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よりｉｎ　ｖｉｖｏに近いポドサイト培養系の確立をめざして－ＶＥＧＦを中心に－

腎臓糸球体上皮細胞(ポドサイト)は、糸球体濾過機能、構造維持に非常に重要であり、in vivoの形質を維持した培養条件の確立はポドサイトの研究を行う上で不可欠である。本研究は、初代培養を用いin vivoの細胞の性質を保つ培養条件を確立しようとするものである。最も低下の激しい特異遺伝子(ネフリン)の発現量を指標にして検討した結果、単離糸球体培養3日目での継代、非酵素的細胞剥離、ヘパリンの添加、胎仔牛血清の濃度の低下、細胞密度の適正化などにより、遺伝子発現レベルでin vivoに近い培養条件が確立できた。また、形態学的には、デキサメサゾン、ATRAの添加によって細胞突起の改善が認められた。腎臓糸球体表面を覆う足細胞は、腎臓の機能維持に重要であり、その傷害は慢性腎不全の原因となる。本研究は、生体内の足細胞と類似した性質をもつ初代培養を用い、より生体内の細胞の性質に近い培養条件を確立することによって、足細胞の研究に貢献しようとするものである。これまでに、培養液へのヘパリン添加が足細胞の初代培養細胞において、特異遺伝子(ネフリン、ポドシン、ポドカリキシン)の発現を増強することを明らかにしてきた。この機序は、未だ明らかではないが、糖鎖構造の異なるデキストラン硫酸は同じ効果を認めること、さらに同じ糖鎖構造を持つが硫酸化の低いヘパラン硫酸ではこの効果がないことから、硫酸化の程度に依存することが考えられた。ポドシンの局在を見ると、ゴルジ装置に留まることが多かったが、ヘパリン添加により、in vivoに近似して細胞間に集積することが分かった。ヘパリン添加のみでは、細胞の形態変化は見られなかったが、デキサメサゾンを加えることにより、一次突起に似た構造物が細胞内に認められるようになった。血管内皮細胞増殖因子(VEGF)を加えると単独で有意にネフリンの発現量が増加したが、ヘパリンの効果より少なかった。また、VEGFは有意に培養足細胞の生存に有利に働くことを示すことができた。トランスクリプトーム解析の結果、VEGF受容体であるVEGFR-1、VEGFR-2ではなく、ニューロピリン1,2を介して作用していることが考えられた。以上のように、in vivoんお特異形質に近づく条件を検討していくことにより、足細胞が特異形質を維持するメカニズムへの理解が進んでいくものと考えられた。腎臓の糸球体の上皮細胞である足細胞は、腎臓の機能維持に重要であり、その傷害は慢性腎不全の原因となる。足細胞の初代培養細胞を、ラット単離糸球体から得て、培養初期におけるポドサイトの足突起の消失などの形態変化、特異遺伝子の発現低下(ネフリンは1000分の1、ポドシンは50分の1、ポドカリキシンは60分の1)を確認した。発現低下の著しいネフリン遺伝子の発現量を指標として、過去に報告されている株化細胞のネフリン発現を増加すると報告されている物質を調べたところ、単独で有意に発現を増加させたのは、へパリンのみであった。ネフリン発現を10倍近く増加させるが、ポドシン、ポドカリキシンの発現は高々3倍であった。また、培養系で発現低下のなかったコネキシン43、ネフ1を増加させなかった。このことから、培養による発現低下の程度に応じて、ヘパリンはその発現を上げていることが考えられた。血清を除いただけでもネフリンの発現が2倍以上に増加するが、へパリンの添加は、さらにネフリンの有意な増加をもたらした。このことは、へパリンが直接細胞に作用して、発現の増加をもたらしていることを示している。また、低分子量へパリン、糖鎖構造の異なるデキストラン硫酸でも、同様の効果が認めたれ、硫酸化されていないデキストランでは、有意な効果がみられなかったことから、へパリンの増強効果は、硫酸基を介した陰性荷電の関与が考えられた。以上のことから、ヘパリンを加え、胎仔牛血清の濃度を減少させることによって、より生体内の遺伝子発現状態に近づけることができることが明らかとなった。ポドサイトを通常の条件下で培養すると、ポドサイト特異遺伝子の発現量は経時的に急激に低下する。ヘパリンを加えることによって、発現低下を抑制することができる。しかし、単離糸球体の発現量を指標にすると、単離糸球体の1/1000までに低下するネフリンの発現量が1/100になる程度であった。そのため、基本的な培養手技条件を見直した。

単離糸球体培養4日目に継代を行っていたものを3日目に変更した。細胞数は3割程度減少したが、ネフリンの発現量は4倍に増加した。継代で細胞を剥離する際トリプシンを使っていたが、代わりに非酵素性細胞剥離液(Sigma)の使用したところ、ネフリンの発現量はさらに4倍に増加した。これらの組み合わせによりネフリンの発現量は、単離糸球体の1/10程度まで上昇した。さらに、胎仔牛血清の濃度の低下または無添加、フィルター上での培養がネフリンの発現を有意に増加させることが分かった。細胞密度の影響を検討したところ、生体内のポドサイトの占有面積近くまで細胞密度を上げた方が発現量は多くなることが明らかになった。これらにより、ネフリンの発現量は、単離糸球体の発現量の1/41/2を示すようになった。次に、細胞外基質の影響を見ると、I型コラゲンのコーティングの量に依存して発現量は増加し、細胞の付着伸展を低下させるもののネフリンの発現量が単離糸球体レベルとなった。他のポドサイト特異遺伝子、ポドシン、ポドカリキシンもほぼ単離糸球体レベルを示した。単離糸球体は、ポドサイト以外にも内皮細胞、メサンギウム細胞も含まれるが、遺伝子の発現量の標準化に用いているGAPDHは培養によって23倍に増加することを考慮すると、ほぼ生体内のポドサイトの発現レベルになったと考えられた。以上のことから、遺伝子発現レベルでは、in vivoに近い培養条件が確立できた。腎臓病理学本研究の目的は、特異性質を失ってしまう培養足細胞がよりin vivoに近い特異性質を持つ培養条件を見つけ出すことにある。そのため、ヘパリン、デキサメサゾン、血清濃度、細胞外基質、成長因子などを一つ一つ検討してきている。現在、ヘパリン、デキサメサゾン、血清濃度、VEGFが効果をもたらすことが明らかになりつつある。これらは、研究当初の目的に合致している。よって、上記の判断が妥当と考えられた。基本的な培養条件、たとえば、ヘパリン、胎仔牛血清、デキサメサゾン、細胞密度、コラゲンやラミニンの細胞外基質、透過性膜の条件が、どのように培養足細胞の形質遺伝子発現に影響するかのデータが蓄積することができ、これはほぼ該当年度の目的を達成できていると判断している。培養足細胞の形質に影響を与えうる因子の検討を続けていく。未だ、不十分なのは、細胞の極性に影響を与える透過性のある膜状での培養、糸球体基底膜に特異的に含まれる細胞外基質の影響、そしてこれまでに分かってきた効果のある因子の組み合わせによる影響である。これらによって、どこまでin vivoの形質に近似できるかが次の目標となる。特に足細胞の基本的な構造である足突起、スリット膜がどこまでできるかがひとつの指標となる。足細胞の特異的遺伝子ネフリンの発現量をひとつの指標として、培養条件を設定してきた。胎仔牛血清の濃度を下げ、ヘパリン、デキサメサゾンを加えることにより、発現量を10倍から20倍に増やすことが可能となった。しかしながら、通常の培養条件下では1/1000以下に低下するものを1/1001/50までに回復させることができたに過ぎず、生体内の細胞との間には未だ大きなギャップがある。そのため、本研究費を申請したときの計画に従って、生体内の足細胞に豊富な血管内皮細胞増殖因子(VEGF)の効果を検討していきたい。予備実験では、培養細胞を採取するときの混入細胞の処理、血清濃度に大きく影響されることが示唆されている。
認知症患者の医療同意と財産権保護における本人自己決定のための法的枠組みの研究

1研究実績平成30年度の研究実績は、(1)日本と海外における意思決定支援の調査と(2)日本モデルとの比較検討並びにその中間成果を発表した。(1)日本と海外における意思決定支援の調査:山梨県理宇大学における認知症認定看護士コースにおける成年後見法講義の中で看護現場における金銭管理上の課題についてケース検討を行った。また、ドイツにおいて地区裁判所裁判官、世話人協会からヒアリングを行い、シンガポールの家庭裁判所、スペシャルニーズトラストカンパニー、金融機関、弁護士事務所へのヒアリングを実施した。(2)日本モデルとの比較検討並びにその中間成果:具体的な後見や財産管理者の担い手の法的スキームをもとに、地域における支援関係機関と実効性の検証を行い、理論上並びに実務上の法的問題点を明らかにするため、『高齢社会における信託・成年後見・金融の課題と展望』シンポジウムを3月に開催した。その中で、「金融包摂と高齢者財産管理制度の課題」として基調報告を行った。調査研究につき、スペシャルニーズトラストの比較研究において、アメリカ、アジア地域での動向と日本における成年後見制度改革の最新情報を分析する必要が生じた。今年度については、The Office of the Public Guardian (OPG)とスペシャルニーズトラストの比較研究のための調査と国内における地域連携モデルの検証を行い、具体的な認知症患者を想定した意思決定と財産管理の支援モデルを策定する。その上で、全体の研究結果を総括し、地域における認知症患者の意思決定支援モデルの課題と結論を得る。研究成果については公開シンポジウムなどの場で発表するとともに、論文を学会誌等に投稿して査読を受ける。1研究実績平成28年度の研究実績は、(1)認知症看護・介護における意思決定の調査と(2)専門職連携モデルの策定を行った。(1)認知症看護・介護における意思決定の調査:地域における認知症患者の意思決定の実態把握のため、看護実践開発研究センター認知症看護認定看護師教育課程の協力を得て、認知症高齢者などの具体的なニーズや問題点を把握できた。また、県内の弁護士・司法書士などの法律専門職や地域NPO法人への聞き取り調査を行った。(2)医療同意と財産管理に関する専門職連携モデルの策定と法的分析医療現場での家族同意についての基礎調査を行った。また、医療現場での判断基準と同意の違法性阻却事由について分析と、本人の意思決定についての法的問題点を実務面と理論面から検証した。財産管理における本人の意思能力減少の場面ごとにより、代行権限の法的性格を比較検討した。代行者の定義、本人との利益相反関係、同意権の射程を検討した。医療行為の同意と財産管理権としての法律行為との違いを本人の意思決定のためのいくつかの支援モデル案を策定するため、国際比較、後見制度の改正などの動きをフォローした。当初計画した項目につき、海外の制度比較と整理を除き概ね順調に推移した。1研究実績平成29年度の研究実績は、(1)海外における意思能力決定制度の調査と(2)日本モデルの比較検討を行った。(1)海外における意思能力決定制度の調査:イギリス意思能力法とドイツ「世話人」制度と医療同意と意思決定支援モデルの調査を行い、併せてアジアにおける同様の意思決定支援の状況について調査、分析し、日本への示唆を得ることができた。昨年度の海外調査の取りまとめ作業と日本制度との比較を行った。(2)日本モデルの比較検討:医療関係者、弁護士、司法書士会および社会福祉協議会などへの聞き取り調査を行い、現状と課題を明らかにした。また、地域金融機関などの担当者を交えた議論を経て、スペシャルニーズトラストや後見制度支援信託や預金取引における意思決定支援の方法を具体的に検討した。当初計画した項目につき概ね予定通りに調査・分析を実施できた。平成29年度の研究内容は、今までのドイツにおける「世話人」制度の調査から、わが国の成年後見利用促進基本計画の動向を比較検証する。また、第4回成年後見法世界会議の成果を分析し、アジアにおける制度調査や医療同意と意思決定支援モデルの調査を行う予定である。国内の研究者、実務家の協力を得て、金融機関、医療機関、弁護士協会および支援NPO法人などへの聞き取り調査を行い、現状と課題を明らかにする。日本モデルとの比較検討については、各国における医療同意と財産管理についていかなる示唆が得られるのかについて多角的に検討する。

調査結果をもとに、医療機関、支援関係機関、地域金融機関などの担当者を交えた議論を経て、より実効性の高い結論を導き、今後の地域における意思決定支援の実践に活かせるよう研究を進める。平成30年度の研究計画は、アメリカにおける自己決定支援制度と信託活用事例の調査と実態把握を行う予定であるが、他の事例・制度比較に変更することも状況によって検討する。その理由は、アジア、ヨーロッパにおける制度の調査を優先する必要性も生じる可能性があるからである。また、日本モデルとの比較検討から、認知症患者を想定した意思決定と財産管理の支援モデルを策定する作業を進める。総括作業も同時並行で進め、全体の研究結果を総括し、所属する学会等の場で発表する準備や論文公刊のための資料を取集する。今年度については、The Office of the Public Guardian (OPG)とスペシャルニーズトラストの比較研究のための調査と国内における地域連携モデルの検証を行い、具体的な認知症患者を想定した意思決定と財産管理の支援モデルを策定する。その上で、全体の研究結果を総括し、地域における認知症患者の意思決定支援モデルの課題と結論を得る。研究成果については公開シンポジウムなどの場で発表するとともに、論文を学会誌等に投稿して査読を受ける。予定していた認知症等の意思決定に関する国際比較調査を翌年度へ延期したため。平成29年度の調査等を繰り延べたためであり、平成30年度中に実施する予定である。2018年度の調査等を繰り延べたためであり、2019年度中に実施する予定である。平成29年度中には調査研究(アジア地域)を実施する予定。
光触媒作用による水中の微量有害重金属の高効率捕集

酸化チタン系(Ti0_2,BaTi_4O_9)の光触媒酸化物粒子とα-FeOOH微粒子からなる複合体について、水中溶存鉛イオンに対する光電析捕集効果およびその反応メカニズムについて検討した。α-FeOOH微粒子の分散担持によって用いた酸化チタン系の酸化物粒子は、鉛イオンに対する光電析作用を示した。鉛イオンに対して光電析作用を示した試料の高分解能走査電子顕微鏡像観察結果から、TiO_2およびBaTi_4O_9のそれぞれの粒子表面に酸化鉛が不均一に析出することを見いだした。α-FeOOH微粒子の分散担持による光電析反応は、光励起によって生成したホールと電子の電荷分離促進によってもたらされることを示した。鉛イオンの光電析捕集後の水溶液pH変化と鉛イオン除去量の定量的関係から、溶存酸素が光電析反応に関与する反応機構を明らかにした。本研究では、水分解に高い活性を示すBaTi4O9及びCeO2系光触媒酸化物粒子にα-FeOOH微粒子を分散析出させることによるPb(II)イオン除去効果とその光電析反応析出メカニズムについて検討した。BaTi4O9粒子及びCeO2系粒子は固相反応法により合成した。合成したこれらの酸化物粒子と硝酸鉄を所定比で混合した溶液とKOH溶液における水酸化物粒子沈殿反応により酸化物粒子表面にα-FeOOH微粒子を分散析出した試料を作製した。作製試料について主としてPb(II)イオン水溶液に対する吸着特性を評価した。光電析作用によるPb(II)イオン除去能はα-FeOOH微粒子の分散析出によって著しく向上した。カットフィルターを用いた照射波長を制限したPb(II)イオン除去試験の結果から、α-FeOOHを分散させた複合粒子の光吸収は光触媒酸化物に起因することを示した。吸着試験後の試料の走査型電子顕微鏡によって観察された二次電子像より、光触媒酸化物単体粒子表面に比べて複合粒子表面には多くの析出物を認めた。この析出物はエネルギー分散型X線元素分析により鉛を含む物質であることを確認した。α-FeOOH添加による除去能の向上は光触媒粒子表面に存在するα-FeOOHのイオン交換吸着ではなく、生成ホールによるPb(II)イオンの酸化酸化作用に基づく除去能向上に寄与していることを見出した。この除去能の向上はα-FeOOHが光励起によって生成したホールと電子の電荷分離促進に起因していると考察した。Pb(II)イオンの光電析後の水溶液pH変化とPb(II)イオン除去量の定量的関係、及びアルゴン雰囲気下でのPb(II)イオン除去試験の結果から溶存酸素が反応に寄与していることを見出し、光電析反応メカニズムを明らかにした。本研究では水分解に高い活性を示すBaTi4O9光触媒酸化物粒子にα-FeOOH微粒子を分散析出させることによるPb(II)イオン除去効果とその光電析反応析出メカニズムについて検討した。BaTi4O9粒子は固相反応法により合成した。合成したBaTi4O9粒子と硝酸鉄を所定比で混合した溶液とKOH溶液における水酸化物粒子沈殿反応によりBaTi4O9粒子表面にα-FeOOH微粒子を分散析出した試料を作製した。作製試料についてPb(II)イオン水溶液に対する吸着特性を評価した。光電析作用によるBaTi4O9のPb(II)イオン除去能はα-FeOOH微粒子の分散析出によって著しく向上した。カットフィルターを用いた照射波長を制限したPb(II)イオン除去試験の結果から、α-FeOOH-BaTi4O9複合粒子の光吸収はBaTi4O9に起因することを示した。吸着試験後の試料の走査型電子顕微鏡によって観察された二次電子像より、BaTi4O9単体粒子表面に比べα-FeOOH-BaTi4O9複合粒子表面には多くの析出物を認めた。α-FeOOH添加による除去能の向上はBaTi4O9粒子表面に存在する針状結晶のα-FeOOHではなく、微細なα-FeOOH微粒子が除去能の向上に寄与していることを見出した。Pb(II)イオンの光電析後の水溶液pH変化とPb(II)イオン除去量の定量的関係、およびアルゴン雰囲気下でのPb(II)イオン除去試験の結果から溶存酸素が反応に寄与していることを見出し、光電析反応メカニズムを明らかにした。

BaTi4O9酸化物がTiO2よりも光電析により高い鉛イオン捕集能力を示すことを見いだし、さらにその光電析反応メカニズムをαオキシ水酸化鉄微粒子の分散担持状態と関連づけて明らかにすることができた。これらの研究結果は、光電析反応解析、高分解能走査電子顕微鏡観察、および特性X線元素分析等によって見いだしたものであり、概ね当初の予定どおりの研究計画によって進捗している。目的とする重金属イオン捕集能に対する妨害重金属イオンの影響を明らかにして、選択性の優れた捕集材料の開発を目指す。そのために、分散担持する水酸化物微粒子の選択と分散担持形態を、高分解能走査電子顕微鏡観察、特性X線元素分析、表面電位測定などによって明らかにしていく。主として、重金属イオン捕集実験に必要な消耗品と研究成果の学会発表、及び論文投稿料に使用する予定である。
腸炎ビブリオ感染による腸管運動の変化が下痢誘発に与える影響

申請者は腸管細菌感染症に伴う分泌吸収機構の変化に関する研究を行ってきた。とくに腸管感染細菌が分泌する溶血毒に着目し、Vibrio parahaemolyticusの分泌する耐熱性溶血毒(TDH)はpore forming作用だけではなく、腸管上皮細胞の細胞内Ca^<2+>を増加とPKCの活性化を誘導しCl-分泌を亢進し下痢を引き起こすことを明らかにした。また細胞内に取り込まれたて、その細胞にapoptosisを引き起こすことも明らかにした。本研究では、TDHが、ラット大動脈を用いて、血管の収縮、仕官反応に与える影響について解析した。TDHをラット大動脈に添加すると大動脈の収縮を認め、Kmは8.6 μg/mlであった。この収縮は、細胞外のCa^<2+>をなくして時阻害された。またprotein kinase Cの阻害剤によっても抑制された。これらのことより、TDHは細胞外Ca^<2+>やprotein kinase C依存性に血管平滑筋を収縮させることがかんがえられた。この反応が腸炎ビブリオ感染症の病態に関与して可能性が考えられた。我が国で最も多い食中毒原因菌の一つとして腸炎ビブリオが上げられ、また、近年アジアを中心に特定の血清型を持つ腸炎ビブリオ(O3:K6)が流行し世界各地に伝播し問題となっている。腸炎ビブリオ感染症の主要な病原因子の一つとして耐熱性溶血毒(TDH)が考えられており、その作用は、下痢原性と共に、心臓毒性を持つと言われている。腸炎ビブリオ感染症患者で、心電図上QTc延長、ST-Tの変化が認められる事が報告されており、心、血管系に影響を与えることが推測されているが、詳しい心臓毒性の機序は不明である。そこで、本研究ではRat大動脈を用いて、TDHが血管の収縮、弛緩反応に与える影響について解析を行った。TDHをRat大動脈に添加すると大動脈の収縮を認め、Km=8.6μg/mlであった。この収縮は、細胞外のCa2+をFreeにしたとき阻害された。またprotein kinase C (PKC)の阻害剤であるcalphostin C(1μM)の添加によっても一部阻害された。よってTDHは、細胞外Ca2+、PKC依存性に血管平滑筋を収縮させることが考えられ、この反応が腸炎ビブリオ感染症の病態に関与している可能性が示唆された。
日本統治下台湾・朝鮮からの「留学生」に関する研究

研究期間に実施したのは、1台湾・朝鮮留学生に関する年表の補完作業、2留学生に関する統計資料の再調査と補完作業、3関係者へのインタビュー、4留学生の受け入れ校の事例研究、5留学生の送り出し状況の調査である。主な成果としては、1台湾、朝鮮から学生を受け入れた中等教育機関、旧制金川中学校の事例を研究論文「旧制金川中学校の台湾・朝鮮留学生」として発表したこと、2留学生統計資料のうち、学校別の受け入れと送り出しの状況を「日本統治下台湾・朝鮮からの『留学生』に関する研究資料:学校別学生・生徒数」にまとめたことが挙げられる。本年度の研究実施計画は次の3点にあった。1先行研究の分析を行い、そこで得た知見を留学生年表に反映させること、2基礎資料(政策文書、新聞資料、留学生関係資料等)の調査及び内容分析を行い、そこで得た知見を留学生年表に反映させること、3インタビュー調査(これまでに収録した分のテープ起こしを含む)と内容分析を行うことである。1については、先行研究の読み直しを行っている。かつて作成した留学生年表と比較すると、年月日が若干異なっている事項もあり、今後もこの作業は継続していく計画である。刊行されていない学位論文があることもわかった。2については、古書や復刻版の資料を購入することができた。『在日朝鮮人関係資料集成』、『日本植民地教育政策史料集成(第7集)』、『雅丹文庫未公開資料叢書海外留学生発行雑誌』等である。これに加えてアジア歴史資料センターの茗荷谷文書等も利用し、統計資料の確認や年表への反映を継続中である。新たにキリスト教系雑誌の留学生記事の抽出と内容分析を開始した。3については、2001年から開始した留学経験者へのインタビューのテープ起こしや見直し作業を中心に行った。また留学経験者だけでなく当時の台湾及び朝鮮の教育状況を知るために新たなインタビューイー2名、過去のインタビューの補足を兼ねて1名のインタビューイーに話を聞いた。台湾1件、韓国1件、国内1件である。この他、留学生の送り出し状況や受入れ状況を調べるために国内外で予備調査を行った。過去に台湾でのインタビュー調査から岡山県内に台湾留学生を多く受け入れた中学校があると聞いていたため、岡山県立図書館の郷土資料コーナーで資料の閲覧を行った。2年目に向けて本格的に計画したいと考えている。本研究の具体的な目的は1)「留学生」に対する政策・制度の変遷と「留学生」数の推移を明らかにすること、2)学校別の「留学生」の送り出しと受け入れの実態を明らかにすること、3)「留学生」の就学状況や社会生活、進路の実態を明らかにすること、4)1)3)を比較分析することにある。当該年度は当初、留学生の送り出し、受け入れについて学校の事例研究を行う計画であった。1対象とする学校の選定及び訪問、2学校文書や学籍簿、同窓会誌、学校関係者へのインタビュー、3初年度からの継続作業(年表・統計の完成版の作成、「留学生」政策・制度の変遷の文章化、インタビュー調査とそのまとめ)を研究実施計画として掲げていた。資料調査は大韓民国で2回行った(2015年9月、2016年3月)。中央図書館、済州大学校図書館郷土資料室、光州教育大学校図書館他で学校史の調査を行った。また知人研究者の協力を得てナラ記録館での資料調査を行った。初年度に収集した資料、購入した復刻資料と併せて現在、内容分析を行い、年表や統計資料、政策・制度の変遷に反映させている。新たな資料としてミッションレポートにも注目し、目録から関係記事の抜粋を開始した。個人情報保護の観点から学籍簿の閲覧は厳しくなっていることが予測されるが、「留学生」の送り出しと受け入れの実態を読み取ることのできる貴重な史料である。当該年度中には学校の選定や訪問には至らなかったが、現在も調査を継続している。「留学生」を送り出した当時の台湾社会、朝鮮社会、それぞれの学校状況についても関心の範囲であり、当時の学校教育経験者へのインタビュー(補足を複数回実施)とまとめを行った。総じて研究目的の1)4)について継続中である。上記「研究実績の概要」で示した13の作業に、前年度に引き続き時間を費やしていることが理由である。学校教育経験者へのインタビューとそのまとめはほぼ終わっている。資料調査の範囲を拡大したこともあり、昨年度からさらに遅れることになってしまった。ただし全体としては多角的な視野で課題に向き合えている。本研究の目的は、日本統治下(1920年代1940年代中心)の台湾・朝鮮からの「留学生」(「内地」への進学生)の就学状況や社会生活の諸相を調査・分析することによって、彼らが社会的・歴史的にどのような役割を果たしたのかについて以下の諸点を明らかにすることにある。1)「留学生」(「在内地台湾・朝鮮学生」)に対する政策・制度の変遷と「留学生」数の推移2)学校別(学校種・公立/私立・専攻・台湾/朝鮮)の「留学生」の送り出しと受入れの実態3)「留学生」の就学状況や社会生活、進路の実態(専攻別・男女別・地域別のケーススタディ)4)1)3)の分析を通じて、時期的(皇民化政策の前後)にどのような違いがみられるか。5)1)3)の分析を通じて、台湾出身学生と朝鮮出身学生でどのような違いがみられるか。具体的な研究実施計画として以下の7点を挙げていた。1.日本統治下台湾・朝鮮からの留学生年表の完成版作成(1920年代1940年代)2.日本統治下

台湾・朝鮮からの留学生統計の更新版作成(1920年代1940年代)3.日本政府及び台湾総督府、朝鮮総督府の留学生政策と制度の変遷4.台湾・朝鮮の公立学校及び私立学校からの留学生の送り出し(学校別事例研究)5.日本の諸学校における台湾・朝鮮留学生の受入れ(学校別事例研究)6.留学経験者の就学状況、社会生活の実態調査(個別インタビュー)7.台湾・朝鮮からの留学生の時期的な特徴、台湾と朝鮮との違いを分析当初、平成28年度の計画は、2年目の継続と総括を行い、学会発表、論文発表を行うことを計画していたがそこまでには至らなかった。現在の研究実績としては、上記の1,2,3,5,6について一定の調査・分析を終え、まとめが進行中である。国内調査(奈良女子大学・岡山県立図書館)は実施した。今後は4を進め、7の包括的な分析に進む計画である。1)研究が遅れた一番の理由は、本務校における業務のためにまとまった調査の時間やその準備のための時間が取れなかったことである。台湾や韓国にそれぞれ1週間でかけるだけの日程が確保できなかった。2)韓国のミッションスクールからの「留学生」送り出しについて、ミッションレポートから記事の抽出・複写を行ったものの、訳出が予定通り進まなかった。最終年度の研究計画は、1日本統治下台湾・朝鮮の官公立学校及び私立学校からの留学生の送り出し(学校別事例研究)、2日本の諸学校における台湾・朝鮮留学生の受け入れ(学校別事例研究)3台湾・朝鮮からの時期的な特徴、台湾と朝鮮との違いなど包括的な分析を行うことにあった。このうち、1については「日本統治下台湾・朝鮮からの『留学生』に関する研究資料:学校別学生・生徒数」(平成30年3月)を作成し、掲載の<資料2>で、「内地(東京大阪)留学生出身学校別(中等学校以上)調」(昭和14年7月朝鮮総督府警務局大韓民国国立中央図書館所蔵))をもとに単年度の留学生数を示した。Seoulの私立学校、とりわけミッションスクールからの留学(「内地進学」)者数が突出して多いことから、『KOREA MISSION FIELD』の関係記事を訳出したが、学校別事例研究には至らなかった。台湾については、台南の長栄高級中学(長老教中学校)校史室の資料を閲覧し「内地」進学や「内地」ミッションスクールとの関係を確認したが、全体像の把握には至らなかった。今後も継続したい研究課題である。2については、作成した上掲資料の<資料1>で、「在内地朝鮮学校調」「本島人内地留学者調」等の史料から、1920年1939年の留学生数の経年変化を一覧として示した。「在内地朝鮮学生調」のうち「昭和4年末現在」は、これまで所在が確認できなかった『奨学部報』第12号(桃山学院史料室所蔵)に依る。また、学校別事例研究として、「旧制金川中学校の台湾・朝鮮留学生」について、アジア教育学会研究例会(平成29年4月)で発表し、同名の論文にまとめた(『アジア教育』第11巻掲載平成29年11月)。3については、時期的な特徴や志望に違いなど分析は進めているが、論文化はできていない。今後、論文発表や著書の刊行等を検討し、継続していきたいと考えている。
樹幹のエイジングに関わる遺伝子を獲得する

マツ属は,心材時にピノシルビン誘導体等のスチルベン化合物が蓄積することはよく知られている.そこで,樹幹のエイジングに関わる遺伝子としてマツのスチルベン合成酵素遺伝子(sts)に的を絞った.まず,マツゲノムからPCRにより,この遺伝子のクローニングを試みた.PCRによる増幅条件を検討した結果,0.2マイクログラムという少量のゲノムDNAからも予測される断片長のバンドが増幅された.このPCR断片をクローニングすることなく塩基配列決定した結果,バンドにはstsが複数個存在することが示唆された.また,サザン解析の結果もこれを支持した.そこで,PCR産物をサブクローニングして異なるstsを探したところ,2つのクローニングが見いだされた.両者は既知のオウシュウアカマツのsts配列に非常に類似しており,stsの活性部位を持っていた.両者は,芽生えではマツの根に特異的に発現していた.半数体由来のゲノムDNAからも両者が得られたことから,両者の関係は,対立遺伝子ではなく,アイソジーンであると結論した.一方,樹幹からmRNAを単離し,逆転写後PCRによりstsの発現を解析したところ,季節特異的発現が予測されると,樹幹中の見かけ上の発現部位は予測される移行材に限られないことなど興味深い知見が得られた.研究課題名の遺伝子獲得には成功したが,樹幹における転写レベルでのsts遺伝子発現の意味を説明する研究がさらに必要となろう.マツ属は,心材時にピノシルビン誘導体等のスチルベン化合物が蓄積することはよく知られている.そこで,樹幹のエイジングに関わる遺伝子としてマツのスチルベン合成酵素遺伝子(sts)に的を絞った.まず,マツゲノムからPCRにより,この遺伝子のクローニングを試みた.PCRによる増幅条件を検討した結果,0.2マイクログラムという少量のゲノムDNAからも予測される断片長のバンドが増幅された.このPCR断片をクローニングすることなく塩基配列決定した結果,バンドにはstsが複数個存在することが示唆された.また,サザン解析の結果もこれを支持した.そこで,PCR産物をサブクローニングして異なるstsを探したところ,2つのクローニングが見いだされた.両者は既知のオウシュウアカマツのsts配列に非常に類似しており,stsの活性部位を持っていた.両者は,芽生えではマツの根に特異的に発現していた.半数体由来のゲノムDNAからも両者が得られたことから,両者の関係は,対立遺伝子ではなく,アイソジーンであると結論した.一方,樹幹からmRNAを単離し,逆転写後PCRによりstsの発現を解析したところ,季節特異的発現が予測されると,樹幹中の見かけ上の発現部位は予測される移行材に限られないことなど興味深い知見が得られた.研究課題名の遺伝子獲得には成功したが,樹幹における転写レベルでのsts遺伝子発現の意味を説明する研究がさらに必要となろう.
中国における「民主」と「憲政」の展望-制度改革に見る「上から」と「下から」の動き

本年は、本課題の下で行ってきた研究を総括するとともに、これまで行った研究の基礎の上で新しい研究課題を打ちたて、さらにその指針を示すことを目標に研究を行った。研究成果として、まず小稿「『矛盾』から読み解く中国」では、近時生じた中国の現在を象徴する事件・事情を題材に、憲法に規定される四つの基本原則と現代社会との「矛盾」を示し、中国の「今」の姿を描き出すとともに、将来の変化への展望を行った。本稿は、広く一般の読者を意識したカラー雑誌に掲載されたものであることから、中国社会の諸事情を法的側面からビジュアルに分かり易く紹介することを企図しており、今後中国法の研究が果たしていくべき役割の一つの可能性を示せたのではないかと考えている。さらに、「物権法草案違憲論争の諸相」では、近時の最重要立法における議論の紹介を通じて、中国における規範秩序構造の現状と再構築の可能性について検討した。同論文では、政治宣言的な憲法の統治構造が社会の現実状態と乖離していることの危険性を示した上で、この危機を回避するキーは、統治の正当化契機という「名」のみの民主という現状を打破し、自己決定と自己統治という民主の「実」を確保することにある、との見解を示している。今後はこの視点から、統治構造に関する研究を深めていきたいと考える。なお、上記研究に関して、本年度いくつかの学会に出席した。このうち、8月の東大での日中物権法シンポや12月の早大での法継受に関する国際シンポ等では通訳を担当している。また研究のため調査を行う中で、現地の裁判官や弁護士などの実務家及び学識軽験者等と活発な交流を行った。特に、華東政法学院の管建強副教授や上海交通大学の周偉教授等中国の「草の根民主」に関わる人物や、個人情報保護・情報公開立法等に参与する社会科学院の呂艶濱副研究員には、情報提供や調査協力など、様々な形で協力頂いている。本年度は、まず中国の所謂「憲政」制度の構造について、その理論構造を整理し現状の把握を行うべく、憲法における「民主」と「法治」に関する理論的考察を行った。その成果として、公権力とそれを担う人員に対する制約及び監視の権限を定める「監督制度」に関する論文を発表しており、同論文において、「監督」の規定及び実態の分析に基づいて議会と党の権限及び位置づけを明らかにし、もって憲法に予定される権力構造の暇疵及び虚偽というべき問題を指摘することができた。次に、次年度に予定する実地調査の準備として、裁判官や学者等とコンタクトをとり、傍聴や訴訟の実情に関する調査への協力をお願いした。具体的には、本年度は科研費により一回、また私費などにより二回訪中し、まず憲法訴訟に積極的に参加している上海交通大学の周偉教授との面識を得て、憲法訴訟についてのお話をうかがうとともに、同氏の行う訴訟に関する資料の提供と実地調査の約束を頂いた。また、同時に日本の憲法学者及び実務家との交流についても依頼を受けている。実務家については、上海第二中級裁判所の王智剛裁判官に現地の裁判手続について細かくご教示いただくとともに、実際に裁判の傍聴をさせていただいた。さらに、次年度に長期の滞在調査を行うことの許可を得ることができ、同氏が裁判長を担当する事件について傍聴した上で、疑問点について審理後に質疑応答の機会を頂けることになった。このほかにも、上海高級裁判所人事処副処長の孫磊氏とも面会し、上海市の虹口区、嘉定区の各裁判所副所長らとともに、中国の裁判所及び裁判官が現在直面する問題、特に行政機関との関係や裁判官の地位及び処遇、そして担当事件の量・質の変化による過剰な責任負担、といった問題について討議を行うとともに、今後の研究への協力をお願いしている。本年は司法制度と選挙制度の改革における「上から」と「下から」の動きを具体的かつ感覚的に把握することを目標に、それぞれの制度の改革の現状についての観察・分析を行った。司法制度改革の現状分析についてはまず、司法実務に強い発言力を持ち司法制度改革について積極的に発言している中国政法大学司法学院院長の曲新久教授、そして死刑制度存廃問題について詳細な研究が見られる中国社会科学院の田禾教授など、有識者との対話を行った。これにより、司法制度改革の動向に強い影響力を持つ研究者が、今後の展開についてどのように予測しているか、そしてどちらに方向付けようとしているのか、という点を探ることができたと考える。次に、一般に外国人の刑事法廷傍聴は許されないが、今回懇意にしている裁判官の好意で特別に数回にわたって傍聴を行うとともに、毎審理後に裁判長にインタビューする機会もいただき、裁判の現状と裁判官の法廷運営上の意識の所在を観察・分析することができた。特に、公判廷で裁判官が非常に積極的に発言する、という点には、実体的真実重視という職権主義の影響が感じられると同時に、当事者全体が一体化する運動型の裁判運営という姿も垣間見られたといえる。選挙制度改革については、人民代表大会代表候補者とその支援者の活動に同行し、選挙制度の理論と実際に触れることができた。同候補者は「上から」の指名候補に対抗して「下から」推薦された候補であり、選挙活動および規制の観察・分析と選挙関係者へのインタビューにより、中国の選挙における「民主」の虚偽性を再確認するとともに、人々の党に対する複雑な感情と選挙への冷熱入り混じる思いを実感することができたと考えている。

なお、同問題に関しては、06年12月11日に上海の華東政法学院で選挙制度における民主性の保障をテーマとした講演を行うとともに、下記の論文を提出している(6月出版)。本年は、本課題の下で行ってきた研究を総括するとともに、これまで行った研究の基礎の上で新しい研究課題を打ちたて、さらにその指針を示すことを目標に研究を行った。研究成果として、まず小稿「『矛盾』から読み解く中国」では、近時生じた中国の現在を象徴する事件・事情を題材に、憲法に規定される四つの基本原則と現代社会との「矛盾」を示し、中国の「今」の姿を描き出すとともに、将来の変化への展望を行った。本稿は、広く一般の読者を意識したカラー雑誌に掲載されたものであることから、中国社会の諸事情を法的側面からビジュアルに分かり易く紹介することを企図しており、今後中国法の研究が果たしていくべき役割の一つの可能性を示せたのではないかと考えている。さらに、「物権法草案違憲論争の諸相」では、近時の最重要立法における議論の紹介を通じて、中国における規範秩序構造の現状と再構築の可能性について検討した。同論文では、政治宣言的な憲法の統治構造が社会の現実状態と乖離していることの危険性を示した上で、この危機を回避するキーは、統治の正当化契機という「名」のみの民主という現状を打破し、自己決定と自己統治という民主の「実」を確保することにある、との見解を示している。今後はこの視点から、統治構造に関する研究を深めていきたいと考える。なお、上記研究に関して、本年度いくつかの学会に出席した。このうち、8月の東大での日中物権法シンポや12月の早大での法継受に関する国際シンポ等では通訳を担当している。また研究のため調査を行う中で、現地の裁判官や弁護士などの実務家及び学識軽験者等と活発な交流を行った。特に、華東政法学院の管建強副教授や上海交通大学の周偉教授等中国の「草の根民主」に関わる人物や、個人情報保護・情報公開立法等に参与する社会科学院の呂艶濱副研究員には、情報提供や調査協力など、様々な形で協力頂いている。
グローバル生産環境下における国際生産・物流シミュレータの開発

近年,多くの企業体を包含したものの流れの効率化を目指すサプライ・チェーン・マネジメント(SCM)が脚光を浴びている.しかしながら,生産・物流・販売を包括する多段階システムにおけるフロー制御のモデルは確立されていない.本研究では,ハイブリッド生産方式と多重ループ制御という二つの考え方をベースに調達・生産・物流・販売を統一したフロー制御の体系化を目指したところに特徴がある.ハイブリッド生産方式は受注生産と見込生産の利点を結合し,ダイナミックな需要変動に対処しようとするものである.フロー制御に関する研究の多くは国内外でかんばん方式の改良といった形で進められ,その適応環境の拡大が図られている.しかしながら,従来のかんばん方式の枠組みから脱却することができないでいる.「最適なフローを作り出す方式は何か」といったごく当たり前の発想から出発することによって,多くの代替案が存在することが明らかになった.多段階システムにおいて,すべての段階からその上流工程へのかんばんループをもつ多重かんばんループシステムの性能をシミュレーション評価することにより,すべての下流工程から源流工程を制御する入れ子型かんばんループ構造の有効性が明らかにされた.また,多様な生産フローの構造が実地調査され,多段階生産・物流モデルの構築に利用された.さらに.大規模な生産システムを高精度で高速に解析できる準モンテカルロ・シミュレーション解析法が開発された.これらの研究成果を利用することによって,グローバル環境下における国際生産・物流シミュレータの開発が可能であると考える.近年,多くの企業体を包含したものの流れの効率化を目指すサプライ・チェーン・マネジメント(SCM)が脚光を浴びている.しかしながら,生産・物流・販売を包括する多段階システムにおけるフロー制御のモデルは確立されていない.本研究では,ハイブリッド生産方式と多重ループ制御という二つの考え方をベースに調達・生産・物流・販売を統一したフロー制御の体系化を目指したところに特徴がある.ハイブリッド生産方式は受注生産と見込生産の利点を結合し,ダイナミックな需要変動に対処しようとするものである.フロー制御に関する研究の多くは国内外でかんばん方式の改良といった形で進められ,その適応環境の拡大が図られている.しかしながら,従来のかんばん方式の枠組みから脱却することができないでいる.「最適なフローを作り出す方式は何か」といったごく当たり前の発想から出発することによって,多くの代替案が存在することが明らかになった.多段階システムにおいて,すべての段階からその上流工程へのかんばんループをもつ多重かんばんループシステムの性能をシミュレーション評価することにより,すべての下流工程から源流工程を制御する入れ子型かんばんループ構造の有効性が明らかにされた.また,多様な生産フローの構造が実地調査され,多段階生産・物流モデルの構築に利用された.さらに.大規模な生産システムを高精度で高速に解析できる準モンテカルロ・シミュレーション解析法が開発された.これらの研究成果を利用することによって,グローバル環境下における国際生産・物流シミュレータの開発が可能であると考える.電子部品、塗料、食品など9社における調達・生産・物流・販売を包含する多段階のものの流れの実態調査を行った。その結果、各段階におけるフロー制御が押出型と引張型に分類されること、また、生産形態が見込型から受注型に移行していることが浮き彫りにされた。これは、近年の景気後退にともなう製品在庫保有のリスク増大が大きく影響しており、多段階システムにおけるスムーズなものの流れの実現において、見込生産に伴う仕掛在庫の保有リスクを本研究で開発を目指すシミュレータに組み込むことが必要なことを示唆している。従って、受注・見込みハイブリッド生産方式の性能評価では、受注によるかんばん枚数の増加(生産指示の繰上げ)と需要を見込んだ先取り生産における仕掛在庫の意味の相違に着目し、製品劣化に伴う廃棄リスクと仕掛在庫により資金固定リスクを区別して評価する仕組みを導入し、その性能を評価している。また、従来、かんばんは離散化された計数値として取り扱われていたが、時間バッファーの概念を導入し、連続値としての扱いを可能とし、スムーズなフロー制御を可能にすることができた。これは、国際生産・物流のシミュレータの機能を、現状分析としてよりも、むしろ、新しい方式を提供するところまで拡大できる成果と考えている。多重ループかんばん制御方式の性能評価においては、トヨタかんばん方式よりも有効な制御方式を構築できることが明らかにされた。ここでは、システムの生産性能と在庫スペースが評価尺度として取り込まれており、より汎用性の高いフロー制御が実現可能である。しかしながら、以上の研究では、単一品目を対象に解析が進められて、多品目への拡張が必要となってくる。資材・製品等の調達のための各種在庫管理方式の統一的比較については、いまだ、十分な成果は得られていないので、次年度以降において継続して研究を行う。前年に続き、電子部品と電子機器、自動車部品など7社における調達から生産・物流・販売に至るまでの多段階におけるものの流れの実態調査を行った。その結果、各段階におけるフロー制御が押出型と引張型に分類されること、また、生産形態が見込型から受注型に移行していることが再確認された。さらには、複数品目を同一設備で生産し、共同配送するといった多品目生産・物流のための方策の必要性が浮き彫りにされた。ここでは、生産スケジュールが生産効率、配送効率に重大な影響を及ぼしており、大規模問題に対する生産スケジューリングの方法論の確立が重要である。これらの実体を受けて、見込生産に伴う仕掛在庫の保有リスクを考慮し、需要状況に応じてダイナミックにかんばん枚数を制御するフロー制御方式を開発し、その有効性を検証した。

また、従来、多段階におけるものの流れは、定期的にフローが制御される離散モデルと連続的に制御される連続モデルが混在していたが、これらを調査間隔の考えを導入した統一モデルを構築し、現在、単一段階における各種のフロー制御方式が多段階システムに及ぼす影響を解析中である。多品目生産・物流の問題についても、経済ロットサイズ問題を多段階へ拡張する観点からのモデル化が検討されている。生産スケジューリング問題に対しては、ジョブショップスケジューリングのための探索解法を開発し、多くのベンチマーク問題に対して有効性を確認し、さらなる性能の向上に取り組んでいる。これらの研究成果は、グローバル生産環境下における多段階物流システムを統一的に整理するための方策を提供することになる。次年度は、やや発散的になった以上の研究を研究発表としてまとめることに重点をおいて研究を進めることになる。ダイナミックに変動する市場需要に柔軟に対処するために,受注生産方式と見込生産方式の利点を結合したハイブリッドな生産指示方式(需要適応型かんばん制御方式)を設計し,その有効性をシミュレーション解析によって明らかにしている.近年,在庫を持つことは罪悪であるといった風潮により,多くの企業が見込生産方式を受注生産方式へ移行してきているが,見込生産による完成品在庫を保有するリスクを定量的に定義することにより,顧客サービスの指標となる納入リードタイムとの定量的な比較・評価が可能になる.すなわち,トータルバランスを考慮したフロー制御を実現することが可能である.多段階の生産・物流システムにおいては,各段のものの流れを統制する生産指示方式・発注方式が重大な関わりをもつことになる.本研究では,多段階生産・物流システムのシミュレータを開発し,全体最適化を実現するためのフロー制御方式を明らかにしている.また,全体最適を実現するための生産・物流システムの構築に際しては,生産工程の設計も重要に影響をもつことが知られている.そこで,本研究では,生産システムの設計にまで言及し,ライン生産方式における作業者の配置が生産性能に及ぼす影響を明らかにしている.その結果,多能工の活用による応援作業方式が変動に柔軟な生産システムの設計であることを明らかにしている.ライン型生産システムに対して,ショップ型の生産工程では,生産スケジューリングが生産効率を大きく左右することから,フローショップ工程およびジョブショップ工程の生産スケジューリングアルゴリズムの開発にも注力し,短時間に高精度のスケジュールを作成するアルゴリズムを開発している.以上の結果を統合することにより,資材調達から生産・物流・販売を統合システムとして捕らえた国際的なグローバル生産・物流シミュレータの構築が可能となる.
ＨＡＭ動物モデルの作製と新規治療法開発

HTLV-1感染CD4陽性細胞とHTLV-1特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)が脊髄に浸潤し、HAMが発症すると考えられている。我々はHAM動物モデルを作成することを目的とした。HLA-A2+A24+のHAM患者末梢血リンパ球より樹立したHTLV-1感染CD4陽性細胞株を、NOD/SCID/JAK3欠損マウスに腹腔内投与した。同一患者より樹立したHTLV-1 Tax11-19またはTax301-309特異的CTL株を投与し、感染細胞株だけのマウス、それぞれのCTLも追加投与したマウスの3群に分けた。しかし神経症状は発現しなかった。今後、細胞数、移入ルート等の改善が必要である。HAMの脊髄ではHTLV-1感染CD4陽性細胞とHTLV-1特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)が浸潤し、脊髄内でHTLV-1特異的炎症を起こしHAMが発症していると考えられている。HTLV-1感染CD4陽性細胞とHTLV-1特異的CTLをマウスに移入することでHAM動物モデルを作成し、新規治療法開発のツールとすることが本研究課題であり、本年度は以下の研究を行った。HLA-A2またはHLA-A24陽性のHAM患者のリンパ球を用いて、HTLV-1感染CD4陽性細胞株およびHTLV-1 Tax特異的CD8陽性CTL株の樹立を試みた。末梢血リンパ球よりCD4陽性細胞をマグネットビーズを用いて分離し、IL-2存在下で長期培養した。HTLV-1感染細胞株は昨年度の3株に追加して本年度は新たに3株の感染細胞株がえられた。HTLV-1特異的CTL株については、同一患者の末梢血リンパ球よりCD8陽性細胞またはHTLV-1 Tax/MHCテトラマー陽性細胞をマグネットビーズで分離した。非感染者のリンパ球を3Gの放射線照射後ペプチドを添加し、上記のCD8陽性細胞またはHTLV-1 Tax/MHCテトラマー陽性細胞に添加後IL-2存在下で混合培養した。しかしながら、動物実験に用いるレベルの細胞数に達しなかった。そこで、添加IL-2の比較を行い、力価の高いIL-2を選別した。また、感染者の全リンパ球を培養しリンパ球自己増殖反応を起こさせた後、HTLV-1特異的CTLが約10倍以上に増加した状態でテトラマーにて陽性細胞を分収し、ビオチン化CD2、CD3、CD28を結合したマイクロビーズを刺激粒子として混合培養を行い、CTLの株化を行っている。現在2株が樹立されつつある。HAM患者より末梢血リンパ球を分離しDNA抽出後、PCRにてHLAを同定した。HLA-A2またはHLA-A24陽性者の10例のHAM患者のリンパ球を用いて、HTLV-1感染CD4陽性細胞株およびHTLV-1 Tax特異的CD8陽性CTL株の樹立を試みた。HTLV-1感染細胞株は2ヶ月目までは全例順調に増殖したがそれ以降は増殖が低下し、最終的に3例で安定して増殖する感染細胞株がえられた。同じHLAを持つ非感染者の末梢血リンパ球をマイトマイシンCで処理し、HLA-A2拘束性のTax11-19またはHLA-A24拘束性のTax301-309エピトープを合成したペプチドをパルスした。これをHAM患者より分離したCD8陽性細胞またはHTLV-1 Tax/MHCテトラマー陽性細胞に添加後IL-2存在下で混合培養し、この刺激操作を数回繰り返した。CTLの状態についてはHTLV-1 Tax/MHCテトラマーにてモニターし、HTLV-1特異的CTL株を作成した。

しかしながら、動物実験に用いるレベルの細胞数に達せず動物実験にまでいたっていない。HAMの脊髄ではHTLV-1感染CD4陽性細胞とHTLV-1特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)が浸潤し、脊髄内でHTLV-1特異的炎症を起こしHAMが発症していると考えられている。HTLV-1感染CD4陽性細胞とHTLV-1特異的CTLをマウスに移入することでHAM動物モデルを作成し、新規治療法開発のツールとすることが本研究課題であり、本年度は以下の研究を行った。HLA-A2またはHLA-A24陽性のHAM患者の末梢血リンパ球を用いて、HTLV-1感染CD4陽性細胞株およびHTLV-1 Tax特異的CD8陽性CTL株の樹立を試みた。末梢血リンパ球よりCD4陽性細胞をマグネットビーズを用いて分離し、IL-2存在下で長期培養した。5株のHTLV-1感染CD4陽性細胞株がえられた。HTLV-1特異的CTL株については、同一患者の末梢血リンパ球よりCD8陽性細胞をマグネットビーズで分離した。CTLの誘導に抗原提示細胞が大量に必要なため、HLA-A2+A24+のHTLV-1非感染者のBリンパ球をEBVで不死化して細胞株を作成した。この細胞株はMHCおよびCD80を発現していた。放射線照射あるいはマイトマイシンC処理後の抗原提示細胞にHTLV-1 Tax11-19およびTax301-309のペプチドを添加後、上記のCD8陽性細胞とIL-2存在下で混合培養した。以下同様の刺激を繰り返し、3株のHTLV-1特異的CD8陽性CTLがえられた。HLA-A2陽性の同一HAM患者よりえられたHTLV-1感染細胞株、HTLV-1 Tax11-19およびTax301-309特異的CTL株を用いて以下の実験を行った。高度免疫不全マウス(NOD/SCID/JAK3欠損マウス:NOJマウス)に感染細胞株を腹腔内投与した。3日後にCTLを投与し、何も投与しないマウス、Tax11-19特異的CTLを投与したマウス、およびTax301-309特異的CTLを投与したマウスの3群に分けた。現在、感染細胞とCTLを投与したマウスに下肢麻痺が現れないか経過観察中である。神経免疫学本研究課題の重要な点は、ヒトのHAMの脊髄で観察された浸潤HTLV-1感染CD4陽性細胞およびHTLV-1特異的CD8陽性細胞傷害性Tリンパ球(CTL)によるHTLV-1特異的炎症を両細胞を移入した動物の脊髄で再現し、これによりHAM発症モデルを作成し、さらに新治療法開発のツールとすることである。これを実現するためには、最低10の6乗オーダーの細胞数が必要になると考えられる。現時点ではHTLV-1感染CD陽性細胞株は十分な細胞数に達しているが、HTLV-1特異的CTL株は未だ十分な細胞数に達しておらず、本年度はマウスへの移入実験を行うことができなかった。本研究課題の重要な点は、ヒトのHAMの脊髄で観察された浸潤HTLV-1感染CD