hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
軽症脳卒中患者の再発予防に向けた教育支援プログラムの開発

再発予防に関するこれまでの支援の課題として、再発予防に関する患者の関心が十分ではないこと、再発予防への対処行動を実施した場合の効果に関するフィードバックが十分ではないことが明らかになった。最終年度はこれらのデータ分析から教育支援プログラムを開発するために、多様な自己管理行動への焦点を当てた介入研究についての文献検討を行い、介入方法、介入内容、アウトカム評価について検討した。この結果、脳卒中の再発予防への効果的な介入には患者が自己管理行動を振り返ること、フィードバックが得られることなどが必要と考えられた。また、長期的に行動変容の支援を継続できるプログラムが必要である。本研究は、軽症脳卒中患者へ再発予防の教育支援プログラムを検討することを目的とした。まず、軽症脳卒中患者を対象に混合研究法による実態調査を行い、退院後の健康管理、QOL、生活上の困難と対処について明らかにした。次に、脳卒中再発予防の介入研究に関する文献検討を行い、再発予防へ介入の課題を検討した。これらの結果から、効果的なプログラムは、入院時から再発予防の必要性に関する動機づけを行うこと、退院後も行動変容を維持できること、ピアカウンセリングやセルフモニタリングを活用し、何らかのフィードバックを行ことが必要と考えられた。今後は、これらを含めたプログラムを展開し、臨床での効果について評価していく。今年度は再発予防教育支援プログラムを実施し効果を検証する予定であったが、データ分析に時間を要したこと、脳卒中の再発予防のアウトカムが多岐にわたり複雑であるため、効果的なアウトカムを抽出するための文献検討に時間を要したために実施が遅れている。看護学・高齢看護学・老年看護学今後はこれまでの研究成果をもとに、当初の計画に則ってプログラム開発を行う予定である。さらに論文として公表する予定である。本年度は研究代表者の所属移動により研究に必要な環境整備に時間を要した。また、現在分析中のインタビューデータの内容も踏まえて教育支援プログラムの検討に着手する予定である。実態調査の調査内容の検討および所属研究機関の倫理審査に時間を要した為。今年度はプログラム開発・検証のための予算を計上していたが、プログラム作成が遅れたため、検証のための経費が次年度使用額として生じた。今後は当初の計画通り教育支援プログラムの開発を行う予定である。平成25年度は、平成24年度に実施した質問紙調査のデータ分析、およびインタビュー調査のデータ分析を進める。本調査結果および先行研究をもとに、軽症脳卒中患者の再発予防を目的として教育的支援方法を検討する予定である。平成26年度は、検討した教育的支援方法の実践、評価を課題とする。軽症脳卒中再発予防教育支援プログラムの開発・検証のために執行予定である。今年度は平成24年度に実施し調査の分析が遅れたため、教育支援プログラム作成のためのプレテストのための謝金等にかかる経費が次年度使用額として生じた。平成26年度は8月までに教育支援プログラムの検討を行い、その後に効果の検証を実施する予定である。平成25年度の研究費の使用計画は実態調査をもとに検討した教育支援内容の実施
有機金属化合物(前駆体)の熱分解を利用してセラミックスを合成することが可能である、本手法はセラミック複合材料合成法として有用である。そこで、本研究ではAlN前駆体である(HAlNPr^i)_mとSi_3N_4前駆体である(MeSiHNH)_nが均質に分散した前駆体を合成し、これを熱分解してセラミックス複合材料を得ることを試みた。生成物中のAl:Si比が1:1となるように(HAlNPr^i)_m〔固体〕と(MeSiHNH)_n〔液体〕を仕込んで室温で攪拌したところ、次第に粘性が高まり最終的には白色の固体となった。これを前駆体とした際のセラミック収率は、室温900°CのTG測定において約70%であり、(HAlNPr^i)_mの35%、(MeSiHNH)_nの30%に比べ非常に高い値を示した。また、(HAlNPr^i)_mと(MeSiHNH)_nを単独で熱分解した際に観測される(HAlNPr^i)_m、(MeSiHNH)_nなどの分子イオンやフラグメントイオンが、この前駆体を用いた場合は観測されなかった。従って、前駆体合成時または熱分解時に(HAlNPr^i)及び(MeSiHNH)間で架橋構造が形成されていることが示唆された。前駆体のAr雰囲気下での焼成物は、800°C処理ではアモルファスであったが、1350°C処理によりブロードな回折線を生じた。さらに1600°C処理を行うと結晶化の進行が確認され、主にAlNとSiCが生成していると考えられた。この試料のSEM観察では2030nmの粒子が見られた。一方、NH_3雰囲気下の焼成物では、主にAlN及びSi_3N_4が生成していると考えられた。またSEM観察の結果、60200nmの粒子から構成されていることがわかった。
超高輝度・高偏極ＲＦ電子銃開発

高周波電子銃に偏極電子ビーム生成が可能なNEAーGaAsカソードを導入するには、その脆弱性を克服することが大きな課題である。NEA表面は超高真空が必要であるので、真空排気システムが増強可能なDAW型高周波電子銃空洞を設計した。また一方、Cs-Oによる従来の表面修飾法ではなくCsTe薄膜をGaAsカソード表面に形成することにより、NEA表面が生成できることを実験的に確認した。扁平ビーム生成については、シミュレーションによりカソード表面に縦方向磁場を適切に作り出すことによりビームに角運動量を与えスキュー四極電磁石を使うことで扁平ビーム生成が可能であることシミュレーションにより明らかにした。今年度は、低エミッタンスかつ高品質電子ビーム生成を可能にする光陰極高周波電子銃の基本設計を昨年度に引き続き電磁場解析コード(HFSS)を用いて行なった。基本設計を進めている高周波空洞の構造は、DAW(Disk-And-Washer)構造のものであるが、これまで空洞の形状と高周波特性の関係など電気的な設計を行なってきたが、25年度は空洞の加工・製作も考慮した機械設計を重点的に進めた。機械設計においてディスク部分とワッシャー部分をつなぐサポート部の設計に問題があることが判明した。設計当初は、ワッシャー部、サポート部、ディスク部を別々に製作し、ロウ付けの際に組み合わせる方法をとることを検討していたが、加工やロウ付けの際に精度良くワッシャーを取り付けることが困難であることが、機械加工の専門家との議論で分かった。そのため、空洞ボディー(ディスク部含む)とサポート部、ワッシャー部を一体として加工し、それらをスタックするような形で空洞全体をロウ付けするという方針で現在は機械設計を進めている。KEK-STFでの扁平ビーム生成実験は、まず最初に光陰極高周波電子銃でソレノイド電磁石を使い水平垂直方向の運動量結合ビームを生成し、ソレノイド磁場とその結合度の関係を確認する実験を行なうこととした。金属スリットをビームラインに挿入し、その下流でビーム形状を測定することによって、水平垂直の結合度合いを測定する。測定の準備等は完了している。25年度に試験実験を計画したが、光陰極用レーザーの不調やSTFのスケジュールの関係で実験時間を確保できなかったため、26年度の初めに運動量結合ビームの試験実験を行なう。その他、高い扁平率を生成するための理論考察を昨年度に引き続き行い、高い扁平率の電子ビーム生成を可能にする運動量分配用ビームライン光学系を設計した。この結果については今年度加速器学会で報告する予定である。今年度は、高品質電子ビーム生成に用いる高周波電子銃(RF電子銃)の基本設計と高エネルギー加速器研究機構の超電導過疎空洞試験施設(KEK-STF)での扁平ビーム生成実験のための理論考察を行った。高周波空洞の構造は、超高真空を達成するために真空排気ポートなどが取付け易いDAW(Disk-And-Washer)構造をベースに電磁場解析コードであるHFSSを使い、空洞形状の検討を進めた。加速周波数はSバンド(2856MHz)とし、DiskとWasherサポート部の構造を決めた後、排気ポートのサイズや配置を変えながら空洞パラメータの最適化を試みた。排気ポートは空洞パラメータに大きく寄与はしないが、十分な真空コンダクタンスを得ようとするとQ値が低下してしまうなどの問題が生じる事が分かった。今後、アルミ製の試験空洞を製作し高周波特性を詳細に調べる予定である。また、KEKーSTFでの扁平ビーム生成実験に関する考察では、RF電子銃とソレノイド電磁石の組み合わせとスキュー四極電磁石を使い、水平ー垂直エミッタンス交換(変換)をすることにより扁平ビームを作り出すパラメータサーチを行った。ソレノイドで水平垂直の運動量結合を作り出し、スキュー四極電磁石で相関を取り除くことにより、水平・垂直比が50以上のビームを作り出せる事をシミュレーションにより確認した。扁平率250のビームを作り出す事を目標にしているが、ビームの初期条件を変えることにより水平・垂直比が大きく異なるということが考察から分かったので、初期条件(カソード上でのレーザースポットサイズや強度分布)の最適化により目標を達成できると考えている。また、金属スリットを用いてRF電子銃から生成されたビームの水平垂直運動量結合を検証する測定システムの設計も行った。平成26年度にDAW構造をもつ高周波電子銃の最終機械設計を完了し試験空洞を製作する予定であったが、前年度に判明した加工の際に一部の部品の強度耐性の問題を解決するために機械設計および製作方法の変更、見直しを検討したが完全な解決作を見出すことはできなかった。これまで、空洞全体の試作空洞を製作することを検討してきたが、空洞の高周波入力カプラー部は他の主空洞部分に比べ構造が複雑であるので、26年度の空洞設計の制作方法に関する研究から、DAW型の主構造部(DiskとWasherの一体部分、空洞外壁部分)のみを製作し、その高周波特性を評価することが本研究の目的を達成するのに妥当であるという結論に至った。最終的にホットモデルの実機を製作する際は、部品の製作とその強度、精度などの評価を繰り返し、設計や制作方法にフィードバックをかける必要がある。KEK-STFでの水平・垂直方向の運動量結合ビームを生成する試験実験に関しては、KEK-STFが所有するRF電子銃の光陰極を照射するレーザーが不調であったため、ビーム実験を実施することはできなかった。代わりに理論考察として運動量結合ビームを生成するのに使用するソレノイド電磁石の主コイルとバッキングコイルの励磁比の最適化を行なった。

現在、コイルを通電するのに単極の直流電源を2台使用しているが、バッキングコイル用の電源を双極直流電源に変えることにより動径方向の運動量の極性を幅広く変化させられることを確認した。分担者である栗木を中心に実施しているNEAフォトカソードに関する研究は、GaAs表面にCeTeを蒸着し耐久性、量子効率などの確認をした。その結果、量子効率については約0.5%あることが確認されたが、耐久性については従来のCs-Oなどよりも劣る結果であった。今後は、耐久性の向上のために蒸着条件の最適化を行なう予定である。また、光電子分光によるNEA表面が生成されていることの確認を行なう。平成27年度はDAW型の高周波電子銃の最終的なデザイン設計を決定した、このDAW型空洞は十分な真空の排気速度が期待できる構造となっている。また、KEK-STFでのビームラインを仮定した水平・垂直方向のエミッタンス交換による超高品質フラットビーム生成に関するシミュレーションスタディーを完了し、リニアコライダーなどで必要とされる高いアスペクト比をもった電子ビーム生成の可能性を明らかにすることができた。また本研究の1つの柱である偏極電子源については研究分担者である栗木を中心に行なってきた。スピン偏極電子源として実績のあるNEA-GaAs光陰極は、RF電子銃での使用にはCs-OによるNEA表面の脆弱生を克服することが課題である。ヘテロ接合モデルによると、仕事関数がGaAsのエネルギーバンドギャップよりも小さい物資をGaAs表面に薄膜接合すると、実効的なNEA表面が形成されることが予測される。そこで我々は、高い耐久性が知られているCs-Te薄膜をGaAs上に生成し、光電子生成を試みた。光電効果の量子効率を光の波長の関数として測定したところ、GaAsのエネルギーバンドギャップに相当する1.4eVにおいて有限の量子効率が観測され、Cs-Te薄膜によるGaAsのNEA活性化に成功したことがしめされた。これにより、ヘテロ接合による実効的NEA表面の形成が可能であることを実証することができた。本研究の成果をもとに今後の偏極電子源開発においては、Cs-Te NEA GaAsの量子効率および耐久性の評価をすすめるとともに、より適切な表面薄膜の探索により、高耐久スピン偏極電子源の実現が見込めると考える。高周波電子銃に偏極電子ビーム生成が可能なNEAーGaAsカソードを導入するには、その脆弱性を克服することが大きな課題である。NEA表面は超高真空が必要であるので、真空排気システムが増強可能なDAW型高周波電子銃空洞を設計した。また一方、Cs-Oによる従来の表面修飾法ではなくCsTe薄膜をGaAsカソード表面に形成することにより、NEA表面が生成できることを実験的に確認した。扁平ビーム生成については、シミュレーションによりカソード表面に縦方向磁場を適切に作り出すことによりビームに角運動量を与えスキュー四極電磁石を使うことで扁平ビーム生成が可能であることシミュレーションにより明らかにした。
フォノン物性制御による高効率熱電半導体の開発研究

本研究は新しい高性能の熱電材料の開発を目的とし、かご形結晶構造をもつ物質系であるスクッテルダイト化合物およびクラスレート化合物について、熱電性能を飛躍的に向上させるための電子・フォノン輸送特性の制御に関して基礎的研究を行った。特に、これらの化合物の結晶構造中に存在する空隙へ原子充填を行い、原子充填による電子構造と電子・フォノン物性への影響について調べた。YbFe_4Sb_<12>充填スクッテルダイトについて、FeをNiで置換した化合物およびYb充填率を変化させた化合物を新規に作製して、それらの熱電気的特性について詳しく調べた。これらの化合物はp型でNi置換量やYb充填率によって熱電特性が大きく変化し、特にYb充填率が増加するとゼーベック係数が増大する効果のあることがわかった。これは価電子帯電子構造へのYb f軌道の効果(状態密度およびバンド質量の増加)に起因すると考えられる。さらに、Yb充填率の増加に伴って、格子熱伝導率が大幅に減少した。一方、クラスレート化合物については、Ba_8Ga_<16>Ge_<30>化合物のGa組成を変化させた新規化合物を創製して、その熱電特性を調べた。この化合物で従来報告のないp型材料がGa組成を制御して作製できることがわかった。また、クラスレート化合物は、SiO_2と同等の異常に低い格子熱伝導率をもち、フォノングラス材料であることがわかった。さらに、希土類元素を系統的に充填した結果、充填原子の原子量の増加とイオン半径の減少により格子熱伝導率が低下することがわかった。これら2種類の化合物系での低い熱伝導率の主因として、充填原子の局在的熱振動(アインシュタイン)モードとホスト格子の音響フォノンモードとの間の相互作用による効果が考えられる。したがって、これらの化合物のフォノンおよび熱電物性を向上させるためには、原子充填の制御が非常に重要であることがわかった。本研究では、新しい熱電変換用電子材料としてスクッテルダイト型結晶構造をもつCoSb_3系化合物について、熱電性能を飛躍的に向上させるための電子・フォノン輸送特性の制御について基礎研究した。この物質のもつ特有のかご状結晶構造に着目して、かご格子(空隙)中に希土類Ybイオンを充填した物質を創製し、その充填原子の熱振動、価数不安定性、電子構造と電子・フォノン物性との関連について詳しく調べた。CoSb_3化合物のかご格子中にYbイオンを充填した新規化合物の創製を、溶融法と放電プラズマ焼結法を併用したプロセスにより行った。CoSb_3へのYbイオンの充填は、最大で約10at%程度であり、CoサイトをFeで置換して電荷補償するとほぼ100at%充填可能であることがわかった。また、Ybの原子変位パラメータの値は、Co、Sbより大きく、希土類La、Ce充填の場合と比べても大きく、結晶格子中で大きく熱振動していることがわかった。このYb充填化合物の格子熱伝導率はCoSb_3の約1/4と極端に低く、Yb充填はフォノンの散乱効果が大きいことがわかった。X線光電子分光測定より、充填されたYbイオンの電子状態を調べ、その電子構造、電子・フォノン物性との関連について考察した。その結果、Ybイオンは2価と3価の価数揺動状態にあり、価電子帯頂上付近は主にYb^<2+>の4f軌道とCo3d軌道との混成により形成されていることがわかった。この混成を通した充填YbイオンとCoSb_3格子との間の相互作用が電子・フオノン物性に影響を与え、特に格子熱伝導率の低減において重要な役割を果たしていると考えられる。したがって、かご状結晶構造中に価数の不安定な希土類イオンを充填することは、熱電物性を制御する一つの有効な手法であることがわかった。

これら2種類の化合物系での低い熱伝導率の主因として、充填原子の局在的熱振動(アインシュタイン)モードとホスト格子の音響フォノンモードとの間の相互作用による効果が考えられる。したがって、これらの化合物のフォノンおよび熱電物性を向上させるためには、原子充填の制御が非常に重要であることがわかった。
インスリン大量投与による死亡例の剖検診断：インスリン製剤の検出法の開発

本研究期間内において、ヘッドスペース固相マイクロ抽出(HS-SPME)法、ガスクロマトグラフ・タンデム型質量分析装置(GC-MS/MS)を用いて、インスリン製剤の添加物であるm-クレゾールの検出が可能であることが確認され、応用することにより、その定量も可能であると考えられた。また、インスリンアナログの検出法について、液体クロマトグラフ・タンデム型質量分析装置(LC-MS/MS)を用いて検討を行い、その定量の可能性が示唆された。インスリン製剤は合成インスリンとともに、数種類の保存剤、安定剤等を含有している。そこで、法医鑑定例において、インスリンの大量投与の際に検出され得る特異的な微量物質の検出法を確立することによって、インスリン大量投与による低血糖症の証明を、現段階では困難とされている、死体血、死体尿から行い、実際の法医鑑定への応用を目指すことを本研究の目的としている。平成24年度から、法医鑑定例において、インスリン大量投与例の血液、尿を採取・保存し、投与の疑われるインスリン製剤の情報を収集すること、死体血、尿中のヒトインスリン及び合成インスリンのLC/MS/MSを用いた定量方法を開発すること、インスリン製剤に添加されている、防腐剤のフェノール、m-クレゾールや、安定剤である硫酸プロタミンなどの死体血、尿中におけるGC/MSやLC/MS/MSを用いた定量方法を開発する計画をたて、平成25年度は、前年度の研究の継続と、更にヒトインスリン及び合成インスリンの分解物をLC/MS/MSを用いて定量する方法を開発する計画をたてた。実際の法医鑑定例において、平成24年度はインスリン大量投与の疑われる事例があり、その血液、尿を保存し、投与の疑われるインスリン製剤の情報収集を行った。また市販の代表的なインスリン製剤を購入し、それらを当教室の実際の法医鑑定例におけるスクリーニング検査の手法をもとにして抽出し、機器分析を行った。その結果、現在の手法により、GC/MSを用いて、m-クレゾールの検出は可能であることが確認され、応用することにより、その定量も可能であると考えられた。その他のインスリン製剤の含有成分や、分解物の最適な検出法についても、検討を行っているところである。平成24年度は、法医鑑定例において、インスリン大量投与例の血液、尿を採取・保存し、投与の疑われるインスリン製剤の情報を収集すること、死体血、尿中のヒトインスリン及び合成インスリンのLC/MS/MSを用いた定量方法を開発すること、インスリン製剤に添加されている、防腐剤のフェノール、m-クレゾールや、安定剤である硫酸プロタミンなどの死体血、尿中におけるGC/MSやLC/MS/MSを用いた定量方法を開発すること等を、本研究において実施するべく計画をたてた。その結果、現在の手法により、GC/MSを用いて、m-クレゾールの検出は可能であることが確認された。その他のインスリン製剤の含有成分の最適な検出法についても、検討を行っているところである。平成24年度から平成26年度で、法医鑑定例において、インスリン大量投与例の血液、尿を採取・保存し、投与の疑われるインスリン製剤の情報を収集すること、死体血、尿中のヒトインスリン及び合成インスリンのLC/MS/MSを用いた定量方法を開発すること、インスリン製剤に添加されている、防腐剤のフェノール、m-クレゾールや、安定剤である硫酸プロタミンなどの死体血、尿中におけるGC/MSやLC/MS/MSを用いた定量方法を開発すること、ヒトインスリン及び合成インスリンの分解物をLC/MS/MSを用いて定量する方法を開発する計画をたてた。またこれまでに市販の代表的なインスリン製剤を購入し、それらを当教室の実際の法医鑑定例におけるスクリーニング検査の手法をもとにして抽出し、機器分析を行った。

平成24年度から平成27年度で、法医鑑定例において、インスリン大量投与例の血液、尿を採取・保存し、投与の疑われるインスリン製剤の情報を収集すること、死体血、尿中のヒトインスリン及び合成インスリンのLC/MS/MSを用いた定量方法を開発すること、インスリン製剤に添加されている、防腐剤のフェノール、m-クレゾールや、安定剤である硫酸プロタミンなどの死体血、尿中におけるGC/MSやLC/MS/MSを用いて定量する方法を開発する計画をたてた。実際の法医鑑定例において、平成24年度はインスリン大量投与の疑われる事例があり、その血液、尿を保存し、投与に疑われるインスリン製剤の情報収集を行った。またこれまでに市販の代表的なインスリン製剤を購入し、それらを当教室の実際の法医鑑定例におけるスクリーニング検査の手法をもとにして抽出し、機器分析を行った。その結果、平成27年度の研究により、現在の手法でGC/MSを用いて、m-クレゾールの検出が可能であることが確認され、応用することにより、その定量も可能であると考えられた。また、インスリン製剤の含有成分の検出法についても、検討を行い、その定量の可能性が考えられた。当初の研究期間内の定量法開発には至らなかったが、今後更に、設定条件等の検討を行い、実際の法医鑑定に利用できるように進めていきたいと考えている。本研究期間内において、ヘッドスペース固相マイクロ抽出(HS-SPME)法、ガスクロマトグラフ・タンデム型質量分析装置(GC-MS/MS)を用いて、インスリン製剤の添加物であるm-クレゾールの検出が可能であることが確認され、応用することにより、その定量も可能であると考えられた。また、インスリンアナログの検出法について、液体クロマトグラフ・タンデム型質量分析装置(LC-MS/MS)を用いて検討を行い、その定量の可能性が示唆された。平成26年度は、LC/MS/MSを用いたインスリン含有成分の検出法の検討、インスリンの分解物についての検出法の検討を行うとともに、国際学会において発表する予定であったが、インスリンの分解物の標準品入手に時間を要したこと、他研究者との共同利用のため、LC/MS/MSの使用時間が制限されたこと等から、分解物の分析法の検討を行う時期がずれ込んだため、研究期間延長を申請した。研究期間延長が承認されたため、研究全体の達成度としては、支障のないレベルと考える。法医学分解物の標準品入手、当研究に必要なLC/MS/MSの使用時間確保の目途がついいたため、当初の研究実施計画のように、引き続き、インスリン大量投与例の試料採取と情報収集、インスリン含有成分の検出法の検討を行い、更にヒトインスリン及び合成インスリンの分解物についても検出法の検討を行う。本研究の成果は、国内及び海外の学会発表や、論文を投稿しての誌上発表を通じて、実際の法医鑑定への応用を目指すとともに、社会・国民に還元する。
サイクリン依存性キナーゼ阻害分子の分解機構の解明

p27などCDKインヒビターと呼ばれる分子群は、CDK/Cyclin複合体に結合し酵素活性を阻害することから細胞周期調節に直接関わる重要な因子と考えられる。p27の蛋白量は蛋白分解に規定されていることが既に報告されていたがその分子機構はは不明であった。そこでその分解のメカニズムの解明を試み以下の点が明らかとなった。1.培養細胞(NIH3T3)を用い接触阻害によって細胞周期を同調させ、細胞周期によるp27の変動を観察した。p27は細胞周期依存性にG1-S移行期にもっとも強くユビキチン化された。2.ユビキチン付加部位を特定するためp27の変異体を作製しユビキチン化を調べたところ,アミノ酸残基134番、153番、165番目のリジンをアルギニンに置換したところユビキチン化が抑制された。3. p27をウェスタンブロットで観察すると、p27のユビキチン化と同時に22kDaの蛋白も同時に認識された。これはp27がユビキチン化以外にプロセシングを受けていることを示唆する。この反応はATP依存的であり、lactacystin、chymostatin、PMSFで抑制されたが、antipain、pepstatin、leupeptin、E64では影響を受けない。このプロセシング反応はプロテアゾームに関与しているchymotrypsin様プロテアーゼによるものと考えられた。4.プロセシングされた22kDa蛋白(p27Δ22k)は、p27のN末端より3540アミノ酸が切断されたものであると予想され,この蛋白はCDK阻害活性が野生型に比べ1/100に低下していた。今回の研究の結果,p27の分解にはユビキチン化だけでなく他のプロセシング機構も関与していることが示された。ユビキチン化やプロセシングに直接関与している酵素群の同定が今後の課題である。
チアミン結合タンパク質の構造、機能と種子改良に関する研究

1.コムギ種子、ゴマ種子のチアミン結合活性は種子の登熟とともに増加し、発芽期においては経時的に減少していった。また、チアミン結合タンパク質に対する抗体を用い、SDS-電気泳動で展開したタンパク質に対してウエスタンブロッティングを行なったところ、いずれの種子においてもチアミン結合タンパク質は種子の登熟とともに蓄積されていくことが、一方、種子発芽とともに分解されることが明らかとなった。2.種子のパラフィン切片を作成し、抗体を用いて免疫染色を行なったところ、ゴマ種子では残存胚乳部分に、一方コムギ種子ではアリューロン層と、いずれの種子においても種子周辺部分の細胞にチアミン結合タンパク質は蓄積されることが明らかとなった。また、その蓄積量は種子の登熟とともに高まり、発芽とともに減少した。種子以外の植物の部位においてはチアミン結合タンパク質の蓄積は認められなかった。3.ゴマ種子チアミン結合タンパク質をコードするcDNAの情報をもとに、その遺伝子発現についで検討した結果、ゴマの場合には登熟期の種子においてのみチアミン結合タンパク質遺伝子は発現していることが明らかとなった。4.種子中のチアミン含量は種子の登熟とともに増加すること、特に遊離型チアミン含量の増加が著しいことが明らかとなった。一方、発芽期の種子においては、遊離型チアミン含量は減少する傾向にあること、逆にリン酸エステル型チアミン含量は増加する傾向にあること、さらにこの傾向はゴマ種子において顕著であることが明らかとなった。1.チアミン結合活性を測定したところ、活性はゴマ種子の登熟とともに高まり、発芽期においては減少していった。又、チアミン結合タンパク質に対する抗体を用い、SDS-PAGEで展開したタンパク質に対してウェスタンブロッティングを行なったところ、種子の登熟とともにチアミン結合タンパク質に対するシグナルは明瞭なものとなり、一方、種子発芽とともに、そのシグナルが弱まっていくことが明かとなった。2.チアミン結合タンパク質をコードするcDNAの情報をもとに、その遺伝子の発現について検討した。ゴマ種子及びゴマ植物の他の部分(根、茎、葉、果皮)から抽出した全RNAを鋳型としてRT-PCRを行なったところ、登熟期の種子から得たRNAに対してのみ遺伝子の増幅が認められた。遺伝子の増幅により得られるシグナルは登熟段階が進んだ種子においてより強いものであった。又、cDNAをプローブとしてノーザンハイプリダイゼーションを行なったところ、同様の結果を得た。3.種子のパラフィン切片を作成し、抗体を用いて免疫染色を行なったところ、種子の残存胚乳部分に反応シグナルが認められ、チアミン結合タンパク質はゴマ種子では残存胚乳部分に蓄積されることが明かとなった。又、その蓄積量は種子の登熟とともに高まり、発芽とともに減少した。種子以外の部分ではチアミン結合タンパク質の蓄積は認められなかった。4.種子の登熟、発芽にともなうチアミン量の変化を測定したところ、登熟期の種子では登熟とともにチアミン量、特に遊離型チアミンの量が著しく増加した。一方、発芽期の種子においては、遊離型チアミン量は減少していったが、リン酸エステル型チアミンの量は増加していった。コムギを圃場で栽培し、開花から完熟までの登熟段階の異なる種子を採取した。また、コムギ種子を水耕栽培し、発芽日数の異なる種子を得た。これらの種子を分析の材料として、チアミン結合活性の変化、チアミン量の変化、チアミン結合タンパク質の変化を、それぞれ調べた。その結果、(1)コムギ種子から得たタンパク質抽出液をチアミン存在下で平衡透析した後、チオクローム蛍光法でチアミン結合活性を測定したところ、チアミン結合活性は種子の登熟とともに増大した。一方、発芽期では発芽とともに減少することが明らかとなった。(2)コムギ種子からチアミン類を抽出精製し、HPLCを用いて、その分析を行ったところ、登熟期の種子においては遊離型のチアミン含量は種子の登熟とともに大きく増加することが明らかとなった。他方、リン酸エステル型チアミンの含量には変動はみられなかった。一方、発芽期の種子においては、遊離型チアミン量、リン酸エステル型チアミン量ともに変動はみられなかった。

(3)コムギ種子より得たタンパク質の抽出液をSDS電気泳動で展開し、コムギ種子チアミン結合タンパク質に対する抗体を用いたウエスタンブロッティング法で分析を行ったところ、チアミン結合タンパク質は種子の登熟にともない、種子中に蓄積されることが明らかとなった。また、チアミン結合タンパク質は種子発芽にともなって分解され失われることも明らかとなった。さらに、種子切片を作成し、抗体を用いて免疫染色を行い、その局在を見たところ、チアミン結合タンパク質はコムギ種子ではアリューロン層に特異的に蓄積されることが明らかになった。
選択的分離試薬の開発と分析化学への適用に関する研究

選択的錯生成反応を行うリガンドの分子設計には、第一に立体的な規制の高いリガンドを見い出すことが必要であり、第二にこれらの有機リガンドの骨格の末端基に修飾を施し、どのような機能を賦与するかにある。本年度はrigidなリガンドであるポリピラゾリルボレ-ト塩を各種合成し、これらの金属キレ-トの熱的性質および抽出挙動を前年度に引き続き検討した。他方アシルピラゾロン、α-アシル-d-カンファ-、ジフォスフィンオキシド類など、O,O-配位のリガンドの末端基をかえ、抽出機能に及ぼす影響を検討した。1.ポリピラゾリルボレ-トリガンドはホウ素にピラゾ-ル環の1位のN原子が24ケ結合したN,N型リガンドで中間の硬さをもつ塩基であり、遷移金属イオンとはボ-ト型配位構造をもつ極めて安定で特異的な錯体を生成する。しかし硬い酸の金属であるアルカリ土類などは普通N,N-配位のリガンドとはクロロフィルなどを除き安定な錯体を生成しないが、ハイドロトリスピラゾリルボレ-トなどのリガンドではとくにMg^<2+>と安定な錯体を生成した。すなわち、常圧で分解されることなく昇華し、酸定数よりかなり低いph値で抽出された。その他数種のリガンドの金属錯体の抽出機構、熱的安定性について研究を進めた。2.アシルピラゾロンの4位などに置換基を導入し、主として希土類元素との錯生成反応に与える立体的効果を抽出法により検討を加えた。その結果、4-位のベンゼン基のオルト位にFが2ケ置換したリガンドは3位のメチル基との立体効果によるひずみが大きく、最も大きな立体効果を与えた。またポリフォスフィンオキシドを中性ルイス塩基として用い、アシルピラゾロンとの協同効果についても検討を加えた。その他有機ゲルマニウム種とハロゲン化イオンとの錯生成反応について、抽出法により研究を進め、水溶液相におけるこれらの反応の生成定数などを求め、θ結合の錯生成に及ぼす影響について考察した。選択的機能を持つリガンドとして、ポリピラゾリルボレート塩誘導体、アシルピラゾロン類を合成してその分析化学的機能を研究するとともに、光学活性体に対して識別機能を持つキレートについても研究を進めた。1.ポリピラゾリルボレート塩誘導体の合成とその金属キレートの分伏化学的研究。本リガンドと金属とのキレート環がボート型をとることがこのリガンドの特異的機能をもつ1つの要因と考えられたが、予測通り、例えばヒドロトリスピラゾリルボレートは遷移金属と昇華性の安定なキレートを生成し、また極めて低いpHで溶媒抽出されるばかりでなく、N,Nー配位リガンドでは珍らしくアルカリ土類元素とも抽出可能なキレートを生成することが判明した。このリガンドは水溶性で有機相への分配が低い。そのため、抽出平衡は主として水溶液中の反応が支配し、また酸性側でのリガンドのプロトン化のためpHーlogD曲線の匂配が著しく高くなることが判明した。2.アシルピラゾロン系リガンドの合成と金属の溶媒抽出の研究。アシルピラゾロン系リガンドは他の抽出試薬では困難なバリウムなどアルカリ土類を酸性側で容易に抽出分離できるのみならず、Li^+、Na^+といった従来不可能であったアルカリ金属をも抽出の可能性を抱かせるリガンドである。

そこで本リガンドに立体規制を与える置換基をもつ誘導体、或いは2ケのキレート環をもつビスピラゾロン誘導体を合成し、これらの構造が金属の溶媒抽出に与える影響をキレートの構造と関連づけて研究を行った。3.光学異性体と選択的に反応する光学活性リガンド金属キレートの合成と溶媒抽出の研究。dーおよびlーカンファーを含むリガンドなど光学異性体を含む金属キレートと、これらと付加反応するキナアルカロイドとの反応の立体選択性を溶媒抽出挙動を通して研究した。その結果Co^<2+>>Eu^<2+>>Zn^<2+>の順で光学異性体に対する選択性が大となるなど興味ある結果を得た。選択的錯反応を行うリガンドの分子設計には、第一に立体的な規制の高いリガンドを見い出すことが必要であり、第二にこれらの有機リガンドの骨格の末端基に修飾を施し、どのような機能を賦与するかにある。本年度はrigidなりガンドであるポリピラゾリルボレ-ト塩を各種合成し、これらの金属キレ-トの熱的性質および抽出挙動を前年度に引き続き検討した。他方アシルピラゾロン、α-アシル-d-カンファ-、ジフォスフィンオキシド類などO,O-配位のリガンドの末端基をかえ、抽出機能に及ぼす影響を検討した。1.ポリピラゾリルボレ-トリガンドはホウ素にピラゾ-ル環の1位のN原子が24ケ結合したN,N型リガンドで中間の硬さをもつ塩基であり、遷移金属イオンとはボ-ト型配位構造をもつ極めて安定で特異的な錯体を生成する。しかし硬い酸の金属であるアルカリ土類などは普通N,N-配位のリガンドとはクロロフィルなどを除き安定な錯体を生成しないが、ハイドロトリスピラゾリルボレ-トなどのリガンドではとくにMg^<2+>と安定な錯体を生成した。すなわち,常圧で分解されることなく昇華し、酸定数よりかなり低いpH値で抽出された。その他数種のリガンドの金属錯体の抽出機構、熱的安定性について研究を進めた。2.アシルピラゾロンの4位などに置換基を導入し、主として希土類元素との錯体生成反応に与える立体的効果を抽出法により検討を加えた。その結果、4-位のベンゼン基のオルト位にFが2ケ置換したリガンドは3位のメチル基との立体効果によるひずみが大きく、最も大きな立体効果を与えた。またポリフォスフィンオキシドを中性ルイス塩基として用い、アシルピラゾロンとの協同効果についても検討についても検討を加えた。その他有機ゲルマニウム種とハロゲン化イオンとの錯生成反応について、抽出法により研究を進め、水溶液相におけるこれらの反応の生成定数などを求め、σ結合の錯生成に及ぼす影響について考察した。
巨核球系細胞の増殖・分化・腫瘍化の分子機構の解析

巨核球の多倍体化がどのような細胞周期制御によって、また、どのような分子によって制御されているのかを検討した。微小管機能を制御することにより細胞質分裂を進行させることが明らかにされているセリン・スレオニンキナーゼAIM-1の巨核球の多倍体化機構における関与について検討を行った。AIM-1mRNA及びその蛋白は増殖期にある造血細胞ではG2/M期特異的に発現されたが、K562、CMK、F-36Pなどの巨核球系株及び正常巨核球が多倍体化する際にはその発現が持続性に抑制された。また、K562細胞がTPA刺激によって多倍体化する際に、野生型AIM-1を誘導的に発現させると多倍体化が有意に阻害された。さらに、通常の培養条件下で増殖しているK562に誘導的に優性阻害型のAIM-1を発現させると、多倍体化が誘導された。これらの結果から、巨核球の多倍体化にはAIM-1の発現が持続性に低下することが必要かつ十分であることが明らかとなった(J. Cell Biol. 152:275,2001)。また、BCR/ABL陽性の赤巨核球系細胞株K562に優性阻害型のRas、STAT5、PI3-Kを誘導的に発現させ、K562の腫瘍性増殖・生存の分子機構を検討した。K562にいずれの優性阻害型分子を発現させても、その増殖は3050%抑制された。また、これらの優性阻害型分子を2つ同時に発現させた場合、いずれの組み合わせでも、強い増殖抑制と細胞死が誘導された。更に、K562は抗腫瘍剤であるdexamethasone、αIFNに対して耐性を示すが、いずれかの優性阻害型分子を発現させた場合には、これらの薬剤に対して高い感受性を示した。これらの結果からK562の増殖・生存・薬剤耐性にはこれらのシグナル伝達分子すべてが同時に活性化されることが必要であると考えられた(J. Biol. Chem.,in press)。我々は巨核球系細胞の分化にはTPOによるRasの活性化が関与することを報告してきた。しかし、Rasの活性化はTPOに特異的な現象ではなく、多くの造血因子はRasを介して細胞増殖を誘導する。本研究では、Rasによって成熟巨核球への分化が誘導されるにはどのような分子が必要であるのか検討を行った。また、巨核球の多倍体化機構についても研究を行った。赤巨核球系細胞株K562、F-36Pに活性型Rasを発現させると成熟巨核球への分化が誘導された。一方、骨髄系細胞株32Dでは活性型Rasの発現を誘導しても巨核球への分化は誘導されなかった。一方、32Dに赤巨核球系統の特異的な転写因子GATA-1を導入すると、32Dの系統は赤巨核球系へと変化し、活性型Rasに反応して成熟巨核球へと分化するようになった。この際、GATA-1は転写因子として機能するのみでなく、骨髄系特異的転写因子PU.1やc-mybの機能を阻害することにより、Rasによる巨核球への分化誘導を支持すると考えちれた。AIM-1はAuroraファミリーに属するセリンスレオニンキナーゼであり、G2/M期特異的に発現し微小管機能を制御する。

巨核球の多倍体化におけるAIM-1の機能を検討するために、正常巨核球や各種の巨核系細胞株が多倍体化する際のAIM-1の発現変化を検討した。その結果、いずれの細胞においても多倍体化の過程でAIM-1の持続性発現低下が認められた。K562をTPAで処理するとAIM-1の発現の低下と共に多倍体化が誘導されるが、この際、野生型AIM-1を発現させるとTPAによる多倍体化が阻害された。また、K562、CMKにドミナントネガテイブ型のAIM-1を発現させると通常の培養条件下でも多倍体化が誘導された。これらの結果から、巨核球の多倍体化にはAIM-1の発現が持続的に低下することが必要かつ十分であると考えられた。巨核球の多倍体化がどのような細胞周期制御によって、また、どのような分子によって制御されているのかを検討した。微小管機能を制御することにより細胞質分裂を進行させることが明らかにされているセリン・スレオニンキナーゼAIM-1の巨核球の多倍体化機構における関与について検討を行った。AIM-1 mRNA及びその蛋白は増殖期にある造血細胞ではG2/M期特異的に発現されたが、K562、CMK、F-36Pなどの巨核球系株及び正常巨核球が多倍体化する際にはその発現が持続性に抑制された。また、K562細胞がTPA刺激によって多倍体化する際に、野生型AIM-1を誘導的に発現させると多倍体化が有意に阻害された。さらに、通常の培養条件下で増殖しているK562に誘導的に優性阻害型のAIM-1を発現させると、多倍体化が誘導された。これらの結果から、巨核球の多倍体化にはAIM-1の発現が持続性に低下することが必要かつ十分であることが明らかとなった(J. Cell Biol.152:275,2001)。また、BCR/ABL陽性の赤巨核球系細胞株K562に優性阻害型のRas、STAT5、P13-Kを誘導的に発現させ、K562の腫瘍性増殖・生存の分子機構を検討した。K562にいずれの優性阻害型分子を発現させても、その増殖は3050%抑制された。また、これらの優性阻害型分子を2つ同時に発現させた場合、いずれの組み合わせでも、強い増殖抑制と細胞死が誘導された。更に、K562は抗腫瘍剤であるdexamethasone、αIFNに対して耐性を示すが、いずれかの優性阻害型分子を発現させた場合には、これらの薬剤に対して高い感受性を示した。これらの結果からK562の増殖・生存・薬剤耐性にはこれらのシグナル伝達分子すべてが同時に活性化されることが必要であると考えられた(J. Biol. Chem., in press)。
不活性炭素－水素結合の触媒的な直接カルコゲン化反応の開発

有機カルコゲン化合物は、生物活性物質や機能性有機材料の基本骨格としてよく見られ、有機化学において重要な位置を占めている。よって、その効率的な合成法の開発が求められている。われわれは、パラジウム触媒を利用することで、通常不活性な炭素ー水素結合をジスルフィドにより直截的に硫黄化する反応を開発し、有機硫黄化合物の新たな合成法を確立した。また、その手法を拡張して、ジスルフィドの代わりにジセレニドを用いることで、炭素ー水素結合の直截セレノ化反応にも成功した。有機カルコゲン化合物は、その特異な性質から有機化学において重要な位置を占めている。中でも、アリールカルコゲニドは、機能性有機分子や生物活性物質中によく見られ、非常に有用な化合物群である。その一般的な合成法は、ハロゲン化アリールと有機カルコゲン反応剤とのカップリング反応である。この反応は収率良く進行するものの、出発物質としてハロゲン化物を調製しなければならない。そこで、芳香族炭素ー水素結合を直截的にカルコゲン化することができれば、理想的なアリールカルコゲニドの合成法となる。われわれは、適切な配向基を用いることで、パラジウム触媒による芳香族炭素ー水素結合の直截硫黄化反応が進行することを見いだした。パラジウム/ホスフィン触媒存在下、2-アリールピリジンとジスルフィドの混合物をDMSO溶媒中加熱することで、対応する硫黄化体を良好な収率で得ることができた。本反応は、高い基質一般性をもって進行し、さまざまなアリールスルフィドを合成することに成功した。また、本反応に利用するジスルフィドは、基質に対して半当量で十分であり、ジスルフィドの硫黄部位は両方とも生成物に組み込まれることが明らかになった。さらに、ジスルフィドの代わりに、ジセレニドを用いることで、対応する炭素ーセレン結合生成反応が進行することも見いだした。その後、配向基に関する検討の過程で、用いる配向基を変えることで、ナフタレン環の反応点を完全に制御することにも成功している。これらの反応は、これまで達成できなかった直截的なアリールカルコゲニドの合成法であり、機能性有機材料ならびに医農薬品の合成プロセスを一変する手法となりうる。その一般的な合成法は、ハロゲン化アリールと有機カルコゲン反応剤のカップリング反応である。パラジウム/ホスフィン触媒存在下、2-アリールピリジンとジスルフィドの混合物をDMSO溶媒中加熱したところ、対応する硫黄化体を良好な収率で得た。本反応は高い基質一般性をもって進行し、さまざまなアリールスルフィドを合成することに成功した。また、本反応に利用するジスルフィドは基質に対して半当量で十分であり、ジスルフィドの硫黄部位は両方とも生成物に組み込まれることを明らかにした。これら一連の炭素ーカルコゲン結合生成反応の研究過程から、パラジウム触媒によるアゾリルスルフィドを用いた末端アルキンの位置および立体選択的なカルボチオ化反応を開発することにも成功した。本研究において、遷移金属触媒を利用した炭素ーカルコゲン結合の新規構築法を確立することができた。これらの知見は、機能性有機材料や医薬品の研究開発に大きく貢献することができる。平成26年度は、いくつかの触媒的な炭素ー水素結合の直截カルコゲン化反応を開発することに成功した。本物質変換法に適用可能な基質は、未だに芳香族炭素ー水素結合に限られているが、より不活性な炭素ー水素結合のカルコゲン化反応に関する知見も着実に蓄積している。合成化学当初の研究計画に基づいて、さまざまな不活性炭素ー水素結合のカルコゲン化反応の開発に取り組む。また、反応機構に関する詳細な知見を得るために、反応中間体の単離・同定および量論実験をおこなう。さらに、開発した触媒反応を利用して、機能性有機分子や生物活性物質を合成することで、本反応の有用性を明らかにする。概ね計画通り研究費を使用することができた。
組織培養法を応用した肺癌多臓器転移モデルによる転移先臓器特異性決定遺伝子群の同定

本研究は,組織培養法を応用して複数臓器への同時多発転移をsimulateしたin vitroの実験系に,多数のヒト非小細胞肺癌細胞株をapplyし,マイクロアレイを用いて転移先臓器決定遺伝子群の同定を行うものである.ヒト肺腺癌培養細胞株A549,PC-14,およびVMRC-LCDを用い臓器上培養から得られた各細胞株の遺伝子発現をoriginalの細胞株の遺伝子発現と比較した.以上の処理により,肺,肝,腎,副腎,骨,筋において,それぞれ24, 212, 25, 76, 151, 27の候補遺伝子を抽出した.これらが臓器特異性決定遺伝子群の候補であると考えられる.本研究は,組織培養法を応用して複数臓器への同時多発転移をsimulateしたin vitroの実験系に,多数のヒト非小細胞肺癌細胞株をapplyし,マイクロアレイを用いて転移先臓器決定遺伝子群の同定を行うものである.ヒト肺腺癌培養細胞株A549,PC-14,およびVMRC-LCDを用い臓器上培養から得られた各細胞株の遺伝子発現をoriginalの細胞株の遺伝子発現と比較した.以上の処理により,肺,肝,腎,副腎,骨,筋において,それぞれ24, 212, 25, 76, 151, 27の候補遺伝子を抽出した.これらが臓器特異性決定遺伝子群の候補であると考えられる.肺癌は多数の臓器に転移を来すが,転移の生じる臓器は症例により異なる.どの臓器に転移しやすいかについて症例ごとに個性が異なると考えられる.個々の臓器への転移のしやすさを予測する遺伝子マーカーの検索はこれまで殆んどなされていない.本研究は,組織培養法を応用して複数臓器への同時多発転移をsimulateしたin vitroの実験系に,多数のヒト非小細胞肺癌細胞株をapplyし,マイクロアレイを用いて転移先臓器決定遺伝子群の同定を行うものである.具体的には,ヌードマウス摘出臓器片(肺,肝,腎,副腎,骨,筋)をヒト非小細胞肺癌細胞株とともに組織培養し,培養組織に生着,浸潤した細胞亜株を回収し,臓器上培養を繰り返した後の細胞性状の変化をマイクロアレイにて比較する.本年度は,各種肺癌細胞株における臓器親和性の検討と,確立した亜株における遺伝子発現の変異を検討した.検討した細胞株6種のうち,2株では組織片上での生着が得られず,3株では一部の臓器,1株(PC-14)で6臓器全てから細胞を回収した.PC-14を臓器上で5継代したところ,肝を除く5臓器上で継代が可能であった.得られた細胞とoriginalの細胞株の遺伝子発現をマイクロアレイで比較したところ,5臓器全てで共通した変動を示す遺伝子はDUSP1の増加のみであり,これは実験系に依存するものと考えられた.変動遺伝子数は肺,腎,副腎,筋肉,骨について,それぞれ,57,70,20,29,23個であった.さらに多数の細胞株を検討し,各転移先臓器別に共通因子を抽出する必要があるものと考えられる.肺癌は多数の臓器に転移を来すが,転移の生じる臓器は症例により異なる.どの臓器に転移しやすいかについて症例ごとに個性が異なると考えられる.個々の臓器への転移のしやすさを予測する遺伝子マーカーの検索はこれまで殆んどなされていない.本研究は,組織培養法を応用して複数臓器への同時多発転移をsimulateしたin vitroの実験系に,多数のヒト非小細胞肺癌細胞株をapplyし,マイクロアレイを用いて転移先臓器決定遺伝子群の同定を行うものである.具体的には,ヌードマウス摘出臓器片(肺,肝,腎,副腎,骨,筋)をヒト非小細胞肺癌細胞株とともに組織培養し,培養組織に生着,浸潤した細胞亜株を回収し,臓器上培養を繰り返した後の細胞性状の変化をマイクロアレイにて比較する.現在,腺癌の細胞株を中心に検討しており,PC-14を肺,腎,副腎,筋,骨で5継代したもの,A549を肺,肝,腎,副腎,筋,骨で5継代したものを得,それぞれoriginalの細胞株からの遺伝子発現の変動をマイクロアレイで比較した.臓器全てで共通した変動を示す遺伝子を除外し,臓器ごとにPC-14とA549で共通の変化を示す遺伝子を調べたところ,肺,腎,副腎,筋肉,骨について,それぞれ7,7,5,2,8個の変動遺伝子を抽出した.重複するものは筋と肺での1遺伝子のみであった.さらに多数の細胞株を検討し,各転移先臓器別に共通因子を抽出する必要があるものと考えられる.肺癌は多数の臓器に転移を来すが,転移の生じる臓器は症例により異なる.どの臓器に転移しやすいかについて症例ごとに個性が異なると考えられる.個々の臓器への転移のしやすさを予測する遺伝子マーカーの検索はこれまで殆んどなされていない.本研究は,組織培養法を応用して複数臓器への同時多発転移をsimulateしたin vitroの実験系に,多数のヒト非小細胞肺癌細胞株をapplyし,マイクロアレイを用いて転移先臓器決定遺伝子群の同定を行うものである.具体的には,ヌードマウス摘出臓器片(肺,肝,腎,副腎,骨,筋)をヒト非小細胞肺癌細胞株とともに組織培養し,培養組織に生着,浸潤した細胞亜株を回収し,臓器上培養を繰り返した後の細胞性状の変化をマイクロアレイにて比較する.

現在,腺癌の細胞株を中心に検討しており,PC-14を肺,肝,腎,副腎,筋,骨で継代したもの,A549を肺,肝,腎,副腎,筋,骨で継代したもの,VMRC-LCDを肺,肝,腎,副腎で継代したもの得,それぞれoriginalの細胞株からの遺伝子発現の変動をマイクロアレイで比較した.臓器ごとに共通の変動を他臓器変動とt-検定にて比較して検出し,そのうち,1.5 fold以上の変動を示した遺伝子群を選出した.これらは転移の臓器特異性を決定する候補と考えられる.肺,肝,腎,副腎,筋,骨について,それぞれ22,212,25,76,27,141の候補が得られた.これらについては,発現強度の順に追加検討を行うことで,さらに絞り込むことが必要と考えられる.肺癌は多数の臓器に転移を来すが,転移の臓器特異性を決定する遺伝子マーカーの検索はこれまで殆んどなされていない.本研究は,組織培養法を応用して複数臓器への同時多発転移をsimulateしたin vitroの実験系を用いて転移先臓器決定遺伝子群の同定を行う.ヌードマウス摘出臓器片(肺,肝,腎,副腎,骨,筋)をヒト肺腺癌培養細胞株A549,PC-14, VMRC-LCDとともに組織培養し,培養組織に生着,浸潤した細胞亜株を回収し,臓器上培養を繰り返した後、臓器上培養から得られた各細胞株の遺伝子発現の変化をoriginalの細胞株の遺伝子発現とマイクロアレイにて比較した.それぞれの遺伝子について,各臓器から回収された各細胞株の発現変動と他の5臓器から回収された細胞株の発現変動を比較し,t検定にて有意差(p<0.05)が認められ,かつoriginalに比し平均で1.5倍以上の変動が確認された遺伝子をそれぞれの臓器特異性を決定する候補遺伝子として抽出した.肺,肝,腎,副腎,骨,筋において,それぞれ24, 212, 25, 76, 151, 27の候補遺伝子を抽出した.うち最も最も特徴的な変動は副腎におけるcalbindin-D28kの増強であった.Calbindin-D28kはsteroid induced apoptosisを抑制する.originalのPC-14細胞はin vitroで1, 4, 16, 64 μM/mlのdexamethazoneによりそれぞれ5.9%, 35.5%, 51.8%, 76.8%と濃度依存性の増殖抑制を示すが,副腎組織培養上から回収されたPC-14細胞はいずれの濃度においても有意な増殖抑制を認めなかった. calbindin-D28k発現増強は副腎転移特異性決定遺伝子であり.本研究手法により臓器特異性決定遺伝子群の抽出が可能であると考えられる.肺癌は多数の臓器に転移を来すが,転移の生じる臓器は症例により異なる.どの臓器に転移しやすいかについて症例ごとに個性が異なると考えられる.個々の臓器への転移のしやすさを予測する遺伝子マーカーの検索はこれまで殆んどなされていない.本研究は,組織培養法を応用して複数臓器への同時多発転移をsimulateしたin vitroの実験系に,多数のヒト非小細胞肺癌細胞株をapplyし,マイクロアレイを用いて転移先臓器決定遺伝子群の同定を行うものである.具体的には,ヌードマウス摘出臓器片(肺,肝,腎,副腎,骨,筋)をヒト非小細胞肺癌細胞株とともに組織培養し,培養組織に生着,浸潤した細胞亜株を回収し,臓器上培養を繰り返した後の細胞性状の変化をマイクロアレイにて比較する.現在,腺癌の細胞株を中心に検討しており,PC-14を肺,肝,腎,副腎,筋,骨で継代したもの,A549を肺,肝,腎,副腎,筋,骨で継代したもの,VMRC-LCDを肺,肝,腎,副腎で継代したもの得,それぞれoriginalの細胞株からの遺伝子発現の変動をマイクロアレイで比較した.臓器ごとに共通の変動を他臓器変動とt-検定にて比較して検出し,そのうち,1.5 fold以上の変動を示した遺伝子群を選出した.