hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生体適合構造を有する新規生分解性Mg合金プレートの開発－頭蓋顎顔面領域への展開－

昨年度施行した豚を用いた埋植実験で得られたデータを分析した。豚の顔面骨(下顎と眼窩下縁部)に骨折をおこしMg合金プレートで固定し、埋植後1週間と4週間で屠殺し検体を採取した。血液検査では、Mg合金群とコントロール群(チタンプレート固定群)を比較し異常は認められなかった。主要臓器の組織標本でも特に異常な初見は認められなかった。Mg合金プレートで固定を行った埋植部位のコンピューター断層撮影と組織標本検査では、埋植後1週間ではチタン同様骨固定されており、術後4週間ではチタンプレート同様の骨折治癒、骨形成が認められていた。組織学的に検討した結果でも、Mg合金固定群で骨折部は新生骨の細胞が認められ、偽関節になるような所見は認められなかった。一方でMg合金プレート固定群では、金属が分解する過程で生じたと思われるガス発生がみられ、それにより埋物周囲の骨吸収像が見られた。今後、臨床での応用に向けてマグネシウムの分解過程で発生するガスを抑える、もしくはそれらを拡散するような仕組みが必要だと考えられた。またミニブタの顔面骨にMg合金プレートを埋植した長期生体安全試験では、埋植後1年、1年半で屠殺を行い血液生化学検査、各主要臓器の組織検査を行った。血液検査状、異常所見はなく。組織検査でも異常組織反応はなく、マグネシウム合金の長期埋植における安全性が示唆された。昨年度に得られた研究結果を分析し、今後のプレート開発を検討する。ガス発生の機序を解析し、ガス発生を抑制する方法とガスが発生しても拡散できるような構造を検討する予定である。マグネシウム合金を臨床応用する上で問題となるガスの発生について対策を検討する。具体的には埋植プレートやスクリューの形状の改変を行う。分解過程で生じる水素ガスがプレート、スクリューと骨の間に溜まることで骨吸収像が見られたことから、プレートにガス排泄溝を作る、また中空のスクリューを作るなどの検討を行っており、新しい材料で埋植試験を行いこれらの問題が解決するか検討する。今回開発したマグネシウム合金を用いて顔面骨用のプレート、スクリューを作成した。開発されたマグネシウム合金プレートは、既存の吸収性プレートと比べ引っ張り強度、延性に優れたていることが確認された。実際の臨床の現場での使用を想定し、豚を用いた短期骨折治癒実験、長期生体安全性実験の二つを行った。豚の眼窩下縁と下顎骨に人為的に骨折を起こしプレートで固定する短期骨折治癒試験を行った。眼窩下縁は骨欠損を作成しプレートを橋渡し固定、下顎骨は下顎角部を骨切りし、その骨片をプレートで固定した。対照群として、反対側は同様の操作を行いチタンプレートを用いて固定を行なった。埋植後4週の時点で屠殺を行い、同部位のレントゲン検査および組織学的な検討を行った。その結果、マグネシウム合金で固定した眼窩下縁では、対象群のチタンプレート同様の骨治癒が得られることが確認できた。また下顎各部では、対照群のチタンプレート固定と同様の骨癒合が得られたことが確認できた。また長期生体安全性実験では、豚の顔面骨、頭蓋骨に複数枚のプレートを埋植し、有害事象がないかを確認した。1年半の長期経過を観察し、各種臓器の採取、血液、尿を採取し、微量金属分析、組織学的な検討を行う予定である。以上の実験を通して開発したマグネシウム合金プレートでは、既存のチタンプレート同様の成形ができることを確認した。またスクリューにおいては、下穴を開けるだけでネジが挿入できるセルフドリリング機能があることが確認できた。予定通りに実験、解析を行うことが出来た。平成29年度の結果をもとに平成30年度に予定していた実験・解析を進めて行く予定である。顎顔面骨固定材として適した形状を選定し、最後に生体安全性について評価する。ブタの頭蓋顎顔面に、臨床で想定される最大量を算出し埋入する。

経時的に血液・尿検査を行い状、異常行動、食欲の低下などがないか検査する。24週間経過後にブタを屠殺し、マイクロCTを用いて合金残量と骨形成量の計測を行う。組織標本を用いて各主要臓器とインプラント周囲の病理組織学的分析を行う。合金周囲の骨芽細胞の分化と形態、骨芽細胞と破骨細胞の数と局在を免疫組織学的に検討する。血液、尿を採取して血液生化学検査および骨代謝マーカーの計測を行う。マグネシウム合金を臨床応用する上で問題となるガスの発生について対策を検討する。具体的には埋植プレートやスクリューの形状の改変を行う。分解過程で生じる水素ガスがプレート、スクリューと骨の間に溜まることで骨吸収像が見られたことから、プレートにガス排泄溝を作る、また中空のスクリューを作るなどの検討を行っており、新しい材料で埋植試験を行いこれらの問題が解決するか検討する。次年度使用額には、今年度の研究を効率的に推進したことに伴い発生した金額であり、平成30年度請求額と合わせ、平成30年度の研究遂行に使用する予定である。
内胸動脈,胃大網動脈グラフトの流量特性および薬剤反応性に関する研究

大動脈--冠状動脈バイパス手術時のグラフト材料として、動脈硬化に対する抵抗性、遠隔期での高い開存率から、内胸動脈(ITA)及び胃大網動脈(GEA)が、臨床応用されている。しかし、これらの動脈グラフトの血液供給能、運動負荷時の血流量変化に関しては、殆んど研究されていないのが現状である。本研究では、これらを解明し、動脈グラフトの適応拡大の論拠とすることを目的とした。GEA特性の検討では、成犬22頭のGEAを剥離し、末梢端を開放したfree flowとして血流量を、更に、上行大動脈血流量(AoF)、腹腔動脈血流量(CAF)を測定した。その結果、各種薬剤負荷によりGEA血流量は増加を示したが、ノルエピネフリン追加投与時には、CAFの減少とGEA血流量の増加を示し、GEA末梢端開放に起因した血管抵抗差から、血流再分配が生じ、GEA血流量の著明な減少は示さなかった。ITA特性では、ITAの末梢を切離しない状態(in situ)時、free flow時の薬剤反応性を検討した。その結果、in situ状態では、ITA末梢側の血管収縮に伴う血管抵抗増加のためか、薬剤負荷の影響が明らかに出現した。一方、free flow測定では、血管径の変化が出現しにくいためか、血流量は不変であった。体外循環下の実験では、GEA及びITAグラフト長の種・個体差のため、さらに、手技的な困難さ、体外循環および術後管理の問題から、結果的に、グラフト血流量の十分な測定には至らなかった。以上の動物実験から、今回、後負荷を無視した最大流出量を中心に検討したが、GEAは、胃を灌流していた時と同様の血流特性を示し、ITAは、末梢端の開放により、本来とは異なる特性を示した。今後は、グラフト血流量を規定する一因子としての冠状動脈の薬剤反応性、冠血管抵抗、心筋酸素需要とグラフト材料との相互関係を解明することが肝要と考える。大動脈ー冠状動脈バイパス手術のグラフト材料として,内胸動脈や胃大網動脈が使用されている。これらの動脈グラフトは,動脈硬化に対する抵抗性が高く,遠隔期でも高い開存率が報告されている。しかし,その血液供給能や薬物反応性,また運動時の血流量変化などの特性に関しては殆ど研究されていない。これらの点を明らかにするために,平成4年度においては,イヌを用いた動物実験で主に胃大網動脈グラフトの流量特性,および薬剤負荷に対する反応を検討した。実験方法として,雑種成犬の右胃大網動脈を剥離し,末梢端を開放して分時血流量を求め,同時に上行大動脈血流量,腹腔動脈血流量を測定した。薬剤負荷としてノルエピネフリンを0.2μg/kg1分から1.0μg/kg1分まで漸増負荷し各血流量の変動を測定した。さらにクロールプロマジン,ワゴスチグミン,ガストリンを先行投写し,ノルエピネフリンを同様に追加投与した3群について検討し以下の結果を得た。1.ノルエピネフリン負荷により,濃度依存性に胃大網動脈流量の増加,腹腔動脈分枝間での血流再分配の存在が推測された。2.各種薬剤負荷により,胃大網動脈血流量は増加したが,ノルエピネフリン追加投与にても明らかな減少は認めなかった。3.ガストリン投与により胃大網動脈流量が増加することから,臨床例では食後に移植グラフトの血流量が増加すると推測された。4.胃大網動脈

グラフトは胃を灌流する血管と同様に,ホルモン,神経の影響を強く受けるグラフトであることが示唆された。本年度は、内胸動脈グラフトの特性、及び体外循環実験を中心に行った。1.内胸動脈グラフト特性では、1015kgの成犬6頭を用い、胸骨正中切開にて左側内胸動脈(ITA)を剥離した。測定は、ITAの末梢を切離しない状態(in situ)時、次に末梢側を切離した状態(free flow)時に行い、ドパミン(DOP)及びノルエピネフリン(Norepi)負荷下のITA血流量を検討した。その結果、in site状態時、DOP 5γ負荷で、心拍出量に対するITA血流量比(ITAF/AoF)は、前値15.1±9.3%から10.6±6.8%へ、また10γ負荷で4.42±2.91%へと有意(p<0.05)に減少した。しかし、DOP負荷を中止すると、14.4±3.59%へと、ほぼ前値に回復した。また、Norepi0.5γ負荷で、ITAF/AoFは前値14.3±6.01%から7.88±6.56%へ、1.0γ負荷で5.04±3.78%と有意(p<0.05)に減少し、負荷を止めると12.9±5.61%へと回復した。一方、free flow状態時には、前値22.5±7.00%が、Norepi負荷にても、ほぼ不変であった。この実験から、成犬のITAの内径は約34mmと比較的太く、血流量も心拍出量の約2025%と豊富であった。このような血管でのfree flow測定では、血管収縮作用のある薬剤を投与しても、血管径の変化が出現しにくいためか、血流量は不変であったものと考えられた。一方、in situ状態では、ITA末梢側の血管収縮に伴う血管抵抗増加のためか、薬剤負荷の影響が明らかに出現したものと推測された。以上のことから、冠血行再建に使用した際には、ITA本来の末梢血管特性は変化し、冠血管抵抗、心筋酸素需要に大きく依存している可能性が示唆された。2.体外循環下実験では、GEA及びITAを剥離して、実際に成犬の前下行枝へ吻合した。その結果、GEA及びITAグラフト長の種・個体差のため、さらに、手技的な困難さ、体外循環および術後管理の問題から、グラフト血流量の十分な測定には至らなかった。
水生生物に由来する生物活性物質の機能発現構造

我々はこの10年来海洋生物由来の生物活性物質に興味を抱き,それらの合成と生物活性の検討を行って来た。本研究はその発展として海洋だけではなく淡水産生物由来の生物活性物質にまで範囲を広げ,それらの効率的合成をはかると同時に,合成品やその類縁体の生物活性試験を通じて,これら生物活性物質の作用発現構造を特定化することを目的としている。具体的天然物としては海綿由来のスロンビン阻害活性を有するサイクロセオナマイドB,海洋細菌由来の強力鉄キレーターアルテロバクチンA,そして淡水産ラン藻由来のトリプシン阻害剤ラディオスミンにつき合成研究を行い,これらの全合成に成功した。そしてサイクロセオナマイドBについてはスロンビン阻害活性の発現操作を立証することができた。アルテロバクチンA,ラディオスミンについては,現在機能発現構造を特定化しているところである。
果実軟化機構の分子構造基盤研究：トマト果実をモデルとして

本研究課題は,トマト果実をモデルとして果実の発育・成熟過程における細胞壁分解酵素の一つであり,トマト果実の軟化に重要な役割を果たしていると考えられるβ-ガラクトシダーゼについて,酵素特性や基質認識機構を明らかにすることを目的とした.トマトβ-ガラクトシダーゼ(TBG)4は果実軟化に重要な役割を果たしているため,酵母による発現系を構築し,X線結晶構造解析を行った.その結果,植物では初めてβ-ガラクトシダーゼの構造を明らかにすることができた.また,TBG1の酵素特性も明らかにし,TBG4とは異なる基質特異性を持つことを明らかにした.平成24年度は,TBGファミリーについて発現系を順次構築し,組換え酵素タンパク質の産生,酵素特性・基質特異性の検討,および結晶化,構造解析を行うことを目的とした.平成23年度に遅れていたTBG4の構造解析が終了し,植物で初めてβ-ガラクトシダーゼの構造を明らかにした(未発表).β-ガラクトシダーゼは,GHファミリーの中で,GH1,GH2,GH35およびGH42に属し,(α/β)バレル構造をとるとされており,今回トマトから得られたβ-ガラクトシダーゼの構造も同様に(α/β)バレル構造をとっていた.しかしながら,活性中心であるカタリティックドメイン以外は他のGHファミリーのアミノ酸配列と相同性が低く,位相決定が困難であった.今回の解析により,これまでの解析データの蓄積を利用し,TBGファミリーの構造解析を行うことができるようになった.また,TBG1については,酵素特性および基質特異性を明らかにし,β-1,3およびβ-1,6結合を特異的に認識し,開花後10日および20日の幼若な果実の細胞壁成分(アルカリ可溶ペクチン)に作用することを明らかにした.TBG3およびその他のTBGファミリーについては,組換え酵素タンパクの活性が低いことからまだTBG3の酵素特性が解析できていない.次年度も引き続き行う予定である.TBG1およびTBG5については,大量培養および精製を行っており,次年度中には構造解析が完了できる予定である.本研究課題は,トマト果実をモデルとして,成熟過程における果実軟化に深く関与するβ-ガラクトシダーゼファミリーの役割について,X線結晶構造解析によって酵素特性および基質認識機構を明らかにする目的で行った.トマトβ-ガラクトシダーゼ(TBG)4のX線結晶構造解析の結果,TBG4は4つのドメインからなる分子量約80kDaのタンパク質であり,第一ドメインは,TIMバレル構造をしたGH35ファミリーの触媒ドメインであった.第二ドメインは,β-サンドイッチ構造をしており,第一ドメインを安定化させる役割があると考えられる.第三ドメインは長いループを有するβ-サンドイッチ構造であり,この長いループは植物由来β-ガラクトシダーゼに特有であり,基質結合部に近いことから基質の結合に関与していると考えられる.第四ドメインは,同じく長いループを有するβ-サンドイッチ構造をしており,このドメインの長いループはGH35に属する酵素によく保存されており,酵素活性に重要な役割を果たしていると考えられる.TBG1の酵素特性は,β-(1,3)結合とβ-(1,6)結合を認識し,β-(1,4)結合はほとんど認識にしないことを明らかにした.また,最適pHは5.0であり,最適音素は40-50°Cであった.TBG3は発現した酵素活性が低く,酵素特性および基質特異性を明らかにするまでには至らなかった.以上の結果から,本研究課題の目標はほぼ遂行できた.今後はTBG4の立体構造をモデルとしてTBGファミリーの構造を明らかにし,トマト果実の成熟過程におけるβ-ガラクトシダーゼの役割を明らかにしていく.本研究課題は,トマト果実をモデルとして果実の発育・成熟過程における細胞壁分解酵素の一つであり,トマト果実の軟化に重要な役割を果たしていると考えられるβ-ガラクトシダーゼについて,酵素特性や基質認識機構を明らかにすることを目的とした.トマトβ-ガラクトシダーゼ(TBG)4は果実軟化に重要な役割を果たしているため,酵母による発現系を構築し,X線結晶構造解析を行った.その結果,植物では初めてβ-ガラクトシダーゼの構造を明らかにすることができた.また,TBG1の酵素特性も明らかにし,TBG4とは異なる基質特異性を持つことを明らかにした.平成23年度は,トマト果実中に少なくとも7種存在するβ-ガラクトシダーゼ遺伝子(TBG)のうちTBG4のX線結晶構造解析,TBG1の酵素特性について明らかにすることを目的とした.このうちTBG4のX線結晶構造解析について,TBG4のアミノ酸配列は,植物以外の微生物および動物とはアミノ酸配列の相同性が30%以下であるため,位相の決定が困難であった.TBG4はGH35ファミリーに属し,微生物および動物の立体構造はとられているが,高等植物の立体構造の報告はない.そこで,我々は数種の重原子置換によりデーターの収集を試みたが,位相を決定することはできなかった.現在,セレノメチオニン置換による発現系の再構築を進めている.しかし,これまでに結晶格子タイプ等の基礎的なデーターの収集はできており,成果があった.TBG1の酵素特性については,温度,pH,反応速度パラメーターについて明らかにし,基質特異性についても,種々の合成基質および天然由来基質を用いて解析を行った.TBG1の酵素特性については計画通りに成果が得られ,論文として発表予定である.TBG3については,発現系の構築が遅れており,現在までに活性を有する組換え酵素タンパクは得られていない.

特に,TBG1の基質特性は種々の結合様式をもつ3糖では,β(1,3)結合を特異的に認識し,トマト成熟過程の細胞壁との反応性から未熟段階の果実由来細胞壁から多くのガラクトースを遊離することが明らかとなった.トマト果実の成熟過程における果実軟化に重要な役割を担っていると考えられるTBG4の結晶構造を明らかにできたことで,今後TBGファミリーの構造解析が進められると期待できる.また,酵素特性や基質特異性についても構造を基に変異体の作成などを行っており,おおむね順調に進展している.平成23年度の研究目的は,1.トマトβ-ガラクトシダーゼ(TBG)4の基質複合体の構造解析および2.トマトβ-ガラクトシダーゼ(TBG)1および3の酵素特性解析であった.このうち,1については,TBG4の構造解析は終了していないが,構造解析の目途が立ち,次年度中には終了する予定である.これはTBG4のアミノ酸配列が既知のβ-ガラクトシダーゼとの相同性が低く,位相を決定することができなかったためである.このことは予想されたことであったが,新たにセレノメチオニン置換での解析に期待できる. 2については,TBG1の酵素特性は終了し,TBG3についても発現系の再構築は終了しており,解析の目途はついている.酵素特性,反応速度論パラメーターなどは順次TBG1と同様に行い,基質特異性についても同様に種々の結合様式をもつ合成基質,天然物由来基質を解析することが可能である.以上の2つの項目について,若干の遅れはあるが,研究の進展の目途がついており,おおむね研究計画通りに進んでいる.平成25年度は,平成24年度に得られたTBG4の構造を基に,引き続きTBG1,TBG3およびTBG5の構造解析を進める.昨年度から糖加水分解酵素の構造解析に実績のある五十嵐氏(東大)と金子氏(食総研)から研究協力を得ており,引き続き解析に協力を依頼した.また,基質に関して,植物細胞壁の糖鎖構造に実績のある小竹氏(埼玉大学),阪本氏(大阪府大)の協力を引き続き得られることになっており,最終年度の目標を達成できる実施体制を構築できつつある.平成24年度は,平成23年度の計画で未達成であったTBG4の構造解析と基質複合体との構造解析を重点的におこなう.これまで重原子置換でデーターの収集の行ったが,位相決定までには至らなかったため,セレノメチオニン置換により解析を行う.セレノメチオニン置換での構造解析に実績のある五十嵐氏(東大)と金子氏(食総研)の研究協力を得て,実施する予定である.また,TBG3の酵素特性については,発現系の構築は終わっているので,発現誘導をおこない,組換えタンパクの産生をおこなう.基質特異性については,微生物のβ-ガラクトシダーゼなどで実績があり,多種の基質を有している阪本氏(大阪府大)の協力を得て,実施できる環境にある.平成25年度は,昨年度研究に使用した微量高速遠心分離機の故障が多発したため,機器の購入を考えている.また,これまでの成果を論文や学会発表する目的で,海外の細胞壁関連の研究者と連携を進めるため海外渡航費を計上したい.平成24年度の研究費は,主に構造解析を行うための旅費,そして,組換えタンパクの産生に関する実験補助の謝金に使用を検討している.
新規ドセタキセル結合タンパクの前立腺癌におけるタキサン系抗癌剤耐性獲得機序の解明

本研究では、先行研究(平成24年-26年度科研費基盤研究(C)課題番号:24592405)で我々がケミカルバイオロジーの手法を用いて同定したドセタキセル結合タンパクの前立腺癌における抗癌剤耐性獲得機序の分子生物学的解明を試みる。先行研究で用いた、アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞株DU145の親株(ドセタキセル感受性株)と、親株から確立した2種類のドセタキセル耐性株を用いる。先行研究において、ドセタキセル結合タンパクとして同定したbasonuclin 1 (BNC1)のmRNA発現量はドセタキセル耐性株において感受性株の約20%に低下していることを明らかにしている。一昨年度の研究では、BNC1特異的siRNAの処理でドセタキセル感受性株におけるBNC1の発現を低下させた状態で、種々の濃度のドセタキセルを添加し細胞増殖アッセイを行ったところ、control siRNAで処理した場合に比べ、高濃度ドセタキセル存在下での細胞増殖が高く、BNC1の発現低下がドセタキセル抵抗性獲得に関与することが示唆された。昨年度は上記の実験の至適条件を決め再現性を確認すべく、色々な条件で実験を重ねたが、実験結果の再現性が得られなかった。このため、当初の予定を変更し、BNC1発現抑制による遺伝子発現変化を網羅的に解析し、その中からドセタキセル感受性に関わるもしくは癌の進展に関わる遺伝子を同定することを考え、DU145をcontrol siRNAおよびBNC1特異的siRNAで処理した後にcDNA microarrayを行った。また、BNC1が転写因子であり、かつドセタキセル結合タンパクであることより、同様の処理をドセタキセル存在下にも行い4つの条件でcDNA microarrayを行った。現在、これらの結果の解析を行っている。cDNA microarrayは、当初は平成30年度に行う予定であった。Basonuclin 1(BNC1)がドセタキセル耐性株で発現低下していることを先行研究で示したが、現行研究ではBNC1の発現抑制実験でドセタキセル感受性低下との相関を示せなかったため、計画を変更しcontrol siRNAおよびBNC1特異的siRNAで処理後にcDNA microarrayを行った。発現変動する遺伝子が予想以上に多く結果解析が難渋し、候補遺伝子が絞れず研究を進められなかった。cDNA microarrayの結果より、BNC1発現低下に伴い遺伝子発現が変化する遺伝子の中から、ドセタキセル感受性に関与する候補を選定する。選定された遺伝子の発現をDU145ドセタキセル感受性株およびDU145ドセタキセル耐性株で確認し、ドセタキセル感受性と関与する可能性があれば、当該遺伝子をsiRNAで発現抑制した後にドセタキセル存在下の細胞増殖アッセイでドセタキセル抵抗性獲得に関連するかを判断する。上記の如く解析された遺伝子の発現変化がドセタキセル存在下でさらに同様の方向へ変化することがcDNA microarrayの結果で確認された場合は、zinc finger proteinであるBNC1が転写因子として当該遺伝子の発現を制御しており、さらにその転写活性がドセタキセルのBNC結合により調節されていることが推測される。これらを確かめるために、当該遺伝子のプロモーターを用いたCAT assayを行う。ドセタキセル存在下に転写活性が変化するかを評価することで、ドセタキセル結合によるBNC1転写活性能への影響を評価する。BNC1とは別に、我々がドセタキセル結合タンパクとして精製・同定した40S-ribosomal protein S18および16S- ribosomal proteinのDU145ドセタキセル感受性株および耐性株における発現を定量RT-PCRで比較し、ドセタキセル感受性との関連が示唆された場合は、siRNAによる発現抑制を行ったうえで細胞増殖アッセイを行いドセタキセル感受性への影響を評価する。上記の検討よりドセタキセル感受性調節タンパクであることが確かめられた場合は、前立腺生検標本、手術検体を用いて免疫組織染色を行い、ドセタキセルによる治療効果(腫瘍縮小効果、PSA反応性、奏効期間)との相関について解析を行い、治療効果予測因子としての有用性を評価する。本研究では、先行研究(平成24年-26年度科研費基盤研究(C)課題番号:24592405)において我々がケミカルバイオロジーの手法を用いて同定したドセタキセル結合タンパクの前立腺癌における抗癌剤耐性獲得機序の分子生物学的解明を試みる。本年度の研究では、ドセタキセル感受性株におけるBNC1の発現を低下させることで、ドセタキセル感受性が低下するかを以下の通り検討した。先行研究終了後に凍結保存していた上記3種類の細胞株の細胞培養を開始し細胞の状態が安定した後、ドセタキセル感受性株を用いて2種類のsiRNAによるBNC1発現抑制実験を行った。siRNA添加72時間後のBNC1 mRNA発現量を定量RT-PCRで検討したところ、両方のsiRNAともcontrol siRNAに比べ約20%までBNC1 mRNA発現量を低下させることを確認した。

次に、siRNAでドセタキセル感受性株を72時間処理しBNC1の発現を抑制した後に細胞を継代し、その24時間後に種々の濃度のドセタキセルを添加し細胞増殖アッセイを行った。ドセタキセル感受性株をBNC1特異的siRNAで処理した場合、control siRNAで処理した場合に比べ、高濃度ドセタキセル存在下での細胞増殖が高く、ドセタキセルに対する感受性が低下していた。以上より、アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞株DU145においてBNC1の発現低下がドセタキセル耐性獲得に関与していることが示唆された。長期凍結保存していた3種類の細胞株を安定した状態にするための細胞培養およびsiRNAによるBNC1発現抑制実験・ドセタキセル感受性評価のための細胞増殖アッセイの条件決めに予想以上に長い時間を要したため、予定した実験の一部が施行できなかった。本研究では、先行研究(平成24年-26年度科研費基盤研究(C)課題番号:24592405)で我々がケミカルバイオロジーの手法を用いて同定したドセタキセル結合タンパクの前立腺癌における抗癌剤耐性獲得機序の分子生物学的解明を試みる。先行研究で用いた、アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞株DU145の親株(ドセタキセル感受性株)と、親株から確立した2種類のドセタキセル耐性株を用いる。先行研究において、ドセタキセル結合タンパクとして同定したbasonuclin 1 (BNC1)のmRNA発現量はドセタキセル耐性株において感受性株の約20%に低下していることを明らかにしている。昨年度の研究では、BNC1特異的siRNAの処理でドセタキセル感受性株におけるBNC1の発現を低下させた状態で、種々の濃度のドセタキセルを添加し細胞増殖アッセイを行ったところ、control siRNAで処理した場合に比べ、高濃度ドセタキセル存在下での細胞増殖が高く、BNC1の発現低下がドセタキセル抵抗性獲得に関与することが示唆された。本年度は上記の実験の至適条件を決め再現性を確認すべく、色々な条件で実験を重ねたが、実験結果の再現性が得られなかった。このため、当初の予定を変更し、BNC1発現抑制による遺伝子発現変化を網羅的に解析し、その中からドセタキセル感受性に関わるもしくは癌の進展に関わる遺伝子を同定することを考え、DU145をcontrol siRNAおよびBNC1特異的siRNAで処理した後にcDNA microarrayを行った。また、BNC1が転写因子であり、かつドセタキセル結合タンパクであることより、同様の処理をドセタキセル存在下にも行い4つの条件でcDNA microarrayを行った。現在、これらの結果の解析を行っている。cDNA microarrayは、当初は平成30年度に行う予定であった。BNC1発現抑制下のドセタキセル感受性評価のための細胞増殖アッセイの条件至適化に長い時間を要したにも関わらず、BNC1発現抑制のみではドセタキセル抵抗性につながることが予想に反して示せなかった。
トコトリエノールによるパーキンソン病モデル細胞の保護作用機構に関する研究

本研究では、トコトリエノール(T3)のパーキンソン病(PD)モデル細胞およびPDモデルマウスに対する保護効果とその作用機序を検討した。PDモデル細胞では各T3同族体が細胞保護効果を示した。T3の細胞保護機序として、PI3K/Akt経路の活性化が認められた。さらに、上流分子としてエストロゲン受容体β(ERβ)を同定し、T3のERβへの結合を確認した。また、PDモデルマウスを用いてT3がPD関連症状を軽減することを明らかにした。パーキンソン病(PD)は代表的な神経変性疾患であり、酸化ストレスが病態の一部に関与することが報告されている。ビタミンEがPD発症を抑制する可能性が示唆されているが、種々の抗酸化物質による治療や発症予防の試みによってもPDに対する明確な効果は証明されていない。本研究では近年注目されているビタミンEの非抗酸化作用による抗PD効果の可能性を探るために、ビタミンE同族体のトコトリエノール(T3)を用いてPDモデル細胞に対する保護効果とその機序を検討した。その結果、前年度の実験で、T3同族体の内、γ-, δ-T3の保護効果が優れていることが明らかになり、T3による細胞保護機序として、PI3K/Akt経路の活性化が認められた。本年度の研究ではPI3K/Aktシグナルの上流分子として、既報告から候補分子を絞り込み、阻害剤およびsiRNAを用いた検討からエストロゲン受容体β(ERβ)を同定した。T3およびトリチウムラベルしたエストラジオールのERβへの結合競合実験により、T3のERβへの結合が確認された。T3のERβへの結合能はδ- >γ-> β-> α-の順であった。前年度の実験で明らかになったT3同族体の細胞保護効果の差はT3のERβへの結合能の差と相関しており、T3が抗酸化能以外にERβそしてPI3K/Aktシグナルを介して細胞保護に働いているという新しい知見が得られた。最近の疫学研究から、ビタミンE投与によってパーキンソン病(PD)発症が抑制される可能性が示唆されている。本研究ではビタミンE同族体としてトコトリエノール(T3)に注目し、細胞内シグナル伝達を介した細胞保護効果を明らかにする目的で、PDモデル細胞およびMPTP誘発PDモデルマウスを用いて研究を行った。PDモデル細胞では各T3同族体が細胞保護効果を示したが、γ-、δ-T3の保護効果が相対的に優れていた。T3による細胞保護機序として、PI3K/Akt経路の活性化が認められた。PI3K/Aktシグナルの上流分子として、既報告から候補分子を絞り込み、阻害剤およびsiRNAを用いた検討からエストロゲン受容体β(ERβ)を同定した。T3および3H-エストラジオールのERβへの結合競合実験により、T3のERβへの結合が確認された。ERを介したシグナルはカベオラ形成と深く関与していることが示唆されている。最終年度は、カベオラ形成がT3/ ERβを介した細胞保護効果にどのように影響するのかを検討した。カベオリンをノックダウンすることによりT3/ERβによる細胞保護効果が減弱したことから、ERβが細胞内に刺激を伝達する際にカベオラ形成が重要な役割を果たしていることが示唆された。さらにMPTP誘発PDモデルマウスを用いてT3を中心とするビタミンEの効果を検討した結果、δT3がPD関連症状を軽減することが示された。また、ER阻害剤であるタモキシフェンの共投与によりδT3のPD抑制効果が減弱した。本研究では、ビタミンEの非抗酸化作用による抗パーキンソン病(PD)効果の可能性を探るために、ビタミンE同族体のトコトリエノール(T3)を用いて細胞保護効果とその作用機序を検討した。PDモデル細胞として、実際のPD時に見られるようにα-synuclein過剰発現によって内因性カテコールアミン依存性に緩徐に細胞死を誘導することができる臨床病態に即したモデル細胞系(PC12-α-synuclein TetOFF)と従来から用いられているSH-SY5Y細胞におけるMPP+投与モデルを用いた。これら2種類のPDモデル細胞に、α-,β-,γ-,δ-T3を添加し、効果を検討した。PC12-α-synuclein TetOFF細胞において、100 pM - 1μM程度の低濃度T3が有意に細胞保護効果を示した。SH-SY5Y細胞モデルでは10 nM-1μM T3が細胞保護効果を示した。α-,β-,γ-,δ-各T3の保護効果に顕著な差は認められなかったが、γ-,δ-T3の保護効果が相対的に優れていた。また、いずれのT3同族体も使用した濃度においてはPDモデル細胞に認められた過酸化脂質増加を有意には抑制しなかった。DNAアレイ、抗体アレイを行い、その結果からT3によるPI3K/Akt経路の活性化が示唆された。

T3投与によりAktのリン酸化が確認され、T3による細胞保護効果はPI3K阻害剤の前投与により阻害された。またエストロゲン受容体阻害によりT3による細胞保護効果が抑制されることから、PI3K/Akt関連シグナルの上流候補分子としてエストロゲン受容体(ER)の関与が考えられた。本年度はPI3K/Aktシグナルの上流分子の同定と解析を目的としていた。上流分子として、既報告から候補分子を絞り込み、阻害剤およびsiRNAを用いた検討からエストロゲン受容体β(ERβ)を同定した。トコトリエノール(T3)およびトリチウムラベルしたエストラジオールのERβへの結合競合実験により、T3のERβへの結合が確認された。T3のERβへの結合能はδ- >γ-> β-> α-の順であった。本年度の研究実施は上記の結果よりおおむね達成されているものと考える。T3によるPD細胞保護効果がT3の抗酸化作用によらない生理作用によるものか、およびT3のどの同族体が最も効果的に細胞保護効果を示すかを検討した。その結果、γ-,δ-T3の保護効果が優れていることが明らかになった。また、これらの保護効果はT3の抗酸化作用よりもPI3K/Akt関連シグナル伝達を介したものであることが示唆された。さらに予備実験の結果から、PI3K/Aktシグナルの上流分子として、エストロゲン受容体(ER)を候補分子として絞り込んだ。本年度の研究実施は上記の結果より達成されているものと考える。ERを介したシグナルは、カベオラ形成と深く関与していることが示唆されている。そこでカベオラ形成が、T3/ ERβを介した細胞保護効果にどのように影響するのかを検討する。さらに動物実験として、マウスにMPTPを投与するパーキンソン病(PD)モデルを用い、トコフェロールおよびT3の抗PD効果を行動学的および病理学的に検討する予定である。平成23年度に得られた結果を基にして、上流シグナル分子候補としてERの関与を検討する。また、ERα, ERβのどちらがT3細胞保護効果に最も関与するかも検討する。ERのRNA干渉によるノックダウンや阻害剤による阻害によりT3の効果がどのように影響されるかを調べ、T3とERの相互作用を間接的に証明する。相互作用の可能性が証明された場合、T3および3H-エストラジオールのERへの結合競合実験により、T3のERへの結合を直接証明する。該当なし平成23年度と同様に培養細胞を用いた検討が中心となるが、細胞保護効果を示すT3同族体が既に明らかになっていること、および上流の受容体としてERを考えているので、網羅的な検討を行う必要がないと思われる。そのため、培養関連費用を中心に減額設定を行う。また、24年度に得られる結果を学会報告(日本ビタミン学会、日本酸化ストレス学会を予定)する予定である。
2光子共鳴を利用した真空紫外フェムト秒サンプリング分光法の開発

新しい非線形分光法として2光子遷移を用いた超高時間分解能サンプリング分光法の開発を行った。測定すべき物質の過渡発光とパルスレーザー光とを同時に金属蒸気に入射させて2光子遷移を起こさせた。この時レーザー光と発光から各々1光子を用いて遷移が行われるので超短パルスレーザーを用いることにより極めて高い時間分解能が得られた。2光子遷移の検出は励起状態からの蛍光またはレーザー光によるイオン化信号を観測することにより行った。特に後者は観測が容易でかつ高感度であった。2光子共鳴媒質としてナトリウム、水銀、カドミウム、亜鉛等の蒸気を用い、発光試料に有機色素溶液を用いて発光減衰が観測された(「超高速現象に関する国際会議」で報告)。励起光源としてモード同期Nd:YAGレーザーの単一パルスとシンクポンプ色素レーザーを用いた。後者は近年広く使われ始めた波長可変超短パルスレーザーで、これによる高感度測定が実用上最も望まれるが、本手法のような非線形効果を利用する分光法では尖頭強度の低いレーザーは不利となる。実験ではまだ色素溶液の発光を十分な感度で検出できていないが、本課題で購入した真空排気装置を用いて原子線と電子増倍管の組合せで高感度化の準備を進めている。一方、固体の2光子遷移に起因する光電効果も上記の方法と同様な高時間分解能サンプリング分光法の有力な手法となることに着目し、実験を始めた。これまでに市販の光電子増倍管の光電陰極を用いて赤外レーザー光の2光子光電効果が検出されており、現在、発光試料を用いたサンプリング分光を試みている。同時に種々の光電材料を選び可視。紫外域での測定も行っている。また光電子増倍管を撮像管(ビジコン管)に替えることにより2次元測定を行い測定の高能率化をはかる他、内部光電効果、すなわち2光子励起光導電効果の測定も試み、新しい非線形分光の固体検出素子の開発も進める予定である。
中間径線維動態の光学顕微鏡による可視化

大腸菌内でビメンチン(中間径線維の代表的なサブユニット)を大量発現させる系を確立し、これを用いて精製したビメンチンのアミノ基に対してX-ローダミンで蛍光標識をおこない、1分子あたり1分子の修飾に成功した。この蛍光ビメンチンの重合・脱重合を蛍光顕微鏡を用いて観察した。(1)様々な濃度のビメンチンと塩溶液をスライドガラス上で混合後、封入条件下で一定時間後に繊維状構造が形成されるかを観察した。0.2mg/ml以上の濃度で30分以上置くと、線維が束になった構造が観察された。4°Cで一昼夜放置した場合には、全長が1mmにも及ぶような三次元ネットワークが見られた。この巨大な三次元ネットワークは微分干渉顕微鏡でも観察可能であり、未標識のビメンチンでも同様の構造が形成された。このことから、これらの大きな構造体は蛍光標識によって変性したビメンチンが非特異的に凝集してできたものではなく、ビメンチンの重合能を反映した構造体ということが出来る。(2)簡易型のフローチェンバーを用いて、重合反応開始時からの線維形成を観察した。大量に存在する未重合ビメンチンの蛍光がコントラストを下げるため、通常の蛍光顕微鏡では線維の形成の観察は困難であったので、共焦点顕微鏡を用いて観察を行った。塩溶液と接触後1分以内に、界面付近に多数の長さ5-10μm程度の細い線維状構造が観察された。この線維は暗視野顕微鏡では観察できなかったことから、少なくとも微小管よりは細い、おそらく1本の中間径線維であるものと思われる。(1)で観察された構造物はこの線維が多数束になった構造であるものと考えられるが、現時点ではフローチェンバーでは大きな構造物の形成は観察できていない。この線維も(1)の構造物も、ともに8M尿素で消失する様子が観察できたことから、生化学的な条件で脱重合可能な線維の形成に顕微鏡下で成功したということができる。ビメンチン遺伝子を組み込んだpETベクターを作成し、大腸菌内で大量発現させる系を確立した。精製したビメンチンのアミノ基に対してX-ローダミンで蛍光標識を行った。標識反応は、重合には直接影響しないアミノ基を修飾するため重合条件下で行った。反応後尿素依存的な重合・脱重合サイクルによって、変性ビメンチンを除去し、ビメンチン1分子あたり1分子の色素修飾に成功した。(1)様々な濃度のビメンチンと塩溶液をスライドガラス上で混合後、ただちにカバーガラスをかけ、一定時間後に繊維状構造が形成されるかを観察した。未標識のビメンチンでも形成されたことから、これらの大きな構造体は蛍光標識によって変性したビメンチンの凝集体ではないといえる。また、8M尿素でこの構造が破壊される様子も観察できた。以上の結果から、生化学的な条件で脱重合可能な線維の形成に顕微鏡下で成功したということができる。大量の未重合ビメンチンが非常に強い蛍光を持つため、通常の蛍光顕微鏡では線維の形成の観察は困難だったので、共焦点顕微鏡を用いて観察した。塩溶液と接触後1分以内に、界面付近に多数の長さ5-10μm程度の細い繊維状構造が観察された。

(1)で観察された構造物はこの線維が多数束になった構造であるものと考えられるが、現時点ではフローチェンバーでは大きな構造物の形成は観察できていない。この線維も(1)の構造物も、ともに8M尿素で消失する様子が観察できたことから、生化学的な条件で脱重合可能な線維の形成に顕微鏡下で成功したということができる。
筋骨格多自度ヒューマノイドにおける注意・反射・発達機構の統合モデルの研究

昨年度の研究において,人間の反射・学習系の機能要素の整理に基づいて,「注意」・「反射」・「発達」の統合された行動システムモデルとして,並列監視・評価構造を提案し,ヒューマノイド実機を用いて,その有効性を確認するに至ったが,本年度は,その昨年度の成果を踏まえた応用展開を行ってきた.以下にその詳細を示す.○より多様な行動における「注意」「反射」「発達」モデルの検証を可能にするための筋骨格ヒューマノイドロボットハードウェアの新規開発○新たな身体構造を持つロボットにおける並列監視・評価構造の応用展開○高次認知システムとの連携として,模倣行動システムとの連携昨年度まで,主に用いてきた筋骨格ヒューマノイド腱太,腱次を改良し,更に,多様な行動における統合モデルの検証を行っていくために,新たに筋骨格ヒューマノイド小太郎を開発した.小太郎においては,それまでの柔軟脊椎構造や筋配置・構成可変性といった特徴に加えて,電装系まわりの安定度の向上,通信プロトコルにUSBを採用することによる通信系の安定性向上,鎖骨・肩甲骨構造を導入による,腕部自由度の冗長性増大,といった点に関して大幅に改良を加えた.そして,この新たに開発した小太郎において,筋の異常負荷を監視・評価する注意,反射機能など,これまで提案してきた並列監視評価構造による自律系の構成に関して実証実験を進めている.一方,他の高次認知システムとの連携による応用展開として,模倣行動システムとの連携を試してきている.模倣のように,それ自体の中に環境や人に対する能動的注意やそれに対する解釈・評価系と行動実行系を持つ高次認知システムにおいても,実世界の中で,確実に目標とする行動を行っていく上で,自らの身体性に強く根ざした自律系システムが常に行動修正を行うように高次認知システムのバックグラウンドで走っていることは大変有効であることを確認した.本年度は,人間の情報処理系において実現されている「注意」,「反射」,「発達」の統合された行動システムに対するモデルの中で,特に「注意誘導機構」,「反射統合系」,「学習反応系」に着目して研究を進めた.本年度の研究の実績の詳細を以下に示す.○人間における反射・学習系の機能的整理に基づくヒューマノイドの全体統合モデルの設計○全身感覚情報系の統合に基づく注意誘導機構の実現○注意誘導機構に基づく反射行動統合系の動的調整機構○注意誘導機構に基づく新たな反射行動の獲得人間における反射・学習系を機能的に整理し,元々ロボットが行おうとしていた合目標的行動を反射系,学習系によって行動修正する統合モデルを設計した.その際に,刺激の発生に応じて自動的に処理される注意過程によって,そのような行動修正機能の修正の程度を調節可能にした.この時,反射機能は刺激・動作の複数の型を予め人間が並列モジュールとして実装して与え,その出力の強さ及びタイミングを調節するようにした.また,学習系は自らの動作の結果に基づき学習を進める強化学習を導入し,注意機構により計算される状態量を利用して状態行為空間及び選択した行為の評価のための報酬関数を構築した.そして,全体の構造として,そのような環境からの刺激によって生じる自動的な注意に基づく行動修正機能を,合目標的行動を行うプロセスのバックグラウンドで並列に実行するよう設計することで,ヒューマノイドの合目標的行動の記述を簡易化するとともに,これまでの行動プログラミング資産を有効利用できる形にした.以上の注意・反射・発達の統合モデルに関して,超多自由度ヒューマノイドKenta, Kenji及びヒューマノイドプラットホームHRP2の異なるハードウェア,ソフトウェア構成のヒューマノイドに適用した行動統合実験を行い,その有効性を確認した.そして,これらの成果を博士論文としてまとめた.昨年度の研究において,人間の反射・学習系の機能要素の整理に基づいて,「注意」・「反射」・「発達」の統合された行動システムモデルとして,並列監視・評価構造を提案し,ヒューマノイド実機を用いて,その有効性を確認するに至ったが,本年度は,その昨年度の成果を踏まえた応用展開を行ってきた.以下にその詳細を示す.○より多様な行動における「注意」「反射」「発達」モデルの検証を可能にするための筋骨格ヒューマノイドロボットハードウェアの新規開発○新たな身体構造を持つロボットにおける並列監視・評価構造の応用展開○高次認知システムとの連携として,模倣行動システムとの連携昨年度まで,主に用いてきた筋骨格ヒューマノイド腱太,腱次を改良し,更に,多様な行動における統合モデルの検証を行っていくために,新たに筋骨格ヒューマノイド小太郎を開発した.小太郎においては,それまでの柔軟脊椎構造や筋配置・構成可変性といった特徴に加えて,電装系まわりの安定度の向上,通信プロトコルにUSBを採用することによる通信系の安定性向上,鎖骨・肩甲骨構造を導入による,腕部自由度の冗長性増大,といった点に関して大幅に改良を加えた.そして,この新たに開発した小太郎において,筋の異常負荷を監視・評価する注意,反射機能など,これまで提案してきた並列監視評価構造による自律系の構成に関して実証実験を進めている.一方,他の高次認知システムとの連携による応用展開として,模倣行動システムとの連携を試してきている.模倣のように,それ自体の中に環境や人に対する能動的注意やそれに対する解釈・評価系と行動実行系を持つ高次認知システムにおいても,実世界の中で,確実に目標とする行動を行っていく上で,自らの身体性に強く根ざした自律系システムが常に行動修正を行うように高次認知システムのバックグラウンドで走っていることは大変有効であることを確認した.
骨吸収抑制因子カルデクリンレセプターの解析

カルデクリンは、急性膵炎患者で低カルシウム血症が頻発することから膵臓から血清カルシウム降下因子として精製クローニングされた因子である。本研究では、カルデクリンが骨吸収抑制作用を示したことから、カルデクリンの骨吸収抑制ドメインからのアプローチと受容体側からのアプローチを検討することを目的とした。まずカルデクリンフラグメントをチオレドキシンとの融合蛋白として大腸菌で発現させアフィニティーカラムで精製した。骨吸収抑制活性は、既報を参考にウサギ大腿骨から調製した骨髄細胞を象牙スライス上で培養し、破骨細胞により形成された吸収窩の面積で比較した。カルデクリンは前後2か所のβ-バレル構造を取ることから、各バレル構造フラグメントの骨吸収抑制活性を検討すると両者に抑制活性が認められた。前半のバレル構造はさらに前後に分割すると後半に骨吸収抑制活性が認められた。後半のバレル構造はジスルフィド結合を改変しても抑制効果に変化がなかった。破骨細胞の単離も既報を参考に行い吸収窩形成系で比較した。単離破骨細胞による骨吸収窩形成系を用いてもカルデクリンは吸収窩形成を抑制したことから、破骨細胞にカルデクリン受容体が存在することが示唆された。そこで、ウサギ単離破骨細胞のcDNAライブラリーを作製した。10^4細胞のウサギ単離破骨細胞から全長cDNAを取得するためにSMART oligo primerとoligo(dT)primerでPCRを行い発現ベクターに組込み、発現ライブラリーの大腸菌のサブプールを作製した。以上のことから、ウサギ破骨細胞カルデクリンレセプター遺伝子の抗チオレドキシン抗体による発現クローニングの系が確立した。カルデクリンは我々により膵臓から精製、クローニングされた血清カルシウム降下因子であり、急性膵炎にみられる低カルシウム血症の惹起因子と考えられる。一次構造解析からカルデクリンはキモトリプシン型プロテアーゼ構造を持ち、遺伝子組換え産物もキモトリプシン活性を示した。一方、プロテアーゼ活性を阻害したカルデクリンは依然として血清カルシウムを降下させ、またプロテアーゼ活性に関与するアミノ酸を変異させたプロテアーゼ活性欠失遺伝子組換えカルデクリンも血清カルシウム降下活性を保持していた。また、カルデクリンの血清カルシウム降下作用は骨吸収の抑制によることを明らかにしたが、骨吸収抑制作用はプロテアーゼ活性に影響されなかった。さらに単離破骨細胞に直接抑制作用を表す事も明らかにした。以上の結果から、カルデクリン分子内に破骨細胞に直接働き骨吸収抑制に関わる構造が存在することが示唆された。次にカルデクリン分子の前半と後半のフラグメントを用いた骨吸収抑制活性の検討で両者に骨吸収抑制活性が見られた。ところが両者には構造の類似性がないことから破骨細胞におけるカルデクリンによる骨吸収抑制は複数の受容体系を介している可能性が示唆された。そこでウサギ単離破骨細胞のcDNAを発現ベクターに組み込んだライブラリーを作製し、組換えカルデクリンフラグメントをリガンドとした発現クローニングを行いカルデクリン受容体を検索中である。カルデクリンは、急性膵炎患者で低カルシウム血症が頻発することから、膵臓から血清カルシウム降下因子として精製クローニングされた因子で、Chymotrypsin-type serine proteaseである。本研究では、カルデクリンが骨吸収抑制作用を示したことから、カルデクリンの骨吸収抑制機序を明らかにするために、カルデクリンの骨吸収抑制ドメインからのアプローチと受容体側からのアプローチを検討することを目的とした。

カルデクリンは前後2か所のβ-バレル構造を取ることから、各バレル構造フラグメントの骨吸収抑制活性を検討すると両者に抑制活性が認められた。前半のバレル構造はさらに前後に分割すると後半に骨吸収抑制活性が認められた。後半のバレル構造はジスルフィド結合を改変しても抑制効果に変化がなかった。破骨細胞の単離も既報を参考に行い吸収窩形成系で比較した。単離破骨細胞による骨吸収窩形成系を用いてもカルデクリンは吸収窩形成を抑制したことから、破骨細胞にカルデクリン受容体が存在することが示唆された。そこで、ウサギ単離破骨細胞のcDNAライブラリーを作製した。10^4細胞のウサギ単離破骨細胞から全長cDNAを取得するためにSMART oligo primerとoligo(dT)primerでPCRを行い発現ベクターに組込み、発現ライブラリーの大腸菌のサププールを作製した。以上のことから、ウサギ破骨細胞力ルデクリンレセプター遺伝子の抗チオレドキシン抗体による発現クローニングの系が確立した。
ドライバー遺伝子異常肺癌の薬剤耐性機序における長鎖ノンコーディング RNAの意義

本研究は、ドライバー遺伝子異常(EGFR, ALK、METなど)肺癌の分子標的薬耐性機序と癌幹細胞に関わる長鎖ノンコーディングRNA(lncRNA)の臨床的意義を明らかにし、耐性克服と根治を目指すことを目的とする。前年度までに、EGFR-TKI耐性株、ALK-TKI耐性株、MET-TKI耐性株と親株を用いて、網羅的lncRNA発現解析にてスクリーニングした分子標的薬耐性に共通に関与するlncRNAとしてCRNDEを同定し、定量的RT-PCRにて耐性株で発現が上昇していることを確認した。さらにバイオインフォマテイクス解析にて、CRNDEパートナー蛋白質としてIRX5をスクリーニングした。本年度(最終年度)は、肺癌細胞株HCC-827のオシメルチニブ耐性株を用いて、CRNDEをsiRNAにより抑制したところ、IRX5の発現低下を認めた。また、IRX5をsiRNAにより抑制したところ、cPARPの発現上昇あり、アポトーシスが誘導されることを明らかにした。以上より、肺癌の分子標的薬(EGFR-TKI, ALK-TKI、MET-TKI)耐性に共通に関与するlncRNAとして、CRNDEを同定し、その関連タンパク質がIRX5であり、耐性克服に向けた新規治療標的となることを明らかにした。今後、EGFR-TKI耐性株やALK-TKI耐性株を用いて、薬剤耐性解除法の開発などの更なる研究を継続し、新規治療法開発に繋げていく予定である。EGFR-TKI耐性株、ALK-TKI耐性株、MET-TKI耐性株を樹立し、網羅的lncRNAプロファイリングを施行し、薬剤耐性に関わるlncRNA候補のスクリーニングに成功し、研究の第1段階での目標は達したと考える。本研究は、肺癌のEGFR-TKI,ALK-TKI,MET-TKIなどの分子標的薬耐性と癌幹細胞(CSC)に関わるlncRNAの意義を明らかにし、分子標的薬耐性克服法の確立、根治を目指した臨床応用を目的とする。研究期間内には以下のことを明らかにする。本研究の大きな3本柱は、1EGFR-TKI,ALK-TKI,MET-TKI耐性およびCSC/EMTに関わるlncRNAの同定、2再発時の再生検(Re-biospy)検体を用いたlncRNA発現の検証3候補lncRNAの機能解析と耐性克服法の開発である。昨年度、Afatinib、Osimertinibに対するEGFR-TKI耐性株、Crizotinib、Alectinib(A、Ceritinibに対するALK-TKI耐性株およびMET-TKI耐性株を樹立し、CSC/EMTの特徴を有することを確認した。これらの樹立した耐性株と親株およびEGFR-TKI自然耐性株を用いて、lncRNAアレイを用いた網羅的lncRNAプロファイリングを施行した。今年度は、バイオインフォマティクスの手法を用いて、耐性に共通して関与するlncRNAとしてCRNDEを同定した。またlncRNAデータベースを用いて、候補となるパートナーを検索し、IRX5を選出した。耐性株においてCRNDEとIRX5の発現上昇はqRT-PCRにて確認した。また、siRNAを用いたCRNDEとIRX5のノックダウンに成功し、現在機能解析を施行中である。候補lncRNAとパートナー蛋白質の同定に成功し、予定通リに研究は遂行されていると考える。分子標的薬耐性に関与する候補lncRNAとパートナー蛋白質の同定および発現の検証に成功し、予定通りに研究は遂行されていると考える。平成28年度にスクリーニングした薬剤耐性に関わるlncRNA候補の発現の検証をqRT-PCRを用いて行う。またCSC/EMT表現型耐性細胞株におけるlncRNA発現プロファイルを検討する。さらに、EGFR-TKI/ALK-TKI再生検検体におけるlncRNA発現の検討および候補lncRNAの機能解析および標的遺伝子/相互作用/miRNAの同定を行う。siRNAを用いた候補lncRNAとパートナー蛋白質であるCRNDEとIRX5のノックダウンに成功し、現在機能解析を施行中である。

さらに、EGFR-TKI/ALK-TKI再生検検体におけるCRNDE、IRX5の発現の検証を予定している。今年度は、計画通リ、主に樹立した耐性株のlncRNAアレイ解析に使用した。今年後は計画通り、候補lncRNAの発現検証およびsiRNAを用いた機能解析の試薬購入を中心に使用した。次年度の機能解析および臨床検体を用いた研究に使用する予定である。次年度以降は、計画通リ、候補lncRNAの検証および機能解析のためのqRT-PCR試薬、タンパク質発現解析試薬等に用いる予定である。