hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
長期PDCAによる低侵襲治療時代の急性期病院高回転手術部のモデルプランの提案

医療施策の基本方針である在宅化に向けて,急性期病院では高回転運営による入院の短期化が求められている。その要は手術待ちの解消である。回転率の向上に寄与する運用と建築平面の関係を紐解くため,長期に渡る手術室の実践的PDCA(plan-do-check-action),すなわち実態調査ー改善計画・予測ー現場変更ー実態調査・検証ー改善計画・予測ー現場変更を繰り返し行い,直接的な前後比較による要因分析を行う。フェーズ1(2014年度実行済):看護体制ヒアリング調査,物品配置調査,看護師追跡調査1(4名)を行い,現状把握を行った。診療材料が分散配置されているため,ピッキングの動線量が課題であることが明らかになった。そこで1全材料の中央保管し,手術個人キットと消耗・予備キットを一括で準備し手術室へカート搬送する保管と準備作業の中央化,2看護補助員の2名追加による看護師の準備作業負担の軽減を,シミュレーションした上で提案した。フェーズ2(2015年度実行済):2015.4に提案通り看護補助員の2名が追加された。看護師追跡調査2:看護師19名を行った。手術室増築後のシミュレーションも付加し,再提案を行った。尚フェーズ1・2について,2016.8に口頭発表を行った。フェーズ3(2018年度成果):2015.8に物品配置,物品供給方式も提案通り変更され,手術室が増築された。また2017.3に一部改修された。尚フェーズ1について,2019.2に学術論文として発表した。実態調査として変更後の資料収集およびベータベースの更新を行った。事例研究として約10病院を訪問し,さらに資料調査から事例研究対象の情報整理を行った。今年度に変更後の実態調査および,先端医療技術導入の事例調査の絞り込みを行う。フェーズ3の実態調査は2018年度に行う予定であった。予定変更の理由は,対象病院との日程調整である。しかし現時点で既に実態調査に取りかかっており,また当初の予定でも今年度は調整域を見込んでいたため,調査人員を増やして挽回可能であると考える。実態調査について2019度は,昨年度予定であったフェーズ3の変更後実態調査を行い,当初予定であった提案説明と変更依頼まで行う。先端医療技術導入の事例調査ついて2019度は,昨年度予定であった3病院について平面型と運用についてヒアリング調査を行い,計画のポイントと課題を整理する。差が生じたのは旅費である。2018年度に予定していた調査が今年度に変更になったためである。しかし,現時点で既に調査にとりかかっており,また人員を増員して日程を挽回する予定であるため,申請金額の使用となる予定である。
中枢神経系GABAニューロンの解析

本研究の目的は系統発生的に異なる広義の大脳皮質の幾つかの部位において、化学的性質、三次元形態的特徴、シナプス結合の全体像を明かにすることで、従来のニューロンタイプの分類を考え直し、新たなニューロンタイプの分類を創り上げ、それに基づく各部位のニューロン構成を明らかにすることである。特にpaleocortexである嗅覚1次中枢嗅球における局所回路ニューロン、archicortex海馬及び、新皮質体性感覚野のGABAニューロンについての電子顕微鏡、光学顕微鏡及び共焦点レーザー走査顕微鏡を用いたサブポピュレーション解析更に、disectorによる定量解析を進めた。1.嗅球外網状層カルシウム結合蛋白parvalbumin含有細胞カルシウム結合蛋白parvalbuminPVは生理学的にfast-spiking neuronという特徴あるニューロン群に特異的に含まれていると考えられている。PVは嗅球においては非常に選択的に外網状層のGABAニューロンの一部に局在し、しかもそれらが形態的には少なくとも5タイプ以上のニューロン群に分類できた。その内いくつかはこの免疫細胞学的解析により始めて見いだされたタイプであった。更に、PV含有ニューロンを光学顕微鏡で観察後、連続超薄切片を作成し電子顕微鏡でシナプス結合を中心に解析した。その結果、従来他のGABAニューロンと主ニューロンとの間にしか存在しないとされていた相反性シナプスreciprocal synapseをPV含有ニューロンも主ニューロンとの間に形成していることが明かとなった。このことは電子顕微鏡レベルでの神経突起の同定が従来考えられていたほど確実ではなかったことを示唆しており、従来のデータそのものの再検討が必要になると考えられる。2.体性感覚野及び、海馬皮質でのdisector解析0.5μm厚の連続準超薄切片を用いdisectorにより体性感覚野及び、海馬CA1野各層での全ニューロン、GABAニューロン、PV含有ニューロンの密度、割合を明らかにした。部位及び、層のニューロン構成の差異が明らかになり、特に、海馬皮質のGABAニューロンが新皮質に比べ非常に密度が低く、割合的にも極めて低いことが明かとなった。GABAニューロン及びその一つのサブポピュレーションと考えられるPV含有ニューロンの大脳皮質での密度、層別の分布等を明らかにするためdisectorによる定量解析を行なった。disectorは一定間隔離れた二つの面(reference planeとlookup plane)で、reference planeに断面が見え、lookup planeには断面が見られない粒子、すなわち両者の間の空間にその粒子の端があるものだけを数えることで、バイアスなく粒子数、密度が測定できる方法である。本研究では1.5μm離れた2枚の0.5μm準超薄切片をpairとしてtoluidine blue(TB)染色し、解析を行なった。そしてdisectorで数えた細胞の化学的性質を、reference切片に隣接する3枚の切片にそれぞれ抗GABA抗体、抗PV抗体、抗S-100β蛋白抗体の包埋後免疫細胞化学を適応することで同定した。体性感覚野のTB染色標本で抽出された細胞のうち64%がニューロン、36%がグリアであった。ニューロンのうち25%がGABA陽性細胞であった。また13.5%がPV陽性細胞であったが、これはすべてGABA陽性でもあり、GABA陽性細胞の54%を占めた。グリアの52%はS-100β蛋白陽性のアストロサイトであった。

体性感覚野におけるニューロン密度は59.4x10^3/mm^3、GABA陽性細胞は13.8x10^3/mm^3、PV陽性細胞は7.5x10^3/mm^3であった。GABA陽性細胞の密度はIV層で最も高く(22.6x10^<3/>mm^3)、ここではGABA陽性細胞の75%はPV陽性であった。PV陽性ニューロンの密度には層によって大きな違いがみられた。すなわち、PV陽性細胞はI層にはなく、IV層には他の層に2-4倍もみられた。これに対し、PV陰性のGABA陽性細胞はI層からVI層まで比較的一様に分布していた。本年度は主に海馬カルシウム結合蛋白parvalbumin(PV)含有細胞について2種の定量解析を進めた。第1は神経細胞内でのPVの局在及び、各部位でのPV濃度を明らかにするため、コロイド金(直径15nm)標識二次抗体を用いた、いわゆるコロイド金免疫電顕で解析した。電子顕微鏡に設置したTVカメラにより直接倍率1万5千倍、最終倍率9万倍でパーソナルコンピュータに画像を取り込み、モニター上でPV細胞及び他の細胞の各部位を同定し、単位面積(1mum^2)当たりのコロイド金粒子数を測定した。コロイド金免疫電顕におけるコロイド金密度と抗原密度との相関について調べる目的で、既知量のPVを含有している標準試料を作製した。コロイド金密度(粒子数/mm^2)は細胞体及び樹状突起で9-14、軸索及び軸索終末23-27であり、以前解析した小脳purkinje細胞と同様に、明らかに細胞内におけるPVの濃度差があった。PV標準試料のCalibration curveに基づいてPV濃度を細胞体樹状突起では約25muM、軸索及び終末部では約75muMであろうと推定した。第2は、disector法による海馬CA1領域でのPV含有細胞及びGABA陽性細胞の密度、全神経細胞における割合、層別分布等についての定量解析である。今回のdisector定量解析により海馬CA1領域ではGABA細胞と考えられる神経細胞群は2500/mm^3であり全神経細胞の約7%であることが明かとなった。これらの所見は前年度我々が解析した新皮質(体性感覚野)に比較して海馬CA1領域ではGABA細胞の密度(約1/5)、割合(約1/3)ともかなり低いことを示している。本研究の目的は系統発生的に異なる広義の大脳皮質の幾つかの部位において、化学的性質、三次元形態的特徴、シナプス結合の全体像を明らかにすることで、従来のニューロンタイプの分類を考え直し、新たなニューロンタイプの分類を創り上げ、それに基づく各部位のニューロン構成を明らかにすることである。特にpaleocortexである嗅覚1次中枢嗅球における局所回路ニューロンについての電子顕微鏡、光学顕微鏡及び共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて解析及び、archicortex海馬のGABAニューロンのdisectorによる定量解析を進めた。1.嗅球外網状層
人工網膜の視覚情報伝達能力の検討

網膜電気刺激によって誘発される皮質反応の評価は、人工網膜によって脳に与えられる情報を理解するために重要である。これまでの研究では皮質反応を誘発電位やマルチユニット記録と視野マップとの関係を解析したものが主である。本研究では網膜刺激に対する電気生理学的反応をネコ大脳皮質から記録し、数理的手法を用いて解析した。脳表面電位(ECoG)のデータセットから機械学習の方法を用いて、刺激している網膜電極を予測することが可能であった。現時点では予測の精度は高くないが、学習データセットの前処置の改良やセット数の増加で改善が期待される。予測精度は、電極や刺激パラメータの評価に有用と考えられた。人工網膜の基礎技術である電気刺激によって、どのような視覚情報を中枢神経系に与えることができるかを明らかにすることが本研究の目的である。そのため、初年度の本年は、まず、複数部位の網膜電気刺激によって生じる大脳皮質の誘発反応を、より安定して記録するための系の確立を行った。ネコ大脳皮質の一次視覚野から、網膜電気刺激によって誘発される皮質電位を、急性実験用多点記録電極を用いて複数箇所から同時的に記録を行った。電気刺激への反応領域を含んだ領域において刺激電極部位に対応した電気誘発電位を記録することができた。しかし、システム上、大脳皮質から完全に同時に記録できるチャンネル数に制限があることと、現状で入手可能な多点記録電極では広い範囲を均一にカバーすることがまだ困難であるという形状についての制約があるために、完全な同時マッピングを実施するためにはまだ課題が残されていることがわかった。また、網膜への電気刺激に用いる刺激電流パターンの自由度を上げるために、プログラムの開発を行った。これによって、複数チャンネルの刺激電極に対して、自由な刺激波形を用いて同時に出力を行い、それに対する反応を記録することが可能になった。人工網膜の基礎技術である電気刺激によって、どのような視覚情報を中枢神経系に与えることができるかを明らかにすることが、本研究の目的である。前年度に引き続き、ネコ大脳皮質一次視覚野から単一ニューロン活動および誘発電位の記録を行った。特に、誘発電位による人工網膜の評価だけでなく単一ニューロン活動の記録によって評価を行うために、多極の電極を有するシリコンプローブ電極を用いて、ネコ大脳皮質視覚野からの記録を行った。その結果、多くの電極からスパイクソーティングに充分な大きさの振幅を持つ多数のスパイクを安定して記録することができた。しかし、このようなスパイク活動が記録できるまでには、電極を脳内に刺入した後数十分程度の時間が最低でも必要になること、そのため電極の深さや刺入部位を頻繁に変えることが容易ではないことから、今回使用した、電極の載るshankの数の少ないタイプの市販型のシリコンプローブは、スパイク活動を記録することによってトポグラフィックマッピングを実施するためには、あまり適切ではないことが明らかとなった。誘発電位の解析として、網膜電気刺激によって記録された誘発電位波形の電極間の相関を計算した。その結果、電気刺激に対して最も大きな反応であった誘発電位と相関が高い誘発電位を生じた場所は、一次視覚野上で二次元的に見て、最大反応の生じた場所に近いところに存在していた。距離の離れた場所では相関は認められなかった。網膜電気刺激による脳への視覚情報を評価する際の一つの目標は、脳が網膜上の複数点の刺激を弁別できるかどうかである。単一ニューロン活動の記録は、記録できた各ニューロンの網膜刺激応答性を調べるには適しているが、ニューロンのサンプリングの状況に影響されるため、マッピングを行うのに最適な手法とはこれまでの研究からは言えない。また電場電位を脳内に刺入した電極から記録する場合は、多点でのマッピングを同時記録で行うことが難しい。そのため、本年は、脳表の電極から誘発電位を記録し、そのデータから機械学習のアルゴリズムを行い、誘発電位から刺激電極の推定ができるかどうかを検討した。ネコの一次視覚野を含む大脳皮質表面に16極のマッピング記録用電極を設置し、強膜上に設置した4点の刺激電極それぞれから刺激した時の誘発電位波形を多数回記録した。記録波形を10Hzにダウンサンプリングしたデータを用い、記録した800回のうち784回分のデータをk-近傍法による学習に用い、16回分のデータで刺激電極の判定をさせた。単独の記録電極のみのデータを用いた学習では、チャンスレベルの25%を有意に越える判別はできなかったが、全記録電極のデータから学習させた場合は、50%とチャンスレベルを有意に越える正答率が得られた。現在のダウンサンプリングの方法にはまだ改良の余地があり、学習に用いるデータの処理を工夫することで成績を向上させることができると考えた。この手法を用いることにより、記録した電気生理学的データから電気刺激を推定することが可能であることが明らかになった。また、刺激パラメータの良否を検討するために機械学習の正答率を用いることができると考えられた。

実験動物の生産において、コロニーの母群の不調のために、実験に充分な動物数が得られなかった。25年度が最終年度であるため、記入しない。コロニーの母群構成に改良を加えて実験動物の安定供給を図った。
LNg-IUDの子宮内膜血管新生因子に及ぼす影響 甲状腺ホルモンのトロホブラスト浸潤能に及ぼす影響

子宮筋腫や子宮腺筋症に伴う過多月経の長期管理では、LNg-IUDを子宮腔内に装着すると定常的な黄体ホルモン様作用により子宮内膜の分泌腺と間質の増殖能抑制とアポトーシス誘導が惹起され子宮内膜は強く萎縮、菲薄化して月経時出血量の著明な減少をみる。しかし、LNg-IUD装着後3ヶ月間は少量の不規則な出血(spotting)が出現し、同IUD使用時の臨床的問題となっている。そこで本年度の研究では、子宮筋腫や子宮腺筋症に伴う過多月経患者を対象に、LNg-IUD装着前ならびに装着3ヶ月後に採取した子宮内膜における血管新生関連因子(VEGF、アドレノメヂュリン等)発現を免疫組織学的に検討した。VEGFに関しては、LNg-IUD装着前には子宮内膜腺ならびに間質にその強い発現が観察されたが、LNg-IUD装着3ヶ月後にはその発現は大きく減弱した。一方、アドレノメヂュリンはLNg-IUD装着前には子宮内膜にその発現は観察されなかったが、LNg-IUD装着3ヶ月後には、その発現は子宮内膜腺ならびに間質において増強していた。このことから、LNg-IUD装着後3ヶ月間の少量の不規則な出血(spotting)はLNgによるアドレノメヂュリン発現の亢進によると推察された。甲状腺機能低下症ではしばしば流産を伴う。受精卵の着床に際しては絨毛外トロホブラスト(EVT)が重要な役割を果たすことから、甲状腺ホルモンがEVT機能発現に及ぼす影響を検討した。これまでにEVT培養細胞系を確立、EVTに甲状腺ホルモン受容体が存在し、甲状腺ホルモンが培養EVTのFas/FasL、caspase-3、PARP、Bax、Bcl-2蛋白発現調節を介してEVTのアポトーシス発現を抑制することを明らかにした。
原発性胆汁性胆管炎におけるエクソソーム内のmicroRNAを標的とした予後予測

原発性胆汁性胆管炎(PBC)患者20例の末梢血液を収集した。収集された末梢血液から血清を分離して溶血のないことを確認して遠心による前処理を行った後、エクソソーム溶液をmiRNeasy Mini Kit (QIAGEN社)を使用して、small RNAを含むtotal RNAとして抽出した。このRNAが、小分子のRNA領域に高いピークが認められ、高分子領域のリポソームRNAにピークバンドが検出できなかったため、エクソソーム由来のRNAとして確認できた。エクソソーム由来のmiRNAを回収し、これをアレイ用のサンプルとした。アレイ(東レ、2555分子のmiRNAを搭載)に、標識(Ambion社、mirVanaTM miRNA labeling kit)したサンプルをオリゴチップ(東レ、Human miRNA Oligo chip-4 plex ver.21)にハイブリダイゼーションした後、アレイ用スキャナーでスキャニングを行った。その後各スポットにおける蛍光強度値の定量化を行い、シグナル値を算出し、エクソソーム内のmiRNAを同定した。発現プロファイルの解析は、計算解析サーバを使用し、従来の統計学的方法のみならずマイクロアレイに適した統計的手法SAM (Significant Analysis of Microarray)、RDAM (Rank Difference Analysis of Microarray)などを用いた。そして、PBCの治療抵抗群と治療良好群において、2555分子のエクソソーム内のmiRNAの解析により、それぞれ独立したクラスターを形成するかどうかを現在確認中である。PBCの治療抵抗群と治療良好群において、2555分子のエクソソーム内のmiRNAの解析により、それぞれ独立したクラスターを形成するかどうかを現在確認中である。この確認が可能であれば概ね順調に進展していると評価できる。研究実施計画に基づいて、今後PBCの治療抵抗群と治療良好群において、2555分子のエクソソーム内のmiRNAの解析により、それぞれ独立したクラスターを形成するかどうかを確認し、差異のみられたmiRNAを同定し、どのようにどの程度発現しているか、リアルタイムPCR法により定量を行い、個別に検証していく予定である。当初の予定症例数よりも少ない解析になったため、次年度使用額が生じたものと考えられる。次年度以降に症例数を重ねて検討を行う計画としている。
食事由来の個人の温室効果ガス排出量の推定手法の構築と利用に関する栄養疫学的研究

食事由来の個人の温室効果ガス排出量(GHGE)を推定するには、日本標準食品成分表と突合可能な、食品の単位重量当たりの温室効果ガス排出量データベース(GHGEDB)が必要不可欠である。本研究の目的は、GHGEDBを構築とその応用研究により、日本人において、食事に由来するGHGEが小さく、かつ栄養学的にも適切な食事の在り方を明らかにすることである。2018年度は、先行研究を幅広く精読した上で、GHGEDBの作成方法を検討し、実際にデータベースを構築した。具体的には、1)日本の食品の環境負荷をライフサイクルアセスメント(製品のライフサイクル中に発生する環境負荷を、評価対象とする製造段階を定め、各段階で生じる環境負荷の情報をすべて集めて分析する手法)を用いて評価した個々の研究を体系的にレビューすることで、各食品の単位重量あたりGHGEの情報を集める方法、2)国立環境研究所が公表する、環境産業連関表を用いた排出量原単位表(ある製品の製造に関わる産業部門間での財価の流れを把握することで、環境影響を評価した表)を用いる方法、の2つを用い、複数のデータベースを構築した。これにより、食事由来のGHGEの推定、ならびに食事由来のGHGEと他の因子(食品や栄養素の摂取量)の関連の検証が可能となった。本研究では、構築したデータベースを用いて、日本人成人の食事由来温室効果ガス排出量の推定と、主な寄与食品の同定を行った。その結果、日本人成人の食事由来GHGEは、欧米での先行研究と同等であり、その主な寄与食品は穀類、魚介類、肉類であることが明らかになった。欧米とは異なり、日本では牛肉、豚肉、酪農食品の寄与は穀類、魚介類と比べて特に大きいとは言えないこと、肉の摂取量を削減のみは、GHGEの削減にはそれほど大きく寄与しない可能性が示唆された。食事由来の個人の温室効果ガス排出量の推定には、日本標準食品成分表と突合可能な、食品の単位重量当たりの温室効果ガス排出量データベース(GHGEDB)が必要不可欠である。今年度は、専門外である環境分野の論文も含め、先行研究を幅広く精読した上で、GHGEDBの作成方法を検討し、実際にデータベースを構築した。具体的には、1)日本の食品の環境負荷をライフサイクルアセスメント(製品のライフサイクル中に発生する環境負荷を、評価対象とする製造段階を定め、各段階で生じる環境負荷の情報をすべて集めて分析する手法)を用いて評価した個々の研究を体系的にレビューすることで、各食品の単位重量あたり温室効果ガスの情報を集める方法、2)国立環境研究所が公表する、環境産業連関表を用いた排出量原単位表(ある製品の製造に関わる産業部門間での財価の流れを把握することで、環境影響を評価した表)を用いる方法、の2つを用いた。後者では、公開された表は排出量原単位が「CO2-eq/百万円」の単位であらわされているため、製品の単位価格を掛け合わせる必要がある。最初に、公的統計を用いて食品の価格のデータベースをつくり、それから排出量原単位に乗じることで、各食品の単位重量あたり温室効果ガスの情報を得た。次に、これらのデータと食品の単位重量当たりの栄養成分を記載した日本標準食品成分表との突合を行うことで、データベースを構築した。この構築したデータベースに、当該の食品の摂取量を掛け合わせることで、食事由来の温室効果ガス排出量の推定が可能となった。そこで、それらの複数のデータベースを用いて、日本人成人における食事由来温室効果ガス排出量の推定と、主な寄与食品の同定を行い、用いたデータベースによる結果の相違を比較する分析を行った。現在は、その結果を国際誌に投稿すべく準備を進めている。今年度は、昨年度の研究成果を英語論文にまとめ、国際誌への投稿を行うとともに、国際学会での発表を行う。昨年度構築した、食品の温室効果ガス排出量データベースを必要に応じて改善および修正した上で、データベースを用いた分析研究を通じて、温室効果ガス排出量が比較的小さく、かつ栄養学的にも適した食事の在り方を探る。具体的には、食事の栄養学的な適切さの指標である食事の質スコアを用いて、個人の食事由来の温室効果ガス排出量と、食事の栄養学的な適切さをそれぞれ評価し、両者の関連を検証する。さらに、線形直線モデルを用いて、日本において、温室効果ガス排出量が最小になり、かつ食事のガイドラインを最大限準じた食べ方のモデリングを行う。また、所属研究室が保持する、4季節8日間にわたる詳細な食事データを用いて、食事由来の温室効果ガス排出量の地域差や季節間差を検証する予定である。昨年構築したデータベースは、環境影響の指標として温室効果ガス排出量しか考慮できていないという限界点がある。「水資源利用」や「土地使用」、「生物多様性」などの他の指標について、公開されているデータベースの二次利用および食品標準成分表との突合を行い、データベースの拡張を行う。さらには、これらの環境指標を統合的に評価し、食事との関連を検証することを目指す。この手法に知見を持つオランダの研究機関に半年間滞在し、複数の環境指標を用いて統合的に環境負荷を評価する方法(Recipe method)の概念を学び、日本のデータへの応用を行う。さらに、派遣先機関では、欧州数か国の多国間比較研究が進行している。派遣中には、多国間比較の知見、方法論を学び、本研究分野における日本と欧州諸国の比較を行う。学会での発表を行う。

昨年度構築した、食品の温室効果ガス排出量データベースを必要に応じて改善したうえで、食事由来の個人の温室効果ガス排出量(GHGE)を推定するには、日本標準食品成分表と突合可能な、食品の単位重量当たりの温室効果ガス排出量データベース(GHGEDB)が必要不可欠である。本研究の目的は、GHGEDBを構築とその応用研究により、日本人において、食事に由来するGHGEが小さく、かつ栄養学的にも適切な食事の在り方を明らかにすることである。2018年度は、先行研究を幅広く精読した上で、GHGEDBの作成方法を検討し、実際にデータベースを構築した。具体的には、1)日本の食品の環境負荷をライフサイクルアセスメント(製品のライフサイクル中に発生する環境負荷を、評価対象とする製造段階を定め、各段階で生じる環境負荷の情報をすべて集めて分析する手法)を用いて評価した個々の研究を体系的にレビューすることで、各食品の単位重量あたりGHGEの情報を集める方法、2)国立環境研究所が公表する、環境産業連関表を用いた排出量原単位表(ある製品の製造に関わる産業部門間での財価の流れを把握することで、環境影響を評価した表)を用いる方法、の2つを用い、複数のデータベースを構築した。これにより、食事由来のGHGEの推定、ならびに食事由来のGHGEと他の因子(食品や栄養素の摂取量)の関連の検証が可能となった。本研究では、構築したデータベースを用いて、日本人成人の食事由来温室効果ガス排出量の推定と、主な寄与食品の同定を行った。その結果、日本人成人の食事由来GHGEは、欧米での先行研究と同等であり、その主な寄与食品は穀類、魚介類、肉類であることが明らかになった。欧米とは異なり、日本では牛肉、豚肉、酪農食品の寄与は穀類、魚介類と比べて特に大きいとは言えないこと、肉の摂取量を削減のみは、GHGEの削減にはそれほど大きく寄与しない可能性が示唆された。食事由来の個人の温室効果ガス排出量の推定には、日本標準食品成分表と突合可能な、食品の単位重量当たりの温室効果ガス排出量データベース(GHGEDB)が必要不可欠である。今年度は、専門外である環境分野の論文も含め、先行研究を幅広く精読した上で、GHGEDBの作成方法を検討し、実際にデータベースを構築した。具体的には、1)日本の食品の環境負荷をライフサイクルアセスメント(製品のライフサイクル中に発生する環境負荷を、評価対象とする製造段階を定め、各段階で生じる環境負荷の情報をすべて集めて分析する手法)を用いて評価した個々の研究を体系的にレビューすることで、各食品の単位重量あたり温室効果ガスの情報を集める方法、2)国立環境研究所が公表する、環境産業連関表を用いた排出量原単位表(ある製品の製造に関わる産業部門間での財価の流れを把握することで、環境影響を評価した表)を用いる方法、の2つを用いた。後者では、公開された表は排出量原単位が「CO2-eq/百万円」の単位であらわされているため、製品の単位価格を掛け合わせる必要がある。最初に、公的統計を用いて食品の価格のデータベースをつくり、それから排出量原単位に乗じることで、各食品の単位重量あたり温室効果ガスの情報を得た。次に、これらのデータと食品の単位重量当たりの栄養成分を記載した日本標準食品成分表との突合を行うことで、データベースを構築した。この構築したデータベースに、当該の食品の摂取量を掛け合わせることで、食事由来の温室効果ガス排出量の推定が可能となった。
新規含テルル分子ーテルロカルボン酸誘導体の分子設計と新合成法の開発

近年カルボン酸セレン及びテルル同族体に脳神経ブロック剤としての有効性さらには液晶性能も見い出され注目を集めている。本研究では含テルル有機分子,特にテルロカルボン酸誘導体の最も基本的かつ重要な出発化合物となるセレノカルボン酸ナトリウム塩及びカリウム塩の合成法の確立とそれからの反応性を明らかにすることを目的とした。結果:液体アンモニア中金属ナトリウムとテルルとから調製したテルル化ナトリウムにエ-テル中当モルのアシルクロリドを加え,O°Cで2時間反応させることにより目的のテルロカルボン酸ナトリウム塩が高収率で合成できることを見い出した。また同様にテルル化カリウムとの反応からは対応するテルロカルボン酸カリウム塩が高収率で合成できることを見い出した。これらナトリウム及びカリウム塩を系統的に合成し,スペクトルを明らかにした。特にIRスペクトル及びテルル125核磁気共鳴スペクトルからこれらの塩はテルルに陰電荷が極存化した構造をしているものと推測された。これまで合成例のないテルロカルボン酸Teーアルキルエステルの合成法を確立し,それらのスペクトルを明らかにできた。また,テルロカルボン酸ナトリウム塩はトリオルガノシリルクロリドと反応しOートリオルガノシリルテルロカルボキシレ-ト(RCTeOSiR^1_3)が成することを見い出した。Teー125NMRの測定から上記テロンエステルはTeートリオルガノシリルテルロカルボキシレ-ト(RCOTeSiR^1_3)と平衡にあると見られた。アシルクロリドとリチウムテルリドとの反応からはテルロカルボン酸リチウム塩が生成するが、これら塩はTHFを1分子含み結晶化はむつかしいとみられた。
ブリテン諸島における軍隊と社会,1660－1720s:都市・城砦守備隊に注目して

本研究員の本年度における研究は、年度始めの計画に沿ってほぼ計画通りに進められた。成果として具体的には以下の三点が挙げられる。まず一点目として、昨年度から引き続き行っている、イングランド、スコットランド、アイルランドの都市・城砦守備隊に関するデータベースの完成、二点目として、スコットランドの守備隊に関する史料調査と分析、三点目として、二点目の成果に基づきイングランドとスコットランドの事例を総合する形での軍隊-地域社会関係の考察である。二点目、三点目については、2012年9月にイギリスで2週間の調査を行い、そこで収集した手稿史料と、活字化されている救貧関連文書および兵士の自叙伝を組み合わせて利用することにより、17世紀後半から18世紀イギリスの陸軍兵士と地域社会との交流に関する分析、彼らとその家族についての社会史的考察に取り組んだ。その成果については、すでに近現代史研究会、イギリス革命史研究会で口頭報告を行っており、さらに近日中に論文としてまとめ、学術雑誌に発表することが予定されている。また、本研究プロジェクトにおいて、スコットランドと並ぶ考察対象であるアイルランドについても、本研究員は、本年度中にゴールウェイとウォーターフォードについて史料収集・分析を終え、現在ダブリンについての検討を進めているところである。その成果は、2013年中に事例研究としてまとめるとともに、あわせてプロジェクト全体の分析結果についても口頭報告および論文の形で発表を進めていきたい。今年度は、本研究者にとって特別研究員としての研究初年度にあたり、次年度以降に計画している、三王国の守備隊駐屯地における軍隊と社会の相互関係についてのケーススタディのための予備的作業を中心に研究を行った。具体的には、一年間をかけて、イングランド国務文書要覧、アイルランド国務文書要覧、スコットランド枢密院文書録、さらに国立公文書館(The National Archives)に所蔵されている戦争局文書、とくに年度ごとに作成される陸軍の構成リスト(WO24)を用いて、三王国の都市・城砦守備隊について基礎的なデータベース(1660-1730)を作成した。調査した項目は、守備隊の配置・兵力・構成、守備隊長官および副長官の氏名、任期、経歴である。このデータベース作成により、三王国の守備隊の全体像を明らかにし、また相互の相違点についても具体的に示すことが可能となった。さらに、17世紀後半のイングランドにおける陸軍将兵と地域住民の社会的つながり、日常的な交流について社会史的な考察を行った。考察にあたっては、軍隊に関わる人物の日記や書簡、軍隊駐屯地の行政・裁判文書、教区簿冊などを幅広く利用した。この研究によって明らかとなったいくつかの知見についてはすでに一本の論文としてまとめ、現在修正作業を行っている。今年度は、本研究者にとって特別研究員としての研究二年目にあたる。実施した研究内容としては、1.昨年度に進めた三王国の守備隊に関するデータベース(兵力、構成、守備隊長官および副長官の伝記的データなどをまとめたもの)の作成を引き続き行うとともに、2.今年度の中心課題である、イングランドおよびスコットランドの守備隊と地域社会の関係の分析に取り組んだ。1.に関しては、昨年度十分にデータを収集できなかったスコットランド、アイルランドの守備隊についてDalton(ed.),English army lists and commission registers,1661-1714;Dalton(ed.),George the First's army 1714-1727,Dalton(ed.),Irish army lists,1661-1685,Johnston-Liik(ed.),History of the Irish Parliament,1692-1800,Oxford Dictionary of National Biography,および昨年度The National Archives of Scotlandにおいて調査した史料を基に補足を行った。ただし、アイルランドについてはなお不明な部分があり、次年度に予定しているアイルランドでの史料調査においてさらなる補足を行いたい。2.に関しては、イングランドの守備隊駐屯地における将兵と住民の社会・経済的関係を、とくに両者の日常的な接触を中心に考察した。史料としては、都市自治体公文書、教区史料、守備隊関係者の日記や書簡などを用いた。日本はもとより欧米においても、地域レベルにおける軍隊-社会関係の実相を具体的に明らかにした研究はこれまでほとんどなく、本研究は研究史上において大きな意義を有していると言える。その成果の一部については、論文「17世紀後半のイングランドにおける軍隊と地域社会-将兵と住民の日常的な関わりに注目して」にまとめ、『西洋史学』241号においてすでに公表している。一方、スコットランドの軍隊-社会研究については、現時点では昨年度の文書館調査によって収集した史料の読み込みにとどまっており、次年度において学会報告、論文の形でまとめることを期したい。

その成果は、2013年中に事例研究としてまとめるとともに、あわせてプロジェクト全体の分析結果についても口頭報告および論文の形で発表を進めていきたい。昨年度は、大学の夏期休暇中にイギリスでの長期の史料調査を予定していたが、3月に発生した東日本大震災の影響により夏前の時点で科学研究費補助金が申請通り受給できるか不透明な状況であったため、調査を次年度に延期することとした。代わりに、昨年度から引き続いて三王国の守備隊に関するデータベースの作成を進めるとともに、イングランドにおける軍隊-地域社会の関係についての論文執筆(9を参照)、および次年度の取り組みの基礎的作業(スコットランド、アイルランド軍事史の研究史整理)を行った。次年度においては、引き続き三王国の守備隊のデータベースの作成を進めるとともに、スコットランド、アイルランドにおける軍隊と地域社会の関係について、政治、社会、経済的側面に注目したケーススタディを行っていく。昨年度、11に記した理由によりイギリスでの史料調査を行えなかったため、次年度ではこれを行うとともに、当初の計画において予定されている、アイルランドでの史料調査もあわせて行う。2013年には、ドイツにおいて軍事史に関する大規模な国際学会が開かれる予定となっており、そこで本研究課題の成果の一部について報告を行うことを計画している。
次世代X線コンピュータ断層撮影装置における高精度な画像構築のための物理的評価

【研究目的】本研究は、近年開化された二種類の強度(低・高エネルギー)のX線を同時に発生させながら回転撮影が可能なDual-SourceCTを研究対象とした高精度な画像構築のための物理的評価を研究期間内に実施した。また、がんに対する放射線治療を実施する際に必要となる病巣や人体の解剖学的なCT画像から放射線の集中や減弱の現象をシミュレーションする放射線治療計画への利用に向けての考察を加えた。【研究方法】DSCT装置は, SOMATOM Definition Flash (Siemens社製)を用いた.方法の概要は、まず、体内臓器や組織と同等な物理密度で構成される16種類の物質ロットが装填された模型の撮影を行い、10keV間隔での40keVから140keVの範囲における仮想的なCT画像(以下、仮想単色CT画像)を再構成し、CT値測定を実施した。次に、DSCT装置による仮想単色CT画像のX線エネルギーの値および模型内の物質組成の比率をモンテカルロシミュレーションによって理論値を算出した。最後に、測定値と理論値の比較から誤差率および画像構築精度を求め,人体の各組織をどの程度正確に撮影可能かの評価を実施した。【研究成果】仮想単色CT画像のCT値は、70keV以上の仮想単色CT画像の場合、高精度に人体の情報を画像化している可能性が高く、放射線治療計画で使用する場合の一つの使用条件の指標になると考察した。今後は、放射線治療計画装置へ画像転送を行い、実際に治療用のX線エネルギーを使用した人体中における放射線の分布状況に関する追加検討が必要になる。また、本研究手法は、DSCT装置のような次世代CTに対する機器の精度管理の基礎として提示できる可能性がある。
ハマダラカ防除に向けた吸血・消化に関わる遺伝子の解明と制御

昨年度のトランスクリプトーム解析により明らかとなった、ハマダラカ(Anopheles stephensi)dsxF-KOヘテロ接合雌個体(以下、dsxF-KO雌)の吸血後12時間の中腸で野生型と比較して発現が低下する遺伝子のうち、酵素活性のあるものについてノックアウト系統作成のため、sgRNAを設計し、発現ベクターを作製した。また、CRIPSR/Cas9系確立のコントロールとして眼の色素遺伝子(kmo)と体色遺伝子(yellow)についても発現ベクターを作製した。転写させたsgRNAとCas9をハマダラカ卵へ顕微注入したが系統の樹立には至っていない。また、新たにdsxF-KO雌の吸血後24時間の中腸で野生型と比較して発現が変動する遺伝子のトランスクリプトーム解析を行った。その結果、5273遺伝子に発現量に差が見られ、発現上昇するものが2331遺伝子、低下するものが2942遺伝子であった。これら遺伝子についてホモロジー解析を行い、発現レベルが大きく低下するものにアミノペプチダーゼ、アンモニア代謝関連遺伝子、トランスポーターが含まれることを見出した。他の生物での栄養代謝における解析例の情報などから、これらは血液消化・吸収にも関与する可能性が予想される。一方で、消化酵素として知られるトリプシンやキモトリプシン類については、吸血後12時間及び24時間どちらでもあまり変化が見られていない。唾液腺の解析については、過去の報告から吸血時に関与していることが示唆されて唾液タンパク質遺伝子から6種類ついて、qRT-PCR解析を行い、dsxF-KO雌でも野生型と差がないことを見出した。実験計画に基づき、dsxF-KO系統と野生型系統で吸血後12時間の検体を用いてRNA-Seqによる発現比較解析を行なったところ、当初の想定に比べて発現が低下する遺伝子数が少なかった。そこで、さらに解析候補遺伝子を選別するために、新たにdsxF-KO雌の吸血後24時間の中腸トランスクリプトーム解析を行うことにした。そのため、検体採取とRNA-Seq後の解析も含めると当初の想定以上の時間が必要になった。しかしながら解析の結果、吸血後12時間に比べて発現量に有意差のある遺伝子を多数同定できた。現在、アミノペプチダーゼとアンモニア関連遺伝子について遺伝子クローニングし、ラボ系統での遺伝子配列の確認及びgRNAの設計を進めている。すでにノックアウトを進めている遺伝子(吸血後12時間で低下する遺伝子及びコントロール遺伝子)については系統を樹立できていないため、設定するgRNAの数を増やして顕微注入を行なっている。Cas9についてはmRNAの代わりにタンパク質を注入する方法でも試みている。dsxF-KO雌で発現レベルが低下する遺伝子について、ノックアウト系統の樹立と解析を進める。dsxF-KO雌の吸血後24時間の中腸で発現レベルが大きく低下している遺伝子はかなり多い。そこで、他の生物での解析例の情報もなどから血液消化・吸収にも関与する可能性が予想される、アミノペプチダーゼ、アンモニア代謝関連遺伝子、トランスポーターなどの遺伝子について優先してノックアウト解析を進める予定である。また、発現が上昇する遺伝子についても相同性や構造の解析を行い、代謝への影響の可能性が推測される遺伝子を選別する。ノックアウトの方法はCRISPR/Cas9で行うが、今の所系統の樹立に至っていないため、すでに研究代表者が実績のあるTALENによる方法も検討する。ノックアウト系統が得られた場合にはそれらにおける表現型解析(血液消化、不妊、致死など)を行い、血液消化に関わるかを明らかにする。マラリアのベクターであるハマダラカの中腸や唾液腺中には血液消化や吸血に重要な因子が含まれている。しかしこれらの遺伝子機能の解明はほとんど進んでいない。ハマダラカにおいてこれらの遺伝子を解明することは、その遺伝子を標的としたハマダラカ防除やマラリア制御の新規技術開発につながる。本研究では、性分化を制御する遺伝子(doublesex: dsx)のノックアウトにより作製した、メスで血液消化が出来ないハマダラカ系統(dsxF-KO系統)において、この系統の中腸・唾液腺の遺伝子情報を網羅的に探索し、それらのノックアウト解析から血液消化や吸血に重要な遺伝子の同定・解析を行う。最初に、本研究で用いるdsxF-KO系統での中腸トランスクリプトーム解析を行うにあたり、本系統で正常なdsxの雌特異的mRNA(dsxF)の発現が欠損または低下していることの確認をRT-PCRで行なった。本系統は血液消化が出来ないことや外部生殖器の形態に異常が出ることから、メスが不妊でホモ化できないためにヘテロ個体を用いた。メスでdsxFの発現に低下が見られ、dsxFのノックアウトは成功していることが確認できた。しかしながらRT-PCR解析から、ハマダラカのdsxのmRNAには予想以上に多くのスプライシングバリアント(異型体)(10種類以上)が存在することが明らかとなった。それぞれのバリアントの推測されるアミノ酸構造を解析したところ、当初に解析対象としていたバリアント以外は機能ドメインの構造を持っておらず、これらのバリアント雌性分化には影響がなく、本研究での解析には支障がないことが考えられた。一方、上記の実験と並行して、dsxF-KO系統の蚊のマウスに対する吸血行動を解析したところ、野生型の蚊に比べて吸血する個体数が少ないことがわかった。寿命を調べたところ、野生型の蚊に比べて生存期間が短いことが明らかになった。

dsxF-KO系統での中腸トランスクリプトーム解析を行うにあたり、この系統でノックアウトした雌性分化に特異的なdsx(dsxF) mRNAの発現が確実に欠損または低下していることを確認する必要があるために、その発現を調べた。その結果、dsxFは間違いなく発現は低下しており、血液消化不全はdsxによって制御されている遺伝子、またはその下流の遺伝子に変化によることが示唆された。一方、dsxは雌雄で異なるスプライシングバリアントが発現することは知られているが、ハマダラカでは想定外のバリアントが多数発現していることが明らかになった。これらの解析に時間がかかったために、前年度中にトランスクリプトーム解析に進むことができなかった。解析の結果、それらはアミノ酸構造的に機能を持たず、発現の低下が確認できたdsxFのバリアントのみが雌性分化に関わることが示唆されたため、トランスクリプトーム解析には支障がないと考えられる。今年度はdsxF-KO系統の中腸トランスクリプトーム解析を行い、血液消化に重要な遺伝子と推測されるものを選抜する。それらについてゲノム編集によるノックアウト個体の作出とそれらの表現型解析を行う。一方で、dsxF-KOの雌個体は血液消化の他にも吸血率の低下が見られることから、唾液にも影響が出ていることが考えられる。今年度は唾液腺の遺伝子についても解析を進める。本年度は、まず本研究で用いるdsxF-KO系統の中腸でのトランスクリプトーム解析を行った。未吸血時の野生型雌成虫個体(以下:野生型雌)および、dsxF-KOヘテロ接合雌個体(以下、dsxF-KO雌)、さらに、吸血12時間後の野生型雌成虫および、dsxF-KO雌成虫から抽出したRNAを用いてRNA-Seq解析を行ったのち、野生型雌とdsxF-KO雌間で遺伝子発現量の比較を行った。その結果、未吸血状態で野生型雌とdsxF-KO雌で発現量に差のある遺伝子が10遺伝子であった。また吸血12時間後では49遺伝子に発現量に差が見られた。これら遺伝子についてホモロジー解析や他の昆虫種での解析の調査を行ったところ多くが機能不明であった。吸血12時間後にdsxF-KO雌で発現が低下している遺伝子のうち2つは、アミノ酸のドメイン解析から酵素活性を有し、1つはプロテアーゼ活性をもつこと推測された。これら遺伝子は定量PCR解析からも発現低下が確認できた。現在これらの遺伝子についてノックアウト実験を進めている。唾液腺の解析についてはSDS-PAGE解析ではdsxF-KO雌でタンパク質量に差のあるバンドが確認できなかった。また、RT-PCR解析では吸血に関与する唾液タンパク質遺伝子のaappについてはdsxF-KO雌で変化が見られなかった。その他の表現型解析として、吸血対象に対する吸血行動の有無について調べたところ、dsxF-KO雌は野生型と同等に吸血対象に対してプロービング行動を示すことが分かった。また、卵巣も縮小していることが確認できた。その一方で、精巣の形成は見られなかった。dsxF-KO系統の中腸トランスクリプトーム解析が終了し、KO系統の中腸においてに発現量に有意差のある遺伝子が同定できた。
固形癌における革新的ゲノム解析法を用いた免疫微小環境ならびに腫瘍不均一性の解明

我々はこれまで原発巣腫瘍サンプルのRNAならびにDNAシークエンスデータを用いて網羅的にゲノム・エピゲノム解析することで、その臨床的意義を解明する手法を確立、そして報告してきた。特に乳癌・大腸癌においては革新的な網羅的ゲノム解析法を確立し、腫瘍内の免疫微小環境が腫瘍内ゲノム不均一性に寄与し、予後を悪化させることを明らかにした(論文審査中)。本研究は消化器癌の、特に転移巣腫瘍を網羅的ゲノム解析することにより、転移形成そのものや転移巣腫瘍内不均一性増悪における免疫微小環境の役割とその臨床的意義の解明を目的とする。近年、腫瘍内の多様性や不均一性(heterogeneity)はその腫瘍の悪性度や治療抵抗性に関わることが示された。そこで我々は固形癌の腫瘍内における免疫微小環境が腫瘍内不均一性に寄与し、癌を臨床的に悪化させると仮説を立てた。特に乳癌・大腸癌においては革新的な網羅的ゲノム解析法を確立し、腫瘍内の免疫微小環境が予後と関連していることを明らかにした(論文審査中)。本研究は消化器癌の、さらなる革新的な網羅的ゲノム解析手法の導入により、転移浸潤における免疫微小環境の役割とその臨床的意義の解明を目的とした。従来の腫瘍を分割して複数の解析をする手法と異り、本研究では単一のシーケンスデータから複数のパラメターを計測、独自に開発した数理モデル解析基盤を適応した。さらに申請者の所属研究室ならびに協力研究施設であるロズウェルパーク癌センターで採取した腫瘍臨床サンプルに対して次世代シーケエンサー解析を行い、得られたRNAシーケエンスならびにDNAシーケエンスデータに独自の数理モデル解析基盤を適応する。すなわち、革新的なトランスクリプトミクスレベルの解析アルゴリズムを応用し、腫瘍内の免疫微小環境を定量、評価する。またDNAシーケエンスデータを元に腫瘍内のゲノム不安定性を定量し、さらに癌細胞や免疫担当細胞(Tリンパ球やBリンパ球)の腫瘍内多様性(不均一性)をゲノムレベル評価する。それらのデータを元に消化器癌などの固形癌における悪性度の獲得や腫瘍内多様性(heterogeneity)獲得における免疫微小環境の役割とその臨床的意義を解明することを目的とした。解析アルゴリズムの構築はおおむね終了したので、今後、臨床データを合わせた解析結果の解釈、追加の解析などを行い、論文投稿を目指している。順調に経過している。独自の数理アルゴリズムに汎用性があることを確認し、特に免疫原性の解明が必要な頭頚部領域などの他癌種での解析も予定している。順調に経過している。
プロトポルフィリン症の発症におけるエピジェネティクスと環境要因に関する研究

1)肝障害を合併発症した本邦EPP5症例(5家系)から抽出したgenomic DNAあるいはmRNAを用いてFECH遺伝子を(RT-)PCR法により増幅し、シークエンス解析にて変異部位の解析を行なった.その結果、4種の異なる欠失変異でかつヘテロ異常が確認された.2)各変異の酵素活性への影響を検討するため、上記のFECH遺伝子変異それぞれについて、部位特異的突然変異誘発法により大腸菌で異常FECH蛋白を発現させその酵素活性を測定した.それぞれの異常FECHはいずれも酵素活性の低下を示した.3)家族内健康保因者発掘のためにDNAを利用した簡便なアッセイ系を確立し、同意の得られた家系について解析を行ったところ、生化学的には診断困難であった家系内保因者を同定しえた.4)発症のメカニズムを解明するため、一部の症例につきFECH IVS1領域と5'上流プロモーター領域を中心として、SNPsの有無をシークエンス解析にて、およびCpGアイランドのメチル化の有無をbisulfite-PCR法にて解析したところ、解析対象者すべてにおいて5'上流プロモーター領域の転写因子結合部位に異常を認めなかったが、発症者においてはCpGアイランドの一部にメチル化が認められた.このことにより、EPPの発症にはメチル化による転写活性の低下が示唆される.ポルフィリン症はmultifactorial diseaseと考えられており、引き続き、遺伝子学的背景のみならず環境因子との関わりなど、多角的観点からの検討が望まれる.1)肝障害を合併発症した本邦EPP5症例(5家系)から抽出したgenomic DNAあるいはmRNAを用いてFECH遺伝子を(RT-)PCR法により増幅し、シークエンス解析にて変異部位の解析を行なった.その結果、4種の異なる欠失変異でかつヘテロ異常が確認された.2)各変異の酵素活性への影響を検討するため、上記のFECH遺伝子変異それぞれについて、部位特異的突然変異誘発法により大腸菌で異常FECH蛋白を発現させその酵素活性を測定した.それぞれの異常FECHはいずれも酵素活性の低下を示した.3)家族内健康保因者発掘のためにDNAを利用した簡便なアッセイ系を確立し、同意の得られた家系について解析を行ったところ、生化学的には診断困難であった家系内保因者を同定しえた.4)発症のメカニズムを解明するため、一部の症例につきFECH IVS1領域と5'上流プロモーター領域を中心として、SNPsの有無をシークエンス解析にて、およびCpGアイランドのメチル化の有無をbisulfite-PCR法にて解析したところ、解析対象者すべてにおいて5'上流プロモーター領域の転写因子結合部位に異常を認めなかったが、発症者においてはCpGアイランドの一部にメチル化が認められた.このことにより、EPPの発症にはメチル化による転写活性の低下が示唆される.ポルフィリン症はmultifactorial diseaseと考えられており、引き続き、遺伝子学的背景のみならず環境因子との関わりなど、多角的観点からの検討が望まれる.1)肝障害を合併発症した本邦EPP3症例の末梢血から抽出したgenomicDNA、あるいは培養化したリンパ球芽球から抽出したmRNAを用いてFECH遺伝子を(RT-)PCR法により増幅し、ABI PRISM3100Genetic Analizerによるシークエンス解析にて変異部位の解析を行なった.その結果3症例とも欠失変異でかつヘテロ異常であった。症例ではFECH遺伝子エクソン3の303番目に1塩基の欠失変異が認められ(303delT)、症例2ではエクソン5に16塩基の1欠失が認められた(578-593del16bp).また症例3ではエクソン11に3塩基の欠失変異が認められた(1248delCTT).2)変異が酵素活性にどのような影響をもたらすかを検討するため、あらかじめプラスミドベクター(pGEX-4T)にヒト正常FECHcDNAをクローニングしておき、上記で同定しえた.FECH遺伝子変異それぞれについて、部位特異的突然変異誘発(site-directed mutagenesis)法により大腸菌に異常FECH蛋白を発現させ、その酵素活性をHPLC法で測定した.発現実験で3つの異常。FECHはいずれも酵素活性の低下を示し、したがって各々の変異によるフレームシフトが各酵素の立体構造に影響を及ぼした結果、FECH活性が障害されたものと推定された.3)制限酵素などを利用した家族内健康保因者発掘のための簡便なアッセイ系を確立し、同意が得られた2家系について同胞の解析を行った.生化学的に診断不能であった家系内保因者を同定しえた.ただ、遺伝診断の有用性は十分に示されたものの、同一変異を持つ同胞でも肝障害のみられない例があり、変異によるFECH活性低下のみでは肝障害発症を説明することはできなかった.1)あらたに肝障害を合併発症した本邦EPP2症例の末梢血から抽出したgenomic DNAを用いてFECH遺伝子をPCR法により増幅し、オートシークエンサーにて変異部位の解析を行なった.その結果、今回の症例1(W県在住)では欠失変異でかつヘテロ異常が認められた.この症例ではFECH遺伝子エクソン7の751番目から755番目に5塩基の欠失変異が認められた(751-755delGAGA).症例2(F県在住)ではエクソン9にpolymorphismが認められたもののアミノ酸レベルでの置換はなく、異常蛋白を引き起こす変異としては認められなかった.この症例ではさらに鋭敏なスクリーニング法とされるGDDE analysisを試みたが遺伝子異常はみられなかった.

2)変異が酵素活性にどのような影響をもたらすかを検討するため、同定しえたFECH遺伝子変異(751-755delGAGA)について、部位特異的突然変異誘発法により大腸菌に異常FECH蛋白を発現させ、その酵素活性をHPLC法で測定したところ酵素活性の低下を示した.したがって、欠失変異によるフレームシフトによりFECH活性が障害されたものと推定された.3)SSCPによる家族内健康保因者発掘のための簡便なアッセイ系を確立し、同意が得られたW県症例の家系について同胞の解析を行った結果、家系内健康保因者(父、妹)を同定しえた.4)W県症例につき、FECH IVS 1領域と5'上流プロモーター領域を中心に、SNPsの有無をシークエンス解析にて、およびCpGアイランドのメチル化の有無をbisulfite-PCR法にて解析したところ、解析対象者すべてにおいて5'上流プロモーター領域の転写因子結合部位に異常を認めなかったが、発症者においてはCpGアイランドの一部にメチル化が認められた.このことにより、メチル化による転写活性の低下が示唆された.