hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規物理気相法によるダイヤモンドナノクラスターの創製とＭｎ添加による磁性付与

新規粉末専用チャンバーでCrドープPDCの作製に成功した.新規粉末作製装置で作製できるCrドープPDC粉末の回収量は,これまでの40倍以上になり,0.4 mg / minの回収量である.このCrドープPDCは,TEMのEDおよびSR-XRDで測定解析でdiamond - 111に起因する回折が認められ,ダイヤモンドの存在を確認している.このCrドープPDC粉末は,10 nm以下の結晶化したダイヤモンドが一面に無数に広がっていた.更に,VSMやSQUID測定結果,磁化を確認した.XAFS測定ではCrの2価の存在を確認している.一昨年までに減額の為作製に至っていなかった粉末専用の作製装置が他の資金の調達により温度可変基板を備えることが出来たため動き出した.しかしながら,アーク銃一式(CAPD源)は,予算不足のため,まだ借用している.装置稼働により,サンプルの生成量を増やすことに成功している.申請時には, MnドープPDC (粉末ダイヤモンドクラスター)の磁化発現を目指していたが,出発原料の作製が不可能であったため,途中からCrドープPDCでの磁化発現を行ってきている.新規粉末専用チャンバーでCrドープPDCの作製に成功した.新規粉末作製装置での,CrドープPDCの回収量は,借用していたそれの3倍以上になり,約3時間で70 mgの回収につながった.作製したCrドープPDCのサンプルをTEMのEDおよびSR-XRDで測定したところ,diamond - 111に起因する回折が認められ,サンプルにはダイヤモンドの存在も確認された.また,暗視野像で10 nm以下の光る結晶化したダイヤモンドが一面に無数に広がる像をとらえることができているため,サンプルに一様にダイヤモンドが作製できている状況にあることも確認した.また,SR-PESでC1sを測定し,解析したところ,ダイヤモンドであることを示すsp3成分が観察された.このことからも,ダイヤモンドが作製できている事が証明された.更に,作製したCrドープPDCのサンプルのCr-K端をXAFS測定して解析したところ,Cr2+に起因するピークが認められた.磁化測定は,同方法で作製した薄膜で測定し,10 at.% CrドープPDC薄膜でVSMでもSQUIDでも磁化を観測できている.しかしながら,強磁性のCrO2がコンタミしてこれに起因した磁化の発現である可能性もあり,今後,検証していく必要がある.新規粉末専用チャンバーでCrドープPDCの作製に成功した.新規粉末作製装置で作製できるCrドープPDC粉末の回収量は,これまでの40倍以上になり,0.4 mg / minの回収量である.このCrドープPDCは,TEMのEDおよびSR-XRDで測定解析でdiamond - 111に起因する回折が認められ,ダイヤモンドの存在を確認している.このCrドープPDC粉末は,10 nm以下の結晶化したダイヤモンドが一面に無数に広がっていた.更に,VSMやSQUID測定結果,磁化を確認した.XAFS測定ではCrの2価の存在を確認している.今回の科研費により,ダイヤモンド粉末(PDC)を作製するための真空チャンバーを購入し,設置が出来た.しかしながら,予算減額の都合上,温度可変システム付きの基板フォルダとガス設備に関する物品を購入することが出来なかった.そのため,サンプルは薄膜サンプル用のチャンバーを用いて膜を作製し,膜から粉末化している.こうして出来た粉末を,放射光X線回折(SR-XRD)で測定したところ,Diamond-111,220のピークが出現し,ダイヤモンドの存在を確認することが出来た.また,ガス圧力の変化(0-159.6 Pa)により粒径が1.8 - 2.6 nmの間で平均粒径の変化が起こったことがScherrerの式から見積もられた.しかしながら,透過型電子顕微鏡(TEM)の測定に関しては,試みたがカーボンそのものの電子線回折像を得ることが出来ていない.XRDでは観察出来るため,理由も含めて考察し,引き続き,観察中である.本実験では,Mnによる磁性付与を狙い実験をしてきたが,Mnを練りこんだターゲット材を作製することが不可能であることが研究を進める上でわかってきた.磁性付与が期待できるCrのドーピングにシフトし,研究をしている.Crでは2価で磁性が発現する理論予測があるためである.Crをドーピングしたターゲットは,作製が可能で既に得ている.ここからアークプラズマ銃でサンプルを作ることも可能であった.ドープされたCrの価数を観察するために,X線吸収端近傍構造(XANES)の測定を申請,採択され今年度予定している.磁気測定に関しては,試料振動型磁力計(VSM)と超伝導量子干渉素子(SQUID)測定を検討していたが,VSMは測定の手筈が整わず,SQUIDに関しては液体Heが入手困難なことより,現在までに測定が出来ていない.しかしながら,準備を行なっている.真空チャンバーにヒーターシステムとガス配管を設置出来なかったため,ダイヤモンド薄膜作製時に好条件だった温度とガス雰囲気が新規導入のチャンバーでは実現出来ていないことで薄膜チャンバーを用いてサンプルを作製している.この薄膜から粉末を作製する方法を見出すことに時間を要した.また,新規チャンバーは量産化に向けての工夫の施されたチャンバーであったため,作製の効率化の点からも研究の進捗を少々滞らせている.言い換えればサンプル作製に34倍の時間を費やしている.

また,Mnドープのターゲットを作製できないことが判明し,磁化が発現可能な元素を検索し,代替材料のCrを見つけ出してターゲットを作製することにも時間がかかった.磁気測定に関しては利用予定のVSM装置が,粉末では測定出来ないことが判明し,粉末での測定方の開発もしくは粉末で測定できる装置の検索に時間がかかっている.SQUIDでの磁気測定に関しても液体Heが入手困難な観点から測定を行えないでいる.以上の2点から磁気測定を行えないのでサンプルの特性を見ることが出来ないできた.放射光や中性子の測定は申請から測定までに約1-2年の月日を要しているためこの点でも実験日程やはり当初の予定からがやや遅れている.結果より同軸型アーク銃を用いれば,真空下の作製条件でもダイヤモンドが成長しPDCを作製することが可能と判ったので,温度可変基板フォルダとガスラインの配備されていない新規チャンバーを改良しこれを用いてPDCを作製し今後はスピードアップを測りたい.CrドーピングでのPDCの磁性付与での成果を主軸として挙げていく予定である.しかしながら,MnドーピングでのPDCの磁性付与に関しても作製法から検討し,模索して行きたい.その時のダイヤモンド結晶存在とドーピング元素の存在はSR-XRD,XPS,XANESの各放射光測定により同定する.また,SR-XRD結果より,結晶粒径変化も導き出す.磁気測定に関しては,本法のサンプルに適合した共同利用開放がなされているVSMやSQUIDを探して測定につなげる.それに加えて装置の工夫により粉末測定が可能な状況を導き出していくことにも務める.これに加え,X線磁気円二色性(XMCD)測定も申請し,スピン磁気モーメントおよび軌道磁気モーメントを見積り,磁化の発現を評価する.中性子散乱法用いた磁化率の測定のチャンスも伺っていく予定である.XMCDや中性子散乱は磁化発生の可能性も見出すことにつながる.言い換えればVSMやSQUIDでは検出出来ない磁化の可能性を検出できるので測定可能な環境を整える.継続してTEM測定を行いダイヤモンド結晶の像観察にチャレンジする予定としている.結晶粒径や存在頻度を確認していく.最近,キャンパス内のTEM装置を使うことが出来る体制になったので測定出来る環境になったので,勢力的に使って結果を出して行きたい.予定している通り,XRDおよび電子線回折の結果からPDC中のMnの存在サイトの同定をする.決定した格子モデルを用いて第一原理計算ソフトwien2kを用いて構造からXANES等の分光測定予測を逆算したもので検証も行う.主には,サンプル作製のための同軸型アーク銃のCrドープグラファイトターゲット料金,実験器具(ビーカーやろ紙,手袋等),消耗する真空部品(ガスケットや凹リング等)といった消耗品費(物品費にあたる)に使用していく.ここに55万円を当てている.その主たるところは,Crドープのターゲットと同軸型アーク銃の碍子である.ターゲットに関しては,少なくとも3種のCrのドープ量変化させたサンプルを各種作製するため,おおよそ5万円で6本程度の計30万円かかる.これにアーク銃専用の碍子(単価5万円)が2個は必要となるので,先に述べたターゲットとで物品費の費用のほとんどを占める.また,僅かではあるが測定の際に必要な人件費やその他として測定料金をそれぞれ計上している.それぞれ,5万円と9万円(1日の放射光施設の学術機関の使用料金にあたる)を使用していく予定である.
全ゲノムCGHマイクロアレイ法の開発とその臨床応用

1.研究計画1年目に予定していたwhole genome microarrayの開発は、全ゲノム上から750kb間隔で選び出したBACをすべてFISHで確認し、4200クローンをアレイ作製まで遂行した。2.既に完成していた2100クローンのwhole genomeアレイを使用した、Kabuki Make-upsyndrome,非症候性精神運動発達遅滞を対象とする解析は完了し、その結果は論文として受理された。疾患責任遺伝子の単離は、Kabuki make-upsyndromeに関して、候補となる領域に含まれる遺伝子の中で2つの遺伝子について点変異の有無をスクリーニングしたが、異常は検出されなかったため、現時点疾患責任遺伝子の同定はされていない。非症候性精神運動発達遅滞の疾患責任遺伝子の解析は、いくつか候補遺伝子領域を同定する事が出来た。3.解析対象疾患としてあげていた、Cornelia de Lange症候群は他のグループにより、疾患責任遺伝子であるNIPBLが同定されたため、同遺伝子の点変異解析を行い、4つの新規の遺伝子変異を同定し、その結果は論文に受理された。4.自然流産物の解析は、現在進行中である。以上研究計画に沿って着実に実験を遂行・一定の成果を得た。今後は作製した4200アレーを用いてさらなる疾患解析(ゲノム病が疑われる奇形症候群、自然流残物、染色体異常症など)に役立て、責任遺伝子を同定したいと考えている。
遅延耐性ネットワークにおける省電力情報散布手法の研究開発

無線通信機器の小型化に伴い、無線端末の移動によりネットワークが分断される、遅延耐性ネットワークは、今後、様々なところに現れる。遅延耐性ネットワークにおいて、情報散布が重要であるが、既存の遅延耐性ネットワークやセンサネットワークの研究では、消費電力を考慮した情報散布はほとんど検討されていない。そこで、本研究課題では、遅延耐性ネットワークにおける省電力情報散布手法を提案した。既存の手法とは異なり、提案手法を用いることで、ネットワーク全体の消費電力の増加を抑えつつ、情報散布率を高くすることができる。また、理論検討のみにとどまらず、実ネットワーク上で動作する手法であることを示した。初年度は、単純なネットワーク上における情報散布手法の検討をおこなった。具体的には、無線端末の移動がなく、かつ、無線端末が格子点上に存在するネットワークを対象として、情報散布手法を提案し、性能評価を行った。提案手法は、メッセージを受け取った際の受信電力に応じて、メッセージをブロードキャストするタイミングを決定する。受信電力が小さければ小さいほど、より遠くのノードからメッセージを受信したことを示す。この性質を利用して、提案手法では、送信ノードからより遠くにあるノードが先にブロードキャストを行う。また、提案手法では、新しいメッセージを受信したノードが、受信したメッセージをブロードキャストする前に、再度、同じメッセージを受信した場合には、ブロードキャストを取りやめる。シミュレーションにより提案手法の評価を行い、提案手法が従来のフラッディング手法とは異なり、無線の電波の送信距離を大きくするほど、効率的な情報散布ができることを示した。具体的には、格子点上へノードを配置する確率(以降、配置確率)を変化させたときのフラッディング手法および提案手法の情報散布率を示した。その結果、まず、配置確率に関しては、いずれの場合においても情報伝播率が急激に上昇する閾値が存在することが分かった。また、フラッディング手法および提案手法どちらの場合でも、無線電波の送信距離が伸びるほど、配置確率の閾値が小さくなる、すなわち、配置確率に対して、情報散布率が高い領域が広くなることが分かった。また、無線の送信距離が大きいほど、より消費電力量の減少が大きいことが分かった。これは配置確率が増加するにつれて、また、送信距離が大きくなるにつれて、提案手法が、より効率的にメッセージの送受信することを示す。平成27年度は、「無線端末が格子点上に存在するネットワークにおける性能解析」に取り組んだあと、対象とするネットワークを拡張して、「無線端末が格子点上に存在する遅延耐性ネットワークにおける性能解析」を取り組む予定であった。これを予定通り達成できており、順調に進んでいると言える。また、実機での実装評価のためのプログラム開発もすでに初めている。計画通りの研究遂行が期待できる。平成28年度は、解析モデルのさらなる拡張を行った。これまでのモデルでは、全てノードが正方格子上に存在することを仮定していた。これを非格子モデルへと拡張した。このモデルを確立することで、真の遅延耐性ネットワークの性能解析ができる。サイト確率、ボンド確率を定め、情報散布率を導出し、シミュレーションにより、手法の有効性を示した。さらに、実機による実験を行い、手法の実現性を示した。具体的には、シミュレーションにより、以下を示した。フラッディング手法と提案手法ではどちらも、より大きな電力を消費することによって送信距離を増加させると、送信の際に、より大きな電力を用いて無線の送信距離を増加させることで、情報散布率の高い領域を広くすることができる。このとき、フラッディング手法は、より大きな電力を用いて無線の送信距離を増加させると、それにともなって、ネットワーク全体の消費電力量が、非常に増加するが、提案手法では、ネットワーク全体の消費電力量の増加を、最小限に抑えることに成功している。さらに、フラッディング手法は、ノード数が増加するにつれて、消費電力量が増加する。一方、提案手法は、ノード数が増加するにつれて、ネットワーク全体の消費電力量が減少していることが分かる。以上より、ノードをランダム配置した場合において、提案手法は、正方格子上に配置した場合と同様の性質を示すことを示した。また、実機を用いた実験を行い、提案手法を用いて、実際のネットワークにおいて、情報を散布できることを示した。さらに、提案手法がフラッディング手法と同等の情報散布率を維持しつつ、ネットワーク全体の消費電力は、フラッディング手法より小さいことを示した。現在のところ、研究計画の変更は考えていない。平成28年度は、予定通り、「遅延耐性ネットワークにおける性能解析」、および、「実験ネットワークにおける実験評価」に取り組む。大阪大学の村田正幸教授と、定期的に打ち合わせをしている。本研究課題において何らかの問題があった場合は、コメントいただく予定である。また、実験評価に用いるプログラムの開発は、実際の製品を扱うプログラマに協力してもらう予定である。トランスポートアーキテクチャ約16万円の次年度使用額が発生した。これは以下のためである。平成28年度に、実ネットワークでの実験でセンサ端末を用いる。平成27年度に、このセンサ端末のうち、小数を先に購入して、プログラム開発を行う予定であった。

しかし、平成27年度は、エミュレーター上で開発を行ったため、端末を購入しなかったため、次年度使用額が生じた。実験全体に必要な端末の数は、現状変更はない。平成27年度に購入しなかった分も、平成28年度に購入する予定である。
免疫複合体型糸球体腎炎の発症・進展の制御に関する研究

平成11年度平成12年度にかけて免疫複合体型糸球体腎炎の発症・進展における補助シグナルの役割について検討してきた。野生型(Wild-type)マウスとCD28分子欠損(CD28KO)マウスに抗糸球体基底膜抗体を用いた加速型馬杉腎炎を惹起した。Wild-typeマウスでは糸球体における半月体を伴う増殖性病変をきたし、血清クレアチン値の上昇と蛋白尿の増加が認められた。しかし、CD28KOマウスにおいては、このような糸球体腎炎の所見はみられなかった。CD28KOマウスにおいては糸球体へのマウスIgGの沈着が認められず、autologous phaseにおける糸球体障害性の自己抗体の産生が阻害されていることが推定された。血清中のマウスIgGの濃度が低く、flow cytometryで確認した脾細胞におけるMHC classII抗原の発現が抑制されていた。よって、抗糸球体基底膜抗体を用いた免疫複合体型糸球体腎炎の発症には、CD28分子を介する補助シグナルが重要な役割を果たしていると考えられた。次いで、Wild-typeマウスとCD28KOマウスにGVHRを惹起した。Wild-typeマウスでは糸球体基底膜に免疫グロブリンの沈着をきたし、血清中dsDNA値経時的に上昇した。しかし、CD28KOマウスにおいては、このような変化はみられなかった。よって、GVHRのモデルにおける糸球体病変の形成においてもを、CD28分子を介する補助シグナルが重要な役割を果たしていると考えられた。そこで、免疫複合体型糸球体腎炎の発症を阻止する方法を確立することにした。6週齢の自然発症IgA腎症モデルであるddYマウスにhuman IgG(コントロール群)とhuman CTLA4Ig(実験群)を100μgの割合で週2回、腹腔投与した。15週目と40週目の血清Cr値と24時間尿蛋白量、血清IgA値および腎糸球体組織所見を観察した。その結果、コントロール群では、15週目と40週目の比較で尿蛋白量の有意な増加を認めたが、実験群では有意な増加がみられなかった。いずれの群においても、血清Cr値の増加は認められなかった。一方、コントロール群に比し実験群では、40週目における血清IgA値が有意に低下していた。それに伴って、実験群ではメサンギウム増殖は軽度で、糸球体へのIgA沈着も低下していた。これらの結果より、ddYマウスの糸球体病変の発症には、CD28分子を介する補助シグナルが重要な役割を果たしていると考えられた。免疫複合体型糸球体腎炎の発症・進展における補助シグナルの意義について検討するため、野生型(Wild-type)マウスとCD28分子欠損(CD28KO)マウスに抗糸球体基底膜抗体を用いた加速型馬杉腎炎を惹起した。

しかし、CD28KOマウスにおいては、このような糸球体腎炎の所見はみられなかった。免疫組織化学で糸球体における免疫グロブリンや補体の沈着様式を検討したところ、CD28KOマウスにおいてはマウスIgGの沈着が認められず、autologous phaseにおける糸球体障害性の自己抗体の産生が阻害されていることが推定された。実際に、血清中のマウスIgGの濃度が低く、flow cytometryで確認した脾細胞におけるMHC class II抗原の発現が抑制されていた。よって、抗糸球体基底膜抗体を用いた免疫複合体型糸球体腎炎の発症には、CD28分子を介する補助シグナルが重要な役割を果たしていると考えられた。野生型(Wild-type)マウスとCD28分子欠損(CD28KO)に抗基底膜抗体糸球体腎炎およびgraft-verusus-host reaction(GVHR)を惹起したところ、CD28KOマウスでは糸球体病変がほぼ完全に抑制された。よって、免疫複合体型糸球体腎炎の発症には、CD28分子を介する補助シグナルが重要な役割を果たしていると考えられた。そこで、免疫複合体型糸球体腎炎の発症を阻止する方法を確立することにした。そのために、B7/CD28分子シグナルを阻害するCTLA4Igを投与することにより実験腎炎の発症を抑制できるかどうかを検討することにした。6週齢の自然発症IgA腎症モデルであるddYマウスにhuman IgG(コントロール群)とhuman CTLA4Ig(実験群)を100μgの割合で週2回、腹腔投与した。15週目と40週目の血清Cr値と24時間尿蛋白量、血清IgA値および腎糸球体組織所見を観察した。その結果、コントロール群では、15週目と40週目の比較で尿蛋白量の有意な増加を認めたが、実験群では有意な増加がみられなかった。いずれの群においても、血清Cr値の増加は認められなかった。一方、コントロール群に比し実験群では、40週目における血清IgA値が有意に低下していた。それに伴って、実験群ではメサンギウム増殖は軽度で、糸球体へのIgA沈着も低下していた。これらの結果より、ddYマウスの糸球体病変の発症を阻止するために、CD28分子を介する補助シグナルを制御することが重要と考えられた。
ベクトリアル偏光干渉非線形レーザ顕微鏡によるナノ微粒子分光イメージング

非線形共焦点顕微鏡にマイケルソン型のベクトリアル偏光干渉を組み込んだ新しいタイプの3次元分光計測システムを構築した.単一ナノ微粒子にドープされた非等方的なクロモファ分布を高空間分解能で分布計測可能なシステムである.被測定物体からの等方的バックグラウンド散乱信号を参照光信号との偏光干渉ベクトリアル差分演算によって強制的に抑制することで,極微小領域に生じる僅かな非線形感受率変化をコントラストエンハンス画像として再生することができる.これによりz軸に沿った光学的断層画像から3次元でのχ(3)分布の影像化に成功した.以上,助成期間内で提案顕微システムの最適化設計と実際の微粒子計測・評価を行った.本提案手法は直径数百ナノメートルの微粒子単体の表面及び内部の光学定数分光計測を目指すものである.初年度であるH23年度はベクトリアル偏光干渉共焦点顕微鏡の最適化設計を行った.ジョーンズマトリックスモデルを利用し,微粒子からの異方性散乱を理論的に計算した.被測定物体のバックグラウンド(光学的に均一な等方性領域からの散乱)信号を参照光との偏光干渉ベクトリアル差分計測により強制的に抑制することで極微小領域に生じる僅かな感受率変化をコントラストエンハンスト画像として再生することができる.同偏光干渉計にはマイケルソンタイプの光学系を利用する.共焦点レーザ顕微鏡内にマイケルソンベクトリアル差分偏光干渉系を構築するには,光軸近傍,焦点近傍の電界ベクトルについてのみベクトル差分を実現可能な偏光干渉系を設計する必要がある.しかも多波長同時励起が可能な光学系を目指すため,多波長下での各種収差条件(色収差,波面収差等)を考慮した光学系の設計が非常に重要となるため,それらパラメータを考慮し最適な光学系の条件を算出した.以上の最適化設計によりコントラスト分解能を大幅に高めることが可能であることを示唆する理論的な結果が得られた.それら得られた成果はシドニーで開かれたオーストラリア物理学国際会議にて発表し,異分野である環境分析の研究者からも強い関心を頂いた.これまで微粒子の物理・化学計測はある程度マスとしてのマクロな量でしか計測できなかったため,DDS(drug delivery system)応用のみならず環境計測へも十分応用が期待できることが分かった.本提案手法は直径数百ナノメートルの微粒子単体の表面および内部の光学定数分光計測を目指すものである.助成期間3年間でベクトリアル偏光干渉共焦点顕微鏡の最適化設計と実際に作成したシステムの評価を行った.ジョーンズマトリックスモデルを利用し,微粒子からの異方性散乱を理論的に計算した.被測定物体のバックグラウンド(光学的に均一な等方性領域からの散乱)信号を参照光との偏光干渉ベクトリアル差分計測により強制的に抑制することで極微量領域に生じる僅かな感受率変化をコントラストエンハンス画像として再生することができる.同偏光干渉計にはマイケルソンタイプの光学系を利用する.共焦点レーザ顕微鏡内にマイケルソンベクトリアル差分偏光干渉系を構築するには,光軸近傍,焦点近傍の電界ベクトルについてのみベクトル差分を実現可能な偏光干渉計を設計する必要がある.しかも多波長同時励起が可能な光学系を目指す為,多波長下での各種収差条件(色収差,波面収差等)を考慮した光学系の設計が非常に重要となるため,それらパラメータを考慮し最適な光学系の条件を算出した.以上の最適化設計により,コントラスト分解能を大幅に高めることが可能であることを理論的に証明した.また,この理論に基づき,実際に各種空間周波数をもつナノ微粒子群に対して3次元計測を行い,通常の共焦点顕微鏡のコントラスト分解能特性の大幅な向上を達成した.得られた成果はNonlinear Optics 2013(Hawaii)とInt. Conf. on Experimental Mechanics (ICEM) 2013(Bangkok)にて発表し,非線形光学分野の研究者や電子機械分野の研究者から強い関心を頂いた.当方の開発した顕微システムはDDS(drug delivery system)応用にみならず,各種環境計測へも応用が規定できることが分かった.非線形共焦点顕微鏡にマイケルソン型のベクトリアル偏光干渉を組み込んだ新しいタイプの3次元分光計測システムを構築した.単一ナノ微粒子にドープされた非等方的なクロモファ分布を高空間分解能で分布計測可能なシステムである.被測定物体からの等方的バックグラウンド散乱信号を参照光信号との偏光干渉ベクトリアル差分演算によって強制的に抑制することで,極微小領域に生じる僅かな非線形感受率変化をコントラストエンハンス画像として再生することができる.これによりz軸に沿った光学的断層画像から3次元でのχ(3)分布の影像化に成功した.以上,助成期間内で提案顕微システムの最適化設計と実際の微粒子計測・評価を行った.本提案手法は直径数百ナノメートルの微粒子単体の表面及び内部の光学定数分光計測を目指すものである.初年度であるH23年度はベクトリアル偏光干渉共焦点顕微鏡の最適化設計を行った.ジョーンズマトリックスモデルを利用し,微粒子からの異方性散乱を理論的に計算した.被測定物体のバックグラウンド(光学的に均一な等方性領域からの散乱)信号を参照光との偏光干渉ベクトリアル差分計測により強制的に抑制することで極微小領域に生じる僅かな感受率変化をコントラストエンハンスト画像として再生することができる.同偏光干渉計にはマイケルソンタイプの光学系を利用する.共焦点レーザ

顕微鏡内にマイケルソンベクトリアル差分偏光干渉系を構築するには,光軸近傍,焦点近傍の電界ベクトルについてのみベクトル差分を実現可能な偏光干渉系を設計する必要がある.しかも多波長同時励起が可能な光学系を目指すため,多波長下での各種収差条件(色収差,波面収差等)を考慮した光学系の設計が非常に重要となるため,それらパラメータを考慮し最適な光学系の条件を算出した.以上の最適化設計によりコントラスト分解能を大幅に高めることが可能であることを示唆する理論的な結果が得られた.それら得られた成果はイタリアで開かれたInternational Conference on Microelectronics, Optoelectronics, and Nanoelectronicsにて発表し,異分野である環境分析の研究者からも強い関心を頂いた.これまで微粒子の物理・化学計測はある程度マスとしてのマクロな量でしか計測できなかったため,DDS(drug delivery system)応用のみならず環境計測へも十分応用が期待できることが分かった.昨年度は科学研究費予算が大幅に減額されるかもしれないとの報道があり,本来必要な高価な光学部品等の購入を当初控えて研究を行った.そのため特に再生照明系の基本形を構築する実験などで多少の遅れを生じていた.今年度はその遅れをほぼ取り戻すことができたため,最終年度である次年度にて実際のベクトリアル偏光干渉計測を実施する.H23年度の科学研究費予算が大幅に減額されるかもしれないとの報道があり,本来必要な高価な光学部品等の購入を当初控えて研究を行った.そのため再生照明系の基本形を構築する実験的な領域で若干の遅れを生じた.結果的にはあまり予算支出を伴わない理論的な領域での研究を中心に行いある程度の成果を得た.次年度は光学系構築の遅れをどこまで取り戻せるかが重要である.最終年度であるH25年度では,下記に示す顕微システムトータルを構築し,実際の3次元影像を行う.参照信号と均一バックグラウンドからの非線形散乱信号とのベクトル差分を極力ゼロに抑え,被測定物体からの不均一ナノ領域から生じる僅かな差分ベクトルの変化を検出する顕微システムを作成する.昨年度までに同顕微システムの理論的な側面(ジョーンズマトリックスによる偏光ベクトル解析)からの研究と実験的な側面(コントラスト分解能の評価)からの研究をほぼ終え,実際に生体サンプルを利用して,ナノ領域での3次元影像を試みる.コントラスト分解能の評価データからは同顕微システムの入力レーザ光の光強度に対して,非線形的に分解能が向上することも確認できた.これにより線形顕微鏡ではほぼ不可能だった波長以下でのナノ計測がほぼ可能であることも実証できた.今年度で同補助金にて援助頂く研究期間は終了するが,これをステップアップとして次年度以降に上位の科学研究費補助金申請へとつなげる予定である.H23年度で若干おくれを被った再生照明系の構築をまず最初に手がけ,続いて当初から予定していたベクトリアル偏光干渉共焦点レーザ顕微鏡による多波長3次元分光システムの構築に着手する.標準化サンプルを使って構築したシステムのコントラスト分解能(CTF)を測定し,同システムの性能評価を行う.理論的に予測される理想的な値にどの程度まで近づけることができるかが第一の課題である.H24年度では次に示す実際のシステムを構築する.
メラニン凝集ホルモン産生神経の活動操作と運命制御を用いたレム睡眠調節機構の解明

MCH産生神経特異的に光遺伝学を適用し、その活動を光で操作した。その結果表出する個体レベルでの睡眠覚醒を解析することによって、ノンレムーレム睡眠を調節する神経回路とその動作原理について解析した。その結果、MCH神経を光遺伝学を用いて活性化させると、ノンレム睡眠時間が減少し、レム睡眠時間が3倍に増加した。一方、覚醒時間はほとんど影響無かった。これらのことは、MCH神経活動が、睡眠覚醒状態変化において、ノンレム睡眠ーレム睡眠の切り替えにおいて役割を担っていることを示している。睡眠はノンレム睡眠とレム睡眠に分かれている。必ずノンレム睡眠が先行し、ノンレム睡眠後にレム睡眠が現れる。このノンレムとレムがどのような神経回路によって調節されているのかについてはほとんど分かっていなかった。これまでに、視床下部のメラニン凝集ホルモン(MCH)産生神経活動を光遺伝学を用いて制御可能なマウスの作成に成功し、MCH神経の活動を光を用いて操作するとレム睡眠が約3倍に増加することを見いだした。本研究では、これらのマウスを用いてノンレム睡眠ーレム睡眠の調節メカニズムを個体動物を用いて詳細に解明することを目的としている。MCH神経は元々摂食行動を促進すると考えられていたことから、MCH神経活動を操作したときの摂食代謝などエネルギー恒常性における作用について解析した。MCH神経特異的な長時間の活性化を行うために、薬理遺伝学を用いた。MCH-tTAマウスとアデノ随伴ウイルス(AAV-TetO hM3Dq)を用いて、MCH神経特異的にhM3Dqを発現させ、クロザピンNオキサイド(CNO)投与によって、MCH神経を持続的に活性化させ、その時の摂食代謝を測定した。免疫組織化学的解析によって、MCH神経特異的にhM3Dqが発現していることを確認し、CNO投与後に神経活動上昇のマーカーであるcFosが発現していることを確認した。また、脳スライスパッチクランプを用いた解析から、CNO投与によって神経活動が持続的に亢進することを確認した。次に丸ごとの個体を用いて、MCH神経を活性化させ、行動を解析した。CNO投与後に摂食行動、飲水行動、自発活動量、代謝のいずれにおいても大きな変化は認められなかった。これらのことはMCH神経が摂食代謝行動にはあまり関わっていないことを示唆している。メラニン凝集ホルモン(MCH)産生神経の活動を特異的に操作するために、プロMCHプロモーターでCreリコンビナーゼをドライブするMCH-Creマウスを導入した。このマウスとCre依存的に遺伝子発現を起こすアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを用いて、MCH神経特異的に遺伝子発現を誘導した。MCH神経の存在する視床下部にAAVを微量局所注入して、局所感染させた。MCH神経特異的に薬理遺伝学を適用するために、改変型GPCR(hM3Dq)を発現させた。免疫組織化学的解析にて、MCH神経特異的にhM3Dqが発現していることを確認した。また、hM3Dqの機能を確認するために、スライスパッチクランプを用いてMCH神経から活動電位を記録しながら、hM3Dqのリガンドであるクロザピン-N-オキサイド(CNO)を投与した。hM3Dqを発現したMCH神経はCNO投与によって持続的に脱分極して活動電位の発生頻度を増加させた。次にインビボにおいてMCH神経を活性化させたときの、摂食代謝調節における役割を明らかにするために、摂食量、飲水量、自発行動量、酸素消費量が同時に測定出来るCLAMS装置にて変化を記録した。しかしながら、CNO投与によってMCH神経を活性化させてもいずれのパラメータにも大きな変化は見られなかった。また、光を用いてMCH神経活動を測定するために、MCH神経特異的にカルシウムインディケータタンパク質であるGCaMPもしくはイエローカメレオン(YC)を発現する遺伝子改変マウスを作成し、カルシウムイメージングを用いてMCH神経活動をモニターする実験系を確立することに成功した。ウイルスベクターと遺伝子改変マウスを用いて薬理遺伝学を用いたMCH神経特異的な活動操作の実験系を確立することに成功し、MCH神経活動と様々な行動発現を解析出来るようになった。これを用いて今後睡眠覚醒調節や睡眠関連脳機能への影響について詳しく解析することが可能となったため。MCH神経の投射先を明らかにするために、MCH神経特異的にtTA(テトラサイクリントランスアクティベーター)を発現するMCH-tTAマウスと、tTA依存的にYellow Camelleon (YC nano)を発現するマウス(TetO YC)を交配させて、MCH-tTA; TetO YCマウスを作成した。YCnanoは、非常に強い蛍光を発するタンパク分子で、軸索先端まで輸送されるために、MCH神経の軸索が脳のどの部位に投射しているのかについて明らかにすることができる。組織化学的解析の結果、MCH神経軸索が海馬や中隔核などの記憶との関連が指摘されている領域に密に投射していることを見いだした。これらの結果は、MCH神経が睡眠覚醒調節だけでなく記憶の制御にも関わっていることを示している。そこで、MCH神経を時期特異的に脱落させることが出来るマウスを用いて記憶のテストを行った。MCH-tTAマウスをTetO diphtheria toxin A fragment(DTA)マウスと交配させ、MCH-tTA; TetODTAマウスを作成した。

ドキシサイクリンの有無によって、DTA発現が制御されるため、MCH神経の脱落時期を制御することが可能になる。認識記憶を評価できる新奇物体認識試験を用いてMCH神経脱落マウスの記憶を評価したところ、記憶が優位に向上していることが明らかになった。そこで、記憶保持の間に断眠を行ったところ、断眠を行うとMCH神経脱落群と非脱落群間に差が見られなかった。これら一連の行動実験から、MCH神経が睡眠中に活動し、記憶を抑制又は消去していることが示唆された。MCH産生神経特異的に光遺伝学を適用し、その活動を光で操作した。その結果表出する個体レベルでの睡眠覚醒を解析することによって、ノンレムーレム睡眠を調節する神経回路とその動作原理について解析した。その結果、MCH神経を光遺伝学を用いて活性化させると、ノンレム睡眠時間が減少し、レム睡眠時間が3倍に増加した。一方、覚醒時間はほとんど影響無かった。これらのことは、MCH神経活動が、睡眠覚醒状態変化において、ノンレム睡眠ーレム睡眠の切り替えにおいて役割を担っていることを示している。当初の予定をほぼ達成しており、計画通りに順調に進展している。今後はMCH神経活動操作を用いて、行動発現における役割について詳細に検討していく。また、MCH神経脱落マウスを用いた行動実験からもMCH神経の生理的役割の解明を行う。特にMCH神経特異的にカルシウムインディケータを発現したマウスを用いた入力系路の探索によって、MCH神経がどのような神経系からどのような入力を受けているのかを明らかにすることで、神経回路レベルでの検討も行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。神経生理学メラニン凝集ホルモン産生神経の生理的役割を明らかにするために、摂食・飲水・代謝などの行動以外の生理機能について検討を行う。特に、事前の検討で関与が考えられる記憶形成などの行動への関与について中心的に解析を行う。光遺伝学、薬理遺伝学を用いた解析を中心に進めて行く予定である。MCH神経特異的にカルシウムインディケータを発現する遺伝子改変マウスを繁殖させるために、名古屋大学の動物実験支援センター(SPF施設)に導入するのに予想以上に時間がかかり、そこでの飼育と実験にかかる予算を次年度に回すことになったため。メラニン凝集ホルモン産生神経特異的にtTAを発現する遺伝子改変マウスの繁殖が悪く、実験に使用するマウスの数が限られており、電気生理学的実験を次年度に行うことにしたため。遺伝子改変マウスの飼育・管理維持費用と、カルシウムイメージングを用いた入力系路の探索を行う。マウスの繁殖に成功し、電気生理学的解析に用いる十分な数が整い次第、電気生理学実験を開始する。
高秩序環境場における光反応ダイナミックス

(1)発色団、カルバゾール基、アントラセン基を導入したポリペプチドを材料としてラングミュア・プロジェット(LB)膜を調製し、累積膜の昼間および層内の励起エネルギー伝達・移動について検討した。単層での層内励起エネルギー伝達・移動を定量的に評価するとともに、層の配列制御により層間で効率よくエネルギー移動を起こし得ることを明らかにした。またポリペプチドLB累積膜は少なくとも100°Cまでは熱的に安定であることを示した。(2)カルバゾール基を有する高分子および低分子化合物の非晶パルク固体フィルム中における光誘起電子移動過程を、ピコ秒からマイクロ秒時間域の過渡吸収と発光挙動を通して検討した。光励起により生成したイオン対の電荷再結合過程はホール移動過程と競争していること、電荷再結合を逃れたホールはアニオンとナノ秒からマイクロ秒時間域で再結合して消失すること、また再結合による発光が見られることを明らかにしている。(3)p-ニトロフェニルアラニンを種々の部位に導入したストレプトアビジンによるビオチン化ピレニルアラニンの蛍光消光を検討し、タンパク質中の電子移動の距離依存性が単純に距離だけの関数となることを見出した。また2-アントリルアラニン(antAla)を部位特異的に導入したストレプトアビジンにビオチン化ニトロフェニルアラニン(ntrPhe)を結合させてantAlaからntrPheへの光誘起電子移動を調べ、タンパク質の構造と電子移動速度との関係を明らかにした。(4)ホールバーニング分光を用いて種々の色素-高分子ハイブリットナノ構造体における色素周囲のミクロ環境や色素自身の励起状態ダイナミックスを評価した。色素含有ユニマ-をPVA膜中に分散した試料について疎水基の違いにより色素微環境の緩和挙動が異なることを明らかにするとともに、硬い構造に対応する低エネルギー励起モードが存在することを見出した。(5)両親媒性高分子電解質が水溶液中でつくる極めてコンパクトで硬いユニマ-ミセル中では、励起三重項ZnTPPが著しく長寿命化する。このユニマ-ミセルの外部表面にメチルビオロゲン(HV^<2+>)を静電結合させ、これとの間で起こる光誘導電子移動により、内部にはZnTPPカチオンラジカルが、ミセル表面にはMV^<2+>が生成するが逆電子移動は著しく抑制され、カチオンラジカル種は数ミリ秒と極めて長寿命化することを見出した。(6)ポルフィリダイマー、ポルフィリンモノマー、ピロメリットイミドからなる3元系光合成モデルを合成し、それぞれのクロモフォア-の距離や角度、あるいはエネルギーレベルを精密に調製することで、光吸収された励起エネルギーが一旦ダイマーに捕集され、そこからポルフィリン色素間の電子移動により電荷分離状態が生成し、電荷シフト反応により長寿命電荷分離状態が生成するという光合成反応中心に類似した一連の励起エネルギー移動および連続電子移動を一つの分子上で実現することに成功した。(1)ポリビニルオクタナ-ルアセタールに桂皮酸基を導入した光反応性高分子のLB膜を調整し、これの光架橋により高分子LB膜構造の膜構造の評価法として、励起エネルギー移動法と表面プラズモン法を確立し、これらを用いて高分子LB膜の構造・物性評価を行い、これらの方法の有用性を示した。(2)ポリビニルカルバゾールとテトラシアノベンゼンを多孔性高分子吸着剤に共吸着させた試料を光イオン化させたとき、数時間以上の極めて長寿命のイオン種が生成することを見出した。その要因として、側鎖に沿った効率のよいホール移動と、その遠隔サイトでトラップ及び長距離電子移動による再結合によることを明らかにした。(3)種々の電子ドナー、電子アクセプター、及び光増感剤としてピレニル基を鎖上に分子設計配置したポリペプチドを合成し、光誘起電子移動の移動経路、距離依存性を検討した。またタンパク質の光機能化を図るために、ストレプトアビジンの83番目のチロシンを2-アントリルアラニンに変換した超タンパク質を作製した。(4)亜鉛テトラベンゾポルフィリン(ZnTTBP)を電子受容体とともにPMMAにドープした試料を、二光子励起による高励起三重項から電子移動反応させることにより、ソ-レ帯にPHBホールを形成することに成功した。またゾルゲル法で作成したZnTTBP/酸化チタン系について140Kの高温でPHBホールを形成することに成功した。(5)剛直でかさ高い疎水基シクロドデシル基を側鎖に有する両親媒性ポリスルホン酸ナトリウムは水溶液中において疎水基が分子内で自己組織化し、疎水性の束縛環境を作ることを見い出した。この高分子にごく少量の亜鉛テトラポルフィリンを共有結合すると、個室化束縛環境のもとで励起三重項の長寿命化や遅延蛍光の増加等の特異的な発光挙動や光化学挙動を示すことを見い出だした。(1)ポリメタクリル酸オクタデシルのLB膜の膜内における三重項励起エネルギー伝達の挙動を燐光測定により検討した結果、三重項エネルギー伝達の起こる約1nmの尺度においても二次元平面とみなせるほどにこのポリマーを用いると発色団位置を制御できること、平均発色団間距離が1.2nm以上のときエキシマー形成部位のないエネルギー移動系を調整できること、を明らかにした。(2)昨年度に報告した極めて長寿命のイオン種生成の要因を検討するため、PVCZよりバルキーな側鎖を有する高分子について調べ、深いトラップサイトの生成がカチオン形成サイトと吸着剤の極性基との静電的相互作用によることを認した。

また、ポーラスガラス吸着系の電荷再結合速度定数のエネルギーギャップ依存性は、定量的に溶液系と同じであり、媒体の再配合の寄与は小さく、比較的高い分子内振動によりその速度が律せられていることを明らかにした。(3)ピレニル(Py)基を結合したビオチンを蛋白質アビジンに結合させ、アビジン4量体中の16個のトリプトファンからPy基へのエネルギー移動を調べた結果、エネルギー移動効率はフェルスター理論から予想される値と大体一致し、Py基がビオチンと共にアビジンに結合していることを明らかにした。非天然アミノ酸であるアントリル(An)アラニンをtRNAに担持させ、それを細胞外蛋白質生合成系に導入する手法で、83番目にAn基を導入したストレプトアビジンを作製した。その蛍光励起スペクトルによりトリプトファンからAn基への蛋白質内エネルギー移動が確認され、An基が部位特異的に蛋白質に導入されていることを証明した。(4)S_1とS_2のエネルギーギャップが比較的大きい亜鉛テトラベンゾポルフィリン誘導体(ZnTTBP)をCHCl_3とともにPMMAにドープした試料を用い、二波長励起により高励起三重項から電子移動反応させることにより、ソ-レ帯にホール形成することに初めて成功した。ソ-レ帯のホール形成は同時にQバンドの非共鳴ホールを形成するが、これらの不均一吸収帯の共鳴周波数は強い相関をもっていることを明らかにした。(5)前年度に引き続き、両親媒性高分子電解質が水溶液中でつくる極めてコンパクトで硬いユニマ-ミセル中での亜鉛テトラフェニルポルフィリンの特異的な発光挙動を調べて、励起三重項状態が通常の10倍以上も超寿命になり、室温でも強い燐光と遅延蛍光を発することを見い出した。また著しく長寿命化した励起三重項ZnTPPとスルホニウム塩との間で光誘起電荷分離が効果的に起こり、生成したZnTPPカチオンラジカル種は束縛環境場による保護効果により異常に長時間生き残ることを見い出した。(1)発色団、カルバゾール基、アントラセン基を導入したポリペプチドを材料としてラングミュア・プロジェット(LB)膜を調製し、累積膜の昼間および層内の励起エネルギー伝達・移動について検討した。単層での層内励起エネルギー伝達・移動を定量的に評価するとともに、層の配列制御により層間で効率よくエネルギー移動を起こし得ることを明らかにした。またポリペプチドLB累積膜は少なくとも100°Cまでは熱的に安定であることを示した。(2)カルバゾール基を有する高分子および低分子化合物の非晶パルク固体フィルム中における光誘起電子移動過程を、ピコ秒からマイクロ秒時間域の過渡吸収と発光挙動を通して検討した。光励起により生成したイオン対の電荷再結合過程はホール移動過程と競争していること、電荷再結合を逃れたホールはアニオンとナノ秒からマイクロ秒時間域で再結合して消失すること、また再結合による発光が見られることを明らかにしている。(3)p-ニトロフェニルアラニンを種々の部位に導入したストレプトアビジンによるビオチン化ピレニルアラニンの蛍光消光を検討し、タンパク質中の電子移動の距離依存性が単純に距離だけの関数となることを見出した。また2-アントリルアラニン(antAla)を部位
中学校理科におけるバイオテクノロジーを利用した実験法と学習プランの開発

次の2つの目的で研究に取り組んだ。(1)地域の植物素材によるバイオテクノロジーを活用した実験法を活用し、植物のつくりやはたらき、生殖への理解を深めることができる。(2)地域の植物素材によるバイオテクノロジーを活用した学習プランを開発することで,実社会と実生活の関連を図り科学技術の重要性を認識し,科学技術の発展による持続可能な社会の実現に向けて体験を通して学ぶ。そのため、次のようにバイオテクノロジーを活用した実験法と学習プランを開発した。第1学年植物の世界「植物のはたらき光合成と呼吸」では、地域にある植物工場との連携授業や水耕栽培実験装置を通し、バイオテクノロジーが産業に結びついていることを学習するプランを開発した。第3学年「生物の生殖DNA」では、コシヒカリが福井県農業試験場の育種で開発されDNAを摘出し、DNAのバンドを観察する実験法を確立した。第3学年「科学技術と人間エネルギー資源の利用」バイオテクノロジーを利用して間伐等を廃棄せずに,バイオエタノール、バイオチップ、再生紙として利用している実例を学習し、実験を通してバイオテクノロジーの有用性を理解した。第3学年「自然と人間自然界のつりあい」では、自然界で生産者である植物,消費者である動物、分解者である菌類や細菌類の役割をバイオケミカルテスターで測定し、分解を理解する学習プランを開発した。実践研究を通して、「理科は日常生活に結びついている」との問いに対して実践前は58%であったが、実践後は95%へと向上した。「バイオテクノロジーの推進は科学技術の発展につながる」の問いに対しては83%、「バイオテクノロジーの推進は持続可能な社会を実現する」の問いに対しては92%、「バイオテクノロジーの推進は地域を活性化する」の問いに対しては85%の生徒が肯定的な考えを持っている。理科と日常生活や社会との強い結びつきを実感したり、バイオテクノロジーの推進への必要性が向上したり、地域活性への期待感が向上したりした。
筋強直性ジストロフィーにおけるCTGリピート不安定性の病態研究

本研究では筋強直性ジストロフィー1型(DM1)患者由来iPS細胞を用いて、原因となるDMPK遺伝子のCTGリピート伸長の解析を行った。成果としてDM1-iPS細胞におけるリピート伸長は未分化細胞維持培養時に顕著にみられ、分化誘導時にはあまり認めらないことが分かった。またDM1-iPS細胞から分化させた神経、心筋、骨格筋細胞において、患者で認められるのと同様のスプライシング異常が起きること、そしてDMPK遺伝子近傍にエピジェネティックな異常が存在することが明らかとなり、DM1患者由来iPS細胞が疾患モデルに有用であることが示された。本年度は、筋強直性ジストロフィー(DM1)患者3例からのiPS細胞各2クローン、計6クローンについて、継代維持培養、神経細胞、骨格筋細胞および心筋細胞への分化誘導培養を実施し、3段階の異なる継代数でそれぞれのゲノムDNAを回収し、精度の高いSmall pool PCR法(Sp-PCR法)にてCTGリピート数を解析した。まず継代維持培養時においては、すべてのクローンにおいて、約10継代ごとの継代数の増加とともにCTGリピート数のピーク値が増大する傾向が認められた。次に特定組織への分化誘導時については、元の未分化細胞と比較して、ほとんどCTGリピート数には変化がない事が明らかとなった。これは神経細胞、骨格筋細胞、心筋細胞のどの系譜においても同様であった。また継代数が増えれば、分化細胞でのCTGリピート数は増大する傾向が、未分化細胞と同様に認められた。以上の結果から、CTGリピート数の増大を決定づける因子は、特定組織への分化ではなく、細胞の増殖過程であることが強く示唆される。次に、網羅的遺伝子発現解析に移行する前の段階として、患者由来iPS細胞から分化させた組織細胞において、RNAのスプライシング異常が本当に起こっているかどうかを確認するため、既報で報告されているいくつかの遺伝子について、そのRNAスプライシングパターンをPCRにて健常iPS細胞由来組織と比較した。いくつかの遺伝子において、患者で報告されているのと同様のスプライシング以上を検出することに成功した。本年度は、筋強直性ジストロフィー(DM1)患者1例からのiPS細胞2クローンと、健常者由来iPS細胞2クローンについて、心筋細胞への分化時におけるエピジェネティックな変化を解析した。方法としては、計画書の段階ではCHIP-seqにてヒストン修飾を解析する予定であった。しかし当研究室で実験系の立ち上げを行ったが、ノイズが多く解析が困難を極めたため断念した。そこで代替案として、高次クロマチンの構造がヘテロクロマチンであるのかユークロマチンであるのかを解析するATAC-seqという研究手法を用いて、クロマチン構造を網羅的に解析した。まず得られたリード数のクオリティチェックにより、患者由来心筋の1クローンにおいて、十分なリード数が得られなかったためデータ解析は行わず、健常2クローンと患者1クローンの比較解析を行った。その結果、ユークロマチン状態を意味するATACピークの総数が、健常と比べ患者で約1/2となっていることが分かり、DM1患者由来細胞で遺伝子発現が全体に抑制されている可能性が示唆された。ピークが下がっている遺伝子領域は中胚葉発生や心臓の形成にかかわる遺伝子群が含まれ、CTGリピート伸長あるいはスプライシング異常が心筋文化に影響を及ぼす可能性が明らかとなった。さらにCTGリピート部位付近のゲノムにおけるクロマチン構造を詳細に解析すると、DMPK遺伝子のCTCF領域近傍およびSIX5のプロモーター領域でATACピークが有意に減弱していた。これらは既報においてゲノムDNAのメチル化促進が報告されている領域であり、DM1においてCTGリピート伸長そのものが近傍領域の転写抑制に関わる機構の存在が示唆された。当初の予定通り27年度以降に実施するエピゲノム解析を中心に実施し、ChiP-seqは断念したが代替のATACseqを実施することで、DM1患者由来心筋細胞でのクロマチン構造の異常という新しいフェノタイプを同定した。また網羅的遺伝子発現解析としてRNAseqも実施したが、3月末時点では解析が終了しておらず、リピート伸長に関わる因子の同定は28年度に行うこととした。本年度は、筋強直性ジストロフィー(DM1)患者1例からのiPS細胞2クローンと、健常者由来iPS細胞2クローンについて、それぞれ心筋細胞へ分化させRNAseqによる網羅的遺伝子発現解析を進めた。DM1細胞で特異的に5倍以上上昇する遺伝子として約300個を、1/5以下に発現が低下する遺伝子として約200個を同定したが、これまで報告のあるミスマッチ修復蛋白などリピート伸長に関連するような分子の同定には至らなかった。また前年度にエピジェネティックな異常が認められたDMPKおよびSix5について、アンチセンス鎖の発現量も含めて解析したが明確な差は認めず、エピジェネティックな異常が発現異常に直結しているわけではないという結果であった。リピート伸長と細胞分裂の関連を調べるため、Cell Traceによる分裂回数測定実験を行った。リピート伸長が認めらられたiPS細胞の維持培養中では1週間で平均8.9回の分裂であったのに対し、筋分化誘導では1週間で平均5.6回の細胞分裂回数であった。我々が評価したサンプルの分裂回数を試算すると、維持培養では約55回、筋分化誘導では約6回となる。このことからiPS細胞モデルにおけるリピート伸長は、細胞分裂時に起きていることが示唆された。期間全体を通して得られた成果としては、1)DM1-iPS細胞におけるリピート伸長は未分化細胞維持培養時に顕著にみられ、分化誘導時にはあまり認められないこと。2)またそれは細胞分裂回数と関連があること。