hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
培養単離尿細管遺伝子発現調節系を用いた近位尿細管管腔側輸送体の解析

本研究では、近位尿細管(PT)管腔側Na依存性酸塩基輸送の全容を明らかにするために、単離PTと遺伝子発現調節を行った培養単離PTに各種阻害剤(NHE阻害剤EIPA、重炭酸/陰イオン輸送体阻害剤DIDS)を用いた細胞内pH測定を行った。結果、動物(マウス、ラット)とヒトにおいてPT管腔側Na依存性酸塩基輸送能の種差があることを見いだした。さらにPT管腔側には従来考えられていたNHE3だけではなくDIDS感受性の未知のNa依存性塩基輸送体が存在する可能性を見出した。本年度は、1新鮮な単離近位尿細管(PT)管腔側の全NHE活性の同定、2培養PT管腔側のNHEアイソフォーム活性の同定、3PT管腔側V-ATPaseaサブユニットの同定についての検討を行った。1新鮮な単離PT管腔側の全NHE活性の同定:マウス、ラットの腎から単離した直後の新鮮なPTおよび腎癌症例から得た正常ヒトPTを、Cell-Takで表面を処理したカバーガラスに接着させ、マニュピレーターに接続した微小ガラス管によりPT管腔側の一部を露出させ、申請者らが開発した手法により蛍光色素BCECFを用いて細胞内pHの測定が可能であることを再確認した。さらに、NHE1特異的阻害剤Capilorideの添加により基底側NHE1活性を抑制し、管腔側NHE活性を同定した。2培養単離PT管腔側のNHEアイソフォーム活性の同定:Na除去により細胞内pH低下をきたすNHE様活性を同定し、アミロライドアナログに対する反応性から、NHEアイソフォームの寄与率をマウス、ラットの腎から単離したPTおよび腎癌症例から得た正常ヒトPTで検討したところ、著しい種差が存在する可能性を見出した。3PT管腔側V-ATPaseaサブユニットの同定:マウス、ラット、ヒトの腎から単離した直後の新鮮なPTを用いて、管腔側NHE活性と同様に管腔側を露出した尿細管の細胞内pHを測定し、Na非存在下での細胞内pH回復過程からBafilomycin感受性V-ATPase活性を同定した。また、V-ATPase活性化を介したエンドゾーム酸性化障害についても検討し、マウス培養単離PTを用いてanti-B2,anti-CLC5 siRNA実験によりPTのV-ATPaseにB2 subunitが必須であることおよび、V-ATPase/CLC-5が機能的に共役していること(Pflugers Arch. 2016)を解明した。新鮮な単離近位尿細管管腔側のNHE活性の同定は、申請者らが開発し報告した手法(Pflugers Arch. 2016)を用い、マウス、ラットの腎から単離した直後の新鮮な近位尿細管および腎癌症例から得た正常ヒト近位尿細管を、Cell-Takで表面を処理したカバーガラスに接着させ、マニュピレーターに接続した微小ガラス管により尿細管管腔側の一部を露出し、申請者らが開発した(Kidney Int.2015)した手法を組み合わせ、蛍光色素BCECFを用いて細胞内pHを測定を行い、細胞内pH変化の測定が可能であることを再確認した。その上で、NHE1特異的阻害剤の添加によりNHE1活性を抑制し、管腔側NHE活性を同定することができた。次に、Na除去により細胞内pH低下をきたすNHE様活性を同定し、アミロライドアナログに対する反応性から、NHEアイソフォームの寄与率をマウス、ラットの腎から単離したPTおよび腎癌症例から得た正常ヒトPTで検討したところ、著しい種差がある可能性を見出した。近位尿細管管腔側V-ATPaseaサブユニットの同定は、マウス、ラット、ヒトの腎から単離した直後の新鮮な近位尿細管を用いて、管腔側NHE活性と同様に管腔側を露出した尿細管細胞内pHを測定し、Na非存在下での細胞内pH回復過程からBafilomycin感受性V-ATPase活性を同定することができた。さらに、申請者らが開発した手法により、マウスの培養近位尿細管でanti-B2,anti-CLC5 siRNA実験によりPTのV-ATPaseにB2 subunitが必須であることおよび、V-ATPase/CLC-5が機能的に共役していること(Pflugers Arch. 2016)を解明した。このような複数の新規知見を得ており、おおむね順調に進展している。申請者は、新鮮単離近位尿細管(PT)および遺伝子発現調節した培養単離PTを用いて、申請者らが開発したsplit open法により、野生型マウス、ラット、およびヒトのPT管腔側Na依存性酸塩基輸送能を推定した。まず、Ang2のヒトPT管腔側の、Na-H交換輸送体(NHE)全活性に対しては、ヒト近位尿細管特異的な濃度依存性の一相性刺激作用を確認した。次に、NHE阻害剤であるEIPA 0.1mMの添加によるPT管腔側Na依存性酸塩基輸送能活性を測定したところ、マウス、ラットでは30%程度の抑制効果を認めたが、ヒトではほとんど抑制効果を認めなかった。次に、マウスPTによる遺伝子発現調節実験を行った。NHE3またはNHE8に対する特異的siRNAを導入した遺伝子発現調節単離PTでは、残存する管腔側Na依存性酸塩基輸送能活性は、EIPAと同程度の抑制効果であった。このことから、PT管腔側には、EIPA感受性以外の他のコンポーネントの存在が示唆された。

そのため、重炭酸/陰イオン輸送体阻害剤であるDIDS 0.5mMの添加によるPT管腔側Na依存性酸塩基輸送能を測定したところ、マウス、ラット,ヒトの管腔側反応は50%程度の抑制効果を認めた。さらい、EIPAとDIDSの同時添加によるPT管腔側Na依存性酸塩基輸送能を測定したところ、管腔側Na依存性酸塩基輸送能活性は、マウス、ラット、ヒトにおいて大部分が抑制されていた。以上より、PT管腔側にはEIPAに加えてDIDS感受性のコンポーネントが存在する可能性を見出し、さらにその比率には種差がある可能性を明らかにした。本研究では、近位尿細管(PT)管腔側Na依存性酸塩基輸送の全容を明らかにするために、単離PTと遺伝子発現調節を行った培養単離PTに各種阻害剤(NHE阻害剤EIPA、重炭酸/陰イオン輸送体阻害剤DIDS)を用いた細胞内pH測定を行った。結果、動物(マウス、ラット)とヒトにおいてPT管腔側Na依存性酸塩基輸送能の種差があることを見いだした。さらにPT管腔側には従来考えられていたNHE3だけではなくDIDS感受性の未知のNa依存性塩基輸送体が存在する可能性を見出した。27年度の計画を継続、完了させる。マウス、ラット、ヒトの単離近位尿細管(PT)にLipofectaminを用いてNHEアイソフォーム(NHE3/NHE8)に対する特異的siRNAを導入し、申請者ら開発した手法(Kidney Int.2015、Pflugers Arch. 2016)を併用し管腔側の細胞内pH測定実験を行う。Capiloride存在下で残存する管腔側のNHE活性を測定し、管腔側NHEアイソフォーム活性の比率(NHE3/NHE8)を同定する。またNHE3/8に対するsiRNA導入によるNHE1/V-ATPaseの活性およびmRNA発現量に対する影響も検討する。さらに培養細胞(NHE1とNHE8のみ発現していることが知られているラットPT由来のNRK細胞)にNHE8に対するsiRNAを導入し、細胞内pHを測定し、管腔側NHE8活性および基底側NHE1活性を同定する。同時に特異的抗体を用いたWestern blotおよび定量的PCRにより、ラットNHE8に対するsiRNAの特異性と抑制効率を評価する。またNHE3の発現が確認されているヒトPT由来の初代培養細胞系を用いて、NHE3に対するsiRNAの効果と特異性も確認する。さらに、アミロライドアナログでは、抑制されないNHE様活性については、他の輸送体阻害剤などを使用し検討する。次に、PT管腔側NHEアイソフォームに対するAngII効果の解析を行う。具体的には、マウス、ラットの単離した新鮮なPTを用いて、管腔側NHE活性に対するAngII作用の二相性作用を確認する。ヒトPT管腔側NHE全活性に対しては、ヒト特異的な濃度依存性の一相性刺激作用も確認する。腎臓内科学
リハビリテーション効果の定量評価を目的とした運動機能計測手法の研究

リハビリテーションにより期待される四肢筋肉の機能を可視化するため,グリップを5分間握り続ける負荷を腕の筋肉に与え,前腕に貼付した電極により筋電図と酸素モニタによる組織の酸素化状態を記録,同時に光拡散イメージングを試みた.同様に,運動負荷のある場合とない場合,マイクロ波CTにより当該部位の断層撮影を行った.筋電図と酸素モニタにより観測された被験者2名の反応は何れも筋肉の典型的活動状態を示しており基本的には類似した傾向を示したが,一定バネ強度の負荷では筋肉に疲労現象が発現する場合と発現しない場合とが生じ,違いを明確に定量化するまでには至らなかったものの,両者では異なる画像情報を得ることができた.グリップ負荷のある場合とない場合,マイクロ波CTで四肢筋肉の断層撮影を行いその画像を比較した.変化は微小であり,差分画像の評価を行った,筋力の有無により前腕断面形状が変化するため,近似的な差分画像で評価を行ったにも関わらず,この差分画像から,運動に関わらない骨部位と運動に関わる筋肉組織領域の区別が可能で,運動による筋肉組織の状態変化はマイクロ波CT画像に反映されることを確認した.光拡散イメージングではグリッピングにより外側の筋肉が活性化され,動脈の酸化ヘモグロビンが増加するほか,筋肉組織領域でも酸素化ヘモグロビン増加の傾向が観測された.また,当然のことながら酸素モニタでも対応部位で発現している組織酸素化状態の変化が確認された.結論として,グリップ程度の運動でも筋肉組織に起こる疲労現象などの生理学的変化をマイクロ波イメージング,光断層イメージングによって画像化することができた.本手法をリハビリテーション効果判定に利用すると目標とする筋肉組織が正しく活性化されているか否かの判定が可能である.ただし効果の定量評価にはさらに計測精度の向上が必要である.リハビリテーションにより期待される四肢筋肉の機能を可視化するため,グリップを5分間握り続ける負荷を腕の筋肉に与え,前腕に貼付した電極により筋電図と酸素モニタによる組織の酸素化状態を記録,同時に光拡散イメージングを試みた.同様に,運動負荷のある場合とない場合,マイクロ波CTにより当該部位の断層撮影を行った.筋電図と酸素モニタにより観測された被験者2名の反応は何れも筋肉の典型的活動状態を示しており基本的には類似した傾向を示したが,一定バネ強度の負荷では筋肉に疲労現象が発現する場合と発現しない場合とが生じ,違いを明確に定量化するまでには至らなかったものの,両者では異なる画像情報を得ることができた.グリップ負荷のある場合とない場合,マイクロ波CTで四肢筋肉の断層撮影を行いその画像を比較した.変化は微小であり,差分画像の評価を行った,筋力の有無により前腕断面形状が変化するため,近似的な差分画像で評価を行ったにも関わらず,この差分画像から,運動に関わらない骨部位と運動に関わる筋肉組織領域の区別が可能で,運動による筋肉組織の状態変化はマイクロ波CT画像に反映されることを確認した.光拡散イメージングではグリッピングにより外側の筋肉が活性化され,動脈の酸化ヘモグロビンが増加するほか,筋肉組織領域でも酸素化ヘモグロビン増加の傾向が観測された.また,当然のことながら酸素モニタでも対応部位で発現している組織酸素化状態の変化が確認された.結論として,グリップ程度の運動でも筋肉組織に起こる疲労現象などの生理学的変化をマイクロ波イメージング,光断層イメージングによって画像化することができた.本手法をリハビリテーション効果判定に利用すると目標とする筋肉組織が正しく活性化されているか否かの判定が可能である.ただし効果の定量評価にはさらに計測精度の向上が必要である.[1]マイクロ波イメージングの研究四肢の実時間計測が可能な初めての実測用チャープパルスマイクロ波CTを試作した.周波数は24GHzの範囲で任意帯域,任意掃引時間の計測が可能である.商用機とは計測回路が一つでアンテナ数だけ備えていないため,スイッチによる切り替えで計測を行うが,ヒト四肢を7分程度以下の時間でイメージングできる.センサ部分である受信アレイアンテナは損失媒質中でも完壁なアンテナとして機能する受信アンテナの設計に成功したため,予定を変更し,引き続き開発試作を続行中である.生体画像の復元に利用する最適点拡がり関数を求め,実測データの処理に備えた.実例として,果実の糖度イメージングにおける画像復元実験を行い,顕著な復元効果が得られることを示した.[2]光断層イメージングの研究健常者の前腕と下肢の筋運動を観測の対象として,筋疲労と酸素化状態の関係を見いだすべく,筋電図による筋運動のリアルタイムモニタ下に,光拡散イメージングの基礎実験を行った.男性の場合,被験者の太い骨による光散乱,量的に富む筋肉による光吸収により断層イメージング自体が難しい状況に遭遇したが,女性ではグリッパー運動による手首の酸素化状態変化が画像として明瞭に可視化された.[3]実験プロトコルの検討最終的にはリハビリテーション効果や高齢者の適切なトレーニング法を見いだす目的で新たなイメージング手法を開発しているが,当面は健常者の四肢の運動による生理学的影響を画像により観測する方法を確立する.マイクロ波CT画像,光断層画像,筋電図計測データの相関解析のため,観測部位の第一義的対応関係を求めるため,MRI撮影を同時に行い,相互関係を明確化する実験手法について相互討議により検討を行った.代表者と木竜、中村の両分担者はグリッピングによる前腕負荷の実現を目標に、筋電図計測状態で各種強度の運動用グリップを用い、被験者に筋疲労が生じ、かつ5分間の連続負荷に耐えられるグリップの設定など、適切な負荷条件の具体的検討を行った。

代表者と分担者全員が協力し、筑波の産業技術総合研究所において二度、前腕の筋活動を計測の対象として、2名の成人男子に一定強度のバネを押さえ続けるグリップ負荷を5分間課し、この間の筋電図連続計測と光断層イメージング実験を実施した。筋電図の振幅及びスペクトルから疲労状態の発現が明確に観測される負荷時間中に光断層イメージング実験を行い、前腕の光拡散画像を得た。筋が負荷状態にあるために光ファイバセンサが前腕密着状態を保持できず、負荷前腕筋の酸素化度を表す光断層画像が筋電図から得られた筋疲労状態と部分的に一致しない場合も生じたが、ほぼ、筋疲労状態を反映していると解釈できる画像を得た。代表者は、試作した四肢計測用マイクロ波イメージング装置試作を完成するとともに、同装置による生体計測画像を解釈するため、スーパーコンピュータによる前腕の数値イメージング実験を行った。前腕数値モデルは筑波の産業技術総合研究所で実際に被験者のMRI画像を得て、作成したものである。骨とその周囲組織の間で残存する散乱・回折成分が画像を乱すが、微少な温度変化や酸濃度の変化として模擬した筋活動の結果が観測できることを実証した。以上の結果を踏まえ、筋活動を通して運動機能を可視化する新しいイメージング手法について、適切なイメージングパラメータの再検討を行った。グリップを5分間握り続ける負荷を腕の筋肉に与え,前腕に貼付した電極により筋電図と酸素モニタによる組織の酸素化状態を記録,同時に光拡散イメージングを試みた.同様に,運動負荷のある場合とない場合,マイクロ波CTにより当該部位の断層撮影を行った.筋電図と酸素モニタにより観測された被験者2名の反応は何れも筋肉の典型的活動状態を示しており基本的には類似した傾向を示したが,一定バネ強度の負荷では筋肉に疲労現象が発現する場合と発現しない場合とが生じ,両者では画像情報も異なったものの,違いを明確に定量化するまでには至っていない.マイクロ波CT画像ではグリップ負荷のある場合とない場合の断層撮影を行い両者の画像を比較した.変化は微小で目視による影響評価は困難で差分画像を求めたが,筋力の有無により前腕断面形状が変化するため,近似的な差分画像で評価を行った.それにも関わらず,この近似的差分画像からは運動に関わらない骨の部位と運動に関わる筋肉組織領域の区別が可能で,運動による筋肉組織の状態変化はマイクロ波CT画像に反映されることを確認した.光拡散イメージングではグリッピングにより外側の筋肉が活性化され,動脈の酸化ヘモグロビンが増加するほか,筋肉組織領域でも酸素化ヘモグロビン増加の傾向が観測された.また,当然のことながら酸素モニタでも対応部位で発現している組織酸素化状態の変化が確認された.結論として,グリップ程度の運動でも筋肉組織に起こる疲労現象などの生理学的変化をマイクロ波イメージング,光断層イメージングによって画像化することができた.本手法をリハビリテーション効果判定に利用すると目標とする筋肉組織が正しく活性化されているか否かの判定が可能である.ただし効果の定量評価にはさらに計測精度の向上が必要である.
3放射線の相補利用による浸炭焼入鋼の残留応力測定法の開発

ホームラボX線,放射光X線,中性子線の3放射線の相補利用により,浸炭焼入した鋼に発生する残留応力の全貌を非破壊で実測できるか検討した.研究の結果, 3放射線を用いることで,応力評価に必要な回折面間隔を実測できることがわかった.また,中性子ひずみスキャニングで内部応力を,X線応力測定で硬化層の残留応力を測定することで,残留応力の全貌を測定できることを示した.ホームラボX線,放射光X線,中性子線の3放射線の相補利用により,浸炭焼入した鋼に発生する残留応力の全貌を非破壊で実測できるか検討した.研究の結果, 3放射線を用いることで,応力評価に必要な回折面間隔を実測できることがわかった.また,中性子ひずみスキャニングで内部応力を,X線応力測定で硬化層の残留応力を測定することで,残留応力の全貌を測定できることを示した.中央切欠を有するクロムモリブデン鋼の円筒試験片を作製し,ガス浸炭後油焼入を行った.ついで,日本原子力開発機構JRR-3の中性子線を試験片に照射し,浸炭焼入により試験片内部に発生する残留応力分布により鉄の211回折に生ずる回折面間隔を非破壊測定した.また,試験片を切断し,断面の炭素濃度と硬度変化を測定するとともに,差動トランス型変位計を用いて試験片のたわみを計測する手法の検討と,弾塑性有限要素法を用いて円筒試験片の浸炭焼入過程をシミュレーションし,断面の炭素濃度や硬度変化,試験片内部の残留応力変化を解析した.研究の結果,浸炭焼入した試験片の炭素濃度は,切欠底では実測値と解析値はほぼ一致したが,切欠のない平滑部表面極近傍では解析値が実測値より高くなった.一方,断面硬度は,浸炭表面で実測値と解析値に若干のずれが生ずるが,硬化層深さは両者でよく一致した.また,弾塑性有限要素法により解析した浸炭焼入により試験片内部に発生する残留応力は複雑で,円筒試験片の半径,円周,長手方向が必ずしも主応力軸ではないことがわかった.そこで,半径,円周,長手方向のひずみ分布を計算し,中性子回折から得られた試験片内部の回折面間隔変化と比較した結果,試験片長手方向のひずみ変化と実測値の変化は,良く一致することがわかった.以上,浸炭焼入による炭素濃度と硬度の変化は,弾塑性有限要素法による解析結果とほぼ一致するが,熱処理時の境界条件や炭素濃度に対する機械的性質などの材料定数など再検討する必要があることがわかった.また,浸炭焼入により試験片内部に発生する残留応力は,中性子線により非破壊測定できる可能性が高いことが十分確かめられた.クロムモリブデン鋼の円筒試験片とブロック試験片を作製し,浸炭処理した.浸炭処理は,油焼入と炉冷の2条件で行った.まず,浸炭処理後の断面硬度と炭素濃度を測定し,浸炭層から浸炭濃度の異なる薄片と円筒試験片内部から小片(クーポン試験片)を切出した.薄片には4点曲げ荷重を負荷し,応力解析と残留応力測定に必要な浸炭層の弾性率を実測した.また,小片には中性子線を照射し,未浸炭部の回折面間隔を無ひずみ時の回折面間隔として定義した.ついで,円筒試験片内部に中性子線を照射し,ひずみスキャニングにより円筒の半径,円周,長手の3方向の回折面間隔測定し,残留ひずみ分布を非破壊で実測した.さらに,弾塑性有限要素法により浸炭処理後の炭素濃度,硬度,残留ひずみを解析し,実測値と比較して両者が定性的に一致することを示した.また,解析と実測値の相違から,浸炭処理部品の残留応力の全貌を実測する手法の確立の重要性を強く示すことができた.一方,薄片表面のX線残留応力測定を行い,面内の残留応力の主応力比を求め,sin^2ψ線図から浸炭層の無ひずみ時の回折面間隔を実測する方法を検討した.また,薄片を回転揺動させた状態で中性子線を照射し,無ひずみ時の回折面間隔を実測する方法を検討し,両者を比較した.その結果,薄片の中性子回折実験から浸炭層の無ひずみ時の回折面間隔を実測でき,無ひずみ時の回折面間隔は炭素濃度に比例し,その値は炭素濃度の3次関数で表されることを明らかにした.以上の成果は,浸炭鋼の回折面間隔から,残留するひずみ成分と浸炭による格子定数の増加分を分離できることを示すもので,3放射線による回折実験から残留ひずみ成分を分離する『ひずみ分離法』で,浸炭層内の残留応力分布を実測できる可能性が高いことが十分確かめられた.クロムモリブデン鋼の浸炭ブロックから厚さ0.3mmの薄板試験片を切出し,薄板に負荷した曲げ荷重と縦ひずみの関係から浸炭層の弾性率を測定する方法を検討した.その結果,薄板試験片に曲げ荷重を負荷すると,試験片の厚みに対してゲージ箔の厚みが無視できないため,ひずみゲージの抵抗線と試料表面の距離が縦ひずみの計測値に影響を及ぼすことがわかった.

そこで,抵抗線と試料表面の距離を計測して薄板表面のひずみ量を見積った結果,浸炭層の弾性率は出発材料の弾性率とは異なり,浸炭による炭素濃度の増加とともに上昇することを明らかにしたが,浸炭層より深い内部の弾性率も出発材料の弾性率とは異なる値を示した.また,薄板試験片に一定の曲げ応力を負荷した状態でX線応力測定を行い,鉄211回折のX線的弾性定数を実測し.3放射線で応力測定する際に必要な回折面弾性定数と炭素濃度の関係を実験的に明らかにすることができた.一方,クロムモリブデン鋼の円筒試験片を浸炭焼入し,浸炭層の炭素濃度に対する回折面間隔変化と内部の回折面間隔を3放射線の相補利用により実測するとともに,X線応力測定と中性子線によるひずみスキャニングを併用して半径,円周,軸の垂直ひずみ成分に分離して浸炭焼入による円筒試験片内部の残留応力場を実験的に明らかにした.また,弾塑性有限要素法を用いて浸炭焼入シミュレーションを行い,加熱,浸炭拡散,焼入の3工程での応力場を解析し,浸炭焼入後の残留ひずみ分布を算出して実験結果と比較した.その結果,浸炭焼入後の垂直ひずみ成分の解析値と実験値は良い一致を示し,熱処理工程中の応力変化の特徴とその絶対値は弾塑性有限要素法で解析可能で,浸炭焼入後の残留応力は3放射線の相補利用によりその全貌を実測できることを示すことができた.
大腸癌の発生に関わるアンチセンスRNAの機能解析と血液を用いた新規診断法の開発

我々はこれまでに、ヒト大腸癌組織に関して、4万種類を超えるセンス/アンチセンスRNAの発現を網羅的に解析し、特定のセンス/アンチセンスRNAが大腸癌の発生・進行に伴って増加又は減少していることを確認した(Kohno et al,IntJ Oncol 2010、Saito,Kohno etal,BMC medical Genomics 2011)。そこで、本研究では、これまでの解析で明らかになった特定の複数のアンチセンスRNAの機能解析を行い、癌診断および治療におけるアンチセンスRNA解析の重要性を検討し、健常人及び大腸癌患者の末梢血中のRNAを抽出して網羅的解析を行い、最終的には大腸癌の層別化ならびにテーラーメード治療のマーカーとすることを目的としている。これまでに、大腸癌患者28例、健常人6例の末梢血中のRNAを抽出し、カスタムマイクロアレイを用いてセンス/アンチセンスRNAの発現を網羅的に解析した。その結果、末梢血中でも組織と同様に大腸癌特異的にセンス/アンチセンスRNAの発現が変化していることを証明した。癌特異的に変化するセンス/アンチセンスRNAを用いてクラスター解析を行ったところ、癌患者と健常人を明確に区別することに成功した。主成分分析でも同様に明確に癌患者と健常人を区別することが可能だった。さらに、大腸癌患者に関して術後1週間と術後3ヶ月に各6例ずつ採血し網羅的発現解析を行った。術後1週間ではそれほど発現に変化はないが、3ヶ月後には特定のアンチセンスRNAの発現が変化していた。症例数が少ないので今後さらに増やして検討を続けていく。以上の結果から、アンチセンスRNAは血液を用いた大腸癌の新規バイオマーカーとなる可能性が期待される。
C型肝炎ウイルス感染B細胞でのA20分子異常による癌化メカニズムに関する研究

本研究では、HCV感染B細胞でのA20分子異常によるB細胞リンパ腫発症メカニズムに関して検討した。HCV感染B細胞において、NF-κB抑制因子であるA20が発現亢進していること、更に、A20の一部が分解されていること見いだした。HCV NS3プロテアーゼによるA20分解の可能性を検討したところ、HCV NS3プロテアーゼによるA20分解を示す直接的な結果は得られなかった。一方で、HCV感染B細胞において、A20を分解することが知られるMALT1が発現亢進していたことから、MALT1がA20を分解している可能性が示唆された。本研究はHCV感染が原因で誘発される様々な病変の中で、特にB細胞リンパ腫発症メカニズムの解明に焦点を当てている。B細胞リンパ腫においてNF-κB抑制因子(癌抑制因子)の1つであるA20遺伝子が改変され機能消失が起きていることが報告され注目を集めている。そこで、(1) HCVプロテアーゼが、A20分子の機能消失を引き起こすこと、(2)慢性C型肝炎患者由来B細胞(CHC-B細胞)で顕著に発現亢進しているAID(Activation-induced cytidine deaminae)が、A20分子に遺伝子改変を引き起こしていることを検討し、HCV感染によるA20分子の機能不活性化とB細胞リンパ腫発症との関連性を解明することを研究目的とした。今年度は、主に、AIDによるA20遺伝子変異導入のNMR解析を進めるため、AIDの大量発現系の構築と精製条件の確立を目指して研究を進めた。AIDのN末側にGSTタグやHisタグを付加させたコンストラクトを作製し大腸菌による発現及び精製を試みた。しかし、NMR解析に必要となる純度及び十分量を調製するのが困難であり、NMR解析まで到達することができなかった。現在、更なるAID調製の条件検討を実施している。HCVプロテアーゼによるA20分子切断の可能性を検討したところ、A20切断を確認できなかったことから、CHC-B細胞内でのA20分子の分解は他の分子によって引き起されている可能性が高い。興味深いことに、CHC-B細胞内においてMALT1の発現亢進を確認した。MALT1はA20を切断し、37kDaのC末側分解物と共に30kDaのC末側分解物を産生することが知られている。本研究で観測したA20分解物の大きさ(30kDa)と一致していることから、CHC-B細胞内で発現亢進したMALT1がA20を切断する可能性が考えられる。そこで、(1) HCVプロテアーゼがA20分子を分解すること、(2)慢性C型肝炎患者由来B細胞(CHC-B細胞)で顕著に発現亢進しているAID(Activation-induced cytidine deaminase)がA20遺伝子に変異を導入していることを検討し、HCV感染によるA20分子の機能不活性化とB細胞リンパ腫発症との関連性を解明することを研究目的としている。1.A20蛋白質の発現解析:健常者とCHC-B細胞に関してA20のウエスタンブロット解析を実施した。その結果、A20はCHC-B細胞で顕著に発現亢進していることが明らかになった。更に、CHC-B細胞でA20の一部が分解されている可能性が示唆された。2.HCV NS3/4AプロテアーゼによるA20切断解析:CHC-B細胞におけるA20蛋白質の解析結果で示唆されたA20分解がHCV NS3/4Aプロテアーゼにより生じているかを検討した。リコンビナントA20とHCV NS3蛋白質・4Aペプチドを混合しA20分解の有無を調べた。また、293T細胞にA20とHCV NS3/4Aを共発現しA20分解の有無を調べた。本条件下では、HCVプロテアーゼによるA20の分解は確認されなかった。現在、更なる検討を行っている。3. AIDによるA20遺伝子変異導入解析:AIDがA20遺伝子に変異を導入するかどうかを検討するためにAID発現系を構築した。AID蛋白質の調製を進めている。本年度は、CHC-B細胞でA20の発現が顕著に亢進していること、A20の一部が分解されている可能性を明らかにした。また、HCVプロテアーゼが、NF-κB抑制因子(癌抑制因子)の1つであるA

20分子の機能消失を引き起こすかどうかを検討した。その結果、HCVプロテアーゼはA20を分解しない可能性が示唆された。現在、更なる検討を実施し、本件の最終結論に達する予定である。一方、CHC-B細胞で顕著に発現亢進しているAIDがA20分子に遺伝子改変を引き起こしているかを検討するため、AID蛋白質の調製を進めている。研究実施計画通り、AIDによるA20遺伝子変異導入解析を中心に研究を進めていく。そのため、AID蛋白質の調製が必須となる。リコンビナントAID蛋白質を用いて、A20遺伝子変異導入の検出を核磁気共鳴(NMR)法で実施する。また、本研究から見出されるであろうA20変異体がNF-κB活性抑制を損失しているかを検討する。分子生物学実験に必要な消耗品と一緒に、AID蛋白質調製に関わる試薬等、NMR測定・解析に必要な試薬・NMR測定管等、NF-κB活性測定の試薬等を物品費として計上する。
モンゴル語の母音に関する総合的研究－－言語普遍性の観点から－－

平成26年7月まで、研究指導委託によりモンゴル国立大学にて研究を行い、「複合語のアクセント」「語頭母音添加」「母音体系」に関するデータを収集した。帰国後、収集したデータを分析し、成果をまとめて学会や論文などで発表した。「複合語のアクセント」に関しては、様々な意味関係、音韻構造を持つ複合語を対象に調査を行い、「前部要素の末尾子音の種類」がアクセントパターンに影響することを明らかにした。アクセントに対する分節音の影響は、通言語的にしばしば見られる現象であるが、モンゴル語ではこれまで報告されていなかったものである。「語頭母音添加」は、語頭に子音連続やrを持つ借用語に対して母音が添加されるという現象であるが、この母音添加の頻度は音韻環境、話者の世代・出身地によって差があることを示した。さらに、頻度に差が生じるメカニズムを、最適性理論を用いて分析した。母音添加を個別言語の事象として記述するだけでなく、理論を用いて分析することにより、言語普遍性の観点を取り入れたという点で重要な研究である。「母音体系」については、先行研究で主張されている母音体系に対して、音声学的根拠をもって対案を示した。一例を挙げると、「ウランバートルのモンゴル語で、短母音のiとeが合流した」という報告に対し、iとeを音声的に区別する話者のフォルマント周波数のデータを提示した。これらの研究は、先行研究を批判的に捉え、自らデータを収集して分析し、新たな案を提示したことに意義がある。26年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年11月に行われた日本言語学会第145回大会において、修士論文の内容を発展させた「モンゴル語の母音調和ー外来語を用いた分析」という題目で口頭発表を行い、多数の研究者との意見交換を行った。具体的には、新たに「語彙層」の観点を加え、語の定着度によって母音調和に対する振る舞いが異なることを示した。また、ロシア語からの借用語で定着度の高い語では、本来語に見られるような母音の弱化が起こり、そのうえでアクセントを持つ母音が接尾辞の母音調和を決定していることから、モンゴル語の本来語の母音調和にもアクセントが関わっている可能性が高いことを示した。この結果は、各音韻現象を個別のものではなく相互に関わりのあるものとして捉え、モンゴル語の母音を総合的に研究することを目的とする本研究において、重要な知見をもたらすものである。また、平成24年7月8月にモンゴル国において、借用語の母音の取り入れられ方に関する調査を行った。日本語の/u/がモンゴル語に導入される際に、/〓/と/u/に分岐するという事実があるが、その分岐の要因を探るため、モンゴル語母語話者を対象に行った知覚実験である。その結果、母音の分岐には母音調和と直前の子音が関わっていることが明らかとなった。母音調和はモンゴル語の音韻的な要因であり、直前の子音は日本語の音声的特徴をモンゴル語話者がどのように知覚しているかという問題に関わる。このように音韻的要因と音声的要因を考慮に入れた分析は、一般的な「借用語音韻論(Loanword Phonology)」からのアプローチであり、通言語的な研究も盛んに行われている。したがって、借用語音韻論を用いた分析は、言語普遍性の観点からの研究に大きく貢献すると考えられる。本年度は主に、モンゴル語のピッチアクセントと借用語音韻論について研究を行った。モンゴル語のアクセントに関してはいくつか先行研究があるが、複合語のアクセントについては未解明の部分が多い。本研究では、モンゴル語の地名複合語のアクセントを網羅的に調査することによって、以下の3点を明らかにした。1地名複合語はほとんどの場合、音韻的に1つの語としてアクセント付与を受ける。アクセントは、基本的に第1要素にある。2複合語の各構成要素の音節数や、母音の長さによって、アクセント位置に差が出る。3複合語のアクセント位置には、音節の重さが関わっている可能性がある。この研究は、これまであまり取り上げられることのなかった複合語のアクセントを網羅的に扱った点、アクセントと母音の長さ・音節数の関係を明らかにした点で重要である。さらに、アクセントと他の要素(母音の長さ・音節数・音節の重さなど)との関連は、他言語でも広く見られる現象であるため、言語普遍性の観点からも意義のある研究である。また「借用語音韻論」の観点から、モンゴル語に見られる借用語を扱うことによって、モンゴル語内部の音韻構造の特徴を明らかにすることを試みた。一例を挙げると、ロシア語の/u/がモンゴル語に借用される際、/u/と/ʊ/に分かれるという現象に対して、この分岐の条件に母音調和が関与していること、音韻的には母音調和に従わない場合でも、音声的には母音調和に従うように発音されていることを明らかにした。本研究は、借用語が受け入れられる際、母音調和というモンゴル語内部の音韻現象が深くかかわっているということを明示した点で重要である。

アクセントに対する分節音の影響は、通言語的にしばしば見られる現象であるが、モンゴル語ではこれまで報告されていなかったものである。「語頭母音添加」は、語頭に子音連続やrを持つ借用語に対して母音が添加されるという現象であるが、この母音添加の頻度は音韻環境、話者の世代・出身地によって差があることを示した。さらに、頻度に差が生じるメカニズムを、最適性理論を用いて分析した。母音添加を個別言語の事象として記述するだけでなく、理論を用いて分析することにより、言語普遍性の観点を取り入れたという点で重要な研究である。「母音体系」については、先行研究で主張されている母音体系に対して、音声学的根拠をもって対案を示した。一例を挙げると、「ウランバートルのモンゴル語で、短母音のiとeが合流した」という報告に対し、iとeを音声的に区別する話者のフォルマント周波数のデータを提示した。これらの研究は、先行研究を批判的に捉え、自らデータを収集して分析し、新たな案を提示したことに意義がある。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、モンゴル語の母音に関する様々な現象を包括的に捉えたうえで、モンゴル語の音韻論の全体像を明らかにすることである。モンゴル語に見られる母音調和とアクセントとの関係を示したことは、音韻現象の相互作用を明らかにしたと言え、本研究の目的を達成するうえで重要である。また、借用語音韻論の分野では通言語的な研究が盛んに行われており、借用語の導入には、言語個別的な特徴のみならず、言語の違いを超えた共通性が見られることが指摘される。したがって、借用語を対象にすることは、言語普遍性の観点を持つ意味で有意義であると考えられ、目的に沿って研究が進展していると言える。平成25年度は,主にモンゴル語のアクセントについて調査・研究を行う予定であった。その計画通り、平成25年度8月より、モンゴル国立大学・モンゴル言語文化学部J. Bat-Ireedui教授のもと、モンゴル国においてアクセントの聞き取り調査を行い、外来語や複合語のアクセント規則について考察を行った。その成果を国際学会において発表するなど、研究成果の発表も積極的に行った。また.前年度から継続して行ってきた外来語の導入というテーマについても、外来語の導入と母音調和の関係を明らかにし、関連雑誌に論文を発表するなど、一定の成果を上げているため、研究はおおむね順調に進んでいると考えられる。平成24年度の研究により、モンゴル語のアクセントが複数の音韻現象に関わっている可能性が示唆されたが、モンゴル語のアクセント、特に外来語や複合語のアクセントについて十分な研究がなされているとは言い難い。よって今後、主に外来語や複合語のアクセントの記述、分析を行う。また、アクセントと他の音韻現象との相互関係についても、引き続き観察する。モンゴル語のアクセントの詳細な調査は、日本国内では実施が困難であるため、研究指導の委託を受け、モンゴル国立大学で多数の母語話者を対象とした調査を行う予定である。モンゴル語のアクセンに関しては個人差が大きいため、アクセント規則を解明するには、対象とする語彙や調査の条件を精査したうえで、複数回調査を行う必要がある。したがって、引き続きアクセントの調査を行う。
門レベルで新規の極小アーキアＡＲＭＡＮの生理学的性状の解明と機能未知遺伝子の解析

(1)最適継代培養条件の検討、(2)宿主AS-7株の生理学的性状の解析、(3)宿主AS-7株との共培養下におけるARM-1株の生理学的性状の解析、(4)AS-7株およびARM-1株の形態観察、(5)AS-7株およびARM-1株の全ゲノム配列の決定。(1)については、これまで「増殖速度が非常に遅く」「培養は困難である」と言われてきたARMANについて、比較的速い増殖速度かつ高い細胞密度を保ったまま継代培養するための培養条件を確立した(最大細胞密度:約10^9 cells/mL)。(2)については、宿主AS-7株の生育温度範囲、生育pH範囲、炭素源利用性について明らかにした。(3)については、宿主AS-7株との共培養下におけるARM-1株の生育温度範囲、生育pH範囲、複合基質利用性、糖利用性、独立栄養性を、定量PCR法を用いて明らかにした。加えて、宿主の非存在下ではARM-1株は増殖しない事を明らかにし、本株が共生性アーキアである実験的な証拠を得た。(4)については、AS-7株は直径約1μmの球菌であり、ARM-1株は直径100300 nmの極小サイズの球菌であることを明らかにした。(5)については、AS-7株およびARM-1株の共培養液から抽出した混合DNAをPacBio RSIIシークエンサーに供して両株の全ゲノム配列を決定することに成功した。現在、これらの研究成果をまとめた論文を執筆中である。ARMANに属すアーキアは「増殖速度が非常に遅く」「培養は困難である」と考えられてきた。いっぽう本研究では、様々な継代培養条件を検討する中で、非常に高い細胞密度を保ちながらARMAN(ARM-1株)を安定して継代培養する為の培養条件を確立した。この培養条件を確立したことで、ARMANに属すアーキア(ARM-1株)について、初めて培養性状(生育温度・pH範囲、複合基質・糖の利用性、独立栄養性)を詳細に明らかにし、共生性アーキアである実験的証拠を得ることができた。加えて、高濃度のDNAを得る事ができたため、一度の解析で全ゲノム配列を決定する事もできた。平成30年度に予定していた比較ゲノム解析はまだ行う事ができていないものの、培養が困難であるARMANについて、ほぼ予定通り上記の研究成果が得られた事から、「おおむね順調に進展している」と判断した。最終年度である令和元年度(平成31年度)は、以下の4項目に関する研究を実施する。(1)ARM-1株の正式記載、(2)より高品質な遺伝子配列情報の取得、(3)ARM-1株の遺伝子発現解析、(4)系統の異なる極小および共生性アーキア(Nanoarchaeota門)の培養性状の解析。(1)については、記載の為に必要な解析項目について追加実験を行い(透過型電子顕微鏡観察、脂質骨格の解析など)、その性状を論文としてまとめて投稿する。これにより、アーキア界における新門の正式提唱を行う。(2)については、Illumina MiSeqシークエンサーを用いてショットガンシークエンスを行い、得られた配列データをPacBio RSIIシークエンサーの配列データに加える。これにより、シークエンスエラーの補正を行い、より高品質なゲノム配列情報を取得する。(3)については、ARM-1株の増殖が確認されたいくつかの培養条件下において、RNAseq法を用いた遺伝子発現解析を行う。これにより、極小アーキア-宿主間の共生メカニズムの一端を明らかにする事を目指す。(4)はこれまで予定していなかった解析項目であるが、ARMANと同様に細胞が極小で共生性のNanoarchaeota門アーキアについても培養性状を調査し、その特徴をARMANと比較する。これにより、ARMAN特有の性質がより明確になると同時に、極小アーキア-宿主間の共生メカニズムについて、より広範な知見が得られると考えている。

ARMANに属すアーキアは「増殖速度が非常に遅く」「培養は困難である」と考えられてきた。いっぽう本研究では、様々な継代培養条件を検討する中で、非常に高い細胞密度を保ちながらARMAN(ARM-1株)を安定して継代培養する為の培養条件を確立した。この培養条件を確立したことで、ARMANに属すアーキア(ARM-1株)について、初めて培養性状(生育温度・pH範囲、複合基質・糖の利用性、独立栄養性)を詳細に明らかにし、共生性アーキアである実験的証拠を得ることができた。加えて、高濃度のDNAを得る事ができたため、一度の解析で全ゲノム配列を決定する事もできた。平成30年度に予定していた比較ゲノム解析はまだ行う事ができていないものの、培養が困難であるARMANについて、ほぼ予定通り上記の研究成果が得られた事から、「おおむね順調に進展している」と判断した。最終年度である令和元年度(平成31年度)は、以下の4項目に関する研究を実施する。(1)ARM-1株の正式記載、(2)より高品質な遺伝子配列情報の取得、(3)ARM-1株の遺伝子発現解析、(4)系統の異なる極小および共生性アーキア(Nanoarchaeota門)の培養性状の解析。(1)については、記載の為に必要な解析項目について追加実験を行い(透過型電子顕微鏡観察、脂質骨格の解析など)、その性状を論文としてまとめて投稿する。これにより、アーキア界における新門の正式提唱を行う。(2)については、Illumina MiSeqシークエンサーを用いてショットガンシークエンスを行い、得られた配列データをPacBio RSIIシークエンサーの配列データに加える。これにより、シークエンスエラーの補正を行い、より高品質なゲノム配列情報を取得する。(3)については、ARM-1株の増殖が確認されたいくつかの培養条件下において、RNAseq法を用いた遺伝子発現解析を行う。これにより、極小アーキア-宿主間の共生メカニズムの一端を明らかにする事を目指す。(4)はこれまで予定していなかった解析項目であるが、ARMANと同様に細胞が極小で共生性のNanoarchaeota門アーキアについても培養性状を調査し、その特徴をARMANと比較する。これにより、ARMAN特有の性質がより明確になると同時に、極小アーキア-宿主間の共生メカニズムについて、より広範な知見が得られると考えている。
非変性条件2次元電気泳動と質量分析によるヒト血漿タンパク質間相築作用の解析

ヒト血漿タンパク質の非変性条件のマイクロ2次元ゲル電気泳動(ゲル等電点電気泳動とサイズ分離ゲル電気泳動のいずれにも変性剤を用いず、縦横38mm、厚み1mmの平板ゲル上に2次元分離する)によるパターンと、部分的変性条件のマイクロ2次元ゲル電気泳動(非変性条件の等電点電気泳動とSDSゲル電気泳動を組み合わせ、同じマイクロサイズの平板ゲル上に分離する)によるパターンを比較することによって、タンパク質間相互作用の存在を確認した。また、これらパターン上でのタンパク質(非変性条件157スポット、部分的変性条件175スポット)について、網羅的に質量分析による構造解析を行った。質量分析による構造解析には、主としてマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計MALDI-TOFMSとデータベース検索によるペプチドマスフィンガープリント法を用いた。これらの構造解析結果を比較した結果、非変性条件の2次元ゲル電気泳動と部分的変性条件の2次元ゲル電気泳動の組み合わせのみによって、ヒト血漿タンパク質の(相互作用による複合体形成状態を含む)存在状態を解析することができることが明らかになった。2次元ゲル電気泳動法は従来完全変性-還元条件で行われてきたが、質量分析によるタンパク質同定法の進歩により、研究代表者らが開発した非変性条件の2次元ゲル電気泳動は、さらにその有用性が高まったと考えられる。ヒト血漿タンパク質の非変性条件の2次元ゲル電気泳動(ゲル等電点電気泳動とサイズ分離ゲル電気泳動のいずれにも変性剤を用いない)によるパターンと、部分的変性条件の2次元ゲル電気泳動(非変性条件の等電点電気泳動とSDSゲル電気泳動を組み合わせる)によるパターンを比較することによって、タンパク質間相互作用の存在を確認した。また、これらパターン上でのタンパク質について、網羅的に質量分析による構造解析を行った。質量分析による構造解析には、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計MALDI-TOFMSによるペプチドマスフィンガープリント法と、エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析計(ESI-MS/MS)による部分アミノ酸配列決定法を用いた。これらの構造解析結果を比較した結果、非変性条件の2次元ゲル電気泳動と部分的変性条件の2次元ゲル電気泳動の組み合わせのみによって、ヒト血漿タンパク質の生理的条件での存在状態、すなわちタンパク質間相互作用による複合体形成の状態を含む存在状態を解析することができることが明らかになった。従来2次元ゲル電気泳動法は完全変性-還元条件で行われてきたが、質量分析によるタンパク質同定法の進歩により、研究代表者らが開発した非変性条件の2次元ゲル電気泳動は、さらにその有用性が高まったと考えられる。ヒト血漿タンパク質の非変性条件のマイクロ2次元ゲル電気泳動(ゲル等電点電気泳動とサイズ分離ゲル電気泳動のいずれにも変性剤を用いず、縦横38mm,厚み1mmの平板ゲル上に2次元分離する)によるパターンと、部分的変性条件のマイクロ2次元ゲル電気泳動(非変性条件の等電点電気泳動とSDSゲル電気泳動を組み合わせ、同じマイクロサイズの平板ゲル上に分離する)によるパターンを比較することによって、タンパク質間相互作用の存在を確認した。
肺がんにおけるカルボキシペプチダーゼMの発現と予後の研究

ヒトおよびラット肺がんにおけるCarboxypeptidase M(CPM)の解析を行った.ラット肺がんモデルはBHPを投与して作製し,腺がん様の組織が形成された.抗ラットCPM抗体7F9等を用いた免疫組織染色でCPMは,正常組織部分でII型肺胞上皮細胞の細胞膜に局在し,肺がん組織部分でも同様の局在であった.またそれらは抗TTF-1抗体と陽性細胞がよく一致した.ウェスタンブロッティングで発現量が経時的に増加した.以上よりCPMはがん関連分子の1つと考えられた.肺がんの病理学的診断に有用なマーカータンパクを確立することが本研究の目的である。カルボキシペプチダーゼM (Carboxypeptidase M, CPM)は次の理由でその候補と考えられた。すなわち、Epidermal growth factor (EGF)はEpidermal growth factor receptor(EGFR)を活性化させ、下流のシグナル伝達を活性化させて肺がんを進展させると考えられているが、カルボキシペプチダーゼMはこのカスケードの上流でEGFを制御するため、肺がんの進展度との相関が高いと推測した。以上を明らかにするため、カルボキシペプチダーゼMの発現量と局在を、ヒトの肺がん組織標本、ラットの肺がんモデルを使用して、免疫組織化学的および生化学的に検討した。またヒトでは臨床的な各因子との相関を統計学的に解析する予定である。ヒトおよびラット肺がんにおけるCarboxypeptidase M(CPM)の解析を行った.ラット肺がんモデルはBHPを投与して作製し,腺がん様の組織が形成された.抗ラットCPM抗体7F9等を用いた免疫組織染色でCPMは,正常組織部分でII型肺胞上皮細胞の細胞膜に局在し,肺がん組織部分でも同様の局在であった.またそれらは抗TTF-1抗体と陽性細胞がよく一致した.ウェスタンブロッティングで発現量が経時的に増加した.以上よりCPMはがん関連分子の1つと考えられた.カルボキシペプチターゼM(CPM)はEGFを分解し活性化させる酵素タンパクとして知られている.EGFはEGFRのリガンドであり, CPM-EGE-EGFRというカスケードは肺癌との関連が予想されている.またCPMは従来I型肺胞上皮細胞に発現しているとされてきたが,むしろII型肺胞上皮細胞に特異的である可能性が示唆されている。以上を踏まえて以下の研究を行った。1.ヒト肺がん標本におけるCPMの発現量と局在を検討するため、市販の抗ヒトCPM抗体を使用して免疫組織化学の条件検討を行った。結果は肺がん組織から陽性所見が得られたが、正常組織からは陽性所見を得られず、I型肺胞上皮細胞またはII型肺胞上皮細胞に局在するといういままでの知見と矛盾することとなり、新たに抗体を作製して検討する必要があると考えられた。2.ラット肺がんモデルを作製するため、6匹のラットにN-ニトロソビス(2-オキソプロピル)アミン(BHP)を12週間経口投与し,それからさらに12週間後に安楽死させた,結果はBHPを投与したすべてのラットに腺癌様の肺腫瘍が複数個ずつ形成された.この方法は安定してラットに肺がんを作製できることが確認された。3.ラット肺がん標本におけるCPMの発現量と局在を検討するため、2.で作製したラット肺がん標本に対して、抗ラット、CPM抗体で免疫組織化学およびウェスタンブロッティングを行った。結果は(1)正常組織部分ではCPMはII型肺胞上皮細胞に局在していた。(2)腫瘍組織部分では異型度が低い部分に強く発現する傾向があった。(3)ウェスタンブロッティングで発現量が正常組織よりも腫瘍組織で増加していることが示された。以上よりCPMはII型肺胞上皮細胞に局在することが確認され、II型肺胞上皮細胞由来の肺がんについては発癌や増殖などに関連があると考えられた.カルボキシペプチダーゼM(CPM)はEGFを分解し活性化させる酵素タンパクとして知られている.EGFはEGFRのリガンドであり,CPM-EGF-EGFRというカスケードは肺癌との関連が予想されている.またCPMは従来I型肺胞上皮細胞に発現しているとされてきたが,むしろII型肺胞上皮細胞に特異的である可能性が示唆されている。1.ヒト肺がん標本におけるCPMの発現量と局在を検討するため、新たにポリクローナル抗体の作製を開始した。抗原部位解析や立体構造解析を行い適切なペプチド配列を選択、合成を開始した。2.ラット肺がんモデルをN-ニトロソビス(2-オキソプロピル)アミン(BHP)を投与することにより再度作製した。標本におけるCPMの発現量と局在を確認するため、抗ラットCPM抗体で免疫組織化学およびウェスタンブロッティングを行った。結果は昨年度とほぼ同様であり、(1)正常組織部分ではCPMはII型肺胞上皮細胞に局在していた。(3)ウェスタンブロッティングで発現量が正常組織よりも腫瘍組織で増加していた。3.2.と同時にBHP投与後の期間の長短によりがんの組織像に差異があるかどうか検討し、BHP投与後の期間が長いほど異型度の高いがん組織が生成され、短いほど異型度の低い組織となり、CPMの発現が強くなる傾向にあった。

肺がんの病理学的診断に有用で、患者の予後予測が可能となるようなマーカータンパクを確立することが本研究の目的である。カルボキシペプチダーゼMは以下の理由でその候補となりうると考えられた。すなわち、Epidermal growth factor(EGF)はEpidermal growth factor receptor(EGFR)を活性化させ、さらに下流のシグナル伝達を活性化させて肺がんを進展させると考えられているが、カルボキシペプチダーゼMはこのカスケードの上流でEGFを制御すると言われているため、肺がんの進展度との相関が高いと推測される。以上の点を明らかにするため以下の研究を行った。(i)ヒトカルボキシペプチダーゼMに対するポリクローナル抗体の作製し、それを用いてヒト肺がんの病理組織標本におけるカルボキシペプチダーゼMの発現量と局在を免疫組織化学により検討した。肺がんの分化度によって染色性が変化すれば、臨床病期分類と対比させ、予後を予測できる可能性がある点で意義がある。ポリクローナル抗体を数種類作製して感度の良い抗体で検討中である。(ii)ラット肺がんモデルを作製しカルボキシペプチダーゼMの発現量と局在を検討した。比較的分化度の高い腫瘍組織に多く発現しているのが観察された。ヒト肺がんの組織でも同様のことが観察されるか、基準となるため重要と考えられる。またラット肺がんモデルから幹細胞を抽出し、培養を継続する過程で染色性が変化するか検討した。肺がんの病理学的診断に有用で,患者の予後予測が可能となるようなマーカータンパクを確立することが本研究の目的である.カルボキシペプチダーゼMは以下の理由でその候補となりうると考えられた.すなわち,Epidermal growth factor(EGF)はEpidermal growth factor receptor(EGFR)を活性化させ,さらに下流のシグナル伝達を活性化させて肺がんを進展させると考えられているが,カルボキシペプチダーゼMはこのカスケードの上流でEGFを制御すると言われているため,肺がんの進展度との相関が高いと推測される.以上の点を明らかにするため以下の研究を行った.ヒトカルボキシペプチダーゼMに対するポリクローナル抗体の作製し,それを用いてヒト肺がんの病理組織標本におけるカルボキシペプチダーゼMの発現量と局在を免疫組織化学により検討した.ポリクローナル抗体を4種類作製し,ヒト肺腺がん,扁平上皮がん,大細胞神経内分泌がんのサンプルに対してパイロットスタディを行ったが,先に得られていたラットカルボキシペプチダーゼMに対するモノクローナル抗体の染色性および局在といずれも異なるため臨床検体を使用したマススタディは行わなかった.ラット肺がん組織からShirasawaらが記述した肺細胞初代培養の方法を用いて,ラットの肺がんから細胞培養を行い,自己複製能のある細胞群,すなわちがん幹細胞群を抽出できるか検討した.抽出された細胞群を限界希釈して観察すると,一部の細胞群でsphereの形成を認めるようになった.これらの性質については解析途中である.