hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
子どもの時間管理能力育成のための基礎的研究

本研究は,時間認知能力の発達メカニズムについての基礎的研究である。時間との類似点が指摘される空間認知能力との関係を検討した。その結果,両者の発達は言語認知学で言われるように空間が基礎であるのではなく平行的であり,両者に共通する発達的要因がある可能性が示唆された。時間についての認知的処理方略と空間に関する認知的処理方略の分析から,両者に共通する発達的要因が参照系であることが示唆された。本研究は、時間管理能力の育成のための基礎的知見となる時間に関する認知能力の発達プロセスとメカニズムを明明らかにすることである。発達プロセスとメカニズムを詳細に検討するために縦断的手法を用いる。平成19年度においては、縦断調査の第一回調査を行った。時間概念を測定する目的で時問表現の測定を行った。当初計画していた「時間表現課題」は、対象児に近い過去、現在、近い未来における出来事や予定について会話するように求めるものであった。しかし、実際に実施したところ場面設定などの問題点が明らかになった。そのため、時間表現を測定するものとして、研究代表者がこれまでに開発使用してきた「生活時間記述課題」と「カード分類課題」の2種類を同一対象児に行った。「生活時間記述課題」とは、一日の活動のスクリプトを言語報告するものである。「カード分類課題」とは、一日の活動16個を1つずつ描いたカードをまとまりに分類することである。両者とも、報告や分類結果から時間概念の様相とくに時間構造の階層性を検討するものである。つまり、「生活時間記述課題」は言語的表現、「カード分類課題」は空間的表現の観点から時間概念(構造)を検討することになる。「生活時間記述課題」は、高次な構造から順に「高階層化」「中階層化」「低階層化」、「カード分類課題は、高次な構造から順に「階層的構造化」「全体的構造化」「非構造化」に分類した。分析の結果、「生活時間記述課題」で「高階層化」に分類されても、「カード分類課題」で「全体的階層化」に分類されるものが多いことが示された。つまり、時間表象は言語的報告によるもののほうが空間的表現によるものよりも階層性が高いもの、すなわち高次な時間構造が示されることが明らかになった。これは、空間表象とは反対の結果であり(Uttal, 2006)、時間表象の特徴の検討のための示唆が得られたといえる。本研究課題は、時間管理能力の基礎的認知能力のメカニズム及び発達プロセスの解明である。昨年度の結果から、言語及びジェスチャーなどによる時間表現の発達について検討した。さらに、認知メカニズムと発達プロセスを詳細に検討するたあに、時間に関する認知能力の基盤となると考えられている空間に関する認知能力についても同様の方法と課題を用いて、空間表現について検討することで時間認知のメカニズムについて詳細に検討できると考えられたため、空間についても時間と同様の性質を持つ課題を行った。その結果、時間と空間の概念構造は類似した性質を持ち、その発達過程も極めて類似していることが示された。さらに、発達的視点からは、時間、空間ともに同時期に認知能力が発達的変化を示し、必ずしも従来の知見のように空間認知が時間認知の基盤となるとはいえないことが明らかになった。つまり、時間の認知能力については、その発達にこれまで想定されていた以外の要因が大きくかかわっていることが示唆された。本研究の目的は,時間管理能力の基礎的認知能力のメカニズムおよび発達プロセスの解明である。昨年度の結果から,従来,空間概念などの空間に関する認知能力が時間に関する認知能力の基礎となると考えられてきたことが,発達的には同時期に空間概念,時間概念が同時期に発達することが示された。本年度は,小学1年生,2年生,3年生を対象にして,時間については「間隔時間比較課題」,空間については「距離比較課題」を行った。「間隔時間比較課題」2つの間隔時間の長さを比較するものであり,「距離比較課題」は2つの距離の長さを比較するものである。どのような方略を用いたのかを分析することによって,時間および空間に関する問題解決を行うときに時間構造,空間構造がどのように利用されるのか,構造化の程度によってどのように異なるのかどうか検討するためにこの課題を実施した。各試行は,始点が同じ,終点が同じ,比較する間隔時間(距離)が同一階層,異なる階層にまたがるなどの特性を持つように作成された。正答率についての学年差および時間構造・空間構造のレベルによる差は,すべての試行において示されなかった。「間隔時間比較課題」における方略については,時間構造の程度が高くないと,間隔時間に含まれる活動の数を比較したり,順序を比較する継時的な処理方略が用いられ,構造化の程度が高くなると比較する間隔時間や行為を時間構造に位置づけるという同時的な処理方略を使用する傾向が示された。同時的処理方略とは,時間構造における出来事の位置をその構造のなかで表象するものである。

「距離比較課題」については,空間構造の構造化の程度が高くなるにしたがい,比較する距離やランドマークを空間内に位置づける傾向が示された。このことは,時間認知能力のメカニズム等を検討するうえで示唆的であるといえる。
色素増感太陽電池における電子移動機構の分子理論

近年PbSe量子ドット系に光照射すると一光子当たり複数の励起子を生成する現象が見いだされた。半導体を用いた通常の太陽電池では、一光子が励起する電子は高々一つであり、励起された電子は速やかに伝導体の最低エネルギー準位までエネルギー散逸する(オージュエ冷却)。上述した複数の励起子生成は、従来では熱として損失していたエネルギーを直接電流へと変換できる可能性を示しており、太陽電池の性能を飛躍的に向上させるものとして期待されている。そこで本研究では、PbSe量子ドット系における二励起子状態と一励起子状態間のデコヒーレンス時間を理論的に求めた。まず第一原理分子動力学計算を行い、その結果をもとに統計力学および半古典力学を用いた二種類の方法でデコヒーレンス時間を見積もった。一原子あたりのデコヒーレンスへの寄与を、重心からの距離に対して解析すると、デコヒーレンスはSe原子による寄与が大きく、また量子ドットの中心ほど大きいことが解った。また二励起子状態と3Eg状態間の電子密度差をプロットすると、量子ドット全体にゆるやかな変化を示しており、デコヒーレンスには電子-音響フォノン結合が重要と考察された。さらに半古典力学での表式から、デコヒーレンス時間は、陰イオンの質量の平方根にほぼ比例していると考えられる。したがって同族イオンからなるPbSe, PbTe量子ドットは、PbSよりも長いデコヒーレンス時間を持つことが予想できた。
マスカスタマイゼーション志向の再構成可能生産システムに対する機動的管理方式の開発

顧客の多様化する要求に効率的かつ機動的に対応するマスカスタマイゼーションを実現するため,本研究では,まず,総需要量が安定した下で,各製品の需要量比の変化に対する機動的管理方式を開発した.また,需要量比の変化に対応してセル構成を機動的に変更する適応型セル生産システムを開発した.これにより,多品目の製品を生産する環境の下で,プロダクトミックス変化と同時に,総需要量の変化に機動的に対応する管理方式の基本となる方式が開発できたといえる。本研究では,多品種の製品を扱う生産システムにおいて,需要の非定常な変化に対して,生産システムのパラメータや構成を状況に応じて制御する,再構成可能生産システムに対してその機動的管理方式を開発することで,マスカスタマイゼーションの実現を目指す.そのため,平成18年度では,多品種多段階生産システムにおいて,総需要量そのものは安定しているとして,需要比の変化に対する検知・調整機能を持つ再構成可能生産システムの機動的管理方式について,以下の計画・方法により進めた.(a)対象とする多品種多段階生産システムの検討:待ち行列理論に関する研究や,米国における再構成可能生産システムに関する研究の調査をもとに,動的に制御可能なパラメータを持つ多品種・多段階生産システムのモデルを構築した.(b)需要量比の影響分析と工程編成方式の検討:構築した生産システムモデルのシミュレータにより,候補となる工程編成の下で需要比の影響を実験的に分析し,需要比の変化に対する工程編成の方式について検討した.(c)需要量比変化に対する検知・調整方式の開発:続いて,需要量比の非定常な変化の検知機能と,生産システムの工程編成の調整機能を開発する.上の(b)で明らかにした需要量比に応じた工程編成が生産システムの特性に与える影響から,需要量比の変化に対する工程編成の調整方式を開発した.(d)需要量比変化とその検知・調整機能を持つ生産システムシミュレータの開発:開発した需要量比に対する検知・調整方式を基に,需要量比変化とその検知・調整機能を持つ生産システムシミュレータを開発する.申請者らのこれまでの研究の成果をもとに,多品種多段階生産在庫システムおよびその生産管理システムを,物と情報の待ち行列ネットワークで表現し,モデルを構築し,そのモデルから生産システムシミュレータを開発した.本年度は,まず総需要量が安定した下で,各製品の需要量比の変化に対する機動的管理方式として,平成18年度に開発した需要量比変化に対する検知・調整方式について,そのために開発した生産システムシミュレータにより実験的評価を行い,その結果について検討した.その結果,開発した機動的管理方式により十分な効果が得られたことから,場合によっては開発した機動的管理方式の改良を行うことも考えていたが,その必要の無いことを確認した.その結果より,以降の研究の方針について決定した.続いて,平成18年度に開発した多品種多段階生産システムシミュレータにより,候補となる工程編成の下で総需要量と需要比の影響を実験的に分析し,その結果より総需要量と需要比の変化に対する工程編成の方式について検討した.その上で,総需要量と同時に需要量比の非定常な変化の検知機能と,生産システムの工程編成の調整機能を開発した.総需要量も変化することを前提とするため,生産システムの工程編成としては,生産工程数も変化に応じて変更すると同時に各生産工程に割当てる要素作業について検討する必要があることから,総需要量と需要量比の変化に対する工程編成の調整方式を開発した.さらに,開発した総需要量と需要量比に対する検知・調整方式を基に,需要量比変化とその検知・調整機能を持つ生産システムシミュレータを開発した.その際には,平成18年度に開発した多品種多段階生産システムシミュレータに,需要量比のみならず総需要量の変化に対する検知と調整方式を組み込むことで,生産システムシミュレータを開発した.本年度の計画では,各製品の需要量比と同時に総需要量の変化に対する機動的管理として,平成19年度に開発した総需要量・需要量比の変化とそれらの検知・調整方式について,そのために開発した生産システムシミュレータにより実験的評価を行い,その結果について検討する.また,研究機関最終年度ということで,研究成果としてまとめ,学会発表などにより,他の研究者の評価を受けることで客観的な評価となるようにする予定を立てたと同時に,評価の結果,開発した機動的管理方式により十分な効果が得られない場合には,開発した機動的管理方式の改良を行うことも考えておいた.検討により,総需要量の変化を考慮する前に、各製品の需要量比の変化に対して,これまでの生産ラインを前提としてその工程編成により対応する方式のみならず,生産品種に対して生産セルを構成したセル生産方式を採用し,需要量比の変化に対応してセル構成の変更により対応する適応型セル生産システムについて検討することが有望であることが明らかとなった.セル生産方式,特に需要変動への対応について取り上げている文献調査を行い,将来の需要が既知の場合にセル構成の変更計画を最適化することを目的とした研究はいくつか見られるものの,不確実な需要変動の下で,需要変動によりセル構成を変更する適応能力を持った適応型セル生産システムについて研究が見当たらないことを確認し,適応型セル生産システムのモデル構築と,評価実験を行い,有効性を明らかにした.
高次元代数多様体の研究

(1)非完備代数多様体に対する消滅定理を証明しそれによって非完備代数多様体の繊維空間に対する対数的相対標準層の多重テンサ-の直像の弱正値性を証明し論文とした。(2)特異点なある場合に正則写像の像の非変形性を示し論文とした。(3)関数体上の高次元モ-デル予想の類似を一般の繊維の正則微分層がネフビックのときに証明し論文とした。(4)代数および解析多様体の消滅定理の全体を研究し総合報告とした。(5)飯高加法予想への消滅定理の応用を総合報告に加えた。(6)D-加群の多様体への応用と正標数のときフロベニウス射の複素多様体への応用を総合報告に加えた。(7)ハミルトンヤコビ方程式に対する特異点に関する研究を深め論文とした。(8)指数的非線形性をもつヂリクレ問題に対するバイファ-ケ-ション現象の研究を論文とした。(9)ブランチングフラグとネットそれに逆マチングの研究を論文とした。(10)組み合わせ論のフェラ-風ダイアグラムに対する母関数の研究を論文とした。(11)コンピュ-タ-グラフィックを理論的に応用して微分方程式の研究に役立てた。(12)大坂大学へ研究連絡と高次元モ-デル予想の類似の講演を行った。
多彩なRabエフェクター分子群によるポストゴルジ輸送経路制御機構の包括的解析

ゴルジ体以降の後期輸送経路は複雑なネットワークを形成している。故に後期輸送経路を通過するタンパク質、脂質の輸送の経路及びそれを制御する分子基盤は未だ判然としていない。複雑な後期輸送経路を支える主要な因子としてRabタンパク質とその結合分子(エフェクター)が知られている。しかしながら現在においてもエフェクターの未同定、不十分な解析などにより、輸送の分子機構の全貌の解明には程遠い。本研究では(1)新規Rabエフェクタータンパク質の探索、解析、(2)それを通じて後期輸送経路の形成、維持の機構、さらにタンパク質輸送における後期輸送経路の役割について未解明な問題の解決を目指す。
実解析的・複素解析的関数と非線型偏微分方程式論

関数論(複素解析)の手法を使って非線型偏微分方程式について調べた.ある曲面または曲線に沿って特異性をもつ解を構成することに興味がある.非線型波動方程式を始めとするある種の非線型偏微分方程式については主要項が対数関数で表される特異解を構成した.非線型シュレーディンガー方程式について,主要項が-1乗の特異性を持つ形式解の収束を証明した.関数論(複素解析)の手法を使って非線型偏微分方程式について調べた.ある曲面または曲線に沿って特異性をもつ解を構成することに興味がある.非線型波動方程式を始めとするある種の非線型偏微分方程式については主要項が対数関数で表される特異解を構成した.非線型シュレーディンガー方程式について,主要項が-1乗の特異性を持つ形式解の収束を証明した.非線型の偏微分方程式について研究した.係数や初期値としては実解析的または複素解析的な関数を考える.方程式のタイプは非線型波動方程式を典型的な例とする2階の方程式である.この種の方程式について,特異解を組織的に構成する方法を考え出した.まず与えられた方程式を常微分方程式の摂動とみなす.基本となる非線型常微分方程式の解は求積できる.偏微分方程式の解であって,超曲面t=f(x)に特異性を持つものを構成しよう.T=t-f(x)という変換によって超曲面はT=0という簡単な式で与えられる.偏微分方程式はTに関する常微分方程式の摂動とみなせる.その常微分方程式の解であってT=0に特異性を持つものをv(T)とする.偏微分方程式の解u(T,x)はv(T)に摂動項を加えたものとして求められる.すなわち,最も強い特異性を担うのがv(T)であり,それに穏やかな項(あるいはまったく特異性のない項)w(T,x)を加えたものがu(T,x)である.結局w(T,x)をうまく構成すればいいことになる.そこで用いるのはFuchsian Reductionと呼ばれる方法である.u(T,x)が満たす非線型波動方程式自体には特異性がないが,w(T,x)が満たす方程式は特異性をもつ.すなわち,Tに関する最高階の微分の係数がTを因数として含む.この方程式は非線型フックス型であり,Gerard-田原らの結果を用いて解を構成することができる.こうしてw(T,x)が構成され,u(T,x)も構成されることとなる.非線型の偏微分方程式について研究した.係数や初期値としては実解析的または複素解析的な関数を考える.もともと非線型波動方程式を典型的な例とする2階の方程式の研究から始めたが,今では一般のm階の方程式を扱えるようになっている.我々は特異解を組織的に構成する方法を考え出した.偏微分方程式の解であって,t=0での漸近展開の主要項がtの1乗とlog tの積を含むものを構成した.ここで1は方程式の非線型項から決まる指数であって,小林隆夫が定義したものである(小林は1=0,1,2,...m-2の場合を除外した.我々はその除外された場合に興味がある.)上述のような解が存在するであろうということは,偏微分方程式をtに関する常微分方程式の摂動とみなせば予想できる.つまり,プロトタイプとなる常微分方程式は求積法で解けて,それが上述のタイプの解を持つのである.それを多変数化するには,Fuchsian Reductionと呼ばれる方法を用いる.元の方程式の解をu(t,x)とするとき,uから主要項を引いた残りをtの1乗かけるv(t,x)とすると,vがフックス型方程式を満たすのである.結局このフックス型方程式について調べれば良いことになる.田原秀敏との共同研究によって,既にある程度の結果を得ている.今は仮定を弱める努力をしている.非線型の偏微分方程式について研究した.係数や初期値としては実解析的または複素解析的な関数を考える.もともと非線型波動方程式を典型的な例とする2階の方程式の研究から始めたが,今では一般のm階の方程式を扱えるようになっている.我々は特異解を組織的に構成する方法を考え出した.偏微分方程式の解であって,t=0での漸近展開の主要項がtのl乗とlogtの積を含むものを構成した.ここでlは方程式の非線型項から決まる指数であって,小林隆夫が定義したものである(小林はl=0,1,2,...,m-2の場合を除外した,我々はその除外された場合に興味がある.)上述のような解が存在するであろうということは,偏微分方程式をtに関する常微分方程式の摂動とみなせば判る.つまり,プロトタイプとなる常微分方程式は求積法で解けて,それが上述のタイプの解を持つのである.それを多変数化するには,Fuchsian Reductionと呼ばれる方法を用いる.元の方程式の解をu(t,x)とするとき,uから主要項を引いた残りをtのl乗掛けるv(t,x)とすると,vがフックス型方程式を満たすのである.結局このフックス型方程式について調べれば良いことになる.田原秀敏との共同研究の成果がJournal of the Mathematical Society of Japanに掲載されることが決まった.非線型の偏微分方程式について研究した.係数や初期値としては実解析的または複素解析的な関数を考える.一般のm階の方程式について,特異解を組織的に構成する方法を考え出した.偏微分方程式の解であって,t=0での漸近展開の主要項がtの1乗とlog tの積を含むものを構成した.

ここで1は方程式の非線型項から決まる指数であって,小林隆夫が定義したものである(小林は1=0,1,2,...m-2の場合を除外した.我々はその除外された場合に興味がある.)上述のような解が存在するであろうということは,偏微分方程式をtに関する常微分方程式の摂動とみなせば判る.つまり,プロトタイプとなる常微分方程式は求積法で解けて,それが上述のタイプの解を持つのである.それを多変数化するには,Fuchsian Reductionと呼ばれる方法を用いる.次に,ある種の非線形シュレーディンガー方程式について,Clarksonが構成した-1乗の特異性を持つ形式解の族について,その収束を証明した.非線形項に絶対値が含まれるにも関わらず,(通常は絶対値と相性が悪いと思われている)実解析解を構成した.可積分系の技法を生かして,方程式の個性を明らかにすることが出来た.ちょっと傾向の違う研究としては,熱方程式の逆問題を取り上げた.ここでは関数解析を用いたが,複素解析の結果も引用している.
抗血小板抗体による血小板のコラ-ゲン受容体に関する研究

特発性血小板減少性紫斑病患者(Y.A.)から得た血小板のコラ-ゲン受容体を認識する抗体(Y.A.IgG)を用いて同受容体を検討し、以下の成績を得た。1.対応抗原(コラ-ゲン受容体)の検討、Y.A.IgGの認識する血小板膜蛋白はイムノブロット法でも分子量62kDa(還元)であり(P62)、免疫沈降法での既報(Blood69:1712、1987)の成績と合せてこの膜蛋白P62が抗体の認識する特異蛋白(コラ-ゲン受容体)と考えられる。P62に不溶性コラ-ゲン(I型)が特異的に吸着したことから、その機能的意義も示唆された。Y.A.IgGはウサギ血小板をも凝集したことからP62は種族特異性に乏しいことが示唆された。ヒト巨核芽球系細胞株(CMK)とY.A.IgGの反応(間接蛍光抗体法)で、約60%の細胞に抗原の発現が認められたことから、巨核球系幼弱細胞にもコラ-ゲン受容体の発現が示唆された。2.Y.A.IgGを用いたイムノアフィニティ-クロマトグラフィ-によるP62の分離・精製、Y.A.IgGのFab部分をカップルさせたセルロファインに、可溶化した血小板膜標品を反応させpH2.5での溶出蛋白をWGA-アガロ-スカラムに添加・洗滌後D-アセチルグルコサミンで溶出した。溶出された糖蛋白をSDS-PAGEで展開し、ゲルの銀染色では複数の蛋白バンドが検出され、Y.A.IgGを一次抗体としたイムノブロット法ではP62の存在が認められた。したがってP62がWGAに結合する糖蛋白であることが判明したが、さらにHPLCやpreparative SDS-PAGE等を併用して分離・精製をすすめる必要がある。3.本患者のリンパ球による抗血小板コラ-ゲン受容体単クロン抗体(MoAb)の作製、患者リンパ球のEB virus transformantとAC33を細胞融合させて得たヒト-ヒトハイブリド-マのクロ-ニングによりMoAbを得た。本抗体はヒト血小板のコラ-ゲン刺激による凝集・放出反応を制御し、コラ-ゲン受容体と密接な関連を持つことが推察された。今後このMoAbの反応抗原を明らかにし、コラ-ゲン受容体の分離・精製に利用したい。特発性血小板減少性紫斑病患者から得たヒト血小板上のコラーゲン受容体を認識する抗体を用いて研究計画(1、2、3)を実施し、以下の成績を得ている。1.対応抗原の検討。正常人の洗滌血小板を1%Triton X-

100で可溶化し、Laemmli変法でSDS-PAGEを行った後ニトロセルロース膜に蛋白を転写しこれに患者抗体を反応させた後biotin-avidin系を用いて検討したところ抗体は分子量62kDa(還元;非還元では57kDa)の血小板蛋白(P62)を認識することが明らかとなった。次に不溶性のコラーゲン(I型)を、可溶化した血小板と反応させてから充分洗滌した後、コラーゲンに結合した蛋白を1%SDSで溶出し、上記のイムノブロット法で検討したところ62kDa(還元)の血小板蛋白が検出された。したがって抗体はP62(分子量62kDaの血小板蛋白)を認識し、この蛋白はコラーゲンを結合することが示された。今後はP62(コラーゲン受容体)の分離・精製をすすめたい。2.種族特異性。抗体はウサギ血小板をも凝集したことから、ヒトとウサギに共通した抗原を認識すると考えられ、さらに他種動物についても検討を重ねたい。3.巨核球系細胞のコラーゲン受容体発現に関する検討。ヒト巨核芽球Cell line CMKを用いて間接蛍光抗体法により本抗体の反応を検討したところ、約60%の細胞に抗原の発現が認められた。さらにTPA刺激によるCMKの巨核球への分化誘導により、その発現率は約80%に増加したことから血小板の母細胞においてもコラーゲン受容体の発現が示唆された。今後はこの抗原蛋白について血小板のそれと比較検討を行いたい。1.コラ-ゲンの血小板膜62kD蛋白(P62)への結合、不溶性I型ウシ・コラ-ゲンとTritonX-100で可溶化した正常人血小板をCa^<2+>、Mg^<2+>存在下に孵置し、コラ-ゲンを洗滌後蛋白をSDSで溶出し、SDS-PAGE後抗血小板抗体を一次抗体としたイムノブロット法でP62が検出され、これがI型コラ-ゲンに吸着する蛋白で機能的意義を有することが示唆された。またゲルの銀染色では複数の蛋白バンドが染色されたことからP62はコラ-ゲンに吸着する複数の蛋白の一種であった。2患者抗体を用いたイムノアフィニティ-クロマトグラフィ-によるP62の分離・精製・抗体より作製したFab部分をformyl-cellulofineにカップルし、これに可溶化した血小板膜標品を加えてバッチ法で反応させた後、クロマト管に充填・洗滌しグリシン緩衝液(pH2.5)で溶出した。溶出液のピ-ク画分(OD280)をWGA-アガロ-スカラムに添加・洗滌後D-アセチルグルコサミンでの溶出画分をSDS-PAGE施行し、ゲルの銀染色を実施したところ10本の蛋白バンドが検出され、患者抗体を一次抗体とするイムノブロット法ではP62の存在が認められた。したがってP62がWGAに結合する糖蛋白であることが判明したが、今後HPLCやpreparative SOS-PAGE等を併用して分離・精製を進める必要がある。3本抗体を産生する患者の末梢血リンパ球を用いたヒト抗血小板コラ-ゲン受容体単クロン抗体(MoAb)の作製、患者リンパ球のEB virus transformantとヒトB lymphoidcell liveAC33をPEG法により細胞融合させ、ヒト-ヒトハイブリド-マを得た。クロ-ニングにより得たMoAb(KYA-49)は、正常人血小板のコラ-ゲン凝集・放出反応を抑制しコラ-ゲン受容体と密接な関連をもつことが推察された。
新人為起源有害物質によるマウス生殖細胞への影響

腹腔投与によってダイオキシン(TCDD)は肝臓の約4%が精巣に到達した。この結果は、肝臓の68%が精巣に到達したメチルニトロソウレア(MNU)の結果に比べ、極めて低い。TCDDの100μg/kg腹腔投与により精細管中のセルトリ細胞に障害が生じた。この障害は処理後の時間とともに増大し、生殖細胞にも及んだ。しかし、100μg/kgの腹腔投与後の生殖細胞の不定期DNA合成(UDS)やDNA切断及び染色体異常は誘発されなかった。この結果は、これらの細胞障害はDNA損傷以外に起因することを示唆する。そこで、TCDDを精巣に直接1μgつづ投与(12.5mg/kgに相当)し、UDSを検索したところ、アルキル化物質やX線と同じ、早期精原細胞から早期精子細胞にかけて誘発され、後期精子細胞から精子には誘発されなかった。この結果は、腹腔投与によって1μg以上のTCDDが精巣に到達するとUDSが検出できることを意味する。また、精巣投与によるTCDDの精子への結合度は、MNUの4.4倍で、生殖細胞の結合依存性はメチルメタルスルホネートの結果に似ていた。以上の結果から、TCDDの腹腔投与によって生殖細胞のDNA損傷と修復を検出するには、アルキル化遺伝毒性物質物質と同じ数百mg/kgオーダーの投与量が必要である。すなわち、TCDDは、DNA損傷の検出可能量が生殖細胞に到達したなら、アルキル化物質と同様な振舞いで継世代的影響を及ぼすことが予想される。しかし、100μg/kg腹腔投与でセルトリ細胞のみならず生殖細胞にも障害を受け、1ケ月以内に30%のマウスが死亡した事実から、TCDDは、雄マウスの腹腔投与に限り、着床後の優性致死や特定遺伝子座突然変異の様な継世代的影響を誘発する可能性は少ないかもしれない。1.ダイオキシンの生殖細胞への到達とその解析放射性ダイオキシンを雄マウス(C3H/He,10週令)の腹腔に投与した。投与12時間後、精巣および肝臓の一部を摘出し、オートラジオグラフィー標本を作成し、組織中の銀粒子を検索した。ダイオキシン投与量33.3mug/kg(3.7MBq)において、標識された肝組織は細胞内脂肪滴や小胞体膨張などの細胞障害が認められた。一方、標識生殖細胞はほとんど検出されず、また、細胞障害像も検出されなかった。ところが、単位組織重量当たりの放射活性を検出したところ、精巣の到達量は肝臓の約1/25であるが、ダイオキシンは有意に到達していることが判明した。2.ダイオキシンによる細胞内微細構造変化の検索非放射性ダイオキシン(100mug/kg)を雄マウスの腹腔に投与した後、経時的に肝臓及び精巣を摘出した。摘出臓器の電子顕微鏡用標本を作成し、電子顕微鏡像から細胞内微細構造の変化を検索した。肝細胞においては、投与後24時間で細胞内脂肪滴の増加や小胞体及び核膜周囲腔の膨張などの細胞障害が認められ、3日後では、細胞核や細胞そのものの消失などがみられ、1週間後にはそれらがさらに顕著になった。一方、生殖細胞においては、24時間後から3日にかけて、小胞体の退化とその集合体と思われる像がセルトリ細胞に認められ、1週間後には、生殖細胞の一部が消失した精細管が認められた。3.ダイオキシンによる生殖細胞の不定期

DNA合成(UDS)の検索非放射性ダイオキシンを雄マウスの腹腔に投与した後、経時的に^3H-チミジン(0.74MBq)を各々の精巣に投与した。ダイオキシン投与24時間後、精巣を摘出し、酵素を用いて生殖細胞を捕集した。固定後、その塗抹オートラジオグラフィー標本を作成し、細胞核内の銀粒子を検索した。100mug/kgの投与では、投与後24時間までのいずれの時間においても、また、いずれのStageの生殖細胞においても不定期DNA合成は誘発されなかった。さらに、同時に検出したDNA合成を生じた精原細胞の数も対照群と変わらなかった。そこで、ダイオキシンを直接精巣に大量投与(0.5mugおよび1.0mug)したところ、少量ではあるが、UDSが検出できた。UDSの細胞依存性はこれまで用いた変異原に似て精原細胞から早期精子細胞に誘発され、後期精子細胞から精子にかけては検出されなかった。1)2、3、7、8-Tetrachloro didenzo-p-dioxin(TCDD)の精子への結合:放射性TCDDの0.02μgを雄マウス(C3H/He,10週令)精巣に投与後,経時的に精子を採取し、精子頭部の放射活性を検出した。精子頭部に結合したTCDD分子の数は、処理時未成熟精子(処理後7日目)が200と多く、早期精子細胞(処理後21日目)が25と最も少なかった。しかし、TCDDの数は、MMSやMNUの結果(10^5-10^6)に比べ桁違いに低かった。2)TCDDによる精子DNAの切断:TCDD100μg/kgの腹腔投与後、経時的に精子を採取した。採取した精子頭部のDNAの切断を、アルカリ蔗糖密度勾配遠心法を用いて検出した。DNA切断は、TCDD処理後に採取したいずれの時期の精子においても、ほとんど生じていなかった。この結果は、以前検出したMMS処理(100mg/kg)の結果と異なり、100μg/kg処理ではDNA切断が生じないことを示している。ただし、MMS処理ではマウスの死亡率は0%であったが、TCDD処理では30%のマウスが死亡した。3)生殖細胞の染色体分析:TCDDの腹腔投与後、コルヒチンを処理した後、生殖細胞を採取し、その染色体標本を得た。TCDDの100、200、300μg/kgのいずれの投与群においても、また、検索したいずれの染色体も異常は検出できなかった。上記の結果より、ダイオキシン、TCDDは、アルキル化変異原やX線と異なり、雄マウス生殖細胞のDNA損傷を誘発しにくい物質であると考えられる。この結果は、前年度検索した不定期DNA合成を誘発しない結果を支持する。しかし、TCDDは腹腔投与で精巣に到達し、セルトリ細胞に障害をおよぼし、生殖細胞とのcell to csll interactionを阻害するようである。雌マウス生殖細胞については現在検索中である。
真菌の低酸素応答・適応・生存戦略の分子機構

真菌(カビや酵母)には、病原菌、醸造・発酵、抗生物質や酵素などの有用物質生産に使われる重要な菌が多く、環境中ではしぶとく生き残るための工夫をし、我々の身の回りに多く生息する。酸素が少ない環境では、呼吸によるエネルギーの維持が困難となり生存の危機を迎えるが、このときの細胞内での代謝の変化のほとんどが未解明な点が多い。本研究で解明したこの代謝変化は、今後の真菌の生育の制御技術の開発に役立つ。カビAspergillus nidulansを好気条件から低酸素条件に移すことによって、細胞内のNADH/NAD+比が大きくなるが、このとき、NAD+とNADHの絶対量も減少する。本研究では、低酸素条件下におけるNADHの分解に関わる酵素を探索し、その役割について検討した。近年、NADHの加水分解酵素としてNudix hydrolase(NUDT)が報告されている。A.nidulansのゲノム中に見出される12種のNudix hydrolase(AnNUDT)遺伝子の中から、AnNUDT1,2,3を選抜しそれらの組換え蛋白質を調製し検討したところ、AtNUDT1,3がNADHを加水分解できた。AnNUDT1,2,3遺伝子の遺伝子破壊株を作製し、これらと野生株を低酸素条件下で培養したところ、AnNUDT1の遺伝子破壌株では、野生株の36%の細胞内NADH hydrolase活性を示した。また、細胞内のNAD+量はすべての株で同程度であったのに対して、AnNUDT1の遺伝子破壊によりNADHが増加したことから、AnNUDT1が低酸素条件下でのNADHの分解に関わることが示された。一方、Aspergillus nidulansのNmrAは窒素代謝の制御に関わる転写抑制因子として知られる。近年、NmrAはShort-chain dehydrogenase/reductase familyに属し、NAD(P)Hに比べNAD(P)^+に高い親和性を示すことが明らかとなった。しかしながら、NmrAが有する上記の特徴と生体内での機能との関連性は見出されていない。我々は、様々なストレス条件下でのNmrA遺伝子破壊株(DnmrA株)の生育を観察したところ、野生株に比べDnmrA株の生育がメナジオン(MD)により強く阻害されることがわかった。また、MD存在時、DnmrA株では野生株に比べ、glucose-6-phosphate dehydrogenaseおよび6-phosphogluconate dehydrogenaseの発現量が少なかった。これより、NmrAはペントースリン酸回路を介したNADPHの生産およびMD耐性に関与すると考えられた。近年、NADHの加水分解酵素としてNudix hydrolase (NUDT)が報告されている。A.nidulansのゲノム中に見出される12種のNudix hydrolase (AnNUDT)遺伝子の中から、AnNUDT1,2,3を選抜しそれらの組換え蛋白質を調製し検討したところ、AtNUDT1,3がNADHを加水分解できた。AnNUDT1,2,3遺伝子の遺伝子破壊株を作製し、これらと野生株を低酸素条件下で培養したところ、AnNUDT1の遺伝子破壊株では、野生株の36%の細胞内NADH hydrolase活性を示した。近年、NmrAはshort-chain dehydrogenase/reductase familyに属し、NAD(P)Hに比べNAD(P)^+に高い親和性を示すことが明らかとなった。

本研究では真菌が低酸素条件に応答・適応し生存する際に発現する酸素以外の代替電子受容体の利用メカニズム、核酸・糖代謝の改変による細胞内化合物の在庫整理、オルガネラ機能の調節、代謝のスローダウン、呼吸・発酵副産物に対する防御機構に関する個々の研究を分子生物学およびオミクスの手法を用いて推し進め、真菌の低酸素応答・適応・生存戦略の分子機構の全体像を解明することを目的とする。このために、モデル真菌Aspergillus nidulansを題材として以下の研究を行い成果を得た。1.これまで、カビを含む真核生物では細胞外電子シャトルの報告はなく興味深い。細胞内の電子がグルタチオン系を介して細胞外硫黄へとシャトルされることを発見した。また、この際、可溶性のpolysulfideが電子の媒介をすることを明らかとした。2.チアミン生合成に必須であるThiAは、未同定のペントースなどを基質にしてチアミン前駆体であるthiazoleの合成に寄与する。A. nidulansのThiAがチアミン生合成に必須であること、さらに低酸素条件下でThiAが高発現することを見出した。3.低酸素応答に関するトランスクリプトーム解析を行った。さらに、A. oryzaeについても同様の解析を行い、これら近縁の2種の真菌の低酸素応答の比較トランスクリプトームを明らかとした。24年度が最終年度であるため、記入しない。
口唇・口蓋裂児に対する計量心理学的研究

本症の患者および家族に対する精神的コンサルテーションの方法論と実際を確立する目的で以下の調査を実施した。1、当科では顎裂部骨移植において、患者ならび保護者に移植材料の利欠点などの説明をした上で手術法を決定している。そこで実際に手術を受けた患者とその保護者を対象に、治療内容等をどのように感じているか質問紙法による調査を行った。その結果、当科で説明を受ける前に顎裂部骨移植についての知識を有している者は0%、また、最終的に自分が選択した移植材料、手術法に満足している者は95.7%であった。インフォームド・コンセントには87.0%が満足していた。この結果は第21回日本口蓋裂学会において発表し、また論文として日本口蓋裂学会雑誌(平成10年4月号)に掲載した。2、本症患者を出産した直後の精神的に動揺している両親に対して、長期にわたる治療等の説明が十分に理解されているとは言い難い。そこで「患者の親の会」に協力を求め、初回手術前におけるインフォームド・コンセント等に関する質問紙法による調査を実施した。212名の回答が得られ、初回手術前におけるインフォームド・コンセント全般に満足していたのは63.0%であった。本調査より、インフォームド・コンセントの満足度には治療方法の詳しい説明だけでなく担当医師の態度が大きく関わっていることが明らかになった。この結果は第37回先天異常学会、22回日本口蓋裂学会において発表した。3、本症は顔面に現われる先天的な奇形であり、思春期を迎えた患者の心理的な負担を調査すべく、口唇裂二次手術を受ける患者に対し手術前後の不安度を調べた。現在データの収集と解析を行っている。4、患者の手術前後の顔面のイメージについて調査するため口腔外科医、研修医、一般人に患者の顔面の規格写真を見せその印象を対人印象に関する形容詞について回答を求めた。当科では現在、89才以降の患者に対して、自家腸骨、下顎骨、同種保存骨、またこれらの材料の欠点を補うため、各々の材料の混合移植について、患者本人ならび保護者い可及的にその利欠点を説明した上で、手術法を決定している。今年度は、実際に手術を受けた患者とその保護者を対象に質問紙法による調査を行い、患者側が、最初の説明から手術後、創が安定するまでの我々の治療内容について、どのように感じているかについての情報を得た。1当科での説明を受ける前に、顎裂部骨移植についての知識を有しているものは0%であった。2手術を決定する際に患者が相談した相手については、父69.9%、母82.6%、矯正歯科医39.1%で、誰にも相談しなかったのは4.3%であった。3患者が選択した手術法は、自家腸骨の使用29.2%、下顎骨25.0%、同種骨20.8%、混合25.0%であった。4最終的に自分が選択した移植材料、手術法に満足しているものは95.7%であった。5インフォームド・コンセントについては、87.0%が満足しており、不十分であると答えたものは8.7%であった。この結果は第21回日本口蓋裂学会において発表し、また論文として日本口蓋裂学会雑誌(平成10年4月号)に掲載予定である。
細胞膜及び人工膜の揺らぎが関与する制がん機能メカニズム

生体分子の揺らぎと機能は密接な関係にあり、生体膜の揺らぎを理解することは、生命現象を解明する上で極めて重要である。脂質分子とミセル分子から成るハイブリッドリポソーム(HL)は、抗がん剤を含まず、がん細胞膜に融合・蓄積してアポトーシスを誘導することを見出している。本研究において、HLが正常細胞よりも膜流動性の高いがん細胞膜をターゲットとして、選択的に制がん効果を示すことを明らかにした。HLは、新しい制がん機構を有するがん化学療法剤として期待される。生体分子の揺らぎと機能は密接な関係にあり、生体膜およびタンパク質の揺らぎを理解することは、生命現象の本質を解明する上で極めて重要な課題となっている。研究代表者らは、脂質分子とミセル分子から成るハイブリッドリポソーム(HL)が、抗がん剤を含まず、がん細胞の細胞膜に特異的に融合・蓄積してアポトーシスを誘導することを見出し、副作用のない新しいがん治療の可能性を明らかにしている。しかし、がん細胞を正常細胞と区別するHLの膜融合プロセスには、物理化学的概念を導入する必要がある。そのため、細胞膜の揺らぎの指標として膜流動性に焦点を合わせ、「流動性の大きなHL単独で流動性の大きながん細胞に対してのみ選択的にアポトーシスを誘導する」ことの一般則を確立する予定である。さらに、細胞膜をターゲットとするHLの制がん効果の分子論的機構解明のため、計算科学的手法により膜の揺らぎとがん抑制作用との相関性を明らかにする。カチオン性脂質を含有する三成分系ハイブリッドリポソーム(HL)を新たに創製し、ヒト腎臓がん細胞に対するin vitroでの制がん効果を検討した。50パーセント増殖抑制濃度から、腎臓がん細胞に対する高い増殖抑制効果が明らかになった。正常ヒト腎臓細胞に対しては、低毒性であった。TUNEL法から、腎臓がん細胞に対してアポトーシスを誘導することが明確になった。さらに、溶血試験からは、血液毒性はなく安全であることが確認できた。(Biol. Pharm. Bull., 31, 1816(2008))高ガストリン血症による自然発症胃腫瘍コトンラットから胃がん細胞株(CoRa 622 G6)を樹立した。リン脂質DMPCおよび非イオン性界面活性剤C12(E0)n(n=21,23,25)からなるHLは、胃がん細胞の増殖を抑制することを明らかにした。蛍光顕微鏡により、HLが胃がん細胞膜に融合・蓄積することを明確にした。Annexin-VおよびTUNEL法によりHLは胃がん細胞に対してアポトーシスを誘導することを始めて明らかにした。(薬誌,128,1485(2008))リン脂質DMPCと非イオン性界面活性剤C12(E0)23からなるHLは、ヒトBリンパ腫(RAJI)細胞に対して顕著な増殖抑制効果を示し、フローサイトメーター、アガロース電気泳動法およびTUNEL法によりアポトーシスを誘導することが明確になった。in vivoにおいてRAJI細胞移植がんモデルマウスに対して顕著な延命効果が得られ、正常ラットに対する安全性を確認した。さらに、臨床応用において副作用の無い固形腫瘍の縮小効果と延命効果が確認された。(Anticancer Res., 28, 1187(2008))ハイブリッドリポソーム(HL)の乳がん治療に関する研究において、次のような新しい知見が得られた.(1)ヒト乳がん(MDA-MB-453)細胞に対するHLのアポトーシスメカニズムの解析から、HLがMDA-MB-453細胞に融合・蓄積後、(A)Fasを活性化する経路、(B)直接ミトコンドリアを通る2つの経路を明確にした。(2)担がんモデルマウスに対するHLの治療実験において、治療開始時の腫瘍容積と変わらず、アポトーシス誘導を伴う顕著な腫瘍抑制効果が明らかになった。(3)正常マウスの2週間反復投与毒性試験において、重篤な副作用を示さず、安全性が明らかになった。患者にやさしい制がん剤としての臨床応用が期待される。(International Journal of Pharmaceutics.,372, 162 (2009).)ハイブリッドリポソーム(HL)を用いたエイズ関連リンパ腫(PEL)に対する膜融合ついて検討したところ、正常末梢血単核球にはほとんど蓄積せず、PEL細胞選択的に蓄積することを明らかにした。また、HL処理によるPEL細胞膜の流動性を検証したところ、経時的な膜流動性の増大を明らかにした。さらに、細胞死について、カスペース活性および細胞膜の縮小を指標に検討した結果、PEL細胞に対するアポトーシス誘導を明確にした。以上の結果より、HLが正常細胞には影響を与えず、PEL細胞にのみ融合蓄積し、細胞膜のゆらぎが増大し、アポトーシスを誘導することが判明した。PELに対する、副作用の無い新しい治療薬の可能性が期待できる。(Biochemical and Biophysical Research Communications, 393, 495 (2010).)

生体分子の揺らぎと機能は密接な関係にあり、生体膜およびタンパク質の揺らぎを理解することは、生命現象の本質を解明する上できわめて重要である。ナノ粒子の一つである「ハイブリッドリポソーム(HL)」は、正常細胞膜とがん細胞膜の膜流動性(揺らぎ)の違いを見分けることができ、かつ、副作用が少ない新しいがん治療薬としての期待が高まっており、ナノ医療(nanomedicine)を一歩進めたナノ治療(nanotherapy)と位置づけることができる。また、DDS(Drug Delivery System)へ展開する「がん分子標的」という視点からも、抗がん剤の副作用を軽減し、患部への選択性を高める結果が得られている。さらに、HIV-1感染細胞膜は、非感染細胞と比べて細胞膜の揺らぎが大きく、HLは、HIV-1感染細胞に対して、選択的な増殖抑制を示し、「エイズ治療」への展開が期待できる。(揺らぎと機能,Medical Bio10月別冊,(株)オーム社,pp.78-85(2010年))リン脂質(DMPC)およびPEG系界面活性剤(C_12(EO)_n ; n=21,23,25)から成るHL-nの細胞膜をターゲットとする制がん機構について検討した。HL-nは、種々のがん細胞に対して顕著な細胞増殖抑制効果を示し、アポトーシスを誘導することをin vitroで明らかとした。さらに、HL-nは膜流動性の大きながん細胞に選択的に融合蓄積した。がん細胞膜の流動性とHL-nの制がん効果との間に相関性が認められ、がん細胞膜の揺らぎが制がん効果に寄与することを初めて明らかにした。以上のことより、HL-nのがん細胞膜をターゲットとする新しいがん治療に向けて一般化が期待できる。(ACS Med. Chem. Lett., 2,275-279(2011).1.リン脂質(DMPC)およびPEG系界面活性剤(C_<12>(EO)_n,n=23)からなるハイブリッドリポソーム(HL-23)を用い、ヒト前骨髄性白血病(HL-60)細胞に対するアポトーシス誘導へのラフトの関与についてin vitroで検討した。HL-23を添加すると、HL-60細胞膜の流動性を増大した。蛍光脂質含有HL-23は、短時間でHL-60細胞膜に集積することが分かった。さらに、HL-23は、白血病細胞に対して、細胞膜上で脂質ラフトのクラスターを形成し、アポトーシスシグナル伝達を活性化させることが初めて明らかになった(Chem.Lett.,39,1291(2010))。2.HL-n(n=21,23,25)の細胞膜をターゲットとする制がん機構について検討した。がん細胞膜の流動性とHL-nの制がん効果との間に相関性が認められ、「がん細胞膜の揺らぎが制がん効果に関与する」ことを初めて明らかにした。以上のことより、がん細胞膜をターゲットとする新しいHL-nのがん治療に向けて一般化が期待できる(ACS Med.Chem.Let.,2,275(2011))。
酵母細胞表層デザインのための細胞壁高次構造の解析

酵母細胞表層への標的分子提示のための技術開発の基礎研究を行った。1)我々は分裂酵母S.pombeブロトプラスト液体培養における細胞壁再生系を開発し、細胞壁形成機構を三次元的に解明し、アクチン細胞骨格がコンダクターとして関与する理論を提案してきた。細胞壁物質の分子結合様式とアクチン細胞骨格の役割を解明するために、アクチン点変異株cps8を用いて、アクチン分子変異の細胞壁物質輸送への影響を検討した。cps8細胞は、隔壁の異常形成や細胞が分離せず、細胞壁は野生株よりも薄い部位や、数層重なった構造を呈した。プロトブラストの再生過程では、野生株に比べ、細くよじれたロープ状のグルカン繊維が観察され、グルカン・ネットワーク構築におけるアクチン細胞骨格の役割の重要性が実証された。2)この知見を出芽酵母S.cerevisiaeに応用し、GPIアンカー型α-アグルチニンと外来グルコアミラーゼの融合蛋白の細胞表層への提示過程を検討した結果、融合蛋白は細胞内と細胞壁において不均一な分布をすることが確認された。また、細胞内輸送経路を分泌変異株seclを用いて解析し、制限温度下では分秘小胞の蓄積とERの伸長が観察され、融合蛋白の過剰発現に伴うGPIアンカーの不足、またはsecl細胞変異による融合蛋白の蓄積が、ERの伸長を誘導したと考える。3)一方、細胞に存在する蛋白はマンナンと結合しているので、マンナン糖鎖の結合異常が細胞壁に及ぼす影響について調べた。マンナン糖鎖欠損株は、細胞の成長が遅く、互いに凝集し、細胞壁は最外層のマンナン蛋白層に異常が見られた。4)また、S.cerevisiaeプロトブラストの液体培養における細胞壁再生系を確立するため、プロトブラストの作製法を確立した。これにより、S.pombeの成果を基礎にしてS.cerevisiae細胞壁の形成機構を解明することが可能となる。以上の研究から、外来遺伝子が細胞内で発現・輸送・分泌する機構と、細胞壁の構成分子の高次構造への構築機構の概要が解明され、それらの分子間へデザインしたい蛋白分子を架橋し、細胞壁の最外層へ提示する過程が理解され、新しい機能をもった酵母をデザインする可能性が高まったと考える。
分離型バイオリアクターによる動物細胞からの抗体生産の効率化

動物細胞からのモノクロナール抗体(MAb)の効率的生産を目指して、分離型バイオリアクターを用いて検討を行った。実験装置は培養容積250mlのスピナーフラスコ底部に分子量カット10^4のUF膜(Diaflo YM10)を備えており、灌流液と同量の瀘液が排出される。フラスコ内の液はクロスフローの逆洗式セラミック膜フィルターで細胞懸濁液と瀘液とに分離され、細胞は再びフラスコへ返送される。瀘液はホロファイバー透析膜で抗体と透析液とに分離される。透析液はゼオライトA3充填層でアンモニアが除去され、スピナーフラスコへ返送する培養システムである。供試細胞としてハイブリドーマTO-405を用い、無血清培地ERDFにITESと仔牛血清を添加して用いた。実験結果から、細胞濃度は最高2.7×10^7Cells/mlに達し、既存の値10^7Cells/mlに比して大幅な増加が見られた。逆洗式セラミックスフィルターは正方向6秒、逆方向4秒の条件で330時間にわたって連続実験が可能であることが明らかになった。抗体濃度は2.62×10^6mIU/mlとなり、ラットの腹腔内で得られた濃度の約6倍の濃度が得られた。このことは、分離型バイオリアクターによってアンモニア濃度が阻害濃度以下に保持され、モノクロナール抗体の生産性が増大したものと考えられる。更に、アンモニア阻害について、定常条件の下で培養実験を行い、比増殖速度、比抗体生産速度、比死滅速度、生存率などを求め、アンモニア濃度との関係を明らかにした。以上の結果の一部は、化学工学会第25回秋季大会等で発表を行った。
鉄硫黄クラスターの生合成機構:二種のクラスター形成マシナリーの分子構築と反応機序

我々は近年、Fc-Sクラスター(Fe-S蛋白質のコファクター)の形成に必須な二種の独立した大腸菌マシナリー(ISCとSUF)を明らかにした。残る重要課題は構造と機能、反応機構の解明である。マシナリーの個々の成分がどのような役割を演じているのか?また、複数の成分がどのように調和してマシナリーとしての機能を発揮するのか?二種類の合成系の存在意義と合わせて、分子レベルで詳しく理解する必要がある。本基盤研究では、以下の成果を得た。1.大腸菌のISCとSUF、好熱菌Aquifex aeolicusのISC、好熱性古細菌SulfolobustokodaiiのSUFマシナリーの構成成分について、各々単独、または複合体として発現させ、大腸菌変異株の相補実験と並行して、精製と機能解析を進めた。SufB+SufC+SufDが複合体を形成することを見出し、さらにサブユニットの入れ替えを含むダイナミックな構造変換を行うことを明らかにした。またSufDについては、構造情報(下記)に基づいて種々の変異を導入し、機能的に重要な部位を同定した。一方、AquifexのIscUが意外にもFe-Sクラスター中間体を結合した状態で精製できることを見出し、変異を導入することによってさらに中間体の安定化を達成した。2.上記精製タンパク質(複合体)の結晶化を試み、大腸菌のYfhJ(IscX)に続いて、SufA, SufC, SufDの構造決定に成功した。SufAの二量体では4残基のシステインが近接する機能部位の実体、SufCではATPase活性と構造変換を共役させ得るドメイン間の塩橋、SufDではβ-helix二量体という重要な構造を、次々に明らかにすることができた。一方、SulfolobusのSufC+SufD複合体についても良質の結晶を得ることができた。鉄硫黄(Fe-S)蛋白質は、Fe-Sクラスターを持つ蛋白質の総称で、構造と機能は多種多様、これらFe-S蛋白質の機能発現において、Fe-Sクラスターの形成は必須である。近年我々は、クラスターの生合成に必須な二種の独立したマシナリー(ISCとSUF)を明らかにすることで、従来の"自発的なクラスター形成"という概念を覆した。次なる課題はメカニズムの解明である。本年度は、下記の研究を推進した。1.各成分の精製と生化学的な解析、機能マシナリーとしての分子構築、分子間相互作用の解析(高橋)大腸菌のISC並びにSUF、好熱菌Aquifex aeolicusのISC、古細菌SulfolobustokodaiiのSUFマシナリーの構成成分について、各々単独、または複合体として過剰に発現させ、精製と機能解析を進めている。SufS+SufE、SufB+SufC+SufDが、それぞれ複合体を形成すること、また、AquifexのIscUは、意外にもFe-Sクラスター(中間体?)を結合した状態で精製できることを見出した。今後、これらの精製標品を用いて、in vitro実験系の確立を目指す。2.結晶化とX線結晶構造解析(福山)上記の精製タンパク質(複合体)の結晶化を試み、大腸菌のIscA、SufA、SufC、SufDとSufS+SufE複合体、SulfolobusのSufCとSufC+SufD複合体について結晶を得ることができた。そのうち、SufDとSufC+SufD複合体の結晶は良質であり、現在、重原子誘導体をスクリーニング中。