hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞伸展培養用マイクロデバイスを用いた組織押圧核酸導入法のメカニズム解明

我々は物理的な刺激を利用したnaked核酸導入法である押圧法を開発してきた。本研究では押圧法のメカニズム解明を目指して、培養細胞を用いたin vitroの研究を行った。押圧法では、押圧した臓器内の細胞に伸展刺激が負荷され、その伸展刺激が何らかの重要な役割を担っていると考えられる。そこで培養細胞に対して伸展刺激を効率よく負荷できるマイクロデバイスを開発し、それを用いて伸展刺激による血管内皮細胞層の物質透過性への影響と伸展刺激による培養細胞への核酸導入効率への影響を明らかにした。その結果、伸展刺激は血液中に投与したネイキッド核酸が血管内皮細胞層を透過することを促進し、押圧した組織におけるネイキッド核酸の分布量を増大させることには関与するが、ネイキッド核酸が細胞膜を突破し細胞内でのネイキッド核酸の分布量を増大させることには大きく関与しないことが示唆された。このように本研究により目標であった押圧法のメカニズムの一部が明らかになった。我々は独自のin vivoネイキッド核酸導入法である組織押圧核酸導入法(押圧法)の研究を進めてきた。本研究では培養細胞を用いて押圧法のメカニズム解明を目指す。メカニズムが明らかになることで、押圧法の技術改良が可能になり臨床応用への展開が期待される。平成25年度は研究実施計画に基づいて「伸展刺激により培養細胞への核酸導入効率は向上するのかを明らかにすること」を目的とし、以下の通り研究を行った。まず細胞伸展マイクロデバイス上での細胞培養技術を確立した。前年度に開発した細胞伸展マイクロデバイス上で押圧法が適用できる臓器由来の細胞2種(株化肝細胞、ヒト血管内皮細胞)と適用できない臓器由来の細胞1種(株化骨格筋細胞)を培養した。まずそれぞれの細胞の最適培養条件を見出した。次にネイキッドGFP発現プラスミドDNA存在下で、デバイスを駆動させ、それらの細胞に対して押圧法と同様の条件(5秒間1回)の伸展刺激を負荷した。結果として、最大20%のひずみを細胞に負荷した場合においても、使用したすべての細胞種においてネイキッドプラスミドDNAの導入効率は向上しなかった。このことからin vitroにおいて一過性の伸展刺激のみではネイキッド核酸が細胞膜自体を突破し難いことが分かった。本研究により押圧法において伸展刺激は、血液中に投与したネイキッド核酸が血管内皮細胞層を透過することを促進し、押圧した組織におけるネイキッド核酸の分布量を増大させることには関与するが、ネイキッド核酸が細胞膜を突破し細胞内でのネイキッド核酸の分布量を増大させることには大きく関与しないことが示唆された。我々はin vivoネイキッド核酸導入法である組織押圧核酸導入法(押圧法)の研究を進めてきた。本研究では、培養細胞を用いたin vitroの研究を行い、押圧法のメカニズム解明を目指す。メカニズムが明らかになることで、押圧法の技術改良が可能になり臨床応用への展開がさらに進むと期待される。平成23年度は研究実施計画に基づいて「伸展刺激による血管内皮細胞層の物質透過性への影響を明らかにすること」を目的とし、以下の通り研究を行った。1、細胞伸展培養マイクロデバイスの開発_培養した血管内皮層に伸展刺激を加えることが出来るマイクロデバイスを開発した。フォトリソグラフィー技術とソフトモールディング技術を用いてポリジメチルシロキサン(PDMS)を材料とするマイクロデバイスを製作した。デバイス上にコラーゲンゲル層を形成し、その上で血管内皮細胞を培養した。空気圧を印加することでデバイスが駆動し、血管内皮細胞層を伸展することが出来た。2、デバイス上での血管内皮層物質透過性計測技術の確立_デバイス上に形成したコラーゲンゲルに物質が浸透していく様子を共焦点顕微鏡で観察する技術を確立した。蛍光標識アルブミン溶液は数分間でコラーゲンゲル層に十分に浸透した。またコラーゲンゲル上で培養した血管内皮細胞は、蛍光標識アルブミンのゲルへの浸透を防ぐ機能を保持していることを確認した。3、伸展刺激による血管内皮細胞層物質透過性への影響を評価_デバイス上に形成したコラーゲンゲル上で血管内皮細胞を培養した。蛍光標識アルブミン溶液に曝露し、デバイスを駆動することで血管内皮細胞層に伸展刺激を加え、物質透過性への影響を評価した。

その結果、伸展刺激の大きさにより、物質透過性が変化することが示唆される結果を得た。研究実施が困難になったり、進捗が大幅に遅れるような事態が発生していないため、おおむね順調に進展している。平成24年度の研究実施計画に従い、伸展刺激により培養細胞への核酸導入効率が向上するのかを検討する。当初の計画通り研究費を使用する予定である。細胞培養試薬、プラスチック器具、ガラス器具などを購入するために物品費を計上している。また成果発表および情報収集のための国内、国外交通費などとして旅費を計上している。
中国国内所蔵敦煌・吐魯番文献の歴史学的・文献学的研究

1.敦煌・吐魯番文献の所蔵状況の調査(1)天津市歴史博物館ならびに西北大学図書館(西安)に所蔵されている敦煌文献の内容が閲覧を通じて明らかになった.いずれも写経だが,後者については,入手の経路についても情報を収集できた.(2)陝西省図書館ならびに河南省博物館には敦煌・吐魯番文献が所蔵されていないことが関係者の証言や目録カードなどによって確認された.また従来所蔵説のあった黒竜江省図書館ならびに陝西省博物館については,所蔵されていないことが,関係者の証言から明らかになった.(3)陝西師範大学では,歴史系に敦煌文献が所蔵されていることが関係者の証言によって確認された.(4)北京大学図書館所蔵の敦煌文献に関しては,閲覧とともにデジタルカメラによる撮影を行った.とくに題跋や印影については,今後の検討材料となりうる成果である.2.所蔵敦煌・吐魯番文献の研究(1)敦煌研究院所蔵の敦煌文献には,北魏時代,5世紀前半のものが含まれており,暦書の貴重な実例である.(2)浙江省博物館所蔵の敦煌文献には,付領文書が含まれている.同種のものは,ロシアのサンクトペテルブルグにも所蔵されており,比較対照作業へと道を拓く可能性が確認できた.また近年出土した唐西州時代の吐魯番文書にも類例を見出すことができるものである.1.敦煌・吐魯番文献の所蔵状況の調査(1)天津市歴史博物館ならびに西北大学図書館(西安)に所蔵されている敦煌文献の内容が閲覧を通じて明らかになった.いずれも写経だが,後者については,入手の経路についても情報を収集できた.(2)陝西省図書館ならびに河南省博物館には敦煌・吐魯番文献が所蔵されていないことが関係者の証言や目録カードなどによって確認された.また従来所蔵説のあった黒竜江省図書館ならびに陝西省博物館については,所蔵されていないことが,関係者の証言から明らかになった.(3)陝西師範大学では,歴史系に敦煌文献が所蔵されていることが関係者の証言によって確認された.(4)北京大学図書館所蔵の敦煌文献に関しては,閲覧とともにデジタルカメラによる撮影を行った.とくに題跋や印影については,今後の検討材料となりうる成果である.2.所蔵敦煌・吐魯番文献の研究(1)敦煌研究院所蔵の敦煌文献には,北魏時代,5世紀前半のものが含まれており,暦書の貴重な実例である.(2)浙江省博物館所蔵の敦煌文献には,付領文書が含まれている.同種のものは,ロシアのサンクトペテルブルグにも所蔵されており,比較対照作業へと道を拓く可能性が確認できた.また近年出土した唐西州時代の吐魯番文書にも類例を見出すことができるものである.1.敦煌文献を所蔵していると報道があった黒竜江省図書館において、現地に赴いて副館長立ち合いのもとで所蔵目録やカードなどを調べてみたが、同館には所蔵されていないことが判明した.また分担者の鶴田が河南省博物館に赴き、関係者に確認したところ、同館にも該当の文献は所蔵されていないことが明らかになった.従って従来の報道は修正の必要がある.2.北京大学図書館においては、敦煌・吐魯番文書を約20点程閲覧し調査を行なった.その際あわせてデジタルカメラにより撮影を試みた.とくに題跋や印もデジタル撮影によって比較作業が可能になった.これは李盛鐸研究にも多くの材料を提供することになろう.詳細は次年度の課題である.3.天津市歴史博物館においては、3点の敦煌文書を閲覧し調査を行なった.いずれも詳細不詳のまま残されていたものであるが、その中の仏説仏名経は題記から帰義軍時代のものと判明した.この時代、同名の経典が多く書写されており、敦煌仏教の性格の一端がここから明らかになる.これも課題である.4.以上のような成果については、北京において栄新江北京大学教授・〓中国文物研究所研究員など中国の研究者と交流した際報告して意見交換を行なった他、以下のような発表によって示した。(1)関尾史郎「トウルファン、高台出土五胡時代契約文書初探」2003年1月11日内陸アジア出土古文献研究会例会(2)岩本篤志「唐朝の医事政策と『新修本草』-李盛鐸将来『新修本草』序例を手がかりとして-」2003年3月5日西北出土文献を読む会例会1.敦煌研究院、敦煌市博物館など地元敦煌の所蔵機関において敦煌出土漢文文献の閲覧・調査を行ない、約20点の文献を対象とすることができた.これら文献はいずれも510世紀に書写されたもので大半は写経である.異体字や別字の使用状況,避諱の有無、朱筆の使用,紙の貼り継ぎ方などの諸点に留意しながら閲覧を行なった.また文献が出土した敦煌莫高窟ならびにそれと同時代の西千仏洞の参観も行なった.2.西安の西北大学図書館では4点の敦煌文献を閲覧できた.また全所蔵点数が6点であることも確認した.いずれも写経だが,入手した経緯やそれに関わる真贋の問題について副館長と意見交換を行なった.

西安の諸機関のうち敦煌文献を収蔵しているのは西北大学図書館と陝西師範大学図書館だけで,陝西省博物館や陝西省図書館には所蔵されていないことも確認できた.従って陝西省博物館に所蔵されているという従来の説は再検討を迫られることになる.3.西安の陝西省博物館・碑林・陝西省考古研究所などでは,敦煌文献と同時代の石刻資料を閲覧した.とくに異体字や別字の使用状況,書体・書風について手がかりを得るためである.最後の考古研究所では壁画など非文字資料も参観し,莫高窟の壁画や同じ敦煌仏爺廟湾の魏晋墓から出土した画像磚などとの比較対照の可能性についてもあわせて検討した.とくに魏晋墓は莫高窟の技術的・社会的な前提を用意したと言うことができる.1.中国・浙江省の浙江省博物館において所蔵敦煌文献を閲覧・調査することができた.内容は写経を中心として,一部断片的な俗文書にも及んだ.2.写経のうち,『佛説天地八陽神呪經』は偽経だが,ロンドンの大英図書館所蔵のスタイン将来敦煌文献のコレクションに含まれる写本と比べると,特色を有するものであることが初歩的な比較対照の結果,明らかになった.今後,スタイン文献のみならず,パリの国立図書館所蔵のペリオ将来敦煌文献のコレクションに含まれる写本なども含めて,本格的な比較対照作業が必要となろう.3.俗文書のなかで注目されたのは,断片的な交付文書の一種だが,同種のものには,サンクトペテルブルグのロシア科学アカデミー東洋学研究所サンクトペテルブルグ支所に所蔵されているものがあることが指摘できる.今後は本研究の成果をふまえ,これらを比較対照する作業が必要となろう.4.文献の性格や内容を問わず,筆写の過程で誤字・脱字をいかにして修正するのか,という問題関心から各種文献を仔細に観察すると,多様な手段が使われているごとを再認識することができた.その手段によって,当該文献の性格や機能,換言すれば重要性がわかるし,またさらに言えば,当該文献の真贋判定にも手がかりを提供することになるという確信をもつことができた.
放射線治療中の癌細胞"再増殖"に関する遺伝子蛋白発現の解明および分子画像

マウス肉腫細胞QRsPを用い、放射線照射により誘発されるがん細胞"再増殖(repopulation)"という現象が、放射線耐性株の出現にあることをin vitroの実験系で明らかにした。耐性株(QRsPIR)のmRNA発現を網羅的に検索したところ、親株と比較して、matrix metalloproteinase(MMP)13が26倍、MMP3が22倍、の発現上昇を認め、またCDK inhibitorであるP16およびP57がそれぞれ1/15,1/12に発現が低下をしていた。同時にクローニングした他の耐性株についても、MMP13、MMP3、P16、P57の発現はそれぞれ4.0倍、6.4倍、1/11、1/7.6とほぼ同様の結果がえられこれらの細胞株の強い増殖・浸潤能が示唆されるとともに、耐性株は元来親細胞株の中にヘテロに存在していたものがセレクションされた可能性が示唆された。さらにC57BL/6マウス(not node mouse)への移植実験によりQRsPIRが"がん幹細胞"の特徴(高い移植率と増殖能、自己再生能)を有していることが明らかになった。また、QRsPIRの腫瘍組織のarrayパターンとin vitroのデータを比較し、両者に共通する約80の遺伝子発現を認め、この中に固形癌の"がん幹細胞"のマーカー分子が潜んでいる可能性が高い。2つのヒト肺癌細胞株H1299(p53-/-)とA549(p53+/+)を用いた照射実験にても、照射に誘発された再増殖細胞は、放射線耐性となったQRsPIRに共通する遺伝子発現(MMP, integrin, rhoなど)を示し再増殖の背後に、種を越えた共通の遺伝子的背景があることが判明した。この様に放射線照射中に出現する放射線耐性・高度増殖能をもった癌細胞に対しの戦略として癌栄養血管からの大量の抗癌剤注入と放射線治療との組み合わせが有効であることを臨床例で示した。また腫瘍の悪性度に応じた(cDNAアレイを用いた)オーダーメードの治療法の可能性を頭頚部原発悪性リンパ腫の治療の分析より示した。マウス繊維芽肉腫細胞株QRSP11に対し0,10,20,30Gyの異なる放射線の総量を投与しコロニーアッセイを施行した。10Gyで22/10^4の比率でコロニーの発現を認めたが、20Gy以上ではコロニーは出現しなかった。つぎにこの細胞についてP53のmutationの有無を各エクソンについて検索しwild typeであることを確認した(上記コロニーアッセイとあわせ、この細胞は放射線にsensitiveであるといえる)。10Gy照射後に形成された細胞集落のうち6コロニーをクローニング(耐性候補株として)し、これら細胞株に10Gyの放射線照射を施行し(トータル20Gy)、親株と耐性候補株の間のコロニー出現率を比較した。6個の耐性株候補のうち一つが88/10^4のコロニー形成率(親株の4倍)を示し、放射線照射に耐性となっていることが示された。次に親株とこの耐性株の間でcDNAアレイを用いてmRNAの発現の差を検出した。耐性株において2倍以上の発現を示したmRNAが133個、また親株で2倍以上の発現を示したmRNAが239個検出された。

このうち前者においては、interleukin6(Il6)が36倍、matrixmetalloproteinase 13(Mmp13)が26倍、matrixmetalloproteinase 3(Mmp3)が23倍、GR01 oncogene(Gro1)が13倍、後者においてはcyclin-dependent kinase inhibitor 1C(P57)(Cdkn1c)が12倍、cyclin-dependent kinase inhibitor 2A(Cdkn2a)が15倍の発現を示した。これらのことから耐性株では腫瘍増殖にかかわる因子について10倍以上のオーダーの強発現がみられ、また細胞周期を抑制する因子について10倍以上のオーダーで親株よりも発現が低下していることが分った。以上の結果より細胞株を用いた実験ではあるが、臨床の場で観察されている放射線照射後の癌細胞再増殖という現象を分子レベルである程度矛盾なく説明したといえる。また臨床例においてもDNAアレイが悪性腫瘍の予後示す有効な手段となることを悪性リンパ腫の治療成績の解析の中で示した。マウス肉腫細胞QRsPを用い、放射線照射により誘発されるがん細胞"再増殖(repopulation)"という現象が、放射線耐性株の出現にあることをin vitroの実験系で明らかにした。耐性株(QRsPIR)のmRNA発現を網羅的に検索したところ、親株と比較して、matrix metalloproteinase(MMP)13が26倍、MMP3が22倍、の発現上昇を認め、G1/S期において細胞周期を停止させるCDK inhibitorであるP16およびP57がそれぞれ1/15,1/12に発現が低下をしていた。同時にクローニングした他の耐性株についても、MMP13、MMP3、P16、P57の発現はそれぞれ4.0倍、6.4倍、1/11、1/7.6とほぼ同様の結果が得られ、これらの細胞株の強い増殖・浸潤能が示唆されるとともに、耐性株は元来親細胞株の中にヘテロに存在していたものがセレクションされた可能性が示唆される。さらにC57BL/6マウス(not node mouse)への移植実験によりQRsPIRが"がん幹細胞"の特徴(高い移植率と増殖能、自己再生能)を有していることが明らかになった。また、QRsPIRの腫瘍組織のarrayパターンとin vitroのデータを比較し、両者に共通する約80の遺伝子発現を認め、この中に固形癌の"がん幹細胞"のマーカー分子が潜んでいる可能性が高い。2つのヒト肺癌細胞株H1299(p53-/-)とA549(p53+/+)を用いた照射実験にても、照射に誘発された再増殖細胞は、放射線耐性となったQRsPIRに共通する遺伝子発現(MMP, integrin, rhoなど)を示し再増殖の背後に、種を越えた共通の遺伝子的背景があることが判明した。
日独両国および両国民の将来像--意識の実証的研究に基づく--

日本及びドイツは第二次世界大戦後,荒廃から立ち上がり,異なる道を辿りながら繁栄の頂点に立ち,世界に強い影響を及ぼすに至った。今後ドイツ及び日本がどうなって行くかは,アジア諸国,ECに大きな影響を与えることはもとより,世界の行く方を左右する大きな要因となることは間違いない。今日到り得た繁栄は同じようなものであっても,ここに到る過程には,同じ所と異なったところがある。これが今後の両国の発展の様相を方向付けることになる。この発展の動因は,両国の人々の考え方,社会意識に基づくところが極めて大きいものと考えられる。特にドイツにおいては,旧東ドイツの合併問題の影響を見極めておくことも不可欠のことであり,最近の東ヨーロッパの状況とも無縁ではない。これらのことを研究する方法は様々あるが,思弁的方法によるものは,ややもすると思いつき,思い込みが先行し,成果の科学的積み上げは困難である。我々の立場はこれと異なり,計量的方法によるのがその特色である。日独共同研究により,国民性・社会意識の変遷を実証的に捉え,さらに,これが過去の発展とどう係わってきたかを明らかにする。こうして国民性・社会意識の変化を踏まえ,今後の日本(人)・ドイツ(人)の行方の同異のすがたを科学的方法によって探ることが本研究の目的である。即ち,(1)両国民の態度,意識構造,物の考え方,生活様式等の社会的,文化的側面についてその同異のあり方を比較・検討する。これらの側面は両国の社会において今後一層重要度を増すとみられる。(2)(1)で比較・検討された側面のうち,たとえば社会構造,社会的変化,経済的安定度あるいは労働意欲,消費行動,政治的態度等について,相互関連の強い要因を探索する。(3)これらにより本研究の主目的である将来の方向を予測する手がかりが得られる。年度別計画は次の通り平成4年度は幅広く問題を取り上げ基礎資料の再検討を行なった,これらは,◎問題意識の明確化◎研究内容の決定◎実証的研究実施のあり方の討論,決定および共同調査項目決定を含むものであり,日本側より1993年3月別紙のように研究者8名が訪独し,調査打ち合せを行なった。平成5年度は◎日独それぞれでデータ収集日本側--日本国内で全国調査ドイツ側-旧東ドイツを含む全体で調査データ交換,データ分析の実施◎日本側より訪独(1993年10月)研究発表・討論・まとめ◎成果の刊行準備(成果の刊行は次年度以降別途考える)の予定である。
バクテリオファージライシンを利用する新しい多剤耐性結核制御法の創出

近年多くの病原細菌で多剤耐性化が進行しており、抗菌薬にのみ依存した細菌感染症治療の将来が懸念されている。この状況は結核においても同様であり、抗菌薬が無効の場合の対処法が求められている。本研究では、抗菌薬非依存的な結核制御法の可能性の一つである、バクテリオファージ(ファージ)の溶菌酵素(ライシン)を使用する、いわゆるファージライシン療法の開発を行う。ライシンの供給源は、低病原性のスメグマ菌と高病原性の結核菌の両者に感染できるファージY10、およびその近縁ファージとする。これらのライシンを使用し、単独生活の結核菌およびマクロファージ内の寄生状態の結核の両者を殺菌するシステムの構築を行なう。
ファイナンスにおけるジャンプ型モデルの数値解析とマリアバン解析の応用

本研究では、主にMalliavin解析や作用素分解法を使いジャンプ型確率微分方程式解のシミュレーション方法について研究を行った。新シミュレーション方法を発見し、数学的な性質について結果を得た結果、従来の方法に比べ正確で素早く計算できる方法を発見した。また、数理ファイナンスモデルでよく使用されるジャンプ型確率微分方程式は、リスクを計るためにGreeksと呼ばれる量を計算しなければならない。この分野におけるさまざまな無限次元部分積分公式により計算式が得られシミュレーションを行った。アジアン型確率変数に対しての密度関数の下からの評価を得られて、これからフィルテリングに対しての応用を考えています。1.ジャンプ型確率微分方程式に対して楠岡近似を基にした新方法を提案した。この方法によりレヴィ測度が無限大であっても適用できる。金融モデルでは(たとえばVariance Gamma過程、CGMY過程、generalized hyperbolic過程、normal inverse Gaussian過程などが候補に挙げられている)各時間区間に無限回ジャンプがあり、計算時間が長くなることが問題であった。提案した方法ではジャンプの数を制限することにより誤差評価が得られた。2.金融リスク管理のためにGreeksと呼ばれるリスク量について研究を進めている。特にVGモデルのブラウン運動に関する部分積分公式やBismutの方法を用いた計算式を得、シミュレーションを行った。今後、Bouleau-Denisの方法を使って新しい算出公式を作り上記の計算式と比べる必要がある。多次元問題に関しては、Malliavin-Thalmaier公式を使い、シミュレーションの実験が終わった。3.ベイズ推定とシミュレーションを合わせた方法のパラメータ設定は、理論的な誤差評価に従って可能になった。4.常理論的なMalliavin解析に関してアジア型確率微分方程式の密度関数の下からの評価を得られた。この例が楕円型ではないため、これからの分野展開に参考になると思われる。5.部分積分公式を使い統計学的な推定量を作ることが証明できた。今後、ジャンプ型モデルに適用し、新推定量を提案する予定である。今年度、ジャンプ型確率微分方程式の近似に関して:前年度の結果を踏まえて、ランダムな時間を使ったシミュレーション方法を拡張し、ブラウン運動を含めたLevy過程に関して近似方法を提案し、その誤差評価が得られた。この方法を使うためにモーメントの存在が必要だが、安定分布の場合ではモーメントが存在しないため特別な解析を行う必要がある。誤差評価が難しいため、現在この解析の研究を行っている。ジャンプ型過程のMalliavin解析に関して、リスク量を計るためにジャンプ型モデルのGreeksの計算方法を検討し、いくつかの基本と思われる公式を得た。また、この公式よりさらに、最適な方法がないかと検討している。特に、分散減少法や加重サンプリング法の構築を行う。このため別の部分積分公式について研究を行う必要がある。Bayesian方法のパラメータ推定の場合にもシミュレーションを用いることが、度々あるがその近似誤差についての研究が少なく、特にtunningの必要が認められているが、理論的な研究を成功させた。この結果は、非常に理論的でありながら具体的な応用にも影響があると思われる。(現在、査読中)Malliavin解析が応用道具として使われている時に、確率微分方程式の係数が滑らかであるという仮定が必要であるが、応用例では係数が滑らかでないケースがある。そのため、ドリフトが滑らかでない場合についての解析方法を検討した。その結果、Asianと呼ばれる確率変数に関して密度関数の存在と滑らかさについての結果が得られた(現在、査読中)。しかし、この確率変数は、楕円型ではないので偏微分方程式法(Krylov氏)による証明ができない。一つの応用として、非線形偏微分方程式の近似に関して検討を行っている。特にポテンシャルが滑らかでないときの近似法や誤差評価について検討を行っている。確率微分方程式の近似理論:応用問題においては、ジャンプの頻度、特に小さいジャンプが多いものに関してはシミュレーションを行うことが難しい。本研究ではその背景を踏まえ、ジャンプ型確率微分方程式に関して新計算方法を提案した。その新計算方法は、ジャンプ数を制限した環境でシミュレーション方法を提案し、数値解析を行った。また、小さいジャンプが多いモデルではその小さいジャンプの近似について以下の研究を行った。誤差評価の証明を元にし、近似の理論的な性質が判明した。さらにその理論的性質を具体的な金融モデルに適用した。これによってLevy測度が無限である時にも適用可能であることが分かった。主な考え方として作用素分解法を用いる。密度関数の推定問題:連続過程の場合における多次元の密度関数の近似方法を提案し、金融リスク量のGreeks計算方法を提案し、理論の結果とシミュレーションの結果についてさまざまな論文にまとめた。ここで使った基本数学はMalliavin-Thalmaier公式であるが、この公式をそのまま使うと分散が発散することが起こり、我々の研究では核推定という修正方法を使った。また、数学的な証明を与えることでシミュレーションパラメーターが調整可能となった。さらに、この方法を使って金融リスクの数値計算を行った。

Malliavin解析の数理ファイナンスの応用:Greeksと呼ばれる量の計算に関して研究を行った。最初にジャンプの性質を使って金融モデルに適用し、シミュレーションも行った。その結果、方法として適用が実現可能であること示した。その後、具体的な部分積分公式を証明し、それによって非連続な金融商品でもこの技術が適用可能であることを証明した。密度関数の下からの評価:ジャンプ型確率微分方程式の場合やFractional Brownian motionの確率微分方程式の場合でも、上からと下からの評価を得られるかどうか検討し始め、いくつかの結果を得られた。特にジャンプ型確率微分方程式では上からと下からの評価が空間に関して同様の性質であったため、これからこの評価を使い統計学の近似論で使えるかどうか検討する。
リソソームのターンオーバーと数に関する制御機構

本年度は、昨年度に引き続きオートファジー関連遺伝子EPG5の機能を、オートファジー経路のどこに働いているのかおよびリソソーム機能に与える影響をセルラインとゲノム編集を用いた方法で評価した。これまでEPG5に変異のあるVici症候群患者皮膚線維芽細胞を用いた解析およびHeLa細胞でsiRNAを用いたEPG5のノックダウン実験を行い、オートファジー機能の低下が観察されていた。しかしエンドサイトーシスの機能は全く正常であった。細胞の懸濁液で評価したリソソーム酵素活性は正常か軽度低下に留まり、リソソームの分解機能に障害を与えるほど(10%以下)の低下は認めず、数の変化も明らかではなかった。本年度はsiRNAで用いたものと同じHeLa細胞に対してCRISPR/Cas9を用いてEPG5遺伝子を破壊し、オートファジー及びエンドサイトーシスの評価を行った。皮膚線維芽細胞やノックダウンで認められたオートファジーの障害と正常なエンドサイトーシスはノックアウト細胞でも同様の結果を示した。さらに皮膚線維芽細胞やノックダウンにてはっきりしなかったEPG5のオートファジーへの作用点に関しては、オートファゴソームのマーカーであるLC3とリソソームのマーカーであるLamp1の共局在、オートファゴソームとリソソームの融合を酸性度で評価するtfLC3などを用いて、最終的にEPG5はオートファゴソームとリソソームの融合に働いている事を明らかにした。同様の結果は海外のグループからも確認されたが、我々の研究ではエンドサイトーシスが正常である点において未だ意見の相違がある。本研究結果は申請者を(共)筆頭著者として現在論文を投稿中である。28年度が最終年度であるため、記入しない。リソソーム酵素のマンノース6リン酸(M6P)化が障害されているムコリピドーシスII型(MLII)のモデルマウスを用い、免疫細胞に焦点を当ててリソソーム機能の解析を行った。MLIIマウスではリンパ球B細胞のリソソーム機能が特異的に障害されている事が明らかとなり、その結果B細胞の増殖・分化・抗原提示能・抗体産生能が低下していた。一方でT細胞の機能は正常であった。以上の事から、B細胞とT細胞ではリソソーム酵素の細胞内輸送経路が違う事が示唆され、B細胞はプロテアーゼの運搬をよりM6Pに依存している一方で、T細胞はM6P非依存性の細胞内輸送を利用している事が分かった。興味深い事に両細胞においてグリコシダーゼ活性は保たれており、グリコシダーゼはM6Pに非依存性に輸送されている可能性が示唆された。酵素特異的・組織特異的なリソソーム酵素輸送経路が複数存在している事が改めて確認され、本研究を基礎としてM6P非依存性経路の解明及びリソソーム酵素の新しい補充方法(ドラッグデリバリーシステム)の開発が期待出来る。また、本研究結果はMLII患者においても確認され、患者のフォローにおける臨床的意義も高い。本年度はリソソーム機能とオートファジーの関連に関して解析を進めた。オートファジーに関連する遺伝子として同定されたEPG5(Vici症候群の原因遺伝子)に注目し、患者細胞を用いてオートファジーの解析を行った。患者細胞ではオートファジー機能の低下は既報のモデルマウスやノックダウンの報告に比べると非常に軽度であった。非常に興味深い事に、オートファジー経路に異常が出ている一方でエンドサイトーシス経路には全く異常を認めなかった。さらにノックダウン細胞を用いて同様の実験を行い、同様の結果を得た。これは既報と異なる結果であった。オートファジー分解系のどの部分に障害があるかを検討したところ、オートファゴソームの形成やリソソームとの融合には異常を認めなかったが、融合後のオートリソソームの分解に障害があった。リソソーム酵素は保たれているもののリソソームの酸性化が障害されている事が分かった。従ってオートファジーに異常によってリソソーム機能が影響を受けている可能性が示唆される。今後CRISPR/Cas9を用いたノックアウト細胞を樹立し解析を進める予定である。今後リソソーム機能を解析し、オートファジーがリソソーム機能に与える影響を検討する。本年度(2年目)はオートファジーの欠損細胞を用いた解析(当初では3年目の計画)を先に行ったためリソソーム側の評価についてはまだであるが、それは次年度に行う予定である。

さらに皮膚線維芽細胞やノックダウンにてはっきりしなかったEPG5のオートファジーへの作用点に関しては、オートファゴソームのマーカーであるLC3とリソソームのマーカーであるLamp1の共局在、オートファゴソームとリソソームの融合を酸性度で評価するtfLC3などを用いて、最終的にEPG5はオートファゴソームとリソソームの融合に働いている事を明らかにした。同様の結果は海外のグループからも確認されたが、我々の研究ではエンドサイトーシスが正常である点において未だ意見の相違がある。本研究結果は申請者を(共)筆頭著者として現在論文を投稿中である。研究計画に従って研究を行い、論文発表を行った。当初の計画どおり、引き続きリソソーム機能の評価とオートファジーの関連について解析を進めていく。28年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画どおり研究を進めていく。
生体内恒常性制御システムを標的とした、生活習慣病と慢性臓器障害治療薬の創出

生活習慣病や慢性臓器障害の新規治療戦略のためには、生体内恒常性制御のメカニズムの包括的な解析を進め、病態の本質を解明することが不可欠である。我々は、生体内の恒常性維持と臓器間連携を司る、新しい「生理活性因子の情報制御システム」=「RAMPシステム」を同定し、生活習慣病や慢性臓器障害の新たな治療標的としてRAMPシステムに着目した。アドレノメデュリン(AM)は、血管拡張作用をはじめ、血管新生作用、抗酸化ストレス作用、抗炎症作用など多彩な生理活性を有する心脈管作動物質である。我々はAMの機能の多様性を制御するメカニズムを解明するため、AMの受容体システムに着目した。AMおよびそのファミリーペプチドからなるカルシトニンスーパーファミリーの受容体である7回膜貫通型Gタンパク共役型受容体CLRには、RAMPと呼ばれる受容体活性調節タンパクが結合し受容体の機能を制御している。RAMPには13までのサブアイソフォームが存在する。本研究では、我々のこれまでの研究基盤に基づき、心血管代謝系疾患を中心に、RAMPシステムの障害に伴い、生体内外からのストレスへの応答不全・破綻から引き起こされる病態のメカニズムを解明する。各病態に対して、抗体や低分子化合物を用いることで、RAMPシステムの制御法を開発する。これらのアプローチにより、生活習慣病や慢性臓器障害などに対する新たな創薬につなげることを目的とする。アドレノメデュリン(AM)は、血管拡張作用に留まらず、多彩な生理活性を有するペプチド因子である。我々はこれまで、AMおよびAM受容体活性調節タンパクRAMP2のホモノックアウトマウス(-/-)が、共に血管の発生異常により胎性中期に致死となること、さらに血管内皮細胞特異的RAMP2-/-も、その多くが血管の構造異常と全身性浮腫により出生直前に致死となることから、AM-RAMP2系が血管の発生、特に血管内皮細胞の分化に必須の因子であることを明らかとした。一方、成体の血管におけるAM-RAMP2系の意義の詳細は不明であった。我々は、RAMP2遺伝子改変マウスを用いてWire injury modelを作成し、RAMP2系の病態生理学的意義を検討した。まず、成体が得られるRAMP2ヘテロノックアウトマウス(RAMP2+/-)を用いて、大腿動脈にWire injuryを行い、新生内膜形成を検討した。4週間後、RAMP2+/-では野生型マウス(WT)に比較して、有意に新生内膜形成が亢進し、再内皮化の抑制、平滑筋増殖の亢進、新生内膜、外膜のマクロファージ浸潤亢進、炎症性サイトカインや酸化ストレスレベルの亢進を認めた。次に、成体において血管内皮細胞RAMP2欠損を誘導することができる、誘導型血管内皮細胞特異的RAMP2-/-(DI-E-RAMP2-/-)を作成して同様の検討を行ったところ、新生内膜形成の著明な亢進が確認された。さらに、骨髄由来幹細胞の関与を検討するため、骨髄移植(BMT)を行なったところ、RAMP2+/-からWTにBMTを行なったマウスでは、RAMP2+/-と同等の新生内膜形成が認められた。以上から、AM-RAMP2系は、血管内皮再生作用、抗炎症作用、抗酸化ストレス作用により新生内膜形成を抑制すること、さらにこうした血管保護作用には骨髄由来血管前駆細胞の関与が示唆された。従来、RAMP2とRAMP3の機能分化や病態生理学的意義は不明であった。今後の研究では、RAMP2とRAMP3について、胎生期から全身で遺伝子欠損させたマウス、あるいは成体において各組織特異的に遺伝子欠損を誘導できるマウスを樹立し、発生の異常や、成体での遺伝子欠損誘導後の変化を検討し、両者の機能分化を明らかとする。さらに、炎症の促進に関わるRAMP3を抑制する、あるいは炎症の抑制に関わるRAMP2を活性化することで、潰瘍性大腸炎などの自己免疫性疾患の治療に応用する。我々はこれまで、AMおよびAM受容体活性調節タンパクRAMP

2のホモノックアウトマウス(-/-)が、共に血管の発生異常により胎性中期に致死となること、さらに血管内皮細胞特異的RAMP2-/-も、その多くが血管の構造異常と全身性浮腫により出生直前に致死となることから、AM-RAMP2系が血管の発生、特に血管内皮細胞の分化に必須の因子であることを明らかとした。一方、成体の血管におけるAM-RAMP2系の意義の詳細は不明であった。我々は、RAMP2遺伝子改変マウスを用いてWire injury modelを作成し、RAMP2系の病態生理学的意義を検討した。まず、成体が得られるRAMP2ヘテロノックアウトマウス(RAMP2+/-)を用いて、大腿動脈にWire injuryを行い、新生内膜形成を検討した。4週間後、RAMP2+/-では野生型マウス(WT)に比較して、有意に新生内膜形成が亢進し、再内皮化の抑制、平滑筋増殖の亢進、新生内膜、外膜のマクロファージ浸潤亢進、炎症性サイトカインや酸化ストレスレベルの亢進を認めた。次に、成体において血管内皮細胞RAMP2欠損を誘導することができる、誘導型血管内皮細胞特異的RAMP2-/-(DI-E-RAMP2-/-)を作成して同様の検討を行ったところ、新生内膜形成の著明な亢進が確認された。さらに、骨髄由来幹細胞の関与を検討するため、骨髄移植(BMT)を行なったところ、RAMP2+/-からWTにBMTを行なったマウスでは、RAMP2+/-と同等の新生内膜形成が認められた。以上から、AM-RAMP2系は、血管内皮再生作用、抗炎症作用、抗酸化ストレス作用により新生内膜形成を抑制すること、さらにこうした血管保護作用には骨髄由来血管前駆細胞の関与が示唆された。従来、RAMP2とRAMP3の機能分化や病態生理学的意義は不明であった。今後の研究では、RAMP2とRAMP3について、胎生期から全身で遺伝子欠損させたマウス、あるいは成体において各組織特異的に遺伝子欠損を誘導できるマウスを樹立し、発生の異常や、成体での遺伝子欠損誘導後の変化を検討し、両者の機能分化を明らかとする。さらに、炎症の促進に関わるRAMP3を抑制する、あるいは炎症の抑制に関わるRAMP2を活性化することで、潰瘍性大腸炎などの自己免疫性疾患の治療に応用する。
慢性疼痛における反応の場脊髄での細胞内情報伝達と細胞間生理活性物質の時空間的解析

神経障害性疼痛、帯状疱疹後神経痛、末梢神経再生動物モデルでグルタミン酸受容体NR2BサブユニットのTyr1472のリン酸化が慢性疼痛の維持に必須であることや神経損傷を増悪させること、リン酸化カスケード、PGE2とNOが脊髄後角の活性化ミクログリアの遊走を阻害することを明らかにした。多光子励起顕微鏡や質量顕微鏡を用いて脊髄後角での神経回路網の時空間的解析を行った。さらに臨床応用をめざして、徐放剤による術後鎮痛法の開発や帯状疱疹後神経痛患者の脳脊髄液のプロテオミクス解析を行った。本研究では、疼痛刺激の入力応答反応に伴う可塑性変化を分子レベルから疼痛行動まで1ヶ月以上の長期にわたり、in vitro、in vivoで解析できる脊髄の利点を利用して、(1)慢性疼痛に伴う脊髄の神経可塑性におけるグルタミン酸受容体-Ca^<2+>/カルモジュリンキナーゼII(CaMK II)の情報伝達機構の解析、(II)反応の場脊髄後角でのニューロン-グリア間相互作用における生理活性物質プロスタグランジンE_2(PGE_2)や一酸化窒素(NO)の時間的、空間的解析、(III)NMDA受容体、PACAPなど疼痛反応に関与する物質の末梢神経再生に対する役割を解明することを目的とする。今年度は、(1)NMDA受容体サブユニットNR2BのTyr1472をPheに置換してリン酸化できないノックインマウス(NR2BY1472F-KI)で神経因性疼痛が生じないことを確認し、神経因性疼痛に関与する因子の中で、NMDA受容体の活性化とCaMKIIの活性化(T286のリン酸化と細胞膜へのトランスロケーション)のみが障害されていることを明らかにした。さらにトランスロケーとしたCaMKIIが細胞膜上のAMPA受容体のGluR1サブユニットのSer831をリン酸化することを示した。NR2BY1472F-KIマウスと野生型マウスのプロテオミクスにより2つの候補タンパクを同定し、現在ノックアウトマウスを作製し、標的候補タンパクの機能解析の準備を進めている。(II)PGE合成酵素のノックアウトマウスに神経因性疼痛モデルを作製し、神経因性疼痛にPGE_2が関与すること、さらに、PGE受容体サブタイプEP1EP4の中で、PGE_2は直接EP2を介して、EP1を介して産生されたNOにより間接的にミクログリアの遊走を抑制することを明らかにした。本研究は、疼痛刺激の入力応答反応に伴う可塑性変化を分子レベルから疼痛行動まで1ヶ月以上の長期にわたり、in vitro、in vivoで解析できる脊髄の利点を利用して、遺伝子改変マウスを駆使して、生体機能分子の役割と機能の解析に焦点をあて、その成果を疼痛治療への臨床応用をめざすことを目的としている。昨年度は(1)ノシスタチンは,オピオイドペプチドのノシセプチン/オーファニンFQ(N/OFQ)と同一の前駆体タンパク質から産生され神経ペプチドである。ノシスタチンの疼痛制御の分子機構を明らかにするため,ノシスタチンを固定化したラッテクスビーズ(SGビーズ)を用いノシスタチンに結合する分子NIPSNAP1の同定に成功した。さらに、NIPSNAP1のノックアウトマウスを作製し、ノシスタチンの疼痛抑制反応に関与する分子であることを明らかにした。(2)基礎研究の疼痛治療への臨床応用をめざすために、術後痛を緩和するために、術後痛モデルをラットで作製し、生体吸収性ハイドロゲルの手術創埋込みによる鎮痛薬の除放効果を用いた術後鎮痛法を開発した。局所麻酔薬リドカイン、消炎鎮痛薬で1週間にわたる効果が見られ、現在、この術後鎮痛法の臨床応用への取り組みを行っている。(3)ヘルペスウイルス接種による帯状疱疹、帯状疱疹後神経痛モデルを作製した。野生型モデルマウスでは50%以上のマウスで50日後にも帯状疱疹後神経痛が持続したが、NMDA受容体遺伝子改変マウスでは、帯状疱疹後神経痛の発症頻度、強度が減少し、NMDAグルタミン酸受容体が帯状疱疹後神経痛の発症に関与することを明らかにした。本研究は(1)神経可塑性と慢性疼痛の反応の場・脊髄での細胞内情報伝達と細胞間情報伝達物質の時間的、空間的解析、(2)末梢神経再生における疼痛反応の役割に焦点を当てている。平成24年度は、1)一酸化窒素(NO)は細胞間伝達物質としてcGMP-PKG系とS-nitrosyl化、Tyr-nitro化による多彩な反応で多様性を示すことを明らかにした。2)神経障害性疼痛モデルだけでなく、帯状疱疹後神経痛においてもNMDA受容体を介する疼痛維持機構があることを示した。

さらに帯状疱疹後神経痛患者の脳脊髄液をプロテオミクス的手法で解析し、プロスタグランジンD合成酵素が減少することを明らかにし、微量かつ迅速な測定法を開発した。3)茸毒アクロメリン酸の脊髄後角での作用機構を明らかにするために、そのアロディニア誘導作用を抑制する化合物PSPA4の11C標識を合成し、その結合活性と抑制作用を検討した。4)我々が発見したノシスタチンの結合タンパクNIPSNAP1の同定、さらにノックアウトマウスを作製してノシスタチンの疼痛抑制作用に関与する分子であることを明らかにした。5)我々が確立した神経再生モデルで、さまざまな物質の神経再生における役割を検討し、脊髄後角だけでなく、神経再生においてもニューロン・グリアの細胞間相互作用が重要であることを明らかにした。また、6)徐放性剤による術後鎮痛法の開発を行った。現在、疼痛刺激の入力応答に伴う可塑性変化をin vivoで解析できる脊髄の利点を利用して、神経回路網を可視化できるレポーターマウスを用いて多光子励起顕微鏡下に神経回路網を構成するニューロン群のイメージング、質量顕微鏡によるPGE2のイメージングを推進している。上記の通り、実験結果を次々と論文発表している。24年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画通り、CaMKIIキナーゼ活性欠損マウスの疼痛行動と神経可塑性の解析を進める。質量顕微鏡のテーマを進める。年度末に学舎移転を予定しているので、それまでに実験を進め、論文作成に取り掛かる。
注血吸虫の発育に伴うDNA配列の変動

マンソン注血吸虫と日本住血吸虫のDNAのサザン法で分析し,注血吸虫におけるDNA再構成について検討した。マンソン注血吸虫ミラシジウムの全DNAをプロ-ブとして用いたサザン解析の結果から,マンソン住血吸虫ミラシジウムに存在するDNA配列が成虫では大規模に減少する事が明らかとなった。一方マンソン住血吸虫成虫雄の全DNAをプロ-ブとして解析結果から,成虫雄に存在するDNA配列が,幼虫のミラシジウムDNA中では1部のみが存在する事が示唆された。更にマンソン住血幼虫ミラシジウムDNAより得られたDNAクロ-ンのあるものでは,その配列がマンソン住血吸虫成虫に存在しない事が示された。また,マンソン住血吸虫成虫DNAから得られた二個のDNAクロ-ンの配列は,マンソン住血吸虫ミラシジウムや日本住血吸虫ミラシジウム及び成虫には存在していない事が判明した。以上の結果から,マンソン住血吸虫において,それぞれの発生段階に特異的なDNA配列が存在する事が示唆された。また日本住血吸虫とマンソン住血吸虫虫卵DNAには終宿主であるマウスのいくつかの反復配列が存在する。それらの配列はA型レトロウイルス,C型レトロウイルス,B1,B2及びミニサテライトmoー2である。ミニサテライトの解析から,住血吸虫DNA中の宿主関連配列の少なくとも一部は本虫の一代の生活環で変化する事が明らかとなった。これらの宿主関連配列の大部分はマンソン住血吸虫成虫DNAには存在しない。従ってマンソン住血吸虫においてはミラシジウムの体細胞が発生,分化する際と,成虫の体細胞が発生,分化する際とでは、異なるDNA再構成が起こることが想定された。これに対して,日本住血吸虫ではDNA再構成をほとんど起こさないか,もしくは,ミラシジウムと成虫の体細胞で同じ様式のDNA再構成が起き,それがマンソン住血吸虫ミラシジウムと同じ様式と考えられる。マンソン住血吸虫と日本住血吸虫のDNAをサザン法で分析し、住血吸虫おけるDNA再構成について検討した。マンソン住血吸虫ミラシジウムの全DNAをプロ-ブとして用いたサザン解析の結果から、マンソン住血吸虫ミラシジウムに存在するDNA配列が成虫では大規模に減少する事が明らかとなった。一方マンソン住血吸虫成虫雄の全DNAをプロ-ブとした解析結果から、成虫雄に存在するDNA配列が、幼虫のミラシジウムDNA中では一部のみが存在することが示唆された。更にマンソン住血吸虫ミラシジウムDNAより得られたDNAクロ-ンのあるものでは、その配列がマンソン住血吸虫成虫に存在しない事が示された。また、マンソン住血吸虫成虫DNAから得られた二個のDNAクロ-ンの配列は、マンソン住血吸虫ミラシジウムや日本住血吸虫ミラシジウム及び成虫には存在していない事が判明した。以上の結果から、マンソン住血吸虫において、それぞれの発生段階に特異的なDNA配列が存在することが示唆された。発育段階に特異的な配列の由来としてはウイルス感染やトランスポゾンによる遺伝子の導入等が考えられる。しかしそれら発育段階に特異的な配列は調べた限り、宿主DNAには存在しない。また外来遺伝子の導入では全DNAの大規模な変動は説明しにくい。従ってマンソン住血吸虫においてはミラシジウムの体細胞が発生、分化する際と、成虫の体細胞が発生、分化する際とでは、異なるDNA再構成が起こることが想定された。一方、日本住血吸虫では、全ての実験において、ミラシジウム、成虫共に、マンソン住血吸虫ミラシジウムとよく似たDNA構成であった。この結果より、日本住血吸虫では発育段階でDNA再構成をほとんど起こさないか、もしくは、ミラシジウムと成虫の体細胞系で同じ様式のDNA再構成が起き、それがマンソン住血吸虫ミラシジウムと同じ様式と考えられる。

従ってマンソン住血吸虫においてはミラシジウムの体細胞が発生,分化する際と,成虫の体細胞が発生,分化する際とでは、異なるDNA再構成が起こることが想定された。これに対して,日本住血吸虫ではDNA再構成をほとんど起こさないか,もしくは,ミラシジウムと成虫の体細胞で同じ様式のDNA再構成が起き,それがマンソン住血吸虫ミラシジウムと同じ様式と考えられる。マンソン住血吸虫と日本住血吸虫のDNAをサザン法で分析し,住血吸虫におけるDNA再構成について検討した。マンソン住血吸虫ミラシジウムの全DNAをプロ-ブとして用いたサザン解析の結果から,マンソン住血吸虫ミラシジウムに存在するDNA配列が成虫では大規模に減少する事が明らかとなった。一方マンソン住血吸虫成虫雄の全DNAをプロ-ブとした解析結果から,成虫雄に存在するDNA配列が,幼虫のミラシジウムDNA中では一部のみが存在する事が示唆された。更にマンソン住血吸虫ミラシジウムDNAより得られたDNAクロ-ンのあるものでは,その配列がマンソン住血吸虫成虫に存在しない事が示された。また,マンソン住血吸虫成虫DNAから得られた二個のDNAクロ-ンの配列は,マンソン住血吸虫ミラシジウムや日本住血吸虫ミラシジウム及び成虫には存在していない事が判明した。以上の結果から,マンソン住血吸虫において,それぞれの発生段階に特異的なDNA配列が存在する事が示唆された。また日本住血吸虫とマンソン住血吸虫虫卵DNAには終宿主であるマウスのいくつかの反復配列が存在する。それらの配列はA型レトロウイルス,C型レトロウイルス,B1,B2及びミニサテライトmoー2である。ミニサテライトの解析から,住血吸虫DNA中の宿主関連配列の少なくとも一部は本虫の一代の生活環で変化する事が明らかとなった。これらの宿主関連配列の大部分はマンソン住血吸虫成虫DNAには存在しない。従ってマンソン住血吸虫においてはミラシジウムの体細胞が発生,分化する際と,成虫の体細胞が発生,分化する際とでは,異なるDNA再構成が起こることが想定された。
食用担子菌由来口腔バイオフィルム制御因子の解明

食用担子菌、特に「しいたけ」子実体のカサの部分の水溶性抽出物に、ミュータンスレンサ球菌のバイオフィルム形成阻害活性を確認した。その作用として、水溶性グルカン合成、グルカン合成遺伝子の発現、バイオフィルム関連シグナル遺伝子発現等が抑制されることを見いだした。特に、バイオフィルム形成の引き金の一つと考えられているcomC遺伝子の発現抑制が起きていることを見いだした。上記の活性は、食用シイタケをはじめ、複数のきのこに存在することを確認し、本研究では、生産量が最も多く、日本のみならず世界において食されているシイタケを主な材料として解析を進めている。まず、シイタケからの抽出法について検討を行ったところ0.4から1M程度の食塩を含む水溶性緩衝液を用いたときに、効率的に抽出が可能であそことが明らかとなった。機能性因子として、低分子化合物、ポリフェノールオキシダーゼ(ラッカーゼ)等の可能性が考えられたが、未知のタンパク質成分が主たる機能性因子であることが明らかとなってきた。シイタケ子実体からの抽出について、子実体の部位、採集時期等の検討を行ったところ、カサの部分にのみ活性が存在し、子実体自己溶解時にバイオフィルム形成阻害活性、あるいはバイオフィルム分解活性が強まる傾向があることを明らかとした。これらの機能性因子本体については精製作業の段階にあり、未だ同定には至っていない。多糖系の担体を使用したカラム全般において、分画が困難であることが判明し、多糖類と何らかの相互作用を持つ成分が機能性因子である可能性が示唆されている。シイタケの子実体より、齲蝕細菌であるストレプトコッカス・ミュータンスのバイオフィルム形成阻害因子の精製作業を実施した。粗精製物の生理活性を検討したところ、グルカン合成の阻害活性、バイオフィルム形成シグナル伝達の撹乱活性が存在する事が明らかになった。細菌の支部なる伝達において主要な役割を担う二成分系がミュータンス菌では15種存在する事が報告されており、そのうちバイオフィルム形成に関連するとされるvicRK, comDE, ciaRK等の発現がシイタケ特異的に発現抑制が見られた。バイオフィルム阻害活性を有すると想定されたタンパク質を電気泳動にて確認、分離し、アミノ酸配列を元に機能未知のcDNAの単離を行った。データベース検索の結果、相同なタンパク質は報告されておらず、阻害活性の確認のため大腸菌をはじめとする複数の宿主にてタンパク質を発現させたが、活性を有するタンパク質の生産には至らなかった。一方で、タンパク質以外の阻害活性物質の一つが、シイタケの熱水抽出多糖類であることが明らかになり、シイタケの有するアルファグルカン、およびその類似物質の関与が示唆された。以上、研究開始当初想定されていたように、シイタケ抽出物中にはグルカン結合タンパク質、分解酵素等の単純な活性物質のみが存在しているのではなく、シグナル伝達を撹乱するなど、多様なバイオフィルム阻害活性物質が存在する事が解明されたが、個々の活性物質の構造決定には至っていない。これまで食品から報告がない、新しいタイプの阻害成分同定と解析を実現するためにはさらなる研究が必要である。