hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
悪性腫瘍の非侵襲的温熱療法のための深部温度計測法の研究

感温磁性体を用いるソフトヒーティング法を応用し,感温磁性体に発熱効率の高い発熱体を併用することで高効率な加熱とワイヤレス温度計測を可能にする手法を考案し,生体模擬物質を用いた物理実験により,その妥当性を実証した.本技術は悪性腫瘍の温熱治療(ハイパーサミア)技術の基盤技術となる.感温磁性体を用いるソフトヒーティング法を応用し,感温磁性体に発熱効率の高い発熱体を併用することで高効率な加熱とワイヤレス温度計測を可能にする手法を考案し,生体模擬物質を用いた物理実験により,その妥当性を実証した.本技術は悪性腫瘍の温熱治療(ハイパーサミア)技術の基盤技術となる.平成19年度は,感温性磁性体微粒子を温度計測用のプローブとして利用するために必要な要素技術を研究した.過去の研究で開発された感温性磁性体微粒子は熱容量が小さいため,周囲温度に対する追従性が高く,温度プローブとして理想的であると考えている.体外から感温性磁性体の透磁率をモニタすることで目標加熱温度に到達したか否かを調べ,印加する磁場をコントロールする新たな温熱治療システムの実現に必要な技術基盤を構築した.平成19年度前半は生体に無害な誘導加熱に適した非磁性材料として直径が2mmのスチール球を高効率発熱体として利用し,188kHz,5mT程度の誘導磁場に対する粉体(微粒子)としての発熱特性を調べた.平成19年度後半は,感温性磁性体の透磁率の変化を磁束の垂直成分の大きさとして計測する「磁束ベクトル計測ユニット」を構築した.ここでは,微弱な磁束ベクトルの変化を検知できるようにデジタルロックインアンプを用いて計測装置を構成している.発信器で生成した正弦波電圧を電力増幅器に入力し,電力増幅器から駆動用コイルに励磁電流を供給する.駆動用コイルから出力される磁束の垂直成分をピックアップコイルで計測し,ロックインアンプにて励磁電流と同相成分を計測し,その妥当性を実験的に検証した.一方,試作した「磁束ベクトル計測ユニット」を用い,ファントム(生体模擬物質)中の感温性磁性体を対象として計測限界距離を実験的に調べると共に,電磁界シミュレーションにより駆動コイルの最適形状および磁気センサの最適配置を明らかにした.研究計画当初は「非侵襲深部温度計測システム」と「3次元位置姿勢デジタイザ」を組み合わせた検査装置を想定していたが,深部温度を検知するピックアップコイルのズレが極めて大きな計測誤差の原因となること,また,当初想定していた駆動コイルおよびピックアップコイルを動かしてスキャンする計測手法は手間と時間がかかり,臨床上適用しがたいことがわかった.そこで, 188kHzの誘導加熱用高周波磁場の磁束ベクトルの垂直成分を同期検波できる高周波用ロックインアンプを導入し,生体内深部を誘導加熱しながら到達温度を検知できる検査システムを構築し,ファントムを用いたin vitro実験により本手法の妥当性を検討した.その結果,ピックアップコイルに接続したロックインアンプで誘導加熱用コイルが発生する磁束の水平・垂直の両成分を同期検波モニタリングすることで,ワイヤレスに加熱対象が目標温度に到達したか否かを検知できることを明らかにした.また,生体に無害で誘導磁場による発熱効率の高い発熱体として金を選定し,感温磁性体に発熱体を混合することで誘導加熱の発熱効率を向上しながら到達温度をワイヤレスに検知できることを実証した.本研究成果は国際学会の場で発表され,また,学術論文として公表されている.次年度以降は,動物実験および臨床の場で本治療装置の妥当性を評価していく予定である.
全方位視覚センサを用いた複数人物のライフログに関する研究

ライフログの具体的な用途として体験活動の振り返るタスクを設定して研究を進めた.集団的な体験活動を頭部装着型のカメラで記録して研究を行う上で十分な量の個人視点映像を取得した.それらを用いて自身の気づきを効果的に振り返る手法を導入したところ,気づきの思い出しが増加する・より詳細に思い返すことができる,などの結果を得た.個人視点映像を用いた対話状況の推定では環境センサとの組み合わせることで精度が向上することが確かめられた.ライフログの具体的な用途として体験活動の振り返るタスクを設定して研究を進めた.集団的な体験活動を頭部装着型のカメラで記録して研究を行う上で十分な量の個人視点映像を取得した.それらを用いて自身の気づきを効果的に振り返る手法を導入したところ,気づきの思い出しが増加する・より詳細に思い返すことができる,などの結果を得た.個人視点映像を用いた対話状況の推定では環境センサとの組み合わせることで精度が向上することが確かめられた.平成21年度では,ログを記録するための電子機材の検討・試作を通して,ログのテスト収録を行った.収録機材は被記録者の見た経験(主観映像)を記録するための装着型カメラ,会話を収録するための小型マイクロフォン,および移動軌跡を記録するためのGPS装置を選択した.ただし,GPSは屋内では著しく精度が低下するため,別途ビジュアルマーカーを施設内に設置し,前述の主観映像を画像処理することで屋内位置推定を行う.テスト収録では,博物館収蔵庫の見学ツアー,グループ単位のスタンプラリー等の集団行動を対象として人物行動を記録した.結果,集団行動ならではの振る舞いが多く観測された.特に人物間のコミュニケーション等の従来のライフログでは扱われてこなかった情報が多く含まれており,種々の有効な利用が期待される.収録されたログの閲覧・利用法についても基礎的な検討を行った.人物軌跡は屋外と屋内で計測法が異なるため,統合・補正・閲覧に関して検討した.また,ユーザーの意図や状況に応じたログの提示についてや,その状況認識法,ログを強化するためのアノテーション付加を支援する枠組みなどについても検討した.前年度ではテストフィールドを記録対象としたが,平成22年度では,実際の集団行動を記録対象としてログを収録した.各種体験学習を研究対象としている研究グループと協力して,フィールド調査型,およびモノ作り型の体験学習を開催することで,よりアプリケーションに近い状態での収録を行った.参加者の頭部に装着したビデオカメラは,説明を聞く,調査対象を見て驚く,他の人に気づきを伝える,議論を行う,アイデアを出し合う,協力して作業する等の種々のイベントを収録する.それらは,後から振り返ることで事後に体験学習を強化する,体験学習を評価する,また,以降の体験学習において予習に用いる,体験活動中に参照する,といった用途に有効であると考えた.なかでも,自身の記録を後から参照する利用方法は,フィールド調査型の体験学習において調査内容をまとめる作業に役立つと思われる.その効果を検証するために,手作業を含めた情報処理を用いて記録の再生実験を行った.記録をそのままに再生しても効果的な振り返りが期待できないため,再生対象として「気づきがあった」時の記録を選択した.複数デバイスによる記録の利用や画像処理を用いた注視状態の推定,および一部の手作業により再生対象のビデオクリップを切り出した.フィールド調査型の体験学習を行った参加者を被験者として実験を行い,調査内容をまとめるタスクにおいて気づき体験の再生が与える影響を明らかにした.前年度までに得た知見を基に,種々の支援を自動処理により行うための基礎検討および基礎処理の実装を行った.体験の振り返りにより事後学習が効果的に行われるが,どのような体験に対してどのような振り返りを行えば良いかはまだ明らかにされていない.そこで,複数人でアイデアを出し合いながら1つの作品を作り上げる「ものづくり形式のワークショップ」を対象として体験と振り返り方法の対応について検討した.結果,意見交換・個人作業・共同作業,などのそれぞれの体験において振り返りに有効な撮影視点や行動パターンが得られた.これらは振り返り支援のためのインタラクション設計や自動処理アルゴリズムの検討に大いに役立つものである.それと同時に,明らかに振り返りに有効であると考えられる現象については自動認識することに取り掛かった.体験では人物同士のインタラクション,特に対話が大きな意味を持つため,対話が行われている時間や対話における各人物の役割を,参加者頭部に装着したカメラにより撮影された個人視点映像から推定する手法について検討した.個人視点映像には装着者が見たものとほぼ同じ内容が記録されるため,発話者や対話に固有の動作の検出を通して対話状況の認識が可能となる.また,カメラの動き=装着者の頭部運動となるため,そこに含まれるうなづきや発話者への顔向けなども有効利用できる,現時点では高精度な認識性能には到達しなかったが,利用方法の検討とも組み合わせた振り返り支援のための基盤が整備されてきたと言える.
ハイブリッド量子分子動力学法に基づくトライボケミカル反応シミュレータの開発

最近,化学反応を含むトライボロジー現象いわゆるトライボケミカル反応の電子レベルでの解明に対する要求が高まってきているが,トライボケミカル反応を解明可能な理論計算プログラムは皆無である.本研究では,研究代表者が開発してきた高速化量子分子動力学プログラムColorsと,分子動力学法に基づき原子レベルでのトライボロジー現象の解明が可能なトライボロジーシミュレータTRIBOSIMを統合化し,トライボケミカル反応ダイナミクス解明可能なトライボケミカル反応シミュレータを世界に先駆けて開発し,これを活用した電子レベルでのトライボロジー材料・プロセスの理論設計を行うことを目的とした.平成1617年度は当初の計画通り,上記プログラムの統合化によるトライボケミカル反応シミュレータの開発,ハイブリッド量子分子動力学法プログラムHybrid-Colorsの開発とこれに基づくトライボケミカル反応シミュレータの開発,に成功した.平成18年度には,エンジンオイルのフリクション低減用添加剤ジアルキルジチオカルバミン酸モリブデン(MoDTC)の酸化鉄基板上での化学反応ダイナミクスを検討したところ,MoDTC分子のアルキル基が解離し最終的にはMo-S結合が酸化鉄基板上に残るという化学反応ダイナミクスが得られた.また,エンジンオイル用リン酸エステル系極圧添加剤であるリン酸トリメチルのトライボケミカル反応ダイナミクスについても,摩擦条件下においてのみ鉄とリン酸トリメチルの酸素原子が結合することが解明された.平成19年度には,MoDTCより境界潤滑下,摩擦界面に形成する二硫化モリブデン(MoS_2)の境界膜間すべり現象に起因する摩擦緩和において,MoS_2の異なる原子層間の硫黄原子どうしのクーロン反発の寄与が大きいことをはじめて解明した.以上より本研究で開発したトライボケミカル反応シミュレータがトライボケミカル反応やトライボロジー特性解明において非常に有効であることが示された.最近,化学反応を含むトライボロジー現象いわゆるトライボケミカル反応の電子レベルでの解明に対する要求が高まってきているが,トライボケミカル反応を解明可能な理論計算プログラムは皆無である.本研究では,研究代表者が開発してきた高速化量子分子動力学プログラムColorsと,分子動力学法に基づき原子レベルでのトライボロジー現象の解明が可能なトライボロジーシミュレータTRIBOSIMを統合化し,トライボケミカル反応ダイナミクス解明可能なトライボケミカル反応シミュレータを世界に先駆けて開発し,これを活用した電子レベルでのトライボロジー材料・プロセスの理論設計を行うことを目的とした.平成1617年度は当初の計画通り,上記プログラムの統合化によるトライボケミカル反応シミュレータの開発,ハイブリッド量子分子動力学法プログラムHybrid-Colorsの開発とこれに基づくトライボケミカル反応シミュレータの開発,に成功した.平成18年度には,エンジンオイルのフリクション低減用添加剤ジアルキルジチオカルバミン酸モリブデン(MoDTC)の酸化鉄基板上での化学反応ダイナミクスを検討したところ,MoDTC分子のアルキル基が解離し最終的にはMo-S結合が酸化鉄基板上に残るという化学反応ダイナミクスが得られた.また,エンジンオイル用リン酸エステル系極圧添加剤であるリン酸トリメチルのトライボケミカル反応ダイナミクスについても,摩擦条件下においてのみ鉄とリン酸トリメチルの酸素原子が結合することが解明された.平成19年度には,MoDTCより境界潤滑下,摩擦界面に形成する二硫化モリブデン(MoS_2)の境界膜間すべり現象に起因する摩擦緩和において,MoS_2の異なる原子層間の硫黄原子どうしのクーロン反発の寄与が大きいことをはじめて解明した.以上より本研究で開発したトライボケミカル反応シミュレータがトライボケミカル反応やトライボロジー特性解明において非常に有効であることが示された.近年、環境・エネルギー対策、ダウンサイジング等の要請から微小領域での摩擦・潤滑、いわゆるナノトライボロジーの重要性が高まっている。これに対し、研究代表者らは分子動力学法に基づき、原子レベルでトライボロジー現象の解明を可能とするトライボロジーシミュレータTRIBOSIMを開発し、潤滑剤の定量的な物性値予測、摩擦・潤滑メカニズムの解明を可能にしてきた。一方、最近では化学反応を含むトライボロジー現象、いわゆるトライボケミカル反応の電子レベルでの解明に対する要求が強くなってきた。しかし、世界的に見てもトライボケミカル反応を解明可能な理論計算プログラムは皆無である。そこで本研究では、研究代表者らが開発してきた分子動力学法に基づくトライボロジーシミュレータTRIBOSIMとSCF-Tight-Binding近似に基づく高速化量子分子動力学プログラムColorsを統合化し、トライボケミカル反応ダイナミクスを解明可能なトライボケミカル反応シミュレータTribo-Colorsを世界に先駆けて開発することを目的とした。さらに開発プログラムを活用し、電子レベルでのトライボロジー材料・プロセスの理論設計を行うことを目的とした。本年度は、予定通りプログラム開発を中心に研究を遂行した。具体的には、上記の2種類のプログラムを統合化することで、「化学反応」と「機械的摩擦」の両方を扱えるトライボケミカル反応シミュレータの開発に成功した。さらに、高速化量子分子動力学法に関して、化学反応が起こらない部分を古典分子動力学法で計算し、化学反応が起こる部分を量子分子動力学法で扱うことにより、数千原子上の大規模計算を可能とするハイブリッド量子分子動力学法の開発にも成功した。さらに、この大規模系を扱うことが可能なハイブリッド量子分子動力学法を活用したトライボケミカル反応シミュレータの開発にも成功した。近年、環境・エネルギー対策、ダウンサイジング等の要請から微小領域での摩擦・潤滑、いわゆるナノトライボロジーの重要性が高まっている。

一方、最近では化学反応を含むトライボロジー現象、いわゆるトライボケミカル反応の電子レベルでの解明に対する要求が強くなってきた。しかし、世界的に見てもトライボケミカル反応を解明可能な理論計算プログラムは皆無である。そこで本研究では、研究代表者らが開発してきた分子動力学法に基づくトライボロジーシミュレータTRIBOSIMとSCF-Tight-Binding近似に基づく高速化量子分子動力学プログラムColorsを統合化し、トライボケミカル反応ダイナミクスを解明可能なトライボケミカル反応シミュレータTribo-Colorsを世界に先駆けて開発することを目的とした。さらに開発プログラムを活用し、電子レベルでのトライボロジー材料・プロセスの理論設計を行うことを目的とした。本年度は、予定通りプログラム開発を中心に研究を遂行した。具体的には、上記の2種類のプログラムを統合化することで、「化学反応」と「機械的摩擦」の両方を扱えるトライボケミカル反応シミュレータの開発に成功した。さらに、高速化量子分子動力学法に関して、化学反応が起こらない部分を古典分子動力学法で計算し、化学反応が起こる部分を量子分子動力学法で扱うことにより、数千原子上の大規模計算を可能とするハイブリッド量子分子動力学法の開発にも成功した。さらに、この大規模系を扱うことが可能なハイブリッド量子分子動力学法を活用したトライボケミカル反応シミュレータの開発にも成功した。近年,環境・エネルギー対策,ダウンサイジング等の要請から微小領域でのトライボロジーの重要性が高まっている.特に最近では,化学反応を含むトライボケミカル反応の解明に対する要求が強くなってきた.しかし,世界的にもトライボケミカル反応を解明可能な理論計算プログラムは皆無である.そこで本研究では,研究代表者らが開発してきた分子動力学法に基づくトライボロジーシミュレータTRIBOSIMとSCF-Tight-Binding近似に基づく高速化量子分子動力学計算プログラムColorsを統合化し,トライボケミカル反応ダイナミクスを解明可能なトライボケミカル反応シミュレータTribo-Colorsおよびハイブリッド量子分子動力学法シミュレータHybrid-Colorsを世界に先駆けて開発し,電子レベルでのトライボロジー材料・プロセスの理論設計を行うことを目的とした.エンジンオイルのフリクション低減用添加剤であるジアルキルジチオカルバミン酸モリブデン(Mo-DTC)の酸化鉄基板における化学反応ダイナミクスの解析にHybrid-Colorsプログラムを適用したところ,Mo-DTC分子のアルキル基が解離し,最終的にMo-S結合が酸化鉄基板上に残るという化学反応ダイナミクスが観察された.
鋼構造部材の座屈と破壊の連成に関する研究

本研究の成果を要約すると,次のようになる。大きな塑性ひずみを繰返し受ける構造用鋼材が破壊するまでの全挙動を表現する数理モデルを考案したこと。それを組み込んだ数値シミュレーションを開発したこと。それにより座屈後挙動の大変形繰返し挙動を再現できることを実験との比較により確認したこと。亀裂の発生条件の数理モデルを構築し,材料実験によりその精度を確認したこと。鋼管柱の繰返し実験で座屈と破壊の連成を再現し,本研究で開発したシミュレーターでそれを数値的に追跡できることを確認したこと。地震応答解析により鋼構造に座屈と破壊が連成すると,座屈単独の場合より倒壊までの塑性変形能力が低下することを示したこと。当初交付申請書に記載した研究実施計画に基づき、山形断面筋かいの圧縮・引張繰返し実験をスタートし、座屈と破壊の連成現象を再現したが、2つの問題があることが判明した。一つは、支持点の境界条件が明確でない(特に偏心の大きさが精確に検出できない)こと。もう一つは、塑性履歴の数理モデルの選択肢が多く、どれが適切であるかが明確でないことである。この二つの不確定要因のため、実験結果を精確に数値シミュレーションできないという事態となった。そこで、鋼材の繰返し塑性履歴モデルの検証を先に行っておく必要があると判断し、材質および境界条件が明確な砂時計型丸棒の繰返し実験を様々な履歴パターンで実施し、有望と思われるいくつかの履歴モデルを選出して、どれが最も精確に実験結果を追跡できるかを検証した。実験:予ひずみなし8ケース(単調引張1、単調圧縮1、ランダム振幅6)予ひずみあり4ケース(単調引張1、単調圧縮1、ランダム振幅2)シミュレーションに用いた塑性履歴モデル:(1)Pragerモデル,(2)Chabocheモデル,(3)Yoshida-Uemoriモデルその結果、等方硬化と移動硬化を適切に組み合わせれば、ChabocheモデルとYoshida-Uemoriモデルがともに、非常に大きな塑性ひずみ領域まで実験結果を追跡できることが明らかとなった。また、今回の研究により、モデルパラメータの値も明確となり、予ひずみの有無によってその数値が変わる様子も明らかにすることができた。鋼材の繰返し実験とその数値シミュレーション,および電子顕微鏡での破面分析を行った。具体的には次の事項である。(1)鋼材の繰返し履歴実験:砂時計型試験片を厚鋼板(厚さ65mm)から中央偏析を避けて採取し,単調引張試験,単調圧縮試験,および圧縮引張繰返し試験(載荷プロトコール7ケース)を行い,直径の変化をレーザー幅計で計測することにより,破断に至るまでの繰返し真応力-真ひずみの精確なデータを得た。(2)繰返し履歴の数値シミュレーション:砂時計型試験片の繰返し履歴挙動について有限要素解析で数値解析を行った。このとき,圧縮と引張の繰返しによるバウシンガー効果を考慮した履歴則としてPragerモデル,Chabocheモデル,Yoshida-Uemoriモデルを用いた。それぞれのモデルには未定係数が含まれるので,上記の実験データから係数値を求めた。応力ひずみ状態が刻々変化し,その過程で延性亀裂が進展する実験結果全体を一貫して精度良く再現できる数理モデル(応力ひずみ履歴構成方程式および延性破壊規範式)を決定した。延性破壊規範式については既に実施した実験データとの整合性も確認した。(3)破面分析:本研究で既に行っている座屈ー破壊連成実験および上記砂時計型実験の破面をサーフィスビュー顕微鏡(走査型電子顕微鏡)で観察し,両者の破面形態が共通していること,および破壊進展過程(ボイド発生,ボイド連結,亀裂進展,最終破断)が数理モデルに適合していることを確認した。本研究は,鋼構造部材に座屈と破壊が連成する場合の塑性変形能力を解明することを目的とする。座屈は固有値問題としての座屈ではなく大変形を伴う座屈後挙動を指し,そのうち,破壊と連成する板要素の座屈すなわち局部座屈が主として対象となる。一方,破壊は延性破壊(あるいは部分的に擬似脆性破壊)を指す。延性破壊は鋼材の伸び能力がすべて消費され,全断面に延性き裂が進行したのち破壊する形態である。座屈と破壊の連成現象は,1995年兵庫県南部地震で少なからず報告されているが,まだ本格的な研究が着手されていなかった。座屈と破壊が連成する場合の塑性変形能力を解明して鋼構造物の耐震安全性を格段に向上させることが本研究の目標である。本年度は,鋼構造建築物で多く用いられる角形鋼管柱の座屈と破壊の連成現象を実験室で再現した。

実験装置には高軸力の圧縮と引張の繰返しを与えることのできる5000kN試験機(現有)を用いた。座屈と破壊の連成には,鋼材の材質,幅厚比,載荷パターンが関与するので,これらを実験変数とした(材質2ケース,幅厚比3ケース,載荷パターン4ケースの全24ケース)。角形鋼管は断面内で材料特性が変化するので,材料試験片を細かく採取して,平板部・角部・溶接部それぞれの材料特性を調査した。実験により荷重と変形の履歴曲線,ビデオカメラを使った亀裂の発生進展状況,ひずみゲージによるひずみ分布を計測した。試験後には試験体から破壊部分をサンプリングし走査型電子顕微鏡(新規導入)で破面分析を行い,破壊形態が予想通り延性破壊であることを確認した。前年度の研究で,鋼材が大きな繰返し塑性変形を受けるときの履歴挙動を追跡するための数値解析シミュレータを開発したので,これを用いて座屈を含む大変形履歴を概ね予測できることを確認した。破壊との連成挙動の解析技術は次年度の課題となる。平成26年度は,本研究課題の最終年度となるので,年度の前半で今までの実験データを補足するための実験を行い,年度の後半で座屈と破壊の連成を考慮した鋼構造建築物の地震応答解析を行った。これらを総合して,座屈と破壊の連成を考慮した耐震設計の技術提案を行った。補足実験は,鋼管柱がH形梁と接合される仕口部分に生じる鋼管柱の局部変形と延性破壊の再現実験を行った。そこでは,鋼管を冷間成形ままのものと熱処理を施したもの2種類の材質で実験し,座屈と破壊の連成現象の違いを観察するとともに,前年度までに構築された連成現象評価のスキームを再確認した。地震応答解析は,座屈と破壊の連成現象がもっともクリティカルになる鋼管柱に連成現象評価スキームを組み込んで地震応答解析を行い,従来型の耐震設計,すなわち座屈あるいは破壊のみを単独で評価する場合と比べて,どの程度,塑性変形能力の指標となる構造特性係数(いわゆるDs値)に差が生じるかを定量化した。このとき,座屈には鋼管柱の幅厚比が関与すること,破壊には鋼管材料自体がもつ延性が関与するので,これらを変数としたシミュレーションを行った。以上で得られた知見を総合して,本研究テーマの結論を整理した。ただし,座屈と破壊の連成問題が関わる構造設計領域は広いので,残された課題についても整理した。26年度が最終年度であるため、記入しない。建築構造26年度が最終年度であるため、記入しない。塑性変形履歴を数値的に再現できる数理モデルとそのモデルパラメータを明らかにすることができたことは今後の研究にとって非常に有益であった。座屈と破壊が連成する場合は、大きな塑性変形後に亀裂が微視的な部分から発生するので、その微視的部分の応力-ひずみ状態は数値シミュレーションによってのみ知ることができるからである。座屈と破壊の連成を実験室で再現する際には、境界条件を明確にしておかないと、シミュレーションの精度に影響を与えてしまうので、今後の再現実験ではそのことについても十分な配慮が必要であることがわかったことも有益であった。当初予定より試験体数を若干縮減する必要があったが,既往の実験データを援用することにより当初研究目的を達成することができた。翌年度実施予定の座屈と破壊の連成を考慮した地震応答解析の一部を先取りして実施し,翌年度の研究が進められることを確認した。
インフルエンザウイルスキャップ依存エンドヌクレアーゼの機能解析

インフルエンザウイルス(FluV)のRNA依存RNAポリメラーゼは,mRNAキャップ構造に依存したエンドヌクレアーゼ活性を有し,宿主細胞核内のmRNAからキャップ構造を含んだRNA断片を切り出し,これをプライマーに利用してウイルスmRNAを合成する.本研究ではFluVのキャップ化RNAプライマー切り出し反応の分子機構を解析し,以下の結果を得た.(1)精製FluV-RNPを用いた効率の良いin vitroキャップ化RNAプライマー切り出し反応系を確立した.(2)キャップ構造のメチル基はA型FluVのエンドヌクレアーゼ活性には必要であるが,B型FluVの場合には必ずしも必須でないことが示され,両ウイルス型でキャップ構造の認識能に差があることを見出した.(3)切り出されたキャップ化RNAプライマーを分析したところ,それらは11から13ヌクレオチド長であり,その3'末端は主にAおよびG残基であることが明らかとなった.また,3'側のRNA断片に関してもその5'末端塩基を分析したところ,ほとんどがA残基であることが示された.(4)FluVキャップ依存エンドヌクレアーゼの阻害薬を簡便にスクリーニングできる系を構築した.5'末端キャップ構造を放射標識し,3'側をビオチン化したRNAを調製し,これをFluVエンドヌクレアーゼの基質に用いた.in vitroキャップ化RNAプライマー切り出し反応を行い,反応後のRNAをストレプトアビジンビーズで回収した.FluVエンドヌクレアーゼが阻害されると,RNA鎖5'キャップ構造の放射活性はビーズ画分に回収されるスクリーニング系を構築した.インフルエンザウイルス(FluV)のRNA依存RNAポリメラーゼは,mRNAキャップ構造に依存したエンドヌクレアーゼ活性を有し,宿主細胞核内のmRNAからキャップ構造を含んだRNA断片を切り出し,これをプライマーに利用してウイルスmRNAを合成する.本研究ではFluVのキャップ化RNAプライマー切り出し反応の分子機構を解析し,以下の結果を得た.(1)精製FluV-RNPを用いた効率の良いin vitroキャップ化RNAプライマー切り出し反応系を確立した.(2)キャップ構造のメチル基はA型FluVのエンドヌクレアーゼ活性には必要であるが,B型FluVの場合には必ずしも必須でないことが示され,両ウイルス型でキャップ構造の認識能に差があることを見出した.(3)切り出されたキャップ化RNAプライマーを分析したところ,それらは11から13ヌクレオチド長であり,その3'末端は主にAおよびG残基であることが明らかとなった.また,3'側のRNA断片に関してもその5'末端塩基を分析したところ,ほとんどがA残基であることが示された.(4)FluVキャップ依存エンドヌクレアーゼの阻害薬を簡便にスクリーニングできる系を構築した.5'末端キャップ構造を放射標識し,3'側をビオチン化したRNAを調製し,これをFluVエンドヌクレアーゼの基質に用いた.in vitroキャップ化RNAプライマー切り出し反応を行い,反応後のRNAをストレプトアビジンビーズで回収した.FluVエンドヌクレアーゼが阻害されると,RNA鎖5'キャップ構造の放射活性はビーズ画分に回収されるスクリーニング系を構築した.インフルエンザウイルス(FluV)のRNAポリメラーゼは,宿主のmRNAからキャップ構造を含んだRNA断片を切り出し,これをプライマーに利用してmRNAを合成する.本研究ではFluVのキャップ化RNAプライマー切り出し反応の分子機構を明らかにすることを目的に,本年度はFluV A型(FluV-A)およびB型(FluV-B)エンドヌクレアーゼのRNA基質特異性について解析した.1.in vitroキャップ化RNAプライマー切り出し反応系の確立:既に構築したin vitroキャツプ化RNAプライマー切り出し反応系を基本に,反応諸条件を至適化し,効率の良い系を確立した.この系で切り出されたRNA断片はヌクレオチドの添加によりRNA鎖を伸長したことから,プライマーとして機能することが示された.2.5'末端構造の異なる基質RNAの合成:(1)RNAの調製:T7RNAポリメラーゼによるin vitro転写系で,33ヌクレオチド長のRNAを合成した.(2)酵素の調製:ワクシニアウイルス感染HeLa細胞抽出液から,硫安沈殿およびイオン交換クロマトグラフィーにより,ワクシニアウイルスキャッピング酵素を部分精製した.また,ヒトmRNAメチル基転移酵素を大腸菌内で大量発現し,精製した.(3)キャップ化RNAの調製:これらを用いて,m^7GpppGm-,GpppGm-,pppGm-,m^7GpppG-,GpppG-,pppGm-RNAを合成した.3.FluV-AおよびFluV-Bエンドヌクレアーゼの基質特異性:これら5'末端構造の異なるRNAを用いて,in vitroキャップ化RNAプライマー切り出し反応を行ったところ,キャップのメチル基はFluV-Aのエンドヌクレアーゼ活性には必要であるが,FluV-Bの場合には必ずしも必須でないことが示され,両ウイルス型でキャップ構造の認識能に差があることが見出された.インフルエンザウイルス(FluV)のRNAポリメラーゼは,宿主のmRNAからキャップ構造を含んだRNA断片を切り出し,これをプライマーに利用してmRNAを合成する.本研究ではFluVのキャップ化RNAプライマー切り出し反応の分子機構を明らかにすることを目的に,本年度はFluVエンドヌクレアーゼによるRNAの切断位置,および切断部位の塩基特異性を明らかにすること,および抗インフルエンザウイルス薬のスクリーニング系を確立することを目的とした.

1.キャップ化RNA切断部位近傍の塩基配列の解析:昨年度構築したin vitroキャップ化RNAプライマー切り出し反応系を基本に,解析を進めた.ランダムな配列のキャップ化RNAを合成し,これをFluVエンドヌクレアーゼの基質に用い,切り出されたキャップ化RNA断片を分析したところ,それらは11から13ヌクレオチド長であり,その3末端はAまたはG残基であることが明らかとなった.また,3側の断片に関してもその5末端塩基を分析したところ,A残基であることが示された.これらの結果より,FluVエンドヌクレアーゼは,キャップ構造から11から13ヌクレオチドの位置にあるAまたはG残基とA残基を認識してその間を最も効率よく切断している可能性が示された.2.インフルエンザウイルス薬のスクリーニング系の確立:FluVのキャップ依存エンドヌクレアーゼを阻害する活性を指標に,薬抗剤を簡便にスクリーニングできる系を構築した.5末端キャップ構造を放射標識し,3側をビオチン化したRNAを調製し,これをFluVエンドヌクレアーゼの基質に用い,in vitroキャップ化RNA切り出し反応を行った.反応後のRNAをストレプトアビジンビーズで回収することにより,FluVエンドヌクレアーゼが阻害されると,放射活性がビーズ画分に回収されるスクリーニング系を構築した.
3次元多様体上の接触構造と葉層構造の研究

研究代表者の三松は分担者の水谷を含む葉層構造の研究グループとともに双接触構造及び、射影的Anosov流の研究に取り組み、多くの例を構成した。特に、3次元球面上に共にover tiwistedなものからなる双接触構造を構成し、Anosovの場合とは異なり双接触構造から普通の意味ではtight性が得られない事を示した。一方、実現できる平面場のホモトピー類は今のところ少なく、この事情を解明することが今後の課題として残った。分担者の小野は、深谷氏との共同研究で擬正則曲線の理論をsymplectic topologyに応用する際の障害であった負多重曲線の問題を倉西構造の概念を導入して解決した。また、小野と神田は、太田氏との共同研究で、接触構造論へのSeiberg-Witten理論の応用として、単純特異点の近傍のsymplectic fillingのトポロジーをSW理論を使って調べる研究をした。これらは、今後に更なる発展が期待できるが、それは最後にのべる研究項目との関わりにおいて最も顕著になるだろう。神田は3次元トーラス上のtightな接触構造の分類やBennequinの不等式が最良評価でないこと等の、接触構造の位相的研究を行った。高倉が以前から研究してきた幾何学的量子化の理論を基礎として、symplectic多様体上の擬正則曲線の理論を適用する替わりにLegenderian/Lagrangiaanトーラスによる双対的な方法を、三松と高倉は模索してきた。代数関数論における主要な概念の類似が定式化できることが分かったが、これにより接触構造の位相を調べることは、今後の問題であり、大きな発展が期待される。初年度なので共同研究者各自の特徴を生かした基礎的な研究を行なった。本研究では、初期段階における研究方向を二つに大別している。葉層構造との関連に於て接触構造の凸性を位相的に追求する位相・葉層グループでは、研究代表者と分担者の水谷が、葉層構造の変形として得られる接触構造の族が強い凸性を示す(つまりsymplectic構造を生成する)場合にはその葉層がAnosov葉層に近い性質(tautであり多様体の基本群は指数的成長)を持つという結果を得た。また射影的Anosov流に付随する葉層・接触構造は予想されていた凸性(Reeb成分を持たない・tight)を一般には満たさないことを示す反例を構成する一方で、射影的Anosov流がC1級のAnosov分解を持つ場合には付随する葉層構造は期待する凸性を持つことを示した。これらの結果は国内外の幾つかの研究集会で発表され、論文として準備中である。これに対し神田は、接触構造の凸性に於いて重要なLegendre結び目のThurston-Bennequin不変量が一般には凸性を示すBennequinの不等式を過剰に満たしてしまうことを、結び目と接触構造の向きに着目して示し、本研究にとって基礎的かつ示唆的な結果を得た(研究発表欄の二番目)。更に水谷はPoisson葉層の定性論を創始し、特にその特性類等のコホモロジー論を展開しており、論文が既に準備された。より代数的な接触構造に対して幾何学的量子化の手続を試みるsymplecticグループでは、高倉がその基礎として常に問題となるsymplectic商のコホモロジー論を進展させ、その成果を国内外で発表した。一方この方面での重要な手段となる擬正則曲線の理論を深化させた小野は、その一つの大きな結実としてArnold予想を概ね解決するに至った。この一部が研究発表欄一番目の論文として発表され、更なる論文が準備されている。代表者の三松は分担者の水谷を始めとする葉層構造の研究者グループと共に、接触構造と葉層構造が同時に現れる双接触構造(射影的Anosov流といっても同値)が任意の有向閉3次元多様体上に存在する事をつきとめたが、逆にそれは、構造の凸性が一般には成り立たず、微分可能性の問題が深刻であることを示すことにもなった。

一方で3次元トーラス上の射影的Anosov流に付随する弱Anosov分解に微分可能性があるときは、分担者の一人の神田による3次元トーラス上のtight接触構造の分類に現れる構造が、きれいに対をなして現れることが分かった。接触構造のsymplectizationに対して幾何学的量子化の方法論を応用することにより接触構造の不変量を構成しようという第二の研究テーマについて、大きく分けてKahler偏極と実偏極の二つの方法があるが、3次元接触構造の場合、Kahler偏極は擬正則曲線の理論と考えることができる。これは、分担者の小野と深谷による擬正則曲線のmoduli空間の構造に関する基礎的で深い結果に基づき、Eliashberg-Hofer-Giventalにより接触ホモロジーという概念として創始されるに至った。本研究では、その双対ともいえる実偏極を目標としており、分担者の高倉のtoric多様体の場合の理論が雛形である。三松と高倉は、接触多様体内のpre-Lagrangian torusと呼ばれる特殊なトーラスの族を基本とするある種のホモロジー論を展開すれば理論が構成されることまでを理解したが、そこから先は、今後の研究課題である。代表者の三松は、3次元球面上に共にOverTwistedなもののpairからなる双接触構造の存在を示した。これにより、付随する葉層構造(可積分な平面場)の微分可能性を仮定しない場合の双接触構造の凸性はむしろ平面場としてのホモトピー類の制約を求める問題に帰着されたと言える。これはまだ未解決。この方面で分担者の水谷を含む葉層構造の研究グループと共にこれまで得られた結果は、現在作成中の論文にまとめられるが、上記の結果を含めその大部分は研究発表・図書欄に記載の報告論文に紹介した。分担者の水谷はPoisson構造およびPoisson cohomologyから定まる3次元多様体上の葉層構造の構成・分類を研究し、未発表論文にまとめている。またその研究を南部-Jacobi構造の場合にまで拡張することを開始して基礎を固めた。代表者と分担者の高倉が中心となって進めている、幾何学的量子化の理論の実偏極の概念を接触構造に応用して不変量を構成する方向の研究に於いては、本年度は、代数関数論の多くの基礎概念が我々の研究において重要な雛形となる別の幾何学的概念に相当することを見いだした。従って研究の基礎は出来始めたと言えるが、本来期待された発展は今後への大きな研究課題として残る。分担者の小野は幾何学的量子化のもう一つの柱であるKahler偏極に相当するsymplectic多様体における擬正則曲線の理論の基礎を深谷氏と共同で完成させ、2編の論文にまとめた。更に擬正則曲線の理論とほぼ等価であるSeiberg-Witten理論を使って、単純特異点などに付随する接触構造のsymplecticfillingの微分トポロジーを調べた。Brieskornの仕事のsymplectic化とも言えるこの研究は今後更に発展する予定である。
高等植物の2つのクロロフィラーゼの生理機能に関する分子細胞生物学的研究

【目的】研究代表者はクロロフィル分解に関与する酵素の遺伝子として初めてクロロフィラーゼ遺伝子の単離に成功し、これによりクロロフィル分解についてこれまで出来なかった分子生物学的手法を用いた研究を行うことが可能となった。本研究課題ではシロイヌナズナに存在する2つのクロロフィラーゼイソ酵素の発現および機能を解析することを目的とした。【結果】1、イソ酵素の細胞内局在シロイヌナズナの葉より無傷葉緑体およびそのサブフラクションを分画し、ウエスタン解析をおこなったところ、全タンパク質で検出されたクロロフィラーゼ1のバンドは葉緑体には存在しなかったが、クロロフィラーゼ2では葉緑体およびストロマ画分に検出された。これより、2つのクロロフィラーゼイソ酵素はそれぞれ葉緑体の内外に局在することが判明した。2、発現組織の解析シロイヌナズナの各器官での発現と活性を調べたところ、葉や茎など緑色組織を含む器官で活性が見られたが、根にはほとんど活性がなかった。さらに、花や未熟な莢では葉と同等以上の活性が存在した。このことはレポーター遺伝子(GUS)を用いた解析結果と一致した。また、クロロフィラーゼ2についてレポーター遺伝子を導入した形質転換体では、おそらく発現量が低いためか全くGUS染色されなかった。3、形質転換体の解析2つのクロロフィラーゼ遺伝子のセンス鎖またはアンチセンス鎖を強発現させたシロイヌナズナのT3のホモのラインを確立し表現型を見たところ、クロロフィラーゼ2のセンス株でのみ僅かなクロロフィル量の減少が見られたが、他の株ではクロロフィル量の変化は見いだせなかった。しかし、クロロフィラーゼ2のセンス株では野生型より早く花芽が伸長することが判明した。クロロフィル分解と植物の生長との関連について新たな知見であると考えられ、今後の解析が期待される。
糖尿病性動脈硬化病変におけるオステオポンチンの関与

動脈硬化性病変の一部をなす血管内膜肥厚について、オステオポンチンがどのような役割を果たしているかを解明する目的で計画した。その中で、最終的に緑茶成分Epigallocathechin gallate (EGCG)が内膜肥厚に対して抑制効果を表すか否かを検討する予定であったことから、本研究では健常マウス大腿動脈に作成した血管内膜肥厚がEGCGによって抑制されるかどうかを検討した。光増感反応性に基づいてICRマウス(5週齢、オス)大腿動脈の血管内皮細胞を傷害し、その後3週間にわたって形成される血管内膜肥厚の厚さを検討した。この方法で形成される肥厚は傷害血管に対する一種の修復反応と考えられており、増殖した血管平滑筋細胞の蓄積によって構成される。内皮傷害後3週間の飼育期間中、飲水中にEGCGを添加することによってEGCG3mg/kg30mg/kgを負荷したところ、予想に反して肥厚は抑制を認めなかった。この理由としては(1)用量が不十分であった、(2)EGCGの血中濃度が十分に上昇していなかった、(3)アポトーシスを介した抑制効果を検出するためには投薬時期が不適であった、という3つの可能性が考えられた。特に(2)の血中濃度が上昇しない点については、マウスにEGCGを連続投与した際、メカニズムは不明であるが血中濃度が高値に保たれているのは投与開始の4日目過ぎまでであり、その後8日目以降は低下して再び上昇しない、との報告があり同様の現象が起きた可能性が考えられた。これらのことから我々は(1)EGCG用量を300mg/kgまで増大させて投与を行う、(2)EGCGの飲水中添加を内皮細胞傷害の5日目から開始し、細胞増殖が最も増大するとされる術後710日目の期間中にEGCGの血中濃度が保たれる可能性を高める、(3)血管内膜肥厚が進行した術後3週の時点からEGCG負荷を開始し、その後一定期間投薬を続けて効果を観察する、というプロトコールを検討している。光増感反応法を用いて雄性ウィスターラットの大腿動脈に選択的内皮傷害を与え、この部位の修復過程における変化を観察した。本法では色素ローズベンガルと緑色光線との相互作用により発生した活性酸素が内皮細胞を脱落させ、その部分に粘着・凝集した血小板血栓が放出するサイトカイン類(血小板由来増殖因子PDGF、線維芽細胞増殖因子FGFなどをはじめとする)の働きによって中膜層の血管平滑筋細胞が刺激され、形質変換を起こすことによって増殖・遊走活性が増大して血管内膜肥厚を形成する。この過程では多数の生理活性物質が関与するとされているが、その中の一つとしてオステオポンチンがどの様に発現・作用するかを定量化して検討中である。また、糖尿病状態にあるヒトおよびストレプトゾトシン誘発糖尿病ラットの血管ではオステオポンチンの発現そのものが亢進しているとめ報告があることから、高血糖あるいは耐糖能低下が上記血管傷害部位のオステオポンチン発現を増強することが考えられ、我々はこの点も引き続き検討してゆく。これと並行してラット大動脈より採取した血管平滑筋培養細胞においてもin vitroレベルでオステオポンチン発現の変化が同様に捉えられるか、を検討する。

その中で、最終的に緑茶成分Epigallocathechin gallate(EGCG)が内膜肥厚に対して抑制効果を表すか否かを検討する予定であったことから、本研究では健常マウス大腿動脈に作成した血管内膜肥厚がEGCGによって抑制されるかどうかを検討した。光増感反応法に基づいてICRマウス(5週齢、オス)大腿動脈の血管内皮細胞を傷害し、その後3週間にわたって形成される血管内膜肥厚の厚さを検討した。この方法で形成される肥厚は傷害血管に対する一種の修復反応と考えられており、増殖した血管平滑筋細胞の蓄積によって構成される。内皮傷害後3週間の飼育期間中、飲水中にEGCGを添加することによってEGCG3mg/kg30mg/kgを負荷したところ、予想に反して肥厚は抑制を認めなかった。この理由としては(1)負荷用量が不十分であったことと、(2)EGCGの血中濃度が十分に上昇していなかった可能性が考えられた。特に(2)の血中濃度が上昇しない点については、マウスにEGCGを連続投与した際、メカニズムは不明であるが血中濃度が高値に保たれているのは投与開始の4日目過ぎまでであり、その後8日目以降は低下して再び上昇しない、との報告があり同様の現象が起きた可能性が考えられた。これらの仮説を検証するためには、(1)EGCG用量を300mg/kgまで増大させて投与を行う、(2)EGCGの飲水中添加を内皮細胞傷害の5日目から開始し、細胞増殖が最も増大するとされる術後710日目の期間中にEGCGの血中濃度が保たれる可能性を高める、というプロトコールを行う必要があると考察された。
ゆるやかなつながりにより心身の健康に複合的効果を及ぼす農の社会的価値の検証

肥満や虚弱に至る原因として、栄養摂取量と活動量の問題が挙げられるが、農園芸作業に従事することにより、ストレスを軽減し、食嗜好に変化が生じ、適度な活動量の維持を促進する可能性が考えられる。本研究では、糖尿病患者を対象に、農園芸作業の効果について検討を行う。介入に用いる農園芸作業について、京都大学大学院農学研究科附属農場中崎鉄也教授の協力を得て、大豆栽培と花卉園芸作業の詳細を設定した。倫理委員会の審査を経て承認を受けた研究計画書に沿って、介入研究の前半を実施した。糖尿病患者をリクルートし、9名から参加の同意を得た。無作為に2群に割りつけ、2018年に介入する群と2019年に介入する群に分けた。2018年介入群は2018年7月から11月まで、京都大学大学院農学研究科附属農場における農園芸作業に従事した。農園芸作業では、附属農場の技術指導員の指導のもとに作業を行った。この間、2019年介入群は従来治療を継続し、両群で測定項目のデータ収集を行った。2019年度は、2019年介入群の参加者に、2018年度と同様の農園芸作業に従事してもらうため、準備を行った。計画通りに実施できているが、介入研究への参加者数は少なくとどまっている。2019年度に介入する予定の群5名について、2019年7月から11月に、2018年度と同様の大豆栽培と花卉園芸の作業を行うという介入を実施する。この間、2018年介入群は従来治療を継続し、測定項目のデータ収集を行う予定である。本研究は、地域社会における農の意義を明らかにするために、肥満・虚弱者における農の効果を農場において実証するものである。初年度であるH29年度は、H30年度とH31年度に実施予定の本試験に向けて、研究計画の検討・作成と実施可能性の検証を行った。パイロット的に、被験者の動線の確認や、測定項目(血液指標、心理学的指標、食事内容、活動量)を確認し、適切かどうかの検討を行った。農場における作業という介入内容について、季節や被験者の特徴を踏まえて、適切な作業内容と頻度について検討し、介入の内容と期間について確定した。本試験の研究計画を作成し、倫理委員会に申請を行った。本試験の実施に向けた準備が順調に進んでいる。本試験の研究計画について、倫理委員会の承認を得る。本試験を実施開始する。被験者のリクルートを開始し、インフォームドコンセントを経て、インクルージョンし、介入を開始する。
体細胞核移植技術を用いた癌幹細胞モデルの作成と新しい分化誘導療法の検討

本研究は、体細胞のリプログラミング技術を用いて培養癌細胞から癌幹細胞モデルを作出し、癌幹細胞を標的とした治療法の可能性について検討することを目的とした。癌細胞を用いた体細胞核移植法による胚の発生率は低率だが、エピジェネティック修飾薬を併用するなど培養条件を改良することでマウスteratocarcinoma細胞から癌細胞由来ES細胞を得ることに成功した。この細胞はオリジナルの細胞と比較して幹細胞的な性質を有していることも確認できた。今後、このような癌細胞由来ES細胞を複数樹立し癌幹細胞としての特性解析を進めることで癌幹細胞を標的とした治療法の開発につながるものと考える。本研究は、培養癌細胞を初期化することにより、癌治療を困難なものとしている原因とされている癌幹細胞のモデルを作成し、正常細胞に影響のない新たな治療を確立することを目的としている。平成24年度は、京都大学iPS細胞研究所(CIRA)のプロトコール(エピソーマルベクターを用いたヒトiPS細胞樹立プロトコール)を参考として、主に、培養癌細胞のiPS細胞化を試みた。具体的には、本研究では、効率よく遺伝子導入が可能なエレクトロポーレーション法を用いるが、最適な出力条件は細胞により様々であり、線維芽細胞を対象としているCIRAのプロトコールにある条件のままでは、期待する結果が得られなかった。したがって、細胞毎に良好な遺伝子導入効率が確認できる条件を詳細に検討した。また、研究をすすめていく過程で、遺伝子導入に用いるベクターの純度が、iPS細胞作成において非常に重要であることが確認されたため、ベクターの精製方法を検討し、エンドトキシンレベルの低い、高純度のベクターを調製した。以上の工夫を行ったことで、培養癌細胞のiPS細胞化の手技を確立しつつある状況に至った。本研究は、癌細胞を初期化することで癌幹細胞モデルを作成し、その特性解析から、正常幹細胞へ影響することのない新たな治療法を確立することを目的としている。培養癌細胞の初期化は、染色体の不均一性や遺伝子発現の異常のため想定よりも効率が悪く、研究開始当初は、培養癌細胞核を除核未受精卵子に移植する体細胞核移植法(クローン細胞化)を用いて細胞の初期化を試みていたが、平成24年度から初期化の4因子を遺伝子導入して作成するiPS細胞化に変更し、エレクトロポーレーションや培養条件の調製を行い癌幹細胞モデルの作成を試みていた。平成25年度は、癌細胞のiPS細胞化の最終調整を行い、同手法により作成された癌幹細胞モデルについて表面抗原や色素排泄能、増殖能、浸潤能などについて、オリジナルの培養癌細胞との相違を検討した。この結果、培養癌細胞をiPS細胞化により初期化して作成した細胞は、癌幹細胞的特性を有することが確認されたため、再度、核移植技術による、培養癌細胞の初期法の確立を試みている。癌細胞核のクローン細胞化は、技術的に極めて困難なものであり、平成25年度の後半は、その技術修練に専念することとなった。本研究では、培養癌細胞を用いて癌幹細胞モデルを作成し、正常体細胞ならびに正常幹細胞に影響しない新しい治療法の可能性について検討することを目的としている。体細胞を初期化し幹細胞化する手法は、1つは体細胞の核を除核未受精卵に核移植し、発生胚からES細胞を得る方法で、研究者が所属する研究室では、既にこの体細胞核移植実験系を確立しており、クローン動物の作成も成功している。しかし、癌細胞核を移植した場合の胚発生率は、正常体細胞の核を用いた場合と比較して非常に低率であり、また、癌細胞および卵細胞を1つ1つ処理する必要があるため時間的な浪費が大きく、研究の成果を得るまでに時間を要すると考えられた。一方、もう一つの幹細胞作成技術であるiPS細胞化は、4種の初期化遺伝子を導入することにより体細胞を初期化する方法であり、卵細胞を必要とせず、一度に扱える癌細胞の数も多数であることから、はるかに効率的な研究が行えると考えられた。従って23年度は、癌幹細胞核の除核未受精卵への移植実験に並行して、京都大学iPS細胞研究所のエピソーマルベクターを用いたヒトiPS細胞樹立プロトコールを利用した実験系を確立すべく、遺伝子導入に用いるエレクトロポレーションの各種ヒト癌細胞毎の至適条件ならびにiPS細胞作成の効率化について検討し、癌細胞のiPS細胞化を試みているところである。平成23年度は、癌細胞の核を除核未受精卵に移植する体細胞核移植法(クローン化)により、癌幹細胞モデルを作出することから開始したが、この手法によるクローン胚発生率は正常体細胞であっても低率であり時間的浪費が極めて大きいため、並行して、初期化の4因子を遺伝子導入するiPS細胞化にも着手した。平成24年度、平成25年度は、エピゾーマルベクターをエレクトロポーレーションにより遺伝子導入する方法で癌細胞のiPS細胞化を試みた。

しかし、既報の遺伝子導入条件では遺伝子導入後の細胞生存率が不良であったため、ベクターの調製によりエンドトキシンレベルの低い高純度のベクターを得るための工夫を重ねた。これにより細胞生存率ならびに遺伝子導入効率を改善させることに成功したが、遺伝子導入した細胞をフィーダー細胞上に再播種してもiPS細胞コロニーを得ることが困難であった。他施設における報告からは、癌細胞のiPS細胞化においては、細胞毎で培養条件は多様であり、非常に繊細な調整が必要であることが示唆された。また、この間、当教室における体細胞核移植技術は、種々の工夫により胚発生率の飛躍的な改善がみられていたため、平成25年度の後半からは、再度癌細胞のクローン化による癌幹細胞モデルの樹立を目指した。平成26年度は、マウスteratocarcinoma細胞のES細胞を得ることに成功した。この細胞はオリジナルの細胞と比較して形態的ならびに増殖能に相違があり、より幹細胞的な性質を有するものであることが証明された。今後は、他の癌細胞種でのクローン化を進めるとともに、癌幹細胞としての特性解析を進め、研究目標である癌幹細胞を標的とした治療法の開発にむけた研究を行っていく予定である。婦人科腫瘍平成24年度行った研究の成果により、培養癌細胞のiPS細胞化手技は確立しつつあり、今後は作成されたiPS細胞の特性解析を行い、正常細胞との相違を明らかにできれば、新たな治療法の可能性を見出すことにつながると考える。培養癌細胞のクローン細胞化法の確立のために、技術的修練が必要であり、未だ、核移植技術を用いた癌幹細胞モデルの作成には至っていない。培養癌細胞のiPS細胞化とその特性解析は進捗している。体細胞核移植法による胚発生率が想定以上に不良であったため、iPS細胞化による幹細胞化に着手しているため。培養癌細胞のiPS細胞化を精力的に行い、得られた癌幹細胞モデルについて、細胞表面マーカーや分化/未分化マーカーを含む遺伝子発現の状況を、オリジナルの培養癌細胞あるいは、正常体細胞を比較検討する。体細胞核移植法を用いた培養癌細胞の初期化ならびに癌幹細胞モデルを作出し、iPS細胞化によりすでに作成した細胞との特性解析を行う。2つの方法で作成された癌幹細胞モデルについて、エピジェネティクな薬理作用を有する薬剤を用いた形質変化誘導の可能性について、とくに正常な組織幹細胞への影響の相違に重点を置き、検討する。体細胞核移植法を用いた癌細胞由来ES細胞の樹立については、引き続き技術面での改善と胚発生条件の調整を行いながら継続して行く。これと並行して、癌細胞のiPS細胞化を行い、細胞表面マーカーの変化や分化マーカー・未分化マーカーを含む遺伝子発現の変化についての検討を行う。該当なし本年度の計画は、(1)培養癌細胞のiPS細胞化とその特性解析、ならびに、(2)培養癌細胞の核移植法によりクローン細胞化し、癌幹細胞モデル作出方法を確立するとともに、iPS細胞化により得られた癌幹細胞モデルと比較した、癌幹細胞としての特性を評価する予定であったが、癌細胞核の移植および胚の再構築は技術的に極めて困難であり、平成25年度後半は、癌細胞のクローン化技術の修練に費やすこととなり、癌幹細胞としての特性解析等のための予定していた研究費が未使用となった。