hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
フェロモン記憶における神経幹細胞の役割

近年、成熟動物でも中枢神経組織に神経に分化しうる神経幹細胞の存在が示されてきた。神経幹細胞が神経回路網の再構成に関わることが示されれば、神経幹細胞の増殖・分化の誘導、あるいは神経幹細胞の補充により神経変性疾患の治療が可能となろう。しかし、神経幹細胞の機能は謎に包まれたままである。そこで本研究では、優れた記憶学習パラダイムとして申請者らが解析してきたフェロモン記憶の形成、維持、消去に神経幹細胞が如何に関わるかを明らかにすることを目指して本研究を行った。1.可視化した神経幹細胞の形態及び機能の解析分裂中の細胞だけを標識する緑色蛍光タンパクのレトロウィルス発現ベクター(NIT-GFP)を作成した。この濃縮レトロウィルスストックをマウス脳室下帯に注入し、注入48時間後及び4週間後にマウスを屠殺し、生きた嗅球スライス標本を調製した。緑色蛍光を発する細胞の形態を共焦点レーザー顕微鏡で解析したが、レトロウィルスストックの濃縮が十分でなく、濃縮度を上げて再度検討する予定である。2.神経幹細胞が特異的に除去されたトランスジェニックマウスの記憶・学習能の解析Immunotoxin系による神経幹細胞特異的除去を可能にするトランスジェニックマウスを用いて、特定の時期及び場所において神経幹細胞の特異的除去処置を受けたマウスの記憶・学習能を解析する予定である。トランスジーンの発現はGFP蛍光により同定が可能となるように作成したが、十分な緑色蛍光が確認できず、改良が必要であることが判明した。今後、この濃縮レトロウィルスストックをマウス脳室下帯に注入し、注入48時間後及び4週間後にマウスを屠殺し、生きた嗅球スライス標本を調製する。緑色蛍光を発する細胞の形態を共焦点レーザー顕微鏡で解析するとともに、その細胞からホールセル記録を行い、電気生理学的特性(静止膜電位、入力抵抗、時定数、膜容量、自発発火活動、興奮性シナプス後電流EPSC等)を調べる予定である。2.神経幹細胞が特異的に除去されたトランスジェニックマウスの記憶・学習能の解析Immunotoxin系による神経幹細胞特異的除去を可能にするトランスジェニックマウスを用いて、特定の時期及び場所において神経幹細胞の特異的除去処置を受けたマウスの記憶・学習能を解析する予定であるが、現在このトランスジェニックマウスが作成され、次のステップの解析が可能になった。
経済構造と経済循環の変化に関する実証的分析

ロシアの経済構造と経済循環に関して1992年頃を境に何がどのように変わったのか、何故そのように変わったのかについて明らかにした。基本的資料は、近年作成されるようになったロシアのSNA統計であり、その5つの基本勘定である国民所得勘定、産業連関表、資金循環勘定、国民貸借対照表、国際収支表を、分担者5人で1つずつ担当し、データの収集、検証、分析を行った。ロシアSNA統計の本格的な検証という点でも、本研究は世界的に初めてのものである。データの分析によって得られた新たな知見は以下のとおりである。1.近年のロシアGDPの減少が基本的に総固定資本形成の減少によるものであることを明らかにし、今後も、この点がロシア経済成長の制約要因となることを示した。2.産業構造の変化は、名目値で見た場合には、かなりの程度、生産物税・補助金の部門別分配の変化(所得再分配メカニズムの変化)によっており、実質値で見た場合には、貿易の影響が大きいことを明らかにした。3.取引税・価格差補給金を通した所得再分配メカニズムと、貿易に関わる所得再分配メカニズムが体制転換によって大きく変化したことを明らかにした。4.国家財政を通じた拡大再生産メカニズムが崩壊したものの、それに代わるメカニズムが生まれていないことを明らかにした。崩壊の原因としては、歳入不足という形で財政が破綻したことを示した。そして、現時点では、国外への資本逃避や、資金の外貨市場・国債市場への集中により、企業や家計の貯蓄が生産投資に向かわないことを示した。ロシアのSNA統計に関して、その5つの基本勘定である国民所得勘定、産業連関表、資金循環勘定、国民貸借対照表、国際収支表を、分担者5人で1つずつ担当し、データの収集、検証、基礎的分析を行った。1.上記の5つの基本勘定に関係する基本的データと人口・労働力データの収集を行った。2.収集・整理したデータの検証を行った。5つの基本勘定に関係する基本的データ相互の関係を検討した。3.ロシアの統計の問題点を明らかにした。ロシアの従来の統計方法についての理解を深めると同時に、国際的統計方法への移行期の特殊性を明らかにすることに努めた。とくに、(1)GDPの名目値、実質成長率、(2)工業生産の実質成長率、(3)SNA方式の産業連関表、(4)予算統計、(5)マネーサプライ統計および銀行統計、(6)資本ストック統計、(7)国際収支および貿易統計、などに関して、どのような問題があるのかについて綿密な検討を行った。このうち、(1)(3)に関しては、ロシア統計国家委員会との研究協力を開始した。4.以上の統計データを利用して、経済構造と経済循環の変化について基礎的な分析を行った。とくに、(1)生産の大幅な減少、(2)産業構造の転換、(3)財政・金融改革、(4)固定資産の評価替え、(5)経済の開放化、(6)所得再分配メカニズムの変化、などに関して集中的な検討を行い、変化の基本的な方向性を明らかにした。ロシアのSNA統計に関して、その5つの基本勘定である国民所得勘定、産業連関表、資金循環勘定、国民貸借対照表、国際収支表を、分担者5人で1つずつ担当し、データの収集、検証、分析を行うことにより、以下の知見が得られた。1.ロシアのGDP統計、財政統計、国際収支統計、貿易統計について、本研究が対象とする1990年以降のデータを収集・検証することにより、統計方法上の特徴や問題点を詳細に明らかにした。いずれの統計についても、このような詳細な検討は、これまで欧米でもきちんと行われていなかった。2.GDP統計の分析により、とくに間接税や補助金の大きさ・形態が、この市場経済移行期に大きく変化したことが明らかにされた。税金や補助金の動態は、財政統計の分析によって、さらに詳しく明らかにされた。しかしながら、税・補助金の統計上の取り扱いには毎年変更があり、経済循環を把握するうえで重要な税・補助金についての検討は、産業連関表の分析を深めることなどにより、さらに断続する必要があることも明らかになった。3.国際収支表の分析により、ロシアの対外債務・債権の繰り延べの問題、資本流出の問題が極めて重要であることが明らかにされた。しかし、国際収支表作成方法も毎年のように変更されているため、資本流出などの大きさを時系列的に捉えるには至っておらず、こうした問題は今後の課題となっている。

3.取引税・価格差補給金を通した所得再分配メカニズムと、貿易に関わる所得再分配メカニズムが体制転換によって大きく変化したことを明らかにした。4.国家財政を通じた拡大再生産メカニズムが崩壊したものの、それに代わるメカニズムが生まれていないことを明らかにした。崩壊の原因としては、歳入不足という形で財政が破綻したことを示した。そして、現時点では、国外への資本逃避や、資金の外貨市場・国債市場への集中により、企業や家計の貯蓄が生産投資に向かわないことを示した。
消化器粘膜免疫におけるケモカインの時間的・空間的制御機構の生体解析

1、Balb/cマウスの腸管(小腸・大腸)における、ケモカイン(LARC, SDF1α)の局在をRT-PCRで解析をした。また、各々の対応するケモカインレセプター(CCR6,CXCR4)の発現をFACSで解析した。2、同系マウスにTNFαを腹くう内投与し炎症を惹起したところ、ケモカイン(LARC, SDF1α)の発現量をRT-PCR法で比較し、発現の亢進を認めた。3、マウスより分離したリンパ球(SPL:脾臓リンパ球、LPL:腸粘膜固有層リンパ球)を蛍光色素でラベルして経静脈的に投与し、腸粘膜へのmigrationの様子を蛍光顕微鏡下に生体観察した。さらにTNFαを腹腔内に投与すると、migrationが亢進することが観察された4、ケモカイン受容体(CCR6,CXCR4)の中和抗体を予め経静脈より投与することによりブロックし、リンパ球migrationを比較したところ、migrationの減少が観察された。5、リンパ球を大量のケモカイン(LARC, SDF1α)によってdesensitizationしてから経静脈投与すると、リンパ球migrationの減少が観察された。6、CCR6とCXCR4両方のケモカイン受容体の中和抗体を予め経静脈より投与すると、単独の抗体投与時よりも、リンパ球migrationの減少が観察された。7、さらにTNFα投与マウスにおいても、同様の検討を行い、コントロールにおいてよりも、より一層のmigrationの抑制が観察された。
神経組織での低分子量分子シャペロンのストレス応答と生理的意義

平成12年度の研究成果を以下に列挙する1)αBクリスタリンもHsp27と同様に、リン酸化を受けると重合状態に変化が起こり、解離することを明らかにした。また、リン酸化され、解離状態のαBクリスタリンは分子シャペロンとしての活性が低下することを、リン酸化部位のセリン残基をアスパラギン酸に置換した変異蛋白質を発現させた細胞レベル、および変異蛋白質を大腸菌で作製し、in vitroで証明した。2)細胞中のHsp27は各種ストレスに応答して、重合型がリン酸化され、解離することを我々は見いだし報告しているが、今回このストレスによる解離が、各種の蛋白質リン酸化酵素阻害剤で抑制されることを明らかにした。すなわち、ホルボールエステル(PMA)以外の薬剤(亜砒酸ナトリウム、塩化カドミウム。過酸化水素、や高張ストレス)によるHsp27の解離は、p38MAPAKの阻害剤で完全に阻止された。一方、PMAによる解離は、Protein kinase C(PKC)の阻害剤で阻止された。このことはHsp27のセリン残基のリン酸化酵素として、p38MAPKの下流のMAPKAPK-2/3とPKCのδ型が関与しているとする報告を裏付ける結果であたった。3)尾部懸垂により誘発させた廃用萎縮ラットヒラメ筋では、αBクリスタリンのSer-59のリン酸化が特異的に高進し、特に筋肉ホモジェネートの不溶性分画で顕著であることを明らかにした。すなわち、αBクリスタリン、とくにそのリン酸化型が筋細胞内の蛋白質品質管理に関与していることが示唆された。4)U373MGヒトグリオーマ細胞の培養液にプロテアゾーム阻害剤を添加して培養を継続すると、数時間内にαBクリスタリンが不溶性分画に増量しはじめ、Ser-59のリン酸化型が著しく増加すること、細胞をSer-59のリン酸化を認識する抗体で蛍光染色すると、核周辺に濃縮されたいわゆるaggresomeが形成され、リン酸化型αBクリスタリンが、その構成成分の一つであることを見つけた。この結果もαBクリスタリンが細胞内の蛋白質の品質管理に関与していることを示唆している。
細菌のセプタ形成阻害に関する基礎研究

1.Bacillus cereus JCM2152株より温度感受性変異株tsー4を分離した。tsー4を30°Cで培養後、対数期に45°Cで2時間培養してDNA複製を一日完了させた30°Cで15分間培養してDNA合成を開始後、更に45°Cで培養することで同調培養できた。複製開始時より経時的に細胞を芽胸形成培地に移し、芽胞形成率を調べた結果、複製開始直後には20%であった芽胞形成率が、複製開始から40分後には100%となり、90分後には再び15%へと低下した。これより、DNA複製開始より約40分の複製途中の菌のみが、芽胞形成培地にある時、芽胞形成期特有のセプタを形成し芽細胞に向かうものと考えられる。2.B.cereusのクロモソ-ム調製法について検討した。菌体を先ずリゾチ-ム2.5mg/mlとNーアセチルムラミタ-ゼSG10mg/mlで37°C、30分間処理した後、Brij58及びSDSで23°C、20分処理した。これに0.2MになるようにNaCl溶液を加えて溶菌し、4,000Xg,5分間遠心分離後、上清を更に40,000Xg20分間遠心し、沈澱としてクロモソ-ムを調製できた。3.DNA複製開始より10,40,90分後に芽胞形成培地に移し、2時間目まで培養後、集菌した菌より各々クロモソ-ムを調製し、2次元電気泳動によりクロモソ-ム蛋白質の比較を行った。複製開始時に[ ^<35>S]メチオニンを加え複製開始から新たに合成される蛋白質、DNAセルロ-スカラムで調製したDNA結合蛋白質についても同様に比較した。その結果、分子量59K付近の蛋白3種と46K付近の2種の蛋白質は、芽胞形成率の高い時期にのみ新規合成クロモソ-ム蛋白質及びDNAセルロ-スカラムで調製した蛋白質の両方で検出された。これら5種の蛋白質には、分裂期のセプタ形成を阻害するリプレッサ-、芽胞形成期に特有のアクチベ-タ-、RNAポリメラ-ゼのσ因子などが含まれる可能性が考えられる。現在、それぞれの結合するB.cereusの制限酵素断片を検索中である。tsー4を30°Cで培養後、対数期に45°Cで2時間培養してDNA複製を一旦完了させた。再び30°Cで15分間培養してDNA合成を開始させた後、更に45°Cで培養することでDNA複製を同調できた。DNA複製開始時より経時的に細胞を芽胞形成培地に移し、芽胞形成率を調べた結果、複製開始直後には20%であった芽胞形成率が、複製開始から40分後には100%となり、90分後には再び15%へと低下した。

これより、DNA複製開始より約40分後の複製途中の菌のみが、芽胞形成培地にある時、芽胞形成期特有のセプタを形成し芽胞形成に向かうものと考えられる。2.B.cereusのクロモソ-ム調製法について検討した。菌体を先ずリゾチ-ム2.5mg/mlとNーアセチルムラミダ-ゼSG10mg/mlで37°C、30分間処理した後、Briji58及びSDSで23°C、20分処理した。これに0.2MになるようにNaCl溶液を加えて溶菌し、4,000Xg,5分間遠心分離後、上清を40,000Xg,20分間遠心し、沈澱をクロモソ-ム画分とした。クロモソ-ム画分はA_<280>/A_<260>=0.85であり、細菌についてのこれまでの報告(A_<280>/A_<260>=0.60.89)と近い値であったのでクロモソ-ムが調製できたと考えた。3.DNA複製開始より10,40,90分後に芽胞形成培地に移し、120分目まで培養後、集菌した菌より各々クロモソ-ムを調製し、2次元電気泳動によりクロモソ-ム蛋白質の比較を行った。(1)芽胞形成率の高い時期のクロモソ-ムからは検出されなかった蛋白質は74,60,43,40,39,36,33,31,29kDaの蛋白質であった。(2)逆に、芽胞形成率の高い時期のクロモソ-ムからのみ検出された蛋白質は59,45,39kDaであり、(1)には芽胞形成期に特有のセプタ形成を制御するリプレッサ-、(2)には分裂期のセプタ形成を阻害するリプレッサ-、芽胞形成期に特有のRNAポリメラ-ゼのσ因子などが含まれる可能性が考えられる。1.Bacillus cereus JCM 2152株より分離した温度感受性変異株tsー4のDNA複製を同調し、同調開始時に[ ^<35>S]メチオニンを添加し、これより10,40,90分目に芽胞形成培地に移して同調開始より2時間目まで培養した。各菌体からクロモソ-ムを調製し、二次元電気泳動を行い、de novoに合成されるクロモソ-ム蛋白質と芽胞形成の関係を調べた。その結果、芽胞形成のsensitive stageである40分目に増加した蛋白質17種、減少した蛋白質1種を検出した。2.B.cereusのDNAをMarmurらの方法を改良した方法で調製し、これをセルロ-スに結合し、DNAーセルロ-スカラムを調製した。同調培養開始から10,40,90分目に芽胞形成培地に移して同調開始より2時間目まで培養した菌体を超音波破砕し、無細胞抽出液からB.cereus DNAセルロ-スカラムを用いて調製したDNA結合蛋白質の二次元電気泳動を行った。また、対数期及び対数期の菌体を芽胞形成培地に移して2時間培養した菌体からも同様にDNA結合蛋白質を調製し、電気泳動を行った。その結果、芽胞形成のsensitive stageである40分目と対数期の菌体を芽胞形成培地に移して培養した後の両方で増加した蛋白質14種、逆に減少した蛋白質1種を見出した。3.複製開始から新たに合成させる蛋白質、DNAセルロ-スカラムで調製したDNA結合蛋白質について比較した結果、分子量59K付近の蛋白3種と46K付近の2種の蛋白質は、芽胞形成率の高い時期のクロモソ-ム、DNAセルロ-スカラムで調製した蛋白質からのみ検出された。これら5種の蛋白質には、分裂期のセプタ形成を阻害するリプレッサ-、芽胞形成期に特有のアクチベ-タ-、RNAポリメラ-ゼのσ因子などが含まれる可能性が考えられる。現在、それぞれ精製し、結合するB.cereusの制限酵素断片を検索中である。
アルブミン遺伝子プロモーターを結合した癌遺伝子による肝発癌

albumin遺伝子が肝細胞で特異的に発現するのは、albumin遺伝子のpromoter領域に肝細胞特異的な転写因子が働くためである。本研究はalbumin promoterを癌遺伝子に結合して肝細胞に導入後、肝内に移植することにより肝細胞を癌化させる発癌モデルを確立することを目的とした。実験は以下の点に分けて行った。1)albumin promoter領域の470baseをPCRにて増幅し、これをpUCE1Aに組み込み、pAlbE1A vectorを作製した。これをラット分離肝細胞及び不死化マウス肝細胞にtransfectしたところ、E1A mRNA及び蛋白が、transientに発現することが認められた。2)retroviral vector法により分離肝細胞に遺伝子導入するために、β-gal遺伝子をreporterとするpMNSM-Tk-lac Z vectorを作製し、これをPA317 amphotropic packagingcell lineにtranfectしてレトロウィル粒子に封入した。これをnewborn ratの分離肝細胞に感染させたところ、効率よく導入できることが明らかになった。3)肝臓内に分離肝細胞を移植する系を確立するためにcongenic無アルブミンラットの肝内にF344ラットの分離肝細胞を注入た。生着率はalbumin陽性細胞数、RT-PCR法によるalbumin mRNA、血清albuminの上昇をマーカーとして検討したところ、donor肝細胞は宿主肝細胞1000個に対して約1個の割合で生着することが確認された。4)in vitroで遺伝子操作を加えた細胞を生体内に戻すことができるか否かを検討した。培養細胞を回収しやすくするためにspheroid培養を行い、これを肝内または脾内に移植したところ、生着し、生常の肝細胞の機能と形態を回復することが確認された。また、in vitroでretro-viral vectorをtransfectした肝細胞は短期間であるが、脾内に生着し、transgeneを発現することが確認された。本研究の目的は、ラットアルブミン遺伝子のプロモ-タ-領域をクロ-ニングし、その下流に癌遺伝子を組み込んで肝細胞に特異的に発現するベクタ-を作製し、これを肝細胞及びトランスジェニックマウスに導入して肝における癌遺伝子の働きを調べることである。本年度は1.ラットgenomic DNAからアルブミンプロモ-タ-のcore elementsを含む470bpの領域を、両端にBam Hl siteをもつprimerを用いてPCR法により増幅し、クロ-ニングした。このDNA断片の塩基配列を調べたところ、既に報告されている配列に一致した。次に、このDNA断片をadenovirus ElA遺伝子を含むpUCElAに組み込み、pAlbElAベクタ-を作製した。2.このベクタ-を電気穿孔法により、F344ラット分離肝細胞に導入し、プロモ-タ-が肝細胞で作用するか否かを検討した。陽性コントロ-ルとしてはpLTRElA,陰性コントロ-ルとしてはpUCElAを用いた。Transfection後24時間以内にmRNAを分離し、ElAをプロ-ブとしてNorthern hybridizationを行なったところ、pAlbElAではpLTRElAと同様にElAmRNAの発現が見られた。さらに抗ElA抗体によるimmunoprecipitationにより、蛋白の発現についても検討中である。3.さらにこの遺伝子をマウス受精卵に導入してトランスジェニックマウスを作製するべく準備中である。本研究の目的は、ラットアルブミン遺伝子のプロモ-タ-領域をクロ-ニングして、癌遺伝子の上流に組み込み、これを肝細胞に導入することにより、肝細胞特異的に癌遺伝子を発現させる新しい肝発癌モデルを確立することである。

1.ラットgenomic DNAからアルブミンプロモ-タ-のcore elementsを含む470bpの領域を、両端にBam HI siteを持つprimerを用いてPCR法により増幅し、クロ-ニングした。次に、このDNA断片をadenovirus E1A遺伝子を含むpUCE1Aに組み込み、pA1bE1Aベクタ-を作製した。さらにこのベクタ-をF344ラット分離肝細胞に導入し、プロモ-タ-が肝細胞で作用するか否かを検討した。Transfection後24時間以内にmRNAを分離し、E1Aをプロ-ブとして、Northern hybridizationを行なったところ、E1AmRNAの発現が見られ、また、抗E1A抗体によるimmunoprecipitationにより、蛋白の発現が確かめられた。2.正常ラット肝細胞をスフェロイド培養し、レトロウィルスベクタ-に組み込んだ外来遺伝子をトランスフェクトしたところ、高率にトランスフェクションが可能であった。また、この遺伝子導入肝細胞を同系ラットの脾内に移植し、生体内で外来遺伝子を発現できることが確認された。3.C3Hマウスの不死化した正常肝細胞にpA1bE1Aを単独または他の癌遺伝子と組み合わせてトランスフェクトして、トランスフォ-マントを作製した。このトランスフォ-マントをC3Hに移植して、それらの腫瘍形成能を検討中である。本研究の目的は、アルブミン遺伝子のプロモータを上流に組み込んだ癌遺伝子を分離肝細胞に導入し、これをを肝内に移植して、肝癌を誘発するモデルを製作することである。これまでアルブミンのプロモーター領域のクローニング及びそれを癌遺伝子の上流に組み込んだベクターの作製、さらに外来遺伝子を分離肝細胞に導入する方法について検討を行なってきたが、本年は分離肝細胞を再び生体内に戻す方法についての検討を行った。1)無アルブミンラット肝内にF344ラットの分離肝細胞を門脈内に注入して、アルブミン陽性細胞数、アルブミンmRNA、血清アルブミンの上昇をマーカーとして生着率を測定した。この結果、正常肝細胞を2x10°個注入した場合には宿主細胞1000個中に約12個の割合でドナー細胞が生着することが確認された。また、門脈内への注入を1週おきに繰り返することにより、生着細胞数を有意に増加することができた。2)培養肝細胞を回収して再び生体内に移植することができるか否かを検討した。分離肝細胞をspheroid培養したのち、肝内及び脾内に移植したところ、正常の構造と機能が回復し、分離直後の肝細胞の移植と同様の結果になることが確認された。3)spheroid培養したnewborn rat肝細胞にretroviral vectorによるβ-gal遺伝子の導入を行ったところ効率よく導入できることが明らかになった。
iPS心筋組織の細胞外基質リモデリングによる移植心とのintegration開発

一般的に心筋組織は心筋細胞や線維芽細胞等が細胞外マトリックス(ECM)を介して物理的接合または細胞間、細胞-ECM間での細胞シグナルの伝達を行っており、移植心筋細胞の生存及び移植心筋組織のレシピエント心筋へのintegrationに関してECMの果たす役割は大きい。心筋組織がvivoに移植された際、心筋組織内のECMのremodelingが移植心筋細胞の成熟性、生着性及びレシピエント心筋組織へのintegrationに大きく寄与すると考えられるが、その詳細は明らかではない。本研究の目的は、体外で作成した人工的心筋組織をvivoに移植した際におこるECMのremodeling及び移植心筋細胞の表現型を詳細に検討し、移植後remodelされたECMの特性及びレシピエント心筋ECMとの相同性を検証することである。我々はフィブロネクチンとゼラチンによるLayer by Layer法でヒトiPS由来心筋構築組織を作成し、心筋梗塞により慢性心不全をきたした免疫不全ラットに移植し、12週後に犠死させ、心臓組織検体を作成した。免疫染色法を用いてラミニン、IV型コラーゲン、パールカン、エンタクチンなどのECMが心筋構築組織の移植前後で変化し、さらにレシピエント心筋のECM構成と似ていることがわかった。また心筋細胞の成熟評価については膜タンパクであるインテグリン、サルコグリカン、ディストログリカン、中間型フィラメントも心筋構築組織が移植前後で成熟し、より正常心筋細胞に近づいていることがわかった。CMのremodeling及び、心筋細胞成熟評価としてマイクロダイセクション法にて移植した心筋構築組織、移植部位の周囲組織を分離し、移植前後の心筋構築組織をmRNA化した後、DNAマイクロアレイで発現しているECM蛋白の発現、心筋蛋白を網羅的に評価したが、検体も数が少なくさらなる検体の数が必要と思われる。
内耳免疫応答の成立過程の解明

マウス内リンパ嚢における免疫担当細胞の分布について飼育環境の異なるGF,SPF,およびCVマウスを用いて免疫組織化学的に検討した。その結果、抗原刺激の頻度が高くなるにつれて内リンパ嚢上皮下組織に存在するリンパ球数が増加した。2)中耳炎起炎菌であるHaemophilus influenzaeの菌体成分であるエンドトキシンを中耳腔に注入し内耳への影響について検討した。その結果、エンドトキシンが正円窓を透過して内耳の炎症反応さらに内リンパ水腫を引き起こすことが示された。3)内耳への抗原刺激時における内耳局所免疫応答において内リンパ嚢上皮下組織に動員されるリンパ球が内耳局所での抗体産生に与かっていることを以下のごとく証明した。同系ラットであるWistar-Kingラットを用いて、抗原特異的(KLH特異的)抗体ならびに感作リンパ球の受動感作モデルを作成し、内耳へKLHで抗原刺激を行い、その際の外リンパ液中の抗原特異的抗体価を測定し、さらに内リンパ嚢上皮下組織に動員されたリンパ球のサブセットについて免疫組織学的な定量的検討をおこなった。その結果、免疫血清のみを受動移入したラットにおいては、抗原注入側外リンパ液中の抗原特異的抗体価は非注入側と比べ上昇せず、内リンパ嚢上皮下組織における単位面積あたりのIgG陽性リンパ球の数においても差がなかった。一方、免疫血清ならびに感作リンパ球を同時に移入したラットでは、抗原注入側外リンパ液中の抗体価が非注入側に比べ上昇し、内リンパ嚢上皮下組織の単位面積あたりのIgG陽性リンパ球の数が有意に増加していた。さらに同時期の内リンパ嚢上皮下組織においてhelperT細胞やsuppressorT細胞も動員されていた。以上の結果より、内耳局所二次免疫応答においては、内耳局所感作後早期においての内リンパ嚢への免疫担当細胞の動員には抗原特異的抗体ならびに前駆細胞としての感作リンパ球が必要であることが示唆された。1)ICRマウスを用いて.GermーFree(GF),specific pathogen free(SPF),Conventional(CV)のそれぞれ異なる環境で飼育し8週令のマウスの内リンパ嚢周囲組織における免疫担当細胞の分布を見た。その結果、鼻腔粘膜に比べ抗原刺激の少ないとされる中耳粘膜ではCVマウスでIgA,IgM,Lytー1陽性細胞のみが散見され、SPFやGFマウスでIgM陽性細胞が僅かにみられたが、中耳よりもさらに抗原刺激の少ない内リンパ嚢周囲ではGFやSPFマウスではリンパ球はほとんど見られずCVマウスにおいても少ないながら染色した結果、IgM陽性細胞が一部同定されたのみであった。以上の結果は、抗原刺激を受けていない内リンパ嚢周囲には分化成熟した免疫担当細胞は存在しない事を示唆し、内リンパ嚢が内耳に微生物等の異物の侵入に際し、即時に局所免疫応答をしうる組織で無いことが示された。2)ヒヒより得られた側頭骨を用いて内リンパ嚢に液性免疫さらに粘膜免疫機構が存在するがどうか検討した。死後直後のヒヒより側頭骨を採取しホルマリン固定後、内リンパ嚢を顕微鏡下に分離し、気管粘膜を陽性コントロ-ルとして抗ヒトIgG,IgM,IgAポリクロ-ナル抗体および抗ヒト分泌因子抗体を用いてABC法で免疫染色を行った。その結果、内リンパ嚢上皮下の結合織にIgGが染色されたがIgMやIgAは染色されなかった。上皮および他の部位に分泌因子は染色されなかった。

内リンパ嚢周囲組織においてもIgG保有リンパ球は散見されたもののIgMやIgAを保有するリンパ球は無かった。これらの結果は、内リンパ嚢は免疫的に液性免疫のコントロ-ル下にはあるものの、気道や消化管に存在する粘膜免疫は内リンパ嚢には備わっていない事を示唆した。(1)鼓室内エンドトキシンの内耳への影響について:グラム陰性の中耳炎起炎菌であるHaemophilus influenzaeよりphenolで抽出したエンドトキシン1mgをチンチラの鼓室内に注入後、経時的(24、48、72、96時間)に内耳への影響を組織学的に検討した。また、同時に中耳貯溜液および外リンパ液中のエンドトキシン活性を測定した。エンドトキシン鼓室内注入後96時間まで外リンパ液中にエンドトキシン活性が認められた。内耳の組織学的所見では観察した96時間後までの全経過を通して、外リンパ腔(鼓室階、前庭階、ラセン靭帯)への炎症細胞浸潤および出血、血管条の細胞間隙の拡大、有毛細胞の変性、ならびに内リンパ水腫が認められた。以上の結果より、Haemophilus influenzae由来のエンドトキシンの鼓室内注入で内耳に強い炎症反応や内リンパ水腫が起こることが示された。この結果は、エンドトキシンを細胞壁に有する中耳炎起炎菌によって内耳障害が起こりうる可能性を示唆するものと考えられた。(2)内耳免疫応答における内リンパ嚢の役割:抗原としてKLHを用いて、WistarーKingラットを全身的に前感作し二次的に外リンパ腔にKLHを投与し、内耳局所二次免疫応答における内リンパ嚢へのリンパ球サブユニットの動員につき免疫組織学的検討を行った。その結果、内リンパ嚢上皮下組織にB細胞サブセットやT細胞サブセットなどの免疫担当細胞の動員が起こることを示した。この結果より外リンパ液中の抗原特異的抗体の少なくも一せは内リンパ嚢上皮下組織に動員されたBリンパ球により産生されたと考えられ、T細胞により抗体産生の調筋がおこなわれている可能性が示唆された。また、特異抗体ならびに感作リンパ球による受動感作の実験から内リンパ嚢への免疫担当細胞の動員に特異抗体ならびに感作リンパ球が必要であることが示された。1)内耳への抗原刺激時における内耳局所免疫応答において内リンパ嚢上皮下組織に動員されるリンパ球が内耳局所での抗体産生に与かっていることを証明するとともに内リンパ嚢へのリンパ球の動員のメカニズムについて以下のごとく証明した。同系ラットであるWistar-Kingラットを用いて、抗原特異的(KLH特異的)抗体ならびに感作リンパ球の受動感作モデルを作成し、内耳へKLHで抗原刺激を行い、その際の外リンパ液中の抗原特異的抗体価を測定し、さらに内リンパ嚢上皮下組織に動員されたリンパ球のサブセットについて免疫組織学的な定量的検討をおこなった。その結果、免疫血清のみを受動移入したラットにおいては、抗原注入側外リンパ液中の抗原特異的抗体価は非注入側と比べ上昇せず、内リンパ嚢上皮下組織における単位面積あたりのIgG陽性リンパ球の数においても差がなかった。一方、免疫血清ならびに感作リンパ球を同時に移入したラットでは、抗原注入側外リンパ液中の抗体価が非注入側に比べ上昇し、内リンパ嚢上皮下組織の単位面積あたりのIgG陽性リンパ球の数が有意に増加していた。さらに同時期の内リンパ嚢上皮下組織においてhelperT細胞やsuppressorT細胞も動員されていた。
浸透圧調節に利用するイオン種からみた緑色植物と黄色植物の違い

黄色植物(ストラメノパイル)に属する淡水産オカフシナシミドロ(Vaucheria terrestris sensu Gotz)の光屈性は約8Wm^<-2>で正から負に転換するが,外液に20mM程度のNaClを加えるとさらに低強度で負光屈性が起こる.一方,汽水産のV.DichotomaはNaCl濃度を増しても正光屈性のままであった.この違いは後者は膨圧回復能力があるのに対し,前者はそれがなく,下がった膨圧を回復できないことに起因すると思われる.そこで膨圧調節機構を解析するため,フシナシミドロが浸透圧調節に利用するイオン種を調べたところ,(1)両種とも,カチオンは多くのK^+と少しのNa^+を吸収するのに対し,アニオンはCl^-より遙かに多くのSO_4^<2->を吸収することがわかった.(2)比較のため調べたマリモ(Egagropira linnaei)(緑藻)は,シャジクモなどと同様に,もっぱらK^+とCl^-だけを吸収して浸透圧を制御することがわかった.そこで,SO_4^<2->の浸透圧調節への利用能力の違いが緑色植物と黄色植物を分ける形質であるかを検討した.(3)緑藻としてシャジクモ(Chara australis)やマリモ,ネダシグサ(Rhizoclonium sp.),チョウチンミドロ(Dichotomosiphon tuberosus)など,黄色植物としてフシナシミドロや淡水の褐藻類,珪藻などを純粋培養し,同一光条件下で浸透調節に用いるイオンン分析を行った.フシナシミドロ,シャジクモおよび,いくつかのCladophora類で上の仮説を支持する結果が得られた.黄色植物はSO_4^<2->チャンネルがCl^-チャンネル多いと推測できた.今後さらに多くの黄色植物について検討を重ね,遺伝子レベルで確かめたい.また,(4)神戸大学の川井教授のグループと共同して,海産褐藻類アミジグサの仲間で硫酸を蓄積するものと,しないもののイオン組成を比較した.その結果,硫酸をためるものも,ためないものも,多量のSO_4^<2->を吸収している事実は上の仮説を支持する.藻類の系統進化を浸透制御やイオン制御の観点から見た研究はほとんどない.浸透圧制御に用いるカチオンについてみれば,K^+とNa^+の使用に系統の違いは見られないが,その対イオンであるアニオンについて,不思議なちがいが認められた.黄色植物フシナシミドロは,塩素イオンが豊富な外液環境においても,塩素イオン(Cl^-)より硫酸イオン(SO_4^<2->)を好んで吸収する.一方,同じ培養液で同時に行った実験で,緑色植物マリモはSO_4^<2->は吸収せず,もっぱらCl^-を吸収して浸透圧や膨圧を調節する.同様のことはシャジクモでもよく知られている.この違いが,界の違いに由来するのか,あるいはもっと下位の系統の違いに由来するのかを調べることが,本研究の目的である.平成10年度は,そのための実験系の確立につとめた.黄色植物として淡水産フシナシミドロ3種,汽水産フシナシミドロ1種,卵菌ミズカビ,緑色植物として,シャジクモ,マリモ類数種,ヒザオリ,ニワツノゴケ,および,種子植物のヒンジモの収集と培養をほぼ確立した.さらに系統保存機関からいくつかの藻類種を取り寄せ,本研究に適した,淡水系と汽水ないし海水系の2種の単純な培養システムを開発中である.一方で,神戸大学の川井らとの共同研究を行い,黄色植物の代表ともいうべき海産褐藻類の,アミジグサ目藻類での硫酸(H_2SO_4),あるいは,SO_4^<2->の蓄積を比較解析した.この目には,高濃度のH_2SO_4を蓄積し,雨水に打たれる等の急激な外液浸透圧低下で自らが死ぬと,流出したH_2SO_4で周辺の藻類をも殺してしまう種がある.ところが,酸を蓄積しない種でも,ほぼ匹敵する量のSO_4^<2->をもっていることをあきらかにした(1998植物学会,1999藻類学会).これらはH^+のかわりにMg^<2+>を多量にもっていた.これは,フシナシミドロでの結果に一致する.黄色植物(ストラメノパイル)に属する淡水産オカフシナシミドロ(Vaucheria terrestris sensu Gotz)の光屈性は約8Wm^<-2>で正から負に転換するが,外液に20mM程度のNaClを加えるとさらに低強度で負光屈性が起こる.一方,汽水産のV.DichotomaはNaCl濃度を増しても正光屈性のままであった.この違いは後者は膨圧回復能力があるのに対し,前者はそれがなく,下がった膨圧を回復できないことに起因すると思われる.そこで膨圧調節機構を解析するため,フシナシミドロが浸透圧調節に利用するイオン種を調べたところ,(1)両種とも,カチオンは多くのK^+と少しのNa^+を吸収するのに対し,アニオンはCl^-より遙かに多くのSO_4^<2->を吸収することがわかった.(2)比較のため調べたマリモ(Egagropira linnaei)(緑藻)は,シャジクモなどと同様に,もっぱらK^+とCl^-だけを吸収して浸透圧を制御することがわかった.そこで,SO_4^<2->の浸透圧調節への利用能力の違いが緑色植物と黄色植物を分ける形質であるかを検討した.

(3)緑藻としてシャジクモ(Chara australis)やマリモ,ネダシグサ(Rhizoclonium sp.),チョウチンミドロ(Dichotomosiphon tuberosus)など,黄色植物としてフシナシミドロや淡水の褐藻類,珪藻などを純粋培養し,同一光条件下で浸透調節に用いるイオンン分析を行った.フシナシミドロ,シャジクモおよび,いくつかのCladophora類で上の仮説を支持する結果が得られた.黄色植物はSO_4^<2->チャンネルがCl^-チャンネル多いと推測できた.今後さらに多くの黄色植物について検討を重ね,遺伝子レベルで確かめたい.また,(4)神戸大学の川井教授のグループと共同して,海産褐藻類アミジグサの仲間で硫酸を蓄積するものと,しないもののイオン組成を比較した.その結果,硫酸をためるものも,ためないものも,多量のSO_4^<2->を吸収している事実は上の仮説を支持する.
PDE2遺伝子変異を標的とした悪性腫瘍の新規治療方法の開発

cAMPやcGMPの分解酵素であるPhosphodiesterase (PDE)はPDE111のファミリーにより構成されている。これまでにわれわれは口腔由来悪性黒色腫細胞でPDE2が浸潤に関係し、PDE2遺伝子変異が見られることを報告した。そこで,細胞浸潤とこの変異との関係を検討した。PDE2の発現のない口腔悪性黒色腫細胞に変異型を強制発現させると浸潤は促進した。そして、浸潤細胞はヘテロ変異型であった。これらの結果より、PDE2の変異が細胞浸潤に関係する可能性を認めた。cAMP等の分解酵素であるPhosphodiesterase (PDE)はPDE111のファミリーにより構成されており,更に,各ファミリーにはAからDのサブタイプが存在する.これまでに我々は,PDE2阻害により浸潤能が低下する口腔悪性黒色腫細胞で,PDE2遺伝子変異がみられることを報告した.そこで,本変異と細胞浸潤との関係を調べるため,最初に口腔悪性黒色腫細胞に変異型PDE2を強制発現させて浸潤能への影響を解析した.導入の確認は免疫染色,PDE assay,western blottingで行い,マトリゲルインベージョンチャンバーを用いたinvasion assayで細胞浸潤の解析を行った.野生型と変異型PDE2A導入群はいずれも導入効率は免疫染色で約35%で,PDE assayでは高いPDE2活性を、Western blottingでは強いPDE2Aタンパク質の発現を認めた.しかし,control群とplasmid群では全く認めなかった.変異型PDE2A導入群のみInvasion assayで約40%細胞浸潤が増加していた.以上より,PDE2の遺伝子変異が悪性黒色腫細胞の浸潤能亢進に関与する可能性が示唆された.また、下流シグナルを誘導体等で検討し、cAMPとPKAのシグナルが関係する可能性が示唆された.現在までに、研究実施に支障はなく、概ね順調である。研究成果の一部は、第52回口腔組織培養学会にて報告した。細胞内伝達物質(cAMPやcGMP)の分解酵素であるphosphodiesterase(PDE)はPDE1からPDE11のファミリーで構成されており、各ファミリーにはAからDのサブタイプが存在する。これまでにわれわれはアイソザイムの一つであるPDE2を特異的阻害剤、siRNA、ドミナントネガティブで阻害すると悪性黒色腫細胞の浸潤が阻害されることを初めて報告した。しかし、その作用機序は全く不明であったため、PDE2遺伝子の塩基配列を検討したところPDE2遺伝子変異を確認した。そこでPDE2を発現していない細胞に野生型と変異型PDE2を導入したところ変異型を導入した細胞のみ浸潤能が上昇した。しかし、シークエンスでは変異部位に重なって非常に低い別のピークらしきものを認めたため、デジタルPCRで確認を行った。その結果、親細胞はホモ野生型、ホモ変異型、ヘテロ変異型などの組み合わせが考えられた。浸潤細胞はヘテロ変異型であったがほとんどの遺伝子が変異していたので変異型が浸潤に重要であることが示唆された。そこで、野生型と変異型PDE2を導入した細胞で細胞内局在を検討したところ変化は明瞭ではなかった。また、浸潤に関係する下流シグナルは各種インヒビターやアクチベーターなどのによりcAMP-PKAシグナルが関係することがわかった。以上の結果よりPDE2関連シグナルが悪性黒色腫に対する新しい分子標的試薬のターゲットとなり新規の診断方法や治療方法を確立することができる可能性が示唆された。現在までに研究に支障なく概ね順調である。研究成果の一部は、第71回日本口腔科学会総会(平成29年4月)で発表予定である。cAMPやcGMPの分解酵素であるPhosphodiesterase (PDE)はPDE111のファミリーにより構成されており,更に,各ファミリーにはAからDのサブタイプが存在する.これまでにわれわれは口腔由来悪性黒色腫細胞でPDE2が浸潤に関係し,PDE2遺伝子変異によりアミノ酸の変化が見られることを報告した.本変異と細胞浸潤の関係を調べるために,PDE2発現のない口腔悪性黒色腫細胞に野生型,あるいは,変異型PDE2を強制発現させて浸潤能への影響を解析した.導入の確認はリアルタイムPCR,免疫染色,PDE assay,western blottingで行い,マトリゲルインベージョンチャンバーを用いたinvasion assayで細胞浸潤の解析を行ったところ変異型PDE2導入群のみ細胞浸潤が増加していた.しかし,親細胞ではホモ野生型,ホモ変異型,ヘテロ変異型の3タイプが考えられたため浸潤細胞での高次構造解析や特異的複合体形成の研究の前に浸潤細胞の変異型について詳細に検討することが必要となった.マトリゲルインベージョンチャンバーを用いたinvasion assayで浸潤した各浸潤細胞はヘテロ変異型のみであった.また,野生型と変異型の遺伝子発現の割合はほとんどが変異型であり,各浸潤細胞でほぼ同様な割合であった.次に,口腔悪性黒色腫細胞でPDE2の遺伝子変異が悪性黒色腫細胞の浸潤能亢進に関与する可能性が示唆されたことより,他の悪性腫瘍細胞で検討したところいくつかの悪性腫瘍細胞でも同様の結果であった.以上より,PDE2の遺伝子変異が悪性黒色腫細胞の浸潤能亢進に関与する可能性が示唆された.cAMPやcGMPの分解酵素であるPhosphodiesterase (PDE)はPDE111のファミリーにより構成されている。

これまでにわれわれは口腔由来悪性黒色腫細胞でPDE2が浸潤に関係し、PDE2遺伝子変異が見られることを報告した。そこで,細胞浸潤とこの変異との関係を検討した。PDE2の発現のない口腔悪性黒色腫細胞に変異型を強制発現させると浸潤は促進した。そして、浸潤細胞はヘテロ変異型であった。これらの結果より、PDE2の変異が細胞浸潤に関係する可能性を認めた。研究計画に特に変更点はなく、当初の計画に従って進めていく予定である。研究計画に沿って行う予定であるが、浸潤細胞がヘテロタイプであることがわかったことより確認の実験を追加する予定である。口腔外科消耗品の価格変動により、少額ではあるが、次年度使用額が生じた。消耗品の価格変動により、次年度使用額が生じた。今年度使用予定の薬品には、当初の予定よりも価格が高騰しているものがある。次年度使用額をあてて購入する予定である。今年度使用予定の薬品等には、当初の予定より価格が高騰しているものがある。
天然RNAライブラリを基盤とした新規機能性RNAおよび新規機能性ペプチドの探索

本研究では、in vitroセレクション法を用いて生体内標的分子に特異的に結合する新規機能性RNAおよび新規機能性ペプチドの探索を行った。本研究の特色は、生体から抽出したRNA(=天然RNA)をライブラリ化した点にあり、これをビーズ担体に固定化した葉酸などの標的分子と相互作用させビーズ画分を回収することにより、標的分子に結合する天然機能性RNAのセレクションを行った。また、天然RNAライブラリをin vitro翻訳したペプチドライブラリを用いてmRNA display法と組み合わせることにより、Keap1などの標的分子に特異的に結合する天然ペプチドの探索を行った。本研究では、生体内標的分子に特異的に結合する新規機能性RNAおよび新規機能性ペプチドの探索を行うための新しいin vitroセレクション法の開発を実施している。SELEX法やmRNAディスプレイ法などの既存のin vitroセレクション法ではランダムRNAライブラリやランダムペプチドライブラリを用いて標的に結合する分子の探索を行うが、本手法では生体から抽出したRNA(=天然RNA)やそれを翻訳したペプチドをライブラリ化したものを用いることにより天然由来の機能性RNAや機能性ペプチドの探索を可能にするものである。現在までに、まずヒト培養細胞から抽出したsmall RNA画分を数十から数百塩基程度の長さに限定分解してRNAライブラリの構築を行い、これを用いて葉酸を標的としたin vitroセレクションの実施をした。また、RNAライブラリの5'末端側にSD配列と開始コドンを、3'末端側に終止コドンをそれぞれ付加することでペプチド翻訳用のRNAライブラリの構築を行った。さらにこの翻訳用RNAライブラリをpuromycinリンカーと連結したのちin vitro翻訳系を用いて翻訳することでペプチドライブラリを作成することに成功した。そしてこれを用いてin vitroセレクションが可能かどうかを検証するために、既知のペプチドリガンドが知られているタンパク質標的を用いたin vitroセレクションを開始した状況である。これにより、in vitroセレクションがうまく機能することが確認できれば、今後リガンド未知のタンパク質標的(オーファンGPCRなど)を用いたin vitroセレクションを開始する。本研究課題では、特定の生体分子を標的として特異的に結合する新規機能性RNAないし新規機能性ペプチドの探索を進めており、そのための方法論として新しいin vitroセレクション法の確立を目指している。RNAに対するSELEX法やペプチドに対するmRNAディスプレイ法などの既存のセレクション法では、完全にランダムな配列からなるRNAライブラリやペプチドライブラリの中から標的に結合する分子の探索を行うが、本手法では生体から抽出したRNAやそれを翻訳したペプチドをライブラリとして用いることにより天然に存在する機能性RNAや機能性ペプチドの探索を目指している。これまでにヒト培養細胞から抽出したsmall RNA画分を用いてRNAライブラリの構築を行い、これを用いて葉酸を標的としたin vitroセレクションを実施した。その結果、葉酸に結合するとみられるsmall RNAの配列を複数種類同定することに成功し、中でもマイクロRNA前駆体の一つであるpre-miR-125aに対する着目してその結合能の解析を進めた。また、生体内由来のRNAから翻訳したペプチドライブラリの構築に成功し、これを用いてKeap1やcMet、アンジオテンシンレセプターなどのタンパク質を標的としてペプチドのin vitroセレクションを実施した。その結果、実際にこれらの標的タンパク質に結合するペプチド配列が複数種類得られた。天然RNAライブラリを用いたin vitroセレクションにおいては、葉酸を標的とするセレクションに成功しており、葉酸に結合するとみられるsmall RNAの配列を複数種類見出すことができた。セレクションで得られた配列のうちいくつかのものについてはライブラリに付加したアダプター配列が存在しないと葉酸に結合できないアーティファクトであったが、ヒトマイクロRNA前駆体の一つであるpre-miR-125aについてはアダプター配列がなくても実際に葉酸に結合することが確かめられた。現在、pre-miR-125aと葉酸との結合様式や結合力の強さの解析を進めているところである。天然ペプチドライブラリ用いたin vitroセレクションについては、Keap1、cMet、アンジオテンシンレセプターを標的とするセレクションを実施した。その結果Keap1については複数種類のペプチド配列が得られており、Keap1の既知のリガンド中に含まれるペプチド配列の獲得に成功したほか、アストラタクチン由来の新規結合配列の取得に成功し、この手法が新しいペプチド-タンパク質間相互作用の探索に有効なものであることを示した。本研究課題では、小分子やタンパク質などの特定の生体分子を標的として特異的に結合する生体内RNAおよび生体内ペプチドの探索を進めている。そして、そのための新しい手法として生体由来RNA画分を用いたin vitroセレクション法の確立を目指している。既存のRNAに対するSELEX法やペプチドに対するmRNAディスプレイ法などのセレクション法では、通常は完全にランダムな配列からなるRNAライブラリやペプチドライブラリを用いて標的に結合する分子の探索を行うが、本手法では生体から抽出したRNAやそれを翻訳したペプチドをライブラリとして用いることにより天然に存在するRNAやペプチドと標的分子との相互作用を探索する。また、生体由来のsmall RNAから翻訳したペプチドライブラリの構築に成功し、これを用いてKeap1やcMet、Lgr5、アンジオテンシンレセプターなどのタンパク質を標的としてペプチドのin vitroセレクションを実施した。現在、得られたペプチドの結合力や標的特異性の検証を進めている。

また、ペプチドライブラリの改良を実施している。天然RNAライブラリを用いたin vitroセレクションにおいては、磁気ビーズに固定化した葉酸を標的とするsmall RNAのセレクションに成功しており、葉酸に結合するRNA配列を複数種類同定することができた。得られた配列のうちいくつかはライブラリ作成の際に付加したアダプター配列が存在しないと葉酸に結合できないアーティファクトであったが、ヒトマイクロRNA前駆体の一つであるpre-miR-125aについてはアダプター配列がなくても実際に葉酸に結合することが確認された。さらに、葉酸がpre-miR-125aのどの部分に結合するかを解析するためにpre-miR-125aの様々な箇所に変異を導入した変異体を作成し、葉酸との結合力を解析したところpre-miR-125aのループ部分に葉酸が結合していることが示唆された。上記の内容は、2016年12月にRNA誌に論文として発表した。天然ペプチドライブラリ用いたin vitroセレクションについては、Keap1、cMet、Lgr5、アンジオテンシンレセプターを標的とするセレクションを実施した。その結果Keap1については複数種類のペプチド配列が得られており、Keap1の既知のリガンドであるNrf2中に含まれるペプチド配列の獲得にも成功したため、本手法が生体内のタンパク質間相互作用の検出に有効であることが示された。また、Nrf2のほかアストラタクチン由来の新規結合配列の取得に成功し、この手法が未知のタンパク質間相互作用の探索にも有効なものであることを示した。現在、得られたペプチドを化学合成し細胞内での相互作用様式の解析を進めているところであるが、ペプチド合成用の施設が火災のため使用できない状況となったため中断中である。その他、ペプチドライブラリの改良のための手法の確立を進めている状況である。本研究課題では、特定の生体分子を標的として特異的に結合する生体内RNAないし生体内ペプチドを探索するための新しい手法の開発を目指して、生体由来RNA画分から構築したRNAライブラリを用いたin vitroセレクション法の確立を進めた。
移住労働者とその家族の国際人権保護基準に基づいた法基盤整備の総合的研究

グローバリゼーションが進み「人の国際移動」が多様化・複雑化・大規模化する中で、移動プロセスや移動先での人権問題は国際社会の懸案事項となっており、新たな国際基準が検討・策定・実施されている。日本では2019年度より新たな出入国・在留管理体制が導入され、さらなる外国人労働者の受入れが意図されているが、これまでの実態として多様な外国人労働者に対する人権保障が不十分であったことをふまえ、「移住労働者とその家族」という枠組みで国際的な人権保護基準に基づく受入れのために、どのような法的基盤を整備する必要があるのかを、とくに地方公共団体の機能という視点を含めて総合的に検討する。