hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
３次元画像を用いた機能統合型嚥下モデルの構築とその評価・応用

1320列面検出型CT (320-ADCT)使用により、時間分解能が10fr/sec、空間分解能0.5 mmの高精度・高分解能の3次元画像を取得し、この画像をもとに食塊や軟組織をトレースし嚥下シュミレーションモデル(生体モデル)を構築した。2嚥下運動に関わる筋の動態は、嚥下時の舌骨の運動軌跡の計測を基に、筋トルクを算出し、筋張力および筋長の変化を推定することで、嚥下に関与する骨格筋の筋骨格モデルを構築した。3嚥下運動は極めて短時間(約2秒)で終了するため、現在は解剖学的形態やその位置変化情報のみを利用しているが、咽頭圧と筋活動の時空間的変化を同時計測し、時間軸(潜時)の導入にすることで、器官の運動との関係が推測可能となり、脳幹反射モデルと結合できる可能がひらけた。嚥下運動は、末梢器官における複雑な反射の連鎖である(咽頭期と食道期)と同時に、随意運動の側面(口腔期)も持っており、神経系(脳)の機能を備えた、統合型嚥下シュミレーションモデルの構築が必要とされている。嚥下運動に関与する器官の形状ならびにその動きが複雑であることが、嚥下を支配するバイオメカニズムの解明、あるいは診断・治療法の新規開発や治療の予測を行う上で大きな障壁となっている。近年、CTや嚥下造影(VF)の(2次元)画像を基に、生体データを数理モデル化し、3次元嚥下シュミレーションモデルを構築し、コンピュータ・シミュレーションにより評価をおこなう手法が確立された。が、軟組織、とりわけ気道、咽頭・喉頭の細部、や食塊の描出は困難で可視化が未だ充分でない。2嚥下運動に関わる筋の動態は、嚥下時の舌骨の運動軌跡の計測を基に、筋張力および筋長の変化を推定し、嚥下に関与する舌骨上筋群の筋骨格モデルを構築した。体の表面から深い位置に存在する筋(舌骨下筋群)では、表面電極では筋活動の記録が困難であるため、多チャンネルの筋電図計測と解析により、筋活動の推測を試みた。これにより、嚥下時の喉頭蓋の運動軌跡の計測により、舌骨下筋群の筋骨格モデルの構築、評価が可能になると考えられる。3嚥下運動は極めて短時間(約2秒)で終了するため、現在は解剖学的形態やその位置変化情報のを利用している。咽頭圧と筋活動の時空間的変化を同時計測し、時間軸(潜時)の導入により、器官の運動と嚥下圧との関係が推測可能となり、脳幹反射モデル等と結合でした統合型嚥下シュミレーションモデルの構築が可能となると思われる。嚥下を支配するバイオメカニズムの解明、あるいは診断・治療法の新規開発や治療の予測を行うことを目的とし、CTや嚥下造影(VF)の(2次元)画像を基に、生体データを数理モデル化し、3次元嚥下シュミレーションモデルを構築し、コンピュータ・シミュレーションにより評価をおこなうことを継続して試みる。生体モデル、骨格筋モデル、脳幹反射モデルなどのモデルの統合をはかることで機能統合型嚥下シュミレーションモデルを構築する。また、シュミレーションモデルのパラメターの標準化/最適化により、モデルの一般化と妥当性の検証をおこなう。1正常嚥下のバイオメカニクス:嚥下の各々の過程について、1)舌運動のバイオメカニクス研究、2)咽頭壁運動、食道入口部、声門部のバイオメカニクス研究に使用できるモデルの構築、評価。2誤嚥のバイオメカニクス:Parkinson病、筋ジストロフィー患者から、形態およびCT/MRI画像および自発嚥下時の機能データ(嚥下音、筋電図、咽頭圧)、さらには他の脳データfunctional MRI(fMRI)のデータを収集行い、モデルのシュミレーション結果との比較をすすめる。
焼畑の技術と知恵を活かした日本の森づくりに資する実践的地域研究

本研究では、森林の伐採・再生サイクルを有効に活用した循環的農業である焼畑に着目し、短期的には火入れの効果を活かした持続的な食料生産の確立、長期的には荒廃する里山の再生を目的とした。余呉町での焼畑実践から、焼畑の伝統的な技術や知恵が収量の最大化ではなく、環境の不確実性に対するリスクの最小化を目指しながら培われたことが確認された。また、焼畑の赤カブは常畑に比べ品質がよいこと、火入れ直後の播種がカブの発芽を促進すること、焼畑により林相転換が可能なこと等が確認された。これらの調査結果から、焼畑を活かした里山再生手段として、草地伐採型、雑木林伐採型、林相転換型、有用樹伐出型等の農林循環モデルを考案した。1.火入れ前後の土壌特性値の変化と休閑期の植生回復状況余呉町の焼畑では、火入れ直後に表層土の交換性塩類・有効態リン酸の増加と、アンモニウム態窒素の増加が認められた。前者は焼却灰からの養分添加効果、後者は焼土効果による有機態窒素の無機化の結果であると思われる。なお、火入れ時の地表面の温度は、最大270°Cから最低60°Cまで大きなばらつきがあり、これらの養分添加効果や焼土効果も空間的に不均一であった。また、ササ優占地であった土地を焼畑に切り拓いた結果、1年後には先駆性の樹木や木本の萌芽再生個体が優占する林へと遷移しており、焼畑による林相転換の可能性が示唆された。2.日本の焼畑耕作に受け継がれた技術や知恵の体系化余呉町の焼畑で栽培しているカブの生育は、火入れの時期、斜面方位、耕起の有無などの要因に影響を受けていたが、ある年はプラスに働いた要因が別の年には全く意味をなさないこともあり、極端な気象条件下でこそ意味を持つものが多かった。焼畑のように、時間的・空間的に不均一な農業においては、環境の不確実性に対するリスクをいかに最小限に抑えられるかが重要であり、焼畑の技術や知恵が「収量の最大化」ではなく「リスクの最小化」を目指しながら培われてきた結果であることが示唆された。3.土地利用の履歴と焼畑の歴史の再構成過去の空中写真判読により、余呉町の焼畑耕作や休閑林の利用がどのような変遷を経て現在に至ったのかを解析中である。これらは、余呉町の森づくりの将来像を描く上で重要な基礎資料となる。4.東南アジアとの比較研究・相互訪問準備文献調査により、東南アジアの焼畑に関する先行研究事例をとりまとめ、日本の焼畑との共通点、相違点を検討した。また、インドネシアで焼畑を営む人々を余呉町へ招聘するための準備を行った。昨年度に引き続き、今年度も雑木林とススキ草地の2箇所で焼畑を行った。一般には、地上部のバイオマス量が大きい雑木林の方が火入れ後の土壌養分の上昇量も大きいとされるが、ススキ草地を開いた焼畑でも十分な灰の養分添加効果や焼土効果が得られ、両者の間で窒素、リン、カリウムなどの土壌養分の増加量の平均値に有意な差異は認められなかった。また、前者では地点ごとの養分増加量のバラツキが大きかった。雑木林の焼畑では、伐採した木々を均等に伐開地に並べるのが難しく、焼きムラができやすいため、燃え残りも多い。一方、ススキ草地の焼畑では焼きムラができにくく、バイオマスのほとんどは燃焼して灰になる。また、一定以上の温度に達すればそれなりの焼土効果は得られるため、両者の伐採前の地上部バイオマス量の差ほどには、火入れ後の土壌養分の増加量に差がみらなかった。余呉町では、このようなススキ草地を開く焼畑が伝統的に好まれてきたが、火入れによる土壌養分増加量のバラツキが少なく、雑木林を開く焼畑に比べて伐採が容易で労働生産性が高いことが、その理由であると思われる。また、2010年にササ優占地を伐採して焼畑を行った休閑3年目の地点では、ヌルデ、タラノキなどの先駆性の樹木や、タニウツキ、ウツギなどの萌芽再生個体が優占する林へと遷移していたが、後継樹となりうる高木性の木本の定着は少なく、早期の森林再生を促すには後継樹の植栽も視野に入れる必要があることが分かった。また、日本の赤カブは焼畑でなければ本来の色、風味、食感などがでないとされ、焼畑での栽培を続ける農家が東北・北陸の日本海側を中心に残っている。山形県温海地区や新潟県山北地区での事例調査から、カブのブランド化や火入れ・収穫・赤カブ漬けの体験会などにより、余呉町に伝わる焼畑の技術や知恵を活かした中山間地域の食糧生産・森林再生・地域活性化を実現できる可能性が示唆された。今年度は、タニウツギ・エゴノキなどが優占する雑木林とススキ草地の2箇所に火入れをして焼畑を行った。草地では火がしっかりと入ったが、雑木林ではやや燃え方が弱かった。これは、伐採から火入れまでの期間(18日間)が長すぎたため、伐倒木の枝から葉が落ちきってしまったのが原因であった。火入れはやや弱かったものの、火入れ後には焼却灰からの養分添加効果に伴う交換性塩類・有効態リン酸の増加と、焼土効果に伴うアンモニウム態窒素の増加が表層土壌に認められた。

火入れ時の地表面温度は250°C以上、深さ5cmでは45126°Cであり、深さ5cmの地温が7080°C程度の地点でも十分な焼土効果が得られた。また、一昨年にササ優占地を伐採して焼畑を行った休閑2年目の地点では、先駆性の樹木や木本の萌芽再生個体が優占する林へと遷移しており、焼畑による林相転換の可能性が示唆された。余呉町の焼畑で栽培した山カブラと実験的に京都府亀岡市の常畑で栽培した山カブラを比較すると、前者は後者に比べ肉食の赤みが強く破断応力が高かった。赤色の原因となるアントシアニンは気温が低下することで増加するため、気温の低い余呉町で栽培された山カブラの方が赤みが濃くなったものと思われる。また、施肥量が多いとカブラの肉質は柔らかくなることが知られているが、焼畑では施肥をしないため、前者の破断応力が高くなったものと思われる。なお、カブは焼畑でなければ本来の色、風味、食感などがでないとされ、焼畑での栽培を続ける農家が東北・北陸の日本海側を中心に今なお残っている。現在でも焼畑によるカブ栽培が営まれる山形県温海地区と新潟県山北地区でも現地調査を行い、前者ではカブのブランド化が、後者では火入れ・赤カブ漬けなどの体験会開催により、人手と参加費を同時に確保しながら外部者との交流を促進していることが、焼畑の存続に大きな役割を果たしていることが確認された。本年度は、滋賀県長浜市余呉町の共有林における雑木林及び4年目の休閑地の2箇所を伐開・火入れし、焼畑による山カブ(余呉在来の赤カブ)の栽培を行った。カブは焼畑でなければ本来の色、形、風味、食感などがでないとして、焼畑での栽培を続ける農家が今なお残っているが、焼畑と常畑のカブの品質の差異を定量的に比較した研究例は少ない。本研究で、余呉町の焼畑で栽培した山カブと、同じ種子を用いて亀岡市の常畑で栽培した山カブの肉色を比較したところ、前者は後者に比べて赤味が強く鮮やかであることが確認された。カブの赤色のもとになるアントシアニンの生合成には昼夜の温度差が大きいことが必要で、高温下では抑制されることが知られているため、この結果は両地域の気温差を反映したものと思われる。一般に、焼畑は常畑よりも標高の高い山地で行われるため、同一地域内で比較すれば、焼畑の方が日中の気温は低く明け方の冷え込みも厳しくなることが、焼畑のカブの赤味が強くなる一因ではないかと思われる。また、温海地方の焼畑では「灰が熱いうちにカブの種を播け」といわれ、余呉町の焼畑でも火入れ直後に播種を行う。本研究で山カブの発芽率と温度の関係を調べた結果、80°Cで510分程度加熱した場合に発芽率が最も高くなり、火入れ直後の播種がカブの発芽を促進している可能性が示唆された。また、焼畑作物の害虫被害に関するこれまでの調査結果から、エンマコオロギの大発生の年と火入れ・播種の遅れが重なると、カブに甚大な被害が出ることが分かった。火入れが8月下旬以降にずれ込むと、9月上旬に7齢から成虫へと生長する食欲旺盛なエンマコオロギに発芽直後のカブの子葉のほとんどが食べられてしまうためである。伝統的な余呉町の焼畑では、遅くともお盆までには火入れを行ったそうであり、このことがコオロギの食害リスクを低減する一因となっていることが示唆された。本年度はタニウツギ、ヤブデマリなどが優占する雑木林を伐開・火入れし、焼畑による山カブの栽培を行った。休閑地の植生調査を行った結果、ササ群落を伐採して焼畑を行った休閑5年目の場所では、タニウツギなどの萌芽再生個体が優占する低木林へと遷移し、焼畑による林相転換が可能なことが確認された。しかしながら、高木性の木本の定着は少なく、早期の森林再生を促すには後継樹となりうる樹木の植栽も視野に入れる必要があることが分かった。また、ススキ草地を伐開した休閑23年目の場所では、雑木林を伐開した焼畑休閑地に比べて木本の萌芽再生個体が少なく、休閑期の植生遷移の進行は遅いことが確認された。
24時間社会で育児が立脚すべき生物学的エビデンスに関する研究

昨年度の3歳児における検討に引き続き、今年度は3歳以下の児でアクチウオッチによる行動量と起床時刻、就床時刻の関連、ならびに尿中のコルチゾール代謝物(17OHCS)とセロトニン代謝物(5HIAA)とこれら因子の関連を検討した。17OHCS,5HIAAの結果はまだ得られていないが、行動量に関しては貴重な結果を得ることができた。昨年度の3歳児での検討では行動量が多いほどその晩の就床時刻が早くなること、早寝早起きでは遅寝遅起きに比し、朝の尿中17OHCS濃度が高いことの2点を得たが、今年度は、6ヶ月から3歳の75名で検討した。その結果、(1)加齢ともに行動量は増加する、(2)男児が女児よりも行動量が多い、(3)起床時刻が早いほどその日の行動量が多くなる、(4)ある日の行動量はその晩の就床時刻には影響しない、の4点が現時点で確認されている。このうち(4)に関しては昨年度の3歳児における検討と相容れない結果ではある。これは今年度得た行動量が加齢とともに有意に増加する点を考慮すると、行動量が未だ十分に増していない若年層においては、起床・就床時刻よりも加齢が行動量の決定に大きな影響を与えることが想定された。しかし興味あることは、このような若年齢において起床時刻が早まるとその日の行動量が増加することが確認された点である。この所見は「起床時刻が遅れると内的脱同調をきたし、日中の行動量が低下する」という研究者自身の仮説を支持する知見として注目したい。1.足立区中央本町保健総合センターとの緊密な連携のもと、当初より多数の研究協力者を得、研究は順調に開始された。2.当初予定されていた研究項目中、就床時刻、起床時刻と唾液中メラトニン、及び尿中6-hydroxymelatonin sulphate(メラトニン代謝物)濃度との関連については、就床時刻が遅延し、起床時刻が遅延するほど唾液中メラトニン、ならびに尿中6-hydroxymelatonin sulphate濃度が低下する傾向のあることを見出した。両所見のうち、朝の光そのものがメラトニン分泌を抑制するので、起床時刻の遅延とメラトニンとその代謝物の濃度低下は生理学的にも生じると考えた。しかし就床時刻の遅延とメラトニンとその代謝物の濃度低下は有意な所見と考えた。3.アクチウオッチによる行動量を自己相関で解析、オートコレログラムを検討したところ、生後3ヶ月からほぼ24時間の概日リズムを検出できた。またオートコレログラムの振幅が加齢とともに増大する傾向のあることを見出した。後者に関しては、リズムの安定性の反映とする仮説もあるが、今後とも例数を増して検討してゆく。4.現在1-2歳児13名で、行動量、受光量、と尿中メラトニン、セロトニン・コルチゾール代謝物(6-hydroxymelatonin sulphate、5HIAA、170HCS)との検討が行われている。5.本研究過程で新たに認識された事項として、(1)子育て支援サービス提供者の知識の不均一性と(2)教育の実効性の観点からみた、養育者参加型の研究調査の重要性がある。(1)については子育て支援サービス提供者に対する生涯教育システムの拡充が望まれる。
臍帯血繊維芽細胞移植による放射線曝露個体の自己造血回復を目指した新規治療法の開発

今後、日本の原子力政策では原発再稼働と廃炉作業が同時に進行することから、その作業過程で生じうる大量放射線被ばく事故に対しては万全の医療体制を整えておく必要がある。本研究では、大量放射線曝露によって失われた自己造血機能を回復させるための新たな治療法の開発を目指す。申請者はこれまでに混合臍帯血移植による自己造血機能回復の有効性を証明してきたが、本研究ではさらに新たな治療選択肢として、臍帯血に含まれる造血幹細胞ではなく、繊維芽細胞を用いた移植法の有効性をマウスモデルで検証する。繊維芽細胞は容易に培養増殖が可能なことから、供給面でより安定した移植ソースと成り得る。
ラングラウフスキ-の実験的研究

本研究は、積雪地住民の健康・体力の改善に効果的なクロスカントリ-スキ-の運動処方のための基礎的な知見を得ることである。総数20名のクロスカントリ-スキ-の初心者および中級者を被検者として、1.滑走特性と生理学的応答との関係、2.トレ-ニングによるこれらの指標の変化、3.初心者のストライド技術のバイオメカニクス的特性、を明らかにするための実験を課した。結果を要約すると以下の通りである。1.初心者や中級者の場合も競技選手と同じ様に、同じ速度に対してストライドが長くテンポの少ない滑走法の方が、ストライドが短くテンポの早い滑走法よりも有利であろうという仮説を酸素摂取量の点から検証した。2.酸素摂取量は、速度に比例して増加するが、ストライド技術および雪の状態による変動もかなり見られる。3.初心者のダイアコナル滑走時の筋電図の特徴は、(1)キック期の腓腹筋の相動的な放電、(2)滑走期の前脛骨筋の持続的な放電、(3)ストック動作での上腕三頭筋の相動的な放電、であった。4.VTR画像の動作解析から、初心者のダイアゴナル滑走でストライドが伸びない欠点は、以下の点から特徴づけられた。(1)キック終了時の下腿角度が小さいこと、(2)滑走期における支持脚の膝の屈曲が不十分であること、(3)ストックでの突き出し動作で上肢の動きが小さいこと。当初の計画通り、以下の研究を実施したが、たまたま今年度は史上稀な暖冬異変に見舞われたため、実験条件の設定および実行の過程で一部変更せざるを得ない点も生じた。すなわち、当初の計画では初心者3名について2カ月間のトレーニングを課する予定であったが、今年度は積雪期間が例年より約1カ月短かったため、トレーニング期間を3週間半とし、被検者を8名とした。また、熟練者の筋電図、VTRによる動作解析については、被検者の競技期間の終わる3月中旬の実験は不可能となったため、歩くスキー愛好者の中で習熟度の異なる6名について2月下旬に実施せざるを得なかった。<1>ラングラウフスキーの先行研究の収集および関連研究者との交流、本テーマに関する運動生理、トレーニング、バイオメカニクスの内外の研究成果を収集し、他研究者との交流を図ることによって、トレーニングおよび技術指導上の課題および研究方法上のオリジナリティを確証した。<2>ラングラウフスキーの動作解析、代謝およびトレーニング(1)学内のコースで、性、年齢、習熟度の異なる被検者20名について5Km滑走中の心拍数、酸素摂取量、ピッチ、ストライドを測定し、高い滑走速度を維持するためには高い有酸素性作業能が必要であり、効率良く滑るためにはストライドを伸ばすことが重要であることが確認された。(2)上記被検者中8名について1回あたり約5Kmのトレーニングを週に3回、3週間半で延べ50Kmのスキー滑走(ダイアゴナル)トレーニング量となる様に課し、有酸素性代謝、ピッチ、ストライドの変化を検討した。その結果トレーニングによる滑走速度の増加は、エネルギー効率の改善、ストライドの増加および高い作業強度の維持によるものであることが明らかとなった。多雪寒冷地域の住民の健康増進・体力づくりに効果的な運動である「ラングラウフスキ-」の運動処方化を目指す目的で、総数20名の健康のクロスカントリ-初心者および中級者を被検者として、ノ-ワックス・タイプのスキ-を使用した平地でのダイアゴナル滑走を課し、(1)心拍数および酸素摂取量などの代謝指標、速度やストライドなどの滑走特性の測定、(2)トレ-ニングによる変化の検討、(3)筋電図およびVTRによる動作の解析等の一連の実験を1989年1月から3月にかけて実施し、以下の結果を得た。1.競技選手と同様に初心者や中級者レベルの者においても、平地でのダイアゴナル滑走においてストライドの長い滑走法が合理的であることがエネルギ-代謝の面からも確証された。

2.これまでの内外の研究で高い相関度が認められている酸素摂取量と速度との関係も、ストライド技術や雪質により大きく変動する可能性のあることが、技術レベルの異なる群別の比較実験およびトレ-ニングの実験により明らかにされた。3.筋電図記録により、ダイアゴナル滑走でストライドを伸ばす動作に関与する筋群の諸特徴が、VTR画像解析によりキック期、滑走期、ストックによる推進動作のチェックポイントが明らかにされた。
生殖補助医療が胎盤の構造・機能の変化を介して分娩時出血量に及ぼす影響の解析

ARTによる妊娠では、同年代の自然妊娠例と比し、その分娩時に多量出血を来す例が多く認められる。分娩時には胎盤基底膜板の構成要素である基底脱落膜で胎盤が子宮より剥離、娩出され、その際の出血は分娩時の総出血量に少なからず影響をおよぼす。胎盤基底膜板を組織学的に分析し、ARTと自然妊娠例の比較、ART手技による胎盤の形態学的な違いについて検討した。ホルモン負荷周期凍結胚移植による妊娠では自然妊娠に比較して基底脱落膜の菲薄化や欠損が優位に高く妊娠初期の人工的な内分泌学的環境は胎盤-子宮付着部の構造や機能を変化させる原因となり分娩時出血量の増加に影響を与えている可能性が示唆された。生殖補助医療(ART)の発達により女性の妊娠・出産年齢が高齢化する一方、異常分娩率の上昇・分娩時出血量の増加という問題が報告されている。ARTによる妊娠では、同年代の自然妊娠例と比し、その分娩時に多量出血を来す例が多く、その原因に胎盤と子宮の接着面である基底盤とりわけ脱落膜に形態的変化が生じている可能性を検討している。胎盤の構成成分の一つである脱落膜は母体由来の子宮内膜から妊娠初期に変化するが、ART治療による胎盤絨毛組織及び胎盤基底膜板の変化を観察・解析している。平成26年度は浜松医科大学付属病院周産母子センターにて、ART妊娠症例および比較対象として自然妊娠症例において、流産産物の脱落膜組織、分娩した際に得られた胎盤組織、帝王切開分娩時に子宮側の胎盤付着部の脱落膜組織の収集を予定通りに行っている。ART治療としてホルモン補充のみで着床環境を作り出す人工周期による融解胚移植妊娠は自然妊娠より有意に分娩時出血量が多く、組織学的にも胎盤基底膜板の有意な変化を認めている。ART治療の分娩例は治療方法毎に分類し、浜松医科大学周産母子センターの総合データベースより臨床的因子と出血量の解析を行っている。流産産物の脱落膜組織、分娩後の胎盤及び帝王切開時に胎盤床組織を採取し光学顕微鏡を用いて脱落膜及び基底膜板の組織学的形態変化の解析を行っている。ART治療後妊娠において脱落膜の欠損及び菲薄化と基底膜板上のフィブリノイド沈着の肥厚が認められた。サンプリングされた組織はHE染色及びAZAN染色を行い、基底膜板部をランダムに20視野デジ膜板部をランダムに20視野デジタル撮影を行い、この画像情報より胎盤の子宮筋癒着の有無、脱落膜層及びフィブリン層の計測・解析中である。生殖補助医療(ART)の発達により女性の妊娠・出産年齢が高齢化する一方、異常分娩率の上昇、分娩時出血量の増加という問題が報告されている。ARTによる妊娠では同年代の自然妊娠例と比較しその分娩時に多量出血を来たす例が多く、その原因に胎盤と子宮の接着面である基底膜板とりわけ脱落膜に形態的変化が生じている可能性を検討している。胎盤の構成成分の一つである脱落膜は母体由来の子宮内膜から妊娠初期に変化するが、治療にARTよる胎盤絨毛組織及び胎盤基底膜板の変化を観察解析している。平成27年度は前年度に引き続き浜松医科大学周産母子センターにてART妊娠例及び比較対象としての自然妊娠症例において分娩をした際に得られる胎盤組織、帝王切開分娩時に子宮側の胎盤付着部脱落膜組織、また流産産物の脱落膜組織の収集を継続している。各組織はHE染色及びAZAN染色をを行い光学顕微鏡下、高倍率にて20視野をランダムにデジタル撮影を行い基底膜板の形態変化を解析したところ、ARTの治療内容と子宮筋癒着の発生率の関連が認められた。ホルモン補充による着床環境を調整した人工周期下の融解胚移植群では子宮筋の付着率が上昇し、また脱落膜層及びフィブリン層についてもART治療の内容により層の厚さや欠損率に変化が生じることが認められた。収集した脱落膜組織はタンパク質を抽出及び二次元電気泳動法を用いてタンパクの分離と質量分析による解析を継続していく。浜松医科大学周産母子センター分娩例はART治療内容別に自然妊娠群・新鮮胚移植群・自然周期凍結胚移植群・ホルモン補充後凍結胚移植群の4群に分類し、分娩後の胎盤組織を採取し、特殊及び免疫染色による光学顕微鏡下の脱落膜層及び基底膜板の組織学的形態変化の解析を行っている。ART症例の脱落膜組織から特異的タンパク質の同定を行うため、タンパク質の抽出後二次元電気泳動法を用いてタンパク室の分離を行っている。生殖補助医療(ART)の発達により女性の妊娠・出産年齢が高齢化する一方、異常分娩率の上昇・分娩時出血量の増加といった問題が報告されている。そこで胎盤基底膜板を組織学的に分析し、ARTと自然妊娠例の比較、ART手技による胎盤の形態学的な違いについて検討した。ART妊娠および自然妊娠例において分娩の際に得られる胎盤組織、帝王切開分娩時に子宮側胎盤付着部脱落膜組織、流産産物の脱落膜組織の収集を行った。胎盤についての観察方法はHE染色およびAZAN染色後基底膜板を中心とした光学顕微鏡下高倍率にてランダムにデジタル撮影し基底膜板の形態的変化の解析及びフィブリン層の解析を行った。

ART治療については自然胚移植群、凍結胚自然周期胚移植群、凍結胚ホルモン周期胚移植群、自然妊娠群に分類し、Rohrフィブリン層の垂直方向の最大の厚みと脱落膜欠損率を計測し解析を行った。凍結胚ホルモン周期胚移植群でRohrフィブリン層厚および胎盤基底膜板の脱落膜欠損率が有意に厚く分娩時出血量と相関が認められた。また基底膜板に子宮平滑筋の付着が他群と比較して優位に高く認められた。この結果より妊娠初期の人工的な内分泌学的環境は脱落膜の欠損に代表されるような子宮付着部の構造や機能を変化させる原因になっている可能性が示唆された。子宮側胎盤付着部脱落膜や流産産物の脱落膜についてはフィブロネクチン・フィブリノゲンによる免疫染色を行ったがいずれの群間においても染色性の差は認められなかった。生検組織における特異的たんぱく質の同定については現在解析を進めており継続して検討を行う予定である。ARTによる妊娠では、同年代の自然妊娠例と比し、その分娩時に多量出血を来す例が多く認められる。分娩時には胎盤基底膜板の構成要素である基底脱落膜で胎盤が子宮より剥離、娩出され、その際の出血は分娩時の総出血量に少なからず影響をおよぼす。胎盤基底膜板を組織学的に分析し、ARTと自然妊娠例の比較、ART手技による胎盤の形態学的な違いについて検討した。ホルモン負荷周期凍結胚移植による妊娠では自然妊娠に比較して基底脱落膜の菲薄化や欠損が優位に高く妊娠初期の人工的な内分泌学的環境は胎盤-子宮付着部の構造や機能を変化させる原因となり分娩時出血量の増加に影響を与えている可能性が示唆された。浜松医科大学周産母子センター分娩例はART治療内容別に自然妊娠群・新鮮胚移植群・自然周期凍結胚移植群・ホルモン補充後凍結胚移植群の4群毎に分類し、分娩後の胎盤及び帝王切開時に胎盤床組織を採取し特殊染色及び免疫染色による光学顕微鏡を用いての脱落膜及び基底膜板の組織学的形態変化の解析を行うと共に病理組織学的異常を解析を行っている。当センターで採用している総合データベースより臨床的因子と出血量との関連を解析し、各ART治療が与える影響について関連を検討している。昨年度に引き続き組織の形態解析およびタンパク質の抽出および同定を行う。胎盤基底膜板および脱落膜の評価として組織学的変化と細胞接着の評価を行い、ART治療による妊娠後分娩時出血量との関連を検討する。ヒト子宮内膜間質細胞のプライマリーカルチャーを行い、同定したタンパク質を解析後検証実験を行う予定である。周産期医学胎盤病理組織サンプリング及び形態変化の解析は前年度に引き続き継続する。ART治療後妊娠の胎盤脱落膜に特異的なタンパクの同定。前年度から継続して収集するART妊娠ならびに対照群としての自然妊娠群の胎盤奇胎盤の脱落膜組織ならびに子宮側の胎盤付着部、したART症例の脱落膜組織から特異的タンパク質の同定を行う。脱落膜組織からタンパク質を抽出後、二次元電気泳動法を用いてタンパク質を分離し、質量分析による解析を行う。ART妊娠に特異的に変化している蛋白質、とりわけ細胞外マトリックスの構成に重要な役割を果たすタンパク質群の同定を目指す。同定したタンパク質の特異的変化が、流産産物の脱落膜組織において既に発現に差を認めるか否かの解析を目指す。検討中の胎盤病理検査に関して免疫染色用の物品の購入が遅れたため次年度の請求になっている検討中の胎盤病理検査に関して、免疫染色用物品の購入が遅れたため次年度の請求になっている。
無保護アミノ酸を用いた環状ペプチドの連続的マイクロフロー合成法の開発

前年度において、無保護アミノ酸を出発原料として用いたN-カルボキシアミノ酸無水物(NCA)の調製法と、N-フェノキシカルボニルアミノ酸を出発原料として用いたNCA調製法を開発した。本年度はまず、別途調製したNCAを用いてアミド化反応を検討した。反応溶媒や塩基の添加、基質濃度、二相系反応などを検討した結果、フェニルアラニンのNCAとグリシンの反応において、高収率で目的のジペプチドが得られる条件を見出すことに成功した。またその検討の中で、フェニルアラニンのNCAとセリンのNCAが同程度の反応性をもつという知見を得た。一方、求核剤であるアミンについては、立体障害の大きいセリンを用いた際に目的のジペプチドの収率が中程度となり、主反応であるアミド化反応と副反応であるNCAの自己重合反応の反応速度の差が小さく、反応の制御が困難であることが示唆された。また、前年度において、5-ブロモ-7-ニトロインドリンが光活性化基として有用であることを見出し、非光照射時は保護基として機能してペプチド鎖の伸長が可能であることを確認していた。本年度は環状ペプチドのモデル基質として、ケミカルプローブに利用されている環状RGDペプチドを選択した。まず、C末端に光活性化基をもつ鎖状ペプチドを合成した。続いて、ポータブルUVランプを光源として利用したマイクロフローリアクターを作成し、光照射を行った結果、目的の環状ペプチドを得ることに成功した。本研究結果はOrg. Biomol. Chem.誌に掲載された。28年度が最終年度であるため、記入しない。本年度はまず、無保護のアミノ酸を出発原料として用いたN-カルボキシアミノ酸無水物(NCA)の調製方法について、フェニルアラニンをモデル基質として用い、マイクロフローリアクターを用いる際の混合効率や活性化試薬であるトリホスゲンの当量、反応溶媒、反応時間、反応温度等を網羅的に検討した。その結果、フェニルアラニンのNCAを良好な収率で調製できる反応条件を見出した。なお、条件検討では不安定なNCAとイソプロピルアミンを反応させたアミド体の収率を基に評価を行ったが、最適条件においてはNCAの単離にも成功し、反応活性種がNCAであることを確認した。また、難溶性の無保護アミノ酸の代わりに、有機溶媒に可溶なN-フェノキシカルボニルアミノ酸を用いて、酸性条件下、マイクロフローリアクター内で加熱してNCAを調製する手法も開発した。本手法では複数のアミノ酸でNCAを調製できることを確認した。さらに、環状ペプチド合成法の開発に向けて、非光照射時にはカルボン酸の保護基、光照射時には脱離基として機能する7-ニトロインドリン類縁体を選定し、アミノ酸への導入と光照射による分子間アミド化反応、非光照射下におけるペプチド鎖の伸長を検討した。その結果、5-ブロモ-7-ニトロインドリンを用いたときに、アミノ酸への導入と光照射によるアミド化反応、ペプチド鎖の伸長が可能であることを見出した。今後はケミカルプローブに利用されている環状RGDペプチドを標的の環状ペプチドとし、マクロラクタム化の前駆体であるC末端に光活性化基をもつ鎖状ペプチドの合成を行ったのち、マクロラクタム化の反応条件を検討する予定である。NCA調製/アミド化連続反応によるペプチド合成法の開発については、反応条件を網羅的に検討することでNCA調製法の確立に成功すると共に、別法によるNCA調製方法も確立し、さらにその後のアミド化反応の検討にも着手しており、おおむね順当に進展している。光活性化基を用いた環化反応の開発については、モデル基質を用いた十分な検討ができており、おおむね順調に進展している。まず、別途調製したNCAを用いてアミド化反応を検討し、その後本年度に開発したNCA調製法と組み合わせてNCA調製/アミド化連続反応によるジペプチド合成法を開発する。最適条件における基質適用範囲の調査を行ったのち、ジペプチド合成法を連続的に繰り返すことによる鎖状ペプチド合成法を開発する。

また、C末端に光活性化基をもつ鎖状ペプチドを用いたマクロラクタム化の検討を推進し、得られた最適条件と前述の鎖状ペプチド合成法を組み合わせ、環状ペプチドの連続的マイクロフロー合成法の開発を目指す。研究計画に遅れが発生し、環状ペプチド合成法の開発が困難な場合、NCAを用いたペプチド合成法と光活性化基を用いた環状ペプチド合成法をそれぞれ独立に開発し、結果を学会誌等で発表する。28年度が最終年度であるため、記入しない。
異種物質基板上におけるタンパク質結晶の配向制御

本年度は主として有機基板上へのタンパク結晶の成長とその配向評価を行った。また前年度から継続してタンパク質分子吸着過程の観察を行った。まず、基板となる結晶として真空蒸着法により作製し、その構造を原子間力顕微鏡(AFM)で評価したベヘン酸薄膜上にリゾチームの結晶化を行ったところ、単層膜が存在するときのみ{110}面を薄膜に平行に向けた結晶が観察され、それ以外の条件ではこの配向をする結晶は生成しなかった。一方、他の方向を向いた結晶の数は膜の厚さ・構造によらず一定であった。さらに、詳細な検討をおこなったところ、{110}面に配向する結晶の個数は単に基板の構造のみならず溶液のpH、バッファ濃度などにも大きく影響を受けることが明らかとなった。この配向のメカニズムを解明する上で重要なタンパク質の初期吸着過程をより詳細に解析するために全反射型赤外分光法(ATR/FT-IR)を用いてタンパク質吸着測定を行い、主要なノイズ成分である大気中の水蒸気並びにタンパク溶液中の水の吸収を取り除く方策について検討し、分子レベルでの吸着量の定量測牢とX線解析に匹敵する精度で二次構造の比率を決定する方法を確立した。また、非結晶状態の有機基板としてポリウレタンを基板として検討した結果、タンパク質結晶の核形成・配向については系統的な結果は得られなかったが、この基板上ではタンパク結晶が安定に固定できるため、X線解析・AFM観察などに極めて有効であることが明らかとなった。以上の結果の一部は、既に日本物理学会、日本結晶成長学会、国際会議(ISDSB2003)等で発表され、J.of Crystal GrowthならびにJJAPに投稿中である。さらに、来年度の結晶成長ならびにタンパク質結晶化の国際会議(ICCG、ICCBM)においても発表が予定されている。本年度は、(1)単結晶基板の作製と評価ならびに、(2)タンパク質分子吸着過程の観察に加え、一部先行して(3)基板上へのタンパク結晶の成長とその配向評価を行った。まず、基板となる結晶として、真空蒸着法により作製した脂肪酸薄膜及ならびに水素終端されたSi単結晶(以下H-Si)の作製と評価を行った。脂肪酸としては常温前後での蒸着が容易なベヘン酸を選び、その蒸着条件を適切に設定することにより被覆率、膜の構造の異なる良く定義された薄膜を作製することに成功した。また、弗化アンモニウム処理により、H-Si表面を作製し、これが水素のみで終端された1×1構造をもち、原子スケールで平坦あることをRHEED、FT-IRならびにAFMにより確認した。さらに、このH-Si表面を純水中に浸したときの安定性についても検討した。これらの基板の上にタンパク質を吸着させることを試みた。タンパク質としては、構造ならびに特性が最も良く知られているlysozymeを取り上げ、これを未飽和状態となるよう純水中に溶かし、AFMでその場観察を行った。H-Si面については、はっきりとしたデータが得られていないが、ベヘン酸薄膜については、その表面に分子が吸着している様子が観察された。このとき、ベヘン酸薄膜の構造、ステップの有無には依存せずランダムに吸着する傾向が見られた。また、作製したベヘン酸薄膜上にリゾチームの結晶化を行ったところ、単層膜上でのみ{110}面を薄膜に平行に向けた結晶が観察され、それ以外の条件ではこれはみられなかった。一方、{101}面を薄膜に平行に向けた結晶は膜の厚さ、構造によらず、常に同様の数が得られた。以上の結果の一部は立命館理工学研究所主催のシンポジウムならびに同紀要で既に発表し、また春の日本物理学会及びつくばで行われる国際会議(ISDSB2003)で発表が予定されている。
モデル微生物への細胞死スイッチの導入の試み

本申請研究では環境修復そのものの手法ではなく環境修復後の標的環境の正常化を目指している。その手法として環境修復に利用した生物を環境修復後に系から除去するための手法として、分子レベルで制御が可能な細胞死スイッチを構築し、それを道具として使用する微生物に導入することで環境修復と環境修復後の正常状態への復帰を目指す。これまでの研究では、細胞死スイッチのためのモデル系構築を目標とし、具体的には全生物において普遍的に存在し、かつ、必須の酵素であるリボヌクレアーゼPという酵素を細胞死のための分子スイッチとしての利用を検討している。経過年度において酵素内のP3ドメインと呼ばれる部位だけでなく、新たにP12ドメインと呼ばれる部位を利用した酵素活性制御の系の構築が可能なことを明らかにしてきた。またこの部位を利用することでより酵素活性の制御が確実に行えることを種々の解析によって明らかにした。本年度の成果としては、2つの部位を同時に標的とした酵素活性スイッチを構築することでより効率的な分子スイッチを構築できること、を明らかにした。またこの研究を通して標的とした酵素の基質認識機構を開明することができ、今後の分子スイッチのデザインにおいて有益な情報を得ることができた。今後はこれらの情報をもとにした分子スイッチをよりエレガントなモノへと改良を進める一方で、構築した分子スイッチを細胞死へと応用する系を立ち上げる。その手法として環境修復に利用した生物を環境修復後に系から除去するための手法として,分子レベルで制御が可能な細胞死スイッチを構築し,それを道具として使用する微生物に導入することで環境修復と環境修復後の正常状態への復帰を目指す。本年度の研究では,細胞死スイッチのためのモデル系構築を目標とし,具体的には全生物において普遍的に存在し,かつ,必須の酵素であるリボヌクレアーゼPという酵素を細胞死のための分子スイッチとしての利用を検討した。この酵素の部分構造であるP3部位を人工的に変異させた変異体酵素は通常の酵素活性を維持し,かつ,分子スイッチとしてデザインされたtatタンパク質の添加によって酵素活性を失うことは既に確認した。また,酵素活性のより確実な制御のために,酵素内の他の部分構造においても分子スイッチを導入可能な箇所を実験的に検討し,幾つかの候補を得ることができた。今後はこれまでに得られた知見を利用して,分子スイッチをより確実なものとし,細胞死スイッチとして機能させるための検討を行う。本年度の研究では、細胞死スイッチのためのモデル系構築を目標とし、具体的には全生物において普遍的に存在し、かつ、必須の酵素であるリボヌクレアーゼPという酵素を細胞死のための分子スイッチとしての利用を検討した。昨年度において酵素内のP3ドメインと呼ばれる部位を利用した酵素活性制御の系の構築を進めてきたが、より確実な活性制御を行うことと、より簡便な制御手段へと発展させるために酵素内の別の部位を利用した活性制御手法を併せて検討してきた。その結果としてP12ドメインと呼ばれる基質認識に関わる部位を利用することでこれまで本申請研究では環境修復そのものの手法ではなく環境修復後の標的環境の正常化を目指している。
日本における土壌,底質および植物体中有害金属元素の自然界値

本研究は特には汚染の孝えられない土壌(水田,畑,森林)、湖沼底質および植物(米)中の有害金属元素含有率を求め、いわゆる自然界値を明らかにすることを目的として行ない、以下の知見を得た。1.土壌(水田,畑,森林)の有害金属元素の自然界値:各種土壌の表土についてCd,Zn,Pb,Cu,Ni,Cr,Co,Fe,Mn,V,Sb,Biの含有率を明らかにした。この値はBowenによる世界の土壌の「中央値」と比較するとCd,Co,Vがほぼ同程度、Biが高く、それ以外の金属含有率は低かった。Iimuraによる非汚染土壌の平均値と比べるといずれの金属の含有率も低かった。環境庁による重金属自然賦存量調査の値と比べるとCd,Zn,Pb,Mnが同程度、その他の金属含有率は低かった。なお日本の土壌におけるSb,Biの自然界値についての報告は今日までない。地目別にみると水田土壌〉畑土壌≧森林土壌の傾向がCd,Pb,Ni,Cr,Co,Fe,Biについて認められた。またMclaren & CrawfodによるCuの分画法を改良し、土壌におけるCd,Zn,Pb,Cuの存在形態を明らかにした。2.湖沼底質における有害金属元素の自然界値:霞ケ浦底質の非汚染と考えられる部分と牛久沼底質を用い、有害金属元素の平均含有率を明らかにした。土壌に比べて湖沼底質の金属含有率はCu,Ni,Co,Feがかなり高く、Cd,Cr,Sb,Biはほぼ等しかった。3.植物(米)のCdの自然界値:人為的汚染が特には考えられない奈良県生駒郡平群町久安寺の農家保有米を集め分析したところ、50±19μg/gのCdが検出された。この値はMasironiらによるブラジル,イラン,ガテマラ,アメリカ,ドミニカ,台湾,フィジー,ペルー産米のCd含有率より高く、日本産米は外国産米に比べCd含有率が高いとする見解と一致する結果が得られた。
アントラセン誘導体を光プローブとする分子集合体形成における不斉識別の機構と制御

本研究では9-位に不斉中心を持った置換基を有するアントラセン誘導体について均一溶液、結晶、包接化合物等、種々の反応場における光二量化の反応性や生じた二量体の立体化学から、各反応場での隣接分子同士の相互作用、特に分子集合体を形成する際にホモキラルな会合とヘテロキラルな会合の分子間相互作用の差異を明らかにすることを目標としている。今回はまず、一つの極性基を持った種々の誘導体の合成と光反応生成物の同定から着手した。アルコール(X=OH)は基質が酸化されやすく光反応性を充分に調べることが出来なかったが、X=OAcではいずれもベンゼン溶液中、head-to-tail dimerをdl:meso=1:1で与えた。また、固相ではR=Meの化合物は反応性が低く選択性も見られなかったが、R=Et,i-Prでは短時間の光照射で定量的にmeso体のみを与えた。X線結晶構造解析の結果、R=Et,i-Ptでは対称中心で関係づけられるアントラセン環同士が平行に3.5Å程度の両間距離でスタッフしており、一方R=Meの結晶では二量化に好都合のパッキングはとっていないことがわかった。X=NH_2についてはR=Meしか合成できていないが、この化合物はベンゼン中、塩酸酸性水溶液中のいずれにおいても光二量化が進行した。水溶液中で、γ-シクロデキストリンへの包接を検討したが、蛍光スペクトルに変化が見られなかったことより結合定数は低いものと思われ、これは9-位の置換基の立体障害が大きいためと考えられる。
難病患者の視点に立った災害マニュアルの作成

本研究では、難病患者の災害準備に対する意識調査、実態調査をALS協会や、静岡市保健所、三重難病相談支援センターの協力を得て調査した。その結果、災害準備をしている人は30%であった。さらに「何をどのように準備したらよいかわからない」といった自由回答もあったため、難病患者宅に訪問し、どのような内容がマニュアルに載せてほしいか意見を聞きながら、難病患者当事者の視点に立った災害マニュアルを作成した。本研究は、特定疾患としての在宅療養中の難病患者に対して、2005年4月2007年3月までの3年間で難病連54団体、31万人中全国5都道府県(北海道・新潟・静岡・三重・兵庫)から、1,500名を抽出し、災害時に必要とされる避難状況等の実態調査とその分析を行い、そこから難病患者自身の視点に立った災害マニュアルの作成をめざす研究である。1年目は、準備的研究として、文献整理や難病患者へのインタビューを行った。またALS協会の協力を得て、ALS患者へのアンケート調査を行った。1.人工呼吸器装着中の難病患者で、地域の自主防災組織への事前連絡を行っている人は17.4%と少なかった。2.薬やケアに必要な消耗品を備蓄している人は39.5%であった。3.災害時の移動について、援助者の不足から不安に思っている人が多い。4.介護者が一人だけで、介護者自身の健康の不安も大きい。5.施設に入所できず日常生活を送ることで精一杯で行政による介護用品等援助を希望する人も多い。など、ALS患者・家族の現状が明らかになった。しかし多くの施設では慢性的な看護・介護職員不足が指摘され、重度のALS患者のケアをする体制に至っていないことなどがあげられる。また備蓄物品について、災害時のことまで考えられない人が多いため、何をどのようにどのくらい準備すればよいのか、患者会の協力を得ながら、難病患者・家族主体で考えていく機会をつくっていくことが次年度の課題となった。今年度はパーキンソン患者の災害準備の実際を調査し、災害支援の課題を明らかにすることを目的に研究を行った。静岡市保健所の協力を得て、平成19年度の特定疾患更新申請者453名に保健所から県庁へ依頼しアンケート用紙を郵送した。質問内容は、食事、排泄等ADLや介護認定、障害者手帳の有無、介護保険サービスの活用の有無、災害時の準備(耐震対策の有無、水・食料・薬の備蓄、消防署・地域の自主防災への事前連絡の有無、災害に対する不安の有無)などである。【結果】230人(回収率50.8%)から回答が得られた。療養者の性別は男性50%、女性50%であった。年齢について70代が一番多かった。災害準備について「耐震対策をしている」が47.4%「3日以内薬の備蓄あり」が12.2%「1週間位備蓄あり」が33.5%「それ以上備蓄あり」が26.1%「備蓄していない」が17.4%であった。「3日以内の水の備蓄あり」が40%「水の備蓄なし」が31.7%「3日以内の食料の備蓄あり」が39.1%「食料の備蓄なし」34.8%「病院の確保あり」が19.6%「自主防災組織への事前連絡あり」が17.8%であった。「災害に対する不安あり」が70.9%であった。災害に対する不安についての自由記述では、薬の不安、移動についての不安や避難所で生活の不安(ベッドでの生活ができるかなど)が多かった。また独居や老夫婦二人暮らし、家人が留守の時の不安もあった。【考察】外出に関して、一部介助、全部介助をあわせて約80%の人が自力では外出できず、在宅パーキンソン患者の約74%が在宅療養をしていることから、ほとんどの人が災害時の移動は困難であると考える。そのため災害時家にいることが予想されるため耐震対策や薬・食料・水等の災害準備が重要である。しかし薬の備蓄について3日以内の備蓄や備蓄をしていない人が約30%いること、災害時の移動、薬、避難所での生活等についての不安も多く、災害準備に関する支援が必要と考える。<研究目的>本年度は、他県の難病患者の災害準備について把握するため、他県の難病連に協力をお願いし、同意が得られた三重県の難病相談支援センターに依頼し、2600部のアンケートを配布した。(プライバシー保持のため用紙や封筒や切手を貼付し、宛名のみタックシールで難病支援相談センターや各患者団体に貼っていただくようにした。)<結果>1012部返信をいただいた(回収率38.9%)。そのうち災害準備についての未記入があるものを除いた数は877部であった(回答率33.7%)。様々な患者団体からの回答のため、難病の種類も74種類中、38種類から回答をいただいた。最も多い疾患は、パーキンソン病で85名(9.7%)悪性関節リウマチ63名(7.2%)であった。

災害時の支援として、家族・親戚の支援がある人が687名(78.4%)いた。災害準備について、耐震対策をしている人は、279名(31.8%)であった。薬を備蓄している人は、144名(16.4%)であった。3日以内の水の備蓄をしている人は、390名(44.5%)であった。食料の3日以内備蓄している人は、408名(46.6%)であった。災害時の不安について「ある」と答えた人は597名(68.2%)であった。その他備蓄や災害準備をしていない人の自由回答では、「水はいつでも確保できると考えている」「余裕がない」「町内会が解散した」「病名を知られたくない」などの意見があった。災害時に求める支援について「安否確認」「洋式トイレの確保」「避難時の手伝い」「身内への連絡」などがあり、災害ボランティアについて、「必要性がある」と答えた人は609名(69.5%)で、内容は「運搬」「生活全般援助」「片付け」などであった。さらに難病患者の意見を取り入れ、外部バッテリーやハザードマップ画像を入れたマニュアルを作成した。
タンパク質マトリクスを利用した新規生体金属触媒の創製と小分子の活性化

本年度は、まずヘムタンパク質の機能化として、昨年かなり物性が明らかになったコロール鉄錯体を駆使し、ミオグロビンや西洋ワサビペルオキシダーゼの天然のヘムをコロール鉄錯体に置換した再構成タンパク質を調製し、その触媒活性を評価した。実際に、コロール鉄錯体を含むミオグロビンは、フェノール誘導体を基質とする過酸化水素酸化反応において、天然のミオグロビンを大幅に超える触媒活性を示した。一方、西洋ワサビペルオキシダーゼにおいては、コロール鉄錯体を有するタンパク質の方が活性が低下し、同じタンパク質でも顕著な反応性の違いがあることも明らかとなった。さらに、この酸化反応の中間体の検出を、ストップドフロー法を用いて実施し、天然のペルオキシダーゼと同様に、compound Iと呼ばれる2電子酸化当量の高酸化中間体を、過渡的に観測することに成功した。一方、ニトロゲナーゼのモデルとして、システインを多く含むメタロチオネインのαドメイン(アミノ酸3031量体)をタンパク質マトリクス及び配位子に用いた鉄-硫黄(システイン)クラスター錯体の合成を行った。その結果、鉄4核のクラスターがタンパク質クラスター内に生成することを電子スペクトル及びマススペクトルを用いて同定し、鉄2価状態では、メチルレッドなどのN=N結合を水素化し、さらに切断してアミンまで還元することを見出した。現在は、まだ触媒反応までは至っていないが、今後この系を検討し、新しいニトロゲナーゼ機能モデルとして発展すると期待される。生体分子を配位場として用いた金属錯体の構築は、複雑な金属タンパク質のメカニズム解明に対して有用であるだけでなく、水中で働く環境負荷軽減型触媒の開発として極めて興味深いテーマである。本申請研究では、ヘムタンパク質のヘムポケット及びメタロチオネインの含システインαドメインをそれぞれ金属イオンの配位場として利用して、配位子のファインチューニングをしながら、新しい人工金属タンパク質を構築し、生体金属触媒としての応用をめざした。具体的には、まず、ヘムタンパク質の高機能化としては、ミオグロビンの天然ヘムを除去したアポ体に高い酵素活性が期待されるコロール鉄錯体を挿入し、高酸化触媒活性の獲得を試みた。その結果、天然のミオグロビンに比べて200倍以上も酸化触媒活性が上昇し、鉄コロール錯体が優れた補欠分子であることが判明した。さらに、その錯体化学的知見を得るために、NMRやEPRなどの分光手法を用い、その解析を現在進行中である。一方、もう一つのテーマとして、メタロチオネインのモチーフを合成し、メタロチオネイン鉄クラスターの合成を実施した。まだ、完全な構造的知見は得られていないが、メタロチオネインマトリクス中に4核鉄クラスターが構築されたことが明らかとなり、次年度に向けて得られた生体金属分子の触媒活性評価を開始している。
人癌細胞由来血栓誘発因子(TIA)の酵素抗体法による定量法の確立

進行肺癌患者の末梢血中に高頻度にある種の血栓誘発因子(Thrombosis-Inducing Activity,TIA)出現がみとめられる。この因子は癌の進行に伴い末梢血に出現する頻度が上昇することより、癌細胞より産生され末梢血中に分泌されるものと考え、各種人肺癌細胞株に対する抗血清を作製した。癌細胞株の中でも、特にProcoagulant activityの強いQG-56に対するポリクローナル抗体はTIA活性を中和することが解ったので、この細胞株を抗原としTIAを中和しうるモノクローナル抗体を作製した。この抗体を用いELISA法によるTIAの定量測定法を確立した。モノクローナル抗体を用いた免疫染色では癌細胞株の細胞質内に強く染色された。また、ELISA法により癌細胞株の培養上清中のTIAを測定すると、経時的にTIAの上昇が認められた。以上よりTIAは癌細胞株の細胞質内に存在し培養上清中に分泌される物質と考えられた。QG-56の無血清培地における培養上清のTIAの分子量を測定するためにWestern-Blottingをおこなったが染色されるバンドを同定することができなかった。また、モノクローナル抗体をSepharose-4Bゲルに結合させAffinity PurificationによりQG-56培養上清中よりTIAの精製を試み、抽出物を電気泳動し蛋白染色を行ったがバンドが検出されなかった。現在TIAが糖脂質である可能性を検討している。肺癌患者をTIA陽性群を陰性群に分けこれらの患者の血清中のTIA量をELISA法にて検討した。TIA陽性群は陰性群に比し高い傾向にあった。また、TIA陽性群は陰性群に比しDICの合併が多くみられ予後が不良であった。肺癌患者の末梢血中におけるTIAの出現が予後に関与している可能性が示唆された。