hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
サイクリックADPリボース高親和性安定等価体の創製とその標的分子同定への応用

サイクリックADPリボース(cADPR)結合蛋白質に対する特異的な光アフィニティープローブとして、8-アジド-3"-O-アジドエチルサイクリックADPカーボサイクリックリボース(cADPcR)を設計、合成した。しかし、この誘導体のウニ卵抽出液中におけるCa^<2+>放出活性を評価したところ、ほぼ不活性であった。この理由をcADPcRに対して2箇所置換基を導入したためと考え、8-位のアジド基を除去した3"-O-アジドエチルcADPcRを新たに設計、合成した。しかし、この誘導体もまたウニ卵抽出液中におけるCa^<2+>放出活性はEC_<50>=15μMであり、cADPcR(EC_<50>=0.079μM)と比べて著しく低下した。以上の結果から、cADPcRの3"-位に嵩高い置換基は許容されず、この位置を修飾して特異的な光アフィニティープローブを合成することは困難であることが判明した。一方、cADPcRおよびすべてのcADPcR誘導体が、Jurkat T細胞においてcADPRと比べてCa^<2+>放出活性が低下したことを踏まえて、T細胞においてcADPRと同等のCa^<2+>放出活性を示すことを期待した新たな誘導体、4",6"-不飽和cADPcRを設計した。この誘導体は、cADPcRに比べてよりcADPRに近い安定配座を取ることができ、そのためcADPRと同等の生理活性を示すと考えた。しかし、予想に反しこの誘導体のウニ卵抽出液中におけるCa^<2+>放出活性は、EC_<50>=1.9μMとcADPcRよりも低下した。そこで、溶液中の安定配座を解析したところ、おそらく二重結合を導入したことにより歪みが生じ、cADPRとは異なる配座であることが判明した。一方、T細胞においてはcADPRよりは弱いもののcADPcRを上回るCa^<2+>放出活性を示した。現在、この理由を検討中である。サイクリックADPリボース(cADPR)結合蛋白質に対する、光アフィニティープローブの創製を検討した。すでに、cADPRの安定等価体であるサイクリックADPカーボサイクリックリボース(cADPcR)誘導体の構造活性相関研究により、3"-位水酸基は修飾可能であることが判明しているが、光アフィニティープローブの創製を検討する上で修飾可能な位置は複数存在することが望ましいので、アデニン塩基部8-位の修飾を検討した。ウニ卵抽出液において最も強いCa^<2+>放出活性を示した3"-デオキシcADPcR(EC_<50>=0.014μM)の塩基部8-位修飾誘導体を種々設計、合成し、それらのCa^<2+>放出活性を評価した。その結果、クロロ基、アジド基、アミノ基で修飾した誘導体が、cADPRと比べて約2割程度のCa^<2+>放出活性を示すパーシャルアゴニストとして作用することが判明した。EC_<50>を比較すると、8-クロロ体が0.34μM、8-アジド体が0.53μM、及び8-アミノ体が0.028μMであった。一方、炭素鎖の導入を検討するために合成した8-プロピルアミノ体は、アゴニスト及びアンタゴニストのいずれの活性も有しておらず、cADPR誘導体として作用しなかった。よって、cADPRの塩基部8-位にはかさ高い置換基は許容されないことが明らかになった。以上の知見を基に、cADPR結合蛋白質に対する光アフィニティープローブとして、8-アジド-3"-O-アジドエチルcADPcRを設計した。この誘導体は、アデニン塩基部の8-位アジド基が光反応性基となるため、この部分で標的蛋白質と共有結合を形成することができる。その後、アルキルアジド基を足がかりとして、Staudinger-Bertozzi縮合反応によりビオチンなどを含むトリアリールホスフィン試薬で標識することが可能である。現在、この誘導体の合成を検討している。

この誘導体は、cADPcRに比べてよりcADPRに近い安定配座を取ることができ、そのためcADPRと同等の生理活性を示すと考えた。しかし、予想に反しこの誘導体のウニ卵抽出液中におけるCa^<2+>放出活性は、EC_<50>=1.9μMとcADPcRよりも低下した。そこで、溶液中の安定配座を解析したところ、おそらく二重結合を導入したことにより歪みが生じ、cADPRとは異なる配座であることが判明した。一方、T細胞においてはcADPRよりは弱いもののcADPcRを上回るCa^<2+>放出活性を示した。現在、この理由を検討中である。
新規蛍光物質gGlu-HMRGの臨床応用と遺伝学的アプローチからの精度向上

1)臨床応用を目指した条件設定の改善:既存の機器は検出感度が低く、一度に測定できる検体量に限界があることがわかった。企業提携を行い、1光学系のシステムの改良、2機器設計を見直し、一度に多数の検体を同時に測定できること3蛍光値のカットオフ値を使用して蛍光陽性陰性を判定、表示できるソフトウェアの開発を計画した。現在も症例の蓄積と機器の開発中である。2)GGT発現のゲノム・エピゲノムレベルの機構:1)の測定機器の見直しのために解析のために必要な検体が得られていないのが現状である。また、GGT蛋白質発現と癌放射線治療の効果の大小や酸化ストレスに関連する蛋白質との発現の関連について検討中である。1gGlu-HMRGを用いた術中の乳癌細胞検出の実臨床応用へ向けて:これまでの研究ではNIHが開発した蛍光検出器を使用したが、これは市販されておらず数に限りがある。しかし実臨床応用に向けては、流通している機器を用いた検出が必要と考える。そのため米国Indec社の蛍光検出機器である「Discovery」を用いて現在、乳癌のgGlu-HMRG蛍光を再測定している。また、試薬の適正濃度を決定するために種々の濃度でのgGlu-HMRGを用いて蛍光実験を行っている。2GGT蛋白質発現の癌に関する生物学的意義に関して:GGT蛋白は細胞内のグルタチオン代謝に関連する蛋白質として知られている。GGT代謝で多いほど細胞内グルタチオン濃度が増すと考えられる。一方グルタチオンは細胞内のスカベンジャーとして知られており、細胞内の活性酸素を除去する、すなわち酸化ストレス耐性を増すことになる。そのためGGT蛋白の発現がジェムザールなどの酸化ストレスを介した抗癌剤用を持つ抗癌剤の耐性に関連する可能性が高い。そのため酸化ストレスに関連する蛋白質との発現の関連を実験中である。3GGT蛋白発現に関するゲノム・エピゲノム解析に関して:GGT蛋白発現の有無と乳腺腫瘍の良性/悪性との関連を明らかにするため、GGT蛋白発現のある/なしと良性/悪性の乳腺腫瘍の4パターンでの検体を集積中である。臨床応用に向けての準備、実際のサンプルを用いた再検証を行っており、おおむね順調に進展していると考えている。1gGlu-HMRGを用いた術中の乳癌細胞検出の実臨床応用へ向けて.これまでの研究ではNIHが開発した蛍光検出器を使用したが、これは市販されておらず数に限りがある。米国Indec社の蛍光検出機器である「Discovery」を用いて乳癌のgGlu-HMRG蛍光を再測定したが、機器の問題が明らかとなった。現在、企業と提携して日本発の新たな機器の作成とそれを用いた蛍光実験をすすめている。2GGT蛋白質発現の癌に関する生物学的意義に関して.GGT蛋白は細胞内のグルタチオン代謝に関連する蛋白質として知られている。そのため酸化ストレスに関連する蛋白質との発現の関連について実験中である。3GGT蛋白発現に関するゲノム・エピゲノム解析に関して.GGT蛋白発現の有無と乳腺腫瘍の良性/悪性との関連を明らかにするため、GGT蛋白発現のある/なしと良性/悪性の乳腺腫瘍の4パターンでの検体を集積中である。幅広く利用されるように、販売されている機器を用いた蛍光検出を試みていたが、米国製の機器には不具合があることがわかったため、測定機器を新たに開発、今後販売できるように企業と提携している。そのため、測定実験はやや遅れている。これまでの研究ではNIHが開発した蛍光検出器を使用したが、これは市販されておらず数に限りがある。そのため米国Indec社の蛍光検出機器である「Discovery」を用いて現在、乳癌のgGlu-HMRG蛍光を再測定したが、機器の性能として検出感度が低く、一度に測定できる検体量に限界があることがわかった。そのため新たに企業提携を行い、機器の開発を行い、同時に蛍光測定データを蓄積しているところである。2GGT蛋白質発現の癌に関する生物学的意義に関してGGT蛋白は細胞内のグルタチオン代謝に関連する蛋白質として知られている。また、胃癌、大腸癌のリンパ節転移や遠隔転移病変のGGT発現が原発巣とは異なっているという仮説の元に、各組織でのGGT発現の比較検討を行っている。3GGT蛋白発現に関するゲノム・エピゲノム解析に関してGGT蛋白発現の有無と乳腺腫瘍の良性/悪性との関連を明らかにするため、GGT蛋白発現のある/なしと良性/悪性の乳腺腫瘍の4パターンでの検体を集積中である。

1)臨床応用を目指した条件設定の改善:既存の機器は検出感度が低く、一度に測定できる検体量に限界があることがわかった。企業提携を行い、1光学系のシステムの改良、2機器設計を見直し、一度に多数の検体を同時に測定できること3蛍光値のカットオフ値を使用して蛍光陽性陰性を判定、表示できるソフトウェアの開発を計画した。現在も症例の蓄積と機器の開発中である。2)GGT発現のゲノム・エピゲノムレベルの機構:1)の測定機器の見直しのために解析のために必要な検体が得られていないのが現状である。また、GGT蛋白質発現と癌放射線治療の効果の大小や酸化ストレスに関連する蛋白質との発現の関連について検討中である。GGT蛋白の臨床的意義についてさらに検証する必要があり、現在実験系について考慮を重ねている。今後の臨床応用に向けて、臨床試験を計画している。新たな機器の開発が不可欠であるため、企業連携を加速させていきたい。乳腺外科学
モダリティに関する意味論的・語用論的研究

本研究の成果は以下のようにまとめることができる。1モダリティに関して、「証拠性」に基づいた新しい分析視点を確立した。2英語だけでなく、スウェーデン語、スペイン語、ポルトガル語、フランス語、(古典)日本語など多岐にわたる言語資料を材料とした。3志向性、推意、言語行為論、驚嘆性、コントロールサイクル、ダイクシス、会話分析、因果性、主観性、動機づけ、“modality packaging"、条件性など多様な概念や枠組みを用いて分析がなされた。以下のワークショップを開催して、モダリティ研究の方法とデータについて、多様な観点・枠組みに基づいて、(古代)日本語、英語、スペイン語等のモダリティ表現に関して討議した。平成23年度第1回モダリティワークショップ(平成24年3月17日(土)10:0017:30(関西外国語大学)1.「現代日本語のモダリティをめぐって-文の意味階層構造の観点から-(益岡隆志)(神戸市外国語大学)2.「古代日本語のモダリティをめぐって」(高山善行)(福井大学)4.「Could +完了形構文の多義性をめぐって」(澤田治美)(関西外国語大学)5.「調整理論とモダリティ-'We'の志向性をめぐって-」(久保進)(松山大学)6.「条件節における認識的willの意味機能について」(吉良文孝)(日本大学)7.「モダリティと驚嘆性」(和佐敦子)(関西外国語大学)8.「動機づけと英語条件文について」(長友俊一郎)(関西外国語大学)10.「ダイクシスを捉える枠組みとその語用論的基盤-ダイクシスの定義と認定基準の問題を中心に-」(澤田淳)(関西外国語大学)これ以外にも、平成24年1月から3月にかけて「モダリティ研究会」を3回実施し、意味論的・語用論的観点から、条件文、構文文法、diminutive shift、日本語指示詞などについて議論した。各発表を通してモダリティの本質とは何かが次第に明らかになってきた。以下のワークショップを開催して、モダリティ研究の方法とデータについて、多様な観点・枠組みに基づいて(古代)日本語、英語、スウェーデン語、スペイン語等のモダリティ表現に関して討議した。平成25年度第1回モダリティワークショップ(平成25年8月27日(火)13:00から、28日(水)9:00から(関西外国語大学))Exclamativity and Mirativity(Lars Larm (Lund University))/テンス、アスペクト、モダリティの階層性をめぐって(澤田治美(関西外国語大学))/確実性の度合いと調整行為ー日本語のモダリティについての一つのケーススタディー(久保進(松山大学))/couldと実現性の含意(吉良文孝(日本大学))/スペイン語の逆接を表すSi条件節と日本語の不同意表現(和佐敦子(関西外国語大学))/力動的・束縛的モダリティを表す英語(疑似)法助動詞構文をめぐって(長友俊一郎(関西外国語大学))/The Meaning and Use of Noteworthy Comparison(Osamu Sawada (Mie University))/日本語ダイクシスの歴史的展開ー「Vてくる」の拡張パターンを中心にー(澤田淳(青山学院大学)/確信性を表す日英語の法副詞ー(間)主観性の観点からー(岡本芳和(金沢星陵大学))これ以外にも、平成25年度第2回を平成26年3月14日15日に開催した。発表者は、10名であった。「「自然の成り行き」を表すwill be -ing構文についてー意味論と語用論の立場からー」(佐藤健児)(日本大学)これ以外にも、平成24年度第2回を平成25年3月15日16日に開催した。発表者は10名であった。(1)「平成26年度第1回モダリティワークショップ」を開催した。日時:平成26年8月27日(水)13:00から、28日(木)9:00から、場所:関西外国語大学、発表者:Lars Larm(Lund University)、研究代表者1名、研究分担者6名、を含む総勢10名。発表内容は、『科学研究費による国際モダリティワークショップ発表論文集第6巻』(平成26年8月27日刊行)に収録。(2)「平成26年度第2回モダリティワークショップ」を開催した。日時:平成27年2月23日(月)13:00から、24日(木)9:00から場所:関西外国語大学、発表内容は、『科学研究費による国際モダリティワークショップ発表論文集第7巻』(平成27年2月23日刊行)に収録。26年度が最終年度であるため、記入しない。語用論26年度が最終年度であるため、記入しない。

平成24年1月から3月にかけて「モダリティ研究会」を3回、「モダリティワークショップ」を1回実施し、意味論的・語用論的観点から、条件文、構文文法、diminutive shift、日本語指示詞などについて議論した。また、多様な観点・枠組みに基づいて、(古代)日本語、英語、スペイン語等のモダリティ表現に関して討議することができた。平成25年8月27日、平成26年3月14-15日の2回にわたって、第4回と第5回の「モダリティワークショップモダリテ.イに関する意味論的・語用論的研究」を開催した。それぞれ、9名、10名の研究者が研究を発表し、『発表論文集』の第4巻と第5巻を発行した。海外からの発表者として、Vanderveken, Jeci de Sousa Melo, Larm教授を招聘した。平成24年8月28日、平成25年3月15ー16日の2回にわたって、第2回と第3回の「モダリティワークショップーモダリティに関する意味論的・語用論的研究」を開催した。それぞれ、9名、10名の研究者が研究を発表し、『発表論文集』の第2巻と第3巻を発行した。スウェーデンからラース・ラーム教授とカリン・アイメル教授が発表された。平成24年度においても、海外から一流の研究者を招いて、モダリティの定義と分類、モダリティと文の階層構造、未来性、条件性、動機づけ、尺度性、直示、日本語の終助詞、「陳述論」、ムードなどに関して、活発で、建設的な議論を展開する予定である。さらに、フランス語やドイツ語、中国語などのデータも取り入れたい。具体的には、平成24年8月中旬、平成25年3月中旬に、それぞれ、「第2回モダリティワークショップ」、「第3回モダリティワークショップ」を開催すると同時に、平成23年度と同じように、モダリティ研究会を開く予定である。さらに、可能であればぜひとも国際学会に出席してモダリティ研究に関する現在の動向を把握したい。平成26年度においても、平成26年8月、平成27年3月、第6回と第7回の「モダリティワークショップ」を開催する。共同研究者だけでなく、国内外のすぐれた研究者が研究発表する予定である。とりわけ、「モダリテ.イとは何か」という理論的な問題と共に、英語、現代日木語以外にも、古典日本語、中国語、スペイン語などのデータに基づく実証的な問題を論じたい。また、海外から数名の発表者を招請する予定である。平成25年度においても、平成25年8月、平成26年3月、第4回と第5回の「モダリティワークショップ」を開催する。とりわけ、「モダリティとは何か」という理論的な問題と共に、英語、現代日本語以外にも、古典日本語、中国語、スペイン語などのデータに基づく実証的な問題を論じたい。
食の安全や食品ロスなどの現代的課題に対応した家庭科における食教育プログラムの開発

食の安全や食品ロスなどの現代的課題に対応した家庭科における食教育のあり方を検討した。その結果、家庭科においては、それぞれの時代に応じた食の課題を取り上げ、最新の科学的知見を取り入れながら、その時代の社会と生活実態に適合した学習が行われてきたことを明らかにした。また、食の安全に対する意識調査から、食の安全意識を高めるとともに、安全に関する知識を身に付けることが、実際の食の安全行動に結びつくことを明らかにした。本研究では、食の安全や食品ロスなどの現代的課題にも対応できる自立した生活者を育てることをめざした家庭科における食教育プログラムを開発することを目的とする。そのため本年度は、昭和と平成期における小学校家庭科教科書を資料とし、家庭科における食の安全に関わる教育内容とその時代や社会の情勢を分析し、それぞれの時代において食の課題をどのように捉え、どのような学習が行われていたかを検討した。食品の選び方についてみると、昭和50年代では品質表示や製造年月日に注意して選ぶことの大切さが記述され、平成期になるとできるだけ食品添加物を使ってないものを選ぶことの大切さが記述されていた。加工食品の使用が増加したことや、食品の表示や衛生・安全に関する法が整備されたことを反映した記述であることが明らかとなった。調理に用いる燃料についてみると、昭和30年代では、炭火、プロパンガス、石油こんろ、昭和40年代・50年代は、プロパンガス、都市ガス、電気、木炭、石油、昭和60年代以降はガスが主な家庭用燃料として記述されていた。家庭用燃料が炭から灯油に移行し、さらにガス、電気へ移行してきた歴史を反映したものとなっていた。野菜の洗い方についてみてみると、野菜の栽培方法の変化とともに、野菜の洗い方に関する記述も変化していることが明らかとなった。以上から、小学校家庭科における食の安全に関わる教育内容は、その時代と社会における生活実態をふまえたものであり、それぞれの時代における食の課題を反映したものであることを明らかにした。安全な食を入手し安心を得ることは、生活の基盤として重要であり、生活者にとって大きな関心事である。そこで本研究では、食の安全や食品ロスなどの現代的課題に対応できる自立した生活者を育てることをめざし、家庭科における食教育プログラムを開発することを目的とする。そのため本年度は、家庭科学習においてそれぞれの時代における食の課題をどのように取り上げどのような学習が行なわれてきたかを小学校家庭科教科書を資料とし、それぞれの時代の社会情勢、経済状況、生活実態、食糧事情などと照らしながら分析を行った。調理についてみると、昭和30年代に野菜を生で食べることが一般的になると、野菜を中性洗剤で洗うよう記述され、当時の野菜の栽培方法を反映したものになっていた。昭和50年代に入ると、洗剤の洗浄効果よりも洗剤の残留の方が問題となり、野菜を洗うときに中性洗剤を使わないよう学習内容が変更されていた。本来食べられる食品を廃棄してしまう食品ロスの問題については、平成10年代頃から冷蔵庫にある食品を使っておかずを作ろうという記述がみられ、平成20年代になると無駄なく食品材料を使った料理が紹介されている。家庭科においては安全と健康を守るたあにそれぞれの時代に即した食の課題が取り上げられてきたこと、食材の栽培方法や調理方法の変化に応じ、最新の科学的知見を取り入れることにより学習内容や指導方針が変更・改善されてきたことを明らかにした。同時に生活者の食の安全に対する意識や関心の所在を明確にすることも学習内容を考える上で重要なことである。現在の食の安全を取り巻く状況を考えると、家庭科における従来の食の学習に加え、食品を安全に適切に選び食の安全について適切な判断力を持った生活者を育てるための学習が必要とされる。そこで本年度は、中学校家庭科においてそれぞれの時代における食の課題をどのように取り上げどのような学習が行なわれてきたかを中学校家庭科教科書を資料として、把握することとした。小学校では野菜や卵の選び方が中心であったが、中学校では魚や肉などの生鮮食品の安全で適切な選び方と安全で衛生的な扱い方が中心となっていた。また、食品を腐敗させないための保存方法についてもふれられており、昭和30年代では、野菜や魚類、肉類、飯などの腐敗を防ぐための家庭での保存方法が記述されていた。昭和40年代後半になると、市販されている加工食品の選び方が記述されるようになり、食品添加物や表示なども学習内容となっていた。昭和50年代には加工食品の問題点が記述されるようになり、加工食品の利用の増加にともない加工食品の選び方だけではなく加工食品の問題点などが記述されるようになっていた。昭和60年代には、保存のための冷蔵庫や冷凍庫の使い方が記述されるようになった。平成に入ると、加工食品に関する記述はさらに増えるとともに、外食や輸入食品への依存にかかわる問題点などにもふれられていた。食品の生産、加工、貯蔵などの技術の進歩、輸送機関の発達などにともなって食生活が大きく変化する中で、家庭科においては安全と健康を守るために、それぞれの時代に応じた食の問題を取り上げ、学習が行われてきたことを明らかにした。

これまでの家庭科学習をふり返り、それぞれの時代において食の課題をどのように取り上げどのような学習が行われてきたかを明らかにすることができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの分析結果及び生活者の安全に対する意識や関心をふまえ、食の現代的課題に対応できる自立した生活者を育てるための家庭科学習内容と方法について引き続き研究をすすめる。
糸状菌における植物ホルモンABA生合成経路の解明-従来仮説への反証

1.Cercospora cruentaにおけるアブシジン酸の初期生合成経路:C.cruentaの初期菌体から新規な生合成中間体(2Z,4E)-γ-イオニリデンアセトアルデヒドを単離した。この内生アルデヒドは、^<18>O_2雰囲気下にて、ほぼ完全に標識化された。同様に内生ABA分子は、カルボキシル酸素の一箇所、リング上酸素の二箇所、計三箇所の酸素原子が^<18>Oで置換された。また、[1-^<13>C]-グルコースの代謝実験において、ABAおよびβ-カロテンのいずれもがメバロン酸経路単独で生合成されていることが示された。これらの結果は、(2Z,4E)-γイオニリデンアセトアルデヒドが、現時点では未知なカロテノイド前駆体の酸化的切断によって生成する鍵ABA生合成中間体である可能性を示唆している。2.Cercosporaのアブシジン酸生合成経路における光学活性イオニリデン酢酸類の代謝:キラル・セルOJカラムを用い、ABA生産糸状菌C.rosicolaとC.cruenta由来のそれぞれα、γ-イオニリデン酢酸の絶対立体配置を、初めて(R)と決定した。これは、天然型(S)-ABAの生合成前駆体として矛盾しなものであった。更に[1,2-^<13>C_2]-αおよびγ-イオニリデン酢酸の両鏡像異性体を調製し、C.rosicolaおよびC.cruentaに投与した。6通りの組み合わせによる代謝実験によって、C-1',4'位の二段階のハイドロキシレーションを含む生合成変換での立体選択性が、対照的かつ明確に示された。3.Cercospora cruentaにおける2,3-ジヒドロ-γ-イオニリデンエタノールの同定:C.cruentaのアブシジン酸(ABA)生合成において中間体として想定されるC_<15>アルコール類をGC-EI-MSにて検索した。標品類との比較の結果、糸状菌C_<15>経路を支持する化合物は見出されず、痕跡量の5-[2',2'-dimethyl-6'-methylene-1'-cyclohexyl]-3-methyl-4-penten-1-ol(2,3-ジヒドロ-γ-イオニリデンエタノール)が新たに同定された。代謝実験の結果、2,3-ジヒドロ-γ-イオニリデンエタノールは、ABAの生合成中間体ではなく、γ-イオニリデンアセトアルデヒトの代謝物であることが示された。4.糸状菌生合成遺伝子のクローニング:上記のように、高等植物と糸状菌との生合成経路については、カロテノイドの酸化的切断を経由するC_<40>経路という見地からの共通性が強く示唆された。既にクローニングに成功している植物遺伝子との高い相同性の予想の元、、RT-PCRなどの分子生物学的手法を駆使しDioxygenase,P-450 monooxygenaseなどの糸状菌生合成酵素のクローニングを検討した。

4.糸状菌生合成遺伝子のクローニング:上記のように、高等植物と糸状菌との生合成経路については、カロテノイドの酸化的切断を経由するC_<40>経路という見地からの共通性が強く示唆された。既にクローニングに成功している植物遺伝子との高い相同性の予想の元、、RT-PCRなどの分子生物学的手法を駆使しDioxygenase,P-450 monooxygenaseなどの糸状菌生合成酵素のクローニングを検討した。
変異型DCC遺伝子を利用した口腔癌細胞のアポトーシス誘導

本研究では、Netrin-1結合部位を除去したDCCの一部を癌細胞に強制発現させることでアポトーシスの誘導を試み、その解析を行った。DCCのレセプター部分を欠失させたcDNA (⊿DCC)をベクターに組み込み、4種類の癌細胞に導入した。癌細胞株は扁平上皮細胞癌細胞株(MISK81-5, HSC3)と胃の腺癌細胞株(MKN45, MKN74)を用いた。まず、MTS assayを用いて4種類の細胞株における細胞生存率を検討した。次に、active-caspase-3蛋白の発現の変化をWestern blotting法にて検討した。さらに、TUNEL染色を行った。その結果、4種類の癌細胞においてΔDCCベクターを導入した細胞群は、コントロール群に対して残存細胞数が有意に少なかった。また、Western blottingによりΔDCCベクター導入群にactive-caspase-3蛋白の発現量の上昇が認められた。さらに、TUNEL染色によりΔDCCベクター導入群にTUNEL陽性細胞が多く認められた。以上より、⊿DCCベクター導入によるMISK81-5, HSC3, MKN45, MKN74細胞株の癌細胞に対するアポトーシス誘導の可能性が示唆された。そして、⊿DCCベクターを扁平上皮癌モデルマウスに導入し癌組織への影響を検討する目的で、口腔扁平上皮癌細胞株HSC3をマトリゲルと混合し、ヌードマウスの背部皮下に移植した。移植3週間後から1日おきに計3回⊿DCCベクターを接種し、2週間後に癌組織を回収し、HE染色による組織観察を行ったところ、⊿DCC接種群では癌細胞が減少し、癌胞巣に縮小傾向が認められた。さらなる詳細な検討が必要ではあるが、本研究結果により、⊿DCCはin vitroおよびin vivoにおいて癌細胞のアポトーシスを誘導することが示唆された。
ファイトプラズマの病原性・宿主決定因子の免疫組織化学的解明

媒介昆虫ヒメフタテンヨコバイにおけるOnion yellowsファイトプラズマ(OY)の経時的局在変化が未だ行われなかった。そこで、本年度nested-PCR、リアルタイムPCR、免疫組織化学的手法により、OYの野生株(OY-W)、弱毒(OY-M)及び昆虫伝搬能喪失株(OY-NIM)の動態を比較解析した。Nested-PCRにより、OY-W、-Mの獲得吸汁1日後では腹部、46日後では胸部、1014日後では頭部でファイトプラズマが検出された。以上より、吸汁により虫体内に取り込まれたファイトプラズマは腹部、胸部、頭部という順番で移行・増殖することが明らかとなった。一方、OY-NIMは、獲得吸汁直後nested-PCRを用いても検出されなかったことから、(1)虫体内増殖量が検出限度以下であるか、(2)植物篩管から口針を通じた取り組みが出来ないか、(3)吸汁直後に口針あるいは消化器官内で速やかに分解されるか、のいずれかの可能性が考えられた。リアルタイムPCRにより昆虫体内におけるファイトプラズマを定量した結果、OY-W、-Mは1週間当たり約911倍の割合で増殖することが明らかとなった。また、OYの抗IDP抗体を用いた免疫組織化学的手法により得られた画像をもとに虫体の3次元立体構造を再構築し、虫体内におけるファイトプラズマの三次元動態を解析した。その結果、OY-W、-Mは、獲得吸汁14日後には腸の一部、20日後には腸の大部分、体腔と唾腺の一部、27日後には唾線の大部分、34日後では唾腺全体、41日後には脳の一部で検出された。媒介昆虫体内におけるファイトプラズマの増殖速度の解明および動態の可視化はこれが初めてである。宿主植物におけるファイトプラズマの動態はこれまで知られていない。そこで、高感度検出法であるnested-PCRによりファイトプラズマの植物体内の移行を追跡し、リアルタイムPCRによりファイトプラズマの増殖速度を測定し、免疫組織化学的手法により、各組織におけるファイトプラズマの分布を観察した。これらの結果をもとにファイトプラズマの植物における動態を解析した。すなわち、16SrRNA遺伝子を増幅するnested-PCRにより、接種1日後には接種葉に加えて茎頂と主茎全体にOY-Wの移行が認められた。2日後には根と最上位葉に検出された。1週間後より順次新たな最上位葉が展開を始めたが、これらの葉では常にOY-Wが検出された。そして2週間後以降上位葉から下位葉に向けて順にOY-Wが移行し、3週間後にはすべての葉より検出された。以上から、OY-Wが植物体全体に展開するのは接種3週間後であることが明らかになった。また、翻訳伸長因子EF-Tuをコードするtuf遺伝子を増幅するリアルタイムPCRにより、接種葉においても根においても、接種後24週間のあいだ、1週間あたり約6倍ずつOY-Wは増殖することが明らかになった。さらに、感染植物の茎と根について切片を作製し、抗SecA抗体を用いてファイトプラズマの所在を観察した結果、接種1週間後までは検出されず、2週間後に一部の篩部にシグナルが観察され、3週間後以降には篩部全体に観察された。以上から、OY-Wは接種後短時間のうちに接種葉から主茎まで移行し、接種1日後に茎頂を含む主茎全体に、2日後には最上位葉および根に、その後は最上位葉から下位葉へと篩管を通じて移行することが明らかになった。リアルタイムPCRによるファイトプラズマの定量的解析はこれが初めてである。また、ウェスタンブロット解析及び免疫組織化学的解析により、抗SecA抗体はAY,WX,EY,RYDの四つ異なる16S-groupに属する8種のファイトプラズマに反応することが明らかになり、ファイトプラズマに共通した抗体である可能性が示唆された。
電場・温度場制御による細胞・組織の接触式不可逆エレクトロポレーション

本研究では印加電圧を大幅に低減した表在組織治療用の接触式不可逆エレクトロポレーションの開発を行った.電気パルス印加に伴う組織の温度上昇を計測および解析する方法,さらにラマンイメージングからタンパク質熱変性を計測する方法を確立した.次に,数値計算によって寸法形状を最適化した微小表面電極を実際に製作し,生体組織を模した試料に対して施術した.その結果,パルス印加条件を変えることによって所望の深さの細胞まで壊死させられること,薬剤の併用によって印加電圧を最大30%低減できることを明らかにした.平成26年度は,不可逆エレクトロポレーションの更なる低侵襲化を目的として,ジュール発熱による温度上昇の計測方法の確立,細胞膜の破壊目的の定量化,低電圧印加MEMSエレクトロポレータの開発を行った.1電圧印加時のジュール発熱による組織の温度上昇を計測するため,感温性インクを添加した生体ファントム試料を対象として白金細線を使用した短細線法によって感温性インクの温度特性を調べた.白金短細線法の解析解をインクの輝度値の変化と比較することで,インクの輝度値から温度上昇量を求めることが可能になった.実際に生体ファントムに対してエレクトロポレーションを行い,電極周囲のインクの輝度値の変化から温度上昇量を計測した.2パルス電圧を印加した後の細胞膜の穿孔状態や膜電位計測,生死判定などを等電位面に直交した面から観察できるようなマイクロギャップエレクトロポレータの設計製作を行った.これはITO膜を蒸着した2枚のガラス基板の間に厚さ50ミクロンのシリコンゴムシートを挟んだものである.この流路に膜電位感受性色素DiBAC4(3)で染色した細胞懸濁液を滴下し,電圧印加した時の細胞膜電位の変化を蛍光観察する方法を確立した.3低電圧印加MEMSエレクトロポレータの開発のため,静電場の数値シミュレーションを行い,細胞膜を破壊するために最適な電極の形状を決定した.これを基に微小櫛形電極の製作にとりかかった.平成27年度は,1不可逆エレクトロポレーションで避けるべきタンパク質の熱変性の定量化手法の確立とその計測,2細胞膜穿孔に及ぼす電圧印加条件の定量化と細胞破壊条件の決定,3MEMSエレクトロポレータを用いた実験による有効性の検討を行った.1感温性のインクを混入したアガロースおよびアルブミンからなる生体ファントムを試料として,様々な印加条件(パルス幅,間隔,印加回数)でパルスを印加し,電極周辺部の温度上昇を検出した.これには,26年度に開発した光学顕微鏡によって電極周囲の感温性インクの輝度値を計測する方法を用いた.また,レーザーラマン顕微鏡によってラマンイメージングを行い,アルブミンの熱変性によって生じるα-helix構造からβ-sheet構造への変化をAmide I領域のスペクトルから定量化できることを確認した.2電位勾配,印加回数,パルス幅,パルス間隔を変えながら細胞懸濁液にエレクトロポレーションを行い,細胞致死率を求めることによって細胞死に関わるパルス印加条件の影響を調べた.蛍光観察によって生細胞・死細胞の判定を行い,細胞致死率のパルス印加条件依存性を定量化した.326年度の電場解析により得られた電極幅,電極間距離を参考にして微小表面エレクトロポレータを作製した.そして,線維芽細胞を分散させたアガロースゲルを生体ファントムとして用いて,微小表面エレクトロポレータに接触させてパルス印加を行った.蛍光染色した試料を共焦点レーザー顕微鏡によって観察し,印加電圧と細胞壊死深さの関係を調べた.平成27年度は,1タンパク質の熱変性の定量化手法の確立とその計測,2細胞膜穿孔に及ぼす電圧印加条件の定量化と細胞破壊条件の決定,3MEMSエレクトロポレータを用いた実験による有効性の検討を行う予定であった.1については,感温性インクを混合した生体ファントムを試料に用いてパルス印加後の電極周囲の輝度値を計測することによって温度上昇を計測した.また,ラマンイメージングによってアルブミン構造変化を計測した.その結果,厳しいパルス印加条件では,IREに伴って特に陽極の温度上昇と変性が顕著に生じることを初めて明らかにした.これは,陽極と陰極の電極界面で生じる化学反応の違いに起因するものと推察された.2については,キュベット内の細胞懸濁液に対して電気パルスを与える実験を行い,印加回数を変数として細胞致死率の増加をフェルミ分布関数で表せることを示した.また,パルス幅やパルス間隔がフェルミ分布関数における傾きと50%致死率を与えるパラメータに与える影響を明らかにした.本研究では,パルス間隔が長いほど細胞致死率の増加が著しくなるという新しい知見を得た.これはこれまでの予想に反する結果であった.細胞膜穿孔による試料の電気的特性の変化や電極分極による実印加電圧の低下などが原因ではないかと調査したが,いまだ原因究明には至っていない.3については,電場解析の結果をもとにして,実際にフォトリソグラフィ法を用いて微小表面エレクトロポレータを作製した.線維芽細胞を分散させた生体ファントムに対して最大印加電圧100 Vまでの電気パルスを印加し,表層の細胞が壊死することを蛍光染色によって確認した.しかし,レーザー顕微鏡によって観察された細胞壊死深さは電場解析で予想された深さの約半分であり,0.1 mmに満たないことが明らかになった.平成28年度は以下に示す内容の研究を進めた.1細胞膜穿孔プロセスの観察と薬剤添加による低電圧化の検討2枚のガラス製透明電極と流路から形成されるマイクロギャップエレクトロポレータを作製して,共焦点レーザー顕微鏡ステージ上で電気パルスを与えながら蛍光観察のできるシステムを構築した.

このシステムを用いて,細胞に電気パルスを印加したときの細胞膜電位の変化を膜電位感受性色素DiBAC4(3)やDiSBAC2(3)を用いて観察することを試みた.極短時間で生じる膜穿孔現象と膜電位の変化を蛍光色素の発光強度変化として計測する難しさのため,細胞膜が損傷していく過程や再シールされる過程を観察するには至っていない.しかし,電圧印加前後の膜電位の違いを計測することには成功した.電気パルスの低電圧下を図るために,DMSO,SDSなどの界面活性剤の添加が膜破壊閾値に与える影響について調べた.キュベット内の細胞分散液に電圧印加する実験系とアガロースゲルに細胞を包埋した生体ファントムに電圧印加する実験系の両方で研究を実施した.その結果,DMSOの添加によって濃度依存的に膜破壊閾値を低減できることが明らかになった.その効果は10%DMSO添加時に閾値電界を10%低下させられる程度であった.2MEMSエレクトロポレーションの改良と最適化前年度に引き続き,ガラス基板上に作製した微細櫛形電極を用いた.電極を生体ファントムに押し付けて電気パルスを印加する実験において,電圧印加条件が壊死深さに与える影響を調べた.電圧を100V,パルス長さを100μsまで大きくしても,細胞壊死領域は表層より0.1mm程度に留まることが明らかになった.さらに,電極の厚さが非常に薄い(約50nm)ために,電圧を大きくした場合,電圧印加の途中に電極が溶断する可能性のあることが明らかになった.電極の耐久性を高める方策が必要と思われた.平成28年度は,1細胞膜穿孔プロセスの観察と薬剤添加による低電圧化の検討,2MEMSエレクトロポレーションの改良と最適化,の2つの研究を進める予定であった.1では,当初の計画通りマイクロギャップエレクトロポレータを作製し,流路内の細胞に電気パルスを与えながら共焦点レーザー顕微鏡で観察できるシステムを構築した.まず,CC2-DMPEとDiSBAC2(3)によって予め細胞を染色し膜電位の計測を試みた.陽極側の細胞膜が破壊し,細胞質が外部へ流出する様子を観察することはできたが,膜破壊直前に生じるはずの膜電位の変化を計測するには時間分解能が不十分であった.膜電位感受性色素DiBAC4(3)を用いた実験では,電気パルス印加後に細胞内の蛍光強度が上昇する過程を計測できた.この上昇には膜電位の変化だけでなく,膜穿孔による蛍光色素の細胞内拡散が関与している.電気パルスの低電圧下を図るために,界面活性剤のDMSOとSDSが膜破壊閾値に与える影響について調べた.いずれも膜破壊閾値を下げることが確かめられたが,SDSについては電気パルスなしでも有意な細胞致死が観察され,無視できないほどの毒性の高さが明らかになった.一方,DMSOの添加は濃度依存的に膜破壊閾値を低減させ,その効果は10%DMSO添加時に閾値電界を10%低下させられる程度であった.2では,作製した微細櫛形電極を用いて,電圧とパルス長さが細胞壊死深さに与える影響を調べた.電圧を100V,パルス長さを100μsまで大きくしても,表層より0.1 mm程度の細胞しか壊死させることは出来なかった.
難波分類に基づく銅鐸出土地名表の作成

本研究では、多くの機関や個人の所蔵する銅鐸を実見・調査し、銅鐸の形態・各部分の法量とその比率・文様・製作技法・鋳型の構造・鋳造後の仕上げ法・鋳掛けや補刻や研磨の技術などについて、多量のデータを収集し新たな知見を得ることができた。この調査を基礎として、難波による、銅鐸群の抽出、銅鐸群の細分、その相互関係の分析などが目覚しく進展した。具体的には、菱環鈕式の細分、扁平鈕式新段階の銅鐸群の抽出と細分およびその相互関係の解明、突線鈕1・2式段階の銅鐸群の抽出と分析、近畿式銅鐸の系列についての分析、三遠式銅鐸内の系列の発見などが、その研究成果である。そして、これらの成果を反映することによって、銅鐸出土地名表をより精密で価値の高いものにすることができた。この銅鐸出土地名表は2007年3月に完成し、研究成果報告書に掲載した。本研究の成果は、銅鐸出土地名表に関するものに留らない。その具体的な内容は、研究成果報告書に掲載した難波の6篇の論文によって知ることができる。中でも、近畿式と三遠式の成立時の銅鐸群の動向の解析から、大きな社会変化が起った弥生時代後期前葉における地域勢力間の関係とその連合の成立過程を明らかにした研究は、今後、倭王権の成立過程を考察する上で非常に重要な成果である。この研究成果は、2006年12月1日-3日に国立歴史民俗博物館で開催された国際シンポジウム『古代アジアの青銅器文化と社会-起源・年代・系譜・流通・儀礼-』において、「近畿式・三遠式銅鐸の成立」の表題で発表したが、日本経済新聞(2007.1.6)と毎日新聞(2007.1.26夕刊)に記事として採り上げられるなど、注目を浴びた。平成15年度は、徳島県椿鐸、徳島県源由1・2・3号鐸、徳島県安都真1・2・3・4号鐸、徳島県名東鐸、香川県大麻山鐸、香川集源氏峰鐸、香川県旧練兵場鐸、大阪府恩智都塚山鐸、大阪府恩智垣内山鐸、奈良県高瀬川鐸、三重県磯山鐸、福井県美浜町南伊夜山鐸、出土地不明渦森型銅鐸、出土地不明大福型銅鐸、出土地不明近畿式突線鈕5式鐸、など約30個の銅鐸と、奈良県唐古・鍵遺跡出土銅鐸鋳造関係遺物などについて、実見し、観察、計測、写真撮影などの方法で調査を実施した。平成15年11月に徳島市立考古資料館で開催されたシンポジウム「銅鐸の謎をさぐる」においては、これらの銅鐸の調査成果を基礎として、扁平鈕式新段階の四区袈裟襷文銅鐸の亀山型と六区袈裟襷文銅鐸の名東型を取り上げ、これまでなされていなかったその型式細分をし、その位置付けを検討し、さらにこれらを含む扁平鈕式新段階の銅鐸群の動向にまで言及した。ほかに、岡山周辺などの銅鐸出土地の調査をおこなった。また、これまでの調査で撮影したまま未整理であった写真資料について、紙焼を作り、台紙に貼って整理し、資料カードとする作業を調査補助者を使っておこない、約1000枚の写真資料カードを作成した。

平成16年度は、伝大阪府四条畷出土1・2号銅鐸、出土地不明扁平鈕式新段階六区袈裟襷文銅鐸、出土地不明近畿式銅鐸(以上、関西大学蔵)、出土地不明扁平鈕式新段階四区袈裟襷文銅鐸、伝滋賀県出土近畿式銅鐸(以上、名古屋市博物館蔵)、香川県明神原出土銅鐸(福岡市博物館蔵)、鳥取県小田軍人墓地出土1号銅鐸(倉吉市博物館蔵)、滋賀県大岩山明治14年出土銅鐸(辰馬考古資料館蔵・東京国立博物館蔵・野洲市立博物館保管)、滋賀県大岩山昭和37年出土114号銅鐸(安土城高琥珀物館蔵・野洲市立博物館保管)など、約40個の銅鐸や、愛知県朝日遺跡出土銅鐸鋳型、奈良県唐古・鍵遺跡出土銅鐸鋳型、香川県旧練兵場遺跡出土名東型銅鐸破片、福井県高柳・下安田遺跡出土近畿式銅鐸破片などを実見し、観察・計測・写真撮影・ビデオ撮影などの方法で調査した。また、平成16年7月17日に國学院大学で開催された21COE考古学・神道シンポジウム『日本列島における青銅器祭祀』では、「銅鐸と銅鐸祭祀の展開と終焉」と題し、扁平鈕式以降に特に顕著化する銅鐸製作地の拡散が銅鐸祭祀の地域性の出現と多様化を引き起こしたこと、近畿式と三遠式で顕著化する東海地方と近畿以西の地域の対峙が扁平鈕式新段階ですでにみられること、近畿式と三遠式の相違が祭器の違いだけでなく祭式の違いでもあることなどの研究成果を発表した。ほかに、近畿式の細分と近畿式内の工房系列の展開過程についての研究を深化させ、破片となって出土した近畿式銅鐸に対する従来の型式比定を再検討した。また、今年度の調査で撮影した写真資料の紙焼を作り、これを台紙に貼って整理し、資料カードとする作業を進めた。前年度に引き続き、平成17年度も、東京国立博物館蔵鐸、辰馬考古資料館蔵鐸などのほか、個人蔵鐸も多く調査し、計測写真、ビデオ撮影などによって、資料化を計った。中でも、東京国立博物館蔵出土地不明35509鐸、兵庫県中川原鐸、出土地不明辰馬考古資料館402鐸、同428鐸、福井県井向2号鐸といった、菱環鈕式を集中的に調査し、その特徴を詳細に検討して、これまで不明瞭なまま放置されていた菱環鈕1式と2式の分類基準を明らかにするとともに、それぞれの型式の細分を試みた。また、はばきを使って内型を固定して鋳造する朝鮮式小銅鐸から、型持だけで内型を固定しはばきは使わない銅鐸へと、鋳型の構造がどのように変化していったのか、いつこの変化があったのかなども検討した。その成果は、平成18年4月に刊行予定の、朝日遺跡第14次調査報告書に掲載予定である。また、愛知県豊橋市西川遺跡出土の近畿式銅鐸破片に関係して、近畿式銅鐸の破壊と埋納や、銅鐸の複数埋納の意味などについて考察し、その成果を報告書掲載の論文としてまとめた。これは、平成18年度中に刊行される予定である。平成17年12月の大阪府埋蔵文化財センター主催の文化財講座では、近畿式と三遠式の成立とその後の展開ついて発表し、近畿式・三遠式成立前夜の銅鐸群の相互関係を解明し、近畿式銅鐸内の系列の分析をおこなった。その内容は、講座資料集に論文として掲載している。平成18年度は、東京国立博物館蔵鐸、岡山県立博物館蔵鐸、弥生文化博物館蔵銅鐸破片、辰馬考古資料館蔵鐸、奈良県田原本町所蔵唐古・鍵遺跡出土鋳造関係遺物、神戸市青木遺跡出土銅鐸などを調査し、観察、計測、写真・ビデオ撮影などによって、資料化を計った。特に、東京国立博物館では、突線紐1・2式を中心とした銅鐸を多数調査し、近畿式・三遠式の成立直前の銅鐸群について、新たな知見を多く得ることができた。岡山県立博物館で調査した銅鐸のうち、出土地不明三遠式銅鐸は、三遠式の最古段階に属する珍しい例であり、三遠式の成立、使用状況、伝世のありさまなどを考える上で重要な知見を、その観察調査によって得ることができた。また、本研究による、近畿式・三遠式成立前夜の銅鐸群の動向、それから復原できる地域勢力間の相互関係、それらの地域勢力の連合の成立による近畿式・三遠式の成立とその歴史的意味などについての研究成果を、2006年12月1日-3日に国立歴史民俗博物館で開催された国際シンポジウム『古代アジアの青銅器文化と社会-起源・年代・系譜・流通・儀礼-』において、「近畿式・三遠式銅鐸の成立」の表題で発表した。
母親特有の適応的社会行動を司る神経回路の解析

これまでの研究で、出産後雌マウスが示す社会行動のうち、新生仔マウスに対して示す養育行動(Maternal Care)の表出と、仔子育て中の巣に近く雄マウスに対して示す攻撃行動(Maternal Aggression)の表出には、内側視索前野へのエストロゲンの作用が重要な役割を果たしていることが見出されている。内側視索前野には、アルファおよびベータの2種のエストロゲン受容体(ER)が局在していることが知られていることから、本研究では、養育行動、攻撃行動の各々の表出に伴い活性化している神経細胞がERアルファあるいはERベータのいずれかを単独で発現する神経細胞なのか、両者を共発現する細胞なのかを解析することとした。ERベータ発現細胞をin vivoで可視化するため、ERβBACプロモーターの下流に赤色蛍光タンパク質(RFP)遺伝子をつないだBAC tgレポーターマウスであるERβ-RFPtgを用い、出産後5日目に養育行動あるいは攻撃行動のテストした後に採取した脳組織において、ERアルファ及びERベータのシグナルとしてのRFPと神経活動のマーカーであるc-fosとの共発現を免疫組織化学染色により解析した。その結果、養育行動の表出時に活性化している細胞の多くはERアルファを単独で発現している細胞であり、ERベータ発現細胞やERアルファとERベータの共発現ではないことが明らかとなった。攻撃行動の表出時に活性化している細胞については、現在解析中である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。(1)内側視索前野、内側扁桃体でのエストロゲン受容体(ER)アルファ、ERベータ遺伝子欠損が授乳期雌マウスの養育及び攻撃行動におよぼす影響の解析:siRNA-AAV法によるERアルファ、ERベータのKD実験から、出産後の雌マウスが侵入雄マウスに対して示す攻撃行動(Maternal Aggression)の表出と、新生仔マウスに対して示す養育行動(Maternal Care)の表出を制御しているメカニズムが異なることを示唆する結果が得られた。すなわち、養育行動には、内側視索前野のERアルファが促進的に作用し、攻撃行動には、内側扁桃体のERベータは促進的に、内側視索前野のERベータは抑制的に働いていることが見出された。(2)内側視索前野、内側扁桃体でのエストロゲン受容体(ER)アルファ、ERベータ発現細胞の特色の解析:先行研究では、内側視索前野、内側扁桃体には、ERアルファとERベータの両方が発現していることが報告されているが、実際にどの程度、同じ細胞に共発現しているのかどうかは十分には解析されていない。その主な理由は、ERベータの同定が困難であることにある。そこで、我々の研究室での別のプロジェクトの一環として作製したERベータに赤色蛍光タンパク質(RFP)遺伝子をつないだレポーターマウスを用いて、内側視索前野、内側扁桃体でのERアルファとERベータの共発現の解析を行った。その結果、どちらの領域においても、ERアルファあるいはERベータを単独で発現する神経細胞と、両者を共発現する細胞が同定された。30年度には、養育行動、攻撃行動の各々の表出に伴い活性化している神経細胞がこの3種のいずれにあたるのかを解析することを計画している。当初の計画では、神経細胞内において、最初期遺伝子c-fosの活性に伴い、tTAを産生するcFos-tTAマウスと、テトラサイクリン産生に伴って光受容体と蛍光タンパクを産生するTetO-ChR2-EYFPマウスを交配して得られる(cFos-tTA)×(TetO-ChR2-EYFP)の雌マウスを用いて、出産後に見られる養育行動と攻撃行動の神経回路の違いを同定することを目指していた。しかしながら、このマウスモデルでは、神経活動の信頼性の高い標識が困難であることが判明した。そこで、出産後雌の行動の制御に深く関わるホルモンの内側扁桃体、内側視索前野での作用に着目して、養育行動と攻撃行動の神経回路の違いを同定することとした。その結果、当初の目標を達成するために、30年度に計画しているc-fos解析、および光遺伝学、薬理遺伝学的操作による行動変容の解析に必須となる研究成果が得られた。したがって、計画に変更はあったものの、概ね順調に進展していると自己評価した。

その結果、養育行動の表出時に活性化している細胞の多くはERアルファを単独で発現している細胞であり、ERベータ発現細胞やERアルファとERベータの共発現ではないことが明らかとなった。攻撃行動の表出時に活性化している細胞については、現在解析中である。実験1:エストロゲン受容体β発現細胞をin vivoで可視化するため、ERβBACプロモーターの下流に赤色蛍光タンパク質(RFP)遺伝子をつないだBAC tgレポーターマウス、ERβ-RFPtgを用いる。すべてのマウスにおいて、出産後1、3日目に攻撃行動テストを行う。出産後5日目には、半数のマウスで攻撃行動テストを行い(養育+攻撃群)、攻撃行動テストを行わない残りの半数のマウス(養育群)とともに、テスト終了後1時間以内に脳組織を採取する。また、出産後に攻撃行動テストはしないが、それ以外は養育群と同様の手続きを行う統制群も設ける。免疫組織化学染色法を用いて、ERα及びERβのシグナルとしてのRFPとc-fosとの共発現を解析する。実験2:実験1の結果から、養育+攻撃群と養育群の間で、c-fosとERαあるいはc-fosとERβの共発現が有意に異なる部位を選び、ERα-CreあるいはERβ-Creマウスを用いて、オプトジェネティックスあるいはDREADD法によるERα、ERβ陽性細胞特異的な神経活動の操作が行動発現に及ぼす効果を検討する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
ケトンカルボニル基の活性化に基づく不斉触媒反応の開発

既に確立されたかに見えるカルボニル基のエナンチオ選択的活性化に基づく不斉合成反応も多くの制約を抱えている。特に、使用可能なカルボニル化合物の構造面での制約は、実際これらの反応を複雑な構造を有する生体機能分子の合成に使用しようとする際に直面する深刻な問題である。本研究では、これまでの研究で明らかとなったオキサザボロリジノン(OXB)触媒の諸特性を活用することで、ケトンカルボニル基の活性化によって触媒される不斉合成反応の開発をめざした。不飽和ケトンの不斉Diels-Alder反応:OXB触媒が、不飽和ケトンの不斉Diels-Alder反応において高いエナンチオ選択性を示すばかりでなく、従来困難であったベンザルアセトンなどの低反応性ジエノフィルや、2,3-ジメチル-1,3-ブタジエンをはじめとする低反応性ジエンの反応を可能にする十分なLewis酸活性を有することが明らかとなった。また、OXB触媒によるカルボニル基の活性化モデルを提示した。ケトンの不斉Aldol反応:ジメチルシリル基の利用によりアセトフェノンとシリルケテンアセタールの不斉アルドール反応が、OXB触媒の存在化、90% ee程度のエナンチオ選択性で進行することが明らかとなった。OXB触媒の構造最適化を実施し、0-ビフェノイル誘導体が最良の結果を与えることが明らかとなった。フランへの不斉Diels-Alder反応:フランのDiels-Alder反応により得られる7-オキサビシクロ[2.2.1]ヘプト-2-エンは、有用な合成中間体であるが、キラルルイス酸触媒反応による不斉合成の報告はわずかである。OXB触媒により、フランとビニルケトンのDiels-Alder反応が高エナンチオ選択的に進行することを見いだした。また、高選択性の発現には、トルエンなどの低極性溶媒の使用が必須であることもわかった。例えば不斉Diels-Alder反応の場合、二座配位型ジエノフィル配位様式が単純で構造制御が容易な不飽和アルデヒドに研究が集中しており、不飽和ケトンへの反応は、選択性、触媒効率、並びにジエンの適用範囲の面で解決されるべき多くの問題を残している。不飽和ケトンの不斉Diels-Alder反応:不斉Michael反応の研究で、非環式不飽和ケトンのエナンチオ選択的活性化に高い性能を示したOXB触媒が、不飽和ケトンの不斉Diels-Alder反応において高いエナンチオ選択性を示すばかりでなく、従来困難であったベンザルアセトンなどの低反応性ジエノフィルや、2,3-ジメチル-1,3-ブタジエンをはじめとする低反応性ジエンの反応を可能にする十分なLewis酸活性を有することが明らかとなった。また、OXB触媒の構造とエナンチオ選択性の関係から、OXB触媒によるカルボニル基の活性化モデルを提示した。ケトンの不斉アルドール