hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
遺伝的リスクを考慮して骨粗鬆症予防策を立案する大規模無作為標本コホート研究

平成8年にBaseline調査を実施した無作為抽出標本の日本人女性1650人について3年後の追跡研究を実施した。受診者は1285人で受診率はほぼ80%と良好であった。得られた骨密度変化の決定要因を、年齢、体格、Lifestyle、Vitamin D受容体遺伝子多型とこれらの組み合わせから検討した。その結果、以下の諸点が明らかになった。1.腰椎、前腕の骨密度の低下は高齢者では小さくなったが、大腿骨頚部では70歳代で最大の低下を示し、高齢者での対策の必要性が示された。2.Lifetyle要因と骨密度との関連では、生活活動強度が高い、牛乳を1日1杯以上飲む、納豆を毎日食べる、カルシウムを十分摂る、等が骨密度の維持に寄与していた。3.Vitamin D受容体遺伝子の5末側と3末側多型の遺伝子頻度は従来の報告と同様であったが、骨密度との関連は弱く、リスクの高い型も当初の報告と異なっていた。4.Vitamin D receptor遺伝子多型とLifestyle要因との骨密度への複合影響を調べたところ、3末端側多型ではtt型とTt型で運動の影響が強く現れ、3末端側多型ではFF型とFf型で牛乳摂取の影響が強く認められた。以上より、骨量には遺伝的負荷が大きいとされているが、成人後は遺伝要因よりもLifestyle要因が大きく関与すると考えられた。しかし、Vitamin D受容体遺伝子多型とLifestyle要因の骨密度への有意な複合影響も認められ、遺伝子型別に骨密度維持策を講じることがより効果的な対策、すなわち、Tailor-madepreventive procedureとなりうることが示唆された。個人の骨量減少のリスクの的確な評価法とそのリスクに見合った指導法を開発して骨粗鬆症を予防することを目的として、初年度の調査を以下のように行った。申請者らが平成7年度に実施したBaseline studyを受診した沖縄県H市と香川県S町在住の当時15歳から79歳だった住民1,244人を対象に、満3年時の追跡調査を以下の研究項目で実施した。2.DNAの解析VitaminD受容体遺伝子多型とOsteocalcin遺伝子多型を同定した。3.既往歴、家族歴、Lifestyleについての面接調査本人と家族の骨折の発生状況、食生活、喫煙・飲酒歴、運動習慣、労働状況などのLifestyle項目を詳細に聴取した。4.骨代謝指標の測定と評価Osteocalcin、活性型VD_3などを測定した。本報告書作成段階で、沖縄県H市の調査は終了し、概数で420名が受診した。香川県S町の調査は順調に進んでいる。データが揃い次第、現有のコンピューター上にデータベースを構築する。平成11年度の調査地区である福島県N町とは調査の打ち合わせを既に行い、町長の承認も得、担当者と日程調整に入った段階である。個人の骨量減少のリスクの的確な評価法とそのリスクに見合った指導法を開発して骨粗鬆症を予防することを目的として、平成11年度の調査を以下のように行った。追跡率向上のため香川県S町にて短期の追跡調査を、また、福島県N町では予定の追跡調査を実施した。骨密度の測定、既往歴、家族歴、Lifestyleについての面接調査など、計画通りに実施できた。現在までにデータベースは完成し、解析しえた結果の概要は以下の通り。・受診者はS町で合計496人、N町で438人で、3地区あわせて1,285人となった。20歳代、30歳代では対象者の移動が多く、追跡が困難であった。受診率は死亡者、転居者など追跡不能者を除くと約80%であった。

・腰椎骨密度は有経者では変化せず、閉経後急速に低下し、閉経後10数年で低下は鈍化した。・大腿骨頚部の骨密度は有経者を含め、全年齢階級で低下し、70歳代では加速して、腰椎とまったく様相を異にした。大腿骨頚部骨折を予防するには、70歳代での骨密度の低下要因を遺伝要因を含めて明らかにし、積極的な予防対策を立案、実施していく必要がある。現在、DNAの解析を実施中であるが、Lifestyle要因を含めて、骨密度の保持要因を明らかにし、積極的な骨密度低下予防対策を立案ていく予定である。平成6、7年度に採取・保存していたDNAについていくつかの骨代謝関連遺伝子多型を同定し、平成11年度までに実施した調査データを併せて最終的なデータベースを完成させた。それを解析して以下の結果を得た。1.Vitamin D receptor3末端側遺伝子多型は遺伝子頻度は従来の報告と同様であったが、骨密度との関連性は当初の報告ほど強くはなく、影響する遺伝子型も異なっていた。2.Vitamin D receptor5末端側遺伝子多型では、やはり遺伝子頻度は従来の報告と同様であったが、骨密度との関連性は当初の報告とは異なっていた。3.Lifetyle要因と骨密度との関連では、生活活動強度が高い、牛乳を1日1杯以上飲む、納豆を毎日食べる、カルシウムを十分に摂る、などが骨密度を維持する方向に働いていた。4.Vitamin D receptor遺伝子多型とLifestyle要因との骨密度への複合影響を調べたところ、3末端側多型ではtt型とTt型で運動の影響が強く現れ、3末端側多型ではFF型とFf型で牛乳摂取の影響が強く認められた。以上より、骨量には遺伝的負荷が大きいとされているが、成人後は遺伝要因よりもLifestyle要因が大きく関与すると考えられた。しかし、Vitamin D receptor遺伝子多型とLifestyle要因の骨密度への有意な複合影響も認められ、遺伝子型別に骨密度維持策を講じることがより効果的な対策、すなわち、Tailor-made preventive procedureとなりうることが示唆された。
失木鋳造技法の研究

シベリア遊牧民青銅器フクの縄状文原型に羊毛など5種類の縄を使用した鋳造実験から、これらが、焼失原型鋳造法の原型材料になりうることが判明した。さらに、木の原型を鋳型で包み、鋳型焼成で木を燃焼消失させ、青銅を鋳造する実験をおこなった。800°C程度を長時間保持すれば、硬質な樹種の木材原型を消失することが分かった。木材の消失によって得られた鋳型空隙部に青銅を流しこみ、直方体枠型の作品制作を試みた。表面に多少のトラブルはあるものの、健全な青銅鋳物を制作することができた。失木鋳造法はこれまで提唱されていない古代鋳造技法であったが、北方遊牧民の青銅器研究者らとの共同研究から、着想した研究である。遊牧民青銅器のフクの縄目文様や糸巻文刀子、糸巻文獣頭金具など、従来の蝋型鋳造法では説明できない青銅製品があり、解釈に苦慮していた。木を原型にして鋳型内で燃焼焼失して鋳造する失木鋳造法の着想によって、木以外の有機物である糸や縄の現物を原型にして焼失鋳造することが可能なら、糸巻文に鋳型分割線がないことの説明がつく。一方、有機物の焼失には無機質が灰になり鋳造障害になるという反論が中国の考古学内でも起こり、縄目文のユウ釣手に鋳型分割痕跡があることから、有機物原型焼失鋳造法に否定的な立場をとる研究者もいる。そこで、高さ47センチの四角柱枠を杉棒で組んで鋳型非分割法の失木鋳造の実験を行ったところ、鋳造は成功した。木の焼失を早めるために、木が炭化した時点で、鋳型を部分的にでも分割すれば短時間で焼失できるため、あるいは灰を除去するため、ユウ釣手の分割范線があったのではないかと推測できた。失木鋳造法の着想から、木以外の有機物である縄や紐の焼失に至り、中国青銅器の可動式ユウ釣手1式5式の鋳造技法解明の成果を得た。これには有機物焼失鋳造法を用いて解明できるもので、失木鋳造法の広がりとなった。日本列島で古代に鋳造されたもので幾何学的形状を持つものはいくつかあり、回転体である銅鏡や、あおり形状である銅鐸などである。しかし、直線的な幾何形体のものは多くなく、巨大な東大寺八角燈籠が八角であるがゆえに特殊な鋳造法を用いたと推測した。特に羽目板や扉などを取り付ける火袋は直線度、直角度、等間隔度などが求められ、3D形状計測し、その精度を科学的に解明し、木工の指し物技法で組んだ木製火袋原型を用いた失木鋳造法の検討を行う計画を立て、平成25年10月に東大寺で3D計測を実施した。古代鋳造技法は、土で原型を作り分割鋳型で外型を作り、原型を削って鋳造する分割技法と、常温で固体で低温加熱で液化する蝋などの油脂で原型を作り分割しない鋳型で鋳造する蝋型法の2通りの方法が考えられている。ところが、これまで、蝋型や分割型では説明のつかない鋳造製品があり、その技法について、見過ごされてきた。むしろ、考える術がなかった。これは、古代技法は蝋型法か分割型法という二者択一で全てを考えてきたためであるが、中国あるいはシベリア古代青銅フクの鋳造技法を、考古学者と鋳造技術者が共同で鋳造実験する中で、動物油脂の代わりに木材を原型にする手法が提案され、基礎実験を試みた。5片の小木棒を土に包み加熱燃焼し鋳造する基礎実験を行った。そのうち1つだけ鋳型内を空気が通る仕組みにしたが、これだけが鋳造が成功し、他は木が炭化し消失せず失敗した。しかし、燃焼率を高めれば成功することが分かり、国宝東大寺八角燈籠、中国北方系青銅器の糸巻紋獣頭金具、糸巻紋刀子、双尾形金具、ボタン状金具、格子紋柄短剣、駱駝形帯飾板、シベリア青銅フクの縄目紋など、蝋以外の木や実際の縄を原型として焼失させる技法が古代に存在したのではないかという予測を立てた。長さ30センチの角棒を原型とした失木鋳造の展開実験を経て、高さ60センチの枠型木原型による失木鋳造の応用実験を行った。これらは、鋳型内を空気が通過する鋳型ばかりではなく、湯口のみの鋳型もあった。結果湯口のみのものでも、800度前後を通常の3倍の時間を掛ければ木は焼失することが明らかになった。その後、ケイ素を多く含むもみ殻は500度の低温で長時間燃焼すれば焼結が防げることなども知り、木の焼失条件は高温超時間でなくても良いのではとの発想を得た。考古学者、鋳造技術者でこの成果を論文として発表した。平成25年度に行った東大寺国宝金堂八角燈籠の3D計測から抽出するデータ作成を中心に行った。

天平時代以前には大型の金堂仏が鋳造され、これらの製作技術を含めた総合研究は進んでいるが、巨大な幾何形体として異彩を放つ八角燈籠の鋳造方法については研究されていなかった。土やロウ原型からの鋳造では幾何形体度を高くすることは難しいと思われる。また、分割型で鋳造した場合に発生する鋳型のズレや鋳バリなどが発生するが、そういった顕著な痕跡がないことから、八角燈籠は非分割の方法と思われる。しかし、ロウでは平面を作るのが難しいであろうということから、平成24年度までにおこなった、木棒原型で非分割の鋳造実験を基に、八角燈籠の鋳造法を木製棒原型の非分割法と推測した。八角燈籠の3D計測の生データから、火袋の8本の縦柱と32本の横棒それぞれの、平面度(任意の直線に対して5センチおきの面がプラスマイナス何ミリかを数値化する)や、幾何形体度(八角柱の枠の歪み度を横断面図で図化する)や、8面の笠面の同一度(8面の笠の縦断面図を重ねて28通りの比較図で図化する)など、数値化、図化の詳細を決定して、作業を行った。論文発表は平成28年度を予定している。鋳金工芸、鋳造技術史遊牧民青銅器の考古学者との共同研究により鋳造技法が不明だった糸巻文青銅器に着目し、木原型焼失鋳造の基礎、展開、応用実験で検証を重ねた。特に高さ47センチの応用実験青銅枠の成功は、木原型焼失での灰の障害がないことと、焼失の簡易を証明した。これによって、難解な中国殷周代のユウの可動式釣手の連結部分に有機物原型焼失法を用いるという解釈に至り釣手全形式の鋳造法を論文発表し、中国青銅器の技術研究を大きく進展させた。日本では失木鋳造法が想定できる東大寺八角燈籠の火袋計測が、本研究の大きな成果になるが、東大寺、文化庁、奈良市文化財課への交渉を経て、平成25年10月に全体をFARO社のFocus3D(点間距離2mm)で、火袋を計測はGOM社のATOS Compact SCAN 5M(点間距離0.481mm)で3Dスキャンした。このデータを解析して、火袋の形状特徴を解明し、失木鋳造法を検討できる段階に到達している。これらの歩みから評価した。実験により、失木鋳造を成功させることが第1段階の目的であった。基礎実験、展開実験、応用実験と、実験試料を徐々に大きくさせての実験で、全てにおいて、鋳造が成功した。このことにより、古代に失木鋳造法が存在した可能性が高くなり、これ以後の調査研究に確信を得ることができた。成功には高温長時間鋳型焼成がカギとなったが、このことにより、通常よりも鋳型の亀裂が多く入り、鋳造品としては荒れ肌になる。もみ殻焼成の研究情報から、低温(約500度)長時間でも焼失する可能性があり、継続した実験が必要である。しかしながら、成功した事実は今後の古代鋳造技法研究に大きな成果を残すことができた。木の原型だけではなく、実際の縄などの原型による焼失鋳造法存在の可能性も高まり、古代鋳造技法の捉え方も広がった。3回の小失鋳造実験報告、古代青銅製品で焼失鋳造法の可能性が高い製品の考察、シベリアフクの縄紋鋳造の焼失法の可能性など、これまで、不明であった製品の鋳造技法の考察を含め、アジア鋳造技術史学会誌4号(2012年9月発行)に3本の論文、研究ノートを発表した。アジア鋳造技術史学会誌5号(2013年1月発行)に中国北方系青銅フクの把手の焼失法の可能性、紙を原型とする失紙鋳造法の実験報告の2本を論文、研究ノートに発表した。また、中国青銅器のユウの釣手の鋳造に焼失鋳造法を用いた可能性を、アジア鋳造技術史学会研究発表概要集6号に発表した。さらに、連携研究者と調査し、ユウの釣手を5式に区分し、それぞれの鋳造方法を解明し、その技術変遷を明らかにした。この論文はアジア鋳造技術史学会誌6号に投稿し、査読を受けている。
自然免疫反応に関与する分子量1000万の巨大粒子ボルトの構造生物学的研究

ラット肝臓から抽出したボルト、昆虫細胞で大量発現したMVPのみで構成されるボルトの両方について良質な結晶を得ることに成功し、SPring-8のBL44XUでのX線回折実験において2. 8Å分解能の回折点を得ることに成功しました。今後、結晶の凍結条件や回折実験条件をより最適化することで、高分解能回折強度データ収集ができる見通しが立ちました。1986年に米国UCLAのL.H.Romeらのグループによってラット肝臓より単離されたボルト(Vault)は3種類の蛋白質と1種類のRNAによって構成されており、分子量約1000万でサイズが約40nm×67nmという今日までに報告されている中では最大のRNA-蛋白質複合体である。粒子の発見から20年以上もの間、多くの研究者らにより核細胞質間物質輸送や多剤耐性への関与など様々な可能性が探られてきたが、2007年、ハーバード大学の研究グループにより自然免疫反応への関与が示された(M.P.Kowalski et al., Science 317,130-132(2007))。我々は2008年にVault粒子外殻の全体構造を3.5A分解能で決定することに成功し、構造情報からvaultが脂質ラフトに結合する可能性を示した。この結果は、Kowalskiらの報告を強く支持するものであった。本研究では、Vault外殻を構成するMVP(Major Vault Protein)のショルダードメインがどのようにして脂質ラフトを認識するのかをX線結晶構造解析により原子レベルで明らかにするためにコレステロール誘導体との複合体結晶の作成を目指している。また、MVP以外の成分も含めたvaultの全立体構造をX線結晶構造解析によって決定し、本粒子の機能解明におけるさらなるブレイクスルーとするために精製条件や結晶化条件の最適化を行っている。1986年に米国UCLAのLH.Romeらのグループによってラット肝臓より単離されたボルト(Vault)は3種類の蛋白質と1種類のRNAによって構成されており、分子量約1000万でサイズが約40nm×67nmという今日までに報告されている中では最大のRNA-蛋白質複合体である。粒子の発見から20年以上もの間、多くの研究者らにより核-細胞質間物質輸送や多剤耐性への関与など様々な可能性が探られてきたが、2007年、ハーバード大学の研究グループにより自然免疫反応への関与が示された(M.P.Kowalski et al., Science 317,130-132(2007))。我々は2008年にVault粒子外殻の全体構造を3.5Å分解能で決定することに成功し、構造情報からvaultが脂質ラフトに結合する可能性を示した。粒子の発見から20年以上もの間、多くの研究者らにより核-細胞質間物質輸送や多剤耐性への関与など様々な可能性が探られてきたが、2007年、ハーバード大学の研究グループにより自然免疫反応への関与が示された(M.P.Kowalski et al.,Science 317,130-132(2007))。我々は2008年にVault粒子外殻の全体構造を3.5A分解能で決定することに成功し、構造情報からボルトが脂質ラフトに結合する可能性を示した。本研究では、ボルト外殻を構成するMVP(Major Vault Protein)のショルダードメインがどのようにして脂質ラフトを認識するのかをX線結晶構造解析により原子レベルで明らかにするためにコレステロール誘導体との複合体結晶の作成を目指している。また、MVP以外の成分も含めたボルトの全立体構造をX線結晶構造解析によって決定し、本粒子の機能解明におけるさらなるブレイクスルーとするために精製条件や結晶化条件の最適化を行っている。これまでに2.8A分解能の回折点を示すボルト結晶の作製に成功しており、次年度以降のできるだけ早い時期に高分解能で構造決定したい。
内耳障害時のミトコンドリアにおけるシグナル伝達の役割

研究の目的は,ミトコンドリアを保護することを作用機序とした内耳保護療法の可能性を明らかにし,将来的に臨床応用につながる研究を行うことである。そのため,マウス卵形嚢の器官培養を用いて実験を行った。ネオマイシンの存在下で培養を行うと感覚細胞のみに細胞死を認めた。一方で培地中にBcl-xlを溶解させると,細胞死の程度に影響が見られた。また, Bcl-xlは細胞死のシグナル伝達物質であるJNKのリン酸化は阻害しなかったが,カスパーゼの活性化を阻害していた。これらの結果より,ミトコンドリアにおけるシグナル伝達分子が,有毛細胞死にも強く影響していることが示された。これらの結果は学会で報告済みであるが,現在,海外論文にも投稿中である研究の目的は,ミトコンドリアを保護することを作用機序とした内耳保護療法の可能性を明らかにし,将来的に臨床応用につながる研究を行うことである。これらの結果は学会で報告済みであるが,現在,海外論文にも投稿中である研究の目的は、ミトコンドリアを保護することを作用機序とした内耳保護療法の可能性を明らかにし、将来的に臨床応用につながる研究を行うことである。そのため申請者は、研究期間内の、内耳障害においてミトコンドリアのシグナル伝達がどのような役割を持つのかを明らかにしたい。本年度は、卵形嚢の器官培養を用いて実験を行った。ネオマイシンの存在下で培養を行うと感覚細胞のみに細胞死を認める。培地中にミトコンドリアにおいて作用する分子を溶解させることで、細胞死の程度に影響が見られた。中でもBcl-xlは、有意に細胞死を抑制させた。これらの結果より、ミトコンドリアにおけるシグナル伝達分子が、有毛細胞死にも強く影響していることが示された。さらに、これらの分子と相互作用を持つ熱ショック蛋白質の細胞死への影響を明らかにした。これらの結果は学会で報告済みであるが、現在、海外論文にも投稿中である。そのため申請者は,マウス卵形嚢の器官培養を用いて実験を行った。また,Bcl-xlは細胞死のシグナル伝達物質であるJNKのリン酸化は阻害しなかったが,カスパーゼの活性化を阻害していた。これらの結果は学会で報告済みであるが,現在,海外論文にも投稿中である。
バイオフィルターを組み込んだ自己脱臭型コンポスト装置の開発

自己消臭型のコンポスト装置を開発するために、反応器内にバイオフィルターを組み込み、コンポスト過程で発生する悪臭物質の除去性能を評価した。研究はアンモニアを人為的に発生させるモデル装置実験と社員食堂から排出する厨芥を堆肥化する1mφ×1.5mHの旋回スクープ撹拌方式のコンポスト装置実験からなる。バイオフィルターは硝化汚泥を植種した1cm×1cm×1cmのポリウレタンキューブを連ねて製作し、コンポスト装置上部に設置した。モデルリアクター実験では0.9mg-N/cm^3/dのアンモニア酸化能が得られた。また、ファイルター容積あたり10^9cells/mLのアンモニア酸化細菌と亜硝酸酸化細菌が生息していることをFISH法を適用して計測した。クローニング解析の結果、アンモニア酸化細菌の優占菌種はNitrosomonas oligotrophaであった。実際のコンポスト装置に設置したバイオフィルターは、モデルリアクター実験に比較してアンモニアおよび硫黄系物質の酸化能は小さかった。これはフィルター内の温度が上昇することによってフィルター内の中温性細菌の増殖が阻害されたものと考えられる。このバイオフィルター中の硫黄系悪臭物質の酸化除去を担っている菌種を集積培養とPCR-DGGE法で組み合わせて解析した結果、HalothiobacillusとThiomonasであることが判明した。自己消臭型のコンポスト装置を開発するために、1cm×1cm×1cmのポリウレタンキューブを等間隔に円盤状に連ねたフィルターを製作し、密閉容器モデルリアクターを用いてその消臭性能とウレタン内の微生物相の解析を行った。フィルターは予め活性汚泥から集積した硝化細菌培養液に浸して植種を行い、密閉容器モデルリアクター内に懸垂した。100日間にわたって容器内に遊離アンモニアを供給し、アンモニア減少量とフィルター内の蓄積硝酸濃度からバイオフィルターのアンモニア分解量の評価を試みた。しかし、アンモニア減少量の測定は誤差が大き過ぎたため、フィルターに無機塩溶液を一定流量で流してフィルターから滴下してくる液中の硝酸濃度からアンモニア酸化速度を評価した。その結果、フイルターの表面積当たりのアンモニア酸化速度は最大1250mg-N/m^2/dに達した。フィルターのアンモニア酸化速度は気相のアンモニア濃度の影響を大きく受けるものであった。フィルターに付着した汚泥内のアンモニア酸化細菌の動態を蛍光遺伝子プローブのFISH法を用いて追跡した。モデルリアクターの運転期間中に定期的にフィルターのスポンジキューブを絞って搾汁サンプルを採取し、FISH法で検出したアンモニア細菌のダイレクトカウントを行った。搾汁サンプル中のアンモニア酸化細菌数は当初10^7/mLレベルであったものが運転の継続にともなって増大し、運転100日では10^9/mLレベルに達した。本年度の実験は室温条件下で行ったが、コンポスト装置内の温度は高いため、今後は温度の影響を評価する必要がある。実験装置は1mφ×1.5mHの旋回スクープ撹拌方式のコンポスト装置で、昼食を提供する社員食堂から排出する厨芥を試料とした。バイオフィルターは活性汚泥を植種した1cm×1cm×1cmのポリウレタンキューブを袋状ネットに詰めてコンポスト装置上部に設置した。まず、フィルターを設置せずに、厨芥のコンポスト化で発生する悪臭物質の濃度変化を追跡した。測定した物質はアンモニア、硫化水素、メチルカプタンである。気相中のこれら悪臭物質は厨芥の投入後12日でピークとなり、アンモニアは最大200ppm、硫化水素は1.2ppm、メチルメルカプタンは0.3ppmであった。これら悪臭物質は約一週間後には極めて低濃度にまで徐々に減少した。バイオフィルターを設置した系においては、アンモニアおよび硫化水素は僅かに減少させる効果が認められたが、メチルカプタンについては全く効果が無かった。この原因としては、バイオフィルターへの通気量が不足し、微生物と悪臭物質の接触効率が小さかったこと、気相部の温度変化が激しいために悪臭分解微生物の活性が保持されなかったことが考えられる。

バイオフィルターに付着した汚泥内のアンモニア酸化細菌の動態を蛍光遺伝子プローブのFISH法を用いて追跡した。フィルター搾汁サンプル中には当初10^7/mLレベルの硝化細菌が検出されたが、運転を継続してもそのカウントが増加しなかった。
多孔質ポリマーを骨格物質とする機能性マイクロカプセルの製造と用途開発

抽出マイクロカプセルの調製水中の低級脂肪酸を回収する抽出性マイクロカプセルをin situ重合法により,全モノマー濃度1.85-3.55M,架橋剤比0.1-0.4および撹拌回転速度400-1200rpmの条件下で調製した。芯物質には抽剤であるトリオクチルアミンを,膜物質にはスチレン-ジビニルベンゼン共重合体を使用した。その結果,本研究で調製した抽出性マイクロカプセルにより,水相中のプロピオン酸を効果的に回収することができた.さらに抽出性マイクロカプセルの抽出容量は,液々系における場合と同等であった。抽出性マイクロカプセルによるプロピオン酸の抽出速度機構について検討した結果,膜拡散が支配的であることを明かにし,マイクロカプセル調製条件の抽出速度に及ぼす影響を定量的に検討した。マイクロカプセルトナーの調製マイクロカプセルトナーの単分散化及びin situ重合法と界面重合法を組み合わせによる内包液のもれ防止を目的に研究を遂行した。マイクロカプセルトナーの単分散化技術としてSPG管による製造プロセスを取り上げた。管端からのもれや微粒子発生など問題が残されてはいるが,ほぼ単分散化したマイクロカプセルトナーを調製することができた。界面重合膜として,塩化アジポイルとヘキサメチレンジアミンによるポリアミド膜及び塩化アジポイルとエチレングリコールによるポリエステル膜を使用した。これらの界面重合膜をin situ重合法によるスチレン-アクリロニトリル共重合体膜形成に引き続き行わせた。その結果,内包液のもれを防止することができた。さらにポリアミド膜を形成したマイクロカプセルトナーの帯電特性は,ポリエステル膜を形成させたものに比べ優れていることがわかった。マイクロカプセルトナ-の調製アマニ油を芯物質とし、染料を着色物質、p-スチレンスルホン酸ソ-ダとスチレンとの共重合体を帯電制御剤として、これらをスチレン、アクリロニトリルモノマ-と共に水相中でin situ重合を行うことで約10μmのマイクロカプセルを得た。次に、あらかじめ有機相中に溶解した界面重合用油溶性モノマ-と水溶性モノマ-とで界面重合を行わせ、in situ重合で調製した多孔質ポリスチレン膜の空間をポリエステルで充填し、ほぼ完全に芯物質と外部環境を遮断した。ホモジナイザ-で液滴を調製した場合には液滴径分布がかなり広がるために、シラスポ-ラスガラス(SPG)管による均一液滴群製造技術を検討した。界面活性剤に問題がある等のためにこの技術の確立にはまだ日時を必要としている状況にある。画出しによる検討でも今後解決すべき多くの課題が明らかになった。抽出性マイクロカプセルの調製外皮をポリスチレンとレトリオクチルアミン(TOA)を主要芯物質とするマイクロカプセルを調製し、水溶液中の微量のプロピオン酸の抽出実験を行い、プロピオン酸濃度が高い場合にはTOAの平衡比が高いために抽出率は上がる傾向にあり、ある程度の成果を収めた。しかし、プロピオン酸濃度が0.1wt%程度の低濃度では実用に供すには問題を残しており、新たなマイクロカプセルを開発すべきことが明らかになった。抽出マイクロカプセルの調製水中の低級脂肪酸を回収する抽出性マイクロカプセルをin situ重合法により,全モノマー濃度1.85-3.55M,架橋剤比0.1-0.4および攪拌回転速度400-1200rpmの条件下で調製した。芯物質には抽剤であるトリオクチルアミンを,膜物質にスチレン-ジビニルベンゼン共重合体を使用した。(1)マイクロカプセル平均径は、攪拌回転速度により大きく変化した。しかし全モノマー濃度および架橋剤比には依存しなかった。一方,マイクロカプセル平均膜厚は,全モノマー濃度の増加に伴い増加し、攪拌回転速度の増加に伴い減少した。

しかし架橋剤比の影響はなかった。(2)抽出マイクロカプセルの抽出容量は液々系操作におけるトリオクチルアミンの抽出容量と同じ値を示した。さらに水中のプロピオン酸濃度依存性も液々系操作におけるそれと同様な挙動を示した。このことからマイクロカプセルに内包したトリオクチルアミンは劣化することなく抽剤として作用している。(3)抽出マイクロカプセルによるプロオピオン酸の抽出速度を測定した結果、透過係数は全モノマー濃度および架橋剤比の増加に伴い減少し、重合時の攪拌回転速度の増加に伴い減少した。マイクロカプセルトナーの調製in situ重合法と界面重合法を組み合わせることで内包液のもれを防ぎ、マイクロカプセルトナーとしての機能を賦与することを目的に研究を遂行した。界面重合膜として,塩化アジポイルとヘキサメチレンジアミンによるポリアミド膜及び塩化アジポイルとエチレングリコールによるポリエステル膜を使用した。これらの界面重合膜をin situ重合法によるスチレン-アクリロニトリル共重合休膜形成に引き続き行わせた。その結果、内包液のもれを防止することができた。さらにポリアミド膜を形成したマイクロカプセルトナーの帯電特性は、ポリエステル膜を形成させたものに比べ優れていることがわかった。
曖昧で突発的な仕事状況に置かれた従業員のストレス並びにその軽減についての解明

過労自殺の原因となるうつ反応と仕事の要因との関係をアンケート調査から分析し、うつ反応を説明する要因を検討した。結果として第1に、多くの人に役割を担わされるという役割葛藤と、自分が職場でどのような役割を担うべきかわからないという役割曖昧性が、大きな要因であった。第2に、対人関係を壊したくない気持ちである対人関係の秩序というパーソナリティも大きな要因であった。ただし、残業時間は影響しなかったため、時短よりむしろ仕事の内容に注目すべきである。また、産業クラスターコーディネーターの調査を通じて、曖昧で突発的な仕事の具体的な内容にも着目した。昨年度は、Webによるアンケート調査を行い、調査結果の分析を進めている。ストレス、仕事の内容、仕事に関する出来事の関係を分析し、役割葛藤(職場での異なる役割の間で悩む)と、対人関係で遠慮するという性格が、ストレスの主要な原因であることを明らかにした。この2つの内容は、性別、職種別、職位別のどのような要因でも原因であるため、この原因を緩和することが、従業員のストレスを削減するためには重要であることが理解できた。ただし、本研究の主テーマである曖昧な仕事(調査内では「役割曖昧性」としている)のストレスへ影響は、主要な要因ではなかった。この点については、今後さらに検討する必要がある。また、残業時間とストレスとの関係では、役割葛藤、遠慮、役割曖昧性に比較すれば、大きな要因ではなかった。ただし、ストレスに影響する要因の1つではあった。したがって、今後は残業時間が顕著に多い群とそうでない群を比較して検討し、残業時間の顕著に多い群ではどのような要因がストレスに関連が深いかを探索したい。これらの内容については、今年度の日本経営学会や産業・組織心理学会で報告し、学術論文として投稿する予定である。昨年度は、共著の著書1篇、学術論文3本、学会発表1本(日本経営学会全国大会)を提示した。共著の著書ならびに学術論文(3本のうちの1本)では、曖昧な仕事に対応する能力を探求するために、産業クラスターコーディネーターという、曖昧な仕事に直面する人に必要な能力を検討した。学術論文の残りの2本のうち1本は日本労務学会誌のレフェリー誌であり、中間管理職の過労自殺とストレスの関係を検討した。最後の1本は、過労自殺研究とストレス研究の関係を理論的に検討し、アンケート調査に必要な項目を検討したものである。平成24年度は、研究目的における研究期間内に明らかにする点の第1番目である、曖昧で突発的な仕事に就いたという出来事が、ストレスの原因となる要因をいかに増大させているのか、さらに、その仕事がどの程度ストレスを増大させたかを明らかにすることを主眼とした。具体的には、アンケート調査によって、仕事の量的・質的負荷等のストレスの原因、媒介要因としての仕事上の出来事やコンピテンシー、ストレスの結果としてのうつ反応や身体的反応という3者関係を、定量的な側面から把握するためのアンケート調査項目・尺度を確定することを目的とした。具体的な実績は以下のとおりである。1.過労自殺研究とストレス研究の関係の検討過労自殺研究では、終身雇用慣行・年功序列制度を中心とした日本的雇用慣行との関係や、日本人独自のパーソナリティに関する要因、仕事そのものに関する要因等の多くの要因が過労自殺に関係すると指摘されている。これらの要因をストレス研究と対応させ、ストレス研究の枠組みを用いて検討した。ストレス研究はアンケート調査での実績が豊富であるため、アンケート調査がほとんどない過労自殺研究へ応用することで、過労自殺の先行要因を探った。結果として、「過労自殺研究からみたストレスモデル」を新たに作成し、アンケート調査の分析枠組みとした。2.出来事とストレスの関係この領域では、イベント型ストレッサという研究分野があり、この分野の研究業績を概観した。結論として、厚生労働省が平成23年12月に改訂した「心理的負荷による精神障害の認定基準」をもとに、出来事に関する変数を作成した。イベント型ストレッサはストレス研究で検討されており、実証的にも妥当性は高い。ただし、過労自殺研究に直接接近したものではない。したがって、「心理的負荷による精神障害の認定基準」を直接用いることで、過労自殺とストレスの関係に直接接近する。本研究は、曖昧で突発的な仕事の内容とストレスの増大との関係、さらには、そのストレスを低減し、仕事を円滑に行うためのコンピテンシーを探すことが主目的であった。そこでまず第一に、曖昧で突発的な仕事に就いたという出来事が、ストレスの原因となる要因をいかに増大させているのか、さらにその仕事がどの程度ストレスを増大させたかを明らかにすることを試みた。1600サンプルによるアンケート調査の結果、自殺に最も結びつきやすいうつ反応を、役割葛藤が強力に正で説明しており、役割曖昧性、仕事負荷がこれに続く結果となった。また、「気が小さい」「人と争うのは苦手」等からなる対人関係の秩序(対人関係を壊したくないというパーソナリティ)も、正の説明因となった。

したがって、役割葛藤や役割曖昧性といった、曖昧で突発的な仕事に関連の深い要件が、うつ反応を強く説明しており、この点は仮説通りであった。また、パーソナリティ要因も特定のものについては、説明因となった。ただし、過労死・過労自殺研究で原因として注目されている残業時間は有意な説明因とはならなかった。したがって、残業時間そのものの削減よりも、仕事の割当て方に注目すべきことが示唆される。次に、ストレスフルなイベントとの関連では、イベント数は正でうつ反応を説明していた。ただし、残業時間との交互作用になると有意な説明因にはならず、イベントそのものに対処する方法を考えるべきことが把握できた。さらに、ストレス削減能力に関しては、仕事の段取り等を考えることのできるマネジメントスキルと、トラブルに対処できるトラブルシューティングスキルはうつ反応を負で説明したが、コミュニケーションスキルはうつ反応に影響を与えなかった。したがって、従業員のストレスを削減するには、仕事の段取りをうまく行い、トラブルがあった時の対処法を考えた方が良いことが明らかになった。人的資源管理昨年度は、Web調査によって、ストレス、ストレスの原因、ストレスの増大に関連する出来事の関係を検討できた。この内容についての分析にも既に着手しており、本年度の学会発表へのエントリーを念頭に入れている。インタビュー調査については、曖昧な仕事に直面する可能性の高い産業クラスターコーディネーターへの聞き取り調査が終わっており、その内容を検討したのちに、今年度のアンケート調査項目へ組み入れる予定である。具体的には、北海道、青森県、福岡県における産業クラスターコーディネーターや当該地域の自治体職員への聞き取り調査である。現在までの達成度としては、2おおむね順調に進展していると考えている。理由は以下のとおりである。研究実績の概要1.については、中間管理職のストレスと過労自殺の関係を検討した論文を査読論文として投稿し、現在修正中である。この論文では、「過労自殺研究からみたストレスモデル」を新たに作成したことに特徴があり、このモデルに則れば、アンケート調査に応用可能である。さらに、過去に行った調査をこのモデルで解釈している。また、この論文は査読論文に投稿し修正中であるが、査読者からは、このモデル自体の問題を指摘されてはいない。したがって、来年度以降のアンケート調査にもこのモデルを援用する。研究実績の概要2.については、ストレス研究と過労自殺研究の変数間の関係を理論的に検討した論文を執筆中であり、今年度前半には本学紀要に公刊する予定である。この論文では、前述のストレスモデル全体に関する議論だけでなく、出来事とストレス、さらに結果としての過労自殺との関係も検討している。
KCNQ(Kv7)K+チャネル開口薬による慢性疼痛緩解の脊髄後角シナプス機構

末梢から上位中枢へ至る疼痛シグナル伝達経路では、多様なイオンチャネルがその興奮性制御に関わる。中でも、KCNQカリウムチャネル開口薬が慢性疼痛モデル動物で鎮痛作用を示すことから、末梢側終末から脊髄後角の中枢側終末に至る一次求心性神経上に存在するKCNQチャネルは新規鎮痛薬開発の上で重要なターゲット分子である。本研究課題では、慢性疼痛モデルマウスおよびnaiveマウスから作製する脊髄スライス標本を用い、電気生理学的手法と膜電位感受性色素を用いた光学測定法により、脊髄後角におけるKCNQチャネルの疼痛制御におけるシナプスレベルの役割を詳細に明らかにする。
矯正的歯の移動に伴う疼痛発現：三叉神経節ニューロン-グリアのクロストークの役割

本研究では、ラット臼歯の矯正学的な歯の移動に伴う歯根膜由来の三叉神経節ニューロンの興奮性増強に対する三叉神経節内のニューロン-グリア細胞間クロストークの病態生理学的役割を明らかとするために、行動学・電気生理学・免疫組織化学的手法にて系統的に解析した。その結果、上顎臼歯への矯正力の付与に伴い上顎顔面皮膚に異所性痛覚過敏が認められた。歯根膜の炎症に伴い顔面皮膚への機械刺激に対する三叉神経脊髄路核尾側亜核広作動域ニューロンの閾値の低下と発火頻度が増加することにより発現することが判明し、三叉神経節ニューロンの興奮性に対するニューロン-グリア細胞間のクロストークが重要な役割を果たすことが強く示唆された。本年度では、NiTiコイルスプリング矯正装置(15g荷重)を使用して、ラット上顎第一臼歯の近心移動を行った。今回のNiTiコイルスプリング矯正装置を装着した動物実験例(20個体)では、最長7日間の観察期間に矯正装置の脱落・破損は3例にとどまり、相同な負荷条件下では臼歯移動様式の再現性も高いことが確かめられた。7日間持続負荷の条件においては、第一臼歯はすべて近心移動していることが確かめられた。なお、40g荷重群も設定したが、移動歯の歯軸傾斜が増強され、第一臼歯の強度な傾斜移動がみとめられたため、本年度の研究はすべて15g荷重条件を採用した。第一臼歯の近心移動に伴う疼痛(自発痛)の関連行動ついて、Face Grooming行動を指標とした定量解析(装置装着前後において、毎日20分間デジタルビデオカメラで撮影、Face Grooming行動の回数と時間を計測)を実施したところ、装置装着後1日でFace Grooming行動が最大値を示し、処置後5日目には無処置群と同レベルにまで回復することが確かめられた。また、歯の近心移動に伴う誘発痛の有無を検証する目的で、ラット口吻部においてvon Frey hairによる逃避反射閾値を測定したところ、誘発痛においても装置装着後1日目で逃避反射閾値が有意に減少し、5日目に回復することがわかった。現在は、歯の移動に伴う歯根膜由来の三叉神経節ニューロンの興奮性増強に対する三叉神経節内のニューロンーグリア細胞間クロストークの役割を明らかとするために、歯の矯正移動に伴う疼痛関連行動の誘導に伴って、歯根膜支配の三叉神経節ニューロン周囲のグリア細胞の活性が変調するかを評価する目的で、GFAP活性とサイトカイン(IL-β, TNFα)産生が炎症により誘導されるかを逆行性蛍光標識および免疫組織化学法を用いて検討を継続している。動物モデルを用いた矯正学的な歯の移動実験においては、ラット臼歯が実験系として頻用されてきたが,負荷される矯正力の性質(荷重量,作用方向,作用期間,負荷頻度など)が厳密に規定されていない例が多い。そのため、本年度においては、ラット上顎第一臼歯の近心移動モデルにおいて、矯正処置と歯の近心移動に伴う疼痛発現との関連を三叉神経節のニューロンとグリア細胞との相互作用を明確に理解することを目指して、矯正装置の装着操作に起因する疼痛を可能な限り排除し、第一臼歯の移動による疼痛のみを解析対象とできるよう、ラット矯正学的歯の移動モデルの規格化に注力してきた。これにより、所定の実験プロトコールを遂行するうえでは、麻酔の導入からNiTiコイルスプリングの装着まで30分程度で完了できるようになった。そのため、荷重開始1時間後からのFace Grooming解析が可能となり、自発痛のより詳細な解析データを得ることに繋がった。また、臼歯の矯正移動に伴う炎症により歯根膜由来の三叉神経節ニューロンとサテライトグリア細胞のクロストークに変調が生じるか、あるいは、自発痛に関連する歯根膜由来の三叉神経節ニューロンの自発的発火に起因する疼痛関連行動がどの様なシグナルで変調するのかについての免疫組織学的検索については、上顎第一臼歯歯根膜部に蛍光色素(2% Fluorogold:FG, 10μl)をマイクロシリンジにて注入し、この部位を支配する三叉神経節ニューロンを蛍光標識することに成功している。一次抗体にはグリア細胞の活性化マーカであるGFAP(希釈倍率1:500)とTNFα抗体(1:200)またはIL-1β抗体(1:200)の組み合わせでの免疫反応を想定し、二次抗体に励起波長の異なる蛍光抗体(Alexa488/568, 1:1000)使用した蛍光免疫二重染色のプロトコールを確立した。昨年度から継続して、NiTiコイルスプリング矯正装置(15g荷重)を使用し、ラット上顎第一臼歯の近心移動実験を行った。動物モデルを用いた矯正学的な歯の移動処置においては、負荷される矯正力の性質(荷重量、作用方向、作用期間、負荷頻度など)を規定することにより、動物の麻酔導入からNiTiコイルスプリングの装着まで30分程度で完了できるようになった。第一臼歯の近心移動に伴う疼痛(自発痛)の関連行動について、Face Grooming行動を指標とした定量解析(ビデオカメラによる行動解析)を実施したところ、矯正力の負荷後1日でFace Grooming行動が最大値を示し、矯正力負荷後5日目には無処置群と同一レベルにまで回復することを確かめた。

また、歯の近心移動に伴う誘発痛の有無を検証する目的で、ラット口吻部におけるvon Frey hairによる逃避反射閾値を測定したところ、誘発痛においても矯正力負荷後1日目で逃避反射閾値が有意に減少し、5日目に回復することが判った。歯の近心移動に伴う歯根膜由来の三叉神経節ニューロンの興奮性増強に対する三叉神経節内のニューロンとグリア細胞間のクロストークの役割を解明する目的では、上顎第一臼歯歯根膜部に蛍光色素(2% Fluorogold)をマイクロシリンジで注入し、歯根膜部を支配する三叉神経節ニューロンを標識したうえで、グリア細胞活性化マーカ(GFAP)とTNFαまたはIL-1βを組み合わせた免疫染色を実施し、病理学的形態解析を遂行している。ラット上顎第一臼歯の近心移動モデルにおいて、矯正処置と歯の近心移動に伴う疼痛発現との関連性における三叉神経節のニューロンとグリア細胞との相互作用を理解する目的では、矯正装置の装着操作に起因する疼痛を可能なかぎり排除し、第一臼歯の移動による疼痛のみを解析対象となるよう、ラット矯正学的歯の移動モデルを規格化した。これにより、矯正力負荷後1時間からFace Grooming解析が可能となり、自発痛の詳細解析データを得ることが可能となった。免疫組織学的解析においては、上顎第一臼歯歯根膜部に蛍光色素をマイクロシリンジにて注入し、歯根膜領域を支配する三叉神経節ニューロンを蛍光標識したうえで、複数のマーカ抗体と励起波長の異なる蛍光二次抗体を使用した蛍光免疫多重染色法のプロトコールを確立している。前年度から継続して、NiTiコイルスプリング矯正装置(15g荷重)を使用して、ラット上顎第一臼歯の近心移動実験を行った。動物モデルを用いた矯正学的な歯の移動処置においては、負荷される矯正力の性質(荷重量、作用方向、負荷頻度)を規定することにより、動物の麻酔導入からNiTiコイルスプリングの装着まで30分程度で完了できるプロトコールを確立できた。第一臼歯の近心移動にともなう疼痛(自発痛)の関連行動について、ビデオカメラ撮影による行動解析を行った結果、矯正力の負荷後1日でFace Groomig行動が最大値を示し、矯正力負荷後5日目には無処置群と同一レベルにまで回復した。また、歯の近心移動に伴う誘発痛の有無を検証する目的で、ラット口吻部におけるvon Frey hairによる逃避反射閾値を測定したところ、誘発痛においても矯正力負荷後1日目で逃避反射閾値が有意に減少し、矯正力負荷後5日目に回復することが確かめられた。歯の近心移動に伴う歯根膜組織由来の三叉神経節ニューロンの興奮性増強に対する三叉神経節内のニューロンとグリア細胞間のクロストークの役割を解明する目的では、上顎第一臼歯歯根膜部に蛍光色素(2% Fluorogold)をマイクロシリンジで注入し、歯根膜部を支配する三叉神経節ニューロンを標識したうえで、グリア細胞活性化マーカとTNAαまたはIL-1βを組み合わせた免疫染色を実施した。本研究では、ラット臼歯の矯正学的な歯の移動に伴う歯根膜由来の三叉神経節ニューロンの興奮性増強に対する三叉神経節内のニューロン-グリア細胞間クロストークの病態生理学的役割を明らかとするために、行動学・電気生理学・免疫組織化学的手法にて系統的に解析した。その結果、上顎臼歯への矯正力の付与に伴い上顎顔面皮膚に異所性痛覚過敏が認められた。歯根膜の炎症に伴い顔面皮膚への機械刺激に対する三叉神経脊髄路核尾側亜核広作動域ニューロンの閾値の低下と発火頻度が増加することにより発現することが判明し、三叉神経節ニューロンの興奮性に対するニューロン-グリア細胞間のクロストークが重要な役割を果たすことが強く示唆された。
環境微生物におけるビフェニル代謝遺伝子のネットワークと分子進化

ビフェニル(BP)資化菌は環境中に広く分布しており、本研究において32株のBP資化菌についてBP代謝(bph)遺伝子の相同性、BP環開裂酵素の免疫学性質を検し、BP資化菌を4つのグループに分類した。ついで、代表的なビフェニル(BP)資化菌Pseudomonaspseudoalcaligenes KF707株のBP代謝遺伝子(bph)クラスター、11.3kbの全塩基配列を決定した。bphクラスターの各遺伝子はトルエン資化菌P.putida F1株のトルエン代謝tod遺伝子クラスターのそれと遺伝子構成が類似しており、各遺伝子の塩基配列は約60%の高い相同性を示した。しかし、両代謝系の分解特牲は明らかに相違していた。ビフェニル資化KF707株のトランスポゾン変異株にトルエン代謝tod遺伝子を、逆にトルエン資化F1株にbph遺伝子を導入することにより相互の相補試験を行った。その結果、ビフェニル代謝系においては、初期酸素添加酵素がトルエン代謝の障害になっており、F1株のトルエン代謝系においては環開裂物質加水分解酵素がビフェニル代謝の障害となっていた。そこでトルエン初期酸素添加酵素遺伝子群を構成している4つのサブユニット遺伝子のうち、todCIC2の2つの遺伝子を広宿主ベクターにのせ、ビフェニル資化菌KF707株に導入するとトルエン資化能が獲得された。一方、トルエン資化F1株にbphD(ビフェニル環開裂物質加水分解酵素遺伝子)を導入するとBP資化能が生じた。ビフェニル資化菌は他の芳香族化合物資化菌と同様、リグニンの末端分解に関与しているものと考察した。ビフェニル(BP)資化菌は環境中に広く分布している。今回新たに分離した16株を加え、計32株についてBP代謝bph遺伝子の相同性、BP環開裂酵素の免疫学的性質を調べた。32株は全てBPを酸化し、フェニルカテコールを経て安息香酸へ分解した。その多くはグラム陰性菌でPseudomonas属、20株、Achromobacter属、2株、Alcaligenes属、2株、Moraxella属、1株、未同定株、6株、及びグラム陽性Arthrobacter属1株であった。先にクローン化したP.pseudoalcaligenesKF707株のbphABCD遺伝子をDNAプローブとして、各BP菌のゲノムDNAを制限酵素処理しサザン解析を行った。その結果、KF707bphオペロンと同一か、きわめて類似したbph遺伝子を有する9株が認められた。(第1グループ)。KF707bphと高い相同性を示すが、制限酵素パターンの異なる5株は、第2グループ、KF707bphと60-70%の相同性を有し、弱く交雑する6株は第3グループとして分類した。残りの12株は相同性が低く、第4グループとしたが、この中にはグラム陽性Arthrobacter sp.M5株や米国で分離したP.paucimobilis Q1株も含まれる。次に、KF707株の環開裂酸素添加酵素の抗体を用いて上記32株の酵素について免疫沈降反応を行った。第1グループはKF707株酵素と融合した沈降線を形成し、第2グループは強いクロス反応を示すがスパーを生じた。第3グループは弱いクロス反応を示し、第4グループは全く反応しなかった。この結果は、サザン解析の結果とよく一致した。次いで4つのグループからそれぞれ代表的な菌株を選び、コスミドを用いてゲノムライブラリーを作製した。このライブラリーからbph遺伝子を含むクローンが見いだされ、BP完全代謝をコードする遺伝子群のサブクローン化と解析を行っている。代表的なビフェニル(BP)資化菌Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707株のBP代謝遺伝子(bph)クラスター、11.3kbの全塩基配列を決定した。

bphクラスターの各遺伝子はトルエン資化菌P.putida F1株のトルエン代謝tod遺伝子クラスターのそれと遺伝子構成が類似しており、塩基配列は約60%の高い相同性を示した。しかし、両代謝系の分解特性は明らかに相違していた。ビフェニル資化KF707株のトランスポゾン変異株にトルエン代謝tod遺伝子を、逆にトルエン資化F1株にbph遺伝子を導入することにより相互の相補試験を行った。その結果、ビフェニル代謝系においては、初期酸素添加酵素(ビフェニルジオキシゲナーゼ)がトルエン代謝の障害になっており、F1株のトルエン代謝系においては環開裂物質加水分解酵素がビフェニル代謝の障害となっていた。そこでトルエン初期酸素添加酵素遺伝子群を構成している4つのサブユニット遺伝子のうち、todC1C2の2つの遺伝子を広宿主ベクターにのせ、ビフェニル資化菌KF707株に導入するとBP資化能に加えて、トルエン資化能が獲得された。一方、トルエン資化F1株にbphD(ビフェニル環開裂物質加水分解酵素遺伝子)を導入すると、トルエン資化能に加えてBP資化能が生じた。:以上の結果はビフェニル代謝遺伝子とトルエン代謝遺伝子が共通の祖先に由来し、長い年月を経て進化しその基質特異性が変化したものと考えられる。