hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ジーンターゲティング法で作製した変異マウスによる遺伝病の発症機構の解析

血清アミロイドp成分(SAP)は、全てのアミロイドに共通の微量成分として存在し、アミロイド沈着を促進することを示唆する種々の知見が報告されているが、確証はない。先に我々は、家族性アミロイドポリニューロパチー(FAP)のトランスジェニックマウスモデルを用いて、SAPがアミロイド沈着に関与するとしても、その血中濃度は正常値で充分であることを示唆する実験結果を得た。そこで、本研究では、ジーンターゲティング法でSAPを完全に欠損した無SAPマウス株を作製し、これを用いて、SAPがFAPにおけるアミロイド沈着にどう関与するかを明らかにすることを目的に遂行し、以下の結果を得た。1.マウス胚幹(ES)細胞株CCEの由来した129/Sv/Evマウスの遺伝子ライブラリーより単離したsap遺伝子領域を用いて、以下のような置換ベクターを構築した。置換ベクター:5′-flanking region(約1.6kb)及び3′-flankingregion(約8.7kb)を含む全sap遺伝子の第2エクソンに、ES細胞で発現するGK(phospho-glyserate kinase)プロモーターに接続したG418耐性遺伝子挿入し、さらに、ES細胞で発現するMCIプロモーターに接続した単純ヘルペスウイルスのtk遺伝子を3′端に結合したもの。2.この置換ベクターをCCE細胞株に導入し、ベクターを取り込んで、G418とFIAUとに耐性となった250コのクローンの中から相同組換えでsap遺伝子に挿入変異が導入された6コの細胞株をサザーンブロット法及びPCR法で選択した。3.これらsap遺伝子に挿入変異をもつES細胞の中から4コを選んでC57BL/6マウスの胚盤胞に注入し、キメラマウスを得た。4.これらキメラマウスの雄とC57BL/6マウスの雌とを交配させ、2匹の雄キメラマウスが生殖細胞のsap遺伝子に挿入変異を持つことを確認した。5.現在、一対のsap遺伝子の一方に変異を持つマウス株同志の交配により、変異sap遺伝子のみをもつ無SAPマウス株の確立を目指している。1.家族性アミロイドポリニューロパチーの病因であるヒト変異トランスサイレチン(ttr)遺伝子を運ぶFAPのトランスジェニックマウスモデルと胚幹(ES)細胞でのジーンターゲティング法を用いて作製した無TTRマウスとの交配により、マウス正常TTRを完全に欠損し、ヒト異型TTRのみを産生するマウス株を確立した。これらマウスの雌雄それぞれ3匹につき、月齢を追って、アミロイドの沈着を調べた。対照として、正常TTRをもち、ヒト異型TTRも産生するマウスを同様に調べた。ヒト異型TTRのみを産生するマウスでは、月齢11カ月頃から6匹中、4匹に食道、大腿骨を中心にアミロイドが沈着し始めていた。一方、正常TTRとヒト異型TTRとを産生する同月齢の対照マウスでは、6匹中、1匹で食道にのみ、アミロイドが沈着していた。月齢14カ月では、ヒト異型TTRのみを産生するマウス4匹、対照マウス2匹にアミロイドの沈着を認め、いずれのマウスでも月齢11カ月に比し、沈着臓器の拡大と沈着程度の増大傾向が認められた。TTRは、同一のモノマーからなるテトラマーとして血中に存在する。ヒト異型TTRのみを産生するマウスでは、ヒト異型TTRからなるホモテトラマーのみが存在し、対照マウスでは、マウス正常TTRとヒト異型TTRとからなるヘテロテトラマーが形成される。今後さらに月齢を追って比較解析を続ける必要があるが、上記の結果は、異型TTRのみからなるホモテトラマーが主にアミロイドを形成して沈着することを示唆すると考えられる。2.ES細胞の由来した129/Sv//Evマウスの遺伝子ライブラリーより単離した血清アミロイドP成分(sap)遺伝子領域を用いて、sap遺伝子への挿入変異導入用のベクターを作製し、ES細胞に導入した。こうして得たG418及びFIAUに耐性の約120個の細胞の各々からDNAを抽出し、DNAポリメラーゼ増幅法で調べたが、未だsap遺伝子への挿入変異の導入には成功していない。1.ジーンターゲティング法で作出した無トランスサイレチン(TTR)マウスとヒト変異ttr遺伝子を運ぶ家族性アミロイドポリニューロパチー(FAP)のトランスジェニックマウスモデルとを交配させて作出したヒト異型TTRのみを生産するマウス株をでは、月齢11ヶ月頃から消化管を中心にアミロイドが沈着し始め、月齢を増すにつれ、沈着臓器の拡大傾向が見出された。なお、これらマウスと正常TTRとヒト異型TTRとを産生する同月齢の対照マウスとには、アミロイドの沈着程度や沈着臓器に差異を認めなかった。また、これらマウスには月齢20ヶ月でも抹消神経にアミロイドが沈着せず、神経障害を認めていない。2.遺伝子型、表現型ともにFAPにより近似した優れた疾患モデルマウスの作出を目的に、ジーンターゲティング法を用いて、マウスttr遺伝子の一方のアレルにヒトFAPの原因となる1塩基置換のみを導入する方法の確立を目指した。点変異導入用のベクターを取り込み、標的組換えで点変異が導入された2個のクローンの一つを3.7×10^4cells/6cm-dishとなるようにプレートし、FIAUで選択した。16個のFIAU耐性株を調べ、選択マーカー両端の繰り返し

配列間の組換えでマーカーを欠失し、目的の点変異のみが導入された2個のクローンを見出した。そして、この変異ES細胞クローンをC57BL/6のブラストシストに注入し、キメラマウスを得ている。以上の結果から、本法は簡便で効率の良い新しい点変異導入法として一般に応用可能と考えられる。血清アミロイドp成分(SAP)は、全てのアミロイドに共通の微量成分として存在し、アミロイド沈着を促進することを示唆する種々の知見が報告されているが、確証はない。先に我々は、家族性アミロイドポリニューロパチー(FAP)のトランスジェニックマウスモデルを用いて、SAPがアミロイド沈着に関与するとしても、その血中濃度は正常値で充分であることを示唆する実験結果を得た。そこで、本研究では、ジーンターゲティング法でSAPを完全に欠損した無SAPマウス株を作製し、これを用いて、SAPがFAPにおけるアミロイド沈着にどう関与するかを明らかにすることを目的に遂行し、以下の結果を得た。1.マウス胚幹(ES)細胞株CCEの由来した129/Sv/Evマウスの遺伝子ライブラリーより単離したsap遺伝子領域を用いて、以下のような置換ベクターを構築した。置換ベクター:5′-flanking region(約1.6kb)及び3′-flankingregion(約8.7kb)を含む全sap遺伝子の第2エクソンに、ES細胞で発現するGK(phospho-glyserate kinase)プロモーターに接続したG418耐性遺伝子挿入し、さらに、ES細胞で発現するMCIプロモーターに接続した単純ヘルペスウイルスのtk遺伝子を3′端に結合したもの。2.この置換ベクターをCCE細胞株に導入し、ベクターを取り込んで、G418とFIAUとに耐性となった250コのクローンの中から相同組換えでsap遺伝子に挿入変異が導入された6コの細胞株をサザーンブロット法及びPCR法で選択した。3.これらsap遺伝子に挿入変異をもつES細胞の中から4コを選んでC57BL/6マウスの胚盤胞に注入し、キメラマウスを得た。4.これらキメラマウスの雄とC57BL/6マウスの雌とを交配させ、2匹の雄キメラマウスが生殖細胞のsap遺伝子に挿入変異を持つことを確認した。5.現在、一対のsap遺伝子の一方に変異を持つマウス株同志の交配により、変異sap遺伝子のみをもつ無SAPマウス株の確立を目指している。
三次元多様体の表示とそこから導かれる幾何的情報について

2.結び目の外部空間を用いたHeegaard分解のstrongirreducibilityの局所定判定法3.森元予想に関する研究小林は三次元多様体内の結び目の連結和とそのトンネル数に関する森元予想をm-smallな結び目に関して考察した.4.Heegaard分解の接着写像のDehn twistへの分解アルゴリズム落合は,与えられたHeegaard分解を実現する,閉曲面上の向きを保つ自己同相写像を,標準的なDeh twistの積に分解するためのアルゴリズムを種数2のHeegaard分解に対して与えた.5.Riemann多様体の計量のmoduliアインシュタイン計量(3次元多様体上では定曲率計量)は全スカラー曲率汎関数の臨界点として特徴付けられる.片桐は,スカラー曲率よりも情報を多く含むリッチ曲率を用いたリーマン汎関数について考察した.アインシュタイン計量はこの汎関数の臨界点となるがそれ以外にも存在することを示した.また臨界点がアインシュタイン計量となる十分条件を与えた.2.結び目の外部空間を用いたHeegaard分解のstrongirreducibilityの局所定判定法3.森元予想に関する研究小林は三次元多様体内の結び目の連結和とそのトンネル数に関する森元予想をm-smallな結び目に関して考察した.4.Heegaard分解の接着写像のDehn twistへの分解アルゴリズム落合は,与えられたHeegaard分解を実現する,閉曲面上の向きを保つ自己同相写像を,標準的なDeh twistの積に分解するためのアルゴリズムを種数2のHeegaard分解に対して与えた.5.Riemann多様体の計量のmoduliアインシュタイン計量(3次元多様体上では定曲率計量)は全スカラー曲率汎関数の臨界点として特徴付けられる.片桐は,スカラー曲率よりも情報を多く含むリッチ曲率を用いたリーマン汎関数について考察した.アインシュタイン計量はこの汎関数の臨界点となるがそれ以外にも存在することを示した.また臨界点がアインシュタイン計量となる十分条件を与えた.本年度研究代表者の小林は佐伯修氏との共同研究で得た,Rubinstein-Scharlemann graphicのorbifold versionの理論を更に発展させる事により,以下のような結果を得た.以下ではγを三次元多様体Mにproperに埋め込まれた1次元多様体とする.1.対(M,γ)のorbifold Heegaard splittingに対してHaken型の定理を証明した.即ちMがγ-既約であるなら,(M,γ)の任意のHeegaard splittingはweakly reducibleであることを示した.尚この結論においてweakly reducibleをreducibleに置き換えることができないことを具体的に例を与えることによって示した.3.上記の結果と,以前に行った2橋結び目のトンネルの分類の手法と結びつけることにより,2橋結び目の外部空間のHeegaard分解の完全な分類に成功した.なおこの結果に関してはプレプリント"Heegaard splittings of exteriors of two bridge knots"としてまとめられており,http://front.math.ucdavis.edu/よりmath.GT/0101148として入手可能である.また研究協力者の落合は種数2のHeegaard分解を調べる為に,種数2の閉曲面の自己同相写像が与えられたときにそれを標準的なDehn twistの積に分解するアルゴリズムを与えた.本年度は以下の三つの話題について主に研究をした.Rieckは研究代表者の小林と共同で「既約な三次元多様体と内のstrongly irreducibleなHeegaard surfaceとトーラスとの交わり」について研究したこれに関してはそのようなトーラスがsolid torusの境界になっているような場合についてはMoriah-Rubinstein, Scharlemannによって詳細な分析が既になされているが、我々はトーラスが非自明な結び目の外部空間になっている場合についてもその交わりについて詳細情報を得ることに成功した.尚この共同研究は現在も進行中である。2.Heegaard分解のuntelescopingについて三次元多様体のHeegaard分解に対しては2種類のuntelescoping(Casson-Gordon untelescoping, Scharlemann-Thompson untelescoping)が存在するが,これらが実際に異なるものであるかどうかについては,知られていなかった.今年度の研究でこれらが異なる概念であることを示す例を具体的に構成することができた。3.Stronglyirreducibleな最小種数Heegaard分野とWeakly reducibleな最小種数Heegaard分解を許容する三次元多様体の例Moriahによって「strongly irreducibleな最小種数Heegaard分解とWeakly reducibleな最小種数Heegaard分解を許容する三次元多様体は存在するか?」という問題が提出されたがそのような例が具体的に与えた。2.結び目の外部空間を用いたHeegaard分解のstrongirreducibilityの局所定判定法3.森元予想に関する研究小林は三次元多様体内の結び目の連結和とそのトンネル数に関する森元予想をm-smallな結び目に関して考察した.4.Heegaard分解の接着写像のDehn twistへの分解アルゴリズム落合は,与えられたHeegaard分解を実現する,閉曲面上の向きを保つ自己同相写像を,標準的なDehn twistの積に分解するためのアルゴリズムを種数2のHeegaard分解に対して与えた.5.Riemann多様体の計量のmoduliアインシュタイン計量(3次元多様体上では定曲率計量)は全スカラー曲率汎関数の臨界点として特徴付けられる.片桐は,スカラー曲率よりも情報を多く含むリッチ曲率を用いたリーマン汎関数について考察した.アインシュタイン計量はこの汎関数の臨界点となるがそれ以外にも存在することを示した.また臨界点がアインシュタイン計量となる十分条件を与えた.
組織特異的遺伝子発現のマスターレキュレーターPEBP2の解析

ショウジョウバエのrunt遺伝子の哺乳類ホモログは、Runx1、Runx2、Runx3の3種が存在する。このうちRunx3/Pebp2αCの機能は従来殆んど未解明であったので、Runx3のノックアウトマウスを作製しその表現型の解析を行った。1,Runx3の発現は、消化管上皮細胞で観察された。Runx3-/-マウスの胃上皮細胞層は、増殖能が亢進しアポトーシスが起こらないために、過形成をおこした。Runx3-/-マウスから単離した胃上皮細胞にTGF-βを作用させた実験から、この現象は、Runx3-/-の胃上皮細胞の、TGF-β感受性の喪失に起因するということが判明した。2,RUNX3はIgCαプロモーターを活性化し、IgMからIgAへクラススィッチを誘導する。従ってRunx3-/-マウスではクラススィッチが起こらない可能性が考えられたが、実際にはRunx3-/-マウスでもクラススィッチが観察された。他のRUNXファミリーが代償している可能性が考えられた。3,T細胞の分化に於いてCD4+CD8+ダブルポジティブT細胞からCD4+及びCD8+シングルポジティブ細胞が形成される。Runx3-/-マウスではCD4+シングルポジティブは形成されるがCD8+は形成されない。CD8+の形成にあたりCD4サイレンサーが機能することが知られている。従ってRunx3がCD4サイレンサー活性に重要な機能を持つことが予測された。4,ICRマウスのRunx3を破壊すると、重篤な神経症状が観察された。TrkCを発現する後根神経節細胞からの神経線維は、脊髄内で前角の運動神経核にシナプスを作りstretch reflex circuitを形成するが、Runx3-/-ではこの回路が形成されないことが判明した。よって、Runx3はTrkCを発現する後根神経節細胞からの神経線維のpathfindingに必須なものと思われた。PEBP2による骨及び造_組織等の誘導を解析し以下の結果を得た。マウス筋原細胞C2C12をBMPで処理すると骨芽細胞株の性質を示す様になるが、この機構を解析した。BMP処理でC2C12細胞にPEBP2αA/RUNX2の発現が誘導された。この結果C2C12の筋細胞への分化は阻止されたがこれだけでは骨芽細胞のマーカーは誘導されなかった。しかしRUNX2とSmad1(BMPにより特異的に活性化されるシグナル伝達分子)が直接相互作用しそれらの共同作業でアルカリフォスターゼ(骨芽細胞のマーカー)が誘導された。これにより骨形成に関与するBMPとRUNX2の関係を明らかにすることができた。PEBP2αC/RUNX3はSmad3/4と共同でIgCαプロモーターを活性化しIgMからIgAヘクラススィッチを誘導する。従ってRUNX3-/-マウスではクラススィッチが起こらない可能性が考えられたが実際にはホモ変異体でもクラススィッチが観察された。T細胞の分化に於いてCD4^+8^+ダブルポジティブT細胞からCD4^+及びCD8^+シングルポジティブ細胞が形成される。RUNX3-/-マウスではCD4^+シングルポジティブは形成されるがCD8^+は形成されない。

CD8^+の形成に当たりCD4サイレンサーが機能することが知られている。従ってRUNX3がCD4サイレンサー活性に重要な機能を持つことが予測された。ニューヨーク大学Dan Littman博士との共同研究で実際RUNX3がCD4サイレンサー機能の主役を担う事を明らかにすることができた。ショウジョウバエのrunt遺伝子の哺乳類ホモログは3種ありRunx1、Runx2、,Runx3と呼ぱれる。Runx3の機能は従来殆ど未解明であったので、Runx3のノックアウトマウスを作製しその表現型の解析を行った。Runx3の発現は消化管上皮細胞で見られた。野性型マウスでは生後約1週間、胃内腔に面した腺上皮細胞に広範なアポトーシスがみられた。しかしRunx3-/-マウスではアポトーシスが全く観察されない。この上皮細胞のアポトーシスを更に解析するため、上皮細胞を単離しin vitroで培養した。培養細胞はRunx3+/+もRunx3-/-もTUNEL法で検出されるアポトーシスは見られない。しかしこの培養細胞をTGF-βで処理するとRunx3+/+の場合はTUNEL陽性細胞が出現するのにRunx3-/-の場合は全く出現しなかった。従ってin vivoでもTGF-βがアポトーシスを誘導していることが示唆された。B6系統と異なり、ICRマウスのRunx3を破壊すると、仔の約30%は数ヶ月生存できるようになる。このようなマウスには重篤な神経症状が見られる。TrkCを発現する後根神経節細胞からの神経線維は脊髄内で前角の運動神経核にシナプスを作りstretch reflex circuitを形成するRunx3-/-ではこの回路が形成されないことが判明した。予備的結果によるとaxon guidanceの異常が示唆され、Runx3の新しい、しかも重要な機能が明らかになりつつある。
18世紀英国救貧事業の貧困児の生命・健康への配慮にみる家族・性差規範の形成

本研究は、子どもの健康、生についての質的向上、女性の身体(産育主体としての身体をもつ母親)像と、家族の役割や家庭像が、特に貧困層の子どもに対する博愛と憐憫を伴いつつ社会秩序維持や感染症予防を目的とした医療救済事業において注目され、それを根拠に事業が展開されていくプロセスを解明することを目的としている。家族や性差・女性の社会史研究、児童保護・救済研究、子どもや産婦に関する医療史研究の領域を横断し、イギリスの教育史(研究)の前提となる、18世紀に「本来的」「自然」とされる子どもや家族、性差の規範の形成過程の解明に取組む。
下顎骨生体アパタイト結晶配向性からみた咀嚼時主機能部位のミクロ解析

近年の微小領域エックス線回折装置の開発により、局所領域における生体アパタイト結晶配向性の計測が可能となった。これにより、顎骨においても機能力が歯根近傍の生体アパタイト結晶配向性に及ぼす影響について、詳細な観察を行う環境が整った。そこで本研究では、主機能部位と呼ばれ咀嚼運動時の中心と考えられる第一大臼歯歯根周囲の顎骨を対象に、その生体アパタイト結晶配向性の特徴を明確にすることを第一の目的とした。さらに、歯の喪失後もこのような配向性の特徴が骨内に履歴として残されているならば、その部位が主機能部位と合致するよう補綴装置の設計を行うことの妥当性について、咀嚼運動路の安定性の観点から臨床的に検討を加えることを第二の目的とした。初年度では、まず本研究計画が円滑に遂行できるよう研究プロトコルを整え、遺体から採取した下顎骨を用いて生体アパタイト結晶配向性に関する分析が適切に行われるよう環境整備を行い、次年度以降ではデータ収集を進めた。初年度では、まず本研究計画が円滑に遂行できるよう研究プロトコルを整え、遺体から採取した下顎骨を用いて生体アパタイト結晶配向性に関する分析が適切に行われるよう環境整備を行った。研究に必要な機材はほぼ揃えることができ、研究環境の整備についてはおおむね順調に進展してると言える。しかし、資料の採取や被験者の獲得が予定通り進んでいないために、"やや遅れている"の評価とした。初年度では、まず本研究計画が円滑に遂行できるよう研究プロトコルを整え、遺体から採取した下顎骨を用いて生体アパタイト結晶配向性に関する分析が適切に行われるよう環境整備を行い、次年度ではデータ収集を進めた。また、資料の採取やデータ収集等は進めることができた一方で、被験者の獲得が予定通り進んでいないために、"やや遅れている"の評価とした。1.実験計画の再修正・確立:28年度の実績を踏まえて、計画の修正を行い最終計画の確立を目指す。2.資料の採取や被験者の獲得:引き続き資料の採取や被験者の獲得を行う予定である。3.咀嚼運動データの収集:確立された実験計画に基づき、6自由度顎運動測定装置を用いて咀嚼運動のデータ収集を行う。アパタイト結晶配向性の結果から得られた基礎データをもとに第一大臼歯の排列位置を決めた場合に、従来通り前方歯から順に形態的要因に基づき排列を行った場合と比較して、咀嚼運動経路がどの程度安定するのかを検討する予定である。

4.データの分析:集計したデータをもとに、「歯の喪失後においても、第一大臼歯相当部にはアパタイト結晶配向性の特徴が骨内に履歴として残っており、適切な補綴歯科治療を行うことで第一大臼歯相当部が主機能部位として確実に機能する」という仮説を検証すべく、統計学的に分析を加える計画である。5.研究成果の発表:研究成果をまとめ、学会発表、論文投稿を行う。なお、学会発表は、各研究段階において成果が得られ次第、随時行う予定である。1.実験計画の再修正・確立:29年度の実績を踏まえて、計画の修正を行い最終計画の確立を目指す。2.資料の採取や被験者の獲得:引き続き資料の採取や被験者の獲得を行う予定である。3.咀嚼運動データの収集:確立された実験計画に基づき、6自由度顎運動測定装置を用いて咀嚼運動のデータ収集を行う。アパタイト結晶配向性の結果から得られた基礎データをもとに第一大臼歯の排列位置を決めた場合に、従来通り前方歯から順に形態的要因に基づき排列を行った場合と比較して、咀嚼運動経路がどの程度安定するのかを検討する予定である。物品費を¥2,300,000で計上していたが、実際の支払額が¥1,728,000となり、その差額分が次年度使用額として生じた。(理由)物品費を¥200,000で計上していたが、実際の支払額が¥111,747となり、その差額分が次年度使用額として生じた。(使用計画)本研究では精密部品を多く用いた機器を使用するため、研究期間中に破損する可能性が考えられる。したがって、当初の研究計画では購入予定のリストにはあげていなかったが、研究を遂行する上で必要となる物品に対して次年度使用額を充当する予定である。本研究では精密部品を多く用いた機器を使用するため、研究期間中に破損する可能性が考えられる。
湖沼の微生物群集が産出する難分解性溶存有機物の化学的描像と動態解明

国内の主要な湖沼において、従属栄養性細菌に分解されにくい難分解性溶存有機物(R-DOM)が増加、蓄積しているとの報告があり、湖沼の炭素循環や今後の有機物管理を考える上で、湖沼有機物の起源や化学的特性、時空間的変動を理解することは極めて重要である。本研究は、湖沼の細菌群集が産出する難分解性有機物に着目して、その化学的描像を究明するとともに、環境動態の解明を目指すものである。平成30年度は、琵琶湖における難分解性溶存有機物(R-DOM)の化学組成と環境動態を分子レベルで解明するため、琵琶湖溶存有機物(DOM)(0.5m、60m)と琵琶湖の主要な流入河川水中DOM(安曇川、野洲川上・下流)の高分解能質量分析計(FT-MS)による精密質量分析を行った。さらに、モデル基質(グルコース、グルタミン酸ナトリウム)、ラン藻類(ミクロキスティス)等に対する生分解性試験を実施することで、微生物(群集)が産出する有機物を実験室内で調製し、FT-MSによる網羅的な有機物組成解析を実施した。生分解性試験で使用した植種は、微生物株(アルファプロテオバクテリア綱、ベータプロテオバクテリア綱)と琵琶湖微生物群集であった。各々の微生物(群集)が産出した溶存有機物を固相抽出した後、FT-MSによるプロファイリングを実施した結果、琵琶湖水のみで検出されたDOM成分は、琵琶湖溶存有機物(DOM)の約4割を占め、残りの約6割は流入河川DOMまたは微生物が産出した有機物であった。また、微生物(群集)が産出した有機物が琵琶湖DOM全体の34%を占めることが明らかとなり、琵琶湖DOMの生成経路の一つとして微生物群集の機能と役割が重要であることが示された。一方で、河川を経由して琵琶湖に流入する陸域由来DOM成分は、琵琶湖DOM全体の47%を占めており、陸域由来DOMの寄与も決して少なくないことを明らかにした。国内の主要な湖沼において、微生物に分解されにくい難分解性有機物が増加・蓄積しているとの報告があり、湖沼の炭素循環や今後の有機物管理を考える上で、湖沼有機物の起源や化学的特性、時空間的変動を理解することは極めて重要である。本研究は、湖沼の微生物群集が産出する難分解性有機物に着目してその化学的描像を究明すると共に、環境動態を解明を目指すものである。本研究では、琵琶湖における難分解性溶存有機物(R-DOM)の化学組成と環境動態を分子レベルで解明するため、湖水と河川水に加えて、モデル基質、藻類、土壌等に対して生分解性試験を実施して、有機物代謝の規定要因の把握と、高度機器分析(FT-MS、NMR等)による網羅的な有機構造解析を実施する。平成28年度は、モデル基質(グルコース、グルタミン酸ナトリウム)、湖水天然有機物(NOM)(琵琶湖北湖)、河川水NOM(安曇川)、琵琶湖藻類(北湖)、培養藻類(Microcystis aeruginosa、Staurastrum dorsidentiferum)に対して生分解性試験を実施した。本試験に使用した植種菌は、綱の異なる微生物株(3種)および琵琶湖微生物群集(湖水)であった。生分解性試験後に得られたDOMの化学組成を、琵琶湖DOM(北湖、南湖)、河川DOM(安曇川、野洲川の上・下流)、下水二次処理水中DOM(EfOM)のそれと比較した結果、微生物が産出したDOMの組成は、河川水DOMやEfOMよりも湖水DOMの組成に近いことが明らかになった。また、培養藻類の生分解性試験の結果より、藻体を構成する成分ごとに分解挙動が異なること、藻類の光合成によって生産された有機物の多くが直接無機化されていること等が明らかとなった。当初の計画では、起源が明白に異なる有機物として土壌を想定したが、平成28年度は流入河川水中の微細粒子態有機物(FPOM)を用いた生分解性試験を実施した。このFPOMの起源は琵琶湖流域の森林土壌由来と考えられるため、他生性有機物の代表として採用したものである。また、固相抽出(SPE)により生分解性試験後の溶存有機物を精製・濃縮してFT-MSおよびNMRによる網羅的な有機構造解析を実施した。このように、平成28年度は当初の研究計画どおり、おおむね順調に進展している。

本研究は、湖沼の微生物群集が産出する難分解性有機物に着目してその化学的描像を究明すると共に、環境動態の解明を目指すものである。本研究では、琵琶湖における難分解性溶存有機物(R-DOM)の化学組成と環境動態を分子レベルで解明するため、湖水と河川水に加えて、モデル基質、藻類、土壌等に対して生分解性試験を実施して、有機物代謝の規定要因の把握と、高度機器分析(FT-MS、NMR等)による網羅的な有機構造解析を実施する。平成29年度は、過年度までのサンプルに加えて、成層期の琵琶湖北湖深層水(60 m)約20 Lを採取し、生分解性試験を実施して微生物産出有機物を実験室内で調製した。同時に採取した表層水(0.5 m)の結果との比較を通して、深水層DOMは芳香族性に富んだフミン酸やフルボ酸を主成分とする難分解性有機物から構成され、表水層の藻類由来有機物の微生物分解産物であることが示唆された。また、平成28年度に使用していたオービトラップ型質量分析計に替えて、平成29年度はフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計(FT-ICR MS)による再解析に着手した。これにより、分解能の大幅な向上が見込まれ、より詳細な有機物組成解析を可能とする解析方法を再構築した。再解析は、琵琶湖北湖で採取した微細粒子態有機物(FPOM)等を平成28年度のサンプルに加えて、着実に進めているところである。新たなサンプルの生分解性試験を実施すると共に、FT-ICR MS分析による分解能の改善を達成し、詳細な有機物組成解析を可能とする解析方法を構築して再解析を進めており、おおむね順調に進展していると考えられる。国内の主要な湖沼において、従属栄養性細菌に分解されにくい難分解性溶存有機物(R-DOM)が増加、蓄積しているとの報告があり、湖沼の炭素循環や今後の有機物管理を考える上で、湖沼有機物の起源や化学的特性、時空間的変動を理解することは極めて重要である。本研究は、湖沼の細菌群集が産出する難分解性有機物に着目して、その化学的描像を究明するとともに、環境動態の解明を目指すものである。平成30年度は、琵琶湖における難分解性溶存有機物(R-DOM)の化学組成と環境動態を分子レベルで解明するため、琵琶湖溶存有機物(DOM)(0.5m、60m)と琵琶湖の主要な流入河川水中DOM(安曇川、野洲川上・下流)の高分解能質量分析計(FT-MS)による精密質量分析を行った。さらに、モデル基質(グルコース、グルタミン酸ナトリウム)、ラン藻類(ミクロキスティス)等に対する生分解性試験を実施することで、微生物(群集)が産出する有機物を実験室内で調製し、FT-MSによる網羅的な有機物組成解析を実施した。生分解性試験で使用した植種は、微生物株(アルファプロテオバクテリア綱、ベータプロテオバクテリア綱)と琵琶湖微生物群集であった。各々の微生物(群集)が産出した溶存有機物を固相抽出した後、FT-MSによるプロファイリングを実施した結果、琵琶湖水のみで検出されたDOM成分は、琵琶湖溶存有機物(DOM)の約4割を占め、残りの約6割は流入河川DOMまたは微生物が産出した有機物であった。また、微生物(群集)が産出した有機物が琵琶湖DOM全体の34%を占めることが明らかとなり、琵琶湖DOMの生成経路の一つとして微生物群集の機能と役割が重要であることが示された。一方で、河川を経由して琵琶湖に流入する陸域由来DOM成分は、琵琶湖DOM全体の47%を占めており、陸域由来DOMの寄与も決して少なくないことを明らかにした。
シリコン表面化学種のテラヘルツ振動測定に関する研究

初年度に構築した「ATR法によるシリコン表面のテラヘルツ分光計測システム」を用いて、ダブルビーム方式を適用し、シリコンの水素終端及び酸化表面における化学種のテラヘルツ振動に関して以下の知見を得た。水分子がクラスターを構成する水素結合によるテラヘルツ振動ピーク(1.6THz)は水分子の重水素化によりその位置が低周波数側にシフトした。これは軽水と重水のそれぞれにおいて水素結合により形成されるネットワークのわずかな違いを反映したものと考えている。水の温度を下げることにより、水分子のテラヘルツ帯吸収は小さくなる。同様の測定についてMgOをプリズムとして行い、これらの特性が水分子自体によるものかシリコン表面に特有のものかを議論した。テラヘルツ帯における水の吸収係数はメタノールの混入により減少する。水とメタノールにより構成される分子集団(クラスター)構造の変化に起因するものと考えられる。水にある一定量以上のメタノールが混合することにより水本来のクラスター構造の維持が困難になり、水とメタノールのそれぞれの分子による安定なクラスターが新たに形成されているのではないかと推測される。アルコールの炭素数が1から2に増えるとアルコール自体のテラヘルツ吸収は小さくなる。3以上ではその変化はなくなり、プロパノールとブタノールの吸収係数は50cm^<-1>程度であった。また、シリコン表面における微量有機物としてグルコースおよびデオキシグルコースの水溶液のスペクトルを測定した。デオキシグルコースはグルコースの第2炭素原子に結合している酸素が欠落している分子である。これらの分子構造における違いは小さいがスペクトル形状には大きな違いが見られた。半導体の表面分析については多くの研究が行われており、表面振動状態についても赤外分光法による解析がなされている。しかしながら、赤外線のなかでも、ミリ波との境界に位置するテラヘルツ領域はその光源に適当なものがなかったために研究が制限され、測定手段について有効なものがなかった。本研究は広帯域において高出力のテラヘルツ波光源を用いて、シリコンのテラヘルツ表面振動特性について内部反射(ATR)法を用いて明らかにすることを目的としている。本年度は、GaP及びGaSeの半導体結晶における近赤外線の差周波混合により発生するテラヘルツ波のp偏光成分を高抵抗シリコン結晶に入射し、ATR法によるシリコン表面の振動スペクトル測定を行うことが可能な光学システムを構築した。シリコン表面に対するテラヘルツ波の入射角を変化させることにより、全反射条件が成立する。システムの有用性を確認するために、シリコン表面近傍の水についてテラヘルツスペクトル測定を行なった。水分子がクラスターを構成する水素結合による振動(1.6THz)の観測を確認した。さらに、水にエタノールやグルコースを添加することにより水分子のクラスター構造が変化する様子を観測した。テラヘルツ領域におけるATR法について詳細を検討し、シリコン表面における化学種のテラヘルツ振動についての解析技術を確立した。ATR法による光学システムでは、シリコン結晶の内部から反射するテラヘルツ波を検出する。テラヘルツ波は自由キャリアによる吸収を受けるため、表面状態の高感度検出にはテラヘルツ領域における自由キャリアを制御する必要がある。本年度はGaSe結晶を用い、半導体結晶中における自由キャリアのテラヘルツ領域における振る舞いに関する知見を得た。2THz以下の低周波領域において特に自由キャリアの影響が大きく、観察においてその影響を考慮する必要がある。
キャピラリー電気泳動による環境科学関連物質の高感度迅速分離検出システムの構築

本研究課題では,高性能分離分析法であるキャピラリー電気泳動(CE)を中核とした環境汚染物質の高感度迅速分離検出システムの構築を目指し,主にオンライン試料濃縮を適用したミセル動電クロマトグラフィー(MEKC)による各種試料の高感度分離検出と,質量分析法(MS)による高性能検出の実現について検討を行った。1.モデル化合物としてダイオキシン類,フタル酸ジアルキルエステル類,芳香族アミン類,キラルな農薬成分等を選定し,オンライン試料濃縮MEKCによる分離検出条件の最適化を試みた。試料によって検出感度は異なるが,従来法と比較して,数十倍から数千倍の感度向上を達成した。2.大気圧化学イオン化(APCI)MSをMEKCの検出器として用いるMEKC-APCI-MSの基礎研究を行い,オンライン試料濃縮法と組み合わせることにより,フタル酸ジアルキルエステル類を中心にエレクトロスプレーイオン化(ESI)では検出困難であった試料の検出を可能とし,また検出感度を通常のMEKC-APCI-MSに比べて数百倍向上させることに成功した。3.MEKCの擬似固定相に合成した高分子量界面活性剤を利用し,有機溶媒を高濃度に添加した分離溶液を用いて多環式芳香族炭化水素類の分離を達成した。4.マイクロチップ電気泳動(MCE)を利用して,オンライン試料濃縮法の一つであるスウィーピング法の濃縮過程を観測することに成功し,その濃縮機構を明らかにした。5.MCEの検出器にMSを利用するMCE-MSについての基礎検討を行った。イオン化法にはESIを利用した。マイクロチップ端面に短いキャピラリーを接続することで安定なESIを達成し,MS検出が可能であることを見出した。キャピラリー電気泳動(CE)の一手法であるミセル動電クロマトグラフィー(MEKC)では中性物質のCE分析が可能である。環境科学関連物質には構造の類似した中性化合物が多種存在するので,これらの物質の分析にはMEKCが有効である。MEKCとオンライン試料濃縮法との組み合わせにより高感度分析が可能になるものと期待され,本研究課題初年度である本年は特に濃縮による高感度化に重点をおいて以下の検討を行った。1.モデル化合物として数種の塩素化ジベンゾ-p-ジオキシン(ダイオキシン)及びその類縁体,フタル酸アルキルエステル,除草剤,アミノ酸誘導体などを選定し,それぞれのMEKCによる濃縮及び分離について分析条件検討を詳細に行った。疎水性の高い化合物については添加剤としてシクロデキストリン(CD)を利用する分離モード(CD-MEKC)を採用した。濃縮法にはスタッキング法とスウィーピング法を適用し,最適分離条件を設定した後,オンライン濃縮を用いるMEKCによりモデル化合物の分離を試みた。対象試料により濃縮効率には差が見られたが,105000倍程度の感度向上が可能であることが明らかとなった。2.スウィーピング法を中心にオンライン濃縮法の基礎的性質の解明と応用研究を行った。スウィーピング法は本研究代表者らが開発した新しい濃縮法であり,数千倍から場合によっては百万倍近くまでの濃縮効率が達成できることを明らかにすると共に,MEKCだけではなく,擬似固定相にマイクロエマルションやイオン性CDを利用する系でも有効であることを明らかにした。3.高感度・高選択性検出法である質量分析法(MS)を用いるCE-MSを環境分析に応用するための予備検討として,CE-MSによる光学異性体の分離検出を行った。部分注入法を利用することによりエレクトロスプレーイオン化法によるMS検出が可能であることが明らかとなった。キャピラリー電気泳動(CE)の一手法であるミセル動電クロマトグラフィー(MEKC)では中性物質のCEによる分析が可能である。環境科学関連物質には中性で構造の類似した化合物が多種存在するので,それらの分析にはMEKCが有効である。本研究課題2年目の本年は,オンライン試料濃縮を適用したMEKCによる環境科学関連物質の高感度分離検出と,それらの質量分析法(MS)による検出の高感度化について検討を行った。1.モデル化合物として数種のフタル酸ジアルキルエステル,芳香族アミン,及び除草剤成分を選定し,それぞれのMEKC分離及びオンライン試料濃縮について紫外吸光(UV)検出を用いて条件検討を詳細に行った。疎水性の高い化合物については有機溶媒を添加剤として利用した。濃縮法にはスタッキング法とスウィーピング法を適用した。酸性条件下におけるスウィーピング-MEKCにより,比較的疎水性の高い試料については1000倍以上程度の感度向上が可能であることが明らかとなった。2.高感度・高選択性検出法であるMSを検出法に用いるMEKC-MSによる上記試料の分離検出について検討した。イオン化法に大気圧化学イオン化(APCI)を用いることにより,通常CE-MSにおいて利用されているエレクトロスプレーイオン化(ESI)ではイオン化効率が極めて低く検出できないフタル酸ジアルキルについても良好に検出できた。また硫酸ドデシルナトリウム(SDS)を分離溶液に含むMEKC条件においても,MS検出が可能であった。3.MEKC-APCI-MSの濃度検出感度向上のためスウィーピングを適用したところ,1001000倍程度の感度向上が見られた。フタル酸ジイソプロピルについては,検出限界濃度約0.4ppmが得られた。

本研究課題では,高性能分離分析法であるキャピラリー電気泳動(CE)を中核とした環境汚染物質の高感度迅速分離検出システムの構築を目指し,主にオンライン試料濃縮を適用したミセル動電クロマトグラフィー(MEKC)による各種試料の高感度分離検出と,質量分析法(MS)による高性能検出の実現について検討を行った。1.モデル化合物としてダイオキシン類,フタル酸ジアルキルエステル類,芳香族アミン類,キラルな農薬成分等を選定し,オンライン試料濃縮MEKCによる分離検出条件の最適化を試みた。試料によって検出感度は異なるが,従来法と比較して,数十倍から数千倍の感度向上を達成した。2.大気圧化学イオン化(APCI)MSをMEKCの検出器として用いるMEKC-APCI-MSの基礎研究を行い,オンライン試料濃縮法と組み合わせることにより,フタル酸ジアルキルエステル類を中心にエレクトロスプレーイオン化(ESI)では検出困難であった試料の検出を可能とし,また検出感度を通常のMEKC-APCI-MSに比べて数百倍向上させることに成功した。3.MEKCの擬似固定相に合成した高分子量界面活性剤を利用し,有機溶媒を高濃度に添加した分離溶液を用いて多環式芳香族炭化水素類の分離を達成した。4.マイクロチップ電気泳動(MCE)を利用して,オンライン試料濃縮法の一つであるスウィーピング法の濃縮過程を観測することに成功し,その濃縮機構を明らかにした。5.MCEの検出器にMSを利用するMCE-MSについての基礎検討を行った。イオン化法にはESIを利用した。マイクロチップ端面に短いキャピラリーを接続することで安定なESIを達成し,MS検出が可能であることを見出した。キャピラリー電気泳動(CE)の一手法であるミセル動電クロマトグラフィー(MEKC)では中性物質のCEによる分析が可能である。構造類似中性化合物が多種存在する環境科学関連物質の分析にはMEKCが有効である。本研究課題最終年の本年度は,オンライン試料濃縮を適用したMEKCによるそれらの高感度分離検出と,質量分析法(MS)による高性能検出について検討を行った。あわせて,マイクロチップ電気泳動(MCE)についての基礎検討も行い,環境分析への適用の可能性を探った。1.モデル化合物として数種のフタル酸ジアルキルエステル,芳香族アミン,及びキラルな農薬成分を選定し,それぞれ分離及びオンライン試料濃縮について条件検討を詳細に行った。疎水性の高い化合物についてはシクロデキストリンや有機溶媒を添加剤として利用した。濃縮法には主にスウィーピング法を利用した。濃縮倍率は試料により異なったが,数十倍から千倍以上程度の感度向上が可能であった。2.高感度・高選択性検出法であるMSを検出法に用いるMEKC-MSによる分離検出について検討した。イオン化法に大気圧化学イオン化(APCI)を用いることによりフタル酸ジアルキルの良好な検出が可能となった。また硫酸ドデシルナトリウム(SDS)を分離溶液に含むMEKC条件においても,MS検出が可能であった。本条件下でスウィーピングを適用したところ,数百倍程度の検出感度向上が見られた。3.高分子量界面活性剤を用いたMEKCにより,多環式芳香族炭化水素の良好な分離検出が達成できた。4.マイクロチップMEKCにおいてスウィーピングの過程を観察し,試料ピークの挙動を追跡した。
樹状細胞への革新的遺伝子デリバリー技術を基盤とした抗腫瘍DNAワクチンの開発

最終年度はこれまでに構築及び改良を行ったベクターを用いて、樹状細胞への核酸の導入及びin vivo抗腫瘍効果について検討を行った。1.タンパク質封入リポソームを用いた抗腫瘍効果評価オクタアルギニン(R8)を修飾したリポソームにTLRリガンドを組み込み、in vivoにおける細胞障害性T細胞(CTL)誘導能及び抗腫瘍効果を評価した。その結果、TLR3のリガンドである合成二本鎖RNAをR8リポソームに抗原と共封入することによってin vivo CTL誘導能が著しく増強された。また、CTL誘導能と相関する抗腫瘍効果が認められた。2.機能性核酸の樹状細胞への導入続いて、機能性核酸であるsiRNAのマウス骨髄由来樹状細胞への導入について検討を行った。GAPDHに対するsiRNAをsiRNAの細胞質送達のために最適化した新型MENDに封入し、樹状細胞へ導入した。その結果、市販のsiRNA導入試薬を上回る高い効率でGAPDHの発現を抑制することに成功した。3.SOCS1ノックダウンによる樹状細胞の抗腫瘍効果増強JAK/STAT経路を介するサイトカインシグナル伝達の負のフィードバック分子として機能するSOCS1の発現をsiRNAによりノックダウンすることで樹状細胞の免疫誘導能を増強可能か否かについて検討を行った。その結果、新型MENDを用いたSOCS1に対するsiRNAの導入により、SOCS1の発現が顕著に抑制され、またIFN-γ刺激に対するシグナル伝達の増強及び、サイトカイン産生量の増加が認められた。さらに、SOCS1,をノックダウンした樹状細胞を投与したマウスでは、コントロールのsiRNAを導入した樹状細胞を投与したマウスに比較して、より強い抗腫瘍効果が認められた。本年度は、細胞膜・核膜を膜融合により突破するという新しい遺伝子デリバリー戦略に基づき、多重型MENDの構築及び機能評価を行った。また、遺伝子発現の律速過程の一つであると考えられる核内動態に、正の非線形性を見出した。1.多重型MENDの構築凝縮化したpDNAを核膜と融合能の高い脂質より構成される脂質膜で封入し、さらに細胞膜と融合能の高い脂質より構成される脂質膜で封入することにより、多重型MENDを調製した。ショ糖密度勾配遠心により精製後電子顕微鏡で観察した結果、複数の脂質膜で覆われた構造を持つことが確認された。2.遺伝子発現能評価ルシフェラーゼを発現するpDNAを多重型MENDに封入し、マウス骨髄由来樹状細胞株JWAS II細胞にトランスフェクションした結果、従来のMENDに比較して数百倍遺伝子発現活性が上昇した。3.細胞内動態の定量的評価4.核内動態の非線形性の解析MENDを含む多くの非ウイルス性遺伝子デリバリーシステムの投与量と発現量の関係は正の非線形性を示すことが知られている。そこでMENDの低用量と高用量におけるpDNAの細胞内取り込み量・核移行量を定量することにより、この非線形性の要因が核内動態にあることを明らかにした。また、カチオン性リポソームとpDNAの複合体(lipoplex)による遺伝子デリバリーにおいて、lipoplex調製時の濃度が核内動態に影響を及ぼすことを明らかにした。(Moriguchi et al.投稿中)平成19年度はin vivoにおいて有効な抗腫瘍ワクチンの基本設計を目的として、抗原タンパク質を用いた基礎的検討を行った。1.タンパク質を封入したオクタアルギニン(R8)修飾リポソームの樹状細胞における機能解析モデル抗原としてオブアルブミン(OVA)を封入したR8リポソームを樹状細胞に投与することにより、高効率で抗原ペプチドのMHC class I提示が誘導された。細胞内動態を詳細に解析したところ、内封物の細胞質への拡散が認められ、さらにOVAが細胞質プロテアソームによって分解されることが確認された。以上の結果より、R8修飾リポソームは樹状細胞において効率よくエンドソームを脱出し、内封物を細胞質に送達可能であることを明らかにした。(Nakamura,Moriguchi, et. al.投稿中,Ono, Moriguchi, et. al.投稿予定)カチオン性リポソームをマウスの尾静脈内あるいは皮下に投与し、脾臓および所属リンパ節細胞への取り込みを評価したところ、MHC class II陽性細胞(抗原提示細胞)に取り込まれることが確認された。標的化リガンドであるマンノースを修飾することによる取り込みの促進は認められなかった。リポソームの正電荷が取り込み促進に大きく寄与していると考えられる。3.抗腫瘍効果評価、アジュバントの組み込みOVA封入R8リポソームをマウスに免疫することにより、OVA発現癌細胞の増殖が抑制された。現在、非メチル化CpGオリゴヌクレオチドと合成二本鎖RNAの免疫増強作用について検討中であり、抗腫瘍効果の増強及び抗原特異的細胞障害性T細胞誘導能の著しい促進が認められている。

2.機能性核酸の樹状細胞への導入続いて、機能性核酸であるsiRNAのマウス骨髄由来樹状細胞への導入について検討を行った。GAPDHに対するsiRNAをsiRNAの細胞質送達のために最適化した新型MENDに封入し、樹状細胞へ導入した。その結果、市販のsiRNA導入試薬を上回る高い効率でGAPDHの発現を抑制することに成功した。3.SOCS1ノックダウンによる樹状細胞の抗腫瘍効果増強JAK/STAT経路を介するサイトカインシグナル伝達の負のフィードバック分子として機能するSOCS1の発現をsiRNAによりノックダウンすることで樹状細胞の免疫誘導能を増強可能か否かについて検討を行った。その結果、新型MENDを用いたSOCS1に対するsiRNAの導入により、SOCS1の発現が顕著に抑制され、またIFN-γ刺激に対するシグナル伝達の増強及び、サイトカイン産生量の増加が認められた。さらに、SOCS1,をノックダウンした樹状細胞を投与したマウスでは、コントロールのsiRNAを導入した樹状細胞を投与したマウスに比較して、より強い抗腫瘍効果が認められた。
原発性アルドステロン症診断のためのCYP11B2標的イメージングプローブの開発

高血圧は、患者数が35004000万人もいる国民病のひとつである。その分類は、原因が明らかでない本態性高血圧とホルモン異常などによって生じる二次性高血圧に分類される。二次性高血圧の原因疾患のひとつとして、アルドステロン産生腺腫が引き起こす原発性アルドステロン症(PA)の割合が高いことが明らかとなってきた。PAの原因病変としてのアルドステロン産生腺腫においてCYP11B2が特徴的に発現していることに着目し、CYP11B2を標的とするPET/SPECT用分子イメージングプローブの開発を行ったところ、放射性フッ素キノリン誘導体の中で有望な化合物を見出した。本研究の目的は、アルドステロン産生腺腫が引き起こす原発性アルドステロン症(PA)の発症に関わる分子機構を標的として、医薬品化学および薬物動態学的な観点から分子設計を行い、副腎でのPA責任病変を高感度で検出・評価しうるPET/SPECT用分子イメージングプローブの開発を行うことにある。ステロイド生合成系において、アルドステロン合成酵素(CYP11B2)はアルドステロン合成のみに関与する酵素である一方、ステロイド11βー水酸化酵素(CYP11B1)は、アルドステロン及びコルチゾールの両方の合成に関与する。したがって、アルドステロンの過剰分泌をコルチゾールの過剰分泌と区別して検出するには、CYP11B2に対する選択性が高いことが好ましい。そこで化合物を探索したところ、テトラヒドロキノリン骨格が母体となり得ることが示唆された。今年度は、数種のテトラヒドロキノリノン誘導体を設計・合成し、その有用性を評価した。先ず、ヒト副腎皮質由来の癌細胞であるNCI-H295Rを用いたインビトロの評価法の構築を行った。確立したアッセイ法を用い今回開発した化合物を評価したところ、化合物Aは標的分子であるCYP11B2に対して高い親和性と選択性を有していた(IC50 = 0.97 nM)。そこで、123I標識体を作製し、その体内分布実験を正常マウスを用いて実施したところ、副腎への集積を認めた(4.8%ID/g,60min)。今後は、モデル動物を作製し、より詳細な検討とPETあるいはSPECTを用いた画像化を試みる。ステロイド生合成系において、アルドステロン合成酵素(CPY11B2)はアルドステロン合成のみに関与する酵素である一方、ステロイド11β-水酸化酵素(CPY11B1)は、アルドステロン及びコルチゾールの両方の合成に関与する。従って、アルドステロンの過剰分泌をコルチゾールの過剰分泌と区別して検出することには、CPY11B2に対する選択性が高いことが好ましい。今年度は、新規化合物の開発と、インビトロ評価法の再構築、モデル動物の作製を検討した。新規化合物としては、平成25年度までの研究成果を基に構造活性相関研究を行い、CYP11B2への選択性((Selectivity Factor (S.F.) = IC50CYP11B1 / IC50CYP11B2)を向上させた誘導体(SF=223, IC50B2=0.63 nM)の開発に成功した。インビトロ評価法としては、原発性アルドステロン症の治療のためヒト患者から摘出された副腎を用いて切片を作製し、オートラジオグラフィー法で特異性を評価する方法を確立した。モデル動物として、ラット低ナトリウム負荷モデルの作製を検討している。PET/SPECT用イメージングプローブとしては、これまでの研究成果を基に構造活性相関研究を行い、CYP11B2への選択性((Selectivity Factor (S.F.) = IC50CYP11B1 / IC50CYP11B2)を向上させた誘導体(SF=223, IC50B2=0.63 nM)の開発に成功している。プローブの開発は計画通りに進んでいたが、in vitroの評価系を見直したところ組織切片を用いたCPY11B1、CPY11B2の免疫染色法を再構築する必要性が生じた。これまで、免疫染色に関しては上手く行えていなかったが、最近市販された抗体を用いることでこの問題を解決出来ることが分かった。また、市販のヒト患者組織切片を用いて免疫染色を行ったところ、切片間でのバラつきが大きく開発したプローブを用いたオートラジオグラフィーとの乖離も見受けられた。