hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ケイジド試薬を用いたカルシウム依存性細胞機能の研究

本年度は、主として哺乳動物中枢神経細胞のスライス標本において、2光子励起でケイジドグルタミン酸を破壊し、グルタミン酸感受性をマップするシステムを開発した。ケイジド試薬を細胞外に投与しながら海馬錐体細胞をホールセルクランプして電流記録を行い樹状突起部位において超短パルスレーザー照射を行うとシナプス後電流とほとんど同じ速い時間経過で一過性内向き電流が活性化した。このグルタミン酸電流は励起光のパワーの2.2-2.5乗に依存した。これは励起が2光子過程であること、及び、グルタミン酸の受容体への結合の共同性からよく説明される。この電流の空間分布を測定するために、およそ一辺10ミクロンの立方体内に樹状突起領域を覆う2000ピクセルの各点において、グルタミン酸電流を記録するシステムを構築した。こうして、樹状突起はスパインごとにグルタミン酸感受性が大幅に異なること、そして、グルタミン酸感受性はスパイン形態と強い相関があることが明らかとなった。また、グルタミン酸感受性はスパインごとに独立に調節されていること、0から約150個の受容体を発現することが明らかとなった。2光子励起法を応用した我々のシステムは脳標本においてシナプスの重み分布やその動態、或いは単一シナプスレベルの局所刺激を行うことのできる新しい方法論であることがわかった。こうして、2光子励起法を応用した我々のシステムは脳標本においてシナプスの重み分布やその動態、或いは単一シナプスレベルの局所刺激を行うことのできる新しい方法論であることがわかった。ケイジドカルシウム試薬による細胞内カルシウム上昇をPC12細胞に投与することにより、開口放出を誘起して、生起した分泌小胞の開口放出を2光子励起法で観察する方法論を新たに開発した。開口放出は細胞外蛍光トレーサーによってモニターし、2光子励起法の同時多重染色性を利用して、異なるトレーサーの同時多重染色を行った。まず、水溶性で小胞内を染色するSRBと、脂溶性で膜を染色するFM1-43の同時染色を行い、その蛍光比を取ることで分泌小胞の大きさを推定した結果、大型小胞以外に大量の小型小胞の開口放出が起きていることが速く起きていることがわかった。その大きさは直径43nmと推定された。次に、異なる大きさの水溶性蛍光色素の染色性により、融合細孔の大きさを推定したところ、大型小胞のそれはすぐ大きくなるのに対し、小型小胞のそれは1.6nm以上に大きくならず、一秒以内に閉鎖することがわかった。このエンドサイトーシスはGTP-g-Sで阻害されず、dynamin-clathrin依存的なエンドサイトーシスとは異なることが明らかとなった。この過程を立証するために電子顕微鏡観察を行ったところ、FM1-43の蛍光によるDAB陽性の小型の小胞(直径45nm)が多数細胞内に観察され、更にご細胞内に拡散し、エンドソームに融合していることが明らかとなった。こうして、融合細孔閉鎖によって形成される新しいオルガネラの存在が初めて確認された。
個体で機能する革新的レポータータンパク質の創製

本課題では、生体・個体への応用が期待できる核磁気共鳴法を利用したレポータータンパク質の開発を目指した。特に、生体直交型酵素反応に基づくプローブ原子配列組み換えと多重共鳴核磁気共鳴技術を用いた核磁気共鳴シグナルOFF-ON型(シグナルactivatable型)レポータータンパク質の創製を実施した。まず、安定同位体(13C)ラベル化ピルビン酸を用いた乳酸脱水素酵素の核磁気共鳴シグナルOFF-ON型検出実験をもとに、生体直交性を持つピルビン酸誘導体と他種由来の乳酸脱水素酵素ペアの探索を行い、ヒト乳酸脱水素酵素に高い生体直交生を持つ基質-酵素ペアを見いだした。実際、同条件で酵素反応を行ったところ、見いだしたピルビン酸誘導体はヒト乳酸脱水素酵素とはほとんど反応せず、他種由来の乳酸脱水素酵素と選択的に反応した。また、安定同位体ラベル化したピルビン酸誘導体を基質に用い、多重共鳴核磁気共鳴測定下で検出したところ、この他種由来の乳酸脱水素酵素共存下において、OFF-ON型で発生するプロトンシグナルが確認された。この候補レポータータンパク質をプラスミドに組み込み、真核細胞で発現させたところ、その発現が確認された。また、細胞系においてもOFF-ON型でプロトン核磁気共鳴シグナル(多重共鳴)が検出され、このペアが機能することが示唆された。この結果、プローブ原子配列組み換えと多重共鳴核磁気共鳴技術に基づく、核磁気共鳴法を利用した新しいレポータータンパク質候補の探索に成功したと言える。
プラズマ支援非平衡燃焼化学のモデル構築

プラズマ支援燃焼に関するミクロな理解を得ることを目的とし,実験およびシミュレーションにより研究を行った。その結果,火炎の余熱帯と呼ばれる部分において,プラズマが生成する高エネルギー電子と酸素分子の衝突で酸素原子が生成されることが,プラズマによる燃焼特性改善の大元であるとの理解を得た。水蒸気が添加された場合には,水蒸気の電子衝突解離で生成されるOHラジカルが燃焼特性改善の大元であることを示唆する結果が得られた。最近になって高い注目を集めるようになったプラズマ支援燃焼の研究において,非平衡プラズマの高エネルギー電子が燃焼化学反応をどのように変化させるのかに関するミクロな視点からの理解を得ることが本研究の目的である。当初の研究計画において,平成25年度には,メタン/酸素/アルゴンの混合ガスにおいて誘電体バリア放電を生成し,その中でレーザー着火実験を行って,着火特性におよぼす非平衡プラズマの効果を調べる計画であった。これについては,専用の実験容器を設計製作し,実験を開始する準備を整えた。なお,この実験で用いるYAGレーザーを本予算外で調達できたので,その予算(基金分)を平成26年度に繰り越し,充足率から単年度での調達が困難化していたFT-IR装置を平成26年度に整備できるように努力した。一方,燃焼状態にあるメタン火炎におけるプラズマ支援効果のミクロな理解は,当初計画において最も難易度の高い課題に位置づけ,平成27年度に研究する予定であったが,レーザー誘起蛍光法を用いたOHラジカル密度計測を含む詳細なプラズマ・火炎診断を実施したところ,有用な実験結果が得られたので,本年度は先行してこの実験に注力した。その結果によると,プラズマ支援燃焼において最も重要なラジカル種と一般に想定されているOHラジカルについては,プラズマの高エネルギー電子の生成と時間的に相関しない密度変化を示し,高エネルギー電子によって生じる燃焼化学反応変化の高次の効果としてOHラジカル密度が変化するものの,非平衡化した燃焼化学反応系の根底にあるのではないことがわかった。一方,電子励起状態OH(OH(A))は,プラズマの高エネルギー電子と時間同期して密度が増加し,それは電子衝突励起によるものではなく燃焼化学反応の変化によることから,H(A)を生成する反応が高エネルギー電子の効果を比較的直接的に受けているとの示唆を得た。平成25年度の研究により,電子励起状態OHラジカル(OH(A))を生成する反応が燃焼状態にあるメタン火炎において高エネルギー電子の効果を直接的に受けているとの示唆が得られたので,平成26年度も引き続き本件に関する研究を継続した。実験結果によると,高エネルギー電子の効果を受けて生成されるOH(A)は低い回転温度を有していた。文献調査の結果,回転温度の低いOH(A)を生成する反応は酸素原子とCHOの反応であるとの報告を見出したので,2光子レーザー誘起蛍光法を用い,誘電体バリア放電が重畳された予混合バーナー火炎における酸素原子密度を計測した。その結果,未燃ガス領域と反応帯との遷移領域にあたる余熱帯と呼ばれる領域において,誘電体バリア放電による高エネルギー電子のパルス状供給に伴って酸素原子密度が特徴的な増減を示すことを見出した。即ち,放電により付加的に供給された酸素原子は燃焼化学反応系の変化に直接的に寄与していることがわかった。化学反応計算ソフトChemkinを用いた0次元計算において,反応開始時刻に酸素原子を人工的に付加すると着火遅れ時間が短縮されることがわかり,低温酸化反応が進行する時空間領域に酸素原子を僅かに供給することが,非平衡プラズマ支援燃焼において根源的な重要性を持つとの知見を得た。以上の研究と並行し,研究計画調書に記載の通り,メタン/酸素/アルゴン混合誘電体バリア放電のアフターグローガス中におけるレーザー着火に関する実験を進めた。シャドウグラフ法を用いた高速動画撮影によりレーザーで誘起された火炎核の伝播速度を調べたところ,誘電体バリア放電の生成により伝播速度の高速化が観測された。火炎核が伝播していく空間におけるラジカル密度計測の結果と比較すれば,火炎燃焼速度の増大をもたらすプラズマ支援効果に関する知見が得られると考えられる。アルゴン・酸素・メタンからなる定常予混合バーナー火炎を用いた実験では,火炎先端部における火炎形状の過渡的変化に関する実験結果を解析した。長露光時間の撮影で短縮して見える火炎(火炎長の短縮は燃焼速度の増加をあらわす)は,過渡的には伸張と短縮を繰り返しており,それと連動する低発光強度部の繰り返し構造が発光強度の軸方向分布に見られた。また,火炎先端部のOHラジカル密度の時空間変化の測定からは,未燃ガスが軸方向に周期的に残存する様子が観測された。これらの結果は,火炎下部において燃焼化学反応レートが時間的に振動していることを示しており,その振動周期として0.18-0.2 msが評価された。非平衡燃焼化学反応系の固有振動数である可能性があり,プラズマ支援燃焼化学反応のキー反応を理解するためのヒントとなる結果が得られた。アルゴン・酸素・メタンの予混合ガス中における誘電体バリア放電のアフターグローガスの中でレーザー着火を行う実験では,火炎核の伝播速度が放電電力の増加につれて大きくなることが観測された。ノズルから遠ざかる鉛直上方に伝播する火炎核とノズルに近づく鉛直下方に伝播する火炎核の伝播速度には違いがあり,ノズル付近で火炎核の伝播速度が大きくなった。また,ノズル付近での火炎核は,複雑な凸凹形状に変化したが,それはプラズマの影響によるガス流の乱流化によるものでは無く,誘電体バリア放電の効果によるものであることがわかった。

レーザー誘起蛍光法によるOHラジカル密度計測では,ノズルから上方に向かい大きな勾配で低下する密度分布が計測されており,プラズマから供給されるラジカルの密度分布が火炎核の伝播速度の違いなどの原因であることが示唆された。プラズマ支援燃焼に関するミクロな理解を得ることを目的とし,実験およびシミュレーションにより研究を行った。その結果,火炎の余熱帯と呼ばれる部分において,プラズマが生成する高エネルギー電子と酸素分子の衝突で酸素原子が生成されることが,プラズマによる燃焼特性改善の大元であるとの理解を得た。水蒸気が添加された場合には,水蒸気の電子衝突解離で生成されるOHラジカルが燃焼特性改善の大元であることを示唆する結果が得られた。平成26年度には,研究計画調書において平成25-26年度に実施を予定していた誘電体バリア放電中でのレーザー着火実験を開始し,放電の効果により火炎核の伝播速度が増大することを観測した。一方,平成27年度に実施予定であった燃焼状態にあるメタン火炎におけるプラズマ支援効果に関するミクロな理解を得るための実験については,平成25-26年において先行して成果が得られ,低温酸化反応が進行する時空間領域に酸素原子を供給することがプラズマ支援効果の根源であるとの理解が得られている。また,当初はメタン火炎中でのプラズマ支援効果の理解の難易度の高さから,より単純な水素火炎中でのプラズマ支援効果に関する研究を中間ステップとして計画していたが,メタン火炎中でのプラズマ支援効果に関する理解が得られたことから,水素火炎での実験の必要度が低下した。以上のことから,実施順序に変化が生じているものの,本計画はおおむね順調に進展している。27年度が最終年度であるため、記入しない。プラズマ応用工学誘電体バリア放電中でのレーザー着火実験を継続し,火炎核が伝播する領域にどのようなラジカルを供給することが燃焼速度の増加をもたらすのかに関する実験的な理解を得る。燃焼状態にあるメタン火炎で得られたプラズマ支援効果に関する理解と統合し,プラズマ支援燃焼および着火の反応モデルを構築する。当初計画で平成25年度の実施予定のレーザー着火実験のための専用の装置を整備した。レーザー着火実験の進展は平成26年度に持ち越しとなったが,平成27年度に実施予定の燃焼状態にあるメタン火炎におけるプラズマ支援効果に関する研究を先行し,成果が得られた。平成25年度より繰り越した予算を用い,平成26年度にはFT-IR装置を購入する計画であったが,既燃ガスの分析に用いるFT-IR装置を購入するよりも,反応場のその場観察のためのICCDカメラを購入した方が本計画をスピーディに進められるとの判断から,購入物品を変更した。ICCDカメラはFT-IR装置よりも安価なため,次年度への繰越金が発生した。なお,本報告書における繰越金には上記ICCDカメラの金額も含まれているが,これは北海道大学の経理システム上の理由により翌年度の4月支払になるために繰越が生じているもので,物品の納品は済んでいる。
動脈硬化病変局所におけるLeY抗原発現とその機能解析

動脈硬化病変におけるLeY抗原の発現について免疫組織学手法を用いて検討した.内膜の動脈硬化病変に存在する泡沫細胞は抗CD68抗体にて染色性を認めたが,LeY抗原の発現は弱い,あるいは認められなかった.内膜・中膜の境界部に存在する,あるいは中膜に存在する抗CD68抗体に対する反応性が弱いか認めない泡沫細胞ではLeY抗原の発現が認められた.このLeY抗原の発現はA型個体ではα-N-acetylgalactosaminidaseによる酵素処理後,B型個体ではα-galactosidaseによる酵素処理後に認められた.外膜からの新生血管侵入部周囲に存在する泡沫細胞にも染色性を認めた.内膜,中膜における細胞内の脂質含有量が少ない泡沫細胞ではLeY抗原の発現が強く,脂質含有量が多い細胞ではLeY抗原の発現が弱い,あるいは認めなかった.これらの結果から冠動脈,大動脈の粥状動脈硬化病巣に集簇する泡沫細胞はLeY抗原を発現しているが,A型個体はα-N-acetylgalactosaminidase処理により,B型個体はα-galactosidase処理により染色性が増強していることから,血液型がA型,B型個体においてはALeY, BleY抗原として発現していると考えられる.粥腫周囲のshoulder regionにはTリンパ球が混在すると言われているが,この部位に存在する泡沫細胞ではLeY抗原の発現は弱い,あるいは認めなかった.中膜に存在する含有脂質量が少量の泡沫細胞にはLeY抗原の発現が認められた.泡沫細胞の存在部位,泡沫化形態によりLeY抗原の発現様式が異なることから,内膜でのTリンパ球との,あるいは中膜での血管平滑筋細胞とのインターアクションがLeY抗原の発現に何らかの影響を与えていると考えられる.また,細胞内脂質含有量の違いがLeY抗原の発現に影響を与えていることから,マクロファージの泡沫化の課程でLeY抗原が発現する,あるいは中膜の胎児化した血管平滑筋細胞が泡沫化した際にLeY抗原が発現することが推測される.α-(1,3)-fucosyltrasferase(α1,3FuT)はsLeX抗原合成に関与する糖付加酵素の1つである.マクロファージを変性リポ蛋白により泡沫化させることによりα1,3FuTファミリーのうち,FuTIVおよびFuTVIIの活性が減少することが報告されている.本研究において変性リポ蛋白によるマクロファージあるいは胎児化血管平滑筋細胞の泡沫化においてα1,2FuT活性が上昇,Le型抗原の合成経路のうちLeY抗原合成経路が活性化されることが推測された.法医解剖症例全21症例から採取した左冠動脈主幹部,大動脈弓部あるいは腹部大動脈-総腸骨動脈分岐部に免疫染色を施した.年齢分布は0歳(1ヶ月)から83歳であった.血液型はA型10症例,B型6症例,O型が5症例であった.以上の結果より,冠動脈,大動脈の粥状動脈硬化病巣に集簇する泡沫化したマクロファージはLeY抗原を発現し,血液型がA型,B型個体においてはALeY,BleY抗原として発現していることが判明した.マクロファージを変性リポ蛋白により泡沫化させることによりα-(1,3)-fucosyltransferase(α1,3FuT)ファミリーのうち,FuTIVおよびFuTVIIの活性が減少することが報告されている.本研究においてLeY抗原の発現は粥腫周囲の泡沫細胞に認められ,マクロファージの泡沫化が初期段階である,あるいは泡沫化していないマクロファージにおいては認められなかったことから変性リポ蛋白によるマクロファージの泡沫化においてα1,2FuT活性が上昇,Le型抗原の合成経路のうちLeY抗原合成経路が活性化されることが推測された.この成果発表は平成14年4月に第86次日本法医学会にて行う予定である.動脈硬化病変におけるLeY抗原の発現について免疫組織学手法を用いて検討した.内膜の動脈硬化病変に存在する泡沫細胞は抗CD68抗体にて染色性を認めたが,LeY抗原の発現は弱い,あるいは認められなかった.内膜・中膜の境界部に存在する,あるいは中膜に存在する抗CD68抗体に対する反応性が弱いか認めない泡沫細胞ではLeY抗原の発現が認められた.このLeY抗原の発現はA型個体ではα-N-acetylgalactosaminidaseによる酵素処理後,B型個体ではα-galactosidaseによる酵素処理後に認められた.外膜からの新生血管侵入部周囲に存在する泡沫細胞にも染色性を認めた.内膜,中膜における細胞内の脂質含有量が少ない泡沫細胞ではLeY抗原の発現が強く,脂質含有量が多い細胞ではLeY抗原の発現が弱い,あるいは認めなかった.

これらの結果から冠動脈,大動脈の粥状動脈硬化病巣に集簇する泡沫細胞はLeY抗原を発現しているが,A型個体はα-N-acetylgalactosaminidase処理により,B型個体はα-galactosidase処理により染色性が増強していることから,血液型がA型,B型個体においてはALeY, BleY抗原として発現していると考えられる.粥腫周囲のshoulder regionにはTリンパ球が混在すると言われているが,この部位に存在する泡沫細胞ではLeY抗原の発現は弱い,あるいは認めなかった.中膜に存在する含有脂質量が少量の泡沫細胞にはLeY抗原の発現が認められた.泡沫細胞の存在部位,泡沫化形態によりLeY抗原の発現様式が異なることから,内膜でのTリンパ球との,あるいは中膜での血管平滑筋細胞とのインターアクションがLeY抗原の発現に何らかの影響を与えていると考えられる.また,細胞内脂質含有量の違いがLeY抗原の発現に影響を与えていることから,マクロファージの泡沫化の課程でLeY抗原が発現する,あるいは中膜の胎児化した血管平滑筋細胞が泡沫化した際にLeY抗原が発現することが推測される.α-(1,3)-fucosyltrasferase(α1,3FuT)はsLeX抗原合成に関与する糖付加酵素の1つである.マクロファージを変性リポ蛋白により泡沫化させることによりα1,3FuTファミリーのうち,FuTIVおよびFuTVIIの活性が減少することが報告されている.本研究において変性リポ蛋白によるマクロファージあるいは胎児化血管平滑筋細胞の泡沫化においてα1,2FuT活性が上昇,Le型抗原の合成経路のうちLeY抗原合成経路が活性化されることが推測された.
社会科授業コミュニケーションにおける異種的思考の組織過程の分析

本研究では、社会科授業での認識課題を解決するときに発生する思考の諸タイプを「思考の異種性(異種的思考)」という概念でとらえ、子供の思考発達がそうした「異種的思考のコミュニケーション=交換」によって生起していく様相を分析してきた。その結果、「教科教育の社会文化的活動理論」を構成しうる以下のような知見がえられた。1.子供の思考行為は、言語などの文化的・制度的ツールに媒介されたものであり、「思考の異種性」は言語使用(発話や談話の様式)の特有性と根本的に結びついている。社会科授業における社会問題の談話では、次のような二つの談話様式がありうる。(a)子供自身の生活の個性的な文脈から社会問題を直接的・経験的に論じる様式、(b)社会科学的概念の観点から社会問題を一般的に説明しようとする様式。2.授業における「異種的思考」の組織過程では、個々の子供の思考過程の発生と変容は、共同参加者の間での「意味論的内容」や「パースペクティヴ」の差異によって媒介されている。授業が「対話的」な意味空間をつくり出している場合、個々の子供の思考は、意味を生成する相互交渉的なコミュニケーションの連鎖の中で生起してくる。3.社会科授業は、「異種的思考の応答的なネットワーク」による意味生成であると同時に、「科学的・理論的思考」という特定の思考形式の「特権化」の過程と見なすこともできる。この点へのアプローチでは、授業コミュニケーションを通して学級に流通・分配される「認知的価値」が注目される。以上のような分析は、「市みんのつくり出すもの」(小学校3年)、「わたしたちの食生活と水産業」(小学校5年)、「資源を守る」(小学校5年)の各授業実践のAV機器による記録、トランスクリプト(文字記録)の作成を進めながら、収集・確定された基本データに基づいた実証的な授業分析と理論枠組みの提出として行ったものである。
急性白血病の幹細胞を根絶する分子標的薬の効果を予測するコンパニオン検査法の開発

急性白血病の治癒には、症例ごとの白血病幹細胞を複製する分子メカニズムを明らかにし、それに対応した分子標的薬を開発して、白血病幹細胞を根絶する必須がある。さらには、その薬の効果を予測するコンパニオン検査法が必要である。平成30年度は、幹細胞性を制御することが知られているNOTCH、Hedgehog、WNTの3つの分子が関わるシグナル伝達系の白血病細胞の増殖に対する作用とそのシグナルの阻害の効果、および解析方法を中心にを研究を行い、その成果を4編の論文として発表した。急性骨髄性白血病細胞で、Hedgehog系やWNT系のシグナル構成分子をノックダウンすると、NOTCHやmTORシグナルが活性化することがある現象を見出した(論文1)。また、Tリンパ芽球性白血病で、FOXP3分子をノックダウンすると、NOTCHシグナルを抑制して増殖を抑える現象を見出した(論文2)。これらの事実は、ある分子標的薬を用いる場合には、関連するシグナルへの影響を考慮する必要があることを示唆している。また、NOTCHシグナルの活性化にはNOTCH蛋白への糖鎖の付加が影響を与えることが知られているが、急性骨髄性白血病細胞において、NOTCHの活性化が糖転移酵素の発言が増強することを見出した(論文3)。さらに、急性骨髄性白血病細胞に対して、受容体型チロシンキナーゼであるMERTKの阻害剤がその増殖を抑制することを示した(論文4)。糖鎖に関連した分子やMERTKも新たな分子標的となりうる可能性を示した。白血病幹細胞に関わるシグナルの分子標的に関する知見と、それを解析する方法について、充分な成果が上がり、英文原著論文として成果を公表できているため、順調に進捗していると判断する。2019年度以降は、研究計画に従い、体内で白血病幹細胞が存在する低酸素環境において発現されるHIF蛋白とNOTCHなど幹細胞制御分子との関連性を検討し、それらの阻害による効果、および、その効果を予測する検査法の開発を進める予定である。また、昨年は白血病細胞株を中心とした研究であったが、これらで得られた知見が、患者から採取した白血病細胞にも当てはまるかを検証する予定である。さらには、これらの結果から、どのような解析手法が、コンパニオン診断検査として有用かを総括する。急性白血病を治癒させるには、白血病幹細胞の根絶が必須である。それには、症例ごとの白血病幹細胞を複製する分子メカニズムを明らかにし、それに対応した分子標的薬を開発し、さらに、その薬の効果を予測するコンパニオン検査法を確立する必要がある。平成29年度は、幹細胞性を制御することが知られているBMI1、NOTCH、Hedgehogの3つの分子が関わるシグナル伝達系の、白血病細胞の増殖に対する作用を解析し、その成果を論文発表した。BMI1は転写制御に関わる分子であるが、白血病細胞の培養系に、その発現や機能を阻害する低分子化合物、および、BMI1発現をノックダウンするsiRNAを添加すると、細胞増殖が抑制され、その機序の一部として、NOTCHシグナルの抑制が関与していることを明らかにした。BMI1阻害剤は新たな分子標的薬となりうる可能性を示し、その有効性をin vitroで調べる検査法を開発した(論文1)。ある種のTリンパ芽球性白血病細胞のHedgehogシグナルを活性化させると、NOTCHシグナルも活性化され、両者の幹細胞制御シグナルがcross-talkしている現象を見出した。分子標的治療にあたっては、他のシグナルへの作用をも考慮する必要があることを明らかにした(論文2)。この他、血液腫瘍の細胞増殖を活性化するMYD88遺伝子変異の、蛍光消光現象とPCR法を用いた新規検出方法を開発した(論文3)。また、MYD88阻害剤は腫瘍細胞の増殖を抑制すること、およびその分子機序を解析して報告した(論文4)。白血病の幹細胞制御に関わる分子やそのシグナル伝達系に関して、新たな知見を得ることができ、それに対する分子標的治療の可能性を示すことができたため。

平成30年度以降は、研究計画に従い、白血病幹細胞におけるTIM-3分子や、低酸素環境において重要なHIF蛋白の、白血病幹細胞制御における意義や、その阻害による効果、および、その効果を予測する検査法の開発を進める予定である。2019年度以降は、研究計画に従い、体内で白血病幹細胞が存在する低酸素環境において発現されるHIF蛋白とNOTCHなど幹細胞制御分子との関連性を検討し、それらの阻害による効果、および、その効果を予測する検査法の開発を進める予定である。また、昨年は白血病細胞株を中心とした研究であったが、これらで得られた知見が、患者から採取した白血病細胞にも当てはまるかを検証する予定である。さらには、これらの結果から、どのような解析手法が、コンパニオン診断検査として有用かを総括する。
肉牛における脂肪交雑粒子の細かさを利用した不飽和脂肪酸含有量の画像解析による推定

本研究はミラー型枝肉横断面撮影装置で得られた高精細デジタル画像を利用し、牛脂肪交雑の形状的特徴量を詳細に解析する手法を開発し、また、モノ不飽和脂肪酸割合の推定を試みた。1.新たな脂肪交雑のあらさの指標として個々の脂肪交雑を面積の大きい順番に並べ替え、最も大きい脂肪交雑粒子から5個までを加算し、脂肪交雑総面積で除した指数(上位15のあらさ)が有効であった。上位15のあらさは黒毛和種×ホルスタイン種(19.88)およびホルスタイン種(20.14)において和牛などに比べ有意に高い値となった(P<0.05)。2.高精細枝肉撮影装置で撮影した黒毛和種枝肉横断面画像の解析から筋肉内脂肪の融点を推定した。融点測定値の平均は28.22±3.24°C(19.4034.95)であった。204頭を1データセットとして融点を推定した結果、重回帰式のR^2値は0.13と低かったが、調査日ごとに推定した結果、R^2値は0.600.86と高く、画像解析により融点を推定できる可能性が示唆された。3.高精細枝肉横断面画像を利用したMUFA割合推定法は、様々な品種を用いても、比較的高い精度でMUFA割合を推定可能であったが、調査日の影響が強く、一つの推定式ですべてを説明することはできなかった。調査日の影響を排除するための枝肉温度情報(レーザによる非接触温度計)の利用は有効であり、決定係数を約20%向上させる効果があることが確認できた。【目的】これまでの研究から、黒毛和種の高精細枝肉横断面画像の解析により、筋肉内脂肪中のもの不飽和脂肪酸(MUFA)割合が推定可能であることが示唆された。本研究では、脂肪交雑の形状的特徴が異なる褐毛和種(JBR)およびホルスタイン種(HOL)に同手法を適用し、その推定精度を検証した。【方法】高精細枝肉撮影装置により、JBR25頭(去勢19頭、めす6頭、1ロット)およびHOL76頭(去勢、5ロット)の枝肉横断面を撮影した。MUFA割合実測値は、ロース芯をスライドガラスで削り取り、定法で求めた。枝肉横断面画像を解析し、脂肪粒子のあらさに関する形質(10形質)、ロース芯形状に関する形質(4形質)、ロース芯の色に関する形質(84形質)、脂肪交雑の形状に関する形質(43形質)、横断面面積に占める皮下脂肪および筋間脂肪の面積割合を算出した。MUFA割合の推定は、以上の143形質を用い、5変数を上限とした最大R^2値改良法による重回帰分析で行った。【結果】JBR(1ロット)では脂肪赤成分下位10%、脂肪粒子全体のあらさ、ロース緑成分のばらつきおよびロース芯脂肪割合の4形質が選択された(R^2=0.69)。HOLにおいて、全ロットを一つのデータセットとした重回帰式のR^2値は0.38であった。各ロットで枝肉表面の温度、屠殺後の経過時間などが異なると推察されたため、ロットごとに重回帰分析を行った。各ロットで選択された変数はおおむね共通しており、皮下脂肪割合、筋間脂肪割合、脂肪粒子全体のあらさ、脂肪粒子の凹凸度、筋肉緑成分のばらつきおよび脂肪緑成分のばらつきの6形質であった(R^2=0.390.91)。精度を高めるために、推定に使用する画像解析形質を再検討する必要はあるが、JBRおよびHOLにおいてもMUFAを推定可能であった。

食肉に関するモノ不飽和脂肪酸割合や融点(以下、MUFA割合等)の理化学的分析は、サンプル採取で肉に傷をつけることや時間と費用がかかるなどの問題があり、非破壊的かつ簡単・迅速・低コストにMUFA割合等を推定する方法の開発が望まれる。本研究の目的は、高精細枝肉撮影装置で撮影した枝肉横断面画像の解析から、筋肉内脂肪のMUFA割合等を推定することである。材料として、黒毛和種間接検定材料牛、黒毛和種一般肥育牛、ホルスタイン去勢肥育牛、褐毛和種肥育牛を用いた。ミラー型枝肉横断面撮影装置で得られた高精細枝肉横断面画像を詳細に解析し、脂肪交雑のあらさや細かさなどの評価値を利用することで、MUFA割合等を推定した。どの材料牛を用いても、比較的高い精度で推定可能であったが、調査日の影響が強く、一つの推定式ですべてを説明することはできなかった。調査日の影響を排除するための枝肉温度情報(レーザによる非接触温度計)の利用は有効であり、決定係数を約20%向上させる効果があることが確認できた。
日本人におけるTrimethylaminuriaの検出を透析導入前後のTMA分析

健康成人の尿においてトリメチルアミンの検出をガスクロマトグラフ(GC)器機を用いて試みたが、標準ガスの発生可能な最小濃度以下のものがほとんどであった。そこでGC-質量分析計(MS)での検出に切り替えた。しかし、測定濃度の再現性も悪く、尿中からの検出は困難であった。今後、健康成人で検出する場合は、現在使用しているGC-MSのカラムをプロットカラムなどに変更することや、検体保存方法の改善、クレアチニン補正の適正化に留意したいと考えている。透析患者についても、尿中のトリメチルアミン量の測定が困難であったために、呼気の官能試験を内科医1名、歯科医2名で行った。官能試験の結果は0(臭いなし)から5(強い悪臭)までの6段階のスコアで表した。3名の判定者の2名以上の一致をもって、その患者のスコアとした。透析導入予定の患者5名において導入前はスコアがそれぞれ1、1、2、2、3であったが0、1、1、1、2と減少した。また、その臭いの種類は、官能試験では、「明らかに口臭ガスとして広く認知されている揮発性硫化物(メチルメルカプタン、硫化水素)と違う種類の臭いがする」と、3名の判定者の意見が一致した。さらに、腎疾患患者を多数診察している医師3名にインタビュー調査をしたところ、「透析導入前のBUNの悪化した状態では独特の口臭があり、透析を導入すると改善していく傾向があり、これは患者も家族も内科医も頻繁に経験する」とのことであった。これまで、歯科臨床経験上、「透析患者は独特の口臭がする」と考えていたが、今回の調査で「腎臓障害により、口臭は悪化し、透析によりそれが改善する」可能性が示唆された。ただし、この腎障害患者の口臭原因ガスが、続発性トリメチルアミン尿症のトリメチルアミンであると断定するには、さらなる検討が必要である。この研究の目的は、日本人で未だ検出されていないTrimethylamiuria(Fish Odour Syndrome)の患者を検出することであり、腎透析患者においては、その前後で、トリメチルアミンの分泌量に変化が生じるか、検討することである。既存器機のサンプリング方法を変更する為に、既に導入されたオートインジェクションシステムの、消耗部品を交換し、ガスクロマトグラムの妨害ピークを除去した。また、微量なガスを検出するために、キャリアガスなどに、ハイドロカーボントラップ、モイスチュアトラップ、活性炭トラップを繋いだことにより、ベースラインが安定した。トリメチルアミンの検出限界は、標準ガスの発生可能な4.6ng/10mlであった。それ以下は定量が不可能であった。定量できた患者4名の尿について、同じ患者でもばらつきが大きく、トリメチルアミン量は、0.06mg/mgcreatinine0.88mg/mg creatineとなった。現在、このばらつきについては、食事の影響や、尿の保存方法、分析条件、カラムの種類、分析前のサンプルの処理方法に関する問題点の可能性を考え、検討中である。また、腎不全患者に対する体臭や口臭に対するアンケートは心理面の難しさもあり、回収に苦慮しているが、ひとり、腎臓移植後に汗の臭い(体臭)がかなり変化したと自覚している者がいた為、先天的なFish OdourSyndromcによるトリメチルアミンの排泄障害だけではなく、腎機能不全によるものからの検出にも、今後、期待している。
赤外線熱画像によるリンゴの検出方法に関する研究

本研究は,リンゴ果実と葉との体積の違いや光合成作用の相違から,その間に存在する温度差の情報に着目し,赤外線熱画像によるリンゴの検出方法を構築しようと試みた。そのために,まずリンゴ果実と葉の温度を24時間リアルタイムに計測し,その変化の特徴及びそれらが外気温との関係について詳しく調査した。またリンゴ果実と葉の温度差情報を利用して,取得した温度データに基づいてリンゴ果実を検出する方法を提案した。上記の研究結果を踏まえ,遺伝的アルゴリズムによるパターン認識方法を応用し,赤外線熱画像から得られたリンゴの2値画像及び輪郭線画像を基に,リンゴを円として検出することを試みた。検出アルゴリズムは,リンゴの輪郭線画像の情報を基に仮想生物個体の初期設定,検出用円モデルに対する2値画像及び輪郭線の適応度の算出,適応度の高い個体に対するエリート保存,または探索空間の多様性を維持するための突然変異,近親相殺などの遺伝子操作で構成されている。その結果,昼夜の外部環境の相違に関係なく,画像中に存在するすべてのリンゴを検出することができた。しかも検出されたリンゴはおおよそ画像中の位置及び大きさと一致している。またリンゴの一部が葉などに隠れている場合や二つのリンゴが連結されている状態でもよい検出結果を得た。これらの基礎知見は、リンゴのみならず他の果実などにも応用できるものであると考える。本研究は,非接触で対象物の温度を計測できる赤外線熱画像撮影装置を利用して,果樹園において樹上のリンゴや葉の温度変化特性及びそれらの外気温との関係について検討した。またその温度情報に基づいて,リンゴと葉を識別する2値画像の取得方法をも検討した。その結果,以下のような基礎知見が得られた。1リンゴ樹上において,晴れた日の午前10時ごろから午後7時ごろまでの間,リンゴと葉の温度変化の傾向はほぼ外気温と同様になることが判明した。しかしながら,両者の平均温度値の間には,光合成作用や体積の相違からリンゴは葉より温度が高く,その平均温度値には約1°C以上の差が認められた。葉の温度はほぼ外気温と同じであった。また代表的な赤色系品種フジと黄緑色系品種王林とはほぼ同様な傾向を示した。2晴れた日の午後7時ごろから午前10時ごろまでの間,各部分の温度変化特性はほぼ外気温と同様な傾向をしている。しかも各部分の平均温度値の差はほとんどなく,ほぼ等しいものであった。3晴れた日の午前10時ごろから午後7時ごろまでに,リンゴと葉の間に温度差を存在することを利用して,ある時刻に計測した全温度データの平均値+1°Cをしきい値として2値化した場合,擬似温度画像からリンゴを検出することができた。
ジュルジュ・ペレックの作品における結合的書法

前年度に引き続き本年度は、メディアとペレックの作品のかかわりについての考察を進めた。研究のなかで、まずジョルジュ・ペレックがナレーションを担当したドキュメンタリー番組、『撮影された生活1930-1934』(1976)を分析した。この番組は1930年代前半に撮影された一般家庭のホームムービーを編集したものである。そしてナレーションは作家自身の手により書かれ、作家によって読まれた。番組内での作家の語りは映像の内容について言及するものの、映像そのものに重きをおいているようにはみえない。そこで作家が何について語ったのかに着目した。作家はナレーションによって、映像のなかに視聴者の集合的記憶を呼び起こし、視聴者にとって何の関係もない映像に視聴者自身の記憶を見出させ、作家自身の願望とも呼べる虚構の記憶を映像に投影している。この記憶という主題は1970年以降の作家の創作活動の鍵となっている。さらに、この番組には、沈黙や「永遠のものと束の間のもの」、作家の創作において重要な二つの主題もあらわれている。記憶の投影、沈黙、「永遠のものと束の間のもの」、この三つの主題は『撮影された生活』の前後の作品でも登場するが、この番組のナレーション以前と以後では内容が大きく変化している。したがってこのテレビ番組の仕事が作家の作品のなかで蝶番として機能していると考えることが出来るだろう。ナレーションの分析によって、前年度に引き続きペレックの創作におけるメディア作品の重要性に焦点を当てることができた。この番組についての分析の成果は『早稲田大学文学研究科紀要』に掲載された。フランス国立図書館やジョルジュ・ペレック協会で収集した草稿、先行研究、書簡を参照し、メディア作品にみられる精神分析の痕跡、テクストの固有名にあらわれる映画俳優の影と小説の人物描写の関係について詳らかにしつつある。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画通り、今年度はジョルジュ・ペレックの創作とメディアの関わりを詳らかにした。権利者の承諾を得て、フランス国立図書館に所蔵されている映画版『眠る男』についての手稿やタイプ稿を収めた創作ノートを判読し、作家の手で切り貼りされた複数の映画評から作家が言及しなかった劇中の音楽を作家がどの様にとらえていたのかうかがい知ることが出来た。映画評のなかで必ず批評家は『眠る男』の音楽と日常生活の音を加工した「具象音楽」の類似性を指摘していた。こうした指摘がなされた記事をペレック自身が創作ノートに切り貼りしたことに鑑みても、作家が「具象音楽」のなかに作家のエッセイ「何に近づくのか」で詳らかにする「並以下のもの」を読みとっている点を明らかにした。加えて、手稿に残されたメモから映画制作者としての作家という視座を得ることもできた。ラジオ番組の分析について、自身にとって大切な作品の抜粋を朗読する番組(『途絶えざる詩』)でジャック・ルーボーが編纂した平安時代の歌人の歌と『枕草子』の抜粋を読んでいた点にまず着目した。ペレック研究の先駆者であるベルナール・マニェによればこの番組の中で引用された作家は西洋の文脈の中で二項に分類できるとしているが、引用された日本の中世の文人たちはその分類には入らず、引用された日本の作品にはペレックの作品において重要な主題が隠されていることを明らかにした。そしてペレック自身が『枕草子』を書こうとしていた点に鑑みて、清少納言の作品をいかに創作の中に取り込んだのか、なぜ『枕草子』が未完に終わったのかをペレックの創作ノートの断片(『さまざまな空間』、『枕草子』)から分析した。ラジオ番組から『さまざまな空間』以降の作品(『考える/分類する』に収録されるいくつかのエッセイ、『人生使用法』)を読み解くうちに二つの観点では回収できない第三の視座を得ることができた。作家の創作活動と当時のメディアの関りについては当初の計画通り進展した。ペレック協会が所蔵している創作ノートのなかの構想や走り書きによって、『眠る男』については先に挙げた音楽と日常性との連関性や、作家自身がセリフの手直しや演出だけでなく、予算や報酬の分配といった実務にもかかわっていた痕跡を発見することができた。作家がプロデューサーとしての仕事をしていたという事実は、新たなる視座を与えるだろう。そしてそれを詳らかにしていくのも今後の課題である。しかし『エリス島物語』といった他作品の分析、デュラスやロブ=グリエといった同時代の作家たちの映像作品との比較については十分に行えたとは言えないだろう。次年度はペレックの他作品の分析も創作ノートによって行い、制作過程を明らかにしていくことでペレックがどのように映像作品を創作していったのかを詳らかにしていく必要がある。そして作家と中世の日本の歌人たちの関係という視座は当初の計画にはなく、計画実施中に生まれたものである。しかしこの主題を見つけたことで、ペレックの作品を修辞学とメディアという二つの項だけではなく、三つの項から検討することを可能にしたという事実は計画の段階からみて意図せぬ研究の進展といえるだろう。成果については、一つの発表と一本の論文で公表した。『途絶えざる詩』の分析からペレックと日本の歌人というこれまでの研究で詳らかにされていなかった主題を展開することができたが、フランス語で放送されたラジオ作品全体の分析については十分に行えたとはいえないので、次年度の課題とする。

研究のなかで、まずジョルジュ・ペレックがナレーションを担当したドキュメンタリー番組、『撮影された生活1930-1934』(1976)を分析した。この番組は1930年代前半に撮影された一般家庭のホームムービーを編集したものである。そしてナレーションは作家自身の手により書かれ、作家によって読まれた。番組内での作家の語りは映像の内容について言及するものの、映像そのものに重きをおいているようにはみえない。そこで作家が何について語ったのかに着目した。作家はナレーションによって、映像のなかに視聴者の集合的記憶を呼び起こし、視聴者にとって何の関係もない映像に視聴者自身の記憶を見出させ、作家自身の願望とも呼べる虚構の記憶を映像に投影している。この記憶という主題は1970年以降の作家の創作活動の鍵となっている。さらに、この番組には、沈黙や「永遠のものと束の間のもの」、作家の創作において重要な二つの主題もあらわれている。記憶の投影、沈黙、「永遠のものと束の間のもの」、この三つの主題は『撮影された生活』の前後の作品でも登場するが、この番組のナレーション以前と以後では内容が大きく変化している。したがってこのテレビ番組の仕事が作家の作品のなかで蝶番として機能していると考えることが出来るだろう。ナレーションの分析によって、前年度に引き続きペレックの創作におけるメディア作品の重要性に焦点を当てることができた。この番組についての分析の成果は『早稲田大学文学研究科紀要』に掲載された。フランス国立図書館やジョルジュ・ペレック協会で収集した草稿、先行研究、書簡を参照し、メディア作品にみられる精神分析の痕跡、テクストの固有名にあらわれる映画俳優の影と小説の人物描写の関係について詳らかにしつつある。これまでの成果から研究をより発展させるために、ペレックが制作にかかわったメディア作品の総合的な分析を行っていく。具体的には、『エリス島物語』、『撮影された生活』、『家出の道筋』、『セリ・ノワール』についても創作ノートを参照し、映像作品の創作経験が小説やエッセイの創作に、小説の創作経験が映像作品にどのように取り込まれていったのかを検証する必要がある。ラジオ番組については、「1978年5月19日にマビヨン通りで見られた事象の描写の試み」を分析する必要があるだろう。なぜならこの番組の内容は未完の作品『場所』と密接につながっているからである。番組の分析を通じて、テクストを書く経験がラジオ番組にどのように生かされていたのかを示すことができるだろう。また、当初の計画で今年度の末から行う予定だったペレックと修辞学という主題についても作品の分析を進めていく。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
クルマエビにおけるD-グルタミン酸の生合成機構および生理機能の解明

クルマエビの雄の生殖腺に存在するD-グルタミン酸の生理機能を明らかにするために、生殖腺を精巣、輸精管および生殖口に分けてD-グルタミン酸の分布を測定したところ、全ての組織にD-グルタミン酸は検出されたが、特に輸精管では全グルタミン酸の80%をD体が占めていた。さらに、動物組織で初めてグルタミン酸ラセマーゼ活性が検出されたことから、クルマエビに存在するD-グルタミン酸の生合成経路が明らかとなった。水生無脊椎動物の諸組織中には、D-アラニンとD-アスパラギン酸が存在していることが知られており、D-アラニンは甲殻類や二枚貝では海水順応過程でL-アラニンとともに蓄積されることから、細胞内等浸透圧調節の主要なオスモライトの1つであると考えられている。一方、クルマエビの生殖腺では、動物組織ではほとんど検出されていなかったD-グルタミン酸が特異的に存在しており、全D-グルタミン酸の50%以上をD体が占めていることが明らかとなった。そこで、本研究では、クルマエビ生殖腺に存在するD-グルタミン酸の生合成機構および生理機能を解明するために、高浸透圧環境下における精巣のD-グルタミン酸含量の変動を明らかにするとともに、精巣に存在する代謝産物およびタンパク質を網羅的に解析することで、D-グルタミン酸の代謝系に関わる因子の全容を明らかにすることを目的とした。本年度は、まずクルマエビ各生殖組織におけるD-グルタミン酸の分布を明らかにした。オスの生殖腺を、精巣、輸精管および貯精嚢に分け、各組織に存在するD-グルタミン酸含量の測定を行ったところ、いずれの組織においてもD-グルタミン酸は検出されたが、特に輸精管において多量のD-グルタミン酸が存在しており、全グルタミン酸に占めるD体の割合はおよそ80%を占めていた。さらに、D-グルタミン酸抗体を用いて免疫染色を行ったところ、精巣の精祖細胞にD-グルタミン酸の分布が認められたため、D-グルタミン酸は精子の形成に関係していることが示唆された。また、クルマエビを高塩濃度海水に順応させたところ、精巣のD-アラニン含量の増加は認められたが、D-グルタミン酸含量の著しい増加は認められなかったことから、精巣におけるD-アラニンとD-グルタミン酸の生理機能は異なるものと考えられた。一方、クルマエビの生殖腺では、動物組織ではほとんど検出されたことがなかったD-グルタミン酸が特異的に存在しており、全グルタミン酸の50%以上をD体が占めていることを明らかにした。そこで、本研究では、クルマエビ生殖腺に存在するD-グルタミン酸の生合成機構および生理機能を解明するために、各生殖組織におけるD-グルタミン酸の分布を明らかにするとともに、高浸透圧環境下におけるD-グルタミン酸含量の変動を明らかにすることとした。クルマエビ各生殖組織におけるD-グルタミン酸の分布を明らかにするために、オスの生殖腺を、精巣、輸精管および貯精嚢に分け、各組織に存在するD-グルタミン酸含量の測定を行ったところ、いずれの組織においてもD-グルタミン酸は検出されたが、特に輸精管において多量のD-グルタミン酸が存在しており、全グルタミン酸に占めるD体の割合はおよそ80%を占めていた。さらに、抗D-グルタミン酸抗体を用いて各組織の免疫染色を行ったところ、精巣の精祖細胞にD-グルタミン酸の分布が認められたため、D-グルタミン酸は精子の形成に関係していることが示唆された。さらに、各生殖組織のメタボローム解析を行ったところ、代謝産物のパターンは大きく異なっており、それぞれの組織が異なる機能を有していることが特徴づけられた。生化学今年度は、クルマエビ生殖腺におけるD-グルタミン酸の分布を明らかにするとともに、高浸透圧環境下における精巣のメタボローム解析を行う予定であった。生殖腺におけるD-グルタミン酸の分布については、各生殖組織におけるD-グルタミン酸含量の測定を行い、D-グルタミン酸抗体による免疫染色も順調に進めることができたが、クルマエビの飼育環境のコントロールに難航したため、メタボローム解析まで到達できなかった。

しかしながら、そのかわりに次年度行う予定であったD-グルタミン酸生合成酵素活性の検出に成功できたことから、本研究はおおむね順調に進展しているものと考えられる。今後は、今年度行えなかったクルマエビ生殖腺のメタボローム解析を行うとともに、次年度に予定していた高浸透圧環境下におけるクルマエビ精巣のタンパク質発現変動の解析を合わせて行うことで、D-グルタミン酸の代謝系に関わる因子の全容を明らかにしていく。また、次年度にD-グルタミン酸生合成酵素の活性測定を行う予定であったが、D-グルタミン酸生合成酵素の活性は本年度確認することができたため、その分メタボローム解析に専念することができる。また、D-グルタミン酸生合成酵素の活性測定の際に、精巣のタンパク質抽出条件の検討も行ったことから、プロテオーム解析についても順調に遂行できると考えている。本研究では、試料である活きたクルマエビをできるだけ良い状態でサンプリングすることが重要であるが、飼育環境のコントロールに難航し、当初予定していたメタボローム解析まで到達できなかった。また、D-グルタミン酸抗体の免疫染色も今年度は予備検討までで終了したため、メタボローム解析および免疫染色の本試験にかかる費用を翌年度に持ち越すこととなった。翌年度に持ち越した助成金は、今年度達成できなかったメタボローム解析および免疫染色にかかる委託分析費用として使用する。翌年度分として請求した助成金については、プロテオーム解析を行うための物品費や委託費として使用する。
ウイルス性慢性肝炎モデルのための免疫機能を保持したヒト肝細胞キメラマウスの作成

ウイルス性肝疾患に対する治療法研究が困難な理由として、ウイルスの種特異性によりマウス、ラットといった簡便な実験動物による研究が不可能な点が挙げられる。そこで本研究では免疫機能を保持したヒト肝細胞キメラマウスの作製を目指して研究を行った。その結果、(1)ヒトiPS細胞を用いた肝幹・前駆細胞の純化・長期培養系を確立し、移植用のヒト肝細胞の有力な候補として考えられた。(2)肝障害誘導マウスを用いた、生体由来肝幹・前駆細胞の移植系の構築として、マウス新生仔への肝前駆細胞の移植法の検討などを行った。肝炎ウイルスの持続感染に伴う慢性肝炎は、肝硬変・肝癌の原因となる。ヒト肝炎ウイルスは種特異性を持ち、実験動物を用いた解析が困難であった。そこで、新規病態解析モデル系構築のため以下の研究を行う。1.ヒトiPS細胞からの肝幹・前駆細胞の純化・培養系の構築申請者らは当研究室で樹立したヒトiPS細胞を、定法に従い複数のサイトカインで連続的に刺激して、HNF4α,α-フェトプロテイン陽性の肝細胞様細胞を誘導した。この細胞を、肝幹細胞の表面抗原マーカーであるCD13およびCD133の特異的抗体を用いて染色・解析した結果、サイトカイン刺激依存的にCD13、CD133両陽性の細胞が出現した。CD13+CD133+細胞をフローサイトメトリーを用いて分離しフィーダー細胞上で低密度培養を行ったところ、細胞1個から増殖した大型のコロニーが多数得られることが分かった。このコロニーは、HNF4α,α-フェトプロテイン陽性でトリプシン等の処理により継代培養が可能であり、約1月にわたり持続的に増殖できる。この細胞をスフェロイド形成による3次元培養を行うことで、CYP3A4やCYP7A1といった成熟肝細胞機能遺伝子の発現誘導が見られた。以上の結果から、ヒトiPS細胞からCD13およびCD133両陽性の肝幹・前駆細胞様細胞を純化・培養できたと考えられる。今後、この細胞をマウスに移植することで、生体内で生着・増殖が可能か検討する。2.肝障害誘導マウス胎仔を用いた、生体由来肝幹・前駆細胞の移植系の構築マウス胎仔・新生仔肝臓への細胞移植の条件検討のために、GFPマウス胎仔より分離したCD13,CD133陽性細胞の移植実験を行った。新生仔マウスの肝臓または系静脈的に実体顕微鏡下で細胞移植を行った。移植後、1週間から1カ月での細胞の動態を観察した結果、肺への異所的な生着が見られる一方で一部の細胞は肝臓への生着が見られた。(2)次に得られた肝臓系細胞の中に、高増殖性と多分化能を持つ肝前駆細胞が存在するか検討を行った。当研究室では、マウス胎仔由来の肝前駆細胞を用いた網羅的解析によって、その特異的表面抗原マーカーとしてCD13(Aminopeptidase N)およびCD133(Prominin 1)を同定している。そこで、純化したヒトiPS細胞由来CD13+CD133+細胞をマウス胎仔線維芽細胞上で培養を行ったところ、シングルセルに由来するAFP+HNF4A+の肝細胞様コロニーが多数形成され、この分画に高い増殖性を持つ肝前駆細胞様細胞が濃縮されていることがわかった。(3)CD13+CD133+細胞をMEF上で培養しコロニーを形成した後に増殖細胞特異的マーカーKi67での染色を行った結果、多数のKi67陽性細胞が観察された。また得られたコロニーをトリプシンによって分散し継代培養を繰り返した結果、1月以上にわたり継続して増殖可能なこと、また継代培養を重ねた細胞でも肝細胞様のコロニーの形成能を保持していることを見出した。(4)CD13+CD133+細胞から形成されたコロニーを酵素的に分散し、ハンギングドロップ法によってスフェロイドを形成させたのちに様々な肝細胞マーカーの発現を解析した結果、この細胞が成熟肝細胞様の細胞への分化能を保持していることが確認された。1.ヒトiPS細胞からの肝幹・前駆細胞の純化・培養系の構築当研究室で独自に樹立したヒトiPS細胞由来肝幹・前駆細胞の純化・培養系による検討を行った。ヒトiPS細胞をサイトカイン存在下で培養し、肝幹細胞表面マーカーCD13, CD133両陽性細胞をフローサイトメトリーを用いて分離した結果、HNF4α, α-フェトプロテイン陽性でトリプシン等の処理により継代培養が可能な肝幹・前駆細胞様細胞を得ることができた。