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市民の価値判断の行政意思決定への反映：イギリス都市法・環境法との比較を通じて

これについては比較法学会(2016年6月6日予定)で報告予定である。また、都市計画の文脈での固有の検討としては、転換期を迎えた土地法制度研究会(土地総合研究所)において2回行った報告(2014年5月22日、10月30日)において、「コミュニティの権利」というテーマとして一部反映されている。それを論文としてものがこれから公刊される予定である(「利用放棄等の消極的行為の法的コントロールーイギリスにおける法的対応」)。以上のように、集団的価値判断の意思決定過程への反映というテーマについて、複数の分野にわたり、それぞれ異なる観点から多元的に考察をし、論文等に取りまとめた。行政法2013年度の研究実施計画において予定をしていたように、イギリスでの風力発電所に関する法的紛争を念頭に置いた論文(「風力発電所の立地をめぐる紛争と法ーイギリスにおける模索を通じて」)を、紀要に掲載した。また、日本における市民の価値判断に関する法的紛争についての考察として、2つの小論を取りまとめた。同様に、計画において予定していたイギリスにおける調査も、2013年度に実施し、今後につながる研究材料を仕入れることができた。現在、2013年度までの研究成果と新たな研究素材をもとに、環境意思決定における手続法理として、オーフス条約についての検討を中心とした研究を進めている。平成24年度から所属先の大学が変わったため、それに係る公私の雑事に追われ、国内での調査研究を行うことができなかった。但し、国内調査での目的の一部は、所属する土地総研の研究会での報告等にて一定程度補えていると考える。同研究会においては、住民参加についての報告を伺い議論をするとともに、自分の報告(「基盤施設の整備・管理と法」)として、風力発電所の設置をも含む公共施設・民間重要施設の設置に係る実体的・手続的法制のあり方について報告・議論を行ったためである。また、民主科学者協会法律部会の研究合宿に参加し、施設の立地について環境社会学者の議論を聞くとともに、六ヶ所の原子力諸施設、建設中の大間原発をめぐり、論叢のある施設の立地における住民参画の認識を深めた。論文執筆や研究会報告については、司法アクセスについての論稿を執筆するとともに、上記のように施設設置に係る報告を行った。しかし、住民の懸念・リスク評価については十分に検討する暇がなく、論文としてまとめたり、報告をするまでには至らなかった。2013年度に行ったイギリスでの調査の結果を踏まえて、計画許可についての参加・協議の事前手続と争訟の事後手続との相互連関を念頭に置いて、環境意思決定における手続法理について、論文として取りまとめる。具体的には、従来のイギリス国内的要請から生じた手続法理と、環境意思決定に係るオーフス条約のイギリス法への影響による国際的な要請からの手続法理とについて、理論的に検討を行う。他方で、国内における調査として、風力発電所に関する論文で扱った長野県飯田市への実態調査、名古屋市等での事前・事後手続の実務についての調査を予定し、これらを論文に反映させる。また、研究報告の機会として、2013年度に執筆した風力発電所に関する論文について、イギリス行政法研究会などにて報告を行う予定である。
肝門部胆管癌からの胆管癌幹細胞の分離と網羅的遺伝子解析に基づく分子標的治療の開発

分化能と自己複製能を有する癌幹細胞が癌の発生、進展機序において重要であることが指摘されている。胆管癌由来細胞株HuCCT1よりCD133抗体を用いて分離したCD133陽性胆管癌細胞とCD133陰性胆管癌細胞のDNAアレイ法による網羅的遺伝子解析を行なった。その結果CD133の発現と肝幹細胞の表面マーカーと考えられているCD45、TER、CD49f、c-Metの発現の間に関連性を見いだすことはできなかった。また胆管癌由来細胞株HuCCT1から分離したCD133陽性胆管癌細胞とCD133陰性胆管癌細胞のヌードマウス皮下発癌モデルにおいて、大腸癌と異なり胆管癌では腫瘍形成能に有意差がないことが明らかになった。これは癌由来臓器の違い、CD133以外の癌幹細胞マーカーの関与など様々なことが原因と考えられた。またヌードラット肝転移モデルに対して脾静脈に留置したアクセスポートを用いたNek2 siRNAを経門脈的投与により肝転移巣数の減少および各肝転移巣の腫瘍径の縮小を認め、肝転移に対してsiRNAの経門脈的な薬剤投与法が有効であることを明らかにした。癌に対する新たな治療法としての分子標的治療薬などが開発され消化器癌の多くは治療成績が飛躍的に向上しつつある。肝門部胆管癌は化学療法や放射線療法には治療効果が認められず、手術で切除する以外には有効な治療法はない。最近の分子生物学の進歩により癌の発生、進展機序において癌幹細胞の存在が指摘されている。癌幹細胞は分化能と自己複製能を有する細胞で効率に癌を作ることが報告されている。癌幹細胞の分離においては癌幹細胞のマーカーの特定が重要である。本研究では、肝門部胆管癌より胆管癌幹細胞を分離し、その網羅的遺伝子解析により新たな癌幹細胞のマーカーを同定し、それらの遺伝子に対して分子標的治療を開発し、その実用化を目指すものである。本研究の最終目的は、胆管癌幹細胞を標的にした新たな分子標的治療による肝門部胆管癌の治療成績の向上である。胆管癌幹細胞の分離およびその網羅的遺伝子解析1.細胞株における検討肝幹細胞ではCD45陰性、TER陰性、CD49f陽性、CD29陽性、c-kit陰性、c-Met陽性と考えられている。胆管癌由来細胞株からCD29陽性、c-kit陰性細胞をセルソーターにて分離した。これらの細胞について無血清培地にて培養後、血清を加え、肝細胞のマーカーであるアルブミン、胆管細胞のマーカーであるサイトケラチン19に関して免疫染色をおこなった。CD29陽性、c-kit陰性細胞において免疫染色にてアルブミン、サイトケラチン19の発現の確認でき、この細胞群の中に分化能をもつ胆管癌幹細胞の存在が示唆された。さらにCD45陰性、TER陰性、CD49f陽性、c-Met陽性細胞について同様の検討をおこなう予定である。2.臨床検体を用いた検討臨床検体の使用に関して名古屋大学医学部倫理委員会より研究課題名「胆道癌、膵癌、乳癌における癌幹細胞の網羅的遺伝子解析」にて承認された。名古屋大学における胆管癌手術症例より胆管癌組織を収集し、CD29陽性、c-kit陰性細胞をセルソーターにて分離した。ソーティングによる細胞の回収が不十分であった。これはソーティング前の処理が不十分なため細胞以外の組織成分の混入したと考えられた。今後の方針としてソーティング前に磁性ビーズによる分離をおこない、ソーティングの精度を上げ、回収した細胞に関して網羅的遺伝子解析をおこなう予定である。<胆管癌幹細胞の分離およびその網羅的遺伝子解析>胆管癌症例から採取した臨床サンプルから胆管癌幹細胞の分離をおこなったが、癌組織から回収された細胞数が1×10^7個と不十分であり、そこから分離した胆管癌幹細胞数とそのRNA収量も網羅的遺伝子解析を行うためには不十分であった。また回収された胆管癌幹細胞に不要な細胞(血球細胞)が混入しており実験を進めることができなかった。血球細胞を除去するためのキットを用いてから、新たな磁性ビーズを用いる分離か法へ変更し、臨床サンプウレでの収集を継続している。<胆管癌細胞株、造血幹細胞、骨髄細胞などを用いたsiRNAの機能解析、とくに副作用などの検討>胆管癌

由来細胞株HuCCT1からセルソーターにて分離したCD45陰性、TER陰性、CD49 f陽性、c-Met陽性細胞に関して肝細胞のマーカーであるアルブミン、胆管細胞のマーカーであるサイトケラチン19の発現をウエスタンブロティング法で検討したが、アルブミン、サイトケラチン19のいずれの発現も確認できなかった。<外科手技を併用した薬剤投与法の開発>ラットの開腹手術により脾静脈にアクセスポートを留置し、このアクセスポートを用いた肝臓への薬剤投与システムを開発した。このアクセスポートを用いてラット肝臓への蛍光標識したsiRNAの導入を行った。イントラバイタル法により肝臓内に蛍光標識したSiRNAが確認され、この方法によるsiRNAの導入効果の有効性を明らかにした。<胆管癌幹細胞の分離およびその網羅的遺伝子解析>臨床サンプルより入手が容易な胆管癌由来細胞株HuCCT1からの胆管癌幹細胞の分離を行った。分離したCD45陰性、TER陰性、CD49f陽性、c-Met陽性細胞には肝細胞のマーカーであるアルブミン、胆管細胞のマーカーであるサイトケラチン19の発現がなかった。このため異なるマーカーとして大腸癌において癌幹細胞のマーカーとして報告されているCD133に対する磁性ビーズを用いて胆管癌由来細胞株HuCCT1からCD133陽性の癌幹細胞の分離を行った。十分量の細胞が採取可能であり、CD133陽性胆管癌細胞とCD133陰性胆管癌細胞の網羅的遺伝子解析を行い、CD133の発現の有無による遺伝子発現の違いについて解析中である。<胆管癌細胞株、造血幹細胞、骨髄細胞などを用いたsiRNAの機能解析、とくに副作用などの検討>分離したCD133陽性胆管癌細胞とCD133陰性胆管癌細胞に関してウェスタンブロティング法で癌特異的遺伝子NeK2(NIMA relatedkinase2)の発現を検討した。CD133陽性、陰性いずれの細胞においても、Nek2は発現しており、その発現量に有意な差がなかった。<担癌動物実験モデルを用いたsiRNAの効果的かつ安全な投与法の開発>膵癌細胞株KP4を用いたヌードラット肝転移モデルに対して脾静脈に留置したアクセスポートを用いてNek2 siRNAを投与した。この結果、肝転移巣数の減少および各肝転移巣の腫瘍径の縮小を認め、肝転移に対する有効性を明らかにした。癌幹細胞は分化能と自己複製能を有する細胞で、発癌メカニズムにおける重要性が報告されている。本研究の目的は、胆管癌幹細胞の網羅的遺伝子解析により同定した遺伝子に対して分子標的治療を開発し、その実用化を目指すものである。【胆管癌幹細胞の分離およびその網羅的遺伝子解析】胆管癌由来細胞株HuCCT1より磁性ビーズを用いて分離したCD45陰性、TER陰性、CD49f陽性、c-Met陽性細胞の免疫染色において肝細胞のマーカーであるアルブミン、胆管細胞のマーカーであるサイトケラチン19の発現を認めることができなかった。CD133抗体を用いて胆管癌由来細胞株HuCCT1をCD133陽性胆管癌細胞とCD133陰性胆管癌細胞に分離した。この分離した細胞に関してDNAアレイ法による網羅的遺伝子解析を行った。その結果CD133陽性胆管癌細胞とCD133陰性胆管癌細胞の間にCD45、TER、CD49f、c-Metの発現に定まった傾向を認めなかった。
超低周波音の人体に及ぼす影響

超低周波音が,人体にどのような影響を及ぼすかを実験するために,産業医科大学共同利用研究施設に設置された超低周波音発生装置を使用し,自律神経障害の定量的指標として考えられた心電図RーR間隔を測定し,超低周波音を暴露した時と,暴露しない時の違いを検討した.超低周波音は,超低周波音暴露室において15Hz 110dB SPLで,全身暴露を行なった.心電図RーR間隔を求める方法は2種類行なった.1つは,安静仰臥位で心電図RーR間隔の平均値とその変動係数であるCV値を求める実験で,これについては15分間の安静仰臥位後に行ない,その間に超低周波音を暴露する場合と,暴露しないコントロールに分けた.もう1つは, 30分間の起立状態で同様の測定を行なった.被験者は,健康な女子学生5名である.仰臥位および起立姿勢において,超低周波音暴露の時RーR間隔が大きくなる傾向が見られたが,大きな差は見出せなかった.安静仰臥位では, CV値は特に大きな差は見られないが,起立姿勢では,超低周波音を暴露した時にCV値が大きくなる傾向が見られた.更に3年間の研究の総括と資料収集を行なった.超低周波音は我々の取りまく環境内に広く存在しており,殊に飛行機,自動車,新幹線によって生ずる超低周波音が人体に影響を及ぼす可能性があるかどうか検討することは極めて大事な事と思われる.しかしこれまでこの問題に関して十分な基礎的な研究が行なわれていない.本研究は超低周波音が人体に及ぼす影響について基礎的な研究を行なった.1)モルモットを用いた電気生理学的な実験において超低周波振動と音響を負荷する事によって蝸牛機能の低下が示唆された.2)病理組織学的にも超低周波振動と音響を負荷する事によって内リンパの虚脱を示唆する所見が得られた.3)ABR(聴性脳幹反応)上,脳幹に異常を認めなかった.4)心電図R-R間隔を用いた実験では自律神経に対する影響が示唆された.今後更に内耳,自律神経に及ぼす影響について多方面からの研究を行なう必要を痛感しており,血中カテコールアミンの定量,心電図R-R間隔の長時間分析の為のソフト開発等を今後の課題と考え鋭意準備中である.超低周波音が,人体にどのような影響を及ぼすかを実験するために,産業医科大学共同利用研究施設に設置された超低周波音発生装置を使用し,自律神経障害の定量的指標として考えられた心電図RーR間隔を測定し,超低周波音を暴露した時と,暴露しない時の違いを検討した.超低周波音は,超低周波音暴露室において15Hz 110dB SPLで,全身暴露を行なった.心電図RーR間隔を求める方法は2種類行なった.1つは,安静仰臥位で心電図RーR間隔の平均値とその変動係数であるCV値を求める実験で,これについては15分間の安静仰臥位後に行ない,その間に超低周波音を暴露する場合と,暴露しないコントロールに分けた.もう1つは, 30分間の起立状態で同様の測定を行なった.被験者は,健康な女子学生5名である.仰臥位および起立姿勢において,超低周波音暴露の時RーR間隔が大きくなる傾向が見られたが,大きな差は見出せなかった.安静仰臥位では, CV値は特に大きな差は見られないが,起立姿勢では,超低周波音を暴露した時にCV値が大きくなる傾向が見られた.更に3年間の研究の総括と資料収集を行なった.低周波音がアルコール摂取時に人体にどの様な影響を与えるかを検討した。被験者は健康成人を用い、100mlのウイスキーを被験者1には100ml、被験者2には200mlの水で薄めたものを10分以内に摂取させ、30分後,60分後,120分後にアルコールの血中濃度を測定した。低周波音は15Hz、122dB SPLで8分間全身暴露として負荷した。そして1時間間隔で重心動揺,心電図R-R間隔,脈拍数,血圧の測定を行なった。その結果、重心動揺面積は被験者1,2いずれもコントロールに比べて低周波を暴露した時に明らかに増加した。R-R間隔は被験者2で暴露時に延長した。CV値は被験者1,2いずれも変動は見られたが、有意の変動ではなかった。脈拍数は暴露時やや増加の傾向を示したが、これも有意とはいえなかった。血圧は特に大きな変動を示さなかった。以上アルコールを摂取することによって低周波の暴露の影響が大きくなることが示唆された。
19世紀後期アメリカの立憲主義モデルに関する考察

本研究課題では、19世紀後期アメリカの憲法解釈観及び法の支配観などの分析を通じて、当時の連邦最高裁及び学説が構想した立憲主義モデルを明らかにする。課題は2つある。1つは、19世紀後期アメリカの政治的・経済的背景をおさえつつ、裁判史を整理し、特に今日でも重要判例の1つとされるスローターハウス判決の当時における意義と今日の憲法解釈論への影響を探ることである。もう1つは、クリストファー・ティードマン、トーマス・クーリーなど、同時代を代表する憲法理論家たちの言説について分析を行うことである。課題は2つある。
臓器不足解消を目指した画期的脂肪肝グラフト修復法の開発

ラット正常肝、脂肪肝を用いて、新規臓器保存液、新規灌流液、低温酸素化灌流、水素ガスの併用治療の有効性を確認し、Proof of Conceptを得ることができた。低温酸素化灌流の課題である、灌流中の門脈抵抗上昇やグラフト膨張を抑制した画期的な方法論を確立することに成功した。しかしながら、当初の目的であった脂肪肝の修復は完全には達成できなかった。その原因として心停止肝の胆管障害が挙げられ、動脈灌流も必要と考えられた。本研究は肝移植における臓器不足の解消を目指し、脂肪肝グラフトの修復法を確立するために行う。具体的には、A)ラット正常肝および脂肪肝の冷保存における低温酸素化灌流(HOPE)の至適条件、B)見出された至適灌流条件におけるグラフト保護効果のメカニズム、を明らかにすることを目的とする。上記の当初目的に対し、オリジナルの重水含有緩衝液、低温酸素化灌流(HOPE)、水素ガスを組み合わせて、脂肪肝グラフトの冷保存再灌流障害を軽減する方法論を確立することが目的である。まず、ラット正常肝の48時間冷保存、単離肝灌流による再灌流のモデルにおいて、1)単純冷保存後のラット肝に対するHOPEの臓器修復効果を検討した。既存のUW-MP液を用いると、単純冷保存のみの場合に対する優位性は認められなかった。2)再灌流時に水素ガスを投与すると、HOPEの有無によらず再灌流障害が軽減された。の併用効果、をラット単離肝灌流でスクリーニングし、有用性を確認した。3)得られた肝組織を用いてタンパクのリン酸化動態、酸化ストレスマーカー(8-OHdG, 4-HNE)を解析した。水素ガスは酸化ストレスを軽減するとともに、門脈循環を改善した。マウス肝細胞株(AML12)に細胞保護効果を有するシャペロン分子を強制発現させ、低温、低酸素ストレスに対する耐性の変化を評価した。また、シャペロンによる細胞保護効果に対して、重水と水素がどのように作用するかを検討した(on going)。さらに、ラット正常肝から肝構成細胞を分離し、冷保存による障害の推移と、重水、低温酸素化、水素化による変化を主にタンパクレベルで解析した。現在、HOPEにおける既存液(UW-MP液)に対する重水液の優位性、HOPE時水素ガスの併用効果、再灌流時水素ガスの併用効果、を検討中である。(全体構想)本研究は肝移植における臓器不足の解消を目指し、脂肪肝グラフトの修復法を確立するために行う。低温酸素化灌流、重水含有緩衝液、水素ガス投与の至適条件を見出し、これらを組み合わせた肝灌流修復法を確立する。また、至適条件で処置されたラット脂肪肝を同系同所性に移植し有効性を確認する。また、保護メカニズムを肝構成細胞のレベルで精査する。(結果)まず、ラット正常肝を冷保存後に低温酸素化灌流(HOPE)し、至適な灌流量、圧、酸素分圧を探索した。単離肝灌流装置による37°Cで再灌流し、組織障害、逸脱肝酵素、胆汁産生量、酸素消費率等により効果を評価した。既存の保存液を用いてHOPEを行い、さらに、HOPE中、再灌流時に水素ガスを投与し、臓器保護効果を比較した。既存液で至適と判断された条件を用いて、同様の検討を自作の灌流液でも行った。その結果、新液は既存液よりも障害を軽減し、再灌流時の水素ガス投与によって相加効果が得られた。しかし、HOPE中に水素ガスを投与すると灌流圧は低下したが、障害軽減の上乗せ効果は認められなかった。さらに、同様の検討をラットの脂肪肝で行ったところ、既存液ではHOPEにより単純冷保存よりもグラフトが障害されたことから、非生理的温度下での酸化的リン酸化が条件によってはむしろ臓器障害を増強することを示した。一方、自作液では単純冷保存と比べ、非劣性を示した。これらの結果から、新規肝灌流液による低温酸素化灌流、再灌流時水素ガス投与は正常肝の長期冷保存による障害を軽減することが示された。しかし、脂肪肝の修復には、さらに強力な保護機序が必要と考えられた。正常肝の長時間冷保存後の再灌流のモデルで観察された新規灌流液、水素ガス投与の併用効果が、脂肪肝では不十分であった。使用した急性の脂肪肝モデルの適否を含め、モデルの再検討を要したため、予定よりもやや遅れたものである。H26年度迄に冷保存障害保存後のラット正常肝移植を低温酸素化灌流(HOPE)の灌流量、圧、酸素分圧、新規臓器保存液、新規灌流液、再灌流時に水素ガス投与等の至適条件を組合わせて処置し、単離肝灌流装置で再灌流障害を検討した。H27年度はH26年度迄に採取した組織の解析と、脂肪肝、心停止ドナー等の易障害性グラフトでの効果を検証した。新液は既存液よりも障害を軽減し、再灌流時の水素ガス投与によって相加効果が得られた。しかし、HOPE中の水素ガス投与は灌流圧を下げたが、障害軽減の上乗せ効果を認めなかった。ラットの脂肪肝では既存液でのHOPでは障害が寧ろ増強され、非生理的温度下での酸化的リン酸化が障害を増強すると考えられた。一方、自作液で灌流すると、単純冷保存や既存液による灌流に対する非劣性が示された。

これらの結果から、新規肝灌流液による低温酸素化灌流、再灌流時水素ガス投与は正常肝の長期冷保存による障害を軽減することが示された。脂肪肝の修復にはさらに強力な保護機序が必要と考えられた。H26年度迄に採取した組織を解析した結果、HOPEによってATPを含む多くの高エネルギーリン酸化合物が増加していた。また、エネルギー量の変化に起因すると考えられる、エネルギー代謝とオートファジーを制御するタンパクのリン酸化が合目的的に制御され、生存シグナル・抗アポトーシスの増強を伴っていた。これらの結果をさらに詳細に解析するため、ラット肝から肝細胞、クッパー細胞、星細胞、類洞内皮細胞を初代培養し、上記の臓器実験を模した細胞実験系を構築した。しかし、脂肪肝の冷保存、灌流に対応する細胞モデルのでは、十分な数の星細胞、類洞内皮細胞を培養することに難渋し、これらの細胞の不死化を検討し、今後の検討に使用できるめどが立った。ラット正常肝、脂肪肝を用いて、新規臓器保存液、新規灌流液、低温酸素化灌流、水素ガスの併用治療の有効性を確認し、Proof of Conceptを得ることができた。低温酸素化灌流の課題である、灌流中の門脈抵抗上昇やグラフト膨張を抑制した画期的な方法論を確立することに成功した。しかしながら、当初の目的であった脂肪肝の修復は完全には達成できなかった。その原因として心停止肝の胆管障害が挙げられ、動脈灌流も必要と考えられた。脂肪肝では肝重量が正常肝の1.5-1.7倍になるため、ネット上に静置した肝臓では自重により脈管が圧迫されていることが、灌流の有効性を損なっている可能性が考えられた。それゆえ、自重による肝内脈管の虚脱を防ぐことを目的に肝臓を液中に浮遊させた状態で灌流するモデルを検討する。また、低温による脈管収縮を回避するため、あるいは、低温によるストレス応答に関与する遺伝子発現、転写、翻訳、あるいは、活性調節の失調を回避するため、4-7°Cではなく、22-27°Cを検討をの中心温度として、同様の検討を行う。27年度が最終年度であるため、記入しない。移植・再生医療本課題の当初記載の目的は、オリジナルの重水含有緩衝液、低温酸素化灌流(HOPE)、水素ガスを組み合わせて、脂肪肝グラフトの冷保存再灌流障害を軽減する方法論を確立することが目的であった。まず、1)脂肪肝冷保存におけるUW液に対する重水液の優位性と保存限界時間の検討、2) HOPEにおけるUW-MP液に対する重水液の優位性を明らかにする。さらに、3) HOPE時水素ガスの併用効果、4)再灌流時水素ガスの併用効果、5)冷保存時の加圧酸素化の併用効果、を明らかにすることであった。得られた肝組織を用いて重水、酸素化、水素化の保護メカニズムをタンパク、遺伝子レベルで解析する。また、保存終了時の肝をメタボローム解析し、代謝物の動態から作用点を見出す。さらに、正常肝、脂肪肝から肝構成細胞を分離し、冷保存による障害の推移を検討し、重水、低温酸素化、水素化によってどのように変化するかを主にタンパクレベルで解析する。これまでの検討により、低温酸素化灌流と水素投与の方法が、正常肝の長期単純冷保存モデルを用いて、ほぼ確立された。これらの知見に基づき、脂肪肝モデルを用いた検討を行う予定である。一方、メカニズム解析については、AML12細胞株を用いた検討とともに、ラット初代培養細胞(肝細胞、星細胞、類洞内皮細胞、クッパー細胞)の分離が可能となり、レンチウィルスを用いた遺伝子制御(up/down)を行えるようになった。今後、シャペロン分子の動態を精査する予定であり、pilot studyを終えている。
在宅非がん高齢者の終末期ケアを支えるチームアプローチモデルの開発

本研究では熟練訪問看護師のインタビューと質問紙調査を実施。非がん疾患群の予後予測の困難性は高く、本人の認知機能に関わらず、本人より家族への意向確認の実態が確認された。エキスパートの実践は本人の生活史や日常生活の状態の変化の把握と医師の病状判断から予後予測の判断指標としていた。患者の意思表明の支援は、療養者本人の言動の背景を理解した上で本人の意思を代弁し、家族とチームメンバーが本人の意向と理由を共有できるように支援する構造が明確化した。チームアプローチの向上には、介入効果のメンバーへのフィードバックが効果的であったことからチームのコミュニケーション改善やフィードバックの必要が示唆された。本研究の目的は予後予測が困難な非がん高齢者の終末期の予後予測を明らかにし、在宅における終末期ケアの提供のためのチームアプローチを開発することである。先行研究において非がんを含む高齢者の終末期の予後予測において訪問看護師の予後予測と実際の転機の的中率は他の先行研究と比較して高く、6割の在宅医は訪問看護師の予後予測を参考にしていたことから、訪問看護師は在宅高齢者の終末期ケアのゲートキーパーとしての役割、機能を期待できると考えた。初年度の平成26年度は、2つの目的で研究を実施した。まず、訪問看護師の非がん高齢者終末期ケアの事例について予後予測の判断根拠となる兆候や症状、判断後の終末期の看護実践(プロセス)とケアアウトカムとして訪問看護師が考える「望ましい死」を明らかにすることである。2つめは予後予測が困難な非がん疾患の場合、療養過程における患者の意向や意思決定が終末期ケアの質を左右することから、文献から非がん疾患別に療養過程における意思決定の事柄と支援内容、かかわる職種を明らかにすることである。結果として、訪問看護師12名の14事例(がん5事例含む)の分析から、ターミナル期、看取り期ともに看護師は身体症状の変化を捉えており、継続的な看護の関わりによってその変化の程度や速さを把握していた。全ての看護師は食事の量や形態の変化を主な兆候としていた。また患者の病状だけでなく家族の様子や生活状況の変化をも判断指標とし、家族支援を含めた終末期ケアを行っていた。訪問看護師の考える「望ましい死」とは患者と家族が納得のいく死を迎えられることであった。事例の限界はあるが、非がんの場合は医師の方針に影響されることが多く患者、家族、看護師の意向が反映されにくい傾向がみられた。さらに、在宅の場合、患者によってケアメンバーが異なるため、非がん高齢者の終末期のチームケアの困難さが改めて示された。本研究目的は在宅非がん高齢者の終末期の予後予測による適切な終末期ケアの提供をもたらすチームアプローチモデルの開発である。2年目である本年度は、初年度の訪問看護師を対象に実施した在宅高齢者終末期ケアの事例の聞き取り調査(がん及び非がん患者を含む)18ケースを内容分析した。結果、看護師は終末期ケアへの移行するタイミングとして予後予測を行い、終末期ケアに移行していたが、チームによる終末期ケアの移行、実践には至っていなかった。在宅死が実現した事例は、患者および家族の在宅での看取りの意向や意思が明確な場合が多く、患者・家族の強い意向に従う形で終末期ケアが行われていた。そこは多職種によるチームケアというより、終末期の病状管理について医師と看護間の情報提供の形態が多く、看護師に終末期のチームケアの認識や実践は見られなかった。これらの高齢者終末期の多様で個別な状態像を示した事例から終末期ケアやチームアプローチの共通性を見出すことは困難でチームアプローチの類型化には至らなかった。一方、調査からチームアプローチのアウトカムである「高齢者の尊厳ある死」を可能にするには、高齢者の人生の終え方の意向や意思の存在が重要であったことから、終末期の看護師の意思決定支援に焦点をあて文献レビューを行った。高齢者終末期の病態像は多様なため、終末期の病の軌道別を参考にして疾患別の文献検討を行った。慢性疾患として、心不全、COPD、腎不全疾患を選び、さらに神経系疾患、認知症、高齢者がんの各疾患と意思決定支援をキーワードに検索し、意思決定時の病状と時期、内容と主体、支援者について抽出した。結果、疾患別の差異はあるが、大方、治療や病状管理に関する意思決定支援が医師・看護師を中心に行われ、家族代理者による意思決定も多かった。患者本人への終末に関する意思決定支援については計画的に行われていない傾向がみられた。訪問看護ステーションを拠点に調査を実施しているが、非がん疾患患者の終末期像は多様で複雑なだけに、調査対象として終末期にある非がん高齢者事例を捉えにくく、データ収集が困難であった。在宅がん患者は終末期の病態像がわかりやすく、緩和ケアチームによる実践の意識も高いのに対して、非がん患者の終末期においては、チームに終末期としての認識が共有されておらず、終末期ケアのチームアプローチの認識が低かったこともデータ収集に影響した。平成28年度は、最終年度として在宅非がん高齢者を支えるチームアプローチモデルを開発するために、訪問看護師を対象とした聞き取り調査を行った。調査内容は、終末期にある非がん高齢者の終末期の判断した時期とその根拠、終末期を判断した後のチームケアとして実践した内容についてであった。

訪問看護師の聞き取り調査の結果から、終末期の移行への判断が困難な非がん疾患の病態軌道の特徴から、訪問看護師は高齢者の状態悪化を判断し緩和ケアへの移行として認識しつつも、悪化症状への対処として症状管理を行う医療方針との間にチームケア実践の難しさを認識していた。また、それぞれの事例において病状や医師の治療方針において個別性が強く、そのため、在宅非がん高齢者の終末期において緩和ケアのチームアプローチとしての特徴は明確にならなかった。そのため、さらに質の高い地域医療連携や緩和ケア実践をしている専門看護師を対象にして、尊厳ある死を目指す専門看護師の予後予測とチームアプローチに関するグループフォーカスインタビューを実施した。インタビュー内容は、専門看護師はがん・非がんに限らず終末期の緩和ケアへの移行をどのように判断し、ケアチームを形成し、チームアプローチを実施しているかについてフォーカスをあてたグループインタビューを実施した。現在、インタビューを逐語にし分析を進めケアチームアプローチのための要件等の抽出をしている。28年度内に聞き取り調査分の統合のために研究を継続し、当初の研究目的である在宅非がん高齢者を支えるチームアプローチモデルの開発を行う。調査対象を訪問看護師としたが、テーマである在宅非がん高齢者の終末期像が把握しにくく、緩和ケアのチームアプローチとしての実践の記述が困難であった。チームアプローチおよび地域連携のリーダーとしての専門看護師の調査協力の機会を得た。しかし、その調査実施は28年度後半だったため、年度内に研究目的である在宅非がん高齢者終末期ケアチームアプローチモデルを抽出できなかった。平成29年度は、これまでの調査結果を統合し「在宅非がん高齢者の終末期ケアを支えるチームアプローチモデルの開発」を目的として、終末期ケアを実践している訪問看護師1000人を対象に質問紙調査を実施した。調査対象は、在宅看取り率が高い都道府県上位10都道府県の訪問看護事業所を無作為抽出し、調査の回収・有効回答率は16.7%であった。訪問看護師の訪問看護経験は、平均9.08(SD8.02)年、終末期の看取りの経験は、平均20名以上であった。看取りの療養者は、非がん疾患が7割であった。訪問看護師の看取り期の判断は、9割以上が臨床経過と症状により可能(できる・概ねできる)と回答した。在宅緩和チームケアに必要な看取りの意向確認とケア目標の共有は、9割ができていたと回答したが、共有した内容は、本人の意向より家族に確認した意向である傾向がみられた。他職種との情報の共有は、9割がほぼできていると認識し、その共有のマネジメントは訪問看護師であったと8割が回答していた。訪問看護師のチームアプローチの実施における困難性として、症状判断と予後予測が最も困難性が高いと回答(2割強)した。また、看取り期のケア評価は8割強が実施しており、そのうち6割強がチームカンファレンスの開催を行っていた。以上から、予後予測が難しい非がん高齢者の看取り期の判断や看取りのチームケアアプローチについては訪問看護師がマネジメントを担っていること、予後予測や本人の意向など不確実性のある非がんの終末期ケアにおいてはチームカンファレンスの実施によるチームの合意を確認しながらケア実践しているという様相が明らかとなった。
イネ亜硝酸レダクターゼの構造遺伝子と制御遺伝子の構造解析

1.イネ亜硝酸レダクターゼ(NiR)cDNAライブラリーの作成。硝酸塩(NO_3)によって誘導したイネ緑化幼植物の葉と根の両組織からmRNAを単離精製し、cDNAを合成した。λgt11を発現ベクターとして、両者のcDNAライブラリーを作成した。その大きさは、それぞれ6×10^6pfu/mlと8×10^6pfu/mlであり、80-90%の組換へ効率を示す良質なcDNAライブラリーであった。2.スクリーニングとクローニング。既に取得しているイネNiRcDNA(0.5kb)をプローブとして両ライブラリーのスクリーニングを行い、5×10^4ファージ当り、葉では67個、根では54個の陽性プラークの存在を認めた。この中から全長NiRcDNA(2.2kb)を持つクローンを取得した。3.塩基配列の決定。全長NiRcDNAの塩基配列を決定した結果、葉と根の両方に2種類のNiRcDNAが存在することが判明した。即ち活性酸素蛋白質に対応する塩基配列を持つcDNAと、この塩基配列の中に93bpの塩基配列が挿入された挿入型cDNAが存在することが判明した。4.イネcDNAの塩基配列の特徴。非挿入型cDNAは596個のアミノ酸をコードするクローンであった。このクローンにはポリAシグナルと思われるAAΤAAA配列が存在する。挿入配列を持つcDNAクローンは93bpの挿入配列を除けば、非挿入型クローンの塩基配列と同一であった。この挿入配列の由来を解明するために、イネ核ゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った結果、この塩基配列はゲノムDNA中に存在することが判明した。挿入型NiRcDNAはイントロンの不完全な切り出しに帰因するのか、或いは生理的に意義のあるmRNAの存在の反映であるか否か不明である。この点についてはNiR遺伝子の全塩基配列の決定によって解明する予定である。3.塩基配列の決定。1.イネ亜硝酸レダクタ-ゼ(NiR)cDNAライブラリ-の作成。硝酸(NO^-_3)によって誘導したイネ緑化幼植物の葉と根の両組織からmRNAを単離し、合成後、λgt11を発現ベクタ-として、両者のcDNAライブラリ-を作成した。その大きさは、それぞれ6×10^6と8×10^6pfuであり、80ー90%の組換へ効率を示す良質のライブラリ-であった。2.スクリ-ニングとグロ-ニング。既に取得しているイネNiR cDNA(0.5kb)をプロ-ブとして、両ライブラリ-のスクリ-ニング行い、5×10^4個ファジ-当たり、葉では67個、根では54個の陽性プラ-クの存在を確認した。この中から全長NiR cDNA(2.2kb)を持つクロ-ンを取得した。3.塩基配列の決定.全長NiR cDNAの塩基配列を決定した結果、葉と根にそれぞれ2種類のNiR cDNAが存在することが判明した。即ち活性酵素蛋白質に対する塩基配列をもつcDNAが存在する事が判明した。即ち活性酵素蛋白質に対応する塩基配列をもつcDNAと93bpの挿入配列をもつcDNAが存在する。4.イネNiR cDNA塩基配列の特徴,非挿入型cDNAは956個のアミノ酸をコ-ドするクロ-ンであった。このクロ-ンにはポリAシグナルと考えられるAATAAの配列が存在する。しかしポリA配列は見出せなかった。挿入配列をもつcDNAは、93bpの挿入配列を除けば、非挿入型クロ-ンの塩基配列と同一であった。この挿入部分はホウレンソウNiR

遺伝子に存在する第3番目のイントロンと同一の長さ(93bp)であった。挿入型cDNAはイントロンの不完全な切り出しに帰因するのか、或は生理的に意味のあるクロ-ンであるか否か不明である。この点についてNiR遺伝子の構造解析によって解明する予定である。1.イネ亜硝酸レダクターゼ(NiR)cDNAの塩基配列の決定。葉cDNAライブラリーから3個、根cDNAライブラリーから4個のcDNAクローンを単離しそれぞれのクローンについて制限酵素地図を作成した。その結果、葉と根の両方に制限酵素地図の異なる2種類のクローンが存在することが判明した。制限酵素地図の異なる2つの完全長cDNAクローンについて、それぞれの全塩基配列を決定した結果、一つは活性酵素蛋白質に対応する塩基配列をもつものであった。他の型のクローンは前者の塩基配列中に93bpの塩基配列が挿入された挿入型cDNAであることが判明した。2.イネNiR cDNAの塩基配列の特徴。正常型NiR cDNAは596個のアミノ酸をコードするクローンである。このクローンにはポリA附加シグナル配列と思われるAATAAA配列が存在する。挿入配列をもつcDNAクローンは93bpの挿入塩基配列を除けば正常型クローンの塩基配列と同一であった。両クローンともコドン3番目のG/C含有量は96%である。これはトウモロコシNiR cDNAの98%に近い値であり、単子葉植物起源のNiR cDNAに共通する特徴である。しかし93bpの挿入塩基にはこのような偏りは認められない。この挿入配列の由来を解明する目的でイネ核ゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った結果、この塩基配列がゲノムDNA中に存在することが判明した。挿入型NiR cDNAの存在はイントロンの不完全な切り出しに帰因するのか、或いは生理的に意味のあるmRNAの存在の反映であるか否か不明である。この点についてはNiR遺伝子の全塩基配列の決定によって解明する予定である。
廃用性筋萎縮後の筋合成を促進するプレニルフラボノイドの研究

不活動状態や無重力状態で引き起こる廃用性筋萎縮からの回復を助ける食品成分に関する研究を行った。実験動物に筋肉の萎縮を誘導し、そのあとにプレニルフラボノイドを混合した飼料を与えることで骨格筋の回復状況を評価した。プレニルフラボノイドを与えることで、骨格筋の萎縮からの回復の程度は改善した。作用メカニズムとしてフィトエストロゲン活性が寄与する可能性が示唆された。今回の成果は筋萎縮によって引き起こされるQOLの低下を改善する可能性がある。平成26年度には、筋萎縮からの回復を評価できる動物実験の確立と、プレニルナリンゲニンの筋合成促進効果について件相することを目的とした。1.動物実験系の確立:廃用性筋萎縮の動物実験モデルは、尾懸垂試験、坐骨神経切除試験、ギプス固定試験がある。廃用性筋萎縮からの筋肉合成(回復)を見るためには上記の筋萎縮状態からの解放がなされることが必要である。そこで、ギプスを固定した動物実験モデルを採用した。ギプス固定によって、筋肉が減少することはすでに分かっているため、今回の目的はギプス解除後の運動機能の回復である。ギプス固定の一定期間あとに、関節が動きにくくなる等の問題があったが、固定の強さと角度を工夫することで、それらの問題は解除された。ギプス解除後に骨格筋量が増えることが確認できた。2.プレニルナリンゲニンの骨格筋合成促進効果:1)で確立した動物実験方法で飼育するマウスにプレニルナリンゲニンを与えた。プレニルナリンゲニンを与えた場合は、与えない場合と比較して筋肉量が多くなることが分かった。このため、プレニルナリンゲニンは骨格筋合成を促進する効果があることが示唆された。3.エストロゲンとの効果の比較:プレニルナリンゲニンにはエストロゲン様の作用があるといわれている。27年度への準備段階として、1)で確立した動物実験方法に、エストロゲンを投与する実験を行った。エストロゲンにおいてもプレニルナリンゲニンと同様の効果が認められたので、本法を用いて、プレニルナリンゲニンの効果メカニズムを解明できる見通しが立った。本研究はプレニルフラボノイドの機能性として、骨格筋への蓄積量が高く廃用性筋萎縮を予防しうる可能性を背景にし、廃用性筋萎縮からの回復を促進するか否かについて検討する研究である。平成27年度に廃用性筋萎縮を誘導する器具を開発した。本器具を使用し、骨格筋萎縮を誘発した後にプレニルフラボノイドを与えることで骨格筋の回復が早くなることを見出した。平成28年度は平成27年度に確認された骨格筋の回復の程度について、時間の経過を追いながら観察を行った。この研究により、骨格筋の回復の促進が認められる経過日数について明らかにした。また、同様の評価はエストロゲン投与動物においても実施したが、同じ経過日数によって骨格筋の回復が認められることを確認した。プレニルフラボノイドのエストロゲン様作用が本機能性の作用機序であることを確かめるために、エストロゲン受容体阻害剤を用いた動物実験を開始した。阻害薬の投与方法を検討したが、適した投与方法を見つけるには更なる見当が必要な段階である。一方で同阻害剤を使用した細胞実験を実施した。一部の骨格筋合成にかかわる経路についてはエストロゲン受容体阻害剤によって減弱する可能性が示唆されたが、明確な経路の同定には至っていない。今後は阻害剤の種類や他の分子標的を阻害する薬剤を用いて作用機序の検討が必要である。タンパク質合成にかかわる因子としてアミノ酸トランスポーターの機能やアミノ酸取り込み量に関する検討を実施した。プレニルフラボノイドはアミノ酸トランスポーターの発現量に影響を及ぼす可能性が示唆された。実績の概要に示した通り、今年度は3つの項目について実施予定であった。結果もおおむね良好で、27年度の研究の準備が整った。27年度が最終年度であるため、記入しない。食品機能学順調に推移しているため、27年度も予定通り実施する。
環境化学物質の脳機能発達に与える影響についての解析

初代培養細胞系を用いて、内分泌攪乱物質である、ジエチルスチルベストロール(DBS)およびビスフェノールA(BPA)の神経機能発達に対する影響の検討を試みた。マウス小脳顆粒細胞ニューロン初代培養系では、培地中のKCl濃度を25mMから5mMに落とすとアポトーシスによる神経細胞死が誘導される。その後5mMから再び25mMに戻して再脱分極を起こすと、細胞内Ca^<2+>流入依存的にc-fosや脳由来神経栄養因子BDNFの遺伝子が活性化され、細胞死が抑制される。この系を用いて、脂溶性が高く母乳から乳児へと移行すると考えられる、DESやBPAの遺伝子発現に与える影響を検討した。その結果、25mMKClやNa^+チャネル賦活剤ベラトリジンで脱分極を起こすとCa^<2+>流入依存的にc-fosやBDNF遺伝子発現が誘導された。この誘導は、DESやBPAの前処置により、殺虫剤のDDTやペルメトリンと同様に、濃度依存的に阻害された。また、脱分極刺激で誘導された細胞内Ca^<2+>流入も、DESやBPA前処置で抑制された。このことより、内分泌攪乱物質が、神経系に対しても影響を及ぼし、脂溶性の高いこれら化学物質が、細胞膜に直接、あるいは膜上の種々のイオンチャネルに作用してカルシウム流入を抑制し、遺伝子発現に影響していることが考えられた。さらに、これら脂溶性の高い化合物が、複合的に作用するのではないかと考え実験を行った。その結果、ペルメトリンとDDTを同時に前処置した場合、それぞれ単独処理のときよりも、脱分極刺激で誘導したc-fosやBDNF遺伝子発現を有意に強く抑制した。また、ペルメトリンとDDT、DESの3種の化合物を同時に前処置すると、さらにその遺伝子発現阻害は増強された。これらのことより、脂溶性の高い環境化学物質は、遺伝子発現に対して、複合的阻害効果を及ぼすことが考えられた。初代培養細胞及び生体脳を用いて、環境化学物質である殺虫剤の神経機能発達に対する影響の検討を試みた。1.培養細胞系における検討マウス小脳顆粒細胞ニューロン初代培養系では、培地中のKC1濃度を25mMから5mMに落とすとアポトーシスによる神経細胞死が誘導される。この系を用いて、母乳から乳児へと移行すると考えられる殺虫剤の遺伝子発現に与える影響を検討した。この誘導は、DDTやピレスロイド系殺虫剤であるペルメトリン、シぺルメトリン、デルタメトリン、フェンバレレートの前処置により阻害された。また、DDT及びペルメトリンは、脱分極刺激で誘導された細胞内Ca^<2+>流入を抑制した。さらに、DDTとペルメトリンは、遺伝子発現を阻害する濃度では、細胞生存効果に影響を与えなかったが、細胞内ミトコンドリア活性の指標である、MTT活性やアコニターゼ活性に対して抑制効果を示した。2.生体脳における検討出産直後の母親マウスに、ペルメトリンあるいはDDTを連続経口摂取させ、仔マウスの小脳の遺伝子発現レベルを測定した。その結果、生後3週目のペルメトリン投与群でc-fos遺伝子発現の有意な減少がみられた。以上のことより、種々の殺虫剤が、生存および神経活動に必要な遺伝子発現やミトコンドリア活性を抑制することが明らかになり、これら殺虫剤が、マウス小脳発達に対して影響を及ぼしている可能性が考えられた。

その結果、ペルメトリンとDDTを同時に前処置した場合、それぞれ単独処理のときよりも、脱分極刺激で誘導したc-fosやBDNF遺伝子発現を有意に強く抑制した。また、ペルメトリンとDDT、DESの3種の化合物を同時に前処置すると、さらにその遺伝子発現阻害は増強された。これらのことより、脂溶性の高い環境化学物質は、遺伝子発現に対して、複合的阻害効果を及ぼすことが考えられた。
符号理論、格子理論と正標数の代数多様体

有限体F_2上の[n,k,d]符号全体の集合Fを考える。[n,k,d]符号に対し、(d/n,k/n)を対応させる写像〓はFからIR^2の部分集合[0,1]^2への写像を与える。その像Im〓の集積点の集合は、Maninによって研究され、[0,1]区間で定義されたある連続関数R=αg(δ)によって{(δ,R)|0≦R≦αg(δ)}として表わされることが知られている。本研究では、[7,4,3]Hamming符号に対応する点(3/7,4/7)を考え、そのまわりに存在する符号の様子を調べた。[n,k,d]符号Cの像〓(C)=(x,y)とするとき、Cと同値な符号C′で〓(C)=〓(C′)となるものが存在しないとき、Cは完全孤立であるという。また、Br((x,y)={(u,v)∈〔0,1〕^2|(u-x)^2+(v-y)^2<r}とおく。Br(〓(C))の中に〓(C′)(C′はCと同値ではない)がはいるような符号C′が存在しないとする、そのようなrの最大値をCの孤立半径という。これらの用語の下に次のような結果を得た。1)[7,4,3]Hamming符号は完全孤立であり、その孤立半径は2√<2>/77である。また、この符号に一番近い符号は[11,6,4]符号である。2)[7,4,3]Hamming符号と[8,4,4]拡張Haraming符号の距離は1/(√<98>)であるが、それを半径とする円板の内部に含まれる線型符号は6種類しかない。Golay符号に対しても同様の考察をおこないほぼ最終的な結果を得た。
機能的義歯が備えるリリ-フ量とその適用範囲に関する研究

人口の高齢化が進む今日、有床義歯を用いた補綴処置を行う頻度が高まっている。特に、全部床義歯の必要な患者の多くは高齢者であり、一般に新しい環境に対する順応性が低下している。このような患者が新しい義歯を受入れやすくするためには、義歯装着が床下粘膜へ及ぼす影響について、特に義歯機能時の挙動を考慮した情報が必要である。本研究は、荷重前後の床下粘膜の抹消血液循環の変化を、粘膜の特に薄い口蓋正中部を中心にレーザードップラ血流量計を用いて計測し、さらに当教室で従来より行われているBモード超音波診断装置による計測を同一部位に加え、義歯装着による床下粘膜への影響とその対応策について検討することを目的とする。本研究においては、実験義歯が血流量の変化・床下粘膜厚径計測のテンプレートを兼ねているため、以下の点に注意して慎重に製作した。前歯部からプローブの挿入が可能となるように臼歯部のみに咬合堤を付与し、床用レジンは適合性に優れているイントプレスを用いた。荷重量を最大咬合力に規定できるように下顎実験義歯の左右第1大臼歯相当部に小型荷重センサを設置し、センサの受圧部のみで上顎実験義歯と咬合するように調整した。また、粘膜表層の血流量は温度変化に大きく影響されるので、実験義歯口蓋部に温度センサを組み込み粘膜表面の温度をモニタリングできるようにした。同一部位を繰り返し計測できるように上顎実験義歯の各計測部位にはプローブホールを設けた。この実験義歯を用いて測定をおこなった結果、安静時粘膜厚径に対する粘膜沈下量の割合(粘膜沈下率)が、12.715.1%と他の部位より高い値を示した口蓋正中部を中心とする範囲で、荷重前後の血流量の変化が大きい傾向が示された。また、この範囲において除重時の粘膜変位の変位回復比が他の部位より小さいことが明らかになった。これらの結果は義歯機能時にリリ-フすべき範囲と量を決定する判定基準となる。
Cdk5とホスファターゼによる視細胞の光-化学信号変換能力の調節

我々は脊椎細胞のGタンパク質信号系を用いてin vitroおよびin situ実験において、1)Gタンパク質標的酵素(PDE6の阻害サブユニット:Pγ)のリン酸化がこれまで機能の不明確であった神経細胞特異的サイクリン依存性プロテインキナーゼ(Cdk5)によって行われていること、2)そのリン酸化は基質とGタンパク質の相互作用に伴って生起すること。つまり、Gタンパク質が効果器を活性化した段階ではじめてリン酸化基質になる。3)脱リン酸化酵素は常に働いており、in situにおいて迅速な脱リン酸化が行われ、信号系の応答時間特性を向上させていること、などを明らかにできた。我々の研究成果の重要な点は、1)サイクリン依存性プロテインキナーゼの未知の機能を示唆したこと、2)これまで3量体型Gタンパク質信号系の不活性化プロセスはGタンパク質自身が内在性のGTPase活性によって不活性化すれば自然に不活性化すると考えられてきたが、このプロセスに効果器酵素のリン酸化が関与する可能性を明らかにした、3)視細胞における光信号変換系の機能調節にもG蛋白質標的酵素のリン酸化と脱リン酸化が関与しているという視細胞研究の新しい展開を引き出した点などである。JBC誌上で報告した。さらに、Cdk5が視細胞外節のどのような領域に局在するのかを検討する過程で、視細胞光受容膜にTriton X-100難溶性の膜領域(ラフト様膜領域)が存在することを発見した。この発見は視細胞でのCdk5の役割に関する研究にとって副次的なものではあったが、円板膜上で行われる光信号変換の分子機構を考えるに当たって、きわめて重要な知見であった。Cdk5及びホスファターゼがラフト様膜領域とどのような関係にあるかを検討するとともに、ラフト様膜領域と光信号伝達系(ロドプシン、トランスデューシン、PDE6)の関係を詳細に検討し、JBC誌上で報告した。脊椎動物の視細胞に存在する光信号変換機構は3量体型Gタンパク質が仲介する細胞シグナリングシステムである。この系の活性化過程はかなり分かってきたが、不活性化過程については不明な点が多い。申請者はこの系のGタンパク質の標的酵素であるcGMP-加水分解酵素(PDE)がリン酸化されることを発見し、そのリン酸化現象の生理的意義について検討た。1.本年度の成果:1)PDE上のリン酸化部位は、その阻害サブユニットであるPDE_γ(P_γ)の^<22>Thrである。^<22>Thrはプロリン指向性プロテインキナーゼの共通リン化部位として知られるアミノ酸配列PXTPの中に位置する。2)トランスデューシンαサブユニット(T_α)が退色ロドプシンとGTPによって活性化されると、P_γを結合してPDE_<αβ>(P_<αβ>)の触媒活性を開放するが、Cdk5はこの際に形成されるGTP-T_α/P_γ複合体上のP_γを選択的にリン酸化する。3)リン酸化酵素はCdk5(神経特異的サイクリン依存性キナーゼ)である。4)リン酸化されたP_γはトランスデューシンが不活性化されるのを待たずにP_<αβ>に対する親和性を強め、P_<αβ>を抑制する能力を持つようになる。5)生きた視細胞内でもこの光依存的P_γリン酸化現象を確認したが、その定常的リン酸化量はP_γ全量の数パーセントに過ぎなかった。2.今後の研究の展開:当初予定した成果に加え申請者は最近視細胞光受容膜にリピッド・ラフトが存在することを発見した。

この局所膜領域に活性化されたPDEが集合する。このPDEにはP_γが再結合しているがなお活性を維持しており、単にGタンパク質が不活性化しても、必ずしもPDEが阻害されるわけではないことが示唆され、ここでもCdk5によるリン酸化が不可欠となる可能性が示唆された。本年度以降はラフト上のPDEとそのリン酸化の意義について検討したい。脊椎動物の視細胞における光信号変換分子機構は脊椎動物視細胞の光-化学信号変換の分子機構は3量体型Gタンパク質が仲介する細胞内信号系の典型として盛んに研究されてきた。しかし、この系の特徴である背景光強度に対する極めて広いダイナミックレンジの順応作用についてはまだほとんど解明されておらず、その理解には信号系の不活性化のメカニズムの解明が不可欠であると信じられている。本研究計画ではCdk5というセリン・トレオニンキナーゼによるcGMP加水分解酵素(PDE)阻害サブユニットのリン酸化とPP2Aと考えられるホスファターゼによる脱リン酸が光で活性化されたPDEの不活性化過程にどのような役割を果たすのかを明らかにすることを目指している。この研究の過程で、視細胞外節膜はこれまで漠然と考えられてきたような均一な膜系ではなく、高度不飽和脂肪酸を有するリン脂質の膜の上に高度に飽和した脂肪酸を有するグロセロリン脂質(特にホスファチジルコリン)やスフィンゴ糖脂質を主成分とするラフト様の膜領域が存在すヘテロな膜であることやGタンパク質やPDEなどの主要な信号系タンパク質が活性依存的に両膜領域間を往復することを発見した。本年はPDE阻害サブユニットをリン酸化、脱リン酸化するCdk5やPP2Aのこうした膜間の分布とその変化について検討した。本年の成果:ウシの無傷の視細胞外節を用いて検討した結果、Cdk5及びPP2AはTriton X-100不溶性分画に局在が認められたが、ショ糖密度勾配遠心法で分離すると細胞骨格と見られる高比重分画に分布していることが確認できた。この分布はCa2+の濃度や光刺激に無関係である。今後の研究の展開:活性化したPDEはラフト様膜領域に移行することを見つけている。このPDEのラフトへの移行現象にCdk5によるPDE阻害サブユニットのリン酸化やPP2Aによる脱リン酸化がどのような影響を与えるかなどを検討する。PIらは、2000年に、脊椎動物視細胞の光受容部に神経特異的サイタリン依存性キナーゼ5(Cdk5)が存在することを発見し、この酵素が光信号系の効果器酵素であるcGMP加水分解酵素(phosphodiesterase6:PDE6)の阻害サブユニット(Pγ)をリン酸化することを明らかにした。さらに2001年に、視細胞のTriton X-100難溶性ラフト様膜分画への活性化に伴うPDEの移行を発見した。本年度は、1)Cdk5によるPγのリン酸化がPDEのラフトへの移行にどのような影響を与えるか、2)ラフトへ移行したPDEはどのようなタンパク質と相互作用するのか、3)ラフトへ移行したPDEのPγサブユニットはCdk5によるリン酸化を受けるのか、4)視細胞外節内でのCdk5とホスファターゼの局在、ラフトへの分布、などを検討した。その結果、(1)Cdk5によってリン酸化されたPDEはTriton X-100可溶性分画にとどまり、ラフト様分画には移行しない。