hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
面部材と棒部材に共通のせん断耐力算定理論の確立

本研究では、大きく分けて4つの研究テーマに分けて検討を行った。得られた知見を以下に示す。1.RCディープスラブのせん断破壊における有効幅についてRCディープスラブについて、せん断耐力に対する有効幅の検討を実験的に行った。有効幅は支持板長さより載荷板長さの影響が大きい。有効幅は、載荷板と支持板の間で形成される圧縮ストラットを考えたとき、幅方向の膨らみはせん断スパンが大きな影響因子である。2.RCスラブの局部せん断破壊におけるせん断補強鉄筋の効果についてRC一方向スラブとRC片持ちスラブについて、せん断補強鉄筋の補強効果について実験的に調査した。押抜きせん断破壊するスラブにおいては、補強効果が認められせん断耐力が大きく増加したが、はり型せん断破壊の場合は、若干の効果が認められた。また、せん断補強鉄筋のひずみはある荷重から急激に増加し始めるが、終局時においてはいずれも降伏ひずみには達しなかった。3.RC部材のせん断破壊における軸方向鉄筋のダウエル作用と付着作用の力学モデルせん断耐荷機構における軸方向鉄筋のモデル化を行った。鉄筋に沿って生ずる縦ひび割れはダウエル力と引張力の相乗効果による。鉄筋の変形は周囲のコンクリートを弾塑性バネとして表すことができ、縦ひび割れの発生基準は、鉄筋の鉛直方向変位とすべり量で表すことができる。4.軸対称RCスラブの解析的研究軸対称円形スラブの非線形有限要素解析によって、せん断耐力に対するせん断補強鉄筋の効果を表した。また、部材剛性に対して曲げ補強鋼材およびせん断補強鋼材の影響を表した。現行の土木学会コンクリート標準示方書による棒部材のせん断耐力算定式と面部材の押抜きせん断耐力算定式では、引張鉄筋比の影響や寸法効果等主要な因子の影響について共通のパラメータを用いている。しかし、面部材の押抜きせん断破壊では、引張鉄筋の降伏後にせん断破壊すること、圧縮部のコンクリートが三軸応力状態であること等の相違点がある。そのため、面部材の自由縁付近に集中荷重が作用する場合や大きなフランジを持つT型断面部材等のように棒部材と面部材の中間的な破壊に対して拡張することが困難な状況にある。本研究は、両者を包含する統一的なせん断耐力算定法法の確立を目的としているが、本年度は以下に示すことを調査し検討を行った。1.一方向RCディープスラブにおけるせん断破壊に対して載荷幅と支持幅の影響を実験的に調査した。その結果、ディープスラブははり的なせん断圧縮破壊を示した。そのときのせん断耐力は載荷幅と支持幅の大きさで決まる有効幅を用いたディープビームのせん断耐力として与えることができる。2.一方向RCスラブと両側に対称な張出しをもつRCスラブについて、せん断補強鉄筋の効果について実験的に調査した。その結果、押抜きせん断破壊が卓越する領域においては、せん断補強効果が期待できるが、はり型せん断破壊が卓越する領域では期待できない。せん断補強鉄筋が配置されたスラブの剛性は、配置されていないスラブに比べて小さくなる場合がある。また、スラブはせん断補強鉄筋が降伏しないで破壊に至ることが明らかとなった。3.軸対称RCスラブについて、押抜きせん断破壊に対して曲げ補強鉄筋量とせん断補強鉄筋量をパラメータとして有限要素解析を行った。曲げ補強鉄筋が増加するにつれて、スラブの剛性および押抜きせん断耐力が増加する。せん断補強鉄筋が増加するにつれて、押抜きせん断耐力が増加するが、合成の増加は認められなかった。本年度の研究において、得られた知見を以下に示す。実験変数は、載荷板長さ、支持板長さおよびせん断スパンである。

実験結果より以下のことが明らかとなった。載荷板長さおよび支持板長さがスラブ幅より小さいときは、内部で発達したひび割れ面と側面にあらわれたひび割れが異なり、3次元的な破壊面を形成している。有効幅の大きさは支持板長さより載荷板長さの影響が大きい。有効幅は、載荷板と支持板の間で形成される圧縮ストラットを考えたとき、幅方向の膨らみはせん断スパンが大きな影響因子である。2.RCスラブの局部せん断破壊におけるせん断補強鉄筋の効果についてRC一方向スラブとRC片持ちスラブについて、せん断補強鉄筋の補強効果について実験的に調査した。実験結果から以下のことが明らかとなった。押抜きせん断破壊するスラブにおいては、補強効果が認められせん断耐力が大きく増加する。はり型せん断破壊の場合、せん断補強は若干の効果が認められたが、せん断補強鉄筋が無い場合に比べてそれほど大きな耐力増加はない。また、せん断補強鉄筋のひずみはある荷重から急激に増加し始めるが、終局時においてはいずれも降伏ひずみには達しなかった。
変形性関節症の発症予防を目指したWISP遺伝子の機能解析

超高齢社会に突入している我が国において,国民が要支援となる最大の原因である変形性関節症(OA)の治療法ならびに予防法を確立することは,社会保障費の削減において非常に重要であり,いまだ明らかとなっていないOAの発症メカニズムを解明することを目的とした本研究では,これまでに,OAの原因遺伝子のひとつであると推測されているWISP1遺伝子に着目した.OAを発症したヒト膝関節軟骨においてWISP1の遺伝子ならびにタンパク質が高発現していることが報告されているが,高発現しているWISP1がOAの発症と病態の進展にどのようにかかわっているのかを解明するため,今年度は以下3種類のOAモデルマウスを作製した.1加齢モデル: 3,6,12ヶ月齢の野生型ならびにWISP1遺伝子欠損マウスから膝関節を回収し,加齢に伴う膝関節軟骨への経時的変化を観察した.2機械的負荷モデル: 12週齢野生型マウスの内側半月板の脛骨半月靭帯(MMTL)を外科的に切断することで膝関節軟骨への機械的負荷を増強させる内側半月板不安定性モデルを作製し,8週間後に膝関節組織を回収した.3炎症誘発モデル: 12週齢野生型マウス膝関節の関節腔にコラゲナーゼを投与して炎症を惹起し,6週間後に膝関節組織を回収した.加齢モデルを用いて作製したOAマウスでは,3ヶ月と比較して6ヶ月,12か月のマウスの膝関節においてOARSIスコアが高い値を示しており,加齢に伴い膝関節症が誘発されていることが確認されたが,野生型とWISP1遺伝子欠損マウスとの比較ではいずれの月齢においてもOARSIスコアに有意差は認められなかった.機械的負荷モデルならびに炎症誘発モデルを用いて作製した野生型のOAマウスでは,サフラニンO染色において関節軟骨の破壊像が認められ,実験的に膝関節症が誘発されていることが確認された.野生型あるいはWISP1遺伝子欠損マウスを用いて,当初計画していた通り1加齢モデル,2機械的負荷モデル,3炎症誘発モデルの3種類の変形性関節症(OA)モデルマウスを作製することに成功した.既に作製したOAモデルマウスのうち,加齢モデルでは野生型とWISP1遺伝子欠損マウスでOAの進行の程度に有意差が認められなかったため,今後は機械的負荷モデルならびに炎症誘発モデルを用いて,WISP1遺伝子の有無がOAの病態にどのような影響を与えているか,組織学的に検討する.また,OAモデルマウスの軟骨組織からRNAを抽出し,WISP1遺伝子の有無がOA関連遺伝子の発現に与える影響についても解析する.超高齢社会に突入している我が国において,国民が要支援となる最大の原因である変形性関節症(OA)の治療法ならびに予防法を確立することは,社会保障費の削減において非常に重要であり,いまだ明らかとなっていないOAの発症メカニズムを解明することを目的とした本研究では,これまでに,OAの原因遺伝子のひとつであると推測されているWISP1遺伝子に着目した.OAを発症したヒト膝関節軟骨においてWISP1の遺伝子ならびにタンパク質が高発現していることが報告されているが,高発現しているWISP1がOAの発症と病態の進展にどのようにかかわっているのかを解明するため,今年度は以下3種類のOAモデルマウスを作製した.1加齢モデル: 3,6,12ヶ月齢の野生型ならびにWISP1遺伝子欠損マウスから膝関節を回収し,加齢に伴う膝関節軟骨への経時的変化を観察した.2機械的負荷モデル: 12週齢野生型マウスの内側半月板の脛骨半月靭帯(MMTL)を外科的に切断することで膝関節軟骨への機械的負荷を増強させる内側半月板不安定性モデルを作製し,8週間後に膝関節組織を回収した.3炎症誘発モデル: 12週齢野生型マウス膝関節の関節腔にコラゲナーゼを投与して炎症を惹起し,6週間後に膝関節組織を回収した.加齢モデルを用いて作製したOAマウスでは,3ヶ月と比較して6ヶ月,12か月のマウスの膝関節においてOARSIスコアが高い値を示しており,加齢に伴い膝関節症が誘発されていることが確認されたが,野生型とWISP1遺伝子欠損マウスとの比較ではいずれの月齢においてもOARSIスコアに有意差は認められなかった.機械的負荷モデルならびに炎症誘発モデルを用いて作製した野生型のOAマウスでは,サフラニンO染色において関節軟骨の破壊像が認められ,実験的に膝関節症が誘発されていることが確認された.野生型あるいはWISP1遺伝子欠損マウスを用いて,当初計画していた通り1加齢モデル,2機械的負荷モデル,3炎症誘発モデルの3種類の変形性関節症(OA)モデルマウスを作製することに成功した.既に作製したOAモデルマウスのうち,加齢モデルでは野生型とWISP1遺伝子欠損マウスでOAの進行の程度に有意差が認められなかったため,今後は機械的負荷モデルならびに炎症誘発モデルを用いて,WISP1遺伝子の有無がOAの病態にどのような影響を与えているか,組織学的に検討する.また,OAモデルマウスの軟骨組織からRNAを抽出し,WISP1遺伝子の有無がOA関連遺伝子の発現に与える影響についても解析する.平成30年度の予算として,海外共同研究者との研究打ち合わせのための旅費を計上していたが,日程が合わず見送りとなったため,次年度使用額が生じた.
小学校理科における認知と「ことば」の関係を探るためのリフレクション研究

本研究は、授業ビデオを使用したリフレクション(授業後の省察)の中から、児童の理科授業における「わかり方」や科学概念の形成と「ことば」との関係を明らかにすることを目的としており、理科授業中の児童の様子(発話・行動)を多く記録してデータ化するとともに、そのデータを質的に分析して、指導法の開発やカリキュラム開発に活かすことをねらいとしていることが特色である。そこで、(1)理科授業における児童の発話のデータ化と分析、(2)認知心理学的アプローチによるデータ分析及び資料収集、(3)研究成果を活かした指導法開発、及び、カリキュラム開発などを中心に研究を進めた。特に、本年度は、小学校3年「太陽と地面の様子」及び「光の性質」におけて、影と光、及びその関係に対する概念形成に関わる「ことば」に着目した。研究の成果として、自分の考えを「ことば」で十分に語らせることは、考えの妥当性を振り返らせるとともに、具体的な思考を促し生活経験を掘り起こすことに有効であることが明らかになった。例えば、太陽の高さと影の長さの関係について、観察・実験結果をもとに考察する中で、「(太陽の位置が)どてっぺん」や「(角度が)急、ゆるやか」などの自分の「ことば」を使いながら、小学3年生なりに理解していくことができたと考える。また、科学的用語と子どもたちの日常的な「ことば」の両方が理解に大きく関係していることを改めて確認することができた。例えば、中学年においても空気の変化に対して「反射」「光線」「遮る」などの科学的用語を使う子どもが見られるとともに、光線を図で示して説明しようとする子どももいた。しかしながら、その子どもたちが「光」や「光線」に対してある程度妥当なイメージをもっているとは限らなかった。反対に、「光がもれる」や「光がはね返される」、「ものが光のじゃまをする」といった「ことば」が、前述した科学的用語を説明し、多くの子どもたちを納得させる場面も見られた。これらのことから、学習を先取りした子どもたちの「ことば」や日常的な「ことば」のよさを生かした授業デザインが必要なことや、十分の自分の「ことば」で語ることができる環境づくりが今後の課題として明らかになった。
衛星データによる土地被覆の季節的変化と経年的変化の比較研究

LANDSATデータを利用したこの研究は、(1)GISソフトで解析した土地利用区分と衛星画像反射率による土地被覆の経年的変化の詳細な対比研究、(2)衛星画像の季節的変化に関する調査研究の2点を中心に実施した。(1)の研究では、GISソフトを用いて、太宰府市域などで1975年と1998年の地形図から10mメッシュの土地利用データを作成し、土地利用データの差分から土地利用の経年的に変化したメッシュを抽出した。その結果、水田から一般宅地への変化(150ha)、など8類型の変化が認められた。また、1986年と1999年のLANDSATデータの各バンド別のGridファイルの反射率をそれぞれ抽出し、GIS上の同一Grid反射率について1999年データから1986年データの差分を求め、上記の土地利用変化地点との比較を検討した。両者のオーバーレイを行ない、ndvi値とb1の組み合わせで判定できる変化域が最も対応が良いことが判明した。また,土地利用の変化しなかった地点でも,広場や果樹園の反射率の年次変化は少なくないことが判明した。(2)の研究では、2001年度の4月・5月・9月・10月・2月のLANDSAT/TMデータを比較した。5月のデータで教師付分類の手法でポイントトレーニングを行い、6分類に土地被覆を区分した。この時期と同じ基準を用いて、他の4時期の土地被覆を区分し、その図を比較した。その結果、土地被覆は経年的な季節変動を示す様子を明らかにすることができた。現地調査によって、水田は秋期冬期に教師付分類の手法では一見して水田内部に市街地が拡大するような変化を示す。これらの変化は土地利用区分で異なっており、水域ではバンド別反射率特性の季節変化は小さいが、水田では大きくなることなどが判明した。これらは、季節性の区分のためには有力な指標になりうることを明らかにした。「衛星データによる土地被覆の季節的変化と経年的変化の比較研究」の目的は、LANDSATデータ(衛星画像)1ドット毎の各バンド別の反射率特性の季節的経年的変化様式を解明することにより、土地被覆の季節的・経年的変化の特性と土地利用区分との関連性を検証することにある。本年度はLANDSATデータの1ドット毎の反射率特性の経年的変化を正確に把握し、ほぼ同じ季節で経年的に反射率がどのように変化しているかを微細に検討した。このような検討作業の基礎として、福岡市近郊で宅地開発などが急速に進展し、人為的な土地利用変化の激しかった太宰府市などや、雲仙噴火によって火砕流や土石流が堆積し自然的ではあるが急激な土地改変が進んだ島原市を対象として微細な反射率特性の変化を検討した。また、現地調査を実施し反射率変化の原因を確認した。この検討のために、同一の土地利用区分の中で衛星画像GISデータとLANDSATデータを重ね合わせて、地形図上で正確な位置を示せるように作業を進めた。作業の手順は次の通りである。1)1/25000地形図から作成した土地利用図と数値地形図をGISソフト上で重ね合わせ、また土地利用区分をポリゴン化して示す。2)このデータを10m×10mのメッシュデータとして地図上に示す。3)1986年と1999年の春のLANDSAT/TMデータに衛星画像解析ソフトを利用して幾何補正を加えたものを、GISソフトで取り込み2)のデータに重ね合わせる。なお、重ね合わせばTMデータの7バンド毎に個別に実施した。

4)土地利用区分ごとに衛星画像の各バンド別の反射率特性値に着目し、同一土地利用区分内の反射率特性の平均値と標準偏差値を求めた。これは土地利用区分の反射率特性と反射率の変異の関係を検討する目的である。1999年と1986年の同一地点の反射率特性の差分を検討した結果、広場や果樹園では同一土地利用区分でも年次別反射率の変異が大きかったことなどが明らかになった。平成17年度の研究は、(1)太宰府地域などの土地利用と衛星画像の土地被覆の経年的変化の詳細な対比研究、(2)日田市周辺の衛星画像の季節的変化に関する調査を中心に実施。(1)の研究では、GISソフトを用いて、1975年と1998年の地形図から10mメッシュの土地利用データを作成し、土地利用データの差分から土地利用の経年的に変化したメッシュを抽出した。その結果、75年から98年の間の太宰府市の土地利用変化は、水田から一般宅地への変化(150ha)、など8類型に区分された。ついで、1986年と1999年のLANDSATデータの各バンド別のGridファイルの反射率をそれぞれ抽出し、同一Grid反射率について1999年データから1986年データの差分を求め、上記の土地利用変化地点との比較を実施した。また差分データの標準偏差から分散幅別に3つに類型区分し比較した。両者のオーバーレイを行ない、ndvi値とb1の組み合わせで判定できる変化域が最も対応が良いことを明らかにした。(2)の研究では、2001年度の4月・5月・9月・10月・2月のLANDSAT/TMデータを比較した。5月のデータで教師付分類の手法でポイントトレーニングを行い、6分類に土地被覆を区分した。この時期と同じ基準を用いて、他の4時期の土地被覆を区分し、その図を比較した。その結果、土地被覆は経年的な季節変動を示す様子を明らかにすることができた。現地調査によって、水田は秋期冬期に大きく表面の姿を変えるため、教師付分類の手法では一見して水田内部に市街地が拡大するような変化を示す。これらの変化は土地利用区分で異なっており、水域ではバンド別反射率特性の季節変化は小さいが、水田では大きくなることなどが判明した。これら同一土地利用で認められる反射率の変動は、季節性の区分のためには有力な指標になりうることを明らかにした。
ペルオキシソーム酵素の進化-動物進化に伴う尿酸分解酵素群の脱落機構

プリン塩基の分解最終産物は動物種により異なり、ヒト上科、新世界のサルでは尿酸、その他の霊長類や哺乳類ではアラントイン、魚類、両生類では尿素、さらに下等になるとアンモニアである。このように動物のプリン分解は高等なほど、不完全であり進化の過程で尿酸以降の分解酵素群が脱落している。AllantoinaseとAllanto-icaseは魚類では別個の酵素であるが両生類になると両酵素は複合体を形成するようになり、さらに進化すると脱落することを報告した。本研究はAllantoinase-Allantoicase複合体形成と脱落の機構を明らかにするために、まづ両生類のAllantoinaseの遺伝子解析を行った。カエル肝臓のmRNAよりλgtllcDNAライブラリーを作製し、E.coliY1090を宿主としてCLlK(clontech社)によりカエルAllantoinase抗体を用いてスクリーニングし、単一のクローンを得た。M_<13>mp19とKSをベクターとしてE.coli JM109に形質導入して得たDNAをMultiprime DNA labelling system(Amersham社)でシーケンシングを行った。得られた塩基配列の内、7種のoligonucleotideを選びノースウエスタン大学に合成を依頼し、プライマーとしてさらに確実に塩基配列を決定し1.5kbのopenreading frameを得た。他方カエル肝臓より精製したAllantoinaseの54KDのペプチドの一次構造をハーバード大学で解析し、16種のアミノ酸配列を決定したが、この配列は、cDNAの10001051bpの配列と一致した。次に虹鱒のλEXlox^<TM>cDNAライブラリーを作製し、T7RNA Polymeraseを持つ宿主菌BL26(DE3)plysEに感染させて、イワシAllantoinase抗体を用い抗体発色法により得た純粋なプラークとBM25.8宿主菌と混合しオートマチックサブクローンを得た。このDNAを蛍光DNAシーケンサーにより塩基配列を決定し、カエルと虹鱒の遺伝子の比較からカエル複合体形成の意義を考察する。また、これらのDNAプローブを用い哺乳類のAllantoinase遺伝子の存在を調べ、進化に伴う尿酸分解酵素群の脱落機構を遺伝子レベルで解明してゆく予定である。カエル肝アラントイナ-ゼのDNAの遺伝子解析:カエル肝よりRNAを抽出し、mーRNAを調製してcDNAを作った。これをλgtllphageにパッケ-ジして、カエル肝cDNAライブラリ-を得た。予めbacterium columnにて精製したアラントイナ-ゼ抗体を用いてCLIKの方法に従ってスクリ-ニングを行い、クロ-ンを得た。EcoR1切断後小断片を生じた。このクロ-ンを大量に生産して精製したphugeDNAを以下の研究に用いた。(1)DNAとRNAの単離ーphageDNAをEcoR1切断後、電気泳動して得られる小断片をagarasegelより溶解抽出し、精製した。これを用いてmulti primed DNA Labeling法により^<32>PcCTPでラベルしたProbeを作製し、サザンブロット及びノ-ザンブロットのhybridizationを行った。(2)トランスホ-メ-ション:得られた小断片をKsvectorとM13mp19vectorを用いて予めJM10.9bacteriaより調製していたcompetent cellにトランスホ-ムして、小断片を挿入したvectorを得た。これらはEcoR1切断後、小断片が得られた。この断片を挿入されたM13mP19vectorのCーテストを行い、DNA合成が逆方向に進行する2つの組み込み体を選んで、^<35>SdATPでラベルし、3時間電気泳動してシ-ケンシングを行って結果、小断片は310bpより構成されていることが解った。現在、31obpをProbeとして、より大きい断片を検索中である。なお魚類肝のペルオキシソ-ムのアラントイカ-ゼ及び両生類肝のアラントイナ-ゼ・アラントイカ-ゼ複合体のDNAの遺伝子解析も始めたところである。

次に虹鱒のλEXlox^<TM>cDNAライブラリーを作製し、T7RNA Polymeraseを持つ宿主菌BL26(DE3)plysEに感染させて、イワシAllantoinase抗体を用い抗体発色法により得た純粋なプラークとBM25.8宿主菌と混合しオートマチックサブクローンを得た。このDNAを蛍光DNAシーケンサーにより塩基配列を決定し、カエルと虹鱒の遺伝子の比較からカエル複合体形成の意義を考察する。また、これらのDNAプローブを用い哺乳類のAllantoinase遺伝子の存在を調べ、進化に伴う尿酸分解酵素群の脱落機構を遺伝子レベルで解明してゆく予定である。
雷撃の衝撃波による椎茸発生メカニズム解明と栽培促進技術の確立

本研究は,雷撃時の衝撃波による椎茸発生のメカニズムの解明と栽培促進技術の向上を目的とし,第1段階「先行研究の再現性確認」と第2段階「衝撃波による効果とメカニズム解明」に分けて検討を進めている.2018年度は,これまでの研究結果をベースとして,先行研究で得られた結果との再現性確認を行った.この先行研究の再現性確認では,椎茸の菌を植菌をした榾木に対し,インパルス電圧発生装置により発生させた高電圧を直撃させることなく印加し,無印加の榾木と雷撃に曝した榾木とで比較を行うものである.これまで,榾木に直接電気的な刺激を与える方法による報告もあるが,自然界で発生する雷が榾木に直撃する可能性は極めて低く,自然界で想定される状況を模擬するため,本研究では,榾木へ直撃をさせず,雷撃は電極に印加させ,その周囲に榾木を設置する方法により,実験を行った.その結果,無印加のケースと雷撃に曝すケースを比較すると,椎茸の成長速度が著しく早くなるとともに,収量も約2倍を示した.また,椎茸の傘直径が規定サイズ(50mm)に達する本数についても,雷撃に曝すケースでは多い傾向を示した.この傾向は,先行研究での傾向と同様であることを確認した.以上の第1段階において,先行研究との再現性が概ね確認できたため,雷撃時に発生する衝撃波がシイタケの発生促進に影響を与えているとの仮説を導き出した.そして,雷撃時に発生する衝撃波を模擬し,これと同等のレベル(音圧,周波数など)の音波を作り出す音波システムの構築に着手をしている.現在までの研究進捗状況は,概ね計画通りに進行している.2018年度では先行研究との再現性確認に重点を置いて研究を遂行した.研究分担者とも定期的に打合せをし,進捗報告,実験データの吟味,研究の進め方について検討をしている.椎茸の榾木へ雷撃を直撃させることなく印加しても,椎茸の成長促進に大きな効果があることが確認できた.この内容について,査読付き論文化をするための実験結果の取得ができたため,現在,鋭意データの精査や検討を行っている.また,音波システムの構築に着手し,雷撃時の衝撃波の収録およびスピーカによる再現を試みた.予備実験をいくつかの条件で行っており,現在はこのデータの精査や実験条件の見直しを行っている.2018年度では,第2段階での重要なポイントとなる音波システムの構築に着手をしたところである.この音波システムは,雷撃時に発生する衝撃波を録音し,スピーカで再現可能な音圧,周波数を発生させるものである.次年度は,この音波システムを用いて榾木に照射し,仮説である衝撃波による効果の検証や最適条件を求める予定である.これにより,仮説として立てた衝撃波による椎茸への成長促進効果の詳細な検討を行うとともに,促進されるメカニズムの解明についても検討を予定している.本研究は,雷撃時の衝撃波による椎茸発生のメカニズムの解明と栽培促進技術の向上を目的とし,第1段階「先行研究の再現性確認」と第2段階「衝撃波による効果とメカニズム解明」に分けて検討を進めている.2018年度は,これまでの研究結果をベースとして,先行研究で得られた結果との再現性確認を行った.この先行研究の再現性確認では,椎茸の菌を植菌をした榾木に対し,インパルス電圧発生装置により発生させた高電圧を直撃させることなく印加し,無印加の榾木と雷撃に曝した榾木とで比較を行うものである.これまで,榾木に直接電気的な刺激を与える方法による報告もあるが,自然界で発生する雷が榾木に直撃する可能性は極めて低く,自然界で想定される状況を模擬するため,本研究では,榾木へ直撃をさせず,雷撃は電極に印加させ,その周囲に榾木を設置する方法により,実験を行った.その結果,無印加のケースと雷撃に曝すケースを比較すると,椎茸の成長速度が著しく早くなるとともに,収量も約2倍を示した.また,椎茸の傘直径が規定サイズ(50mm)に達する本数についても,雷撃に曝すケースでは多い傾向を示した.この傾向は,先行研究での傾向と同様であることを確認した.以上の第1段階において,先行研究との再現性が概ね確認できたため,雷撃時に発生する衝撃波がシイタケの発生促進に影響を与えているとの仮説を導き出した.そして,雷撃時に発生する衝撃波を模擬し,これと同等のレベル(音圧,周波数など)の音波を作り出す音波システムの構築に着手をしている.現在までの研究進捗状況は,概ね計画通りに進行している.2018年度では先行研究との再現性確認に重点を置いて研究を遂行した.研究分担者とも定期的に打合せをし,進捗報告,実験データの吟味,研究の進め方について検討をしている.椎茸の榾木へ雷撃を直撃させることなく印加しても,椎茸の成長促進に大きな効果があることが確認できた.この内容について,査読付き論文化をするための実験結果の取得ができたため,現在,鋭意データの精査や検討を行っている.また,音波システムの構築に着手し,雷撃時の衝撃波の収録およびスピーカによる再現を試みた.予備実験をいくつかの条件で行っており,現在はこのデータの精査や実験条件の見直しを行っている.2018年度では,第2段階での重要なポイントとなる音波システムの構築に着手をしたところである.

この音波システムは,雷撃時に発生する衝撃波を録音し,スピーカで再現可能な音圧,周波数を発生させるものである.次年度は,この音波システムを用いて榾木に照射し,仮説である衝撃波による効果の検証や最適条件を求める予定である.これにより,仮説として立てた衝撃波による椎茸への成長促進効果の詳細な検討を行うとともに,促進されるメカニズムの解明についても検討を予定している.2018年度では,主に椎茸の榾木を購入する予定として物品費に計上していたが,2019年度に購入予定の音波システムの導入を早めたため,使用額に差が生じた.2019年度は,榾木の購入や音波システムを構築する予定である.
リアルタイムPCRとFCMによる乳癌リンパ節癌微小転移の自動診断と予後の観察

乳癌のリンパ節癌微小転移の有無は臨床的に癌の手術法を決定することで重要な問題である。しかし病理学診断は連続切片の作成に膨大な時間と労働力を要すため検討すべき課題は多い。そこで定量化が可能なReal-time(quantitative)PCRとフローサイトメトリー(FCM)とを用いリンパ節癌微小転移を検討した。リンパ節癌微小転移の判定は病理学において診断されるが、リンパ節全体像の観察が困難なため、検出感度を低下させる。そこでリンパ節全体を測定するReal-time PCRとFCMを用いて極めて少量の癌を高感度に証明する診断法を確立する(0.2立方mm以下の微小癌転移の証明)。さらに迅速に測定できるFCMでリンパ節微小癌転移を短時間に判定し迅速診断法を確立する。様々な乳癌培養癌細胞と正常リンパ球細胞を種々の比率(1×10^<28>個の検体細胞に対して癌細胞が1個)で混和させたものと凍結されたリンパ節を溶かした後、そこに1立方mmに細切した癌組織を様々な比率で混ぜる。Real-time PCRは、CEAとサイトケラチン(17や19など)、BRCA1,BRCA2,β-HCGを指標とし細胞からDNA,RNAを抽出し、β-アクチンを指標とし検量線を作成し解析をした。正常リンパ球を陰性コントロールとし、FCMとReal-time PCRで解析した。乳癌培養癌細胞MCF-7と正常リンパ節細胞を種々の比率で混和した。細胞を70%エタノールで-20°C、30分間固定し、PBSで遠心洗浄した後、FITC標識抗サイトケラチンモノクロナル抗体(MNF116)を室温で1時間、反応させた。PBSで遠心洗浄した後、RNase AとDM染色色素Propidium Iodide(PI)を含むPBSに細胞を再浮遊させ、フローサイトメトリーにて解析をした。横軸がPI蛍光(DNA量)、縦軸がFITC蛍光(サイトケラチン量)のドットプロット表示で測定した。まず始めに、「癌細胞が正常細胞から観察可能か」をしらべるため、腫瘍マーカーとして知られるCEAと上皮マーカーとし有名なサイトケラチの二重染色をする事とした。さらにフローサイトメトリーに応用するために二重蛍光染色した。正常ヒト培養乳腺上皮細胞とヒト正常繊維芽細胞および5種類のヒト培養乳癌細胞を培養した。それら培養細胞に対して抗CEA抗体と抗サイトケラチ抗体を使用し二重蛍光染色を試行した。培養癌細胞の種類において、CEA単独では染色性の陰性の細胞群を認めた。サイトケラチンはほぼ陽性であった。それに比して陰性コントロールである正常ヒト培養乳腺上皮細胞とヒト正常繊維芽細胞は両抗体とも陰性であった。これらのことから蛍光二重にて癌細胞はほとんど診断可能であった。さらにこれら培養癌細胞と陰性コントロールである正常ヒト培養細胞を様々な比率で混合し蛍光顕微鏡下で観察したところ、一万分の一までのがん細胞の判定が可能であった。また、手術標本のリンパ節よりの細胞採取法は物理的回収法とコラギナーゼ法がある。物理的回収法は、鋏による細切法と摩り下ろし法があり、コラギナーゼ法も作用時間と温度に様々な組み合わせがある。これらの組み合わせで持つとも細胞を多く回収する方法を検討している。現在のところ、鋏による摩り下ろし法とコラゴナーゼを組み合わせる方法が、最も多くの細胞を回収できた。

これらのことから、この方法でリンパ節癌微小転移の観察は十分可能と推測される。様々な癌培養癌細胞と正常リンパ球細胞や正常乳腺上皮培養細胞を種々の比率(1×10^<28>個の検体細胞に対して癌細胞が1個)で混和し、さらにCEAとサイトケラチンに対して蛍光二重染色をおこなって蛍光顕微下で観察した。リンパ節より出来るだけ多く細胞を分離回収することはFCMの測定に重要であることから、「ハサミ分散法」を確立した。ハサミ分散法は眼科用ハサミを用いて組織をミンチ状に細切し、36度で1%コラギナーゼPBS数mlに懸濁させ1時間反応させた細胞を回収する方法が効率的であった。この方法において1cm^3の手術標本から1x10^6の細胞をかいしゅうできたが、改善し10^7から10^8個の細胞を回収する予定である。細胞膜透過性亢進は抗体やDNA染色色素が細胞内にアクセスし易くするための処理である。エタノール固定法が界面活性剤Triton X-100(TX)法より優れていた。また染色条件であるが、細胞に対してサイトケラチンとCEAは、36度で1時間染色することで、好ましい染色条件となった。これらの改善で染色時間は、短くなり、手術標本作成から観察可能の状態まで3時間以内で終了できることが可能となった。これらのことから細胞を蛍光標識した抗サイトケラチンモノクロナル抗体(17と19)とCEAモノクロナル抗体で二重染し、FCMにて測定した。これらの結果をX軸がDNA量、Y軸がサイトケラチン量、Z軸がCEAのドットプロット表示で測定・解析し、高い感度にてFCMに対して使用する染色条件を決定できた。乳癌のリンパ節癌微小転移の有無は臨床的に重要な問題である。しかし病理学診断は連続切片の作成に膨大な時間と労働力を要すため検討すべき課題は多い。そこで定量化が可能なReal-time(quantitative)PCRとフローサイトメトリー(FCM)とを用いリンパ節癌微小転移を検討した。リンパ節癌微小転移の判定は病理学において診断されるが、リンパ節全体像の観察が困難なため、検出感度を低下させる。そこでリンパ節全体を測定するReal-time PCRとFCMを用いて極めて少量の癌を高感度に証明する診断法を確立する(0.2立方mm以下の微小癌転移の証明)。さらに迅速に測定できるFCMでリンパ節微小癌転移を2時間以内に判定し迅速診断法を確立する。乳癌培養癌細胞MCF-7と正常リンパ節細胞を種々の比率で混和した。細胞を70%エタノールで-20°C、30分間固定し、PBSで遠心洗浄した後、FITC標識抗サイトケラチンモノクロナル抗体(MNF116)を室温で1時間、反応させた。PBSで遠心洗浄した後、DNA染色色素Propidium Iodide(PI)を含むPBSに細胞を再浮遊させ、フローサイトメトリーにて解析をした。横軸がPI蛍光(DNA量)、縦軸がFITC蛍光(サイトケラチン量)のドットプロット表示で測定した。乳癌培養細胞(SK-BR-3)と正常リンパ節細胞を種々の比率で混和しCEAをプライマーとし遺伝子発現量をReal-time PCR法にて解析した。固形組織のFCMに際して従来から用いられてきた細胞分散法や染色法が適用できた。2)症例毎に陰性対照を設ける必要があった。
浮世絵デジタルアーカイブ・検索システムための研究

本研究では、浮世絵の画像を対象として、色情報を使い、自動的に落款の種類を判別し、適した処理を行うことで、落款文字列を自動的に抽出・ニ値化する方法を開発した。立命館大学アート・リサーチセンター浮世絵データベースでの12人絵師の作品、計400枚を対象とし、提案手法を用いて落款を自動的に抽出・分析することにより、実験用の落款データベースを構築した。また、加重方向指数ヒストグラム(HOG)、自己相関関数などの特徴量を利用し、落款情報を利用した浮世絵検索システムを実装した。近年、国内外において人文科学分野へのコンピュータ技術の応用として、有形あるいは無形の歴史・文化情報資源をデジタル化、保存・流通することを可能にするデジタルアーカイブの研究が注目を集めている。本研究の長期的な目標は、膨大な数の浮世絵コレクションをデジタル技術によって保存・流通し、継承するとともに、最新の情報処理技術によるさまざまな解析を行うことにより、浮世絵研究支援システム構築しようとすることである。本研究では、浮世絵の画像解析の研究を行った上で、コンピュータで自動的に浮世絵を分類し、検索するシステムを開発することを目的とする。平成25年度は、浮世絵の画像を対象とし、色情報を用いて自動的に落款の種類を判別し、適した処理を行うことを通して、落款文字列を自動的に抽出・ニ値化する方法を開発した。そして、立命館大学アート・リサーチセンター浮世絵データベースでの12人絵師の作品、計400枚を対象とし、提案手法を用いて落款を自動的に抽出・分析することにより、実験用の落款データベースを構築した。さらに、加重方向指数ヒストグラム(HOG)、自己相関関数などの特徴量を用い、落款情報を利用した浮世絵検索システムを実装した。また、立体視浮世絵閲覧システムとの融合を検討した。世界に誇れる日本文化の一つである浮世絵は,国内外に約100万点以上存在するといわれている.本研究では,浮世絵の画像解析の研究を行った上で,コンピュータで自動的に浮世絵を分類し,検索するシステムを開発することを目的とする.平成24年度は,浮世絵画像検索システムの開発または閲覧システム構築の検討を行った.具体的には以下に示す研究を行った.1.浮世絵画像の色情報および種類に注目し,マセマティカル・モルフォロジ演算とラベリング・統合処理を用い,落款文字列を自動的に抽出した.また,抽出した落款の加重方向指数ヒストグラム(HOG)特徴量などを利用し,浮世絵類似画像検索・作者同定システムの開発を行った.2.ヘッドマウントディスプレイ(HMD)・方位センサ・体感センサKinectを用いたインタラクティブな立体視浮世絵閲覧システムの構築方法について検討した.バーチャル空間中の浮世絵画像をHMDで利用者に提示し,利用者の視点の方向情報はHMDに取り付けった方位センサで獲得される.さらに,Kinectを用いて,バーチャルCG環境において,利用者の位置情報だけではなく,利用者のジェスチャをKinectで認識することにより,視点移動や浮世絵画像との直感的なインタラクションが可能になった.3.古典籍の画像を対象として,文字の切り出しやキャラクタスポッティングを行い,学習支援システムの構築の研究を行った.文字切り出しは,汚れや染みの除去,2値化,行の切り出し,ラベリング処理による文字の分離と統合などからなっている.キャラクタスポッティングについては,相互相関係数とHOGを特徴量として用いた類似文字の抽出を行った.浮世絵落款自動抽出の精度を向上したとともに,浮世絵検索システムへの応用も検討した.研究成果を国際会議MMSP2012にて発表した.インタラクティブな立体視浮世絵閲覧システムの構築を検討した.国際会議投稿準備中.また,古典籍画像解析の研究は,国際会議MMSP2012,IICST2012,MPR2012にて発表し,国際的にも高く評価されている.平成25年度では,昨年度の研究を継続するとともに,充実した検索システムを構築し,研究成果の公開を進める.1.画像の特徴を抽出・分析し,浮世絵主題により分類方法について検討する.2.抽出された構図・感性特徴量を用い,様々な視点から画像を検索することにより,非常に充実した検索システムを構築する.3.バーチャル・リアリティ技術を利用し,インタラクティブな立体視浮世絵閲覧システムを構築する.研究成果の公開を進める.1.研究成果発表のための旅費2.会議参加費、別刷り購入費3.論文の投稿費及び英語論文の校閲費4.浮世絵関連資料購入5.プリンタ用紙・カラープリンタトナー等文具
子宮体癌妊孕性温存療法におけるプロゲステロン抵抗性の形成機構

子宮体癌のプロゲステロン(P4)抵抗性の研究のためには、正常な子宮内膜に対するP4作用の分子メカニズムの解析が不可欠である。P4作用により着床直前に子宮内膜上皮増殖停止と間質の増殖開始が起こることが知られている。この変化をproliferation-differentiation switching(PDS)と名付けた。PDSは子宮の胚受容能の指標として知られるが、この細胞増殖の変化自体が着床の成否を調節しているかは不明であった。細胞周期抑制因子であるretinoblastoma(Rb)遺伝子の子宮特異的遺伝子欠損マウスを用いて、着床期の子宮内膜上皮増殖抑制と着床の調節機構を検討した。子宮のRB欠損マウスはPDSが障害され、内膜上皮の増殖抑制が起こらなかった。胚浸潤の際のバリアとなる内膜上皮の消失が起こらず、胚浸潤が障害された。P4を着床前に投与すると、これらの表現型が完全に救済された。つまり、着床直前の子宮内膜上皮の細胞増殖抑制は単なる胚受容能の指標というだけでなく機能的な変化であること、P4による内膜上皮の細胞増殖抑制はその後の内膜上皮の消失と関連し胚浸潤を制御していること、が示された。本研究により、P4による正常子宮内膜上皮の分化とその意義が明らかとなり、癌の病態を考える上での参考になる成果が得られた。子宮体癌のプロゲステロン(P4)抵抗性を考える上では、子宮内膜に対する黄体ホルモンの作用の検討は極めて有用である。P4作用により着床直前に子宮内膜上皮増殖停止と間質の増殖開始が起こる。この変化は子宮の胚受容能の指標として知られるが、この細胞増殖の変化自体が着床の成否を調節しているかは不明である。そこで細胞増殖を抑制する機能を持つことが知られているがん抑制遺伝子であるretinoblastoma(Rb)の子宮特異的欠損マウスを用いて、RbおよびP4による着床期の子宮内膜上皮増殖抑制と着床の調節機構を検討した。方法として、Rb-loxPマウスとPgr-Creマウスを用いて子宮のRb欠損マウス(CKO)を作成し、コントロールマウス(Con)と着床の表現型を比較検討した。腟栓確認後に新生仔を得た雌マウスの割合はConが85%、CKOが16%であり、子宮のRb欠損で妊孕能が低下することが示された。腟腺確認日をDay1とすると、CKOでは着床直前であるDay4のKi67陽性の子宮内膜上皮細胞が著明に増加しており、Rb欠損による子宮内膜上皮細胞の増殖能亢進が認められた。CKOではDay5で胚接着は起こるもののDay6で胚浸潤の異常(間質へのトロホブラスト浸潤の異常)が認められ、Day8で70%の胚が死滅した(Conは0%)。CKOにDay2からP4投与(2mg/日)を行ったところ、Day4の子宮内膜上皮の細胞増殖が抑制されDay8の死滅胚は完全に消失しConと同等に新生仔が得られた。本研究により、RbおよびP4が着床直前の子宮内膜上皮の細胞増殖能と胚浸潤を調節していること、着床直前の子宮内膜上皮の細胞増殖抑制は単なる胚受容能の指標というだけでなく機能的な変化であることが示唆された。またP4はRbを介さない経路でも子宮内膜上皮の増殖抑制を誘導できたことから、黄体ホルモンによる子宮内膜の多様な細胞内シグナル調節経路の存在が明らかとなった。ヒト子宮体癌のホルマリン固定サンプルからの遺伝子抽出が難航したため、子宮体癌に関連する子宮内膜増殖抑制する遺伝子の欠損マウスを作成し、マウスモデルを用いた研究に焦点を当てて進めることができたため、順調に成果が得られている。これらの成果をさらに発展させ、研究の更なる進展が期待できる。成果が上がっているマウスモデルを用いた研究を推進することで、更なる成果を得られるものと考えている。マウスモデルを用いた研究に焦点を当てて研究をさらに推進する。ヒト子宮体癌

パラフィン検体からのmRNA回収に技術的に難渋し、それ以降の作業が進まなかったために次年度使用額が生じた。研究概要に示したようにマウスモデルを用いた研究で最近成果があがってきており、次年度に繰り越した研究費を成果が確実に期待できる研究内容の推進に当てて、次年度は確実に成果を得る予定である。
胎児抗原に着目した腫瘍関連蛋白の網羅的探索と診断・治療への応用

癌の診断や治療をより効率的に行うためには、癌にのみ発現しているような胎児性蛋白を標的マーカーとして診断や治療に用いることがで効果的である。そこで悪性腫瘍の中でも特に死亡数の多い肺腺癌が異的に発現している胎児性蛋白を網羅的に探索し、診断や治療に有用な新しいマーカー蛋白を見出す研究を行った。ヒト胎児を用いた研究は倫理的に問題があるため、ブタ胎見の肺の凍結材料から抽出した蛋白を免疫原としてマウスの腹腔に免疫し、モノクローナル抗体を多数作製した。スクリーニングのために、ブタの成体肺と胎児肺を載せた組織アレイと、ヒトの肺腺癌6例、肺肉腫1例、および正常肺を載せた組織アレイの計2種類の組織アレイを作製した。スクリーニングには自動疫染色装置を用いた免疫染色を用い、腫瘍に特異的に応する抗体を産生するクローンの選別を行った。その結果、ブタ成体肺に陰性で胎児肺に陽性を示し、ヒト肺組では癌組織に特異的に陽性を示す11クローンを選別した。中でもの間質に選択的に応るD-7クローンは、正常肺では静脈壁に陽性を示すが、肺胞部分は陰性で、間質性肺炎の症例や肺腺癌細胞株でもほぼ陰性であることから癌の間質だけに特異的に陽性を示すことが確認できた。なお、肺腺癌の前癌病変として知られている異型腺腫様過形成の間質では陽性率が低く、また癌が進展するに従って陽性率が高くなる傾向が見られた。D-4抗体は肺腺癌の診断や悪性度判定に応用できるマーカーに成りえる抗原を認識する抗体である可能性が示された。D-7抗体が認識する蛋白質はウエスタンブロット法による解析で約30kDaの分子量を持つことが分かった。現在更なる抗原解析を実施している。本研究はブタ胎児組織を免疫原にしてモノクローナル抗体を作製し、ヒト悪性腫瘍でスクリーニングする事に寄って腫瘍関連胎児性タンパクを網羅的に探索する事を骨子としている。得られたモノクローナル抗体を悪性腫瘍の免疫組織診断に用いるとともに、ELIZA系などを利用して血清診断に利用しる。さらには腫瘍の分子発生機構の解明のための手般として用いる。平成20年度は肺濠癌をターゲットにして以下の研究を推進した。研究の進捗状況は以下のとおりである。(1)ブタ5週令、14週令の胎児肺組織を合わせて免疫原とし、マウスモノクロ一ナル抗体を常法に従って作製し、約100個クローンを得た。(2)これらのクコーンをまず免疫に用いたブタ胎児肺組織および成体ブタ肺組織の両者を含む組織標本で免疫染色を用いてスクリーニングし、胎児ブタ肺に陽性で、成体ブタ肺に陰性となるクローンを選別した。(3)ヒト肺癌緩織、特に初期肺癌仁特徴的なbronchioloalveoalr carcinoma componentを持つ肺腺癌怨織5例と1例の癌肉腫、さらに王堂肺1例を含む組織アレーを作製した。これを屠いて(2)で選別されたクローンを免疫農織学的にスクジーニングし、肺癌組織、肺癌問質、あるいは突種成分などに陽性で王常飾に陰性のクローンを選別した。(4)(3)の詰果、4から5演のクローンの絞り込みに歳功した。この中の複数のクローンまブタ胎児貯紅胞の核に陽控で肺癌紀胞の紅胞質に陽性のパターンを示した、興暖あることこ選副されたクローンの内の1つはブタ胎児喬に陽性で、旦つヒト肺腺癌間質に特異的に陽窪となった。
有機多層超薄膜の作製・評価・物性研究

1.フタロシアニン超薄膜のエピタキシャル成長各種フタロシアニンのアルカリハライド基板上での超薄膜エピタキシャル成長の条件を検討した。時に一方向配向の均一単結晶性膜の成長条件を探るために、分子平面に垂直な方向に突き出た置換基(原子)をもつ分子として、アルミニウムフタロシアニンクロライド(AlPcCl)、バナジルフタロシアニン(VOPc)、アルミニウムフタロシアニンフルオライドポリマ-((AlPcF)n)をとりあげた。その結果、アルカリハライド結晶(100)表面の超格子(3×3、√<10>×√<10>、√<13>×√<13>)に対してエピタキシャル成長が観測され、かつその超格子定数は14ー15A^^°の範囲内に限られることが示された。又、一方向配向正方格子は、VOPcと(AlPcF)nではKBr上で、又AlPcClではKI上でエピタキシャル成長することが示されたが、両者の間では超格子定数が約1A^^°異っており、突き出た原子と一方向配向性との間の相関については更に検討を要する。2.フタロシアニン超薄膜の非線形光学特性上記のように、OMBE法によって得られたフタロシアニン超薄膜の非線形光学特性、特にSHG、及びTHGと薄膜構造との相関について検討した。石英ガラスとアルカリハライドとでは、基板上の分子配向が全く異っており(前者では分子面〓基板面、後者では分子面//基板面)かつ前者ではエピタキシャル成長していないので面内配向は全く無秩序である。アルカリハライド上では面内一方向又は二方向配向をしていること、及び膜内分子配向の違いを反映して、非線形特性はアルカリハライド上の方が一般的に大きい。又、その入射光角度及び偏光特性も膜構造と相関していることが示された。THG特性を規定している三次非線形応答係数1X^<(3)>1は、(AlPcF)n/KBr,AlPcCl/Quartz,VOPc/KBrで、それぞれ1X10^<ー10>、5×10^<ー10>、4×10^<ー10>esuであった。
角化細胞の分化関連蛋白の細胞内相互作用の解析

角層における脱イミノ化をつかさどる酵素、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ(PAD)ファミリーに属する分子、PAD1,2,3の発現と基質特異性を調べた(Cell Mol Life Sci 2005)。その結果、それぞれフィラグリンを異なる効率で脱イミノ化することが分かった。また、PAD1とPAD3は角層下層でフィラグリンと共存することがわかった。PAD1は角層上層でも発現しており、K1の脱イミノ化に関与していると考えられた。表皮のセリンプロテアーゼインヒビターであるLEKTIが層板顆粒によって運搬、分泌されることを明らかにした(J Invest Dermatol 2005)。その際、LEKTIの基質であるカリクレインはLEKTIよりも産生と輸送、分泌が遅れてなされており、カリクレインによるデスモゾームの分解が角層下部では始まらないように調整する機構として働いていると考えられた。また、LEKTIの欠損による遺伝性疾患であるNetherton症候群ではデスモゾームの異常解離がおきていることも明らかにした。Netherton症候群のモデル動物としてLEKTIノックアウトマウスを作成し、ここでもデスモゾームの異常な解離がおきており、これはデスモゾーム構成要素であるデスモグレイン1の分解亢進によるものであることを明らかにした(Nature Genetics 2005)。表皮角化細胞が分化の過程で発現する各種蛋白の相互作用を解析し、本年度は以下の実績を得た。1)乾癬をはじめとする異常角化過程で発現する蛋白であるelafinの細胞内局在を、角質細胞の辺縁帯前駆体蛋白であるinvolucrinの局在の変化とともに径時的に検討した(J Inv Dermatol 2002)。その結果、乾癬表皮ではelafin分子はinvolucrin分子の辺縁帯への架橋以前は細胞質内の分泌顆粒内に蓄えられ、暫時分泌されるが、involucrinの架橋開始とともに、細胞内の顆粒の分解、細胞内への拡散、辺縁帯への架橋がおこるおとがわかった。すなわち、異常角化状態では分泌蛋白が細胞内で辺縁帯前駆体蛋白としても利用されることが明らかになった。2)Loricrin分子は正常角化では辺縁帯の成分として働くが、loricrin遺伝子に特異な変異による読み枠のずれがおきると核内移行シグナルを獲得し、野生型loricrinやinvolucrinなど他の前駆体蛋白とは架橋せず、核内、とくに核小体に局在し、角化細胞の分化を阻害することを明らかにした(J Dermatol Science 2003)。3)Keratin 1(K1)およびK10は表皮角化細胞の分化型ケラチンであるが、従来からこれらの遺伝子の異常としてしられていた角化異常症である水庖型先天性魚鱗癬様紅皮症に加え、豪猪皮状魚鱗癬の1型であるCurth-Macklin型lchthyosis HystrixにおいてはK1のテイルドメインに変異があることによって細胞骨格の異常がおきることが病因であることをつきとめた(Histology Histopathology,2002)。さらに、K1テイルドメインの異常をもつ蛋白が細胞内で部位、分化特異的に発現していること、他の研究者が示唆しているようなデスモゾームの異常をまねいているのではないことを明らかにした(J Inv Dermatol 2003)。表皮角化細胞が分化の過程で発現する各種タンパクの相互作用を解析した。本年度の主な研究成果は以下のごとくである。1.分化型ケラチンのひとつであるK1のテールドメインに変異が導入されることによって生じる角化異常症であるCurth-Macklin型豪猪皮状魚鱗癬では、他の研究者の報告ではそのような異常なケラチンは異常に核内移行すると報告されていたが、これは少なくともわれわれのin vivoの系では認められないことを報告した(J Invest Dematol 2003)。また、他の研究者が指摘していた異常ケラチンによるデスモゾームの障害も認められないことを報告した(J Invest Dermatol 2003)。2.角化細胞が分化に伴って合成する顆粒である層板顆粒の実態について報告した(J Invest Dermatol 2004)。

この顆粒は従来考えられていたような孤立性の顆粒ではなく、ゴルジ複合体の延長構造として網目状に細胞内に発達している構造であることが判明した。また、各種分泌酵素、構造タンパク、セラミド前駆対がこの構造の中に含まれ、独立して輸送されることも示した。1.表皮角化細胞が分化の過程で産生する蛋白のうち主に層板顆粒によって輸送され、分泌されるものについて検討した。その結果、カリクレインに属するセリンプロテアーゼ2種、デスモゾーム成分となるコルネオデスモシン、ライソゾーム酵素として知られるカテプシンDはいずれも角層細胞間脂質を提供するセラミドの前駆体とともに層板顆粒によって輸送されることが明らかになった。しかし、個々の分子は独立した顆粒として互いに混じることなく、また、時期を違えて運送、分泌されていた。これにより細胞内でデスモゾーム成分の分解などがおきないように仕組まれているものと考えられた(J Invest Dermatol,122:1137,2004)。2.表皮のセリンプロテアーゼインヒビターであるLEKTIの局在を検討したところこれも層板顆粒によって運搬、分泌されることを明らかにした(J Invest Dermatol, in press)。その際、LEKTIの基質であるカリクレインはLEKTIよりも産生と輸送、分泌が遅れてなされており、カリクレインによるデスモゾームの分解が角層下部では始まらないように調整する機構として働いていると考えられた。また、LEKTIの欠損による遺伝的角化異常症であるNetherton症候群ではデスモゾームの異常解離がおきていることも明らかにした。3.Netherton症候群のモデル動物であるLEKTIノックアウトマウスを作成し、ここでもデスモゾームの異常な解離がおきており、これはデスモゾーム構成要素であるデスモグレイン1の分解亢進によるものであることを明らかにした(Nature Genetics 37:56,2005)。1.表皮のセリンプロテアーゼインヒビターであるLEKTIが層板顆粒によって運搬、分泌されることを明らかにした(J Invest Dermatol,124:360,2005)。また、LEKTIの欠損による遺伝性疾患であるNetherton症候群ではデスモゾームの異常解離がおきていることも明らかにした。2.Netherton症候群のモデル動物としてLEKTIノックアウトマウスを作成し、ここでもデスモゾームの異常な解離がおきており、これはデスモゾーム構成要素であるデスモグレイン1の分解亢進によるものであることを明らかにした(Nature Genetics 37:56,2005)。3.重篤な神経症状、魚鱗癬と掌蹠角化症が認められる、北イスラエルの1家系が、細胞内輸送小胞の癒合に関与するSNARE蛋白のひとつ、SNAP29の遺伝子変異による新規の劣性遺伝性疾患であることを発見した(Am J Hum Genet 77:242,2005)。