hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
活イカの巨大軸索を用いた軸索機能再建に関する研究

神経移植などは再生における有効な手段として臨床に応用されているが、完全に満足のいく効果が得られない場合も多い。そこでWaller変性する前に神経軸索をつなぐ実験を構築することとした。活イカ巨大軸索を用いて観察することを目指した。計画前には明らかでなかった活イカの疼痛対策を行うため、高侵襲実験法に対する麻酔法を確立した。また巨大電気生理学的な軸索刺激および伝導速度計測法を確立した。同時に蛍光マーカーを用いて軸索輸送の動きを観察し軸索輸送の回復過程を観察する方法については、ミトコンドリア染色の困難さと想定よりも高倍率が必要であることが分かり、今後染色法や染色標的の変更により可視化を検討中である癌などの腫瘍切除後、マイクロサージェリー技術を用いて神経吻合・神経移植・血管付き神経筋移植などを行っている。しかし神経再生のための足場を構築しているに過ぎない。欠点としてI)神経再生までに一般的に数カ月かかり、効果器である筋などは再生神経到達前に萎縮してしまい本来の機能回復を得られない。II)神経軸索再生時に神経鞘が瘢痕化し再生軸索数が制限されることがあげられる。今回の研究でこれらの欠点を突破する神経軸索融合を目指す基礎的実験を行っている。細胞内骨格およびモータータンパクなどの移動などが“生きたまま"可視化でき、電気生理学的手法の併用で、Waller変性回避の細胞内変化と機能回復過程とが同時に確認することを目的として実験を行った。平成24年度は生きたヤリイカ(冬季)およびスルメイカ(夏季)を用いて、平成23年度にて確立が出来ていない、軸索内輸送の蛍光観察手法を確立をめざした。1)巨大軸索の正常軸索内輸送の観察手法を確立するため、現在他の蛍光マーカー(JC-1等)による染色実験及び光学顕微鏡による観察実験を計画した。2)筋電図および神経伝導速度等の計測データについて検討を行いつつ、来年度圧迫挫滅実験を行いそのデータを集積する予定である圧迫挫滅実験の電気生理学的・分子解剖学的データおよびスミソニアン博物館のデータをもとにその再生過程を比較検討することとした。切断・坐滅により神経はWaller変性を起こすことが知られている。現在の医学では変性後の神経をいかに再生させるかが最重要とされている。その理由はI)筋などは再生神経到達前に萎縮して本来の機能回復を得られない。II)神経軸索再生時に神経鞘が瘢痕化し再生軸索数が制限される。ことである。そこで発想を転換し、Waller変性する前に切断された神経軸索をつなぐこと実験モデルを構築することとした。活イカの巨大軸索を用いて、まず経時的な電気生理学的手法および分子解剖学的手法を用いて観察することを目指した。同時に蛍光マーカーを用いて軸索輸送の動きを観察し軸索輸送の回復過程を観察する方法については、想定よりも高倍率が必要であることが分かり現在共焦点蛍光顕微鏡等を用いて実験を行い、軸索内染色を確立した。細胞内骨格およびモータータンパクなどの移動などが"生きたまま"可視化でき、電気生理学的手法の併用で、Waller変性回避の細胞内変化と機能回復過程とが同時に確認することを目的として実験を行った。平成23年度は生きたヤリイカ(冬季)およびスルメイカ(夏季)を用いて、1)巨大軸索の正常軸索内輸送の観察手法を確立すること。2)圧迫による軸索挫滅後、軸索機能再生の変化を経時的に電気生理学的手法および分子解剖学的手法を用いて観察する。電気生理学的には軸索に対し電気刺激を行い、筋電図および神経伝導速度等を適宜計測し機能回復過程を観察する。同時に蛍光マーカーを用いて軸索輸送の動きを観察し軸索輸送の回復過程を観察することをめざした。平成24年度は昨年切断後再接合の前段階として活イカを用いて冷水麻酔下に背側より巨大軸索を露出させ, In vivoで実験を行っていたが、実験中に起こるイカの急激な内腔圧上昇による内臓破裂を経験していた。

特に神経露出時にイカが暴れることから、痛みを感じている可能性が考えられたため、神経節に神経ブロックを行う手法を開発し、これにより神経の露出および刺激挫滅実験を安定的に行うことが可能となった。1)軸索内ミトコンドリアを蛍光マーカーとしてmitotrackerやJC-1にて染色実験をおこなったが、観察は困難であったため、現在他の蛍光マーカーによるミトコンドリア以外の染色実験を行っている。平成23年度は切断後再接合の前段階として活イカを用いて冷水麻酔下に背側より巨大軸索を露出させ, In vivoで実験を行う手法の安定化を図れた。・In vivoにおける正常活イカ軸索の電気生理学的データを取得する。1)巨大軸索の正常軸索内輸送の観察手法を確立することを目的に、軸索内微小管および微小管上を走行するモータータンパクのうちKIF1bによって運ばれるミトコンドリアを蛍光マーカーにて染色し、経時的変化を実体顕微鏡および蛍光顕微鏡にて観察し使用する適切な蛍光マーカーをmitotrackerとして染色実験をおこなった。また適切な濃度および使用方法についても検討をおこなったが、実体蛍光顕微鏡ではmitotrackerの染色による観察は困難であったため、現在他の蛍光マーカーによる染色実験及び光学顕微鏡による観察実験を計画中である。2)圧迫による軸索挫滅後、軸索機能再生の変化を経時的に電気生理学的手法および分子解剖学的手法を用いて観察については、刺激装置の設定および刺激電極の開発をおこなった。軸索に対し電気刺激を行い、筋電図および神経伝導速度等を適宜計測した。in vitroにおける巨大軸索の神経伝導速度とほぼ同等であり、コントロールとして使用可能であると考え、来年度圧迫挫滅実験を行いそのデータを集積する予定である。2)圧迫による軸索挫滅後、軸索機能再生の変化を経時的に電気生理学的手法および分子解剖学的手法を用いて観察については、昨年度から行っている圧迫挫滅実験を追加で行いそのデータを集積する予定である。1)巨大軸索の正常軸索内輸送の観察手法を確立するため、現在他の蛍光マーカー(JC-1等)による染色実験及び光学顕微鏡による観察実験を計画中である。2)筋電図および神経伝導速度等の計測データについて検討を行いつつ、来年度圧迫挫滅実験を行いそのデータを集積する予定である。平成24年度の実験データの解析まとめと追加実験を行う。平成24年度にも確立が出来ていない、軸索内輸送の蛍光観察手法を確立する。手法の確立後In vivoにおける正常活イカ軸索切断後の再生に関する検討を圧迫実験と同じ手法を用いて行い、分子解剖学的データを比較検討する。これと並行して圧迫実験による電気生理学的変化のデータを取得する。。上記が予定通り遂行されれば、東京大学工学部と協力し、電気的細胞融合法を用いた細胞融合法の確立をめざす。軸索に孔を作成しこれをシーリングすることをめざす。
眼球運動中の知覚特性を利用した視覚情報提示手法の研究

人間の感覚情報のなかで視覚情報は大きな割合を占めるものであり,これまで様々な視覚情報提示手法が提案されている.そして視覚情報提示において,2次元情報提示はその基礎をなすものである.一般に2次元の視覚情報を提示するためには2次元光源が必要となる.しかし,1列の光源がなんらかの運動を行う,もしくは観察者が眼球運動を行うと,1次元光源でも2次元情報を提示することが可能となる.本研究では,サッカードと呼ばれる高速眼球運動を利用した手法に着目し,2次元光源とスクリーンを利用したこれまでの提示手法とは異なる,新たな視覚情報提示手法の可能性を探り,その設計に必要な人間の視知覚特性を調べた.具体的にはサッカード時に生じる残像の空間特性・時間特性について調べた.空間特性(残像の知覚される位置,形態)について,これまで,サッカードを利用した情報提示で使用しているような,ある時間幅を持った光点刺激(例えば,高速に連続点滅するフリッカー刺激)に対しての定位,形態を同時に調べた研究は存在していなかった.そこで,サッカードに対して様々なタイミングでフリッカー刺激を提示し,その定位される位置,形態を調べた.その結果,サッカード時に時間幅を持って提示された光点刺激の定位は,はじめに刺激間の形態表象(一点や点列)が網膜像に基づいて形成され,その形態表象をまとめて定位しているということがわかった.また,時間特性(サッカード時に知覚される残像の持続時間)について,これまでサッカード時に生じる残像がどの程度の時間,保持されるか調べられていなかった.そこで,サッカード時の残像の持続時間を,これまで調べられてきた固視時の持続時間の計測手法に倣って計測した.その結果,サッカード時の残像は固視時と同等の時間保持されていることがわかった.人間の感覚情報のなかで視覚情報は大きな割合を占めるものであり,これまで様々な視覚情報提示手法が提案されている.そして視覚情報提示において,2次元情報提示はその基礎をなすものである.一般に2次元の視覚情報を提示するためには2次元光源が必要となる.しかし,1列の光源がなんらかの運動を行う,もしくは観察者が眼球運動を行うと,1次元光源でも2次元情報を提示することが可能となる.本研究では,サッカードと呼ばれる高速眼球運動を利用した手法に着目し,2次元光源とスクリーンを利用したこれまでの提示手法とは異なる,新たな視覚情報提示手法の可能性を探り,その設計に必要な人間の視知覚特性を調べた.具体的にはサッカード時に生じる残像の空間特性・時間特性について調べた.空間特性(残像の知覚される位置,形態)について,これまで,サッカードを利用した情報提示で使用しているような,ある時間幅を持った光点刺激(例えば,高速に連続点滅するフリッカー刺激)に対しての定位,形態を同時に調べた研究は存在していなかった.そこで,サッカードに対して様々なタイミングでフリッカー刺激を提示し,その定位される位置,形態を調べた.その結果,サッカード時に時間幅を持って提示された光点刺激の定位は,はじめに刺激間の形態表象(一点や点列)が網膜像に基づいて形成され,その形態表象をまとめて定位しているということがわかった.また,時間特性(サッカード時に知覚される残像の持続時間)について,これまでサッカード時に生じる残像がどの程度の時間,保持されるか調べられていなかった.そこで,サッカード時の残像の持続時間を,これまで調べられてきた固視時の持続時間の計測手法に倣って計測した.その結果,サッカード時の残像は固視時と同等の時間保持されていることがわかった.
同定誤差評価を考慮したシステム同定法に関する研究

本研究の目的は、システムモデルの同定を、丸め誤差、打ち切り誤差などの計算誤差も考慮した同定精度まで含め、客観的かつ定量的に行なうための手法を、確定システムのみならず観測雑音など確率的要素を含む確率システムについて考察する。1.同定誤差の評価と改良同定アルゴリズムの開発同定アルゴリズムの実行において、丸め誤差、打切り誤差などの計算誤差が同定誤差にどのように影響するかについて把握するために、区間演算法をバッチ型の同定アルゴリズムに組み込んで、計算誤差の大きさが同定結果にどのように影響するかについて検討した。この解析に基づき同定誤差を減少させるアルゴリズムの開発にも取り組んだ。2.確率近似型逐次推定法における収束性解析と改善確率近似型逐次推定法によって時間とともに変動する非線形回帰方程式の根を推定する問題に対し、収束性の改善を図るために残差の経験分布を求めて、これに基づいて修正量を変換するアルゴリズムを導出し、その漸近的挙動の解析を理論的に行なった。またランダム打ち切りを用いて、時間とともに変動する非線形回帰方程式の根を推定するための確率近似型逐次推定法の収束条件の緩和についても検討を進め、さらに確率近似型非線形フィルタにも応用した。3.モデルに不確定さが存在するときのシステムの変化検出モデルに不確定さが存在する場合について、システムの変化検出を速やかに検知するための手法について考察を行なった。このとき、バッチ型同定法に加えて、これに対峙する逐次同定法についても検討するほか、同定法の開発も視野において研究を展開している。1.確率近似型逐次推定法における収束性解析確率近似型逐次推定法によって時間とともに変動する非線形回帰方程式の根を推定する問題に対し、収束性の解析を行ない、従来よりゆるい条件下での収束を証明した。この結果は非線形システムの状態推定へ応用の可能性が期待できる。2.計算誤差の同定誤差に与える影響に関する考察同定アルゴリズムの実行において、丸め誤差、打ち切り誤差などの計算誤差が同定誤差がどのように影響するかについて把握するために、計算誤差の大きさを定量的に評価する手法の一つである区間解析法を、システム同定に適用することの可能性の検討を開始したが、十分な成果はまだ得られていない。本研究の目的は、システムモデルの同定を、丸め誤差、打切り誤差などの計算誤差も考慮した同定精度まで含め、客観的かつ定量的に行なうための手法を、確定システムのみならず観測雑音など確率的要素を含む確率システムについて考察する。このとき、バッチ方同定法に加えて、これに対峙する逐次同定法についても検討するほか、同定法、システムの変化検出法の開発も視野において研究を展開している。1.確率近似型逐次推定法における収束性解析と改善確率近似型逐次推定法によって時間とともに変動する非線形回帰方程式の根を推定する問題に対し、収束性の改善を図るために残差の経験分布を用いて、修正値を変換する手法を提案し、数値実験によりその有効性を検証した。この手法では観測誤差を観測値と推定値の外挿から評価していることになっている。2.計算誤差の同定誤差に与える影響に関する考察同定アルゴリズムの実行において、丸め誤差、打切り誤差などの計算誤差が同定誤差にどのように影響するかについて把握するために、計算誤差の大きさを定量的に評価する手法の一つである区間解析法を、システム同定に適用することの可能性の検討を行なっている。3.モデルに不確定さが存在するときのシステムの変化検出モデルに不確定さが存在する場合について、システムの変化検出を速やかに検知するための手法についての考察を進め、補助入力を加えることの有用性を示した。このとき、従来多くとりあげられている入出力データをすべて入手した後での(バッチ型)同定法に対し、これに対峙する逐次同定法についても検討し、この基礎の上に、計算誤差を含め同定精度を考慮した同定法を開発することにある。

1.逐次同定法による同定誤差の評価と改良同定アルゴリズムの開発入出力データを入手する毎にシステムモデルを逐次的に修正する逐次同定法に対し、同定誤差を評価し、これに基づき同定誤差を減少させるアルゴリズムの開発に取り組んだが、このアルゴリズムの性能評価は今後に委ねることとなる。2.確率近似型逐次推定法における収束性解析と改善確率近似型逐次推定法によって時間とともに変動する非線形回帰方程式の根を推定する問題に対し、ランダム打ち切り手法の導入により収束条件の緩和を図った。またその性能を数値実験により評価し、有効性を確認した。3.モデルに不確定さが存在するときのシステムの変化検出モデルに不確定さが存在する場合について、システムの変化検出を速やかに検知するための手法について、引き続き考察を行なった。なおIECON2000で発表した成果の一部はConference Paper Awardを受賞した。
IVIMイメージングによる人組織血液酸素飽和度の定量

MRI拡散強調画像は、ランダムに位置を変える(水)分子の集合から得られる信号を捉えることができる。b値と呼ばれるパラメータを大きくするほど、僅かな動きを捉えることができる。生体の分子は、熱運動以外に血流に伴う運動もしている。毛細管など微小血管の向きの分布はほぼ等方的と考えられ、血流に乗った分子の運動はランダムな移動と見なすことができる。血流は速いので、小さなb値でも信号変化が生ずる。一方で熱運動は、より大きなb値で変化が明瞭となる。さらに生体中では、細胞膜などで自由な熱運動が制限され(制限拡散)位置の変化が小さくなるので、さらに大きなb値を用いると制限拡散による信号変化が明瞭となる。IVIMは、大小の複数のb値を用いて、血流を含めた分子の運動を捉えようとする方法である。しかし、組織の血液量が小さいと、血流の信号が小さく、ノイズに埋もれて捉えることが難しくなる。さらに、脳では脳脊髄液、腎では尿細管内液からの信号も考慮する必要がある。液体の信号はFLAIRという撮像法を用いて抑制することができると考えられる。これら3成分(血液、組織水、自由水)を考慮に入れたモデルを作り、様々な条件下でIVIMの信号のシミュレーションをおこない、さらに、その信号から得られるパラメータを評価した。その結果、臨床的撮像条件においては、画素ごとに計算する場合、血液量が10%程度以上あれば、血液酸素飽和度を推定可能であるという結果が得られた。脳では血液量が5%以下であり、画素ごとの解析では困難であり、画素の集合を平均した信号を用いるなどの工夫が必要と考えられた。結果の一部は、2018年国際磁気共鳴医学会と日本磁気共鳴医学会の大会で報告した。・シミュレーションを行うための計算モデルを構築するプログラミングに時間がかかり、シミュレーションの一部は、まだ行われていない。・微小血管を模した水流ファントムも作成中であり、現在、基本的なデザインと型取りが完成したところである。微細構造の作成に手間取り、まだ完成していない。・シミュレーションの方法は、ほぼ定まっているので、これには、これまで以上の時間を割り当てて、2019年度半ばまでにはシミュレーションを完了することを目指す。これが完了した後、2019度後半に健常ボランティアの撮像を行う。・ファントム制作の作業は、その中心部分が既に製造工程に入った段階にある。それが出来上がればファントム全体を作成ことは1ヶ月程度で可能と考えられる。完成すればMRIの撮像を開始する。2018年度に、旅費を少しだけ節約できたためで、2019年度は旅費が不足する見込であり、これを充てる予定である。
遺伝子発現プロファイリングによる閉塞性細気管支炎(慢性肺拒絶)の発生機序の解明

臓器移植より多くの命が救われるようになった一方で、慢性拒絶による臓器不全で死に至る場合が少なくない。慢性拒絶の発生機構を知ることを目的として、ラット気管の大網移植モデルにより同種の免疫依存性ならびに免疫非依存性の気管閉塞に関わる因子を同定した。これらの分子群の機能調節によって、移植された臓器組織の生着率の向上につながるかどうか検討を重ねたい。ラットを用いて気管を腹部大網内に移植した。対照群を同系移植(LEWラット->LEW)とし,同種移植群(BN->LEW)(同種免疫応答が介在),脱上皮処理+同系移植群(LEW->LEW)(同種免疫応答非依存性)を実験群とした。大網に移植した気管はOTCコンパウンドにより凍結保存した。その凍結材料を厚さ10mmで薄切しプレパラートに付着後エタノールー酢酸にて固定した。それらを脱ヌクレアーゼ水で処理し、組織片よりtotal RNAを抽出してプローブ用aRNAを合成した。aRNAはcy3あるいはcy5でラベルし、マイクロアレイ解析を行った。得られた結果に基づき発現変動遺伝子を抽出し、遺伝子オントロジー解析やパスウェイ解析を行い検討した。同系移植した気管(ISO気管)、同種移植した気管(ALLO気管)、同系移植ではあるが気管上皮を脱落処理した後同系移植した気管(Denude-ISO気管)の3群間で明らかな差異が認められた。すなわち、ALLO気管ではT細胞やB細胞の活性化や細胞遊走に関わるケモカインの発現が顕著であった。一方でDenude-ISO気管ではMHCに基づく免疫応答の充進は認められなかったものの、ニューロペプチドYやバゾプレシンなどのホルモン受容体に関わる遺伝子発現の増加が認められた。他にもDenude-ISO気管特異的な発現を示す遺伝子群があり、これらの機能的意義について今年度解析を進めて行きたい。昨年に行ったマイクロアレイのデータに基づき発現変動遺伝子を抽出し、遺伝子オントロジー解析やパスウェイ解析を行い検討した。同系移植した気管(ISO気管)、同種移植した気管(ALLO気管)、同系移植ではあるが気管支粘膜を脱落処理した後同系移植した気管(Denude-ISO気管)の3群間で差異が認められた。その中で特に変動値が明確であったものを9種類選び、8個体の気管組織よりtotal RNAを抽出して定量PCRによる再解析を行ったところ、2つの遺伝子がマイクロアレイによる変動と同じ挙動を示した。すなわちDenude-ISO気管で特異的な発現上昇を確認できた遺伝子はcoagulation factor II(thrombin)受容体であり、その発現はISO気管はもとよりALLO気管でも低い傾向を示していた。coagulation factor II受容体は7回膜貫通型のG蛋白共役型受容体に属し線維化や炎症反応に調節に深く関わっているため、Denude-ISO気管におけるその機能的意義に大変興味が持たれた。また、RAS-related C3 botulinum substrate2(RAC2)はALLO気管で発現が高かった遺伝子であり、Th2細胞に高発現するsmall GTP-binding proteinとして知られる。従って同種間の免疫細胞応答が活発に行われていたことを示しているものと考えられた。
プロテオソーム解析による新規脳腫瘍マーカーの臨床応用における有用性の検討

悪性腫瘍である神経膠腫患者の血清をプロテオソーム解析技術により腫瘍マーカーとなりうる蛋白の候補を見つけることができた。そのタンパクは既知のものではあるが、腫瘍マーカーとして知られているものではなく、新規の脳腫瘍の腫瘍マーカーとなりえる可能性のあるタンパク質であった。次にこのタンパクが脳腫瘍のみに特異的に発現しているかを調べるために、このタンパクの抗原に対し抗体を作成し、様々な脳腫瘍に対する免疫染色を行った。その結果、このタンパクは悪性神経膠腫に多く発現し、それ以外の良性脳腫瘍、転移性脳腫瘍での発現は少なかった。このとこから、このタンパクは良性脳腫瘍と原発性でない悪性脳腫瘍(癌)での発現が少ないことから、このタンパクの血清値が高いものは原発性悪性神経膠腫である可能性が高く、悪性神経膠腫の腫瘍マーカーとして使用可能と考えられた。また、これと同時進行に行った5-aminolevulinic acid (5-ALA)を使用した時の尿中のポルフィリン測定が腫瘍マーカーとして有用であるかを検討した。悪性腫瘍では5-ALAをヘムの基質として多く取り込み、それを腫瘍細胞内で合成をするが、ヘムが合成されるひとつ前のポルフィリンであるprotoporphyrin IX (PPIX)が悪性腫瘍では多く産生されていることは知られていた。しかし、それ以外の中間代謝物のポルフィリン代謝については不明であった。我々の検討では、この中間代謝物であるポルフィリンのうち、血清と尿中のcoproporphyrinの濃度が、悪性神経膠腫で高くなることがわかった。これらの値も、転移性脳腫瘍では悪性神経膠腫に比べ低く、腫瘍マーカーとして有用であることがわかった。これらのことは、今回の検討で初めて明らかにされたことであり、今後腫瘍マーカーとして有用な知見であった。
緑内障モデル動物におけるGPNMBの発現解析と治療への試み

緑内障モデルであるマウス軸索挫滅で、RT-PCR法、蛍光色素の逆行性染色法、ウェスタンブロッティング法により、網膜神経節細胞の特異的マーカーの発現をみると経時的に減少していた。緑内障モデル動物の網膜における網羅解析で発現が上昇していた、緑内障においても神経保護機能を有する可能性があると考えられるGlycoprotein nonmetastaticmelanoma protein Bについて軸索挫滅4日後をピークに有意なタンパク質の発現上昇が認められた。軸索挫滅時における網膜神経節細胞の詳細な障害パターン、緑内障の分子病態の解明および薬効評価実験における基礎的なデータが得られた。1.緑内障モデル動物の作製と網膜神経節細胞障害の評価正常眼圧緑内障モデル動物の作製として、視神経軸索挫滅後の網膜神経節細胞(RGC)障害の評価を行った。RNA発現変化は網膜神経節細胞に特異的に存在するThy1, Nefh, Brn3a, Brn3b, Brn3cに加え、近年報告された新たな特異的マーカーであるRbpmsの遺伝子発現量をqRT-PCRで調べた。無治療、軸索障害後2,4,7日後の網膜を回収し、RNA抽出、cDNA合成の後にリアルタイムPCRを行った。その結果、Thy1, Nefh, Brn3a, Brn3b, Brn3cおよびRbpmsの発現は軸索障害後に経時的に減少していた。生存RGC密度を定量化するために、脳からの逆行性染色法により網膜神経節細胞をラベルし、染色されたRGC密度を網膜伸展標本で蛍光顕微鏡下に計測した。軸索障害後7日後の網膜では無処置のマウス網膜に比べて網膜神経節細胞数が有意に減少した。RBPMSのタンパク質発現をウェスタンブロッティングおよび免疫染色法にて確認したところ、軸索障害後7日後では、軸索障害後に著明な発現の減少を認めた。これらの結果から、視神経挫滅により経時的なRGCの減少が示唆され、緑内障モデル動物の作製とRGC障害の変化を確認できた。2.網膜神経節細胞障害時におけるGPNMBの発現解析上記の緑内障モデル動物を用いて、網膜神経節細胞障害後の網膜内におけるGPNMBの発現を調べた。ウェスタンブロッティング法および免疫組織化学によりGPNMBの網膜内タンパク質発現および局在を検討した。しかしながらウェスタンブロッティング法、免疫染色によるGPNMBの発現を検出することができなかった。網膜内のGPNMB発現をウェスタンブロッティング法および免疫組織化学により確認することができず、GPNMBの網膜内局在やタンパク質としての生理的機能を検証する段階にまで至ることができなかった。試薬や実験方法を再度検証する必要がある。前年度では、正常眼圧緑内障モデルであるマウス軸索挫滅により、神経保護効果の対象となる網膜神経節細胞の継時的な障害をRT-PCR法、蛍光色素の逆行性染色法、網膜神経節細胞の特異的マーカーであるRBPMSのウェスタンブロッティング法により確認することができた。一方で、標的であるGPNMBのタンパク質を網膜組織内で検出することができなかった。そのため本年度は、GPNMBのタンパク質発現を検討する予備実験として、マウス軸索挫滅により誘導されるGPNMBが高発現される時期を調べるため、軸索挫滅後のマウス網膜を継時的に摘出し、GPNMBのmRNA発現レベルをRT-PCR法により検証した。その結果、軸索挫滅2日後の網膜内GPNMBは未処置眼に比べて約4倍(p=0.03)、軸索挫滅4日後では約5.5倍(p=0.006)、軸索挫滅7日後では約2倍(p=0.03)の有意な上昇が認められた。軸索挫滅7日後にGPNMB発現レベルが軸索挫滅2日後、軸索挫滅4日後に比較して低いレベルであった理由として、軸索挫滅7日後では網膜神経節細胞が変性、減少することを反映している可能性が示唆された。また、GPNMBのmRNA発現レベルは軸索挫滅4日後にピークであったことから、網膜内GPNMBのタンパク質発現レベルを検討するには軸索挫滅4日後が最適であると考えられるため、今後検討する。また、軸索挫滅4日後は網膜神経節細胞の細胞死が有意に上昇する時期であることが当研究室の津田らの報告から明らかとなっており(Tsuda et al., Exp Eye Res. 2016)、GPNMBがその細胞死を抑制するために代償的に発現している可能性が考えられた。〈1.網膜神経節細胞障害時におけるGPNMBの発現解析〉前年度に引き続き、網膜神経節細胞障害時におけるGPNMBの発現解析の条件検討を行い、軸索障害モデル動物の網膜におけるGPNMBの遺伝子発現およびタンパク質の発現レベルを生化学的、分子生物学的ならびに免疫組織学的な手法を用いて評価し、GPNMBの緑内障における関与を明らかにする。〈2.緑内障モデル動物におけるGPNMB過剰発現を用いた神経節細胞保護の評価〉

軸索障害モデル動物の眼内にGPNMBを過剰発現させるウイルスベクターを投与し、網膜神経節細胞にGPNMBを過剰発現させることで緑内障における網膜神経節細胞死の抑制を試みる。細胞死の評価法として、生細胞数を直接カウントする他、網膜神経節細胞のマーカー遺伝子の発現レベルを測定する。加えて、網膜内死細胞を蛍光眼底in vivoイメージングにより計測してその神経保護作用を評価する。〈3. GPNMB過剰発現による神経保護メカニズムの解明〉GPNMBによる細胞死抑制の分子メカニズムを解明する。特に、緑内障の原因および進行と関連があるとされている酸化ストレスおよび小胞体ストレス存在下において、GPNMBがどのようなシグナル経路を経て細胞死を抑制するのかを生化学的および分子生物学的な手法により明らかにする。28年度が最終年度であるため、記入しない。緑内障28年度が最終年度であるため、記入しない。
薬剤耐性マラリアの耐性を解除するモルフィナン化合物の創製とチオール基捕捉能の影響

当研究室では以前、モルフィナン骨格を基盤とした7-ベンジリデンナルトレキソン(BNTX)誘導体が、薬剤耐性マラリアの耐性を解除する作用や抗トリコモナス活性を有する事を見出し、これらの作用機序の鍵として、分子内の不飽和二重結合が関与していると推察した。本研究では、この仮説を「モルフィナン分子構造」と三要素(抗マラリア活性、チオール付加能(チオールとの反応速度)、細胞内活性酸素種の存在濃度)との相関から実験的に立証することを目的とする。そしてそれらの構造活性相関の蓄積を基に新たな分子設計を行い、最終的に、薬剤耐性マラリアにも適用可能な強力な抗マラリア活性を有するリード化合物創製を目指す。
液体窒素温度を越える高温で四極子秩序転移を示すイッテルビウム炭化物の研究

申請者は希土類炭化物YbAl_3C_3において、液体窒素温度を越える80Kで反強四極子秩序と考えられる相転移を報告している。四極子秩序は化合物を構成する希土類元素のf電子軌道が整列する現象であり、スピン・電荷に継ぐ第3の秩序として近年注目されているが、隠れた秩序とも呼ばれ特定が難しい。本年度は作成に成功した単結晶を用いて、四極子秩序を現時点で唯一実験的に観測可能な手法とされる共鳴X線散乱実験を行った。実験では反強四極子秩序に伴う明らかな共鳴現象を残念ながら捉えることはできなかったが、相転移温度以下で僅かな原子変移が原因である超格子反射を発見することができた。観測された超格子反射強度は六方晶で反強四極子秩序が生じていることが確定しているUPd_3のそれと同程度であり、今後群論的考察により四極子の秩序パターンを検討できる情報を得ることに成功した。さらに画期的な進展は大きな磁気相互作用の存在にもかかわらず、極低温まで磁気秩序が観測されなかった原因が低温でのYbのスピン二量体化によることを実験的に明らかにしたことである。昨年度に中性子非弾性散乱実験より明らかにした低エネルギー磁気励起の存在は二量体化によるスピン一重項と三重項のスピンギャップがその起源であり、今年度行った分解能を上げた実験で励起状態が三重項である直接的な証拠を捉えた。この低エネルギー磁気励起構造はフラストレーションを含んだ2次元d電子系物質の実験結果と酷似している。希土類金属間化合物において基底状態にスピン二量体化を実現する物質は初めてのケースであり、大きな成果と考える。多くの希土類化合物では磁気秩序化によって電子系のエネルギーを下げるが、YbAl_3C_3はYbの2次元三角格子によるフラストレーションにより磁気秩序が抑制されており、フラストレーションがYbAl_3C_3のスピン二量体化現象に重要な役割を果たしていることを明らかにできた。申請者は希土類炭化物YbAl_3C_3において、液体窒素温度を越える80Kで四極子秩序と考えられる相転移を発見した。四極子秩序は化合物を構成する希土類元素のf電子軌道が整列する現象であり、スピン・電荷に継ぐ第3の秩序として近年注目されている。この80Kという転移温度はこれまでの記録を大幅に更新する結果となり、これまで弱いと考えられてきたf電子軌道間の相互作用は条件さえ整えば十分強い相互作用になり得ることを示している。本年度は四極子秩序を議論する上で出発点ともいえる、Yb(イッテルビウム)の4f電子が受けている結晶場の影響を調べるために日本原子力研究所にて中性子非弾性散乱実験を行った。その結果、明瞭な磁気励起が3本観測され結晶場の解析に必要な情報を揃えることができた。そして、より詳しく5meV以下の低エネルギー領域の中性子非弾性散乱実験を行ったところ、結晶場では説明の付かない激しく温度変化する磁気励起を観測した。これはYbの結晶場基底状態であるクラマース二重項が動的な内部磁場を感じ、ゼーマン分裂した現象を観測しているのではないかと考えている。非常に良く似た実鞄結果を示す物質にYb_4As_3という電荷秩序を示す化合物がある。Yb_4As_3は290Kで111軸方向に一次元的に3価のYbが秩序配列することが知られており、低温では低エネルギー領域にYbAl_3C_3と共通性のある磁気励起が観測されている。更に、単結晶試料を用いた実験で逆格子空間での分散関係も測定されており、その結果この磁気励起は一次元ハイゼンベルグ反強磁性模型で説明されるフラストレート起源によるものと理解された。翻って本研究の対象物質であるYbAl_3C_3を眺めてみると磁性を担うYb原子は二次元的な三角格子を組んでいる。つまり、二次元三角格子のフラストレートがこの物質の物性に重要な役割を果たしていることが実験結果から明らかになり、高い四極子転移温度発現の一端を担っていると推測される。また、本年度の目標の一つである単結晶試料の作成も一定の成果を見ることができた。次年度に軌道秩序を直接観測することができる、共鳴X線散乱実験をSpring-8にて行う計画を進めている。

さらに画期的な進展は大きな磁気相互作用の存在にもかかわらず、極低温まで磁気秩序が観測されなかった原因が低温でのYbのスピン二量体化によることを実験的に明らかにしたことである。昨年度に中性子非弾性散乱実験より明らかにした低エネルギー磁気励起の存在は二量体化によるスピン一重項と三重項のスピンギャップがその起源であり、今年度行った分解能を上げた実験で励起状態が三重項である直接的な証拠を捉えた。この低エネルギー磁気励起構造はフラストレーションを含んだ2次元d電子系物質の実験結果と酷似している。希土類金属間化合物において基底状態にスピン二量体化を実現する物質は初めてのケースであり、大きな成果と考える。多くの希土類化合物では磁気秩序化によって電子系のエネルギーを下げるが、YbAl_3C_3はYbの2次元三角格子によるフラストレーションにより磁気秩序が抑制されており、フラストレーションがYbAl_3C_3のスピン二量体化現象に重要な役割を果たしていることを明らかにできた。
遺伝的組換えウイルス殺虫剤の安全性に関する研究

遺伝的組換えウイルス殺虫剤のモデル実験として、ポリヘドリン遺伝子をクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子に置換した組換えAutographacalifornica核多角対病ウイルスを作製した。この組換えウイルスをSpodoptera frugiperda細胞に接種したところ、接種後24時間には高いCAT活性が認められた。4種の鱗翅目昆虫、ハスモンヨトウ(Spodoptera litura)、カイコ(Bombyx mori)、ヨトウ(Mamestra brassicae)、アワヨトウ(Pseudaletia separata)に組換えウイルスを接種した場合、いずれの種においてもウイルス由来のCAT活性が認められ、CATアッセイにより容易に組換えウイルスが検出できることを確認した。また、環境への残留や拡散の少ない組換えウイルス殺虫剤を創製するため、宿主である培養細胞に予め多角体蛋白質遺伝子を導入することによって、多角体蛋白質遺伝子が欠損した組換えウイルスを、多角体に包埋することを試みた。組換えウイルスには上述のウイルスを使用し、導入プラスミドには、多角体蛋白質遺伝子の全長を含んでいるプラスミド、pAcEIを用いた。選択マーカーとして、ネオマイシン耐性遺伝子のコード領域が、それぞれショウジョウバエの熱ショックプロモーターあるいはトランスポゾンcopiaのLTRに接続されたプラスミド、pUChsneoあるいはpUCcneo-2を用いた。Spodoptera frugiperda細胞にpAcEIとpUChsneoあるいはpUCcneo-2をDNA-りん酸カルシウム共沈法によって共導入し、抗生物質G-418を含む培養液で選択した後、組換えウイルスによる感染実験を行った。形質転換細胞がpUChsneoにより3株、pUCcneo-2により3株得られたが、いずれの細胞株に組換えウイルスを感染させても、多角体の形成は認められなかった。現在はその原因について検討中である。
19世紀のドイツ語圏における、演劇作品に表現された歴史意識についての考察

ヘーゲルの理解によれば、ドイツの哲学的思惟は啓蒙精神の代表とされるカントに至って始めて思考の自律性をかち得た。ヨーロッパにおいてのフランス大革命とその帰結は、ドイツでは啓蒙の精神にのっとった「哲学的省察」に付されて、革命の意味そのものが問われる事になる(カントの啓蒙とは何か?」、「大学の学部論争」参照)その結果、思考は単に「経験」によってのみ自己を表現していくという従来の形而上学的束縛を脱する。もっとも、この啓蒙の精神による思考の自律化が徹底して完遂され得なかったことから、19世紀及び20世紀におけるドイツの歴史的迷誤、が生まれたといえる。言葉をかえていえば、啓蒙の精神そのものが、もともと二面性をもち、それ故第二次大戦までのドイツの過去の歴史は再検討される必要があった。(アドルノー/ホルクハイマーの「啓蒙の弁証法」、及びハーバーマスのコミニュニケーション理論など参照の事)。このドイツの歴史及び哲学思想の流れに19世紀のドイツ演劇が提出した問題を関連づければ、従来、否定の精神より出立した演劇、或いは未完結の演劇を構成したのみとされるビュヒナー及びグラッベの歴史劇が意外にもドイツの歴史の実相に肉薄し、ドイツの歴史の再検討につながる歴史意識を作品内に提示した。この論証に加え、今年度の研究では次の二項目につき集中的に検証を加えた:1)グッツコウ及びラウベが歴史劇及び歴史小説(社会小説)で行なった19世紀後期の「社会診断」2)ヘベル及びワーグナーが歴史・神話との対峙による導びき出した「歴史意識」もしくは広く彼らの「歴史観」。古典主義のJ・W.v.ゲ-テ及びF.シラ-、そしてロマン派作家群を中心とする19世紀ドイツ文学ではなく、私の今年度の研究では、ドイツ語圏の演劇作品、特に歴史劇を新たに再評価しようと努めた。以下、今年度の研究、及び成果を箇条書きにして具体的に挙げる事とする。1.今年度は特に、G.ビュヒナ-、Ch.D.グラッベ及びF.ヘッベルの三劇作家を主として研究対象とし、政治的にはフランス革命の影響を多大に受けて成立した彼らの歴史劇を解釈する作業と通じて、彼らの歴史観をを解明する事に努めた。特に18世紀啓蒙期、さらには初期ドイツ観念哲学の展開以来、19世紀及び20世紀のドイツ思想に決定的な影響を及ぼした重要なテ-マ「人間の神に対する対峙」を上記三人の作家につき集中して取り扱い、結論として彼らの演劇の「現代性」を導びきだした。これらの作家は、古典派の歴史、特に同時代の変革との関わりが稀薄である事を認識し、ビュヒナ-、グラッベ及びヘッベルは、新たなる歴史意識を涵養すべく、市民階級の自律性、及び主体性の樹立を志向する意図での歴史劇を創造していったといえよう。当時の絶対主義封建体制の残存という歴史的事実にかんがみれな、彼らの既存政治制、従来の価値観に対する懐疑、批判も肯首できるところで、彼らの否定の精神こそ、彼らの時代以後の新たなる歴史の展望、革新の社会の建設の寄与するところ大であった。あわせて、彼らの演劇が古典派及びロマン派に何故理解されるところ少なかったかの理由も、具体的に考慮した。2.さらに他の論考では、Ch.D.グラッベの「ナポレオンもしくは百日天下」を詳細に解釈し、英雄としての皇帝という存在は、市民階級の権利伸長の時代に至っては滅びざる得ないとするグラッべの歴史観を解明し、グラッベの生き過渡期の時代精神を理解する事に努めた。
アミロイドーシス伝播機構解明と感染物質検出システムの開発

アミロイドーシスは生理的構造を持つ蛋白質がアミロイド線維に会合し、傷害を与える「蛋白質の後天的な構造異常」が原因の新たな概念の疾患の総称である。プリオンと類似した「アミロイドーシスの伝播」の検証と機構解明のため、1)各種アミロイドーシスモデルとして新規の遺伝子改変マウスを作成する。2)従来のモデルマウスを改良し食品や環境中に存在するアミロイド線維構造物質の高感度、迅速検出システムを開発する、を目指して、本年度は以下のような研究を実施した。1)R1.P1-Apoa2^cに改良を加えたトランスジェニックマウス(Apoa2^cTg+, Apoa2^<c/c>)を作成した。このマウスは血清Apoa2^cの濃度が高く、アミロイド線維の伝播について感度が有意に上昇していること(10^<-8>μg)が明らかになった。2)透析アミロイドーシスのモデルマウス(hβ2MTg+, mβ2m^<-/->)にアミロイド繊維(Aβ2MやAApoAll)を投与してアミロイドーシスの発症が誘発されるかを検討した。AApoAll線維の投与でAApoAll線維の沈着が誘発され、その周囲にβ2Mの沈着が観察された。3)反応性AAアミロイドーシスのモデルマウス(hSAA1Tg)を新規に作成した。現在系統の確立と基本的な解析を行っている。4)ヒトプリオンプロモーターの下流にApoa2^c遺伝子を持つ、新規のトランスジェニックマウスを作成した。5)熱ショックタンパク質を誘発するHSF1のトランスジェニックとノックアウトマウスを導入し、各種アミロイドーシスモデルマウスと交雑しアミロイドーシス発症との関連を検討した。6)インターロイキン6(IL-6)ノックアウトマウスと各種アミロイドーシスモデルマウスと交雑し、感染・炎症とアミロイドーシス発症との関連を検討した。7)アミロイドーシスの伝播経路として、筋肉や唾液中のアミロイド線維を確認した。1)AApoAIIアミロイドーシスのモデルであるR1.P1-Apoa2^Cマウスを用いて、アミロイド線維が母親のミルクを介して伝播する可能性を示した。2)FAP(家族性アミロイド神経障害)モデルマウス(hMet30TTR Tg+,mTtr^<-I->)を用いて、AApoAIIアミロイド線維の沈着がATTRの沈着を促進することを示した。3)透析アミロイドーシスのモデルマウス(hβ2M Tg+,mβ2m^<-I->)に試験管内で作成したアミロイド線維(Aβ2M)を投与してアミロイドーシスの発症が誘発されるかを検討した。4)反応性AAアミロイドーシスのモデルマウス(hSAA1Tg)を新規に作成した。5)ヒトプリオンプロモーターの下流にApoa2^C遺伝子を持つ、新規のトランスジェニックマウスを作成した。6)R1.P1-Apoa2^Cに改良を加えたトランスジェニックマウス(Apoa2^CTg+,Apoa2^<C/C>)を作成した。このマウスは血清Apoa2^Cの濃度が高く、アミロイド線維の伝播について感度が有意に上昇していることが明らかになった。7)その他熱ショックタンパク質を誘発するHsf1のトランスジェニックとノックアウトマウスを導入し、アミロイドーシス発症との関連を検討した。

5)熱ショックタンパク質を誘発するHSF1のトランスジェニックとノックアウトマウスを導入し、各種アミロイドーシスモデルマウスと交雑しアミロイドーシス発症との関連を検討した。6)インターロイキン6(IL-6)ノックアウトマウスと各種アミロイドーシスモデルマウスと交雑し、感染・炎症とアミロイドーシス発症との関連を検討した。7)アミロイドーシスの伝播経路として、筋肉や唾液中のアミロイド線維を確認した。
オオムギの幼穂形成早晩の解析による耐雪性品種間差異の要因解明

オオムギの耐雪性の品種間差異には、低温要求性および日長反応性による幼穂形成の早晩が非構造性炭水化物(NSC)の蓄積性に影響することが関係していると考えられる。そこで、積雪前および消雪後におけるオオムギの幼穂形成とNSC含有率、耐雪性との関係を解析した。その結果、1.オオムギ茎葉のNSC含有率が高いほど雪害程度が低くなること、2.NSC含有率は早晩性、とくに幼穂の生育と明瞭な関係があり、生育が早いほどNSC含有率が低くなること、3.低温要求性遺伝子と日長反応性遺伝子の組合せによりNSC含有率に差があること、が示され、幼穂形成早晩が耐雪性品種間差異の一因であることが明らかとなった。1.早晩性の異なるオオムギ品種の積雪前および消雪後の形態とNSC蓄積量、雪害程度調査オオムギの積雪前および消雪後の非構造性炭水化物(NSC)蓄積量やNSC含有率と雪害程度に相関があることが示された。早晩性とNSC含有率の間には関係があり、とくに幼穂長、幼穂分化程度、小穂原器数など幼穂の生育とより明瞭な関係にあった。さらに、条性や播性により、早晩性とNSC含有率との関係が異なる可能性が示唆された。2.低温要求性程度の評価1.の供試品種について、低温処理期間を変えて止葉展開日数を調査したところ、播性Iとされる非低温要求性の品種は、低温処理期間にかかわらず止葉展開日数がほぼ一定であった。それ以外の品種は、春播型では低温処理30日程度、秋播型では40-50日程度で止葉展開日数が最短に達すると推測される結果であったが、低温処理30日以降では個体差が大きく明瞭な結果は得られなかった。一方で、低温処理期間により止葉展開日数が短縮される割合に品種間差がみられ、低温要求性の新たな指標となり得るか検討が必要と考えられた。3.低温要求性遺伝子および日長反応性遺伝子の遺伝子型同定供試品種の播性は3つの低温要求性遺伝子のうちVrn-2により決定されていると判明した。日長反応性遺伝子については4つの遺伝子のうち主に2つの遺伝子に変異があり、品種の育成地により温暖地品種と寒冷地品種で大きく遺伝子型の傾向が異なっていた。寒冷地品種の間ではほとんど変異がないことが明らかとなった。1.早晩性の異なるオオムギ品種の積雪前および消雪後の形態とNSC蓄積量、雪害程度調査:26年度と同じくポット試験を2播種期で実施するとともに、標高の高い圃場においても調査を行った結果、いずれの栽培条件においても積雪前および消雪後の非構造性炭水化物(NSC)蓄積と雪害程度に関係があることが確認された。また、各試験において形態の調査を行ったところ、26年度にNSC含有率との関係が認められた幼穂長、幼穂分化程度、小穂原基数の品種間差異は、互いに関係するものの異なる制御機構の影響を受けている可能性が示された。2.低温要求性程度、日長反応性程度の評価:低温要求性程度について2か年にわたり評価を行った結果、低温要求性を満たす低温処理期間は、7日以下の非低温要求型の春播種型品種をのぞき、春播型、秋播型品種とも30-50日の間であまり差がなく、春播型と秋播型で明確に区別されたコムギと傾向が異なることが明らかとなった。また、純粋早晩性の指標となる低温要求性程度評価試験における止葉展開までの最短日数と圃場出穂期は高い相関関係にあったが、寒冷地品種に限ると逆転する現象がみられた。日長反応性程度について評価を行ったところ、寒冷地品種の早晩性は日長反応性程度によるものと推察される結果が得られた。26年度に行った4つの日長反応性遺伝子の遺伝子型の調査では寒冷地品種内に変異がなく、本研究で示された日長反応性程度の差異は、未知の因子による可能性が示唆された。3.低温要求性程度および日長反応性程度とNSC蓄積性の関連性についての検討:各栽培条件におけるNSC含有率と低温要求性程度、日長反応性程度および26年度解析を行った遺伝子型との関係について現在解析を進めている。低温要求性程度と日長反応性程度について、これまでの概念や予想と異なる結果となり、新たな知見を得ることができた。NSCのデータは順調に得られており、今後、低温要求性程度、日長反応性程度による形態変異との関係について解析をすすめる予定で、全体としておおむね順調に進展している。最終年度では、1.早晩性の異なる寒冷地オオムギ4品種の積雪前から積雪下および消雪後の形態と非構造性炭水化物(NSC)含量を調査し、積雪下での幼穂長、小穂原基数の増加や幼穂分化程度の進展に伴いNSC含有率の低下する現象が観察された。2.低温要求性程度および日長反応性程度とNSC蓄積性の関連性について、低温要求性程度と日長反応性程度がともに小さい品種、特に日長反応性遺伝子を早生型で2個以上もった品種は積雪前のNSCの蓄積が顕著に少なくなることが明らかとなった。3.積雪前および消雪後の茎葉の窒素含量と雪害程度とは関係しないことが確認された。

研究期間を通して、1.オオムギの積雪前および消雪後の茎葉のNSC含有率が高いほど雪害程度が低くなること、2.NSC含有率は早晩性、とくに幼穂長、幼穂分化程度、小穂原基数などの幼穂の生育と明瞭な関係があり、生育が早いほどNSC含有率が低くなること、この現象が積雪下でも確認されること、3.低温要求性遺伝子春播型1個と日長反応性遺伝子早生型2個以上の組合せでNSCの蓄積が顕著に少なくなること、が示され、幼穂形成早晩が耐雪性品種間差異の一因であることが明らかとなった。一方で低温要求性遺伝子と日長反応性遺伝子の組合せが異なる早晩性が同程度に中庸の品種どうしで、NSCの蓄積性が異なることが示された。このことには、低温要求性程度や日長反応性程度の違いのほか、NSCの主成分であるフルクタンの合成・代謝遺伝子の変異が関係している可能性が考えられる。今後フルクタン合成遺伝子の変異解析を予定している研究者に協力し、オオムギの耐雪性研究を発展させる。また、本研究において、寒冷地品種間における日長反応性程度の差異は未知因子によることが示唆され、新たな日長反応性遺伝子を同定するための研究を別途開始している。オオムギの耐雪性の品種間差異には、低温要求性および日長反応性による幼穂形成の早晩が非構造性炭水化物(NSC)の蓄積性に影響することが関係していると考えられる。そこで、積雪前および消雪後におけるオオムギの幼穂形成とNSC含有率、耐雪性との関係を解析した。その結果、1.オオムギ茎葉のNSC含有率が高いほど雪害程度が低くなること、2.NSC含有率は早晩性、とくに幼穂の生育と明瞭な関係があり、生育が早いほどNSC含有率が低くなること、3.低温要求性遺伝子と日長反応性遺伝子の組合せによりNSC含有率に差があること、が示され、幼穂形成早晩が耐雪性品種間差異の一因であることが明らかとなった。低温要求性程度について明瞭な結果が得られなかったが、低温処理期間による反応性の品種間差や、条性、播性による早晩性とNSC含有率の関係性の相違など、計画以上の成果もあった。そのほかについては計画通りに成果があり、全体としておおむね順調に進展している。1.早晩性の異なる寒冷地オオムギ品種の積雪前から積雪下および消雪後の形態とNSC蓄積量、雪害程度調査:昨年度までに結果を得た積雪前および消雪後に加えて、積雪中の形態およびNSC蓄積の動向について寒冷地品種5品種を用いて調査を行う。2.低温要求性程度および日長反応性程度とNSC蓄積性の関連性についての検討:27年度行った日長反応性程度評価について追試を行うとともに、低温要求性程度および日長反応性程度が形態変異ならびにNSC蓄積性におよぼす影響について検討する。3.積雪前および消雪後の窒素含量と雪害程度との関係調査:窒素含量についてはNSCにくらべて雪害程度に対する効果が小さいと想定して、当初測定を計画していなかったが、このことを確認するため、これまで得たサンプルについて窒素含量測定を行う。以上より、低温要求性程度および日長反応性程度によるオオムギの形態変異とNSC蓄積性および耐雪性との関係を明らかにする。作物育種1.早晩性の異なるオオムギ品種の積雪前および消雪後の形態とNSC蓄積量、雪害程度調査26年度と同様に試験を行い、年次間差や気象条件の影響について検討する。2.低温要求性程度、日長反応性程度の評価26年度に明瞭な結果が得られなかった低温要求性程度について追試を行うとともに、低温処理期間による反応性の品種間差についても解析を行う。26年度と同じセルトレイを用いた試験に加えて、品種数、低温処理期間水準を限定して生育が安定するポット栽培でも並行して試験を行う。低温処理期間3水準で24時間日長下と12時間日長下の止葉展開日数の差異により、日長反応性程度の評価を行う。日長反応性程度についても、セルトレイとポットを用いた両試験を並行して行う。3.低温要求性程度および日長反応性程度とNSC蓄積性の関連性についての検討
日本語および中国語を対象とした音声対話システムの開発

本研究は、日本語と中国語の両言語に対応した音声対話システムを試作し、多言語音声対話システムの実用化の可能性を探ることを目的としている。以下の成果(主なもの)を挙げた。1.学術文献情報検索を対話システムのタスクとし、関連のデータベースを整備するとともに、音声合成用の辞書データベースを実装した。また、音声認識学習・評価用の音声データベースを作成した。2.収集した音声データをもとに、音素HMM、音素クラスHMMの学習を行うとともに、音素、音素クラスの系列の特徴から日本語・中国語の識別を行う手法を開発した。3.頑健な音声認識手法として、ビタビアルゴリズムに基づくベイズ予測分類法を提案するとともに、使用環境のデータを用いて順次により確からしい事後確率密度関数を推定する手法を開発した。また、Minimax法にビタビ探索を導入することで、連続音声への拡張が可能であることを示した。4.人手を介さない波形編集音声合成を開発した。これは、音声認識技術を利用して合成素片を作成し、LMAフィルタ分析によりピッチマークを自動付与することに基づく。これを利用して中国語の音声合成部を構築した。5.波形編集合成との切り替えが可能なフォルマント音声合成システムを完成した。これにより、従来音質の悪かった無声子音で格段の向上が得られた。6.中国語音声の基本周波数パターンの形状を統一的に表現する関数を定義し、それにもとづいて合成に適した中国語韻律モデルを構築した。7.節の声調核(母音核に対応)のみの特徴を見ることによって中国語連続音声声調認識を高精度に行う手法を開発した。8.音学術文献情報検索日本語・中国語音声対話システムを作成した。中国語については定形文を出力したが、日本語については応答文生成に際し、既知情報を表層文に含めることの検討を行った。日本語、中国語における動作を確認し、所期の目標を達成した。本研究は、音声入力、出力に関する制約を緩和したユーザにとって利用し易い音声対話システムを日本語と中国語の両言語に対応したシステムとして試作し、多言語音声対話システムの実用化の可能性を探ることを目的とする。本年度は、音声データベース作成、言語自動識別機能表現、音声認識機能実現等を中心として以下の成果を達成した。1.対話システムのタスクとして、天気予報情報、World-wide Web情報を取り扱うこととし、関連のデータベースを整備するとともに、音声合成用の辞書データベースを実装した。2.収集した音声データをもとに、音素HMM、音素クラスHMMの学習を行うとともに、得られたHMMを用いて認識された音素、音素クラスの系列の特徴から日本語・中国語の識別を行う手法を開発した。さらに、系列の特徴をニューラルネットに入力することにより、対象言語以外の言語を排除することに成功した。3.HMMの学習環境と認識環境が異なる場合に認識率の低下が小さい頑健な音声認織手法として、ビタビアルゴリズムに基づくベイズ予測分類法を提案した。これは、入力音声のモデルに対する尤度を求める際に、環境の差による非整合性が生じることを仮定するものである。特に、雑音下での認識で10%以上の認識率の顕著な向上が見られた。4.天気予報情報のタスクについて、ユーザの質問内容と対話履歴ベースを参照しつつ知識ベースにアクセスし、必要な情報を取り出してユーザへの適切な応答内容を生成する応答内容生成手法を開発した。また、応答内容から、適切な省略・照応、語順の応答文を、韻律制御情報とともに生成する手法を開発した。これらを、既存の音声認識システム、対話音声合成システムと組み合わせて、日本語に対する音声対話システムのプロトタイプを作成した。