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日米ICT多国籍企業とアジアICT企業の研究開発力に関する国際比較

リーマン・ショック後の世界経済と多国籍企業の世界では、歴史的に見て大きな構造的な変化が起きていた。「デカップリング論」が指摘するように、新興経済地域の経済成長が、先進国経済地域における経済成長から自立して発展し、逆に先進国経済の景気後退を回復するのに役立つ、という世界経済の構造的変化が起きている。このような世界経済の構造的な変化が、多国籍企業の世界でいかにして起きていたのか、をICT産業で明らかにしている。2010年度に実施した研究実績は、大きくわけて3つの研究成果に分けることができる。その第1は、研究実施計画に基づき、日本とアメリカのICT企業のサービス事業における人材育成(人材開発)に関するヒアリング調査を4回に分けて実施し、その内容を調査報告書にまとめた。調査報告「日本アイ・ビー・エム株式会社における経営戦略と人材育成」(『龍谷大学経営学論集』第50巻第2/3号(査読有り)2010年12月15日発行、3147頁)、調査報告「シスコシステムズ合同会社における人材育成」(『龍谷大学経営学論集』第50巻第4号(査読有り)2011年3月10日発行、134146頁)、調査報告「NECのITサービス事業における人材育成」(『龍谷大学経営学論集』第51巻第1号(査読有り)2011年6月30日発行予定)がそれである。富士通株式会社のヒアリング調査は、次年度に報告書としてまとめる予定である。その第2は、本研究の課題である「日米ICT多国籍企業とアジアICT企業の研究開発力に関する国際比較」をまとめるにあたり、昨年までの科研費補助金(基盤研究B)の成果と本年度に実施した調査報告の成果をまとめて学術論文「リーマンショック後のアジアICT企業」(『アジア経営研究』第17号(査読有り)2011年6月発行予定と巻頭言「市場の危機から政府の危機へ」(『比較経済体制研究』第17号(査読無し)010年12月発行、1-3頁)を研究成果としてまとめた。そして、これらの学術論文をまとめるために学会報告したのが、第3の研究成果である。「世界から見たアジアICT企業の競争力と人材の国際移動」(アジア経営学会第17回全国大会(札幌大学)2010年9月12日)、「世界金融危機後のアメリカ多国籍企業」(アメリカ経済史学会第53回全国大会(関西大学千里山キャンパス):2010年10月9日)がそれである。今日、日米欧ICT多国籍企業とアジアICT企業との間に研究開発力の格差が存在する。本研究の課題は、日米ICT多国籍企業とアジアICT企業との間のICT研究開発力の格差は、どのような内容なのか、今後、この格差は埋められるのか、を解明することにある。平成23年度の研究計画は、4月から9月までを前期としアメリカICT企業を調査対象とした。また、10月から翌年3月までを後期としてアメリカICT企業の日本子会社を調査研究対象としていた。前期の研究成果が、以下の2本の研究成果である。夏目啓二(2011)「アメリカの産業競争力をどう見るか」『経済』No.190,7月号、pp.82-88.「査読なし」夏目啓二・上田智久・陸雲江(2011)「調査報告:NECのITサービス事業における人材育成」『龍谷大学経営学論集』第51巻第1号、6月、30頁39頁。「査読あり」である。これらの調査研究では、ICT産業におけるアメリカ企業と日本企業を調査し、とくに、人材育成に焦点を当てて分析した。このICT産業分野における人材育成に関する開拓的な調査、分析である。また、後期の研究成果が、以下の2本の研究成果である。夏目啓二(2012)「調査報告:富士通のITサービス事業における人材育成」『龍谷大学経営学論集』第51巻第3号、2月、「査読あり」、夏目啓二(2011)「リーマン・ショック後のアジア企業経営」『アジア経営研究』第17号、pp.23-36.「査読有り」である。これらの論文では、リーマンショック後の日米欧のICT産業とアジア企業の経営戦略比較を通じてその企業経営の特質を明らかにした。また、日本のICTサービス企業である富士通における人材育成に関する調査研究を行い、ICTサービス事業における競争優位の源泉を明らかにした。2012年度の研究成果は、以下の3件である。第1は、学会発表:「世界経済危機後の多国籍企業ーWorld Investment Report 2011から読むー」多国籍企業学会西部例会(京都私学会館):2012年3月3日、である。この学会発表は、2011年にUNCTADが発表したWorld Investment Report 2011を分析した報告である。この報告は、本研究の目的である、アジア発多国籍企業の台頭を分析している。報告は、前年度であるが、その研究は、継続して2012年度に引き継がれている。

第2は、夏目啓二(2012)「世界経済危機後の多国籍企業」『龍谷大学経営学論集』第52巻第1号、6月、pp.44-61、査読あり、である。この研究成果は、本研究の目的である、アジア発多国籍企業の台頭の内実を分析している。さらに、アジア発多国籍企業の台頭に対して日米欧の先進国多国籍企業が、いかに対応しているのかを明らかにしている。これにより、本研究の課題である「日米ICT多国籍企業とアジア企業との研究開発力の国際比較」をすることにより、台頭するアジア発多国籍企業の国際競争力の源泉が何であるのかを明らかにしている。第3は、上田智久・夏目啓二(2012)『半導体製造装置企業A社の受注・納入業務と人材育成』『龍谷大学経営学論集』第52巻第2・3号、12月、pp.64-70、である。研究実施計画にもとづき、日本の半導体装置企業を調査し、その人材育成の実態と国際競争力上の意義を確認した。今日、日米欧ICT多国籍企業とアジアICT企業との間に研究開発力の格差が存在する。本研究の課題は、日米ICT多国籍企業とアジアICT企業との間のICT研究開発力の格差は、どのような内容なのか、今後、この格差は埋められるのか、を解明することにある。これまでの研究成果は、日本とアメリカのICT企業のITサービス事業分野での研究開発力の調査分析をおこなってきた。また、アジアICT企業の研究開発力の調査を行い、それらの比較研究を行うことができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度の研究計画を4月から9月までを前期とし在欧州の日米ICT子会社を調査研究対象とする予定であったが、この調査研究は、昨年度に実施することができた。昨年度は、富士通社の在英企業をヒアリング調査することができた。この成果をもとに、これまでの2年間の研究成果を総括する。また、10月から翌年3月までを後期として本調査の全体的な総括を行う。その総括を研究成果としてまとめる予定である。
トビイロウンカのイネの圃場抵抗性に対する適応の遺伝解析

トビイロウンカに対し圃場抵抗性を持つイネ品種IR64を用い、圃場抵抗性に対するトビイロウンカの加害性の遺伝解析を行った。IR64に対して高いパフォーマンス(成長速度と羽化率)を示すウンカ系統と、示さないウンカ系統をそれぞれ作出した。二つの系統を交配し、交配後代のIR64に対するパフォーマンスを検定したところ、F2において両親の中間のパフォーマンスを示し、メンデル遺伝しなかった。F2集団のゲノムDNAを個体別に抽出し、RAD法によってIR64上のパフォーマンスを決定する因子のマッピングを試みた。国際イネ研究所(IRRI)が育成した抵抗性イネ品種のうち、トビイロウンカ抵抗性遺伝子Bph1をもつIR26、Bph1に加えて圃場抵抗性を持つIR64、抵抗性遺伝子bph2を持つIR42、bph2に加えて圃場抵抗性を持つIR36の種子を国内2カ所の機関から入手し、種子を増殖するとともに、トビイロウンカ生存率を指標に抵抗性の強さを調査した。結果、国内1か所から入手したIR品種は、トビイロウンカに対する抵抗性をほとんど失っていた。一方、国内もう1か所から入手した種子は中程度のトビイロウンカ抵抗性を示した。一方、IR64は非常に強い抵抗性を示した。IR64のみが強い抵抗性を示した理由として、IR64が持つ抵抗性が、Bph1, bph2といった主要な抵抗性遺伝子が持つ抵抗性とは異なるメカニズムによって発現している可能性が示唆された。イネ品種IR64が保有する圃場抵抗性の効果がトビイロウンカ系統間で異なるかを明らかにするため、以下の実験を行った。東南アジアにおいてIR64品種の普及する以前に日本に飛来したトビイロウンカ系統C89(1989年筑後市)と最近採集した系統K10(2010年合志市)の2つについて、圃場抵抗性品種IR64と通常の抵抗性品種IR26、感受性品種IR22の3品種の播種後2週間のイネ体に孵化幼虫を放飼し、羽化までの日数、発育ステージ構成の変化および羽化率を比較した。また、Development Index(Bird & Hodkinson, 2005)を求め、各品種に対する適応の程度を比較した。トビイロウンカの羽化率は、どちらの系統もイネ品種間で差がなかった。一方、発育日数は、C89系統と圃場抵抗性品種IR64の組み合わせにおいてのみ一部の個体の発育の有意な遅延が認められた。K10系統は全体的に発育が遅かったが、発育速度に品種間差は認められなかった。要するに、圃場抵抗性IR64の普及前のトビイロウンカ集団はこの品種に対し適応度の低い個体が含まれていることが明らかになった。それぞれのトビイロウンカ系統からIR64上での発育の速い集団、遅い集団のふたつを選抜した。それぞれの系統は交配に備えて継代飼育を行っている。また、テスト用のDNAを抽出し、QTL解析のためのMultiplex PCRによるSNPs多型解析の検討を行った。本年度はライブラリの作成を行った。昨年度作製したトビイロウンカ圃場抵抗性品種IR64の加害系統K10Fと非加害系統C89Sの交配を行い、後代F2世代を作製して、IR64における発育を検定した。K10F♀xC89S♂交配F2世代とC89S♀xK10♂交配F2世代それぞれ3集団について、孵化幼虫を播種後7日後のIR64芽出しを準備したプラスチックカップに移して飼育した。最も早く羽化した個体が得られた日(12ー14日)に残りの個体もすべてサンプリングし、体重を個体別に測定した。また、コントロールとしてK10F系統とC89S系統についても同様のデータを取得した。F2世代458個体の体重は平均1.52gで、親系統(K10F, 1.68g; C89S, 0.73g)の中間の値を示した。回収したF2世代について個体別にゲノムDNAを抽出した。このうち、C89S♀xK10F♀交配F2世代1集団78個体とF0親2個体を用いて、Double-Digested Restriction-site Associated DNA sequences (ddRADseq)ライブラリを作製した。作製したライブラリはイルミナHiSeq2500シーケンサーで解読し、ソフトウェアstacksで解析した。結果、48Gbpの塩基情報から13万のマーカーが得られ、そのうちマッピング可能な共優性のSNPsマーカーが4000以上得られた。現在、表現型データと合わせてQTL解析を行っている。IR64が持つ圃場抵抗性がトビイロウンカの発育に与える影響は、ウンカ系統によって異なることが明らかになった。

IR64が普及する以前のウンカ系統に発育が遅い個体が含まれていることは、野外における加害性の選抜の過程を考えるとリーズナブルである。また、今回発育速度の異なる系統を樹立できたことから、交配実験とQTL解析を行う準備ができた。応用昆虫学今回選抜した系統の交配を行い、遺伝様式を明らかにする。F2世代について個体別にDNAを抽出し、SNPsマーカーを用いてQTL解析を行う。QTL解析の結果から、適応の遺伝的因子を明らかにしていく予定である。初年度は種子増殖と検定方法の調整など準備に時間がかかったが、概ね順調に進んでいる。入手した品種が過去の研究や文献と比較して弱い抵抗性を示さなかった理由として、検定に用いたイネの生育ステージが若かったこと、栽培時の光量が不足していたことが考えられた。また、幼苗における集団飼育では加害性の強さに応じて集団内の個体を分離することが難しい等の問題が生じたため、より生育ステージの進んだイネ体を用いるなど、検定法の改善が必要である。SNPsを用いた多型解析のためにはDNA抽出、multiplex PCRによるマーカー領域の増幅、次世代シーケンス解析のためのライブラリ作成ののち、委託によるシーケンス解析が必要である。このうち、ライブラリの作成から先のステップについては最終年度に行う必要があるが、その準備に時間がかかり、2年目は試薬費等の支出が予定より少なかった。本課題で予定しているIR64とIR36の2つの圃場抵抗性品種のうちIR64が強い抵抗性を示したことから、まずこれに対する加害性の遺伝解析を行うことが有効と考えられる。2年目の計画としてIR64において発育日数が異なる2つのトビイロウンカ集団を作製し、交配と後代検定を行う予定である。次世代シーケンスライブラリの作成に必要な試薬費とシーケンスの委託に必要な経費として最終年度に使用する。また、交配系統の作成と維持に必要な補助員の賃金として使用する。本年度は入手した品種の評価と系統作成を行う予定であったが、最初に入手した品種が期待された形質をもたなかったため、別の機関から品種を再入手して増殖したのち、再実験を行う必要が生じた。このため、選抜系統の作製と検定、DNA抽出と多型解析等その他の実験を次年度に行うことにした。平成25年度に行う予定だった交配後代のDNA関連の実験に必要な試薬について、平成26年度に購入して実験を行う予定である。具体的には、DNA抽出キット6万円、RNA抽出キット6万円、シーケンス試薬13万円等。
酵母新規応答型プロモーターの開発によるアルギン酸からの効率的なエタノール発酵

アルギン酸資化能を酵母に付与するためにSaccharophagus degradans由来のエンド型及びエキソ型アルギン酸リアーゼをコードする遺伝子、Asteromyces cruciatus由来DEH transporter遺伝子、Vibrio splendidus由来DehR遺伝子、Escherichia coli由来KdgK遺伝子、Vibrio splendidus由来KdgpAをゲノムに導入し、アルギン酸資化酵母を作出した。アルギン酸を唯一の炭素源とする培地を用いた培養試験によって、構築した酵母がアルギン酸を資化できることを確認した。さらにアルギン酸資化能を増強するために、アルギン酸を唯一の炭素源とする培地で継代培養を行った。その結果、アルギン酸資化能が増強したAlg1株の育種に成功した。次に、嫌気的な培養条件では、アルギン酸の資化効率が低かったため、酵母の改良を行なった。特に、細胞内のレドックスバランスを調整するためにAlg1株にマンニトール資化能を付与した。Alg1株をマンニトール含有の最小培地で培養し、マンニトール資化関連遺伝子の発現が高まったAM1株の育種に成功した。本株は、アルギン酸とマンニトールを同時に資化できることを見出した。本株により、アルギン酸とマンニトールの混合培地から直接のエタノール生産に成功した。さらに、pHや温度などの発酵条件を最適化することで、より効率的にエタノール発酵できることを確認した。28年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの研究で行った定量プロテオーム解析の結果を踏まえて、S. degradansのアルギン酸資化経路の予測を行った。特に、アルギン酸分解単糖であるDEHを資化するための最初の酵素であるDEH reductase(DehR)を同定するために、DehR候補遺伝子の大腸菌での異種発現系を構築し、DehR活性検出に成功した。さらに、S. degradansのゲノム情報を活用することで、DEHからピルビン酸まで代謝経路を予測した。S.degradans由来Endo型アルギン酸リアーゼとExo型アルギン酸リアーゼを一つの酵母の細胞表層に提示させるためのプラスミド構築を行った。それぞれのタンパク質をFLAG tag及びStrep tagと融合発現することで、Endo型・Exo型アルギン酸リアーゼが一つの酵母の細胞表層に提示されていることを確認した。さらにpHや温度などの反応条件を最適化することで、Endo型・Exo型アルギン酸リアーゼ共提示酵母によるアルギン酸の効率的な分解に成功した。DEH資化酵母作製のために、プロテオーム解析と代謝酵素機能解析によって同定に成功したS.degradans由来のDEH代謝酵素遺伝子を酵母に異種発現させた。DEH代謝酵素遺伝子は酵母にコドンを最適化して、プロテインタグと融合発現した。さらに、これまでの報告を参考にして、DEHトランスポーター遺伝子を人工合成し、EGFPと融合発現することで細胞膜への局在を確かめた。現在、DEHトランスポーター及び代謝酵素遺伝子をすべて一つの酵母に導入後、DEHを唯一の炭素源とする培地で培養することで、DEHを資化することを確かめている。本年度は、当初予定していたEndo型・Exo型アルギン酸リアーゼ共提示酵母の作製を完了した。また、DEHトランスポーター及びDEH代謝酵素遺伝子を全て一つの酵母にゲノム挿入し、機能解析した。作製した酵母を用いて、アルギン酸からのエタノール発酵を行う予定である。生育阻害などが確認された場合、当初の計画通りストレス応答性のプロモーター開発によって細胞ストレスを制御するシステムを構築する予定である。
金属焼付陶材の焼成速度と残留応力の関係に関する研究

焼付用合金と陶材の温度依存の物理、機械的性質及び複合化にあたっての素材の力学的挙動と作製条件との関係について調べ、以下に示すように結果を整理した。1.本研究に係わる分野の研究場況を整理し、研究目的を達成するに必要な項目を明らかにした。そして、シミュレ-ションプログラムを開発、利用して以下の35に関して有益な結果を得た。2.市販焼付用合金の現況について調べ、今後、研究開発の必要性をもつPd基の焼付用合金の合金組織と熱膨張係数の温度依存性、相変態と熱膨張係数の関係について調べた。そして、固有状態で変態をもたない2元合金の熱膨張係数の推定法を明らかにした。また、一次相変態、二次相変態と熱膨張係数の関係を定量的に明らかにした。3.陶材の冷却速度と残留応力の関係、残留応力の発生機構の定量的解析を行い、冷却速度と陶材使用時の強度の関係を明確にした。4.陶材のガラス転移温度域での粘弾性挙動の解明を試み、陶材の冷却時のガラス転移温度域での挙動と加熱時の加熱速度、外からの負荷荷重、変形温度の関係を明らかにした。5.陶材/合金積層板の適合性につして、シミュレ-ションプログラムを利用して実用材料について熱膨張係数、陶材の粘度、冷却速度と残留応力の関数について調べた。その結果、陶材のガラス転移温度域での熱膨張係数の適合と冷却速度が重要な因子であることが明らかにされ、相互の関係について定量的に調べた。6.陶材及び陶材/合金積層板中の残留応力の評価法として熱衝撃試験を試み、冷却速度と残留速度と残留応力の関係を熱衝撃試験により明らかにした。金属焼付陶材の焼成過程での内部応力と熱変形を計算するプログラム,すなわち異種材料を積層した複合材料の熱変形問題に関するプログラムを以下の点を検討して作成した.1.加熱/冷却過程での材料内温度分布は熱伝導方程式の解析解より求めた.2.前記の温度場で生じる内部応力,材料の変形は不静定梁の理論より導いた.3.材料の弾性係数,熱膨張係数,粘性係数の温度依存を考慮した.4.相変態と加熱/冷却速度の関係を考慮した.シミュレーションに必要な素材の物理的性質を測定した.各種市販合金,市販陶材について熱膨張係数,陶材の転移温度領域での性質を明らかにした.上記のプログラムと測定データを用いて,歯科焼付用陶材の焼成過程での冷却速度と残留応力の関係を明らかにした.また,残留応力の発生メカニズムを連続体力学の立場から考察し,その制御方法につき検討した.また,陶材の加熱過程をシミュレートし,その結果から測定時の加熱速度,負荷荷重が陶材の変形温度,荷重軟化温度に及ぼす影響を明らかにした.次に,合金と2層の陶材を積層したモデルに対し解析を試み,合金と陶材の不適合性について,冷却速度,熱膨張係数のミス・マッチと残留応力,熱変形の関係を調べ,考察した.以上の解析は平板積層モデルに対してなされたが,歯科補綴物の焼成問題へ適用するには,平板モデル同様円筒モデルに対する解析も重要であるところから,現在,軸対称モデルの解析方法につき検討中である.歯科材料学の分野での合金・陶材接合問題に関する研究の動向を整理し、本研究の位置付けをした(日本金属学会会報に掲載)。転移温度域での陶材の応力緩和現象、材料の熱膨張・収縮挙動が冷却過程と加熱過程とで異なることに着目し、その相互関係を明確にして、シミュレーション・プログラムを開発した。そして、陶材の変形温度が合金・陶材積層板中に応力が生じ始める温度と一致することが明らかにされた。市販焼付用陶材の変形温度と加熱速度との関係について調べ、材料間の熱・機械的性質の違いと陶材の焼付方法との関係について検討した。

パラジウム基の二元合金(Pd-Ag:Pd-Cu:Pd-Co)について、温度依存の熱膨張係数を状態図、融点、鋳造偏析、相変態との関係で調べ、合金組成と熱膨張係数の関係を明らかにし、焼付用合金開発の指針を示した。また、市販焼付用合金について、温度依存の熱膨張係数を調べ、貴金属系の合金と卑金属系合金を比較し、陶材焼付時の適合性を検討した。その結果、卑金属系の合金では鋳造後のマクロ偏析が大きい。従って、鋳放し材では熱膨張係数の温度依存性が大きくなり、合金の鋳造性に関する特性が、技工上の問題になることが示された。補綴物の形態と適合性との問題を明らかにする目的で、平板モデル、円筒モデル、球殻モデルでの積層材中の残留応力分布の違いについて検討し、在来の合金・陶材間の適合性に関する評価方法に問題があることを指摘した。加熱・冷却の方法と適合性の問題については現在、シミュレーション・プログラムを開発中であり、次年度に明らかにする予定である。上記の研究に利用されたプログラム、材料の熱・機械的性質に関する資料は、パーソナル・コンピュータでの利用に供する為の準備を終え、次年度に移行する予定である。市販焼付用合金の現況について調べ、今後、研究開発が必要性と考えられているPd基の合金の合金組成と熱膨張係数及びその温度依存性、相変態と熱膨張係数の関係について調べた。そして、固相変態をもたない2元合金の熱膨張係数の推定法と一次相変態、二次相変態と熱膨張係数の関係を定量的に明らかにした。金属焼付陶材の焼成過程での冷却速度を実測し、焼成条件、補綴物の大きさと冷却速度の関係について調べた。その結果、陶材の冷却過程の温度変化は時間の指数関数で、冷却速度は時間の一次式で表示され、歯科技工で利用されている冷却方法とその定数との関係が明かにされた。陶材のガラス転移温度域での冷却速度をシミュレ-ションプログラムに組み込み、金属焼付陶材の焼成過程で生じる残留応力の推定を試みた。焼付用陶材のガラス転移温度域での粘度は残留応力を決める重要な因子であるところから、この温度域での粘度の測定方法を考案し、市販陶材について粘性の活性化エネルギ-を測定した。今後は、数歯にわたる大きな金属焼付陶材補綴物が臨床的に要求されてきたことから、焼付用合金を固溶硬化、時効硬化により強化したときの問題点、すなわち、合金の相変態時の温度、歪の変化と陶材を焼付けたときの残留応力との関係を明らかにして上記の目的を達成することを計画している。
遺伝子導入動物における導入遺伝子構造と発現遺伝子産物の機能について

プリオン病のモデル動物としての遺伝子改変マウスは、プリオン複製の仮説からすると、正常なプリオン蛋白質を過剰に発現する方が有利であると考えられる。実際にハムスターやマウス型のプリオン蛋白発現系マウスでは過剰発現による高感受性マウスの系統が樹立されている。我々は、ヒト・プリオンに対するバイオアッセイ系の確立を目指している。ヒト/マウスキメラ型プリオン蛋白質(キメラ型)を発現する遺伝子改変マウスは、ヒト・プリオンに対して高い感受性を示すことが判明したが、過剰発現になると抵抗性を示すことも明らかになった。次に、C末端までヒト型プリオン蛋白質を発現する、全ヒト型プリオン蛋白質遺伝子導入マウス、同じ導入ベクターを用いた全マウス型プリオン蛋白質遺伝子導入マウスについても検討した。その結果、全ヒト型マウスと全マウス型プリオン蛋白質遺伝子導入マウスでは共に発現量が高くなるにつれて感受性が高くなることが判明した。このことから、プリオン病モデル動物作製時の導入遺伝子のキメラ型遺伝子産物は、必ずしもプリオン複製の仮説にそぐわないことが推定された。このことは、導入遺伝子産物の一次構造がその機能発現に影響していることを示唆するものであった。1.トランスジェニックマウスの作製マウスプリオンタンパク遺伝子のpromoter, exson, intron, exson2, intron2の基本構造とexson3のORFのシグナルペプチドを含むN-末端は全て共通で、制限酵素SmaIサイト以降のORF全てをヒト型に置換したヒト全長導入遺伝子(Tg-HuW)、SmaI-BstEII間をヒト型配列に置き換えプロセッシングに関連するC-末端をマウスにしたヒト・マウスキメラ導入遺伝子(Tg-ChM)、対照としてORFも全てマウス型のマウス全長導入遺伝子(Tg-HuMo)の3タイプのTgマウスを作製した。続いてこれらをTgマウスをプリオンタンパク遺伝子ノックアウトマウス(以下PrPKOと略す)と交配し、それぞれのマウスについて、ヒトプリオンタンパク質、ヒトプリオンタンパクC末ペプチドに対する抗体を用いて、ウエスタンブロットによりそれぞれの導入遺伝子産物(ヒトプリオンタンパク質)発現を確認した。2.導入遺伝子発現とプリオンに対する感受性その結果、マウス/ヒトキメラプリオンタンパク遺伝子導入マウスではマウス内在性のプリオンタンパク遺伝子の存在がヒト・プリオンの感受性に抑制的に働くことが明らかとなった。しかしながら、同じ導入ベクターを用いながら全マウス型プリオンタンパク遺伝子発現マウスでは内因性のマウスプリオンタンパク遺伝子に相加的に作用することがことが示された。また、これらのマウス/ヒトキメラプリオンタンパク遺伝子導入マウスでは発現量の増加が必ずしも感受性の増加にはならないことも明らかにされた。1.トランスジェニックマウスとノックインマウスの作製マウスプリオンタンパク遺伝子のpromoter,exson, intron, exson2, intron2の基本構造とexson3のORFのシグナルペプチドを含むN-末端は全て共通で、制限酵素SmaIサイト以降のORF全てをヒト型に置換したヒト全長導入遺伝子(Tg-HuM)、SmaI-BstEII間をヒト型配列に置き換えプロセッシングに関連するC-末端をマウスにしたヒト・マウスキメラ導入遺伝子(Tg-ChM)、対照としてORFも全てマウス型のマウス全長導入遺伝子(Tg-HuMo)の3タイプのTgマウスを作製した。同じ遺伝子構造でヒト型ノックインマウス、Ki-HuMとKi-ChMを作製し、Tgマウスと交配することによりそれぞれの過剰発現系を作製した。

また、これらのマウス/ヒトキメラプリオン蛋白質遺伝子導入マウスでは発現量の増加が必ずしも感受性の増加にはならないことも明らかにされた。しかしながら、ヒト全長遺伝子導入マウス、Tg-HuMとKi-HuMを組み合わせたものは発現量の増加と共に感受性が向上した。これまでの研究で、マウス/ヒトキメラプリオンタンパク遺伝子導入マウスではマウス内在性のプリオンタンパク遺伝子の存在がヒト・プリオンの感受性に抑制的に働くことを明らかにした。また、マウス/ヒトキメラプリオンタンパク遺伝子導入マウスでは発現量の増加が必ずしも感受性の増加にはならないことも明らかにした。しかしながら、同じ導入ベクターを用いた全ヒト型プリオンタンパク遺伝子発現マウスの感受試験の結果、C-末端までヒト型プリオン蛋白遺伝子の構造を有するTgマウス、ノックインマウスでは発現量にしたがってヒト・プリオンの感受性が向上することが判明した。本年度はこれらのマウス/ヒトキメラプリオンタンパク遺伝子導入マウスの凍結脳を用いてウエスタンブロッティングによる詳細検討した。解析に使用した抗体はヒト型プリオンタンパク質にのみ反応し、マウス内在性の野生型プリオンタンパク質には反応しない3F4と、逆にマウス野生型プリオンタンパク質にのみに反応してヒト型プリオンタンパク質には反応しないSAF-83である。この結果、導入マウス/ヒトキメラ型プリオンタンパク遺伝子産物はヒト・プリオンにより効率的に変換されるが、マウス内在性のプリオンタンパク遺伝子産物の存在により異常プリオンタンパク質(PrP^<Res>)に構造変換されにくいことが明らかになった。同様に、マウス内在性のプリオンタンパク遺伝子産物も導入マウス/ヒトキメラ型プリオンタンパク遺伝子産物の存在によりPrP^<Res>に構造変換されにくいことが明らかになった。そして、その抑制効果はマウス/ヒトキメラ型プリオンタンパク遺伝子産物が内因性プリオンタンパク遺伝子産物の構造変換を抑制する方が大きいことが明らかとなった。このことは、今後、内因性プリオンタンパク質が導入されたプリオンタンパク遺伝子産物に与える影響を考えるうえで重要である。
圧縮変形を考慮した大型ケーブルインコンジット超伝導体内の素線位置の最尤推定解析

大型超伝導コイルではケーブル・イン・コンジット導体を用いるが,高磁界下で運転すると予期しない超伝導特性の劣化が発生する場合がある。この原因は,各素線が初期に予想されていた位置から大きく変位して外部磁界と不規則に鎖交して発生することによる。この特性劣化を究明するために,導体の製造パラメータ(素線占有率,撚りピッチなど)と圧縮変形を考慮した等面積法と各素線の機械的エネルギーを最小化する方法で3次元素線配置を解析し,実際の素線位置測定結果と比較した。その結果,種々の統計的指標が一致したので,この解析方法を基に特性劣化の原因を究明し,その対策を提案した。大型の超伝導コイルでは,多数本の細い超伝導線を撚り合せて圧縮し,コンジットの中に挿入した構成のケーブル・イン・コンジット(CIC)導体を用いるが,高磁界下で運転すると,予期しない超伝導特性の劣化が発生する場合がある。これらの原因究明のためには,CIC導体内各素線の3次元位置の情報を詳細に把握する必要がある。CIC導体を約1cm幅に切断して,各素線の3次元位置を計測する装置を開発して測定した結果,多数本の超伝導素線が導体製作時に圧縮を受けて,予期していた所定の位置から大きく変位するために発生することが分かった。導体を構成する製造パラメータである素線径,素線占有率,各サブケーブル次数の撚りピッチ,導体の断面形状などに注目して,圧縮変形を反映できる断面内の素線位置を解析する等面積法を提案した。この解析結果と3次元実測結果と比較した結果,素線がケーブルの表面に現れる平均の長さや,表面に出てこない素線数などのパラメータは比較的良く一致した。しかし,等面積法では,素線同士が重なりある場合があるので,素線間の機械的エネルギーを評価して全素線の総エネルギーが最小となるように素線に微小な摂動を加えて素線配置の最適化を行った。その結果,素線の重なりを解消すると同時に,素線が表面に出現する平均長さやその標準偏差を実測値と一層合致することを確かめた。実際の導体間の接続を考えると,全ての素線がケーブル表面に現れて同程度の長さで接触すると,接続部での直流電流の分布が等しくなるはずであるから,導体の製造パラメータである各サブケーブルの撚りピッチを変化させてパラメータサーベイを行った。その結果,計測したCIC導体では約13%の素線が表面に現れなかったが,全ての素線が表面に現れるピッチを見つけることができた。また同時に,標準偏差も少なくでき,接続部での一様電流分布の可能性を明らかにした。大型の超伝導コイルでは,大電磁力に耐えるために,細い超伝導線を多数本撚り合せて圧縮し,ステンレスのコンジットの中に挿入して構成したケーブル・イン・コンジット(CIC)導体を用いる場合が多い。しかし,高磁界下で励磁すると予期しない異常な交流損失を発生する場合がある。これらの原因究明のためには,CIC導体内各素線の3次元の位置情報を詳細に把握する必要があるので,CIC導体を1cm幅に切断して各素線の位置を測定した。その結果,多数本の超伝導素線が製作時に圧縮を受けて,所定の位置から大きく変位し,これが特性劣化を惹起する主要な原因であることが分かった。この解明のために,導体の製造時の圧縮工程を考慮した断面内の素線位置を解析する等面積法を提案したが,素線同士が重なる場合が出てくるので,遺伝的アルゴリズムを用いて全素線の機械的エネルギーが最小となるように素線に微小な位置摂動を加えて素線の再配置を行うことにより素線の重なりを解消した。また,導体内の素線配置分布の妥当性を推定するために,統計的な分布指標として,素線位置の変位,3本で構成する面積,ツイストピッチ等の変形に関する指標,および,素線対で構成されるループ長,ループ面積,接触長等のループ特性に関する指標,素線がケーブルの表面に出現する指標,交流損失の指標などを用いる。解析と実験でこれらの指標を調べた結果,傾向は比較的一致したので,本素線配置の解析手法は実際のケーブルの特性を良く反映しているといえる。特に,導体内電流分布の偏流の原因の一つである素線の表面出現特性は,ピッチを最適化することにより全素線が均等に表面に現れることが分かり,本解析方法は偏流現象の防止として有効な方法であることを示した。また,交流損失のツイストピッチ依存性を調べると,適切なループの構成が可能であることが分かり,交流損失の低減にも有用であることが分かった。

大型の超伝導コイルでは,多数本の細い超伝導線を撚り合せて圧縮し,コンジットの中に挿入した構成のケーブル・イン・コンジット(CIC)導体を用いるが,高磁界下で運転すると,予期しない超伝導特性の劣化が発生する場合がある。これらの原因究明のためには,CIC導体内各素線の3次元位置の情報を詳細に把握する必要があるので,CIC導体を約1cm幅に切断して,各素線の位置を測定した。その結果,多数本の超伝導素線が導体製作時に圧縮を受けて,所定の位置から大きく変位するために発生することが分かった。この解明のために,導体の圧縮変形を反映できるように導体の製造過程を考慮した断面内の素線位置を解析する等面積法を提案した。等面積法では,素線同士が重なる場合があるので,全素線の機械的エネルギーが最小となるように素線に微小な摂動を加えて素線配置の最適化を行った。その結果,素線の重なりの解消と同時に,素線の表面に出現する長さ分布などが実測結果と良く一致した。実測したCIC導体では約13%の素線がケーブル表面に出現しないことがわかり,その導体製造条件を基に解析すると,同様に約13%の結果を得ることができた。導体の製造パラメータの一つである各サブケーブルの撚りピッチが素線分布に大きな影響を与えているのが分かったので,全ての素線が表面に出現するピッチの条件を見つけ,かつ,標準偏差も少ない条件を明らかにした。さらに,実際の素線分布の状態を表す評価指数として,ケーブル表面に出現する素線分布,素線間で対を形成するループのループ長や接触長分布などを提案した。また,素線間の機械エネルギーを最小とする摂動計算の遺伝的アルゴリズムを工夫して時間短縮した。さらに,実導体を用いて極低温下でケーブル表面に出現する素線分布を調べ,本解析方法の妥当性を得た。初期に予定していた3次元素線位置測定の技術は確立できた。この結果を用いて,接続部の直流特性を調べた結果,ケーブル表面に現れない素線の割合が13%もあることが分かった。さらに,等面積法を用いるとこれらの結果を予想することができた。また,機械エネルギーを導入すると,素線同士の重なりがなくなり,現実に近い素線配置になると同時に,一層の素線位置の推定が可能となった。これらは世界で初めての結果であり,国際超電導会議では多くの研究者から注目を浴びた。25年度が最終年度であるため、記入しない。CIC導体内の素線位置の3次元計測技術は確立できた。また,導体製造工程を考慮した等面積法を用いて導体内の素線位置分布を解析した。その結果は実際に測定した素線位置分布と統計的に良く一致することが分かった。また,現実の素線配置に近づけるために,機械エネルギーを最小にする摂動解析により素線間の重なりも解消できた。さらに,解析法の妥当性を実証するために,ケーブルの表面に出現する素線の長さ分布を実際の導体を用いた極低温下での抵抗測定評価により,本提案方法の有効性が実証された。多数本の素線位置を3次元で推定できる可能性の高いことが分かったので,位置推定の基準となる指標を定め,それらの評価を行うことで統計推定を評価する必要がある。これまでの結果から,素線がケーブルの表面に現れる素線数や長さの指標では統計的に一致することを確かめたので,今後は,実際のCIC導体を分解して表面に現れる素線数や長さを実験で実証する計画である。さらに,他のCIC導体についても同様な指標について調べて,推定技術の確立を図る。さらに,素線間の機械エネルギーを最小とするための計算時間は極めて長いので,遺伝的アルゴリズムを導入するなどして計算時間の短縮を図る計画である。
免疫病の病因と病理-組繊傷害機序を中心に-

いわゆる膠原病群の中で量的質的に大きな部分を占める難治性炎症性疾患には常に免疫異常の影がつきまとう。これらの病態とその病因は極めて複雑で、一次的な病因に二次、三次の反応が重なり病像が進行してゆく。近年の免疫学の進行は、これらの疾患の一次的あるいは求心的部分の異常のいくつかを説明してくれるようになったが、それにより細胞組織が破壊されてゆく遠心的部分、例えば肉芽腫という破壊と増生の入り混った病像が何故生体のフィードバック機構がかからず進行してゆくのかといった点はなお、不明である。我々はこれらの機序を、破壊する側の細胞とされる側の細胞および増殖するintrinsicな細胞間の相互作用からなるcell sociologyの立場から捉え、上述の問題の解明を試みた。1,SLE,PN,RAに代表される免疫病の病像の基本型である(1)糸球体腎炎、(2)血管炎、(3)肉芽腫、についてその浸潤細胞、増殖細胞、免疫複合体を主に単クローン性抗体を用いた免疫組織学的解析を行った。2,これらの病像の発現と進行に重要な役割をはたすと考えられた宿主要因として(1)免疫複合体、(2)レトロウィルス、(3)クロファージ、(4)T細胞由来調節因子をとりあげ、以下に概略する如く、新しいアプローチと方法論をもって、これらの組織傷害機序における重要性を明確にした。(1)では単クローン性抗体の分子的マニプレーションを通じて免疫複合体機能の発現機構を解析、またループスマウスの免疫複合体の化学的性状を分析した。(2)ではレトロウイルスの細胞膜抗原修飾による動脈炎発症機序を免疫病理学的、ウィルス学的見地から明らかにした。(3)では肉芽腫性炎の発症におけるマクロファージの機能異常の重要性とその機能を制御する因子の異常の存在を示した。(4)ではT細胞産生因子が難治性炎症において一方では増悪因子として、他方では機能回復因子として働く事実を示した。以上、免疫応答調節異常から来る難治性炎症性疾患としての実験モデル系を確立した。
放射光微小血管撮影法を用いた肺高血圧症における微小肺細動脈リモデリング解析

肺動脈性肺高血圧症は、原発性ないし種々の疾患に伴って肺動脈圧が上昇する肺血管疾患であり、無治療では予後不良の病態である。肺動脈性肺高血圧症の原因には特発性肺動脈性肺高血圧や膠原病、先天性心疾患に伴う高肺血流によるものなどが様々であるが、いずれの肺高血圧症でも肺細動脈の中膜肥厚や内膜増殖、さらには叢状病変を認める。これらの変化は、炎症や増加したshear stressによって血管内皮細胞が障害され、エンドセリン(Endothelin: ET)や血管内皮増殖因子(Vascular endothelial growth factor :VEGF)などの物質が肺動脈閉塞の進行へ関与している可能性が示唆されている。本研究は高エネルギー加速器研究機構放射光研究施設における放射光由来X線源と高感度HARP受像管、ハイビジョンシステム(NHK放送技術研究所提供)を用いた高感度放射光微小血管撮影法を用いて、肺動脈における微小血管血流変化と血管内皮細胞障害の機序を解明すること目的としている。この高感度放射光微小血管撮影法の最も大きな特徴は、ラットなどの小動物におけるin-vivoの血管リモデリング可視化を可能にすることができる点である。本年度は、炎症性肺高血圧症であるモノクロタリン誘導肺高血圧ラットおよび腹部大動脈ー下大静脈シャントによる高流量性肺高血圧症モデルラットを作成し、異なるメカニズムによって惹起される微小肺動脈血管抵抗増加を可視化し、さらには肺動脈流速を測定することにより、微小肺動脈にかかるシアストレスを定量化することを試みている。また、この微小血管撮影法によるシアストレス評価を、病理組織学的所見と比較することにより、従来では生検による病理組織診断のみが病期評価を行う手段であった肺高血圧症に対する、非侵襲的病期診断モダリティとしての高感度放射光微小血管撮影法の確立を目指している。本研究は、高エネルギー加速器研究機構において、放射光由来X線源と高感度HARP受像管、ハイビジョンシステム(NHK放送技術研究所提供)を用いた高感度放射光由来微小血管撮影法を用いた研究である。高エネルギー加速器研究機構との共同研究においては、あらかじめ年間マシンタイムの割り当て調整が必要であり、常時施行可能ではない。また、同様にマシンタイムに合わせた、HARP管使用日程の調整が必要であり、年間で限られた日数しか微小血管造影が施行できない点が研究の律速段階となり、また遅れを生じる原因となる可能性がある。しかしながら、高エネルギー加速器研究機構での実験施行時には、良好な微小血管造影が施行できており、全体としてはおおむね順調に研究は進展していると考えている。肺高血圧症の重症度を評価するための診断モダリティとして、肺動脈シアストレスの評価を行うための、肺動脈内微小血管における肺血流量の評価と、その病理学的評価との相関を評価する予定である。また、肺高血圧症の原因となる微小肺血管抵抗増加と、肺血流量の関連を異なる肺高血圧モデルで評価する予定である。肺動脈性肺高血圧症は、原発性ないし種々の疾患に伴って肺動脈圧が上昇する肺血管疾患である。肺動脈性肺高血圧症の原因は、特発性肺動脈性肺高血圧や膠原病、先天性心疾患に伴う高肺血流によるものなど様々であるが、いずれの肺高血圧症でも、肺細小動脈のびまん性閉塞を認め、これが肺高血圧の重症度に相関すると考えられている。肺高血圧症の重症化にともない、右心不全や呼吸不全が順次進行する予後不良の難治性疾患として知られているが、近年では血管拡張薬などの開発により、肺高血圧症の治療成績の向上が期待されている。この好感度放射光微小血管撮影法の最も大きな特徴は、ラットなどの小動物におけるin-vivoの血管リモデリング可視化を可能にすることができる点である。本年度は、炎症性肺高血圧症であるモノクロタリン誘導肺高血圧ラットを作成し、比較的早期肺高血圧症モデルと考えられる投与2週間および進行期と考えられる投与3週間の、異なる病期の肺高血圧モデルを用いて、病期進行に伴う経時的な微小肺動脈の狭小化とを可視化を試みた。この高感度放射光微小血管撮影法を新たな診断モダリティとして使用することにより、経時的な肺高血圧症における病期診断が可能となることが示唆された。本研究は高エネルギー加速器研究機構において放射光由来X線源と高感度HARP受像管、ハイビジョンシステム(NHK放送技術研究所提供)を用いた高感度放射光微小血管撮影法を用いるため、施行可能な時期が極めて限られているため常時研究が継続できるわけではない点が研究の遅れおよび律速段階となりうる。しかしながら、放射光実験施行時には、良好な高感度放射光微小血管撮影が施行できており、全体としておおむね順調に研究が進展していると考えている。

これらの変化は、炎症や増加したshear stressによって血管内皮細胞が障害され、エンドセリン(Endothelin: ET)や血管内皮増殖因子(Vascular endothelial growth factor :VEGF)などの物質が肺動脈閉塞の進行へ関与している可能性が示唆されている。本研究は高エネルギー加速器研究機構放射光研究施設における放射光由来X線源と高感度HARP受像管、ハイビジョンシステム(NHK放送技術研究所提供)を用いた高感度放射光微小血管撮影法を用いて、肺動脈における微小血管血流変化と血管内皮細胞障害の機序を解明すること目的としている。この高感度放射光微小血管撮影法の最も大きな特徴は、ラットなどの小動物におけるin-vivoの血管リモデリング可視化を可能にすることができる点である。本年度は、炎症性肺高血圧症であるモノクロタリン誘導肺高血圧ラットおよび腹部大動脈ー下大静脈シャントによる高流量性肺高血圧症モデルラットを作成し、異なるメカニズムによって惹起される微小肺動脈血管抵抗増加を可視化し、さらには肺動脈流速を測定することにより、微小肺動脈にかかるシアストレスを定量化することを試みている。また、この微小血管撮影法によるシアストレス評価を、病理組織学的所見と比較することにより、従来では生検による病理組織診断のみが病期評価を行う手段であった肺高血圧症に対する、非侵襲的病期診断モダリティとしての高感度放射光微小血管撮影法の確立を目指している。本研究は、高エネルギー加速器研究機構において、放射光由来X線源と高感度HARP受像管、ハイビジョンシステム(NHK放送技術研究所提供)を用いた高感度放射光由来微小血管撮影法を用いた研究である。高エネルギー加速器研究機構との共同研究においては、あらかじめ年間マシンタイムの割り当て調整が必要であり、常時施行可能ではない。また、同様にマシンタイムに合わせた、HARP管使用日程の調整が必要であり、年間で限られた日数しか微小血管造影が施行できない点が研究の律速段階となり、また遅れを生じる原因となる可能性がある。しかしながら、高エネルギー加速器研究機構での実験施行時には、良好な微小血管造影が施行できており、全体としてはおおむね順調に研究は進展していると考えている。今後は、エンドセリン受容体拮抗薬やホスホジエステラーゼ5阻害剤などの肺高血圧症の治療薬の効果を評価する診断モダリティとしての、高感度放射光微小血管撮影法の確立を進めてゆく予定である。また、安定的にラットに上記内服薬を投与する方法の検討が課題である。肺高血圧症の重症度を評価するための診断モダリティとして、肺動脈シアストレスの評価を行うための、肺動脈内微小血管における肺血流量の評価と、その病理学的評価との相関を評価する予定である。また、肺高血圧症の原因となる微小肺血管抵抗増加と、肺血流量の関連を異なる肺高血圧モデルで評価する予定である。撮影した画像からら血管内変位追跡プログラムを使用して、微小肺動脈内血流流速測定を行う計画であるが、微小血管内の微小な濃度変化を検知するためのソフトウエアの開発並びに画像解析用パソコンを購入する予定であったが、研究の進捗から使用するスペックの選定に時間がかかったため研究費を繰り越すこととなった。平成30年度は適切なスペックを持ったパソコンを購入し、ソフトウエアの開発および画像解析を進める予定である。
がん遠隔転移における集団的細胞遊走の優位性の検証

上皮性癌の細胞間接着性の減少は多くの場合、転移・浸潤を促進する。先行研究では集団的に移動する改変肺がん細胞は元の株よりも遠隔転移を促進する事を報告した。本研究では骨肉腫という間葉系のがん細胞を用い、遠隔転移における接着性の変化の影響を明らかにしようとした。実験的に肝・腎臓に転移するように誘導したがん細胞では接着分子の変化が認められた。また元株との遺伝子の網羅的解析を用いた比較ではこれまで抗癌作用を期待されていた分子(PEDF)が過剰発現していた。元株にPEDFを発現させた株はカドヘリン種の変化を引き起こし、膝関節から血流に乗り、肝臓・腎臓に転移した。メカニズムについて調べたので報告する。細胞生物学研究や発生生物学の研究を介して方向性のある長距離の細胞移動に対して集団的細胞遊走の優位性が示されるようになってきた。しかしながら、がんの転移・浸潤においては集団的細胞遊走は血管などの狭窄部を通る際にデメリットになると考えられてきたことから否定的に扱われている。問題点として生体内の細胞移動をモニタする安価で簡便な方法が無いことと、集団的細胞移動中の細胞が狭窄部でどのように振る舞うかが不明なことが挙げられる。そこでがんの遠隔転移における集団的細胞遊走の優位性、ひいては細胞接着の遠隔転移に対する影響を探索することを目的とした。これまでの研究においてN-cadherinという細胞間接着因子が集団的細胞遊走のカギとなる役割を果たすことが示唆された。これを踏まえ、N-cadherin発現細胞株の中から143Bヒト骨肉腫細胞株という高い転移能を持つ細胞株を調べた。がん細胞を心臓に注射し、全身に転移させる実験をおこなったが副腎にのみ転移巣ができるという意外な結果になった。長時間飼育を行うと遠隔転移する細胞がごく少量だけ出てくることが分かったのでその細胞を回収し、繰り返し注射することで効率よく転移する細胞を得た。それぞれの臓器・器官に転移する細胞同士を比較すると遺伝子発現がかなり異なっていることが分かった。そしてN-cadherinの発現はやはり上昇している傾向が見られた。接着分子の変化をもたらした細胞内の変化に注目し、遠隔転移特異的な細胞機構に迫る。がんの遠隔転移にかかる細胞接着の影響を調べた。まず高転移骨肉腫細胞株143Bの生体内の挙動をモニタするために143BにmCherry (赤色蛍光タンパク)とルシフェラーゼ遺伝子を同時に発現するカセットを挿入し、株化した。この細胞をヌードマウス(免疫不全マウス:ヒトの細胞が生着する)の心臓に注射したところ、すべて副腎に転移するという結果を得た。この結果は若干想定外であったが、表現形が安定しているため、この細胞株を元にさらに転移する細胞株を探すことにした。副腎転移は14日目程度で観察される。このマウスを28日を超えて飼育すると遠位の骨転移が認められ、さらに他の内臓にも転移することが分かった。他の部位に転移した細胞を手術で摘出し、各摘出部の細胞接着分子カドヘリンの発現を定量的PCRで調べた。すると遠位の転移巣で特定のカドヘリン分子の発現が増加していた。さらに摘出した転移巣から初代培養を行い、上記のカセットを導入する際に用いた抗生物質を用いて143B+mCher/luc2細胞由来のがん細胞のみを単離した。単離した細胞を別々のマウスの心臓に注入し、似た場所に転移する細胞のみを回収した。これを5回繰り返したところ14日目には副腎転移を伴わずに直接遠隔転移する細胞株が数種類得られた。この細胞におけるカドヘリンのプロファイルを調べたところ、元は同じ細胞であったにも関わらず、あるカドヘリンは増加し、他のカドヘリンが減少するなど複雑な変化が定着していることが示唆された。このカドヘリンの変化を引き起こした細胞内の変化を担う分子を調べるために細胞内シグナリングに注目し、各細胞株からリン酸化タンパクを抽出し比較した。細胞の生存にかかるAktのリン酸化は強調されており、他にも特異的なチロシンリン酸化バンドやセリン・スレオニンのリン酸化特異的なタンパクが存在することも認められた。本研究はがんの生体内における集団性とその転移・浸潤能を比較し、がん細胞が集団を形成していることが優位に働くかどうかを明らかにしようとするものである。高転移性の骨肉腫細胞株を複数入手し、免疫不全マウスの心臓に注射することで全身への転移の表現形を比較した。発案時に行った遺伝子プロファイルによると骨肉腫細胞株のうちN-カドヘリンの発現とOB-カドヘリンの発現に逆相関が見られる細胞株のセットが認められた。しかしながら入手した細胞株のうちHuO9細胞のsub alleleの2種類は遺伝子導入が極めて困難な細胞であったため以降の実験に支障をきたす可能性があったので使用を断念した。理研より入手した143B細胞は過去の報告では肺などに転移することが報告されていたが、それに反し特定の臓器のみに転移した。このため143Bの改変細胞を心臓に注射し、特定臓器以外の臓器に転移した微小病巣から細胞を回収し、複数回繰り返してこの細胞を注入して元株とは別の臓器に転移する株を樹立した。この株と親株の遺伝子発現をマイクロアレイ解析により調べ、当初の目的であった細胞接着分子のプロファイルを行った。

その結果、骨肉腫細胞では従来知られていなかったカドヘリン種のスイッチが起こっていることが明らかになった。残念ながらその組み合わせは予め考えていたセットとは異なるため、転移途中でカドヘリンスイッチを切り替える遺伝子発現スイッチの人為的な組み換えは現在完了していない。それと平行して臓器選択性や遠隔転移に関与すると考えられる遺伝子の発現が発見されたのでこれらの候補遺伝子群と細胞接着や臓器の選別に係る遺伝子発現を明らかにしていく。研究の発案時に使用していた抗体に不備があり、発現プロファイルを作成し直すと若干の方向性の変更を余儀なくされた。また入手した細胞株についても過去の文献と合致しない特徴であったので修正を行った。その結果、親株から遺伝子発現が変化し、表現型も異なる特徴あるsub alleleの作成に成功し、その遺伝子発現を網羅的に解析することで当初予定していた細胞接着分子の発現プロファイルも得られ、新規の関与分子も同定した。本研究はがんの遠隔転移において細胞接着の亢進によるがん集団化が転移を促進するかを明らかにし、いつどこで集団化が起こる事が重要であるかを明らかにしようとするものである。研究の発案にあたり、発生生物学を背景に持つ研究代表者の主な研究材料である神経堤細胞とがん細胞の類似性に注目し、神経堤細胞と同様の発現パターンの変化を持つがん細胞として骨肉腫高転移株を2種選択していた。1つはN-cadherin++/OB-cadherin-株である143B,もう一つはN-cadherin-/OB-cadherin++株であるHuO9-M132株であった。これらの株の転移機序の違いを中心に研究を進めていく予定であったが、当時使用していたOB-cadherinの抗体に不備があり発現変化が顕著では無かった事、HuO9由来株が遺伝子導入などの編集に全く適さない株であった事などから実施計画を修正し、当該研究室で再度セレクションした143B株を元に転移の性質が異なる細胞株を複数作成することに成功した。当初の計画通り遠隔転移と細胞接着分子の発現変化を中心に株を検証したところ肝臓と腎臓に特異的に転移する株と頭部のリンパ節に高頻度で転移する株でN-cadherin他、複数のカドヘリンに変化が生じている事を発見した。この変化の機序を探るため親株である143Bと肝・腎高転移株143Bkid,リンパ転移株143Blymの間で遺伝子発現変化を網羅的に解析した。候補遺伝子の発現のValidationを行い、数種類の亢進遺伝子を発見した。そのうちの一つPEDFは一部ドメイン構造のペプチドが血管新生抑制機能を持つとされているが、全長の過剰発現で集団化が促進され、かつ肝臓・腎臓に転移する性質が上昇した。血管から出る性能には関与していないが転移巣での生着に関与している事が予想された。以上を論文にまとめ報告する。上皮性癌の細胞間接着性の減少は多くの場合、転移・浸潤を促進する。先行研究では集団的に移動する改変肺がん細胞は元の株よりも遠隔転移を促進する事を報告した。本研究では骨肉腫という間葉系のがん細胞を用い、遠隔転移における接着性の変化の影響を明らかにしようとした。実験的に肝・腎臓に転移するように誘導したがん細胞では接着分子の変化が認められた。また元株との遺伝子の網羅的解析を用いた比較ではこれまで抗癌作用を期待されていた分子(PEDF)が過剰発現していた。