hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
炎症性サイトカインのIn vitro及びIn vivoでの発現機序の解析とその制御

私共はIL-1やTNFによって誘導されるIL-8、MCAFなどの炎症性サイトカインがin vitroおよびin vivoでの生体防禦機構に重要な役割を果たしていると考え本研究を行い、以下のような成果が得た。(1)In vitroにおけるIL-1、TNFによる炎症性サイトカイン遺伝子発現誘導とその制御機序の解析:我々はIL-1やTNFおよびLPSがヒトの培養細胞(神経系、線維芽細胞株など)に対し、IL-8、MCAFなどの炎症性サイトカイン遺伝子を速やかに発現誘導することを見いだした。これらの細胞株における炎症性サイトカイン遺伝子発現とグルココルチコイドによる遺伝子発現の制御,とくに発現制禦蛋白(NF-kB、C/EBP、NF-IL-6、AP-1)の同定をゲルシフトアッセイにより明らかにした。(2)種々の疾患における炎症性サイトカインの関与とその動態解析:我々はすでに、IL-8、MCAFに対するMoAbの作製と酵素免疫測定法を確立した。種々の感染症(尿路感染、子宮内感染症、髄膜炎など)および炎症性疾患(慢性関節リューマチ、免疫賦活剤投与癌患者、心筋梗塞および過敏性肺臓炎など)患者体液中のIL-8、MCAFレベルをELISA,RIA法で測定し、その臨床的意義づけを行った。(3)MCAFの大量発現とin vivoにおける感染防御作用:動物細胞由来のヒトMCAFを大量に発現させ、マウスにおけるSalmonella,Pseudomonas感染に対する防御能がを検討したところ、予めを投与したマウスでは明らかな防御作用があることが知られた。MCAFはin vitroでもマクロファージによる貪食および殺菌作用があることが示され、MAFとして働くことがわかった。現在さらに、MCAFcDNAを導入した腫瘍細胞を作成し、in vivoにおける抗腫瘍増殖効果を検討しているところである。私どもは生体防御機構の解明をめざし感染や炎症の場における炎症性サイトカインの動態解析と遺伝子発現の制御の解析を目的としている。本年得られた成果は以下の通りである。1.炎症性サイトカインの微量測定法の確立と種々の病態における動態解析:私どもはすでにIL-8,MCAFに対するモノクロナル抗体の作製とその免疫学的測定系の開発を行った(koら、1992)。この測定法を用いて、(1)110例に及ぶ尿路感染症患者尿中及び血清中でのIL-8の定量を行い、IL-8はIL-1やTMF-α量に比べ細菌・真菌感染と膿尿、白血球浸潤の程度とよく相関し、尿路感染症のよい指標となることを示した(koら、1993)。また、(2)妊婦羊水中で種々のサイトカイン産生を定量し、早期分娩とくに絨毛羊膜炎合併群でIL-6,G-CSF,IL-8が著しい高値を示すことを明らかにした。またこれらのサイトカインの産生部位を同定した(Saitoら、1993)。さらに、(3)免疫賊活剤(OK-432)投与した癌性胸膜炎癌者胸水中への炎症性サイトカインの同定を行った(Tsuchiyaら、投稿中)。2.炎症性サイトカインのin vitroにおける遺伝子発現とその調節:私どもはIL-1,TNF-α及びLPSに反応してIL-8,MCAFなどの炎症性サイトカイン遺伝子が速やかにかつ高度に発現誘導される種々の培養細胞(ヒト線維芽細胞、グリオーマ、ヘパトーマなど)を用い、今回はとくにIL-8遺伝子発現に必要な5'上流部位の同定をCATアッセイ等によって行った(Mukaidaら、1992)。さらにグリオーマ細胞株においてグルココルチコイドによってIL-8遺伝子発現のダウン・レギュレーションが起きるが、これに必要な部位の同定を行った(Moritaら、投稿中)。

以上、今年度はin vitro及びin vivoにおけるIL-8の動態解析と遺伝子発現の調節機構の解析を中心に行ってきた。次年度はさらに、MCAFの生体防御における役割を中心に本課題を進展させてゆきたい。私共はIL-1やTNFによって誘導されるIL-8,MCAFなどの炎症性サイトカインがn vitroおよびin vivoでの生体防禦機構に重要な役割を果たしていると考え本研究を行い、以下のような成果が得た。(1)In vitroにおけるIL-1,TNFによる炎症性サイトカイン遺伝子発現誘導とその制御機序の解析:我々はIL-1やTNFおよびLPSがヒトの培養細胞(神経系、線維芽細胞株など)に対し、IL-8,MCAFなどの炎症性サイトカイン遺伝子を速やかに発現誘導することを見いだした。これらの細胞株における炎症性サイトカイン遺伝子発現とグルココルチコイドによる遺伝子発現の制御、とくに発現制禦蛋白(NF-kappaB,C/EBP,NF-IL-6,AP-1)の同定をゲルシフトアッセイにより明らかにした。(2)種々の疾患における炎症性サイトカインの関与とその動態解析:我々はすでに、IL-8,MCAFに対するMoAbの作製と酵素免疫測定法を確立した。種々の感染症(尿路感染、子宮内感染症、髄膜炎など)および炎症性疾患(慢性関節リューマチ、免疫賦活剤投与癌患者、心筋梗塞および過敏性肺臓炎など)患者体液中のIL-8,MCAFレベルをELISA,RIA法で測定し、その臨床的意義づけを行った。MCAFの大量発現とin vivoにおける感染防御作用:動物細胞由来のヒトMCAFを大量に発現させ、マウスにおけるSalmonella,Pseudomonas感染に対する防禦能がを検討したところ、予めを投与したマウスでは明らかな防御作用があることが知られた。MCAFはin vitroでもマクロファージによる貧食および殺菌作用があることが示され、MAFとして働くことがわかった。現在さらに、MCAFcDNAを導入した腫瘍細胞を作成し、in vivoにおける抗腫瘍増殖効果を検討しているところである。
IVR低コントラスト改善のためのフィルタK吸収端から最高管電圧までの解析

IVR装置において、低コントラストの組織を描出するには管電圧を低くすれば吸収係数が大きくなりコントラストの変化分を大きくすることができる。しかし、体厚が厚くなればK吸収端から最高管電圧までのエネルギーが増加するので、低コントラスト描出の改善のためにフィルタ材質の解析を行った。(1)既存のスペクトル測定装置により、IVR手技中におけるX線透視条件でのx線スペクトルの測定を行い、付加フィルタなしでのファントム厚変化によるX線線質の相違を解析したところ、ファントム自体がフィルタの役目をし、低エネルギーではアクリルのX線透過率が高く、高エネルギーではx線透過率が低い傾向にあった。厳密な比較を行うときにはアクリルに問題がある。(2)付加フィルタ装置により、K吸収端までのX線スペクトル解析を行った。アルミニウム、銅、ニオブ、モリブデンの付加フィルタを検討したが、stripping補正しないスペクトルでHubbe11の質量減弱係数を使って求めても減弱の程度を相対的に比較できることが分かった。ニオプやモリブデンは低エネルギーでX線をよく減弱させ高エネルギーでは透過率が高い。アルミニウムは同じ傾向であるが二オブやモリブデンの方が顕著である。銅はこれらの中間であった。(3)低コントラスト分解能テストツールにより、低コントラスト領域の示現能とX線スペクトルの関連性を追求した。増感紙のX線透過率を測定したが、40keVから70keVまでの領域ではオルソ系の増感紙がX線をよく減弱(吸収)し、それ以外の領域ではレギュラー系の増感紙がX線をよく減弱させることが分かった。低コントラストの組織を描出するには、管電圧を低くすれば吸収係数が大きくなり、変化分を大きくすることができる。しかし、体厚が厚くなれば、このK吸収端から最高管電圧までのエネルギーが増加するので、低コントラスト描出の改善のためフィルターの材質と厚さの解析を行い、最適材質と厚さを追求した。(1)既存のX線スペクトル測定装置により、IVR手技中におけるX線透視条件でのX線スペクトルの測定を行い、付加フィルタなしでのファントム厚変化よるX線線質の相違を解析したところ、ファントム自体がフィルタの役目をし、低エネルギー分の吸収が多くなっていることがわかった。ファントムの厚さを各種フィルタ材質の厚さに換算することを、シミュレーションで行っている途中である。(2)X線の出力が常時一定に保たれているかを考慮しつつ管電圧の変化を検討した。X線出力アナライザーによる測定では、透視条件で長時間使用しなければ、出力はほぼ一定であった。(3)付加フィルター装着により、K吸収端から最高管電圧までのX線スペクトル解析を行った。フィルタ材質のタングステン、ヨウ素、金によりX線スペクトルを測定したが、K吸収端を用いる場合、フィルタ厚の違いによって低エネルギー成分の減弱割合が非常に影響することが分かった。モンテカルロにより解析中である。(4)低コントラスト分解能テストツールにより、低コントラスト領域の示現能とX線スペクトルの関連性を追求している途中である。(5)他施設における現状を調査しているが、条件が種々あり、整合性の必要があることが分かった。IVR装置において、低コントラストの組織を描出するには管電圧を低くすれば吸収係数が大きくなり変化分を大きくすることができる。しかし体厚が厚くなればK吸収端から最高管電圧までのエネルギーが増加するので、低コントラス描出の改善のためフィルタの材質の解析を行った。(1)既存のスペクトル測定装置により、IVR手技中におけるX線透視条件でのX線スペクトルの測定を行い、付加フィルタなしでのファントム厚変化によるX線線質の相違を解析したところ、ファントム自体がフィルタの役目をし、低エネルギー分の吸収が多くなっていることがわかった。また、水およびアクリルのスペクトルを見ると低エネルギーではアクリルのX線透過率が高く、高エネルギーではX線透過率が低い傾向にあった。

アルミニウム、銅、ニオブ、モリブデンの付加フィルタを検討したが、stripping補正しないスペクトルでHubbellの質量減弱係数を使って求めても減弱の程度を相対的に比較できることが分かった。ニオブやモリブデンは低エネルギーでX線をよく減弱させ、高エネルギーでは透過率が高い。アルミニウムは同じ傾向であるがNbやMoの方が顕著である。銅はこれらの中間であった。(3)低コントラスト分解能テストツールにより、低コントラスト領域の示現能とX線スペクトルの関連性を追求した。増感紙のX線透過率を測定したが、40keVから70keVまでの領域ではオルソ系の増感紙がX線をよく減弱(吸収)し、それ以外の領域ではレギュラー系の増感紙がX線をよく減弱させることが分かった。
精密加工へ用いる時空間波形歪が補償された超短パルスビームアレイの生成法の研究

超短パルスレーザーを用いた生産性に優れた加工技術への期待が大きい。高スループットの鍵となる超短パルスビームアレイを回折を利用して生成する光学系が国内外で研究されているが実用に至っていない。光学系の色収差と分散により生じる時空間のパルス波形歪を除く方法が確立していないためである。本研究では回折光学素子と屈折光学素子を組み合わせた光学系を開発し、色収差補正と同時に分散補償を行って波形歪を除く。この技術を応用すれば、超短パルスの非熱特性を利用した高品質な加工を高スループットで実現でき、超短パルスレーザー加工の実用化に貢献できる。
新規ヒストンO-Glc NAc修飾による栄養状態依存的Nodal遺伝子制御機構

Nodal遺伝子はマウスES細胞においてエピジェネティック制御領域(ERE)により発現誘導されている。先行研究において、マウスES細胞ではEREがグルコース反応性のヒストン修飾であるH2AS40-Gcを受けており、培地中のグルコース濃度により修飾レベルが変化することを見出した。しかし前年度の研究より、培地中のグルコース濃度がマウスES細胞におけるNodal遺伝子の発現レベルに影響を与えないことがわかった。EREは細胞分化に伴いH3K27me3修飾を受けて機能が抑制される。そこで本年度はH2AS40-Gcの関わりを分子レベルで探っていくための準備として、EREの制御メカニズム、特にエピジェネティックな制御についての研究を進めた。前年度の研究でEREを様々な長さで欠失させたマウスES細胞を樹立している。これらの細胞の比較検討から、Oct4-Klf4モチーフを含む極めて短い領域の欠失がNodal遺伝子の発現を顕著に減少させるのに十分だとわかった。しかしながら、Oct4-Klf4モチーフ欠失細胞でもNodal遺伝子の発現は10%程度残存していたため、他の制御領域も発現誘導に参加していると考えられた。既知の関連シグナル阻害剤を用いた検討を進めているが、今のところマウスES細胞におけるNodal遺伝子発現を変動させるものは見つけられていない。CRISPR/dCas9法によりゲノム上の特定の領域にH3K27me3修飾を付加するためのベクター、同様にH3K27me3を脱修飾するためのベクターを構築し、機能評価を進めている。CRISPR/dCas9法による特異的効果と比較するため、EPZ6438処理により核全体にわたりH3K27me3を減少させたマウスES細胞について、RNA-seqによる網羅的遺伝子発現解析を実施した。グルコース濃度がNodal遺伝子の発現に影響を及ぼさないため、グルコース-H2AS40-Gc-遺伝子発現という単純なカスケードを描くことができず、明確な働きを示せていない。一方、EREを中心に詳細な解析を進めるための細胞やベクターの準備は十分に進んでいる。今後はEREを主軸に分子機構を調べていく。H3K27me3とH2AS40-Gcの相互関係を明らかにするため、CRISPR/dCas9によりH3K27me3レベルを増減させたEREのH2AS40-Gc状態をクロマチン免疫沈降法(ChIP)により解析する。また、H3K27me3によるEREの機能抑制がASEやPEEなど他の既知エンハンサーのH2AS40-Gcやクロマチン状態にどのような影響を与えるかをChIPやDNase感受性試験により確認する。Oct4-Klf4モチーフ欠失ES細胞をグルコース濃度の異なる培地で培養し、Nodal遺伝子発現やヒストン修飾、クロマチン状態への影響を調べることで、転写因子制御との関係を明らかにする。また、CRISPR/dCas9とO-GlcNAc修飾酵素・脱修飾酵素を組み合わせたゲノム標的特異的O-GlcNAc調節法を確立し、推測されたH2AS40-Gcの機能の証明に活用する。H2AS40-Gcはグルコース反応性のヒストン修飾であり、遺伝子発現やゲノム修復などへの関与が示されつつある。研究代表者は先行研究において、マウスES細胞においてNodal遺伝子のエピジェネティック制御領域(ERE)がH2AS40-Gcを受けており、培地中のグルコース濃度により修飾レベルが変化することを見出している。本年度はグルコース・H2AS40-GcがEREを介してNodal遺伝子発現におよぼす影響に関して研究を進めた。(1)培地中のグルコース濃度がNodal遺伝子発現に与える影響を調べるため、マウスES細胞を25 mM(high glucose)と5.5 mM(low glucose)で培養し、RT-qPCR解析を行ったが、有意な変化は認められなかった。(2)ゲノム標的特異的H2AS40-Gc調節による機能解析のための準備を進めた。pPlatTET-gRNA2(Morita et al., Nat Biotechnol. 2016)をベースとして、O-GlcNAc転移酵素OGTにscFvタグを融合し、dCas9-SunTagと共発現することで、ゲノム上の任意の領域にOGTをリクルートできるベクターを構築した。(3)CRISPR/Cas9法によりEREを様々な長さで欠失させたマウスES細胞を樹立した。これについてNodal遺伝子の発現状況を比較した結果、特定のOct4結合モチーフがNodal発現誘導に必須であることが明らかになった。初年度に予定していたES細胞以外の解析が完了しておらず、早急に進めていく必要がある。一方、ERE領域欠失細胞の作出と転写因子モチーフの同定は予定よりも早く達成された。欠失細胞はメカニズム解析のツールとしても有用であり、二年目以降の研究を加速させうる。ゲノム標的特異的H2AS40-Gc調節の試みは順調に進んでおり、実証実験に移行する。

そこで本年度はH2AS40-Gcの関わりを分子レベルで探っていくための準備として、EREの制御メカニズム、特にエピジェネティックな制御についての研究を進めた。前年度の研究でEREを様々な長さで欠失させたマウスES細胞を樹立している。これらの細胞の比較検討から、Oct4-Klf4モチーフを含む極めて短い領域の欠失がNodal遺伝子の発現を顕著に減少させるのに十分だとわかった。しかしながら、Oct4-Klf4モチーフ欠失細胞でもNodal遺伝子の発現は10%程度残存していたため、他の制御領域も発現誘導に参加していると考えられた。既知の関連シグナル阻害剤を用いた検討を進めているが、今のところマウスES細胞におけるNodal遺伝子発現を変動させるものは見つけられていない。CRISPR/dCas9法によりゲノム上の特定の領域にH3K27me3修飾を付加するためのベクター、同様にH3K27me3を脱修飾するためのベクターを構築し、機能評価を進めている。CRISPR/dCas9法による特異的効果と比較するため、EPZ6438処理により核全体にわたりH3K27me3を減少させたマウスES細胞について、RNA-seqによる網羅的遺伝子発現解析を実施した。グルコース濃度がNodal遺伝子の発現に影響を及ぼさないため、グルコース-H2AS40-Gc-遺伝子発現という単純なカスケードを描くことができず、明確な働きを示せていない。一方、EREを中心に詳細な解析を進めるための細胞やベクターの準備は十分に進んでいる。今後はEREを主軸に分子機構を調べていく。Nodal遺伝子のH2AS40-Gc修飾標的領域をマウス分化細胞やヒト正常細胞・がん細胞で解析し、プロファイリングを完了する。ERE領域欠失細胞について、H2AS40-GcやH3K27me3状態の変化、両者の相互関係、細胞分化の影響を解析する。ゲノム標的特異的H2AS40-Gc調節の実証実験として、初年度に構築したベクターを培養細胞に一過的に発現させ、Ogtの標的への局在とH2AS40-Gcの変化を確認する。H3K27me3とH2AS40-Gcの相互関係を明らかにするため、CRISPR/dCas9によりH3K27me3レベルを増減させたEREのH2AS40-Gc状態をクロマチン免疫沈降法(ChIP)により解析する。また、H3K27me3によるEREの機能抑制がASEやPEEなど他の既知エンハンサーのH2AS40-Gcやクロマチン状態にどのような影響を与えるかをChIPやDNase感受性試験により確認する。Oct4-Klf4モチーフ欠失ES細胞をグルコース濃度の異なる培地で培養し、Nodal遺伝子発現やヒストン修飾、クロマチン状態への影響を調べることで、転写因子制御との関係を明らかにする。また、CRISPR/dCas9とO-GlcNAc修飾酵素・脱修飾酵素を組み合わせたゲノム標的特異的O-GlcNAc調節法を確立し、推測されたH2AS40-Gcの機能の証明に活用する。おおよそ計画通りに支出したが、若干の誤差が生じた。少額であり、次年度の消耗品に充てる。
日本の「精神医療改革」に関する基礎的研究

本研究では自治体レベルでの精神保健福祉施策を比較するために、首都圏で早くから精神保健福祉サービスに取り組んできた東京都と、大都市圏外に位置する山口県の施策を対象にその変遷を追いそれぞれの地域の特徴と問題点について検討した。2つの自治体の精神保健福祉施策を、戦後の国の制度・政策的な変遷を軸に4つの時期に区分した結果、各自治体の施策は、第1期(昭和2539年):無策あるいは精神科ベッド増床の時代、第2期(昭和4050年):「病院から地域へ」の兆し、第3期(昭和5162年):「働く場」の確保、第4期(昭和63現在):「生活の場」への拡大、と重点がほぼ共通して移行している。さらに、東京都では地方精神保健福祉審議会の答申を基軸にして施策が展開している一方、山口県では答申が必ずしも施策に反映していない。ただし、東京都では運営主体となる豊富な任意団体の存在を背景に、小規模施設の運営費補助という形での社会資源の充実が中心で、精神保健福祉法に定める社会復帰施設の整備は遅れがちである。逆に、山口県では民間の任意団体等による小規模施設の設置は少なく、法内の社会復帰施設を中心に整備されているが、その数はまだ少ない。
プレストレストアンカーボルトを用いた鉄骨露出型柱脚に関する研究

1.鉄骨構造の露出型柱脚において、アンカーボトルにPC鋼棒を用い、これに高い緊張力を導入した場合の力学的性状を、実験及び解析的に調査し、次の諸量を定量化することを目的とする。(1)ベースプレートがコンクリート基礎ばりと全面接触でなくなるモーメント(以後、開口モーメントと呼ぶ)、(2)柱脚部の耐力、(3)柱脚部の剛性、(4)柱脚部の復元特性2.実験は鋼柱に角形鋼管を用い、ベースプレート剛性及びアンカーボトルの本数をパラメータとした試験体を用いて行われた。3.平成3年度及び平成4年度の実験及び解析から得られた知見は以下の通りである。(1)開口モーメントを与える評価式を得た。本評価式は2次元の半無限弾性体に作用する剛体パンチの理論解を拡張し、これに係数を乗じたものとして表せる。この係数はベースプレートの剛性に依存し、本研究では、これを実験式して与えた。(2)柱脚の剛性は開口モーメントまでの剛性と開口モーメント以降の剛性が異なる。前者は主として基礎ばりコンクリートの局部変形に依存し、後者はベースプレートの変形及びアンカーボルトの伸び変形に依存する。従って、後者の場合はアンカーボルトの本数やその配置に影響される。本研究では両剛性に対しアンカーボルトが4本と6本の場合の柱脚の剛性値を与える評価式を得た。(3)柱脚部の復元力特性の形態を開口モーメント、柱脚部の剛性を用いて予測する作図法を得た。(4)柱脚部の耐力、特にリブ補強された場合のベースプレートの耐力の評価法を確立する必要がある。1.鉄骨構造の露出型柱脚において、アンカ-ボルトにPC鋼棒を用い、これに高い緊張力を導入した場合の力学的性状を、実験及び解析的に調査し、次の諸量を定量化することを目的とする。(1)ベ-スプレ-トがコンクリ-ト基礎ばりと全面接触でなくなるモ-メント(以後、剛接合限界モ-メントと呼ぶ)、(2)柱脚部の降状モ-メント、(3)柱脚部の剛性、(4)柱脚部の復元力特性2.試験体は鋼柱として角型鋼管を用い、ベ-スプレ-トの厚さを変化させたものと、ベ-スプレ-トの厚さを一定にしリブ補強したものの2種類である。リブ補強に於ける補強方法は、ベ-スプレ-トの外周にリブを配置した、いわゆるロ型形式のものと、角型鋼管柱の隅角部からXーY方向にリブを配置した、いわゆる、共型形式のものとし、リブの高さを変化させてベ-スプレ-トの剛性を調整した。試験体の総数は10体である。3.実験及び解析結果から得られた知見は以下の通りである。(1)剛接合限界モ-メントの予測式として、2次元の半無限弾性体に作用する剛体パンチの理論解を拡張して、これに係数を乗じた式を得た。この係数は、本柱脚を3次元の有限弾性体同志の接触問題として有限要素法により求めよれたもので、ベ-スプレ-トの楓からの突出部(以後、オ-バ-ハング部と呼ぶ)の曲げ剛性に依存する。(2)柱脚の回転剛性はコンクリ-ト基礎ばりの局部変形による要素とベ-スプレ-トの変形による要素から成る。初期回転剛性は、上記と同様の有限要素法によって得られた予測式で評価することができた。(3)柱脚部の復元力特性の形態を剛接合限界モ-メント、降状モ-メント、初期剛性、及び剛接合限界モ-メント以降の剛性の値を用いて予測する作図法を得た。剛接合限界モ-メント以降の剛性は実験値から求めだが、今後この値の定量的評価法を確立する必要がある。

1.鉄筋構造の露出型柱脚において、アンカーボルトにPC鋼棒を用い、これに高い緊張力を導入した場合の力学的性状を、実験及び解析的に調査し、次の諸量を定量化することを目的とする。(1)ベースプレートがコンクリート基礎ばりと全面接触でなくなるモーメント(以後、開口モーメントと呼ぶ)、(2)柱脚部の耐力、(3)柱脚部剛性、(4)柱脚部の復元力特性2.試験体は鋼柱として□-200×200×9を用い、ベースプレートは400×400mmで厚さは25mmとし、井形にリブ補強したものを用いた。リブ厚さは12mmとし、リブ高さは75と100mmの2種類である。アンカーボルトは4-φ23-6-φ19の2種類とた。3.平成3年度及び平成4年度の実験及び解析から得られた知見は以下の通りである。(1)開口モーメントを与える評価式を得た。本評価式は2次元の半無限弾性体に作用する剛体パンチの理論解を拡張し、これに係数を乗じたものとして表せる。この係数はベースプレートの剛性に依存し、本研究では、これを実験式して与えた。(2)柱脚の剛性は開口モーメントまでの剛性と開口モーメント以降の剛性が異なる。前者は主として基礎ばりコンクリートの局部変形に依存し、後者はベースプレートの変形に依存する。従って、後者の場合はアンカーボルトの本数やその配置に影響される。本研究では両剛性に対しアンカーボルトが4本と6本の場合の柱脚の剛性値を与える評価式を得た。(3)柱脚部の復元力特性の形態を開口モーメント、柱脚部の剛性を用いて予測する作図法を得た。(4)柱脚部の耐力、特にリブ補強された場合のベースプレートの耐力の評価法を確立する必要がある。
ミクロとマクロの原価改善システムにおける管理会計情報の有用性に関する実証研究

本研究は、管理会計の領域においてこれまで研究が十分蓄積されていないと思われるカイゼン・コスティング(原価改善システム)について、管理会計の影響システムとしての側面からアプローチしたものである。本年度の研究実績は次のとおりである。第一に、日本的な現場改善の発展・進化を促進する手法としてわが国において広く浸透しつつあるミニ・プロフィットセンター制度(マイクロ・プロフィットセンター制度とも称される)について、本研究期間においてこれまで蓄積してきた研究成果に基づいて、改めてカイゼン・コスティング手法の観点から、当該研究成果のまとめを行った。第二に、ボトルネックの管理による全体最適化のための原価改善手法であるTOC(制約条件の理論)とスループット会計について、特殊調査ではなく経常的な原価改善システムの構築という面から、どのようにボトルネック情報を提供・共有し、目標とすべき指標を使用したらよいかについて検討し、その研究成果を提出した。さらに、TOC(制約条件の理論)とスループット会計に類似した経営手法であるわが国のトヨタ生産方式との比較検討およびバックフラッシュ・コスティングの意義と構造についても併せて考察した。第三に、前年度において実施したオープンブック・マネジメント(OBM)の共通原則と実施上の諸問題に関する文献研究の結果に基づいて、OBM実施企業へのフィールド調査を実施し、現在のところ、その研究成果の提出へ向けた準備を行っているところである。本年度では、第一に、ミクロとマクロの原価改善システムを構築していくという、より大きな研究の一部として、ミニ・プロフィットセンター(MPC)制度についての事例研究を実施し、その成果の一部を発表した。第二に、上記の研究課題と密接に関連する内外の著書、論文を網羅的に収集し、文献研究を行った。このうちMPCについては、管理会計の影響システムとしての側面を重視し、従業員の動機づけに対して望ましい影響を及ぼすためには、提供される管理会計情報の特性をどのように工夫したらよいのか、管理会計システムをいかに運用していけばよいのかということを製造現場の実態調査に基づいて考察した。組織メンバーに対する改善活動への動機づけ方法を、(1)管理会計情報による動機づけの方向への影響、(2)管理会計情報による動機づけの強さへの影響、(3)管理会計システムの運用方法の3つに概念的に分類したうえで、管理会計システムの設計および運用方法を考察した。(2)については、管理会計情報の特性面として、(1)意味のある目標であること、(2)シンプルで分かりやすい目標であること、(3)年度ベースと月次ベースの目標値であること、(4)高い目標値であること、(5)行動の結果が反映され実感しやすいこと、(6)成果がタイムリーに利用可能であること、(7)市場志向、などの側面から、管理会計情報の意義を考察した。さらに、(3)の管理会計システムの運用方法の側面として、(1)少人数であること、(2)情報をガラス張りにすること、(3)自己評価、(4)管理会計教育を施すこと、(5)社内用語を管理会計に統一すること、(6)月次経営会議でPDCAサイクルを実施すること、(7)自主性を尊重すること、(8)高い目標値を要求すること:実験主義、(9)人事評価とは直結させないこと、(10)トップマネジメントがエネルギーを注入すること、といった要素から、原価改善活動を支援するためのMPCシステムの有効性を検討した。前年度では、第一に、ミクロとマクロの原価改善システムを構築していくという、より大きな研究の一部として、ミニ・プロフィットセンター(MPC)制度についての事例研究を実施し、その成果の一部を発表した。こうした研究を踏まえ、本年度では、主として次の二つの点で当該研究を拡充した。まず、管理会計システムの運用方法の観点から、MPCと親和性が高く、しかもこれまで直接的に取り上げ、られることの少なかったように思われるオープンブック・マネジメント(OBM)についての文献研究を実施し、その論点を整理したうえで、この経営システムを導入し実践していくうえで解決が図られなければならないであろう諸間題について検討した。というのも、昨今の管理会計領域では、MPCなど各種の原価改善手法が開発されているものの、これらが戦略実行の手段/道具として有効であるためには、適切な管理会計システムを設計するのみならず、適切に管理会計システムを運用することが肝要だからである。さらに、OBMの文献研究に終止するのみならず、次年度の研究を見据えてOBM実施企業のモデルケース1社のパイロット調査も実施した。第二に、上記の研究と並行させながら、MPC制度以外の原価改善手法(TOCなど)について予備的矢文献研究を実施した。このTOCは、ボトルネックの管理による全体最適化のための原価改善手法であり、日本企業の小集団活動の活性化にとって有益な経営手法であると考える。

第二に、ボトルネックの管理による全体最適化のための原価改善手法であるTOC(制約条件の理論)とスループット会計について、特殊調査ではなく経常的な原価改善システムの構築という面から、どのようにボトルネック情報を提供・共有し、目標とすべき指標を使用したらよいかについて検討し、その研究成果を提出した。さらに、TOC(制約条件の理論)とスループット会計に類似した経営手法であるわが国のトヨタ生産方式との比較検討およびバックフラッシュ・コスティングの意義と構造についても併せて考察した。第三に、前年度において実施したオープンブック・マネジメント(OBM)の共通原則と実施上の諸問題に関する文献研究の結果に基づいて、OBM実施企業へのフィールド調査を実施し、現在のところ、その研究成果の提出へ向けた準備を行っているところである。
アルミニウム脱酸鉄中の非金属介在物の起源に関する基礎的研究

1.溶鉄を超急冷できる装置を作成し、非金属介在物をTEMで観察するための新しい試料作製法を開発した。2.超急冷したAl脱酸鉄中には微小球状介在物やネットワーク状介在物が観察された。これらは冷却速度の減少と共にそのサイズが大きくなっており二次介在物と考えられる。微小球状介在物はFeO,FeO・Al_2O_3,Al_2O_3であり,ネットワーク状介在物はAl_2O_3であった。これらのAl_2O_3介在物はαではなくγ,δ,κ,θ-Al_2O_3であった。3.γ,δ,κ,θ-Al_2O_3は液体-Al_2O_3の状態を経由して生成した可能性があり,これについてオストワルドのステップルールと均一核生成理論の立場から考察した。4.デンドライト状,もみじ状の介在物も併せて観察されたが,これらは冷却速度による顕著な観察されず一次介在物と判断した。これらはその枝や葉あるいはその幹がAl_2O_3の場合もあればFeO・Al_2O_3の場合もある。5.Alを溶鉄中に拡散,脱酸させた実験ではAlの拡散最前線に微小なFeO・Al_2O_3が生成していたと考えられ,それが臨界過飽和度に達しデンドライト状やもみじ状の介在物として晶出すると考えられる。さらにAlが拡散し,Al濃度が高くなると微小なAl_2O_3が生成しFeO・Al_2O_3の場合と同様にAl_2O_3がFeO・Al_2O_3上に晶出するかあるいはFeO・Al_2O_3がAl_2O_3に変化すると考えられる。1.あらかじめアルミニウム脱酸した鉄試料を再溶融し超急冷を行った試料中には,直径が50nm程度の微小な球状のアルミナ,ハ-シナイト,FeO介在物が観察された.水冷した場合には0.5μm程度の同様な球状介在物が観察され,冷却速度が大きいほど径が小さく,2次介在物だと考えられる.透過型電顕(TEM)での回折パターンから,アルミナ球状介在物はδ,γ-アルミナだと同定された.急冷の際に,オストワルドのステップルールに基づき,会合体アルミナが不安定な固体δ,γ-アルミナに変化したと考えれば,介在物が安定なα-アルミナでないことの説明はつく.なおアルミニウム濃度が高くなるとFeO球状介在物は減少し,アルミナ球状介在物は逆に増加する.2.炉中で昇温した電解鉄中にアルミニウム脱酸剤を添加し超急冷を行った試料からは,ミクロンオーダーの紅葉状,デンドライト状,棒状,クラスター状,網目状,球状など様々な形態の脱酸生成物が観察された.脱酸剤添加後の時間経過を追った場合にも(1hr.)同様な介在物が観察され,微小な球状介在物は観察されなかった.これは添加した脱酸剤が試料上面に浮くため試料底部までアルミニウムが十分に拡散せず,常に脱酸初期の状態を観察した結果だと推測され,これらの様々の形態の介在物は一次介在物だと考えられる.電解鉄,脱酸剤を共に1600°Cの炉中に投入した場合には,脱酸剤と電解鉄の混合性が良く,この方法で得た試料中には網目状アルミナ介在物と共に微小なFeO,ハ-シナイト,アルミナ球状介在物が観察された.この場合脱酸剤添加後の時間経過と共に微小なFeO球状介在物は減少し,アルミナ球状介在物が増加する.

3.ヨウ素メタノール法によりろ紙上に抽出した微小な介在物を,抽出レプリカの手法を用いて,簡単にTEM観察できる方法を考案した.(1)装置の改善一次脱酸生成物あるいは二次脱酸生成物が坩堝中のどの部分で生成するのかを確認するため、炉の下部の超急冷用のローラーボックスを水槽と交換できるように装置を改良した。これにより、アルゴン雰囲気で試料を坩堝ごと水冷できる。(2)介在物の観察(1)昨年、溶鉄の上部にアルミニウムを添加して溶鉄中にアルミニウムを拡散させた試料の超急冷試料からはデンドライト状、紅葉状等サイズの比較的大きな(数μmから十μm)介在物が観察されていたが、微細な球状介在物が観察されていなかった。今回同じ試料を昨年考案したTEM観察試料作成法に基づき観察したところ、非常に微細(数nm数十nm径)なFeO・Al_2O_3の球状介在物が観察された。(2)(1)と同様な試料を坩堝ごと水冷し観察すると、坩堝下部ではFeO球状介在物、中部ではFeO・Al_2O_3球状介在物(数百nm1μm径)が観察された。上部にはデンドライト状、クラスター状(数μmから十μm)の(1)デンドライト状等の介在物と同サイズレベルのものが観察された。アルミニウム濃度は上部で高く下部では非常に低い。従って溶鉄中へのアルミニウム拡散の最前線付近にFeO・Al_2O_3が生成しているといえ、これが一次脱酸生成物である様々な形状の比較的大きな介在物の生成の前段階に存在し、一次脱酸生成物の生成に重要な役割を果たしていると考えられる。なおこのFeO・Al_2O_3介在物は冷却速度とともにそのサイズが変化しており二次介在物と考えられる。(3)電解鉄(0を100ppm程度含有)を1600°Cで溶融し超急冷あるいは水冷した試料中にFeOの球状介在物が観察された。この溶融Fe-O合金液体は酸素飽和濃度以下の組成にあり、FeOは原理的に二次介在物である。これらはアルミニウム脱酸鉄を超急冷、水冷した試料中の介在物とサイズ、形状がほぼ等しい。
消化器癌の転移制御における分子標的の同定に基づく新しい治療法の確立

消化器癌の予後を規定する最大の因子は、浸潤、転移である。この浸潤、転移の制御こそが我々消化器癌を治療する医師の解決すべき最大の問題である。本研究は分子生物学的アプローチにより、まず癌の浸潤、転移に関わる標的分子を明確にし、さらに遺伝子工学的手法を持って、かかる標的分子の発現および機能の抑制、あるいは強制発現を実現し、合理的な癌治療戦略を確立しようとするものである。本研究で得られた主たる成果は以下のとおりである。1)肝に特異的に発現する遺伝子(kan-1と命名)を発見し、これが肝細胞癌の予後予知因子になることを示した。Rb蛋白を制御する新しい蛋白(gankyrinと命名)を発見し、これが肝細胞癌で過剰発現していることを示した。2)臨床切除標本の検討からVEGF,MMPファミリー、Rho,HME・MMEが癌の浸潤、転移に関与することを示した。3)VEGF遺伝子導入癌細胞株を樹立し、VEGFの増殖、転移における意義を明らかにした。4)MMP阻害剤、血管新生阻害剤の浸潤、転移抑制作用を明らかにした。VEGFの受容体Flt-1の可溶型の発現プラスミドを用いた遺伝子治療実験により、これが癌の腹膜播種を抑制することを示した。1.新しい癌の浸潤・転移関連分子のクローニング・同定。2.既知の癌の浸潤・転移関連分子の臨床的・生物学的意義の解明3.癌の浸潤・転移関連分子の阻害剤を用いた癌治療法の確立1)抗細胞外マトリックス分解療法:MMP活性化阻害剤R94138線維肉腫細胞株の脾注肝転移モデルにて有意な肝転移の抑制が認められた。2)抗細胞遊走療法:低分子量G蛋白質rhoのエフェクター分子であるp160ROCK阻害剤Y-27632を膵癌細胞株に作用させるとin vitroで遊走能の抑制効果が確認され、in vivoでは脾注肝転移モデルにで有意な抗転移効果が認められた。本研究は分子生物学的アプローチにより、まづ癌の浸潤が転移に関わる標的分子を明確にし、さらに遺伝子工学的手法をもってかかる標的分子の発現および機能の抑制、あるいは強制発現を実現し、合理的な癌治療戦略を確立しようとするものである。以下の研究成果を得た。1)肝に特異的に発現する遺伝子(kan-1)を発見し、これが肝細胞癌の予後予知因子となることを示した。2)Rb蛋白を抑制する新らしい蛋白(gankyrin)を発見し、こらが肝細胞癌で過剰発現していることを示した。4)VEGF遺伝子導入癌細胞株を樹立し、VEGFの増殖、転移における意義を明らかにした。5)MMP阻害剤、血管新生阻害剤の浸潤・転移抑制作用を明らかにした。
血漿リボソームタンパク質Ｓ１９の細胞性血栓溶解作用のノックインマウスを用いた検討

リボソームタンパク質S19(RP S19)のリボソーム内機能は維持しながらリボソーム外機能が特異的に障害されるGln137Glu-RP S19ノック・イン・マウスを用いて、RP S19多量体のリボソーム外機能の役割について研究した。1.前年度明らかにしたノック・イン・マウス由来の凝血塊に対するマクロファージ動員の低下と貪食処理遅延は、RP S19多量体の機能を持つC5a/RP S19組換え体を凝血塊内に共存させることで解消した。2.計画では、1に続いて血管内の凝血塊に対するマクロファージ動員におけるRP S19多量体の役割を観察する予定であったが、静脈注射や頸動脈確保手技が確立できなかったため、胸膜炎モデルにおけるマクロファージ動員に関する実験に切り替えて実施した。カラゲニン胸膜炎においても、卵白アルブミンを用いたアレルギー性胸膜炎においても、ノック・イン・マウスでは野性型マウスに比べて胸腔へのマクロファージ動員が減少して多核球の貪食処理が遅延したことで急性炎症が遷延し肺実質まで拡大した。この急性炎症の遷延と拡大も、C5a/RP S19の胸腔内同時投与で完全に防止された。これらの結果から、凝血塊吸収や急性炎症終焉におけるRP S19多量体のリボソーム外機能の重要性が明らかになった。3.計画では、2で起きる脳梗塞を観察する予定だったが、予備的脳観察時に、ノック・イン・マウスの海馬が野生型の70%しかないことを見出した。海馬と皮質の抽出液を調べたところ、海馬にのみRP S19多量体が存在し、しかもノック・イン・マウスではそれが激減していた。そこで一連の行動観察を行った。ノック・イン・マウスでは海馬が関与する空間記憶が低下していた。ノック・イン・マウスを作成して脳を観察したことでRP S19多量体の海馬における予期せぬ役割を見いだせた。本研究は、リボソームタンパク質S19(RP S19)の機能の内、リボソームにおける機能は維持しながら、リボソーム外機能が特異的に障害されているGln137Glu-RP S19ノック・イン・マウスを用いて、RP S19架橋化多量体の単球/マクロファージ動員能と動員細胞による細胞性線溶機構の、凝血塊や血栓の吸収における重要性を明らかにすることを目的としたものである。平成24年度の研究では以下のことが明らかとなった。1.リボソームタンパク質S19(RP S19)の機能の内、リボソームにおける機能は維持しながら、リボソーム外機能が特異的に障害されているGln137Glu-RP S19ノック・イン・マウスを作成し、実験に供する個体数を維持できるようになった。2.in vitroの実験では、末梢血を採取し凝血させて血清を調製し、ヒト末梢血単球に対する走化活性をマイクロチャンバー法で測定する系を用いて、野生型マウス血清が持つ強い単球走化活性が、ノック・イン・マウスの血清には見られないことを明らかにできた。3.in vivoの実験は以下のように行った。両マウスの末梢血0.2 mlを、片方をパラフィルムでシールした細管に流し込んで凝血塊を調製した。その際、野生型マウス由来の血液にはあらかじめ蛍光標識タンパク質を微量混じておくことで標識した。野生型マウスを麻酔下に開腹して両凝血塊を腹腔中に挿入し、縫合閉腹した。

3日目にマウスを安楽死させた後に腹腔内から両凝血塊を回収し、重量測定を行った後に、蛍光強度の測定を行い、吸収の速度を比較した。その結果、ノック・イン・マウス由来の凝血塊では吸収が有意に遅れることが明らかとなった。24年度の研究計画に沿って、Gln137Glu-RP S19遺伝子ノックインマウスを調べていたところ、このマウスは高齢になると大量の自己抗体を産生し始めるという予想外の興味深い表現型を見いだした。その一方で、当該研究はその影響が無い比較的若年のマウスを使って行う必要が出てきたが、それは飼育期間が減るという利点も生む。もともとこの研究の速度は、マウスの繁殖速度と必要な飼育期間が規定する。幸いに、繁殖効率が予想以上に良かったため、繁殖・飼育ケージを増やせば、研究速度を上げて効率よく実験を実施することができた。今後は、敗血症性播種性血管内血液凝固症候群におけるRP S19架橋化多量体の単球/マクロファージ動員能と動員細胞による細胞性線溶機構の病態軽減上の役割を明らかにすることを目的とし、同症候群のマウス用疾患モデルである全身性シュワルツマン反応をノック・イン・マウス並びに野生型マウスに起こさせ、病変の強度を病理学的に比較する。平成25年度に行った実験的研究結果を整理し、学会並びに国際学術誌に公表する。
HGFおよびそのファミリー因子の作用分子機構の解析と神経変性疾患への適用

神経変性疾患に対する新規神経栄養因子としてのHGFの機能解析:戦略として、まず神経特異的HGF発現トランスジェニックマス(HGF-Tg)を作成し、これと神経変性疾患モデルトランスジェニックマウスを交配した。このことで、HGF遺伝子を疾患マウスの神経細胞に直接長期間発現せることができる。このアプローチでスマートにHGFの神経変性疾患に対する効果を解析した。(1)筋萎縮性側索硬化症(ALS)に対するHGF遺伝子供給の効果の解析:まず神経特異的HGF発現トランスジェニックマウス(HGF-Tg)を作成した。HGF-Tgは、生後HGFを神経細胞特異的に発現し、発生過程で運動ニューロン数、筋肉湿重量等に修飾のないラインを選択した。このHGF-TgラインとALSのモデルトランスジェニクマウス(ALS-Tg:SOD1G93A)を交配し、Wildtype、HGF-Tg,ALS-Tg,ALS/HGF-Tgの4群について解析を加えた。ALS-Tgでは、約7ヶ月で運動麻痺を起こし7ヶ月半で死亡してしまうのに対し、ALS/HGF-Tgでは麻痺の発症が遅延し寿命が大幅に延長した。より重篤なALS(+/+)マウスにおいても発症遅延および延命効果があることを明らかにした。さらにALS(+/+)/HGF-Tgでは運動機能も改善し、運動ニューロン数の減少や軸索変性を効果的に抑制することが明らかとなった。メカニズムとしてはcaspase-1の誘導抑制およびAktのリン酸化等運動ニューロンに対する直接的神経栄養効果に加えて、グリア細胞に働きグルタミン酸毒性を抑制している可能性が示唆され、HGFは従来の神経栄養因子に加えた新しいメカニズムを介してより有利にALSに作用することが示唆された。現在筋肉特異的HGF発現トランスジェニックマウスの作成も進めており、これとのトリプルトランスジェニックマウスを作成することでどこまでHGFがALSに寄与できるかの確認を急ぐとともに、HGF供給法の検討も開始する。(2)アルツハイマー病およびパーキンソン病に対するHGFの機能解析:HGFは、大脳皮質、海馬および中脳ドーパミン作動性ニューロンに対して神経栄養活性をもつ。HGFが神経変性疾患で惹起されるこれらの神経細胞死を効率良く抑制し機能を改善するかを解析するため、HGF-Tgをアルツハイマー病モデルトランスジェニックマウスと交配したダブルトランスジェニックマウスを作成している。
ニジマス卵巣のNADPH-チトクロームP450還元酵素とチトクロームb5

サケ科魚の卵母細胞の最終成熟は卵濾胞組織で生成される17alpha,20beta-ジヒドロキシ-4-プレグネン-3-オン(17alpha,20beta-DHP)により誘起されるが、この卵成熟誘起ホルモンの生成には卵濾胞莢膜細胞層での前駆体17alphaヒドロキシプロゲステロン(17alpha-HP)の生成が必要である。本研究では、莢膜細胞での17alpha-HP生成の分子機構を解析することを目的として、ステロイド代謝酵素チトクロームP450c17(17alphaヒドロキシラーゼ/C17-20リアーゼ)の活性に影響を与えると考えられるNADPH-チトクロームP450還元酵素あるいはチトクロームb_5のcDNAをクローニングを行った。ニジマス莢膜細胞のcDNAライブラリーをラットのチトクロームb_5cDNAをプローブとしてスクリーニングした結果、1.5X10^5プラークから7個のポジティブクローンが得られた。現在その中の一つの塩基配列を決定中である。また、NADPH-チトクロームP450還元酵素については、ニジマスのこの酵素は既に精製されておりアミノ酸配列が決定されているので、このアミノ酸配列から予想される塩基配列を持つ合成ヌクレオチドを作成し、それをプローブに現在ニジマス莢膜細胞のcDNAライブラリーをスクリーニング中である。得られたそれぞれのcDNAは塩基配列の決定後、発現用プラスミドに組み込みサルの細胞株COS-1細胞等で発現させて、その活性を調べることにより最終的な同定を行う予定である。既に得られているチトクロームP450c17 cDNAと本課題でのNADPH-チトクロームP450還元酵素とチトクロームb_5のcDNAを用いて莢膜細胞での17alpha-HP生成に果たすこれらの酵素の役割を明らかにして行きたいと考えている。
腸内フローラ構成細菌の産生する一酸化窒素(NO)の生体に及ぼす作用の解析

無菌ラットへの硝酸塩(1mmol/kg/day)投与期間、シトロバクター属菌(Ci)を感染させた。Ciの感染により盲腸内のpHは上昇した。また、本菌の感染により、消化管腔での一酸化窒素(NO)産生、血中および盲腸内亜硝酸塩量の増加が認められた。これらの結果より、腸内菌は血中および消化管内での硝酸塩,亜硝酸塩,NO代謝を調節することが明らかとなった。in vitroでの硝酸塩および亜硝酸塩のHelicobacter pylori増殖に及ぼす効果を調べた。硝酸塩、亜硝酸塩いずれも0.13mM900mMの範囲にて増殖培地に添加して、37°Cにて微好気培養を行った。11mM以上の濃度の硝酸塩添加はH.pyloriの増殖を対照の1/2以下に抑制した。これに対して、0.13mM以上の濃度の亜硝酸塩はH.pyloriの増殖を対照の1/2以下に抑制した。これらの結果よりnitrateに比べnitriteが強い抗H.pylori作用をもつことが明らかにされた。日本食と西洋食の硝酸塩および亜硝酸塩代謝に及ぼす効果に関するボランティア研究を行った。本研究では食餌中への硝酸塩添加が血中および唾液中、硝酸塩および亜硝酸塩濃度にどのような効果を示すかを検討した。硝酸塩を多く含む食餌(日本食型)および硝酸塩を少量しか含まない食餌(西洋食型)を摂取した場合の硝酸塩および亜硝酸塩の体内動態を明らかにした。日本食期間ではボランティアの拡張期血圧の有意な低下が認められた。また、日本食期間の血中硝酸塩および亜硝酸塩はプラセボ期間中のそれらに比べ有意に増加していた。一酸化窒素(nitric oxide : NO)は平滑筋弛緩作用、血管拡張作用、殺菌作用、神経伝達物質としての作用など様々な生理活性を有する。細菌は亜硝酸塩から尿素サイクルを介してNOを産生するが、腸内フローラ構成菌のNO産生性に関する知見は少ない。本研究では腸内菌のNO産生性および消費性を共同研究者が開発した培養バッグ法(Sobko et al., Nitric Oxide 13:272・278,2005)を用いて評価する。本培養バッグ法により、硝酸塩(NO_3)や亜硝酸塩(NO_2)を含まない純粋なNOの定量が可能となる。本年度は培養バッグ法で採取されたガス内のNOを測定する機器の選定を行った。スイスで製造され我が国のEKOコーポレーションにて販売されているCLD66 NOアナライザーが本実験に適切であることが明らかとなった。来年度において種々の腸内フローラ構成細菌のNO産生性および消費性の詳細に関する実験を行っていく。加えて、近年その医学的応用が注目されているプロバイオティクス細菌株のNO産生性の有無および腸内フローラ構成菌のNO産生性および消費性に対する効果について検討を行う予定である。Helicobacter pyloriは胃粘膜に生息するグラム陰性らせん状細菌であり、胃炎を惹起する他、胃・十二指腸潰瘍の再発因子として作用し、かつ胃癌や胃MALTリンパ腫の発生とも関与すると想定されている。H.pylori感染モデルとしてスナネズミを使用して、長期感染とNO産生との関連性を調べるための動物実験を開始した。スナネズミに予め2週間、硝酸塩(nitrate)を経口投与した。その後H.pyloriを経口接種し、本菌の持続感染モデルを作成した。感染3ヶ月後にスナネズミを安楽死させ、胃粘膜内のH.pylori菌数、胃粘膜の肥厚度および炎症スコアの評価、胃粘膜内インターロイキン-8産生量の測走、胃内NO_2/NO_3,iNOS発現などを評価する予定である。腸内フローラ構成菌は硝酸塩より一酸化窒素(NO)を産生する。NOは平滑筋弛緩作用、血管拡張作用、殺菌作用などの作用をもち、種々の疾患の治療、予防および病態に関与することが知られている。本研究では腸内フローラ由来菌のNO消費性およびNO誘導能を解析した。加えて、Helicobacter pyloriの長期感染とNO産生との関連性を調べ、本菌の病原性発現におけるNOの意義について検討を行った。無菌ラットに硝酸塩含有飲料水を1週間摂取させた後、腸内菌として硝酸塩還元酵素および亜硝酸塩還元酵素を有するCitrobacter freundiiを経口接種した。4週後にラットを安楽死させ、血液中、盲腸組織内での硝酸塩および亜硝酸塩濃度を測定した。感染ラットでは血液および盲腸内の亜硝酸塩濃度の有意な上昇を認めた。盲腸内容物におけるアンモニア量の増加も認められた。これらの結果より、C.freundiiは体内に投与された硝酸塩を還元し、亜硝酸塩を産生し、NO産生に寄与することが明らかにされた。スナネズミに予め2週間、硝酸塩を経口投与し、その後H.pyloriを経口接種し、本菌の持続感染モデルを作成した。感染3ケ月後にスナネズミを安楽死させ、胃粘膜内のH.pylori菌数、胃粘膜病変の評価、胃および血中硝酸塩・亜硝酸塩、誘導性NO合成酵素(iNOS)発現を評価した。H.pylori定着菌数およびiNOS量は硝酸塩添加群と非添加群の間に差は認められなかった。硝酸塩添加群では胃腺拡張像、血清中亜硝酸塩濃度の増加、胃内硝酸塩濃度の減少が認められた。

これらの結果より胃内に定着するH.pyloriは硝酸塩、亜硝酸塩の動態に影響を与えることが示された。無菌ラットへの硝酸塩(1mmol/kg/day)投与期間、シトロバクター属菌(Ci)を感染させた。Ciの感染により盲腸内のpHは上昇した。また、本菌の感染により、消化管腔での一酸化窒素(NO)産生、血中および盲腸内亜硝酸塩量の増加が認められた。これらの結果より、腸内菌は血中および消化管内での硝酸塩,亜硝酸塩,NO代謝を調節することが明らかとなった。in vitroでの硝酸塩および亜硝酸塩のHelicobacter pylori増殖に及ぼす効果を調べた。硝酸塩、亜硝酸塩いずれも0.13mM900mMの範囲にて増殖培地に添加して、37°Cにて微好気培養を行った。11mM以上の濃度の硝酸塩添加はH.pyloriの増殖を対照の1/2以下に抑制した。これに対して、0.13mM以上の濃度の亜硝酸塩はH.pyloriの増殖を対照の1/2以下に抑制した。これらの結果よりnitrateに比べnitriteが強い抗H.pylori作用をもつことが明らかにされた。日本食と西洋食の硝酸塩および亜硝酸塩代謝に及ぼす効果に関するボランティア研究を行った。本研究では食餌中への硝酸塩添加が血中および唾液中、硝酸塩および亜硝酸塩濃度にどのような効果を示すかを検討した。硝酸塩を多く含む食餌(日本食型)および硝酸塩を少量しか含まない食餌(西洋食型)を摂取した場合の硝酸塩および亜硝酸塩の体内動態を明らかにした。日本食期間ではボランティアの拡張期血圧の有意な低下が認められた。また、日本食期間の血中硝酸塩および亜硝酸塩はプラセボ期間中のそれらに比べ有意に増加していた。