hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
非正規雇用の健康影響に関する国際比較研究

具体的には、日本・欧米の中高齢者縦断調査を入手し、国の社会・文化・制度的背景の違いが非正規雇用の構成要素である雇用不安とメンタルヘルスとの関連にどのように影響するかを検証した。その結果、各国の労働市場における男女格差が雇用不安とメンタルヘルスの関連に影響することが示唆された。すなわち、日本のように性別役割分担意識が強く、男女格差が大きい国では、男性は雇用が不安定になるとメンタルヘルスが悪くなり、女性は逆に雇用が安定するとメンタルヘルスが悪くなることが明らかとなった。つまり、多くが家計の主な担い手である男性は、その責任から雇用が不安定になるとストレスを感じる。一方、女性は雇用が安定化する状況、たとえば正社員になったり、昇進すると、ワークファミリーバランスが崩れるなどでストレスを感じると考えられた。したがって、わが国における非正規雇用への社会政策に求められる要件の一つは「男女格差の解消」であると考えられた。妊娠・出産のため、研究の実施が遅れている。日本の非正規雇用者の割合は、欧米諸国と同様に増加している。2016年現在、パート、アルバイト、派遣社員、契約社員、嘱託といった非正規雇用者は雇用者全体の約4割を占める。雇用の不安定性や低所得など、非正規雇用に伴うさまざまな社会的不利および格差の集積によって、健康障害が引き起こされることが国内外で報告されている。一方で、正規雇用と非正規雇用の間で健康に差はないとする報告や、正規雇用者の健康の方が悪いとする報告も散見される。研究成果が必ずしも一致しない要因の一つとして、国によって社会・文化・制度的背景が異なることが考えられる。そこで、(1)非正規雇用の健康影響に関する文献調査や有識者へのインタビュー調査を行い、各国の非正規雇用を取り巻く社会・文化・制度的特徴を整理することと、(2)縦断調査の比較分析を行い、社会・文化・制度的背景によって非正規雇用の健康影響が異なるかどうかを検証することを目的とした。その結果、社会保障の手厚いスカンジナビア諸国では、非正規雇用の健康影響が比較的小さい傾向が見られた。一方、東アジア諸国は社会保障を家族と企業に依存しており、頼る家族がいない場合に非正規雇用の健康影響が大きくなる傾向が見られた。また、縦断調査から、日本のように性別役割分担意識が強く、男女格差が大きい国では、男性は雇用が不安定になるとメンタルヘルスが悪くなり、女性は逆に雇用が安定するとメンタルヘルスが悪くなることが明らかとなった。わが国における非正規雇用への社会政策に求められる要件の一つは「男女格差の解消」であると考えられた。非正規雇用の健康影響の国際比較を行うため、国内外の研究者や有識者にインタビュー調査を行い、非正規雇用の健康影響について質的な情報を収集する。ここで得られた情報を元に、非正規雇用の健康影響の国内外における共通点と相違点を推測する。次に、日本の官庁統計の利用申請を行うとともに、欧米のパネルデータについても利用申請を行い、日本と欧米のデータを比較可能な形式に整え、比較分析する。日本・欧米で実施中の大規模な中高齢者縦断調査の比較分析を行い、文化的・制度的背景によって非正規雇用の健康影響が異なるかどうかを検証する。
体静脈-肺動脈吻合術後の肺動静脈瘻発生に関する臨床的検討

Fontan型手術の術後急性期には静脈庄上昇、低心拍出量状態のため肝障害が生じ、凝固機能が低下すると考えられる。一方、肝臓で合成される凝固促成因子であるProtein C,Protein Sが肝障害などで低下すると逆に血液凝固が充進する。さらに遠隔期にはこれらの肝臓由来の液成因子特にこれら凝固線溶系の変動が肺動脈瘻に少なからず関係していると推測されているが、術後の凝固線溶系の経時的な変動については明かではない。本研究ではFontan型手術術後において、肺動静脈瘻の一つの原因とされている蛋白液成因子及び凝固線溶系に着目し、肝臓由来の凝固抑制因子であるProtein C,Sと血液凝固線溶機能の経時的な変動を検討することを目的とした。2)TAT,PICともに術後急性期には高値で、凝固系、線溶系ともに更新していたが遠隔期には正常化していた。Protein C,Sの異常に影響する因子に関して、今後の検討が必要である。(目的)上大静脈ー肺動脈吻合術後には約30%に肺動静脈瘻が生ずると報告されているが、フォンタン手術後での発生は極めて希である。何れも、肺動脈圧は低値であり、しかも拍動性に乏しい。一方、肝硬変患者にも、肺動静脈瘻の発生をみたとの報告もある。肺と肝は共に、多くの体液性、内分泌性、代謝性機能を有している。肝臓由来の何等かの因子と肺血管の間の重要な関連に障害が生ずると、肺内での肺動静脈瘻が発生するのかも知れない。そこで、我々は肝機能の異常と肺動静脈瘻の発生に関係があるのではないかと考え、肝機能検査上最も敏感な凝固線溶系及び一般肝機能について検討した。(対象と方法)手術時年齢2-19(平均7.2)才のフォンタン術後9例を対象とした。これらの例は何れも肺動静脈瘻を形成していない。4例で術前と術直後1ヵ月までの急性期に、また、5例では術後7-58ヵ月の遠隔期に凝固線溶因子並びに一般肝機能を測定した。凝固線溶因子としてProtein C,Protein S,TAT,PICを測定した。一方、肺動静脈瘻の存在について、経食道超音波検査にて検索した。(成績) Protein C,Protein Sは術前は正常値であったが、術後経時的に低下し、術後1ヵ月時には各各54±5%,5.1±0.9mcg/ml(平均±標準偏差)であった。TAT,PICは共に高値であった。遠隔期には、Protein Sは全例低値(5.1+3.0mcg/ml)であったが、Protein Cは2例で低値(35,53%)、3例で正常値(83+6%)であった。TAT,PICは正常値であった。一般肝機能との関係は明かではなかった。全例で肺動静脈瘻を認めなかった。(結語)フォンタン手術後の凝固線溶因子について検討した。フォンタン術直後には全例に、遠隔期においても約半数に凝固線溶系の異常が認められた。このことは、フォンタン手術後においては肝機能は正常ではない事を示した。しかし、これらの例では肺動静脈瘻は発生していなかった。平成5年度は前年に引き続き臨床的検討として、肝静脈血中の体液性因子と体静脈-肺動脈吻合術後の肺動静脈瘻発症の因果関係を検討した。【対象】対象はFontan型手術術後症例10例で、手術時年齢は219(平均6.9)歳であった。【方法】検査項目は肝機能低下時には低下するProtein C,S、PT,APTT,AT3、TAT,PICなどの止血検査や、T.Bil,GPT,LDHなどの一般肝機能検査及び、グルカゴン、ソマトスタチン、各種growth factorで、急性期症例4例では術前、術後1日、1ヵ月、6ヵ月と経時的に、遠隔期症例6例では術後7カ月から7年平均31ヵ月で検査を行った。【結果】術後急性期にはProtein C,Sいずれも全例で正常下限から正常値以下を示し、術後1カ月では各々54±5.1%,5.1±0.9mcg/mlであった。

Protein CとT.Bil、GPT、LDHとの間に明かな関係を認めなかった。術後遠隔期の6例について検討すると、Protein Cは2例で低値(35,53%),4例で正常値(83±5.7%)と2群にわかれ、Protein Sは5.7±1.6mcg/mlで1例を除いて低値であった。そこで、Protein Cが低値であったLow PC群2例と正常値であったHigh PC群4例に分けて比較検討すると、TATはいずれも正常値であったが、PICはHigh Protein C群で高値をとり線溶亢進を示すものがあった。growthfactor,グルカゴン,ソマトスタチンについてはいまだ結果をえていない。【まとめ】1)Protein C,SはFontan型手術術後急性期には低値であり、遠隔期にもProtein Cは2例(33%)で、Protein Sは5例(83%)で低値であった。2)TAT、PICはともに術後急性期には高値で、凝固系、線溶系ともに亢進していたが、遠隔期には正常化していた。肝静脈中の体液性因子とそれと肺動静脈瘻発症の関係に関しては、今後の検討が必要である。
数値情報処理における計算の品質保証に関する研究

数値情報処理とは,従来の数値計算技術を主体とし,それを取り巻く種々の解析・吟味手法や,最近では精度保証技術などの手法も取り込んだ数値データの処理全体を指す.近年の計算機の能力向上により,このような数値情報処理の規律は非常に大きくなてきているが,そこでの数値計算の結果である膨大なデータから有用な情報を取り出すためには,データ自身の信頼性,精度というものに多くの注意を払い,それらを吟味するべきであるということの再認識が広まってきている.多種多様な数値情報処理の全体に対して統一的な手法を適用するための接近法である「自動微分・高速自動微分」,「区間演算」などが実用になりつつあるからである.本研究の目的は,数値計算結果の精度保証の自動化の仕組みを発展させ,より広い枠組である数値情報処理の中に適切に融合することである.具体的には,個々のプログラムレベルの精度保証を基礎そして,より抽象度の高いレベル,たとえば,ベクトル,行列などの形態での精度保証の効率の良い実現方法を研究する.また,多様な「数のデータ構造」を用いる技術の実現法の高効率化を模索しつつ,数値計算用の「数」として,何を用い,どの精度保証の手法を用いるべきであるかというデータ構造選定の自動化も目指す.以上のような目的の下で,次のような結果を得た.(1)試作中の精度保証の自動化のための処理系を用いた計算実験を行い,実際的な側面から,処理系の高効率化,改良を試みた.これは,数値情報処理の品質保証のための技術の根幹部分になる.その結果,常微分方程式の初期値問題の解の精度保証アルゴリズムを整理することができ,近似式の次数を一定にした場合には,最も狭い保証区間を与え得るアルゴリズムを得た.(2)並行して開発していた高速自動微分用プリプロセッサについて,国際会議で発表した.また,当初研究予定に組み入れていながら,課題として残ったものは,次の2点である.(1)数値情報処理を支援する一般的な枠組を考えると,その支援システムの機能および形態,すなわち,利用者との接点の実装も重要となる.ここでは,いわゆる「グラフィカルユーザインタフェース」も備えた使い勝手のよい品質保証の処理系を設計し,実験によりその妥当性を確認することを目指したが,それ以前の段階に留まってしまった.(2)処理系の汎用性・頑健性を高めるために,異なる様式の計算機上でシステムを試験することが必要であったが,そこまでに至らなかった.なお,計画どおりのワークステーションを購入し,数値実験を行ない,秋には研究成果に関して京都大学数理解析研究所における共同研究集会にて発表した.この発表に旅費を使用した.数値情報処理とは,従来の数値計算技術を主体とし,それを取り巻く種々の解析・吟味手法や,最近では精度保証技術などの手法も取り込んだ数値データの処理全体を指す.近年の計算機の能力向上により,このような数値情報処理の規律は非常に大きくなてきているが,そこでの数値計算の結果である膨大なデータから有用な情報を取り出すためには,データ自身の信頼性,精度というものに多くの注意を払い,それらを吟味するべきであるということの再認識が広まってきている.多種多様な数値情報処理の全体に対して統一的な手法を適用するための接近法である「自動微分・高速自動微分」,「区間演算」などが実用になりつつあるからである.本研究の目的は,数値計算結果の精度保証の自動化の仕組みを発展させ,より広い枠組である数値情報処理の中に適切に融合することである.具体的には,個々のプログラムレベルの精度保証を基礎そして,より抽象度の高いレベル,たとえば,ベクトル,行列などの形態での精度保証の効率の良い実現方法を研究する.また,多様な「数のデータ構造」を用いる技術の実現法の高効率化を模索しつつ,数値計算用の「数」として,何を用い,どの精度保証の手法を用いるべきであるかというデータ構造選定の自動化も目指す.以上のような目的の下で,次のような結果を得た.(1)試作中の精度保証の自動化のための処理系を用いた計算実験を行い,実際的な側面から,処理系の高効率化,改良を試みた.これは,数値情報処理の品質保証のための技術の根幹部分になる.その結果,常微分方程式の初期値問題の解の精度保証アルゴリズムを整理することができ,近似式の次数を一定にした場合には,最も狭い保証区間を与え得るアルゴリズムを得た.(2)並行して開発していた高速自動微分用プリプロセッサについて,国際会議で発表した.また,当初研究予定に組み入れていながら,課題として残ったものは,次の2点である.(1)数値情報処理を支援する一般的な枠組を考えると,その支援システムの機能および形態,すなわち,利用者との接点の実装も重要となる.ここでは,いわゆる「グラフィカルユーザインタフェース」も備えた使い勝手のよい品質保証の処理系を設計し,実験によりその妥当性を確認することを目指したが,それ以前の段階に留まってしまった.(2)処理系の汎用性・頑健性を高めるために,異なる様式の計算機上でシステムを試験することが必要であったが,そこまでに至らなかった.なお,計画どおりのワークステーションを購入し,数値実験を行ない,秋には研究成果に関して京都大学数理解析研究所における共同研究集会にて発表した.この発表に旅費を使用した.
ショウジョウバエ培養細胞を用いた再構築概日系の確立

per,timに対する正の転写因子であるCLKを強力な定常的発現プロモーターであるcytoplasmicactinプロモーターを使って(Act5C-clk)培養細胞内で発現させた。western blotによりPERおよびTIMの発現をモニターすると、TIMの発現は誘導されるが、PERの発現は誘導されなかった。そこで、Act5C-clkとともにper遺伝子のゲノム断片(G-per)をS2 cellにco-transfectした。その結果、TIMのみでなくPERの発現も観察された。次に28時間に渡って、TIMおよびPERの発現量の変動のモニターを試みたが、変動は観察されなかった。これは、正の転写因子であるCLKが恒常的に供給された結果であると解釈された。そこで、一過的な発現を誘導するheat shock protein 70のプロモーター下流にclk遺伝子を連結し(hs-clk)、37°C30分の熱ショックにより一過的にCLKを発現させて、その後のPERおよびTIMの発現をモニターした。hs-clkとG-perのco-transfectionを行うと、熱ショックを与えた場合にのみPERの強い発現が誘導された。熱ショックを与えた後、約5日間に渡って3-4時間ごとのサンプリングを行い、PERおよびTIMの発現量の変動のモニターを試みると、約26時間の周期性を持ったPER/TIM量の変動が観察された。振動は約4回繰り返された。再現性を確認するために、実験を繰り返した。実験毎に、周期、およびPER量のピーク位相にはズレが生ずるが、振動がほぼ一定周期で繰り返されること、数日後にはPER/TIMの発現が観察できないレベルにまで減衰することには再現性があり、培養細胞内での概日リズムの再構築に成功したと判断した。ショウジョウバエの培養細胞を用いて概日振動系を再構築することを試みた。本年度は、まず、概日振動を簡便に調べるためのレポーター遺伝子をゲノムに持つ形質転換細胞株の確立を試みた。GFPと分泌性アルカリフォスファターゼを試した。どの発現系においても、レポーター遺伝子の発現は検出可能であったが、薬剤耐性を指標に安定な形質転換細胞を選別しても、全細胞の約20%程でしか充分なレポーター遺伝子の発現が起こらなかった。そこで、用いるショウジョウバエ培養細胞をS2 cellからKc cellとhaploid cellの1182-4に変えて同様の実験を行った。しかし、これらの細胞を用いてもレポーター遺伝子の発現を協力にすることはできなかった。発現が弱い理由として、ゲノムへのプラスミド導入数が少なすぎることが考えられたので、形質転換の方法をリポフェクション法から、プラスミドがゲノムにタンデムに多数挿入されることが期待される燐酸カルシウム法へと変更し、安定な形質転換体を得るための選別マーカーも、比較的強力なZeocinから弱いhygromicinに変えてみたが、効果はなかった。哺乳類の培養細胞で、外来遺伝子の翻訳阻害を起こすdsRNA-activated inhibitorに対して阻害効果を持つ、Adenovirus VAI RNAの効果に関しては現在検討中である。これらの実験とは別に、確立した安定細胞株に対して、高濃度のserum shockをあたえた時に哺乳類で観察されるような概日リズムの振動が誘発されるかどうかを調べたが、明瞭な振動は見られなかった。現在、培養液組成の変更により高濃度のserum shockの効果があらわれるかどうかを検討中である。来年度はdCLKの一過的発現により培養細胞系で概日リズムが誘発されるかを調べる予定である。
学校歯科保健支援ICTシステムを導入した自律的健康づくりを目指す食育介入の効果

「学校歯科保健支援ICTシステム」を導入し、小学校児童を対象として口腔保健の状況を調査した。その結果、不十分な咀嚼習慣と歯肉の炎症に関連性があることが示された。さらに、「噛ミング30学習」は、よく噛むことを促すだけでなく、歯肉の炎症の増悪抑制にも効果がある可能性が明らかになった。また、男子高校生を対象とした横断的研究において、歯肉の炎症は肥満と関連すること、更に縦断的研究において、肥満改善群では有意な歯肉の炎症の改善が示された。これらの内容は、学校教諭や養護教諭および学校保健に関わる歯科専門職が口腔と全身の健康との関連性を深く理解し、児童・生徒への保健指導に活用する必要性を示唆している。小学校児童を対象とした研究:咀嚼習慣と口腔内状態との関連性を調査すること、よく噛むことを健康づくりに取り入れた食育介入を実施し、口腔内状態の変化としての効果を検証することを目的とした。徳島県内にある2つの小学校のうち,1校の5年生(81名)を介入群とし,他校の5年生(39名)をコントロール群として,食習慣に関する保健調査を実施した。介入群では,児童それぞれのPMA indexを評価した。さらに,1年間を通して計5回学校給食時に咀嚼計を用いた「噛ミング30学習」を実施した。介入終了後,“よく噛む"項目が改善した者の割合は、コントロール群では13.2%、介入群では40.7%と有意な差が認められた(p<0.01)。“よく噛む"項目の変化の有無により,介入群を2つのグループに分類した。“よく噛む"項目の非改善群ではPMA indexが有意に増加していた(p<0.05)が,改善群ではPMA indexに増加は認められなかった。これらの結果は,小学生において,不十分な咀嚼習慣と歯肉の炎症に関連性があることを示している。「噛ミング30学習」は,よく噛むことを促すだけでなく,歯肉炎の予防にも効果がある可能性が示唆された。小学校児童を対象とした研究において、噛むことを健康づくりに取り入れた食育介入を実施した。その際、「学校歯科保健支援ICTシステム」を活用し児童にタブレット端末を使用させ、自身の歯科健康診断結果及び生活習慣の振り返りを行った。介入の結果、非介入群と比較して、介入群では“よく噛む"項目が有意に増加していたことや、“よく噛む"項目が改善した群では歯肉の炎症増悪を抑制する可能性が示されるなどの成果が得られている。上記の結果から、本研究課題の小学校での活動においては、おおむね順調に進んでいると考えられる。高校生を対象とした研究:2013年度から2016年度に徳島県内のA高校に在籍した1年生の男子生徒1027名を対象とし、保健調査結果と学校健康診断結果との連結データを用いて分析を行った。対象者を歯肉の炎症の有無(健康またはG/GO)で2群に分けて従属変数とし、BMI(≧25or<25)、3つの保健調査項目、歯垢、齲歯数、歯列を独立変数とした二項ロジスティック回帰分析を行った。分析結果から歯肉の炎症と肥満の関連性が示され、歯列不正である者はオッズ比にて2.07倍、歯垢付着がある者は21.66倍、BMI≧25である者は1.78倍歯肉の炎症が起こり易いことが示された。以上の結果より、高校生男子において、歯肉の炎症は肥満と関連することが明らかとなった。さらに、2016度の歯科健康診断において、GOと診断された1年生男子生徒50名に対し、養護教諭が学校歯科保健ICTシステムの利用及び45名を1グループとした口腔衛生に関する個別歯科保健指導を実施した。2013年度の歯科健康診断でGOと診断された1年生男子生徒71名を対照群として、1年後の変化を比較することにより介入の効果をカイ二乗検定にて分析したところ、対照群と比較して介入群では1年後の歯肉の状態が有意に改善していた(p<0.01)。以上より、養護教諭による個別歯科保健指導が歯肉の炎症の改善に効果的であることが明らかになった。高校生男子を対象とした研究において、2013年度から2016年度に徳島県内のA高校に在籍した1年生の男子生徒1027名に対し保健調査を実施し、保健調査結果と健康診断結果を連結させたデータを用いて分析を行った。分析の結果、歯肉の炎症と肥満の関連性が示され、BMI≧25である者は1.78倍(信頼区間:1.08-2.95)歯肉の炎症が起こり易いなどの結果が得られている。上記の結果から、本研究課題の高校での活動においては、おおむね順調に進んでいると考えられる。高校生を対象とした研究:2013年度から2016年度に徳島県内のA高校に在籍した1年生の男子生徒1027名のうち、2013年度および2014年度に入学した508名を対象としてコホート研究を行った。1年生、3年生時点での定期健康診断結果を比較し、BMI<25を維持またはBMI≧25からBMI<25へ肥満が改善した者を肥満改善群、BMI≧25を維持またはBMI<25からBMI≧25へと悪化した者を肥満非改善群として2群に分類し、両群の歯肉の炎症の変化をMcNemar検定およびWilcoxon符号付順位和検定にて調べた。

その結果、肥満改善群437名では歯肉の炎症が有意に軽減していた(p<0.05)が、非改善群71名では歯肉の炎症の軽減は認められなかった。したがって、男子高校生において歯肉の炎症と肥満には関連性があると考えられる。以上より、学校保健に携わる学校関係者、歯科医療従事者および医療従事者は、相互の役割を理解した上で、生徒の健康増進のために連携し介入を行う必要があるといえる。小学生を対象とした研究:前年度に引き続き「学校歯科保健支援ICTシステム」により、タッチパネル式のタブレット端末を活用し歯科健康診断結果の入力を行った。また、ゲストティーチャーとして実施した児童参加型授業では、同システムを用いて児童に自身の歯科健康診断結果および生活習慣等の保健調査結果に関するフィードバックを実施した。本授業は、児童が自身の健康状態に関心を持ち、食生活や生活習慣を主体的に改善できる資質や能力を身に付けるための一助となると考える。「学校歯科保健支援ICTシステム」を導入し、小学校児童を対象として口腔保健の状況を調査した。その結果、不十分な咀嚼習慣と歯肉の炎症に関連性があることが示された。さらに、「噛ミング30学習」は、よく噛むことを促すだけでなく、歯肉の炎症の増悪抑制にも効果がある可能性が明らかになった。また、男子高校生を対象とした横断的研究において、歯肉の炎症は肥満と関連すること、更に縦断的研究において、肥満改善群では有意な歯肉の炎症の改善が示された。これらの内容は、学校教諭や養護教諭および学校保健に関わる歯科専門職が口腔と全身の健康との関連性を深く理解し、児童・生徒への保健指導に活用する必要性を示唆している。1.前年に引き続き、小学校において「学校歯科保健支援ICTシステム」を用いた歯科健康診断および食習慣に関する保健調査を実施する。また、噛むことを健康づくりに取り入れた食育介入も実施し、継続して介入効果を検証する。2.高校生を対象とし、断面調査として、「食べる速さ」、「よく噛む習慣」および「歯磨き習慣」などの食育と口腔衛生習慣に関連する質問に対し、「1:良好,2:改善が望ましい,3:要改善」の内容で回答させる保健調査を実施する。その結果と定期的に高校で実施されている身体測定(BMI)および歯科健康診断結果の集計・分析を行い、口腔保健と他の生活習慣との関係性を明らかにする。引き続き、高校生男子を対象とし、1年次から3年次のBMIの変化に伴い歯肉の状態や他の生活習慣が変化するのか追跡調査を行う。調査結果を分析することで、肥満の改善に寄与する習慣を明らかにする。学校歯科保健従来予定していた高等学校での「学校歯科保健ICTシステム」の活用が遅延しており、システム運営費の経費が十分に執行できなかった。また、小学校における本研究の結果を学会雑誌に投稿し受理されたが、採択が遅れて投稿料及び別冊代金の支払いが遅延したことも理由として挙げられる。さらに、高校でのアンケート調査の集計・分析の実施が遅れており、データ入力を依頼していた研究補助者の雇用ができなかった。3月に納品となり、支払いが完了していないため。高等学校において上記のシステムを活用し、経費を執行する。また、遅延しているデータ集計・分析を進めるために研究補助者を雇用する予定である4月に支払いが完了する予定である。
同種神経移植の実験的研究

ラットを使った同種神経移植において血管柄付き神経移植群と遊離神経移植群の神経再生をCAT活性値、病理組織学的検査、筋電図で評価した。免疫抑制剤投与期間を制限して神経再生後に投与を中止して良好な神経再生の維持が可能であるかを調べた。ラットはFisher系とBrown-Norway系の主要組織適合抗原不適合間において同種移植を施行。免疫抑制剤としてFK506を使用した。モデルはFK506非投与群、2、4、6、8週投与群を設定し16週目に標本を採取した。また再生神経が成熟して神経筋接合部に到達した後の薬剤中止効果をみるために12種投与後して中止直後、中止後4週目、中止後8週目調査群を追加した。検索法は移植神経中央部より採取した神経片をH-E染色、Luxol Fast Blue染色Glial Fibrillary Acid Protein染色を施し、拒絶反応、軸索、髄鞘、シュワン細胞の状態を観察した。また移植神経片遠位吻合部の5mm末梢より神経片を採取してCAT活性値を測定した。結果は移植神経片を再生軸索の通過が完了する6週以前に免疫抑制剤を中止した群は良好な神経再生を獲得できなかった。しかし軸索再生が完了する8周以降までFK506を投与した群は最終的に良好な再生を維持した。免疫抑制剤中止後の効果としてドナー由来の組織である軸索は薬剤中止後も拒絶反応は起こらなかった。レシピエント由来のシュワン細胞、髄鞘には薬剤中止後4周目に一旦拒絶反応が生じたが、その後4週で再び回復した。同種神経移植において免疫抑制剤の投与期間を限定することが可能であった。全ての再生軸索が移植神経片を通過するまで投与する必要があった。CAT活性値は今回の実験のように一度に大量の検体を評価する時に非常に有効な検査法であった。本年度はFischer系ラットの同系間T遊離神経移植と血管柄付神経移植の軸索再生速度の違いを比較した。判定はCAT活性(コリンアセチルトランスフェラーゼ活性)、神経断面の光顕的検索、脱神経、再生神経による支配筋肉湿重量の相違でみる事にした。又電気生理学的検索としてM波の導出を追加した。実験は遊離神経移植群はFischer系の7Wラットの坐骨神経に1cmの欠損をつくり、そこに他のFischer系7Wラットの坐骨神経1.2cmを授取し、10.0ナイロン系で縫合、移植した。血管柄付移植群は坐骨神経の栄養血管である後大腿動静脈をつけて、大腿動静脈を柄とし、ドナーの大腿動静脈と吻合、神経の処理は遊離神経移植群と同様とした。血管柄付植群に関してはその血行動態をマイクロアンギオグラフィーで確認した。基礎的実験として正常のFischer系7Wラットの坐骨神経の神経伝導速度CAT活性、腓腹筋の湿重量を計測した。神経伝導速度は平均41mm/sec、CAT活性は6500、腓腹筋の湿重量は1.43gであった。その他の結果については、現在統計学的処理中である。Fishcer系7週ラット坐骨神経の遊離神経移植と血管柄付神経移植における神経再生速度の違いをみるためにCAT活性、腓腹筋湿重量の変化、電気生理学的検索、病理組織を比較した。移植神経の長さ(15mm)と神経軸索再生速度より推察し両群とも神経再生していないと思われる2週目ではCAT活性は低値であった。

しかし4週目に関しては血管柄付神経移植群(VNG群:平均6820CPM)は遊離神経移植群(FNG群:平均2750CPM)に比べて有意に高かった。(正常ラットの坐骨神経CAT活性は平均9860CPM)6週目以降は両群ともほぼ同値であった。電気生理学的検索に関しては坐骨神経で刺激して腓腹筋でM波を導出した。2週目においては両群ともM波は導出されなかったが4週目ではVNG群は導出されFNG群は導出されなかった。6週目以降は両群とも導出可能となったこのことより再生軸索が移植神経片を通過すると思われる4週目においてはCAT活性上は血管柄付神経移植群の方が優位であるという結論を得た。同種間移植での遊離神経移植と血管柄付神経移植において免疫抑制剤の使用、未使用群の間でその神経再生の違いを検索する。主要組織適合抗原の異なる成熟雄ACIラットをrecipientとし、成熟雄Lewisラットをdonorとする。前年度自家移植実験群と同様にACIラット(recipient)の坐骨神経を展開し15mmを採取。Lewisラット(donor)に10mmの欠損を作りそこに移植する。遊離神経移植モデル群と大腿動静脈をつけた血管柄付神経移植モデル群を作る。免疫抑制剤としてFK506を使用し、投与群(A群)非投与群(B群)、さらにコントロール群として自家移植群(C群)を作成。A群においては投与量0.5mg,1mg,5mg/kg/dayの3群に分ける。2週、4週、8週、12週後に屠殺20mm末梢の坐骨神経を採取、それぞれのコリンアセチル基転移酵素活性(CAT活性)の測定、組織学的検索にて神経の再生状態を確認する。その結果にてFK506の最適使用量を決定する。さらに最適投与期間を決定するために免疫抑制剤を2週間、4週間、12週間投与した群を作成し、16週後に屠殺後移植した部位より末梢の坐骨神経を採取し、CAT活性の測定および病理組織学的検索を行い神経の再生状態を検討する。この結果を前年度のデータと比較し、神経再生後に免疫抑制剤の投与を中止した後の神経の状態を検討する。<結果>同種移植において血管柄付に神経移植群と遊離神経移植群の神経再生をCAT活性値によって評価した。結果は免疫抑制剤を中止した後も軸索は保たれ良好な再生を維持することができた。シュワン細胞と髄鞘には投与中止後に一時的に拒絶反応が起きたが,致命的なものではなく回復傾向があった。免疫抑制剤の投与を短期間に限定した場合、血管柄付き神経移植の方が遊離神経移植より有利であった。薬剤の投与期間は全ての再生軸索が移植神経片を通過するまで続けることが適当であった。CAT活性値測定は簡便な方法であり神経再生の評価に有用であった。
緑内障でみられた自己免疫機序による網膜神経節細胞死の分子機構の解明

目的:原発開放隅角緑内障(POAG)および正常眼圧緑内障(NTG)における血清網膜自己抗体と病態との係わりについて検討した。また、自己抗体の網膜への影響について、ラット網膜を用いて、組織学的および電気生理学的に検討した。対象と方法:当科緑内障外来通院中のPOAG56例、NTG23例が対象である。血清中自己抗体の検出にはウエスタンブロット法を用いた。結果:網膜神経節細胞に特異的な50kDa抗原に対する自己抗体がPOAGおよびNTGの約20%に認められた。免疫組織化学で、これらの患者血清は網膜神経節細胞を特異的に認識した。またPOAGでは、自己抗体を有する患者の最高眼圧は、有しない患者のそれに比べて有意に低かった。しかし、両群において視野障害の分布に、差は認められなかった。次に、蛋白質化学的手法により網膜50kDa抗原の同定を行い、50kDa抗原はneuron specific enolase(NSE)であることが判明した。患者IgGまたは抗NSE抗体をラットに投与したところ、網膜神経節細胞のアポトーシスおよび網膜電位図においてb波の低下が認められた。考按:網膜神経節細胞に特異的な50kDa抗原に対する自己抗体がPOAGおよびNTGの約20%に認められ、自己抗体の存在するPOAGでは低い眼圧経過でも視野障害が進行する傾向があった。緑内障患者にみられた網膜50kDa抗原はNSEであり、これに対する自己抗体が網膜神経節細胞のアポトーシスを誘導することが示唆された。結論:NSEに対する自己抗体が、POAGやNTGの分子病態(網膜神経節細胞のアポトーシスに関係している可能性が示唆された。
圧縮文書データに対する高信頼化技法

本研究では文書データの圧縮に利用される無歪データ圧縮において、圧縮データに生じた誤りによる影響から伸長後のデータを保護し高信頼化する手法を提案した。具体的手法は下記のとおりである。1.圧縮データの後方からも逐次伸長可能なHuffman符号を利用した誤り回復手法を提案した。生じた誤りまでの前方と後方からの伸長結果に生じる重複を利用して誤りの位置を特定し、誤りを除去することで誤り回復を行う。2.算術符号の出力を固定長のブロックに分割し、伸長の過程で用いる変数を伸長器の内部状態ととらえて各ブロックの先頭に挿入することにより誤り検出および、誤り状態からの回復を行う手法を提案した。検査情報を追加してバースト誤りの生じたブロックの回復が可能となる手法も提案した。3.Ziv-Lempel符号における圧縮データには誤りが生じたときの影響が大きい重要部分があることに着目し、重要部分を他の部分よりも強く誤りから保護するUEP(不均一誤り保護)の考えに基づく手法を提案した。重要部分に何重にも検査情報を付加して誤り訂正能力を強化する入れ子構造を用いた手法、及び圧縮データを重要部分と他の部分に分離して誤り制御符号化する手法を提案した。4.LZ77符号とHuffman符号による2段階圧縮に対する手法に対して、LZSS符号(LZ77の改良版)の出力を要素ごとに別々にHuffman符号化する手法を提案した。ビットの再構成を用いて符号語の開始位置を固定し、Huffman符号の1符号語に生じた誤りが他の符号語に波及することを防止する。5.パターンマッチングを用いた圧縮法の1種である類パターンマッチング法に対して、中間符号語中の重要な部分を誤り制御符号で符号化し、他の部分を誤り回復可能なエントロピー符号で圧縮する手法を提案した。文書データの圧縮に使用されている可逆データ圧縮(伸長の結果が圧縮前のデータと完全に一致する圧縮)として、Huffman符号、算術符号、Ziv-Lempel符号を基本とする符号が最近よく使用されている。これらの符号に関し、具体的に各種文書データを対象に前述の符号を用いて圧縮し、その圧縮データの様々な位置に誤りを生じさせたとき、それを伸長したときの影響を解析した。これは、約10種の様々の内容、スタイルを有する文書データ(10Kバイトから60Kバイト程度の大きさを有する、ソースプログラムデータ、技術論文データ、等)をとりあげ、また単一の誤りとして、1バイト(8ビットの塊り)誤り、バースト(長さ10ビットから40ビットを有する)誤りを文書の最初の位置より最後の位置まで次々に与えていき、その影響を調べるもので、本年度購入した高性能ファイルサーバ装置を使用してデータを採取した。その結果、いずれの符合により圧縮する場合においても、一般に前部におきる誤りであればあるほど伸長後に大きな影響を及ぼすこと、また特に、Ziv-Lempel符号においては、圧縮の形態(一致位置・一致長・次シンボル)をとり圧縮を行っていくため、特に、一致長部分に生じた誤りは顕著な影響を与えることが判明した。次に圧縮後のデータに誤りが生じたとき、これを伸長前、伸長中、伸長後に誤り検出・訂正を行うための誤り制御符号の研究を行った。圧縮データの伝送、記録において生じる誤りとしてランダムビット誤り、バースト誤りを想定し、これに対するランダム2ビット誤りおよびb(2以上の整数)ビットバイト誤り、l(lは2以上の整数)ビットバースト誤り、を訂正または検出できる具体的な誤り制御符号の構成を考案した。前年の種々の文書データに対する評価データをもとに、適用すべき符号の選択を行った。文書圧縮法の基本であるZiu-Lempel符号を対象に圧縮後の情報単位(記号、一致長、一致位置)に対し、それぞれ分解し(記号と一致長)(一致位置)を各単位から集め、特に(記号と一致長)を集めた部分に誤り制御符号(ECC)を適用する手法を考察した。

これは特に一致長部分に誤りが生ずると伸長後に顕著な誤りの影響が生ずること、また圧縮後のデータの前部に生じた誤りほど後に大きな影響を与えること、という前手の評価結果にもとづいている。そこで特に(記号と一致長)を集めた部分に対し、均一なバースト誤り訂正符号の適用、および前部と後部に半分に分け、前半部に強いバースト誤り訂正能力、後半部には弱いバースト誤り訂正能力を有する不均一バースト誤り訂正符号の適用が妥当であると判断した。この考の下で、いくつかの文書データに対しこの2種の符号を適用してその効果に関するデータを採取した。その結果、特に後者の不均一バースト誤り訂正符号を適用した場合には平均して誤りが残存する量が約1/20に減少できる良好な結果を得た。さらにZiu-Lempel符号の一種であるLZ-77符号とLESS符号にさらにハフマン符号による圧縮を行う。2段階圧縮法に対しても、同様の考えで符号の適用を行い、評価を行った。特にハフマン符号においては統計情報を有するヘッダ部に対しては2重化とCRCチェックを併用した。また関連する誤り制御符号の設計を行い、研究後、論文誌に発表を行った。本年度は以下に示す3種類の手法の開発と研究を行った。第1の手法はHuffman符号に対するものである。双方向伸長可能、すなわちデータの最後尾(後方)から圧縮データを読み込んでも逐次的に伸長可能なHuffman符号を利用した誤り回復手法を開発した。双方向伸長可能なHuffman符号では前方から伸長可能な圧縮データと後方から伸長可能な圧縮データをシフトさせて排他的論理和をとって出力データとしているため、シフトの大きさが大きい場合には生じた誤りまでの前方と後方からの伸長結果に重複が生じる。この重複を利用して誤りの位置を特定し、それを除去することで誤り回復を行う。得られた成果をまとめて口頭発表を行った。第2の手法は類パターンマッチングに対するものである。本圧縮法はマッチング方式を改良し、巡回シフトしたものにもマッチング可能にすることにより圧縮効率を高めた手法である。類パターンマッチングではマッチング情報をHuffman符号や算術符号等のエントロピー圧縮法を用いて更に圧縮を行う。類パターンマッチングの中間データ形式を複数の固定長データに分割しそれぞれのデータの重要度を考慮して誤り訂正符号化を行った後に、誤り回復機能を有するエントロピー圧縮を適用することによって高信頼化する手法を開発した。第3の手法はZiv-Lempel符号に対する手法である。同符号の圧縮データ中には誤ると伸長データに大きく影響を及ぼす部分と誤りの影響が比較的少ない部分が存在する。本手法ではこの誤りによる影響が大きい部分を重要な部分と考えこの部分を他よりも強く誤りから保護する符号(不均一誤り保護符号、略してUEP符号)を適用することを提案している。前年度に引き続きシミュレーションによる評価を行い、得られた成果を学術論文にまとめて学会誌に発表した。
PCR法による歯石からのHLADQα型,PM^R型およびSTR型分析について

【試料・方法】試料は歯科治療時に採取した新鮮歯髄76例・新鮮歯石10例,および110年間室内に放置した歯から採取した陣旧歯髄19例である。DNA抽出は歯髄は洗浄・乾燥した後に細切し,また歯石は洗浄・0.5M EDTAで半日脱灰した後,通法に従い行った。PCR増幅は,HLADQα座位ではパーキンエルマ-社のAmplitype^<TM>キットに,またPM^R座位では同社のAmplitype^RPMキットのプロトコールに準じた。DNA型検出はリバース・ドットブロット・ハイブリダゼーション法により行った。【成績・考察】歯髄95例および歯石10例についてHLADQα型およびPM^R型検査を行ったところ,すべての例で型検出は可能であった。HLADQα型の遺伝子型は21タイプのうち11タイプが出現した。1.3-3型が24.2%と最も多く,ついで3-3型21.1%,1.2-3型18.9%および3-4型13.7%の順であった。遺伝子の出現頻度は3が52.6%と最も多く,ついで1.3が16.8%,1.2が13.7%,4が12.1%および1.1が4.7%の順であり,2の遺伝子は認められなかった。ある集団の中で任意の2人を選んだ時,その2人の型が異なって判定される識別率(power of discrimination, PD)を算出した結果,0.8302であった。一方,PM^R型検査では,各ローカスの遺伝子数は2ないしは3個であるために,各ローカスの遺伝子型数による各PDは低いが,PM^R型としてのPDは0.9925であった。HLADQα型およびPM^R型による総合PDは0.9987であり,個人識別能は極めて向上した。以上,各遺伝子座位のallele sizeは小さいことから,低分子化したDNAの型検出には適していると考えられた。STR(short tandem repeat)型分析は,現在,実験継続中である。
肺胞マクロファージを介して起きる粒子状大気汚染物質の静体影響の病態生理学的研究

アスベストの発癌性は動物実験および疫学調査で明かになっているが、in vitro実験で変異原合は殆ど認められない。この事実はアスベストの生体影響が生体内での反応を介して起きることを示唆するが、我々はこの反応の相手をマクロファージ(Mφ)と考え、アスベスト粒子(クリソタイル)を貪するときに産生する種々の内因性物質の作用と生体影響との関連性を調べるため、次の実験を行った。実験1:in vitroでホスホリパーゼA_2(PLA_2)およびそれ以降のアラキドン酸代謝に関与する酵素(シクロオキシゲナーゼ、リポキシゲナーゼ)の活性阻害剤などをMφに投与し、粒子で刺激したときの活性酸素(O_<2>)産に対するケミカルメディエータの関与を検討した。実験2:in vivoで、O_<2>消去酵素(SOD)またはPLA_2活性阻害剤(pBPB:p-ブロモフェナシルブロミド)をマウスに前投与し、粒子を気管内に投与したときの肺影響に対する効果をみた。実験3:in vivo実験で、粒子投与後、2,4,7日に肺洗浄を行い、BALF中のMφの貪食状態を観察し、粒子形状と貪食状態および肺重量との関係を検討した。その結果、以下のことが判明した。(1)in vitroのO_<2>産生はpBPBの投与、Caキレート剤の添加、およびZnの添加により抑制されるが、アラキドン酸代謝に関与する酵素の活性阻害剤およびPAF阻害剤(U69885)の投与で抑制されない。(2)SODの投与により、粒子投与5時間後の肺重量の増加および肺毛細血管透過性の亢進は一部抑制されるが、pBPBの投与の効果はない。(3)肺胞Mφ完全に貪食されない位、粒子の粒径が大きいと、in vivoの肺影響は強くなる。逆に、Mφにファゴゾームが形成される位小さい場合は、影響は殆どない。
特定高齢者の生活機能・身体機能・生活の質低下に及ぼす腎機能の影響に関する介入研究

腎機能低下者はeGFR<60.0 ml/min/1.73m2は24.3%、25(OH)D<75 nmol/Lは86.4%であった。歩行能力・筋力改善に、腎機能(eGFR)、VD製剤服用有無、25(OH)D濃度が関係していた。筋力維持には歩行能力維持より25(OH)D濃度が高い方が望ましく、できれば腎機能を考慮し67.5nmol/L以上維持することが要介護化予防可能である。特定高齢者の特徴として、転倒・ふらつきが多く、食品摂取の偏り・「閉じこもり」・日照不足によるビタミンD不足者が多い。ビタミンD不足とバランス能力・転倒・骨折と関連があると報告されている。慢性腎臓病(CKD)が増加しているが、腎機能低下と身体機能低下との関連については不明である。そこで、平成22年度の目標である(1)特定高齢者を対象にeGFRから求めた腎機能レベルの分布状況の把握。(2)腎機能低下と血清25(OH)D_3・1,25(OH)_2D_3濃度との関連を検証した結果、全解析対象者185名の平均年齢76.4±5.5(65-90)歳、男性23.8%、脳血管疾患の既往有23.1%、高血圧50.3%、心疾患8.1%、過去1年に1回以上の転倒歴有54.6%であった。開始時eGFRを10ml/min間隔に分類し、その分布は、eGFR<30ml/min:0名、30ml/min≦eGFR<40ml/min:1.6%、40ml/min≦eGFR<50ml/min:5.4%、であった。特定高齢者のeGFR<60ml/minの腎機能低下者は少ないものの、約24%おり、特定高齢者の腎機能低下も考慮する必要があることが示唆された。さらに、eGFR<50ml/minが13名と少ないため、eGFR<50ml/minをまとめ6群に分割し(以下、eGFR<50ml/min:3G90≦eGFRml/min:8Gとする)、対象者の特性・身体機能を6群間で比較した。6群間で年齢に有意差が見られ、4Gは6G・7Gより有意に高齢であった。自己申告による身体状況は6群間で有意差はみられなかった。eGFRレベルによる6群間で教室開始前の血清iPTH濃度を比較した場合、3Gの腎機能の低いGは、他の群と比較し有意に高い値であった。また、8Gの腎機能が正常Gは1,25(OH)_2D_3濃度はその他の群と比較し有意に高い値を示していたが、25(OH)D_3濃度はeGFRのレベルによる差はみられなかった。現在、さらに対象者を増やし縦断的研究を実施している。平成23年度は、これまで蓄積したデータにさらに対象者を増やし以下の点を検証した。特定高齢者の運動教室参加後の体力改善に、ビタミンD(以下,VD)濃度、VD製剤補充、腎機能がどのように影響しているか検討した。介護予防運動教室に3ヵ月間参加した茨城県Y町とS市(いずれも北緯36度)に在住の65歳以上の特定高齢者で初回と3ヶ月後のデータがそろっている177名(平均年齢76.4±5.5歳)を対象とした縦断研究を実施した。質問紙による面接調査、血液検査(血清intact parathyroid hormone(iPTH),25-hydroxyvitamin D(25(OH)D),1,25-dihydroxyvitamin D(1,25(OH)2D)、クレアチニン、カルシウムなど)を実施した。アルファカルシドール1μg/日を3ヵ月間希望者に投与し、80%以上服用者をVD群とした。体力測定項目は移動能力、バランス能力、筋力である。以上のことより、特定高齢者が、自立した生活を継続するためにも腎機能を管理し、体力レベルに応じた25(OH)D濃度を適正に維持し、可能であれば67.5nmol/L以上維持することが介護予防に重要である事が示唆された。ビタミンD濃度と教室参加終了1年後の体力との関連について検討した。茨城県Y町の特定高齢者を対象に運動教室開始時(pre)・終了時(post)・1年後(1Y)に質問紙調査・採血・体力測定を実施した。Pre・post・1Yのデータが揃っている者を解析対象(50名)とした。Pre25(OH)Dを4分位で3群(45nmol/L未満、4567.5nmol/L、67.5nmol/L以上)に分類し体力変化を比較した。繰返しのある二元配置分散分析を施し、腎機能をeGFR60ml/min/1,73m2未満(腎機能低下有群)と以上(腎機能低下無群)に分け、年齢、性で調整した。

解析対象者の平均年齢77歳で3群間に有意差は無かった。Timed up & go(TUG)とステップテストは交互作用が有り(P<0.001、P=0.023)、25(OH)Dレベルで体力変化パターンが異なっていた。次に、各群で体力変化を比較した。45nmol/L<25(OH)D群では握力がpostに比し1Yに有意に悪化していたが、その他の体力項目に変化がなく低いレベルであった。歩行能力を表わすTUGは25(OH)D<45nmol/L群では有意ではないが悪化していたが、25(OH)D≧45nmol/L群ではpostに有意に改善し、1年後にpostより悪化したがpreの状態を維持していた。筋力の指標であるステップテストは、25(OH)D≧65.7nmol/L群では、preの時点ですでに他の群より体力は高かくpostでも維持していたが1年後に悪化していた。25(OH)D<65.7nmol/L群ではpost・1年後でも改善しなく時間がかかっていた。腎機能を考慮しながら、歩行維持には開始時25(OH)D濃度を45nmol/L以上、バランス・筋力維持には65.7nmol/L以上を維持することが重要である。対象者の運動教室参加後の体力の改善に腎機能やビタミンD服用有無の関連を検討したが、1年後のデータがまだ十分な数を得られていない。しかし、確実にデータは収集されている。ただし、3ヵ月後の体力の変化に腎機能やビタミンD濃度又はビタミンD製剤服用有無が関連していたことが示唆されたことから、当初の目的は達成されたと考える。24年度が最終年度であるため、記入しない。介護予防教室1回あたりの参加者が平均15、16名のためデータの蓄積に時間がかかっている。しかし、これまで継続してきた教室参加者も加え1年後を調査し、運動教室の1年後の効果にどのように腎機能やビタミンD製剤服用、ビタミンD濃度が関連しているかを検討していく。
TALENによるノックアウトウサギモデルの作製と動脈硬化研究への応用

TALEN並びにCRISPR-Cas9法を用いて遺伝子欠損ウサギの作製を試みた。脂質代謝において重要なアポリポ蛋白であるアポEの欠損ウサギとアポAIIのノックインウサギの作製に成功した。アポE欠損ウサギでは通常食下でも血漿総コレステロールと中性脂肪値が正常ウサギより上昇しており、軽度な高脂血症を呈している。高コレステロール食を負荷してから2週間、アポE欠損ウサギの血漿脂質値が著しく上昇し、高度な高脂血症を示した。アポE欠損ウサギはヒトのIII型高脂血症モデルになりうることが示唆された。また、野生型ウサギHDLには存在しないアポ蛋白であるアポAIIノックインウサギ作製にも成功した。本年度では、まず、ZFN技術を用いてアポCIII/KOウサギの作製に成功した。15対ウサギアポCIII・ZFN配列を設計し、ウサギの受精卵35個に注入した後、5日目に受精卵への導入率を比較した。その結果、最も効率の良い配列(Set1)は50%(8/16)であったため、マイクロインジェクションに選定した。Set1配列のmRNA((4-10 ng/μl in 1 mMTris-Cl/0.1 mM EDTA)を精製し、145個のウサギの受精卵質へマイクロインジェクションを行い、7羽の雌仮親の子宮への移植を実施した。21羽の子ウサギが得られ、5羽がアポCIII/KOウサギであることがPCRで検出できた。1羽は生後すぐ死亡したが、成功率は23.8%であった。アポCIII遺伝子変異をPCRにより解析したところ、生存している4羽のFounderウサギのアポCIII遺伝子変異(KO)が確認できた。これらの研究成果はJ Vis Exp雑誌で発表した(J Vis Exp. 2013; doi: 10.3791/50957)。また、成功効率が格段に優れた新しい技術としてRNA-guide Cas9systemを利用し、アポ蛋白EやLDL受容体、CD36など4種類のウサギの欠損モデルの作製に成功した( J Mol Cell Biol 2014; doi: 10.1093/jmcb/mjt047)。今後、これらのウサギのgermlineの確認と表現型の解析を推進していきたい。本年度では、すでに作製されたアポEノックアウトウサギの解析を行い、以下の研究成果を得た。ホモ結合体のアポE欠損ウサギでは野生型ウサギと比べ血中の総コレステロールと中性脂肪の増加が見られた。また、血中のアポBが上昇しているが、アポAIの変化はなかった。超遠心法及びHPLC法により、リポタンパクの変化を検討したところ、アポE欠損ウサギには著しくレムナントリポタンパクの増加が認められた。これらのリポタンパクのアポB48の量がアポB100の量を上回っていることが確認できた。さらに、高脂肪食を2週間負荷させたところ、アポE欠損ウサギの総コレステロール値は1200 mg/dlまで上昇しており、高脂肪食に対する敏感性が非常に高いことが判明した。これらの結果から、アポE欠損ウサギは新しい高脂血症モデルになりうると考えられ、今後、動脈硬化研究にも応用できるかを見極めていきたいと考えている。現在はこれらの成果をまとめ、投稿中である。また、アポCIII欠損ウサギの繁殖を開始しており、ホモ結合体アポCIII欠損ウサギの獲得を目指している。TALEN技術より作製されたアポAII遺伝子ノックインウサギはgermlineができず、Cas9技術により新たにアポAIIノックインウサギの作製を試みた。すでに出産した17羽のウサギのうち、2羽がアポAII遺伝子のノックインがPCR法により確認された。今年の夏ころからの繁殖開始が期待される。1.Cas9技術により、新たにアポAIIノックインウサギの作製を試み、4羽のノックインFounderが確立された。現在では、人工授精による繁殖を行い、脂質代謝および動脈硬化の実験に必要な数を増やしている。2.アポEノックアウト(KO)ウサギ(ホモとヘテロ)の血漿脂質(総コレステロール、中性脂肪、HDL-C)やリポ蛋白分画、アポ蛋白の変化を正常野生ウサギと比較した。KOウサギ(特にホモKO)の血漿総コレステロール値と中性脂肪値は正常ウサギより著明に増加していることが認められた。超遠心法並びにHPLC法により、リポ蛋白プロフィルを検討したところ、アポE・KOウサギには著しく血中レムナントリポ蛋白が上昇しており、またレムナントリポ蛋白にはアポB48が多く含まれることが特徴的である。従って、アポEの欠損がレムナントの蓄積に寄与していることが判明した。高コレステロール食を与えた後の血漿脂質の変化を検討したところ、アポE・KOウサギは正常ウサギと比べ、著しく高脂血症を呈しており、コレステロール代謝においてのアポEの役割を示された。12週間のコレステロール食負荷での大動脈硬化病変面積は、KOウサギ群が正常ウサギより大きかった。これらの結果は、平成27年度の日本動脈硬化学会および2016年のAtherosclerosis誌にて発表している。現在はアポE・KOウサギの繁殖を行い、詳細な分子メカニズムの解析を予定している。3.CETP・KOウサギのフェノタイプ解析を行った。通常食事下では、雄CETP・KOウサギの血漿脂質(総コレステロールとHDL-C)は正常雄ウサギと比べて差が認められなかったが、雌CETP・KOウサギの血漿総コレステロール並びにHDL-C値が正常ウサギより1.42倍増加していた。