hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
重症心不全患者の心機能回復を目指した補助人工心臓による心臓リハビリシステムの構築

本研究によって、自己心拍に同期してポンプ駆動状態を制御して自己心に対する負荷をコントロールできるNative Heart Load Control System(NHLCS)が開発された。本システムは自己心拍数の変化や不整脈にも追随して駆動することができることも確認され、急性動物実験にて自己心の負荷を変化させることに成功した。また、心収縮力を落として不全心を作成した実験モデルに装着しても、同様に有効であることも確認できた。最終的に、慢性動物実験にて慢性安定期の心不全モデルに対しても同様に有効であることまで確認しえた。さらに、本システム駆動中に冠動脈血流を増加させうることも発見され、新たに虚血性心不全に対する効果も期待させることとなった。また、本システムの駆動によって全身血流における動脈圧の拍動性も増加させうることも解明された。現在、これら様々な付加的効果も含めて、今後の人工心臓実機への搭載が検討されている。自己心機能回復を目指した補助人工心臓による心臓リハビリシステムの構築を目指して、本年度は補助人工心臓制御システムの作成および大動物を用いた急性実験でのシステムの有効性評価を行った。最初に制御システムの設計目標の設定のため、模擬循環回路に定常流型左心補助人工心臓(EVAHEART)を接続し、制御駆動を行った。模擬循環装置の模擬心臓をリニアアクチュエータによって生体心の一回拍出量および心拍数を模擬するように駆動し、この模擬心臓の負荷状態をコントロールするように同期させてEVAHEARTを駆動した。この予備実験にて目標回転数到達時間を20-50msecに設定することとして制御システムを構築することとなった。次いで、完成した制御システムを用いて15頭の成山羊に対して急性実験を行いシステムの有効性評価を行った。本実験において、上記システムにて駆動するEVAHEARTを左室心尖部脱血・下行大動脈送血にて生体内に植え込み、様々な条件にて駆動させた際の心筋酸素消費量と冠動脈血流量の変化を計測した。制御法として自己心電図同期下に拡張期に回転数を上昇させるCounterpulseモードと収縮期に回転数を上昇させるCopulseモードを用いた。Copulseモードにおいては拡張末期左室圧と心筋酸素消費量が有意に上昇した。Counterpulseモードでは冠動脈血流が有意・に増加した。また、心筋酸素消費量の実測値と圧容積面積の間には有意な相関関係が成立していることが示された。以上の結果は、本研究の最終目的である自己心にかかる負荷量を自由に調整することができるシステム(Native Heart Load Control System NHLCS)の構築が現在の制御システムによる自己心拍同期モードによって可能となることを強く示唆していると考えられた。自己心機能回復を目指した補助人工心臓による心臓リハビリシステムの構築を目指して、本年度は補助人工心臓制御システムを用いた心不全モデルに対する急性実験でのシステムの有効性評価を行った。昨年度に作成した制御システムを用いて15頭の成山羊に対してマイクロスフェアの冠動脈動注によって急性虚血性心不全を作成し、急性実験を行いより臨床に近い心不全状態に対するシステムの有効性の評価を行った。Counterpulseモードでは冠動脈血流が有意に増加した。これらの結果は昨年度に正常心モデルで得られた結果と同様であり、本システムが収縮力が低下した心不全状態に対しても有効に駆動できることを示している。自己心機能回復を目指した補助人工心臓による心臓リハビリシステムの構築を目指して、本年度は補助人工心臓制御システムを用いた心不全モデルに対する急性実験および覚醒下での慢性実験にてシステムの有効性評価を行った。昨年度までに作成した制御システムを用いて15頭の成山羊に対してマイクロスフェアの冠動脈動注によって急性虚血性心不全を作成し、急性実験を行いより臨床に近い心不全状態に対するシステムの有効性の評価を行った。

本実験において、上記システムにて駆動するEVAHEARTを左室心尖部脱血・下行大動脈送血にて生体内に植え込み、様々な条件にて駆動させた際の心筋酸素消費量と冠動脈血流量の変化を計測した。制御法として自己心電図同期下に拡張期に回転数を上昇させるCounterpulseモードと収縮期に回転数を上昇させるCopulseモードを用いた。Copulseモードにおいては拡張末期左室圧と心筋酸素消費量が有意に上昇した。Counterpulseモードでは冠動脈血流が有意に増加した。また、心筋酸素消費量の実測値と圧容積面積の間には有意な相関関係が成立していることが示された。これらの結果は昨年度に不全心急性期モデルで得られた初期成績と同様であり、本システムが収縮力が低下した心不全状態に対しても有効に駆動できることを示している。また、8頭の成山羊に対してマイクロスフェア冠動脈動注およぎラピッドペーシング法にて作成した、慢性心不全モデルによる検討でも、急性実験とほぼ同等の結果が得られた。以上の結果より、本研究の最終目的である自己心にかかる負荷量を自由に調整することができるシステム(Native Heart Load Control System NHLCS)の構築が現在の制御システムによる自己心拍同期モードによって可能であり、臨床においても使用可能である可能性が示唆された。
面内及び面外荷重下での覆工を有するだ円形トンネルに関する準3次元解折とその応用

本研究では、まず複素応力関数を用いたただ円形介在物に関する厳密解を求める手法をを発展させ、覆工を有する場合の厳密解を求め、覆工を有するだ円形トンネルの厳密解を用いた順解析法を行った。問題を2次元面外せん断問題と2次元面内問題に分け、無限遠より一様な荷重が作用する場合を想定し解析手法としは、エアリ-の複素応力関数を用いて、級数解ではなく、計算速度が早く精度がよい厳密解にこだわり解析を行った。その定式化においては巻き立てを有する楕円形トンネルを共焦点だ円とし、写像関数を用いることによりそれを円形に写像して、この2つの円形境界上で鏡像原理を用いることにより比較的容易に解析解(厳密解)を求めることに成功した。これにより、覆工の地山に対する影響を面外せん断問題、面内問題ともに解析できた。この解析解の特徴としては、通常問題とされる応力場だけでなく、変位場も容易に求められることが挙げられる。このことより本研究の逆解析においては同定パラメータの判定基準に、だ円の長軸、短軸上の変位を解析解より求めることにより求めた歪みと現場で計測される歪みと比較し行うこととする。なお、現在逆解析については研究進行中である。
多点固定化により金属タンパク質を精密複合化した電極材料の構築とバイオデバイス応用

バイオ燃料電池はエネルギー分野や農業分野あるいは医療分野への応用が期待されるバイオデバイスである。とくに金属タンパク質の酸化還元反応を用いたバイオ燃料電池の高性能化において、より高い電極特性を達成するためには、タンパク質と電極材料間の効率的電子移動の実現が強く求められる。そこで、活性中心となる補因子の配向性を制御し、金属タンパク質を電極上に多点で固定化した系を構築するために、合成化学的アプローチと生化学的アプローチを統合した金属タンパク質ー電極材料複合化手法の確立をめざした。活性中心に補因子ヘムを有する電子伝達タンパク質シトクロムb562をモデルタンパク質に選定した。アジド基を有するヘムをアポシトクロムb562に挿入することで、アジド基を有するシトクロムb562を調製し、金電極へのタンパク質固定化の条件検討・電気化学的評価を試みた。合わせて、タンパク質N末端選択的に機能性分子修飾剤の開発にも取り組んだ。本研究では、タンパク質に普遍的に存在し、機能への影響が小さいと考えられるN末端アミノ基をターゲットに選択した。アルキンとアジドを前駆体とし、銅を触媒とする環化付加反応(CuAAC反応)により簡便に合成することが可能である1,2,3-トリアゾール-4-カルボアルデヒド(TA4C)誘導体がN末端アミノ基に選択的に作用し、イミダゾリジノン環を形成することを見出した。種々のTA4C誘導体を用い、モデルペプチド・タンパク質との反応も実施した。さらに質量分析による修飾反応の評価から、本反応がN末端選択的に進行することを確認した。補因子およびTA4Cにより修飾されたシトクロムb562の二点固定化について現在検討中である。原子間力顕微鏡を用いた固定化タンパク質の可視化に向け、平滑な金電極上へのアルキン基導入手法の検討を行った。また、異なる長さのリンカーを介してアジド基を補因子ヘムに直接導入したシトクロムb562を調製し、アルキン基修飾金電極への固定化を検討した。これに加えて、多点固定化に向けタンパク質マトリクスに機能性分子を簡便に一段階で導入する手法の開発にも取り組んだ。修飾法の普遍性と機能への影響低減の観点から、タンパク質N末端アミノ基をターゲットに選択し、含窒素芳香族カルボニル化合物を母骨格とする種々のN末端修飾剤を合成し、モデルペプチドとの反応評価を質量分析法により行った。中でも、1,2,3,-トリアゾール-4-カルボアルデヒド(TA4C)誘導体は高いN末端選択性および修飾率を示すことを見出した。本化合物群は、従来のN末端修飾剤に比べ、購入可能なアルキンおよびアジド化合物前駆体などから簡便に合成することが可能な点で優れる。TA4C誘導体による種々のタンパク質基質へのN末端機能性分子導入では温和な条件下80%と良好な修飾率が得られた。また、本手法を用いて、ビオチン・蛍光色素・ポリマー材料のN末端選択的な導入を達成している。現在、当初の計画どおりアジド基が補因子ヘムおよびN末端にアルキン基・アジド基が導入されたシトクロムb562の調製とCuAAC反応を介した電極基板上への二点固定化について検討を進めている。以上のように、本研究課題の実施によって酸化還元活性なヘムタンパク質の電極材料表面への配向性を制御した固定化と、タンパク質N末端選択的かつ一段階での機能性分子導入が可能となった。これらの研究成果をもとに、複数の学会での発表を行い国内外より大きな反響を得ている。また特許申請・学術論文の作成を進めており、本研究課題はおおむね順調に進展したと判断した。本研究課題の実施によって、効率的な電子伝達を実現する、電極材料と酸化還元活性なヘムタンパク質を複合化したバイオハイブリッド電極の構築に成功した。現在、電極上におけるヘムタンパク質の挙動解析に向けたサンプル調製の検討を行っている。金電極へのアルキン基導入量の調節によって、適度にタンパク質が分散して固定化されたサンプル調製が可能となる。またN末端選択的な一段階での機能性分子導入剤TA4Cの開発も達成している。今後はこれまでの電極修飾/タンパク質修飾技術を統合し、ヘムタンパク質を電極表面に多点で固定化することで、空間配置に加えて動的挙動が精密に制御されたバイオハイブリッド電極の構築をめざす。具体的には、アジド基が補因子ヘムおよびN末端に導入されたシトクロムb562の調製とCuAAC反応あるいは歪み解消型環化付加反応(SPAAC反応)を介した電極基板上への二点固定化を行い、得られたヘムタンパク質多点固定化電極のサイクリックボルタンメトリー測定・インピーダンス測定など電気化学測定からタンパク質の固定化量・電子伝達効率などの電極特性を評価する。また一点で固定化した系との電気化学的特性の違いについても検討する。さらに、タンパク質固定化構造を原子間力顕微鏡(AFM)、紫外可視・赤外分光法など分光学的手法からも評価が可能である。得られた知見を基に、シトクロムb562修飾に用いるリンカー分子の構造を検討することで、精密な固定化構造構築に向けた最適化が期待できる。以上のように、タンパク質二点固定化電極の作成と評価系の構築に加えて、構造の最適化による電極機能向上が今後の推進方策として挙げられる。

そこで、活性中心となる補因子の配向性を制御し、金属タンパク質を電極上に多点で固定化した系を構築するために、合成化学的アプローチと生化学的アプローチを統合した金属タンパク質ー電極材料複合化手法の確立をめざした。活性中心に補因子ヘムを有する電子伝達タンパク質シトクロムb562をモデルタンパク質に選定した。アジド基を有するヘムをアポシトクロムb562に挿入することで、アジド基を有するシトクロムb562を調製し、金電極へのタンパク質固定化の条件検討・電気化学的評価を試みた。合わせて、タンパク質N末端選択的に機能性分子修飾剤の開発にも取り組んだ。本研究では、タンパク質に普遍的に存在し、機能への影響が小さいと考えられるN末端アミノ基をターゲットに選択した。アルキンとアジドを前駆体とし、銅を触媒とする環化付加反応(CuAAC反応)により簡便に合成することが可能である1,2,3-トリアゾール-4-カルボアルデヒド(TA4C)誘導体がN末端アミノ基に選択的に作用し、イミダゾリジノン環を形成することを見出した。種々のTA4C誘導体を用い、モデルペプチド・タンパク質との反応も実施した。さらに質量分析による修飾反応の評価から、本反応がN末端選択的に進行することを確認した。補因子およびTA4Cにより修飾されたシトクロムb562の二点固定化について現在検討中である。原子間力顕微鏡を用いた固定化タンパク質の可視化に向け、平滑な金電極上へのアルキン基導入手法の検討を行った。また、異なる長さのリンカーを介してアジド基を補因子ヘムに直接導入したシトクロムb562を調製し、アルキン基修飾金電極への固定化を検討した。これに加えて、多点固定化に向けタンパク質マトリクスに機能性分子を簡便に一段階で導入する手法の開発にも取り組んだ。修飾法の普遍性と機能への影響低減の観点から、タンパク質N末端アミノ基をターゲットに選択し、含窒素芳香族カルボニル化合物を母骨格とする種々のN末端修飾剤を合成し、モデルペプチドとの反応評価を質量分析法により行った。中でも、1,2,3,-トリアゾール-4-カルボアルデヒド(TA4C)誘導体は高いN末端選択性および修飾率を示すことを見出した。本化合物群は、従来のN末端修飾剤に比べ、購入可能なアルキンおよびアジド化合物前駆体などから簡便に合成することが可能な点で優れる。TA4C誘導体による種々のタンパク質基質へのN末端機能性分子導入では温和な条件下80%と良好な修飾率が得られた。また、本手法を用いて、ビオチン・蛍光色素・ポリマー材料のN末端選択的な導入を達成している。現在、当初の計画どおりアジド基が補因子ヘムおよびN末端にアルキン基・アジド基が導入されたシトクロムb562の調製とCuAAC反応を介した電極基板上への二点固定化について検討を進めている。以上のように、本研究課題の実施によって酸化還元活性なヘムタンパク質の電極材料表面への配向性を制御した固定化と、タンパク質N末端選択的かつ一段階での機能性分子導入が可能となった。これらの研究成果をもとに、複数の学会での発表を行い国内外より大きな反響を得ている。また特許申請・学術論文の作成を進めており、本研究課題はおおむね順調に進展したと判断した。
ルチル微粒子および薄膜の室温合成とその生成機構の解明

本研究によって得られた主なる成果は以下の通りである。1.ルチルの室温での生成条件チタンイソプロポキシド(TTIP)の加水分解条件(酸の種類、その濃度およびH_2O/TTIP比)と加水分解生成物の熱転移温度との関係を詳細に調べた。その結果、硝酸および塩酸酸性条件下で生成したアモルファス生成物は、検討した条件下ではすべて200°Cでアナターゼに転移した。一方、アナターゼ→ルチル転移は酸濃度が高ければ高いほど、またH_2O/TTIP比が大きければ大きいほど促進されることが判明した。特に、H_2O/TTIP比が20の条件下においては、硝酸濃度7wt%以上または塩酸濃度4wt%のときに、室温付近で長さ約0.1μmの針状晶のルチル微粒子が生成した。このルチル組成は、熱分析によりTiO_2・H_2Oと推定された。2.ゾルゲル過程における熱分析室温でのルチル微粒子の生成機構の解明の一環として、ゾルゲル過程、特に加水分解および縮重合反応の前過程であるチタンアルコキシドの各種アルコール溶媒によるアルコーリシスについて重点的に検討を加えた。その結果、TTIPのアルコーリシスは比較的容易に起こり、直鎖型アルコール(炭素数1から7)に対して反応熱は1517kJ/molであった。一方、側鎖をもつアルコールに対しては数kJ/molの正または負の値であり、この反応熱の低下は、立体障害効果により説明された。本年度に得られた研究成果は、以下の通りである。1.ルチルの室温での生成条件まず、チタンテトライソプロポキシド(TTIP)の加水分解条件(酸の種類とその濃度およびH_2O/TTIP比)と加水分解生成物の熱転移温度との関係を調べた。その結果、銷酸および塩酸酸性条件下で生成したアモルファス生成物は、検討した条件下(酸の濃度:37wt%、H_2O/TTIP比:5,10,20)ではすべて200°Cでアナターゼに転移した。1方、アンターゼ→ルチル転移は酸濃度が高ければ高いほど、またH_2O/TTIP比が大きければ大きいほど促進されることが判明した。再現性に問題があるものの、特に、H_2O/TTIP比が20の条件下においては、硝酸濃度7wt%以上または塩酸濃度4wt%のときに、室温付近で長さ約0.1μmの針状晶のルチル微粒子が生成した。このルチルの組成は、熱重量分析によりTiO_2・H_2Oと推定された。2.ゾルゲル過程における熱分析の試み加水分解生成物がどのようなゾルゲル過程で結晶化して、アナターゼおよびルチルとなるのかを調べるために、示差熱分析装置を試作して、ゾルゲル過程における反応熱の測定を試みた。まず、TTIPと各種アルコールとのアルキル基の交換反応の熱測定を行った結果、エタノール、2-プロパノール、1-ブタノールの各溶媒に対してその反応熱としてそれぞれ1.47、-0.25、0.98klmol^<-1>を得た。次に、ルチル微粒子が生成する場合の加水分解および縮重合反応を含む総括的反応熱(エンタルピー変化)の測定を行った。その結果、見かけの加水分解反応熱はTTIPと酸の濃度に依存し、1.0moldm^<-1>濃度のTTIPエタノール溶液に6wt%の塩酸水溶液を加えた場合に対し、その値として約65kj/molが得られた。1.ルチル微粒子の室温合成条件とルチル薄膜の作製昨年度は、チタンテトライソプロポキシド(TTIP)の加水分解条件(酸の種類とその濃度およびH_2O/TTIP比)と加水分解生成物の熱転移温度との関係を詳細に調べた。今年度は、有機金属化合物でない四塩化チタンを用いて検討した結果、四塩化チタンのエタノール溶液(Ti:0.5mol/1)に塩酸酸性水溶液を滴下することによりルチルが合成できることを確認した。

また、これらの微粒子を含むジエチレングリコール溶液を前駆体ゾル溶液とするスピンコーティング法によりチタン薄膜を作製した。2.ゾルゲル過程における熱分析3.室温でのルチル微粒子の生成機構の解明の一環として、ゾルゲル過程の熱分析、特に加水分解および縮重合反応の前過程であるTiアルコキシドの各種アルコール溶媒によるアルコーリシスについて重点的に検討を加えた。その結果、チタンテトライソプロポキシドのアルコーリシスは比較的容易に起こり、、直鎖型アルコール(炭素数1から7)に対して反応熱は1517kJ/molであり、一方側鎖をもつアルコールに対しては数kJ/molの正または負の値であった。
表皮ギャップジャンクションの網羅解析と難聴を伴った掌蹠角化症の病態探索

難聴を伴う掌蹠角化症の母子例と同じ臨床症状を呈する個発例を数例経験し,ミトコンドリアDNAやコネキシン(Cx)の異常が報告されている症例と臨床症状が合致するにも関わらず,これらの異常は検出できなかった。患者由来の表皮細胞と健常者から得た表皮細胞では,その増殖や分化に差違は認められず,三次元培養した際の形態も障害は生じなかった。また,Cx遺伝子の発現を解析したが,これも差異を認めることはできなかった。難聴を伴う掌蹠角化症の母子例を経験し,同じ臨床症状を呈する個発例も数例経験した。難聴を伴う掌蹠角化症では,母系遺伝のものの一部ではミトコンドリアDNAの異常が,それ以外のものではGap junctionに関わるコネキシン(Cx)の異常が報告されているが,我々が経験した症例では,ミトコンドリアDNAやCxの異常が報告されている症例と臨床症状が合致するにも関わらず,ミトコンドリアDNAの既報告領域およびCx26(GJB2),Cx31(GJB3),Cx30.3(GJB4),Cx30(GJB6),Cx43(GJA1)の全配列を検索したが,異常は検出できなかった。そこで,健常者および患者検体よりインフォームドコンセントを行い同意を得た後,表皮細胞の三次元培養を行った。この際,単層培養系での表皮細胞の増殖能,培養液中のCa2+濃度を変化させた際の分化度に関しては,患者由来の表皮細胞とコントロールとしての健常者から得た表皮細胞では差違は認められなかった。さらに,三次元培養した際の形態学的な差異を検討しても,患者由来の表皮細胞に障害は生じていなかった。また,PCRにてCx遺伝子の発現を網羅的に解析したが,発現に健常者由来の表皮細胞と比して差異を認めることはできなかった。しかしながら,これらの解析を通じて角化症研究を専門としている先生方にCxの遺伝子異常を当教室で行っていることが認知され,長崎大学の皮膚科から遺伝子検査を依頼されるなど,一定の成果を上げられたと思っている。今後も,今回樹立した培養細胞を用いて発現遺伝子の網羅解析などの解析を継続していく予定である。
高感度ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法によるＣ型肝炎ウイルス遺伝子型の同定

ロックド核酸/DNAキメラプローブとチラミド増感法を組み合わせた高感度in situハイブリダイゼーション法により、ホルマリン固定パラフィン切片上でのHCV-RNAの検出に成功した。ヒト肝臓型HCV感染キメラマウスおよび慢性C型肝炎の9/11例(98%)で陽性シグナルが認められた。慢性B型肝炎、脂肪肝、自己免疫性肝炎および肝細胞癌では、いずれも陰性だった。ネステッド逆転写PCR法では、8/11例(73%)でHCV-RNAが確認された(1b型6例、2a型2例)。高感度in situハイブリダイゼーション法によるHCV遺伝子型の同定は、HCV遺伝子型間での交差反応が生じたため鑑別困難だった。LNA修飾オリゴヌクレオチドプローブとチラミド増感法を組み合わせた高感度in situ hybridization法(LNA-ISH法)を用いて、本年度は臨床材料に焦点を絞って検討した。対象は、C型慢性肝炎の肝生検を11例およびHCV関連肝細胞癌の手術材料を1例用いた。陰性対象として、B型慢性肝炎、脂肪肝および自己免疫性肝炎の肝生検、HBV関連肝細胞癌の手術材料を各1例ずつ加えた。C型慢性肝炎は、いずれも血清中のHCV-RNAが高値(1.9×102 KIU/mL以上)を示したが、HCV関連肝細胞癌では低値(84 KIU/mL)だった。パラフィン切片からtotal RNAを抽出したのち、nested RT-PCRを施行した結果、C型慢性肝炎の8/11例(73%)でHCV-RNAが検出できた。いずれの陽性例においても、HCV遺伝子型は血清データと相関した。LNA-ISH法は、HCV感染ヒト肝臓化キメラマウスで設定した検出条件で明瞭な陽性シグナルを得ることができた。C型慢性肝炎の9/11例(82%)で陽性シグナルが確認され、そのうち3例はびまん性に陽性を示したが、6例は一部あるいは部分的に陽性だった。Nested RT-PCRで陰性だった3例のうち、1例はLNA-ISH法も陰性、2例はLNA-ISH法で一部あるいは部分的に陽性だった。Nested RT-PCR陽性かつLNA-ISH法が陰性だった症例は1例のみだった。陰性対象およびHCV関連肝細胞癌では、いずれもHCV-RNAは検出されなかった。NS4領域に加えて、NS5AおよびNS5B領域に対するHCV genotypingプローブ(1a型、1b型、2a型、2b型)によるHCV遺伝子型の鑑別を行った。LNA-ISH法とAT tailing-ISH法を用いて検討を加えたが、陽性シグナルは検出できるものの遺伝子型間での交差反応が生じるため、遺伝子型の鑑別までには至らなかった。LNA-ISH法とAT tailing-ISH法の検出感度を比較すると、両者はほぼ同程度の染色性を示すことが確認された。平成24年度は、1) LNA/DNAキメラプローブ(HCV共通プローブとHCV genotypingプローブ)の作製、2)ヒト肝臓型HCV感染キメラマウスを用いたin situハイブリダイゼーション(ISH)法による至適検出条件の確立とnested RT-PCRによるHCV genotypingを行った。抗ヒトCK8/18マウスモノクローナル抗体を用いて、ヒト肝臓型HCV感染キメラマウスのホルマリン固定パラフィン切片におけるマウス肝組織とヒト肝組織の染め分けを行った。市販のブロッキング試薬(マウス組織とマウス抗体による免疫染色に有効)を加えた結果、ヒト肝組織のみに陽性シグナルが確認され、明瞭に両組織の分布を鑑別できた。さらに、各HCV亜型別のパラフィン切片からHCV-RNAを抽出して、nested RT-PCRによるHCV genotypingにも成功している。われわれは、すでに本研究の準備段階でHCV共通ゲノムをターゲットとしたLNA/DNAキメラプローブを作製している。さらなる検出感度の向上を図るため、LNAの組み込む位置が異なるプローブを2種類追加作製した。ヒト肝臓型HCV感染キメラマウスを陽性コントロールとして、ISH法において最も陽性シグナルが明瞭かつ非特異反応が抑制された至適検出条件を確立した。さらに、違う種類のプローブ(RT-PCRを用いたcDNAプローブとcRNAプローブ)を作製して比較したが、LNA/DNAキメラプローブが最も検出感度に優れていた。いずれもRNase処理による陽性シグナルの陰性化を確認している。HCV genotypingプローブ(4種類の遺伝子型×2パターン=8種類)を作製した後、ISH法によるHCV genotypingを行ったが、陽性シグナルは確認されたものの、各HCV遺伝子型別に鑑別できるまでには至っていない。

平成24年度は、ほぼ研究計画どおりに進行しているが、一部実現できなかった項目が残っており、次年度の研究計画と並行しながら改良を加える。HCV感染ヒト肝臓型キメラマウス(ホルマリン固定パラフィン切片)を用いた検討では、ヒト特異的CK8/18抗体による免疫染色で、マウス肝組織とヒト肝組織の染め分けが可能となった。さらに、各HCV遺伝子型別(1a型、1b型、2a型、2b型)のパラフィン切片からHCV-RNAを抽出した後、nested RT-PCRによるHCV genotypingも計画どおり成功した。HCV共通プローブを用いた高感度ISH法では、さらにLNAの組み込む位置が異なる3種類のLNA/DNAプローブ、RT-PCRによるcDNAプローブおよびcRNAプローブの計5種類のプローブを用いて条件検討を行った。LNA/DNAキメラプローブとbiotin-freeチラミド増感法の組み合わせが最も優れており、HCVが感染しているヒト肝組織に限って明瞭な陽性シグナルが検出できた。3種類のLNA/DNAキメラプローブは、若干だが陽性シグナルの差が認められ、その中でシグナルが強くかつ非特異反応が最も抑えられたプローブを選出した。本法では、従来ISH法で行われている核酸露出処理後の4%パラホルムアルデヒドによる再固定や、非特異反応を抑えるための操作(塩酸処理、0.25%無水酢酸/0.1 Mトリエタノールアミン処理)を行わなくても、簡便な手法で明瞭なシグナルを検出できることに成功した。次年度に予定されている臨床検体を対象とした検討のために、本学「疫学・臨床研究等に関する倫理審査委員会」への申請書を提出して、すでに承認を得ている。すでに本学「疫学・臨床研究等に関する倫理審査委員会」から臨床検体使用の承認を得ており、平成25年度は、次のステップである臨床検体への応用に移行する。本学大学病院に保管されているホルマリン固定パラフィン包埋ブロックを対象に、慢性肝炎、肝硬変、肝細胞癌の症例を生検、手術材料に分けて各10症例ずつを目途に選出する。その後、臨床検体を用いたnested RT-PCRによるHCV genotypingを行い、HCV亜型の同定を行う。血清データと照らし合わせて、各検体のHCV遺伝子型の一致を確認する。高感度ISH法は、動物モデルにおける検出条件はすでに確立したが、臨床検体にあわせた検出条件を設定する必要がある。とくに、核酸露出処理については生検と手術材料間で条件が大きく異なる可能性があるため、プロテイナーゼK濃度に注意して条件設定する。適宜ブロッキング処理を施行して、背景染色の抑制を図る。上記と並行して、課題である高感度ISH法に使用するHCV genotypingプローブを改良する。現在、ターゲットとしているHCV遺伝子領域は、HCV遺伝子型間の塩基配列レベルで相同性が低いとされるNS4領域である。プローブを見直すために、同領域から約50mer程度のプローブを新たに設計して、さらにNS5領域からも同程度の長さのプローブを各HCV遺伝子型別に作製する。「BLASTN」を用いたホモロジー検索により、標的以外の遺伝子と相同性を持たないことを確認する。すべてのデータ解析後、今年度内に成果発表と英文論文を作成する。研究費の大半は、実験消耗品にあてる。
膵癌ミトコンドリアDNA体細胞変異は抗癌剤耐性を示す(オーダーメード医療への道)

近年、癌細胞の抗癌剤に対する耐性の獲得に関してmtDNAの変異も関与していることが分かってきた。我々は、変異mtDNAの意義を明らかにするために、癌細胞においてmtDNAの変異が抗癌剤耐性に関与するかを、同一の細胞核をもちmtDNAのみが異なる癌細胞(cybrid cell)を作成して検討した。staurosporine(STS)と5FU, CDDPを作用させ薬剤に対する耐性を比較検討した。in vitroではSTS5時間、5FU 48時間、CDDP 24時間作用させ、蛍光染色にて細胞死を計測した。in vivoでもヌードマウスに5FU、CDDPを腹腔内投与し、移植腫瘍の増殖阻止率やmassive cell deathの領域の大きさを比較検討した。野生型mtDNA癌細胞と比較して有意に変異mtDNA癌細胞の抗癌剤耐性が確認できた。さらにその機序を分子生物学的に検討した。はじめにフローサイトメトリーにおいても薬剤による細胞死がApoptosisであることを確認した。さらにミトコンドリアからのチトクロムcの放出を比較検討した。カスパーゼ活性についてpro caspase3、PARPなど検討し、変異型mtDNA癌細胞のanti-Apoptosisを証明した。癌細胞および正常細胞由来のミトコンドリアDNAとHELA細胞由来のρ0細胞を元としたCybrid細胞を8種類(15株)樹立した。Western blotにて細胞融合の成功を確認した。これらの細胞の特徴(呼吸活性、DNAコンテント、膜電位ほか)を測定し、親細胞と比較した。いずれのCybrid細胞もバイアスのかかる変異、特徴を示していなかった。In vitroの検討で癌細胞由来ミトコンドリアDNAを持ったCybrid細胞が正常細胞のそれと比較して、5Fu,CDDPに対する耐性が認められた。蛍光顕微鏡によりApoptosisを中心に検討した。これらは時間、濃度のパラメーターを変化させても同結果であった。さらに分子生物学的検討において、チトクロームC細胞質への放出やカスパーゼ3活性も癌細胞由来ミトコンドリアDNAを持ったCybrid細胞に多く見られ、アポトーシスに差があることを確認した。抗癌剤投与に対するP53の上昇をWestern blotで確認したところ癌細胞由来ミトコンドリアDNAを持ったCybrid細胞に優位に高く認められた。現在更なるアポトーシスカスケードの検討を行っている。In vivoにおいてもヌードマウスにこれら細胞を移植して実験を開始している。細胞を移植後、5FU、CDDPを投与することにより正常細胞および癌細胞由来のCybrid細胞の両細胞群において増殖の抑制が見られたが、癌細胞由来ミトコンドリアDNAを持ったCybrid細胞においては、抑制率が少なく組織を観察(HE、TUNELをはじめとした各種免疫染色)してもApoptosisやNecrosisを示す領域が少ないことが分かった。平成20年度に日本外科学会総会、日本消化器外科学会をはじめとした学会発表を予定している。癌細胞および正常細胞由来のミトコンドリアDNAとHELA細胞由来のρ0細胞を元としたCybrid細胞を8種類(15株)樹立し、Back groundを比較した後にIn vitro, In vivoの実験を行った。形態学的な検討はH19年度にほぼ終了していたので、その後のまとめとApoptosisの経路の解明を目的とした実験を行った。(1)各種カスパーゼの活性。(2)ROSとの関連。(3)ミトコンドリア呼吸鎖との関連について基礎実験を中心に行った。(1)各種カスパーゼは上位においてすでに活性化されていた。ROSについてもMutant mtDNAにおいて発生量は多かった。呼吸鎖ではComplex Iを止める酵素により、anti-apoptosisを見た。更なる検討を行っている。発表は日本外科学会総会、日本消化器外科学会総会での発表を行った。論文ではcancerscienceにおいてin pressの状況である。癌細胞および正常細胞由来のミトコンドリアDNAとHELA細胞由来のρ0細胞を元としたCybrid細胞を8種類(15株)樹立し、Back groundを比較した後にIn vitro,In vivoの実験を行った。In vitroにおける形態学的な検討はH19、20年度にほぼ終了していたので、その後のまとめとApoptosisの生化学的証明、apoptosis経路の解明と細胞死誘導刺激の違いによる検討、および、in vivoでも同様の結果を示すかどうかを実験した。(1)Caspse 3をはじめとした各種カスパーゼの活性の測定。

(2)膜電位、呼吸活性の測定をはじめとしたROSの産生についての検討と、チトクロームCオキシダーゼ阻害薬投与下でのapoptosis誘導とROS産生低下の関連。(3)温熱療法下でのwild,mutantcybrid細胞群のapoptosis耐性の検討。(4)in vivoでは、ヌードマウスにwild, mutant cybtridを移植して抗癌剤耐性を検討する。(1)カスパーゼ活性は上位のカスケードにおいて活性を認めた。Cytchrome C dependent apoptosisであった。(2)ROSについてもMutant mtDNAにおいて発生量は多かった。Complex Iを阻害することによりanti-apoptosisを認めたことでROSの産生能力とapoptosis耐性に密接な関連があることが分かった。(3)温熱療法下ではwild cybridがmutant cybridよりapoptosis耐性を示した。(4)in vivoにおいてもmutant cybridがwild cybridよりapoptosis耐性を示した。
ヒトサイトメガロウイルス前早期発現遺伝子(CMV-IE)による血管病変形成機序の解明

1.ヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子(CMV-IE)を血管壁特異的に発現するトランスジェニックマウス(TG)の構築:まずCMV-IEのcDNAをIE-1、IE-2をそれぞれ実験室株(AD169)より分離、クローン化し、マウスプレ・プロエンドセリン-1プロモーターにそれぞれを連結したコンストラクトを作成し(pEP-IE1、pEP-IE2)、挿入部位の塩基配列をDNAsequencerで確認した。マウス胚へのマイクロインジェクションをそれぞれ300個以上行い、C57BL/6Jマウスの子宮内に戻し、それぞれ30頭以上の産仔を得た。断尾したサンプルからゲノムDNAを採取し、IE1およびIE2の配列に特異的なプライマーを用いてPCRスクリーニングを行った。その結果、1E-1には2個体(雄:2頭、雌:0頭)、IE-2には7個体(雄:4頭・雌:3頭)が陽性であった。PCRによるゲノムスクリーニングにより、遺伝子導入が確認されているF1世代の個体の一部(IE-1:2系統、IE-2:1系統)について、全身臓器に対しRT-PCRにてmRNA発現を確認した。現時点で20週までは明らかなフェノタイブの変化は観察していない。またこれらの個体の全身臓器をホルマリン固定、パラフィンブロックにした後、ヘマトキシリン・エオジン染色を行ったが、肺に軽度の線維化を認める以外に明らかな組織学的変化を認めていない。2.組換えウイルスによる病的血管新生の分子病態に関する解析:病的血管新生における各種血管新生因子の役割の解析について、今回の我々の成績は従来の通説と比較すると意外なものであった。つまり血管新生過程において組換えウイルスにより発現させた外来性血管新生因子のみならず、内因性の血管新生因子の発現の挙動が極めて重要であり、単一遺伝子を発現させるだけでは血流を回復させる効果的な血管新生を誘発することは容易ではないということである。さらにVEGFやHGFに対する中和抗体FGF-2の血流回復効果を遮断できることが明らかになっていることから、「機能的」血管新生には複数の血管新生因子の協調的連動が重要であり、それらのバランスが崩れることにより「病的」血管新生を誘発するという仮設が想定される。さらに各血管新生因子は、各々が血管新生過程の重要なパートを担っており、それらのいずれかが活性低下すると血管新生因子による治療効果に歪みが出て来ると考えられる.1.ヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子(CMV-IE)を血管壁特異的に発現するトランスジェニックマウス(TG)の構築:まずCMV-IEのcDNAをIE-1、IE-2をそれぞれ実験室株(AD169)より分離、クローン化し、マウスプレ・プロエンドセリン-1プロモーターにそれぞれを連結したコンストラクトを作成し(pEP-IE1、pEP-IE2)、挿入部位の塩基配列をDNAsequencerで確認した。さらに各血管新生因子は、各々が血管新生過程の重要なパートを担っており、それらのいずれかが活性低下すると血管新生因子による治療効果に歪みが出て来ると考えられる.我々はこれまで、ヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子(CMV-IE)が原因不明の疾患であるヒト炎症性腹部大動脈瘤(inflammatory abdominal aortic aneurysm:IAAA)の炎症性外膜肥厚部に特異的に発現することを証明した(Lab Invest 1996)。本遺伝子をウサギ頸動脈へ遺伝子導入し強制発現させた場合、炎症性変化は認められず、血管平滑筋細胞増殖性の内膜肥厚性病変を認めた(Biochem Biophys Res Commun 1997)。以上の知見をもとに、平成12年度はCMV-IEを血管壁特異的に発現するトランスジェニックマウスの構築を進めている。

まずマウスゲノムより転写調節配列の全長を含むマウス・プレプロエンドセリン-1のプロモーター領域(約10kbp)をクローニングし、噛乳動物発現ベクターを構築した。本プロモーターの下流にCMV-IE1および-IE2のcDNAをそれぞれサブクローニングし、マウス胚へのマイクロインジェクションを行った。産仔をそれぞれ30-40頭程得たので、現在遺伝子導入個体の選別を進め、それぞれについて系統確立を進めている。以上のように本研究計画はほぼ予定通りに進んでいる。来年度以降は様々な循環器疾患モデルマウスなどとの交配を行い、惹起される血管病変について形態学的、分子生物学的解析を進めて行く予定である。1.ヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子(CMV-IE)を血管壁特異的に発現するトランスジェニックマウス(TG)の構築:まずCMV-IEのcDNAをIE-1、IE-2をそれぞれ実験室株(AD169)より分離、クローン化し、マウスプレ・プロエンドセリン-1プロモーターにそれぞれを連結したコンストラクトを作成し(pEP-IE1、pEP-IE2)、挿入部位の塩基配列をDNA sequencerで確認した。マウス胚へのマイクロインジェクションをそれぞれ300個以上行い、C57BL/6Jマウスの子宮内に戻し、それぞれ30頭以上の産仔を得た。断尾したサンプルからゲノムDNAを採取し、IE1およびIE2の配列に特異的なプライマーを用いてPCRスクリーニングを行った。その結果、IE-1には2個体(雄:2頭、雌:0頭)、IE-2には7個体(雄:4頭、雌:3頭)が陽性であった。PCRによるゲノムスクリーニングにより、遺伝子導入が確認されているF1世代の個体の一部(IE-1:2系統、IE-2:1系統)について、全身臓器に対しRT-PCRにてmRNA発現を確認した。現時点で20週までは明らかなフェノタイプの変化は観察していない。またこれらの固体の全身臓器をホルマリン固定、パラフィンブロックにした後、ヘマトキシリン・エオジン染色を行ったが、肺に軽度の線維化を認める以外に明らかな組織学的変化を認めていない。2.組換えウイルスによる病的血管新生の分子病態に関する解析:病的血管新生における各種血管新生因子の役割の解析について、今回の我々の成績は従来の通説と比較すると意外なものであった。つまり血管新生過程において組換えウイルスにより発現させた外来性血管新生因子のみならず、内因性の血管新生因子の発現の挙動が極めて重要であり、単一遺伝子を発現させるだけでは血流を回復させる効果的な血管新生を誘発することは容易ではないということである。さらにVEGFやHGFに対する中和抗体FGF-2の血流回復効果を遮断できることが明らかになっていることから、「機能的」血管新生には複数の血管新生因子の協調的連動が重要であり、それらのバランスが崩れることにより「病的」血管新生を誘発するという仮説が想定される。さらに各血管新生因子は、各々が血管新生過程の重要なパートを担っており、それらのいすれかが活性低下すると血管新生因子による治療効果に歪みが出て来ると考えられる。
培養表皮細胞システムを用いたダリエ病の病因蛋白の推定

ダリエ病は,おもに脂漏,間擦部位に粟粒大の角化性小丘疹を多数生じる常染色体優性遺伝性,難治性の疾患でる。本研究の目的は,ダリエ病の培養表皮細胞システムをもちいて,動的状態における表皮細胞接着因子の微細分布状態の異常を解析することにより,本症の病因蛋白を推定することであった。既存のへミデスモゾーム、デスモゾーム構成蛋白に対する抗体の他に、最近発見された新しい分子に対するモノクローナル抗体も加えて、これら分子の発現異常が動的培養表皮細胞系においてどのように存在するのかを、検討した。ダリエ病の培養表皮細胞を培養過程で単層,23層,重層の3段階に分け,それぞれの分化段階において、細胞外のみならず細胞内に存在する細胞間接着因子の微細局在の動的な異常を,共焦点レーザー顕微鏡で検索した。しかし、本研究実施期間中に、イギリスの研究グループから、ダリエ病の原因遺伝子が表皮細胞内カルシウム濃度を調節するカルシウムポンプをコードするものであることが明らかとされた。ダリエ病では,遺伝的にカルシウムポンプの機能が約半分に落ち、Heteroinsufficiencyにより、2次的に表皮細胞間接着蛋白産主の異常がおこり、desmosomeが崩壊し棘融解が生じるという我々の結果は、原因遺伝子の機能を解明するうえで重要な情報であると考えられた。(1)ダリエ病の表皮細胞培養ダリエ病の健常部皮膚,病変部皮膚,および対照として正常ヒト皮膚を採取後,Dispase-trypsin法で処理し表皮細胞の浮遊液を作り,これをカルシウム濃度0.1mM培地により単層上皮細胞の状態で培養した。(2)光顕レベルでの免疫組織化学(4)コンフォーカル顕微鏡による観察上記の免疫組織化学染色については,蛍光顕微鏡のみならずコンフォーカル顕微鏡によりさらに詳細な蛍光の分布を観察した。(5)凍結固定,凍結置換法を用いたpost-embedding免疫電顕法ダリエ病の病変部表皮細胞、非病変部表皮細胞、単層培養表皮細胞、23層培養表皮細胞、重層培養表皮細胞をさらにコラーゲン膜上で培養し,それを細切してグリットにのせ,凍結固定装置を用いて-190°Cに冷却した液体プロパン中に急速に挿入し,凍結固定する。凍結置換装置に写し,-80°Cに保ったままアセトン置換し(凍結置換),LowicrylK11Mに包埋,超低温(60°C)のまま数日間紫外線重合させた後,超薄切片を作り,これを基質としてラベリングを行う。一次抗体として上述した抗体を用い,金コロイド標識二次抗体と反応させたのち電顕的に観察した。
Large Scale Micro Whole Mount ISHの開発

直径が100umに満たない微小サンプルに対するwhole mount in situ hybridizationのための装置を開発した。この装置は、微小サンプルを保持しつつ、溶液をスムーズに交換することが可能で、従来のような顕微鏡下の操作が不要である。サンプルは標的遺伝子ごとに独立したinsert内に格納され、1回の実験で最大20個の遺伝子を標的としたmicro-WMISHを行うことが可能となった。本装置とcRNAprobeを組み合わせたmicro-WMISHprotocolを作成した。マウス初期胚において発現が知られているいくつかの遺伝子に対してcRNAprobeを作成し、未受精卵から胚盤胞までの各ステージに対し、形態を完全に維持したままmicro-WMISHを行うことに成功した。cRNAprobeを作成するには、鋳型となるcDNAを入手する必要がある。また、その配列によって、ターゲットとなるmRNAへの結合力や、似た配列を持つ他の遺伝子由来のmRNAとの交差反応の程度が異なるため、probe毎にprotocolを最適化しなければならない。これは、large scale studyを行うにあたって大きな障害である。これに対しoligo DNAprobeは、標的とする遺伝子配列情報を元に、標的mRNAに対する結合力が強く、交叉反応の小さなprobeをデザインし、合成することが可能である。そこで現在、large scale化に有利なoligo DNA probeによるmicro-WMISHのprotocolを作成し、最適化のためのテストを繰り返している。
痛覚を伝える一次求心性線維の伝達物質と情報伝達機構

本年度の計画調書・交付申請書に記した各課題につき、下記の成果を得た。課題1大塚班員は、新生ラット摘出脊髄標本において大内臓神経を刺激し、胸髄前根より内臓痛反射とみなされる約40秒持続する脱分極反応を記録した。新しく開発されたペプチド性および非ペプチド性タキキニン受容体(NKー1)拮抗薬はこれを抑制した。課題2大久保班員は、サブスタンスPおよびK受容体のcDNA間で14種のキメラcDNAを作成し、構造と機能の相関を解析した。その結果、リガンドに対する選択性に関与する領域は、主に第2膜貫通部位から第2細胞外ル-プを含む領域であることなどが明らかにされた。杉本班員は、ラット脳幹・脊髄後角におけるニュ-ロテンシン受容体発現細胞の分布様式を明らかにした。課題3堅田班員は、ハチ毒由来のマストパランやある種の三環系抗うつ薬などが、受容体を介さずに直接G蛋白質を活性化する機構を明らかにし、タキキニンによる細胞内情報伝達系の研究に有用なモデルを提供した。芳賀班員は、ヒトムスカリン性アセチルコリン受容体およびロドプシンが、アゴニストおよび光依存性にリン酸化されること、これに関与するキナ-ゼにはG蛋白質のβγサブユニットによって活性化されるものとされないものの2種あることを示した。課題4井川班員は、新生ラットの下肢に化学的痛み刺激を長時間与えた後、腰髄から得た核分画で、200Kと55Kの蛋白が増え、80Kの蛋白が減少することを示した。56°Cの熱刺激を加えた後は、cーfos,cーmycのmRNAは増加し、cーras,Krevー1のmRNAには変化がなかった。今後、これら痛み刺激特異蛋白について解析する予定である。課題5村瀬班員は、幼若ラット単離脊髄後角細胞で、興奮性アミノ酸受容体チャネルに対するcAMPの効果をみたところ、カイニン酸による電流が1.5ー2倍増大することを見いだした。広部班員は、鎮痛効果を有するキョウトルフィンのチロシン残基を縮合環に変換した安定な誘導体を合成し、この効果をみたところ、マウスで持続の長い鎮痛効果が認められた。このことより、芳香族アミノ酸縮合閉環体が内因性鎮痛関連物質として生成されていることが期待された。課題6矢内原班員は、主として抑制性の作用を示すガラニンについて、その誘導体を合成し、構造ー活性相関を追究したところ、誘導体のひとつが分泌系と神経系のガラニン受容体に対して異なった親和性を示すことを明らかにした。
高齢者の夜間頻尿アセスメントとケアにかかわる排尿間隔調節因子の検討

年をとることで夜間の排尿回数が増すことは経験的にも知られ、その要因は様々ではあるが、最近体内時計の変化が夜間頻尿の原因になっている可能性が示されている。そこで、体内時計のリズムに深く関わるメラトニンの前駆物質であり、頻尿を呈する過活動膀胱で収縮反応が増強することが報告されているセロトニンへの反応性が年をとることでどのように変化するかを実験動物を用いて検討した。その結果、今回使用した老化実験モデルラットでは、セロトニンに対する反応性が減弱傾向にあり、その反応経路も変化している可能性が示された。高齢者に多い夜間頻尿はQuality of lifeを著しく損なうばかりか生命予後にもかかわり,対象に合った看護援助や治療が重要といえる.しかし,加齢による夜間頻尿の発症機序にはいまだ不明点が残されており解明が待たれている.その中で加齢に伴い排尿機能の正常な日内変動が損なわれることが夜間頻尿の一因となっている可能性が示されている.そこで、加齢による日内変動が損なわれる原因を明らかにするため、本研究では実験動物を使用し基礎的な検討を行う。初年度は予備実験として、若齢動物を使用して明期、暗期で採尿、採血の方法を検討した。採尿に関しては代謝ケージで糞や餌の混入を少なくする方法を検討したが、混入を完全には防ぐことができず尿中のメラトニン量の測定は現時点では難しい状況である。採血に関しては尾静脈採血を検討し、採血量が限られるものの数回の繰り返しは可能であった。一方、収縮機能実験については諸事情により予定していた実験機器の使用が難しくなり、計画を変更し先に関連受容体の定量的実験方法としてRT-PCR法の検討を進めている。また、組織学的な検討を行うために、免疫染色の条件検討、HE染色を実施している。高齢者に多い夜間頻尿は生命予後にも関わることが報告されており、対象にあった看護援助や治療が重要である。しかし、加齢による夜間頻尿の発生機序は未だ不明な点が残され、解明が待たれている。その中で、加齢に伴い排尿機能の正常な日内変動が損なわれることが、夜間頻尿の一因の可能性が示唆されており、そのメカニズムを明らかにするため本研究では実験動物を用いて基礎的な検討を行っている。本年度は、過去にも報告している高齢動物で明期、暗期で排尿間隔が均一化している原因を検討するため、各個体の排尿間隔の測定後、膀胱体部平滑筋を採取し、そこからRNAを抽出、cDNAを作成し加齢により変化している可能性のある数種類の受容体について、RT-PCRで検討した。また、組織学的な検討も並行して行っている。前年度の報告書に示した通り、諸事情により予定していた収縮機能実験の実施が困難となり、当初予定していたメラトニンの膀胱直接作用の検討ができておらず、前駆物質であるセロトニンに対する機能実験の結果を元にその後の検討を続けている状況である。また、排尿間隔の加齢変化に関してはデータを加えることができたが、尿・血液中のメラトニンの濃度の測定も高齢動物では繰り返しの採尿・採血が難しく実施できていない。しかし、若齢・高齢動物の膀胱組織から抽出したmRNAのRTーPCRによる検討は進められており、組織学的解析も行っていることからやや遅れているとした。高齢者に多い夜間頻尿はQuality of lifeを著しく損なうばかりか生命予後にもかかわり,対象に合った看護援助や治療が重要といえる.しかし,加齢による夜間頻尿の発症機序にはいまだ不明点が残されており解明が待たれている.その中で加齢に伴い排尿機能の正常な日内変動が損なわれることが夜間頻尿の一因となっている可能性が示されている.そこで本研究では排尿機能への様々な修飾因子を排除し,加齢による影響のみを見るために実験動物を用いて、日内変動因子として重要なメラトニンの前駆物質であり、アトロピン抵抗性収縮の原因物質の一つとも言われているセロトニンの膀胱直接作用とその加齢変化について検討した.その結果、セロトニンに対する反応性は、老齢動物で変化していた.またセロトニンによる神経を介した収縮を排除するためにテトロドトキシンを前処置した場合では、老齢動物でのみ収縮反応が抑制される結果が得られた.この反応性の変化の原因を探るために摘出膀胱からmRNAを抽出し、cDNAを作成しRTーPCRでセロトニン受容体サブタイプの発現量が加齢の影響を受けているか検討した結果、老齢動物で一部のサブタイプの発現量が減少している可能性が示された.これらの結果から、加齢によりセロトニンに対する膀胱の収縮反応性が一部変化していることが明らかになり、排尿行動の変化の原因の一つとなっている可能性が考えられた.年をとることで夜間の排尿回数が増すことは経験的にも知られ、その要因は様々ではあるが、最近体内時計の変化が夜間頻尿の原因になっている可能性が示されている。

カリキュラム上前期の研究時間があまり取れなかったことに加え、実験設備の利用などで研究協力を得ていた山形大学の教授が昨年9月ごろから体調不良が続き年末急逝され、山形大学での実験が難しい状況となった。在籍している順天堂大学に設備の移転も検討中であるが、研究棟の建て替え時期と重なりすぐの設置は難しい状況でもあり、予定していた実験が行えていないが、在籍施設で使用可能な設備での実験検討は進めているためやや遅れているとした。メラトニンの直接作用や尿・血液中の濃度測定が困難な状況のため、メラトニンの前駆物質であり過去のデータ蓄積もあるセロトニンの受容体サブタイプについての検討を中心に実験を進めていく。基礎看護学当初予定していた収縮機能実験については上記の理由により、また後任教授も決まっていないため引き続き使用困難な状況であるが、後任者が決まり次第協力を依頼するとともに、機能実験以外の実施可能な実験方法への変更も視野にいれ進めていく。膀胱の排尿リズムの調整に関与している可能性の高い細胞をFACSで分取し、その数や関連受容体の抗体で標識し加齢によるそれらの変化を検討することを計画している。また、高齢動物での採血や組織学的検討も進めていく予定である。予定していた機能実験の実施が諸事情により実施できず、機能実験のため山形への出張費で計上していた額が大幅に未使用となった。また、人件費に関しても、この機能実験に伴うアルバイトの雇用を予定していたため、その分も未使用となった。前述した通り、当初計画していた実験方法では研究が行えなかったため、計画より支出額が少なくなった。また、研究の一部補助をアルバイトに依頼する予定としていたが、適任者がおらず人件費を使用しなかった。現在、新たに学内の施設である環境医学研究所でも実験ができるよう手続きをとり、これまでよりも実験の機会を増やし、機能実験とは別のアプローチで研究を進めていたいと考えている。その為の、消耗品、設備費用として余剰金を使用していきたいと考えている。別な実験方法を検討し、それにかかる消耗品、使用料、外注で行う検査費用等支払いにあてる。