hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
温熱電流同時印加により誘導される新規インスリン作用・インスリン分泌関連分子の同定

温熱と微弱電流刺激(MET)によりHSP(heat shock protein)が効率的に増加し、糖尿病モデル動物はヒト2型糖尿病の代謝異常・インスリン抵抗性を改善する。本研究では、インスリン感受性臓器および膵β細胞においてMET刺激後の遺伝子発現変化を検討し、種々の候補遺伝子を同定した。特にターゲットとしてAMPK, Sirt1, PGC-1aなどが重要な遺伝子である事が判明した。*糖尿病動物の膵島においてHsp72発現誘導が、どのような遺伝子発現を変化させ、膵β細胞機能に影響を与えているかを検討する。1.インスリン抵抗性糖尿病モデルマウスとして高脂肪食負荷(HFD)マウス(4週間投与)とob/obマウス(10週齢)を、インスリン分泌不全糖尿病モデルマウスとしてHFD(4週間投与)+少量STZ投与マウス(100mg/kg投与4日間)と高齢db/dbマウス(20週齢)を、小胞体ストレスによる糖尿病マウスとしてAkitaマウス(12週齢)とHsp72KO+高脂肪食負荷(1216週齢)を使用する。2.各糖尿病動物の膵島を単離し、3. GGAおよびMET刺激が十分に、細胞内に伝達できたか否かを確認するためにHsp72のウエスタンブロットを行い、現存確認を行っている。インスリン抵抗性糖尿病モデルマウスとして高脂肪食負荷(HFD)マウスとob/obマウスを、インスリン分泌不全糖尿病モデルマウスとしてHFD負荷+少量STZ投与マウスと高齢db/dbマウスを、小胞体ストレスによる糖尿病マウスとしてAkitaマウスとHsp72 KO+HFD負荷を使用した。各々対照マウスとともに肝臓・筋肉・内臓脂肪を摘出し、即座に4060μmで薄切し、膵臓はコラゲナーゼ処理により膵島を単離した。(1)それらの組織をex vivoで短時間培養し、(3)現在、下記遺伝子群の同定・選択を行っている。(a)糖尿病・インスリン抵抗性状態において発現が増加・減少する遺伝子群(b)糖尿病・インスリン分泌不全状態において発現が増加・減少する遺伝子群(c)正常血糖状態においてGGAもしくはMETにより発現が増加・減少する遺伝子群(d)糖尿病・インスリン抵抗性状態においてGGAもしくはMETにより発現が増加・減少する遺伝子群(e)糖尿病・インスリン分泌不全状態においてGGAもしくはMETにより発現が増加・減少する遺伝子群(f)小胞体ストレス過剰状態において発現が増加・減少する遺伝子群(g)小胞体ストレス過剰状態においてGGAもしくはMETにより発現が増加・減少する遺伝子群2.HepG2(肝臓)・L6(筋肉)・3T3-L1(脂肪細胞)およびMIN6(膵臓β細胞)の細胞系に上記過剰発現ベクターもしくはsiRNA発現ベクターをトランスフェクションする。3.HepG2・L6・3T3-L1においてはインスリン作用関連分子のシグナル伝達経路を、MIN6においてはインスリン分泌能・インスリン生合成・PDX-1などの重要な転写因子の発現などを検討する。4.細胞レベルで有効性が確認された遺伝子群の過剰発現ベクターもしくはsiRNA発現ベクターをin vivo JET PEIシステムを用いて腹腔内に投与する。
塩蔵ダイコンの黄変化制御による品質保持技術ならびに食品機能に関する研究

長期の塩蔵処理により、ダイコンは鮮黄色化する。しかし、その黄色は光退色しやすい性質を持っている。本研究は塩蔵ダイコンの黄変化制御技術と黄色関連物質の機能性に着目した実験を行った。その成果の概要は、次の通りである。(1)塩蔵ダイコンの退色は、500nm未満の光を遮光することで抑制された。(2)青色LEDの照射により、効率の良い淡色化が可能になった。(3)黄色関連物質はアスコルビン酸と同等以上の抗酸化性を有していた。(4)ダイコンを干すことで、機能性アミノ酸や黄色関連物質の生成が促進された。前年度までに,塩蔵ダイコンの抗変異原性物質としてパルミチン酸やα-リノレン酸を主とした遊離脂肪酸の存在を明らかにしてきた。そこで,本年度は加工工程による脂肪酸の消長と製品中の分布を明らかにし、塩蔵ダイコンとタクアン漬け製品中の機能性脂肪酸の動態を検討した。その結果,最も食品成分が溶出しやすいと考えられる脱塩・圧搾工程において,塩蔵ダイコンと比較して脂肪酸含量に違いはなく,極性の低い脂質・遊離脂肪酸の溶出が認められなかったことを明らかにした。また,市販製品の分析結果から,干しタクアン漬けにおいて,全脂肪酸および遊離脂肪酸ともに多く含まれていた。この結果は,他のタクアン漬けとの比較により,全脂肪酸に対する遊離脂肪酸の存在比の高さは,干すことによる単なる濃縮効果だけでなく,熟成効果に違いが現れることが明らかになった。次に,青首ダイコンを用いて異なる条件下で塩蔵ダイコンを試作し,脂肪酸生成のメカニズムを明らかにするとともに,その他の品質に関わるアミノ酸,糖,有機酸についても経時的な変化について解析を行った。その結果,塩蔵ダイコンの成分変化の差はダイコンの脱水方法に依存し,陰干し後の塩蔵ダイコンでは,プロリン,コハク酸,スクロース,そして不飽和脂肪酸の蓄積が見いだされ,これらは塩のみで脱水させた塩蔵ダイコンではあまりみられない成分である。本年度の研究成果は,伝統的な手法でつくられる干しタクアン漬けの優位性を科学的に裏付けるものとなり,塩押しタクアン漬けが主流となりつつある漬物業界の中で“干す"という一手間を加えることで機能性,呈味性に関しても期待できるタクアン漬けになることが明らかになった。本年度は、タクアン用の品種である"干し理想"を用いて塩蔵ダイコンを試作し、経時的な成分解析を行った。昨年度と同様に、塩押し、日干しによる脱水を行い、塩蔵ダイコンを試作した。呈味性および機能性に関わるアミノ酸、糖、有機酸、脂肪酸、そして黄変化に関わるダイコン辛味成分関連化合物について1年以上の長期塩蔵下での経時的分析を実施し,脱水方法の差による影響,塩蔵中の消長について解析を行った。その結果、昨年度の研究により明らかになった干すことによる成分の蓄積効果は、コハク酸、ショ糖では確認されず、プロリン以外にγ-アミノ酪酸(GABA)の蓄積効果が見いだされた。脱水条件による成分変化においては品種の違いは重要な因子であり、特にGABAは血圧降下機能等の食品機能が知られているため、次年度以降の研究において、検討を重ねる必要があると考えられた。また、長期塩蔵における経時的な分析結果から、各種成分含量は1ヶ月で最大になり、その後の熟成に伴う変化は小さい、もしくは緩やかな減少傾向にあった。また、昨年同様、遊離脂肪酸や有機酸のピログルタミン酸の増大が確認された。他方、塩蔵ダイコンの黄変化について、漬込み初期の低温下では着色物質の生成はほとんど認められず、貯蔵温度(20°C)が高くなるにつれ、ダイコンは鮮黄色に変化し、その生成と増大が確認され、812ヶ月間の貯蔵で色素生成は最大になった。塩蔵過程における色素発現は、微生物発酵というよりは主として貯蔵温度に依存する非酵素的な化学反応であることを明らかにした。さらに,鮮黄色塩蔵ダイコンの光退色防止並びに白色化については、光源の照射波長の制御を行うことにより実現可能である事実を見いだし、これまでの製造現場における黄変化に関わる諸問題を解決する糸口さらには実用化まで踏み込んだ成果を得ることができた。本年度は、前年度と同様に塩蔵ダイコンを試作し、経時的な分光測色計(CIELAB)による色調解析ならびに黄色色素関連化合物のHPLC解析を行った。また、前年度明らかにした波長制御による退色防止の知見をもとに、本年度はLED光源を用いた光淡色化試験を行った。ダイコンは塩押しならびに日干しによる脱水を行った後、低塩並びに高塩条件下で温度管理しながら8ヶ月間塩蔵させた。

漬込み初期の2ヶ月間(4°C)では、全ての塩蔵ダイコンはわずかに着色するのみで、HPLC分析において色素前駆体は生成していたが、黄色物質の生成はほとんど認められなかった。高塩蔵ダイコンについて10°C(2-4ヶ月)、20°C(4ヶ月以降)と貯蔵温度を上昇させたところ、干し塩蔵ダイコンにおいて顕著にあらわれた。黄色を示すb^*値が6ヶ月後で最も高く、その後は明るさを示すL^*値の低下と赤色を示すa^*値の上昇とともに濃色化が始まった。HPLC分析の結果も同様に、黄色色素生成量が増大し、色相角度(h°)との高い相関を示した。以上のことから、塩蔵過程における前駆体から黄色色素への変換は温度に依存し、それに伴う色調の変化との相関を明らかにすることができた。鮮黄色化したダイコンの光淡色化試験については、窒素充填包装と青色もしくは白色LEDを組み合わせることで実現可能である事実を見いだした。品質に関わる脂肪酸、アミノ酸、有機酸、遊離糖への影響については、不飽和脂肪酸の減少が見られたが、他の成分への影響はほとんどなかった。脂肪酸については、窒素充填することで、光による酸化促進を抑制することができた。以上の結果より、これまでの製造現場における黄変化に関わる諸問題を解決する糸口さらには実用化まで踏み込んだ成果を得ることができた。
ヘテロ元素ドープ炭素スピン材料のボトムアップ合成法の開発

昨年度に引き続き1.各種フタロシアニンシートの高純度化及び2.金属ドープポリトリアジンイミド(PTI)合成法に関する研究を行った。オクタシアノフタロシアニンを原料としたフタロシアニンシートの合成法では反応生成物に炭素不純物が混在する欠点がある。そこで反応前処理の検討を行いフタロシアニンシートの高純度化を目指した。具体的にはボールミリングや湿式法等の原料混合方法、反応時の各種添加剤を検討した。反応時に尿素を添加したところフタロシアニンシートのX線回折強度に明瞭な増大が見られた。そこで反応条件の最適化を行い、フタロシアニンシートの結晶性の向上を達成した。また、これまでの合成法ではフタロシアニンシートに金属欠損が生じることが判明した。そこで、金属欠損をなくすことを意図して、金属欠損フタロシアニンシートと遷移金属塩の再反応を検討した。その結果、金属欠損フタロシアニンシートと遷移金属塩化物の400度以上の加熱で金属欠損の低減に成功した。さらに、金属量を過剰にして合成したフタロシアニンシートの磁気測定を行ったところ、低温で強磁性を観測した。強磁性の原因として、フタロシアニンシートの積層によって形成される空孔中に遷移金属クラスタが形成されたことが考えられる。前年度に引き続きPTIの合成に関する調査を行った。メラミンとシアヌル酸クロリドを金属粉末と混合し、真空中加熱するとPTIが生成する。そこで、金属の種類を変えてPTIの合成を行ったところ、マンガン及び銅を原料に用いた場合のみPTIが生成することが分かった。反応温度、金属混合比を検討し最適条件を得た。加えて、ヘテロ元素ドープ炭素物質の探索の試みとして各種有機ビルディンブルロックと金属の組み合わせによる反応を行った。有機ビルディングブロックに芳香族カルボン酸を用いたところ、金属イオンと連続的な構造を形成した新規有機金属構造体が得られた。本プロジェクトでは金属錯体、有機分子をビルディングブロックとしたボトムアップ型反応により様々なヘテロ元素ドープ炭素が合成可能な方法の確立を目指している。本年度は窒素及び遷移金属(銅)を炭素中にドープすることを目指し、以下2つのボトムアップ反応を研究した。1.オクタシアノ銅フタロシアニン(銅含有金属錯体)をビルディングブロックとした金属(銅)ドープ炭素の合成2.テトラクロロフタロニトリル(窒素含有有機化合物)ビルディングブロックとアルカリ金属のウルツ反応による窒素ドープ炭素の合成1.においては反応温度、添加剤を検討することにより高品質な銅フタロシアニンシートが生成することを明らかにした。フタロシアニンシートはフタロシアニンがベンゼン環を共有して重合した2次元炭素物質であり、均一分散した金属を含むことからスピントロニクス材料としての応用が期待される。本年度の研究により高品質なフタロシアニンシートを大量合成できる方法を確立した。さらに、X線回折法、透過型電子顕微鏡により反応生成物の構造解析を行った結果、フタロシアニン中心に金属と空孔が交互に配置した新しい型のフタロシアニンシートを発見した。これらの研究成果はAppl. Phys. Lett誌に投稿、掲載された。2.ではウルツ反応の結果、黒色の反応生成物が得られた。X線光電子分光法により反応生成物の組成を調べたところ、窒素が多量にドープされたナノグラファイトであることを明らかにした。この窒素ドープナノグラファイトは磁性元素を含んでいないにもかかわらず、弱い常磁性を示した。電子顕微鏡を用いて試料の構造を調査したところ、試料中にグラファイトエッジ、空孔が多く存在することが示唆された。グラファイトのエッジ、空孔には磁気モーメントが生じることが予想されており、本試料の磁性源となっている可能性がある。本研究成果は応用物理学会において報告された。本年度の研究計画では金属錯体、有機分子をビルディングブロックとしたボトムアップ型反応により様々なヘテロ元素ドープ炭素物質を合成することを目標としている。前述の通り今年度は1.金属ドープ炭素及び2.窒素ドープ炭素の合成を試み、以下の項目を達成した。1.オクタシアノ銅フタロシアニンをビルディングブロックとしたボトムアップ型反応により、均一分散した遷移金属を含む2次元炭素物質であるフタロシアニンシートの合成に成功した。その際、反応温度、原料混合比、添加物等の調査を行い、高品質なフタロシアニンシートが生成する反応条件を明らかにした。さらにX線構造解析、透過型電子顕微鏡により構造解析を行い、フタロシアニンシートの構造を綿密に調査し、構造を明らかにした。2.窒素ドープ炭素物質を得ることを目的に窒素含有有機化合物であるテトラクロロフタロニトリルをビルディングブロックに選定し、アルカリ金属との反応を試みた。反応温度、反応時間、原料混合比の検討を行った結果、とアルカリ金属のウルツ反応により窒素を多量に含んだナノグラファイトの合成に成功した。更にX線回折、透過型電子顕微鏡、X線光電子分光法による組成、構造解析、を行い、空孔の多いナノグラファイト構造を明らかにした。以上の研究により、当初の研究目標を達成した。さらに、研究計画を前倒しし、窒素ドープナノグラファイトの磁気特性の評価を行い、その磁性解明を達成した。本年度は以下3点に関して研究を推進し成果を得た。オクタシアノ金属フタロシアニンをビルディングブロックとしたフタロシアニンシートの合成。前年度2次元窒化炭素物質の一種であるフタロシアニンシートの合成に成功したが、反応温度が高いためグラファイトが副生成物として生じることが判明した。

そこで反応温度の低減を目指し、反応前処理の検討を行った。ボールミル混合による反応前処理を導入した結果、フタロシアニンシートの生成温度が大幅に低減することを突きとめた。さらにこれまで合成できていなかったMnフタロシアニンシートの合成に成功した。テトラクロロフタロニトリルをビルディングブロックとした窒素ドープ炭素の合成。本年度はカップリング材の検討を行った。カップリング材にアルカリ金属を用いた場合、窒素を多量に含んだ常磁性ナノグラファイトが得られた。構造解析の結果、窒素がエッジ、空孔を安定化させ、それらに誘起される磁気モーメントが常磁性の原因であることを明らかにした。本成果はSolid State Sciences誌に投稿し掲載された。さらにカップリング材に遷移金属に用いた場合、遷移金属イオンが均一分散したナノグラファイトが得られ、その磁気モーメントによる秩序磁性を示すことを明らかにした。メラミン、シアヌル酸クロリドをビルディングブロックとした窒化炭素シートの合成。メラミン、シアヌル酸クロリドを有機ビルディングに用いボトムアップ反応を検討した。その結果、秩序構造を持った反応生成物が得られた。XRDパターンから反応生成物の構造解析を行ったところ、窒化炭素シートの一種であるポリトリアジンイミドが生成したことを明らかにした。PTIは光化学触媒能を示す有用な炭素材料であり、本研究により新規合成法の可能性を示すことができた。研究計画に従い、フタロシアニンシートの合成及び窒素ドープ炭素の合成に関する研究を推進した。各進捗状況を以下に示す。1.フタロシアニンシートの原料となる各種オクタシアノ金属フタロシアニンを合成し、同定した。次に各種オクタシアノ金属フタロシアニンをビルディングブロックとしたフタロシアニンシート合成において、ボールミリングによる反応前処理を施すことにより、炭素不純物の低減を達成した。現研究段階で純度の高いフタロシアニンシート合成の可能性を示すことが出来た。さらに合成した各種オクタシアノ金属フタロシアニンを用いて各種フタロシアニンシート合成を試み、Mn, Fe, Co, Cuフタロシアニンシートの合成に成功した。また、磁気測定によりその磁性を調査した。2. TCPNをビルディングブロックに用いた場合、反応生成物が窒素を多量に含むナノグラファイトであること、ナノグラファイトのエッジ、空孔に生じた磁気モーメントによる常磁性を明らかにした。加えて、各種遷移金属をカップリング材に用い、各種炭素材料の合成を行った。X線回折、X線光電子分光法、透過型電子顕微鏡により反応生成物の構造を調査し、窒素配位遷移金属イオンが均一分散したナノグラファイトであることを突き止めた。また、遷移金属に由来する磁性を明らかにした。窒素ドープ炭素の合成において有機ビルディングブロックの検討を行った。有機ビルディングブロックをメラミン、シアヌル酸クロリドに変更し、反応を検討したところ、特定の反応条件で規則構造を示す反応生成物を得た。
統合失調症リスク遺伝子TCF4の中間表現型および機能解析

Transcription factor 4 (TCF4)遺伝子多型は、全ゲノム関連解析(GWAS)で同定された遺伝子の中でもヒトの脳機能との関連が報告されている遺伝子である。TCF4の遺伝子多型rs2958182は中国人において統合失調症と関連することが報告されており、日本人にも共通して存在する。本研究では統合失調症の病態におけるTCF4の関連を調べたところ、危険対立遺伝子(T)を持つ患者は、持たない患者と比べて性格傾向を見る自記式質問紙TCIにおいて新奇性追求が低いことを見出した。また、危険対立遺伝子(T)を持つ患者は、持たない患者と比べて後部帯状回の灰白質体積が小さいことを見出した。統合失調症リスク遺伝子TCF4は、ヨーロッパ系白人に対象者を絞った統合失調症の大規模な全ゲノム関連解析(GWAS)により見出された遺伝子である。本研究の目的は、TCF4遺伝子多型の中間表現型及び機能解析を行うことである。これまでに、さらに被験者数を増やしたGWASより、最初のGWASにおいて同定したTCF4遺伝子多型とは異なるTCF4遺伝子多型がいくつか同定されてきている。しかし、これらの遺伝子多型を、日本人を含むアジア人において調べてみると、遺伝子多型ではないものや遺伝子多型の頻度がcommonと言われる基準である5%以下であるなど、TCF4の遺伝子多型の頻度には人種による違いが存在することが分かった。これまでに、中国人サンプルを用いた再現研究において、白人のGWASで同定された遺伝子多型近傍の遺伝子多型rs2958182が統合失調症患者と関連することが報告されている。しかし、この遺伝子多型の機能はよく分かっていない。この遺伝子多型rs2958182は日本人にも共通して存在する遺伝子多型であったため、機能解明のために統合失調症で障害される認知機能、生理機能、脳構造を用いた中間表現型解析を行った。224名の統合失調症患者において、遺伝子多型rs2958182と様々な中間表現型との関連を検討した結果、リスクTアレルを持つ患者は、非リスクジェノタイプを持つ患者と比べて、統合失調症でスコアが低いことが知られている自記式性格傾向を見る質問紙であるTCIの新奇性追求が低いことを見出した。また、125名の統合失調症患者と333名の健常者において、リスクTアレルを持つ患者は、非リスクジェノタイプを持つ患者と比べて後部帯状回の灰白質体積が小さいことを見出した。これまでに中国人サンプルを用いた再現研究において、TCF4の遺伝子多型rs2958182が統合失調症患者と関連することが報告されている。224名の統合失調症患者において、遺伝子多型rs2958182と様々な中間表現型との関連を検討した結果、リスクTアレルを持つ患者は、非リスクジェノタイプを持つ患者と比べて、自記式性格傾向を見る質問紙TCIにおいて新奇性追求が低いことを見出した。平成26年度は、死後脳サンプルを使用して背外側前頭前皮質におけるTCFの遺伝子発現量を測定した。死後脳サンプルはAustralian Tissue Resourse Centerから健常者、統合失調症患者各37名分を使用し、Stanley Medical Research Institute (SMRI)から各群35名分を使用した。その結果、いずれの施設の死後脳サンプルにおいても、健常者と統合失調症患者に明らかな遺伝子発現量の違いはみられなかった。SMRIのデータベースでは統合失調症においてTCF4遺伝子発現量は増加しており、今回の結果と矛盾する。理由としてプローブ番号の違いや位置の違いが考えられるが、今回の結果からは成人統合失調症患者において、TCF4の転写レベルでは健常者と明らかな違いはないことが示唆された。医歯薬学本研究では、日本人におけるTCF4遺伝子と統合失調症の関連、さらに、そのTCF4リスク多型のTCF4遺伝子発現やスプライシングに対する影響や、統合失調症にて障害される認知機能、脳構造、神経生理機能との関連についての検討を行うことを目的とする。これまで、ヨーロッパ系白色人種を対象とした統合失調症のGWASにおいて、統合失調症に関連するTCF4遺伝子多型がいくつか同定されている。

しかし、これらの遺伝子多型は、日本人を含むアジア人では遺伝子多型ではないものや遺伝子多型の頻度が5%以下であり、TCF4の遺伝子多型の頻度には人種による違いが存在することが分かった。これまでに、中国人サンプルを用いた白人を対象とした統合失調症GWAS結果の再現研究において、ヨーロッパ系白色人種のGWASで同定された遺伝子多型近傍の遺伝子多型rs2958182が統合失調症患者と関連することが報告された。日本人においても、このTCF4遺伝子多型rs2958182は存在するが、このTCF4遺伝子多型の機能はよく分かっていないことから、アジア人統合失調症のTCF4リスク遺伝子多型と考えられる遺伝子多型rs2958182の中間表現型解析を行った。その結果、この遺伝子多型が統合失調症で障害される性格傾向や脳構造と関連することを見出した。TCF4遺伝子は、これらの中間表現型を介して統合失調症の病態に関わっている可能性が考えられた。引き続き、この遺伝子多型が遺伝子発現やスプライシングに対する影響や、TCF4遺伝子内の他の遺伝子多型で、日本人統合失調症と関連する遺伝子多型が存在するかを検討していく。研究はここまでおおむね計画通り遂行できているため、引き続きTCF4に着目して、統合失調症の分子遺伝学的基盤を明らかにしていく。これまで同様に、既に確立された体制により効果的、効率的に健常対照群および患者群のリクルートを継続して行っていく。中間表現型解析を行ったアジア人統合失調症患者と関連するTCF4遺伝子多型rs2958182以外にも、日本人において、統合失調症とさらに強く関連するTCF4遺伝子多型があるかを検討する。収集したサンプルを追加した統合失調症及び健常者サンプルを用いて、TCF4遺伝子全体をカバーする遺伝子多型を選択して、日本人において遺伝子内で最も関連するリスク多型を同定する。また、統合失調症由来の死後脳、芽球化細胞、iPS細胞を用いて遺伝子多型の遺伝子発現量やスプライシングバリアントの発現への影響を検討する。我々が包括的遺伝解析研究として発足した脳表現型の分子メカニズム研究会や国内外の学会においても成果発表をしていく。さらに新聞発表などのマスメディア、インターネットなどのアウトリーチにて研究成果を社会・国民に発信していく。TCF4を見出したGWAS以外にも、GWASにより統合失調症と関連するいくつかの遺伝子多型が同定されている(ZNF804A、MIR137、NRGN、CSMD1、CNNM2など)。また、遺伝子発現調節に関わるmicroRNAが統合失調症の病態に関与しているという報告がいくつかある。そのmicroRNAの1つであるMIR137遺伝子多型がGWASで見出され、MIR137の結合するターゲーット領域としてこれまでにGWASで見出された遺伝子多型領域が含まれることが分かってきた。このように、これまで個々に考えられていた遺伝子多型が、分子メカニズムの面でいくつかに収束する可能性がある。そこで、TCF4遺伝子多型とGWASにおいて既に報告のある他の遺伝子多型との相互作用を検討することにより、統合失調症の分子遺伝学的基盤から病態メカニズムを明らかにしていく。
部分環族を用いた極小位相力学系の接合積の構造解析

(1)位相力学系や測度空間上の群作用の拡大から生ずる作用素環の包含(接合積構成法)に対して,自由という自然な状況の中で,包含の間に現れるすべての作用素環がもとの力学系の情報から自然に生じるもののみである,という強固な制約を発見した.これにより,従来計算がごく限られた状況でのみ可能であった,「中間作用素環がなす束」の具体的計算が可能なクラスを飛躍的に広げることができた.非可分作用素環の構造分解の剛性について,Popaの古い技術を用いて研究した.具体的には,近似的有限次元(=有限次元環の帰納極限)である単純作用素環で,テンソル積分解,正則可換部分環,漸近的中心列といったものを全く持たないものを構成することができた.これは可分の場合にもつ,よく知られていて重要な数々の柔軟性を裏切る決定的な現象である.類似した現象は,集合論を背景に作用素環論を研究している勝良らのグループにより,部分的な結果が連続体仮説のもとで検証されていたが,我々の解析はZFC内で行われており,特に彼らが掲示していた未解決問題をより強い形で完全に解決した.(3)局所コンパクト群のAPとその群作用に付随する接合積C*環の関係について,期待すべき定理を証明した.これは(1)で得られた定理を局所コンパクト群に拡張するために必要不可欠な最初の足掛かりである.我々の解析はvon Neumann環の設定でも通用する方法であり,特にHaagerup-Krausの定理に,非有界荷重など入り組んだ道具を必要としない簡潔な新証明を与える.この研究のおまけとして,「APは完全性を導くか?」という,離散群の場合にはよく知られていたが,一般の局所コンパクト群については長年未解決のまま残されていた問題を肯定的に解決することができた.これよりAPをもつ第二可算局所コンパクト群について,Baum-Connes予想の単射性が従う.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。Anantharaman-Delarocheの著名論文(Trans.AMS, 2002)に掲示されていた未解決問題を二つ解決した.これはC*環への群作用に対する従順性の定義にまつわる問題である.従順性はもともとBanach-Tarskiの病理の原因として,von Neumannが特定した群の性質である.意味のある解析を行うためには従順性はなくてはならない性質である.Delarocheは,上記の論文において,C*環上の群作用の従順性を一応定義し,期待されるよい性質が従順性を持つ場合には保証されることを示している.しかし本人も論文で言及しているように,この定義は作用される環の中心上の力学系がとても大きいという性質が大前提となっており,満足のいく完全な定義とは言い難い.とくにこの定義では,非従順群は単純な環の上に従順に作用することはできない.私は今年度,このような定義が実際に強すぎる要請であることを,単純環への従順とみなすべきいくつかのよい性質を備えた作用を構成することで実証した.(特に上述した二つの未解決問題が否定的に解決される.)(ii)プレプリントarXiv:1702.04875v2に,次の定理を追加した.「ねじれを持たない可算無限群は,広いクラスの空間に,亜群として識別されるよい極小作用をたくさんもつ.」極小作用は単純C*環の材料として,古くから研究されている重要な対象である.とくに去年度私やDavid Kerrが開発した技術により,一般の従順群の極小作用の接合積の構造解析が行えるようになってきたが,どのぐらい実際にそれらの群の極小作用が存在しているのかについてはこれまで言及されていなかった.一般に亜群のレベルで二つの作用を識別することは難しいが,われわれは固有値集合という新しい不変量を亜群に対して導入し,この困難を乗り越え,定理を証明することができた.想定していなかったC*環の群作用の従順性について,重要な発見をすることができた.また,今年度達成することができた,互いに構造の異なる極小位相力学系の構成は,今後接合積の構造解析を行う人々の一つの原動力となるだろう.(1)位相力学系や測度空間上の群作用の拡大から生ずる作用素環の包含(接合積構成法)に対して,自由という自然な状況の中で,包含の間に現れるすべての作用素環がもとの力学系の情報から自然に生じるもののみである,という強固な制約を発見した.これにより,従来計算がごく限られた状況でのみ可能であった,「中間作用素環がなす束」の具体的計算が可能なクラスを飛躍的に広げることができた.非可分作用素環の構造分解の剛性について,Popaの古い技術を用いて研究した.具体的には,近似的有限次元(=有限次元環の帰納極限)である単純作用素環で,テンソル積分解,正則可換部分環,漸近的中心列といったものを全く持たないものを構成することができた.これは可分の場合にもつ,よく知られていて重要な数々の柔軟性を裏切る決定的な現象である.類似した現象は,集合論を背景に作用素環論を研究している勝良らのグループにより,部分的な結果が連続体仮説のもとで検証されていたが,我々の解析はZFC内で行われており,特に彼らが掲示していた未解決問題をより強い形で完全に解決した.(3)局所コンパクト群のAPとその群作用に付随する接合積C*環の関係について,期待すべき定理を証明した.

これは(1)で得られた定理を局所コンパクト群に拡張するために必要不可欠な最初の足掛かりである.我々の解析はvon Neumann環の設定でも通用する方法であり,特にHaagerup-Krausの定理に,非有界荷重など入り組んだ道具を必要としない簡潔な新証明を与える.この研究のおまけとして,「APは完全性を導くか?」という,離散群の場合にはよく知られていたが,一般の局所コンパクト群については長年未解決のまま残されていた問題を肯定的に解決することができた.これよりAPをもつ第二可算局所コンパクト群について,Baum-Connes予想の単射性が従う.C*環の作用の従順性の正しい定式化には,作用の近似中心列のふるまいが重要な役割を果たしているように思える.今後は作用の「従順性」から,近似中心環のよい性質を取りだすという方針で研究を進めていきたい.また,作用の従順性を駆使して,これまで未開であった非従順群の群作用の分類や,接合積C*環の構造解析にも研究を推し進めていきたいと考えている.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。論文,講演,出張の報告を公表している.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。論文リスト,講演発表歴,出張日程などを,日英二言語で公表している.
フォトクロミック材料における光構造変化の動力学的研究

フォトクロミック化合物ー光によって分子構造が可逆的に変化し、それに従って色も可逆的に変化する化合物ーは書換え可能な光記憶材料として注目されている。特に有機化合物においては、この構造変化が分子単位で起こるため超高密度記録が可能になる。本研究は有機フォトクロミック化合物であるフルギドについて、光構造変換速度及び変換量子収率の向上について調べた。1)閉環反応速度とポリマ-マトリックス効果ー3種類のポリマ-(PMMA,PS,NC)に1wt%のフリルフルギドを溶かしたフィルムについて、ピコ秒レ-ザフォトリス測定を行った。その結果、電子閉環反応はポリマ-には依存せず、10ピコ秒以内に完了することがわかった。2)高密度光記録材料として用いる場合、フルギドを高密度でポリマ-フィルム中に溶かさなければならない。このとき問題になるのはフォトクロミック分子間の相互作用である。これを、閉環体の発光寿命と発光スペクトルのフルギド濃度依存性から推測した。その結果、0.1M濃度以上では分子間相互作用が顕著になるが、0.01M濃度以下ではほとんど無視できることが分かった。このことから、もしフルギドをホ-ルバ-ニング材料として使う場合は、その濃度は少なくとも0.01M以下にする必要がある。3)量子収率の向上ーフルギドの各位における置換基が量子収率にいかに関与しているかを調べた。すなわち、置換基としてHや傘高いイソプロピル等を用いたときの置換基の位置と傘高さが量子収率、及び開環直色体の吸収帯に及ぼす影響を明らかにした。マトリックス効果は、閉環反応はマトリックスの影響をほとんど受けないが、開環反応の量子収率はマトリックスの極性が増大すると減少する。
顎運動機能におけるヒスタミン神経系の役割

今回取り上げた口腔顎顔面ジスキネジ-(orofacial dyskinesia)は難治性のものが多く,高齢化社会に基づくパーキンソン病,痴呆をともなう精神病などの長期治療薬服用中(ハロペリドール,抗パーキンソン薬など)に多く見られる顎の異常運動である.この口腔顎顔面ジスキネジ-の実験モデルとして覚醒剤methamphetamineにより誘発される顎運動(oral stereotypy)が知られており,錐体外路系(とりわけ線条体)のドパミンとアセチルコリン神経系のバランスの異常が原因と考えられる.今回このモデルを用い,ヒスチジン処置によりヒスタミン神経系を賦活させるとmethamphetamineにより誘発される顎運動(oral stereotypy)が抑制された.一方,ヒスタミン受容体遮断薬メピラミン,ゾランチジン処置によりヒスタミン神経系を抑制させるとmethamphetamineにより誘発される顎運動が亢進した.また,神経化学的研究により,線条体のドパミンの遊離により顎運動が亢進されるが,ヒスタミンはドパミンより遅れて遊離して、ドパミンの過剰な刺激を緩衝しているという結果を得た.これらの結果より,ジスキネジ-の治療薬としてヒスタミンH3受容体拮抗薬が有効である可能性を示唆するとともに,ヒスタミン神経系は抑制系として顎運動に関与していることが判明した.今回取り上げた口腔顎顔面ジスキネジ-(orofacial dyskinesia)は難治性のものが多く,高齢化社会に基づくパーキンソン病,痴呆をともなう精神病などの長期治療薬服用中(ハロペリドール,抗パーキンソン薬など)に多く見られる顎の異常運動である.この口腔顎顔面ジスキネジ-の実験モデルとして覚醒剤methamphetamineにより誘発される顎運動(oral stereotypy)が知られており,錐体外路系(とりわけ線条体)のドパミンとアセチルコリン神経系のバランスの異常が原因と考えられる.今回このモデルを用い,ヒスチジン処置によりヒスタミン神経系を賦活させるとmethamphetamineにより誘発される顎運動(oral stereotypy)が抑制された.一方,ヒスタミン受容体遮断薬メピラミン,ゾランチジン処置によりヒスタミン神経系を抑制させるとmethamphetamineにより誘発される顎運動が亢進した.また,神経化学的研究により,線条体のドパミンの遊離により顎運動が亢進されるが,ヒスタミンはドパミンより遅れて遊離して、ドパミンの過剰な刺激を緩衝しているという結果を得た.これらの結果より,ジスキネジ-の治療薬としてヒスタミンH3受容体拮抗薬が有効である可能性を示唆するとともに,ヒスタミン神経系は抑制系として顎運動に関与していることが判明した.顎運動に関しては歯科の研究対象として機能的,形態的両面から各種研究がなされているが,中枢神経とりわけ精神機能ならびに情動行動の面からとらえる研究は進んでいないのが現状である。しかし,口腔癖や歯ぎしりの発生に精神的,情緒的な要素が重要な役割を演じていることは認められており,顎関節症の患者の中で,精神安定剤の内服が症状軽減に有効な手段であることも報告されている.また,精神病治療薬(ハロペリドールなど)での治療中に,orofacial dyskineiaが起こることはよく知られている.これは錐体外路系のドパミンとアセチルコリン系のバランスの異常が原因とされていた.しかし,ヒスタミン神経系に関する報告はない.これらの背景から,本研究では覚醒剤methamphetamine (MAP)投与により誘発されるoral stereotypyの顎運動に絞り,その発現メカニズムにおけるヒスタミン神経系の投与を明らかにすることを目的とした.今回は脳内とりわけ線条体において顎運動時のヒスタミンの動態を捕らえ,この変化が顎運動にどのような影響を与えているか検討した.1. MAP投与により誘発される顎運動時における脳内ヒスタミン量の変動についてマイクロダイアリシス法および高速液体クロマトグラフィーを用いて分離定量した結果,1.ヒスタミンの細胞外遊離量は増加した.2.また,ヒスタミン合成酵素のヒスチジン脱炭酸酵素の活性は上昇し,ヒスタミン神経系の活性はMAP投与に活性化されることが判明した.3.しかし,この遊離はドパミンの遊離よりも遅れて現れ,さらにハロペリドール(D2受容体拮抗薬)前処理により抑制されることを認めた.現在oral stereotypy (licking, biting)との相関性についてまとめている段階であるが,脳内ドバミンは促進系,ヒスタミン系は抑制系として関与していることが示唆されると思われる.今回取り上げた口腔顎顔面ジスキネジ-(orofacial dyskinesia)は難治性のものが多く、高齢化社会に基づくバ-キンソン病,痴呆をともなう精神病などの長期治療薬服用中(ハロペリドール,抗パーキンソン薬など)に多く見られる顎の異常運動である.この口腔顎顔面ジスキネジ-の実験モデルとして覚醒剤methamphetamineにより誘発される顎運動(oral stereotypy)が知られており,錐体外路系(とりわけ線条体)のドパミンとアセチルコリン神経系のバランスの異常が原因と考えられる.今回このモデルを用い,ヒスチジン処置によりヒスタミン神経系を賦活させるとmethamphetamineにより誘発される顎運動(oral stereotypy)が抑制された.一方,ヒスタミン受容体遮断薬メピラミン,ゾランチジン処置によりヒスタミン神経系を抑制させるとmethamphetamineにより誘発される顎運動が亢進した.

また,神経化学的研究により,線条体のドパミンの遊離により顎運動が亢進されるが,ヒスタミンはドパミンより遅れて遊離して,ドパミンの過剰な刺激を緩衝しているという結果を得た。これらの結果より、ジスキネジ-の治療薬としてヒスタミンH3受容体拮抗薬が有効である可能性を示唆するとともに,ヒスタミン神経系は抑制系として顎運動に関与していることが判明した.
ドップラー速度選択方式共鳴イオン化質量分析法に関する研究

エネルギー準位の同位体シフトを利用する同位体選択的共鳴イオン化質量分析に着目し、これを波長可変狭帯域半導体レーザーベースのコンパクトなシステムで実現するため、高分解能分光法で常に問題となるドップラー拡がり効果を簡便に抑制できることが期待されるドップラー速度選択方式共鳴イオン化質量分析法を考案した。レーザー波長をある同位体の吸収波長に合わせたとき、他の同位体ではその同位体シフトに相当する分だけ異なった速度を持つものが共鳴吸収・イオン化される。本手法ではこのことに着目し、その僅かな速度差により同位体を分離・測定するものである。検出器前に可動スリットを設置し、イオンの検出器面での到達位置分布を調べた結果、各同位体が持つそれぞれ特有の速度に対応する位置分布が得られた。また、イオン化初期位置分布の広がりが本方式の同位体選択性を制限するという問題を、静電イオンレンズの適用により改善した。この結果、本方式の同位体選択性(着目同位体に対する検出効率/質量数が1つ異なる同位体に対する検出効率)が16と見積もられ、本方式を採用することで、質量分析器の同位体選択性が1桁向上することがわかった。他の共鳴励起遷移の利用や多段階励起スキームの採用により更なる同位体選択性の向上が見込まれる。本方式と飛行時間型等の他の質量分析系と組み合わせることで、従来より、コンパクトで同位体選択性の高い、質量分析装置が構築可能であると結論付けられる。本手法は、レーザー波長をある同位体の吸収波長に合わせたとき、他の同位体はその同位体シフトに相当する分だけ異なった速度を持つものが共鳴吸収・イオン化されることに着目し、その僅かな速度差により同位体を分離・測定するものである。イオン引き抜き系の電場計算とイオン輸送モンテカルロ計算により、本方式の実現可能性を検討した結果、現実的な装置規模で十分に各同位体の弁別が可能であることを見出した。また、上記の検討結果をもとに設計した試作分析装置により、1mm幅のスリットを設置することでドップラー拡がり効果を抑制することに成功し、さらにCa-40とCa-44を選択的に測定することに成功した。これらにより実験的にも本方式の原理を実証できたといえる。現状の試作装置における同位体選択性を評価したところ、Ca-44/Ca-40=15という結果が得られた。また、レーザー出力等の測定条件の検討、多色多段イオン化スキームの採用により、同位体選択性Ca-41/Ca-40=1.5×10^8が得られることを見出した。さらにイオン引き抜き系の最適設計、連続発振レーザーによる試料の蒸気化を行うことで検出効率についても更なる改良が見込まれる。
分子鎖の直接観察による天然セルロ-スおよびその誘導体の構造解析

4年間の研究成果を以下にまとめる。(1)NMRスペクトルによって大別されたバクテリア・バロニア型セルロ-スとコットン・ラミ-型セルロ-スは、それぞれ3斜晶系と単斜晶系のミックス、単斜晶系であることを電子線回折によって明らかにした。(2)3斜晶系の単位胞は1本のセルロ-ス鎖で構成されていることを初めて示した。従って、セルロ-スIは平行鎖構造であり、バロニアは大単位胞ではないことになり、Honjo & Watanabeの説に替わる新しいモデルが提案された。(3)種子植物間でも、針葉樹材(N材)、広葉樹材(L材)、タケ類などでセルロ-ス結晶の回折強度や格子面間隔に差があることが分かっている。そこでN材17種、L材61種がバクテリア・バロニア型であるかコットン・ラミ-型であるかを半別分析した結果、N材15種、L材7種がバクテリア・バロニア型であった。ところがN材、L材を精製してホロセルロ-スにすると、すべてがコットン・ラミ-型に変わった。しかし、依然として2つのグル-プ間には差異があることが示された。(4)セルロ-スIはマ-セル化によって不可逆的にIIに変態する。膨潤初期のアルカリセルロ-スを種々検討した結果、不可逆性はアルカリ膨潤の過程で起こると推定された。(5)セルロ-ス微結晶を高度に分散させた状態でマ-セル化を行い、電顕、X線回折で調べた結果、X線の変化が生じる処理では、ミクロフィブリルに細かい縦割れや寸断が生じ、ビ-ズ状の粒子が出現するなど、結晶のマクロ形態に大きな変化を生じることが分かった。(6)ホヤなど高度に結晶化しているセルロ-スミクロフィブリルを用いて、磁力線に対するセルロ-スの配向挙動を調べた。その結果、分子鎖軸が磁力線に垂直に配向することが分かった。マーセル化のメカニズムを明らかにするためにはどうしてもセルロースIIの結晶構造を明らかにする必要があると考え、セルロースIIの単結晶を調製した。またセルロースを誘導体化した際、どういった分子・結晶構造が誘導体の化学的・物理的性質に影響するのかを明らかにするため、種々のセルロースエーテル3置換体の単結晶を調製した。得られた単結晶を電子顕微鏡ならびにX線回折法により解析しており、現時点での進行状況は次の通りである。1)セルロースIIの単結晶:細長いリボン状の単結晶でその厚さは用いたセルロースの重合度と一致する。つまり分子鎖は伸長鎖であることが分かった。そこで現在、分子鎖配向に関する情報を得るために、この単結晶の還元末端にブロムを結合させたカルバジド基を導入し、これを可視化して、平行・逆平行鎖のいずれであるかを明らかにすることを試みている。2)メチル、エチル、プロピル、ブチル、ベンジル、メタリル、アリルセルロース等の3置換体セルロースエーテルの単結晶調製を試みた結果、エチル,プロピル、ブチル、ベンジル、メタリルセルロースについては良好な単結晶を調製することができた。ブチルセルロース以外は、すべてhexagonal unitであるのに対して、それはtetragonal unitである等、エーテル基の違いと結晶構造との関連において大変興味深い知見を得ている。現在、コンフォメーション解析のために基礎的データを収集中である。CP/MASーC13

NMR分析によれば、天然セルロ-スはバクテリア・バロニア型とコットン・ラミ-型に大別される。そこで両者の結晶構造の差異を明らかにするため、前者からバロニアを、後者からホヤを選び、制限視野電子線回折図を撮り比較検討した。両者の回折図は60以上の独立した回折点を示し、それら全てを説明できる結晶単位胞に著しい違いが見いだされた。すなわちホヤの回折点は小単位胞(a=0.821、b=0.829、c=1.038nm、γ=97.3°によって指数づけできたが、バロニアは第1、3、4、5層線に小単位胞では指数づけできない回折点があることがわかった。Yamamotoらはバロニアを高温水蒸気処理すると、そのNMRスペクトルがコットン・ラミ-型に変ることを見いだしている。そこでその試料の電子線回折図を撮り、詳細に検討した結果、水蒸気処理温度が高いほど小単位胞で指数づけできない回折点の強度が減少することがわかった。それらの結果からバロニアの単位胞は大単位胞ではなく、3斜晶の小単位胞(a=0.954、b=0.825、C=1.036nm、α=90.0°、β=57.0°、γ=96.6°であることを見いだした。したがって天然セルロ-スには単斜晶と3斜晶の2種類の結晶があることがわかった。セルロ-スIはマ-セル化によって不可逆的にセルロ-スIIに変態する。不可逆性の機構を明らかにする第一歩として、アルカリ膨潤初期のラミ-繊維を水洗乾燥して、繊維の横断面内における結晶型の分布を電子線回折によって調べた。その結果、繊維の表層部はIIに変態していたが内層部はIとIIのミックスで、表層部に比べて内層部のマ-セル化は遅れがあることを見いだした。また水洗温度によってIとIIの量比が変ることもわかった。さらに長時間膨潤させた場合にも量比が変ることから、不可逆性はアルカリ膨潤段階に生じると判断できた。昨年度までの研究によって、天然セルロ-スの結晶には、単斜晶系の他に三斜晶系に属するものがあることが明らかなった。引き続いて検討した結果、三斜晶系の結晶は、常に単斜晶系の結晶と共存していることがわかった。従って三斜晶系の結晶構造解析を進めるには、三斜晶系の結晶だけの試料が得られない現時点では、単斜晶結晶を差し引くしか方法がない。そこで、単斜晶系の結晶だけから成り立っているラミ-並びにホヤのセルロ-スについて研究を進めた。先ず、単斜晶系の結晶構造を決定するための基本的条件を検討した。すなわち、既発表のセルロ-ス結晶の分子鎖はすべて2回らせん軸を持っているので、2回らせん軸を持たない場合の分子鎖形態についても検討した。すなわち、両者のエネルギ-的安定性を比較した。その結果、エネルギ-的な安定性には大差はなく、いずれの形態も可能であることが判明した。続いて、分子鎖の平行鎖構造と逆平行鎖構造の是非を追求するために、ラミ-セルロ-スのマ-セル化過程を検討した。その結果、アルカリセルロ-スには、煮沸によってセルロ-スIに戻るものと、セルロ-スIIに変態するものとがあり、その量比がアルカリセルロ-ス形成時の物理的環境条件に依って異なってくることが明らかになった。しかし、平行鎖から逆平行鎖への変化機構の核心は明かではない。ホヤセルロ-スについては、先ず、成長段階の異なるホヤを用意し、個体の特定な位置から皮膜の一部を切り出して、X線回折法によって結晶の分子鎖軸の配向を調べた。その結果、皮膜面内に分子鎖軸がほぼランダムに配向していることがわかった。ただし特定の方向に偏りがあることも判明した。
PCR法による口腔白板症における癌遺伝子発現異常の解析

舌に発生した扁平上皮癌11例、白板症9例、正常歯肉2例のフォルマリン固定パラフィン包埋材料および扁平上皮癌培養細胞A431よりDNAを抽出し、PCRによってp53遺伝子のexon58部分をそれぞれ増幅させた。パラフィン切片からDNAを抽出する方法は、chelating vesinおよび界面活性剤を用いた方法では増幅産物が得られず、脱パラフィンの後、proteinaseKで消化した材料をPCR-templateとすることで増幅産物が得られた。この増幅産物を濃度勾配ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、銀染色でDNAを可視化してp53遺伝子の変異の有無を検索した(PCR-SSCP)。変異バンドの同定がやや困難であったが、扁平上皮癌1例、白板症1例において変異と考えられる異常バンドが検出された。PCR-SSCP原法ではアイソトープを用いており、変異DNAの量が微量でも検出が容易であるが、本研究では一般検査室でも利用可能なp53変異検出系の確立を目指したため、銀染色による変異検出法を採用した。検出感度を上げるために、希釈したPCR産物をさらに同一プライマーで再度PCRにかけたところ、バンドは濃くなったが非特異産物のバンドも増幅されてきた。客観的な変異バンドの検出には、さらにアニーリングの温度を上げる必要があると思われた。前癌病変と考えられている口腔白板症におけるp53癌抑制遺伝子変異の意義を明らかにするには、PCR-SSCPの条件を吟味し、更に症例数を追加して検討することが必要と思われた。1.実験対照としての核酸の調整本学第1口腔外科学講座より供与されたAー431細胞より、フェノ-ルクロロホルム法にてDNAを抽出,精製した。Aー431細胞はEGFレセプタ-遺伝子が著明に増幅していることが知られている培養細胞で、このDNAを今後の研究において、目的DNAの増幅を定量する際のコントロ-ルとして使用する。また、正常コントロ-ルとして、健常成人末梢血白血球より同様にDNAを抽出した。2.パラフィンブロックからのDNA抽出本研究は、白根症・扁平上皮癌症例のDNAの量的および質的異常を検索することが目的である。新鮮組織からのDNA抽出が望ましいが、パラフィンブロックからでも充分解析可能なDNAが抽出出来るとされている。このため、予備実験として炎症性病変などのパラフィンブロックからDNA抽出を試みた。3.DNA変異の検出癌遺伝子などの変異を検出するために,直接塩基配列決定法、アレル特異的オリゴヌクレオチドを用いたハイでリダイゼ-ション,濃度勾配変性ゲル電気泳動法、PCRーSSCP法などを利用されている。RAS遺伝子の点突然変異を検出するため変異特異的オリゴスクレオチドプロ-ブを入手したが、変異遺伝子の数だけハイブリダイ・ゼ-ションを繰り返す必要があり,多数症例の確析には不適当と判断されたため,アイソト-プを使用する必要のない濃度勾配変性ゲル電気泳動法をスクリ-ニングに導入する予定である。遺伝子の異常を検出するには通常アイソトープが利用されているが、被爆の問題や、2週間程度しかもたないといった欠点を有するため、今回の研究ではnon-RIの検出系を使用することにした。ジゴキシゲニン標識したVH・CTβDNAプローブを用いて悪性リンパ腫患者のリンパ節から抽出したDNAとサザンブロットを行ったが、感度が低く、明瞭なバンドが得られなかった。これはプローブの標識率をRIの様にモニターできない事が原因と考えられた。最近では遺伝子の点突然変異の検出にPCR-SSCP法やDGGE法などがよく用いられているが、PCR-SSCP法の原法ではRIを使用している。これもメンブレンを銀染色することでRIを用いずに変異を検出する変法が報告されており、来年度ではこの方法を利用して研究を進めたい。また、研究計画の当初ではrasやmycといった癌遺伝子をターゲットとしていた。

我々の研究対象である白板症においてこれら癌遺伝子の異常を調べた報告はまだないが、口腔の扁平上皮癌ではこれら癌遺伝子の異常の頻度は少ないとする報告が出てきている。一方、最近癌抑制遺伝子としてp53が注目を集めており、口腔の扁平上皮癌でp53遺伝子の変異を高率に検出したという報告も認められる。白板症から扁平上皮癌への多段階発癌を考えると、p53の果たす役割は興味深く、我々も来年度はp53を中心として研究を進める予定である。舌に発生した扁平上皮癌11例、白板症9症例、正常歯肉2例のフォルマリン固定パラフィン包埋材料および扁平上皮癌培養細胞A431よりDNAを抽出し、PCRによってp53遺伝子のexon5、6、7、8部分をそれぞれ増幅させた。パラフィン切片からDNAを抽出する方法は、chelating resinおよび界面活性剤を用いた方法ではPCR産物が得られず、脱パラフィンの後、proteinase Kで消化した材料をPCR templateとすることで増幅産物が得られた。この増幅産物を濃度勾配ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、銀染色でDNAを可視化してp53遺伝子の変異の有無を検索した(PCR-SSCP)。材料が生検材料のパラフィン切片であるため、鋳型DNA量が極めて微量で、泳動後ゲル上の正常2本鎖および1本鎖DNA以外の変異DNAのバンドは薄く、判定が困難であったが、扁平上皮癌1例、白板症1例において変異と考えられる異常バンドが検出された。PCR-SSCPの原法ではアイソトープ標識を用いるため変異DNAの量が微量でも判定が容易であるが、我々は一般検査室でも利用可能なp53 DNAの変異検出方法確立を目指しているため、銀染色による変異判定方法を採用した。検出感度を上げるために、希釈したPCR産物をさらに同一プライマーで再度PCRにかけたところ、バンドは濃くなり判定しやすくなったが、非特異産物と思われるバンドも増幅されて来たため、やはり判定には慎重を要した。客観的な変異バンドの検出には、さらにアニーリングの温度を上げる必要があると思われた。前癌病変と考えられている口腔白板症におけるp53癌抑制遺伝子変異の意義を明らかにするには、PCR-SSCPの条件をさらに検討する必要があると考えられた。
血清中IL-1受容体補助タンパク濃度を用いた新規歯周病病態マーカーの開発

歯周病の検査と診断は歯科医しか行えないのが現状である。他の全身疾患のように血液検査で簡単に測定できれば、集団検診などでも容易に歯周病の可能性を把握することができるようになる。申請者はIL-1受容体補助タンパク質(IL-1RAcP)は健常者血清中、で数百pg/mlの濃度で検出され、歯周病患者において、健常者に比べその濃度が上昇することを見出した。そこで歯周病患者を歯周組織検査に基づき病態別に分類する。その後、血清中のIL-1RAcP濃度と歯周病病態との関連性を統計学的に解析し、血清中IL-1RAcP濃度が歯周病の新たな疾患マーカーに成りうるかどうかについて検討する。