hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
封入体筋炎の治療戦略を切り拓くための新たなモデルマウスの開発と治療法の探索

孤発性封入体筋炎(sIBM)は、高齢者に頻発する炎症性筋疾患である。本疾患は、炎症性筋疾患に分類されると同時に筋変性疾患の性質も有しており、アルツハイマー病や筋萎縮性側索硬化症(ALS)などの神経変性疾患と共通する病態の関与が予想される。本研究では、本患者の骨格筋形質内にTDP-43が異常沈着することに着目し、骨格筋特異的TDP-43発現マウスを作製し、sIBM患者に類似の筋病理学的変化や運動機能の低下の有無を評価するとともに、本マウスの筋変性の病態メカニズムを解明することを目的とする。CK8プロモーター下に野生型TDP-43を発現するトランスジェニックマウスを作製すると、血清中筋逸脱酵素の上昇と、筋線維の大小不同、TDP-43の筋線維内凝集、Tubular aggregateなどの筋病理学的変化を認めた。また変性筋線維を摘出し、網羅的プロテオミクス解析を行うと、カルシウム恒常性を制御するSR/ER局在蛋白とともにNT5C1Aが高頻度に検出された。電子顕微鏡による観察では、変性筋内に異常な自己貪食空胞と傷害されたミトコンドリアを認めた。また変性筋を用いた生化学的解析より、断片化TDP-43はミトコンドリア内に局在する可能性が示された。しかし本マウスではsIBMに特徴的な病理変化は見出せなかった。TDP-43を骨格筋内に過剰発現することで、カルシウムの恒常性が破綻し筋変性をもたらすことから、骨格筋内のTDP-43凝集が一次的に筋毒性を発揮することを明らかにした。またNT5C1Aは、近年sIBM患者血清中に見出されている自己抗体の標的蛋白であり、TDP-43とNT5C1Aは相互作用を示し、何らかの機序で抗原提示される可能性が示された。さらに断片化したTDP-43はミトコンドリア内部に局在することから、ミトコンドリア機能障害が本マウスにおける筋変性に関与することも示唆された。封入体筋炎(IBM)は欧米では高齢者で最多の炎症性筋疾患であり、近年本邦でも患者数が急増している。本疾患はステロイドや免疫グロブリンに抵抗性を示し、患者のQOL低下を改善することが強く求められる。不明な点が多い本疾患の病態を明らかにし、新たな治療法の開発を目指す必要がある。本研究では、本患者の骨格筋にTDP-43が異常沈着することに着目し、1)骨格筋特異的TDP-43発現マウスを作製し、IBM患者と同様の筋病理学的変化や運動機能の低下が再現可能か評価し、2)本マウスの変性筋における発現蛋白を網羅的に解析し病態メカニズムを解明する。さらに、3)本マウスに抗マウスインターロイキン6(IL-6)受容体抗体を投与し、運動機能および筋病理学的変化に及ぼす影響を評価した。クレアチンキナーゼ(CK)8プロモーター下に野生型TDP-43を発現するトランスジェニックマウスでは、血清中のASTやLD、CKなどの筋原性酵素の上昇を認め、筋線維の大小不同や空胞変性、TDP-43の筋線維内凝集などの筋病理学的変化が見られた。変性筋線維をレーザーマイクロダイセクションにより摘出し、抽出蛋白をLC-MS/MSによりプロテオミクス解析を行ったところ、ミスフォールディング蛋白を認識するシャペロンや小胞体関連分子の発現上昇を見いだした。本マウス骨格筋を用いた免疫染色では、小胞体シャペロンとTDP-43が共局在を示し、小胞体関連アポトーシスに関わる分子の発現を認めた。IBMでは異常蛋白凝集に加えて、IL-6などの炎症所見が関与することから、本マウスに抗IL-6受容体抗体を投与したが、運動機能や病理学的所見に改善は見られなかった。筋形質内のTDP-43凝集は、炎症所見と無関係に小胞体ストレスを介して筋変性をもたらすことが明らかとなった。本マウスは、IBMの変性性の病態の解明に有用なモデルとなることが期待される。平成28年度の研究を通じて、新たな封入体筋炎のモデルマウスを確立することが可能となった。本モデルマウスでは、筋病理学的に炎症細胞浸潤はみられず、またIL-6受容体に対するモノクローナル抗体を投与しても、運動機能や病理学的変化の改善を認めなかったことから、TDP-43による筋線維内凝集は炎症性機転と無関係に筋変性をもたらすことが明らかとなった。すなわち本疾患の治療法探索に関しては、筋線維内凝集蛋白のコントロールがターゲットとなる可能性が示された点で、我々の知見はきわめて有用と考える。孤発性封入体筋炎(Sporadic inclusion body myositis: sIBM)は、欧米では50歳以上の高齢者でもっとも頻度の高い炎症性筋疾患の一つである。本疾患は、炎症性筋疾患に分類されると同時に筋変性疾患の性質も有しており、アルツハイマー病や筋萎縮性側索硬化症(ALS)などの各種神経変性疾患と共通する病態の関与が予想される。

H28年度までに明らかにしたこととして、クレアチンキナーゼ(CK)8プロモーター下に野生型TDP-43を発現するトランスジェニックマウスでは、血清中のASTやLD、CKなどの筋逸脱酵素の上昇と、筋線維の大小不同、TDP-43の筋線維内凝集、Tubular aggregateなどの筋病理学的変化を認めた。また変性筋線維をレーザーマイクロダイセクションにより摘出し、LC-MS/MSを用いた網羅的解析を行うと、カルシウム恒常性を制御するSR/ER局在蛋白とともにCytosolic 5'-nucleotidase 1Aが高頻度に検出された。H29年度は電子顕微鏡を用いて本マウスの変性筋の微細構造を評価するとともに、骨格筋内のTDP-43の局在を検討した。電子顕微鏡所見として、変性筋内に異常な自己貪食空胞と傷害されたミトコンドリアを認めた。また変性筋からミトコンドリアを抽出しProteinase Kによる消化を行うと、断片化したTDP-43はミトコンドリア外膜蛋白よりも高濃度のProteinase Kにより消化されたことより、断片化TDP-43はミトコンドリア内に局在する可能性が示唆された。sIBMの筋病理変化として、縁取り空胞と非壊死線維内部や周囲に浸潤する炎症細胞が特徴的である。我々の作製した骨格筋特異的TDP-43発現マウスでは、これらのsIBMに特徴的な病理変化は見出せなかった。しかし一方でTDP-43を骨格筋内に過剰発現することで、カルシウムの恒常性が破綻し筋変性をもたらすことから、骨格筋内のTDP-43凝集が一次的に筋毒性を発揮することを明らかにした。またプロテオミクス解析において増加していたNT5C1Aは、近年sIBM患者血清中に見出されている自己抗体の標的蛋白であり、TDP-43とNT5C1Aは相互作用を示し、何らかの機序で抗原提示される可能性が示された。さらに断片化したTDP-43はミトコンドリア内部に局在することから、ミトコンドリア機能障害が本マウスにおける筋変性に関与することも示唆された。孤発性封入体筋炎(sIBM)は、高齢者に頻発する炎症性筋疾患である。本疾患は、炎症性筋疾患に分類されると同時に筋変性疾患の性質も有しており、アルツハイマー病や筋萎縮性側索硬化症(ALS)などの神経変性疾患と共通する病態の関与が予想される。本研究では、本患者の骨格筋形質内にTDP-43が異常沈着することに着目し、骨格筋特異的TDP-43発現マウスを作製し、sIBM患者に類似の筋病理学的変化や運動機能の低下の有無を評価するとともに、本マウスの筋変性の病態メカニズムを解明することを目的とする。CK8プロモーター下に野生型TDP-43を発現するトランスジェニックマウスを作製すると、血清中筋逸脱酵素の上昇と、筋線維の大小不同、TDP-43の筋線維内凝集、Tubular aggregateなどの筋病理学的変化を認めた。また変性筋線維を摘出し、網羅的プロテオミクス解析を行うと、カルシウム恒常性を制御するSR/ER局在蛋白とともにNT5C1Aが高頻度に検出された。電子顕微鏡による観察では、変性筋内に異常な自己貪食空胞と傷害されたミトコンドリアを認めた。また変性筋を用いた生化学的解析より、断片化TDP-43はミトコンドリア内に局在する可能性が示された。しかし本マウスではsIBMに特徴的な病理変化は見出せなかった。TDP-43を骨格筋内に過剰発現することで、カルシウムの恒常性が破綻し筋変性をもたらすことから、骨格筋内のTDP-43凝集が一次的に筋毒性を発揮することを明らかにした。またNT5C1Aは、近年sIBM患者血清中に見出されている自己抗体の標的蛋白であり、TDP-43とNT5C1Aは相互作用を示し、何らかの機序で抗原提示される可能性が示された。
Fコート材の改良に関する基礎的研究

これまでの方法では知ることのできなかったFコート材直下の状態を電子線微小部分分析装置(EPMA)を用いて観察することを計画した。Fコート材を塗布した後に、Fコート材から遊離したフッ素イオンが周辺酸処理エナメル質に取り込まれる様相を経時的に観察した。すなわち、周辺酸処理エナメル質がフッ素を取り込むと同時に、再石灰化していく過程をCa、P、F、Mgについてmappingした。観察した全てのFコート材はFコート材中に一様にフッ素を含有しているのではなく、フッ素濃度の高い部分が塊状にFコート材中に分散していることが観察された。これらの実験はFコート材をエナメル質の一定面積に塗布し、重合させた後フッ素を含まない石灰化液に浸漬したものであるが、浸漬後、30分ではCa、PおよびFはFコート材直下および周辺酸処理エナメル質でもはっきりとした変化は見られなかった。MgはFコート材周辺の酸処理エナメル質で明らかな溶質が認められた。その後は時間の経過とともにFコート材直下および周辺でより多くのFが認められ、CaとMgの回復が周辺エナメルで認められた。周辺エナメル質の状態はエナメル質生検法の結果をEPMA観察結果が裏付けるものであったが、周辺エナメル質のMgの再沈着は興味ある所見であり、検討を重ねる予定である。
根菜類の養液栽培の確立と貯蔵根の発育に関する研究

根菜類を円筒形のロックウールを用いて養液栽培を行うと、円筒空間に貯蔵根を形成する。この方法を用いて根菜の養液栽培を確立するため、ゴボウを用いて検討した。まず給液法を検討した。間断給液では地上部の生育は良好であったが、地上部に比べて根部の肥大が劣り、さらに岐根の発生が多かった。連続給液では岐根の発生が著しく減じた。根菜の水耕での給液法は連続給液に近い方法が望ましいと考えられた。円筒形ロックウール内の夏期の高温下での温度経過を測定した。90cm高の円筒において、1/2高の円筒空間の温度は底面の温度に比べて、高温で経過したのは610時の間であり、最大で+1°Cであった。それ以外の時間は低温で経過し、その差の最大は-5°Cに達した。すなわち、円筒空間は昼は涼しく、夜は暖かくなり、他の部位に比べて温度較差が小であった。貯蔵根の直接観察をファイバースコープを用いて試みた。ゴボウでは主根の肥大が他の根菜に比べてそれほど大きくない上に、細根が主根に絡んで主根の正確な計測が困難であった。主根の肥大が著しい他の根菜を用いて、引続き検討する予定である。
液体急冷法によって作製した非平衡結晶質および非晶質合金粉末の圧着成形

昭和59年度の本研究予算で設置した真空ホットプレス機を用いて、昭和61年度では、1.Pd-Ni-P系アモルファス合金を用いて、ガラス遷移挙動とアモルファス圧着体の成形性との相関性および得られた圧着体の密度,組織,機械的性質、熱的安定性を解明すること、および2.鉄系のアモルファス合金粉末を用いて、ホットプレス法による高密度な焼結材の形成および得られた塊状焼結材の密度,組織,機械的強度,硬さ,耐磨耗性を調べ、耐熱耐磨耗合金を開発するための基礎的知見を得ることを目的とした。(1)過冷却液体領域が結晶化温度以下の広い温度域で現われるPd-Ni-Pアモルファス合金粉末の圧着性と過冷却液体の粘性,比熱,エンタルピーとの関連性を調べた結果、過冷却液体の粘性が【10^(11)】ポアズ以下に低下する温度域では3秒の短時間でもほぼ100%の密度をもつアモルファス圧着体が得られることおよび得られた圧着体の比熱やエンタルピーは急冷したままのアモルファス合金粉末と大きな差異はないことが明らかになった。(2)Fe-Cr-Mo-C,Fe-Cr-Mo-C-Si,Fe-Cr-V-Siなどの高炭素高合金鋼アモルファス粉末は950°C1150°Cの温度域で約60MPaの加圧力下で1030分間プレスすることにより、約100%の真密度をもつ塊状材(10mmφ×8mm高さ)を得ることができた。しかも、これらの塊状材は約0.2um径の微小な合金炭化物を高硬度なマルテンサイト母相中に均一かつ高密度に含み,1000014000MPaの高い硬さと粉末高合金耐磨耗鋼に匹敵する良好な耐磨耗性を有すると共にその高い硬さが約700°Cの高温域までほとんど変化しない良好な耐熱性を示すことを明らかにした。このように、液体急冷法によって作製した非平衡相合金粉末から得た圧着体は通常の凝固プロセスでは得られない優れた性質を示すことを明らかにできた。本試験研究費で設置した真空ホットプレス機が昭和60年1月から順調に稼動し始めて以来、約1年余りの期間に非晶質合金粉末および非平衡相結晶質合金粉末のホットプレス法による圧着成形挙動ならびに得られた圧着体の密度、組織、機械的性質、磁気的性質、熱的安定性などに関する多くの知見を得ると共にその結果を公表してきている。これらの結果を纏めると以下のようになる。(1)Co-Fe-Si-B系非晶質強磁性粉末は750840Kの温度域で0.21GPaの圧力下で約10分間プレスすることにより、5mmφ×1.7mmの円板状非晶質材を作り出すことができた。この塊状材は約96%の密度を有すると共に、硬さや磁気的性質はもとの非晶質粉末とほぼ同じであり、塊状化に伴う非晶質相固有の特性は劣化しないことが判明した。(2)過冷却液体領域が結晶化温度以下の広い温度域で現われるPd-Ni-P非晶質合金粉末の圧着性と過冷却液体の粘性、比熱、エンタルピーとの関連性を調べた結果、過冷却液体の粘性が【10^(11)】ポアズ以下に低下する温度域では3秒の短時間でもほぼ100%の密度をもつ非晶質圧着体が得られることおよび得られた圧着体の比熱やエンタルピーは急冷したままの非晶質粉末と大きな差異はないことが明らかになった。(3)Fe-Cr-Mo-C系の高炭素高合金鋼非晶質粉末は950°C1150°Cの温度域で62MPaの加圧下で30分間プレスすることにより、99.7%の高密度の塊状材(10mmφ×8mm)を得ることができた。しかも、この塊状材は約0.2μm径の微小な合金炭化物をマルテンサイト母相中に均一かつ高密度に含み、1000014000MPaの高い硬さと粉末ハイス材に匹敵する良好な耐摩耗性を有すると共にその高い硬さが約700°Cの高温域までほとんど変化しない良好な耐熱性を示すことが明らかになった。このように、液体急冷法によって作製した非平衡相粉末から得た圧着体は通常のプロセスでは得られない優れた性質を示すことが明らかになってきている。(1)過冷却液体領域が結晶化温度以下の広い温度域で現われるPd-Ni-P

アモルファス合金粉末の圧着性と過冷却液体の粘性,比熱,エンタルピーとの関連性を調べた結果、過冷却液体の粘性が【10^(11)】ポアズ以下に低下する温度域では3秒の短時間でもほぼ100%の密度をもつアモルファス圧着体が得られることおよび得られた圧着体の比熱やエンタルピーは急冷したままのアモルファス合金粉末と大きな差異はないことが明らかになった。(2)Fe-Cr-Mo-C,Fe-Cr-Mo-C-Si,Fe-Cr-V-Siなどの高炭素高合金鋼アモルファス粉末は950°C1150°Cの温度域で約60MPaの加圧力下で1030分間プレスすることにより、約100%の真密度をもつ塊状材(10mmφ×8mm高さ)を得ることができた。しかも、これらの塊状材は約0.2um径の微小な合金炭化物を高硬度なマルテンサイト母相中に均一かつ高密度に含み,1000014000MPaの高い硬さと粉末高合金耐磨耗鋼に匹敵する良好な耐磨耗性を有すると共にその高い硬さが約700°Cの高温域までほとんど変化しない良好な耐熱性を示すことを明らかにした。このように、液体急冷法によって作製した非平衡相合金粉末から得た圧着体は通常の凝固プロセスでは得られない優れた性質を示すことを明らかにできた。
保型形式のL関数の解析的研究

保型形式の研究の中で、種々の形のフーリエ展開(周期)や保型的L関数との関連で、球等質空間の球関数の重要性が認識されてきた。本研究では、主に一般線形群の球部分群に対する球関数を中心に研究した。これらの球関数はアフィンヘッケ環の構造論や表現論と深く結び付いているもので、保型的L関数と本質的関連があるものと期待される。この問題を議論するために定期的にしたセミナーを開催した。さらに以下のような研究を行った。・量子対称空間上の、有限次元表現に付随する、球関数を調べ多くの場合これらがルート系に対応するMacdonald多項式を用いて記述されることを示した。また、BC_n型のAskey-Wilson多項式に対して、ヘッケ環を用いてこれらを同時固有関数にもつ可換なq差分作用素の族が構成できることを示した。(野海)・超幾何関数の研究において、ツイストホモロジーやツイストコホモロジーの交点数の計算が重要であるが、高階の場合にこれらの計算方法を開発した。またq解析に現れるアフィンワイル群やアフィンヘッケ環などに対し、種々の実験を行うための数式処理系のための言語およびアルゴリズムを開発した。(高山)・有理数体上階数1の数論的多様体の代数幾何的性質を調べた。不定符号四次元数体の極大orderから定まる離散的部分群の合同部分群による2次のSiegel上半平面の商は,四元数体の判別式が十分大きいとき、一般型であることを示した。また幾何種数が2以上のHilbert modular曲面を分類した。(浜畑)保型形式の研究の中で、種々の形のフーリエ展開(周期)や保型的L関数との関連で、球等質空間の球関数の重要性が認識されてきた。(浜畑)
代数的位相幾何学の新展開

研究代表者の南は,研究分担者の土屋の強い要請の基,Keller, Toen, Tabuadaらのdg圏や,Toen-Vessozi, LurieらのDerived Algebraic Geometryの研究に多くの時を注いだ.これらの対象自体にはまだ結果が出てないが,その副産物として,安定ホモトピー論の中心問題の一つであるHopkins Chromatic Splitting Conjectureについて重要な知見を得ることが出来た.また,代数幾何学のMotif理論の大問題であるTate予想について,ある数学者がその証明と主張していたものに致命的な間違いがあることご発見・指摘することにより,学術的社会貢献をするとともに,Tate予想解決にむけたある方向性についての知見も得ることが出来た.研究分担者の土屋は,C2条件をみたす頂点作用素代数に付随したリーマン面上の共形場理論に大いなる進展を見出した.研究分担者の古田と亀谷は,b1が正の場合のBauer-Furuta-Seiberg-Witten不変量について,現段階のホモトピー論を用いてはほぼ決定的と思われる仕事をした.研究分担者の島川は,Labeled configuration spacesと連続関手の観点から,コンパクトり一群に関して同変な一般コホモロジー論へのまったく新しいアプローチを開拓した.ごく最近,研究分担者の小林亮一は,Perelmanの手法を駆使して,Leburan予想の解決等の極めて目覚ましい一連の仕事をおこなった.これは本研究当初には予期もしていなかった重要な成果である.研究代表者の南は,研究分担者の土屋の強い要請の基,Keller, Toen, Tabuadaらのdg圏や,Toen-Vessozi, LurieらのDerived Algebraic Geometryの研究に多くの時を注いだ.これらの対象自体にはまだ結果が出てないが,その副産物として,安定ホモトピー論の中心問題の一つであるHopkins Chromatic Splitting Conjectureについて重要な知見を得ることが出来た.また,代数幾何学のMotif理論の大問題であるTate予想について,ある数学者がその証明と主張していたものに致命的な間違いがあることご発見・指摘することにより,学術的社会貢献をするとともに,Tate予想解決にむけたある方向性についての知見も得ることが出来た.研究分担者の土屋は,C2条件をみたす頂点作用素代数に付随したリーマン面上の共形場理論に大いなる進展を見出した.研究分担者の古田と亀谷は,b1が正の場合のBauer-Furuta-Seiberg-Witten不変量について,現段階のホモトピー論を用いてはほぼ決定的と思われる仕事をした.研究分担者の島川は,Labeled configuration spacesと連続関手の観点から,コンパクトり一群に関して同変な一般コホモロジー論へのまったく新しいアプローチを開拓した.ごく最近,研究分担者の小林亮一は,Perelmanの手法を駆使して,Leburan予想の解決等の極めて目覚ましい一連の仕事をおこなった.これは本研究当初には予期もしていなかった重要な成果である.内容的には既に出来ていた事だが、思いのほか簡潔に見通しよく書き上げることができた。本年度も恒例の名工大ホモトピー論集会を3回開催し、計5名の講演者の方々にOHPを用いた連続講演をしていただいた。その中でも、五味清紀氏による連続講演「Abelian grebe anditsapplication tofield theory」と、梶浦宏成氏による連続講演「ホモトピー代数とその弦理論への応用について」は代数的位相幾何学の物理への応用としての出発点を与え、田中祐二、小西由紀子、野原雄一諸氏による講演は、より物理的・幾何的な方面との関係を明らかにさせるものだった。これらはBauer-Furuta安定コホモトピーSeiberg-Witten不変量に続く代数的位相幾何学の物理的・幾何的方面への応用の道筋を示唆し、新しい知見を得ることができた。研究代表者によるここ数年の"universal Euler類"に関するHELPの研究は、必要となるgeneral topologyの技術的困難もクリアされ、特異点論におけるThom-Boardman多項式の一般化等、様々な応用を書き下すことが可能になった。昨年度Geometry and Topologyに投稿した。Bauer-Furuta安定コホモトピーSeiberg-Witten不変量関係の2つの論文は指示に従い若干の修正の後,無事受理された。b_1=0の場合の安定ホモトピーSeiberg-Witten不変量が持つ幾つかのホモトピー論的に重要な性質はこの2つの論文に簡潔にまとめられたと思う.空間の(非安定)ホモトピー圏を,"安定化"して安定ホモトピー圏を構成する前段階として,Spanier-Whitehead圏があるが,そのSpanier-Whitehead圏と安定ホモトピー圏の違いには,ある意味で(非安定)ホモトピー圏の大域的な性質が反映していることに気がついた.Goodwillie calculusを通して考えると,chromaticな見地と予想外に相性が良いことがわかった.これについては,平成17年12月26日の大島商船高専における「大島ホモトピー論談話会2005」と,平成18年3月29日の中央大学における日本数学会年会トポロジー分科会で報告した.本年度も恒例の名工大ホモトピー論集会を2回開催した.入谷寛氏には,量子コホモロジー,特にVirasoro constraintsについて,連続講演をしていただいた.Virasoro constraintsは可積分系等広汎な分野の数学と関連するものなので,これを契機に「代数的位相幾何学の新展開」にぜひ絡めて行きたい。

鳥居猛氏には,安定ホモトピー論の形式群・p-divisible group等の関係をにそって連続講演していただいた.鳥居氏の連続講演は分担者の土屋昭博氏の興味を大いに引き,土屋氏の音頭により平成18年3月25日に大島商船高専において鳥居氏の連続講演を中心とした勉強会を開催した.この勉強会においては研究代表者も,Hopkins-Singerによるテータ関数を用いたKervaire不変量の構成についても報告した.この方向の研究は研究代表者の過去の研究を集大成する可能性の幾つかの証拠を得た.2006年7月5日(水)から7月7日(金)まで、「名工大ホモトピー論集会06-1」として、米国イリノイ大学のMatthew Ando教授による連続講演、STRING ORIENTATIONS OF ELLIPTIC COHOMOLOGYを行い、HopkinsやLurieによる代数的位相幾何学の最先端の手法が、Katzらの数論の深い結果と融合する状況を知ることができ、大いに感銘を受けた。研究代表者の南は、2006年9月25日(月)から9月29日(金)まで、東京大学大学院数理科学研究科において開催された「モチーフの勉強会第2回」において、Symmetric Spectra (following Hovey-Shipley-Smith).の題で講演した。これはVoevodskyの代数多様体のホモトピー論でのモチーフの圏となる「安定ホモトピー圏」を「ホモトピー圏」から安定化して構成する場合の一般論に関する紹介であるが、ここではQuillen Model Categoryに関する考察が極めて頻繁に行われている。さて、Quillen Model Categoryといえば、道来ホール代数を含むToenのdg圏に関する一連の仕事でも、Tabuadaによって与えられたdg圏の圏におけるQuillen Model Category構造が本質的な役割を果たしていた。本年度、研究分担者の土屋は南にこの周辺のToenの一連の仕事を理解し、それを説明するように要求した。遺憾ながらまだ理解の途上段階ではあるが、少なくとも根幹のTabuadaによるdg圏の圏におけるQuillen Model Category構造に関しては、かなりわかる様になった。そこで、これについて11月27日(月)から11月30日(木)まで愛媛大学において開催された「ホモトピー論シンポジウム」において、Tabuadaによるdg圏の圏におけるQuillen Model Category構造の題で講演した。2007年3月24日(土)3月26日(月)には、名古屋工業大学において、「NYメイツの集い-名工大ホモトピー論集会07-1」を開催し,、研究代表者の南、研究分担者の西田、吉村、島川をはじめ、計14名が講演をした。このうち南は、Behrens-LawsonによるTopological Automorphic Formsの題で、Behrens-Lawsonによって発表されたばかりの重要な結果の一端について紹介した。
蘇生後脳症における脳保護戦略

突然の心停止は世界的に主要な死因の一つである。自動体外式除細動器や蘇生後の低体温療法といった心肺蘇生法の進歩にもかかわらず心停止・心肺蘇生後の死亡率は非常に高く、新しい治療方法の開発は急務である。蘇生後の患者は低体温療法によるシバリングの予防、痙攣発作の治療や気管内挿管の苦痛の軽減といった治療や苦痛の緩和のためしばしば鎮静剤の投与を受ける。しかし、蘇生後患者の意識管理や鎮静剤の使用に関する研究はなく、漫然と鎮静剤が選択され投与されているのが現状である。本研究では心肺蘇生後の鎮静剤の選択が予後に与える影響を明らかにすることを目的としている。研究実施計画に基づき、心肺蘇生後の鎮静剤投与が蘇生後の生存率に与える影響をマウスを用いて調べた。マウス心停止・心肺蘇生モデルでは、中心静脈より塩化カリウム投与を行い心停止を起こした。8分の心停止後に人工呼吸、エピネフリンの持続投与の開始と胸骨圧迫(約300回/分)を行い蘇生を行った。これまでの研究結果では、イソフルランの吸入により蘇生後の生存率が改善することが明らかになっていた。プロポフォール投与が蘇生後の生存率に与える影響を調べるため、自己心拍の回復10分後からプロポフォールの持続投与開始した。プロポフォール投与条件の検討を行ったが、蘇生後の予後に対する影響は確認出来なかった。心停止による死亡率は非常に高く世界的に主要な死因の一つである。自動体外式除細動器や蘇生後の低体温療法といった心肺蘇生法の進歩にもかかわらず心停止・心肺蘇生後の予後は未だ不良であり、今現在有効な治療薬は存在しない。しかし蘇生後患者の意識管理や鎮静剤の使用に関する確立されたガイドラインはなく、漫然と鎮静剤が選択され投与されているのが現状である。本研究では心停止・心肺蘇生後の鎮静剤の選択が予後に与える影響を明らかにすることを目的としている。研究実施計画に基づき、平成27年度は蘇生後の鎮静剤投与が蘇生後の生存率に与える影響を明らかにすることを目的として研究を行った。麻酔下にマウスに気管内挿管後、動脈圧、中心静脈ラインを確保し塩化カリウム(KCl)投与により心停止を起こす。8分の心停止後、人工呼吸(FiO2=1.0)、エピネフリンの持続投与を開始し胸骨圧迫(約300回/分)を行い、蘇生を行った。これまでの我々の研究結果から心停止・心肺蘇生後のマウスの10日間の生存率が、蘇生後10分後から開始した1.0 MACのイソフルランの吸入により改善することを確認した。蘇生後のイソフルラン吸入が生存率を改善するとの報告は今までになく、蘇生後のイソフルラン吸入が臨床試験に発展する場合には本研究結果は非常に重要な意味を持つと考えられる。動物実験に関する学内倫理委員会の承認手続きが予想以上にかかってしまった。これは、本実験がマウスを一時的に心肺停止状態にすることが動物実験の倫理上問題であると判定されてしまったからである。倫理委員会を説得するのに、時間を要したため、実験を実際に開始するのが遅れてしまい、予定症例数の60%程度しか消化することができなかった。ただ、実験の手順そのものは、問題なくこなせており、単純に日程上の遅れと考えている。しかし蘇生後患者の意識管理や鎮静剤の使用に関する研究はなく、漫然と鎮静剤が選択され投与されているのが現状である。研究実施計画に基づき、蘇生後の鎮静剤投与が蘇生後の生存率に与える影響を調べた。具体的には、麻酔下にマウスに気管内挿管後、動脈圧、中心静脈ラインを確保し塩化カリウム投与により心停止を起こす。8分の心停止後、人工呼吸、エピネフリンの持続投与を開始し胸骨圧迫(約300回/分)しながら蘇生行為を行った。これまでの研究結果から、心停止・心肺蘇生後10分後から開始した1.0 MACのイソフルランの吸入により、心停止・心肺蘇生後のマウスの10日間の生存率が改善することを確認した。これらの結果をもとにイソフルランとプロポフォールによる鎮静が蘇生後の予後に与える影響について比較検討を行っている。当該年度は、まずイソフルランの投与設備を確立した。さらに、プロポフォールの確実な投与方法について検討を重ね、最終的な方法を確立した。マウスの心停止・心肺蘇生モデルの作成は問題なく行われており、蘇生後のイソフルランの吸入装置の設置は完了している。しかしながら、プロポフォールの確実な持続投与法を確立するのに、時間を要したため、プロポフォール投与群の実験が予定よりも遅れている。

自動体外式除細動器や蘇生後の低体温療法といった心肺蘇生法の進歩にもかかわらず心停止・心肺蘇生後の死亡率は非常に高く、新しい治療方法の開発は急務である。蘇生後の患者は低体温療法によるシバリングの予防、痙攣発作の治療や気管挿管の苦痛の軽減といった治療や苦痛の緩和のためしばしば鎮静剤の投与を受ける。しかし蘇生後患者の意識管理や鎮静剤の使用に関する研究はなく、漫然と鎮静剤が選択され投与されているのが現状である。本研究では心停止・心肺蘇生後の鎮静剤の選択が予後に与える影響を明らかにすることを目的としている。研究実施計画に基づき、蘇生後の鎮静剤投与が蘇生後の生存率に与える影響を調べた。具体的には、麻酔下にマウスに気管内挿管後、動脈圧、中心静脈ラインを確保し塩化カリウム投与により心停止を起こす。8分の心停止後、人工呼吸、エピネフリンの持続投与を開始し、胸骨圧迫(約300回/分)を含めた心肺蘇生を行った。これまでの研究結果から、心停止・心肺蘇生後10分後から開始した1.0 MACのイソフルランの吸入により、心停止・心肺蘇生後のマウスの10日間の生存率が改善することを確認した。同様の手法を用い、1.0 MACのセボフルランが蘇生後の予後を改善するかの検討を現在行っており、吸入麻酔薬とプロポフォールによる鎮静が蘇生後の予後に与える影響について比較検討を行っている。マウスの心停止・心肺蘇生モデルの作成は問題なく行われいるものの、追加実験(イソフルランの吸入に加え、セボフルラン吸入が蘇生後の予後を改善するかの検討)を行う必要が生じたので、全体の進捗状況としてはやや遅れている。突然の心停止は世界的に主要な死因の一つである。蘇生後の患者は低体温療法によるシバリングの予防、痙攣発作の治療や気管内挿管の苦痛の軽減といった治療や苦痛の緩和のためしばしば鎮静剤の投与を受ける。しかし、蘇生後患者の意識管理や鎮静剤の使用に関する研究はなく、漫然と鎮静剤が選択され投与されているのが現状である。本研究では心肺蘇生後の鎮静剤の選択が予後に与える影響を明らかにすることを目的としている。研究実施計画に基づき、心肺蘇生後の鎮静剤投与が蘇生後の生存率に与える影響をマウスを用いて調べた。マウス心停止・心肺蘇生モデルでは、中心静脈より塩化カリウム投与を行い心停止を起こした。8分の心停止後に人工呼吸、エピネフリンの持続投与の開始と胸骨圧迫(約300回/分)を行い蘇生を行った。これまでの研究結果では、イソフルランの吸入により蘇生後の生存率が改善することが明らかになっていた。プロポフォール投与が蘇生後の生存率に与える影響を調べるため、自己心拍の回復10分後からプロポフォールの持続投与開始した。プロポフォール投与条件の検討を行ったが、蘇生後の予後に対する影響は確認出来なかった。1平成28年度は臨床で一般的に用いられる鎮静剤である、プロポフォール、ミダゾラムの蘇生後の投与が生存率に与える影響について調べる。2蘇生後の鎮静剤投与による脳保護作用を明らかにするため、神経学的機能の評価、脳虚血後の神経細胞障害の指標として用いられる血清neuron specific enolase(NSE)、S100Bの測定を行う。さらにCaspase 3の免疫組織染色を行い鎮静剤投与が蘇生後の脳神経細胞のアポトーシスに及ぼす影響について明らかにする。
ハンチントン病病態関連遺伝子のゲノムワイドスクリーニング

ハンチントン病はその原因遺伝子にCAGリピートの伸長が存在し、その転写産物の伸長ポリグルタミンが発症に強く寄与していると考えられている。この伸長ポリグルタミンを含む遺伝子産物は核内に凝集体形成を引き起こし、これが発症に強く関わっているのではないかと考えられている。近年遺伝子発現を特異的に抑制するsiRNAが利用可能となり、shRNAとして細胞への導入が容易になっている。また多くの遺伝子をカバーするshRNAの利用が可能となり、アッセイ系が確立すれば全ゲノムレベルでの遺伝子抑制による凝集体形成に対する影響をスクリーニングすることが可能となっている。本研究では凝集体形成を抑制するshRNAのスクリーニングを行い、凝集体形成に影響する遺伝子を同定することにより、凝集体形成に関与するカスケードの同定を目指す。1)ハンチンチンエクソン1(伸長CAGリピートを含むもの)をGFPと結合した蛋白を発現する系を用いて、この凝集体形成についてshRNAの影響をアッセイする系をArrayScanを用いて確立した。15000クローン(全遺伝子の1/3)をスクリーニングした。2)shRNAライブラリーは市販のものを用い、検討した範囲で遺伝子抑制が十分行われることを確認した。150Q発現細胞の凝集体抑制効果のあるshrNA682クローンを得た。3)これから16Qの発現に影響を与えない322クローンを選択した。4)150Q細胞でスクリーニングで選択した682遣伝子のうち369遺伝子について全長遺伝子の発現ベクターを得たのでこの効果がshRNAと対応するかどうかを検討し、43クローンがshRNAと対応する効果を示すものであることがわかった。5)スクリーニングで得られた遺伝子の機能解析を予定している。3)shRNAライブラリーのplasmid抽出を効率よく行う方法を確立した。4)shRNAライブラリーの効率の良い遺伝子導入法と時期を確立し、遺伝子発現に対する影響の検討を開始した。5)現段階で96遺伝子を含むプレート、50プレートについてスクリーニングを終了し、約200の凝集体形成へ影響する候補遺伝子を得ている。今後150プレートについてさらに検討する予定である。
固体ゲート絶縁体を利用した電界効果による強相関酸化物の電子相制御

現在、半導体を利用した電子デバイスの小型化が進んでいる。しかし、これらの小型化にも限界が近付いている。そのため、その限界を超えるためにこれまでにない特性を持った材料を利用したデバイスの開発が進められている。その一つが金属絶縁体相転移と呼ばれる現象を応用したモットトランジスタである。本研究では、NdNiO3とSmCoO3と言う二種類の酸化物を利用してモットトランジスタの試作を行い、その性能を比較する研究を行った。研究計画に基づき、下記の手順で固体Mott transistorの加工プロセスの最適化に取り組んだ。(Nd,Sm)NiO3薄膜をパルスレーザー堆積(PLD)装置を用いて成膜し、産業技術総合研究所の共用設備であるナノプロセシング施設の微細加工装置を用いてチャンネル形状への微細加工を行った。チャンネル形成後、ナノプロセシング施設のスパッタ成膜装置と物質材料研究機構の共用施設にある原子層堆積装置を用いてHfO2ゲート絶縁膜を成膜した。ゲート絶縁膜成膜後、ナノプロセシング施設のスパッタ成膜装置を用いてPtのゲート電極及びソース電極、ドレイン電極を成膜した。平成25年度は、チャンネルの膜厚及び形状、ゲート絶縁層の膜厚及び形状、及びゲート電極の形状を変化させ、そのときの素子特性の変化を測定する研究を行った。素子の特性としてはドレイン電流のゲート電圧依存性、ゲート絶縁層の静電容量及び電圧耐性を測定した。測定の結果は、ゲート絶縁層の静電容量は最大で2μF/cm2(@1Hz)程度、電圧耐性は最大で6 MV/cm程度であり、本課題開始前に作成したゲート絶縁膜とほとんど変わらない値であった。ドレイン電流のゲート電圧依存性に関しても本課題開始前の実験結果とほとんど変わらなかった。この結果はチャンネル、ゲート絶縁層、電極の膜厚及び形状を変化させても素子の特性が向上しなかったことを示している。これらの結果から、素子の特性を向上させるためには、ゲート絶縁層の成膜条件やゲート絶縁層に利用する絶縁体及びゲート電極に利用する金属等を変える必要があると考えられる。研究計画に基づき、下記の手順で固体ゲートMott transistorの開発を進めた。本研究で開発に取り組んでいる固体ゲート強相関酸化物FETは、チャンネルとゲートが共に酸化物であるため、チャンネルーゲート間で酸素イオンが移動し易い。そのため、電荷のみをチャンネルにドープするのが難しく、また素子を流れる電流の変化が、電荷ドープによって誘起されたのかそれとも酸素イオンの移動によって引き起こされたのかを判断するのも容易ではない。H25年度の実験結果は、ゲートに電圧を印加してもチャンネルが金属絶縁体相転移を起こしていないことを示していたが、この結果が、電荷のドープ量が不十分だった結果なのか、またはゲート絶縁膜として用いたHfO2中の酸素イオンがゲート電圧により動きチャンネル中に移動してしまった結果なのかが明らかではなかった。そこで、H26年度は、HfO2を酸化膜層としたReRAMを作成し、その特性を調べ、HfO2をゲート絶縁膜として利用した固体ゲート強相関酸化物FETの特性と比較することで、酸素イオンの移動による素子の特性への影響を調査した。その結果、固体ゲート強相関酸化物FETの実験で観測された素子の特性はReRAMの特性とは異なっていることが分かった。この結果は、固体ゲート強相関酸化物FETの実験で良い結果が得られなかった原因は酸素イオンが移動してしまっているからではなく、ゲート絶縁膜の成膜条件が最適化されておらず、耐電圧特性等が十分でなかったことを示している。これまでチャンネル材料にNdNiO3を用いて固体ゲートMott transistorの開発を進めていたが、期待していた性能は得られなかった。H26年度の実験結果は、固体ゲート強相関酸化物FETの実験で良い結果が得られなかった原因はチャンネル-ゲート間で酸素イオンが移動してしまっているからではなく、ゲート絶縁膜の成膜条件が最適化されておらず、耐電圧特性等が十分でなかったことを示していた。そのため、当初はH27年度はFET構造及びゲート絶縁体の成膜条件の最適化を行う予定であった。しかし、他の実験結果から、NdNiO3チャンネルの固体ゲートMott transistorが動作しないのは固体ゲートによってNdNiO3が固定されてしまい、構造相転移が妨げられていることが原因である可能性が出て来た。そのため、当初の予定を変更し、H27年度は構造相転移を伴うことなく金属絶縁体相転移を起こすと考えられているSmCoO3をチャンネルとして利用した実験を行うために下記の実験を行った。まず、新しいチャンネル材料を利用するため、パルスレーザーデポジション(PLD)法に用いるターゲットの作製を行った。その後、PLD装置による成膜、X線回折装置を用いた構造解析、PPMSを用いた物理特性評価等をMott transistorのチャンネルに利用可能な薄膜を成膜するための条件最適化を行った。新しいチャンネル材料を成膜するための条件最適化を行っていたため、予定していたMott transistorのナノレベルへの微細化に進めていない。H26年度及びH27年度の実験結果から、金属絶縁体相転移に伴い構造相転移も起こすNdNiO3のチャンネルは、固体ゲートに覆われると構造相転移を抑制されてしまうため、電荷をドープしても金属絶縁体相転移が起きず、抵抗率がほとんど変化しないことが分かった。そこで、H28年度は、構造相転移を伴うことなく金属絶縁体相転移を起こすと考えられているSmCoO3をチャンネルに用いて固体ゲートMott transistorを作製する研究を進めた。

まず、パルスレーザーデポジション(PLD)法を用いてLaAlO3及びNdGaO3基板上にSmCoO3薄膜を成膜するための研究を進め、条件最適化を行った。比較的酸素圧の高い雰囲気での条件最適化を行った結果、LaAlO3基板上に結晶性が高く絶縁性も高い薄膜の成膜に成功した。しかし、この絶縁性の高いSmCoO3膜を用いて固体ゲートMott transistorの作製を試みたところ、これまで利用して来たデバイス構造だとチャンネルの抵抗率が高過ぎてPPMSを用いた抵抗率の温度依存性の測定が出来ないことが分かった。常温で電荷ドープを行いドレイン電流の増減を観測するだけでは電子相が制御出来ているかは分からない。電子相の制御に成功したかを確認するためには、電荷をドープしていない時とした時の抵抗率の温度依存性を測定し比較する必要がある。そこで、チャンネルの抵抗率が高くてもPPMSで抵抗率の温度依存性の測定が可能なデバイス構造の開発に取り組んだ。具体的にはチャンネル幅を広く、チャンネル長を短くしたデバイス構造に変更した。また、固体ゲートであるHfO2膜を成膜する方法をスパッタ法から原子層堆積(ALD)法に変更した。現在、新しい構造のデバイスを用いて抵抗率の温度依存性を測定する研究を進めているところである。現在、半導体を利用した電子デバイスの小型化が進んでいる。しかし、これらの小型化にも限界が近付いている。そのため、その限界を超えるためにこれまでにない特性を持った材料を利用したデバイスの開発が進められている。その一つが金属絶縁体相転移と呼ばれる現象を応用したモットトランジスタである。本研究では、NdNiO3とSmCoO3と言う二種類の酸化物を利用してモットトランジスタの試作を行い、その性能を比較する研究を行った。モット絶縁体に金属絶縁体相転移を誘起するのに必要な電荷量をドープ可能なゲート絶縁膜の成膜に時間が掛かっており、予定していたナノレベルの微細化に進めていない。SmCoO3をチャンネルに用いた固体ゲートMott transistorを作製し、その特性を評価すると共に、ナノレベルの微細化を推進する。酸化物エレクトロニクス本年度の研究により、素子が動作しないのは、酸素イオンの移動ではなく、ゲート絶縁膜の耐電圧及び誘電率に問題があることが分かった。今後はHfO2膜の成膜条件及びアニーリング条件等を見直し、ゲート絶縁膜の最適化に取り組む。具体的には水素と窒素の混合ガスを用いたフォーミングガス中でのアニール処理等を行い、ゲート絶縁膜の最適化を目指す。固体ゲート強相関酸化物FETを実現するために、素子の形状を変化させたときの素子の特性の変化を調べたが、ほとんど形状依存性はなかった。そのため、素子の加工プロセスの最適化するためには、ゲート絶縁層の成膜条件の最適化も行う必要が生じた。H27年度は既に購入済みの材料等を用いてSmCoO3膜の成膜条件最適化を行ったため、支出が生じなかった。試料の作製に手持ちの材料を利用出来たため、消耗品への出費を抑えられたため。
混合型複合構造の簡易な部材接合に関する研究

本研究では、異種部材要素の接合構造として、プレキャストPC桁と現場打ちPC桁を接合するループ鉄筋継手方式と鋼部材と場所打ちPC部材との支圧摩擦接合形式に着目して検討が行われた。研究期間2年のうち、初年度では、ループ継手の基本的な性状を調べるため、重ね長を変数とした1軸静的引張試験および桁供試体を用いた疲労載荷試験が行われた。この結果、(1)静的試験結果から、ループ内に圧縮応力が作用していること、重ね長の大きさによってコンクリートの破壊と鉄筋に降伏による破壊が生じること、(2)疲労試験結果から、打継目で局部的な曲げが生じ疲労寿命を低下させる可能性があること、が確認された。最終年度では、ループ状継手方式に対して、ループ径および鉄筋径を変数として追加し1軸引張試験を行った。この結果、(1)ループ鉄筋内のコアコンクリートが圧壊する場合の終局耐力は、ループ径、重ね長、鉄筋径が増加するにつれて大きくなることが確認され、(2)実測値を基に簡易な力学モデルを作成し、ループ内に作用する腹圧力の推定方法およびその限界値をコンクリート圧縮強度によって定義し、終局耐力の推定方法を示した。支圧摩擦接合形式における実験では、鋼桁とPC桁を接合した供試体が用いられた。供試体は、鋼桁側の接合面にエポキシ系接着剤と珪砂処理を塗布後、PC桁を打設し桁全体にプレストレス力を導入した。実験は、接合面に曲げモーメントとせん断力を同時に作用させ、接合面のずれによる破壊を生じさせた。この結果、(1)接合面の接着強度を与えることにより通常のはり理論を用いて接合面でのひび割れ発生荷重を推定できること、(2)ひび割れ後に接合の圧縮域のみでせん断抵抗していること、(3)その場合のせん断伝達強度を推定する式を導くことができた。断面形状及ぴ接合部での継ぎ手方法を主たる実験変数とした,プレキャストPC部材と場所打ちPC部材とをポストテンションニング方式により接合したはり部材の静的及び疲労試験を通じて得られた知見を以下に示す.・曲げひび割れ発生前における部材の剛性は,接合部を持たない場合のそれとほぼ等しい.しかし,曲げひび割れ発生荷重は,接合部を持たない場合よりも若干小さく,その荷重は.土木学会式により得られる引張強度を80%に低減することにより予測できる.・接合部のひび割れ幅は,断面形状や鉄筋の継ぎ手方法によらず土木学会式により予測できる.・曲げ耐力は通常のはり理論により,また,せん断耐力は土木学会式により予測できる.・静的荷重及び疲労荷重のいずれの場合にも,ループ継手を接合部に配置することで,接合部でのひび割れの成長が抑制され,健全部にひび割れを誘導できる.・重ね継手を用いた場合,ひび割れを跨ぐ鉄筋に局所的な曲げが発生する.その結果として,ひび割れを跨ぐ鉄筋の疲労寿命が低下するが,通常の応力振幅下においては,200万回の繰返し荷重を受けても鉄筋の破断は起こらず,部材は十分な疲労耐久性を有する.異種部材要素を接合する混合型の複合構造は、部材接合部の基本的な設計コンセプトが確立されていないのが現状である。これまでに、混合型複合部材を用いた構造物は、主に大規模な橋梁を対象に実用化が図られてきた。本年度は、上記のような背景を踏まえて、中小規模の構造物に適用可能な比較的簡易な部材接合法として、鋼部材と場所打ちPC部材との摩擦抵抗を主体とする簡易な支圧接合形式、プレキャストPC部材と場所打ちPC部材を接合するループ状鉄筋による継手方式の有効性を実験によって検証を行った。支圧接合形式における実験では、鋼桁とPC桁を接合したはり供試体を用いた。

供試体は、鋼桁側の接合面にエポキシ系接着剤および珪砂処理を施した後、PC桁を打設し桁全体にプレストレス力を導入した。実験は、接合面に曲げモーメントとせん断力を同時に作用させ、接合面のずれによる破壊を生じさせた。その結果、接合面の接着強度を与えることにより通常のはり理論を用いて接合面でのひび割れ発生荷重を推定できること、ひび割れ後に接合面の圧縮域のみでせん断抵抗していること、また、その場合のせん断伝達強度を推定する式を導くことができた。ループ状鉄筋による継手方式の実験では、ループ径、重ね長および鉄筋径を変数とした角柱供試体を用い、1軸引張載荷を行った。その結果、ループ鉄筋内のコアコンクリートが圧壊する場合の終局耐力は、ループ径、重ね長、鉄筋径が増加するにつれて大きくなることが確認された。実測されたひずみ等を基に、簡易な力学モデルを作成し、ループ内に作用する腹圧力の推定方法およびその限界値をコンクリート圧縮強度によって定義し、終局耐力の推定方法を示した。
遺伝子導入による増殖制御可能な高分化肝実質株化細胞の樹立

各種遺伝子(主に癌遺伝子)を培養細胞に導入し発現をコンディショナルに制御することにより、増殖及び分化を制御することを目的としている。既に昨年度に導入用にクローニングを済ませている遺伝子とその発現プラスミドの構築を終了するとともに、新たな遺伝子のクローニングと発現ベクターの構築を行なった。更に研究の進行により、細胞の増殖を抑制する因子を新たに決定し、それらの遺伝子をコンディショナルにノックアウトすることにより増殖を制御することを目的として研究を遂行した。肝細胞癌cell lineを用いた検討から、胃癌の癌抑制遺伝子として近年度同定されたRUNX3遺伝子を細胞内に導入することにより細胞増殖能を検討した。また、肝細胞癌の予後に関与するDCP(Des-gamma-carboxyl-prothrombin)が、Metを介して肝細胞の増殖を亢進(Journal of Biological Chemistry投稿予定)させることを明らかにした。この研究の中で、肝細胞の増殖を制御する一つの因子として、DCPの産生を制御することに意義があると考えた。更に、DCPの産生にはGGCX遺伝子の発現が関係していることを明らかにした。GGCX遺伝子のクローニングも終了し、デキサメタゾンによる発現制御可能なMMTVpを有するベクターに組み込んだ。GGCX遺伝子の細胞への導入は、細胞増殖を抑制することも判明した。これらの検討結果を元に、今まで細胞への導入および発現制御を予定していたEGFR,c-Met,MEK,hTRTに加えて、RUNX3およびGGCXの発現を制御することとした。これらの遺伝子は、クローニングを終了し、更にこれらはMMTVpを有するベクターにサブクローニングにより組み込み発現プラスミドを構築した。更に蛋白の精製、発現の指標とするためにポリヒスチジンTagを付加した。RUNX3は抗体がないため、in situ hybridizationによる検出系を確立した。これらの遺伝子は発現を抑制することにより細胞増殖が亢進することが上記の検討により明らかになっているため、RNA干渉の技術を用いて細胞内で発現をノックアウトすることを計画し施行中である。RUNX3およびGGCXの遺伝子発現をノックアウトすることを目的としたターゲット配列を各々5'-AAGGCACCTCGGAACTTTCAA,5'-AACACTACAGAGCTTGCACTGとしてステムループ型のRNAi発現ベクターを構築した。発現ベクターはPLC,HLE,Hu-7の肝細胞癌cell lineを用いて、RUNX3およびGGCXの発現を抑制可能であるかどうかの検討を行っている。この検討の後に、テトラサイクリンにより遺伝子発現抑制を制御可能なsiRNA発現ベクター(pSUPERIOR)に組み込む予定である。特別研究員を中途辞退させていただいたため、当該科学研究費での研究遂行は中断するが、今後も継続して本研究を完結させたいと考えています。本研究においては、各種の遺伝子(主に癌関連遺伝子)を培養細胞に導入し、その遺伝子産物の発現をコンディショナルに制御し、増殖を制御することを目的としている。本年度は主に導入に用いる遺伝子のクローニングと発現プラスミドの構築を行った。EGFRは、当該研究員の前勤務先よりcDNAを入手し、デキサメタゾンにより制御可能なMMTVプロモータと組み合わせた発現ベクターを構築した。テロメラーゼ逆転写酵素も肝細胞癌cell line PLCよりRT-PCRによりクローニングを終え、PCR4ベクターに組み込んだ。テトラサイクリンで制細可能な蛋白発現システム(tetシステム)は本来二つのプラスミドより構成され、その遺伝子導入に二つのセレクション用抗生物質が必要となるが、本研究においては、二つの遺伝子を同時に独立して制御するため、tetシステムは一つのセレクション用抗生物質で確立できるほうが望ましいと判断し、tetシステム蛋白発現ベクターの改変を行った。具体的には、tetシステムのtetresponsive elementの発現と他のインサート用発現プラスミドを二方向に蛋白発現が起こるようにサブクローニングによりつなぎ合わせ、一つの抗生剤でセレクションが行えるようにした。当該研究員は、ラットを用いた肝臓の門脈からのコラゲナーゼ環流には、習熟しておりラット肝臓より分離した肝細胞を実験室内で老化させる実験を行っている、マウスの門脈はラットと比較して細く破れやすく還流の手技習得は困難であったが、平成15年3月の時点では、ほぼ問題なく環流が遂行できるようになり、現在マウス肝実質細胞を実験室内で継代培養し老化実験を遂行中である。

GGCX遺伝子の細胞への導入は、細胞増殖を抑制することも判明した。これらの検討結果を元に、今まで細胞への導入および発現制御を予定していたEGFR,c-Met,MEK,hTRTに加えて、RUNX3およびGGCXの発現を制御することとした。これらの遺伝子は、クローニングを終了し、更にこれらはMMTVpを有するベクターにサブクローニングにより組み込み発現プラスミドを構築した。更に蛋白の精製、発現の指標とするためにポリヒスチジンTagを付加した。RUNX3は抗体がないため、in situ hybridizationによる検出系を確立した。これらの遺伝子は発現を抑制することにより細胞増殖が亢進することが上記の検討により明らかになっているため、RNA干渉の技術を用いて細胞内で発現をノックアウトすることを計画し施行中である。RUNX3およびGGCXの遺伝子発現をノックアウトすることを目的としたターゲット配列を各々5'-AAGGCACCTCGGAACTTTCAA,5'-AACACTACAGAGCTTGCACTGとしてステムループ型のRNAi発現ベクターを構築した。発現ベクターはPLC,HLE,Hu-7の肝細胞癌cell lineを用いて、RUNX3およびGGCXの発現を抑制可能であるかどうかの検討を行っている。この検討の後に、テトラサイクリンにより遺伝子発現抑制を制御可能なsiRNA発現ベクター(pSUPERIOR)に組み込む予定である。特別研究員を中途辞退させていただいたため、当該科学研究費での研究遂行は中断するが、今後も継続して本研究を完結させたいと考えています。