hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
PUVA処理した制御性樹状細胞によるヒトGVHDに対する新たな細胞療法の開発

In vitroの解析ではMHC非依存性にTリンパ球に対し抑制作用を示し、細胞間接着およびIDO増加による免疫寛容誘導が示唆された。しかしIDO阻害物質下におけるリンパ球混合培養では免疫抑制作用は解除されなかった。マウスGVHDモデルでPUVA-DC(Host,Donor,Third-party)を輸注したがGVHD抑制作用は認めなかった。生体内での生着・生存が不十分であることが考えられ、生体内投与後においても生存するPUVA-DC作成を探索する研究へと繋がった。マウスGVHDモデルでは同じ様に移植を行ったとしても、移植細胞数の僅かな誤差や移植前処置の放射線照射の違いによって、予想以上にGVHDが強く惹起することがある。そのため制御性樹状細胞(PUVA-DC)を輸注しても、GVHDを十分に抑えられなかったことが考えられる。ホストタイプおよびサードパーティーのPUVA-DCの輸注がうまく行かなかった原因として、PUVA-DCの必要輸注細胞数がマウスGVHDモデルで異なる可能性があり、再度PUVA-DCの輸注必要細胞数の検討を行う。またそれらの移植したPUVA-DCが、生着しているかどうかの検討を行う。マウスGVHDモデルの最適化を行い、その後、制御性樹状細胞(PUVA-DC)数の最適化を行う。また制御性樹状細胞(PUVA-DC)数の最適化が得られなかった場合には、その原因検索を行う。In vitroで得られたデーターとIn vivoで得られたデーターとの間に乖離を認め、その原因検索をする必要性が生じた。そのため、Humanの血液細胞による制御性樹状細胞の作製にとりかかることが出来なかった。理想的なマウスGVHDモデルを作成できず、そのため適正な制御性樹状細胞(PUVA-DC)の輸注細胞数の最適化が得られなかった事から、humanの血液細胞における制御性樹状細胞(PUVA-DC)の作成へ進めなかった。また作成予定だったhumanの制御性樹状細胞を用いて、異種系マウス骨髄移植(NOGマウス)を行うことができなかったため、次年度への先送りとなった。制御性樹状細胞(PUVA-DC)の輸注細胞数の最適化、マウスGVHDモデルの適正化、Humanの制御性樹状細胞の作製およびその機能評価のための経費に充てる。50万以上の物品の購入はない。理想的なマウスGVHDモデルおよび制御性樹状細胞の輸注細胞の適正化のための実験のための経費や次年度の研究推進のための経費に充てる。
オートファジーにおけるリソソーム膜タンパク質ＬＡＭＰー２の役割

LAMP-2遺伝子変異であるダノン病は、精神発達遅滞をきたすにもかかわらず神経病理学的所見は明らかでない。本研究では、LAMP-2ノックアウトマウスを用いて中枢神経系を中心にLAMP-2の機能を解明することを目的とした。ノックアウトマウスの脳では心臓や肝臓と異なり、オートファジー空胞はほとんど認められず、神経系細胞への凝集物蓄積が見られ、リソソーム蓄積病の所見であった。ノックアウトマウス脳ではカルシウム関連シグナルの発現が変化しており、新生児脳低酸素虚血と中大脳脈梗塞モデルを作製し野生型と比較すると明らかに強い変化が認められ、LAMP-2が病巣修復機序に関与している可能性が示唆された。リソソーム膜タンパク質lysosome-associated membrane protein-2 (LAMP-2)は、肥大型心筋症、自己貪食空胞性ミオパチー、精神発達遅滞を主徴とするダノン病の原因遺伝子であり、サブタイプのひとつLAMP-2Aは、シャペロン介在性オートファジー(CMA)の受容体として知られている。平成24年度は、ヒトのダノン病剖検症例を検討し、その神経病理所見をActa Neuropathologicaに発表した。また、23年度に引き続きLAMP-2欠損マウスの解析を行った。今回報告したダノン病の剖検症例は31歳男性。ダノン病の3主徴があり、LAMP-2 exon 6-skipping変異が確認されている。脳の神経細胞では、骨格筋、心筋、肝臓と異なり、オートファジー空胞は見られず、グリコーゲン顆粒の蓄積もなかった。神経細胞にリポフスチン顆粒、戻し電顕で神経細胞の細胞質に蓄積物質が認められた。また、リン酸化タウ陽性神経細胞が動眼神経核にみられ、黒質神経細胞にマリネスコ小体が散見された。Corpora amylaceaも多数認められた。これらの所見はリソソーム分解不全による蓄積物質の貯留と加齢促進現象であると考えられ、リソソームの機能と加齢の関係が示唆された。ダノン病で認められた蓄積物質の貯留はLAMP-2欠損マウスでもみられた。神経細胞の細胞質に見られた蓄積物質の形態は糖脂質が示唆され、物質の同定を試みたいと考えている。さらに、病的状態におけるLAMP-2の機能を解析するため、12週齢で中大脳動脈閉塞モデル、7日齢で低酸素脳虚血モデルを作製し、LAMP-2欠損マウスと野生型マウスを比較したところ、欠損マウスの方が致死率が多かった。今後、病変の検討を行う予定である。リソソーム膜タンパク質であるLAMP-2は、リソソーム膜の単なる構造タンパク質ではなく選択的オートファジーに関連する重要な機能分子であると報告されている。LAMP-2遺伝子変異であるダノン病は、精神発達遅滞をきたすにもかかわらず、精神神経症状に対応する神経病理学的所見は記載されていなかったためダノン病の剖検脳を詳細に検討したところ、リソソーム蓄積病として矛盾しない病理像を呈していた(Furuta et al. Acta Neuropath 2013)。本研究では、LAMP-2ノックアウトマウスを用いて中枢神経系を検討しLAMP-2の機能を明らかにすることを目的とした。ノックアウトマウスの脳では心臓や肝臓と異なり、黒質網様部の軸索以外にLC3陽性のオートファジー空胞はほとんど認められず、神経系細胞への凝集物蓄積が主な所見であった。機能分子の変化を検討するためにノックアウトマウスと野生型マウスの脳を2次元電気泳動で比較したところ、ユビキチンープロテアソーム系、熱ショックタンパク質、シナプス関連、カルシウムシグナル系の分子群の発現が変化していた。また、LAMP-2ノックアウトマウスに新生児脳低酸素虚血と中大脳脈梗塞モデルを作製し野生型と比較すると明らかに強い変化が認められ、LAMP-2が病巣修復機序に関与している可能性が示唆された。最終年度(H25)は、継続して実験を行うとともにこれらの結果をオートファジー研究会と日本解剖学会総会で発表した。今後、病的状態におけるLAMP-2の役割を含めて中枢神経系における機能を検討していきたいと考えている。平成23年度は、病態に結びつくLAMP-2分子の機能を解明する為、LAMP-2欠損マウスの解析を行った。LAMP-

2欠損マウスの中枢神経系の病変を検討したところ、免疫組織化学染色において12週齢雄のミュータントマウスの大脳大型神経細胞ではLAMP-1およびカテプシンDの染色性が増加していた。電顕では神経細胞にリポフスチンが多くなり、多彩な像を呈する蓄積物質が認められた。これらの蓄積物質はコンカナバリンA陽性であった。また、ゴルジ体マーカーであるGM130陽性構造物が増加し、電顕でゴルジ体の形態変化が見られた。一方、ウェスタンブロット法でオートファゴソームの形成を示す膜型LC3は、LAMP-2欠損マウスの肝では増加していたが大脳では変化が見られなかった。中枢神経系はリソソーム内の蓄積が主病変であり、LAMP-2欠損マウスの神経細胞では、リソソームにおける基質の分解が不完全であると考えられた。さらに、LAMP-2欠損マウスの脳組織において発現変化する分子を、2次元電気泳動と質量分析で同定したところ、ユビキチンープロテアソーム関連タンパク質、熱ショックタンパク質、シナプス関連タンパク質、カルシウム伝達タンパク質が変化していた。ヒトのダノン病の剖検例を詳細に検討したことにより、現在までに記載されていなかった中枢神経系病変の概要が明らかになった。脳虚血低酸素モデル解析は、LAMP-2欠損マウスにおける病態形成の機序解明につながると考えられる。LAMP-2欠損マウスの組織学的変化を解析することにより、現在までに記載されていなかった中枢神経系病変の概要が明らかになり、発現が変化したタンパク質の同定は、次年度以降の病態形成の機序解明につながると考えられる。最終年度は、今年度得られた結果をもとに、病態形成にどのようなシグナル伝達系が関与するか検討する。次年度は、今年度得られた結果をもとに病態形成にどのようなシグナル伝達系が関与するか検討するとともに、生体内での意義が未だ評価されていないCMAの生理的・病的意義についても実験を進める予定である。該当なしLAMP-2欠損マウスの維持、組織検討と、欠損マウス由来の初代神経系培養細胞を用いた実験を施行するために必要な消耗品費、及び学会出席のための旅費を使用する予定である。
消化器癌の難治性メカニズムに基づいた先端的治療開発

我々は難治性癌の中にプロテアソーム活性に依存しない少数の癌細胞集団が内在することを見出した。本研究ではその可視化システムを構築し、手術臨床検体および培養癌細胞へ導入した。その結果、プロテアソーム活性が低いGhigh分画を確認し、Ghighの非対称性分裂によりGlowが生じるが、低酸素下ではGhighの対称性分裂が活発化し抗癌剤耐性を獲得すること、低酸素誘導因子阻害剤により抑制されることを見出した。Ghighは細胞内ROSが低値であり、GhighROSlow分画が特徴的な幹細胞性遺伝子シグネチャーを持ち、マクロファージ遊走を伴う高転移能を示すこと、臨床検体におけるGhighROSlow遺伝子シグネチャーが術後再発予測に役立つことを明らかとした。我々は難治性癌の中に、プロテアソーム活性が極めて低下した癌細胞集団が内在することを見出している。本研究では、この特性の可視化システムを構築し、難治性癌の基礎解析とその治療開発を目的としている。まず、ユビキチン非依存性プロテアソーム活性によって分解される代表的な蛋白ornithine decarboxylase(ODC)のプロテアソーム認識部位degron配列と蛍光蛋白ZsGreenの融合蛋白を発現するレトロウイルスベクターを構築し、ヒト肝癌細胞へ導入した。その結果、ほとんどの癌細胞は非蛍光のままであるが(G-)、数‰の細胞群(G+)に蛍光発現が認められた。G+細胞群とG-細胞群をFACS sortingにより単離してタイムラプス解析を行なった結果、G+細胞が非対称性分裂によりG-細胞を生じること、G-細胞は急速に対称性分裂して増殖すること、G-細胞からはG+細胞を生じないことを明らかにした。さらにG+細胞では通常酸素下でもhypoxia-inducible factor-1(HIF-1)が安定化すること、低酸素下では特異的にG+細胞が増殖すること、低酸素下で抗癌剤耐性を示すことを見出した。またG+細胞ではG-細胞に比べ活性酸素濃度が有意に低いことも確認した。これらの性質は休眠型幹細胞の特性と合致しているが、今までに報告されている癌幹細胞マーカーの発現(CD133,CD90,EpCAMなど)とは必ずしも一致しなかった。現在、G+細胞特異的分子の発現解析により新規癌幹細胞マーカーの同定を進めるとともに、マウス腫瘍モデルを用いて造腫瘍性や腫瘍内局在の解析を進めている。癌細胞の特徴として一般にプロテアソームが高活性状態にあり(proteotoxic stress)、プロテアソーム阻害剤による治療効果が期待されている。我々は、難治性癌の中にプロテアソーム活性が極めて低下した少数の癌細胞集団が内在することを見出した。本研究では、プロテアソーム活性低下に伴い蛍光を発する可視化システムをヒト肝癌細胞へ導入して解析を進めている。その結果、肝癌細胞全体の約0.5%に、プロテアソーム活性が低いG^<high>分画の存在を確認した。Time-lapse解析によりG^<high>の非対称性分裂によりG^<low>が生じること、G^<low>からはG^<high>が生じないこと、G^<high>はG^<low>に比べ細胞分裂が遅いことを確認した。FACSで分離したG^<high>分画は5日間で100%→59.3%まで比率が低下し、3週間で全体の0.5%に戻り安定した。低酸素条件下の長期培養により、G^<high>細胞比率は20日間で0.5%→9.25%へ上昇を認めた。疑似低酸素条件下ではG^<high>肝癌細胞の対称性分裂が活発となりG^<high>比率が6.51%に上昇すること、抗癌剤耐性を獲得すること、低酸素誘導因子阻害剤によって特異的に抑制されることが明らかとなった。さらに活性酸素種(reactive oxygen species;ROS)の細胞内濃度の解析では、G^<high>細胞はG^<low>細胞に比べ有意に低値であること見出した。G^<high>ROS^<low>細胞分画をソーティングして、NOD-SCIDマウスにおける腫瘍形成能を解析した。その結果、G^<high>ROS^<low>細胞が極めて高い腫瘍形成能を持つことを見出した。現在、DNAマイクロアレイによってG^<high>ROS^<low>細胞の網羅的遺伝子発現解析を行なっており、高腫瘍形成能の獲得メカニズム解明を進めている。癌細胞の特徴として一般にプロテアソームが高活性状態にあるが、我々は難治性癌の中にプロテアソーム活性が極めて低下した少数の癌細胞集団が内在することを見出した。

本研究では、プロテアソーム活性低下に伴い緑色蛍光を発する可視化システムを構築し、肝細胞癌の手術臨床検体およびヒト肝癌培養細胞へ導入した。その結果、臨床検体および培養細胞において、肝癌細胞全体の約0.5%にプロテアソーム活性が低いGhigh分画の存在を確認した。Ghighの非対称性分裂によりGlowが生じること、GlowからはGhighが生じないこと、GhighはGlowに比べ細胞分裂が遅いことを確認した。FACSで分離した低酸素条件下の長期培養により、Ghigh細胞比率は14日間で0.5%→28.0%へ上昇を認めた。疑似低酸素条件下ではGhigh肝癌細胞の対称性分裂が活発となりGhigh比率が6.51%に上昇し抗癌剤耐性を獲得すること、低酸素誘導因子阻害剤によって特異的に抑制されることが明らかとなった。Ghigh細胞は活性酸素種(reactive oxygen species; ROS)の細胞内濃度が有意に低値であることを見出し、GhighROSlow細胞分画をソーティングして解析した。DNAマイクロアレイ解析により、GhighROSlow肝癌細胞で特徴的な遺伝子シグネチャーを持ち、特にケモカイン・ネットワークの亢進を検出した。ヒトマクロファージ細胞を用いた解析により、GhighROSlow肝癌細胞が高いマクロファージ遊走作用を呈することを証明した。GhighROSlow肝癌細胞はNOD-SCIDマウスにおいて高い腹腔転移能を示し、生体内でもマクロファージの集簇を認めた。さらに肝細胞癌の臨床検体における解析によって、GhighROSlow肝癌細胞の遺伝子シグネチャーが術後再発と極めて高い相関を示すことを明らかとした。ヒト肝癌に内在する高腫瘍形成能の細胞分画を、可視化・抽出することに成功しており、研究は順調に進行している。24年度が最終年度であるため、記入しない。高腫瘍形成能を持つヒト肝癌の細胞分画を可視化・抽出し、網羅的遺伝子発現解析によってその特性を同定する。可視化によってin vitro解析のみならず、腫瘍内での局在、転移などin vivo解析を進め、難治性癌、転移性癌のメカニズムを解明する。
肝細胞癌およびその境界病変におけるアシアロ糖タンパク受容体の定量

はじめに正常ラット肝を0.25M蔗糖中で軽くホモジナイズし,1層のガ-ゼを通した後,1,000g,5分間遠沈,沈渣を0.25M蔗糖中で2回洗浄した.Tc-99mGSA(galactosyl human serum albumin)を用いてbindingassayを試みた.肝細胞と血球との分離が不十分であったためか,肝細胞とGSAの結合率は不十分であった.そこで,培養化されたヒト肝細胞(Chang Liver)を用い,同様のbinding assayを行った.この場合,GSAの結合率は平均0.56%とやはり非常に低かった.その原因として細胞分離に用いたトリプシンの作用,反応時の温度が4°Cと低かったことなどが考えられた.そこで,培養細胞を組織培養フラスコに付着させたままで,培地にGSAを加え,37°Cで3時間インキュベーション後,上清を採取し,これをカウントした.細胞数は一定(7.5×10^5個),GSAの濃度を変化(A群:3mg/ml,B群:3×10^3mg/ml,C群:3×10^6mg/ml)させ,細胞結合放射能と非結合放射能の比率(B/F)を計算した.結果はA,B,C群のB/Fはそれぞれ0.0656,0.1384,0.1925であった.これをScatchard plotすると,その傾き-K_aは-0.002となり,親和定数K_aは2.0×10^6M^<-1>と算定された.このことからin vitroで肝細胞とGSAの特異的な結合を確認することができた.次の段階として,手術標本を用いたGSAのbinding assayを試みたい.その際の問題点として腫瘍細胞をいかにviableな状態で採取し,GSAと反応させられるかという点があげられる.はじめに正常ラット肝を0.25M蔗糖中で軽くホモジナイズし,1層のガ-ゼを通した後,1,000g,5分間遠沈,沈渣を0.25M蔗糖中で2回洗浄した.Tc-99mGSA(galactosyl human serum albumin)を用いてbindingassayを試みた.肝細胞と血球との分離が不十分であったためか,肝細胞とGSAの結合率は不十分であった.そこで,培養化されたヒト肝細胞(Chang Liver)を用い,同様のbinding assayを行った.この場合,GSAの結合率は平均0.56%とやはり非常に低かった.その原因として細胞分離に用いたトリプシンの作用,反応時の温度が4°Cと低かったことなどが考えられた.そこで,培養細胞を組織培養フラスコに付着させたままで,培地にGSAを加え,37°Cで3時間インキュベーション後,上清を採取し,これをカウントした.細胞数は一定(7.5×10^5個),GSAの濃度を変化(A群:3mg/ml,B群:3×10^3mg/ml,C群:3×10^6mg/ml)させ,細胞結合放射能と非結合放射能の比率(B/F)を計算した.結果はA,B,C群のB/Fはそれぞれ0.0656,0.1384,0.1925であった.これをScatchard plotすると,その傾き-K_aは-0.002となり,親和定数K_aは2.0×10^6M^<-1>と算定された.このことからin vitroで肝細胞とGSAの特異的な結合を確認することができた.次の段階として,手術標本を用いたGSAのbinding assayを試みたい.その際の問題点として腫瘍細胞をいかにviableな状態で採取し,GSAと反応させられるかという点があげられる.
母体状態・薬剤が胎生期器官の細胞周期に及ぼす影響：子宮内ライブ評価系の構築

「母体状態・薬剤が胎生期器官の細胞周期に及ぼす影響:子宮内ライブ評価系の構築」は,器官形成期に,ヒト胎児の種々の組織内で進行する細胞周期に対して母体の全身状態の急性変化や薬剤がどのような影響を及ぼしうるかに関して,産婦人科学はもとより,幅広い医学領域にとって有用となる全く新しい知見を得ることをめざし,マウスを用いた鋭敏な評価系を開発する.「母体状態・薬剤が胎生期器官の細胞周期に及ぼす影響:子宮内ライブ評価系の構築」は,器官形成期に,ヒト胎児の種々の組織内で進行する細胞周期に対して母体の全身状態の急性変化や薬剤がどのような影響を及ぼしうるかに関して,産婦人科学はもとより,幅広い医学領域にとって有用となる全く新しい知見を得ることをめざし,マウスを用いた鋭敏な評価系を開発する.
ホヤ幼生末梢神経の誘導メカニズム

本研究では、ホヤ幼生の末梢神経誘導におけるNodalシグナルの役割について解析した。その結果、Nodalは神経板境界でのChordin、BMP遺伝子の発現を調節することでホヤ幼生末梢神経を誘導することを明らかにした。また、Nodal標的遺伝子であるci-chordin、ci-Pax3/7が神経板境界に発現するのに必要な転写調節領域を単離し、nodalシグナル応答領域を同定した。本研究では、ホヤ初期発生過程におけるnodalシグナル伝達経路を解析し、ホヤ幼生末梢神経の誘導メカニズムを明らかにすることを目的としている。本年度は、nodalの遺伝子発現制御に関して以下の研究を行った。1. nodalシグナル阻害剤で処理したマボヤ胚におけるHrBMPb遺伝子の発現様式をin situ hybridization法により解析した。その結果、尾芽胚神経管におけるHrBMPbの発現がnodalシグナルにより制御されていることを明らかにした。nodalシグナルはchordin陽性神経細胞でHrBMPbの発現を阻害し、色素細胞でHrBMPbの発現を誘導した。2. nodal標的遺伝子であるci-chordin,ci-snail,ci-Pax3/7の遺伝子発現調節領域の単離・同定を行った。それぞれの遺伝子の転写開始点近傍約5kbのゲノム配列をユウレイボヤ近縁2種間で比較したところ非翻訳領域内に複数の保存領域が存在した。それらの保存領域内に転写調節配列が存在すると推定されることから、保存領域をPCR法によりカタユウレイボヤゲノムから単離し、LacZを含む解析用ベクターに組み込んだ。それらのコンストラクトをエレクトロポレーション法によりカタユウレイボヤ卵に導入し、嚢胚期及び尾芽胚期におけるLacZの発現を調べた。その結果、3遺伝子ともに5'上流の保存領域(約300bp)に転写調節配列があることが判明した。また、ci-Pax3/7についてはさらに1stイントロンにも転写調節配列があることを明らかにした。1.nodal過剰発現胚におけるHrChordin、HrBMPa、HrBMPb遺伝子の発現様式をin situhybridization法により解析した。その結果、神経板におけるHrChordinの発現は過剰なnodalシグナルにより促進され、一方HrBMPb,HrBMPbの発現は阻害されることを明らかにした。Nodalシグナル阻害胚におけるHrChordin、HrBMPa、HrBMPb遺伝子の発現はいずれも末梢神経前駆細胞で阻害されることから、HrBMPa、HrBMPb遺伝子の発現についてはNodal濃度依存的に制御されていることが示唆された。2.nodal標的遺伝子であるci-chordin, ci-Pax3/7の遺伝子発現に必要な最小転写調節領域を同定するために、昨年度単離した約300bpの遺伝子発現制御領域について5'側及び3'側からディリーションコンストラクトを作成し、カタユウレイボヤ胚を用いたプロモーター解析を行った。その結果、ci-chordinについては5'上流域の80bpに転写活性があり、ci-Pax3/7についてはイントロン内134bpに転写活性があることを明らかにした。本研究では、ホヤ初期発生過程におけるNodalシグナル伝達経路を解析し、ホヤ幼生末梢神経の誘導メカニズムを明らかにすることを目的としている。昨年度までにNodalシグナル標的遺伝子であるci-chordin,ci-Pax3/7遺伝子の発現制御領域を単離・同定したことから、本年度はそれら遺伝子のNodalシグナル応答領域について解析を行った。昨年度までに単離したci-chordin,ci-Pax3/7遺伝子の発現制御領域の下流にレポーターとしてLacZをつないだコンストラクトをエレクトロポレーション法によりカタユウレイボヤ卵に導入し、Nodalシグナル阻害剤(SB431542)存在下で嚢胚期まで発生させた。その結果、ci-chordinについては5'上流域の119bp、ci-Pax3/7についてはイントロン内の134bpの転写活性がSB431542処理により神経板で阻害されることを明らかにした。これまで、Nodalシグナル応答にSmad、FoxH1、Mixerが関与することが報告されている。一方、本研究で同定したci-chordin,ci-Pax3/7遺伝子のNodalシグナル応答領域にはSmad結合配列は存在するが、FoxH1結合配列は存在しなかった。また、Mixer遺伝子はホヤゲノム上に存在しないことから、これまで知られていない新たなNodalシグナル伝達経路の存在が示唆される。
自閉症の予後-この19年間に東大病院精神神経科小児部ディケアで治療した症児の追跡調査

東大病院精神神経科小児部で幼児期にデイケア治療教育をうけた発達障害児の追跡調査のため,現住所が判明している190例の両親に現在の教育的,福祉的処遇をふくめた社会との関係,医療,家庭生活,両親の障害に対する考え,および幼児期にうけた治療教育に対する評価を内容とするアンケート調査を行なった. 145通を回収し76.3%の回収率を得た.このうち自閉症は103例(男84,女19, 4.4:1)を占め,調査時年齢は527歳,平均14.3歳であった.発達障害の治療のために54.0%が現在も医療機関に通院中であった.通院例の比率は15歳以下の群(年少群)で58.3%, 16歳以上の群(年長群),で47.5%と,年齢が高くなっても半数近くあった.通院目的のなかには, 55.6%に養育上の助言をうけることがあり, 42.6%にてんかんの予防または治療があった.調査時点における子どもの症状・行動異常のなかで親として気がかりなことは, 70.9%が知能障害を, 54.5%が対人関係の問題および話し言葉の問題を, 45.6%が人への関心の乏しさを, 40.8%が固執傾向をあげていた.対人関係と肥満の問題は年長群の方が年少群よりも有意に多かった.熱性けいれんをふくむ臨床発作の既住が幼児期には8.9%にあったが,調査時点では25.0%と上昇した.発作の発現年齢は10歳以下とそれ以降とが相半ばした.発作の通算回数は5回までが78.0%, 10回以上のものが13.0%あった.男女比は,発作を生じた群が2.6:1,発作を生じなかった群が5.3:1であり,女子に発作出現が多い傾向を認めた.調査時点までの発作の有無を幼児期における認知発達水準との関係でみると,幼児期に関係概念が形成され始めている群12例では,発作の発現が1例もなかった.小学校入学時の教育形態は幼児期の認知発達水準によってかならずしも決定されていなかったが,小学校卒業時及び中学校入学時において普通学級に在籍した例は,すべてが幼児期に関係概念の形成まで達していた.本研究は2年間の見込で計画された追跡研究である。本年度は当科の小児部デイケアで治療教育を受けた全症例についてアンケート調査をするために必要な資料の同定作業が中心となった。それらの資料とは、対象児の氏名,カルテ番号,診断名,デイケアでの治療期間,デイケア終了後の当科通院状況,現住所などである。その結果、1967年デイケア発足以来86年3月までの間にデイケアで治療教育をうけた全症例は201例(男子146例、女子55例)、このうち自閉症は103例であり、全例のおよそ5分の1が現在も当科に通院中であった。もっとも困難であったのは現住所の確認である。現住所確認を目的として第1回の予備的調査が行なわれた。それによって136例(約70%弱)の現住所が確認された。住所が判明しなかった症例については引き続き確認作業が行なわれている。一方、郵送または手渡し(現在も通院中の症例に対して)するアンケートは基本事項についてはすでに作成されている。当初の計画では61年度がアンケートの作成・配付および回収であり、62年度はデータ解析としたのであるが、61年度の到達目標を予定よりも遅い段階へ引き戻すことにした。それは、この調査によってあらたな治療への種々のニーズが掘り起こされた場合に治療側としてそれに対応できるだけの体制を用意しておくことが重要であると考えられたからである。大量の調査対象に対してつねに治療配慮が十分払われなければならないため、そういった判断を行なった。この方がおそらくは、結果的にはアンケートへより大きな協力が得られると思われる。今後の具体的方針としては67月には配付を完了し、秋からは回収された資料の解析に入る。今秋の学会において中間報告を行なう予定である。東大病院精神神経科小児部で幼児期にデイケア治療教育をうけた発達障害児の追跡調査のため,現住所が判明している190例の両親に現在の教育的,福祉的処遇をふくめた社会との関係,医療,家庭生活,両親の障害に対する考え,および幼児期にうけた治療教育に対する評価を内容とするアンケート調査を行なった. 145通を回収し76.3%の回収率を得た.このうち自閉症は103例(男84,女19, 4.4:1)を占め,調査時年齢は527歳,平均14.3歳であった.発達障害の治療のために54.0%が現在も医療機関に通院中であった.通院例の比率は15歳以下の群(年少群)で58.3%, 16歳以上の群(年長群),で47.5%と,年齢が高くなっても半数近くあった.通院目的のなかには, 55.6%に養育上の助言をうけることがあり, 42.6%にてんかんの予防または治療があった.調査時点における子どもの症状・行動異常のなかで親として気がかりなことは, 70.9%が知能障害を, 54.5%が対人関係の問題および話し言葉の問題を, 45.6%が人への関心の乏しさを, 40.8%が固執傾向をあげていた.

対人関係と肥満の問題は年長群の方が年少群よりも有意に多かった.熱性けいれんをふくむ臨床発作の既住が幼児期には8.9%にあったが,調査時点では25.0%と上昇した.発作の発現年齢は10歳以下とそれ以降とが相半ばした.発作の通算回数は5回までが78.0%, 10回以上のものが13.0%あった.男女比は,発作を生じた群が2.6:1,発作を生じなかった群が5.3:1であり,女子に発作出現が多い傾向を認めた.調査時点までの発作の有無を幼児期における認知発達水準との関係でみると,幼児期に関係概念が形成され始めている群12例では,発作の発現が1例もなかった.小学校入学時の教育形態は幼児期の認知発達水準によってかならずしも決定されていなかったが,小学校卒業時及び中学校入学時において普通学級に在籍した例は,すべてが幼児期に関係概念の形成まで達していた.
歯周病原細菌の菌体表層複合糖質の構造学的・免疫分子生物学的研究

ヒト歯肉縁下プラーク中に存在する黒色色素産生グラム陰性嫌気性桿菌の一種であるPrevotella intermediaは、歯周病、なかでも歯肉炎との関係が注目されている。しかしながら、これら歯肉炎に対するP.intermediaの病原因子およびその病態形成機構についてはいまだ不明な点が多く残されている。そこで、P.intermediaの菌体表層に存在する複合糖質であるリポ多糖に注目し、その化学構造を解析するとともに免疫分子生物学的性状を明らかにするために研究を計画した。本年度は、昨年度に精製したP.intermedia由来リポ多糖の活性中心であるリピドAの化学構造および免疫分子生物学的性状について検討した。リピドAの化学構造は、化学組成分析、核磁気共鳴、質量分析によって解析した結果、ジグルコサミンの2、3、2'、3'位に分枝長鎖脂肪酸を含む5本の脂肪酸と4'位にリン酸基が結合したものであった。本化学構造は、大腸菌由来リピドAのそれとは、脂肪酸、リン酸基、分枝長鎖脂肪酸において異なっていた。また、P.intermedia由来リピドAは、C3H/HeNマウス由来腹腔マクロファージからのIL-6産生を誘導したが、C3H/HeJマクロファージに対しては誘導活性を示さなかった。さらに、TLR4/MD-2発現Ba/F3細胞においてNF-κBの活性化を誘導したが、TLR2発現Ba/F3細胞では同活性はみられなかった。これらの所見は、生物活性の程度差はあるが、大腸菌由来リピドAと同様の活性パターンを示した。以上の結果から、P.intermedia由来リピドAは、大腸菌由来リピドAとその化学構造は異なるが、TLR4を介して細胞を活性化することを明らかにした。しかしながら、これら歯周炎に対するP.intermediaの病原因子およびその秒低形成機構についてはいまだ不明な点が多く残されている。そこで、P.intermediaの菌体表層に存在するリポ多糖や今日莢膜多糖などの複合糖質に注目し、その化学構造を解析するとともに免疫分子生物学的性状を明らかにするために研究を計画した。本年度は、P.intermedia由来複合糖質としてリポ多糖の抽出をおこない、その活性中心であるリピドAの精製をおこなった。P.intermediaは嫌気性条件下で培養、集菌した。凍結乾燥菌体から温水-フェノール法を用いて抽出操作をおこなうと、リポ多糖と同時に菌体外多糖などの多糖成分が抽出され、リポ多糖自体の精製は困難であった。そこで、P.intermediaのリポ多糖が短鎖のラフ型であることを利用して、フェノール-クロロホルム-石油エーテル法を用いて抽出した。その結果、リポ多糖のみを効率良く抽出することに成功した。ついで、リポ多糖を弱酸加水分解することによりリピドA画分を得た。本画分はリピドA以外に複数の成分を含むことが薄層クロマトグラフィーによって確認された。そこで、リピドA画分をカラムクロマトグラフィー、分取薄層クロマトグラフィーを用いてさらに精製した結果、二次元薄層クロマトグラフィーで単一スポットを示すリピドAを得た。今後、この成分の化学構造および免疫分子生物学的性状を明らかにすることを考えている。
ncRNAの細胞内局在に基づいたネオタクソノミの確立

<塩見>ショウジョウバエ卵巣内体細胞OSCにおけるpiRNA生合成機構に関して研究を進めた。ArmitageはSF1 RNA helicaseに属するタンパク質であるが、そのRNA bindingおよびRNA unwindingはATP加水分解によって制御される。piRNA生合成機構においてArmitageはYbが結合したpiRNA前駆体には安定的に結合することができるが、それ以外のRNAには、一旦は結合するもののATP加水分解から得られるエネルギーを利用することによって、速やかに離れる仕組みがあることが判明した。また、piRNA前駆体は長鎖RNAであるため構造をとりやすく、これがpiRNA生合成を阻害する要因となると考えられたが、ArmitageはRNA unwinding能を利用することによってpiRNA前駆体を構造的にリラックスさせることによってpiRNA生合成を促す機能を担うことも判明した。これらの成果はCell Reportsに論文として発表した。<大野>マウスNeat1_1 RNA中に、このRNAの核内保持に必須である約800塩基長の領域を同定し、この領域にmRNA前駆体のスプライシング因子群が結合することを明らかにした。スプライシング阻害剤であるFR901464処理により、NEAT1-1 RNAの核内保持活性は解除され、同時にパラスペックルが消失した。このことから、Neat1 RNAはスプライシングを受けないにもかかわらず、その核内保持はmRNA前駆体の核内保持と共通の機構で行われていて、その核内保持がパラスペックル形成に重要であることが強く示唆された。昨年度に浮かび上がってきたNeat1 RNAの核内保持機構についての興味深い仮設を証明することができた。現在、論文投稿準備中である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。【塩見グループ】piRNA生合成の場であるYb bodyの構成因子の一つであるVretに対するモノクローナル抗体を作成し、これを用いてOSCより免疫沈降を行なったところ、複数のタンパク質が得られた。Yb、SoYb、Vret、Armiは得られたが、新規因子は得られなかった。異なる因子に対する抗体を作成し、それを用いて免疫沈降すれば新規因子が同定できる可能性があるため、SoYb抗体の作成をすすめた。importin a/bなど既知の核局在因子をノックダウンし、Piwiの核局在への影響を免疫染色で観察したところ、importin aがPiwi-piRNA複合体の核移行に重要であることが判明した。ショウジョウバエは3つのimportin a遺伝子を発現する。興味深いことに、1、2、3いずれのimportin aを欠失した場合でも、Piwiの核移行に影響があらわれた。典型的なNLSを有するタンパク質においても同様の結果が得られたため、Piwiに特有な減少ではないと判断した。各importin aに対するモノクローナル抗体の作成をすすめたところ、importin a1と3に対する抗体は得られた。現在、importin a2に対する抗体を作成中である。【大野グループ】哺乳類細胞核で多量に発現しているlncRNAであるNeat1、Malat1、gomafu、Xistの様々なcDNAクローン、発現コンストラクト、培養細胞などの準備を行った。そして手始めに、分子機能や結合因子などの情報が比較的研究されているマウスNeat1に着目し、それを1kb程度のRNA断片としてアフリカツメガエル卵母細胞核に顕微注入したところ、核外輸送がほとんどみられない断片が複数見つかった。しかし、RNA断片の安定性が低下していたので、輸送阻害をクリアーに示すためには、RNAの安定性の問題と切り分ける必要が生じた。【塩見グループ】Piwiは核移行シグナルを保有するが、piRNAと結合してはじめて核へ移行する事が判っている。しかしこの制御機構の分子メカニズムは不明である。Piwiの核移行に重要な因子の同定を試みたところ、importin aがPiwi-piRNA複合体の核移行に重要であることが判明した。TnTで作成したPiwiにはimportin a1とimportin a3が結合することが判った。TnTにはpiRNAがないことから、少なくともin vitroではimportin a1と3はpiRNAに結合していないPiwiにも結合する能力があるといえる。細胞内ではpiRNAに結合していないPiwiにはimportin aには結合しないと考えられる。つまり細胞内にはpiRNAに結合していないPiwiとimportin aの結合を阻害するタンパク質が存在する可能性が示唆された。現在、その因子の同定を試みている。マウスNeat1_1 RNAを約150塩基長の断片に分割しU1 RNAとのキメラを作った。それらの輸送阻害活性をツメガエル卵母細胞核へ顕微注入の系で検定したところ、核外輸送が強く阻害される断片が複数見つかった。これにより、Neat1_1 RNAは複数の核外輸送阻害エレメントを持つことが明らかになった。本年度の計画に沿って実験をすすめることが出来たのみならず、論文発表することができた。また、piRNAに関する総説も学術雑誌から執筆の依頼を受けた。学会発表も滞り無く行なった。招待講演の依頼も複数受けた。

U1 RNAとキメラを作ることによりRNAの安定性を確保することが可能となり、核外輸送阻害エレメントを同定することができた。<塩見>Importin a遺伝子Impa1、Impa2、Impa3それぞれをOSCにおいてRNAi法によってノックダウンしたところ、Impa2あるいはImpa3の欠損によってPiwi-piRISCの核移行が阻害された。OSCではImpa1は殆ど発現していない。免疫沈降実験から、Impa2、Impa3はpiRNAに結合したPiwiには結合するが、piRNAと結合していないPiwiとは結合しないことが分かった。Piwiモノクローナル抗体を用いた解析からPiwiのN末端は、piRNAと結合していない時は分子表面に現れておらず、Impa2及びImpa3はPiwiに結合できず核移行が阻害されるが、piRNAが結合した後にそれが引き金となってN末が突出するためImpa2あるいはImpa3が結合できるようになり、Piwiの核移行を成立させるというモデルが提唱された。piRNA前駆体に見出されるcis配列のコンセンサスを決定するため、翻訳を阻害した時にYbが結合する領域の塩基配列の同定を進めた。<大野>マウスNeat1_1 RNAを約70塩基長の断片に分割し、U1 RNAの核外輸送を阻害する活性をツメガエル卵母細胞核への顕微注入の系で検定したところ、核外輸送が強く阻害される断片が少なくとも2つ見つかった。さらに、それらの領域が哺乳類培養細胞中でも長いRNA(mRNA)の核外輸送を阻害することを明らかにした。また、これらの領域に結合する因子群の生化学的同定のための方法論を確立し、結合因子についての予備的な結果を得た<塩見>本年度の計画に沿って実験を進めることができ、結果も順調に得られている。piRNAに関する総説の依頼も新たに受け、その執筆に取り組んだ。複数の国際会議から招待を受け、招待講演を行うとともに、piRNA研究領域の第一線で活躍する海外の研究者との交流を深めることができた。学生の国際会議への参加を促し、海外研究者との交流の場を提供することができた。<大野>複数の核外輸送阻害エレメントを同定し、それらを70塩基長まで狭めることができた。さらにそれらに結合する因子の生化学的同定に道を開いた。<塩見>piRNAは、遺伝子間領域に存在するpiRNAクラスタから転写されるncRNAの前駆体とする。我々はこれまでショウジョウバエ卵巣由来体細胞OSCを用いてpiRNA前駆体の選択に関わるシス作動エレメントの同定に成功した。このシス作動エレメントの解析をさらにすすめることによって、コンセンサス配列を決定するとともに、piRNAと内在性siRNAの生成機構の交差性に関する研究をつづける。OSCにおける翻訳阻害の条件を決定するために時間を要したが、その条件が整った。
蛍光標識グルコースを用いた単一細胞のグルコース取り込み・機能連関の解析

従来、細胞膜を介したグルコース輸送ならびに組織のグルコース利用に関する研究は、主に放射性標識したグルコース誘導体を用いて行われてきた。これらの方法は優れた定量性をつが、単一細胞レベルでの分析が困難であった。申請者らは単一細胞におけるグルコース取り込みのリアルタイム計測を行う目的で、2-デオキシグルコースに蛍光標識した2-(N-(nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose(2-NBDG)を用いた。その結果、まず哺乳動物細胞のグルコーストランスポーター(GLUT)を介して、グルコースと類似したキネティクスをもって細胞内に取り込まれること初めて明らかにした。次に2-NBDGとCa^<2+>指示薬であるfura-2を用いることにより、ラット単一膵島細胞におけるグルコースの取り込みおよび細胞内Ca^<2+>濃度の変動のリアルタイム計測を試みた。その結果、高グルコース刺激によりインスリン分泌を示すようなグルコースセンサー機能を有するGLUT2発現膵β細胞は、グルコース刺激に対して細胞内カルシウム濃度上昇を示すと同時に、α細胞に比べてはるかに多くの2-NBDGを取り込むことが明らかになった。これらの結果は、単一細胞レベルでグルコース取り込みと細胞機能の同時評価を行った国内外で初めての試みであり、J.Biol.Chem(275:22278,2000)に掲載された。本研究ではさらに、代謝阻害剤を用いて、グルコース刺激によるインスリン分泌にはグルコースの取り込みとそれに続く代謝が重要であるというグルコース代謝説を直接支持する結果も得た。現在、2-NBDGを用いて、現在未だに十分に解明されていない神経活動とグルコースの取り込みとの相関を、単一細胞レベルあるいはスライスで観察を試みている。従来、細胞膜を介したグルコース輸送ならびに組織のグルコース利用に関する研究は、放射性標識したグルコース誘導体を用いて行われてきた。また活動状態にある細胞のダイナミズムを知る上でも大きな制約があった。申請者らは単一細胞におけるグルコース取り込みのりアルタイム計測を行う目的で、2-デオキシグルコース蛍光標識した2-(N-(nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose(2-NBDG)を用いた。先ず、グルコーストランスポーターであるGLUT2を過剰発現させた哺乳動物細胞を用いて、2-NBDGがGLUTを介して哺乳動物細胞内に取り込まれることを初めて明らかにした。次に2-NBDGとCa^<2+>指示薬である血fura-2を用いることにより、ラット単一膵島細胞におけるグルコースの取り込みおよび細胞内Ca^<2+>濃度の変動のリアルタイム計測を試みた。その結果、高グルコース刺激によりインスリン分泌を示すようなグルコースセンサー機能を有するGLUT2発現β細胞は、グルコース刺激に対して細胞内カルシウム濃度上昇を示すと同時に、α細胞に比べてはるかに多くの2-NBDGを取り込むことが明らかになった。これらの結果は、単一細胞レベルでグルコース取り込みと細胞機能の同時評価を行った国内外で初めての試みであると同時に、グルコース刺激によるインスリン分泌にグルコースの取り込みとそれに続く代謝が重要であるというグルコース代謝説を直接支持する所見である(投稿中)。
位相制御された音響放射圧による生体内部の歪み加振の効率化に関する研究

生体内部の硬さ計測の一般的な方法では,力を加えて内部に生じた歪み量を計測している.本研究では,対象物の両側から2つの音響放射圧を同期させて照射し,対象物内部に歪みを発生させ,その歪みの空間分布を別の超音波によって可視化するための手法を基礎的に検討し,生体の機械的特性評価へ応用した.1つの音響放射圧によって生体内部に生じる変位は数ミクロンと小さいため,効率的な加振方法を検討する必要がある.そこで本年度は次の研究課題を行ない解決した.(1)加振の効率化の検討:線状集束トランスジューサによる実験:対象物を点で加振するのではなく,奥行き方向に線状の領域にわたり対象物を加振できるような広い開口のトランスジューサを設計・試作し,加振の効率が1.5倍に向上し,歪みを精度良く計測することが可能となった.(2)歪みの空間分布の超音波計測:超音波加振によって生じる歪みの分布を別の超音波で計測する場合の両方の超音波干渉を防ぐため,超音波周波数の大きく異なる組み合わせを採用し,加振を連続的に行った(計測用20MHz,加振用500kHz).加振用超音波の連続的照射が,超音波計測に影響がないことを実験的に確認した.(3)異方性の計測:弾性率に異方性がある筋肉(トリ肉)に関して,線維の方向によって加振され易さに差異があることを実験的に確認した.(4)総括:音響放射圧を複数同期させた新しい超音波加振による生体組織内での局所的歪みの発生法と,その内部歪みや変位の空間分布の超音波による計測システムに関する研究を実験的に行った.加振効率の向上のために線状集束超音波トランスジューサを試作し,計測用超音波と加振超音波が干渉しない工夫などを導入し実験的に確認した.さらに生体組織への応用を行った結果,生体組織の硬さを内部にわたって評価できる可能性を示すことができた.今後,弾性率分布の算出などへの発展が期待できる.1.超音波加振・変位計測システムの構築音響放射圧は音圧の2乗に比例するため, 1つの超音波トランスジューサを,異なる2つの周波数の信号を加算した信号で駆動することで差の周波数Δfで正弦的に変動する音響放射圧を発生させる.本研究では,差の周波数Δfで変動する音響放射圧を2つ用いて,左右から対象物に音響放射圧を加え効率的に対象物内部に歪みを発生させる.そのため信号発生装置,高周波増幅器,超音波トランスジューサを2組用意し,両者を完全に同期させた.また,超音波加振と同時に,対象物内部に生じた変位分布を別の超音波で計測するシステムを付加した.2.超音波音場などの基礎的特性の測定加振用の集束トランスジューサの音圧分布をハイドロホンにより計測し,方位方向の音響放射圧の半値幅が, 2mmであることを確認した.次に,超音波ビーム方向(距離方向)の音圧を焦点位置±10mmの範囲で調べ,焦点付近では,距離方向には音圧がほぼ一定で広い範囲にわたって(細いビーム状に)加振できることを確認した.3.模擬生体への超音波加振の適用上記1.の加振・計測システムを用いて,模擬生体に音響放射圧を印加した際に,(a)対象物表面の変位を計測し,対象物表面に振幅数ミクロンの変位が発生できることを確認した.さらに超音波加振と同時に,(b)超音波を用いて対象物表面の変位を計測し,本超音波加振・変位計測システムよって対象物を加振でき,さらに同時に超音波を用いて対象物変位が測定できることを確認した.4.不安定となる原因の解明と対策:点集束トランスジューサによる実験集束トランスジューサが1つの場合に対し, 2つの場合の焦域の重なり部分での音場計測を行い, 2つの音圧分布が干渉し合って音圧分布が網目状になる現象を確認した.これによって, 2つの音響放射圧による加振が計測点位置によっては不安定になることが分かった.生体内部の硬さ計測の一般的な方法では,力を加えて内部に生じた歪み量を計測している.本研究では,対象物の両側から2つの音響放射圧を同期させて照射し,対象物内部に歪みを発生させ,その歪みの空間分布を別の超音波によって可視化するための手法を基礎的に検討し,生体の機械的特性評価へ応用した.1つの音響放射圧によって生体内部に生じる変位は数ミクロンと小さいため,効率的な加振方法を検討する必要がある.そこで本年度は次の研究課題を行ない解決した.(1)加振の効率化の検討:線状集束トランスジューサによる実験:対象物を点で加振するのではなく,奥行き方向に線状の領域にわたり対象物を加振できるような広い開口のトランスジューサを設計・試作し,加振の効率が1.5倍に向上し,歪みを精度良く計測することが可能となった.(2)歪みの空間分布の超音波計測:超音波加振によって生じる歪みの分布を別の超音波で計測する場合の両方の超音波干渉を防ぐため,超音波周波数の大きく異なる組み合わせを採用し,加振を連続的に行った(計測用20MHz,加振用500kHz).加振用超音波の連続的照射が,超音波計測に影響がないことを実験的に確認した.(3)異方性の計測:弾性率に異方性がある筋肉(トリ肉)に関して,線維の方向によって加振され易さに差異があることを実験的に確認した.

(4)総括:音響放射圧を複数同期させた新しい超音波加振による生体組織内での局所的歪みの発生法と,その内部歪みや変位の空間分布の超音波による計測システムに関する研究を実験的に行った.加振効率の向上のために線状集束超音波トランスジューサを試作し,計測用超音波と加振超音波が干渉しない工夫などを導入し実験的に確認した.さらに生体組織への応用を行った結果,生体組織の硬さを内部にわたって評価できる可能性を示すことができた.今後,弾性率分布の算出などへの発展が期待できる.
化学物質特異的抗体の健康影響マーカーとしての意義とそのエピトープ

研究成果の概要(和文):樹脂(プラスチック)原料のヒト血清アルブミンへの結合体に対する化学物質特異的抗体(IgG)の半定量法を開発した。本半定量法の再現性は90%以上であり、信頼性および再現性の高い測定法と考えた。化学物質特異的抗体以外の既存のアレルギーのマーカーはエポキシ樹脂による皮膚炎の有無との間に関係が認められなかった。化学物質アレルギー患者の化学物質特異的抗体は、いずれの化学物質-ヒト血清アルブミン結合体とも反応していた。ウレタン樹脂、エポキシ樹脂、アクリル樹脂などの原料であるトルエン-2,4-ジイソシアネート(TDI)、ビスフェノールAジグリシジルエーテル(BADGE)、無水フタル酸(PA)、p-フェニレンジアミン(PEA)、ホルムアルデヒド(FA)、グルタルアルデヒド(GA)、アセトアルデヒド、無水マレイン酸、メチルアクリル酸等を対象とする。樹脂(プラスチック)原料とHSAを種々の条件下で反応させ、それぞれの化学物質に対する診断用抗原を作製した。続いて、ニトロセルロース膜に化学物質に対する診断用抗原をスポットし、150名の一般人の血清と反応させ、さらに蛍光標識した抗ヒトIgG抗体を用いて、それぞれの化学物質に対する特異的IgG抗体の保有率を調べた。また、樹脂(プラスチック)原料を取り扱う作業者について、作業内容とアレルギー症状の有無についての調査を行った。末梢血中の白血球数、白血球分画、血清中の非特異的IgE、吸入および食事アレルゲンに対する特異的IgE、サイトカイン(IL-1β, Il-2, IL-4, Il-5, IL-6)、コルチゾール、総カルチニン、遊離カルチニン、アシルカルチニン、リンパ球サブセット(CD4, CD8, CD4/CD8比)を調べた。さらに上記と同じ方法で種々の化学物質に対する特異的IgEおよびIgGも調べた。樹脂(プラスチック)原料を取り扱う作業者の血清から種々の化学物質に対する特異的IgEは検出されなかった(検出感度以下)が、IgGは検出された。化学物質特異的IgGの有無とアレルギー症状の有無、白血球数、白血球分画、吸入および食事アレルゲンに対する特異的IgE、リンパ球サブセット(CD4, CD8, CD4/CD8比)との間には関係は認められなかった。平成26年度は前年度に引き続き対象者の募集を行い、樹脂(プラスチック)原料を取り扱う作業者、アレルギー患者、学生、一般人(年齢2040歳程度)からアレルギー疾患やアレルギー症状の有無・生活環境における樹脂(プラスチック)の有無などに関する質問を含む自記式質問票の回収、血清採取を行った。結果として2,000名以上の方の自記式質問票の回答と血清を集めることができた。ウレタン樹脂、エポキシ樹脂、アクリル樹脂などの原料であるトルエン-2,4-ジイソシアネート(TDI)、ビスフェノールAジグリシジルエーテル(BADGE)、無水フタル酸(PA)、p-フェニレンジアミン(PEA)、ホルムアルデヒド(FA)、グルタルアルデヒド(GA)、アセトアルデヒド、無水マレイン酸、メチルアクリル酸等の樹脂(プラスチック)原料とHSAを種々の条件下で反応させ、それぞれの化学物質に対する診断用抗原を作製した。続いてニトロセルロース膜にこの化学物質に対する診断用抗原をスポットし、上記の血清と反応させ、さらに蛍光標識した抗ヒトIgG抗体を用いて、それぞれの化学物質に対する特異的IgG抗体を測定した。この測定は平成27年度も継続する。本研究で実施している、プラスチック原料モノマーやプラスチック前駆体と血清アルブミン(HSA)との結合体を診断用抗原として化学物質特異的抗体(IgG及びIgE)を検出し、当該化学物質への曝露を推測する方法が平成27年6月12日に特許承認された(特許第5757519号)。また、エポキシ樹脂作業者19名を対象に、エポキシ樹脂原料で処理したHSAに対する特異的IgGを測定したところ、皮疹ありの10名作業者のうちの8名が特異的IgG陽性(感度:8/10 = 80%)、皮疹なしの作業者の9名の内の6名が特異的IgG陰性(特異度:6/ 9 = 67%)であった。この結果に平成25年度本研究内容を加えたものをBMC Public Healthに発表した。さらに、平成27年度は本方法の再現性について検討した。具体的には、ビスフェノールAジグリシジルエーテル(BADGE)、無水フタル酸(PA)、トルエン-2,4-ジイソシアネート(TDI)、p-フェニレンジアミン(PEA)、ホルムアルデヒド(FA)、グルタルアルデヒド(GA)の6物質でヒト血清アルブミン(HSA)を処理して種々の化学物質- HSA付加体を作製した。処理は反応溶液のpHを6.0、8.0、10.8の3濃度、化学物質:HSA比を1:0(コントロール)、1:1、1:10、1:100の4つの組み合わせで、計12種の診断用抗原を作製した。それぞれの診断用抗原を用いて、3名の血清中の化学物質特異的抗体の半定量測定を異なる3日繰り返して行った。結果として、一致率は85.2%、わずかな違いは10.0%で、ワンポイント以上の差異があったのは3.8%であり、本方法の再現性が高いことが確認された。平成27年度は、研究代表者の川本が開発した化学物質特異的抗体検出法を本研究にて改良を加え、特許取得を達成した。