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枯草菌ＡＴＰ合成酵素の活性調節の包括的理解

また、阻害型の構造に固定した変異型酵素にLDAOを添加すると、活性化はほとんど見られず、野生型よりも低い活性を示した。すなわち、LDAOを添加した、ADP阻害の影響の小さい条件下では、εが阻害サブユニットとして機能していると言える。これらの結果をまとめた論文を執筆中である。この他、枯草菌ATP合成酵素のホロ酵素についても活性測定条件を検討し、基本的な測定を終えることができた。その結果、枯草菌ATP合成酵素においても、εへのATP結合に依存した脱共役状態が存在することが示唆された。これまでの研究から、枯草菌細胞膜上のATP合成酵素の量が少なく、ホロ酵素の生化学的な解析が困難であると考えられたため、大腸菌を宿主とした枯草菌ATP合成酵素の大量発現系を構築することとした。発現効率を上げるための変異や、タグの導入などを行った、オペロン全長を含むクローンの単離に時間がかかったが、ようやく発現プラスミドの作製に成功した。本プラスミドを大腸菌に導入し、大腸菌細胞膜上で枯草菌ATP合成酵素が機能的に発現することを確認した。単離した反転膜のSDS-PAGEにより、BF1のα、βサブユニットのバンドを確認することができた。しかしながら、得られた大腸菌反転膜小胞に含まれる枯草菌ATP合成酵素の活性は、枯草菌反転膜と比較しても低かった。タンパク質量が多いにもかかわらず、活性が低かった事から、発現条件が悪く、不完全な形の複合体が多く含まれているものと考えられた。宿主大腸菌の種類、培養条件、集菌のタイミング等を検討した結果、比較的活性の高い状態で、発現する条件を見出す事ができた。現在この条件で調製した枯草菌ATP合成酵素の基本的な性質を調べている。枯草菌由来のものと同様の性質を持つことが確認できたら、枯草菌ATP合成酵素を大量調製し、生化学的な実験を行う予定である。この他、枯草菌F1-ATPaseのDELSEED領域とεサブユニットによる調節の関係の解析を行った。本年度は、作製に成功した枯草菌ATP合成酵素の大腸菌を宿主とした大量発現系を用い、その生化学的な解析を行った。発現系由来の反転膜は枯草菌ATP合成酵素の含有量が多く、枯草菌反転膜を用いた場合には測定が困難であった低基質濃度での活性測定などを行うことができた。その結果、枯草菌ATP合成酵素においても、好熱菌ATP合成酵素で観察されているATP加水分解とプロトン輸送の脱共役が起こることが分かった。また、細胞内ATP濃度センサータンパク質を組み込んだ枯草菌株の作製、観察、細胞内ATP濃度センサータンパク質への応用が期待できる、ATP結合能の高いATP合成酵素εサブユニット変異体の作製にも成功した。この他、ATP合成酵素の活性調節の生理的意義を解明するために、ATP合成酵素εサブユニットの、活性調節能を失った変異株と野生株での生育を比較する実験を行った。その結果、これらの株の生育に差が見られる条件を見出すことに成功した。本研究の研究期間全体を通じて、枯草菌F1-ATPaseの基本的な生化学的性質の解析、枯草菌F1-ATPaseのε
頚部リンパ節転移における微小循環系の血流動態の実験的解析研究

12年度に担癌ウサギを用い、頸部リンパ節の転移過程の観察をおこなった。本年度は、とくに炎症性および転移性リンパ節の鑑別に注目し以下の結果を得た。1)超音波ドップラ法による頸部リンパ節の経時的変化の把握(白色家兎を使用)VX2癌細胞および炎症惹起物質の口底部への注入により頸部に転移性および炎症性リンパ節腫脹を起こした。転移リンパ節は、一過性に樹枝状の豊富な血管が描出されたのち、血流欠損部位の出現、増大を認め、最終的には全体が無信号となった。リンパ門の血流速は、一過性に増加するものの、腫瘍の増大により急激に減少するといった層性の変化を呈した。炎症性リンパ節に関しては、樹枝状の豊富な血管が描出され、血流欠損部位は認めなかった。リンパ門部の血流速も増大・急激減少といった二層性の変化は認めなかった。しかしながら転移性、炎症性にかかわらず一過性に血流速の増大を認めるため、とくに早期での血流動態解析における転移・非転移の鑑別は困難と考えられた。血流欠損部位の早期発見が、微少転移検出に有効であると考えられた。以上の結果より臨床応用を検討した。2)術前照射前後の血管描出面積の変化による転移・非転移の検討(臨床応用)微少転移発見の為に、術前照射による描出される血管構築の変化を検討した。正常な血管構造をもつ非転移リンパ節では、照射により血管径の増大、血流速の増大により、描出血管の面積が増大した。一方血管の破綻をきたした転移リンパ節は、血流信号の増大を認めなかった。微少転移巣を有するリンパ節に関しては、照射後は、周囲正常リンパ組織のドップラ信号が増強されるのに対して、腫瘍塊の部位は無信号として描出され、血流欠損部位の同定が容易となった。このような結果から20Gy30Gy程度の照射による末梢血管構築の描出改善より早期の微少転移の発見が可能となった。本研究の初年度(12年度)の成果は以下の通りである。VX2癌細胞を白色家ウサギ(15匹)の顎下腺または口腔底に移植した。1週間おきに頸部リンパ節内に描出される血管の形態的変化を観察した。病理的に転移と確認されたリンパ節に関しては、転移初期には描出される血管が増加し、樹枝状に描出された。時間の経過と共に血流の欠損部位が出現しついにはリンパ節全体を占めるようになった。また血流欠損部位の出現とともにリンパ節周囲に血管が出現する傾向にあった。一般にhilumといわれるリンパ門での血流速を測定した。転移初期では、一過性にリンパ門部からの血流速の増大をみとめ、時間の経過とともに減少することが解明された。血管構造と血流動態の変化をあわせて判断すると、転移初期は正常なリンパ門部からの血流の増加を認めるのに対し、転移巣がリンパ節内で増大すると血管の破綻、圧迫などにより既存の血管(リンパ門からの血液供給)が低下し、周囲から被膜をとおして分布する微細な血管が、主なる血液供給のルートとなることが想定された。3.白色家ウサギの頸部の固定装置の作成白色家ウサギの頸部に対する超音波(特にDoppler法)を行う際は、麻酔下での長時間の固定が必要なため、専用の固定器具の作成が必要である。そこで、安全かつ効率よく超音波検査を行うための白色家ウサギの頸部専用の固定器具の設計および作成を行った。
中国移植ツーリズムに関する社会調査の実施とそれに基づくＥＬＳＩの検討

中国で臓器移植を受けた日本人患者へのアンケート調査及び聞き取り調査を踏まえて、倫理的、法的、社会的視点から以下のような考察を行った。平成24年度(第2年度)は予定通り社会調査(アンケート調査及び聞き取り調査)を実施した。具体的には、まず第一に、平成23年度(初年度)に札幌市の腎臓移植医を通じて発掘していた北海道在住の患者さん(10人)を対象に平成24年4月、アンケート調査を実施した(全員から回答あり)。そのうち5人には聞き取り調査を行った。3月末日までの段階(15人分)のアンケート調査結果の概要(重要部分のみ)は下記の通りである。腎臓はうまく機能していますか、という問いに86%の人がYESと答えている。中国の移植技術の水準については79%の人が高いと思うと答えている。現地の医師や看護師は好意的であったか、との問いには93%の人がYESと答えている。ドナーが死刑囚であることの説明を受けたか、との問いには64%の人がNOと答えている。中国で移植を受けることに葛藤や迷いがあったか、との問いには53%の人がNOと答えている。中国で移植を受けたことを後悔しているか、との問いには80%の人がNOと答えている。臓器提供者、医師、海外渡航移植援助業者に感謝しているか、との問いには、それぞれ、86%、100%、100%の人がYESと答えている。聞き取り調査に関しては、札幌、高知、岡山、大阪、静岡などに在住する患者さんに面会して詳細な情報を得た。彼らからは、自己の行為は間違っていないとする心情等が読み取れた。ほか、平成25年3月下旬、海外渡航移植援助業者を通じて30人の患者アンケートを発送した(5月現在、6名から回答を得ている)。なお、同じく3月下旬、本調査についてNHKのインタビューを受けた(4月5日ほか放映済み[中国地方のみ])。平成25年度(最終年度)は予定通り社会調査(アンケート調査及び聞き取り調査)を実施した。具体的には、前年度末(平成25年3月下旬)に海外渡航移植援助業者の助力を得て30人にアンケートを発送していたが、回答率が20%にとどまっていたので、再度、未回答だった人を含めて40人にアンケートを送付した。そのうち15人から回答を得た。平成26年年3月末日までの段階(計41人分)のアンケート調査結果の概要(重要部分のみ)は下記の通りである。腎臓はうまく機能しているか、という問いに92%の人がYESと答えている。移植結果に満足しているか、という問いに91%の人がYESと答えている。中国の移植技術の水準については82%の人が高いと思うと答えている。現地の医師や看護師は好意的であったか、との問いには88%の人がYESと答えている。ドナーが死刑囚であることの説明を受けたか、との問いには54%の人がNOと答えている。中国で移植を受けることに葛藤や迷いがあったか、との問いには58%の人がYESと答えている。中国で移植を受けたことを後悔しているか、との問いには88%の人がNOと答えている。帰国後に、中国で移植を受けたことを理由に診療拒否をされた経験があるか、との問いには41%の人がYESと答えている。聞き取り調査に関しては、浜松に在住する患者さんに面会して詳細な情報を得た。彼は、「つらい透析で生きるより、刑務所に入ってもよいから中国で移植を受けようと思った(そして、現に受けた)」と語った。中国現地調査も実施し(2回)、現地の患者担当医や手術医などから貴重な情報を得た。なお、平成25年4月、NHKが本調査についての番組を制作した(4月5日ほか放映[25分間、「現場に立つ」、「フェイス」ほか(中国地方のみ)])。本研究の目的は、日本人の中国渡航移植患者に対する社会調査(アンケート調査及び聞き取り調査)を実施することによって中国への日本人患者の移植ツーリズムの実態を明らかにし、その上で、調査結果に基づいて、中国移植ツーリズムに関して具体的にどのような倫理的、法的及び社会的問題が存在するかを明らかにすることである。さらには、本研究はそれらの問題解決への処方箋を用意することも目的とする。平成23年度(初年度)は、「平成23年度科学研究費助成事業(学術研究助成基金助成金)交付申請書」(平成23年5月25日提出)に記した研究実施計画通りに進行した。すなわち、まず第一に、研究代表者である粟屋剛、研究分担者である大林雅之、同じく研究分担者である小河達之、連携研究者である高木美也子が、活動方針を決定した。第二に、各種情報をもとに社会調査(アンケート調査及び聞き取り調査)の対象者、すなわち中国渡航移植患者の発掘を、部分的にではあるが、行った。具体的には、札幌市の腎臓移植医を通して約10人の患者を発掘した(3月4月アンケート実施済み、5月聞き取り調査予定)。さらには、3月下旬、現在、全国に70あまりの病院を経営するグループの理事長に面会し、調査協力につき快諾を得た。ただ、移植患者関係の団体からは協力を断られた。第三に、岡山大学大学院医歯薬学総合研究科の倫理審査委員会に倫理審査を申請し、承認を得た。

以上のように、本研究はこれまでのところ順調に進行している。当初の予定通り本研究のために時間、労力、資金(=科研費)等を投入したため、また、とくに研究の進行を妨げるような事態も発生しなかったため、順調に進展した。平成25年度は、調査を継続するとともに、結果の分析(統計学的解析)を行う。その上で、中国移植ツーリズムにまつわるELSI(倫理的、法的、社会的問題)を抽出し、それらへの対応策を検討する。平成24年度は研究支援者(調査等補助者)の協力を得て、実際に社会調査(アンケート調査及び聞き取り調査)を実施する。ここでは患者のプライバシー及び個人情報の保護に最大限の配慮を行う。そして、統計学的解析を行う。ほか、岡山生命倫理研究会で、中間報告の形でミニ・シンポジウムを開催する。ここでは、これまでの研究成果を披露し、参加者からの批判を仰ぐ。そして、それを今後の考察(分析)に役立たせる。研究費使用に関しては、平成25年度は24年度と同様、調査実施のために実際に日本各地の患者さんに会うことになるので、科研代表者、分担者、連携研究者、研究支援者等の旅費、宿泊費支出が主要なものとなる。研究費使用に関しては、平成24年度は調査実施のために実際に日本各地の患者に会うことになるので、科研代表者、分担者、連携研究者、研究支援者等の旅費、宿泊費支出が主要なものとなる。なお、平成23年度予算のうち、77,725円の繰越金が生じた理由は、当初予定していた中国の調査が先方の都合により中止になったためである。これについては、24年度に再度実施する予定である。
限定されたアミノ酸からなるランダム配列タンパク質の機能探索

本研究では、独自の試験管内選択技術であるin vitro virus (IVV)法を用いて、「原始的」アミノ酸を含む、限定された数種類のアミノ酸からなる大規模なランダム配列タンパク質ライブラリーを構築し、その中から機能や構造をもつ配列の探索を行う。これにより、タンパク質や遺伝暗号の初期進化の可能性に関する「実験進化学」的アプローチを試みるとともに、「20種類よりも少ないアミノ酸からなる限定された配列空間を探索する」というアイデアが、新しい機能タンパク質の効率的な探索法として有効か否か検証することを目的とする。ランダム配列として、コドンの2文字目と3文字目の塩基をN(4種類の塩基の混合)とし、コドンの1文字目の塩基をGまたはAに限定した合成DNAを用いて、12種類のアミノ酸からなるランダム配列を設計した。コントロールとして、コドンの1文字目の塩基もNとした20種類すべてのアミノ酸からなるランダム配列も準備した。SH3ドメインの約半分をこれらのランダム配列で置換したライブラリーをそれぞれ作製し、SH3ドメインの基質ペプチドへの結合能を指標として試験管内選択を行った。その結果、アミノ酸の種類を限定した場合と20種類すべてを用いた場合とで、いずれもスクリーニングの3ラウンド目で結合能をもつ配列の濃縮が確認されたことから、2つのライブラリーはアミノ酸の種類に関わらずほぼ同程度の機能配列を含んでいることが示唆された。現在、得られたタンパク質を大量発現・精製して、アミノ酸の種類によって結合能以外の物性に違いがあるか詳細に検討中である。本研究では、タンパク質や遺伝暗号の初期進化の可能性に関する「実験進化学」的アプローチを試みるとともに、「20種類よりも少ないアミノ酸からなる限定された配列空間を探索する」というアイデアが、新しい機能タンパク質の効率的な探索法として有効か否か検証することを目的とする。まず、コドンの2文字目と3文字目の塩基をN(4種類の塩基の混合)とし、コドンの1文字目の塩基をGまたはAに限定した合成DNAを用いて、12種類のアミノ酸からなるランダム配列ライブラリーを作製した。このとき、ランダム配列の下流に付加したFLAGタグを利用して、mRNAディスプレイ法によるプレセレクションにより、ランダム配列ライブラリーから終止コドンを含む配列を除去した。このランダム配列DNAライブラリーからmRNAディスプレイ法により1012種類の配列を含むタンパク質-mRNA連結分子ライブラリーを作製し、ビーズに固定した低分子化合物に結合するタンパク質を試験管内選択した後、逆転写PCRにより遺伝子を増幅し、次のサイクルの鋳型とした。この試験管内選択のサイクルを数回繰り返したが、標的分子に特異的に結合するランダム配列タンパク質遺伝子の濃縮は見られなかった。そこで、次善の策として、天然の機能ドメインの約半分を上記ランダム配列カセットで置換したライブラリーを作製し、元の標的分子への結合能をもつタンパク質の試験管内選択を行った。その結果、アミノ酸の種類を限定した場合と20種類すべてを用いた場合とで、ほぼ同程度の機能配列を含んでいることが示唆された。
アンチリジンを含む元素ブロックを用いる機能性超分子ポリマーの創製

分子間で働く非共有結合性相互作用により形成される超分子ポリマーは、熱力学的に最も安定な構造を選択的且つ自己組織化的に形成できる。複数の相互作用を含む超分子ポリマーに関する研究は非常に限られている。本研究では、お互いに影響しあわない複数の分子間相互作用(水素結合、πスタッキング)を持つ超分子ポリマーの創製を目的とし、アンチリジン骨格を含む元素ブロック分子1を設計した。昨年度は、1の分光学的性質、分子間相互作用形成を明らかにした。本年度は、1を用いた超分子ポリマーの形成、1の問題点の改善に向けた分子設計・合成について検討した。1.1を用いた超分子ポリマーの形成1と水素結合ドナー部位を2個持つ分子2による会合体形成について検討した。1と2を1:1で混合し、動的光散乱(DLS)測定を行ったところ、大きな粒径(d 10^3 nm)を持つ粒子の生成が観測された。これは、予期された粒子径よりも非常に大きく、最初に生成した会合体がさらに二次的会合を起こしていると考えられる。この溶液に1とπスタッキングを形成可能な4を添加した結果、粒径が非常に小さくなった。これは、4の添加による解会合を示唆している。1の低溶解性のため、会合体の構造についての解析は困難であった。2.元素ブロック1の再設計および合成、会合挙動1の低溶解性が研究の進展の妨げとなったため、1に対する置換基の導入による溶解性の向上を図った。その結果、Ph基を導入した10の合成に成功した。10はCHCl3やTHFに良好な溶解性を示した。10の会合体形成について検討した結果、10は水素結合、πスタックともに形成可能であり、比較的大きな会合定数を示した。10と両末端に水素結合部位および芳香環部位を有する分子を用いて超分子ポリマーの形成について検討したところ、DLS測定によって大きな粒子径を持つ会合体の形成が明らかになった。27年度が最終年度であるため、記入しない。平成25年度は、1,9,10-アンチリジンの構造を含むorthogonal相互作用が可能な元素ブロックの合成と、分光学的性質、特に発光特性について検討を行った。目的とする元素ブロックを合成するために、ジベンゾアンチリジン(dbanth)のジクロロ体、dbanth-Cl2の合成を行った。dbanth-Cl2は、2-ブロモ-4-クロロトルエンを出発源料とし、5段階の過程で得られた。次に、dbanth-Cl2に対してフッ素置換芳香環の導入を試みたが、反応がほとんど進行せず、当初目的としていた化合物は得られなかった。そこで、広いπ系を持ち、目的とするπ-πスタッキングの形成に有利であると考えられるアントラセンを置換基として導入することを考えた。dnath-Cl2に対して9ーアントラセニルボロン酸をPd触媒によるクロスカップリング法により導入することにより、Tweezers型の元素ブロック1を合成することに成功した。1は溶解性が低く、1,1,2,2-テトラクロロエタン(TCE)にのみ良好な溶解性を示した。1の発光スペクトルを測定したところ、濃度依存性があることがわかり、2.0×10^-5 Mよりも濃い条件ではエキシマー発光を示すと考えられる。1とヘキサフルオロベンゼン(2)およびトリニトロフルオレノン(3)との会合について紫外可視吸収スペクトルによる観測を行った。その結果、416 nmに新しい吸収が出現した。この現象についてさらなる実験を行なったが、再現性に乏しく、その原因については現在のところ明らかにできていない。一方、水素結合ドナー分子の合成を同時に行った。三重の水素結合を形成できる分子として、2,6-ビス(ヒドロキシメチル)-4-メチルフェノール(4)および1,8-ビス(3,5-ビス(ヒドロキシメチル)-4-ヒドロキシフェニル)オクタン(5)をそれぞれ合成した。

10はCHCl3やTHFに良好な溶解性を示した。10の会合体形成について検討した結果、10は水素結合、πスタックともに形成可能であり、比較的大きな会合定数を示した。10と両末端に水素結合部位および芳香環部位を有する分子を用いて超分子ポリマーの形成について検討したところ、DLS測定によって大きな粒子径を持つ会合体の形成が明らかになった。平成25年度は、アンチリジン誘導体の合成および分光学性質の解明、水素結合・π-πスタッキングの形成能について検討を行う予定であった。目的とするアンチリジン含有元素ブロックの原料であるdbanth-Cl2は、5段階の過程を経て合成する。本化合物合成における各段階の反応条件の最適化にやや手間取り、目的物を得るために相当の時間を費やした。当初計画していたアンチリジン誘導体は、2個のジベンゾアンチリジンユニットを2個の架橋芳香環で結合した環状分子を想定していた。しかしながら、フルオロ置換芳香族化合物とのクロスカップリング反応が上手く進行しないことが明らかになった。そこで、目的とするorthogonal相互作用を発現でき、かつ合成可能な分子としてTweezers型分子の合成を行うこととし、π-π相互作用を形成する部位のユニットとしてアントラセンを用いることとした。目的物である化合物1の合成に成功したが、溶媒に対する溶解性が悪いという問題が残存した。TCEに対して溶解することがわかったため、各種測定を行うことができたが、必ずしも充分とは言えず、新たな分子設計が必要であると考えられる。1と2および3との反応によって紫外可視吸収スペクトルにおいて416 nmに新しい吸収が出現したことに関して、1と芳香族化合物の間に新しい相互作用が生じていると考え、検討を行ったが、上記のとおり再現性に乏しく、現時点では本事項については考慮に入れず研究を進行することとした。27年度が最終年度であるため、記入しない。アンチリジン誘導体の溶解性の向上を図る。平成25年度の研究によって、アンチリジン骨格を含む元素ブロック分子1が興味深い発光特性を示すこと、π-πスタッキングが可能であることを明らかにできた。しかしながら、溶解性の問題から、水素結合形成、π-πスタッキング形成に関する詳細な検討は出来ておらず、目的とするorthogonal超分子ポリマーの構築は困難であると予想される。そこで、今後の方策として、アンチリジンユニットに対する置換基の導入により、溶解性の向上を目指す。ピリジン環はイミン窒素に隣接した炭素に対してアルキルリチウムなどの試薬を使うことにより置換基を導入できることが知られていることから、この方法を応用することにより溶解性を持ったアンチリジン誘導体の合成を行う。合成した置換基を持つアンチリジン誘導体について、各種スペクトル測定により化学的性質を明らかにする。さらに、π-πスタッキングの形成について、核磁気共鳴および紫外可視吸収スペクトルによる測定を行い、上記1との相違について明らかにする。水素結合形成のためのドナー分子4および5の合成に成功しているので、これらの分子とアンチリジン誘導体との水素結合形成能について、核磁気共鳴スペクトルを用いた検討を行い、会合の強さを明らかにする。
麻酔薬の動脈硬化予防作用の臨床応用を目指した研究-麻酔薬の新たなる作用の検討-

近年、虚血性心疾患の合併症をもつ患者の手術件数は増加の一途をたどっている。これらの予防に血管平滑筋増殖を抑制することがこれらの発生予防につながり種々の対策が模索されている。一方、麻酔薬は手術に広く使用されているにもかかわらず、現在まで麻酔薬の動脈平滑筋の増殖に与える影響については良く知られていない。申請者らは現在までに静脈性麻酔薬ケタミンは細胞内cAMPの上昇を介して細胞増殖を抑制するという麻酔薬の新たな作用を見いだした。この麻酔薬の細胞増殖抑制作用は血管平滑筋増殖にも大きな影響を及ぼしているだろうと考えられるが、短期的、長期的にも血管平滑筋への作用を検討した報告はない。今回申請者らは血管平滑筋細胞の増殖機能にどのように麻酔薬が作用するか検討する目的で、培養ヒト冠動脈、大動脈平滑筋細胞を用いて、1.静脈性麻酔薬が培養ヒト大動脈平滑筋細胞の増殖にどのように作用するかを[^3H]-thymidineの取り込みおよび細胞数の増加を解析した結果、ケタミンが培養ヒト大動脈平滑筋細胞への[^3H]-thymidineの取り込みおよび細胞数の増加を抑制した。3.さらに、ラットを用いてバルーンカテーテルによる血管障害性動脈硬化を作り、ケタミン投与がその増殖を病理学的にも抑制していることを確認した。以上の研究で本研究の目的を達成したと考えられる。現在は、先天的に動脈硬化を容易に起こす動脈硬化モデルマウスを用いて、長期間経口により投与し、病理学的に麻酔薬の持続低量投与が細胞増殖を抑えて動脈硬化を予防しえるか検討し、培養ガン細胞に対しても増殖抑制作用があるのかもスクリーニングを行っており、本研究により麻酔薬の生活習慣病予防につながる新たな作用が今後発見される可能性が示唆された。麻酔薬は手術に広く使用されているにもかかわらず、現在まで麻酔薬の動脈平滑筋の増殖に与える影響については良く知られていない。現在までに申請者らは血管平滑筋と似た性質を持つラット腎メサンギウム細胞を用いた研究において、静脈性麻酔薬ケタミンは細胞内cAMPの上昇を介して細胞増殖を抑制するという麻酔薬の新たな作用を見いだした。そこで今回申請者らは麻酔薬の細胞増殖抑制作用を動脈硬化の予防に効果があるのではないかということを思いついた。本年度は血管平滑筋細胞の増殖機能にどのように麻酔薬が作用するか検討する目的で、培養ヒト冠動脈、大動脈平滑筋細胞を用いて、臨床で麻酔や疼痛管理に広く使用されているケタミンなどの静脈性麻酔薬が培養ヒト大動脈平滑筋細胞の増殖にどのように作用するかを[^3H]-thymidineの取り込みおよび細胞数の増加を測定することにより解析した。その結果ケタミンは有意に[^3H]-thymidineの取り込みおよび細胞数の増加を抑制した。これらの反応の機序を探る上で各種細胞内燐酸化酵素の阻害薬存在下で麻酔薬がどのように培養ヒト動脈平滑筋細胞の増殖に作用するかを検討し、これらの反応にPKCが関与していることが明らかとなった。さらに、ラットを用いて大動脈にカテーテルを挿入し、血管障害性動脈硬化を作り、麻酔薬の短期間投与が血管平滑筋の増殖に影響しているのかを確認したが、病理学的にも動脈硬化を抑制していることがあきらかとなった。今後はまた、先天的に動脈硬化を容易に起こす動脈硬化モデルマウスを用いて、長期間経口により投与し、病理学的に麻酔薬の持続低量投与が細胞増殖を抑えて動脈硬化を予防しえるか検討する。最後に種々の臓器由来の培養ガン細胞に対しても増殖抑制作用があるのかもスクリーニングする。

現在は、先天的に動脈硬化を容易に起こす動脈硬化モデルマウスを用いて、長期間経口により投与し、病理学的に麻酔薬の持続低量投与が細胞増殖を抑えて動脈硬化を予防しえるか検討し、培養ガン細胞に対しても増殖抑制作用があるのかもスクリーニングを行っており、本研究により麻酔薬の生活習慣病予防につながる新たな作用が今後発見される可能性が示唆された。
災害看護における倫理的課題の可視化と対応能力向上のための教育プログラムの開発

国内外の絶え間ない災害発生に伴い、近年では倫理的観念をもった質の高い災害支援が求められるようになっており、災害看護もその一つである。災害が発生した現場は、医療資源の不足はもとより、日常とは異なる悪条件の下、公平性や公正さの判断に戸惑う倫理的ジレンマを経験する。本研究は、災害という特殊な状況下であっても適正な看護を提供すべく、現場で発生している看護上の倫理的課題を明らかにし、その課題に対応できる能力を備えた人材育成のための教育プログラムを開発するものである。
高齢者介護施設において普通食が摂取可能になるまでのプログラム開発

本研究では、アセスメントと介入の視点と身体状況と介入経過の関連を明らかにし、介入に必要な具体的な技術を明らかにすることを目的として、研究1:高齢者の食形態を普通食へと回復させるためのケアの方略の抽出、及び、研究2:摂食・嚥下障害を対象とした食形態改善プログラム開発のための事例研究を行った。研究1:5名の研究協力者に、食形態が普通食へ回復した経験についてインタビューを行った。インタビュー内容を分析し、高齢者の食形態を普通食へと回復させるためのケアの方略として14のケアの方略を抽出した。研究2:4名の研究協力者に、食事場面の参加観察と食事場面に関するインタビューを行った。研究1から抽出した14のケアのカテゴリーを参考にしながら参加観察とインタビュー内容を分析した。食形態改善プログラムの時機として、1)普段から行っておくこと、2)食事前の準備、3)食事中の援助、の3つに分けられた。ケアの方略は、1)【クライエントを理解する】【全身状態を整える】【身体機能の向上】【家族との連携】、2)【食べる体勢を整える】【食欲や意欲を引き出す】【食事への準備性を高める】【クライエントの気持ちを理解する】、3)【食形態を調整する】【食事の状況を把握する】【食べることが嫌にならない援助】【クライエントのペースに合わせる】【恥をかかせない】【日常会話を楽しむ】【食べたという満足感を味わってもらう】【援助内容の見直し】【積極的に口腔ケアを行う】【多職種の役割を明確にした連携】の時機に行われていた。普通食を食べることを支援するためには、食べる場面以外での多くの援助が必要であり、出来るだけクライエントの希望や好みに添うことを優先し、クライエントが主役となって食事を行えるよう援助することが重要である。また、身体面だけでなく、精神面や社会面など多方面から「食べる」を援助していくことが重要だと考えられた。
ミレニアム開発目標がアフリカ諸国の教育政策に内部化されるプロセスの比較研究

1990年代に国際的に合意された、発展途上国の社会・経済的開発のための一連の目標を「ミレニアム開発目標」という。そのなかで、教育に関連する目標・指標群を「万人のための教育(Education for All:EFA)」と呼ぶ。本研究は、国際的に合意されたEFAによって、各国の教育政策が一定の方向に基準化されていくグローバルな動きのなかで、援助を受ける途上国が、既存の教育制度や国内の教育需要を鑑みつつ、国際的な目標や指標をどのように取り入れ、自らのものとしているかを分析することを目指している。外部からの影響を内部化するプロセスは、国によって異なるため、本研究では、事例調査を重視する。アフリカ諸国は、他地域よりも一般的にEFAの影響が強いとされるが、ここでは、特に日本とのかかわりの深いタンザニア、ケニア、そして、近年、急激に教育セクターへの援助が増加しているエチオピアを取り上げる。事例研究に基づき、政策科学・比較教育学の手法により、国際的モデルの適応過程を把握し、より適切な教育協力の方法を模索することを目的とした。科研費調査としての最終年度に当たった平成19年度は、3カ国の調査・分析の結果を共有するとともに、比較に基づく政策提言、モデル構築を行なった。具体的には、平成19年10月に英国オックスフォードで行なわれた学会で、アフリカ側の共同研究者とともに発表を行なったほか、論文集の刊行(印刷版とWeb版)、研究成果に基づく政策提言シンポジウムを行なった。本研究は、東アフリカ3ヵ国(ケニア、タンザニア、エチオピア)の研究者とともに、教育セクターの開発目標として国際社会で合意、採択されているEducation for All(EFA)が、途上国の教育政策に実際に取り込まれ、内部化されていく過程において、どのような変容、適応を果たしているかを国ごとに比較分析することを目的としている。平成17年度は初年度であったため、まず、3ヵ国比較調査の基礎として、調査フレームワーク、調査課題、インタビューの質問リストなどを3ヵ国の研究者と詳細に議論し、共有化を図った。予算の制約もあり、今年度はケニアでの調査を中心に行い、タンザニア、エチオピアでは、試行的にインタビューを行い、本調査は次年度以降に持ち越すこととした。ケニアで行ったインタビュー調査では、「万人に教育を与える」という発想自体は新しくない、という発言が多く聞かれた。本調査では、そのように元来その国にある「万人のための教育」理念に、EFA開発目標がどのように当てはめられるのか、教育政策や実施の変容がどの程度外生的要因によってもたらされ、どの程度固有の制度や文化、歴史によって既定されるのかを分析している。調査の結果、Education for allという概念自体は新しくないが、達成目標を設定して、達成度の測定を行って国際的評価がなされること、これまでと違う資金援助方法が持ち込まれたことがEFAの新しさだという反応が多かった。しかし、EFA開発目標の達成度を報告書に纏めたり、援助機関の資金援助の受け入れ窓口になっている人々は教育省の中でも一部で、それ以外の人々にとって、教育行政の実施は、EFA開発目標導入前と後で大きな違いはないとの声も聞かれた。来年度以降は、分析の精緻化を図るとともに、調査結果を発表していくことも積極的に検討したい。本研究は、東アフリカ3ヵ国(ケニア、タンザニア、エチオピア)を中心に、教育セクターの開発目標として国際社会で合意、採択されているEducation for All(EFA)が、アフリカ諸国の教育政策に実際に取り込まれ、内部化されていく過程において、どのような変容、適応を果たしているかを国ごとに比較分析することを目的としている。平成18年度は、事例3力国で具体的な調査を行ったほか、インタビューデータを解析し、その結果を共同研究者とともに共有し、比較研究を行った。インタビュー調査では、「万人に教育を与える」という発想自体は新しくない、という発言が多く聞かれた。来年度は、研究成果を英文報告書として取りまとめるとともに、学会発表やワークショップなども実施し、研究成果の普及に努める予定である。

アフリカ諸国は、他地域よりも一般的にEFAの影響が強いとされるが、ここでは、特に日本とのかかわりの深いタンザニア、ケニア、そして、近年、急激に教育セクターへの援助が増加しているエチオピアを取り上げる。事例研究に基づき、政策科学・比較教育学の手法により、国際的モデルの適応過程を把握し、より適切な教育協力の方法を模索することを目的とした。科研費調査としての最終年度に当たった平成19年度は、3カ国の調査・分析の結果を共有するとともに、比較に基づく政策提言、モデル構築を行なった。具体的には、平成19年10月に英国オックスフォードで行なわれた学会で、アフリカ側の共同研究者とともに発表を行なったほか、論文集の刊行(印刷版とWeb版)、研究成果に基づく政策提言シンポジウムを行なった。
無症候性頚動脈狭窄症における認知機能障害の治療効果に関する前向き研究

無症候性頚動脈狭窄症(狭窄率81.8±9.6%)の105例(男93例、70.6±6.2歳)において認知機能を評価した.WAIS-R2下位検査、JARTでは機能低下が認められなかったが、RBANS対WAIS-R2下位検査、JARTのディスクレパンシー分析の結果、90%以上の症例において即時記憶、視空間・構成、言語、注意、遅延記憶、総指標のうち最低一項目以上の低下が認められた.頚動脈ステント治療を施行した60例ではRBANSのすべての項目において術後に有意な改善が認められた.Fazekas分類を検討した結果、深部白質病変が軽度であることが術後に改善する条件であることが示された.2014年4月から無症候性高度頚動脈狭窄症例の前向き登録を開始しており、症例数は20例を超えている.こられの症例については研究実施計画の通りRBANS、JART、WAIS-R2下位検査による高次脳機能評価を実施するとともに、頚動脈エコー、CTA、脳血流SPECT、プラークMRI、脳MRIの評価も施行している.これに2004年から2013年の間に高次脳機能評価を施行した過去の症例を加え、総数103症例について分析を行っている.またこの症例の中で頚動脈ステント留置術(CAS)を施行した症例については研究実施計画の通り、術後1週間、3ヶ月、6ヶ月、1年の各時期においてRBANSによる再評価を実施している.平成26年度はこれらの症例についてRBANS、JART、WAIS-R2下位検査を用いたディスクレパンシー分析をおこなった結果、無症候性高度頚動脈狭窄症例ではRBANSの各尺度において次のような高次機能低下が認められた;即時記憶の低下症例67%、視空間構成の低下例21%、言語機能低下例44%、注意低下例64%、遅延記憶低下例59%、総指標低下例69%.またこの103例の中でRBANSのどの尺度も低下していない症例はわずか8%であった.よって無症候性頚動脈狭窄症の症例にはある程度の認知機能障害が存在することが明らかとなった.この結果は「研究発表、平成26年度研究成果」欄に記載学会にて発表した.2014年4月から無症候性高度頚動脈狭窄症例の前向き登録を開始しており、症例数は30例を超えている。こられの症例については研究実施計画の通りRBANS、JART、WAIS-R2下位検査による高次脳機能評価を実施するとともに、頚動脈エコー、CTA、脳神経外科血流SPECT、プラークMRI、脳MRIの評価も施行している。平成27年はこれまでに頚動脈ステント留置術(CAS)を施行した118例(症候性59例、無症候性59例)の頚動脈狭窄症例における、術前と術後の高次脳機能を評価、検討した。術前におけるRBANS、JART、WAIS-R2下位検査を用いたディスクレパンシー分析の結果、高度頚動脈狭窄症例ではRBANS各尺度において次のような高次機能低下が認められた;即時記憶の低下症例60%、視空間構成の低下例25%、言語機能低下例47%、注意低下例70%、遅延記憶低下例57%、総指標低下例76%。これに対し、CAS術後に5%有意水準を越えて回復を示した症例の率は、即時記憶で63%、視空間構成で65%、言語機能で42%、注意で40%、遅延記憶で69%、総指標で52%であった。結論として、頚動脈狭窄症ではわずかな高次脳機能低下を伴い、CASを施行することでそれが改善することを示唆していると考えられた。この結果は「研究発表、平成27年度研究成果」欄に記載学会にて発表した。前向き登録症例は30例を越えており、またこれに過去の症例を加えた総数118例について評価したところ、研究仮説に近い結果が得られているため。最終年度までに105例(男93例、70.6±6.2歳)の無症候性頚動脈狭窄症(狭窄率81.8±9.6%)が登録された.1.105例における認知機能評価:結晶性知能のWAIS-R2下位検査は101.9±12.0、JARTは99.2±13.7で健常値と比して有意差はなかった.流動性知能のRBANSは即時記憶82.5±14.8、視空間構成96.3±14.3、言語87.8±10.7、注意82.4±15.4、遅延記憶85.1±18.3、総指標82.9±13.2であり、健常値と比して全ての尺度で有意な低下を認めた(p<0.01).結晶性知能と流動性知能の間でディスクレパンシー分析を行った結果、即時記憶で69例、視空間構成26例、言語54例、注意63例、遅延記憶54例、総指標で78例に低下が認められた.結果、無症候性頚動脈狭窄症では90%以上の症例において何らかの高次脳機能低下があることが示された.2.頚動脈ステント留置術(CAS)後の認知機能:105例中60症例にCASを施行した.治療3カ月後のRBANSの平均点は全ての尺度において有意な改善を示した.以上より無症候性頚動脈狭窄症では認知機能が軽度低下をきたし、それがCAS後に改善することが示唆された.3.認知機能改善の要因:

CASの60例中49例で、術前のMRIでFazekasによる深部虚血病変の分類を行った.側脳室周囲病変についてはタイプ0または1の軽度虚血例は40例、2または3の重度虚血例は9例、深部白質病変では軽度虚血例は22例、重度虚血例は27例であった.RBANS総指標が改善しない群では深部白質の重度虚血が有意に多かった(χ二乗検定、p=0.013).深部白質病変が軽度であることが、CAS後に高次機能が改善する条件となることが示唆された.無症候性頚動脈狭窄症(狭窄率81.8±9.6%)の105例(男93例、70.6±6.2歳)において認知機能を評価した.WAIS-R2下位検査、JARTでは機能低下が認められなかったが、RBANS対WAIS-R2下位検査、JARTのディスクレパンシー分析の結果、90%以上の症例において即時記憶、視空間・構成、言語、注意、遅延記憶、総指標のうち最低一項目以上の低下が認められた.頚動脈ステント治療を施行した60例ではRBANSのすべての項目において術後に有意な改善が認められた.Fazekas分類を検討した結果、深部白質病変が軽度であることが術後に改善する条件であることが示された.前向き登録症例は20例を越えており、またこれに過去の症例を加えた総数103例について評価したところ、研究仮説に近い結果が得られているため.平成28年も研究計画書の通りに症例の蓄積を進め、無症候性高度頚動脈狭窄症における軽度高次脳機能低下を確認するとともに、あらたにCASによる血行再建後の機能評価を加える。これにより低下していた高次脳機能がCASを行うことによって改善するか否かを評価、検討する。脳血管内治療平成27年も研究計画書の通りに症例の蓄積を進め、無症候性高度頚動脈狭窄症における軽度高次脳機能低下を確認するとともに、あらたにCASによる血行再建後の機能評価を加える.これにより低下していた高次脳機能がCASを行うことによって改善するか否かを評価、検討する.
人工染色体を利用した新規マラリアワクチンの開発

マラリアは最も重要な感染症の1つである。肝臓感染ステージでは以前よりガンマ線で弱毒化したスポロゾイトにより強力な感染阻止免疫が誘導できることが知られていた。また最近では遺伝子操作した弱毒化スポロゾイトによる免疫誘導が報告されている。しかしながらスポロゾイトの生ワクチンとして利用には、蚊から得られる原虫数の少なさを考慮すると、多くの困難が伴うことが予想される。一方このステージでのコンポーネントワクチン作製の試みは、特定の原虫タンパク質に限られており、その可能性が十分に引き出されているとは言い難い。本研究ではマラリア人工染色体を利用することによって、スポロゾイトと肝臓内ステージの複数の抗原タンパク質を弱毒化した赤血球感染ステージの原虫に発現させ、感染阻止免疫を誘導することを試みた。肝臓感染ステージの遺伝子CS protein, pbs36を、HSP70遺伝子上流領域を発現プロモーターとして組み込んだ人工染色体ベクター(pH70CEN)にサブクローニングした。この人工染色体ベクターは大腸菌とのシャトルベクターであり,大腸菌でプラスミドとしてクローン化した後、エレクトロポーレーションで原虫のシゾントに導入した。人工染色体が導入された原虫は人工染色体上のhumanDHFR遺伝子により抗マラリア薬に耐性を獲得した。また人工染色体を持つ原虫は、当該遺伝子を赤血球感染ステージで発現していた。現在人工染色体を導入した原虫をマウスに感染させ、感染阻止免疫の誘導を評価している。今日までマラリア制圧のための様々な試みがなされているが、殺虫剤耐性蚊の出現、抗原多型や薬剤耐性原虫の出現などによりその多くが行き詰まっている。こうしたなかで肝臓感染ステージを標的としたワクチンが注目されている。肝臓感染ステージの遺伝子CS protein,pbs36を、HSP70遺伝子上流領域を発現プロモーターとして組み込んだ人工染色体ベクター(pH70CEN)にサブクローニングした。今後人エ染色体を導入した原虫をマウスに感染させ、感染阻止免疫が誘導されるかどうかを評価する。
温度勾配を外場とする高分子の不可逆的分子拡散の解析

物理的に制御可能な非平衡系として安定な温度勾配をつくり、温度勾配により誘起される濃度勾配形成現象に着目する。この現象は、ルードヴィッヒ・ソレー効果または熱泳動現象などと呼ばれ、水溶性高分子での実験データが圧倒的に不足している。オリジナルな手法であるレーザ干渉法を用いた測定と、システマティックな系選びにより、高分子の持つ自由度や溶媒との相互作用などに起因する多様なふるまいに着目した解析を進めることで、水系かつ非平衡状態に特有な分子拡散と構造形成現象を理解し、非平衡熱力学や高分子物理学の発展に寄与する成果を提供していく。本研究は熱拡散型強制レイリー散乱法(TDFRS法)を用いて、熱的に非平衡な状態にて顕在化する高分子の輸送現象(分子拡散と構造形成現象)を調べる。すなわち(1)高分子溶液に外場として安定な温度勾配を与え、熱平衡状態から離れた条件にて起こる濃度勾配形成現象(ルードヴィッヒ・ソレー効果)のデータ取得を行い、(2)このような構造形成現象を支配する主な因子であろ物質流やエネルギー流、そして分子レベルでの相互作用が果たす役割の詳細を解析する。さらに(3)これまで申請者によって見出された異常なルードヴィッヒ・ソレー効果(負のソレー係数)の分子論的メカニズムの解明を目指す。以上の事により、非平衡熱力学分野に実験データを提供するとともに高分子物理学や非平衡熱力学に新たな知見をもたらし、これら分野の発展に寄与することを目的としている。初年度は、単糖、オリゴ糖、環状オリゴ糖、多糖類の水溶液を用いた測定によりデータ取得を実施した。この結果、温度勾配を駆動力とする分子の輸送係数が、溶質の分子量や分子サイズによらず符号反転温度からの距離のみに依存することが明らかになった。ここで用いたすべての試料は、最小構成単位がグルコースであることから、輸送係数の決定因子はこれまで知られていた分子量や分子サイズだけではなく、グルコースと水分子との分子レベルでの相互作用に強く依存することが分かった,一方、これら糖水溶液においてもソレー係数が負の値を示すことから、ソレー係数の符号反転現象には水素結合が関係していることが確かめられた。並行して合成高分子を用いた測定(熱平衡系および非平衡系)を実施し、水系と非水系での比較を行い、ルードヴィッヒ・ソレー効果の分子論的な理解のための基礎データが得られた。すなわち(1)高分子溶液に外場として安定な温度勾配を与え、熱平衡状態から離れた条件にて起こる濃度勾配形成現象(ルードヴィッヒ・ソレー効果)のデータ取得を行い、(2)このような構造形成現象を支配する主な因子である物質流やエネルギー流、そして分子レベルでの相互作用が果たす役割の詳細を解析する。この一連の研究により、非平衡熱力学分野に実験データを提供することに加え、高分子物理学や非平衡熱力学の発展に寄与することを目的としている。初年度および2年目には、多類の水溶液を用いた測定によりデータ取得を実施し、温度勾配を駆動力とする分子の輸送係数が、溶質の分子量や分子サイズによらず符号反転温度からの距離のみに依存することが明らかになった。ここで用いたすべての試料は、最小構成単位がグルコースであることから、輸送係数の決定因子はこれまで知られていた分子量や分子サイズだけではなく、グルコースと水分子との分子レベルでの相互作用に強く依存することが分かった。一方、界面活性剤や絵一連グリコールを用いたシステマティックな測定を実施し糖類で得られた結果とひかくすることにより、水酸基と水分子との相互作用や分子サイズをパラメータとする解析により、疎水性相互作用の果たす役割についても解釈が可能となる一連のデータおよび成果が得られた。本研究は、熱的に非平衡な状態(安定な温度勾配)にて顕在化する高分子の輸送現象(分子拡散と構造形成現象)を調べることを主要な目的としている。これにより、非平衡熱力学分野に実験データを提供するとともに高分子物理学や非平衡熱力学に新たな知見を提供し、これら学問分野の発展に寄与することを目的としている。これまで研究は順調に推移しており、研究成果は学術論文、招待講演、国内外での学会発表等を下記の通り行っている。本課題の一連の研究から派生した共同研究の成果を発表した国際会議では、Best Poster Awardを受賞している。また、科研費新学術領域「ゆらぎと構造の協奏」公募研究に申請し採択に至った。新学術領域「ゆらぎと構造の協奏」の研究目的は、非平衡物理学の深化を目指すものであり、そういった意味では本課題の目的と共通している。したがて、研究業績は区別するのが難しく本課題および新学術の両者に記載している。

3年目終了までに、測定対象としている高分子と糖類を溶質とし、溶媒としての水およびアルコールからなる測定系は順調にデータ取得が進んでいる。これら得られた実験データをベースに現象を理解するためのモデル構築をしつつ、ここで必要となった新たな実験条件にてデータ取得を続けている。本研究は、非平衡系高分子溶液の新たな物性解析の試みとして、熱的に非平衡な状態(安定な温度勾配)にて顕在化する高分子の輸送現象(分子拡散と構造形成現象)を調べることを主要な目的としている。(1)高分子溶液に外場として安定な温度勾配を与え、熱平衡状態から離れた条件にて起こる濃度勾配形成現象(ルードヴィッヒ・ソレー効果)のデータ取得を行い、(2)このような構造形成現象を支配する因子である物質流やエネルギー流、そして分子レベルでの相互作用が果たす役割の詳細を解析する。(3)これまで申請者によって見出された異常な“負"のルードヴィッヒ・ソレー効果の分子論的メカニズムの解明を目指す。本課題は4年間の計画で、データ取得はほぼ計画通りに推移し、解析や解釈を進めてきた。データ取得を基本とする現象の普遍性の探求と、個々の系が分子レベル有する多様性を明らかにしながら、非平衡系の輸送現象の理解を深めるという大きな枠での研究はこれからも続けていかねばならないが、個々の系における成果は業績欄に示した通り得られている。一方、新たな研究展開が可能となる新事実や基礎データも得られている。既発表の学術論文、招待講演、国内外での発表などは次項以降に示した通りである。さらに、まだ論文発表していない成果については、今後発表していく予定である。本課題の3年目と4年目に重なるように採択されていた、新学術領域「ゆらぎと構造の協奏」の研究目的は、非平衡物理学の理解の深化をめざすものであり、大局的な観点では本課題と新学術の目的は共通している。各課題の個々の目的は異なるが、これらの成果は将来的には融合していくべきものであり、この2年間の両課題遂行は相乗効果が大きかったと言える。研究業績は相互に関連しているので区別せず両者に記載している。物理的に制御可能な非平衡系として安定な温度勾配をつくり、温度勾配により誘起される濃度勾配形成現象に着目する。この現象は、ルードヴィッヒ・ソレー効果または熱泳動現象などと呼ばれ、水溶性高分子での実験データが圧倒的に不足している。オリジナルな手法であるレーザ干渉法を用いた測定と、システマティックな系選びにより、高分子の持つ自由度や溶媒との相互作用などに起因する多様なふるまいに着目した解析を進めることで、水系かつ非平衡状態に特有な分子拡散と構造形成現象を理解し、非平衡熱力学や高分子物理学の発展に寄与する成果を提供していく。3年目に計画していた研究内容とそれに関するデータ取得はおおむね順調に進んでいると判断される。それは、水系サンプルおよび非平衡系のデータ取得を実施するという実験研究という難しさを鑑みても、データ取得がほぼ予定通り進んでいると判断したためである。27年度が最終年度であるため、記入しない。高分子物理学、非平衡熱力学最終年度(4年目)は、これまでの研究成果をまとめ論文発表をすることに重きを置き、そのための再現性の確認や不足しているデータ取得などを中心に進める。また、現象の理解を深めるために理論研究者を分担者として新たに迎える。
新たな視点で解明する原腸胚形成のしくみ

原腸胚形成は多細胞動物の形づくりにおいて極めて重要な現象であるにもかかわらず、そのメカニズムの実質的な解明が進んでいない。本研究課題では、この時期に単離した両生類の胚細胞がみせる振る舞いの解析を通して、原腸胚形成のしくみを明らかにする目的で研究を行った。その結果、予定外胚葉細胞と予定中胚葉および内胚葉細胞では、それぞれ異なるカルシウムシグナル系を介した細胞骨格の再構築により、胚葉特異的かつ自律的な細胞運動が行われていることが明らかとなった。このような胚葉特異的なカルシウムシグナル系の発達は、原腸胚形成運動の開始と維持において重要な役割を果たしていることが示唆された。原腸陥入を中心とする「原腸胚形成」は多細胞動物の形づくりにおいて極めて重要な現象であるにもかかわらず、現在までそのメカニズムの実質的な解明が進んでいない。本研究課題では、単離胚細胞がみせる振る舞いの解析を通して、原腸胚形成のしくみを明らかにする目的で研究を進めている。これまでに、本研究課題による研究により、原腸陥入が起きる時期に両生類の胚細胞を単離すると、予定外胚葉細胞では自律的なブレッブ形成と、その周回運動がみられ、予定中胚葉および内胚葉細胞の多くは自律的にシリンダー状に細長く伸長すること、および、それらが細胞内部から放出されるカルシウムイオンにより制御されていることを明らかにした。本年度の研究では、自律的な胚細胞運動を制御するカルシウムイオンや細胞骨格の構築について、さらなる解析を進めた。その結果、1,予定外胚葉細胞では、ブレッブ以外の細胞膜直下に豊富なアクチン線維の存在が認められた。2,予定中胚葉および内胚葉細胞では、収縮部位の細胞膜直下にアクチン線維が細胞の長軸と直交する向きで細胞を取り囲んでいることが確認された。3,これら単離胚細胞にみられる自律的な細胞運動は、カルシウムポンプ阻害薬およびアクチン重合阻害薬により阻害され、微小管重合阻害薬では阻害されなかった。これらの結果から、自律的な細胞運動は細胞内部から放出されるカルシウムイオンを介したアクトミオシン系の再構築により制御されていることが示唆された。この原腸陥入が起きる時期に両生類の胚細胞を単離すると特徴的かつ自律的な細胞運動がみられるが、その制御機構や原腸陥入に果たす役割についてはほとんど解明されていない。本年度に実施した研究において、イモリ原腸胚から単離した胚細胞について細胞内カルシウムイメージングや各種カルシウムチャネル阻害薬の効果を調べた結果、(1)単離外胚葉細胞は細胞内カルシウムイオン濃度の上昇をともなうブレッブを形成し、そのブレッブが細胞周囲を回転する自律的な細胞運動を行うこと、(2)この細胞運動は、ジヒドロピリジン受容体とリアノジン受容体による細胞内部からのカルシウムイオンの放出により制御されていること、(3)単離中胚葉および内胚葉細胞ではカルシウムイオン濃度の上昇をともなう硝子様突起をもつシリンダー状の形態をしており、原形質流動および細胞表面の波打ち運動によって一方向に伸長する自律的な細胞運動を行うこと、(4)この細胞運動には、イノシトール3リン酸受容体とリアノジン受容体による細胞内部からのカルシウムイオンの放出が関与していることが示唆された。原腸陥入を中心とする「原腸胚形成」は多細胞動物の形づくりにおいて極めて重要な現象であるにもかかわらず、現在まで、そのメカニズムの実質的な解明が進んでいない。これまでに、本研究課題による研究により、原腸陥入が起きる時期に両生類の胚細胞を単離すると、予定外胚葉細胞では自律的なブレッブ形成と、その周転運動がみられ、予定中胚葉および内胚葉細胞の多くは自律的にシリンダー状に細長く伸長すること、および、それらがカルシウムイオンを介した細胞骨格の再構築により制御されていることが示唆された。本年度の研究では、「自律的かつ胚葉特異的な細胞運動が原腸胚形成に果たす役割」についてさらに解析を進めた。その結果、予定外胚葉細胞でみられる細胞運動と予定中胚葉および内胚葉細胞でみられる細胞運動では、それぞれ異なるカルシウムシグナル系を介して細胞骨格(アクトミオシン系)の再構築が行われることで特異的な細胞運動が行われていることが示唆された。本研究課題では、単離胚細胞がみせる振る舞いの解析を通して、原腸胚形成のしくみを明らかにする目的で研究を行った。前年度までの本研究課題による研究により、原腸陥入が起きる時期に両生類の胚細胞を単離すると、予定外胚葉細胞では自律的なブレッブ形成と、その周転運動がみられ、予定中胚葉および内胚葉細胞の多くは自律的にシリンダー状に細長く伸長すること、および、それらがカルシウムイオンを介した細胞骨格の再構築により制御されていることが示唆された。