hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
海産性硝化・脱窒汚泥による海面ゴミ埋め立て地余水の窒素と難分解性物質の同時除去

海産性硝化汚泥の揮発性脂肪族塩素化炭化水素分解能力について検討し、海産性硝化汚泥がクロロホルム(CF)、トリクロロエチレン(TCE)、1,1,2-トリクロロエタン(1,1,2-TCA),1,1,2,2-テトラクロロエタン(PCA)を分解する能力を有するものの、塩素置換度の高い1,1,1-テトラクロロエタン(1,1,1-TCA)、テトラクロロエチレン(PCE)を分解する能力を有していないことを明らかにした。海産性硝化汚泥によるCF、TCE、1,1,2-TCA、PCAの分解には、海産性硝化汚泥にとっての主基質であるアンモニアの存在が必要であった。海産性硝化汚泥により好気条件下で四塩化炭素(CT)が分解されることを認めたが、これは海産性硝化汚泥中に棲息する嫌気性細菌の働きによるものであることを明らかにした。海産性硝化汚泥以外の各種汚泥を用いてCTの微生物分解を検討し、CTが自然界に広く分布する嫌気性細菌によって容易に分解されることを認めた。海産性硝化汚泥による各種揮発性脂肪族塩素化炭化水素の分解をその分解性、硝化阻害効果から、4つのタイプに分類できることを提案した。ポリビニールアルコール(PVA)で固定化した海産性硝化汚泥を用いて、海面ゴミ埋め立て地余水の連続硝化試験を行い、硝化と並行して余水中に含まれるプラスチックの可塑剤であるリン酸トリエステル類がどのように除去されるかを検討した。その結果、溶解性の高いリン酸トリエステルである、リン酸トリス(2-クロロエチル)(TCEP)、リン酸トリス(β-クロロプロピル)(TCPP)が高い効率で除去されることを明らかにした。リン酸トリエステル類のPVAビーズによる吸着を考慮しても、溶解性の高いリン酸トリエステルであるTCEP、TCPPは海産性硝化汚泥によって分解されていることを確認し、余水の硝化処理と並行してリン酸トリエステルの分解除去が可能であることを明らかにした。海面ゴミ埋め立て地余水の窒素除去を可能にするために、海水希釈し尿処理場汚泥から調製した海水馴養硝化汚泥と海水馴養脱窒汚泥が、近年水環境汚染物質として問題となり、海面ゴミ埋め立て地余水中にも当然含まれる揮発性有機塩素化合物(トリクロロエチレン、テトラクロロエチレン、1,1,1-トリクロロエタン、四塩化炭素、クロロホルム等)を分解する能力があるかどうか検討した。その結果、海水馴養脱窒汚泥にはこれら揮発性有機塩素化合物を分解する能力はないが、海水馴養子硝化汚泥には程度の差はあるもののこれら揮発性有機塩素化合物を分解する能力のあることが明らかとなった。中でも、好気条件下では分解がほとんど報告のされていない四塩化炭素が海水馴養硝化汚泥によって分解されるという新しい知見を得た。硝化阻害剤であるnitraprinで四塩化炭素の分解が完全に阻害されることから、四塩化炭素の分解が硝化細菌の働きによることが証明された。四塩化炭素濃度が10mg/L以下であれば、硝化反応が四塩化炭素によって阻害されることなく進行すること、基質としてNH_4-Nが存在しない条件での四塩化炭素分解速度が一番高いことを実験的に明らかにした。

また、四塩化炭素の分解に関与する酵素成分が細胞膜区分に存在すること、四塩化炭素の分解に伴う代謝中間体がクロロホルムで、NH_4-Nを添加することでクロロホルムの更なる分解が進行することを認めた。さらに、固定化した海水馴養硝化汚泥を用いることによって、繰り返して四塩化炭素の分解が可能となることを示した。我々が始めて調製に成功した海水馴養硝化汚泥には、現在土壌、地下水の汚染物質として大きな社会的関心を集め、しかも海面ゴミ埋め立て地余水中にも含有されている揮発性塩素化脂肪族炭化水素を分解する能力のあることが昨年度の研究で明らかにした。本年度は、海面ゴミ埋め立て地余水中に含まれる代表的な難分解性物質であるリン酸トリエスエル類が、固定化した海水馴養硝化汚泥を用いる余水の硝化処理によってどのように分解を受けるか実験的に検討した。固定化海水馴養硝化汚泥による液滞留時間3.8時間の海面ゴミ埋め立て地余水の連続硝化処理において、tributyl phosphate(TBP)が0.34ppbから0.6ppbに82.3%の効率で除去された。同様に、tris(1.3-dichloro-2-propyl)phosphate(TDCPP)は3.35ppbから0.92ppbに、tris(2-butoxyethyl)phosphate(TBXP)は2.32ppbから0.64ppbに、tris(3-cholropropyl)phosphate(TCPP)は20.87ppbから12.08ppbに除去された。固定化担体によるリン酸トリエステル類の吸着除去も考えられることから、海水馴養硝化汚泥を含まないがポリビニルアルコールを冷凍法でゲル化したビーズで同様の余水処理を行い、リン酸トリエステル類の挙動を検討した結果、疎水性のTBPについては、ビーズのみの処理でも除去されることから、その除去に海水馴養硝化汚泥の関与する度合いは低いことが分かった、しかし、TCPPのような親水性のリン酸トリエステルについては、明らかに固定化海水馴養硝化汚泥による硝化処理ととビーズのみによる処理との間で差が見られたことから、固定化海水馴養硝化汚泥がその分解に関与していることが示された。
アクチン・ミオシン複合体の結晶化の試みとX線回析

我々は筋収縮のエネルギー変換を蛋白質の分子構造に立脚して理解するために、最小単位であるアクチンとミオシン頭部の単量体コンプレックスを調製し、その結晶化とX線結晶構造解析ならびに溶液X線散乱による溶液構造解析を併用してエネルギー変換中のアクトミオシン分子の構造解明を目指した。(1)改良されたDHT/MBS-アクチンとミオシン頭部複合体の調製。すでに二価性架橋剤マレイミドベンゼン酸エステル(MBS)で難重合性アクチンとミオシン頭部との架橋複合体を形成させることに成功し、ATPによりアクチン結合部位が頭部上で1-2nm変位することを示唆する電顕観察を昨年度報告した。しかし高蛋白濃度で2:1複合体を形成し重合する欠点があった。アクチンのサブドメインIIのチロシン53をジアゾニウムテトラゾル(DHT)で化学修飾した。その結果、ファロイジンを作用させても全く重合しないアクチンモノマーが調製できた。MBS-アクチンを化学修飾してできたDHT/MBS-アクチンはDHT-アクチンより安定で、ミオシン頭部と1:1に結合した。さらにMBSによりアクチンとミオシン頭部S1との1:1架橋複合体を形成させることに成功した。この架橋複合体モノマーをカラムクロマトグラフィーにより分離精製することにも成功し、X線溶液散乱実験と結晶作成の試料とした。(2)アクチン・ミオシン頭部複合体のX線溶液散乱実験。MBS-アクチンのX線溶液散乱実験はすでに行い、分子の形態を表す慣性半径、分子コード長、分子間相互作用を示す慣性半径の濃度依存性などは未処理のG-アクチンとほぼ同じであった。しかし結晶解析されたアクチン分子とは慣性半径、コード長は少し大きかった。現在この違いが何によるのか水分子の配位、ドメイン間内部運動などモデル計算により検討している。MBS-アクチンまたはDHT/MBS-アクチンとミオシン頭部S1と1:1に混合した試料、DHT/MBS-アクチン・S1架橋複合体モノマーの試料についてX線溶液散乱実験を開始した。予備的実験によると慣性半径はS1単独に比べかなり大きいことがわかった。(3)アクチン・ミオシン頭部複合体の結晶化。DHT/MBS-アクチン・S1架橋複合体モノマーを試料として結晶化を試みている。蒸気拡散法を主に使用しマイクロプレート上でスクリーニングした。以上、現在までアクチン・ミニオン複合体モノマーの結晶化には至っていないが、これらの試料のX線溶液散乱実験はかなり進展した。現在結晶化を精力的に押し進めている。
コラーゲンによる血栓形成におけるトロンボキサンA_2、ADPとのクロストークの意義

コラーゲンによる血小板凝集は、血栓形成に最も重要な止血カスケードの最初に位置するイベントである。コラーゲンは血小板濃染顆粒からADPを放出させ、またアラキドン酸カスケードを活性化してトロンボキサンA2(TXA_2)を産生し、ADPとTXA_2の助けを借りて凝集を強める。昨年度の研究からコラーゲン単独、また放出されたADPあるいはTXA_2単独ではいずれも凝集作用は弱く、3つのアゴニストが協力して凝集を起こしていることが分かった。平成18年度は3者間の協力関係をウシとラットの血小板を用いて検討した。得られた主な知見は以下の通りである。1)TXA_2の活性アナログU46619は単独ではウシ血小板を凝集させなかった。しかし閾値以下のADPが存在すると凝集を起こした。ADPとU46619の協力には両者による血小板内Ca^<2+>([Ca^<2+>]_i)の上昇が相加的に起こることが関係していた。凝集および[Ca^<2+>]_i上昇の協力に関わるADPの受容体はP2Y12受容体よりP2Y1受容体が主であった。2)コラーゲンとADPも協力的に凝集を増強した。この増強にはADPがコラーゲン受容体の一つインテグリンα2β1を活性化する作用が関係していた。3)コラーゲンとU46619(TXA_2)の間には協力関係は認められなかった。4)ADPを含有する濃染顆粒が未発達な遺伝疾患Chediak-Higashi症候群(CHS)のウシやラットの血小板ではコラーゲンによるADP放出が低下しており、そのためADPとTXA_2,ADPとコラーゲンの間のクロストークが成立せず、凝集が抑制され、出血傾向となると考えられた。濃染顆粒からのADP放出に比べてα顆粒からのP-selectin放出はCHSのウシおよびラット(ベージュラット)血小板で正常であった。ヒト血小板では、TxA2とADPの協力関係にはPI3キナーゼ→Aktリン酸化経路を下流に持つP2Y1受容体が関与すると報告されているが、ウシ血小板ではCa^<2+>動員系であるP2Y1受容体が関与しており、動物種によって血小板におけるADPとTXA_2のクロストークは異なっていることが示唆された。血管が破綻して、血小板が内皮下組織にあるコラーゲンに接触すると、コラーゲンは血小板を活性化し、血小板の粘着、凝集を起こして血栓を形成する。コラーゲンは、それ自身の凝集作用だけでなく、血小板内の濃染顆粒からADPを放出し,かつアラキドン酸カスケードを活性化してトロンボキサンA_2(TXA_2)を合成し、ADPとTXA_2がコラーゲンの作用を増強する。

しかしADPやTXA_2がコラーゲンによる凝集においてどういう役割を果たしているかは詳細には検討されていない。そこで遺伝的に濃染顆粒が欠損しているChediak-Higashi症候群(CHS)のウシの血小板と正常なウシの血小板と比較することで内因性ADPやTXA_2の役割を検討した。今年度得られた主な知見は以下の通りである。1.CHS血小板と正常血小板からのコラーゲンによるADP放出を比較するとCHS血小板でのADP放出量は正常血小板の1/20で、濃染顆粒欠損を反映していた。しかし正常血小板でもコラーゲンによって放出されるADP量はそれ単独では凝集を起こす閾値濃度には達しなかった。2.中濃度コラーゲンによるTXA_2産生はCHS血小板でやや抑制されていたが、高濃度コラーゲンによる産生は正常血小板と差がなかった。TXA_2の活性アナログであるU46619は10μMまで投与しても凝集を起こさなかった。3.閾値以下のADPとU46619を同時投与すると約50%の凝集が起こった。これは血小板内Ca^<2+>濃度の相加としても認められた。ADPの受容体にはP2Y1とP2Y12の2つがあるが、この増強に主に関わっているのはP2Y1であることが示唆された。4.コラーゲンモノマーへの血小板の接着はコラーゲン受容体の一つα2β1を介して起こる。凝集閾値以下のADPはこの接着を増強し、ADPがα2β1を活性化することが認められた。以上の結果より、コラーゲンによって放出されるADPは、(1)TXA_2と協力することによって凝集を起こす、(2)α2β1活性化を起こしてコラーゲンと血小板の結合を強める、これらの作用によってコラーゲンの凝集作用を強めていることが示された。ウシ血小板ではこれまでTXA_2は生理的意義がないといわれてきたが、今回の結果はウシ血小板でもTXA_2が重要な役割を有することを示した。コラーゲンやトロンビンなどの活性物質による血小板凝集は血小板内濃染顆粒に含まれるADPに大きく依存する。濃染顆粒がわずかしかなく、ADP放出が少ない遺伝疾患Chediak-Higashi症候群(CHS)のウシおよびラット(ベージュラット)の血小板を用いながら、内因性ADPの役割を解析した。平成18年度は以下のような研究成果を得た。1.コラーゲン刺激によってCHSのウシおよびベージュラットの血小板から放出されるADP量は正常血小板の1/10以下であった。しかし正常血小板においてもコラーゲン刺激によって放出されるADPはそれ単独では凝集を起こす濃度には達しなかった。2.トロンボキサンA2の活性アナログであるU46619はウシ血小板で高濃度を投与しても凝集を起こさなかった。しかし閾値以下のADPが存在すると有意な凝集を起こした。U46619とADPの協力作用にはCa^<2+>動員が相加的に起こることが重要で、それにはADP受容体のうちP2Y12受容体よりもP2Y1受容体の役割がより重要であった。この点はヒト血小板ではP2Y12受容体の方が重要であるという仮説と対照的である。3.ADPはコラーゲンとも協力関係を示した。その協力関係には前年度に明らかにしたコラーゲン受容体の一つα2β1のADPによる活性化が関与していた。4.しかしU46619はコラーゲンとは協力関係を示さなかった。5.ベージュラット血小板でもCHSウシ血小板と同様、コラーゲンによる凝集が著しく抑制されており、ADP放出も少なかった。U46619は単独では作用を示さなかったが、ADPが共存すると凝集を起こした。6.コラーゲンはもう一つの血小板内顆粒であるα顆粒からP-selectinを放出させ、血小板膜への発現を増やすが、P-selectin発現はCHSのウシ血小板およびラット血小板で異常は認められなかった。
放牧家畜生産におけるリモートコントロールシステムの構築

本年度は、これまでに開発したGPSエンジンを搭載したPIC制御によるデータ通信システムを改良し、これまで一方向通信であったものに、双方向通信機能を付加し、動物体の行動を制御するシステムの構築を目指し、システム構築に掛かる設計図(原案)の作成と、これまでの成果の評価および実地試験を中心に行った。現在使用しているPICコントローラのCPUに負荷が掛かり、体内(CPU内蔵)時計が誤差を生む結果となったことから、当初はPICプログラムの変更で対応可能と考え、プログラムの書き替えを行った。しかし、システムは改善できず、時計機能が低下する結果となった。このことから本システムの本システムの抜本的な改良を余儀なくされた。したがって、動物個体管理を行う双方向通信に加え、心拍、体温などの動物側のデータ収集モジュールの増設を念頭においたPIC内蔵のメモリーのみでなく、別回路でのメモリー搭載も視野に入れた開発を進める必要が生じた。このことから、PICバージョンの更新とシステム基盤の改良を行った。現在、本システム設計図を元に新規プロジェクトの創出を検討中である。これまでに開発したシステムを用いて野外フィールドでの試験を実施し、数ヶ月使用など比較的長期での耐久性やデータ受信の安定性など、実用性に向けた試験を実施した。野外フィールドにおける連続使用期間について、消費電力の関係から20日程度が現在のシステムでは目安になることが分かった。また、野外フィールドでの耐久性について、約半年間の装着を行い、回収後に電源電池を交換した場合においても、不具合なく使用が可能であったことから、耐久性においては問題はないものと示唆された。今後は、システムの修正箇所、改良点などリストアップし、次なるプロジェクトの創出に向けた課題を明確にし、速やかに次試験に移行できるよう準備を進めたい。本年度は、これまでに開発した移動量計測システム(A1間欠信号を2方向交点計測法による家畜の移動量計測)を改良し、メイン回路にGPSエンジンを搭載し、さらにマイコン制御とすることで動作を安定化させ、家畜が「今どこで何をしている」のかをリアルタイムで確認することができるシステムの開発を行った。その結果、上記システムは完成しPC上でリアルタイムに対象動物がどこで何をしているかが確認できるようになった。これにより、以後の体温情報の付加について、開発がスムーズとなった。現在、PICをメイン回路としてGPS、顎運動計測センサをモジュールとする構成となっていることから、今後の体温計測センサはモジュールの追加で対応が可能であると考えられる。これによって放牧環境における家畜の行動と草地について詳細に検討が行えるようになった。また開発した機器を用いて放牧地内のウシの行動を計測し、得られたデータから放牧地内の草地利用性について検討を行った。本研究の成果は、学術面においては、放牧環境における家畜の栄養について詳細に検討できると同時に草地利用性についても詳細に検討を行う上で有用な手法である。これによって、家畜の省力的管理法に関する検討がスムーズに行えるようになった。特に、これまでの手法と比較し労力の大幅な削減が可能となると同時により正確なデータが得られるようになったことで、今後の放牧などの環境下における研究手法の一つとなる可能性が極めて高い。さらにデータをリアルタイムで計測することが可能となったことで、研究分野のみならず農家レベルでの使用も可能となった。これにより遠隔地から家畜の状態を把握し、家畜の生産を制御することができる。本年度は、これまでに開発したGPSエンジンを搭載したPIC制御によるデータ通信システムを改良し、これまで一方同通信であったものに、双方向通信機能を付加し、動物体の行動を制御するシステムの構築を目指した。これまで、ゲル状パットを用い低周波電流でパルス刺激することで、あたかもヒトがたたいたかのような感覚を動物体に与え行動を制御することを試みた。試験開始時は順調であったが、試験開始から数時間で動物体はその刺激に「馴れ」それによって行動を制御することが不可能となった。さらに、ゲル状パットの耐久性が動物体の行動に影響を与えている可能性が高かったことから、短画鋲パットによる同刺激を与えることで動物体の行動制御を試みた。結果は良好であったものの、短画鋲による動物体へ傷を負わせることもあった。これらのことから、動物体の行動を制御するシステムとして、低周波によるパルス刺激は効果的であったものの、刺激の与え方については今後さらに検討を加える必要がある。また、データ通信システムの双方向通信については、現在使用しているPICのCPUに負荷が掛かり、体内時計が誤差を生む結果となったことから、本システムの抜本的な改良が必要とされる。また、同時にこれらの双方向通信に加え、データ収集モジュールの増設を念頭においたPIC内蔵のメモリーのみでなく、別回路でのメモリー搭載も視野に入れた開発を進める必要がある。これらのことから、次年度では抜本的な改良案の作成とこれまでの成果の公表に努めたい。

したがって、動物個体管理を行う双方向通信に加え、心拍、体温などの動物側のデータ収集モジュールの増設を念頭においたPIC内蔵のメモリーのみでなく、別回路でのメモリー搭載も視野に入れた開発を進める必要が生じた。このことから、PICバージョンの更新とシステム基盤の改良を行った。現在、本システム設計図を元に新規プロジェクトの創出を検討中である。これまでに開発したシステムを用いて野外フィールドでの試験を実施し、数ヶ月使用など比較的長期での耐久性やデータ受信の安定性など、実用性に向けた試験を実施した。野外フィールドにおける連続使用期間について、消費電力の関係から20日程度が現在のシステムでは目安になることが分かった。また、野外フィールドでの耐久性について、約半年間の装着を行い、回収後に電源電池を交換した場合においても、不具合なく使用が可能であったことから、耐久性においては問題はないものと示唆された。今後は、システムの修正箇所、改良点などリストアップし、次なるプロジェクトの創出に向けた課題を明確にし、速やかに次試験に移行できるよう準備を進めたい。
脊椎動物内耳の形態形成機構の解析

ニワトリ胚を用いた解析【FRET】三半規管形成過程にプログラム細胞死がどの程度寄与するかを明らかにするため,in ovoでFRET法を用いたcaspase-3活性化のリアルタイム検出を行うシステムを開発してきた.ドナーとアクセプターはMiCi-mKOの組み合わせが最も有望である.また蛍光実体鏡の代わりに正立顕微鏡で低倍率の対物レンズを使用しタイムラプス撮影を行うべく装置の調整中である.【器官培養】内耳原基(上皮のみ)の器官培養系で半規管形成過程に関わる因子の解析を行った.間充織細胞の増殖や細胞外基質の増加による機械的な圧力を考慮し,ガラスビーズを用いて耳胞に圧力を加えながらの培養を試みたり,間充織から分泌される因子の影響を仮定し,FGFあるいはヒアルロン酸でコートしたガラスビーズを用いてみたが,半規管形成には至らなかった.【Gbx2-Otx2の相互作用と蝸牛神経節形成】転写制御因子の領域形成への関与を知るため,正常内耳では相補的に発現するGbx2とOtx2を異所的に発現させて,その影響を見た.Gbx2を異所的に発現させるとOtx2の発現は抑制され,逆にOtx2を異所的に発現させると,Gbx2の発現が抑制された.さらに,正常胚では耳胞の腹側部にGbx2もOtx2も発現しない部位が存在し,ここではFgf10が発現しているが,Gbx2あるいはOtx2の異所的な発現により,このFgf10の発現が抑制され,その部位から生ずる蝸牛神経節の形成も抑制された.またFgf10を耳胞で異所的に発現させたところ,その外側に異所的に神経節が形成された.ゼブラフィッシュミュータントを用いた解析ゼブラフィッシュの半規管形成過程に異常を生ずるミュータントを一昨年度に4系統分離し,表現型の解析と合わせ,原因遺伝子の同定が進行中である.ニワトリ胚を用いた解析【器官培養】内耳形成の過程を「生」で解析するため,内耳原基の器官培養系の改良を進めてきた.2004年にマウス胚の内耳原基を用いた器官培養法の報告があり,これを応用する事でようやくニワトリ胚内耳の器官培養のめどが立ち,技術的基盤が整った.【FRET】ニワトリ,マウス,人などの半規管は,耳胞の背側の膨らみが扁平化し,その中心に穴が開く事で形成される.この過程にはapoptosisが重要な役割を担っていると考えられている.しかしながら,固定した組織で観察している限り,本当に細胞死が起こった場所で最初に穴が開くのかを確かめられない.この点を明らかにするためFRET(Fluorescence response enaergy transfer)法を用いたcaspase-3活性化のリアルタイム検出を,試みた.しかしながらECFPとVenusとの組み合わせでは蛍光スペクトルの変化が少ないため,画像処理して蛍光強度の比を可視化する必要があり,実体鏡レベルでのタイムラプス観察は困難であった.ゼブラフィッシュミュータントを用いた解析【ミュータント表現型の解析】ゼブラフィッシュの半規管形成は,耳胞内部への上皮の突出に始まる.この過程に異常を生ずるミュータントを昨年度に4系統分離し,解析を進めて来た.その内の一つは,上皮の突出が全く起こらず,半規管が形成されない.他の3系統は耳胞内部への突出形成が異常で,それぞれ表現型が異なるが,いずれも結果として三半規管の形態に異常が生ずる.これらのミュータントの耳胞で発現するマーカー遺伝子に異常が無いか検討する一方,細胞を蛍光ラベルして,個々の細胞の動態を野生型のそれと比較しながら解析し,どのような原因で形態形成の異常が生ずるのかを解析中である.また,原因遺伝子の同定も同時に進行中である.ニワトリ胚を用いた解析【FRET】三半規管形成過程にプログラム細胞死がどの程度寄与するかを明らかにするため,in ovoでFRET法を用いたcaspase-3活性化のリアルタイム検出を行うシステムを開発してきた.ドナーとアクセプターはMiCi-mKOの組み合わせが最も有望である.また蛍光実体鏡の代わりに正立顕微鏡で低倍率の対物レンズを使用しタイムラプス撮影を行うべく装置の調整中である.【器官培養】内耳原基(上皮のみ)の器官培養系で半規管形成過程に関わる因子の解析を行った.間充織細胞の増殖や細胞外基質の増加による機械的な圧力を考慮し,ガラスビーズを用いて耳胞に圧力を加えながらの培養を試みたり,間充織から分泌される因子の影響を仮定し,FGFあるいはヒアルロン酸でコートしたガラスビーズを用いてみたが,半規管形成には至らなかった.【Gbx2-Otx2の相互作用と蝸牛神経節形成】転写制御因子の領域形成への関与を知るため,正常内耳では相補的に発現するGbx2とOtx2を異所的に発現させて,その影響を見た.Gbx2を異所的に発現させるとOtx2の発現は抑制され,逆にOtx2を異所的に発現させると,Gbx2の発現が抑制された.さらに,正常胚では耳胞の腹側部にGbx2もOtx2も発現しない部位が存在し,ここではFgf10が発現しているが,Gbx2あるいはOtx2の異所的な発現により,このFgf10の発現が抑制され,その部位から生ずる蝸牛神経節の形成も抑制された.

またFgf10を耳胞で異所的に発現させたところ,その外側に異所的に神経節が形成された.ゼブラフィッシュミュータントを用いた解析ゼブラフィッシュの半規管形成過程に異常を生ずるミュータントを一昨年度に4系統分離し,表現型の解析と合わせ,原因遺伝子の同定が進行中である.
ヒト胃癌における新規がん抑制遺伝子産物CYR61蛋白発現と浸潤抑制効果の検討

プロテオーム解析により同定した新規ヒト胃癌抑制遺伝子産物候補CYR61の発現細胞の同定、発現低下メカニズムとCYR61の機能解析をおこなった。胃粘膜におけるCYR61発現は、主としてセロトニン産生細胞であり、がんの進展に伴い、エピジェネティックな異常により発現が抑制されることが示された。CYR61は、胃癌細胞株に対し浸潤能抑制性に作用し、同時にMatrilysin/MMP-7発現の低下が観察された。加えて、胃癌組織標本においてMMP-7発現例とCYR61発現例が逆相関していた。以上より、ヒト胃においてCYR61発現はエピジェネティックな異常により低下し、結果としてMMP-7発現誘導により胃癌細胞の浸潤を促進する可能性が示唆された。本研究では、ヒト胃癌切除組織標本14例を用いたプロテオーム解析により、非腫瘍胃粘膜と比較し胃癌組織において発現が低下している蛋白として同定されたCYR61(Nishigaki,Osaki, et. al. Proteomics2005)に着目し、(1)ヒト胃におけるCYR61蛋白発現細胞の同定、(2)ヒト胃癌におけるCYR61発現低下メカニズムの解明、および(3)ヒト胃癌細胞の浸潤能とCYR61発現との関連をin vtiro、in vivoの系で検索した。ヒト胃切除標本127例を用いた免疫組織化学法により、ヒト胃粘膜におけるCYR61蛋白陽性細胞は、内分泌細胞であることが形態的に示唆され、蛍光二重染色法により、CYR61陽性細胞は主としてセロトニン産生細胞と一致することが示された。次に、CYR61発現低下メカニズムについて、ヒト胃癌細胞株8株(CYR61高発現株:MKN-1,-7,-28、低発現株:MKN-45,-74,TMK-1,KATO-III,HSC39)を用いてジェネティックおよびエピジェネティックな観点から検索した。全株ともCYR61コード領域に遺伝子変異はなかった。低発現株にピストン脱アセチル化阻害剤を添加したところ、いずれも株もmRNAレベルでの発現量増加が観察された。かかる所見は、ヒト胃癌細胞におけるCYR61発現低下は、ピストン脱アセチル化によるエピジェネティックな異常により生じていることが示された。しかしながら、一部の細胞株ではヒストン脱アセチル化阻害剤による蛋白レベルでの発現量増加が観察されなかったことから、さらに転写後調節後異常の関与も示唆された。以上の結果より、分泌蛋白であるCYR61は、主としてセロトニン産生細胞から分泌され、パラクラインおよびオートクライン的に作用し、胃上皮細胞の増殖あるいは遊走能を制御していると考えられる。エピジェネティックな異常がきっかけとなり、CYR61発現低下が引き起こされ、胃癌の発生あるいは進展に関与していることが示唆された。さらに、CYR61の機能を解析するためにCYR61発現ベクターの構築にとりかかり、CYR61のN末端にFLAGタグをつけたプラスミドベクターを作製した。今後、本ベクターを利用し、細胞増殖能、遊走能や浸潤能の変化を解析する予定にしている。本研究では、ヒト胃癌切除組織標本14例を用いたプロテオーム解析により、非腫瘍胃粘膜と比較し胃癌組織において発現が低下している蛋白として同定されたCYR61(Nishigaki, Osaki et al.Proteomics 2005)に着目し、(1)ヒト胃におけるCYR61蛋白発現細胞の同定、(2)ヒト胃癌におけるCYR61発現低下メカニズムの解明、および(3)ヒト胃癌細胞の浸潤能とCYR61発現との関連をin vitro、in vivoの系で検索した1(1)および(2)は、平成19年度に既に報告しており、本年度は(3)の検討を行った。FLAGタグを融合させたCYR61発現ベクター(pcDNA3/FLAG-YR61)を構築し、ヒト胎児腎由来細胞株293T細胞に導入し、培養上清中にFLAG-CYR61発現を確認した。このFLAG-CYR61を含む上清とpcDNA3のみ導入した293T由来の上清をそれぞれヒト胃癌細胞株MKN-45に添加し、マトリゲルを用いたインベージョンアッセイをおこなったところ、CYR61蛋白を含む上清の量依存的に浸潤能が抑制された。一方、細胞増殖能には影響しなかった。そこで、胃癌細胞株の浸潤能に関わる因子の代表として知られるマトリックスメタロプロテアーゼ-7(MMP-7)発現を解析したところ、対照群と比較しFLAG-CYR61を含む上清を80%置換した場合、MMP-7蛋白発現量が約20%抑制された。

CYR61発現とMMP-7発現の関連をヒト胃癌組織標本を用い比較検討したところ、CYR61高発現例の多くがMMP-7低発現例であり同時にCYR61低発現例の多くがMMP-7高発現例であり、統計学的に有意に逆相関していた(P<0.001)。加えて、ヒト胃癌細胞株8株(MKN-1-7,-28,-45,-74TMK-1,KATO-III,HSC-39)におけるCYR61およびMMP-7発現をウエスタンブロットで解析したところ、8株中5株でヒト胃癌組織標本と同様に両蛋白発現の逆相関が観察された。以上より、胃癌細胞におけるCYR61発現低下は、MMP-7発現を誘導し、結果として胃癌細胞の浸潤能を促進し、胃癌の進展に関与している可能性が示唆された。
グローバル化時代における生産性向上技術とその移転に関する研究

本研究は、製造業において用いられている管理技術のうち、日本が他国の追随を許さない生産性向上技術に焦点を当ててそれらを分類し、グローバル化時代におけるそれらの有効性ならびに、異なる企業文化を有する国内外の生産現場や開発、物流、間接、営業の各機能への移転のパターン、移転の方法論、運用方法、移転後の問題点、及び結果の評価について実態調査を行い、これらを整理、検討することによって、生産性向上技術に内在する問題点の解消と移転を成功させるための処方箋を提案することを目的として実施された。平成15年度は実態調査に焦点を当て、移転主体である欧米主要先進産業国の企業における生産性向上アプローチ、管理技術の事例、抱えている問題点などを文献調査及び対象企業の協力のもとにインタビュー調査を実施することによって把握した。次いで、日本で開発、育成されてきた生産性向上技術に焦点を当てて、日本企業に対しその内容及び他部門への移転活動を調査した。平成16年度は、引続きこれらの企業を対象とした調査を継続実施して事例情報の充実を図ると共に、国内外の主要企業で用いられている生産性向上技術のフレームワーク、構成要素、適用方法等を比較することによって共通点と相違点、特長と問題点を分析した。また、2004年11月には本研究テーマに関連して、国際会議ICLS-2004を主催し、研究交流を行った。平成17年度は、生産性向上技術の機能強化のための研究に注力し、フォローアップ調査活動を実施することによって、生産性向上技術移転に関する事例情報の一層の高品質化を図った。また、構築した事例データベースに基づいて実施した海外及び国内他分野への移転のパターン分類を介して開発した汎用的生産性向上技術移転スキームの精緻化を行った。さらに協力企業と協働し、提案スキームの導入実験の追実験を行い、その有効性評価を行った。本年度においては第1段階として実態調査に焦点を当て、国内と国際の2つの研究部会を設けて相互補完的、融合的形態により研究の進捗を図った。まず国際部会(主査:片山博)においては、技術移転については海外の実態に学ぶべきことが多い点を踏まえ、欧米の主要先進産業国における管理技術や生産性向上技術の移転事例、そのアプローチ、抱えている問題点などを調査した。また、移転受入れ側である東南アジア、オセアニア、南アメリカなどの主要発展途上国/圏域についても、同様に移転事例や抱えている問題点について実態把握のための調査活動を行った。また、国内部会(主査:平木秀作)においては、日本固有の生産性向上技術に焦点を当て、国内の代表的製造業へのコンタクトを介して製造関連各部門において開発、育成されてきた諸管理技術(在庫管理技術等)を調査、整理した。また、併せて、このような工場の生産性向上技術の他部門への移転活動についても調査を実施した。方法としては、統計データの検索、アンケート調査及び現地におけるインタビューを用い、これによって得たいくつかの移転事例情報を事例データベースの形式に整理した。以上、調査を主とした研究活動を展開したが、これによって得た情報は次年度以降に実施される評価、問題点抽出及び機能強化に関する研究に資する予定である。

本研究は、製造業において用いられている管理技術のうち、日本が他国の追随を許さない生産性向上技術に焦点を当ててそれらを分類し、グローバル化時代におけるそれらの有効性ならびに、異なる企業文化を有する国内外の生産現場や開発、物流、間接、営業の各機能への移転のパターン、移転の方法論、運用方法、移転後の問題点、及び結果の評価について実態調査を行い、これらを整理、検討することによって、生産性向上技術に内在する問題点の解消と移転を成功させるための処方箋を提案することを目的として実施されている。研究初年度の昨年度においては、第1段階として実態調査に焦点を当て、国際と国内の2つの研究部会を設けて調査活動を行った。すなわち前者においては移転主体である欧米主要先進産業国の企業における生産性向上アプローチ、管理技術の事例、抱えている問題点などを文献調査及び対象企業の同意・協力のもとにインタビュー調査を実施することによって把握し、また、同時に東南アジア、中国をはじめとする移転先での生産性向上技術導入事例や抱えている問題点について調査を行った。後者においては日本で開発、育成されてきた生産性向上技術に焦点を当てて、日本企業に対しその内容及び他部門(製品開発部門、物流部門、間接部門、営業部門等)への移転活動を調査した。これらの移転事例情報のいくつかは、事例データベースの形式に整理された。本年度は、(1)引続きこれらの企業を対象とした調査を継続実施して事例情報の一層の充実を図ると共に、調査結果を踏まえて、(2)国内外の主要企業で用いられている生産性向上技術のフレームワーク、構成要素、適用方法等を比較することによって共通点と相違点、特長と問題点を分析した。また、(3)ISOによる国際認証スキーム、各国の認証スキーム及び業界特有の認証スキームとこれらの生産性向上技術との関係を分析し、これらの生産性向上技術的側面を評価すると共に生産性向上技術の拡張の方向性を検討し、(4)生産性向上技術の汎用性強化のために必要とされる要件の整理を行った。これらの知見は、最終年度に実施される生産性向上技術の機能強化のための研究に資する。一方、(5)昨年11月には本研究テーマに関連して、ロジスティクス生産性に関する国際会議ICLS-2004を主催し、研究交流を行った。本研究は、製造業において用いられている管理技術のうち、日本が他国の追随を許さない生産性向上技術に焦点を当ててそれらを分類し、グローバル化時代におけるそれらの有効性ならびに、異なる企業文化を有する国内外の生産現場や開発、物流、間接、営業の各機能への移転のパターン、移転の方法論、運用方法、移転後の問題点、及び結果の評価について実態調査を行い、これらを整理、検討することによって、生産性向上技術に内在する問題点の解消と移転を成功させるための処方箋を提案することを目的として実施された。平成15年度は実態調査に焦点を当て、移転主体である欧米主要先進産業国の企業における生産性向上アプローチ、管理技術の事例、抱えている問題点などを文献調査及び対象企業の協力のもとにインタビュー調査を実施することによって把握した。次いで、日本で開発、育成されてきた生産性向上技術に焦点を当てて、日本企業に対しその内容及び他部門への移転活動を調査した。
筋ミトコンドリアによる無重力ストレス感知機構

前回の公募研究で無重力ストレスは、酸化ストレスを介してTCAサイクルの律速酵素であるアコニターゼを不活化し、代謝リプログラミングを誘導することを発見した。本研究では、この酸化ストレスの起源がオルガネラ相互作用の分子装置MAM (Mitochondria-associated ER membranes)であることを実証し、無重力の感知機構(無重力センサー)の全貌を解明する。2018年度の解析で、以下のことを明らかにした。1)模擬微小重力環境では、MAMを構成する蛋白質の一つであるMitofusin2 (MFN2)量が減少し、MAM構造が破綻した。2)その結果、ミトコンドリアの分裂と酸化ストレスの上昇が誘導された。3)MFN2をノックダウンした筋芽細胞を模擬微小重力環境に供すると、細胞内カルシウム濃度が上昇した。MFN2をノックダウンした結果、MAM構造が壊れやすくなり、小胞体から細胞質へカルシウムがリークしていると考えられた。4)MFN2をノックダウンした筋管細胞は、最大酸素消費量が低下しており、好気的解糖系から嫌気的解糖系へ代謝変化していることがわかった。5)さらに、MFN2ノックダウンは、遅筋タイプのミオシン重鎖の分解を促進した。4)と5)の結果から、MAM構造の破綻は、遅筋の速筋への変化を促進していることが示唆された。6)筋特異的MFN2ノックアウトマウスの作製に成功した。7)宇宙実験を実施し、実際の無重力環境がミトコンドリアの分裂を誘導する動画を世界で始めて撮影することができた。以上のことより、in vitroの実験系においては、筋細胞のMAM構造が、無重力という機械的ストレス感知において重要な働きをしていることと考えられた。in vitroの実験系では、人工的にMFN2を欠失することにより、その下流のシグナル(MAM構造の破綻、カルシウムリーク、酸化ストレスの増大、ミトコンドリア機能異常、筋萎縮)を適確に再現できている。おそらく、MAM構造が無重力ストレスにおいて重要な働きをしているという我々の仮説は正しいのではないか自負している。しかしながら、in vivoでもこのような事象が起こっているのかや、カルシウムシグナルの異常と酸化ストレスのどちらが上流で起こっている事象なのか(カルシウムシグナルが酸化ストレスを誘導しているのか。逆に、酸化ストレスがカルシウムシグナルの異常を起こしているのか。)など、細かなメカニズムはまだ解明できていない。2年目で、以上のことを明らかにしたい。1)無重力センサーの同定某精密機械メーカーと共同で、カルシウムシグナルと酸化ストレスを同時計測できるシステムを開発中である。その機器を用いて、無重力ストレスは、カルシウムシグナルの異常と酸化ストレスのどちらを優先的に誘導しているのかを決定する。その結果により、無重力センサーは、カルシウムチャネル(またはトランスポーター)なのか、NOX/NADPHオキシダーゼ・システムなのかを明らかにする。骨格筋特異的MFN2ノックアウトマウスを作製したので、それらを用いて、in vivoでもMAM構造の破綻が無重力による筋萎縮を誘導するのかを実証する予定である。

2年目で、以上のことを明らかにしたい。1)無重力センサーの同定某精密機械メーカーと共同で、カルシウムシグナルと酸化ストレスを同時計測できるシステムを開発中である。その機器を用いて、無重力ストレスは、カルシウムシグナルの異常と酸化ストレスのどちらを優先的に誘導しているのかを決定する。その結果により、無重力センサーは、カルシウムチャネル(またはトランスポーター)なのか、NOX/NADPHオキシダーゼ・システムなのかを明らかにする。骨格筋特異的MFN2ノックアウトマウスを作製したので、それらを用いて、in vivoでもMAM構造の破綻が無重力による筋萎縮を誘導するのかを実証する予定である。
盲ろう者の触覚による情報獲得・発信のための知覚特性解明と情報支援手法の検討

盲ろう者は通訳者がいないと外部から取得できる情報が突然ゼロとなってしまい、人や障害物に接触する、あるいは、接触されるまでその存在にすら気付くことができない。また、電話、手紙等の情報通信手段や新聞、WWWなどの情報獲得・発信手段も通訳者を介してしか利用することができない。そこで本研究では以下の二点に焦点を絞り、盲ろう者をとりまく統合的情報通信環境の実現を最終目標とした基礎研究を行なった。(1)日常生活の支援研究:盲ろう者に対し、周囲状況(周囲の雰囲気、人の存在、障害物の有無、光など)を触覚で伝えるための認知特性の解明および時計等日常生活で必要不可欠な計器を触覚で読み取る要素技術の検討を行なった。まずはじめに、盲ろうの方々の日常生活におけるニーズを知るため、盲ろう関係者および有識者への面談、文献調査を行ない、また、市販の触覚計器を購入・借用し、操作性調査を行なった。その後、マイクから拾った対話相手の発声を振動として伝達する装置を開発し、その装置を盲ろうの方に付けていただき、対話実験を実施した。通訳者を介した盲ろう者と健常者の対話過程において、盲ろう者の身体的な動き、話者交替、および対話の構造に変化が生じ「振動装置を用いた対話」の学習が行われる可能性が示された。(2)情報通信の支援研究(触覚による情報通信環境と情報獲得・発信環境の実現):盲ろう者が他者(健常者および障害者)と実時間で会話を行なえる情報通信環境およびWWWなどによる情報獲得・情報発信環境の検討を行なった。盲ろう者に対する情報通信支援技術に利用しやすい指点字による通信に着目し、まずはじめに、オフラインの情報通信機器として、指点字WWWブラウザと指点字エディタの開発を行なった。次に、オンラインの情報通信機器として、健常者と盲ろう者が一緒に会議を行なえる指点字会議システムを開発した。その際、発言権により会話の流れを制御することにより、盲ろう者と健常者が平等に発言することが可能となった。健常者による擬似実験および盲ろう者による評価実験を通して、会議がスムーズに進行し、本手法では従来の手法に比べて、盲ろう者が話題から取り残されることがなくなったことを確認した。そこで本研究では以下の二点に焦点を絞り、盲ろう者をとりまく統合的情報通信環境の実現を最終目標とした基礎研究を行なってきた。(1)日常生活の支援研究盲ろう者に対し、周囲状況(周囲の雰囲気、人の存在、障害物の有無、光など)を触覚で伝えるための認知特性の解明および時計等日常生活で必要不可欠な計器を触覚で読み取る要素技術の検討を行なっている。(2)情報通信の支援研究(触覚による情報通信環境と情報獲得・発信環境の実現)盲ろう者が他者(健常者および障害者)と実時間で会話を行なえる情報通信環境およびWWWなどによる情報獲得・情報発信環境の検討を行なっている。

今年度は、(1)に関しては、盲ろうの方々の日常生活におけるニーズを知るため、盲ろう関係者および有識者への面談、文献調査を行ない、また、市販の触覚計器を購入・借用し、操作性調査の準備を進めた。(2)に関しては、情報通信支援技術に利用しやすい指点字による通信に着目し、オフラインの情報通信機器として、指点字WWWブラウザと指点字エディタの開発を行なった。指点字の入出力装置には「ユビツキィ」を用い、評価実験により、その有用性を確認した。盲ろう者は通訳者がいないと外部から取得できる情報が突然ゼロとなってしまい、人や障害物に接触する、あるいは、接触されるまでその存在にすら気付くことができない。また、電話、手紙等の情報通信手段や新聞、WWWなどの情報獲得・発信手段も通訳者を介してしか利用することができない。そこで本研究では以下の二点に焦点を絞り、盲ろう者をとりまく統合的情報通信環境の実現を最終目標とした基礎研究を行なってきた。(1)日常生活の支援研究盲ろう者に対し、周囲状況(周囲の雰囲気、人の存在、障害物の有無、光など)を触覚で伝えるための認知特性の解明および時計等日常生活で必要不可欠な計器を触覚で読み取る要素技術の検討を行なっている。(2)情報通信の支援研究(触覚による情報通信環境と情報獲得・発信環境の実現)盲ろう者が他者(健常者および障害者)と実時間で会話を行なえる情報通信環境およびWWWなどによる情報獲得・情報発信環境の検討を行なっている。今年度は、(1)に関しては、マイクから拾った音を振動に変換する装置を作成し、その装置を盲ろうの方に付けていただき、会話を行ない、その装置の有用性に関する評価実験を行なった。(2)に関しては、情報通信支援技術に利用しやすい指点字による通信に着目し、オンラインの情報通信機器として、指点字会議システムの検討を行なった。これは健常者と盲ろう者が一緒に会議を行なえるシステムであり、評価実験により、その有用性を確認した。(1)日常生活の支援研究(2)情報通信の支援研究(触覚による情報通信環境と情報獲得・発信環境の実現)今年度は、(1)に関しては、マイクから拾った対話相手の発声を振動として伝達する装置を開発し、対話実験を実施した。通訳者を介した盲ろう者と健常者の対話過程において、盲ろう者の身体的な動き、話者交替、および対話の構造に変化が生じ「振動装置を用いた対話」の学習が行われる可能性が示された。また(2)に関しては、発言権を実装した、指点字と文字による会議システムを開発し、擬似実験および盲ろう者による評価実験を通して、盲ろう者と健常者が平等に発言可能であることを確認した。さらに、盲ろう者の豊かな会話の実現を目指して、指点字におけるプロソディを分析し、筋電位測定および認知実験の結果、指動作の時間構造並びに強度において文構造が表現されることを確認した。
インド瑜伽行派の基本典籍『瑜伽師地論』における無常説の解明

インド仏教の中でも瞑想修行の実体験を重視する瑜伽行派の基本典籍である『瑜伽師地論』に着目し、仏教の根本教義である無常について、単なる理論に収まらない彼らの実体験に基づいた無常説を修行道の観点から明らかにすることである。『瑜伽師地論』は瑜伽行派の基本典籍でありながら、内部の複雑な相互引用や教理の発展から新古層に区分される特殊な論書であるため、各章に見られる無常説と比較、分析することで、瑜伽行派の学僧らが実体験した無常性をいかに説明し、いかに受け継いだかを突き止め、『瑜伽師地論』全体の無常説を解明する。
植物の有限成長と無限成長を切り替える分子機構の解析

高等植物の体制構築において、有限成長と無限成長を適切に制御することは重要である。本課題では、これまで示されてきたように、TCP転写因子が葉の形態を制御するだけでなく、有限成長の最終段階である老化に至るまでの過程を包括的に制御することと、その制御下でERF転写抑制因子が老化進行を促進することを明らかにした。特に、ERF転写抑制因子がプロテアソームタンパク質分解系による活性調節を受けることを示すとともに、ERF転写抑制因子の直接的な標的遺伝子を同定し、ERF転写抑制因子による老化進行制御の詳細を明らかにした。高等植物では、メリステムのような無限成長する組織から、葉や花などの有限成長する器官が生じる。これら2種類の成長を制御することが植物の体制維持機構の特色である。本研究では、無限成長から有限成長へ転換する分子機構を明らかし、その転換を遺伝子工学的に制御することを目的にしている。そのために、シロイヌナズナのTCP転写因子遺伝子ファミリーの欠失変異体が葉の縮れ形態とメリステム遺伝子の葉における異所発現誘導を示すことに着目し、TCP転写因子ファミリーの包括的な機能解析、ならびにそれらの下流遺伝子の解析を行ってきた。本年度は、TCP転写因子の下流で機能するERFファミリー転写因子の機能を明らかにした。具体的には、相同な5つのTCP遺伝子が多重に破壊されたtcp変異体が老化遅延すること、ならびに転写抑制活性を示す相同なAtERF4とAtERF8がtcp変異体で遺伝子発現が減少することを明らかにした。さらに、それらERF遺伝子の過剰発現が葉の老化を促進すること、逆に、aterf4 aterf8二重変異体は葉の老化遅延を示すことを明らかにした。AtERF4とAtERF8の下流遺伝子を探索するために、遺伝子発現実験とクロマチン免疫沈降法などを用いて、AtERF4とAtERF8が老化の鍵制御遺伝子であるESP/ESR遺伝子を直接制御することを明らかにした。これらの解析からTCPを起点とし、ERF転写因子を介した葉の老化制御系の存在を明らかにし、葉の有限成長の最終段階において機能する情報伝達系の一端を解明することができた。さらに、本年度は有用植物の成長転換制御の基盤として、タバコ光独立栄養細胞から確立された細胞株の形質転換系構築を目指し、コントロールであるGFPを本細胞株に再現性よく効率的に導入することができ、今後の研究へ展開可能な実験基盤を構築した高等植物の体制構築において、有限成長と無限成長を適切に制御することは重要である。本研究では、高等植物の発生において、無限成長と有限成長を転換する分子メカニズムを明らかにし、この成長転換を遺伝子工学的に制御することを目的にしている。そのために、我々が同定した葉の形態のマスターレギュレーターであるTCP転写因子と、その下流遺伝子の機能を分子レベルで明らかにし、植物組織培養へ応用する基盤を構築する。TCP転写因子の中で、CIN-like TCP遺伝子を欠失する多重変異体の子葉から切片を作製し、そのカルス形成率を指標にして、脱分化能を評価した。その結果、野生型と比較して、低濃度のオーキシン含有培地で、tcp変異体の切片はカルスを形成することが明らかになった。次に、CIN-like TCP転写因子の下流で機能する一群のTCP転写因子の機能解析を行った。これらのTCPの中で、様々な遺伝子の組み合わせで、2重変異体を作製したが、表現型の違いは認められなかった。そのため、機能重複があると推測されるので、過剰発現体やCRES-T法を用いたSRDX体等の形質転換植物を作製した。これらの過剰変異体では、致死的な表現型を示すものがあり、それらの中で、TCP過剰変異体の1つは成熟胚の根が緑色を呈し、通常の胚発生では抑制される色素合成系への関与が示唆された。一方、そのTCPのSRDX体は芽生えで強い異常を示し、根が脱分化し、カルス様の細胞塊や不定芽を形成することがが明らかになった。一方で、CIN-like TCP転写因子の下流で機能する遺伝子の中で、ERFファミリーの転写因子の機能解析を行った。これらのERFを過剰発現した植物の葉では老、有限成長の最終段階である老化が促進されること、これらのERFを欠失した変異体の葉では老化が遅延することが明らかになった。研究の目的の達成度について、おおむね順調に進展している。今年度は、有限成長を示す子葉の分化制御におけるCIN-like TCP転写因子の役割を明らかにすることができた。植物の通常の発生において、有限成長を示す器官から無限成長を示す組織が生じることは稀であるが、脱分化の過程は有限成長から無限成長へ転換される重要な制御である。CIN-likeTCP転写因子は、葉の形態を制御するばかりでなく、成長転換を制御する機能があることが明らかになった。さらに、CIN-like TCP転写因子の下流遺伝子の機能について、重要な予備的な知見を得る事ができた。CIN-likeTCP転写因子は他のTCP転写因子を制御することにより、ファミリー内での機能調節を行っている可能性が示唆された。

また、葉の有限成長における遺伝子制御ネットワークに、ERFタイプ転写因子が関与することも明らかになった。これらの解析から有限成長と無限成長の制御における重要な制御遺伝子を同定することができた。次年度は、CIN-like TCPの下流で機能する転写因子を解析する。これら転写因子の発現解析やマイクロアレイ、ならびに、クロマチン免疫沈降による下流遺伝子の同定を行う。また、変異体や過剰発現植物を用いた解析により、それら転写因子の生物学的な機能を明らかにし、無限成長と有限成長を切りかえる分子機構の基盤を明らかにする。次年度は、有用植物のシュート再生の効率化を目的にして、CIN-like TCP遺伝子、および、CIN-like TCPの下流遺伝子を有用植物に導入する。導入する遺伝子は、過剰発現型、あるいは、ドミナント抑制型(SRDX)の発現コンストラクトを用いる。有用植物として、増殖に光のみを要求にし、スクロースを必要としない選抜細胞である光独立栄養培養細胞を用いる。これらの解析から、植物の成長を制御する遺伝子スイッチを開発できると期待できる。分子生物学実験、および、生化学実験の実施に必要な物品等を購入する。分子生物学実験では、遺伝子発現の検出に用いる試薬類やシーケンシング、核酸抽出に用いるキット類である。生化学実験では、抗体やタンパク質蓄積量を検出する試薬類である。その他に、プラスチック類や植物の栽培に必要な消耗品等を購入する予定である。研究打ち合わせや情報収集のために、国内外への出張を予定する。さらに成果を論文発表するために、英文校正や論文掲載料として、研究費を使用する予定である。