hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脳血流モニタリングを用いた高齢者脳血管障害患者に対するせん妄マネジメントの開発

本研究では高齢者脳血管障害患者に対し近赤外線分光法NIRSによる脳血流モニタリングを行い、看護ケア行動の脳血流に対する影響とせん妄との関係を明らかにし、脳血流変化を視野に入れた新たなせん妄マネジメントを確立することを目的とした。しかしながら、せん妄リスクの高い高齢脳血管障害患者は認知機能低下を併発していることが多く、また、携帯型NIRSプローブを前頭部に長時間貼付すること等により、協力者が得られず、成果を見いだせないまま研究期間が終了となった。携帯型NIRS装置自体は優れたツールであるため、高齢者患者を対象とするためには研究プロトコールの再構築を行い、引き続き研究を継続していく予定である。本研究の目的は高齢者脳血管障害患者のせん妄予防・早期発見における近赤外線分光法NIRSの有用性を検討し、各看護行動における脳血流への影響を考慮したせん妄マネジメントを開発することである。看護師にとってせん妄への対応は重要な課題であり、特に術後やクリティカルな状態に陥った高齢者脳血管障害患者は予防困難なせん妄高リスク状態であり、脳血管障害患者のせん妄への早期発見・早期対応は看護の質に大きく影響するものと考え、本研究の着想から申請に至った。ベッドサイドでNIRSを利用してリアルタイムに脳血流の変化をみながらせん妄早期発見を含めた評価・診断に努めることで看護の負担軽減にもつながるものと考える。本研究計画の柱は、1看護ケア行動の脳血流に対する影響、2せん妄発症時の脳血流変化、3せん妄対処目的看護ケアのせん妄への効果と脳血流への影響、以上である。これらに基づき、25年度の研究計画は本学付属病院脳神経外科所有の2チャンネルNIRS装置および携帯型NIRS装置の操作、データ方法およびデータ解析法に習熟し、倫理審査申請および受理の後、正常被験者等での解析を行い、病棟におけるせん妄ケアの実際を把握することであった。しかしながら、今年度はNIRS装置の操作法習熟に終始した。携帯型NIRSモニタリングを行うにあたり、患者の皮膚トラブル予防や観察方法、またデータ取得方法に工夫が必要と判断し、現在いかにして効率よく病棟での研究を行えるかを検討中である。また、共同研究者が、他の業務に支障のない形で本研究に参画できるシステムを構築中である。本研究の目的は高齢者脳血管障害障害患者のせん妄予防・早期発見における近赤外線分光法NIRSの有用性を検討し、各看護行動における脳血流への影響を考慮したせん妄マネジメントを開発することである。看護師にとってせん妄への対応は重要な課題であると考える。本研究の柱は、1看護ケア行動の脳血流に対する影響、2せん妄発症時の脳血流変化、3せん妄対処目的看護ケアのせん妄への効果と脳血流への影響、である。これらに基づき、平成26年度の研究は、ベッドサイドにおけるNIRSによる脳血流測定を行うことと、そのための患者選定ならびに病棟での現状把握であった。今年度は、共同研究者とともに研究施設附属病院ICUでの高齢患者への看護の実態把握に着手したものの、患者に対し実際にNIRS測定を行うに至らなかった。最終研究年度である来年度は、本学附属病院のみならず実習関連施設での高齢者脳血管障害患者のせん妄実態を把握し、現在行われているせん妄予防および対処看護行動を詳細に解析し、携帯型NIRSをどのように介入・活用し、脳血流がどのような場面で変化するのかを捉えていきたいと考えている。携帯型NIRSモニタリングを行うにあたり、患者の皮膚トラブル予防や観察方法、またデータ取得方法に工夫が必要と考えており、昨年同様いかに効率よく病棟でのモニタリングを行えるかを引き続き検討中である。また、NIRSモニタリングと患者行動をビデオモニタリングでリンクさせる方法についても検討している。本研究に使用する携帯型NIRS測定装置は研究用機器であり、臨床患者に使用するために事前に学内倫理審査の許可を得た(承認番号879)。承認の際、研究対象患者の選定は大分大学医学部附属病院のみならず、研究者が実際に患者と接触できる、学外2施設(別府リハビリテーションセンター、一ノ宮脳神経外科病院)を協力施設とした。携帯型NIRS装置はBluetoothを介する通信によりデータ転送を行うものである。データ取得および解析には専用の解析ソフトウェアがインストールされたパソコンが必要である。学外施設でのデータ取得も必要であるため、データ取得・解析専用使用目的でノート型パソコンを購入した。学内LANへの接続の必要性も考慮し、windows8を選択した。ところが、このパソコンへソフトウェアをインストールしたものの、予備テストにおいてデータの取得プログラムが作動せず、繰り返し販売元とのやり取りを行った。しかしながら当該年度中に問題が改善しなかった。また、研究対象患者の選定においても、高齢者という点では該当候補は多数経験するものの、既存の認知機能障害が強く、研究への理解協力が得られにくい方が多く、また、携帯型NIRS装置のデータ取得用プローブを前頭部に数時間貼付することに理解がえられないといった事情により、対象患者もうまく集まっていない。以上のことから、研究費の延長使用をお願いし、28年度の承諾を得ているような状況である。旅費の拠出に関しては、NIRSの知見を幅広く知る目的で看護および脳神経系学会へ参加した。具体的には、看護研究学会(於:広島)、脳神経外科学会総会(於:札幌市)、日本頭痛学会(於:東京都)研究遂行にあたり携帯型ノートパソコンを新規に購入したが、脳血流解析ソフトウェアがうまく作動していない。また、対象患者の認知機能の問題、家族の同意等の問題から研究対象者が十分に集まっていない。

携帯型NIRS装置はBluetoothを介する通信によりデータ転送を行うものであるが、昨年度はデータ取得プログラムが作動せず、科研延長申請を行い、販売元とのやり取りを行った。しかしながら当該年度中にも問題が改善せず、やむを得ず旧型のパソコンを使用して研究を試みた。研究対象者は研究協力施設入院中の75歳以上の高齢者で、せん妄リスクが高い患者を対象とし、研究の趣旨を理解でき協力が得られる人とした。研究デザインの概略として、入院中の高齢者に対し携帯型NIRSを装着し、研究者の監視下に対象者の行動(発言やせん妄行動も含む)における脳血流変化を捉える観察研究である。データ収集方法は1医療機関の病院長、看護部長に対し、文章と口頭で研究の趣旨と研究依頼について説明し承諾を得る。2看護部長より対象者・対象者の家族を紹介してもらい、研究の趣旨を文章・口頭で説明し研究の同意を得る。また、同意撤回についても説明する、とした。対象者の観察方法は、1同意を得られた対象者・家族に研究者および研究分担者がせん妄リスクを評価する。2せん妄高リスク対象者に携帯型NIRS装置を装着する。3研究者は対象者を監視下に置き、脳血流をモニタリングしつつ、対象者の言動や対象者周囲の環境(医療従事者や他の患者の行動等)をビデオカメラ等を用いて記録する。以上の条件下に対象選定を行ったが、高齢者という点では該当候補は多数経験するものの、既存の認知機能障害が強く、研究への理解協力が得られにくい方が多く、また、携帯型NIRS装置のデータ取得用プローブを前頭部に数時間貼付することに理解がえられないといった事情により、対象患者が選定できなかった。携帯型NIRS装置は優れたものであり、高齢者入院患者の実情に即した研究プロトコールの再構築が必要である。本研究では高齢者脳血管障害患者に対し近赤外線分光法NIRSによる脳血流モニタリングを行い、看護ケア行動の脳血流に対する影響とせん妄との関係を明らかにし、脳血流変化を視野に入れた新たなせん妄マネジメントを確立することを目的とした。しかしながら、せん妄リスクの高い高齢脳血管障害患者は認知機能低下を併発していることが多く、また、携帯型NIRSプローブを前頭部に長時間貼付すること等により、協力者が得られず、成果を見いだせないまま研究期間が終了となった。携帯型NIRS装置自体は優れたツールであるため、高齢者患者を対象とするためには研究プロトコールの再構築を行い、引き続き研究を継続していく予定である。26年度に予定していた固定型ベッドサイドNIRSモニタリングを行えなかったため。脳血流解析装置販売会社とのやり取りを重ね、解析ソフトウェアの作動を確実にしたい。また、研究対象者確保のため、協力施設を増やし、対象者の確保に努めたい。脳神経外科学共同研究者との高齢者入院患者の実態把握をすすめる。また、研究協力施設とも密に連携を図り、効率的な研究が行える体制づくりに着手し、携帯型NIRSモニタリングを実行したい。25年度に予定していた病棟におけるせん妄ケア実践の把握と本研究の倫理審査申請に至らなかったため。
重粒子（炭素）線が生成する活性酸素の制御：重粒子線癌治療の高度化を目指して

電子常磁性共鳴(EPR)スピントラッピング法で、放射線によって生成するヒドロキシルラジカルの生成密度を解析することに成功した。EPRスピンプローブ法でスーパーオキシドのおよその発生量を予測できた。EPRスピンプローブ法で比較的簡便に過酸化水素を定量できるようにした。その結果、高LET放射線の生じるヒドロキシルラジカルは生成密度が高すぎて制御不可能であるが、その他の活性酸素種は抗酸化剤で制御可能という予測を得た。マウスの大腿部にX線あるいは炭素線を照射して生じる筋の線維化に対してTEMPOLが有効に抑制するか否かを検討した。予想に反し、重粒子線による線維化にも抑制効果が見られた。平成23年度までの研究で、X線および重粒子(炭素イオン)線が生成する活性酸素のおよその量と生成の密度と分布の様子がわかってきた。平成24年度からはX線および重粒子線を用いてそれぞれで放射線誘導性筋繊維化モデルマウスの作製を試みた。マウスの大腿部にX線あるいは炭素線を照射した場合に、筋の線維化に伴い後肢の短縮がそれぞれの放射線の照射線量に依存して観察された。重粒子線で生じる活性酸素種を制御するに当って、最終的に癌を植え付けた実験動物(マウスあるいはラット)を用いて、癌と周辺組織の同時観察を行い、活性酸素生成の制御が実際の治療へ応用可能か否かを検討するため、重粒子線照射水溶液試料における活性酸素種の生成量の評価と重粒子線照射組織に対する抗酸化剤の効果を検討した。水溶液試料を使用して活性酸素種の定量的検出法の開発と反応条件設定を行う。そのため化学的な活性酸素発生系を用いる実験系により、ヒドロキシルラジカルの定量性の検討、スーパーオキサイドの定量性の検討、過酸化水素の定量性の検討を行った。ヒドロキシルラジカルに関してはEPRスピントラップ法の変法により水溶液中で定量することが可能となり、局所的に高濃度で生成していることが分かった。スーパーオキサイドについてはそれ自体を検出することはできなかったものの、水溶液中でのスーパーオキサイドが主に関与する反応量として評価することができた。過酸化水素についてもTEMPOLを用いた間接測定法により、水溶液中での生成量を評価することができた。動物に抗酸化剤等を投与した上で腫瘍へ炭素線を照射し、正常組織での繊維化の程度を数値化し、TEMPOLによる活性酸素生成の制御が重粒子線にも有効に働くか否かを検討した。予想に反し、重粒子線による組織の線維化に対してTEMPOLが抑制することが分かった。TEMPOLが効果を示したことからヒドロキシルラジカルよりもむしろスーパーオキサイドの関与が懸念された。重粒子線がん治療技術の高度化が求められている。その中で、患者の負担を軽減する目的から一回の照射線量を増大して分割照射の回数を減らすことが試みられている。それによって患者の拘束時間を大幅に減少できる。しかしながら一回の照射線量を増加すると、これまでは問題とされてこなかった重粒子線での酸素効果(活性酸素種の発生とそれによる影響)が無視できなくなる。そのため重粒子線で生成する活性酸素を制御することが必要となってきた。そこでまず、放射線の影響に関係の深いヒドロキシルラジカルとスーパーオキシドアニオンラジカル、および過酸化水素、この3種類の活性酸素種について定量的にかつそれぞれを区別して測定する方法の開発を試みた。本年度は活性酸素種の発生源としてX線を用いて実験を行った。水溶液および水溶液をゼラチンで固めた試料にX線を照射したときに、試料内で発生するそれぞれの活性酸素種を測定した。ヒドロキシルラジカルについては電子常磁性共鳴(EPR)スピントラッピング法による測定を試みた。ヒドロキシルラジカルのディテクターであるスピントラッピング剤の濃度を変えて測定することにより、ヒドロキシルラジカルの発生する密度を解析することに成功した。スーパーオキシドアニオンラジカルは、EPRスピンプローブ法により測定を試みた。EPRスピンプローブ法はスーパーオキシドアニオンラジカルの検出に比較的好感度であったが、充分な特異性が得られず、反応特異性と定量性を向上させるため引き続き検討が必要である。過酸化水素の測定は従来法とEPRスピンプローブ法との相関を求めることにより、EPRスピンプローブ法で比較的簡便に定量できるようになった。X線および重粒子(炭素)線を用いてそれぞれ放射線誘導性筋繊維化モデルマウスを作製し、放射線による筋繊維化を客観的に数値化することができた。当初の研究計画で予定していたように、活性酸素種毎の測定法をほぼ確立することができた。当初の研究計画と比較すると、例えばヒドロキシルラジカルの測定では予想以上の結果を得ることができ、しかしスーパーオキシドアニオンラジカルの測定ではやや定量性の面で遅れており、活性酸素種によってその進展度合いが幾分異なるが、全体的には順調に進展していると思われる。

平成25年度は、平成24年度に作成した放射線障害モデル動物を用いて、抗酸化剤による重粒子線の影響の制御の可能性を調べる。またその結果をX線での結果と比較する。平成24年度からは重粒子線を用いて実験を行う。先ず平成24年度は、現在までに開発した測定法を応用して、重粒子線が生成する活性酸素種の生成量とその密度の解析を行う。これをこれまでのX線での結果と比較し、抗酸化剤を用いて制御可能か否かを探る。そのうえで、平成25年度は実際に動物を用いて、抗酸化剤による重粒子線の影響の制御を試みる。放射線の影響を数値化するためのモデルとして放射線誘導性筋繊維化モデルマウスの作製を行ったが、1回の実験で充分な繊維化症状を観察するまでに予想よりも時間がかかり実験がずれ込んだため、研究費の繰り越しが必要となった。観察期間の目途はついたので、計画的に動物実験を繰り返し、予定通り研究を終了する見込みである。一般消耗品・試薬・動物および飼料(530,000円)、英文公正のための諸謝金(30,000円)、研究室設備の維持および修繕費(100,000円)。平成24年度に平成25年度の動物実験の準備のため平成24年度中にイソフルラン麻酔器と動物体温維持装置を購入(700,000円)し、重粒子線照射時に使用できるよう必要に応じて改造を施す(200,000円)。また本年度までの実験結果を海外の関連分野の学会で報告する(400,000円)。
壁面での気体-固体分子干渉解析に基づくマイクロ・ナノチャネル内熱流動現象の解明

マイクロ・ナノチャネル内における気体の熱流動は,固体表面や界面での気体分子の反射状態に直接影響されることから,チャネル内熱流動特性の正確な把握には,各々の分子の種類に応じた気体と固体の分子干渉を含む分子論的な流体解析が必要である.そこで,本研究では,固体表面の性状や気体の種類により,固体表面における気体分子の適応係数,気体分子反射特性,固体に働く応力,表面に伝わる熱流がどのように変わり,また,それに伴う熱流動特性への影響を明らかにすることを目的とし,気体の運動解析に対してはDSMC法を,気体-固体分子干渉には分子動力学法を用いて調べた.固体表面として白金,気体分子として単原子分子のアルゴン,および,二原子分子の窒素を取り,表面性状としては,清浄な場合と表面に異分子(キセノンあるいは水分子)が物理吸着している場合を取り扱っている.クヌーセン数が0.2と1.0における二平板間のクエット流れと上下平板間に温度差のある問題を解析し,次のような結果を得た.窒素分子に対するエネルギー適応係数の値が対応する実験値とその傾向がよく一致しており,また,並進エネルギー適応係数が回転エネルギー適応係数よりも大きくなるという実験的結果と同様の傾向が見られた.また,壁において反射される気体分子のもつ分子速度分布関数,および,回転エネルギー分布関数について調べたところ,壁面にふさわしい適応係数を取るときにマックスウェル型の反射境界条件によって記述されることが示された.さらに,アルゴン気体と水分子吸着白金表面との接線方向適応係数を求め,吸着分子数の適応係数に及ぼす影響を定量的に明らかにした.とくに清浄な表面に比べて吸着分子表面の熱流動への影響が大きいことを確認した.さらにまた非経験的分子間ポテンシャルを構築し,同様の解析に拡張できるよう進めている.マイクロ・ナノチャネル内における気体の熱流動は,固体表面や界面での気体分子の反射状態に直接影響されることから,チャネル内熱流動特性の正確な把握には,各々の分子の種類に応じた気体と固体の分子干渉を含む分子論的な流体解析が必要である.そこで,本研究では,固体表面の性状や気体の種類により,固体表面における気体分子の適応係数,気体分子反射特性,固体に働く応力,表面に伝わる熱流がどのように変わり,また,それに伴う熱流動特性への影響を明らかにすることを目的とし,気体の運動解析に対してはDSMC法を,気体-固体分子干渉には分子動力学法を用いて調べた.固体表面として白金,気体分子として単原子分子のアルゴン,および,二原子分子の窒素を取り,表面性状としては,清浄な場合と表面に異分子(キセノンあるいは水分子)が物理吸着している場合を取り扱っている.クヌーセン数が0.2と1.0における二平板間のクエット流れと上下平板間に温度差のある問題を解析し,次のような結果を得た.窒素分子に対するエネルギー適応係数の値が対応する実験値とその傾向がよく一致しており,また,並進エネルギー適応係数が回転エネルギー適応係数よりも大きくなるという実験的結果と同様の傾向が見られた.また,壁において反射される気体分子のもつ分子速度分布関数,および,回転エネルギー分布関数について調べたところ,壁面にふさわしい適応係数を取るときにマックスウェル型の反射境界条件によって記述されることが示された.さらに,アルゴン気体と水分子吸着白金表面との接線方向適応係数を求め,吸着分子数の適応係数に及ぼす影響を定量的に明らかにした.とくに清浄な表面に比べて吸着分子表面の熱流動への影響が大きいことを確認した.さらにまた非経験的分子間ポテンシャルを構築し,同様の解析に拡張できるよう進めている.
非線形ファイバループミラーを用いたスクイズド光の生成に関する研究

1.広帯域スクイズド光検出器の製作高速でかつ量子効率の良いpinフォトダイオードと、広帯域低雑音の増幅器を用いて、スクイズド光を広帯域に測定するためのバランス型ホモダイン検出器を設計・製作した。レーザーを用いた特性評価の結果、検出器の帯域はDC50MHz、又、同相成分除去比は30dB以上あることが分かった。又、この検出器を用いてショット雑音レベルの規定を行い、理論値とほぼ一致した結果を得ることができた。2.光ファイバを用いたスクイズド光の新しい生成手法の考察これまで、光ファイバを用いたスクイズド光の生成は、スクイズド状態の真空場と励起光が異なる出力端から出射されるため、二つの光の間の位相差が不安定で、時間的に安定なスクイズド光の検出は難しかった。本研究において我々は定偏波ファイバと偏波光分岐器を用いることによって、スクイズド光を安定に生成することができる実験系を独自に考察した。3.新しいファイバループミラーを用いたスクイズド光の生成実験波長1.064μmのYAGレーザーと今回考察した偏波分岐型ファイバループミラーの組み合わせを用いて、スクイズド光の高安定な生成実験に取り組んだ。その結果、スクイズド光の揺らぎを時間的に安定に測定することができた。又、生成系に組み込んだ波長板を回転することによって、揺らぎの位相依存性を観測することができ、新しいファイバループミラーの有効性を確認することができた。4.パルス光と光ファイバを用いたスクイズド光の生成・検出過程の解析光ファイバ中におけるパルス光によるスクイズド光の生成・検出過程をコンピュータシミュレーションを用いて解析した。解析は、光ファイバにおける非線形性や波長分散の影響を考慮して行った。その結果、観測されるスクイジング量は分散によるパルス波形の変化に大きく依存することが明らかになった。
後期旧石器集団の領域と遊動：石刃の３Ｄ情報分析とＧＩＳ分析の統合的研究

1.対象資料の三次元計測とGIS分析秋田県縄手下遺跡の後期旧石器時代前半期石刃石器群の三次元計測を実施した。また、群馬県後田遺跡の遺跡内GIS分析のために、群馬県埋蔵文化財調査事業団が所蔵する全現場図面をスキャンし、出土遺物全点の位置情報を復元した。これについては、前年度に実施した同遺跡の前半期石刃石器群の三次元計測および形態分析の成果と併せて、搬入石刃の地点間形態的変異を評価する分析に用いる。この他に、福島県笹山原No.8・No.16遺跡(郡山女子大学所蔵)の後期旧石器時代前半期石刃石器群の資料調査を実施した。2.分析手法の確立前年度の実施状況をふまえて、石器の三次元形態の評価について、資料群の単なる統計的な代表値を採用するのではなく、使用痕分析、実験資料などの参照情報を用いて遺跡間変異を評価する方法に切り替えた。これを受けて今年度は実資料での検証を行った。成果は国内学会でポスター・口頭で発表している3.資料集成と広域編年の検討本研究で主な対象資料としている後田段階の石刃石器群について、その編年的位置づけを検討するために、愛鷹山麓から南関東、北関東、東北地方の石刃石器群の細分編年の地域間比較を行い、広域編年を検討した。成果は口頭発表と論文で発表している。また、列島規模での後期旧石器時代前半期石器群の広域編年の検討、後期旧石器時代前半期後葉の構造変動の理解のために、南九州(熊本県・宮崎県・鹿児島県)の台形様石器群の悉皆的な資料調査を実施した。4.その他2018年9月に群馬県後田遺跡の発掘調査を実施した。また2018年12月に徳之島アマングスク遺跡の発掘調査、2019年3月に群馬県三ツ木東原遺跡の発掘調査に従事した。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。1、対象資料の三次元計測、後期旧石器時代前半期に相当する関東地方の群馬県後田遺跡(群馬県埋蔵文化財調査事業団所蔵)および周辺遺跡の石刃および接合資料の三次元計測を進めた。また当初の予定とは異なるが、後期旧石器時代後半期に相当する東北地方の東山系石刃石器群(高倉山遺跡、お仲間林遺跡)の計測と分析も進めている。これは次の分析手法の見直しのためである。2、三次元形態分析手法の見直し、本研究の骨子である3Dモデルに基づき石器形態の器械的機能を評価する際の基準について再検討を行った。これは、当初の実施計画には無い分析であるが、本研究遂行において極めて重要であるため計画を変更し実施した。具体的には石器形態の遺跡間変異を評価する基準について、当初予定していた(1)本研究で三次元計測・分析した資料から導き出した統計的な代表値による評価から、(2)使用痕分析研究などを参照し旧石器資料に不足する動的情報を重み付けした上での評価へと変更する。以上の変更をふまえて、東山系石刃石器群の計測結果を用いて新たな評価手法での分析を行い、評価基準策定への見通しを得た。その成果を国内学会のポスター発表にて報告した。3、資料の集成、資料の集成は修士論文で既に行っているが、新出資料を加えて地域細別編年を再検討した。その成果については、学内学会(2018年度4月)で発表する予定である。2017年度は北関東の後田段階の資料の計測を進めたが、資料集成の結果を踏まえ、次年度以降の三次元計測リストに武蔵野台地北部の新出資料、同時期の別系統石器群に想定される東北から下総にかけての珪質頁岩石器群を加える。主たる対象資料である関東地方の石刃石器群の分析事例の蓄積は、概要の2に示した分析手法の見直しにより、当初の計画より停滞している。しかし、分析手法の見直しは本研究遂行において極めて重要な変更であり、分析手法の確立については当初の予定よりも進捗している。

また、列島規模での後期旧石器時代前半期石器群の広域編年の検討、後期旧石器時代前半期後葉の構造変動の理解のために、南九州(熊本県・宮崎県・鹿児島県)の台形様石器群の悉皆的な資料調査を実施した。4.その他2018年9月に群馬県後田遺跡の発掘調査を実施した。また2018年12月に徳之島アマングスク遺跡の発掘調査、2019年3月に群馬県三ツ木東原遺跡の発掘調査に従事した。1、対象資料の三次元計測、2017年度の関東地方の原産地資料の資料の計測と分析結果をふまえ、今後は消費地遺跡の計測を進める。加えて資料集成の結果をふまえ、東北地方の前半期石刃石器群、後半期の東山系石刃石器群の計測も進める。2017年度は各遺跡全資料の悉皆的な計測を進めたが、上記研究計画の変更に伴い、選択的な資料計測を進める。2.分析手法の確立、計測・分析資料を蓄積し、2017年度の指標をふまえ遺跡間変異を評価する基準を検証する。3.地域間比較と通時的比較、2017年の資料集成結果を踏まえ、関東・東北地方の研究状況、遺跡規模の違いを考慮し、1の計測・分析結果をふまえながら、既存の報告データから遺跡内分布、遺跡間比較のGIS分析を進める。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
医療環境におけるHazardous drugsの定量的かつ可視的評価方法の確立

医療環境におけるhazardous drugs(HD)を定量化、可視化することを目的に、まず、ラマンイメージングで実績のあるフルオロウラシル(FU)のイメージングに取り組んだ。使用した薬剤は、テガフール配合内服薬であるユーエフティ(UFT)配合カプセル、ティーエスワン(TS-1)配合カプセルまたはOD錠の製剤またはPTPシートを用いた。検討の結果、UFT、TS-1カプセル及びTS-1OD錠いずれも、PTPシートの内側にはFTが付着していた。UFTでは、約20 ng/シートのFUが検出されたが、検出されたロットは購入から約4年が経過した製品であり、購入して間もないロットではFUはほとんど検出されなかった。一方、TS-1OD錠並びにそのオーソライズドジェネリック医薬品であるエスワンタイホウOD錠でもFUが検出された。TS-1OD錠、エスワンタイホウOD錠の錠剤表面をラマン顕微鏡にて可視化したところ、錠剤断面の辺縁部にはFT、FUともに検出されず、また、FUはどこにも検出されなかった。平成29年度の検討により、テガフール配合内服薬では、ロットや剤形によってはPTPシートからFUが曝露し得ることが示唆された。また、今回の検討で微量のFUをイメージングすることができる確証を得るまでには至らなかったため、今後の課題となった。以上、平成29年度の成果は、日本医療薬学会及び日本臨床腫瘍薬学会の学術大会にて報告した。1.小松原早織、武田有紀、髙見陽一郎ほかテガフール配合内服薬のPTPシートに付着するフルオロウラシル量の検討第27回日本医療薬学会年会、2017年11月3日(幕張メッセ、千葉)。2.島田倫栄、髙見陽一郎、森山圭ほかテガフール配合口腔内崩壊錠のPTPシートに付着するフルオロウラシル日本臨床腫瘍薬学会学術大会2018、2018年3月17日(パシフィコ横浜、横浜)。
表皮の増殖・分化異常がもたらす疾患制御機構の解明

表皮特異的PLCδ1遺伝子欠損マウス、3次元ヒト人工皮膚モデル系を用いて、PLCδ1発現抑制が分化抑制とバリア機能の低下を誘導する事を明らかにした。その分子機構として、フィラグリンのプロセシング異常や表皮顆粒層のバリアに重要なタイトジャンクションの形成異常を見出した。タイトジャンクションを構成するZO-1の発現低下、Rhoの不活性化、p38MAPキナーゼの活性化等の異常が生じ、これが表皮バリア機能不全をもたらすことが判明した。また実際の乾癬やアトピー性皮膚炎の患者皮膚でのPLCδ1発現が顕著に低下していることが判明し、こうした疾患とリン脂質代謝酵素PLCδ1の関連性が示唆された。リン脂質代謝酵素PLCd1は増殖・分化制御に重要な役割を果たす事が判明してきている。PLCd1欠損による増殖・分化制御の乱れが、乾癬やアトピー性皮膚炎などの皮膚疾患やがんを誘導すると考えられる。そこで第一に、表皮バリア機能におけるPLCd1の重要性を、PLCd1欠損(KO)マウスやケラチノサイトの3Dヒト人工皮膚モデル系等を用いて検討した。いずれの系においても外からの浸透性が増大し、バリア機能が低下している事が判明した。またその分子機構として、フィラグリンのプロセシング異常や、タイトジャンクション異常等が判明しつつある。第二に、PLCd1の欠損によってもたらされる乾癬様皮膚炎と肥満の関連性を検討した。遺伝的肥満マウス(db/dbマウス)にイミキモドを塗布し乾癬様炎症を誘導した所、通常マウスに比べて耳の腫脹やインターロイキン17(IL-17), IL-22の増加など著しい乾癬の憎悪が観察された。また乾癬に関与するReg3γの発現が定常時にも誘導されている事、肥満時に血清で増加するパルミチン酸でヒト初代角化細胞を処理すると、Reg3γの発現が増加する事がわかった。これらの結果は、肥満が乾癬の重症化を引き起こす事を示している(K. Kanemaru, et al, Exp.Derm. in press)。第三に、PLCd1が、がん細胞悪性化を阻害するE-カドヘリンの発現を誘導し、大腸がんにおいてがん抑制因子として機能することを報告した。またPLCd1は大腸がん臨床検体においても著しく発現が低下している事、がん遺伝子K-Rasの活性型変異でPLCd1の発現が抑制される事を明らかにした。これらの成果は、増殖・分化に関与するPLCd1が表皮のみならず、種々な上皮系細胞においても重要な役割を担っている事を示している(Satow et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111, 13505-13510 (2014))。表皮におけるリン脂質代謝酵素ホスフォリパーゼC(PLC)d1が増殖・分化制御に重要な役割を果たす事が判明してきているため、表皮特異的PLCd1欠損マウスやヒトケラチノサイトでPLCd1発現抑制を行ない、増殖・分化制御の乱れや表皮の重要な機能であるバリア機能に対する影響を検討した。またバリア機能障害が生じている乾癬やアトピー性皮膚炎などの皮膚疾患との関連性を検討した。PLCd1欠損(KO)マウス表皮やケラチノサイトの3Dヒト人工皮膚モデル系でのPLCd1発現抑制が細胞増殖性の亢進と分化の抑制を引き起こすことが、マウスの表皮のみならず、3Dヒト人工皮膚モデル系でも生じることが判明した。分化異常は表皮バリア機能の低下を誘導した。そこで今年度は表皮バリア機能の低下をもたらす分子機構の詳細を検討した。第一に、フィラグリンのプロセシング異常が形態学的解析やプロセシングに関与する酵素群の発現低下等によって生じていることを検証した。第二に、表皮バリア機能に重要や役割を果たす細胞間脂質の減少やCornified envelope(角化膜)の形態や数の異常を見出した。第三に、表皮顆粒層のバリアに重要なタイトジャンクションの形成異常を見出した。PLCd1欠損(KO)マウス表皮やケラチノサイトでLCd1発現抑制を行なうと、タイトジャンクションを構成するZO-1の発現低下、Rhoの不活性化、p38MAPキナーゼの活性化等の異常が生じ、これが表皮バリア機能不全をもたらすことが判明した。更に、乾癬やアトピー性皮膚炎の患者さん皮膚でのPLCd1発現を検討した結果、これらの患者さんでの発現が顕著に低下していることが判明し、こうした疾患とリン脂質代謝酵素PLCd1の関連性が示唆された。増殖・分化制御におけるリン脂質代謝の重要性に焦点を当てて解析を行った。表皮においては、リン脂質代謝酵素PLCd1の欠損が分化異常を引き起し、その結果バリア機能不全をもたらす事を明らかにした。今年度は特に、バリア機能不全をもたらすメカニズムに着目し、概ね全容を解明できたと考えている。表皮におけるリン脂質代謝酵素ホスフォリパーゼC(PLC)d1が増殖・分化制御に重要な役割を果たす事が判明してきているため、表皮特異的PLCd1欠損マウスやヒトケラチノサイトでPLCd1発現抑制を行った後3D cultureで人工皮膚モデル系を作製し、PLCd1の増殖・分化制御の乱れや表皮の重要な機能であるバリア機能に対する影響を検討した。特に今年度はバリア機能不全を引き起すメカニズムの詳細な解明と、バリア機能障害が生じている乾癬などの皮膚疾患との関連性を検討した。PLCd1欠損(KO)マウス表皮やケラチノサイトの3Dヒト人工皮膚モデル系でのPLCd

1発現抑制が細胞増殖性の亢進と分化の抑制を引き起こすことが判明した。分化異常はいづれの系においても表皮バリア機能の低下を誘導した。そこで次に表皮バリア機能の低下をもたらす分子機構の詳細を検討した。その結果、PLCd1欠損下では、PLCd1によるリン脂質PIP2の分解, IP3の産生を介して生じる細胞内のカルシウム濃度の上昇が抑制され、カルシウム依存的なNFATの核移行が阻害されている事が判明した。またPLCd1欠損はNFATが制御するp38MAPキナーゼの活性化異常を誘導し、Rhoの不活性化、タイトジャンクションの形成異常を生じていることが明らかになった。こうしたタイトジャンクションの形成異常が表皮バリア機能不全をもたらしていると考えられた。乾癬の患者さん皮膚においてもPLCd1発現が顕著に低下していることが判明し、こうした疾患とリン脂質代謝酵素PLCd1の関連性が示唆された。今後乾癬の治療にも貢献し得ると予想される。これらの結果をCell Death & Differentiationに報告した(2017)。表皮特異的PLCδ1遺伝子欠損マウス、3次元ヒト人工皮膚モデル系を用いて、PLCδ1発現抑制が分化抑制とバリア機能の低下を誘導する事を明らかにした。その分子機構として、フィラグリンのプロセシング異常や表皮顆粒層のバリアに重要なタイトジャンクションの形成異常を見出した。タイトジャンクションを構成するZO-1の発現低下、Rhoの不活性化、p38MAPキナーゼの活性化等の異常が生じ、これが表皮バリア機能不全をもたらすことが判明した。また実際の乾癬やアトピー性皮膚炎の患者皮膚でのPLCδ1発現が顕著に低下していることが判明し、こうした疾患とリン脂質代謝酵素PLCδ1の関連性が示唆された。増殖・分化制御におけるリン脂質代謝の重要性に焦点を当てて解析を行った。表皮においては、リン脂質代謝酵素PLCd1の欠損が分化異常を引き起し、その結果バリア機能不全をもたらす事が判明してきており、解析は順調に推移している。PLCd1の欠損によってもたらされる乾癬様皮膚炎が肥満によって増悪することを論文発表できた事も成果として挙げられる(Exp.Derm. in press)。また表皮のみならず、大腸上皮においても、PLCd1が増殖・分化制御に関与し、特に大腸がんの抑制因子として機能する事が判明した点は予想外のことであるが、大変面白い結果と成った(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (2014))。以上を総合し、想像以上の成果が上がったと判断した。リン脂質代謝酵素PLCd1の欠損が分化異常を引き起し、その結果バリア機能不全をもたらす事に関する解析が順調に進行してきている。今後バリア異常をもたらすメカニズムについて更なる解析を行なう。またバリア異常を主な症状としているアトピー性皮膚炎の診断や治療に繋がる分子機構を検討し、臨床応用を目指す。28年度が最終年度であるため、記入しない。皮膚科学表皮においては、リン脂質代謝酵素PLCd1の欠損が分化異常を引き起し、その結果バリア機能不全をもたらす事に関する解析が順調に進行してきている。3Dヒト
薬物徐放制御能を有するハイブリッド生体材料の開発

顎骨骨髄炎の治療期間を短縮するための臨床応用に即した基礎的研究を行う必要性がある。家兎顎骨骨髄炎モデルを作製し、各種抗菌薬を含有させた高機能性薬物徐法担体の抗菌効果および骨伝導能・骨形成能などの組織学的評価を行う。具体的には、顎骨骨髄炎動物モデルを作製した後、炎症の組織学的評価、各種抗菌薬を含有させた高機能性薬物徐法担体の組織親和性と骨伝導性の検討、各種抗菌薬を含有させた高機能性薬物徐法担体の骨置換性の検討を行う。骨髄炎治療に骨補填剤を担体としたdrug deliverysystemの臨床応用は、一部の整形外科領域において試験的に用いられているが、基礎的な実験的研究の報告は少ない。また歯科口腔外科領域での応用はほとんどなく、基礎的なデータが不十分であると考えられる。そこで、骨伝導能を有し、さらに比較的早期にセメントが吸収し骨置換され、それと同時に抗菌薬が持続的に徐放するような複合材料(ハイブリッド材料)を調整・設計し、より高機能な薬物徐放担体を開発する必要がある。具体的には、まずpoly(L-lactic acid)(PLLA)とpoly(DL-lactic-co-glycolic acid)(PLGA)の共重合体(生体吸収性有機材料)に炭酸低結晶アパタイト(生体吸収性無機材料)をいろいろな条件で(重量比など)添加し、各種抗菌薬を複合材料内に含有させ作製する。また、練和液にこれまで中性リン酸ナトリウムを用いて基本的な徐放試験を行ってきたが、骨伝導性を高める目的で、アテロコラーゲンを用いた検討を行う。なお、以前、申請者がアテロコラーゲンを含有させた非崩壊型アパタイトセメント(無機材料)における組織学的検討を行い、従来型と比較して良好な骨伝導性と新生骨の形成を確認している。その後、徐放抗菌薬の有効濃度の持続日数など抗菌薬の特異性についてin vitroで検討する。また、顎骨骨髄炎動物実験モデルを作製し、高機能性薬物徐放担体を顎骨内に埋入後、その治療効果についてX線学的および組織学的評価(脱灰、非脱灰切片を作成し炎症の組織学的評価)で判定する。また、骨伝導性、骨置換性についても検討する。骨髄炎治療に骨補填剤を担体としたdrug deliverysystemの臨床応用は,一部の整形外科領域において試験的に用いられているが,基礎的な実験的研究の報告は少ない.また歯科口腔外科領域での応用はほとんどなく,基礎的なデーターが不十分であると考えられる.そこで,骨伝導性を有し,さらに比較的早期にセメントが吸収し骨置換され,それと同時に抗菌薬が持続的に徐放するような複合材料(ハイブリッド材料)を調整・設計し,より高機能な薬物徐放担体を開発する必要がある.具体的には,まずpoly(L-lactic acid)(PLLA)とpoly(DL-lactic-co-glycolic acid)(PLGA)の共重合体(生体吸収性有機材料)に炭酸低結晶アパタイト(生体吸収性無期材料)をいろいろな条件で(重量比など)添加し,各種抗菌薬を複合材料内に含有させ作製する.また,練和液にアテロコラーゲンと中性リン酸ナトリウムの混合液を添加し複合材料(ハイブリッド材料)と混和させ、高機能性薬物徐法担体を作製する.その後,徐放抗菌薬の有効濃度の持続日数など抗菌薬の特異性についてin vitroで検討する.また,顎骨骨髄炎動物実験モデルを作製し,高機能性薬物徐放担体を顎骨内に埋入後,その治療効果についてX線学的および組織学的評価(脱灰,非脱灰切片を作製し炎症の組織学的評価)で判定する.また,酒石酸抵抗性酸フォスファターゼ(TRAP)染色を行い,破骨細胞による各種抗菌薬を含有させた高機能性薬物徐法担体の吸収状態および破骨細胞数についても検討する.これまでの顎骨骨髄炎の研究は単一(無機)材料を主体にした研究が行われていた。無機材料は、形態付与が困難で溶解・吸収性の面で問題点があり、有機材料は形態付与が容易で加水分解して生体内に吸収されるが、その分解過程で炎症を惹起することがある。そこで今回は、有機・無機材料の欠点を補い、かつ利点を生かした複合材料(ハイブリッド材料)の開発を行い、その後各種抗菌薬を含有させた高機能性薬物徐放担体の開発を行うことが、顎骨骨髄炎への基礎的研究に有効であると考えた。材料として有機材料はpoly(L-lactic acid)(PLLA)とpoly(DL-lactic-co-glycolic acid)(PLGA)の共重合体を使用し、無機材料はリン酸カルシウム(α-TCPあるいはβ-TCP)を複合させた材料である。溶解性に優れた本材料はインテリジェントマテリアルとして期待している。本研究に関連する国内・国外の研究動向及び位置づけとしては、欧州および北米で、無機材料であるアパタイトセメントの臨床応用が数年前から行われており、本邦においても平成12年にアパタイトセメントの臨床応用が許可されたため、アパタイトセメントに関する研究は国内外で活発に研究されている。本研究は、これまでの研究をさらに発展させ有機材料と無機材料の長所を生かし、生体内の環境に順応したインテリジェントマテリアルを作成し、それに各種抗菌薬を含有させ高機能性薬物徐法担体を開発することを目的としていることから国内・国外の生体材料研究における先駆的研究であると考えられる。各種抗菌薬を含有させた高機能性薬物徐法

担体が開発されれば、国内・国外の生体材料研究における先駆的研究になるとともに、顎骨骨髄炎の治療期間を短縮できるため臨床応用に即した画期的な研究になると考えられる。顎骨骨髄炎の治療期間を短縮するための臨床応用に即した基礎的研究を行う必要性がある。家兎顎骨骨髄炎モデルを作製し、各種抗菌薬を含有させた高機能性薬物徐法担体の抗菌効果および骨伝導能・骨形成能などの組織学的評価を行う。具体的には、顎骨骨髄炎動物モデルを作製した後、炎症の組織学的評価、各種抗菌薬を含有させた高機能性薬物徐法担体の組織親和性と骨伝導性の検討、各種抗菌薬を含有させた高機能性薬物徐法担体の骨置換性の検討を行う。顎骨骨髄炎動物実験モデルを作製し,高機能性薬物徐放担体を顎骨内に埋入後,その治療効果について組織学的評価(脱灰,非脱灰切片を作製し炎症の組織学的評価)が可能であった.口腔外科高機能性薬物徐放担体を顎骨内に埋入後,その治療効果についてX線学的に評価する.また,酒石酸抵抗性酸フォスファターゼ(TRAP)染色を行い,破骨細胞による各種抗菌薬を含有させた高機能性薬物徐法担体の吸収状態および破骨細胞数についても検討する.生体吸収性有機材料であるpoly(L-lactic acid)(PLLA)とpoly(DL-lactic-co-glycolic acid)(PLGA)の混合率を変化させ,その強度・溶解率を調整出来た.生体吸収性有機材料をさらにジメチルスルホアミド(DMSO)で再溶解させ、生体吸収性無機材料である炭酸アパタイトを混和させた.この混合物の液体中に粒径の異なるsugar crystalを添加させ、凍結乾燥させた.その後、得られた資料を流水下にてsugar crystalだけを除去し、海綿状の複合材料(ハイブリッド材料)を作成出来た.主に物品,旅費に使用したが端数が生じた.家兎顎骨骨髄炎モデルを作製し、各種抗菌薬を含有させた高機能性薬物徐法担体の抗菌効果および骨伝導能・骨形成能などの組織学的評価を行う。具体的には以下の通りである.1各種抗菌薬を含有させた高機能性薬物徐法担体から抗菌薬の徐放特性の検討,2骨芽細胞を用いた各種抗菌薬を含有させた高機能性薬物徐法担体の初期接着の測定,3相対増殖率の測定,4骨形成マーカー遺伝子の発現解析,5顎骨骨髄炎動物モデルの作製,6炎症の組織学的評価、各種抗菌薬を含有させた高機能性薬物徐法担体の組織親和性と骨伝導性の検討,7各種抗菌薬を含有させた高機能性薬物徐法担体の骨置換性の検討.物品費として使用予定である.主に物品費,旅費に使用したが端数が生じた.物品費として使用予定である.
行動遺伝学の手法を援用したパーソナリティ理論と測定法の構築に関する研究

本年度は、昨年度に引き続いて、双生児住所録の作成を行った。東京23区全てを網羅することは時間的制約のため行うことが出来なかったが、約2000組の双生児住所録を作成することが出来た。そして、最終的に、昨年度と本年度の作業によって作成した双生児住所録を基に、質問紙調査を行った。結果として、一卵性双生児約130組、二卵性双生児約70組の協力が得られた。現時点では、調査対象の30%以下の協力しか得られておらず、今後、協力者が増える可能性はある。解析は今後適正なデータが揃った段階で行う予定である。本年度は、当初の研究実施計画どおり、双生児住所録の作成を行った。行動遺伝学の研究を行うためには、最初の研究対象となりうる双生児のデータを大量に確保しなければならず、そうした双生児の住所などのデータを得るためには、各地方自治体の役所窓口において、住民基本台帳から、(1)「生年月日」(1日違いも含む)と(2)「住所」が一致している個人を手作業にて検索し、双生児住所録を作成するのである。こうした一連の手作業が、行動遺伝学の研究においては、最も基本的かつ重要な作業である。本年度に関しては、地理的条件、住民台帳閲覧費等の条件から、東京都の千代田区、足立区、品川区、葛飾区、荒川区、板橋区、練馬区、神奈川県の横浜市港北区を対象とした。このうち、荒川区、葛飾区、練馬区、横浜市港北区については、全住所録の閲覧を行うことができず、その一部を対象とするに留まった。結果的に、それぞれの地方自治体において、上記条件に合う組は下記の通り抽出された。千代田区61組、足立区48組、品川区126組、葛飾区122組、荒川区306組、板橋区751組、練馬区358組、神奈川県横浜市港北区85組、計1857組が抽出された。上記条件に当てはまる者の中には、双生児ではなく、夫婦などの可能性もあるため、双生児かどうかの確認は、実際の質問紙調査において行うこととする。来年度に関しては、本年度に全ての住所録からの抽出を行うことができなかった、荒川区、葛飾区、練馬区、横浜市港北区を優先し、さらに可能な範囲での住所録抽出の作業を行い、本研究において得られた双生児住所録を基に、質問紙調査を行う予定である。
鶏コクシジウムの発育鶏卵培養系を利用したアピコプラストゲノム操作の検討

マラリアなど様々な感染症の原因となる寄生性原虫アピコンプレクサ類の細胞には、アピコプラストという独特な細胞内小器官が存在する。アピコプラストは内部に独自のゲノムをもち、原虫の増殖にはその発現が必須である。現在は不可能なアピコプラストゲノムの人為的操作による形質転換を可能にする新技術開発に利用するため、生活環の全ての分化ステージの細胞を得ることができる、鶏コクシジウムの発育鶏卵培養系を検討した。鶏卵にインスリンを投与すると漿尿膜の発達が亢進する傾向が見られ、投与量と接種原虫数を最適化して回収原虫数を増やすことができる可能性が示唆された。本研究には発育鶏卵を用いた鶏コクシジウムの継代培養系が必須である。発育鶏卵に接種した鶏コクシジウムの増殖は使用する鶏卵の品種や培養条件に影響されると考えられる。そこでまず発育鶏卵培養設備を立ち上げ、使用する鶏卵を選定し、その系を用いて実験を行う際の鶏コクシジウム接種のタイミングや細胞数等の検討を行った。安定して入手することができ、かつサイズが大きい、チャンキー(ブロイラー品種)の発育鶏卵に鶏コクシジウムを接種したところ、二次メロゾイトまでは順調に増殖することが確認された。培養を続けると次世代オーシストが得られるが継代培養するのに十分な細胞数を得るのは容易ではなく、形質転換体作成に利用することができる鶏コクシジウムの発育鶏卵培養系を実現するにはさらなる条件検討が必要であることがわかった。年度内に異動した先で発育鶏卵を利用した実験が認可されるまでに時間がかかり、継代培養に十分な数の次世代オーシストを得ることができる条件の検討および形質転換諸条件の検討は次年度に持ち越しとはなったが、細胞のサイズや形状から考えて最も形質転換に向いていると予想される二次メロゾイト期やそれまでの分化ステージの鶏コクシジウムは、感染ニワトリ成体を飼育しその盲腸を集めそこから外科手術的に回収する通常の手段を用いなくても、発育鶏卵培養系によって安定して得られることを確認できた。ヒト、家畜やペット、野生動物など、様々な動物宿主に寄生する原虫、アピコンプレクサ類の細胞には、アピコプラストと呼ばれる特殊なオルガネラ(細胞内小器官)が存在し、原虫の生存に欠かせない代謝を担っている。アピコプラスト内部に存在するゲノムを操作することができれば、オルガネラの機能を詳細に調べ、マラリアなど、重要なアピコンプレクサ類感染症の予防・治療に役立つ新薬剤開発につながる知見を得るのに大いに役立つと思われる。しかし、現実にはアピコプラストゲノムの操作は難しく、成功例の報告は未だ皆無である。アピコンプレクサ類の生活環は複雑で、原虫は異なる様々なステージに分化することが知られている。一般的に難しいアピコプラストゲノムの操作も、特定の分化ステージでは可能かもしれない。鶏コクシジウムは、他のアピコンプレクサ類とは異なり、発育鶏卵培養系を用いれば通常の実験室内で生活環上のどの分化ステージの細胞をも得ることができると報告されている。そこで本課題では、鶏コクシジウムを発育鶏卵で培養し、アピコプラストゲノムの形質転換を実現可能にするのに役立つ基礎的な諸条件の検討を行った。異動したため前年度使用したニワトリの品種「チャンキー」の鶏卵の入手が難しくなり、本年度は別の品種「もみじ」を用いて実験を行った。「チャンキー」同様、二次メロゾイト期までの分化ステージの原虫は安定して得られたが、原虫の一部を実験に使用しながら培養系を維持するのに十分な数のオーシストを得ることは難しかった。原虫接種と同時にインスリンを投与すると回収オーシスト数が増大するという報告の追試を行ったところ、オーシスト数の明確な増大は確認されなかったが、漿尿膜が肥厚する傾向が見られた。今後は原虫の形質転換の改善と併せて、接種原虫数とインスリン投与量を最適化すること等で回収オーシスト数を増大させることが可能かの検討も行いたい。次世代オーシストを十分量回収することができ、安定して継代することができる、鶏コクシジウムの発育鶏卵培養の条件を検索する。その培養系を使って得た鶏コクシジウムにエレクトロポレーション法でDNAを導入し、アピコプラストゲノムおよび核ゲノムそれぞれの安定した形質転換体が得られるかを調べる。さらに可能であれば、発育鶏卵組織から単離しない原虫にin ovoエレクトロポレーション法や遺伝子銃法などで直接DNAを導入する方法も検討したい。寄生虫学・分子生物学・進化学年度内に異動し、異動先で発育鶏卵を利用する実験の計画および施設の認可に時間がかかったため、年度内に計画していた実験の一部を実施することができなかった。
ショウジョウバエにおける体細胞性生殖巣原基の分化およびニッチ形成の分子基盤の解明

幹細胞は、生体内において未分化状態を保ちながら増殖を続け、組織のもとになる細胞を供給することのできる特殊な細胞である。幹細胞を、失われた組織の修復などの医療分野へ応用するためには、幹細胞の維持と分化を自由にコントロールすることが必要である。本研究では、ショウジョウバエの生殖巣をモデルとし、生殖幹細胞を制御する微小環境(ニッチ)形成の分子基盤を解明することを目的としている。このような目的を達成する第一段階として、生殖幹細胞ニッチの原基細胞である体細胞性生殖巣原基を単離し、発現している遺伝子の同定を行っている。平成21年においては、以下の2つの解析を行った。1)ショウジョウバエ胚からのlateral mesoderm細胞の単離:LateralmesodermでGFPマーカーを発現する胚から、セルソーターを用いてGFP陽性細胞を単離する条件を決定した。単離された細胞における遺伝子発現を定量的PCRにより解析し、lateral mesodermが濃縮されていることを確認した。2)体細胞性生殖巣原基の単離:正常胚ではごく少数の細胞が体細胞性生殖巣原基に分化する。また、特異的なマーカーが存在しないため、体細胞性生殖巣原基を単離することは非常に困難である。このような問題を解決するために、lateral mesoderm全体が体細胞性生殖巣原基に分化転換する突然変異系統を使用する。現在、このような突然変異系統に、細胞単離のためのマーカーを導入した系統を作成中である。今後、この系統から体細胞性生殖巣原基を前述の方法により単離し、マイクロアレイにより発現している遺伝子を同定する予定である。平成20年においては、以下の2つの解析を行った。1)ショウジョウバエ胚からのlateral mesoderm細胞の単離:申請者が作成した中胚葉でGFPマーカーを発現する胚から、セルソーターを用いて中胚葉細胞を単離するための条件を決定した。さらに、これらの細胞から、体細胞性生殖巣原基を生じるlateral mesodermを単離するために、GFPの発現量を指標としたいくつかの細胞分画を単離した。次に、各分画におけるlateral mesodermマーカーの発現を調べることにより、lateral mesodermを多く含む分画を同定した。2)体細胞性生殖巣原基の単離:体細胞性生殖巣原基は、正常胚では細胞数が限られている。このような問題を解決するために、遺伝学的手法を用いて、lateral mesoderm全体を体細胞性生殖巣原基に分化転換させるような系統の作成を現在行っている。体細胞性生殖巣原基に分化転換したlateral mesoder mを1)で確立された方法により単離し、マイクロアレイ解析を行う予定である。