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iPS細胞による次世代骨・軟骨再生療法のための培養誘導技術の開発

iPS細胞から胚様体形成を行わずに平面培養だけで高効率に骨芽細胞系細胞を作製することが可能となった。作製した骨芽細胞系細胞とマウス骨髄由来間葉系幹細胞および頭蓋骨由来細胞を比較した結果、高いアルカリフォスファターゼ活性を示すだけでなく、増殖能、遊走能および骨形成能をもつことを特徴としていた。また本細胞は、ホックスおよびセマフォリン遺伝子群の一部を共発現していた。我々は、無血清培地、低酸素培養および表面加工処理された培養皿に加え、低分子化合物およびサイトカイン添加などの因子を組み合わせることにより、iPS細胞から骨芽細胞系細胞を高い効率で作製することに成功した。大型骨・軟骨欠損を対象とした画期的な次世代再生療法の開発のためには、iPS細胞による培養誘導技術を確立する必要がある。我々は、まず動物細胞を用いて、iPS細胞から間葉系前駆細胞へ分化誘導する培養環境条件の最適化を行い、高効率な誘導条件を決定するに至った。具体的には、EB形成を経ずに平面培養のみにより、無血清培地にて6種類のサイトカインと2種類の低分子化合物による段階的な培養誘導であり、2種類の異なる表面処理が施された培養皿の使用に加え、5%酸素濃度下で低酸素培養を段階的に併用する独自の分化誘導法を確立した。また、間葉系前駆細胞作製のためのさらなる効率化を目指し、マイクロアレイおよび次世代シーケンサーによる網羅的遺伝子発現解析、トランスクリプトーム解析を行い、分化誘導法の評価のみならず新規の分化誘導候補因子の解析を行ってきた。現在、バイオインフォマティクスを駆使した新規候補因子の絞り込み、因子同定も同時に進めており、分化誘導培養および作製細胞に関する種々の評価法が整ったところである。また、ヒトiPS細胞への応用を考慮し、サイトカインを使用せず低分子化合物のみによる新たな分化誘導法について、マトリックスコーティングおよび低温プラズマ照射など、培養皿の各種表面処理を併用し最適化を行っている。さらに、iPS細胞から作製した間葉系前駆細胞の組織再生能と安全性を評価するため、NOGマウスやヌードマウスを用いて実験動物への細胞移植を行い、骨組織再生能および造腫瘍性試験法の評価法確立を行い、移植した作製細胞ごとに実施を重ねている。今年度の成果概要としては、1動物iPS細胞の間葉系前駆細胞への分化誘導条件の最適化、2間葉系前駆細胞の培養誘導に関する純化、増幅法の確立、3新規分化誘導因子の候補絞り込み、4作製した間葉系前駆細胞の骨再生能および安全性に関する評価法の確立、などを達成した。大型骨軟骨欠損を対象とした画期的な次世代再生療法の開発のためには、iPS細胞による新しい培養誘導技術を確立する必要があった。我々は、今年度までに動物iPS細胞を用いた間葉系前駆細胞への分化誘導するための培養誘導条件の改良を重ね最適化に関する基礎的検討を行ってきた。その結果、間葉系前駆細胞より成熟した骨芽細胞系細胞に近い特性を有すると考えられる細胞を作製することが可能となった。具体的なiPS細胞から骨芽細胞系細胞への培養誘導法としては、FGF、BMPなどをはじめとする6種類のサイトカインと2種類の低分子化合物を濃度勾配により段階的に組み合わせ添加する誘導法を採用した。無血清下でEB形成を経ずに単層培養法のみで行い、低酸素培養と表面処理された培養皿を段階的に併用した。その結果、培養誘導開始から4週間後には、基質石灰化形成を認める骨芽細胞系細胞が作製することが可能となった。この作製細胞は、継代後8週12週間を経ても高いアルカリフォスファターゼ(ALP)活性を示すだけでなく、増殖能を失っていなかった。作製されたALP陽性を示す細胞は80%以上に及び、骨芽細胞分化液性因子の添加により約10日間で石灰化形成能を示したことから、高い骨形成能と増殖能を有する成熟した骨芽細胞系細胞を作製する培養誘導法を確立することができた。また骨芽細胞系細胞の三次元組織化については、三次元力学負荷装置を用いて培養人工骨を作製し、実験動物生体内での骨形成能と安全性を確認中である。さらに本培養誘導系では、マイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析を行い、分化指向性の確認と新規分化誘導因子の探索を進めており、複数の新規分化マーカー候補を同定している。今年度の成果概要としては、1動物iPS細胞から骨芽細胞系細胞への分化誘導条件の最適化、2新規分化マーカーの同定、3骨芽細胞系細胞の三次元組織化を達成した。今年度は、前年度に引き続き動物iPS細胞を用いて、間葉系幹細胞に比べより骨芽細胞系細胞に近い特性を有する骨芽細胞系細胞を作製するための分化誘導条件の最適化を行った。その結果、iPS細胞から骨芽細胞系細胞を培養誘導し、大量に作製する分化誘導法を確立することができた。作製した骨芽細胞系細胞は、FACS、遺伝子発現解析、ALP活性、増殖能および石灰化能を有することから、高い骨形成能をもつ成熟した骨芽細胞系細胞であることを確認している。本培養誘導法は、段階的な低酸素培養と表面処理された培養皿を併用することにより、無血清下でEB形成を経ずに平面培養だけでも大量に培養誘導可能な技術である。動物iPS細胞による骨芽細胞系細胞への分化誘導条件の最適化は完了しており、新たな分化誘導因子候補の同定も行い検証を進めている。また本培養誘導法の三次元組織化の最適化を行うと同時にヒト細胞への応用も開始している。

サイトカインに頼らない化合物だけによる分化誘導法の最適化も進めており、作製した骨芽細胞系細胞の生体内での骨形成能と安全性の評価についても現在進行中である。上記に挙げた今年度の成果概要の通り、本研究はほぼ予定通り実施、達成できている。本研究の目的は、従来から行われている間葉系幹細胞による骨芽細胞の作製に頼らない、無限の増殖能と分化能を合わせ持つiPS細胞から間葉系前駆細胞へ分化誘導し、より多くの骨芽細胞系細胞を細胞源とする三次元組織化を目指した次世代骨・軟骨の再生療法の確立である。本研究ではiPS細胞から間葉系前駆細胞への分化誘導を行い、培養人工骨作製技術の最適化を行った。主な内容としては、1iPS細胞由来間葉系前駆細胞への分化誘導法の最適化、2間葉系前駆細胞から作製した骨芽細胞系細胞の特性解析、3実験動物への培養人工骨移植による骨再生能および造腫瘍性の評価などである。iPS細胞由来の間葉系前駆細胞、骨芽細胞系細胞への分化誘導法の最適化については、6種類のサイトカインと2種類の化合物の濃度と添加時期を組み合わせた基礎的検討に加え、初期の分化誘導過程に沿った二段階の低酸素培養法の併用などにより、骨芽細胞系細胞への分化誘導プロトコールの最適化を行った。iPS細胞から分化誘導し作製した骨芽細胞系細胞の特性については、骨髄由来間葉系幹細胞および頭蓋骨由来骨芽細胞に比較して増殖能、遊走能がともに高いだけでなく、著しく高いアルカリフォスファターゼ活性を有しており、分化液性因子の添加にともない基質石灰化が生じることを確認した。また、網羅的な遺伝子発現解析の結果から、HoxbおよびSemaphorin遺伝子がクラスター発現を示すことも特徴の一つであることを見出した。作製した骨芽細胞系細胞による培養人工骨を実験動物に移植した結果、移植時期が早期になる場合、あるいはサイトカイン添加が高濃度の場合には腫瘍化し易いことが判明した。このため移植時期は、分化誘導開始から少なくとも8週12週以降にすべきであり、ActivinだけでなくBMPにおいても段階的に適切な濃度での添加が必要となることを明らかにした。iPS細胞から胚様体形成を行わずに平面培養だけで高効率に骨芽細胞系細胞を作製することが可能となった。作製した骨芽細胞系細胞とマウス骨髄由来間葉系幹細胞および頭蓋骨由来細胞を比較した結果、高いアルカリフォスファターゼ活性を示すだけでなく、増殖能、遊走能および骨形成能をもつことを特徴としていた。また本細胞は、ホックスおよびセマフォリン遺伝子群の一部を共発現していた。我々は、無血清培地、低酸素培養および表面加工処理された培養皿に加え、低分子化合物およびサイトカイン添加などの因子を組み合わせることにより、iPS細胞から骨芽細胞系細胞を高い効率で作製することに成功した。初年度は、まず動物細胞を用いて、EB形成を経ずに平面培養によりiPS細胞から間葉系前駆細胞を大量に作製するために必要となる高効率な培養誘導法の最適化を中心に実施した。今年度の成果としては、1iPS細胞の間葉系前駆細胞への分化誘導法の確立、2間葉系前駆細胞の純化、増幅法の確立、3新規分化誘導因子の候補絞り込み、4作製した間葉系前駆細胞の評価法の確立、など4項目を達成することができた。培養誘導に関する基本的なプロトコールの確立はほぼ完了しており、さらなる培養誘導の効率化を目指した分化誘導法の検証、新規候補因子の同定および造腫瘍性試験など、安全性の評価も現在進行中である。
離散事象システムの解析と合成に関する基礎研究

本研究期間に入る前に,筆者らは,条件/事象ネット(プレースの容量が1のペトリネット)に対して,“仕様として与えられた半語の集合に対して,アクティビティがそれと一致するような条件/事象ネットを求めよ"という合成問題(この問題は,条件/事象ネットを合成する際に補助事象の導入を許すかどうかに応じて,補助事象導入合成問題と補助事象無し合成問題に大別される)を定め,それの性質・解法等について検討してきた.本研究では,その結果をもとにして,次のことを行った.1.条件/事象ネットに対して,与えられた半言語に適合するアトム(これは上記合成問題の可解性の検討に関連して導入された概念.)全体の集合を求めるアルゴリズムの開発を行った.2.前項の結果を応用して,補助事象無し条件/事象ネット合成問題の解全体の集合を求めるアルゴリズムの開発を行った.3.プレースの容量が有限のペトリネットに対して,条件/事象ネットについて考えたと同様の合成問題を定めるとともに,それが解をもつために仕様が満たすべき条件について考察した.4.仕様が階層構造をもつ形で記述される条件/事象ネット合成問題を考え,それに対して,下位レベルの合成問題の解から上位レベルの合成問題の解を求める方法を導き,条件/事象ネットの段階的詳細化の1つの枠組みを与えた.5.条件/事象ネットの補助事象導入合成問題に対して,それが解をもつための1つの必要十分条件が筆者らによってすでに与えられていたが,解を機械的に求めるための実用的なアルゴリズムはまだ得られていなかった.この研究期間では,仕様として与えられる半言語が有限である場合と周期的である場合に対して,1つずつアルゴリズムを与えた.本研究期間に入る前に,筆者らは,条件/事象ネット(プレースの容量が1のペトリネット)に対して,“仕様として与えられた半語の集合に対して,アクティビティがそれと一致するような条件/事象ネットを求めよ"という合成問題(この問題は,条件/事象ネットを合成する際に補助事象の導入を許すかどうかに応じて,補助事象導入合成問題と補助事象無し合成問題に大別される)を定め,それの性質・解法等について検討してきた.本研究では,その結果をもとにして,次のことを行った.1.条件/事象ネットに対して,与えられた半言語に適合するアトム(これは上記合成問題の可解性の検討に関連して導入された概念.)全体の集合を求めるアルゴリズムの開発を行った.2.前項の結果を応用して,補助事象無し条件/事象ネット合成問題の解全体の集合を求めるアルゴリズムの開発を行った.3.プレースの容量が有限のペトリネットに対して,条件/事象ネットについて考えたと同様の合成問題を定めるとともに,それが解をもつために仕様が満たすべき条件について考察した.4.仕様が階層構造をもつ形で記述される条件/事象ネット合成問題を考え,それに対して,下位レベルの合成問題の解から上位レベルの合成問題の解を求める方法を導き,条件/事象ネットの段階的詳細化の1つの枠組みを与えた.5.条件/事象ネットの補助事象導入合成問題に対して,それが解をもつための1つの必要十分条件が筆者らによってすでに与えられていたが,解を機械的に求めるための実用的なアルゴリズムはまだ得られていなかった.この研究期間では,仕様として与えられる半言語が有限である場合と周期的である場合に対して,1つずつアルゴリズムを与えた.本研究では,6年度までに,条件/事象ネット(プレースの容量が1のペトリネット)に対して,それのアクティビティなるもの(そのネットから定まる一つの半語の集合)を考え,“仕様として与えられた半語の集合に対して,アクティビティがそれと一致するような条件/事象ネットを求めよ"という合成問題を定め,それが解をもつための条件と一つの解法を示した.7年度では,上の結果をもとに,条件/事象ネットとプレースの容量が有限のペトリネットに対して,それぞれ次のことを行った.1.条件/事象ネットに対して.まず,与えられた半言語に適合するアトム(これは上記合成問題の可解性の検討に関連して導入された概念.)全体の集合を求めるアルゴリズムの開発を行い,次に,これを応用して,合成問題の解全体の集合を求めるアルゴリズムの開発を行った.さらに,仕様が階層構造をもつ形で記述される合成問題を考え,それの可解性と解法に関する検討を行った.2.プレースの容量が有限のペトリネットに対して.条件/事象ネットについて考えたと同様の合成問題を定めるとともに,それが解をもつために仕様が満たすべき条件について考察した.結果の要点は次の(1),(2)の通りである。.(1)同じ事象が並行的に生起することが仕様に含まれない場合.この場合には,ペトリネットの合成問題が条件/事象ネットの合成問題に帰着されること,すなわち,条件/事象ネットの合成問題が解を持たなければ,どんなペトリネットも解にはなり得ないことがわかった.(2)同じ事象の並行的な生起が仕様に含まれる場合.この場合については,ペトリネットの合成問題が解を持つための2つの必要条件を導いた.本研究では,7年度までに,条件/事象ネット(プレースの容量が1のペトリネット)に対して,それらのアクティビティなるもの(そのネットから定まる一つの半語の集合)を考え,"仕様として与えられた半語の集合に対して,アクティビティがそれと一致するような条件/事象ネットを求めよ"という合成問題(この問題は,条件/事象ネットを合成する際に補助事象の導入を許すかどうかに応じて,補助事象導入合成問題と補助事象無し

合成問題に大別される)を定め,それの性質・解法等について検討してきた.8年度では,上の結果をもとに,ペトリネットの段階的詳細化とペトリネットの解析・合成支援システムに関して,次のことを行った.1.ペトリネットの段階的詳細化について7年度から,仕様が階層構造を持つ形で記述される合成問題を考え,それの可能性と解法に関する検討を行っている.7年度ではこれを,補助事象無し合成問題について考えたのに対し,この年度ではこれを,補助事象導入合成問題について考えた.その結果に基づいて,下位レベルの合成問題の解から上位レベルの合成問題の解を求める方法を導き,条件/事象ネットの段階的詳細化の1つの枠組みを与えた.2.ペトリネットの解析・合成支援システムについて条件/事象ネットの補助事象導入合成問題に対して,それが解をもつための1つの必要十分条件が筆者らによってすでに与えられていたが,解を機械的に求めるための実用的なアルゴリズムはまだ得られていなかった.この年度では,仕様として与えられる半言語が有限である場合と周期的である場合に対して,1つづつアルゴリズムを与えた.
金属強磁性体の磁性電子運動量分布の温度変化

アモルファスGdxFel-x(x=0.22,0.33,0.52,0.60)合金の磁性電子運動量分布の測定を行った。この化合物はフェリ磁性を示し、Gdの4f電子の磁気モーメントに対し、Feの3dの磁気モーメントが逆にカップルしている。この物質の電子状態について、磁気コンプトン散乱実験を行い系統的な情報を得ることに成功した。この実験手法では、高エネルギーのX線と電子とのコンプトン散乱を利用することにより、電子の運動量分布を調べることができる。また円偏光X線を用いると電子スピンの向きにより散乱断面積が異なるため、磁性電子のみの情報を得ることができる。この測定物質では、Gdの4f磁性電子、Feの3d磁性電子、およびs,p的な偏極した伝導電子を合わせた運動量密度分布が観測される。ただし、これらの各電子の運動量空間内での分布がかなり異なるため、曲線最適化を行い、それぞれの存在比を知ることができる。この様に磁性電子の存在比を知ることのできる実験手法は、他に例がなく、磁気コンプトン散乱実験の利点を表している。この物質のTcは組成によって大きく変化し500Kから700K近傍にある。また、全磁気モーメントの温度変化も組成によって大きく異なる。今年度は、それぞれの組成において低温(10K)から室温までの温度領域において磁気コンプトン散乱実験を行った。その結果、4f磁性電子、3d磁性電子、およびs,p的な偏極した伝導電子の温度変化が組成によって大きくなる事が明確になった。またこの温度変化は、単純な分子場近似法によって説明され得ることがわかった。今年度は、加熱炉の製作を行った。これを使用し今後高温領域(室温-900K)もカバーする予定である。従ってより広い温度領域の測定が可能となり、今後のこの研究の発展が期待される。
眼科悪性腫瘍(網膜芽細胞腫等)に対する遺伝子治療に関する基礎的研究

現在まで、各種悪性腫瘍に対する遺伝子治療の基礎的研究あるいは臨床治験が進められているが、眼科領域あるいは眼内悪性腫瘍に関する研究には乏しい。本研究の目的は、網膜芽細胞腫を主体に、他の致死的な眼科関連腫瘍(眼内悪性リンパ腫、脈絡膜悪性黒色腫、脂腺癌等)に対する遺伝子治療の臨床応用につなげる基礎的データを得ることである。ヒト網膜芽細胞腫培養細胞(Y79)に、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV-TK)遺伝子を導入させた細胞株(Y79-TK)を樹立し、in vitro及びin vivoにおいて、ガンシクロビル(GCV)による抗腫瘍原生を確認してきた(Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.40:265,1999)。現在まで、Y79-TK細胞株として、7つの異なる細胞株を樹立しており、in vitroにて、再度GCVによる抗腫瘍性の差異を検討したと共に、ヌードマウスにおいて、硝子体内及び腫瘍転移モデルとして頭蓋内及び腹腔内にY79-TK細胞及びY79細胞を移入するため、大量の細胞培養を継続中であり、十分な細胞数が得られ次第、in vivoの研究に入る予定である。また、他の致死的眼科関連疾患に対する本研究を進める目的で、一例のヒト眼中枢神経系悪性リンパ腫患者において、硝子体手術の際、患者の同意を得た上で、硝子体内に浸潤しているリンパ腫細胞を分離したのち、新たな細胞株の樹立に向け、培養中である。また、他の致死的眼科関連疾患に対する本研究齲を進める目的で、一例のヒト眼中枢神経系悪性リンパ腫患者において、硝子体手術の際、患者の同意を得た上で、硝子体内に浸潤しているリンパ腫細胞を分離したのち、新たな細胞株の樹立に向け、培養中である。
魯迅をめぐる日本人-新資料の発掘-に関する研究

魯迅をめぐる日本人のうち、内山完造、児島亨(中村亨)、須藤五百三、及び林芙美子、に関する新資料の発掘を行った。調査の対象とした中村耕雲の旧宅(岡山県後月郡)からは、内山完造、内山嘉吉等の書簡、写真と、内村鑑三の自筆原稿等が発掘され、また、魯迅日記に二度登場する林芙美子が所蔵してきた、魯迅から贈られた腕輪と、方紀生から贈られた化粧箱が新資料として発掘された。その研究成果は論文としてまた国際学会において報告した。魯迅をめぐる日本人のうち、内山完造、林芙美子、児島亨、及び須藤五百三に関する新資料の発掘を研究の目的とした。この研究の目的を達成するために、A.伝魯迅贈林芙美子腕輪の解明、B.中村耕雲に関する資料の発掘、C.中村耕雲旧宅に残る文化遺産の掘起し、D.須藤文庫の調査、E.内山完造三家系の系譜の構築の、AからEまでを並行して実施する計画であったが、Dについては実施することができなかった。しかし、A、B、C、Eにおいては、それぞれの研究の進展に比例する新発見があった。Aでは、国立国会図書館の東京本館と関西館での華字新聞と日本語新聞の資料を調査することによって、林芙美子と満洲の接点を示す資料が得られ、魯迅との関連性の強弱をつかむことができた。また、厦門大学で開催された、魯迅国際学術研討会において「林芙美子所蔵の魯迅と釋芝峰の親筆墨跡及びその他の文物について」と題して研究発表を行い、魯迅と腕輪に関する中国の研究者の見解を収集することができた。また、魯迅揮毫「歸雁」詩の作年代を考証した論文を著して、本学紀要に発表した。Bでは、昌平坂学問所で学んだ飫肥藩士、阿萬豊蔵と中村耕雲の関係とその事蹟を明らかにすることができた。飫肥の郷土史にとって中村耕雲の薬草調査は新知見のことで、小村寿太郎記念館の研究者に関係資料を提供することができた。Cでは、中村耕雲旧宅に残る文書資料のほぼすべてを収集することができた。内山完造の葉書、写真、内山嘉吉の葉書と長男の写真などは新資料といえるものである。Eでは、内山完造の姪の子息の内山氏への調査の過程で、内山完造に宛てた佐藤春夫の書簡の存在が明らかになった。これは和歌山県新官市の佐藤春夫記念館を中心とする佐藤春夫研究者にとっては、新発見の書簡であった。以上の研究調査を継続して行うことにより、更なる新資料の発掘が期待できる。魯迅をめぐる日本人のうち、内山完造、児島(中村)亨、林芙美子及び須藤五百三について、それぞれが残した魯迅に関する文物資料のうち、未だ世に知られていない未発見の資料を、新たに発掘することを目的とした。平成22年度4月に行った、児島(中村)亨の祖である江戸末の漢方医中村耕雲の旧宅の調査では、江戸期以来の母屋が倒壊したことが判明した。1月末に降った大雪が原因と思われる。母屋の横に建つ農具等を納めた小屋は健在で、内に風呂敷に包まれた幾つかの遺物があり、その中からは、児島(中村)亨の叔父中村文太郎、従兄弟中村喜久太、その長男中村九郎に関係する、書簡、写真、雑誌、自筆原稿等が見つかった。特筆すべきは、上海北四川路から発送された内山完造と児島(中村)亨の書簡とそれぞれの写真、及び、雑誌『浙江文化研究』、『中国文學』、新聞『日本文化時報』等の発行物があったことで、更に大書すべきことには、内村鑑三の『聖書之研究』の自筆原稿15枚が見つかったことである。また平成22年度9月には、林芙美子が魯迅から贈られたと伝わる腕輪の真相解明のために、黒竜江省宝清県に入り実地調査を行った。当地では档案館や史志辮を訪れて得た情報から、林芙美子が『凍れる大地』で記した兵舎や病院、協和会本部を特定することができた。この調査の報告は、論文に著して本学紀要に発表した。宝清県への途次に経由した北京では、魯迅と周作人が居住した八道弯11号の四合院を調査し、多くの日本文人が詣でた路地の原姿を見ることができた。また平成23年3月には、『初期社会主義研究』誌により、森近運平(大逆事件で幸徳秋水と共に刑死。中村家と同地の高屋村出身)から中村喜久太に宛てた書簡3通が存在することが判明し、また中村喜久太の弟、中村登が森近運平と同年齢で共に高屋小学校で学んだことが確認され、本研究は新たな展開を迎えることになった。これは現在調査中である。

魯迅をめぐる日本人のうち、林芙美子、内山完造、児島(中村)亨について、それぞれが残した魯迅に関する文物資料とその背景を調査することを目的とした。平成23年8月の長春調査では、林芙美子と協和会との関係を明らかにするために、吉林省档案館、吉林省方志館、吉林省図書館等の資料に当たり、吉林省社会科学院の王慶祥氏から偽満期の調査をする便宜を得た。また新京の協和会本部、新京日日新聞社、関東軍官舎などの遺跡を実地に検証した。平成23年12月の水戸調査では、上海内山書店の店員であった中村亨の祖中村耕雲の事跡を記した佐藤方定(水戸藩士)著『備急蓬莱八薬新論』(安政四年刊)の背景を調査した。また明治大学では、周作人と関係がある方紀生の父・方宗鰲が商科に在籍したことを「清国留学生学籍簿」により確認し、林芙美子記念館では林福江氏が所蔵する写真帳8冊を閲覧し、芙美子が自書した説明の中に「方紀生」の名がありそれを撮影保存することができた。平成24年1月の林福江氏資料調査では、芙美子の書き損じ原稿244枚を調査し、また文芸評論家尾形明子氏と面談し満洲と女流作家について情報交換をした。平成24年3月の鹿児島調査では、林芙美子の自筆原稿と、改造社の山本實彦に宛てた胡適、堺利彦等の書簡を閲覧調査し、屋久島調査では、芙美子の「浮雲」「屋久島紀行」に記されたトロッコ道、営林署官舎、安房館等を実地に検証した。また、長野県山ノ内町角間の調査では、志賀高原ロマン美術館が林福江氏から借用した芙美子の書簡一枚と、尾道東高等学校が所蔵する芙美子の書簡一枚と合わせて元来の一通となる可能性があることが分かり、後に尾道市教育委員会を通して調査したところ一通の書簡であることが判明した。また同じく3月には、方紀生が京都に居住していた形跡を調査した。その結果四条大宮に現存する賀陽コーポラスに居住していたことが判明した。
骨髄赤芽球造血ニッチの解明

遺伝子改変マウスを用いて、骨髄中で造血を助ける細胞について解析した。骨髄中の特定の非造血細胞(nestin発現細胞)において、細胞内の特定のシグナル系統が働かないようにすることで、骨髄における赤血球造血が障害されることが明らかになった。この原因は、nestin発現骨髄非造血細胞に異常が生じた結果、骨髄局所においてマクロファージと呼ばれる赤血球造血を助ける細胞からインターロイキン6という物質が過剰に分泌されるようになり、これが赤血球造血に悪影響を及ぼすためであることが明らかになった。(背景)血液細胞は絶え間なく骨髄で産生されている。このためには、造血を支持する環境(微小環境と呼ばれる)が必要である。この微小環境は造血支持細胞によって作られるが、造血支持細胞にはさまざまな由来の細胞があり、その全貌は明らかになっていない。(目的と方法)本研究の目的は、遺伝子改変マウスと患者骨髄サンプルを駆使して、骨髄の造血支持細胞の実態を明らかにすることである。特に、造血支持細胞の中で、重要な機能を持つと報告されている、"nestin"というタンパク質を発現する細胞に注目する。マウスを用いる研究では、"NOTCHシグナル"という細胞内シグナルが、"nestin"を発現する細胞でのみ伝達されないように遺伝子を改変したマウスを作製して解析に用いる。患者サンプルを用いる研究では、免疫染色という手法を用いて"nestin"を発現する細胞の分布や数の異常を検討する。(結果)(1)"Nestin"発現細胞だけで"NOTCH"シグナルが伝わらないように遺伝子を改変したマウス(nestin-NOTCH障害マウス)は、骨髄における赤血球系統の血液細胞産生が障害されていた。一方で、脾臓において赤血球系統の血液細胞産生が亢進していた。また、正常(野生型)マウスの骨髄細胞をレシピエントマウスに移植する実験を行う際、レシピエントマウスとしてnestin-NOTCH障害マウスを用いると、この遺伝子改変マウスそのものと同様に、骨髄における赤血球造血の障害と脾臓における赤血球造血の亢進が観察された。(2)Nestin-NOTCHマウスにおける異常の原因を検索するために、正常、およびNOTCHシグナルが伝わらない、"nestin"発現細胞からRNAを調整した。(3)骨髄異形成症候群患者の骨髄標本の免疫染色により、"nestin"を発現する造血支持細胞が増加していることが明らかになった。(結論)マウスおよび患者双方で、"nestin"発現造血支持細胞について情報が得られた。予定した遺伝子改変マウスの異常についての解析が進み、またその分子基盤について解析する準備も整っている。また、骨髄異形成症候群患者骨髄でnestin陽性細胞が増えていることを見出し、この由来解明に向けて免疫染色による解析が進んでいる。Nestinプロモーターが働く細胞で、蛍光タンパク質(green fluorescent protein; GFP)が発現し、同時にNOTCHシグナルに必須のDNA結合タンパク質であるRbpjが欠失するマウス(nestin-Rbpj欠失マウス)を作製したところ、骨髄が白色調を呈していたことから、本研究においては骨髄赤芽球ニッチの解析を目的として研究を行った。このマウス骨髄では、CD45(-)の非造血細胞の約0.1%でGFPが発現していたが、CD45(+)の造血細胞ではGFP発現細胞は検出されなかった。Nestin-Rbpj欠失マウスでは、骨髄が白色調を呈するとともに脾腫が認められた。骨髄では成熟赤芽球が著明に減少しており、脾臓では成熟赤芽球の割合が増えていた。致死量の放射線照射後のRbpj欠失野生型マウスに、野生型マウス由来の骨髄細胞を移植すると、生着後にもとのnestin-Rbpj欠失マウス同様の骨髄成熟赤芽球減少と脾腫が認められた。一方、放射線照射後の野生型マウスに、nestin-Rbpj欠失マウス由来骨髄細胞を移植しても、正常に生着し、類似の異常は認められなかった。したがって、nestin-Rbpj欠失マウスは、骨髄の中にごくわずかに存在するnestin発現ストローマ細胞の異常によると推察された。Nestin-Rbpj欠失マウス骨髄由来マクロファージは、インターロイキン6の発現が亢進し、赤芽球島形成能が障害されていた。同じマウスの脾臓由来マクロファージのインターロイキン6発現は野生型マウス脾臓由来マクロファージと同じレベルであったことから、nestin発現骨髄ストローマ細胞が何らかのネットワークを介して骨髄局所でマクロファージに影響を与え、赤芽球分化が阻害されたと考えられた。(1)H27年度に準備したGFP陽性細胞由来のRNAを用いてRNAシークエンスによる発現比較を行い、nestin陽性BMSCにおいてNotchシグナル下流で赤芽球造血を支持している分子機序を解明する。
性ホルモンによる乳癌組織内マクロファージの分化制御を探る

抗体アレイを用い、マクロファージにおいてアンドロゲンによって誘導される液性因子(ケモカイン、サイトカイン)の同定を行った。THP-1をデキサメサゾンで刺激して得られたマクロファージに合成アンドロゲンR1881(10uM)でさらに24時間刺激し、蛋白を抽出して液性因子の発現を検討したところ、Chemokine (C-C motif)ligand 5 (CCL5)、CCL20、CCL22、Macrophage migration inhibitory factor(MIF)の発現が誘導されることを見出した。中でも最も強く誘導されたCCL5に着目し、乳癌培養細胞MCF-7にCCL5リコンビナント蛋白を添加して遊走能を評価したところ、MCF-7の遊走が有意に亢進した。また、乳癌病理標本を用いてCCL5の免疫組織化学を施行したところ、CCL5は乳癌細胞と間質細胞の両方に発現が見られた。マクロファージマーカーであるCD163とCCL5の二重免疫組織化学を行ったところ、共陽性細胞が間質領域に確認され、腫瘍浸潤マクロファージがCCL5を発現することが分かった。予後解析では、間質細胞のCCL5陽性症例は有意に予後不良であることを見出した。CCL5の腫瘍促進の機序をさらに詳細に精査するため、CCL5の受容体のひとつであるC-C chemokine receptor type 5(CCR5)の免疫免疫組織化学を施行したところ、思いがけずCCR5陽性症例は有意に予後良好であることが分かった。また、プラスミドを用いてMCF-7にCCR5を過剰発現させたうえでCCL5を添加して遊走能を評価したが、CCR5の強制発現による遊走能の亢進は確認できなかった。CCL5の受容体にはCCR5の他にCCR1、CCR3が知られており、これらががCCL5の腫瘍促進作用を媒介するものと考えられ、今後の更なる検討が必要である。1.ヒト探求系白血病培養細胞であるTHP-1細胞からマクロファージ様細胞への分化誘導の確認:マクロファージには、腫瘍抑制的に働くM1型と、血管新生や転移を誘導するM2マクロファージに大別される。ヒト探求系白血病培養細胞であるTHP-1細胞を用いてin vitroでマクロファージ様細胞に分化させることができるかどうか検討した。M1マクロファージへの分化はリポ多糖およびtumor necosis factor alphaの暴露により可能であることを確認した。M2マクロファージへの分化はデキサメサゾンによって誘導できた。2.マクロファージにおけるアンドロゲン受容体の発現:THP-1細胞を上記の方法でM1およびM2マクロファージに分化させ、アンドロゲン受容体(AR)の発現をウェスタンブロットにて比較し、M2マクロファージにおいてARの発現が亢進していることを見出した。3.免疫染色を用いた乳癌組織に浸潤するM2マクロファージの同定:M2マクロファージのマーカーであるCD163を用いて乳癌組織に浸潤するM2マクロファージの局在を明らかにした。また、アンドロゲン合成の指標である5 alpha reductase 1の免疫染色も同時に行い、これらと臨床病理学的因子との関連を解析することでマクロファージに対するアンドロゲンの作用の意義を検討した。M2マクロファージの浸潤が多い症例は有意に増殖能が高く予後不良であったが、この傾向は5 alpha reductase 1陽性症例において特に顕著であった。このことから、アンドロゲンはM2マクロファージの腫瘍促進作用を増強させる可能性が示唆された。現在、THP-1細胞より分化させたM2マクロファージ様細胞にアンドロゲンを暴露し、そこから得られた培養上清を乳癌細胞に添加して細胞の増殖や浸潤能に与える影響を評価するin vitroの実験系を構築中である。THP-1細胞からM2マクロファージへの分化誘導の方法の確立に時間を要したが、最終的にデキサメサゾンによって安定的にM2マクロファージに誘導できることを見出した。その分、平成29年度に予定していた免疫染色によるマクロファージの同定を先行して行うことにより、全体としては遅滞なく進行していると考えられる。性ホルモンによるマクロファージの分化制御制御の検討について、少なくともアンドロゲンは分化誘導自体には影響しないことを見出したが、エストロゲンやプロゲステロンについては今後も検証を続けていく。乳癌組織中アンドロゲン濃度をLC-MS/MS法により測定し、CD163陽性細胞の浸潤との関連を解析したところ、両者に有意な相関は見られなかった。アンドロゲンがTHP-1細胞におけるCD163の発現を増強させないという昨年度の結果とあわせ、アンドロゲンはマクロファージの分化誘導には直接関与しないことが示唆された。THP-1細胞をM2マクロファージに分化させ、さらに合成アンドロゲンR1881を暴露した後に培養上清を回収し、乳癌培養細胞MDA-MB-231に添加して浸潤能を評価したところ、R1881に暴露したマクロファージの培養上清によりMDA-MB-231の浸潤能が有意に亢進することを見出した。この結果は、M2マクロファージの浸潤が多い症例は悪性度が高く、アンドロゲン合成酵素(5aRed1)陽性症例において特に顕著という昨年度の報告を支持する。すなわち、マクロファージによる乳癌の促進作用においてアンドロゲンが重要な役割を果たすことが強く示唆される。

一方で、マクロファージ培養上清はMDA-MB-231の増殖能には影響を与えず、抗癌剤(パクリタキセル、5-フルオロウラシル、エピルビシン)の感受性にも変化を与えなかった。これらの実験はMDA-MB-231細胞で行ったのみであり、引き続きその他の細胞株(MCF-7、SK-BR-3、T-47D等)でも検証を続けたい。アンドロゲンがマクロファージの乳癌促進作用を増強する機序として上皮間葉転換(EMT)の可能性を検討したが、R1881暴露マクロファージの培養上清は乳癌細胞の上皮系マーカー((E-cadherin)や間葉系マーカー(vimentin)の発現には影響を与えず、マクロファージによる乳癌細胞のEMTの誘導にアンドロゲンが関わるわけではないことが示された。29年度は乳癌培養細胞を用いた機能解析に主眼をおき、マクロファージによる乳癌の進展促進作用にアンドロゲンが重要であるという仮説を、部分的にではあるが実証できた。細胞増殖試験等、さらに追加検討を行いたい項目も多少残しているため、30年度も継続して行っていく予定である。組織中アンドロゲン濃度とCD163陽性細胞浸潤との関連を解析したことにより、アンドロゲンがマクロファージの分化自体には関与しないことを実際の乳癌組織を用いて確かめることができ、乳癌組織を用いた解析には目処がついた。平成30年度はマクロファージにおいてアンドロゲンによって誘導される液性因子の同定を予定しているが、抗体アレイのキットの選定は遅滞なく進んでいる。抗体アレイを用い、マクロファージにおいてアンドロゲンによって誘導される液性因子(ケモカイン、サイトカイン)の同定を行った。THP-1をデキサメサゾンで刺激して得られたマクロファージに合成アンドロゲンR1881(10uM)でさらに24時間刺激し、蛋白を抽出して液性因子の発現を検討したところ、Chemokine (C-C motif)ligand 5 (CCL5)、CCL20、CCL22、Macrophage migration inhibitory factor(MIF)の発現が誘導されることを見出した。中でも最も強く誘導されたCCL5に着目し、乳癌培養細胞MCF-7にCCL5リコンビナント蛋白を添加して遊走能を評価したところ、MCF-7の遊走が有意に亢進した。また、乳癌病理標本を用いてCCL5の免疫組織化学を施行したところ、CCL5は乳癌細胞と間質細胞の両方に発現が見られた。マクロファージマーカーであるCD163とCCL5の二重免疫組織化学を行ったところ、共陽性細胞が間質領域に確認され、腫瘍浸潤マクロファージがCCL5を発現することが分かった。予後解析では、間質細胞のCCL5陽性症例は有意に予後不良であることを見出した。CCL5の腫瘍促進の機序をさらに詳細に精査するため、CCL5の受容体のひとつであるC-C chemokine receptor type 5(CCR5)の免疫免疫組織化学を施行したところ、思いがけずCCR5陽性症例は有意に予後良好であることが分かった。また、プラスミドを用いてMCF-7にCCR5を過剰発現させたうえでCCL5を添加して遊走能を評価したが、CCR5の強制発現による遊走能の亢進は確認できなかった。
軟骨細胞のメカニカルストレス受容機構における細胞骨格分子と接着分子の相互作用

本研究では,牽引力の負荷に伴う軟骨細胞の線維芽細胞への形態変化とa5b1インテグリン分子の発現の関係を解明することを目的として,これを細胞生物学的に検討する.また,軟骨細胞に対する牽引力の負荷に伴いその分化形質としてのII型コラーゲン及びアグリカンの発現が抑制され,かわって線維芽細胞としての形質、フィブロネクチン及びI型あるいはIII型コラーゲンの発現を獲得する,という仮説を検証する.さらに,この過程にインテグリンによる細胞-細胞外基質間の接着が寄与していることを示す.実験材料として胎齢12日のSD系ラットを用い,四肢胚より細胞を顕微鏡下で採取する.続いてこれにtrypsin-collagenaseで処理を施し,細胞を分離した後,DMEM培地を用い培養した.メカニカルストレスの負荷にはFlexer cellを用いた.細胞の分化指標としてのI型,II型,III型コラーゲンや,アグリカン,フィブロネクチンの発現については半定量的RT-PCR法を用いたmRNAの定量によって行った.また,共焦点レーザー顕微鏡と蛍光抗体間接法を用いた免疫染色による形態観察によって,細胞内骨格と細胞・細胞外基質を接着タンパクであるインテグリンが仲介して作り出す接着斑の形成を経時的に観察した.伸展力を負荷した軟骨細胞よりtotal RNAを抽出し,その後逆転写酵素によりcDNAテンプレートを作製し,半定量的PCR法により目的遺伝子の定量実験を行った.結果、伸展力を加えなかった群に比べ,II型コラーゲンおよびアグリカンの遺伝子発現は1020%用量依存的に有意に抑制されることが分かった.また,形態観察により,経時的に接着斑の形成が促進されることが示された.これらのことから、機械的伸展力がラット四肢原器由来軟骨細胞の初期分化を抑制すること,これにはintegrinによる細胞-基質問接着が寄与していることが示唆された.本研究では,メカニカルストレスが軟骨細胞分化に与える影響を分子レベルで解明することを目的として,おもに細胞一細胞外基質間に形成される接着斑を構成するインテグリン,細胞骨格,細胞骨格関連分子,細胞内シグナル伝達分子および細胞外基質聞篠果たす役割を分子生物学的に解明する.特にインテグリンを介した細胞外基質と細胞の接着の阻害あるいは促進によってメカニカルストレスに反応する軟骨細胞で惹起される接着斑の形成,あるいは細胞骨格関連遺伝子の発現,タンパクの局在の変化などを定量的RT-PCP法によるメッセンジャーRNA量の定量や,蛍光抗体間接法による免疫染色と共焦点レーザー顕微鏡を用い形態学的に明らかにする.本研究は,牽引力の負荷にともないII型コラーゲンの合成が減少して軟骨細胞が脱分化し,この脱分化にはインテグリンを介した細胞外基質との接着が必要であるという作業仮説に基づいて行うものである.現在までのところ,Flexer cell plateを用い,ラット胎児四肢胚から得られた未分化間葉系細胞をコラーゲンゲル内で高密度培養し,軟骨組織の分化を誘導することが可能になった.また,これにより得られた軟骨組織よりmRNAを採取し,RT-PCR法により軟骨組織の分化マーカーであるII型コラーゲンのmRNAの検出が可能である.さらに,牽引力の負荷を行い,負荷する牽引力の範囲を検討中である.本研究では,牽引力の負荷に伴う軟骨細胞の線維芽細胞への形態変化とa5b1インテグリン分子の発現の関係を解明することを目的として,これを細胞生物学的に検討する.また,軟骨細胞に対する牽引力の負荷に伴いその分化形質としてのII型コラーゲン及びアグリカンの発現が抑制され,かわって線維芽細胞としての形質、フィブロネクチン及びI型あるいはIII型コラーゲンの発現を獲得する,という仮説を検証する.さらに,この過程にインテグリンによる細胞-細胞外基質間の接着が寄与していることを示す.実験材料として胎齢12日のSD系ラットを用い,四肢胚より細胞を顕微鏡下で採取する.続いてこれにtrypsin-collagenaseで処理を施し,細胞を分離した後,DMEM培地を用い培養した.メカニカルストレスの負荷にはFlexer cellを用いた.細胞の分化指標としてのI型,II型,III型コラーゲンや,アグリカン,フィブロネクチンの発現については半定量的RT-PCR法を用いたmRNAの定量によって行った.また,共焦点レーザー顕微鏡と蛍光抗体間接法を用いた免疫染色による形態観察によって,細胞内骨格と細胞・細胞外基質を接着タンパクであるインテグリンが仲介して作り出す接着斑の形成を経時的に観察した.伸展力を負荷した軟骨細胞よりtotal RNAを抽出し,その後逆転写酵素によりcDNAテンプレートを作製し,半定量的PCR法により目的遺伝子の定量実験を行った.結果、伸展力を加えなかった群に比べ,II型コラーゲンおよびアグリカンの遺伝子発現は1020%用量依存的に有意に抑制されることが分かった.また,形態観察により,経時的に接着斑の形成が促進されることが示された.これらのことから、機械的伸展力がラット四肢原器由来軟骨細胞の初期分化を抑制すること,これにはintegrinによる細胞-基質問接着が寄与していることが示唆された.
神経再生機構の加齢による影響について

末梢神経損傷後、再生軸索が骨格筋に進入し、脱神経された神経筋接合部(neuromuscular junction.NMJ)を再支配する機構が老化によりいかなる影響を受けるかについて解析した。若年期(3月令)に比較すると老齢期(24月令)ラットでは次の特徴がみられた。1.再生軸索の筋内進入時期は遅れる。2.神経線維束内にて増殖する大食細胞はより長い期間存在する。3.軸索、細胞外物質・レクチン(PNA)、NMJ(bunngarotoxin陽性部位)の三者の相互関係を蛍光組織化学的に重染色法により解析した。再生軸索は(1)屈曲蛇行、(2)NMJへの方向性の喪失を示し、NMJのPNA陽性部位は顕著な分布異常(変性物質の出現、不均一な分布)を示した。これらの所見は再生軸索のシナプス認識機構における異常を反映する。現在の研究展開。1(in vivo).神経損傷部位、脊髄前角における再生活性の発現様式。2(in vitro).単離された毛様体神経節細胞と脱神経筋よりえられたNMJ試料をco-cultureし、神経細胞からの突起とNMJ部位の再結合、相互関係を解析する。現在の研究展開。
健全な水環境維持に貢献する新規な浄水処理用非対称性ポリエチレン中空糸膜の開発

1.ポリエチレン多孔膜の膜構造に及ぼす溶媒抽出と乾燥条件の影響10種類の抽出溶媒と2種類の乾燥方法(凍結乾燥と空気乾燥)を用いた。抽出溶媒の溶解度パラメーター、表面張力および沸点を用いて膜特性の相関を試みた。乾燥後の膜サイズは、溶解度パラメーターについては相関は認められなかったが、表面張力が増すほど、また沸点が増すほど一様に低下する傾向を示した。2.熱誘起相分離法によるエチレン-ビニルアルコール共重合体多孔膜の作製における熱力学的及び動力学的検討EVOHのエチレンコンテントが増すほど、液-液相分離の境界(binodal線)は高温側にシフトすることがわかった。エチレンコンテントが32や44mol%の場合には液-液相分離がEVOHの結晶化の前に起こるためセルラー構造の多孔膜が得られた。逆に27mol%の場合は、結晶化に由来する粒子となることを示した。3.ポリエチレンおよびエチレン-ビニルアルコール共重合体中空糸多孔膜の作製ポリエチレン中空糸膜の作製においては、溶媒としてジイソデシルフタレート(DIDP)および流動パラフィン(LP)を用いた。DIDP系では液-液相分離が起こるものの、LP系では高分子の結晶のみが起こることがわかった。すべての場合に外表面付近で孔径が小さく、内表面付近で大きいという非対称性構造が得られた。また、EVOH中空糸膜ではエチレンコンテントが増すほど孔径は増加するものの、孔の連結性が極端に低下し、その結果透水性も一様に減少した。4.高分子濃度勾配に基づく非対称性膜の作製と構造成長のシミュレーション濃度勾配形成下においてCahn-Hilliardモデル式を解くことにより、スピノダール分解による相分離過程のシミュレーションを行った。得られた非対称性構造における平均孔径やスキン層厚みに関して、実験結果とシミュレーション結果は概ね一致することがわかった。1熱力学的相平衡の測定高分子としてポリエチレン(種々の分子量の物や、単分散度の高いメタロセン触媒のもの)を,溶媒として種々の溶解度パラメータを有するジフタル酸系のものを用い、高分子溶液のbinodal線をホットステージを備えた光学顕微鏡により求めた。さらに各系の結晶化温度をDSC測定のより決定した。さらに、高分子にシリカ超微粒子(一次粒子径:7nm)を添加した系についても相平衡関係を明らかとした。シリカの添加により、結晶化温度に変化はあまり見られなかったが、binodal線は低温側にシフトすることがわかった。2相分離過程の検討相分離に伴う相の成長過程を追跡するため,準安定領域と不安定領域にクエンチされた溶液についての相分離過程を、速い初期の過程から遅い後期の過程に至るまで、ホットステージをセットした高分子フィルム光散乱装置により系統的に測定した。130°C/minの一定の冷却速度の条件下では、相分離はspinodal分解過程のより進行することがわかった。また、シリカの添加により初期構造の大きさが顕著に増大することがわかった。3 TIPS法による非対称性平膜の作製とその構造評価ホットステージを用い、キャスト溶液の片面で一相領域,他面で二相領域となる状態にクエンチし、非対称性膜を作製した。この場合には高温側で孔が大きく、低温側で小さいという構造であった。また、高分子溶液の上面のみから溶媒を蒸発させることで、高分子濃度勾配を形成させた手法によっても非対称性膜の作製を行った。シリカ微粒子添加系膜もこの方法により作製した。膜中のシリカ量を測定したところ、ほぼ定量的に膜内に残存することがわかった。

得られた膜の透水量を測定した結果、シリカの添加は透水量を増大させる上で効果的であることがわかった。1.非対称性構造を有するポリエチレン中空糸膜の作製混練り押し出し装置を用いることにより、多孔性を有する中空糸膜を作製した。用いた高分子は平均分子量25万(HDPE25)と13万(HDPE13)の高密度ポリエチレンである。すべての場合に、膜内側近傍で孔径が大きく、外側近傍で小さいという非対称性構造であった。3つの系、HDPE25/ジイソデシルフタレート(DIDP)、HDPE13/DIDPおよびHDPE25/流動パラフィン(LP)について、相図を作製した。DIDPを溶媒に用いた場合には、曇り点が観察され、相分離が液-液型で有ることがわかった。また、HDPEの分子量が低下するほど曇り点は減少した。一方、LPを用いた場合には、高分子の結晶化のみが起こることがわかった。大きな分子量のHDPEを用いて作製した中空糸膜は、大きな孔径を有しており、透水量も大きいことがわかった。製膜時のバス温度が高いほど、またエアーギャップの長さが長いほど、透水量は大きくなった。DIDPを用いた方が、LPの場合より、高い透水量を示す中空糸膜が作製できた。これは、高い透水量を得るためには、高分子の結晶化よりは、液-液相分離が望ましいことを示している。2.非対称性構造形成のシミュレーション熱誘起相分離法による等方的な相分離構造形成過程について、spinodal分解機構に基づくシミュレーションを行った。相分離成長過程の光散乱実験結果とシミュレーション結果は概ね一致することがわかった。高分子溶液の片面からの溶媒を蒸発させることにより高分子濃度勾配を形成させ,非対称性膜の作製を行った。溶媒蒸発時間が増すほどスキン層の厚みは、顕著に増加するものの、ガラス面での孔径はあまり影響を受けなかった。溶媒蒸発過程と相分離過程を組み合わせたシミュレーションを行った。ガラス面での孔径とスキン層厚みについて、実験結果とシミュレーション結果との一致は良好であった。
アラキドン酸カスケード受容体を介する生体調節機構の解析

本研究の目的は、プロスタグランジンの有する多種多様な生理作用を、それぞれの作用を媒介する受容体の構造と機能から明らかにし、生体調節の機構を分子レベルで理解することである。研究成果は;(1)各プロスタノイド受容体をCHO細胞にパ-マネント発現させ、それを用いてリガンド結合活性とG蛋白活性化を明らかにした。(2)受容体のカルボニル基を認識するドメインがリガンド結合とG蛋白活性化に関与することをプロスタグランジンE_2 (PGE_2)受容体サブタイプEP3を用いて、明らかにした。(3)このPGEのカルボン酸と第7膜貫通部位のアルギニン残基(Arg-309 : R309)との相互作用を、種々の点変異(R309Q, R309N, R309L)受容体を作成し、これら受容体に対するカルボン酸修飾誘導体の結合活性やGi活性を比較した結果から、水素結合が必要充分であることを明らかにした。(4)カルボニル基の非解離は、GsとGqの活性化に必須であるが、Giの活性化には関係ないことを明らかにした。(5)各プロスタノイドのゲノム解析を行い遺伝子ターゲッテイングベクターを構築し、得られたcDNAをES細胞に導入し、相同組み換え細胞をクローニングし、胚細胞に注入し、これを偽妊娠マウスに戻し、キメラマウスを作製し、ホモのノックアウトマウスを作成することに成功した。(6) PGF受容体のノックアウトマウスの雌は、分娩において異常を起こすことがわかった。その成因は、PGF受容体の黄体特異的発現とそのアポトーシスによる退縮不能である。(7) EP2とEP4ノックアウトマウスの形質発現を検討中であるが、EP4ノックアウトマウスにおいて顕著な変化、すなわち生後12日以内に循環系の障害により死亡がすることがわかった。本研究は、アラキドン酸カスケード産物であるプロスタノイドの有する多種多様な生理・薬理作用を、それを介達する受容体の構造と機能の分子レベルでの解析により明らかにし、生体調節機構を理解することを目的とする。我々は既に、プロスタノイド受容体のうちトロンボキサンA2とプロスタグランジン(PG) F2α、PGI2受容体、及びPGE2受容体サブタイプEP1、EP2、EP3、EP4、EP3については複数種のイソフォーム、等のcDNAクローニングとその構造決定に成功した。本研究はこれらの成果を基に、これら受容体のリガンド結合様式やG蛋白結合ドメインを明らかにし、またこれらプロスタノイドが生体内でいかなる重要性をもつのかを明らかにしようとするものである。当該年度の成果として、我々は、プロスタノイド受容体全てに保存された第7膜貫通領域に存在するアルギニン残基が、プロスタノイド・リガンドの1位のカルボン酸との会合に重要であることをEP3受容体(プロスタグランジンE受容体のサブタイプ)をモデルとして用いることにより明らかにした。また、EP3受容体においては、このアルギニン残基の【.encircled+.】電荷とリガンドの【.encircled-.】電荷との相互作用はGs蛋白の活性化には必須であるが、他のGiやGqの活性化には必ずしも必要ではないことを見出した。本知見は、受容体のリガンド結合部位を同定したのみならず、EP3受容体が複数のG蛋白に対して異なる活性化ドメインを持つことを示唆するものである。一方、我々はまた、PGI2受容体についてその受容体発現部位の同定を行い、大動脈・環状動脈・肺動脈・脳動脈等の動脈系平滑筋や成熟胸腺細胞、リンパ球、巨核球、後根神経節の神経細胞等に発現していることを見出した。現在、これらの部位において既知作用の確認ならびに新たな機能の検索を進行中である。さらに我々は受容体遺伝子欠損マウスの作製を試み、既にいくつかの欠損マウスの作出に成功している。現在、これらの解析に必要な受容体特異アゴニストや解析項目の検討、ならびに解析システムの確立を行っている。今後は、これらのマウス個体について解析を進めることによりプロスタノイドの生理作用の全貌を明らかにする予定である。(5)各プロスタノイドのゲノム解析を行い

遺伝子ターゲッテイングベクターを構築し、得られたcDNAをES細胞に導入し、相同組み換え細胞をクローニングし、胚細胞に注入し、これを偽妊娠マウスに戻し、キメラマウスを作製し、ホモのノックアウトマウスを作成することに成功した。(6) PGF受容体のノックアウトマウスの雌は、分娩において異常を起こすことがわかった。その成因は、PGF受容体の黄体特異的発現とそのアポトーシスによる退縮不能である。(7) EP2とEP4ノックアウトマウスの形質発現を検討中であるが、EP4ノックアウトマウスにおいて顕著な変化、すなわち生後12日以内に循環系の障害により死亡がすることがわかった。本年度の研究実施計画に基づき以下の研究成果を得た。1。PGE受容体サブタイプのリガンド結合ドメインとGTP結合蛋白質を活性化するドメインの研究:(1)PGE_2受容体サブタイプEP3を用いて、このPGEのカルボン酸と第7膜貫通部位のアルギニン残基(Arg-3 09:R309)との相互作用を明らかにするため、R309に種々の点変異(R309Q,R309N.R309L)を導入し、作製した変異受容体に対するアゴニストのカルボン酸基の修飾有無の様々な誘導体を合成し、それらを用い各変異受容体の結合活性とGi活性を比較した結果、水素結合が相互作用に必要で充分であることを明らかにした。(2)カルボニル基の非解離は、GsとGqの活性化に必須であるが、Giの活性化には関係ないことを明らかにした。2。PGの生理・病態作用の生体機能での意義の解明研究:(1)PGE受容体サブタイプの遺伝子ターゲッテイングベクターを構築し、得られたcDNAをES細胞に導入し、相同組み換え細胞をクローニングし、胚細胞に注入し、これを偽妊娠マウスに戻し、キメラマウスを作製し、ホモのノックアウトマウスを作成することに成功した。(2)EP2とEP4ノックアウトマウスの形質発現を検討中であるが、EP4ノックアウトマウスにおいて顕著な変化、すなわち生後12日以内に循環系の障害により死亡がすることがわかった。EP2に関しては子宮の機能に影響を及ぼす可能性が得られている。