hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
看護職における交代勤務に伴う眠気に関する疫学研究

夜勤前後の睡眠では、三交代勤務の深夜が平均3時間37分の短時間の睡眠であり、入眠潜時は「5分以下、20分以上」が多く、睡眠状況においても「ほとんど眠れない」が40%を越えており、質の良い睡眠がとれていない状況であった。主観的な睡眠の質は、「やや悪い」「とても悪い」が42.8%を占め、交代勤務が非交代勤務より有意に高かった(P<0.001)。主観的な睡眠の質とJESSの相関係数ρ=0.084であり、IESSが高値で眠気が強い状態でも主観的な睡眠の質を悪く評価していないことが考えられ、眠気が自覚しにくい状況にあることが推察される。以上のことから、勤務中における眠気のセルフチェックの必要性が示唆された。
高等植物ゲノムにおける転写開始複合体の多様性と機能分化

本研究によって、進化の過程で葉緑体ゲノムから核に転移した遺伝子群はコアプロモーター領域の構造に特徴的な類型のあること、この類型は正常な転写調節に必要であること、さらに、植物核遺伝子群のプロモーターを構成する上流調節領域とコアプロモーター領域は、それらを組み合わせたときに正常な転写が生じるかどうかによって、いくつかのサブグループに分類されること等が明らかになった。これらの知見は、高等植物の核ゲノムでは機能的に分化した多様な転写開始複合体が使われており、それらを介した高次の転写制御ネットワークが存在していることを示唆している。本研究では、以上の生化学・分子生物学的アプローチに加えて、新たにゲノム科学的なアプローチを導入し、このネットワークの多様性の解析を進めた。まず、植物のコアプロモーターを網羅的に同定/解析するために、新たに、CT-MPSS法と名付けた転写開始点の超ハイスループット決定法を開発した。この方法用いてシロイヌナズナの核ゲノム上に、およそ16万の転写開始点タグ配列をマップした。これは、植物の転写開始点に関する情報としては世界最大の規模である。次に、これらの転写開始点情報を基にして、その近傍にあるコアプロモーター配列の包括的解析を進めた。その結果、例えば、動物ゲノムの転写開始領域に頻出するCpGアイランドが植物ゲノムでは見出されず、動物のCpG配列に相当するニッチを植物ではピリミジンに富んだ配列が占めているなど、動物ゲノムと植物ゲノムでは、コアプロモーターの構造や性質に様々な差異のあることが明らかになった。また、これらの研究成果を一般に公開するために、新たに植物プロモーターデータベースppdbと名付けたデータベースを作成した。植物核遺伝子の転写研究では、これまでコアプロモーターや基本転写機構の多様性は殆ど注目されてこなかった。しかし、筆者らは、光合成核遺伝子に関する研究の中から、進化の過程で葉緑体ゲノムから核に転移した遺伝子群はコアプロモーター領域の構造に特徴的な類型のあること、この類型は正常な転写調節に必要であることを見出した。さらに、植物核遺伝子群のプロモーターを構成する上流調節領域とコアプロモーター領域は、それらを組み合わせたときに正常な転写が生じるかどうかによって、いくつかのサブグループに分類されることを見いだした。これらの知見は、高等植物の核ゲノムでは機能的に分化した多様な転写開始複合体(PIC)が使われており、それらを介した高次の転写制御ネットワークが存在していることを示唆している。しかし、その分子的実体や進化的な位置づけなどはまだ明らかにされていない。本研究は、植物核で機能する多様な転写開始複合体(PIC)について、特にコアプロモーターサブタイプの特異的認識に関連している成分を比較プロテオミクスの手法で同定すること目的としている。本年度は、主に以下の3点について解析を進めた、(1)パーティクルガンによる一過的発現系で、タバコの葉組織に於ける種々のキメラプロモーターの転写活性、光応答などを解析し、その結果を基に、PIC成分の比較分析に用いるモデル遺伝子を選定した。(2)タバコの培養細胞からプロトプラスト法で調製した単離核に、外来遺伝子を加え、in vitroでの転写活性を検討した。その結果、この系でde novoの転写が生じることが明らかとなり、現在、転写系の作成法や反応条件などについての検討を進めている。(3)合成シリコンオイルを用いた核の単離精製法について、条件検討を進めている。

これらの知見は、高等植物の核ゲノムでは機能的に分化した多様な転写開始複合体(PIC)が使われており、それらを介した高次の転写制御ネットワークが存在していることを示唆している。しかし、その分子的実体や進化的な位置づけなどはまだ明らかにされていない。本研究は、植物核で機能する多様な転写開始複合体(PIC)について、特にコアプロモーターサブタイプの特異的認識に関連している成分を比較プロテオミクスの手法で同定すること目的としている。本年度は、昨年度の成果を基にして、LC/MS法による包括的蛋白質同定の条件検討を行った。その結果、タバコから抽出した核酸結合性蜜白質を実験試料としたところ、シロイヌナズナのデーターベースとの比較では、目的とする差分蛋白質成分の同定は困難だった。そこで、新たに、シロイヌナズナの光合成培養細胞を入手し、それを使った実験系の再構築に取り組んだ。昨年度までの研究によって、進化の過程で葉緑体ゲノムから核に転移した遺伝子群はコアプロモーター領域の構造に特徴的な類型のあること、この類型は正常な転写調節に必要であること、さらに、植物核遺伝子群のプロモーターを構成する上流調節領域とコアプロモーター領域は、それらを組み合わせたときに正常な転写が生じるかどうかによって、いくつかのサブグループに分類されること等が明らかになった。これらの知見は、高等植物の核ゲノムでは機能的に分化した多様な転写開始複合体が使われており、それらを介した高次の転写制御ネットワークが存在していることを示唆している。本年度の研究では、これまでの生化学・分子生物学的アプローチに加えて、新たにゲノム科学的なアプローチを導入し、このネットワークの多様性の解明を進めた。まず、植物のコアプロモーターを網羅的に同定/解析するために、新たに、CT-MPSS法と名付けた転写開始点の超ハイスループット決定法を開発した。この方法用いてシロイヌナズナの核ゲノム上に、およそ16万の転写開始点タグ配列をマップした。これは、植物の転写開始点に関する情報としては、現時点では世界最大の規模である。次に、これらの転写開始点情報を基にして、その近傍にあるコアプロモーター配列の包括的解析を進めた。その結果、例えば、動物ゲノムの転写開始領域に頻出するCpGアイランドが植物ゲノムでは見出されず、動物のCpG配列に相当するニッチを植物ではピリミジンに富んだ配列が占めているなど、動物ゲノムと植物ゲノムでは、コアプロモーターの構造や性質に様々な差異のあることが明らかになった。以上の研究成果を整理して一般に公開するため、新たに、植物プロモーターデータベースPpdbと名付けたデータベースを作成した。
奥州藤原氏と蝦夷ヶ島の砂金

奥州藤原氏は、約百年にわたって東北地方を支配した。その富の源泉は砂金である。世界遺産の中尊寺金色堂は、黄金に輝く建物で有名である。瀬川拓郎は、北海道のアイヌが交易品として砂金を平泉に持って行ったとする仮説を立てた。本研究の目的はその仮説の検証である。まず、北海道と東北地方の砂金を分析した。つぎに藤原秀衡の別邸の柳之御所遺跡から出土した遺物に付着した砂金を分析した。両者を比較することにより、北海道の砂金が平泉にもたらされていたかどうかを確認した。これまでの検討では、平泉から出土した砂金は岩手県産のものである可能性が高い。北海道から砂金が持ち込まれたとする仮説は証明できなかった。北海道の太平洋岸の遺跡からは、「かなまり」という特徴的な金属食器が出土する。これらの遺物は、奥州藤原氏への朝貢に対する対価として与えられたと思われる。ただし何が朝貢されたかはわかっていない。一方、1970年代に奥州藤原氏が建立した平泉の中尊寺の修復を行った際、金工の専門家たちの間から、北海道の砂金が使われているのではないかとの意見が多く見られたが、その時点ではそれ以上の検討はなされなかった。本研究は、北海道の砂金が平泉に運ばれていたのではないかとする仮説をもとに、平泉の中尊寺や、藤原秀衡の政庁である平泉館といわれている柳之御所遺跡から出土した金箔に用いられている砂金について、蛍光X線分析装置による非破壊分析を実施する。測定によって得られた数値を、東北北部ならびに北海道から産出した砂金と比較して、北海道の砂金が平泉にもたらされていた可能性を探る。また、「かなまり」から採取した緑青(塩基性炭酸銅)に含まれる炭素を抽出して、放射性炭素年代測定を試みる。このように、新しい分析手法を用いて、遺物の制作年代あるいは埋納年代を明らかにする。以上の成果を文献調査の成果や遺物の年代測定の結果と比較検討して、古代末期の北方世界における交易の実態を明らかにする。本研究は、北海道の砂金が平泉に運ばれていたのではないかとする仮説をもとに、奥州藤原氏が建立した平泉の中尊寺や、藤原秀衡の政庁である平泉館といわれている柳之御所跡遺跡から出土した金箔に用いられている砂金について、蛍光X線分析装置による非破壊分析を実施する。本研究では、北海道と東北地方で産出される砂金の成分調査を行う。東北地方の砂金の成分についての先行研究は、金と銀との比率しか報告しておらず、微量元素の含有量を測定し直す必要がある。次に、平泉町教育委員会の協力を得て、中尊寺に残る金箔や柳之御所跡遺跡から出土した金箔について、蛍光X線分析装置等を用いた非破壊の成分分析を実施する。東北地方ならびに北海道の砂金との比較を行って、とくに北海道産の砂金の使用の可能性の有無について検討する。また砂金の流通については、文献史料からも情報を得て検討を加える。また文献史料の調査については、近世の砂金伝説も含んで網羅的に情報を収集する。このほか、また青銅製品の緑青から年代を測定する方法を導入し、遺物の年代についても総合的に検討する。平成27年度には、前年度に続き、北海道・東北地方の砂金の収集と分析を継続した。これまでに発表された砂金の成分分析の結果では、カドミウムなどの元素が検出されていなかったが、函館工業高等専門学校のEDS分析装置で砂金の断面を測定した結果、カドミウムなどが見つかったのである。そのため27年度は、特に東北地方の砂金サンプルを集めることを継続した。しかし、27年度の途中にEDS分析装置が不調になってしまい、測定が進まなくなってしまった。そのため、蛍光X線分析装置に切り替えて測定を続けようとしたが、測定数値に違いがあって使用できず、EDS分析装置の回復を待つことになった。文献史料の調査は、昨年度に続き予定どおり継続した。また青銅製品の緑青から年代を測定する件については、無量光院遺跡から出土した真鍮製かと思われる金属製品から錆を抽出して分析中である。一方、平泉町の金箔製品の分析については、平泉町から資料を動かすことは無理と判断していたため、携帯型の蛍光X線分析装置を同町に持ち込むことを当初は考えていた。しかし、柳之御所跡遺跡などから、砂金を加工する際に用いられたすり鉢の破片が出土していることが判明した。すり鉢には砂金が付着しており、これを借用することができれば、函館工業高等専門学校で分析ができることがわかった。この結果、同じ装置で測定を行うことができることになった。この点は、分析数値の信頼性を上げるうえで、大きな成果であった。このように、測定の前段階の準備は整えることができたものの、測定装置の不調という原因により、研究計画を予定どおりに完了することはできなかった。

本研究の目的は、平泉を中心に繁栄した奥州藤原氏のもとに北海道の砂金が交易で入っていたのではないかとする仮説を、砂金の成分分析によって論証しようとするものである。この仮説は、研究協力者である瀬川拓郎によって主張された。瀬川の仮説の論拠は、北海道の日高地域から出土する平安貴族の高級食器が、平泉から供給されたことが確実であること、日高以外からは出土しないことから、何か特別な交易品が日高から平泉に供給されたと考えられ、それは砂金である可能性が高いことである。また昭和におこなわれた中尊寺の大修理で、金箔に用いられた砂金が北海道のものではないかとする指摘が、美術関係者から主張されたこともあげている。本研究では、まず北海道・東北地域から採取した砂金の成分を分析しデータベースを作成した。また藤原秀衡の別邸であった柳之御所遺跡から出土した、砂金を加工するための道具に附着していた砂金の成分を分析し両者を比較した。クラスター分析という手法では、北海道と東北の砂金を大まかに分けることはできたが、平泉の砂金との関係で言えば明確な傾向は認められなかった。つぎに主成分分析の結果では、岩手県の砂金が平泉の砂金に近いという結論を得た。最後にSVM(サポート・ベクター・マシン)による分析では、岩手県の砂金が平泉の砂金の数値と同じグループに属するという結論となった。このように、本研究では北海道の砂金が平泉にもたらされたのではないかとする仮説を論証することはできなかった。ただ、データベースの砂金は断面を出して測定しているが、遺物に附着した砂金は表面の非破壊分析であるなど、測定条件が違うという問題点があり、これは今後の課題である。このほか、柳之御所遺跡から出土した青銅製品の錆と思われる遺物の成分分析や、緑青を用いた年代測定などの分析や、北海道で出土した遺物の分析も平行して行ったが、成果を収めるには至っていない。奥州藤原氏は、約百年にわたって東北地方を支配した。その富の源泉は砂金である。世界遺産の中尊寺金色堂は、黄金に輝く建物で有名である。瀬川拓郎は、北海道のアイヌが交易品として砂金を平泉に持って行ったとする仮説を立てた。本研究の目的はその仮説の検証である。まず、北海道と東北地方の砂金を分析した。つぎに藤原秀衡の別邸の柳之御所遺跡から出土した遺物に付着した砂金を分析した。両者を比較することにより、北海道の砂金が平泉にもたらされていたかどうかを確認した。これまでの検討では、平泉から出土した砂金は岩手県産のものである可能性が高い。北海道から砂金が持ち込まれたとする仮説は証明できなかった。先に述べたように、1970年代に奥州藤原氏が建立した平泉の中尊寺の修復を行った際、金工の専門家たちの間から、北海道の砂金が使われているのではないかとの意見が多く見られたことが知られている。このことは、北海道と東北の砂金が、見た目で区別することが可能であったことを示している。本研究の前提として、北海道と東北の砂金の成分に違いがあることが論証されなければならない。しかし北海道と東北地方の砂金の成分についての先行研究は、金と銀との比率しか報告していない。そのため、微量元素の含有量を含む砂金の再測定の必要がある。北海道・東北の約40地点の砂金についてサンプルを採集し、測定を行った。またクラスター分析の手法を用いて、北海道と東北の砂金が二つに分けられるかどうかを確認した。
ヒト高齢者モデルの真猿類マーモセットを用いた顎口腔機能老化と社会行動に関する研究

真猿類コモンマーモセットにおいて、顎骨、歯周組織、顎運動、咀嚼・嚥下、呼吸機能の変化など、老化にともなう問題を明らかにし、ヒト高齢者モデルとしてのコモンマーモセットの有用性を評価する。高齢コモンマーモセットを非拘束状態で三次元X線動画を撮像し、顎運動、咀嚼・嚥下、呼吸などの機能について若年対照との比較解析を行なった結果、加齢による解剖学的および機能的変化が認められた。口腔内細菌叢のメタゲノム解析を行なった結果、ヒトとマーモセットに共通の細菌および種特有の細菌が確認され、加齢にともなう口腔内細菌叢の変化が認められた。コモンマーモセットはヒト高齢者の口腔疾患モデルとして高い有用性が確認された。本研究の目的は、高齢マーモセットにおいて、顎骨変形、歯周組織退縮、顎運動・咬合異常、咀嚼・嚥下障害、発声障害、高次脳機能低下など個体としての老化程度を質的・量的に明らかにする。特に、国内外でもマーモセットを用いた歯科研究はほとんど皆無であるが、他方、医学においては、霊長類であるマーモセットは、従来のラットマウスなどの齧歯類に代わって、特に、脳科学研究では筆頭的地位となっており、歯科でも早晩、マーモセットを用いた研究が勃興するのは確実である。その先駆的研究として意義がある本研究では、特にマーモセット老化の各段階を通して、顎骨・歯周組織退縮、顎運動・咬合異常、咀嚼・嚥下障害、発声障害と音質変化が明らかになる。老化に伴う二足歩行の変化と顎口腔機能低下が、高次脳機能低下との関連で明らかにする。当初は、ヒト高齢者モデルとしての真猿類コモンマーモセットにおいて、顎骨、歯周組織、顎運動・咬合、咀嚼・嚥下、発声等の変化と、音声コミュニケーションおよび高次脳機能の変化を解明され、老化にともなう個体構造上の問題と社会行動学的な問題を並行して明らかにする予定であったが、老齢マーモセットの需要が全国的に急増し、需給が逼迫したため、専用ラボでできる実験に制限され、音声集音が難しくなった。その代替として、口腔内細菌を採取し、高齢化に伴う口腔疾患と全身性の代謝との関連、高齢化にともなう口腔疾患と社会行動の変化に注目し、その底流にある分子レベルの環境変化を追求するという、最先端のアプローチに切り替えた。その結果、特に高齢マーモセットに特徴的な口腔疾患と口腔内細菌に特化したメタゲノム解析とメタボローム解析を行なうことに初めて成功した。高齢化に特徴的な口腔内疾患と、全身性代謝の変化、口腔内細菌の活動性変化との関連などを、分子レベルで解析する強力なツールを得る機会に恵まれ、特に高齢マーモセットに特化して口腔内細菌に関連したメタゲノム解析とメタボローム解析を行なうことにも成功し、現在、高齢化にともなう口腔疾患との関連性を解析中である。本研究の当初の目的は、ヒト高齢者モデルとしての真猿類コモンマーモセットにおいて、顎骨、歯周組織、顎運動、咬合・咀嚼・嚥下、発声等の変化と、ストレス応答性の変化などを解明し、老化にともなう個体構造上の問題と社会行動学的な問題を並行して明らかにする予定であった。しかし、老齢マーモセットの需要が全国的に急増し、需給が逼迫したため、実施可能な実験内容が制約を受け、特に多くの個体数を必要とする解析が難しくなった。平成29年度では、代替として、高齢化に伴う口腔疾患と全身性の代謝/機能、行動との関連、およびその底流にある口腔内細菌叢などのミクロ分子環境の変化を追求するというアプローチにより、高齢マーモセットに特徴的な口腔疾患と口腔内細菌に特化したメタゲノム解析を行なった。対象としたのは、高齢マーモセット(オス:4頭、メス:4頭)および比較対照として若年マーモセット2頭、さらにヒトモデルとしての検証対照としてヒト(男性:4名、女性4名)試料を用いた。一般的な歯科診断(現存歯数、歯肉炎の有無、プラークおよび歯石の付着状況など)に加えて、唾液中の細菌叢の解析を行い、種間比較解析を行った。採取した唾液から核酸を抽出し、シーケンスライブラリを作成し、得られた塩基配列データを基にして細菌叢プロファイルを作成し、サンプル間のプロファイル比較解析を行なった。その結果、歯肉炎など歯周病症状の潜在的誘導性の細菌として、ヒトとマーモセットに共通の細菌および種特有の細菌などが確認され、口腔内細菌の多様性が認められた。またマーモセットの加齢に伴う唾液中のストレスタンパクについても定量解析した。これらの分子解析と平行して、得られたX線動画像については、顎運動、咬合・咀嚼・嚥下などは、専門の海外協力研究者による解析データと合わせて、最終的にヒト口腔疾患モデルとしてのマーモセットの有用性について評価する。

口腔内細菌叢のメタゲノム解析を行なった結果、ヒトとマーモセットに共通の細菌および種特有の細菌が確認され、加齢にともなう口腔内細菌叢の変化が認められた。コモンマーモセットはヒト高齢者の口腔疾患モデルとして高い有用性が確認された。昨年度に着手した、高齢化にともなう社会行動の変化について、老齢歯科学の分子レベルでの情報取得に積極的に挑戦し、この領域で世界初のデータ化を目指すべく、精力的に研究を継続する。硬組織病態生化学老齢マーモセットの需要が全国的に急増し、需給が逼迫したため、専用ラボでできる実験に制限され、音声集音が難しくなった。その代替として、老齢マーモセットから口腔内細菌を採取し、高齢化に伴う口腔疾患と全身性の代謝との関連、高齢化にともなう口腔疾患と社会行動の変化の底流にある分子レベルの環境変化を追求するという方針に切り替えた。これにともなって全体の予算消化に若干の差が発生した。前年度発生した差額を今年度予算に融合し、高齢化にともなう口腔疾患と社会行動変化について、口腔内衛生状態および全身性代謝などとの関連で分子レベルで、これまでにない、極めて斬新なデータを取得しつつあり、展望は大変明るい。
咽頭残留に影響する嚥下機能・食品物性の探索－レトロネーザルを用いた咽頭残留評価－

超高齢社会を迎えた日本では、肺炎は死因の第3位を占め、その多くは誤嚥性肺炎である。しかし、誤嚥の原因となる咽頭残留を簡便かつ定量的に評価する方法は確立されていない。申請者は、食品から放出された香気が咽頭から鼻腔へと流れる経路(レトロネーザル)に着目し、香気量から咽頭残留を短時間で定量評価できる可能性を見出してきた。本研究課題では、咽頭残留の定量評価法の確立を目指すとともに、さらに嚥下障害患者における咽頭残留の影響因子について検討することを目的とする。
ヘムタンパク質の新しい機能変換に対する化学的アプローチ

これまで、ヘムタンパク質の機能評価や機能改変等の研究は、殆ど遺伝子工学的手法を用いてある特定のアミノ酸の変換を行った変異体を用いるものであった。しかしながら、その手法では、かなりの制約を受けること、また劇的な機能改変はなかなか期待できない欠点もある。本課題研究では、この問題を克服するため、ヘムタンパク質のひとつであるミオグロビンのヘム分子を除去して、合成した非天然ヘムを挿入することにより新しい機能を誘導することを行った。以下にその成果を示す。1.ミオグロビン表面に、人工的なインターフェースを構築し、ミオグロビンとチトクロムcなどのユニークなタンパク質複合体を構築した。2.人工的なインターフェースを介したタンパク質間電子移動反応を追跡し、生体内電子移動反応の優れたモデルを提案した。3.ミオグロビン表面に基質認識部位を構築し、ペルオキシダーゼ、ペルオキシゲナーゼ活性示す酸化触媒としての機能発現に成功した。4.ヘムプロピオン酸側鎖を欠損したヘムを合成し、アポミオグロビンに挿入することにより、プロピオン酸側鎖の酸素錯体形成への役割を示した。5.ヘム分子を非天然の構造異性体であるポルフィセン鉄錯体に置換することにより、劇的に酸素親和性が向上した。以上、非天然ヘムをデザインして、アポミオグロビンに挿入することにより、既存の方法で得られないタンパク質の機能化に成功した。このように、有機化学的にヘム分子を修飾・構造変換する手法は、今後のタンパク質工学への新たなアプローチとして提案できると考えている。本年度は、当該申請研究の初年度として、タンパク質表面の認識部位の形状と認識挙動・電子移動反応との相関の評価について検討を行った。まず、ヘムタンパク質として良く知られているミオグロビンに焦点を絞り、補欠分子であるヘムのプロピオン酸側鎖末端に合成化学的に多数の官能基(カルボン酸)を修飾した。得られたヘムをアポ化したミオグロビン常法に従って挿入することにより、アニオンドメインを表面に有するミオグロビンを構築した。この再編成ミオグロビンはNMR,UV,CD等から天然のミオグロビンと同様の構造を保ち、かつ表面にアニオンドメインが局在化して分布していることが明らかとなり、等電点の測定から酸性タンパク質になっていることも判明した。このミオグロビンの溶液に対して、カオチン電荷をタンパク質表面に多く有するチトクロムcを添加した結果、静電相互作用を介した極めて安定な再構成ミオグロビン-チトクロムc複合体が人工的に構築したアニオンドメインを介して形成した。さらに再構成亜鉛ミオグロビンからチトクロムc3価への光駆動型電子移動反応をフラッシュホトリシス法によって観測し、生体内でのタンパク質間電子移動反応のモデルとして有用であることを証明した。またアニオンドメイン(分子認識部位)の形状によって、両タンパク質の親和性及び電子移動反応が大きく変化することを明らかにし、認識様式が電子移動反応を制御していることを示した。本年度は、昨年度の成果をもとに、ミオグロビン表面に正電荷を有する基質結合(認識)部位の構築を試みた。具体的には、ヘムプロピオン酸側鎖末端に合計4個のアミノ基を導入し、カチオンドメインをタンパク質表面に呈示させた。その結果、アントラキノンスルホン酸など負電荷を有する基質と極めて安定な複合体を形成し、静電相互作用を介した光駆動型高速重項電子移動反応が観測可能となった。さらに、結合定数を比較すると、アニオンドメインをタンパク質表面に呈示したミオグロビンに比べて極めて親和力が強いことも明らかとなった。これは、タンパク質のヘムポケット近傍に集中して存在する塩基性のアミノ酸残基と協同的に効率よいカチオンクラスターを形成しうるからと理解される。また、本年度はミオグロビンに新しい基質認識部位を導入し、へムオキシゲナーゼ活性の向上を試みた。その結果、特に疎水性の小分子であるフェノール誘導体、カテコール、グアイアコールに対して、基質結合部位を有する再構成ミオグロビンの活性は天然のミオグロビンに比べ大幅に上昇した。

特にグアイアコールを基質として用いた場合、天然のミオグロビンに比べて極めて効率の良い触媒的酸化反応が認められた。これはヘム末端に疎水性基を導入することにより、新たな疎水性基質結合部位がヘムポケット入り口に形成され、基質がスムーズに酸化されたことを示している。ヘム末端を化学的に修飾することによる新しい酵素活性機能の付与の最初の例として興味深い。本年度は、これまでの知見をもとに、以下の3つの研究を推進した(1)新たな生体触媒を創製するために、ミオグロビン表面に基質認識部位を構築し、過酸化水素存在下の酸素化反応を追跡した。その結果、天然のミオグロビンでは殆ど反応の進行しないスチレンのエポキシ化、スルフィドの酸素化などが円滑に進むことが実証された。したがって、タンパク質表面に適した基質認識部位を構築することにより、新しい生体触媒の開発につながることを示した。(2)昨年度まで実施していたミオグロビン-チトクロムc人工複合体の系を、他のタンパク質複合体の構築へ展開した。タンパク質表面に、正電荷・負電荷を修飾することにより、様々な組み合わせのタンパク質複合体、例えばミオグロビン2量体、ミオグロビンチトクロムb562、チトクロムb562-チトクロムc、ヘモグロビン-ミオグロビン、ヘモグロビン-チトクロムcなどの複合体を得て、それぞれのタンパク質間での電子移動反応の追跡を行った。(3)ミオグロビンの補欠分子として、ポルフィリンの構造異性体であるポルフィセン骨格を有する鉄錯体を挿入して、青色の再構成ミオグロビンを得た。このミオグロビンの酸素結合能を詳細に評価した結果、天然のミオグロビンに比べ、約1400倍の酸素親和性があり、さらに、生理学的には好ましくない酸素錯体の自動酸化速度も天然に比べ1/7に減少し、酸素錯体自身も極めて安定であることが示された。今後、この再構成ミオグロビンが酸素センサーや人工血液としての応用が期待される。以上、本研究を通じて有機合成化学的手法を駆使したヘムタンパク質の新しい機能化を提案した。この手法は、タンパク質のアミノ酸残基の遺伝子工学的変換とともに、今後の生物無機化学、タンパク質工学に対する斬新なアプローチとして有用と考えられる
複式学級における教育効果に関する研究

昨年度に引き続きフィンランドの教育状況を現地視察することができた。今年度の教育状況視察は3日間同じ学校に入ることができたことで,じっくり子どもたちの様子を観察することができた。私は、複式学級の異学年を交流させながら進める授業を期待していたが、実際教室の中での授業ではそのような授業を創造している様子はなかった。ただ、低学年での絵本の読み聞かせや中学年で学校裏の森などへ植物観察を行なう際には異学年が一緒になって活動していた。また、授業の方法としては教科書・ワークブックを中心にして進められていた。教師が自分で単元の構成を考えたり、子どもに興味をもたせたりするための特別な取り組みは行われていなかった。一校のみの視察であったので、フィンランドのすべての学校とまでは言い切れないところだが、多くの学校で教科書を中心にすすめられているであろうことが推察された。教科書を使ってある程度統一された内容を学習することで、国全体のレベルを上げているように感じた。それに対して、私たち日本の複式学級を担当するものは、なんとかして上学年と下学年の関わりを持たせるように授業を構成したり、単元をそろえたりする努力をしている(本校、鹿児島大附属等)。異学年を利用して教育効果を得られるようであれば、フィンランドをしのぐ教育効果を得るができる可能性を感じた。そういう意味でも複式学級での関わりに主眼を置いた各教科のカリキュラムを考えることが必要になってくるであろう。なお研究費で購入したPCはフィンランドの学校とのメール連絡等に活用できた。
競争ダイナミズムと適応行動の評価法開発

本研究課題の成果として、評価法開発のためのモデルの提案並びにデータ収集を実施し、学会等でモデルの提案を行なった。特に、これまで行なってきた組織能力のダイナミズムに関する研究で、データの制約上行えなかった組織能力学習の一般化についての研究、ダイナミックケイパビリティ尺度の評価研究、戦略グループ論の動学化についてのモデルの提案を学会報告並びに論文によって発信した。本研究は、経営環境の変動に対しての企業の適応行動並びに環境の構築行動についてのモデル化と評価法開発を目的として実施するものである。具体的には、企業の環境適応行動について、組織内部における適応行動と外部環境への働きかけと、その効果について明らかにすることを最終目的として研究を進める。この課題を果たすために、これまで実施してきた組織のケイパビリティに関する学習についての実証研究、ダイナミックケイパビリティの測度に関する研究を発展させることをに加え、企業の環境適応のダイナミクスとそれらの共進化の構造を定量的を行う。本研究課題の初年度の成果として、評価法開発のためのモデルの提案並びにデータ収集を実施し、学会等でモデルの提案を行なった。組織内部における変化への適応行動を主眼にコホートモデルを用いた従業員の適応行動についての調査並びに分析を行い日本経営学会において研究報告を行った。具体的には、企業家志向性について従業員レベル、経営者レベル、組織レベルそれぞれの階層を考慮した上で組織の志向性の変化のプロセスを分析する枠組みを組織社会化の概念を利用して提案した。分析の結果から、従業員の社会化については在職年数の影響があること、在職年数が及ぼす影響は一定ではないこと、組織内の風土が従業員の社会化に影響をおよぼすこと、経営理念の浸透が従業員の社会化に影響をおよぼすことが確認できた。個別の分析結果を示すと、1企業の在籍年数、特に3年-5年の在職期間で企業家志向が上昇し経営者に近づく。これは在職によって従業員の過小なEOを改善することを意味しており、従業員は経営者を学習の規範として活用している可能性が見いだされる。2経営理念について、経営理念の浸透は従業員EOを増加させるため、従業員EOが経営者EOよりも低い従業員が多い場合、経営者との差異を縮小する効果を持つ可能性が指摘できる。3企業EOについて、企業家志向性の企業内平均値や組織内の情報交換によって経営者との距離が離れていくため、組織内での同一化は問題があると考えられる。ことを明らかにした。これは、本研究のテーマである組織の環境適応行動は前年度報告した組織レベルでのマクロな適応行動とともに組織内部のミクロレベルでの適応行動のリンクを解明する必要がありその手がかりとして今年度の研究を実施したものである。また、別途、組織構造の影響を企業レベルで分析するためのモデルについて組織学会でも研究報告を行っている。本研究課題の最終年度の成果として、評価法開発のためのモデルの改善を実施し、モデルの推定を試みた。特に、これまで行なってきた組織能力のダイナミズムに関する研究で、データの制約上行えなかった組織能力学習の一般化についての研究、ダイナミックケイパビリティ尺度の評価研究、戦略グループ論の動学化について検証を行った。引き続き分析を行い学会誌等に報告予定である。11月以降病休したため当初予定していた論文の投稿が遅れている。本年4月より復職し、前年度の学会報告成果に基づき論文作成を行う予定である。経営学前年度までの成果を踏まえ論文の作成を行い学会誌等に投稿する予定である。本年度は、当初の計画通り分析モデルを学会等で発表しモデルのブラッシュアップ、企業が収集している企業データベースを購入し、合理的な形で個々のパネルを融合することでデータベースの構築を行い次年度以降の論文作成の基礎を構築した。病気休職のため予定していた研究が遂行できなかった。26年度の方向として、25年度に収集・整理したデータを分析し、この成果を、秋に開催される学会ならびに学会誌論文にて報告し、広く公開する。また、既存のデータ分析の結果から発見された事実を深化するために個別アンケート調査を実施するとともに、各研究者と資料を利用した研究を深化させる。休職期間中のため購入できなかった物品の購入費として充当する購入するデータベースをより高品質なものに変更したため経費がかかり、それに伴い全体の経費の調整を行ったため差異が生じている。加えてデータベースの購入費をその他費目にて購入するものと考えていたため大きなズレが生じている。

加えて、期間中に所属機関を変更したためそれに関連して研究環境の変更に伴う支出も発生している。高額のデータベース購入は初年度のみの計画のため次年度以降は計画通りの予算執行を行う予定である。
認知スタイルとグローバル処理対ローカル処理の関係：認知スタイルは変えられるか？

同じくゲシュタルト心理学を源流に持ち、一方は安定した個人特性とされてきた認知スタイルと、比較的新しいNavonらによるグローバル・ローカル処理との因果関係について研究した。グローバル処理あるいはローカル処理課題を行うと、適切な条件(暗室、課題遂行時間が3分)では、認知スタイル課題の成績を場依存的あるいは場独立傾向に変化させることをロッド・フレーム課題を用いて明らかにした。このことは認知スタイル課題の成績が安定した個人特性を反映するものではなく、条件によって変化しうるモードであることを示唆している。本研究の主要な目的は、グローバル(G)処理・ローカル(L)処理と場依存性・独立性との関係の確定である。まず、認知スタイルの測定方法としてロッドフレームテストをコンピュータ制御によってCRT上で行うためのプログラムの開発を行い、運用を可能にした。次に、G処理・L処理課題として、Navonの課題を用いた。G処理・L処理を行うことが、安定した認知特性とされている場依存性・独立性に及ぼす影響を調べるために、G処理・L処理課題をどの程度の試行を行えば、場依存性・独立性に影響を及ぼすか予備実験を行い、一定の目処をつけることができた。さらに場依存性・独立性の指標として、日常行動における行動の自己観察質問紙を開発したところである。今後はこの質問紙の各因子とG処理・L処理傾向およびロッドフレームテスト課題による場依存性・独立性との関係について研究を進展させる予定である。さらに、来年度着手予定の発達障害の人々に関する研究の展開のために、ADHDのNavon課題遂行に影響する諸要因とりわけローカル文字の視角の変化の影響について検討した。このことによって、ADHDは一貫して、健常者に認められるグローバル処理優位性、グローバル情報によるローカル情報処理への干渉が見られないことが明らかになり、今後の研究遂行にとって、貴重な情報を得ることができた。また、最近研究が進んでいる、言語的遮蔽効果、すなわち視覚刺激を言語化するとその後の再認が阻害されるという効果について、グローバル処理・ローカル処理がどのように関与しているかを調べるために嗅覚情報を対象に実験を行い、同様の効果が存在することを明らかにした。さらにこの効果にNavon課題のグローバル・ローカル処理訓練がどのように影響するかを検討している。本研究は「認知スタイルとグローバル処理対ローカル処理の関係:認知スタイルは変えられるか?」というテーマについて、グローバル処理あるいはローカル処理の訓練をすることがどのような影響を与えるかということの検討を行うものである。この研究の一環として行っていた、匂いの再認に及ぼす言語的遮蔽効果が、言語的記述のみならずグローバル処理あるいはローカル処理の訓練によっても生起できるということが分かり、そこには処理の試行数が決定的に重要であることがわかった。このことによって認知スタイル課題(ロッドフレームテスト)へのグローバル処理あるいはローカル処理訓練をある一定の試行数に設定すれば、目指している成果が得られることが分かった。(1)グローバル処理訓練は試行数を増やすとその効果はほとんど認められなくなるが、(2)ローカル処理訓練は試行数にかかわらず一定の効果が認められる。なぜ、(1)のような効果が得られるか、そのメカニズムについてある仮説(ゲシュタルト崩壊)が考えられる。今後、明らかにすべき問題が見つかった。申請者自身の健康上の問題で2015年度は計画通りに実験を進めることができなかったため、やや進捗が遅れている。しかし、その問題も2016年度に入り、ほぼ解決したので、遅れを取り戻すべく努力している。本研究課題の成果は3つに大別できる。一つ目は明順応下で行った、Navon課題のグローバル・ローカル処理課題がその後の認知スタイル課題(ロッド・フレームテスト:R-Fテスト)の成績にどのような影響を与えるか調べた研究である。この実験結果はグローバル処理課題はR-Fテストの成績にはなんら影響を及ぼさないが、ローカル処理後にはR-Fテストの成績を向上させること(物理的鉛直と心理的鉛直の誤差が小さくなること)が明らかとなった。この成果は国際心理学会2016で発表された。二つ目は、刺激を言語化することによってその再認が低下する現象(言語遮蔽効果:VOSE)が、言語化だけでなく、処理モードの変更によっても生起するのでないかという仮説の検証実験である。匂い刺激を用いて、刺激呈示後にNavon課題のグローバル・ローカル処理課題を実施することによって検証したところ、予測どおり、グローバル処理課題を行うと、匂いの再認成績が向上するが、ローカル処理課題を行うと低下することが明らかになった。この成果は日本認知心理学会2017年大会で発表予定である。三つ目は、グローバル・ローカル処理課題がR-Fテストの成績に及ぼす効果を暗順応条件下で行った研究である。その結果、暗順応条件下ではグローバル処理課題を実施するとR-Fテストの成績が低下し、ローカル処理課題を行うと成績が向上することが分かった。これらの結果は、我々の情報処理モードはNavon課題の実施によってコントロールすることが可能であり、これによって従来は安定していることを暗黙の前提としていた、認知スタイルの成績に影響を与えることを示すものである。この成果は2018年日本心理学会大会で発表の予定である。研究代表者の発病とその治療のため時間を要したので、研究計画書に記した当初の予定の予定の一部が実施不可能となったが、基本的な部分はほぼ研究することができ、興味深い成果も得られた。本研究は、「認知スタイルとグローバル処理対ローカル処理の関係:認知スタイルは変えられるか?」と言うテーマについて、グローバル処理あるいはローカル処理の訓練をすることがどのような影響を与えるかということの検討を通じて考えることをである。

この着想の基になった、言語化すると顔の再認成績が低下する現象である「言語遮蔽効果」が言語化するのではなく、1Navon課題のグローバルあるいはローカル処理をすることでも生じること、2グローバル処理は顔の再認を向上させ、ローカル処理は顔の再認を低下させるという先行研究を匂いの再認実験において批判的に検討し、グローバル処理時間が3分の時にのみ向上させるという生起条件を特定することができた。さらにこのことに基づいて、グローバル処理、ローカル処理が日常事物の触覚においても上記と同様の現象が生じることを明らかにできた。そして、認知スタイルの代表的課題である、外枠を無視して棒を鉛直に調整する「ロッドフレームテスト(RFT)」において、ローカル処理を行うと調整値と物理的鉛直との差が小さくなるが、グローバル処理を行うと差が大きくなることが分かった。しかも、この効果はグローバル処理の時間が3分間のときに得られた。同様の効果は、semantic coherence課題(意味結束性課題)でも認められ、グローバル処理を行うといくつかの事例から背景にあるカテゴリー名を生成する成績が向上するが、ローカル処理を行うとその成績は損なわれることが分かった。このように、認知スタイルとグローバル処理・ローカル処理は密接な関係がある、従来の、認知スタイルを安定した個人特性と見なす考え方は誤っており、状況によって変動する情報処理モードであることを示している。同じくゲシュタルト心理学を源流に持ち、一方は安定した個人特性とされてきた認知スタイルと、比較的新しいNavonらによるグローバル・ローカル処理との因果関係について研究した。グローバル処理あるいはローカル処理課題を行うと、適切な条件(暗室、課題遂行時間が3分)では、認知スタイル課題の成績を場依存的あるいは場独立傾向に変化させることをロッド・フレーム課題を用いて明らかにした。このことは認知スタイル課題の成績が安定した個人特性を反映するものではなく、条件によって変化しうるモードであることを示唆している。「認知スタイルとグローバル処理対ローカル処理の関係」という本研究遂行には予想以上に多くの解決すべき問題があり、「G処理・L処理を行うことが、場依存性・独立性に及ぼす影響」を調べる研究の進捗はやや遅れている傾向がある。しかし、関連する実験を行う中でいくつかの重要な発見、例えば、ADHD児のNavon課題遂行に及ぼすローカル文字の視角の影響に関する研究や、嗅覚刺激の言語化による再認成績に及ぼすNavon課題実施の効果に関する予備的研究などが進んでおり、いくつかの重要な発見を行うことができた。総合的には、本研究テーマに関する包括的な研究成果が得られつつある。グローバル処理あるいはローカル処理訓練をどのような条件で行えば、認知スタイル課題に影響を及ぼすかについての重要なデータを得たので、そのデータを踏まえて鋭意、証拠固めをおこなう。
死細胞により誘導される炎症応答に対して老化が及ぼす影響とそのメカニズムの解明

本研究では、アポトーシス細胞に対するマクロファージの貪食能と炎症応答における老化の影響を解明するため、若年および老化マウスを用いて常在性マクロファージの後期アポトーシス細胞貪食能と炎症応答の解析を行った。後期アポトーシス細胞をマクロファージに貪食させたところ、若年マウスと比較し老化マウスで有意に低下することが観察された。また、後期アポトーシス細胞を腹腔内に投与したところ、若年マウスと比較し老化マウスの方がアポトーシス細胞の速やかな除去が行われず長時間残存し、MIP-2が早期かつ多量に産生されることが確認され、それにつづく好中球浸潤も早期かつ多量に浸潤することが明らかとなった。生体内でアポトーシスに陥った細胞は、マクロファージなどの貪食細胞によって速やかに除去される。しかし、この除去システムに何らかの破綻が生じると、アポトーシス細胞が残存し、ネクローシスに移行した細胞が原因となって強い炎症応答を誘発する。この炎症応答に着目し、アポトーシス細胞貪食除去における老化の影響を調べた。昨年までに老化マウスとして、老化促進モデルマウスであるSMP-30欠損マウスを用いて解析を進め、若年マウスに比べ、老化モデルマウスではアポトーシス細胞の貪食除去が遅延し、またそれに伴って好中球の浸潤を主徴とする炎症応答が強く現れたことを示してきた。またこれらの結果は、SMP-30タンパク質が欠損することとは、直接関係することではなく、SMP-30欠損による老化促進による結果であることも明らかにした。また老化モデルマウスでの結果は、野生型老化マウス(24週齢)のマウスでも観察されたことからも上述の見解を裏付けることが出来た。しかし、この除去システムに何らかの破綻が生じると、アポトーシス細胞が残存し、ネクローシスに移行し細胞が原因となり、強い炎症応答を引き起こす。この炎症応答は、老化に伴う様々な疾病に関わる可能性がある。そこで本研究では、アポトーシス細胞に対する応答やマクロファージの貪食能に着目し、アポトーシス細胞貪食除去における老化の影響を調べた。投与したアポトーシス細胞の残存量を解析したところ、若年マウスでは速やかにアポトーシス細胞が除去されているのに対し、老化マウスでは長時間残存していることが確認できた。次に浸潤細胞を経時的に調べると、炎症応答時にみられる好中球の浸潤は若年マウスと比較して老化マウスの方が有意に増加し、かつ、早期に浸潤していることが確認できた。次に、in vitroで腹腔常在性マクロファージの貪食率および貪食能を解析した。貪食率では老化マウスの方が若年マウスよりも有意に低く、時間が経過しても若年マウスのように貪食率が上がることはなかった。一方、貪食能では、共培養1 hの時点では若年マウスの方が有意に高くなったが、6 hの時点では、老化マウスの方が有意に高くなることが確認された。これは、若年マウスの方が速やかに貪食が行われるため6 hでは貪食したアポトーシス細胞が消化されつつあるためと考えられる。これらの結果から、老化マウスでは腹腔常在性マクロファージの貪食能が低下し、アポトーシス細胞の速やかな除去が行われず、長時間アポトーシス細胞が残存し、強い炎症応答を引き起こすことが示された。さらに、老化マウスの腹腔常在性マクロファージが、前活性化状態にあることも明らかにしており、この前活性化状態が、マクロファージの貪食能低下を引き起こしていると考えている。昨年までに老化マウスでは、腹腔常在性マクロファージの貪食能が低下し、アポトーシス細胞の速やかな除去が行われず、長時間アポトーシス細胞が残存し、強い炎症応答を引き起こすことを示した。

また老化マウスの腹腔常在性マクロファージが、前活性化状態にあることも明らかにしており、この前活性化状態が、マクロファージのM1/M2マクロファージへの分化の差であることを示し、老化マウスでは、炎症性マクロファージであるM1マクロファージが有意に増加していることを明らかにした。免疫本年度は、炎症応答の慢性化への老化の影響を解明するために以下の実験を計画していた。『ネクローシス好中球から放出されるS100の解析』として1)炎症終息期におけるS100産生量への影響、2)S100中和による炎症応答の慢性化への影響。1)のためにすでにS100に対する抗体を作成するべく組み替え型S100を調整し、抗体作成に取りかかっており、ほぼ順調に計画を遂行している。また、2)関してはS100に対する抗体が取得できた際には、直ちに解析に取りかかれる状況にある。本年度は、老化マウスにおける死細胞に対する自然免疫応答の仕組みを解明するために以下の実験を計画していた。『常在性マクロファージの貪食応答に対する老化の影響』として1)常在性マクロファージの貪食応答への老化の影響、2)アポトーシス細胞認識分子への老化の影響、3)組織マクロファージの生体内分布への老化の影響。『炎症応答の重篤化への老化の影響(その1)』として4)ネクローシス細胞から放出されるHMGB-1の解析。上記項目のうち、1)および2)の項目については、ほぼ明らかとしており、国内学会および国際学会への発表とともに論文発表の準備をしている。3)および4)の項目については、発表には、まだ至っていないが、発表できる段階にあり、総合的におおむね順調に研究計画を遂行している。『炎症応答の終息への老化の影響』1)炎症終息期に浸潤する好酸球の役割:好酸球が炎症応答の終息に重要な役割を果たしていると推察されるので、好酸球走化性因子であるEotaxinおよびRANTESに対する抗体を用いて炎症巣への好酸球の浸潤を阻害したとき、炎症応答の終息がどのような影響を受けるか調べる。2)好酸球の浸潤への影響(老化マウスで浸潤が抑制されていた場合)好酸球を移植したときの炎症応答への効果について解析を行う。『TRECK法による好酸球の重要性の証明』『炎症応答の重篤化への老化の影響(その2)』1)炎症巣でのDAMPsの産生およびその受容体の解析:ネクローシス細胞によって誘発された炎症巣では、様々なDAMPsが検出され、HMGB-1以外のDAMPsも炎症反応の重篤化に重要な役割を果たしていると考えられる。そこで、炎症巣で検出されることが知られているHSPs (heat shock proteins)、Defensins、Uric acidの産生量に対する老化の影響を調べる。また最近、DAMPsの受容体としてMincleという分子が注目されている。そこで、老化による炎症応答の重篤化とMincleとの関わりを探る。これらの目的のため、HSPsなどの液性因子の解析には、ELISA kitを、受容体および分子の抗体作成には、マウスおよびウサギを購入する。『炎症応答の慢性化への老化の影響』2)ネクローシス好中球から放出されるS100の解析:ネクローシスした浸潤好中球からS100が放出されると、二次的な好中球の浸潤を促し、炎症応答が連鎖的に引き起こされ、結果として慢性化すると考えられる。そこでまず、S100の生化学的解析を行う。
リボソーム蛋白質が分解制御因子として機能する新規ポリアミン合成制御機構の解明

反芻動物ルーメン(第一胃)の主要共生細菌で、偏性嫌気性のグラム陰性菌Selenomonasruminantiumは、細胞壁に必須構成成分としてポリアミンを共有結合している。本菌のポリアミン生合成に必須なリジン/オルニチン脱炭酸酵素(LDC/ODC)は、「原核生物には存在しない」とされていたアンチザイム様調節因子が関与する厳密な分解制御を受け、その本体としてリボソーム蛋白質L10が作動する。本研究では生物で初めて見出された、リボソーム構成蛋白質が分解促進因子として機能する分解制御機構の全容を、L10およびプロテアーゼの特性と構造、並びに分解複合体における各因子の相互作用と構造変化に焦点を合わせて解明することを目的としており、当該年度において以下の成果を得た。昨年度において、本分解制御機構に関わるATP依存性セリンプロテアーゼの候補遺伝子として、S.ruminantiumの全ゲノム配列を参考に、真核生物ODCの分解に関わるプロテアソームの原型ともされるClpP型プロテアーゼに着目し、本遺伝子(clpP)をクローニングして大腸菌での大量発現系を構築、さらにClpP組換え蛋白質を精製して精製標品のペプチダーゼ活性を確認した。本年度においては、ClpP型プロテアーゼによる蛋白質分解活性の発現に必要とされるATP結合サブユニット相当遺伝子(clpx)をクローニングし、大腸菌で大量発現させて、約46kDaの組換え蛋白質を得た。精製したS.ruminantiumのClpPおよびClpX存在下におけるL10依存的なLDC/ODC分解活性を、坑LDC/ODC抗体を用いたウエスタンブロッティングにより測定した。その結果、LDC/ODCがATP依存的に分解されること、またL10やClpXの非存在下では分解が起こらないことが明らかとなり、本分解制御機構に関わるプロテアーゼがClpP型プロテアーゼであり、リボソーム蛋白質がアンチザイム様分解促進因子として働くことを強く示唆する結果をin vitroの再構築系で得ることができた。本分解制御機構に関わるプロテアーゼについては、細胞質内に存在するATP依存性セリンプロテアーゼであることが明らかにされていたが、非常に失活しやすい性質から精製には成功していなかった。そこで、S. ruminantiumの全ゲノム配列[東北学院大学・神尾好是教授(当時)、東北大学・金子淳准教授、独立行政法人製品評価技術基盤機構(NITE)により2009年に決定]を参考にして本プロテアーゼの候補遺伝子を3つに絞り込み、これらの中でも特に、真核生物ODCの分解に関わるプロテアソームの原型ともされるClpP型プロテアーゼに着目した。本遺伝子(clpP)、およびClpP型プロテアーゼによる蛋白質分解活性の発現に必要とされるATP結合サブユニット相当遺伝子(clpX)をクローニングし、大腸菌での大量発現系を構築した。大量発現を確認できた約24kDaのClpP組換え蛋白質を、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーにより精製し、SDS-PAGEで単一バンドとなる精製標品1.6mgを得た。本精製標品のペプチダーゼ活性を蛍光基質を用いて評価した結果、本活性を有することが確認でき、比活性は0.685 pmol/h・μg of proteinと求められた。

精製したS.ruminantiumのClpPおよびClpX存在下におけるL10依存的なLDC/ODC分解活性を、坑LDC/ODC抗体を用いたウエスタンブロッティングにより測定した。その結果、LDC/ODCがATP依存的に分解されること、またL10やClpXの非存在下では分解が起こらないことが明らかとなり、本分解制御機構に関わるプロテアーゼがClpP型プロテアーゼであり、リボソーム蛋白質がアンチザイム様分解促進因子として働くことを強く示唆する結果をin vitroの再構築系で得ることができた。
膜タンパク質の機能を制御する中分子アプタマーの創出とその構造学的基盤の解明

がん、高血圧、慢性炎症など種々の疾病に対する医薬品の分子標的の多くは膜タンパク質である。その構造解析の難度は依然として高いため、現時点で構造ベースの創薬研究の進展は限定的である。これまで研究代表者らは膜タンパク質に抗体フラグメントを結合させて結晶化を促進するという独自技術を開発し、X線結晶構造解析を推進してきた。本研究では、膜タンパク質の機能を制御する中分子アプタマーの創出とその構造学的検証に有用な新しい方法論を確立することを目指している。本年度は、大環状ペプチドではなく、立体的束縛を有する安定なペプチド分子骨格(50-90残基)を基盤として複数の末端ループの配列と長さを多様化した合成ライブラリーを作製し、高い親和性と特異性を兼ね備えたバインダーの探索を試みた。具体的には分子内に多数のジスルフィド結合が架橋され強い立体的束縛のある安定な中分子ペプチド骨格であるICK (inhibitor cysteine knot)フォールドをベースとして、その末端ループの配列と長さを多様化した中分子母集団を人工合成し、ファージディスプレイ系ライブラリーを作製した。免疫チェックポイント受容体PD-1、炎症性サイトカインTNFα等の複数のモデル標的分子を用いて、特異的に認識し結合するファージ集団を4-12サイクル程度の選抜を経て、増幅・濃縮した。選抜過程でのファージ集団の優占度の遷移をシーケンス解析にて評価した。以上の解析から解離定数が数μM程度の中分子バインダーが取得可能であることを示した。立体的束縛を有する安定なペプチド分子骨格(50-90残基)を基盤として複数の末端ループの配列と長さを多様化した合成ライブラリーを実際に作製して、異なる複数の創薬ターゲットに対して中分子バインダーが取得可能であるというフィージビリティーを検証することができたため、初年度の目標は概ね達成できていると自己評価した。大きな細胞外ドメインをもつ一回膜貫通受容体膜タンパク質(PD-1)や可溶性サイトカイン(TNFα)など限られた標的のみならず、今後はGタンパク質共役受容体(GPCR)、イオンチャネル、膜輸送体など比較的小さな細胞外ドメインしか持たない多数回膜貫通型の内在性膜タンパク質をも標的とした中分子バインダー取得のための技術開発を進めてゆきたい。当初計画では,本年度にX線結晶構造解析の回折データ測定のためSPring-8への出張を見込んでいたが、創薬ターゲットタンパク質ー中分子バインダー複合体の結晶がまだ生成していないことから、その出張計画を中止した。そのため出張経費を使用しなかったために次年度使用額が生じた。当該経費は、次年度以降に当初計画通りのSPring-8出張費として使用する計画である。