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なぜ血管炎症候群は起こるか―血管内皮・周皮細胞機能と二次的遺伝子変異に着目して―

本研究では、血管炎症候群患者の血管内皮細胞の機能異常を証明することを目標に研究を進めた。血管炎症候群患者の血管内皮細胞を直接得ることが難しいことから、iPS細胞を用いた研究を行った。大動脈炎症候群患者末梢血単核球からセンダイウイルスベクターを用いて、大動脈炎症候群患者由来のiPS細胞を誘導した。多分化能の評価として、免疫染色・mRNA発現解析・核型検査・NOD-SCIDマウスを用いた奇形腫形成能を確認し、iPS細胞の樹立に成功した。次に作製したiPS細胞から血管内皮細胞の分化誘導を行った。分化誘導プロトコールは既報告のフィーダーフリー分化誘導を中心に行ったが、大動脈炎症候群患者由来のiPS細胞から血管内皮細胞を効率よく分化誘導できなかった。そこで既報告の論文を参考にし、古典的なOP-9を用いた分化誘導法や、胚様体を用いた誘導方法を応用しながら血管内皮細胞の誘導を試みたが、分化誘導効率の改善は得られなかった。最終的には血管内皮分化誘導プロトコールを一から見直し、独自の血管内皮細胞の分化誘導法を樹立した。Wntシグナルを活性化するサイトカイン・低分子化合物を用いることで、高効率で中胚葉細胞を誘導することに成功した。また、Lateral plate mesodermが血管内皮前駆細胞の形成に重要であることから、必要な誘導因子を添加することにより、高効率に血管内皮前駆細胞を誘導することに成功した。この誘導前駆細胞はVEGFを大量に添加した培地で培養すると血管内皮細胞に分化した。この方法により、大動脈炎症候群患者由来のiPS細胞から血管内皮細胞を高効率で誘導することができた。最後に、健常人あるいは大動脈炎症候群患者のiPS細胞から誘導された血管内皮細胞の機能比較解析を行ったが、研究期間内に特定の機能異常を同定するには至らなかった。今後更なる検討による展望が期待される。28年度が最終年度であるため、記入しない。血管炎症候群患者末梢血単核球からセンダイウイルスベクターを用いて、血管炎症候群患者由来のiPS細胞の作製を行った。具体的には、大動脈炎症候群患者2名の末梢血単核球から各3ラインずつ、計6ラインのiPS細胞を樹立した。多分化能の評価として、免疫染色、mRNA発現解析、核型検査、NOD-SCIDマウスを用いた奇形腫形成能を確認した。これらのことから、大動脈炎症候群患者由来のiPS細胞の樹立に成功した。分化誘導プロトコールはOrlova VV, etal. Nat Protoc. 2014を用いて行った。この分化誘導法は健常人由来iPS細胞では、実際に血管内皮細胞を分化誘導可能であることが確認できていたが、大動脈炎症候群患者由来のiPS細胞では血管内皮細胞を効率よく分化誘導することができなかった。そこで、次にOrlova VV, et al. Nat Protoc. 2014の血管内皮分化誘導プロトコールを添加するサイトカイン・低分子化合物の量、添加時期などを一部変更し、分化誘導効率の改善を試みたが、めざましい改善は認められなかった。また、その他の既報告の論文などを各種調査し、古典的なOP-9を用いた分化誘導法(Sone, M. et al. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2007)や胚様体を用いた誘導方法(Nakahara M, et al. Cloning and Stem Cells 2009)などの誘導法を適宜応用しながら血管内皮細胞の誘導を試みた。しかし、血管内皮細胞は、少量であれば誘導されるが、機能解析実験が可能なほどの高効率で、血管内皮細胞を誘導することは困難であった。現在独自の方法での血管内皮細胞の誘導プロトコールを開発している。健常人iPS細胞での実験では血管内皮細胞の誘導が可能であったが、患者由来のiPS細胞で同様の実験を行った際に、効率よく血管内皮細胞を誘導することができず、その後の実験をすすめるために大幅に研究計画を修正する必要が生じたため。

Wntシグナルを活性化するサイトカイン・低分子化合物を用いることで、高効率で中胚葉細胞を誘導することに成功した。また、Lateral plate mesodermが血管内皮前駆細胞の形成に重要であることから、必要な誘導因子を添加することにより、高効率に血管内皮前駆細胞を誘導することに成功した。この誘導前駆細胞はVEGFを大量に添加した培地で培養すると血管内皮細胞に分化した。この方法により、大動脈炎症候群患者由来のiPS細胞から血管内皮細胞を高効率で誘導することができた。最後に、健常人あるいは大動脈炎症候群患者のiPS細胞から誘導された血管内皮細胞の機能比較解析を行ったが、研究期間内に特定の機能異常を同定するには至らなかった。今後更なる検討による展望が期待される。患者由来iPS細胞で血管内皮細胞の誘導効率が十分に得られない原因をiPS細胞の質の問題、分化誘導プロトコールの問題、実験手技の問題に分けて検討し、一つずつ条件改善を行っていった。最終的に分化誘導プロトコールを改めて構築するのが最も有効であろうという結論となり、現在、段階的に分化誘導プロトコールを見直して独自の誘導方法を開発中である。28年度が最終年度であるため、記入しない。
X線構造に基づく好熱性放線菌α-アミラーゼのシクロデキストリン加水分解機構の解明

好熱性放線菌(Thermoactinomyces vulgaris R-47)は,2つのα-アミラーゼ(TVA1,TVA2)を持つ。これらは,デンプンに加えて,通常のα-アミラーゼがほとんど加水分解できない環状オリゴ糖であるシクロデキストリン(CD)やα-1,6結合を規則正しく含む多糖(プルラン)をも加水分解できるという興味深い基質特異性を持つ。また,TVA1はデンプン・プルランなどの高分子量基質に,TVA2は,CD・オリゴ糖などの低分子量基質に対してよく働く。これらの酵素の加水分解機構を解明するために,以下の研究を行った。不活性型TVA2ミュータント酵素と,α-,β-,γ-CD(それぞれグルコース単位が6,7,8)との複合体の結晶を作成し,X線結晶解析を行い,CD認識・加水分解機構について新たな知見を得たので論文誌に発表した。また,プルラン認識機構を明らかにするために,プルランモデルオリゴ糖(パノシルパノース)との複合体についてもX線結晶解析を行い,α-1,6結合認識について新たな知見を得たので論文誌に発表した。TVA1不活性型ミュータント酵素とマルトヘキサオースとの複合体のX線結晶解析を行った。その結果,触媒部位とは別に,ドメインNに2箇所の基質結合が認められた。このことは,ドメインNがデンプン結合ドメインとして働き,TVA1が高分子量基質を好むことと密接に関係があると考えられる。この結果は,それを立証する生化学データとともに,論文誌に発表した。TVA1,TVA2のX線結晶解析の結果から,CDを認識するアミノ酸を相互置換することにより,TVA1とTVA2の基質特異性の相互変換を試みた。その結果,TVA1ミュータント酵素(F313A)において,デンプン:CDに対する加水分解活性比を,野生型TVA2のものに近づけることに成功した。この結果は,論文誌に発表した。これらは,デンプンに加えて,通常のα-アミラーゼがほとんど加水分解できない環状オリゴ糖であるシクロデキストリン(CD)をも加水分解できるという興味深い基質特異性を持つ。これらの酵素のCD加水分解機構を解明するために,平成14年度においては,以下の研究を行った。(1)TVA2不活性型ミュータント酵素とα-,β-,γ-CDとの複合体のX線結晶解析TVA2の触媒残基であるAsp325とAsp421の2残基をAsnに置換したミュータント酵素を合成し,α-,β-,γ-CD(それぞれグルコース単位が6,7,8)との複合体の結晶を作成し,X線結晶解析を行った。X線データは,放射光(高エネルギー加速器研究機構PF,およびSPring-8)により収集した。3.0Å程度の分解能での解析ではあるが,全ての複合体において,触媒部位へのCD結合が認められた。現在,酵素-基質間の相互作用を詳細に観るため,構造の精密化をすすめている。また,同時に,より高分解能データ収集の準備をすすめている。(2)TVA1不活性型ミュータント酵素とγ-CDとの複合体のX線結晶解析TVA1は,TVA2と異なり,γ-CDだけを加水分解する。TVA1不活性型ミュータント酵素とγ-CDとの複合体のX線結晶解析を,TVA2と同様の方法で行った。

その結果,γ-CDは,触媒部位には,結合しておらず,触媒部位から離れた酵素表面に結合していた。現在,触媒部位へのγ-CDの結合を目指し,結晶化条件を検討するとともに,酵素表面結合部位も,酵素触媒活性に何らかの役割りを果たしているのではないかと考え,その役割りを解明すべく実験計画を立てている。好熱性放線菌(Thermoactinomyces vulgaris R-47)は,2つのα-アミラーゼ(TVA1,TVA2)を持つ。これらは,デンプンに加えて,通常のα-アミラーゼがほとんど加水分解できない環状オリゴ糖であるシクロデキストリン(CD)やプルランをも加水分解できるという興味深い基質特異性を持つ。また,TVA1はデンプン・プルランなどの高分子量基質に,TVA2は,CD・オリゴ糖などの低分子量基質に対してよく働く。これらの酵素の加水分解機構を解明するために,前年度から引き続き平成15年度においては,以下の研究を行った。不活性型TVA2ミュータント酵素と,α-,β-,γ-CD(それぞれグルコース単位が6,7,8)との複合体の結晶を作成し,X線結晶解析を行った。X線データは,放射光(高エネルギー加速器研究機構PF,およびSPring-8)により収集した。3.0Å程度の分解能での解析ではあるが,全ての複合体において,触媒部位へのCD結合が認められた。CD認識・加水分解機構について新たな知見を得たので現在,論文執筆中である。TVA1不活性型ミュータント酵素とマルトヘキサオースとの複合体のX線結晶解析を行った。その結果,触媒部位とは別に,ドメインNに2箇所の基質結合が認められた。このことは,ドメインNがデンプン結合ドメインとして働き,TVA1が高分子量基質を好むことと密接に関係があると考えられる。この結果は,それを立証する生化学データとともに,論文誌に発表した。TVA1,TVA2のX線結晶解析の結果から,CDを認識するアミノ酸を相互置換することにより,TVA1とTVA2の基質特異性の相互変換を試みた。その結果,TVA1ミュータント酵素(F313A)において,デンプン:CDに対する加水分解活性比を,野生型TVA2のものに近づけることに成功した。この結果は,論文誌に発表した。
ホメオボックス遺伝子の二段階転写調節による胚芽の区画化と遠近軸形成

ショウジョウバエの肢や背中でのBarホメオボックス遺伝子による区画形成の分子・遺伝子機構解明を中心として研究した。ショウジョウバエの肢での、Bar発現は、少なくとも二段階の転写制御を受ける。最初期の発現(発現のイニシエーション)は、Wg,Dpp,Dll,(Rasシグナル)及び未知の時間因子により支配されている。この最初期Barは、Bar発現以前に発現している、dacの発現領域を先端側(内側)から細胞自律的に負に制御する。Bar発現細胞と非発現細胞が、接触するとそこで、領域の分節化・溝形成が起り、その過程には、Bar依存的な細胞接着因子、Dachsusが関わる。Bar発現領域の内側では、Barとは独立に別のホメオボックス遺伝子、aristaless(alが発現し、両者の拮抗的な相互作用により、排他的な発現境界が形成される。alと類似の機能を持つarisataless-like(all)を単離し、その変異体をつくり、構造解析を行い、Barとの相互作用を調べた。Barの区画化遺伝子としての機能がどの程度一般的であるかを調べるために、背中の区画化におけるBarの役割を調べた。従来背中は、転写制御遺伝子の発現により前後方向の複数の区画から形成されていると考えられていたが、本研究(Bar発現)により、むしろ碁盤の目のように区画化されていることが初めて示された。背中には、多数の神経器官が規則正しく分布しており、その形成にはacheate-scuteが、必要である。acheate-scuteの発現は、Barによりの正に制御されていた。Bar変異株や、Barの強制発現・モザイク分析を利用し、またacheate-scuteの発現や、bristleの形成の有無を調べることで、Barがプレパターン遺伝子として機能していることを明らかにした。
ロボット支援下手術が及ぼす眼動脈血流への影響

ロボット支援下前立腺全摘出術を施行された患者8人に対し、視覚誘発電位の測定をおこなった。麻酔導入後、患者頭部に針電極を装着し、更に光刺激装置を有するゴーグルを装着した。測定のタイミングは、執刀開始前、頭低位開始後30分、60分、90分、120分、頭低位終了後5分、10分の7点とし、高度頭低位により視覚誘発電位がどのように変化するかを、執刀開始前の値と比較し、継時的に評価した。高度頭低位開始に伴い、ほとんどの測定点で視覚誘発電位の潜時延長がみられた。また、超音波を用いて視覚誘発電位同様に眼動脈血流の流速測定を試みた。しかし、眼動脈血流測定は、超音波プローベを当てる位置により、測定値に幅が生じてしまい、また、頭低位によりプローベ角度を毎回一定にして測定することが困難であった。結果としては同一動脈の流速を測定できているかどうかに疑問が生じ、さらに、測定には予想以上に時間を要し、患者の眼球への影響を心配する必要も生じた。よって眼動脈血流ではなく、視神経鞘の径を測定することにした。測定点は視覚誘発電位と同じとした。ほとんどの測定点において視神経鞘も頭低位開始時間とともに径の増大を認めた。視覚誘発電位、視神経鞘測定点では血圧、中心静脈圧、心拍出量(エドワーズライフサイエンス社フロートラック使用)、中心静脈酸素飽和度(エドワーズライフサイエンス社プリセップカテーテル使用)といった循環動態をモニタリングして記録した。視覚誘発電位は頭低位開始後から経時的に潜時が延長する傾向を示したものの、統計的に有意差を認めるまでには至らなかった。また、視神経鞘の径も経時的に増加する傾向を示したものの、統計学的有意差が出るほどではなかった。まだ、循環動態のモニタリング値と視覚誘発電位、視神経鞘径との関連性を統計学的に評価をしていないため、今後考察する予定である。ロボット支援下手術において、眼動脈血流、さらに網膜中心動脈、上眼静脈の流速を超音波を使用して継時的に計測した。どの症例においても頭低位後では流速の低下がみられた。ただし、測定する際、毎回同じ血管の流速を測定できているかは、プローベの角度、位置などの技術的要素で不安な点もあるため、新たに視神経鞘の径も併せて測定することにした。その結果、視神経鞘の径も頭低位後は増加することが確認された。さらに視覚誘発電位も測定することにした。視覚誘発電位でも頭低位後は潜時の延長が認められた。いずれの項目も、コントロール値を測定後、頭低位後30分毎に測定し、頭低位解除後は5分毎に測定した。また、血圧、心拍数、中心静脈圧、心拍出量、終末期呼気炭酸ガス濃度、脳波もモニタリングしている。これらの所見は、頭蓋内圧亢進状態であることを反映していることが過去の文献から確認されている。流速低下、視神経鞘径増大、視覚誘発電位の潜時延長は、いずれも頭低位を解除したあとはコントロール値にほぼ戻る傾向を示した。以上のことから、ロボット支援下手術における気腹、高度頭低位は、頭蓋内圧亢進、眼の血流低下、眼圧上昇、視神経系への影響など、予想した通りの影響がある可能性が示唆された。ただし、現状ではロボット支援下手術の症例数が限られており、症例があったとしても人員的問題で毎回その手術に立ち会うことが難しいため、種々の測定ができた症例数はまだ少ない。さらに症例数を増やし、各測定項目の変化の傾向、また、循環動態、脳波所見との関連性を検討していく予定である。

まだ、循環動態のモニタリング値と視覚誘発電位、視神経鞘径との関連性を統計学的に評価をしていないため、今後考察する予定である。現在は手術室勤務であるが、科研費取得後、集中治療室勤務であったため、手術室での勤務機会が少なかったこと、また、ロボット支援下手術の症例数が限られていること、ロボット支援下手術がある場合でも、人員不足のため、必ず自分がロボット支援下手術に従事できるとは限らないことにより、まだ症例数が不足している。眼動脈血流、視神経鞘径、視覚誘発電位の変化の傾向をさらに症例数を増やして把握し、血圧、心拍数、中心静脈圧などの値との関連性も検討していく。研究費交付後、購入予定であった血流を測定するための超音波機器が発売中止となり、購入不可であった。そのため、他部署にある機器を実験日のみ借りて代用させ、血流を測定する流れとなった。その後、新たに、視覚誘発電位の潜時の値が、頭低位による脳圧亢進、眼圧上昇、血流低下を反映して変化する可能性を考え、視覚誘発電位に使用する機器、ソフトウェアなどを購入したが、それらの額が当初購入予定であった機器の購入額に満たなかったため。視覚誘発電位測定に使用する針電極、測定記録を電子ファイルとして保存しておくための記録媒体、記録を印刷するための用紙などの購入に充てる予定である。特に針電極は、患者への感染の懸念を考慮すると、毎回新しい電極を使用したほうが良いと思われ、測定の度に新品を購入する予定である。また、視覚誘発電位を測定するためのソフトウェアをインストールしているパソコンのオペレーティングシステムのサポートが終了したため、新たにそのソフトを再インストールするためのパソコンの購入にも充てる予定である。
高血圧発症に占める高インスリン血症の中枢性catecholamine作動性血圧調節機序への作用

【インスリン投与時の心血管反応】雄性Wistarラットを用いウレタン麻酔下でregular Insulinの静脈内投与を行ったところ8mU20mU/kg ratの濃度においては投与濃度依存性の昇圧及び頻脈反応を認めた。またこの昇圧反応は静脈内ヘキサメトニウムの投与によってブロックされることより末梢の交換神経活動の亢進を介していることが示唆された。次に同じく麻酔下で静脈内投与では昇圧反応をきたさない少量のInsulinの側脳室内投与を行ったところ、末梢交換神経活動の亢進を伴う昇圧反応を認めた。さらにこれらのInsulin投与に伴う反応は、AngiotensinIIの拮抗薬であるlosartanの脳室内前投与によりブロックされたことよりInsulinが中枢を介して末梢交換神経活動の亢進をきたし昇圧する機序の存在が示唆された。さらに浸透圧ポンプをラットの腹腔内に埋め込み慢性のInsulinの脳室内投与を行ったところ対照群に比べ有意な昇圧を認めたことより高インスリン血症が高血圧発症に関与する可能性が示唆された。【視床下部細胞外ノルエピネフリン(NE)濃度】自作のBrain Microdialysis Probeのin vitroにおけるNEのrecovery rateは今回の実験に用いた灌流速度、すなわち2mul/min、37°Cでは5±0.2%であった。今回対象とした後部視床下部(PH)および視床下部室傍核(PVN)はともに昇圧中枢の一部と考えられている部位であるが、安静時の灌流液中NE濃度は低濃度ながらRadioenzymatic assay(0.5pg)の測定感度内であった。覚醒下のラットを用いShakingストレス負荷を行うと、負荷開始直後より、PHおよびPVNの灌流液中NE濃度はShaking頻度依存性に上昇し、終了後比較的すみやかに減少した。またこの変化は昇圧および頻脈反応と相関した。さらにその負荷終了後の減少の速度はPHに比べPVNでより速く、隣接する細胞核内においてもnoradrenergic newronの作動に差があることが示唆された。但しInsulin投与に伴う灌流液中のNE濃度には有意な変化を認めなかった。これはInsulinの作用機序として視床下部NE分泌が関与していないためか、Insulin投与時の昇圧に伴う末梢よりの圧受容体反射を介する視床下部NE分泌抑制が変化をcoverしてしまったためか詳細は不明であり今後、圧受容体神経除去ラットにおいての検討が必要となるものと考えられらる。
土壌粘土のカオリナイト化に関する研究

1.調査区域:昭和63平成2年度の3年間にわたる土壌調査区域は、タイ北部のチェンマイ、チェンライ、ランバン、パヤオ、メホンソン、ロエイの各県、および対照に選んだ中南部のチャンタブリ、ナコンラッチャシマ、コンケン、ロップブリ、プケットの各県である。調査断面は40、採取した土壌試料は約250個である。ほかに河床沈泥20試料を採取した。分析項目は、土壌の理化学性(土壌反応、有機物含量、交換性陽イオン含量、微量要素含量、粒径組成)及び紘物組成である。2.土壌反応と交換性陽イオン:pHは規定塩化カリウム中で4付近の強酸性を示し、交換性陽イオン含量も低く(〈2me/100g)、全体に強い溶脱を受けていることを示す。ただ、表層のpHも交換性陽イオン含量も下層土よりやや高いが、これは植物による塩基環元と地表からの水分蒸発によると思われる。3.有機物含量:表層の12%以外は、断面全体ほとんど例外なく0.5%で、極めて低い。4.微量要素(亜鉛、銅、マンガン、モリブテン等):王水浸出による含量は例外を除き数ppm以下で、温帯下の土壌に比べて一般に低い。土壌によっては花弁(バラ、キク)に亜鉛欠乏症状が認められる。5.粒径組成:母岩によって異なるが、概して堆積物と砂岩由来の土壌は砂質(砂〉70%)、塩基性岩と崩積物由来のものは粘地質(粘土〉50%)、花こう岩質岩由来のものはこれらの中間にある。粒径組成を層位(深さ)別に見ると、いずれの断面も、粘土含量は表層で低く、下層に向って増加する傾向を示す。これは表層の粘土の流去水による流失(表層侵食)及び浸透水による溶脱よると思われる。なお、シルトの含量は一般に非常に低く(〈10%)、温帯の類似の土壌の1/31/4である。このことは、強風化下の熱帯土壌では、シルトは微粒のため風化し易く、土壌中に長く留まれないことを示すものと思われる。6.鉱物組成:(1)砂:玄武岩質母岩のものを除いた全ての土壌でほとんど石英が占め(〉95%)、これ以外はそれぞれ微量の難風化紘物(磁鉄紘、鋭錐石、電気石、くさび石、チタン鉄紘、赤鉄紘等)である。これは明らかに強風化のためである。玄武岩質母岩のものにかなり石英が認められるが、これは母岩の噴出時またはその後の風化過程で、石英を侵入したためと解釈される。(2)粘土:全土壌で、粘土紘物組成はカオリナイトが優勢(>60%)で特長付けられる。ただし、年間降雨量が多い場合は(≧3000mm)多少のハロイサイトが生成しており、また、年間を通じて土壌が湿状態にある断面では表層はカオリナイト、下層はハロイサイトが優勢という分布がみられ、このハロイサイトは常にがなり(≦20%)のギプサイトを伴っている。このことから、熱帯においても湿潤条件ではハロイサイト(とギプサイト)が生成し、ハロイサイトは乾燥によってカオリナイトへ変るとい1つの変化系列が示唆される。また、花こう岩質母岩の土壌には多少(≦5%)のギプサイトが生成しているが、この紘物の生成と母岩の関係はよく分らない。カオリナイト(とハロイサイト及びギプサイト)以外の粘土成分で全土壌を通じて最も多いのは遊離鉄酸化物であり(≦15%)、その主体はヘマタイトと少量のゲ-タイトである。粘土含量の低い土壌ではこれらは重要な粘土成分と言える。このほかに頻繁に認められる紘物はバ-ミキュライトとスメクタイトである。とくに古い沖積層由来の土壌では、後者はカオリナイトと不規則混合層をなしており、このことは、このような土壌のカオリナイトは堆積母材中のスメクタイトの風化によって生成したものであることを示している。(3)河床沈泥:雨期に新しい岩石風化面から流出した河床沈泥には、カオリナイトのほかにかなりの2:1型紘物を含んでおり、これがタイ低地土壌中の2:1型の給源をなすと考えられる。

4.微量要素(亜鉛、銅、マンガン、モリブテン等):王水浸出による含量は例外を除き数ppm以下で、温帯下の土壌に比べて一般に低い。土壌によっては花弁(バラ、キク)に亜鉛欠乏症状が認められる。5.粒径組成:母岩によって異なるが、概して堆積物と砂岩由来の土壌は砂質(砂〉70%)、塩基性岩と崩積物由来のものは粘地質(粘土〉50%)、花こう岩質岩由来のものはこれらの中間にある。粒径組成を層位(深さ)別に見ると、いずれの断面も、粘土含量は表層で低く、下層に向って増加する傾向を示す。これは表層の粘土の流去水による流失(表層侵食)及び浸透水による溶脱よると思われる。なお、シルトの含量は一般に非常に低く(〈10%)、温帯の類似の土壌の1/31/4である。このことは、強風化下の熱帯土壌では、シルトは微粒のため風化し易く、土壌中に長く留まれないことを示すものと思われる。6.鉱物組成:(1)砂:玄武岩質母岩のものを除いた全ての土壌でほとんど石英が占め(〉95%)、これ以外はそれぞれ微量の難風化紘物(磁鉄紘、鋭錐石、電気石、くさび石、チタン鉄紘、赤鉄紘等)である。これは明らかに強風化のためである。玄武岩質母岩のものにかなり石英が認められるが、これは母岩の噴出時またはその後の風化過程で、石英を侵入したためと解釈される。(2)粘土:全土壌で、粘土紘物組成はカオリナイトが優勢(>60%)で特長付けられる。ただし、年間降雨量が多い場合は(≧3000mm)多少のハロイサイトが生成しており、また、年間を通じて土壌が湿状態にある断面では表層はカオリナイト、下層はハロイサイトが優勢という分布がみられ、このハロイサイトは常にがなり(≦20%)のギプサイトを伴っている。このことから、熱帯においても湿潤条件ではハロイサイト(とギプサイト)が生成し、ハロイサイトは乾燥によってカオリナイトへ変るとい1つの変化系列が示唆される。また、花こう岩質母岩の土壌には多少(≦5%)のギプサイトが生成しているが、この紘物の生成と母岩の関係はよく分らない。カオリナイト(とハロイサイト及びギプサイト)以外の粘土成分で全土壌を通じて最も多いのは遊離鉄酸化物であり(≦15%)、その主体はヘマタイトと少量のゲ-タイトである。粘土含量の低い土壌ではこれらは重要な粘土成分と言える。このほかに頻繁に認められる紘物はバ-ミキュライトとスメクタイトである。とくに古い沖積層由来の土壌では、後者はカオリナイトと不規則混合層をなしており、このことは、このような土壌のカオリナイトは堆積母材中のスメクタイトの風化によって生成したものであることを示している。(3)河床沈泥:雨期に新しい岩石風化面から流出した河床沈泥には、カオリナイトのほかにかなりの2:1型紘物を含んでおり、これがタイ低地土壌中の2:1型の給源をなすと考えられる。
高層因子分析法によるわが国における貨物流動パターンの抽出

Smith(1970)によれば、貨物流動のOD行列に多変量解析を適用する目的は、輸送パターンの構造を解明することにある。しかし、Davies(1984)が指摘するように、OD行列特有の正規性や線形性からの逸脱が因子分析などの適用を困難にする。今日の輸送費や輸送距離の概念の変化は公錯輸送を増加させ、宅配便やJust in Time方式の発展による短距離配送・新たな工業立地や生鮮食糧品のための長距離輸送・輸出入貨物の国内中継などの、一層の輸送の複雑化を招いている。そこで、因子分析を適用しても、因子が抽出できなかったり、因子の解釈が困難になることが多い。そこで、当初の方針を変更し、一度データを変えて、研究方法を模索することとした。具体的には1990年の日本道路公団のOD行列に多次元尺度構成法(ALSCAL)とクラスター分析の適用を試みた。その結果、各輸送品目について、三大都市圏と、南東北・関東内陸などの新しく工業化が進行している地域と、北海道・山陰・四国など高速道路のネットワーク上で疎であり孤立的な地域といったパターンが認められた。この分析のためには、従来から用いてきたSPSS-XからSASに転換する必要があった。新潟大学にはSASが設置されていないので、東大のセンターを利用した。そのため、東大のJCLについて一から習得しなければならなかった。今後の課題としては、OD行列に正準相関分析を適用して、地域間の輸送品目や輸送手段との関係を分析してみたい。また運輸省地域貨物流動調査の磁気テープからは、大量にクロス集計の結果を求めた。これらのデータも地図上での分布の確認が可能である。以上の成果について、できる限り早くレフエリー制を有する全国学会誌に投稿する予定である。しかし、研究者自身として、OD行列に多変量解析を応用することは、もともとのデータの質に大きな影響を受けるから、対症療法的な次善の策といった感触を否めなかった。そのため、海外のレギュラシオン理論とそのJust in Timeに関する経済地理学文献を渉猟・展望し、産業構造の転換を視野に入れて貨物流動の構造の理解に努めている。
地盤材料の変形の局所化挙動における圧縮帯とせん断帯の解明と圧縮・破壊挙動の予測

地盤材料の変形の局所化問題、すなわちせん断帯やすべり面の発生問題などは,破壊の前兆現象として工学的に重要であり、過去30年以上にわたり多くの研究がなされてきた.一方、圧縮変形の局所化すなわち圧縮帯の形成は海底プラットフォームの大沈下などの現象から近年注目され,90年代から多孔質の砂岩や土で実験的な報告がなされてきている。圧縮帯の形成は,透水係数の減少や地盤の大沈下問題に関連し工学的に重要である.本研究では,ジオマテリアルの変形の局所化のメカニズムを明らかにするため,粘土や軟岩について解析的及び実験的研究を行ってきた。実験的研究は特に軟岩を中心に行い,地盤材料の圧縮帯を中心とした変形の局所化の解明を行った.粘土については、構造の劣化しやすい鋭敏な粘土では圧縮の局所化が発生することを数値解析によって明らかにした。実験的研究については、珪藻泥岩や戸室石など圧縮性に富む軟岩において,圧縮帯の形成を明らかにするとともに,その解析法についての提案を行った.本研究では,三軸圧縮条件下における多孔質軟岩の圧縮帯生成とその生成条件の解明を目的とし,多孔質凝灰岩の戸室石と多孔質堆積泥岩の珪藻泥岩を用いて種々の応力径路の排水三軸圧縮試験を行った.三軸試験中に角柱供試体の隣り合う2側面を定点撮影し,PIVにより画像処理および画像解析を行うことで,供試体側面のひずみの局所化挙動を定性,定量的に調べた.また,試験後の供試体を含水状態が変化しないように保存し,産業用X線CTスキャナ装置を用いて供試体内部の密度変化を調べるとともにSEM(走査電子顕微鏡)を用いて供試体の変形局所帯部における微細構造の変化を詳細に観察した.高圧三軸試験装置は高圧用スチール製セルを用いているため,セル外からの供試体撮影が不可能であり,画像処理節に示すように至近距離からの観察しか出来ない.円柱供試体の場合に多く用いられるstereopbotogrammetryはある程度の距離確保が必要であるため,本研究では至近距離からの観察が可能である平面(角柱)の方が有利であると考え,角柱供試体を採用した.数値解析では、弾粘塑性モデルを開発し有限変形に基づくFEM数値シミュレーション法を確立し、解析を行った。(1)豊浦砂,珊瑚混じり砂および人工軟岩の角柱三軸圧縮試験三軸圧縮試験中の角柱供試体を三軸セルの外部からデジタル撮影し,それをPTV画像解析することにより供試体表面の局所ひずみを高精度で計測できる手法を開発した。それを用いて,豊浦砂,珊瑚混じり砂および人工軟岩の角柱三軸圧縮試験を行った結果,比較的ゆる詰めの構造を持つ供試体では明確なせん断帯は観察されず,軸圧縮が卓越するせん断ひずみおよび体積ひずみの分布が観察された。(2)高圧三軸試験用セルの製作および軟岩を用いた角柱三軸圧縮試験鋼製三軸セルに設けた耐圧ガラスの観測窓からCCDカメラで供試体表面の局所ひずみの計測を行うことを可能とした高圧三軸試験装置を製作した。

これを用いて,堆積凝灰岩の戸室石の角柱供試体に対して低高拘束圧レベルでの排水三軸試験およびストレス・プルーブ試験を行い,戸室石の降伏局面の特定をするとともに,供試体表面の局所ひずみの計測を行った。また,実験後の供試体を用いて,X線CTスキャン装置を用いて供試体内部の密度分布の観察も行った。その結果,低拘束圧下の試験では,供試体表面では明確なせん断帯が観察されるのに対し,供試体の内部では水平方向の高密度領域が観察された。一方,高拘束圧下での実験では,供試体表面ではせん断ひずみ,体積ひずみともに,軸圧縮方向に卓越する局所ひずみの分布が観察されるとともに,供試体内部でも不均質な密度分布が存在することが確認できた。(3)構造の劣化を考慮した砂の構成式の高度化と三次元ひずみの局所化解析砂の弾塑性構成式に構造の劣化の効果を取り入れて拡張し,その構成式を三次元有限変形FEM解析に組み込み,角柱砂供試体の三軸圧縮試験のシミュレーションを行った。供試体表面ではX型のせん断帯が発生するのに対し,供試体内部では体積ひずみが増加する高密度領域が発生することを解析的に示した。本研究の目的はこれまでほとんど注目されていない砂,粘土および軟岩等の地盤材料における圧縮変形の局所化形成である圧縮帯を解明するとともに,せん断変形の局所化としてのせん断帯の形成との相互作用の研究を行い地盤材料の変形の局所化問題を総合的に解決することであった.実地盤での圧縮帯の発生は想定外の地盤沈下の原因と成りうる上,周囲と比べて間隙が小さくなるため透水性が低下し,流体の流れを妨げる障害となり得る.供試体レベルでの圧縮帯の発生を観察するため,高拘束圧下における多孔性砂岩の排水三軸圧縮試験を行った.特に珪藻泥岩を用いて種々の応力経路の排水試験を行い,せん断中に排水量が急増する応力状態を調べることにより,珪藻泥岩の初期降伏曲面の形状を得ることに成功した.曲面の内部では比較的ひずみの発生が小さく,得られた初期降伏曲面はcap型の降伏曲面に相当するといえる.本研究で用いた珪藻泥岩はせん断過程における応力経路の違いによって分岐挙動の違いが見られた.すなわち,応力経路が初期降伏曲面のcapの部分と交差する場合は,せん断変形よりも圧縮変形が卓越し,圧縮帯が発生した.また,特定の応力状態でせん断帯と圧縮帯が同時に発生する遷移領域が認められた.X線CTによる画像解析結果より,一次元的な圧縮変形を示した高拘束圧のケースにおいて供試体上下端部で特に強い圧縮傾向が確認された.また,解析的研究では破壊応力線近傍のみならず,圧縮変形が卓越する場合にもひずみ軟化を示す構成モデルを取り入れた有限要素解析を行うことにより,一次元圧縮変形において排水面近くにひずみが集中する圧縮帯を再現することができた.以上,本研究では実験および解析的考察により,応力経路によって,ひずみの局所化挙動の傾向が異なることを示し,分岐挙動のメカニズムについて解明した.今後の展開として供試体側面のひずみの観察手法の充実および精度の向上,さらに構成式の改良と境界条件を検証した数値シミュレーションが挙げられる.せん断帯やすべり面の発生問題など地盤材料の変形の局所化問題は,破壊の前兆現象として工学的に重要であるため過去30年以上にわたり多くの研究がなされてきた.近年,圧縮変形の局所化すなわち圧縮帯の形成が注目され,90年代から多孔質の砂岩や土で実験的な報告がなされできた.圧縮帯の形成は,透水係数の減少や地盤の大沈下問題に関連し工学的に重要である.本研究では,ジオマテリアルの変形の局所化のメカニズムを明らかにするため,軟岩を中心に実験を行い,圧縮帯を中心とした変形の局所化の解明を行った.その結果,珪藻泥岩や戸室石など圧縮性に富む軟岩において,圧縮帯の形成を明らかにするとともに,その解析法についての提案を行った.
アレルギー性炎症における好酸球の浸潤機構並びに好酸球の炎症反応に対する役割の解析

近年、アレルギー性炎症における組織障害には好酸球が大きく関与していることが示唆されてきた。本研究では、抗原刺激による好酸球浸潤に関与する好酸球走化性因子を解析し、さらに、組織傷害を引き起こすと考えられる好酸球顆粒蛋白質の精製及びその放出機序について基礎検討を行った。1.好酸球走化性因子の解析:ラット好塩基性白血病細胞RBL-2H3をIgEで感作した後、対応抗原で刺激すると、1時間をピークとして好酸球走化性因子が産生された。この因子は脂溶性で5ーリポキシゲナーゼ阻害剤によりその産生は抑制されたが、その活性は血小板活性化因子の拮抗剤では阻害されなかった。さらに抗原で刺激して30分後の培養液上清中にはロイコトリエンB_4(LTB_4)が検出され、しかも培養液上清中の好酸球走化活性は、測定された濃度のLTB_4による好酸球走化活性とほぼ一致した。これらの結果から、ラット肥満細胞が抗原刺激後1時間以内に産生する好酸球走化性因子の本体はLTB_4であることが示唆された。2.ラット好酸球の顆粒蛋白質の解析:抗原で感作・惹起することによりラットの腹腔内に好酸球を主体とする白血球浸潤を誘発するモデル(好酸球増多モデル)を開発した。腹腔内浸潤白血球から好酸球を分離し、さらに好酸球顆粒蛋白質を殺菌活性を指標として精製した。これまでに分子量16kD、18kD、及び20kDの顆粒蛋白質を精製し、このうち16kD及び20kDの顆粒蛋白質のN末端アミノ酸配列を決定した。現在さらに18kDのN末端アミノ酸配列の決定を行っている。3.好酸球の脱顆粒反応機序の解析:ラット好酸球の脱顆粒反応についてeosinophil peroxidaseの放出を指標として測定する実験系を確立した。カルシウムイオノフォアA23187は強い脱顆粒反応を誘発したが、血小板活性化因子にはその作用が認められなかった。
Acellular matrix graftを用いた膀胱再生の研究

1)VEGF溶液中で一晩incubationしたラットBAMGを、VEGF溶液の局所投与を行った50%膀胱部分切除ラットの宿主膀胱に移植した。術後4週ではVEGF投与群で膀胱容量の増加と残尿率の低下を認め、術後8週以降では膀胱容量、膀胱コンプライアンス、最大膀胱内圧および残尿率は両群とも同じレベルで推移した。VEGF投与群では術後早期から血管新生と平滑筋の再生が促進され、また術後早期にNGF陽性細胞が多く出現しPGP染色陽性の神経繊維も術後4週から認められ、より総括的な膀胱再生が促進された。2)下部胸椎レベルで脊髄を切断した脊髄損傷ラットを作成し、脊髄切断後8週で50%膀胱部分切除ラットの宿主側膀胱に同種BAMGを移植した。この場合でも、正常ラット膀胱と同様、BAMG移植後8週では尿路上皮、平滑筋、血管および神経の順調な再生が確認され、BAMG移植後の排尿効率の改善はBAMGでの機能的に正常な膀胱組織の再生を反映していた。下方、BAMGの相対面積は術後の排尿効率の改善と相関し、結石、尿路感染症、血尿を合併した場合にBAMGの相対面積が明らかに減少するため、これら合併症を予防することがfunctional bladderを再生する上でのkey factorと思われた。3)全身麻酔下に膀胱部分切除を行ったブタ膀胱に同種由来BAMGを移植した。術後8週では、宿主側BAMGに宿主膀胱と同程度の粘膜、粘膜下層及び筋層の発達を認め、BAMG中央部でも筋繊維の再生を確認した。次に膀胱全摘後にBAMGで膀胱を完全置換するためには、BAMGに尿管を移植することが必要で、切断した尿管をBAMGの左右の後側壁に5-0バイクリルで連続縫合した。内視鏡的には、術後2週で、膀胱側と尿管移植側のBAMGで上皮被覆が観察され始めた。尿管移植群では、術後4週でBAMG側のより広範囲な上皮被覆が観察された。術後4週の生検では、宿主膀胱側と尿管移植側のBAMGに尿路上皮の被覆と、新生血管と筋繊維が認められた。BAMGに尿管を移植するとその部に平滑筋組織の再生が誘導が観察され、BAMGによる完全膀胱置換の可能性が示唆された。【目的】ラットでは正常膀胱にcollagenを基本骨格とするbladder acellular matrixgraft(BAMG)をscaffoldとして移植すると、この部に形態的にも機能的にも正常に近い膀胱組織が再生することが報告されている。今回、宿主ブタ膀胱に同種由来BAMGを移植する際、尿管同時移植が膀胱再生に促進的に作用する可能性を検討した。【材料と方法】正常ブタより採取した膀胱組織は、DNaseおよびsodium deoxycholateで処理し、BAMGを作成した。全身麻酔下にブタ12匹に膀胱部分切除を行い、同種由来BAMGを宿主膀胱に4-0vicrylの2層連続縫合で移植した。尿管移植群6匹は両側尿管を遠位端で結紮し、切断した尿管はBAMGの左右後側壁に5-0 vicrylの連続縫合で吻合した。宿主膀胱にBAMGのみを移植した6匹は対照群とした。

両群とも術後1週、2週および4週に膀胱の再生状態を内視鏡的に評価した。【結果】内視鏡的な変化として、術後1週では両群とも宿主側膀胱粘膜に強い炎症性変化を認めたが、BAMG側では明らかな変化はなかった。術後2週では両群とも宿主側粘膜の炎症性変化の改善が観察され、吻合部付近ではBAMG側に上皮の被覆が観察され始めた。尿管移植群では、同様に尿管吻合部付近のBAMGにも上皮の被覆が観察され、術後4週では両群ともBAMG側への上皮被覆が進行していたが、尿管移植群ではより広範囲な上皮被覆が観察された。【結語】BAMGを膀胱に移植する際、同時に尿管を移植することで膀胱再生が促進されることが内視鏡的に示され、完全膀胱置換への可能性を示唆するものと考えられた。1)VEGF溶液で一晩incubationしたラットBAMGを、VEGF溶液の局所投与を行った50%膀胱部分切除ラットの宿主膀胱に移植した。術後4週ではVEGF投与群で膀胱容量の増加と残尿率の低下を認め、術後8週以降では膀胱容量、膀胱コンプライアンス、最大膀胱内圧および残尿率は両群とも同じレベルで推移した。VEGF投与群では術後早期から血管新生と平滑筋の再生が促進され、また術後早期にNGF陽性細胞が多く出現しPGP染色陽性の神経繊維も術後4週から認められ、より総括的な膀胱再生が促進された。2)下部胸椎レベルで脊髄を切断した脊髄損傷ラットを作成し、脊髄切断後8週で50%膀胱部分切除ラットの宿主側膀胱に同種BAMGを移植した。この場合でも、正常ラット膀胱と同様、BAMG移植後8週では尿路上皮、平滑筋、血管および神経の順調な再生が確認され、BAMG移植後の排尿効率の改善はBAMGでの機能的に正常な膀胱組織の再生を反映していた。一方、BAMGの相対面積は術後の排尿効率の改善と相関し、結石、尿路感染症、血尿を合併した場合にBAMGの相対面積が明らかに減少するため、これら合併症を予防することがfunctional bladderを再生する上でのkey factorと思われた。3)全身麻酔下に膀胱部分切除を行ったブタ膀胱に同種由来BAMGを移植した。術後8週では、宿主側BAMGに宿主膀胱と同程度の粘膜、粘膜下層及び筋層の発達を認め、BAMG中央部でも筋繊維の再生を確認した。次に膀胱全摘後にBAMGで膀胱を完全置換するためには、BAMGに尿管を移植することが必要で、切断した尿管をBAMGの左右の後側壁に5-0バイクリルで連続縫合した。内視鏡的には、術後2週で、膀胱側と尿管移植側のBAMGで上皮被覆が観察され始めた。尿管移植群では、術後4週でBAMG側のより広範囲な上皮被覆が観察された。術後4週の生検では、宿主膀胱側と尿管移植側のBAMGに尿路上皮の被覆と、新生血管と筋繊維が認められた。BAMGに尿管を移植するとその部に平滑筋組織の再生が誘導が観察され、BAMGによる完全膀胱置換の可能性が示唆された。
平坦型尿路上皮腫瘍の鑑別に有用なマイクロRNAおよび関連分子の発現機序の解明

尿路上皮癌は尿路に異時性、同時性に多発する上皮性腫瘍である。尿路上皮癌には特異的な分子マーカーは知られておらず、尿中の癌細胞を形態診断する事が診断手段となるが、その診断に難渋しているのが現状である。申請者は尿路上皮に恒常的に発現する分子の一つ、NACC1が尿路上皮癌細胞の増殖や浸潤の抑制に寄与することを見出した。本研究では尿路上皮癌を分子生物学的に鑑別可能なマーカーを見出すことを最終目標とし、非腫瘍性尿路上皮、前癌病変である異形成及び上皮内癌におけるNACC1の発現や遺伝子多型の検索、関連するmicroRNAの検索などをそれぞれ特定することにより、分子生物学的な腫瘍診断手法を解明する。
エストロゲンによって免疫系細胞に発現誘導される新規遺伝子の検討-全身性エリテマトーデスはなぜ女性に多発するか?-

女性において免疫応答がより強いことや自己免疫疾患の発病頻度が高い事実を踏まえて、代表的女性ホルモンであるエストロゲンが免疫応答に及ぼす影響を、発現誘導される遺伝子を介して理解することを試みた。免疫系細胞株にエストロゲンによって発現誘導されるGORヒトホモログ遺伝子を単離し、その生理的意義、自己抗原性、免疫応答への関与について検討を行った。その結果GORヒトホモログは細胞内では顆粒を形成して核周囲または核内に局在し、安定して発現させることが可能であった。サザン解析によって相同遺伝子は高等哺乳動物には存在することが示唆されたが、鳥類との間では相同性が低いことが予想された。エストロゲン刺激により48時間後をピークに発現が誘導され、5日後には発現が低下していた。組み替えGOR蛋白を抗原に用いた抗体の保有については、従来HCVと交差反応性があるとされていた領域は1塩基置換によってヒトでは翻訳されず、また翻訳領域に対する自己抗体は保有する患者が存在するものの疾患との関連性は見出されず、いわゆる自己抗原としての病原性はほぼ存在しないと結論した。いっぽう組み替えGOR蛋白を強制発現させた細胞株は、炎症性サイトカインの刺激によりケモカインMCP-1の産生誘導が抑制されることが観察され、全体としてエストロゲンやその下流の制御分子は免疫応答を抑制する傾向を有していることが推察された。したがってエストロゲンと免疫応答の強弱や自己免疫疾患との関連においては、その濃度変化や他のステロイドホルモンの関与などを含めて多角的に考えることが必要と予想され、今後多数の遺伝子を同時に観察するマイクロアレイシステムなどを導入した検討などの必要性を認識した。我々が既に単離したGORヒトホモログの遺伝子断片をもとにその全翻訳領域のアミノ酸配列を決定し、過去に報告されているチンパンジーの配列とを詳細に比較したところ、その相同性が非常に高いにもかかわらずC末端側約200残基が翻訳されない短い蛋白を生成することがわかった。それに伴い、従来C型肝炎ウィルスに対する抗体検索系に用いられ、抗原交差性が存在すると予測されていた配列はヒトにおいては翻訳されず、自己の蛋白としてでなく偶然交差反応性を有するペプチドであった可能性が高いと考えられた。同遺伝子断片をプローブに用いたゲノムサザン解析では、少数のバンドから成るパターンを認めヒトにおいてGORホモログが単一遺伝子であることが示され、他種哺乳動物のゲノムDNAに対しても明瞭な交差反応が見られたことから、高等動物においてはGOR遺伝子が種を超えて保存されていることが予想された。ただし鳥類では同反応が認められず、相同性が低い可能性が示唆された。また本配列についてデータベース検索を反復して行ったところ、ヒト8番染色体上の遺伝子として最近新たに登録されていることも明らかになった。全身諸組織や細胞株での発現をRT-PCR法にて検索したところ、一般的には通常の状態でのmRNAの発現は検索を行った臓器や細胞株においてはほとんどなく、単球系細胞株であるU937細胞においていったんstarveした後にエストロゲンを添加すると約48時間で発現がピークに至り、その後減弱していくことが判明した。GOR遺伝子産物の蛋白としての意義に関しては、自己発光蛋白であるGFPとの融合蛋白を哺乳動物細胞株に発現させたところ、粗大な顆粒形成を伴って核周囲に集合し、一部は核内へ移行していくのが観察され、この遺伝子産物が多量体を形成する核蛋白である可能性が示唆された。
消化器癌におけるエピゲノム関連酵素ＴＥＴファミリーおよび5-hmCの解析

癌細胞におけるDNAの脱メチル化機構に関わると考えられているTET酵素群及び5-hmCの消化器癌における発現の意義を検討した。まず食道癌組織において免疫染色法及びELISA法にて癌部で5-hmCの発現が有意に低下していた。また、食道癌ではTET2が癌部で有意に低値であり、5ーhmCの発現量とも有意に相関していた。更に5-hmC発現がLINE-1メチル化レベルとも相関していることが判明した。そこで5-hmC発現低下と食道癌患者の予後との関係を調べたところ、予後不良な傾向はあるものの有意な関係は見出せなかった。以上より5-hmCとTET2の発現低下は食道癌の癌化に影響を及ぼす可能性が考えられた。また、5-hmCの定量化のため、免疫染色による評価もおこなった。食道扁平上皮癌切除症例10例のパラフィン切片を用いて5-hmC抗体(Active Motif, Carlsbad, CA, USA)で染色を行ったところ、いずれの症例も周辺正常上皮と比較して癌部の5-hmCは減少していることがわかった。食道癌は非常に予後の悪い疾患であるが、今回の結果は食道癌における新たなバイオマーカーとして有用な可能性があり、非常に臨床的意義があると考えられる。食道癌細胞におけるDNAの脱メチル化機構に関わると考えられているTET酵素および5-hmCの消化器癌における発現の意義を検討することが当研究の目的である。前年度はDNAの抽出および5-hmCの定量を行ったが、当年度においてはまず食道扁平上皮癌切除症例のうち、当施設の凍結切片77例と共同研究施設である九州がんセンターの凍結切片29例からRNAを抽出した。そしてTET酵素群の発現をqRT-PCRを用いて定量し癌部と非癌部で比較したところ、TET1の癌部はmedian: 0.019; mean: 0.022; SD: 0.02、非癌部はmedian: 0.015; mean: 0.018; SD: 0.01で、両者を比較するとP = 0.23とほぼ同等であった。TET2の癌部はmedian: 0.045; mean: 0.053; SD: 0.03、非癌部はmedian: 0.087; mean: 0.090; SD: 0.03で、比較するとP < 0.0001と癌部が有意に低値であった。また、5-hmCとTET酵素群の発現量の相関関係について解析した結果、TET1とTET3はそれぞれP = 0.306、P = 0.927で有意な相関関係は認めなかった。一方、TET2はP = 0.003で有意な相関関係を認めた。よって5-hmCとTET2の減少は食道癌の癌化において重要な役割を担っていると考えられ、これらの結果はOncotargetという癌研究分野の一流誌に既に掲載された。計画書に記した予定通りに研究は遂行され、意義深い結果が得られている。これらの結果は、Oncotargetという癌研究分野の一流誌に既に採択されている。癌細胞におけるDNAの脱メチル化機構にかかわると考えられているTET酵素および5ーhmCの消化器癌における発現の意義を検討することが当研究の目的である。前年度までの研究で、食道癌の凍結切片より抽出したDNAおよびRNAを用いてTET酵素の発現を解析したところ、TET2が癌部で有意に低値であり、5ーhmCとの発現量とも有意に相関することが判明した。以上の結果はOncotargetという癌研究分野の一流誌に既に掲載された。そこで当年度はまず、食道癌および胃癌の細胞株を培養して抽出したRNA中のTET酵素の発現量を解析したところ、多数の細胞株を培養して解析を行ったがいずれからも有意な発現量を確認することができなかった。したがって抗がん剤の感受性とTET酵素の発現の相関関係について細胞株を用いて確認する行程まで至らなかった。一方、食道癌患者の予後とTET2および5ーhmCの発現が相関するかについて95例の検体を用いて検討したところ、5-hmCの発現量と予後に有意な相関関係は見いだせなかった(P=0.08)。またTET2の発現量と予後にも有意な相関関係は見いだせなかった(P=0.38)。しかしながら、5-hmCの発現量と食道癌患者の病理学的背景因子の相関関係について網羅的に解析した結果、組織学的悪性度と有意に相関していることが分かった(P=0.017)。以上より、食道癌において5-hmCの発現は食道癌においてその癌化の進む過程に影響を及ぼす可能性が考えられた。今後は、胃癌および大腸癌患者の検体を用いて5-hmCやTET酵素の発現についてデータを解析し、病理学的背景因子や予後との関連について検討していく方針である。

そこで5-hmC発現低下と食道癌患者の予後との関係を調べたところ、予後不良な傾向はあるものの有意な関係は見出せなかった。以上より5-hmCとTET2の発現低下は食道癌の癌化に影響を及ぼす可能性が考えられた。計画書に記した予定通りに研究は遂行され、意義深い結果が得られている。さらに今後も予定通り研究を推進することで、癌細胞における脱メチル化と生物学的悪性度との関係が明らかとなる可能性がある。このことは、食道癌における新たなバイオマーカーの発見を意味している。今後は、食道癌5-hmCレベルおよびTET酵素群が抗癌剤感受性の関連について研究を進めていく予定である。また、食道癌細胞株を用いたin vitroの研究も開始する予定であり、準備を行っている。食道癌細胞株の5-hmC、TET酵素群の値を測定し、in vitroでの癌細胞浸潤能、増殖能、細胞サイクル、Docetaxel感受性などとの関係を評価する。エピジェネティクス、消化器癌DNAを抽出した症例と同一症例の凍結切片からISOGEN II(ニッポンジーン)を用いてtotal RNAを抽出する。その後、RT-PCR法でcDNAを作成し、Real-time PCR法でmRNAレベルのTET酵素(TET1,TET2,TET3)の発現を定量的に測定する。5-hmCとTET酵素の発現レベルの相関関係を検証する。また、凍結切片から抽出したDNAをバイサルファイト処理したのち、Pyrosequencingを行う。Pyrosequencing technologyは、遺伝子変異解析やメチル化解析において非常にすぐれたtoolである。この方法を用いて解析された食道癌LINE-1メチル化レベルは、食道癌の予後予測因子となりうることが報告されているため、LINE-1メチル化レベルと5-hmCやTET酵素の発現と相関関係を検証することで、癌細胞におけるメチル化と脱メチル化のバランスが予後といかに関係しているかを検証する予定である。医局内保管の消耗品を使用することが出来たため。試薬消耗品に関し、医局内保管のものをしようできたため。また、食道癌細胞株を用いたin vitroの研究も開始する予定であり、今年度以上の実験消耗品を要する予定である。次年度はそれらの購入費に研究費を充てたいと考える。また、データ管理、資料作成を補佐する事務補佐員の人件費としても使用したいと考える。DNA抽出およびReal Time PCR等に係る試薬消耗品費購入に充てる。また、外部にいる研究分担者との連絡をスムーズに行うため、データ管理棟にかかる事務補助員の人件費にしようしたいと考える。