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膜貫通型人工受容体の化学修飾法の開発とがん免疫治療への適用

本研究では、膜透過型分子を開発し、それによりシグナル伝達を誘導すること、およびそれを用いてNK細胞を改変し、がん免疫治療を行うことである。膜透過の方法として、膜電位を利用した直接膜貫通法を試みた。膜貫通分子の合成の収率が低く、その後の評価が困難であったため、合成法の検討を引き続き行った。膜貫通分子を二つの部分に分断し、クリックケミストリーを用いて連結したところ、高い収率で得られた。得られた分子は従来法で合成した分子と同様に、膜透過性を有し、またストレプトアビジンを複合化することにより、膜透過性がなくなり、膜上にとどまった。そこで、eDHFR-GFPに対するリガンドを細胞質部に相当する箇所に修飾した膜貫通分子を作製し、eDHFR-GFPの細胞膜への移行を評価した。しかしながら、添加条件を変えたり、膜貫通領域のリンカー長を延長するなど、種々の検討を行ったが、eDHFR-GFPの膜移行を示すデータは得られなかった。この原因として、リンカー長の不足が考えられた。細胞膜には糖質が修飾された膜タンパク質が存在し、その厚みは細胞種に依存するが、本研究で用いた上皮細胞であれば、数十nmと言われている。一方、膜貫通分子の膜透過領域は、伸び切りの状態で15 nmである。細胞膜厚の5 nmよりは十分長いものの、糖脂質タンパク質の厚みよりは短い。したがって、この糖質タンパク質により、膜貫通分子/ストレプトアビジン複合体の膜貫通が妨げられた考えらえる。本研究は、外部から膜貫通分子を添加することで、膜タンパク質様の構造を作るという本研究は難易度の高い挑戦である。遺伝子組み換え不要になるという意義は大きいため、今回の成果をもとににして、今後も継続して挑戦していく予定である。膜透過の方法として、膜電位を利用した直接膜貫通法と、膜融合性リポソームを介する間接膜貫通法の2つを試みた。前者については、合成の収率が低く、その後の評価が困難であったため、合成法の検討が必要となった。その結果、胆汁酸の副反応およびオリゴエチレングリコールの縮合の過程が収率低下の原因であることが分かった。また、膜電位感受部の構造を単純化すると、合成の収率が上がることが分かった。この分子は膜貫通が可能であるが、従来分子よりも透過の速度が遅いことが明らかとなった。したがって、より高収率で合成可能な分子構造への変更と、合成法を見直し(胆汁酸への保護基の利用)が必要であること分かった。間接法については、細胞膜上に分子が存在することがわかった。しかし、分子の細胞への修飾に伴うeDHFR-GFPの細胞膜への移行は見られなかった。これは実際には分子が膜貫通していいないか、あるいは膜貫通しているもののリンカー長が短い可能性がある。膜貫通分子が膜透過することを人工二分子膜を用いて評価する系を二つ構築した。一つは蛍光の消光を利用する方法であり、従来の膜電位感受部が、2時間以内という短時間で膜電位の掛かっていない膜を透過できることを明らかとした。また、平板膜を用いて膜電位を生じさせた場合の透過をK+電流の計測から示す系を構築した。その結果、膜電位感受が膜透過することを明らかにした。間接膜貫通法:これは膜融合リポソームを用いる方法である。膜貫通可能な分子を作製し、文献に倣って膜融合リポソームに組み込んで、これを細胞に添加した。細胞表面に膜貫通分子に由来する蛍光が確認されたものの、細胞内で発現させているeDHFR-GFPの細胞膜への集積は見られなかった。うまく行かなかった原因として、(1)細胞膜上に蛍光は見られるものの膜を貫通した状態で存在していない、(2)リンカー長が短く、細胞内のeDHFR-GFPと結合できないなどが考えられる。直接膜貫通法:これは膜電位を利用して、分子を膜貫通させるオリジナルの方法である。分子の合成は可能であるが、大変収率が低く、詳細な検討することが困難であることが分かった。そこで改めて合成法を検討し、さらにより単純な分子で膜透過が可能であるかを検討した。単純な分子として、これまでの胆汁酸を2つ含む分子から、一つに減らしたところ、膜電位感受部の合成収率が大きく改善した。したがって、胆汁酸を無保護で修飾することが大きく収率を低下させていると考えられた。この新しい膜電位感受部に対してオリゴエチレングリコールのリンカーを縮合したところ、収率が大きく低下した。この部分も収率の低下の原因であることが分かった。得られた分子を細胞に修飾したが、細胞への修飾率が従来分子よりも大きく低下することが分かった。すなわち、胆汁酸は2つ以上ないと、修飾が困難であることが分かった。合成法の再検討として、N端とC端を反転させること、クリックケミストリーの利用などを検討した。クリックケミストリーに関しては、膜電位感受部の疎水性が高いため、水中で行うクリックケミストリーは収率が低かった。有機溶媒を用いたり、界面活性剤を添加するなどして、収率を改善する必要のあることが分かった。

膜透過の方法として、膜電位を利用した直接膜貫通法を試みた。膜貫通分子の合成の収率が低く、その後の評価が困難であったため、合成法の検討を引き続き行った。膜貫通分子を二つの部分に分断し、クリックケミストリーを用いて連結したところ、高い収率で得られた。得られた分子は従来法で合成した分子と同様に、膜透過性を有し、またストレプトアビジンを複合化することにより、膜透過性がなくなり、膜上にとどまった。そこで、eDHFR-GFPに対するリガンドを細胞質部に相当する箇所に修飾した膜貫通分子を作製し、eDHFR-GFPの細胞膜への移行を評価した。しかしながら、添加条件を変えたり、膜貫通領域のリンカー長を延長するなど、種々の検討を行ったが、eDHFR-GFPの膜移行を示すデータは得られなかった。この原因として、リンカー長の不足が考えられた。細胞膜には糖質が修飾された膜タンパク質が存在し、その厚みは細胞種に依存するが、本研究で用いた上皮細胞であれば、数十nmと言われている。一方、膜貫通分子の膜透過領域は、伸び切りの状態で15 nmである。細胞膜厚の5 nmよりは十分長いものの、糖脂質タンパク質の厚みよりは短い。したがって、この糖質タンパク質により、膜貫通分子/ストレプトアビジン複合体の膜貫通が妨げられた考えらえる。本研究は、外部から膜貫通分子を添加することで、膜タンパク質様の構造を作るという本研究は難易度の高い挑戦である。遺伝子組み換え不要になるという意義は大きいため、今回の成果をもとににして、今後も継続して挑戦していく予定である。直接膜貫通法:合成の収率改善に取り組む。膜電位感受部の合成について、胆汁酸の水酸基を保護して副反応を抑えることとする。胆汁酸以外の合成の容易な疎水基(ピレンブチレートなど)を用いることにする。また、膜電位感受部と膜貫通部の連結にはクリック反応を用いる。膜電位感受部は反応溶媒への溶解性に乏しいことから、有機溶媒との混合溶媒を用いること、および界面活性剤の添加を行い、反応性の向上を目指す。また、膜透過速度は遅いものの膜透過しうることは分かったので、S-パルミチルトランスフェラーゼを用いて、細胞膜の内葉側に分子をとどめ、膜貫通の状態を安定する方法についても検討する。間接膜貫通法:間接膜間通法については、膜上への分子の存在することは確認されており、なぜ、eDHFR-GFPが細胞膜に結合しないのかが問題である。リンカー長の不足が考えるためリンカー長を長くする。また、リポソーム作製時に、膜透過していない可能性が考えられるため、膜電位を持つリポソームを作製し、膜貫通をした状態でリポソームに分子を挿入する方法を検討する。膜貫通分子のラフトへの移行の評価:当初の研究計画に従い、修飾した分子がT細胞とがん細胞が接触している免疫シナプスに濃縮されるかどうかを評価する。また、分子に修飾したITAMペプチドが、リン酸化していることをHPLCにより評価し、シグナル伝達を証明する。合成に時間を費やしたため、当初計画にあった細胞実験への出費が予定額を下回った。次年度は、まだ合成法の最適化が必要であるため、繰越した予算は効率的な合成法を見出すために用いる試薬費として用いる。また、細胞実験への出費に用いる。
近世西欧神秘主義の信仰論をめぐる系譜学的・宗教哲学的研究

本年度は、前年度に引き続き、近世神秘主義の信仰論について思想史的・系譜学的な研究を行った。前年度からの持ち越し課題であった、中世北方神秘思想と近世フランス神秘主義との比較考察については、論文1本にまとめることができた。そこでは、L.コニェやM.ベルガモの先行研究を基本的枠組みとして、とくに北方神秘思想の重要概念である「魂の根底」概念を焦点に各種の文献を逐次検討することで、「存在論から心理学へ」と端的に整理できる神秘主義言説の質的変容を浮き彫りにすることができた。先行研究の成果をなぞるだけにはとどまらず、個々のテクスト(とりわけJ.J.スュランのテクスト)の精読に重点を置くことで、従来のマクロな系譜学的図式を内側から問い直すような新たな視点を提示することができた。他方、西欧霊性の転換期としての17世紀フランスにおける十字架のヨハネの信仰論をめぐって、解釈の多様性を明らかにする研究を進め、このテーマについて市民講座における講演1回、学術的シンポジウムにおける講演1回、学会発表1回を行った。これらの成果については本年度中に論文にまとめるまでには至らなかったが、近世以降広く西欧思想史上に豊かな宗教的イメージを提供し続けてきた十字架のヨハネの「暗夜」の信仰論について、その両義性に注目しての受容史・解釈史の射程を説得的に示すことに成功した。加えて、現在の西欧神秘主義研究の不可避の参照点であり、本研究も決定的に依拠しているM.ド・セルトーの領域横断的な業績について、宗教言語論を中心的論点として統一的な解釈を与えることを試み、論文1本を発表した。さらに、20世紀前半に活躍した宗教画家で、19世紀末からのフランスにおけるカトリック神秘主義復興の動きとも密接な関係にあったG.ルオーについての研究に着手し、講演1回を行った。当初視野に入っていなかった重要な先行研究の消化に時間を要したことから、初年度の課題を持ち越さざるをえなかったものの、むしろそれによって中世と近世との霊性の断絶をより明確にすることができた。またその過程で、近世神秘主義における言語の問題の重要性を再確認することができたため、かえって研究は進展したといえる。他方、十字架のヨハネの信仰論については、いまだ十分に先行研究を消化できておらず、スペイン語原文の読解などの課題も残る。しかし、17世紀以降の受容のあり方を見越したときにポイントになってくると考えられる、「暗夜」の信仰論の要諦を押さえることはできている。また、当初予定していた17世紀フランスにとどまらず、19世紀から20世紀にかけての受容の広がりを明らかにすることもできている。以上から、おおむね順調に進展していると判断する。各種学会、研究会において積極的に発表することで一層の研究の進展を図る。また、今年度予定していながら(研究代表者の異動のため)叶わなかったフランスにおける成果の発表も実施したい。とくに、十字架のヨハネの信仰論とその解釈については、これまでの口頭発表の成果を踏まえて早急に論文にまとめたい。研究開始初年度となる平成29年度の研究実施計画においては、中世から近代にかけて神秘主義言説に生じた質的変容の概要を明らかにすることが主な研究目的であった。M.ド・セルトー、M.ベルガモ、D.サランらの先行研究を再検討し、「存在論から心理学へ」という大きな見通しのもと、中世ライン・フランドルから近世フランスへと至る霊性史を系譜学的に記述することを目指した。当初検討すべきと考えていた先行研究については、十分に吟味できたと考える。ただし、17世紀フランスにおけるエックハルトないしタウラーの影響に関する最近の研究成果が当初の視野には入っておらず、今後の課題として残った。先行研究を踏まえ、西欧霊性史において中世と近世のはざまに位置づくフランソワ・ド・サルの重要性を確認するとともに、「魂の根底」概念の変遷を焦点に研究会での発表を行った。また、宗教学会の発表において、中世ライン・フランドルの神秘思想と近世フランス神秘主義の連続性および断絶という大テーマをめぐって問題提起を行った。中世と近世、北方とフランスの霊性を橋渡しするような研究は世界的にみても蓄積が少ない。この点で本研究は、いまだ萌芽的な段階にとどまるが、西欧神秘思想研究の新たな端緒となりうるものである。文献については、フランスでの現地調査も行い、近年出版が相次いでいる各種校訂版を中心に収集・購入し、本研究全般の基本作業を進めることができた。本研究の最終的な目標は、近世神秘主義の信仰論の現代的可能性を明らかにすることである。この点、スュランの信仰論を中心的題材として今後の研究の糸口となるべき発表二回を行い、論文一本を発表した。また、本研究を通じて最も重要な参照点となるM.ド・セルトーの宗教言語論についても査読論文一本を投稿した。中世から近代にかけて神秘主義言説に生じた質的変容を明らかにすべく、二度の研究発表を行ったが、論文として研究成果をまとめるまでには至らなかった。扱うべき思想家・神秘家たちの数およびテクストの分量が当初の予想を上回ってしまったことが主原因である。とくに、ライン・フランドルの神秘思想については先行研究の蓄積が予想以上に分厚く、当初は視野に入っていなかった近年の研究成果もあった。17世紀フランス神秘主義を研究してきた申請者のこれまでの専門領域とは異なることもあって、準備段階として基礎的な研究を必要とした。

また、当初の研究実施計画では、「魂の根底」の変容という問題に加え、「受動性」概念の意味内容の変遷にも注目する予定であったが、同様の理由から後者については手つかずに終わった。他方、スュランの信仰論をめぐる二度の発表と論文一本、またセルトーの宗教言語論をめぐる論文一本をまとめることで、近世神秘主義の信仰論を現代宗教思想に引きつけて解釈するという本研究課題の将来的な方向性につながる成果を出すことはできた。総合的にみて当初の予定より若干遅れていると判断するが、今後の見通しは暗くない。本年度は、前年度に引き続き、近世神秘主義の信仰論について思想史的・系譜学的な研究を行った。前年度からの持ち越し課題であった、中世北方神秘思想と近世フランス神秘主義との比較考察については、論文1本にまとめることができた。そこでは、L.コニェやM.ベルガモの先行研究を基本的枠組みとして、とくに北方神秘思想の重要概念である「魂の根底」概念を焦点に各種の文献を逐次検討することで、「存在論から心理学へ」と端的に整理できる神秘主義言説の質的変容を浮き彫りにすることができた。先行研究の成果をなぞるだけにはとどまらず、個々のテクスト(とりわけJ.J.スュランのテクスト)の精読に重点を置くことで、従来のマクロな系譜学的図式を内側から問い直すような新たな視点を提示することができた。他方、西欧霊性の転換期としての17世紀フランスにおける十字架のヨハネの信仰論をめぐって、解釈の多様性を明らかにする研究を進め、このテーマについて市民講座における講演1回、学術的シンポジウムにおける講演1回、学会発表1回を行った。これらの成果については本年度中に論文にまとめるまでには至らなかったが、近世以降広く西欧思想史上に豊かな宗教的イメージを提供し続けてきた十字架のヨハネの「暗夜」の信仰論について、その両義性に注目しての受容史・解釈史の射程を説得的に示すことに成功した。加えて、現在の西欧神秘主義研究の不可避の参照点であり、本研究も決定的に依拠しているM.ド・セルトーの領域横断的な業績について、宗教言語論を中心的論点として統一的な解釈を与えることを試み、論文1本を発表した。さらに、20世紀前半に活躍した宗教画家で、19世紀末からのフランスにおけるカトリック神秘主義復興の動きとも密接な関係にあったG.ルオーについての研究に着手し、講演1回を行った。当初視野に入っていなかった重要な先行研究の消化に時間を要したことから、初年度の課題を持ち越さざるをえなかったものの、むしろそれによって中世と近世との霊性の断絶をより明確にすることができた。またその過程で、近世神秘主義における言語の問題の重要性を再確認することができたため、かえって研究は進展したといえる。他方、十字架のヨハネの信仰論については、いまだ十分に先行研究を消化できておらず、スペイン語原文の読解などの課題も残る。しかし、17世紀以降の受容のあり方を見越したときにポイントになってくると考えられる、「暗夜」の信仰論の要諦を押さえることはできている。また、当初予定していた17世紀フランスにとどまらず、19世紀から20世紀にかけての受容の広がりを明らかにすることもできている。以上から、おおむね順調に進展していると判断する。
金属の固液共存状態におけるせん断変形のその場観察による偏析形成機構の解明

本研究では、時間分解X線イメージングを利用してAl-CuおよびFe-C合金などの金属合金を対象に固液共存体の変形挙動を粒子スケールでその場観察を行い、固液共存体の変形機構や偏析形成機構の解明を目指した。固液共存体の変形により、せん断領域において、せん断ひずみ速度の局在化と固相率の低下が起こることを定量的に明らかにした。また、水-粒子混合体のモデル実験により、固相形態が、せん断帯の幅に与える影響について調べた。また、金属合金において、固相率および変形速度は、せん断変形の挙動およびせん断帯の幅に影響を及ぼすことが明らかとなった。固相と液相が共存している状態(固液共存状態)での変形は、鋳造プロセスにおいて発生する鋳造物の割れ、偏析といった鋳造欠陥と関係している。固相と液相が共存した場合、固相のみでは観察されない固液共存状態特有の変形挙動が発現する。例えば、延性に富む金属の固体と液相が共存した場合、その特性が脆性に変化し、変形を与えると割れを引き起こす。またせん断変形によって、固体と液体の領域が分離し、偏析が発生する。本研究では、放射光X線イメージングを利用して、粒子スケールで固液共存体のせん断変形のその場観察を行い、鋳造欠陥に繋がるせん断の形成機構の解明を行った。平成25年度では、Fe-C系合金を中心に高固相率で起こるせん断変形挙動の観察を行った。固相率が約98%、変形速度が10um/sの場合、固相同士がすべりを起こしながら、並進および回転運動を起こした結果、固相間隙が拡大し、せん断帯を形成した。一方、変形速度が1000um/sと早くなると、わずかな変形であってもせん断面の平行方向にほぼチャネル状に割れが形成された。つまり、偏析帯の形成において液相の流動が大きく関係しており、高固相率であっても、変形速度が低い場合、固体間隙が拡大しても周囲から液相が補給され、せん断帯がされることが明らかとなった。中程度の固相率の場合と比較して、固相粒子の回転運動が抑制され、せん断帯の幅は、半分程度まで低減した。また、特にせん断領域において固相同士の相互作用が大きくなった結果、幾つかの固相粒子のアスペクト比が変化しており、固液共存状態において、固相粒子の変形が観察された。また、水と粒子の混合体を利用したモデル実験においても、固相粒子の形態によって、せん断帯の幅が大きく異なることが明らかとなった。液相中に結晶が分散している固液共存状態における変形現象は、金属材料における鋳造・結晶成長プロセスにおいて発生する欠陥(偏析、割れ)に深く関係している。遠心鋳造や高圧鋳造法において頻繁に観察される正偏析やポロシティを含んだバンド偏析は、固液共存状態において大きなせん断変形が生じたことが原因であると報告されているが、詳細なメカニズムは不明である。これは、通常の凝固後の組織観察では、固相と液相の独立した運動によって起こる変形過程を正確に把握することが出来ないからである。そこで粒子スケールで組織の変化過程を直接観察することのできる、放射光X線イメージングを利用したその場観察手法により、変形機構の解明を試みた。平成24年度では、Fe-2C合金、Al-15Cu合金を対象に、せん断変形速度や固相率が変形挙動に与える影響を中心に調べた。Al-15Cu合金において固相率が、約60%の場合、変形速度(503000 um/s)によらず、せん断領域近傍において、せん断力の印加によって固相同士の衝突および再配列により、固相率が低下している領域がバンド状に形成されることが明らかとなった。固相率が70%、変形速度が2000 um/sとした高固相率、高変形速度下では、固体同士の衝突により、固体間に間隙が形成されるが、周囲からの液相の供給が欠乏し、割れへと繋がる空隙が形成されることが明らかとなった。金属の固液共存体の変形過程においてせん断応力を評価するための予備実験として、水-ポリスチレン粒子混合体に対してせん断力を与えた場合に生じる等方性応力(せん断方向と法線方向)を定量評価可能な装置の開発を行った。スピンドルによってせん断力(固相率50%、回転速度5rpm)を与えた場合、せん断応力および法線応力は、大きく増加し、偏析帯が形成された後、急激に低下し、その後一定の値を示すことが明らかとなった。鋳造プロセスにおいて発生する組成の不均一な偏析や割れといった鋳造欠陥は、固体と液体が共存した組織(固液共存体)の変形現象と深く関係している。例えば、遠心鋳造法や高圧鋳造法などのプロセスでは、固液共存体の変形が要因とされる、バンド偏析と呼ばれる欠陥が形成される。

このような欠陥は、凝固後の熱処理などで除去することが困難であるため、凝固過程での欠陥の制御・低減手法の開発が必須である。ただし、高温下での固液共存体の変形挙動は複雑であるため、欠陥形成の機構は、殆ど理解されていない。そこで本研究では、放射光X線イメージングを利用して、金属合金やモデル材料を対象に固液共存体の変形挙動を粒子スケールでその場観察を行い、変形機構、鋳造欠陥形成機構の解明を行ってきた。期間全体として、主に以下の知見が得られた。1.固液共存体の変形挙動は、初期固相率と変形速度に強く依存していることが明らかとなった。高固相率かつ高変形速度の場合、固相粒子の回転運動が抑制された結果、変形によって形成されるせん断帯の幅が大きく低減した。さらに高い固相率になると、中固相率の場合に観察されたせん断帯ではなく、液相流動の低下によって、割れが形成された。2.水-ポリスチレン粒子混合体を利用したモデル実験において、固液共存体にせん断を付与すると、せん断応力だけでなく、せん断方向に垂直な法線方向にも応力が発生することが明らかとなり、定量的にそれらの応力を評価することに成功した。3.高固相率であっても、変形速度が小さい場合、固相同士がすべりを起こしながら、並進および回転運動によって、再配列が起こり、中固相率の場合と同様に固相率の低いせん断帯が形成されることが分かった。4.Sn合金を対象に中固相率、低変形速度の条件において、固液共存体の変形挙動の際に発生する力の測定を行い、その場観察で得られた組織変化との関係性を明らかにした。凝固・鋳造本年度は、放射光X線イメージングを利用したその場観察により、固相率、固相粒子の形態などの初期条件や変形速度がせん断変形の挙動やせん断帯の形成に与える影響について調べることを目標とした。これまでの中固相率だけでなく、凝固末期の高固相率における固液共存体のせん断変形のその場観察を行うことに成功した。また、変形速度によって、同じ固相率でもせん断帯の形成の形態が異なることや、固液共存状態においても固相率が高い場合、固相粒子そのものが変形することを初めて明らかとなった。また、固相粒子の形態の影響については、水と粒子の混合体を用いたモデル実験により、明らかにすることができた。ただし、実際の金属合金を用いたその場観察の実験では、特に鉄鋼材料の場合、固相粒子の形態を制御することが困難であり、十分に検証することが出来なかった。以上の結果を踏まえておおむね順調に進展していると判断した。平成24年度の研究計画であるリアルタイムでのせん断変形による組織の変化とせん断応力を評価できる装置の開発に関して、計画通り、達成することができた。試料の厚さ、組成、セルの材質や構成、X線エネルギーなどの最適化により、Fe系、Al系などの高融点材料において粒子スケール(100-300 um)で固液共存体の変形挙動(固相粒子の運動)をその場観察可能な装置の開発に成功した。また、3000 um/sの高変形速度まで粒子スケールで固体粒子の運動を明瞭に観察することが可能であり、変形速度、固相率、固相の形状や大きさなどの初期条件がせん断挙動に与える影響を系統的に調べることが可能となった。本年度では、固相率や変形速度が変形挙動に与える影響について調べることができ、せん断ひずみや固相率の分布などの定量評価のためのデータ収集に成功した。一方、水-ポリスチレン粒子の混合体に対してせん断力を印加した場合、せん断応力、法線応力、せん断歪速度などの定量評価を行うことに成功した。つまり、マクロな組織とせん断応力、法線応力との関係を明らかにすることが出来た。
宇宙機への利用を目的とした金属/絶縁体相転移による自己熱放射率制御薄膜の作製

スパッタリング法およびCSD法を用いて、高熱伝導で大面積化が容易なSi基板上に外界温度によって熱放射特性が変化する(Lal-xSrx)Mn03(LSMO)を薄膜として形成し、LSMO中のMnの原子価制御により金属/絶縁体相転移温度、すなわち、薄膜の熱放射率を制御し、人工衛星用熱放射率可変素子(Smart Radiation Device)の製膜条件を検討した。スパッタリング法ではプラズマ出力を下げることで、目標温度に近い相転移温度を実現した。化学溶液堆積(CSD)法では,結晶化が最大となる製膜条件を得た。酸素分圧を制御した雰囲気中での熱処理により用途に応じて特性の異なる薄膜の合成を可能にした。本研究では優れた熱放射特性を示す数μm程度のLal-xSrxMn03(LSMO)薄膜をスパッタリング法およびCSD法で、高熱伝導性大面積基板(Si)上に直接形成し、LSMO中のMnの原子価の制御による金属/絶縁体相転移温度、すなわち、薄膜の熱放射率を制御し、優れた人工衛星用熱放射率可変素子(Smart Radiation Device)を製作することを目的とする。(1)スパッタリング法によるLSMO薄膜の試作:現有のRFスパッタリング装置を用いて、Si基板上に製膜を行い、結晶化、相転移挙動に与える組成の影響、アニールの影響について検討した。その結果、アニールによって相転移温度を高くなった。また、Sr量を増やすことで相転移温度が高温側にシフトする現象が得られた。前者は酸素欠損のアニールによる回復の影響と考えられ、これらの結果はいずれもOを介したMnイオン間の二重交換相互作用によって説明できる。(2)化学溶液堆積(CSD)法によるLSMO薄膜の試作: Si基板上に6wt%MOD溶液をスピンコートすることで、単一相で緻密なLSMO薄膜を作製した。成膜条件の最適化を行った結果、熱分解温度:500530°C/10min、結晶化処理温度:750°C/30min以上のときに結晶化度および飽和磁化の値が最大となるLSMO薄膜が得られた。さらに、LSMO薄膜が基板から受ける応力について検討した結果、製膜条件による相転移温度の大きな影響は見られなかった。これらのLSMO薄膜の放射率を測定した。低温域と高温域における放射率差は同一組成の焼結体とほぼ一致し、PLD法により見いだした結果と同等な結果を得た。(3)雰囲気熱処理装置の試作と薄膜の雰聞気熱処理とその解析:本年度は、(1),(2)について条件検討に手間取ったことから、雰囲気熱処理装置の試作は平成27年度に行う事とした。本研究ではスパッタリング法およびCSD法を用いて、高熱伝導性で大面積化が容易なSi基板上に、外界の温度によって熱放射特性が変化する材料であるLal-xSrxMn03(LSMO)を薄膜として形成し、LSMO中のMnの原子価の制御による金属/絶縁体相転移温度、すなわち、薄膜の熱放射率を制御し、優れた人工衛星用熱放射率可変素子(Smart Radiation Device)を製作することを目的とした。(1)スパッタリング法によるLSMO薄膜の製膜条件の検討:組成の異なるターゲットを作製し、Si基板上に製膜を行い、結晶化、相転移挙動に与える組成の影響、スパッタガス中の酸素比、スパッタ圧力、基板、RF出力の影響を調査した。RF出力を下げることで、目標温度に近い60°C程度の相転移温度まで上げることが出来た。(2)化学溶液堆積(CSD)法によるLSMO薄膜の検討:スピンコートにより、結晶化度および飽和磁化の値が最大となるLSMO製膜条件を得た。また、CSD法では薄膜が基板から受ける応力の影響はPVD法に比べて小さいことを見いだした。(3)酸素分圧可変熱処理装置の試作と相転移温度に与えるアニール雰囲気の影響:酸素分圧可変熱処理装置を試作し、相転移とアニール雰囲気の関係を検討した。酸素分圧の対数とTcの間に比例関係がみられ、相転移温度が酸素欠損量の変化によるMnの価数変化と対応することが予想された。(4)スパッタによる薄膜はPLDで作製した場合に比べて、組成のばらつきが大きいことから、ペロブスカイト構造ABO3のA/Bサイト比、Aサイト中の2価と3価のイオンの比が同時に変化することから、それらをともに考慮し、見かけのMn価数を定義した。それにより、各種製膜条件とTcの関係を定性的に議論することが可能となった。宇宙機用自己熱放射制御材料の薄際化の総括として、宇宙機に搭載可能な薄膜型自己熱制御材料の作成の可能性を見いだした。

スパッタリング法、化学溶液堆積法による製膜の条件探索にかなりの時間を要したため、酸素分圧制御によるMn価数の制御実験のための酸素分制御装置の試作の時間的な余裕を見いだすことができなかった。このため、この部分は平成27年度の検討課題とした。酸化物薄膜工学平成26年度の研究進捗状況でも述べたように、平成27年度に予定している酸素分圧制御による相転移温度制御に関する実験に関する装置試作を平成27年度に繰り越した。しかしながら、装置試作に関する原理的な困難性はなく、全体計画自体の変更等は不要と考えている。平成27年度に平成26年度に試作できなかった酸素分圧制御装置を製作するが、当初研究計画に全体の変更は行わない。、
アップグレードカスケードリサイクルを促進する高圧熱水反応の機能解析とシステム評価

本研究では、高圧熱水反応の再資源化技術としての可能性評価と、この目的での今後の研究の方向性を明示することを目的として、既往の関連情報の集積と整理・解析、可能性の高い分野での一層の技術の発展をめざした研究開発を行なう。研究期間終了までに、再資源化を目的とした高圧熱水反応に関する情報データベースの構築、実用化が見込まれる分野の検索と実用化の要素となる技術の研究開発、地域あるいは産業間物質ネットワークへの組込み、特に生成物の付加価値を一層向上するアップグレードを伴うカスケードリサイクルの可能性評価に関する成果を提示することを目標としており、1)高圧熱水の特性に基づく有機物の反応機構等の実験研究と関連情報を付加した特性評価、2)反応生成物の分離精製と利用用途開拓、3)実用反応装置を設計するための知見集積、4)物質循環プロセスへ導入するための評価である。昨年度は、上記した研究の目的・目標にしたがって、まず、高圧熱水反応によるタンパク質系を中心とした未利用物質の分解とアミノ酸生成に加えて、アミノ酸自体の分解、さらには高圧熱水の特性と新たなアミノ酸の合成反応に関する知見を、新たな実験を加えて取りまとめた。さらに、高圧熱水反応を適用したポリ-L-乳酸の分解によるL-乳酸の高収率回収のための最適反応条件を検討した。省エネルギー化の実現を兼ねて出来るだけ低温領域での反応解析がほぼ完了した。今年度は、実サンプルへの応用を前提に、ポリ乳酸に含まれる添加剤の影響、混合プラスチックから、あるいは、光学純度の異なった様々なポリ乳酸からのL-乳酸の収率向上を試みた。併せて、物質循環ネットワーク設計のための物質フローおよび再資源化技術情報の集積にあたった。研究期間終了までに、再資源化を目的とした高圧熱水反応に関する情報データベースの構築、実用化が見込まれる分野の検索と実用化の要素となる技術の研究開発、地域あるいは産業間物質ネットワークへの組込み、特に生成物の付加価値を一層向上するアップグレードを伴うカスケードリサイクルの可能性評価に関する成果を提示することを目標としており、主に、○高圧熱水の特性に基づく有機物の反応機構等の実験研究と関連情報を付加した特性評価、○実用反応装置の操作設計のため知見集積、○物質循環プロセスへ導入のための評価である。今年度は、高圧熱水反応による(1)タンパク質系を中心とした未利用物質の分解とアミノ酸の生成、(2)ポリ-L-乳酸の分解によるL-乳酸の高収率回収のための最適反応条件を検討した。(3)物質循環ネットワーク設計のための物質フローおよび再資源化技術情報の集積にあたった。具体的な研究実績を下記に示す。(1)タンパク質系未利用物質に加えて様々なモデル物質を取り上げ、温度、圧力、反応時間、pH、添加物(実際の再資源化過程で共存が予想される物質)を変化して、生成物質、生成収率、反応速度等を測定し、水熱条件下における反応の経路および反応速度に対する影響因子を明らかにした。(2)ポリ-L-乳酸のアップグレードリサイクルを実現するためには、D-乳酸の生成を抑制しながら高い収率でL-乳酸を生成する必要があり、さらに、省エネルギー化の実現を兼ねて出来るだけマイルドな条件でL-乳酸を高収率で生成できる反応条件を検討した。(3)既存の再資源化技術の関連情報を集積し、データベース化した。

研究期間終了までに、再資源化を目的とした高圧熱水反応に関する情報データベースの構築、実用化が見込まれる分野の検索と実用化の要素となる技術の研究開発、地域あるいは産業間物質ネットワークへの組込み、特に生成物の付加価値を一層向上するアップグレードを伴うカスケードリサイクルの可能性評価に関する成果を提示することを目標としており、1)高圧熱水の特性に基づく有機物の反応機構等の実験研究と関連情報を付加した特性評価、2)反応生成物の分離精製と利用用途開拓、3)実用反応装置を設計するための知見集積、4)物質循環プロセスへ導入するための評価である。研究初年度となる昨年度は、上記した研究の目的・目標にしたがって、まず、高圧熱水反応によるタンパク質系を中心とした未利用物質の分解とアミノ酸生成に加えて、アミノ酸自体の分解、さらには高圧熱水の特性と新たなアミノ酸の合成反応に関する知見を、新たな実験を加えて取りまとめた。さらに、高圧熱水反応を適用したポリ-L-乳酸の分解によるL-乳酸の高収率回収のための最適反応条件を検討した。省エネルギー化の実現を兼ねて出来るだけ低温領域での反応解析がほぼ完了した。今年度は、実サンプルへの応用を前提に、ポリ乳酸に含まれる添加剤の影響、混合プラスチックから、あるいは、光学純度の異なった様々なポリ乳酸からのL-乳酸の収率向上を試みた。併せて、物質循環ネットワーク設計のための物質フローおよび再資源化技術情報の集積にあたった。本研究では、高圧熱水反応の再資源化技術としての可能性評価と、この目的での今後の研究の方向性を明示することを目的として、既往の関連情報の集積と整理・解析、可能性の高い分野での一層の技術の発展をめざした研究開発を行なう。
潰瘍性大腸炎関連遺伝子多型の機能解析と治療効果への応用

我々は、これまで、潰瘍性大腸炎という難病の原因遺伝子(FCGRをはじめSLC26A3,JAK2遺伝子)を同定してきましたが、本研究は潰瘍性大腸炎のさらなる病態究明と臨床経過にどのように影響しているかを調べたものです。疾患関連遺伝子多型の解析では、FCGR遺伝子領域にはコピー数多型(CNV)が存在しFCGR3A遺伝子上のSNPのアレルのコピー数が潰瘍性大腸炎と関連がありました。次に、これらの遺伝子多型の臨床経過に及ぼす影響を検討し、FCGR2A遺伝子上の多型と13q領域の多型が寛解維持に影響することが判明し、潰瘍性大腸炎の発症とともに病気の経過にも遺伝子の影響があることが明らかになっています。本研究は次の3つの研究から構成されており,各研究での実施状況を以下に記載した。1疾患関連遺伝子多型の解析:ゲノムDNAの収集については,752例の潰瘍性大腸炎患者のゲノムDNAをすでに収集した.実験と解析に関しては,上記の752例のサンプルを用いてFCGR2A, SLC26A3,JAK2遺伝子領域の遺伝子多型の解析を行っている.FCGR遺伝子領域にはコピー数多型(CNV)の影響が存在し,single nucleotide polymorphism(SNP)の解析のみでは不十分であることが判明した.そのため,その領域のCNVの影響の詳細な解析を行い,その結果,FCGR2A遺伝子上のSNPとほかのFCGR遺伝子のCNVのハプロタイプが潰瘍性大腸炎と非常に強い関連があることがわかった.この結果は現在論文化し投稿している.2疾患関連遺伝子のヒト組織での発現解析(遺伝子多型や腸管炎症との関連):潰瘍性大腸炎患者30名と対照群25名の血液と大腸組織からのゲノムDNA,mRNAの抽出,および腸管各所からの組織を採取した.さらに,現在, SLC26A3遺伝子についてはジェノタイプ毎に発現量に差があることを大腸組織の免疫染色で確認しており,FCGRをはじめSLC26A3,JAK2遺伝子のmRNAレベルでの発現解析を進めているところであり,今後有用な知見が得られた時点で論文化を行う予定である.3遺伝子多型、および、遺伝子発現の臨床経過との関連解析:既採取のゲノムDNAサンプル109名を用いてその臨床経過との関連を解析した.その結果,二つの遺伝子の多型が,潰瘍性大腸炎の寛解維持期間に影響していることが判明した.この成果は学会報告を予定しており,その後論文化する予定である.また,さらにサンプル数を増やして,他の遺伝子多型についても解析を行っていく予定である.本研究は次の3つの研究から構成されており,各研究での実施状況を以下に記載した。1疾患関連遺伝子多型の解析:ゲノムDNAの収集については,752例の潰瘍性大腸炎患者のゲノムDNAをすでに収集した.実験と解析に関しては,上記の752例のサンプルを用いてFCGR2A, SLC26A3,JAK2遺伝子領域の遺伝子多型の解析を行っている.FCGR遺伝子領域にはコピー数多型(CNV)の影響が存在し,single nucleotide polymorphism(SNP)の解析のみでは不十分であることが判明した.そのため,その領域のCNVの影響の詳細な解析を行い,その結果,FCGR2A遺伝子上のSNPとほかのFCGR遺伝子のCNVのハプロタイプが潰瘍性大腸炎と非常に強い関連があることがわかり、この結果を論文化した.2疾患関連遺伝子のヒト組織での発現解析(遺伝子多型や腸管炎症との関連):潰瘍性大腸炎患者30名と対照群25名の血液と大腸組織からのゲノムDNA,mRNAの抽出,および腸管各所からの組織を採取した.さらに,現在, SLC26A3遺伝子についてはジェノタイプ毎に発現量に差があることを大腸組織の免疫染色で確認しており,FCGRをはじめSLC26A3,JAK2遺伝子のmRNAレベルでの発現解析を行い、臨床経過との関連を解析し論文化する予定である.3遺伝子多型、および、遺伝子発現の臨床経過との関連解析:既採取のゲノムDNAサンプル109名を用いてその臨床経過との関連を解析した.その結果,二つの遺伝子の多型が,潰瘍性大腸炎の寛解維持期間に影響していることが判明した.この成果は学会報告を行った。現在、論文化を行っている.我々は、これまで、潰瘍性大腸炎という難病の原因遺伝子(FCGRをはじめSLC26A3,JAK2遺伝子)を同定してきましたが、本研究は潰瘍性大腸炎のさらなる病態究明と臨床経過にどのように影響しているかを調べたものです。本研究では潰瘍性大腸炎と関連する遺伝子多型の機能解析を進めて疾患の病態を解明するとともに、遺伝要因と環境要因の相互作用、および、臨床経過や治療経過との関連を解析することにより、治療効果や予後の予測因子の検討を行うことを目的としている。研究は次の3段階から構成されており,各段階での実施状況を以下に記載した。

(1)疾患関連遺伝子多型の解析:ゲノムDNAの収集については,752例の潰瘍性大腸炎患者のゲノムDNAをすでに収集した.実験と解析に関しては,上記の752例のサンプルを用いてFCGR2A, SLC26A3,JAK2遺伝子領域の遺伝子多型の解析を行っている.(2)疾患関連遺伝子のヒト組織での発現解析(遺伝子多型や腸管炎症との関連):サンプルの収集については,大腸組織からのmRNAの収集と血液細胞からのmRNA,ゲノムDNAを4例で採取した.これについては潰瘍性大腸炎患者,対照群各30例ずつを目標としており,今後もサンプルの収集を継続する.実験と解析に関しては(1)で遺伝子多型を解析した752例の潰瘍性大腸炎患者のうち,同意が得られ,大腸組織が入手できた潰瘍性大腸炎患者100例に関して,SLC26A3の免疫組織化学染色を行い,その遺伝子多型の違いによる発現の解析を行った.その結果,SLC26A3遺伝子内のあるSNPと同遺伝子の転写産物の発現との関連を認めた.(3)遺伝子多型、および、遺伝子発現の臨床経過との関連解析:現在,サンプル収集と臨床情報の収集を行っている.潰瘍性大腸炎関連遺伝子領域の遺伝子解析は順調に進み,論文投稿している.遺伝子発現解析についてはコントロールのサンプル収集は困難であり,やや遅れている.臨床経過と遺伝子多型の解析についてもすでに結果がでており最終的な確認とサブ解析を行い論文化予定である.サンプル収集について,ゲノムの収集は順調に進み,一部は解析も終了した.組織とmRNAの収集に関してはまだ少ないが,予定通り進んでおり,今後継続して収集する.発現解析は一つの遺伝子については免疫組織化学染色が終了しており,必要なサンプルが収集できれば順次ほかの遺伝子についても解析していく予定であり,順調に進んでいる.1)疾患関連遺伝子多型の解析:FCGR,SLC26遺伝子領域以外の領域の詳細な遺伝子解析を行う.2)疾患関連遺伝子のヒト組織での発現解析(遺伝子多型や腸管炎症との関連):潰瘍性大腸炎患者30名と対照群25名の血液と大腸組織からのゲノムDNA,mRNAの抽出,および腸管各所からの組織を採取した.さらに,サンプル数を増加し,FCGRをはじめSLC26A3,JAK2遺伝子のmRNAレベルでの発現解析を進め,今後有用な知見が得られた時点で論文化を行う.3)遺伝子多型、および、遺伝子発現の臨床経過との関連解析:既採取のゲノムDNAサンプル109名を用いてその臨床経過との関連を解析しており,他の遺伝子多型についても,必要なら,さらにサンプル数を増やして,解析を行っていく予定である.サンプルの収集を継続すると同時に,潰瘍性大腸炎患者の大腸組織,免疫細胞での遺伝子発現解析を進め,遺伝子多型との関連を含めた機能の解析を進めていく.並行して臨床情報を収集し,遺伝子多型,遺伝子の発現との関連を調べていく.ゲノムDNA抽出,mRNA抽出.遺伝子多型解析と発現解析用の試薬の購入.研究成果の発表のための旅費.さらに現在研究が困難な領域の情報収集費用に使用予定である.血液サンプルからのゲノムDNA抽出と組織からのRNA抽出に使用する試薬類.組織での免疫染色と発現の解析に使用する試薬類.匿名化作業.
PM2.5に寄与するバイオマス燃焼の種類を識別する指標の開発と発生源解析への応用

2018年10月に研究代表者の所属機関が変更となり、当初予定していた前所属機関が保有する埼玉県の長期PM2.5試料の使用ができなくなった。現在の所属機関において、バイオマス燃焼が盛んな東南アジアのマレーシアで捕集された長期のPM2.5試料および一部バイオマス燃焼の発生源試料を保有、且つ使用可能な状況であるため、本研究プロジェクトにおいてマレーシア関連のPM2.5試料を活用する。2018年度は、バイオマスの燃焼特性(粒子生成)を把握するために、温度制御可能な燃焼チャンバーを用いて粒子生成実験を行った。泥炭土壌およびもみ殻を本実験に用い、2 °C/minで室温から600°Cまで試料温度を上げ、その間、走査モビリティーパーティクルサイザーで粒子径別の個数・体積濃度分布を測定した。泥炭土壌は200 °C付近で個数濃度が最も高くなり、2040 nmの粒子が支配的であった。一方、もみ殻は240 °C付近で個数濃度が最も高くなり、2040 nmの粒子が支配的であり、泥炭土壌との粒子濃度ピークの温度の違いが認められた。体積濃度についても個数濃度の場合と同様に、泥炭土壌ともみ殻の違いが認められた。また、泥炭土壌ともみ殻、稲わらの熱重量分析、熱分解GC/MS分析を行い、これらのバイオマスの種類による性状の違いに関する知見を得た。その他、マレーシアの大気環境に影響を及ぼし得るインドネシアの泥炭火災(バイオマス燃焼の一種)のPM2.5発生源試料の水溶性イオン成分特性について解析し、その内容について国際誌への掲載が決定した。2018年10月に研究代表者の所属機関が変更となり、新しい所属機関における研究環境の整備に時間を要しており、本研究プロジェクトで使用を予定している一部の分析装置(特にGC/MS)の整備に遅れが生じているため。・泥炭土壌、もみ殻、稲わらの昇温速度や酸素濃度等を変えた様々な条件下で燃焼実験を行い、粒子生成や化学性状への影響について解析する。・バイオマス燃焼由来の指標となり得る有機化合物の分析前処理を含む分析方法を確立し、PM2.5試料の化学分析を開始する。・もみ殻、稲わらを主な対象とした野焼きの野外フィールド観測/化学分析を行う。また、大阪でPM2.5の野外フィールド観測を開始する。2018年10月1日付けで所属機関が変更になり、研究に一部遅れが生じたため。追加の次年度使用額分は、2018年度に使用を予定していたができなかったGC/MS装置の整備に充てる。
培養視交叉上核電気活動リズムに対する時計遺伝子の役割

視交叉上核は生物時計の中枢であり,そこで,身体のすべてのリズムがコントロールされている.視交叉上核は両側性の小さな神経核で,片側10,000個ほどの神経細胞とそれに匹敵するグリア細胞からできている.これらの細胞は協調して神経活動に24時間周期を示す.その原因は視交叉上核の細胞に発現している遺伝子が関係していることがわかってきた.これら,10個ほどの時計遺伝子が24時間周期の生成に関与していて,ある遺伝子の発現が数時間の時間遅れで,別の遺伝子の発現を促進し,それが再び自分自身の発現を抑制するというようなフィードバック機構が存在していると予想されている.我々は時計遺伝子の一つであるPer1遺伝子のアンチセンスオリゴ核酸をラットの視交叉上核に投与して,それが,光に対する応答を抑制することを発見した.Per1アンチセンスオリゴ核酸単独の投与では位相を動かすことは観察されなかった.さらにPer1遺伝子が過剰発現するラットを用いて,行動と視交叉上核における時計遺伝子の発現リズムを検索し,この動物では周期が延長し,明暗周期に材する同調が障害されていることを発見した.Per1遺伝子は予想通り一日中強く発現し,Per1遺伝子はワイルドの半分程度に抑制されていた.他の時計遺伝子はほぼ正常に発現していた.これらの事実はPer1遺伝子が生物時計のリズム生成機構の本体に組み込まれているだけではなく,光の入力を受けるところでも働いていることを示唆している.視交叉上核は生物時計の中枢であり,そこで,身体のすべてのリズムがコントロールされている.視交叉上核は両側性の小さな神経核で,片側10,000個ほどの神経細胞とそれに匹敵するグリア細胞からできている.これらの細胞は協調して神経活動に24時間周期を示す.その原因は視交叉上核の細胞に発現している遺伝子が関係していることがわかってきた.これら,10個ほどの時計遺伝子が24時間周期の生成に関与していて,ある遺伝子の発現が数時間の時間遅れで,別の遺伝子の発現を促進し,それが再び自分自身の発現を抑制するというようなフィードバック機構が存在していると予想されている.我々は時計遺伝子の一つであるPer1遺伝子のアンチセンスオリゴ核酸をラットの視交叉上核に投与して,それが,光に対する応答を抑制することを発見した.Per1アンチセンスオリゴ核酸単独の投与では位相を動かすことは観察されなかった.さらにPer1遺伝子が過剰発現するラットを用いて,行動と視交叉上核における時計遺伝子の発現リズムを検索し,この動物では周期が延長し,明暗周期に材する同調が障害されていることを発見した.Per1遺伝子は予想通り一日中強く発現し,Per1遺伝子はワイルドの半分程度に抑制されていた.他の時計遺伝子はほぼ正常に発現していた.これらの事実はPer1遺伝子が生物時計のリズム生成機構の本体に組み込まれているだけではなく,光の入力を受けるところでも働いていることを示唆している.生物が示すサーカディアンリズムの中枢は視床下部視交叉上核に存在することが確立されている.最近の急速な進歩はその分子,遺伝子レベルのメカニズムを明らかにしつつある.この課題では,去年クローニングされた時計遺伝子の一つと目されるPer遺伝子の機能を明らかにする目的で研究を進めている.初年度の今年はPer遺伝子のラットにおけるホモローグrPerを神戸大学岡村研究室の協力でクローニングし,そのアンチセンスオリゴ核酸を合成した.これをラットの視交叉上核に作用させたときの行動を記録するシステムを作成した.ラットを麻酔して,2μlのアンチセンスオリゴ核酸を投与するためのカニューレを慢性的に植え込んだ.その後,ラットを恒暗条件に移して,リズムを自由継続させ,一日の様々な時刻にrPerlアンチセンスオリゴ核酸を2nmol視交叉上核に微量注入した.その結果,rPerlアンチセンスの投与だけでは位相変化を引き起こさないことが観察された.次に恒暗条件におかれたラットに光を照射すると自由継続している行動リズムの位相が変化する.これに対するrPerlアンチセンスオリゴ核酸の影響を光を照射する時間より前に投与して,位相変位がブロックされるかどうかを見て,検討した.その結果,光照射より1時間,4時間前のrPerlアンチセンスオリゴ核酸の投与は位相変位をブロックできなかったが,6時間前に投与すると統計的に優位な位相変位量の減少が観察された.その大きさは約半分にまで小さくなった.この結果は,c-fosとjun-Bのアンチセンスオリゴ核酸を投与して位相変位を観察したWollnikに結果とも一致している.また,ラットにおいてはPer遺伝子が3つもあって,その一つしかブロックしていないことを考慮すれば,光に対する生物時計の応答が部分的に,すなわち50%だけ阻害されたことが解釈できる.Period遺伝子のアンチセンスオリゴを視交叉上核に投与する実験per1,Per2のアンチセンスオリゴを慢性的に視交叉上核に植え込んだカニューレを通してラットの視交叉上核に特定に時間に投与した.その結果,単独投与では活動リズムの位相に影響を与えないことが明らかになった.しかし,動物に光を当てて,リズムの位相が変化する効果に対してはアンチセンスオリゴの投与は一定の影響を示すことがわかった.すなわち,光に当てる前,6時間の時点でアンチセンスオリゴを視交叉上核に投与すると光による位相変位の大きさが約半分から3分の1の抑制されることが確認された.この効果はPer1でもPer2でも見られた.さらにPerのアンチセンス

オリゴ投与によるそのmRNAの抑制が直接in situ hybridization法によって確かめられた.ラット視交叉上核におけるPer遺伝子発現の時間的,空間的分布についてPer1,Per2遺伝子に対するDigoxigeninプローブを作成し,腹外側と背内側の部域差がはっきりしているラットを用いて視交叉上核における発現を解析した.その結果,ラットでは日周変動は主として背内側側で,光応答はほとんど腹外側側で観察されることが明らかにされた.これは,今まで知られていたペプチドの変動パターンと一致しており,視交叉上核の中に存在する二つの部域の機能が,腹外側は光の応答,背内側はリズムの維持というように別の機能を分担しているとする説を支持する結果となった.生物時計の分子機構は,いくつかの遺伝子発現とその産物がお互いに時間遅れを持ちつつ,抑制しあっていることが基本的なメカニズムあると予想されている.しかし,その具体的な連鎖の形は,まだ明らかではない.そこで,マウス,ラットの視交叉上核での生物時計機構を検討するために,生物時計遺伝子の一つであると目されるPeriod1遺伝子を過剰発現するトランスジェニックラットを東大医科研の程先生との共同研究で作成し,その遺伝子発現と行動のリズムを測定した.その結果,1)神経特異的なプロモーターにPeriod1遺伝子をつないだ動物では脳だけに,どの細胞でも働いているプロモーターにつないだ動物では全身に,Period1mRNAの発現が高くなっていた.2)そのような動物ではPeriod2の遺伝子発現が逆に下がっていることが見つかった.3)Clock,BMal1,Cry1,Cry2の4つの時計遺伝子について視交叉上核の発現を調べたが,特別著しい異常は見られなかった.4)行動リズムの自由継続周期がバックグラウンドの動物に比べて有意に長くなっていた.それらはPeriod1遺伝子のコピー数が多いほど自由継続周期が長かった.5)その上,明暗条件下においても,明期が200ルックスでは同調しなかった.しかしながら,点灯,点滅には反応し,相対同調(relative coordination)も示しているので,環境の光を感じなくなっているのではなかった.これらの結果からPeriod1遺伝子は生物時計の分子機構のリズム生成機構に関わっているとともに,光に対する入力機構にも関与していることが示唆された.