hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
局所液相エピタキシャル成長によるGeSnワイヤの形成とその光電子デバイス応用

急速加熱処理による液相エピタキシャル成長法により単結晶GeSn細線を非晶質基板上に形成し、それを用いた電界効果トランジスタとフォトダイオードを試作し、その特性を評価した。トランジスタ特性より求めた正孔の電界効果移動度はピーク値で423 cm2/Vsに達した。また、フォトダイオードについては光通信で用いられている波長1.55 μmの光に対して良好な光応答を確認することができた。本研究課題は、局所液相エピタキシャル成長によるGeワイヤ作製法を進化させ、歪み制御したSn添加Geワイヤを作製し、次世代の高度情報化社会を担う高速かつ低消費電力の光・電子融合デバイスへの応用を目指すものである。Si-LSIの微細化が限界に近づいている現在、ポストスケーリングテクノロジーによるLSIの高性能化を目指す研究が盛んに行われている。GeはSiより高移動度を有するチャネル材料であり、Siに比べ電子で2.5倍、正孔で3.5倍の値を示すが、歪み印加によるさらなる移動度向上が期待されている。また、光通信で用いられる1.55 um帯の光に感度を持つため、Si-LSIに集積可能な光検出器用材料としても注目されてきたが、2010年にはSi基板上に形成したGeにおいて歪み制御と高濃度ドープを併用することにより室温でのレーザー発振が確認されている。さらに、歪み印加に加え、Snを添加することによりさらなる移動度の向上と間接遷移型から直接遷移型半導体へのバンド構造変調が示唆されており、次世代の高度情報化社会を担うと期待されている高速かつ低消費電力の光・電子融合デバイスへの期待が高まっている。本研究では、局所液相エピタキシャル成長を用いた歪み制御Sn添加Geワイヤの作製とその基礎的知見の取得、また電子デバイス応用に向けたトランジスタの試作と特性評価、さらに光・電子融合デバイスに向けた光学特性評価とフォト・発光ダイオードの試作を行う。平成27年度は局所選択液相エピタキシャル成長実験の装置整備、横方向選択液相エピタキシャル成長のSn添加歪み制御技術の基礎的知見の取得、トランジスタの試作とデバイス特性評価を行った。トップゲートのトランジスタを試作したところ、420 cm2/Vsを超える良好な電界効果移動度を確認することができた。デバイス作製プロセスにおいてリーク電流の発生等の問題が発生したが、プロセスの見直しを行うことにより正常な特性を示すトランジスタを作製することができた。本研究では、局所液相エピタキシャル成長を用いた歪み制御Sn添加Geワイヤの作製とその基礎的知見の取得、また電子デバイス応用に向けたトランジスタの試作と特性評価、さらに光・電子デバイス融合デバイスに向けた光学特性評価とフォト・発光ダイオードの試作を行う。本年度は下記の3項目を行った。1)シードレス横方向選択液相エピタキシャル成長のSn添加歪み制御技術の基礎的知見の取得:前年度、シードを用いずに石英基板上で横方向選択液相エピタキシャル成長を実現することができた。本年度は、作製したGeSnワイヤについて、電子後方散乱回折(Electron BackScattering Diffraction : EBSD)による結晶方位分布測定、透過電子顕微鏡(TEM)による結晶欠陥評価、X線回折による歪み測定を行った。GeSnワイヤにはGeとSiの熱膨張係数差に起因する0.4%の引張り歪みが印加されているが、石英基板を用いることにより、0.5%の引張り歪みが印加されていることが確認できた。(2)トランジスタの試作とデバイス特性評価:石英基板上のGeSn細線について、トップゲートのトランジスタを試作し、デバイス特性の取得により、本手法の有効性を確認した。Sn組成2.6%のGeSnワイヤでピーク電界効果移動度で423 cm2/Vsの値が得られ、本手法の有効性を示すことができた。(3)光学特性評価とフォト・発光ダイオードの試作:電気特性評価と平行して光学特性評価を進め、1.5 umの光に対する光応答を確認することができた。当初の計画通り、おおむね順調に進展している。本研究課題は、局所エピタキシャル成長によるGeワイヤ作製法を進化させ、歪み制御したSn添加Geワイヤを作製し、次世代の高度情報化社会を担う高速かつ低消費電力の光・電子融合デバイスへの応用を目指すものである。本研究では、局所液相エピタキシャル成長によるGeワイヤの作製とその基礎的知見の取得、また、電子デバイス応用に向けたトランジスタの試作と特性評価、さらに光・電子融合デバイスに向けた光学特性評価とフォト・発光ダイオードの試作を行う。本年度は下記の4項目を行った。1)反転型nチャネルトランジスタの試作と特性評価:局所液相エピタキシャル成長により作製したp型Geワイヤにイオン注入によりn型ソース/ドレイン領域を形成しトランジスタを試作した。活性化アニール条件を最適化することにより271 cm2/Vsという高い電子移動度を確認することができた。2)近赤外領域の発光ダイオードの試作と特性評価:1)と同様にイオン注入によりpn接合を形成し、フォトダイオードを試作したところ、低い暗電流と高いon/off比を同時に達成することができた。3)レーザー溶融結晶化による単結晶GeSnアレイの作製とフォトダイオードの近赤外受光

特性評価:実用化を目指しレーザーアニールによる局所加熱による局所液相エピタキシャル成長法を検討し、単結晶GeSnアレイを形成できることを示した。また、この手法により作製したフォトダイオードの近赤外受光特性を評価したところ、1.55 um光に対し、1.3 A/Wという高い受光感度を確認することができた。4)室温レーザー発振に向けたファブリ・ペロー(FP)型共振器の試作と特性評価:Geワイヤを短冊状に加工することでFP型共振器を作製した。共振ピークが共振長に対応することからFPモードの共振であることが確認できた。急速加熱処理による液相エピタキシャル成長法により単結晶GeSn細線を非晶質基板上に形成し、それを用いた電界効果トランジスタとフォトダイオードを試作し、その特性を評価した。トランジスタ特性より求めた正孔の電界効果移動度はピーク値で423 cm2/Vsに達した。また、フォトダイオードについては光通信で用いられている波長1.55 μmの光に対して良好な光応答を確認することができた。平成27年度に引き続き実験の装置整備、エピタキシャル成長のSn添加歪み制御技術の基礎的知見の取得を進めつつ、トランジスタの作製プロセスの最適化を進める。また、光学特性評価とフォト・発光ダイオードの試作を行い光デバイス材料としての特性評価を行う。当初の計画通り、おおむね順調に進展しているので、引き続き、研究を着実に進めていきたい。29年度が最終年度であるため、記入しない。電子デバイス材料29年度が最終年度であるため、記入しない。
糖尿病の新しい病型「非自己免疫性劇症1型糖尿病」の確立

1型糖尿病は、「(自己)免疫性」と「非(自己)免疫性=特発性」の2つの亜型に分けられている。しかし、特発性(非自己免疫性)1型糖尿病については不明な点も多い。我々は、患者の臨床的、病理学的分析により、特発性1型糖尿病の中に、きわめて激烈な発症様式を示す患者のいることに気付き、新しいタイプの糖尿病の存在を確立すべく検討を行った。大阪大学分子制御内科の関連病院において、過去5年間に受診した成人の急性発症1型糖尿病患者すべてを対象に、きわめて激烈な発症様式を示す1型糖尿病がどの程度の頻度で存在するのか、また、その特徴はどういうものか、をhospital baseで検討した。その結果、5年間で発症早期(発症後1年未満)の1型糖尿病患者は56名あり、そのうち、抗GAD抗体が陰性で激烈な発症様式を示した者は11名であった。それらの患者の特徴は以下の如くである。1.糖尿病関連抗体が陰性である。2.ケトアシドーシスを伴って非常に急激に発症する。3.発症時に著明な高血糖を認めるにもかかわらず、HbA1cは正常または軽度上昇にとどまる。4.尿中Cペプチドは10μg/day以下と発症時に既にインスリン分泌は枯渇している。5.発症時に血中膵外分泌酵素の上昇を認める。6.膵島炎を認めない。7.膵外分泌腺にTリンパ球を主体とした単核球の浸潤を認める。我々は、これらの特徴を有する一群の糖尿病を、「劇症1型糖尿病)」と名付けた。成因としてウイルス感染が推定される。現在、全国調査を行い、病因・病態の解明、診断基準の作成を行っている。我々は、これらの特徴を有する一群の糖尿病を、「劇症1型糖尿病」と名付けた。本研究の結果、1型糖尿病は、1)自己免疫性、2)非自己免疫性劇症型、3)非自己免疫性慢性型、の3亜型に分類されるべきものと考えられた。
広塩性魚類における浸透圧と血圧の内分泌調節機構

1.竹井は、マンチェスター大学のBalment教授の研究室を訪問して、博士が実験動物として用いているカレイ(Platichthys flesus)を用いて次の実験を行なった。(1)カレイに血管弛緩物質であるpapaverineを注射して血圧を下げ、その後経時的に血漿アンギオテンシン濃度、バソトシン濃度、飲水量等を測定した。次に、血液中でのアンギオテンシンの生成を抑制するカプトプリルで前処理した際の、バソトシン分泌や飲水量に対する影響を調べた。哺乳動物では、アンギオテンシンが、バソプレシン分泌や飲水を促進することが知られている。(2)竹井は、ウサギで心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)の構造を魚類で初めて明らかにし、それを合成した。そこでそのANPをヨーロッパウナギに注射して、血液中のアンギオテンシンやバソトシン濃度に対する影響を調べた。哺乳動物では、ANPはアンギオテンシンの生成やバソプレシンの分泌を抑制することが知られている。2.兵藤も、マンチェスター大学のBalment博士の研究室を訪問して、次の実験を行なった。(1)兵藤は、自らクローン化したニジマスバソトシンのcDNAを用いて、ニジマスを淡水から海水に移すとバソトシンmRNAの発現が減少することを明らかにした。一方、Balment博士のグループは、バソトシンのラジオイムノアッセイを用いて、ニジマスを淡水から海水に移すと血漿バソトシン濃度が減少することを明らかにした。そこで、カレイに対して同様の実験を協力して行なった。(2)アンギオテンシンが、バソトシンの血漿濃度を上昇させることは既に述べたが、同時に合成速度も上昇しているか否かを調べるため、アンギオテンシンを注射した後の、ニジマス視床下部におけるバソトシン合成速度の継時的変化を調べた。3.浜野は、以前共同研究を行なったセント・アンドリュース大学のHazon博士を訪問して、次の実験を行なった。(1)竹井らは、軟骨魚類にはないといわれていたアンギオテンシンをドチザメで発見し、その構造を明らかにした。そこで合成ホルモンを用いて、ドチザメの血圧に対する作用を調べたところ、作用機構が他の魚類と異なることが明らかになった。そこで今回、ドチザメの単離血管標本を用いて、アンギオテンシンの作用機構を更に明らかにした。(2)竹井らは、ドチザメでC型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)を単離し、これが唯一のサメのナトリウム利尿ペプチドであることを明らかにした。そこで、合成CNPを用いて、ドチザメの単離血管標本に対する作用を調べた。
Th1関連ケモカインCXCR3及びCCR5の実験的自己免疫ぶどう膜炎における役割

目的:ぶどう膜炎の動物モデルであるマウス実験的自己免疫ぶどう膜炎モデル(以下、EAUと略す)おいて、Th1細胞の眼内浸潤が炎症惹起に中心的役割を果たす事が知られている。本研究は、マウスEAUにおける、Th1関連ケモカイン受容体(CXCR3,CCR5)の意義を明らかにする事を目的として、CCR5とCXCR3を共に欠失するダブルノックアウトマウス(DKO)を用いて、EAUの重症度を野生株マウス(WT)と比較した。方法:ヒト網膜内蛋白の合成ペプチド(IRBPp)200μgをWTマウス、DKOマウスに免疫してEAUを惹起させた。免疫後22日目にマウスの眼底を観察してEAUの重症度を臨床的、病理組織学的に検討した。同時に、マウスの頚部リンパ節と脾臓よりリンパ球を採取し、IRBPp刺激下で培養して、増殖反応の強さと産生されるサイトカイン濃度を調べた。結果:WTマウス、DKOマウスの免疫後22日目の臨床的EAUスコアは、0.85±0.97、2.94±1.56であり、DKOマウスで有意に高度であった(p<0.01)。病理学的EAUスコアも各々0.88±1.23、2.65±1.80で、DKOマウスで有意に強く、眼内への顆粒球の浸潤がより強い事が観察された。リンパ球増殖試験では、脾臓・頚部リンパ節細胞ともに、DKOマウスでWTより強い増殖が見られた。脾臓・頚部リンパ節細胞におけるIFN-γの産生がDKOマウスで有意に亢進しており、脾臓リンパ球におけるIL-6産生もDKOマウスで亢進していた。結論:CXCR3、CCR5両者を阻害すると、眼内へのTh1リンパ球の遊走が阻害され、頚部リンパ節と脾臓に留まるIRBPp感作リンパ球が増加していた。しかし、脾細胞におけるIL-6産生が亢進する事で、顆粒球系細胞による代償機転が働き、眼内への顆粒球浸潤の増加して、ぶどう膜炎の悪化が起きていると考えられた。目的:ぶどう膜炎の動物モデルであるマウス実験的自己免疫ぶどう膜炎(EAU)おいて、Th1細胞が眼炎症の惹起に中心的な役割を果たしている。本研究は、マウスEAUにおける、Th1関連ケモカイン受容体(CXCR3,CCR5)の役割を明らかにすることを目的として、CCR5とCXCR3をともに欠失しているダブルノックアウトマウス(DKO)を用いて検討した。方法:ヒトIRBPペプチドを正常C57BL/6マウス、およびDKOマウスに免疫してEAUを惹起させ、免疫後21日目に眼底を観察してEAUの重症度を臨床的に評価し、22日目に眼球摘出して病理組織学的にも検討した。同時にマウスの頚部リンパ節と脾臓よりリンパ球を採取し、ペプチド刺激下で培養し、増殖反応の強さと、産生するサイトカイン濃度を調べた。結果:DKOマウス(n=30)、正常B6マウス(n=31)の免疫後21日目の臨床的EAUスコアは、それぞれ2.0±1.8、0.9±1.3であり、DKOマウスで有意に高度であった(p<0.05)。病理学的にもDKOマウスでより強いEAUが発症しており、眼内への顆粒球の浸潤が多い事が観察された。リンパ球増殖試験では、脾臓・頚部リンパ節細胞共に、DKOマウスでより強い増殖が見られた。サイトカイン産生試験では、脾臓・頚部リンパ節細胞におけるIFN-γの産生がDKOマウスでWTより有意に亢進しており、脾臓リンパ球におけるIL-6産生もDKOマウスで有意に亢進していた。結論:ケモカイン受容体CXCR3、CCR5両者を阻害すると、眼内へのTh1リンパ球の遊走が阻害されるために、頚部リンパ節と脾臓でIRBPペプチド感作リンパ球が増えるている事が考えられた。また、脾細胞のIL-6産生が亢進することで、主に顆粒球系細胞による代償機転が働き、顆粒球浸潤の増加によって、かえってより強い炎症が起こる可能性が考えられた。

結果:WTマウス、DKOマウスの免疫後22日目の臨床的EAUスコアは、0.85±0.97、2.94±1.56であり、DKOマウスで有意に高度であった(p<0.01)。病理学的EAUスコアも各々0.88±1.23、2.65±1.80で、DKOマウスで有意に強く、眼内への顆粒球の浸潤がより強い事が観察された。リンパ球増殖試験では、脾臓・頚部リンパ節細胞ともに、DKOマウスでWTより強い増殖が見られた。脾臓・頚部リンパ節細胞におけるIFN-γの産生がDKOマウスで有意に亢進しており、脾臓リンパ球におけるIL-6産生もDKOマウスで亢進していた。結論:CXCR3、CCR5両者を阻害すると、眼内へのTh1リンパ球の遊走が阻害され、頚部リンパ節と脾臓に留まるIRBPp感作リンパ球が増加していた。しかし、脾細胞におけるIL-6産生が亢進する事で、顆粒球系細胞による代償機転が働き、眼内への顆粒球浸潤の増加して、ぶどう膜炎の悪化が起きていると考えられた。
腫瘍溶解アデノウイルスを用いた悪性中皮腫に対する新規治療法の開発

癌特異的なミッドカインプロモーターによりウイルスの複製及び自殺遺伝子の発現が制御される腫瘍溶解アデノウイルスを開発し、1)悪性中皮腫細胞を初めとする多くの癌細胞特異的に細胞障害をきたす事、2)ヒト悪性中皮腫細胞株を皮下、胸腔内、腹腔内に移植した担癌マウスにおける抗腫瘍効果、3)自殺遺伝子療法併用による抗腫瘍効果の増強を示した。本研究の成果は、我々が開発した本ウイルスが悪性中皮腫の新規治療法として臨床応用される道への第一歩である。本研究では、in vivo蛍光イメージングによる非侵襲的な診断・治療評価が可能な悪性中皮腫の致死性進行癌モデルマウスを作製し、このモデルを用いて本ウイルスの抗腫瘍効果及び安全性を検討する事によって、次世代に向けた先端治療法としての開発を目指す。本年度は、悪性中皮腫のin vivoイメージング致死性モデルの作製及びその検証を行った。まずmCherry(組織透過性の高い赤色蛍光)で蛍光標識したヒト悪性中皮腫細胞株(MSTO-211H、ACC-MESO-1及びACC-MESO-4)を、レンチウイルスベクターを用いて作製し、安定して強い蛍光を発現する細胞クローンを選別する事により赤色蛍光蛋白発現細胞株を樹立した。続いて蛍光標識したヒト中皮腫細胞を、ヌードマウスの胸腔内(胸膜中皮腫モデル)、あるいは腹腔内(腹膜中皮腫モデル)に移植し、蛍光シグナルの検出をin viyoイメージングシステムを用いて経時的に行う事で蛍光標識腫瘍細胞を追跡し、浸潤・遠隔臓器への転移を観察し得た。上記マウスの一部を経時的に安楽死させ、病理組織学的検討を行い、イメージングで得られた情報との整合性を評価した。一方で、移植細胞数毎の腫瘍生着率、生存率、平均生存期間などを比較検討することにより、これら基礎データを収集する事ができ、同モデルを確立し得た。また予備実験の結果、ヒト悪性中皮腫皮下腫瘍モデルにおいて腫瘍溶解アデノウイルス(GFP発現単位搭載)の腫瘍内増殖伝播をGFPの発現を追跡する事により評価し得る事を明らかにした。本年度は、ヒト悪性中皮腫細胞株(MSTO-211H、ACC-MESO-1及びACC-MESO-4)を用いた悪性中皮腫マウスモデルにおける腫瘍溶解アデノウイルスの有効性を検討した。まずヒト悪性中皮腫皮下腫瘍モデルにおいて、腫瘍溶解アデノウイルス(GFP発現単位搭載)の腫瘍内増殖伝播をGFPの発現をin vivoイメージングにて追跡する事により評価し得る事を明らかにした。また腫瘍溶解アデノウイルスは、これらモデルにおいて著明な抗腫瘍効果を示す事に成功した。また現在、悪性中皮腫のin vivoイメージング致死性モデル作製を確立し、同モデルにおける腫瘍溶解アデノウイルスの抗腫瘍効果を検討する予備実験を繰り返し、in vivoイメージングを含めた条件検討を行っている。本年度は、悪性中皮腫のin vivoイメージング致死性モデルの作製及びその検証を前年度に引き続き行った。mCherry強陽性ヒト中皮腫細胞を、ヌードマウスの胸腔内(胸膜中皮腫モデル)、あるいは腹腔内(腹膜中皮腫モデル)に移植し、蛍光シグナルの検出をin vivoイメージングシステムを用いて経時的に行う事で蛍光標識腫瘍細胞を追跡し、浸潤・遠隔臓器への転移を観察し得た。上記マウスの一部を経時的に安楽死させ、病理組織学的検討を行い、イメージングで得られた情報と比較検討する事で、両者の整合性が確認され、同モデルを確立し得た。一方で、MSTO-211H細胞を用いた致死性進行癌モデルにおいて抗癌剤シスプラチンの抗腫瘍効果がイメージングで判定できるかどうかを検討したが、シスプラチン単独では有意な抗腫瘍効果が得られず、イメージングの有用性を示すには至らなかった。しかし腹膜中皮腫モデルにおける腫瘍溶解アデノウイルスを用いた予備治療実験においては、腫瘍の縮小及び生存期間の延長が得られた。今後実験の規模を拡大して結論を確定づけ、その有効性を示して行くとともに、安全性や抗がん剤との併用効果などについても研究を進めて行きたい。またさらに同ウイルスによる感染効率を更に向上させるべく、ファイバー置換及び修飾型ウイルスの開発を目指したい。in vivo蛍光イメージングによる非侵襲的な診断・治療評価が可能な悪性中皮腫の致死性進行癌モデルマウスの作製に成功し、腫瘍溶解アデノウイルスの抗腫瘍効果の検討に入っているため。24年度が最終年度であるため、記入しない。

今後、予定通り腫瘍溶解アデノウイルスの抗腫瘍効果の検討をすすめ、さらにその有効性を示して行くとともに、安全性や抗がん剤との併用効果などについても研究を進めて行きたい。24年度が最終年度であるため、記入しない。
小線量多分割照射法による耳下腺放射線損傷の軽減

小線量一日多分割照射法による耳下腺の反応について、モデル実験系を用いて検討した。多分割照射効果を検討する前に、放射線一回照射による耳下腺の損傷を定量的に検出するため、wistar系ラットの耳下腺にX線を020Gy、一回照射した。照射後、損傷した耳下腺由来の血清アミラーゼ活性、尿中に排泄された総アミラーゼならびに耳下腺中に残存している総アミラーゼを,経時的に測定した。血清アミラーゼ活性は、耳下腺照射12時間後から経時的に高くなり、照射20時間後に最大値を示した。最大値を示した時期は、各々の線量でほぼ一定で、線量の大小による最大値発現の時期に差は認められなかった。これに対し、尿中総アミラーゼは、血清アミラーゼ上昇よりも遅れて、徐々に高くなり、15Gyならびに20Gy照射時には、2448時間後に最大値を示したが、10Gy照射では、4872時間後に、5Gy照射では、96120時間後にそれぞれ最大値を示した。すなわち、耳下腺の吸収線量が小線量と大線量とでは、尿中総アミラーゼの最大値発現の時期の異なることが、明らかになった。このことは、耳下腺腺房細胞の照射による細胞死の発現の機構が、小線量と大線量とでは、異なることを示唆するものである。今後、一回照射線量(02Gy)、照射間隔(一日13回)、全照射日数、総線量(060Gy)の、それぞれのパラメータを変えた条件下での照射効果を検討する。
プラズマとプリオンやウイルスのナノ粒子・構造体相互作用

医療器具を介した感染が院内感染の主要部分を占めるなか、高圧蒸気滅菌などの既存の滅菌方法では、医療器具や機器は処理に耐えられないことが問題とされている。近年これらの機材に対応可能な過酸化水素ガスプラズマ滅菌方法が提案されているが、毒性残留物の危険性などが指摘され始めている。さらに細菌由来のエンドトキシンの残留は、発熱などの症状を引き起こすが、過酸化水素ガスプラズマ滅菌ではエンドトキシンには効果がないと報告されている。そのような中、本研究は、N_2ガスプラズマをナノ粒子であるウイルスやプリオンと反応させることで、これまでに研究されてこなかったウイルス学分野にナノ界面プラズマの研究展開をはかることを目的とした。昨年度までに、本研究で使用しているN_2ガスプラズマ装置について、熱、紫外線、酸化ストレスが装置稼働時に発生していることを明らかにした。さらに、エンベロープウイルスであるインフルエンザウイルスをプラズマ処理し、プラズマ処理によりウイルスが不活化されることを示した。平成23年度は、インフルエンザウイルスがプラズマ処理により不活化されるメカニズムを明らかにするため、プラズマ処理時に発生する熱、紫外線、酸化ストレスの3殺菌因子がインフルエンザウイルスを不活化するのにどの程度寄与しているのかを明らかにすることを目的に解析を行った。その結果、N_2ガスプラズマ処理(1.5kpps)により、インフルエンザウイルスは5分以内に効率的に不活化された。この不活化メカニズムとしては、酸化ストレスが最も寄与しているものと考えられた。近年これらの機材に対応可能な過酸化水素ガスプラズマ滅菌方法が提案されているが、毒性残留物(過酸化水素)の危険性などが指摘され始めている。平成22年度の解析の結果、N_2ガスプラズマの発生時には、温度上昇、紫外線発生、酸化ストレス源発生が起きていることが確認された。インフルエンザウイルスを用いた解析では、N_2ガスプラズマ処理により、ヌクレオプロテインの分解やエンベロープ膜の修飾が観察され、BSAを用いた解析では処理によりαヘリックス構造が増加し、βターン構造が減少していた。一方で、BSAの温度処理の場合は、βシートが増加し、αヘリックスが減少していた。したがって、N_2ガスプラズマ処理による蛋白質の構造変化や分解は温度上昇によるものでなく、紫外線も蛋白質の構造変化や分解を起こさないため、プラズマ処理により発生した酸化ストレス源が蛋白質の構造変化や分解および脂質の修飾を引き起こしたのではないかと考えられた。また、プラズマ処理後のインフルエンザウイルスは構成蛋白質であるヌクレオプロテインが減少していることから、処理により有効に不活化されていることが示唆された。これらのことから、N_2ガスプラズマ処理は、インフルエンザウイルスの殺菌消毒法として有用であると考えられた。
神経変性疾患におけるニューロン死を制御する内在性保護因子の解明

グルタミン酸および活性酸素により惹起されるニューロン死を制御する内在性保護因子の作用の解明を目的として、in vitroの初代培養ニューロン系を用いて以下の3項目の研究を行った。1)ウシ胎仔血清(FCS)のエーテル抽出物中から単離された非蛋白性の神経保護活性物質の化学構造を決定し、推定構造に基づいて合成した化合物の薬理作用を検討した。単離した化合物はスルホキシド基をもち、分子式がC_<21>H_<34>O_4Sであることが明らかになった。NMR解析を行った結果、本化合物の化学構造は15-hydroxy-17-methylsulfinylatisan-19-oic acidであること推定された。本化合物は基本骨格に環状ジテルペンテルペンを有する新規化合物であり、血清中から発見された神経保護活性物質という由来からセロフェンド酸(serofendic acd)と命名した。推定構造をもとに合成した化合物もグルタミン酸およびNOドナーにより誘発される神経毒性を強力に抑制した。2)新生仔ラットから摘出した黒質切片を培養し、ドパミンニューロン生存に対する神経活動の役割について、グルタミン酸受容体拮抗薬を用いて検討した結果、グルタミン酸受容体刺激による脱分極に伴って流入するカルシウムによりドパミンニューロンの生存が促進され、その機序の一つとしてcAMP系が関与することが示唆された。3)ビタミンD、エストラジオール、ニューロトロフィンなどの内在性物質の神経保護作用について検討した。活性型ビタミンDである1α,25-(OH)2D3、女性ホルモンのエストラジオール、神経成長因子などのニューロトロフィン類はグルタミン酸神経毒性を濃度依存的に抑制するとともに、カルシウムイオノフォアおよび活性酸素により誘発される神経毒性も抑制し、さらに、細胞内での活性酸素の生成も抑制した。これらの知見から、これらの内在性神経保護活性物質は活性酸素の生成を抑制することによりグルタミン酸神経毒性に対する保護作用を発現し、種々の神経疾患時のラジカルストレスかでのニューロンの生存を促進する役割を果たすことが示唆された。1)牛胎仔血清(FCS)のエーテル抽出物中に含まれる非蛋白性の神経保護活性物質を精製・単離を行った。本化合物はグルタミン酸およびNOドナーのS-nitrosocysteine(SNOC)誘発神経毒性を抑制した。分子量は382であり、MS/MSの解析により分子量250前後の安定したフラグメントイオンが検出されることやHPLCでの抽出の際にステロイドに類似した挙動を示すことなどから、17位の置換基にスルホキシドを含む新規のステロイドであると推定した。しかし、推定構造と同一の化合物の合成が困難であったことなどから構造的に近似した化合物を合成してNMR解析を行った結果、本化合物の基本骨格はステロイドではないことが明らかになった。そこで、再度FCSから抽出を行いNMR解析を行った結果、本化合物の基本骨格はステロイドではなくテルペン様の構造を有しており、スルホキシドを含む特有の置換基を持つ新規化合物であることが明らかになった。

2)新生仔ラットから摘出した黒質切片を培養し、ドパミンニューロン生存に対する神経活動の役割について、高カリウム培地およびニコチンを用いて検討した結果、脱分極伴う細胞内カルシウム流入により生存が促進され、その機序の一つとしてcAMP系が関与することが示唆された。3)神経成長因子(NGF)のグルタミン酸神経毒性に対する作用をラット胎仔由来大脳皮質ニューロン系を用いて検討した。その結果、NGFはNO神経毒性を抑制することによりグルタミン酸神経毒性に対する保護作用を示すことを示唆する知見が得られた。培養大脳皮質ニューロンにはNGFの高親和性受容体は認められず、ニューロトロフィン低神話受容体(p75)の発現が認められたこと、NGFはセラミドの産生を促進したことなどの知見から、NGFの神経保護作用には主としてp75が関与することが明らかになった。グルタミン酸およびNOなどのラジカルにより誘発されるニューロン死を制御する内在性新規神経保護活性物質の単離・同定およびその作用の解明を目的として、初代培養大脳皮質ニューロンを用いて以下の研究を行った。前年度までの研究により、ウシ胎仔血清のエーテル抽出物に含まれる新規神経保護活性物質がスルホキシド基を含む特有の置換基を持つアチサン骨格の環状ジテルペンであり、分子量が382であることが明らかとなった。我々はこの化合物をセロフェンド酸と命名した。セロフェンド酸の合成法を確立し、合成した化合物でのグルタミン酸神経毒性に対する保護作用を検討した結果、天然物と同様の保護作用が観察された。また、その保護作用機序解明のために、セロフェンド酸のグルタミン酸受容体に対する作用を電気生理学的に検討した。グルタミン酸受容体のサブタイプ特異的アゴニストであるNMDA、KA、AMPA誘発電流に対するセロフェンド酸の作用を検討した結果、短時間の前処置したセロフェンド酸は各グルタミン酸受容体アゴニスト誘発電流に影響を与えなかった。ついで、カルシウム流入によって引き起こされるニューロン死に対する作用について検討した。カルシウムイオノフォアであるイオノマイシンを用いた細胞内へのカルシウムの流入によって引き起こされるニューロン死に対してセロフェンド酸は保護作用を示した。今までにセロフェンド酸がNOドナーであるS-ニトロソシステインによって誘発されるニューロン死に対して保護作用を発現することを明らかにしていることと考え合わせると、セロフェンド酸はグルタミン酸受容体への作用は持たず、カルシウム流入以降に作用してNOを介するグルタミン酸神経毒性を抑制することが示唆された。
明治時代の地震資料のデータベース化に関する研究

地震活動の研究には、信頼できる地震カタログが不可欠である。我が国の全国的な地震調査事業は、明治17年に、内務省地理局(後の中央気象台)によって開始された。初期段階の約25年間は、主として測候所、郡役所等からの震度報告に基づいて震央が推定されていた。しかしそれら原報告及び解析結果のかなりの部分は既に散逸しているため、明治時代の地震活動の研究は進んでいない。本研究は残存する地震資料を収集・整理し、新たな地震カタログをつくり、データベース化することを目的としている。平成7年度には、1885-92の7年間についてミルンが作成したカタログをファイル化するとともに、気象庁に残存する原報告、中央気象台による調査結果を整理し、震度観測データファイルを作成した。平成8年度には、1904-10の7年間について「中央気象台年報(地震の部)」所載の地震観測表から震度観測データファイルを作成した。また、当時の震度観測地点約1500点の位置を特定し、観測地点データファイルを作成した。さらに、これらのデータファイルを用いて震度分布図をパソコンに表示させるとともに、第一近似の震央を自動推定し、これをマニュアルで修正するプログラムを開発した。これによって震度データに基づく震央再決定が効率的におこなえるようになった。中部地方以西については、震度分布からの震央決定が可能であるが、東日本については、異常震域の現象のため困難な場合が多い。このため目的とした地震カタログの完成には、さらに地震計記録の活用が必要である。平成9年度には、国立天文台水沢観測センターに保存されている地震計記録の調査を行った。わが国の全国的な地震調査事業は,明治17年末に,内務省地理局東京気象台(後の中央気象台)によって始められた.当初は主として測候所や郡役所からの有感報告に基づいて,震度分布図を作り,震源地を推定していたが.残念ながら当時の膨大な原報告やそれをとりまとめた地震調査原簿の大部分は,震災等で焼失したりして残っていない.しかし,1885-92の8年間については,ミルン(Milne,1895)が調査原簿を要約して,すべての地震(8331個)を含むカタログ(第1カタログと第2カタログからなる)を作っているので,それを手掛かりに全国的な小地震をふくむ地震活動の推移をある程度明らかにできる可能性がある.今回は、この2つのカタログのデータをパソコンで扱えるようファイル化したのち、ひとつのデータベースにとりまとめた.さらにこれと気象庁に残存している原資料類(最近マイクロフィルム化されている)と照合し,このカタログの震源推定の精度等を再検討した.第1カタログに与えられている震源地が比較的正しいと考えられる中部地方以西についてこのカタログによる震央分布図や地域別の各種の時系列図をSEIS-PCを用いて作成した.濃尾地震前の震源地周辺の高い活動度や,地震後,震源域の延長にあたる福井県のほかに,やや離れた京都付近でも地震活動が活発化したようにみえることなど,興味深い結果が得られた.しかし,報告点の増減などの状況変化が著しく影響している場合もあり,事実の有意性についてはさらに原資料とのくわしい対比による検討が必要であることも分かった.明治37年-43年(1904-1910)の7年間については、中央気象台による全国的な地震調査結果が「中央気象台年報地震の部」として刊行されている。この内容の一部は気象庁によってフアイル化されているが、各地の震度報告の大部分はフアイル化されていなかった。今回は、この部分もフアイル化し、全体をデータベース化した。また、明治時代の震度報告点約1500カ所の位置を特定し、緯度、経度を求めて、震度報告点フアイルを作成した。

これらを用いることによって、上記の期間のすべての地震および前年度に調査した期間で原資料が残存している地震について震度分布図をパソコン画面に表示するとともに、第1近似の震央を推定することができるようになった。しかし、東日本については、震度分布から自動的に推定した第1近似の震央は、誤差が大きく、他の験測地も考慮しながら推定することが必要であり、最終的に決め手になるのは、地震計の記録そのものである。上記期間については、東大地震研および国立天文台水沢観測センターに利用可能な形で地震計記録が保存されていることを確認し、その調査に着手した。平成7年度にデータベース化した明治18ー24年の震度観測データと平成8年度に「中央気象台年報地震の部」に基づいてデータベース化した明治37ー43年の震度観測データを、同年度作成した震度報告点ファイルおよび震度分布図表示・震央推定プログラムを使用して解析し、震央を推定する作業を行った。これだけでは正しく推定できない東日本の地震の震源を推定するため、気象庁、東大地震研、国立天文台水沢観測センターの、地震計記録の調査も行った。しかし、地震計記録の調査には当初予想したよりも多くの労力と時間を要し、この作業の完了までにはなおかなりの時間を要する見込みとなった。一方、新たな状況として、最近気象庁が展開した計測震度計観測網によって大量の震度観測データが得られるようになってきた。このデータを用いることにより、地域別、M別の標準的な震度分布図を作成し、それとの比較によって明治時代の地震の震源をより高い信頼性をもって推定できる途が開けてきた。このため、今後、地震計記録の調査と計測震度データの活用により、引き続き震源推定作業をすすめ、当初の目標である新たな震源カタログを含む地震資料データベースを完成させ、関係研究者の利用に供する予定である。なお、上記期間以外に、明治6ー17年についても、地震資料データベースを作成した。
LAMP法を用いた看護ケア環境累積微生物汚染度の新評価システム構築

本研究は、病院内の新たな清浄度評価ツールとしてLamp法(Loop-mediated Isothermal Amplification)を導入することを目指して、ATPとスタンプ法に加えて菌叢解析を実施した。病院環境の清浄度指標であるATP法とスタンプ法には弱い相関がみられるもの、エラーバーが大きい傾向にあった。病院環境の清浄度測定を的確にするためには、このエラーバーの要因を明らかにすることが必要である。そこで、規模の異なる3病院の50サンプルを菌叢解析し、細菌叢に差異があるかを検証した。その結果、2病院の菌叢はバリエーションが類似していたが、1病院は特異的な細菌叢の構成を示した。医療施設における患者を取り巻く環境を、安全で快適な状態に整えることは看護実践の基本であり、同時に全面的な責任を負う。これまで、病院内の清浄度管理については、国内外問わずATPを指標として測定された院内累積微生物量を利用した病院内清浄度評価が普及している。しかし、ATP値の増減は決して病原菌存在の有無や量を正確に反映するものではない。我々は、看護師が臨床で日常的に使える看護ケア環境累積微生物汚染度の新規評価システムを構築することを目指している。平成25年度は、メタゲノム解析による院内環境微生物プロファイルを取得し、その結果よりベッドサイドで簡単に取り扱い可能な網羅的微生物量定量LAMP法を確立することを目的とし研究を進めてきた。データ収集方法として、規模の異なる3病院の各2病棟の環境表面各箇所において、各箇所1日1回、合計3回、環境表面サンプルを採取した。測定場所は、看護師管理環境:1点滴処置台、2ナースステーションの机、3看護師用ワゴン、患者周辺環境:多床室4床頭台、5オーバーベッドテーブル、6室内の棚、個室7床頭台、8オーバーベッドテーブル、9室内の棚等とし、ふき取り調査を実施した。その後、この院内環境表面サンプルについて、環境微生物のDNA抽出後、PCR(polymerase chain reaction)法を用いて、菌種を特定する分析を継続している。今後は、この分析終了後に、院内環境サンプルからのメタゲノム解析を進める予定である。また、これまでに集積した研究結果について、研究報告および論文投稿に取り組んでいる。病院内の感染管理の累積環境微生物汚染評価ツールとして一般的に用いているのが、ATP量やスタンプ法である。しかし、これまでの調査結果より、ATP量とスタンプ法どちらの方法でも院内環境微生物汚染度を正確に評価するには不十分であると考えられた。そこで、本研究課題は、看護師がベッドサイドで簡便に病院内の感染管理の累積環境微生物汚染度を正確に評価するために網羅的微生物量定量LAMP法を導入し、新たな院内評価システムを構築することを目指している。平成26年度は、メタゲノム解析を導入し、環境微生物汚染度の指標となる幾つかの細菌群を選定することを目標に研究を進めた。平成25年度に、規模の異なる3病院の各2病棟の環境表面各9か所、合計3回、滅菌生理食塩水に浸した滅菌綿棒でサンプルを採取した。その後、本年度は、環境微生物のDNA抽出後、PCR(polymerase chain reaction)法を実施し、メタゲノム解析を業者に依頼した。次世代シーケンス解析、微生物群集解析を実施し、微生物叢のゲノムDNA塩基配列を一度に取得し、微生物間の相互作用の網羅的解析をすすめている。現在、メタゲノム解析を終了し、解析結果を再分析し、検討している段階である。また、これまでの調査結果から、一部の測定場所では、ATP法およびスタンプ法によって検出結果に差があったため、より精度の高い評価を行うためには、更なる検討が必要だと考えた。環境表面の物性が異なることが細菌の挙動に影響している可能性も否定できないと考え、医療現場における環境表面の物性(メラニン化粧版、ステンレス、塩化ビニルなど)とATP値と生菌数の関連性について再分析した。その結果、物性によってATP値および生菌数の結果に差異があり、病院内の感染管理の累積環境微生物汚染評価には、環境表面の物性も考慮する必要があるのではないかと考えられた。本研究は、病院内の感染管理の累積環境微生物汚染評価ツールとして一般的に用いているATP量やスタンプ法に加えて、看護師がベッドサイドで簡便に病院内の感染管理の累積環境微生物汚染を正確に評価するための新たな院内評価システムを構築することを目指している。これまでの研究結果では、ATPおよびスタンプ法で得られたデータの数値には日によっての変動が認められ、エラーバーが大きかった。病院環境の清浄度を適確の測定し、感染予防対策につなげるためには、このATP値およびスタンプ値の結果にみられたエラーバーの要因を明らかにすることが必要である。そこで平成27年度は、これまで調査してきた3病院の各病棟内のサンプルを次世代シークエンサーにて網羅的な菌叢解析調査の結果を分析し、病院による細菌叢の構成に差異があるのかを検証した。このことは、今後医療施設での清浄度調査をどのように測定することが可能なのか、清浄度各病院の清浄度の実態と細菌叢の様相に即した院内感染予防を検討するうえで重要な基礎資料になると考える。規模の異なる3病院における50サンプルについて、Step1:Quality check for sample DNAs and sampleselection、Step2:Illumina Run、Step3:Population analysisの過程を辿り、菌叢解析した結果、3病院中2病院は菌叢にバリエーションがある分布になっているにも関わらず、1病院は他の病院と比較しても細菌叢の腸内細菌叢の割合が大きく、病院内の細菌叢が同様の構成になっているとは限らないことが明らかになった。

この結果は、病院内の清浄度の値に影響を及ぼしている要因として細菌叢が関連している可能性を示唆するものである。本研究は、病院内の新たな清浄度評価ツールとしてLamp法(Loop-mediated Isothermal Amplification)を導入することを目指して、ATPとスタンプ法に加えて菌叢解析を実施した。病院環境の清浄度指標であるATP法とスタンプ法には弱い相関がみられるもの、エラーバーが大きい傾向にあった。病院環境の清浄度測定を的確にするためには、このエラーバーの要因を明らかにすることが必要である。そこで、規模の異なる3病院の50サンプルを菌叢解析し、細菌叢に差異があるかを検証した。その結果、2病院の菌叢はバリエーションが類似していたが、1病院は特異的な細菌叢の構成を示した。本研究で予定していた、メタゲノム解析に向けたサンプル処理とメタゲノム解析に、計画立案時に想定していたよりも時間を要したため。しかしながら、平成27年度に向けた研究実施には、大きな影響はないと判断している。看護学・LAMP法プライマーの設計と設計したプライマーを用いて各種細菌を検出する上での感度・特異度を検証する。計画通りに、平成25年度は、規模の異なる3病院でデータ収集を行い、院内環境サンプルを確保することができた。また、そのサンプルを用いて、DNA抽出後、PCR(polymerase chain reaction)法を用いて、菌種を特定する分析を実施しているが、正確性・再現性を伴う実験手法の特定、機器の故障などにより、予想以上に時間を要した。平成26年度は、メタゲノム解析の結果から、LAMP法のプライマー設計を実施予定であった。しかし、メタゲノム解析に向けたサンプル処理とメタゲノム解析に、計画立案時に想定していたよりも時間を要したため、LAMP法の段階に進めることができなかったため1.院内環境サンプルからのDNA抽出後、メタゲノム解析を行う。メタゲノム解析は外注する。2.LAMP法プライマーの設計:メタゲノム解析から得られた院内環境微生物プロファイルより指標となる細菌を10菌種程度ピックアップし、LAMP法プライマーを設計する。3.LAMP法の確立のために指標とする環境細菌を購入し、DNAを抽出する。2で得られたプライマーを用いて環境細菌を検出する上での感度・特異度を検証する。予定しているLAMP法のプライマー設計を今後実施する。さらに、設計したプライマーを用いて各種細菌を検出する上での感度・特異度を検証するための実験を実施する。平成25年度に実施できなかったメタゲノム解析を今後実施する。
水生昆虫シルクナノ繊維と3次元織布技術を用いる幹細胞培養足場材料開発

ヒゲナガカワトビケラ(Stenopsyche marmorata)のE2Pタンパク質、および蚕シルク(SF)との混合系膜におけるMC3T3-E1細胞の付着増殖評価によると、E2P膜は、SF膜より細胞接着性は良好であった。SFと生体適合性高分子のシルク複合ナノファイバー表面ではNIH3T3細胞が、SFとポリ乳酸(PLA)の複合ナノファイバー表面では、ヒトの角膜実質細胞が良好に付着増殖することが検証された。水生昆虫のE2Pタンパク質膜およびシルク複合ナノファイバーは、細胞足場材として有効であることが示唆され、今後の再生医療技術の発展に必要なバイオ材料として利用できる展望を開くことが可能となった。水生昆虫およびカイコシルクの3次元不織布評価の前段階として、シルクタンパク質を原料とするナノファイバー2次元不織布を作成した。カイコシルクタンパク質では、可溶化手法から検討し、幾つかの溶媒系と濃度の最適化を経て、比較的均一なカイコシルクナノファイバー2次元不織布が得られている。これらのシルクタンパク質はしかしながら、タンパク質組成が今のところ不明であり、生化学的分析を実施することにより、フィブロイン以外の成分の存在比、および、翻訳後修飾の有無について知る必要がある。水生昆虫シルクタンパク質では、他方、最適シーズンにおける天候不順が原因となり、タンパク質試料の大量確保に難があった。少量スケールでの水生昆虫シルクタンパク質ナノファイバー2次元不織布は得られたが、これをどのように新規足場材料として評価するか、という課題が残っている。ひとつは、水生昆虫シルクタンパク質ナノファイバー2次元不織布の耐水安定性を向上すること、他方は、最初に評価を行う細胞腫の決定である。これらの課題は、基礎研究を継続することにより解消または低減することができると期待されるため、平成27年度では、3次元織布作成に向けた知見を引き続き収集する。水生昆虫体内の絹糸腺からシルクタンパク質を精製するこれまでの手法を改良し、より多量かつ高品質な試料を得るため、次のことを試行した: (i)飼育水槽内で吐糸されたシルク繊維から、シルクタンパク質の直接可溶化、(ii)適切な昆虫捕獲時期を特定するための時系列的遺伝子解析および水温との相関、(iii)シルクタンパク質収量の評価。(i)では、ある種のキレート化合物およびタンパク質変成剤の共存下において、シルクタンパク質主成分であるSmsp-1が可溶化できることが判った。(ii)では、シルクタンパク質遺伝子発現が季節、すなわち、幼虫ステージにが5令となる初夏において、シルクネット品質がある程度保証されること、また、水温が低下する冬期にはシルクタンパク質合成(翻訳)活性が低下することが明らかになった。(iii)では、(i)の手法により可溶化・回収される収率は、原料乾燥重量のおよそ40-50%であり、絹糸腺からのシルクタンパク質主成分精製と比較して操作効率が向上した。特に、絹糸腺からのシルク抽出物と異なり、(i)の手法により得られるシルクタンパク質は体液と等張な緩衝液に溶解することから、足場材原料としてより好適な性質をもつ。上記(i)-(iii)の知見は、個別の原著論文および国際学会発表として対外発信し、一般向けにプレスリリースも行った。当初研究目的の計画的な進捗に加え、血管内治療薬としての水生昆虫シルクタンパク質の利活用に関するPCT出願も併せて行った。水生昆虫の1種でヒゲナガカワトビケラを実験室飼育環境におき、吐糸されるシルク様繊維をグラムスケールで採取する手法を前年度開発した。本年度では、採取したシルク様繊維から、構成成分タンパク質を「直接」可溶化できる手段を見いだす事ができ、これにより、従来、絹糸腺から精製していた水生昆虫シルク主成分タンパク質を、より効率的かつ簡便に取得することが可能となった。水生昆虫シルク主成分タンパク質をさらに効率的に得るため、シルクタンパク質遺伝子発現の通年パターン解析、および、シルクタンパク質合成装置である絹糸腺リボゾーム活性と水温との相関を示唆する結果が得られている。他方で、水生昆虫シルクタンパク質をグラムスケール以上に取得可能な技術開発はより困難であると想定されるため、当初、シルクタンパク質単独のナノファイバー作成を試行する方向をやや転換し、水生昆虫シルクタンパク質とカイコフィブロインとの複合化を細胞培養足場として最初に評価することとした。ヒゲナガカワトビケラ(Stenopsyche marmorata)が水中環境において吐糸するシルク様タンパク質の原料確保、ならびに、効率的な抽出・純化手段の開発と、その材料化学的応用研究を同時進行する研究課題のもと、主に、足場系材料創出を試行したサブテーマを実施した。その結果(i)S. marmorata実験飼育法を工夫し、水中吐糸したシルク様繊維からの高効率なタンパク質抽出法が創出され、原料重量の半分程度までの収率改善が実現できた。(ii) (i)の手段によって調製されたタンパク質組成物が、良好な水溶性を示しながら、同時に、カルシウムイオン等の刺激により瞬時に凝固することが見出され、さらに、(iii)上記(ii)の性質を利用しつつ、従来のカイコフィブロインとのハイブリッド多孔質に整形可能であり、これを足場とする細胞培養実験において、特に、骨芽細胞との良好な親和性を持つことが明らかになった。上記に関連する成果を、原著論文、国際学会、国内学会、および特許として出版・情報発信した。S. marmorata幼虫集団動態解析を含む基礎生物研究の論文もオープンアクセス出版物として公表した。

2015年度に導入した細胞凍結保存用備品を活用しながら、現有設備との有機的な連携により、実験作業の現場環境改善は顕著であり、効率的なデータ収集および正確な実験結果整理が可能となった。このことにより、次の研究課題申請においても、上記(iii)サブテーマにおいて取り扱う細胞腫がより多彩となり、成果波及範囲が拡張された。当初計画としてヒゲナガカワトビケラ(Stenopsyche marmorata)の水中シルクタンパク質(E2P)のみを「唯一の原料」とし、さらに、その原料を用いてエレクトロスピニング行程を経て得られる「ナノファイバー不織布」を足場材料として評価するサブテーマがあったが、次の想定内の理由(i)および(ii)により、部分的に当初計画を見直している:(i)E2Pの量的制限により実験条件設定の多様化とバッチ母数確保に難があった。(ii)エレクトロスピニング行程は実施可能であったが、得られたナノファイバー不織布が高い水溶性を持つため、細胞培養実験系に組み込むことの障害となった。左記(i) (ii)は当初計画段階において想定されため、「研究実績の概要」記載(iii)のとおり、カイコ(Bombyx mori)フィブロインと(Bmsf)のハイブリッド多孔質をカルシウム処理し、水不溶性足場の創出を試みることとした。左記足場の骨芽細胞に対する親和性評価結果に基づき、主題区分(2)とした。ヒゲナガカワトビケラ(Stenopsyche marmorata)由来のシルク(SS)の純化法を見つけ、特性解明とその用途開発を目指す研究課題のもとで、細胞付着のための足場材となるバイオ材料を創出する研究を進めた。野外におけるトビケラ群集の個体群維持機構の検証を深化させた。シルクナノ繊維素材のリン酸化組換えシルクタンパク質調製への広範な応用を想定し,SSの特性解析では、ヒゲナガカワトビケラ絹糸腺由来プロテインキナーゼ遺伝子の探索及びクローニングを通して、幼虫絹糸線RNA-seq解析結果からSer/Thrプロテインキナーゼと推定されるものをいくつか見つけた。Fam20Cホモログに注目して遺伝子をクローニングすることに初めて成功した。水生昆虫1個体からとれるSS量が微量であり化学修飾加工を施すには高度な技術的工夫が必要であるため、昨年度計画を若干方向転換し、多量入手が可能な生体高分子であるカイコのシルク(SF)への化学修飾加工、シルク複合ナノファイバー製造ならびに足場材として適否評価のため細胞培養実験を行った。SFと生体適合性水溶性高分子のメタクリル酸2-ヒドロキシエチルとアクリル酸4-ヒドロキシブチルとからなるシルク混合溶液をエレクトロスピニングして製造できるシルク複合ナノファイバー表面ではNIH3T3細胞が良好に付着・増殖した。SFとポリ乳酸(PLA)とからなり繊維径360580nmのシルク/PLA複合ナノファイバー表面では、ヒトの角膜実質細胞が効率的に付着増殖することが検証できた。ヒゲナガカワトビケラ(Stenopsyche marmorata)のE2Pタンパク質、および蚕シルク(SF)との混合系膜におけるMC3T3-E1細胞の付着増殖評価によると、E2P膜は、SF膜より細胞接着性は良好であった。