hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
分泌発現系ｃＤＮＡライブラリを用いた細胞性免疫責任抗原同定への新しいアプローチ法

アクネ菌分泌発現系ライブラリを作製し、本菌感作マウス細胞を用いて細胞性免疫反応を指標としたスクリーニングを施行した。計1132クローンに対しリンパ球刺激試験を行った結果1陽性クローンを得た。この組み換え蛋白はサルコイドーシス患者細胞には反応せず、疾病素因を有する患者細胞でのスクリーニングの必要性が生じた。患者細胞で同様の系を行ったが細胞数の観点から難航し、患者血漿を用いたスクリーニングで抗原候補を選別した後に細胞性免疫を確認することとした。その結果得られた5つの候補蛋白はアクネ菌感作マウスにおいて細胞性免疫反応を誘導することが確認された。現在患者における反応性を検証している。サルコイドーシス患者および健常人血漿を用いて本症原因細菌であるアクネ菌の菌体成分に対しwestern blotを施行し、疾患特異的な反応を見せる菌体成分の同定を目指した。Western blotにおける陽性バンドはIgG, A, M各クラスとも30-50 kDa付近に見られたが、患者群に特異的なバンドはなかった。患者・健常人で高頻度に認められたバンドについてはアクネ菌菌体成分の可溶性分画からwestern blotの陽性バンドの分子量に相当するバンドをCBB染色したアクリルアミドゲルから切り出し、MALDI TOF-MS解析によりタンパクを同定した。同定し得た5種類のタンパクについては組み換えタンパクを作製し、アクネ菌感作マウスおよびサ症患者・健常人における液性免疫反応と、感作マウスおよびサ症患者細胞を用いて細胞性免疫反応を検証した。液性免疫反応はELISA法にて抗体価を測定した。アクネ菌感作マウスは生食免疫した対照マウスと比較し、5種類のタンパクすべてに対し有意に高い抗体価を示した。ヒト血漿では2種類のタンパクに対してサ症患者群で有意に高い抗体価を示した。細胞性免疫反応はELISPOT assayにて評価した。アクネ菌感作マウスは対照マウスに比べIFNγ、IL-2ともに高い反応を示す中、3種類については強い反応を示した。患者では4例中3例にマウスで強い反応を示した3種類のうち2種類に対する反応を認めた。本研究では“患者特異的に液性免疫を誘導する"ではなく、ヒトに抗原性を有するアクネ菌由来のタンパクを液性免疫反応から選別し細胞性免疫反応を評価した。宿主要因が存在する疾病の病因解明研究においては患者細胞に限りがある以上本研究のような工程を踏む必要がある。当初目指した細胞性免疫反応を指標としたスクリーニング法の確立には至らなかったが、本症の責任抗原同定へは前進したものと考える。サルコイドーシスの本質である細胞性免疫反応で責任抗原候補を選別する手法の開発に着手した。アクネ菌の分泌発現系ライブラリを作製し、本菌感作マウス細胞を用いてリンパ球刺激試験(LST)によるスクリーニングを施行した。作製した分泌系ゲノムライブラリはアクネ菌由来の遺伝子が正確なフレームでクローニングされている確率、さらにその遺伝子がコードするタンパクが分泌される割合が低率であった。この分泌系ライブラリ由来のタンパクを抗原としたスクリーニングでは感作マウスのstimulation indexが2.0以上であり、かつ未感作マウスとの比が2倍以上であったcloneを選別した。計1132 clonesに対しリンパ球刺激試験(LST)を施行し、「PTS systemマンノース特異的IIB複合体(IIBC)」を得た。IIBCの組み換えタンパクを作製しLSTを施行した結果、本症患者で細胞性免疫反応は誘導されなかった。これは組み換えタンパクが大腸菌内でアクネ菌と異なる糖修飾を受けるなど本来のタンパクと抗原性が異なることも考えられるが、感作マウスにおいて抗原となりえたタンパクの可能性もある。本スクリーニング法は効率が悪いと考え、液性免疫反応を指標とすることになるが、本症患者および健常人の血漿を用いて本菌の菌体成分に対しwestern blotを施行し、疾患特異的な反応を見せる菌体成分の同定を目指した。Western blotはIgG, IgA, IgMクラスごとに施行した。検出されたバンドは分子量解析ソフトにより分子量を決定し、陽性バンドのサイズごとにグループ化した。疾患特異的なバンドはIgGクラスで2サイズ、IgAクラスで6サイズ、IgMクラスで3サイズであったが、患者群における陽性頻度は最大で8%であった。IgAクラスでは53 kDaのバンドにおいて患者群に定量的に有意差を認めた。細胞性免疫反応を指標とした抗原スクリーニング法の開発は、分泌発現系cDNAライブラリの質に改善の余地があるものの、起因体感作マウス細胞を用いてリンパ球刺激試験による抗原スクリーニングを行う当初の計画まで到達した。しかしながら、このままスクリーニングを継続した場合、最終目的である責任抗原となりうる起因体

由来のタンパク抗原を同定するまでには膨大な労力と費用を費やさなければならず、期間も必要となる。それを避けるためにはライブラリのvectorの改良などによる効率の改善を図らなければならない。そこで並行して、サルコイドーシスに関しては本症患者および健常人の血漿を用いて本菌の菌体成分に対しwestern blotを施行し、疾患特異的な反応を見せる菌体成分の同定を目指した。鳥関連過敏性肺炎に関しても同様に患者および健常人の血漿を用いてハトの各臓器から抽出したタンパク成分に対し、western blotによる液性免疫反応の比較を行っている。サルコイドーシス患者で特異的に検出されたバンドならびに患者群で定量的に有意差を認めたバンドのタンパク抗原を同定する。組み換えタンパク作製後患者における液性および細胞性免疫反応を確認し、責任抗原候補であるかを検証する予定である。鳥関連過敏性肺炎では、現在患者と健常人で認められたバンドパターンを解析中である。患者群に有意なバンドを選別し、サルコイドーシス同様タンパク抗原を同定後組み換えタンパクによる免疫反応性の検証へと進める予定である。サルコイドーシス、鳥関連過敏性肺炎ともに起因体由来のタンパク抗原の中から患者血漿と反応を示すものをwestern blotにて選別し、選別したバンドのタンパク抗原を同定するためにTOF-MAS解析を行う。解析は学内施設に委託するが、その解析料を研究費から支出する。また、解析により同定されたタンパク質の組み換え体の作製(発現・精製)ならびにこれを使用した免疫系のアッセイに必要となる試薬を含む消耗品の購入も研究費でまかなう。
広帯域誘電分光法による高分子-低分子量分子性液体混合系のガラス転移

本研究では有極性高分子溶液の広帯域誘電分光(BDS)測定を30GHz1μHzの周波数域で行い,液体状態からガラス状態までの誘電緩和を観測し,溶液中の高分子と低分子量分子それぞれのダイナミクスとこれらが互いに及ぼす影響を調べた。1.PVPアルコール溶液の誘電緩和ポリビニルピロリドン(PVP)とモノアルコールおよび多価アルコール混合系の25°CにおけるBDS測定を行った結果,2GHz100MHzの周波数域にアルコールの緩和が,10MHz10kHzの周波数域にPVP分子鎖の運動による緩和がそれぞれ観測された。1価アルコールの緩和時間は水素結合密度ρ_Aで決まる事がわかった。一方,多価アルコールの緩和時間はρ_Aでは決定されず,1価アルコールとは異なる要因で緩和時間が決定される。また,PVPの緩和時間τは,PVP濃度とともに増加する。1価アルコール溶液中の無限希釈濃度のτは溶媒の粘性の1.3乗に比例するが,多価アルコール溶液のτは溶媒粘度に比例した。1価のアルコールと多価アルコールの溶液中のτの違いは,溶媒中の高分子の広がりや,高分子と協同的に分子運動を行う溶媒の有無などが原因であると考えられる。2.EGO水溶液の液体からガラス状態までの誘電緩和様々な分子量のエチレングリコールオリゴマー(EGO)を用い凍結せずにガラス転移温度まで温度を下げる事のできる65wt%EGO水溶液のBDS測定を10μHz10GHzの周波数域128298Kの温度範囲で行った。その結果,溶液が液体状態の高温側で観測される誘電損失の対称,非対称性が溶液を構成する2種類の分子の協同運動性と関係し,さらに低温域におけるα,β緩柏の分離機構と密接に関連していることがわかった。本研究では水以外の液体と高分子の混合系の超広帯域誘電分光(BBS)測定を30GHz1μHzの周波数域で行い,液体状態からガラス状態までの誘電緩和を観測し,高分子-低分子量分子混合系の緩和機構の一般論を確立する。ポリビニルピロリドン(PVP)とメタノールからノナノールまでの様々な炭素数の1価アルコールの混合系の25°Cにおける広帯域誘電分光測定を行った。その結果,溶液中のアルコールの緩和と,PVP分子鎖のミクロブラウン運動による緩和がそれぞれ独立に観測された。アルコールの緩和は2GHz100MHzの周波数域に観測され,PVPの緩和は10MHz10kHzの周波数域で観測された。PVP濃度の増加と共にアルコール構造によりアルコールの緩和時間が増加するものと減少するものが存在することがわかった。解析の結果,PVP濃度の増加により水素結合アクセプター密度,ρ_Aが増加するものは緩和時間が小さくなり,ρ_Aが減少するものは緩和時間大きくなる。つまり,1価アルコールの緩和時間がρ_Aによって一義的に決定されることがわかった。また,PVPの緩和時間は,いずれのアルコール溶液でもPVP濃度の増加とともに増加することがわかった。この結果は,PVPの緩和時間の濃度依存性がPVP高分子鎖同士の排除体積効果と絡み合いによって決まることを意味する。また,アルコールの構造によってPVPの緩和時間が異なるが,PVP孤立鎖の緩和時間はアルコールの緩和時間によって決定されることがわかった。現在PVP-プロパノール混合系で,1μHz30GHzの周波数域で25°Cからガラス転移温度以下(100K)の温度域の広帯域誘電分光を測定中である。これらの結果により,アルコールとPVPのそれぞれの緩和メカニズムに起因する温度依存性の違いを明らかにする。

本研究では水以外の液体と高分子の混合系の超広帯域誘電分光(BDS)測定を30GHz1μHzの周波数域で行い,液体状態からガラス状態までの誘電緩和を観測し,高分子-低分子量分子混合系の緩和機構の一般論を確立する事を目的とする。多価アルコール-PVP混合系のBDS測定ポリビニルピロリドン(PVP)と様々な構造の多価アルコールとの混合系の25°Cにおける広帯域誘電分光測定を行い,PVP-1価アルコール溶液の結果と比較した。多価アルコール溶液でも1価アルコール溶液と同様,アルコールの緩和は2GHz100MHzの周波数域で,PVPの緩和は10MHz10kHzの周波数域で観測された。溶液中の1価アルコールの緩和時間は水素結合密度ρ_Aによって一義的に決定されるが,多価アルコールの緩和時間は水素結合密度では決定されず,1価アルコールとは異なる要因で緩和時間が決定されている。PVPの緩和については,緩和時間と溶媒粘度の関係が1価アルコールとは異なる事が示された。プロパノール-PVP混合系の液体ガラス転移温度におけるBDS測定アルコールの中でも構造が比較的単純で結晶化せずにガラス化しやすいプロパノールを用い,液体からガラス転移温度までの広い温度域でアルコールに起因すると思われる3つの緩和とPVP分子鎖の局所運動に起因する緩和を観測した。純粋なプロパノールでは主緩和の高周波側に2つの副緩和が観測されたが,PVP-プロパノール溶液で観測された2つの副緩和は,1つは主緩和の低周波側,1つは高周波側に観測された。PVPの影響によりプロパノールの緩和機構が大きく変化したことを意味する。今後さらにPVP濃度を変化させて緩和を観測することにより,これらの緩和のメカニズムが明らかになると考えられる。本研究では水溶液を含む様々な水以外の液体と高分子の混合系の超広帯域誘電分光(BDS)測定を30GHz1μHzの周波数域で行い,液体状態からガラス状態までの誘電緩和を観測し,高分子-低分子量分子混合系の緩和機構を調べる事を目的とする。1.ポリエチレングリコール水溶液のBDS測定分子量600のポリエチレングリコール(PEG)を用い,65wt%PEG水溶液の温度を300K133Kの範囲で変化させBDS測定を行った。この温度範囲では65wt%PEG水溶液は凍結せず,液体から192Kのガラス転移温度を経てガラス状態の固体へと変化する。測定の結果,全ての温度で対称な広がりを持つ誘電損失ピークが一つ観測された。PEG水溶液が液体状態では,この損失ピークの温度依存性は,温度の低下と共にみかけの活性化エネルギーが増大するが,ガラス転移温度以下では,見かけの活性化エネルギーが温度に依存しない。この結果は溶液のガラス転移が,ガラス転移とは直接関係が無さそうな局所的な水分子運動に対しても影響を与えている事が示唆された。2.多価アルコール-PVP混合系のBDS測定ポリビニルピロリドン(PVP)と様々な構造の多価アルコールとの混合系の25°Cにおける広帯域誘電分光測定を行い,PVP-1価アルコール溶液と多価アルコール溶液それぞれで観測された高分子鎖の局所的な分子運動によると思われる緩和を比較した。その結果,1価のアルコール中の高分子の緩和の緩和時間は溶媒の粘性の1.3乗に比例するが,多価アルコール高分子溶液の高分子の緩和時間は溶媒粘性に比例した。
口腔粘膜疾患の基礎的研究(環境汚染物質の影響について)

本研究は,原因不明の難治性口腔粘膜疾患や歯肉増殖性疾患の病因の一部が環境汚染物質である有機塩素化合物により薬物代謝酵素の誘導と,それに続くビタミンAの減少によるものであり,種々の免疫パラメーターや酵素を誘導しホルモンリセプターの発現に影響を与え発症するという仮説を証明することを目的とした.マウスにPCB等を投与し,投与後1日,4日,7日,14日,30日,60日に屠殺し,舌,頬部,歯肉の粘膜における形態変化を光顕および電顕にて観察した.特に細胞質内における空胞の出現と核の異常がみられた.一方同組織をポッターホモジナイザーを用いてホモジナイズし,薬物代謝酵素の測定(AHH活性,NADH-cytochrome c reductase,NADPH-cytochromecreductase),vitamin Aおよびβカロチン量の測定を行い薬物代謝酵素の誘導とそれに伴うビタミンAの減少を確認した.細胞質内の空胞に関連して,Lysosome酵素である,cathepsin D,B,Lおよびacid-phoshatase,β-glucuronidaseについて,蛍光光度計および分光光度計を用いて酵素活性の測定を行った.酵素活性はやや上昇したものの有意な差は認められなかった.TGF-β,b-FGF,EGFの測定をwestern blottingにて行い,ERISA法による定量をおこなったが有意差はみられなかった.また,アンドロゲンリセプター,エストロゲンリセプター,カドヘリンを,モノクローナル抗体を用い,プレートリーダーにてERISA法による定量を行ったが有意差はみられなかった.アポトーシスとの関連についての研究の必要性が示唆された.本研究は,原因不明の難治性口腔粘膜疾患や歯肉増殖性疾患の病因の一部が環境汚染物質である有機塩素化合物により薬物代謝酵素の誘導と,それに続くビタミンAの減少によるものであり,種々の免疫パラメーターや酵素を誘導しホルモンリセプターの発現に影響を与え発症するという仮説を証明することを目的とした.マウスにPCB等を投与し,投与後1日,4日,7日,14日,30日,60日に屠殺し,舌,頬部,歯肉の粘膜における形態変化を光顕および電顕にて観察した.特に細胞質内における空胞の出現と核の異常がみられた.一方同組織をポッターホモジナイザーを用いてホモジナイズし,薬物代謝酵素の測定(AHH活性,NADH-cytochrome c reductase,NADPH-cytochromecreductase),vitamin Aおよびβカロチン量の測定を行い薬物代謝酵素の誘導とそれに伴うビタミンAの減少を確認した.細胞質内の空胞に関連して,Lysosome酵素である,cathepsin D,B,Lおよびacid-phoshatase,β-glucuronidaseについて,蛍光光度計および分光光度計を用いて酵素活性の測定を行った.酵素活性はやや上昇したものの有意な差は認められなかった.TGF-β,b-FGF,EGFの測定をwestern blottingにて行い,ERISA法による定量をおこなったが有意差はみられなかった.また,アンドロゲンリセプター,エストロゲンリセプター,カドヘリンを,モノクローナル抗体を用い,プレートリーダーにてERISA法による定量を行ったが有意差はみられなかった.アポトーシスとの関連についての研究の必要性が示唆された.
乾燥地における植林が地域の水収支に与える影響についての研究

砂漠化する地域の森林は住民の生活に欠かせないが,森林は大量の水を使うので地域の水収支への影響が懸念される。そこで,ケニヤのキツイ県で天然林の構造と人工林の生育経過と水収支を測定した所、地域の環境は多様で高密度な林分を維持できるものであり、高密度の植栽でも旺盛な成長が継続された。しかし、林床蒸発量は林冠の状態の影響を大きく受け、林分蒸発量は地域の降雨量と比べてかなり高いことも判明した。アフリカ諸国の中で最も水資源の少ない国であるケニヤでは、水源涵養と木質資源の増産を目的に大規模な植林が始まっている。その主要な造林樹種であるAcacia senegal(アカシア)とMelia volkensii(メリア)の植林後の生育経過と林地の水分状態を測定した。調査地はケニヤ中央部のキツイ県のケニア森林研究所のティバ試験林である。2002年に造成された両樹種の密度試験林と近くに残っている天然林で、毎木調査と生理特性の測定を行うと共に、土壌水分の推移を測定した。天然林の立木密度は6016個体/haと大変高く、出現種は18科22属29種にのぼり、平均降雨量は770mmに過ぎないが、多様で豊かな森林が成立する環境条件にあることが明らかとなった。アカシア人工林内にも13科14属15種が出現した。樹冠投影面積は低密度区ほど大きく、個々の個体が広い空間を占めていたが、樹冠投影面積合計は立木密度が低くなるほど小さくなる傾向を示した。胸高直径と樹高の関係から推定した最高樹高は7.5mであった。植栽13年目であるが、どの密度区においても70%を超える高い生存率を示した。展葉は12月1月と3月4月の2回あり、開花は2回の乾季(1月2月と6月9月)のうちの2月3月と7月8月であった。メリア人工林の樹冠投影面積合計は立木密度の影響を受けていなかった。推定最高樹高は9.8mであった。植栽後8年目で植栽密度が高くなるほど生存率が低くなった。2回の雨期に対して、3回(7月、1112月、34月)展葉が見られ、2回落葉した。開花は降雨量の少ない2月3月と7月におこった。土壌水分の測定は継続しているが、まだ解析結果を得るところまでは至っていない。本研究は、平成23年度から4年間を研究期間としてケニア国キツイ県で実施されている研究の3年目である。平成25年度は、2回現地調査を実施した。4月の渡航では、これまでに得られているM.volkensiiの樹液流の特性をより詳しく測定するため、試験地内の2本の樹木に樹液流センサーを設置した。樹液流センサー(SFM_R1-2、ITC社製)は、熱を出すヒータプローブと上下の温度センサープローブからなり、1時間に1回、自動的に樹液流速度を測定した。11月の渡航では、年度当初に設置した樹液流センサーからデータを回収した。さらに、樹液流速度を用いた年蒸散量の推定を行うために、プローブの設置深度を変えて測定することで樹幹内部の樹液流速度分布を測定した。また、試験林から3個体を選んで足場を設置し、蒸散速度、葉の水分特性、葉の形態の測定を行った。その後、1本を伐倒し、葉量測定を行い、単木の最大蒸散速度の推定を行うためのデータを採取した。さらに森林と水環境の関係について地理情報システムを用いた対象樹種の分布と気象要因との関係のモデル化を行い、広域的な潜在分布域の予測により、本試験地のケニアでの位置づけを行い、その結果から植林適地の分布に関する情報を整理した。2002年に造成された両樹種の密度試験林で毎木調査と生理特性の測定を行うと共に、植林適地の判定を行った。メリアとアカシアの密度変化は全く異なる経過をたどった。メリアは高密度区で高い死亡率を示し、アカシアは長く高い生存率を示した。肥大成長は両種とも早い時期から密度効果が認められ、間伐による密度管理が樹幹の肥大成長に大きな影響を与えることが示唆された。林分密度や樹木サイズが地域の水収支に与える影響を評価するため、土壌水分を測定したところ、両種とも主な吸水深度はかなり深いことが明らかとなった。

3年間のリターフォール量の季節的変化と展葉、落葉の観察より、両樹種とも比較的短期間に展葉を行い、一斉に落葉することが明らかとなった。したがって、蒸散活動を行っている期間は葉量が比較的安定していると予想された。既存の分布域の気象条件と同じ気象条件の地点を抽出することによって、両種の生育可能な地域を推定した。さらに推定精度を向上させるために、メリアとアカシアの分布と直接関係する情報の収集を進めるとともに、天然林の構造や分布の情報を元にした林分特性の類型化によって、造林樹種の生育適地の判定を試みる予定である。本研究は、平成23年度から4年間を研究期間として実施している研究の最終年度である。ケニアの内陸部でJICAが1997年に造成したMelia volkensii(以下、メリア)とAcacia senegal(以下、アカシア)の密度試験区を用いて、現在の造林木の蒸散量や土壌水分量の日変化、季節変化を測定することで、樹木個体および地域の水収支を明らかにする。さらに、間伐試験や伐倒・掘り取り調査で、生長経過や密度効果についての解析を行う。それらの結果から、乾燥地における樹木の生長が地域の環境や林分動態に与える影響を明らかにすることを目的としている。平成26年度は林分の内外の蒸発量を測定するために、メリア密度試験林の林床と林外で蒸発パンによる蒸発量の測定を行った。さらに樹木個体の蒸散量を推定するために、4個体について樹液流速度と日中の蒸散速度を測定した。それらのデータを元に、葉面積と樹冠投影面積から日蒸散量を推定し、水収支を求めた。樹冠上、中、下の日蒸散量は7.74, 5.77, 1.42mm/dayとなり、上部は下部の約5.47倍の速度を示した。単位面積あたりの日蒸散量は個体間で2倍ほどの違いはあったが、平均すると19.1mm/dayとなった。林内と林外の蒸発量は1.4mm/day、5.1mm/dayとなり、林冠被覆で蒸発量は70%ほど減少した。しかし、林冠被覆率が2%減少すると蒸発抑制効果は5%減少した。この時期の日平均降雨量は3.4mmで、裸地からは5.7mmが蒸発し、メリア林からは20.5mmが蒸発散で失われたことになる。葉量が最も多くなる時期の蒸発散量であるため、降雨量よりを大きく上回る結果となったが、乾期やその前後の落葉期の収支を求めて、年間を水収支と林分管理の関係を検討する必要があることが示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。樹木生理生態学26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度に実施予定の項目はすべて順調に終了した。さらに、次年度実施予定の蒸散量測定や同位体分析について一部実施し始めることが出来ている。当初計画では、3年目はこれまでの継続調査に加え、伐倒調査、GISによる植林適地の整理を予定していた。この目的はほぼ達成され、おおむね順調に進展しているものと判断した。さらに、個体単位および林地面積単位での蒸散量の推定にも成功した。本年度に実施予定の項目のうち蒸散量の推定がまだ不十分である。その他の項目はすべて順調に終了した。さらに、次年度実施予定の植林地適地の判定についても成果を得ることができた。初めに提出した研究計画調書に沿って研究を推進する予定であり、現在の所変更の予定はない。最終年度は、これまで得られたデータと新たに取得するデータから地域の水収支について試算を行う。また、本調査地域での林木の成長モデルを構築し、潜在的な植林ポテンシャルについて検討する。初めに提出した研究計画調書に沿って研究を推進する予定であり、現在の推進方法を変更する予定はない。
時刻依存的な睡眠パターンを形成する神経基盤の解明

生物は約1日周期の生物時計(概日時計)を内在しており、様々な生理リズムは概日時計による制御を受ける。概日時計中枢の時計細胞が刻む時刻情報から生理機能(行動・脳高次機能・代謝など)のリズムを制御する出力機構の理解は極めて重要であるが、生理リズムの基盤となる睡眠覚醒リズムでさえも、そこに至る出力経路は未解明である。本研究では、Creリコンビナーゼとウイルスベクターを用いて目的の神経細胞に特異的な遺伝子操作を行い、概日時計中枢が睡眠・覚醒の制御領域に時刻情報を伝える神経ネットワークの機能解明を行う。
骨吸収関連遺伝子改変マウスを用いた歯周炎モデルの解析及び治療薬の開発

骨吸収遺伝子であるRANKLの強発現マウス(RANKL-TG)とOPGの遺伝子欠損マウス(OPG-KO)における歯槽骨吸収量を評価した。RANKL-TGとOPG-KOは,長管骨と同様に歯槽骨量を低下させた。その低下量は,OPG-KOの方が多かった。更に,ヒトと同様にCEJ-ABCの距離を測定して,歯槽骨の喪失を評価した。その結果,OPG-KOでは,wild-typeマウスに対して約2倍の歯槽骨の喪失が観察された。一方,RANKL-TGは歯槽骨の喪失は認められなかった。この結果より,OPG量の低下が歯槽骨の喪失に重要であることが明らかとなった。歯周病は細菌感染による慢性炎症疾患であるが、病態の解明は部分的で病原因子に対する生体側の反応は明確でない。そこで,歯周病の治療を進歩させるために生体側の病態の解明が必須である。そこで,実験的歯周炎モデルの確立は,歯周炎の発症機構の解明に有効である。本研究の目的は, (1)歯周炎モデルマウスを確立すること, (2)骨吸収関連の遺伝子改変マウスを用いて歯周炎モデルを作製し,歯周炎に対する骨吸収関連遺伝子の役割を生体レベルで解析することである。(3)歯周炎モデルに歯周治療薬を投与して,薬の効果を評価することである。以上の解析は,病態の解明及び治療法を飛躍的に進歩させると考えられる。平成20年度は,マウス歯周炎モデルを確立する実験を行った。ラット歯周炎モデルで使用されている歯周病関連細菌であるP. g.菌の口腔への接種により,マウスでの歯周炎の惹起を評価する。評価項目は,ヒトと同様にセメントエナメル境から歯槽骨頂までの距離を歯槽骨吸収量として測定した。その結果, P. g.菌の接種により歯槽骨吸収が亢進する結果が得られた。現在,破骨細胞の分化因子であるRANKL強発現マウスにP. g.菌を接種して,歯槽骨吸収に及ぼす影響を検討している。これらの結果,歯周病モデルの応用により,骨吸収関連遺伝子と歯槽骨吸収の関連性が明らかになることが期待される。本研究の目的は,骨吸収関連の遺伝子改変マウスを用いて歯周炎モデルを作製し,歯周炎に対する骨吸収関連遺伝子の役割を生体レベルで解析することである。更に,歯周炎モデルに歯周治療薬を投与して,薬の効果を評価することである。平成21年度は,骨吸収遺伝子であるRANKLの強発現マウス(RANKL-TG)とOPGの遺伝子欠損マウス(OPG-KO)における歯槽骨吸収量を評価した。これらの結果より,OPG量の低下が歯槽骨の喪失に重要であることが明らかとなった。次に,骨吸収抑制薬であるビスホスホネートをOPG-KOに投与した。その結果,ビスホスホネート投与により,腰椎の骨密度は有意に上昇した。OPGO-KOの歯槽骨量の減少および歯槽骨喪失を防ぐことが出来た。以上の結果より,OPG-KOマウスは歯槽骨喪失の新規モデルであることを見出した。このモデルにより,歯槽骨吸収に対するビスホスホネートなどの骨吸収抑制薬の評価を行うことが出来る。OPG-KOは歯周病の病態解明及び治療薬および治療法の開発に有効なモデルである。
歌舞伎を中心とした演劇雑誌の研究

主要な歌舞伎雑誌の総目次の統合と総覧をめざすための、演劇雑誌全般に関する基礎的調査を行うという点では、所期の成果を収めることができた。創刊から終刊までの大半を押さえる雑誌タイトルは、研究着手時点の3倍に近い約110誌を数えるに至った。そのなかには、公的機関への収蔵がまったく知られていないタイトルも含んでいる。雑誌メディアを通して歌舞伎という文化が近代に占めていた位置の大きさを再確認するという点においても、より大きな発表機会のための基礎調査を行い得た。前年度に引き続いて、演劇雑誌の発掘と、整理を進めた。現在、103タイトルの演劇雑誌について、電子化の整理検討と、目次の整理を進めている。最も代表的な演劇雑誌である「演芸画報」など、総索引がありながら総目次の作成されていない雑誌を優先的に取り上げる予定である。さらに、公共機関に所蔵が知られていない雑誌(「新舞台」など)も発掘することができた。これらを総合して、楽劇学会例会において、「歌舞伎雑誌の系譜」(3月4日)と題する研究発表を行い、明治以来の演劇雑誌の刊行と普及について、おおよその全貌を示すことができた。同発表では、1)鑑賞誌、2)研究・批評誌、3)グラフ誌、4)ファン雑誌、5)劇場広報誌、6)劇壇同人誌、に分類した独自の体系案を提示し、刊行時期・判型・写真頁の扱いなどを勘案した整理分類の試みを公表した。これらは、従来の歌舞伎を中心とした演劇雑誌研究を包括的に継承し、より多くのタイトルを分類整理しうる体系の樹立をめざすものと位置づけている。雑誌記事に関わる研究としては、雑誌記載の一代記を参照して、知られざる女性芸能者「お狂言師」の活動について、AAS(Association for Asian Studies)のフィラデルフィア大会におけるテーブル「Women on the stage」で英語論文発表を行った。また、ニューヨーク市立図書館において発掘した未紹介のフィルムについて、演劇雑誌(「帝劇」「東宝」)と照らし合わせることで、フィルムの概要や意義を解明しうることを知り得た。本研究は、歌舞伎を中心とした演劇雑誌の総合的研究をめざすもので、その第一の段階として、創刊から終刊までをおさえた雑誌タイトルをできるだけ多く増やすことと、その細目を集積するための情報収集をめざしている。初年度である24年度までに、99種の雑誌に着手しており、その他に1号で終わったと思われる雑誌数種を数えている。以上をふまえて、すでに着手の用意ができている入力作業を進めるのと並行して、共通して検索をかけるための条件作り、ないし目次統合のための条件をさぐることをめざしつつ、各種雑誌の複写とデータ化を進めた。調査先は、蔵書量と閲覧の利便性から、早稲田大学演劇博物館と国立劇場伝統芸能情報館を中心にした。また、表紙の複写の利便性からは、架蔵分が最も有効であり、欠本を補いつつ、演劇博物館等にも所蔵のない演劇雑誌の収集につとめた。これらの結果、主要演劇雑誌59種の、創刊と終刊を図示化した鳥瞰図「歌舞伎雑誌の変遷」を、『最新版歌舞伎大事典』(柏書房)の巻末付録として掲載することができた。あわせて、同事典の演劇雑誌関係項目の多くを執筆し、現時点における演劇雑誌に関する知見を、従来の成果よりも広げることができた。また、雑誌の表紙の美術的価値およびデザイン性等について、「歌舞伎と近代美術」を主題するシンポジウム(歌舞伎学会秋季大会)において、基調講演を担当することで、演劇と美術を架橋する場所としての演劇雑誌の役割について言及した。前年度以前に引き続いて、演劇雑誌の発掘と、整理を進めた。現在、147タイトルの演劇関連雑誌について、電子化の整理検討と、目次の整理を進めるに至った。前年度のおよそ1.5倍のタイトル数を数える。目次の整理と並行して、雑誌の公開・紹介の検討も行い、テストケースとして、演劇博物館における展示「寄らば斬るぞ!ー新国劇と剣劇の世界」において、雑誌「新国劇」35冊の全ページの複写を展示会場でPDF公開する機会を得た。また、演劇雑誌をはじめとするメディアの歴史や演劇ジャンルの階層化をめぐって、日仏演劇学会(ストラスブール大学)における研究発表「日本における劇場の分布と演劇の階層化」、およびAAS(Association for Asian Studies)シカゴ大会における研究発表「A Media Hisotry of Kabuki and Actor's Body」をおこなう機会を得た。これらによって、歌舞伎を中心とする演劇雑誌の存在を、演劇をめぐるメディア研究の中に位置づけるとともに、その重要性を再認識させる足がかりを得た。前年度に続き、公共機関にない雑誌や、従来言及されたことのない雑誌の出現も少なからずあり、とりわけ「演藝写真」(19221927)や「演藝」(19251926)は、舞台写真の歴史を考える上で重要な雑誌であることが判明した。

また、これまで知られていない「藝界」(1911年)が、のちに劇作家として大成する行友李風が劇作修業時代に主宰し、習作も載せている点で注目に値する雑誌であることなどもわかった。こうした新発掘の新資料が相次いだこともあり、目次の整理と入力作業の進捗がややはかばかしくないまま、期間を終了することとなってしまった。この点については、本研究の後継と位置づけられる次年度以降の演劇とメディアをめぐる科研費事業において、さらに補ってゆく予定である。歌舞伎、日本演劇演劇雑誌の発掘と整理については、おおむね順調に進展していると考えている。これらの中から、どのように効率的に目次をデータ入力してゆくかが、次なる課題になる。研究成果を利用した発信については、展示や図録作成、口頭発表、論文発表など、様々な形態が考えられ、いくつかについては、次年度にも具体的な計画を有している。演劇雑誌のデータ化と情報収集については、当初の計画通り順調に進展している。従来ほとんど知られていなかった雑誌の出現などもあり、その点では「喜ばしい誤算」も含めて、およそ順調に情報収集はできていると判断する。研究成果を公表するという点でも、機会に恵まれたといってよいと判断する。これらから、総目次を完成させてゆくためのデータ入力に力をいれることが、次年度以降の課題となると思われる。雑誌「新国劇」の全貌を初めて紹介する機会を、展示や図録において計画している。これをひとつのテストケースとして、今後、どのように雑誌の創刊から終刊までを紹介するか、宝塚歌劇の100年史(雑誌「歌劇」ほかの全表紙を図版紹介している)などの試みを参照しながら、試行することになろう。各雑誌の総目次の統合については、データ入力の効率的な方法の模索とともに、今年度の最重要課題として推進してゆく予定である。どのように重点的なマンパワー配分を行い、将来の進展につなげてゆくか、模索することとなろう。これまでの成果を踏まえて、演劇雑誌の情報収集につとめることが第一となる。99種を数える雑誌のタイトルを、一つでも増やしてゆくことが当面の目標である。また、これらの目次細目を入力するに当たり、アルバイトに作業をさせることになるが、多くの雑誌を統合して、どのような統一フォーマットを作るか、これまでの検討を踏まえながら結論を出してゆくことが急がれる。雑誌表紙についても、画像データの収集を進め、今年度は写真を中心とした大判雑誌のデータ収集に力を注ぐ予定である。昨年度未消化の1万円未満の研究費は、演劇雑誌および周辺資料の購入にあてる。
西アジアの都市化における土器製作技術の多角的研究

本研究により、人々の暮らしに欠かせぬ「火の利用」の一端に迫ることができた。復原構築した窯による焼成実験の結果、彩文土器の焼成には800°C以上の温度を約1時間維持する必要があり、900°C以上の高温を1時間以上持続させることで西アジア都市形成期の彩文土器に近い硬質な仕上がりとなることを確認した。また、黒色顔料(二酸化マンガン)よりも赤褐色顔料(酸化第二鉄)の吸着に高度な技術が必要であったことも確かめた。本年度は、国内に収蔵されている西アジアの都市形成期(ウバイドウルク期)の土器資料を観察して製作技術について比較分析した。とくに、東京大学総合研究博物館に収蔵されているシリア・アラブ共和国のテル・コサック・シャマリ遺跡で出土した都市形成期の土器を詳細に肉眼観察した。また、中近東文化センターに収蔵されている都市形成期の土器資料もあわせて肉眼観察した。こうした観察所見をもとにして成形・器面調整技法に留意しながら、ウバイド期の彩文土器の復原を試みた。まず、信楽テラコッタ粘土(約500g)で用意した粘土紐を輪積みして鉢器形を成形し、実際の土器片を製陶具としてケズリ・ナデ調整を器面に施し、黒色陶芸用絵具を絵筆で塗彩した。つぎに、郊外(早稲田大学本庄キャンパス)にて、研究協力者に手伝ってもらいながら小型土器焼成実験窯を築窯した。同地では、すでに実験窯が設置済みであったが、焼成効率の向上を狙って規格の小さい実験窯を新たに構築した。築窯後、上述の復原製作品を試験的に焼成する実験を行った。その結果、ある程度の高温状態を一定時間維持することに成功し、焼き上がった作品の器面に彩文が適度に吸着していることを確認できた。他方、特定領域研究「北メソポタミアにおけるアッシリア文明の総合的研究」(代表:沼本宏俊)の研究分担者としてシリア・アラブ共和国へ渡航した。幸いにも現地滞在中に、ユーフラテス川流域の都市形成期の遺跡を踏査し、該当期の土器資料を現地で肉眼観察する機会を得た。その結果、シリアにおけるユーフラテス水系のウバイド土器の胎土は、イラク国境付近からトルコ国境付近にかけて、ほぼ同質な混入物を含有する、というこれまでの見通しを確認することができた。本年度も引き続き、国内に収蔵されている西アジアの都市形成期(ウバイドウルク期)の土器資料を観察して製作技術について比較分析した。とくに、岡山市立オリエント美術館に収蔵されているシリア・アラブ共和国の都市形成期の表採土器資料を詳細に肉眼観察した。こうした観察所見などにもとづいて、前年度と同様の成形・器面調整技法でウバイド期の彩文土器を製作した。10月初旬、前年度に築窯した小型土器焼成窯において焼成実験を行った。その結果、前年度に比べて短時間かつ少量の薪で高い温度を出すことができ、良好な焼上りとなった。また、昇温時に焚口から送風することにより、900°C以上の高温帯を約1時間持続させることが可能となった。総じて、すべての個体はウバイド彩文土器に近い硬質な焼き上がりとなり、とくにマンガン系黒色顔料はほぼ吸着することを確認した。他方、トルコ共和国およびシリア・アラブ共和国へ渡航し、ティグリス川およびユーフラテス川流域の都市形成期の遺跡や博物館を見学し、現地の研究者と情報交換や意見交換を行った。その結果、前年度において得られた見通しをさらに強めることとなり、ユーフラテス水系のウバイド土器は、イラク国境付近からシリアおよびトルコにおいて、ほぼ同質な技術のもとで製作されていたことを確かめられた。同時に、ティグリス水系のウバイド土器は、とくに胎土に関してユーフラテス水系とは異なる様相も改めて確認できた。昨年度に引き続き、国内に収蔵されている西アジアの都市形成期(ウバイドウルク期)の土器資料を観察して土器製作技術について比較分析した。本年度は、古代オリエント博物館に収蔵されているウバイド彩文土器のゴブレットおよび直線状外向鉢などを詳細に観察し、実測図を作成するとともにデジタル一眼レフカメラにより撮影記録を行った。同時に、こうした土器資料の観察と併せて、昨年度まで実施してきた屋外の小型土器焼成窯での焼成実験の成果を検証するために、屋内に設置してある電気焼成窯を用いて彩文土器の顔料吸着実験を行った。屋外での焼成実験とほぼ同様の環境(時間経過と昇温の相関)をプログラム設定して、電気窯にて屋外での焼成状況を再現し、とくに二酸化マンガンと酸化第二鉄の顔料の吸着に関する有効性を検証実験した。検証実験の結果、900°C以上の高温帯を約1時間持続させることで、ウバイド彩文土器に近いかなり硬質な仕上がりとなり、二酸化マンガン(黒色顔料系)は器面に十分に吸着することを確認した。

また、酸化第二鉄(赤褐色系顔料)に関しては、900°C以上の高温帯を約1時間維持するだけでは、彩文の吸着が不十分であることも確かめた。さらに、ウバイド彩文土器に特徴的な多重色調(赤褐色黒褐色)は、酸化第二鉄による発色であることも追認できた。いずれも屋外での焼成実験の成果と合致する結果となり、これまでの一連の焼成実験が有効性をもつことを検証できた。以上の研究成果について、日本西アジア考古学会および早稲田大学考古学会にて研究発表し、論文等でも成果の公表に努めた。
高地でのバースト測定器の設置によるPeV領域一次宇宙線組成の研究

チベットに建設している空気シャワー観測装置(32000m^2)とエマルションチェンバーを連動して運転し、ファミリーとそれに伴う空気シャワーを同時に観測すれば、PeV領域の宇宙線陽子成分のスペクトルを測定できる。平成6年度には、この連動実験のために必要なバースト測定器を製作して調製し、現地への設置に備えるとともに、運転中の装置(8100m^2)による空気シャワーの観測データを用いてPeV領域の宇宙線の全粒子成分のスペクトルを測定して、ファミリーの観測から推定した陽子成分のスペクトルと比較検討することを目的とした。1.バースト測定器(0.8m^2を1単位として4単位)を製作して、点検し調整した。これにより、(1)この測定器のシンチレータの減衰距離を測定して200cm程度であるとの結果を得たこと、(2)この測定器のフォトダイオードのための増幅器として300倍を越えるゲインのものを製作できたこと、により、このバースト測定器を用いて、ファミリーによる10TeV以上のバーストを20cmの分解能で位置決定できることを確認した。これらは平成7年度に現地へ運搬して設置し、空気シャワー観測装置とエマルションチェンバーの連動運転に用いて、PeV領域の宇宙線の陽子成分のエネルギースペクトルを測定する。2.また、運転中の装置(8100m^2)による空気シャワーの観測データを用いて5×10^<14>-2×10^<16>eV領域の宇宙線の全粒子成分のエネルギースペクトルを測定した。その結果、(1)宇宙線の全粒子成分のスペクトルのいわゆるニ-(knee)はエネルギー2×10^<15>eV程度であること、(2)スペクトルの変化は滑らかで、ベキの急激な変化(kink)はなく、また、コブ(bump)もないこと、(3)これをエマルションチェンバーによるファミリーのこれまでの観測から推定した陽子成分のスペクトルと比較検討すると、ニ-領域では陽子成分は20%以下に減少していること、を確認した。これらの結果は、すでに平成6年8月、チベット国際宇宙線シンポジウムで報告しており、また、平成7年9月ローマの宇宙線国際会議で報告する予定である。
広ダイナミックレンジ画像の高速・高画質圧縮手法の研究

H23年度の研究実施計画では、コントラスト低下を招かないハロー効果抑制を目的としていたが、未解決だった中間期度におけるコントラスト強調の問題の優先度を上げ、これの改善に取り組んだ。これまでに構築した捕正システムは、局所的に自然なコントラスト強調を行うことを可能にしたが、特定の中間輝度範囲において得られるゲインが低くなってしまう。当学年度で実施した研究では、総ての輝度領域にわたって一定のゲインが得られ、ゲインをパラメータ調節できるように補正システム改善することに成功した。今回、補正関数を構成する基底関数として、ガンマ補正関数の代わりにシグモイド関数を用いた。前年度に組み込んだ階級平均値はシグモイド関数の中心として用いられ、階級ごとのシグモイド関数を加算することで変換関数が得られる。これにより、前年度の補正システムと比較して局所ヒストグラムごとの適切なゲインを一定に割り当てることができるようになり、画像特性によって補正効果が左右されることがなくなった。また.前の補正システム同様に階級境界における連続性を保ち、アーティファクトは抑制される。さらに、前の補正システムにおける基底関数に対する複数の階級平均値の重み付けが不要となり、処理が高速化された。シグモイド関数の採用によりゲインが改善したが、コントラストが強調されることでグラデーション領域に階調差起因のストライプ状のアーティファクトを発生した。しかし、局所ヒストグラム取得の際に、隣接画素の差分(エッジ情報)を取得し、グラデーション/テクスチャヒストグラム分類し、それぞれのヒストグラムに合わせたシグモイド関数のゲインを割り当て、重み付けすることで、アーティファクトの抑制とともに、テクスチャ詳細のコントラスト強調も同時に実現できた。以上、23年度研究成果は、ソフトウェアツールとして完成させ、従来の補正システムによる画質を大幅に向上することで、研究目的の達成を行なった。22年度の研究実施計画では、階級数の削減に起因するアーティファクトの抑制を、前処理工程から得られた適正な階級幅から行うことを目的とした。当該年度で実施した研究では、このアーティファクトの抑制を画像補正システムの内部に組み込むことに成功した。今回、画像補正の局所的パラメータとしてヒストグラムに加えて新たに階級平均値を導入した。階級平均値は階級内のヒストグラムの分布を表し、階級数の削減によって失われた階級境界の情報を補うことを可能とした。階級平均値を重みとしてヒストグラムを制御することで、画像補正システムは外部パラメータなしにアーティファクトを抑制した。本手法は、階級幅制御と比べて局所的な画質調整の幅を大きくし、画像補正システム一つでアーティファクトを抑制するため、システムの信頼性が高い。また、二極化したヒストグラムが存在する領域で発生するハロー効果は業界でもよく議論される問題だが、これを抑制する手法を提案した。階級ごとにヒストグラムをガウス関数により重み付けし、ヒストグラムを一極の輝度階級に集中させることでハロー効果の抑制を行った。通常のハロー効果の抑制はバイラテラルフィルタを用い、輝度・空間のパラメータを併用して処理するため、演算量が多く、画質調整も困難である。ハロー効果をヒストグラムの輝度成分から抑制する手法はバイラテラルフィルタに比べて高速であり、これまでに提案した画像処理システムを使用することで自然な画質を得ることができる。このように、ハロー効果抑制をヒストグラムからアプローチする手法は業界としても前例が無く、画期的と言える。以上、22年度の研究成果はこれまでの画質補正システムの制御性を大幅に向上させるものであり、研究目的に大きく近づく結果となった。
歯周病原菌のタンパク分解系と鉄獲得機構の相互関係の研究

Prevotella nigrescensはグラム陰性嫌気性歯周病原菌の一つであるがシデロフォアを欠損しているので他の特殊な鉄獲得機構が備わっていると考えられる。事実、キレーティング試薬で除鉄処理された培地ではP.nigrescensは発育できないが、これにヘモグロビンやミオグロビンを加えると発育できる。菌体とヘモグロビンを混合して反応させるとヘモグロビンは菌体に結合することが判明した。このことはヘモグロビン結合タンパク(HbBP)が菌体に表層部に存在することを示唆する。結合は菌体を超音波処理と100,000g遠心で調製したエンベロープとでも起こるり、その結合はpH依存性で酸性緩衝液中で起こるが、アルカリ性緩衝液中では起こらない。さらに結合したヘモグロビンはアルカリ性緩衝液中でエンベロープから解離することも分かった。湿重量1mgのエンベロープは最大51.2μgのヘモグロビンと結合しpH5.0での解離定数はScatchard法で2.1×10^<-10>M(210 pM)と算定された。エンベロープを非イオン性デタージェント(CHAPS)で可溶化した画分はヘモグロビンと結合するすることがドットプロット法で確認され、HbBPをイオン交換クロマトグラフィー、ヘモグロビン-アガロースでのアフィニティクロマトグラフィー、等電点電気泳動で分離精製した。精製標品もヘモグロビンなどヘムタンパクと結合できることも確認した。HbBPの分子量は46 kDa、等電点は6.1であった。本課題研究によりP.nigrescensがHbBPを持ち、出血部位のヘモグロビンからヘム鉄を獲得している可能性が考えられるに至った。1.タンパク分解酵素(プロテアーゼ)の探索培養上清,細胞抽出液(超音波処理上清),エンベロープ抽出液には有意のタンパク分解活性は観察されず今後の課題として探索を継続する.菌を鉄欠乏培地での増殖はほぼ完全に阻害され,これにヘミンまたはヘモグロビンを加えると対照の鉄欠乏非操作培地での増殖レベルに回復しヘム要求性であることが確認された.3.エンベロープとヘムタンパクの結合エンベロープと4種のヘムタンパクとの結合がみられその結合の強さの順はヘモグロビン,ミオグロビン,チトクロームc,カタラーゼであった.またヘモグロビンは全菌体とも結合するが,outer membraneとはほとんど結合しなかった.この結合能は70°C,15分加熱しても低下はなかった.ヘモグロビンの結合には強いpH依存性がありその至適pHは4.55.0で中性pH以上での結合はほとんどなかった.さらに結合したヘモグロビンは高pHでエンベロープから解離することが判明した.1分間に1mgのエンベロープが結合するヘモグロビンの最大量は600pmol/lであった.ヘモグロビンとエンベロープの解離定数(Kd)は210pmol/lであった.4.ヘモグロビン結合タンパク分離の試み現在エンベロープのオクチルピラノシド抽出物を出発材料として,イオン交換クロマトグラフィークロマトグラフィー,ヘモグロビンアガーロースを用いたアフィニティクロマトグラフィーでヘモグロビン結合タンパクの分離精製作業を行っており継続年度も続行することにしている.細菌は発育上鉄が必要であることは当然であるが宿主生体内の遊離鉄濃度は極端に低く(10^<-18>Mレベル),細菌の必要とする濃度の10^<-10>10^<-11>に過ぎず

これでは細菌は生息できない.いたがって病原細菌には鉄キレート機能を持つシデロフォアが備わっておりトランスフェリンやラクトフェリンなどの鉄運搬タンパクに結合した鉄原子をキレートしている.しかしPrevotella nigrescensをはじめPorphyromonas gingivalisなど歯周病原菌はこのシデロフォアを欠損しているので別の手段で鉄を獲得している筈である.今回P. nigrescens菌体および3日間嫌気培養した菌体の超音波処理で得たエンベロープがヘモグロビンを含むヘムタンパクに結合することを観察した.その結合様式はpH依存で,酸性溶液中ではよく結合するが中性,アルカリでは起こらない.また結合したヘモグロビンはアルカリ溶液中でエンベロープから分離する.タンパク分解酵素阻害剤や種々のタンパク変性剤で結合の阻害は見られなかった.また60°Cで予め加熱処理したエンベロープでもヘモグロビンとの結合能に変化はなかった.湿重量1mgあたりエンベロープに結合するヘモグロビンは51.2μgでpH5.0での解離定数(Kd)は2.1×10^<-10>M(210pM)であった.このタンパクをヘモグロビン結合タンパク(HbBP)とし,ヘモグロビン-アガーロースを用いたアフィニティクロマトグラフィー,等電点電気泳動でエンベロープのデタージェント抽出液より分離精製した.その分子量は46KDaで等電点は6.1であった.HbBPはヘモグロビンのみならずミオグロビン,カタラーゼにも結合するがチトクロームCへの結合は微弱であった.
がん組織におけるリンパ管・血管新生の共通分子機構

がんの進展・転移状況は、その予後を大きく規定する。腫瘍内の血管・リンパ管新生は、がんの進展・転移に果たす役割は大きいため、その分子機構を解明することは、がん制御に重要不可欠な研究である。本研究により、腫瘍原発巣の微小環境の変化でアンジオポエチン様因子2発現が著明に誘導され、腫瘍血管・リンパ管新生促進などを介してがん進展・転移を促進させること、その制御ががん転移の新規治療法開発に貢献できる可能性を明らかにした。がんの制御を目指し、がんの生物学的特性である「発生(発がん)」、「増殖」、「進展」を考慮し、本研究においては、発がんに続くステップ「増殖」及び「進展」、さらに遠隔転移においてその病態形成の中心的役割を果たしている『血管新生』『リンパ管新生』に着目し、がん組織におけるリンパ管・血管新生の共通の分子機構を明らかにすることを目指し研究を進めてきた。平成17年度は(1)リンパ管内皮特有な分子であるマウスLYVE-1(Lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor-1)に対するモノクローナル抗体の作成に成功した。このLYVE-1抗体で蛍光細胞分離装置(FACS)を用いてマウス胎児より発生過程でのリンパ管内皮細胞を純化、単離することが可能となった。純化・単離されたリンパ管内皮細胞の解析で今まで血管系で重要と考えられていたシグナルの受容体(VEGFR1,VEGFR2,TIE2)などがLYVE-1陽性のリンパ管内皮細胞にも同等量発現していることを見出した。このことは、血管新生・リンパ管新生には共通の分子機構があることを強く示唆する結果であると考えている。特に、血管内皮細胞とリンパ管内細胞に発現するTie2受容体のリガンドであるアンジオポエチン(Ang)シグナルがリンパ管新生にも重要であることを明らかにした。リンパ管研究が血管研究に比較して大きく遅れている理由の一つとして、その細胞株の有無も一つの起因としてあげられている。血管、リンパ管の比較にはその細胞内シグナルの比較も必須であるため、ヒトリンパ管腫よりリンパ管内皮細泡の細胞株樹立に成功した。この細胞株と複数の血管内皮細胞株で発現する分子の比較険討を行ったが、今まで血管系で重要と考えられていたシグナルの受容体(VEGFR1,VEGFR2,TIE2)などがリンパ管内皮細胞株にも同等量発現していることを見出し、このことからも、血管新生・リンパ管新生には共通の分子機構があることが確認できた。がん組織におけるリンパ管・血管新生の共通分子機構の解明研究遂行に際し、リンパ管内皮細胞を単離・同定できる抗体作成を目指し、免疫染色、FACSに使用できるマウスLYVE-1抗体の作成に成功したことを昨年度報告した。これまで、リンパ管内皮細胞を単離・同定できる抗体は海外の研究室にしかなく自由に使用できないことが、国内のリンパ管研究の推進にあたり障害となっていたが、我々の作成したマウスLYVE-1抗体を国内の研究者に配布し、多くの研究グループがこの抗体を用いることによりリンパ管を用いた研究で成果を上げ、一部は既に論文として報告されはじめたことは、国内におけるリンパ管研究のインフラ整備に貢献できたと考えている。また、ヒトリンパ管腫症例のリンパ管腫摘出症例からヒトリンパ管内皮細胞株の樹立を行い、さらに不死化にも成功し(投稿準備中)、リンパ管研究のin vitroでの研究推進に役立つものと考えている。さらに本年度掲げた研究プロジェクトの中で「アンジオポエチンシグナル制御による悪性腫瘍の進展・転移制御解析」に関しては、アンジオポエチンシグナルを負に制御するために特異的受容体であるTie2受容体の可溶型Tie2受容体及びファミリー分子のTie1受容体の可溶型Tie1受容体を発現するアデノウイルスを作成し、マウスにおける腫瘍移植モデルでその効果を検討した。複数のがん細胞株を用いた実験で可溶型Tie2受容体が腫瘍増大を抑制する効果があることを見出しており、現在その機構を検討している。また、「Angpt1シグナル制御による悪性腫瘍の進展・転移制御解析」に関しては、Angpt12が様々ながん細胞株で発現が亢進していることを見出した。また、Angpt12の生物学的機能として血管新生作用、リンパ管新生作用、単球遊走能促進を見出しており(投稿準備中)がんの増大、進展、転移に関わっている可能性を見出しており、その抑制が治療につながる可能性を考え、現在中和活性を有する抗体の作成を試みている。我々はアンジオポエチンシグナルとがんに関する研究で血管内皮細胞とリンパ管内皮細胞に発現するTie2受容体のリガンドであるアンジオポエチンシグナルが血管制御のみならずリンパ管新生重要であることを明らかにし、リンパ管内皮細胞を同定できる抗Lyve-1抗体の樹立に成功してきた。本年度はアンジオポエチンとTIE2受容体との結合に対して競合的に結合することによってアンジオポエチンシグナルを抑制させる可溶型Tie2受容体タンパクを作製し、マウスへの腫瘍移植モデルにおいてアンジオポエチンシグナルの阻害と腫瘍増大・進展の関連を検討した。