hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
家族の個別化現象と家族的価値再発見の動向に関する実証的調査

それらが今年度の課題達成に大きく作用したことを先にお断りしておきたい。調査項目は主に1、情緒関連項目2、個別化・共同化(2次元操作化)3、夫婦・家族生活への評価4.経済状況変化5、家族境界意識にみる個別化・共同化関連項目で構成し、調査対象は1、東京下町地域住民カップル2、大学院卒女性およびそのパートナー3、有職女性およびそのパートナー4、短大生を持つカップル(7年前の調査との比較対象集団)とし、(1)は無作為抽出で、(2)(4)は有意抽出をした。留置法と郵送法を併用。一部の対象グループの都合等により実査が長期化し、現在、分析に取りかかりつつある。
生殖細胞を介さず次世代へと伝わる菌細胞ゲノムの遺伝学・進化学的解析

多細胞生物の体は、単一の生殖細胞に由来する細胞の集合体であると、常識的に考えられている。しかし、我々は先攻研究でタバココナジラミBemisia tabaci MEAM1系統を対象とした予備実験を行い、その必須の共生細菌を収納する細胞である“菌細胞"は、独自の遺伝機構を持ち、他の体組織の細胞とはゲノム組成まで異なっている可能性を見出した。本研究課題では、コナジラミ菌細胞の次世代への遺伝様式の詳細な検証や、コナジラミ科昆虫における菌細胞ゲノムの進化、コナジラミ菌細胞ゲノムで独自進化した遺伝子の検出と機能解明を目的とする。平成29年度は、以下の研究成果を得た。研究課題3)菌細胞ゲノムで独自発達した遺伝子の探索と機能解析タバココナジラミMEAM1系統の菌細胞ゲノム、および頭部から抽出した体細胞ゲノムを対象に、複数の候補遺伝子を対象に菌細胞特異的な配列をクローニング法によって検出することを試みた。その結果、リボソーマルタンパク質遺伝子の5'非翻訳領域に、菌細胞特異的な配列が検出された。そこで、およそ1,000個体のメス個体を材料に摘出した菌細胞および体細胞から、ゲノムDNAを抽出し、Illumina HiSeq用のシーケンスライブラリを作成した。現在、シーケンス結果を解析中である。一方、菌細胞と体細胞のそれぞれから調整したミトコンドリアの全ゲノム配列については完全長が得られたので、両者を比較した。その結果、両者のゲノム間に相違は全く検出されなかった。この結果は、菌細胞と体細胞ゲノムの分化はそれほど進んでいないことを示唆する。これは、昨年までの別種コナジラミの菌細胞ゲノム伝達様式との比較から得られた「タバココナジラミ菌細胞ゲノムの母系遺伝様式は比較的最近に獲得されたものである」という示唆に合致するものであった。昨年度までに、タバココナジラミならびに別種コナジラミにおける菌細胞ゲノムの伝達様式を明らかにすることができた。ミトコンドリアゲノムの解析とあわせて、菌細胞ゲノムの進化についても重要な知見を得ることができた。一方、全ゲノムシーケンスに用いたライブラリ調整においては、菌細胞というきわめて微小な組織からのゲノムを必要量あつめるのに想定以上の時間を有してしまった。総じて、研究は概ね順調に進展したと言える。今年度までに行ったゲノムシーケンスライブラリーを対象に、菌細胞および体細胞をゲノムワイドに解析する。体細胞ゲノムとの変異の程度や、機能遺伝子配列の変異などを確認する。しかし、我々は先行研究で行った予備実験により、タバココナジラミBemisia tabaci MEAM1系統を対象とした解析を行い、その必須の共生細菌を収納する細胞である“菌細胞"は、独自の遺伝機構を持ち、他の体組織の細胞とはゲノム組成まで異なっている可能性を見出だした。平成27年度は、以下の研究成果を得た。1)菌細胞の伝達様式の遺伝学および組織化学的検証3つの独立したラインを対象に、最大5世代までにわたって、4種のマイクロサテライトマーカーを用いた遺伝学的解析をおこなった。その結果、菌細胞の遺伝型は体細胞とは確かに異なっており、父親由来のゲノムが交じることなく、母親の菌細胞と同一の遺伝型がそのまま伝えられることが明らかになった。また、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)を用いて、発生段階ごとに、菌細胞と共生細菌を組織化学的に解析した。その結果、卵に伝えられた母親に由来する菌細胞は、肥大化・分裂を続けた。また、体細胞から新たに菌細胞が生じる様子は観察されなかった。以上の結果から、菌細胞には独自の遺伝機構が存在し、独自の遺伝型をもっていることが示された。2)コナジラミ科昆虫における菌細胞ゲノム組成の遺伝学的・系統進化学的解析コナジラミ科に属する、タバココナジラミMED Q1、オンシツコナジラミ、チャトゲコナジラミのサンプルを入手した。今後、菌細胞の解剖およびミトコンドリアCOIやND5、ribosomal RNA遺伝子のITSといった高変異領域をPCR増幅し、塩基配列を比較を行う。コナジラミ科昆虫における菌細胞ゲノム組成の遺伝学的・系統学的解析については材料の入手等に時間がかかり計画通り進まなかった面もあるが、伝達様式の遺伝学および組織化学的検証においては、大規模な交配実験とマイクロサテライトマーカーをつかった解析により、確かに菌細胞が生殖細胞とは独立した遺伝様式をもつことを示すことに成功した。計画は、概ね順調に進展している。しかし、我々は先攻研究で行った予備実験により、タバココナジラミBemisia tabaci MEAM1系統を対象とした解析を行い、その必須の共生細菌を収納する細胞である“菌細胞"は、独自の遺伝機構を持ち、他の体組織の細胞とはゲノム組成まで異なっている可能性を見出した。

本研究課題では、コナジラミ菌細胞の次世代への遺伝様式の詳細な検証や、コナジラミ科昆虫における菌細胞ゲノムの進化、コナジラミ菌細胞ゲノムで独自進化した遺伝子の検出と機能解明を目的とする。平成28年度は、以下の研究成果を得た。研究課題2)コナジラミ科昆虫における菌細胞ゲノム組成の遺伝学的・系統新科学的解析オンシツコナジラミTrialeurodes vaporariorumの2種類の実験室系統を交配させ、菌細胞ゲノムの伝達様式を解析した。4種類のマイクロサテライトマーカーを用いて、3ラインを最大3世代目まで解析した。その結果、全てのサンプルで、菌細胞ゲノムの遺伝様式は体細胞同様に両性遺伝で説明することが可能であり、母系遺伝の証拠は検出されなかった。本結果から、菌細胞ゲノムの母系遺伝の様式は、オンシツコナジラミとタバココナジラミが共通祖先から分岐した後に、タバココナジラミで獲得されたものであることが示唆された。研究課題3)菌細胞ゲノムで独自発達した遺伝子の探索と機能解析タバココナジラミMEAM1系統の菌細胞ゲノム、および頭部から抽出した体細胞ゲノムを対象に、複数の候補遺伝子を対象に菌細胞特異的な配列をクローニング法によって検出することを試みた。その結果、リボソーマルタンパク質遺伝子の5'非翻訳領域に、菌細胞特異的な配列が検出された。今度、全ゲノムを対象とした詳細な解析を行う。昨年度までに確立したオンシツコナジラミ系統を用いて遺伝学的解析を行うことにより、コナジラミ科における菌細胞ゲノムの遺伝様式の多様性を明らかにすることができた。このことは、タバココナジラミにおいて、菌細胞ゲノムの遺伝様式が比較的最近に生じたことを意味しており、遺伝様式の進化を考察する上で興味深い成果が得られたと考えられる。計画は、概ね順調に進展している。多細胞生物の体は、単一の生殖細胞に由来する細胞の集合体であると、常識的に考えられている。しかし、我々は先攻研究でタバココナジラミBemisia tabaci MEAM1系統を対象とした予備実験を行い、その必須の共生細菌を収納する細胞である“菌細胞"は、独自の遺伝機構を持ち、他の体組織の細胞とはゲノム組成まで異なっている可能性を見出した。平成29年度は、以下の研究成果を得た。そこで、およそ1,000個体のメス個体を材料に摘出した菌細胞および体細胞から、ゲノムDNAを抽出し、Illumina HiSeq用のシーケンスライブラリを作成した。現在、シーケンス結果を解析中である。一方、菌細胞と体細胞のそれぞれから調整したミトコンドリアの全ゲノム配列については完全長が得られたので、両者を比較した。その結果、両者のゲノム間に相違は全く検出されなかった。この結果は、菌細胞と体細胞ゲノムの分化はそれほど進んでいないことを示唆する。
転写因子HES1を制御する小分子化合物の探索と応用

小分子によって、細胞分化の分岐点にかかわるタンパク質間相互作用の抑制を試みた。まず目的のタンパク質間相互作用を検出できる蛍光偏光を用いたスクリーニング系を構築した。相互作用に特に重要なトリプトファン(W)-アルギニン(R)-プロリン(P)-トリプトファン(W)ペプチドを含むペプチドを合成した。さらにこのぺプチドに蛍光基(FAM)を付加し蛍光ペプチドが完成した。このペプチドと相互作用するタンパク質TLE1のC末端部分のWDドメイン(TLE1WD)を昆虫細胞でヒスチジンタグを付加して発現させた。このタグを利用し、ニッケルカラムによってTLE1WDを精製した。この精製したTLE1WDと合成した蛍光ペプチドの相互作用を蛍光偏光を用いて観察し、タンパク質の濃度依存的に蛍光偏光が強くなることが観察された。さらに蛍光基のないペプチドで競合試験も行い、蛍光ペプチドとペプチドの競合がみられた。以上のように、スクリーニング系の構築が完了した。この蛍光基のないペプチドをポジティブコントロールとして、2939個の小分子を用いてスクリーニングを行なった。その内2つのヒット化合物を得た。この化合物の構造活性相関を行い官能基の必須な位置が分かった。さらにどのように活性を上げられるかを考えるため、TLE1WDと化合物との共結晶構造解析を試みた。共結晶化に取り組んだが、まだ結晶は得られていない。細胞内での化合物活性を評価するための系の構築を試みた。しかしトランスフェクションした目的のタンパク質ではなく、内在性のタンパク質の存在が評価に影響していることが考えられ、さらなる改良が必要となった。細胞分化を制御する出発点となる化合物の取得に成功した。さらなる構造活性相関研究により創薬への応用が期待できる結果が得られた。
木材・木質材料の材質劣化同に関与する微小欠陥部の形態とその力学的評価

本研究では,木材・木質材料の基本的構成単位である木材細胞壁の材質的劣化に関与する微小欠陥部として,外力によって壁中に発生するスリッププレ-ン(SP)と,微生物の菌体外酵素によって発生する微細腐朽を取りあげ,これらの形態的特徴と,これらが木材・木質材料の強度的性質に及ぼす影響について評価した。SPについては主に平成元年度に,微細腐朽については平成2年度に実験を行った結果,以下の結論を得た。(1)SPの発生していた木材(圧縮破損材)は健全材に比べて,強度的性質が著しく低下し,材質的に弱くしかも脆くなるのが特徴であった。SPは,圧縮破損程度が低い場合には,材全体に均一にしかも粗に分布していたが高負荷レベるで圧縮破損した場合は,材中に明瞭な破壊線(シワ)を生じ,この付近に集中的に発生していた。圧縮破損材中のSP傾斜角と破断部の壁破面傾斜角が一致したことにより,圧縮破損材は最終的にSPのところで破断することが判明した。さらに,本実験では,SPの発生数や発生頻度と材質劣化度との関連性を定量化することに成功し,SPが木材の材質を劣化させる重要な因子であることを明らかにすることができた。(2)木材細胞壁は,木材腐朽菌やカビ類によって材質が著しく劣化されたが,キトサン処理することによってこれらによる劣化を効果的に防除できることが分った。とくに,木材腐朽菌のCOVやSELに対して顕著な生育抑制効果があり,しかも処理試験片表面にはこれらの菌による腐朽跡や付着跡が全く認められなかった。これらのことから,キトサンは木材の材質を生物的に劣化する菌の菌体外酵素の分泌を効果的に抑制しているようであった。この点については,基礎的・応用的両面から,今後の研究課題としたい。本年度の研究では、木材や木質材料の材質劣化に関与すると思われる微小欠陥部として、これらの主要構成要素である仮道管や木繊維細胞壁のS_2中に存在するスリッププレ-ンを取りあげ、これの形態的特徴ならびに発生状況、発生数と強度的性質との関連性について明らかにすることを目的とした。この目的達成のために、本研究では,異なる荷重レベルで供試材料(スギ、コナラ)を縦圧縮すること(予備圧縮)によって人為的にスリッププレ-ン発生密度を変えた試料を調製し、これの縦引張強度特性および、壁中のスリッププレ-ン発生数、スリッププレ-ンの形態計測を行った。とくに、壁中のスリッププレ-ンの検出および発生数の測定には、本年度補助金によって購入した高解像度テレビ付光学顕微鏡を用いた。本設備は、無染色解繊試料中のスリッププレ-ンを容易に検出することができ、しかもVTRに記録した光顕画像と現有の画像解析装置を用いてスリッププレ-ンの傾斜角度を迅速に測定することができた。本研究の結果:(1)スリッププレ-ンは縦圧縮最大荷重の25%荷重レベルから発生し、最大荷重(100%荷重レベル)附近で急増する、(2)スリッププレ-ンは放射組織と交差するところに集中的に発生する、(3)50%荷重レベルで、靱性は約25%低下し、強度は10%低下するが,100%荷重レベルでは靱性の約8割が失われ、強度も半分以下になるなど、スリッププレ-ンは材質を著しく劣化させる、(4)スリッププレ-ンは繊維軸に対して6065°傾斜している、(5)最終破断はスリッププレ-ンのところで発生する、などが明らかとなった。このように、スリッププレ-ンは低い荷重レベルから木材中の特定部位に発生し、しかもこれが材質を著しく脆化させる要因であることが判明した。

平成2年度は微生物により生じた微小欠陥部を取りあげ、これによる材質劣化を検討する予定であり、それに必要な基礎的実験を本年度内に実施完了した。本年度の研究では,木材・木質材料の細胞壁が微生物の体外分泌酵素によって劣化した部位を微小欠陥部として取りあげ,これの形態的特徴と力学的性質に及ぼす影響について検討した。本研究では,とくに微生物による欠陥部の発生を抑制する新らしい手法(キトサンを用いた防腐処理法)の開発に係わる基礎的研究に重点をおいた。2%乳酸水溶液に溶解した1.5%高分子キトサン溶液を均一に塗布したブナ板目切片を,3種の木材腐朽菌(COV,TYP,SEL)と5種のカビ類(AUP,GLV,PEF,ASN,RHJ)で強制的に劣化促進試験を行い,無処理のものと比較した。劣化部位の形態的特徴ならびに破断形態をSEMで観察するとともに,処理および無処理試験片の強度的特性(縦引張強度,縦引張ヤング率,破壊までの仕事量)の変化を,劣化促進期間中1週間毎に調べた。その結果,以下の結論を得た。(1)キトサン処理試験片では,木材腐朽菌やカビ類の生育が著しく抑制され,とくに白色腐巧菌のCOV,褐色腐朽菌のSEL,カビ類ではAUP,GLV,RHJにおいて,その効果は顕著であった。(2)キトサン処理試験片では,強制劣化後もSEM観察した限り,道管・木繊維内腔表面に何んらの腐朽跡も観察されず,また菌糸の付着跡も認められなかった。さらに壁破断形態も健全のそれと同じであった。これらのことから,キトサン処理は,木材の微生物による微小欠陥部の発生を効果的に抑制することが分った。(3)無処理試験片では,COV,SELによる3週間腐朽で強度的性質が急激に低下したのに対して,キトサン処理試験片では5週間腐朽においても健全材と同等であった。以上のことから,キトサンは市販の化学防腐剤とは全く異なり,無害の天然系素材でありながら,木材・木質材料を腐巧する微生物による酵素的劣化を顕著に抑制できることが判明した。
遠心羽根車インデューサ翼端漏れ渦による不安定流動発生機構の解明

本研究では、インデューサ付き径向き羽根遠心羽根車内流れの3次元粘性数値解析および実験解析により、入口循環流形成に基づく不安定流動抑制効果および予旋回が羽根車特性に与える影響を追究するとともに、サージ発生の原因と考えられる前縁剥離すなわち限界入射角について検討することによって、運転流量範囲拡大および羽根車特性改善のための最適な入口循環流形成デバイスを提案した。まず、3次元粘性数値解析により、(1)初期の不安定流動は、インデューサ喉部近傍の翼端漏れ流れと隣接羽根圧力側に生じる局所的逆流域内の主流方向縦渦との相互干渉による翼端漏れ流れの巻上がり現象に起因していること、(2)サージ初生流量近傍での不安定要素は羽根前縁に発生する剥離泡の形成であり、遠心羽根車の限界入射角は二乗平均半径位置で判断できること、また、供試遠心羽根車のそれは、二次元翼列の7.2[deg]より大きい9.0[deg]であること、(3)循環流形成デバイスによる不安定流動の抑制効果がシュラウド壁面上の逆流域の吸出し、および流入流量増大に基づく入射角の低減にあること、(4)低流量においては、循環流の旋回成分に基づく予旋回が羽根車内圧力上昇を低下させるので、上流溝部分に装着したガイドベーンの設定角度を変化して予旋回強さを制御することにより、運転範囲の更なる拡大および羽根車特性の改善が同時にできることを検証した。その結果、ガイドベーン付環状溝による循環流形成デバイスの効果として、(5)循環流が有する旋回成分の入射角低減効果が上流溝の設置により促進されること、(6)上流溝にガイドベーンを挿入することにより入射角の過剰低下を抑制し、かつ、インデューサにおける圧力上昇が増して循環流量が増加すること、(7)適切なガイドベーン設定角を与えることにより、羽根車特性を悪化することなく不安定流動発生流量を53%低流量側へ移行できること、などを明らかにした。本研究では、インデューサ付遠心羽根車の低流量域で発生する不安定流動を抑制して運転流量範囲を拡大するために、不安定流動の発生機構の明確化とともに、設計流量並びに過大流量域においても羽根車性能を悪化することなくインデューサ失速を抑制するための入口循環流形成デバイスの最適化を目指して、CFD解析と実験の両面から追究した結果、低流量域での不安定流動の発生機構として、インデューサ翼端漏れ渦の不安定な巻き上がり、羽根なしディフューザ内の逆流、およびインデューサ前縁における過大入射角の3つを明確に分類した。得られた主な知見は以下のとおりである。(1)初期の不安定流動は、インデューサ喉部近傍の翼端漏れ流れと隣接羽根圧力側に生じる局所的逆流域内の主流方向縦渦との相互干渉による翼端漏れ流れの巻上がり現象に起因していると推定された。(2)ディフューザ通路幅を約2/3幅に縮小することにより、設計流量での性能を悪化することなくディフューザ失速に基づく不安定流動を抑制できる。(3)羽根車入口で限界入射角を越える場合に前縁剥離に基づくサージが発生する。二乗平均半径位置における限界入射角は約9°であり、二次元翼列の場合よりわずかに大きい。(4)過大流量時のバイパス流吹出しに基づく羽根車性能低下を最小にするためには、下流側環状溝コーナーに適度な丸みを与えること、また、適切な幅を有する上流側環状溝を設けることが有効である(5)循環流形成デバイス流路内に設置したガイドベーンによって、循環流が有する予旋回強さを抑制することにより循環流量が増大され、ひいては入射角が低減されるとともに羽根車特性が顕著に改善される。

(6)ガイドベーン付入口循環流形成デバイスとディフューザ流路幅縮小により、サージ発生流量を約50%低流量側へ移行できることが検証された。本研究では、インデューサ付き径向き羽根遠心羽根車内流れの3次元粘性数値解析および実験解析により、サージ発生の原因と考えられる前縁剥離すなわち限界入射角について検討するとともに、入口循環流形成に基づく予旋回が羽根車特性に与える影響を追究することによって、運転流量範囲拡大および羽根車特性改善のための最適な入口循環流形成デバイスを提案した。まず、3次元粘性数値解析における計算格子を精緻なものにすることにより、サージ初生流量近傍での不安定要素として羽根前縁に発生する剥離泡の存在およびその挙動を明らかにした。その結果、遠心羽根車の限界入射角は二乗平均半径位置で判断することが適当であり、供試遠心羽根車のそれは、二次元翼列の7.2[deg]より大きい9.0[deg]であることを明らかにした。次いで、循環流形成デバイスによる不安定流動の抑制効果が、シュラウド壁面上の逆流域の吸出し、および流入流量増大に基づく入射角の低減にあることを明らかにした。また、低流量においては、循環流の旋回成分に基づく予旋回が羽根車内圧力上昇を低下させるので、上流溝部分に装着したガイドベーンの設定角度を変化して予旋回強さを制御することにより、運転範囲の更なる拡大および羽根車特性の改善が同時にできること数値解析で示すとともに実験的に検証した。その結果、ガイドベーン付環状溝による循環流形成デバイスの効果として、(1)循環流が有する旋回成分の入射角低減効果が上流溝の設置により促進されること、(2)上流溝にガイドベーンを挿入することにより入射角の過剰低下を抑制し、かつ、インデューサにおける圧力上昇が増して循環流量が増加すること、(3)適切なガイドベーン設定角を与えることにより、羽根車特性を悪化することなく不安定流動発生流量を53%低流量側へ移行できること、などを明らかにした。
濾過型培養槽を用いる遺伝子組換え菌の二段階培養と好気性菌用バイオリアクターの開発

遺伝子工学を応用した有用物質の生産はいよいよ実用化の段階には入ろうとしているが、遺伝子組換え菌を工業レベルでどのように培養したらよいかという点については例が少なく未知の分野である。我々は種々検討した結果、遺伝子組換え菌を効率的に培養するためには増殖と遺伝子産物の生産の時期をわける二段階培養に必須な遺伝子産物の誘導生産には培地条件をかえてやる必要があるので、濾過型培養槽を適用した。まずトリプトファンプロモーターやphoプロモーターを組込んだプラスミッドを持つ微生物について、トリプトファンやリン酸を含む培地で遺伝子産物の生産を押えて菌を充分増殖させた後、濾過により培地を交換しこれらを含まない培地に変えることにより、遺伝子産物が効率的に誘導生産できることを示した。またトリプトファンプロモーターからの遺伝子発現の誘導は培地中のトリプトファンのみならずグルコースによっても影響を受ける。そこで我々が開発したオンライングルコースアナライザーを利用して、まず高濃度のグルコース存在下で菌を充分増殖させた後、グルコースを欠乏させ遺伝子発現の誘導を行なうことにより、遺伝子産物が効率よく生産できることを示した。濾過培養は特別の操作なしで微生物を固定化できるすぐれた方法であるが未利用の栄養源も濾過によって失なってしまうという欠点がある。そこで濾過培養をより効率化するために生産物やグルコース濃度のオンライン推定を試み、乳酸発酵やグルコン酸発酵、パン酵母の培養などでその有効性を示した。さらに濾過型培養槽で枯草菌遺伝子組換体やグルコン酸菌を高濃度まで培養し、このバイオリアクターが絶対好気性菌の培養にも適用できることを実証した。1.トリプトファンプロモーターからの遺伝子発現は培地中にトリプトファンが存在すると抑制され,逆にトリプトファン非存在下では爆発的に起る.この性質を利用して遺伝子組換え菌における遺伝子産物の効率的生産を行なった.まず,トリプトファンプロモーターにβーガラクトシダーゼ遺伝子を連結したプラスミドを大腸菌に導入した.この大腸菌を最初はトリプトファンを含む培地で高菌体濃度まで培養した.トリプトファンが存在するので,大腸菌が生合成によって作り出すエネルギーの大部分は増殖に使われ,比較的短時間で高菌体濃度になる.つづいて十字流瀘過によって培地を入れかえ,トリプトファンを除去した.このような二段階培養によって, βーガラクトシダーゼの効率的な生産が可能な事を示した.2.抑制型phoプロモーターはトリプトファンプロモーターと類似の機構により,培地中のリン酸により発現制御をうける.そこで,phoプロモーターにβーガラクトシダーゼ遺伝子を連結したプラスミドを酵母に導入した.この酵母をリン酸存在下で高菌体濃度まで培養した後,十字流瀘過によって培地を入れかえ,リン酸を除去することにより,大変効率よく遺伝子産物の生産が酵母でも可能なことを明らかにした.さらに,同様のシステムが大腸菌でも可能なことを実証した.3.乳酸菌を瀘過型養槽を用いて長期間培養するためには,阻害的生成物である乳酸が高濃度にならないように制御する必要がある.また,瀘過流束が低下しない程度に菌体濃度の制御も必要となる.この両者を適切に制御することによって,乳酸菌の連続生産が効率よく行ないうることを示した.1.βーガラクトシダーゼ遺伝子を含むプラスミッドを導入した枯草菌を、濾過型培養槽を用いて好気的に培養した。枯草菌は酢酸など有機酸を分泌しそれらの蓄積が増殖を抑制するので、濾過によりこれらを系外に除くことにより超高菌体濃度迄培養できることを示した。また培養後期に濾過を停止し流加培養に戻すことにより、遺伝子産物を大量に生産できることが明らかになった。2.トリプトファンプロモーターからの遺伝子発現の誘導は、トリプトファンのみならずグルコースによっても大きな影響をうける。そこで我々が開発したオンライングルコース測定装置を利用し、グルコースが消費されたのを確認した後にインドールアクリル酸で遺伝子発現の誘導を行なった。

トリプトファンプロモーターの下流に大腸菌βーガラクトシダーゼ遺伝子を連結したプラスミッドをもつ大腸菌を培養し、グルコース非存在下で誘導を行なったところ、多量のβーガラクトシダーゼが生産された。一方、グルコース存在下では遺伝子産物生産が誘導されなかった。3.グルコースを酸化してグルコン酸を生産するGluconobacter suboxydansは典型的好気性菌である。そこで濾過型培養槽がこのような好気性菌にも適用可能かどうかを検討するため、この菌をホローファイバーを組込んだ培養槽で培養したところ、通常の回分培養の3倍の高菌体濃度が得られグルコン酸の効率的生産が可能であった。さらにグルコン酸発酵を効率化するために、生成したグルコン酸を中和するのに必要なアルカリ添加量からこの有機酸濃度を推定することを試み、回分培養では正確な推定が可能であることを明らかにした。
ラットにおける脳内セロトニン濃度と異常行動の検討―セロトニン症候群予防への試み

弱オピオイド作用とセロトニン・ノルアドレナリン再取り込み阻害作用を有するトラマドールが慢性疼痛に使用可能となり三環系抗うつ薬との併用で、セロトニン症候群の発生率上昇が予想される。本実験でトラマドール持続静注により視床下部セロトニン濃度が上昇し痙攣が誘発されたが、トラマドール誘発性痙攣がセロトニン症候群の一症状であるかを吟味する必要が出てきた。次に脳内セロトニンを増減させる薬物を用いたうえで、トラマドールを持続静注した。その結果セロトニン減少ラットのほうが増加ラットと比較し有意に痙攣発現時間が短縮した。これによりトラマドール誘発性痙攣とセロトニン症候群は異なる病態であることが明確になった。慢性疼痛の治療に三環系抗うつ薬やSSRIなどセロトニン再取り込み阻害作用を有した薬剤が使用されることが多く、本邦においても弱オピオイド作用とセロトニン・ノルアドレナリン再取り込み阻害作用を有するトラマドールとアセトアミノフェンの合剤が慢性疼痛に使用可能となり三環系抗うつ薬と併用されている。これにより脳内セロトニンが増加するセロトニン症候群の発生率が上昇することが予想される。これらの薬物を投与したラットの視床下部等のセロトニン濃度をマイクロダイアライシス法で測定するとともに異常行動を評価することでセロトニン症候群を誘発する薬物投与量を検証する試みであった。今回我々の実験によりトラマドールの持続静注により視床下部でのセロトニン濃度が上昇し痙攣が誘発されることが判明したが、トラマドール誘発性痙攣がセロトニン症候群の一症状であるかを吟味する必要が出てきた。そこで我々は脳内セロトニンを増加もしくは減少させる薬物(増加させる薬物:ベンセラジド・5ハイドロキシトリプトファン、減少させる薬物:p-クロロフェニルアラニン)を用いたうえで、トラマドールを持続静注することとした。その結果脳内セロトニンが減少していたラットのほうが増加していたラットと比較し有意に痙攣発生までの時間が短縮していた。これによりトラマドール誘発性痙攣はセロトニン症候群の一症状ではないが、その痙攣発生閾値に関与する因子であることが明確となった。トラマドールによる痙攣にμ受容体が関与するかを吟味するため、ナロキソン投与後にトラマドールを持続静注したが、痙攣発生までの時間に変化はなかった。したがってトラマドール誘発性痙攣にμ受容体が関与していないことが示唆された。今後トラマドールによる痙攣の原因解明とセロトニンの関与についてさらなる研究を進める予定である。

そこで我々は脳内セロトニンを増加もしくは減少させる薬物(増加させる薬物:ベンセラジド・5ハイドロキシトリプトファン、減少させる薬物:p-クロロフェニルアラニン)を用いたうえで、トラマドールを持続静注することとした。その結果脳内セロトニンが減少していたラットのほうが増加していたラットと比較し有意に痙攣発生までの時間が短縮していた。これによりトラマドール誘発性痙攣とセロトニン症候群は異なる病態であることが明確になった。またトラマドールによる痙攣にμ受容体が慣用するかを吟味するため、ナロキソン投与後にトラマドールを持続静注したが、痙攣発生までの時間に変化はなかった。したがってトラマドール誘発性痙攣にμ受容体が関与していないことが示唆された。神経科学当初のセロトニン症候群についての研究とは異なるが、トラマドール誘発性痙攣と脳内セロトニン濃度の関係を解明しつつある。当初のセロトニン症候群についての研究とは異なるが、トラマドール誘発性痙攣と脳内セロトニン濃度の関係を解明しつつある。トラマドール誘発性痙攣に対する脳内セロトニン濃度の影響についてデータ収集がかなり進んでいる。今後もう少しデータ収集を行い、研究結果を公表する段階に移行する。トラマドール誘発性痙攣に対する脳内セロトニン濃度の関係についてさらなる研究を進めるため、昨年度同様に脳内セロトニンの変化と痙攣発生までの時間を測定する。またトラマドールによる痙攣の原因を追究するため、トラマドールの有するμ受容体アゴニストとしての作用を拮抗するナロキソンを投与し痙攣発生の有無などについても研究する予定である。かなり小額の残金であったため、実験に必要な消耗品を購入できなかったため。次年度の予算と合わせて、実験に必要な消耗品などを購入する費用に充当する。該当なし。
近接場ラマン分光法を用いた半導体ナノデバイスの分析・評価技術の開発

チップ増強近接場ラマン(TERS)顕微鏡は原子間力顕微鏡とラマン散乱分光法を組み合わせた分光分析手法のひとつであり、ナノメートルの空間分解能で分子や結晶の種類や組成を明らかにすることができる手法である。AFMプローブ先端の金属部分に光を照射することで、先端の局在プラズモンポラリトンを誘起し、その周囲に増強電場を生成する。この局所増強電場を用いることで、金属先端下の数ナノメートル領域のみのラマン信号を選択的に増強し、検出することができる。これまでに最適化したTERS顕微鏡や金属プローブを適用し、実際のデバイスとして使用されている歪みシリコンナノデバイス表面上の結晶方位分布の観察を行い、そのナノスケールの欠陥状態や結晶特性変化をナノラマンイメージングにより調べてきた。しかし、歪みシリコンのラマン信号は弱く、歪みの大きさによってシリコンのラマン信号から数nmだけシフトして現れるため、より高い増強度と空間分解能が必要となった。金属プローブを再現性高く作製するための改良が、測定時間の短縮や測定領域の拡大に繋がる不可欠な要素として挙げられた。そこで、形状な金属ナノ粒子を金属プローブ先端にのみ付着させる方法を検討した。化学合成法に基づいて作製した金属ナノ粒子は、均一な形状で大量生産が可能である。粒子の大きさや形状によって相互作用する光の波長が異なるため、励起波長に応じた粒子を選択することでラマン散乱光を効率良く増強させることができる。作製した金属ナノ粒子をAFMプローブに接着させることによって、試料に最適な励起光に対して増強度の高い金属プローブを作製することが可能となった。さらに、金ナノ粒子に局所的に誘起される増強光電場を計算によって求め、光硬化性樹脂を用いることによってその増強光電場を実験的に示した。チップ増強近接場ラマン顕微鏡は、数ナノメートルの空間分解能で分子の組成や結晶の種類を分析・観察することのできる、原子間力顕微鏡とラマン分光法を組み合わせた手法である。本研究では、半導体ナノデバイスなどの不透明基板の表面を分析・評価するための反射型チップ増強近接場ラマン顕微鏡システムの構築およびその最適化を目的としている。この目的を達成するために、本年度は半導体ナノデバイスの測定に適し、ラマン散乱の増強効果が高く得られるカンチレバープローブの作製に取り組んだ。これまでのチップ増強近接場ラマン顕微鏡システムでは、カンチレバープローブにはシリコン製のものを用いていた。しかし、プローブのシリコンからもラマン信号が生じ、試料であるシリコンナノデバイスからのラマン信号と重なってしまうため、分析には不向きであった。そこで、水蒸気を流した1100°Cの高温炉で既成のシリコン製カンチレバープローブを処理することにより酸化シリコンプローブを作製した。透過型電子顕微鏡を用いてプローブ形状を調べたところ、先端直径が約10nm程度の先鋭性を保っており、結晶性を持たないことが判明した。また、高温処理時間を変化させることで、プローブ先端からの酸化度合いを調整することができた。次に、この酸化シリコンプローブ有用性を調べるために、近接場ラマン顕微鏡を用いてプローブのラマン散乱測定を行った。酸化シリコンプローブの先端にレーザー光を照射しラマン信号の有無を確認したところ、プローブ由来のシリコンのラマン信号は検出されなかった。また、酸化シリコンプローブはシリコン製よりも増強度が高いことも報告されているため、作製したプローブは半導体ナノデバイスの近接場ラマン散乱測定に有用であると期待できる。チップ増強近接場ラマン(TERS)顕微鏡は、原子間力顕微鏡とラマン分光法を組み合わせた、ナノメートルの空間分解能で分子や結晶の種類や組成を明らかにすることができる手法である。本研究では昨年度までに、半導体ナノデバイスなどの不透明基板でも使用可能なシステムとして反射型TERS顕微鏡を構築し、ラマン散乱の増強効果が高く得られる金属プローブの作製を行った。本年度は、最適化したTERS顕微鏡や金属プローブを適用し、実際のデバイスとして使用されている歪みシリコンナノデバイス表面上の結晶方位分布の観察を行った。そのナノスケールの欠陥状態や結晶特性変化をナノラマンイメージングにより調べた。具体的には、STI(Shallow Trench Isolation)基板やシリコンゲルマニウム型の歪みシリコンナノデバイスに対して、表面の不均一で多軸性である歪みやその方向性の分布測定を行った。また近年、グラフェンシートは欠陥が少なく化学的に安定していて電子の移動速度が高いため、デバイスとしての応用が期待されている。そこで、グラフェンシートの積層数や境界面または局所的な欠陥や歪みといったナノスケールの物性測定への応用も試みた。さらに、金属プローブの増強度向上を目指し、化学合成法に基づいて金属ナノ粒子を作製する研究も行った。金属ナノ粒子は、そのサイズや形状によって相互作用する光の波長が異なるため、励起波長に応じた粒子を選択することでラマン散乱光を効率良く増強させることができる。

これまでに最適化したTERS顕微鏡や金属プローブを適用し、実際のデバイスとして使用されている歪みシリコンナノデバイス表面上の結晶方位分布の観察を行い、そのナノスケールの欠陥状態や結晶特性変化をナノラマンイメージングにより調べてきた。しかし、歪みシリコンのラマン信号は弱く、歪みの大きさによってシリコンのラマン信号から数nmだけシフトして現れるため、より高い増強度と空間分解能が必要となった。金属プローブを再現性高く作製するための改良が、測定時間の短縮や測定領域の拡大に繋がる不可欠な要素として挙げられた。そこで、形状な金属ナノ粒子を金属プローブ先端にのみ付着させる方法を検討した。化学合成法に基づいて作製した金属ナノ粒子は、均一な形状で大量生産が可能である。粒子の大きさや形状によって相互作用する光の波長が異なるため、励起波長に応じた粒子を選択することでラマン散乱光を効率良く増強させることができる。作製した金属ナノ粒子をAFMプローブに接着させることによって、試料に最適な励起光に対して増強度の高い金属プローブを作製することが可能となった。さらに、金ナノ粒子に局所的に誘起される増強光電場を計算によって求め、光硬化性樹脂を用いることによってその増強光電場を実験的に示した。
スコットランド啓蒙思想の痕跡と現代的意義

今年度は、研究課題着手の初年度ということで、資料収集および情報収集をメインに行った。資料収集は文献調査、情報収集は学会参加および研究会開催などを通じて行った。その後の7月下旬には、ブタペストで開催されたHume Conference 2018にて出席し、国際ヒューム学会においてトレンドとなっているトピックが「共感」とどのように関連しているのかを調査した。ヒュームやアダム・スミスがその必要性を論じた共感メカニズムであるが、彼らが活躍した18世紀中盤から後半にかけてはその限界も意識されはじめ、それにヒュームも気付いており、だからこそそれを補正・補強する政治システムを模索しているとのではないか、という議論が活発になされていた。その後、関連書籍を収集・分析しながら、今年度得られた知見を研究成果として論文にまとめる作業を行った。古典文献の収集と確認は計画どおりすすんでいる。また、各種学会でトレンドとなっているトピックと本研究課題との関連を調べることもおおむねできたといえる。勤務先の変更によって11月以降ドタバタしていたので、本年度前半の研究成果の論文化は完成に至らず、次年度以降となってしまったという反省点はあるものの、計画そのものに大きな遅れはみあたらないため、本研究課題はおおむね順調に進展しているといえる。前年度の成果をもとにした論文を完成し、できれば今年度中に英語化をしてネイティヴチェックをすませ、さらにはどこかで報告もしくは投稿したいと考えている。また、本研究の方向性についてコメントや批判的意見をもらいたいので、国内外の学会に参加して他の研究者と議論をしたり、研究会を積極的に開催したい。今年度は、日本国内において「共感」に関するシンポジウムやワークショップがあまり見受けられなかったこと、そして諸般の事情により数少ないそれらに参加できなかったことがあった。また、研究成果をまとめたものをネイティヴチェックにまわすことができず、そ次年度以降にそれが持ち越されたということが大きな理由である。
脳の形成と高次機能調節における巨大分泌蛋白質リーリンの新規情報伝達機構

1.リーリンのC末端領域(CTR)のみを欠損するノックインマウスの作製と表現型の解析CTRをFLAGタグで置換したノックインマウスを作製した。マウスリーリンのゲノム遺伝子には69個のエキソンがあり、CTRはそのうち最後のエキソン(エキソン69)にコードされている。ゲノム遺伝子のエキソン69からCTRをコードする配列を除き、FLAGタグをコードする配列に置換したΔC-FLAGノックインマウス(d__-elta C__--F__-LAG k__-nock-i__-n mouse、以後DCF-KIマウスと略す)を樹立した。まず、DCF-KIマウスのΔC-FLAGリーリンは、細胞内に蓄積する傾向があるものの、分泌量自体には大きな異常はないことを確認した。次に、DCF-KIマウスのDab1はチロシンリン酸化誘導能を野生型と比較した。Dab1はチロシンリン酸化を受けると分解されることが知られている。実際、リーラー・マウス胎仔の脳内のDab1量は、正常マウス胎仔より約10倍多い。このように、Dab1量はDab1チロシンリン酸化誘導能を反映する。そこで、DCF-KIマウスと正常マウスのDab1量を比較した結果、DC-KIマウスでは正常マウスよりDab1量が多かった。従ってin vivoにおいてもCTRは、Dab1チロシシウシ酸化に関与することが強く示唆された。現在DCF-KIマウスとDab1欠損マウスとの二重変異マウスを作製中である。DCF-KIマウスの脳組織をニッスル染色した結果、正常マウスの神経細胞は、大脳皮質辺縁体(MZ)にほとんど見られないのに対し、DCF-KIマウスでは、神経細胞がMZに多数侵入していた。さらにDCF-KIマウスでは第II/III層の構造に乱れが見られた。2.リーリンの細胞内情報伝達経路活性化のメカニズムの解明リーリンCTRと結合する分子の候補としてグリコサミノグリカン鎖(GAG鎖)を想定し、そのGAG鎖の同定を試みている。3.成体のCTR置換ノックインマウスにおける高次機能及び行動解析1.リーリンのC末端領域(CTR)のみを欠損するノックインマウスの作製と表現型の解析CTRをFLAGタグで置換したノックインマウスを作製した。3.成体のCTR置換ノックインマウスにおける高次機能及び行動解析
ヒトExtravillous trophoblastの母体血管内浸潤誘導機構の解析

【研究の背景】着床後、胚由来の絨毛細胞は絨毛上皮を構成するvillous trophoblastと、絨毛の先端部から母体側脱落膜へ向かい浸潤するextravillous trophoblast(EVT)の2つの経路に分化する。EVTは着床部から母体側に向かい子宮内膜から子宮ラセン動脈血管平滑筋・内皮に浸潤し、これに伴う血管抵抗低下が胎盤循環の確立に重要であるとされている。我々は子宮内膜に浸潤するEVTに特有の浸潤抑制機構の解析を行ってきたが、その過程で母体血管周囲のEVTでは浸潤能が維持されており免疫細胞がその浸潤誘導因子である可能性を示唆する知見を得た。この母体血管周囲のEVTに何らかの誘導機構が存在するという概念は母体血管浸潤による胎盤循環の確立というEVTの機能を考えると合目的的であり、本概念は近年EVTの浸潤不全が関与するとされている子宮内胎児発育遅延・妊娠中毒症等の病態・治療を考える上でも重要であると考えられる。そこで本研究では免疫系細胞によるEVTの母体血管内浸潤誘導機構を解析することをその目的として以下の解析を行った。【結果】1)ヒトEVTにおけるケモカイン受容体の発現の検討RT-PCR法によるスクリーニングの結果、ヒトEVT初代培養細胞に於いてケモカイン受容体であるCCR1、CCR10及びXCR1の発現が確認された。その中でCCR1はcell columnを構成するヒトEVT及び母体血管に向かうEVTに限局して発現することが免疫組織染色法により確認された。2)ヒトEVTの浸潤に及ぼすケモカインの作用の検討CCR1のリガンドであるRANTESは母体血管周囲の免疫系細胞に発現を認め、更にRANTESの存在により分離ヒトEVT細胞の浸潤能が亢進することが確認された。3)ヒトEVTにおけるケモカイン受容体の発現制御因子の検討分離初代ヒトEVT細胞におけるCCR1の発現制御因子を検討したところ、低酸素状態及びヒト脱落膜組織との共培養によりCCR1の発現は低下した。【結論】以上の結果より、EVTに発現するケモカイン受容体であるCCR1は高酸素環境である母体血管周囲ではその発現が維持されており、母体血管周囲の免疫細胞から産生されるCCR1のリガンドであるRANTESの作用によりEVTが母体血管に向けて浸潤誘導されている可能性が示唆された。【背景と目的】着床後、胚由来の絨毛細胞は絨毛上皮を構成するvillous trophoblastと、絨毛の先端部から母体側脱落膜へ向かい浸潤するextravillous trophoblast (EVT)の2つの経路に分化する。

この母体血管周囲のEVTに何らかの誘導機構が存在するという概念は母体血管浸潤による胎盤循環の確立というEVTの機能を考えると合目的的であり、本概念は近年EVTの浸潤不全が関与するとされている子宮内胎児発育遅延・妊娠中毒症等の病態・治療を考える上でも重要であると考えられる。そこで本研究では免疫系細胞によるEVTの母体血管内浸潤誘導機構を解析することをその目的として以下の解析を行った。【平成15年度の研究実績】1)ヒトEVT初代培養細胞におけるケモカイン受容体の発現の検討分離ヒトEVTにおけるケモカイン受容体の発現をRT-PCR法によりスクリーニングした。その結果、ヒトEVT初代培養細胞に於いてケモカイン受容体であるCCR1、CCR10及びXCR1の発現が確認された。免疫組織染色法による検討の結果、ケモカイン受容体の中でCCR1はcell columnを構成するヒトEVT及び母体血管に向かうEVTに限局した発現様式を呈していた。2)ヒトEVTの浸潤に及ぼすケモカインの作用の検討CCR1のリガンドであるRANTESは母体血管周囲の免疫系細胞に於いて発現が認められた。更にRANTESの存在により分離ヒトEVT細胞の浸潤能が亢進することが確認された。3)ヒトEVTにおけるケモカイン受容体の発現制御因子の検討分離初代ヒトEVT細胞におけるCCR1の発現制御因子を検討したところ、低酸素状態及びヒト脱落膜組織との共培養によりCCR1の発現は低下した。以上の結果より、EVTに発現するケモカイン受容体であるCCR1は高酸素環境である母体血管周囲ではその発現が維持されており、母体血管周囲の免疫細胞から産生されるCCR1のリガンドであるRANTESの作用によりEVTが母体血管に向けて浸潤誘導されている可能性が示唆された。【背景と目的】着床後、胚由来の絨毛細胞は絨毛上皮を構成するvillous trophoblastと、絨毛の先端部から母体側脱落膜へ向かい浸潤するextravillous trophoblast(EVT)の2つの経路に分化する。EVTは着床部から母体側に向かい子宮内膜から子宮ラセン動脈血管平滑筋・内皮に浸潤し、これに伴う血管抵抗低下が胎盤循環の確立に重要であるとされている。我々は子宮内膜に浸潤するEVTに特有の浸潤抑制機構の解析を行ってきたが、その過程で母体血管周囲のEVTでは浸潤能が維持されており免疫細胞がその浸潤誘導因子である可能性を示唆する知見を得た。【平成16年度の研究実績】平成15年度の検討により、ヒトEVT初代培養細胞にケモカイン受容体であるCCR1、CCR10及びXCR1が発現することが確認され、その中でもCCR1はcell columnを構成するヒトEVT及び母体血管に向かうEVTに限局した発現様式を呈することが明らかになった。そこで平成16年度はヒトEVTの浸潤に及ぼすケモカインの機能解析を行った。
デヒドロアミノ酸の幾何異性制御に基づく新規アミノ酸・ペプチドの創製

デヒドロアミノ酸(Dhaa)は、アミノ酸側鎖が不飽和化された非天然型アミノ酸である。構造がアミノ酸に近似していることや、アミノ酸側鎖がオレフィン平面上に固定された特性から、ペプチドの配座固定や生物活性の向上のための研究ツールとして期待が集まっている。本研究ではDhaa合成において残された課題となっている1置換および2置換体の立体制御にかかる課題の解決に取り組んだ。その結果(あ)独自に開発したホスホノ酢酸エステル試薬を用いたE-Dhaaの立体選択的合成、(い)ジ置換Dhaaの立体選択的合成、(う)ホモプシンAに含まれるDhaaが連続した側鎖の合成を達成した。さまざまなE-デヒドロアミノ酸(E-Dhaa)を合成する方法は数少ない。そのためE-Dhaaを利用したアミノ酸化学・ペプチド科学研究は立ち遅れている。本研究ではE-Dhaaの合成法を開発し、E-Dhaaを利用した新しいアミノ酸・ペプチド研究を開拓することを目的としている。H25年度は、その基盤となる、さまざまなタイプのE-Dhaaを自在に合成する方法の開発に取り組んだ。具体的には、独自に開発したジフェニルホスノホグリシンエステルと市販で入手容易なアルデヒド類とのオレフィン化を制御することで、E-Dhaaを合成する計画を立てた。まず、塩基としてNaHまたはDBU、添加剤としてNaIを用いて反応を試みたところ、芳香族アルデヒド類は高立体選択的に望むE-体を与えた。一方、アルキル側鎖を有するアルデヒド類に本反応条件を適用した結果、立体制御に対する効果は低いことがわかった。そこで、金属塩をさらに精査したところMgBr2・OEt2あるいはZnCl2を用いることで、芳香族アルデヒド以外のアルデヒド類をE-Dhaaに変換できた。反応機構を調べる目的でいくつかの実験を行った。その結果、立体選択性の発現には、窒素上のアシル基(N-Ac、N-Boc、N-Cbz)および-P(=O)(OPh)2と金属塩の添加剤が必須であることを明らかにした。ジ置換Dhaaの立体選択的合成についてもあわせて取り組んだ。計画に従って、独自に開発した試薬とケトンとの直接縮合を試みたが未反応であった。現在、他の合成経路によるアプローチに取り組んでいる。デヒドロアミノ酸はアミノ酸のα位とβ位に炭素・炭素二重結合を有するアミノ酸類縁体である。アミノ酸では、α位炭素上に置かれているアルキル側鎖が自由に回転できることに対して、デヒドロアミノ酸の側鎖は、アミノ基と同じ側あるいはカルボン酸と同じ側のいずれかに固定される。前者はZー体、もう一方はEー体と呼び、立体化学が異なる化合物として区別されている。デヒドロアミノ酸に特徴的な側鎖固定の特性は、ペプチドへの組み込みによるペプチドの立体の制御に利用されてきた。また、デヒドロアミノ酸は生物活性天然物の構成成分として天然からみいだされていることから、デヒドロアミノ酸の立体選択的な合成とケミカルバイオロジー研究が活発になされてきた。デヒドロアミノ酸の有用性は広く認識されている一方で、Eーβ置換デヒドロアミノ酸とβ、βー二置換デヒドロアミノ酸の幾何異性を制御する合成研究は、ほとんど手つかずのままであった。こうした状況を踏まえて、Eーβー置換ならびにβ、βー二置換アミノ酸の立体制御合成法の確立と、それらを含む生物活性天然有機化合物の合成研究に着手した。H26年度は、デヒドロイソロイシンを構成成分に含むアントリマイシンDおよびホモプシンAの全合成研究に取り組んだ。その結果、アントリマイシンDの全合成前駆体と位置づけた3つのフラグメントが合成できた。ホモプシンAについては、左側環状部位を構成する2つの非天然型アミノ酸の合成に取り組み、それらの合成法を確立した。環化に向けたモデル研究を行い、アミノ酸連結の順序、環化反応条件、適切な保護基の組み合わせを検討した。デヒドロアミノ酸(Dhaa)は、アミノ酸のα位とβ位に二重結合が配置されたnonproteiogenicなアミノ酸である。Dhaaは、天然由来の生物活性ペプチドの配列中に、しばしば見いだされているため、その合成、ペプチド組み込み、および生物活性ペプチドの機能制御研究が活発になされてきた。これまでに、デヒドロアラニンや熱力学的に安定なZ型の一置換Dhaaの合成は盛んに試みられてきたが、それ以外の熱力学的に不安定なE型の一置換体や、ジ置換体Dhaaの立体制御合成法は限られていた。そのため、それらの生物学的な機能を調べる研究も遅れをとっていた。そこで、本研究ではDhaaの潜在的有用性の発掘に向けた基礎研究として、E型の一置換Dhaa類および二置換Dhaa類の立体制御法の開発に取り組んだ。H26年度までに、E型の一置換Dhaa類および二置換Dhaa類の立体制御法を確立した。H27年度は、ペプチドへの組み込みを検証する研究としてデヒロドイソロイシン含有天然物、シラチオマイシンAとホモプシンAの全合成を試みた。前者については全合成を達成した。後者については鍵と位置付けた3連続Dhaa側鎖の合成経路を確立した。天然物の全合成を達成したことによりペプチドへの組み込み法が確立できた。これにより、研究は順調に推移していると評価した。デヒドロアミノ酸は非天然型アミノ酸の一種であり、生物活性天然の部分構造としてしばしば見出されている。デヒドロアミノ酸にはβ位置換基の有無によって置換基がないもの、1つ存在するもの、2つ存在するものがある。

置換基が1つ以上存在するものには幾何異性体としてE体とZ体が存在する。このうち、1置換体のEー体と2置換体のE,Zー体を立体選択的に合成することは困難な課題と位置付けられていた。本研究では、従来の課題を解決するデヒドロアミノ酸の幾何異性制御法を開拓し、それをもとにデヒドロアミノ酸含有ペプチドの構造制御、デヒドロアミノ酸含有天然物の全合成研究に展開することを提案した。最終年度は、デヒドロアミノ酸の立体特異的ヨウ素化と根岸クロスカップリング反応を組み合わせた、βージ置換型デヒドロアミノ酸類の立体制御合成法を用いてアントリマイシン類やホモプシンAの全合成に取り組んだ。(1)アントリマイシン類の全合成:これまでに確立した合成法を利用して、アントリマイシンAvとDvを全合成した。現在、これらの抗菌活性試験を検討中である。(2)ホモプシンAの全合成:ホモプシンAに含まれるトリペプチド鎖を量的に合成した。あわせてシクロファン型大環状ラクタムの構築に取り組んだ。その構成アミノ酸であるデヒドロバリンの合成法を確立した。現在、デヒドロアミノ酸含有側鎖との連結による全合成を検討している。これまでに得られた研究成果は論文ならびに日本化学会をはじめとする学会にて発表した。デヒドロアミノ酸(Dhaa)は、アミノ酸側鎖が不飽和化された非天然型アミノ酸である。構造がアミノ酸に近似していることや、アミノ酸側鎖がオレフィン平面上に固定された特性から、ペプチドの配座固定や生物活性の向上のための研究ツールとして期待が集まっている。本研究ではDhaa合成において残された課題となっている1置換および2置換体の立体制御にかかる課題の解決に取り組んだ。その結果(あ)独自に開発したホスホノ酢酸エステル試薬を用いたE-Dhaaの立体選択的合成、(い)ジ置換Dhaaの立体選択的合成、(う)ホモプシンAに含まれるDhaaが連続した側鎖の合成を達成した。アントリマイシンDについては、合成前駆体と位置づけた3つのフラグメントを縮合、脱保護することで、H27年度の早い段階で全合成が達成できる見通しである。ホモプシンAについても、環化に向けたモデル合成において好結果が得られており、全合成の鍵となる環状部位の合成への目途が立っている。当初の計画以上に、研究が進展していると評価した。これまでの成果を踏まえて、H28年度は2つの全合成研究に焦点を絞った研究を行う。具体的には、1)シラチオマイシンBの全合成とその生物活性評価、および、2)ホモプシンAの初の全合成に向けた、環状ユニットの合成とデヒドロアミノ酸ユニットの連結による全合成に取り組む。最終年度に当たることを考慮し研究のとりまとめを行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。天然物化学1)アントリマイシンDの全合成:3つのフラグメントを順次カップリングすることで標的天然物の全合成を達成する。全合成が達成でき次第、NOEを含む各種NMR解析により、アントリマイシンDの立体構造を明らかにする。あわせて、アントリマイシンDの抗結核菌作用を調べるための誘導体合成を検討する。2)ホモプシンAの全合成:モデル合成での結果を踏まえて、ホモプシンAの環状部位を構築する。