hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
NGF遺伝子導入カテコ-ルアミン産生培養神経細胞の脳内移植:パ-キンソン病治療の試み

1.マウス大脳組織をラット脳室内に移植する異種間脳移植において、移植組織内の血管の一部はDonor由来にであり、移植後4日目以降Hostの血管と吻合し、血流が始まることがことが明らかになった。また移植組織内の血管には脳血液関門が存在するが、その後の免疫学的拒絶反応により破綻することが判明した。脳移植における拒絶反応は、他臓器の移植の場合と比較して遅く始まるが、移植組織内結果における脳血液関門の形成が、その一因であることが示唆された。2.マウス大脳組織をラット脳室内に移植する異種間脳移植において、Streptomyces Tsukubaensisにより産生されるFK506は、腎障害等の重篤な合併症の危険のあるCyclosprolin Aの10分の1の投与量で免疫学的拒絶反応を抑制することが判明し、副作用の少ない新しい免疫抑制剤としての可能性が示唆された。4.未分化、あるいはretinic acid処理により神経細胞に分化したSHーSY5Y細胞をWistar albinoラット、Balb/cマウス・Nudeマウスの脳内に移植する実験の結果、分化型SHーSY5Y細胞は未分化SHーSY5Y細胞よりも生着率が悪く、免疫学的拒絶反応に加えて、それ以外の要因により生存できないことが判明した。5.Retinic acid処理により分化したSHーSY5Y細胞をWistar albinoラット線条体に移植した場合、NGFの脳室内投与を併用することにより、SHーSY5Y細胞を神経細胞に分化させたまま生存させ得ることが判明した。1.レトロウィルスベクタ-(pZipSV(×)1)にβNGF遺伝子を組み込み、ψAMにリン酸カルシウム法にて導入し、G418をselection markerとしてクロ-ニングを行いウィルスを得た。感染能力をN1H3T3細胞で確認した後、SHーSY5Y細胞に感染させ、G418でselectionし、計15種類のcloneを得た。βNGF遺伝子の導入をSouthern blottinf法によって確認した後、PC12細胞を用いて各々のclone上清のNGF生物活性を測定したが、PC12には反応が認められなかった。この原因としては(1)NGF産生量が極めて少い。(2)産生されたNGFが細胞外へ分泌されていない。(3)産生されたNGFが生物活性を有していないなどが考えられた。現在(1)に対しnothern blotting法による検討、微量NGFの測定の試み、(2)に対し細胞膜の破壊による細胞質内NGFの定量、(3)に対しさらに新しいcloneの採取、などを行なっている。2.ヒト神経芽細胞腫株SHーSY5Y細胞を成熟ラット脳内に移植して生存率の検討を行なった。その結果、(1)未分化なSHーSY5Y細胞の生存率は移植2週後までは優れていたが、4週目では細胞数が減少し、小型の単核の細胞が見られた。(2)移植後にレチノ-ル酸を宿主ラットに投故して移植細胞の分化を図ったもの、および予めin vitroで分化させたSHーSY5Y細胞を移植したものでは、(1)に比し生存率が低かった。現在これらの生存率の低下が末梢神経由来の細胞を脳内というheterotopicな環境に移植したためによるのか、あるいはヒトの細胞をラット脳内へという異種間脳移植における免疫学的拒絶によるのかを明らかにすべく、更に検討中である。1、脳植移によるパ-キンソン病の治療に関する基礎的実験として、ヒト神経芽細胞腫株SHーSY5Y細胞をマウス脳内に移植し、異種間脳移植における免疫学的拒絶反応につき検討を行った。BALB/cマウスとヌ-ドマウス脳内にレチノ-ル酸によって分化誘導したSY5Y細胞を移植し比較検討した。その結果、移植細胞の生着率は脳実質内ではBALB/cマウスはヌ-ドマウスとほぼ同じであったが、脳室内移植ではヌ-ドマウスに著明な生着を認めた。

一方BALB/cマウスでは移植組織にマウスcytotoxic/suppressor Tーcellに対する抗Lytー2抗体陽性細胞が僅かに認められた。したがって、ヒト神経芽細胞腫株細胞のマウス脳内移植における生着に関して免疫学的拒絶反応の関与があるものの、criticalではない事が示唆された。そこで現在、ドナ-細胞の分化に伴うMHC classI、II抗原性の変化について検討している。2、βNGF遺伝子導入SY5Y細胞の脳内移植に先駆け、ラット脳内におけるNGFの持続脳室内投与が移植細胞の生着および分化に及ぼす効果を検討した。その結果NGF投与群では8例すべてに生着は良好であり、内5例に抗neurofilament抗体陽性の細胞突起が伸展し分化した形態を示していた。一方、NGF非投与群では7例中3例に生着が見られたが、分化した形態は一例も存在していなかった。以上より、NGFの脳室内投与は、移植細胞の生着向上と神経細胞様への分化を促進する効果が明かとなった。よって、βNGF遺伝子導入細胞の脳内移植についても同様の効果が期待できるものと考えられ、現在βNGF遺伝子をベクタ-(pMAMneo及びpHMT3neo)にトランスフェクトし検討中である。1.異種間脳移植において免疫学的拒絶反応が起きるが、異種間脳移植による免疫学的拒絶反応の詳細な機序、その克服法についてさらに検討を行った。Balb/cマウスをWistar albinoラット脳室内に移植し、マウス血管内皮細胞を特異的に認識する抗Mouse endothelial surface antigenー1(MESAー1)抗体を用いた免疫組織化学染色と、血流マ-カ-としてインデイアンインクにて灌流を行い2重標識を行い、移植組織内の血管と血流動態について検討した。その結果、移植後3日目以降には、移植組織内血管の内皮細胞においてMESAー1が発現し、移植組織内の血管の一部はDonor由来であることが明かとなった。また、移植後6日目以降ではDonor由来の血管に血流が開始し、Donor由来の血管とHost由来の血管とが吻合することが、明かとなった。血流開始直後には、移植組織内血管には、血液脳関門が存在するが、免疫学的拒絶反応が開始する時期には血液脳関門が破綻していることが判明した。異種間脳移植においては、他臓器の移植に比較して免疫学的拒絶反応の始まる時期が遅いが、移植組織内血管における血液脳関門の存在がその一つの理由になっているものと考えられる。また、streptomyces Tsukubaensisにより産生されるFK506はCyclosprolin Aの10分の1の投与量で免疫学的拒絶反応を抑制することが判明し、新しい免疫抑制剤としの可能性が示唆された。2.ヒト神経芽細胞腫由来培養細胞SHーSY5Yは、神経細胞に特的に発現しているneurofilament蛋白の分析の結果、nerve growthfactorの処理よりもretinoic acidの処理により、SHーSY5Y細胞はより分化した神経細胞に変化することが判明した。
自己脂肪由来幹細胞移植による骨再生促進とそのメカニズムの解析

自家脂肪組織から容易に作成可能である脂肪由来再生細胞を延長仮骨に移植することで,仮骨延長法での骨成熟の促進が可能であるかを検討した.60匹のラットを3群に分け,骨延長終了時に生理食塩水を投与したコントロール群,コラーゲンゲルのみを投与したコラーゲンゲル群,脂肪由来再生細胞とコラーゲンゲルを投与したADRC群を作成した.移植後6週のADRC群の延長仮骨骨密度は,コントロール群と比較し46%上昇し,骨折強度は66%上昇した.ADRC群の延長仮骨内では,BMP-2,VEGF,SDF-1のRNA量が増加していた.細胞ラベリングでは移植したADRCの骨組織への分化が示唆された【目的】骨延長法は長期の治療期間を必要とするため,延長部骨形成を促進する手法の開発が期待されている.脂肪組織から容易に得られる細胞集団であるAdipose-derived regenerative cells(以下ADRCs)は,多分化能を有する脂肪由来幹細胞を多く含む幹細胞移植材として注目されている.私たちはこの技術に着目し,ADRCsが骨延長部の骨成熟を促進すると仮説を立てた.本研究の目的は、骨延長部にADRCs移植を行い,骨延長部における骨成熟の促進について検討、評価を行うことである.【方法】Wister系ラット(週齢911週)の大腿骨に創外固定器を設置し,8日後から1日0.8mmの速度で骨延長を8日間行った.延長終了時にラットの鼠径部から脂肪を採取し,加工して得たADRCsをコラーゲンゲルに包含して延長仮骨内に経皮的に注入した.生理食塩水注入モデルとコラーゲンゲル注入モデルを作成し比較した.【結果】ADRCs移植群の延長部平均骨塩量は,移植後3,4,6週で他群と比較し有意に高値であった(p<0.05).組織学的にはADRCs移植群で延長部骨梁形成が促進した.3点曲げ試験では,移植後4,6週でADRCs移植群で有意に高い最大点応力が得られた.ADRC群の延長仮骨はBMP-2,VEGFA,SDF-1のmRNAの発現が有意に高値であった(p<0.05).DiIで蛍光標識したADRCは移植後2週で新生骨に生着しており,骨組織への分化が示唆された.【結論】ADRCs移植は延長仮骨の成熟を促進し,骨硬化の時間を短縮した.その機序としては,細胞の骨組織への分化が示唆され、またBMP-2やVEGFA等液性因子の増加が骨形成と血管新生を促進したと考える.ADRCsは骨髄由来間質細胞と比較し,細胞の採取が簡便かつ大量に可能である.移植に際し培養を必要とせず,感染や免疫反応の危険が低く安全性が高いため,早期の臨床応用が可能であると考える.自家脂肪組織から容易に作成可能である脂肪由来再生細胞を延長仮骨に移植することで,仮骨延長法での骨成熟の促進が可能であるかを検討した.60匹のラットを3群に分け,骨延長終了時に生理食塩水を投与したコントロール群,コラーゲンゲルのみを投与したコラーゲンゲル群,脂肪由来再生細胞とコラーゲンゲルを投与したADRC群を作成した.移植後6週のADRC群の延長仮骨骨密度は,コントロール群と比較し46%上昇し,骨折強度は66%上昇した.ADRC群の延長仮骨内では,BMP-2,VEGF,SDF-1のRNA量が増加していた.細胞ラベリングでは移植したADRCの骨組織への分化が示唆された平成24年度の研究計画は、動物モデルの確立と自己由来脂肪からの幹細胞の採取技術の確立、採取した細胞の分化能を証明することである。脂肪採取し細断後、0.12%コラゲナーゼ内での振盪を当初の45分間から40分間に変更することで、培養細胞の増加効果を得た。これにより細胞採取技術は安定、確立した。得られた脂肪幹細胞を骨分化誘導培養液で培養し、Alkaline phosphatase染色を行うことで、脂肪幹細胞が骨芽細胞に分化したことを確認した。ラット大腿骨は小さいため、創外固定器のハーフピンの刺入が難しく、固定性が得られにくいという問題点があっが,指節骨用創外固定器と1.6mmセルフドリリングピンを使用することで固定性は著しく改善し、手術手技は確立し技術的にプラトーに達した。作成したstromal-vascular fractionを0.1mlのコラーゲンゲルに混入し、レントゲンイメージ下で延長仮骨内に経皮的に注射投与した。試験的に造影剤を使用することで、延長仮骨内に投与可能であることを確認した。細胞移植後2,3,4,6週でレントゲンを撮影し、Scion Image Betaを用いて延長仮骨部の骨塩量を測定した。移植後4,6週で脂肪幹細胞移植群の骨塩量が優位に高値であった。細胞移植後4週においてHE染色標本を作成した。細胞非投与群では延長仮は成熟しておらず、線維芽細胞様細胞が多数残存していたが、細胞投与群では骨性架橋が完成し、線維芽細胞様細胞は消失し成熟した骨梁が形成されていた。平成24年度に予定した実験は既に終了し、平成25年度に予定した幹細胞投与モデルの確立、各モデルの評価へと実験を進めている。

延長仮骨部に幹細胞を投与し骨成熟促進の他のモデルとの評価,蛍光タンパクと免疫染色を使用した成熟促進のメカニズムの解析,投与時期を変えたモデルの比較を行い,当初の実験計画の全ての遂行を目指す.コントロール群では延長終了後何も処置を行わない。コラーゲンゲル投与群ではレントゲンイメージ透視下に注射針で骨延長部にコラーゲンゲル1mlを注入する。脂肪由来幹細胞投与モデル群では,同様の方法で,脂肪組織から得られた脂肪幹細胞約5×105個ををコラーゲンゲル1mlに混入し、骨延長部に移植する。これら3群の比較で,脂肪由来幹細胞の骨延長部投与での骨成熟促進を証明することができる。また緑色蛍光タンパク質遺伝子(GFP)導入ラットより採取したstromal-vascular fractionを免疫抑制ラットの骨延長部に移植し、移植細胞の分化の観察を行う.延長終了後から1週毎にレントゲンを撮影し評価を行なう。仮骨が成熟し始める時期や形成の速度,及びその形態を観察する。延長終了後8週までfollow-upし屠殺する。その他に各群1匹ずつで延長終了後2週,4週,6週での病理を評価する。また摘出標本を用い,pQCTにてBone mineral density,mineralized callus areaの測定,力学強度試験を行う。レントゲン上の仮骨の濃度,pQCT,力学強度試験の結果を評価する。次の研究として最も効果的に延長仮骨を成熟させる脂肪幹細胞の投与時期を調査する。骨延長には延長前の待機期間,延長期間,延長後の骨成熟期間の3つの期間がありこれらのうちどの時期に投与することが最も骨成熟を促進するのかを明らかにする。上記の研究では延長終了後の骨成熟期間に脂肪幹細胞を骨延長部に投与したが,この実験では同じ条件で投与時期をかえた場合の検討を行う。計30匹(15匹×2群)。次年度使用額765685円本年度購入予定であった画像解析用コンピューターと解析ソフトを次年度に購入を予定している(約300000円).また,脂肪由来幹細胞の移植後の役割を判断するための各種試薬,外注での解析は次年度に予定している(約460000円)次年度の研究費は予定通り使用する.
酸化亜鉛を母体材料とした外部電源不要なウェアラブル紫外線検出器の開発

前年度に引き続き目標とする紫外線検出器の実現に向けて研究を行った.特許出願済の独自技術[1,2]を用いて単結晶シリコン(111)基板上に酸化マグネシウム亜鉛(ZnMgO)混晶膜を作製し,波長選択性を有する光導電型セルを試作した.しかし,当セルの光応答性を調べたところ,光スイッチング特性(ON/OFF比と時定数)が悪いことに気がついた.この特性を改善するためには,ヘテロ接合やショットキー電極の導入が不可欠である.そこで,自発分極およびピエゾ分極によってZnO井戸層に2次元電子ガスが形成されるZnMgO/ZnO/ZnMgOダブルヘテロ構造を利用して,トップゲート型の電界効果トランジスター(FET)を試作した.ここで,ZnO井戸層による紫外光の吸収を減らすため井戸幅を薄く設定し,さらにゲート電極の光透過性を高めるためAu/Tiショットキー電極を薄く設定した.FET動作時に波長の異なる単色光を照射したところ,ZnMgO障壁層のバンドギャップエネルギーに相当する紫外光を照射した際に大きな光電流を検出した.また,ゲート電圧を閾値電圧よりもやや低く設定することで,光スイッチング特性が大幅に改善されることも判った.以上の結果は,当該FET構造が目標とする電源一体型のウェアラブル紫外線検出器の実現に有望であることを示すものである.[1]単結晶シリコン基板上の酸化亜鉛単結晶膜の製造方法,矢野,井上,佐々,小池特開2003-165793,科学技術振興事業団から出願,2001年11月[2]薄膜積層構造体及びその製造方法,矢野,井上,佐々,小池特開2005-145753,科学技術振興機構・大阪工大摂南大学から出願,2003年11月シリコン基板上に単結晶酸化亜鉛薄膜を製造する既存技術(特開2003-165793)を用いて,汎用性の高いシリコン基板上に単結晶の酸化亜鉛薄膜および酸化マグネシウム亜鉛薄膜を分子線エピタキシャル成長した.しかしながら,当該技術は生産技術の観点から不充分で,製造した単結晶酸化亜鉛膜に微細なクラック(割れ)が発生し易いという問題点を残していた.実験を重ねた結果,このクラックがシリコン基板,酸化亜鉛膜の二者とシリコン表面の酸化を防止する為に用いたフッ化カルシウム膜の熱膨張係数差によって発生していることが判った.そこで,熱膨張係数差の影響を抑制するためにフッ化カルシウム薄膜の成長温度を従来の650°Cから300°Cに低下させた.その結果,クラックの発生を完全に抑制することに成功した.この方法で製造した酸化亜鉛膜は,従来法で製造した膜と比べて,結晶性・発光特性・電気的特性のいずれも飛躍的に改善されていることが判った.すでに,この製造技術を特許に出願している(特願2003-385344).また,シリコン基板上にマグネシウムの組成比を正確に制御して酸化マグネシウム亜鉛膜を作製する技術を開発した.酸化マグネシウム亜鉛の成長機構をモデル化し,各構成元素の供給量(実際は蒸発ルツボの温度)の関数として成長膜の組成比を数式化した.この式は組成比の広い範囲で実験値によく一致するため,酸化マグネシウム亜鉛の組成比を蒸発ルツボの温度で精密に制御出来るようになった.また,当該科研費にて購入した紫外可視分光光度計を用いて酸化マグネシウム亜鉛の透過測定を行った.その結果,マグネシウムの組成比が増加すると吸収波長が近紫外線領域から中紫外線領域に遷移することが確認できた.これらの成果は,特定波長を選択的に検出する紫外線センサーを開発するための第一ステップである.昨年度に引き続き目標とする紫外線検出器の実現に向けて研究を行った.先ず,シリコン(Si)基板上に単結晶酸化亜鉛(ZnO)薄膜を製造する既存技術(特開2003-165793,特願2003-385344)を用いて,マグネシウム(Mg)組成の異なる酸化マグネシウム亜鉛(ZnMgO)混晶膜を分子線エピタキシャル成長した.ここで,ZnMgO混晶膜の成長モデルに基づく独自に開発した数式を用いてMg組成を厳密に制御した.低温ZnOバッファ層の導入および低温成長技術を取り入れることで,高いMg組成の単結晶ZnMgO混晶膜を得ることに成功した.作製した混晶膜に対して,分光光度計を用いて透過率測定を行った.その結果,Mg組成が増加したことで光学バンドギャップが3.3eVから4.5eVまで増大していることが判った.次に,Mg組成の異なる単結晶ZnMgO混晶膜の上に40μm間隔の櫛形電極を蒸着し,5mm角の光導電型セルを試作した.このセルの分光感度特性を調べた結果,Mg組成の増加に伴って紫外線のカットオフ波長が380nmから300nmまで短くなっていることが判った.このことは,当該セルの検出波長が生活紫外線であるUVAUVBの領域をほぼカバーしていることを意味している.光応答性に優れた紫外線検出器を得るためには,ヘテロ接合を利用してキャリアの輸送能力を高める必要がある.そこで上記技術を用いてZnO/ZnMgOダブルヘテロ構造を作製し,その電気的特性を詳しく調べた.その結果,ヘテロ界面における歪みの影響でピエゾ分極が発生し,ZnO井戸内に2次元電子ガスが形成されていることが明らかになった.

これらの結果は,波長選択性と光応答性に優れたウェアラブルな紫外線検出器を実現する上で重要である.前年度に引き続き目標とする紫外線検出器の実現に向けて研究を行った.特許出願済の独自技術[1,2]を用いて単結晶シリコン(111)基板上に酸化マグネシウム亜鉛(ZnMgO)混晶膜を作製し,波長選択性を有する光導電型セルを試作した.しかし,当セルの光応答性を調べたところ,光スイッチング特性(ON/OFF比と時定数)が悪いことに気がついた.この特性を改善するためには,ヘテロ接合やショットキー電極の導入が不可欠である.そこで,自発分極およびピエゾ分極によってZnO井戸層に2次元電子ガスが形成されるZnMgO/ZnO/ZnMgOダブルヘテロ構造を利用して,トップゲート型の電界効果トランジスター(FET)を試作した.ここで,ZnO井戸層による紫外光の吸収を減らすため井戸幅を薄く設定し,さらにゲート電極の光透過性を高めるためAu/Tiショットキー電極を薄く設定した.FET動作時に波長の異なる単色光を照射したところ,ZnMgO障壁層のバンドギャップエネルギーに相当する紫外光を照射した際に大きな光電流を検出した.また,ゲート電圧を閾値電圧よりもやや低く設定することで,光スイッチング特性が大幅に改善されることも判った.以上の結果は,当該FET構造が目標とする電源一体型のウェアラブル紫外線検出器の実現に有望であることを示すものである.[1]単結晶シリコン基板上の酸化亜鉛単結晶膜の製造方法,矢野,井上,佐々,小池特開2003-165793,科学技術振興事業団から出願,2001年11月[2]薄膜積層構造体及びその製造方法,矢野,井上,佐々,小池特開2005-145753,科学技術振興機構・大阪工大摂南大学から出願,2003年11月
人為起源物質分解能をモデルとした環境中での細菌の機能進化を司る分子基盤の解明

細菌の環境中での機能進化に関する知見を得ることを目的として、完全な人工合成化合物である有機塩素系殺虫剤γ-HCHを完全分解資化する細菌と、有機塩素系化合物分解の鍵酵素である脱ハロゲン酵素に関する詳細な解析を実施した。その結果、(1)いくつかの脱ハロゲン酵素の構造-機能相関を明らかにし、酵素の機能進化過程に関する知見を得た。また、(2)ゲノム構造の観点から、環境細菌が新規能力を獲得する過程に関する知見を得ると共に、その過程における特定の可動性遺伝因子の重要性を提示した。さらに、(3)得られた知見を利用して、細菌の環境中での機能進化を実験的に検証する系を構築した。自然環境中に棲息する細菌の多くは既存の手法では培養困難であり、未開拓な微生物機能を従来の微生物学的手法で利用するのは難しい。近年盛んに行われている培養過程を介さないメタゲノム解析も、環境遺伝子の潜在能力は明らかにしているが、現段階では膨大な塩基配列情報を直接「機能」と結び付けることはできない。本研究では、従来の微生物学的手法で扱える培養可能な環境細菌が自然生態系で新規能力を獲得する機構を解明することで、潜在的微生物機能を有効利用するための分子基盤を確立することを目的とする。本年度は、「環境細菌」として、全ゲノム情報が判明し分子遺伝学的手法が確立している有機塩素系殺虫剤γ-HCH完全分解資化細菌Sphingobium japonicum UT26株、分解の鍵酵素遺伝子として、UT26株のγ-HCH分解代謝の初期過程に関与する脱ハロゲン酵素LinAとLinBをコードする遺伝子およびそのホモログを材料として、(i)UT26株のゲノム構造の近縁種との比較、(ii)UT26株の複数レプリコンの複製装置の詳細な解析、(iii)LinAとLinBおよびそのホモログの蛋白質構造解析、(iv)これら酵素群の反応機構の詳細と構造-機能相関の解明、(v)その他環境細菌を材料とした関連研究、を実施することで、自然環境中で実際に起こったどのようなイベントが分解細菌および酵素に機能変化を与えたのかを解明するための基礎データを得た。本年度は、前年度に引き続き「環境細菌」として、全ゲノム情報が判明し分子遺伝学的手法が確立している有機塩素系殺虫剤γ-HCH完全分解資化細菌Sphingobium japonicum UT26株、分解の鍵酵素遺伝子として、UT26株のγ-HCH分解代謝の初期過程に関与する脱ハロゲン酵素LinAとLinBをコードする遺伝子およびそのホモログを主な材料として、研究を進めた。主な成果は以下の通りである。(1)環境中での酵素進化に関する研究として、(i)LinBの構造的ホモログをデータベースの情報から取得し、人工合成した遺伝子を用いて機能解析を行った、(ii)LinB_UTとわずか7アミノ酸残基の違いにもかかわらず、β-HCH分解能が大きく異なるLinB_MIの詳細な解析を実施し、LinB_UTからLinB_MIへの機能進化に関わる知見を得た、(iii)LinBの酵素遺伝子進化の実験的検証を行う系の構築に成功した。(2)環境中での環境細菌のゲノム進化に関する研究として、UT26およびその類縁菌が有するプラスミドや挿入配列などの可動性遺伝因子が、ゲノム進化に重要な役割を果たしていることを強く示唆する知見を得た。(3)環境中での進化機構を利用した新規能力獲得細菌の育種のための基礎的知見を取得した。本年度は、前年度に引き続き「環境細菌」として、全ゲノム情報が判明し分子遺伝学的手法が確立している有機

塩素系殺虫剤γ-HCH完全分解資化細菌Sphingobium japonicum UT26株、分解の鍵酵素遺伝子として、UT26株のγ-HCH分解代謝の初期過程に関与する脱ハロゲン酵素LinAとLinBをコードする遺伝子およびそのホモログを主な材料として研究を進めると共に、他のγ-HCH分解細菌株3株についても解析を実施した。主な成果は以下の通りである。(1)環境中での酵素進化に関する研究として、(i)データベースから取得したLinBの構造的ホモログが新規の反応特性を持つことを明らかにした、(ii)LinBのbeta-HCH分解機能進化に関する知見を得た、(iii)LinBおよびそのホモログの酵素進化の実験的検証系を構築した。(2)環境中での環境細菌のゲノム進化に関する研究として、UT26以外のγ-HCH分解細菌株3株の全ゲノム配列を完全決定し、複数のγ-HCH分解細菌株が特有のプラスミドと挿入配列を介して独立に出現したことを強く示唆する知見を得た。(3)UT26株近縁株を利用して、細菌の環境中での機能進化を利用した新規能力獲得系を構築した。環境中での酵素進化およびゲノム進化に関する重要な基礎的知見の取得に成功し、最終年度に向けて現段階ではおおむね順調に進展していると判断できる。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでに得た重要な基礎的知見を新規能力獲得細菌の育種という応用面に活かすよう尽力する。
植物のミトコンドリアはなぜ小さくて数が多いのか？

細胞のエネルギー生産を担うミトコンドリアは、細胞内で融合・分裂を繰り返しながらダイナミックに形を変える。動物のミトコンドリアと比較して、粒状で数が多い植物ミトコンドリアが、なぜそのような形態なのか、その制御機構を探るとともに生物学的意義の考察に挑んだ。具体的にはミトコンドリアを蛍光可視化したシロイヌナズナを材料として、その形態が変化した突然変異体を多数単離し、その原因遺伝子を同定、細胞内での作用機序などを明らかにした。植物ミトコンドリアは、動物や菌類のものと比較して小型で数が多い。細胞内に数百から数万個ある植物ミトコンドリアは、ミトコンドリアゲノムのコピー数よりも数が多いため、個々のミトコンドリアでは遺伝子情報不足による不具合が生じる可能性があるが、お互いが頻繁に融合・分裂を繰り返し内部物質を共有してこれを乗り越えていると考えられている。しかしながら、なぜそれほど複雑なメカニズムとコストを駆使して植物ミトコンドリアが小粒多数という特徴を維持するのか?その明確な意義はわかっていない。一つの可能性はミトコンドリアを小粒多数化することで、細胞の隅々にまで均一に分布し、また代謝上関連の深いオルガネラと頻繁に接触することができる利点が考えられる。本研究では申請者が単離したシロイヌナズナミトコンドリア長大化突然変異体と、ミトコンドリア細胞内分布突然変異体や形質転換体等を用いて、通常条件並びに環境変動下での細胞・植物体生育と代謝変化を解析することで、植物ミトコンドリアの形態や細胞内分布がもつ生物学的役割を明らかにする。5つの突然変異体について、その原因遺伝子の同定を完了した。それらの遺伝子産物の細胞内での分子的な働きを観るために、各種の形質転換ベクターを作った。また、二つの変異体において、それぞれ異なる環境変異に応答してそのミトコンドリア形態が著しく異なることを見いだした。詳細な表現型と刺激の種類の検討を行っている。植物ミトコンドリアは独特の形態(小さく数が多い)と動態(分裂・融合を繰り返しながら、また動物細胞のものよりも速く動き回る)を持っている。これらを支える分子メカニズムと生物学的意義を探索するために、ミトコンドリアの形態や細胞内分布に異常を持つ突然変異体を多数単離し、原因遺伝子を同定、遺伝子産物の機能解析を進めるとともにその突然変異体の植物生育や発達の様子を解析することで、その生物学的意義を探っている。ミトコンドリアの分裂に異常が生じたelm1突然変異体が低温に応答したミトコンドリア分裂には関わらないことについて、アルゼンチンで開催された国際植物ミトコンドリア会議や植物細胞分子生物学会で発表した。elm1突然変異体はミトコンドリアが分裂できず、著しく長いミトコンドリア(elongate mitochondria)を持つのが特徴であるが、4度程度の低温に曝露することで、ミトコンドリアが小さく粒状になる、つまりミトコンドリア分裂が促進されることが明らかになった。この現象は注意深く観察したところ野生型でも起こる現象であり、植物ミトコンドリア分裂は、通常はELM1を用いた分裂がおこり、また低温に応答してELM1非依存的な分裂機構によりミトコンドリアの小型化と数の増加を達成させていることが明らかになった。また、ミトコンドリアの大きさが不均一になるfzr(fuzoroi)変異体について日本植物生理学会で発表した。FZR1はその配列特徴から脂質代謝酵素であることが推測され、実際にfzr突然変異体ではいくつかの脂質の組成に異常が見られ、ミトコンドリア特異的な脂質代謝経路を担う興味深い酵素であることが判明した。人類の生存環境と食べ物を支えている植物は、その生育において細胞内のミトコンドリアの働きが必須である。植物ミトコンドリアは動物と比べて一般的に形が小さく数が大変多い。またその動きは動物の物よりも十倍程度速く、よりダイナミックな形態変化を示す。本研究では、これらを支える分子機構とその生理学的な意義を追求するために、植物ミトコンドリアの形態やダイナミクスに異常をもつ突然変異体多数を同定し、その原因遺伝子同定と、遺伝子産物の細胞内の挙動、突然変異体の生育調査などを通して、解析を行ってきた。その結果、植物ミトコンドリアの増殖に必要な分裂を支える遺伝子、ミトコンドリアの脂質代謝に関わる酵素遺伝子、ミトコンドリアの細胞内分布を支える遺伝子などを同定することに成功した。これらはアブラナ科双子葉植物のシロイヌナズナで同定したが、基部陸上植物ゼニゴケでも同様の遺伝子の解析を試みており、その陸上植物全体での共通性や多様性を見いだしつつある。また、真核生物に広く共通する仕組みと、陸上植物にのみ存在する仕組みなども明らかになってきており、環境に適応するその進化の過程とこれらの分子機構獲得の間の推察を行っている。また、この研究を通じて、ミトコンドリアの形態や細胞内分布が、光や温度などの生育環境変化に応じて数分から数時間のオーダーで変化していくことを見いだした。これらは植物細胞内の代謝適応の一種だと考えられるが、まだその意義は不明であり、今後の解析が楽しみな現象を見いだしたと考えている。植物ミトコンドリア形態や動態を司る遺伝子群をシロイヌナズナを材料に、正逆遺伝学手法を駆使して複数同定した。また、それらの遺伝子産物がどのようにして機能するのかを、分子生物学的手法とライブイメージング手法を用いて解析した。

シロイヌナズナのミトコンドリア分裂に関わる遺伝子、ミトコンドリアを構成する脂質の合成代謝に関わる遺伝子、広く動物や酵母でも共通するミトコンドリアの細胞内分布に関与する遺伝子など、多彩な分子を同定した。これらはいずれも基本的にミトコンドリアに局在して機能するが、細胞質とダイナミックに局在を変えるもの、その一部に存在するものなどが同定された。一部については、基部陸上植物であるゼニゴケでの相同遺伝子を探索し、相同遺伝子があったものについては、そのノックアウト個体を作製、解析することで、陸上植物の進化や共通性多様性に関して検討を行った。ゼニゴケとシロイヌナズナに共通し、さらに動物や酵母にまで共通する因子の一部について、これまで逆遺伝学的に信じられてきた共通機能が、植物においては異なることなどが明らかになり、更なる検討課題も明らかになった。また、環境に応答してミトコンドリアの形態が大きく変化することを見出し、特に光環境に応答したミトコンドリアの分布の変化、温度に応答したミトコンドリアなど興味深い現象を見出し、それぞれについて、現象に対応する遺伝子を明らかにした。ミトコンドリアの形態、動態、分布が、植物に特異的な光合成や野外環境など、環境に直に応答するにあたり、これに関係する遺伝子をそれぞれリストアップすることに成功した。また、研究の途上で、植物ミトコンドリアについて、マトリクスと外膜を同時に動態イメージングすることで、特に外膜が特徴的な形態変化を示すことを明らかにした。細胞のエネルギー生産を担うミトコンドリアは、細胞内で融合・分裂を繰り返しながらダイナミックに形を変える。動物のミトコンドリアと比較して、粒状で数が多い植物ミトコンドリアが、なぜそのような形態なのか、その制御機構を探るとともに生物学的意義の考察に挑んだ。具体的にはミトコンドリアを蛍光可視化したシロイヌナズナを材料として、その形態が変化した突然変異体を多数単離し、その原因遺伝子を同定、細胞内での作用機序などを明らかにした。当初目的としていた、植物ミトコンドリアの形態や数、分布に関わる遺伝子について、当初予定数以上複数を同定することに成功した。また、それらの遺伝子産物の細胞内局在などについて、計画していた解析を一通り完了することができた。さらに、シロイヌナズナに加えてゼニゴケを用いて解析を行ったことで、陸上植物全体の普遍性や進化の道筋についての考察を行うこともできたため、当初計画以上に進展したと考えている。27年度が最終年度であるため、記入しない。植物細胞分子生物学上述したように、シロイヌナズナとゼニゴケを用いて、植物ミトコンドリアの形態や動態に関わる複数の遺伝子を見いだした。しかしながら、これらで全ての現象を説明できる訳では無く、今後更に工夫した正逆遺伝学手法によって、もっと多くの関連遺伝子のリストアップが出来ると思われる。また、ゼニゴケにおいては、相同遺伝子と考えられる配列が、本当にシロイヌナズナと同様の機能を持っているのか確認する必要がある。また、シロイヌナズナで見いだした、ミトコンドリア形態や分布の環境変動について、ゼニゴケでも同様の現象が観察されるかを確認する。当初目的通り、これまで見つけてきた突然変異体に付いて、原因遺伝子を同定し、その遺伝子産物を解析するためのDNA発現ベクター作りを行い、ほぼ予定通り完成している。
親水性置換基の導入による木材の耐朽性向上

フタル酸をはじめとするカルボキシル基を有する種々の親水性置換基を導入した化学修飾木材を調製し,置換基の種類・結合量とその耐朽性の関係を系統的に評価することによって,フタル酸で認められた耐朽性向上効果のメカニズムを明らかにすることを目的として検討を行なった。木材試料としてスギ辺材を用いて,これと環状酸無水物(無水フタル酸,無水トリメリット酸,1,2-シクロヘキサンジカルボン酸無水物,無水コハク酸等)を反応させることによって,カルボキシル基を有する置換基を結合させた。得られた化学修飾木材の耐朽性は,白色腐朽菌カワラタケ及び褐色腐朽菌オオウズラタケを用いて評価した。その結果,フタル酸及びトリメリット酸を導入した場合に,少量(1mol/kg程度)の置換基導入で大幅な耐朽性の向上が認められた。これは特に褐色腐朽菌オオウズラタケに対して顕著であった。これに対し,1,2-シクロヘキサンカルボン酸やコハク酸では顕著な効果は認められなかった。これらのことから,少量の導入で顕著な耐朽性向上を得るには,芳香環とカルボキシル基を持つ化学構造を有する置換基を導入することが必要であることを明らかにした。フタル化木材の高い耐朽性発現の理由は,フタル酸及びそのエステル化合物の持つ高い抗菌性が木材成分に結合した状態で働いている可能性と徐放的に少量生成したフタル酸が抗菌性を発揮している可能性とが示唆された。一方,フタル化木材のシロアリに対する抵抗性についても評価を行ない,アセチル化木材と同等もしくはそれ以上の抗蟻性を有することを確認した。フタル酸をはじめとするカルボキシル基を有する種々の親水性置換基を導入した化学修飾木材を調製し、置換基の種類・結合量とその耐朽性の関係を系統的に評価することによって、フタル酸で認められた耐朽性向上効果のメカニズムを明らかにすることを目的として検討を行なった。木材試料としてスギ辺材を用いて、これと環状酸無水物(無水フタル酸、無水トリメリット酸、1,2-シクロヘキサンジカルボン酸無水物、無水コハク酸等)を反応させることによって、カルボキシル基を有する置換基を結合させた。得られた化学修飾木材の耐朽性は、白色腐朽菌カワラタケ及び褐色腐朽菌オオウズラタケを用いて評価した。その結果、フタル酸及びトリメリット酸を導入した場合に、少量(1mol/kg程度)の置換基導入で大幅な耐朽性の向上が認められた。これに対し、1,2-シクロヘキサンカルボン酸やコハク酸では顕著な効果は認められなかった。これらのことから、少量の導入で顕著な耐朽性向上を得るには、芳香環とカルボキシル基を持つ化学構造を有する置換基を導入することが必要であることを明らかにした。今後は、フタル化木材の高い耐朽性発現のメカニズムを解明するための検討を進めるとともに、シロアリに対する抵抗性についても評価を行なう予定である。
カキ属の系統分化及び類縁関係に関する研究

カキ属植物(Diospyros)のうち、わが国に古来より栽培されているカキ(D Kaki)は、その来歴から多数の品種群を形成し、多様に系統化がなされてきた。また、カキの起源についても中国渡来説や日本原生説などがあり、一定した見解が得られていない。そこで、カキの系統分化や類縁関係を知るために本研究を行った。1.カキ226品種(韓国・中国・台湾原産を含む)の諸形態形質について既往の資料から重要94形質を得て、これを数量化して数量化理論第3類による多変量解析を大型コンピュ-タを用いて行った。その結果、`次郎'群、`富有'群`御所'群及び`西条'群など主要経済品種群は、明らかに他の品種とは異なった品種群として座標上位置した。また、韓国・中国・台湾原産の品種は2つを除き、ほぼ同一の一大集団化したグル-プ内に位置した。2.形態形質のうち、カキ属植物の類縁関係を知る上で重要と思われる、子房及び果実表面、とくに毛じの密生状態に注目して走査型電子顕微鏡を用いて詳細に194品種を比較観察した。その結果、子房及び果実表面の毛じの密生状態には品種間にかなりの変異が認められ、わけても九州地方を原産地とする品種群に毛じが多く密生するものが多いのが認められた。一方、中国・四国地方の原産地とする品種群は、毛じが少ないものが多く分布することが明らかとなった。3.アイソザイム及びFIPを用いた化学分類学的手法による解析を試みたが、FIPについては現在に到るまで明確な分析手法を確立できず、今後さらに検討する予定である。一方、アイソザイム分析は、エステラ-ゼ、6PG、パ-オキシダ-ゼ、PGMの計4酵素の葉抽出材料で、種間、品種間の類別が可能と思われるバンディレグパタ-ンを得た。1.日本,中国及びタイ原産のカキ属植物を収集し,現在育成中である.2.上記カキ属植物のうち,カキ種について226品種の形態形質を数量化し,数量化理論第3類による多変量解析を大型コンピュータを用い行った.その結果, '次郎'群, '富有'群, '御所'群及び'西条'群など主要経済品種群は明らかに,他の品種とは異った品種群として座標上位置した.また,中国,韓国,台湾原産のカキ品種は2品種を除き,ほぼ同一の一大集団化したグループ内に位置した.このことは,カキ属のうちカキ品種の類縁関係及び系統分化を論ずる上で貴重な基礎資料となると考えられた.3.分類指標の1つとしてあげていたアイソザイム分析は,葉を材料としてエステラーゼ, 6-フォスホグルコネートデハイドロゲナーゼ,パーオキシターゼ,フォスホグルコムターゼ等について検討した.その結果,上記4酵素については明瞭にカキ属種間及び品種間でバンドパターンに差異が認められ,その分析条件は,パーオキシダーゼでは完全展葉したもの,その外の酵素では展葉直前の材料で最も良い結果が得られることが明らかとなった.従ってアイソザム分析結果も分類指標の1つとして十分有用できるものと考えられた. 4.葉及び果実の表面構造の詳細な観察・比較については樹脂乞埋作製装置を用い,現在顕微鏡観察試料の作製過程に入っている.5.葉内可溶性タンパク質中のフラクションイプロティン(F1P)の抽出方法については,未だ確立できず, F1Pによる1で述べた日本,中国及びタイ原産カキ属植物の類縁関係を明らかにするには至らなかった.早急にこの点に注目し,抽出方法を確立すべく,カキ特有のタンニンその外の夾雑物質の除去,タンパクの精製濃縮について技術検討し, 63年度実験計画に資する技術確立を行う予定である.カキ属植物(Diospyros)のうち、わが国に古来より栽培されているカキ(D Kaki)は、その来歴から多数の品種群を形成し、多様に系統化がなされてきた。

一方、アイソザイム分析は、エステラ-ゼ、6PG、パ-オキシダ-ゼ、PGMの計4酵素の葉抽出材料で、種間、品種間の類別が可能と思われるバンディレグパタ-ンを得た。1.カキ属植物のうち、カキ(Diospyros Kaki)、マメガキ(D.lotus)、アブラガキ(D.olcifera)、ラオヤーシー(D.rlrombifolia)を用い、茎頂を試料とし、試験管培養を試みたところ、カキ及びマメガキでシュート形成が認められたのに対し、後二者では全くシュート形成個体が得られなかった。カキ種内においても変異があり、台湾正柿で最も良くシュート形成した。マメガキのシュート形成率は極めて高く、増殖性の面から分類指標の可能性が示唆された。2.子房及び果実表面の毛じの有無あるいはその形状について、走査型電子顕微鏡を用いて観察した。用いた種は、カキ、マメガキ、アブラガキ及びアメリカガキ(D.virgiuiana)であり、カキ種のうち品種として日本産及び韓国産品種を含めて15品種を用いた。その結果、毛じの状態には種及び品種間に明らかに差異が認められた。最も特徴があったのはアブラガキで子房全体が毛じで覆われていた。アメリカガキとマメガキは、ほとんど毛じが認められず、一方カキでは品種間にかなりの変異があることが判明した。すなわち、毛じのほとんど認められない品種として西条、やや認められるものに富有、ツルノコ、夫婦柿等があった。既往の報告によれば、野性柿に毛じが多いとされていることから考え併せると、これらの毛じに関する形質の変異は品種系統分比の過程で生じたものと思われた。韓国産品種内では、盤柿に全く毛じが認められず、その外の品種においては毛じが存在していたことから、品種の地理的分布との関係は明らかにし得なかった。3.当初計画の大きな目的であるタンパク分析が、その手法の未確立から、ほとんど適当な資料を得られておらず、現在鋭意検討中である。
骨細胞のメカニカルストレス応答を制御するマイクロRNAの機能解析

本研究では骨細胞特異的に発現するmiRNAに着目し、骨細胞のメカニカルストレス応答におけるmiRNAの生理的意義を検討した。骨細胞特異的GFP発現マウスを用いて、骨細胞を単離し、骨細胞特異的miRNAを次世代シークエンスにて同定した。miRNA過剰発現した骨細胞を二次元及び三次元環境下で培養し、骨細胞分化を抑制するmiRNAを同定した。さらに、miRNA標的遺伝子と関連するシグナル伝達経路を検討するため、蛋白発現及び転写調節の解析を行った。以上より、骨細胞分化を制御するmiRNAの転写調節メカニズムの一端を解明し、骨細胞研究の進展に繋がる成果を得た。1次世代シークエンサーによる骨細胞特異的miRNAの同定ー骨芽細胞との比較ー骨細胞および骨芽細胞においてArgonauteタンパク質に結合するmiRNAを、次世代シークエンサーを用いて網羅的に解析した。初代骨細胞を単離するために、DMP1-CreトランスジェニックマウスとEGFPレポーターマウスとを交配し、骨細胞特異的にGFPを発現するマウスを作成した。また、初代骨芽細胞の単離には、Col1プロモーター下流でECFPを発現するトランスジェニックマウスを用いた。フローサイトメトリー(FACS)を用いて、GFP陽性の骨細胞とCFP陽性の骨芽細胞を識別し、骨細胞と骨芽細胞のmiRNA発現を比較検討し、骨細胞特異的に発現が増加または減少しているmiRNAを同定した。2骨細胞培養によるmiRNA標的遺伝子の検討と骨芽細胞分化能の評価piggyBacトランスポゾンを用いて、miRNAを定常過剰発現する骨細胞株を作成し、骨芽細胞分化能と石灰化能を評価した。その結果、骨細胞特異的に発現し、骨芽細胞分化・石灰化調節に重要な役割を担うmiRNAが明らかになった。同定したmiRNAとその下流のシグナル伝達に着目し、メカニズムの解明に取り組んだ。miRNAの標的候補遺伝子はtarget scan, pictar等のデータベースを用いてin silicoで解析を行った。現在は、miRNAの過剰発現あるいはノックダウン試験によって、miRNA標的遺伝子の発現変動の評価を行っている。1三次元培養による骨細胞特異的miRNAの機能評価前年度に骨細胞特異的miRNAの網羅的解析を行い、二次元培養条件下において骨細胞分化調節を制御するmiRNAを同定した。今年度は、生体内により近い三次元環境下においてmiRNAが骨細胞分化能に与える影響を明らかにするため、コラーゲン・ゲル包埋培養法を用いた三次元培養を確立し、miRNAの過剰発現あるいはノックダウン試験を行った。その結果、三次元培養においても骨細胞分化能を調節するmiRNAが存在していることが明らかとなった。二次元培養での骨細胞分化の傾向と比較検討することにより、これまで同定していたmiRNAの中から、骨細胞分化調節において特に重要なmiRNAの絞り込みに成功した。2骨細胞特異的miRNA標的遺伝子の同定と転写調節の解明前年度までに同定したmiRNAの標的候補遺伝子をtarget scan, pictar等のデータベースを用いてin silicoで解析を行った。二次元骨細胞培養において、miRNAの過剰発現あるいはノックダウン試験を行い、miRNA標的遺伝子の蛋白発現をウエスタンブロッティングにより評価した。その結果、複数の標的候補遺伝子の中から、骨細胞特異的miRNAにより発現が変化する標的遺伝子の絞り込みに成功した。また、標的遺伝子に関連するシグナル伝達経路に着目し、ルシフェラーゼアッセイによる転写調節の解析を行った。以上より、骨細胞分化を制御するmiRNAの転写調節メカニズムの一端が明らかとなり、今後の骨細胞研究の進展に繋がる成果が得られたと考えられる。本研究では、骨細胞特異的miRNAに着目し、分子生物学、細胞生物学、組織学的な手法を駆使して、骨細胞によるメカニカルストレス応答機構の解明を目指している。平成26年度は、次世代シークエンサーによる骨細胞特異的miRNAの同定及び骨細胞培養によるmiRNA標的遺伝子の検討と骨芽細胞分化能の評価を行った。骨細胞特異的miRNAの細胞レベルにおける機能は明らかになりつつあり、現在まで研究はおおむね順調に進行している。27年度が最終年度であるため、記入しない。骨代謝平成27年度は、前年度に引き続き、骨細胞培養によるmiRNAのシグナル伝達機構の解明に取り組む。さらに、個体レベルにおけるmiRNAのメカニカルストレス応答と骨代謝動態への影響を明らかにするため、骨細胞特異的miRNAトランスジェニックマウスの作成や、荷重・非荷重条件下における骨代謝動態の解析を行う予定である。以上の研究計画により、骨細胞のメカニカルストレス応答におけるmiRNAの生理的意義の解明を目指す。
着色と超解像化による、貴重な近代モノクロ写真の能動的レストア

1年目は、主として下記の3項目に取り組んだ。(1)深層学習による領域分割と領域ごとの着色手法の開発すでに開発済みの、個別の物体(人の顔、樹木、空や雲)への着色手法に基づいて、建物、服飾、周囲の環境にある物体への着色法について開発を進めた。それらの着色の基準となるカラーの高解像度画像を事例ベースとして収集し、深層学習を用いて特徴を学習させたが、より多数の事例データおよび効率的なデータ増強について模索する必要がある。(2)レストア結果の数値的評価指標の考案レストア処理(着色、高解像度化)の開発には、繰り返し出力される結果画像の品質をコンピュータで自動的に評価する指標が有用である。正解データが存在する事例について、既存のPSNRやSAD、SSIMなどの指標では十分な評価が困難なことが、ユーザ実験から確認された。より有望な特徴量やそれらの重み付けについて次年度以降も検討・実験を進める。(3)効率的なユーザ評価実験の設計実験で参加者に提示できる刺激(レストア結果)の数には限りがあり、提案手法で様々なパラメータを変化させてその影響を全数探索的に調査することは不可能である。したがって、まず小規模な実験を通じてフォーカスすべき画像特徴を絞り、次年度以降の実験に最大限に活用できるよう計画を作成した。第2, 3年度の計画には、モノクロ写真に特化した高解像度化手法の開発、対面によるユーザ評価実験、インターネット経由による評価実験と手法の最終調整、報告書の作成および成果公開、博物館および市の関連施設での展示・公開を含む。計画していた3項目はほぼ順調な進展が見られているが、当初の予定よりより多くの画像データ(事例)の収集が必要なことが判明したため、(2)おおむね順調、と判断した。今年度は下記の2項目を中心に研究を進める。(1)モノクロ写真に特化した高解像度化手法の開発入手可能なモノクロ写真の多くは1000×1000画素程度なのに対し、現在の典型的なデジタルカメラは4000×3000画素以上がカラーで記録できる。このようにデータ量にして1020倍の差を埋めることは本質的に推定問題となる。そこで、モノクロ時代の写真の感光剤の特性を考慮するとともに、同一の場所・構図で撮影した新旧の写真の比較から、画像の各領域単位でマッチングし現在の高解像度な色データを割り当てる推定処理を開発する。幸い、茨城県各地の過去と現在を対比した写真集(写真集日立・高萩・北茨城の今昔,郷土出版社, 2008)により約200の実例データが存在するため、これらの特徴を機械的に学習し精度を漸進的に高める。(2)対面によるユーザ評価実験第一段階として、2030名の参加者に対して対面で実験を行う。評価対象は主に前年度までに構築した着色手法の結果とし、その知見を次の大規模実験に反映する。

評価対象は主に前年度までに構築した着色手法の結果とし、その知見を次の大規模実験に反映する。研究分担者が購入したソフトウェアが当初見込みより安く購入できたため、少額の残額は次年度の利用とした。次年度にはPC(iMac)および結果確認用の4Kディスプレイなどの購入に充当する予定である。
市民の価値判断の行政意思決定への反映：イギリス都市法・環境法との比較を通じて

都市法や環境法の分野では、行政の意思決定において専門的技術的性質といった理由から広範な行政裁量が認められることが多い。この広範な行政裁量を適切に統制するには、意思決定過程への市民参加とともに、意思決定への市民の価値判断の反映も重要になる。こうした課題について、市民参加や市民の意見反映における課題と取組みが見られるイギリス法を参照して検討した。風力発電所の立地と開発、地域施設の撤退といった具体的場面での検討とともに、都市計画・環境争訟手続や大規模事業手続の理論的検討を行うことで、事前・事後の手続を通じて市民の価値判断反映について、多面的に研究を行った。2013年度には、専門的・科学的知見と市民の価値判断との齟齬が明瞭にみられる法的紛争について、検討を行った。こうした紛争の背景には、市民の価値判断が行政の意思決定に反映されていないことがあり、紛争と法的対応の中で、価値判断をいかに反映しうるかが見られるためである。具体的には、風力発電所の立地について、イギリスでの紛争と法的処理の状況に関して、日本の状況とも比較しながら検討を行い、論文として仕上げた(「風力発電所の立地をめぐる紛争と法ーイギリスにおける模索を通じて」)。また、日本について、里山の開発(「平針里山訴訟」)、場外車券販売施設の設置(「『サテライト大阪』設置許可処分と周辺住民の原告適格」)に係る判例等の検討を通じて、こうした齟齬が見られる法的紛争の一端について考察した。上記の諸研究は主として文献と判例の分析を通じた検討によるものであったが、それに加えて、2013年度にはイギリスでの調査も行った。公開の場で討議が行われる公開審問(public inquiry)に参加し、議論の様子を傍聴した。公開審問は、伝統的に市民の価値判断が計画決定に反映されうる機会として機能してきたが、近年の迅速化や職権主義を認める制度改革により、価値判断の反映についての変化があることが見られた。また、フラッキングの手法でのシェールガスの試掘現場の視察も行った。フラッキングについては、主として市民の価値判断の観点から大きな反対運動が巻き起こっており、今後法的紛争に発展しうるものである。さらに、高等法学研究所(Institute of Advanced Legal Studies)の図書館において、文献調査も行った。イギリスでの調査は2013年度末に行ったものであり、2014年度の研究に反映される予定である。平成24年度は、大浜啓吉『自治体訴訟』において、「環境訴訟」との論題で、公害防止協定と裁判について市民参画の観点をも加味して論じた。また、同書において「取消訴訟」との論題で、自治体における訴訟の特性について論じた。本研究の研究目的との関連では、前者は、市民による参画や統制が及びにくい契約手法について環境法の観点から検討したものであり、後者は意思決定過程への参加の最終段階である司法アクセスについて議論をしたものである。環境訴訟については、研究会報告で「環境訴訟における司法アクセス」として、イギリスにおける環境訴訟の特性について報告を行った。また、別の研究会にて、「基盤施設の整備・管理と法」として、公共施設等を含めた都市の縮減・集約化について市民の価値判断をも含めた実体的・手続的統制のあり方について報告した。本研究における市民の価値判断の反映の一場面として、今後の日本において論ずべき局面であると考える。判例評釈として、二項道路と処分性に関する評釈を著し、原告適格に関する判例報告(サテライト大阪事件差戻後第一審判決)を行った。いずれも市民の司法アクセスの観点から本研究とかかわるものである。全体の研究の中で、平成24年度は意思決定過程と市民の価値判断についての実態調査を行う予定であったが、調査を十分に行うことができず、意思決定過程の最終段階の司法アクセスについての論稿等が中心となった。最終年度である2014年度には、前年度までの研究を発展させる研究を行い、論文執筆、研究会報告等を行った。2013年度に市民の価値判断の行政意思決定への反映の場面として陸上風力発電所の立地に係る紛争と法についての論文を執筆したが、2014年度には洋上風力発電所の立地について同様の検討を行う論文を執筆した(「洋上風力発電所の立地・開発をめぐる法ーイギリス法との比較を中心に」)。両論文を基に、再生可能エネルギーに関する法的問題検討班・第4回研究会(エネルギー法研究所、2015年1月16日)、民科合宿・行政法分科会(2015年3月31日)で報告を行い、環境法政策学会(2016年6月13日予定)において報告を行う予定である。裁判を通じた市民の価値判断の意思決定への反映に関して、榊原秀訓編著『行政法システムの構造転換ーイギリスにおける「行政的正義」』(日本評論社、2015年2月)において論文を掲載した(「環境行政訴訟における司法アクセスの論理ーオーフス条約に基づく議論を中心に」)。