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肺移植後の虚血再還流障害による移植肺生着阻害に関する研究

肺移植は終末期肺疾患の唯一の治療法であるが、肺移植後の5年生存率は他の臓器移植より低く約50%に過ぎない。肺移植後の虚血再還流障害は移植肺の生存期間を悪化するとされているが、虚血再還流障害による移植肺生着への影響やその機序についてはあまり明らかにされていない。本研究では同所性マウス左肺移植モデルを用いて、肺移植後の虚血再灌流障害が移植肺生着阻害に与える影響やその機序について検討した。肺移植では虚血再還流障害が移植肺の生存期間を悪化するとされているが、虚血再還流障害による移植肺生着への影響やその機序については解明されていない。本研究では肺移植後の虚血再灌流障害による移植肺生着阻害の機序を解明することが目的である。このため、同所性マウス肺移植モデルを用いて、肺移植後の虚血再灌流障害により発生する炎症性シグナル、特にIL-6が移植肺生着阻害において果たす役割を検討した。まずIL-6中和抗体の生体外での効果を検討するため、IL-6が細胞生存と増殖に必要なセルラインを使用し、IL-6中和抗体が容量依存性にセルラインの増殖を抑制することを確認した。次に同所性マウス肺移植をBalb/cマウスからB6マウスに冷虚血時間1時間で施行し、移植後7日目に急性拒絶反応が発症することを確認した。この急性拒絶反応はMR1とCTLA4-Igの2剤投与(二重共刺激阻害)で抑制され、免疫寛容の導入が可能であった。しかし、Balb/cドナー肺の冷虚血時間を1時間から18時間に延長すると、B6レシピエントに移植後に二重共刺激阻害で免疫抑制を施行しても、移植後7日目に高度の急性拒絶反応の所見を認めた。IL-6中和抗体のマウス生体内での効果を検討するため、移植日前日にドナーBalb/cマウスにIL-6中和抗体を投与し、18時間冷虚血時間でB6レシピエントに移植し二重共刺激阻害による免疫抑制を施行した。レシピエントにもIL-6中和抗体を移植日前日、移植日から術後4日目まで投与した。未治療のマウスに比べ、移植後7日目の急性拒絶反応が軽度であり、フローサイトメトリーでは移植肺内のIFN-γ産生CD8陽性Tリンパ球の割合が著明に低下していた。これらは肺移植後の虚血再灌流障害による移植肺生着阻害においてIL-6が重要な役割を果たしていることを示しており、機序解明に向けて今後更なる検討を行う予定である。肺移植では虚血再還流障害が移植肺の生存期間を悪化するとされているが、虚血再還流障害による移植肺生着への影響やその機序については明らかにされていない点が多い。このため、同所性マウス左肺移植モデルを用いて、肺移植後の虚血再灌流障害により発生する炎症性シグナル、特にIL-6が移植肺生着阻害において果たす役割を検討した。前年度のIL-6中和抗体を使用した検討に引き続き、本年度はIL-6ノックアウトマウスを用いた検討を行った。同所性マウス左肺移植を異型間のBalb/cマウスからB6マウスに冷虚血時間1時間で施行すると、移植後7日目で急性拒絶反応が確認されるが、この急性拒絶反応はMR1とCTLA4-Igを2剤投与することで抑制され(二重共刺激阻害)、免疫寛容の導入が可能となった。しかし、Balb/cドナー肺の冷虚血時間を1時間から18時間に延長すると、移植後、B6レシピエントに二重共刺激阻害による免疫抑制療法を施行しても、移植後7日目に高度の急性拒絶反応の所見を認めた。しかし、18時間冷虚血時間で異型間のBalb/c→IL-6ノックアウトマウスの肺移植を行い、二重共刺激阻害による免疫抑制療法を施行すると、B6レシピエントに比べ移植後7日目の急性拒絶反応は抑制され、IL-6中和抗体を投与した群と同様であった。これらの結果は肺移植後の虚血再灌流障害による移植肺生着阻害においてIL-6が重要な役割を果たしていることを示しており、急性拒絶反応の発症を抑制する一つの機序を示していると考えられる。
M系列を用いる論理回路およびメモリの故障診断

(1)CPUおよびその周辺回路を含んだボ-ドの故障診断ができるシステムを構築した.具体的には,パソコンPCー9801の拡張ボ-ドの一つにZ80を組み込んだボ-ドを挿入し,それに検査対象回路を接続して,その検査対象回路に色々の故障を発生させて,筆者等の開発したMSEC法と呼ばれる故障診断法を用いて故障検出できるか否かの実験を行なっダた.検査出象回路としては,DtypeFFとFull Adderを用いた.Full Adderでは入力5点,出力3点で,挿入した故障はショ-ト5ヶ所,断線3ヶ所をスイッチで任意に入れることができるような回路を構成した.その結果,本方法を用いると故障検出ができるだけでなく,使用した検査対象回路の場合,大部分は100%(少数のものは50%)の確率で故障箇所の検出も行うことができることがわかった.(2)ICのメモリのパタ-ン依存故障を検出する方法として,2次元のメモリ配列について,M系列を用いる方法を筆者等は先に開発したが,本年度は更にそれを発展させて,3次元メモリについて,3次元のパタ-ン依存故障を検出できるアルゴリズムを開発することに成功した.すなわち,メモリは高集積化・高密度化が進んでおり,近い将来3次元的に集積化されることが予想されるので,本研究ではそれを見越して3次元のパタ-ン依存故障を検出する簡便で用法が容易な方法を開発した.具体的には注目するセルの東西南北および上層・下層の計6セルのパタ-ンが,すべてのフェ-ズですべて異なり一度の重複もなく変わるように,M系列を書き込んで行く方法を開発した.(1)CPUおよびその周辺回路を含んだボ-ドの故障診断ができるシステムを構築した.具体的には,パソコンPCー9801の拡張ボ-ドの一つにZ80を組み込んだボ-ドを挿入し,それに検査対象回路を接続して,その検査対象回路に色々の故障を発生させて,筆者等の開発したMSEC法と呼ばれる故障診断法を用いて故障検出できるか否かの実験を行なっダた.検査出象回路としては,DtypeFFとFull Adderを用いた.Full Adderでは入力5点,出力3点で,挿入した故障はショ-ト5ヶ所,断線3ヶ所をスイッチで任意に入れることができるような回路を構成した.その結果,本方法を用いると故障検出ができるだけでなく,使用した検査対象回路の場合,大部分は100%(少数のものは50%)の確率で故障箇所の検出も行うことができることがわかった.(2)ICのメモリのパタ-ン依存故障を検出する方法として,2次元のメモリ配列について,M系列を用いる方法を筆者等は先に開発したが,本年度は更にそれを発展させて,3次元メモリについて,3次元のパタ-ン依存故障を検出できるアルゴリズムを開発することに成功した.すなわち,メモリは高集積化・高密度化が進んでおり,近い将来3次元的に集積化されることが予想されるので,本研究ではそれを見越して3次元のパタ-ン依存故障を検出する簡便で用法が容易な方法を開発した.具体的には注目するセルの東西南北および上層・下層の計6セルのパタ-ンが,すべてのフェ-ズですべて異なり一度の重複もなく変わるように,M系列を書き込んで行く方法を開発した.
好酸球性副鼻腔炎の病態形成におけるサイトカインネットワークの解明と創薬展開

好酸球性副鼻腔炎の病態形成におけるサイトカインネットワークの解明として、鼻副鼻腔粘膜におけるサイトカインの発現、好酸球性副鼻腔炎の外的因子とされる黄色ブドウ球菌外毒素や真菌抗原に対するサイトカイン産生、サイトカイン産生を制御する微生物コンポーネントやプロスタグランジンの解析を行った。黄色ブドウ球菌の外毒素、真菌抗原、TLRアゴニスト、プロテアーゼなどの微生物コンポーネントはサイトカインネットワークを活性化し、鼻茸の形成や難治化に関与することが明らかとなった。【背景】我々は好酸球性副鼻腔炎におけるEx vivoモデルとして、鼻茸分離細胞(DNPCs)の黄色ブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)刺激による好酸球性炎症関連サイトカイン産生モデルを樹立し解析を行ってきた。これまでに、TLR4リガンドであるLPSの曝露はSEB刺激によるDNPCsからのIL-5、IL-13、IFN-γ、IL-17A産生を抑制することを報告した。しかしながら他のTLRの関与については不明な点が多い。そこで今回は、TLR3に注目し、TLR3リガンドであるPoly (IC)による好酸球性炎症関連サイトカイン産生の制御について検討した。【方法】DNPCsをPoly (IC)にて前処置した後にSEBで刺激し、上清中のIL-5、IL-13、IFN-γ、IL-17Aを測定した。COX代謝やIL-10の関与を検討するために、ジクロフェナック(DIC)や抗IL-10抗体にてDNPCsを前処理した。【まとめ】TLR3を介するシグナルは慢性副鼻腔炎における好酸球性炎症を制御し、その機構としてCOX代謝およびIL-10が関与することが示唆された。TLR3を用いた好酸球性副鼻腔炎に対する創薬展開が期待された。サイトカインの発現については、自然免疫リンパ球の誘導にも強く関わるIL-18やIL-33の鼻茸における発現を免疫染色にて観察した。IL-18は主に上皮に発現していたが、浸潤炎症細胞にも発現していた。IL-33は上皮や浸潤炎症細胞に加え、血管内皮細胞にも発現していた。IL-18に関しては浸潤細胞での陽性細胞数とCTスコアおよび鼻茸浸潤好酸球数との間で正の相関を認めた。鼻茸細胞からのIL-18およびIL-33産生はプロテアーゼ刺激により誘導された。鼻茸細胞は黄色ブドウ球菌エンテロトキシンの刺激により、IL-5やIL-13などのTh2型サイトカインに加え、IFN-γなどのTh1型サイトカイン、さらにはIL-17AなどのTh17型サイトカインを産生した。中和抗体によってIL-18の働きをブロックすると、エンテロトキシンにより誘導される鼻茸細胞からのIL-5、IL-13、IFN-γの産生は有意に抑制されたが、IL-17Aの産生に関しては有意な変動を認めなかった。さらにサイトカインネットワーク成立のメカニズムヲ検討するために、衛生仮説に注目した。TLR4アゴニストであるLPSの前曝露はエンテロトキシンにより誘導されるIL-5、IL-13、IFN-γ、IL-17A産生を全て抑制した。この抑制作用は後曝露ではみられなかった。LPSの抑制作用はPGE2産生作用を介していた。鼻茸細胞をCOX阻害すると、LPS単独でもIL-5およびIL-13産生が誘導された。一方、その産生頻度や産生量はエンテロトキシンに比べ低かった。以上の結果より、黄色ブドウ球菌の外毒素、真菌抗原、TLRアゴニスト、プロテアーゼなどの微生物コンポーネントはサイトカインネットワークを活性化し、鼻茸の形成や難治化に関与することが明らかとなった。本年度は、当初の研究実施計画通り、(1)Danger signal様サイトカイン(IL-18、IL-33、HMGB-1)の好酸球性鼻副鼻腔炎における発現と機能、(2)IFN-γとIL-31の好酸球性鼻副鼻腔炎における発現と機能、(3)好酸球性鼻副鼻腔炎における炎症収束性アラキドン酸代謝物の好酸球性炎症の制御作用、(4)好酸球性鼻副鼻腔炎を解析するためのEx vivoモデルの開発を行い、以下の知見を得た。(1)IL-18は主に鼻茸および鉤状突起の上皮細胞に発現し、また一部の浸潤炎症細胞にも発現していた。IL-18の発現陽性細胞は鉤状突起に比較して鼻茸に増加していた。

鼻茸分離細胞はプロテアーゼ刺激や壊死刺激によってIL-18を産生した。また鼻茸分離細胞の黄色ブドウ球菌エンテロトキシン刺激によるIL-5およびIFN-γ産生は抗IL-18中和抗体の添加により、有意に抑制された。IL-33は主に血管内皮細胞の核内に発現していた。(2)鼻茸分離細胞は黄色ブドウ球菌エンテロトキシン刺激により有意なIFN-γ産生を示した。一方、IL-31の産生は明らかではなかった。(3)鼻茸分離細胞の黄色ブドウ球菌エンテロトキシン刺激によるIL-5やIL-13等の好酸球性炎症関連サイトカインの産生はリポキシンやレゾルビンの添加によって有意な変化を認めなかった。(4)H23年度は、非スーパー抗原型の黄色ブドウ球菌外毒素であるαトキシンの作用を検討した。αトキシンは濃度および時間依存性に鼻茸分離細胞からのIL-5、IL-13、IFN-γ、IL-17Aの産生を誘導した。その作用はng/mlオーダーであればエンテロトキシンと同等であった。創薬展開の点で、今回の結果は自然免疫系やIL-10が好酸球性副鼻腔炎の治療ターゲットとなりうることが示された。H23年度は、大きく4項目の研究を計画していたが、いずれの研究も結果を集積しつつあり、概ね順調に進展している。一方、HMGB1についてはさらなる検討が必要である。今回の結果ではIL-10が好酸球性副鼻腔炎の病態に抑制的に関与することが示唆された。引き続きIL-10の局所発現やIL-10の産生誘導物質や誘導メカニズムを解析し、創薬展開に繋げる。平成24年度は、平成23年度の研究を継続し、さらに好酸球性炎症や慢性炎症に関与すると思われるサイトカイン・アラキドン酸代謝分子(IL-22やプロスタサイクリンなど)に関しても検討を進める。菌体成分に関しては、特にαトキシンについて興味深い結果を得たので、H24年度には好酸球性鼻副鼻腔炎患者におけるαトキシン産生黄色ブドウ球菌の鼻腔内定着率を非好酸球性鼻副鼻腔炎患者を対照として検討する。平成24年度に主に試薬費に使用計画をしていたが、安く購入できたため残額が生じた。平成25年度にて試薬費や成果発表のための旅費への使用を計画している。本研究の遂行に必要な設備は概ね研究代表者の研究室および共同実験室などの本研究施設に備えられており、研究費は主に消耗品費に用いる。また得られた成果を国内外の学会にて発表することを予定しており、旅費を計上している。
中間エネルギー領域における中性子弾性散乱断面積に関する実験的研究

実験データの不足が指摘されている約100MeV以上の中間エネルギー領域における中性子弾性散乱断面積を、準単色中性子ビームと液体有機シンチレータを利用して、高効率で精度よく測定するための手法を確立した。取得した実験データは、他の実験データと良く一致しており、既存の高エネルギー核データファイルの問題点を明らかにした。本測定手法を用いることで、系統的な中性子弾性散乱断面積データの整備が可能となった。平成19年度は本研究課題の初年度であり、次年度以降の本格的な測定のための予備調査を行った。大阪大学核物理研究センター(RCNP)において、150MeV陽子を7Liターゲットに入射し生成した準単色中性子ビームを用い、測定場におけるバックグラウンドイベントの混入率を実測した。このデータと放射線輸送コードを用いたシミュレーション解析の結果から、本測定に最適なビームコリメータとシャドウブロックの設計・製作を行った。測定時にこれらを利用することにより、測定場におけるバックグラウンドイベントの混入率を1/10以下に抑え、統計精度の良いデータの取得が可能となる。原子力機構高崎量子応用研究所イオン照射研究施設(TIARA)にて、75MeV準単色中性子ビームを用いた炭素原子核に対する中性子弾性散乱断面積を測定した。測定する散乱角度は実験室系で15度の一点とし、散乱サンプルから3.5m下流に中性子検出器として直径12.7cm厚さ12.7cmの液体有機シンチレータを配置した。非弾性散乱イベントは飛行時間法により分離し、低励起準位からのイベントは核反応計算コードTALYSの計算値に基づき補正した。導出された中性子弾性散乱断面積の値は評価済みの核データの値と誤差の範囲内で一致した。この成果により、本課題の測定システムおよびデータ解析手法の妥当性が実験的に証明されたと共に、RCNPにおけるより高いエネルギー領域での測定の展望が得られた。平成19年度の研究成果を基に設計したビームコリメータおよびシャドウバーを用い大阪大学核物理研究センター(RCNP)において、中性子弾性散乱断面積測定を実施し、測定システムの妥当性の検討およびビーム条件の最適化を行った。設計したコリメータとシャドウバーを利用することで、RCNPにおいてもバックグラウンドイベントを1/10以下に抑えられることが分かった。また、シンクロトロンのビーム電流や加速周波数を考慮し、データ取得のために最適な測定システムのパラメータを決定した。140MeV陽子ビームを^7Liターゲットに入射して生成した準単色中性子ビームを用いた測定では、炭素原子核に対する中性子散乱断面積が導出された。得られた実験データは、反跳陽子法で測定された実験データおよび評価済み核データと比較された。実験データ同士は非常に良い一致を示し、本課題で検討している液体有機シンチレータと飛行時開法による測定手法は、より簡便で高効率な測定系で従来の反跳陽子法と同等の精度を与えることを実験的に証明した。また、最前方角度領域で核データが実験値を再現できておらず、評価に用いた光学模型ポテンシャルに問題のある可能性を指摘した。平成20年度までに大阪大学核物理研究センター(RCNP)において構築した高効率中性子弾性散乱断面積測定手法を用い、炭素と鉛原子核に対する134MeV中性子の弾性散乱断面積を実験室系6,8,10,及び15度で測定した。弾性散乱断面積は前方角度ほど大きな絶対値を持ち重要となるが、既存の手法では難しかったこの領域の断面積データを精度良く取得できたことは大きな成果である。RCNPの加速器運営の都合上、計画していた250及び350MeVの測定を本年度実施できなかったことは残念ではあったが、本研究の成果がRCNPビーム運営委員会によって認められ、22年度以降の実験ビームタイムを獲得することができた。また、中性子計測に関する国際会議(ISORD5[北九州]、NEUDOS-11[南アフリカ])に出席し、本研究の成果を広く世界に公表することができた。
重症度、臓器連関を考慮したｍｉｃｒｏＲＮＡによる急性心不全の病態解明

これまでの検討で得られた心不全による肝障害による血中microRNA-122-5pの変動という現象についてマウスにおける検証実験を行った。具体的にはマウスに対して虚血性・鬱血性の肝障害の誘導を行い、血中micro RNAの濃度を検討した。いずれのモデルにおいてもヒトでの現象を再現する結果が得られた。近年、遊離micro RNAが遠隔臓器に浸潤あるいは吸収され、遺伝子発現を制御する現象が相次いで報告されている。今回の検討によって示された心不全の病態による血中microRNAの変動が他臓器の影響を及ぼしているかどうかの検討を進める必要があると考えられる。次に、血清中の異種由来のRNAについてシーケンスリードの再解析を行った。これらのRNAが由来する菌株の同定を試みたところこれらのRNAは多くが腸内細菌叢に属する細菌に由来することが確認された。今後、これらのRNAの存在量と病態との関係を検討することによって、新たなバイオマーカーの発見に繋がる可能性があり、検討を進めていく予定としている。また、本年度においてはmicroRNAの全身に与える影響を観察するため、microRNA33のノックアウト・microRNA33bのノックインマウスを用いた実験も行った。結果としてmicroRNA33aとmicroRNA33bの生体内での働きの違いについて知見を得ることができた。今後のmicroRNA33に関する治療応用において重要なデータとなることが考えられる。29年度が最終年度であるため、記入しない。社会の高齢化に伴い心不全の発症数は増大しており、社会医学・医療経済的に問題となりつつある。本疾患についての理解を深め、診断・治療を適正化することは重要である。このような観点から多くのバイオマーカーが開発され使用されているが、いまだ我々の心不全に関する理解は十分ではなく、新規のバイオマーカーの開発およびそれによる病態の理解が必要である。一方、血液中のマイクロRNAはバイオマーカーとして近年盛んに研究がなされている。マイクロRNAは血液中にて小胞に包まれて安定して存在しており、臨床血清検体から正確に測定することができるとされている。これは多方面の疾患においてバイオマーカーとしてふるまうことが報告されており、心不全分野においてもすでにいくつかの報告がある。しかし、その生理的意義や動態についてはまだ未解明な部分が多い。本研究では心不全における急性増悪とその寛解という現象に着目し、その経過中における血清中のマイクロRNAの変動を検討する。急性増悪において強調された病態を治療介入による安定後の状態と比較することで心不全の病状を反映する新たな血清マイクロRNAが探索できる可能性は高いと考えている。これを通じて病態についての理解を深めることが本研究の目的である。具体的には心不全の急性増悪にて入院となった患者群の入院時血清と多くの患者で病態の寛解が得られる入院後7日目の血清を臨床情報とともに収集する。収集した血清より小胞中のマイクロRNAを抽出し定量を行う。このようにして得たマイクロRNAの血清中の存在量やその治療による変化量を、疾患予後やその他の臨床情報と比較検討し生理学的意義を検討する予定である。また、これによって得られた知見の心不全における分子生物学的意義を検討するため動物モデルによる検討も予定している。血清中のマイクロRNAは微量であり、正確な測定を行うためにまずは測定系の確立から取り組む必要があった。さまざまな条件を検討したのち比較的安定して測定することができる方法を確立することができた。この測定法を用いて、すでに採取してあったサンプルよりスクリーニング実験を行った。この実験の結果、いくつかの疾患関連マイクロRNAを検出することができた。これについて各症例ベースの検討を行った。結果としてあるマイクロRNAが急性心不全患者において重要な臨床指標と相関することを見出すことができた。この結果は今後の血清中のマイクロRNA研究の重要な基礎データとなる可能性を示唆しており現在論文投稿準備中である。我が国において急性・慢性心不全の発症数は増大の一途をたどっている。その管理、予後予測の改善は患者予後の改善のみならず医療経済的観点からも危急の問題である。このような目的で開発された心不全関連のバイオマーカーは診断、管理、予後予測に重要な役割を果たしている。しかし、その性能には改善の余地があると考えられ多方面より新規のバイオマーカーの検索が行われている。近年、血中に短鎖のRNA分子が安定して存在していることが知られており、各種疾患においてバイオマーカーとなることが知られている。今回我々は心不全の急性増悪およびその寛解の過程を通じて病態の差分を観察することにより、心不全の病態に関与しいているバイオマーカーを探索する計画を立て実行した。昨年度までの研究により心不全患者の血清において病態変動に伴って変動する短鎖RNAのスクリーニングに成功した。本年度はこのRNAの変動の個人レベルでの確認、定量を行った。この結果と臨床情報との照合により、血清の短鎖RNAは心不全による臓器障害を反映して変動していることが確認された。血液中の短鎖RNAがこのような短期間で変動することは今まで示されていなかった。これらの知見から、血中の短鎖RNAは心不全の病状を鋭敏に反映するバイオマーカーとなる可能性が示唆される。今後、違う条件や患者集団においてさらなるスクリーニングを行うことでこの他の病的状態を反映するバイオマーカーをスクリーニングできる可能性を考えている。心不全関連バイオマーカーのスクリーニングにおける検出力を向上させるために病態が急激に悪化する心不全の急性増悪期に注目してサンプル収集を行った。

これらのサンプルを用いて網羅的な血清中の短鎖RNAのスクリーニング実験を行ったところ、病態に反応して短期的に変動するmicroRNAのスクリーニングに成功した。個人レベルでの血中RNAの定量によってもこの変動は確認された。この変動と臨床情報との統合解析を行ったところ、血清中の短鎖RNAの変動は急性心不全の臨床経過中に生じる肝障害の指標と連動していることを指摘することができた。これは新規の知見として欧州の心臓病学会誌に投稿し掲載された。臓器障害は近年心不全の重要な因子であると認識されつつあり、血中の短鎖RNAをこのような臓器障害を反映するマーカーとして用いることができる可能性を示唆する知見であると考えている。現在は今回見られた病状に付随するmicroRNAの変動の生理的意義の検討のため、肝障害モデルや心不全モデルを用いて検討を進めている。これまでの検討で得られた心不全による肝障害による血中microRNA-122-5pの変動という現象についてマウスにおける検証実験を行った。具体的にはマウスに対して虚血性・鬱血性の肝障害の誘導を行い、血中micro RNAの濃度を検討した。いずれのモデルにおいてもヒトでの現象を再現する結果が得られた。近年、遊離micro RNAが遠隔臓器に浸潤あるいは吸収され、遺伝子発現を制御する現象が相次いで報告されている。今回の検討によって示された心不全の病態による血中microRNAの変動が他臓器の影響を及ぼしているかどうかの検討を進める必要があると考えられる。次に、血清中の異種由来のRNAについてシーケンスリードの再解析を行った。これらのRNAが由来する菌株の同定を試みたところこれらのRNAは多くが腸内細菌叢に属する細菌に由来することが確認された。今後、これらのRNAの存在量と病態との関係を検討することによって、新たなバイオマーカーの発見に繋がる可能性があり、検討を進めていく予定としている。また、本年度においてはmicroRNAの全身に与える影響を観察するため、microRNA33のノックアウト・microRNA33bのノックインマウスを用いた実験も行った。結果としてmicroRNA33aとmicroRNA33bの生体内での働きの違いについて知見を得ることができた。今後のmicroRNA33に関する治療応用において重要なデータとなることが考えられる。今回の検討において急性心不全患者の血清中においてマイクロRNAはその疾患の状態を反映しつつ変動することが示された。今後はこの変動がどのような機序に基づいて生じているのかを検討していく予定である。また、本研究の最終目的はこのように血清中で変動するマイクロRNAが遠隔臓器において作用を示し、心不全の病態形成に関わっている可能性を検討することにある。
汎用的な水泳運動中の推進力測定システムの開発

本研究では、手部(一部前腕を含む)の人体モデルを作成し、気流中に留置した場合の歪みゲージを用いた応力計測及び手部模型表面にかかる圧力分布計測の2方法によって揚力、抗力を算出し、手部表面の揚力発生のメカニズムを明らかにしようとした。さらに手部の形態の違いによる揚力、抗力の変化を測定し、推進力を定量化するための基礎的データ入手を試み、以下のような結論を得た。(1)手部の形態の違いによって揚力、抗力の発生も異なり、水泳運動中のプル動作は、進行方向に対し身体の外側から内側へ掻き込むときは、迎角を40度に保ち、親指を開いた状態で移動すること、内側から外側に移動する場合は、全指を閉じた形態で迎角を140度に保つことが揚力を最大に発揮させるのに適していることが示唆された。(2)本研究結果より、泳者が自由水泳中に手部において発揮している正味の推進力を非拘束の状態で測定することが可能となった。今後この成果を生かして、トップスイマ-のストローク技術の解明に取り組みたい。
テトラ・イソシアネート・シランを用いたシリコンの液相堆積

テトラ・シソシアネート・シランを用いたシリコンの液相堆積の予備的検討の段階において、分解時に発生する副生成物のアンモニアが分解特性を大きく変化させることが判った。さらに、このアンモニアは、類似した原料であるテトラ・エトキシ・シランの加水分解と、生じたシラノールの脱水縮合とを加速することがわかった。そして、アンモニアと蟻酸の水溶液にテトラ・エトキシ・シランを導入すると、良質の二酸化シリコン膜が析出するできることも判明した。この液相堆積法ではさまざまな強さの酸化剤が利用できるので、エトキシ基の一部をメチル基に置き換えた原料モノメチル・トリエトキシ・シランを原料に用いれば、メチル基を含有した低誘電率酸化膜を室温堆積できることに気づいた。この低誘電率膜は、ULSIの最近の急激な極微細化に伴う配線間のCR遅延が問題を軽減する決め手となる可能性を秘めており、この分野での基礎的研究が重要になっている今日、この酸化膜堆積法は萌芽研究として十分に意味があると判断した。様々な堆積条件とアニール条件における有機含有酸化膜の電気的特性を調べた。その結果、アンモニア濃度が1.5mol/l、蟻酸濃度が1mol/l、が最適堆積条件であること、アニールなしでも絶縁性を示す膜が得られることが判った。さらに、500度の真空アニールによって誘電率が2.6(従来の酸化膜の約65%)という極めて低い酸化膜を実現できた。液相堆積には、蒸気圧が低い原料も利用できるという特徴があることに注目して、高次のアルキル基を含む原料を用いて堆積し、それらの膜質を評価した。その結果、メチル基が最も優れていることを確認するとともに、メチル基膜に残された欠点(酸化耐性に欠ける、加工性に劣る)を克服できる可能性を持った新しい有機シリカ膜の構造(アルキレン基含有シリカ膜)を発案した。この新構造膜の堆積原料としてビス・トリアルコキシ・アルキレンを探し出した。この原料の蒸気圧が極めて低いことから、液相堆積法を応用すれば、このアルキレン基含有シリカ膜が堆積可能と判断して、実際にも成膜に成功した。膜質の解明は今後の課題である。テトラ・シソシアネート・シランを用いたシリコンの液相堆積の段階において、分解時に発生する副生成物のアンモニアが分解特性を大きく変化させることが判った。液相堆積には、蒸気圧が低い原料も利用できるという特徴があることに注目して、高次のアルキル基を含む原料を用いて堆積し、それらの膜の耐熱性を評価した。その結果、メチル基が最も耐熱性を有すること、300度程度の耐熱は、様々な有機基で達成できることが判った。

液相堆積には、蒸気圧が低い原料も利用できるという特徴があることに注目して、高次のアルキル基を含む原料を用いて堆積し、それらの膜質を評価した。その結果、メチル基が最も優れていることを確認するとともに、メチル基膜に残された欠点(酸化耐性に欠ける、加工性に劣る)を克服できる可能性を持った新しい有機シリカ膜の構造(アルキレン基含有シリカ膜)を発案した。この新構造膜の堆積原料としてビス・トリアルコキシ・アルキレンを探し出した。この原料の蒸気圧が極めて低いことから、液相堆積法を応用すれば、このアルキレン基含有シリカ膜が堆積可能と判断して、実際にも成膜に成功した。膜質の解明は今後の課題である。
サイクリンとMAPキナーゼ系を連関する新規細胞周期遺伝子ファミリーの解析

ショウジョウバエで同定した新規細胞周期因子Gp99のC末側の配列に類似性を示す機能未知のタンパク質がゲノムデータベースから多数見い出され、これらは3つのサブファミリーに分類できる。全ゲノム配列が明らかにされた出芽酵母では4遺伝子(Sc-A,Sc-B1,Sc-B2,Sc-C)が存在し、全サブファミリーが揃っている。本研究では、昨年度に引き続き、これらの破壊株(昨年度に作成)の表現型などに関する詳細な解析を行った。そして、互いに類似性の高いSc-B1,Sc-B2の二重破壊株では増殖に異常が認められなかったが、C1b2破壊株と類似の細胞形態の異常を示すことを見い出した。また、生存に必須でG1期制御に関わると予想されるSc-Aに関して、Two hybrid法でこれと相互作用を示す因子の検索を行った。そして、これまでにGMP生合成に関わるIMPDH(inosine monophosphate dehydrogenase)を同定し、その意義について解析を進めつつある。ショウジョウバエGp99は、G2サイクリンと強い遺伝的相互作用を示したが、出芽酵母でも同様な相互作用が認められるのか検討を進めつつある。そして、これまでにSc-Cの低温感受性増殖異常がC1b3欠損によって抑圧されることを見い出し、その確認などを進めつつある。Sc-Aについては、これまで各種サイグリン遺伝子との遺伝的相互作用が認められていない。Sc-B1 Sc-B2二重破壊株とC1b2破壊株との間では、増殖に関して相互作用が認められなかったが、今後、細胞形態に関して解析の予定である。また、ショウジョウバエにおいても、Gp99の複眼原基での強制発現による効果などを調べつつある。
ネットワークの余力を最大化するサーバ割当アルゴリズムの開発

ネットワークにおいて回線帯域を逼迫しないようなサーバからユーザへのデータ配信方法を求める問題を,グラフにおける組合せ問題として定式化し研究した.特に,グラフ構造の観点からこのサーバ割当問題の計算困難性と容易性の解析を進め,グラフ中の閉路の個数やサーバの個数が計算可能性に与える影響を明らかにした.多くの場合,この問題は計算困難であるため,本研究課題では,動的計画法に基づく擬多項式時間アルゴリズムや固定パラメータアルゴリズムを与えた.平成25年度は,サーバからユーザへの配信経路が指定され,1つのユーザへ複数のサーバから供給することが許されている場合のサーバ割当問題について研究を行った.特に,グラフ構造の観点から,その計算困難性と容易性を解析した.まず,計算困難性として,カクタスと呼ばれる非常に限定された構造を持つグラフに対してさえ,サーバ割当問題はNP困難であり,多項式時間では解けそうにないことを示した.カクタスは,後述する木に近いグラフクラスである.なお,NP困難の証明は近似率を保持するように構成されている.そのことから,どんな定数に対しても,カクタスには多項式時間の定数倍近似アルゴリズムが存在しそうにないことも示した.次に,計算容易性として,グラフを木に限定したときに,サーバ割当問題を擬多項式時間で解くアルゴリズムを与えた.アルゴリズムは動的計画法に基づいており,グラフの点数と辺容量の最大値に関する多項式の計算時間で最適解を求めることができる.これは,辺容量の最大値が小さい(すなわち,多項式サイズ)であるときには,問題が多項式時間で解けることを意味している.ただし,辺容量が大きいときに,この問題が木に対してNP困難であるかどうかは未解決である.最後に,1つのユーザが通信できるサーバの個数に上限を設けたサーバ割当問題も扱った.この供給サーバ数が制限された問題は,その上限を十分に大きく設定すれば,先の問題と一致する.このように一般化した問題に対しては,木に対してNP困難であることを示した.平成26年度は,サーバ割当問題において,経路指定がないモデルについて,グラフ構造の観点から詳細な解析を行った.特に,このモデルにおいて,配信経路を効率よく策定するアルゴリズムを開発した.まず,ユーザの要求が限定的であれば,グラフのフロー問題に帰着でき,したがって一般のグラフに対して多項式時間で解けることを示した.一方で,ユーザの要求に制限がない場合には,たった1つの閉路を含むグラフに対してさえ,この問題はNP困難であり,多項式時間アルゴリズムは存在しそうにないことを証明した.そこで本研究では,閉路を1つしか持たないグラフに着目し,2つのアルゴリズムを開発した.一つはユーザ数をパラメータとした固定パラメータアルゴリズムであり,もう一つは閉路上の辺容量の最大値に関する擬多項式時間アルゴリズムである.これらはともに多項式時間アルゴリズムではないが,入力グラフのサイズに応じて,それぞれ計算時間に利点を持つ.また,これらのアルゴリズムは,閉路の個数が定数であれば,カクタスと呼ばれるグラフに拡張できることも示した.また平成26年度には,これまでの研究で得られた知見を基に,グラフの脆弱性最小化問題に関しても研究を行った.この問題は,辺コストフロー最小化問題や辺素パス問題,共通辺最小化問題などの一般化である.本研究では,しきい値グラフや直並列二部グラフに対してさえ,脆弱性最小化問題がNP困難であることを示した.一方で,木幅制限グラフに対しては擬多項式時間で解けることを示し,弦グラフに対しては経路の本数をパラメータとした固定パラメータアルゴリズムを開発することができた.平成27年度は,サーバ割当問題において,複数のサーバから1つのユーザへ配信することが許され,サーバからユーザへの配信経路には事前の指定がないモデルを扱った.このようなモデル上で,配信経路を効率よく策定するアルゴリズムと計算困難性を詳細に解析した.昨年度までの研究で,この問題はグラフ中に閉路がたった1つしかないユニサイクルと呼ばれるグラフに対してさえNP困難であることを示している.本年度は,この成果を発展させ,グラフが閉路そのものであったとしても(すなわち閉路以外の点や辺がない),サーバが1個しかなければNP困難であることを証明した.その一方で,閉路にサーバが2個以上含まれる場合には,問題が多項式時間で解けることを示した.このようにサーバの個数の観点から,問題の計算困難性と容易性の境界を与えることに成功した.また,サーバの個数が増えることによって問題が容易になったことは興味深い結果である.なお,グラフ中に閉路が1つもない木と呼ばれるグラフに対しては,本問題は多項式時間で解けるため,この点でも計算困難性と容易性の境界を与えている.また,ネットワークをモデル化したグラフの様々な問題に対しても,本課題で得られた知見を基に研究を行った.昨年度に引き続き,グラフの脆弱性最小化問題に関しては,アルゴリズムの計算時間と証明の詳細化を行った.さらに,ネットワーク上での情報拡散をモデル化した問題も扱い,グラフ構造の観点から解析を行っている.特に,線状森に対しては動的計画法に基づいた擬多項式時間アルゴリズムを与えている.ネットワークにおいて回線帯域を逼迫しないようなサーバからユーザへのデータ配信方法を求める問題を,グラフにおける組合せ問題として定式化し研究した.特に,グラフ構造の観点からこのサーバ割当問題の計算困難性と容易性の解析を進め,グラフ中の閉路の個数やサーバの個数が計算可能性に与える影響を明らかにした.多くの場合,この問題は計算困難であるため,本研究課題では,動的計画法に基づく擬多項式時間アルゴリズムや固定パラメータアルゴリズムを与えた.

平成25年度は経路指定があるモデルに関して研究を行い,平成26年度は経路指定がないモデルに関して研究を行うことができた.これにより,モデル設定の相互関係についても,解析を進めることができるようになった.理論計算機科学平成26年度にはグラフの脆弱性最小化問題も扱ったが,これはサーバ割当問題に対するアルゴリズム開発へ新しい知見を与えてくれている.特に,脆弱性最小化問題においては,木幅制限グラフだけでなく,弦グラフという異なる構造を持つグラフに対してもアルゴリズムが開発できている.これらの新しいアルゴリズム手法をサーバ割当問題にフィードバックし,「木」に構造が近いグラフだけでなく,より様々な構造を持つグラフに対しても,アルゴリズム開発を進めていきたい.グラフを木に限定してはいるものの,25年度中に経路指定があるモデルに対して,アルゴリズムの開発を行うことができた.一方で,モデル設定の相互関係の解析は,今回のアルゴリズム開発を受けて,26年度も継続する予定である.サーバからユーザへの配信経路が指定されていないモデルについて,計算困難性と容易性の解析を行う.特に,よく知られているグラフのフロー問題との関係を解析し,本問題に対するアルゴリズムを開発したい.25年度に得られた結果と,これらの解析を基に,モデル設定の相互関係を調べていきたい.パソコンなど物品購入が,予定よりも安価に済んだため.計画に大きな変更はないが,26年度以降は成果発表に伴い,旅費の支出が多くなる予定であるため,次年度使用額と合わせて有効に活用していく.
生体内機能分子の作用機序を応用した高特異性MMPインヒビターの開発

(1)MMP-2に対し、高い阻害選択性を持つ10残基ペプチドインヒビターAPP-IPのアミノ酸配列を改変し、MMP-7、MMP-9およびMMP-14のそれぞれに対する選択性を高めたペプチドインヒビターを開発した。(2)さらに、MMP-9に対する選択性を高めたAPP-IP改変体と、MMP-9およびMMP-2の非触媒領域に対し親和性を持つTIMP-1とを組み合わせることで、MMP-9とMMP-2に対して、高い選択性を持ち、かつ強力なインヒビタータンパク質の設計に成功した。(3)がん細胞表層でMMP-7により、特異的に切断され、細胞凝集誘導に関わるタンパク質がHAI-1であることを明らかにした。悪性がんの組織内で高発現しているマトリックスメタロプロテアーゼ(MMPs)は、がん細胞の浸潤性増殖および転移を支えることから、がん治療の有望な標的分子である。しかし、従来型MMP阻害剤は特異性が低く、臨床試験の過程で様々な副作用を示したため、それらを抗がん剤として開発することに成功していない。そこで本研究課題では、個々のMMP活性を特異的に阻害するインヒビターを創出することにより、副作用の極めて少ないがん治療薬の開発へ繋げることを目指している。本年度はβ-アミロイド前駆体タンパク質(APP)に由来する10残基ペプチドインヒビター(APP-IPと命名)がMMP-2に対し、高い選択性を持つこと、およびMMP-2選択性に関与するAPP-IPのアミノ酸残基が私達のこれまでの研究で明らかになっていることを利用して、APP-IPを改変し、MMP-7およびMMP-9のそれぞれに対して選択性を持つペプチドインヒビターの開発を試みた。APP-IPの改変方法としては、選択性に関与するアミノ酸残基を一つずつ20種のアミノ酸を網羅するようにランダム変異を導入し、標的MMPとの親和性獲得を指標に選別を行った。選別の方法としては、APP-IP改変体を大腸菌の外膜タンパク質との融合分子として、大腸菌表層にディスプレイさせる方法、およびAPP-IP改変体をGST融合タンパク質として菌体内に発現させ、各クローンの溶解物について標的MMPをリガンドとしたリガンドブロッティング法を用いて親和性を調べる方法を比較した。その結果、リガンドブロッティングを用いる方法が変異導入後の親和性上昇を検出するのに有効であることが判明した。この方法によりMMP-9に対して親和性を獲得したペプチド2種、MMP-7に対する親和性ペプチド1種を得た。今後これらのペプチドと各MMPに対して親和性を持つ生体内物質を組み合わせ、より特異性の高いインヒビターを開発する予定である。そこで本研究では、個々のMMPの酵素活性あるいはそれらの一機能を特異的に阻害するインヒビターを創出することにより、副作用の極めて少ないがん治療薬の開発へ繋げることを目的としている。本年度は昨年度に引き続き、MMP-2に対し高い選択性を持つβ-アミロイド前駆体タンパク質(APP)由来10残基ペプチドインヒビター(APP-IPと命名)のアミノ酸配列を改変し、他のMMPs対して選択性を持つインヒビターを作出することを試みた。APP-IPの改変方法としては、選択性に関与するアミノ酸残基を一つずつ20種のアミノ酸を網羅するようにランダム変異を導入し、MMP-2以外の標的MMPとの特異性獲得を指標に選別を行った。その結果、MMP-9とMMP-7のそれぞれに対する親和性が高まり、反対にMMP-2との親和性が顕著に低下するAPP-IP改変体が得られた。一方、MT1-MMPは各種APP-IP改変体に対する親和性スペクトラムがMMP-2のそれと類似しており、選択性を顕著に高めることは困難であったが、MMP-2に対する親和性よりMT1ーMMPに対する親和性が高いAPP-IP改変体が得られた。また、MMP-9に対する阻害選択性を高めたペプチドはこれをいくつかのMMP-9結合性タンパク質と融合させることにより、その阻害活性とMMP-9選択性を飛躍的に高めることに成功した。そこで本研究は、がんの悪性進展に関わる個々のMMPを特異的に阻害するインヒビターを創出することにより、副作用の極めて少ないがん治療薬の開発へ繋げることを目的とした。本研究では、MMP-2に対し、高い選択性を持つβ-アミロイド前駆体タンパク質(APP)由来10残基ペプチドインヒビター(APP-IPと命名)のアミノ酸配列を改変し、MMP-7、MMP-9、MMP-14対する高選択性インヒビターの創出を試みた。その結果、MMP-7、MMP-9、MMP-14のそれぞれに対する選択性を高めたAPP-IP改変体を得た。

さらに、それぞれのMMPの非触媒領域と相互作用するタンパク質とAPP-IP改変体を融合することにより、阻害活性および酵素特異性を向上させることを試みたが、MMP-14に関しては親和性を持つことが報告されているMT1-AF7pというペプチドやCD44のコアタンパク質との親和性が確認できず、融合タンパク質の作製に至らなかった。一方、MMP-9に対する阻害選択性を高めたペプチドはMMP-9結合性タンパク質であるTIMP-1と融合することにより、その阻害活性を飛躍的に高めることに成功したが、TIMP-1がMMP-2の非触媒領域とも結合することが判明し、MMP-2に対しても阻害活性を示した。(1)MMP-2に対し、高い阻害選択性を持つ10残基ペプチドインヒビターAPP-IPのアミノ酸配列を改変し、MMP-7、MMP-9およびMMP-14のそれぞれに対する選択性を高めたペプチドインヒビターを開発した。(2)さらに、MMP-9に対する選択性を高めたAPP-IP改変体と、MMP-9およびMMP-2の非触媒領域に対し親和性を持つTIMP-1とを組み合わせることで、MMP-9とMMP-2に対して、高い選択性を持ち、かつ強力なインヒビタータンパク質の設計に成功した。(3)がん細胞表層でMMP-7により、特異的に切断され、細胞凝集誘導に関わるタンパク質がHAI-1であることを明らかにした。2年目の目標は、標的MMPsに対して高い親和性および選択性を持つペプチドインヒビターを得ることにあったが、概ね計画どおりに研究が進み、MMP-7とMMP-9に対しては昨年度得られた親和性ペプチドのアミノ酸配列をさらに改変することでそれらの選択性を高めることに成功した。また、MT1-MMPに対する選択性を高めたインヒビターペプチドも得られた。さらに、MMP-9に対するインヒビターペプチドは、これをMMP-9の非触媒部位に結合するタンパク質と融合させることにより、その阻害活性とMMP-9選択性を飛躍的に高めることに成功した。構造生物化学MMP-9に対する選択性を持つように改変したインヒビターペプチドをMMP-9の非触媒部位に結合するタンパク質と融合させて得られた高特異性MMP-9インヒビタータンパク質は、今後、動物実験等に用いる目的で、その大量調製法を確立する予定である。同様に、MMP-7とMT1-MMPに対する親和性ペプチドについては、これらを各MMPの非触媒部位と特異的に相互作用する生体内物質と組み合わせ、より特異性の高いインヒビターの開発を試みる予定である。1年目の目標として、各MMPに対する親和性ペプチドを得るためのスクリーニング方法を確立することにあったが、概ね計画どおりに研究が進み、2種のMMPに対する親和性ペプチドが得られた。当該年度の研究成果として、MMP-9に対する高特異性インヒビタータンパク質の設計に成功したが、このタンパク質を動物実験等に使用するためには培養細胞系を用いて大量発現・調製する必要がある。その細胞培養にかかる費用を次年度に残した。今後は1年目に確立したスクリーニング方法を用いて他の標的MMPに対する親和性ペプチドのスクリーニングを進めるとともに、これらのペプチドを各MMPに対して特異的に相互作用する生体内物質と組み合わせ、より特異性の高いインヒビターの開発を試みる予定である。
血液前駆細胞・心筋前駆細胞を分離可能なマーカー膜蛋白質の同定とその発現解析

血液細胞や心筋細胞は、発生学的には側板中胚葉由来の細胞である。側板中胚葉のマーカーはVEGF受容体Flk1であり、実際に胚性幹(ES)細胞を用いたin vitro分化誘導実験やin vivoトレース実験において、Flk1発現(+)細胞が血液細胞や心筋細胞へ分化することが証明されている。一方、最近の研究からFlk1+細胞は血液前駆細胞や心筋前駆細胞等の分化能の異なる細胞種が混在したヘテロな細胞集団であると考えられているため、新たなマーカー蛋白質を加えてFlk1+細胞をさらに細かく区別することが望ましい。Coxsackievirus and adenovirus receptor(CAR)はアデノウイルス(Ad)の受容体として同定され、その後の研究から、タイトジャンクション構成蛋白質として機能していることが報告された膜蛋白質である。ヒトES/iPS細胞由来Flk1+細胞においてCARの発現を解析したところ、Flk1+細胞中にはCAR+細胞とCAR-細胞の両細胞が存在していること、そしてこれらの両細胞は造血系および心筋系の転写因子の発現パターンが大きく異なっていることを見出した。また、Flk1+かつCAR+細胞(F+CAR+細胞)およびFlk1+かつCARー細胞(F+CAR-細胞)の分化能を評価したところ、F+CAR+細胞は心筋細胞への分化指向性を有し、F+CAR-細胞は血液・血管内皮細胞への分化指向性を有することが明らかとなり、CARはFlk1陽性中胚葉細胞をさらに細かく分別可能なマーカーとなり得ることが明らかとなった。本年度のES/iPS細胞を用いた分化研究から、当初の一番の目的であった「CARが血液前駆細胞と心筋前駆細胞の分離マーカーとなる膜蛋白質である」ことが強く示唆されたので順調に進展しているといえる。今後はin vivo(マウス生体)においても同様のことがいえるかどうか確認していく予定である。側板中胚葉のマーカーはVEGF受容体Flk1であり、Flk1発現(+)細胞が血液細胞や心筋細胞へ分化することが証明されている。また、胎生8.5日のマウスにおいてもFlk1+細胞をCAR+細胞とCAR陰性細胞に分別できることが明らかとなり、それぞれ心筋細胞指向性、血液細胞指向性を示した。したがって、生体においてもCARは中胚葉系細胞を細かく分別できるマーカーとなり得ることが示された。ES/iPS細胞を用いた分化研究から、当初の一番の目的であった「CARが血液前駆細胞と心筋前駆細胞の分離マーカーとなる膜蛋白質である」ことが強く示唆されたので順調に進展しているといえる。また、28年度はin vivo(マウス生体)においても同様のことがいえることが示された。

また、マウスにおいてもFlk1+細胞をCAR+細胞とCAR陰性細胞に分別できることが明らかとなり、それぞれ心筋細胞指向性、血液細胞指向性を示した。したがって、in vivoにおいてもCARは中胚葉系細胞を細かく分別できるマーカーとなり得ることが示された。Flk1陽性細胞の中にCAR陽性細胞とCAR陰性細胞が存在することが示された。次に、in vivo(マウス生体)においても同様のことがいえるかどうか確認していく予定である。また、マウスおよびヒトFlk1+細胞中の前駆細胞を分離可能な膜蛋白質としてPDGFRa(Pa)が報告され、Pa+細胞は心筋細胞へ、Pa非発現(-)細胞は血液細胞へ分化することがES細胞やiPS細胞を用いた実験系により実証されている。今後はFlk1陽性細胞中のPaの発現とCARの発現細胞について解析していきたい。Flk1陽性細胞の中にCAR陽性細胞とCAR陰性細胞が存在することが示され、in vivo(マウス生体)においても同様のことがいえるかどうか確認できた。マウスおよびヒトFlk1+細胞中の前駆細胞を分離可能な膜蛋白質としてPDGFRa(Pa)が報告され、Pa+細胞は心筋細胞へ、Pa非発現(-)細胞は血液細胞へ分化することがES細胞やiPS細胞を用いた実験系により実証されている。したがって、今後はFlk1陽性細胞中のPaの発現とCARの発現細胞について解析していきたい。幹細胞生物学
内臓肥満が大腸癌の進展に与える影響とそのメカニズムの解析

内臓脂肪からのアディポサイトカインが引き起こす慢性炎症が大腸癌の悪性度に関与することを明らかにすべく、Stage I-III大腸癌症例の術前CT内臓脂肪量測定と、手術時に採取した内臓脂肪組織及び血中でのアディポサイトカイン発現解析を行った。内臓脂肪と予後の関係は女性において、脂肪量過多が予後不良因子であった。また、内臓脂肪組織及び血中でのレプチン発現量と炎症マーカー値は女性において相関していた。各種血中アディポカインと臨床病理学的背景との関連性を調べた結果、脈管侵襲陽性が血清レプチン高値と有意な関係にあることが判明した。近年、肥満の増加に伴い大腸癌患者が増加している。また、内臓脂肪からはレプチン、IL-6、VEGF、TNFαなどのアディポサイトカインが分泌され、炎症反応や癌細胞を増殖させることが報告されている。我々は内臓脂肪からのアディポサイトカインが引き起こす慢性炎症が大腸癌の悪性度に関与することを明らかにすべく、内臓脂肪組織及び末梢血でのアディポサイトカインの発現レベルと大腸癌の分子病理学的因子との関連性や全身及び大腸癌局所の炎症反応との関連性を検証することを目的とした。現在までに約100例の内臓脂肪を採取し、70症例で解析を行った。これらの内臓脂肪組織からRNAを抽出し、レプチン、IL-6、VEGF、TNFαのアディポサイトカイン発現はPCRを用いて測定した。内臓脂肪量との関連を検証すると、レプチンの発現は男性でも女性でも有意に正の相関を認めた。他のアディポサイトカインでは相関は認めなかった。また、血中のアディポサイトカインの発現はELISAを用いて測定した。血中レプチンの発現も内臓脂肪量と有意に正の相関があり、また内臓脂肪からのレプチン発現と血中の発現も相関を認めた。全身の炎症反応と内臓脂肪からのレプチン発現とのは有意な相関を認めることはできなかった。大腸癌局所の炎症反応をCD68およびCD163の組織免疫染色で評価し、内臓脂肪からのレプチン発現との関連ではCD68、CD163ともに高発現症例では内臓脂肪からのレプチン発現も有意に高かった。また、内臓脂肪からはレプチン、IL-6、VEGF、TNF-αなどのアディポサイトカインが分泌され、炎症反応や癌細胞を増殖させることが報告されている。我々は内臓脂肪からのアディポサイトカインが引き起こす慢性炎症が大腸癌の悪性度に関与することを明らかにすべく、内臓脂肪と予後の関係、内臓脂肪組織及び血中でのアディポサイトカイン発現と大腸癌分子病理学的因子との関連や全身炎症との関連を検証することを目的とした。108例を対象としたコホートグループを用いて、内臓脂肪組織及び血中でのアディポサイトカイン発現と大腸癌分子病理学的因子との関連の解析を行った。この結果、内臓脂肪量と内臓脂肪からのレプチン及び血中レプチンは男女とも有意に正の相関を示すことが分かった。女性では内臓脂肪からのIL-6の発現とも有意に相関した。内臓脂肪からのレプチン発現を高発現群と低発現群に分け、男女別に血清アディポサイトカインとの関連を検証すると、女性では高発現群で有意に血清アディポカイン(レプチン、IL-6)及び全身炎症反応(high sensitive CRP)が高値であった。男性群ではいずれの関連性も認めなかった。また、各種血清アディポカインと腫瘍の悪性度との関連性を調べた結果、脈管侵襲陽性は血清レプチン高値と有意な関係にあることが判明した。また、別コホートにおいて、術前CTによって定量化した内臓脂肪量とStageI-III大腸癌根治切除後の長期予後との関連性を調べた。女性においてのみ内臓脂肪過多が無再発生存期間に負の影響を与えていることが判明した。現在までに採取したサンプル全症例のアディポサイトカイン発現および内臓脂肪量の測定は施行済みである。研究成果の学会報告も行えており、達成度はおおむね進展している。研究結果については論文執筆中である。大腸癌の診断で切除術を施行したStage IIIIの症例を対象とし2つのコホートブループで検証を行った。コホート1のグループにおいて、術前CTによって定量化した内臓脂肪量と予後との関連を検証した結果、女性においてのみ、内臓脂肪過多が無再発生存期間に負の影響を与えていることが判明した。コホート2のグループを用いて、内臓脂肪組織及び血中でのアディポサイトカイン発現と大腸癌分子病理学的因子との関連の解析を行った。この結果、内臓脂肪量と内臓脂肪からのレプチン及び血中レプチンは男女ともに有意に正の相関を示すことがわかった。さらに、女性では内臓脂肪からのIL-6の発現とも有意に相関した。