hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血清尿酸値に影響を及ぼす遺伝子の解析に関する研究

一方、GLUT9/SLC2A9は血清尿酸値に強い影響力を持つにも係わらず、どの様に高尿酸血症の発症に関与しているのかは不明のままである。腎臓の尿細管において、GLUT9/SLC2A9は再吸収方向に働くトランスポーターであるため、機能低下を示すSNPにより血清尿酸値が低下することが推定される。しかし、今までGLUT9/SLC2A9の変異体の機能変化を証明した報告はない。今回、多くの研究者が用いている通常のアフリカツメガエルの卵母細胞を用いた輸送実験システムでは、変異体の輸送能変化を検出できていない可能性があると考え、実験時の条件の検討を行った。集団によっては血清尿酸値との関連が報告されているV282I (V253I, rs16890979)とR294H (R265H, rs3733591)を対象とした。卵母細胞への通常のcRNA注入量である25-50 ngでは、両変異体とも野生型と同様に尿酸取り込みは1 pmol/injection程度であったが、5 ngの注入量にした場合、両変異体の尿酸取り込みは野生型に比し低下を認めた。これらのことから、生体内において、この機序によりこの2つの変異体が血清尿酸値に影響を与えている可能性が考えられた。しかし、実験毎のばらつきがあることから、更なる追加実験が必要であり、また、この機序の証明には、生体内でのGLUT9/SLC2A9の発現量と尿酸の量比の検討が必要である。URAT1/SLC22A12とGLUT9/SLC2Aは近位尿細管における尿酸再吸収に働くトランスポーターで、この欠損は腎性低尿酸血症を引き起こす。URAT1/SLC22A12とGLUT9/SLC2A9の変異で、尿酸輸送能に影響を与えないと報告されていた変異を検討し、アフリカツメガエルの卵母細胞を用いた輸送実験の条件を変更することにより、変異による尿酸取り込みの減少を示し、腎性低尿酸血症を惹起する可能性を明らかにした。ABCG2は尿酸の分泌に働くトランスポーターであり、この機能低下や欠損を認める一塩基多型により高尿酸血症を来たしやすくなる。血清尿酸値における、ABCG2の機能の重要性を示した。本年度の計画のうち、SLCトランスポーターファミリーの尿酸輸送評価系構築については達成されたが、ABCG2の尿酸輸送評価系の十分な構築には至らなかった。理由として、ヒト胎児腎由来HEK293細胞への安定したABCG2遺伝子導入法確立、および反転膜小胞の調製に詳細な条件検討を行ったため、計画よりも多くの時間を要したことが挙げられる。当初は遺伝子導入法としてエレクトロポレーション法を使用したが、通電による物理的刺激で細胞の生存率が低下することが障害であった。対策として、カチオン脂質とDNAの複合体を導入するリポフェクション法を新たに検討し、トランスフェクション後の細胞生存率を向上させることができた。反転膜小胞の作製に関しては、細胞膜成分を抽出する際のショ糖密度勾配遠心条件を詳細に振って検討することにより、安定した収量を実現した。現在、ABCG2を介した尿酸取り込み量をどの様に増加させるかが問題であるが、次年度においても継続し、反応時の条件検討を行うことにより検出能の向上を図ることが可能であると考える。高尿酸血症患者100例におけるSNPの同定を行う。
肺線維症モデルにおける直接リプログラミングを用いた肺上皮細胞誘導の有効性の検討

肺線維症は進行性の不可逆的肺障害であり、根治的治療として再生医療が注目されているが、実現化には至っていない。再生医療の新手法として、体細胞から幹細胞を経ることなく目的細胞を誘導する直接リプログラミング法が報告されている。当グループはマウスで直接リプログラミングによる肺上皮様細胞の誘導に成功し、誘導細胞のインフルエンザ感染マウスへの投与で、生存率が改善する結果を得た。本研究ではブレオマイシンを用いた肺線維症モデルマウスにおける直接リプログラミング誘導肺上皮様細胞投与の有効性の検討、また同モデルマウスにおける肺線維芽細胞を対象とした生体内直接リプログラミングによる肺上皮細胞の誘導を目的とする。
環境調和型バイオミメティック(生物模擬)建築の開発研究

人体・生物が持つ生理機能や自然智を建築に模擬応用することにより、無駄なく、合理的に環境制御と環境共生を行い得る「バイオミメティック(生物模擬)建築」の実現に向け、有望と考えられる機能や構成要素について、その模擬性、制御性、システム等と、快適感の形成に重要な「ヒトの感覚一行動」について研究を進め、「バイオミメティック建築」の基本構成と性能を確認した。主な研究成果を機能別に分けると以下の通りである。(1)「鳥肌・起毛機能」:形状記憶素材を用いて、温度変化に依存して作動する建築外皮部材のシステム化を図った。(2)「衣替え建築」:1)赤外特性が温度によって変化する二酸化バナジウム系の薄膜材料を建築外皮に用いた場合の夏季と冬季の日射吸収・透過性能の最適化法を提案した。2)二酸化バナジウム薄膜系調光窓の材料改質による日射透過制御性能の向上を図った。3)表面の熱特性が季節により異なる外壁試験体を用いて、実験と解析により夏季・冬季の熱性能を求め、衣替えによる熱効果が大きいことを示した。(3)「植物の導管機能」:浸透現象を生じさせる膜や溶質に関する基本性能や揚水機能を実験的に確認し、膜と粒子径、浸透モジュールの構成等に関する知見を得た。(4)「発汗機能」:不燃性を強化した汗かき屋根を構築し、熱性能と蒸発性能を実験的に確認した。またその熱的効果と最適感温点を予測し評価した。(5)「アリヅカ機能」:「アリ塚」の環境調節機構を模擬した「アリヅカ建築」を提案し、その環境性能を予測評価した。(6)快適感の形成:蒸暑な環境条件の下で、室内環境において長波長放射が果たす役割、風速の変動が快適感に果たす役割、さらに高湿度とヒトの感覚-行動の関係等に着目し、冷放射エクセルギーの効果が夏の温熱快適性に大きな影響を持つこと、また後得的温冷感を培うことの重要性について示した。(1)生物の生息環境と人体・生物が持つ環境生理機構を調査し、建築環境共生・制御への模擬・適用性の分析と有望な機構のモデル化の検討を行った。(2)「植物の揚水機能」の模擬のため、浸透現象を生じさせる膜や溶質に関する基本性能を実験的に確認し、膜と粒子径等に関する知見を得た。(3)「衣替え機能」の模擬には、温度によって赤外光特性が変化する二酸化バナジウム系の薄膜材料が有望であり、これを建築外皮に用いた場合、夏季と冬季で少なくとも10%以上の日射吸収率の変化が生じる事が予測された。また、夏季と冬季の日射透過率の変化幅を増大させる方法も検討した。さらに、住宅(東京)をモデルに、建築外皮の衣替えを行った場合の年間熱負荷を予測し、非衣替え(通常)に対する低下量を評価した。(4)「鳥肌・起毛機能」の模擬のため、材料の探索を行った。形状記憶合金は有望であるが、低温で高速な形状変化を行うには、組織を微細化するとともに伝熱を向上するために薄肉化の必要があることが明らかになった。そこで、Ti粉末とNi粉末をパルス通電焼結でターゲット材に加工し、塩基板を用いたスパッタリングにより100ミクロン以下の薄肉状形状記憶合金を作製するプロセスを開発した。(5)「汗かき機能」の模擬のため、感温性高分子材を用いた「汗かき屋根」の熱的効果と水分蒸発効率を実験的に求め、評価した。

(6)蒸暑な地域環境条件の下で、室内環境において長波長放射エクセルギーが果たす役割、風速の変動が快適感に果たす役割、高湿度とヒトの感覚-行動の関係、さらに、植物の蒸散機構と光合成・エクセルギー消費の定量的な関係を解明する研究を行ない、室温が外気温とほぼ変わらない状況でも、周壁面から冷放射エクセルギーが得られれば、可感気流がなくてもかなり快適になり得ること、光合成で生成されるグルコースが最大化されるような日射エクセルギーと風速の関係があることなどが明らかになった。(1)「鳥肌・起毛機能」:粉末状の塩をパルス通電焼結で固化成形した基板に70μmのTiNi薄膜をスパッタ法で作製し、熱処理によって形状記憶特性を付与できる事を明らかにした。また、市販の線材あるいは板状のTi-Ni系形状記憶素材を用いて、20°Cから30°Cにて形状変形するための熱処理条件を求め、10°Cから40°Cにて本素材の作動状態を確認した。(2)「衣替え建築」:1)赤外特性が温度可変する二酸化バナジウム薄膜系サーモクロミック窓ガラスでは、太陽位置の変化および日射の分光強度分布を考慮すると、日射透過率の変化幅は、垂直入射でエアマス1.5の場合の日射分光強度分布を用いた場合のそれと比較して14%程度の違いがみられる事(南面の例)を明らかにした。2)各種の分光反射率を有する代表的なセラミックタイルについて、分光反射分布の測定とタイルの設置位置、太陽位置、日射分光強度分布を考慮した日射吸収率の計算を行い、日射吸収率がタイルの設置方位に依存する事を示した。3)表面の熱特性が異なる建築外壁試験体を作製し、夏季・冬季の熱性能の測定を行い、結果を熱特性が変化しない場合と比較する事によって衣替えによる熱効果を明らかにした。(3)「植物の導管機能」:浸透現象によって発生する膨圧による膜破損を、金属メッシュを用いて防ぐ浸透モジュールを構築して、実験的に揚水機能を確認した。(4)「汗かき屋根」:不燃性を強化した汗かき屋根を構築し、熱性能と蒸発性能(蒸発効率)を実験的に確認した。(5)(6)「バイオミメティック建築の構築と性能予測」:1)蒸暑な環境条件の下で、室内環境において長波長放射が果たす役割、風速の変動が快適感に果たす役割、高湿度とヒトの感覚-行動の関係などに着目した研究を行ない、天井を2428°Cに冷却した室内における、自然通風と在室者の快適感の関係を明らかにした。2)「アリ塚」の環境調節機構を模擬した「アリヅカ建築」を提案し、その環境性能を予測評価した。[()は研究実施計画の項目に対応]人体・生物が持つ生理機能や自然智を建築に模擬応用した「バイオミメティック(生物模擬)建築」の実現に向けて以下の研究課題を遂行した。(1)「鳥肌・起毛機能」:温度変化に依存して作動する建築外皮部材の自律的駆動機構のシステム化を図った。(2)「衣替え建築」:1)赤外特性が温度によって変化する二酸化バナジウム薄膜系調光窓ガラスに対する日射の入射角を考慮するための試験方法を提案した。2)二酸化バナジウム薄膜系調光窓材料の観点から,非晶質シリコンとの多層膜化と,二酸化バナジウムと酸化チタンとの複合体形成による材料改質に関する研究を進め,日射透過制御性能の向上を図った。3)表面の熱特性が異なる建築外壁試験体を用いた夏季・冬季の熱性能測定を継続し,実験と解析により衣替えによる熱効果が大きいことを示した。(3)「植物の導管機能」:平膜を用いた揚水実験結果に基づき,溶質や膜の材質,浸透モジュールの形態を検討し,揚程の上昇に伴う膨圧や水量の確保のための浸透モジュールの膜面積の拡大等に対応するため,今後,スパイラル膜や中空糸膜等の膜形態を評価する必要があることを明らかにした。
微細藻類の光合成・バイオマス合成を支配する細菌の分子基盤解明とその応用

Chlorella vulgarisやEuglena gracilisなど微細藻類成長促進細菌(Microalgae Growth-Promoting Bacteria: MGPB)の探索を試みた。MGPB候補菌株を200株以上分離し、その中から微細藻類の成長を3倍以上促進するMGPBを見いだした。MGPBの一部は、微細藻類のクロロフィル合成と光合成を2倍以上促進し、その促進にはMGPBが生産する窒素化合物が関与していることが示唆された。さらに、下水二次処理水を用いた微細藻類栽培リアクターにMGPBを接種することにより、微細藻類バイオマスと微細藻類オイルの生産性を2倍高めることに成功した。本研究は、微細藻類の光合成とバイオマス合成を劇的に促進する微細藻類成長促進細菌(Microaglae Growth-Promoting Bacteria: MGPB)の基礎と利用技術を開拓し、エネルギー生産性とCO2排出削減性を徹底的に高めた微細藻類バイオマスプロダクションの開発が目的である。すなわち、「MGPB」×「微細藻類培養」による革新的な超高効率バイオマスプロダクションにより、バイオリファイナリー実現の加速化にチャレンジするものである。平成27年度は、Chlorella vulgari, Chlamydomonas reinhardttiやEuglena gracilisなどの微細藻類のMGPBの探索とその特徴づけを実施した。その結果、合計160株以上のMGPB候補菌株を分離することに成功し、その系統分類学的同定と特徴づけが完了した。その分離菌株の中から、微細藻類の成長を3倍以上促進するMGPBを21株見出した。平成27年度は、MGPBの探索とその特徴づけを実施した。その結果、合計160株以上のMGPB候補菌株を分離することに成功した。さらに、その分離菌株の中から、微細藻類の成長を3倍以上促進するMGPBを21株見出した。当初の達成目標では、「微細藻類の成長を3倍以上促進するMGPBを25株獲得していること」になっており、その目標をおおむね達成。さらに、その成果を第50回日本水環境学会年会(平成28年3月、徳島)で発表することができた。以上のことから判断して、研究進捗を「おおむね順調に進展している」と評価した。本研究は、微細藻類の光合成とバイオマス合成を劇的に促進する微細藻類成長促進細菌(Microalgae Growth-Promoting Bacteria: MGPB)の基礎と利用技術を開拓し、エネルギー生産性とCO2排出削減性を徹底的に高めた微細藻類バイオマスプロダクションの開発が目的である。すなわち、「MGPB」×「微細藻類培養」による革新的な超高効率バイオプロダクションにより、バイオリファイナリー実現の各楚歌にチャレンジするものである。平成28年度は、MGPBによる微細藻類光合成・バイオマス合成の定量評価と分子基盤の解明を試みた。その結果、MGPBを微細藻類に接種することにより、微細藻類のクロロフィル合成と光合成速度(二酸化炭素取り込み速度)が2倍以上促進することが明らかとなった。その促進効果は微細藻類培養液に依存し、貧栄養培地のときに促進効果が高くなった。MGPBによる微細藻類の光合成とバイオマス合成促進の分子基盤解明には至らなかったものの、MGPBが生産する窒素成分を微細藻類が吸収・固定し、それが光合成とバイオマス合成促進の一助になったことが推測された。また、平成28年度は、MGPB利用型微細藻類によるバイオマス生産の実証実験を行った。2Lスケールの微細藻類培養リアクターを試作し、下水二次処理水を培養液として微細藻類を培養した。その微細藻類にMGPBを接種して培養することにより、微細藻類バイオマス生産速度と微細藻類のオイル生産速度が約2倍高まった。このことから、MGPBは実用的な微細藻類培養においても、バイオマス生産とオイル生産を促進する有力な微生物材料であることが裏付けられた。現在の研究進捗状況は、「おおむね順調に進展している」と判断できたことから、当初の計画通りに今後の研究を推進する。平成28年度は、「MGPBによる微細藻類光合成・バイオマス合成の定量的評価と分子基盤解明」と、「MGPB利用型微細藻類によるバイオマス生産の実証実験」に取り組む。これらの研究では、これまでの微細藻類培養実験に加え、微細藻類のメタボロミクス解析やトランスクリプトーム解析を駆使して、確実かつ効率的に分子基盤解明を実施する。さらに、数リットルスケール以上の微細藻類培養リアクターを試作して実証実験を行う。環境工学
リチウムイオン電池の充放電その場評価にむけた透過電子顕微鏡内近接場ラマン分光法

透過電子顕微鏡(TEM)観察下で観察領域にレーザー光を直径10μm以下に集光する装置を開発した。その結果、励起光強度の増加により、実用的な測定条件(エネルギー分解能6meV、10秒励起)での、空間分解能がμmオーダーのTEM観察下その場ラマン分光測定が初めて可能となった。上記のレーザー光照射下で直径60nmの銀微粒子を接触させて散乱型近接場光を形成したが、近接場光強度が期待より小さく、空間分解能がnmオーダーのラマン分光測定はできなかった。近接場光励起によるラマン信号を抽出するには、近接場光と近接場励起用レーザー光のプローブ面積比をあと一桁下げるか、近接場光の強度をあと一桁上げる必要がある。研究開始前において透過電子顕微鏡内その場分光機構により近接場光の形成は実現していたが、近接場光とレーザー光のプローブ面積比が1:10000に対して輝度比は10:1のため、近接場光によるラマン信号はレーザー光によるラマン信号に埋もれていた。そこで、コア径50μmの光ファイバーへの交換および光学系の再設計などその場分光機構を再構築し、透過電子顕微鏡内の顕微鏡観察位置において顕微鏡観察下で直径10μm以下のレーザー光プローブを作成した。計算上、再構築前に比べてプローブ面積比は約1ケタ改善された。さらなるプローブ面積比の改善を目指し、高精度・大開口数のコリメートレンズ機構および開口数の大きな放物面鏡の設計・製作を進めている。また、近接場光の輝度比は微粒子のサイズと励起光のエネルギーに敏感であるため、銀微粒子ごとに光プローブのエネルギーを微調し、共鳴効果により最大輝度の近接場光を形成できるようにした。すなわち、先鋭化させた金属ニードル(曲率半径数100nm以下)を電解研磨で作製し、先端に平均直径50nmの銀微粒子の希薄懸濁液を滴下して銀微粒子を担持させ、構造再現性の高い局在近接場光形成用探針を作成した。さらに、波長可変レーザー光を透過電子顕微鏡内に導入できるようにした。作成した近接場光プローブを用いてダイヤモンドのラマン分光測定を行い、近接場光とレーザー光の輝度比とプローブ面積比の評価を進めている。リチウムイオン畜電池における正負電極の構造特性および充放電(リチウムイオン移動)による電極の構造変化に起因する振動モードの変化を同一ナノ領域で同時観測することを目指し、透過電子顕微鏡観察下における観察領域での散乱型近接場光ラマン分光法(空間分解能:約50nm)を開発することが目的である。近接場光は銀微粒子(平均直径50nm)にレーザー光を照射して形成するが、1)レーザー光のプローブ径を数10μm以下に小さくしてレーザー光励起によるバックグランドのラマン信号の強度を小さくし、さらに2)サイズ制御した微粒子に波長調整したレーザー光を照射して共鳴励起効果により近接場光の輝度を高くする、ことで高輝度のナノ光プローブによる高s/n比のラマン分光測定を目指した。今年度は、光プローブを形成する透過電子顕微鏡内その場分光機構に高精度・大開口数のコリメートレンズ機構を組み込み、波長可変レーザーから共鳴励起が期待されるエネルギー(約2.9eV)のレーザー光を顕微鏡観察領域に観察下で集光(直径10μm以下)できるようにした。その結果、近接場光とレーザー光のプローブ面積比は数百分の1程度まで小さくなったと見積もられた。しかし、共鳴効果による輝度比の増加が予想外に低いようで、近接場光によるラマン信号をレーザー光による強いラマン信号と区別するには至らなかった。近接場光形成用のレーザー光によりダイヤモンドのラマン信号は測定できたが、近接場光によるラマン信号は確認できていない。すなわち、レーザー光の照射下で銀微粒子を試料に接触させても、ラマン信号の強度の変化は確認できなかった。研究実績で述べたように、研究開始前に比べて近接場光とレーザー光の輝度比は大きくなりプローブ面積比は小さくなっているはずだが、まだ不十分と考えられる。研究対象であるリチウムイオン電池電極のラマン信号はダイヤモンドの信号に比べてかなり弱いため、輝度比とプローブ面積比の改善は不可欠である。ナノ構造物性前年度に引き続き、さらなるプローブ面積比の改善を目指し、高精度・大開口数のコリメートレンズ機構および開口数の大きな放物面鏡の設計・製作を進める。透過電子顕微鏡外において、CCDカメラなどによるプローブ面積の実測を行い、その情報をフィードバックして最小プローブ面積比になるよう装置の調整・改良を行う。参照試料としてダイヤモンドをTEM内に設置して局在近接場ラマン分光測定し、実測したプローブ面積を用いて近接場光とレーザー光の輝度比を評価する。最大輝度比になるよう、装置の調整・改良を行う。透過電子顕微鏡観察下における観察領域での局在

近接場光ラマン分光法により、リチウムイオン電池の正極材料(Li2Mn3-LiFeO2系酸化物、LiCoO2など)や負極材料(Li4Ti5O12、グラファイト、シリコンなど)の構造特性と充放電(リチウムイオンの移動)による電極の構造変化に起因する振動モードの変化を同一ナノ領域で同時に観測する。全ての結果を統合・整理し、また国内外の畜電池機能に関する理論研究者と意見交換して、充放電・劣化機構を原子・電子レベルで総合的に議論する。プローブ面積比の改善を目指し、高精度・大開口数のコリメートレンズ機構および開口数の大きな放物面鏡の設計を進めている。前年度にこの製作を行う予定であったが、精度向上のための再設計の必要があり、まだ完了していない。次年度使用額は、これらの製作費として使用する予定である。
細胞外基質蛋白質による骨芽細胞動態制御の分子メカニズムの解明

生体内において、細胞動態は細胞活性を反映する重要な形態学的変化である。細胞の形態学的変化は<細胞外基質蛋白質ー膜貫通型蛋白質ー細胞骨格>の複合体により制御され、細胞外基質蛋白質はこの意味において重要な役割を担う。申請者は、これまで、ヒトの筋・結合織疾患であるウルリッヒ病などの原因となるVIおよびXII型コラーゲンが、骨形成過程における骨芽細胞の細胞動態(細胞移動、骨基質表面への接着、細胞間コミュニケーション、極性化)を制御することで、骨量を維持する役割を担う事を明らかにしてきた。しかしながら、これらコラーゲン分子の骨芽細胞動態制御機構における分子メカニズムについては未だ解明されていない。本申請研究は、骨芽細胞動態を細胞外基質蛋白質であるコラーゲンにより制御するメカニズムを解明するものであり、骨形成機構における新たな制御機構の解明の一助になることが期待される。さらに、2014年に厚生労働省の専門委員会により指定難病疾患に定められたウルリッヒ病の病態解明に貢献することが期待される。本年度は、骨形成過程におけるVIおよびXII型コラーゲンの分子メカニズムを明らかにするために、骨形成過程におけるこれらコラーゲンの作用部位の特定を行った。生体内において、コラーゲンは細胞から分泌されると細胞外基質環境に蓄積されることから、生体内における骨芽細胞動態とコラーゲンの関連性を可視化する事は難しい。そこで、初代培養骨芽細胞を用いて、in vitroにおける詳細な局在について解析を行い、VIとXII型コラーゲンの作用部位を特定した。この作用部位において、VIおよびXII型コラーゲンの骨芽細胞動態制御機構についての分子レベルでの役割について、今後検討を行う。26年度が最終年度であるため、記入しない。
無機化合物のゲル内結晶成長

ゲル内結晶成長では特異なモルフォロジーが現われる場合がある。ニクロム酸カリウム(K_2Cr_2O_7)をゼラチンゲル中で三次元的に成長させると塩濃度とゲル濃度が共に高いある限られた領域で,右巻きの巨大らせん結晶(helical crystal)が出現し,これは人工結晶では他に例がない。この右巻きらせん巨視構造がゼラチンを構成するコラーゲン巨大分子の右巻き三重らせん構造に由来するという我々の仮説を実証するため,溶媒の水(H_2O)を重水(D_2O)に変えることによって,コラーゲン巨大分子の配列(4次構造)をアモルファス型に変えたときのらせん成長の変化を観察した。その結果,重水濃度が増加するに従ってらせん結晶の大きさが劇的に変化し,重水濃度が90%以上になると,らせんがほどけた形の特異な結晶が得られた。この実験結果から,コラーゲン巨大分子の4次構造がらせん成長に不可欠であることを実証することができた。また,微分干渉顕微鏡等を用いた「その場観察」によって,らせん成長は,成長先端の鋭い2本の角(horm)が互いに右回りにねじれることによって先端が成長する極めて特異な二重らせん構造であることを初めて確認した。さらに,このらせん成長系にアスパラギン酸(Asp)やグルタミン酸(Glu),ポリアスパラギン酸やポリアクリル酸等を0.1%添加したときに左巻きらせんが約20%の確率で出現することを初めて発見した。K_2Cr_2O_7のらせん結晶に完全な鏡像体が存在することを実証することができた。1.我々は,ニクロム酸カリウムの右巻き巨大らせん結晶は,ゼラチン媒質を構成するコラーゲン巨大分子の右巻き三重らせん構造に由来するという仮説を立てている。この仮説を実証するために,以前,コラーゲンゾルに種々の物質を添加して,コラーゲン分子配列を変化させた時のらせん成長の変化を調べた(第3論文)。今年度行った実験では,コラーゲンゾルに添加物を一切加えず,溶媒の水(H_2O)を重水(D_2O)に変えることによって,コラーゲン巨大分子の配列をアモルファス型に変えた時のらせん成長の変化を観察した。重水濃度が増加するに従って,らせん結晶の大きさが劇的に変化し,重水濃度が90%以上になると,らせんがほどけたような形の特異な結晶が得られた。この実験から,(1)高濃度のニクロム酸カリウムは,コラーゲン巨大分子配列に影響を与えない(2)コラーゲン巨大分子が正常な配列(長周期構造)をとる時にのみ,らせん成長機構が発動されるという重要な結果が得られたことになる。この実験結果を2001年3月の物理学会で発表し,次年度,論文にまとめる予定である。2.ニクロム酸カリウムの顕微鏡サイズのらせん成長について,「その場観察」を本校の三橋研究室(研究分担者)で行い,その予備実験段階で,きわめて特異な結晶成長が観察されている。つまり,結晶成長の方向とほぼ同じ方向の成長とそれとほぼ直角外向きの成長が交互に起こることが観察された。今後,試料の数を増やして,この現象の確認を行い,さらに精密な「その場観察」を実施する予定である。1.種々の割合の重水(D_2O)を含むコラーゲンゲル中で,二クロム酸カリウム(K_2Cr_2O_7)の結晶成長実験を行い,その実験結果を2001年3月の物理学会で発表した。重水素(D)の同位体効果によって,水素伝達系の水素イオン(H^+)の移動量が著しく疎外されると考えられる。

このような原因によって,コラーゲンらせん上での二クロム酸イオン(Cr_2O_7^<2->)の濃度差が減少し,らせん成長の駆動力が低下するのではないかと推測している。このような,らせん結晶成長機構についての試論の一部を中央大学大学院理工学研究科に提出した博士論文の中で公表した。2.ニクロム酸カリウムのらせん成長の「その場観察」を松下研究室(研究分担者)と共同で行っている。デジタルカメラでコマ撮り撮影を行ない,映像処理ソフトによって連続写真に変換した。これらの映像の解析を通して,この特異な結晶成長の本質を明らかにしようと思っている。3.特定領域研究(B)(代表:三村昌泰(広島大学))の研究活動の一環として,現在,リーゼガング現象の見直しが行なわれている。我々が発見したニクロム酸カリウムのらせん結晶が新しいリーゼガング現象の一つではないかというアイデイアが,現在,他の研究グループによって提出されている。この研究会(リーゼガング現象とそれに関連した沈殿構造形成)で松下貢(研究分担者)が,らせん結晶成長について総合報告を行い,リーゼガング現象を解明するための新しい視点を提供した(2001年12月13日)。1.二クロム酸カリウム(K_2Cr_2O_7)のらせん結晶の「その場観察」を中央大学・松下貢(研究分担者)研究室と共同で行い,その映像解析から次の知見を得た。(1)らせん成長は,先端成長であり,添加物を加えない通常の実験条件では,すべて右巻きキラリティーを持っている。(左巻きらせんは出現しない)(2)成長先端は鋭い2本の角(horn)で構成され,これらが互いに右回りにねじれることによって,K_2Cr_2O_2の極めて特異な右巻き二重らせん構造が出現することを「その場観察」の映像で初めて確認することができた。これらの成果を日本物理学会第57回年次大会で報告した。2.炭酸カルシウムの水溶液からの結晶成長において,0.1%のアスパラギン酸(Asp)を溶かすと,そのD体とL体に対応した互いに鏡像関係にある成長形が得られている。これにヒントを得て,二クロム酸カリウム(K_2Cr_2O_7)のらせん成長実験系に多くの種類のアミノ酸等を加えたところ,0.1%の酸性アミノ酸(D-,L-Asp,D-,L-Glu),ポリアスパラギン酸およびポリアクリル酸において約20%の確率で左巻きらせんが出現した。これらの物質に共通する化学構造は,反応性の高いカルボキシル基(-COOH)であり,これが,らせんキラリティーの転換(右→左)に重要な働きをしていると推測している。これらの成果を日本物理学会第58回年次大会で報告した。
糖鎖転移酵素遺伝子群と視交叉上核における概日リズム発現変動について

我々記述のようにシアル酸転移酵素ST8SiaVI遺伝子の発現が視交叉上核SCN,海馬HCに特異的かつ限局的に発現しており糖鎖関連遺伝子のST8SiaVI遺伝子が概日リズムと関連していることは明暗条件(ZT)で飼育したマウスで、遺伝子発現に周期性があることを発見した。さらに、恒暗条件下で飼育したマウスでのST8SiaVI遺伝子が概日リズムと関連していることは不明であったため、その結果を得るために、恒暗条件下(CT)で飼育したマウスのST8SiaVI遺伝子発現の解析を行い、ZT条件下と同様に概日リズムと関連していることを明らかにした。我々記述のようにシアル酸転移酵素ST8Sia VI遺伝子の発現が視交叉上核SCN,海馬HCに特異的かつ限局的に発現しており糖鎖関連遺伝子のST8Sia VI遺伝子が概日リズムと関連していることは明暗条件(ZT)で飼育したマウスで、遺伝子発現に周期性があることをすでに見いだしていた。しかし、恒暗条件下で飼育したマウスでのST8Sia VI遺伝子が概日リズムと関連していることは不明であったため、その結果を得るために、恒暗条件下(CT)で飼育したマウスのST8Sia VI遺伝子発現の解析を行い、ZT条件下と同様に概日リズムと関連していることを本年度に発見した。また、その光刺激に対してもその反応性は上昇していた。また、シアル酸転移酵素ST8Sia VI遺伝子のファミリー遺伝子α-2,8-sialyltransferase8b(ST8Sia II/STX)遺伝子のもSCNで振動している可能性をGeneChipで見出しているため、ST8Sia II/STX遺伝子のノックアウトマウスをジャクソン研究所より供給を受け、繁殖、凍結卵の作成した。現在、そのマウスの行動解析中である。既報告では、オープンフィールド検査(四角く区切った約1メール四方のマス目の中でのマウスの行動を観察)を解析することにより、精神的な行動異常を感知されるとされているが、飼育しているゲージ内では、徴候はみられない。また発育に関しては、特に異常を言われていないが、当施設で繁殖中のマウスでは、その発育に異常を来している可能性がある。特にST8Sia II/STX遺伝子は少数例で、その遺伝子多型と統合失調症との関連が示唆されているため、ヒトDNAにおけるこれら、遺伝子との関連性を解析するためのSNP解析を行っている。我々記述のようにシアル酸転移酵素ST8SiaVI遺伝子の発現が視交叉上核SCN,海馬HCに特異的かつ限局的に発現しており糖鎖関連遺伝子のST8SiaVI遺伝子が概日リズムと関連していることは明暗条件(ZT)で飼育したマウスで、遺伝子発現に周期性があることをすでに見いだしていた。しかし、恒暗条件下で飼育したマウスでのST8SiaVI遺伝子が概日リズムと関連していることは不明であったため、その結果を得るために、恒暗条件下(CT)で飼育したマウスのST8SiaVI遺伝子発現の解析を行い、ZT条件下と同様に概日リズムと関連していることを本年度に発見した。また、シアル酸転移酵素ST8SiaVI遺伝子のファミリー遺伝子α-2,8-sialyltransferase8b(ST8SiaII/STX)遺伝子のもSCNで振動している可能性をGene Chipで見出しているため、ST8SiaII/STX遺伝子のノックアウトマウスをジャクソン研究所より供給を受け、繁殖、凍結卵の作成した。現在、そのマウスのでは、脳室の拡大を認めた。特にST8SiaII/STX遺伝子は少数例で、その遺伝子多型と統合失調症との関連が示唆されているため、ヒトDNAにおけるこれら、遺伝子との関連性を解析するためのSNP解析を行った。

しかし、恒暗条件下で飼育したマウスでのST8SiaVI遺伝子が概日リズムと関連していることは不明であったため、その結果を得るために、恒暗条件下(CT)で飼育したマウスのST8SiaVI遺伝子発現の解析を行い、ZT条件下と同様に概日リズムと関連していることを発見した。また、その光刺激に対してもその反応性は上昇していた。以上から、ST8SiaVI遺伝子が概日リズムに関連している可能性を証明し、論文報告した。また、シアル酸転移酵素ST8SiaVI遺伝子のファミリー遺伝子α-2,8-sialyltransferase8b(ST8SiaII/STX)遺伝子もSCNで振動している可能性をGeneChipで見出しているため、ST8SiaII/STX遺伝子のノックアウトマウスをジャクソン研究所より供給を受け、繁殖、凍結卵の作成した。現在、そのマウスのでは、いままで報告のない、両側の側脳室の著明な脳室の拡大を認めた。既報告では、ST8SiaII/STX遺伝子オープンフィールド検査(四角く区切った約1メール四方のマス目の中でのマウスの行動を観察)を解析することにより、精神的な行動異常を感知されるとされているが、飼育しているゲージ内では、徴候はみられない。また発育に関しては、特に異常を言われていないが、当施設で繁殖中のマウスでは、その発育に異常を来している可能性がある。昨年から実験研究において、恒暗条件下で飼育したマウスでのST8SiaVI遺伝子が概日リズムと関連していることは不明であったため、その結果を得るために、恒暗条件下(CT)で飼育したマウスのST8SiaVI遺伝子発現の解析を行い、ZT条件下と同様に概日リズムと関連していることを23年度に発見した。現在のそのデータ解析がおおむね終了し論文化している所である。またα-2,8-sialyltransferase8b(ST8SiaII/STX)遺伝子ノックアウトマウス解析でも、従来から知られている表現型以外にも珍しい表現型を示したマウスを解析中であることから、おおむね順調に進展していると考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、α-2,8-sialyltransferase8b(ST8SiaII/STX)遺伝子ノックアウトマウス解析でも、従来から知られている表現型以外にも珍しい表現型を示したマウスを解析中ある。このマウスでは、認知症の原因の一つである正常圧水頭症に関連した表現型を示し、この異常が概日リズムと関連している可能性があることを明らかにすることは、非常にインパクトのある研究と考えられる。
膵癌の肝転移・神経浸潤機序の解明

以前より我々は膵癌周囲に広く存在する神経組織と膵癌との相互作用について注目しており、神経組織から分泌される神経栄養因子(GDNF)が膵癌の神経浸潤に対し重要であるとの報告を行ってきた。また、以前より当科では炎症性サイトカインの1つであるInterleukin-1α(IL-1α)と接着因子integrinが膵癌細胞の肝転移、神経浸潤に大きな影響を与えていることを見出してきた。今回の研究の目的は、神経栄養因子や炎症性サイトカインが膵癌の転移・浸潤能にどのように関与しているかを基礎的検討から明らかにすることである。平成16年には、GDNFやIL-1αがα6β1,α5β1-integrinの発現を増強しており、これらの変化はNF-KB、AP-1などの転写因子の活性化を介して起こっている現象であることを発見した。平成17年度には膵癌組織におけるGDNFの発現程度は膵内神経組織で強く、RETの発現程度は非癌部膵組織よりも癌部で強く、患者の予後とリンパ節転移に関与することがわかった。平成18年度には膵癌細胞におけるさらに詳細なシグナル伝達経路の検討、またintegrin関連因子(ILK, FAK)の関与、その発現レベルと膵癌患者の予後との関連につき検討を加えた。ILK活性と膵癌細胞株の浸潤能との関連につき、ILK kinase-inactive、kinase-dead、kinase-hyperactive cDNAをそれぞれ膵癌細胞に導入して検討した結果、ILK活性化と膵癌細胞の浸潤能亢進には有意な関連があり、その際に活性化される細胞内シグナル伝達経路はp38MAPK経路であることを証明した。また、FAKについても同様にsiRNAを用いた検討で、FAK活性化と膵癌細胞浸潤能との間に有意な関連を認めた。臨床検体での検討では、膵癌患者では有意に強くILKが発現しており、独立した予後規定因子となることを証明した。以前より我々は膵臓周囲に広く存在する神経組織と膵癌との相互作用について注目しており、神経組織から分泌される神経栄養因子が膵癌の神経浸潤に対し重要であるとの報告を行ってきた。また以前より当科では炎症性サイトカインの一つであるInterleukin-1α(IL-1α)と接着分子integrinが膵癌細胞の肝転移、神経浸潤に大きく影響を及ぼしていることを見出してきた。今回の研究の目的は、神経栄養因子や炎症性サイトカインがどのように膵癌の転移や神経浸潤に関与しているかを基礎的検討から明らかにすることである。平成16年度の研究計画としては、膵癌細胞におけるNF-kB、AP=1の活性測定とIL-1αや神経栄養因子GDNFによりそれらの転写因子の活性化がおこるかどうか、であった。Gel shift assayを用いた検討では,GDNFおよびIL-1αにより有意にNF-kBの活性が増強されていることが確認された。またIL-1α刺激によるintegrin発現増強と接着能の変化の検討ではIL-1αによりintegrinα6β1,α5β1の発現は有意に増強され,HUVECへの接着も明らかに亢進していた。つまりGDNFやIL-1αにより細胞内シグナル伝達は活性化しており、それらがひいては細胞接着や浸潤能亢進につながっており、これらの因子を制御することにより新しい膵癌治療の方向性が示せたと考える。この研究は平成17年、18年と計画されており、血管新生を含めて更なる研究を行う予定である。

以前より我々は膵癌周囲に広く存在する神経組織と膵癌との相互作用について注目しており、神経組織から分泌される神経栄養因子(GDNF)が膵癌の神経浸潤に対し重要であるとの報告を行ってきた。また、以前より当科では炎症性サイトカインの1つであるInterleukin-1α(IL-1α)と接着因子integrinが膵癌細胞の肝転移、神経浸潤に大きな影響を与えていることを見出してきた。今回の研究の目的は、神経栄養因子や炎症性サイトカインが膵癌の転移・浸潤能にどのように関与しているかを基礎的検討から明らかにすることである。平成16年には、GDNFやIL-1αがα6β1,α5β1-integrinの発現を増強しており、これらの変化はNF-κB、AP-1などの転写因子の活性化といった細胞内シグナル伝達を介して起こっている現象であることを発見した。平成17年の研究計画は臨床材料を用いた検討であった。今回の検討で膵癌組織におけるGDNFの発現程度は膵内神経組織で強く、RETの発現程度は非癌部膵組織よりも癌部で強いことを発見した。さらに、RETが強発現する膵癌患者では術後予後が有意に悪く、lymphatic invasionも有意に強かった。また、neural invasionは膵内神経組織におけるGDNFの発現と有意な関与を認めた。IL-1 receptor typeI(IL-1RI)の発現程度に関しては膵癌患者の病理所見、予後との間に有意な差を認めなかった。転写因子HOXD3の発現については、現在膵癌細胞株での検討を進めており、RT-PCRによるmRNAレベルでの検討、またWestern Blottingによるタンパクレベルでの検討において、いくつかの細胞株に発現を認めている。今後、平成18年度には膵癌細胞における転写因子とintegrin発現の関連、また、膵癌患者の予後との関連につき検討を加える予定である。平成16年には、GDNFやIL-1αがα6β1,α5β1-integrinの発現を増強しており、これらの変化はNF-κB、AP-1などの転写因子の活性化を介して起こっている現象であることを発見した。平成17年度には膵癌組織におけるGDNFの発現程度は膵内神経組織で強く、RETの発現程度は非癌部膵組織よりも癌部で強いことを発見した。平成18年度には膵癌細胞におけるさらに詳細なシグナル伝達経路の検討、またintegrin関連因子(ILK,FAK)の関与、その発現レベルと膵癌患者の予後との関連につき検討を加えた。ILK活性と膵癌細胞株の浸潤能との関連につき、ILK kinase-inactive、kinase-dead、kinase-hyperactive cDNAをそれぞれ膵癌細胞に導入して検討した結果、ILK活性化と膵癌細胞の浸潤能亢進には有意な関連があり、その際に活性化される細胞内シグナル伝達経路はp38MAPK
看護職の抗がん剤取り扱いにおける職業的曝露の防止対策に関する研究

1.「抗癌剤取扱マニュアル(案)」試用後調査の結果の分析前年度(16年度)に実施した「抗癌剤取扱マニュアル(案)」に対する55医療施設からの試用後調査の回答は,全項目について概ね理解できるものであり,90%以上がマニュアル(案)を導入したい意向であることが明らかになっていた.さらに今年度は,この調査の自由記述による回答内容を分析し,追加すべき項目や表現上の修正点等を明らかにした.要望された追加項目は以下の事項であった。(1)抗癌剤が皮膚に付着した場合や眼に飛び散った場合の処置方法,(2)在宅において抗癌剤治療をする時の曝露防護法,(3)保管・搬送,こぼれた時の処理,安全キャビネット内の清掃,排泄物の取扱い,汚染リネンの取扱い,廃棄物の処理法に対するチェックリスト.表現について指摘された事項は,(1)目次への細項目の記載,(2)語尾の統一,(3)誤字・脱字であった.2.「抗癌剤取扱いマニュアル」の完成と医療施設への送付上記1.で明らかになったマニュアルへの項目の追加,内容の加筆,表現の修正を行い,印刷物として完成させた.完成したマニュアルを,これまでの調査に協力してくれた約150医療施設の看護部最高管理者に送付した.3.成果発表日本の医療施設に勤務する看護師に対して実施した調査結果をもとに,"抗癌剤取扱い看護師の職業性曝露に関する認識と安全行動"という論文を作成し,日本公衆衛生雑誌に公表した.その論文の別刷を調査の対象者が所属する313施設に送付した前年度に「抗癌剤取扱いマニュアル(案)」を送付した医療施設の看護部最高管理者に対して実施したマニュアル(案)の理解や導入の意向に関する調査の結果を,第25回日本看護科学学会学術集会(青森市)において発表した.1.日本の医療施設における抗がん剤の曝露に対する防護状況の調査防護対策を推進する前段階として、日本の医療施設における抗がん剤の取扱い方と防護策の実施状況を把握するために質問紙調査を実施した.抗がん剤治療を行っている310施設の看護最高責任者を対象に、抗がん剤の取り扱い、曝露対策の実施状況、組織的な取組、防護策実施上の課題について尋ねた.回答は166施設(大学病院57、がん専門病院9、総合病院100)から得られた(回収率53.5%).化学療法部門を設置している施設は70(42.5%)であり、病院の種類と有意な関連があった.抗がん剤の準備場所は病棟が約80%で、一連の与薬作業は「注射針の刺入」で医師が多かったが、それ以外の全ての作業は看護師が行っている施設が圧倒的に多かった.最も多く使用されている防護具は手袋(80.6%)で、次いでマスク(59.4%)、ガウン(32.6%)で、30施設(18.2%)では何も使用していなかった。一度に使用する防護具は2種類(22.9%)が多かった.その他に作業環境の考慮(38.8%)、ガイドラインの使用(18.7%)、排泄物取り扱いの配慮(10.3%)であった.抗がん剤の曝露を避けるために、全ての施設で看護師に教育の必要があるとしているものの、実施している施設は34(20.7%)だけであった.防護策実施上の課題は、薬剤部等との調整困難、スペースの狭さ、コスト等であった.2.抗がん剤曝露の防護策を実施している病院の訪問調査7施設(4がん専門病院、3大学病院)を訪問し、抗がん剤を取り扱っている場面を観察した.何らかの防護策を講じているが、施設によって差があり、全体的に理想的な防護策とはいえない現状であった.1.「抗癌剤取扱いマニュアル(案)」の作成前年度(15年度)の調査結果から,日本の医療施設では看護師が抗癌剤を取扱う際の曝露対策が不十分であることが明らかになった.そこで,米国の癌看護学会(ONS)・労働省職業安全局(OSHA)・病院薬剤師会(ASHP)等のガイドラインを参考に日本の医療施設向けの「抗癌剤取扱いマニュアル(案)」の作成を試みた.「抗癌剤取扱いマニュアル(案)」は,抗癌剤を取り扱うことによる健康問題,医療従事者の抗癌剤曝露を防護する方法,安全な抗癌剤取扱いのチェックリストから成り,文章による説明の他に写真を添付して理解のしやすさに配慮した.2.医療施設における「抗癌剤取扱いマニュアル(案)」使用に関する調査作成した「抗癌剤取扱いマニュアル(案)」を,研究の趣旨に同意した78施設の看護部最高責任者に送付し,内容の理解状況およびマニュアル(案)導入の意向について調査した.回答は55施設(大学病院11,癌専門病院6,総合病院38)から得られた(回収率70.5%).マニュアル(案)の内容に対する理解を曝露対策毎にみると,抗癌剤を取り扱うことによる健康問題については全員が理解できたとし、抗癌剤曝露の防護方法ではいずれの事項についても95%以上が理解できたとしている.マニュアル(案)導入の意向をみると,いずれの曝露対策についても90%が"導入したい"としていたが,そのうち"導入したいができそうにない"との回答も多く,理由としては経済的問題や薬剤部門等の他部門との協力の困難さが挙げられていた.写真の位置や表現に対する意見も自由記述式で述べられていた.

1.「抗癌剤取扱マニュアル(案)」試用後調査の結果の分析前年度(16年度)に実施した「抗癌剤取扱マニュアル(案)」に対する55医療施設からの試用後調査の回答は,全項目について概ね理解できるものであり,90%以上がマニュアル(案)を導入したい意向であることが明らかになっていた.さらに今年度は,この調査の自由記述による回答内容を分析し,追加すべき項目や表現上の修正点等を明らかにした.要望された追加項目は以下の事項であった。(1)抗癌剤が皮膚に付着した場合や眼に飛び散った場合の処置方法,(2)在宅において抗癌剤治療をする時の曝露防護法,(3)保管・搬送,こぼれた時の処理,安全キャビネット内の清掃,排泄物の取扱い,汚染リネンの取扱い,廃棄物の処理法に対するチェックリスト.表現について指摘された事項は,(1)目次への細項目の記載,(2)語尾の統一,(3)誤字・脱字であった.2.「抗癌剤取扱いマニュアル」の完成と医療施設への送付上記1.で明らかになったマニュアルへの項目の追加,内容の加筆,表現の修正を行い,印刷物として完成させた.完成したマニュアルを,これまでの調査に協力してくれた約150医療施設の看護部最高管理者に送付した.3.成果発表日本の医療施設に勤務する看護師に対して実施した調査結果をもとに,"抗癌剤取扱い看護師の職業性曝露に関する認識と安全行動"という論文を作成し,日本公衆衛生雑誌に公表した.その論文の別刷を調査の対象者が所属する313施設に送付した前年度に「抗癌剤取扱いマニュアル(案)」を送付した医療施設の看護部最高管理者に対して実施したマニュアル(案)の理解や導入の意向に関する調査の結果を,第25回日本看護科学学会学術集会(青森市)において発表した.
筋・腱・骨 複合組織再生へ向けた基礎的研究：動力機能を獲得するメカニズムの解明

軟口蓋における口蓋腱膜、蝶形骨翼状突起、口蓋帆帳筋が滑車構造(筋-腱-骨複合体)をどのように形成するのかを明らかにするために本研究をおこなった。口蓋帆帳筋と口蓋腱膜はマウスの胎生16.5日においてはじめて結合し、この同時期に蝶形骨翼状突起は急成長し、同部における破骨細胞数も有意に増加した。以上より、口蓋帆帳筋と口蓋腱膜が結合する時期に、蝶形骨翼状突起が急成長することが分かった。したがって、筋と腱が結合することにより開始した筋収縮のメカニカルストレスが、骨の成長を促すことが示唆された。顎顔面領域で舌や口腔底部、下顎周囲の腫瘍により下顎骨を切除した症例は、下顎の左右対称性が失われ、機能時にきわめて不安定な運動様相を呈する。現在、切除された下顎骨はチタンプレートと自家骨移植の併用などにより再建手術が行なわれているが、切離した筋と骨の再付着ができず、咀嚼機能障害などの術後合併症に悩む患者が後を絶たない。この問題を解決するため、筋付着部の再生に向けた筋-腱-骨複合体発生・組織構築メカニズムの基礎研究を進める必要がある。運動器とは、筋、骨、軟骨といった主要組織が腱・靭帯で強固に結びつくことによって動力機能を得るもので、これまで筋、腱、骨、軟骨といった組織単体に対する研究は発生・再生の両面から進められてきた。しかし、筋-腱-骨複合体の組織構築発生・分化メカニズムが長い間不明のままであったため、それら複数組織がいかに1つの機能的な組織を作り上げるかという命題に対して、未だ十分な仮説すら提示されてこなかった。本研究では、骨化様式による筋-腱-骨複合体の組織構築メカニズムの違いを明らかにすることを目的とした。さらに、筋-腱接合部形成細胞の特性の一端を解明することとした。本研究を遂行することにより、iPS細胞や間葉系幹細胞から分化誘導された筋、軟骨、骨などの単一組織を、強靭に融合させるメカニズムが解明できると考えている。さらに、将来的には分化誘導した単一組織を結合した筋-腱-骨複合体の移植が可能となり、損傷した筋付着部を再建できる新たな治療法の開発につながると信じている。骨の発生様式における筋-腱-骨の組織構築の違いを明らかにするためには、(1)膜性骨化により発生する下顎骨と咀嚼筋の付着過程と、(2)軟骨内骨化により発生する尺骨と上腕三頭筋の付着過程を比較解析する必要がある。初年度は、下顎頭と外側翼突筋、下顎骨咬筋粗面と咬筋、尺骨の肘頭と上腕三頭筋のそれぞれの付着領域を胎生期マウスから採取し、形態学的に付着過程を解析した。その際、骨と腱の双方の未分化間葉細胞に発現するSOX9の局在を明らかにすることで、膜性骨特有のenthesis(腱-骨移行部)の発生メカニズムを解析した。また、同時に腱の出現位置を明らかにするために、AZAN染色、Desmin+アルカリフォスファターゼの二重染色(免疫組織化学的染色)、Type II collagen(免疫組織化学的染色)をおこなった。その結果、胎生1318日齢のマウスにおける肘頭のenthesisの発生部位にはSOX9が常に発現していた。一方、翼突筋窩のenthesisにおいては、胎生13日まではSOX9の発現を認めたが、その後下顎頭軟骨の急速な上方への発達と下顎頭軟骨周囲に発生する骨襟(膜性骨)の出現により、enthsisへのSOX9の発現が認められなくなった。また、軟骨が発生に全く関与しない咬筋粗面のenthesisはどの時期においてもSOX9は発現しなかった。運動器は身体運動と構造安定のために協調する効率的な組織の集合体である。運動器を構成するコンポーネントである筋、腱、骨格系(骨や軟骨)は互いに影響を及ぼしながら発生・分化するために、筋、腱、骨格系を1つの機能的な器官として捉えて発生学的な解析をする必要がある。しかしながら、筋、腱、骨格系がどのような過程を経て1つの機能的な複合組織を作り上げるかについては十分に理解されていない。そこで本研究では、発生初期にSRY-box containing gene 9(Sox9)を発現する腱・骨格系前駆細胞に着目し、Sox9+腱・骨格系前駆細胞群(Sox9+細胞群)と筋原基の結合過程を経時的に解析することにより、運動器の組織構築機序を検索した。試料として胎生12.517.5日のICRマウスを用いた。主な観察対象部位は、上腕三頭筋の尺骨への付着部、外側翼突筋の下顎頭への付着部とした。また、凍結切片ならびにパラフィン切片を作製し、続いて各種免疫組織化学的染色ならびにin situハイブリダイゼーションを行った。また、免疫組織化学的染色の結果から、外側翼突筋の下顎頭への付着部におけるBudU陽性増殖細胞の数を計測した。結果より、胎生13.5日の上腕三頭筋の尺骨への付着部において、Sox9+細胞群とDesmin+の筋腱接合部は接触していた。胎生14.516.5日になるとSox9は腱-軟骨接合部と軟骨に限局して発現した。

一方で胎生13.514.5日の外側翼突筋の下顎頭への付着部においてもSox9+細胞群とDesmin+の筋腱接合部は接触していた。しかしながら、胎生15.516.5日においては同部におけるSox9の発現は減弱した。したがって、筋、腱、骨格系の結合初期において筋原基とSox9+細胞群が結合を開始し、付着する骨の骨化様式に合わせてSox9の発現傾向は変化することが示唆された。軟口蓋における口蓋腱膜、蝶形骨翼状突起、口蓋帆帳筋が滑車構造(筋-腱-骨複合体)をどのように形成するのかを明らかにするために本研究をおこなった。口蓋帆帳筋と口蓋腱膜はマウスの胎生16.5日においてはじめて結合し、この同時期に蝶形骨翼状突起は急成長し、同部における破骨細胞数も有意に増加した。以上より、口蓋帆帳筋と口蓋腱膜が結合する時期に、蝶形骨翼状突起が急成長することが分かった。したがって、筋と腱が結合することにより開始した筋収縮のメカニカルストレスが、骨の成長を促すことが示唆された。今後は翼突筋窩、咬筋粗面、肘頭のenthsisにおけるTypeI collagen, Tenascin, Tenomodulinなどの局在をSOX9と共に明らかにし、転写レベルでの検索も追加する予定である。また、形態学的に筋と骨の付着メカニズムの過程を三次元で把握するために、組織連続切片から3D立体構築を行うこととなっている。筋-腱接合部形成細胞の特性については、形態学的に筋芽細胞と筋管細胞との違いを明らかにするために、共焦点レーザー顕微鏡を用いて1細胞あたりの3次元構造を解析する。また、マイクロダイゼクションで筋-腱接合部形成細胞を分離し、マイクロアレイにて遺伝子の網羅的解析を行う予定である。発生学研究を進めていく上で必要に応じて研究費を執行したため当初の見込み額と執行額は異なったが、研究計画に変更はなく、前年度の研究費も含め、当初予定通りの計画を進めていく。3D立体構築ソフトであるAmiraの納品が遅れ、28年度の研究費に未使用額が生じたが、次年度に納入されるため、今年度行う予定の研究計画と併せて実施する。