hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
AI解析を用いたコロトコフ音波形による健康管理指標値の研究

血圧測定時に聞くことができるコロトコフ音は、最高・最低血圧を計測するためだけに現在使用されている。このコロトコフ音の波形自体には測定対象者の血管の粘弾性特性や血液の粘度、血流量という被験者側の身体的な要因が強く反映されていることが予想されるため、通常の血圧計測時にそのような健康に関するパラメータを同時に計測できる可能性が高いと考えられている。しかしながら、このコロトコフ音波形は個人差による変動が大きいために、その解析は容易では無いことから、実際に用いられることは困難であると思われていた。ところが、近年、急速に発展した人工知能(AI:Artificial Intelligence)いわゆるディープラーニング技術を活用すれば、複雑な音波形であっても分類解析が可能な状況になってきた。したがって、本研究ではコロトコフ音波形自体に対してAI解析手法を適用することにより、手軽に使える日常健康管理の健康指標値として確立できるかどうかを検討することを目的としている。解析に使用するデータとしては、近隣のデイケアセンターを利用する主として高齢者のコロトコフ音波形の取得を2009年以来、約10年間近く継続しており、延べ数百人に上る波形データの蓄積を行ってきている。まだ統計的には不十分なデータ量ではあるが、それでもAI解析を活用してコロトコフ音波形の分類が可能かどうかを検討する価値は十分にあると思われる。2018(平成30)年度は、高齢者のコロトコフ音波形の取得を継続しつつ、音波形データに対するAI解析の準備作業を実施した。具体的にはAI解析専用機の選定と購入、解析手順の試行および波形解析専門の研究スタッフの選定等である。ディープラーニング用のAI解析機や解析プログラムの進歩が非常に速いために、これらの準備作業には想定したよりも多くの時間を費やしており、ようやく解析準備が整ったという段階である。2018(平成30)年度は、年度前半にはAI解析専用機を導入して、蓄積された波形データに対して、従来行われてきた波形分類法(周波数スペクトルと加速度波形)と比較しながら、主として年齢的な要因に対する精度のみを検討する予定であった。しかしながら、実際には、AI解析専用機の選定と購入、解析手順の試行および波形解析専門の研究スタッフの選定等に想定よりも多くの時間が費やされてしまった。この理由はディープラーニング用のAI解析機や解析プログラムの進歩が非常に速いため、当初購入予定としていた機種が発売中止となっており、再度機種選定からやり直す必要があったためである。さらに機材導入までの間はGPUではなくCPUベースでのAI解析手法による解析を試みていたが、実際の解析時間よりもデータ加工等準備に時間がかかるために、AI解析手法に精通した波形解析専門の研究スタッフの配置が必要であることも新たに判明した。そのため、波形解析専門の研究スタッフの選定および確保に時間がかかってしまったことも大きな要因である。2019(令和元)年度は、前年度後半に導入されたAI解析専用機を用いて、蓄積された波形データに対して、主として年齢的な要因に対する精度の検討を行う。その際に、コロトコフ音波形のみによるAI解析では入力データにより、クラスタリング(分類)の精度が影響されてしまうことが予想される。そこで、従来行われきた波形分類法についても考慮に入れて、波形データそのものだけでなく、周波数スペクトルもしくは加速度波形のデータを追加した場合の検討を行う。データ量が増えることにより、解析のための準備時間が増大してしまう場合は、コロトコフ音の波形データのうち、一つの波形を切り出すことによりデータ量を削減する。これらの検討により、基本的な教師データを作成するための入力データを決定する。さらに、時間的に可能であれば、運動前後(平静時および運動後の経時変化)や食事前後(食前と食後、食べ物の種類)および症例別(脱臼歴、高血圧、不整脈)についても波形による分類が可能かどうかについての検討も行う。

ディープラーニング用のAI解析機や解析プログラムの進歩が非常に速いために、これらの準備作業には想定したよりも多くの時間を費やしており、ようやく解析準備が整ったという段階である。2018(平成30)年度は、年度前半にはAI解析専用機を導入して、蓄積された波形データに対して、従来行われてきた波形分類法(周波数スペクトルと加速度波形)と比較しながら、主として年齢的な要因に対する精度のみを検討する予定であった。しかしながら、実際には、AI解析専用機の選定と購入、解析手順の試行および波形解析専門の研究スタッフの選定等に想定よりも多くの時間が費やされてしまった。この理由はディープラーニング用のAI解析機や解析プログラムの進歩が非常に速いため、当初購入予定としていた機種が発売中止となっており、再度機種選定からやり直す必要があったためである。さらに機材導入までの間はGPUではなくCPUベースでのAI解析手法による解析を試みていたが、実際の解析時間よりもデータ加工等準備に時間がかかるために、AI解析手法に精通した波形解析専門の研究スタッフの配置が必要であることも新たに判明した。そのため、波形解析専門の研究スタッフの選定および確保に時間がかかってしまったことも大きな要因である。2019(令和元)年度は、前年度後半に導入されたAI解析専用機を用いて、蓄積された波形データに対して、主として年齢的な要因に対する精度の検討を行う。その際に、コロトコフ音波形のみによるAI解析では入力データにより、クラスタリング(分類)の精度が影響されてしまうことが予想される。そこで、従来行われきた波形分類法についても考慮に入れて、波形データそのものだけでなく、周波数スペクトルもしくは加速度波形のデータを追加した場合の検討を行う。データ量が増えることにより、解析のための準備時間が増大してしまう場合は、コロトコフ音の波形データのうち、一つの波形を切り出すことによりデータ量を削減する。これらの検討により、基本的な教師データを作成するための入力データを決定する。さらに、時間的に可能であれば、運動前後(平静時および運動後の経時変化)や食事前後(食前と食後、食べ物の種類)および症例別(脱臼歴、高血圧、不整脈)についても波形による分類が可能かどうかについての検討も行う。通常のAI解析手法では、大量のデータを処理するために、少なくともデータのサイズを一律にそろえる必要がある。また、よく言われるAI解析手法は主に画像解析に特化したものであり、画像より一見単純に見える波形データを解析するには、それなりにAI解析手法に精通した波形解析専門の研究スタッフが必要であることが、AI解析の試行結果から明らかになった。現状の研究スタッフで分担できないかどうかを模索してみたものの、実際にはAI解析準備を片手間で行うのは極めて困難であることが明らかになった。そのため、新たに波形解析専門の研究スタッフの選定・確保の時間がかかってしまい、人件費としてはほとんど使用できなかったことが主たる理由である。幸いなことに、新たに波形解析専門の研究スタッフを確保できたので、今後は購入機材を使用した解析を順次実施していく予定である。
インフルインザ菌外膜抗原に対する粘膜免疫応答およびその制御機構

ヒト扁桃におけるインフルエンザ菌外膜抗原に対する粘膜免疫応答扁桃には多くの免疫担当細胞が存在し、IgA産生細胞も高頻度に認められることから、上気道における粘膜免疫応答に何らかの関与があると推測される。そこで、ヒトロ蓋扁桃より単核球およびCD4^+T細胞を分離し、そのインフルエンザ菌外膜蛋白P6に対する免疫応答を観察した。その結果、扁桃からインフルエンザ菌が検出されなかった症例では、検出された症例と比較して有意にP6特異的IgA産生細胞数が高値であり、扁桃におけるP6特異的IgA産生細胞数は鼻分泌液中のP6特異的IgA抗体価と有意の正の相関を示した。さらに、CD4^+T細胞を抗原提示細胞の存在下でP6とともに培養するとTh1型ならびにTh2型のサイトカイン産生が認められた。以上の結果から、扁桃が鼻咽腔粘膜免疫応答の実効組織として誘導組織として機能し、インフルエンザ菌に対する上気道の感染防御に重要な役割を担っていると考えられた。マウスにおけるインフルエンザ菌外膜抗原に対する粘膜免疫応答インフルエンザ菌外膜蛋白をマウス経鼻、経口、経気管、そして腹腔内投与し、それぞれの粘膜免疫応答を比較し、さらにインフルエンザ菌感染予防における有用性について検討した。その結果、OMPの経鼻、経口、経気管投与のいずれも鼻粘膜にOMP特異的IgA応答が誘導されたが、経鼻免疫で最も顕著であった。また、経鼻免疫では脾臓CD4^+T細胞からのそのIgA応答に比例したTh1型ならびにTh2型のサイトカイン産生が認められた。さらに、鼻咽腔からのインフルエンザ菌クリアランスは、経鼻免疫でもっとも高値であった。したがって、鼻腔は腸管や気管など他の粘膜免疫関連組織と比較してより強力な粘膜免疫の誘導組織であると同時に実効組織でもあること、そして上気道粘膜免疫の賦活にはワクチンの経鼻投与が有用なことが示唆された。1)インフルエンザ菌外膜蛋白に対する免疫応答:ヒト咽頭扁桃(アデノイド)中のインフルエンザ菌の検出をPCR法を用いて行ったところ、従来の細菌学的手法と比較して高頻度にその外膜蛋白であるP6-DNAが検出された。また、鼻咽腔液中の抗体活性を測定してみると、インフルエンザ菌が検出された症例ではIgA抗体価が比較的低値であった。さらに、咽頭扁桃からリンパ球を分離しインフルエンザ菌外膜蛋白特異的免疫グロブリン産生細胞を測定したところ、特異的IgAならびにIgG産生細胞数とインフルエンザ菌数とは負の相関を示した(Acta Otolaryngol掲載予定)。従って、鼻咽腔のインフルエンザ菌の定着、集落形成には鼻咽腔の粘膜免疫が関与し、咽頭扁桃がその制御に関わっていることが推測された。2)実験動物における粘膜免疫応答:インフルエンザ菌死菌および外膜蛋白をアジュバントとともにマウスに経口投与したところ、唾液や鼻咽腔液の抗原特異的IgA抗体価が著しく増加した。さらに、このマウスの鼻咽腔へインフルエンザ生菌を注入したところ経口免疫群は対照群と比較して鼻咽腔からの細菌排除が有為に促進された。また、腸管粘膜のみならず鼻粘膜中の抗原特異的IgA産生細胞の増加を認めた(Laryngoscope,RecentAdvances in Otitis Media掲載予定)。以上の結果から、インフルエンザ菌ワクチンの経口投与により上気道から病原菌を排除し感染の発症を予防し得ることが示唆された。I.インフルエンザ菌に対する扁桃の粘膜免疫応答扁桃のP6

特異的免疫グロブリン産生細胞数をELISPOT法により測定したところ、扁桃組織よりインフルエンザ菌が検出された症例では細菌が検出された症例と比較して有意にP6特異的IgA産生細胞数が少なかった。また、5歳以下の年少児では、扁桃のIgA産生細胞数と鼻咽腔液中IgA抗体価に有意の正の相関が認められた。扁桃CD4^+T細胞を抗原提示細胞とIL-2の存在下にP6とともに培養しそのサイトカイン産生をELISA法、ELISPOT法を用いて観察したところ、Th2型サイトカインであるIL-5、IL-6の産生が有意であった。以上の結果から、扁桃はインフルエンザ菌に対する粘膜免疫応答を備え、これにより組織内への細菌侵入を防いでいること、そしてこの粘膜免疫応答の制御には消化管と同様にTh2型サイトカインが重要な役割を担っていることが示唆された。II.マウスにおけるインフルエンザ菌に対する粘膜免疫応答の解析マウスをインフルエンザ菌外膜蛋白(OMP)で、経鼻、経口、経気管、そして全身免疫し、鼻腔洗浄液、唾液、血清中免疫グロブリンの動態そして鼻粘膜、肺、腸管粘膜、脾臓における特異的抗体産生細胞を観察した。その結果、いずれの経粘膜免疫でも鼻粘膜に極めて多数のOMP特異的IgA産生細胞が誘導され、経鼻免疫でもっとも有意に増加した。全身免疫群ではIgA応答は認められなかった。さらに、脾臓からCD4^+T細胞を分離しサイトカイン産生を比較したところ、経鼻免疫でもっともTh2型そしてTh1型サイトカインの産生が亢進していた。以上の結果から、鼻腔は粘膜免疫の誘導組織としてもまた実効組織としても非常に強力であること、さらには経鼻免疫の有用性が示唆された。ヒト扁桃によるインフルエンザ菌外卷抗原に対する粘膜免疫応答扁桃には多くの免疫担当細胞が存在し、IgA産生細胞も高頻度に認められることから、上気道における粘膜免疫応答に何らかの関与があると推測される。そこで、ヒト口蓋扁桃より単核球およびCD4^+T細胞を分離し、そのインフルエンザ菌外膜蛋白P6に対する免疫応答を観測した。その結果、扁桃からインフルエンザ菌が検出されなかった症例では、検出された症例と比較して有意にP6特異的IgA産生細胞数が高値であり、扁桃におけるP6特異的IgA産生細胞数は鼻分泌液中のP6特異的IgA抗体価と有意の正の相関を示した。さらに、CD4^+T細胞を抗原提示細胞の存在下でP6とともに培養するとTh1型ならびにTh2型のサイトカイン産生が認められた。以上の結果空、扁桃が鼻咽腔粘膜免疫応答の実効組織そして誘導組織として機能し、インフルエンザ菌に対する上気道の感染防御に重要な役割を担っていると考えられた。マウスにおけるインフルエンザ菌外膜抗原に対する粘膜免疫応答インフルエンザ菌外膜蛋白をマウスに経鼻、経口、経気管、そして腹腔内投与し、それぞれの粘膜免疫応答を比較し、さらにインフルエンザ菌感染予防における有用性について検討した。その結果、OMPの経鼻、経口、経気管投与のいずれも鼻粘膜にOPM特異的IgA応答が誘導されたが、経鼻免疫で最も顕著であった。また、経鼻免疫では脾臓CD4^+T細胞からそのIgA応答に比例したTh1型ならびにTh2型のサイトカイン産生が認められた。さらに、鼻咽腔からのインフルエンザ菌クリアランスは、経鼻免疫でもっとも高値であった。
生き物飼育学習の課題分析と解決に向けたデジタル教材の開発

学校や家庭において生命現象の体験的理解が困難になった現代、小学校生活科等において生き物の飼育体験活動が重要視されている。しかし学校現場では、飼育活動は負担が大きいと考える教師が大半で、教材を生かし資質能力の育成に結びつけることは困難になっている。無理のない飼育活動を行い深い学びと豊かな学習成果を実現するためには、教員の主体的努力だけに依存せず、それを支援する学校・地域社会の連携や取り組みを進めること、教員の求める情報や教材を的確に提供することが求められる。本研究は、優れた実践事例の解析から、動物飼育活動のための教員支援の方法を明らかにし、指導法のモデル教材化と公開を行うものである。
下北半島石灰岩地帯における洞窟遺跡の調査

下北半島の尻屋崎周辺で発見した6つの洞窟のうち「尻労安部洞窟」(安部遺跡)と名づけた遺跡を重点的に調査した。この発掘調査は、平成14年から、合計3回、調査区を拡張しながら、約16m^2の範囲を、最深部約2.5mまで掘り進めた。どの層位にも大小さまざまな石灰岩の角礫が大量に含まれているために発掘は困難を極め、掘りあげた全部の土壌を水でとかして、ふるいで遺物を検出するという方法を採った。その結果、上層部(1・2層)から、縄文時代の主に中期末後期はじめに属する土器と共に、石器・人骨それに多種多様な動物遺体が高密度に含まれていることが判った。この発見により縄文時代における狩猟、漁労活動や、埋葬儀礼に関する貴重な成果を得ることが出来た。さらに、最新の調査では、上層部(1・2層)の下にあってほとんど遺物が出土しない層を挟んで、下部に石器と動物遺存体を包含する4層、およびさらに深い12層から動物遺存体を、新たに検出することが出来た。この下層(4層)からは剥片を素材にした錐状石器など数点が出土し、これらは、縄文時代のごく初期か、旧石器時代に属する可能性があると考えられる。また、上層部(1・2層)に含まれている石器のなかにも、旧石器時代かその直後の時期に属する石器類(彫器・大形尖頭器製作に生じる剥片など)が、.新たに発見された。そうした結果から、今後この下層の4層・12層周辺を拡張して調査することによって、旧石器時代の遺物と、絶滅動物、人骨が共伴して発見される可能性が高くなったものと期待できる。下北半島尻労地区において、今年春に実施した予備的調査によって合計6つの石灰岩洞窟発見した。そのうち、夏の本調査では最も低位にあり、アプローチのしやすい安部洞窟1の発掘に主眼を置き、発掘調査を8上旬に行った。尻労安部洞窟1については、昨年の試掘で縄文時代の遺物を包含していることが判明していたため、なるべく広範囲にそして下部の深い包含層の検出を目指した発掘を約10日間実施した。短期間ながらも6m^2を約1mの深さまで掘り進めることが出来、その結果、縄文時代後期を中心とする土器片とともに石器・人骨・骨角器・獣骨・魚骨・貝類などを検出した。各層準とも、大小の石灰岩角礫を大量に含み、土壌は粘性を帯ぴ、洞窟内の現地で小形遺物を発見するのは困難であると判断し、発掘した土壌はすべてメッシュのフルイによる水洗を行った。この作業によって、人骨・小形石器・骨角器をはじめ大量の獣・魚骨類など縄文時代の重要な遺物が発見することが出来た。この洞窟の包含層は墓壙などの遺構が確認しにくい状況ではあるが、人骨は成人と乳(胎)児の最少でも2体の一部が出土していること、骨角器・石器などに精緻なつくりのものが目立つ点などを勘案すると、埋葬施設や副葬品としての性格にも留意しつつ、今後の調査を進めていく必要があると考えられる。また、本年度は旧石器時代の遺物の発見にはいたらなかったが、当遺跡の縄文時代中・後期を中心とする土器片は包含層の上部に多くみられたため、さらに下部に堆積している層準に、より古い時期の遺物が発見できる可能性が高い。今年は、下北半島の尻屋崎周辺でこれまでに発見した6つの洞窟のうち「尻労安部洞窟1」と名づけた遺跡を重点的に調査した。この発掘調査には8月上旬の約2週間をあて、昨年の調査区を拡張しながら、約10m^2の範囲を約1.5mの深さまで掘り進めた。

昨年同様、どの層位にも大小さまざまな石灰岩の角礫が大量に含まれているために発掘は困難を極め、掘りあげた全部の土壌を水でとかして、ふるいで遺物を検出するという方法を採った。その結果、上層部(1・2層)から、縄文時代の主に中期末後期はじめに属する土器と共に、石器・人骨それに多種多様な動物遺体が高密度に含まれていることが判った。さらに、このたびの調査では、上層部(1・2層)の下にあってほとんど遺物が出土しない3層を挟んで、そのさらに下部に石器を包含する4層を新たに検出することが出来た。この下層(4層)からは剥片を素材にした錐状石器など数点が出土し、これらは、縄文時代のごく初期か、旧石器時代に属する可能性があると考えられる。また、上層部(1・2層)に含まれている石器のなかにも、旧石器時代かその直後の時期に属する可能性のある石器類(彫器・大形尖頭器製作に生じる剥片など)が、新たに発見された。そうした結果から、今後この下層(4層)を拡張して調査することによって、旧石器時代の遺物と、動物骨、人骨の共伴した発見に期待がつながったといえる。
脊髄損傷時における移植骨髄幹細胞と脊髄組織の相互作用の解明

骨髄由来間葉系幹細胞(MSCs)は抗炎症などを介し免疫を制御する機能が認められている。本研究は,MSCsとレシピエントの連関を脊髄損傷モデルにおいて調べた。変性したhMSCsは脊髄損傷抑制効果を認めず,hMSCsとレシピエントの連関の重要性が示唆された。神経ペプチドのPACAP欠損マウスを用いるとhMSCsの脊髄損傷抑制作用が失われ,抗炎症作用も認められなくなった。このように,脊髄損傷時において移植されたhMSCsとレシピエントはPACAPを介してコミュニケーションして脊髄損傷を抑制している可能性が示唆された。本年度は脊髄損傷に対するヒト骨髄間葉系幹細胞(hMSCs)の有効性の解明を行うためにマウスの脊髄損傷モデルを作成しhMSCsの脊髄内移植を行った。脊髄損傷はC57/BL6系マウスの11および12胸髄の椎間をナイフで切断することにより作成した。hMSCsは損傷部位より一椎体尾側の椎間から損傷1日後にhMSCs(1x10^5個)投与した。一部の細胞は赤色蛍光色素であるPKH26をラベルし細胞の挙動を組織学的に検討した。さらに細胞の組織内残存数をヒトAlu遺伝子のゲノムPCRにより定量した。脊髄損傷を起こしたマウスは下肢の運動機能障害を起こしマウスの運動機能評価スコア(バソマウススケールBMS)で1.5ポイントを示した。脊髄損傷1日後,hMSCsを医あ移植したところ移植後7日以内に,細胞を移植したマウスは対照群に比べ有意なBMSの改善を認めた。さらにこれらのマウスの脊髄損傷領域をクリア瘢痕として調べると,グリア瘢痕は有意な縮小を認めた。同様の実験を凍結融解により細胞を変性させたhMSCsにより検討するとBMSの改善と損傷領域の改善は全く認められなかった。hMSCsの挙動をPKH26ラベルした細胞にて行うとはhMSCsは移植直後には移植部位のみに認められたが移植7日後には脊髄損傷領域への遊走していることが明らかとなった。しかし,ヒトAlu遺伝子の解析により細胞数は7日で移植直後の1%さらに14日で0.01%と著減した。今後作用機序の解明を試みる。昨年度,当該研究者らは脊髄損傷モデルマウスに対し,ヒト骨髄間葉系幹細胞(hMSCs)を移植したところ脊髄損傷領域の減少と炎症性サイトカインの抑制を認めた。しかし,神経ペプチドのPACAPの遺伝子欠損マウスにhMSCsを移植したところその脊髄損傷抑制作用が失われることを示した。更にhMSCsがマウスの脊髄においてPACAP遺伝子の発現を促している機構を明らかにした。当該年度はそのPACAPの炎症における役割及び造血細胞へ対する役割を調べた。マウスより骨髄を取り出しPACAPおよびPACAP特異的レセプター(PAC1R)の遺伝子発現を調べたところPACAP遺伝子は発現していなかったがPAC1Rの発現は認められた。その細胞を詳細に調べると造血幹/前駆細胞に発現が強く,造血細胞の成熟に伴いその発現が低下することを認めた。さらに,CD34(+)造血前駆細胞にPACAPを加えるとサイクリンD1の遺伝子の増加と細胞周期の修飾がみとめられPACAPが造血ニッチに関与していることをしめした。PACAPの供給源を調べたところ骨髄に投射する脊髄傍神経節細胞に発現がみとめられ,その神経は交感神経であった。この結果は,PACAPが脊髄のみならず交感神経節にも存在し,造血ニッチを調節していることを示唆した。本年度の研究においてPACAPが骨髄ニッチに関与することを明らかにした。hMSCsは部分的にPACAPを介し炎症の抑制に関わっているが,本研究の結果によりhMSCsがimmune depressing syndromeを修飾できる可能性を見出した。これまで我々は、脊髄損傷に対するヒト骨髄間葉系幹細胞(hMSCs)の有効性の解明を行うためにマウスの脊髄損傷モデルを作成しhMSCsの脊髄内移植を行ってきた。その結果、hMSCsの移植がマウスの脊髄損傷後の運動機能と損傷体積を有意に抑制することを見出している。その過程において、脊髄損傷部位より一椎体尾側に移植したhMSCsが7日間で損傷部位に向かい遊走しているような組織像を得た。しかし、hMSCsの損傷部位へのホーミングは十分に理解されていない。そこで我々は、脊髄損傷時においてどのようなケモカインが脊髄損傷部位で増加するのか調べた。脊髄損傷前および損傷後1、3、7、14日に損傷部位を含む4椎体を取り出しmRNAを抽出した。通例に従いcDNAを作成しRT-PCRおよび定量的PCRによりケモカインの変動を調べた。脊髄損傷後、マウスは直ちに下肢麻痺をひき起こし14日間で下肢の運動機能の評価法であるバソマウススケールで3以下とほとんど回復しなかった。これはこれまでの我々の結果と一致した。神経マーカーであるneuron specifi enolase (eno2)の発現は損傷3日後まで低下しその後わずかに回復した。アストロサイトマーカーであるgfapは7日後まで増加しその後わずかに低下した。一方、マイクログリアマーカーのaif1の発現は14日まで継続的に増加した。

そこで、マイクログリアやマクロファージに関わるケモカインを調べたところ、脊髄損傷後13日に増加するケモカインと、14日に急激に増加するケモカインに大きく分類された。今後、それらのケモカインがhMSCsの遊走を導くのか、また脊髄損傷時の炎症とどのように関連付けられるのか明らかにしていく予定である。骨髄由来間葉系幹細胞(MSCs)は抗炎症などを介し免疫を制御する機能が認められている。本研究は,MSCsとレシピエントの連関を脊髄損傷モデルにおいて調べた。変性したhMSCsは脊髄損傷抑制効果を認めず,hMSCsとレシピエントの連関の重要性が示唆された。神経ペプチドのPACAP欠損マウスを用いるとhMSCsの脊髄損傷抑制作用が失われ,抗炎症作用も認められなくなった。このように,脊髄損傷時において移植されたhMSCsとレシピエントはPACAPを介してコミュニケーションして脊髄損傷を抑制している可能性が示唆された。今年度は蛍光ラベルしたヒトおよびマウス骨髄間葉系幹細胞を脊髄に移植しマイクロダイセクションにより移植細胞リッチ分画から遺伝子を得る。脊髄損傷マウスと正常マウスで比較し移植したMSCsがどのような応答をしているか,またレシピエント組織とどのようにコミュニケーションをとっているか調べる。整形外科学今年度は,脊髄損傷モデルに対するhMSCsの有用性およびその挙動を検討した。その結果hMSCsの脊髄損傷に対する有用性が確認でき順調に解析が進んでいると考えられる。次年度にこれらhMSCsの細胞死抑制機構の解明を行うための下準備ができた。現在,近年申請者らのグループが見出しhMSCsの神経ペプチドPACAP制御をベースとした解析を行いたい。年度末に出版が確定したSci Repの出版費用として充当するために,予算の一部を繰り越した。本年度は,脊髄損傷モデルにhMSCsを移植し,マイクロダイセクションを行う予定である。実験用の動物,麻酔薬脳購入,マイクロダイセクション用のスライドガラス,試薬およびその後の解析に用いるプライマーやPCR用の試薬購入する予定である。また,国際学会に参加予定である。次年度も計画通りに遂行したい。次年度は,昨年度得られたhMSCsの脊髄損傷に対する保護効果をもとにその機構の解明に取り組む。本年度の結果は,変性させたhMSCsは細胞死抑制作用がなくなることが見出されている。この結果はhMSCsとレシピエントの組織の相互作用が細胞死の抑制に重要であることが考えられる。この点を踏まえて次年度は研究を進める。特に神経ペプチドのPACAPがこの作用に関与している可能性を見出しているのでPACAP遺伝子欠損マウスを用いてhMSCsの移植およびサイトカインなどのELISAを試みる予定である。2月ー3月に消耗費として物品費として購入した試薬・備品があるが年度末の関係上,決算できなかった。さらに3月末に行われた学会の決算が報告書の作成上決算できなかったためであり,実質未使用分はほとんどない。次年度は生化学的検討や分子生物学的検討をする予定であり,本年度より物品費が増えることが予想されている。さらに,本年度得られた結果を国内外の学会へ報告する予定である。
理工系日本語学習者のためのe-Learning統合学習支援システム開発と評価

国内外の理工系学生がe-Learningとして学べる日本語四技能(読む・聞く・書く・話す)の統合学習支援システムを構築することが目的とし、アジア圏と欧米の理系大学日本語学習者を対象とし、本国では学ぶ機会の少ない科学技術日本語の教科内容をコンテンツとして開発を行い、Web上に公開し、コンテンツの評価をした。漢字圏・非漢字圏学習者に対する科学技術日本語のニーズ調査に基づいて、e-Learning統合学習支援システムのコースデザインを検討した。1)読解支援従来開発してきた「あすなろ」の充実をした。多言語辞書は中国語に続き、インドネシア語、マレー語における基礎的専門語を追加した。E-Learning非漢字圏用テキスト「もっとやさしい科学技術日本語入門」試作版を編集作成した。このテキストを使用した遠隔日本語教育実験としてタイのワライラック大学に講義送信をし、評価を受けた結果、教材を改良する予知があることがわかった。インフラストラクチャーにおいては、語学教室における問題点があることがわかり、今後の課題となった。2)作文支援新たに作文支援システム「なつめ」の開発を始めた。・例文表示では表示用のデータの収集を行うに当たり著作権に抵触しない「青空文庫」にフィルターをかけることで、「学習者レベル」にあうデータを準備することにした。・共起表現例文表示ともに、学習者の作文目的に適つた分野別のデータの収集をするため、新聞記事、青空文庫のほかに、科学技術文の収集を行った。3)練習問題サイト聴解問題練習のためにi-Podを利用したシステムを考案した。学習者ごとに弱点診断をした結果から、弱点を含む問題をダウンロードして練習するシステムであり、実験評価の結果、効果があることがみとめられた。4)読解、作文支援において必要なコーパス分析は、専門分野におけるディスコース、文章構成に関わる分析をおこなった。国内外の理工系学生がe-Learningとして学べる日本語四技能(読む・聞く・書く・話す)の統合学習支援システムを構築することが本研究の目的である。本年度は次のことを実施し、成果を発表した。1)理工系専門分野の文献を読むために既に開発されている読解支援システム「あすなろ」に加え、作文支援システム「なつめ」を新たに平成19年12月に公開した。2)「なつめ」例文表示学習者にとって使いやすい例文表示システムの構築を継続して行い、文のデータベースから日本語能力に適した例文をフィルタリングにより表示できるシステムを完成した。3)なつめ」共起表現提示=名詞と共起する高頻度の用言を格助詞とともにWeb上に表示した。4)「なつめ」分野別例文・共起表現提示のための調査=副詞とモダリティの遠隔共起について分析を行い、さまざまなコーパスにおける頻度調査を行った結果、コーパスごとの特色が明らかになり、その成果をSpringerのLecture Noteに掲載された。5)「なっめ」例文レベル別表示=作文支援システム「なつめ」に学習者にとって使いやすい例文表示システムの構築を継続して行い、データ・ベースから日本語能力に適した例文をフィルタリングにより表示できるシステムを完成した。6)作文支援システム強化のための学習者誤用データ・べース構築=学習上の重要項目を知るためには、誤用分析が必要である。誤用から見えてくる学習上の問題点から誤用例文を収集し、学習者に見られる誤用乃至不自然な表現の原因を意味的・構文的・運用論的な視点で分類し、データベースを構築した。理工系日本語学習者にとって必要な文章理解、表現を支援するe-Learningの開発を行い読解学習支援システムasunaroとともに作文学習支援「なつめ」を搭載し、http://hinoki.ryu.titech.ac.jp/上に公開した。中国、タイなどの学習環境、ニーズの調査による学習システおよびとコンテンツ設計に基づいて、中国、スロベニアの共同研究者を含めた国際的な研究を展開した。昨年度からは特定領域「日本語コーパス」のコーパスが利用可能になったことから、コーパスの利用範囲が大量に利用できるようになり、研究の方法の改善ができた。多数のジャンルの異なるコーパスを比較することで、ジャンル別の共起の傾向が明らかになり、理工系学習者に提示すべき学習項目が明瞭になった。専門分野の漢字データ・べースから基本漢字を選定、各専門分野の学習者向けの練習サイトのために数学専門家からのアンケートを収集して分析し、提示項目を明らかにした。また科学技術文書を書くためのディスコースの型を明らかにし、学習者作文を観測するとともに学習者へのインタビューによって、補強すべき学習項目を明らかにした。また、学習者コーパス構築のため学習者作文5000文を収集し、そのうち3500文について複数の日本語教育専門家による誤用タグ付をすることで学習者誤用データベースを作成した。これをもとに検索サイトのためのAPIの設計試作を行い、学習者並びに日本語教師のための誤用検索を可能にした。
非ヘム鉄酵素モデル錯体による生体内酸素化反応の機能発現と選択性制御機構の解明

非ヘム鉄を活性中心とするカテコールジオキシゲナーゼの反応の活性と選択性を制御する因子を解明すること,および,カテコール鉄錯体を用いてメタンモノオキシゲナーゼ型の機能を発現し,その反応の活性と選択性を制御する因子に関する新しい情報を得ることを目的に研究を行った。カテコール鉄錯体を用いて両反応を行うことが可能となり,両反応の統一的な理解に役立つ情報が得られた。カテコールジオキシゲナーゼの反応において,酸素化が進むためには過剰のカテコールの存在が重要であることがわかった。この過剰のカテコールの存在の意味を検討する目的で,カテコール錯体のカテコール配位子交換反応をスペクトル法およびD化カテコールを用いた同位体法によって検討した。その結果,カテコール配位子は,外部のカテコールと容易に交換するが,酸素との反応は配位したカテコールが優先的に起こることが明らかになった。また,3価鉄によるIntradiol型開裂と2価鉄によるExtradiol型開裂の制御機構の解明に役立つ情報が得る目的で,従来のTHF/py系とは別にTHF/H_2O系で反応を行ったところ,反応活性が水の濃度に著しく依存するばかりか,水濃度によりIntradiol/Extradiol選択性が変化することが見いだされた。特に,水濃度の低いところではExtradiol型反応が優先するのに対し,水濃度が高くなるとExtradiol型反応が阻害されることがわかった。モノオキシゲナーゼの反応型反応に関しては,モデル系においてハイドロキノンを用いて反応を実現した。ハイドロキノンは(H_2Q→Q+2e^-+2H^+)ようにこの反応に適した形で電子及びプロトンを供給するが,反応が起こるためには鉄の電子状態とヒドロキノンの酸化還元電位が適合する必要がある。本研究では,ヒドロキノンの電子状態を置換基を変化することで調整することができること,また,鉄の電子状態をカテコール鉄錯体を用いることによりカテコールの置換基で調整できることを明らかにした。
イメージ生成過程の脳神経基盤：イメージ情報と視知覚情報を抑制する機能の影響から

本研究は,心的イメージの生成を抑制する機能,および,イメージ生成中に外界から入力された視知覚情報の処理を抑制する機能の実在性について検証した。実験の結果,まず,左後帯状回がイメージ生成の抑制に関与することが示された。この結果は,報告者の先行研究と一致するものであり,イメージ生成を抑制する機能が心内に実在することを支持する結果であった。次いで,行動実験により,イメージ生成中には視知覚情報処理が低下することが示された。すなわち,イメージ生成中に視知覚情報処理が抑制する機能が心内に実在することを示唆する結果と考えられる。しかしながら,現段階では,後者の機能を担う脳部位の特定には至らなかった。本研究は,イメージ生成を抑制する機能,および外界からの視知覚情報を抑制する機能,二つの側面から,心的イメージ生成過程を解明する。2012年度は,イメージ生成を抑制する機能について焦点を当て,その機能を担う脳部位の特定につながる実験結果を得た。2013年度は,1)上記知見のさらに詳細な検討を可能とする研究計画の推進と,2)もう一方の視知覚情報処理を抑制する機能についての実験準備を行った。1)ネガティブなイメージはポジティブなものに比べ,イメージが不鮮明であることが先行研究などから指摘されている。このことから,ネガティブイメージ生成時にはイメージ生成を抑制する機能が作動していると考え,研究を進めてきた。ただし,ネガティブなイメージが不鮮明なのは,イメージ生成が抑制されたためではなく,ネガティブなイメージ対象に関する情報が長期記憶内に少なく,その結果不鮮明なイメージが形成されたという可能性も否定できない。そこで,2013年度は,ポジティブとネガティブな刺激間で,長期記憶内に保持されている情報量は同等と考えられる刺激の作成を行った。今後は,それらの刺激を使用することによって,長期記憶内に保持されている情報に違いはない上で,イメージの鮮明度に差があるか否かなどを検討する実験を立案中である。2)今後は,イメージ生成中に,視知覚情報処理が抑制されるか否かを検証する実験を行う予定である。2013年度は,実験機器の購入,刺激の選定,および実験参加者プールの作成などを行った。2013年度は,1)の調査・実験結果を日本イメージ心理学会第14回大会で,また,2012年度までの成果を日本心理学会第77大会の公開シンポジウムにて発表した。本研究では,イメージ生成を抑制する機能,および,外界からの視知覚情報を抑制する機能,二つの側面から,心的イメージ生成過程を解明する。平成24年度は,その一方の機能であるイメージ生成を抑制する機能について焦点を当てた。先行研究において,ネガティブイメージ想起時にイメージ生成を抑制する機能が作動することが示唆されている。本山他(2010)は,そのような機能の実在性を検証するために,イメージ抑制機能を担う脳部位を探索した。その結果,後帯状回が,その機能を担うことを示唆する実験結果を得た。ただし,イメージ抑制機能の脳内メカニズムは,ほとんど先行研究のない新奇な発見であるため,さらなる実験を行うなど慎重に吟味する必要がある。本年度は,ネガティブイメージ想起時以外のイメージが抑制される条件下においても,後帯状回周辺領域の活動が生じるか否かを検証する実験を行い,本山他(2010)の実験結果の妥当性を検討した。先行研究において,視知覚像が形成されているときに同時にイメージ像も形成されてしまっては,形成された像がどちらなのか混同が生じるため,イメージの生成が抑制されることが示唆されている。すなわち,視知覚像を観察しているときには,イメージ抑制機能が強く作動しているのかもしれない。本年度は,視知覚像形成時とイメージ形成時の脳活動を比較検証し,視知覚像を形成しているときに,本山他(2010)で得られた後帯状回の活動が得られるか否かを検証した。その結果,イメージ生成中と比較して,視知覚像を観察しているときに,後帯状回のよる強い活動が生じていた。この結果は,後帯状回がイメージ抑制機能を担うことを支持するものと考えられる。本研究は,1)心的イメージの生成を抑制する機能,および,2)イメージ生成中に外界からの視知覚情報を抑制する機能,について検証する。先行研究において,両機能の存在が指摘されてきたが,現段階では思弁的な推測にとどまっており,実証的にそれらの機能が存在することを示した研究はない。そこで,本研究では,両機能の実在性をを実証的に検討する。現在まで,1)の心的イメージの生成を抑制する機能の実在性に関する実験は終わっている。ただし,その実験結果の学会発表および論文化し投稿した際に,新たな課題も浮上してきた。それは1)の実験で使用された刺激の統制についてである。実験では,快あるいは不快な名詞を呈示し,そのイメージを生成させ,快・不快イメージ生成中の脳活動の違いを検証した。その際,刺激の感情価(Valence)や感情強度は両条件間で統制してきたが,それ以外の特性(たとえば,親密度)などは統制していない。そのため,得られた実験結果が,快・不快という感情の違いではない別の特性の影響によって生じたのではないかということが指摘されたため,昨年度までに新たな刺激作成のための調査および実験を実施した。それらの結果は,昨年度中に学会発表を行い,本年度は論文化を進めてきた。さらに,2)のイメージ生成中に外界からの視知覚情報を抑制する機能が存在するか否かを検証する実験準備を行っている。

現在,刺激の選定と実験プログラムの作成は終了しており,今年度早々に実験機材を整備し,実験を行う予定である。心的イメージの生成過程を解明することは,イメージ研究の中心的なテーマの一つであり,現在までイメージ過程を説明するモデルがいくつか提唱されている。さまざまなモデルに共通するメカニズムとして,イメージを生成すると,長期記憶(LTM)内に貯蔵されている情報が,イメージを生成する機構に移行(転送)され,そこでイメージが形成されるというものがある。近年,このLTMとイメージを生成する機構の間に,移行される情報の量を調整する心的機能(具体的には移行される情報量を抑制する機能)の存在が示唆されている。また,イメージ想起中に,外界から入力された視知覚情報の処理を抑制する心的機能の存在も近年指摘されている。これは,イメージを鮮明に思い浮かべるために閉眼するという方略が日常的に用いられることなどからも推測されるように,視知覚情報の入力は,イメージの形成を妨害するため,イメージ想起中はそれを自動的に抑える機能が働くのではないかという考えによる。上述した機能の実在性が示されれば,それらの機能を加味したイメージ生成モデルの構築が必要であることを意味し,またそれはイメージ生成過程をより詳細に解明することにつながると考えられる。しかしながら,現段階では前述した両機能の実在性は,思弁的に推測されているのみであり,実証的には検証されていない。本研究は,大きく以下2つの研究計画からなる。すなわち,1)イメージを生成を抑制する心的機能の実在性の検証,2)イメージを生成中に,外部から入力される視知覚情報の処理を抑制する心的機能の実在性の検証,である。昨年度までに,1)の機能を担う脳部位を特定する脳イメージング実験を実施した。本年度は,2)についての行動実験,および,その実験デザインを基にその機能を担う脳部位を特定する脳イメージング実験を実施した。さらに,1)の成果をまとめ,学術論文として発表した。本研究は,心的イメージの生成を抑制する機能,および,イメージ生成中に外界から入力された視知覚情報の処理を抑制する機能の実在性について検証した。実験の結果,まず,左後帯状回がイメージ生成の抑制に関与することが示された。この結果は,報告者の先行研究と一致するものであり,イメージ生成を抑制する機能が心内に実在することを支持する結果であった。次いで,行動実験により,イメージ生成中には視知覚情報処理が低下することが示された。すなわち,イメージ生成中に視知覚情報処理が抑制する機能が心内に実在することを示唆する結果と考えられる。しかしながら,現段階では,後者の機能を担う脳部位の特定には至らなかった。研究計画2年目に,報告者は現大学への就職が決定した。そのため,2年目に研究環境が大きく変化し,当初予定していなかった研究環境の整備等が必要になった。また,研究環境の変化だけでなく,異動に伴い当初の予定をはるかに超える本研究以外の業務が生じ,現大学への異動後はほとんど予定通りに研究を進めることができなかった。本年度は,教育・校務に割くエフォートが減少したため,本研究に十分な時間を割くことができると考えている。認知心理学
緑藻に新たに発見した生活史経路に着目して性差の起源を探る

異型配偶子接合の進化は性淘汰の根本的な背景にある。配偶子と接合子のサイズとその適応度の間にある定量的な関係はこれまでの研究代表者(富樫)らによる理論研究などによって雌雄の配偶子サイズの進化に決定的な影響を与えることがわかっている。しかし、実際の生物による検証は未だ十分ではない。我々はこれまでの研究によってこの実験を難しくしている問題をヒトエグサ属の海産緑色藻類を用いて乗り越えることが出来ることを明らかにしてきた。本研究では、特に、配偶子の単為発生と接合子からこれまで知られていた単細胞で微視的な胞子体のみでなく多細胞で巨視的な多細胞体が発生するという我々のこれまでの研究から得られた新しい発見に着目してこの課題に包括的に取り組んでいる。平成30年度は継続して、北海道室蘭市ならびに小樽市で採集したエゾヒトエグサを用いて研究計画に基づいた実験データを収集した。我々のこれまでの研究から、1)本種の配偶子は配偶子嚢になる細胞が同調的な等分割を繰り返しながら形成されること、2)種内の配偶子サイズの大きなバラつきが配偶子嚢のサイズに起因して起こることなどがわかっている。今年度は、これらの性質を活用した実験によって得られた1)生産された雌雄の配偶子には単為発生するものがあり、単為発生には異なる2つの経路(胞子体への単為発生、配偶体への単為発生)があること、2)単為発生が起きる確率は、配偶子のサイズに依存し、大きな配偶子ほど接合しなくても単為発生によって生き残りやすいこと、3)胞子体、配偶体のどちらに単為発生するかはその配偶子のサイズには依存しないことなどの重要な新しい知見について異なるGenotypeについてデータの蓄積を進め、GLMMによるデータ解析を行う準備を整えている。配偶子ならびに接合子のサイズと適応度の関係は、異型配偶子接合の進化を理解するために最も重要な問題のひとつであり、性差の起源を解明するための鍵となる。理論研究から示された主要な課題は、1)配偶子形成過程ならびに接合子の形成後において捨てられてしまう雄性配偶子の資源が本当に接合子の適応度の向上に寄与することが出来るのか?2)大きな接合子は実際に適応度も高いのか?の2点であると言ってよいだろう。これを定量的に示すことは一般に極めて難しい。雌雄の配偶子が接合しないと発生できないため、雌雄それぞれの配偶子に由来する資源が接合子の適応度の向上にどれだけ寄与するかを分けて測定することができない、雌雄の配偶子のサイズが固定されているためサイズの異なる接合子を実験的に作ることができない、次世代の子供の数が多過ぎたり次世代時間が長過ぎたりするため適応度を計測することが事実上できないなどが大きな障害となってきた。我々は、これまでの研究で海産緑藻エゾヒトエグサにこれらの問題を解決する有利な性質があることを明らかにすることが出来た:1)配偶子形成過程で減数分裂を行わないため同一の配偶体からは遺伝的に異ならない配偶子が生産される、2)雌雄の配偶子はどちらも単為発生能することが出来る、3)配偶子のサイズに種内で大きなバラつきが見られる、胞子体が全実性で微視的で生活環も短いため、次世代の子供の数(配偶体数)を計数することが出来る。本研究では、さらに、これらの利点を活用した実験系を駆使して、単為発生による配偶子の生存率が配偶子のサイズに依存し、その関係が理論予測を支持する増加関数によって示されることを支持する実験結果が得られた。加えて、2つの異なる単為発生経路の発現が配偶子サイズと独立に決められるようであることもわかってきた。理論予測を超える新しい研究成果を挙げられる可能性が見えてきた。研究計画に従って、研究分担者(吉村)ならびに研究協力者らと協力し、引き続き以下に主眼を置いてエゾヒトエグサを用いた定量的なデータ収集を進める:1)雄性配偶子が有する資源は接合子のどの程度適応度の向上に役立つか?;2)サイズが大きい配偶子ならびに接合子ほどより適応度が高いか?(特にシグモイド型関数になるか?)。我々は、これまでの研究によって、配偶子が同調的等分割によって単核の栄養細胞から減数分裂を経ずに形成され、配偶子嚢のサイズのバラつきがさまざまなサイズの配偶子を生み出す要因となっていることを明らかにした。これに基づいて、配偶子の単為発生による生存率が、理論予測されたように配偶子のサイズに依存すること、一方で2つの異なる単為発生経路のどちらが発現するかは、配偶子のサイズに依存しないことがわかってきた。今後の研究では、まず、異なるgenotypeを用いてこれらの実験を繰り返し、GLMMによって統計モデリングする。また、サイズの異なる配偶子を雌雄で組み合わせることによって、実験的にサイズの異なる接合子の系列を作製する。これらを培養して、接合子を胞子体ならびに多細胞体に発生させ、接合子のサイズとそれぞれの発生率の関係を調べる。さらに、胞子体、多細胞体のそれぞれの発生ルートにおいて、次世代の子供の数を計数する。接合子から発生してくる多細胞体については性質をより詳細に明らかにしていく。特に、この多細胞体から生産される遊泳細胞を単離して培養し、その発生のプロセスを解明する。また、野外で実際に我々が発見した多細胞体が生育しているか調査する。集めた定量的データは、基本的にGLMMによる統計モデリングを行って解析することによって、本研究目的の達成を目指す。

性淘汰を通して、多くの生物に見られる形態的・行動的な性的二型は進化した。これらの性差を進化させる原因を突き詰めていくと、雌雄の間にある配偶子のサイズの違いに辿り着く。このため、性差の起源を明らかにするためには、これまでの研究代表者(富樫)らによる理論研究などによって雌雄の配偶子サイズの進化に決定的な影響を与えることがわかっていながら未だ実際の生物において検証が行われていない重要課題である接合子のサイズとその適応度の間にある定量的な関係を実験によって明らかにしようとするものである。我々は以下に示す様々な利点から海産の緑色藻類であるエゾヒトエグサを用いてこの問題に取り組んでいるが、本研究では、接合子からこれまで知られていた単細胞で微視的な胞子体に加えて、我々が先に行った多細胞で巨視的な多細胞体が発生するという新しい発見に基づいてこの問題に新しい切り口で迫る。平成28年度は、研究計画に則って、我々のこれまでの研究によって、野外での配偶子生産のスケジュールならびに配偶子の放出機構、放出された配偶子の走光性行動などが詳細に明らかになっている北海道室蘭市のエゾヒトエグサ(Monostroma angicava)を用いて実験を行った。配偶子形成が完了した直後の配偶体を採集した。我々のこれまでの研究から、本種の配偶子は細胞が同調的な等分割を繰り返しながら形成されることがわかっている。我々は、様々なサイズの配偶子を雌雄で組み合わせることによってサイズの異なる接合子の系列を作製し、その適応度を計測しようとしている。今年度は、この配偶子形成過程における細胞分裂の回数とその出発点となる配偶子嚢のサイズを詳細に調べることによって、本種にこれまでも知られていた配偶子サイズの種内における大きなバラつきが後者に起因していることを明らかにすることが出来た。接合子のサイズと適応度の関係は、性差の進化を理解するための鍵となる。具体的な疑問点は2つに分けることが出来る:1)雄性配偶子の資源はどの程度接合子の適応度の向上に寄与するか?2)大きな接合子は適応度も高いのか?ところが、多くの生物でこの疑問点の解明は極めて困難となっている。その主な理由は以下のような点にある:A)雌雄の配偶子が接合せずに発生できないため、雌雄の配偶子が有する資源がそれぞれ接合子の適応度にどれだけ寄与するかを分けて測定することができない;B)雌雄の配偶子のサイズが固定され、同一種内でサイズの異なる接合子を実験的に作ることができない;C)次世代の子供の数が多過ぎるたり、もしくは次世代時間が長過ぎるため適応度を計測することが事実上できない。これに対して、本研究では、研究代表者(富樫)らによるこれまでの研究によって明らかになってきたエゾヒトエグサが有する以下の有利な性質を利用してサイズの異なる配偶子と接合子の系列を作成し、上記の疑問点に答えるための実験系を構築した:a)雌雄の配偶子はどちらも単為発生能することが出来る;b)配偶子のサイズに種内で大きなバラつきが見られる;c)胞子体が全実性で微視的であるため、次世代の子供の数(配偶体数)を計数することが出来る。本研究では、現在までに配偶子形成過程における同調的な細胞分裂の回数と配偶子嚢のサイズの関係を詳細に調べることによって、本種にこれまでも知られていた配偶子サイズの種内における大きなバラつきが配偶子嚢のサイズのバラつきに起因していることを明らかに出来た。
甲状腺ホルモンによる肝P-450遺伝子の発現機構

フェノバルビタール投与によって誘導されるチトクロームP450,CYP2B1についてその誘導発現に対する甲状腺ホルモンの作用を調べた。甲状腺ホルモンの作用を分子レベルで解析するため、まず5′-非翻訳領域の約7kbを含むDNAとクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)との融合遺伝子を用いて、本遺伝子の単離肝細胞への導入法の検討を行った。エレクトロポレーション法を用いて遺伝子を導入したところ、単離肝細胞の損傷のためと考えられるhouse-keeping genesの活性化が起こり、相対的に肝特異的酵素の発現が抑えられていることがわかった。また、培養プレートからの肝細胞の剥離が起こり、活性の測定に必要な3日以上の維持が困難であった。そこでリン酸カルシウム法の改良法であるカルシウム共沈法を用いて再度肝細胞への遺伝子の導入を検討した。一般にマトリゲル等の細胞間基質を塗布したプレートを用いると細胞の長時間維持が出来る。しかしながらカルシウム共沈法では、これらの処置は添加DNAあるいはカルシウムの吸着を招き、遺伝子の導入率の低下あるいは細胞毒性を生じる事がわかった。そこでプライマリアプレートと培地への低濃度グルココルチコイド添加によって2日間単離肝細胞をプレートに接着・安定化させた後に遺伝子を導入したところフェノバルビタールの添加によってCAT活性が発現した。この発現はフェノバルビタールに依存しており、非添加時には活性が検出されなかった。そして、甲状腺ホルモンを添加するとフェノバルビタールによるCAT活性の誘導は抑制された。これらの結果から甲状腺ホルモンはCYP2B1の転写活性の段階に作用してその発現を抑制的に調節していることが明らかとなった。現在、鎖長の異なるCYP2B1遺伝子断片を用いて甲状腺ホルモンに感受性を示す領域を特定するための実験を行なっている。