hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒトヘルペスウイルス6エンベロープ糖タンパク質の機能解析による感染機構解明

ヒトヘルペスウイルス6(HHV-6)は、βヘルペスウイルスであり、T細胞において感染増殖することができる。HHV-6は、塩基配列、抗原性、細胞向性などの違いから二つのバリアント, HHV-6AおよびHHV-6Bに分けられている。HHV-6Bは突発性発疹の原因ウイルスである。今回、我々はHHV-6Aを用いて下記の事象を明らかにした。2.感染細胞で形成されたMVB内には多数の小胞に加え、多数の成熟ウイルス粒子が認められた。さらに、成熟ウイルス粒子上には、MVBのマーカーであるCD63が検出された。3. MVB内の小胞にはウイルスエンベロープ糖タンパク質であるgBおよびgMが検出された。4.未熟ウイルス粒子が、TGNおよびendosomeの性質をもった小胞膜に出芽する像が観察された。5. MVB膜と細胞形質膜が融合し、MVB内の小胞およびウイルス粒子が細胞外へ放出される像が観察された。以上によりHHV-6は、TGNおよびendosomeの性質をもった小胞膜に出芽することにより、成熟ウイルス粒子となること、そしてその小胞膜は次第にMVBへと変化し、最終的には、MVBの膜とに質膜が融合することによってウイルスは細胞外へ放出されることが明らかになった。また、我々は、HHV-6感染において宿主の細胞膜に存在するコレステロールがウイルス感染に必須であることを明らかにした。つまり、膜上のコレステロールは、ウイルスが宿主細胞へ侵入する際のウイルスエンベロープと細胞膜の融合過程に特に重要であることを明らかにした。ヒトヘルペスウイルス6(HHV-6)感染細胞内でのウイルス粒子の挙動および感染細胞の変化を解析するため,電子顕微鏡により感染細胞を観察した。ウイルス感染後期には,非感染細胞では観察されなかった膜様構造物が観察された。その中には多くの小胞に加え,多数のウイルス粒子も観察された。その構造物および小胞は,ウイルスエンベロープ糖タンパク質および後期endosomeのマーカーであるCD63によって染色された。これらの結果より,新たに感染細胞内で形成された膜構造物はMVBであることが判明した。HHV-6エンベロープ糖タンパク質である,glycoprotein B,M(gB,gM)に対する特異的な抗体を作成した。本抗体は,Western blotおよび免疫染色に使用できる抗体であることが判明した。HHV-6感染細胞を作成された抗体で染色することにより,gBおよびgMの局在を同定した。これらは,一部CD63と共局在したことより,免疫電顕の結果と一致した。ヘルペスウイルスの粒子形成,出芽に関する遺伝子を検索するため,αヘルペスウイルスに属する水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)の糖タンパク質においても同様の解析を行った。VZVgMに対する抗体を作成し,ウイルス感染細胞における局在を観察したところ,主にTGNに局在することが判明した。また,gM欠損ウイルス感染細胞ではプラークサイズが縮小し,さらに電顕所見において異常なウイルス粒子が観察されたことにより,gMは,細胞間伝播に関与していることが推測された。また,テグメントタンパク質であると考えられるORF49遺伝子に関する解析を行ったところ本タンパク質も同様にTGNに局在し,ウイルス粒子形成に関与していることが考えられた。
C末端アミド化酵素の中間反応過程の解明と2頭酵素としての構造と機能の関連について

我々は生理活性ペプチドのC末端アミド化反応について、この反応が2段階の反応であり、第1の酵素E1によって末端グリシンのα-炭素が水酸化された中間体が生成され、次に第2の酵素E2によってこの中間体がアミド化ペプチドとグリオキシル酸に解裂することを明らかにし、グリシンの水酸化反応について基質(D-Tyr-Val-Gly)→α-炭素ラジカル中間体→α-水酸化グリシン中間体を経る反応機構を提唱した。本申請研究は、(1)E1によって基質からα-水酸化中間体が生成されるときグリシンのα-炭素ラジカルを経るかどうかを、同位体効果を調べることによって明かにすること、(2)本酵素の機能と構造の関係を明らかにするために、両酵素活性を持つ前駆体蛋白の全長を発現するベクターを構築し、大量に発現させ結晶化を試みるために立案された。その結果以下のことが明らかにされた。(1)グリシンの水酸化反応は、アスコルビン酸とD-Tyr-Val-GlyについてPing-Pong Bi Bi反応である。D-Tyr-Val-Gly-2,2-d_2を調製しその同位体効果を検討した結果、V/K項、Vmaxについて、1.2程度の同位体効果が得られた。このデータは、Kizarらが報告している5.7という同位体効果とは大きな隔たりがある。そこで真の同位体効果を明らかにするために、D-Tyr-Val-Gly-2,2-^3H_2を調製し、更に水酸化反応のキネティクスを検討している。(2)ラット心房のcDNAライブラリーを作製した。現在カエルのE1 cDNAをプローブとして、前駆体蛋白をコードしているcDNAを検索している。(3)病態生理的な観点から各種神経疾患患者の髄液アミド化酵素活性を測定したところ、多発性硬化症(MS)では他疾患に比べ髄液の活性が有意に高く、しかも病態の活動期と一致してアミド化活性が上昇し緩解期には低下していることが知られた。このことは、髄液アミド化活性が中枢神経内の生理的・病的状態で変化するダイナミックな指標となり得ることを示唆する。同位体効果を検討する事によって、水酸化反応における炭素ラヂカルの中間体性を明らかにするためには、第1にその反応の基本的なキネティクスを知る必要がある。軽水素基質について、この事を検討した結果、アスコルビン酸とD-Tyr-Val-Glyについて、ピンポン反応であり、前半の反応は、アスコルビン酸による酸素の還元と活性化であり、後半の反応は酵素上の銅原子に保持された酸素原子が、D-Tyr-Val-Glyに挿入される反応であると推論され、このことは我々が提唱している反応機構と矛盾しなかった。次にD-Tyr-Val-Glyのalpha-水素を重水素に置換した基質を調製しその同位体効果を検討した。その結果、V/K項、Vmaxについて、1.2程度の同位体効果が得られた。我々のデータは、見かけ上ほとんど同位体効果がないことを示しており、Kizarらが報告している5.7という同位体効果とは大きな隔たりがみられた。重水素同位体効果が見られなかった理由として2つ考えられる。

1つは、グリシンのalpha-炭素からの水素の引き抜きに対するに対する見かけの同位体効果は、真の同位体効果(^DK)及びこのステップの前後の反応係数を含む関数であるために、後者の寄与が大きくなると、見かけの同位体効果がみられなくなる。換言すれば、alpha-水素の引抜きが律速段階ではなく、その前後にも充分に遅いステップが存在する可能性がある。第2の可能性は、最初に生成されるラヂカルがalpha-窒素のカチオンラヂカルであり、このものからalpha-炭素ラヂカルに移行するという考えである。そうであれば、alpha-炭素からの水素の引き抜きは単なるproton transferとなり同位体効果が小さくなることが理解される。よって次年度は、トリチウム基質を用いて^DKを決定し、水酸化反応の実態を明確にする。生理活性ペプチドのC末端アミド基は、C端にグリシン残基を持つペプチドの直接の前駆体に、α-アミド化酵素(アミド化酵素)が作用して生成される。我々は、この反応が2段階の酵素反応であり、第1の酵素EIによって末端グリシンのα-炭素が水酸化されたα-ヒドロキシグリシン中間体が生成され、第2の酵素E2によってこの中間体がアミド化ペプチドとグリオキシル酸に解裂すること、更に酸素18同位体を用いて、第1の反応がモノオキシゲナーゼであることを証明した。その結果この酵素反応について、基質(D-Tyr-Val-Gly)→α-炭素ラジカルα-水酸化グリシン中間体を経る反応気候を提唱した。本年度は、水酸化機構の詳細を知るために、E1(ペプチヂルグリシンヒドロキシラーゼ)によってD-Tyr-Val-Glyからα-水酸化中間体が生成されるとき、α-炭素ラジカルを経るかどうかを^3Hラベル基質を用いて検討し、(重水素基質についての実験は昨年度終了した)、更にこの酵素の機能と構造の関係を明らかにするために、両酵素活性を持つ前駆体蛋白をコードするベクターを構築し、培養細胞で発現させ結晶化を試みる計画をたてた。D-Tyr-Val-Gly-2,2-^3H_2をN-Boc-D-Tyr、L-Val-benzyl ester、Gly-2,2-^3H_2を原料としてペプチド合成を行なった。現在D-Tyr-Val-Gly-^3H_2を用いて水酸化反応のキネティクスを行なっている。一方、ラット心房のcDNAライブラリーを作製し、カエルのEl cDNAをプローブとして、前駆体蛋白をコードしているcDNAを検索している。なお、当初の研究計画には含まれていなかったが、病体生理的な観点から各種神経疾患患者の髄液アミド化酵素活性を測定したところ、多発性硬化症(MS)では他疾患に比べ髄液の活性が有意に高く、しかも病態の活動期と一致してアミド化活性が上昇し緩解期には低下していることが知られた。このことは、髄液アミド化活性が中枢神経内の生理的・病的状態で変化するダイナミックな指標となり得ることを示唆する。
台風被災復興支援地域における住血吸虫症対策にかかわる監視システムの開発と適用

本研究の最終目的は、日本で確立され日本住血吸虫症の地理情報システム(GIS)を適用した監視システムをフィリピンの同症流行地に適用することが可能かどうかを検証することである。その目標として、2013年の台風Yolandaによる被災地域での生息環境(土壌・水質)と生息分布の分析を通じ、台風被災後の貝の生息に関わるインパクト評価と地区内での住血吸虫症発生の予測を行う事とした。本年度は昨年度結果が得られたヨランダ台風時点で採水した同じ調査水源(定点と略す)6箇所での水質結果とタクロバン市の被災後の施設・環境の復興状況について2つの国際会議で発表した。12月には本研究の主テーマであるフィリピン共和国のレイテ島を主とした日本住血吸虫症の疫学と対策事業に関わる歴史的背景について総説として発表した。また、2月末から3月初旬に現地調査を実施し、定点5箇所と新たに調査した水源4箇所で得た検水の水質を分析した。その結果、定点のサマール島に関してはバサイ市病院の水道水源である井戸水の殺菌は十分ではないことが示唆された。また同病院近隣の定点管井戸からも少数だが大腸菌が検出された。同調査では住血吸虫症制御研究病院所属のカウンターパート研究者とともに日本住血吸虫の媒介貝(Oncomelania quadrasi)の分布に関わる調査をレイテ州サンタフェ市内の3か所で実施した。貝の分布は有機物が多く地元ではパロと呼ばれる大型のクワズイモ科の植物が密生する場所に集中して得られることが分かった。調査では2名で約50分間の採集時間で402個体の媒介貝を採取した。しかし、これらの採取貝の住血吸虫感染は認められなかった。フィリピンの調査現地での最新情報によると、レイテ島とサマール島では今年に入ってそれぞれ1箇所の流行地が新たに見いだされており、本研究が提案する地理情報監視体制の確立が重要であることを示している。本年度は2月28日から3月6日にかけて現地調査を実施した。レイテ島のタクロバン市にある東ビサヤ地域中央病院の災害対策部およびパロ市にある住血吸虫症対策研究病院の協力を得て、2013年にヨランダ台風の影響を受けたレイテ島とサマール島地域の飲料水源の質を評価した。この調査は同台風による被害直後に実施した場所での水のサンプル結果と比較することを目的とした。水質分析は迅速乾式化学スリップ試験キットを用いた以下の6項目:アンモニウム含量およびアルカリ度、pH、硬度(CaCO3)、硝酸塩、亜硝酸塩、また大腸菌および大腸菌群、ブドウ球菌について検水1ml中の数量について濾紙培養法を用いて測定した。分析は全て現地で実施した。結果は4年前と同じ6つの水源から合計7つの水試料を得た。今回の分析から、レイテ島タナウアン郡のカンパリサーラ集落とピカス集落の2か所の管井戸およびレイテ島に隣接するサマール島のバセイ町の管井戸の水質は、台風被災直後に収集された水質データと比較して化学的にも生物学的にも優れていた。また、タクロバン市の水道水源とタクロバン市病院の貯蔵水は生物学的に安全であるとみなされた。しかし、バセイ町の病院の水道水源に大腸菌群が多く、塩素処理が必要であった。今回採取した試料の水質は、ヨランダ台風直後の同じ採取場で採取された試料と比較して清潔であった。このことから、災害直後の地下水はこの地域の日常とは異なり非常に汚染されていたと推察された。本年度の調査結果の一部はアジア・太平洋地区災害医学会(2018年10月神戸市)等でこれらの施設の研究者と連名で発表する予定である。

しかし、これらの採取貝の住血吸虫感染は認められなかった。フィリピンの調査現地での最新情報によると、レイテ島とサマール島では今年に入ってそれぞれ1箇所の流行地が新たに見いだされており、本研究が提案する地理情報監視体制の確立が重要であることを示している。次年度では住血吸虫症対策研究病院(SCRH)の研究部との連携をさらに強化し、住血吸虫媒介貝の現地パイロット研究地区での分布状況を把握する。同時にヨランダ台風災害前後での住血吸虫症の病院外来での受療数等の比較によるインパクトを検証する。この検証にかんしては特にSCRHの疫学部および外来診療部門、EVRMCの外来診療部門・災害対策部の協力を得て、質問紙による調査を実施する。この方法は、レトロスペクティブではあるが、研究主題の巨大台風が住血吸虫症に与えたインパクト評価に寄与する重要な基礎データとなる。今後はさらに同媒介貝の過去の分布状況に関わる記録・地図や文献等を収集し、過去の台風被災と照らし合わせて変化を検証する。また前述のパイロット研究地区での継続的な共同研究の支援を通じて住血吸虫症対策監視に関わるシステムの導入の可能性を検討する。研究費の執行が7月以降であったこと、および本年度に予定をしていた現地調査において調査が乾季のみに限定されたこと、研究代表者のみの出張旅費を使用したこと、また現地調査において車両の借り上げ費用および謝金の支出が無かった事が主な理由である。この内車両の借り上げ費と謝金を書いたことに関しては研究カウンターパートとなった東ビサヤ中央病院(EVRMC)の車両と運転手および同病院災害対策部の職員がボランティアとして研究に参加してくれたためであった。次年度はEVRMCに加え住血吸虫症対策・研究病院(SCRH)との雨季および乾季での媒介貝の現地調査実施する。そこでは両病院での外来を対象とした調査票による研究をも実施することから、本年度で執行できなかった謝金・その他の支出が発生する。また、それぞれの機会に研究主任および研究分担者、研究協力者を含め3名以上の渡航を行う計画である。
電波利用効率化のための価格メカニズム適用――共用電波の価格形成と先物再配分・移転

本研究の目的は、最近において急速に稀少化した電波資源の利用効率化のため、価格メカニズムによる電波再配分方策を探求することである。稀少化の主な原因は、広帯域無線インターネット(Broadband Wireless Internet、以下BWI、携帯電話を含む)の急速成長である。本研究では稀少な電波資源の再配分のためのEMM(拡張された市場メカニズム)の提案・考察に加え、現在の日本においてBWIにおける電波初期割当へのオークション導入、BWIへの割当に必要な他事業(たとえば放送)からの電波再配分について考察した。また海外諸国のオークション導入状況をデータベースにまとめた。(1)本研究の目的は、最近において急速に稀少化した電波資源の利用効率化のため、価格メカニズムによる電波再配分方策を探求することである。本研究代表者は従来研究の中で、電波利用に既得権を持つ既存利用者に、利用中電波ブロックの「供給価格(利用終止時の補償金額)」の表示義務を課す「拡張された市場メカニズム(EMM, extended market mechanism)」を提案した。本研究では同EMMを強化するため、第1に多数の利用者が電波ブロックを時分割共用する場合のブロック内価格形成と、外部に対するブロック供給・需要価格の形成について分析する。第2に、先物(事前)オークションによる電波再配分、および既存利用者による電波利用先の移転制度を考察する。この目的のため、「周波数帯再編成のための電波価格表示ーとくに多数による電波共用と垂直構造中の電波間接利用」について学会発表をおこない、また「海外における電波オークションの導入状況(資料)」を作成してこれを自身のWebサイト上において公開した。(2)なお本年度はこれに加え、電波有効利用に関する発表・講演をおこなった。(a)電波有効利用のために周波数オークションが果たす役割を解説し(下記項目13.研究発表[学会発表]第2)、(b)最近の海外オークションの動向等について発表した(同第4)。本研究では同EMMを強化し、電波資源の稀少化を反映する「周波数価格」の形成について考察するため、第1に多数の利用者が電波ブロックを時分割共有する場合のブロック内価格形成と、外部に対するブロック供給・需要価格の形成について分析する。この目的のため、論文「周波数オークションについて」(本報告13.研究発表)を発表・刊行し、また「(米国)FCCによる『オープン・インターネット命令(2015年2月)』とインターネット利用価格について」の表題で研究発表をおこなった。(2)今後においては上記に加え、日本における「電波資源の効率的利用とそのための周波数帯価格の形成」につき、現在の日本で電波資源の市場が存在しないにもかかわらず移動通信(携帯電話、広帯域無線インターネット)の普及によって周波数帯の価値が極度に高くなっている事実を考慮した研究展開のための計画を作成する予定である。(2)研究成果:電波が稀少化した主な原因は、広帯域無線インターネット(Broadband Wireless Internet、以下BWI、携帯電話を含む)の急速成長である。これに加え、最近においてBWIは産業活動全般と国民生活の情報基盤(神経網)として急速に普及し、経済成長のエンジンになっている。一般に稀少資源の有効利用のためには、価格メカニズムに基づく市場機構の活用が望ましい。多くの海外諸国(日本以外のすべてのOECD加盟国と多数の中進国・新興国)では、この理由から電波割当にオークションを導入し、かつ電波資源の再販・貸与を認めている。しかしながら現在の日本では電波が政府当局によって直接に割り当てられており、価格メカニズムは作用せず、BWI産業は3事業者の寡占状態が続いている。本年度はこれらの事実を考慮に入れ、稀少な電波資源の再配分のためのEMM(拡張された市場メカニズム)の考察に加え、現在の日本においてBWIにおける電波初期割当へのオークション導入、BWIへの割当に必要な他事業(たとえば放送)からの電波再配分の意義・方式を考察し、これらを論文にまとめて公表した(II.研究発表項目)。また海外諸国のオークション導入状況をデータベースにまとめて公表している。論文「周波数オークションについて」を発表し、その中で本研究事業内容を含め、電波資源の価格形成と周波数オークションに関する内外の事情を記述した。また電波資源の稀少化の主要理由である携帯電話、無線インターネットの普及に関する政策につき、研究発表

「(米国)FCCによる『オープン・インターネット命令(2015年2月)』とインターネット利用価格について」をおこなうことができた。本代表研究者による研究成果一覧(発表年次別、本事業以外の分を含む)については下記を参照。情報・通信の経済学とくに電波資源利用制度の経済分析(1)本研究自体は3年計画で進めており、最終年度となる次年度においては当初計画に沿って稀少化がさらに進んでいる電波資源の再配分のために「電波利用計画」が果たす役割について分析を進める。また日本においてなるべく早期に電波オークション等市場メカニズムを活用する電波の有効利用方策を実現するため、海外における周波数オークション実施データの収集を継続する。(2)さらに今後における研究の推進方策として、(9.研究実績の概要(2)に述べたように)「日本における電波資源市場の創成、周波数帯価格の形成、周波数帯オークションの導入」について研究を開始する予定である。学会発表「周波数帯再編成のための電波価格表示ーとくに多数による電波共用と垂直構造中の電波間接利用」等をおこない、電波価格と電波の有効利用に関する研究を進攻させることができた。上記は本研究代表者による本事業の研究成果の名称およびWebサイト上のURL。本研究自体は3年計画で進めており、次年度以降においてはおおむね当初計画どおり、稀少化がさらに進んでいる電波資源の再配分のために「電波利用価格」が果たす役割について分析を進める。また日本においてなるべく早期に電波オークション等市場メカニズムを活用する電波の有効利用方策を実現するため、海外における周波数実施データの収集を継続する。
加圧制御による有機ラジカル磁性体の分子間相互作用の研究

今年度は、主に2系統の有機ラジカル強磁性体について成果があり、その結果の一部を公表した。1.加圧下・磁場下におけるβ相p-NPNNの磁性:このラジカル結晶は、常圧下での0.61Kによりキュリー点をもつ強磁性体であるが、我々は加圧下・磁場下・比熱・帯磁率同時測定を行うことにより、このキュリー点Tc(P)の圧力(P)依存性を7.5kbarの圧力まで追究した。その結果、Tc(P)が予想に反し、急下降し、7.2kbar下では、Tc(P)=0.35Kとなること,又、比熱の解析から、分子間磁気相互作用が、3次元空間から、2次元空間に低次元化する現象を見出した。すでに知られている結晶構造と対応させ、その相互作用の中身について検討し、その成果は発表(ICM,及びInter'n cont.on Molecular based magnetism)、公表しつつある。特に、このラジカルのTc(P)が双極子相互作用で決定するという報告がなされていたが、この見解は、我々の加圧下における実験から否定された。2.フェルダジル基を有する有機強磁性ラジカルの研究:これまで発見されている有機強磁性ラジカル結晶は、-NO,-NO_2基をもつ物質が殆どであったが、我々は愛媛大学の向井等が合成している一連の誘導体の極低温・磁場中の物性を測定し、有意な結果を得つつある。第一に、P-CDTVにおいて、(TC=0.67K)典型的一次元量子スピン(S=1/2)強磁性体の特徴を定量的に確定した(Phys.Rev.Letters)。従来より、一次元強磁性体は、磁気異方性に敏感で、量子スピンの多体効果を本質的に捕えるには異方性のない系が望まれていた。我々はこのラジカルの磁場中比熱、又零磁場下の帯磁率の解析から、それらをはじめて明らかにすることができた。今後は、この試料の加圧下の実験に精力を注ぎ、Tc(P)の下降が、有機強磁性体の一般的特徴か否かを先ず決めたい。更にP-CDpOVについても、Tc=0.21Kを見出し、その磁気的低次元性も明らかにしつつある(日本物理学会、1995春:公表予定)。
活性酸素種による翻訳後修飾を検出する蛍光バイオセンサー

シグナル分子としての活性酸素種(ROS)や一酸化窒素(NO)の作用により誘起されるタンパク質の翻訳後修飾過程を、蛍光変化により可逆的に計測するバイオセンサーを構築し、細胞内でのROS、NOの時間的・空間的な制御過程をリアルタイムに計測することを目的として、研究を遂行した。ROSにより翻訳後修飾を受ける内在性タンパク質の部分構造をROS反応部位として用いて、分割蛍光タンパク質によるバイオセンサー構築法を応用した、標的タンパク質の翻訳後修飾を引き起こす活性酸素種を検出する細胞内発現型蛍光性センサーを構築した。TRPC5チャネルの部分構造を導入した蛍光タンパク質誘導体2種類を設計、構築したプラスミド遺伝子を導入して形質転換した大腸菌を調製し、それぞれの蛍光タンパク質誘導体を大量発現した。大腸菌を破砕し、単離精製した蛍光タンパク質誘導体のうち、分割型が顕著にNOに応答し、蛍光強度変化を示すのが確認された。また、NO検出の逆過程を還元剤の添加によるジスルフィド結合の開裂で評価したところ、NOの応答とは逆の蛍光強度変化が確認されたが、設計した分割型蛍光タンパク質は、NOを検出可能なバイオセンサーとして機能した。次に、分割型バイオセンサーが設計どおりの機構でNOを検出しているかを明らかにするために、NO添加前後でのチオール基濃度を定量した。正確にチオール基を定量するために、EGFP中のシステインを別のアミノ酸に置換した変異体を作製した。その結果、C49S, C71Vの変異体が蛍光性を維持した状態で発現できた。この変異体を基本骨格として用いて作製したセンサーでも、同様にNOに応答した蛍光強度変化が確認された。検出メカニズムを明らかにし、他の活性種との選択性も評価しつつ、検出感度および応答速度を向上させた変異体の調製をおこなうことにより、細胞内でのNOセンサーの創製が期待出来る。28年度が最終年度であるため、記入しない。生体内で産出される一酸化窒素(NO)は、様々なタンパク質に存在するチオール基を翻訳後修飾(S-ニトロシル化)することにより、シグナル伝達に関与していると考えられている。翻訳後修飾によるタンパク質機能の変化は多岐にわたっているため、NOが関与する細胞内シグナル伝達には、いまだ解明されていないことが多い。それらを解明していくためには、NOを直接生体内で観測する手法が必要である。これまでに生体内のNOを検出するいくつかの方法が報告されている。その中でもNOとの特異的な化学反応を介した蛍光特性変化を利用した蛍光センサーは、非侵襲的な可視化を可能とするため、非常に有用である。蛍光有機小分子を基本骨格としたNOセンサーに関しては、いくつかの報告例がある。一方で、遺伝子として細胞に導入することで、細胞内で直接構築することができる蛍光タンパク質を基本骨格としたNOセンサーは、これまでに報告されていない。本研究では、蛍光タンパク質を基本骨格とした遺伝子導入型のNOセンサーの構築を目指した。ROSによる翻訳後修飾を可逆的に検出する蛍光バイオセンサーの作製スルフェニル基(SOH)やS-ニトロソ基(SNO)などの翻訳後修飾を受けることが既に知られているシステイン側鎖を有する内在性タンパク質(センサータンパク質)の部分構造を「ROS反応部位」として利用した「翻訳後修飾に伴う構造変化を読み出す細胞内発現型蛍光センサー」を蛍光タンパク質にROS反応部位を融合させて作製した。構築したGFP融合タンパク質のうち、NOとの反応によって蛍光発光挙動が変化するものが得られた。TRPチャネルのひとつであるTRPC5 (Nat. Chem. Biol., 2006)の構造変化メカニズムに着目し、そのS-ニトロシル化部位として同定されたCys553を含む部分構造を「ROS反応部位」として用いた。TRPC5から選定したROS反応部位を分割GFP (spGFP : Baird, G. S.; Zacharias, D. A.; Tsien, R. Y. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999, 96, 11241)の発色団付近に融合させた。発色団付近にROS反応部位を導入できるspGFPを用いるため、ROS反応部位の構造変化に鋭敏に応答して蛍光が大きく変化すると期待した。NOによりTRPC5のCys553のチオール基がS-ニトロソ基となった後にCys558とジスルフィド結合を形成することで引き起こされる一連の構造変化が、spGFPの発色団近傍の構造を変化させ、その結果、NOによる翻訳後修飾に依存したspGFPの蛍光変化が観測できると考えた。分割型および円順列変異型の二種類のGFPの蛍光団付近にNO応答部位を導入したNOセンサーを構築し、その機能を評価したところ、構築したGFP融合タンパク質のうち、NOとの反応によって蛍光発光挙動が変化するものが得られた。この結果は、当初の分子設計指針が有効であることを支持している。加えて、当初の設計通り、レシオ型センサーとして機能することも明らかになった。

TRPC5チャネルの部分構造を導入した蛍光タンパク質誘導体2種類を設計、構築したプラスミド遺伝子を導入して形質転換した大腸菌を調製し、それぞれの蛍光タンパク質誘導体を大量発現した。大腸菌を破砕し、単離精製した蛍光タンパク質誘導体のうち、分割型が顕著にNOに応答し、蛍光強度変化を示すのが確認された。また、NO検出の逆過程を還元剤の添加によるジスルフィド結合の開裂で評価したところ、NOの応答とは逆の蛍光強度変化が確認されたが、設計した分割型蛍光タンパク質は、NOを検出可能なバイオセンサーとして機能した。次に、分割型バイオセンサーが設計どおりの機構でNOを検出しているかを明らかにするために、NO添加前後でのチオール基濃度を定量した。正確にチオール基を定量するために、EGFP中のシステインを別のアミノ酸に置換した変異体を作製した。その結果、C49S, C71Vの変異体が蛍光性を維持した状態で発現できた。この変異体を基本骨格として用いて作製したセンサーでも、同様にNOに応答した蛍光強度変化が確認された。検出メカニズムを明らかにし、他の活性種との選択性も評価しつつ、検出感度および応答速度を向上させた変異体の調製をおこなうことにより、細胞内でのNOセンサーの創製が期待出来る。分割型および円順列変異型の二種類のGFPの蛍光団付近にNO応答部位を導入したNOセンサーが機能することが明らかになった。今後は、得られたセンサーをもとにして、一酸化窒素への選択性を評価する。また、レシオ型センサーとして機能することが明らかになったが、さらなる感度の向上(SN比の向上)を目指して、GFPとNO反応部位の連結部分について、様々な誘導体を合成する。NO選択的なセンサーが得られれば、細胞内でのセンシングを検討する。28年度が最終年度であるため、記入しない。
ヒトTUT1によるRNAポリウリジル化の分子構造基盤

TUT1はU6 snRNAの成熟化を担う酵素であり、U6 snRNAを特異的に認識して3'末端にウリジンを付加する活性を持つ。U6 snRNAの3'末端はU6 snRNPの形成やスプライソソームのリサイクルに関わるため、その成熟化は真核生物の遺伝子発現に重要なプロセスである。申請者らは本研究に先だってTUT1単体の立体構造を決定し、U6 snRNAに特異的なウリジル化反応の概要を明らかにしてきた。しかし複合体の立体構造は明らかになっておらず、完全な結合様式の解明には至っていない。本研究の目的は、TUT1とU6 snRNAの複合体立体構造解析から特異的な認識メカニズムを明らかにすることである。
将来の妊孕性に影響する思春期女子の月経困難症の増悪因子と防御因子の探索的研究

本研究は,思春期の月経困難症の実態に着目し,コホート研究を行い,初経以降に進行する月経困難症の実態を把握すること,進行する月経困難症のリスク因子を探索的に明らかにすることを目的としている。1)思春期世代の月経困難症の実態について,女子中学生を対象とし,月経状況,月経痛の現状及び1年前に比べ月経痛が増強した人の割合を把握すること,2)進行傾向を示す月経困難症に影響する要因を探索するため,影響要因をベースラインで調査し,2年間の追跡期間中に影響因子あり群となし群の間で月経痛増強の発生の違いを明らかにすることである。当該年度は,コホート研究に先立ち,月経痛・月経随伴症状に関する変数と月経困難症に影響すると予測される変数を検討するため,文献レビューを行った。本邦の思春期女性は身体発育に伴う初経低年齢化,性機能の早熟,ライフスタイルの変化としてストレスの増加,運動不足,不規則な生活習慣,食生活の欧米化,やせ願望による低体重などの健康課題を抱えており,それらと性周期や月経随伴症状の関連性が指摘されていること,生物学的理論上ではリノール酸や動物性食品,スナック菓子,ショートニングなどはプロスタグランジン産生に関与する食品の摂取などが増強因子として予測されることから月経困難症のリスク因子の探索を幅広く網羅し調査する必要があると考えたためである。月経困難症の文献レビューを行い,調査項目として主観的健康感,睡眠状況,運動習慣,食習慣,食品摂取状況,日常生活のストレス,冷え性,月経に対する認識などを抽出した。本研究は思春期の月経困難症の実態に着目し,コホート研究を行い,初経以降における進行する月経困難症の実態を把握すること,進行する月経困難症のリスク因子を探索的に明らかにすることを目的としている。初年度はコホート研究に先立ち,調査項目の選定を行い,調査開始の準備を進めた。今後は1コホート研究運営に向けたインターネットデータベースの作成,2女子中学生と保護者に向けた月経にまつわる教育セミナーを開催し,プログラムの案内,開催時期,内容などを確認し,研究開始に向けたプレテストを実施し,インターネットデータベースの運営を確認し,研究を進めていく。今後の研究の推進方策は,1コホート研究運営に向けたインターネットデータベースの作成,2女子中学生と保護者に向けた月経にまつわる教育セミナーを開催し,プログラムの案内,開催時期,内容などを確認し,研究開始に向けたプレテストを実施し,インターネットデータベースの運営の確認をする。コホート研究を開始し,2年間の追跡調査を実施する。インターネットデータベース作成においてプレテストを実施したが、修正・再テストの必要性があり、次年度にインターネットデータベース作成することになったため、コホート運営費用予算は翌年度に持ち越した。
古津波調査に基づく環太平洋巨大地震の津波高確率予測

環太平洋で過去に発生した巨大地震による津波を系統的に調査した.1960,2010年チリ地震,2006,2007年千島列島の地震,2009,2010年インドネシアの地震について,すべり量分布の特徴を明らかにした.2004年スマトラ島沖地震より古い地震を地質学的痕跡から調べた.2011年東北地方太平沖地震は869年の貞観地震型と1896年明治三陸津波地震型のほぼ同時発生であった.M9の巨大地震について,M8の海溝型地震の相似則が適用できる.環太平洋で過去に発生した巨大地震による津波を系統的に調査した.1960,2010年チリ地震,2006,2007年千島列島の地震,2009,2010年インドネシアの地震について,すべり量分布の特徴を明らかにした.2004年スマトラ島沖地震より古い地震を地質学的痕跡から調べた.2011年東北地方太平沖地震は869年の貞観地震型と1896年明治三陸津波地震型のほぼ同時発生であった.M9の巨大地震について,M8の海溝型地震の相似則が適用できる.2009年1月にインドネシア西パプア州で発生した津波は,震源域周辺で被害をもたらしたのみならず,日本に向けて伝播し,伊豆諸島や本州・四国南岸で津波注意報が発令された.この津波について,70か所で記録された津波波形を使って,断層面上のすべり量を推定した.2009年8月に駿河湾で発生した津波は,海底が隆起したにも関わらず引き波から始まっていたことから,検潮井戸の応答特性を現地で調査し,検潮記録に施した.その結果,記録された津波波形は検査井戸の特性の影響をほとんど受けていないことが判明した.2009年9月にサモアで発生した地震は,これとは逆に正断層であったにもかかわらず海底水圧計の記録は上げ波から始まっているところが多かった.これについては,正断層地震の直前あるいは直後に逆断層の地震が発生したとされている.これらの研究についてレビューし,Nature誌のNews and Viewsで紹介・解説した.1960年及び2010年に南米チリで発生した巨大地震について,太平洋各地の津波波形ならびにチリの海岸などにおける上下変動データを用いて断層上のすべり量分布を推定した.1960年チリ地震については,地殻変動データのみから推定したものとほぼ同じ地震モーメントが得られ,地震波解析によるものよりも若干小さかった.2010年チリ地震については,津波波形のみからだと陸地の下に大きなすべりが推定されたが,海岸の上下変動データも併用すると,大きなすべりは沖合に推定された.1960年及び2010年に南米チリで発生した巨大地震について,太平洋各地の津波波形ならびにチリの海岸などにおける上下変動データを用いて断層上のすべり量分布を推定した.1960年チリ地震については,地殻変動データのみから推定したものとほぼ同じ地震モーメントが得られ,地震波解析によるものよりも若干小さかった.2010年チリ地震については津波波形のみからだと陸地の下に大きなすべりが推定されたが,海岸の上下変動データも併用すると,大きなすべりは沖合に推定された.また,チリ海岸南部における現地調査を実施し,1960年より前の地震についての古地震学的データの調査を行った.1837年,1737年の地震については,現地の歴史記録には残されているが,津波堆積物は残っておらず,津波堆積物が残るほど大きかったのは,1960年地震の前は1575年であったことを確認した.2010年10月にインドネシア・メンタワイ諸島で発生した地震について,現地調査による震度(地震の揺れ)と津波の高さ,さらには津波記録を使った解析結果から,この地震は津波地震であることが明らかとなった.これまでジャワ島の南では津波地震が発生していたが,スマトラ島の南でも初めてその発生が確認された.2011年3月の東北地方太平沖地震について,東大地震研究所の海底ケーブル式水圧計や国土交通省のGPS波浪計に記録された津波波形は地震直後に数分以上かけて2m以上水面が上昇する第1段階の津波と,それに続いて3分間に2m以上上昇する第2段階の津波波形を記録していた.これらに加えて数多くの津波波形記録を用いたインバージョン解析から,海溝付近に40m以上の大きなすべりが発生し,これは第2段階の津波を説明すること,さらにプレート境界の深い部分でも10m以上の大きなすべりが発生し,これが第1段階の津波に寄与していたことが分かった.環太平洋で過去に発生した巨大地震による津波を,系統的に調査した.南米のチリ沖については,南米の太平洋沿岸の検潮所と海底水圧計で記録された津波の波形データならびにチリの海岸などにおける地殻変動データを用いて,1960年及び2010年の巨大地震の断層上のすべり量分布を推定した.千島列島で2006年と2007年に2つの地震について,2006年のプレート間逆断層地震によるものが2007年のプレート内正断層によるものよりも規模が大きかったことを,深海の磁力計データから確認した.

インドネシアにおいては,2009年にパプア島で発生した地震は指向性によって日本での津波が相対的に大きかったこと,2010年スマトラ島沖(メンタワイ諸島)で発生した地震については,地震のゆれの割には津波が大きな津波地震であり,他の津波地震同様に海溝軸付近で大きなすべりが発生したことを,津波の波形解析から明らかにした.インド洋のアンダマン諸島では,2004年のスマトラ・アンダマン地震の前にも,過去400年に大きな地震が2回発生していたことを,液状化痕跡・津波堆積物から明らかにした.2011年東北地方太平沖地震については,沖合の圧力計・GPS波浪計などに記録された津波波形の詳細な解析により,すべりの時空間分布を明らかにした.その結果,869年の貞観地震のモデルに似たプレート間深部のすべりに引き続き,1896年明治三陸津波地震と似た海溝軸周辺のすべりが発生していたことが明らかになった.20世紀以降に世界(環太平洋・インド洋)で発生したM9クラスの巨大地震の地震モーメント,断層面積,平均すべり量,大すべり域の面積の関係についてまとめた.その結果,これまで知られていたM8クラスの海溝型地震の相似則がほぼそのまま適用できることがわかり,M9クラスの地震からの津波高さの予測に用いることができることが明らかとなった.24年度が最終年度であるため、記入しない。24年度が最終年度であるため、記入しない。
アロマターゼのアンドロゲン降下作用に着目した新たな排卵誘発法の開発

発育卵胞の排卵は、アロマターゼが卵胞内アンドロゲンレベルを低下させることにより始まるとの仮説を検証し、このコンセプトに基づいた不妊治療の開発を目指して研究を実施した。野生およびアロマターゼKOマウス前胞状卵胞を用いたin vitro体外排卵系により、排卵反応を評価したところ、低濃度のhCGで卵胞を刺激したin vitro PCOSモデルでは、Cyp17a1阻害剤により排卵率・卵丘膨化・卵子成熟度の回復がみられ、仮説が支持された。さらに、体外受精時に得られた非主席小卵胞は高アンドロゲン環境下で一定期間competencyを保っていることを確認し、治療応用の可能性を示した。マウス卵胞接着系培養を用いたin vitro排卵系を確立した。rhCG・rEGFなどの添加後の排卵率は、長期(10日)培養系では卵胞破裂(排卵)率が5%前後と低かったが、短期(5日)培養系により4030%と高くなった。短期培養系のアロマターゼ発現、エストロゲンおよびアンドロゲン濃度の基礎的検討を行い、アンドロゲン降下による排卵誘導の検討モデルとしての妥当性を検討した。その結果、エストロゲンの上昇・アンドロゲンの低下が確認され、実験系としての妥当性が確認された。この系によりアロマターゼ阻害剤添加し、アロマターゼ活性抑制により卵胞破裂が抑制されることを確認した。次に、アロマターゼノックアウトマウス卵胞を用いたin vitro排卵系を用いて、アロマターゼknock in実験を行うためのベクター作成とマウスの繁殖を行った。アロマターゼノックアウトマウスの繁殖作業中にエンテロウィルス感染が生じたため、除染作業を行った。ヒト体外受精時の穿刺卵胞液中のステロイド濃度および顆粒膜細胞のLH受容体発現・アポトーシスの解析を行い、主席卵胞と周囲の小卵胞(非選択卵胞)とで比較してアンドロゲン降下の意義を検討した。その結果、主席卵胞ではアンドロゲン高値・エストロゲン低値、小卵胞(非選択卵胞)ではアロマターゼ低発現とアンドロゲン高値・アポトーシスの亢進を確認した。さらに、非選択小卵胞内卵子の少なくとも一部が正常な発生能を有するMII卵子であることを見いだした。アンドロゲンの高値持続により卵胞の増大発育は停止するが卵子の成熟は必ずしも停止しないことが明らかとなったことから、アンドロゲン降下療法が妊孕に繋がる可能性が示された。平成25年度の基礎的検討を踏まえて、幼若マウス(C57BL/6J, JCL)体外排卵系のさらなる改変・改良を実施した。新たに低吸着培養系による体外排卵系を確立した。これにより、卵胞破裂がより容易に判定できるようになった。これらの系を用いて、検討した結果、letrozole(0.01-10μM)添加により濃度依存性に卵胞破裂が抑制されること、このときの培地内のテストステロン濃度は上昇しエストラジオールが検出されないことを確認した。この系に破裂卵胞と同程度の濃度(300-500pg/ml)になるようにエストラジオールを添加しても排卵は回復しなかった。Letrozoleと同様の卵胞破裂抑制は、ステロイド性アロマターゼ阻害薬であるexamestane(0.1-10μM)添加によっても観察された。次に、体外排卵系にアンドロゲン受容体拮抗薬(flutamide)を添加したところ、卵胞破裂が促進された。同様の破裂促進効果はCYP17A阻害薬(avirateron)でも部分的に再現された。これらの実験から、アロマターゼ阻害による排卵抑制がエストロゲン産生の低下によるものではなく、アンドロゲン作用の低下によるものであるとの仮説が支持された。アロマターゼKOマウスによる体外排卵系によるアロマターゼknock in実験のための卵胞内遺伝子発現系を確立した。アンドロゲン作用拮抗薬あるいは合成阻害薬のヒトへの投与研究の準備のため体外受精の際に採取された卵胞液アンドロゲン濃度の測定を実施し、自然周期・アロマターゼ阻害剤投与周期・エストロゲン受容体拮抗薬投与周期における基礎的情報の収集を行った。さらに、ヒトへの阻害剤投与に備え、体外受精時に採取された顆粒膜細胞に阻害剤添加してステロイド合成に対する影響(濃度依存性)を検討した。幼若アロマターゼKOマウスより前胞状卵胞を採取し、アンドロゲン・エストロゲンの卵胞発育と排卵に及ぼす効果を体外排卵系を用いて検討した。野生型マウスでは、アロマターゼ阻害剤(Ai)添加は卵胞径に影響を及ぼさずに排卵率を低下させること、この効果はestradiol(E2)によりキャンセルされること、17α-HSD阻害剤添加(abirateron, AB)はAiの排卵抑制効果を増強することを確認した。

これに対し、アロマターゼKOマウスでは、E2添加およびAB添加によっても排卵は認められず、全身性アロマターゼKOマウスに見られる排卵障害には、E2低下以外の因子が関与していることが示された。そこで、Cas9/CRISPERシステムを用いてアロマターゼ遺伝子エクソンII領域をCre・loxPで挟んだ遺伝子座を持つ条件付きアロマターゼKO(flox)マウスを作成し、tetでCREが発現誘導されるトランスジェニックマウスと交配した。得られたマウス卵胞を用いて体外排卵系を用いて、アロマターゼとアンドロゲンの排卵における役割を評価する実験系を作成し、長期的なE2欠乏の影響がない系での検討を開始した。次に、hCG添加培地を用いてPCOSモデルを作成して検討を行った。このモデルでは、卵胞は大型(>300nm)となり生存率が上昇するが、hCG排卵刺激によっても、卵丘の膨潤と卵子成熟が進行せず、排卵率が低下する。この系でアロマターゼを強制発現させたところ排卵率は上昇した。体外受精胚移植治療時にAi投与を受けた患者より同意を得て検討を行った。その結果、臨床量のAi投与で生じる卵胞内アンドロゲン濃度の上昇は卵胞破裂を阻害しないこと、Aiは主席卵胞および閉鎖卵胞内卵子の成熟度を有意に高めること、卵胞破裂後の卵子の放出不全(破裂後にも卵子が卵胞内に留まる)の頻度がAi投与により若干低下することを確認した。マウスin vitro排卵モデルを確立するための基礎的な検討を進め、最終的に卵胞破裂におけるアロマターゼ発現の意義を解析するためのおおむね適切な排卵系を確立することができた。この結果、アロマターゼ抑制の効果を確認することができ、以後のメカニズム解析が可能となった。第二段階ではアロマターゼノックアウトマウスを用いた解析のための準備を行った。発現ベクター等の準備は順調に進行したが、卵巣特異的アロマターゼノックアウトマウスは時間がかかったため、解析をin vitroに変更し既存のノックアウトマウスを用いることに変更した。マウス繁殖時にエンテロウィルス感染が判明したため、除染が必要となり実験の一部を次年度に繰り越すこととなった。体外排卵系の改良と改変を進めた結果、卵胞の破裂をより容易に判定できる実験系が作成できた。本年度はこの系を用いて、アンドロゲン濃度調節の鍵となる2つの酵素(CYP19A1、CYP17A1)の活性阻害薬やエストロゲン補充実験が可能となり、「成熟後の卵胞ではアンドロゲン作用の低下が卵胞破裂への切り替えに関わっている」との仮説を支持するための輻輳した実験を進めることができた。今後、この実験系を用いてアンドロゲン作用の低下がもたらす分子変化を検討する予定である。さらに、この排卵系を用いてアロマターゼknock inを実施する系を立ち上げることができ、アロマターゼノックアウトマウス卵胞の体外排卵系でのknock in実験の準備を整えることができた。しかしながら、アロマターゼノックアウトマウスは、ウィルス感染の問題を解決できず実施できなかった。ヒト卵胞液の検体採取と保存は予定どおり進行した。アンドロゲン阻害剤のヒトへの投与にそなえ、ヒト卵胞由来顆粒膜細胞のin vivoでの投与実験を開始することができた。生殖内分泌学、婦人科腫瘍学27年度が最終年度であるため、記入しない。ノックアウトマウスの除染がうまく進まないときは凍結受精卵からの作出を行う。
マイトトキシンなどの大型海洋天然物の機能解明

昨今、従来の天然物の範疇を越えるマイトトキシン、ゾ-ザンテラトキシン、パリトキシンのような海洋大型分子が注目を集めている。これら大型分子は、非常に強力な生物活性を有しており、その作用機構は薬物等の低分子とは本質的に異なることが予想され、これを解明すれば生命科学の研究に新たな視点を加えることができる。しかし、化学的方法による誘導や変換がを行なうにはあまりに分子が複雑すぎること(および十分量の天然物試料が入手できないこと)などの理由により研究は進んでいない。本研究では、これらの問題点を解決してマイトトキシンなどの大型天然物の作用機構を解明するために、まず精密な3次元構造を決定し、それに基づく実験方法の開発を行なった。筆者は東北大学と共同で、NMRを用いた鎖状部分の立体構造解析を行なった結果、親水性の分子前半部分(C1-C81)については、準安定な回転異性体が多数存在し一定の3次元構造をとらないと推定されたが、疎水性の高い後半部分(C82-C134,R環-F環)は直線的な配座をとると考えられた。この全長約45Åの疎水性部分は細胞膜を貫通するのに十分な長さを有し、ブレベトキシンやシガトキシンなどの膜蛋白(電位依存性Na^+チャネル)に作用するポリエーテルと類似した構造を有する。そこで、この疎水性部位と高い構造類似性を持つブレベトキシンBを用いて薬理学的検討を行なった結果、1-30μg/mlの範囲で用量依存的にマイトトキシンの活性を阻害し、最大でコントロールに対して約80%の抑制を示した。これは、マイトトキシンのターゲット分子上の結合部位にブレベトキシンBが結合して拮抗的に阻害した可能性を示唆する。
慢性心不全患者の療養環境・療養行動・QOLに関する調査

本研究では、慢性心不全患者を対象とし、QOLと心不全セルフケア行動をアウトカムとした場合の、看護介入と療養環境の影響を検証し、慢性心不全患者に対する看護のEvidenceの蓄積を目指している。その一環として、今回は、慢性心不全看護認定看護師の介入と、療養環境の指標として家族構成・支援者・社会資源の利用・各職種の介入状況を多施設で調査し、従来使用されてきたアウトカム指標である心不全死亡率・心不全再入院率に加え、QOL・心不全セルフケア行動を評価することで、看護介入と療養環境が、アウトカム指標である心不全死亡率や心不全再入院率、およびQOL・心不全セルフケア行動とどのような関連性を持つのかを明らかにするために研究を開始した。2018年3月31日までの症例登録期間中に研究協力の意思表示があった施設が59施設、内42施設が各施設で倫理委員会の承認を受け、症例登録と調査を開始した。本研究の参加施設は、公益社団法人兵庫県看護協会で認定看護師教育課程を修了した慢性心不全看護認定看護師が所属する施設に限定しており、施設の所在地域は西日本を中心に、北は静岡県から南は佐賀県まで15の府県に至っている。2019年3月31日で登録症例の1年間の追跡期間は終了した。追跡調査6ヶ月時点で、認知症による質問票での調査困難、転院、追跡期間中に除外基準に該当、調査票未返却などで追跡困難となった症例が11例、研究協力者からの調査票未郵送が5例、追跡調査1年の時点で、追跡調査困難となった症例は4例、研究協力者からの調査票未郵送2例であった。今年度は昨年度に引き続きデータベースの作成と欠損値と不適切値の確認を行った。目標症例数800症例を満たすことができなかったため、欠損値・不適切値を減らすことを主眼に研究協力者への疑義照会に努めた。また現在得られているデータで分析を行い、傾向を確認した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、慢性心不全患者を対象とし、QOLと心不全セルフケア行動をアウトカムとした場合の、現行の看護介入と療養環境の影響を検証し、慢性心不全患者に対する看護のEvidenceの蓄積を目指している。その一環として、今回は、看護介入の指標として、慢性心不全看護認定看護師や心臓リハビリテーションそして訪問看護師などの介入を、療養環境の指標として、家族構成・支援者・社会資源の利用・各職種の介入状況を多施設で調査し、従来使用されてきたアウトカム指標である心不全死亡率・心不全再入院率に加え、QOL・心不全セルフケア行動を評価することで、看護介入と療養環境が、アウトカム指標である心不全死亡率や心不全再入院率、およびQOL・心不全セルフケア行動とどのような関連性を持つのかを明らかにするために研究を開始した。2018年3月31日で多施設での症例登録期間は終了し、症例登録期間内に、多施設で研究協力の意思表示があった施設が59施設、内42施設が各施設で倫理委員会の承認を受け研究を開始している。症例登録期間は、各施設での倫理委員会承認日から2018年3月31日までとしており、期間中全体で255例の症例登録があり、1例同意撤回のため最終の登録症例数は224例となっている。順次データベースの作成を行い、また同時に欠損値と不適切値の確認を行いながら、各施設の研究協力者に疑義照会を行っている。平成30年度は、登録された患者を1年間追跡調査し、登録後6ヶ月と1年後の転帰・療養環境・多職種の介入の状況と、登録後6ヶ月時におけるQOLと心不全セルフケア行動の状況の調査を進める。2018年3月31日で多施設での症例登録期間は終了した。目標登録症例数は800例であったが、登録症例数は224例となった。統計専門家に依頼し、データベースの作成を行い、また同時に症例登録時のデータを入力し、欠損値と不適切値の確認を行いながら、各施設の研究協力者に疑義照会を行っている。2017年11月と2018年4月に研究協力者を集めカンファレンスを行い、現状の共有と今後の方向性の確認を行った。今後は登録された患者を1年間追跡調査し、登録後6ヶ月と1年後の転帰・療養環境・多職種の介入の状況と、登録後6ヶ月時におけるQOLと心不全セルフケア行動の状況を調査していくことになる。登録時期が早かった症例に関しては、順次6ヶ月後・1年後データが集まり始めている。現時点で、6ヶ月後データは195症例、1年後データは174症例集まっており、多くの追跡データが回収できるよう各施設に働きかけを行なっている。

その一環として、今回は、慢性心不全看護認定看護師の介入と、療養環境の指標として家族構成・支援者・社会資源の利用・各職種の介入状況を多施設で調査し、従来使用されてきたアウトカム指標である心不全死亡率・心不全再入院率に加え、QOL・心不全セルフケア行動を評価することで、看護介入と療養環境が、アウトカム指標である心不全死亡率や心不全再入院率、およびQOL・心不全セルフケア行動とどのような関連性を持つのかを明らかにするために研究を開始した。2018年3月31日までの症例登録期間中に研究協力の意思表示があった施設が59施設、内42施設が各施設で倫理委員会の承認を受け、症例登録と調査を開始した。本研究の参加施設は、公益社団法人兵庫県看護協会で認定看護師教育課程を修了した慢性心不全看護認定看護師が所属する施設に限定しており、施設の所在地域は西日本を中心に、北は静岡県から南は佐賀県まで15の府県に至っている。2019年3月31日で登録症例の1年間の追跡期間は終了した。追跡調査6ヶ月時点で、認知症による質問票での調査困難、転院、追跡期間中に除外基準に該当、調査票未返却などで追跡困難となった症例が11例、研究協力者からの調査票未郵送が5例、追跡調査1年の時点で、追跡調査困難となった症例は4例、研究協力者からの調査票未郵送2例であった。今年度は昨年度に引き続きデータベースの作成と欠損値と不適切値の確認を行った。目標症例数800症例を満たすことができなかったため、欠損値・不適切値を減らすことを主眼に研究協力者への疑義照会に努めた。また現在得られているデータで分析を行い、傾向を確認した。本年度は、登録された患者を1年間追跡し、登録後6ヶ月と1年後の転帰・療養環境・多職種の介入の状況と、登録後6ヶ月時におけるQOLと心不全セルフケア行動の状況を調査する。また追跡調査を行いながら、適時収集したデータを確認し、データの欠損値を減らし、精度を高めるため適時疑義照会を行う。得られたデータの整理・分析を統計専門家に依頼しながら、次年度の論文作成に備える。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。