hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
p53によるDNA修復遺伝子MUTYHの発現制御と細胞死における役割の解明

MUTYHは主要な酸化塩基8-オキソグアニンに誤対合するアデニンを除去するDNA修復酵素であり、MUTYH遺伝子の欠損は常染色体劣性遺伝性の大腸腺腫症の原因となることが報告されています。我々はこれまでに、核あるいはミトコンドリアDNAに蓄積した8-オキソグアニンがMUTYHに依存して2つの独立した細胞死を誘導することを報告しています。本研究において、我々はMUTYHの発現が転写因子p53により制御されることを見いだし、MUTYH遺伝子上に機能的なp53応答配列部位を同定しました。このことは、MUTYHが酸化ストレス環境下で細胞死を誘導することにより、p53による発がん抑制のメディエータとして機能することを示唆しています。p53が劣性遺伝性大腸腺腫症の原因遺伝子MUTYHの転写を促進することにより、細胞死の誘起および突然変異蓄積の抑制を介して発がんを抑制する事を明らかにする。〔平成22年度の研究成果〕1,MUTYH遺伝子プロモーター領域におけるp53の結合領域同定p53野生型HCT116細胞におけるクロマチン免疫沈降を用いた解析により、MUTYH遺伝子上に少なくとも2カ所のp53応答配列の候補を同定した。次に、この2つのp53結合領域由来のp53応答配列を持つプロモーター・レーポーター・コンストラクトを作成し、p53欠損H1299細胞あるいは野生型HCT116細胞に導入後ルシフェラーゼアッセイにより機能を検討した。結果、1つの配列がp53応答配列として機能することが明らかになった。2,p53によるMUTYH依存性細胞死制御機構の解明p53野生型HCT116細胞を用いて、p53抑制薬剤PFTα存在下あるいはMUTYH-siRNAが酸化ストレス暴露後の細胞死に及ぼす影響を検討した。p53の機能抑制あるいはMUTYHノックダウンはそれぞれ同程度に細胞死を抑制した。しかしPFTα存在下においてMUTYHをノックダウンしても細胞死の抑制効果は増強されず、各々単独の場合と同程度であった。酸化ストレス下においてMUTYHはp53の細胞死制御のメディエータであると考えられる。3,がん幹細胞における酸化塩基修復酵素OGG1, MUTYHの役割ある種の大腸がん細胞株においてCD133はがん幹細胞のマーカーとして用いられている(PNAS 2010, 107 : 3722-3727)。p53野生型HCT116細胞株においてCD133陰性と比較しCD133陽性細胞では、ミトコンドリア領域における酸化塩基8-oxoGの蓄積が低くミトコンドリア型hOGG1の発現レベルが高いことを見いだした。p53が劣性遺伝性大朧症の原因遺伝子MUTYHの転写を促進することにより、細胞死の誘起および突然変異蓄積の抑制を介して発がんを抑制する事を明らかにする。〔平成23年度の研究成果〕1,MUTYH遺伝子領域におけるp53の結合領域同定これまでにp53野生型HCT116細胞におけるクロマチン免疫沈降を用いた解析により、MUTYH遺伝子上のp53結合領域を同定した。HCT116細胞はミスマッチ修復酵素であるMLH1発現が欠損しており、この欠損がp53発現の安定性に影響する可能性が国外の報告から示唆されたため、本年度はHCT116細胞にChr3を微小核導入することによりMLH1を発現しているHCT116+Chr3細胞を用いて、p53結合領域の解析を行っている。さらに同定したMUTYH遺伝子上の機能的p53応答配列において、配列特異性を検討するため配列の一部に変異を導入したコンストラクトを作成中である。2,p53によるMUTYH依存性細胞死制御機構の解明これまでにp53によるMUTYH依存性細胞死経路を検討してきたが、MLH1発現HCT116+CHr3細胞においてもMUTYHがp53制御下において酸化ストレス下の細胞死を誘導することを明らかにした。さらに我々が報告した、核あるいはミトコンドリアDNAに蓄積した酸化障害が誘起する異なる2つの細胞死経路を、PARP Calpain阻害剤を用いて検討した。結果、酸化ストレス下のHCT116およびHCT116+Chr3細胞では、核DNAに酸化障害が蓄積することによりPARP依存性に誘起される細胞死経路が主に観察された。3,がん幹細胞における酸化塩基修復酵素の役割ある種の大腸がん細胞株においてCD133はがん幹細胞のマーカーとして用いられている(PMNAS 2010, 107:3722-3727)。

これまでにp53野生型HCT116細胞株においてCD133陰性と比較しCD133陽性細胞ではミトコンドリア型hOGG1の発現レベルが高い事を見いだした。現在MUTYH, MTH1の発現を比較解析中である。以上1.2.3の結果をもとに現在論文投稿を準備中である。p53が劣性遺伝性大腸腺腫症の原因遺伝子MUTYHの転写を促進することにより、細胞死の誘起および突然変異蓄積の抑制を介して発がんを抑制する事を明らかにする。p53応答配列の確認:HCT116細胞はミスマッチ修復酵素MLH1発現が欠損しており、この欠損がp53発現の安定性に影響する可能性が国外の報告から示唆されたためp53野生型HCT116およびMLH発現HCT116+Chr3細胞を用いてクロマチン免疫沈降を行った。MUTYH遺伝子上に3カ所のp53応答配列の候補を同定した。次に候補p53応答配列を含むプロモーターレーポーターコンストラクトを作成し、p53欠損H1299細胞あるいは野生型HCT116、HCT116+Chr3細胞に導入、ルシフェラーゼアッセイを用いて配列の機能性を解析した。1カ所のp53応答配列を同定した。さらに応答配列の一部に変異をもつコンストラクトの導入によりルシフェラーゼ活性が消失したことから、同定したp53応答配列の特異性を確認した。p53制御によるMUTYH依存性細胞死制御機構:HCT116、HCT116+Chr3細胞を用いて、我々が報告した核あるいはミトコンドリアDNAに蓄積した酸化障害が誘起する二つの細胞死経路を、PARP、カルパインの阻害剤を用いて解析した。これらのヒト大腸がん細胞株では、ミトコンドリアDNAに酸化障害が蓄積し誘導される細胞死経路が観察されず、核DNAの酸化障害が引き起こすPARP依存性細胞死経路が主に起動されることを明らかにした。実験の進展に応じて、計画年度の順番は変更している。平成22年度計画:MUTYH田遺伝子上におけるp53結合部位の解析、は計画最後の実験である結合配列への変異導入コンストラクトを作成中である。平成23年度計画:p53の有無によるMUTYH発現の比較、はp53欠損H1299細胞、p53野性型HCT116細胞株、さらにHCT116+Chr3細胞も加えて解析終了している。さらにp53抑制剤PFTαとMUTYH-siRNAを組み合わせてp53の制御下でMUTYHが細胞死を誘起することを明らかにした。MUTYHアイソフォーム導入による細胞死の検討は現在進行中であるが、平成24年度計画:細胞死経路の解析、を同時に進めており、ヒトがん細胞株HCT116細胞においては核DNAに蓄積した酸化障害が誘起するPARP依存性細胞死経路が主に稼働する事を見いだした。さらに実験の過程で、当初にはなかったがん幹細胞におけるDNA修復酵素系の役割について、CD133陽性、CD133陰性細胞の比較によりCD133陽性細胞に特異的な酵素発現のパターンを見いだす事ができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は2期に分けて実験を予定している。前期にp53結合配列への変異導入コンストラクト構築およびルシフェラーゼ活性の抑制の検討、HCT116+Chr3細胞を用いたCHIPアッセイを予定している。後期に細胞死経路の詳細な検討を行う。
水疱性類天疱瘡における自己抗体病原性の直接証明とエピトープデコイ療法の開発

水疱性類天疱瘡(BP)は,XVII型コラーゲン(COL17)に対する自己抗体により発症すると考えられている.COL17は表皮真皮間の接着に非常に重要であり,遺伝子異常により先天的に発現が欠損した場合,外的刺激により容易に水疱を形成する表皮水疱症となる.このCOL17が自己抗原となるBP患者IgGをマウスヘ投与しても病変は形成されない.従って、本当に患者のCOL17に対する自己抗体によってBPが発症するかについては未だ証明されていない.本研究の目的は,遺伝子改変マウスを用いて,BP患者に存在する自己抗体の病原性を直接証明すること,並びに,BP抗原のepitopeに一致するペプチドをdecoy(おとり)として投与する,エピトープデコイ(epitope decoy)という新規治療戦略を開発することにあった。その結果、COL17 KOマウスでは,COL17の発現が無く,皮膚は脆弱で容易に水疱を形成しヒトの表皮水疱症患者に極めて類似していた.COL17 KOマウスの多くは成長障害と高い死亡率を呈し交配は不能だった.一方,ヘテロのCOL17KOマウスでは異常所見は認めず,ヒトCOL17が皮膚で発現するヒトCOL17 cDNAトランスジェニックマウスとの交配を進めた.最終的に,マウスCOLI7が欠損しヒトCOLI7のみ発現するCOL17ヒト化マウスが得られた.このマウスではKOマウスで見られた殆どの異常所見は認めずほぼ正常の表現形を呈しCOL17ヒト化マウス同士の交配も可能だった.この結果、患者の表皮細胞に遺伝子を導入する遺伝子治療の有用性が示された。次に,このCOL17ヒト化マウスへBP患者由来IgGを投与したところ,ヒトIgGがマウス皮膚へ沈着し表皮下水疱が生じBPの所見を再現することに成功した.更に,COL17の抗原エピトープNC16Aドメインをコードする種々の蛋白を合成した。このリコンビナントペプチドをこのBPモデルマウスへ投与したところ,優位に病勢を抑制し,抗体中和療法として有用であることが解った(epitope decoy療法).将来BPに対する新しい治療法をして有用であることが示された。水疱性類天疱瘡(BP)は,高齢者に高発する最も頻度の高い自己免疫性水疱症であり,全身に表皮下水疱が多発する重篤な疾患である。本症患者の血清中には,皮膚の基底膜を認識する抗基底膜抗体(BP抗体)が存在する。本研究の目的は,遺伝子改変マウスを用いて,水疱性類天庖(BP)患者に存在する自己抗体の病原性を直接証明すること,並びに,BP抗原のepitope(抗原決定基)に一致するペプチドをdecoy(おとり)として投与する,エピトープデコイ(epitope decoy)という新規治療戦略を開発することにあった。その結果,BP抗原KOヘテロマウス(マウスBP+/-,ヒトBP-)とTGマウス(マウスBP+/+,ヒトBP+)を交配することにより,ノックアウトマウスのヘテロでありながら,トランスジーン(ヒトのBP抗原遺伝子)を受け継いだマウス(マウスBP+/-,ヒトBP+)を作成した。ヒトBP抗原により救済され,KOマウスの皮膚症状が消失した。交配で得られたBP抗原ヒト化

マウスの表現型を週齢に従い,詳しく解析した結果,230kD類天疱瘡抗原の発現の低下が認められたが,その他の基底膜蛋白は,正常であった。今回で研究では,最終的に接合部型表皮水庖症のモデルであるBP抗原のノックアウトマウスの表皮細胞に,正常の遺伝子が導入されることになるので,遺伝子治療の有用性が証明された。次年度の研究の準備として,北大皮膚科に保存しているBP患者血清のBP-ELISA,ウエスタンブロットを行い,BP抗原への自己抗体を有する血清を選択した。さらに,その血清からプロテインGカラムを用いてIgGを精製した。それらの抗体を先ず正常のマウスに投与して,実際に皮膚に沈着しないことを確認する予定である。水疱性類天疱瘡(BP)は,XVII型コラーゲン(COL17)に対する自己抗体により発症すると考えられている.COL17は表皮真皮間の接着に非常に重要であり,遺伝子異常により先天的に発現が欠損した場合,外的刺激により容易に水疱形成する表皮水疱症となる.このCOL17が自己抗原となるBP患者IgGをマウスへ投与しても病変は形成されない.従って、患者のCOL17に対する自己抗体によってBPが発症するかは未だ証明されていない.本研究目的は,遺伝子改変マウスを用いて,BP患者に存在する自己抗体の病原性を直接証明し,BP抗原のepitopeに一致するペプチドをdecoy(おとり)として投与するエピトープデコイ(epitope decoy)という新規治療戦略を開発することにあった。COL17KOマウスでは,COL17の発現が無く,皮膚は脆弱で容易に水疱を形成しヒトの表皮水疱症患者に極めて類似していた.一方,ヘテロのCOL17KOマウスでは異常所見は認めず,ヒトCOL17が皮膚で発現するヒトCOL17cDNAトランスジェニックマウスとの交配を進めた.最終的に,マウスCOL17が欠損しヒトCOL17のみ発現するCOL17ヒト化マウスが得られた.このマウスではKOマウスで見られた殆どの異常所見は認めなかった.この結果、患者の表皮細胞に遺伝子を導入する遺伝子治療の有用性が示された。こ・のCOL17ヒト化マウスへBP患者由来IgGを投与したところ,ヒトIgGがマウス皮膚へ沈着し表皮下水疱が生じBPの所見を再現することに成功した.更に,COL17の抗原エピトープNC16Aドメインをコードする種々の蛋白を合成した。このリコンビナントペプチドをこのBPモデルマウスへ投与したところ,優位に病勢を抑制し,抗体中和療法として有用であることが解った(epitope decoy療法).将来BPに対する新しい治療法として有用であることが示された。
老年期のニホンザルの行動研究

(1)野外集団における観察:(1)20歳未満の成長期のメスと20歳以上の向老・老年期のメスの行動を勝山集団において、観察し比較した。向老・老年期のメスは成年期のメスに比べて、集団成員との社会的な関わりが少ない。向老・老年期のメスも、自身の血縁系の個体がけんかなどにまきこまれると、それに対して援助行動などを行う。また、運動能力に衰えが目だち始めた老年期のメスであっても、優劣順位の低下は認められない。このように、老化のために不妊になり繁殖能力を喪失した個体も、集団の中で社会的存在として生活していることが明かとなった。(2)第1位成体オスの行動。24歳から25歳にかけての1年間に、背骨の曲がり、採食行動の際の前肢の動かし方、歩行様式等に著しい老化の傾向が見出されるようになった。さらに、このオスとメスとの交尾も見られなくなった。それにも関わらず、このオスは優劣順位第1位を維持している。これは、多くの成体メスが老化に関係なくこのオスに追従するためと思われる。(2)飼育個体の老化と行動変容:(1)野生由来メスの月経周期が2年にわたって記録された。25歳を越える老年期のメスの中に、月経周期が不規則になる個体、さらに閉経している個体のいることが確認された。(2)老年期のメスの中には、若い個体に比べて、夜間に、より頻繁に姿勢を変えるなどの動きを示した。これは老体になると夜間の睡眠が浅くなるためと思われる。(3)向老・老年期のメスの養育行動と20歳以下の成体期のメスの養育行動との間に著しい差異は認められなかった。野外集団における行動観察:ニホンザルの15歳から20歳代の後半までのメスは成年期の後半から老年期にあるといえる。ニホンザルの出産期である4月から7月までと交尾期である11月から翌年の2月までの2期間において、これらの個体の行動観察を行った。出産率は成年期後半のメスは老年期のメスに比べて明らかに高い。しかし、幼体を抱く、授乳する、毛づくろいするなどの積極的な母性行動においても、また、幼体から離れたり、威嚇したりして、母ザルからの独立を促すと思われる行動に顕著な差は見られなかった。交尾期における老年期のメスの行動は、成年期の後半のメスに比べて、発情を示す明瞭な行動(例えば、発情したメスに特有の音声)の頻度が少なく、また、発情と非発情の期間の区別が行動的に不明瞭であった。20歳を越える老年期のオスもメスとの交尾行動は観察されているが、その頻度はきわめて少なく、また、少数の限られたメスと性的な関係を維持する傾向を強く示した。実験室における研究:個別檻の中で母子だけで飼育されたメスの養育行動を、メスの年齢を関数にして検討したが差はなかった。つまり、野外だけでなく、室内飼育事態においても、成年期後半からのメスの養育行動は極めて安定したものであると言える。赤外線カメラを用いて、72時間にわたり連続して、個別飼育されている15歳から30歳までのメスの活動性を記録した。加齢するほどメスの活動性が落ちるだけでなく、睡眠と覚醒のパタ-ンも異なる傾向が見いだされた。

つまり、老年期のメスは昼間も軽睡眠の状態にあることが多く、逆に夜間に活動的ではないが覚醒状態になることが稀ではないと思われた。さらに、老年期のメスの中には、指や趾での対象操作能力に、硬さ、つまり柔軟性の欠如が生じ始めることも見いだされた。(1)野外集団における観察:(1)20歳未満の成年期のメスと20歳以上の向老・老年期のメスの行動を勝山集団において、観察し比較した。成年期のメスは、向老・老年期のメスに比べて、集団成員との社会的な関わり(例えば、毛づくろいをする、他個体の近くに留まるなど)が多い。しかし、向老・老年期のメスが完全に狐立した存在ではない。例えば、自身の血縁系の個体がけんかなどにまきこまけると、それに対して援助行動などを行う。また、運動能力に衰えが目だち始めた老年期のメスであっても、優劣順位の低下は認められない。このように、老化のために不妊になり繁殖能力を喪失した個体も、集団の中で社会的存在として生活していることが明かとなった。(2)第1位成体オスの行動。24歳の時の交尾期にはまだメスとの交尾が見られたが、1年後の25歳の時の交尾期には全く見られなくなった。また、この1年間に、背骨の曲がり、採食行動の際の前肢の動かし方、歩行様式等に著しい老化の傾向が見出されるようになった。それにも関わらず、このオスは優劣順位第1位を維持している。これは、多くの成体メスが老化に関係なくこのオスに追従するためと思われる。(2)飼育個体の老化と行動変容:(1)野生由来メスの月経周期が2年間にわたって記録された。一般に、ニホンザルでは交尾期である秋から春にかけて月経周期が現れるが、飼育ニホンザルでも同様の結果であった。しかし、半数以上の個体で、不定期ではあるが夏季に月経が認められた。また、25歳を越える老年期のメスの中に、閉経している個体のいることを確認した。(2)老年期のメスの中には、若い個体に比べて、夜間により頻繁に姿勢を変えるなどの動きを示し、軽睡眠の状態であると思われる。
超高齢者の口腔・身体機能が疾病予防および生命予後に与える影響

85歳以上の超高齢者のお口の健康状態が、身体的、精神的健康状態および生活予後に及ぼす影響を解明するため、東京在住の超高齢者542人にお口と身体の健康調査を行った。調査は初期調査、3年経過後、6年経過後について追跡調査し、加齢による影響を検討した。その結果、初期調査から3年で91人が死亡し、生存者との比較から、BMI、ADL、MMSEなど身体および認知機能の低い被験者に死亡者が多く、握力や最大咬合力など、身体、口腔機能が低い被験者に多くの死亡者が認められた。血液検査では、死亡者の栄養状態(ALB)は不良であり、炎症傾向が高かった。さらに、食生活の充実が生命予後に影響することが明らかとなった。お口の健康が超高齢者の健康状態に及ぼす影響を検討する目的で,自立して生活する85歳以上の超高齢者524名を対象に,初期調査から3年経過後の口腔の健康状態と肺炎罹患に関する疫学調査を行った.その結果,3年間の追跡期間中48名が肺炎に罹患した.さらに,肺炎罹患の有無と種々の測定項目との関連性を分析したところ,嚥下障害の有無,就寝時における義歯装着,日常生活動作(ADL)の低下,認知機能障害の有無,BMIによる低体重(18.5%未満),疾患では呼吸器疾患と脳卒中の既往に有意な関連性が認められた.血液検査結果からは,肺炎罹患者には栄養状態の指標であるアルブミンの低下,炎症の程度を示すCRP値およびインターロイキン-6値の有意な上昇が認められた..さらに,肺炎罹患との有意な関連性が認められた項目の中で,唯一の行動要因である「就寝時における義歯装着」の有無と肺炎罹患者数との関係を検討した結果,就寝時義歯非装着者に比べ装着者の肺炎罹患患者数は3年間の観察期間中,時間の経過に伴い有意に増加した.さらに、就寝時義歯非装着者に比べ義歯装着者の肺炎罹患リスクは約2.3倍と高かった.これは,嚥下障害,認知症や脳卒中さらに呼吸器疾患罹患など,これまで肺炎罹患リスクの重要なファクターとして考えられてきた疾病と同等の値であった.また,就寝時義歯装着者の口腔内の特徴として,非装着者に比べ舌や義歯へのプラーク付着,歯肉の炎症,カンジダ菌による感染が多く認められた.これらのことから,自立した生活を送っている比較的元気な超高齢者であっても,就寝時の義歯装着は細菌感染や炎症の誘発などにより口腔環境に悪影響を及ぼすだけでなく,肺炎罹患のリスクを高めることが明らかとなり,日常生活での口腔衛生習慣の改善が肺炎予防に重要であることが明らかとなった.お口の健康状態が超高齢者の健康状態およびその後の生存状況にいかなる影響を及ぼすかについて検討する目的で、85歳以上の東京在住の超高齢者542名を対象に疫学調査を2009年から行っている。さらに初期調査から3年経過後、および6年経過後について追跡調査を行い、3年後は約360名からデータを採得することができ、6年後についても約250名からのデータを得ることが出来た。3年後の解析結果の一部については、平成26年度に海外専門誌上にて報告を行っており、現在は最大かみしめ時の咬合力の大きさが、3年後の死亡率に及ぼす影響を検討し、その内容の一部を、海外専門誌に投稿中である。とくに平成27年度は、6年後調査の最終年度にあたるため、おもに調査対象者の居住する施設に赴いてのデータ採取に多くの時間を費やした。この原因として、調査対象者の平均年齢がすでに90歳を超えており、認知機能や日常生活度が低下した被験者が多く、一度に多くを調査対象とできる健診センターでの調査が困難となったためである。なお、追跡調査から得られたデータは現在詳細に解析を行っている。さらに、本年度は超高齢者を対象とした疫学研究では世界的に高い評価を得ている、英国Newcastle大学との共同研究を行うため、研究代表者である飯沼利光が平成27年5月より10月まで現地に赴き共同研究実現に向け共同作業を行った。その結果、英国および日本合わせて1700人規模の大きな超高齢者コホートの作成が行え、国際的な視点での身体、精神さらには社会要因が健康寿命の延伸に及ぼす影響について検討を行った。この結果についても最終年度である平成28年度に逐次学会および誌上にて報告を行っていく予定である。本研究は、調査対象者が85歳以上であるため、初期調査から6年経過時での追跡調査ではすべての対象者が90歳以上となった。そのため、初期調査で行ったような健診センターでの集団調査が不可能となり、歯科医師と医師とがチームを作り、自宅や施設で訪問調査を行った。その結果、1件の事故も起こすことなく、初期調査と同一な内容での6年後調査を終了することが出来た。調査結果から、100名以上の対象者がすでに死亡しており、その状況や健康状態が低下した際の情報を詳細に得ることができているので、詳細な分析により口腔機能とこれら身体機能や認知機能などの精神機能、さらには死亡原因との関連性について解析をする。これらの内容については、当初の計画通りに進捗をしている。また、当初に立てた計画のように、平成27年度に世界最先端の海外研究チームとの共同研究が実現し、両国のデータをマージすることができた。

このことにより、人種や習慣あるいは環境の違いが生命予後に与える影響の検討が出来ることは長寿研究において画期的なことである。お口の健康状態が85歳以上の超高齢者の健康状態およびその後の生存状況にいかなる影響を及ぼすかを明らかとすることを目的として、東京に在住する超高齢者542名を対象に疫学調査を2009年から行っている。今回補助を受けた研究では、これをさらに発展、拡充させるため初期調査から3年経過後、6年経過後の追跡調査を初期調査と同一の項目および内容にて行い、口腔機能に加え加齢が心と身体の健康状態に及ぼす変化、および研究期間内での死亡者数とその死亡原因について調査した。さらに、その調査結果について統計解析を加え、詳細に分析および検討を行った。その結果、3年後追跡調査では約360名、さらに6年後追跡調査では約250名からのデータ採取を行うことが出来た。初期調査から3年間に91名が死亡した。生存者と死亡者との初期調査と3年経過後での各調査結果を比較すると、BMI、ADL、MMSEの測定値が有意に低い被験者には死亡者が多く、握力などの身体機能および最大咬合力値の低い被験者に死亡者が多かった。血液検査結果からは、死亡者は、ALBが低く、炎症傾向が有意に高かった。また、生存者の食生活での満足度は死亡者に比較し有意に高く、超高齢者にとり食生活の充実は、生命予後に大きな影響を及ぼすと考えられた。なお、6年経過後での分析結果については現在解析中である。また、最終年度に当たる平成28年度は、被験者の6年経過以降のさらなる健康状態および生死にかかわる情報収集を電話および郵便等により定期的に行うとともに、これまでの分析結果を国内外の専門学会において、口頭および誌上報告を行った。85歳以上の超高齢者のお口の健康状態が、身体的、精神的健康状態および生活予後に及ぼす影響を解明するため、東京在住の超高齢者542人にお口と身体の健康調査を行った。調査は初期調査、3年経過後、6年経過後について追跡調査し、加齢による影響を検討した。その結果、初期調査から3年で91人が死亡し、生存者との比較から、BMI、ADL、MMSEなど身体および認知機能の低い被験者に死亡者が多く、握力や最大咬合力など、身体、口腔機能が低い被験者に多くの死亡者が認められた。血液検査では、死亡者の栄養状態(ALB)は不良であり、炎症傾向が高かった。さらに、食生活の充実が生命予後に影響することが明らかとなった。本研究は、調査対象者が85歳以上と超高齢者を対象にしているにもかかわらず、542名と大規模な疫学調査を行い、超高齢者の口腔機能と身体機能の関連性を明らかとする事を目的とし、横断でのコホートの確立を行っている。さらに初期調査を終了した被験者への3年後追跡調査を行ったが、70%以上と非常に高い再調査率を得る事が出来ている。また、現在6年経過時の追跡調査を行っており、縦断的な疫学研究としても非常に大きな規模での検討を行っている。今回この縦断的データを分析した結果から、超高齢期における最大の死亡要因である肺炎と、就寝時での義歯装着という、口腔との関連性を明らかとし、緒高齢期における口腔衛生の重要性に関するエビデンスを提供できたことの意義は非常に大きいと考えている。平成28年度は研究最終年度となるため、これまで得られた膨大なデータの解析および得られた成果の社会に向けての発信が活動の中心となる。超高齢者にとり健康維持に関わる情報は、彼らの置かれた状況を考慮すると、躊躇を許さないものであると考えている。そのため、効果的かつ迅速な発信が、国内のみならず全世界視野で行えるような方法を考えている。
セラミックス双結晶の高温強度と粒界の原子・電子構造

セラミックスの各種力学特性は、粒界の構造や状態と密接に関係している。本研究は、(1)セラミックス双結晶の作製、(2)粒界原子・電子構造評価、(3)粒界方位と粒界すべり挙動の相関性、(4)粒界偏析の効果について、以下の研究実績を得た。(1)セラミックス双結晶の作製は、単結晶同士の加熱接合法により行い、ジルコニアの[110]傾角粒界およびアルミナの[1120]傾角粒界を作製した。双結晶の粒界エネルギーを粒界グルービング/AFM法を用いて測定した結果、粒界エネルギーは傾角に大きく依存し、セラミックスの場合でも対応方位関係においてエネルギーカスプが存在することが分かった。(2)双結晶の粒界を高分解能電子顕微鏡法により観察し、像シミュレーションと比較することにより粒界の原子構造を決定した。その結果、対応方位関係と粒界エネルギーおよび粒界の構造の乱れの相関性が明らかになった。また、得られた構造の安定性を分子軌道法により評価し、高分解能法で得られた結果と一致することが分かった。(3)各双結晶の粒界に最大せん断応力が負荷されるように高温圧縮試験を行った。その結果、対応方位関係と粒界すベリの間には相関性があることが判明した。しかし、特に高Σ粒界においては粒界エネルギーと粒界すべり量の相関性は見出されなかった。このことは、粒界すべりは主に粒界の構造の乱れに起因することを示している。(4)セラミックス粒界への偏析効果を明らかにするため、各種ドーパント添加セラミックスの粒界の高分解能電子顕微鏡法と像シミュレーションによる構造同定、電子エネルギー損失分光法と分子軌道法による状態密度分布の同定を行った。ジルコニアの粒界にはYが偏析しているがその結合状態は純ZrO_2結晶と近いこと、さらにこれにSiO_2を添加するとYに加えてSiが数nm幅で偏析し、その粒界結合力を増加させることが分かった。また、粒界性格によって偏析量が変化することも明らかにした。従って、高強度でかつ信頼性の高いセラミックス材料を設計するためには、その相関性を明らかにする必要がある。そのためには、粒界の構造・状態の定量的な評価と粒界性格の明確な双結晶を用いた研究が重要となる。本年度は、粒界の定量的高分解能観察と電子エネルギー損失分光法による計測評価手法のセラミックス粒界への適用と方位を系統的に制御したセラミックス双結晶の作製・評価を中心に行った。セラミックス粒界の構造・状態の定量的評価を行うため、高分解能電子顕微鏡法と像シミュレーションによる同定、電子エネルギー損失分光法と分子軌道法による状態密度分布の同定を行った。その結果、TZPの粒界にはYが偏析しているがその結合状態はZrO_2結晶と近いこと、さらにこれにSiO_2を添加するとYに加えてSiが数nm幅で偏析し、その粒界結合力を増加させることが分かった。また、Al_2O_3の場合、微量の希土類酸化物を添加するとそれが粒界に偏析し、添加元素の価数とイオン半径によって粒界の結合状態が変化することが分かった。さらに、本構造・状態解析手法を一般の金属/セラミックス異相界面にも適用し、その界面構造・電子状態の定量的解析が可能なことを示した。

セラミックス双結晶の作製は、単結晶同士の加熱接合法により行い、ジルコニアの[110]傾角粒界およびアルミナの[1120]傾角粒界を数種類作製した。作製した双結晶の粒界エネルギーを粒界グルービング/AFM法を用いて測定した結果、いずれの場合も粒界エネルギーは傾角に大きく依存し、対応方位関係においてエネルギーカプスが存在することが分かった。また、S7対応粒界を含む一部の粒界を高分解能電子顕微鏡法により観察し、像シミュレーションを行うことによって、粒界の原子構造・配列を決定した。さらに、得られた構造の安定性を分子軌道法により評価し、高分解能法で得られた結果と一致することが分かった。セラミックスの各種力学特性は、粒界の構造や状態と密接に関係している。本研究は、(1)セラミックス双結晶の作製、(2)粒界原子・電子構造評価、(3)粒界方位と粒界すベり挙動の相関性、(4)粒界偏析の効果について、以下の研究実績を得た。(1)セラミックス双結晶の作製は、単結晶同士の加熱接合法により行い、ジルコニアの[110]傾角粒界およびアルミナの[1120]傾角粒界を作製した。双結晶の粒界エネルギーを粒界グルービング/AFM法を用いて測定した結果、粒界エネルギーは傾角に大きく依存し、セラミックスの場合でも対応方位関係においてエネルギーカプスが存在することが分かった。(2)双結晶の粒界を高分解能電子顕微鏡法により観察し、像シミュレーションと比較することにより粒界の原子構造を決定した。その結果、対応方位関係と粒界エネルギーおよび粒界の構造の乱れの相関性が明らかになった。また、得られた構造の安定性を分子軌道法により評価し、高分解能法で得られた結果と一致することが分かった。(3)各双結晶の粒界に最大せん断応力が負荷されるように高温圧縮試験を行った。その結果、対応方位関係と粒界すべりの間には相関性があることが判明した。しかし、特に高Σ粒界においては粒界エネルギーと粒界すべり量の相関性は見出されなかった。このことは、粒界すベりは主に粒界の構造の乱れに起因することを示している。(4)セラミックス粒界への偏析効果を明らかにするため、各種ドーパント添加セラミックスの粒界の高分解能電子顕微鏡法と像シミュレーションによる構造同定、電子エネルギー損失分光法と分子軌道法による状態密度分布の同定を行った。ジルコニアの粒界にはYが偏析しているがその結合状態は純ZrO_2結晶と近いこと、さらにこれにSiO_2を添加するとYに加えてSiが数nm幅で偏析し、その粒界結合力を増加させることが分かった。また、粒界性格によって偏析量が変化することも明らかにした。
石灰化誘導能を有するＴＴＣＰ／ＤＣＰＡ配合４‐ＭＥＴＡ／ＭＭＡレジンの開発

この研究の目的は、齲蝕や歯科治療時のトラブルが原因で生じる露髄や歯根穿孔を修復するための封鎖材料を開発することにある。つまり、象牙質やセメント質に対して優れた接着性を有する4-META/MMAレジンに高い生体親和性と硬組織形成能を有するリン酸カルシウムであるTTCP/DCPAを配合したハイブリッドレジンを作製し、この試作レジンによる象牙質接着性などの材料的特性と石灰化誘導能を検討した。その結果、直接覆髄や穿孔部封鎖材料として、臨床使用が可能であることが示唆された。1ウシ抜去象牙質に対する接着試験(生理食塩水浸漬時間:24時間、1週間、1か月):CPC20wt%試料までは水中浸漬時間に関わらずコントロール試料に比べ接着強さの有意な低下が認められなかった。また、CPC30wt%60wt%試料間での接着強さは同等レベルであった。23点曲げ試験(生理食塩水浸漬時間:24時間、1週間、1か月):CPC10wt%50wt%およびコントロール試料において、曲げ強度の大きな低下は認められなかったがCPC50wt%試料ではコントローと比較して約20%強度の低下が認められた。また、同一試料内においては、水中浸漬期間延長による曲げ強度の低下は認められなかった。CPC含有試料では、曲げ試験後全ての試験体で破断した。3SEM観察(生理食塩水浸漬時間:24時間、1週間、1か月):CPC10wt%90wt%およびコントロール試料において、CPC60wt%試料まではコントロール試料の接合界面と比較して同様なレジンタグおよび樹脂含浸層の形成が認められた。CPC含有量が高い試料ほどセメント体部にボイド形成が認められた。これは、SEM試料作製過程でHCl処理によるCPCの溶解によるものと考えられる。CPC90wt%試料では1週間浸漬で表面に針状結晶化物が認められた。形状観察から析出したハイドロキシアパタイト様リン酸カルシウムであると考えられた。本研究で使用するリン酸カルシウムである四リン酸カルシウム(TTCP)、二リン酸カルシウム(DCPA)等モル混和物の硬組織誘導能を評価するために、まず炭酸カルシウム(CaCO3)のヒト歯髄由来象牙芽細胞(hDPC)に対する生存率、アルカリホスファターゼ(ALP)活性、BMP-2およびオステオカルシン(OCT)量を石灰化形成能と細胞分化能の指標として測定を行った。その結果、細胞生存率は、CaCO3濃度0μg/ml(コントロール)、1μg/mlおよび10μg/ml作用させて24、48、72時間培養したところ濃度依存的にhDPCの生存率が上昇する傾向が認められた。ALP活性の測定では、同様のCaCO3濃度をhDPC作用させて25日間培養したところ、培養10日からALP活性が濃度依存的に上昇し、培養15日でピークとなった。さらにBMP-2とOCT量はCaCO3濃度10μg/mlでコントロールに比べ高い値を示した。また、KossaおよびAlizarin red S染色で経時的に共に染色性が強まっており、石灰化ノジュールの数もコントロールに比べ有意に増加していた。TTCP/DCPA配合レジンを露髄面や穿孔部位に充填する際、簡便で確実な塗布方法が求められる。そこで実験試料をフロアブルレジンタイプとするため、その具備すべき特性を知ることを目的に充填用フロアブルレジンのダイナミック微小硬度計用いてダイナミック硬さと弾性率について検討を行った。その結果、フィラーの含有率のみならずマトリックスレジンの成分についてもフロアブルタイプレジンの機械的特性に影響を与えていることが分かった。この結果から、TTCP/DCPA配合レジンのフィラーであるTTCP/DCPAの含有率の検討によりフロアブルタイプでの応用が可能であることが分かった。TTCP/DCPA配合4-META/MMAレジン試料の作製:4-META/MMAレジンはスーパーボンドC&B(サンメディカル)を使用し、そのPMMA粉末(クリアー)にTTCP/DCPAを等モル比混和した自己硬化型リン酸カルシウムセメント(CPC)を重量比で10、20、30、50および60%添加したものを粉末試料とした。この粉末0.08gをスーパーボンド付属のモノマー液110μlにキャタリストを1滴した活性液に練和させて以下の実験試料を作製した。1.硬化時間(DSCによる最大発熱ピーク時間)の測定結果:(1)CPC添加量増加に伴い、硬化時間は遅くなる傾向が認められた。(2)10%20%添加試料ではコントロールと比較して1分程度の遅延であったが、50%以上の添加量になると硬化時間はコントロール(6分)に比較して2倍(12分)に延長した。2.接着強さの測定結果:(1)CPC20%添加までは接着強さはコントロールと比較して有意差は認められなかった。

(2)CPC30%60%の添加ではコントロールに比較して接着強さは低下する傾向が認められたが、30%60%添加試料間に有意差は無かった。(3)10%60%のCPC添加量では初期(生食水浸漬1日)接着強さと1ヶ月生食水浸漬後の接着強さに有意差はなかった。3.物性試験(3点曲げ強度):コントロールと比較して1020%添加試料では著しい強度低下は認められなかった。(2)添加が50%以上の試料になると脆性特性が顕著になる傾向が認められた。(3)全てのCPC添加試料では、初期浸漬群と1ヵ月浸漬群の曲げ強さに有意差は認められなかった。以上の結果から、4-META/MMAレジンにCPCを50%以下の添加量であれば、4-META/MMAレジンの材料学的物性を大きく低下させないことが明らかとなった。主たる実験材料であるリン酸カルシウムセメント(CPC)の安定的な作製・供給が難しく、その入手に手間取っている。また、接着実験において試料間でデーターにばらつきが大きくなる原因として、TTCPの粒径調整が上手くいっていないと思われる。しかし、昨年CPCを主原料とする象牙質知覚過敏用材が市販され、このCPC粉末が本研究に供試可能であるかを検証したため、再度物性実験を行う必要があったため、達成度に大きな後れを取ってしまった。文献に基づいて実験試料であるTTCP/DCPAからなる自己効果型リン酸カルシウムセメント(CPC)の作製を行ったが、TTCPの焼成やその粉砕に伴う粒径調整に時間を費やしてしまった。また、市販されているCPCの購入も日本国内では難しく、実験試料の恒常的な確保が確立しなかったことが研究遂行の面での遅れに繋がった。1)CPCとPMMA粉末の配合量を変えた含4-META/MMAレジン硬化体の経時的なハイドロキシアパタイトへの転化率を測定する。2)上記実験試料について、ヒト歯髄培養細胞に対する石灰化形成能を細胞増殖能、アルカリフォスファターゼ活性、オステオカルシン産生量の測定および石灰化ノジュールの形成評価を通して石灰化誘導能の確認を行う。3)材料学的検討と細胞実験のデーターからCPCとPMMA粉末の最適な配合比を決定し、これを根管充填用シーラーとして使用した場合の根尖漏洩性試験や根尖部の石灰化について実験を行う。平成23年度に得られた結果を基にして、以下の研究を遂行する。(1)TTCP/DCPAとPMMA粉末の配合を変えた各種4-META/MMAレジンの硬化後の経時的なハイドロキシアパタイトへの転換率を算出し、細胞や動物実験に使用する実験試料の再石灰化に及ぼす影響を検討する。(2)TTCP/DCPAとPMMA粉末の配合を変えた4-META/MMAレジンについてヒト歯髄培養細胞や骨芽細胞に対する石灰化物形成能を細胞増殖能、アルカリホスファターゼ(ALP)活性、オステオカルシン産生量の測定および石灰化ノジュールの形成評価を通して検索し、最適なTTCP/DCPA配合量を検討する。(3)細胞実験でのデーターに基づいて、実験動物(ラット)の露髄面、髄床底部穿孔部や根充用シーラーとして使用した場合の封鎖性や再石灰化そして硬組織形成の観察を病理組織学的に評価する。最終年度となる平成25年度は、以下の項目に対して研究費を使用する。
多剤耐性がん治療薬を目指した海洋天然物の探索

P-glycoprotein発現ヒト咽頭上皮がん細胞(KB-C2株)およびMRP発現ヒト咽頭上皮がん細胞(KB-CV60株)を用いたがん多剤耐性克服物質を探索するアッセイ法を構築し、海洋生物由来の天然物の中から耐性克服物資をスクリーニングした。その結果、沖縄産Xestospongin属海綿から単離構造決定した大環状二量体アルカロイドaraguspongine類に、KB-C2株に対する耐性克服作用が認められた。上記海綿の主成分であるaraguspongine Dについて作用を検討したところ、3μg/mlの濃度でKB-C2株のcolchicineに対する耐性を完全に克服した。また、araguspongine Dの立体異性体であるaraguspongine Eおよびaraguspongine Bも3μg/mlの濃度でKB-C2株のcolchicineに対する耐性を完全に克服することができたが、araguspongine EをNaBH_3CN処理して合成したジオール型開環体やジメチル硫酸で処理して合成したN-メチル体には耐性克服作用は見られなかった。さらに、沖縄県石垣島で採取したSinularia属軟サンゴのacetone抽出エキスからn-ブチルエステルを有するセンブラン型ジテルペンの誘導体を、同じくKB-C2株に対する耐性克服物質として単離し、各種誘導体を合成することにより、その構造活性相関について詳細に検討した。その結果、分子内のエステル部分の構造が活性に大きな影響を与えることを見出した。また、三重県英虞湾で採集したSpongia属海綿のacetone抽出エキスに耐性克服活性が見られたことから、この抽出エキスを活性試験の結果を指標に分画精製して主活性成分としてagosterol Aと命名した新規ステロールを単離し、その全化学構造を決定した。Agosterol Aは、13μg/mlの濃度で各種抗がん剤に対するKB-C2およびKB-CV60株の耐性を完全に克服した。また、agosterol A(310μg/ml)を作用させると、両耐性株におけるvincristineの細胞内蓄積量は親株(KB3-1)と同程度にまで回復し、細胞外へのvincristineの過剰排出も同様に阻害された。さらに、azidopineを用いたP-gpに対する競合結合実験や、KB-CV60株から調製したmembrane vesicleを用いた輸送実験により、agosterol Aは薬剤排出膜蛋白質であるP-gpおよびMRPに直接作用してその機能を阻害し、耐性克服作用を示すことが示唆された。P-glycoprotein発現ヒト咽頭上皮がん細胞(KB-C2株)およびMRP発現ヒト咽頭上皮がん細胞(KB-CV60株)を用いたがん多剤耐性克服物質を探索するアッセイ法を構築し、海洋生物由来の天然物の中から耐性克服物質をスクリーニングした。その結果、沖縄産Xestospongia属海綿から単離構造決定した1-oxaquinolizidine構造を有する大環状二量体アルカロイドaraguspongine類に、P-glycoprotein発現多剤耐性がん細胞(KB-C2)に対する耐性克服作用が認められた。

上記海綿の主成分であるaraguspongine Dについて作用を検討したところ、3μg/mlの濃度でKB-C2のコルヒチンに対する耐性を完全に克服することができ、10μg/mlの濃度でも全く細胞毒性を示さなかった。さらに、araguspongine Dの立体異性体であるaraguspongine Eおよびaraguspongine Bも3μg/mlの濃度でKB-C2のコルヒチンに対する耐性を完全に克服することができ、1-oxaquinolizidine環の9および9'位に水酸基を有するaraguspongine Cも同等の作用を示したが、2-oxoquinolizidine環を有する二量体アルカロイドpetrosinは他のaraguspongine類の1/2程度の活性しか示さなかった。さらに、araguspongine EをNaBH_3CN処理して合成したジオール型開環体やジメチル硫酸で処理して合成したN-メチル体には耐性克服作用は見られなかった。また、三重県英虞湾で採集したSpongia属海綿のアセトン抽出エキスに耐性克服活性が見られたことから、この抽出エキスを活性試験の結果を指標に分画精製して主活性成分としてagosterol Aと命名した新規ステロールを単離し、その全化学構造を決定した。Agosterol Aは、3、4、6位にアセトキシル基、11、22位に水酸基を有する高度に酸素化されたステロールで、3μg/mlの濃度でKB-C2のコルヒチンに対する耐性を完全に克服することができ、10μg/mlの濃度でも全く細胞毒性を示さなかった。さらに、MRPを過剰発現するKB-CV60株のビンクリスチンに対する耐性も1μg/mlの濃度で完全に克服することができた。
地域循環型農村社会におけるNPOの組織・事業の創造に関する総合的研究-新しい共生的ネットワーク論からのアプローチ

本研究は、経済社会のグローバル化のもとで、日本を中心とした地域循環型農村社会における農協・漁協などの協同組合のみでなく、農村女性組織、高齢者組織、さらにナショナルトラスト運動、グリーンストック運動など非営利・協同組織であるNPOの組織・事業の創造と新しい共生的ネットワーク化によって、従来の政策・制度依存型の農村社会から、地域循環型農村社会へのパラダイム転換の仕組みづくりをねらいとして取り組んだ。具体的には、地域循環型農村社会の担い手として「協同組合を含めた多様なNPO」を対象とし、9つの分野の実態解明と新しい共生的ネットワーク化の諸条件の解明に取り組んだ。研究の学術的な特色・独創的な点は、グローバルな市場経済に拮抗しあるいはそのマイナス面を補完し、併せて政策的規制緩和のマイナス面を補完するために、協同組合などNPOを包含した社会的経済セクターの意義が世界的な研究潮流として注目されているが、協同組合を包含したNPO論を縦軸とし、農業経済学、林業経済学、漁業経済学を横軸とした研究チームで取り組んだことである。具体的には、白石を代表とし、岡部守(農村の高齢者福祉に関する組織)、増井好男(農漁村におけるナショナルトラスト運動の組織)、清水昂一(農山村におけるグリーンストック運動の組織)、宮林茂幸(山村・都市交流型組織)、日暮賢司(農村地域のエコ・マネーを活用した組織)、大島一二(中国における農業・農村支援型のNPO組織)、五條満義(男女共同参画型食農教育運動の組織)、田中裕人(周年型農業・農村観光の組織)が、各分野の組織・事業の創造を分担して取り組んだ。国際的研究面の連携では、金貞注(韓国)、章政(中国)、H.ミュンクナー(EU地域)、I.マクファーソン(カナダ・アメリカ地域)が、各地域の地域循環型農村社会における協同組合等の多様なNPOの組織・事業の創造と共生的ネットワーク化を分担して取り組んだ。本研究は、経済社会のグローバル化のもとで、日本を中心とした地域循環型農村社会における農協・漁協・森林組合・生協などの協同組合のみでなく、農村女性組織、高齢者組織、さらにナショナルトラスト運動、グリーンストック運動など非営利・共同組織であるNPOの組織・事業の創造と新しい共生的ネットワーク化によって、従来の政策・制度依存型の農村社会から、地域循環型農村社会へのパラダイム転換の仕組みづくりをねらいとするものである。この目的のもとで、平成14年度は以下のような実態調査研究を実施した。白石は、金教授と共に韓国韓国農協中央会調査部・建国大学校・抱川農協・忠州農協・忠北園芸農協、北海道JAきたそらち、JA沼田町、長野県JA北信州みゆき、群馬県JA沢田において、岡部は、広島県生協ひろしま、栃木県JA塩釜、長野県JA佐久、兵庫県JA五色町、長野県JAながのにおいて、増井は、北海道置戸町役場・置戸町漁協・置戸町森林組合・置戸町清流とヤマベをよぶ会・常呂町役場・常呂町漁協、青森県脇野沢村役場・脇野沢村漁協・脇野沢村水産加工センター・佐井村役場において、日暮は、滋賀県JA草津、青森県JA平賀において、大島は、福岡県国際東アジア研究センター、北海道JAさっぽろ、大阪府日中友好協会・緑の地球ネットワーク、和歌山県幸昭拓友緑化の会、中国日本国大使館・ジェトロ香港事務所・日系NPO組織において、五條は、愛知県一宮市農業改良普及センターにおいて、田中は秋田県能代商工会議所、栃木県宇都宮大学、沖縄県サンゴ礁保護研究センター・川平ファーム、熊本県NPO法人緑のまちづくり交流協会・NPO法人グリーンストックにおいてである。また海外研究者は2名が来日して共同で実態調査研究を行った。

金貞注は、長野県JA北信州みゆき、群馬県JA沢田において、章政は、農林水産省・農業会議所・大田市場・全中、埼玉県JAくまがや・熊谷市中条地区営農組合においてである。本研究は、経済社会のグローバル化のもとで、日本を中心とした地域循環型農村社会における農協・漁協・森林組合・生協などの協同組合のみでなく、農村女性組織、高齢者組織、さらにナショナルトラスト運動、グリーンストック運動など非営利・共同組織であるNPOの組織・事業の創造と新しい共生的ネットワーク化によって、従来の政策・制度依存型の農村社会から、地域循環型農村社会へのパラダイム転換の仕組みづくりをねらいとするものである。この目的のもとで、平成15年度は以下のような実態調査研究を実施した。白石は、東びわこ農協、滋賀県環境生協において調査を実施した。岡部は、三重県勢多町において調査を実施した。増井は、青森県水産総合研究センター増養殖研究所・尻屋漁業協同組合・尻屋漁業研究会において海中造林の実態について調査を実施した。日暮は、北海道栗山町のくりやまコミュニティネットワークにおいて地域通貨の実態について調査を実施した。大島は、福岡県国際東アジア研究センター・(特)はかた夢松原の会、大阪府日中友好協会・緑の地球ネットワーク、和歌山県幸昭拓友緑化の会、岩手県砂漠植林ボランテイア、福島県日中建設技術友好協会、香川県綾南町中国河北省緑化協力事業、広島県日中親善協会において中国における日本のNPOの活動について調査を実施した。さらに台湾NPO法人・中興大学において台湾のNPOの実態について調査を実施した。田中は、熊本県NPO法人緑のまちづくり交流協会において緑のまちづくりについて調査を実施した。本研究は、経済社会のグローバル化のもとで、日本を中心とした地域循環型農村社会における農協・漁協・森林組合・生協などの協同組合のみでなく、農村女性組織、さらにナショナルトラスト運動、グリーンストック運動など非営利・共同組織であるNPOの組織・事業の創造と新しい共生的ネットワーク化によって、従来の政策・制度依存型の農村社会から、地域循環型農村社会へのパラダイム転換の仕組みづくりをねらいとするものである。この目的のもとで、平成16年度は以下のような実態調査研究を実施した。白石は、全ギリシャ農協連合協議会・ギリシャ農協中央会・ギリシャ協同組合研究所・地中海農業研究所・欧州協同組合研究会議、東京都あきる野市、北海道帯広市、広島県において、岡部は、新潟県六日町、福島県いわき市、山形県藤島町において、日暮は、静岡県静岡市において、大島は、中国の広州総領事館・中山大学・華南農業大学・香港中文大学、大阪府緑の地球ネットワーク、広島県日中親善協会、福岡県国際東アジア研究センターにおいて、田中は、熊本県NPO法人緑のまちづくり交流協会・熊本市役所において、である。また海外研究者は2名が来日し、共同実態調査研究を行った。金貞注は、愛知県JAひまわり・JA知多・農協中央会において、イアン・マグファーソンは、東京都生活クラブ協会・東京都農協中央会・農協協会・アジア農協振興機関・日本生活協同組合連合会・生協総合研究所・全国農協中央会・農林中金総合研究所、広島県生協ひろしま・広島大学、兵庫県コープこうべ生協・JA兵庫六甲においてである。これらの実態調査から、NPOの組織・事業において各国の最新の研究実態と実践現場を把握することで、今後の研究と教育、現場との結びつきを得るための示唆を得た。