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ウシ脳由来機能性細胞株の樹立及びその利用技術の開発

本研究ではウシ胎子脳から機能性細胞株を樹立し、その特性解析を行うとともに牛海綿状脳症(BSE)研究への利用を検討した。その結果、内皮細胞様及び神経細胞様の性質を持つ新しいウシ脳由来細胞株を樹立した。これらの細胞には正常ウシプリオン蛋白の発現が確認され、BSE研究への利用も期待された。そこでBSEプリオン感染実験を行ったが、現在までのところ持続感染細胞の樹立には至っておらず引き続き検討が必要である。牛海綿状脳症(BSE)は異常型プリオン蛋白が病原体と考えられるプリオン病の一つであり、ヒトの新変異型クロイツフェルト・ヤコブ病との関連が疑われている。本研究では、主にBSEプリオンのin vitro細胞感染モデル系作出のための候補となりうるウシ胎子脳由来の細胞株の樹立を目的とする。凍結保存したウシ胎子脳組織を酵素処理により分散した後、10%ウシ胎子血清、上皮細胞増殖因子(EGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)などを添加した培地で培養を行い、不死化を目的としてSV40-large T遺伝子の導入を行った。樹立された2種類の新規細胞株は敷石状の形態を呈し、集団倍加数200回以上の増殖能を持っていた。またその細胞増殖能の維持にはbFGFの添加が重要であることがわかった。免疫染色の結果、内皮細胞マーカーであるvon Willebrand Factor (vWF)に陽性であった。さらに培地中からEGF、bFGFを除くことによって平滑筋細胞マーカーであるα-smooth muscle actin陽性の細胞が増加した。内皮細胞としての機能を検討したところ、マトリゲル上での培養で血管様の管状網目構造が構築され、さらにDiI-labeled acetyl-low density lipoprotein (DiI-AcLDL)の取込みも観察された。これらの結果から、今回樹立されたウシ細胞株は脳内血管を形成する内皮細胞様の性質を持つ細胞株であると推察された。また、内皮細胞から平滑筋細胞への分化転換(transdifferentiation)のモデルとして使える可能性が示唆された。これらの細胞株には正常型ウシプリオン蛋白の発現が確認されたことから、BSEプリオンのin vitro感染実験に利用できる可能性も示唆された。本研究では牛海綿状脳症(BSE)プリオンのin vitro細胞感染モデル系作出のための候補となりうるウシ脳由来の細胞株の樹立を目的とする。本年度は、78ケ月齢のウシ胎子脳組織を材料として初代培養を行い、SV40-large T (SV40LT)遺伝子を導入して細胞の不死化を試みた。培養方法はDMEM/Ham's F-12(1:1)培地にトランスフェリン、インスリン、プロジェステロン、プトレシン、亜セレン酸ナトリウムを補充したものを基本培地とし、これに10%ウシ胎子血清(FBS)を加え基本増殖培地とした。さらに増殖因子としてヒト上皮細胞増殖因子(EGF)及びヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)を添加し増殖培地として用いた。SV40LT遺伝子導入後、抗生物質(G418)耐性細胞を選抜し、さらに限界希釈法により集団倍加数100回以上の紡錘状の形態を呈した単一の新規細胞株を樹立した。この細胞の増殖性は、増殖培地からEGF・bFGFを除くことで有意に減少した。また神経細胞分化誘導剤として知られるジブチリルcAMPやフォルスコリンで処理すると増殖抑制に加えて神経突起様の形態を誘導し、神経細胞マーカー蛋白質であるtubulin βIIIの発現量も増加することから神経前駆細胞の性質を持つ細胞株であることが示唆された。またこの細胞では、正常型ウシプリオン蛋白質の発現も確認されたことから、BSEプリオンのin vitro細胞感染モデル系への利用も期待される。これまでに汎用性のあるウシ由来の神経系細胞株はまだ存在しないので、ウシの神経系疾患やウシ脳機能研究のための新しいin vitroモデルとしてもその有用性は高いと考えられる。昨年度までに、ジブチリルcAMPで処理することで神経様細胞に分化し、正常型ウシプリオン蛋白を一定量発現している細胞株(FBBC-1)を樹立した。本年度はこのFBBC-1細胞を用いてBSEプリオンのin vitro感染実験を行った。細胞を35mmシヤーレに播種し、イギリスより輸入された野外発生BSE感染牛脳ホモジネートに暴露した。過剰な脳ホモジネートを洗浄後5回の継代の後、各継代数においてプロテアーゼK抵抗性の異常型ウシプリオン蛋白をウエスタンブロット法により検出した。その結果、2継代目までは異常型ウシプリオン蛋白が検出されエンドサイトーシス等で異常型が細胞内に取り込まれていることが示唆されたが、2継代目では異常型は完全に消失してしまい持続的な感染は確認できなかった。

問題点として野外発生BSE感染牛脳ホモジネートでは感染因子の劣化・減少が考えられるため、実験的にBSEを感染させた牛の比較的新鮮な脳ホモジネートでも検討したが、残念ながら現在までのところ持続的なin vitro感染系の確立には至っていない。またin vitro感染系の成立には細胞での正常型プリオン蛋白の高発現が重要であることも知られている。そこで、FBBC-1細胞の内因性の正常型ウシプリオン蛋白の発現量では不十分であった可能性も考えられるため、ウシプリオン蛋白遺伝子をほ乳動物細胞発現ベクターであるpCEP4に組み込んだプラスミドを作製し、この細胞株への遺伝子導入について検討した。その結果リポフェクタミン法によりFBBC-1細胞には遺伝子導入が可能であることがわかった。今後は選択薬剤を用いて安定的に正常型ウシプリオン蛋白を高発現するFBBC-1細胞株を樹立しin vitro感染実験を検討したいと考えている。
個体発生過程における昆虫視覚機能の発現とその可塑性に関する基礎的研究

パタ-ン視の神経機構形成が、生後の視覚経験に依存することは、多くの研究によって明らかにされて来た。現在までの研究で、昆虫(ハエ)も例外ではないことがわかった。本研究課題では、羽化後のパタ-ン弁別の可塑的発達解明の糸口を、行動実験や組織化学的方法及び生化学的方法によって見いだすことを目的とした。1.パタ-ン弁別機能発達のための視覚経験条件について:羽化直後、パタ-ン弁別の発達には、最低5時間の視経験、視経験直後の短時間(約15分)の正常な神経活動、及びその後5時間の正常な神経活動の維持の3条件が必要であることが明らかとなった。また、羽化後のさまざまな時期でのタンパク合成阻害剤投与の効果によっても、このことは確認された。2.チトクロムオキシダ-ゼ組織化学法による光遮断効果の解析について:細胞活動が高いと、チトクロムオキシダ-ゼ活性のレベルも高まる。これを利用した組織化学法によって調べた結果、非遮断眼の視葉は遮断眼より活性が高く、その活性差は羽化後6日目以降に現れた。脳中心部では差がなかった。これらにより、視覚情報処理が視葉のみでなされ、視覚機能発達がシナプス伝達の可塑的変容によることが示唆された。3.高速液体クロマトグラフ法による視葉の生体アミン類の解析について:電気化学検出法と組合わせて分析した結果、常暗条件のハエ視葉と異なり、明暗条件のハエ視葉では、分析できた物質のうち、2種に、羽化後一定期間、増量傾向が現れた。これら物質は未同定だが、何らかのかたちでシナプス伝達に関与し、ひいてはパタ-ン弁別の神経回路形成の可塑的発達に貢献していることが示唆された。ハエの視覚パターン弁別機能の発達のためには、羽化直後の短時日の視覚経験が必要であることは、すでに行動実験や組織化学的実験から明らかになった。一方、光走性行動は羽化後の光経験はなくとも正常に認められる。このことは光走性機構は羽化時にすでに神経系に組み込まれているが、パターン弁別のような高度な視覚機構は羽化後の視覚刺激によって駆動されて初めて形成される後天的、獲得的な性質のものであることを示す。このよな羽化後の獲得的機構の形成は、視葉ニューロンの活動に伴うニューロン間のシナプス結合形成の可塑性に依存することを推測させる。この解明を分子レベルで追求する目的で、羽化後の光条件を変えて飼育したハエの視葉ニューロンの伝達物質を、高速液体クロマトグラフ法によって分離解析し、高度な視覚機能に関与するニューロン回路形成にかかわる特異的伝達物質を同定し、かつ羽化後早期のニューロン活動レベルとシナプス伝達の可塑性との関係を伝達物質の面から明らかにすることを試みた。昭和63年度はカテコールアミン類及びその代謝物質を、電気化学検出器を中心に分析した。その結果、少くも現在までに分析できた物質中には、脳中心部には存在しないか少なく、視葉に特異的又は多量にある数種の物質があることがわかり、そのうちいくつかの物質は、羽化後の光経験によって影響を受けることもわかった。それらの物質は羽化後の日数の経過とともに量的に変化し、羽化後4-5日で最大に達した後は変化しないもの、羽化後4日又は710日まで増大するが以後減少するものがあり、視覚機能発達との相関をうかがわせた。しかし各種標準試料からのみでは、それら物質を同定することはできなかった。これらの同定を含め、電気化学検出器以外によらねば解析できない物質、飼育光条件の差によるそれら物質の変化等の解明が今後の課題である。

昆虫(ハエ)を用いた行動実験から、視覚パタ-ンの弁別機能は、羽化後の光経験によって発達することが明らかとなったが、このような視覚系神経活動の可塑性の基礎をさぐるため、昨年度は、高速液体クロマトグラフ法(電気化学検出法)(HPLC-ECD)を用いて、神経伝達物質としてニュ-ロン間の情報伝達の役割を担っている生体アミン類の解析を進め、視葉に光経験に依存して、羽化後の一定期間に増量する2種の物質を見いだした。今年度は、これら2物質が光経験依存性物質、つまり神経活動の可塑性に関与する物質であるかどうかを、さらに確かめるため、以下の実験を行った。最初の実験は、行動実験からパタ-ン弁別機能の発達には、羽化後5日目までの光経験が必要であることが知られているので、羽化後5日間常暗(DD)で飼育し、その後、明暗交代条件(LD)で飼育したハエの視葉から作った試料を、HPLCで分析した結果、5日目以降でも、この2物質は特に増量することもなく、羽化後、完全DDで飼育したハエから得た結果と、ほとんど変わらないことを示した。次に、行動実験で、羽化後の光経験ののち、タンパク合成阻害剤を投与すると、パタ-ン弁別機能の発達が見られなかったので、同じ条件で、タンパク合成阻害剤を投与したハエの視葉について、HPLCを試みた。その結果、やはり完全DDと同じ傾向を示し、これら2物質の増量は見られなかった。以上の結果は、これら2物質がシナプス伝達機能の変容と関係があり、神経系発達に伴う可塑性に関与することが示唆される。今後は、これら2物質の同定によって、可塑性機構の解明につなげて行く予定である。
ストレプトゾトシン糖尿病代謝異常を是正する骨格筋AMPK依存性代謝改善因子の探索

AMPキナーゼ(AMPK)は、細胞内のエネルギー枯渇を感知して活性化するキナーゼであり、近年、肥満・糖尿病の分野で注目されている。応募者は、骨格筋選択的dominant negative-AMPK発現マウス(DN-AMPK Tg)にストレプトゾトシン(STZ)を投与すると、血中インスリン濃度は低値であるにも関わらず、糖尿病(STZ糖尿病)による高血糖、高脂肪酸血症、高ケトン体血症などの代謝異常が改善し、致死率が劇的に改善することを見出した。その結果、IL-6、irisinとレプチンが骨格筋AMPK活性に依存してSTZ糖尿病の代謝異常に関わることを見出した。本研究では、STZ糖尿病の代謝異常が、インスリン欠乏だけでなく、骨格筋から分泌されるmyokine及びmyokineを起点とする他臓器間相互ネットワークの異常に起因すると考えに立ち、当該myokineを同定し、その機能を明らかにすることを目的とする。これまでの研究及び本研究において、IL-6、irisin、Meteorin-like、IGF-1、などが候補として見つかった。また、持続活性型AMPK、AMPKに対するshRNAを発現させたC2C12骨格筋細胞株を各々樹立し、cDNAアレイ解析からもいくつかの候補因子が見つかった。これらの因子のいくつかは、STZ糖尿病においてAMPKが活性化することにより発現が上昇する因子(IL-6、irisinなど)の他に、発現が低下するものが存在した。今後、これらの因子、あるいは抗体をマウスに投与することにより、STZ糖尿病の代謝異常に及ぼす効果を調べる。myokineとして知られる既知因子、及び持続活性型AMPK、AMPKに対するshRNAを発現させたC2C12骨格筋細胞株のcDNAアレイ解析から、STZ糖尿病において、AMPKが活性化することにより発現が上昇する因子、発現が低下する因子を発見した。それらの因子の中に、糖・脂質代謝を制御すると考えられる候補因子も存在した。本年度は、これらの因子とその抗体をSTZ糖尿病マウス、STZ糖尿病-DN-AMPK Tgマウスに投与することにより、STZ糖尿病の代謝異常に及ぼす効果を調べる。今年度は、更に、myonectinと脂肪細胞から分泌されるレプチンがSTZの代謝異常に重要であることを見出した。myonectinとレプチンは、STZ糖尿病において血中濃度が低下しており、DNーAMPKマウスにおいて回復していた。さらに、STZ糖尿病マウスにmyonectin又はレプチンを投与すると代謝異常が著しく改善した。反対に、DN-AMPKマウスにmyonectin又はレプチン抗体を投与すると改善していた代謝異常が再び悪化した。以上の実験結果から、IL-6と共に、myonectin、レプチンがSTZ糖尿病の代謝異常に関わることが明らかとなった。本研究で見出した因子、およびその抗体を、STZ糖尿病マウス、STZ糖尿病-DN-AMPK Tgマウスに投与し、STZ糖尿病の代謝異常に及ぼす効果を調べる。代謝学次年度使用額21980円は、3月末に出張旅費として使用したが、会計処理の都合上、4月の支払いとなった。4月上旬に支払いを終了した。
偶相関及び奇相関関数で零相関範囲を有する3値系列の生成法とその応用の研究

本課題では3値(0及び±1)のZCZ系列の生成方法及び応用を研究する。ZCZ系列とは、以下に示す二つの条件を満たす系列セットのことである。・セットのどの系列についても、自己相関関数が位相差の絶対値が1以上Z以下で、常に0となる。・セットのどの系列の対についても、相互相関関数が、位相差の絶対値がZ以下で、常に0となる。本研究課題は、上記の様な系列セットについて、通信、超音波イメージング、位置決め、測距、電子透かし、ステガノグラフィへの応用方法を検討するとともに、それぞれの応用に適した新しい系列セット生成方法を検討した。種々の応用について、それに適した系列を生成する方法の検討を行った。また、新たな系列生成方法の数理的性質を明らかにして、さらに優れた系列の生成方法を開発することを試みた。2年間の研究によって、以下の成果をあげた。(i)2値零相関範囲系列と同様に、3値ゼロ相関範囲系列について、複数のアダマール行列から生成する方法を開発し、生成される系列の相関関数特性を向上させた。(ii)3値零相関系列について、自己相関関数の零相関範囲を従来方法のほぼ倍に広げる方法を考案した(iii)零相関系列の零相関範囲外の相関関数の上界値の詳細な理論的評価を行った。(vii)十字型の零相関範囲を有する2次元零相関範囲系列を生成する方法を考案した(viii)3値零相関系列を用いた超音波イメージングの方法を検討し、シミュレーションによる性能評価を行った。本研究では、セキュリティポリシーの適切な実施を支える技術の一つとして、電子透かしやステガノグラフィや通信への応用を目的とした、系列や配列の生成方法及び系列応用方法の検討を行っている本研究では、主に以下の系列及び配列を研究(設計・開発)対象としている。1)自己相関関数が零となる多値1次元信号(疑似白色雑音系列)2)自己相関関数が零となる多値2次元信号(疑似白色雑音配列)3)自己相関関数と相互相関関数がある位相差範囲で零となる2値(±)の1次元信号(2値零相関系列)4)自己相関関数と相互相関関数がある位相差範囲で零となる2値(±)の2次元信号(2値零相関配列)5)自己相関関数と相互相関関数がある位相差範囲で零となる3値(±,0)の1次元信号(3値零相関系列)6)自己相関関数と相互相関関数がある位相差範囲で零となる3値(±,0)の2次元信号(3値零相関配列)平成16年度には、以下の成果をあげた。(i)2値零相関範囲系列と同様に、3値ゼロ相関範囲系列について、単一のアダマール行列ではなく、2つのアダマール行列から生成する方法を開発し、相関関数特性を向上させた。(ii)2値零相関系列の零相関範囲外の相関関数特性は、実システムの応用上、非常に重要である。そこで、2値零相関系列の零相関範囲外の相関関数の上界値の詳細な理論的評価を行った。(iii)3値零相関系列について、自己相関関数の零相関範囲を従来方法のほぼ倍に広げる方法を考案した。(iv)従来方法の疑似白色雑音系列の長さは偶数$2n^2または、4n^2(nは任意の自然数)の長さをもつものに限られていたが、奇数(2n-1)(4n+1)(nは任意の自然数)の長さを持つ疑似白色雑音系列の構成的生成方法を考案した。

本研究課題は、上記の様な系列セットについて、通信、超音波イメージング、位置決め、測距、電子透かし、ステガノグラフィへの応用方法を検討するとともに、それぞれの応用に適した新しい系列セット生成方法を検討した。種々の応用について、それに適した系列を生成する方法の検討を行った。また、新たな系列生成方法の数理的性質を明らかにして、さらに優れた系列の生成方法を開発することを試みた。平成17年度は、以下の成果をあげた。(1)2値零相関範囲系列と同様に、3値ゼロ相関範囲系列について、複数のアダマール行列から生成する方法を開発し、生成される系列の相関関数特性を向上させた。(2)3値零相関系列について、自己相関関数の零相関範囲を従来方法のほぼ倍に広げる方法を考案した(6)3値零相関系列を用いた超音波イメージングの方法を検討し、シミュレーションによる性能評価を行った。
末梢組織リンパ管を場とした免疫制御機構の解明

本年度は様炎症モデル下でのリンパ管の観察を行った。前年度、蛍光標識抗体の皮内注射によるリンパ管の可視化法を確立したが、同手法は簡便であるもののリンパ管壁を可視化するため、リンパ管内部に入り込んだリンパ球の動態観察は難しい一面もあった。そこで本年度は、耳介先端側に蛍光標識デキストランを皮内投与し、近位側のリンパ管内にデキストランが流れ込むことで可視化する方法を新たに確立し、抗体による可視化法と並行して観察を行った。定常状態および接触皮膚炎の感作相、惹起相のそれぞれにおいてLangerin-GFPマウス(Langerhans細胞の可視化)、CD11c-YFPマウス(真皮樹状細胞の可視化)を用いた。定常状態では、真皮内浅層にランゲルハンス細胞はほとんど認めなかったが、真皮深層ではリンパ管内に散在している様子が観察された。定常状態ではリンパ管内のランゲルハンス細胞は6時間以上にわたってほとんど移動しないという予想外の所見が得られた。真皮樹状細胞は定常状態から真皮内に多数存在し、活発に動き回っているものの、リンパ管内への侵入は観察されなかった。また、ハプテン塗布後の感作相においてもその動態はほとんど変化しなかった。一方で惹起相においては、以前に我々が報告した通り、樹状細胞がクラスターを多数形成した。そのほとんどはリンパ節の外でのクラスター形成であったが、一部リンパ管の中でクラスターが形成される様子を観察した。このクラスターには樹状細胞だけではなく、リンパ球も集合しており、抗原提示が行われていることが示唆された。本年度の後半にはリンパ管内の樹状細胞、T細胞のクラスター形成に干渉し、その生理学的役割について検討する予定であったが、当初考えていたよりもリンパ管内に形成されるクラスターの頻度が低いと考えられ、難航している。よりクラスター形成の多数認められるタイムコース、皮膚炎モデルについて検討を進める予定である。このため当初2年間で研究を完了させる予定であったが、1年間の延長を申請した。接触皮膚炎以外の皮膚炎モデル(GVHDモデル、薬疹モデルなど)について、リンパ管と免疫細胞とのかかわりについて観察する。リンパ管内でのクラスター形成(抗原提示)が活発に行われているモデルが見いだされれば、阻害抗体や試薬などでそれに干渉し、比内におけるリンパ管内クラスター形成の役割について検討をおこなう。H29年度はリンパ管の生体内イメージング方法について検討を行った。Prox1-GFPマウスなどのリンパ管が蛍光ラベルされた遺伝子改変マウスは存在するが、マウスの交配管理など実験を行うまでに大きな労力と時間を要する。そのため、野生型マウスを用いて生体内でリンパ管をラべリングする方法について検討した。様々なサイズのデキストランを静注し、24時間後まで継時的に皮膚を観察した。その結果、低分子量のデキストランではリンパ管の描出は難しいこと、高分子(2000kDa)のデキストランを静注後およそ12時間ほど経過した状態でもっとも明瞭にリンパ管が描出されることを見いだした。引き続いて、蛍光ラベルされた抗体をもちいた生体内免疫染色について検討した。PEで赤色に蛍光ラベルされた抗gp38(Podplanin)抗体を皮下注射し、2時間後に観察した。この方法により生体内で簡便にリンパ管が標識されることを見いだされた。興味深いことにFITCなど他の蛍光色素でラベルされた抗体ではリンパ管の可視化が不可能であった。またリンパ管以外にも抗CD31抗体をもちいることで血管のラベルを容易に行うことが可能であった。これらの手法を用いて、定常状態における真皮樹状細胞、ランゲルハンス細胞とリンパ管との位置官憲について生体イメージングを行い検討した。定常状態では真皮樹状細胞、ランゲルハンス細胞ともにリンパ管の中にはほとんど存在せず、またリンパ管に沿う動きや、リンパ管の周囲に集まるといった、リンパ管と関連のある動態は観察されなかった。研究はおおむね計画通りに進展している。現在のところ想定外の問題は生じていない。

そのほとんどはリンパ節の外でのクラスター形成であったが、一部リンパ管の中でクラスターが形成される様子を観察した。このクラスターには樹状細胞だけではなく、リンパ球も集合しており、抗原提示が行われていることが示唆された。本年度の後半にはリンパ管内の樹状細胞、T細胞のクラスター形成に干渉し、その生理学的役割について検討する予定であったが、当初考えていたよりもリンパ管内に形成されるクラスターの頻度が低いと考えられ、難航している。よりクラスター形成の多数認められるタイムコース、皮膚炎モデルについて検討を進める予定である。このため当初2年間で研究を完了させる予定であったが、1年間の延長を申請した。H30年度は炎症下における免疫細胞(T細胞、真皮樹状細胞、ランゲルハンス細胞)の動態について、おもに生体イメージングの手技を用いて検討する。H29年度に確立した野生型マウスをもちいたin-vivo staining法をもちいて接触皮膚炎、GVHDモデル、薬疹モデルなどにおける免疫細胞とリンパ管との関係について検討の予定である。接触皮膚炎以外の皮膚炎モデル(GVHDモデル、薬疹モデルなど)について、リンパ管と免疫細胞とのかかわりについて観察する。リンパ管内でのクラスター形成(抗原提示)が活発に行われているモデルが見いだされれば、阻害抗体や試薬などでそれに干渉し、比内におけるリンパ管内クラスター形成の役割について検討をおこなう。当初平成29年度後半からH30年度前半にかけて行う予定であった炎症マウスモデルを用いた観察をH30年度前半にまとめて行うこととしたため。計画している実験の内容は当初の計画から変更はない。当初二年で完了予定であったが、研究期間を1年間延長したため。
最新計測技術による誘導モータの超低振動・低騒音化に向けた詳細な実験的検討と考察

近年,環境改善の見地から,より一層低振動・低騒音の三相かご形誘導電動機(IM)が強く求められている。本研究では,IMの電磁振動および電磁騒音の半径方向分布を詳細に測定し検討することにより,電磁振動・電磁騒音の発生の特徴および発生原因などを明らかにし,より一層低振動・低騒音のIMの設計の基礎的資料を得ようとするものである。当該研究では,IM電磁振動・電磁騒音に対して詳細かつ多岐に亘る実験を行い,詳細なデータを公表するとともに,個々の電磁振動および電磁騒音成分の負荷に対する特徴などを明らかにした。誘導モータ(以下,IMと略記)は堅牢・安価であるため多数用いられているが,その構造上,必ず電磁振動・騒音を生じるため,多くの研究がなされてきた。当該研究では,さらなるIMの低振動・低騒音化の要求に応えるべく,実機における構造上の非対称性に起因する電磁振動・騒音の半径方向分布について詳細に検討し,低振動・低騒音化の基礎データを提供し,国際規格制定への寄与を目的としている。三相かご形誘導電動機(以下,IM)は産業動力用等として幅広く用いられており,近年,IMの高性能化の要求からより一層IMの低振動低騒音化が求められている。IMの振動騒音に関する研究は古くから多数行われているが,より一層の低振動低騒音化を諮るには,さらに詳細かつ精密な測定および検討が必須である。そこで,当該研究では,汎用IMの低振動・低騒音化に寄与するため,IMの電磁振動・電磁騒音の特徴を詳細かつ多数の実験により明らかにすると共に,理論的にも検討していこうとするものである。平成26年度は,当該研究課題以前に取得したIMの電磁振動・騒音の半径方向分布の特徴などに対して,追加実験を行い,IM表面の測定位置により,電磁振動の発生の特徴が異なることを詳細なる実験結果に基づき,定量的に明らかにした。その成果は国際会議Inter noise 2014にて公表した。この発表では,IMの負荷状態により滑り(回転数)が変わるため,電磁振動・騒音の発生周波数が変化するが,IMの電源周波数を微調整することにより振動・騒音発生周波数を一定に保つという,世界でも類を見ない超精密な実験結果を公表すると共に,IM表面の測定位置により,負荷に対する電磁振動・騒音の発生の特徴が異なることを明らかにしている。この原因は,機械的な非対称性によると考えられることを示唆しており,現在,その詳細な追実験を行っている。平成27年度は,平成26年度に引き続き,特に機械系の共振がIMの電磁振動・電磁騒音に及ぼす影響を明らかにするために,測定位置および負荷状態に対する電磁振動・電磁騒音の特徴を実験的に明らかにした。その成果は平成27年度電気・電子・情報関係学会東海支部連合大会およびICEMS2015にて公表した。「研究期間内の目標」に記したように,発生の特徴を詳細なる実験結果に基づき検討している。すなわち,実験環境改善としてモータ騒音実験室の暗騒音の低減を行い,三相かご形誘導電動機(以下,IMと略記)の半径方向の電磁振動・電磁騒音に関する基本的な実験データ収集を精力的に行っている。特に,IMの滑りが負荷により変化するため,負荷の増減により電磁振動・電磁騒音が変化した場合,振動成分の発生周波数が変化し,機械系の共振の影響が現れ,電磁力波の大きさそのものが負荷に対してどのように変化したかが捉えられない。そこで,IMの滑りが変化した場合であっても,振動・騒音成分の発生周波数を一定とするように,IMの電源電圧の周波数を変化させると共に,IM内部の磁束をほぼ一定と見なせるように電源電圧の大きさを,定格電圧200V/60Hzの比に保つように設定して実験を行っている。この実験においては,IMの負荷状態によりIMそのものの温度が著しく変化し,機械系の共振の影響が著しく変化する場合があり,IMへの負荷状態,印加電圧の設定を如何に素早く行い,安定したIMの温度状態での超精密な測定が必須となっている。また,その振動・騒音成分の発生原因となる電磁力波に対しての考察も行っており,供試機における電磁振動・電磁騒音の半径方向分布に対しての知見も得られつつある。しかし,より多くの条件下でのIMの電磁振動・電磁騒音の測定は若干遅れている。これは,FFTアナライザおよびマイクロフォンの故障に基づいている。それら計測器の修理期間が数ヶ月に亘ったため,現在,その遅れを取り戻すべく精力的に実験を行っている。以上のように,計測器の故障により,当該研究で設定している研究計画より若干遅れ気味ではあるが,平成28年度には十分遅れを取り戻せる状況にある。誘導モータ(以下,IMと略記)は,その構造が堅牢で安価,希土類などの磁石を用いず,簡単な制御で可変速運転が可能などの長所があるため,もっとも多用されているモータである。近年のより一層快適な環境を得るために,IMの更なる低振動・低騒音化を含めた高性能化を目指し,その基本に立ち返った詳細かつ多岐にわたる実験データを得るとともに,その解析手法などを確立することを目的とする。さらにIMの国際規格制定にも寄与しようとすることを目的としている。以上の目的に対して,研究計画に従って,IMの電磁振動に対して,その発生の特徴などを詳細に検討するため,研究実験などを実施した。すなわち,IMのギャップ中に生じる高調波磁束の相互作用により電磁力波を生じるが,電磁力波の発生周波数は電源周波数,負荷状態,回転子スロット数等により変化する。発生周波数の変化により,機械系の共振の影響が変化するため,実測した電磁振動の大きさは,電磁力波の大きさおよび機械系の共振の影響に依存する。

そこで,電磁力波の発生周波数を一定とするべく,電源電圧および電源周波数を繊細に調整し,多岐に亘る実験を行った。その結果,電磁振動の半径方向分布の特徴は負荷により変化する場合があることを実験的に明らかにした。機械系の影響を同一とした実験結果であるため,電磁力波の半径方向分布の特徴が変化したものと考えられるが,従来の理論では,負荷により電磁力波の半径方向分布が変化するとは考えにくい。以上のように,従来の理論では明らかにできなかった,IMの電磁振動の半径方向分布の特徴を実験的に明らかにすることができた。このことにより,当初の目的通り,IMの電磁振動・電磁騒音の低減対策並びにこれらに対する国際規格などに寄与できる実験データを取得できたものと考えている。近年,環境改善の見地から,より一層低振動・低騒音の三相かご形誘導電動機(IM)が強く求められている。本研究では,IMの電磁振動および電磁騒音の半径方向分布を詳細に測定し検討することにより,電磁振動・電磁騒音の発生の特徴および発生原因などを明らかにし,より一層低振動・低騒音のIMの設計の基礎的資料を得ようとするものである。当該研究では,IM電磁振動・電磁騒音に対して詳細かつ多岐に亘る実験を行い,詳細なデータを公表するとともに,個々の電磁振動および電磁騒音成分の負荷に対する特徴などを明らかにした。「研究期間内の目標」に記したように,発生の特徴を詳細なる実験結果に基づき検討している。すなわち,実験環境改善としてモータ騒音実験室の暗騒音の低減を行い,三相かご形誘導電動機(以下,IMと略記)の半径方向の電磁振動・電磁騒音に関する基本的な実験データ収集を精力的に行っている。特に,IMの滑りが負荷により変化するため,負荷の増減により電磁振動・電磁騒音が変化した場合,振動成分の発生周波数が変化し,機械系の共振の影響が現れ,電磁力波の大きさそのものが負荷に対してどのように変化したかが捉えられない。そこで,IMの滑りが変化した場合であっても,振動・騒音成分の発生周波数を一定とするように,IMの電源電圧の周波数を変化させると共に,IM内部の磁束をほぼ一定と見なせるように電源電圧の大きさを,定格電圧200V/60Hzの比に保つように設定して実験を行っている。この実験においては,IMの負荷状態によりIMそのものの温度が著しく変化し,機械系の共振の影響が著しく変化する場合があり,IMへの負荷状態,印加電圧の設定を如何に素早く行い,安定したIMの温度状態での超精密な測定が必須となっている。また,その振動・騒音成分の発生原因となる電磁力波に対しての考察も行っており,供試機における電磁振動・電磁騒音の半径方向分布に対しての知見も得られつつある。以上のように,当該研究で設定している研究計画にほぼ沿った成果が得られているものと考えている。前述のように,平成26年度までに,実際のIMにおける機械系の非対称性(脚や端子箱の存在)に起因した電磁振動・騒音の半径方向分布の特徴の一部を超精密な測定により明らかにしている。
光MEMSを用いた極微量サンプルの超高感度拡散センシング

生体試料の拡散係数は試料のサイズ、高次構造、フォールディング状態や相互作用等によって変化するため、拡散係数を測定することでナノバイオ試料の構造状態や化学反応状態を分析することができる。本研究では、極微量のサンプルを高速でセンシング可能な小型拡散センサを開発することを目的として、(1)簡易な光導電膜の形成技術の開発、(2)高感度な検出を可能とする新しい濃縮技術の開発、(3)生体試料センシングを可能とするチャネル構造の提案を行い、POCT技術へ適用可能な知見を得るに至った。平成27年度に得られた研究実績の概要を以下に示した。(1)サンドイッチ構造ナノチャネル型サンプルセルの設計と試作初年度はプロトタイプを作製し、原理の妥当性を実験的に検証した。ナノチャネルを形成するためには石英基板をドライエッチングにより溝を形成する方法などが開発されているが、光導電膜と透明電極をサンドイッチ構造に形成させる本デバイスでは適用することができない。そこでSU-8フォトレジストを用いたナノチャネルの形成を試みた。市販されているSU-8ではナノチャネルを形成することができないため、溶媒を用いて希釈し低粘度化することでナノ薄膜を形成することを試みた。また、サンドイッチ構造を形成する場合、膜の均一性がボンディング性能に影響する。本研究ではコーティングプロトコルを確立し、SU-8によるナノチャネルの成膜を目指した。平成27年度はナノサイズのポリスチレンビーズを用いて縞状濃度分布を形成し、励起後の拡散現象を観察することで拡散係数の測定を行い、成膜したSU-8チャネルが拡散係数測定に適用できることを明らかにした。(2)光導電膜の簡易成膜法の開発試料の誘電率によって試料にかかる光誘起誘電泳動力が変化するため、光MEMS拡散センサに特化した光導電膜を成膜する必要がある。本研究課題では、安全かつ簡易に光導電膜を成膜でき、光導電膜の性質を任意に制御することができる光導電膜成膜技術を新たに提案した。本方法により、基板材質に囚われない新しい成膜技術を創出することができ、強力な微細加工技術を提供することができる。平成27年度は、種々の条件により成膜した光導電膜に対して、4端子法による高精度な導電率測定を行うことで膜質を評価し、成膜プロトコルを確立した。また、キャリア濃度制御とオンチップ成膜によるドーパントの注入を行い、従来のPE-CVD法で成膜した光導電膜と同等の明暗導電率比を達成した。現在までに、当初の計画通りの研究成果を挙げることができており、おおむね順調に進展している。一方、次年度に予定している濃縮技術に関しても、簡易的な検証実験を行い、妥当性をCCDカメラを通して観察・確認しており、当初以上の成果が出ている個所もある。また、サンプルセルの改良を行い、試料の封入や調製プロトコルを確立し、再現性が向上している。引き続き精力的に研究を推進し、当初以上の成果が出るよう努力する。最終年度は、実際のナノバイオ試料を用いた実験を通し、提案する超高感度光MEMS拡散センサの実証実験を行った。ナノバイオ試料を測定する際には(1)ナノバイオ試料の吸着(2)溶媒の導電率の影響(3)微量試料センシングの際の測定感度を考慮しなければならない。そこで下記に挙げる研究開発を行った。1.自己組織化単分子膜コーティングによる吸着低減:センサチャネル表面に自己組織化単分子膜をコーティングし、ナノバイオ試料の吸着を飛躍的に低減する方法を開発した。ポリエチレングリコールを均一にコーティングするプロトコルを確立し、XPS分光による妥当性検証を行った。本手法により、ナノバイオ試料の吸着による感度低下や不確かさへの影響を低減することに成功した。2.温度制御型反応性スパッタリング法の開発:溶媒の導電率を考慮した新しい光導電膜の成膜技術を開発した。成膜した光導電膜にコプラナー型電極を作製し、光導電率測定を行い、種々の成膜条件によって光導電率の変化を確認した。このことから温度制御による光導電効果の制御が可能となり、試料の適用範囲を拡大することに成功した。3.干渉縞変調による高感度検出技術の開発:極微量サンプルを濃縮し測定感度を飛躍的に向上させる新たな光照射技術を開発した。また、本手法に適用可能な光MEMSデバイスを開発した。光MEMSデバイスの駆動角度ならびに応答性が目標値に達していることを実験的に明らかにし、POCT分野への適用が可能なセンシングデバイスの構築を実現した。4.ナノバイオ試料を用いた検証実験:タンパク質が修飾されたナノビーズを用いて本提案の妥当性を実験的に確認した。表面のタンパク質の種類によるタンパク質相互作用の変化を高感度に検出することに成功した。最終年度は、実際のナノバイオ試料を用いた実験を通し、提案する超高感度光MEMS拡散センサを実現する。ナノバイオ試料を用いた場合に想定される課題と解決方法を下記に示した。

下記に示す推進方策により解析および実験の両方から課題解決に向けて加速度的に研究を推進する。(1)ナノバイオ試料の吸着:試料セルへのバイオ試料の吸着を抑制するコーティングを新たに提案する。(2)溶媒の導電率の影響:試料を充分に駆動するためのセル条件を明らかにし、バイオ試料中の拡散係数センシングを実現する。ナノ・マイクロ熱工学
半導体微結晶におけるサイト選択時間分解分光法を用いた表面効果の研究

半導体微結晶における励起子の発光寿命は、その微粒子サイズの依存性(量子サイズ効果)に興味をもたれて研究がおこなわれている。しかしながら、励起子の緩和に表面や欠陥などの準位がどのような影響を及ぼしているかなど、解明されていない点は多い。そこで、NaCl結晶中のCuCl微結晶、ガラス中のCuClおよびCuBr微結晶において、発光の時間分解および過渡吸収の時間変化を測定した。NaCl中のCuCl微結晶においては、発光スペクトルには吸収スペクトルと比較してストークスシフトがみられ、発光が「局在状態」からのものであることを示す。発光の時間変化には、4nsの長い緩和成分に加えて、自由励起子状態では40psの速い減衰が、「局在状態」では40psの立ち上がりがみられる。これら各エネルギー位置における発光の時間変化は、自由励起子状態から局在状態へ40psで緩和していると考えることによってうまく説明することができた。すなわち、局在状態に緩和する自由励起子は40psで無輻射に緩和し、それ以外のものは4nsで再結合発光することが明らかになった。NaCl中CuCl微結晶で過渡吸収の時間変化を測定すると、発光の時間変化と一致し、上述の緩和メカニズムを支持している。一方、ガラス中のCuClおよびCuBr微結晶では両者は一致しない。100psまでは両者の減衰(時定数100ps)はよく一致し、発光はそのまま単一指数関数で変化する。しかし、過渡吸収のほうには、1nsの長寿命の減衰成分が残る。この特異な振る舞いは、励起子が無輻射に電子と正孔に分離して表面や欠陥準位にトラップされ、それらが1nsの時定数で無輻射に再結合しているとすれば理解できる。ガラス中のCuBr微結晶でも同様の結果がえられ、ガラス中の微結晶では、無輻射に解離する励起子がその寿命に大きく寄与していることが明らかになった。
VEGF発現による虚血性心疾患の遺伝子治療

1)既にVEGF発現プラスミドは作製されており、これを用いてin vitro、in vivoでの発現実験を行なっている。2)in vitroにおいて、エレクトロポレーション法を用いてウサギ繊維芽細胞に本プラスミドを形質導入し、培養上清についてウェスタン解析を行ない本タンパク質が発現していることを確認した。また、細胞からmRNAを分離し、RT-PCR、ノーザンブロットを行いこれも同様にその発現を確認した。さらに生化薬理学的、検討等を行い、これらの分子的、機能的解析を進めている。また、同じく培養上清をマウス皮膚に投与したところ著明な血管新生を見た。従って本プラスミドから発現されるVEGF蛋白は機能的であると考え更に研究を進めている。3)in vivoでの発現実験については、DNA-リボゾーム法を用いて筋肉内投与を行ったが、明らかな変化を今の所認めていない。更に投与方法を検討している。4)安全性が高く、効率よく生体内に目的遺伝子を投与できると推定される遺伝子銃(日本医科器械製作所)を本学に導入し、併せて研究を進めている。
肝疾患におけるIFNλ4の機能的役割の解明

臨床検体におけるIFNλ4の発現解析と臨床学的意義を検討した結果、肝組織のIFNλ4の発現はDAAs治療後のnon-SVR症例で有意に発現上昇していた。肝組織のIFNλ4の発現はDAAs治療例の治療成績と関連していることが示唆された。また、肝動注化学療法奏効例12例の肝組織におけるIFNλ4の発現は非奏効例8例のIFNλ4の発現に比べ有意に発現上昇していた。IFNλ4の新規シグナル伝達系を検討した結果、IFNλ4は抗ウイルス活性のみならず、他のIFNとは異なり非常に強い抗腫瘍活性を示した。その作用機序として、IFNλ4は他のIFNとは異なり、JNK-ATF2シグナルを活性化することを見出した。そこで、各種IFN (IFNα, IL28B, IFNλ4)のリコンビナントタンパク質をヒト初代肝細胞にそれぞれ処置した後、次世代シークエンス解析を行った。その結果、IFNλ4により特異的に誘導される遺伝子群を同定した。IL28BとIFNλ4はIL28RAとIL10Rのヘテロダイマーを共通のレセプターとして利用しているという報告がある。しかしながら、本研究から、IFNλ4はIL28Bとは異なる表現系を呈することが明らかとなっており、それにはIFNλ4特異的なレセプターが既報のレセプター以外に存在することが想定された。その新規候補レセプターとしてタイプIIサイトカインレセプターに対するsiRNAスクリーニングを行い、レセプターA及びBが新規レセプターであることを同定した。IFNλ4の新規レセプターA及びレセプターBの下流のシグナルを解析することによりIFNλ4の新たな機能的役割が明らかとなることが期待される。更に、IFNλ4の抗腫瘍効果の検討を行った。NOD-SCIDマウスを用いたxenograftモデルにてIFNλ4が抗腫瘍効果を示すことをin vivoで確認した。本研究はIFNλ4の機能的役割を解明すること及び新規肝細胞癌療法の可能性について検討することを目的とする。申請者はIFNα, IFNλ3,IFNλ4の恒常的発現細胞株を作成した。これらの細胞株にHCVを感染させたところ、HCVの複製は完全に抑制された。しかしながら、これら細胞株に種々の抗がん剤を処置した結果、IFNλ4と抗がん剤の併用が最も強い抗腫瘍効果を示すことを見出した。興味深いことに、IFNλ4レセプターをsiRNAを用いてノックダウンしたところ、IFNシグナルは完全に抑制されるにもかかわらず、抗がん剤の増強効果は維持されたままであった。この結果はIFNλ4はIFNλ4レセプター以外の未知のレセプターを介して、抗がん作用を呈することを示唆する。また、本年度はCrispr-cas9システムを用いて、IFNAR1, IFNAR2, IL28RA, IL10RBそれぞれのノックアウト細胞株を作成した。これらの細胞株を用いて未知のレセプターの同定を試みている。本年度はIFNλ4のリコンビナントタンパク質を動物由来細胞から作成することを試みた。その結果、動物由来細胞からIFNλ4を高発現出来る最良の条件を同定することが出来た。培養細胞を用いた研究には十分使用できるリコンビナントタンパク質の作成に成功している。今後はIFNλ4の大量精製方法の検討、精製効率を上げる方法の検討が必要となる。申請者はIFNλ4を特異的に定量できるリアルタイムPCR用のプライマー、プローブセットを作成した。これらプライマー、プローブを用いて血清中のIFNλ4を定量出来るか検討した結果、血清中のIFNλ4を定量することは出来なかった。よって次年度は、IFNλ4のELISA系もしくは全く新しいシステムを用いた測定系を開発する。IFNλ4のリコンビナントタンパク質を効率よく作成できる条件を見出せたこと、種々のノックアウト細胞株、恒常的遺伝子発現細胞株、抗がん剤耐性細胞株を作成できたこと等、本研究の目的を果たす為に必要な実験材料を揃えることが出来た。リコンビナントタンパク質の作成はIFNλ4の特異的抗体の作成やELISA、新規IFNλ4検出系の開発に応用できると期待される。IFNλ4と抗がん剤併用による抗腫瘍増強効果はIFNレセプター以外のレセプターを介していることを見出せた。更に、IFNレセプターノックアウト細胞も作成できたことから、IFNλ4の未知のレセプター及びシグナル伝達経路の解明に向けた研究を進めることができる。本研究は、IFNλ4に機能的役割を解明することを目的とする。申請者は、動物細胞由来のIFNλ4リコンビナントタンパク質の精製に成功している。興味深いことに、大腸菌由来のIFNλ4リコンビナントタンパク質と動物細胞由来のIFNλ4リコンビナントタンパク質ではその生理活性に大きな違いがあることを見出した。本年度は、IFNλ4の生理活性には糖鎖修飾が重要であることを見出し、その糖鎖付加部位を特定した。IFNλ4は抗がん剤による抗腫瘍効果を増強させるが、その効果は、IFNλ4がATF2-cJUN経路を活性化させることが要因であることを見出した。更に、STAT3やSOCS3の発現誘導も抗がん剤による抗腫瘍効果の増強に影響を与えていることを見出した。

更に、IFNλ4の抗腫瘍効果は細胞株によりその感受性の違いがあり、その違いはp53の変異に依存することを見出している。申請者はIFNλ4の遺伝子発現をリアルタイムPCR法により特異的に検出する系を確立しているが、本年度は、IFNλ4のタンパク質を特異的に検出する測定系の開発の準備に取り掛かった。IFNλ4のリコンビナントタンパク質の精製に成功したことから、IFNλ4特異的抗体の作成を試みており、作成された抗体を用いてELISA系を確立する。IFNλ4はIFNαやIFNλ3と同様に抗ウイルス効果を示すことを種々のウイルス感染細胞で確認したが、癌細胞に対する反応性に関してはIFNαやIFNλ3には認められず、IFNλ4特異的に認められることから、IFNλ4の癌細胞に対する特異的反応性の解明は新規肝癌治療法に応用できる可能性がある。本年度は、IFNλ4のリコンビナントタンパク質の大量精製に成功し、IFNλ4抗体の作成に取り掛かることが可能となった。更に、各種IFN(IFNα、IFNλ3、IFNλ4)の恒常的発現細胞株やそれらIFNレセプターのノックアウト細胞の作成に成功し、より詳細にIFNλ4の特異性を解析することが可能となった。臨床検体におけるIFNλ4の発現解析と臨床学的意義を検討した結果、肝組織のIFNλ4の発現はDAAs治療後のnon-SVR症例で有意に発現上昇していた。肝組織のIFNλ4の発現はDAAs治療例の治療成績と関連していることが示唆された。また、肝動注化学療法奏効例12例の肝組織におけるIFNλ4の発現は非奏効例8例のIFNλ4の発現に比べ有意に発現上昇していた。IFNλ4の新規シグナル伝達系を検討した結果、IFNλ4は抗ウイルス活性のみならず、他のIFNとは異なり非常に強い抗腫瘍活性を示した。その作用機序として、IFNλ4は他のIFNとは異なり、JNK-ATF2シグナルを活性化することを見出した。そこで、各種IFN (IFNα, IL28B, IFNλ4)のリコンビナントタンパク質をヒト初代肝細胞にそれぞれ処置した後、次世代シークエンス解析を行った。その結果、IFNλ4により特異的に誘導される遺伝子群を同定した。IL28BとIFNλ4はIL28RAとIL10Rのヘテロダイマーを共通のレセプターとして利用しているという報告がある。しかしながら、本研究から、IFNλ4はIL28Bとは異なる表現系を呈することが明らかとなっており、それにはIFNλ4特異的なレセプターが既報のレセプター以外に存在することが想定された。その新規候補レセプターとしてタイプIIサイトカインレセプターに対するsiRNAスクリーニングを行い、レセプターA及びBが新規レセプターであることを同定した。IFNλ4の新規レセプターA及びレセプターBの下流のシグナルを解析することによりIFNλ4の新たな機能的役割が明らかとなることが期待される。更に、IFNλ4の抗腫瘍効果の検討を行った。NOD-SCIDマウスを用いたxenograftモデルにてIFNλ4が抗腫瘍効果を示すことをin vivoで確認した。今後は以下の点について研究を進行する。(1)各種IFNリコンビナントタンパク質をヒト
脂質代謝とSIK3による軟骨形成・分化の新しい制御機構の解明

軟骨は関節運動と骨の成長に重要な役割を果たす。本研究においてコンディショナルノックアウトマウスを作製し、SIK3が関節軟骨の形質を制御し、関節症治療のターゲットになることを明らかにした。そして、SIK3を阻害する化合物がマウス変形性関節症モデルの軟骨変性を軽減することを示し、薬剤開発のシーズを見出した。また、軟骨細胞の性質を維持する働きがある化合物を同定した。この化合物は軟骨の性質の維持に必要な転写因子であるSox9の分解を抑制していた。1)脂質代謝による軟骨形成・分化制御の解明Dox-iChon細胞にshRNAライブラリーを導入して遺伝子ノックダウンを行い、軟骨形質を失うshRNAを同定した。このshRNAに相当する遺伝子は、脂質代謝に関連することが知られている因子をコードしている。マウス初代軟骨細胞を用いて、この遺伝子のsiRNAを用いて軟骨表現型が失われることを確認した。2)SIK3による軟骨形成・分化制御の研究については、タモキシフェン投与下に生後の関節軟骨特異的にSIK3を欠失するCol11a2-CreER; SIK3flox/floxマウス(SIK3 cKO)を作り、「軟骨細胞特異的なSik3の欠失は関節軟骨の厚みを増大させる」ことを見出した。【結果】Tam-cKOマウスは、Tam-controlマウスに比べて関節軟骨、非石灰化関節軟骨、成長軟骨の幅が有意に増加した。YFPとX型コラーゲンに対する免疫染色の結果、Sik3が欠失したYFP陽性の軟骨細胞はX型コラーゲンを発現しないことが判明した。またSik3D/DマウスはSik3f/fマウスに比べて関節軟骨、成長軟骨の幅が有意に増加した。ライブラリースクリーニングにより、軟骨細胞形質維持に関わる因子の候補を得た。1)脂質代謝による軟骨形成・分化制御の解明については、shRNAライブラリースクリーニングによって得られた、軟骨細胞分化に関わる因子Aの遺伝子ノックダウンをマウス初代軟骨培養細胞で行い、遺伝子発現変化と蛋白発現解析変化を定量的RT-PCRとウエスタンブロットを用いて解析したところ、軟骨マーカーの発現低下が起きていた。さらに、脂質代謝産物としてコレステロール量に変動が見られた。一方、因子Aを過剰発現させた場合は、軟骨マーカーの発現が上昇していた。より生理的な状況での軟骨分化への影響を調べるために、ペレットカルチャーを行い、軟骨マーカーの発現上昇が起きていることを確認した。このことから因子Aは軟骨細胞の表現型の維持に重要な働きをしていると考えた。また、軟骨細胞の代謝におけるFGFR3シグナルの解析を調べるために、FGFR3遺伝子を改変したノックインマウスを作るためのDNAコンストラクトのデザインを行った。2)SIK3による軟骨形成・分化制御の研究については、ヒト軟骨細胞でのSIK3の役割を調べるために、ヒトiPS細胞に対してCRISPR/Cas9を使ってSIK3をノックアウトした。iPS細胞のゲノムを解析したところ、SIK3遺伝子の目的とした領域が両アリルで欠失していることを確認した。このSIK3 KOヒトiPS細胞の軟骨分化を行い、軟骨分化を行えることを確認した。これにより、ヒト軟骨細胞でSIK3の機能を解析する材料を得ることができた。SIK3 KOマウス軟骨細胞のRNA seqを行い、WTマウス軟骨細胞と比べて発現変化している遺伝子Bを同定した。遺伝子Bの発現変化を定量的RT-PCRとウエスタンブロットを用いて確認した。ライブラリースクリーニングにより、軟骨細胞形質維持に関わる因子として、遺伝子Aを得た。この遺伝子の機能及び脂質代謝に対する影響をを培養軟骨細胞を用いて調べた。SIK3ノックアウトヒトiPS細胞を作製した。SIK3 KOマウス軟骨細胞で発現変化している遺伝子として、Bを同定した。また、SIK3が軟骨細胞分化を制御する機構を調べるために、SIK3ノックアウトマウスの軟骨を用いてメタボローム解析とRNA seq解析を行った。その結果、1つの代謝産物がSIK3ノックアウト軟骨で低下し、その代謝産物の合成を阻害する酵素のmRNA発現が上昇していることが判明した。代謝による軟骨分化制御機構の可能性を示唆すると考える。スクリーニングによって得られた、軟骨細胞分化に関わる因子の機能解析を行う。また、FGFR3軟骨形成異常症の疾患iPS細胞モデルの表現型をスタチンが改善させる機序を調べる。SIK3が軟骨細胞の形質をどのように制御しているかを、分子レベルで詳しく解析する。スクリーニングによって得られた、軟骨細胞分化に関わる因子Aの機能解析を行う。遺伝子改変マウスの軟骨原基器官培養を導入し、軟骨マトリックスが保たれた組織の状態で、より生理的な環境における軟骨細胞の増殖・分化の制御機構を解析することを目指す。29年度が最終年度であるため、記入しない。骨・軟骨代謝学29年度が最終年度であるため、記入しない。
小型衛星の最適アーキテクチャとスケール依存性の研究

小型衛星の最適アーキテクチャとそのスケール依存性の研究を行った。前年度に引き続き、小型衛星と大型衛星の設計上の相違点を検討した。その結果小型衛星には設計自由度が少ないことと、軌道上環境の不確定性の2点が問題点であることが分かった。そして、そのことが最も大きな影響を与える熱設計に対する方針の与え方を研究した。小型衛星の熱設計上の問題点は、設計自由度の少なさである。そこで、相転移式蓄熱材の使用を提案した。この蓄熱材は超小型衛星の熱的制約条件下では、現存する手段の中では原理的に最も有効であることを示しつつ、将来ナノテクノロジー等の利用により相転移式蓄熱材を超える熱制御デバイスの存在について示唆した。また他の設計自由度との違いについても検討した。そして、実際に蓄熱材を使用した実験を行い、正確な熱数学モデルを作製し、部位への結合方法に関する考察を行った。外部熱環境の不確定性に関しては、衛星投入軌道が不定ではあるが、高温最悪軌道と低温最悪軌道になる軌道が定まり、この2ケースを確認することで他の軌道を取る場合にも温度範囲が逸脱することがないことを示した。また、姿勢も制御方式に応じて最悪熱環境の分類が可能であることを示した。最適設計は、基本的に構築された熱数学モデルに対して修正パウエル法を用いた数値的最適化により行われる。しかし、解の収束性と求解時間を考慮し、衛星条件に応じて設計自由度を部分的にシーケンシャルに最適化を行うことで最適性を損なわずに迅速に解が求まる方法を提案した。以上をまとめて小型衛星と大型衛星は何が異なるのかスケール依存性の検討を行い、それを元に熱設計論の提案を行った。また、具体的なサンプル衛星に対してその熱設計論を適用して評価を行った。まず、小型衛星と大型衛星の設計上の相違点を検討した。その結果小型衛星には設計自由度が少ないことと軌道上環境の不確定性の2点が問題点であることが分かった。そしてそのことが最も大きな影響を与える熱設計に対する方針の与え方を研究した。そこで、相転移式蓄熱材の使用を提案し小型衛星向き熱制御デバイスとして利用可能であるか確認し、他の設計自由度との違いについても検討した。また実際に蓄熱材を使用した実験を行い、正確な熱数学モデルを作製し、部位への結合方法に関する考察を行った。また、具体的なサンプル衛星に対してその熱設計論を適応して評価を行った。