hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
去勢抵抗性前立腺癌におけるＤｋｋ－１の機能解析及びその治療への応用

前立腺癌細胞株を用いてDkk1発現をウェスタンブロット法にて確認したところ、去勢抵抗性前立腺癌細胞株であるPC-3の細胞上清中にDkk1発現を認めた。去勢感受性前立腺癌細胞株であるLNCaPを用いてテトラサイクリン依存性Dkk1誘導発現株を樹立した。同細胞を用いて生化学的去勢条件下での培養を行ったところ、Dkk1誘導発現による去勢抵抗性獲得は認められなかった。一方、PC-3細胞でsiRNAによるDkk1ノックダウンを行ったところ、boyden chamberでの浸潤能低下を認めた。以上から、Dkk1発現は去勢抵抗性前立腺癌の浸潤能に寄与していると考えられた。当教室で保有するヒトDkk-1 cDNAを用いて、TetR制御下においてテトラサイクリン依存性に発現誘導が可能となる発現プラスミドを作成(pcDNA4/TO-hDkk1-Flag)し、lipofecionによるLNCaP/TR2細胞への導入とブラストサイディン及びゼオシンによる二重選択を行うことによって、Dkk-1蛋白の誘導発現クローンを樹立した(LNCaP/TR-hDkk-1-Flag)。同細胞を用いてレポーターアッセイやcolony formation assayを行ったが、現時点ではDkk-1発現誘導がアンドロゲン受容体活性及びアンドロゲン非依存性増殖に影響を及ぼすことを示唆するような所見は得られていない。さらに、ヒトアンドロゲン非依存性前立腺癌細胞株であるPC-3がDkk-1を発現し、SMARTpool siRNA(Thermo Scientific社)のトランスフェクションによるDkk-1ノックダウンが可能であることを確認し、同細胞の浸潤能に対するDkk-1ノックダウンの影響をBoyden Chamberを用いたinvasion assayにて検討しているが、現時点ではDkk-1ノックダウンが浸潤能に影響を変化させることを示唆する所見は得られていない。申請者は、去勢抵抗性前立腺癌(CRPC)におけるDkk-1の機能解析を目的とて本研究を行った。テトラサイクリン発現誘導システムを用いて、Dkk-1誘導発現が可能であるLNCaP/TR2-hDkk-1-Flag細胞を樹立した。同細胞を用いてDkk-1誘導発現下での去勢抵抗能獲得をin vitroにおいて検討したところ、Dkk-1の誘導発現下では非誘導発現下と比較して同様の細胞増殖速度であることを認めた。またMMTV-luciferaseを使用したレポーターアッセイにおいて、Dkk-1誘導発現下では非発現時と比較してアンドロゲン受容体の転写活性が同程度であることが分かった。また、Dkk-1発現によって誘導されることが報告されているJNKリン酸化といった細胞内イベントも、同細胞内においてDkk-1誘導発現下と非発現時とでは同程度であった。さらにPC-3細胞にてDkk-1ノックダウンを行い、in vitroにおける細胞増殖能と細胞浸潤能を評価したところ、コントロール群と比較して同程度であることが分かった。以上の結果から、Dkk-1はCRPC細胞そのものにautocrine様式にて作用するのではなく、一度前立腺間質細胞にparacrine様式にて作用し、同細胞群からの成長因子による刺激を受け去勢抵抗性に寄与している可能性が示唆された。現在Dkk-1の前立腺間質細胞に対する作用について解析を進めている。同時にcDNAを有さないempty plasmidを用いて、同様にコントロールのクローンも樹立した(LNCaP/TR2-empty)。LNCaP/TR2-hDkk-1-Flagのテトラサイクリン依存性Dkk-1発現はウェスタンブロット法にて確認した。さらに、活性炭処理済み胎児ウシ血清とDihydrotestosterone(DHT)を用いて、これらの細胞がテトラサイクリン無添加(Dkk-1発現非誘導下)の条件ではアンドロゲン依存性増殖をすることを確認、さらにMMTV-luciferaseを使用したレポーターアッセイによってアンドロゲン受容体の活性が保持されていることを確認した。一方、ヒトアンドロゲン非依存性前立腺癌細胞株であるPC-3がDkk-1を発現していることを、市販のヒトDkk-1抗体(R&D systems社製)を用いて確認した。現在Dkk-1を標的としたsiRNA(SMARTpool、Thermo Scientific社製)を用いて、同細胞の発現するDkk-1のノックダウンを確認する実験を行っているところである。申請者は前年度において当初の計画に従い、1アンドロゲン依存性前立腺癌細胞におけるDkk-1過剰発現の影響の評価、2去勢抵抗性前立腺癌細胞におけるDkk-1ノックダウンの影響の評価、を行った。

従って、昨年度も概ね計画通りの研究が推進されている。予想に反し、12ともにDkk-1発現を変化させることによる影響を現時点では認めていないが、1についてはテトラサイクリン非誘導状態におけるleaky expression、2においては当初予想していなかった内因性の要因(例:他のgrowth factorなどへの影響)が実験結果に影響を及ぼしている可能性がある。前年度において、(1)LNCaPを用いたDkk-1のテトラサイクリン誘導発現株の樹立、(2)PC-3を用いたDkk-1誘導ノックダウン株の樹立、を当初の目標としていた。前者においては、lipofection法を用いてLNCaP/TR2細胞に遺伝子導入し、ブラストサイディン及びゼオシンによる二重選択によって、上記の細胞を計画通りに樹立することができた。後者に関しては、テトラサイクリン誘導発現系に必要であるTetRをコードした発現プラスミド(pcDNA6/TR)のlipofection後のブラストサイディン選択の過程において、発現プラスミドが導入されていない細胞が死滅しないという想定外の結果となった。しかしながらin vitroの実験ではsiRNAを用いた手法でもshRNAの定常発現細胞と遜色ない効果が得られる事、さらに特に近年nude miceの皮下に形成したxenograft transplantにおいてもsiRNAの導入が可能であることが報告され、in vivoの系においてもsiRNAによる手法を使用できるという技術的なブレークスルーがなされた。従って、本研究計画でも同様の方法を採用することにより、in vivoの系でもPC-3細胞におけるDkk-1ノックダウンの効果を評価可能と考えられるため、本年度の研究計画が遂行できると考えられる。したがって、現時点において本研究は当初の計画通りおおむね遂行できていると判断した。本年度はまず前年度に得られた結果からの考察を踏まえ、前年度行った研究に新たな条件(Wnt ligandの添加など)を加えて、前年度の研究の再評価を行っていく予定である。こうした条件でDkk-1の発現変化が前立腺癌細胞株の表現型に影響を及ぼす事が見出された場合は、申請書に記載されている研究計画通り、同表現型変化を制御するキナーゼの同定を試みる予定である。日程に余裕があれば、その治療応用の可能性について検討するためにヌードマウスを用いたxenograftの系を用いたin vivoの実験も行って行く予定である。申請書に記載されている研究計画通り、今年度は上述した新規樹立細胞及びsiRNAによるノックダウンの手法を用いて、Dkk-1の前立腺癌細胞のアンドロゲン非依存性増殖やその他の生物学的意義について解析を進めていく予定である。具体的には、1.活性炭処理
ガラス化法によるヒト皮膚の凍結保存および常温乾燥保存

生体組織の凍結保存は特殊な設備を要する。この問題を解決しうる方法がガラス化法である。ガラス化法により凍結保存された細胞の生存率が高くなることが知られている。ガラス化法を用いてヒトおよびラット皮膚の凍結保存および常温乾燥保存を行った。さらに、ラットで皮膚移植を行った。透過型電子顕微鏡により細胞構造が保たれていることは確認できたが、細胞を生存させることはできなかった。本研究の目的は、ガラス化法を用いて皮層の長期乾燥保存および凍結保存の実現である。平成21年度に行った研究の成果を報告する。(1)乾燥保存したヒト皮膚の、透過型電子顕微鏡による観察ヒト皮膚をトレハロースを含む保存液に浸漬した後乾燥させ、3ヶ月間乾燥保存した。透過型電子顕微鏡で細胞構造を観察した。コントロール群と比較したところ、保存液を用いた群は、ミトコンドリアなど細胞内小器官の構造が保たれていた。この結果より、トレハロースが乾燥保存の実現への鍵と考え、動物実験で実際に移植実験を行うことにした。(2)ラットでの皮膚移植実験Green florescence protein-transgenicラット(GFP-LEWラット)を用いて皮膚移植を行った。GFP-LEWラットから皮膚を採取し、保存液に浸漬した後に2ヶ月間常温乾燥保存した。加水した後、近交系LEWラットの皮下に埋め込み移植した。移植から1ヶ月後に移植皮膚を摘出し蛍光顕微鏡で観察したが、発光はわずかであった。組織学的検査でも生着しているとは言い難い結果であった。以上のように、本研究の目的を達成するにはまだ手法の改良が必要である。目的達成における最も重要なポイントは、細胞内にトレハロースをいかに取り込ませるかであると考えられる。今後は類似の研究を参考にし、短時間加温処理によるエンドサイトーシス促進、抗酸化物質の併用などを試みる予定である。本研究の目的は、ガラス化法を用いた皮膚の長期乾燥保存および凍結保存を実現し、スキンバンクの拡充を図ることである。平成22年度に行った研究の成果を報告する。前年度に行ったラットでの皮膚移植実験の結果を踏まえ、保存液のトレハロース濃度がポイントの一つであると判断した。最適な濃度を模索するため、乾燥保存したヒト皮膚の透過型電子顕微鏡による観察を再度行った。ヒト皮膚を保存液に浸漬した後乾燥させ、3ヶ月間乾燥保存し、透過型電子顕微鏡で細胞構造を観察した。その結果、トレハロース濃度が1mol/Lの保存液を使用した際にミトコンドリアなど細胞内小器官の構造が保たれていた。この保存液を使用して、前年度に行った皮膚移植実験を再度行った。Green florescence protein-transgenicラット(GFP-LEWラット)の皮膚を採取し、保存液に浸漬した後に1ヶ月間常温乾燥保存した。加水した後、別のラットの皮下に埋め込み移植した。移植から1ヶ月後に移植した皮膚を摘出し蛍光顕微鏡で観察した。発光は若干強くなったが、組織学的検査では生着しているとは言い難い結果であった。本研究の目的を達成するには更なる手法の改良が必要である。最も重要なポイントは、細胞内にトレハロースをいかに取り込ませるかであると考えられる。平成23年度は、短時間加温処理によるエンドサイトーシス促進、抗酸化物質の併用などを試みる予定である。広範囲熱傷の治療において同種皮膚は有用な生体材料である。同種皮膚はスキンバンクにおいて凍結保存されているが、特殊な設備を要し保存期間も限定されている。本研究の目的は、ガラス化法を用いて皮膚の長期乾燥保存および凍結保存を実現することである。平成2123年度に行った研究の成果を報告する。(1)長期乾燥保存したヒト皮膚の、透過型電子顕微鏡による観察ヒト皮膚をトレハロースを含む保存液に浸漬した後乾燥させ、3ヶ月間常温で保存した。長期乾燥保存したヒト皮膚の細胞構造を透過型電子顕微鏡で観察した。この結果より、トレハロースが乾燥保存の実現への鍵と考え、動物実験で実際に乾燥保存した皮膚を移植する実験を行った。(2)常温乾燥保存ラット皮膚の移植実験Green florescence protein-transgenicラット(GFP-LEWラット)を用いて、実際に皮膚移植を行った。GFP-LEWラットから皮膚を採取し、トレハロースを含む保存液に浸漬した後に2ヶ月間常温乾燥保存した。その後、加水して戻し近交系LEWラットの皮下に埋め込み移植した。組織学的検査でも生着していなかった。保存液への抗酸化物質も行ったが、結果はほぼ同様であった。目的達成における最も重要なポイントは細胞内にトレハロースをいかに取り込ませるかであると考えられるが、本研究の目的を達成するにはまだ手法の改良が必要である。
非ホロノミック大型宇宙構造物の位置・姿勢と振動のハイブリッド制御

本研究では,推進力を持たない宇宙空間に浮遊する大型宇宙構造物(Large Space Structures : LSS)の位置姿勢および振動(Position, Attitude and Vibration : PAV)制御に関する問題点を解決する制御系設計法を検討した.具体的には,宇宙空間に浮遊するLSSを非ホロノミック力学系と考えてモデル化を行い,柔軟構造物としてのLSSの振動抑制問題を考察した.制御系設計法として,周期を時間関数とする制御手法を提案した.これは,多次元システムに対応する制御入力であるが,無限次元システムに対する制御手法としても十分な有効性を持つことを実験によって示した.これにより,無限次元システム理論の制御手法としても新規性の高い新しい多元制御則によるLSSハイブリッドPAV制御系設計法を確立した.研究期間内において得られた具体的な成果を以下に記す.(1)空気圧浮上LSS実験システムの設計・製作とシミュレーション平成12年度は,大型宇宙構造物のプロトタイプモデルとして空気圧浮上型のベースと2リンクのアームから成る柔軟構造物を作成した.フレキシブルモデルの大型宇宙構造物のモデル化を行い,剛体モデルに対して設計した制御則を適用する数値シミュレーションを行った.シミュレーションはフレキシブルモデルを第1振動モードで近似した場合には,剛体系に対して設計した制御則でも十分に有効であることが示された.(2)非ホロノミックLSSのハイブリッドPAV制御系設計法の開発と実験柔軟リンクから成る2リンク平面宇宙ロボットの姿勢制御問題を検討した.このようなシステムはCaplyginシステムと呼ばれる非ホロノミックシステムであることが知られている.本研究では,滑らかで微分可能な時変フィードバック制御による安定化手法を開発し,数値シミュレーションによる制御効果の確認を行った.さらに,空気圧浮上型の平面宇宙ロボットを製作し,提案手法による制御実験を行った.柔軟リンクの振動モードを励起しないよう,詳細なシミュレーションを行い,制御則を設計した.柔軟リンク宇宙ロボットの姿勢安定化を実験により達成した.実験結果は,数値シミュレーションとほぼ同様な応答結果を示し,制御則の有効性を実証できた.本研究では,推進力を持たない宇宙空間に浮遊する大型宇宙構造物(Large Space Structures : LSS)の位置姿勢および振動(Position, Attitude and Vibration : PAV)制御に関する問題点を解決する制御系設計法を検討した.具体的には,宇宙空間に浮遊するLSSを非ホロノミック力学系と考えてモデル化を行い,柔軟構造物としてのLSSの振動抑制問題を考察した.制御系設計法として,周期を時間関数とする制御手法を提案した.これは,多次元システムに対応する制御入力であるが,無限次元システムに対する制御手法としても十分な有効性を持つことを実験によって示した.これにより,無限次元システム理論の制御手法としても新規性の高い新しい多元制御則によるLSSハイブリッドPAV制御系設計法を確立した.研究期間内において得られた具体的な成果を以下に記す.(1)空気圧浮上LSS実験システムの設計・製作とシミュレーション平成12年度は,大型宇宙構造物のプロトタイプモデルとして空気圧浮上型のベースと2リンクのアームから成る柔軟構造物を作成した.フレキシブルモデルの大型宇宙構造物のモデル化を行い,剛体モデルに対して設計した制御則を適用する数値シミュレーションを行った.シミュレーションはフレキシブルモデルを第1振動モードで近似した場合には,剛体系に対して設計した制御則でも十分に有効であることが示された.(2)非ホロノミックLSSのハイブリッドPAV制御系設計法の開発と実験柔軟リンクから成る2リンク平面宇宙ロボットの姿勢制御問題を検討した.このようなシステムはCaplyginシステムと呼ばれる非ホロノミックシステムであることが知られている.本研究では,滑らかで微分可能な時変フィードバック制御による安定化手法を開発し,数値シミュレーションによる制御効果の確認を行った.さらに,空気圧浮上型の平面宇宙ロボットを製作し,提案手法による制御実験を行った.柔軟リンクの振動モードを励起しないよう,詳細なシミュレーションを行い,制御則を設計した.柔軟リンク宇宙ロボットの姿勢安定化を実験により達成した.実験結果は,数値シミュレーションとほぼ同様な応答結果を示し,制御則の有効性を実証できた.今年度は,大型宇宙構造物のプロトタイプモデルとして空気圧浮上型のベースと2リンクのアームから成る柔軟構造物を作成した.同時に柔軟構造物の振動制御を実験的に検証するための3軸駆動型フレキシブル振動実験装置を試作した.フレキシブルモデルの大型宇宙構造物のモデル化を行い,剛体モデルに対して設計した制御則を適用する数値シミュレーションを行った.シミュレーションはフレキシブルモデルを第1振動モードで近似した場合には,剛体系に対して設計した制御則でも十分に有効であることが示された.ただし,振動の抑制は十分ではなく,今後,さらに高次の振動モードを考慮した安定性の評価を行う必要がある.宇宙構造物を力学的に表現すると非ホロノミック系として表現できる.今年度は平面宇宙ロボットなどchained formへと変換できる力学系に対して適用できる新たな軌道追従制御系設計法の開発を行った.この手法は状態すべての情報をエラーシステムの変数として用いるため,初期値に依存しない追従特性をもち,4状態以上,3入力以上の多入力多変数非ホロノミック系の軌道制御を実現することができる.一方,3軸駆動型フレキシブル振動実験装置を用いた非定常最適制御理論およびゲインスケジューリングによる制御実験においては,スケジューリングの効果が顕著に表れる実験結果を得た.非定常最適制御則は時変重みによりフィードバックゲインを時変にすることにより,制御効率を改善する制御手法である.

この時変ゲインにさらにゲインスケジューリングを付加することにより,制御対象のパラメータ変動に対応できるロバスト性を有する制御系を構成することができる.実験では,共振周波数が変動するよう実験装置を調整し,その変動をスケジューリングパラメータによって推定し,共振周波数の変動に応じてゲインを変化させた.実験結果を従来法と比較し,提案法の優位性を実証した.今年度は,昨年度製作した空気圧浮上型大型宇宙構造物と3軸駆動型フレキシブル振動実験装置を用いた実験を行った.宇宙構造物の実験に際しては,実験前にアームの振動を引き起こさないよう,制御則の設計パラメータを調整する必要があった.実装する制御則は,Caplygin systemの特徴を利用したものであり,速度入力を用いて簡単に実装することが可能であるが,アームの周期運動を利用するため,アームの振動モードを励起する可能性がある.そこで,柔軟アームを有する宇宙ロボットのモデル化を行い,設計パラメータを変化させて,最適な設計パラメータを求めた.ステップ入力によるフィードフォワード制御による予備実験を行い,実験精度を確認した.その結果,ベース姿勢が0.4radほどの範囲では,ほぼ角運動量保存則を満たす運動を実現できることが確認できた.そこで,ベースの初期姿勢を0.2radにとり,原点の安定化を実現した.設計パラメータの調整により振動の発生も抑制でき,滑らかな安定化を達成した.一方,今年度は,振動実験装置を改良し,粗動および微動アクチュエータを装備した2段アクチュエータ系の振動実験装置を試作した.このシステムに対する制御系設計法の提案を行い,実験を行った.具体的には,「非定常最適レギュレータ」を適用し,従来のサーボ制御とは異なる効果的な位置決めおよび振動制御が可能となることを示した.また,従来の振動実験装置を用いた実験では,オフラインシミュレーションに基づく高度な目標軌道設計と簡単なフィードバック制御器との組み合わせによる制御実験を行った.具体的には,非定常最適レギュレータによる制振性に優れた目標軌道設計とロバスト性に優れたスライディングモード制御によるフィードバックから成る2自由度制御系を構成した.数値計算および実験により,提案する制御系の有効性を実証した.本研究では,オペレータによって操作されるマスタロボットを用いた遠隔操作による宇宙ロボットのベース姿勢の安定化制御について考察した.手先軌道をオペレータによって操作されるマスタロボットの手先軌道に追従させ,かつ内部状態と考えられるスレーブロボットの衛星べース角速度を完全に安定化する制御系を設計した.この制御目的を達成するため,新たに姿勢反力(attitude reaction force)という概念を導入した.
分子細胞生物学的方法による大気浮遊粒子状物質の健康影響評価

我が国では大気中に浮遊する10μm以下の粒子状物質(SPM)を大気汚染物質として環境基準が定められている。特に粒径2.5μm以下の微小粒子(PM2.5)濃度は推定死亡率や肺がん罹患率との間で有意な相関が認められている。微小粒子の主たる起源はディーゼル車排ガスである。本研究は大阪府内で微小粒子をサンプリングして、その粒径分布とその化学組成を分析し、微小粒子の健康影響、特に変異原性と内分泌攪乱性を細胞生物学的・分子生物学的に調べ、最終的にはリスク評価につなげることを目的とする。大阪府大阪市(商業地)、東大阪市(自排局)、堺市(住宅地)の実大気についてロープレッシャインパクタで粒子別に分粒した大気中粒子試料を2週間ごとに連続して採取し、分析用試料を得た。同時にローボリュームエアサンプラで粒径分離しないフィルター試料を採取した。その結果、東大阪市(自排局)、大阪市(商業地)のSPMを用いて以下の結果が得られた。SPM粒径分布は約2μmを境として2山型を示した。SPMのAhr、ER結合活性および変異原性は粒径分布が小さい方の山に一致した。大気量あたりの両活性は東大阪市の方が大阪市より高かった。堺市(住宅地)のPMのAhrおよびER結合活性は夏期に低く、冬期に高いという傾向があった。SPM濃度は年々減少していく傾向にあった。大気浮遊粒子中に近年発見された強力な変異原物質3-ニトロベンズアントロン(NBA)はG:C→T:A突然変異を起こし、DNA中のNBA付加体は大腸菌においてSOS誘導条件下で損傷乗り越えDNA合成がDNAポリメラーゼV(umuDC)によって行われ、突然変異が生ずることがわかった。また大気浮遊粒子中のアミノビフェニルもDNA付加体を形成するが、こちらはDNA合成を阻害せず、突然変異を起こしにくいことがわかった。我が国では大気中に浮遊する10μm以下の粒子状物質(SPM)を大気汚染物質として環境基準が定められているが、大都市域では基準が達成されないまま推移している。また粒径2.5μm以下の微小粒子(PM2.5)濃度は推定死亡率や肺がん罹患率との間で有意な相関が認められている。微小粒子の主たる起源はディーゼル車排ガスで、その化学組成は各国によって異なり、その成分は複雑である。本研究は日本国内で微小粒子をサンプリングして、その粒径分布とその化学組成を分析し、微小粒子の健康影響、特に変異原性と内分泌撹乱性を細胞生物学的・分子生物学的に調べることを目的とする。大阪府大阪市、東大阪市、堺市の実大気についてロープレッシャインパクタで粒子別に分粒した大気中粒子試料を2週間ごとに連続して採取し、分析用試料を得た。同時にLo-Volサンプラで粒径分離しないフィルター試料を採取した。我々が樹立したヒトの多環水素受容体(Ahr)結合活性を迅速簡便に測定できる酵母とヒトのエストロゲン受容体(ER)結合活性を測定できる酵母を用いてバイオアッセイを行った。その結果、以下の結果が得られた。SPMのAhrおよびER結合活性は夏期に低く、冬期に高いという傾向があった。SPMのAhrおよびER結合活性は粒径分布が小さい方の山に一致した。

特に粒径2.5μm以下の微小粒子(PM2.5)濃度は推定死亡率や肺がん罹患率との間で有意な相関が認められている。微小粒子の主たる起源はディーゼル車排ガスで、その化学組成は各国によって異なり、その成分は複雑である。本研究は日本国内で微小粒子をサンプリングして、その粒径分布とその化学組成を分析し、微小粒子の健康影響、特に変異原性と内分泌撹乱性を細胞生物学的・分子生物学的に調べることを目的とする。大阪府大阪市(商業地)、東大阪市(自排局)、堺市(住宅地)の実大気についてロープレッシャインパクタで粒子別に分粒した大気中粒子試料を2週間ごとに連続して採取し、分析用試料を得た。同時にローボリュームエアサンプラで粒径分離しないフィルター試料を採取した。昨年度我々が樹立したヒトの多環水素受容体(Ahr)結合活性を迅速簡便に測定できる酵母(特許出願中)とヒトのエストロゲン受容体(ER)結合活性を測定できる酵母を用いてバイオアッセイを行った。その結果、東大阪市(自排局)、大阪市(商業地)のSPMを用いて以下の結果が得られた。SPM粒径分布は約2μmを境として2山型を示した。SPMのAhrおよびER結合活性は粒径分布が小さい方の山に一致した。大気量あたりの両活性は東大阪市の方が大阪市より高かった。堺市(住宅地)のPMのAhrおよびER結合活性は夏期に低く、冬期に高いという傾向があった。SPM濃度は年々減少していく傾向にあった。SPM中に含まれる強力な変異原物質3-ニトロベンツアントロン(NBA)による突然変異機構を大腸菌で調べた。DNA中のNBAのグアニン付加体が、DNAポリメラーゼVによってDNA複製される際に、過ってアデニンと対合することがわかった。我が国では大気中に浮遊する10μm以下の粒子状物質(SPM)を大気汚染物質として環境基準が定められている。微小粒子の主たる起源はディーゼル車排ガスである。本研究は大阪府内で微小粒子をサンプリングして、その粒径分布とその化学組成を分析し、微小粒子の健康影響、特に変異原性と内分泌攪乱性を細胞生物学的・分子生物学的に調べ、最終的にはリスク評価につなげることを目的とする。SPMのAhr、ER結合活性および変異原性は粒径分布が小さい方の山に一致した。大気浮遊粒子中に近年発見された強力な変異原物質3-ニトロベンズアントロン(NBA)はG:C→T:A突然変異を起こし、DNA中のNBA付加体は大腸菌においてSOS誘導条件下で損傷乗り越えDNA合成がDNAポリメラーゼV(umuDC)によって行われ、突然変異が生ずることがわかった。
高等植物培養細胞周期とチュ-ブリン分子種の変動

高等植物培養細胞の細胞周期の進行と、チュ-ブリン分子種の変動との関係を調べる為、同調培養を用い、各時期の細胞に含まれるチュ-ブリン蛋白質及びそのmRNAについて量的、質的変動を見た。実験材料としては当初ニンジン細胞を予定していたが、この細胞はアフィディコリンに対する感受性が低い為、すでに方法の確立しているタバコBY2細胞に変更した。タバコ・チュ-ブリンもニンジン同様抗トリ脳チュ-ブリン抗体と反応し、αー、βーチュ-ブリンとも複数の分子種より成ることを確認した。同調培養によって得られた細胞周期各期の細胞抽出液の等電点電気泳動イムノブロッティングによりβーチュ-ブリンの分子種の構成を調査した結果、タバコ細胞においてβーチュ-ブリンは等電点5.255.50まで少なくとも3種のアイソフォ-ムが存在し、その構成比は細胞周期の進行に従って変化し、S、G2、M期にはpI=5.30,5.32のアイソフォ-ムが主成分であるが、G1期にはpI=5.50のものが上昇した。また、各期BY2細胞より抽出されたRNAのドットブロットハイブリダイゼ-ションの結果より、βーチュ-ブリンmRNAは細胞周期各期を通して存在し、その総含量には大きな変化はなかったが、G2期にやや減少し、M期に最大となり、G1期に再び減少する傾向が見られたこれらの変化に、ある特定の遺伝子の発現が関与している可能性についてみるため、ノ-ザンブロッティングによりβーチュ-ブリンmRNAの質的変動を検討したが、何れの場合も単一のバンドとして検出され少なくともサイズの上で異なった遺伝子の発現は見られなかった。従って、これまでの結果からは、細胞周期における蛋白質レベルで見られたβーチュ-ブリンアイソフォ-ムの変動は、遺伝子の転写レベルでの変動よりも翻訳後修飾のレベルでの変動による可能性が高い。本年度は、細胞周期の進行に伴う、微小管の挙動と構成チュ-ブリンの蛋白レベルおよびmRNAレベルでの解析を行った。これまでの研究では、ニンジン培養細胞を主として使用していたが、細胞周期との関係を調べるためにはアフィディコリンにより高度に同調化させることのできるタバコBY2細胞が適しているため、この細胞を材料として実験を行うことにした。ドットブロットにより、タバコチュ-ブリンも抗トリα-、β-チュ-ブリン抗体(DB1,DB2)と交差反応を示すことが確認されたので、ニンジンの場合と同様、これら抗体との反応性を指標として酵素抗体法によりSDS-ポリアクリルアミドおよび等電点電気泳動のウエスタンブロッティングを行いチュ-ブリン分子種について検討した。その結果、タバコにおいてもα-、β-チュ-ブリンとも蛋白レベルにおいて、複数の分子種より成ることがわかった。また同調培養を用いた実験により、これらのチュ-ブリン分子種の構成は細胞周期の進行によりその比率に変化があるらしい事がわかった。一方細胞周期各期よりRNAを抽出し、ニンジンβ-チュ-ブリンcDNAより、知られている各β-チュ-ブリン・アイソタイプに共通なアミノ酸配列部分に相当するプロ-ブを調製し、これを用いてドットブロットおよびノ-ザンブロットによりその転写産物の量的、質的変動を調べた。その結果、何れの時期においても、単一のバンドしか検出できず、果たして複数の転写産物が存在しているのか確認できなかった。また、β-チュ-ブリンmRNAは何れの時期においても存在し、顕著な量的変動は認められなかった。以上の結果、細胞周期の進行に伴うチュ-ブリンの分子種の変化は翻訳以後の修飾の可能性が強いと思われるが今後この点について更に明らかにしていきたい。

本年度は、タバコBYー2同調培養を用いて、細胞周期の進行に伴うβーtubulin遺伝子産物について解析を行う一方、いままでの研究成果を活かすべくニンジンGDー2細胞についても同調化可能な株の選抜を試みた。まず同調培養各期のタバコBYー2細胞より迅速処理により酸性蛋白画分を調製し、一次元等電点電気泳動immunoblottingにより、存在するβーtubulinの構成を調査した。その結果、タバコ細胞において、βーtubulinは等電点5.25から5.50まで主として4種のisoformが存在し、その構成比は細胞周期の進行に伴って変化した。すなわち、S,G2,M期には、pI=5.30,5.32のisoformが主成分であるが、G1期にpI=5.50のものが上昇することが観察された。一方、各期BYー2細胞より抽出されたRNAのdot blotの結果より、βーtubulin mRNAは細胞周期各期を通して存在し、その総含量には大きな変動はなかったが、G2期にやや減少し、M期に最大となりG1期に再び減少する傾向が見られた。このことは、間期細胞質微小管も重要な役割を持つ高等植物細胞では、細胞質微小管のない粘菌ほど大きな変化は示さないにしても、G2期からM期にかけて、tubulin遺伝子の転写活性が上昇するか、その安定性が増すなどの変化の存在する可能性が残っていることを示唆している。これらの変化には、ある特定のtubulin遺伝子が関与している可能性が考えられるが、Northern blotの結果に関するかぎり、質的に異なったmRNAを検出することは出来なかった。Northern blotではサイズが似通ったmRNA同士の区別は困難であるため、今後各期mRNAを鋳型としてin vitroでの翻訳産物の比較をし、この点をさらに確かめていく予定である。またBUDR法を改良することによりニンジンのaphidicolin高感受性株を選抜する実験系をほぼ完成したので、今後これによりニンジン同調培養を誘導し、これまでに蓄積してきたtubulinに関する知見を活かしていきたいと考えている。昨年度までの研究により、タバコ培養細胞においてβーチュ-ブリンが34種のアイソフォ-ムから成ることを示し、細胞周期の進行にしたがってその構成比率が変化する事を示した。またノ-ザンブロッティング解析より発現されているβーチュ-ブリン遺伝子はそのmRNAサイズからは単一であり、細胞周期を通して発現されていた。本年度は蛋白質レベルでの各アイソフォ-ムの構成比率の変化をより明確にする為等電点電気泳動の条件、特にスペ-サ-の利用によるバンドの分離の向上について検討した。まだバンドの分離は不十分だが細胞周期の進行に従って各アイソフォ-ム間にそう大幅ではないが規則的な変動がある事を確認した。また蛋白レベルで見られたアイソフォ-ムが単一の遺伝子産物に由来するかどうかを調べる為タバコcDNA及び、ゲノムDNAを調製し、それらのインバ-スPCRによるβーチュ-ブリン遺伝子のクロ-ニングを試みたが何れの場合も特異的な産物の増幅ができず、サブタイプ特異的プロ-プによる解析はできなかった。
情報教育における個別学習ならびに集団学習を支援するシステムの開発

情報教育の入門段階でのアプリケーションソフトウェアなどの操作演習における学習活動を支援するシステムの開発を行うために,以下のような研究を行った.(1)初学者を対象として行われる大学の情報教育演習場面をVTRで記録し,集団学習場面における制御機能を中心とする教授者の役割について検討した.(2)キーボード・エミュレーション装置を用いて,2第のパーソナルコンピュータを直列に接続し,アプリケーションソフトウェアなどの操作を習得するための個別学習を支援するシステムの仕組みを提案した.(3)個々の学習者を直接支援する複数の個別学習支援機と,学習集団全体の学習進行制御を目的とする集団学習支援機を既存のLANに配置し,共有ファイルを通してパラメタを伝達し,個別支援と集団支援相互の調整を図るメカニズムを提案した.ここで,集団支援機は,各個別支援機の指導状態を共有ファイルを通して収集することにより,学習集団の学習状態を把握する.また個々の個別支援機では,共有ファイルを通して得られる学習集団の学習状態により,支援のための操作チェックや指導の優先順位を変更することにより制御する.(4)教授者の学習制御に影響する項目のひとつとして,課題評価,特にキーワードを与えての短文作成課題における評価を例に取り,キーワードと教授者の評価の関係について検討した.キーワード数や短文行数のような数量的指標と教授者の評価にある程度の関連があることを明らかにした.情報教育の入門段階でのアプリケーションソフトウェアなどの操作演習における学習活動を支援するシステムの開発を行うために,以下のような研究を行った.(1)初学者を対象として行われる大学の情報教育演習場面をVTRで記録し,集団学習場面における制御機能を中心とする教授者の役割について検討した.(2)キーボード・エミュレーション装置を用いて,2第のパーソナルコンピュータを直列に接続し,アプリケーションソフトウェアなどの操作を習得するための個別学習を支援するシステムの仕組みを提案した.(3)個々の学習者を直接支援する複数の個別学習支援機と,学習集団全体の学習進行制御を目的とする集団学習支援機を既存のLANに配置し,共有ファイルを通してパラメタを伝達し,個別支援と集団支援相互の調整を図るメカニズムを提案した.ここで,集団支援機は,各個別支援機の指導状態を共有ファイルを通して収集することにより,学習集団の学習状態を把握する.また個々の個別支援機では,共有ファイルを通して得られる学習集団の学習状態により,支援のための操作チェックや指導の優先順位を変更することにより制御する.(4)教授者の学習制御に影響する項目のひとつとして,課題評価,特にキーワードを与えての短文作成課題における評価を例に取り,キーワードと教授者の評価の関係について検討した.キーワード数や短文行数のような数量的指標と教授者の評価にある程度の関連があることを明らかにした.
タンパク質導入法を用いた興奮性神経細胞死の解析と制御

本研究は、興奮性神経細胞死に重要な役割を果たす、蛋白質の立体構造や生化学的情報に基づき、細胞内情報伝達を制御可能な蛋白質や阻害ペプチドをデザインし、蛋白質導入ドメインと融合することにより、脳梗塞治療可能な分子プローブの開発を目的としている。研究実績としては、蛋白質導入法の導入効率を高める改良を行った。蛋白質導入法では、マクロピノサイトーシスで細胞内に高分子が取り込まれるが、取り込まれた後の細胞質への放出効率が問題となっていた。我々は、インフルエンザウイルスのHAIIペプチドを利用する事により効率を高める事を報告した。また、蛋白質導入法を用いてcalpain, TRPM7の阻害ペプチドの作成を行い、培養細胞レベルで虚血性神経細胞死の検証を行った。その過程で、効果的な細胞内導入阻害ペプチドをデザインし、培養細胞での虚血性神経細胞死での効果を認め、論文としても報告した。以上の結果より、本研究によりタンパク質導入法を用いた興奮性神経細胞死の制御が可能になったと考えられる。今後は、生体レベルでの応用が期待される。11個のアルギニン(11R)からなるペプチドを目的の蛋白質に融合することにより、細胞内へ直接タンパク質を導入する方法の開発を行ってきた。この研究の過程で、導入効率を飛躍的に上昇させる新規導入ペプチドを発見している。本研究では、興奮性神経細胞死に重要な役割を果たす、蛋白質の立体構造や生化学的情報に基づき、細胞内情報伝達を制御可能な蛋白質や阻害ペプチドをデザインし11Rと融合することにより、脳梗塞治療可能な分子プローブの開発をめざした。その結果として、以下の研究成果が得られた。1、導入効率を向上させるインフルエンザウイルス融合ペプチドを開発し、培養細胞にてその効果を確認した。2、タンパク質導入に際して、タンパク質そのものがユビキチン化され分解される場合、ユビキチン化サイトを置換する事により、蛋白分解を抑制し、タンパク質の機能時間を長期にする事に成功した。3、興奮性神経細胞死がタンパク質分解酵素の一種である、カルパインによって効果的に抑制される事を利用し、カルパインの阻害ペプチドとタンパク質導入ドメインを融合し、効果的に神経細胞死を防ぐペプチドを合成した。このペプチドを利用し、培養細胞レベルで神経細胞死を抑制することに成功した。4、転写因子の一つであるPDX-1が細胞内に導入される事を報告していたが、そのメカニズムについてマクロピノサイトーシスが関与している事を明らかにすることができた。また、蛋白質導入法を用いてcalpain、TRPM7の阻害ペプチドの作成を行い、培養細胞レベルで虚血性神経細胞死の検証を行った。
精密同位体比測定による隕石中の消滅核種の検出と太陽系初期年代学への応用

隕石、特に始原的なコンドライトは、太膓系が形成されたとき最も初めに固化した物質の集まりであり、その後、全体が溶融することなく保存されてきたため、原始太陽系の情報をそのまま留めている。消滅核種は、太陽系形成時には存在していたが、半減期が短いために46億年経った現在では壊変し尽くして存在しない核種で、隕石中にその痕跡が発見される場合があり、初期太陽系年代学に利用されている。本研究は、Beardsley隕石からBa同位体異常として痕跡を初めて発見した消滅核種Cs-135(半減期230万年)の検出とこれを用いた年代測定法の確立を目的とする。本研究では、炭素質コンドライトを中心に多くの種類の隕石についてBa同位体の分析を行った。測定した炭素質コンドライトのうち、CI、CM、CRおよびCVグループに属する隕石のほとんどからBa-135とBa-137の同位体異常が見つかった。これらはs-過程やr-過程の元素合成過程により生成された成分が付加されているためと考えられる。一方、熱変成度の高いCKグループやエコンドライトでははっきりした同位体異常が見られず、隕石母天体上での火成・変成作用により均質化した可能性が高い。CMグループの隕石について、r-過程成分を補正し、Cs-135による年代を推定すると、約7(+5/-2)百万年という年代が得られた。これは、消滅核種Mn-53を利用したCI隕石中の炭酸塩の年代に比べて短いため、同位体の再分配が起こった可能性が考えられる。炭素質コンドライトでは普通コンドライトに比べて酸によるCsの選択的溶出は効果的ではなかったが、消滅核種Cs-135による同位体異常の検出には有効であると考えられる。多くの炭素質コンドライトでは核合成過程由来の同位体異常が見られるため、詳細な研究による今後の廃展が望まれる隕石、特に始原的なコンドライトは、太膓系が形成されたとき最も初めに固化した物質の集まりであり、その後、全体が溶融することなく保存されてきたため、原始太陽系の情報をそのまま留めている。多くの炭素質コンドライトでは核合成過程由来の同位体異常が見られるため、詳細な研究による今後の廃展が望まれる消滅核種は、太陽系形成時には存在していたが、半減期が短いために46億年経った現在では壊変し尽くして存在しない核種である。しかし、隕石中等では壊変してできた娘核種の同位体異常として検出できる場合があり、太陽系初期の年代学に応用されている。筆者らは普通コンドライトであるBeardsley隕石から消滅核種Cs-135(半減期230万年)によると考えられるBa-135の明確な同位体異常を世界で初めて発見した(Hidaka et al.,2001)。本研究では、炭素質コンドライトを中心にBa同位体の分析を続けた。これらのうち、CMグループに属するMurchison隕石とSayama隕石から酸により抽出した試料からは、Ba-135とBa-137の正の同位体異常が見つかった。これはγ-processにより生成されたcomponentであると考えられる。一方、酸抽出後のフラクションは、presolar SiCに見られるs-process、componentの同位体パターンを示した。他の炭素質コンドライト試料は小さな同位体異常しか示さず、詳細な検討はできなかったが、やはりこれら2つのcomponentが混ざっていると考えられる。これら、特にr-process componentの影響が大きいため、消滅核種Cs-135による同位体異常ははっきりとしないが、Allende CAIsのデータと同じと仮定してexcessを求めると、CMグループの隕石の平均として、約7(+5/-2)百万年という年代が得られた。

これは、消滅核種Mn-53を利用したOrgueil隕石中の炭酸塩の年代、約17-18百万年(Endress et al.,1996)に比べて短い。同位体の再分配が起こった可能性が考えられる。また、エコンドライトであるJuvinas隕石の分析では、まったく同位体異常が見られなかった。これは上述のようなcomponentおよびCs-135由来の成分がエコンドライト母天体上での火成作用によって、均質化している可能性が高い。年度末になったが、分析精度の向上のために質量分析計の検出部のファラデーコレクタを交換した。今後も安定した精密同位体比測定が続けられるよう調整を行っている。消滅核種は、太陽系形成時には存在していたが、半減期が短いために46億年経った現在では壊変し尽くして存在しない核種であるが、隕石中にその痕跡が発見される場合があり、初期太陽系年代学に利用されている。筆者らは普通コンドライトであるBeardsley隕石から消滅核種Cs-135(半減期230万年)によると考えられるBa-135の明確な同位体異常を世界で初めて発見した(Hidaka et al.,2001)。平成16年度は、まず、質量分析計の測定用アンプ部分のアクイジションユニットを購入、既存のものと交換し、測定精度の向上を行った。その後、昨年度に引き続きコンドライトを中心にBa同位体の分析を続けた。このうち、CRグループに属する新発見のNWA801隕石(暫定名)からBa-135の正の同位体異常が見つかった。同時にBa-137の正の同位体異常も見られるため、これはr-過程元素合成により生成された成分である可能性が高い。一方、COグループに属するKainsaz隕石では誤差が大きいがBa-135のみに正の同位体異常が見られ、Cs-135による異常と考えられる。熱変成度の高いCKグループに属するKaroonda隕石でははっきりした同位体異常が見られず、隕石母天体上での変成作用により均質化した可能性がある。炭素質隕石の他、普通コンドライトでCs-135の痕跡が発見されているZag隕石の構成成分の分離を行っており、今後、順次同位体比を測定する予定である。消滅核種は、太陽系形成時には存在していたが、半減期が短いために46億年経った現在では壊変し尽くして存在しない核種で、隕石中にその痕跡が発見される場合があり、初期太陽系年代学に利用されている。本研究は、Beardsley隕石からBa同位体異常として痕跡を初めて発見した消滅核種Cs-135(半減期230万年)の検出とこれを用いた年代測定法の確立を目的とする。昨年度はCKグループやCRグループ等の特殊な炭素質コンドライトの分析を行ったが、本年度は、多くの隕石で同位体異常の見つかったCMグループの分析を続けるとともに、英仏の自然史博物館からOrgueil隕石の提供を受けて貴重なCIグループの分析を行った。CMグループのMurray隕石とMighei隕石およびCIグループのOrgueil隕石からは、狭山隕石やMurchison隕石と同じくBa-135とBa-137の大きな同位体異常が見つかった。両者の同位体異常はかなり相関しており、r-過程元素合成により生成された成分の付加を示唆している。一方、CVグループのEfremovka隕石の同位体変動はAllende隕石と同じく比較的小さかった。CIおよびCMグループの酸抽出フラクションの同位体比について、r-過程による付加成分をAllende CAIからの推定値を用いて補正すると、Cs/Ba比が高いほどBa-135の異常が大きくなる傾向が見え、これはCs-135による異常の可能性が高い。
省力的空間分布把握システムによる糸状虫症根絶の確認と再燃の早期発見

世界規模でリンパ系フィラリア症根絶計画が進行し、この段階では根絶の確認と再燃の早期発見のためのシステム作りが必要とされている。スリランカにおけるフィールドでの、(1)小学校児童の尿中抗フィラリア抗体検査、(2)フィラリアDNA検査による媒介蚊の検査、(3)得られたデータの位置情報取得から、感染リスクの高い場所が推定できるシステムを構築することができた。このシステムにより、新たな流行地、残存している感染を見つけることができた。1.隠れたフィラリア症流行地を発見するための調査:北部のJaffnaと東部のTrincomaleeでそれぞれ小学校調査と、媒介蚊の予備調査を行った。また以前の調査の結果、Wuchereria bancrofti感染が確認されたRatnapuraより採集された媒介蚊について、フィラリア幼虫の有無を調べた。a) Jaffnaの調査:小学校5校より合計784の尿検体を採取した。また、Gravid Trapを使い、Culexquinquefaciatusを採集した。調べた5校の生徒の抗体陽性率は0%2.8%と差が認められた。全体では陽性率は1.1%であった。採集した蚊はDNAを抽出し、PCRによってW. bancrofti、Brugia malayiの存在を検査したが、いずれも検出されなかった。b) Trincomaleeの調査:小学校11校より合計1,861の尿検体を採取した。生徒の抗体陽性率は小学校により、0.4%4.7%と大きく異なることがわかった。全体の陽性率は2.2%であった。媒介蚊調査からはフィラリアのDNAは検出されなかった。c) Ratnapuraの媒介蚊調査:採集された合計3,000匹のC.quinquefaciatusを調べたところ、W. bancroftiは検出されなかったが、B. malayiが検出された。スリランカではW. bancroftiが分布しているが、B. malayiは見つかっていなかった。2.フィラリアリコンビナント抗原SXP1を結合し、乾燥させて保存性を高めたELISAプレートを作成することができた。今回の全尿検体は、このプレートを用い、すべてRuhuna大学の研究室で測定することができた。(学会発表済)フィラリア症流行状況の情報が全くなかったスリランカ北部のJaffnaと東部のTriconmaleeの調査を優先させたため、Matara地区の定点調査を次年度に変更した。1.スリランカ東海岸のリンパ系フィラリア症未調査地における調査の継続1ー1.昨年度、内戦の影響でこれまでリンパ系フィラリア症の調査が行われてこなかった、スリランカ東部のTrincomalee周辺で、約2,000人の小学生を対象にした尿による抗フィラリアIgG4抗体調査で、抗体陽性者を発見した。これをさらに確認するため、抗体陽性であった児童の自宅周辺の住民を対象に、尿中の抗フィラリアIgG4抗体検査と、血液中のフィラリア由来抗原の検出を行った。さらにPCRによるフィラリア幼虫の検出を目的として、媒介蚊の採取を行った。合計630人の住民を検査し、1.4%に当たる9人が抗原陽性と判定された。この結果は現在もフィラリア感染が継続している可能性を示唆している。集められた11,340匹の媒介蚊は現在検査中である。1ー2.陽性者が見つかったことから、範囲を広げて小学校調査を行った。全生徒358人から尿を採取するとともに、GPSロガーを全生徒に配布し各生徒の住居を地図上にプロットした。尿中の抗体価は現在測定中で、これを組み合わせればリスクマップが作成できるのではないかと考えている。2.リンパ系フィラリア初期感染ならびにBrugia malayi感染を検出するための新たなリコンビナント抗原の作成スリランカではリンパ系フィラリア症に対する対策が終了し、患者数は激減している。このように感染の機会が少なくなった状況では、これまでのフィラリア抗原に対するIgG4抗体に加えて、IgG4が出現する前の感染初期から検出できる抗体検出系が必要とされる。そのための抗原としてこれまでのリコンビナント抗原、SXP1にフィラリアのendochitinaseを融合させたリコンビナント抗原を作成した。また、マレー糸状虫感染も同時に検出できるように、SXP1とマレー糸状虫診断用のBmR1抗原の融合タンパクを作成した。内戦の影響でリンパ系フィラリア症の調査が行われていなかった、スリランカ東部のTrincomaleeでの調査で陽性者が見つかったことから、この地区で重点的に調査を行った。ここでの調査結果から、小学生を対象とした尿によるフィラリア症のスクリーニングが有効であることが確認できた。しかし、Trincomaleeに調査を集中させたため、予定していたMatara地区での定点調査を再度延期せざるを得なくなった。リンパ系フィラリア症の感染リスクマップの作成:スリランカ東部Trincomaleeにおいて実施された、小学校児童の尿中のフィラリアに対する抗体調査と、GPSロガーによる位置情報を組み合わせて、抗体価分布の地理的集積域をローカルモラン統計量により算出、可視化することを通して、この地区での感染リスクマップを作成することができた。かつてのフィラリア症流行地であったMatara地区の小学校児童の尿中のフィラリアに対する抗体調査で、陽性の児童が見つかった周辺から17か月にわたって採取された媒介蚊(14,318匹)を、20匹づつプールして790余りからDNAを抽出し、含まれるフィラリア由来DNAをPCRで検出した。

その結果、採取したかからWuchereria bancroftiが検出され、WHOによるEliminationが認証された後でも少なからず感染が継続していることがわかった。また、陽性率が月によって大きく変動していたことから、今後の調査時期の選定に注意が必要であることがわかった。Galle周辺で発見されたフィラリアの遺伝子解析をした結果、Wuchereria bancroftiとは異なるBrugia malayiであることがわかった。他の地域で採取された蚊からもBrugia malayiを検出しており、低い感染率ながら広い範囲に分布していることが示唆された。世界規模でリンパ系フィラリア症根絶計画が進行し、この段階では根絶の確認と再燃の早期発見のためのシステム作りが必要とされている。スリランカにおけるフィールドでの、(1)小学校児童の尿中抗フィラリア抗体検査、(2)フィラリアDNA検査による媒介蚊の検査、(3)得られたデータの位置情報取得から、感染リスクの高い場所が推定できるシステムを構築することができた。このシステムにより、新たな流行地、残存している感染を見つけることができた。1.根絶確認あるいは再燃発見に関する調査(スリランカ):集団治療が終了し、ミクロフィラリア陽性率が1%以下となったMatara地区(定点)において、「尿と蚊」の調査を実施する。小学校を3校選定し、生徒の尿診断ならびにGPSロガーを用いた調査を行い、全生徒の抗体価とその位置情報を得る。発見された陽性児童とその家族、および陽性者の周辺に住む家族(詳細なinclusion criteriaは現地の状況を考慮して定める)を対象に尿診断、ICTによる抗原検査を行う。CDC Gravid Trapにより媒介蚊を採集し、LAMP法を用いて感染率を調べる。2.JaffnaおよびTrincomaleeで発見された尿抗体陽性者の多い小学校で、も同様の調査を実施する。現地調査は、共同研究者であるルフナ大学医学部寄生虫学教室Weerasooriya教授の協力を得ておこなう。Yahathugoda助教授、多数の技官(1名の昆虫学者を含む)も参加する。3.B. malayiの発見は大きな成果である。Ruhuna大学のある南部のGalleでもB.malayi感染を発見しており、まず、この地域で1,000人規模のB. malayiの調査と媒介蚊の調査を合わせて行う。調査には、現在作成中のB. malayi診断用のリコンビナント抗原を使った尿ELISA法を用いる。媒介蚊調査はこれまで通りPCR法を用いる。1.省力的なGPSロガーを使った小学生の住居の位置情報の収集と、尿中抗フィラリア抗体価の検査結果を組み合わせ、空間分布を把握する新たなシステムを完成させる。これによりリスクマップを作ることができれば、フィラリア対策に大きく貢献できると考えられる。2.新たに作成した融合タンパクを使い、より早い段階での感染の発見と、再燃が危惧されているBrugia malayi感染の検出を試み、スリランカのフィラリア症根絶に貢献できる新たな尿検査を開発する。