hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
子宮頸癌における新しい癌ワクチンの開発

BLマウスにHPV16E7ペプチドワクチンを皮下、経鼻、皮膚パッチにて、2回免役したマウス群と陰性コントロール群とした。これらの群より1回免疫後と2回免疫後に採血し、血清を分離する。同様に膣分泌液を採取する。血清中のHPVE7に対するIgG抗体、膣分泌液中のHPVE7に対するIgA抗体をマイクロプレートリーダーで測定し、免疫した4群とコントロール群を比較検討した。血清中のHPVE7に対するIgG抗体は、すべての群において陰性であり、再度実験方法を検討し、実験する予定である。膣分泌液中のHPVE7に対するIgA抗体は抗体価が低く測定不可能であった。HPV16E7ペプチドワクチン投与4群はコントロール群に比較して腫瘍は小さく、重量も有意に少なく、CD4、CD8陽生リンパ球が増加しており、局所細胞性免疫応答を誘導することによって、腫瘍阻止効果があるが、全身における免疫能については実験方法を検討し、追加実験を行う予定である。子宮頸癌克服のためには、その原因ウイルスであるヒトパピローマウイルス(HPV)感染に対する癌ワクチンの開発が重要である。HPV感染を防御するためには、その感染経路である膣粘膜上の免疫活性を上げる必要がある。近年、腸粘膜や鼻粘膜での粘膜免疫機構の解明により、免疫誘導組織と実行組織があり、粘膜関連リンパ組織が見つかっている。よって、これらの粘膜免疫を活性化させるために、より有効性の高い感染に対するワクチンの開発と投与法について検討した。C57BLマウスにHPV16E7ペプチドワクチンを皮下、経鼻、経膣投与にて、2回免疫したマウス群と陰性コントロール群とした。血清中のHPVE7に対するIgG抗体は、測定できず。HPV16E7ペプチドワクチン投与4群はコントロール群に比較して腫瘍は小さく、腫瘍阻止効果があるが、全身における免疫能については不明であった。
多極化時代における多国籍企業の地域統括マネジメント～欧州地域統括本社を中心に～

本研究の目的は,日本企業が欧州で展開する地域マネジメントについて地域統括本社制の視点から考察することである。本研究で実施した調査の結果,従来は日本本社の延長線でしかなかった地域統括マネジメントが,本社によるグローバル統合が進み地域統括本社の存在意義が弱まったケースと,地域完結型のビジネスモデル構築に迫られているケースがみられ,地域統括本社の位置づけが10年前と異なっていることが明らかになった。本研究は,日本企業が欧州で展開する地域マネジメントについて地域統括本社制の視点から考察することを目的に行うものである。平成22年度はまず,文献調査を行い,これに基づき,日系企業の地域統括本社に関わる最近の動向などを把握するとともに,インタビュー調査やアンケート調査に必要な研究のフレームワークを構築した。また,日系企業の欧州地域統括本社におけるインタビュー調査を実施した。訪問企業は,パナソニック(英国),東芝(英国),テルモ(ベルギー)である。また,コマツは現地でのスケジュールが合わず,東京本社において調査を実施した。この調査から見いだせたことは,経済のグローバル化が進展した結果,従来のように地域内でマネジメントを完結する傾向が弱まり,それに伴い地域統括会社の役割が変化してきていることが明らかになった。また,地域統括本社の重要な役割の一つが,地域で完結することにより効果のあるシェアードサービスが中心となってきていることも明らかになった。このように,調査の結果,日系企業の地域統括マネジメントのあり方が,約10年前と比較すると変化してきていることがわかっただけでなく,その結果を後に実施する予定のアンケート調査の質問項目に反映させることができた。なお,この現地調査は,当初は2011年3月に実施予定であったが,東日本大震災の発生により2011年7月に変更し実施したものである。平成23年度は,まず海外に地域統括本社や海外に統括機能を持つ日本企業本社に対するアンケート調査を実施した。このアンケートは,主に海外に地域統括会社を持つ日本本社195社を対象に実施した。しかしながら,このアンケート調査は,回答依頼を何度か行ったものの,回収率が低く,分析を行うに至らない状況となった。そこで,情報の不足を補うため,日本本社におけるインタビュー調査を実施した。また,欧州に立地する地域統括本社・統括機能を持つ海外子会社230社を対象にアンケート調査を実施した。このアンケートの回答は昨年度末より回収作業を進めており,ある程度の回答を得ることができた。しかしながら,分析の有効性を高めるためには回収率を上げる必要があり,平成24年度に回答依頼を再度行う予定である。それに加え,欧州に立地する地域統括本社においてインタビュー調査をスイスにおいて実施した。スイスを調査対象としたのは,調査研究の結果得られた知見から,近年スイスに立地する地域統括本社がみられるようになったこと,また,地域統括本社を世界本社に格上げし,グローバルなマネジメントを実現しようとする日系企業がスイスにおいてみられたことが理由である。訪問した企業は,サンスター,日産,JTである。あわせてジェトロジュネーブ事務所,IMDを訪問し,日系企業がスイスに立地する背景について調査した。現在,アンケート調査の結果は現在分析を行っているところであるが,インタビュー調査の結果から,従来の地域統括会社のあり方が変わってきていること,また,地域統括本社から世界本社に発展するモデルが現れてきていることなど,本研究において重要な知見を得ることができた。平成24年度は,前年度実施した欧州における地域統括本社に関するアンケート調査の分析を行った。この結果,1地域統括本社の統括範囲が以前よりもロシアやアフリカなどに拡大している,2日本人派遣社員の減少傾向がみられた,3統括機能は,生産よりも販売機能,ファイナンスや法務関係のスタッフ機能,地域戦略の策定や現地法人のモニタリング機能などを中心としたものが多かった,4現地法人は地域統括本社に報告する形が明確になってきている,5地域統括本社の成果では,ファイナンスや法務関係,地域戦略の策定において成果があったとする回答が多かった,6今後も統括機能を強化するとした企業が多くみられた。また,このアンケート調査の結果を補足するため,欧州に立地する地域統括本社においてインタビュー調査をロンドンとアムステルダムで実施した。今回訪問したのは,NECヨーロッパ,YKKヨーロッパ,ヤクルトヨーロッパ,となっている。この調査を通じて明らかになったこととしては,日本本社の延長線上で行われていた地域統括マネジメントが,欧州という地域で独立した形でビジネスモデルを構築することに迫られていること,そのため,地域統括本社に権限が委譲されつつあること,地域統括本社における現地化が進んできていること,などが明らかとなった。以上のことから,欧州における地域統括本社は,新しいビジネス環境における地域統括本社を中心とした新しいビジネスモデルの構築を模索していることがわかった。本研究を通して得られた主な知見は以上の通りである。今後は,これらの知見を活かし,アジアにおける地域統括本社の実態を調査する予定である。

日本本社を対象としたアンケート調査の回収率が低く分析に困難を来した部分はあるが,代替措置としてインタビュー調査を実施し情報を補っていること,欧州本社を対象としたアンケートの回収は概ね順調に進んでいること,さらに現地でのインタビュー調査も予定通り進んでいることなどを勘案し,(2)と判断した。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度は,本研究の最終年度にあたる。まずは,平成23年度に実施したアンケート調査の分析を進めていく予定である。なお,アンケートの回収率を高めるため,平成24年度の早期の段階で,回答依頼を再度行う予定である。また,アンケート調査の内容を補うために,欧州におけるインタビュー調査を計画通り,実施する。最終的には調査研究を総括し,報告書としてまとめる予定である。
知的創作物の創出における「コミュニティ」と、そこでの「慣習」や「規範」の役割

本研究は、知的創作物の創出において重要性を増しつつある「コミュニティ」と、そこにおける「慣習」や「規範」の役割について検討を行った。研究の際には、当該「コミュニティ」における「慣習」や「規範」に社会としていかに向き合うかということを探るべく、「コミュニティ」が達成しようとする社会的価値や、「慣習」や「規範」の生成プロセスに着目し、知的創作物に関係する様々なアクターの社会的ネットワークや相互作用に「コミュニティ」を位置づけることを通じて、知的財産法などの国家法との相互補完関係や矛盾抵触関係を明らかにすることを目指した。平成26年度は、「マス・カスタマイゼーション」の時代を迎えた知的創作物の創出における「コミュニティ」の役割について、「オープンソース」、「クリエイティブ・コモンズ」、「オープンデザイン」、「ユーザーイノベーション」などを素材に検討を行った。それらの一連の新しい動きは、広く社会からの「参加」と「共創」が行われる新しい「ものづくり」の考え方を伴っている。検討の結果、そこで問題となっているコミュニティの慣習や規範のあり方が、アクター間のリソースのやり取りのあり方(いわゆる「資源管理」)に影響を与えており、その資源管理がなされる際の法的規律に影響を与える可能性が高いのではないか、ということが明らかになった。例えばユーザーイノベーションにおいては、いわゆる「リードユーザー」との協働によって、これまで主に企業が負担してきた研究開発コストについて、企業としてそれを減らすとともに、ユーザーから研究開発のリソースを調達できる可能性を秘めているという点は、資源管理の観点から注目に値する。本年度の研究を通して、それらの活動がなされるコミュニティにおける慣習や規範の生成プロセスに着目するとともに、それらの慣習や規範が知的財産法などの国家法といかなる相互補完関係あるいは矛盾抵触関係にあるのか、そして、いかなる場合にこれらの慣習や規範の適用が認められるべきなのか、といった理論的課題について考察する必要性が増している、ということを確認した。知的創作物の創出に関する「地域コミュニティ」のあり方について、伝統的祭祀、「フォークロア」、伝統芸能などの「伝統的文化表現」や、「現代アート」などを素材に検討を行った。伝統的文化表現や現代アートなどについては、単に知的財産権による法的保護を検討するのではなく、その背後にある「地域コミュニティ」を視野に入れる必要がある。伝統的文化表現は、いわゆる「地方」に多く存在するが、そこでは近時、例えば「限界集落」の問題がクローズアップされている。限界集落では「共同体(コミュニティ)」の持続可能性が失われつつあり、そこで培われた民俗芸能などの伝統的文化表現が消失する危険が生じている。この問題は、東日本大震災後の東北地方の地域コミュニティの紐帯を考える上で、特に重要性を増している。また、本年4月に発生した熊本地方・大分地方での震災についても、今後、伝統的文化表現を被災したコミュニティにおいて、どのように後世につないでいくのかという問題が生じることが考えられるため、今後の動向を注視していきたい。これらの問題に対する制度的支援は、地域コミュニティの持続可能な発展に資する形でなされなければ、有意義な結果をもたらさない。この点で参照されるべきなのが、現代アートにおける「アートプロジェクト」である。「アートプロジェクト」は、過疎地域におけるコミュニティの活性化を促す起爆剤として注目されるが、その背景には、現代アートの特徴の1つである「サイトスペシフィック」性が、コミュニティの存立基盤の再検討を促す契機となることが挙げられる。本研究では、伝統的文化表現や現代アートに関係する様々なアクターの配置や相互関係についての分析を通じて、それら「地域コミュニティ」の「慣習」や「規範」のあり方について検討し、当該コミュニティの持続可能性を維持できるような形での制度的支援の可能性について検討を行った。「コミュニティ」に関係する論稿を発表できたほか、伝統的文化表現や現代アートについての現状を把握するための実態調査も実施することができた。最終年度に当たる平成28年度の研究の進め方についても見通しが立っている。平成28年度は、「コミュニティ」の果たす役割について、学際的「コモンズ」研究との接合を目指した。本研究においては、近時の学際的な「コモンズ」研究における知見を参照し、知的創作物の創出における「コミュニティ」と、そこでの「慣習」や「規範」の果たす役割についての理論研究を進めた。また、「コミュニティ」の「慣習」や「規範」の妥当性や適用範囲という問題は、複数の規範が適用可能な状況のもとで、どの規範を適用することが社会的に望ましいのかという「法抵触」の現われでもある。グローバル化とともに、「多元主義」や「文化多様性」などの問題がクローズアップされる現代において、「いかなる規範が、いかなる範囲に属する主体に対して、いかなる局面において適用されるべきであるか」という抵触法の問題設定は、国内外においてアクチュアリティを増している。本研究は、これらの文化論を踏まえた近時の法学研究の知見も視野に入れつつ、分析を行なった。また、平成28年度は、本研究の最終年度であった。したがって、個別テーマの研究に加え、本研究のまとめも同時に行なった。そこでは、個別研究で扱った知的創作物に関係する様々なアクターの社会的ネットワークや相互関係を明らかにし、知的創作物の創出における「コミュニティ」の「慣習」や「規範」の位置づけを行うとともに、その作業を踏まえ、多様な知的創作物が創出される環境を整備するための社会の関わり方を探った。そして、「多元主義」や「文化多様性」が叫ばれる現代社会で必然的に生じる「規範の抵触」を解決する思考枠組みの提供を目指した。

研究の際には、当該「コミュニティ」における「慣習」や「規範」に社会としていかに向き合うかということを探るべく、「コミュニティ」が達成しようとする社会的価値や、「慣習」や「規範」の生成プロセスに着目し、知的創作物に関係する様々なアクターの社会的ネットワークや相互作用に「コミュニティ」を位置づけることを通じて、知的財産法などの国家法との相互補完関係や矛盾抵触関係を明らかにすることを目指した。「マス・カスタマイゼーション」時代の知的創作物の創出や媒介に関係する「コミュニティ」について、平成26年度に公表には至っていないものの、当該研究テーマに関連する論稿2本が脱稿され、平成27年度前半に出版されることが確定している。また、平成27年度に主に検討する予定である「地域コミュニティ」の研究についても、実施に向けた見通しが立っている。平成28年度は、「コミュニティ」の果たす役割について、学際的「コモンズ」研究との接合を目指す。本研究は、近時の学際的な「コモンズ」研究における知見を参照し、知的創作物の創出における「コミュニティ」と、そこでの「慣習」や「規範」の果たす役割についての理論研究を進めたい。また、「コミュニティ」の「慣習」や「規範」の妥当性や適用範囲という問題は、複数の規範が適用可能な状況のもとで、どの規範を適用することが社会的に望ましいのかという「法抵触」の現われでもある。グローバル化とともに、「多元主義」や「文化多様性」などの問題がクローズアップされる現代において、「いかなる規範が、いかなる範囲に属する主体に対して、いかなる局面において適用されるべきであるか」という抵触法の問題設定は、国内外においてアクチュアリティを増している。本研究は、これらの文化論を踏まえた近時の法学研究の知見も視野に入れつつ、分析を行う予定である。本年度は、研究の最終年度である。個別テーマの研究に加え、本研究のまとめも同時に行う。そこでは、個別研究で扱った知的創作物に関係する様々なアクターの社会的ネットワークや相互関係を明らかにし、知的創作物の創出における「コミュニティ」の「慣習」や「規範」の位置づけを行うとともに、その作業を踏まえ、多様な知的創作物が創出される環境を整備するための社会の関わり方を探りたい。そして、「多元主義」や「文化多様性」が叫ばれる現代社会で必然的に生じる「規範の抵触」を解決する思考枠組みの提供を目指したい。知的財産法、文化政策と法平成27年度については、知的創作物の創出に関する「地域コミュニティ」のあり方について、伝統的祭祀、「フォークロア」、伝統芸能などの「伝統的文化表現」や、「現代アート」などを素材に検討する予定である。伝統的文化表現や現代アートなどの文化的表現に関係する様々なアクターの配置や相互関係についての分析を通じて、それら「地域コミュニティ」の「慣習」や「規範」のあり方について検討し、当該コミュニティの持続可能性を維持できるような形での制度的支援の可能性について検討する。
アンジオテンシンII2型受容体を介した心筋イオンチャンネルへの作用機序の解明

申請者らは、心筋αMHCプロモーターを使用し、アンジオテンシンII2型受容体(AT2)心筋特異的発現トランスジェニックマウス(AT2-Tgマウス)を作製した。AT2-Tgマウスではコントロールマウスに比して、AngIIによる循環調節反応において、アンジオテンシンII1型受容体(AT1)作用に拮抗し、陰性変時作用を介した血圧低下作用を発揮することを報告した。同時にAT2-Tgマウスでは、基礎の心筋収縮力および、AngIIに対する心筋収縮力の変化においては野生型マウスと比して差がないことを確認した。以上を考え合わせると、AT2-Tgマウスでみられる陰性変時作用をかいする血圧低下の作用機序として、AT2の心筋刺激伝導系への関与の可能性が考えられた。心筋刺激伝導は主として各種イオンチャンネルにより制御されている。そこで、続いてAT2の心筋イオンチャンネルへの作用を検討した。方法は、AT2-Tgマウスよりランゲンドルフ潅流装置を使用し、コラゲナーゼ処理により心筋を単離し、パッチクランプ法により、電気生理学的検討をおこなった。結果、心室筋細胞においては、L-type Ca^<2+>channel,transient outward K^+channelのPeak currentには、AT1およびAT2とも影響を与えないことを確認した。続いて心房細胞を同様の方法で単離し、各種イオンチャンネルへのAIIの影響を検討したところ、AngIIはT-type Ca^<2+>channelのPeak Currentを約20%程度抑制する傾向を示した。現在この作用の確認とAngIIのサブタイプ別の作用機序およびAngIIのT-type Ca^<2+>channelのcurrent kineticsへの影響を検討中である。アンジオテンシンII2型受容体を介した心筋イオンチャンネルへの作用機序の解明申請者らは、心筋αMHCプロモーターを使用し、アンジオテンシンII型受容体(AT2)心筋特異的発現トランスジェニックマウス(AT2-Tgマウス)を作製した。AT2-Tgマウスではコントロールマウスに比して、AgIIによる循環調節反応において、アンジオテンシンII1型受容体(AT1)作用に拮抗し、陰性変事作用を介した血圧低下作用を発揮することを告した。同時にAT2-Tgマウスでは、基礎の心筋収縮力および、AIIに対する心筋収縮力の変化においては野生型マウスと比して差がないことを確認した。方法は、AT2-Tgマウス、よりランゲンドルフ潅流装置を使用し、コラゲナーゼ処理により心筋を単離し、パッチクランプ法により、電気生理学的検討をおこなった。今後は、これらのイオンチャンネルのcurrent kineticsに及ぼす影響や、他のイオンチャンネルへの作用および心房細胞におけるイオンチャンネルへの作用についても検討を進める予定である。
嗜癖者とその家族の回復に関する社会学的研究-疫学、社会資源、生活世界変容の視点から-

研究テーマは「嗜癖者とその家族の回復に関する社会学的研究」という題目であったが,前年度からの研究の継続・進展の過程で,より身近な問題である不登校問題とその家族に対してのアプローチを中心に研究を進めた。目標としていた質問紙による調査については,不登校児の親の会メンバーとのラポール(親密な関係)の確立が十分でないと判断されたため,年度内に研究目的を達成することが困難と判断し,残念ながら延期した。しかし,前年度から継続的に接触・参与観察していた不登校児の親の会のメンバー(母親)数名にインタビューを申し込み,長時間にわたるインタビューをおこなうことができた。インタビューのテープ起こしスクリプトによって,彼らの得てきた援助機会やそれに対する構え等については,ある程度の知見を得ることができたと考えている。嗜癖と不登校の関係については、参与観察のデータ等も参考にした仮説を日本社会学会大会(1993年10月,於東洋大学)で報告した。その際にも述べたが、不登校にも嗜癖にみられるような「共依存」的な人間関係は成立しており、そこからの離脱が不登校児と親との関係回復の一つの鍵になることは確実である。しかし、不登校という現象を「病気」という隠喩で語ることに対する異論も出されたことから,不登校という現象の定義レベルでの議論をさらに深める必要があることが示唆された。この問題に対しては,嗜癖論と同様に「病気」という隠喩が通常ともなう否定的な含意だけではなく,内部からのメッセージ,という積極的な含意をもつ,という立論が可能であり,理論的に十分対応可能だと筆者は考えている。
野生マウス遺伝資源からの新規近交系の確立と有用モデル系統の育成

本研究の目的は、野生マウス集団の遺伝資源から有用な変異遺伝子を発掘し、新しい自然発症モデルマウスの系統開発とその特性及び遺伝解析を行うことである。これまでにフィリピン産野生マウスより新たな近交系(CASP)を確立し、また既存の近交系マウスとの交配からいくつかのミュータントを発見し系統育成を行ってきた。研究期間内に得られた成果は以下の通りである。野生マウス由来近交系の遺伝特性の検索について、マイクロサテライトマーカーによる多型解析を行った結果、既存の近交系とは大きく異なりミュータント系統の遺伝解析に有用なマーカーとなることを確認した。ミュータント系統の育成においては、インシュリン非依存性糖尿病モデルとして選抜近親交配により安定した高血糖の系統が近交系として確立された。この近交系と既存の近交系との交配パネルを作製し、これから高血糖因子の遺伝解析を行う予定である。形態形成異常マウスはコンジェニック系統として育成してきており、近交系化を目標として今後も引き続けて進める。これらの系統は特性の調査を行い、これまでに報告されていない新規のミュータントであることが予測された。体重変異系統では、マッピングされたマウスの体重や成長に関するいくつかの量的形質遺伝子座(QTLs)について、コンジェニック系統の作出による機能解析と遺伝子の絞込みが行われた。これらのQTLsは新規の体重差に影響する遺伝子としてその特性と発現様式を報告した。亜種間交雑リコンビナント近交系(RI系統)の開発育成については、CASP系統とBALB/cA系統との交雑から作出を始め、正逆交配のF1ペアからそれぞれ15以上のラインを育成してきた。しかしF数世代からF十数世代で繁殖力の低下するラインが多く、最終的に合計20ライン以上を近交系として確立する目標が困難な状況となり、この原因追究と対策が今後の検討課題である。本年度までに得られた成果は以下の通りである。野生マウス由来近交系の遺伝特性の検索はマイクロサテライトマーカーによる多型解析を進め、既存近交系とはかなり分化していることを確認した。ミュータント系統の育成においては、インシュリン非依存性糖尿病モデルとして選抜近親交配により安定した高血糖の系統を近交系として確立しつつある。形態形成異常マウスは繁殖力に難があるため形質の保存に努め、コンジェニック系統として育成を進めている。これらの系統は特性の調査も引続き行い、これまでに報告されていない新規のミュータントであることが予測された。体重変異系統では、マッピングされたマウスの体重や成長に関するいくつかの量的形質遺伝子座QTLs)について、コンジェニック系統の作出による機能解析と遺伝子の絞込みが行われた。亜種間交雑リコンビナント近交系(RI系統)の開発育成については、CASP系統とBALB/cA系統との交雑から作出を始め、正逆交配のF1ペアからそれぞれ15以上のラインが現在F5F10世代まで存続している。最終的に合計20ライン以上が近交系として確立されることを目標に育成を続ける。

これまでにフィリピン産野生マウスより新たな近交系(CASP)を確立し、また既存の近交系マウスとの交配からいくつかのミュータントを発見し系統育成を行ってきた。本年度までに得られた成果は以下の通りである。野生マウス由来近交系の遺伝特性の検索についてマイクロサテライトマーカーによる多型解析を行った。今後ミュータント系統の遺伝解析を行うための既存近交系と異なるマーカーの選別を進めている。ミュータント系統の育成においては、インシュリン非依存性糖尿病モデルとして選抜近親交配により安定した高血糖の系統が近交系として確立された。現在遺伝解析のための交配パネルを作製中である。形態形成異常マウスは、コンジェニック系統として育成段階であり、ある程度近交化したところで遺伝解析を行う予定である。これらの系統は特性の調査も引続き行い、これまでに報告されていない新規のミュータントであることが予測された。体重変異系統では、マッピングされたマウスの体重や成長に関するいくつかの量的形質遺伝子座(QTLs)について、コンジェニック系統の作出による機能解析と遺伝子の絞込みが行われた。これらのQTLsは新規の体重差に影響する遺伝子としてその特性と発現様式を報告した。亜種間交雑リコンビナント近交系(RI系統)の開発育成については、CASP系統とBALB/cA系統との交雑から作出を始め、正逆交配のF1ペアからそれぞれ15以上のラインを育成中であるが、F数世代からF十数世代で繁殖力の低下するラインが多く、最終的に合計20ライン以上を近交系として確立する目標が困難な状況になってきた。この原因と対策について今後検討を行う。
非線型偏微分方程式論と幾何学及び確率論的問題との関連

コンパクトリ-マン多様体上の調和写像に関連して現れる非線型楕円型方程式及び古典力学的ハミルトン系流体現象から現れる同種の非線型方程式を解析し、その幾何学的構造、確率論的解釈及び方程式自身の吟味を試みることが目標である.特に、これらの方程式の泡沫現象、爆発現象、安定性、境界条件の吟味等に焦点を合わせて研究を行っている.これらの幾何学的構造を明らかにし、確率論的意味付けを与えることは純粋数学としての重要性のみならず、応用の立場からも不可欠である.自然現象と照らし合わせながら問題設定、結果の吟味を行う必要がある研究代表者は、方程式の基本構造はその再生的構造が本質的であると考え、この立場から文献1、2(報告書欄11、上から順)をまとめた.楕円型方程式の基本構造は、対応する境界特異積分方程式と境界値問題に帰着する.この立場から、境界上のヒルベルト変換を導入しその構造と境界値条件の関連を調べた.青本氏は方程式の代数化を試みgー解析的立場から文献3,4,5を発表した.舟木氏は確率論的観点から流体力学的方程式(特に、ランダウ型方程式)の吟味とその考察を行い文献6をまとめた.小沢氏は幾何学的立場から、軌跡や安定性についての問題を量子的に定式化した.さらに多様体の埋蔵についての議論も行った.千代延氏は確率論的立場から、ラプラス型方程式の漸近挙動を解析した.内藤氏は微分幾何学的立場から、多様体上の熱力学的調和写象の安定性を議論した.コンパクトリ-マン多様体上の調和写像に関連して現れる非線型楕円型方程式及び古典力学的ハミルトン系流体現象から現れる同種の非線型方程式を解析し、その幾何学的構造、確率論的解釈及び方程式自身の吟味を試みることが目標である.特に、これらの方程式の泡沫現象、爆発現象、安定性、境界条件の吟味等に焦点を合わせて研究を行っている.これらの幾何学的構造を明らかにし、確率論的意味付けを与えることは純粋数学としての重要性のみならず、応用の立場からも不可欠である.自然現象と照らし合わせながら問題設定、結果の吟味を行う必要がある研究代表者は、方程式の基本構造はその再生的構造が本質的であると考え、この立場から文献1、2(報告書欄11、上から順)をまとめた.楕円型方程式の基本構造は、対応する境界特異積分方程式と境界値問題に帰着する.この立場から、境界上のヒルベルト変換を導入しその構造と境界値条件の関連を調べた.青本氏は方程式の代数化を試みgー解析的立場から文献3,4,5を発表した.舟木氏は確率論的観点から流体力学的方程式(特に、ランダウ型方程式)の吟味とその考察を行い文献6をまとめた.小沢氏は幾何学的立場から、軌跡や安定性についての問題を量子的に定式化した.さらに多様体の埋蔵についての議論も行った.千代延氏は確率論的立場から、ラプラス型方程式の漸近挙動を解析した.内藤氏は微分幾何学的立場から、多様体上の熱力学的調和写象の安定性を議論した.
Gタンパク質共役型受容体ヘテロ複合体形成の解析と複合体作用薬開発への応用

ドーパミン神経伝達におけるアデノシン受容体A2サブタイプ(A_<2A>R)-ドーパミン受容体D2サブタイプ(D_2R)ヘテロ複合体を分子レベルで解析し、両受容体ヘテロ複合体を作用点とする新規なパーキンソン病治療薬の開発の可能性を探った。1.ヘテロ複合体形成の動態の解明非侵襲性近接アッセイを用いて生細胞においてA_<2A>RはD_2Rと直接結合してヘテロ複合体だけでなく、ホモ複合体をも形成することを明らかにした。次いで、結合に関与すると推測されるペプチド領域のみを、複合体を形成しないことが明らかな受容体の相当する領域と交換したchimeric mutantを作製した。一方、両受容体の恒常的なヘテロ複合体モデルとなる、両受容体活性を保持した融合タンパク質を作製することに世界で初めて成功した。作製法としては、7回膜貫通型受容体であるGPCRの細胞膜貫通ドメインを奇数個欠損させて両受容体を融合させるのではなく、両受容体の間に別の細胞膜貫通ドメインを介して両受容体を融合させた。これは、受容体二量体作用薬の開発へ応用できる。2.受容体複合体特異的抗体の作製受容体を高度に安定発現する細胞株を樹立、A_<2A>R-D_2Rヘテロ複合体及びA_<2A>Rホモ複合体の精製法を確立した。しかし、単離したA_<2A>R-D_2Rヘテロ複合体の安定性が極めて低いことが明らかとなり、免疫原として細胞膜画分を免疫して受容体複合体特異的モノクローナル抗体の作製を試みた(近畿大学薬学部細胞生物学・益子高先生の協力)結果、複合体特異的抗体の存在の可能性が示唆された。3.ラット線条体由来神経細胞株の解析線条体において形成される受容体複合体の機能を検討する際に、簡便なアッセイ法の確立は有用である。しかし、ラット線条体由来神経細胞株[Freed博士(米国NIH)より供与]は両受容体発現量が極めて低かった。ドーパミン神経伝達におけるアデノシン受容体A2サブタイプ(A_<2A>R)-ドーパミン受容体D2サブタイプ(D_2R)ヘテロ複合体の役割、分子機構を解明するために、両受容体間の直接的な相互作用を明らかにした。1.線条体における両受容体ヘテロ複合体形成の検討天然組織におけるヘテロ複合体形成を同定するために、ラット脳スライス切片を二重免疫染色して共焦点レーザー顕微鏡で観察し、また脳組織から膜画分を調製して免疫沈降を試みた。前者については、用いた抗体の特異性が低いことが明らかになった。2.膜画分からの受容体の可溶化と免疫沈降法または単離の検討A_<2A>RとD_2Rの安定高発現株を樹立した,この受容体あるいは一過性に発現させた受容体の生化学的性質を解析した結果、受容体は機能を維持した状態で細胞膜に、しかもそのアミノ末端を細胞膜外側にして発現しているが、抗タグ抗体による単一受容体の免疫沈降の効率が悪く、タグを複数個有する発現ベクターを新たに構築した。この受容体の生化学的性質を解析するとともに、免疫沈降法を試みて、A_<2A>RとD_2Rとが直接結合してヘテロ複合体を形成することを証明した。さらに両受容体の直接的な相互作用の解析を進めるために、両受容体の恒常的なヘテロ複合体モデルとなる、A_<2A>RとD_2Rとからなる融合受容体蛋白の作製を試みた。またさらに、ヘテロ複合体の単離を抗体アフィニティーカラムを用いて試みた。3.BRETによる両受容体間相互作用の解析A_<2A>RやD_2Rと、ウミシイタケ酵素ルシフェラーゼや蛍光タンパク質GFP^2との融合タンパク質を一過性に発現したトランスフェクタントを、アナライザーで計測することによって両受容体の直接的会合を分子レベルで、かつ細胞を破壊することなく生細胞の状態で解明した結果、A_<2A>RはD_2Rとヘテロ複合体を形成するだけでなく、ホモ複合体を形成することを明らかにした。2.受容体複合体特異的抗体の作製受容体を高度に安定発現する細胞株を樹立、A_<2A>R-D_2Rヘテロ複合体及びA_<2A>R

ホモ複合体の精製法を確立した。しかし、単離したA_<2A>R-D_2Rヘテロ複合体の安定性が極めて低いことが明らかとなり、免疫原として細胞膜画分を免疫して受容体複合体特異的モノクローナル抗体の作製を試みた(近畿大学薬学部細胞生物学・益子高先生の協力)結果、複合体特異的抗体の存在の可能性が示唆された。3.ラット線条体由来神経細胞株の解析線条体において形成される受容体複合体の機能を検討する際に、簡便なアッセイ法の確立は有用である。しかし、ラット線条体由来神経細胞株[Freed博士(米国NIH)より供与]は両受容体発現量が極めて低かった。
植物ホルモンの分析によるキュウリの栽培生理の解明

ミクロとセミミクロカラム用の液体クロマトグラフ(HPLC)システムで、確立した精製法で、つぎの標品を使用してLC-MSシステムにより網羅的な分析を行った。対象は、内部標準として必須の安定同位体ラベルの標品が入手可能なホルモンである;アブシジン酸(ABA)、インドール酢酸(IAA)、ジベレリン類(Gas)はGA1・GA4・GA19・GA20・GA53、サイトカイニン類(CKs)はゼアチン(Z)・リボシルゼアチン(ZR)・イソペンテニルアデニン(iP)・イソペンテニルアデノシン(iPR)、ジャスモン酸類(Jas)はジャスモン酸(JA)・メチルジャスモン酸(MJA)。特にJasは、揮発性が高いので工夫を要した。キュウリ果実を材料として、アルカリの加水分解処理により配糖体からフリーのホルモンを遊離させて、抽出・精製後にLC-MSで定量する方法で、ABA・IAA・Gas・CKsの配糖体を定量した。キュウリ果実を細かく組織に分けて、アポプラスト(AP)液とシンプラスト(SP)液を遠心法で採取した。これらの画分に安定同位体標識試薬を内部標準として加えて、確立した分析法で、植物ホルモンおよびそれらの配糖体の局在性および消長を解析した。内生ホルモンの合成部位や貯蔵器官の特定のため、免疫組織化学染色法により、植物ホルモンのIAA, ABAおよびサイトカイニンのイメージング(可視化)技術を確立して、キュウリのつぼみから幼果までの解析を行ったミクロとセミミクロカラム用の液体クロマトグラフ(HPLC)システムで、確立した精製法で、つぎの標品を使用してLC-MSシステムにより網羅的な分析を行った。内生ホルモンの合成部位や貯蔵器官の特定のため、免疫組織化学染色法により、植物ホルモンのIAA, ABAおよびサイトカイニンのイメージング(可視化)技術を確立して、キュウリのつぼみから幼果までの解析を行った1、キュウリの果実における4種類のホルモン{アブシジン酸(ABA)・オーキシン(IAA)・ジベレリン類(GAs)・サイトカイニン類(CKs)}の高い分離能のHPLCによる植物ホルモンの精製法を確立し、液体クロマトグラフ質量分析計(LC-MS)によるキュウリ果実の内生ホルモンの定量法を確立した。2、キュウリ果実を細かく組織に分けて、アポプラスト(AP)液とシンプラスト(SP)液を遠心法で採取した。それらの画分に安定同位体標識試薬を内部標準として加えて、確立した分析法で、植物ホルモンの局在性および消長を解析した。3、たんぱく質の免疫組織化学染色法(免疫局在法)を用いて植物ホルモンのイメージング(可視化)を行なった。果実の成長とホルモンの関係を解明するため,キュウリの子房内の植物ホルモンの可視化を免疫局在法を用いて行った.子房内の染色レベルは,IAA>ABA=ZR=iPRであった。胚珠、維管束周辺および果皮が他の部位に比べて強く染色された。胚珠は発達段階で染色部位が変化し、発達初期では細胞壁部が細胞内よりも高いレベルで染色され、発達が進むにつれ細胞壁部は染色されなかった。したがって、発達段階で合成部位の変化が起こると示唆された。維管束は師部組織が染色された。表皮では、表皮組織との境が染色された。他の細胞では、細胞壁に弱い染色が示された。したがって,これらの染色により染色された部位が、合成、貯蔵および輸送器官であると示唆された。果実体内に存在している植物ホルモンの網羅的な分析とそれらの成長中の変化を解明した。対象は、内部標準として必須の安定同位体ラベルの標品が入手可能なホルモンである;アブシジン酸(ABA)、インドール酢酸(IAA)、ジベレリン類(GAs)はGA1・GA4・GA19・GA20・GA53、サイトカイニン類(CKs)はゼアチン(Z)・リボシルゼアチン(ZR)・イソペンテニルアデニン(iP)・イソペンテニルアデノシン(iPR)、ジャスモン酸類(JAs)はジャスモン酸(JA)・メチルジャスモン酸(MJA)。特にJAsは、揮発性が高いので工夫を要した。

キュウリ果実を材料として、アルカリの加水分解処理により配糖体からフリーのホルモンを遊離させて、抽出・精製後にLC-MSで定量する方法で、ABA・IAA・GAs・CKsの配糖体を定量した。キュウリ果実を細かく組織に分けて、アポプラスト(AP)液とシンプラスト(SP)液を遠心法で採取した。これらの画分に安定同位体標識試薬を内部標準として加えて、確立した分析法で、植物ホルモンおよびそれらの配糖体の局在性および消長を解析した。内生ホルモンの合成部位や貯蔵器官の特定のため、免疫組織化学染色法により、植物ホルモンのインドール- 3 -酢酸(IAA),アブシジン酸(ABA)およびサイトカイニンのイメージング(可視化)技術を確立して、キュウリのつぼみから幼果までの解析を行った。
ヘムオキシゲネース(HO)-1の誘導能からみた抗酸化ストレス防御能の臨床的評価

・HO-1誘導能の評価法の確立と動脈硬化疾患との関連の検討HO-1の臨床評価を末梢血から分離した単核球を用いて行った。リンパ球分離後、これをヘムで4時間刺激して、その前後のHO-1のmRNAをリアルタイムPCR法で測定したところ、各個人内において再現性のある数値が得られた。また、HO-1発現に関係があると考えられているHO-1遺伝子上流のマイクロサテライト多型の診断法も確立した。そこで、HO-1発現能と遺伝子多型の冠動脈疾患との関連を検討するため、冠動脈造影検査の目的で入院した110名を対象にマイクロサテライト多型と単核球HO-1mRNAを測定した。HO-1mRNAの測定は再現性よくおこなわれ、その発現量の一部はマイクロサテライト多型で決定されることが明らかになった。また、HO-1mRNA量は冠動脈造影の結果を定量化した動脈硬化スコアと有意に正相関し、HO-1の発現量が低下した個体では動脈硬化が進展しやすい可能性が示唆された。・HO-1の誘導を制御する転写因子Bach1の役割を理解する。HO-1の発現を制御する最も重要な転写因子Bach1の機能についてはBach1ノックアウトマウスで検討した。Bach1はHO-1を抑制しているため、Bach1ノックアウトマウスではHO-1の発現が恒常的に増加していることを確認した。このマウスでは心筋虚血に対する組織耐性が向上しており、心筋梗塞後の心不全と大動脈縮窄による心肥大が著しく抑制されることをモデル実験で確認した。また動脈硬化も出るマウスとの交配実験で動脈硬化が起こりにくいことを明らかにした。これはHO-1が心血管疾患の進展に防御的に働くことを示唆し、Bach1の抑制でそのような心血管保護効果が期待できることを示唆している。Bach1のさまざまな病態における役割を理解するための基礎的検討Bach1ノックアウトマウスにおいて以下のことを明らかとなった。1.虚血再灌流障害を大幅に軽減し、そのメカニズムとしてHO-1の発現上昇によるSTAT3リン酸化の増加、p38MAPKの活性化の抑制と、それに伴うアポトーシスの抑制が重要である。2.Bach1の欠失は心筋梗塞後の心不全の経過を大幅に軽減し、そのメカニズムとしては梗塞後1週間以降に発現が増加するHO-1と、これに伴う心筋間質細胞の増殖抑制が重要な役割を演じる。3.Bach1の欠失により血中コレステロール増加による、マウス動脈硬化(アポEノックアウトマウスとBach1ノックアウトマウスの交配マウスを作成し検討)を抑制する効果がある。また臨床研究で以下のことを明らかにした1.虚血性心疾患患者においてリンパ球・単球HO-1の発現量は動脈硬化が上昇なほど低下しており、HO-1の発現量は動脈硬化進展のメカニズムになんらかの関わりをもつ可能性がある。2.リンパ球・単球におけるHO-1の発現量は従来、臨床研究で検討されてきたHO-1遺伝子プロモータのGTリーピーと多型と関連が薄いことが明らかとなり、我々の方法のようにHO-1の発言量を検討することが望ましい。3.心筋梗塞などのストレス下でHO-1が活性化している証拠は報告されていなかったが、急逝心筋梗塞急性期に連続採血をおこない、HO-1の分解産物であるビリルビンが一過性に上昇することを明らかにした。急性疾患における血中ビリルビンの上昇やリンパ球・単球のHO-1発現の検討は臨床的に有用である可能性が示唆される。このような検討結果を踏まえHO-1やBach1による酸化ストレスの制御についての理解を深め、臨床応用が可能となるよう検討を進めたい。・HO-1誘導能の評価法の確立と動脈硬化性疾患との関連の検討

HO-1の臨床評価を末梢血から分離した単核球を用いておこなうことを試みた。リンパ球分離後、これをヘムで4時間刺激して、その前後のHO-1のmRNAをリアルタイムPCR法で測定したところ、各個人内において再現性のある数値が獲られた。また、HO-1発現に関係があると考えられているHO-1遺伝子上流のマイクロサテライト多型の診断法も確立した。そこで、HO-1発現能と遺伝子多型の冠動脈疾患との関連を検討するため、冠動脈造影検査の目的で入院した110名を対象にマイクロサテライト多型と単核球HO-1mRNAを測定した。HO-1mRNAの測定は再現性よくおこなわれ、その発現量の一部はマイクロサテライト多型で決定されることが明らかになった。また、HO-1mRNA量は冠動脈造影の結果を定量化した動脈硬化スコアと有意に正相関し、HO-1の発現量が低下した個体では動脈硬化が進展しやすい可能性が示唆された。・HO-1の誘導を制御する転写因子Bach1の役割を理解する。HO-1の発現を制御する最も重要な転写因子Bach1の機能についてはBach1ノックアウトマウスで検討した。Bach1はHO-1を抑制しているため、Bach1ノックアウトマウスではHO-1の発現が恒常的に増加していることを確認した。このマウスでは大動脈縮窄による心肥大が抑制されることをモデル実験で、また動脈硬化が起こりにくいことを動脈硬化マウスとの交配実験によりそれぞれ明らかにした。これはHO-1が心血管疾患の進展に防御的に働くことを示唆し、Bach1の抑制でそのような心血管保護効果が期待できることを見出した。
RNA編集酵素ADAR1ノックアウトマウスによるワクチン開発の基盤確立

平成30年度はCD28のノックアウトマウスとCD45.1マウスとの掛け合わせを行い、このマウスに対してOX40で切断したADAR1ノックスとマウスのトランスファーによるin vivoの実験を行った。ADAR1のOX40-Creによるコンディショナルノックアウトマウスおよび野生型マウスからナイーブT細胞を脾臓からソートして取り出し、CD28ノックアウトマウスとCD45.1マウスとの掛け合わせたマウスにトランスファーした後にDNP-OVAによる免疫を行った。胚中心が形成される時期にあわせ、経時的に脾臓におけるTfh細胞およびGC-Tfh細胞(GL7+)についてFACS解析を行った。また免疫後、経時的に採血して血中IgMやIgG1抗NP抗体価を親和性とともにELISA法で測定した。また免疫後上記マウスの脾臓由来のTfh細胞とGC-Tfh細胞をセルソータで分取した後、各細胞について、Tfh細胞で発現している遺伝子群の発現をリアルタイムRT-PCR法で解析した。現在は実験結果を解析中である。平成30年4月から平成31年3月までの予定されていた研究計画はおおむね順調である。実験基盤の整備から、Tfh細胞の分化誘導におけるADAR1の機能解明のために行ったin vitroの実験の成果をもとに、コンディショナルノックアウトマウスにおける免疫応答の実験を行い、さらなる成果をあげることができた。in vivoによる実験を予定していたが、Ragノックアウトマウスの入手ができず、代替としてCD28ノックアウトマウスへのトランスファーの実験方法を確立した。これに関しては実験が終了しており、現在は解析及び必要に応じて追加実験を行っている。ノックアウトマウスの脾細胞をトランスファーするin vivoの実験を行ったので、その解析を進める。また同様の手法を用いてソートしてきたGC-Tfh細胞を用いてADAR1の標的RNA探索のための基盤的解析を予定通り進める予定である。平成28年度はADAR1がTfh細胞のみならずT細胞の他系統(Th1、Th2、Th17およびTreg細胞)への分化誘導における役割を解明するためにin vitroの実験系を確立して解析を行った。そのために活性化CD4陽性T細胞特異的にRNA編集酵素であるADAR1を欠損したマウスと野生型マウスの脾臓ナイーブCD4陽性細胞におけるTfh細胞やTh1、Th2、Th17およびTreg細胞への分化誘導実験を行った。その結果、in vitroにおけるTfh細胞の分化誘導に関しては野生株型と比較して標的遺伝子であるBcl6の発現量に依存的な変化を確認することができなかった。他系統のT細胞の分化誘導実験でも同様に野生株型と有意な差は認められなかった。その結果、ADAR1がTfh細胞の分化誘導の初期段階で及ぼす影響は限定的であることが示唆された。また他系統への分化にも影響しないことがわかった。既報であるがBTBに結合できないようにBcl6に変異が入ったマウスでは胚中心はできないが、Tfh細胞の分化は正常に行われていることが既に見出されている。今後はこのような事象との関連性も追求していく。平成28年10月から平成29年3月までの予定されていた研究計画はおおむね順調である。実験基盤の整備から、Tfh細胞の分化誘導におけるADAR1の機能解明のために行ったin vitroの実験の多くを成果として得られた。Tfh細胞への分化転換実験の一部やChIP解析など実験環境の整備が間に合わずに行われてない実験があり、次年度に遂行を予定している。化を誘導するマスター因子である。ADAR1(adenosine deaminase acting on RNA-1)はBcl6の標的遺伝子であることを見出しており本研究ではTfh細胞の分化誘導におけるADAR1の機能の解明している。平成29年度はADAR1のOX40-Creによるコンディショナルノックアウトマウスおよび野生型マウスを免疫(NP-CG+Alm)して、胚中心が形成される時期にあわせて経時的に脾臓におけるTfh細胞およびGC-Tfh細胞(GL7+)についてFACS解析を行った。FACS解析においてはADAR1ノックアウトマウスを免疫した後のTfh細胞およびGC-Tfh細胞の産生に特異所見がみられ、それに伴いTfh細胞およびGC-Tfh細胞の発現に関連する遺伝子群の動きもみられた。またADAR1のノックアウトマウスでは抗体産生の特異所見を認め、これはTfh細胞の産生に関連する事象であることが確認された。ただし、OX40で切断したコンディショナルノックアウトマウスであるため、B細胞の関与やOX40を発現するその他細胞の関与などは否定しきれないため、トランスファーによるin vivoの実験を予定している。平成29年4月から平成30年3月までの予定されていた研究計画はおおむね順調である。

本来であればin vivoによる実験を予定していたが、Ragノックアウトマウスの入手ができておらず、代替としてCD28ノックアウトマウスへのトランスファーの実験方法を確立するのに若干の遅れが生じている。平成30年度はCD28のノックアウトマウスとCD45.1マウスとの掛け合わせを行い、このマウスに対してOX40で切断したADAR1ノックスとマウスのトランスファーによるin vivoの実験を行った。ADAR1のOX40-Creによるコンディショナルノックアウトマウスおよび野生型マウスからナイーブT細胞を脾臓からソートして取り出し、CD28ノックアウトマウスとCD45.1マウスとの掛け合わせたマウスにトランスファーした後にDNP-OVAによる免疫を行った。胚中心が形成される時期にあわせ、経時的に脾臓におけるTfh細胞およびGC-Tfh細胞(GL7+)についてFACS解析を行った。また免疫後、経時的に採血して血中IgMやIgG1抗NP抗体価を親和性とともにELISA法で測定した。また免疫後上記マウスの脾臓由来のTfh細胞とGC-Tfh細胞をセルソータで分取した後、各細胞について、Tfh細胞で発現している遺伝子群の発現をリアルタイムRT-PCR法で解析した。現在は実験結果を解析中である。平成30年4月から平成31年3月までの予定されていた研究計画はおおむね順調である。実験基盤の整備から、Tfh細胞の分化誘導におけるADAR1の機能解明のために行ったin vitroの実験の成果をもとに、コンディショナルノックアウトマウスにおける免疫応答の実験を行い、さらなる成果をあげることができた。in vivoによる実験を予定していたが、Ragノックアウトマウスの入手ができず、代替としてCD28ノックアウトマウスへのトランスファーの実験方法を確立した。これに関しては実験が終了しており、現在は解析及び必要に応じて追加実験を行っている。平成28年度の計画で未実施の実験を行うとともに、in vivoの実験基盤を整えて平成29年度の予定していた実験を同時進行的に進める予定である。平成29年度の計画で未実施の実験を行うとともに、in vivoのトランスファーの実験を進め、ADAR1の標的RNA探索のための基盤的解析を予定通り進める予定である。また平成28年度に予定していたChIP解析を共同研究者の有馬雅史先生とともに進める予定である。ノックアウトマウスの脾細胞をトランスファーするin vivoの実験を行ったので、その解析を進める。また同様の手法を用いてソートしてきたGC-Tfh細胞を用いてADAR1の標的RNA探索のための基盤的解析を予定通り進める予定である。平成28年度は縮小整理されていた実験動物(マウス)やセル・ラインを整備してin vitroおよび平成29年度におけるin vivoの実験が遂行できるように基盤を整えていた。また既に基盤が確立した実験に限定して実験を進めた。これらの理由により、当初予定していた物品購入費などが次年度に繰り越された。また平成28年度(10月3月)では学会発表の機会がなかったため、旅費を使用することができなかった。以上の理由により次年度使用額が生じた。(理由)