hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
単一構造型FRCを用いた新しい支台築造方法の開発

歯根破折は抜歯診断に至る主な原因の一つであり,根管治療後の支台築造が最も影響する治療過程である.従来型ガラス繊維補強型コンポジットレジン(FRC)は歯牙に負担の少ない歯台築造方法として広く臨床で応用されている一方で,従来型FRCはガラス繊維とコンポジットレジンの複合体であることにより機械的強度が不足しておりその適応症が極端に限られている.本研究の目的は,新たに開発された単一構造FRCを用いて,歯牙に優しく且つ機械的強度に優れた支台築造方法を開発することである.平成30年度の研究目的は3次元有限要素法を用いて支台築造を行った支台歯の応力解析を行い,歯髄処置の施された歯牙に最もストレスが少なくなると考えられる,単一構造FRCを用いた築造体形態を検討することである.平成30年度は築造体に用いる材料の機械的性質の評価として引張試験及び築造体と象牙質との接着引っ張り強さ試験を行い,さらに既存の牛根およびヒト上顎中切歯の3Dモデルを用いて予備解析を行った.材料定数は曲げ試験のデータを用いた.築造体の長さ,太さに関して主に築造形態に関して検討し,牛根とヒト歯根のモデル間の比較を行った.さらに,牛根及びヒト抜去歯を用いた破壊試験を行うために,従来型FRC(ガラス繊維+コンポジットレジン),及び単一構造型FRC(ショートファイバーペーストを用いてCAD/CAMシステム上で築造体の製作方法の検討及び試作を開始した.各材料の機械的性質を確認及び築造体と象牙質との引っ張り強さ試験を行った.試料製作に関して,苦慮していおり,当初の予定より遅れているが,来年度以降に予定していたコア材料をCAD/CAMシステム上で削り出す方法に関して検討を行っている.牛歯やヒト抜去歯を使用した試験を行う前に,規格性のある材料での予備試験を現在検討している.今後は29年度に引き続き,築造体と象牙質との接着引張り強さ試験の実施,築造体の製作,さらには有限要素のモデリングを確実な方法で行えるよう,手法を確立し,実験を進めていく予定である.モデリング方法に関しては,マイクロCTで撮影したDICOMデータを,ソフトウェアMimicsを用いて三次元有限要素解析ソフトANSYS上に読み込み失活歯をモデリングする事を検討している.また,規格性のある材料での予備試験後に,牛歯あるいはヒト抜去歯での実験に移行していく予定である.歯根破折は抜歯診断に至る主な原因の一つであり,根管治療後の支台築造が最も影響する治療過程である.従来型ガラス繊維補強型コンポジットレジン(FRC)は歯牙に負担の少ない歯台築造方法として広く臨床で応用されている一方で,従来型FRCはガラス繊維とコンポジットレジンの複合体であることにより機械的強度が不足しておりその適応症が極端に限られている.本研究の目的は,新たに開発された単一構造FRCを用いて,歯牙に優しく且つ機械的強度に優れた支台築造方法を開発することである.平成29年度の研究目的は,3次元有限要素法を用いて支台築造を行った支台歯の応力解析を行い,歯髄処置の施された歯牙に最もストレスが少なくなると考えられる,単一構造FRCを用いた築造体形態を検討することである.まず有限要素解析に先立ち,築造体に用いる材料の機械的性質の評価を行った.材料は従来型FRC(ガラス繊維+コンポジットレジン),及び単一構造型FRC(ショートファイバーペースト)を用い,引張試験を行った.各材料の引っ張り強さ,弾性率,靭性値を評価し,異方性に関しても検討した.さらに,既存の牛根およびヒト上顎中切歯の3Dモデルを用いて予備解析を行った.材料定数は曲げ試験のデータを用いた.築造体の長さ,太さに関して主に築造形態に関して検討し,牛根とヒト歯根のモデル間の比較を行った.さらに,築造体の削り出し方法を検討するにあたり,既存のCAD/CAMシステム上でのデータ取り込み,モデリングに関して検討を開始した.各材料の機械的性質を確認し,三次元有限要素解析による予備解析を行った.機械的性質の一つとして重要な築造体と象牙質との接着引張り強さ試験を現在行っているが,試料製作に関して,苦慮していおり,当初の予定より少し遅れているが,来年度以降に予定していたコア材料をCAD/CAMシステム上で削り出す方法に関して検討を開始している.牛歯やヒト抜去歯を使用した試験を行う前に,規格性のある材料での予備試験を現在検討している.歯根破折は抜歯診断に至る主な原因の一つであり,根管治療後の支台築造が最も影響する治療過程である.従来型ガラス繊維補強型コンポジットレジン(FRC)は歯牙に負担の少ない歯台築造方法として広く臨床で応用されている一方で,従来型FRCはガラス繊維とコンポジットレジンの複合体であることにより機械的強度が不足しておりその適応症が極端に限られている.本研究の目的は,新たに開発された単一構造FRCを用いて,歯牙に優しく且つ機械的強度に優れた支台築造方法を開発することである.平成30年度の研究目的は3次元有限要素法を用いて支台築造を行った支台歯の応力解析を行い,歯髄処置の施された歯牙に最もストレスが少なくなると考えられる,単一構造FRCを用いた築造体形態を検討することである.平成30年度は築造体に用いる材料の機械的性質の評価として引張試験及び築造体と象牙質との接着引っ張り強さ試験を行い,さらに既存の牛根およびヒト上顎中切歯の3Dモデルを用いて予備解析を行った.

材料定数は曲げ試験のデータを用いた.築造体の長さ,太さに関して主に築造形態に関して検討し,牛根とヒト歯根のモデル間の比較を行った.さらに,牛根及びヒト抜去歯を用いた破壊試験を行うために,従来型FRC(ガラス繊維+コンポジットレジン),及び単一構造型FRC(ショートファイバーペーストを用いてCAD/CAMシステム上で築造体の製作方法の検討及び試作を開始した.各材料の機械的性質を確認及び築造体と象牙質との引っ張り強さ試験を行った.試料製作に関して,苦慮していおり,当初の予定より遅れているが,来年度以降に予定していたコア材料をCAD/CAMシステム上で削り出す方法に関して検討を行っている.牛歯やヒト抜去歯を使用した試験を行う前に,規格性のある材料での予備試験を現在検討している.今後は29年度に引き続き,築造体と象牙質との接着引張り強さ試験の実施,築造体の製作,さらには有限要素のモデリングを確実な方法で行えるよう,手法を確立し,実験を進めていく予定である.モデリング方法に関しては,マイクロCTで撮影したDICOMデータを,ソフトウェアMimicsを用いて三次元有限要素解析ソフトANSYS上に読み込み失活歯をモデリングする事を検討している.また,規格性のある材料での予備試験後に,牛歯あるいはヒト抜去歯での実験に移行していく予定である.今後は29年度に引き続き,築造体と象牙質との接着引張り強さ試験の実施,築造体の製作,さらには有限要素のモデリングを確実な方法で行えるよう,手法を確立し,実験を進めていく予定である.モデリング方法に関しては,マイクロCTで撮影したDICOMデータを,ソフトウェアMimicsを用いて三次元有限要素解析ソフトANSYS上に読み込み失活歯をモデリングする事を検討している.また,規格性のある材料での予備試験後に,牛歯あるいはヒト抜去歯での実験に移行していく予定である.平成29年度は,有限要素解析を中心に研究を行ってきたが,当初予算に挙げていた材料費に関しては,主に既存の試料を用いた材料試験が中心であったため,材料試験製作用の備品を購入したものの,新たな接着試験まで至らなかったため,予算を控える形となった.次年度に本年度行うべきであった実験が実施される予定であるため,引き続き材料,消耗品等の購入に用いる予定である.また,来年度以降のデータ収集および学会での成果発表(日本補綴歯科学会,歯科理工学会,IADR)を予定している.平成30年度は,有限要素解析を中心に研究を行ってきたが,当初予算に挙げていた材料費に関しては,主に既存の試料を用いた材料試験が中心であったため,材料試験製作用の備品を購入したものの,新たな接着試験まで至らなかったため,予算を控える形となった.次年度に本年度行うべきであった実験が実施される予定であるため,引き続き材料,消耗品等の購入に用いる予定である.また,来年度以降のデータ収集および学会での成果発表(日本補綴歯科学会,歯科理工学会,IADR)を予定している.
オプティカルフローに基づく自動車走行速度知覚の解明及び予測モデルの構築

若齢運転者および高齢運転者におけるオプティカルフローに基づく自動車走行速度知覚の解明およびその予測モデルの構築を目的とし,本年度では若齢者においてオプティカルフローに基づく移動速度知覚の心理物理実験に取り組んだ。具体的には,1オプティカルフローに含まれる奥行き運動手がかりが自己運動知覚(ベクション)に及ぼす影響,2オプティカルフローの色彩がベクションに及ぼす影響に関する研究に取組んだ。テーマ1については,利用可能な奥行き運動手がかり(物体のサイズ変化および両眼視差変化)が増えるほど,ベクションが強くなり,また身体移動速度評定値も大きくなることが明らかとなった。一方,奥行運動手がかりの増大は,奥行運動印象や空間の奥行き知覚,物体までの距離知覚も増大させることも明らかになった。これらの指標間での相関解析を行ったところ,ベクションや身体移動速度評定値が特に奥行運動印象と関連していることが明らかとなった。テーマ2については,複数の色ドットで構成されたオプティカルフローを用いた場合,無彩色ドットで構成されたオプティカルフローを用いた場合に比べて,ベクションが強くなり,また知覚される身体移動速度も速くなることが明らかになった。また単色で構成されたオプティカルフローを用いた場合でも,特に青色のドットでオプティカルフローが構成された場合に,ベクションが強くなり,また知覚される身体移動速度も速くなることも明らかとなった。1の成果は国際誌に掲載され,2については現在論文投稿の準備を進めている。本年度は高齢者の実験を進める予定であったが,大学業務のため,高齢者実験に着手することができなかった。ただし,実験系がすでに確立している若齢者による実験をさらに進めることができたこと,また得られた研究成果が論文として掲載されたことから,研究全体としては十分に進めることができたと考えられる。これまでの実験手法を用いて高齢者の実験に取り組み,走行速度知覚のモデル化に必要なデータの収集に努める。また疑似白内障ゴーグル等の高齢者の視覚特性を模擬する装置を用いた実験を行い,多角的に高齢者の走行速度知覚特性のデータを収集する。最終的には得られたデータを用いてモデルを構築する。若齢運転者および高齢運転者におけるオプティカルフローに基づく自動車走行速度知覚の解明およびその予測モデルの構築を目的とし、本年度では若齢者においてオプティカルフローに基づく移動速度知覚や物体運動知覚の心理物理実験に取り組んだ。具体的には、1オプティカルフローに含まれる奥行き運動手がかりが自己運動知覚(ベクション)に及ぼす影響、2オプティカルフローの色彩がベクションに及ぼす影響、3重心動揺計測とベクションとの関係、4上下方向に移動する際に生じるオプティカルフロー内を移動する視覚物体の錯覚的な運動知覚(誘導運動)とその物体への運動行動(ポインティング)との乖離現象に関する研究に取組んだ。1については、利用可能な奥行き運動手がかりが増えるほどベクションが強くなり、身体移動速度評定値が大きくなることが明らかになった。2については、単色・複色に関わらず有彩色オプティカルフローは、無彩色オプティカルフローに比べて、ベクションが強くなり、また知覚される身体移動速度を上昇させることが明らかになった。3については、足の可動範囲を基に重心の変動を補正することでベクションの強さと対応することが明らかとなり、身体移動速度知覚の客観的指標となる可能性を示唆する。4については、特定のスポーツ競技(テニス)の熟練は誘導運動を大きく知覚する一方で、ポインティングによってその物体の位置を回答する場合には、錯覚が生じないこと、すなわち、知覚と運動の乖離が生じることを明らかにした。3の成果を除き、研究成果については、国内外の学会において発表し、研究の精緻化に努めた。また、1の成果については、現在、国際誌に論文を投稿している。本年度では、予定したとおり、走行速度知覚に影響する要因の基礎的研究および重心動揺計による客観的指標の開発に取り組むことができた。また、いくつかの成果については学会発表のみならず、論文として執筆し、投稿またはその準備の段階まで進めることができた。

ただし,実験系がすでに確立している若齢者による実験をさらに進めることができたこと,また得られた研究成果が論文として掲載されたことから,研究全体としては十分に進めることができたと考えられる。本年度の知見に基づき、次年度以降では高齢者の実験にも取り組み、走行速度知覚のモデル化に必要なデータの収集に努める。これに並行し、論文の執筆や学会発表などにも取り組み、成果の公表に努める。これまでの実験手法を用いて高齢者の実験に取り組み,走行速度知覚のモデル化に必要なデータの収集に努める。また疑似白内障ゴーグル等の高齢者の視覚特性を模擬する装置を用いた実験を行い,多角的に高齢者の走行速度知覚特性のデータを収集する。最終的には得られたデータを用いてモデルを構築する。学内業務などにより予定していた学会に参加が困難となったなどの理由から、次年度への繰り越しが生じてしまった。次年度では早期の段階で学会と学内業務のスケジュールを確認し、計画的に使用する。次年度使用については,国際学会参加等の際の英文校正費用として使用する。
ナノイオン交換リソグラフィ法の開発と応用

ガラスの表面および表面近傍内部にナノメートルオーダーの屈折率分布および構造体を形成する「ナノイオン交換リソグラフィ法」の開発を行った。本手法に最適な新ガラス組成を開発し、ナノメートルオーダーのリソグラフを可能とするNH^+_4/Ag^+/Na^+を複層ガラスの作製に成功した。このガラスを用い、ガラス内部のコア層よりAgイオンを表面に引き出し、最小線幅270nmのAg細線を正確に描画することに成功し、メタマテリアル素子へ応用展開ができることを確認した。ナノイオン交換法に適した温度特性および電気伝導特性を有するソーダアルミノボロシリケートガラスの組成設計を行い、溶融急冷法により均一なガラス基板を作製した。この基板材料に、銀イオンを含む層をコアとした埋め込み型光導波路をフォトリソグラフィー法およびイオン交換法により形成した。このとき、表面のクラッド層の厚みを1μm以下となるように制御した。この光導波路の表面クラッド層の上面に対して、導電性加工を施したAFMを電極としてナノイオン交換処理を実施し、コア部に銀イオンをガラス表面に引き出す操作を実施した。接触時間と処理時の電流値を制御することで電気量(処理イオン量)を変化させ、ナノイオン交換処理を施した異なるサイズのドット形成した。導波路に対して波長可変レーザー光を導入して光を導波路に伝搬させ、形成したイオン交換部を観察したところ、光導波路を伝搬していたレーザー光の一部が処理ドット部から出射することを確認した。その光の出射の有無は、ナノイオン交換電荷量と光の波長によって決定されていることを明らかにした。これにより,ナノイオン交換法によって埋め込み型光導波路へ光の出入口として機能する開口部を形成できることを示すことに成功した。また、イオン交換中にAFMプローブを動かすことにより、イオン交換処理が施される領域を変え、微細な交換パターンを描くことができることを示し、ナノイオン交換リソグラフィーとしての可能性を示すことに成功した。前年度までに決定したナノイオン交換法に適した温度特性および電気伝導特性を有するソーダアルミノボロシリケートガラスのガラス基板を作製し、この基板材料に銀イオンを含む層をコアとした埋め込み型光導波路を形成した。このとき、表面のクラッド層の厚みを0.58μmとなるように制御したが、この際、従来法とは異なりアルカリイオンを全く含まない均質なクラッド層の形成方法を新たに開発した。この方法の開発により、AFM尖端を常に尖鋭な状態に保つことが保障され、より精細なナノメートルオーダーのイオン交換リソグラフィを実現できると期待できる。この光導波路の表面クラッド層に対して、導電性加工を施したAFMを電極としてナノイオン交換リソグラフィ処理により直径20および5μmの真円弧の作製を行った。ナノイオン交換リソグラフィにより形成された円弧は光学顕微鏡により明瞭に確認され、円弧の線幅は500nm以下となっていることが確認された。このことは、従来までの手法に比べて細い細線の形成が可能になったことを示し、新規に開発したアルカリイオンを含まないクラッド層の形成法がリソグラフィの高精細化に効果的に働いたことを裏付けた。以上の成果により、光の波長よりも小さな構造体の作製が原理及び実際上も可能であることを実証され、ナノ構造体の形成による微細パターンを描くナノイオン交換リソグラフィの実現を実証することができた。本研究は、申請者が新しく開発したナノイオン交換リソグラフィ法を技術として確立し、ガラスを中心とした透明材料の内部および表面にナノメートルレベルの構造体を構築し、近接場光を中心とした光素子の作製方法に関する調査とその応用について明らかにするために行われた。具体的には、高精度のピエゾステージを用いて、導電性AFMプローブチップを高温にある試料表面上でコンピュータ制御により走査することを可能とし、ナノイオン交換過程での電圧や電流等のリソグラフィ条件と作製される構造体との関係を明らかにすること、また作製された構造体のキャラクタリゼーションを行った。まず、ナノメーターレベルの微細構造の構築を可能とするためのガラスの複層構造の作製に必要な条件を明らかにし、適切な溶融塩を用いることでナノレベルの微細な加工を持続させることが可能となることを示した。また、ピエゾ素子のコンピュータ制御により、設計通りのカンチレバー走査を実現でき、イオン交換過程での電流変化と構築される構造体の関係を考察した。ガラス表面への微細なAg細線の作製では、これまで0.8μm程度の微細なものしか作製できなかったが、最小線幅270nmと約1/3の微細化を達成した。作製されたAg細線のキャラクタリゼーションから、金属細線のプラズモニクス素子への応用に際しては細線の成長挙動の理解と制御、細線の導電性の制御が重要であり、素子の高度化をはかる上で更なる研究が必要であることがわかった。
小胞体シャペロンのbeta-アミロイド産生に対する効果

アルツハイマー病は原因タンパク質であるアミロイドβ(Aβ)の神経機能障害作用により発症すると考えられている。我々は、このAβの産生に対する小胞体シャペロンの効果を調べた。代表的な小胞体シャペロンであるGlucose-regulated protein(GRP)78を過剰発現するとAβ産生が抑制された。さらにGRP78のコシャペロンであるERdj3,ERdj4をGRP78と共発現すると、GRP78のAβ産生抑制効果が促進された。また種々の小胞体シャペロンのAβ産生に対する効果を調べた結果、150-kDa oxygen-regulated proteinはAβ40,42の産生をともに抑制し、calnexinはAβ42産生のみ抑制した。一方、GRP94とcalreticutinはAβ40,42の産生を抑制しなかった。GRP78によるAβ産生抑制の分子機構を解析した結果、GRP78はAPP(Aβの前駆体タンパク質)と相互作用することでAPPの成熟を阻害することが分かった。また、その結果APPのβ-,α-セクレターゼによる切断反応が低下し、Aβ産生が抑制されることを見出した。Aβの小胞体シャペロンの発現に対する効果を調べた結果、Aβは小胞体ストレス応答を介し、小胞体シャペロンを誘導することを示した。またAPP過剰発現マウスにおいて小胞体シャペロンの発現が亢進していたことから、Aβはin vivoにおいても小胞体シャペロンを誘導することが示唆された。以上の結果から、細胞はAβによる毒性から自身を守るため、小胞体シャペロンを誘導し、Aβ産生を抑制していると考えられる。小胞体シャペロン誘導剤は、Aβ産生を抑制することでアルツハイマー病の発症・進行を抑制することが期待できる。
エピジェネティクスによる糖・脂質代謝制御の解明

DNAのメチル化やヒストン翻訳後修飾といったエピジェネティクスによる脂質代謝疾患の制御機構は不明な点が多い。KDM6A/Utxはジメチル化・トリメチル化ヒストンH3K27 (H3K27me2/me3)を基質とするヒストン脱メチル化酵素であり、脂肪分化段階依存的に脂肪分化を制御することが報告されている。われわれは成熟脂肪細胞のUtxの機能に着目し、脂肪細胞特異的Utx欠損マウス(Utx cKOマウス)の解析を行った。Utx cKOマウスは高脂肪食負荷で対照群に比べて体重が減少し、脂肪組織が縮小することを見出した。脂肪肝やインスリン抵抗性の進行が抑制されていた。網羅的遺伝子発現解析により、Utx cKOマウスの白色脂肪組織ではコレステロール・エストロゲン合成に関連する遺伝子発現が亢進していることが分かった。トリアシルグリセロール合成に関連する遺伝子発現は低下していた。そこで卵巣由来のエストロゲンを取り除くために卵巣摘出を行ったところ、Utx cKOマウスでは同様に高脂肪食負荷による肥満が抑制された。Utx cKOマウスの内臓脂肪におけるエストロゲンの濃度は対照群に比べて上昇していた。Utx欠失白色脂肪細胞における局所的なエストロゲン産生亢進が、高脂肪食による肥満の抑制に寄与していることが示唆された。以上の結果より、白色脂肪細胞におけるUtxが脂質代謝を制御し、肥満およびメタボリック症候群に関連することを明らかにした。Utxを介したエピゲノム制御が代謝疾患の治療標的となる可能性を示し、新規予防法・治療法開発への分子基盤を確立することができた。
Runx2による骨におけるI型コラーゲン遺伝子発現制御機構の解明

I型コラーゲンは、骨の有機基質の90%以上を占める主要なタンパク質であり、2本のα1鎖と1本のα2鎖が3重コイルをつくる。α1鎖はCol1a1遺伝子、α2鎖はCol1a2遺伝子によってコードされている。Col1a1遺伝子では、転写開始点上流2.3 kbが骨芽細胞でのCol1a1発現制御領域であることが明らかにされている。我々は、GFPとCreの融合タンパク質を発現する、2.3 kb Col1a1プロモーターGFP-Creトランスジェニック(tg)マウスを独自に作製した。このマウスを野生型マウスと交配すると、3段階の発現レベルのtgマウスが得られた。さらに、これらのtgマウスをRunx2fl/flマウスと交配し、Runx2fl/flCreマウスを作製すると、tgマウスの発現レベルに応じて、軽度及び強度の骨量及びCol1a1 mRNAの減少が認められた。しかし、高発現GFP-Creが挿入されたRunx2fl/flCreマウスのGFP-Creの発現レベルは低値であった。これは、Runx2欠失によりCol1a1プロモーター活性が低下、GFP-Cre発現低下につながったと考えられた。すなわち、Runx2により、2.3 kb Col1a1プロモーター活性が制御される可能性が強く示唆された。tgマウスのトランスジーンの挿入部位は14番染色体で1カ所であったが、多コピーが挿入されており、欠失が起こることにより、1系統のマウスから発現レベルの異なる3系統のマウスが出現したことがわかった。交配を続けることにより発現レベルの高い安定したGFP-Cre発現を示すtgマウスの系統を樹立することができた。2.3 kb Col1a1プロモーターを順次欠失させたレポーターアッセイで、Runx2による発現増強に必要な領域を特定した。2.3 kb Col1a1プロモーターGFP-Creマウスの全ゲノム塩基配列を決定、トランスジーンの挿入部位を決定したが、挿入部位は14番染色体の1カ所であった。したがって、全ゲノム塩基配列からでは、1系統のマウスから発現レベルの異なる3系統のマウスが出現した理由を解明することはできなかった。そこで、絶対定量PCRを行い、トランスジーンの各領域のコピー数を定量した。3系統のマウス間で、トランスジーンの各領域のコピー数が異なり、染色体上で欠失が起こり、発現レベルの差を生じていることが明らかとなった。Runx2抗体を用いたChIPシークエンスで、2.3 kb Col1a1プロモーター領域でRunx2が結合する配列を網羅した。次にこのうち3箇所の配列に変異を導入したDNA断片を作成、CRISPR/Cas9システムでゲノムDNAと組み替え、変異を導入したマウスを作製した。しかし、ヘテロ変異でもCol1a1発現は低下せず、ホモ変異では胎生早期に致死となった。解析の結果、これはランダムインテグレーションによって変異DNAが挿入され、挿入部位の遺伝子を破壊に起因する表現型であることがわかった。そこで、in vitroのレポーターアッセイでRunx2による転写活性化に必要な部位を特定してから、マウスに変異を導入することにした。変異を入れた1kb程度のDNAをゲノムDNAと置換させるのは、CRISPR/Cas9システムでも効率が低かった。そのため、すべての変異をin vivoで導入して、最終的にRunx2による活性化に必要な配列を同定するのは効率が悪いことがわかった。そこで、レポーターアッセイを工夫した結果、C2C12細胞を用いてレポーター活性を検出できることがわかった。そのため、レポーターアッセイで変異を入れる配列を選定したのちに、in vivoで変異DNAとゲノムDNAを置換させることにした。このRunx2による発現増強に必要な領域をカバーする3種類のオリゴを作製、EMSAを行い、Runx2が結合するか検討し、結合するオリゴに変異を導入することにより最終的にRunx2結合配列を決定する。さらに、変異を導入したレポーターアッセイも行いRunx2による転写活性化に必要な配列を決定する。決定した配列に変異を導入したDNAを合成、その両端のガイドRNAを作製、CRISPR/Cas9のシステムで、変異を導入したDNAをゲノムDNAと置換する。この方法により、効率良くin vivoでRunx2による転写活性化を証明する。

しかし、高発現GFP-Creが挿入されたRunx2fl/flCreマウスのGFP-Creの発現レベルは低値であった。これは、Runx2欠失によりCol1a1プロモーター活性が低下、GFP-Cre発現低下につながったと考えられた。すなわち、Runx2により、2.3 kb Col1a1プロモーター活性が制御される可能性が強く示唆された。tgマウスのトランスジーンの挿入部位は14番染色体で1カ所であったが、多コピーが挿入されており、欠失が起こることにより、1系統のマウスから発現レベルの異なる3系統のマウスが出現したことがわかった。交配を続けることにより発現レベルの高い安定したGFP-Cre発現を示すtgマウスの系統を樹立することができた。2.3 kb Col1a1プロモーターを順次欠失させたレポーターアッセイで、Runx2による発現増強に必要な領域を特定した。2.3 kb Col1a1プロモーターGFP-Creマウスの全ゲノム塩基配列を決定、トランスジーンの挿入部位を決定したが、挿入部位は14番染色体の1カ所であった。したがって、全ゲノム塩基配列からでは、1系統のマウスから発現レベルの異なる3系統のマウスが出現した理由を解明することはできなかった。そこで、絶対定量PCRを行い、トランスジーンの各領域のコピー数を定量した。3系統のマウス間で、トランスジーンの各領域のコピー数が異なり、染色体上で欠失が起こり、発現レベルの差を生じていることが明らかとなった。Runx2抗体を用いたChIPシークエンスで、2.3 kb Col1a1プロモーター領域でRunx2が結合する配列を網羅した。次にこのうち3箇所の配列に変異を導入したDNA断片を作成、CRISPR/Cas9システムでゲノムDNAと組み替え、変異を導入したマウスを作製した。しかし、ヘテロ変異でもCol1a1発現は低下せず、ホモ変異では胎生早期に致死となった。解析の結果、これはランダムインテグレーションによって変異DNAが挿入され、挿入部位の遺伝子を破壊に起因する表現型であることがわかった。そこで、in vitroのレポーターアッセイでRunx2による転写活性化に必要な部位を特定してから、マウスに変異を導入することにした。変異を入れた1kb程度のDNAをゲノムDNAと置換させるのは、CRISPR/Cas9システムでも効率が低かった。そのため、すべての変異をin vivoで導入して、最終的にRunx2による活性化に必要な配列を同定するのは効率が悪いことがわかった。そこで、レポーターアッセイを工夫した結果、C2C12細胞を用いてレポーター活性を検出できることがわかった。
物理化学システムにおける自律運動と複雑さの起源の理解を目指して

化学反応からみた生命の起源、進化の理論、環境の影響ということについて、深く研究が進行し大変有益であった。具体的には、1)大域的なフィードバックが環境からある場合の小さな自己触媒反応系を計算し、いくつかの条件ではむしろパラサイト的な反応がないと全部死に絶えることがわかった。2)ペプチドモデルにおいてモノマー同志は結合できないという制約のもとで、自己触媒性が出現する化学反応ネットワークの条件を提出できた。これはALIFE国際会議2014でのベストペーパーとなった。この他にも、HCN分子の重合に関する化学実験を行い、プリミティブな結果を得た。これはミュラー・ウーリの実験のミニマル版である。26年度が最終年度であるため、記入しない。H24年12月からH25年4月の繰越金について以下のことを報告する。1) H24年12月には、北大で複雑系に関する研究会が開かれ、Nathanielはそこに参加し、有意義な議論を行うことができた。特にこの研究会では、Lee Cronin (Glasgow大)との有意義な議論が行えた。具体的には、システマティックに進化システムを実験的に創りだすにはどうすればいいか、自律運動を行う油滴の次世代の実験システムをどう作ればいいか、について突っ込んだ議論を行った。われわれの研究はおもにコンピュータ上のシミュレーションに関するものであるが、これをLeeたちのような実際の実験システムで行っていくグループと共同できることは望ましい。2) H25年度4月には、シンガポールで行われたIEEEの人工生命の国際会議に応募、口頭発表に採択され、フィードバックが入ったシステムでの自律運動の実験について報告した。これは、一連の研究のひとつの成果となる。ここで発表することで、人工生命に関する研究を行っている様々な研究者にこの生命システムの自律的運動と、大域的フィードバックループをつなげて議論するということを知らしめる事ができた。ポスドクのNathaniel Virgoの研究テーマは、化学反応からみた生命の起源、進化の理論、環境の影響ということであり、これについて深く議論し大変有益であった。具体的には、彼が研究室に来日する前から一緒に共同研究していた、化学反応のシミュレーションを用いた「動く油滴」の進化的役割などについて議論し、それを発表した。また、エントロピー生成率増大化原理について議論をすすめ、MaxEnt2013で口頭発表した。より具体的には以下のような成果をあげることができた。1)複雑な自己触媒ネットワークの進化:これは、熱力学的に可逆な性質を持ったペプチド重合反応システムのモデルを用いて、モノマーからどのように自己触媒ネットワークが進化するかをシミュレーション実験した。ここでは、そうした自己触媒ネットワークが出現する条件を数学的に調べ、またモノマー同志の重合を禁止することで、指数関数よりも高速に自己触媒システムが進化することを示した。2)実際の化学実験を用いた自己触媒性の進化:東大総合文化の豊田太郎氏と、University of TrentoのMartin Hanczycの協力を得て、水酸化シアンの高分子を調べ、そこに自己触媒性が出現するかどうかを調べた。3)大域的なフィードバックを用いた化学反応システムの性質:Grey Scottらによって最初に主張された化学反応システムの入ったリアクターのコンピュータ・シミュレーションを行なう。このリアクターに外から入ってくるエサとなる化学物質の量が内部の状態で変化するとき、どのような状態変化が起きるかを調べた。4)エントロピー生成率最大化原理と情報理論:遠く平衡から離れたシステムの性質は、エントロピー生成率最大化を原理とするかもしれない。そのことを理論的にいろいろと考察した。シンガポールでのIEEEの国際会議で、日本にきてから議論した論文を口頭発表できたこと、またECAL2013やオーストラリアでのMaxEnt(エントロピー最大化に関する会議)では、さらにそれぞれ進めた研究に関し、口頭発表できた。今後、研究課題を国際ジャーナルの方に投稿していくこと、また生命の起源問題に関する研究に着手する予定である。期待したとおりの成果があがっている。IEEEの国際会議で発表を行うことが出来たから。今後、実際の化学実験として、実現させていく予定である。これは、東大大学院総合文化の豊田太郎研究室と実質的に共同研究という形でおこなっていく。また、H26年度は海外からの研究者も招いて、進化のダイナミクスとしての新規性について議論を進める。
臨床応用をめざした心停止ドナーからの肝移植の研究;臓器保存法の工夫

【目的】ショック状態持続後心停止ドナーからの肝移植における、単純冷却保存法と低温持続灌流保存法との比較、低温持続灌流保存法における動脈と門脈からの灌流の比較、低温持続灌流保存法における拍動流と非拍動流の比較、およびpentoxifylline (POF)の有効性について検討した。【対象と方法】体重約25kgのブタを用いて同所性肝移植を施行。ドナーは脱血量を調節し収縮期圧60mmHgを60分続けた後に心停止させ肝臓を摘出し、以下の6群に分けて2時間保存した。II群:門脈から8mmHgで灌流した非拍動型低温持続灌流保存III群:肝動脈から60mmHgで灌流した非拍動型低温持続灌流保存V群:肝動脈から30mmHgで灌流した非拍動型低温持続灌流保存VI群:肝動脈から30mmHgで灌流した拍動型低温持続灌流保存それぞれの保存の後、同種肝移植を行い、血流再開4時間後の採血にて、AST,LDH,ビアルロン酸(HRA),動脈血ケトン体比(AKBR)の測定、48時間以上の生存率、組織学的検討、灌流保存群における灌流条件の観察と灌流液内への逸脱酵素の測定をおこない比較検討した。【結果】低血圧負荷後心停止させたドナーから摘出した肝を単純浸漬保存あるいは低温持続灌流保存した後に移植した。単純浸漬保存よりも低温持続灌流保存が良好であり、門脈からではなく動脈から非拍動流による灌流保存がより有効であった。肝動脈からの灌流保存では60mmHgよりも30mmHgで灌流したほうが成績がよかった。非拍動流と非拍動流の比較では拍動流のほうが良好な結果を得た。またPOFの添加がグラフトコンディショニングの面から有効であることが示唆された。実験動物をラットに代えて、以下実験を行った。【実験1】Wistar系雄性ラット(体重200260g)をペントバルビタール(50mg/kg)で麻酔後、以下の群に分けて肝組織を採集し、ATP測定および組織標本を作成した。1-II心停止後5分間の温阻血を加えた後に肝摘出1-III心停止後10分間の温阻血を加えた後に肝摘出1-IV心停止後30分間の温阻血を加えた後に肝摘出1-V心停止後60分間の温阻血を加えた後に肝摘出各郡n=3,心停止前にヘパリン化を行った現在上記の実験を終了し、結果報告を待っている。今後これらの結果より、心停止後温阻血時間を設定し、以下の2つの実験を施行する。【実験2】ラットを麻酔下に開腹し門脈にカニュレーションした後、心停止,温阻血負荷を加え肝摘出。摘出肝を門脈より灌流し、灌流保存液UW-Gluconate液,門脈灌流圧3cmH_2O,保存時間2時間の条件のもと、以下の群に分けて実験を行う。2-I灌流保存液4°C2-II灌流保存液8°C2-III灌流保存液20°C2-IV灌流保存液40°C各郡n=5,各群ともに保存液内AST,ALT,LDH,ヒアルロン酸,組織ATPを測定し、組織学的検討を行う。【実験3】実験2より得られた指摘温度において以下の郡に分けて実験を行う。3-I

灌流保存時間6時間3-II灌流保存時間12時間3-III灌流保存時間24時間3-IV灌流保存時間48時間各郡n=5,各群ともに保存液内AST,ALT,LDH,ヒアルロン酸,組織ATPを測定し、組織学的検討を行う。【実験1】Wistar系雄性ラットをペントバルビタールで麻酔後、以下の群に分けて肝組織を採集し、ATP測定および組織標本を作成した。各群n=3,心停止前にヘパリン化を行った。1-IV心停止後30分間の温阻血。1-V心停止後60分間の温阻血。この結果より、心停止後温阻血時間を30分間と設定し、以下の2つの実験を施行した【実験2】ラットを麻酔下に開腹し門脈にカニュレーションした後、心停止,温阻血負荷を加え肝摘出。摘出肝を門脈より灌流し、灌流保存液UW-Gluconate液,門脈灌流圧3cmH_2O,保存時間2時間の条件のもと、以下の群に分けて実験を行った。各群(n=5)ともに保存液内AST, ALT, LDH,ヒアルロン酸,組織ATPを測定し、組織学的検討を行った。2-I灌流保存液4°C。2-II灌流保存液8°C。2-III灌流保存液20°C。2-IV灌流保存液40°C。
周術期における医薬品管理モニタリングツールの開発

【目的】近年、観血的医療行為のために手術前に中止、手術後に再開を忘れた事例が報告され、大きく取り上げられている。手術目的で入院する患者には、入院前から使用している薬剤を持参するため、患者の使用薬剤から周術期に注意が必要な医薬品を正確に抽出し、手術前の使用中止や手術後の再開指導といった業務を完遂することは、薬剤師の職務として重要である。しかしこの情報収集は、大きな労力を伴う業務となっていた。そこで、手術患者における周術期に注意が必要な医薬品を把握するために、簡便かつ短時間で必要な情報の検索、抽出や情報の共有化が可能なスクリプト(プログラム)を付加した管理ツールを構築した。この管理ツール導入による効果を検証する。【方法】徳島大学病院の手術患者を対象とし、周術期に注意が必要な薬剤の抽出に、電子カルテからのデータの抽出が可能なDWH(データウェアハウス)を用い、抽出したデータはデータベースソフトのファイルメーカーProに取り込んだ。【結果・考察】作成した管理ツールを用いた結果、手術患者の医薬品の中止時期である旨を表示するアラートなどを病棟薬剤師に通知ができ、情報収集が簡便になった。さらに病棟薬剤師はこれを利用し、医師に対して医薬品の中止時期などの情報提供を行うことができるようになった。また、管理ツール導入前で一か月当たりの業務時間は約4時間、導入後で2時間であり、導入後における業務時間が大きく短縮された。このことから、今まで薬剤師が患者個々に周術期における医薬品管理モニタリングしていた作業が、薬剤師の経験年数やスキルに問わず、一元化して業務を行うことができるようになった。医療従事者との連携や情報の共有が可能となり、医薬品の適正使用に寄与できると考えられる。
ドイツの地理教育における「人間-環境システム論」を導入したESD教材開発

ドイツにおけるPISA以降の教育改革(主に教育スタンダード)とESDの展開という二つの文脈を視野に入れながら、教育の質的向上とESDとがクロスするところに位置する人間-環境システムの重要性を明らかにした(「教員養成スタンダードと学会版教員養成ガイドラインからみた現代ドイツにおける地理教員像」)。ドイツの地理教育においては伝統的な人間と自然の関係性についての考え方が、1950年代以降のドイツ地理教育界において、人間-空間相互関係から人間-環境システムへと変容する過程を書誌学的に明らかにしつつ、それが現代の地理教育スタンダードにおいては地理学的専門コンピテンシーの中核に位置づけられていることを明らかにした(ドイツの地理教育における「システム」論-人間-空間相互関係から人間-環境システムへ-)。こうした能力を育むためにドイツの高等教育機関が行っている地理学専門教育およびESD教員養成について明らかにした(「持続可能性」へと向うドイツの大学の地理学と地理教育)。以上の研究成果に基づき、東京とベルリンを学習対象とし、「人間-環境システム」を用いたESD教材開発を行った。本研究の目的は、日本のESD(持続可能な発展のための教育)の教育実践を活性化させるために、ESD先進国であるドイツの地理教育に注目し、その理論および実践の分析を通じて、ドイツの現状と課題を明らかにすること、そして日本の地理教育におけるESDへの批判的示唆を得ることである。2011年度は、日本での文献収集および教育実践に関するヒアリング調査に加え、ドイツでの現地調査(2011年9月)を実施した。ドイツでは各種図書館における資料収集にあたるとともに、ハイデルベルク大学やベルリン自由大学の研究者を訪問し、ドイツの地理学および地理教育の史的展開と課題についてヒアリング調査を行った。その結果、1)ドイツでは地理教育に対して学会が与える影響が大きく、かつ近年はドイツ地理学会が教育スタンダード、教員養成ガイドラインを通じて地理教育に積極的に関与していること、2)「人間-環境システム」を地理教育の概念として中心に位置づけられていること、3)本システムは、自然地理と人文地理の観点に基づいた分析と、地理学としての統合というアプローチが用いられる学習理論であること、4)戦前のA.ヘットナーの地誌学スキームに基づく地誌学習から、1970年代の系統地理学習への転換に際して、システム学習として理論を発達させてきたという背景を持っていることが明らかになった。また、ドイツの抱える課題としては、システム学習理論の展開が不十分であることが挙げられるが、現在、教育心理学との協働を通じて、より実践的な学習理論の構築を目指している。日本の地理教育に対して、学会の地理教育への姿勢、自然地理と人文地理に対する分析と総合という視点、人間-環境システム論の導入による科目横断的アプローチを用いたESDの促進といった点が示唆された。本研究の目的は、教育の国際的潮流であるESD(持続可能な発展のための教育)と地理教育の可能性を探るため、ESD先進国であるドイツのESD地理教育を究明することである。2012年度は、ESDに関する文献調査および教育実践に関するヒアリング調査を日本国内で行うとともに、ドイツにおける文献調査、教育実践見学、学校教員へのヒアリング、研究者との意見交換を行った(2012年8月実施)。2011年度の研究に基づき、2012年度は主にシステム学習理論に着目して研究を進めた。特にESDにおける地理教育の役割と位置付けに関する研究において、システムという概念は大きな役割を果たしていた。先行研究から重要だと判断されたESDにおけるシステム思考と、地理教育における人間ー環境システムを取り上げ、それらの特徴および両者の結節点について研究を進めた。前者については、キール大学の研究を追い、システムという概念を操る能力をシステムコンピテンシーとして開発が進められていた。後者に関しては、当該概念の歴史的変遷からその意義について明らかにした(紀要別冊に掲載)。ドイツでは近年、両者を結びつけた地理システムコンピテンシーの研究が盛んに行われており、そうしたドイツ地理教育研究の動向をレビューした(論文執筆中)。日本型の「人間ー環境システム論」の展開については、日本の理科・社会科という教科構造に基づき、教科横断的なアプローチを採用し、副読本において「石灰岩と生活」のシステムについて分担執筆した(糸魚川副読本に掲載)。また、「持続可能性」についての高等教育機関レベルでの教育については、ベルリン大学およびアイヒシュテット大学のカリキュラムの分析から、概念的な理解は促進されるものの、行動へと結びつける点に関しては一部不明瞭な点も見られた(学術研究に掲載)。ドイツ研究出張において、各種図書館での文献収集、各大学での研究者のヒアリング調査によって本年度の目的を達成することができた。

また、国内の研究者や行政機関担当者との連携を通じ、研究を進めるための基盤を整備することができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。交付申請書に記載した研究計画に従い、2011年度に構築した研究基盤を基に教材開発を行う。
インテグリン生存シグナルの新規制御機構による悪性黒色腫のBRAF阻害剤耐性機構

悪性黒色腫は皮膚癌による死亡の80%を占め、約半数の症例ではBRAF遺伝子に活性化変異がある。そのため悪性黒色腫患者ではBRAF阻害剤が奏功するが、すぐに薬剤耐性が生じる。我々は、BRAF阻害剤耐性ヒト悪性黒色腫細胞株と感受性株の比較により、細胞外マトリックス受容体インテグリンシグナルに関わる分子の糖鎖修飾に顕著な差を示唆する予備的結果と、特定の脂質が耐性株の細胞膜に多いことを示唆する予備的結果を得ていた。本研究では、BRAF阻害剤耐性悪性黒色腫の薬剤耐性に、細胞表面糖鎖の改変、細胞膜脂質の改変を介したインテグリン生存シグナルの制御が重要であるとの仮説を検証する。平成29年度は感受性株で高発現し、耐性株では低発現するインテグリンシグナル関連因子としてCD63を同定し、その糖鎖修飾が両細胞株で異なっていることを明らかにした。平成30年度は、CD63の発現量がヒト悪性黒色腫細胞のBRAF阻害剤耐性と逆相関することを示し、CD63の過剰発現や発現抑制により、細胞の接着・生存が制御されることを示唆する結果を得た。加えて、CD63の糖鎖合成に関わる酵素の遺伝子発現レベルが耐性株で亢進していること、当該酵素遺伝子の導入や発現抑制により細胞膜でのCD63の局在が変化することを明らかにした。細胞表面CD63の強制発現が細胞増殖を低下させた結果と合わせ、阻害剤処理によるCD63の糖鎖構造変化がCD63を細胞膜に局在させ、悪性黒色腫の増殖を低下させうることを示した。耐性株と感受性株の細胞膜での量が異なることが示唆された脂質の定量系を構築した。以上の結果の一部を学会で発表し、論文(査読付き)を発表した。6種のヒト悪性黒色腫細胞におけるCD63の発現量とBRAF阻害剤存在下での細胞増殖解析から、CD63の発現量とBRAF阻害剤耐性能が逆相関することを示す結果を得た。BRAF阻害剤に比較的耐性を示す細胞におけるCD63の過剰発現により阻害剤感受性の亢進、逆に感受性の高い細胞でのCD63の発現抑制により阻害剤耐性の亢進を示す結果を得た。増殖コロニーの数や大きさなどから、CD63が細胞の接着・生存・増殖に影響することを示唆する結果を得た。加えて、CD63の糖鎖合成に関わる酵素の遺伝子発現レベルが感受性株にくらべ、耐性株で亢進していること、当該酵素遺伝子の発現により、CD63の細胞膜での局在が増加することを明らかにした。細胞膜タンパク質との融合体として強制的にCD63を細胞表面に発現する細胞の増殖が対照に比べ低下した結果と合わせ、阻害剤処理によるCD63の糖鎖構造変化がCD63を細胞膜に局在させ、悪性黒色腫の増殖を低下させうることを示した。耐性株と感受性株で細胞膜での量が異なることが示唆された脂質を、当該脂質結合タンパク質に基づくプローブを作成し、定量できる系を構築した。また、細胞応答における当該脂質の機能を探索するため、阻害試薬を構築した。以上のことより、実施計画と目標は概ね順調に達成できたと考える。耐性株と感受性株で細胞膜での量が異なることが示唆された脂質の機能を阻害する試薬を用い、細胞接着、遊走などインテグリンを介した細胞応答への影響、細胞増殖、薬剤耐性への影響を調べる。また、当該脂質の量を増減させる培養条件の検討、増減に関わる分子の探索や作成を行う。耐性株の薬剤耐性に対する糖鎖改変と当該脂質量改変の累積的効果を検討する。悪性黒色腫は皮膚癌が原因の死亡の80%を占め、日焼けが関連しない黒色腫の約半数の症例ではBRAF遺伝子に活性化変異がある。そのため悪性黒色腫患者ではBRAF阻害剤が奏功するが、すぐに薬剤耐性が生じる事が問題となっている。我々は、BRAF阻害剤耐性株と感受性株の比較により、細胞外マトリックス受容体インテグリンシグナルに関わる分子の糖鎖修飾に顕著な差を示唆する予備的結果と、特定の脂質が耐性株の細胞膜に多いことを示唆する予備的結果を得ていた。本研究では、BRAF阻害剤耐性悪性黒色腫の薬剤耐性に、細胞表面糖鎖の改変、細胞膜脂質の改変を介したインテグリン生存シグナルの制御が重要であるとの仮説を検証することを目的とする。本研究より、BRAF阻害剤耐性悪性黒色腫の新規標的の発見が期待でき、治療応用、阻害剤デリバリーを念頭にした創薬開発への基盤形成を目指す。平成29年度はBRAF阻害剤感受性株と耐性株で発現量が異なるインテグリンシグナル関連因子の分子特性解析を行った。天然型と糖鎖修飾変異体の解析と、レクチン染色により、感受性株と耐性株において当該分子の糖鎖修飾が変化することを明らかにした。感受性株に発現することで、薬剤処理下でのメラノーマ細胞の増殖がさらに低下することを見出した。耐性株と感受性株で、細胞膜での量が異なることが示唆された脂質を検出するプローブを作成し、その特異性を確認した。以上の結果の一部をポスターにより学会で発表した。BRAF阻害剤感受性株と耐性株でのインテグリンシグナル関連分子の分子特性の差異を解析した。耐性株で発現量が減少しており、感受性株と耐性株での分子サイズが異なる分子を同定した。タグ付き天然型と糖鎖修飾部位に変異をもつ変異体をコードするcDNAを作成した。これらを2種類のヒト

BRAF変異メラノーマ細胞に導入し、免疫沈降と糖鎖遊離酵素消化を用いて、感受性株の薬剤処理により糖鎖修飾が変化することを明らかにした。これらメラノーマ細胞の内在性分子の糖鎖構造が薬剤処理によって変化することを、レクチン固定化ゲルによるプルダウンとウエスタンブロット解析により明らかにした。これら分子の細胞内での局在を解析したところ、糖鎖修飾が分子の細胞膜局在に重要であることが明らかとなった。感受性株に発現することで、薬剤処理下でのメラノーマ細胞の増殖がさらに低下することを見出した。これらの結果の一部を関連学会でポスターによる発表を行った。予備的に耐性株の細胞膜で増加していると示唆された脂質を検出できるプローブを作成し、その特異性を確認した。以上のことより、実施計画と目標は概ね順調に達成できたと考える。悪性黒色腫は皮膚癌による死亡の80%を占め、約半数の症例ではBRAF遺伝子に活性化変異がある。そのため悪性黒色腫患者ではBRAF阻害剤が奏功するが、すぐに薬剤耐性が生じる。我々は、BRAF阻害剤耐性ヒト悪性黒色腫細胞株と感受性株の比較により、細胞外マトリックス受容体インテグリンシグナルに関わる分子の糖鎖修飾に顕著な差を示唆する予備的結果と、特定の脂質が耐性株の細胞膜に多いことを示唆する予備的結果を得ていた。本研究では、BRAF阻害剤耐性悪性黒色腫の薬剤耐性に、細胞表面糖鎖の改変、細胞膜脂質の改変を介したインテグリン生存シグナルの制御が重要であるとの仮説を検証する。平成29年度は感受性株で高発現し、耐性株では低発現するインテグリンシグナル関連因子としてCD63を同定し、その糖鎖修飾が両細胞株で異なっていることを明らかにした。平成30年度は、CD63の発現量がヒト悪性黒色腫細胞のBRAF阻害剤耐性と逆相関することを示し、CD63の過剰発現や発現抑制により、細胞の接着・生存が制御されることを示唆する結果を得た。加えて、CD63の糖鎖合成に関わる酵素の遺伝子発現レベルが耐性株で亢進していること、当該酵素遺伝子の導入や発現抑制により細胞膜でのCD63の局在が変化することを明らかにした。細胞表面CD63の強制発現が細胞増殖を低下させた結果と合わせ、阻害剤処理によるCD63の糖鎖構造変化がCD63を細胞膜に局在させ、悪性黒色腫の増殖を低下させうることを示した。耐性株と感受性株の細胞膜での量が異なることが示唆された脂質の定量系を構築した。以上の結果の一部を学会で発表し、論文(査読付き)を発表した。6種のヒト悪性黒色腫細胞におけるCD63の発現量とBRAF阻害剤存在下での細胞増殖解析から、CD63の発現量とBRAF阻害剤耐性能が逆相関することを示す結果を得た。BRAF阻害剤に比較的耐性を示す細胞におけるCD63の過剰発現により阻害剤感受性の亢進、逆に感受性の高い細胞でのCD63の発現抑制により阻害剤耐性の亢進を示す結果を得た。増殖コロニーの数や大きさなどから、CD63が細胞の接着・生存・増殖に影響することを示唆する結果を得た。加えて、CD63の糖鎖合成に関わる酵素の遺伝子発現レベルが感受性株にくらべ、耐性株で亢進していること、当該酵素遺伝子の発現により、CD63の細胞膜での局在が増加することを明らかにした。