hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
間葉上皮転換（MET）誘導による頭頸部癌転移抑制と癌幹細胞形質制御の研究

本研究より次の成果を得た。1)舌扁平上皮癌において,Cox2の発現亢進およびE-cad発現低下と臨床的悪性度の進行との相関が認められ,E-cadherin低発現癌細胞に対する選択的Cox2阻害によりMET誘導を介した抗腫瘍効果が得られた。2)転写因子Oct3/4とNanogが頭頸部癌細胞における幹細胞マーカーであり,その発現亢進が遊走能・浸潤能の亢進を介して後発頸部リンパ節転移に寄与していると考えられた。3) Flt-4発現頭頸部癌細胞にVEGF-Cの癌細胞自身に対するautocrine機構が存在し,増殖能・遊走能の制御を介して頸部リンパ節転移を含めた癌の進行に寄与していると考えられた。1) E-cadherin低発現頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)細胞に対し,選択的Cox2阻害によるEMTの抑制(E-cad発現増強と遊走運動能抑制)を介した抗腫瘍効果が示唆された。舌扁平上皮癌凍結組織標本の検討において,Cox2とE-cad転写抑制因子の発現亢進,およびE-cad発現低下はいずれも悪性度と進行に関与しており,特にE-cad発現低下は多変量解析における頸部LN転移の独立規定因子であった。2) Flt-4発現HNSCC細胞に対するFlt-4刺激および阻害において,細胞選択的にCNTN-1,VEGF-C自身の発現変化が認められ,VEGF-Cにparacrine作用のみならず癌細胞自身に対するautocrine作用が存在すること,さらに細胞増殖能・遊走能いずれも亢進/抑制されることが示唆された。頭頸部扁平上皮癌組織標本を用いた臨床病理学的因子に関する多変量解析の結果,癌細胞におけるFlt-4陽性は頸部LN転移の独立規定因子であった。4)唾液腺導管癌の臨床統計学的検討において無病3年生存率は29.2%、疾患特異的3年生存率は72.7%で,多変量解析における無病生存率の独立予後因子は年齢とT分類であった。HER2,アンドロゲン受容体発現陽性率は各々50%,100%と高率で,予後との相関は認められなかった。1) Flt-4発現頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)細胞に対するFlt-4刺激および阻害において,細胞選択的にCNTN-1,VEGF-C自身の発現変化が認められることに加えて細胞増殖能・遊走能いずれも亢進/抑制が認められ,VEGF-Cにparacrine作用のみならず癌細胞自身に対するautocrine作用も存在することが示唆された。HNSCC組織標本55例を用いて癌細胞自身のFlt-4, VEGF-C, CNTN-1の発現を免疫組織化学的に評価し臨床病理学的因子に関する相関を検討した結果,単変量解析で各々の発現はいずれも頸部LN転移との間に有意に相関し,多変量解析の結果Flt-4陽性が頸部LN転移の独立規定因子であった。2)舌扁平上皮癌細胞株におけるside population (SP)分画は0.910.2%に認められ,癌幹細胞関連遺伝子発現を検討した結果,SP細胞では転写因子Oct3/4,Nanogの発現がnon SP細胞に比べ顕著に高かった。また細胞遊走能および浸潤能はSP細胞のほうが高いのに対し,増殖能には差を認めなかった。初回治療として舌部分切除を行ったstage I/II舌癌症例組織標本を用いて後発頸部リンパ節転移(DNM)との相関を検討した結果,単変量解析ではOct3/4, Nanogの発現はともに有意に相関し,多変量解析の結果DNMの独立相関因子はOct3/4発現と静脈侵襲であった。3)頭頸部腺様嚢胞癌30症例の臨床統計学的検討において, 5年/10年疾患特異的生存率(CSS)は73.9%/62.4%,5年/10年非担癌生存率(DFS)は64.3%/59.7%で,多変量解析の結果独立予後因子はDSSでは神経周囲浸潤,DFSでは切除断端であった。長期的には高い遠隔転移率が認められることから,外科的切除単独による成績向上には限界があると考えられた。2)舌SCC細胞において,SP細胞ではnon-SP細胞に比べ転写因子Oct3/4,Nanogの発現,および遊走能・浸潤能が高かった。Stage I/II舌SCC症例において,後発頸部リンパ節(LN)転移の独立相関因子はOct3/4発現と静脈侵襲であった。3) Flt-4発現HNSCC細胞において,Flt-4刺激/阻害によるCNTN-1とVEGF-C自身の発現亢進/抑制を介した増殖能・遊走能の亢進/抑制を認め,即ちVEGF-Cの癌細胞自身に対するautocrine機構の存在が示唆された。舌SCC症例において,癌細胞のFlt-4発現は頸部LN転移の独立規定因子であった。4)頭頸部腺様嚢胞癌の臨床検討で5年/10年疾患特異的生存率(CSS)は73.9%/62.4%,5年/10年非担癌生存率(DFS)は64.3%/59.7%で,独立予後因子はCSSでは神経周囲浸潤,DFSでは切除断端であった。

5)唾液腺導管癌の自施設臨床検討において,3年DFS/CSSは29.2%/72.7%,DFSの独立予後因子は年齢とT分類で,HER2およびAR発現陽性率は50%および100%でいずれも予後との相関は認めなかった。多施設共同の141例の検討において,3年粗生存率(OS)/DFSは70.5%/38.2%,独立予後因子はOSでは年齢とN因子,DFSでは亜部位とN2以上で,最頻再発様式は遠隔転移(39%)であった。6)咽頭SCC細胞において,選択的Cox2およびPGE2受容体阻害により,EMT抑制を介した遊走能抑制が認められた。本研究より次の成果を得た。1)舌扁平上皮癌において,Cox2の発現亢進およびE-cad発現低下と臨床的悪性度の進行との相関が認められ,E-cadherin低発現癌細胞に対する選択的Cox2阻害によりMET誘導を介した抗腫瘍効果が得られた。2)転写因子Oct3/4とNanogが頭頸部癌細胞における幹細胞マーカーであり,その発現亢進が遊走能・浸潤能の亢進を介して後発頸部リンパ節転移に寄与していると考えられた。3) Flt-4発現頭頸部癌細胞にVEGF-Cの癌細胞自身に対するautocrine機構が存在し,増殖能・遊走能の制御を介して頸部リンパ節転移を含めた癌の進行に寄与していると考えられた。研究代表者自身に異動がありかつ連携研究者の異動も伴ったために,実験研究の環境整備に相応の時間を費やしたこと,およびスケジュール調整に大幅な制約が生じたこと,HNSCC細胞への遺伝子導入において効率が不十分かつ導入細胞自体のselectionに難渋するとともに,実験の一部で至適条件設定に試行錯誤を重ねていること,組織標本を用いた検討において臨床統計に必要な経過観察期間の延長を要したこと,病理組織学的項目の再評価にも予測以上の期間を要したこと,などが要因となり,当初の計画に比べて遅延が生じている。医歯薬学なお平成27年4月研究代表者自身に異動があり所属が杏林大学医学部から再度慶應義塾大学医学部に移動したため,実験研究の環境再整備とスケジュール再調整を効率よく進める必要がある。現実的にはある程度の遅延は不可避と考えられるが,その状況に合わせて研究計画内容を適宜修正しながら進めてゆく。組織標本を用いた検討においては,経過観察期間を短縮して暫定的な検討を行い,また評価項目を必要不可欠以外のものに関しては一部除外することも考慮する。連携研究者の異動に伴い実験スケジューリングに制約が生じたこと,HNSCC細胞への遺伝子導入において効率が不十分且つ導入細胞自体のselectionに難渋していること,臨床組織標本の検討において臨床統計に必要な経過観察期間の延長を要したこと,病理組織学的事項の再評価にも予測以上の期間を要したこと,などが要因で当初の計画に遅延が生じている。研究代表者の異動に伴い実験研究の推進に遅延が生じたため,予定していた参加学会への出張経費について他の研究資金を充当することができたため,および引き続き効率的な物品調達を行うことができたため。なお平成26年4月より,研究代表者自身に異動があり,所属が慶應義塾大学医学部から杏林大学医学部に移動したため,実験研究環境を新たに構築する必要があり,その状況に合わせて研究計画内容についても修正を要する可能性がある。次年度の研究費と合わせて,必要な消耗品購入・謝金・学会参加出張費・研究成果発表費(論文出版費)などに充当する予定である。予定していた参加学会の出張経費について他の研究資金により充当することができたため,および効率的な物品調達を行うことができたため。次年度の研究費と合わせて,必要な消耗品購入・謝金などに充当する予定である。
脳腫瘍放射線療法に伴う被曝早期における認知機能障害の解析

認知機能の低下は,脳腫瘍や小児白血病における放射線療法に限らず肺がんにおける化学療法においても生じる副作用の一つである。炭素線および陽子線を脳局所に照射した脳腫瘍治療モデル動物の場合,晩発期では実際の治療線量の1/21/3線量である15-30Gyの照射により,記憶の獲得過程の障害が生じることを明らかにし,またその障害の要因として,海馬神経細胞数の選択的な減少が関連していることを明らかにした。19年度において,炭素線および陽子線を脳局所に照射した脳腫瘍治療モデル動物の場合,晩発期では実際の治療線量の1/21/3線量である15-30Gyの照射により,記憶の獲得過程の障害が生じることを明らかにし,またその障害の要因として,海馬神経細胞数の選択的な減少が関連していることを示唆した。一方,照射早期においては,短期(作業)記憶の障害が1-10Gyの比較的少ない線量で生じることを明らかにした。さらにその障害と関連する病理組織学的変化を見いだすことはできなかったが,新たに確立した脳の毛細血管の画像化技術を利用し定量を試みたところ,照射1週間後の比較的早期に海馬領域の毛細血管数の低下が生じることを初めて成功した。これらの結果によって、脳腫瘍および小児白血病の放射線治療によって,記憶の形成に重要な役割を担う海馬の選択的な細胞死が毛細血管の減少により誘導され,それに伴い早期および晩発期に認知機能の低下を生じさせることが推察された。臨床的には,脳腫瘍近傍の正常組織には,再発を予防する目的で治療線量の1/21/3線量が照射されることになるが,19年度の成果から脳腫瘍治療時には海馬を除外した照射方法の確立が重要であることを示唆している。またそのことが脳腫瘍治療後のQOLの向上に貢献すると考えられる。さらに新たに確立した脳の毛細血管の画像化技術によって,これまで晩発期における病理変化しか報告されなかった放射線による中枢神経障害を探る新たな方法が確立でき,かつ粒子線(陽子線および重粒子線)の治療線量を推定する際のキーワードとなるRBE(生物学的効果比)の算出する指標的も利用できる可能性が推察された。19年度において,炭素線および陽子線を脳局所に照射した脳腫瘍治療モデル動物の場合,晩発期では実際の治療線量の1/2-1/3線量である15-30Gyの照射により,記憶の獲得過程の障害が生じることを明らかにし,またその障害の要因として,海馬神経細胞数の選択的な減少が関連していることを示唆した。さらに新たに確立した脳の毛細血管の画像化技術を利用し定量を試みたところ,照射1週間後の比較的早期に海馬領域の毛細血管数の低下が生じることを初めて成功した。これらの結果によって,脳腫瘍および小児白血病の放射線治療によって,記憶の形成に重要な役割を担う海馬の選択的な細胞死が毛細血管の減少により誘導され,それに伴い早期および晩発期に認知機能の低下を生じさせることが推察された。臨床的には,脳腫瘍近傍の正常組織には,再発を予防する目的で治療線量の1/21/3線量が照射されることになるが,脳腫瘍治療時には海馬を除外した照射方法の確立が重要であることを示唆している。さらに新たに確立した脳の毛細血管の画像化技術によって,粒子線(陽子線および重粒子線)の治療線量を推定する際のキーワードとなるRBE(生物学的効果比)の算出する指標にも利用できる可能性が推察された。20年度において,その定量性を実証するため,放射線照射後の腫瘍および他の正常組織障害の診断法との対照実験を行なった。その結果,患者のQOLの向上には,毛細血管密度を指標とした脳機能障害を誘発しない線量推定と, PETによる物理的診断法による腫瘍治療線量の推定が重要であることが推察された。
有害物質除去用含リンポリマー

5員環2-フェニル-1,2-オキサホスホラン(1)はカチオン開始剤によって開環重合し、ポリ-(フェニルトリメチレンホスフィンオキシド)(2)を与えることを明らかにし、さらに、それを市販ポリスチレン樹脂にグラフト重合させて、安定な含リン樹脂を調製した。この含リン樹脂の構造的な特長はリン元素が分子鎖の中で等間隔に存在しており、従って、キレーション効果によって重金属イオンを吸着することが期待される。硫酸銅(【II】),塩化水銀(【II】),塩化パラジウム(【II】)および酢酸ウラニウムの水溶液について、含リン樹脂による吸脱着テストを行った。1×【10^(-4)】mol/Lの濃度の金属イオン水溶液1mLに含リン樹脂50mg(2.5×【10^(-4)】molのリン・ユニット)を加え、時々、振とうし72時間放置した。水溶液中の金属イオン濃度を吸光光度法で定量分析して吸着を調べた。3N H【NO_3】水溶液、pH1(HCl-KCl buffer),pH4(KH Phthalate-NaOH buffer),pH6(KH Phthalate-NaOH buffer),pH8(【H_3】B【O_3】-KCl-NaOH-【Na_2】【CO_3】buffer)での吸着金属イオン%を測定した。この結果より銅(【II】)イオンについてはpH8で84%吸着され、3N H【NO_3】で処理することにより92%まで脱着される。水銀(【II】)イオンについてはpH18で95100%吸着され、3N H【NO_3】で処理すると約40%まで脱着される。パラジウム(【II】)イオンについては3N H【NO_3】およびpH1で定量的に吸着され、0.1N【NH_4】OHにより約40%脱着される。ウラン(【VI】)イオンについては3N H【NO_3】およびpH16で9298%吸着され、10%【Na_2】【CO_3】水溶液により簡単に定量的に脱着する。以上の吸脱着実験は4回繰返してもその吸着機能の劣化は認められなかった。本研究で合成した含リンポリマーは有害重金属イオンの銅(【II】)や水銀(【II】)の吸着除去・濃縮、また、有用重金属イオンの吸着回収・濃縮に対しい望ましい機能を有することが明らかになった。
レドックス制御とシグナル伝達機構

文部省科学研究費・国際学術研究調査(平成34年・ウイルス疾患でのADF/チオール依存性細胞活性化機構に関する学術調査研究;淀井淳司代表者)は、レドックス研究の交流の基礎となった。本国際学術研究調査は、その研究調査を更に発展させてHo Zoon Chae(KOREA)、Michael Karin(USA)らを研究分担者として加え、レドックス制御とシグナル伝達機構に関する研究交流を行った。生体におけるレドックス制御とは、酸化還元に基づく蛋白質システイン残基上のチオール基の可逆的構造変化により、種々の細胞機能を制御することと説明できる。淀井らが報告したHTLV-I感染細胞の産生するATL-derived factor(ADF)は、システイン(Cys)のSH基を介して強い還元活性を示すthioredoxin(TRX)のヒトホモローグである。このADF/TRXは、グルタチオン系と共に細胞内のレドックス制御に関わる抗酸化ストレス因子である。今年度の交流の成果として1)TRX遺伝子のTargetingを行った結果、TRX遺伝子をヘテロに欠損している個体は正常であったが、ホモに欠損している個体は着床後すぐに死亡した。TRX遺伝子はマウス胎仔の早期分化および形態形成に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。2)TRX遺伝子のプロモーター部位の解析を行い、新たに、酸化ストレスに応答する遺伝子配列を同定した。3)遺伝子転写のレドックス制御については、淀井、山本らによるNFκBおよびAP1などの転写因子活性化に、TRXやRef-1/APEX蛋白などのレドックス制御蛋白が、重要な制御的働きをすることが明らかになっている。さらにRef-1がTRXに結合し、AP-1転写活性への役割を新たに明らかとした。ステロイドホルモンなどの核内レセプター群の細胞質・核内移行と遺伝子活性化調節にも、TRXの関与するレドックス制御機構の役割が重要と考えられた(田中らとの共同研究)。転写制御因子PEBP-2の活性化にもレドックス制御が関与することが明らかになった(重定らとの共同研究、投稿準備中)。4)抗酸化機能をもつペルオキシダーゼ活性をもつ新しいタンパク質ファミリーが近年見い出されてきた。Chae,PaakによりTRX依存性peroxidase(peroxiredoxin)や、一部のGSH peroxidaseがTRXによって活性化されることも報告され、抗酸化ストレス機構の解明が進んでいる。今後さらにレドックス関連分子の分子機構および情報伝達における役割を解析する必要がある。レドックス制御は、分子の酸化(酸化ストレス)を契機とするストレス応答反応とも捉えることができるため、レドックス制御と酸化ストレスは表裏一体の関係にある。酸化ストレスに対する防御分子が生体内レドックスセンサー機構としての役割も積極的に担うことが現在明らかにされつつある。酸化ストレスは細胞のレドックスセンサー機構によって認知され、その一部は生体にとって有用なシグナル応答へと変換される。既知のリン酸化によるシグナル伝達経路とクロストークを行っていることなどが相次いで報告された。わが国では淀井などが、リンパ球への酸化ストレスが細胞膜のチロシンキナーゼの活性化につながり、それぞれ正・負のシグナル伝達に関わることを明らかにしたが、海外ではMAP kinaseやtyrosine kinaseのレドックス制御機構は、Karin,らによって進展している。また、山本によりp53の酸化ストレスによる活性化機構の解析がなされた。今後レドックスセンサー機構をさらに解析することが必要である。レドックス制御異常は、エイズ・ATL・肝炎ウイルス感染症など、種々のウイルス感染での細胞死・異常増殖に関係している。豊國らは鉄による酸化ストレス下のレドックス制御不全状態で過酸化脂質蛋白複合体が生体内で生じていることを明らかにし、鉄による発癌に関する研究を展開した。レドックス制御異常による不可逆的酸化ストレスは病態形成に関与することが考えられ、今後様々な病態での解析が必要と思われる。

さらにRef-1がTRXに結合し、AP-1転写活性への役割を新たに明らかとした。ステロイドホルモンなどの核内レセプター群の細胞質・核内移行と遺伝子活性化調節にも、TRXの関与するレドックス制御機構の役割が重要と考えられた(田中らとの共同研究)。転写制御因子PEBP-2の活性化にもレドックス制御が関与することが明らかになった(重定らとの共同研究、投稿準備中)。4)抗酸化機能をもつペルオキシダーゼ活性をもつ新しいタンパク質ファミリーが近年見い出されてきた。Chae,PaakによりTRX依存性peroxidase(peroxiredoxin)や、一部のGSH peroxidaseがTRXによって活性化されることも報告され、抗酸化ストレス機構の解明が進んでいる。今後さらにレドックス関連分子の分子機構および情報伝達における役割を解析する必要がある。レドックス制御は、分子の酸化(酸化ストレス)を契機とするストレス応答反応とも捉えることができるため、レドックス制御と酸化ストレスは表裏一体の関係にある。酸化ストレスに対する防御分子が生体内レドックスセンサー機構としての役割も積極的に担うことが現在明らかにされつつある。酸化ストレスは細胞のレドックスセンサー機構によって認知され、その一部は生体にとって有用なシグナル応答へと変換される。既知のリン酸化によるシグナル伝達経路とクロストークを行っていることなどが相次いで報告された。わが国では淀井などが、リンパ球への酸化ストレスが細胞膜のチロシンキナーゼの活性化につながり、それぞれ正・負のシグナル伝達に関わることを明らかにしたが、海外ではMAP kinaseやtyrosine kinaseのレドックス制御機構は、Karin,らによって進展している。また、山本によりp53の酸化ストレスによる活性化機構の解析がなされた。今後レドックスセンサー機構をさらに解析することが必要である。レドックス制御異常は、エイズ・ATL・肝炎ウイルス感染症など、種々のウイルス感染での細胞死・異常増殖に関係している。豊國らは鉄による酸化ストレス下のレドックス制御不全状態で過酸化脂質蛋白複合体が生体内で生じていることを明らかにし、鉄による発癌に関する研究を展開した。レドックス制御異常による不可逆的酸化ストレスは病態形成に関与することが考えられ、今後様々な病態での解析が必要と思われる。7年度は、1)ADF結合蛋白質の単離、およびその機能解析、2)ADF遺伝子発現調節部位結合因子の同定、単離、3)ADF欠損マウスを作製し、これを用いて、個体レベル、もしくは種々の組織から細胞単離し、正常及びADF-transgenic mouceとの比較において、ADFの抗酸化機能について解析を行うこと、4)核内において、及び、NF-kB,thioredoxin/ADFなどの蛋白性因子の還元状態保持に寄与する物質の単離、同定する事などを目指し、その為に必要な研究交流・情報交換を行うことが目的であった。
光によるマスキング現象の解明と新規睡眠薬の開発

光によるマスキング機構の解明と新規睡眠薬の開発に関する研究を行った。睡眠リズム障害が報告されているclock/clockのミュータント動物を用いて実験を行った。clock/clockマウスを低照度下の条件で飼育すると、明暗周期に応じて活動期が夜間始まるが、その開始位相が遅れることがわかった。これは、外界の明暗周期の光のマスキングによる行動抑制が強く働くためか、また、clockのミューテーションに伴う周期の延長作用により、暗期になってもすぐに行動が開始しないものと考えられた。メラトニンは睡眠薬として使われているが、この薬物には体内時計の前進作用があることもわかっている。そこで、メラトニンを消灯時に投与し、光によるマスキングに影響を及ぼし、かつ体内時計を前進させることにより、行動の開始位相を前進させることができるかどうか調べた。その結果、メラトニンの0.5mg/kgの3日間投与は、約半数のマウスに改善効果をもたらすことが判明した。なぜ全部のマウスに効果が見られなかったのか、その理由は不明であるが、メラトニンの光に対するマスキング効果の軽減ならびに位相前進作用が見出せ、この薬物の入眠薬としての新しいプロファイルを示すことができた。セロトニン系化合物も体内時計に作用することが知られているので、5-HT1A/7受容体のアゴニストである8-OH DPATの作用を調べたところ、メラトニンと類似した作用を示した。したがって、5-HT1A/7受容体関連薬物の作用を精力的に調べる必要がある。さらに本モデル動物を使用することにより、光によるマスキングをより抑制する可能性のある薬物のスクリーニングが可能となった。光によるマスキング現象には2種類ある。すなわち、夜行性動物の飼育室の電燈を昼間に消すことによる行動量の一過性の増加と、夜間に点灯することによる行動量の一過性の抑制である。このようにマスキングとは外界の電燈の点灯や消灯により、体内時計のリセットとは無関係に時計出力の行動に影響を及ぼすことをいう。このマスキングはヒトが就寝するときに、部屋の明かりが点灯していると入眠しにくいことと関連性があり、不眠研究のよいモデルとなりうる。本年度は、(1)外界の飼育環境の照度とマスキングの関係を調べたところ、明暗飼育時の照度差が大きいほどマスキングが出やすいことが判明した。(2)視交叉上核を破壊すると、このマスキング現象も障害されることから外界の光は視交叉上核を通して、光による時計のリセットとのみならず、マスキング現象をもたらしていることが明らかとなった。(3)新規唾眠薬の候補を探す目的で、ヒスタミン受容体の拮抗薬やアデノシン受容体の拮抗薬の作用について調べた。まず臨床上、眠気や鎮静をもたらすことがよく知られている抗ヒスタミン薬の影響を調べた。その結果、H1受容体拮抗薬は昼間の消灯による行動増大を促進させず、また夜間の光照射による行動抑制にも影響を及ぼさなかった。したがって、光によるマスキング現象にヒスタミン神経系の関与は弱いものと考えられた。また、アデノシン拮抗薬のカフェインが覚醒作用をもたらすことはよく知られた事実であるが、カフェインの投与も、マスキング現象にほとんど影響を及ぼさなかった。したがって本年度は、マスキングにかかわる薬物の発見に至らなかった。次年度は光の細胞内情報伝達にかかわる物質に作用する薬物のマスキングに対する作用について調べる予定である。
数理モデルを用いた未分化細胞の分化・脱分化機構の解析

本研究は、数理モデルを用いた解析を用いて、幹細胞の分化機構の理解することを目的とした。細胞分化を引き起こす制御ネットワークの探索を行うことによって、出現し得る分化過程のダイナミクスを網羅的に解析し、その過程における不可逆性や安定性の解析を行った。結果として、分化能を持つ幹細胞は振動する発現ダイナミクスを持つことを示し、それを生み出す制御ネットワークの性質の理解に成功した。それらの知見を基に、マウス初期胚における分化ダイナミクスを説明する数理モデルの構築を行った。本研究は、内部に発現制御ネットワークを持つ細胞が相互作用している多細胞系の数理モデルを用いた解析によって、未分化細胞の分化/脱分化機構の理解することを目的としている。可能な制御ネットワークの全探索を行うことによって、出現し得る分化過程のダイナミクスを網羅的に解析し、その過程における不可逆性や安定性の出現機構の理解を目指す。24年度は、細胞状態の多様性を適応度とした遺伝的アルゴリズムを用いて、細胞間相互作用によって細胞状態の多様化をもたらすことが可能な遺伝子制御ネットワークの探索を行った。そこから、細胞の状態が遷移した後に、一部の細胞が元の状態にと留まるという幹細胞的な振る舞いをするケースを抽出したところ、そのすべてにおいて、分化能を持つ細胞は振動する遺伝子発現ダイナミクスを持つことが示された。また、そのように振動する発現ダイナミクスを持つ細胞からの分化過程は、一部の細胞を取り除くといった外部からの摂動に対して安定であることを示した。加えて、そうした幹細胞的なダイナミクスをもたらす発現制御ネットワークが持つ性質を調べたところ、特定のフィードバックループが有意に多く存在することが確認された。こうした結果に基づき、マウス初期胚におけるエピブラストと栄養外胚葉の分化ダイナミクスを説明できる数理モデルの構築を行った。上記の結果については論文準備中であるが、今年度の特筆すべき成果として、Science誌にperspective論文を発表し、幹細胞分化過程における時間的に振動する発現ダイナミクスの重要性について論じたことが挙げられる。23年度は、遺伝子数が5である可能なすべての制御ネットワーク(総計でおよそ1.5億通り)について、細胞数が32となるまでの発生過程をすべてシミュレートし、細胞間の相互作用によって細胞状態が多様化するケースを抽出した。また、そのように振動する発現ダイナミクスを持つ細胞からの分化過程は、一部の細胞を取り除くといった外部からの摂動に対して安定であることが示された。これらの性質は、幹細胞的なダイナミクスを持つ細胞に共通の性質であると期待することができ、今後の研究として、現実の幹細胞システムの実験データにおいて同様の性質を見いだすことが出来るかを解析する。小さい遺伝子数からなる発現制御ネットワークの全探索を用いて、幹細胞的なダイナミクスをもたらす制御ネットワークの同定に成功した。この結果は、今後の解析の基盤となると期待できる。24年度は、23年度に見いだされた幹細胞が共通に持つと期待できる性質について、そのさらなる解析を行う。特に、現実の発現制御ネットワークなどに、それらの性質を見いだすことが出来るかを検討する。計算機関係の消耗品に使用するとともに、成果発表の旅費と論文投稿料に使用する予定とする。
若年成人女性の身体的・精神的ストレスと骨密度・骨関連生理機能の縦断的比較検討

看護学生の臨床実習におけるストレスと生体反応の関連について検討した。対象はA大学看護学科3年生の女性28名。方法は、ストレスの程度を評価するために状態-特性不安を日本版State Trait Anxiety Inventory (STAI)を用いた。生体反応を測定する項目には、血中エストロゲン、唾液中コルチゾール、唾液中IgAを用いた。これらの測定を臨床実習前と臨床実習中の計2回実施した。測定の結果,臨床実習前と実習中では、STAIの状態不安が高くなり、看護学生が臨床実習でストレスを感じていることがわかった。また、唾液中コルチゾールおよび唾液中IgAに変化がなかったが、血中エストロゲンは実習中に低値を示し、ストレスによってエストロゲンの分泌が抑制されると推察された。骨密度に影響を及ぼす食事や生理機能等を月経周期の観点からアプローチを行う。また、身体的負荷および精神的負担が女性の骨関連生理機能にどのような影響を及ぼしているかを明らかにする。看護学の実習前、実習後と同一の被験者に対して観察研究を行う。F大学看護学科5名、H大学看護学科に在学する学生33名の同意を得た。病院実習の作業負荷を曝露として考えるため、今年度測定時には病院実習に行く前の学生とした。DXA装置:F大学看護学科の被検者に対しては、ALOKA社製:DCX-600を用いて前腕骨の測定を行った。H大学看護学科の被験者には、Hologic社:QDR-4500を用いて腰椎・大腿骨頸部の測定を行った。それぞれの平均値は、腰椎:1.013g/cm^2、大腿骨頸部:0.791 g/cm^2、大腿骨:0.884 g/cm^2であった。採血により、骨代謝マーカー:NTX(血清)、女性ホルモン(血清):総エストロゲン(E2)、骨形成マーカー:PINP(血清)を測定した。平均値は、E2:36.5pg/ml、NTx:10.7nMBCE/L、PINP:55.3ng/mLであった。各学生に対して、性格テスト(YG)、不安状況調査(STAI)を行った。STAIの平均値は、状態:46.0、特性:45.9であり、高いスコアを示した。また、YGとSTAIの相関において、気分の変化・神経質・攻撃的・情緒不安定・社会的不適応で有意な相関を示した。来年度実習中の採血を行い、1.若年層において実習負荷が骨形成・吸収マーカーに与える影響2.筋骨格系の作業負担と骨形成・吸収マーカーとの関係3.実習におけるストレスが女性ホルモンに与える影響を明らかにしていく。看護学実習を身体的負荷および精神的負担として、女性の骨関連生理機能にどのような影響を及ぼしているかを明らかにする。看護学の実習前、実習中と同一の被験者に対して観察研究を行う。病院実習の作業負荷を曝露として考えるため、測定時において昨年度は実習前、今年度は実習中の学生を対象とした。現在、H大学看護学科に在学する学生14名の実習前と実習中の調査が終了している。H大学看護学科の被験者には、Hologic社: QDR-4500を用いて腰椎・大腿骨頸部の骨密度測定を行った。それぞれの実習前・実習中の平均値は、腰椎:前0.983(0.066)g/cm^2・中0.987(0.074)g/cm^2、大腿骨頸部:前0.787(0.109)g/cm^2・中0.770(0.104)g/cm^2、大腿骨:前0.847(0.094)g/cm^2・中0.874(0.090)g/cm^2であった。STAIの平均値は、状態:前46.3±8.1・中52.3±8.9で有意な差が認められ(p=0.007)、特性においては前46.1±8.2・中48.5±9.1で有意な差は認められなかった(p=0.064)。STAIの状態不安の項目が、実習前に比較して実習中に有意に高値を示したことから、臨床実習において看護学生の不安感が上昇していることが示された。引き続き実習中の採血を行い、1.若年層における筋骨格系の作業負担が骨形成・吸収マーカーに与える影響と2.実習におけるストレスが女性ホルモンに与える影響を明らかにしていく。

最近は,加齢に伴う骨量減少を最小限に抑えることよりも若年時に高い骨密度を獲得することが,最大の予防と考えられている。本研究では,若年者の骨密度をDEXA法で測定後,結果を個人に説明し骨粗鬆症に対する認識を深めることで行動変容が起こるかを調査し,さらに骨密度への影響について明らかにすることを目的とした。対象は,2006年度及び2007年度に看護学科に入学した30歳までの女子大学生で,骨密度・ホルモン測定と質問紙調査に同意した者(70人)とした。骨密度測定を入学時,6ヵ月後,12ヵ月後,18ヵ月後,24ヵ月後の各時期に計5回行った。入学時に質問紙調査(食事調査・性格検査・身体活動量調査)及び性ホルモン検査を行い,24ヵ月後に質問紙調査(同上・骨密度知識調査)を行った。性ホルモン値では,エストロゲン(E_2)と腰椎骨密度,大腿骨total骨密度の間で正の相関を認め(p<0.01),卵胞刺激ホルモン(FSH)と腰椎骨密度間でも,正の相関を認めた(p<0.05)。骨密度維持には,女性ホルモンであるE2の分泌が不可欠であり,腰椎骨密度で最も重要であることが示された。身体活動量(METs・min/day)では,それぞれ腰椎骨密度(p<0.05),大腿骨頸部骨密度(p<0.01),大腿骨total骨密度(p<0.05)で正の相関を認めた。また,消費エネルギー(kcal/day)と腰椎骨密度,大腿骨頸部骨密度及び大腿骨total骨密度で正の相関を認めた(p<0.05)。これにより,最大骨密度を獲得し維持するためには,継続的な運動が必要であることが示唆された。本研究結果から,骨粗鬆症予防に重要な骨密度を獲得し,維持するための意識改革及び行動変容をもたらすことが可能であると考えられた。また,骨密度測定参加や行動変容には性格も関与しており,個々の性格に合わせた積極的な啓蒙活動が必要である。
末梢動脈疾患の早期画像診断を目指した定量的な酸素分圧計測法の新規構築

末梢動脈疾患(PAD)に罹患し虚血肢を有する患者は、他の動脈硬化性疾患も併存していることが多く、患者の生活の質の維持には原疾患を含めた早期診断・治療が必要である。PADの客観的評価方法として四肢の血圧比が用いられているが、重症度によっては正確な血流動態が反映されない。そのため、他の定量的評価手法が切望される。虚血肢では患部の酸素分圧が低下するため、評価の指標として酸素分圧情報が有効であると考えられる。定量的に酸素分圧可視化が可能な手法としてオーバーハウザー効果MRI (OMRI)が有用である。本研究では、患肢全体での定量的酸素分圧可視化が可能なOMRI計測手法の構築を目的とした。本研究の最終目的は、末梢動脈疾患等により虚血状態にある生体体表面の定量的酸素分圧評価が可能なOMRI法を新規に構築することである。具体的には、マウス片肢を測定対象として想定し、測定対象の全域の酸素分圧分布可視化が可能なOMRI用共振器の開発を行うことに加え、開発した共振器により虚血肢モデルマウスを使用した酸素分圧測定を行い、定量的な酸素分圧評価が可能であることを実証することであった。このうち、当該年度では実験実施計画に従いマウスを対象としたOMRI用アレイコイル共振器の開発を行った。具体的には、マウス後肢に適した大きさ(2cm*4cm程度)のOMRI用アレイコイルを開発した。それに先立ち、EPR(電子常磁性共鳴)励起を行うためのサーフェイスコイル共振器について、磁場発生効率を向上させ、電磁波照射時間の短縮と測定感度の向上をはかった。従来OMRIで用いられていたサーフェイスコイルは誘導結合により、電力供給部分と試料に接する共振部が結合している共振器であったが、共振部分においてコイルと結合コイル部分間の線路長の改良、電子回路の改良により磁場発生効率を向上させた。さらに、サーフェイスコイル間の磁気的結合による相互誘導の抑制は、共振部分と電力供給コイルとの距離を調整することにより抑制した。試作したアレイコイルを用いて、均一試料を画像化したところ、単一のサーフェイスコイルで取得した画像と同程度の信号対雑音比が得られた。以上より本研究によりOMRI用のアレイコイルが初めて実現できたことは、OMRIによる可視化範囲拡大を可能にしたという点で重要である。初年度においては、オーバーハウザー効果MRI(OMRI)に対応したアレイコイルの実現可能性について検討する計画であった。各チャンネル間の信号強度の補正は必要ではあるものの、アレイコイルそのものの実現は可能であることを示すことができた点で計画通りであるといえる。よっておおむね順調に進展していると評価した。試作したアレイコイルについて、感度補正を行うためのソフトウェアの開発を行い、チャンネルによる信号強度のバラつきを抑制する。また、in vivo計測に適用可能かを検討するため、実際に健常なマウス、スピンプローブ、酸素感受性プローブを用いて計測が可能か検討する。さらに、疾患モデルマウスを用いて当初の目標である虚血肢において広範囲に酸素分圧可能であるかを検討する。なお、in vivo計測において感度不足が認められた場合、必要に応じて高感度化の方策を考案する。

試作したアレイコイルを用いて、均一試料を画像化したところ、単一のサーフェイスコイルで取得した画像と同程度の信号対雑音比が得られた。以上より本研究によりOMRI用のアレイコイルが初めて実現できたことは、OMRIによる可視化範囲拡大を可能にしたという点で重要である。初年度においては、オーバーハウザー効果MRI(OMRI)に対応したアレイコイルの実現可能性について検討する計画であった。各チャンネル間の信号強度の補正は必要ではあるものの、アレイコイルそのものの実現は可能であることを示すことができた点で計画通りであるといえる。よっておおむね順調に進展していると評価した。試作したアレイコイルについて、感度補正を行うためのソフトウェアの開発を行い、チャンネルによる信号強度のバラつきを抑制する。また、in vivo計測に適用可能かを検討するため、実際に健常なマウス、スピンプローブ、酸素感受性プローブを用いて計測が可能か検討する。さらに、疾患モデルマウスを用いて当初の目標である虚血肢において広範囲に酸素分圧可能であるかを検討する。なお、in vivo計測において感度不足が認められた場合、必要に応じて高感度化の方策を考案する。
神経突起の分岐を制御する新規因子のマウスを用いた遺伝学的解析

神経突起の分岐形成は神経回路の複雑性を増加し、より高度な情報処理を可能にしている。申請者は神経系に特に強く発現し神経突起の分岐を強く引き起こすような分子を探索し、プロテインキナーゼBrancKを見出した。BrancKの遺伝子欠損マウスにおいては、軸索突起の軽度分岐不全が見出され、in vitroで観察された分子機能が確認された。結合タンパク質については、yeast two-hybrid法にて新規分子の同定に成功し、神経系に濃縮して発現する分子を見出した。下流因子としては、Branckの存在下にその凝集が観察される細胞骨格分子が得られている。我々の運動や認知、精神活動などを規定する神経回路は、最終分裂を終えた無数の神経細胞がその細胞体の占めるべき位置に向けて移動した後、もしくは移動しながら、神経突起を伸ばし、軸索突起が標的細胞へシナプスを作ったり、逆に樹状突起がシナプス入力を受けたりすることによって形成される。この過程において、神経突起は分岐し側枝を形成するが、そのことによって神経回路は複雑性を増し、より高度な情報処理を可能にしているものと考えられる。申請者はこの過程の分子機構を明らかにするため、神経系に特に強く発現し神経突起の分岐を強く引き起こすような分子を探索し、プロテインキナーゼBranching Kinase(BrancK)を見出した。本研究では、BrancKについて、その遺伝子欠損マウスの解析を中心に、結合タンパク質、上流下流因子の同定を含めた総合的な解析を行い、その作用機序と生体内での役割を明らかにした。遺伝子欠損マウスにおいては、軸索突起の軽度分岐不全が見出され、in vitroで観察された分子機能がin vivoにおける神経発生過程においても確認された。結合タンパク質については、yeast two-hybrid法にて新規分子の同定に成功し、やはり神経系にほぼ特異的に発現する分子を見出した。現在は、その遺伝子欠損マウスを導入して機能を解析中である。必ずしも同様の表現型ではないが、軸索突起の異常が観察されているので、両者の掛け合わせによって表現系の増強などがおこるのかどうかを解析している。下流因子としては、Branckの存在下にその凝集が観察されるような細胞骨格分子が得られているので、そのリン酸化や分子会合に必要な領域などを決定しつつある。本研究では神経突起の分岐形態を制御する新規因子として我々が同定したキナーゼであるBrancKの生理的機能を、主にノックアウトマウスを用いて解析している。BrancKは神経系全体に濃縮して発現がみられ、培養神経細胞においてBrancKの強制発現もしくはshRNAによる発現抑制を行うと神経突起の分岐形態が増加・減少する。それと対応してBrancKノックアウトマウスでは腹部の末梢神経や海馬錐体細胞の神経突起に分岐数減少等の異常が生じることをこれまで明らかにしてきた。平成24年度は、発生過程における神経突起形態の異常が細胞移動に影響をもたらす可能性を考え、各種神経細胞のマーカーを用いてBrancKノックアウトマウスの大脳皮質層構造について検討を行ったが、大きな変化は観察されなかった。一方、ポジティブな結果としては、BrancKが神経突起形態を制御する分子メカニズムを同定するために免疫沈降法などのスクリーニングを行い、物理的結合因子を同定した。さらに、その結合因子に関する遺伝子欠損マウスとBrancKノックアウトマウスとを掛け合せると、その子どもが胎性致死となることを見いだした。この結果は遺伝学的な相互作用が存在するということを示していると思われるが、現在gene dosageの変化に伴う出生率の違いやその脳組織における解剖学的差異について解析を進行中である。また、BrancKおよび結合因子とが係わるシグナル伝達において、その上下関係に関する生化学的な解析を行った。これについては結論が出たので、その詳細について個体を用いた証明を現在検討中である。本研究では主にノックアウトマウスの解析を通じて、神経突起形態の分岐を制御する新規因子として我々が同定したキナーゼであるBrancKの生理的機能を明らかにすることを目的としている。平成24年度はその結合因子を同定するなどin vitroの系において分子メカニズムの解明が進んだが、行動解析などin vivoにおける機能解析には若干の遅れがみられる。上記両分子の上下関係について個体を用いた解析を行うため、まずはリン酸化エピトープに対する抗体を作製する。一方の遺伝子欠損マウスにおいて相手方のリン酸化エピトープが減少するかどうかによってその結論を導き出す予定であるが、表現型が弱いため、分子レベルでの異常までははっきりと判明しないという可能性や、逆にリン酸化自体の変化はかなり大きなものなのに脳組織の形成にはそれほど影響を及ぼしていないといった可能性も考えられる。また、脳組織の解析に於いても、各種マーカー抗体を用い分子レベルでの変化を追うことによって、異常を呈するメカニズムの解明を目指す。脳組織解析のためにかなりの種類の抗体を用意する必要があり、45万円程度の購入を予定している。

また、リン酸化抗体の作製を委託しており、それに30万円程度、マウスの掛け合わせもかなりの数になってきているので、飼育費用に30万円程度の支出を予定している。遺伝子改変マウスのジェノタイピング分を含めて遺伝子工学試薬の購入に25万円程度、初代神経培養の培地やディッシュの購入に20万円程度使用予定である。
ソフトイオン化質量分析法を基盤とする乾燥ろ紙尿中ステロイドの臨床検査法の開発

非侵襲的に採取可能な尿中のステロイド代謝物のプロファイルを明らかにし、内分泌・代謝疾患の病態解析、診断指標の一助とすることを目的として、LC/MSによる尿中抱合型オキシステロールおよびテトラヒドロキシコルチコステロイドのプロファイル分析法を開発した。さらに本法が乾燥ろ紙尿に適用可能なことを示した。乾燥ろ紙尿は尿試料の保存や輸送が簡便であり、実施施設が限られた臨床検査用の検体として有用視される。本年度は、尿中ステロイド代謝物測定のための基礎的検討を行った。1.コレステロール及びその酸化成績体であるオキシステロールが硫酸抱合体に変換された後、尿中に排泄されていることが推測されることから、硫酸抱合型コレステロール及びオキシステロールのLC/ESI-MS/MSによる一斉分析法を構築した。すなわち、尿を疎水性ー弱陰イオン交換ミックス固定相を用いる固相抽出による簡便な前処理後、Pulsed-Q dissociationモードでのLC/ESI-MS/MSにより脱プロトン化分子→硫酸イオンへの特徴的なトランジションを測定することが有用であることを見出した。また、コレステロールから生合成され同じ側鎖を有するビタミンDの代謝物である25-ヒドロキシビタミンD3の硫酸抱合体のヒト血漿中濃度測定法をLC/MSにより開発した。これより得られた知見は、今後尿中代謝物測定法開発上、有用な知見となる。2.同一尿試料中における抱合型糖質コルチコイド代謝物30種のプロファイル分析法を開発した。すなわち、尿を疎水性ー弱陰イオン交換ミックス固定相を用いる固相抽出によりグルクロン酸抱合体と硫酸抱合体に分画後、それぞれLC/MS分析に付したところ、マトリックス効果を受けず、満足のいく精度・正確度を有する測定法を開発することができた。また、本法を健常人尿に適用したところ、尿中排泄量に日内変動が認められ釣ることが明らかになった。このことは、今後、採尿時間にも考慮する必要があるなど、実用化に際しての有用な知見となった。本年度は、LC/MSによる乾燥尿ろ紙中抱合型糖質コルチコステロイド代謝物測定法の開発のための検討を行い、以下の結果を得た。1)はじめに、ろ紙に尿50 μLを塗布し、風乾後、尿が浸透した部分を裁断し、水、2%メタノール、等張リン酸緩衝液(PBS)、又は2%トリフルオロ酢酸(各々3 mL)中で超音波抽出した。固相抽出により脱塩後、LC/MS分析に付したところ、グルクロン酸抱合型テトラヒドロコルチコステロイド(THC-G)は水、硫酸抱合体はPBS中で抽出したときに最も回収率が高かった。また、ろ紙の種類(セルロース、ガラス繊維)、抽出時間(520分)では差異が無かった。そこで、セルロースろ紙を用い、抽出液にPBS、抽出時間を10分としたところ、全操作での絶対回収率は7097%であった。2)本法の再現性試験、添加回収試験を行ったところ、スクリーニングに用いるに足る精度、正確性を有していた。また、本法による乾燥尿ろ紙中THC-G濃度と、既報による液体尿中のそれは、良好な相関性を示した。H27年度は1)乾燥尿ろ紙中ステロイド代謝物測定法の検討と2)三連四重極型質量分析計を用いる定量法の開発を計画していた。1)に関しては、ろ紙の種類、抽出液の種類、抽出時間を最適化するとともにバリデーションも行い、今後、実試料に適用するための基礎的検討は安定性試験を残してほぼ終了した。また2)についても、リニアイオントラップ型質量分析計と両者の特性を考慮しながら最適な測定条件を検討中である。以上の観点から、H27年度は「おおむね順調に進展している」と評価した。本年度は、昨年度に引き続きLC/MSによる乾燥尿ろ紙中抱合型糖質コルチコステロイド代謝物測定法の開発のための検討を行い、以下の結果を得た。乾燥尿ろ紙を検体として用いるメリットは、尿の保存や輸送の簡便性であり、これらを保証するためには、ろ紙中で測定対象が安定に存在し得ることが重要である。そこで、乾燥尿ろ紙の保存条件(温度、保存期間)について検討した。すなわち、凍結保存尿を融解後、その50 μLをろ紙に尿塗布し、風乾後、室温、4°Cまたはー20°Cで保存した。1日、1週間、2週間および1ヵ月後に、ろ紙の尿が浸透した部分を裁断し、PBS中で超音波抽出した。Oasis HLBにより固相抽出後、LC/MSに付し、グルクロン酸抱合型テトラヒドロコルチコステロイド濃度を定量した。その結果、いずれの保存温度でも、12週間後の測定値はろ紙塗布直後のそれの23倍に達していた。この原因については不明であるが、尿中に含まれる最近などによる組成の変化によりマトリックス効果が現れ、イオン強度を強くしていることが考えられた。しかし、採尿直後の尿を用いて同様の検討を行ったところ、保存期間1週間程度までなら室温でも測定値の上昇は抑えられることが分かった。また、硫酸抱合体についても同様に精度、正確性の評価を行い、良好な結果を得た。さらに、内標準物質として用いる抱合型代謝物の安定同位元素標識体の入手が困難であることから、安定同位元素標識誘導体化試薬と非標識誘導体化試薬を用いる誘導体化LC/MSの導入についても検討した。

その結果、本法は感度の上昇に加え、精度・正確性についても良好であり、実試料への適用が可能なことが分かった。非侵襲的に採取可能な尿中のステロイド代謝物のプロファイルを明らかにし、内分泌・代謝疾患の病態解析、診断指標の一助とすることを目的として、LC/MSによる尿中抱合型オキシステロールおよびテトラヒドロキシコルチコステロイドのプロファイル分析法を開発した。さらに本法が乾燥ろ紙尿に適用可能なことを示した。乾燥ろ紙尿は尿試料の保存や輸送が簡便であり、実施施設が限られた臨床検査用の検体として有用視される。H26年度は1)LC/MSによる硫酸抱合型オキシステロール測定法の開発と2)LC/MSによる尿中抱合型糖質・鉱質ステロイド測定法の開発を計画していた。1)に関しては、計画通りに進行した。すなわち、簡便な固相抽出のみの前処理法を開発するとともに、リニアイオントラップ型質量分析計の問題点であるlow mass cutoffを解決する方法として開発されたpulsed-Q dissociationモードでのMS/MSにより硫酸抱合型オキシステロール10種の一斉分析法の開発を達成し、さらに健常人尿中には硫酸抱合型コレステロールは排泄されているものの他のオキシステロール体はほとんど排泄されておらず、血中とは異なるプロファイルであることを明らかにすることができた。また、2)に関しては、糖質コルチコステロイドについては、グルクロン酸抱合体と硫酸抱合体の分画法と各抱合型のLC/MSによる直接一斉分析法の開発を達成することができた。これらの知見は、今後、乾燥ろ紙尿中ステロイド測定値の妥当性を検証するために必須の技術である。一方、鉱質コルチコイドに関してはまだ、抱合体標品が得られていない。以上の観点から、本年度は「おおむね順調に進展している」と評価した。H28年度は最終年度であるので、H27年度の研究で残った課題について進めるとともに、それらの結果を踏まえて当初の計画を実施し、総括していく。その際、以下の点について重点的に研究を推進する予定である。1.乾燥尿ろ紙を検体として用いるメリットは、尿の保存や輸送の簡便性であり、これらを保証するためには、ろ紙中で測定対象が安定に存在し得ることが重要である。そこで、乾燥尿ろ紙の保存条件(温度、保存期間)についても検討し、実用性について検証する。また、THC-G以外の疾患の指標となり得る尿中ステロイド代謝物についても対象を広げていくための検討を行う。2.乾燥尿ろ紙を抽出操作を行うことなく、直接ペーパースプレーLC/MSに付すための条件検討を実施していく。臨床分析化学27年度は、26年度の研究で残った課題について進めるとともに、それらの結果を踏まえて当初の計画を実施していく。その際、以下の点について重点的に研究する予定である。1.各種抱合型ステロイドを含有するモデル尿を塗布したろ紙(乾燥ろ紙尿)を作成し、ろ紙からのステロイドの抽出法について精査する。すなわち、ろ紙の種類、抽出溶媒の種類、抽出時間、抽出効率などについて、抽出液のLC/MS測定により明らかにする。また、乾燥ろ紙尿中ステロイドの安定性について精査する。すなわち、乾燥後の保管温度、保管時間、空気等の接触などによる影響について検討する。さらに、凍結尿と乾燥ろ紙尿によるステロイド測定を行い、乾燥ろ紙尿が臨床検査上有用な試料となり得るか評価する。
未解明一次代謝経路、非メバロン酸経路に関与する遺伝子の機能解析

本研究では、未解明な一次代謝経路である「非メバロン酸経路」に関与する変異株を単離して、次いでその変異株の相補遺伝子を取得し、その遺伝子産物の酵素としての機能を詳細に解析することにより、本経路の全貌解明を目的としている。2001年度は、非メバロン酸経路に関与する遺伝子の取得を大腸菌を材料に行う計画であったので、それに従ってスクリーニング系を実施し、機能未知遺伝子gcpEとlytB遺伝子を非メバロン酸経路の候補遺伝子として取得することができた。これらの遺伝子は、確かに非メバロン酸経路を持つ原核生物に広く分布していることが分かり、非メバロン酸経路の遺伝子として機能していることが強く示唆された。次にgcpE遺伝子欠損株のユビキノン生合成経路を調べてみると、確かに、非メバロン酸経路ではユビキノンを作ることができず、導入したメバロン酸経路でユビキノンを合成していた。このように、今年度の予定であった非メバロン酸経路の欠損株は2種類取得できたが、予想以上にその変異株の種類は少なかった。すなわち、非メバロン酸経路に関与すると考えられる遺伝子の数は予想外に少なかった。これは、これらの遺伝子だけで非メバロン酸経路が完結するのか?それとも、何らかの予想外の理由のため、これ以上新たな変異株が得られないのか?、現段階では不明である。今後は、今年度取得した非メバロン酸経路に関与すると考えられるgcpEとlytB遺伝子産物の酵素としての機能を明らかにし、非メバロン酸経路の後半部分の解明を目指す予定である。