hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
慢性炎症をターゲットとした動脈硬化の機序解明と、新たな薬物治療の可能性

研究の最終的な目標は、動脈硬化の発症、進展を予防する薬剤の開発である。本研究の具体的な目標は、脳神経外科領域で扱う頸動脈プラークの発生、増大、破綻の分子メカニズムを明らかにして新たな薬物療法の開発につなげることである。近年、動脈硬化の発症、進展に炎症が大きく関わっていることが報告されている。慢性炎症では,長期にわたるストレス応答のため、不可逆的な組織のリモデリングが生じる。この応答機構の変調や破綻が動脈硬化性疾患の発症や進展の原因として近年注目されている。今回我々はその慢性炎症の鍵因子としてアンジオポエチン様タンパク質2(angiopoietin-like protein 2 ; Angptl2)に着目し研究を立案した。血管における局所的なAngptl2の発現が血管炎症を惹起し、病態形成および進展に関与していると考えられる。そのため頸動脈プラークの発生、増大、破綻の病態に慢性炎症、特にAngptl2が関与していることが強く推測される。その関与が明らかにされれば、Angptl2が頸動脈プラークに対する薬物治療や、さらには急性冠症候群や閉塞性動脈硬化症などを含めた全身の動脈硬化の治療標的になる可能性があると考えられる。現在までに、ヒト頸動脈プラークのサンプルにおいて、Angptl2及びマクロファージのマーカーである、CD68の免疫染色を施行した。プラークにはマクロファージが浸潤しており、浸潤したマクロファージにはAngptl2が発現していることを確認した。またRT-PCRでAngptl2の発現をプラークで確認し、angptl2の頸動脈プラークの病態への関与につき検討中である。症例の蓄積は行われている。モデル動物の作成で再現性に問題を認めているため、細胞などを使った実験を模索中である。またRT-PCRの条件を検討中でもある。RT-PCRの条件を検討し、より正確な結果を得られるようにする。頸動脈プラークモデルの検討を行う。臨床サンプルでのアンジオポエチン様タンパク質2の発現、分布についてより検討を行う。現在はRT-PCRやwestern blotでAngptl2の発現をプラークで確認している段階でありangptl2の頸動脈プラークの病態への関与につき検討を進めて行く予定である。RT-PCRの条件設定、RNAの抽出に困難を感じている。また現在存在する抗体はwestern blotに有用性が低く、条件を模索している状態である。

モデル動物の作成で再現性に問題を認めているため、細胞などを使った実験を模索中である。またRT-PCRの条件を検討中でもある。サンプル採取法などを検討し、RNAを得る。Western blotを確立する。マウス頸動脈プラークモデルを作成し、Angptl2の存在を確認する。RT-PCRの条件を検討し、より正確な結果を得られるようにする。頸動脈プラークモデルの検討を行う。臨床サンプルでのアンジオポエチン様タンパク質2の発現、分布についてより検討を行う。使用物品の節約、実験の効率化などにより見込みより物品費が少なく済んだ。次年度は最終年度であり動物などの購入に予算が必要であり使用用途に不足はない
マスト細胞関連転写因子によるCebpa転写抑制メカニズムの解析

申請者らは、成熟マスト細胞において転写因子GATA2は、骨髄球分化で中心的な役割を担うCebpaの転写を抑制し、その分化形質の維持に働いていることを明らかにした(Ohmori et al., blood., 2015)。しかしその抑制メカニズムは不明である。GATA2とC/EBPαは互いに血球分化で中心的な役割を担う。申請者は、血球分化過程におけるGATA2とCebpaの転写制御メカニズムを解明することを最終的な目的とし、本研究課題においてBMMCsをプロトタイプとしGATA2によるCebpa転写抑制メカニズムの解明に着手した。2017年度は、研究計画書に従いGATA2欠失時の転写因子の挙動について解析し、GATA2欠失時のCebpaの発現上昇にはPU.が関与することを見出した。2018年度は、前年度の成果からPU.1/GATA2条件付きノックアウトマウス作出と研究計画書に従いCebpa転写活性化に伴うヒストン修飾の変化について検討した。HDAC阻害剤(TSA)とDNAメチル化阻害剤(5Aza)を用いてCebpaの発現を解析した結果、TSA処理でCebpaのmRNA量が増加した。このことから、Cebpaの転写活性化にはヒストン修飾の変化が関与している可能性が示唆された。次に、GATA2欠失後のCebpa遺伝子座のヒストン修飾を調べた結果、Cebpa遺伝子本体とその周囲でH3K27me3(転写抑制の指標)の減少と、H3K27ac(転写亢進の指標)の増加が起こることを見出した。さらにH3K27me3修飾に関与するPRC1/PRC2、UTXの挙動をChIP assayにより解析した結果、UTXの結合増加とH3K27me3修飾の減少が逆相関していた。以上、UTXがリクルートされることでH3K27me3修飾が遺伝子本体の周囲で減少しCebpa遺伝子が活性化する可能性が示唆された。申請書において次年度は、1)GATA2欠失によるCebpa遺伝子座ヒストン修飾の解析、2)骨髄球エンハンサーCebpa +37KGATAの重要性についてBACレポーターマウスを作出し、個体レベルで検証することを計画した。まず2)に関しては、前年度(2017年度)に実施した「ゲノム編集法によるCebpa +37Kの欠失」で得られた成果から、Cebpa +37K領域の欠失はCebpaの転写活性化に影響しないこと明らかとなり、同時に、GATA2欠失時にはCebpa遺伝子座の広い範囲でヒストン修飾が変化し、それを介して発現が上昇する可能性が見出された。従って、Cebpa +37K GATAは、GATA2欠失時のCebpa発現上昇において必須の領域ではなく、BACレポーターマウスの解析が有益でないと考え作出を中止した。一方、1)に関しては予定通り解析が進んでおり、GATA2欠失時のCebpa発現上昇には、DNAの修飾ではなくヒストン修飾が関与していること、またGata2単独の欠失ではH3K27me3修飾の減少とH3K27ac修飾の増加が起こることを見出した。加えてGata2とCebpaを共に欠失させるとH3K27me3修飾の減少は認められるがH3K27ac修飾が増加しないこともわかり、H3K27me3修飾の減少は単なるアセチル基の交換ではなく積極的に脱メチル化させる機構があると考えられた。この結果からさらに解析を進めた結果、H3K27脱メチル化酵素であるUTXが関与している可能性が示唆された。以上の成果から、研究計画全体としておおむね順調に進展していると言える。本年度は、1)GATA2欠失による、H3K27のヒストン修飾の変化とUTXの働きについて、ChIP-assayを中心により深く解析を進める。2)作出したPU.1/GATA2ダブルコンディショナルノックアウトマウスから樹立した骨髄由来マスト細胞を用いて発現解析を行い、同時にH3K27のヒストン修飾の変化とUTXに対する関与についても検証する予定である。以上の解析結果をまとめ、多角的な観点からGATA2によるCebpa転写抑制メカニズムについて解析を進めたい。申請者らは成熟マスト細胞において転写因子GATA2は骨髄球分化で中心的な役割を担うCebpaの転写を抑制することでマスト細胞の分化形質を維持していることをGATA2コンディショナルノックアウトマウス由来の骨髄由来マスト細胞を用いて明らかにした(Ohmori et al., blood, 2015)。しかしその抑制メカニズムの詳細は明らかとなっていない。転写因子GATA2とC/EBPαは、共に血球分化における「鍵因子」である。本研究課題では、BMMCsをプロトタイプとし、GATA2によるCebpa転写抑制メカニズムを明らかにすることで、血球分化全体におけるCebpaの転写抑制メカニズムを解明することを目的とした。初年度は研究計画書に従いGATA2欠失時の転写因子の挙動に着目し解析した。公開されているChIP-Sequenceのデータをもとに野生型BMMCsのCebpa遺伝座におけるGATA2、PU.1、RUNX1、SCL、LMO2の結合を調べた結果、共通して+37K領域に結合が認められた。ところがCRISPR/Cas9法によりマスト細胞株で+37K領域を欠失させてもGATA2欠失時のCebpaの発現上昇は維持されていた。

そこでCebpaの発現増加に関与する+37K以外のシス領域とトランス因子を同定するため、BMMCsを用いてGATA2の欠失と同時に前述した幾つかの転写因子についてsiRNAを導入しKDを行った。その結果、PU.1をKDした時Cebpaの発現上昇が約半分に低下した。次にGATA2欠失BMMCsにおけるPU.1のCebpa遺伝子座に対する結合を調べた結果、+37K領域のみならず複数のシス領域で上昇しており、PU.1はCebpaの正の制御因子であると考えられた。申請書において初年度は以下に記す3つの実験を計画しそれぞれ予定通り実施した。1Cebap遺伝子座に対する各転写因子の結合変化の検証、2GATA2欠失時のCebpaの転写開始に重要な因子の同定、3Cebpa転写抑制におけるCebpa +37KGATAの重要性をゲノム編集によって明らかにする。12ではGATA2欠失時に大きく結合様式が変化する因子としてPU.1を同定し、またGATA2欠失時のCebpaの発現上昇にPU.1が関与していることを明らかにした。3に関しては細胞株を用いてCRISPR/Cas9法を行い、GATA2欠失時のCebpaの発現上昇には、+37K領域以外の領域が働いている可能性を示唆する結果を得た。以上ことから予定した計画通り実施しそれぞれについて結果を得ることができたことから、おおむね順調に進展していると言える。申請者らは、成熟マスト細胞において転写因子GATA2は、骨髄球分化で中心的な役割を担うCebpaの転写を抑制し、その分化形質の維持に働いていることを明らかにした(Ohmori et al., blood., 2015)。しかしその抑制メカニズムは不明である。GATA2とC/EBPαは互いに血球分化で中心的な役割を担う。申請者は、血球分化過程におけるGATA2とCebpaの転写制御メカニズムを解明することを最終的な目的とし、本研究課題においてBMMCsをプロトタイプとしGATA2によるCebpa転写抑制メカニズムの解明に着手した。2017年度は、研究計画書に従いGATA2欠失時の転写因子の挙動について解析し、GATA2欠失時のCebpaの発現上昇にはPU.が関与することを見出した。2018年度は、前年度の成果からPU.1/GATA2条件付きノックアウトマウス作出と研究計画書に従いCebpa転写活性化に伴うヒストン修飾の変化について検討した。HDAC阻害剤(TSA)とDNAメチル化阻害剤(5Aza)を用いてCebpaの発現を解析した結果、TSA処理でCebpaのmRNA量が増加した。このことから、Cebpaの転写活性化にはヒストン修飾の変化が関与している可能性が示唆された。次に、GATA2欠失後のCebpa遺伝子座のヒストン修飾を調べた結果、Cebpa遺伝子本体とその周囲でH3K27me3(転写抑制の指標)の減少と、H3K27ac(転写亢進の指標)の増加が起こることを見出した。さらにH3K27me3修飾に関与するPRC1/PRC2、UTXの挙動をChIP assayにより解析した結果、UTXの結合増加とH3K27me3修飾の減少が逆相関していた。以上、UTXがリクルートされることでH3K27me3修飾が遺伝子本体の周囲で減少しCebpa遺伝子が活性化する可能性が示唆された。申請書において次年度は、1)GATA2欠失によるCebpa遺伝子座ヒストン修飾の解析、2)骨髄球エンハンサーCebpa +37K
脳血管障害の遺伝・環境要因解析を可能にする次世代ゲノムコホートの構築

脳血管障害を含めた生活習慣病などの頻度の高い疾患は、ゲノムの遺伝要因や生活習慣などの環境要因が複雑に組み合わさって発症すると考えられており、グローバルCOE研究から続く山形県コホート研究を用いたゲノムコホートによる前向き研究として、ITネットワーク化による網羅的疾患追跡方法の開発と脳血管障害のゲノムコホートによる病因遺伝子の探索を行った。この結果、遺伝子Xならびに遺伝子Yを候補遺伝子として得た。遺伝子Xは脳血管障害の基礎疾患として知られる心房細動に強く関連し、遺伝子Yは基礎疾患とは関係なく脳血管障害と関連していた。1.ITネットワーク化を利用した網羅的疾患の追跡方法の開発:本学部では、県内4地域の二次保健医療圏うち、既に稼働の3地域(置賜、庄内、最上)の医療情報ネットワークの基幹病院と高セキュリティ回線によるシステムの直接接続を行い、診療情報の共有化を可能とした。2.脳血管障害を対象とした次世代のゲノム情報解析技術の実地応用:山形県対脳卒中研究会から得られた疾患罹患データより、脳血管障害から梗塞型の病型を呈する症例について、山形県コホート健常者を対照群として、Illumina 660W DNAチップによるSNPタイピングを行い、ハプロタイプ並びにコピー数変化について関連解析を行い、複数の候補遺伝子が得られた。3.2万人規模のコホートへの拡大:山形県コホート研究を推進し,酒田市等でベースライン調査を実施した結果,平成26年度末の研究協力者数は,18,955人になった(前年度比2,027人増)。また,約1,500人分の検体を用いたゲノム解析をJーMICC(日本多施設共同コホート研究)を通じて理化学研究所で測定する共同研究を開始するなど共同研究の推進を図った。1.ITネットワークを利用した網羅的疾患の追跡方法の開発:県内3地域の基幹病院との医療情報ネットワーク接続に加え、二次保健医療圏の村山地域に新たに設立された医療情報ネットワークに参画し、県内全域の基幹病院と診療情報を共有することが可能となり、更なる連携拡大に努めた。2.脳血管障害を対象とした次世代のゲノム情報解析技術の実地応用:平成26年度に得られた候補遺伝子について、山形脳卒中研究会症例で山形県コホート該当者についてゲノム網羅的エクソームシークエンスを実施し、遺伝子機能変化をもたらす変異の探索を実施した。この結果、該当候補遺伝子内にアミノ酸置換に関係する複数のバリアントを同定した。3.2万人規模のコホートへの拡大:山形県コホート研究を推進し,引き続き上山市で、そして新規に米沢市でベースライン調査を実施した結果,平成27年度末の研究協力者数は,遺伝子解析研究協力で20,736人と当初の目標である「2万人」超を達成した。また,JーMICC(日本多施設共同コホート研究)とは研究で用いる調査票の共通化や山形県コホート研究約1,500人分の検体を理化学研究所において解析した。さらに、国立がん研究センターJPHC-NEXT研究の主任研究者を客員教授として招き、若手研究者の交流を推進させる等国内のゲノムコホート研究と研究協力体制を整えた。平成27年度は、県内3地域の基幹病院との医療情報ネットワーク接続に加え、二次保健医療圏の村山地域に新たに設立された医療情報ネットワークに参画し、県内全域の基幹病院と診療情報を共有することが可能となり、更なる連携拡大に努めた。また、平成26年度に得られた候補遺伝子について、山形脳卒中研究会症例で山形県コホート該当者についてゲノム網羅的エクソームシークエンスを実施し、遺伝子機能変化をもたらす変異の探索を実施した。さらに、山形県コホート研究を推進し,引き続き上山市で、そして新規に米沢市でベースライン調査を実施した結果、平成27年度末の研究協力者数は、遺伝子解析研究協力で20,736人と当初の目標である「2万人」超を達成した。加えて、JーMICC(日本多施設共同コホート研究)とは研究で用いる調査票の共通化や山形県コホート研究約1,500人分の検体を理化学研究所において解析した。1.ITネットワーク化を利用した網羅的疾患の追跡方法の開発:医療情報ネットワーク上での公開情報の項目を増やし、利用拡大に努めた。また、ネットワークを利用して、当該病院を受診しているコホート研究データを有する患者情報を収集することにより、網羅的に疾患情報を収集するための方策の検討を進めた。2.脳血管障害を対象とした次世代のゲノム情報解析技術の実地応用:平成27年度に得られた候補遺伝子について、ゲノム網羅的エクソームシークエンス解析から。新たに遺伝子機能をもたらす変異が得られ、サンガーシークエンスによる解析によって検証された。一連の遺伝子解析の結果、心房細動に起因する関連遺伝子と、心房細動に起因しない梗塞型病変特有の病因遺伝子が見出されたことになり、先制的診断として有用であるものと考えられる。3.2万人規模のコホートへの拡大:山形県コホート研究のベースライン調査の集計作業を進め、現在10件を超える研究テーマについて、脳卒中を含めて生活習慣と疾患との関連解析が開始されはじめている。追跡調査として、人口動態統計、住民票照会による生存確認、がん、脳卒中、心筋梗塞登録情報との照合作業を行っている。

さらに、平成27年度の5年後二次調査の対象者4,291名に対して郵送調査を行い、3,329名の情報収集を終えた(回収率77.6%)。3月上旬には平成28年度の二次調査の対象者4,240名に郵送を行い返送されたデータについても情報収集を進めており,2万人規模のコホート追跡調査を行う基盤としてのシステムが機能するに至った。脳血管障害を含めた生活習慣病などの頻度の高い疾患は、ゲノムの遺伝要因や生活習慣などの環境要因が複雑に組み合わさって発症すると考えられており、グローバルCOE研究から続く山形県コホート研究を用いたゲノムコホートによる前向き研究として、ITネットワーク化による網羅的疾患追跡方法の開発と脳血管障害のゲノムコホートによる病因遺伝子の探索を行った。この結果、遺伝子Xならびに遺伝子Yを候補遺伝子として得た。遺伝子Xは脳血管障害の基礎疾患として知られる心房細動に強く関連し、遺伝子Yは基礎疾患とは関係なく脳血管障害と関連していた。平成26年度は、県内4地域の二次保健医療圏うち、既に稼働の3地域(置賜、庄内、最上)の医療情報ネットワークの基幹病院と高セキュリティ回線によるシステムの直接接続を行い、診療情報の共有化を可能とした。また、山形県対脳卒中研究会から得られた疾患罹患データより、脳血管障害から梗塞型の病型を呈する症例について、山形県コホート健常者を対照群として、Illumina 660W DNAチップによるSNPタイピングを行い、ハプロタイプ並びにコピー数変化について関連解析を行い、複数の候補遺伝子が得られた。さらに、山形県コホート研究を推進し,年度末の研究協力者数は,18,955人になった。また,約1,500人分の検体を用いたゲノム解析をJーMICC(日本多施設共同コホート研究)を通じて理化学研究所で測定する共同研究を開始するなど共同研究の推進を図った。引き続き、医療情報ネットワークシステムの利用拡大を促すとともに、疾患患者情報収集拡大に努め、網羅的疾患情報の追跡方法の確立に向けた検討を進める。また、平成27年度に得られた候補遺伝子について山形県コホートサンプルでの頻度解析、ならびに大学附属病院等施設の脳卒中罹患者で解析を通して、検証研究を進め、該当候補遺伝子変異と疾患特異性について解析を行う。さらに、脳血管障害を対象とした次世代のゲノム情報解析技術の実地応用で得られた遺伝子バリアントについて、2万人コホートでの解析を通して得られた該当者のベースライン調査データを用いて、脳卒中予測因子の探索を進めるのと同時に山形県コホート参加者の追跡調査を推進する。28年度が最終年度であるため、記入しない。脳神経外科学医療情報のゲノムコホート研究における活用に向けた取組のためのパイロットスタディを行う。具体的には、平成26年度に構築したシステムを用いて、同意を得た研究協力者のカルテの閲覧を行い、複数疾患に関する疾患網羅的情報の収集を行い、最終目標である網羅的疾患の追跡方法の確立に必要なシステムを構築する。また、山形県対脳卒中研究会から得られた疾患罹患データを使い、脳血管障害及びその治療反応についての遺伝環境相互作用解析を行い、平成27年度には、引き続きゲノムコホートデータを利用した遺伝因子間及び遺伝因子と環境因子の相互作用解析を行う。
企業的農業経営における雇用労働に関する研究

1.わが国の農家戸数は、高度経済成長期以降、農家労働力の農外就労、兼業化に伴って断続的に減少し、農民層分解は下降分解が支配的となり、零細規模の兼業農家が大量に滞留するようになった。しかし、一方、少数の雇用労働力に依存した企業的な農業経営が形成されてきたことも統計的に確認される。本研究は、そうした雇用依存型農業経営の存在に着目し、その実態、特に雇用依存型企業的農業経営における雇用の実態とその問題点を明らかにし、雇用面からみた雇用依存型企業的農業経営における課題を整理することを目的としたものである。本研究では、まず第1に、農業センサスの結果から農業雇用労働力の動向を分析し、第2に、全国農業会議所の協力で企業的農業経営のリストを作成し、当該経営に郵送法によるアンケート調査を実施し、その分析を行った。そして、第3に、全国各地で、面接聞き取りによる企業的農業経営の事例調査を実施し、その分析を行った。2.分析結果の要点は以下の以下のとおりである。(1)雇用依存型農業経営は、他産業就業機会の多い東海と他産業就業機会の少ない南九州で増加率が高く、法人形態の企業的農業経営は北海道と東北で増加している。(2)法人形態でない農家の場合、施設園芸の養鶏では年雇の依存が度高く、稲作、果樹作では臨時雇の依存度が高い、また、法人形態の企業的農業経営の場合、雇用専従者に依存する経営は養鶏と養豚が大部分である。(3)農業常雇・雇用専従者は中高年男子が大部分であるが、非農家出身の脱都会志向・脱サラの青年もみられる。(4)法人形態の企業的農業経営の賃金・労働条件は地域労働市場の水準に一応達しているが、社会保険の適用は十分ではない。(5)農業雇用労働力の確保はどこでも難しく、その対策として、経営者は、「快適な農作業環境」の整備、「賃金面での待遇改善」をあげている。1.農業センサス等関連統計資料の分析結果(1)農業雇用労働力の推移;1960年代以降、農業雇用労働力は減少の一途をたどってきたが、80年代に入ってストップが掛かり、85年農業センサスでは、若干増加した。(2)雇用形態別動向;農業雇用専従は畜産法人経営でのシェアが大きく、とりわけ養鶏、養豚の法人経営でのシェアが大きい。臨時雇用は、野菜作、花き・園芸部門でのシェアが大きい。(3)地域別動向;全体として、雇用専従、臨時雇用とも、北海道、九州、沖縄等、遠隔農業地帯でのシェアが大きいが、関東、東海、近畿等、大都市圏に包含される農業地域で臨時雇用の増加が指摘される。2.現地事情調査結果各地での農業雇用労働力の調達は、最近の労働力不足が反映して、5年前に比べてどこでも難しくなってきている。そうした中で、一部の畜産経営では、外国人研修生を受け入れ、雇用労働力の不足を補うといった事態もみられ、また、臨時雇用では、非農家主婦のパ-トが増大し、農業雇用労働力の供給源に変化がみられる。なお、一部の企業的農業経営では、社会保険の適用、福利厚生面での充実を図り、雇用労働力の確保に努めている。しかし、全体として、農業雇用労働力の調達は困難であり、農業雇用労働力の高齢化はきわめて著しく、とくに、臨時雇用の場合、主婦層を対象とした他産業のパ-ト労働市場による労働力吸収の影響を強く受けている。1.企業的農業経営の雇用事情アンケ-ト調査

全国農業会議所の協力で企業的農業経営の名簿リストを作成し、郵送法でアンケ-ト調査を実施した。リストアップされた企業的農業経営は、農業生産法人(農事組合法人、有限会社)が大部分であるが、個人経営も含み、全国(1道22県)300経営であった。アンケ-ト回収率は約5%で、回答経営の主要作目は、稲作、果樹、酪農、養豚、養鶏等に及び、稲作法人経営では、「もち」等の農産加工部門を持つものが比較的多かった。調査結果は、目下、集計分析中であるが、企業的農業経営における雇用労働力の確報状況は、全体として厳しさがうかがえるが、経営の後継者についていえば、確保している経営が比較的多い。なお、農事組合法人の場合、労働力確保および経営継承対策として、雇用労働力の構成員化、快適な作業環境の整備、社会保険適用事業所化等をあげている経営が多い点が指摘される。2.企業的農業経営の雇用実態調査実態調査は、(1)合資会社「愛鶏園」(本社・愛知県小牧市)のロッセファ-ム(岐阜県大野郡丹生川村、養豚・母豚1500頭の一貫経営)、(2)農事組合法人「サカタニ農産」(富山県福野町、水田受託管理・経営面積105ha)、(3)農事組合法人「穂高町農業生産組合」(長野県穂高町、経営面積・水田115ha)、(4)有限会社「舟方総合農場」(山口県阿武郡阿東町、酪農・成牛181頭、肉用牛257頭、花き園芸・温室990m^2ハウス2110m^2、野菜他)の各農業生産法人における実態を調査した。調査結果は、目下、整理分析中であるが、各経営とも、作業環境の整備、労働条件の改善に努めている点で共通している。本年度は、農業における雇用労働の量的推移を把握するために、「国勢調査」及び「農業センサス」による統計分析を行うとともに、前年度に実施した企業的農業経営を対象とした調査の分析を継続し、あわせて北海道、東北、関東、九州で現地事例調査を実施した。1.農業雇用労働に関する統計分析国勢調査の「従業上の地位別就業者数」によると、農業における雇用者数は、1970年118,881人、1975年133,827人、1980年142,972人、1985年167,360人、1990年185,905人と、1970年代以降、増加傾向が継続しており、19701990年の20年間で、56.4%の増加となっている。以上のように、農業就業人口が全体として減少する中で農業雇用者の絶対数が増加していることは、きわめて少数であるとはいえ、雇用労働に依存する企業的農業経営の形成・展開を示唆しているといえる。農業センサスによる農業雇用労働力の量的推移を検討するにたたつては、農家と農家以外の農業事業体における農業雇用労働力の推移をあわせてみなければならない。1970年以降の農業センサスによる農業雇用労働力の推移をみると、まず、農家の場合、年雇の雇入れ農家数及び年雇数はともに増加しているが、臨時雇の雇入れ農家数及び臨時雇延べ人数はともに減少している。農家以外の農業事業体では、臨時雇用は減少しているが、専従雇用は増加している。2.アンケート及び事例の分析農業生産法人の場合、比較的若い専従雇用者がみられ、養豚、養鶏等の施設型蓄産経営では、将来独立するための技術・技能修得を目的としたものが多く、酪農、大規模稲作経営では、一定期間後に法人の構成員なっているものもみられる。そうした経営における賃金水準・労働条件は地域労働市場にリンクしている。
小胞体ストレスで誘導される分子シャペロンを標的としたC型肝炎治療の開発

サイクロスポリンAのHCV増殖抑制が、分子シャペロンであるサイクロフィリンの活性阻害によることを証明するために、特異的遺伝子発現抑制法であるsiRNAを用いてサイクロスポリンAの標的宿主遺伝子であるサイクロフィリン遺伝子発現の抑制を行いHCV増殖への影響を解析した。その結果、小胞体蛋白の分子シャペロンであるサイクロフィリンBのsiRNAによるノックダウンがHCV増殖を抑制することを確認し、Gastroenteologys誌に論文として発表した。種々のERストレスを惹起する薬剤、すなわち蛋白の糖鎖付加を阻害するツニカマイシン、小胞体内カルシウム濃度を低下させるタプシガルギンなどのHCV増殖に与える影響を解析し、ERストレスの中でも小胞体からのカルシウムの枯渇がHCV増殖を抑制することを見出した。また小胞体内に蓄積しERストレスを惹起すると考えらるHCV構造蛋白を発現し、これまでのHCV非構造蛋白のみを発現するHCVレプリコンよりも生体内のHCV増殖をより忠実に再現するHCV全長レプリコンとして、JFH株による培養細胞増殖系の導入を行った。今後、これによりERストレスとHCV増殖の関連を検討する予定である。ATF6はERストレスすなわち小胞体での異常蛋白の蓄積に反応して、小胞体より核に移行しERストレス反応遺伝子群の発現を誘導するERストレス制御の最も上流に位置する転写因子であり、実際にサイクロスポリンによりHCV増殖細胞内で発現が亢進することを見出した。今後、ATF6により誘導されるERストレス反応遺伝子群のなかの如何なる遺伝子がHCV増殖において本質的役割をになっているかを明らかとするため、DNAマイクロアレイを用いた網羅的解析により、HCV増殖下で活性化される遺伝子のなかで、ATF6反応性遺伝子を同定する予定である。サイクロスポリンAのHCV増殖抑制が、分子シャペロンであるサイクロフィリンの活性阻害によることを検証するために、特異的遺伝子発現抑制法であるsiRNAを用いてサイクロスポリンAの標的宿主遺伝子であるサイクロフィリン遺伝子発現の抑制を行いHCV増殖への影響を解析した。その結果、小胞体蛋白の分子シャペロンであるサイクロフィリンBのsiRNAによるノックダウンがHCV増殖を抑制することを見出した。種々のERストレスを惹起する薬剤、すなわち蛋白の糖鎖付加を阻害するツニカマイシン、小胞体内カルシウム濃度を低下させるタブシガルギンなどのHCV増殖に与える影響を解析し、ERストレスの中でもいかなる刺激がHCV増殖を制御するかを検討した。また小胞体内に蓄積しERストレスを惹起すると考えらるHCV構造蛋白を発現し、これまでのHCV非構造蛋白のみを発現するHCVレプリコンよりも生体内のHCV増殖をより忠実に再現するHCV全長レプリコンを構築を開始した。これによりERストレスとHCV増殖の関連を検討する予定である。ATF6はERストレスすなわち小胞体での異常蛋白の蓄積に反応して、小胞体より核に移行しERストレス反応遺伝子群の発現を誘導する、ERストレス制御の最も上流に位置する転写因子である。我々はすでに、このATF6をsiRNAでノックダウンすることによりHCV増殖を抑制した。
デマンド対応型交通システム評価に関する手法論的研究

本研究課題においては,利用者とサービス提供者間が適切な情報交換を行い,効率的に車両を割り当て可能なデマンド対応型交通システムのサービスレベル評価を試みる.そのために,ランダムに発生する需要を車両に割り当てるアルゴリズムを開発することと,開発したアルゴリズムを用いたデマンド対応型交通システムの評価を行うことを試みた.研究最終年度である本年度においては,昨年度構築した乗客デマンド割り当てアルゴリズムを用い,学研都市けいはんなネットワークに適用することで様々な形態のデマンド対応型公共交通システムの評価を試み,各形態の長所・短所を整理することで,今後デマンド対応型交通システムの導入を検討する際に有用な知見を収集した.本研究で得られた具体的な知見は以下の通りである.1.乗車デマンドが増加し,複数車両が導入できればより運行効率性が高まり,コスト効率性の高いサービスが実現可能である.2.フルデマンド方式のDRTでは,バス容量を満たすほどの需要を割り当てることは困難であり,DRTサービスとしては小型車両の方が望ましい,3.予約順序のサービス効率性に及ぼす影響は小さくなく,事後割り当て方式によるサービスも視野に入れた議論が重要である.また,今後の課題として,1)DRT選択に関する意思決定構造の解明,2)異なる評価基準,許容待ち時間の変化など様々なケーススタディの実施,3)車両の容量を考慮する,時々刻々発生するデマンドを動的に割り当てられないなど割り当てアルゴリズムの改善,4)計算アルゴリズムの改良,などがあげられる.研究初年度である本年度には,デマンド対応型交通システムの核となる割り当てアルゴリズムの開発を行った.具体的な内容は以下の通りである.(1)デマンド対応型交通システムの周辺条件の整理デマンド対応型交通システムを一般公共交通システムとして位置づける場合,乗客及びサービス事業者が自身にとって有益であるものでなければならない.サービス事業者側にとっては有益であっても乗客に不利益を被るものであれば,乗車需要の確保が難しく,公共交通として評価できないものとなりうる.そのため,一般公共交通システムとして持つべき性質,すなわち乗客デマンド割り当てアルゴリズムの構築に当たって考えなければならない周辺条件を整理した.また,海外におけるデマンド対応型交通システム導入事例を収集し,成功理由や割り当てに関して考慮すべき点についての調査を実施した.さらに,関連する会議,講演会などに出席することで資料収集を行った.主としてオペレーションズリサーチの分野で多く提案されているデマンド割り当て問題(DaRP)の解法アルゴリズムに関して論文レビューを行い,それぞれの特徴および問題点を明らかにした.特に乗客の乗車・下車希望時刻の考慮の有無,走行中の車両にデマンドを割り当てることの可否,セミデマンドシステムへの対応可能性などの観点から,各割り当てアルゴリズムを比較した.(3)乗客デマンド割り当てアルゴリズムの開発(1)の周辺条件と(2)の既存アルゴリズムを参考に,実用性の高い乗客割り当てアルゴリズムの構築を行った.問題の定式化,バスの巡回ルートの表現方法などの検討を加えるとともに,定式化した問題の解法について考究し,仮想デマンドを用いて,アルゴリズムの妥当性の検討を行った.その結果,構築したアルゴリズムは想定した機能を有することが確認された.本研究課題においては,利用者とサービス提供者間が適切な情報交換を行い,効率的に車両を割り当て可能なデマンド対応型交通システムのサービスレベル評価を試みる.そのために,ランダムに発生する需要を車両に割り当てるアルゴリズムを開発することと,開発したアルゴリズムを用いたデマンド対応型交通システムの評価を行うことを試みた.研究最終年度である本年度においては,昨年度構築した乗客デマンド割り当てアルゴリズムを用い,学研都市けいはんなネットワークに適用することで様々な形態のデマンド対応型公共交通システムの評価を試み,各形態の長所・短所を整理することで,今後デマンド対応型交通システムの導入を検討する際に有用な知見を収集した.本研究で得られた具体的な知見は以下の通りである.1.乗車デマンドが増加し,複数車両が導入できればより運行効率性が高まり,コスト効率性の高いサービスが実現可能である.2.フルデマンド方式のDRTでは,バス容量を満たすほどの需要を割り当てることは困難であり,DRTサービスとしては小型車両の方が望ましい,3.予約順序のサービス効率性に及ぼす影響は小さくなく,事後割り当て方式によるサービスも視野に入れた議論が重要である.また,今後の課題として,1)DRT選択に関する意思決定構造の解明,2)異なる評価基準,許容待ち時間の変化など様々なケーススタディの実施,3)車両の容量を考慮する,時々刻々発生するデマンドを動的に割り当てられないなど割り当てアルゴリズムの改善,4)計算アルゴリズムの改良,などがあげられる.
呼吸および気道の神経性調節:末梢気管支の収縮特性についての検討

イヌに人工心肺を用いた体外循環を導入しました。これにより、筋弛緩薬を使用して呼吸運動を停止させても、生命維持が可能でした。この状態では、呼吸による胸腔内圧の変動がなく、気管支平滑筋の収縮は胸腔内圧に影響されません。そのため、気管支の純粋な収縮活動を記録することが出来ました。気管支の収縮活動は横隔神経活動と同期しており、その収縮は、横隔神経活動の開始から1.4±0.49秒遅れて吸気相中期に開始し、呼気相に最大値をとり、6.9±2.5秒のtime constantで漸減しました。このことは、気管支収縮が呼吸調節の中でも呼気調節に関与している可能性を示しています。人工肺へ二酸化炭素を負荷すると、横隔神経活動の頻度、振幅が増加します。この時、気管支の収縮活動も頻度が増加し、収縮が増強しました。また、気管支収縮の強さと横隔神経活動の振幅の最大値が直線性の有意な相関を示していました。このことから、気管支の収縮活動は、横隔神経活動と同様に、呼吸中枢から収縮の頻度、強さを調節されていると考えられました。また、両側の迷走神経を切断することにより、気管支の呼吸性収縮は消失しました。このことは、気管支の収縮活動が迷走神経を介した、呼吸と同期した神経性調節を受けていることを示しています。自発呼吸では気管支径は胸腔内圧の低下に抗して収縮します。しかし、横隔神経ペーシングによる擬似呼吸運動では、気管支径は胸腔内圧の低下とともに拡張しました。これらのことより、気管支は呼吸中枢からの指令で呼吸に同期した収縮を行っており、その収縮は、胸腔内圧の低下に抗して末梢気道形態を維持する役割を有していると考えられます。自発呼吸下でのイヌの気管支の収縮活動を気管支バルーンを用いて測定すると、その変化は胸腔内圧に強く影響されていました。しかし、詳細に検討すると、呼気終末に胸腔内圧に対抗した気管支の収縮が認められました。この収縮をより詳細に検討するため、人工心肺を用いた体外循環を導入しました。体外循環下で筋弛緩薬により非動化し、呼吸による胸腔内圧の変動を消失させます。これにより、胸腔内圧の影響を受けていない気管支の収縮活動を記録することが出来ました。この記録では、気管支の収縮活動は、横隔神経活動と同期して認められました。胸腔内の影響を受けない場合、気管支の収縮は、横隔神経活動の吸気相中期から始まり、呼気相に最大値をとっていました。次に、人工肺に二酸化炭素を負荷し、高二酸化炭素血症を生じさせると、横隔神経活動の頻度が増加し、振幅も増大しました。この時、気管支の収縮活動も横隔神経活動と同様に頻度が増加し、収縮が増強していました。この気管支収縮の強さと横隔神経活動の振幅の最大値の相関を調べたところ、直線性の有意な相関を示していました。
大腸腫瘍血管新生の分子病態解明と新規診断・治療法の開発

AEBP1は大動脈平滑筋およびアディポサイトに発現する遺伝子として同定され、転写調節因子として働くと考えられている。近年ではがん遺伝子としての機能が示唆されているが、AEBP1とがん間質との関係はこれまで知られていない。これまでの解析から、我々はAEBP1が大腸がん間質において重要な役割を担うことを明らかにしつつある。まず免疫染色の結果、AEBP1は大腸のほぼ全例においてがん間質に発現し、特に浸潤部に高発現することを見いだした。血管内皮細胞HUVECを用いた解析から、AEBP1は大腸がん細胞との共培養によって発現誘導されること、AEBP1のノックダウンはAQP1 (aquaporin 1)、POSTN (periostin)などの腫瘍血管関連遺伝子を含む多数の遺伝子発現を変化させ、血管内皮細胞の増殖・遊走・チューブ形成を阻害し、さらにマウスxenograftモデルにおいて微小血管新生と腫瘍形成を抑制することを見いだした。腫瘍血管新生におけるAEBP1の重要性を明らかとすることができた。AEBP1を標的とした治療法の可能性を探索する。AEBP1はがん線維芽細胞(cancer-associated fibroblast, CAF)においても高発現しており、CAFにおいても、AEBP1がCAFの増殖、活性化、大腸がん細胞の遊走・浸潤、腫瘍血管新生を促進する可能性が示唆された。CAFにおけるAEBP1の機能的意義を明らかとする必要がある。AEBP1抗体を用いたChIPシークエンスの条件検討に時間がかかり、シークエンスまでできなかった。タグ融合AEBP1を過剰発現させ、抗タグ抗体でChIPを行うことが可能となったので、次年度にシークエンスで使用する。
免疫反応による根尖性歯周炎の成立機序について

歯髄炎ならびにこれに継発して生じる根尖性歯周炎は,主として細菌性の侵襲に対して,局所に展開される生体防御反応の結果として発症するものである。それゆえ,局所で発動される炎症あるいは免疫反応の実態を詳細に検索することは,これらの疾患の成立過程を明らかにする上で必要不可欠なものと考えられる。このような観点から,本研究においては,歯髄炎ならびに根尖性歯周炎の成立過程において営まれる免疫反応の実態ならびに意義に関して,主として免疫組織化学的な手法を用いて実験病理学的に検索した結果,以下の知見を得た。1.ラット正常歯髄および根尖歯周組識における各種免疫担当細胞の局在をモノクロ-ナル抗体を用いて免疫組織化学的に検索した結果,ことに歯髄においては,外来侵襲を検知し処理するべく,極めて多数の組織球が常備されていることが明らかになった。2.抗原物質(Keyholeーlympet hemocyanin)で感作の成立したラットの歯髄に同一の抗原物質を作用させることにより,歯髄においてもArthus反応様の過敏反応が惹起され得る事が明らかとなった。また,本実験系において,Ia抗原陽性細胞およびマクロファ-ジが経時的増加を示した事により,これらの細胞が防衛担当細胞として歯髄炎の成立過程に関与している可能性が示唆された。3.Cyclophosphamide投与により生体防御反応を抑制した条件下では,ラットに実験的に惹起させた根尖性歯周炎において,病巣内に細菌の侵入を認めるとともに,骨吸収などの組織破壊が亢進することを見出した。また,本実験条件下では,好中球の浸潤が著明に抑制されていたことから,これらの組織変化は,好中球による非特異的防御反応の抑制に依存したものと考えられた。SPF飼育SD系雄性ラット(屠殺時9週齢)の上顎切歯を用いて、これらを4群(・感作後抗原貼付群、・感作後生理食塩水貼付群、・無感作抗原貼付群、・無感作後生理食塩水貼付群)に分けた。抗原としては、KLHを用い、Freundのアジュバントと混和して、2週間間隔で3回感作を行った後、3日後、上顎切歯の断髄面にKLHもしくは生理食塩水を貼付け仮封した。術後、3、6、12、24、48時間経過後に屠殺し、切片を作製(ホルマリン固定、EDTA脱灰したパラフィン切片、ブアン固定、EDTA脱灰したパラフィン切片、PLP固定した凍結切片)し、断髄面にみられる反応を病理組織学的(HE染色、ギムザ染色、リンタングステン酸ヘマトキシリン染色)及び免疫組織学的(ビオチン化ウサギ抗体ラットIgGを用いたABC法、1次抗体としてOX6、ED2、W3/13などのモノクロナール抗体を用い、2次抗体としてビオチン化ウマ抗マウスIgGを用いたABC法)に検索した(OX6:抗ラットIa抗原陽性細胞、ED2:抗ラットマクロファージ、W3/13:抗ラットTリンパ球、顆粒球、形質細胞)。結果、感作後抗原液貼付群においてのみ、抗原貼付24時間後をピークとする著しい好中球の浸潤が惹起された。また、断髄面直下の小血管周囲にIgGの沈着およびフィブリノイド変性が観察された。他の群では、軽度の炎症性変化が認められるのみであった。以上より、今回の歯髄炎は、アルサス反応型の機序により炎症が修飾されている可能性が示唆された。また、大きな細胞質を有するIa抗原陽性細胞は、歯髄全体に散在しており、特に血管周囲に多く観察された。抗マクロファージ抗体で染色された細胞は、Ia抗原陽性細胞の存在部位及び形態とほとんど一致していた。

これらの細胞は、特に断髄面の近傍において、24時間までは増加の傾向を示した。一方、全期間を通じ形質細胞はほとんど認められず、極めて少数のTリンパ球が歯髄中に観察されるのみであった。SPF飼育SD系雄性ラット(屠殺時9週齢)の左右下顎第一臼歯を用い、これらを以下の4群に分けた。即ち、KLH感作後抗原(KLH)液貼付群、感作後生理的食塩水貼付群、無感作抗原液貼付群、無感作生理的食塩水貼付群、である。抗原としてはKLH(Keyhole Limpets Hemocyanin)を用い、これをFreundの完全アジュバンドあるいは不完全アジュバンドと混和して、2週間間隔で3回以上感作(背部皮下、Food Pad、鼠径部など)を行った。最終感作4日後(感作成立をOuchterlony法にて確認後)に、下顎第一臼歯の遠心根をラバ-ダム防湿下にて出来るかぎり無菌的に抜髄した。さらに根管拡大の作業長を3.5mmとして、30号まで拡大した。拡大終了後、KLHもしくは生理的食塩水を滅菌ペ-パ-ポイントに滲みこませて根管内に貼付し、アマルガムにて確実に仮封した。術後24時間、48時間、1週、2週経過後に屠殺し、下顎第一臼歯を下顎骨ごと取り出し、レントゲン撮影後、PLP固定、EDTA-glycrrol低温脱灰し、凍結切片を作製あるいはホルマリン固定、EDTA脱灰し、パラフィン切片を作成した。現在、根尖歯周組織にみられる組織反応を病理組織学的(HE染色)に観察しているが、細菌感染の影響と思われる組織反応も多く観察され、無菌的処置の再評価を急いでいる。また、免疫組織化学的手法を用いての観察も行えるように、現在その染色法の確立も目指している。本年度においてはまず,ラット臼歯正常歯髄および根尖歯周組織における各種免疫担当細胞の局存について,モノクロ-ナル抗体を用いて免疫組織化学的に詳細に検索した.その結果,歯髄においては,外来侵襲を検知し処理するべく,極めて多数のIa抗原陽性あるいは陰性の組織球が常備されていることが明らかになった.しかしながら,根尖歯周組織においては,組織球は少数が存在するのみであった.リンパ球は歯髄,根尖歯周組織ともほとんど認められなかった.次にアルキル化剤であるCyclophosphamide(CY)の投与により生体防御反応を抑制した条件下での,ラット実験的根尖性歯周炎の成立過程の変動を免疫組織化学的に検索した.すなわち,CY(75mg/kg/week,i.p.)投与下で,ラット下顎第一臼歯を露髄後開放のまま放置することにより実験的に根尖病変を誘発させ,2週間経過後における病変部の組織変化を免疫組織化学的に検索した.その結果,CY投与群においては,病変内に細菌の侵入を認めるとともに,骨吸収などの組織破壊が,コントロ-ル群と比較して亢進していることを見出した.免疫組織化学的には,CYの投与は,マクロファ-ジあるいはIa抗原陽性細胞の病変部への浸潤に対してはほとんど影響を示さないが,好中球の浸潤は著明に抑制することが明らかとなった.従って,これらの組織変化は主として好中球によって営まれる防御反応の抑制に依存したものと考えられた.
ムチン母核構造を認識する抗体を用いた羊水塞栓症の新しい診断

各種抗体による免疫組織染色1)実験的羊水塞栓症モデルにおける免疫組織染色胎便懸濁液のかわりに生理的食塩水を耳静脈より投与したコントロール群のウサギにおいては、TKH-2免疫染色の結果、気管支ゴブレット細胞のみ顆粒状に染色された。一方、アルシャンブルー染色ではTKH-2免疫染色と同様に気管支ゴブレット細胞に染色が認められる以外に気管支軟骨にも陽性所見を認めた。胎便懸濁液静注後1時間と2時間のウサギにおいてはTKH-2免疫染色の場合、肺小動脈内および肺末梢動脈内に陽性所見を認めた。アルシャンブルー染色においても同部位が青色に染色された。肺静脈内にも弱陽性ながら陽性所見が得られた。しかし、この部位のアルシャンブルー染色は陰性であった。2)ヒト羊水塞栓症例における免疫組織染色肺組織のTKH-2免疫染色では全例において肺毛細血管内に陽性所見が得られた。比較的太い血管内にも濃く染色され、この部位には好中球の浸潤が多く認められた。動物実験と同じようにTKH-2免疫染色はアルシャンブルー染色より感度が良好であった。羊水塞栓症は、羊水及び胎便が母体血中に流入することにより発症する。そこで我々は羊水及び胎便中に豊富に含まれるムチンに着目した。このムチンに対し、ムチン母核構造を認識する5種類の抗体(TKH-2,MA54,MA61,CC49,B72.3)が反応すれば、血中に流入したムチンを定量的に測定することが可能であると推測し以下の実験を行なった。羊水及び胎便よりムチンを豊富に含む分画をゲル濾過法により抽出し(胎便抽出液)、これをエライザープレートに固相した胎便プレートを作成した。この胎便プレートで5種類の抗体の胎便抽出液に対する反応性を確認し、また特異性を11種類の糖鎖を用いたcompetition assayにより検討した。さらに、この胎便抽出液に対する5種類の抗体の感度をDot blot法にて検討した結果、TKH-2抗体が感度及び特異度に関し最も優れた抗体であることを証明した。そこで、このTKH-2抗体を用いて羊水塞栓症を発症した5患者の血清でそのSTN抗原濃度を測定した。コントロール群に羊水塞栓症症状を示さなかった分娩直後の母体血清を用い比較したところ、羊水塞栓症を発症した患者血清中のSTN抗原濃度は、コントロール群に比し有意に高値を示した。次に、羊水及び胎便を静注したウサギ動物実験羊水塞栓症モデルを作成し、その肺、肝臓及び腎臓を摘出した。これらに対し従来のムチン染色であるアルシャンブルー染色とTKH-2抗体を用いた免疫染色(ABC法)で、ムチンに対する染色感度を比較検討した。この結果、アルシャンブルー染色よりTKH-2免疫染色の方が、胎便由来のムチンに対し染色感度の良いことが確認された。ヒト羊水塞栓症の肺組織1例につき同様の病理学的検索を行なった。この結果も動物実験モデルと同じ結果を示した。以上より、羊水塞栓症の血清学的診断及び病理学的診断において、TKH-2抗体を用いた診断方法は、有用な検査法の一つであることが確認された。羊水塞栓症例4例が解析され、血中STN値は105.6±59.0U/mlと対照例より高値を示した。Control例のSTN値は11.8±5.6U/mlであった。さらに剖検で入手した母体肺組織をTKH-2抗体で免疫染色すると、気管支以外に肺の血管内に腸性所見が得られた。従来法であるアルシャンブルー染色と比較すると感度が優れていた。TKH-2染色陽性部を詳細に検討すると染色強度が強いところには白血球、好中球の浸潤が多いことに気付いた。我々は胎便あるいは羊水中のムチンが補体を活性化しその結果好中球等の炎症細胞が多く浸潤しているもと推定した。羊水塞栓症の原因か結果かは現時点では不明であるが、臨床的には血中濃度の測定により生前に診断が可能となり、死亡例では剖検例で肺の組織染色により確定診断が可能になった。
脳波・磁気刺激併用法による選択的な前頭葉制御機構の解明

本研究課題は前頭葉制御のメカニズムを、前頭葉から後方連合領域に至るトップダウン経路の信号伝達効率の上昇として明らかにすることを目的としている。このためにまず経頭蓋磁気刺激(TMS)を行いながら被験者の脳活動を脳波により持続的に記録できる実験システムを構築した。本年度の研究では、正常人被験者が特定の視覚次元に選択的注意を向けているときに前頭葉TMSを行ったところ、注意を向けた視覚次元に応じてTMS誘発性脳電位変化が脳表上を異なったパターンで伝播することが明らかになった。さらにTMSを行って30ミリ秒後の脳電位変化の電流源を解析したところ、その視覚次元処理に特化した後方連合領域に電流源が同定された。選択的注意において前頭葉から後方連合領域に対してトップダウン信号が送られると考えられているが、この結果は後方連合領域における前頭葉からの信号伝達効率の変化としてトップダウン信号の実体を初めて明らかにしたものといえる。脳領域間の情報伝達の様相を10ミリ秒単位で特定できる本実験系は、高次認知機能の脳内メカニズムの動的側面を明らかにする有用な手段となる。さらに本年度は前頭葉前方部の脳腫瘍を切除した患者さんを対象として機能的核磁気共鳴画像を用いた実験を行った。前頭葉前方部が損傷を受けていても、注意を向けた視覚次元に対応した後方連合領域に正常な活動の上昇が認められたが、前頭葉後方部と後方連合領域の機能的連関が低下すること、そしてこれが注意の切り替えの障害に対応していることが明らかになった。局所脳領域の活動の解析に終始していた従来の研究から、脳領域間の信号のやり取りに焦点をあてるという一貫した目標のもと研究を行い、今後の新たな研究の展開のさきがけとなる成果が得られた。研究代表者は機能的MRI法を用いて脳領域間での情報の流れに関する解析を行ってきた。特に注意を向ける際や行動を準備する際に、前頭前野から課題に関連した後方連合野に対して選択的な制御信号が送られるとの仮説を検証してきた。本研究課題では脳波計測と磁気刺激を組み合わせることにより、高い時間的解像度で制御信号の流れを可視化しようとする試みである。初年度である平成17年度は、脳波計測中に経頭蓋磁気刺激を行うことが可能なシステムのセットアップを完了した。通常の脳波計では、磁気刺激により電気増幅回路が過負荷となって脳波記録不能となってしまう。このため磁気刺激パルスをトリガーとして、3ミリ秒だけ回路を遮断するシステムを導入することにより過負荷の問題を解決した。また経頭蓋的に磁気刺激を行う場合、脳のどの領域を刺激していることになるのかを正確に知る必要がある。このために機能的MRIにより得られた脳活動情報を3次元再構成し、頭表におかれた磁気コイル、脳波電極と同一画面上に表示するシステムを開発した。以上のシステムを利用して選択的視覚注意課題を用いた実験を行った。まず正常人被験者が視覚標的の動き、あるいは色に注意を向けてその属性に対する判断を下しているときの脳活動を機能的MRIにより計測した。その結果、前頭前野の8野から前頭眼野、および後部頭頂間溝領域が視覚標的提示前から持続的に活動することが明らかとなった。ついで同じ被験者が同じ課題を行っている際に脳波計測を行い、機能的MRIで活動が見られた前頭前野に磁気刺激を行った。課題遂行時と安静時で磁気刺激効果が異なることは明らかとなったものの、脳表での刺激波及効果は被験者間で不安定であった。本研究課題は前頭葉制御のメカニズムを、前頭葉から後方連合野に至るトップダウン経路の信号伝達効率の上昇として明らかにすることを目的としている。このためにまず経頭蓋磁気刺激(TMS)を行いながら被験者の脳活動を脳波(EEG)により持続的に記録できる実験システムを構築した。本年度は正常人被験者が特定の視覚次元に選択的注意を向けた際に前頭葉TMSによって誘発される脳波変化が、課題に関連した後方連合野に限局して伝わる様相から前頭葉制御の選択性を証明した。15名の正常人被験者を対象として、顔画像とサイン波のノイズパターンが重なった画像を標的刺激として用い、顔の性別判断、あるいはノイズパターンの動く方向を判断する課題を行った。前頭眼野(FEF)にTMSを行ったところ、動き検出課題を行っている際には顔判断課題を行っている際に比べてより強い電位変化が、視覚運動情報を処理するMT野上の電極で認められた。この電位変化はTMS後、30ミリ秒から認められた。ところが被験者が課題を準備する時間が十分にない場合にはこの効果は観察されなかった。以上の結果からTMS誘発電位変化は、前頭葉から後方連合野に至るトップダウン経路の信号伝達効率を反映していると結論付けた(Morishima et al. Abstr Soc Neurosci 2006)。以上の結果は同一の課題を用いた機能的MRI実験の結果と合致するものであった。脳領域間の情報伝達の様相を10ミリ秒単位で特定できる本実験系は画期的なものであり、高次認知機能の脳内メカニズムの動的側面を明らかにする有用な手段となる。また本年度はTMSを頭頂葉あるいは上側頭葉に与えることで不活化し、単語に対する意味分析あるいは発音分析という課題特異的な情報の流れをブロックすることに成功した(Nakamura et al. Neuron 2006)。