hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
劇症１型糖尿病の成因ー患者分析より新たに見出された２分子の病態学的意義の解明

本研究では、鍵分子がほとんど明らかにされていない劇症1型糖尿病において、1)ウイルス感染の下流に位置するISG15、2)NK細胞活性化レセプターKLCR3のβ細胞傷害における意義を検討した。マウス膵β細胞株MIN6細胞において、ISG15を過剰発現あるいはノックダウンし、ISG15が細胞傷害性サイトカインなどによるアポトーシスを抑制することを明らかにした。また、劇症1型糖尿病末梢血NK細胞において、KLRC3 (NKG2E)とそのヘテロダイマー(CD94)の遺伝子発現低下を明らかにした。以上、劇症1型糖尿病のβ細胞傷害の分子機構において、ISG15とKLRC3の関与を明らかにした。本研究の目的は、劇症1型糖尿病において、1)ウイルス感染下流に位置する蛋白X(=ISG15)、2)患者免疫担当細胞で発現が低下する蛋白Y(=KLRC3)のβ細胞傷害における意義を明らかにすることである。1)蛋白X (=ISG15)の検討:前年度までの検討から、マウス膵β細胞株MIN6細胞では、IFNα添加により蛋白Xの発現が用量依存的に増加すること、蛋白Xを強制発現させると炎症性サイトカインによるアポトーシスが減少し、逆にノックダウンさせるとアポトーシスが増加することを明らかにしていた。蛋白Xの発現はfreeの蛋白Xのみを評価していたが、今年度は複数の抗体を用いて、ISG15 conjugated蛋白の発現を含めて検討した。その結果、ISG15 conjugated蛋白はfree ISG15と同様にIFNα添加により用量依存的に増加することなどが明らかになった。2)蛋白Y(=KLRC3)の検討:前年度までの検討結果から、蛋白Y(=KLRC3)は主にCD3陰性CD56陽性でソーティングされたNK細胞に発現していることが明らかになっていた。そこで、末梢血単核球中のNK細胞割合を比較したところ、劇症1型糖尿病ではNK細胞の割合が有意に低下していた。また、NK細胞におけるRT-PCRの結果、劇症1型糖尿病では、1)KLRC3発現量が有意に低下、2)KLRC3とheterodimerを形成するCD94の発現が有意に低下、3)KLRC3とファミリーを形成するKLRC1やNKG2Dの発現は有意差がない、などが明らかになった。また、臨床的な解析から、劇症1型糖尿病患者のうち、末梢血単核球中のNK細胞の割合が低いほど、高血糖症状発現までの期間が有意に短く、先行感染から膵β細胞の破壊までの期間が短いことを示唆するものと考えられた。本研究の目的は、劇症1型糖尿病において、1)ウイルス感染下流に位置し、β細胞に発現する蛋白X、2)患者免疫担当細胞で発現が低下する蛋白Yのβ細胞傷害における意義を明らかにすることである。1)蛋白Xの検討マウス膵β細胞株MIN6細胞では、IFNα添加前は蛋白Xの発現をほとんど認めなかったが、IFNα添加により蛋白Xの発現が用量依存的に増加した。このことはRT-PCRにおいても、ウエスタンブロット法においても確認された。同様に、マウス単離膵島におけるRT-PCRによる検討でも、IFNα添加により蛋白Xの発現上昇を認めた。次に、アデノウイルスベクターにマウス蛋白Xをコードする遺伝子を組み込み、蛋白Xを発現させるベクターを作成し、MIN6細胞に蛋白Xの発現を誘導した。この細胞に、IFNγ+IL-1βを作用させ、Caspase3/7活性とFACSによるアネキシンV陽性、PI陰性細胞を測定したところ、アポトーシスが減少することが明らかになった。また、アテノウイルスベクターにSiRNAを組み込み、蛋白Xをノックダウンさせるベクターを作成、MIN6細胞にインターフェロンαを用いて、蛋白Xの発現を誘導し、このベクターを作用させ、IFNγ+IL-1βによるアポトーシスについて検討したところ、アポトーシスが増加することが明らかになった。以上の結果から、蛋白Xは細胞障害性サイトカインによるβ細胞のアポトーシスに対し、保護的に作用する可能性が示された。2)蛋白Yの検討モデルマウスを用いた蛋白Y発現/機能解析の予備研究として、ヒトおよびマウス末梢血免疫担当細胞をFACSにより分類し、発現細胞を検討した。その結果、蛋白Yは主にCD3陰性CD56陽性でソーティングされたNK細胞に発現していることが明らかになった。また、ヒト膵組織における免疫組織学的検討を開始した。

膵β細胞株MIN6を用いて、IFNα添加によりISG15の発現が用量依存的に増加すること、ISG15を強制発現させると炎症性サイトカインによるアポトーシスが減少し、ノックダウンさせると増加することを明らかにした。すなわち、ISG15はMIN6細胞において抗アポトーシス作用を有することが明らかになり、治療応用への可能性が示された。さらに本年度は、ウイルス側の環境をよりヒト劇症1型糖尿病に近似したものとするため、ポリイノシンポリシチジン酸(PIC)をMIN6細胞に導入する系を構築した。その結果、IFNα/βおよびISG15mRNA発現上昇、TUNEL陽性細胞数の増加等によりアポトーシスの亢進を明らかになった(投稿準備中)。次に、host側の環境を近似させるため、ヒトiPS細胞株よりβ細胞を分化誘導し用いる系を構築した。具体的には、SOX17陽性内胚葉細胞、PDX1陽性膵前駆細胞を経て、インスリン陽性細胞を誘導する3段階の誘導法によりインスリン産生細胞を分化誘導しえた。NK細胞におけるmRNA発現量の検討から、劇症1型糖尿病では、1)KLRC3およびheterodimerを形成するCD94の発現が有意に低下、3)KLRCファミリーのKLRC1やNKG2Dの発現は有意差がない、などを明らかした。また、末梢血単核球中のNK細胞の割合と先行感染から膵β細胞の破壊までの期間が短さの関連を明らかにした。以上より、劇症1型糖尿病においてKLRC3の発現低下によりウイルス感染に対する免疫反応の異常を介して、発症に関与することが示唆された。内分泌代謝学平成25年度の計画では、1)蛋白X過剰発現系を用いた機能解析、2)蛋白Xを過剰発現させたモデルマウスの作成と解析、3)蛋白Xの血中濃度測定キットの検証、4)ヒト末梢血NK細胞において蛋白Yに関連して発現増強及び低下が予想される分子の発現を検討する予定であった。このうち、蛋白Xについては、新たにconjugated蛋白の評価も必要であると考えられたため、今年度は1)蛋白Xの発現誘導の検討、2)蛋白X過剰発現系を用いた機能解析、3)蛋白X発現抑制系を用いた機能解析を再評価した。結果の一部は第56回日本糖尿病学会で報告した。一方、4)についてはヒト末梢血を用いた解析が順調に進展し、その一部は第56回日本糖尿病学会で報告し、論文として発表した(Nakata S et al. Immunol Lett 2013)。以上のように本研究はおおむね順調に進展している。平成24年度の計画では、1)蛋白Xの発現誘導の検討、2)蛋白X過剰発現系を用いた機能解析、3)蛋白X発現抑制系を用いた機能解析、4)蛋白Xの血中濃度測定系の樹立、5)モデルマウスおよびヒト膵組織での蛋白Y発現/機能解析を行う予定であった。このうち、1)3)については本年度に達成され、4)については測定キットが他施設で開発されたのでそれについて検証を行っている。5)については、モデル動物での検討は達成されていないが、後の分析を効率よく行うために、対象をヒト末梢血とした解析が進展している。当初の計画に従い、平成26年度は、蛋白X (=ISG15)および蛋白Y(=KLRC3)の総合的評価を行う。このうち平成26年度は、特に蛋白X (=ISG15)の評価を重点的に行う。
FKBP38によるミトコンドリア品質管理とパーキンソン病との関連

Shhシグナルは、初期発生において重要な役割を担っており、その活性化過程では細胞センサーである一次繊毛内の輸送が関係する。最近、一次繊毛におけるShhとオートファジー、および繊毛病との関連が報告された。一方、マイトファジーは損傷ミトコンドリアを消去する機構で、パーキンソン病発症との関係が示唆されているが、われわれはFKBP38がShhを抑制すること、マイトファジーと関連しミトコンドリア品質管理に関与していることを解明した。そしてFKBP38結合分子としてANKMY2を新たに同定した。本研究では、それらの分子の機能解析を通じて、ミトコンドリア品質管理におけるShhの関与と制御機構を検討した。近年パーキンソン病の一因として損傷ミトコンドリアの品質管理システムの破綻が注目されている。われわれはミトコンドリア品質管理へのFKBP38の関与を見いだした[Shirane & Nakayama, Nature Cell Biol., (2003); Saita, et al, Nature Commun., (in revision)]。本研究では、FKBP38によって制御されるShhシグナル伝達経路の詳細と、FKBP38結合分子として新規同定されたANKMY2の機能を明らかにすることを目的とした。そしてドーパミンニューロン特異的なFKBP38およびANKMY2のコンディショナルノックアウトマウスを作製・解析し、パーキンソン病との関連を解明することを目指した。これらの解析により、ミトコンドリア品質管理におけるShhシグナルの関与と機構、およびそのパーキンソン病発症との関連を明らかにすることを最終目標とした。その研究実績の概要は、以下の通りである。(1)神経細胞におけるFKBP38結合タンパク質ANKMY2の同定。(2)FKBP38によるミトコンドリア品質管理(マイトファジー応答)機構の解明。(3)FKBP38とShhシグナルおよびANKMY2との相互関係の解析。(4)一次繊毛内輸送におけるFKBP38とANKMY2の関与の解析。(5)ドーパミンニューロン特異的FKBP38・ANKMY2コンディショナルノックアウトマウスの作製。(6)FKBP38によるミトコンドリア品質管理機構とパーキンソン病との関連の解析。以上のうち、(1)(4)は論文にまとめて投稿し、現在リバイス中である。また、(5)(6)については、ES細胞は作製済みで、マウス作製中の段階まで達成した。
in vivoプロモーター解析によるリポジェニック遺伝子の発現調節機構の解明

近年、耐糖能異常、高脂血症、高血圧症など動脈硬化性疾患の危険因子が集積するメタボリック症候群という病態が認知されてきた。その背景には内臓脂肪を中心とした肥満があることが明らかになり、肥満症が生活習慣病につながる病理現象として注目されている。我々は従来より中性脂肪合成系の調節機構という側面から肥満症の発症機序の解明に取り組んできた。肥満症モデル動物においては肝臓における中性脂肪合成が亢進しているが、中性脂肪合成系諸酵素の活性は主に各遺伝子のmRNA発現量により調節されており、その調節にはSterol Regulatory Element-binding Protein-1(SREBP-1)という転写因子が深く関与している。従って肥満症の病態解明を進める上で、SREBP-1の役割やその調節機構を調べることは重要であり、本研究では過剰エネルギーの蓄積を包括的に制御していると考えられているSREBP-1の発現調節機構の解明を目指した。SREBP-1の主たるアイソフォームであるSREBP-1c遺伝子の発現調節領域は、上流に位置するSREBP-1aのエクソン1とSREBP-1cの転写開始点との間の約10kbの間に存在するものと予想されている。我々はまずこの領域をマウスゲノムからクローニングし、塩基配列を決定した。次に下流部分約2kbの断片をルシフェラーゼベクターに組み込み、マウス受精卵に注入し、トランスジェニックマウスを樹立した。このマウスにおいては、肝臓および脂肪組織において、内因性SREBP-1c同様の強い摂食応答がレポーター遺伝子発現に見られ、SREBP-1c上流2kb領域はSREBP-1C遺伝子の摂食応答に必要十分な領域であることが判明した。さらにこの領域のプロモーター/エンハンサー活性についてアデノウイルスを用いた系で詳細な検討を続け、重要な機能性部位の特定に成功した。近年、耐糖能異常、高脂血症、高血圧症など動脈硬化性疾患の危険因子が集積するメタボリック(インスリン抵抗性)症候群という病態が認知されてきた。肥満症モデル動物においては肝臓における中性脂肪合成が亢進しているとされるが、中性脂肪合成系諸酵素の活性は主に各遺伝子のmRNA発現量により調節されており、その調節にはSterol Regulatory Element-binding Protein-1(SREBP-1)という転写因子が深く関与している。従って肥満症の病態解明を進める上で、SREBP-1の役割やその調節機構を調べることは重要であり、本研究では過剰エネルギーの蓄積を包括的に制御していると考えられているSREBP-1の発現調節機構の解明を目指している。次に下流部分約2kbの断片をルシフェラーゼベクターに組み込み、ルシフェラーゼ(レポーター蛋白)のアッセイにより、培養細胞でのプロモーター活性を各種条件下で測定した。高グルコース/高インスリン条件下では軽度のプロモーター活性の上昇が見られたものの、マウスやラットのin vivoの肝臓や脂肪組織における摂食時のSREBP-1c遺伝子発現上昇(これは数十倍レベルの誘導を受ける)に比べると非常に弱いものであった。残りの上流部分のDNAに対しても同様のルシフェラーゼベクターを作成し、プロモーター/エンハンサー活性を検討したが、同じく非常に弱いものであった。

おそらくこれは、培養細胞系がin vivoの状況をシュミレートできていないためと考えられた。そのため、上記のSREBP-1cプロモーター-ルシフェラーゼプラスミドをマウス受精卵に注入し、トランスジェニックマウスを樹立した。このマウスにおいては、肝臓および脂肪組織において、内因性SREBP-1c同様の強い摂食応答がルシフェラーゼレポーター遺伝子発現に見られ、SREBP-1c上流2kb領域はSREBP-1c遺伝子の摂食応答に必要十分な領域であることが判明した。現在さらにこの領域のプロモーター/エンハンサー活性についてアデノウイルスを用いた系で詳細な検討を続けている。近年、耐糖能異常、高脂血症、高血圧症など動脈硬化性疾患の危険因子が集積するメタボリック症候群という病態が認知されてきた。その背景には内臓脂肪を中心とした肥満があることが明らかになり、肥満症が生活習慣病につながる病理現象として注目されている。我々は従来より中性脂肪合成系の調節機構という側面から肥満症の発症機序の解明に取り組んできた。肥満症モデル動物においては肝臓における中性脂肪合成が亢進しているが、中性脂肪合成系諸酵素の活性は主に各遺伝子のmRNA発現量により調節されており、その調節にはSterol Regulatory Element-binding Protein-1(SREBP-1)という転写因子が深く関与している。従って肥満症の病態解明を進める上で、SREBP-1の役割やその調節機構を調べることは重要であり、本研究では過剰エネルギーの蓄積を包括的に制御していると考えられているSREBP-1の発現調節機構の解明を目指した。SREBP-1の主たるアイソフォームであるSREBP-1c遺伝子の発現調節領域は、上流に位置するSREBP-1aのエクソン1とSREBP-1cの転写開始点との間の約10kbの間に存在するものと予想されている。我々はまずこの領域をマウスゲノムからクローニングし、塩基配列を決定した。次に下流部分約2kbの断片をルシフェラーゼベクターに組み込み、マウス受精卵に注入し、トランスジェニックマウスを樹立した。このマウスにおいては、肝臓および脂肪組織において、内因性SREBP-1c同様の強い摂食応答がレポーター遺伝子発現に見られ、SREBP-1c上流2kb領域はSREBP-1c遺伝子の摂食応答に必要十分な領域であることが判明した。さらにこの領域のプロモーター/エンハンサー活性についてアデノウイルスを用いた系で詳細な検討を続け、重要な機能性部位の特定に成功した。
新規超音波遺伝子導入法を用いた再燃前立腺癌に対する分子標的遺伝子治療の開発

DPDは核酸分解に重要な酵素であると報告されている。また、抗癌剤である5-fluorouracil(5-FU)もこのDPDによって分解される。前立腺癌におけるDPD活性の重要性はほとんど検討されていないのが現状である。そこで今回我々は、前立腺癌におけるDPD発現を測定した。さらに前立腺癌のDPD発現と5-FUに対する感受性との相関関係も検討した。44人の前立腺癌患者より前立腺癌組織を採取し、DPD発現を免疫組織染色法を用いて測定した。前立腺癌のDPD発現率は正常前立腺のDPD発現率に比べて有意に高かった。DPD阻害剤である5-chloro-2,4-dihydropyrimidine(CDHP)により、前立腺癌細胞の5-FUに対する感受性が増強した。前立腺癌においてDPD発現が高く、DPDは前立腺癌の標的分子になる可能性が示唆された。また、CDHP,などのDPD阻害剤を併用することにより、前立腺癌の5-FU耐性が克服される可能性も示唆された。TSは核酸合成に重要な酵素である。そこで、前立腺癌におけるTS発現を測定した。52人の前立腺操患者より前立腺癌組織を採取し、TS発現を免疫組織染色法を用いて測定した。前立腺癌のTS発現率は正常前立腺のTS発現率に比べて有意に高かった。T3前立腺癌のTS発現率はT2前立腺癌のTS発現率より有意に高かった。また、前立腺癌のGleason Scoreが高いほどTS発現率は高かった。TS発現を有する前立腺癌患者よりもTS発現を有しない前立腺癌患者の前立腺全摘除術後の5年生存率は有意に高かった。以上の結果から、前立腺癌、特にStage、Gleason Scoreの高い前立腺癌においてTS発現率が高く、TSは前立腺癌の分子標的になる可能性が示唆された。再燃前立腺癌に対しては、ホルモン療法・化学療法・放射線療法などによる集学的治療が試みられているが、現在のところ有効な治療はなく、新たな治療法の開発が望まれている。これに対し、前立腺癌に対する新規治療法としていくつかの遺伝子治療の臨床研究が実施されている。しかし、現時点で有効性が確認された癌遺伝子治療プロトコールは少ない。さらには、癌遺伝子治療の単独での治療効果そのものにも限界が指摘されてきているのが現状である。このような状況の中で今後癌遺伝子治療をさらに発展させるために以下のことを満たすものを検討する予定であった。1)癌病巣に特異的に発現させることにより、より強い抗腫瘍効果を得ることの出来る分子の同定2)標的癌病巣における高い遺伝子発現効率3)化学療法などの集学的治療との組み合わせも可能な取り扱いの簡便性、低侵襲性と安全性本年度は、1)について検討した。その結果、DPDとTSが同定され、特に以下のようにDPDについて深く検討した。また、抗癌剤である5-FUもこのDPDによって分解される。前立腺癌のDPD発現は、正常前立腺より高かった。DPD阻害剤であるCDHPにより、前立腺癌細胞の5-FUに対する感受性が増強した。また、CDHPなどのDPD阻害剤を併用することにより、前立腺癌の5-FU耐性が克服される可能性も示唆された。

再燃前立腺癌に対する分子標的遺伝子治療を開発するため、その標的となる分子として、今年度は、thymidylate synthase(TS)を同定し、以下のようにTSについて深く検討した。TSは核酸合成に重要な酵素であるが、前立腺癌におけるTS活性の重要性はほとんど検討されていないのが現状である。そこで、前立腺癌におけるTS発現を測定し、Stage、Grade、予後との相関関係を検討した。また、TSは5-fluorouracil(5-FU)の標的分子でもある。52人の前立腺癌患者より前立腺癌組織を採取し、TS発現を免疫組織染色法を用いて測定した。前立腺癌のTS発現率は正常前立腺のTS発現率に比べて有意に高かった。T3前立腺癌のTS発現率はT2前立腺癌のTS発現率より有意に高かった。また、前立腺癌のGleason Scoreが高いほどTS発現率は高かった。TS発現を有する前立腺癌患者よりもTS発現を有しない前立腺癌患者の前立腺全摘除術後の5年生存率は有意に高かった。術前にホルモン療法を施行すると、前立腺癌のTS発現率は有意に低下した。この傾向はT2前立腺癌では認められたが、T3前立腺癌では認められなかった。また、このことはGleason Scoreに関係なく認められた。以上の結果から、前立腺癌、特にStage、Gleason Scoreの高い前立腺癌においてTS発現率が高く、TSは前立腺癌の分子標的になる可能性が示唆された。また、TS発現が前立腺癌患者の前立腺全摘除術後の予後マーカーになる可能性も示唆された。
金融政策の資源配分効果に関する研究

本研究は、金融政策が金融機関行動の変化を通じて資源配分に及ぼす影響を明らかにすることを目的としている。そこで、銀行のバランスシートと金融政策の変化に対する貸出の反応に関する理論的な整理・分析を行い、その仮説を検証した。具体的には、1975年から1999年の期間における日本の全国銀行のバランスシートに関するデータを収集・整備し、金融政策の変化に対する銀行の貸出増加率の反応が、銀行の規模、流動性資産比率および自己資本比率に応じてどう変化するかを検証した。この結果、規模が小さいほど、流動性資産の割合が低いほど、また、自己資本比率が高いほど、コールレートの変化に対する貸出の変化がより大幅であることを見出した。業態別に見ると、主要行は流動性資産やBIS比率による違いが顕著であり、地銀は会計上の自己資本や不良債権による違いが顕著である。時期別にみると、引締め期と金融危機期には流動性資産による違いが顕著であり、緩和期には自己資本による違いが顕著である。貸出先の業種別に見ると、製造業等では自己資本による違いが見られるが、不動産業等では自己資本による反応の違いは見られない。これらの結果は、金融政策の貸出経路の存在を示唆しており、特に銀行の自己資本比率が何らかの外生的ショックによって低下した場合には、金融緩和策の効果は減殺されることを示している。また、金融政策が資源配分に及ぼす効果も無視し得ないこと明らかになった。本研究では、金融政策の効果が90年代の日本において極めて限定的なものにとどまったことを示すとともに、その理由について、理論・実証面から分析し、今後の政策運営に関する示唆を導き出した。まず、90年代における累次にわたる金融緩和にもかかわらず、成長率の鈍化、物価の安定・下落、資産価格の長期低落傾向等が生じたことを確認した上で、その背景として、従来の短期金利コントロール政策の波及経路に生じている様々なボトルネックの存在を検証した。具体的には、ゼロ金利制約等のマクロ的要因に加え、金融システム不安に伴う流動性リスク・信用リスクの高まり、金融機関の不良債権問題による貸出供給の低下等のミクロ的要因について詳細に吟味した。さらに、これらボトルネックをいかに克服するかについての政策的インブリケーションを整理した。具体的には、金融システム不安等によって流動性需要が高まった場合には量的緩和によって流動性リスクを低減されることが有効であること、インフレターゲット制導入に際しては、先見的な政策運営よりは粘着的な政策運営によって将来金利にコミットすることが望ましいこと、公定歩合による日銀貸出(ロンバート型貸出)の導入にあたっては、インターバンク市場による規律付けを損なわないよう、不良債権処理の促進策を進めるべきこと、等である。これらの研究成果は、『金融政策の有効性と限界-90年代日本の実証分析』(杉原茂氏、三平剛氏と共著、東洋経済新報社、2001年3月)の一部に掲載されている。具体的には1975年から1999年の期間における日本の全国銀行のバランスシートに関するデータを収集・整備し、金融政策の変化に対する銀行の貸出増加率の反応が、銀行の規模、流動性資産比率および自己資本比率に応じてどう変化するかを検証した。
アジア大陸における衝突型造山帯の精密解析と大陸形成テクトニクスの解明

本研究では,アジア大陸の広範な地域で地質調査を展開し,大陸衝突帯深部地質について変成岩岩石学的・火成岩岩石学的解析を行うと同時に,最先端同位体年代測定を実施して,ユーラシア大陸極東部(アジア大陸)全域における衝突型造山帯形成に関わる大陸形成テクトニクスを明らかにした.また,アジア大陸形成過程と密接に関連するゴンドワナ超大陸の形成・分裂テクトニクスや,日本海形成以前のアジア大陸東縁部におけるテクトニクスについても考察した.5年間の研究成果は国内関連研究も含め51編の原著論文として学術誌に公表し,招待講演を含む多数の学会発表を行った.本研究では,アジア大陸の広範な地域で地質調査を展開し,大陸衝突帯深部地質について変成岩岩石学的・火成岩岩石学的解析を行うと同時に,最先端同位体年代測定を実施して,ユーラシア大陸極東部(アジア大陸)全域における衝突型造山帯形成に関わる大陸形成テクトニクスを明らかにした.また,アジア大陸形成過程と密接に関連するゴンドワナ超大陸の形成・分裂テクトニクスや,日本海形成以前のアジア大陸東縁部におけるテクトニクスについても考察した.5年間の研究成果は国内関連研究も含め51編の原著論文として学術誌に公表し,招待講演を含む多数の学会発表を行った.本研究計画初年度では,アジア大陸の広範な地域で地質調査を展開し,ユーラシア大陸極東部(アジア大陸)全域における衝突型造山帯形成に関わる大陸形成テクトニクスを明らかにするために,以下の項目を実施し着実な成果を得た.1.本年度は,日本海拡大前の日本列島における衝突型変成岩とアジア大陸の衝突型造山運動の関連を明らかにするため,国内各地の関連変成岩の調査・記載・解析を実施し,精密化学分析による原岩推定を行った.2.国際政治情勢に配慮し,当初予定の調査地域を変更して北中国地塊-シベリア地塊の衝突境界となるモンゴル・アルタイ山脈における衝突型変成岩類の精密調査を実施し,最先端分析装置群を駆使して,記載岩石学および変成岩岩石学的解析を行っている.また,微小領域年代測定を開始した.3.南中国地塊-インドシナ地塊-シャンタイ地塊の複合衝突境界となる中国雲南省・三江地域の変成岩類について岩石化学的,鉱物化学的,同位体岩石学的解析を行い,2つの衝突型変成作用の実態を明らかにした.4.アジア大陸形成に関与したゴンドワナ超大陸構成物質を再検討するため,ゴンドワナ超大陸中心部に位置したスリランカの原生代変成岩類について精密地質調査を実施し,原岩構成の再検討を行っている.5.次年度以降のアジア大陸のおける衝突型造山帯研究を円滑・迅速に実施するため,モンゴルおよび中国の関連研究者を招聘して研究打合せおよび室内実験を行った.なお,今年度は5編の原著論文を公表し,14件の学会発表を行った.今後は得られた研究成果を順次公表する.本研究計画2年目では,アジア大陸の広範な地域で地質調査を展開し,ユーラシア大陸極東部(アジア大陸)全域における衝突型造山帯形成に関わる大陸形成テクトニクスを明らかにするために,以下の項目を実施し着実な成果を得た1.本年度は,日本海拡大前の日本列島における衝突型変成岩とアジア大陸の衝突型造山運動の関連を明らかにするため,西南日本各地の関連変成岩の調査・記載・解析を実施し,精密化学分析による原岩推定と年代測定を行った2.北中国地塊とシベリア地塊の中間に位置し実態が明らかではないモンゴル・アルタイ山脈およびハンホヒン山脈の衝突型変成岩類の精密調査を実施し,最先端分析装置群を駆使して,記載岩石学および変成岩岩石学的・火成岩岩石学的解析を行った.また,LA-ICP-MSおよびFE-EPMAを使用して微小領域精密年代測定を実施した3.シブマス地塊-シャンタイ地塊の衝突境界となるタイ・インタノンフアヒン地域の変成岩類・火成岩類について岩石化学的,鉱物化学的,同位体岩石学的解析を行い,衝突型変成作用のなかで地殻浅部に由来する岩石の実態と形成年代を明らかにした4.アジア大陸形成に関連したインドネシア地域の衝突型変成作用を検討するため,スラウェシ島中部地域およびジャワ島中部地域の中生代変成岩類について精密地質調査を実施し,変成作用の解析と年代測定を開始した5.次年度以降のアジア大陸のおける衝突型造山帯研究を円滑・迅速に実施するため,モンゴル,タイ,ミャンマー,ロシア,インドネシア,スリランカの関連研究者と密接に研究打合せを行い,一部は招聘して室内実験を行った.なお.今年度は5編の論文等を公表し,22件の学会発表を行った.今後は得られた研究成果を順次公表する本研究計画3年目では,これまで調査困難であったミャンマーなどを含め,アジア大陸の広範な地域で地質調査を展開し,ユーラシア大陸極東部(アジア大陸)全域における衝突型造山帯形成に関わる大陸形成テクトニクスを明らかにするために,以下の項目を実施し着実な成果を得た.1.年度当初は,2年目までの海外調査による試料解析を継続し,新たにエクロジャイト相変成岩を見出すとともに,日本海拡大前の日本列島とアジア大陸の衝突型造山運動の関連を明らかにするため,西南日本各地の関連変成岩類・火成岩類の調査・分析を実施し,原岩推定と同位体年代測定を行った.2.シベリア地塊周辺に分布する実態が明らかではないモンゴル・サヤン山脈およびハンガイ山脈の衝突型変成岩類・マントル物質の精密調査を実施し,最先端分析装置群を駆使して,変成岩岩石学的・火成岩岩石学的解析を行った.

また,微小領域精密年代測定を実施した.3.シャンタイ地塊-西ビルマ地塊の衝突境界とみなされるミャンマー・モゴック帯の変成岩類・火成岩類について,ミャンマー政府の正式許可を得て現地調査を実施し,多量の岩石試料を得た.国内では,岩石化学的,鉱物化学的,同位体岩石学的解析を行い,衝突型変成作用のなかでは地殻浅部に由来する変成岩類の実態を明らかにした.また,アジア大陸形成最終期のインド亜大陸衝突の影響を解析した.4.アジア大陸形成に関連したインドネシア地域の衝突型変成作用を検討するため,カリマンタン島中央部および東部地域の中生代変成岩類について精密地質調査を実施し,地質構造解析とともに,変成作用の解析と同位体年代測定を開始した.5.次年度以降のアジア大陸のおける衝突型造山帯研究を円滑・迅速に実施するため,モンゴル,タイ,ミャンマー,ロシア,インドネシア,中国等の関連研究者と密接に研究交流を行い,一部は招聘して室内実験を行った.なお,今年度は共同研究者を含め8編の論文等を公表し,35件の学会発表を行った.また,成果の一部は別に8編の論文として国際誌に投稿・査読中である.本研究計画の最終年度では,これまで調査を継続してきたモンゴル・アルタイ山脈および周辺地域に分布する大陸衝突帯の調査を精密化した.また,ユーラシア大陸極東部(アジア大陸)全域における衝突型造山帯形成に関わる大陸形成テクトニクスがほぼ明らかになったため,アジア大陸形成と日本列島形成過程の関連についても調査・考察した.本年度は,具体的に以下の項目を実施し着実な成果を得た.1.本年度当初は,これまでの海外調査による試料解析を継続しつつ,日本海拡大前の日本列島とアジア大陸の衝突型造山運動の関連を明らかにするため,西南日本各地の関連変成岩類・火成岩類の調査・分析と原岩推定・同位体精密年代測定を実施して,カンブリア紀白亜紀に至るアジア大陸東縁のテクトニクスを明らかにした.成果の一部を公表した.2.アジア大陸形成過程に関して明らかになったテクトニクスモデルを応用し,東南極・セールロンダーネ山地における大陸衝突テクトニクスを解析して,ゴンドワナ超大陸形成過程に制約条件を与え,国際誌に公表した.3.モンゴル・中国(チベット)・カザフスタン国境付近における大陸衝突型変成岩の変成過程を精密解析し,複雑な衝突境界を地質学的に明らかにするとともに,衝突境界における原岩後背地の区別を初めて明確化した.成果は国際誌に公表した.4.アジア大陸のおける衝突型造山帯研究総括を円滑・迅速に実施するため,モンゴル,タイ,ミャンマー,ロシア,インドネシア,中国,スリランカ,インド等の関連研究者と密接に研究交流を行い,一部は招聘して精密化学組成分析・年代測定を行った.なお,今年度は共同研究者を含め国際誌等に論文等を多数公表した.また,本研究計画終了後の新たな研究展開を図り地質現象解析を精密化するため,ベトナム,ミャンマー,スリランカ,インド等の東南南アジア地域の精査を開始した.本研究計画4年目では,これまで調査を継続してきたモンゴル・アルタイ山脈に加え,新たにバイカル湖周辺のシベリア地塊周囲に分布する大陸衝突帯の調査を開始した.
遺伝性QT延長症候群由来ヒト心筋細胞を用いた薬剤誘発性QT延長症候群の病態解明

本研究では、ヒト体細胞由来のiPS細胞を心筋に分化させて遺伝性QT延長症候群の心筋イオンチャネルの機能異常の性質を明らかにした。患者体細胞からiPS細胞を樹立し心筋に分化させた胚葉体(Embryoid Body:EB)を作成した。多電極格子(Multi-electrode array:MEA)を用いてEBの細胞外電位を観察して不整脈の発生様式を観察し、種々のイオンチャネル作動薬の効果を検討した。その結果、遺伝性不整脈の病態の解明と治療法の探索には、iPS細胞を用いた解析が有用であることが判明した。薬物誘発性QT延長症候群の原因として、徐脈や低K血症など後天性の要因に加え、患者背景として心筋Kチャネル(IKr, IKs)やNaチャネルの遺伝子変異、SNPなどが潜在的な機能障害をもたらす可能性が指摘されている。しかしながら、これらのイオンチャネル遺伝子異常と薬物作用の相互作用については明かでない。本年度は、1.健常者および遺伝性QT延長症候群(LQT1)患者からのips細胞の樹立を行った。インフォームドコンセントを取得したうえで、健常者及び遺伝性QT延長症候群LQT1とLAT7の患者の皮膚及びリンパ球を採取。株化した後にウイルスベクターを用いて、Oct3/4、Klf4、Sox2、c-Mycの4因子を遺伝子導入し、ips細胞を樹立した。幹細胞多機能分化性を免疫組織法及び遺伝子増幅により確認した。2.ヒトips細胞から心筋細胞を誘導した。樹立したips細胞を、細胞浮遊法にて拍動する心筋細胞に分化させた。細胞形態や心筋特異遺伝子の発現を、免疫組織染色法とRT-PCRにて確認した。3.ヒト再生心筋細胞の電気生理学的性質を検討した。心筋に分化した細胞塊標本に対し格子状多電極装置を用い、細胞外擬似心電図にて細胞塊の擬似QT時間や薬物に対する反応性を検討した。すなわち、健常者に比較し、LQT1及びLQT7患者由来の細胞塊では、QT時間が延長することを確認した。また、カテコラミンやIKr遮断剤の影響を検討している。現在、さらに細胞を単離し、活動電位、イオン電流を測定し、活動電位波形の諸指標(活動電位持続時間とその頻度依存性、静止膜電位、振幅等)、INa, ICaL, IKr, IKs, IKl, Ito, IKACh, IKATPなど多種イオンチャネル電流を測定している。薬物誘発性QT延長症候群の原因として、徐脈や低K血症など後天性の要因に加え、患者背景として心筋Kチャネル(IKr,IKs)やNaチャネルの遺伝子変異、SNPなどが潜在的な機能障害をもたらす可能性が指摘されている。本研究では、京都大山中らにより樹立されたヒトiPS細胞作成技術を用い、健常人と遺伝性QT延長症候群(LQT1,LQT2,LQT3,LQT7)患者から樹立したiPS細胞株から心筋細胞を分化誘導してQT延長を示す薬物を作用させ、遺伝子異常による潜在的イオンチャネル機能障害と薬物の相互作用の解析から、薬物誘発性QT延長症候群の病態解明とその予防・治療法を探索する。本年度は前年度に引き続き、1健常者および遺伝性QT延長症候群(LQT1)患者からのiPS細胞の樹立を行った。インフォームドコンセントを取得したうえで、健常者及び遺伝性QT延長症候群LQT1とLQT7の患者の皮膚及びリンパ球を採取。株化した後にウイルスベクターを用いて、Oct3/4、Klf4、Sox2、c-Mycの4因子を遺伝子導入し、iPS細胞を樹立した。2ヒトiPS細胞から心筋細胞を誘導した。樹立したiPS細胞を、細胞浮遊法にて拍動する心筋細胞に分化させた。3ヒト再生心筋細胞の電気生理学的性質を検討した。心筋に分化した細胞塊標本に対し格子状多電極装置MEA(multi-electrode array)を用い、細胞外擬似心電図にて細胞塊の擬似QT時間や薬物に対する反応性を検討した。4HEK細胞に変異型イオンチャネルを発現させ、その性質と薬物による修飾作用を検討した。5患者iPS細胞由来心筋細胞を単離し、活動電位波形、各種イオン電流を測定している。

本研究計画の実施期間である平成22年度から24年度までに、1健常者および遺伝性QT延長症候群(LQT1)患者からのiPS細胞の樹立2ヒトiPS細胞からの心筋細胞誘導3このヒトiPS細胞由来の心筋細胞を用いたMEA(multi-electrode array)による細胞外電位測定とそれに対する薬物の反応に関する実験を行った。その結果、LQT1患者由来の心筋細胞標本にてIKrチャネル阻害剤とIKsチャネル阻害剤の作用が臨床的薬効を反映していることを示した。またこのチャネル(1893delC)遺伝子をHEK細胞に発現させ、パッチクランプにてIKs電流がdominant-negative様に抑制されること、免疫染色によりその原因がトラフィッキング異常に基づくことを解明し、Cardiovascular Research (2012,Egashiraら)に報告した。また、LQT7(Anderson症候群)にても同様な検討を行い、特徴的な細胞内Ca動態を介した不整脈発生様式について知見を得ている。現在までに、研究計画のおおよそは達成できている。すなわち、1健常人及びQT延長症候群患者由来のiPS細胞の樹立、2心筋細胞への分化誘導、3MEAを用いた細胞外擬似心電図、4HEK細胞にトランスフェクションした異常イオンチャネル遺伝子の発現電流と薬物による修飾作用については、特にLQT1症候群については順調に実験及び解析が行われた。その結果、健常者に比較してLQT1患者由来の細胞塊ではQT時間が延長していること、カテコラミン添加により異常自動能もしくは撃発活動によると思われる自発性不整脈が発生することを確認した。さらに、IKrチャネル阻害剤とIKsチャネル阻害剤を作用させると不整脈への影響がLQT1患者への臨床的抗不整脈効果を反映していることがわかった。また異常が同定されたLQT1チャネル(1893delC)遺伝子をHEK細胞に発現させ、パッチクランプにて発現電流を観察すると、dominant-negative様に抑制されることも見出した。5のパッチクランプ法による活動電位波形やイオン電流の観察と薬物による修飾作用の解析については、現在主として標本の作成上の問題で難航している。すなわち、ヒトiPS細胞由来の心筋細胞塊から細胞を単離する際に酵素処理による細胞のダメージが強く、良好なイオン電流が観察されていない。現在、パッチクランプについては、共同研究という形式で他大学の専門家と連携を取って問題点の解決を試みている。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後、さらにLQT1症候群については、再度iPS細胞から心筋細胞への分化が十分な標本を作成し、新たに細胞電気生理学的手法により活動電位、各種イオンチャネル活動の観察を行う予定である。今後はさらにLQT7症候群(別名Andersen症候群)についても詳細に検討する予定である。すなわち、LQT7患者等の末梢血Tリンパ球からiPS細胞樹立し、心筋細胞に分化させて不整脈源性、薬物に対する反応を活動電位、イオン電流の測定、細胞内Caイオン動態と膜電位の同時計測、光学マッピングによる不整脈の可視化などの手法を用いて解析し、最適の薬物療法及び遺伝子治療の可能性について探索する。
細胞内運搬機構

細胞内において、タンパク質を合成部位から機能を発揮する部位まで定められた道筋を通って運搬することは、その正常な機能の発現にとって極めて重要である。このダイナミックな過程を支配する細胞骨格系を中心とする機構を様々な角度から解析した。人工アクトミオシン再構成系を用いて、細胞内運搬の動力の発生が、基本的には協調的、非線形的反応であることを明らかにした。非筋細胞の動力装置を支配する様々な細胞骨格調節タンパク質、プロフィリン、フラグミン、コフィリン、カルデスモン、カルスペクチン等を単離し、それらの作用機作を明らかにした。カルシウム・イオン依存性、アクチン繊維に対する結合様式、その他従属因子などについて、新しい知見を得た。また、特異抗体を作成し、動力発生にともなうこれらのタンパク質の細胞内分布の変化を、蛍光抗体法によって明らかにした。血小板放出反応に関連するミオシンL鎖のリン酸化やその他の細胞骨格タンパク質のリン酸化の反応系を再構成し、それらに関与するタンパク質キナーゼの種類を明らかにした。軸索輸送において、細胞膜成分である糖脂質や修飾糖鎖前駆体の輸送方式を新たに見出した。また、軸索におけるミクロチューブルと中間径繊維をクロスリンクする新しいタンパク質を同定した。細胞をDMSO、サイトカラシンD、あるいは熱ショック処理すると、細胞質のアクチンが核に移行し、条件によってはアクチンロッドに変化する反応を解析した。その結果、アクチンロッドはアクチン繊維によって形成されるにもかかわらず、ファロイジンと結合しないことを見出した。これは、アクチン外の未同定のタンパク質が結合部位をブロックしていることを示唆する。筋弾性タンパク質コネクチンはその非可溶的性質から、生合成後のプロセシングを受けているはずであるが、コネクチンの部分的分解物を単離し、それらの分子的性質を明らかにした。
思春期吃音児の自己肯定感促進要因の検討～社交不安障害や自死の防止を目指して～

本研究では.成人吃音者を対象として聞き取り調査,および質問紙によるアンケート調査を行い,思春期の吃音児の自己肯定感促進要因を明らかにすることである.そのため研究期間の12年目は質問紙の作成が課題であり.質問紙作のため,浜松言友会の協力を得て15名程度を対象に聞き取り調査を行う予定であった.聞き取りの項目は1)自覚している吃音症状、2)親の様子、3)対人関係、4)悩みと相談相手、5)最も悩んだ時期、6)自己に対する思い、7)吃音に対する思い.以上の7点であった.しかし,2018年8月と10月に浜松言友会主催による一般市民向けの吃音講座を開催し,その中で言友会会員から体験談の発表を行うことになった.体験発表は「吃音をいかに克服し,今を豊かに生きてきたか」がテーマであり,科研費の研究テーマと重なるところが大きいと考えられた.過去の数年の言友会会員の体験発表の原稿が浜松言友会事務局に保存されていることが分かったので,分析対象を直接の聴取のほかに,過去数年の体験発表の原稿の記述内容を加えることが,本研究の質の向上に寄与すると考えられた.そこで,作成者本人の同意を得て15名分の発表原稿を入手し,当初予定していた聞き取り調査を実施する前に,体験発表原稿の記載内容をKJ法にて分析した.その結果,吃音を肯定的に評価するにいたる要因として1いじめにあう経験がないこと2親へ吃音の相談ができること3吃音を受容する考えを持った他者に出会うこと,などが挙げられた.浜松言友会の体験発表原稿を分析することを,質問紙作成の材料に加えたことが遅延の理由である.本研究では.成人吃音者を対象として聞き取り調査,および質問紙によるアンケート調査を行い,思春期の吃音児の自己肯定感促進要因を明らかにすることであった.そのため研究期間の12年目は質問紙の作成が課題であり.浜松言友会の協力を得て15名程度を対象に聞き取り調査を行う予定であった.しかし,2018年8月と10月に浜松言友会主催による一般市民向けの吃音講座を開催し,その中で浜松言友会会員から体験発表を行うことになった.体験発表は「吃音をいかに克服し,今を豊かに生きてきたか」がテーマであり,科研費の研究テーマと重なるところが大きいと考えられた.2018年度の体験発表者の原稿だけでなく,過去数年の言友会会員の体験発表の原稿が浜松言友会事務局に保存されていることが分かったので,分析対象を直接の聴取のほかに,過去数年の体験談発表の原稿の記述内容も加えようと思い立った.作成者本人の同意を得て15名分の発表原稿を入手したので,当初予定していた聞き取り調査を実施する前に,体験発表原稿の記載内容をKJ法にて分析した.浜松言友会会員の体験発表の記載内容をKJ法にて分析した.その結果,吃音を肯定的に評価するにいたる要因として1いじめにあう経験がないこと2親へ吃音の相談ができることと3吃音を受容する考えを持った他者に出会うこと,などが挙げられた.これらの項目を,当初聞き取り調査の項目としていた1)自覚している吃音症状、2)親の様子、3)対人関係、4)悩みと相談相手、5)最も悩んだ時期、6)自己に対する思い、7)吃音に対する思い.以上の7点に付け加えたい.今年度中に聞き取り調査を終え,質問紙を完成させる.本研究では.成人吃音者を対象として聞き取り調査,および質問紙によるアンケート調査を行い,思春期の吃音児の自己肯定感促進要因を明らかにすることである.そのため研究期間の12年目は質問紙の作成が課題であり.質問紙作のため,浜松言友会の協力を得て15名程度を対象に聞き取り調査を行う予定であった.聞き取りの項目は1)自覚している吃音症状、2)親の様子、3)対人関係、4)悩みと相談相手、5)最も悩んだ時期、6)自己に対する思い、7)吃音に対する思い.以上の7点であった.しかし,2018年8月と10月に浜松言友会主催による一般市民向けの吃音講座を開催し,その中で言友会会員から体験談の発表を行うことになった.体験発表は「吃音をいかに克服し,今を豊かに生きてきたか」がテーマであり,科研費の研究テーマと重なるところが大きいと考えられた.過去の数年の言友会会員の体験発表の原稿が浜松言友会事務局に保存されていることが分かったので,分析対象を直接の聴取のほかに,過去数年の体験発表の原稿の記述内容を加えることが,本研究の質の向上に寄与すると考えられた.そこで,作成者本人の同意を得て15名分の発表原稿を入手し,当初予定していた聞き取り調査を実施する前に,体験発表原稿の記載内容をKJ法にて分析した.その結果,吃音を肯定的に評価するにいたる要因として1いじめにあう経験がないこと2親へ吃音の相談ができること3吃音を受容する考えを持った他者に出会うこと,などが挙げられた.浜松言友会の体験発表原稿を分析することを,質問紙作成の材料に加えたことが遅延の理由である.

本研究では.成人吃音者を対象として聞き取り調査,および質問紙によるアンケート調査を行い,思春期の吃音児の自己肯定感促進要因を明らかにすることであった.そのため研究期間の12年目は質問紙の作成が課題であり.浜松言友会の協力を得て15名程度を対象に聞き取り調査を行う予定であった.しかし,2018年8月と10月に浜松言友会主催による一般市民向けの吃音講座を開催し,その中で浜松言友会会員から体験発表を行うことになった.体験発表は「吃音をいかに克服し,今を豊かに生きてきたか」がテーマであり,科研費の研究テーマと重なるところが大きいと考えられた.2018年度の体験発表者の原稿だけでなく,過去数年の言友会会員の体験発表の原稿が浜松言友会事務局に保存されていることが分かったので,分析対象を直接の聴取のほかに,過去数年の体験談発表の原稿の記述内容も加えようと思い立った.作成者本人の同意を得て15名分の発表原稿を入手したので,当初予定していた聞き取り調査を実施する前に,体験発表原稿の記載内容をKJ法にて分析した.浜松言友会会員の体験発表の記載内容をKJ法にて分析した.その結果,吃音を肯定的に評価するにいたる要因として1いじめにあう経験がないこと2親へ吃音の相談ができることと3吃音を受容する考えを持った他者に出会うこと,などが挙げられた.これらの項目を,当初聞き取り調査の項目としていた1)自覚している吃音症状、2)親の様子、3)対人関係、4)悩みと相談相手、5)最も悩んだ時期、6)自己に対する思い、7)吃音に対する思い.以上の7点に付け加えたい.今年度中に聞き取り調査を終え,質問紙を完成させる.当初,浜松言友会会員に聞き取り調査を実施する予定であったが,過去の浜松言友会主催の「吃音講座」における体験発表の原稿が保存されていることが明らかになった.質問紙を作成する上で,この発表原稿内容の分析結果を加えることがより的確な質問項目の設定に有用であると考えられた為,聞き取り調査の前に分析を開始することにした.したがって2018年度は,聞き取り調査を実施できておらず,当初予定していた謝金・交通費・研究代表者の旅費等が発生しなかった為,残金が生じた.次年度は,聞き取り調査の謝礼,交通費,および質問紙作成に係る物品経費に使用する予定である.
有孔虫化石群と白亜紀古環境

日本列島の主な海成白亜紀層について、浮遊性有孔虫による生層序を確立し、地層の年代の決定と堆積環境の復元を行った。とくに、北海道枝幸郡中頓別町西部地域、北海道幾春別東南部地域、北海道浦河町南西部地域に分布する白亜紀後期の地層については、古環境解析の結果、沿岸相から大陸斜面上部相の堆積断面が得られることが判明し、含まれる底生有孔虫の殼形態の解析による、白亜紀海洋中の溶存酸素量の解析を行った。溶存酸素量は、白亜紀初期の中程度の状態から、セノマニアン階後期からコニアシアン階にかけて、酸素極少期へと変化し、コニアシアン階以後高溶存酸素状態へと移化して行った過程が復元された。また、北海道幾春別東南部大夕張および留萌地方の小平(おびら)地域の2つのセクションについては、堆積物に含まれる有機物中の炭素同位体比を測定し、両地域に共通してセノマニアン/チューロニアン階の境界においてδC^<13>が-2 0/00ほど、短期間に急激な変化を記録していることを見出した。類似の変化が、アメリカ中西部、コロラド州のペブロ地域の同時代層にも認められ、その原因は汎海洋的なものであることを示唆している。したがって、この炭素同位体比の変化は、今後世界の後期白亜紀層の対比に有効な、同時間面を与えることが明らかになった。西南日本の四万十帯の白亜紀層は、多くが海溝斜面の堆積物であり、強い構造変化を受けていることと、深い堆積深度のために、古海洋学的な研究目的には不適である。しかし、研究の副産物として、これらの地層に顕著に異質岩体として含まれる石灰岩塊は、多くがアルビアン階の深海に堆積したことが明らかになった。平成3年度において,北海道全域,紀伊半島,赤石山地,常盤地域について,白亜紀層の生層序の検討と微化石の採集を行った。この中で、大陸棚から大陸斜面にかけての環境断面を復元できるのは、北海道中南部の,幾春別ー大夕張ー穂別地域に分布する、後期白亜紀のセノマニアンからキヤンパニアン階の地層であることが判明した。この地域の有孔虫群の群集構成と数形態の解析を進めている。生層序については,白亜紀の国際的な階区分を北海道やその他の日本各地の地層で、どのように認識するかが重要な課題として浮かび上って来た。初年度の研究において重要な成果は、セノマニアン/チュ-ロニアン階の境界付近で炭素13同位体比の2‰の短期間での増大が認められたことである。この変化は、最初ヨ-ロッパ,特にフランス・イギリスのこの境界付近で認められ,その後北アメリカ西部において詳細な変化が測定された。日本では大夕張ー穂別地域と,留萌支庁小平(オビラ)地域と北海道の離れた2地点で,急激なスパイク状の増大が起っている。測定は有機炭素を対象にしたが,この事実は有機炭素の炭素同位体比のスパイクを認めることで、汎世界的な同時間面が樹立されることを証明したという点で重要な意義がある。つまり,同位体比のスパイクの原因としては,炭素12の同位体に富む有機物が,当時の停滞した海洋循環のために酸化されずに海底に保存され,そのために海洋上層部においては炭素13同位体比の増加をもたらすという。海洋無酸素水(OAE)の考えを支持するものである。
磁性粒子上のソフト界面制御に向けた刺激応答性人工タンパク質の分子設計

本研究では、温度応答性ポリペプチドを配した磁性粒子の設計とその特性評価を行うことを目的とした。本年度は、異なる長さ(50-150 mer)の温度応答性ポリペプチドの遺伝子設計、磁性細菌を用いた磁性粒子上への発現、及び温度変化による磁性粒子上の界面制御を試みた。温度応答性ポリペプチドとして、エラスチン様ポリペプチド(アミノ酸配列:(VPGVG)n)のn = 10, 20, 30となるように設計した。またこの時の遺伝子は、磁性細菌のコドン頻度に合わせてDNA配列を設計し、アンカー遺伝子と融合することで磁性粒子上への局在を可能とした。各融合遺伝子を導入した磁性細菌からタンパク質ー磁性粒子複合体を抽出し、SDS-PAGEにより発現を確認した結果、目的のサイズに融合タンパク質が確認できた。また、ELP鎖長が増加することにより、わずかに融合タンパク質の発現量が低下したことが示された。次に50 merのELPー磁性粒子複合体表面の温度変化による疎水性の変化を蛍光プローブにより評価した。その結果、コントロールである磁性粒子においては、蛍光強度に変化が観察されないのに対し、ELP-磁性粒子複合体においては20°Cから60°Cに温度上昇することにより蛍光強度が増大することが示された。さらに温度上昇による粒子径の変化を粒度分布測定により評価した結果、ELP-磁性粒子複合体において温度の上昇に伴い粒子径が2倍以上、増大することが示された。この結果は温度上昇に伴い、磁性粒子表面の疎水性度の増加により凝集塊形成が促進したと考えられた。また、これらの凝集塊形成は、温度を下げることで、再度分散状態に変化することが示され、可逆的な現象であることが示された。以上より、本研究では磁性粒子界面を温度によって制御できることが示された。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、刺激応答性ポリマーの特性を模倣したアミノ酸配列から構成される、刺激応答性ポリペプチドを配した磁性粒子の設計を目的とした。本年度は、温度応答性ポリペプチドの探索に向けて、CFP及びYFPを用いた蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)によるポリペプチド構造変化の評価系を構築した。磁性細菌をホストとして用い、刺激応答性ポリペプチドとして、加熱により収縮する特性を有する温度応答性ポリペプチドであるエラスチン様ポリペプチド(ELP、配列:(-Val-Pro-Gly-Val-Gly-)n)を用いた。ELP(n=10>をコードしたDNA配列の上流及び下流に蛍光タンパク質CFP及びYFP遺伝子をそれぞれ融合した人工遺伝子を構築した。設計した人工遺伝子を磁性細菌に導入し、得られた形質転換体からCFP、YFP、及びELP融合タンパク質発現磁性粒子を作製した。得られた磁性粒子表面で起きるELPの構造変化をFRETの効率により評価した結果、粒子を加熱した際にFRET率の上昇が示された。これはYFPとCFPが近傍に存在する時にのみ生じる蛍光特性であることから、ELPが加熱により収縮したことが示唆された。また、磁性粒子上でのELPの構造変化が生じる温度(相転移温度)の制御に向けて、(-Val-Pro-Gly-X-Gly-)nのX部位にバリン、アラニン、及びロイシンを導入した発現ベクターを構築し評価を行った。その結果、アミノ酸側鎖の疎水性度の増加により相転移温度が低下することが示された。本年度の成果として、FRETの効率を評価することにより、磁性粒子上で温度変化に伴ったポリペプチドの構造変化を評価できることが示された。さらにポリペプチドのアミノ酸変異を導入することで相転移温度が制御できた。従って、本手法を用いることで温度応答性ポリペプチドの粒子上での構造変化の評価及びその機能改変に利用できることが示された。