hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
正・側面頭部X線および顔面写真を用いた立体画像構築システムの開発とその応用

顎顔面頭部の形態異常を取り扱う分野にとって、診断のためには同部位の構造を立体的に把握することが必須である。そのためにComputed Tomography (CT)画像を三次元構築した3D-CTが用いられているが、先天異常や大がかりな手術を行う症例を除いてすべての形態異常の患者にCTを撮影することは被爆線量が大きいため許されることではない。本研究は通常の臨床で撮影されるX線や顔面写真や歯列印象模型から三次元画像を構築し、診断や治療方針の決定などに役立たせることを目的として開始した。本学倫理委員会の許可のもと、本研究について説明を行い承諾が得られた成人男子11名、成人女子10名を対象としてCTと歯列印象模型を採得した。まず構築した3D-CT画像上に硬組織36個、軟組織80個の解剖学的特徴点を設定してその三次元座標値を求め、男女別に平均座標を算出した。そして既成の頭部モデル(Viewpoint社、USA)の該当する特徴点を標準モデルの平均座標に合わせて適合、変形させて日本人成人の男女標準頭部モデルを作成した。ついで個人の頭部モデル作成のため、正・側頭部X線規格写真(セファロ)上に同じ特徴点を設定して拡大率などの補正のあとそれぞれの三次元座標値を算出し、標準モデルを適合・変形させて個人の三次元頭部モデルを作成した。同様に歯列については非接触型三次元形状読み取り装置を用いて被験者の歯列上の特徴点で既成モデルを変形し、頭部モデルに組み込んだ。構築された硬・軟組織・歯列統合頭部個人モデルとその構築システムは、パーソナルコンピュータに回転表示し、あらゆる方向から観察できる特徴を備えさせた。また、頭部を、上顎脳頭蓋、上顎歯列、下顎骨、下顎歯列、および顔軟組織とに分轄表示する機能を持たせ、広範囲な臨床応用ができるようにした。開発した本システムの臨床応用として、下顎前突症患者の下顎枝矢状分割術による手術後シミュレーションを試みた。その結果、手術後の実際の形状を比較的正確かつ三次元的に予測でき、このシステムが患者への説明やインフォームドコンセントを確立するために有用であることが確認された。これら一連の研究から、研究代表者の中島が西日本歯科矯正学会から依頼を受けて特別講演を行った。そのほか、いくつかの雑誌から研究の紹介記事の要請があり、またNHKの特別番組(NHKスペシャル)「日本人のルーツを探る」において、頭部三次元構造の紹介で取材を受け、その一部が放映された。日常臨床で用いられる頭部X線規格写真(セファロ))と顔面規格写真の二次元情報を用いて三次元画像を作り、顎顔面形態の分析や診断に応用することが目的である。本年度は硬組織の部分について研究を実施した。構築された骨構造はリアリティーに富んだものでなくてはならない。そのため患者のセファロ上の特徴点を用いて日本人の三次元標準モデルを変形する方法を採用した。

まず、九州大学歯学研究院の倫理委員会の許可のもと男女それぞれ5名ずつの頭部CTを撮影し立体画像を構築し、医療用画像処理システム(Mimics)を用いてその画像上の特徴点三次元座標を抽出した。そして男女別個に算出した平均座標より日本人成人標準三次元モデルを構築し、歯科矯正学領域で繁用されている標準プロフィログラムおよび標準偏差図表(ポリゴン表)と比較することによって、日本人の標準値にほぼ合致していることを確認した。このモデルはパソコン画面上に回転表示でき、また下顎骨や歯列を切り離して観察できる特長を持っている。ここまでの成果は平成13年2月10-11日沖縄において開催された西日本歯科矯正学会に発表した。さらに個人のセファロからの変形プログラムを作成中であり、軟組織の三次元構築も併せて平成13年度の日本矯正歯科学会に発表予定である。できあがった日本人成人骨格モデルは、本研究目的だけでなく他分野からも興味が持たれており、本年夏にNHKが考古学および人類学的観点から日本人のルーツを探るという科学番組を企画しているが、その一部に登場する予定である。歯科矯正学は形態異常を取り扱う分野であり、頭部の立体的構造を把握することが必要となる。しかし先天異常や顎変形症など大がかりな手術を要する症例を除いて、その治療のためにComputed Tomography(CT)を撮影することは被曝線量の上から許されない。本研究は通常のX線写真や顔面写真から三次元画像を構築して、診断や治療方針の決定に役立たせることを目的として開始した。平成12年度、九州大学歯学研究院の倫理委員会の許可の基にボランティア10名を対象としてCTを撮影し、日本人成人男女の頭部基準(平均)モデルを構築した。平成13年度はその基準モデルを頭部X線規格写真と顔面写真上に設定した特徴点にあわせて変形させる方法を用いて、被験者個人の三次元頭部モデルを構築するシステムを確立した。このシステムは頭部構造を高いリアリティーをもって再現できることに加え、パーソナルコンピュータ上で迅速かつ自由に回転表示でき、また硬組織、軟組織、および頭蓋骨と下顎骨に分けてディスプレーできる。成果は逐次、西日本歯科矯正学会、日本矯正歯科学会、日本顎変形症学会、日本顔学会および電子情報通信およびComputer vision関連の国際学会に発表した。平成14年2月開催の西日本歯科矯正学会では、研究代表者の中島がこのシステムの臨床応用について特別講演をした。論文は別紙の通り欧文、邦文の数編に報告した。最終年度である平成14年度は、さらにコンピュータプログラムを開発し、一般臨床医がより使いやすいシステムに改変する計画である。顎顔面頭部の形態異常を取り扱う分野にとって、診断のためには同部位の構造を立体的に把握することが必須である。そのためにComputed Tcmography(CT)画像を三次元構築した3D-CTが用いられているが、先天異常や大がかりな手術を行う症例を除いてすべての形態異常の患者にCTを撮影することは被爆線量が大きいため許されることではない。本研究は通常の臨床で撮影されるX線や顔面写真や歯列印象模型から三次元画像を構築し、診断や治療方針の決定などに役立たせることを目的として開始した。本学倫理委員会の許可のもと、本研究について説明を行い承諾が得られた成人男子11名、成人女子10名を対象としてCTと歯列印象模型を採得した。
大腸菌転写因子によるRNAポリメラーゼ機能分化機構の解析

ゲノム上で厳密に制御される遺伝子発現の全貌を理解する上で、RNAポリメラーゼの機能分化が重要であると考えられる。大腸菌では、基本転写装置RNAポリメラーゼの分子構造は明らかとされ、DNA結合転写因子によるRNAポリメラーゼの機能分化のモデルが提唱されている。本研究では、単純な特定のアスパラギン酸のリン酸化で活性化するDNA結合性転写因子であるレスポンスレギュレーターについて解析した。昨年度までに、レスポンスレギュレーターは二量体としてDNAに結合し、その活性化がDNAポリメラーゼの機能を変化させ、転写制御する可能性を示唆した。解析したレスポンスレギュレーターのプロモーター結合位置は、RNAポリメラーゼ結合付近であり、その結合アフィニティーが複数遺伝子の発現ヒエラルキーを決定していることが示された。これらの知見に加え、大腸菌ゲノム発現の包括的解析から、レスポンスレギュレーター(PhoP)が他のレスポンスレギュレーター遺伝子(rstA)発現を制御するカスケードに加え、同一プロモーター(spy)上に異なるレスポンスレギュレーターCpxRとBaeRが作用し得る独立したシス因子が存在し転写制御するネットワークを見出した。後者のネットワーク機構では、CpxRのプロモーターへの結合はspyプロモーターのRNAポリメラーゼ結合付近であったのに対して、BaeRは少し上流の2箇所に結合していた。このような結合様式はCitBレスポンスレギュレーターでも観察された。これらの結果は、大腸菌のレスポンスレギュレーターによるRNAポリメラーゼの機能変化はプロモーター付近の相互作用に加え、上流のエンハンサー様の作用によっても機能制御を受けること可能性を示唆した。大腸菌の基本転写装置RNAポリメラーゼの分子構造は明らかである。大腸菌RNAポリメラーゼ機能分化を誘導すると考えられるDNA結合性転写因子の作用機構を調べるため、単純な特定のアスパラギン酸のリン酸化で活性化するレスポンスレギュレーターのDNA結合能および分子内機能制御について解析した。大腸菌レスポンスレギュレーターCpxRは細胞外高濃度銅イオンにより、活性化され、少なくとも15プロモーターを活性化する。そこで、CpxRレギュロンの15プロモーターに対して、CpxRの全ての結合特性を生化学的に測定した。その結果、結合認識シグナルである5塩基リピート配列(CpxR-box)が保存されていることに加え、リピート間のスペーサーの長さに多様性を見出した。さらに、結合強度が、これらの特徴とは無関係な、保存性が低いCpxR-boxの4塩基上流のアデニンが関与していることが示唆された。これらの結果は、CpxRレギュロン間において発現制御のヒエラルキーが存在し、ゲノム上の、転写因子が認識するコア配列以外のシス因子がヒエラルキー決定の重要な要素であると考えられた。さらに、ケミカルクロス法によるレスポンスレギュレーターの二量体形成能が解析された。その結果、YgiXの二量体形成が検出された。そこで、YgiXのリン酸化部位である51番目のアスパラギン酸を様々なアミノ酸に置換した5種類の変異YgiXを精製した。これらの変異YgiXは野生型と同様に二量体を形成することが確認された。これらの結果は、レスポンスレギュレーターの活性化について新しい分子機構モデルを与え、今後に展開されるRNAポリメラーゼ活性における制御機構の解析に大きな示唆をもたらした。
アエロモナスのセリンプロテアーゼの成熟化過程におけるカルボキシ末端領域の役割

病原細菌であるAeromonas sobriaが産生するセリンプロテアーゼ(ASP)の成熟化機構について研究を行った。ASPの成熟化にはシャペロン蛋白質(ORF2)との相互作用が必要である。本研究ではORF2との相互作用に必要なASPの領域を種々の変異遺伝子を作製して解析した。その結果、ASPのカルボキシ末端519591番目の領域がORF2との相互作用に重要である事を明らかにした。下痢症や皮膚炎の原因となるAeromonas sobriaの産生するセリンプロテアーゼ(ASP)は本菌感染症の主要な病原因子である。ASPの成熟化はシャペロン蛋白質であるORF2 proteinの作用を介して行われる。本研究課題はASPのカルボキシ末端領域に注目し,その成熟化機構における役割の解明を目指したものである。本年度はASPのカルボキシ末端領域とORF2 proteinとの相互作用解析を行う目的で,1.Peptide display法によるORF2 protein相互作用ペプチド配列のスクリーニング2.ASPのカルボキシ末端領域の欠損による,ASPの活性に及ぼす影響について検討を行った。その結果,以下の知見を得た。1.Peptide display法によりORF2 proteinと相互作用するペプチド配列を選抜し,ASPのアミノ酸配列と比較した。その結果,選抜された29種類のペプチド配列の内8種類がASPの546624位のアミノ酸配列と類似していた。この事は,ASPの546624位の領域がORF2 proteinとの相互作用部位である事を示唆している。2.ASPの543位以降のアミノ酸を欠損する様な変異ASP遺伝子を作製し,大腸菌に導入し菌の産生するプロテアーゼ活性を測定した。その結果,野生型のASPを産生する菌と異なり,変異ASPを産生する菌ではプロテアーゼ活性が認められなかった。以上の結果から,変異ASPはORF2 proteinとの相互作用ができなくなったために活性化が阻害されたもと考えられ,ASPのカルボキシ末端領域はASPの活性化に重要である事が裏付けられた。本研究成果は細菌の産生する毒素であるASPの成熟化機構の全貌を明らかにする為の足がかりになると考えている。来年度はASPとORF2 proteinとの相互作用について免疫沈降法を用いて検出する事を試みる予定である。Aeromonas sobriaが産生する菌体外セリンプロテアーゼ(ASP)は本菌感染症の主要な病原因子である。ASPはシャペロン蛋白質(ORF2)の作用を受け成熟体になる事がわかっている。本研究課題はASPの成熟化機構の解明を目指したものである。昨年度、ASPのC末端領域がORF2との相互作用部位である事を示唆させる解析結果を得た。そこで、本年度はASPのC末端領域がORF2との相互作用部位である事を証明する目的で、1.C末端領域の欠損したASPとORF2との相互作用をpull-down assayで検出を試みた、2.ORF2との相互作用に重要なASPの595位Hisについて他のアミノ酸残基に置換した変異体を作製して解析した。その結果、以下の知見を得た。1.C末端領域が欠損したASPとORF2にHisタグを付加した蛋白質をin vitro蛋白合成キットで合成し解析に用いた。相互作用はNi-sepharoseを用いたpull-down assayで検出を行った。その結果、ASPのC末端から6個のアミノ酸残基を欠損させた場合、ORF2との相互作用が検出されなかった事から、このアミノ酸残基(His595)はORF2との相互作用に重要である事が明らかになった。2.ORF2との相互作用に重要なHis595を種々のアミノ酸残基に置換したASPを作製しORF2との相互作用に及ぼす影響について解析を行った。その結果、His595をAsp, Cys, Proに置換したASPではORF2との相互作用が検出されず、プロテアーゼ活性も検出されなかった。一方、Ala, Arg, Asn, Phe, Thrに置換したASPではORF2との相互作用が検出されたが、AlaとPheに置換したASPのプロテアーゼ活性は野生型ASPと比較して著しく低い事がわかった。これらの結果より、His595はORF2との相互作用に重要であり、また相互作用後の活性構造構築にも関与している事が示唆された。本研究成果は細菌の産生する毒素であるASPの成熟化機構の全貌解明を目指したものであり、本菌感染症の新たな治療や予防方法を提案するものと考えている。
新しい時代の共通教養と教育課程の構成に関する研究-ドイツの学校改革を事例に

本研究では、ドイツにおける学校改革が、90年代から2000年代に大きく転換し、求められる共通教養の標準化(教育スタンダード)とそれに応じた教育課程編成の変化が見られることを明らかにした。具体的には、現代的課題(クラフキの「鍵的問題」)への対応を主眼に置いた共通教養とそれに基づいた教育課程編成から、共通教養を求められる能力(コンピテンシー)モデルとして提示し、その達成を図る教育課程編成への転換である。本年度は、以下の点に関して検討を行った。(1)Klafkiの「鍵的問題」構想で示された普通教育と共通教養の全体構想とこれに対する議論を国内外の文献により把握した。彼の構想に関しては、これまでの学校教育に見直しを迫るものとして評価される一方で、普通教育論として検討すべき論点が提出されていることが明らかになった。また、PISA学力調査以降の普通教育と共通教養をめぐるドイツの議論の動向の検討として、ドイツにおける学力問題などに関して主に国内の研究論文を中心に情報を収集した。(2)彼の構想に影響を受けたノルトライン-ヴェストファーレン州の新しい学校構想に関する建白書『教育の未来学校の未来』で示された共通教養と教育課程の構成(教育課程全体の編成と各教科内容の編成に関する具体的指針)の全体構想の特徴を検討した。検討の過程で、「学習のパースペクティブ」として示された教育課程編成モデルの中で示された学習の7つの次元が、各教科の教育課程にどのように反映されているのかをさらに検証していくことが課題となった。なお、州の構想の評価などに関しては、現地調査で新たに得た資料やこれまで入手してきたドイツの文献などを通して目下検討中である。(3)ノルトライン-ヴェストファーレン州の文科省において、建白書の公表後の州の改革の状況などに関して担当者にインタビューを行った。また、次年度以降に、州の教育改革のモデル校を紹介していただくなどの研究協力も要請した。本年度は,現地調査を中心に行った。他州の教育改革の状況の調査として,元ハンブルグ大学のグードヨンス博士へのインタビューと総合制学校への訪問,バーテンービュルテンベルク州の学校訪問などを行うと共に,ノルトラインーヴェストファーレン州文科省の協力の下,改革のモデル校4校(Grundschule am Lerchenweg,Peter-Ustinov-Gesamtschule,Gustav Heinemann Schule,Hulda-pahkok-Gesamtschule)を訪問し,関係者へのインタビューおよび授業観察を行った。その結果,95年の『未来の学校』の構想が一部修正されて引き継がれており,「学びの家」(Haus des Lernen)という学校のコンセプトを基に,獲得すべき能力(コンピテンシー)を明示した主要教科のコア・カリキュラム(Kernlehrplan)の作成と,共通教養(スタンダード)を保障するための授業づくりの取り組みが現在主要には進められていることを明らかにした。特に,州が中等段階Iにおいて作成しているコア・カリキュラムは,KMK(常設文部科学大臣会議)が示した教育スタンダードを参考にしながら,各学年終了時までに獲得すべき能力(コンピテンシー)がモデルとして提示されているもので,各学校がそれに基づいて教育活動を行い,学校の独自性を発揮させることをねらうものである。現在は,主要3教科(ドイツ語,英語,数学)が既に作成されており,他教科も順次作成される予定である。このコア・カリキュラムの特徴は,身につけるべき共通教養が,能力モデルとして示されている点にある。また,各学校の授業が,子どもの個性に応じながら,コンピテンシー獲得を志向する授業づくりへと向かっており,共通教養が多様な形で保障されようとしている点も重要である。これらは,先行研究では必ずしも十分な形で明らかにされてきておらず,今後の共通教養のあり方と教育課程の構成を考えていく上では有益な情報であると考える。20年度は以下の3つの研究を行った。1、2000年代以降の教育課程の統一的な国家基準を示した教育スタンダーズの策定が、各州の学習指導要領の改訂に具体的にどのような形で反映されているかを調査し、ドイツにおける共通教養の理念とそれに応じた学校の教育課程の構成を具体的に検討した。ドイツでは、国家的基準として示される教育スタンダーズも、それに基づいて各州が策定する学習指導要領もより大綱的な基準として提示されており、各学校の実践の多様性を引き出すものとして位置づけられていることを明らかにした。しかし、一方で、達成状況を確認するための調査がかえって各学校の多様性を阻害するなどの諸問題もあり、今後の検討課題となっていることを指摘した。2、Weingarten教育大学のシュナイトマン博士の協力の下、Stuttgart市の州立教育研究所を訪問し、他州における教育課程を中心とした学校評価の取り組みに関する情報を収集すると共に、バーテンービュルテンベルク州内の学校を訪問し、授業参観と関係者へのインタビュー調査を行った。これにより、共通教養を多様な形で保障する学校の教育課程が、統一的な達成状況調査の他に、日常的にどのように評価され運営されているかを具体的に明らかにした。

3、90年代の普通教育の議論と学校改革構想の理論的中核となったクラフキの「鍵的問題」構想の2000年代の展開とドイツ教授学研究における評価を検討した。彼の構想は、PISA2000調査以降の学力保障を中心とした教育改革の流れの中で、教育スタンダーズの獲得も位置づけた構想へと発展していることを示し、共通教養のあり方と教育課程の構成を具体的に構想する教授学的枠組みとして今もなお有効な視点があることなどを指摘した。これらの成果は、今後の共通教養の内容と教育課程の構成、共通教養の保障のための教育課程編成と運営を考えていく上で有益な情報である。
マクロライド系抗菌薬の抗炎症作用解明と炎症性肺疾患への臨床応用

マクロライド系抗菌薬は抗菌作用以外に抗炎症作用を有することが知られており、病態が各々異なる炎症性肺疾患に対して幅広く有用性が報告され、新たな治療法として期待されているマクロライド系抗菌薬が抗炎症作用を発揮するメカニズムに関する先行研究としては、肺胞マクロファージからの炎症性サイトカイン産生抑制、気道上皮細胞からのIL-8等の好中球遊走因子抑制やムチン産生抑制など、いずれも液性因子に関する研究が主であり、マクロライド系抗菌薬自身が、宿主側の免疫抑制性の細胞集団を誘導するかということに注目した先行研究はなく、細胞レベルで研究を進めた。クラリスロマイシン(CAM)を3日間腹腔内投与し、肺と脾臓の免疫担当細胞をFACSにて解析を行ったCAM投与により肺・脾臓にそれぞれ、CD11b(+)Gr-1(+)細胞が有意に増加している事を新たに見出した。この細胞集団の増加は経口投与でも同様の傾向が確認された。クラリスロマイシンによって誘導されるCD11b(+)Gr-1(+)細胞をでマイクロアレイ解析を行ったところ、CAMによって誘導されたCD11b(+)Gr-1(+)細胞において、Arginase-1が最も強く発現し、in vitroにおいて、CAMによって誘導されるCD11b(+)Gr-1(+)細胞は免疫抑制性に作用することが示された。さらに、CAMはCD11b(+)Gr-1(+)細胞を介して、LPS腹腔内投与ショックモデル及び肺炎球菌性肺炎モデルの予後を改善させることを明らかにした。26年度が最終年度であるため、記入しない。マクロライド系抗菌薬は抗菌作用以外に抗炎症作用を有することが知られており、病態が各々異なる炎症性肺疾患に対して幅広く有用性が報告され、新たな治療法として期待されている。マクロライド系抗菌薬が抗炎症作用を発揮するメカニズムに関する先行研究としては、肺胞マクロファージからの炎症性サイトカイン産生抑制、気道上皮細胞からのIL-8等の好中球遊走因子抑制やムチン産生抑制など、いずれも液性因子に関する研究が主であり、マクロライド系抗菌薬自身が、宿主側の免疫抑制性の細胞集団を誘導するかということに注目した先行研究はない。マクロライド系抗菌薬が宿主に及ぼす免疫機構を細胞レベルで細密に検討することで、その抗炎症作用の本体に迫り、炎症性肺疾患の新たな治療法の開発につながると考え、研究を進めた。通常マウスに腹腔内投与及び経口投与した所、肺と脾臓にCD11b(+)Gr-1(+)cellsという免疫抑制性の細胞集団を認め、このクラリスロマイシンによって誘導され、抗炎症作用を有するCD11b(+)Gr-1(+)cellsはLPS腹腔内投与ショックモデルの予後を改善させた。計画通りに進んでいる。通常マウスに腹腔内投与及び経口投与した所、肺と脾臓にCD11b(+)Gr-1(+)cellsという免疫抑制性の細胞集団を認めた。現在まで、このような細胞集団の報告はなく、CAMにより誘導されるCD11b(+)Gr-1(+)cellsがマクロライド系抗菌薬の抗炎症作用の本態を担っている可能性があり、さらなる解析を進めると共に、ヒトにおける免疫抑制性細胞集団の誘導に関しても詳細な解析を進めていく予定である。
抗血小板薬シロスタゾールが脳卒中後の遷延性気分障害に及ぼす影響

リハビリの臨床場面では脳梗塞後に抑うつ状態やアパシーなどの遷延性気分障害を呈し,リハビリの阻害要因となることが少なくない。これに対する治療の主なものとして抗うつ薬が挙げられるが,傾眠などの副作用が逆にリハビリの阻害要因になることも少なくない。そこで抗うつ薬以外の薬剤として抗血小板薬のシロスタゾールに着目した。シロスタゾールは脳卒中後には再発予防薬として投与されるが、一方でアパシーに対して効果があったとの報告があり,その作用機序の詳細は明らかでない。そこで培養細胞を使用した基礎研究としてノルエピネフリントランスポーター(NET)およびセロトニントランスポーター(SERT)に対するシロスタゾールの効果を検討した。結果はシロスタゾールがNETおよびSERTをともに濃度依存的に抑制しており,実際の臨床濃度ではコントロールの約7割程度の取り込み抑制効果を認めた。抗うつ薬はほぼ10割を抑制するので,培養細胞レベルでは抗うつ薬の作用を弱めた効果を示すことが明らかとなった。シロスタゾールの作用機序の検討として蛍光タンパク質である緑色蛍光タンパク質(Green Fluorescent Protein:GFP)をSERTに発現させて遺伝子導入した培養細胞にシロスタゾールを反応させ、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。シロスタゾール投与によりSERTが細胞膜表面から細胞内部へ向かって時間経過とともに転移する様子が観察された。すなわちシロスタゾールが細胞膜表面のSERTの量を減らすことにより、セロトニン再取り込みを抑制したと考えられた。以上の結果より、細胞レベルの検討ではニセルゴリンやシロスタゾールがNETやSERTの機能を抑制しており、この効果が脳卒中後の遷延性気分障害の予防や改善に寄与する可能性が考えられた。シロスタゾールがでノルエピネフリントランスポーター(NET)およびセロトニントランスポーター(SERT)機能を抑制することが培養細胞での実験で明らかとなっており,また作用機序の検討では蛍光タンパク質である緑色蛍光タンパク質(Green Fluorescent protein :GFP)をSERTに発現させて遺伝子導入した培養細胞にシロスタゾールを反応させ,共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察したところ,SERTが細胞表面から内部に向かって時間経過とともに転移する様子が観察された。すなわち細胞表面のセロトニントランスポーターの数が細胞表面から減少することにより抑制効果が発揮されていると考えられた.これにより複数の視点から抗血小板薬シロスタゾールがモノアミントランスポーターを抑制することが明らかとなった。動物モデルを用いた研究に関しては実行できておらず,今後検討している。今後はまず培養細胞を用いてノルエピネフリントランスポーター(NET)およびセロトニントランスポーター(SERT)の抑制機序の検討を予定している。シロスタゾールがプロテインカイネースAの活性に関与しているとの報告があり,阻害剤を用いて検討を予定している。またドパミントランスポーター(DAT)に対するシロスタゾールの影響についても検討する。【目的】シロスタゾールは脳梗塞後に投与される抗血小板薬で、3型ホスホジエステラーゼを選択的に阻害することでcAMPの分解を抑制し、増加したcAMPによりプロテインキナーゼA(PKA)の活性型を増加させて血小板の凝集を抑制する。一方で脳梗塞後のうつやアパシーにも効果があると報告されており、マウスを使用した行動実験でも抗うつ効果および抗不安効果について報告されている。その機序としてcAMPおよびCREBの上昇によって引き起こされる脳由来神経栄養因子(BDNF)の発現促進などが考えられている。しかし詳細な機序は明らかでなく、今回シロスタゾールが抗うつ薬の標的蛋白であるノルエピネフリントランスポーター(NET)およびセロトニントランスポーター(SET)へ及ぼす作用およびPKAの関与について、細胞レベルの実験系を用いて検討した。【方法】ヒト神経芽細胞腫由来のSK-N-SH細胞およびSERTを遺伝子導入したアフリカミドリザル腎由来のCOS-7細胞をシロスタゾールで処理した後、[3H]NEと[3H]5-HTそれぞれと反応させ、細胞内への取り込みを測定した。【結果】シロスタゾールは[3H]NE、[3H]5-HT取り込みの両方を抑制した。【考察】シロスタゾールは臨床濃度で抗うつ薬の標的蛋白であるNETおよびSERTに作用している可能性が考えられ,この作用により抗うつ効果が発揮される可能性が考えられた。今後はPKA阻害剤と反応させて、シロスタゾールがPKAあるいはcAMPに与える影響に対して検討することを予定している.シロスタゾールが細胞レベルでノルエピネフリントランスポーター(NET)およびセロトニントランスポーター(SERT)に及ぼす影響について、NETについてはヒト神経芽細胞腫由来のSK-N-SH細胞を使用して、SERTについてはSERTを遺伝子導入したアフリカミドリザル腎由来のCOS-7細胞を使用して検討できている。結果については臨床濃度で抑制するという当初の予想通りの結果がでており、おおむね進行状況は順調と考えている。しかし詳細な機序は明らかでなく、今回シロスタゾールが抗うつ薬の標的蛋白であるノルエピネフリントランスポーター(NET)およびセロトニントランスポーター(SERT)へ及ぼす作用について、細胞レベルの実験系を用いて検討した。

【方法】ヒト神経芽細胞腫由来のSK-N-SH細胞およびSERTを遺伝子導入したアフリカミドリザル腎由来のCOS-7細胞をシロスタゾールで処理した後、[3H]NEと[3H]5-HTそれぞれと反応させ、細胞内への取り込みを測定した。また作用機序の検討として蛍光タンパク質である緑色蛍光タンパク質(Green Fliorescent Protein: GFP)をSERTに発現させて遺伝子導入した培養細胞にシロスタゾールを反応させ、共焦点レーザー顕微鏡を用いて検察した。【結果】シロスタゾールは[3H]NE、[3H]5-HT取り込みの両方を抑制した。SERTが細胞表面から細胞内部へ向かって時間経過とともに転移する様子が観察された。【考察】シロスタゾールは臨床濃度で抗うつ薬の標的蛋白であるNETおよびSERTに作用している可能性が考えられ,この作用により抗うつ効果が発揮される可能性が考えられた。シロスタゾールが細胞レベルでノルエピネフリントランスポーター(NET)およびセロトニントランスポーター(SERT)機能を抑制することが結果として出ており、また作用機序の検討としても蛍光タンパク質である緑色蛍光タンパク質(Green Fliorescent Protein: GFP)をSERTに発現させて遺伝子導入した培養細胞にシロスタゾールを反応させ、共焦点レーザー顕微鏡を用いて検察したところ、SERTが細胞表面から細胞内部へ向かって時間経過とともに転移する様子が観察された。このように細胞表面のモノアミントランスポーターの数が減少することにより抑制作用が発揮されていると考えられ、また複数の視点から抗血小板薬シロスタゾールがモノアミントランスポーターを抑制することが検討できており、進行状況はおおむね順調と考えている。リハビリの臨床場面では脳梗塞後に抑うつ状態やアパシーなどの遷延性気分障害を呈し,リハビリの阻害要因となることが少なくない。これに対する治療の主なものとして抗うつ薬が挙げられるが,傾眠などの副作用が逆にリハビリの阻害要因になることも少なくない。そこで抗うつ薬以外の薬剤として抗血小板薬のシロスタゾールに着目した。シロスタゾールは脳卒中後には再発予防薬として投与されるが、一方でアパシーに対して効果があったとの報告があり,その作用機序の詳細は明らかでない。そこで培養細胞を使用した基礎研究としてノルエピネフリントランスポーター(NET)およびセロトニントランスポーター(SERT)に対するシロスタゾールの効果を検討した。結果はシロスタゾールがNETおよびSERTをともに濃度依存的に抑制しており,実際の臨床濃度ではコントロールの約7割程度の取り込み抑制効果を認めた。
計算困難な組合せ最適化問題への多方面からのアプローチ

同じ葉集合を持つ一組の生物系統樹が入力されたとき,入力生物系統樹から一部の葉を除去して,除去後の生物系統樹をすべて含むような生物系統樹(中心生物系統樹という)を1本構築する問題について研究を行った.入力生物系統樹から削除される葉の総数を最小化する場合の問題をAST-LRで表し,各入力生物系統樹から削除される葉の最大個数を最小化する場合の問題をAST-LR-dで表す.ChauveらがAST-LRもAST-LR-dもNP困難であることを証明して,固定パラメータアルゴリズムを設計した.本研究では,ChauveらのAST-LRを解くためのアルゴリズムに不備があることを指摘した後,新しい固定パラメータアルゴリズムを設計して解析した.また,ChauveらのAST-LR-dを解くためのアルゴリズムを指数倍高速化した.残念ながら,Chauveらのアルゴリズムと同様に,本研究で提案した固定パラメータアルゴリズムは両方とも時間計算量が大きく,実用的ではない.そこで,AST-LRとAST-LR-dの整数線形計画モデルを設計して,その性能を実験で検証した.その結果,2つのモデルとも小規模の入力データに対してよい性能を示すことを確認した.より大きい規模の入力データのために,AST-LRとAST-LR-dの近似整数線形計画モデルをそれぞれ設計した.近似モデルの解は必ずしも厳密モデルの解にならないが,近似モデルの解の目的関数値は厳密モデルの解の目的関数値の下界になるだけでなく,近似モデルを解いてからその結果(近似解)を厳密モデルの「MIP Start」として使える.このアイディアに基づいて,近似モデルを厳密モデルの解決の手法として使ったときの性能を実験で検証した.検証の結果,近似モデルの有用性を確認できた.AST-LRとAST-LR-dについての研究が予定通り順調に進んだ.その一部の結果をまとめた論文は国際会議BIBM-2018に受理されて,昨年の12月に発表された.残りの結果をまとめた論文は国際会議ISBRA-2019に受理されて,今年の6月に発表されることになっている.今後はAST-LRとAST-LR-dの固定パラメータアルゴリズムの高速化を図りたい.また,両方の問題の近似アルゴリズムについても研究を行う予定である.AST-LRとAST-LR-d以外の計算困難な問題についても研究していく.現時点で,「グラフの均等分割問題」や「三角不等式を満たすグラフ上の三角形パッキング問題」などの研究を計画している.同じ葉集合を持つ一組の生物系統樹が入力されたとき,入力生物系統樹から一部の葉を除去して,除去後の生物系統樹をすべて含むような生物系統樹(中心生物系統樹という)を1本構築する問題について研究を行った.入力生物系統樹から削除される葉の総数を最小化する場合の問題をAST-LRで表し,各入力生物系統樹から削除される葉の最大個数を最小化する場合の問題をAST-LR-dで表す.ChauveらがAST-LRもAST-LR-dもNP困難であることを証明して,固定パラメータアルゴリズムを設計した.本研究では,ChauveらのAST-LRを解くためのアルゴリズムに不備があることを指摘した後,新しい固定パラメータアルゴリズムを設計して解析した.また,ChauveらのAST-LR-dを解くためのアルゴリズムを指数倍高速化した.残念ながら,Chauveらのアルゴリズムと同様に,本研究で提案した固定パラメータアルゴリズムは両方とも時間計算量が大きく,実用的ではない.そこで,AST-LRとAST-LR-dの整数線形計画モデルを設計して,その性能を実験で検証した.その結果,2つのモデルとも小規模の入力データに対してよい性能を示すことを確認した.より大きい規模の入力データのために,AST-LRとAST-LR-dの近似整数線形計画モデルをそれぞれ設計した.近似モデルの解は必ずしも厳密モデルの解にならないが,近似モデルの解の目的関数値は厳密モデルの解の目的関数値の下界になるだけでなく,近似モデルを解いてからその結果(近似解)を厳密モデルの「MIP Start」として使える.このアイディアに基づいて,近似モデルを厳密モデルの解決の手法として使ったときの性能を実験で検証した.検証の結果,近似モデルの有用性を確認できた.AST-LRとAST-LR-dについての研究が予定通り順調に進んだ.その一部の結果をまとめた論文は国際会議BIBM-2018に受理されて,昨年の12月に発表された.残りの結果をまとめた論文は国際会議ISBRA-2019に受理されて,今年の6月に発表されることになっている.今後はAST-LRとAST-LR-dの固定パラメータアルゴリズムの高速化を図りたい.また,両方の問題の近似アルゴリズムについても研究を行う予定である.AST-LRとAST-LR-d以外の計算困難な問題についても研究していく.現時点で,「グラフの均等分割問題」や「三角不等式を満たすグラフ上の三角形パッキング問題」などの研究を計画している.研究成果を2つの国際会議にて発表する予定であったが,研究対象が計算困難な問題であるため実験等で時間が取られてしまい,1つの国際会議にてだけ研究成果を発表した.今年の6月に開催される国際会議ISBRA-2019にて研究成果を発表するので,次年度使用額をその旅費として使う予定である.
側鎖にイミダゾリウム塩を有するポリマーブラシの界面ダイナミクスの精密解析

本研究では、高分子電解質ブラシが示す極低摩擦特性に及ぼす分子鎖形態および分子鎖運動特性の影響を明らかにすることを目的とし、カチオン性高分子電解質ブラシをモデルとして研究を行った。高分子電解質ブラシは溶液中のイオン強度により、その膨潤形態や分子鎖形態が変化することが知られており、このような分子鎖形態の変化は低摩擦特性を含む高分子電解質ブラシの表面物性にも大きく影響すると考えられる。本年度は、カチオン性のpoly [2-(methacryloyloxy) ethyltrimethylammonium chloride](PMTAC)ブラシをシリカ粒子上に調製し、塩化ナトリウム水溶液中における分子鎖形態に与えるイオン強度の影響を、超小角X線散乱測定(USAXS)および小角X線散乱測定(SAXS)に基づき評価を行った。さらに、表面間力測定装置を用いて、塩化ナトリウム水溶液中において対向させた2つのPMTACブラシ間に働く摩擦力の塩濃度依存性について調べ、PMTACブラシ鎖の分子鎖形態と摩擦力の相関について検討を行った。小角X線散乱によりPMTACブラシ鎖の膨潤膜厚は、孤立鎖として存在した場合よりも2倍程度大きく、また伸び切り鎖長のおよそ50%程度に達しており、塩化ナトリウム水溶液中においてPMTACブラシ鎖は高度に伸長した形態を取っていることがわかった。シリカ粒子のコア半径が96nmのPMTACブラシの膨潤挙動は全て濃厚ポリマーブラシ領域のスケーリング則で記述できるのに対し、コア半径が53nmのものは、0.1Mおよび0.5Mの塩化ナトリウム水溶液中において、濃厚ポリマーブラシ領域から準希薄ポリマーブラシ領域への転移が起こっていることが示唆された。一方で、PMTACブラシは0.1、1、10mMの塩化ナトリウム水溶液中においては10^<-4>オーダーの非常に低い摩擦係数を示すものの、塩濃度が100mM以上になると摩擦係数は10^<-2>オーダーに転移した。この急激な摩擦係数の変化は、グラフト鎖の、延伸された形態から収縮した形態への分子鎖形態の変化、およびブラシ鎖間に働く静電反発力が溶液の塩濃度の増大により遮蔽されたことなど、多くの要因が重なって起こったものであると推測される。(抄録なし)本研究は,電解質ポリマーブラシが示す極低摩擦特性に及ぼす分子鎖形態および分子鎖運動特性の影響を明らかにすることを目的としている.ポリマーブラシの分子鎖形態や分子鎖運動特性を正確に評価するためには,末端が固定されていない孤立鎖(フリーポリマー)の諸物性を把握する必要がある.本年度は,精密評価を行う上で必要な分子量分布が狭く設計通りの分子量を有するカチオン性ポリマーブラシならびにフリーポリマーを調製出来る重合条件の探索,さらに両者の溶液中における膨潤挙動の評価を行った.電解質モノマーは一般的に極性の高い溶媒にしか溶解しないため重合中に成長末端や触媒の失活が併発し重合の制御が困難であった.原子移動ラジカル重合の重合溶媒として高分子電解質に対し良好な溶解性を示す2,2,2-トリフルオロエタノールを用い塩化物イオンを有する塩を添加することで,対アニオンが塩化物イオンであるカチオン性電解質モノマーの重合が制御出来ることを見出した.この要因として添加塩の塩化物イオンが重合触媒に影響し,重合速度を低下させていることがあげられる.その結果,設計通りの分子量かつ分子量分布が狭い(Mw/Mn<1.2)の第4級アンモニウム塩またはイミダゾリウム塩を有するポリメタクリレートを得ることが可能となった.次に,イミダゾリウム塩を側鎖に有するフリーポリマーと,これを直径100nmのシリカ粒子にグラフトしたポリマーブラシの塩化ナトリウム溶液中での膨潤挙動を放射光小角X線散乱および動的光散乱により評価した.ポリマーブラシおよびフリーポリマーの回転半径および流体力学的半径は塩濃度の増加とともに減少した.これは高分子鎖間に働く静電反発が塩化ナトリウムにより遮蔽されたためであると考えられる.ブラシ層の拡がりはフリーポリマーのおよそ5倍程度大きく,高度に延伸された構造を取っていることがわかった.本研究では,高分子電解質ブラシが示す極低摩擦特性に及ぼす分子鎖形態および分子鎖運動特性の影響を明らかにすることを目的として、原子移動ラジカル重合により精密に合成したカチオン性高分子電解質ブラシをモデルとして研究を行っている.高分子電解質および高分子電解質ブラシは溶液中のイオン強度により膨潤形態が変化することが知られており,またこの膨潤形態の変化は高分子電解質ブラシの摩擦特性にも大きな影響を及ぼす.そこで本年度は,側鎖に第四級アンモニウム塩を有するpoly[2-(methacryloyloxy)ethyltrimethylammoniumchloride](PMTAC)カチオン性の高分子電解質およびカチオン性高分子電解質ブラシの分子鎖形態に与える溶液のイオン強度の影響を,小角X線散乱測定(SAXS)および動的光散乱測定(DLS)に基づき評価を行った.PMTAC孤立鎖の根平均二乗回転半径(<S^2>_z^<1/2>)は重量平均分子量M_wが2.0×10^4以上の時,溶液のイオン強度の増大に従って小さくなったが,M_wが2.0×10^4以下の時にはこの傾向は全く逆となることがわかった.これは分子鎖内の排除体積の変化や,分子鎖の堅さの変化のみからでは記述することが不可能であった.そこで分子鎖の局所形態の変化を記述可能ならせんみみず鎖モデルを用いて解析を行ったところ,溶液のイオン強度の低下につれて分子鎖の局所形態が棒状に近づくように変化していることが分かった.

また,直径200nmのシリカ粒子にグラフトしたPMTACブラシについても同様な分子鎖の局所形態変化を確認した.PMTACブラシ鎖のくS^2>_z^<1/2>は孤立鎖に比ベイオン強度に関わらず2倍以上大きな値となっており,伸びきり鎖と比較した時の約70%まで高度に伸長していることが明らかとなった.本研究では、高分子電解質ブラシが示す極低摩擦特性に及ぼす分子鎖形態および分子鎖運動特性の影響を明らかにすることを目的とし、カチオン性高分子電解質ブラシをモデルとして研究を行った。高分子電解質ブラシは溶液中のイオン強度により、その膨潤形態や分子鎖形態が変化することが知られており、このような分子鎖形態の変化は低摩擦特性を含む高分子電解質ブラシの表面物性にも大きく影響すると考えられる。本年度は、カチオン性のpoly [2-(methacryloyloxy) ethyltrimethylammonium chloride](PMTAC)ブラシをシリカ粒子上に調製し、塩化ナトリウム水溶液中における分子鎖形態に与えるイオン強度の影響を、超小角X線散乱測定(USAXS)および小角X線散乱測定(SAXS)に基づき評価を行った。さらに、表面間力測定装置を用いて、塩化ナトリウム水溶液中において対向させた2つのPMTACブラシ間に働く摩擦力の塩濃度依存性について調べ、PMTACブラシ鎖の分子鎖形態と摩擦力の相関について検討を行った。小角X線散乱によりPMTACブラシ鎖の膨潤膜厚は、孤立鎖として存在した場合よりも2倍程度大きく、また伸び切り鎖長のおよそ50%程度に達しており、塩化ナトリウム水溶液中においてPMTACブラシ鎖は高度に伸長した形態を取っていることがわかった。シリカ粒子のコア半径が96nmのPMTACブラシの膨潤挙動は全て濃厚ポリマーブラシ領域のスケーリング則で記述できるのに対し、コア半径が53nmのものは、0.1Mおよび0.5Mの塩化ナトリウム水溶液中において、濃厚ポリマーブラシ領域から準希薄ポリマーブラシ領域への転移が起こっていることが示唆された。一方で、PMTACブラシは0.1、1、10mMの塩化ナトリウム水溶液中においては10^<-4>オーダーの非常に低い摩擦係数を示すものの、塩濃度が100mM以上になると摩擦係数は10^<-2>オーダーに転移した。この急激な摩擦係数の変化は、グラフト鎖の、延伸された形態から収縮した形態への分子鎖形態の変化、およびブラシ鎖間に働く静電反発力が溶液の塩濃度の増大により遮蔽されたことなど、多くの要因が重なって起こったものであると推測される。本年度は今後研究を行っていくうえで必要となる分子量分布の狭いポリマーブラシおよびフリーポリマーの調製およびその基礎物性評価を目的とした.原子移動ラジカル重合の条件を適切に設定することで,分子量分布の狭いポリマーおよびポリマーブラシの調製が可能であることを見出し,今年度の内にその溶液物性評価に取り組めたため,研究はおおむね順調に進展していると言える.本年度はカチオン性高分子電解質およびカチオン性高分子電解質ブラシの塩水溶液中での分子鎖形態を散乱手法により明らかにすることを目的とした.本研究において、特にカチオン性高分子電解質の孤立鎖においてはらせんみみず鎖モデルを適用することで、溶液のイオン強度の変化に伴う分子鎖の局所形態の変化を確認できた.
繊維質有機廃棄物を資化する水素生成ミクロフローラの菌叢制御

本研究では、微生物による安定した水素製造の技術を進展させるため、水素生成能の高い複合微生物群(ミクロフローラ)を人為的に形成して、繊維質有機性廃棄物を原料にした水素生産に利用することを目的とした。熱ストレス処理によりClostridium属とBacillus属の菌群を優占化し、さらにHRT、窒素濃度、温度条件を変えて水素発酵に資する菌叢を制御する手法について検討した。その結果、熱ストレス処理による優占化と発酵温度の調節は繊維質有機廃棄物を資する水素生成ミクロフローラの菌叢制御に有効であるとの見通しが得られた。本研究では、微生物による安定した水素製造の技術を進展させるため、高度に水素生成能の高い水素生成菌を優占化した複合微生物群(ミクロフローラ)を人為的に形成して、リグノセルロース系のバイオマスを原料にした水素生産に利用することを目的とした。今年度は、100°C程度の熱ストレス処理により、供試した微生物群の中から水素生産能力の高いClostridium属の水素生成菌を優占化し、水素生成能、代謝物および水素生成菌の菌叢変化を検討した。牛糞原料メタン発酵消化液を供試微生物源にして、熱ストレス処理ミクロフローラを作出し、連続発酵過程の初動時の水素生産性について検討した。発酵基質として、グルコースの他に稲わらを原料としたエタノール発酵の発酵残渣を供試して、発酵原料の水理学的滞留時間(HRT)、酸化還元電位(ORP)および発酵原料中の窒素濃度の条件を変えて発酵開始から72時間程度の水素生成性を調べた。その結果、原料培地中の窒素の初期濃度およびその後追加投入する培地の窒素濃度がミクロフローラの菌叢と水素生産性に大きな影響を及ぼしていることが分かった。発酵過程で乳酸の蓄積およびその原因と考えられるBacillus属が検出されたことから、芽胞形成能を有するBacillus属は今後の繊維質バイオマス分解に重要な役割を果たしている菌叢であることが示唆された。本研究では、微生物による水素製造技術を進展させるため、高度に水素生成能の高い水素生成菌を優占化した複合微生物群(ミクロフローラ)を人為的に形成して、水素生産に利用することを目的とした。今年度は、各種の嫌気生態系から採取した微生物群の中から水素生産能力の高い水素生成菌を優占化し、水素生成能を検討した。(1)各種ミクロフローラ源と優占化手法の検討(a)メタン発酵消化液、(b)下水汚泥(活性汚泥、余剰汚泥)を供試材料にして、(1)熱ストレス処理(Clostridium属の耐熱性芽胞形成を利用)および(2)紫外線ストレス処理によって水素生成細菌と共生細菌群を優占化させたミクロフローラを用いて嫌気条件下で水素発酵実験を行い、優先化されたミクロフローラ毎の発酵特性を調べた。発酵特性は基質としてグルコースを使用し、発生する水素、二酸化炭素、生成されるVFAs(揮発性脂肪酸)濃度により、評価した。発酵過程で発生する微少なバイオガス量(水素,二酸化炭素)、pH等をリアルタイムで精密にモニタリングする手法について検討した。その結果、紫外線ストレス処理は微生物濃度の低い汚泥に対しては有効に作用することが分かった。(2)分子生物学的手法を用いたミクロフローラの菌叢解析PCR-SSCP法により、連続発酵過程で採取した水素生成微生物群を分離、特定した。その結果、当初優占化された水素生成細菌が、連続発酵の過程で変遷することが示された。今年度検討したミクロフローラ源は2点であり、ストレス処理も2方法だけであった。また、基質材料として、実際のバイオマスではなく、グルコースだけにとどまった。しかし、連続発酵過程の中で、優占化したミクロフローラが変化することが確認できたことは成果であった。このことから、研究は概ね順調に進展していると評価した。今年度取り扱えなかったミクロフローラ源および新たな微生物ストレスを組み入れた優占化手法に取り組む。今年度の残予算は、ミクロフローラの採取と優占化に使用する予定である。(1)各種ミクロフローラ源と優占化手法の検討:平成23年度に検討しなかったミクロフローラ源について、平成23年度と同様な優先化手法に加えて、pHストレス処理を検討する。(2)分子生物学的手法を用いたミクロフローラ微生物叢と酵素発現特性の解明:上記(1)によって優先化されたミクロフローラについて、平成23年度と同様に菌叢解析を進める。また、分解酵素の発現特性についても同様に実験を行って解析する。(3)目的に応じたミクロフローラの菌叢制御手法の検討(a)難分解有機性廃棄物(繊維質バイオマス、廃グリセリンなど)を原料とし、高基質濃度条件での発酵不安定化、競合細菌群である乳酸菌群の活性増大による水素生成減など、実際に発生が予測される発酵不調現象を実験系内で再現できる不安定発酵モデルを作成する。

(b)水素生成速度をモニタリングしながら、複数のミクロフローラの追加投入制御、pH制御やHRT(水理学的滞留時間)制御を組み合わせて、安定的な水素生産を可能とする菌叢制御手法を検証する。
地衣類の二次代謝に関する基礎研究

地衣類の採集・培養これまで得ていなかったLetharia columbiana、Letharia vulpinaの2種のサンプルはカナダの研究者より、Pseudocyphellaria crocata(ニセキンブチゴケ)は調査により入手した。Pseudocyphellaria aurata(キンブチゴケ)は調査でも見つからず入手できなかった。これらは培養条件等の検討を行っている段階である。地衣成分生産株の培養すでに培養株のあったVulpicida juniperinus(ハイマツゴケ)、Vulpicida pinastri(コナハイマツゴケ)、のうち、前者の中からは、1年ほどの長期培養によってプルビン酸類様の黄色の代謝産物を培地中に蓄積する株が得られた。その蓄積は、結晶となるほど大量であった。しかし、培養による増殖が非常に遅く、短期培養での生産株の作出が困難である可能性が示された。また、その代謝成分が目的とするプルビン酸類かどうか、まだ結論を得ていない地衣成分の代謝に関わる遺伝子の単離後者からは二次代謝産物の合成に関わるポリケチド合成酵素遺伝子のケトシンターゼ(KS)ドメインの増幅を試みた。その結果、830bpの断片が得られ、塩基配列を決定した。240アミノ酸(2つのイントロンを除く)をコードすると推定された。このアミノ酸配列のホモロジーを検索した結果、他の糸状菌の相同遺伝子と高い相同性がみられ、目的とする遺伝子であると考えられた。また、KSドメインとしては、WAタイプと呼ばれるサブグループに属することが分かった。現在、この遺伝子の全長cDNAおよびゲノム領域を解析中である。本研究は、大きく以下の3つの実験からなる。1.地衣類の採集、共生菌・藻の分離、共生菌の培養本研究で材料として使用する予定の6種類の地衣類のうち、Pseudocyphellaria crocata(ニセキンブチゴケ)を剣山周辺(徳島県)での調査で採集した。採集した地衣類から共生菌・藻の分離を試みたが、分離培養を確立できていない。今後も、調査・採集・分離培養を継続する。2.地衣成分生産株の培養、地衣成分非生産突然変異体の作出現時点では、まだ培養の初期段階であり、新たな知見は得られていない。3.地衣成分の代謝に関わる遺伝子群の検索・同定・単離予備実験として、Cladonia cristatellaを含む3種類の地衣類由来の培養地衣菌からゲノムDNAを抽出し、地衣類の二次代謝に関わっているとされるポリケチド合成酵素(PKS)遺伝子からケトシンターゼ(KS)ドメインを増幅・クローニングし、1種類について塩基配列を決定した。その結果、目的とするKSドメインと高い相同性を示す240アミノ酸をコードしていることが分かった。今後、材料の菌類からPCRによるPKS遺伝子のクローニングを試みる。また、蛍光ディファレンシャルディスプレイ(FDD)用の電気泳動槽および備品として購入した二次元電気泳動装置を用いて、各電気泳動法の条件検討を行った。今後は、二次代謝産物の生産・非生産を指標にして、転写・発現レベルで制御される遺伝子群の検索・同定・単離を試みる。