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バイカル湖の物質負荷・循環過程が駆動する巨大湖の生物生産・生態変動システム

平成14年度から17年度の4年間の研究によって、次の成果を得た。1.バルグジン湾とリストビアンカ沖で沈降粒子束の組成と季節変動を調査した。湖面の凍結期から解氷期にかけて、生物生産の増大に伴う急激な粒子束の増加が見られた。2.尿素の生物地球化学的循環過程を調査した。尿素の滞留時間は、夏季には3-6日であったが、冬季ではきわめて長く560日に及んだ。3.ピコ植物プランクトンの水平・鉛直分布、栄養状態、増殖制限因子を明らかにした。ピコ植物プランクトンは、バルグジン湾では沖に行くほど個体数が増加したが、リン制限ではなかった。4.植物プランクトンの基礎生産における制限栄養塩について研究した。中央ならびに南湖盆では、第1の制限栄養塩はリンであると考えられた。5.フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型質量分析器を用いて、分子レベルでの溶存有機物のキャラクタリゼーションを行った。河川由来の腐植物質は変性を受けずそのまま沖に運ばれていた。有機硫黄化合物などの自生有機物の生産が沖域で行われていた。6.水草によるリン酸の取込みと蓄積の機構について研究した。カナダモやオオカナダモの生育環境から推定する限り、リンの取込みと蓄積についてバイカル湖と琵琶湖の間に大きな差はなかった。7.南湖盆沿岸域での付着藻類の現存量と光合成量について研究した。UllothrixとDrapanaldiopsisが高い現存量にあった。沿岸で浅い水域の岩上に生育するUllothrixが高い光合成速度を示した。8.バルグジン湾でのバクテリア、植物プランクトン、原生動物の鉛直・水平分布を調べた。沖域で植物プランクトンとせん毛虫の間に、緊密な捕食関係が存在した。9.バルグジン湾でのピコ植物プランクトンの密度、増殖速度、捕食損失速度を調べた。その結果、ピコ植物プランクトンの密度、構成、微生物食物網における役割に、沿岸域と沖域で違いがあった。10.2004年6月10月に水温の連続観測を行った。夏季に中央湖盆と南湖盆の西岸表層で同時に日変化10°Cの水温低下が記録された。深層水湧昇と推測された。季節を変えて3回ロシアに渡航し(2002年6月25日7月5日、8月20日9月6日、2003年3月7日3月24日)バイカル湖での調査を行った。リストビアンカ周辺、バルグジン湾、南湖盆中央域、セレンガデルタ沖で各種の生物・化学観測を実施した。その結果として、次のような成果を得た。バルグジン湾での動・植物プランクトン、バクテリアの水平・垂直分布を調査した。沿岸域では表面から水深10mの層に、沖域では水深10-15mの層に従属栄養生物が高密度で存在していた。これらの生物群集が物質循環にいかなる寄与を果たしているかは現在解析中である。リストビアンカ周辺で採取した沿岸藻類を用いてリン酸代謝実験を行った。

車軸藻は低温下においてもリン酸を高濃度で体内に蓄積することが明らかになった。リストビアンカ周辺での付着藻類の分布と活性を調査した。陸域から湖への物質負荷とその消費を議論するうえで、付着藻類は非常に重要な役割を果たしていることが明らかになった。バルグジン湾の水深150mの地点で深度50mの位置にセジメントトラップを係留して、沈降粒子捕集実験を行った。その結果、全沈降粒子束として270mg/m^2/dayという値を得た。これは琵琶湖でのものと同様の値である。バイカル湖は琵琶湖に比べてはるかに巨大な湖であるが、バルグジン湾での物質循環に対する沈降粒子の寄与は琵琶湖と同程度であることが示唆された。全粒子束のうち灼熱減量として与えられる有機物画分の値は、116mg/m^2/dayであって全体の約40%を占めた。この値も琵琶湖と同様であった。沈降粒子束の値が測定されたのは、バイカル湖ではこれがほとんど初めてと言ってよいほどである。この値が季節と場所によってどのように変化するかは、きわめて興味の持たれる点である。2003年5月25日6月8日と2003年7月25日8月8日の2回に渡ってロシアに渡航し、バイカル湖の調査を行った。リストビアンカ周辺、バルグジン湾、南湖盆中央域、セレンガデルタ沖で各種の生物・物理・化学観測を実施した。その結果として、次のような成果を得た。1)7月-8月のバルグジン湾には水面下10-100mの厚みで強い鉛直混合の履歴があった。このことから、同湾での栄養塩の供給にはこの湾に固有の湖水鉛直混合過程も無視出来ないことが分かった。2)夏季のバルクジン河口域では、沖帯でみられるフィコエリスリン(PE)を多く含むタイプの他に、フィコシアニン(PC)を多く含む、計二つの色素タイプが観察された。3)5月末の水草類を採取して含有無機リン酸濃度を測定した。越冬したと思われる藻体、融氷後新規に生育したと思われる藻体ともに、他の季節のものに比べてその濃度は有意に低い値であった。4)5月-6月のバイカル湖、南および中央湖盆における栄養塩欠乏を、栄養塩添加実験およびN-、P-debt法で検証した。その結果、この季節の南および中央湖盆は窒素欠乏にあると判断された。また、このときの中央湖盆沖帯での光合成速度は水柱全体で、852mg-C/m^2/dayであった。5)5月に南湖盆で、7月にバルグジン湾で沈降粒子束を測定した。全粒子束とその灼熱減量画分は279と75.3mg/m^2/day(南湖盆)、97.4と28.2mg/m^2/day(バルグジン湾)であった。昨年の結果とも併せて季節と場所による粒子束の違いが明瞭に観察された。2004年6月6日6月18日と2004年10月15日10月29日の2回に渡ってロシアに渡航し、バイカル湖の調査を行った。リストビアンカ周辺ならびにバルグジン湾で各種の生物・物理・化学観測を実施した。本年度の調査で、2002年から始まった本研究の中で初めて、沈降粒子と湖水温について5ヶ月に渡る長期連続観測に成功した。この長期連続観測の結果、バイカル湖では6月から10月にかけて複数回の深層水湧昇が起こっていたことが分かった。湖上の風速と風向が深層水湧昇の発生に影響していると考えられた。沈降粒子束は水温の変動とともに大きく変化した。最も沈降粒子束の大きかった7月下旬の値は、最も小さい期間であった10月上旬のそれの8倍に相当していた。生物活動の季節による大きな変動が示唆された。
熱ショックタンパク質Hsp72のC末端配列が初期免疫系に果たす役割

通常HSPは細胞内に存在し、分子シャペロンとして機能している。一方近年では、細胞の傷害時における細胞外でのHSPの免疫学的な機能が注目されている。申請者はこれまでにマウス誘導型Hsp72およびそのC末端欠失変異体とlymphoid neoplasm P388D1細胞が特異的に結合し、この結合にはC末端の構造が関与していることを明らかにしている。本研究では、Hsp72C末端領域の構造の免疫系での働きについて明らかにすることを目的とした。P388D1細胞と各種Hsp72C末端欠失変異体での種々の炎症性サイトカイン発現をRT-PCRにより検討したが、特異的なサイトカインの発現はみられなかった。次に、マウス腹腔マクロファージについて検討したところ、C末端が欠失するにつれ結合が強くなる傾向がみられ、IL-1βの発現がみられた。しかし、IL-1βの発現に対するC末端領域の関与については認められなかった。次に、マウス腹腔マクロファージを用い、貪食能についてフローサイトメーターを用いて検討した。いずれのHsp変異体においても貪食能の亢進が観察されたが、変異体による差異はみられなかった。HSP70の一時配列は異種生物間においてもよく保存されているが、C末端領域の配列は多様性に富む。そこで、この違いが異種生物の侵入などの自己非自己の見極めに関与するという仮説のもとに、現在ヒトおよび大腸菌のHSP70組換えタンパク質の発現を試みており、さらにはマウスHSP70およびこれらの異種生物HSP70とのキメラタンパク発現を試みている。一方、腸管は生体における最大の免疫器官であり、食物や腸内細菌等の多くの外来異物と直接接触する器官である。腸管免疫系における細胞外のHSP70の機能について検討するため、ヒト小腸上皮細胞Caco-2細胞を用いたモデル系の構築も試みている。またこの際、ヒト単球細胞THP-1とCaco-2の共培養モデル系を構築する為に現在研究を進めている。一方近年では、細胞の傷害に続く炎症における、細胞外でのHSPの免疫学的な機能が注目されている。申請者は、マウス誘導型Hsp72およびそのC末端欠失変異体とlymphoid neoplasm P388D1細胞が特異的に結合し、結合にはC末端の構造が関与していことを明らかにしているが、機能については不明であった(Ohno et.al., Mol. Immunol.44,2344-2354(2007))。そこで、本研究では、Hsp72の免疫系における働きを明らかにすることを目的とした。Hsp72とそのC末端欠失変異体について、P388D1細胞との結合における、種々の炎症性サイトカイン(TNF-α,IL-1β,IL-6,GM-CSF)の発現をRT-PCRにより検討した。しかしながら、P388D1では特異的なサイトカインの発現はみられなかった。したがってこれについては、さらにケモカイン等の他のケミカルメディエーターの発現についても検討を行うとともに、ELISA法による検討も行う予定である。一方、腸管におけるモデル系の構築も試みている。生体には多くの免疫器官が存在するが、中でも腸管は生体における最大の免疫器官であり、食物や腸内細菌等の多くの外来異物と直接接触する器官である。

腸管免疫系において、HSPが免疫学的機能をもっか、HSPの由来する生物種の違いによる応答の違いの有無を検討するため、ヒト小腸上皮細胞Caco-2を用いた検討を予定している。またこの際、pholbol ester処理によりマクロファージ様に分化することの知られるヒト単球細胞THP-1とCaco-2の共培養系を構築し、これを腸管のモデル系とし検討することを目標とし、現在研究を進めている。通常HSPは細胞内に存在し、分子シャペロンとして機能している。一方近年では、細胞の傷害時における、細胞外でのHSPの免疫学的な機能が注目されている。申請者は、これまでにマウス誘導型Hsp72およびそのC末端欠失変異体とlymphoid neoplasm P388D1細胞が特異的に結合し、この結合にはC末端の構造が関与していることを明らかにしている。本研究では、Hsp72C末端領域野構造の免疫系での働きについて明らかにすることを目的とした。昨年度この結合における、P388D1細胞での種々の炎症性サイトカイン発現をRT-PCRにより検討したが、特異的なサイトカインの発現はみられなかった。そこでマウス腹腔マクロファージについて検討したところ、C末端が欠失するにつれ結合が強くなる傾向がみられ、IL-1βの発現がみられた。しかし、IL-1βの発現に対するC末端領域の関与については認められなかった。次に、マウス腹腔マクロファージを用い、貪食能についてフローサイトメーターを用いて検討した。いずれのHsp変異体においても貪食能の亢進が観察されたが、変異体による差異はみられなかった。HSP72の一時配列は異生物種間においてもよく保存されているが、C末端領域の配列は多様性に富む。そこで、この違いが異種生物の侵入などの自己非自己の見極めに関与するという仮説のもとに、現在ヒトおよび大腸菌のHSP70組換えタンパク質の発現を試みており、生物種の違いによる影響を検討する予定である。一方、腸管におけるモデル系の構築も試みている。腸管は生体における最大の免疫器官であり、食物や腸内細菌等の多くの外来異物と直接接触する器官である。腸管免疫系における細胞外のHSPの機能について、ヒト小腸上皮細胞Caco-2を用いた検討を予定している、またこの際、ヒト単球細胞THP-1とCaco-2の共培養モデル系を構築する為に現在研究を進めている。
穀物調製施設における殼粒移送パイプの騒音発生機構と放射特性

1.穀物調製施設における騒音環境穀物調製施設の例として、中規模の精米施設の騒音環境を豊査した結果、施設内の騒音レベルは7690dB(A)の範囲にあり、作業者が就労時間内に受ける等価騒音レベルは8487dB(A)であり、さらに一日間のそれは7883dB(A)となり、これらの値は日本産業衛生学会並びに米国環境保護局の騒音許容基準を大きく上回ることが判明した。2.揚穀パイプ中を流動する籾の発生騒音揚穀機を供試して、揚穀パイプ中を流動する籾の発生騒音を検討した結果、発生騒音は、中・高周波数帯域が主成分の定常騒音で、これらは籾とパイプ壁あるいは籾粒子相互間の摩擦音及び衝突音に起因していることが明らかになった。3.籾とその移送材料間の摩擦抵抗と発生騒音籾と移送パイプ材料(鉄板、塩ビ板、金網等)及び籾粒子相互間の摩擦係数と発生摩擦音を測定した結果、摩擦係数の大きな材料ほど摩擦音は大きくなり、摩擦板の移動速度は増加に伴って、摩擦係数は直線的にやや減少の傾向が、発生摩擦者は対数曲線で近似される上に凸の曲線を画いて増大することが認められた。4.籾とその移送材料間の衝突エネルギと発生騒音籾と移送パイプ材料間及び籾粒子相互間の衝突エネルギと発生衝突音を測定した結果、籾の落下高さを一定にした場合、籾の落下流量の増加に伴って、発生衝突音は対数曲線で近似される上に凸の曲線を画いて増大し、又、籾の落下流量を一定にした場合、籾の落下高さの増加に伴って、発生衝突音は直線的に増大することが認められた。以上のことから、パイプ中の穀粒の流動騒音は穀物調製施設における主要な騒音源の一つと考えられた。1.穀物調製施設における騒音環境穀物調製施設の例として1日の処理能力が48tonの中規模程度の精米施設の騒音環境を調査した。その結果、施設内の騒音レベルは7690db(A)の範囲にあり、特に作業者が常時操作を行う精米装置は8890db(A)と非常に高いことが明らかになった。このことから、作業者が就労時間内に受ける等価騒音レベルは8487db(A)であり、さらに一日間のそれは7883db(A)となり、これらの値は日本産業衛生学会の騒音の許容基準を越えており、また作業者の実際の年間就労日数が米国環境保護局の騒音の許容基準による年間許容就労日数の610倍に相当することが判明した。2.揚穀パイプ中を流動する穀粒の発生騒音上記1.とは別途に実験室において揚穀機を供試して、揚穀バイプ中を流動する穀粒の発生騒音を穀粒の流動状態との関係で計測し検討した。その結果、揚穀パイプ中を流動する穀粒の発生騒音は中・高周波数帯域が主成分の定常騒音であり、その大きさは穀粒の流量変化に対してはさほど大きな変動はないが、揚程の増加に伴ってほぼ直線的に増大することが明らかになった。また、バイプの表面から放射される騒音レベルは95100db(A)と非常に大きく、その放射騒音分布は穀粒の流量が少ない時はパイプ表面全周でほぼ均一であるのに対し、穀粒の流量が多い時は穀粒がパイプ下側で密に流動することから、穀粒粒子群間あるいは穀粒とパイプ壁面との摩擦や衝突の増大に起因して、放射騒音分布はパイプ上側で小さく下側で大きな上下方向に短軸を有するだ円形状になることが明らかになった。

以上のことから、パイプ中の穀粒の流動騒音は穀物調製施設における主要な騒音源の一つと考えられた。1.籾とその移送材料間の摩擦抵抗と発生騒音移送パイプ中を流下する籾の発生騒音は、籾とパイプ壁あるいは籾粒子相互間の摩擦音に起因すると考えられるので、移送材料に鉄板、塩ビ板、金網等を選び、さらに籾粒子を一面に貼り付けた籾板も供試して、材質間の相違の一つの指標として、これら供試板が籾層表面を移動する際の摩擦抵抗を測定して、その際発生する摩擦音との関係を考察した結果、(1)摩擦係数は0.55(塩ビ板)0.78(籾板)の範囲にあり、摩擦係数の大きな摩擦板ほどその発生騒音は大きくなる。(2)摩擦板の移動に伴う籾層表面の籾粒子は、摩擦係数の大きい摩擦板ほど、又移動速度が増加するにつれてその動きは激しくなり、転がりを伴った動きが観察された。このため、(3)摩擦板の移動速度の増加に伴って、摩擦係数は直線的にやや減少の傾向がみられ、発生騒音は対数曲線で近似される上に凸の曲線を画いて増大することが認められた。2.籾とその移送材料間の衝突エネルギと発生騒音移送パイプ中を流動する籾の発生騒音は、上述の摩擦音の他に籾とパイプ壁あるいは籾粒子相互間の衝突音も大きな要因と考えられるので、上述の移送材料を供試して、籾の衝突エネルギと発生騒音の関係を考察した結果、(1)籾の衝突によって発生する衝突音は、衝突板の材質、形状、表面の形態の相違により衝突板固有の大きさになる。(2)籾の落下高さを一定にした場合、籾の落下流量の増加に伴って、発生騒音は対数曲線で近似される上に凸の曲線を画いて増大する。(3)籾の落下流量を一定にした場合、籾の落下高さの増加に伴って、発生騒音は直線的に増大する。(4)籾の落下高さ及び落下流量を一定にした場合、衝突板の衝突角度の増加に伴って、発生音は直線的に減少することが認められた。
公的年金制度における会計フレームワークの構築ー公的年金制度の給付債務の研究ー

本研究は、公的年金制度における債務概念の検討のために、これまで私的年金制度を対象として1980年代以降、国内外の会計基準の著しい進展を参照しながら新たな債務概念を明確にして、会計フレームワークを構築することにあった。この目的のために、本研究は、まずは米国の公務員年金制度をめぐる会計基準に関する詳細な研究をおこない、下記に述べるような成果をえた。本研究テーマは、公的年金制度における給付債務の研究であるが、本年度は米国の地方公務員の年金債務の会計基準を対象として研究を実施した。すなわち、2012年に米国の政府会計基準審議会(GASB)から公表された公開草案「年金会計と財務報告」を素材として、従来の会計基準が公務員年金制度にかかる給付債務概念を明確にしないまま、州または地方政府の拠出規定にもとづく毎年の拠出額を債務ならびにコストとして認識してきたのに対して、公開草案では拠出額と債務とは別個の性格のものとしてとらえて、給付債務それ自体を問題にしてきた。それは拠出にもとづく財務サイドから給付債務をみるのではなく、会計サイドから改めて債務概念を構築しようという試みであるとみなされる。この公開草案は、私的企業の年金会計基準FAS87号のフレームワークの構築と基本的には同じものに立脚して、公的年金制度の給付債務概念を構築したものといっても間違いないであろう。もちろん、給付債務の測定レベルに関しては、FAS87号のようにすべての給付債務に対してリスクフリー・レートを割引率として使用するのではなく、非常に限定的な利用にとどまっている。すなわち、基本的な割引率は年金資産の期待収益率の利用が認められている。しかし、そうした限界があるとしても、従来のようにすべてを期待運用収益率をもとに給付債務の現在価値を算定していたのと異なり、割引率の選択に一定の制約がもとめられている点が、評価されるべきであろう。そうした動向をうながす要因の1つとして、地方債市場に向けて地方債発行の際のディスクロージャー問題が考えられる。政府であっても、資本市場に関与するなかで会計(会計基準)のあり方が問われている点も、給付債務概念のフレームワークの再構築をうながす要因の1つであることも忘れてはならない点である。次年度は、主題の検討にむけて研究を展開する予定である。本年度における研究は、企業年金会計基準という民間の会計基準のフレームワークが、公的年金会計といっても米国における公務員の年金会計基準のフレームワークの構築にどのような影響をおよぼしているのか、という課題にむけて検討された。その際の中心課題は、公務員年金会計における主題は、私的企業の年金会計基準と同じく年金負債のとらえ方にある。すなわち、私的企業の年金会計基準が、既発生債務を安全性の高い利回りによって割り引いて算定されるのに対して、米国地方政府の財政の考えかたにもとづく制約をうけて、負債を2つのタイプに区別している。ひとつは年金負債のうち給付のために現に積み立てられている年金資産によって給付が確実な負債、ならびに拠出が予定される債務については、割引率は期待運用収益率で、そうでない年金負債については民間企業と同じ安全性の高い割引率によって計算される。このように、公的年金負債の測定にとっては、必ずしも信頼性の高い年金負債の測定とはならないまでも、そこにも民間企業の年金会計基準のフレームワークが導入されてきている点が、重要である。以上の観点から、本年度は民間企業の年金制度と会計問題とのあいだの相互作用に注目して、年金負債の売却ーバイアウトー問題が会計基準のフレームワークにおおきな影響の可能性があること、そしてそうした状況が、上述した公的年金制度の会計基準問題にも一定の影響をあたえると予想されること、という観点にたって、英国のバイアウト会計問題についても検討した。以上、本年度の当該研究テーマに対する研究実績は、誇れるほどの成果をあげたとはいえないが、これまでほとんど問題にされてこなかった公的年金会計基準の研究にむけて一歩推し進めたといっても、許されるであろう。本年度の研究は、本研究テーマにおけるフレームワークを構築する上で必要な前提となる作業、ならびに基本的な概念の検討に中心がおかれた。その意味で、とくにつぎの2つが重要であった。一つは、研究論文「受給権保護と年金会計」で検討された、会計における受給権概念の意味とその位置に関してである。それは、私的な企業年金制度の会計を対象におこなわれたものではあるが、公的年金にとっても十分に意義のある問題である。もう一つは、米国の公的年金、とくに公務員年金制度の会計基準公開草案をめぐる検討である。それはすでに本学部紀要『経済集志』に寄稿されている(本年5月刊予定)。ここで初めて公的年金制度に会計基準の統一化問題が焦点となった。これは平成24年度以降の本研究テーマの進展に少なからず影響すると考える。上記の「9研究実績の概要」で述べたように、これまでの研究では公的年金制度の給付債務を直接に対象としたものではなく、間接的に公務員年金制度における給付債務のフレームワークの構築の契機と意味を明らかにしているにすぎないからである。ただし、この作業は主題におけるフレームワークの再構築にむけて大きな前進となる。

本年度の達成度は(3)やや遅れているが、その主たる理由は「研究実績の概要」でふれたとおり、本年度は本研究テーマの前提となる作業に時間がさかれたがゆえである。しかし、そこで言及されたように米国の公的年金をめぐる会計基準案を対象として本研究テーマのフレームワークの一端が構築されているので、進行の遅れに対する措置は図られていると考えている。平成25年度は、上記のGASBの公開草案が平成22年6月に承認されたこと、ならびに地方債発行をめぐる米国証券取引委員会(SEC)の州政府への訴追の動向などを詳細に検討して、給付債務概念のフレームワークの構築に資するよう研究する予定である。さらに、上記の研究をふまえて公的年金制度ーわが国の公的年金制度ー財政に対するもう1つの見方を提示する意図から、公的年金制度の給付債務概念を会計学の研究アプローチをつかって明らかにしたい。平成24年度はつぎの2つの問題について展開する予定である。すでに「研究実績の概要」と「現在までの達成度」でふれたとおり、米国の公的年金、とくに公務員年金制度の会計基準案の検討、ならびにそれをもとにわが国の公務員年金制度の会計基準問題を明らかにする。第2に、厚生年金制度等の公的年金制度の会計のあり方を債務概念を中心として、そのフレームワークの構築を当面の課題としたい。平成25年度は、最終年度でもあるため、国内外の調査研究のための費用、ならびに情報機器の購入を中心として使用し、その他内外の関連文献の購入にも支出する予定です。平成23年度において計画された海外における本研究テーマにかかわる研究が、諸般の事情により平成24年度に繰り越されたので、この点に関する研究費として一定額が使用される予定である。また、本研究テーマに関する文献、とくに海外文献を精力的にリサーチして、当該文献の購入についても計画している。その他研究上必要なソフト等の購入について使用予定である。
ウマを用いた直接転換法による迅速な骨の再生医療の新規基盤技術の確立

本研究では、馬の真皮組織から抽出した皮膚線維芽細胞群より、分化能の高い前駆細胞をフローサイトメトリーおよび三種類の抗体を用いて選別することに成功した。これらの細胞を、骨分化用培地およびBMPの蛋白を添加した培地を用いて培養したところ、無選別の細胞に比較して、骨形成に関わる遺伝子が有意に活性化しており、またVon Kossa染色で視認されたミネラル小瘤の数も有意に多かった。これらの結果から、分化能の高い皮膚細胞を選別して、BMP蛋白と一緒に局所投与することで、迅速な骨の再生医療が可能であることが示唆された。本研究では、遺伝子導入した皮膚線維芽細胞を局所投与して、生体内環境を利用して骨形成細胞に直接転換させ、簡便に臨床応用できる骨再生医療の基盤技術を確立させることを目的とする。まず馬の皮膚組織から皮膚線維芽細胞の分離を行った。生検パンチで採取した皮膚片から、真皮組織を分離して、二時間にわたるコラゲナーゼ酵素への攪拌浸透をすることで、多数の皮膚線維芽細胞を抽出した。このような細胞の抽出方法は、骨髄液や脂肪組織から行う細胞の抽出に比較して、手技的に簡易であり、侵襲性が非常に少ないことから、広範な臨床応用への意義が高いと考えられる。次に、これらの皮膚線維芽細胞をフローサイトメトリーにて解析した結果、間葉系幹細胞と同様に、CD90陽性およびMHCII陰性の特徴を示し、高い分化能を有する前駆細胞を特異的に選別できることが示された。またこのようにして選別された皮膚線維芽細胞は、非常に優れた細胞増殖能を有している事が確認され、これまで再生医療に使われてきた骨髄幹細胞と比べて、極めて短期間で多数の治療用細胞を増殖できることが示唆された。この事から、この皮膚線維芽細胞を用いることで、骨組織の再生医療を、多数の細胞の局所注射によって実施できることが示唆された。そして、皮膚線維芽細胞に対するアデノウイルスベクターを用いた遺伝子導入では、良好なマーカー蛍光遺伝子の発現が認められ、このベクターによる細胞の遺伝子受容性が確認された。また、複数のベクター濃度を比較したところ、200MOI(=細胞ひとつ当たりに200感染単位のベクターを作用させる)において遺伝子発現が有意に優れており、その際の、細胞生存性の低下は軽度に留まることが示された。このため、200MOIのベクター濃度を用いて治療用遺伝子を導入することで、皮膚線維芽細胞の死滅を引き起こすことなく、骨形成細胞への分化を誘導できることが示唆された。本研究では、遺伝子導入した皮膚線維芽細胞を局所投与して、生体内環境を利用して骨形成細胞に直接転換させ、簡便に臨床応用できる骨再生医療の基盤技術を確立させることを目的とした。前年度で確立させた手法を用いて、馬の真皮組織から多数の皮膚線維芽細胞を抽出した。これらの細胞群からより分化能の高い前駆細胞をフローサイトメトリーにて選別するため、1CD90のみに陽性の細胞群、2CD90とCD34の両方に陽性の細胞群、3三つともに陽性の細胞群を選別してみたところ、2と3の細胞群において、三種類の表面抗原を有する細胞を最も効率的に選別できることが分かった。さらに、これらの細胞を、骨分化用培地を用いて培養したところ、1および無選別の皮膚線維芽細胞に比較して、2および3の細胞群において、骨形成に関わる遺伝子が有意に活性化しており、またVon Kossa染色で視認されたミネラル小瘤の数も、2と3では有意に多かったことが確認された。次の段階として、当初は、BMPの遺伝子を導入させた細胞の局所注射を予定していたが、組み換え遺伝子実験を馬という大動物を使って行うことが研究施設内において難しい事から、遺伝子導入を介さない手法を検討するため、BMPの蛋白を添加して培養した細胞における骨分化能を評価した。上述のように、フローサイトメトリー法で選別した細胞を、BMP蛋白を含んだ培地を用いて培養させたところ、無選別の皮膚線維芽細胞に比較して、13の細胞群において、骨形成に関わる遺伝子の活性、および、染色されたミネラル小瘤の数が有意に向上していた。これらの結果から、皮膚から分離した細胞群に含まれる前駆細胞を、フローサイトメトリー法で特異的に分離したあと、その細胞をBMP蛋白と混ぜて局所投与することで、迅速な骨の再生医療が可能であることが示唆された。理由:当初の予定通り、分化能を持つ皮膚線維芽細胞の選別法の設定(工程表のA)、および、即時的な遺伝子導入法の条件設定(工程表のB)をほぼ完了しているため。再生医療本研究では、これまでに判明した遺伝子導入に適した条件を用いながら、生体内環境を利用して骨形成細胞に直接転換させて、骨治癒を促進させる手法を確立させる。

しかし、当初予定していた、遺伝子導入させた細胞の局所注射は、組み換え遺伝子実験を馬という大動物を使って行うことが研究施設内において難しいため、InVitroにて骨組織の生成を達成できることを証明することで代替する事とする。この際には、RT-PCRによる骨系遺伝子の活性化だけでなく、細胞組織学的な石灰化およびミネラル化の発現を確認することで、In Vivoでも同様な治療作用を誘導できることを包括的に立証することとする。その次の段階としては、馬の骨治癒モデルを用いた動物実験によって、迅速な再生療法によって骨治癒を加速させる手法を確立させる。このためには、フローサイトメトリー法によって選別した皮膚線維芽細胞を、ウマの肋骨のドリル孔および副管骨の骨切術部に局所投与して、6週間にわたって画像検査を行う。そして、投与の6週間後には、外科的に摘出した肋骨と副管骨に対して、物理的強度検査、組織学的検査、骨化速度解析などを実施して、骨再生の度合いを定量的に評価する事とする。次年度使用額が生じたのは、初年度のIn Vitro実験で使用した培養液や抗体などを、併行して実施している他の共同研究の費用で購入したもので転用できたためである。この分の研究費は、次年度で実施する遺伝子解析や組織学的解析、および、動物実験に際して、解析する遺伝子数や検体数を増加させることに当て、より包括的な治療効果の評価につなげる事とする。
腎系球体,尿細管機能の調節機構の細胞生物学的解析

今回本研究で我々が得た知見は以下の通りてある。1)メサンギウム細胞は形質変換成長因子β(TGF-β)のmRNAを発現しており、その発現は牛胎児血清やCキナーゼにより刺激される。一方メサンギウム細胞で産生され上清中に放出されるTGF-βはほとんどが不活性な形である。TGF-βを投与するとメサンギウム細胞の増殖は抑制される。これらのことはメサンギウム細胞においてTGF-βがautocrine的に作用し、生理的、病態生理的に重要な役割を持つことすることを示唆する。2)一種類の血小板活性化因子(PAF)受容体がモルモットの腎に存在するが、これは皮質にもっとも豊富に存在している。3)クローン化された腎上皮細胞LLCPKlには一種類のPAF受容体が存在し、PAFは容量依存性にLLCPKl細胞において細胞内カルシウム濃度を上昇させた。以上の観察は腎においてPAFが作用し生理的に意義のある役割を持っていることを示唆している。4)エンドセリンーlは容量依存性に皮質および髄質の集合尿細管の細胞内カルシウム濃度を上昇させた。エンドセリンーlのmRNAはネフロン内で、糸球体の他には皮質および髄質の集合尿細管にのみ発現していた。また、エンドセリンーlの結合もやはり糸球体と集合尿細管にのみ認められた。これらはエンドセリンーlのネフロン内におけるautocrine/pracrine的な作用機構を想定させる知見である。5)培養メサンギウム細胞を用いた観察に基づき、我々は尿細管糸球体フィードバック機構における細胞間刺激伝達に関してメサンギウム細胞が重要な役割を持つとの仮説を提唱している。腎糸球体機能および尿細管機能とその調節機構について細胞生物学的アプロ-チをするのが、本研究の基本的目的である。本年度は、主として以下の知見を得た。1.TGFーβは、メサンギウム細胞の増殖及び分化に重要な役割を果たしていることが知られている。我々は、メサンギウム細胞が外因性のTGFーβに反応するだけでなく、牛胎児血清やphorboresterに反応して自らTGFーβを産生し、細胞外に分泌することを示した。しかし、この分泌されたTGFーβは生物学的活性のなく、不活性型であることが判明した。したがって、骨基質の場合と同様に、分泌されたTGFーβはメサンギウム基質に蓄積した後に何らかの機序によって活性化されてautocrine factorとして働くことが示唆された。2.エンドセリンに関しては、尿細管におけるエンドセリン分泌の可能性について検討した。その結果腎尿細管由来のMDCK細胞において、プレプロエンドセリンmRNAが発現しており、この発現はTGFーβやphorbor esterで刺激された。さらに、MDCK細胞を単層培養してエンドセリンの分泌を検討したところ、その分泌には極性があり、基底側に分泌されることが分った。また、ラットの腎臓を検討したところ、髄質外側のinner stripeでプレプロエンドセリンmRNAが発現されていることがわかった。3.アルギニンーバソプレッシン(AVP)は尿中に大量に存在しているが、この生理的意義について検討した。その結果、AVPは皮質集合管に管腔側より作用し、管腔側のKイオン透過性を抑制し、基底膜側のClイオン透過性を亢進させることが明らかとなった。この機構はCーkinaseと細胞内Caイオンを介していると考えられる。本年度に得た知見は以下の通りである。1.メサンギウム細胞のTGFーβ産生:昨年までの研究で我々は培養メサンギウム細胞は牛胎児血清やフォ-ルボ-ルエステルなどに刺激されてTGFーβを産生分泌するが、その多くは不活性型であることを明らかにした。

本年はさらにshear stress(剪刀)がメサンギウム細胞でのTGFーβの代謝に及ぼす影響につき検討し、shear stressを作用させるとメサンギウム細胞より分泌されるTGFーβの総量は変化セず、活性型の比率が増加することが観察された。また、この活性型の比率の増加は細胞を取り除いた条件でも見られ、機械的な刺激で起こると考えられる。これらの観察からメサンギウム細胞で産生されたTGFーβは糸球体における血行動態の変化などにより様々な程度に活性化を受けた後autocrine的にメサンギウム細胞に作用するのではないかと我々は結論した。2.腎におけるエンドセリンのmRNA発現:ラットの腎臓からmicrodissectした糸球体・尿細管よりPCR法で増幅したmRNAを用い、各ネフロンセグメントにおけるエンドセリンIのmRNAの発現を見た。エンドセリンmRNAは糸球体、皮質および髄質の集合尿細管に発現しており、近位尿細管とヘンレのル-プには発現が見られなかった。3.腎における血小板活性化因子レセプタ-のmRNA発現:ラットの腎臓からmicrodissectした糸球体・尿細管よりRCR法で増幅したmRNAを用い、各ネフロンセグメントにおける血小板活性化因子レセプタ-のmRNAの発現を見た。血小板活性化因子レセプタ-mRNAは糸球体、近位尿細管曲部と直部、皮質ヘンレ上行脚太部、皮質および髄質内層の集合尿細管に発現していることを確かめた。本年我々が得た知見は以下の通りである。メンサギウム無細胞に関する検討:(1)メサンギウム細胞において二つの構造的に異なるV1バゾプレシン受容体拮抗剤の効果につき検討した。非ペプチド物質のOPC-21268とペプチド物質のd(CH2)5Try(Me)AVPは共にバゾプレシンによるメサンギウム細胞の細胞内Ca上昇を抑制した。後者の効果は薬物を除去した後も持続しこれら二つの拮抗薬のV1レセプターに及ぼす効果に相違があることが示唆された。(2)メサンギウム細胞の増埴につき3H-thymidineを用いて検討した。多(46)継代培養メサンギウム細胞では従来の報告と同様エンドセリン、バゾプレシンは細胞増殖を刺激したが、初期(13代)継代培養メサンギウム細胞においては逆に細胞増殖を抑制した。一方血小板活性化因子はメサンギウム細胞増埴をいずれの代においても刺激し生体内でも増殖刺激因子としての生理作用を持つ可能性が示唆された。(3)細胞外C1濃度の低下はメサンギウム細胞によるプロスタグランディンE2の産生を増加させることは我々は以前より報告しているが、今回の検討では細胞外Naの変化はメサンギウム細胞によるプロスタグランディン産生に大きく影響しなかった。尿細管に関する検討:(1)各ネフロンセグメントにおけるエンドセリンの結合につき検討した。この結果エンドセリン-1.3は同程度に糸球体、近位尿細管S1、集合尿細管に結合し、従ってこれらの部位にはエンドセリンBレセプターがあると考えられた。(2)各ネフロンセグメントにおけるEP3-プロスタグランディンE2レセプターのmRNA発現につきRT-PCR法で検討し、これがヘンレ上行脚太い部分に豊富に発現していることを見いだした。(3)近位尿細管S3
対向型高温超伝導バルク磁石を用いたマウス用MRIシステムの開発

本研究課題の目的は,高温超伝導バルク磁石を対向型に配置することにって,マウス等の小動物を撮像することが可能な広い撮像領域を持ったMRIシステムを開発することである.磁石は,直径60mmのバルク体を対向型に配置(ギャップ4.5cm)することで開発した.ガウスメータを用いて着磁した対向型磁石の磁場分布を計測した結果,評価領域内(1.5cm立法)で5000ppmを超えることが明らかになった.次に,均一かつ広い静磁場均一領域を得るために,円筒型のバルク磁石を採用し, MRIを用いた着磁過程評価手法を開発した.その結果,バルク磁石の着磁過程のうち,減磁過程における磁場分布の変化が極めて大きいことがわかった.さらに,バルク磁石の温度が転移温度以下になったとき,バルク磁石内部に設置されている勾配磁場コイルの電流効率がマイスナー効果によって,大幅に低下することも判明した.マイスナー効果による影響を小さくするために,コイルと超伝導体間の距離を大きくした構造を持ったバルク磁石を採用した.さらに,静磁場均一性を向上させるために,有限差分法を用いてマイスナー効果を考慮した単層シムコイル設計手法を開発した.開発したシムコイルを用いることによって,静磁場均一性・均一領域は,大幅に改善し,マウス胎児(高さ10mm)の高分解能撮像(50mm立法)に成功した.また,圧縮センシング技術を用いた撮像シーケンスを用いることによって,マイクロイメージングにおける撮像時間を大幅に短縮することに成功した.本研究課題は平成26年度が最終年度のため,記入しない.本研究課題は平成26年度が最終年度のため,記入しない.平成25年度においては,高温超伝導バルク磁石の着磁手法を改善するために,実験的な検証を行った.Phase Shift法を用いて, MRIによる磁石着磁過程中の磁場の変化を計測し,着磁過程における静磁場均一性の低下の原因を検討した.本手法によって,磁場不均一性の原因が磁石内部の温度差もしくは,高温超伝導体結晶自体の不均一性が原因であるということが示唆された.また,この計測によって,高温超伝導体が転移温度を下回った際に,磁石とMRIにおける位置情報の付加に重要な勾配磁場との間にインタラクションがあることが判明した.このインタラクションは高温超伝導体のマイスナー効果によるもので,今後はこの効果を考慮した勾配磁場コイルの設計が求められる.また,静磁場均一性を向上させるためのシムコイルも同様に,マイスナー効果によって理想的な磁場補正が難しいことも判明したため,シムコイルも同様にマイスナー効果を考慮した設計が必要であることがわかった.また,本成果を元に,有限要素法を用いた磁石の改善を行った.高温超伝導体の厚みや直径等の構造を有限要素法を用いた最適化計算を行った結果,静磁場の均一性が約4割程度改善した.また,磁石の内径を大型化することによってマイスナー効果による勾配磁場のインタラクションの減少が確認された.この成果によって,さらなる高分解能撮像が可能となった.さらに,高分解能撮像をするにあたって,信号のSNRが著しく低いため,圧縮センシングを用いたシーケンスを開発した.この手法を用いることによって,単位時間当たりのSNRが大幅に改善し,高分解能撮像を現実的な撮像時間内で行うことが可能になった.本研究課題の目的は,高温超伝導バルク磁石を対向型に配置することにって,マウス等の小動物を撮像することが可能な広い撮像領域を持ったMRIシステムを開発することである.磁石は,直径60mmのバルク体を対向型に配置(ギャップ4.5cm)することで開発した.ガウスメータを用いて着磁した対向型磁石の磁場分布を計測した結果,評価領域内(1.5cm立法)で5000ppmを超えることが明らかになった.次に,均一かつ広い静磁場均一領域を得るために,円筒型のバルク磁石を採用し, MRIを用いた着磁過程評価手法を開発した.その結果,バルク磁石の着磁過程のうち,減磁過程における磁場分布の変化が極めて大きいことがわかった.さらに,バルク磁石の温度が転移温度以下になったとき,バルク磁石内部に設置されている勾配磁場コイルの電流効率がマイスナー効果によって,大幅に低下することも判明した.マイスナー効果による影響を小さくするために,コイルと超伝導体間の距離を大きくした構造を持ったバルク磁石を採用した.さらに,静磁場均一性を向上させるために,有限差分法を用いてマイスナー効果を考慮した単層シムコイル設計手法を開発した.開発したシムコイルを用いることによって,静磁場均一性・均一領域は,大幅に改善し,マウス胎児(高さ10mm)の高分解能撮像(50mm立法)に成功した.また,圧縮センシング技術を用いた撮像シーケンスを用いることによって,マイクロイメージングにおける撮像時間を大幅に短縮することに成功した.本研究課題は平成26年度が最終年度のため,記入しない.本研究課題は平成26年度が最終年度のため,記入しない.当初の目標であったシムコイルの設計に関して,マイスナー効果による磁場のシールディング効果が発見されたため,従来どおりの設計では困難であることが判明したため.有限要素法等を用いたマイスナー効果を考慮した計算手法を用いてシムコイル及び勾配磁場コイルの設計を行うことを予定している.
マクロファージのphospholipaseA2依存性殺菌メカニズムに関する研究

本研究は,抗酸菌の菌体や菌体成分による活性化シグナルにより誘導されるマクロファージ(Mφ)のcPLA_2のphagosome膜へのtranslocationとリン酸化による活性化現象に焦点を当て,そのメカニズムを解明しようとするものである。一連の検討により,(1)Mφの結核菌に対する抗菌活性はATPで増強されるが,この効果はcPLA_2阻害剤のa-TFMKでブロックされること,(2)Mφの細胞膜アラキドン酸のphagosome内局在結核菌へのtranslocationはa-TFMKで阻害されること,また共焦点レーザースキャン法による観察では,(3)マウス腹腔MφやRAW-MφにMycobacterium avium complex(MAC)菌を感染させた場合に,cPLA_2のphagosome内局在菌へのtranslocationが認められるが,この現象はATPを作用させることでup-regulateされること,(4)こうした現象は,その後のphaseでみられるMAC感染Mφのアポトーシスに先行して起こること,(5)cPLA_2α-GFP発現プラスミドで形質転換したCHO細胞あるいはCD36^+CHO細胞にMAC菌を感染させると,強毒菌と弱毒菌の別なく,1224時間でphagosome内局在MAC菌体へのcPLA_2α-GFPのtranslocationが強く認められることが明らかになった。現在は,cPLA_2α中のセリン残基のリン酸化がcPLA_2のtranslocationにどのような影響を及ぼすのかについて検討するために,S505A,S515A,S727Aの各変異体cPLA_2α-GFPを発現するプラスミドを調製するための検討を進めつつある。本研究は,抗酸菌の菌体や菌体成分による活性化シグナルにより誘導されるマクロファージ(MΦ)のcPLA_2のphagosome膜へのtranslocationとリン酸化による活性化現象に焦点を当て,そのメカニズムを解明しようとするものである。本年度の一連の検討により,(1)MAC感染後のRAW-MΦでは,細胞質にdiffuseに存在するFITC標識cPLA_2が速やかに菌体周囲に集積して行くこと,(2)この感染により誘導されるcPLA_2のMAC菌が内在するphagosome膜へのtranslocationは3 mM ATPによって強くup-regulateされること,(3)こうした現象は,その後のphaseでみられるMAC感染MΦのアポトーシスに先行して起こること,(4)cPLA_2のSer505のリン酸化については,RAW-MΦではconstitutiveに起こっており,MAC感染により特に著しくup-regulateされるという現象は認められないことなどが明らかになっている。さらに現在までの取り組みで,(5)ヒトcPLA_2αのcDNAをRT-PCRで増幅し,GFPとの融合蛋白発現ベクターへ組み込む作業を完了し,(6)cPLA_2α-GFP発現ベクターを用いてのCHO細胞へのtransfectionを行い,融合蛋白がintactな形で発現し細胞内で一様に分布していることを共焦点レーザースキャン顕微鏡で確認しており,現在,ヒトMΦ細胞株を用いて,MAC感染により誘導されるMΦ内でのGFP標識cPLA_2αのtranslocationの様相についての検討を実施しつつある。また,S505A/S505E, S515A/S515E, S712A/S712Eなどの変異が導入されたcPLA_2αとGFPとの融合蛋白発現ベクターの作製も進めており,今後はGFPで標識された種々の変異cPLA_2αを用いての検討を進める予定にしている。本研究は,抗酸菌の菌体や菌体成分による活性化シグナルにより誘導されるマクロファージ(Mφ)のcPLA_2のpahosome膜へのtranslocationとリン酸化による活性化現象に焦点を当て,そのメカニズムを解明しようとするものである。

前年度の検討に引き続いて,特に抗酸菌の貪食による活性化シグナルにより誘導されるMφのcPLA_2のpahosome膜へのtranslocationのプロフィールについての検討を進めた。本年度の一連の検討により,(1)Mφの結核菌に対する抗菌活性はATPで増強されるが,この効果はcPLA_2阻害剤のa-TFMKでブロックされること,(2)Mφの細胞膜のアラキドン酸のpahosome内局在結核菌へのtranslocationはa-TFMKで阻害されること,また共焦点レーザースキャン法による観察では,(3)マウス腹腔MφにMAC菌を感染させた場合には,cPLA_2のpahosome内局在菌へのtranslocationが認められるが,この現象はATPを作用させることでup-regulateされること,(4)cPLA_2α-GFP発現プラスミドで形質転換したCHO細胞あるいはCD36+CHO細胞にMAC菌を感染させると,強毒菌と弱毒菌の別なく,1224時間でpahosome内局在MAC菌体へのcPLA_2 α-GFPのtranslocationが強く認められることが明らかになった。現在は,cPLA_2α中のセリン残基のリン酸化がcPLA_2のtranslocationにどのような影響を及ぼすのかについて検討するために,S505A,S515A,S727Aの各変異体cPLA_2α-GFPを発現するプラスミドを調製するための検討を進めつつある。
シンギュラービリヤードを用いた量子カオスの研究

点状散乱体を持つ量子擬可積分系のスペクトル(エネルギー固有値および波動関数)の性質に関して、次のような知見が新たに得られた。1.点状散乱体を持つ量子擬可積分系では、場の理論等で最近話題になっている、量子異常や幾何学的位相(ベリ-の位相)が現れる。点状散乱体を持つ擬可積分系の量子力学は、数学的には関数解析の一分野である閉対称作用素の自己共役拡張理論に従って定式化されるが、その際不足空間の定義にスケールの選び方の任意性があり、その結果、系に質量スケールが導入される。このことが量子スペクトルに古典系では見られないエネルギー依存性をもたらす(量子異常)。また、散乱体を非摂動系の固有関数の節に置いた場合、その条件下で適当にパラメータ(散乱体の座標)を調節すると摂動固有関数と縮退が生じる。パラメータ空間において、この縮退点の回りを一回り回ると一般に波動関数の符号が反転する(幾何学的位相)。二次元系では縮退点はパラメータ空間内で孤立しているが、三次元系では縮退点は曲線群をなす。2.点状散乱体を持つ量子擬可積分系から得られた知見を、小さいが有限の大きさを持つ散乱体を持つ量子系に応用した結果、低エネルギー領域において散乱体は近似的に点状として振舞い、その影響は散乱体が弱引力の時に強く現れることを示した。また、量子系のユニタリー性を壊さずに散乱体の大きさを無限に小さくする極限操作の方法を示した。3.複数の点状散乱体を持つ量子擬可積分系のスペクトルの性質は各散乱体の結合強度で決まり、特に各散乱体は、結合強度で定まる特定のエネルギー領域に限りスペクトルに影響を与えることを示した。
DMRT1突然変異メダカを用いた生殖腺の性的可塑性の解析

Dmrt1は、様々な脊椎動物から見つかっている遺伝子で、そのすべての場合で、精巣分化に連関した発現を示すことから、精巣形成に重要な働きをもつ遺伝子であると推察されている。しかし、マウス以外の脊椎動物種ではその機能は示されていなかった。本研究では、メダカのDmrt1遺伝子突然変異体の遺伝的雄個体は雌へと分化し、正常な卵を産卵することを見いだした。このことから、Dmrt1はメダカの精巣分化に必要な遺伝子であることがわかった。多くの脊椎動物では、授精の瞬間に決定された遺伝的な性に従って、メスでは未分化生殖腺が卵巣に、オスでは精巣に分化することで、個体の性は決定される。しかし、現在までのところ分かっている性決定遺伝子は、哺乳類のSRY/SryとメダカのDMYのみであり、未分化生殖腺から精巣や卵巣が形成される機構を明らかにする目的にメダカは最適な実験動物の一つである。魚類の性決定遺伝子は様々であることがわかってきたが、その一方、他の生命現象と同様に性分化に関わる遺伝子の脊椎動物における共通性が明らかとなってきている。本研究では、精巣特異的な発現パターンから精巣形成に重要な役割を持っていると予測されるDMRT1遺伝子の突然変異体の表現型を解析した。誘発突然変異体ライブラリーより得たDMRT1突然変異体は4種あるが、そのうち表現型の明らかな2種(b対立遺伝子座とc対立遺伝子座)について解析を進めている。c対立遺伝子座に関しては、表現型出現頻度が安定しないため本年度は、近郊系への戻し交配を進めた、b対立遺伝子座に関しては、Y染色体の由来する系統によって、初期発生時の表現型が異なっていたので、さらに個体数を増やして解析したい。突然変異体の表現型を正常なDMRT1ゲノムの導入によってレスキューするために、DMRT1ゲノムを含むBAC(細菌人工染色体)ベクターを単離し、顕微注入法によりDNAを導入した。現在、F0世代を飼育中でF1が得られ始めたので、このF1世代に外来DMRT1遺伝子を遺伝する個体の存在することを期待している。多くの脊椎動物では、授精の瞬間に決定された遺伝的な性に従って、メスでは未分化生殖腺が卵巣に、オスでは精巣に分化することで、個体の性は次定される。しかし、現在までのところ分かっている性決定遺伝子は、哺乳類のSRY/SryとメダカのDmyのみであり、未分化生殖腺から精巣や卵巣が形成される機構を明らかにする目的にメダカは最適な実験動物の一つである。誘発突然変異体ライブラリーより得たDMRT1突然変異体は4種あるが、そのうち表現型の明らかな2つの対立遺伝子(bとc)について解析を進めている。cに関しては、表現型出現頻度が安定しないため、近郊系への戻し交配をさらに進めた。一方、b遺伝子座に関しては、Y染色体め由来する系統によって、初期発生時の表現型が異なっていたので、さらに近交系へ戻し交配して解析した。b対立遺伝子をホモにもつ突然変異体のXY個体は最終的に雌に分化するが孵化後5日までは、雄と同様の生殖腺形態を示すことがわかった。つまり、変異ホモXYの生殖腺は最初精巣方向へ分化しているが途中から卵巣方向へと分化の方向を転換していること解釈できた。メダカは、遺伝学的解析が容易な上に性決定遺伝子が同定されているので、未分化生殖腺から精巣や卵巣が形成される機構を明らかにする目的に最適な実験動物の一つである。近年、魚類の性決定遺伝子は様々であることがわかってきたが、その一方、他の生命現象と同様に性分化に関わる遺伝子の脊椎動物における共通性が明らかとなってきている。本研究では、精巣特異的な発現パターンから精巣形成に重要な役割を持っていると予測されるDMRT1遺伝子の突然変異メダカの表現型を解析した。誘発突然変異体ライブラリー探索から得られたDMRT1突然変異体は4種のうち表現型の明らかな2つの対立遺伝子(bとc)について解析を進めている。一方、性染色体型型がXYで、DMRT1遺伝子座についてb対立遺伝子をホモに持つ個体の生殖腺は、艀化後5日までは野生型のXYと同様であるが、艀化後10日では、減数分裂に入った生殖細胞が見られた。

これらXY個体は最終的に雌に分化することから、変異ホモXYの生殖腺は最初精巣方向へ分化しているが途中から卵巣方向へと分化の方向を転換していることが明らかとなった。つまり、DMRT1の機能不全により、遺伝的雄メダカであっても生殖腺は卵巣へと分化するのである。さらに、DMRT1ゲノムの導入により変異体の表現型を回復できたことと合わせて、本研究の結果は、DMRT1が精巣分化に必要かつ十分な遺伝子であることを示した。また、突然変異ホモのXX個体の生殖腺分化過程は、正常発生と遜色ないことから、DMRT1の変異は、雌の分化には影響しないと考えられた。
短期海外研修と教育の質保証－事前・事後指導の全学モデル構築

教育再生実行会議による日本人留学生倍増の提言を踏まえ、短期海外研修を正課科目として認定する大学が近年増加している。しかしながら量的拡大を急ぐあまり、教育理念に沿った短期海外研修プログラムを派遣先大学と協同で開発する余裕のない大学も少なくない。本研究の目的は、派遣先大学が提供する既製の画一的な短期海外研修プログラムに、派遣元大学での効果的な事前・事後指導を付加することにより、学士課程カリキュラムの正課科目としての教育の質を保証することにある。そのために、参加学生の経年データを量的・質的に分析し、地方国立大学で実行可能な事前・事後指導の全学モデルを構築する。