hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
相対差集合及び関係する　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｍａｔｒｉｘ　の研究

このような行列の各行はUのn個の直積群Un=U×...×Uの元と見ることができる.H24年度にはこのようなdifference matrixの中で行全体の集合がUnの部分群Wのcoset達の和集合となるものについて考察した.このようなdifference matrixは部分群Wに関するcoset型であるという.特にWがAのある行wで生成されるとき行wに関するcoset型difference matrixであるという.coset型のdifference matrixに関してde Launeyは行全体が群をなすときでk=uλ場合についてgroup Hadamard matrixと呼んだ.McDonough等はこのときU基本可換p-群となることを示したこのcoset型に関してH24年度には次の結果を得た.定理1.AがU上の(u,uλ,λ)-difference matrixで,Aがある行に関してcoset型ならばλ=1かまたはexp(U)はλの約数である.26年度は(u,k,λ)difference matrixのパラメータkの限界に関する研究をさらに進めた.なかでもdifference matrixを定めている位数uの群Uが基本可換p-群のときを中心に研究を行った.与えられたu, λに対してk≦uλであることが知られているが,現状ではk=uλが可能かどうかが未決定のλが大部分である.このようなλについて,kの限界及びより大きなkの構成について研究を行った.方法の一つとして,群Uは基本可換p-群であるからu=q (pの累乗)とおいて加法群(GF(q),+)とみなすことができる.従ってGF(q)の乗法群(GF(q)-{0},x)の利用が重要となると考える.これよりλがq-1の約数の場合に注目して,GF(q)からGF(q)への関数を考えてそれが構成につながるものを考察した.知られている実例をもとにそれを一般化して無限系列を構成することが目標の一つであった.素数pがソフィージェルマン素数であるとは2p+1も同時に素数となることをいうが,この研究ではそれを一般化して2p + 1が素数べきになるとき,pを擬似ソフィージェルマン素数と呼んで利用した。pを擬似ソフィージェルマン素数としてq=2p+1とおく。この条件のもとで有限体の加法群Fqから乗法群Fq - {0}への関数fを利用してZp上の(p, (p-1)q/2, q)-difference matrixの存在を示すことができた。その方法は上記の関数を用いて点上正則に作用する位数p2qの群でブロック集合上は正則でないTDq((p-1)q/2, p)を構成することである。このようにして構成されたdifference matrixは従来知られていたものより可能な行数を大幅に改善したという点において価値ある結果であると考える。(理由)26年度の目標であった(u,k,λ)difference matrixのパラメータkの限界に関する研究が擬似ソフィージェルマン素数の場合に大幅に改善できた.具体的にはこの分野の研究をまとめたHandbook of Combinatorial Designs (Colbourn-Diniz), 2007にある表では得られていなかった部分を追加することができた.擬似
顕熱輸送に対する草地面粗度長の評価とそのパラメタリゼーション

本研究では、顕熱輸送に対する粗度長を草地面を対象にして詳細な微気象観測によって決定し、同時にもとめる草丈、葉面積指数などの植生情報と合わせることで、そのパラメタリゼーションを行なった。必要なデータは、筑波大水理実験センター熱収支観測圃場において、牧草の成長に合わせた観測を春から秋にかけて行内、観測項目として熱収支項(正味放射、地中熱流量、顕熱、潜熱)、地表面温度、温度および風速の鉛直プロファイル、葉面積指数を求めた。得られたデータより、各季節毎に顕熱に対する粗度長を決定し、それが何により決められているかを探るために、日射量、太陽高度、草丈、葉面積指数、日射量に対する直達日射量の比、風速などを対象に重回帰分析を行なった。その結果、日射量、葉面積指数、晴れ指数、日射量に対する直達日射量の比を加えた重回帰式で相関係数0.75で粗度長の推定が行なわれることが分かった。さらに、この様にして得た粗度長と、地表面温度、気温、風速のデータから顕熱フラックスの値を求め、実測値と比較すると相関係数0.90以上で一致することが分かった。さらに、熱収支式を利用して求めた蒸発量は実測値と比較して0.97という高い相関係数で一致することが確かめられた。したがって、ある地表面を対象にして顕熱に対する粗度長がパラメタライズできれば、衛星から得られる地表面温度と衛星または地上からの観測によって得られる大気中の温度、風速から高い精度で地表面熱収支項の推定が行ない得ることが分かった。
新しい口腔粘膜脈管系炎症評価法と粘膜マッピング法による口腔粘膜炎発症予防法の開発

口腔乾燥症で悩む高齢者や周術期口腔機能管理の必要な医科治療の患者の口腔粘膜の傷害を予防して口腔QOLの向上を目指すために、口腔粘膜傷害の予防法を構築した。新技術である狭帯域光観察法を用いて粘膜病変を明示化し、口腔内を詳細に位置決めする粘膜マッピング法を用いて、新しい口腔粘膜評価法を提案する。口腔粘膜炎回避のための予防策を考えて、最終的には総合的な口腔粘膜傷害の診療指針の策定を考えた。周術期口腔機能管理の必要な患者や口腔乾燥症で悩む高齢者の口腔粘膜の傷害を予防するために、効果的な口腔粘膜傷害の予防法を構築する。そのために、口腔粘膜病変の治癒過程を詳細に検討し、口腔粘膜の血管を基準として粘膜病変部位を明示化する粘膜マッピング法を確立し、口腔粘膜潰瘍化の発症メカニズムの解明とその修飾因子の検索、及び、口腔粘膜炎の潰瘍化回避のための予防策と治療技術の開発の研究を実施する。本年度は、狭帯域光観察の技術を用いた口腔粘膜脈管系炎症評価法の確立を目指した。口腔粘膜全域の狭帯域光観察による評価可能閾を確認し、狭帯域光観察の技術を用いて様々な口腔粘膜の状態の血管観察状態を評価し、口腔粘膜の可視部部位に関して脈管系の評価観察が可能であることを確認すると同時に、各部位の撮影位置を決定した。さらに、粘膜病変部位の正確な位置を確認するための粘膜マッピング法の確立のための実験を実施した。狭帯域光観察像では細血管が緑の像で薄く背景に観察されるが、その細血管の位置を元に、粘膜上で再現性ある位置決めができるかを検証した。写真撮影時には明白に観察される細血管は、実際の目視では細部を確認することが難しく、写真撮影による評価が前提になることが考えられた。写真上での作業は、臨床でその場での診断に結びつけるのは困難であるために、光学フィルターや強調画像等の画像加工が必要であるので、只今調整中である。同時に、軟組織の形態・機能・組織の評価を行うための新しい口腔粘膜チャートを制作した。これまでは口腔粘膜表層の全域をカバーする口腔粘膜記録用のチャートは存在しなかった。本研究で制作した口腔粘膜チャートは、口腔前提の粘膜面や口底、口蓋の粘膜の各構造の全ての口腔軟膜の部位を直感的に指し示すことができ、一般臨床でも臨床研究児にも応用して、本口腔粘膜チャートを多用している。本研究では、口腔乾燥症で悩む高齢者や周術期口腔機能管理の必要な患者の口腔粘膜の傷害を予防して、本来の治療の達成と日々のQOLの向上を目指すために、口腔粘膜傷害の予防法を、粘膜マッピング法と共に全く新しい口腔粘膜評価法にて構築する事にある。則ち、狭帯域光観察の技術を用いた口腔粘膜脈管系炎症評価法による局所炎症評価法と、狭帯域光観察像からの粘膜マッピング法を考案して再現性のある口腔粘膜の位置座標を決定する。狭帯域光観察は、血液中のヘモグロビンに吸収されやすい狭帯域化された2つの波長の光を照射することにより、粘膜表層の毛細血管、粘膜微細模様の強調表示を実現する粘膜観察システムで、毛細血管の状態と細血管の位置情報を同時に得ることができ、それぞれ色分けされて明示される。本システムは、下咽頭、食道、大腸、胃などの粘膜の構造異常や早期がんの検出が可能として、臨床で大きな注目を浴び消化器の医療に大きく活用されている。この技術を活用することにより、口腔粘膜の炎症状態と位置を適確に把握する手法の開発が可能となる。この技術を活用することにより、口腔粘膜炎の潰瘍化のメカニズムが解明されるならば、抗がん剤や放射線治療の副作用である口腔粘膜炎を制御する手法の開発や口腔乾燥症によって悪化する口腔内の問題を解決する糸口となる。この開発によって、総合口腔粘膜炎症評価法を創設し、口腔粘膜脈管系炎症評価法による口腔粘膜潰瘍化発症のメカニズムの解明とそれの修飾因子の影響の検索していくのが本研究である。平成27年度は2年目の研究年度であり、臨床的な多くの技術的課題を抱えながらも、本研究で制作した口腔粘膜全域をカバーする口腔粘膜チャートを活用しながら、粘膜病変部位の正確な位置を確認するための粘膜マッピング法の構築と歯肉の炎症の特徴の抽出の実験を行った。平成27年度には、粘膜病変部位の正確な位置を確認するための粘膜マッピング法の構築を行った。粘膜下の脈管系の走行が多種多様で、位置決めには精密な脈管系の走行の観察が必要である事から、一見同様な構造であるが幾何学的な特徴を検出する方法を検索したが、コンピュータプログラムのアルゴリズムを構築する手法は困難で有り、ある程度の目視による確認が必須であると判断した。さらに、微細な特徴を追っていくと口腔粘膜全体の中での位置が把握しにくくなり、近赤外線カメラを用いたマッピングを目的とした観察等も実施するも十分な観察を行うに至らなかったことから、粘膜面全域を把握する鳥瞰図的な観察を含んだ口腔粘膜チャート上でのマッピング法を考案した。さらに歯肉炎炎症局所の狭帯域光観察を実施し、得られた画像から特徴を抽出した。皮膚と違って錯角化の状態にある歯肉上皮は、炎症部位では毛細血管が拡張し透過性が高くなっていた。同時に、保湿剤や臨床で使用する薬剤等が毛細血管観察に及ぼす影響を検索し、特に大きな影響が無かったことから、抗がん治療患者の術前・術中の変化・高齢健常者・口腔乾燥症患者に関する口腔粘膜の炎症状態の観察を行う統合的な観察環境が構築された。

これらの研究は、申請当初の計画から口腔粘膜チャートの開発の必要性等を行わなければならなかった事から、実験的歯肉炎による歯肉炎症の観察等の実験に関して遅延気味であるが、平成27年度申請時に計画の修正を行い、歯肉炎の観察を実施したことから研究結果の読み替えが可能で有り、研究計画を概ね踏襲している。口腔乾燥症で悩む高齢者や周術期口腔機能管理の必要な患者の口腔粘膜の傷害を予防して、本来の治療の達成と日々のQOLの向上を目指すために、口腔粘膜傷害の予防法を構築する。口から高齢者のQOLを高めるためには、高齢者の悩みである口腔乾燥症と誤嚥への対策が重要で有り、一方で、様々な全身疾病は症状が口腔内に現れるので、口腔乾燥症と誤嚥により重篤な闘病状態へ陥ることとなる。さらに、がん療法中の口腔粘膜炎による潰瘍と高齢者の口腔乾燥症に由来する潰瘍の形成には、粘膜の萎縮や傷害などに伴う局所の防衛機能の低下と、口腔乾燥症に伴う口腔環境の変化の2つの大きな因子が関与している。よって、口腔粘膜の障害を予防するには、唾液の機能を最大限に生かすと共に、全身状態が現れる口腔根膜の局所の状態を正確に把握して、以上な状態を早急に見つけて対応する必要がある。本研究では、光学的手法を用いた口腔内診察法の提案と唾液の性状分析の総合的評価を行った。新技術である狭帯域光観察は、口腔粘膜の血管を染め分け、粘膜病変を明示化できる。これを活用して、粘膜マッピング法と共に全く新しい口腔粘膜評価法を提案した。さらに、口腔粘膜潰瘍化発症のメカニズムの解明とそれの修飾因子の影響の検索、及び、口腔粘膜炎の潰瘍化回避のための予防策と治療技術の開発の研究として唾液成分に関する実験を実施し、総合的な口腔粘膜傷害の診療指針を考察した。口腔粘膜炎の潰瘍化のメカニズムが解明されて潰瘍化の回避が可能になると、多くのがん患者や口腔乾燥症で悩む高齢者にとって福音となることを望む。口腔乾燥症で悩む高齢者や周術期口腔機能管理の必要な医科治療の患者の口腔粘膜の傷害を予防して口腔QOLの向上を目指すために、口腔粘膜傷害の予防法を構築した。新技術である狭帯域光観察法を用いて粘膜病変を明示化し、口腔内を詳細に位置決めする粘膜マッピング法を用いて、新しい口腔粘膜評価法を提案する。口腔粘膜炎回避のための予防策を考えて、最終的には総合的な口腔粘膜傷害の診療指針の策定を考えた。本年度の研究では、狭帯域光観察の技術を用いた口腔粘膜脈管系炎症評価法の確立と口腔粘膜の位置座標を決定する粘膜マッピング法の確立の実験を実施したが、概ね当初の予定通りに実験を行った。狭帯域光観察の装置は、光ファイバー先端に画像入力素子を配置した内視鏡であるが、ファイバー先端の屈曲の角度によって口腔粘膜の観察する方向が決定される。よって、口腔粘膜の全体を観察するためには、器具の挿入方向等の手順を決めておく必要があった。さらに狭帯域光観察像の写真撮影時には明白に観察される細血管は、実際の目視では細部を即時に確認することが想定よりも難しく、写真撮影による評価が前提になることが考えられた。しかしながら、写真上での作業は、臨床の現場での診断に結びつけるのは困難であるために、光学ファイルターや強調画像等の画像加工が必要であるとの考えから、只今映像装置を調整中である。この修正は平成27年度春期に完了を予定している。
看護学生の知識の構造化を目指した演習・実習連携授業の開発

本研究の目的は,看護学生が看護学実習で活用できるような知識の構造化を目指した,演習と実習を繋ぐ授業の開発である。2018年(平成30年)度は,前年度の評価活動に基づき次の1)から7)を実施した。1)学生が実習において実施する看護技術の頻度と困難さ等の把握,これを踏まえ,2)授業目的・目標・方法・内容を検討し教材を作成する,3)授業を実施し,学生の思考状態を把握する,4)実習における知識・技術の活用状況を把握する,5)授業の改善点を明らかにし,改善案を作成する,6)2018年度に実施した授業内容を整理しテキストを作成する,7)授業内容の他分野への応用を検討する,の,7項目である。1)実施する頻度の高い技術は,前年度と同様に,「バイタルサインの測定」と「清潔に関する援助」であった。。2),1)の結果を踏まえ,授業目的・目標・方法は変えず,今年度は,新たに,呼吸・循環系に関する演習を追加した。3)授業計画に沿って教授活動を実施した。ワークシートの記述より,バイタルサインの測定では,右半身麻痺の事例患者の特徴を捉えた測定部位の選択や体位の工夫などがみられており,清潔に関する援助では,体位や場所の工夫と援助時の観察事項も考えられていた。また,呼吸・循環系に関しては,呼吸困難という症状でも,障害された部位によって原因が異なることなどが記述されていた。4)知識・技術の活用状況は,4年次のすべての実習が終了した時点で調査を行い,「腋窩だけの体温測定にとどまらず状況に応じて測定部位を考えた」,「異常値が出た時にあわてず,環境を確認した」など,演習内容が活用されていた。5),1)4)の状況を踏まえ,完成版として6)のテキストの作成に至った。7)今回の教授活動は,知識を伴って技術習得を目指す分野で活用できることが期待される。研究は3年計画で,授業の改善を行いながらテキスト化を目指す。具体的には,基礎的な看護技術に関する講義・演習を終えた段階(3年次前期)で,条件が付加された事例に対して,看護技術を実施する演習課題を示し,最適な実施方法を思考させる。演習の中で,演繹的思考を促すために,課題解決に必要な知識の確認を行い,その後,事例の症状からそのメカニズムを考えさせるといった,帰納的な思考を行わせる展開とする。このような思考の結果を自らが確認できるように,ワークシートを作成し使用する。ワークシートの作成は,1実習中の看護技術の実施頻度と実施する際の困難さ,具体的な不安の内容等を調査し,その結果を基に,2看護技術に関する課題を特定し,課題解決を目的とした授業を実施する。3授業中の学生の思考状態について記録物を基に分析をする。4授業で行った課題解決の際の思考と獲得された知識について,実習場面での活用状況を調査する。5,3および4の結果から,授業の妥当性と改善点を明らかにし,次年度の授業に反映させる。6,25の活動を複数年度実施する。平成28年度の計画,1実習中の看護技術の実施頻度は,前年度の基礎看護技術の使用頻度および技術達成度のデータより,「バイタルサインの測定」,「清潔に関する援助」だった。1の結果を基に,2事例課題は「バイタルサインの測定」とし,ワークシートを作成した。3学生の思考状態については,ワークシートの記述内容を分析した。4の実習場面での活用状況については,授業を受けた学生が29年度の前期で実習を終了するので,終了後に実施予定である(計画通り)。5演習後,改善点を修正し29年度版を作成した。また,ワークシートの分析内容に関しては日本教育工学会で研究発表を行った。今年度の研究計画通り,事例課題を,実習中に実施する頻度の高い,「バイタルサインの測定(97.2%)」と「清潔に関する援助(80.6%)」とした。実習中の実施する際の困難さ,具体的な不安については,「対象者の疾患や症状の程度で変わる」であったため,異なる年齢,疾患,症状の複数の事例を課題として配置した。ワークシートは,課題を解決するために必要な知識の確認(人体の構造や機能等のメカニズム)という演繹的思考を行わせた後,事例の症状からそのメカニズムを考えさせるといった,帰納的な思考を行わせる展開となるように作成した。また,発問・応答の形式にし,学生が問いに回答することで自らの思考を確認することができるようにワークシートを作成し,授業で使用した。ワークシートの記述内容,学生の個人ワークおよびグループワークの様子を分析し,課題内容,分量,発問・応答の適切性について評価活動を行った。その結果を日本教育工学会で発表した。ワークシートの問いの数・内容・事例課題・時間配分については変更の必要がなかった。文章表現を一部わかりやすく修正したものを,平成29年度版ワークシートとして作成した。平成29年度の計画は,前年度作成したワークシートを改善することを主たる目的として次の5つの項目を上げ,実施した。

1)学生が実習において実施する看護技術の頻度と困難さ等の把握,2),1)の結果を基に,授業目的・目標・方法・内容を検討し教材を作成する。3)授業を実施し,学生の思考状態を把握する。4)実習における知識・技術の活用状況を把握する。5)授業の改善点を明らかにし,改善案を作成する。次年度の授業に反映させる。1)実施する頻度の高い技術は,前年度と同様に「バイタルサインの測定」と「清潔に関する援助」であった。バイタルサインの測定のうち,体温測定では腋窩での測定をすべての学生が実施しており,それ以外に,口腔検温2例,直腸検温2例,外耳道5例,頸部14例,肘3例があった。2),1)の結果を踏まえ,授業目的・目標・方法は変えず,回答が少なかった問いの項目を整理してワークシートを改善した。3)授業計画に沿って教授活動を実施した。ワークシートの記述より,バイタルサインの測定では,右半身麻痺の事例患者の特徴を捉えた測定部位の選択や体位の工夫などがみられており,清潔に関する援助では,体位や場所の工夫と援助時の観察事項も考えられており,知識を活用できていると推測された。4)知識・技術の活用状況は,4年次のすべての実習が終了した時点で調査を行い,血圧測定時のマンシェットの巻き方や清拭時の体位の工夫などがみられ,すべての学生が知識を活用できたと回答していた。5)次年度は,1)4)の結果を踏まえると,内容および方法は変更せず,バイタルサインの測定のうち,取り扱っていなかった呼吸に関する授業を追加し,学生の知識の構造化を目指すことにする。今年度の計画は予定通りに実施されており,ワークシートの記述を見る限り,既有の知識を活用できていることが明らかである。そのため,研究はおおむね順調に進んでいると評価する。次年度は,バイタルサインの測定のうち,取り上げていなかった,呼吸に関する援助技術の授業を追加する。新たに追加する授業も,これまでの評価結果を踏まえて,ワークシートを使って学生の知識の構造化を促すことを目指す。本研究の目的は,看護学生が看護学実習で活用できるような知識の構造化を目指した,演習と実習を繋ぐ授業の開発である。2018年(平成30年)度は,前年度の評価活動に基づき次の1)から7)を実施した。1)学生が実習において実施する看護技術の頻度と困難さ等の把握,これを踏まえ,2)授業目的・目標・方法・内容を検討し教材を作成する,3)授業を実施し,学生の思考状態を把握する,4)実習における知識・技術の活用状況を把握する,5)授業の改善点を明らかにし,改善案を作成する,6)2018年度に実施した授業内容を整理しテキストを作成する,7)授業内容の他分野への応用を検討する,の,7項目である。1)実施する頻度の高い技術は,前年度と同様に,「バイタルサインの測定」と「清潔に関する援助」であった。。2),1)の結果を踏まえ,授業目的・目標・方法は変えず,今年度は,新たに,呼吸・循環系に関する演習を追加した。ワークシートの記述より,バイタルサインの測定では,右半身麻痺の事例患者の特徴を捉えた測定部位の選択や体位の工夫などがみられており,清潔に関する援助では,体位や場所の工夫と援助時の観察事項も考えられていた。また,呼吸・循環系に関しては,呼吸困難という症状でも,障害された部位によって原因が異なることなどが記述されていた。
腫瘍移植鶏卵モデルによる低酸素腫瘍の解糖系亢進を標的とした新規放射線増感剤の創製

本研究の目的は,低酸素がん細胞が解糖系に依存していることに着目し,解糖系の基質となるグルコースに放射線増感活性基を付与した「ニトロアゾール修飾グルコース型放射線増感剤」の創製である.実施内容として,アセチルグルコース修飾2-ニトロイミダゾール体TX-2244およびその誘導体5種類を分子設計・合成し,腫瘍細胞や腫瘍移植鶏卵モデルを用いて放射線増感活性やその作用機序の解析を行った.得られた成果として,TX-2244はグルコースの細胞内取り込み阻害,細胞内NADH量の低下,放射線由来DNA損傷の増強を介して高い放射線増感活性を発揮することを明らかにした.昨年度は放射線増感剤TX-2244の作用機序を明らかにするために、種々のグルコースと2ーニトロイミダゾールをハイブリッドした化合物を合成して構造活性相関を行い、6位の修飾は増感活性に不利になることを見出した。本年度は、TX-2244のin vivo放射線増感活性を評価するために、低酸素誘導因子HIF-1の発現に連動してGFPを発現するEMT6/5HRE-GFP細胞を作製し、この細胞を用いて発育鶏卵に移植・形成させた固形腫瘍中の低酸素領域の解析を試みた。受精鶏卵は、37°C、高湿度下で1時間毎に1回転卵して発育させ、発育開始11日目に漿尿膜上の太い血管の分岐部分にテフロンリングを置き、リング内にEMT6/KU細胞もしくはEMT6/5HRE-GFP細胞懸濁液を添加した。発育開始15, 16, 17, 18日目にヘキスト33342を静注して1分後に腫瘍を摘出し、OCTコンパウンドで包埋した。クライオスタットで腫瘍切片を作製し、H&E染色と蛍光観察を行った。結果として、18日目の腫瘍切片の蛍光画像より、マウスと同様、鶏卵に形成させた固形腫瘍内にもHIF-1陽性細胞が存在していることから、低酸素領域の存在が示唆された。しかしながら、マウスに形成した固形腫瘍と異なり、腫瘍内部の血管が少なく、また、血管形成が不十分であった。さらに、1518日目に単離した腫瘍を比較したところ、15日目において最も強いGFP由来の緑色蛍光が確認され、その後減少していることが示された。そこで、15日目の腫瘍移植鶏卵に対して8 GyのX線を照射したところ、2時間後の腫瘍切片においてHIF-1陽性細胞の減少が観察された。以上の結果より、腫瘍内血管形成の違いによってマウスの腫瘍と異なる低酸素領域とその変化を示したことが示唆された。本研究は,がんへの糖の取り込み亢進に着目した糖ハイブリッド低酸素細胞放射線増感剤の開発を目的としている.平成23,24年度において,アセチル化グルコースを修飾した放射線増感剤TX-2244が,他の糖修飾放射線増感剤と比べて極めて高いin vitro放射線増感活性を有すること,グルコースの取込み阻害を引き起こすこと,TX-2244のアセチル基の代謝やグリコシド結合の開裂がTX-2244の高い増感活性に重要であることを明らかにした.そこで平成25年度は,TX-2244の更なる作用機序解明を目的とし,グルコースの6位に2-ニトロイミダゾール基を導入したUTX-90および4-ニトロイミダゾール基に改変したUTX-98を合成し,放射線増感活性を評価した.また,TX-2244の解糖系酵素に与える影響についてウェスタン解析を行った.結果として,UTX-90およびUTX-98の放射線増感活性は,それぞれER=1.42,1.11であり,TX-2244(ER=2.30)と比べてかなり低い活性を示した.よって,TX-2244におけるグルコース1位に2-ニトロイミダゾール基を導入することの重要性が示唆された.また,低酸素条件下でEMT6/KUをTX-2244(600 μM)とX線(2 Gy)の併用処理を行ったところ,Pyruvate Dehydrogenase発現量に減少していることが示された.よって,TX-2244はPyruvate Dehydrogenaseを阻害することでNAD+からNADHへの還元を抑制し,細胞内NADH量を低下させることが示唆された.以上の結果より,TX-2244はグルコース取り込み阻害,細胞内NADH量の低下,放射線由来DNA損傷の増強により高い放射線増感活性を発揮することを明らかにした.本研究で創出したTX-2244は臨床応用が可能な放射線増感剤として有望である.本研究の目的は,低酸素がん細胞が解糖系に依存していることに着目し,解糖系の基質となるグルコースに放射線増感活性基を付与した「ニトロアゾール修飾グルコース型放射線増感剤」の創製である.実施内容として,アセチルグルコース修飾2-ニトロイミダゾール体TX-2244およびその誘導体5種類を分子設計・合成し,腫瘍細胞や腫瘍移植鶏卵モデルを用いて放射線増感活性やその作用機序の解析を行った.得られた成果として,TX-2244はグルコースの細胞内取り込み阻害,細胞内NADH量の低下,放射線由来DNA損傷の増強を介して高い放射線増感活性を発揮することを明らかにした.本年度の研究成果は、まず、グルコースの6位ヒドロキシル基を2ーニトロイミダゾール基に置換したUTX-86およびそのアセチル化体であるUTX-87を分子設計・合成した。

放射線増感活性の指標としてMOPAC03を用いて電子親和性(EA)を求めたところ、UTX-86がEA=0.7713eV、UTX-87がEA=0.7677eVとなり、リード化合物のTX-2244(EA=0.9661)と比較してやや低い電子親和性を示した。また、薬物動態の指標としてPallas 3.0を用いて疎水性パラメータを算出したところ、UTX-86がP=0.023、UTX-87がP=0.87であり、UTX-86はTX-2244(P=0.105)よりも低い疎水性を示した。マウス乳腺癌由来EMT6/KU細胞に対するin vitro低酸素細胞放射線増感活性は、UTX-86がER=1.37(1.0mM)、UTX-87がER=1.01(1.0mM)であり、TX-2244(ER=2.30、1.0mM)と比べて大きく活性が低下した。両化合物の細胞内取り込みについて細胞抽出液を逆相HPLCで評価したところ、UTX-86が0.67%、UTX-87が1.39%であり、疎水性に比例した取り込み率を示した。また、グルコースの取り込み阻害活性を2-NBDG法で調べたところ、UTX-87(1mM)はグルコーストランスポーター(GLUT)の阻害剤であるサイトカラシンB(10uM)と同程度の阻害活性を示したが、UTX-86は全く阻害活性を示さなかった。以上の結果より、GLUTに対する阻害活性は放射線増感活性に寄与しない事、また、グルコースの6位ヒドロキシル基の2ーニトロイミダゾール基による置換は放射線増感活性に不利に働くことが示唆された。この知見は、今後のグルコース修飾放射線増感剤の分子設計に対して有用な情報となった。本年度は、放射線増感剤のin vivo増感活性を評価するための低酸素応答性腫瘍移植鶏卵モデルの構築に成功しており、本評価系を用いることで薬物動態を反映した分子設計が可能となったことから、おおむね順調に進展していると言える。本研究の初年度の目的であるグルコースに直接2ーニトロイミダゾール基を導入した放射線増感剤UTX-86およびUTX-87を分子設計・合成できた事,またそれら化合物のin vitro放射線増感活性,細胞内取込み率,グルコーストランスポーターに対する作用を評価できた事から,当初の目的をほぼ達成していると思われ,「おおむね順調に進展している」を選択した.来年度は本申請研究の最終年度になるので、これまでに分子設計・合成した放射線増感剤について構造活性相関を行い、最適な放射線増感剤として創出された候補化合物を合成し、放射線増感活性と薬物動態解析、作用機序解明を実施し、動物実験・前臨床試験に供与可能なニトロアゾール修飾グルコース型放射線増感剤を創出して本申請研究を完了する計画である。今後は,グルコースの6位にスペーサーを介して2ーニトロイミダゾール基を導入した化合物や,グルコースの2,3,4位のいずれかを用いて2ーニトロイミダゾール基を導入した化合物を分子設計・合成する.そして,それら化合物のin vitro放射線増感活性,細胞内取込み率,グルコーストランスポーターに対する作用,薬物動態解析を評価し,定量的構造活性相関によりニトロアゾール修飾グルコースのリード薬剤の創出を試みる.本研究を実施するにあたり、放射線増感剤の合成に必要な薬品代として30万円、がん細胞培養に必要なプラスチック器具代として10万円、血清代として10万円、作用機序解析に必要な生化学試薬やキット代として20万円、受精鶏卵の購入代として20万円を使用する計画である。本年度の予算残金が1348円生じたことの理由として,当初予定していた試薬の価格に若干の変更があったことが挙げられる.この残金については翌年度の物品費と合算して,合成用試薬や細胞培養用試薬,発育鶏卵,各種キットを購入する予定である.
銅－典型金属結合種から構築される精密制御反応場

1,8-ジアミノナフタレン(dan)とピナコール(pin)で置換した非対称ジボロンと銅触媒からdan置換ボリル銅を選択的に発生できる.今回,銅ーホウ素結合の分極に基づくB(dan)求核剤としての潜在性を活かし,有機ハロゲン化物の置換型ホウ素化反応を達成した.N-ヘテロ環状カルベン(SIMes)を配位子とする銅触媒を用い,塩基存在下ハロゲン化アルキルとマスク型ジボロンを作用させるとB(dan)選択的な置換型ホウ素化反応が進行し,マスク型アルキルボランを直截合成できることを明らかにした.ハロゲン化アルキルとしては,様々な一級および二級のものが利用可能であり,脱離基としては臭素やヨウ素が優れていた.また,反応の官能基許容性は高く,C(sp3)-Cl結合やエステル基,C-C二重結合をそのまま残すことができる.反応は,ハロゲン化アリルにも適用できマスク型アリルボランを得ることができるが,クロチルブロミドではα置換体,γ置換体の混合物となった.炭素求電子剤としてはハロゲン化アリールも利用可能であり,C(sp2)-X結合を直接的にC(sp2)-B(dan)結合に変換できる.この際の最適配位子はPCy3であり,様々な電子状態のハロゲン化アリールに加え,多環芳香環(ナフタレン・フェナントレン),複素芳香環(ピリジン・チオフェン)へも展開できる.シクロプロピルメチルブロミドを用いた際には開環を伴った生成物が,Z体のアルケニルブロミドを用いた際には立体化学が反転したE体の生成物が得られたことから,反応がラジカル中間体を経由して進行していることが示唆される.29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。一方のホウ素を1,8-ジアミノナフタレン(dan)でマスクした非対称ジボロンをアルケン,炭素求電子剤と銅触媒存在下作用させると,三成分連結型のカルボホウ素化が進行することを明らかにした.配位子としてはdppfが最適であり,マスク型ホウ素部位(B(dan))のみが選択的にアルケンに導入される.反応にはビニルシラン,ビニルボランなどのアルケンが利用可能であり,ホウ素部位は高い位置選択性でアルケンの末端炭素に導入される.また,ケイ素上にビニル基とホモアリル基を併せ持つ基質を用いた際にはビニル基選択的にカルボホウ素化が進行し,反応の高い化学選択性を実証できた.炭素求電子剤としては,電子供与性,および電子求引性置換基を有する種々のベンジルハライドが利用可能であるうえ,芳香環上に塩素が置換していてもその炭素ー塩素部位が損なわれることはない.また,ベンジルハライドに加え様々なアルキルハライドも用いることができた.この際の官能基許容性も高く,エステル・炭素ー塩素結合・アセタールなどの反応性官能基を損なうことなくカルボホウ素化体を得ることができた.さらに,シクロプロピルメチルブロミドを炭素求電子剤として用いた反応は,三員環の開環を伴わずに進行し,本カルボホウ素化がラジカル中間体を経由せずに進行していることを明らかにした.本反応はB(dan)導入を伴うカルボホウ素化の初めての例であり,多彩な置換様式のマスク型アルキルボランの一段階合成法として有用である.マスク型ボリル銅種からなる精密制御反応場を非対称ジボロンの選択的σ結合メタセシスにより構築し,不飽和炭化水素類の銅触媒三成分連結型ホウ素導入反応を当初の計画通り順調に新規開拓できているため.1,8-ジアミノナフタレン(dan)とピナコール(pin)で置換した非対称ジボロンと銅触媒からdan置換ボリル銅を選択的に発生できる.今回,銅ーホウ素結合の分極に基づくB(dan)求核剤としての潜在性を活かし,有機ハロゲン化物の置換型ホウ素化反応を達成した.N-ヘテロ環状カルベン(SIMes)を配位子とする銅触媒を用い,塩基存在下ハロゲン化アルキルとマスク型ジボロンを作用させるとB(dan)選択的な置換型ホウ素化反応が進行し,マスク型アルキルボランを直截合成できることを明らかにした.ハロゲン化アルキルとしては,様々な一級および二級のものが利用可能であり,脱離基としては臭素やヨウ素が優れていた.また,反応の官能基許容性は高く,C(sp3)-Cl結合やエステル基,C-C二重結合をそのまま残すことができる.反応は,ハロゲン化アリルにも適用できマスク型アリルボランを得ることができるが,クロチルブロミドではα置換体,γ置換体の混合物となった.炭素求電子剤としてはハロゲン化アリールも利用可能であり,C(sp2)-X結合を直接的にC(sp2)-B(dan)結合に変換できる.この際の最適配位子はPCy3であり,様々な電子状態のハロゲン化アリールに加え,多環芳香環(ナフタレン・フェナントレン),複素芳香環(ピリジン・チオフェン)へも展開できる.シクロプロピルメチルブロミドを用いた際には開環を伴った生成物が,Z体のアルケニルブロミドを用いた際には立体化学が反転したE体の生成物が得られたことから,反応がラジカル中間体を経由して進行していることが示唆される.非対称ジボロンと銅触媒からマスク型ボリル銅種を選択的に発生できる成果に基づき,今後も新しい触媒的B(dan)導入反応の開発を軸として研究を推進してゆく.

さらに,B(dan)以外の新しい非対称ジボロンを合成し,それを鍵反応剤とする触媒的ホウ素導入反応開発も計画している.29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。
放射光ＳＴＭによる金属内包有機分子の識別と元素選択的制御

原子分解能をもつ元素分析法「放射光STM」の拡張を試みた。本手法は元々「浅い電子準位」しか見ないSTMに、X線励起による内殻情報を付与し、励起後のトンネル電流変化から試料組成を原子分解能で分析する。従来、半導体基板に限定されたが、金属系さらに金属内包有機分子に適用した。測定の不安定性や照射下の走査損傷など多くの困難があったが、光源の安定性を改善し、金属コントラスト自体は初めて観測された。その後、有機分子系(金属フタロシアニン)を試み、吸収端を挟む明確なコントラスト変化は見えていない。しかし特異な照射効果の萌芽が見えたことで、元素選択的な分析・反応制御の足がかりを得た。本研究の目的はSTMの最大の弱点を克服すること、つまり元素分析STMの実現である。STMは原子分解能をもつ汎用分析法だが、「浅い電子準位に依拠」するため、元素分析には致命的な難点がある。そこで内殻情報を付与、つまり特定波長・単色の高輝度X線をSTM観察点に入射し、内殻励起後のトンネル電流変化から試料の組成・状態を原子分解能で分析することが主眼である。特に本課題では、金属内包有機分子の元素選択的な分析の足がかりを得ることが目標である。このためまず知っておくべきは、金属自体の元素コントラストがどう見えるか、である。そこで前提として、金属基板上のコントラスト取得を初年度から行ってきた。なぜなら従来ずっと同じ目的で行ってきた半導体基板と異なり、金属では表面光起電力(SPV)もなく、励起寿命が短く、バンド局在も小さいためコントラストが著しく出難いと予想されるからである。初年度より一連の試みでは、有機分子に先立つテスト系としてAu(111)清浄表面ーCoナノアイランドの試料分析を試みてきた。初年度のポジティブな知見(Au上でもCoコントラストが得られること。その基本的な諸特性の知見)に基づき、当該年度は金属コントラストの様々な挙動を精査した。ただし、元素コントラストの得られる条件が限られ、不安定であり、かつCoの走査損傷が大きいこと、は困難な壁として残った。その状況下で、当該年度の成果は、入射光の輝度、およびエネルギーに対して、元素コントラストの依存性が、ある程度の再現性と共に得られたことである。またその再現性を得るための解析法の工夫にも大きな進展があった。それらを支える光源安定性の技術にも、極めて大きな進展があった。こうした一連の結果は今後に向けて、重要な布石となった。特に入射光パラメータに対するコントラスト依存性は、コントラスト原理を知る上で不可欠なヒントである。本研究の目的は、STM最大の弱点の克服、つまり元素分析STMの実現である。STMは原子分解能をもつ汎用分析法だが、「浅い電子準位に依拠」するため、元素分析に致命的な難点がある。その前提として、従来は半導体基板の解析だけで不明だった「異種金属間の元素コントラスト」の様態を追求してきた。なぜなら金属では表面光起電力(SPV)もなく、励起寿命が短く、バンド局在も小さいためコントラストが著しく出難いはずだからである。初年度より有機分子に先立つテスト系としてAu(111)清浄表面-Coナノアイランドの分析を試みてきた。光源の安定化は進捗したものの、測定の不安定性やCoの走査損傷など多くの制限で難渋した。その中で金属コントラスト自体は観測され、一連の知見に基づき、当該年度前半は金属コントラストの入射光密度依存性を精査した。その後、金属コントラストの理解は中途ながら最終的に有機分子系(Cuフタロシアニン(Cu-Pc))を試みた。詳細な解析はまだ途上にあるが、有機分子では恐らく金属密度の低さがネックとなり、Cu吸収端を挟む明確なコントラスト変化は見えていない。ただし当該年度の成果は、Cu-Pcで特異な照射効果の萌芽が見えたこと、そして前段の金属系に対し、元素コントラスト変化の新知見(印加電圧の影響と、ほかに探針起因の新たなコントラスト要因)を得たことである。この一連の結果は今後に向けて、重要な布石・萌芽となる。特にコントラスト要因の理解が深化し、Cu-Pc系など低密度金属での今後の対策が検討可能になったことは将来に向けた有効な足がかりである。本研究の目的はSTMの最大の欠点を改善すること、つまり元素分析STMの実現である。

STMは原子分解能をもつ強力な分析法だが「浅い電子準位に依拠」するため元素分析に致命的な難点がある。そこで内殻情報を付与、つまり特定波長・単色の高輝度X線をSTM観察点に入射し、トンネル電流変化から試料の組成・状態を原子分解能で分析することが主眼である。特に本課題では、金属内包有機分子の元素選択的な分析と制御(内殻励起と探針刺激を組み合わせ、ナノ局所反応制御に応用)の足がかりを得る。このためまず、最初に行うべきは金属自体の元素コントラストの取得である(そのために特に、金属基板でのコントラスト取得が重要なヒントとなる)。なぜなら従来ずっと同様の目的で行ってきた半導体基板と異なり、金属では表面光起電力(SPV)もなく、励起寿命が更に短く、かつバンド局在性が小さいためコントラストが著しく出難いと予想されるからである。この点は今年度の試みで様々なことが分かった。具体的には有機分子に先立つテスト系としてAu(111)清浄表面ーCoナノアイランドの試料分析を試みた。その結果まず、SPVが皆無の金属基板でも「元素コントラストが出る」こと、また元素コントラスト像は形状像にない情報を数多く含んでいること、また、光軸調整は全反射調整について途中過程は従来と異なるが、従来通りできること、また半導体基板と決定的に異なり、照射損傷が著しく低いこと、等である。一方、元素コントラストの得られる条件が限られること、それが探針状態に大きく依存すること、Auの損傷は微小でもCoは走査で損傷が大きいこと、全反射が得られにくい場合があること、等の留意点もわかった。これらは今後に向けて、大きな布石となった。なお、本テーマは国内外で注目度が高く、比較的多めの講演依頼を受けているため、旅費の支出が多い状況になっている。本課題は、萌芽的な内容であり挑戦も含むため、段階的な準備がいくつか必要である。まず前提として、当初は長らく半導体でのみ行われてきた「放射光STMによる元素分析」について、初めて金属基板への適用を試みた。その結果、当初に懸念が多かった「金属の元素コントラスト」について、実績欄のとおりポジティブな結果が得られた。この事実は初年度も部分的には(極めて不安定ながら)得られていたが、当該年度で再現性が得られ、さらに一歩突っ込んだ「金属コントラストの光源パラメータ依存性」が得られた。金属基板上の異種金属でもコントラストが得られることで本手法の一般性が保証され、かつ、金属内包分子への展開にとっても重要かつポジティブな前提が得られた(ただし同時に、コントラストの不安定性を始め、実績欄で述べた種々の困難も浮き彫りになった)。また、本手法の「金属元素コントラスト」解析では解析法に新たなノウハウが得られ(サンプリングの基準設定)、次のステップへの重要な布石が得られた。最終年度では最終段階の挑戦的な試みを行うが、その準備として有益であった。理想的には、次段階の試みいくつかを行いたかったが、それらは限られたマシンタイムという事情もあり、最終年度に行う。具体的には、金属そのものから発展し、実際の金属内包分子による元素コントラスト取得(このための試料作製ノウハウは当該年度に構築している)、また、そのための光源の工夫(ノイズ減のための工夫)である。本来、光源の関連では集光系の立上げを行いたかったが、その途上で、ベースにあるSTM装置の試料・探針回りにメンテナンス事項が非常に多く、その事情が物品費の使用量に現れている。
一過性全脳虚血後の脳微小循環反応に対する脳低体温療法の影響

ペントバルビタールで麻酔した日本白色ウサギに頭窓を作成した。,ネックターニケットを装着し、二酸化炭素応答とアセチルコリンに対する脳軟膜動脈血管の反応を、生体顕微鏡を用いて直接観察できるように設定した。生体顕微鏡可の観察により一過性全脳完全虚血に維持されていることを確認した。6分間の一過性全脳完全虚血により、二酸化炭素応答は完全に消失した。一方で、アセチルコリンに対する応答は維持された。これは、血管内皮細胞の昨日は残存しているにもかかわらず、神経細胞機能が消失しているために一酸化窒素の放出が消失しているためと考えられた。一方、低体温を導入しても、二酸化炭素応答は消失したにもかかわらず、アセチルコリンに対する反応は維持された。また、その程度は、常温の時と比べて差を認めなかった。これは低体温を導入したにもかかわらず、虚血になると脳神経保護効果が必ずしも発揮されない可能性があることを示唆している。一方、ニトログリセリンなどのNOドナーの投与を併用しても一過性全脳虚血後の脳血管応答は回復しなかった。これは神経細胞から放出されるNOの障害だけではなく、血管内皮細胞の機能低下が背景にあると考えちれた。吸入麻酔薬のような血管内皮細胞と神経細胞の両方に作用する脳血管拡張薬を投与した場合も、常温において、全脳虚血前後では明らかに血管拡張応答の消失を認めた。これらの知見は従来から指摘されたMCA閉塞法による一過性局所虚血モデルに一過性全脳虚血モデルも類似しているが、必ずしも完全に一致していないことも明らかになった。一過性脳虚血後に脳微小循環に及ぼす影響と低体温モデル作成を検討した。ペントバルビタール麻酔下にて、兎2kg白色家兎を気管挿管後人工呼吸し、側頭骨に頭窓を作成した。続いて生体顕微鏡を用いて脳軟膜上動脈を観察し、血管径を測定した。さらにネックターニケット法で全脳虚血モデルを作成した。虚血時間は6分で頭窓法により完全脳虚血状態が確認された。本研究を始めるために様々な前提条件を解決する必要があり、先行実験を行った。まず、血圧維持は脳血管径の測定における重要な条件になることから、ネックターニケット後の血圧の安定化を得るために、種々の工夫が必要になった。低体温導入には時間がかかるが、ネックターニケットによる完全脳虚血後の血圧維持を得るための昇圧薬の影響を調査した。昇圧薬自身の脳微小循環への影響は各種報告されているが、低体温時の影響はやはり完全には明らかにされていない。また低体温導入により血圧低下をきたした家兎モデルに併用する昇圧薬の妥当性と必要量を検討した。この点で、低体温時の血管収縮薬の反応は常温時と変化がないことが明らかになった。さらに、モデル作成において低体温導入により出血傾向を認めるため、新たなモデル作製技術の開発も必要になった。この点で動脈血中の二酸化炭素分圧を積極的に低下させることで精度の高い頭窓モデルが作成できることが判明したが、一方でこのモデルの妥当性を検証する必要も生じた。二酸化炭素分圧を一時的に低下させてもその後の反応は可逆的であり維持されることも明らかになった。現在では、頭窓作成という技術に加えて低体温導入によるモデル作成技術が確立できつつある。次年度では、白色家兎のネックターニケット法による全脳虚血モデルにおける脳低体温導入時の血管反応を引き続きおこなう。
微小気泡を用いた超音波遺伝子導入の発現効率向上法に関する検討

○パルス超音波による遺伝子導入の実証従来,連続波もしくは波数の多いバースト波を用いて行われてきたソノポレーションが,波数3波程度の短い超音波パルスを1回照射するだけでも実現できることを,GFP遺伝子の導入と発現のタイムラプス観察を通じて実証した.しかしその導入効率は低く,パルス超音波が撹拌効果を持たないことが原因の一つと考えられた○遺伝子付着気泡の作成撹拌効果を持たないペルス超音波でも効率が高いソノポレーションを実現するための方法として,細胞に穿孔をもたらす微小気泡自体に遺伝子を付着させる方法について検討した.その結果,アルブミンとGFP遺伝子を混入した生理食塩水を撹拌することで,遺伝子が付着した直径数ミクロンの微小気泡を再現性良く作成できることを確認した.○導入効率の向上上記で作成した気泡を用いて,遺伝子導入効率の向上効果を調べた.GFT遺伝子を培養液中に懸濁させた条件と気泡に付着させた条件で発現効率を調べた結果,気泡に付着させることによって導入効率が,培養駅に懸濁させた場合の約4倍に向上することを確認した.○気泡の種類による膜損傷の違い種々の気泡を用いてパルス超音波を用いたソノポレーションを行い,細胞の損傷率と修復率が気泡の種類によってどのように変化をするかを調べた.その結果,気泡の種類に依存して修復率が60%から100%近くまで変化することが確認され,ソノポレーションに最適な気泡の開発の可能性が示された.○培養状態での長期間連続観察手技の確立遺伝子導入時の状況と発現頻度を関連づけるためには,導入後遺伝子が発現するまで培養状態で持続的に観察を続ける必要がある.現在のところ,細胞観察用の水槽の滅菌を十分に行うこと,抗生物質を培養液に多めに添加することで,20時間程度の持続観察が実現されており,導入から発現の開始までは観察が可能となった.今後さらに期間の延長を試みて行く.○多点タイムラプス観察システムの開発本研究費で購入した顕微鏡用電動XYテーブルを用いて多点タイムラプス観察を行うため,XYテーブルによる自動スキャンと,民生用デジタルカメラでの自動撮影を実現するパソコン制御システムを作成した.また,制御用ソフトウエアの基本部分を作成した.○遺伝子導入実験手技の習得富山大学医学部において,GFP遺伝子を用いた遺伝子導入実験の手技を習得した.また,実験に必要なGFPの増幅,精製の手技の習得も行った.さらに,北大内でこれを行うために第二種使用等拡散防止措置承認申請を行い,承認を得た.その上で,GFPの増幅・精製を行った.○遺伝子を付着させた微小気泡の作成方法に関する検討我々が提案しているソノポレーションでは,細胞膜に気泡が付着した状態でパルス超音波を照射することにより気泡付着部に膜損傷を与え,細胞への遺伝子取り込みを実現する.この際,気泡自身に遺伝子が付着していれば,取り込みの頻度が大幅に向上すると考えられる.そこで,遺伝子が付着した微小気泡を我々の実験室で作成する方法について検討を行い,基本的実験を通じて作成の見通しを得た.○パルス超音波による遺伝子導入の実証従来,連続波もしくは波数の多いバースト波を用いて行われてきたソノポレーションが,波数3波程度の短い超音波パルスを1回照射するだけでも実現できることを,GFP遺伝子の導入と発現のタイムラプス観察を通じて実証した.しかしその導入効率は低く,パルス超音波が撹拌効果を持たないことが原因の一つと考えられた○遺伝子付着気泡の作成撹拌効果を持たないペルス超音波でも効率が高いソノポレーションを実現するための方法として,細胞に穿孔をもたらす微小気泡自体に遺伝子を付着させる方法について検討した.その結果,アルブミンとGFP遺伝子を混入した生理食塩水を撹拌することで,遺伝子が付着した直径数ミクロンの微小気泡を再現性良く作成できることを確認した.○導入効率の向上上記で作成した気泡を用いて,遺伝子導入効率の向上効果を調べた.GFT遺伝子を培養液中に懸濁させた条件と気泡に付着させた条件で発現効率を調べた結果,気泡に付着させることによって導入効率が,培養駅に懸濁させた場合の約4倍に向上することを確認した.○気泡の種類による膜損傷の違い種々の気泡を用いてパルス超音波を用いたソノポレーションを行い,細胞の損傷率と修復率が気泡の種類によってどのように変化をするかを調べた.その結果,気泡の種類に依存して修復率が60%から100%近くまで変化することが確認され,ソノポレーションに最適な気泡の開発の可能性が示された.
外側翼突筋筋電図の機能的分析(顆頭の動態との関連性について)

外側翼突筋下頭と顎二腹筋前腹が開口運動に果たす役割を明らかにすることを目的とし、顆頭部と切歯部の2点を測定点とした下顎運動と外側翼突筋下頭および顎二腹筋前腹の筋電図を同時記録し、両筋のonsetと下顎運動の関係を分析し以下の結果を得た。なお、開閉口運動は、習慣的な開閉口運動(Hーpath)、習慣的な開閉口路より前方を通る開閉口運動(Aーpath)、また後方引き付けを伴い習慣的な開閉口路より後方を通る蝶番運動に近い開閉口運動(pーpath)について行った。外側翼突筋下頭のouset時の顆頭部移動量は、(Hーpath)>(Pーpath)>(Rーpath)の順に小さいもののその間には、不意な差は認められなかった。また、外側翼突筋下頭のouset時の顆頭移動量の平均は、すべての運動路において0.7mm以内であった。外側翼突筋下頭のauset時の切歯部移動量は、(Pーpath)>(Hーpath)>(Aーpath)の順に小さく有意な差が認められた。顎二腹筋前腹のouset時の切歯部移動量は、(Aーpath)>(Hーpath)>(Pーpath)の順に小さく有意な差が認められた。以上の結果より、外側翼突筋下頭のousetは、開閉口運動の種類に影響されることなく、顆頭の移動量に密接な関係があることがわかった。また顎二腹筋前腹のousetは、開閉口運動の種類により影響され、とくに切歯部の後方への運動要素に密接な関係があった。
核磁気共鳴によるカルモデュリン及びトロポニンCの高次構造の解明

カルモデュリン(CaM)のNMRスペクトルについては既にかなり解析されてきたので、小ペプチド、マストパラン(MP)の結合の詳細を調べた。【Ca^(2+)】存在下でCaMにMPを加えると、N,C両ドメインの疎水性アミノ酸残基のピークが変化した。MPが存在するとNドメイン及びCドメインのみの2つのフラグメントのアミドプロトン領域のスペクトルの和がCaMそのものと全く異なることがわかった。従って、MPがCaMのリンカ一部分及び両ドメインの疎水性部分と結合することがわかった。複合体と遊離体との交換速度は【50_S^-1】より遅い。MP存在下で【Ca^(2+)】滴定を行うと、His-107が3段階で変化することを見いだした。MPは【Ca^(2+)】がCドメインに結合することによってCドメインに結合し、更にNドメインに【Ca^(2+)】が結合することによってNドメインにも結合し、それと同時にCドメインのコンホメーションも変えると考えられる。トロポニンC(TnC)についてはそのNMRスペクトルの解析が遅れているのでそれに力を注いだ。TnCは会合しやすいのでそれを避けるためにジチオスレイトールを加えて測定すると良い結果が得られた。2つの存在するTyrを帰属した。その結果、N-ドメインにあるTyr-10はC-ドメインに【Ca^(2+)】が結合することによっても変化しTncではドメイン間の相互作用が認められた。また、COSY,NOESY,リレードCOSY等の2次元NMRを用いてアミドプロトン及びαプロトンのシーケンシャルアサインメントを試みた。現在のところ、C-ドメインのカルシウム結合部分のGlyを含むいくつかの残基を帰属した。C-ドメインのカルシウム結合部分はNMRで見てもCaMに似ていることがわかった。