hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イネのファイトアレキシン生産に関与するジャスモン酸受容体複合体の同定

イネにおける代表的な病害抵抗性反応として、抗菌性二次代謝産物であるファイトアレキシンの生産が挙げられる。イネにおけるファイトアレキシンの生産を誘導するシグナル物質として植物ホルモンであるジャスモン酸が知られている。ジャスモン酸の活性型であるジャスモン酸イソロイシンは、COI1-JAZ受容体複合体により認識される。イネに3種存在するCOI1のうち、OsCOI1cがファイトアレキシン生産の制御に関与することがこれまでに明らかになっている。本研究は、OsCOI1cを介したJA-Ile誘導的なファイトアレキシン生産の制御機構の解明を目的とする。本年度は、OsCOI1cとイネのJAZの相互作用の解析を開始した。イネのJAZについてはこれまでに組換えタンパク質発現系が確立されていなかった。そこで、OsCOI1cと相互作用するJAZをプルダウンアッセイにより同定するため、15種のイネのJAZの全てについて発現系の構築を試みた。コムギ胚芽無細胞発現系を用いることにより、これまでに一部のJAZについて十分な組換えタンパク質を得ることに成功し、残りのJAZについてもベクター構築をほぼ完了した。得られたJAZタンパク質を用いて、予備的にOsCOI1cとの相互作用をプルダウンアッセイにより解析したところ、相互作用が見られたJAZが存在した。今後は全てのJAZタンパク質について発現を行い、プルダウンアッセイによりOsCOI1cとの相互作用を解析する。また、酵母2ハイブリッド法によりOsCOI1cとJAZの間の相互作用を行うことを計画し、ベクター構築を完了した。今後、酵母2ハイブリッド法による相互作用解析も行う。さらに、イネ葉を用いた一過的発現系によるレポータージーンアッセイにより、イネのJAZの機能解析を試みた。その結果、これまでに解析を行った12種のJAZがファイトアレキシン生産を制御する鍵転写因子DPFの発現を抑制することが明らかになった。本研究の遂行においては、OsCOI1cとJAZの相互作用の解明が重要となる。そして、これらの相互作用解析においては組換えタンパク質の調製が必要となる。JAZについてはコムギ胚芽無細胞発現系を用いることにより、効率的に組換えタンパク質を調製することが可能となった。また、OsCOI1c組換えタンパク質については共同研究者から提供を受けることが出来る状況である。以上のように、これらの組換えタンパク質を用いて相互作用解析を遂行していくことが可能な状況となった。また、本年度はイネ葉を用いた一過的発現系によるレポータージーンアッセイ系を構築した。今後、この実験系を用いて様々な遺伝子に対するJAZの転写抑制能を解析していく。OsCOI1cとJAZの組換えタンパク質の供給が可能な状況となったため、プルダウンアッセイにより相互作用解析を行う。これと並行して酵母2ハイブリッド法によるOsCOI1cとJAZの相互作用も行う。これらの相互作用解析の結果から、イネのファイトアレキシン生産に関与するJAZを予想し、その変異株や過剰発現株の作製を行う。得られた形質転換体については、ジャスモン酸処理時のファイトアレキシンの蓄積を解析する。

また、OsCOI1c組換えタンパク質については共同研究者から提供を受けることが出来る状況である。以上のように、これらの組換えタンパク質を用いて相互作用解析を遂行していくことが可能な状況となった。また、本年度はイネ葉を用いた一過的発現系によるレポータージーンアッセイ系を構築した。今後、この実験系を用いて様々な遺伝子に対するJAZの転写抑制能を解析していく。OsCOI1cとJAZの組換えタンパク質の供給が可能な状況となったため、プルダウンアッセイにより相互作用解析を行う。これと並行して酵母2ハイブリッド法によるOsCOI1cとJAZの相互作用も行う。これらの相互作用解析の結果から、イネのファイトアレキシン生産に関与するJAZを予想し、その変異株や過剰発現株の作製を行う。得られた形質転換体については、ジャスモン酸処理時のファイトアレキシンの蓄積を解析する。本研究の計画時にはCOI1とJAZの間の相互作用を免疫沈降を用いて行うことを予定しており、JAZ抗体の作製費用をその他の経費として計上していた。しかし、プルダウンアッセイなどのin vitro実験によりCOI1とJAZの間の相互作用を十分に評価することが可能な状況となり、JAZ抗体の作製は行なわず剰余金が発生したため、次年度使用額が生じた。これらの助成金は、次年度においてプルダウンアッセイに用いるグルタチオンビーズやエピトープタグ抗体などの物品購入に充てる。
カルシウム依存的な神経細胞死過程の停止と細胞再活性化機構の解明

(1)BDNF-PIと-PIIIのCa^<2+>シグナルへの異なった応答性について:電位依存性L-型カルシウムチャネル(L-VDCC)とNMDAレセプター(NMDA-R)からのCa^<2+>流入に対して、BDNF-PIはL-VDCCからのCa^<2+>流入に対してだけ応答したが、BDNF-PIIIはNMDA-R由来のCa^<2+>流入にも弱いながら応答した。(2)BDNF-PiのCa^<2+>応答エレメントの検索:BDNF-PIの部分欠失、変異型プロモーターを作製してCa^<2+>応答性を調べた所、-80-90の存在するCREが応答性に強く関わっていることが明らかとなった。また、CREBの関わりも明らかとなった。3.神経細胞活性化に関わる細胞内情報伝達系の解析:PACAPによる細胞活性化には、MAPキナーゼの活性化が関わっていることが明らかとなった。また、内在的に合成されたPACAPが神経細胞活性化に寄与していることが明らかとなった。4.BDNFのシナプス形成に与える影響:ラット大脳皮質初代神経細胞培養系でBDNFを加えて培養を行うと、シナプス形成の促進が認められた。本研究の遂行によって、神経細胞における活動依存的な生存・維持活性の細胞内制御系の理解が一段と進んだ。今後、このカルシウムシグナル依存的な発現制御系に作用し得る薬物の検索が可能になるものと期待される。1.細胞内カルシウム流入ミトコンドリア酵素アコニターゼ活性変化との関係:顆粒細胞は非脱分極状態でアポトーシスを起こす。L-型カルシウムチャネル(L-VDCC)からのカルシウム(Ca^<2+>)流入をニカルジピンで阻止すると、やはりアポトーシスが誘起された。したがって、非脱分極誘導性のアポトーシスには、少なくとも部分的にCa^<2+>流入の停止が関与していることが明らかとなった。このどちらの場合でも、アコニターゼ活性の減少が認められた。アコニターゼは活性酸素などで失活するので、アポトーシスの過程でミトコンドリア内に活性酸素が発生していることが裏付けられた。また、MTT還元化活性の減少も認められた。しかし、ミトコンドリア活性の阻害だけでは、アポトーシスを完全には引き起こせなかった。再び脱分極を起こして細胞内へCa^<2+>を流入させると、これら活性減少は停止し、細胞死抑制が認められた。また、アコニターゼは、細胞死におけるミトコンドリア活性を示す一つの指標として用いることができる。(1) BDNF-PIと-PIIIのCa^<2+>シグナルへの異なった応答性について:電位依存性L-型カルシウムチャネル(L-VDCC)とNMDAレセプター(NMDA-R)からのCa^<2+>流入に対して、BDNF-PIはL-VDCCからのCa^<2+>流入に対してだけ応答したが、BDNF-PIIIはNMDA-R由来のCa^<2+>流入にも弱いながら応答した。(2) BDNF-PiのCa^<2+>応答エレメントの検索:BDNF-PIの部分欠失、変異型プロモーターを作製してCa^<2+>応答性を調べた所、-80-90の存在するCREが応答性に強く関わっていることが明らかとなった。3.神経細胞活性化に関わる細胞内情報伝達系の解析: PACAPによる細胞活性化には、MAPキナーゼの活性化が関わっていることが明らかとなった。
食道癌における高発現遺伝子抑制:創薬ターゲット遺伝子の同定

前年度までに解析した遺伝子のうち,細胞株での再現性を確認したところ,正常細胞株HET1Aと比較して,すべての食道癌癌細胞株での発現上昇が認められたCaveolin2に関して解析を進めた。Caveolin1とcaveolin2はcaveolaeの主要な構成タンパクである。TE1-15の食道癌細胞株で,CAV1もCAV2も高発現を認めていた。臨床検体47例に関して,RTPCRによる発現定量と抗体を用いた免疫染色を施行した。RTPCRの解析では,癌部での発現は,非癌部の発現と比較して有意に高発現であった。(CAV1,p=0.0024,CAV2,p=0.0136)その他の臨床病理学的因子とは相関は認めなかった。免疫組織染色では,CAV1は,13/47(27.7%)で陽性であり,CAV2は22/47(46.8%)に陽性であった。CAV1とCAV2の免疫染色とT因子,Ly因子,V因子,分化度に重要な相関を認めた。CAV1がpositive症例はnegativeな症例より生存期間が短い傾向にあった。CAV2がpositive症例についてもnegativeな症例より生存期間が短い傾向にあった。これらの結果はCAV1とCAV2が重要な予後因子であり,食道癌治療のターゲットとなりうることを示唆していた。さらにCAV1のRNAiを用い,食道癌細胞株におけるCAV1の発現を抑制し,治療に応用を目指したが,現在までにpositiveなdataは得られていない。今後さらに解析をすすめる予定である。1.マイクロアレイを用いた癌細胞株での高発現遺伝子リストの作製我々は今までに、食道癌細胞株(TEシリーズ13種類、KYSEシリーズ2種類)および食道正常細胞株(HET1A)を用いてマイクロアレイを行って、癌細胞株で共通して発現が上昇している約150遺伝子リストを作製した。これらの遺伝子には既知遺伝子のほか未知遺伝子(新規遺伝子)も40ほど含まれていた。まず解析に順序をつけるために、癌増殖機能、アポトーシス阻害活性、などの癌遺伝子機能をもつ遺伝子が優先することとした。2.LightCyclerを用いた標的遺伝子の発現定量LightCyclerは、定量RTPCRの装置であり、1種の遺伝子発現をマイクロアレイより安価に定量でき、マイクロアレイよりは精度が高い。マイクロアレイのデータは、細胞株のデータでもあり、またやや精度にかける面もみられることから、実際の臨床応用をめざすために、臨床検体において定量RTPCRを行い、その発現に関して癌部で発現が有意に上昇していることを確認した。まず遺伝子のうちCaveolin2遺伝子を選択し、細胞株での再現性を確認したところ、正常細胞株HET1Aと比較して、すべての食道癌癌細胞株での発現上昇が認められた。次に臨床検体にて発現を定量したところ、有意差をもって非癌部より癌部での発現上昇が認められた。臨床病理学的因子との解析では、特に有意差をもつパラメーターは認めなかった。現在、抗体を入手し、免疫染色にての解析を行う予定としている。またNothernについては、すべての遺伝子について解析を行うのが困難であったため、まず正常組織の6種類程度の組み合わせで、RTPCRを行い、安価に正常組織での発現を確認している。現在のところ、正常組織で発現を認めない癌特異的に発現上昇する遺伝子は認めていない。
海洋細菌群集の共同作業?-水圏の有機物代謝過程での"社会主義"的働き-

海洋での有機物代謝過程における従属栄養細菌群集の働きについて、細菌群集全体としてだけでなく、群集を構成するメンバーそれぞれの持つ能力の多様性とその相互作用に注目して解析を行った。その結果、異なる有機物分解能を持つ多様な細菌が共存することが海洋生態系における高分子有機物利用の鍵となっていること、また、細菌によって得意とする有機物が異なり微生物群集内に役割分担があることが示唆された。本研究は、水圏生態系における高分子有機物再利用系の動態を知ることを目的とし、溶存態・粒子態有機物の動態に関与する微生物群集の組成と機能に着目して、海洋での有機物代謝過程について、微生物群集の中で"誰が""何を"し、どのような相互作用があるのかを理解することを目指している。そのために研究全体として、1.海洋から分離した細菌単離株を用いたアプローチ、2.マイクロコズムを用いた実験的アプローチ、3.天然環境の調査による観測的なアプローチを計画した。平成21年度は、1および2のそれぞれ一部を実施し、引き続き現在も進行中である。1に関しては、沿岸・外洋(表層・深層)を含む様々な環境の天然海水から細菌株を分離し、それぞれの細菌単離株について、エンド型・エキソ型のプロテアーゼ活性を中心とした有機物分解特性を分析中である。株により有機物分解特性が異なることはわかってきたが、今後も引き続き分析株数を増やし、さらに、分離株の遺伝子解析による系統グループ分けと合わせて解析を行う。2に関しては、北太平洋の亜熱帯海域および亜寒帯海域において、ポリマー型有機物が添加された場合とモノマー型有機物が添加された場合とで、海水中の微生物群集全体および群集を構成する各微生物がどのように応答するかを評価するための海水マイクロコズム実験を実施し、各マイクロコズム中の細胞外加水分解酵素活性およびその特性・微生物活性・微生物群集構造の変化を追跡した。その結果、マイクロコズム中の細胞外加水分解酵素活性・特性については、添加される有機物の種類により応答が異なることがわかった。その他の項目については、採取した試料を分析中である。本研究では、海洋における有機物代謝過程について、海洋細菌群集の組成と機能に着目し、水圏生態系での高分子有機物再利用系の動態を知ることを目的としている。特に、群集の中での細菌種ごとの機能に注目して、"誰が""何を"し、どのような相互作用があるのかを理解することを目指している。研究全体として、(1)海洋から分離した細菌単離株を用いたアプローチ、(2)マイクロコズムを用いた実験的アプローチ、(3)天然環境の調査による観測的なアプローチを計画し、遂行中である。(2)のアプローチの一つとして、ポリマー型の有機物(タンパク質)を添加した系とモノマー型の有機物(アミノ酸)を添加した系、何も添加していない系(対照区)を作成し、海水中の細菌群集の反応を追跡・比較するマイクロコズム実験を行った。北太平洋亜熱帯域で実験を行った結果、アミノ酸添加区では添加1日後には微生物群集構造が大きく変化するのに対し、タンパク質添加区では少し遅れて変化すること、それぞれの有機物添加後に活発に増殖する細菌種はアミノ酸添加区とタンパク質添加区とで異なることがわかった。また、系内の細胞外加水分解酵素(タンパク質分解酵素)の変化にも違いが見られた。これらの結果は、細菌のエサとなる有機物が添加された場合、有機物のタイプによって、応答する微生物種が異なること、また応答の仕方が異なることを示している。すなわち、細菌種によってそれぞれの"得意分野"が異なることが示唆された。一方、同様の実験を北太平洋亜寒帯域で行ったところ、いずれの添加区でも対照区との差が見られなかった。すなわち、亜寒帯域の測点では、エサとなる有機物以外の要因が海水中の細菌群集全体の活性を律速していたと考えられる。なお、これらの結果に系内の有機物(タンパク質、アミノ酸)の分析結果等をあわせてより詳細な解析を進める予定である。天然微生物群集を含む天然海水にモノマー態の有機物(アミノ酸)とポリマー態有機物(タンパク質)をそれぞれ添加したマイクロコズムで、微生物の反応および微生物群集構造の変化を追跡する実験を行った。その結果、遊離のアミノ酸を添加した系では、添加後1日以内に系内の微生物活性が上昇し、細菌数が増加した。このとき増殖した細菌の大部分はGammaproteobacteriaに属するVibrio属であった。一方、タンパク質を添加した系では、添加1日後には微生物活性・細菌数・微生物群集組成ともに大きな変化が見られなかったが、添加2日後から系内のタンパク質分解酵素活性が上昇し、細菌数が増加した。このとき微生物群集はBacteroidetesグループを中心とした群集に変化し、さらにその数日後にはBacteroidetesに加えてAlphaproteobacteriaに属する細菌も主要な構成員となった。これらの結果は、海水にポリマー態の有機物(タンパク質)が加わった場合はモノマー態(アミノ酸)が加わった場合に比べて微生物群集に変化が現れるまでに時間がかかること、および、添加された有機物によって反応する微生物種が異なることを示している。

すなわち、海洋微生物群集の中でもそれぞれの微生物の得意分野が異なり、役割分担があることが示唆された。また、海水から分離した細菌単離株について、19種類の基質を用いてプロテアーゼ活性を測定し、それぞれの細菌株の持つタンパク質分解特性を調べた。その結果、Bacteroidetes、Gammaproteobacteria、Alphaproteobacteriaの分類グループ間でやや異なる傾向はあるものの、細菌株の持つタンパク質分解特性は実に多様であることがわかった。海洋においては、異なる有機物分解能を持つ多様な細菌が共存することが有機物利用の鍵となっている可能性が示された。
環境センサと移動ロボットを連携させた見守りシステムの開発

環境センサと移動ロボットを連携させ、見守りを行うシステムの開発を行っている。具体的には、設置したカメラから得られる画像を用いて人物を発見・追跡し、人物の姿勢や動きをもとに状況を確認する。そして、人物が倒れ、より詳しい状態の推定が必要であると判断された場合には、移動ロボットが自動的に人物の傍へ行き、呼吸状態などのバイタルサインの確認や通報を行うことを想定している。平成29年度には移動ロボットによる人物の呼吸推定を実装できため、平成30年度は特に移動ロボットが実際に転倒した人物に自動的に近づくための方法を中心に研究開発を行った。平成30年度の実績としては、指導学生の卒業研究として次の6つのテーマについて研究開発を行った。1地図作成:ロボットの自己位置推定精度を向上させるため、レーザ距離センサの観測誤差の影響を抑え、ノイズの少ない屋内地図を作成した。2人物領域抽出:天井カメラで転倒した人物を検出するため、ノイズが多く含まれる距離画像から人物領域を抽出する方法を実装した。3転倒方向判別:転倒した人物の姿勢を認識するため、色情報を用いて体の向きを判別する方法を実装した。4自己位置推定:ロボットを転倒した人物の近くへ移動させる際、転倒した人物は事前に学習した地図情報には含まれておらず、新たな障害物となるために自己位置推定に誤差が生じてしまう。そこで、転倒した人物を考慮して正しく自己位置推定を行う方法を提案した。5経路計画:転倒した人物や他の障害物を考慮した経路計画を実装し、実際にロボットが人物の近くまで移動できるようにした。6再起反射物体の認識:レーザ距離センサで観測された反射強度を用いて再起反射物体を認識することで、ロボットの自己位置推定の精度を向上させる方法について検討した。そして、上記4の内容について学会発表を行った。また、これまでの研究成果をまとめ、査読付き論文誌に投稿した。当初の計画通り、平成29年度には人物の状態確認を行う方法を実装できたため、平成30年度は実際に移動ロボットが状態確認を行うための方法について研究を行った。必要な機能を6つの卒研テーマに分け、1レーザ距離センサを用いたICP-SLAMによる地図作成の改良、2距離値を用いた背景差分による人物領域抽出、3色情報を用いた転倒人物の方向判別、4転倒人物領域を考慮したロボットの自己位置推定、5転倒人物領域を考慮したロボットの移動経路計画、6レーザ距離センサの反射強度を用いた再起反射物体の認識について研究開発を行った。そして、転倒した人物を考慮してロボットの自己位置推定を行う方法について、電子情報通信学会総合大会で成果発表を行った。さらに、これまでの研究成果をまとめ、査読付き論文誌Journal of Robotics and Mechatronicsに投稿した。今後は見守りシステム全体の改良を進めつつ、提案したシステムの性能評価実験を行い、学会発表や論文投稿を行う。当初の計画通り、構築したシステムを用いて実証実験を行い、さらなるシステムの改良や高機能化を行う。特に研究最終年度であるため、見守りシステムの完成とその性能評価を目指す。これまでの研究成果によって個々の機能はある程度実現できているが、各機器で提供されているドライバの影響により、各モジュールの開発環境(OS、プログラミング言語)が異なるため、統合したシステムを完成させるためにはモジュール間の情報通信機能の実装も課題の一つである。また、個々の誤差の蓄積がシステム全体に与える影響を調査し、それを解決する必要がある。さらに、システムの性能評価をどのように行うかも課題である。例えば、ロボットによる呼吸推定の誤差を求めるためにはその正解値も計測する必要があり、他のウェアラブルセンサなどを使用する必要がある。平成29年度の実績としては、指導学生の卒業研究として次の6つのテーマについて研究開発を行った。1天井カメラを用いた転倒検知:部屋の上部にKinectを設置し、人物の頭部の高さ情報を用いて転倒を検知できるようにした。また、人物の姿勢情報からロボットの移動目標座標を自動的に計算した。2通信機能の実装:天井カメラや移動ロボット、通知端末などで情報のやり取りを行うため、C言語のTCP/IP通信プログラムを用いて実際に画像や座標情報などを送受信する機能を実装した。3地図作成方法の検討:ロボットの自律移動を実現するための地図作成方法について検討した。レーザ距離センサを用いて実際に研究室内の地図を作成し、ノイズの影響を抑える方法を実装した。4カメラ方向制御:人物の状態観測を行う際にカメラを適切な向きに制御するための方法について検討した。LEGO EV3を用いてサーボモータを制御し、カメラを制御する機構を構築した。5呼吸判定方法の改良:距離画像を用いて胸の動きから呼吸を推定する方法を改良した。距離変動の波形から極大と極小を抽出し、一般的な呼吸の特徴を考慮して、より安定に判定する方法を実装した。6体温測定方法の検討:赤外線サーモカメラを用い、見守りロボットのための非接触な体温測定方法を検討した。カメラの特性を調査し、表面温度画像から人物の体調を推定する方法について検討した。

当初の計画通り、見守りシステムの試作を行い、天井カメラを用いた転倒検知や移動ロボットによる呼吸推定、各機器の簡単な通信機能などの個別モジュールを実装した。今後はこれらを連携させて見守りシステム全体の自動化を目指しつつ、個々のモジュールの改良を行う。特に各機器で提供されているドライバの影響により、各モジュールの開発環境(OS、プログラミング言語)がバラバラであるため、統合したシステムを実現するためにはモジュール間の情報通信機能を実装する必要がある。また、移動ロボットを用いた呼吸推定の機能について、これまでの研究成果をまとめ、査読付き論文誌Journal of Robotics and Mechatronicsに投稿した。今後は天井カメラなどの環境センサと移動ロボットを連携させた見守りシステム全体の開発を進め、学会発表や論文投稿を行う。環境センサと移動ロボットを連携させ、見守りを行うシステムの開発を行っている。具体的には、設置したカメラから得られる画像を用いて人物を発見・追跡し、人物の姿勢や動きをもとに状況を確認する。そして、人物が倒れ、より詳しい状態の推定が必要であると判断された場合には、移動ロボットが自動的に人物の傍へ行き、呼吸状態などのバイタルサインの確認や通報を行うことを想定している。平成29年度には移動ロボットによる人物の呼吸推定を実装できため、平成30年度は特に移動ロボットが実際に転倒した人物に自動的に近づくための方法を中心に研究開発を行った。平成30年度の実績としては、指導学生の卒業研究として次の6つのテーマについて研究開発を行った。1地図作成:ロボットの自己位置推定精度を向上させるため、レーザ距離センサの観測誤差の影響を抑え、ノイズの少ない屋内地図を作成した。2人物領域抽出:天井カメラで転倒した人物を検出するため、ノイズが多く含まれる距離画像から人物領域を抽出する方法を実装した。3転倒方向判別:転倒した人物の姿勢を認識するため、色情報を用いて体の向きを判別する方法を実装した。4自己位置推定:ロボットを転倒した人物の近くへ移動させる際、転倒した人物は事前に学習した地図情報には含まれておらず、新たな障害物となるために自己位置推定に誤差が生じてしまう。そこで、転倒した人物を考慮して正しく自己位置推定を行う方法を提案した。5経路計画:転倒した人物や他の障害物を考慮した経路計画を実装し、実際にロボットが人物の近くまで移動できるようにした。6再起反射物体の認識:レーザ距離センサで観測された反射強度を用いて再起反射物体を認識することで、ロボットの自己位置推定の精度を向上させる方法について検討した。そして、上記4の内容について学会発表を行った。また、これまでの研究成果をまとめ、査読付き論文誌に投稿した。当初の計画通り、平成29年度には人物の状態確認を行う方法を実装できたため、平成30年度は実際に移動ロボットが状態確認を行うための方法について研究を行った。
H2S/活性イオウ分子と同産生酵素CBS/CTHの適応免疫と経口寛容における役割

Cystathionine β-synthase (CBS)とCystathionine γ-lyase (CTH)はメチオニン代謝回路の中間産物ホモシステインからシステインを生合成する一連の酵素である。この経路の破綻は高ホモシステイン血症を招くが、CBS欠損が脳機能や全身性の重篤な症状を招き短命であるのに対し、CTH欠損は一見正常に見えるが様々な栄養的なストレスや投薬に対する潜在的なリスクを持つ。また両酵素は硫化水素産生酵素であるが、硫化水素産生酵素は他に3-mercaptopyruvate sulfurtransferase(MPST)が知られている。免疫疾患においても高ホモシステイン血症や硫化水素の産生不全が炎症を増悪化するが、免疫細胞での含硫アミノ酸代謝物の作用には不明点が多く、欠損のリスクは定まっていない。本件では我々が作成した長生きなCbs欠損マウス、Cth欠損マウスおよびMpst欠損マウスを用い、腸管免疫系と皮膚免疫系におけるCbs、CthおよびMpstの発現を確認し、これらの酵素の欠損マウスに対しハプテン誘導性腸炎、接触性皮膚炎およびI型アレルギーであるアナフィラキシーショックを惹起し、その炎症を評価する。それぞれの免疫系とその相関を含めた適応免疫の全体に対する含硫アミノ酸代謝異常の影響を個体レベルで解析する。本年度の研究では、全身性および皮膚アナフィラキシーモデルを試験し、皮膚免疫系で主にマスト細胞を主としたTh2細胞型の液性免疫優位な応答の惹起について比較解析した結果、CTH欠損マウスでは受動的皮膚アナフィラキシーに伴う炎症応答が減弱することが明らかになった。Cth欠損マウスではPCAでは炎症応答の減弱が認められたが、PSAでは差異はなく、局所的な免疫応答か血管透過性に関連する調整機能に異常があると考えられた。PCAでの炎症応答では投与されたIgEを保持する皮膚マスト細胞から炎症応答が始まるので、Cth欠損マウスの骨髄マスト細胞を初代培養し、成熟させることで得られる結合組織型マスト細胞(皮膚マスト細胞に近いとされる)を使用して、IgE-抗原投与による脱顆粒応答に違いがあるか確認する。Cth欠損マウスでは全身的に酸化ストレスの原因となる高ホモシステイン血症、あるいは血管弛緩因子である硫化水素の産生不全などの免疫応答が変動する要因が考えられるため、Cth欠損マウスに負荷をかけて脆弱性の変化がないかを検討する。負荷としては高メチオニン食による高ホモシステイン血症の増強や低シスチン食による抗酸化物質の低減、あるいは絶食といった食事性の負荷と、硫化水素ドナーの投与を予定している。またCthとは異なりホモシステイン代謝には影響しないMpst欠損マウスでアナフィラキシー応答の変化があるか確認する。Mpstは肝臓、腎臓に多く発言するが、大腸やその他の臓器にも広く発現しているため、Mpst欠損でハプテン誘導性腸炎および皮膚炎モデルを試験する。Cystathionine β-synthase (CBS)とCystathionine γ-lyase (CTH)はメチオニン代謝回路の中間産物ホモシステインからシステインを生合成する一連の酵素で、ともに硫化水素産生酵素でもある。本件では我々が作成した長生きなCBS欠損マウスとCTH欠損マウスを用い、腸管免疫系と皮膚免疫系におけるCBSとCTHの発現を確認し、両酵素の欠損マウスに対しハプテン誘導性腸炎および接触性皮膚炎を惹起し、その炎症を評価する。またこれらのハプテンを経口投与することにより経口寛容を起こした場合も解析し、それぞれの免疫系とその相関を含めた適応免疫の全体に対する含硫アミノ酸代謝異常の影響を個体レベルで解析する。本年度の研究では、ハプテン誘導性の2種の腸炎モデル、4種の接触性皮膚炎モデルを試験し、腸管免疫系および皮膚免疫系でのTh1細胞型の細胞性免疫優位な応答と、Th2細胞型の液性免疫優位な応答の惹起について比較解析したが、平常の飼育下のCTH欠損マウスと野生型マウスでは炎症応答に有為な違いはないことが明らかになった。今後は食事性の負荷や硫化水素ドナー投与などの条件下で症状の変化を確認する予定である。CTH欠損マウスに対してハプテン誘導性大腸炎および接触性皮膚炎を試験した。大腸炎では、ハプテンとしてトリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)とオキサゾロンを使用した。TNBSは組織内のタンパク質と結合して抗原化し、クローン病に似たTh1優位の腸炎を引き起こすとされているのに対し、オキサゾロンは潰瘍性大腸炎に似たTh2優位の腸炎を引き起こすとされている。CTH欠損マウスとその同腹仔野生型マウスに対し、TNBSまたはオキサゾロン背面皮膚に経皮感作したのち、7日後に同じハプテンを直腸内に投与することにより腸炎を誘導した。誘導後2日後の腸炎の初期段階で評価した結果、TNBS、オキサゾロンともに野生型・CTH欠損型の腸炎に有為な違いは見られなかった。

接触性皮膚炎では、ジニトロフルオロベンゼン(DNFB)、トリニトロクロロベンゼン(TNCB)、Th2型優位な応答を示すとされるハプテンであるフルオレセインイソチアネート(FITC)、Th1型/Th2型の応答も示すとされるハプテンであるオキサゾロンを背面皮膚に経皮感作したのち、7日後に同じハプテンを耳に塗布することで皮膚炎を誘導した。惹起後2時間の急性応答および24時間後の皮膚炎ともに野生型・CTH欠損マウスに有為な差は見られなかった。CTHの単独欠損では、ハプテン誘導性の適応免疫応答に総じて違いがないことが明らかとなり、本年度予定した研究は遂行されたと考えている。一方、長生きCBS欠損マウスについてはC3H背景の繁殖が難航しており、マウスの数を揃えることが現在できていない。Cystathionine β-synthase (CBS)とCystathionine γ-lyase (CTH)はメチオニン代謝回路の中間産物ホモシステインからシステインを生合成する一連の酵素である。この経路の破綻は高ホモシステイン血症を招くが、CBS欠損が脳機能や全身性の重篤な症状を招き短命であるのに対し、CTH欠損は一見正常に見えるが様々な栄養的なストレスや投薬に対する潜在的なリスクを持つ。また両酵素は硫化水素産生酵素であるが、硫化水素産生酵素は他に3-mercaptopyruvate sulfurtransferase(MPST)が知られている。免疫疾患においても高ホモシステイン血症や硫化水素の産生不全が炎症を増悪化するが、免疫細胞での含硫アミノ酸代謝物の作用には不明点が多く、欠損のリスクは定まっていない。本件では我々が作成した長生きなCbs欠損マウス、Cth欠損マウスおよびMpst欠損マウスを用い、腸管免疫系と皮膚免疫系におけるCbs、CthおよびMpstの発現を確認し、これらの酵素の欠損マウスに対しハプテン誘導性腸炎、接触性皮膚炎およびI型アレルギーであるアナフィラキシーショックを惹起し、その炎症を評価する。それぞれの免疫系とその相関を含めた適応免疫の全体に対する含硫アミノ酸代謝異常の影響を個体レベルで解析する。本年度の研究では、全身性および皮膚アナフィラキシーモデルを試験し、皮膚免疫系で主にマスト細胞を主としたTh2細胞型の液性免疫優位な応答の惹起について比較解析した結果、CTH欠損マウスでは受動的皮膚アナフィラキシーに伴う炎症応答が減弱することが明らかになった。ハプテン誘導性の腸炎、接触性皮膚炎ともにCTHの単独欠損では差異はないため、当初の予定通りCTH欠損マウスに負荷をかけて脆弱性の発露がないかを検討する。負荷としては高メチオニン食や低シスチン食、あるいは絶食といった食事性の負荷と、硫化水素ドナーの投与を予定している。また経口免疫寛容についても試験し、腸管免疫での免疫成立時において、含硫アミノ酸経路破綻によるストレスの影響を確認する。負荷試験と平行して、受動的全身性アナフィラキシーや受動的皮膚アナフィラキシー、プリスタン投与による全身性エリテマトーデスモデルといった免疫疾患モデルを試験する。さらに、CTH欠損マウス、CBS欠損マウスに加えて、もう一つの硫化水素産生酵素である3-mercaptopyruvate sulfurtransferase(MPST)の欠損マウスについて同様にハプテン誘導性腸炎、接触性皮膚炎モデルを試験する。MPST欠損マウスはCRISPR-Cas9システムで作成し、現在キメラマウスからF1世代を得ている。
シスチン・グルタミン酸交互輸送体機能障害による海馬酸化ストレス増強機序の解明

中枢神経疾患において細胞外グルタミン酸濃度上昇や抗酸化能低下の関連が示唆されている。今回、我々はラット海馬で細胞外グルタミン酸濃度上昇が抗酸化能低下をもたらすことを示した。また、鉄塩誘導てんかんモデルラットでは鉄塩注入30日後に鉄塩注入側海馬で抗酸化物質のグルタチオン産生に欠かせないシスチンを輸送するシスチン・グルタミン酸交互輸送体のmRNA発現低下が認められた。併せて、鉄塩注入てんかんモデルラット海馬では抗酸化能が低下していることが確認された。グルタミン酸トランスポーターは酸化状態下では機能低下することが知られている。鉄塩注入てんかんモデルラット海馬では抗酸化能が低下し、抗酸化能低下は細胞外グルタミン酸濃度上昇に結びつき、細胞外グルタミン酸濃度上昇は抗酸化能低下をまねくという悪循環によって、てんかん原性が獲得されていくのではないかと考えられた。cystine/glutamatetransporter(xCT)は細胞内外のグルタミン酸濃度勾配を利用して、グルタチオン(GSH)生成に必要なシスチンを細胞内に取り込むことによって細胞内外レドックス状態に関与し、さらにはそのレドックス状態がグルタミン酸トランスポーター(EAATs)の機能を修飾することから、多岐にわたって、てんかんの病態に対して重要な働きをしている。自発性けいれんのみられるELマウスで細胞外グルタミン酸濃度測定、グルタミン酸トランスポーター、xCTの発現解析を行った。初発けいれんを示すictogenesis期にあたる8週齢目に細胞外グルタミン酸濃度の上昇と、ECCA-1,xCTの顕著な低下がみられた。8-10週齢目のELマウスでは、海馬レドックスの著しい酸化シフトが生じており、その背景には今回明らかにできたxCTの発現低下が関与していると考えられた。酸化シフトとGSHの供給が減少することで、EAATsのグルタミン酸の再取り込み機能が低下し、細胞外グルタミン酸濃度が上昇し、その結果、xCTの発現ばかりでなく、その機能も損なわれることで、GSH合成能が低下し、さらに酸化シフトが進み、さらなるグルタミン酸の上昇を引き起こし、生化学的な興奮性が惹起されるものと考えられる。加えてictogenesisを示す8週齢目には、GABA合成を司るEAAC-1が低下しており、GABA合成能も減弱すると推測される。これらの結果がictogenesisを誘導し、けいれん履歴を繰り返す中でELマウスのepileptogenesisが次第に固定されると考えられる。本実験によりてんかん病態におけるグルタミン酸と細胞内外のレドックス状態の役割、関与、結びつきが明らかになった。levetiracetam (LEV)の抗てんかん作用機序に抗酸化能、xCTの関与があるのではないかとの仮定に基づき実験を行った。血液脳関門を通過するnitroxide radical (PCAM)をラット腹腔内に投与しマイクロダイアリーシス法を用いて海馬細胞外液中に存在するPCAMの減衰で抗酸化能を評価した。その結果灌流液にLEVを同時に灌流した群はそうでない群と比較して有意に減衰半減期が短くなっていた。また、細胞外グルタミン酸濃度はLEVを同時に灌流した群で有意に低下していた。一方、LEV(54mg/kg)を腹腔内に14日間連日投与した群は生食投与群と比較して有意に海馬のxCTが増加していた。以上からLEVには抗酸化能を増強する作用があり、xCTは細胞外から細胞内にグルタミン酸の濃度勾配を利用しGSH生成に必要なシスチンを取り込むことから、細胞外グルタミン酸濃度低下はGSH生成増加、抗酸化能増強につながると考えられた。LEVの慢性投与はxCTを増加させ、このこともGSH生成増加、抗酸化能増強に寄与すると考察した。cystine/glutamatetransporter (xCT)は細胞内外のグルタミン酸濃度勾配を利用して、抗酸化物質であるグルタチオン(GSH)生成に必要なシスチンを細胞内に取り込むことによって細胞内外レドックス状態に関与し、さらにはそのレドックス状態がグルタミン酸トランスポーター(EAATs)の機能を修飾することから、多岐にわたって、てんかんの病態に対して重要な働きをしている。平成22年度は外傷性てんかんモデルラットにおけるxCT mRNA発現解析をreal-time PCR法を用いて解析した。

右扁桃体に鉄塩(100mM FeCl_3 1μl)注入から二次性全般化発作の出現する30日後に両側海馬を摘出した。対照群はpH 2.2 NaCl水溶液注入から30日後に両側海馬を摘出した。xCT mRNA発現量は鉄塩注入側である右側の海馬でコントロール群と比較して有意に発現が低下していた。対側では対照と有意な発現変化はみられなかった。てんかんの病態では細胞外グルタミン酸濃度上昇がおこり、xCTに機能不全がもたらされるが、xCT自体の発現も低下していると考えられた。グルタミン酸トランスポーターはSH基を有し、酸化状態下では輸送機能低下を来す。外傷性てんかんモデルにおけるxCT発現低下、機能不全はGSH生成低下、それによる抗酸化能低下、それによる更なるグルタミン酸再取り込み低下を来たす、悪循環が存在するものと思われる。これら細胞外グルタミン酸濃度上昇、抗酸化能低下がてんかん原性獲得に結びついていくものと考えられた。
先天性心疾患モデルラットの全胚培養による刺激伝導系の発生及び細胞機能異常の解明

正常ラット胚とビスダイアミン投与先天性心疾患モデルラット胚の心臓刺激伝導系の発生について全胚培養により検討した。正常に比し心疾患モデルラットでは刺激伝導系原基の形成は遅く部位も不明確であった。心筋細胞の成長に伴う生理学的特性を細胞単離しやすい新生仔マウスを用いて検討した。細胞はすべて紡錘状で、形態では心筋細胞、線維芽細胞、刺激伝導系細胞の区別ができなかったが、成長に伴う生理学的特性の変化が明らかになった。正常ラット胚の心臓における刺激伝導系のマーカー、特にHNK-1、コネキシン40、43、45、30.2の発現について、妊娠(ED)10.5日、11.5日、12.5日、13.5日、14.5日のWisterラット胚で検討した。HNK-1陽性細胞が集塊をなすのはED13.5日以後で、特に心室中隔後端の房室結節に一致する部位に強い発現が認められた。ED14.5日には発達した心室中隔の左室側と右室側に連続したHNK-1陽性細胞が確認された。この部位に一致してコネキシン40、43、45、30.2の発現が認められたが、心室壁内にも少数の陽性細胞が散在して認められた。しかし、ビスダイアミン投与群では心室中隔の形成が正常より遅く、ED14.5日でHNK-1陽性細胞の発現が認められたが、明らかな集塊の形成は認められなかった。全胚培養したラットでも同様の結果で、ED11.5日や12.5日ではHNK-1陽性細胞は少なく、散在する傾向があった。コネキシン40、43、45、30.2の発現も正常に比べ少なかった。以上より、ビスダイアミンはHNK-1、及びコネキシン40、43、45、30.2陽性細胞の発現と分布に影響を与えることから、正常な刺激伝導系の発生を発生の早期から阻害することが確認できた。ビスダイアミンが心筋細胞および刺激伝導系の細胞の生理学的特性に与える影響について明らかにすることを次年度の課題としたい。また、この研究の最終目標であるビスダイアミン投与心奇形モデル動物における不整脈発生機序を明らかにするためには、さらに日齢の大きなラットで細胞の生理学的特性の差を検討する必要がある。この場合、ラットよりマウスの方が細胞の単離がしやすい可能性があり、マウスでも検討する予定である。すでに予備研究として、正常新生仔マウスの心筋細胞を用い、カルシウムチャネルの特性について検討を開始した。平成21年度の研究で、ビスダイアミンは正常な刺激伝導系の発生を早期から阻害することが明らかとなった。今年度はビスダイアミンが刺激伝導系細胞の生理学的特性に与える影響について検討することを目的に研究を開始した。最初に正常ラット新生仔を用いたが、心筋細胞の単離が困難であったため、Langendorff灌流後に心筋細胞を単離する手技が確立しているマウスを用いて実験を行なった。日齢0、7、14の正常新生仔C57BL/6Jマウスと日齢60の成獣の心臓をLangendorff灌流後に心室の心筋細胞を単離し、Tyrode液で保存した状態でパッチクランプ法により膜電位を測定した。急速活性型遷延整流性カリウムチャネルであるIkrの電位は、日齢0の10.0±1.0pA/pFから成獣では1.0±0.1pA/pFまで、日齢が進むにつれ低下した。また、新生仔ではウエスタンブロットでIkrの発現蛋白であるERGの強い発現が確認されたが、日齢が進むにつれ減少した。同様に、細胞外からのCa^<++>流入の主たる分子実体であるTRPCチャネルの成長に伴う発現の変化についてマウス単離心筋細胞を用いて検討した。TRPCチャネルを介する膜電流(タプシガルギンで誘発される細胞膜電流で代用)の日齢0における電位は5.8±1.2pA/pFであったが、日齢が進むにつれ低下し、成獣では1.8±0.9pA/pFとなった。ウエスタンブロットでTRPC1、3、4,5の発現を検討したところ、成長に伴いいずれの発現も減少した。以上の結果から、心筋細胞の生理学的特性は成長に伴い変化することが明らかになり、ビスダイアミンが与える影響についても成長によって差があることが推測された。次年度は心筋細胞と刺激伝導系細胞の各々について成長に伴う生理学的特性の変化を明確にし、ビスダイアミンが与える影響と抗不整脈薬の効果について検討したい。平成22年度の研究で、マウス単離心筋細胞の生理学的特性は成長により差があることを明らかにした。今年度は、ラットを用いて発生初期の心筋細胞の生理学的特性を明らかにすることを目的に研究を開始したが、平成21年度の研究でラットの心筋はLangendorf罐流後の細胞単離が困難であったため、従来の機械的な破砕による細胞単離法を用いることにした。

そこで、出生直後のマウスの心筋細胞をLangendorff灌流により単離した場合と機械的な破砕により単離した場合で形態や生理学的特性に差が生じないかを検討した。その結果、Langendorff灌流により単離された心筋細胞は従来の機械的破砕によって単離された細胞と比較して、(1)形態的に紡錘状で細胞の大きさを反映する膜容量は平均32.3±5.9pFと大きい(従来の方法で単離した細胞は球形で20.4±2.7pFと小さい)、(2)活動電位時間に差はなかったが、静止膜電位は-80.6±1.1mVと機械的破砕の-60.5±2.6mVより有意に過分極しており、(3)内向き整流性カリウムチャネルの電流密度は45.5±8.OpA/pFで機械的破砕の9.2±1.8pA/pFに比して有意に大きいことが明らかになり、細胞を機械的に破砕して細胞を単離する方法では正確な生理学的特性が示されない可能性が示唆された。この結果を受け、ラットの心臓での研究を中断し、マウス胚の心臓を用いて刺激伝導系細胞の成長に伴う生理学的特性の変化とビスダイアミンが心筋細胞と刺激伝導系細胞の成長に与える影響について検討することにした。しかし、マウス胚の心臓ではラットほどHNK-1陽性組織が明らかでなく刺激伝導系の存在が明確でなく、Langendorff灌流で単離された細胞はすべて紡錘状で心筋細胞、線維芽細胞、刺激伝導系細胞の区別ができなかった。また、ビスダイアミンはマウスではラットのような心臓発生の異常をきたさなかったことでマウスを用いて研究を行なうには限界がある。今後ラッドの細胞単離法を確立し研究を継続していきたい。
リンパ浮腫に対する細胞移植治療によるリンパ管再生研究

本研究は,未だ有効な治療法が確立されていないリンパ浮腫に対して,単核球細胞移植治療の可能性を研究,開発するものである.マウスによるリンパ浮腫モデルに対する単核球細胞移植を行い,浮腫の軽減効果,有効な移植経路,リンパ管新生の有無,リンパ管新生の機序を明らかにする事を目的としたが,マウスtail,後肢に二次性リンパ浮腫作成を試みたが,いずれも自然軽快が認められ慢性リンパ浮腫モデルとして適当なモデルが確立できなかった.<研究目的>本研究は,未だ有効な治療法が確立されていないリンパ浮腫に対して,単核球細胞移植治療の可能性を研究,開発するものである.リンパ浮腫(ラットによるリンパ浮腫モデル)に対する単核球細胞移植の1.浮腫の軽減効果, 2.有効な移植経路,3.リンパ管新生の有無,4.リンパ管新生の機序を明らかにする.<研究方法概要>1.ラットtailに二次性リンパ浮腫を作成2.異なるラット骨髄より単核球細胞を採取,分離3.ラットtailリンパ浮腫モデルへ,1局所投与,2患肢中枢側動脈内投与の2種類の投与法にて骨髄単核球細胞移植を施行4.リンパ浮腫に対する単核球細胞移植の有効性を,1ラットtail周囲径の変化,2リンパ管新生(マクロな変化および病理学的変化),3リンパ管新生機序(VEGF-C,VEGFR-3系の評価)を評価,検討する.(実験モデルの作成)週齢8-9の雌性ラットを用い,tail基部にて全周性の皮膚切開と尾動静脈は温存しつつ皮下組織およびリンパ管郭清にてモデル作成を試みるが,良好なモデルが作成できず.このため、tailのリンパ浮腫を断念し,ラット下肢にリンパ浮腫作成を試みた.tailと同様な手技にて、片側鼠径部にて、皮下組織およびリンパ管郭清し、創縁を電気メスにて焼却を加えるだけで放置し二次治癒を待った.術後経時的に,下肢の周囲径を計測,創部が治癒し,リンパ浮腫が形成されるのを確認した.<研究結果>リンパ浮腫モデルとしてマウスtailの二次性リンパ浮腫作成を試みたが,その困難性から下肢リンパ浮腫モデルの作成を試みた.しかし,tailモデルと同様に1リンパ管同定の困難性.2個体によって浮腫の程度に差が認められ,概ね一時的な浮腫はできるが自然軽快する.このため,細胞移植を行う前に多数の個体で浮腫の軽快が認められ,細胞移植の効果が判定できない状況となっている.<研究目的>本研究は,未だ有効な治療法が確立されていないリンパ浮腫に対して,単核球細胞移植治療の可能性を研究,開発するものである.リンパ浮腫(ラットによるリンパ浮腫モデル)に対する単核球細胞移植の1.浮腫の軽減効果, 2.有効な移植経路,3.リンパ管新生の有無,4.リンパ管新生の機序を明らかにする.<研究方法概要>1.ラットtailに二次性リンパ浮腫を作成2.異なるラット骨髄より単核球細胞を採取,分離3.ラットtailリンパ浮腫モデルへ,1局所投与,2患肢中枢側動脈内投与の2種類の投与法にて骨髄単核球細胞移植を施行4.リンパ浮腫に対する単核球細胞移植の有効性を,1ラットtail周囲径の変化,2リンパ管新生(マクロな変化および病理学的変化),3リンパ管新生機序(VEGF-C,VEGFR-3系の評価)を評価,検討する.(実験モデルの作成)週齢8-9の雌性ラットを用い,tail基部にて全周性の皮膚切開と尾動静脈は温存しつつ皮下組織およびリンパ管郭清にてモデル作成を試みるが,良好なモデルが作成できずラット下肢でのリンパ浮腫作成を試みた.tailと同様な手技にて、片側鼠径部にて、皮下組織およびリンパ管郭清し、創縁を電気メスにて焼却を加えるだけで放置し二次治癒を待った.術後経時的に,下肢の周囲径を計測,創部が治癒し,リンパ浮腫が形成されるのを確認した.<研究結果>下肢リンパ浮腫モデルの作成にあたり,郭清幅を広くし,郭清部の皮膚断端を皮下に縫着し郭清部のリンパの再疎通が起こりにくい状況が得られるようにした.しかし,tailモデルと同様に1リンパ管同定の困難性.2個体によって浮腫の程度に差が認められ,概ね一時的な浮腫はできるが自然軽快する.このため,細胞移植を行う前に多数の個体で浮腫の軽快が認められ,細胞移植の効果が判定できない状況となっている.本研究は,未だ有効な治療法が確立されていないリンパ浮腫に対して,単核球細胞移植治療の可能性を研究,開発するものである.マウスによるリンパ浮腫モデルに対する単核球細胞移植を行い,浮腫の軽減効果,有効な移植経路,リンパ管新生の有無,リンパ管新生の機序を明らかにする事を目的としたが,マウスtail,後肢に二次性リンパ浮腫作成を試みたが,いずれも自然軽快が認められ慢性リンパ浮腫モデルとして適当なモデルが確立できなかった.<研究目的>本研究は,未だ有効な治療法が確立されていないリンパ浮腫に対して,単核球細胞移植治療の可能性を研究,開発するものである.リンパ浮腫(ラットによるリンパ浮腫モデル)に対する単核球細胞移植の1.浮腫の軽減効果, 2.有効な移植経路,3.リンパ管新生の有無,4.リンパ管新生の機序を明らかにする.<研究方法概要>1.ラットtailに二次性リンパ浮腫を作成2.異なるラット骨髄より単核球細胞を採取,分離

3.ラットtailリンパ浮腫モデルへ,(1)局所投与,(2)患肢中枢側動脈内投与の2種類の投与法にて骨髄単核球細胞移植を施行4.リンパ浮腫に対する単核球細胞移植の有効性を,(1)ラットtail周囲径の変化,(2)リンパ管新生(マクロな変化および病理学的変化),(3)リンパ管新生機序(VEGF-C,VEGFR-3系の評価)を評価,検討する. (実験モデルの作成)週齢8-9の雌性ラットを用い,リンパ管を同定するために0.5% Patentblueをラットtail先端の皮下に注入する.tail基部にて全周性の皮膚切開をおき,尾動静脈は温存しつつ皮下組織も全周性に切開を加え体幹とtailとの間に2-4mmの間隙を作成,tailの側方にある深部の染色されたリンパ管を確認,剥離後,結紮切離する.創縁は全周にわたり電気メスにて焼却を加えるだけで放置し二次治癒を待つ.術後経時的に,tailの周囲径を計測する.創部が治癒し,リンパ浮腫が形成されるのを確認する.<研究結果>リンパ浮腫モデルをラットより扱いやすいマウスにて作成することを試みた.上記方法にてマウスtailの二次性リンパ浮腫作成を試みているが,(1)リンパ管同定の困難性.(2)一時的な浮腫はできるが自然軽快する.(3)浮腫の程度が様々といった理由により良好なモデル作成に至っていない.現在の実験施設環境,実験の効率化,簡便性を考え,実験動物としてラットではなくマウスを使用した.マウスtailの二次性リンパ浮腫モデル作成を試みたが,期待した結果を得られずマウス下肢でのリンパ浮腫作成を試みた.しかし,同様に1リンパ管同定の困難性.2個体によって浮腫の程度に差が認められ,概ね一時的な浮腫はできても自然軽快する.このため,細胞移植を行う前に多数の個体で浮腫の軽快が認められてしまうため,少数のモデルに細胞移植を試みたが,その効果判定に至っていない現状にある.<理由>実験の効率化,簡便性を考え,実験動物としてラットではなくマウスを使用した.マウスtailの二次性リンパ浮腫モデル作成を試みたが,(1)リンパ管同定と郭清の困難性(個体のサイズの問題も関与).(2)作成された浮腫が自然軽快する.(3)浮腫の程度が様々といった理由により安定したモデル作成に至っていない.リンパ浮腫モデルの確立を目指す.対策としてさらなる作成技術の習熟とともにマウスのリンパ管郭清方法を見直し、体幹とtailの間隙の距離、郭清部断端の処理方法を改良してみる.リンパ浮腫モデルが確立できれば,単核球の採取と静脈内投与の方法についてはすでに単核球移植による肺血管床新生の研究において確立されている.リンパ管新生に対する評価方法やそのメカニズム解明においても同様な方法論が利用できると考える.リンパ浮腫モデルの確立を目指す。対策として、作成技術の習熟とともにマウスのリンパ管郭清方法を見直し、体幹とtailの間隙の距離、郭清部断端の処理方法を改良してみる。これでも困難な場合には原案通りラットにてモデル作成を試みるか、ウサギ耳でのリンパ浮腫作成も視野に入れる。リンパ浮腫モデルが確立できれば,単核球の採取と静脈内投与の方法についてはすでに単核球移植による肺血管床新生の研究において確立されている.