hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
N-イリド及びS-イリドを利用したヘテロ中員環化合物の合成

cis-及びtrans-2-phenyl-1-[(trimethylsilyl) methyl]tetrahydrothiophenium塩の混合物にフッ化セシウムを24時間反応させ,脱シリル化反応によってテトラヒドロチオフェニウムメチリドを発生させその転位生成物を調べた.その結果,cis,transの混合比に関わらず,1,4,5,10a-tetrahydro-3H-2-benzothiocine([2,3]シグマトピー転位体,含硫黄8員環化合物)と4-methylsulfanyl-1-phenyl-1-butene(Hofmann脱離体)が8:2の生成比で得られ,目的とした含硫黄8員環化合物が効率よく得られてきた.しかし,この転位反応に疑問がもたれた.即ち,5員環イリドにおいてtrans体はイリド炭素と2位の置換基であるフェニル基との距離が非常に離れているため,[2,3]シグマトロピー転位は直接起こらず,Hofmann脱離が進行するものと思われ,[2,3]シグマトロピー転位体はcis体のみから得られると考えられていた.ところが,実際はtrans体からも[2,3]シグマトロピー転位体が得られた.この事からtrans体はいったんcis体に異性化した後で[2,3]シグマトロピー転位すると考えた.この異性化はスルフラン中間体を経由し硫黄原子上で起こるか,2位のプロトンの[1,3]転位によりベンジリド中間体を経由し,フェニル基が反転して起こるかのいずれかと考えた.そこで,プロトンの[1,3]転位が起こらないようなイリドを考えた.即ち,cis-及びtrans-2-methyl-2-phenyl-1-[(trimethylsilyl)methyl]tetrahydrothiophenium塩をフッ化セシウムと反応させ,対応するイリドを発生させたところ,cis体からは[2,3]シグマトロピー転位体を,trans体からはHofmann脱離体を選択的に得た.この実験よりtrans体のイリドからcis体のイリドへの異性化は,2位のプロトンの[1,3]転位によりベンジリドを経由し,フェニル基が反転し起こっているものと思われる.さらにこの事を確かめるため,イリド炭素上の水素を重水素でラベルし,転位反応を試みた.その結果,重水素が移動した[2,3]シグマトロピー転位体及びHofmann脱離体が得られてきた.以上の結果より,スルホニウムイリドにおいてはα-プロトンの[1,3]転位が非常に速く起こっていることが明らかになった.1-Methyl-1-(trimethylsi1yl)methyl-2-(2-furyl)piperidinium塩にフッ化セシウムを3時間反応させ,脱シリル化反応によってピペリジニウムメチリドを発生させその転位生成物を調べた。その結果,反応を水でクエンチするとイリドの[2,3]シグマトロピー転位体である(E)-2-methyl-1,3,4,5,6,10a-hexahydro-2H-furo[3,2-c]azonine及び5-(2-furyl)-N-methylpentanamineが生成した。ところがこの反応を強塩基でクエンチしたところ,先に得られた[2,3]シグマトロピー転位体の他(Z)体の[2,3]シグマトロピー転位体も得られてきたが,pentanamineは生成しなかった。これらの結果から,この反応ではイリドは速やかに[2,3]転位を起こし(E)及び(Z)体の[2,3]シグマトロピー転位体を与えるが,(Z)体はプロトンの作用により,容易にpentanamineに分解する事が明らかになった。実際,(E)及び(Z)体の[2,3]シグマトロピー転位体の混合物を,1%塩酸で処理すると,(E)体の[2,3]シグマトロピー転位体は変化しなかったが,(Z)体はpentanamineに分解した。また,フランの3位にピペリジン環が付いたイリドの転位反応においても上記に示した結果と同様の結果が得られた。次に1-Methyl-1-(trimethylsilyl)methyl-2-(2-furyl)pyrrolidinium塩とCsFとの反応を行った。その結果水によるクエンチでは非常に低収率であったため,強塩基でクエンチを行うと(E)及び(Z)体の[2,3]シグマトロピー転位体の他,Stevens転位体である3-(2-furyl)-1-methylpiperidineが得られた。この反応においては,アンモニウム塩のフランとtrimethylsilylmethyl基との間のシス,トランスの立体が反応に影響し,シス体の塩からは,(E)の[2,3]シグマトロピー転位体が得られ,トランス体の塩からは(Z)の[2,3]シグマトロピー転位体とStevens体が得られることが明らかになった。この塩の立体の影響は先のpiperidinium塩の反応では見られなかった。cis-及びtrans-2-phenyl-1-[(trimethylsilyl) methyl]tetrahydrothiophenium塩の混合物にフッ化セシウムを24時間反応させ,脱シリル化反応によってテトラヒドロチオフェニウムメチリドを発生させその転位生成物を調べた.その結果,cis,transの混合比に関わらず,1,4,5,10a-tetrahydro-3H-2-benzothiocine([2,3]

シグマトピー転位体,含硫黄8員環化合物)と4-methylsulfanyl-1-phenyl-1-butene(Hofmann脱離体)が8:2の生成比で得られ,目的とした含硫黄8員環化合物が効率よく得られてきた.しかし,この転位反応に疑問がもたれた.即ち,5員環イリドにおいてtrans体はイリド炭素と2位の置換基であるフェニル基との距離が非常に離れているため,[2,3]シグマトロピー転位は直接起こらず,Hofmann脱離が進行するものと思われ,[2,3]シグマトロピー転位体はcis体のみから得られると考えられていた.ところが,実際はtrans体からも[2,3]シグマトロピー転位体が得られた.この事からtrans体はいったんcis体に異性化した後で[2,3]シグマトロピー転位すると考えた.この異性化はスルフラン中間体を経由し硫黄原子上で起こるか,2位のプロトンの[1,3]転位によりベンジリド中間体を経由し,フェニル基が反転して起こるかのいずれかと考えた.そこで,プロトンの[1,3]転位が起こらないようなイリドを考えた.即ち,cis-及びtrans-2-methyl-2-phenyl-1-[(trimethylsilyl)methyl]tetrahydrothiophenium塩をフッ化セシウムと反応させ,対応するイリドを発生させたところ,cis体からは[2,3]シグマトロピー転位体を,trans体からはHofmann脱離体を選択的に得た.この実験よりtrans体のイリドからcis体のイリドへの異性化は,2位のプロトンの[1,3]転位によりベンジリドを経由し,フェニル基が反転し起こっているものと思われる.さらにこの事を確かめるため,イリド炭素上の水素を重水素でラベルし,転位反応を試みた.その結果,重水素が移動した[2,3]シグマトロピー転位体及びHofmann脱離体が得られてきた.以上の結果より,スルホニウムイリドにおいてはα-プロトンの[1,3]転位が非常に速く起こっていることが明らかになった.
ミトコンドリア抗酸化タンパクのノックアウトがマラリア原虫の生育に及ぼす影響の解析

ミトコンドリアに局在する2-Cys型Prx(TPx-2)の遺伝子をノックアウトした熱帯熱マラリア原虫株(Plasmodium falciparum)を作製した。PfTPx-2遺伝子ノックアウト原虫は、通常培養条件下で、親株(FCR-3株)と同様に増殖した。酸化ストレス負荷時の増殖を調べるためt-BOOHを培養液に添加した試験でも、ノックアウト原虫は同過酸化物に対して親株と同等の感受性を示した。ミトコンドリアの電子伝達系を標的とする抗マラリア薬、アトバコンに対するIC50値をノックアウト原虫と親株の間で比較したところ、両者に差を認めることはできなかった。マラリア原虫のミトコンドリアにおいて機能することが知られているNADH再酸化系末端酸化酵素(AOX)の阻害剤に対する感受性をノックアウト原虫と親株の間で比較したところ、やはり両者に差を認めることができなかった。PfTPx-2遺伝子ノックアウト原虫については、他の酸化ストレス負荷時の増殖阻害、他の抗マラリア薬に対する感受性の比較をおこなうとともに、Prxに最近見出された新たな機能(シャペロン機能や細胞内情報伝達に関連した機能など)に対する表現型についても検討をおこなう予定でいる。次に、in vivo環境において、TPx-2の欠損が原虫生理に与える影響を観察する目的で、TPx-2遺伝子を欠損するローデントマラリア原虫(P.berghei, ANKA strain)の作製を試みた。遺伝子欠損用ベクター(ノックアウトコンストラクト)の作製は、置換型ベクターpMD204(マラリア研究標準試薬機構(MR4)より領布)を用いておこなった。表現型を確認する目的で、P. berghei TPx-2組換え体タンパク質に対する抗血清を作製した。現在PbTPx-2 KO原虫の作製をおこなっている。ノックアウト原虫が作製できたら、その赤血球内発育型での増殖等について観察する予定である。ミトコンドリアに局在する2-Cys型Prx(TPx-2)の遺伝子をノックアウトした熱帯熱マラリア原虫株を作製した。ノックアウトは、ヒトDHFR遺伝子(WR99210耐性)およびヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子(ガンシクロビル感受性)を選択マーカーとする置換型ベクターを用いておこなった。TPx-2 locusとベクター配列との置換は、限界希釈によるクローニング操作の前後に、PCRおよびSouthem blotで確認した。TPx-2の発現(-)はRT-PCR法で確認した。酸化ストレス負荷時の増殖を調べるためt-BOOH(0,100,150および200μM)を培養液に添加した試験でも、ノックアウト原虫は同過酸化物に対して親株と同等の感受性を示した。マラリア原虫のミトコンドリアにおいて機能することが知られているNADH再酸化系末端酸化酵素(AOX)の阻害剤(Salicylhydroxamic acidおよびn-propyl gallate)に対する感受性をノックアウト原虫と親株の間で比較したところ、やはり両者に差を認めることができなかった。現在、他の酸化ストレス負荷時の増殖阻害、他の抗マラリア薬に対する感受性の比較をおこなうとともに、Prxに最近見出された新たな機能(シャペロン機能や細胞内情報伝達に関連した機能など)に対する表現型についても検討をおこなう予定でいる。

昨年度、ミトコンドリアに局在する2-Cys型Prx(TPx-2)を欠損する熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)(TPx-2KO)を作製した。TPx-2KOは、通常のin vitro培養では親株と同様に増殖し、また、過酸化物(t-BOOH)あるいはNADH再酸化系末端酸化酵素(AOX)阻害剤の負荷についても、親株と同様の感受性を示した。そこで今年度は、in vivo環境において、TPx-2の欠損が原虫生理に与える影響を観察する目的で、TPx-2遺伝子を欠損するローデントマラリア原虫(P. berghei, ANKA strain)の作製を試みた。遺伝子欠損用ベクター(ノックアウトコンストラクト)の作製は、pMD204(マラリア研究標準試薬機構;MR4より領布)を用いておこなった。P. bergheiゲノムDNAを鋳型にしてTPx-2遺伝子5'/3'領域を増幅するため、データベース配列を基に制限酵素配列を付加したプライマーセットをデザインした。向プライマーセットで増幅した5'/3'断片をpMD204のdhfr-tsカセット(ピリメタミン耐性遺伝子)の、それぞれ、上流と下流に方向性を保ってクローニングした。次に、P. berghei TPx-2の抗血清を作製した。P. bergheiゲノムDNAからTPx-2翻訳領域をPCRで増幅して、大腸菌用発現プラスミドにクローニングして、GSTタグ付きタンパク質を作製した。発現タンパク質をGSHセルロースカラムで精製して、ウサギに免疫して、抗血清を作製した。現在TPx-2 KO原虫の作製をおこなっている。P. bergheiメロゾイトへの電気穿孔法によるノックアウトコンストラクトの導入後、薬剤マーカー(ピリメタミン)によるスクリーニングをおこない、限界希釈で得られたクローンについて、TPx-2遺伝子座での相同組換えをSouthern blotで、また、TPx-2 nullの表現型をWestern blotで碓認し、KO原虫の赤血球内発育型での増殖等について観察する予定である。
運動ストレスによる細胞性免疫機能調節に関する基礎研究

我々はこれまでの研究で,運動時の視床下部-下垂体-副腎皮質(HPA)系を介する応答による副腎皮質ホルモンの分泌亢進に注目し,副腎皮質ホルモンであるグルココルチコイド(GC)連続投与による細胞性免疫機能(NK活性)の変化を測定した.その結果,GC(0,1mg/kg/day)の5日間連続投与により細胞性免疫機能が亢進することを確認した.そこで本研究では生理学的レベルのGC連続投与による細胞性免疫機能の変動をGCの5日間連続投与後の細胞数及びホルモン・サイトカイン関連の遺伝子発現量の変動を中心に検討を加え,免疫機能亢進に至るまでの主要調節因子を明らかにすることを目的とした.そして本研究で,このGCの連続投与によるNK活性亢進は,basalな状態でのNK細胞活性化因子の発現及び分泌の亢進によって起こっているとの仮説を検証した.7週齢のC57BL/6マウスをGC投与群,対照群の2群に分け,GC投与群にはGC(0.1mg/kg/day)を対照群には同量の生理食塩水を5日間連続で投与した.投与期間終了後,マウス脾臓よりリンパ球を採取し,各実験に供した.その結果,脾臓リンパ球をFACSにより解析したところGCの5日間連続投与群はCD3^+/NK1.1^-T細胞,CD3^-/NK1.1^+ NK細胞,CD3+/NK1.1^+ NKT細胞の割合がそれぞれ対照群と比較して有意に増加していた(p<0.01).この結果は前年度のGC連続投与4日目以降に脾臓NK細胞の割合が増加するという研究結果を支持するものである.また,RT-PCR法を使って脾臓リンパ球におけるGCレセプター,IL-2,IL-2レセプター,IFN-γ,IFN-γレセプターmRNAの発現量は対照群と比較して変動は見られなかった.したがって,これらの結果はGCの5日間の連続投与によるNK細胞活性亢進は脾臓リンパ球中のNK細胞およびNKT細胞の割合の増加によって起こっている可能性を示唆するものである.継続的な運動が生体内の免疫機能調節に及ぼす影響については人,実験動物を対象とした研究により数多く報告されているものの,唯一の統一的見解がナチュラルキラー(NK)活性の亢進であり,そのメカニズムについては未だに不明である.そこで我々は運動時の視床下部-下垂体-副腎皮質(HPA)系を介する応答による副腎皮質ホルモンの分泌亢進に注目し,副腎皮質ホルモンであるグルココルチコイド(GC)連続投与による細胞性免疫機能(NK活性)の変化を測定した.その結果,0.1mg/kg/dayのGCの5日間連続投与により細胞性免疫機能の亢進を確認した.本研究では生理的レベルのGC連続投与による細胞性免疫機能の変動をNK細胞の細胞数および関連サイトカインの遺伝子発現量の変動を中心に検討を加え,免疫機能亢進に至るまでの主要調節因子を明らかにすることを目的とした.その結果,NK細胞(NK1.1^+,CD3^-)の割合は,投与当初は減少するものの投与4日目以降増加し未投与のレベルまで回復するという傾向が観察された.また,関連サイトカインの遺伝子発現量については有意な変動は観察されなかった.したがって,グルココルチコイド連続投与によるNK細胞数の減少は4日目以降軽減されるものの,その原因となるbasalな状態における細胞性免疫調節因子については特定されなかった.我々はこれまでの研究で,運動時の視床下部-下垂体-副腎皮質(HPA)系を介する応答による副腎皮質ホルモンの分泌亢進に注目し,副腎皮質ホルモンであるグルココルチコイド(GC)連続投与による細胞性免疫機能(NK活性)の変化を測定した.その結果,GC(0,1mg/kg/day)の5日間連続投与により細胞性免疫機能が亢進することを確認した.そこで本研究では生理学的レベルのGC連続投与による細胞性免疫機能の変動をGCの5日間連続投与後の細胞数及びホルモン・サイトカイン関連の遺伝子発現量の変動を中心に検討を加え,免疫機能亢進に至るまでの主要調節因子を明らかにすることを目的とした.そして本研究で,このGCの連続投与によるNK活性亢進は,basalな状態でのNK細胞活性化因子の発現及び分泌の亢進によって起こっているとの仮説を検証した.7週齢のC57BL/6マウスをGC投与群,対照群の2群に分け,GC投与群にはGC(0.1mg/kg/day)を対照群には同量の生理食塩水を5日間連続で投与した.投与期間終了後,マウス脾臓よりリンパ球を採取し,各実験に供した.その結果,脾臓リンパ球をFACSにより解析したところGCの5日間連続投与群はCD3^+/NK1.1^-T細胞,CD3^-/NK1.1^+ NK細胞,CD3+/NK1.1^+ NKT細胞の割合がそれぞれ対照群と比較して有意に増加していた(p<0.01).この結果は前年度のGC連続投与4日目以降に脾臓NK細胞の割合が増加するという研究結果を支持するものである.また,RT-PCR法を使って脾臓リンパ球におけるGCレセプター,IL-2,IL-2レセプター,IFN-γ,IFN-γレセプターmRNAの発現量は対照群と比較して変動は見られなかった.

したがって,これらの結果はGCの5日間の連続投与によるNK細胞活性亢進は脾臓リンパ球中のNK細胞およびNKT細胞の割合の増加によって起こっている可能性を示唆するものである.
ボルネオ産霊長類に関する総合的研究

インドネシア国は大小多くの島嶼からなり、なかでもカリマンタン(ボルネオ)島は単独でも日本の本州の3倍の面積を有しており、いわゆるスンダランドの中心をなし、オランウータンを初めとして多くの霊長類を擁している。霊長類研究所のアジア研究グループは1973年よりこの国で調査研究を継続発展させてきた。しかしながらそれらは総てカリマンタン島の外の世界であった。平成8年度調査はいわば、アジアグループにとって残された最後の地域の、予備調査と位置づけ多くの専門分野からの参加を求めた。第一班は竹中そして、毛利、平井、バンバンで構成し、同島の広い地域での試料採取を目的とし、パンカランプン、バリックパパン、バンジャルマシン等の都市及びその近郊で能率を考え、テナガザル、プタオザルのペットからの形態学資料、血液試料の採取を行った。延べ80頭に及ぶそれらの試料については、現在形態学的分析、染色体分析、ミトコンドリアDNAのチトクローム遺伝子の塩基配列を決定中である。第二班の松村は東部カリマンタンにおいて、野生霊長類調査のための良好なフィールドの発見に努めた。結果カニクイザルはどの地域でも村落のそばで比較的たやすく観察が可能であるが、プタオザルはアクセスが困難であること、テングザル、シルバ-ルトンも河川沿いの地域で観察が可能であることを見いだした。第三班の味覚の嗅覚の嗜好性に関する実験心理学的研究班では、マカク種において苦味・渋味への耐性に関して差違のあること、またマカク種において状況に合わせ自発的に道具を使い分けることを発見し、その道具使用に関する実験的分析を行った。第四班の鈴木はオランウータンの社会性に関する継続調査を行った。以上本年度の調査は予備調査の性格をおびているが今後の調査計画について立案中である。平成8年度調査はいわば、アジアグループにとって残された最後の地域の、そして予備調査と位置づけ多くの専門分野からの参加を求めた。第一班は竹中、毛利、平井、バンバンで構成し、同島の広い地域での試料採取を目的とし、パンカランプン、バリックパパン、バンジャルマシン等の都市及びその近郊で能率を考え、テナガザル、プタオザルのペットからの形態学的資料、血液試料の採取を行った。
海馬苔状線維終末に発現するシナプス前カイニン酸型グルタミン酸受容体の機能

海馬CA3野苔状線維シナプスはカイニン酸受容体を高密度に発現している。これまでに、苔状線維の高頻度刺激に応じてシナプス後部のカイニン酸受容体が活性化され緩徐な興奮性シナプス後電位(slow EPSP)の発生に寄与することが示されているが、シナプス前部のカイニン酸受容体の機能については明らかでない。本研究では、カイニン酸受容体活性化がシナプス前性の作用を示す可能性について検討した。マウス海馬スライス標本において苔状線維の電気刺激により生じるフィールド電位変化を細胞外記録法により記録した。低濃度(0.2μM)のカイニン酸投与によりフィールドEPSPは抑制され、このときシナプス前線維集合活動電位(presynaptic volley)は可逆的に増大した。低Ca^<2+>液中で単離して測定したシナプス前線維集合活動電位も同様にカイニン酸により増大し、この作用はカイニン酸受容体脱感作剤SYM2081により抑制された。これらの結果から、苔状線維シナプスにおいてカイニン酸受容体活性化はシナプス前線維の興奮性を亢進する作用を示すと考えられた。海馬CA3野はカイニン酸受容体サブユニットの多くを発現し、カイニン酸投与により過剰な興奮状態である発作波を発生することが知られている。これまでに報告された苔状線維シナプス後部の興奮作用とともに、本研究で明らかにされたシナプス前部のカイニン酸受容体を介した苔状線維入力の興奮性亢進が協同的に作用し、カイニン酸による過興奮状態に寄与する可能性が考えられた。
新しい細胞周期阻害剤レプトマイシンを用いる真核細胞増殖制御遺伝子のクロ-ン化

レプトマイシンB(LMB)は、極めて低濃度で分裂酵母に著しい細胞伸長を誘起する物質として単離されたものであるが、これが正常繊維芽細胞と分裂酵母の細胞周期をともにG1とG2で特異的に停止させる新しい細胞周期阻害剤であることを明らかにした。そこでLMBの作用機構を明らかにするとともに、新たな増殖関連遺伝子のクロ-ン化をめざして、分裂酵母のLMB耐性変異株を多数取得したところ、その中に許容温度でLMB耐性、制限温度ではLMB非存在下で増殖が温度感受性となるLMB耐性温度感受性変異株が2株得られ、それぞれLM101とLM102と命名した。この両株においては胞子解析の結果、LMB耐性と増殖の温度感受性(cdc性)が連鎖していることが判明し、同一遺伝子の変異であることが示唆された。さらに安定2倍体を形成し、優劣検定を行なったところ、LM101ではLMB耐性、cdc性がともに劣性であり、LM102ではLMB耐性が優性、cdc性が劣性であった。LM101から目的の変異遺伝子をクロ-ン化するため、cdc性を相補する野生株の遺伝子をスクリ-ニングすることとし、大腸菌とのシャトルベクタ-pDB248′を用いた遺伝子ライブラリ-からLM101へのショットガンクロ-ニングを行なった。約4万のトランスフォ-マントの中から目的の遺伝子を含む5.2kbの遺伝子断片が得られ、サブクロ-ニングの結果1.0kbに切り縮めることができたので、その塩基配列を決定した。ところが、この配列中には頻繁に終止コドンが現われ、オ-プンリ-ディングフレ-ムをとりうる最長のものでもアミノ酸数40の蛋白質しかコ-ドしていなかった。現在、この遺伝子に相当するmRNAと、その産物の存在の確認を行なうとともに、新たにLMB102由来のLMB耐性遺伝子のクロ-ン化にも着したところである。
哺乳類Rif1タンパクによる複製タイミングドメイン制御機構の解析

Rif1はDNAの複製時期を制御する因子である。染色体構造維持に関与するコヒーシン複合体やラミン等の発現抑制はDNA複製タイミングに影響を与えなかった。Rif1は非相同末端連結に関与することが知られているがRif1 KO B細胞ではクラススイッチ組換え反応に異常を示した。更に、Rif1 KO細胞の転写プロファイルの解析を行い、Rif1が遺伝子クラスターを含む領域の転写活性を包括的に制御している事を見いだした。Rif1は核膜にアンカーすると共に、C端領域を介して多量体を形成している事が示唆された。Rif1はクロマチン構造の制御を介してDNA複製、転写ドメインを協調的に制御しているかもしれない。哺乳類細胞におけるゲノムの複製開始には、時間的、空間的な制御機構が備わっている。Rif1は、染色体の構造維持を介して複製開始のタイミングドメインを制御する因子の1つである。Rif1欠損が与える核内の変動メカニズム、あるいは個体発生や臓器の機能性維持への影響を解析した。条件的にRif1を脳で欠損させたマウスを作製し、ロータロッドテスト、自発的交替行動実験を行い運動機能障害の有無を測定した。結果、野生型マウスとRif1欠損マウスとの有意な差は観察されなかった。次に、血球系(T細胞)におけるRif1の機能解析を行った。T細胞分化の途中であるDN3時期ではT Cell Receptor (TCR)の再編成が行われる。TCR再構成以前にRif1欠損を誘導すると末梢のT細胞数の減少が見られた。しかし、TCR再構成以後に誘導するとこの減少は観察されなかった。またIn-vitro分化誘導実験では、Rif1欠損によりDN3時期の細胞の分化に遅延が認められ、TCRの再編成が野生型と比べて異なる様式で編成が行われていることが分かった。一方、B細胞やマクロファージ、樹状細胞の分化についても解析を行ったが著しい変化が観察されなかった。細胞レベルの解析では、Rif1以外の他の染色体構造の維持に関与すると報告されているコヒーシンやコンデンシン因子、あるいは核骨格の構築するラミンをノックダウンさせ、DNA複製タイミングの変動解析を行っている。この研究で、Rif1依存的、非依存的な複製タイミングの制御領域を明確にすることができると期待している。哺乳類Rif1タンパクはDNA複製の開始時期を制御する因子であり、またDNA損傷時の非相同末端結合の修復にも寄与している。昨年度から継続してRif1タンパクのクロマチン動態における機能解析を行った。核内の染色体構造維持に関与している因子(ラミン、コヒーシン複合体、コンデンシン複合体など)をsiRNA法で発現抑制し、DNA複製タイミングのプロファイル解析を行った。その結果、どの発現抑制細胞も野生型のプロファイルと類似しており、著しいタイミングドメインの変化は観察されなかった。この事は、タイミングドメインの制御は染色体の核内構造だけではない事を示している。造血幹細胞でRif1欠損を誘導するマウスを作製して分化過程あるいは成熟した血球細胞でのRif1の機能解析を行った。Rif1欠損B細胞において、CSR( class switch recombination )に異常を示しIgG1の産生が減少した。この事実は2013年に報告された結果と一致している。更に転写解析から1 Mbに渡る巨大な遺伝子クラスター領域がRif1欠損により活性化されることを見いだした。この領域内のDNAメチル化解析を行ったところ、野生型と比較して大きな変化は無かった。すなわち、DNAのメチル化制御以外のエビジェネティックな変化が転写の活性化を誘導したと考えられる。細胞生物学条件的Rif1ノックアウトマウスについては、当初計画していた脳特異的KOマウス、さらに血球系特異的KOマウスなど種々のマウスを円滑に作製することができた。機能解析において、Rif1脳特異的KOマウスに大きなPhenotypeが観察されなかったのは想定外の結果であった。しかしながら、血球系(T細胞)解析では、Rif1が分化時に重要な役割を担っていることを3種類(Lck Cre, CD4 Cre, ER Cre)の条件的Rif1 KOマウスの作製から明らかすることができた。複製タイミングの解析では、サンプル調整が終了したものについては、共同研究を行っているフロリダ州立大学へ送り解析を進めている。Rif1を欠損による核内配置の変動を3D FISHなどで解析を試みている。通常のFISH解析では良好な条件を得ているため、3D FISHでの固定条件やプローブの浸透性などを検討し、H26年度中に明確な結論を出すことを目指す。Rif1のT細胞の分化への影響については、更に条件的Rif1 KOマウス(Vav Cre)の作製を行っている。

これは造血幹細胞時にRif1を欠損させることができるため、血球細胞全体への影響を見る事ができる。また、In-vitro分化誘導系を用いて、Rif1欠損でT細胞の分化途中段階でのBrdUの取り込み量、細胞周期の変動など詳細な解析を試みる予定である。更に、成熟したRif1欠損T細胞(TCR再構成後に欠損誘導して獲得)のDNA複製タイミングについても現在解析を進めている。我々が以前報告した、HeLa細胞(ヒト子宮頸癌細胞)と同様に著しい複製タイミングの変動が生じているか解析する。Rif1のゲノム結合領域の同定のための次世代シークエンスサーで解析を行う際、当初HeLa細胞を用いる予定であったが、HeLa細胞のKaryotypeが著しく変動していることから、K562細胞に変更することにした。現在、この細胞にRif1に対するshRNAを導入して安定的に発現抑制される細胞株を作製している。K562細胞はENCODEプロジェクトに広く用いられている細胞で、本研究で獲得したデータと他の研究者が行ったデータ(ヒストン修飾など)との比較が容易である。次世代シークエンサーを用いたRif1のゲノム結合領域の解析において細胞をHeLaからK562へ変更し、条件検討を行っている。この実験に用いる抗体や解析など関連研究費は、次年度に持ち越すこととなった。H26年度、K562細胞、Rif発現抑制K562細胞を使用して、Rif1のゲノム結合領域を次世代シークエンサーにて解析し明らかとする。
STMを用いた大気圧・低真空環境下でのナノプロセシング開発

(1)大気圧・低真空環境下でのSTM/AFMプロ-ブ先端形状評価法の開発原子サイズで構造の確定した標準試料のSTM像より逆にプロ-プ先端の構造を確定する大気圧・減圧環境下での新しいナノ構造評価法の提案・開発を試みた。計算より、ステップ構造に対しては、プロ-ブ先端の曲率半径(R)はステップのエッジに、先端の開き角(2θ)はステップ側面に反映されていることが示唆された。Pr-Irプロ-ブを用い、実際のSTM観察を行ない本評価法の有効性を調べた。標準試料としてリソグラフィ-処理により表面に1μm角の溝をつけたSiウエファ-および自然ステップが存在するBi系酸化物高温超伝導体膜を用いた。前者ではθのSTM像への反映は確認されたが、Rの10nmの精度で推定はできなかった。これは、ステップが10nmの精度で切れていないためと考えられる。後者ではRの反映が見出された。(2)AFMナノプロセシングの開発大気圧下AFMナノプロセシング(ナノ加工、ナノ物性評価、ナノ構造評価)への応用を進めている。ナノ加工については、大気中でマイカ上に数十nmの大きさのドットを作製することに成功した。一方、ナノ物性評価については、Au、ダイヤモンド薄膜、マイカなどを対象にして大気中での距離-力特性(フォ-スカ-ブ)測定を行った。今回の実験では、試料の表面状態(平坦さ、水蒸気などの吸着分子など)の厳密な制御を行っていないため、物質間の差以上に、それらの効果による違いが現れた。さらに、CVD法により作瓢したダイヤモンド膜の堆積時間依存性のナノ構造評価を大気中で行った。100nm程度までの構造は比較的簡単に得られたものの、それ以上の高倍率(数十nmの構造)ではプロ-ブの曲率半径数十nmと試料の平坦さ(20nm程度)との相互関係から、像の解釈においては十二分に考慮すべきである。
ラット肝臓に見いだされた新規蛋白質合成阻害因子の構造生物化学的研究

申請者らは、ラット肝臓細胞質画分から過塩素酸によって抽出される新規な蛋白質(過塩素酸可溶性蛋白質:PSP)を発見し、その一次構造とin vitroでの機能を明らかにしてきた。本蛋白質は、136個のアミノ酸から構成されており、分子量14,149 daltonと計算された。またホモロジー検索からPSP遺伝子は大腸菌からヒトに至る広範囲の生物種において高度に保存されており、PSPの細胞内における生理学的重要性が示唆されている。本研究は、PSPによる蛋白質合成阻害の生理的意義を明らかにする目的で、PSPの高次構造を検討することを目的とする。まず初年度はPSPの大腸菌における発現系の開発について検討した。精製組換えPSPの蛋白質合成阻害活性を、ウサギ網状赤血球の無細胞蛋白質合成系を用いて検討した結果、authentic PSPの蛋白質合成阻害活性より低いが、0.1μMのIC50を示した。次年度は、大量に得た精製PSP及び遺伝子組換えPSPを用いて、PSP蛋白質の結晶化を行い立体構造のX線解析を行った。精製PSPにポリエチレングリコールを滴下することによりサイズ0.5 mmサイズの8面体結晶が得られた。これらの結晶は、X線回折において2.4Åの分解能を示し、またESRF Grenobleでのbending magnetbeamlineでは1.8Åの分解能を示した。結晶構造はunit cell parameter a=b=cが2.12Å3/Daを示すP2_13 cubic space groupに属していた。蛋白質の一部に結合させたプラチナの重原子解析によって得られた立体構造は、6個のβシ一ト構造に2個のαヘリックス構造が隣接した構造を示した。構造のホモロジー検索からsignal recognition particle receptor、chorismate mutaseならびにHsp70に相同性があることが示唆された。申請者らは、ラット肝臓細胞質画分から過塩素酸によって抽出される新規な蛋白質(過塩素酸可溶性蛋白質:PSP)を発見し、その一次構造と機能を明らかにしてきた。本蛋白質は、136個のアミノ酸から構成されており、分子量14,149daltonと計算された。本研究ではPSPの高次構造を明らかにすること、またPSPによる蛋白質合成阻害の分子機構ならびに生理学的意義を明らかにすることを目的とする。本年度は、特にPSPの大腸菌における発現系の開発について検討した。PSP cDNAからPCRによってopen reading frameを増幅させた後、pGEX4T-1ベクターに挿入し、PSPをグルタチオントランスフェラーゼ融合蛋白質として発現させる系を開発した。組換え大腸菌を培養した後、遺伝子組換えPSPをグルタチオンのアフィニテイーカラムによって精製した。精製組換えPSPの蛋白質合成阻害活性を、ウサギ網状赤血球の無細胞蛋白質合成系を用いて検討した結果、authentic PSPの蛋白質合成阻害活性より低いが、0.1μMのIC_<50>を示した。

本研究は、PSPによる蛋白質合成阻害の生理的意義を明らかにする目的で、PSPの高次構造を検討することを目的とする。本年度は、大量に得た精製PSP及び遺伝子組換えPSPを用いて、PSP蛋白質の結晶化を行い立体構造のX線解析を行った。精製PSPにポリエチレングリコールを滴下することによりサイズ0.5mmサイズの8面体結晶が得られた。これらの結晶は、X線回折において2.4Åの分解能を示し、またESRF Grenobleでのbending magnetbeamlineでは1.8Åの分解能を示した。結晶構造はunit cell parameter a=b=cが2.12Å3/Daを示すP2_13 cubic space groupに属していた。蛋白質の一部に結合させたプラチナの重原子解析によって得られた立体構造は、6個のβシート構造に2個のαヘリックス構造が隣接した構造を示した。構造のホモロジー検索からsignal recognition particle receptor、chorismate mutaseならびにHsp70に相同性があることが示唆された。
バイオカソード型MFCを利用した新規脱窒プロセスに関する挑戦的研究

有機性廃棄物の処理と電気の生産を同時に行うことのできるシステムとして微生物燃料電池(MFC)を改良し、カソード側でも微生物反応を利用して有害物質を処理するバイオカソード型MFCをを開発することを目標とする。バイオカソード型MFCは電気エネルギーの生産を伴いながら有害物質の除去を行うことができ、持続可能な環境修復技術としての発展が期待されるため、挑戦的研究として取り組む意義は大きい。
温度ジャンプNMRによるヘムタンパク質多元構造のダイナミックス

1。ラジオ波コイルを内側にマイクロ波コイルを外側にもつ設計を基本に、比較的高感度で温度ジャンプ効率のよい、マイクロ波温度ジャンプ用NMRプローブの制作に一応成功した。しかし特にスペクトル分解能、安定性において改良すべき点が残っている。2。ウマメトミオグロビンについて、0。1M酢酸に含む重水溶液中pH5。7、20-30°Cではほぼ100%天然状態を、0°Cでほぼ100%抵温変性状態を実現した。400MH_zプロトンNMRスペクトルは、抵温変性状態が部分的にある種の高次構造をもつ可能性を示唆した。抵温変性状態はにおける高次構造についての詳しいスペクトル解析が進行中である。3。ウマアポミオグロビン重水溶液を対象に、1。で作製した温度ジャンプNMRプローブを用いて、0°C付近から20°C付近まで250msecの間に急激に温度をジャンプさせた。温度ジャンプ直後から数秒間時間を追って信号を採取、3分間の冷却後これを繰り返して信号を積算し、温度ジャンプ後のスペクトル変化を観測した。この結果は、高次構造形成が意外と速く、マイクロ波照射の250ミリ秒の間にほぼ完結していることを示した。抵温変性状態からの温度ジャンプによる構造形成過程を観測したのはこれが初めてであり、抵温変性状態の構造とも関連して、ミオグロビンの高次構造形成過程を考える上で興味ある知見である。1。2。3。
カラマツ根株心腐病の生態学的解析

1.筑波大学川上演習林内27年生カラマツ造林地0.9haの試験地において林床内のカラマツ根株心腐病菌の1種(末同定菌)の捕捉試験によりその分布が判明した。本菌の分布は集団状であったが、一部は散発的であった。また、本菌は土壌深度約20cmまでに大部分が棲息することが確認された。これと平行して同試験地内の全カラマツ生立木901本についてShigometerを用いて腐朽の有無を調査した結果、心材腐朽木は10.8%に達し、腐朽木は主に集団状に分布していることが明らかになり、興味ある点は、腐朽木の試験地内での分布と同林床内の根株心腐病菌の分布と比較的良く一致する場所が多いことである。本試験地には少なくても3種の異なる根株心腐病菌の存在が明らかになっているが、その内1種の林床内分布と腐朽木と関連があることを示したことは、他の腐朽菌の林床内分布状況および腐朽木がどの病原菌に侵されているか調査する必要がある。2.土壊水分およびPHと腐朽木・腐朽菌の関連についても興味ある結果が得られた。平均土壌含水率80%以上、PH4.64.8の土壌に腐朽菌および腐朽木が多い傾向が示された。従来土壌水分と本病発生に関連があると云われて来たが、それを暗示するデ-タが得られた。なお、地形との関係は現在解析中であるが、本研究では排水が良いと考へられる尾根において根株心腐病の発生が多くみられ、単なる地形からの本病発生の推測は困難と云えよう。3.根株心腐病菌の1種カイメンタケを人工的に接種したカラマツ生立木樹幹内の菌類相と自然感染木樹幹内の菌類相を調査したところ、カイメンタケの存在する部位の周辺に常に他の菌類および細菌が存在し、この種類も類似していた。しかし生立木へ接種したカイメンタケの生育は極めて遅く、接種法を改善する必要があろう。本実験により腐朽の樹幹内の進行状態を知る可能性があることが明らかになった。1.カラマツ造林地内に0.9haの試験区を設定し、正確な測量を実施し地形図を作製した。ここに一定間隔にカラマツ抗を413本打ち込み、一定期間後それを引き抜き、カラマツ根株心腐病菌のうち未同定菌Basidiomycete-1を捕捉した。これを分離同定し同菌であることを確認した。この捕捉試験により試験区内での同菌の林床での分布状態が判明した。即ち同菌は試験区全面に分布しているのではなく、県団状に分布しているが、数ケ所では散発的な分布も認められた。これと平行して試験区内44ケ所の土壌水分を1988年6月11月にかけて4回計測した。土壌水分と同菌の分布との関連は土壌水分の高い場所に同菌が分布している傾向が認められた。また同菌の分布と地形との関連は極めて複雑で湿地(低地)でその分布が低いこともあり、より詳細な調査が必要である。

2.5年前にカラマツ生立木に根株心腐病菌3種(カイメンタケ、ハナビラタケ、レンゲタケ)の接種を行ない、これら生立木を供試して接種部位を中心として心材及び辺材から細菌、菌数及び病原菌の分離を行った。結果はカイメンタケでは供試木14本中6本(43%)、ハナビラタケは18本中5本(28%)、レンゲタケは20本中0本から接種した病原菌が分離された。接種が成功した樹幹での病原菌の伸展は平均1.5cmにとどまり、5年経過しても病原菌の生育は遅く、一部供試木では接種部位のみから分離された場合も認められた。病原菌以外の菌類及び細菌が多く分離され、これら微生物と病原菌との樹幹内の関係は今後の課題の一つである。3.約75年カラマツの伐倒にともない樹幹内の腐朽状態及び腐朽菌の分離を行なった。これらのデータを整理し根株の腐朽直径と樹幹上部への腐朽の伸展には正の相関があることが明らかとなった。1.カラマツ造林地0.9haの試験地内の27年生カラマツ生立木901本の位置を測量するとともに、全生立木に対して1989年1112月の間Shigometerを用いて健全木および罹病木の判定を行なった。その結果、901本中97本が根株心腐病に罹病しており、10.8%におよんでいた。これら罹病木の試験地内での分布状況は尾根沿いに比較的集団的であるものと、散発的に分布するものも多少認められた。試験地内42地点の地下15cmの土壌を採取し、その物理性・化学性の調査を行なった。このうち腐朽病と関連すると考へられる要因は土壌含水率およびpHで、その他の物理・化学的性質は直接的に腐朽とは関連が少ないと考へられた。土壌含水率80%以上および土壌pH4.64.8を示した林床土壌に腐朽菌および腐朽木が多く見られた。2.カイメンタケを接種したカラマツ生立木樹幹内の菌類相と同菌に自然感染した生立木樹幹内の菌類相の比較を行なった。接種木樹幹内のカイメンタケの生育は極めて悪く、接種6年経過しているにもかかわらず樹幹内での伸展は接種部位のみで確認され、それ以外への伸展は極めてわずかであった。これは接種方法が悪いのか、本来カラマツ樹幹には病原菌を抑制する微生物等の存在によるのは今後さらに実験を進める必要がある。菌類相に関しては自然感染木と人工接種木で類似点が多く観察されたことは、人工接種により根株心腐病菌のカラマツ樹幹内での侵入後の動向を知ることの可能性が暗示された。長期的な連続観察が必要であろう。
哺乳類のテロメア結合蛋白質間相互作用の構造的基盤とテロメア調節機構

mPot1PBRとmTPPIRDの複合体作成と結晶化を行った。両者とも大量調製の条件は整っていたが、結晶化やその後の重原子誘導体の探索を考えると、一回の収量を改善しなければ後々での困難が予想された。そこで、発現に用いる大腸菌の宿主をいくつか検討し、1番発現量が良いものに宿主を切り替えて、1回の発現と精製で得られるタンパク質の量を改善した。続いて、両者の複合体形成に最:適なモル比を検討するためにm:Pot1PBRを35Sで標識し、これにmTPPIRDの濃度を変化させて加えていって、両者の複合体のシフトバンドが検出されるモル比をゲルシフト法で解析した。ここで得られた複合体を形成するのに適したmPot1PBRとmTPPIRDのモル比で複合体を形成させ、これの結晶化を試みた。両者の複合体の結晶を得るための結晶化条件の最適化に移る。まずは、複合体濃度をIgG濃度換算のBradford法で10mg/mlにして様々なバッファーを試してみた。複合体が沈殿を作ってしまうという問題が生じたのでこれに対する対処法を講じ、沈殿生成避けることができたが、未だ安定して多量の結晶を得られる条件が確定していない。結晶を再現性良く多量に得られる方法を確立することは大切なので、このステップは時間をかけて詰めていくことにした。一応結晶は得られることはあるので、得られた結晶を用いて重原子誘導体の探索も同時に行っている。一方で、MAD法が適応できる結晶が得られることを期待して、セレノメチオニンを含むタンパク質の調製に取り掛かった。普通のタンパク質の発現と同じように、発現条件の最適化を行い、続いて精製条件を最適化にとりかかる。中々、可溶性タンパク質として高い発現量が見込める条件が見つからないので、大腸菌の宿主を毒性タンパク質に強い宿主等に変えてみて今後も発現条件の最適化を進めていく。複合体の結晶構造を得ることができたら、ReverseTwoHyblid法によって、複合体形成に重要と見込まれたアミノ酸と得られた構造を見比べて変異を入れるアミノ酸を決定したい。蛋白質複合体の結晶を得て構造を確定する予定であったが、複合体がかなり不安定なため結晶を得ることが未だできず、構造決定に至っていない。しかし、結晶を得るステップを高収量で確実にしておくことは非常に重要なのでこのステップは時間をかけてでも取り組みたい。蛋白質複合体の安定性が悪いので扱いを考えていかなければならない。また、他の複合体の調製も計画しているのでこちらの扱いも困難が予想される。今回の複合体の結晶構造解析をできるだけ早く行うと共に、複合体の扱いに関しても有効な扱い方の知見を集めて、次の複合体の結晶構造解析を迅速に行えるように準備をし、複合体構造解析を通じて、蛋白質間相互作用の様式を解明し、テロメアの伸長機構の解析を急ぎたい。

また、他の複合体の調製も計画しているのでこちらの扱いも困難が予想される。今回の複合体の結晶構造解析をできるだけ早く行うと共に、複合体の扱いに関しても有効な扱い方の知見を集めて、次の複合体の結晶構造解析を迅速に行えるように準備をし、複合体構造解析を通じて、蛋白質間相互作用の様式を解明し、テロメアの伸長機構の解析を急ぎたい。
動的生産要素需要分析への確率微分方程式の導入の試み

公共的な企業の民営化・規制緩和は世界的な潮流である。あまりに急激な規制緩和もいきすぎであるとの評価を免れない。規制緩和によって公共的な企業の生産性がどのように変化するのかを十分に分析する必要がある。本研究は、現在、規制緩和に直面している被規制産業の生産性の分析をおこなうさいの、動的生産要素需要分析において、オイラー方程式を用いた動学的な費用関数の分析を行った。さらに、そのオイラー方程式の中に確率微分方程式を導入したものである。トランスログ型の生産関数や費用関数を用いた生産性・技術変化・非効率性の推定については、その生産要素需要における動学的な分析は現在、端緒についたところである。本研究はそのうちの、動学方程式であるオイラー方程式に確率微分を導入し、動学的な動きを研究したものである。単一の確率微分方程式の研究は最近、ファイナンスの分野では多いが、費用関数もしくは生産関数の推定の一部に確率微分方程式を導入する試みは、Real Optionの分野においても世界的にまったく実施されていない。このように、これまで研究されていない関数形での分析が本研究の特色と独創的な点である。この結果、従来のオイラー方程式を用いた動学分析に比較して、はるかに詳細な分析を行うことができた。研究発表のいくつかは特に経済学の分野においてよりも、システムサイエンスや確率分析の分野において、注目を集めた。世界的な先駈けになったと考えている。平成16年度は研究の前段階として、規制という制約条件のかかった費用関数および一般化費用関数を用いて、動学的な規制緩和の効果が発見できるかどうかのチェックを行った。このために当初の予定どおり、以下の費用関数システムを推定した。分析の対象は、すでに成熟した産業である日本のガス供給企業9社のデータを用いた。(1)規制のかかったトランスログ型の総費用関数を含んだ方程式群のシステム推定。(2)投入要素価格に制約条件を加えないトランスログ型の一般化費用関数を含んだ方程式群のシステム推定。以上の結果はすでに研究発表し、レフリー付きの雑誌上に公表した(次ページの第11項参照)。次に、確率微分方程式とハミルトン-ヤコビ-ベルマン方程式の研究と、すでに導出の終了した、動学的生産要素需要のトランスログ費用関数(動学的)に含むべき、投資関数に関するオイラー方程式が、間違いがないかどうかの確認を行った。現在は、この方程式と動学的生産要素需要のトランスログ費用関数の、他の方程式との間の制約条件の確認を行っているところである。平成17年度は、(1)確率微分方程式を含むオイラー方程式と、動学的生産要素需要のトランスログ費用関数(動学的)の、他の方程式との間の制約条件の確認を、前年度に引き続いて行った。(2)実際のデータを用いて、『オイラー方程式に確率微分を導入した、動学的生産要素需要のトランスログ費用関数(動学的)の推定』を行った。これは次年度に向けてのパイロット研究とする。(3)今回、得られた成果は平成17年10月に開催された、下記学会において発表した。さらに12月に開催された、下記学会において発表した。平成18年度は、昨年度に引き続き、(1)確率微分方程式を含むオイラー方程式と、動学的生産要素需要のトランスログ費用関数の、他の方程式との間の制約条件を確認し、改善に努めた。(2)次に、わが国のガス供給企業の1981年から1995年までの、実際のデータを用いて、『オイラー方程式に確率微分方程式を導入した、動学的生産要素需要のトランスログ費用関数の推定』を行った。推定し、比較した方程式群は以下の2つである。(1)動学的生産要素需要のトランスログ費用関数を制御するオイラー方程式が、確率微分方程式で表現される場合(確率化するのは資本の割引き率、depreciation rate)。(2)動学的生産要素需要のトランスログ費用関数を制御するオイラー方程式が、通常の微分方程式で表現される場合(資本の割引率を確率化しない場合)。

以上の2ケースについて、トランスログ主方程式、コストシェア方程式、オイラー方程式の3本ないし、4本の方程式群をGMM手法を用いて、システム同時推定した。(3)得られた成果は学術雑誌(査読つき、裏面参照)に発表した。結果の要約は以下である。(1)2つのシステム推定方程式群の推定結果は、F検定、t-検定等では有効であった。(3)資本の割引率のフラクチュエイションの程度(シグマの2乗)は、ファイナンスの計量分析の分野で計測される利子率等のフラクチュエイションの程度に比べて、小さかった。平成19年度は過去3カ年の成果を基礎にして、日本のガス供給企業9社の15カ年のデータを用いて、「ネットワーク効果を含めた、動学的生産要素需要のトランスログ費用関数の推定」を実施した。この研究によって、(1)動学的な制約条件のかかった費用関数における、投資関数の確率的な動きを明らかにした。(2)3本の方程式で構成されるシステム推定における、「オイラー方程式に確率微分を導入した投資関数」の動きを明らかにし、確率微分を導入する場合と導入しない場合における差異を明確にした。(3)規制緩和の結果、効率性がどのように変化したのか、従来の研究以上に現実に接近できた。なお、平成19年度の成果である『ネットワーク効果を含めた、動学的生産要素需要のトランスログ費用関数の推定』は、下記のレフリー付きの雑誌上にアクセプトされた。「地方公営企業の生産関数の推定」地域学会誌(2008予定)。