hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
胃癌における変異RHOAの機能解明と治療への応用

RHOAノックダウン細胞のマイクロアレイによる網羅的蛋白発現解析より得た、RHOAノックダウン関連分子の候補については、前年度より、表現型の責任分子であるか否かを確認すべく、RHOAノックダウン細胞のレスキュー実験の条件検討を開始していたが、RHOAノックダウンに下流分子の発現変化のレスキューを加えると、RHOAノックダウン効率の低下を招くだけでなく、下流分子の発現変化のレスキューも効率が著しく低下したため、レスキュー実験系を確立できなかった。そこで、各種細胞株のRHOAのGenotype、3次元スフェロイド培養における表現型の変化、RHOAノックダウン細胞のマイクロアレイによる網羅的蛋白発現解析の結果を再検討し、RHOA変異株に対するRHOAノックダウンで共通して発現変化した遺伝子群・そのontologyの解析に加え、さらにRHOAノックダウンで増殖抑制を示した細胞株で共通して発現変化した遺伝子群・そのontologyの解析も加えて行い、RHOA・変異RHOAの機能が消化管腫瘍のtumorigenicityに与える影響を解析し、治療標的の候補となり得る経路・下流遺伝子の情報を得た。具体的には、RHOA変異株のRHOAノックダウンでは、lnc-DERA-1が共通して発現低下することを発見し、さらにRHOAノックダウンで増殖抑制を示した細胞株では、小分子代謝と酸化還元に関与する遺伝子群が共通して発現低下することを発見した。これらの成果を取り纏め、論文投稿した。1.胃癌細胞株を培養し、変異の解析に十分な量のDNAを回収・分離し、RHOAの変異をSanger法で確認後、RHOA変異株とRHOA野生株を2次元培養および3次元スフェロイド培養し、短二重鎖RNA (siRNA)を用いたRNA干渉にて、RHOA mRNAをノックダウンした。トランスフェクションには、短二重鎖RNAでリポフェクション法を用い、各細胞株のRHOAをノックダウン後に、細胞を回収し、蛋白を抽出し、Western blotting法を用いてRHOA発現の変化を確認すると、有効なノックダウンが得られていた。また、実験の再現性も得られた。2.変異RHOAノックダウン細胞について96 well low attatchment plateを用いて3次元スフェロイド培養を行い、増殖抑制を経時的にATPを測定することにより定量化した。経時的変化には有意差がみられ、再現性も確認された。3.RHOA変異あるいはRHOA野生細胞株のRHOAノックダウン細胞と非ノックダウン細胞を回収し、RNAを抽出した。さらに、抽出したRNAが、今後マイクロアレイで解析可能な濃度、RNA integrity numberであることをbionanalyzerにて確認した。4.また、胃癌肝転移切除例における予後とその病理像の関連について、既知のRHOA変異が示唆される病理組織型を含め考察し、後向き観察研究として論文報告した。1.胃癌細胞株のRHOA変異の状態をSanger法で確認する行程、RHOA変異株とRHOA野生株を2次元培養および3次元スフェロイド培養を滞りなく行うことができた。2.短二重鎖RNA (siRNA)を用いたRNA干渉にて、RHOA mRNAをノックダウンしWesternblotting法を用いてRHOA発現の変化を確認する行程も滞りなく行うことができ、有効なノックダウンが得られ、再現性も得られた。3.変異RHOAノックダウン細胞の増殖抑制を経時的にATPを測定する行程では、過去報告と同様のデータの再現が必要であったが、そのためにはmethodに記載がなかった細かい箇所での系の確立が必要で多少の試行錯誤があったが、最終的には再現性のある有効なデータが得られた。4.RHOA変異あるいはRHOA野生細胞株のRHOAノックダウン細胞と非ノックダウン細胞を回収し、RNAを抽出する行程も滞りなく行うことができ、抽出したRNAのqualityも、今後マイクロアレイで解析可能な濃度、RNA integrity numberであったため、特に問題なく完遂可能であった。5.論文発表した胃癌肝転移の後向き観察研究では、予後因子の検討の際、RHOA変異例での病理所見の特徴を含め考察した。今後の解析結果と照らし合わせることで、理解が深まるものと思われる。全体として、実験の行程で予期しない試薬のlossや、実験を滞らせるような大きなミスなどはなく、予定の実験を終了することができ、さらに次年度分の実験に進むための準備ができているため、本研究課題の進捗状況は、おおむね順調に進展していると判断した。RHOA変異あるいはRHOA野生細胞株のRHOAノックダウン細胞と非ノックダウン細胞より回収、抽出し、濃度とRNA integrity numberが検討可能であることを確認したRNAを用いて、マイクロアレイによる網羅的蛋白発現解析を行った。この際は、RHOAのhotspot変異を伴いRHOAノックダウンにて生存、増殖が抑制された細胞、抑制されなかった細胞、それ以外のRHOA変異を伴いRHOAノックダウンにて生存、増殖の抑制を認めた細胞、RHOA野生細胞株でRHOAノックダウンにて生存、増殖に変化を認めなかった細胞におけるRHOAノックダウン前後の変化を調べた。その結果を、平成28年度までに行ったRHOAノックダウン細胞の3次元スフェロイド培養における表現型の変化と照らし合わせながら検討し、その原因となりうるsignal pathway活性の変化、遺伝子オントロジーエンリッチメント、発現蛋白の変化を同定した。さらに、これらRHOAノックダウン関連分子については、表現型の責任分子であるか否かを確認すべく、RHOAノックダウン細胞のレスキュー実験の条件検討までを行った。また、RHOA変異をcompound mutationsとして持つ細胞株に対しては、その機能的意義についての考察のために、trans-compound heterozygousであるかcis-compound heterozygousであるかを確認する必要があったため、mutant specific primersを作成し、これを用いて得られた特異的なPCR産物の配列をSanger法にて確認した。

その結果、その細胞株におけるRHOA変異はtrans-compound heterozygousであることを確認した。また、粘膜内胃癌のリンパ節転移におけるRHOAの関与をpanel sequencingにより確認し、病理学的特徴とともに考察し、論文報告した。1.十分量かつ質の保たれたRNAを用いて、マイクロアレイ解析を行うことができた。2.マイクロアレイ解析の結果より、RHOAノックダウン細胞の3次元スフェロイド培養における表現型の変化の原因となりうるsignal pathway活性の変化、遺伝子オントロジー、発現蛋白の変化を同定できた。3.RHOAノックダウン後のレスキュー実験に関しては、RHOAノックダウンにより高発現となった特定の分子を候補分子として、siRNAのco-transfectionによるレスキューを複数の分子に対して試み、それぞれ条件検討を行ったが、co-transfectionを行うことによりいずれもRHOAのノックダウン効率が著しく低下し、かつ候補分子の十分なノックダウン効果も得られなかったため、検討可能な実験系を成立できなかったが、それまでの経過が当初の予定より進展していたため、全体としての遅滞は殆どなかった。4.RHOA変異をcompound mutationsとして持つ細胞株においても、その変異はtrans-compound heterozygousであることを確認でき、その機能的意義についてのより詳細な考察ができた。RHOAノックダウン細胞のマイクロアレイによる網羅的蛋白発現解析より得た、RHOAノックダウン関連分子の候補については、前年度より、表現型の責任分子であるか否かを確認すべく、RHOAノックダウン細胞のレスキュー実験の条件検討を開始していたが、RHOAノックダウンに下流分子の発現変化のレスキューを加えると、RHOAノックダウン効率の低下を招くだけでなく、下流分子の発現変化のレスキューも効率が著しく低下したため、レスキュー実験系を確立できなかった。そこで、各種細胞株のRHOAのGenotype、3次元スフェロイド培養における表現型の変化、RHOAノックダウン細胞のマイクロアレイによる網羅的蛋白発現解析の結果を再検討し、RHOA変異株に対するRHOAノックダウンで共通して発現変化した遺伝子群・そのontologyの解析に加え、さらにRHOAノックダウンで増殖抑制を示した細胞株で共通して発現変化した遺伝子群・そのontologyの解析も加えて行い、RHOA・変異RHOAの機能が消化管腫瘍のtumorigenicityに与える影響を解析し、治療標的の候補となり得る経路・下流遺伝子の情報を得た。
寿命予測・障害予防・修復を可能とする集積回路の信頼性設計手法

集積回路の構成部品であるMOSトランジスタは、経時的に特性が劣化すること、高温、高電源電圧において特に劣化がすすみやすいことが知られている。本研究ではトランジスタの特性劣化を観測し、そのモデル化を行うことにより、集積回路の中・長期的な特性変動を予測可能としている。また,開発したモデルを用いて、回路中で特に劣化の進みやすいトランジスタを効果的に指摘する方法、および、劣化が進みやすいトランジスタの劣化度合を定量的に予測し、さらに劣化を緩和するための回路設計方法を与えている。半導体デバイスの長期信頼性を左右する代表的な劣化モードの一つである負バイアス温度不安定性(NBTI)に関し、NBTIによるデバイス特性の変動の効率的な測定を可能とするアレイ回路を提案した。提案回路により、1チップ上に約4000個という多数のデバイスを搭載し、並列にストレス電圧印加を行いながら閾値電圧の測定を行なえるようになり、測定時間の大幅な短縮とデバイスごとの経時特性変化の差違を統計的に観測することが可能となった。試作チップの測定データより、NBTIによる閾値電圧変動の標準偏差は、チャネル面積に反比例するモデルで表されることを明らかとした。界面トラップでのキャリア捕獲・放出によりデバイスの閾値が離散的な値をとって過渡変動する現象として観測されるランダムテレグラフノイズ(RTN)は、BTIの主要な原因であると考えられている。BTIによる回路特性の経時的変動の予測に向けて、まず、RTNによる回路特性変動を高速に予測する方法を検討した。従来、長時間を要していたモンテカルロ法による回路不良確率計算を高速化するため、1)仮説空間を動きまわるサンプル粒子を使って重点的サンプリングで必要となる代替分布を推定する手法と、2)これらのサンプルを用いて2クラス識別器を構成し回路シミュレーション回数を削減する手法、を組合せて用いる新たな手法を提案した。SRAMメモリセルの不良確率計算を例として提案手法を評価した所、従来手法と比較して約15倍の高速化が達成できた。本手法により、デバイス特性の経時変動と回路特性の変動を結びつけることが可能となる。また、オンチップでの小振幅・高速な閾値変動の観測に向けて、専用のオンチップA/D変換器の回路方式検討を実施し、その結果に基づいて回路設計を行った。今後、試作したチップの測定を実施する。特性劣化現象、およびそのデバイス毎のばらつきを観測するために、複数のプロセスを用いてチップ試作を行ってきている。前年度に開発した大規模アレイ回路では、1チップ上に約4000個のデバイスを搭載し、ストレス電圧を並列に印加することを可能とした。ただしこの回路を微細なプロセスで製造する場合、特定のバイアス・温度条件において、無視できない漏れ電流が観測される場合が有ることがわかった。漏れ電流が観測される条件をシミュレーションにより把握し、現在、漏れ電流対策を強化した回路の設計を行っている。あまり微細でないプロセスにおいては、提案回路の正常な動作が確認されており有用なデータが得られている。この回路を効率よく、また時間精度よく測定するための自動測定環境を作成した。人間が読んで意味を理解しやすい制御プログラムを命令列に変換し、命令列をフィールドプログラマブルゲートアレイ(FPGA)が読み込んでバイアス印加時間を計測しつつ測定装置を制御する構成となっている。また、現在用いている市販の電圧・電流源による測定を超える、高サンプリングレートでの観測を実現するため、専用の高速A/D変換回路をFPGAから制御する測定環境を構築し、そのデバッグをおおむね終えている。今後、モデル改善のためのデータ取得をすすめる予定である。作成したモデルに基づくアナログ回路、大規模ディジタル回路のシミュレーション環境を整えており、その結果が得られ始めている。デバイス劣化の進むゲートの負荷確率から、各論理ゲートの特性劣化を求める一連の手順を定義できた。これは、回路特性の予測、障害予知につながる重要な技術である。回路の特性変動の原因と考えられるキャリアの捕獲と放出にかかわるランダムテレグラフノイズ等を、18bit, 2Mspsの高サンプリングレートで、長時間連続観測できる測定環境を整えた。また、この測定環境では、人間が読んで理解しやすい制御プログラムにより一連の測定を実施することが可能となっており、劣化と回復のバイアス条件を繰り返すような複雑な指示も誤りなく実行可能である。この環境による測定結果を今後、モデル化に生かしていく計画であるため、本研究課題にとって大きな進展であると考える。さらに、アナログ回路・ディジタル回路双方について、特性変動モデルやばらつきモデルを用いたシミュレーションが新たに可能となった。特に、従来は小規模回路に限られていた回路特性劣化の予測を大規模回路において実施できる見通しを得られたことは、今後の回路特性の予測、障害予知に関する研究を進展させる重要な成果である。回路試作を行うとともに、既存の試作チップの測定結果と合わせて特性劣化のモデル検討を行った。長時間のストレス電圧をトランジスタに印加する際に観測されるしきい値変動について、複数のモデルを用いて評価した。その結果、しきい値劣化を永続成分と回復可能成分とに分離し、それぞれの成分が異なるメカニズムにより生じていると考えることで実測結果がよく表せることを見出した。また、回路設計においてデバイス劣化の影響を適切に考慮するため、ばらつきと劣化を考慮する高速なタイミング解析およびタイミング歩留まり解析の手法について検討した。さまざまなばらつき成分を扱う高次元のモンテカルロ解析は特に困難な問題として知られているが、Line samplingと呼ばれる手法を応用し、劣化をばらつき変数の一つとして扱うことにより、回路シミュレータを用いる正確なタイミング歩留まり解析を実現した。

さらに、ディジタル回路の設計フローで広く用いられている静的タイミング解析(STA)の概念を拡張して、劣化を考慮できる新たなSTA手法を提案した。提案手法により、プロセッサなどの大規模回路に対してデバイス劣化を考慮したタイミング解析を現実的な時間で行うこと、回路内で劣化が早く進み故障の起こりやすい論理ゲートを指摘すること、等が可能となった。さらに回路設計時に回路中のデバイス劣化によるタイミングエラーを未然に防止するよう故障の起こりやすい論理ゲートの劣化を緩和する手法を検討した。劣化の進みやすい論理ゲートの上流のゲートを改変し、回路が動作しないタイミングに合わせてリカバリ信号を与えて劣化を回復する。回路オーバヘッドが小さくできるよう、改変するゲート数を最小化しつつタイミング違反を防止する設計手法を考案することで回路動作中の劣化回復を実現し、回路寿命を延ばすことが可能となった。集積回路の構成部品であるMOSトランジスタは、経時的に特性が劣化すること、高温、高電源電圧において特に劣化がすすみやすいことが知られている。本研究ではトランジスタの特性劣化を観測し、そのモデル化を行うことにより、集積回路の中・長期的な特性変動を予測可能としている。また,開発したモデルを用いて、回路中で特に劣化の進みやすいトランジスタを効果的に指摘する方法、および、劣化が進みやすいトランジスタの劣化度合を定量的に予測し、さらに劣化を緩和するための回路設計方法を与えている。従来のBTI測定回路では、被測定デバイス数を増加させると、スイッチ回路の漏れ電流等により測定精度が劣化する課題があった。このため、1チップあたりに搭載できるデバイス数には制約があった。今年度の成果では、約4000デバイスを1チップに集積することを可能としたことにより、閾値変動の統計的性質を明らかにできたためである。また、ランダムテレグラフノイズによるデバイスの特性変動モデルが与えられた際に、メモリ回路の動作にどの程度の影響があるかを、高速に計算するアルゴリズムを与えることができた。今後、BTIによるデバイスの特性変動モデルが与えられた場合の、回路特性への影響を検討する上で、大いに参考となる成果である。本研究課題は、概ね当初の計画通り順調に進展している。来年度は研究のまとめの年度となるため、本研究の大きな目標である回路特性の予測、障害予知・対策回路を確実に実現するべく、複数の角度から研究に取り組む。(1)複数の製造プロセスについての回路試作・測定を通じて、特性変化に関係するモデルの汎用性を評価し、必要に応じてモデルを改善する。(2)モデルに基づいて、アナログ回路およびディジタル回路の中・長期的な特性変動を予測するための、統計的シミュレーション環境を確立する。特に、代表的なアナログ回路であるメモリセルについて、その不良率を効率よく解析する方法の確立を目指す。
不連続あるいは正定でない入力コストを用いた省エネルギー制御

本研究計画では、現実に近いエネルギー消費関数を考慮できる省エネルギーを目指した制御系設計手法を構築することを目指す。従来、入力オフセットによる入力コスト項の非正定性や、待機パワー削減のためのアクチュエータon/offによる入力コストの不連続性等により、実際のエネルギー消費関数を理論に反映できない場合が多々存在した。本研究では、この2種類の要因に対し、最適制御・制御リアプノフ関数・モデル予測制御の各アプローチにおいて解決策を提示する。これにより、入力制約下で状況に応じた適切なアクチュエータ選択を実現でき、入力コストの非対称性を陽に考えることができる。
抗がん剤耐性因子GST-Pを標的としたアポトーシス誘導機構の解析と治療への応用

1.JNK活性化によるアポトーシス誘導のためのJNKの標的分子検索GSH-DXRによるアポトーシス誘導がJNK活性化を介したミトコンドリア経路である結果を得たので、標的候補分子としてBcl-2 familyのBcl-xL, Baxに着目して、これらの機能的、質的変化を調べた。Bcl-xLを過剰発現させたAH66をGSH-DXRで処理すると、ミトコンドリア膜上でJNKの活性化と一致してBcl-xLは脱アミド化され抗アポトーシス効果が低下した。また、Bcl-xL脱アミド化変異体、脱アミド化抑制変異体を用いた結果から、JNKを介したBcl-xLの脱アミド化による不活化が考えられた。一方、Baxを過剰発現させたAH66のGSH-DXR処理で、JNK活性化と一致してBaxの細胞質からミトコンドリアへの移行が観察され、JNKのターゲット分子の一つとしてアポトーシス誘導への関与が示唆された。2.肝癌発症過程における標的治療の有効性や早期治療効果、発癌予防の可能性の追求ラットの実験的肝癌発症の各段階におけるGST-P発現量の変動とJNK活性の相関について調べた。ラットへのジメチルニトロサミン投与により、23週でmini-fociが観察され、56週でFoci/noduleが多くなり、それ以降ではnoduleが形成された。Foci/noduleにおけるGST-P量は投与後5週目で著しく上昇し、7週目、10週目でやや減少した。JNKの発現量については変動はなくFoci/noduleの形成に伴いJNK活性の抑制が癌化を亢進していることが示唆された。また、GSH-DXRの殺細胞効果は各段階で同程度の効果を示したことから、癌化によるGST P1-1耐性をGSH-DXRが有効に克服できる可能性が得られた。JNKとの結合に関わるGST P1-1のC末端領域欠損体(ΔC/194-209)およびC末端領域変異体(R201A)、さらにGST P1-1の活性中心の変異体(W38HおよびC47S)のコンビナントタンパク質をそれぞれ調製し、活性型JNK(細胞から抽出)に添加した。C末欠損体およびC末変異体はいずれもJNKと結合せずJNK活性抑制能もなかった。また、活性中心変異体はJNKと結合するもののJNK活性抑制能は非常に低下した。さらに、JNKと野生型GST P1-1との結合体にGSH-DXRを添加すると、その結合は解離しないにも関わらずJNK活性が回復したことから、GSH-DXRによるGST P1-1活性の阻害がJNK活性に重要であることが判明した。3.GST P1-1のJNKへの相互作用と薬剤耐性(細胞レベル)野生型および変異型GST P1-1を、HepG2細胞に発現させたところ、変異型では薬剤感受性にほとんど変化はみられなかったが、野生型では薬剤に対する抵抗性が高まった。さらに、野生型はJNKと結合しその活性を阻害していた。これらの結果は試験管レベルの結果と一致した。1.JNK活性化によるアポトーシス誘導のためのJNKの標的分子検索GSH-DXRによるアポトーシス誘導がJNK活性化を介したミトコンドリア経路である結果を得たので、標的候補分子としてBcl-2 familyのBcl-xL,Baxに着目して、これらの機能的、質的変化を調べた。

Bcl-xLを過剰発現させたAH66をGSH-DXRで処理すると、ミトコンドリア膜上でJNKの活性化と一致してBcl-xLは脱アミド化され抗アポトーシス効果が低下した。また、Bcl-xL脱アミド化変異体、脱アミド化抑制変異体を用いた結果から、JNKを介したBcl-xLの脱アミド化による不活化が考えられた。一方、Baxを過剰発現させたAH66のGSH-DXR処理で、JNK活性化と一致してBaxの細胞質からミトコンドリアへの移行が観察され、JNKのターゲット分子の一つとしてアポトーシス誘導への関与が示唆された。2.肝癌発症過程における標的治療の有効性や早期治療効果、発癌予防の可能性の追求ラットの実験的肝癌発症の各段階におけるGST P1-1発現量の変動とJNK活性の相関について調べた。ラットへのジメチルニトロサミン投与により、23週でmini-fociが観察され、56週でFoci/noduleが多くなり、それ以降ではnoduleが形成された。Foci/noduleにおけるGST P1-1量は投与後5週目で著しく上昇し、7週目、10週目でやや減少した。JNKの発現量については変動はなくFoci/noduleの形成に伴いJNK活性の抑制が癌化を亢進していることが示唆された。また、GSH-DXRの殺細胞効果は各段階で同程度の効果を示したことから、癌化によるGST P1-1耐性をGSH-DXRが有効に克服できる可能性が得られた。
傍脊柱筋へのボツリヌス毒素投与と夜間姿勢ケアによる重度脳性麻痺児の体幹変形改善

脳性麻痺児に見られる体幹変形に生活姿勢が及ぼす影響を調査し、姿勢へのアプローチの可能性を検証した。その成果は以下の3点にまとめられる。1骨盤に対する体幹の傾斜やねじれの量(角度)で表す体幹変形評価は、信頼できるものである。2睡眠時に体幹と頭部が非対称的な肢位を取る時間の長さは、変形の大きさに関係しない。3夜間姿勢ケアは快適な寝姿勢を作ることは可能だが、器具の取り回しの手間の解消など、さらなる改善が必要である。本研究の最終ゴールはA型ボツリヌス毒素(BTX-A)に夜間姿勢ケアを併用し、重度脳性麻痺児に対する体幹変形(側弯、骨盤傾斜、股関節脱臼等)の改善を定量的評価で検証することである。平成25年度は体幹変形の定量的評価の信頼性と妥当姓の検証を目的とした。体幹変形評価は、肩峰、肋骨下端、上前腸骨棘といった体表から探れる骨ランドマークに基づき、体幹を上部胸郭、下部胸郭、骨盤の3部位に分け、それぞれの間の傾斜と回旋の角度で体幹の変形量を表す方法である。この方法の信頼性と妥当姓を検証するため、健常成人12名、および脳性麻痺を持つ成人20名を対象に次のような計測を行った。被験者をベッド上仰臥位にした後、左右の骨ランドマーク合計6点に球形反射マーカーを貼付し2台のカメラを同期して撮影した。このカメラ画像を元にランドマークの三次元座標を求め、上部体幹(左右肩峰のラインと左右肋骨下端のライン)の回旋と傾斜、下部体幹(左右肋骨下端のラインと左右上前腸骨棘のライン)の回旋と傾斜を算出した。各算出値について、検者内、検者間の信頼性係数を求めた。その結果、信頼性係数は検者内、検者間とも0.9以上と高い値を示した。健常成人の変形量は7度未満であり、算出された角度の誤差は検査者内、検者間とも平均2.4度であった。重度の脳性麻痺を持つ成人は、上部体幹と下部体幹の傾斜を合わせた角度の平均が13.4度、回旋が平均9.8度であった。また、運動機能が重症な者ほど、傾斜、回旋とも大きくなる傾向も見られた。健常成人では傾斜、回旋とも7度未満と変形がなく、脳性麻痺を持つ成人では障害が重度なほど傾斜、回旋といった変形量が大きいという妥当な結果が得られた。よって、本手法が体幹の変形量を表す評価法として信頼できるものであると結論した。今後はこの評価に用いて介入の効果を検証していきたい。本研究ではA型ボツリヌス毒素(BTX-A)に夜間姿勢ケアを併用し、重度脳性麻痺児に対する体幹変形の改善を定量的評価で検証することを目標においている。平成26年度は介入研究の実施に必要な倫理委員会の承認を受けた後、同意を得た参加者に対し介入前評価を実施した。また、別に体幹変形の定量的評価について、重度の肢体不自由を持つ成人を対象に妥当性の評価を行った。これは、22名の重度肢体不自由者について、体表のランドマーク6点の三次元計測から算出された変形量(上部体幹および下部体幹の傾斜と回旋の角度)が、レントゲン画像で計測されるCobb角の値と密接な関係があるか否かを見ることで方法の妥当性を検討したものである。結果は前額面上の変形を表す上部体幹と下部体幹の傾斜角度はCobb角と有意な相関がある一方(r>0.6、p<0.01)、水平面上の変形を表す回旋角度とCobb角との間に高い相関は見られなかった(r<0.3、p>0.05)。前年度は22名の健常大学生を被験者に、体表ランドマークを用いた計測の再現性と信頼性を確認しており、今年度の結果と合わせ論文にまとめ、国外の学術誌に投稿した。この方法は、被験者が寝た状態で計測できる、拘束しなくてよい、放射線の被曝の恐れもないというメリットがある。また、重度の脳性麻痺児は姿勢を保持することが難しく、レントゲン計測では必ずしも身体の向きと撮影面が一致せず、前額面上での撮影に、水平面での回旋変形の影響が見られることがあった。今回の対象である、寝たきりレベルの重度の脳性麻痺を持つ児の変形評価に適した方法である。介入研究に関しては、対象児の選定が遅れ、現在3名の介入前評価の実施と、2名に対して夜間姿勢ケアの導入が決まっている段階である。今年度が最終年度であるので、残り予定8名について姿勢ケアの導入を図り、BTX-Aと併せた効果について検討していく予定である。25・26年度において、重度脳性麻痺児・者に適応可能な変形評価として、体表ランドマークを用いた体幹変形の定量的評価の手法を開発した。肩、胸郭、骨盤の6点のみを三次元計測し、体幹の傾斜と回旋の角度を計測するこの評価方法は、レントゲンによるCobb角(側弯の程度を測る一般的な方法)ともよく一致していた。この手法により、臨床の場で変形の進行や改善を確認することが容易となった。27年度は夜間姿勢ケアの用い方の参考とすべく、睡眠時の頭部と体幹の非対称性と変形の大きさの関連について調査した。

15名の成人の脳性麻痺者を対象に、体幹の変形量を前述の体表ランドマークを用いて傾斜と回旋量を計測するとともに、夜間睡眠時の頭部と体幹の対称性をウエアラブルモニタを用いて計測した。その結果、8名は睡眠中の頭部と体幹は非対称な位置にあったが、変形の大きさとは明確な関係は見られなかった。この結果から、体幹に対して頭部よりも下肢を肢位を対称に保つことを優先してケアに当たることを着想した。姿勢ケアの適応については、対象者の体調不良などで研究実施予定施設だけでは予定した人数が集まらなかった。そこで、27年度中に別の施設に協力を依頼し、被験者を募り、研究を遂行する体制を整えた。研究期間を1年延長し28年度中に姿勢ケアの効果を検証する。本研究は1年目に計測手法の開発、2年目と3年目に臨床研究に入る予定であった。計測手法の開発は順調に進み、予定通り2年目から臨床研究に着手したが、対象者が予定通りに集まらなかった。本研究では重度の脳性麻痺児を対象としているため、呼吸器疾患を重複して持つ者も多く、感染などで体調の悪化により辞退を余儀なくされる者が多かったことによる。そこで、27年度中に別の施設に協力を依頼し、倫理委員会の承認を受け、対象者の募集を広げる体制を整えた。対象者が集まって来ているので、研究期間の1年間の延長を申請し、承認を得たところである。A型ボツリヌス毒素(BTX-A)は機能レベルの高い脳性麻痺児を対象に、主に歩行の改善を目的に使われている。夜間姿勢ケアも欧米では広まりつつあるが、国内では一部の施設で取り組まれているに過ぎない。そこで、本研究の目的は、改善が難しいとされる重度脳性麻痺児の変形に対し、姿勢ケアとBTX-A治療を合わせ介入し、その効果を検証することであった。対象は重度脳性麻痺者4名(男性2名、女性2名、年齢10歳から27歳)であった。うち2名はBTX-A治療も併用した。姿勢ケアは夜間の姿勢を左右対称に整えるため、体型に合わせ自由に形を整えられる整形フォームとマットレスからなるポジショニングシステムを使用した。ポジショニングシステム自体の有効性、安全性の確認のため、圧力分布測定システムを用い体圧分布の測定を行った。また、変形に対する効果については、体表ランドマークによる体幹と骨盤間の側屈角度と回旋角度で評価した。その結果、対象者4名全員で、使用していた寝具と比較し、接触面積の増大と局所圧力の減少を確認し、快適性が増加することを確認した。しかしながら、対象者4名中3名は、使用して1ヶ月ご以降に、「おむつ替えの際に肢位を変えにくい」「マット使用で位置が高くなる」など、介助のしにくさを理由に使用を中止された。使用を継続している1名については、導入前とBTX-A治療を併用した導入後について、体幹変形量は傾斜が56度から51度、回旋が39度から31度と改善は10度未満であった。夜間姿勢ケアは快適な寝姿勢を作ることは可能だが、器具の取り回しの手間の解消など、さらなる改善が必要である。脳性麻痺児に見られる体幹変形に生活姿勢が及ぼす影響を調査し、姿勢へのアプローチの可能性を検証した。その成果は以下の3点にまとめられる。1骨盤に対する体幹の傾斜やねじれの量(角度)で表す体幹変形評価は、信頼できるものである。2睡眠時に体幹と頭部が非対称的な肢位を取る時間の長さは、変形の大きさに関係しない。3夜間姿勢ケアは快適な寝姿勢を作ることは可能だが、器具の取り回しの手間の解消など、さらなる改善が必要である。申請課題について、倫理委員会の承認が下りたのが7月と予定より2ヶ月遅れとなった。対象児の選定と説明、同意を得たのが現在3名であり、26年度に予定した5名より2名ほど少ない。
揮発性麻酔薬の血管収縮抑制作用における蛋白リン酸化酵素の役割に関する研究

アンギオテンシンやフェニレフリンによるagonist刺激による血管収縮におけるPKC、mitogen-activated protein kinase (MAPK)、tyrosin kinase(TK)および発現を生化学的手法により明らかにし、それに及ぼす揮発性麻酔薬(ハロタン、イソフルラン、セボフルラン)の影響を検討することにより、収縮蛋白Ca^<2+>感受性抑制作用の機序を解明することを本研究の目的とした。その結果、1)アンギオテンシンII(Ang II)により一過性の血管収縮が生じ、その収縮は細胞内カルシウムイオン濃度[Ca^<2+>]_iの上昇を伴っていた。またラット血管平滑筋にはPKCのisoformであるPKCαとPKCεが発現していたが、Ang IIにより発現増加をみたのはPKCαであった。2)イソフルラン、セボフルランはAng II惹起血管収縮を濃度依存性に抑制した。イソフルランによる血管収縮抑制作用は血管平滑筋[Ca^<2+>]_iの低下を伴っていたが、セボフルランは血管平滑筋[Ca^<2+>]_iには有意な影響を与えなかった。逆にセボフルランはAng IIよるPKC発現を抑制したが、イソフルランは有意なPKC発現抑制作用を有しなかった。3)Ang II惹起血管収縮はPKCだけではなく、p44/42mitogen-activated protein kinase (p44/42 MAPK)の発現増加を伴っていた。セボフルランは濃度依存性にp44/42 MAPK活性を抑制した。すなわちセボフルランのAng II惹起血管収縮抑制作用はPKCおよびp44/42 MAPKの抑制を介したものであることが明らかとなった。5)セボフルランもNa_3VO_1によるTKリン酸化を抑制する作用を有するが、同効果濃度で比べるとイソフルランよりも弱いことがわかった。平成16年度はアンギオテンシン収縮に及ぼす揮発性麻酔薬の作用について検討した1.カルシウム蛍光色素であるFura2/AMを負荷した摘出ラット大動脈標本を用い、等尺性張力と細胞内カルシウムイオン濃度を同時測定した。1)アンギオテンシンにより一過性の血管収縮反応が見られた。この血管収縮は細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を伴っていた。2)揮発性麻酔薬であるイソフルラン、セボフルランはアンギオテンシン収縮を濃度依存性に抑制したが、イソフルランとは異なりセボフルランは細胞内カルシウムイオン濃度上昇を有意に抑制しなかった。以上の結果から揮発性麻酔薬はアンギオテンシン収縮を抑制するがその機序は麻酔薬間で異なることが明らかとなった。セボフルランはアンギオテンシン収縮を抑制したが、細胞内カルシウムイオン濃度には有意な影響を与えなかったことから、収縮蛋白のカルシウム感受性を抑制した可能性が高い。この仮説を証明するために、血管平滑筋の収縮蛋白のカルシウム感受性を調節している重要な蛋白リン酸化酵素であるprotein kinase C (PKC)に及ぼすセボフルランの影響を検討した。2.アンギオテンシンによるPKC誘導に及ぼす麻酔薬の影響をWestern blot法により検討した。1)アンギオテンシンによりPKCαのリン酸化がみられた。2)セボフルランは濃度依存性にこのPKCαリン酸化を抑制した。以上より、セボフルランのアンギオテンシン収縮抑制作用の機序は主としてPKCαの活性化の抑制を介したものであることが解明された。平成16年度はアンギオテンシン収縮に及ぼす揮発性麻酔薬の作用を検討し、その結果、セボフルランはアンギオテンシンによる血管収縮を抑制したが、細胞内カルシウム濃度には有意な抑制作用を示さなかった。

Western blot法によりセボフルランは収縮蛋白のカルシウム感受性を調節している蛋白リン酸化酵素であるPKCの発現を抑えることにより、アンギオテンシン収縮を抑制することが明らかとなった。今年度はこの結果を受け、揮発性麻酔薬の他の蛋白リン酸化酵素に及ぼす影響を検討した。1)Rho kinase阻害薬であるY27632およびMAPK阻害薬であるPD98059はアンギオテンシン収縮を濃度依存性に抑制した。2)セボフルランは濃度依存性にアンギオテンシン収縮を抑制した。3)Western blot法によりセボフルランはアンギオテンシン刺激によるRho kinaseおよびMAPKの発現を濃度依存性に抑制した。以上の結果からセボフルランのアンギオテンシン収縮抑制作用はPKCだけでなくRho kinaseおよびMAPKの発現抑制を介したものであることが解明された。2.イソフルランのprotein tyrosine kinases(PTKs)に及ぼす麻酔薬の作用2)PTKsの阻害薬であるgenisteinの処置はこの収縮を完全に抑制した。3)イソフルラン(1.23.5%)はNa_3VO_4による血管収縮を濃度依存性に抑制した4)Western blot法により血管平滑筋細胞内PTKs活性を測定したところ、Na_3VO_4によるPTKsの有意なリン酸化を認めた。5)このリン酸化の時間経過は血管収縮反応の時間経過と一致しており、genisteinにより著明に抑制された。6)イソフルラン(1.23.5%)はNa_3VO_4によるPTKsリン酸化を濃度依存性に抑制した。以上の結果から、イソフルランの血管拡張作用がPTKs細胞情報伝達経路の抑制を介していることが明らかとなった。平成16年度はアンギオテンシン収縮に及ぼす揮発性麻酔薬であるセボフルランの作用を検討し、その結果セボフルランはアンギオテンシンによる血管収縮を抑制したが、細胞内カルシウム濃度には有意な抑制作用を示さないことが解った。次にWestern blot法によりセボフルランは収縮蛋白のカルシウム感受性を調節している蛋白リン酸化酵素であるPKCの発現を抑えることにより、アンギオテンシン収縮を抑制することを解明した。この結果を基に平成18年度はイソフルランのアンギオテンシン収縮に及ぼす影響とその機序を解明し、セボフルランのそれと比較検討を行なった。1)イソフルランはセボフルラン同様、臨床濃度でアンギオテンシンによる血管収縮を抑制した。2)イソフルランによる血管収縮抑制作用は血管平滑筋内カルシウムイオン濃度減少を伴っていた。3)イソフルランは臨床濃度ではアンギオテンシンによるPKC発現増加に有意な影響を与えなかった。以上の結果よりイソフルランはセボフルランとは異なり、主として血管平滑筋内カルシウムイオン濃度上昇を抑えることによりアンギオテンシン収縮を抑制していることが明らかとなった。揮発性麻酔薬はアンギオテンシン収縮を抑制するが、その細胞機序は麻酔薬によって異なることを示した。次いで静脈麻酔薬であるプロポフォールの収縮蛋白のカルシウム感受性調節機構に及ぼす影響を検討した。1)PKCのactivatorであるphorbol
ｐ進クリスタリン表現の合同関係

pを素数とする.本課題では,完備離散付値体のp進Galois表現の間の様々な合同関係についての研究を行った.p進Galois表現は整数論の重要な研究対象だが,本研究の目的は,それらの間の合同関係を用いて,研究が困難な場合を容易な場合に帰着する手法を開発することである.主要な成果として,混標数と等標数の完備離散付値体の絶対Galois群の間に,分岐群を法とした同型があることが証明できた.混標数(等標数)とは1をp回足して0にならない(なる)場合を言い,一般的には等標数の方が易しい.この成果によって,混標数(等標数)のp進Galois表現の研究を等標数(混標数)に帰着することができるようになった.本研究の目的はp進クリスタリン表現に存在する種々の合同関係の構造の解明である。本研究では次の三種類の合同関係を取り扱う。(1)局所体のp進クリスタリン表現の合同(2)局所体のp進クリスタリン表現に含まれるZ_p格子の合同(3)異なる標数を持つ局所体のp進クリスタリン表現の間の合同(分岐対応の理論)。本年度も前年度に引き続き、主に(1)(3)について研究を行った。(1)について述べる。(1)に関する研究の目的は、p進クリスタリン表現(に伴う半単純法p表現)の従順分岐レベルの合同関係を解明することである。本年度は、Colmezの方法に基づき、基礎体が絶対不分岐な場合に、階数2のp進クリスタリン表現に伴う単位円盤上のフロベニウス加群を分類した。この結果により、族の構成や法p還元の構成など、合同関係解明のための次のステップに進むことができる。(3)について述べる。(3)に関する研究の目的は、以前の研究で証明した有限平坦表現の分岐対応定理を剰余体非完全のp進体に拡張することである。そのために本年度は、前年度までの研究で条件付きの結果を得ていた分岐対応定理について、そのより一般の場合に成立する明快な証明を模索した。その結果、分岐対応定理を(p=2や表現がpで消えないときなどの、これまで困難だった)新しい場合に大幅に拡張して証明できた。さらに、この拡張版の分岐対応定理の応用として、アーベル多様体の標準部分群の過収束性も大幅に改良できた。これらの結果を論文にまとめて学術誌に投稿した(査読中)。さらに、分岐対応定理の類似として、標数の異なる完備離散付値体でも法p還元が同型であればある範囲の分岐が対応する、という定理を証明できた。この定理には、(困難な)混標数の分岐理論を(より容易な)等標数の分岐理論に帰着できるという意義がある。これについては現在、研究成果を論文にまとめている。本研究の目的はp進クリスタリン表現に存在する種々の合同関係の解明である.本年度は前年度に引き続き,(1)局所体のp進クリスタリン表現に伴う半単純法p表現の合同(2)異なる標数を持つ局所体のp進表現の間の合同(分岐対応の理論),の二点について研究を行った.(1)に関しては,p進クリスタリン表現に伴う単位円盤上のフロベニウス加群から,半単純法p表現に現れる従順指標を特定する手法について研究を行った.Barsotti-Tate表現の場合の考察から,ある種のスペクトルノルムに着目するというアイデアを得て研究を進めたが,最終的な結果には到達しなかった.(2)に関しては,前年度に得た,標数の異なる完備離散付値体のガロア群の間の同型定理を,証明を改良・結果を拡張したうえで論文にまとめ,学術誌に投稿した(採録決定済).この定理には,混標数のガロア群のガロア表現と等標数のガロア群のガロア表現を結び付け,困難な側の研究を容易な側の研究に帰着させられる,という意義がある.これにより,研究計画で掲げていた,異なる標数のガロア群の表現の間の合同関係の解明,という目標はある程度達成できた.pを素数とする.本課題では,完備離散付値体のp進Galois表現の間の様々な合同関係についての研究を行った.p進Galois表現は整数論の重要な研究対象だが,本研究の目的は,それらの間の合同関係を用いて,研究が困難な場合を容易な場合に帰着する手法を開発することである.主要な成果として,混標数と等標数の完備離散付値体の絶対Galois群の間に,分岐群を法とした同型があることが証明できた.混標数(等標数)とは1をp回足して0にならない(なる)場合を言い,一般的には等標数の方が易しい.この成果によって,混標数(等標数)のp進Galois表現の研究を等標数(混標数)に帰着することができるようになった.本研究の目的はp進クリスタリン表現に存在する種々の合同関係の構造の解明である。本年度は主に(1)(3)について研究を行った。

本年度は、研究実施計画に基づき、局所体のクンマーZ_p拡大の絶対ガロア群について、そのp進表現のp進族を構成する研究を行った。(3)について述べる。(3)に関する研究の目的は、以前の研究で証明した有限平坦表現の分岐対応定理を剰余体非完全のp進体に拡張することである。そのための当初のアイデアは、p進体の整数環上の有限平坦群スキームの定義方程式を、クリスタリン・デュドネ加群を用いて書き下すことだった。しかし、本年度の研究により、群スキームがユニポテントな場合には、別の容易な道筋を発見できた。これにより、従来の手法ではカバーできなかった剰余体完全な2進体についても、ユニポテントな群スキームに関する分岐対応定理を証明できた。応用上はユニポテントな場合だけ考えれば十分であり、(以前より従来の分岐対応定理を用いてp=2の場合を除いては証明できていた)アーベル多様体の標準部分群の過収束性定理も、p=2の場合に一般化できた。これらの成果については論文を作成しプレプリントとして発表済みであり、現在投稿準備中である。研究実績の概要欄に述べた(3):分岐対応に関する研究、に関しては、有限平坦表現の分岐対応の一般形や、その完備離散付値体における類似、アーベル多様体の標準部分群への応用など、本年度において大きな進展があり、当初の研究計画で目標としていたことよりもずっと有意義な成果が得られている。一方で(1):局所体のp進クリスタリン表現の合同、に関してはようやく研究計画の半分程度まで到達したところであり、大幅に遅れている。これはp進クリスタリン表現に伴うフィルター付きフロベニウス加群を具体的に求めることに予定より時間がかかったことによる。これらを総合して、研究目的の達成度はやや遅れていると自己評価する。研究実績の概要に述べた(3):分岐対応に関する研究、に関しては、「クリスタリン・デュドネ加群から群スキームの定義方程式を求める」という困難なステップを回避する道筋が発見できたという進展があり、これによって以前に得られていた結果を一般化し、証明も簡略化することができた。一方で、(1):局所体のp進クリスタリン表現の合同の研究、に関しては、先行研究で用いられている技術の習得に時間がかかったため研究の着手が遅れたことと、(フィルター付きフロベニウス加群に対応する)べき級数環上のフロベニウス加群を求めるステップに困難があり、その困難を年度中に解決できなかったことで、交付申請書で述べた研究計画からは遅れている。これらを考慮して、総合的には当初の研究計画からやや遅れていると自己評価する。本年度に引き続いて、次年度もp進クリスタリン表現(に伴う半単純法p表現)の従順分岐レベルの合同関係について研究を進める。前年度の研究で絶対不分岐な基礎体における階数2のクリスタリン表現に伴う単位円盤上のフロベニウス加群を計算した。次年度は、ここからもとのクリスタリン表現の従順分岐レベルを求める手法を構築し、合同関係を調べる。手法としては、当初の研究計画にあった族の構成を行う方法を試みる。また、研究計画で述べていたような、単位円盤上のフロベニウス加群からその整係数べき級数環上の格子を求めてその法p還元を計算する方法は困難が大きいことがわかってきた。その代わりとして、分岐理論的な手法を利用して、格子を経由しないで従順分岐レベルを求める手法を模索する。その後は研究計画通り、p進クリスタリン表現のZ_p格子の合同について研究を行う。これについても、当初の計画で述べていたような整p進ホッジ理論的な手法には困難があることがわかってきたので、保型形式の合同を用いた大域的なアプローチを試みる。
動物ガレクチンとそのリガンドの分子進化

脊椎動物以外で初めて発見されたガレクチンである線虫Caenorhabditis elegansのタンデムリピートタイプの32kDaガレクチンの遺伝子の全構造を解明した。イントロンが2つ挿入されており、1つは脊椎動物のガレクチン類の場合とほぼ同じ位置であったが、もう1つはこれまでに例のない位置であった。さらに線虫から新たに16kDa型ガレクチンを発見し、構造解明の結果、脊椎動物のプロトタイプガレクチンに相当することを明らかにした。線虫と脊椎動物が共通のガレクチンのセットを持つことは、ガレクチンの普遍的役割を確信させる。一方、線虫ではゲノムプロジェクトにより、全遺伝子の構造決定が進行しているが、既に決定された配列の中に、ガレクチンの共通配列をコードする配列が相当数(現在のところ10種類くらい)含まれることが発見されたので、それらをcDNAを鋳型としてPCRで増幅したところ、いくつかのものは確かに転写されており、発現されるタンパク質には糖鎖結合活性が見られた。このことから、線虫にはタンパク質として単離された2種類以外にもかなりの種類のガレクチンが存在することが判明した。哺乳動物でも既に10種類程度が発見されていることと比較すると興味深い。ガレクチンの内在性リガンドについては、候補となる糖タンパク質を複数分離しており、その構造を解析中である。ガレクチンの組織内、細胞内での分布について、ニワトリ、ヒト、線虫を比較しつつ免疫組織化学により詳しく調べたところ、共通して表皮に多く発現されており、多細胞動物における共通の役割のひとつが示唆された。種々の起源のガレクチンの機能を比較検討するための解析技術として、キャピラリー電気泳動法を利用する新しい有効な手法も開発した。以上のように、本研究を通じてレクチンの分子進化について有用な情報が数多く得られた。線虫Caenorhabditis elegansには以前発見した32kDaガレクチンの他に16kDa型ガレクチンも存在することを発見し、全構造を解明した。32kDa型が糖結合領域を2つタンデムに持つものだったのに対して、16kDa型は1つだけ持つプロト型であった。脊椎動物の場合と同様に線虫にもプロト型タンデムリピート型があることは、ガレクチンの普遍的役割をさらに確信させるものであり、ガレクチンの分子進化を理解することに大きく貢献した。ガレクチンに対する生体内でのリガンドの本体をきわめるために、特に線虫の内在性リガンドに焦点をあて、固定化ガレクチンのアフィニティーカラムにより、脊椎動物のラミニンに匹敵するような高分子蛋白質や、それよりも小さいいくつかの蛋白質を検出できたので、今後は構造解析、cDNAクローニング等により、本体を明らかにしてゆく。ガクレチンの組織内、細胞内での分布、発現状況を、ニワトリ胚の皮膚における2つのプロト型ガレクチン(16kDa、14kDa型)について調べた。16kDa型は主として皮膚形成初期の真皮の細胞間マトリックスおよび基底膜に多く発現され、14kDa型は主として後期の表皮のケラチン合成細胞の表面に多く発現されていた。これら2つのガレクチンが皮膚の形成に異なる役割を担って関与していることが明らかになった。またヒト成人の皮膚においても、ヒトの14kDa型ガレクチンはニワトリの14kDa型と似た分布を示した。また線虫の32kDaガレクチンも特に表皮には多量に発現されており、脊椎動物の場合と同様に、外界との境界を構築するという共通の目的にガレクチンが使われていることは注目に値する。ガレクチンの存在をできるだけ多様な生物で確認するため、さまざまな動物で検索を試みた。

そのうちで環形動物(ミミズ、ヒル等)で、ガレクチンに類似した糖結合性蛋白質を発見したので、構造解析中である。本研究によって、脊椎動物以外で初めて発見されたガレクチンである線虫Caenorhabditis elegansのタンデムリビ-トタイプの32kDaガレクチンの遺伝子の全構造を解明された。イントロンが2つ挿入されており、1つは脊椎動物のガレクチン類の場合とほぼ同じ位置であったが、もう1つはこれまでに例のない位置であった。さらに線虫から新たに16kDa型ガレクチンを発見し、構造解明の結果、脊椎動物のプロトタイプガレクチンに相当することを明らかにした。線虫と脊椎動物が共通のガレクチンのセットを持つことは、ガレクチンの普遍的役割を確信させる。一方、線虫ではゲノムプロジェクトにより、全遺伝子の構造決定が進行しているが、既に決定された配列の中に、ガレクチンの共通配列をコードする配列が相当数(現在のところ10種類くらい)含まれることが発見されたので、それらをcDNAを鋳型としてPCRで増幅したところ、いくつかのものは確かに転写されており、発現されるタンパク質には糖鎖結合活性が見られた。このことから、線虫にはタンパク質として単離された2種類以外にもかなりの種類のガレクチンが存在することが判明した。哺乳動物でも既に10種類程度が発見されていることと比較すると興味深い。ガレクチンの内在性リガンドについては、候補となる糖タンパク質を複数分離しており、その構造を解析中である。ガレクチンの組織内、細胞内での分布について、ニワトリ、ヒト、線虫を比較しつつ免疫組織化学により詳しく調べたところ、共通して表皮に多く発現されており、多細胞動物における共通の役割のひとつが示唆された。種々の起源のガレクチンの機能を比較検討するための解析技術として、キャピラリー電気泳動法を利用する新しい有効な手法も開発した。以上のように、本研究を通じてレクチンの分子進化について有用な情報が数多く得られた。
タンパク質の甘味発現機構に関する研究

甘味タンパク質ソーマチンの甘味発現部位を明らかにするため酵母を発現系として部位特異的変異体の作製を行い、クレフト面に存在するK67、R82の2残基がソーマチンの特異な甘味発現に寄与していることを突き止めた。さらに甘味に重要な構造要因を検討するため、R82変異体の結晶を作製しSPring8にて解析を行った。その結果、R82側鎖の正電荷の厳密な方向性がソーマチンの特異な甘味発現を決定付ける要因であると考えられた。甘味タンパク質ソーマチンの甘味発現部位を明らかにするため部位特異的変異体の作製を行った。ソーマチンI遺伝子を新たに取得し、酵母由来の分泌配列を用いて酵母Pichia pastorisで発現させた。その結果、組換えソーマチンは植物ソーマチンと同様に甘味を呈したが、N末端のプロセッシングがヘテロであり、N末端に余分に数残基のアミノ酸が付加していた。そこで均一な組換え体を得るため、酵母の分泌配列をソーマチン自身が有するシグナル配列に変え発現を試みた。その結果、ソーマチンの分泌量とともにN末端のプロセッシングの問題も改善でき、均一な組換え体ソーマチンを取得できた。この発現系を用いてソーマチンの塩基性アミノ酸残基のアラニン置換を行った。官能検査により甘味に与える影響を検討したところ、クレフト面に存在する塩基性アミノ酸残基の変異体の多くは甘味閾値が上昇した。その中でもR82A,K67Aの甘味閾値の上昇は顕著であった。これまでソーマチンの甘味発現にはアルギニン残基は寄与しないと報告されていたが、本研究によりはじめてアルギニン残基が甘味発現に関わることを明らかにした。また、先行化学修飾実験において重要性が指摘されていたK106については、変異体K106Aが甘味閾値にあまり影響を与えなかった。このことは、かさ高いピリドキサールリン酸の官能基が近傍に存在するR82の側鎖に影響を与えたものと考えられた。甘味閾値に影響を与えたK67,R82の2残基について更に検討を行い、K67側鎖の塩基性度が甘味発現に重要であること、R82では側鎖の塩基性度のみならず、側鎖の構造的要因も重要であることを明らかとした。ソーマチンIの遺伝子を新たに取得し、酵母由来の分泌配列を用いて酵母Pichia pastorisで発現させた。そこで均一な組換え体を得るため、酵母の分泌配列をソーマチン自身が有する分泌配列に変え発現を試みた。その結果、ソーマチンの分泌量とともにN末端のプロセッシングの問題も改善でき、均一なソーマチンを取得できた。官能検査により甘味に与える影響を検討したところ、クレフト面に存在する塩基性アミノ酸残基変異体の甘味閾値は上昇したが、その中でもR82A, K67Aの甘味閾値の上昇は顕著であった。これまでソーマチンの甘味発現にはアルギニン残基は寄与しないと報告されていたが、本研究により初めてアルギニン残基の重要性を明らかにした。また、先の化学修飾実験において重要性が指摘されていたK106については、変異体K106Aが甘味閾値にあまり影響を与えなかったことから、かさ高いピリドキサールリン酸の官能基が近傍に存在するR82の側鎖に影響を与えることにより、甘味を消失したものと考えられた。R82AならびにK67Aの結晶化を行い、構造の詳細を検討した。変異体R82Aについて分解能1.1Aのデーターを取得し、精密化を行ったところ、R82Aの1残基変異により、R79の側鎖、K67の主鎖の構造に影響を与えることが明らかになった。これら一連の構造変化によりクレフト面における変異体R82Aの分子表面の静電的環境が著しく変化していた。以上の結果から、R82、K67で形成される塩基性領域がソーマチンの甘味発現に重要な役割を果たすと考えられた。甘味タンパク質ソーマチンの甘味発現部位を明らかにするため酵母Pichia pastorisを発現系として部位特異的変異体の作製を行い、クレフト面に存在する塩基性アミノ酸残基がソーマチンの甘味発現に重要な役割を果たすことを明らかにした。その中でもR82、K67がソーマチンの特異な甘味発現に寄与していることを突き止めた。ソーマチンの甘味発現に必須な構造的要因を明らかにするため、甘味閾値に顕著に影響を与えた変異体について蒸気拡散法にて結晶化を行った。