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食品アレルギー誘発物質の検索とアレルギー低誘発性・アレルギー抑制食品の開発研究

化学物質β-ベンゼンヘキサクロライド(β-BHC),p,p′-ジクロロジフェニルジクロロエチレン(DDE),クロロニトロフェン(CNP),アンピシリン,o-アセチルクエン酸トリブチルエステル(ATBC)の免疫系に与える影響を解析した.まず,in vitroにおけるマウスT細胞の増殖とインターロイキン(IL)-2,IL-4,IL-10およびインターフェロン-γの分泌に与える影響を調べた.物質によって,上昇,阻害,濃度によって上昇と阻害の両方などの複雑な効果が認められた.次にin vivo実験系を用いて経口摂取抗原により誘導される抗体応答に対する影響を検討した.それぞれの物質において,投与法,投与量,抗体アイソタイプなどにより与える影響が異なりこの場合も複雑な効果が認められた.卵白アルブミン(OVA)特異的T細胞のT細胞抗原レセプター遺伝子を導入したトランスジェニックマウスにOVA飼料を摂取させることにより,脾臓中にIL-4産生能の高いT細胞が誘導され,血中IgE応答が誘導される.そこでこの実験系を用いて食物アレルギーの関わる免疫応答に対する影響について検討した.その結果,ATBCにより脾臓細胞のIL-4号産生が抑制された.さらにこのトランスジェニックマウス由来の脾臓T細胞のサイトカイン分泌への脂質代謝系の物質の影響を調べた.その結果,リノール酸とアラキドン酸が低濃度でIL-4分泌を抑制した.これらの実験系はアレルギー応答に関わる免疫応答に影響を与える食品成分の検索に有用と考えられる.一方で乳製品の製造に用いられるLactobacillus caseiがin vitro IgE産生に与える影響を調べた.L.caseiはマクロファージによるIL-12産生の増強を介してIgE産生を抑制した.乳酸菌はIgEが関与するアレルギーの抑制に有効である可能性が示された.化学物質β-ベンゼンヘキサクロライド(β-BHC),p,p′-ジクロロジフェニルジクロロエチレン(DDE),クロロニトロフェン(CNP),アンピシリン,o-アセチルクエン酸トリブチルエステル(ATBC)の免疫系に与える影響を解析した.まず,in vitroにおけるマウスT細胞の増殖とインターロイキン(IL)-2,IL-4,IL-10およびインターフェロン-γの分泌に与える影響を調べた.物質によって,上昇,阻害,濃度によって上昇と阻害の両方などの複雑な効果が認められた.次にin vivo実験系を用いて経口摂取抗原により誘導される抗体応答に対する影響を検討した.それぞれの物質において,投与法,投与量,抗体アイソタイプなどにより与える影響が異なりこの場合も複雑な効果が認められた.卵白アルブミン(OVA)特異的T細胞のT細胞抗原レセプター遺伝子を導入したトランスジェニックマウスにOVA飼料を摂取させることにより,脾臓中にIL-4産生能の高いT細胞が誘導され,血中IgE応答が誘導される.そこでこの実験系を用いて食物アレルギーの関わる免疫応答に対する影響について検討した.その結果,ATBCにより脾臓細胞のIL-4号産生が抑制された.さらにこのトランスジェニックマウス由来の脾臓T細胞のサイトカイン分泌への脂質代謝系の物質の影響を調べた.その結果,リノール酸とアラキドン酸が低濃度でIL-4分泌を抑制した.これらの実験系はアレルギー応答に関わる免疫応答に影響を与える食品成分の検索に有用と考えられる.一方で乳製品の製造に用いられるLactobacillus caseiがin vitro IgE産生に与える影響を調べた.L.caseiはマクロファージによるIL-12産生の増強を介してIgE産生を抑制した.乳酸菌はIgEが関与するアレルギーの抑制に有効である可能性が示された.現在は使用されていないが過去の使用のため環境中に存在している化学物質を中心として,免疫系に与える影響を解析した.物質としては,β-ベンゼンヘキサクロライド(β-BHC),P,P'-ジクロロジフェニルジクロロエチレン(DDE),2,4,6-トリクロロフェニルエーテル(CNP)のほか,D-α-アミノベンジルペニシリン(Amp),o-アセチルクエン酸トリブチルエステル(ATBC)を選んだ.まず,in vitroにおけるマウスT細胞の増殖とサイトカイン産生に与える影響を調べた.C3H/Heをα_<s1>-カゼインで免疫し,リンパ節を回収し,抗原存在下で各種化学物質を加えて培養した.その結果,20ppm以上のCNPおよびDDEが,T細胞増殖を強く阻害することが判明した.ATBCは可塑剤であり,培養に用いるプラスチック器具への影響が細胞応答に影響したようである.培養上清中に分泌されるサイトカインとして,インターロイキン2(IL-2)のほか,IL-4,IL-10およびインターフェロンγ(IFN-γ)の量を定量した.どのサイトカイン分泌も物質によって,上昇,阻害,濃度によって上昇と阻害の両方,影響なしなどの複雑な効果が認められた.各種物質が毒性をもつ場合でも,サイトカイン産生に対して必ずしも阻害するだけではなく,細胞膜に損傷を与えて分泌を促すこともありうる.したがって,阻害および促進の両者の効果のため,複雑な影響が認められたと考えられる.以上の実験系は,すでに活性化されたリンパ球に与える影響を調べるものである.そこで,抗原未感作リンパ球に与える影響を調べる実験系が,アレルギーの発症に与える影響を調べるのにより適すると考え,別のin vitro実験系を作製している.

また化学物質を動物に投与し,抗体産生に与える影替を調べる実験系を組み立てつつある.本研究では,食品関連の各物質がアレルギー応答に関係のある免疫応答に与える影響を解析した.まず乳製品の製造に用いられるグラム陽性細菌であるLactobacillus caseiが,IgE産生に与える影響を調べた.鶏卵アレルギーの原因物質の1つであるオバルブミン(OVA)で感作したマウス脾臓細胞をL.caseiとともに培養したところ,IgE産生やインターロイキ4(IL-4),IL-5産生が抑制され,インターフェロンγ(IFN-γ)産生が促進された.またこれらの影響は,マクロファージによるIL-12産生の増強が原因であることも判明した.したがって乳酸菌はIgEが関与するアレルギーの抑制に有効である可能性が示された.またアレルギーに関わる免疫応答に対する影響を調べるための新たな実験系の開発を検討した.すなわち抗体産生はT細胞によって制御されていることに注目してT細胞が産生するサイトカインの種類や量に与える影響を調べられるように,OVA特異的T細胞のT細胞レセプター遺伝子を導入したトランスジェニックマウス由来の脾臓T細胞の作るサイトカインを調べた.この実験系では末梢未分化T細胞のエフェクター細胞への終末分化を観察できる.試料としては脂質代謝系の物質を選び,T細胞の増殖や,IFN-γ,IL-2,IL-4,IL-5分泌への影響を調べた.IgE産生に関わるのはIL-4,IL-5を分泌するTh2型のT細胞である.アセチルサリチル酸はIL-5分泌を抑制した.リノール酸とアラキドン酸は高濃度では測定したすべてを抑制したが,低濃度ではIL-4分泌の抑制が顕著であった.水溶液への溶解度の低い物質の検定法にはまだ問題が残されているにもかかわらず,本実験系によりアレルギー応答に関わる免疫応答に影響を与える食品成分を検索することができる.本研究では,食品関連の各物質がアレルギー応答に関係のある免疫応答に与える影響をin vivo実験系を用いて解析した.C3Hマウスにカゼイン飼料を摂取させることにより血中抗体応答が誘導されることを明らかにしている.そこで,この実験系を用いて経口摂取抗原により誘導される抗体応答に対する化学物質の影響を検討した.化学物質としてはβ-ベンゼンヘキサクロライド(β-BHC),p,p'-ジクロロジフェニルジクロロエチレン(DDE),2,〓6-トリクロロフェニルエーテル(CNP),D-α-アミノベンジルペニシリン(Amp),o-アセチルクエン酸トリブチルエステル(ATBC)を選んだ.その結果,それぞれの物質において,投与法,投与量,抗体アイソタイプなどにより与える影響が異なり,複雑な効果が観察された.また,卵白アルブミン(OVA)特異的T細胞のT細胞抗原レセプター遺伝子を導入したトランスジェニックマウスにOVA飼料を摂取させることにより,脾臓中にIL-4産生能の高いT細胞が誘導され,血中IgE応答が誘導されることを見出した.そこで,この系を用いて食物アレルギーの関わる免疫応答に対し化学物質が与える影響について検討した.その結果,ATBCを添加したOVA飼料を摂取した群においては脾臓細胞のIL-
スギ花粉症合併喘息患者における舌下免疫療法の新規バイオマーカー樹立

喘息とアレルギー性鼻炎は、共通する危険因子(アレルゲン)や類似する粘膜構造などから病態生理学上の関連性が強く、喘息患者の70%にアレルギー性鼻炎の合併を認め、アレルギー性鼻炎の合併によって喘息発症リスクが高くなることやアレルギー性鼻炎合併喘息においては、喘息発作の発現率が高くなることなどが報告されている。本研究においては、スギ花粉症合併喘息患者におけるスギ花粉舌下免疫療法の喘息に対する治療効果を解析し、その有効性を明らかにするとともに、スギ花粉舌下免疫療法の治療効果を予測・反映する新規バイオマーカーの開発を目的としている。2016年から2019年にスギ花粉舌下免疫療法を導入したスギ花粉症合併喘息18例のうち妊娠1例、転居1例、転院1例、副作用(掻痒感)1例を除いた計14例が対象となっている。そのうち1年以上が経過した9症例について、治療前後の症状や呼吸機能検査などの変化を比較検討した結果では、花粉シーズン中の鼻症状または喘息症状は、スギ花粉舌下免疫療法前に比べ治療後で有意な改善を認めている。また、治療前後での一秒量や呼気中一酸化窒素濃度に有意差を認めなかったが、強制周波数オシュレーション法では治療前に比べ治療後に改善を認めている。これらの結果からは、スギ花粉症合併喘息患者においてスギ花粉舌下免疫療法により喘息が改善する可能性が示唆される。一方、血液検体のバイオマーカーについては、補助シグナル分子CD27陰性CD4陽性T細胞がハンノキ花粉症患者の減感作療法により減少することが報告されているが、本研究においても、現状の14症例の解析において、治療前のシーズンオフに比べて治療後の花粉シーズン中の末梢血CD27陰性CD4陽性T細胞の減少を認めている。スギ花粉症合併喘息患者におけるスギ花粉舌下免疫療法の喘息に対する有効性が示唆されるが、今後、更なる症例の集積が必要である。平成28年度は4症例でスギ花粉舌下免疫療法が開始され、うち2症例は副作用と他疾患のため投与中止となっている。このため、喘息に対する効果とバイオマーカー検索については、今後の症例集積が必要な状況である。現時点で15症例が投与開始予定となっており、投与開始はスギ花粉飛散時期を避けるため、数か月後に投与開始予定である。血液検体のバイオマーカーについては、補助シグナル分子CD27陰性CD4 T細胞がハンノキ花粉症患者の減感作療法のサロゲートマーカーに成り得ることが報告されている。我々は、抗CD70抗体が喘息モデルマウスの系を抑制すること、CD27陰性CD4T細胞がTh2サイトカインであるIL-4、IL-5、IL-13を有意に産生すること、抗CD70抗体投与によりCD27陰性CD4T細胞が減少することを報告しており、CD27陰性CD4 T細胞をスギ花粉舌下免疫療法のバイオマーカー候補の一つに想定している。スギ花粉舌下免疫療法を開始した4症例のうち投与継続かつ明らかに喘息症状に改善を認めている1例では、末梢血CD27陰性CD4 T細胞の減少を認めている。スギ花粉舌下免疫療法を必要とするスギ花粉症合併喘息患者の集積に難渋しているが、現在15症例が投与開始予定となっている。本研究の適応となる患者をさらに集積する目的に関連医療機関である順天堂大学医学部附属浦安病院、同練馬病院、同静岡病院、同順天堂東京江東高齢者医療センター、公益財団法人東京都保健医療公社東部地域病院での症例集積を実施している。このため、遅れているとした。平成29年度は6症例が追加となり、計10症例となったが、平成28年度に2症例が副作用と他疾患のため投与中止となっている。現時点でスギ花粉舌下免疫療法を継続している8症例では、花粉症症状の軽減を認めている。平成30年度では、更なる症例集積を行い、スギ花粉症合併喘息患者におけるスギ花粉舌下免疫療法の喘息に対する治療効果を解析し、その有効性を明らかにするとともに、スギ花粉舌下免疫療法の治療効果を予測・反映する新規バイオマーカーの開発を目指す。

我々は、抗CD70抗体が喘息モデルマウスの系を抑制すること、CD27陰性CD4T細胞がTh2サイトカインであるIL-4、IL-5、IL-13を有意に産生すること、抗CD70抗体投与によりCD27陰性CD4T細胞が減少することを報告しており、CD27陰性CD4 T細胞をスギ花粉舌下免疫療法のバイオマーカー候補の一つに想定している。1年の経過がフォローできており、明らかに喘息症状に改善を認める1例では、末梢血CD27陰性CD4 T細胞の減少を認めている。スギ花粉舌下免疫療法を必要とするスギ花粉症合併喘息患者の集積に難渋している。本研究の適応となる患者をさらに集積する目的に関連医療機関である順天堂大学医学部附属浦安病院、同練馬病院、同静岡病院、同順天堂東京江東高齢者医療センター、公益財団法人東京都保健医療公社東部地域病院での症例集積を実施している。このため、遅れているとした。喘息とアレルギー性鼻炎は、共通する危険因子(アレルゲン)や類似する粘膜構造などから病態生理学上の関連性が強く、喘息患者の70%にアレルギー性鼻炎の合併を認め、アレルギー性鼻炎の合併によって喘息発症リスクが高くなることやアレルギー性鼻炎合併喘息においては、喘息発作の発現率が高くなることなどが報告されている。本研究においては、スギ花粉症合併喘息患者におけるスギ花粉舌下免疫療法の喘息に対する治療効果を解析し、その有効性を明らかにするとともに、スギ花粉舌下免疫療法の治療効果を予測・反映する新規バイオマーカーの開発を目的としている。2016年から2019年にスギ花粉舌下免疫療法を導入したスギ花粉症合併喘息18例のうち妊娠1例、転居1例、転院1例、副作用(掻痒感)1例を除いた計14例が対象となっている。そのうち1年以上が経過した9症例について、治療前後の症状や呼吸機能検査などの変化を比較検討した結果では、花粉シーズン中の鼻症状または喘息症状は、スギ花粉舌下免疫療法前に比べ治療後で有意な改善を認めている。また、治療前後での一秒量や呼気中一酸化窒素濃度に有意差を認めなかったが、強制周波数オシュレーション法では治療前に比べ治療後に改善を認めている。これらの結果からは、スギ花粉症合併喘息患者においてスギ花粉舌下免疫療法により喘息が改善する可能性が示唆される。一方、血液検体のバイオマーカーについては、補助シグナル分子CD27陰性CD4陽性T細胞がハンノキ花粉症患者の減感作療法により減少することが報告されているが、本研究においても、現状の14症例の解析において、治療前のシーズンオフに比べて治療後の花粉シーズン中の末梢血CD27陰性CD4陽性T細胞の減少を認めている。スギ花粉症合併喘息患者におけるスギ花粉舌下免疫療法の喘息に対する有効性が示唆されるが、今後、更なる症例の集積が必要である。さらなる症例の集積を推進するため、関連医療機関である順天堂大学医学部附属浦安病院、同練馬病院、同静岡病院、同順天堂東京江東高齢者医療センター、公益財団法人東京都保健医療公社東部地域病院での症例集積も継続する。また、血液検体のバイオマーカーの候補としては、上述のCD27陰性CD4 T細胞のほかに、末梢血液中の自然リンパ球分画、抗IL-13抗体治療のバイオマーカーとして期待されるペリオスチンをはじめ、テネイシンCなどの線維化
アンコール遺跡における出土貿易陶磁器の様相解明

主にバイヨン寺院の南経蔵基壇、南経蔵周辺、外回廊南東面、中央塔において綿密な発掘調査を行い、出土貿易陶磁器の整理を行った。主な成果としては、南経蔵基壇より検出したラテライト造内部構築物は、古期のものとして捉える根拠は乏しく、現存する南経蔵と一体の内部構築物と考えるのが妥当であるとした。また、南経蔵が建立後に用途や儀礼の変更を伴いながらバイヨン期の後期や、ポスト・アンコール期においても利用されていた可能性が推測された。研究の対象となるバイヨン寺院、プラサート・スープラ遺跡は、いずれもアンコール時代における都市の中心に位置し、往時の都市設計を考察する上で重要な遺構である。本研究は、アンコール遺跡群における発掘調査から出土した貿易陶磁を中心とした出土遺物の分析をもとにして、(1)東南アジア諸国に通用する精度の高い考古学的基準資料を構築し、(2)これに基づきアンコール遺跡群における空間活用がどのように展開し廃絶され、現在に至ったのかという過程を明らかにすることである。更には、往時のアンコール遺跡群の都市空間の再現に向けての見通しを得ることも重要な課題としている。平成19年度の計画は(A)プラサート・スープラ、バイヨン寺院出土陶磁の基礎調査。(B)アンコール王宮跡の分布調査。(C)調査基準のマニュアル化、整備および英文化。(D)関連陶磁資料の収集を主とし、2007年48月,11月,2008年2月,3月に実施した。以下に実施内容を示す。(A)遺物についてはバイヨン第6次調査(北ロングトレンチ)、第7次(南経蔵周辺)、プラサート・スープラ第7.8.11.12次調査分を実施。なお過去記録に不整合な部分が見られたため、追跡作業を行う。スープラ調査10年分の現場出土品取り上げリスト、整理リスト(手書き)をデジタル入力し、約70%終了。遺構整理については既往調査記録(遺構図・土層図・写真)の整理、プラサート・スープラおよびバイヨン寺院周辺全体図作成・遺跡情報の整理。プラサート・スープラ遺構図のデジタル化を開始。(B)王宮内、また南大門内側など数か所の表面調査を行い、遺物を収集した。(C)今回重点をおいた部分で、カンボジア人スタッフへの技術支援と今後の高度な研究に向けての基礎部分である。発掘調査基準(図化方法・遺構記録表・ラベル記入要項など)・遺物整理基準(資料分類の手引き・実測要項など)・基準陶磁実測図の収集などについて日本文と英文の2種のマニュアルを作成。なお研究資料解析に高度な技術や判定能力を必要とするので、短期の習得は困難であり、長期継続の必要がある。(D)アンコール期以前のサンボー・プレイ・クック出土陶磁の調査(EFEO発掘資料、プノンペン国立博物館所蔵)他。なお今回、発掘調査を行ったバイヨン第7次(南経蔵周辺)からは金銅・銅製の鎮檀具一式が発見され、クメール期の宗教、祭儀の解明に重要な資料となり、今後研究対象に追加されるものである。平成20年度は,(A):19年度に作成した発掘調査基準(遺構,遺物,土層図などの図化方法)及び整理基準(資料の分類・分析方法,実測方法などの方法)マニュアルの微調整,(B):関連陶磁資料の収集,(C):(A)で作成したマニュアルを活用したプラサート・スープラ,バイヨン出土陶磁の基礎調査及び整理作業,(D):(A)で作成したマニュアルを活用したバイヨン寺院南経蔵の発掘調査及び寺院の建造過程に関する調査,以上4項目を中心に研究を実施した。これらは,平成21年度から開始する「遺構出土陶磁と遺構の関連分析,年代の仮構築」に向けての基礎準備でもある。具体的には,国内作業として(A)と(B)を行い,この資料をもとにフィールド調査を実施した(C)。21年度以降に計画する高度な研究に向けての基礎情報の蓄積・整理と,カンボジア人スタッフへの技術支援については、昨年度に引き続き重点的に実施した。(A)で作成したマニュアルは、遺物の整理作業及び発掘調査のオンザジョブトレーニング((C),(D))で活用された。研究資料解析とその補助にあたっては、高度な技術・判定能力を必要とするため,現地スタッフに対する技術支援は今後も継続していく必要がある。今年度の発掘調査は,当初計画中のバイヨン寺院南経蔵に加え,バイヨン寺院基壇基礎部において実施した。この基壇部の調査は,バイヨン建造過程の検討と,中央塔本体の保存方針決定に資する調査であり,1930年代にフランス政府機関が実施して以来約70年ぶりに行われたものである。この調査結果による図面の作成・出土遺物の整理作業は,現在継続して進行中である。ある。

平成21年度は、(A):19年度に作成した発掘調査基準(遺構、遺物、土層図などの図化方法)及び整理基準(資料の分類・分析方法、実測方法などの方法)マニュアルの微調整、(B):関連陶磁資料の収集、(C):(A)で作成したマニュアルを活用したプラサート・スープラ、バイヨン出土陶磁の基礎調査及び整理作業、(D):(A)で作成したマニュアルを活用したバイヨン寺院の発掘調査及び寺院の建造過程に関する調査に加え、(E)カンボジアでは保存処理の難しい金属遺物を日本国内に移送し詳細な研究を継続している他、(F)JASAカンボジアオフィス内に設立されたバイヨン・インフォメーション・センター内におけるパネル及び発掘出土品の展示を通して調査成果を広く一般に公開する等、以上6項目を中心に調査・研究を実施した。これらは最終年度(平成22年度)の目的である「遺構出土陶磁と遺構の関連分析、年代の構築」に向けての基礎準備及び実践であった。具体的には、国内作業として(A)、(B)、(E)を行い、この資料をもとにフィールド調査を実施した(C)。最終年度に計画する最終報告書作成に向けての基礎情報の蓄積・整理作業と、カンボジア人スタッフへの技術指導については、昨年度に引き続き重点的に実施した。(A)で作成したマニュアルは、遺物の整理作業及び発掘調査のオンザジョブトレーニング((C)、(D))にて活用した。研究資料解析とその補助にあたっては、高度な技術・判定能力を必要とするため、現地スタッフに対する技術指導は今後も継続していく必要がある。今年度の発掘調査は、バイヨン寺院外回廊南側外郭、3箇所にて行った。この調査は、1999年にJSAによって行われた北側ロングトレンチの未解明部分を補足するためのものである。この調査結果による図面の作成・出土遺物の整理作業は、現在継続して進行中である。平成22年度は、(A):バイヨン寺院南東外郭部の発掘継続(補足調査)、(B):アンコール地域関連陶磁資料の収集、(C):現地カンボジア人専門家への技術指導(発掘調査・遺物整理)および遺構図面の総合的集約、(D):鎮壇具など金属製出土品の簡易補強処理と鉛同位体分析、(E):花粉分析ほか自然科学分析に関してバイヨン外郭発掘調査時に土層を採取し、今後古期遺跡の植生環境分析のための予備資料とした。また炭化物が出土しており年代測定のための保管資料とする。(F):以上を踏まえた平成19-22年度の調査の報告書を作成、これらの項目を中心に調査・研究を実施した。とくに(A)遺構の分析や年代の構築に関する最新の成果として、バイヨン寺院創建の12世紀後半以後、14世紀前半にも大規模な土木工事を行った結果が出ており、従来の見解として14世紀以降の建設工事は小規模、小範囲とされていた学説とは異なる点も押さえられた。さらに寺院建設に伴う石材加工場や金属工房の一端も把握された。上記に関連して近年のカンボジア内で行われた考古資料にも注目した。フランスEFEOの調査による前アンコール期のロリオス遺跡、アメリカの調査によるプノン・バケン出土陶磁の分析も行い、前アンコールからポストアンコール期およびそれ以降における年代基準となる陶磁器編年の骨格を把握した。これによりクメール建築史に有用な陶磁編年研究の基礎が構築された事になる。平成21-22年度の調査成果は建築史、考古学においてとくに重要で、カンボジアにおける14世紀前半の遺構(建築)・遺物年代の定点資料をなすものであり、遺物整理を進め、詳細な報告書を作成する必要がある。
フェムト秒分光法による金属ナノ結晶の超高速非線形光学応答に関する研究

金、銀、銅といった金属ナノ結晶を分散させたガラスは高い光学非線形性と高速応答性を兼ね備えている。このような特性を支配しているのはナノ結晶中に光励起によって生成するホットエレクトロンである。本年度はバンド間遷移と表面プラズモン共鳴に基づくホットエレクトロンの生成と緩和過程の解明を目指した。1.ガラスの屈折率を増加させると表面プラズモンバンドは長波長シフトし、表面ブシズモン吸収バンドとバンド間吸収帯の重なりを変えることができる。バンド間遷移とプラズモンの光学非線形性への寄与を調べるためにガラスの屈折率を変えた3種の銅ナノ結晶試料を準備し、フェムト秒レーザーを使って過渡吸収スペクトルを測定した。測定においてはポンプ光のエネルギーを表面プラズモンバンドからバンド間吸収に至る広い範囲で変化させた。その結果、ホットエレクトロンの生成効率は表面プラズモン励起の方がバンド間励起よりも約3倍大きいことがわかった。2.金属ナノ結晶分散ガラスの非線形光学応答は時定数が数psの高速成分と数百psの低速成分の二成分からなる。高速成分は光励起によって金属ナノ結晶中に生成したホットエレクトロンが電子格子相互作用によりエネルギーを失い冷却する過程に対応している。また低速成分はナノ結晶からガラスへの熱拡散に対応している。母体がガラスの金ナノ結晶分散試料と母体がチタニア(二酸化チタン)の金ナノ結晶試料を作製した。ガラスと比較するとチタニアは熱伝導率が高い。そのため熱拡散効率が上がり上記の低速成分の寄与が小さくなることが期待できる。これらのフェムト秒ポンプ・プローブ分光測定を行い、非線形吸収の時間挙動を比較した。どちらの試料についてもほぼ同じ時定数の緩和過程が観測され、低速成分の寄与にも差は現れなかった。現在、母体材料への熱拡散を考慮した二温度モデルによりホットエレクトロンの冷却過程を解析中である。金属ナノ結晶を分散させたガラスは高い光学非線形性と高速応答性を示す。このような特性にはナノ結晶中のホットエレクトロンの緩和過程が深く関係している。本研究の目的はバンド間遷移と表面プラズモン共鳴に基づくホットエレクトロンの生成・緩和過程を解明することである。この両者がエネルギー的に離れている銀ナノ結晶と同一エネルギーに存在する銅ナノ結晶について以下の成果を得た。1.現有のフェムト秒ポンプ・プローブ分光装置を使用し、銀ナノ結晶分散ガラスの過渡吸収スペクトルを測定した。プラズモン共鳴励起とバンド間励起の2条件で測定を行った。表面プラズモンバンドのスペクトルの過渡的な変化を解析し、ナノ結晶中の電子温度の時間変化を求めた。両励起条件ではホットエレクトロンの生成効率に差が生じ、プラズモン励起の方が励起光子1個当たりの電子温度上昇率が高いという結果を得た。2.フェムト秒チタンサファイアレーザーを光源とする光パラメトリック増幅器を整備し、これを光源とするポンプ・プローブ分光装置を組み立てた。この装置により励起光のエネルギーを1eVと4eVの間で連続に変えることが可能となった。この測定系を使用して銅ナノ結晶分散ガラスの過渡吸収スペクトルを測定した。励起光のエネルギーは表面プラズモンバンドとバンド間吸収帯を含む広い範囲で変化させた。銀ナノ結晶と同様に表面プラズモンのピーク付近を励起する方がバンド間吸収帯を励起するよりも電子温度の上昇率が高かった。これはプラズモン励起の場合はバンド間励起と異なり自由電子に直接励起光のエネルギーを与えているためであると考えられる。今後は母体ガラスの屈折率を変えることで表面プラズモンバンドを低エネルギーシフトさせ表面プラズモンバンドとバンド間吸収帯の重なりを小さくした銅ナノ結晶試料を用い、バンド間遷移とプラズモンの光学非線形性への寄与を詳しく調べる計画である。

どちらの試料についてもほぼ同じ時定数の緩和過程が観測され、低速成分の寄与にも差は現れなかった。現在、母体材料への熱拡散を考慮した二温度モデルによりホットエレクトロンの冷却過程を解析中である。
尿中水銀化合物の誘導体化抽出による一斉形態別分析法の開発

本研究では、ガスクロマトグラフ/質量分析計(GC/MS)およびガスクロマトグラフ/水素炎イオン化型検出器(GC/FID)による、尿中水銀化合物の同定・定量分析に至るまでのハイスループット分析法の開発を目的とする。最終年度は、前年度までに検討して得られた結果を踏まえ、施設間誤差の検討および分析法の修正と改良を実施した。本研究期間中には、下記の成果が得られた。1)テトラエチルほう酸ナトリウム及びテトラフェニルほう酸ナトリウムを誘導体化剤とすることで、尿中の無機水銀と有機水銀を分離分析する系統的化学形態別抽出が可能となった。2)既存の報告では、尿10mL以上が使用されていたが、0.50.1mLまで減少できることが判明した。3)内部標準物質として分析対象化合物の安定同位体を用いることが理想であるが、水銀化合物では安価な安定同位体が入手できなかったことから、プロピル水銀の市販されていることを突き止め、比較的安価な内部標準物質として使用できることが判明した。4)尿中無機水銀およびメチル水銀濃度を2.5、25、250ng/mlとした場合の日内間のばらつきを上記プロピル水銀を内部標準物質として使用して検討した結果、0.972.75%と良好な再現性が確認できた。5)ただし、MonoSpinC18での抽出を検討した結果、液液抽出に比べてGCMSでのピーク面積値が小さく、回収率の面で問題のあることが判明した、今後の課題として残された。本研究にて開発された手法は、他施設でも同様の結果が得られ、施設間誤差の少ない方法であることも確認され、今後の産業労働衛生に寄与することと期待される。本研究は、水溶液の状態で水銀化合物の化学形態を反映した誘導体へと変換し、ガスクロマトグラフ/質量分析計(GC/MS)を使用した生体試料中水銀化合物の迅速かつ再現性の高い化学形態別分析法の開発を目的とする。本年度は、以下の4項目について重点的に検討を行い、前処理の最適条件を検討した。1)化学形態保持に優れた誘導体化剤の選択:前処理工程の簡素化を念頭に置き、水溶液中での水銀化合物の誘導体化を検討した。水銀化合物はアルキルホウ酸塩と反応しやすいことに注目し、メチル、エチル、プロピル、フェニルなどのを中心に検討を行った。その結果、テトラエチルほう酸ナトリウム、テトラプロピルほう酸ナトリウム、テトラフェニルほう酸ナトリウムの何れの誘導体化剤においても水銀化合物の誘導体化が可能であった。ただし、テトラフェニルほう酸ナトリウムを用いた場合、2価水銀が誘導体化できなかったため、テトラエチルホウ酸ナトリウムを用いることとした。2)テトラエチルほう酸ナトリウムの添加量の検討:誘導体化試薬の濃度、添加量を検討した結果、濃度は1%、添加量は試料1mlに対して40&micro;lで良好な結果が得られた。3)内部標準物質の検討:204水銀が市販されているが、100万円台と非常に高価であった。より安価な安定同位体を調査したが、見当たらなかったため、当面は、n-プロピル塩化水銀を用いることとした。4)抽出条件の検討:誘導体化した水銀化合物の効率的な抽出条件を検討する目的で、抽出溶剤の種類、組み合わせ、添加濃度、添加量を検討した。抽出溶媒については、ヘキサン、酢酸エチル、クロロブタン、tert-ブチルメチルエーテルで検証した結果、クロロブタンで良好な結果が得られた。当初の計画通りに結果が得られている。水銀化合物の誘導体化試薬や内部標準物質については、さらに調査を進めて最適な化合物を調査・検証する。しかし、最終的には健康診断などの検査業務に応用したいため、適切な価格の試薬の選択が求められるこことを考慮する。本年度は、前年度に検討して得られた結果を踏まえ、以下の項目について重点的に検討を行った。1)系統的化学形態別抽出法の検討:テトラエチルほう酸ナトリウムを誘導体化剤と使用した結果、無機水銀と有機水銀(主としてメチル水銀)を分離分析することが可能となった。2)液液抽出でのスケールダウン:既存の報告では、尿10mL以上が使用されている。水銀分析において要求される検出下限を考慮しながら使用する尿量を減少させていった結果、0.51mLまで減少できることが判明した。3)内部標準物質の検討:通常、内部標準物質として分析対象化合物の安定同位体を使用する。しかし、水銀化合物では、安価な安定同位体が存在しない。種々、入手可能な水銀化合物を探索したところ、プロピル水銀の市販されていることを突き止め、内部標準物質として検討した結果、比較的安価な内部標準物質として使用できることが判明した。4)バリデーションの検討:尿中無機水銀およびメチル水銀濃度を2.5、25、250ng/mlとした場合の日内間のばらつきを上記プロピル水銀を内部標準物質として使用して検討した結果、0.972.75%と良好な再現性が確認できた。5)固相抽出法の検討:MonoSpinC18での抽出を検討した結果、液液抽出に比べてGCMSでのピーク面積値が小さく、回収率の面で問題のあることが判明した。概ね、当初の計画通りの結果が得られている。

固相抽出に関しては、要求される検出下限値は検出できるものの、回収率が芳しくないことから、来年度に改善項目として追加する予定である。本研究では、ガスクロマトグラフ/質量分析計(GC/MS)およびガスクロマトグラフ/水素炎イオン化型検出器(GC/FID)による、尿中水銀化合物の同定・定量分析に至るまでのハイスループット分析法の開発を目的とする。最終年度は、前年度までに検討して得られた結果を踏まえ、施設間誤差の検討および分析法の修正と改良を実施した。本研究期間中には、下記の成果が得られた。1)テトラエチルほう酸ナトリウム及びテトラフェニルほう酸ナトリウムを誘導体化剤とすることで、尿中の無機水銀と有機水銀を分離分析する系統的化学形態別抽出が可能となった。2)既存の報告では、尿10mL以上が使用されていたが、0.50.1mLまで減少できることが判明した。3)内部標準物質として分析対象化合物の安定同位体を用いることが理想であるが、水銀化合物では安価な安定同位体が入手できなかったことから、プロピル水銀の市販されていることを突き止め、比較的安価な内部標準物質として使用できることが判明した。4)尿中無機水銀およびメチル水銀濃度を2.5、25、250ng/mlとした場合の日内間のばらつきを上記プロピル水銀を内部標準物質として使用して検討した結果、0.972.75%と良好な再現性が確認できた。5)ただし、MonoSpinC18での抽出を検討した結果、液液抽出に比べてGCMSでのピーク面積値が小さく、回収率の面で問題のあることが判明した、今後の課題として残された。本研究にて開発された手法は、他施設でも同様の結果が得られ、施設間誤差の少ない方法であることも確認され、今後の産業労働衛生に寄与することと期待される。平成29年度以降は、本年度の結果をもとに、水銀の形態分析を可能とする方法や検査に用いる試料の小量化、施設間誤差について検討する。1)系統的化学形態別抽出法の検討2)固相抽出並びにスケールダウンの検討:抽出の選択性を高めるとともに少量の検査試料からの検査実施は、将来の健康診断などへの適用を考慮すると不可欠な課題である。本検討においては、最近少量の試料調製手法として注目されているMonoSpinを活用し、スケールダウンを検討する。3)バリデーションの検討:上記で確立した化学形態別誘導体化-MonoSpin抽出を用い、GC/MSおよびGC/FIDでの検出下限、検量線範囲、ばらつきなどのバリデーションデータを採取・評価し、既存の分析法との有用性を評価する。4)施設間誤差の評価:現状で実施されている方法では、施設間誤差の問題が指摘されているため、協力研究員らと共同で施設間誤差についての検証を実施する。最終年度は、昨年度までの結果を基にして尿中水銀分析法の確立とともに施設間誤差についても検討を行う予定である。1)実用的分析法の検証:昨年度までに確立した方法を協力研究員に実施してもらい、実用性などについての検証を行う。2)固相抽出法の検討:回収率の改善を目的に、固相抽出基剤や誘導体化剤の再検討を行い、尿中水銀分析の際に要求される検出下限値のクリアーを目指す。3)施設間誤差の検証:現状の尿中水銀分析法では、施設間で誤差の生じることが大きな問題となっているため、確立した方法を複数の施設ならびに複数の研究者の協力を得て、本研究で確立した分析法の再現性などについて検証を加える。
磁性酸化チタン光触媒微粒子の製造

本研究は、磁性粉体であるマグネタイトをシード粒子としてチタンアルコキシドの加水分解反応により、チタニアコーティングを行い、磁性酸化チタン光触媒微粒子の製造プロセスの開発を目指すものである。実験は、アルコキシド濃度と水濃度を変化させ様々な分散剤を用いて複合微粒子の合成を行い、結晶化させるための熱処理温度を変化させた。その後、エネルギー分散X線分光分析によってコーティング状態を検討し、粉末X線回折によって酸化チタンの結晶形を測定し、振動試料型磁力計によって複合微粒子の磁化率を測定した。また、熱処理後の複合微粒子を用い、ブラックライトを光源として色素ローダミンB溶液の分解実験を行った。得られた主な実験結果は、要約すると以下のようになる。(1)アルコキシドと反応する水を一括添加するよりも連続滴下するほうが、マグネタイトにチタニアを均一にコーティングすることができる。その時、アルコキシド濃度が0.2mol/lおよび水濃度1.5mol/l以上の条件でなければならない。(2)アルコキシド濃度および水濃度を変化させることによって、光活性を示すアナターゼ型の結晶になる。(3)チタニアコーティング時に、分散剤としてヒドロキシプロピルセルロースを用いることで、コーティング状態の良好な複合微粒子が得られる。(4)有機物分解特性を示すためのチタニアコーティング量は、光触媒微粒子1gに対してチタニアの付着量が0.7g以上必要である。(5)最も効果的な有機物分解特性を示す熱処理温度は、結晶化度や比表面積を考慮すると、500°C程度である。また、このときの試料は十分な磁性を持つことを確認した。(6)チタニアとマグネタイトの間にシリカ層を設けることで、有機物の分解速度は飛躍的に増加する。(7)また、太陽光に含まれる紫外光でも有機物の分解反応が進行することから、自然環境下における水質浄化プロセスへの展開が期待される。本研究は、磁性粉体であるマグネタイトをシード粒子としてチタンアルコキシドの加水分解反応により、チタニアコーティングを行い、磁性酸化チタン光触媒微粒子の製造プロセスを目的としている。本年度は、コーティング微粒子合成条件の検討およびコーティング後のキャラクタリゼーションを行った。実験は、アルコキシド濃度と水濃度を変化させて合成を行い、結晶化させるための熱処理温度を変化させた。その後、エネルギー分散X線分光分析によってコーティング状態を検討し、粉末X線回折によって酸化チタンの結晶形を測定した。さらに、振動試料型磁力計によってコーティング後の微粒子の磁化率を測定した。得られた主な実験結果は、要約すると次のようになる。(1)アルコキシドと反応する水を一括添加するよりも連続滴下するほうが、マグネタイトにチタニアをコーティングすることができる。そのとき、アルコキシド濃度が0.2[mol/l]以上および水濃度1.5[mol/l]以上の条件でなければならない。(2)アルコキシド濃度および水濃度を変化させることによって、光活性を示すアナターゼ型の結晶やルチル型の結晶になる。(3)アモルファスのチタニア粒子は、500°C以上の熱処理によって結晶化を生じ、アナターゼ型の結晶形になる。(4)熱処理の温度が上昇するにつれて、マグネタイトの磁化率が減少する。(5)実際にアナターゼ型の光触媒微粒子が光活性を示すことを、色素ローダミンB溶液の分解によって確認した。

本研究は、磁性粉体であるマグネタイトをシード粒子としてチタンアルコキシドの加水分解反応により、チタニアコーティングを行い、磁性酸化チタン光触媒微粒子の製造プロセスを目的としている。本年度は、コーティング微粒子の検討およびコーティング後のキャラクタリゼーションを行い、さらに得られた複合微粒子の有機物分解特性を検討した。実験は、アルコキシド濃度と水濃度を変化させ様々な分散剤を用いて複合微粒子の合成を行い、得られた複合微粒子を種々の条件で熱処理を行った。また、熱処理後の複合微粒子を用い、ブラックライトを光源として色素ローダミンB溶液の分解実験を行った。得られた主な実験結果は、要約すると次のようになる。(1)チタニアコーティング時に、分散剤としてヒドロキシプロピルセルロースを用いることで、コーティング状態の良好な複合微粒子が得られる。(2)有機物分解特性を示すためのチタニアコーティング層は、光触媒微粒子1gに対してチタニアの付着量が0.7g以上必要である。(3)最も効果的な有機物分解特性を示す熱処理温度は、結晶化度や比表面積を考慮すると、500°C程度である。(4)チタニアとマグネタイトの間にシリカ層を設けることで、有機物の分解速度は飛躍的に増加する。(5)また、太陽光に含まれる紫外光でも有機物の分解反応が進行することから、自然環境下における水質浄化プロセスへの展開が期待される。
生きた細胞中での金属ナノ粒子のレーザー形成

本研究から、細胞の塩環境の中で多光子レーザー照射法を用いて金属を形成できることがわかったが、形成される領域を限定させることは現在でも困難である。しかし、細胞は死滅細胞指標のヨウ化プロピジウムを排出させることがわかり、本研究を今後継続していく上で極めて有望な成果である。暗視野法と発光イメージング法を用いて、強い光散乱を生じさせる領域がレーザーの焦点部位の周囲に観察された。このことは金ナノ粒子が形成されていることと合致する。本研究では、レーザー光照射が誘起する光還元反応により細胞内部に金属ナノ粒子を作製する手法を開発し、ナノ粒子を生体組織の観察や分析に用いることを目的としている。さらに、開発する手法を用いて、細胞内部の任意の微小領域中に表面増強ラマン散乱の計測に用いるプローブを作製できる。本年度は、レーザーを照射しない実験条件で、金イオンが細胞の生存能力に与える影響を解明することを重点的に行った。金イオンが細胞の生存に与える影響は、十分に検証されておらず、重要なポイントでもある。われわれは既に細胞が1mMの四塩化金酸水溶液中で5日間生存可能であることを明らかにしたが、金イオンが細胞の生存に与える影響を定量的に評価することが必要となるため、購入したナノ粒子をテスト用のサンプルとして生細胞内に導入した。マクロファージやHeLa細胞のように、ナノ粒子を飲食作用により体内に取り込む細胞を利用することで実現できる。細胞内部の金ナノ粒子を観察、測定する最適な手法を選定した。まずミクロトーム法により透過型電子顕微鏡で金ナノ粒子を観察し、その後より短時間で観察できる手法を検討した。また、暗視野顕微鏡やレーザー散乱顕微鏡も検討した。この研究提案の目的は、金溶液や銀溶液の光還元法の原理をもとに、培養細胞にフェムト秒レーザーパルスを照射し、金/銀ナノ粒子を形成するための研究を行うことであった。このプロジェクトは、技術的に極めて困難なものであり、一部については目標達成できなかった。研究初期に、塩分が、銀の結晶化をひき起こすため、光還元法で銀ナノ粒子を作るのは不可能であることがわかった。金粒子については、細胞内の限られた領域に作ることができた。ナノ粒子が形成された後、光が吸収され、ナノ粒子が融ける傾向が認められ、粒子サイズをコントロールするのは困難であることがわかった。暗視野イメージング法と色素ルミネッセンス法を使って調べたところ、金ナノ粒子の凝集物が、細胞の「ホール」の周りに形成されていた。このホールは、レーザーアブレーションによるもので、金の構造が形成され、そのことによってより多くの光が吸収されて(周囲の構造が)加熱され、その結果、細胞のアブレーションが生じたものと考えられる。さらに、細胞に対する金溶液の作用について調べ、次のような結果が得られた。ヨウ化プロピジウムテストを実施した結果では、培養細胞に金溶液が急性的な損傷を及ぼすことはないことが示されたが、金溶液によって、細胞によっては複雑な作用が生じることが示唆された。例えば、金溶液中では細胞分裂が観察されず、金溶液が細胞の生理状態に何らかの影響を及ぼすことを示している。細胞の生理状態に対する金溶液の複雑な作用を調べること、および、金(ナノ粒子)形成プロセスを至適化することが今後必要である。銀(ナノ粒子)に関する研究は結論が出ており、ナノ粒子を作るのに適した候補物質ではないことが示された。
うつ治療標的としての海馬成熟神経の機能調節とその意義の解明

海馬成熟神経の興奮性増大を含む「脱成熟」機能変化が、うつ治療効果に寄与するという仮説を立て、海馬のシナプス機能変化に着目した新たなうつ治療標的の同定を目指している。2018年度は、研究課題の内、項目2:うつ病モデルにおける海馬神経機能不全とうつ治療での回復メカニズムと項目3:海馬での接着機能の調節に着目した新たなうつ治療標的を評価を行った。項目2では、うつ病モデルとして、下垂体前葉ホルモンであるACTH長期投与モデルを試みた。本モデルでは、電気けいれん刺激を含む抗うつ治療でも抗うつ様行動を引き起こさなかった。この様な治療抵抗性の要因として抗うつ治療によるBDNFやNPYなどの神経放出因子の発現低下があることを見出した。一方でACTH投与は抗うつ治療による海馬での細胞増殖は抑制しなかった。従って、今後、本モデルを用い海馬成熟神経の機能がどの様に変化しているかを検討し、抗うつ行動とリンクする機能変化の同定を試みる。項目3では接着関連因子であるデスモプラキンの発現低下とうつ治療効果についての検討を行った。デスモプラキンは抗うつ治療による海馬歯状回で発現が減少する。海馬歯状回でデスモプラキンの発現をノックダウンしたところ、予想に反して成熟神経のセロトニン反応性は抑制しており、成熟神経の活動性が低下している可能性が示唆された。従って、デスモプラキンは抗うつ治療による神経興奮性増大を負に制御する因子である可能性が示唆された。2018年度に計画していた項目1での海馬歯状回でのオプトジェネティクスを用いた神経活動制御については、ウイルス感染は確認できたものの、光刺激による最初期遺伝子発現増加が確認できておらず、光刺激の強度・頻度・回数の検討が必要であることが示唆された。一方で、項目2のうつモデルを用いた海馬成熟神経の反応性変化や項目3の標的分子ノックダウンによる新たな機能が示唆されたため、こられについては研究が順調に進展している。項目1:オプトジェネティクス法を用いて、海馬神経特異的に活性化した時の行動変化と機能変化を検討する。AAVウイルス歯状回投与によるチャネルロドプシン発現系を用いて、繰り返しの光刺激による神経機能の持続的変化を、遺伝子発現(c-Fos,成熟神経マーカー等)・組織化学(シナプスマーカー発現)・電気生理(興奮性の変化)によって解析するとともに、うつ治療刺激による機能変化と比較する。また、これらマウスでの抗うつ関連行動(強制水泳試験、新規環境での摂食抑制試験、ショ糖嗜好変化)がどのように変化するかを検討する。神経新生の寄与が少ないよう、光刺激期間は7日から10日程度にする。項目2: ACTH長期投与モデルで海馬成熟神経の機能がどの様に変化しているかを、うつ治療に対する反応性の違いに着目して検討する。項目3:海馬でのデスモプラキンの発現ノックダウンによって、海馬成熟神経の機能がどの様に変化しているかを解析を進めるとともにデスモプラキンによる細胞内シグナル調節機構をカテニンシグナルに着目して検討する。平成29年度は、海馬シナプス機能・接着関連機能の調節に着目した新たなうつ治療標的を評価した。これまでのマイクロアレイ・定量PCR解析による予備検討から、電気けいれん刺激で発現減少する遺伝子を同定している。それら遺伝子の内、2つの遺伝子に着目した。遺伝子Aは上皮接着の構成要素因子であり、遺伝子Bは細胞外で接着や成長因子の機能を制御するプロテオグリカンである。そこで、これら標的候補に対する人工miRNAをAAVベクターに組み込み、AAVウイルスを作成し、海馬歯状回に投与することで、生体海馬でこれら遺伝子の発現を抑制した時の成熟神経の機能変化を検討した。その結果、遺伝子BのmiRNAの海馬導入によるミクログリアの活性化・神経分化マーカー発現変化と、遺伝子AノックダウンによるBDNFの発現増加が観察された。また、オプトジェネティクスを用いて海馬特異的に神経を活性化させるためのAAVウイルスの作成を行った。さらに、電気けいれん刺激による海馬神経の興奮性増大のメカニズムを検索するため、シナプス関連因子のタンパクレベルでの発現変化を興奮性シナプス・抑制性シナプスの構成因子から検討したところ、グルタミン酸AMPA受容体サブユニットのリン酸化の現象が検出された。平成29年度はオプトジェネティクスの立ち上げを目標としていたが、AAVウイスル作成に時間を要した。しかし、平成30年度に予定していた新たなうつ治療標的の同定とその意義については、海馬歯状回におけるノックダウンシステムが構築できたため、予定より先行して解析を進め、2つの遺伝子ノックダウンによりそれぞれ異なる表現系を得ることができた。当初平成29年度に予定していたオプトジェネティクスを用いた解析は、ウイルスの作成が完了したため、平成30年度に遂行可能である。

本モデルでは、電気けいれん刺激を含む抗うつ治療でも抗うつ様行動を引き起こさなかった。この様な治療抵抗性の要因として抗うつ治療によるBDNFやNPYなどの神経放出因子の発現低下があることを見出した。一方でACTH投与は抗うつ治療による海馬での細胞増殖は抑制しなかった。従って、今後、本モデルを用い海馬成熟神経の機能がどの様に変化しているかを検討し、抗うつ行動とリンクする機能変化の同定を試みる。項目3では接着関連因子であるデスモプラキンの発現低下とうつ治療効果についての検討を行った。デスモプラキンは抗うつ治療による海馬歯状回で発現が減少する。海馬歯状回でデスモプラキンの発現をノックダウンしたところ、予想に反して成熟神経のセロトニン反応性は抑制しており、成熟神経の活動性が低下している可能性が示唆された。従って、デスモプラキンは抗うつ治療による神経興奮性増大を負に制御する因子である可能性が示唆された。2018年度に計画していた項目1での海馬歯状回でのオプトジェネティクスを用いた神経活動制御については、ウイルス感染は確認できたものの、光刺激による最初期遺伝子発現増加が確認できておらず、光刺激の強度・頻度・回数の検討が必要であることが示唆された。一方で、項目2のうつモデルを用いた海馬成熟神経の反応性変化や項目3の標的分子ノックダウンによる新たな機能が示唆されたため、こられについては研究が順調に進展している。平成30年度は、オプトジェネティクス法を用いて、海馬神経特異的に活性化した時の行動変化と機能変化を検討するための解析系を構築する。AAVウイルス歯状回投与による遺伝子発現系を用いて、チャネルロドプシンを歯状回成熟神経へ発現させ、どれほどの光刺激が、歯状回神経の持続的な興奮性増大に必要かを検討する。繰り返しの光刺激による神経機能の持続的変化を、遺伝子発現(c-Fos,成熟神経マーカー等)・組織化学(シナプスマーカー発現)・電気生理(興奮性の変化)によって解析するとともに、うつ治療刺激による機能変化と比較する。項目1:オプトジェネティクス法を用いて、海馬神経特異的に活性化した時の行動変化と機能変化を検討する。AAVウイルス歯状回投与によるチャネルロドプシン発現系を用いて、繰り返しの光刺激による神経機能の持続的変化を、遺伝子発現(c-Fos,成熟神経マーカー等)・組織化学(シナプスマーカー発現)・電気生理(興奮性の変化)によって解析するとともに、うつ治療刺激による機能変化と比較する。また、これらマウスでの抗うつ関連行動(強制水泳試験、新規環境での摂食抑制試験、ショ糖嗜好変化)がどのように変化するかを検討する。神経新生の寄与が少ないよう、光刺激期間は7日から10日程度にする。項目2: ACTH長期投与モデルで海馬成熟神経の機能がどの様に変化しているかを、うつ治療に対する反応性の違いに着目して検討する。項目3:海馬でのデスモプラキンの発現ノックダウンによって、海馬成熟神経の機能がどの様に変化しているかを解析を進めるとともにデスモプラキンによる細胞内シグナル調節機構をカテニンシグナルに着目して検討する。
働く女性のストレスマネージメントに関する実証的介入研究

看護師を対象とした平成14年の質間紙調査(GHQ28日本版、職業性ストレス簡易調査票)から、ストレスの指標としたGHQ総得点と職業性や職業以外のストレッサーとの関係を検討した。その結果、高ストレス群(GHQ総得点12点以上)は、低ストレス群(GHQ総得点11点以下)に比べ、職業性ストレッサー(職場内と家庭内支援の不足や仕事のコントロール不良や技術の低活用)の程度が大であった。また高ストレス群では職業以外のストレッサーを有する例も多く見られ、働く女性における多重役割によるストレスの影響が明らかになった。平成9年に実施した質問紙調査と平成14年に実施した質問紙調査に2回とも回答した例を取り上げ、運動習慣の有無と5年間のストレス状況の変化を検討した。その結果、2回の調査時いずれも運動していると答えた「運動習慣の有る」例は、ストレスの程度は変わらず、精神健康度は維持されていた。一方、2回の調査時いずれも運動していないと答えた「運動習慣の無い」例は、ストレスの程度は増強し、精神健康度は5年後に悪化していた。運動習慣のある例は少数で、大多数が運動習慣の無い例であった。職場で実際に運動指導を行い、運動実践によるストレスへの影響を検討した。その結果、運動実践例は、運動前後で身体活動量は増加し、職業性ストレッサーやストレスの程度は軽減する傾向が見られた。以上から習慣的な運動の実践は、働く女性のメンタルヘルスの維持に有用であることが示唆された。今後症例数を増やしていくとともに、働く女性における職場で出来る運動以外の実践可能なストレスマネージメントの方法(手段)についても検討を行っていく。本研究の目的は、働く女性のストレスとさまざまな職場環境要因および多重役割による影響との因果関係を主に縦断調査から明らかにし、その結果をストレスマネージメントにつなげることである。(1)まず予備調査として、平成13年9月に某大学病院の新規採用の看護職員89名を対象に、職業性ストレス簡易調査票とGHQ28精神健康調査票および独自に作成した家庭内のストレス要因に関するアンケート調査を実施した。解析可能であった女性職員84名において、ストレスの強い(ストレス反応の指標としたGHQ総得点や簡易調査票の心身のうつ得点の高値)例では職業性ストレッサーのうち仕事のコントロール度、技術の活用度、仕事の適合性・満足度、職場環境が不良であった(低かった)。また家庭内のストレッサーも大であった。(2)上記の調査結果をもとに本研究に使用するアンケート調査の内容について考案・作成した。調査内容は、追跡調査という観点から平成9年(初回)に実施した内容に準じ、年齢・同居家族の有無、従事期間・勤務形態や病棟・役職の有無および運動状況・食生活・睡眠状況などの生活習慣と、家庭内のストレス(育児、子供の教育、自分や家族の健康状態などに起因するもの)の項目とストレスマネージメントに関連する項目を加えた。更にGHQ28精神健康調査票と新たに職業性ストレス簡易調査票を加えた。(3)本調査は、初回実施日から5年目に当たる平成14年3月に実施した。対象は、某大学病院に勤務する看護職員1138名である。実施に際し、看護部の了解のもとアンケートの配布・回収を職制下に行った。アンケートは記名自記式とし、対象者には文書で同意を求め、個人情報の保護の取扱については十分配慮した。現在、同意が得られ、回収できた女性職員についてストレスの経年変化とそれに関与する職場環境要因、家庭内要因、ストレスマネージメント要因について解析中である。1)平成14年の調査で看護師961名のGHQ28日本版から求めたGHQ総得点(以下G得点)の平均値は、9.0±5.5点であった。