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ペルオキソメタル種の反応性の向上とエナンチオ選択的不斉酸化反応の開発

筆者らは新たに合成した光学活性なサラレン-アルミニウム錯体が様々なアルデヒドの不斉ヒドロホスホニル化反応の優れた触媒として働くことを既に見出しており、得られた結果を本年度に裏面に記載した論文に報告することができた。本反応で得られる生成物は、α-ヒドロキシホスホン酸エステルである。そのアミノ誘導体であるα-アミノホスホン酸エステル類もその生理活性に興味がもたれている。後者の最も直接的な合成法はイミンへの亜リン酸エステルの不斉付加反応と考えられる。特に分子量が小さい亜リン酸ジメチルを用いるエナンチオ選択的付加は原子効率が高く有用な反応であるが、従来法では基質の適用範囲に改善の余地があった。アルデヒドの時に有効であったサラレン-アルミニウム錯体はX線構造解析の結果から広い反応場を有していることがわかっており、イミンにおいても優れた不斉触媒として働くことが期待された。そこで同錯体を用いて亜リン酸ジメチルの様々なアルジミンへの不斉付加反応の研究に着手した。まずアルジミンの窒素原子上の保護基について検討を行った。その結果、芳香族及び枝分かれのある脂肪族のアルジミンに対しては、4-メトキシ-3-メチルフェニル基が、枝分かれのない脂肪族のアルジミンに対してはジフェニルメチル基が保護基として有効に働くことを見出した。これらを用いて、目的とするα-アミノホスホン酸エステルを収率よく高エナンチオ選択的(最高95%ee)に得ることができた。これらの結果は亜リン酸ジメチルを用いて芳香族及び脂肪族の両アルジミンに対してともに高い選択性を得た最初の例である。これらの結果は纏めて投稿中である。またサラレン-チタン錯体を用いる高エナンチオ選択的不斉エポキシ化反応及び光学活性な銅触媒を用いる不斉共役付加反応についても共同研究を行った。これらの結果は裏面に記載した論文として報告した。不斉炭素-炭素結合形成は光学活性な有機化合物の構築の重要な手段であり、その効率的な方法論の開発は重要な課題である。不斉炭素-炭素結合反応の一つとして、既にカルボニル化合物を受容体とするアルキン類の不斉付加反応が数多く報告されているが、それらの受容体は殆どがアルデヒドであり、ケトンの例は限られている。最近キラルな三級アルコールの不斉合成法としてサレン-亜鉛錯体を触媒に用いた末端アセチレンの単純ケトンに対する不斉付加反応が報告されているが、そのエナンチオ選択性には改善の余地がある。そこで今回当研究室で開発された3,3'位に軸不斉を有するサレン配位子を用いて同様の反応を行ったところ、基質によっては最高で93%eeという高い選択性を達成することができた。プロピオフェノンやブチロフェノンのように従来法では十分な選択性が得られない基質に対しても80%ee以上の高い選択性を達成することができた。しかし、枝分かれのない鎖状アルキルケトンに対しては改善の余地が残されている。以上の結果については現在投稿準備中である。一方、先に開発していたスルフィドの触媒的不斉酸化反応において高い選択性を示したチタン-サレン錯体を用いた環状ヘミチオアセタールの効率的な速度論的分割を報告した。さらに、スルフィドへの窒素官能基導入反応である不斉スルフィミド化、不斉分子内アリル位アルキル化反応を用いるテトラヒドロイソキノリン骨格の構築についても共同研究を行った。これらの結果の詳細については裏面に記載した論文にまとめることができた。筆者らが以前に開発したサレン-チタン錯体を用いる触媒的不斉スルホ酸化では、過酸化水素が二座配位したペルオキソ錯体が活性種であり、サレン錯体はcis-β配位をとっている。しかし、サレン金属錯体は単量体では本質的にtrans配位が安定である。それ故、cis-β配位がより安定となる不斉配位子の構築について検討した。最近、サレン配位子の二つのイミンの一方のみが還元、N-メチル化された配位子(サラレン配位子)が金属イオンにcis-β配位することことが報告された。しかし、この配位子の不斉化に関しての報告はなされておらず、新たなcis-β不斉場の構築と関連して興味が持たれた。そこで、新規不斉サラレン配位子の合成に着手し、5段階、約50%の高収率で目的とする新規サラレン配位子を合成することに成功した。ついでこの配位子とアルミニウムからなる錯体を合成し、単結晶X線解析により構造解析を行ったところ、歪んだ三方両錐型を有し、中心金属の極く近傍にN-メチルが存在する得意な不斉場をもつことが明らかとなった。そこで、このサラレン-アルミ錯体を触媒に用いてアルデヒドへの不斉ヒドロホスホニル化の検討を行ったところ、芳香族アルデヒドのみならず、従来法では困難であった脂肪族アルデヒドの反応においても高収率、高エナンチオ選択性を達成することができた。一方、昨年度開発したサレン亜鉛錯体触媒を用いるケトンヘの不斉アルキニル化については予定通り報告することができた。さらに不斉タンデムアリル位置換反応についても共同研究を行った。これらの結果は裏面に記載した論文にまとめることができた。筆者らは新たに合成した光学活性なサラレン-

アルミニウム錯体が様々なアルデヒドの不斉ヒドロホスホニル化反応の優れた触媒として働くことを既に見出しており、得られた結果を本年度に裏面に記載した論文に報告することができた。本反応で得られる生成物は、α-ヒドロキシホスホン酸エステルである。そのアミノ誘導体であるα-アミノホスホン酸エステル類もその生理活性に興味がもたれている。後者の最も直接的な合成法はイミンへの亜リン酸エステルの不斉付加反応と考えられる。特に分子量が小さい亜リン酸ジメチルを用いるエナンチオ選択的付加は原子効率が高く有用な反応であるが、従来法では基質の適用範囲に改善の余地があった。アルデヒドの時に有効であったサラレン-アルミニウム錯体はX線構造解析の結果から広い反応場を有していることがわかっており、イミンにおいても優れた不斉触媒として働くことが期待された。そこで同錯体を用いて亜リン酸ジメチルの様々なアルジミンへの不斉付加反応の研究に着手した。まずアルジミンの窒素原子上の保護基について検討を行った。その結果、芳香族及び枝分かれのある脂肪族のアルジミンに対しては、4-メトキシ-3-メチルフェニル基が、枝分かれのない脂肪族のアルジミンに対してはジフェニルメチル基が保護基として有効に働くことを見出した。これらを用いて、目的とするα-アミノホスホン酸エステルを収率よく高エナンチオ選択的(最高95%ee)に得ることができた。これらの結果は亜リン酸ジメチルを用いて芳香族及び脂肪族の両アルジミンに対してともに高い選択性を得た最初の例である。これらの結果は纏めて投稿中である。またサラレン-チタン錯体を用いる高エナンチオ選択的不斉エポキシ化反応及び光学活性な銅触媒を用いる不斉共役付加反応についても共同研究を行った。これらの結果は裏面に記載した論文として報告した。
英語リスニングとリーディングのパラレリズムに関する基礎的研究

英語リスニングとリーディングとの関連性を「パラレリズム(平行,並行,類似,対応,比較)」として捉え,(1)同一語の聴覚呈示条件下と視覚呈示条件下での情報処理の相関,(2)語彙情報処理効率の個人差と読解力・聴解力の個人差の連続性,の2点の検証のため聴覚・視覚呈示条件英語語彙翻訳実験の結果を比較した。反応時間・正反応率とも条件間の相関が有意で,翻訳実験成績とTOEIC(R)スコアとの相関も部分的に有意であるなど興味深い結果が得られた。翻訳難易決定因の分析や誤反応分析から語彙翻訳のメカニズムについて考察を行うことができた。誤反応分析からは心的語彙情報の質を推定・数値化することを試みることもできた。本研究は同一の英単語の翻訳反応潜時・正反応率を聴覚呈示条件下と視覚呈示条件下とで比較することで「リスニングとリーディングのパラレリズム(parallelism:平行、並行、類似、対応、比較)」について探究するもので、パラレリズムのうち(1)同一語の聴覚呈示条件下と視覚呈示条件下での情報処理の相関、(2)語彙情報処理効率の個人差と読解力・聴解力の個人差の連続性、の2点の検証を目的とする。日本人学習者が評定した親密度や母語話者習得時期をはじめとする語彙特性が最大限に利用可能であるとして既に選定していた165の英語語彙のうち、同音語のあるもの、名詞用法と動詞用法とで発音や強勢位置が異なるものを除いた146語を用いて平成24年度から英語語彙翻訳実験を開始した。平成24年度中に実験実施までこぎつけた被験者はわずか8名であったが、その時点で集まっていたデータを整理・分析し、翻訳反応潜時・正反応率を視覚呈示と聴覚呈示とで比較したところ有意な相関を確認することができたので、中間報告として平成25年度に所属学会で口頭発表をすることができた。平成25年度前期にも実験を継続し、目標だった20名を超える分量のデータを収集した。平成25年度末には正反応率と反応潜時データの解析を終え、パイロット分析での結果にそう分析結果を得た。誤反応の分析もほぼ終了の段階までこぎつけた。研究計画全体の流れは、(1)実験の準備と実施、(2)正誤判定などデータの整理、(3)分析、(4)所属学会で中間結果を発表、(5)論文の執筆・投稿、の5段階であるが、あとは「(5)論文の執筆・投稿」を残すのみである。平成25年度に行った学会発表は中間段階のデータだったので、平成26年度は全体のデータでの分析結果と誤反応分析の結果とを所属学会で発表し、並行して研究成果を論文にまとめることとする。平成24年度は、日本人学習者が評定した親密度や母語話者習得時期をはじめとする語彙特性が最大限に利用可能であるとして既に選定していた165の英語語彙のうち、同音語のあるもの、名詞用法と動詞用法とで発音や強勢位置が異なるものを除いた146語を用いて英語語彙翻訳実験を行った。研究計画全体の流れは、(1)実験の準備と実施、(2)正誤判定などデータの整理、(3)分析、(4)所属学会で中間結果を発表、(5)論文の執筆・投稿、の5段階なので、平成24年度に(1)(2)の段階まで進め、前期夏季に実験を完了し、後期にデータ整理を行うことを当初予定していたが、平成24年度中に実験実施までこぎつけた被験者はわずか8名であった。2030名の被験者が必要なので、平成25年度も実験を継続することとなった。このペースでは、実験の完了を待って前述の「(4)所属学会で中間的結果発表」を行うと、進展があまりにも遅いので、平成25年3月に平成24年度最後の実験を行った後に、現在集まっているデータを整理・分析した。翻訳反応潜時・正反応率を視覚呈示と聴覚呈示とで比較し、有意な相関を確認することができたので、詳細に結果をまとめた発表スライドを作成して、研究発表の準備をすることができた。中間報告として平成25年度に所属学会で発表したい。

本研究は同一の英単語の翻訳反応潜時・正反応率を聴覚呈示条件下と視覚呈示条件下とで比較することで「リスニングとリーディングのパラレリズム(parallelism:平行、並行、類似、対応、比較)」について探究するもので、同一語の聴覚呈示条件下と視覚呈示条件下での情報処理の相関、語彙情報処理効率の個人差と読解力・聴解力の個人差の連続性、の2点の検証を目的とする。平成24年度から25年度にかけ、日本人学習者が評定した親密度や母語話者習得時期をはじめとする語彙特性が最大限に利用可能であるとして既に選定していた165の英語語彙のうち、同音語のあるもの、名詞用法と動詞用法とで発音や強勢位置が異なるものを除いた146語を用いて英語語彙翻訳実験を行った。平成25年度、平成26年度に所属学会での成果発表を行ったが、翻訳反応時間・正反応率とも、条件間(聴覚呈示と視覚呈示)の相関が有意であり、TOEICスコアとの相関もあるという結果が得られ、また、最終年度にあたる平成26年度は、誤反応分析から英語語彙知識の質を数値化することを試みるなど、想定していたよりも研究は進展した。全成果をまとめた論文原稿一篇を執筆し学術誌に投稿した。査読結果はまだ得られていないが、(1)実験の準備と実施、(2)正誤判定などデータの整理、(3)分析、(4)所属学会での成果発表、(5)論文の執筆・投稿、の5段階を設定した研究計画全体については、これを終了することができたと言える。心理言語学平成24年度研究計画において、平成24年度中に実験を終了する予定であったところ、募集に応じて参加した被験者数が少なく、平成25年度にも実験を継続しなければならなくなったのは、想定の範囲内ではあったが、進展の遅れと捉えることもできるかも知れない。しかし、データ数が少ないながらも分析結果を所属学会で発表することができた。また、平成25年度に継続して行った実験でデータ数を当初の予定通りに増やすことができ、平成25年度末には、全てが完了したわけではないが分析のうち重要な部分を終えることもできた。研究論文という形にはまだなっていないものの、内容の点では、研究の目標は達成されている。平成24年度の遅れを取り戻し、平成26年度に成果発表に向けてまい進することができるようになったということであり、総合すると、おおむね順調に進展していると言える。研究計画全体の中で見ると、平成24年度に(1)実験の準備と実施、(2)正誤判定などデータの整理、の段階まで進め、より具体的には前期夏季に実験を完了し、後期にデータ整理を行うことを当初予定していたので、2030名の被験者からデータを得ることを目標としているにもかかわらず平成24年度中に実験実施までこぎつけた被験者がわずか8名で平成25年度も実験を継続することとなったのは遅れとも言えるが、現在集まっているデータを整理・分析したところ、翻訳反応潜時・正反応率を視覚呈示と聴覚呈示とで比較し、有意な相関を確認することができるなど、ある程度の成果を得ることができ、また、詳細に結果をまとめた発表スライドを作成して、研究発表の準備をすることもできた。これをもとに中間報告として平成25年度中に所属学会での発表を目指すことができるようになった。リスニングとリーディングのパラレリズムのうち(1)同一語の聴覚呈示条件下と視覚呈示条件下での情報処理の相関、(2)語彙情報処理効率の個人差と読解力・聴解力の個人差の連続性、の2点の検証が研究目的であるが、これらの達成が可能であるという見通しが立ったということであり、これは評価に値するのではないかと思われる。よって、総合すると、おおむね順調に進展していると言えるのではないかと思われる。
mmオーダー細胞の凍結保存を目的とした細胞内氷晶成長の抑制とその評価

mmオーダー細胞の凍結による損傷を低減するためには,凍結保存状態と解凍後生存率の関係を明確にし,細胞内の氷晶成長を抑制できる条件を模索する必要がある.本年度は,赤血球懸濁液の液体窒素中における凍結保存状態(細胞内凍結とガラス状態)における有効温度伝導率と解凍後生存率を測定し,電子顕微鏡写真と突き合わせ,熱物性値による凍結保存状態評価の可能性を探った.実験試料にはヒト赤血球懸濁液(細胞体積分率:2,40%)を用い,凍結・解凍後の生存率を(1一溶血率)で評価した.凍結保護物質には35wt%プロピレングリコールを用いた.試料は,断熱材製の試料室(φ24×4mm)に配置され,試料室冷却部(蓋兼用のアルミニウム板,tlmm)を液体窒素で冷却した銅ブロック製冷却部との密着により凍結された.試料の伝熱モデルは片面昇温,片面断熱の一次元熱伝導とし.試料室内の温度は熱電対(φ0.1mm)により冷却部と断熱部2ヶ所で測定した.冷却速度は,冷却部上部に設けられたカーボン板ヒーター(t0.1mm)をDC電源と温度調節計により加熱制御し,1約300°C/minを得た.有効温度伝導率は,試料を凍結後-190°Cにおいて5°C加熱たときの2ヶ所の温度変化を100秒測定し,ラプラス変換法により計算した.その結果,細胞内凍結の状態評価とガラス状態評価について以下の結論が得られた.前者においては,細胞内と細胞外の氷晶形成量(有効温度伝導率)が大きく異なったことから.細胞外の影響を排除するため,凍結保護物質だけの凍結状態における有効温度伝導率も共に測定し,細胞内と細胞外の値の違いを吟味する必要がある.後者においては,細胞内外の氷晶形成量(有効温度伝導率)がある程度一致したことから,有効温度伝導率の絶対値を利用できる.mmオーダー細胞の凍結による損傷を低減するためには,凍結・解凍過程において細胞内の氷晶成長を抑制できる条件を模索し,凍結状態と解凍後生存率の関係を明確にする必要がある.本年度は,液体窒素中における熱物性値による凍結保存状態評価の有効性を検討するため,赤血球懸濁液の凍結状態における有効温度伝導率と解凍後生存率を測定した.実験試料にはヒト赤血球懸濁液(ヘマトクリット:HCt.2,4%)を用い,凍結・解凍後の生存率を(1-溶血率)で評価した.凍結保護物質には0,10,35wt%プロピレングリコール(PG)を用いた.試料は,断熱材製の試料室(φ24×4mm)に配置され,試料室冷却部(蓋兼用の窒化アルミニウム板,t0.8mm)を液体窒素で冷却した銅ブロック(50mm立方)との密着により凍結される.試料の伝熱モデルは片面昇温,片面断熱の一次元熱伝導とし,試料室内の温度は熱電対(t0.1mm)により冷却部と断熱部2ヶ所で測定した.冷却速度は,銅ブロック上部のカーボン板ヒーター(t0.1mm)をDC電源と温度調節計により加熱制御し,1約800°C/minを得た.有効温度伝導率は,試料凍結後-190°Cにおいて5°C加熱して試料室内2ヶ所の温度変化を100秒測定し,ラプラス変換法により計算した.その結果,0,10% PGにおける凍結赤血球懸濁液の有効温度伝導率は,冷却速度増加に伴い細胞内外の氷晶形状の変化と微細化により低下した.35% PGにおける有効温度伝導率は,冷却速度増加に伴い細胞内外の氷晶形成量の減少により低下した.そして,Hct増加に伴い細胞内の凍結状態と細胞容積率の増加によりさらに低い値となった.しかも,凍結状態における細胞内外の氷晶形成量と解凍後生存率は相関した.よって,有効温度伝導率により細胞の凍結状態を評価できる可能性がある.mmオーダー細胞の凍結による損傷を低減するためには,凍結保存状態と解凍後生存率の関係を明確にし,細胞内の氷晶成長を抑制できる条件を模索する必要がある.本年度は,赤血球懸濁液の液体窒素中における凍結保存状態(細胞内凍結とガラス状態)における有効温度伝導率と解凍後生存率を測定し,電子顕微鏡写真と突き合わせ,熱物性値による凍結保存状態評価の可能性を探った.実験試料にはヒト赤血球懸濁液(細胞体積分率:2,40%)を用い,凍結・解凍後の生存率を(1一溶血率)で評価した.凍結保護物質には35wt%プロピレングリコールを用いた.試料は,断熱材製の試料室(φ24×4mm)に配置され,試料室冷却部(蓋兼用のアルミニウム板,tlmm)を液体窒素で冷却した銅ブロック製冷却部との密着により凍結された.試料の伝熱モデルは片面昇温,片面断熱の一次元熱伝導とし.試料室内の温度は熱電対(φ0.1mm)により冷却部と断熱部2ヶ所で測定した.冷却速度は,冷却部上部に設けられたカーボン板ヒーター(t0.1mm)をDC電源と温度調節計により加熱制御し,1約300°C/minを得た.有効温度伝導率は,試料を凍結後-190°Cにおいて5°C加熱たときの2ヶ所の温度変化を100秒測定し,ラプラス変換法により計算した.その結果,細胞内凍結の状態評価とガラス状態評価について以下の結論が得られた.前者においては,細胞内と細胞外の氷晶形成量(有効温度伝導率)が大きく異なったことから.細胞外の影響を排除するため,凍結保護物質だけの凍結状態における有効温度伝導率も共に測定し,細胞内と細胞外の値の違いを吟味する必要がある.
血液脳関門トランスポートソームの生理的役割

質量分析装置を用いて、トランスポーターの蛋白質量を測定する方法を開発した。血液脳関門の実体である脳毛細血管内皮に発現するトランスポーターの蛋白量と輸送活性を解析した。その結果、グルコースと異物を運ぶトランスポーターであるglut1とmdr1aの働きを定量的に再構築できたが、炎症時のmdr1aの働きは再構築できなかった。血液脳関門の生理的役割の一部にトランスポートソームが関与していることが示唆された。Cholesterol (Chol)は脳内でde novo合成され、全身の25%が脳に保持される。本研究は、脳関門におけるChol及びその代謝体の輸送機構とその制御について明らかにすることを目的とした。脳内Cholの主要代謝体24-S-hydroxycholesterol (24-S(OH)Chol)は、血液脳関門に発現する有機アニオントランスポーターoatp2によって脳から血液方向へ排出された。脈絡叢上皮細胞(CPE)モデルとして条件的不死化ラット脈絡叢上皮細胞株(TR-CSFB)を用いて解析を行った。CPEおよびTR-CSFB細胞にLXRα,LXRβmRNAが発現していた。CPE及びTR-CSFB細胞にATP bindingcassette transporter A1 (ABCA1), ABCG1が発現し、LXRリガンドT0901317,24-S(OH)Chol処理によってTR-CSFB細胞のABCA1及びABCG1のmRNAとタンパク発現は顕著に誘導された。Transwellに培養したTR-CSFB細胞からapoA-1および高密度タンパク質(HDL)を介した[^3H]-Cholのapical方向への排出は、24-S(OH)Chol処理で顕著に増加した。ApoE3による[^3H]-Cholのapical方向への排出は,apoE4よりも約30%大きかった。ApoE4はアルツハイマー病(AD)の危険因子であり、AD患者では中枢Chol恒常性の破綻が報告され、加齢に伴うCPEの形態学的な変化が大きく脂質の過剰蓄積が報告されている。CPEにおけるChol排出輸送のapoE isoform特異性は、CPEでの脂質蓄積性やADの病態形成に影響を与える可能性が示唆された。血液脳関門においてGLUT1のグルコース輸送は、脳への栄養供給経路として重要な役割を果たしている。また、GLUT1欠損症候群は、抗てんかん薬耐性小児てんかん症として報告されている。本年度は、GLUT1欠損マウスを世界に先駆けて作成し、GLUT1遺伝子欠損のGLUT1発現および乳酸供給経路として機能するMCT1およびMCT2の発現への影響を検討した。GLUT1のホモ欠損は、胚性致死となった。本結果は、ヒトGLUT1欠損症候群患者は、すべてヘテロ接合体であることと一致している。GLUT1のヘテロ欠損マウスでは、成長期におけるGLUT1の脳におけるmRNA発現に低下傾向が認められた。この結果は、ヒトにおけるGLUT1欠損症候群患者では、小児においてGLUT1の発現が低下し脳へのグルコース供給が低下していることを示唆している。また、GLUT1ヘテロ欠損マウスでは、出生直後の脳におけるMCT1およびMCT2のmRNA発現の上昇が認められた。従って、GLUT1の発現とMCT1およびMCT2の発現は独立しておらず、相互に制御を受けていることが考えられる。また、血液脳関門のトランスポーター遺伝子発現をin vivoで抑制する技術の開発を行った。血液脳関門に発現するOAT3に対するsiRNAをハイドロダイナミックス法によってマウスに投与した結果、血液脳関門のOAT3を介した排出輸送の低下が検出された。本技術は、今後の脳関門トランスポートソーム解析における重要な技術になると考えられる。ヒトMDR1/P-gpとマウスGlutlについて、質量分析装置を用いた高感度定量法を開発した。各々の方法を用いて、ヒトMDR1発現細胞とマウス脳毛細血管内皮細胞における発現量を測定し、各々について抗ヒトMDR1モノクローナル抗体、サイトカラシンB結合法を用いて、MDR1,Glutlの発現量を定量した。その結果、両トランスポーターともに質量分析法の測定結果と既存の方法での測定結果が一致したことから、質量分析法が有用であることが検証できた。そこで、マウス脳毛細血管内皮細胞についてMdr1aとMct1の発現量を測定したところ、各々15.5±0.84fmol/μg protein、23.7±0.87fmol/g μproteinという値が得られた。Mdrlaについては、1分子活性をin vivoとin vitroで比較し、トランスポートソーム効果の定量的解析を進めている。一方、Mct1の発現量は想定していたよりかなり多い。Mct4にっいてはCDl47と複合体形成することが輸送機能に必須であることが報告されているが、Mct1については十分明らかにされていない。そこで、質量分析法を用いてCD147のタンパク質レベルの絶対定量法を開発した。

ケトン体の脳への供給は血液中の栄養状態によって変動することから、血液脳関門におけるMct1とCD147の複合体形成とケトン体輸送活性について検討中である。従来、トランスポーター研究のボトルネックであった輸送担体の基質探索法に関して、multi channel modeを用いて複数の基質候補を一括解析するLC/MS/MS-cocktail法を開発した。50種類の化合物を混合した系を用いて1回の輸送実験とLC/MS/MS分析でABCC4/MRP4の基質を探索することができた。血液脳関門におけるmdrlaのタンパク質1分子当たりの輸送活性をwhole animal系で測定し、mdrla遺伝子導入細胞で同様に測定し、両者を比較することでトランスポーターの機能単位(反応の場)としてのintegrityを評価した。Mdrla遺伝子ノックアウトマウスと正常マウスについて、quinidine, loperamide, digoxin, vinblastine, dexamethasoneを定速投与し、定常状態の脳と血漿中薬物濃度比(K_<p, brain>)を測定した。Mdrla遺伝子導入細胞をTranswell型容器で培養し、各薬物についてapical to basal, basal toapicalの各々の透過速度を測定した。マウスの脳毛細血管とmdrla遺伝子導入細胞におけるmdrlaタンパク質の絶対発現量を測定した。In vivo系での血液と脳の間の薬物輸送過程について、mdrla輸送担体の活性とタンパク質発現量を含む数学モデルを構築した。正常と遺伝子ノックアウトマウスのK_<p, brain>の比を指標として、各測定値を用いてin vitroから再構築を行ったところ、in vivoの値とよく一致していた。この結果は、少なくともin vitroの輸送活性を評価したmdrla遺伝子導入細胞におけるmdrlaのトランスポートソーム効果in vivoを再現していたことを示唆している。Mct1とCD147の複合体効果の解析実験は、免疫沈降に用いることができる抗CD147抗体を見出すことができた。マウスの腹腔内にLPSを投与し、炎症モデルマウスを作成した。ベラパミルを静脈内(bolus and infusion)投与し、血漿中と脳内の薬物濃度比(Kp,br)を測定したところLPS投与群のKp, brが対象群に比べて高い値であったことから、炎症時にP-糖蛋白質の機能が低下することが示唆された。両群について脳毛細血管を単離し、質量分析装置を用いてMdr1a、及びマーカー蛋白質としてNa/K-ATPase,glut1などの蛋白質の絶対発現量を測定したところ、いずれも両群で差が見られなかった。従ってLPS処理によってMdr1aの1分子あたりの排出輸送活性が低下したことが示唆された。この原因として、Mdr1a細胞内ドメインのリン酸化による輸送活性機構の低下の可能性が考えられた。そこで、蛋白質のリン酸化を定量的に解析するために質量分析装置を用いてリン酸化ペプチドの絶対定量法を開発した。
癌転移形質に寄与する核内非翻訳RNAの探索と抗体分子架橋による次世代核酸薬の創出

ノンコーディングRNAの1種である核内非翻訳RNA (SnoRNA)は未だに研究が遅れている。我々は膵癌の高肝転移性細胞で増加する核内非翻訳RNAであるSNORA23を新たに同定し、人工核酸アンチセンスによる転移抑制効果を既に確認し、膵癌の肝転移における意義を明らかにした。本研究において、我々は1多種固形癌におけるSNORA23の転移形質における意義を明らかにし、2cDNAマイクロアレイとプロテオミクス解析により癌肝転移に関与する新しい核内非翻訳RNAを見出すとともに、3癌細胞指向性を有する次世代の人工核酸核内非翻訳RNA阻害アンチセンス核酸薬の創出を試みる。
リーマン面の正則写像の研究

Rを複素平面ともリーマン球面とも異なる任意のリーマン面とする。Rの任意の点をPをとり,Pを含むRの単連結領域D全体のなす族を考える。各Dには,それ自身を独立したリーマン面とみることにより双曲的計量を導入することができるが,その計量がPにおけるRの接空間で最も小さな内積を与えるようなDを求める,という極値問題を考察した。複素平面の単連結な真部分領域に対して,それを単位図の上に等両に写す写像が必ず存在する(リーマンの写像定理)。ある極値問題を解くことによりこのリーマンの写像定理を証明することができるが,前述の極値問題はこの極値問題の自然な一般化である.一般の場合においても極値問題の解は必ず存在し,ただ一つしかないことを証明した。極値問題の解は,R上の有理型二次微分で特微付けられる。これを応用して,解の境界はあまり複雑にはなり得ないことを示した。この極値問題は,Rの自己等角写像からなす群GがRに真性不連続に作用している場合,次のように変形できる。すなわち,単連結領域Dの族として,Gの非自明な元によるDの像はどれもDとは交わらないようなDの合体を考えるのである。この極値問題においても解の存在と一意性が証明され,解はR上のG不変な有理型二次微分で特微付けられる。さらに,解はRにおけるGの局所有限な基本領域になる,という著しい性質を持つ。特に,Rが単位図のとき,従って,Gがフックス群である,という重要な場合,この基本領域の境界の各成分は単純曲線となす。しかも,これはディリクレ基本領域やフォート基本領域とは一般に異なる基本領域であることも分かった。こうして,基本領域の全く新しい構成法が得られたのである。
非アルコール性脂肪肝疾患のゲノム・エピゲノム解析による病態解明と診断方法の開発

非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)の発症・進行にはゲノムのメチル化が重要である。Differentiallymethylated regions(DMRs)を同定し、DMRのネットワーク解析を行い、NAFLDの線維化進行に重要な遺伝子を同定することを目的に研究を行った。NAFLD患者の肝生検組織のメチル化レベルをIllumina Infinium HumanMethylation450BeadChipにてを測定し、Probe Lasso法にて高度線維化群と軽度線維化群間のDMRを同定した。アメリカ人NAFLD(GSE31803)で再現性が確認されたDMRに存在するCpGサイトのメチル化レベルについてWGCNAにてtopological overlap measure(TOM)を計算した。各DMRに存在するCpGサイトのTOMの平均値からDMRネットワークを同定した。コントロールはドイツ人のデータ(GSE48325)を用いた。NAFLDで同定した610のDMRは2個のネットワーク(NW1、NW2)を形成した。NW1は34のDMRから形成されPEMTなどの代謝関連遺伝子上に存在し、線維化の進行とともにメチル化レベルが増加した。NW2は28のDMRから形成され転写調節(ZBTB38、TLE3、CASZ1)や細胞骨格調節(FMN1、RHOD、ARHGEF25)に関連する遺伝子、RhoAシグナル系の遺伝子(ADGRG1、CASZ1)、細胞増殖(TIMP2、ITGA3)、がん遺伝子(AGRN)に存在していた。これらのメチル化レベルは線維化、年齢、空腹時血糖と強い相関を認めた。コントロールではNW1は認められず、NW2にみ認められメチル化レベルは年齢と強く相関した。減量でメチル化レベルの可逆性が認められたDMRはNW1に存在し、NW2には可逆性のあるDMRは存在していなかった。非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)の肝臓RNAシークエンスの結果について、TopHat、Cufflinksにて発現定量を行った。繊維化レベルにより軽症NAFLDと進行NAFLDの2群に分け、2群間で約1700の発現変動遺伝子を同定した。発現変動遺伝子について遺伝子共発現ネットワークの解析ツールであるweightedgene co-expression network analysis(WGCNA)を用いて解析を行った。その結果4つのモジュールにクラスターされた。一番大きなモジュールには細胞外マトリックスやシグナルに関連する遺伝子が集簇しており、4個のハブ遺伝子を有するスケールフリーネットワークを構成していた。ハブ遺伝子には細胞外マトリックスに関連するPAPLN、癌抑制作用のあるLBH、DPYSL3、癌関連遺伝子のJAG1が含まれており、いずれもNAFLDの線維化進行に伴い発現量が増加していた。NAFLDの線維化や癌発症に重要な役割を果たすと考えられた。2番目のモジュールにはミトコンドリアに存在する遺伝子が集簇しており、ランダムネットワークを構成していた。これらの遺伝子はNAFLDの線維化進行に伴い減少し、従来報告されてきたミトコンドリア機能異常を反映していた。3つ目のモジュールはネットワークを形成しなかったが、核内に存在する遺伝子が多く含まれていた。肝臓RNAシークエンスによりNAFLDの病態を分子レベルで包括的に示すことができた。同じ肝臓組織よりゲノムを抽出し、メチル化解析も行った。発現変動遺伝子の大半はゲノムDNAのメチル化の変化を伴っており、DNAメチル化がNAFLDの病態に関連することを明らかにして、論文報告を行った。RNAシークエンスを行った同一人物の血液ゲノムのエクソンシークエンスを行い、RNAとDNAの多型を同定した。RNAシークエンス解析については論文が受理されたことが大きい。単に発現変動遺伝子を同定しただけでなく、知識ベースに依存しない遺伝子ネットワーク解析により、NAFLDの病態を説明できる包括的な解析が出来た。メチル化解析については、日本人での解析と既に報告されているアメリカ人のデータを用いて解析し、NAFLDの進行に重要な遺伝子を20以上同定することが出来た。その結果をまとめて論文を作成し投稿するに至っている。さらに、エクソンシークエンスの解析も開始出来たので、おおむね順調に進行していると考える。非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)患者60名の肝生検組織よりゲノムを抽出し、バイサルファイト処理後、イルミナIllumina Infinium HumanMethylation450 BeadChipにてメチル化レベルを測定した。軽度線維化群(35名)と高度線維化群(25名)の2群間でメチル化レベルに有意差を認めたCpGサイトを同定した。Weighted gene co-expressed network analysis (WGCNA)を用いてco-methylation解析を行った。Probe Lasso法にてdifferentially methylated regions (DMRs)を同定した。2群間で有意差のあった59,858 CpGサイトは3個のmoduleに分類された。Module 1に属するCpGサイトは高度線維化群でメチル化が低下していた。免疫反応に関連している遺伝子が多く、NAFLDに伴う炎症に関連していることが示唆された。Module 2に属するCpGサイトは高度線維化群でメチル化が増加していた。ミトコンドリアに存在する遺伝子や酸化還元、脂質代謝に関連する遺伝子上に存在するCpGが多く、NAFLD進行に伴うミトコンドリア機能異常に関連していると考えられた。610のDMRを同定した。DMRのメチル化が低下し発現が増加する遺伝子には細胞増殖に関連しているCYR61、PDGFA、FGFR2、ZBTB38が含まれており、NAFLDが癌化しやすい状態にあることが示唆された。

DMRのメチル化が増加し、発現が減少する遺伝子には代謝関連の遺伝子が含まれていた。多くのDMRは減量治療前後でメチル化レベルに変化を認めなかった。いくつかの遺伝子上に存在するDMRのメチル化レベルは高度線維化群で増加し、減量でメチル化レベルが低下していた。ゲノムワイドメチル化解析が終了し論文報告を行った。データベースを利用して、NAFLDの進行に伴うメチル化レベルの増加が減量により低下するDMRを同定できた。エクソンシークエンスを20検体まで終了しマッピングまで終了した。メチル化解析については、新たな解析を行い論文作成し投稿している。非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)の発症・進行にはゲノムのメチル化が重要である。Differentiallymethylated regions(DMRs)を同定し、DMRのネットワーク解析を行い、NAFLDの線維化進行に重要な遺伝子を同定することを目的に研究を行った。NAFLD患者の肝生検組織のメチル化レベルをIllumina Infinium HumanMethylation450BeadChipにてを測定し、Probe Lasso法にて高度線維化群と軽度線維化群間のDMRを同定した。アメリカ人NAFLD(GSE31803)で再現性が確認されたDMRに存在するCpGサイトのメチル化レベルについてWGCNAにてtopological overlap measure(TOM)を計算した。各DMRに存在するCpGサイトのTOMの平均値からDMRネットワークを同定した。コントロールはドイツ人のデータ(GSE48325)を用いた。NAFLDで同定した610のDMRは2個のネットワーク(NW1、NW2)を形成した。NW1は34のDMRから形成されPEMTなどの代謝関連遺伝子上に存在し、線維化の進行とともにメチル化レベルが増加した。NW2は28のDMRから形成され転写調節(ZBTB38、TLE3、CASZ1)や細胞骨格調節(FMN1、RHOD、ARHGEF25)に関連する遺伝子、RhoAシグナル系の遺伝子(ADGRG1、CASZ1)、細胞増殖(TIMP2、ITGA3)、がん遺伝子(AGRN)に存在していた。これらのメチル化レベルは線維化、年齢、空腹時血糖と強い相関を認めた。コントロールではNW1は認められず、NW2にみ認められメチル化レベルは年齢と強く相関した。減量でメチル化レベルの可逆性が認められたDMRはNW1に存在し、NW2には可逆性のあるDMRは存在していなかった。メチル化解析の結果について論文受理を目指す。
皮膚悪性腫瘍微小環境の新たな評価法:適切な再建と診断を目指して

乳房外Paget病における血管新生は病期の進行に伴い増大するが、リンパ管新生は表皮内癌の段階で既に強力に誘導され、病期の進行とともに増大するものではないことが明らかとなった。一方で浸潤癌においてはNカドヘリン陽性を示すPaget細胞が皮-間葉転換(EMT)を来すことで、高い浸潤能を獲得することが示唆された。さらに、悪性度の高いPaget細胞はEMTを来たして原発巣でリンパ管を活性化し、リンパ行性転移を促進していることが示唆された。乳房外Paget病/Paget癌患者の87症例の皮膚病変部及び正常部より得タパラフィン切片に対して第VIII因子(血管)及びpodoplalin(リンパ管)に対する抗体を用いて蛍光二重染色を行った。二重蛍光免疫組織染色を行なった切片を共焦点レーザー顕微鏡(Zeiss LSM510)で観察し、画象ソフトウェアを用いて血管・リンパ管の単位面積あたりの管腔の相対占有面積(BVA)を算出した。これを1.Paget病とは無関係の正常皮膚群、2.手術の際に切除した辺縁皮膚群、3.表皮内(Stage IA)、4.組織学的浸潤癌(Stage IB-IV)の4群に分け、血管・リンパ管各々について検討した。統計学的解析はWelchのt検定およびX^2検定で行い、p値が0.05未満を有意とした。表皮内癌では血管のBVAは5.77+0.45%であるのに対して、浸潤癌では7.25+0.45%であった(P=0.0267)。一方、正常皮膚、及び手術摘出組織断端皮膚のBVAは各々1.05+0.10%、1.00+0.09%であり、両者に有意差は認めなかった(P=0.684)。しかしながら、正常皮膚と表皮内癌のBVAを比較すると、表皮内癌において明らかにBVAが増加していることが明らかとなった(P<0.001)。従って、乳房外Paget病における血管新生は、病期の進行に伴い増大することが明らかとなった。一方、リンパ管新生において、表皮内癌ではリンパ管の相対占有面積(LVA)は2.17+0.15%浸潤癌では2.32+0.27%であり、表皮内癌との間に明らかな差は同定し得なかった(P=0.632)。また、正津皮膚、及び手術摘出組織断端皮膚のLVAは各々0.63+0.07%、0.46+0.05%であり、両者に有意差は認めなかった(P=0.063)。しかしながら、正常皮膚と表皮内癌のLVAを比較すると、表皮内癌ではすでにLVAが顕著に増加していることが明らかとなり(P<0.001)、乳房外Paget病におけるリンパ管新生は、表皮内癌の段階で既に強力に誘導され、病期の進行とともに増大するものではないことが明らかとなった。乳房外Paget病/Paget癌患者の87症例の皮膚病変部及び正常部より得たパラフィン切片に対して、第VIII因子(血管)及びpodoplanin(リンパ管)に対する抗体を用いて蛍光二重染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡(Zeiss LSM510)で観察し、画象ソフトウェアを用いて血管・リンハの単位面積あたりの管腔の相対占有面積(BVA)を算出した。これを1.正常皮膚群、2.病変部の辺縁正常皮膚群、3.表皮内(Stage IA)、4.組織学的浸潤癌(Stage IB-IV)の4群に分け、統計学的解析(Welchのt検定およびχ^2検定:p値が0.05未満で有意)を行った結果、乳房外Paget病こおける血管新生は病期の進行に伴い増大するが、リンパ管新生は表皮内癌の段階で既に強力に誘導され、病期の進行とともに増大するものではないことが明らかとなった。一方で浸潤癌43例のうち浸潤度が高く、所属リンパ節転移陽性であった14例では上皮一間葉転換(EMT)を来しており、腫瘍細胞の高い浸潤能が示唆された。さらに、悪性度の高いPaget細胞はケモカイン受容体CXCR4を発現しており、さらに、原発巣で活性化したリンパ管は、CXCR4の特異的リガンドであるstromal cell-derived factor-1 (SDF-1)を発現しいた。すわなち、乳房外Paget病では、CXCR4-SDF-1及びEMTを介したリンパ管侵襲が、リンパ行性転移を促進していることが示唆された。乳房外Paget病/Paget癌患者の87症例の皮膚病変部及び正常部より得たパラフィン切片に対して、第VIII因子(血管)及びpodoplanin(リンパ管)に対する抗体を用いて蛍光二重染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡(Zeiss LSM510)で観察し、画像ソフトウェアを用いて血管・リンパ管の単位面積あたりの管腔の相対占有面積(BVA)を算出した。

これを1.正常皮膚群、2.病変部の辺縁正常皮膚群、3.表皮内(Stage IA)、4.組織学的浸潤癌(Stage IB-IV)の4群に分け、統計学的解析(Welchのt検定およびx^2検定:p値が0.05未満で有意)を行った結果、乳房外Paget病における血管新生は病期の進行に伴い増大するが、リンパ管新生は表皮内癌の段階で既に強力に誘導され、病期の進行とともに増大するものではないことが明らかとなった。一方で浸潤癌43例のうち浸潤度が高く、所属リンパ節転移陽性であった14例において、EカドヘリンおよびNカドヘリン抗体を用いた二重蛍光組織染色から、これらの細胞が皮-間葉転換(EMT)を来しており、腫瘍細胞の高い浸潤能が示唆された。さらに、悪性度の高いPaget細胞はケモカイン受容体CXCR4を発現しており、さらに、原発巣で活性化したリンパ管は、CXCR4の特異的リガンドであるstromal cell-derived factor-1 (SDF-1)を発現していた。さらに表皮内癌の段階で既に多発リンパ節転移をきたした2症例における蛍光二重染色で、真皮内の拡張したリンパ管内にN-カドヘリンを発現した腫瘍細胞の浸潤がみられたが、表皮内のPaget細胞はN-カドヘリンを発現していなかった。このことから、乳房外Paget病では、CXCR4-SDF-1及びEMTを介したリンパ管侵襲が、表皮内癌の段階でもリンパ行性転移を促進している可能性が示唆された。
シグナル伝達を調節するSCFリガーゼ

SCF複合体の既知の構成分子Skp1、Cul1、Rbx1、F-boxタンパク質等にTAPタグをつけ、TAPシステムによって会合因子を単離する実験系を確立し、マイクロシークエンサー及び質量分析器でそのタンパク質配列を明らかにした。そのなかには転写調節に重要であるTIP120AがSCF複合体構成成分と結合していることが判明した。またSCF^<Fbw7>の機能解析を目的に、Fbw7ノックアウトマウスを作製したところ、心臓奇形等で胎生致死となり、Fbw7が発生学上Notch系のシグナルに関与することを明らかにした。また、Fbw7がリン酸化依存性に癌遺伝子であるMycのユビキチン化及び分解の制御に関与することを報告した。さまざまなタンパク質合成および修飾ミスにより細胞質で不溶化するタンパク質が存在するが、分子シャペロン等が異常たんぱく質の修復に関与することが報告されている。申請者はもうひとつの異常タンパク質処理メカニズムとしてユビキチン-プロテアソーム系に注目した。つまり、物性が正常にとれないタンパク質をユビキチン化し分解するユビキチンリガーゼの存在を明らかにすることを目的として研究を遂行した。申請者は実際に、タンパク質の品質管理に関する酵素として新たなユビキチンリガーゼ(U-ボックスタンパク質群)を同定し、疾患との関係を解析している。その基質タンパク質や調節タンパク質を同定するために、酵母Two-hybrid法およびTAPシステムによる結合タンパク質の存在をみいだしている。実際に、さまざまな種類のシャペロン群がU-ボックスタンパク質と物理的及び機能的に関わっていることを明らかにした。また、疾患との関係において、特に神経変性疾患(アルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、筋萎縮性側索硬化症など)にU-ボックスタンパク質が異常タンパク質の分解調節に関与することを明らかにした。ユビキチン化された蛋白分子がプロテアソームにより分解される系は、様々な細胞内シグナル分子の発現制御及び活性化において重要な反応系である。中でもSCFユビキチンリガーゼ(E3)の系は特に、細胞周期、発生におけるシグナル伝達に重要であることが示された。その活性制御機構を明らかにするために、まずSCF複合体に結合するタンパク質の取得を試みた。1)新規のSCF結合タンパク質の単離と解析SCF構成要素の一つであるSkp1を餌としてYeast two hybrid法を用い、SCFへの新規結合タンパク質の取得を行った。その結果、4種の新規タンパク質が取得され、その中には、新規のF-boxタンパク質等が含まれていた。これらはいずれもin vivoでSkp1と結合することが確認された。中でもSbp2を酵母の中で高発現すると、フローサイトメーターによる解析で多倍数体の出現が認められ、細胞が致死になることが見いだされた。種々のSbp2欠失変異体を作成し、Skp1及びSCF遺伝子群との遺伝学的解析を進めたところ、Sbp2のF-box領域およびそれに隣接するリンカードメインがSCFに対し負の効果をもたらすことが明らかになった。2)TAPシステムを用いたSCF結合タンパク質の取得最近開発されたTAP(Tandem Affinity Purification Tag)システムを用い、FWD1,Skp2,Cull,Cul2,Cul3複合体を精製した。この場合、対照標品には結合タンパクが全く見られないことから、これらに見られる結合タンパク質は上記タンパク質に対する真の結合タンパクであることが示された。この中には、Skp1,Rbx1、elongin B,elongin Cはもとより新規タンパク質数種が含まれていた。これらはSCFの活性制御などに関わっている可能性が考えられる。現在マススペクトロメーターでこれらのアミノ酸配列の決定を行っている。現在まで蛋白分解機構が報告されているが、特に、酵母におけるユビキチン依存性プロテアソーム介在性蛋白分解に関する研究により、Skp1、Cul-1、F-box蛋白複合体(SCF複合体)と言われるユビキチン化を実行する酵素複合体は、細胞周期をはじめ、さまざまな細胞機能に関与する分子の発現調節(分解調節)を行っていることが明らかになった。SCFとはSkp1、Cul1、F-ボックス蛋白(基質認識受容体)からなるユビキチンリガーゼ(E3)複合体である。我々は、酵母におけるアナロジーを利用して、マウスにおけるSkp1、Cul-1及び複数のFボツクス蛋白を同定した。特に、我々がFWD1/β-TrCP(1つのFboxと7つのWD40リピートを有する)として同定したF-box蛋白は、免疫学上重要であるNF-κBの抑制分子であるIκBαと、細胞接着もしくは癌の分野で注目されるβ-cateninのユビキチン化、及び分解に関与していることを明らかにした。またSkp2というFボックス蛋白を同定し、Skp2の標的分子として、サイクリンEとp27を生化学的及び遺伝学的手法により見い出した。さらに、実際にサイクリンEとp27のユビキチンリガーゼであるかを確証するために、Skp2ノックアウトマウスを作製し、Skp2ノックアウトマウスは野生型マウスと比較して、体重が少なく、全体的に成長が遅い以外、肉眼レベルでは異常は認められなかったが、その線維芽細胞や肝臓細胞においてサイクリンEとp27の蓄積が認められ、これらの細胞において染色体多倍数性や中心体過剰複製などの細胞レベルでの異常所見を認めた。また、最近、HECT型E3、RING型E3と並んでU-ボックス型E3の存在を発見し、その酵素学的解析を発表し、神経変性疾患などの異常蛋白蓄積症に関与するE3の存在を示唆した。

SCF複合体を構成する新規因子の単離同定を行った。SCF複合体の既知の構成分子Skp1、Cul1、Rbx1、F-boxタンパク質等にTAPタグをつけ、TAPシステムによって会合因子を単離する実験系を確立し、マイクロシークエンサー及び質量分析器でそのタンパク質配列を明らかにしている。実際には転写調節に重要であると考えられている分子がSCF複合体構成成分と結合していることが判明した。現在、細胞生物学的に新たなSCF構成成分の役割を検討中である。さまざまなタンパク質合成および修飾ミスにより細胞質で不溶化するタンパク質が存在するはずである。元来、分子シャペロン等が異常たんぱく質の修復に関与することが報告されているが、この他の手段として異常タンパク質を分解するメカニズムが存在する可能性が高い。したがって、物性が正常にとれないタンパク質をユビキチン化し分解するユビキチンリガーゼの存在を明らかにすることを目的として研究を遂行した。そのような分解酵素が存在した場合、神経変性疾患における細胞内封入体のユビキチン化や抗原堤示細胞のClass I MHC上に提示されるペプチドのユビキチン化に関与する可能性も高い。実際に、タンパク質の品質管理に関する酵素として新たなユビキチンリガーゼ(U-ボックスタンパク質群)を同定し、疾患との関係を解析している。その基質タンパク質や調節タンパク質を同定するために、酵母Two-hybrid法およびTAPシステムによる結合タンパク質の存在をみいだしている。実際に、さまざまな種類のシャペロン群がU-ボックスタンパク質と物理的及び機能的に関わっていることを明らかにした。また、疾患との関係において特に神経変性疾患(アルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病など)にU-ボックスタンパク質が異常タンパク質の分解調節に関与することを明らかにしている。そのような分解酵素が存在した場合、神経変性疾患における細胞内封入体のユビキチン化や抗原提示細胞のClass I MHC上に提示されるペプチドのユビキチン化に関与する可能性も高い。
サンゴ礁における炭酸系ダイナミクスと地球環境変動の関係の統合解析

1.サンゴ礁における炭酸系ダイナミクスを長期間連続計測できる全炭酸-アルカリ度自動計測装置を瀬底島サンゴ礁に設置して観測を始めた。連続観測をおこなうことによる以下の初期トラブルを解消した。(1)潮の干満による地下水の湧水の影響が大きいので、塩分計を測定装置に組み込んで自動補正できるように改良した。(2)夏期における太陽日射が強いので測定装置内の温度が許容範囲を超えて上昇するので、冷却用水盤を観測容器上部に取り付けて海水を流して水冷した。(3)台風などの荒天時には海底の砂を巻き上げた海水を揚水するので、計機内の調整槽に砂が貯まってしまう。(4)測定器および現場の状況を把握するためにWebカメラを設置して、計測装置の状況を把握できるように改良した。観測結果について日本化学会西日本大会(2006年9月、沖縄)にて発表した。2.サンゴ礁海水中のPCO2濃度変動を年間を通して15分ごとに観測し、大気海水間のCO2フラックスを求めた。1日ごとのCO2収支を求めて月ごとに積算した値は、2005年12月2006年2月までは大気から海水への吸収を示したが、3月以降12月までは海水から大気への放出を示した。3.PCO2の周期解析をおこなった結果、主要な周期は、13.66日(太陽半月周期)、25.92時間(主太陰周期)、24.09時間(主太陽日周潮)、12.41時間(主太陰半日日周潮)であった。それ以外にも8.19時間、6.21時間、6.10時間の周期も見られたが、これらの由来はわからない。4.サンゴによる代謝活動の2次元その場観察のために、中性子トモグラフィーの基礎的な研究を、Hahn-Meitner研究所(ベルリン,9月)にておこなった。5.瀬底島サンゴ礁における過去6年間の有機炭素生産の観測結果を総括して国際サンゴ礁シンポジウム欧州会議(11^<th>ICRS at Bremen、2006年、9月)にて発表。サンゴ礁における有害化学物質のインパクトについてGoldshmidt国際会議(メルボルン、20066月)にて発表した。6.石西礁湖の竹富海底温泉周辺にて光合成色素の分布を調査した(6月、11月)。その結果、クロロフィルdをもつシアノバクテリア(アカリオクロリス)が生息することが示唆された。クロロフィルdは赤外線を利用して酸素発生型の光合成をおこなうことができる色素であり、海洋における一次生物生産の再評価や光合成過程の進化と多様性の研究に示唆を与え重要な発見である。グローバルな地球環境変動に対するサンゴ礁の応答と役割を明らかにするために、以下のように炭酸システムの時系列観測を継続し、数値モデルに解析をおこなった。