hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
北アフリカをモデルとする地中海食の侵襲性歯周炎への効果の解明に向けたコホート研究

モロッコ等の北アフリカでは侵襲性歯周炎の有病率が高いことが従来から指摘されてきたが、具体的な有病率や原因ならびに進行のメカニズム等の詳細な情報が不足している。これまでの先行研究において侵襲性歯周炎の原因菌の一つであるA.a菌の病原因子との関連についての報告は散見されるが、地中海食といった地域に特異的な食生活と侵襲性歯周炎との関連性を探索した研究はほとんど認められない。そこで我々は3年間にわたり、モロッコの大学生を対象にMohammed V University歯周病講座のEnnibi教授らのメンバーと共同で口腔と全身の健康状態、食生活等の生活習慣について調査してきた。全身疾患を有する者、過去3ヶ月以内に抗生剤の処方を受けた者ならびに喫煙者は解析除外とした。その結果、1075名のモロッコ人(平均年齢20.2歳、男女比:約2:8)のうち、約7%に侵襲性歯周炎罹患者が認められた。歯周組織検査の結果、侵襲性歯周炎群では平均3ミリの歯周ポケットが認められたのに対し、非侵襲性歯周炎群では2.2ミリであった。3ミリ以上のアタッチメントロスについても侵襲性歯周炎群では11%に認められたが、非侵襲性歯周炎群では0%であった。地中海食のスコア(MDS)を基に回帰分析を行ったところ、スコアは1つ多くなるほど15%程度、侵襲性歯周炎のリスクが低下することがわかった。とくにオリーブオイル摂取単独でみると、侵襲性歯周炎の病態と有意に逆相関の関係にあり、45%リスクが低下することが判明した(交絡因子で調整済み)。以上のことから、オルーブオイルの摂取は侵襲性歯周炎の病態進行に抑制的に作用している可能性が示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。モロッコ等をはじめとする北アフリカ地域で多くみられる侵襲性歯周炎の原因ならびに進行のメカニズムを明らかにすることを目的に調査を行ってきた。発症率についての情報はあまりないが、10%程度といわれている。今回我々は、大学生を対象として、モロッコ王国のMohammed V University at SouissiのEnnibi教授ら歯科医師と共同で1000名近いN数を確保した。まだ、調査は継続中なため、予備的なデータ集計にとどまるが、いくつかの成果が得られた。例えば、発症頻度についてみると、1)近遠心のCAL 5mm以上の臼歯and/or切歯が4分割した口腔の2ヶ所以上に存在する場合、2)PDが6mm以上かつCALが6mm以上の歯が8歯以上存在。そのうち3歯以上は切歯、第一大臼歯以外とする、といった2つのケースで集計してみた。その結果、1)では、侵襲性歯周炎の頻度は10%程であり、2)のケースでは、1%程度であることが判明した。今後、地中海食の摂取状況ならびに各種交絡因子を調整した形で解析を進める予定である。対象者数が当初予定していた1000名にほぼ到達できている点、ならびにデータの入力についてもほぼ完了しつつある点等でおおむね順調と考えている。

そこで我々は、モロッコの大学生を対象にMohammed V University歯周病講座のEnnibi主任教授らのメンバーと共同で口腔と全身の健康状態、食生活ないし食事内容および生活習慣等について調査研究を進めてきた。全身疾患を有する者、過去3ヶ月以内に抗生剤の処方を受けた者ならびに喫煙者は解析除外とした。その結果、1075名のモロッコ人(平均年齢20.2歳、男女比:約2:8)のうち、約7%に侵襲性歯周炎罹患者が認められた。歯周組織検査の結果、侵襲性歯周炎群では平均3ミリの歯周ポケットが認められたのに対し、非侵襲性歯周炎群では2.2ミリであった。3ミリ以上のアタッチメントロスについても侵襲性歯周炎群では11%に認められたが、非侵襲性歯周炎群では0%であった。地中海食のスコア(MDS)を基に回帰分析を行ったところ、スコアは1つ多くなるほど15%程度、侵襲性歯周炎のリスクが低下することがわかった。とくにオリーブオイル摂取単独でみると、侵襲性歯周炎の病態と有意に逆相関の関係にあり、45%リスクが低下することが判明した(交絡因子で調整済み)。以上のことから、オルーブオイルの摂取は侵襲性歯周炎の病態進行に抑制的に作用している可能性が示唆された。対象者数が当初目標としていた1000名に到達できている点、ならびにデータ集計ならびに統計解析についても完了しつつある点等でおおむね順調と考えている。現在、調査は進行中であり、N数を1500名を目指して行っている。これまでの予備的な集計データを見る限り、侵襲性歯周炎の重症例は約12%の割合と考えられるため、全体のN数は多いほど望ましいと考えている。データの構築ができ次第、比例ハザードモデル等の統計解析を用いて、侵襲性歯周炎の発症・進行、A.a JP2株の変化ならびに地中海食の摂取状況等の因果関係を解析する予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。対象者数は当初想定していたレベルに達し、データ集計ならびに統計解析についてもほぼ満足できるレベルに達していると認識している。今回、横断研究のデータを用いて解析を行ったので、今後はコホート調査のデータを活用する方向で考えている。たとえば、有病率をアウトカムにした比例ハザードモデルを構築し、侵襲性歯周炎の発症・進行、A.a JP2株の変化に地中海食の摂取状況等の因子がどのように影響しているかといった因果関係等の検証を行いたいと考えている。
音声の遺伝-音声の個人差を規定する音響・生理学的要因

音声への遺伝と環境の影響を明らかにするため、個人差を規定する音響・生理要因を調べた。第1部では、音響・生理計測の標準値を示した。第2部では、成人双生児ペアでの音響・生理の近似性を検証した。周波数・時間特性は、標準値の個体差と個体内変動より、双生児ペアで近値、声道長推定値と口腔内圧b/p比は同等であった。ヒト音声では、遺伝に規定される身体形態と感覚運動性、環境・言語に規定される音声対立が要因となる。音声への遺伝の影響を明らかにするために、個人音声を規定する音響・生理学的要因に関する研究を行った:(1)測定機器(センサ・アンプで組み立てた試作器、本年度調達した測定システム)を用いて、生理学的計測(口腔内圧他)を実施した。(2)双生児と幼児の発語の音響分析により、子音/r/の閉鎖音化〔d〕(Noise burstやStop gapで示された)が双生児間でより一貫していること、語の持続時間に年齢の影響があること(低年齢で有意に長い)がわかった。(3)空気力学的計測の基準的方法を確立するために、両唇音で無声口音の/p/と有声口音の/b/、有声鼻音の/m/を母音間に入れた無意味語を標的語とし、声の大きさと発語速度を3段階に変えて発語させた場合の子音調音時の口腔内圧Poピーク値を正常成人10名(男女各5名)で求めた。この結果、口腔内圧ピーク値(cmH_2O)は、男女差はなく、/p/で高く(平均6.50)、/b/で低く(3.20)、/m/ではわずか(0.50)であった(普通条件)。声が大きいと/p//b/のPoは高くなっていた。さらに、擬似的な異常音声(声門閉鎖不全、鼻咽腔閉鎖不全、口唇閉鎖不全)ではPoが期待される値をとり、構音障害例でも音声特徴と一貫したPo値を示した。(4)双生児(成人女性1組)の声道の形状と音響分析の結果との照合を行った。発語時の声道は、ATRイメージングセンターでのMRを用いた実験で画像データを求め、計測をした。音声(母音と/asa/)の音響学的特性も近似していた。今後、同年代女性群の分析結果を合わせ、その近似性を評価する予定である。(5)言語による音声制御の違いを調べるために、日本語話者10名と英語・中国語話者各6名より発語資料を集め、音響分析により時間的特性を測定した。日本語の特殊音素(促音・長音)を含む語の生成では、英語話者で過剰な延長傾向を認めた。ヒト音声は、かなりの個人差を示し、遺伝によって決まる声道の大きさと形状だけでなく、発語環境や言語などの影響も少なくない。本研究では、音響分析と生理学的計測を用いて、個人音声の特徴を記述・類型化することを目標とし、本年度は以下の研究に取り組んだ:(1)英語・中国語話者の日本語音声の音響特徴:日本語を母語としない話者12名(英語・中国語各6名、学習レベル:初級・中級・上級各2名)と日本語話者10名に日本語音声の特殊音素(促音と長音)を含む語を生成させ、音響分析により閉鎖区間と母音持続時間を測定した。この結果、促音と非促音の対立(あっか・あか)の閉鎖区間は、日本語話者で約2倍であったのが、英語話者で大きく、中国語話者で小さい傾向がみられた。長音と非長音の対立(かーど・かど)の母音持続時間は、日本語話者で約2倍であったが、英語・中国語話者ではより短いかより長かった。(2)発声発語時の口の開き:成人話者8名(男女各4名)に声の大きさ(ふつう・大きい・小さい)と聴覚Masking・はつきりClearの5条件で、前舌3母音(狭/i/・半狭/e/・広/a/)の持続発声とそれを含む語を入れた連続的発語をさせ、レーザー測定装置を用いて標的母音の口の開き(上下唇間距離)を計測した。この結果、口の開きは、母音発声で男性の方が女性よりも大きかったが、発語では男女の違いはなかった。大きな声やMasking・Clearは、ふつう・小さな声と比べ、全ての標的母音で口の開きは大きかった。発語運動は、発語環境に応じて、いずれの話者でも、予想された方向性に変化することがわかった。(3)発声発語時の脳活動-fNIRによる観察:成人話者10名に、声の大きさや話速度の変化、聴覚Maskingや遅延フィードバック条件で、母音の持続発声と連続的発語を行わせ、近赤外線による脳活動(ヘモグロビン)の記録を行った。音声への遺伝と環境の影響を明らかにするために、個人音声を規定する音響学的特性と生理学的側面を調べることを目標に、本年度の研究課題に取り組んだ:

(1)音響特性では、成人の音声資料の分析より、前年度までの研究でも指摘してきた音声基本周波数の平均に加えて、文・文章生成時の基本周波数foの範囲と無意味音節VCV生成時の有声閉鎖音の前の声帯振動(voice lead)が個人差を顕在化させる可能性が示された。(2)成人双生児(一卵性と二卵性)の発声発語の音響分析より、声の高さ(平均)と使用範囲、発語1速度、発語での共鳴周波数(Fn)の変化量で似ていた。これは、言語経験と運動能力を反映する音声の側面と考えられる。(3)生理学的(空気力学的)計測では、言語性と非言語性での流量と圧力の制御に違いがあるかを大学生4名での10試行の変動係数で調べた。唇・舌で制御された流量の変動は言語性課題でいくぶん小さく、非言語性課題の弱く条件で変動が大きかった。声門での流量制御は、非言語性課題での変動が小さかった。口腔内圧は、言語性と非言語性課題で違いはなく、弱く条件でいずれも変動が大きかった。言語性と非言語性課題で、持続時間や区間平均・変化量での違いがあるかを分析をすすめて行く。(4)発語時の口の開きの程度を大学生8名を対象にレーザー光線で計測した。前舌母音(狭イ、半狭エ、広ア)とも、口の開きは大きな声で最も大きく、ついでマスキングノイズと明瞭発語条件であった。発声時と比べて、発語時に口の開きは狭く、特に半狭と広母音で制限されていた。(5)言語による音声制御の背景を知るために、日本語特殊音素の知覚判断の境界を求めた。日本語話者では、促音と閉鎖音(閉鎖区間の持続時間)で150ms前後、長音(母音の持続時間)で120ms前後であった。これが英語・中国語話者ではこの境界が異なるため、特殊音素の生成の時間的調整が難しいことの背景にあると考えられる。
ニワトリ品種をモデル動物として用いた「脳ヘルニア」形成機構の解明

本研究は、Polish系ニワトリ(Polish)と呼ばれるニワトリ品種における"cerebral hernia"に着目した。ニワトリにおけるcerebral herniaは、脳と頭蓋骨の形態異常に関連する遺伝形質である。しかし、この形質の原因と形成メカニズムはいまだに不明であった。研究の結果、[1]ニワトリ胚を用いた形態計測から、Polish胚の脳腔が著しく拡張していることが明らかとなった。[2]野生型の脳と比較して、Polish型の脳は多くの水分を含んでいた。[3]Polishと近交系ニワトリの交配からなるリソースファミリーを用いた連鎖解析により、cerebral herniaの原因遺伝子座がニワトリ連鎖群LGE22に位置づけられた。今回、Polishの脳において観察された脳腔の拡張や水分多含は、ヒトの水頭症(脳浮腫の一種)の主な特徴と類似していた。すなわち、以上の成果は、Polishが脳発生の異常や脳浮腫の発症と関連する可能性を示唆する。よって、Polishはヒト疾患モデル動物としての潜在性を持つことを示す現象が明らかとなった。また、cerebral herniaが常染色体劣性遺伝するということは約100年前から知られていたが、それ以降、遺伝的基盤の実体は不明のままであった。本研究の連鎖解析は、cerebral herniaの原因遺伝子座の位置を染色体レベルにまで絞りこみ、原因遺伝子の同定を現実的なものにする基盤情報を提供した。本研究の主な最終目的は、ニワトリにおけるcerebral herniaの「原因遺伝子の同定」と「形成メカニズムの理解」であった。後者に関しては、胚時期の脳腔の拡張という具体的な事象を突きとめるに至った。一方で、前者に関しては、ニワトリゲノムに関する情報不足の影響もあり、原因遺伝子座の位置する染色体を特定するに留まった。よって達成度に関しては(2)とした。Polishを疾患モデル動物としての有効活用するためには、cerebral herniaの形成メカニズムを理解しなければならない。これまでの研究では、Polish初期胚における脳の形態に関する情報を得ることができなかった。Polish型と野生型を外見的に区別する難しさから、形態学的なアプローチにより形成メカニズムに迫ることには限界があり、効率的ではないと考えられる。一方、本研究の成果によって、原因遺伝子座が位置に関する情報が得られた。よって、原因遺伝子座や、その影響を受ける遺伝子を明らかにすることにより、形成メカニズムの解明に近づくことができる。原因遺伝子座の位置する染色体の有力候補は特定されたが、具体的な座位は不明なままである。よって今後は、ニワトリゲノム情報の活用やDNAマーカーの確立を行い、より詳細な連鎖解析を進める必要がある。
非水溶性合成高分子の電気泳動分析手法の開発

電気泳動法は、高性能分離・分離コスト削減・分離効率向上に優れているが、非水溶性合成高分子分析への適用はほぼ行われていない。当研究室ではすでに界面活性剤を用いる非水系キャピラリー電気泳動法による非水溶性合成高分子の種類別・組成別分離に成功している。今回、界面活性剤種や溶媒組成が分離挙動に与える影響について調査を行い、分離メカニズムについての検討を行ったところ、分離選択性は主として疎溶媒性相互作用に由来するが、静電相互作用が比較的強く働く試料成分が存在することも明らかにできた。また別途、合成高分子のサイズ別分離を行うための、有機ゲル、および汎用的な検出法の開発に成功した。電気泳動法は生体高分子分析では汎用されているが、非水溶性合成高分子分析への適用はほとんど行われていない。申請者はこれまでに、陽イオン性界面活性剤である塩化セチルトリメチルアンモニウム(CATC)を添加した非水系電気泳動により合成高分子のキャピラリー電気泳動分離が可能であることを見出しているが、その分離選択制の詳細は明らかではない。非水溶性合成高分子の電気泳動分離の根幹となる、「有機溶媒中での高分子ー界面活性剤間の相互作用」についての知見を蓄積するため、有機溶媒組成および界面活性剤が電気泳動移動度に与える影響を、キャピラリー電気泳動法を用いて検討を行った。その結果CTACとは異なる界面活性剤である、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)や臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム(DMDOAB)を用いることでも、合成高分子の非水系キャピラリー電気泳動分離が可能であることを明らかにした。また、CTAC、SDS、DMDOABを用いることで異なる分離選択制を得ることが可能であることを見出した。さらに日水系溶媒の組成によりその分離選択制をある程度コントロール可能であることも見出した。合成高分子のゲル電気泳動によるサイズ別分離手法を開発するために、有機ゲルの開発を行った。メタクリル酸メチル(MMA)とエチレンジメタクリレート(EDMA)を用いてテトラヒドロフラン(THF)を主要倍とする有機ゲルの調整を試みた。反応溶液中のMMA、EDMA量などの合成条件を調整し、合成高分子のゲル電気泳動によるサイズ別分離を行うための有機ゲルの調整に成功した。非水溶性合成高分子の電気泳動分離の根幹となる「有機溶媒中での高分子ー界面活性剤間の相互作用」については当初計画通り、種々の知見を蓄積することができている。ゲル電気泳動に関しては有機ゲルの調整に成功しているが、有機ゲル中の分析対象となる合成高分子の検出が予想以上に困難であり、適切かつ簡便な方法の検討を行う必要があることが分かった。そのため、ゲル電気泳動によるサイズ別分離に関しては若干の遅れがある。生体高分子分析では汎用されている電気泳動法は、非水溶性合成高分子分析にはほとんど適用されていない。本研究では、非水溶性合成高分子の電気泳動分離の根幹となる、「有機溶媒中での高分子ー界面活性剤間の相互作用」についての知見を蓄積するため、有機溶媒組成および界面活性剤が電気泳動移動度に与える影響を、8種のイオン界面活性剤について、キャピラリー電気泳動法を用いて検討を行った。その結果、臭化セチルトリメチルアンモニウム・ドデシル硫酸ナトリウム・臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウムを用いた際には合成高分子の電気泳動分離が可能であるが、残りの5種については分離が達成できず、適切な界面活性剤種の選択に関する知見を得ることができた。また、疎水性の高いイオン液体であるトリヘキシルテトラデシルホスフォニウムクロリドを用いても合成高分子の種類別分離を行うことに成功した。一連の分離結果を詳細に検討した結果、疎水性の高いイオン種を用いることが合成高分子の分離に有利であることを明らかにできた。また、有機溶媒中での高分子ー界面活性剤間の相互作用は、主として疎水性相互作用に支配されているが、静電相互作用が比較的強く働く試料成分が存在すること、溶媒組成の影響を強くうける成分が存在することを明らかにした。さらに、合成高分子のゲル電気泳動によるサイズ別分離手法を開発するために、有機ゲルの開発を行った。メタクリル酸メチルとエチレンジメタクリレートを用いてテトラヒドロフランを主溶媒とする有機ゲルの調整を試みた。合成条件に関する検討をこない、合成高分子のサイズ別分離を行うための有機ゲルの調整に成功した。また、汎用性の高い合成高分子の検出手法の開発に成功した。「有機溶媒中での高分子ー界面活性剤間の相互作用」に関する知見は、ほぼ予定通り進んでいるため、この知見を更に蓄積するため、現在対象としている比較的小さな分子量帯の高分子に加えて、重合度の大きい高分子の取り扱いに関する知見を深める。ゲル電気泳動によるサイズ別分離に関しては、まずは有機ゲル中の合成高分子を簡便に検出するための方法の開発を行う。その上で、まだ情報の不足している有機ゲルの調整条件とサイズ別分離挙動に関する知見を蓄積する。

そのうえで、当初計画通り他の種類の高分子への適用に関する基礎検討を進める。分析化学当初予定では27年度に国際会議に参加する予定であったが、28年度に参加することにしたため、旅費の支出が遅れている。また、ゲル電気泳動に関する実験が予定より遅れているため、当初予定していた、標準高分子の購入をまだ行っていない。そのためため消耗品の支出が予定より遅れている。国際会議については、すでに発表の申し込みを行っており、旅費を執行する予定である。また、実験の遅れを取り戻すため、研究に参画させる学生を1名増員したため、消耗品についてはも問題なく執行される予定である。
先端生長細胞における成長点の誘導とその形成機構の解析

赤色光下で培養した単細胞性のシダ原糸体細胞を白色光下に移し、7時間培養したのち、基部方向に向かって20分2000gで遠心した。原糸体の核は平均して約250um基部に移動し、その後はその近辺に留まった。細胞を遠心後赤色偏光下で培養すると、細胞分裂をした後、先端細胞が十分長い細胞においては、細胞を分ける分裂面の近くで分枝が起こった。先端細胞が短い場合には、元の先端部から成長が再開された。遠心後細胞を暗黒下で培養し、分裂を誘導した後赤色偏光を照射した場合には、核は多少先端方向に移動し、その結果分枝の位置が、先端方向で起こる場合が見られた。この時の核の挙動をビデオで連続録画し、解析した結果、核は分裂直後に細胞分裂面から離れた後、分枝に伴って再度分裂面近くに戻ることが分かった。分枝は核が数十ミクロンも離れている状態で開始されることから、成長点の分化には、核の位置は重要ではないことが示唆された。分枝に伴う細胞骨格の変化を観察した。赤色光照射前には、微小管、ミクロフィラメントともに成長軸と平行な配列をしている。分枝の開始の少し前になると、将来分枝が発達する位置に表層微小管のリング状構造が一時的に出現する。この構造は細胞分裂の位置を決定するPreprophase bandと同様な配置と一時的発現をするという2点から、非常に興味深い。その後細胞が膨潤を始めると、表層微小管は新たな成長点を頂点とした扇状に広がるパターンをとる。さらに成長が進むと、すでにその存在が確認されている、先端生長をする原糸体の亜先端部に見られる微小管束が出現する。ミクロフィラメントについても、表層微小管同様な配列が観察されるが、微小管ほど鮮明ではない。本研究から、分枝の分化においては、微小管の配向並びに、核の挙動が重要であることが分かった。この他、先端成長時の核の移動に対する細胞骨格の作用、遠心操作に伴う細胞骨格の変化など、先端成長における成長様式の解析を行なった。植物の細胞伸長方式の一つは、細胞の一端のみで成長する先端成長である。この先端部には、植物細胞の伸長機構が集約されていると考えられる。先端部の構造と機能を解析するには、すでにできあがった先端部の観察よりも、先端部の分化・生成にともなった細胞内構造変化の時系列に沿った解析が望ましい。本研究では、シダ原糸体細胞の一部に新たな先端部を分化させ、その形成過程を観察する。今年度は、原糸体細胞を遠心し、赤色光を照射して成長点を誘導する系の改良と、細胞の遠心にともなう核の構造変化の観察を行なった。赤色光下で6日間培養した原糸体細胞に白色光で細胞分裂を誘導し、その後3日間赤色光下で細胞を伸長させた後、遠心して核を原糸体基部方向に移動する。この処理が最も成長点分化の確立が高いことが分かった。さらい核の移動距離に依存して成長点の発生率とその位置が制御されていることが分かった。原糸体の一部のみに赤色光を微光束照射すると、その近傍から成長点の分化が見られるが、微光束、核、成長点の三者の位置関係は必ずしも一致していない。

細胞を基部方向に長時間遠心すると、核は原糸体基部方向に移動するのみならず、核マトリックスより比重の重い核小体は、核のDNA塊から離脱する。この結果、核本体と核小体は数百ミクロンのDNAの長い糸で結ばれた格好になる。このDNA糸は核膜に囲まれており、核が核本体と核小体の間で長く伸ばされたものである。このDNA糸はその後徐々に短くなり、再び核に吸収されるようだ。赤色光下で培養した単細胞性のシダ原糸体細胞を白色光下に移し、7時間培養したのち、基部方向に向かって20分2000gで遠心した。原糸体の核は平均して約250um基部に移動し、その後はその近辺に留まった。細胞を遠心後赤色偏光下で培養すると、細胞分裂をした後、先端細胞が十分長い細胞においては、細胞を分ける分裂面の近くで分枝が起こった。先端細胞が短い場合には、元の先端部から成長が再開された。遠心後細胞を暗黒下で培養し、分裂を誘導した後赤色偏光を照射した場合には、核は多少先端方向に移動し、その結果分枝の位置が、先端方向で起こる場合が見られた。この時の核の挙動をビデオで連続録画し、解析した結果、核は分裂直後に細胞分裂面から離れた後、分枝に伴って再度分裂面近くに戻ることが分かった。分枝は核が数十ミクロンも離れている状態で開始されることから、成長点の分化には、核の位置は重要ではないことが示唆された。分枝に伴う細胞骨格の変化を観察した。赤色光照射前には、微小管、ミクロフィラメントともに成長軸と平行な配列をしている。分枝の開始の少し前になると、将来分枝が発達する位置に表層微小管のリング状構造が一時的に出現する。この構造は細胞分裂の位置を決定するPreprophase bandと同様な配置と一時的発現をするという2点から、非常に興味深い。その後細胞が膨潤を始めると、表層微小管は新たな成長点を頂点とした扇状に広がるパターンをとる。さらに成長が進むと、すでにその存在が確認されている、先端生長をする原糸体の亜先端部に見られる微小管束が出現する。ミクロフィラメンとについても、表層微小管同様な配列が観察されるが、微小管ほど鮮明ではない。本研究から、分枝の分化においては、微小管の配向並びに、核の挙動が重要であることが分かった。この他、先端成長時の核の移動に対する細胞骨格の作用、遠心操作に伴う細胞骨格の変化など、先端成長における成長様式の解析を行なった。
インスリン作用の分子生物学的検討

本実験の結果より、アクチンフィラメントはClass IAPI3kinase(ClassIAPI3k)依存性にGlut4の細胞膜への移動に主として関与しており、微小管は同kinase非依存性の移動に関与していることが示唆された。一方、トランスフェリン受容体(TfR)の細胞膜への移動にはClassIAPI3k非依存性のシグナルのインプットと共に、微小管が主として関与していることが示唆された。また、アクチンフィラメントがGlut4の細胞膜への挿入、ひいてはブドウ糖の取り込み機序に関与している可能性も示唆され、Glut4vecileの細胞膜へのdocking,fusion等の過程へのアクチンフィラメントの関与の機序をSNARE機能等への影響を検討し今後明らかにする必要がある。インスリンにより産生されるPI3P(ClassIAPI3k非依存性脂質産物)によりGlut4は、細胞膜へは移動するが、挿入されないことから、SNARE機能を正常に調節するシグナルのインプットが欠けていることも示唆されClassIAPI3kがそこに関与しているのかもしれない。本経路では、微小管の関与が大きいことが明らかとなり、インスリンによるGlut4の細胞膜近傍への移動の大部分はClassIAPI3k-アクチンフィラメント依存性の特異的な経路であり、副経路では、非ClassIAPI3k-微小管依存性であり、その経路はTfRと共有している可能性が示唆された。インスリン抵抗性に代表される2型糖尿病への新たな治療戦略開発を目的として、骨格筋のモデル細胞であるL6骨格筋細胞を用いて異なる移動経路を利用したGlut4の移動機序を今回検討した。本実験結果をもとに、異なる経路の障害程度と治療法開発の検討を目的に今後、in vivoへの実験へと展開する予定である。1)microtubulesの構築を破壊するCholcicineでL6細胞を前処置しインスリンで刺激した場合、GLUT4(G4)の細胞膜への移動は部分的に抑制された。AKT阻害剤で細胞を前処置した場合、G4の移動は大部分が抑制された。2)さらに、PI3Pを細胞内へ導入した際のG4の移動はCholcicine前処置によって大部分が阻害される一方、AKT阻害剤前処置による影響は受けなかった。その反面、PI(3,4,5)P_3によるG4の移動はCholcicineの影響は部分的であり、AKT阻害剤により大部分が抑制された。3)1)と同様の条件下でトランスフェリン受容体(TfR)の細胞膜への移動を観察すると興味深いことにAKT阻害剤処置下でもTfRの細胞膜への移動は部分的であることが観察された。4)以上の結果より、インスリンによるG4の移動の大部分はAKT依存性でありmicrotubuleに部分的に依存するが、PI3Pによる移動経路(AKT非依存性)はmicrotubuleの利用率がより高いことが示唆された。TfRの移動の結果と合わせ、AKT非依存性、microtubule依存性の経路を各刺激が異なる分子の移動に対し異なる割合で利用していることが示唆された。5)以上の結果は主にRUMs assayを用いたものでありmembrane lawn assayを利用し同様に検討を進め、現在、実験計画のとおり、各条件下で以下の実験を実行中である。1)移動した異なる分子の細胞膜への挿入機序の条件解明のために細胞膜付近の各分子の細胞外ドメインを認識するアッセイ法で検討2)AKT-AS160等のG4の移動に重要なシグナル分子の関与の検討。3)cytoskeletonの関与を阻害剤により使用し検討。インスリン作用機序を細胞レベルから検討し、その結果を臨床応用ヘインテグレーションすることは、2型糖尿病の病態解明、治療法の開発の一手段として非常に重要である。

今回我々はインスリン標的組織として重要な骨格筋の細胞モデルであるL6細胞を用いて、インスリンによる糖の取り込み作用発現に重要である糖輸送体、Glut4の細胞膜への移動の機序をトランスフェリン受容体(TfR)のそれと比較検討した。その結果、1) Glut4の移動はインスリンによるclassl PI3kinase活性に大きく依存するが、その機序にactinfilamentが関与していた。2)TfRはclassl PI3kianse以外のkinaseにより移動するが、その産物のひとつであるPI3Pにより移動する際、actinfilamentではなくmicrotubuleが関与していた。3)PI3PによるGlut4の移動にもmicrotubuleが関与していることが示された。これらより、インスリンによるGlut4の細胞膜への移動には、kinaseにより産生される異なるphospholipidとactinfilamentまたはmicrotubuleとの密接な相互関係が存在することが明らかとなった。すなわち、Glut4の移動に関与する各々の組み合わせは、1) PI(3,4,5)P_3-actin filament、2)PI3P-microtubuleの少なくとも2経路があり、2)はTfRの移動機序と共通であり特異的ではない可能性が示唆された。このことより、インスリン抵抗性状態で、ある病態において1)、2)のいずれかが優位に障害されている場合、選択的にいずれかの作用を増強させることにより、病態にそくしたオーダーメード医療を実践できる可能性が考えられた。今後それらの異なる経路を規定する他の要因につき詳細に検討していく予定である。
視神経挫滅モデルへの脳脊髄液経由骨髓間質細胞由来シュワン細胞移植

H18年度に引き続いて以下の実験を行った。(1)視神経挫滅モデルの作成:対象動物は8週齢のラットを用いる。麻酔はガス麻酔法を用い、左眼眼球直後にて眼循環を途絶しないように、4gの血管結紮クリップを用いて視神経を30秒間挫滅し、視神経挫滅モデルを作成した。(2)骨髄間質細胞の分化・誘導:ラット骨髄間質細胞を用いる。ラット骨髄間質細胞は4週齢オスからの細胞を用いる。詳しい誘導法は(Dezawa M, et. al.Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone-marrowstromal cells.Eur J Neurosci,(2001),14(11),1771-6)に記載してあるが、約1ケ月で目的のシュワン細胞への分化誘導が終了した。(3)モデルへの脳脊髄液経由骨髄間質細胞由来シュワン細胞移植:モデル作成直後に、第4脳室から細胞移植を行う。細胞移植は100万個/100μlの細胞懸濁液として注入する事により行った。(4)組織学的検討:光学・電子顕微鏡による観察と、免疫染色を行った。(5)電気生理学的検討:Flash VEPを計測し、網膜や視神経の機能評価の検討を行った。更に他施設どの共同研究により以下の論文を発表するに至った。これらを踏まえ、骨髄間質細胞由来シュワン細胞移植は視神経挫滅モデルに対して有効であると結論した。今年度は主に以下の点に関して研究を行った。これらの研究結果を踏まえて、平成18年度は更に、実験固体数を増加させ、組織学的検討・分子生物学的検討・電気生理学的検討を行い、骨髄間質細胞由来シュワン細胞移植が視神経挫滅モデルに対して有効であるか否かを検討する。すでに、第110回日本眼科学会総会に現時点までの結果については報告した。
患者力を高めるためのシミュレーション患者教育プログラムの開発と介入効果

「患者が医療者につたえられていること、伝えられていないことの体験」をテーマとして佐賀県の患者会に属する患者にインタビュー調査を実施し、患者が医療者に伝えられていること、伝えられていない経験についての現状を明らかにすることであることを目的とし、倫理審査申請を実施した。平成31年2月12日付で倫理審査申請を承認された。1.インタビュー結果をもとに、シナリオ設定を検討し、シナリオ、シナリオデザインシートを作成する。このことに関しては、佐賀県の患者会の会長との連絡をとり、研究協力依頼を実施し、研究の依頼を患者を対象にできる日程、患者との日程調整を実施している段階である。シナリオの設定の基本的な軸として、会議を2回実施し、1どのような状況の患者(学習者) :学習者の知識、経験を考慮する。2人数3学習目標:限られた時間内で、達成可能、評価可能、現実的な目標を設定する。4演技者:シミュレーション企画側もしくは、学習者以外の演技者を設定する。5環境6物品7観察者8記録者9評価者、シナリオ数は5つ場面(診察室、病室、処置室、検査室、相談室)を作成する。こととした。2.インタビューガイドを作成した。今後、患者とのインタビュー日程が決定次第、インタビューを実施し、シナリオ設定の検討、シナリオデザインシートの検討、評価表の作成、シミュレーション計画を実施する。インタビューの結果から、シミュレーションの細かい時間設定も実施していく予定である。難病等の患者を対象とする研究であり、インタビュー調査である。患者は、時間的制約もあるが、患者が医療者に対して、伝えられていること、伝えられていないことなどの調査のデータ処理、データ管理、患者に対する倫理的配慮、身体的配慮の必要性から、倫理審査申請に時間を要したことがあった。また患者会のリーダーとの打ち合わせも、日程調整が難しいこともあったため遅れていた。しかし現段階では、倫理審査承認、調整もとれている。1.シナリオをもとにシミュレーション評価表を作成する。評価表は、チェックリストとレーティングスケールを併用する。1チェックリスト:結果や過程を測定する。効果的な方法や技法かを評価する。2レーディングスケール:結果や過程を判断する。3段階スケールを用いて評価する。2.シミュレーション計画を作成する。1シミュレーション時間設定ブリーフィング(導入、状況説明、課題説明)シミュレーション、デブリーフィング、シミュレーション2回目、まとめ・ディスカッション2デブリーフィングガイドを作成する。3.シミュレーション患者教育プログラムの目標を設定し、5つの場面で作成したシナリオをどのような期間で、どのくらいの回数、どのような学習者に実施をしていくのか、シミュレーション患者教育プログラムを作成する。4.シミュレーション患者教育プログラムを医療系ではない学部に所属する学生を対象にαテストを実施する。5.佐賀県の患者会に所属する患者を対象に、シミュレーション患者教育プログラムを実施し、評価表をもとに評価する。こととした。

4.シミュレーション患者教育プログラムを医療系ではない学部に所属する学生を対象にαテストを実施する。5.佐賀県の患者会に所属する患者を対象に、シミュレーション患者教育プログラムを実施し、評価表をもとに評価する。イギリスで実施される学会にて、患者教育シミュレーションについて、発表は出来ないが、各国の医療従事者と交流を図り、患者教育、患者力、シミュレーションについてのディスカッションをしたいと考えている。すでに参加登録をしており、その旅費、学会参加費である。またビデオ、ICレコーダーの購入をする予定であったが、購入する良い機器がなかったため、次年度とした。
斜入射レーザ光干渉による機械加工面の形状精度のコンピュータホログラフィック測定

1.機械加工部品の面形状精度の測定を目的とした干渉測定機の基本技術の構築をはかった.2.従来のホログラムとしてのサーモプラスチックに代わるものとして,CCDイメージセンサの導入は計測環境の影響をあまり受けない測定を可能とした.3.本測定方法では,干渉縞像を基準面および測定対象面ごとに取り込み,その輝度情報はそれぞれ位相差データに変換される.研究課題として提示したコンピュータホログラフィック法の適用により,それらの不連続な位相差データを各ピクセル毎に差し引いて,測定対象面,基準面間の形状偏差に相当する相対位相差曲面の形成する方法を確立した.また,その干渉縞像の輝度情報を,形状偏差に変換するために一連のソフトプログラムの開発をはかり,データ処理の基本構造を確立した.4.本測定方法による干渉縞像の縞密度は著しく高いものとなり,このことは提起したコンピュータホログラフィック法によっても解決しえない問題の存在が明らかとなった.その問題への対処法として、参照光光路途中への凹レンズの配置により干渉縞の縞密度の大幅な軽減をはかる方法,さらに,目標面形状,あるいは,ヘテロダイン法を用いることにより相対位相差の縞密度の低下をはかる方法など,そのいずれも確実な形状偏差を得る上に効果の大きいことを明らかにした.5.フリンジスキャン装置により取り込む干渉縞像の枚数はどの程度が適切かを検証した.平面試験片を測定対象とし,測定精度との関連でその標準偏差を1μmにするためには取り込み画像は3枚でもよく,さらに,測定精度を上げて標準偏差を0.1μmとする場合でもそれは68枚で十分であることを実験的に検証した.この結果,適切な取り込み画像数を決定でき,画像処理速度の高速化およびメモリー占有領域の大幅な節約を可能とした.1.これまでの実験に用いてきた干渉計においては,ソースよりのレーザビームをスプリッタにより物体光,参照光にわけた後,それぞれをエキスパンダーにより拡大しているため,各光学要素のセッティング誤差を光学的に回避することは不可能である.そこで,エキスパンダーを光源直後に配置する,いわゆる,マッハツェンダー形干渉計に変更すること,また,物体光光路途中に配置するミラーなどに回転機構をもたせない方法が,複雑な面形状を持つ機械加工面の面形状の測定に適していることが判明した.このような干渉計によって,歯車歯面のように複雑な面形状をもつ場合でも,被測定歯面を適正にセッティングすれば測定可能なことをシミュレーションにより確認した。2.CCDイメージセンサーを用いて参照面および被測定歯面の干渉縞像を個別に取り込み,それらの干渉縞像より位相に変換して,さらに,連続した位相曲面を形成し,CRT上の各ピクセルに対応した位相差を計算することにより,被測定面の参照面に対する位相差曲面はホログラフィ干渉によるものと同等の結果を得ることを実験により確認した.3.上述の位相曲面の計算はコンピュータ処理によっても困難な場合が多く,そのために一部マニュアル操作を必要とするが問題点としてあげられる.そこで,各測定面の-ππなる位相データをCRT上のピクセルごとに直接差し引きして,そのデータを連続した位相差曲面しても被測定面の参照面に対する位相差を与えうることが判明し,データ処理におけるその方法の有効性を平面試験片,歯車歯面を測定対象として実験を行って確認するとともに,その方法の根拠を理論的解析により与えた.1.機械加工部品の面形状精度の測定を目的とした干渉測定機の基本技術の構築をはかった.2.従来のホログラムとしてのサーモプラスチックに代わるものとして,CCDイメージセンサの導入は計測環境の影響をあまり受けない測定を可能とした.3.本測定方法では,干渉縞像を基準面および測定対象面ごとに取り込み,その輝度情報はそれぞれ位相差データに変換される.研究課題として提示したコンピュータホログラフィック法の適用により,それらの不連続な位相差データを各ピクセル毎に差し引いて,測定対象面,基準面間の形状偏差に相当する相対位相差曲面の形成する方法を確立した.また,その干渉縞像の輝度情報を,形状偏差に変換するために一連のソフトプログラムの開発をはかり,データ処理の基本構造を確立した.4.本測定方法による干渉縞像の縞密度は著しく高いものとなり,このことは提起したコンピュータホログラフィック法によっても解決しえない問題の存在が明らかとなった.その問題への対処法として、参照光光路途中への凹レンズの配置により干渉縞の縞密度の大幅な軽減をはかる方法,さらに,目標面形状,あるいは,ヘテロダイン法を用いることにより相対位相差の縞密度の低下をはかる方法など,そのいずれも確実な形状偏差を得る上に効果の大きいことを明らかにした.5.フリンジスキャン装置により取り込む干渉縞像の枚数はどの程度が適切かを検証した.平面試験片を測定対象とし,測定精度との関連でその標準偏差を1μmにするためには取り込み画像は3枚でもよく,さらに,測定精度を上げて標準偏差を0.1μmとする場合でもそれは68枚で十分であることを実験的に検証した.この結果,適切な取り込み画像数を決定でき,画像処理速度の高速化およびメモリー占有領域の大幅な節約を可能とした.1.測定系における歯車設定のための治具を製作することにより,被測定歯面の位置設定を正確に行える干渉測定機を完成した.2.CCDイメージセンサにより撮影した干渉縞像上の座標と,干渉測定機上の被測定面の位置対応をはかるために,干渉縞像と,シミュレーション像の輪郭形状の一致させることが必要である.

そのために物体光を歯車軸に対して平行に設定する手法を開発して,本方法の有効性を実験により確認した.CCDイメージセンサにより干渉縞像を取り込み,その場合に用いた計算機より実際に計算処理を行うワークステーションへのデータの転送システムを構築した.また,測定データを歯面形状偏差に変換するためのアルゴリズムおよびそれを実現するためのソフトウェアを開発した.4.位相シフト法により干渉縞像データを位相データに変換した場合,その位相は[-π,π]に限定された値でしかないため,この不連続な位相データを連続した位相データに変換する必要がある.しかし,CCDイメージセンサによる撮影した干渉縞像は対象とする機械部品の面形状によりその縞密度が高くなることがあり,そのような場合,画像処理を困難なものとなる.そこで本研究では撮影した基準面,被測定面の干渉縞像より得た[-π,π]の不連続な位相データをどうしをCCDイメージセンサ上の対応する画素ごとに差引することにより得た結果がホログラムな場合と同様の効果をもたらし,いわばコンピュータホログラフィック測定というべき方法の基礎を確立する位相データ処理法を開発し,そのことを補強する理論的裏付けを行った.1.波長の異なる二つの光源をもつ干渉計を構築した.2.本干渉計を用いて測定結果が十分な精度を保証しうるものであるかを検討するために,まず,異なる波長により取り込んだ干渉縞像の処理結果の比較,および,それらを触針法による測定結果とも比較することにより,その測定精度が本研究の目的にかなうものであることを確認した.3.波長の異なる二つの光源を用いた干渉計において,各波長に対する干渉縞像をそれぞれ取り込んでそれら輝度データを位相に変換し,いわばコンピュータホログラフィック法によって二つの位相画像の対応する画素のあいだの相対位相差を算出することにより,実行波長が大きい干渉縞像に相当する相対位相像を得ることができ,その結果,その2値画像の縞密度は著しく減少し,その効果が大きいことを確認した.4.フリンジスキャン装置により取り込み干渉縞像の枚数はどの程度が適切かを検証するために,平面試験片,および歯車歯面を用いての実験を行った.その結果,測定精度との関連でその標準偏差を1μmにするためには取り込み画像は3枚でもよく,さらに,測定精度を上げて標準偏差を0.1μmとする場合でもそれは68枚で十分であることを実験的に検証した.従来,各測定対象面ごとに10枚の干渉縞像の取り込みを行ってきたことに対して,適切な取り込み画像数を決定できたことにより,画像処理速度の高速化およびメモリー領域の節約を可能とした.5.従来の干渉測定機を用いて撮影される干渉縞像では,光軸から離れた箇所での縞密度は著しく高いものとなる.そのために縞密度が高ければその位相接続を十分な精度でもって行なうことは困難な場合があり,その問題を解決する手法を提示するとともに,実験により検証を行い,その効果の大きいことを確認した.
グリニッジ世界標準時の成立に関する歴史的考察

平成22年度には、イギリス国内においてグリニッジ標準時が浸透した経緯およびその社会的な影響に関する研究を行なった。まずグリニッジ天文台の実用的な機能についての理解を深めるための前提として、18世紀初頭から19世紀前半を対象に、同天文台の学者たちが海上において経度を正確に計測するという課題にどのように取り組んだかを解明する雑誌論文(『一橋大学社会科学古典資料センター年報』〉と単著(『経度の発見と大英帝国』)を発表した。同書では、経度の測定と世界標準時の設定という二つの主題が、密接に結びついていたことを示唆している。次に、主としてケンブリッジ大学図書館所蔵のグリニッジ天文台関連文書の解読から、19世紀中葉に開始された同天文台による時報発信サービスの特徴を検討し、その成果を研究論文としてまとめるとともに、「近代英国におけるグリニッジ標準時の浸透」という題目で発表を行なった。従来の研究では、グリニッジ標準時の伝達システムがどのように活用されていたかという点について、詳細な分析が行われてこなかった。そこで本研究は、ロンドンおよび地方都市における時報伝達に関する技術の革新と移転.英国海軍における時報発信装置の航海術への応用、そうした科学と技術に対する科学者と一般市民の認識、標準時を伝える時報の正確性の程度とそれをめぐる責任の所在といった問題を軸に調査を行ない、国内に標準時が一般化した要因とその歴史的な意義を総合的かつ実証的に明らかにした。本研究の目的は、19世紀の英国と国際社会において、いかなる経緯を経て、グリニッジ標準時という枠組が受容されたかを解明することにある。平成21年度には、まず19世紀中葉にグリニッジ天文台が置かれていた状況を分析し、同天文台が標準時に関わる事業を開始するまでの道程を実証的に解明した。その成果をまとめると次のようになる。19世紀の英国では、民間の天文観測施設が数多く設立され、アマチュア天文学が大きな潮流となっていた。そのなかで、例外的な国営のグリニッジ天文台は、天文観測業務の他にも、公共性の高い各種事業に取り組むことで、その存在意義を示す必要に迫られた。そこで、第七代グリニッジ天文台長ジョージ・エアリは、英国社会全般に貢献することを目標に掲げ、電信を用いて標準時の正確な時報を伝達する事業に着手した。次に、エアリが導入したグリニッジ天文台からの標準時報が、国内でどう評価されたかを調査した。特に本研究は、天文台長エアリが時報事業に付与した意義を明らかにする一方で、新聞・科学雑誌文芸評論誌の記事を分析し、グリニッジ標準時が伝統的な地方時にとってかわることに、反対する人々が繰り出す論理を明らかにした。最後に、主に科学者達が集った複数の国際会議の議事録の分析から、グリニッジ標準時が世界標準時として採択された経緯をまとめてみた。その作業を通して、当時の科学者達が、特定の本初子午線の選択を主張する際に用いていた科学的見地を把握した。
有機水銀化合物の特性を利用する炭素環および複素環天然物の合成

1)水銀塩によるフムレン(【I】)の環化機構:シクロフムラノイドへの生合成では常に【I】の9位の二重結合が【H^+】によって攻撃され、【C_2】【C_9】に結合を作っている。しかし、【I】の二重結合の反応性は6位,2位,9位の順であることがわかっており、これを模倣しようとするとき如何にして一番反応性の低い二重結合から反応を起させるかが課題であった。これは水銀塩によって可能になったが、水銀塩は何故他の反応剤と異り9位の二重結合から攻撃を始めるのかという疑問に答えるためその機構を探った。その結果、水銀塩もやはり6位の二重結合から反応を開始しているが、生成物としては恰も9位のそれから反応したようなものを与えていることがわかった。【I】の種々の条件下における水銀塩の反応生成物を調べるとともに、水銀反応生成物のKBr処理で生ずる物質や、生成物をNa【BD_4】で還元してDの入った位置から水銀の作用点や作用様式を探った。また反応の中間体となると考えられるフムロールとβ-フムレンの水銀塩処理生成物も参考として、かなり込みいった反応機構を明らかにした。2)チルシフェロール(【II】)の合成研究:【II】は海藻から単離された抗腫瘍性化合物で、スクワレンが環化して四つのエーテル環を作っている形の化合物である。分子の中心にある6員のエーテル環(C環)は歪が大きく、X線解析でボート型をしていることがわかっており、この環の形成が合成のポイントとなる。われわれは初めの二重結合とエポキシド、或いはアルコールの間で水銀塩によってエーテル環を組立てようとしたが困難があり、結局エポキシドのチタンテトライソプロポキシドによる開裂に伴う分子内のアルコールの攻撃によって構築した。本研究において、合成の鍵となるC環を含むA,B,Cの三環部分を合成出来たので、これに現在進行中のD環を作りつけることで全合成が完成する。
リボ核酸分解酵素T2ファミリの反応機構のヌクレオチド基質類似体による解明

ホスホトランスフェラーゼ型のリボ核酸分解酵素類において、RNase A family, T1familyに属する塩基特異的酵素による「厳密」な塩基認識機構は、種々の複合体のX線結晶構造解析等によって詳細に明らかにされている。一方、本研究のテーマであるRNase T2familyに属する塩基非特異的酵素に関しては、4種類の酵素の立体構造(RNase Rh, RNase MCl, RNase LE, RNase Le2)が報告されているが、同familyに属する酵素による「柔軟」な塩基認識機構に関しては、未だ不明な点が多い。そこで、本研究において、我々は、塩基非特異的酵素による塩基認識機構を明らかにするため、RNase T2 familyに属するトマト由来リボ核酸分解酵素RNase LEおよびシイタケ由来RNase Le2と種々のヌクレオチドとの複合体のX線結晶構造解析を行った。特に、前者においては、基質類似体であるdeoxyguanylyl-3',5'-deoxyguanosine、即ちd(GpG)との複合体結晶の構造解析を行い、後者においてはd(GpG)およびd(ApA)との複合体結晶の構造解析を行った。精密化の結果、RNase LEの複合体結晶の解析により、5'-側グアニン塩基(G)はB1サイト、3'-側のグアニン塩基(G)はB2サイトにproductive binding modeで結合していることが判明した。本酵素の活性に関与するサイトであるB1、R1、P1、R2、B2各サイトの詳細な構造が明らかとなった。当初の方針としては、d(GpG)のような基質類似体よりも、より本当の基質に近いGpcG(リン酸基の酸素原子がメチレン基で置き換わった化合物)のようなホスホネートの合成も目指したが、いまだ合成には至らず、別種の基質類似体である2'-deoxy-2'-fluoroguanyl-(3',5')-guanosine(GfpG)の合成に成功した。この基質類似体とRNase LEとの複合体結晶を調製してX線回折実験を現在行っているところである。ホスホネートの合成はさらに追求していく予定である。リボヌクレアーゼ(RNase)T_2ファミリーに属する酵素の中で、微生物サブファミリーの立体構造は、我々によるRNase Rhの結晶構造解析の成功によって初めて明らかにされた。そのRNase Rhの結晶を用いて、種々の阻害剤との複合体結晶の解析を行ったことにより、活性部位の構造が明らかになってきた。しかし、動植物サブファミリーに属する酵素の立体構造解析は報告されておらず、分子の基本骨格は不明であった。そこで、我々は、動植物サブファミリーに属する酵素の基本骨格を明らかにし、活性部位の構造と反応機構を明らかにする目的をもって、トマト由来リボ核酸酵素RNaseLEのX線結晶構造解析を行った。組換え型RNaseLEの酵母を用いた大量発現によりサンプルを調製し、ハンギングドロップ蒸気拡散法により結晶化を行った。5種[K_3]rCl_6,K_2OsCl_6,PCMBS,K_3UO_2F_5,UO_2(NO_3)_2]の重原子誘導体を用いた多重重原子同形置換法により位相を決定し、溶媒領域平滑化法、ヒストグラムマッチング法等を組み合わせ、解釈可能な電子密度図を得た。3次元グラフィックス上にて、電子密度図の解釈を行い、分子モデルを構築した。本研究によって明らかとなった植物

由来RNaseLEの立体構造を、微生物由来RNase Rhの構造と比較してみると、α-へリックスやβ-シート等の2次構造のトポロジーおよび触媒残基の位置関係は非常に良くにているが、N末端側の構造およびジスルフィド結合の組合わせにおいて顕著な違いが見られた。研究の対象としているホスホトランスフェラーゼ型のリボ核酸分解酵素(RNase)類において、RNaseAファミリやRNaseT1ファミリに属する塩基特異的酵素では、「厳密」な塩基認識機構が、多くのグループによるX線結晶構造解析によって明らかにされている。一方、本課題の対象であるRNaseT2ファミリに属する塩基非特異的酵素による「柔軟」な塩基認織機構に関しては、不明な点が多い。我々は、RNaseT2ファミリーに属する塩基非特異的酵素による「柔軟」な塩基認識機構を明らかにするため、同ファミリーに属し、B2 subsiteにおける塩基認識を優先するトマト由来リボ核酸分解酵素RNaseLEの立体構造を昨年度に解析することに成功したが、本年度は4種類のモノヌクレオチドとの複合体結晶のX線構造解析を行った。浸漬法により、5'-AMP、5'-CMP、5'-GMP、5'-UMPの4種類の複合体結晶を調製し、各々の複合体結晶に関して1.8Å分解能までのX線回折強度データを収集し、構造精密化を行った。その結果、以下の点が明らかとなった。(1)いずれのヌクレオチドにおいても塩基部がB2subsiteに結合していた。(2)塩基の結合様式は、4種類のいずれの場合においても本質的には同様であり、塩基の両面からの芳香族側鎖によるスタッキングと塩基側面からの水素結合であった。これらの構造化学的データおよび本酵素に関する酵素化学的データに基づき、RNaseLEによる「柔軟」な塩基認識機構に関して検討していきたい。ホスホトランスフェラーゼ型のリボ核酸分解酵素類において、RNase A family, T1familyに属する塩基特異的酵素による「厳密」な塩基認識機構は、種々の複合体のX線結晶構造解析等によって詳細に明らかにされている。一方、本研究のテーマであるRNase T2familyに属する塩基非特異的酵素に関しては、3種類の酵素の立体構造(RNase Rh, RNase MC1, RNase LE)が報告されているが、同familyに属する酵素による「柔軟」な塩基認識機構に関しては、未だ不明な点が多い。我々は、塩基非特異的酵素による塩基認識幾構を明らかにするため、RNase T2familyに属するトマト由来リボ核酸分解酵素RNase LEと種々のヌクレオチドとの複合体のX線結晶構造解析を行ってきた。今年度は、基質類似体であるdeoxyguanyly1-3', 5'-deoxyguanosine、即ちd(GpG)の結晶構造解析を行った。複合体結晶は、Native結晶を、d(GpG)を含む溶液にソーキングすることにより得た。X線回折データは高エネルギー物理学研究所の放射光施設BL18Bで収集した。構造は、差フーリエ法により決定し、構造精密化の結果、1.8Å分解能で信頼度因子Rは0.20となった。基質類似体d(GpG)は、以前に構造解析を行った