hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
加齢依存性変形性関節症に関わる新規クロマチン蛋白

クロマチン蛋白HMGB2は加齢依存性の変形性関節症を引き起こす原因遺伝子であることが既に報告されている。今回我々はマウス骨髄細胞より間葉系幹細胞(MSC)を確立し、野生型MSCとマイクロアレイで比較した結果、Hmgb2-/- MSCで最も発現が低かった遺伝子Xは、早老症の原因遺伝子として報告されていた。これはHMGB2-遺伝子Xのカスケードが、老化現象に密接に関わることを意味する。HMGB2-/- MSCは軟骨分化のみならず、骨分化、脂肪分化にも影響を及ぼすため、これまで報告されたWnt/beta-cateninシグナル以外にも、関節軟骨変性に影響を及ぼす他の経路が存在する可能性が示唆された。HMGB2の間葉系幹細胞(MSC)における役割を解明し、加齢依存性に消失するHMGB2の軟骨表層における役割を検討した。初めにヒトMSCの各種組織(軟骨、骨、脂肪など)への分化能を確認した。軟骨分化はII型コラーゲン、骨分化はオステオカルシン、脂肪分化はアディポネクチン等を用いて検出できた。次にレンチウィルスを用いてMSCにHMGB2を強発現させ、その各分化に及ぼす影響について検討した結果、HMGB2にはMSCの分化能を抑制させる働きがあると考えられた。さらにMSCが軟骨分化する際、HMGB2とSuperficial Zone Protein (SZP)の発現パターンを調べ、軟骨表層に存在すると考えられる未分化な細胞はどの過程で発現するのか検討したところ、MSCにおいてHMGB2は発現するが、SZPは発現していなかった。一方、SZPはヒト軟骨細胞では発現が認められた。一方軟骨が成熟し石灰化した場合、HMGB2とSZP両者ともに発現がみられなかった。以上の結果より、SZPはMSCが軟骨に分化する過程で、一過性に発現することが分かった。軟骨表層細胞に特異的なマーカーとして、Superficial Zone Protein (SZP)があり、我々は既に表層細胞におけるHMGB2のとSZPの局在がほぼ一致すること、Hmgb2-/-マウスでは、SZPの発現が6ヶ月齢では低下することを確認している。今回HMGB2が直接SZPを制御する可能性について分子生物学的に検討し、SZPのプロモーターを含むreporter geneにより、Sox5のbinding siteを含む上流-998bpの領域で軟骨肉腫細胞株で転写活性の亢進があることを認めた。今後、この作用が軟骨細胞特異的なものか、またHMGB2のエンハンサーとしての働きについて検討していく予定である。HMGB2レンチウィルスをマウスより抽出した軟骨細胞に強発現させ、そのSZP発現への影響を観察し、更にsiRNA oligoの導入によりHMGB2及び前述Sox5のノックダウンを施行した結果、HMGB2がSZPの発現そのものを直接制御する確証は得られておらず、HMGB2とSox5のマウス軟骨細胞でのendogeneousな結合も現時点では確認できていない。以上の結果より、Sox5はHMGB2とは相互独立してSZP遺伝子発現を制御している可能性がある。野生型とHmgb2-/-マウス骨髄由来の間葉系幹細胞(MSC)を用いてマイクロアレイを行い、両群間で比較した結果、34,000遺伝子の中でHmgb2-/- MSCで最も発現が低かった遺伝子Xに注目した。この遺伝子について検索した結果、ノックアウト(KO)マウスの表現型は、HMGB2 KOマウス同様、早期加齢を引き起こすことが分かった。現在このマウスの関節軟骨における表現型について解析中であり、HMGB2との関連について分子レベルで検討している。また、前述のMSCを使った分化実験で骨分化、軟骨分化、脂肪分化を誘導し、それぞれに特徴的な分化傾向を有することが明らかとなった。変形性関節症の病態においては、軟骨の内軟骨性骨化、脂肪関連転写因子の関与も報告されており、HMGB2を介した新たなカスケードの存在が示唆された。整形外科学これまで申請者はクロマチン蛋白HMGB2の欠失が加齢依存性の変形性関節症を引き起こすことを主に動物モデルを用いて報告した。軟骨表層細胞は未分化な細胞に富むと報告されているため、今回In vitroの系では、軟骨成熟細胞を用いず、幹細胞を用いた実験を進めた結果、HMGB2は軟骨分化だけでなく、他の細胞への分化能も抑制する機能があることが分かった。また、軟骨表層に特異的に発現し、軟骨保護作用が既に報告されているSZPに関しては、初期発現パターンこそ違うもの、成熟した軟骨細胞では同様に減少する傾向を認め、軟骨表層の未分化な細胞の維持にHMGB2、SZPが深く関わる可能性が示唆された。

変形性関節症は高齢者で最も罹患率の高い関節疾患であるが、初期の発症機序とされる軟骨表層の加齢依存的な変性のメカニズムに関しては不明な点が多い。これまで申請者はクロマチン蛋白HMGB2の欠失が加齢依存性の変形性関節症を引き起こすことを主に動物モデルを用いて報告したが、今回HMGB2の軟骨表層の恒常性維持に関する役割を、同様に軟骨表層に特異的に発現し、軟骨保護作用が既に報告されているSZPとの関連を、主に核内転写レベルの観点から検討した。現在のところ、SZP発現にSox5結合領域が関与する可能性は示唆されたが、それに対するHMGB2の役割に関しては更なる検討を要する。野生型とHmgb2-/-マウス骨髄よりMSCを抽出し、各種組織(軟骨、骨、脂肪など)へ分化させ、HMGB2の各分化に及ぼす影響について検討する。これら分化の過程で、SZPの発現が野生型と比べ、Hmgb2-/-細胞でどのように変化するか調べる。我々は、軟骨細胞への分化の過程で一過性に発現するSZP陽性細胞が、軟骨表層細胞に最も近い表現型を表すと考えている。これらの分子メカニズムの解明は、関節軟骨のtissue engineeringへの新しいアプローチに繋がる。軟骨表層細胞は未分化な細胞に富むため、今後は軟骨成熟細胞でなく、幹細胞を用いた実験を展開する。HMGB2の間葉系幹細胞(MSC)における役割を解明することにより、軟骨表層の未分化な細胞に特異的に発現する分子とHMGB2、SZPの遺伝子発現制御の関連がみえてくるかもしれない。具体的には、ヒトMSCにおいてHMGB2を強発現させ、軟骨、骨、脂肪など各分化に及ぼす影響について検討する。また、MSCが軟骨へ分化する際、HMGB2とSZPの発現パターンを調べ、軟骨表層における未分化な細胞の性格について詳細に検討する。さらに野生型とHmgb2-/-マウス骨髄よりMSCを抽出し、各種組織へ分化させ、その過程でのHMGB2の役割について検討する。野生型とHmgb2-/-マウス骨髄よりMSCを抽出し、各種組織(軟骨、骨、脂肪など)へ分化させ、HMGB2の各分化に及ぼす影響について検討する予定であるが、Hmgb2-/-MSCの確立が遅れているため、この細胞を使った一連の実験が次年度へ延期となった。野生型とHmgb2-/-マウス骨髄由来のMSCを用いてmicroarrayを行い、HMGB2の下流遺伝子を調査する。独立した野生型とHmgb2-/-マウスから抽出したMSCのデータを比較し、HMGB2によって制御される候補遺伝子について検討する。上記候補遺伝子とHMGB2との関係をin vitroで証明する。HMGB2レンチウィルスをマウスより抽出した軟骨細胞に強発現させ、その影響を定量的PCRで観察する。更にsiRNA oligoの導入によりHMGB2遺伝子のノックダウンを施行し、その効果を同様に観察し、HMGB2の下流遺伝子を同定する。これらの候補遺伝子を通して、HMGB2が制御する可能性のあるpathwayについて、脂肪分化、骨分化も含めて検討する。ヒトMSCを購入し、各種組織(軟骨、骨、脂肪など)への分化能を確認した後、HMGB2を強発現させ、その各分化に及ぼす影響について検討する。
SRモータ駆動用電流共振形インバータの研究

SRモータは構造が簡単,メンテナンスフリー,堅牢である。誘導機に比べ,大トルクを得ることができる,などの特長を持つことから電気自勲車駆動用モータとして近年注目を浴びている。従来,SRモータの駆動回路は各相巻線に直列にスイッチ素子およびダイオードを接続した,構成の簡単な回路が用いられていた。制御方法は,回転子位置を検出し,それにしたがってスイッチのオン・オフを行う。しかし,SRモータの構造上,スイッチをオンにしてもすぐには電流が流れず,また,オフにしてもモータには電流が流れたままになる。前者は,トルクの低下の原因となり,後者は回転方向とは逆向きのトルクが発生するため,効率の低下の原因となる。そこで本研究では,電気的共振現象を利用したSRモータ駆動回路の開発を行った。本方式では,従来の駆動回路に比べ,共振を利用して電流ピークを大きくすることによって大トルクが得られ,また,回転方向とは逆向きのトルクを極めて小さくできるため,効率の向上が実現できた。定負荷実験においで,提案回路ではトルクは従来回路に比べ34倍,効率は10数%向上したことにより,提案回路では大トルク,高効率が得られることが確認できた。これらの結果は後述のとおり,学会誌等で有用な発表を行なうことができた。近年,スイッチドリラクタンスモータが種々の特性により注目されており,その駆動用インバータの開発が行われている。従来のハードスイッチング形インバータでは低騒音化に伴うスイッチング周波数の高周波化によるスイッチング時のロスの大量発生や、EMIなどが大きな問題となっていたが、共振形インバータの場合にはソフトスイッチングを用いるため、スイッチングの高周波化によるスイッチングロスは少なく、極端に高い周波数の電流成分が少ないため、EMIを低減できる。本研究では、スイッチドリラクタンスモータ駆動用電流共振形インバータを提案し、回路の試作と実験を行った。その実績は以下のとおりである。1.主回路の設計・製作:コンピュータを用いたシミュレーションにより回路素子の設計を行い、それに基づいて主回路の試作を行った。2.制御回路の作成:コンピュータを用いたシミュレーションにより制御回路の設計を行い、それに基づいてディジタルICやDSP(シグナルプロセッサ)を用いた制御回路の製作を行った。3.ソフトウエアの作成:SRモータの位置検出信号を用いてDSPのプログラムの作成とデバッグを行った。このとき,実験装置の基本動作や保護装置との関連動作の確認も行った。4.実験:始動停止の方法の確立と種々の負荷(一定)における運転実験を行った。その結果,提案回路では定負荷時において,トルクは従来回路に比べ34倍,効率は10数%向上したことにより,提案回路では大トルク,高効率が得られることが確認できた。従来のハードスイッチング形インバータでは低騒音化に伴うスイッチング周波数の高周波化によるスイッチング時のロスの大量発生や、EMIなどが大きな問題となっていただけでなく,所望のトルクを得るためには効率を犠牲にせざるを得ないという問題があった。共振形インバータの場合にはソフトスイッチングを用いるため、スイッチングの高周波化によるスイッチングロスは少なく、極端に高い周波数の電流成分が少ないため、EMIを低減できる。また,モータ電流は共振を利用するため,効率を悪化させることなく大トルクを得ることも可能であり,SRモータの用途を広範囲とすることができる。本研究では、昨年度提案を行ったスイッチドリラクタンスモータ駆動用電流共振形インバータの改良を行い、特性の改善をはかった。1.特性の検討と主回路の改良:トルク特性について,検討を行った。トルクは従来回路に比べ34倍,効率は10数%向上した。しかし,スイッチ素子の端子電圧が大きいことから装置の小型化のため,主回路の改良を行った。また,制御回路等については適宜修正を行った。2.周波数特性の検討:電気自動車に搭載することを考慮して,周波数特性,特に,モータの回転速度に着目してトルクおよび効率の特性の検討を行った。その結果,電気自動車に必要なトルク特性を得ることは可能であることが確認された。また,効率特性も良好なものが得られた。
細胞骨格から見た赤血球膜異常症の病因・病態に関する分子生物学的研究

細胞骨格から見た赤血球膜異常症の病因・病態に関して,下記の分子生物学的研究を行った。
ファジィモルフォロジー演算の確立とその画像解析への応用の研究

モルフォロジー演算は画像からの特徴抽出を目的とし、集合的操作からなる画像の変換処理方法である。本研究ではモルフォロジー演算のファジィ化をめざし、構成要素をファジィ集合とするとともにモルフォロジーの基本演算であるdilation,erosion,openingおよびclosingの4つの基本演算をMINおよびMAX演算を用いてファジィ化し、fuzzy dilation,fuzzy erosion,fuzzyopeningおよびfuzzy closingの4つのファジィモルフォロジー基本演算を提案した。そしてファジィモルフォロジー基本演算を用いた画像処理を行うプログラムを作成し、イメージスキャナからコンピュータに取り込んだ2値画像に対し画像処理を施した。その結果、fuzzy dilation演算では画像を滲ませながら膨張する効果があること、fuzzy erosion演算では画像を収縮する効果があること、fuzzyopening演算では画像のエッジをなだらかにし囲まれた部分を広げる効果があること、fuzzy closing演算では画像のエッジをなだらかにし狭い間隙や小さな穴を除去する効果があることがわかった。また、構成要素であるファジィ集合のメンバーシップ関数を変えることにより、画像処理の効果を微妙に調節することが可能である。本研究のファジィモルフォロジー基本演算は、演算をMINおよびMAX演算に置き換えたこと、構成要素をファジィ集合としたところに特徴がある。
情報量最大化原理に基づく皮質回路の理解とモデル構築

大脳皮質の神経回路を,「神経回路は情報を効率的に保持・伝達できるようになっている」という仮説(情報量最大化原理)に基づいてモデル化した.細胞の発火率,発火の信頼性などのパラメタを変えて,繰り返し発火系列の出現,神経雪崩現象の出現を再現した.しかしこのモデルは学習則に生物学的に無理があったので,より無理のないモデルを,情報量最大化原理と密接に関連するスパースコーディング仮説に基づいて構築した.このモデルで一次視覚野の単純型細胞と複雑型細胞の選択性を再現した.大脳皮質の神経回路を,「神経回路は情報を効率的に保持・伝達できるようになっている」という仮説(情報量最大化原理)に基づいてモデル化した.細胞の発火率,発火の信頼性などのパラメタを変えて,繰り返し発火系列の出現,神経雪崩現象の出現を再現した.しかしこのモデルは学習則に生物学的に無理があったので,より無理のないモデルを,情報量最大化原理と密接に関連するスパースコーディング仮説に基づいて構築した.このモデルで一次視覚野の単純型細胞と複雑型細胞の選択性を再現した.近年、実験技術の進歩に伴って、多数の神経細胞の活動の同時記録が可能になってきている。海馬や大脳新皮質のスライス培養では同一の発火パターンが繰り返し出現することが明らかになり、また、連続発火細胞数の分布が幕則に従うことも報告されている。これらの結果を説明するために我々はリカレント情報量最大化原理を提唱し、この原理に基づくモデルによってこれらの実験事実が再現できることを示した。特に今年度はこのモデルの中の神経細胞の特性が不均一な場合、どのような挙動が観察されるかを調べた。これによって、神経細胞モデルに不均一性があっても定性的には以前の均一性を仮定したモデルと同様の振る舞いが見られることがわかった。また、パラメタがモデル全体の振る舞いにどのような影響を与えるかを詳細に調べた。さらに、情報量最大化原理からトップダウン式に導いた以上のモデルとは別に、ボトムアップ的に情報量を最大化するモデルを構築することを試みた。以前のトップダウン式のモデルでは神経細胞の学習則は非常に複雑であり、実際の神経細胞について知られているシナプス可塑性と比較することは困難であった。そこで、フィードフォワードネットワークにおいて伝達される情報量を最大化するような学習則をボトムアップ的に構築し、これが実際の神経細胞によって実現されうることを確認した。続いてこのボトムアップ的なモデルに画像を入力として与えた場合に大脳皮質一次視覚野の単純型細胞に類似した選択性を持つ細胞が出現することを確認した。以前の我々のモデルでは一次視覚野の複雑型細胞の選択性の出現は説明ができなかったため、現在この新しいモデルによって複雑型細胞の選択性の自発形成を再現することを試みている。本年度は局所的な学習則を持つモデルを構築し,その挙動を検討した.神経細胞モデルとしては,発火・非発火の二つの状態のみを持ち,発火率が入力にシグモイド関数をかけたもので与えられるものを使った.このような単純なモデルを利用したのは,単純なモデルならば学習則を導くのが容易だからである.この神経細胞モデルに自然界の写真(自然画像)から切り出した小さな画像の輝度の重み付け和を入力として与えた.和の重みがシナプス結合強度に当たり,重みの更新が学習に対応する.入力に対するモデル神経細胞集団の集団発火率およびモデル神経細胞の発火率の長時間平均をできるだけ小さくする学習則(出力細胞の発火をできるだけスパースにする学習則)を導いた.このような発火率をスパースにする学習則は出力の担う情報量を最大化する学習則と密接に関連することが以前から知られている.入力として自然画像を与えて学習させると,出力細胞は画像の中の特定の位置に存在する特定の傾きの線分に応答する選択性を獲得することがわかった.これは大脳皮質一次視覚野の単純型細胞の選択性に類似している.学習モデルのパラメタに対する依存性を調べたところ,線分に対する選択性の獲得は広いパラメタ範囲で生ずることがわかった.さらに学習が終わって単純型細胞に類似した選択性を獲得したモデル神経細胞の出力を再び入力として使って,二段目のモデル神経細胞群に同一の学習則を適用すると,二段目のモデル神経細胞は特定の傾きを持ち,画像の中のある範囲内に存在する線分に対する選択性を獲得することがわかった.二段目の細胞は一段目の細胞とは違って,位置のずれた線分に対しても応答した.これは一次視覚野の複雑型細胞の選択性に類似しており,本モデルによって一次視覚野の細胞の選択性を広く説明できた.
微生物による悪臭公害の防除

悪臭に対する苦情件数は、環境白書によれば、騒音・振動に続いて2番目に多い。それにも拘わらずその対策は他の公害に比べて非常に遅れている。その理由として、悪臭は直接人命に関わるものではないということだけでなく、悪臭公害の対策には大規模な装置や多大の費用を必要とするからである。現在悪臭対策は、物理・化学的手段が主流である。しかし、われわれの研究から微生物による悪臭公害の対策が有効であると認められてきている。悪臭公害を防除するには、発生源を根絶すること、さらには揮散してしまった悪臭成分を速やかに捕集し処理する2つの方法がある。悪臭の苦情件数の約4分の1は畜産業によるものである。我々は、豚ふんなどの悪臭性農水畜産廃棄物に好んで生育し、無臭化・コンポスト化する微生物を見出している。昨年度は、畜産業からの主要な悪臭成分の一つであるn-吉草酸を菌体内に取り込んで分解するRhodococcus sp.261株を分離した。本菌株は、グルコースなどの糖は利用できず、悪臭性のVFAのみを炭素源とした。これをセラミックビーズに固定化しバイオフィルターを作成した。これに約100ppmのn-吉草酸を含む空気を通した。温度、pH、固定化菌数、水分、流量などを調節することにより、数週間にわたり完全にn-吉草酸を除去できた。今年度は、豚ふんなどを無臭化・コンポストする際に高温となるので、耐熱性の芽胞を形成し、しかも硫化水素を分解する無臭化細菌を検索した。百数十株の無臭化細菌を単離した。それをBacillus sp.と同定した。本菌株の硫化水素をpH79、3545°Cでよく分解した。また、生育の培地の最適化を行い、生育につれて、硫化水素分解性も高くなった。無細胞抽出液でも硫化水素の無臭化能が見られた。本菌株をフスマを用いて拡大培養し、1g当たり5×10^6cfu添加して、鶏ふんを処理すると、硫化水素が発生せず除去できた。今後、本硫化水素分解酵素の単離と、バイオフィルターの作成をし、硫化水素の分解様式と応用について研究を進める。悪臭に対する苦情件数は、全体の約4分の1を占め、騒音・振動に続いて2番目に多い。それにもかかわらず、他の公害に比べてその対策が非常に遅れている。臭気は非常に希薄な濃度でも嗅覚に感じ、また多種多様な成分がある。下水や屎尿処理場や畜舎などからの排気は、活性炭やオゾン、あるいは薬剤などで処理をしているが、いずれも大規模な装置や維持費を必要とする。悪臭公害の防除には、発生源を根本的に処理する方法と発生した悪臭成分をそれ以上揮散しないように捕集する2つの方法がある。われわれは、悪臭性の天然有機廃棄物に好んで生育し、廃棄物中の悪臭成分を分解する悪臭化微生物群を見い出している。

本研究では、環境庁指定の悪臭成分である悪臭性揮発性脂肪酸(VFA)を高性能に分解する微生物を種菌中から分離し、固定化し、空気中のVFAの除去を行った。廃棄物の10%抽出寒天培地を用いて、種菌を分離源として144株を純粋分離した。さらに、悪臭性廃棄物抽出平板培地上にシャーレ-面にW字状に塗抹培養した。官能試験法で5人のパネラ-で判定し、122株を悪臭化微生物としてスクリーニングした。この内、VFAを良好に分離して生育する一菌株をRhodococcus sp.261と同定した。本菌株の生育pH及び温度はそれぞれ89及び3540°Cであった。本菌株は生育の炭素源として、悪臭性のVFAを利用し、グルコースなどの糖類を利用出来なかった。試した様々な担体の中から、多孔質のセラミックビーズが最も良かった。悪臭性のVFAを炭素源として液体培養した本菌株の菌体を減圧下でビーズに固定した。そして、アルミ製の容器に入れ、UV照射下で無菌的に2日間固体培養を行った。これをウオータージャケット付きガラス管(φ5cmx50cm)に入れて、下方からn-吉草酸を含む空気を通した。温度、通気量、pH、固定化菌数などを調節することにより数百ppmのn-吉草酸を長時間除去できた。悪臭に対する苦情件数は、環境白書によれば、騒音・振動に続いて2番目に多い。それにも拘わらずその対策は他の公害に比べて非常に遅れている。その理由として、悪臭は直接人命に関わるものではないということだけでなく、悪臭公害の対策には大規模な装置や多大の費用を必要とするからである。現在悪臭対策は、物理・化学的手段が主流である。しかし、われわれの研究から微生物による悪臭公害の対策が有効であると認められてきている。悪臭公害を防除するには、発生源を根絶すること、さらには揮散してしまった悪臭成分を速やかに捕集し、処理する2つの方法がある。また、悪臭の苦情件数の約4分の1は畜産業によるものである。われわれは、豚ふんなどの悪臭性農水畜産廃棄物に好んで生育し、無臭化・コンポスト微生物を見出している。昨年度は、畜産業からの主要な悪臭成分の一つであるn-吉草酸を菌体内に取り込んで分解するRhodococcus sp.261株を分離した。本菌株は、グルコースなどの糖を利用できず、悪臭性のVFAのみを炭素源とした。これをセラミックビーズに固定化し、バイオフィルターを作成した。これに約100ppmのn-吉草酸を含む空気を通した。温度、ph、固定化菌数、水分、流量などを調節することにより、数週間にわたり完全にn-吉草酸を除去できた。今年度は、豚ふんなどを無臭化・コンポストする際に高温となるので、耐熱性の芽胞を形成し、しかも硫化水素を分解する無臭化細菌を検索した。百数十株の無臭化細菌を単離した。そして、それをBacillus sp.と同定した。本菌株の硫化水素をph79、3545°Cでよく分解した。また、生育の培地の最適化を行い、生育につれて、硫化水素分解性も高くなった。無細胞抽出液でも硫化水素の無臭化能が見られた。本菌株をフスマを用いて拡大培養し、1g当たり5×10^6cfu添加して、鶏ふんを処理すると、硫化水素が発生せず除去できた。今後、本硫化水素分解酵素の単離と、バイオフィルターの作成をし、硫化水素の分解様式と応用について研究を進める。
妊婦のむくみを下肢に限局したSBIA法で解明する

女性にとってむくみ(下肢浮腫)は日常的におこるマイナートラブルであり、妊婦においても健康な妊婦でも7080%、妊娠高血圧症候群妊婦では約85%に浮腫が認められるほどである。臨床的には、体重の増加と浮腫の程度を脛骨稜を手指で圧迫して判定している。しかし、その判断、方法は主観に左右され正確に定量化されていない。また、対処法の効果についても検討されているものはほとんどない。本研究目的は、妊婦の下肢浮腫を部位別多周波生体電気インピーダンス法(SBIA法)を下腿に限局して用いて下腿水分の細胞内外比で評価し、その改善法を検討することである。1)合併症のない健康な妊婦の調査を行った。縦断的に調査した研究対象者においても、妊娠高血圧症候群、貧血などの合併を起こした者はいなかった。また、部位別多周波生体電気インピーダンス法(SBIA法)を実施中に気分不良や起立性低血圧を起こした対象者は見られなかった。今回の対象者の中には脛骨稜を手指で圧迫して判定する浮腫の程度では、++の判定になる症例はいなかった。調査の結果、妊婦のむくみ(下肢浮腫)の自覚と部位別多周波生体電気インピーダンス法(SBIA法)から算出した細胞外液量は相関を認めた。以上から、SBIA法における妊婦の個体のむくみの客観的評価は今後有用であると考えられる。2)成人女性への対処法の検討の結果、下肢挙上は、仰臥位に比べ、SBIA法においても、自覚的にもむくみは軽減した。また、足浴において、グレープフルーツオイルの有無で比較検討したところ、むくみの改善はグレープフルーツオイルの有無で統計的に差は認めなかった。しかし、足浴は、自覚的にもSBIA法によってもむくみに効果的であった。以上から、下肢挙上および足浴の効果が客観的にも明らかとなった。女性において、むくみ(下肢浮腫)は日常的に自覚され、妊婦においても、健康な妊婦でも7080%、妊娠高血圧症候群妊婦では約85%に浮腫が認められるほど高頻度なマイナートラブルである。本研究の目的は、妊婦の下腿のむくみ(浮腫)を、部位別多周波生体電気インピーダンス法(SBIA法)を用いた生体水分量の測定によって、明らかにすること、また、下腿のむくみの対処法を検討することである。平成20年度は、妊婦との比較、妊婦への応用のために、健康な成人女性に対して、下肢のむくみをSBIA法で測定し、さらに弾性ストッキングの効果について検討することを目的とした。対象は、2039歳の健康な成人女性8名で、研究参加の承諾が得られた者とした。所属の倫理委員会の承認を得て実施した(承認番号E-86)。データ収集方法は、コントロール日の朝と夕方(約7時間後)と、弾性ストッキング着用第1日目および第7日目の朝と夕方(約7時間後)にそれぞれ、自覚症状と下腿周囲径およびSBIA法を測定した。自覚症状は、VASスケールを用いて、下肢のむくみ感,足全体の重さ・だるさ感,下肢の冷え感,足先の冷え感,下肢の痛み,全身のむくみ・だるさ感等の回答を得た。弾性ストッキング着用後の自由回答からは、弾性ストッキングの使用によって、夕方の下肢のむくみは出にくい、あるいは改善したと回答しており、足全体の重さやだるさ感も改善したとの回答が得られた。詳細については、分析中である。

本研究の目的は、妊婦の下腿のむくみ(浮腫)を、部位別多周波生体電気インピーダンス法(SBIA法)を用いた生体水分量の測定によって、明らかにすることである。平成21年度は、正常妊婦健康な成人女性に対して妊婦健診時に、下肢のむくみをSBIA法を用いて測定しているところである。現在、中期、後期の横断および、同意の得られた妊婦に縦断調査を行っている。女性にとってむくみ(下肢浮腫)は日常的におこるマイナートラブルであり、妊婦においても健康な妊婦でも7080%、妊娠高血圧症候群妊婦では約85%に浮腫が認められるほどである。臨床的には、体重の増加と浮腫の程度を脛骨稜を手指で圧迫して判定している。しかし、その判断、方法は主観に左右され正確に定量化されていない。また、対処法の効果についても検討されているものはほとんどない。本研究目的は、妊婦の下肢浮腫を部位別多周波生体電気インピーダンス法(SBIA法)を下腿に限局して用いて下腿水分の細胞内外比で評価し、その改善法を検討することである。本年度は、前年度にひきつづき、合併症のない健康な妊婦の調査を行った。縦断的に調査した研究対象者においても、妊娠高血圧症候群、貧血などの合併を起こした者はいなかった。また、部位別多周波生体電気インピーダンス法(SBIA法)を実施中に気分不良や起立性低血圧を起こした対象者は見られなかった。今回の対象者の中には脛骨稜を手指で圧迫して判定する浮腫の程度では、++の判定になる症例はいなかった。調査の結果、妊婦のむくみ(下肢浮腫)の自覚と部位別多周波生体電気インピーダンス法(SBIA法)から算出した細胞外液量は相関を認めた。以上から、SBIA法における妊婦のむくみの評価は今後有用であると考えられる。
脳機能画像を用いた顔面神経麻痺の中枢制御機構の解明と新規リハビリテーション開発

顔面神経麻痺(Facial Palsy:FP)は自然治癒があるが、高度麻痺が生じた場合、麻痺の残存や病的共同運動が生じやすい。麻痺直後の保存的治療、減荷術などの手術治療の有効性が報告されているが、リハビリテーションも病的共同運動が生じないようにするために重要である。しかし、FP時の顔面運動の中枢制御機構やリハビリテーションによる脳活動の変化については報告が少なく、FPリハビリテーションは経験則により実施されているのが現状である。また、高度麻痺が残存する場合には、舌下神経-顔面神経吻合術がFPの動的再建手術として行われ、顔面表情筋が顔面神経と舌下神経の二重支配を受けることが動物実験で証明されている。動的再建術では、リハビリテーションが機能回復に重要であるが、リハビリテーションの効果を脳活動から裏付ける研究は未だ無い。本研究では、機能的核磁気共鳴画像(functional MRI:fMRI)を用いて、FP症例の脳活動を検討することによって、顔面運動の中枢制御機構とリハビリテーションの治療効果を脳機能面から明らかにし、より有効なリハビリテーション法を新規開発することを目的とする。左急性FP15例と健常人15例の解析では、非麻痺側(右)の大脳感覚運動野に強い賦活が認められたが、その一方で、麻痺側(左)の一次運動野および非麻痺側(右)の小脳では賦活が減少していた。このことから、末梢性顔面神経麻痺の急性期においては、麻痺側と反対の大脳運動皮質に対しては興奮性制御が生じ、麻痺側の大脳運動皮質および麻痺側と反対の小脳に対しては抑制性制御が生じている可能性があることが示唆される。右FP症例が当初の予定よりも十分集まっていない。対象症例については、積極的にリクルートを行っていく。本年度中に、急性期FP群の解析(実験2)を終了し、引き続き陳旧性FP群にける解析(実験3)につなげる。顔面神経麻痺(Facial Palsy:FP)は自然治癒傾向があるが、高度麻痺が生じた場合、麻痺の残存や病的共同運動が生じやすい。動的再建術後では、リハビリテーションが機能回復に重要であるが、リハビリテーションの効果を脳活動から裏付ける研究は未だ無い。健常人でのfMRI撮像は既に終了しており、本年度は、主に急性期FP例を対象に解析を行った。左急性FP15例と健常人15例を対象とした解析では、非麻痺側(右)の大脳感覚運動野に強い賦活が認められたが、その一方で、麻痺側(左)の一次運動野および非麻痺側(右)の小脳では賦活が減少していた。このことから、末梢性顔面神経麻痺の急性期においては、麻痺側と反対の大脳運動皮質に対しては興奮性制御が生じ、麻痺側の大脳運動皮質および麻痺側と反対の小脳に対しては抑制性制御が生じている可能性があることが示唆された。研究開始後より得られた右急性FP例は現在8例であり、研究計画当初の予定数にわずかに達していないものの、本研究開始と同時に陳旧性FP例も対象が得られ次第、fMRIの撮像および解析を進めているため全体としては、研究は概ね順調に進展しており何ら問題はないものと考える。

右FP症例が当初の予定よりも十分集まっていない。対象症例については、積極的にリクルートを行っていく。平成30年度中に、急性期FP群の解析(実験2)を終了し、引き続き陳旧性FP群における解析(実験3)を行っていく。本年度中に、急性期FP群の解析(実験2)を終了し、引き続き陳旧性FP群にける解析(実験3)につなげる。平成29年度においては、概ね計画通りに研究を遂行することが出来たが、人件費やその他の必要経費が少なく済んだため、結果的には僅かに次年度使用額が生じた。その残余金に関しては、本年度、新たに解析に使用するためのパーソナルコンピューターや解析ソフトの購入費に充てる予定である。参加出来なかった関連学会があり、結果として次年度使用額が生じた。本年度はこれまで以上に学会に参加し最新の知見も取り入れつつ研究成果も報告するよう計画していく。また、データ保存や解析に使用するためのデバイス購入も必要なため、残預金についてはそれらの購入費に充てる予定である。
歯性感染症が血中脂質濃度に及ぼす影響とそのメカニズムの解明

本研究では歯周病巣局所の炎症病変あるいは歯周病原性細菌の存在が、全身状態に及ぽす影響を検討するため、ラットに実験的歯周炎を作成し、さらに歯周ポケット内にP.gingivalisを接種して、血中脂質濃度、血糖値および炎症性因子に及ぼす影響を検討した。実験動物として8週齢のWistar系雌ラット29匹を用い、Pg感染群(下顎第一臼歯にゴム輪を装着して実験的歯周炎を作成後、歯周ポケット内にPg接種)、Pg非感染群(実験的歯周炎のみ)、未処置群の3群に分け各測定項目を比較検討した。得られた結果は以下のとおりである。1.Pg感染群においてPg特異IgG抗体価が有意に上昇した。2.歯槽骨吸収程度はPg感染群と非感染群の間で有意差は認められなかったが、両群ともに未処置群よりも有意に大きかった。すなわち本実験系での歯槽骨吸収は実験的歯周炎の影響が大きく、Pg感染による差は認められなかった。3.血糖値はPg感染群が非感染群および未処置群よりも有意に上昇したが、中性脂肪濃度は3群間で有意差が認められなかった。4.末梢血中のTNF-α濃度はすべての群で検出限界以下であった。CRPレベルには有意差が認められなかった。本研究ではPg感染群において血糖値が有意に上昇したが、その過程に関与すると推測したTNP-αの上昇は認められず、またCRPの有意差も認められなかった。ただし末梢血中では濃度が希釈され有意差が検出されにくい可能性も考えられるため、今後は歯周組織局所や、血液中の細菌やLPSを処理している肝組織沖の濃度を検討し、血糖値上昇のメカニズムを検討する必要があると思われる。歯周病患者は健常者に比べ、中性脂肪やコレステロールなどの血中脂質濃度が有意に高いと報告されている。しかし高脂血症が歯周病により惹起されたのか、あるいは高脂血症が歯周病の罹患リスクを上げているのかはまだ明らかでない。そこで本研究では、ラットに実験的歯周炎を作成し、歯周ポケット内にPorphyromonas gingivalis(以下P. gingivalisと略す)を接種した群(実験群)と非接種群(対照群)の2群に分け、歯周病原菌の存在が血中脂質濃度などの全身的なパラメーターに及ぼす影響を検討した。実験には8週齢のWistar系雄性ラット24匹の下顎第1臼歯(以下、M1と略す)を用いた。M1の歯頚部にゴム輪を装着して歯肉溝内に軽く圧入し、1週間後にP. gingivalis付着絹糸を結紮する実験群(12匹)と、無菌絹糸を結紮する対照群(12匹)の2群に分けた。絹糸を挿入した4週間後に心臓から全血を採取し、白血球数、血小板数、P. gingivalis特異IgG抗体価、脂質濃度(中性脂肪・コレステロール)および血糖値を測定した。また屠殺後に下顎骨を取り出し、実体顕微鏡下でC-E junctionから歯槽骨頂までの距離を測定した。現在までに得られた結果は以下のとおりである。1.実験群においてP. gingivalis特異IgG抗体価が有意に上昇した。2.歯槽骨吸収量は、実験群および対照群の間で有意差がみられなかった。3.実験群において、血中中性脂肪レベルが有意に上昇した。以上の結果から、歯周病巣へのP. gingivalis感染が直接的に中性脂肪濃度を上昇させることが示唆された。

そこで本研究では、口腔内局所の感染症である歯周病が、血中脂質濃度などの全身的なパラメーターにどのような影響を及ぼすのか、動物実験で検討している。実験には8週齢のWistar系ラット(オス・メス)の下顎第1臼歯(以下、M1と略す)を用いた。M1の歯頚部にゴム輪を装着して実験的歯周炎を作成する実験群と、未処置の対照群に分けた。実験群ではさらにゴム輪を装着した1週後に、歯周ポケット内にPorphyromonas gingivalis(以下P.gingivalisと略す)付着絹糸を結紮する感染群と、無菌絹糸を結紮する非感染群の2群に分け、歯周病原細菌の影響も検討した。ゴム輪挿入時から絹糸結紮4週後まで経時的に採血して、P.gingivalis特異IgG抗体価、中性脂肪濃度および血糖値を測定し、オス・メスそれぞれにおいて、3群間で比較検討した。現在までに得られた結果は以下のとおりである。1.感染群においてP.gingivalis特異IgG抗体価が有意に上昇した。2.オスでは中性脂肪濃度、血糖値ともに3群間で有意差が認められなかった。3.メスでは、対照群に比べ非感染群で中性脂肪濃度が有意に上昇したが、感染群では有意な上昇は認められなかった。一方、血糖値は感染群において非感染群および対照群よりも有意に上昇した。以上の結果から、歯周病の存在、さらに歯周病巣へのP.gingivalis感染が、中性脂肪濃度や血糖値に影響を及ぼし、その程度には性差がある可能性が示唆された。今後は例数を増やし、さらに検討を加えていく予定である。本研府では歯周病巣局所の炎症病変あるいは歯周病原性細菌の存在が、全身状態に及ぼす影響を検討するため、ラットに実験的歯周炎を作成し、さらに歯周ポケット内にP.gingivalisを接種して、血中脂質濃度、血糖値および炎症性因子に及ぼす影響を検討した。実験動物として8週齢のWistar系雌ラット29匹を用い、Pg感染群(下顎第-臼歯にゴム輪を装着して実験的歯周炎を作成後、歯周ポケット内にPg接種)、Pg非感染群(実験的歯周炎作成のみ)、未処置群の3群に分け各測定項目を比較検討した。得られた結果は以下のとおりである。1.Pg感染群においてPg特異IgG抗体価が有意に上昇した。2.歯槽骨吸収程度はPg感染群と非感染群の間で有意差は認められなかったが、両群ともに未処置群よりも有意に大きかった。すなわち本実験系での歯槽骨吸収は実験的歯周炎の影響が大きく、Pg感染による差は認められなかった。3.血糖値はPg感染群が非感染群および未処置群よりも有意に上昇したが、中性脂肪濃度は3群間で有意差が認められなかった。4.末梢血中のTNF-α濃度はすべての群で検出限界以下であった。CRPレベルには有意差が認められなかった。本研究ではPg感染群において血糖値が有意に上昇したが、その過程に関与すると推測したTNF-αの上昇は認められず、またCRPの有意差も認められなかった。ただし末梢血中では濃度が希釈され有意差が検出されにくい可能性も考えられるため、今後は歯周組織局所や血液中の細菌やLPSを処理している肝組織中の濃度を検討し、血糖値上昇のメカニズムを検討する必要があると思われる。
多機能バナジウム分子触媒の設計・創製

本課題は従来触媒で達成できないオレフィンの精密重合を可能とする高性能バナジウム錯体触媒の設計・合成に関する。特に今迄の成果を基盤に、イミド配位子及びアニオン性配位子を有するバナジウム5価錯体に注目し、オレフィンの配位重合やメタセシス反応に有効な高性能分子触媒の創製を目的としている。特に触媒活性種のアルキルカチオンやアルキリデン錯体の合成・同定・構造決定や関連する有機金属錯体の合成や反応性に関する基礎的知見の確立を通じて、より高性能触媒を創製しようと考えている。平成21年度の主な成果は以下の通りである。アリールイミド配位バナジウムートリアルキル錯体と1当量のフェノールとの反応は室温でも速やかに進行するが、さらに1当量のフェノールとの反応は室温では反応せず、加熱かつ長時間を要した。得られたモノフェノキシ及びビスフェノキシ錯体に別のフェノールを添加すると、アルキルとの反応ではなくフェノキシ配位子の交換反応が室温でも速やかに進行した。この事実は、この置換反応が(フェノールが配位した)5配位中間体を経由することを強く示唆し、我々が報告したアルキル錯体とアルコールとの反応との結果とよく一致した。なお、得られたモノアルキル錯体はホウ素化合物との反応でカチオン錯体を形成し、(バナジウムで初めて)環状エーテルのリビング開環重合触媒としての機能を発揮した(論文投稿準備中)。アダマンチルイミド配位子及びキレートピリジルアニリド配位子を有するバナジウムジクロロ錯体は、メチルアルミノキサン助触媒の存在下、極めて高い触媒活性かつ選択性でエチレンの二量化が進行した。フェニルイミド配位子やシクロヘキシルイミド配位子を有する錯体でも二量化が優先的に進行することから、活性や選択性へのイミド配位子の効果が顕著に現れた。本課題は従来のオレフィンの配位重合触媒やメタセシス触媒で達成できない、高機能有機材料の創製を可能とする高性能分子触媒の創出を主目的とする。特に期間内は5価のバナジウム錯体に注目し、オレフィンの配位・挿入やメタセシス反応の鍵中間体である金属-アルキル、アルキリデン錯体の合成・反応性に関する研究を通じ、高性能触媒の設計・創製を目的とする。平成20年度の成果は以下の通りである。アリールイミド配位子を有するバナジウム-トリアルキル錯体を合成・同定し、各種アルコールやフェノールとの反応により、対応するジアルキル錯体の合成・同定手法を確立した。既に合成・同定したアリールイミド配位子及びケチミド配位子を有するバナジウム-アルキリデン錯体を用いて、各種不飽和化合物との反応を検討した。この錯体はニトリルとの反応で、いったんメタラサイクルを形成した後に開環したイミド錯体を与えた。なお生成錯体の選択性は使用するニトリルの立体効果により支配された。また、ジフェニルアセチレンとの反応ではメタラシクロブテン錯体を与え、スチレンとの反応ではアルキリデン間での反応によりいったん3価錯体が形成した後、スチレンの付加によりメタラシクロプロパン錯体を与えることを明らかにした。アダマンチルイミド配位子、及び非対称型のモノアニオン性キレート配位子であるアルコキソ(イミノ)ピリジン配位子を有するバナジウムジジアルキル錯体とアルコールとの反応を詳細に検討し、いったんピリジンとイミンの解離を伴ってアルコールの酸素が配位した錯体を生成・経由して、最終的にアルコキソ錯体を与えることを明らかにした。
インターネット環境における防災システムツールの開発

本年度の研究成果は、(1)昨年度2月に「第3回『災害とネットワーク』ミーティング」を科学研究費の補助で実施した際の研究発表の整理(報告書作成)、(2)以前に開発を行った「防災避難所データベース」から「XMLを利用した異種間防災データベースの構築」への移行およびシステム設計に関する考察、である。以下に概略を述べる。(1)平成12年2月22日に福井工業大学で上記のミーティングを行った。参加者は20名ほどで、議題として、インターネット(WWW)による情報発信の課題、小型携帯情報端末用にカスタマイズされた災害情報ページ構築の提案、インターネット環境における防災システムツールの開発、など主に防災とインターネット技術の接点について熱い議論を行った。そのときの研究発表・議論を報告書という形で整理した。(2)上記のミーティングから生まれた考察である。本研究を通じて、災害時に必要な情報、または災害以前から準備できるシステム作りとして、ちょっとした便利な情報ツールの開発というより、災害時にでも利用できるデータベース技術の開発が急務であることを結論づけた。そのためにインターネットでも利用できて、柔軟性のある技術としてXMLとデータベースとを利用したシステムがこれからの防災情報システムとして注目されていくであろう。またこの技術は今まで不可能であった異種間・異機関のデータベースを一元化・共有化できるということで社会的情報基盤として位置付けられるシステムとなるであろう。本年度はこのシステムの可能性・設計方法について考察を行った。本研究は、防災という社会的問題とIT技術との融合を目的に行った研究であり、また萌芽的要素も多くあったためにいろいろと紆余曲折があり、2年間で本研究を完成することは出来なかった。しかしこの間多くの成果があったので、システム完成後は早い時期に成果の発表・公開を行う予定である。今年度は主に以下の二つの研究を重点的に行なった。WWWによる福井市避難所ホームページの完成11年度科研費の計画であったインターネットサービスであるWWWを用いた福井市避難所データベースを完成させ実験的に公開を行なった。前年度までに行なっていた福井市避難所データベースを拡張させて緊急機関の病院や派出所などのデータも追加し作成した。またWWWの特性である汎用性および災害時の冗長性を考慮し普段から利用できる形式(避難所の検索だけでなく、学校や病院などからの平常時検索を可能にした)に書き換えた。そして筆者の異動に伴って公開を終了し、来年度は本実験についての評価を行なう予定である。小型携帯端末を用いた災害情報システムの構築インターネットを用いたシステムツールとして分析および開発の準備を行なった。最近いくつかの機関で小型携帯端末を用いた被災者安否情報システムの研究されてきているが、まだパソコンの補助的な利用しかされていない。しかしインターネットと携帯電話の普及は目覚しいものがあり、この二つのシステムを融合したシステムを災害システムに利用することは平常時から慣れているのでとても期待できる。そこで来年度は小型携帯端未特有の災害情報システムを構築することを目標にシステムの開発を行なう。まずはコンテンツとしてWMLなどのXMLベースの言語を利用したデータベースの構造化の可能性を考慮する。つぎに小型携帯端末に現在では小型化が実現していないシステムを付加したときの災害システム利用の実験を行なう。以下に概略を述べる。
腫瘍特異的なオートファジー関連遺伝子に着目した肺癌治療抵抗性機構の解明

肺癌は治療抵抗性の悪性腫瘍であるが、分子標的薬の台頭により、大きく治療戦略が変遷してきている。しかしながら、ほぼ全例で薬剤耐性を獲得し、その克服法の開発が待たれている。悪性腫瘍の薬剤治療耐性獲得の一因として、細胞の恒常性を司るオートファジーの関連が示唆されている。本研究では分子標的である、EGFR-TKIに対する耐性を獲得した非小細胞肺癌の細胞株における、オートファジーの活性化とその阻害効果を検討した。EGFR-TKIの薬剤耐性を獲得した細胞株ではオートファジーの活性化指標であるLC3の発現が亢進していた。また、一部の細胞株では代表的なオートファジー阻害薬である、クロロキンに対する感受性が高いことも判明した。申請者が異動したため、研究の継続は不可能となったが、これまでの研究実績を学会で発表する予定である。
αクリスタリン低分子量分子シャペロンに関する研究

(1)細胞内封入体形成とHsp27およびαBクリスタリンに関する研究プロテアゾーム阻害剤やプロスタグランヂンJ2に細胞を曝露したり、変異蛋白質を発現させると、熱ショック転写因子(HSF)の活性化を伴って、細胞内でユビキチン化蛋白質とHsp27およびαBクリスタリン、とくにリン酸化型、を含む不溶性蛋白質複合体の形成が促進され、細胞内封入体が現れ、細胞死につながる。しかし、同時に蛋白質合成阻害剤(シクロヘキシミド、アニソマイシン)を共存させるとこれらの現象は阻止された。HSF1遺伝子を破壊した細胞では、wild typeの細胞に比べ、上記の応答が少ないことから、細胞内不溶性蛋白質複合体、封入体の形成過程にはHSFが関与していることが分かった。しかし、両シャペロンのリン酸化は封入体形成には無関係であることが分かった。(2)ラットを後肢懸垂して誘導した廃用萎縮ヒラメ筋中でも、不溶性分画にリン酸化されたHsp27およびαBクリスタリンが蓄積することを見つけた。この応答は、同側の坐骨神経を切断すると現れないことから、神経支配を受けていることが分かった。(3)αBクリスタリンおよびHsp27のリン酸化と重合状態に関する研究αBクリスタリンのリン酸化部位(セリン残基)をアスパラギン酸に置換した変異蛋白質およびそれを発現させた細胞を用い、αBクリスタリンもHsp27と同様にリン酸化を受けると重合状態が変わり、シャペロンとしての活性が低下するこどを明らかにした。また、細胞中のHSP27が各種のストレスにより、解離するのはリン酸化によることを、各種のリン酸化阻害剤を用いて証明した。(4)αBクリスタリンの生理的・病理的リン酸化に関する研究分裂期の細胞の細胞質に、セリン45がリン酸化されたαBクリスタリンが普遍的に観察されるのに対し、セリン59がリン酸化されたαBクリスタリンは中心体、中央体で検出されることを明らかにした。また、アレキサンダー病、アルツハイマー病脳では、セリン59のリン酸化型が多く検出されることを見つけた。(5)種々の生理活性物質によるHsp27の誘導とその機構を明らかにした。(6)血管平滑筋中のp20が血管内に遊離して、血小板に作用してその機能を調節していることを示唆する結果を発表した。また、αBクリスタリンも類似の作用があることを見つけた。平成12年度の研究成果を以下に列挙する1)αBクリスタリンもHsp27と同様にリン酸化を受けると重合状態に変化が起こり、解離する傾向があることを明らかにした。また、リン酸化され解離状態のαBクリスタリンは分子シャペロンとしての活性が低下することを、リン酸化部位のセリン残基をアスパラギン酸に置換した変異蛋白質を発現させた細胞レベル、および変異蛋白質を大腸菌で作製し、in vitroで証明した。

2)細胞中のHsp27は各種ストレスに応答して、重合型がリン酸化され、解離することを我々は見いだし報告しているが、今回このストレスによる解離が、各種の蛋白質リン酸化酵素阻害剤で抑制されることを明らかにした。すなわち、ホルボールエステル(PMA)以外の薬剤(亜砒酸ナトリウム、塩化カドミウム。過酸化水素、や高張ストレス)によるHsp27の解離は、p38MAPAKの阻害剤で完全にそしされた。一方、PMAによる解離は、Protein kinase C(PKC)の阻害剤で阻止された。これらはHsp27のセリン残基のリン酸化酵素として、p38MAPKの下流のMAPKAPK-2/3とPKCのδ型が関与しているとする報告を裏付ける結果であたった。3)尾部懸垂により誘発させたラットヒラメ筋では、αBクリスタリンのSer-59のリン酸化が特異的に高進していて、特に筋肉ホモジェネートの不溶性分画で顕著であることを明らかにした。すなわち、αBクリスタリン、とくにそのリン酸化型が筋細胞内の蛋白質品質管理に関与していることが示唆された。4)U373MGヒトグリオーマ細胞の培養液にプロテアゾーム阻害剤を添加して培養を継続すると、数時間内にαBクリスタリンが不溶性分画に増量しはじめ、Ser-59のリン酸化型が著しく増加すること、細胞をSer-59のリン酸化を認識する抗体で蛍光染色すると、核周辺に濃縮されたいわゆるaggresomeが形成されていることを見つけた。この結果もαBクリスタリンが細胞内の蛋白質の品質管理に関与していることを示唆している。5)Hsp27がバゾプレッシン、エンドセリン1によって誘導される際に、p38MAPキナーゼカスケードが関与していることを明らかにした。(1)細胞にプロテアゾーム阻害剤MG-132を作用させるとdBクリスタリンのみならずHsp27も合成の誘導と分子内セリン残基のリン酸化が高進することが分かり、その詳細を検討するためHsp27の三カ所のセリン残基(Ser-15,Ser-78,Ser-82)のリン酸化を認識する特異抗体を作製した。(2)MG-132によってHsp27の三カ所のセリン残基のリン酸化が促進された。これらのリン酸化は、p38 MAPKの阻害剤であるSB203580およびPD169316を共存させると、αBクリスタリンのSer-59のリン酸化とともに、強力に阻止された。しかし、PKCの阻害剤およびMEKの阻害剤では影響を受けなかった。(3)リン酸化を阻止しても、MG-32による両シャペロンの合成の促進と不溶性分画への蓄積は影響を受けず、細胞内封入体であるアグリゾームの形成も影響を受けなかった。(4)HeLa細胞にMG-132を作用させると、Hsp27を含むアグリゾームの形成が認められた。(5)NG108-15細胞にcystic fibrosis病因遺伝子をtransfectし、異常蛋白質を発現させると、αBクリスタリンを含むアグリゾームの形成が認められた。以上の結果より、αBクリスタリンとHsp27は細胞内蛋白質の品質管理に関与していることが示唆されたが、それぞれの分子内セリン残基のリン酸化の役割については不明である。(7)後肢懸垂により誘導したラットヒラメ筋中のαBクリスタリンとHsp27の応答は、培養細胞でプロテアゾーム阻害剤で引き起こされる応答と類似していた。後肢懸垂中に片側の坐骨神経を切断すると、切断側のヒラメ筋中での両シャペロンの応答が消失することから、これらの応答は神経支配を受けていることが推測された。(1)ロテアソーム阻害剤(MG-132)に対するHsp27とαB