hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
複雑時空パターンの数理解析

1次元Gray-Scottモデルの自己複製パターンに対してはその力学系的構造を大域分岐構造の観点から明らかにすることにより、自己複製ダイナミクスを駆動する骨格構造が明らかとなり、厳密理論を展開すべき枠組も露わになった。2次元問題に対しては軸対称解に限定した空間でAUTOによりその大域構造を調べた結果、1次元と異なり、極限点の手前で軸対称解は不安定化し、その複製過程は単純でない。しかしここで開発された方法は有用であり、非線形楕円型方程式論とも密接に関連し、今後の発展が期待される。2.カオス的挙動をする1次元パルス弱く拡散結合された離散反応拡散モデルに存在するカオス的パルス解に対してそれが生成される機構を分岐理論的に明らかにした。まずこのカオス的振舞は遷移的なものであり、実際極めて長い時間の後、それは分裂した2パルス解に収束する。2パルス解が存在することばAUTOの追跡により確認された。このカオス的パルス解はパラメータ空間で見て、2種類の周期解進行波型と振幅上下型)の存在が消滅するところから発生していることも確かめられた。これはトーラスの崩壊がカオス的パルス解の生成に関与していることを強く示唆するが、その詳細は今後の課題として残っている。3.カオス的遍歴とミルナーアトラクター現象としてのカオス的遍歴の数学的機構を理解するために、ミニマルモデルを作った。ミルナーアトラクターを唯一のアトラクターとして有する回転子モデルを3個結合させることで、ミルナーアトラクター間をカオス的に遍歴する現象をみいだした。種々の統計量の計算を行ない、この遍軽現象の特徴付けを行なった。ミルナーアトラクター近傍のトポロジセルな性質は今後の課題である。1.非局所項をもつ変分問題と多谷構造複雑かつ多様なパターンを生み出す原因の一つはGlobal minimizerのみならず、非常に多数のLocal minimizerが共存することにある。ブロックコポリマー系においてはその長い鎖を通しての長距離相互作用が非局所項をもたらし、それが非常に多様なポリマー形状を生み出すことが知られている。1次元においてこれに対応する変分問題が特異極限において無限個のLocal minimizerをもつことが厳密に証明された。ここにおける手法はTuring patternを含むより一般の系への拡張が可能でると考えられる。2.複合特異点の開折による複雑時空パターンの出現Bogdanov-Takens-Turingという極めて高い縮退度をもつ特異点の開折により極めて多様な動的パターンが生成されることが数値シミュレーションにより判明した。それは(i)自己複製パターン(ii)2次元における生成と崩壊パターン(iii)カオス的に振舞うパルスなどが含まれる。3.雲のモデリングと数値シミュレーションCML法による雲のモデリングを行い、それにより境界条件等を変えることにより雲形態の相図を得た。これにより低温低湿では層状雲が現れ、高温多湿では積状雲が現れることが判明した。より簡単なminimal modelを構成するための情報もこれから得られる可能性がある。
ナノ構造体を利用した構造を保持した状態でのタンパク質の分離分析法の開発

タンパク質を始めとしたナノメートルサイズの物質は、構造や状態の微細な違いで物性や作用が異なる。そこで本研究は、分離場をナノマテリアルの分離に適合するように精密に設計し、その評価を行った。本研究で、微量な送液が可能なHPLCシステムを構築し、さらに表面状態や大きさによるナノマテリアルの分離に成功した。電気二重層や流体力学の効果が分離カラムの内径を細くすることで顕著になると予想したので、内径の細いカラムを用いたHPLCシステムの構築を目指した。内径が細いカラムでは、カラム体積が小さいので、移動相の流速や試料の注入体積を少なくする必要がある。そこでまず、内径25マイクロメートルのカラムを用いて50nLのヘモグロビン溶液を注入した結果、2本のピークに分離して検出された。2本のピークは、他のタンパク質や低分子化合物を注入した際にも検出され、さらに2本のピーク間の体積差は試料物質には依存せず、オートサンプラーのループ体積に相関していた。以上のことから、オートサンプラーで微量体積を注入すると、ループ部位で試料プラグが2つに分離していると考えた。一般的なHPLC用のカラム(内径4.6 mm)と比較して、内径25マイクロメートルのカラムは、断面積が約3万分の1になっているので、移動相の線速度を変化させないためには、数10nL/分の送液が必要になる。このような少ない流量で安定した送液を実現するために、スプリットを利用することにした。ポンプの流速、廃液側の抵抗を調節することで、移動相を低流速で安定に送液できるようになった。またスプリットの利用によって、注入した試料体積が100分の1程度に減少するため、微量体積の試料を注入する必要が無くなり、上記の試料プラグが2つに分断する問題も克服できた。次に、数10ナノメートルの細孔を有するモノリス型カラムを用いて電気二重層及び流体力学の効果を検証した。試料には、大きさや表面電荷を調節することが可能なナノ粒子を用いた。粒子径と表面電荷を変化させたナノ粒子を分析した結果、大きさに基づく分離は確認されたものの、表面電荷の違いによる分離は確認できなかった。したがってナノ粒子の分離の場合は、電気二重層の効果よりは、流体の効果によって分離が行われていると考えられる。まず始めに、タンパク質等をより分離するために長い細管を用いたキャピラリーLCシステムを構築した。そして本システムにオートサンプラーを用いて微量試料(150nL以下)を注入した際に、一つの化合物が2つのピークに分かれて検出されることを見出した。この原因は注入した試料やカラムや検出器によるものではなく、オートサンプラーの試料溶液の吸引法によるものであった。オートサンプラーが、試料溶液を注射筒に満たし、6方バルブを利用して指定した体積を測りとる際に、その量が微量であると試料の拡散の影響が無視できず、2本の分かれたピークとしてカラムに導入されていた。その結果、検出部でも2本のピークとして検出された。2本目のピークは、マニュアルインジャクターを用いるか、サンプル量を増やすことで消失した。実際に、構築したシステムでカラム長が分離に与える影響について調べた。その結果、カラム長が9mの時は非常にブロードなピークとして検出されていたのに対し、カラム長を60mにすることで、非常に鋭いピークとして溶出し、検出されることが分かった。ピーク幅が、物質の拡散速度から計算されるピークの拡がりの理論値とほぼ一致したことから、物質は理想的な状態で60mのカラム内を移動していることが示唆された。本システムでは、各物質が非常に鋭いピークとして溶出するため、溶出時間に僅かな違いが生じれば、分離することが可能であった。したがって、より多くの物質の分離への応用が期待される。ナノマテリアルの場合は、特に比表面積が大きく、表面状態が物性に大きな影響を与えることから、表面状態に基づいた分離精製法は重要である。そこで本研究では、分離場をナノマテリアルの分離に適合するように精密に設計し、その評価を行った。まず始めに、微量な送液が可能なHPLCシステムを構築し、分析に必要な試料量を大幅に削減することに成功した。特に、試料量が微量な時には、試料導入に用いるオートサンプラーの利用に注意が必要であった。ナノマテリアルを分析するために、アルコキシシランの重合反応によって調製されるシリカ製モノリス構造を利用した。調製条件を変化させることで、貫通孔や微細孔の大きさやカラム長を変化せたモノリスカラムを調製に、その分離能を評価した。その結果、微細孔はナノマテリアルの分離にあまり影響を与えず、主に試料中に存在する低分子化合物の分離に大きな影響を与えることが分かった。貫通孔や表面官能基を調節することで、表面状態や大きさの違いでナノマテリアルを分離することに成功した。そしてナノ粒子の表面修飾や表面へのタンパク質の吸着によって、ナノ粒子の溶出時間が変化することが分かった。さらに本手法は、ナノマテリアルの緩和な条件での迅速な精製法としても利用可能であった。したがって、開発した分析法は今後需要が拡大すると予想されているナノマテリアルの品質や安全性の評価や精製法として利用できると期待される。

そこで本研究は、分離場をナノマテリアルの分離に適合するように精密に設計し、その評価を行った。本研究で、微量な送液が可能なHPLCシステムを構築し、さらに表面状態や大きさによるナノマテリアルの分離に成功した。高分離が期待される内径の細いカラムで分離するために、試料の注入量を減らした結果、検出されるピークが2本に分離されるという予想外の知見が得られ、その原因を明らかにする検討を行ったため。分析化学構築したシステムでタンパク質等の分離を試みる。これまでの検討により、内径25マイクロメートルのフューズドシリカキャピラリーを分離カラムに用いたHPLCシステムの構築に成功した。スプリットを用いることで、低流速で安定した送液に成功した。構築したシステムを用いて、移動相として燐酸緩衝液を用いることでタンパク質の分離を試みている。平成26年8月、長さ60m、内径25mmのカラムという、比較的大きな空間内でもナノ構造体が形成されていることを示唆する予想外の知見が得られたため、計画を変更してカラム内の物質の拡散速度に関して検討を行うこととしため、未使用額が生じた。計画に従って、構築したシステムを用いて機能を維持した状態でタンパク質を分離する手法を開発する。このため、同カラム内でのタンパク質の分離挙動について次年度以降に行うこととし、未使用額はその経費に充てることにしたい。細い内径のカラムを用いたHPLC装置の構築が予定より早く構築できたため、検討に必要な試薬の量を削減できたため、検討に要する費用が少なくなった。多数のタンパク質試料を用いて検討することで、開発した手法の有効性を実証する。
新規DSE―植物共生系を利用した環境保全型植物生産システムの構築

根部エンドファイトと相互作用の関係にあるバクテリアの役割解明一般に菌類の生育に不適である低酸素環境での生育試験にエンドファイト14菌株を供試し、嫌気(0.1%O_2)、微好気(8%O_2)および好気条件で培養した。9菌株が微好気環境下で生育可能であった。この中で特にVeronaeopsis simplexの生育が良好であった。また、この選抜されたV.simplexは、一般的な菌類が生育出来ない高温条件(37°C)でも生育が可能であり、さらに宿主の生育促進効果も認められた。以上より、同エンドファイトの諸形質にバクテリアが影響を与えていることが推察された。そこで、Terminal-restriction fragment length polymorphism(T-RFLP)法によりこれらバクテリアの種構成を求めたところ、Pseudomonas属細菌やDelftia属細菌など複数種の存在が認められた。そこで、van Tieghm法により菌糸外部に存在するバクテリアを取り除いたところ、高温耐性および生育促進効果が低減した。次に、生育促進効果のメカニズムを検討したところ、van Tieghm法処理前のV.simplexに植物ホルモンであるIAA産生が確認された。このIAA産生もvan Tieghm法処理により減少した。一方、外部に認められたPseudomonas属細菌などからは、van Tieghm法処理前のV.simplexとほぼ同等のIAA産生が確認された。本研究では、サンプル採取地を西南地域(屋久島)に設定し、西南地域より分離されるDSEの生態解明や新規菌類を得ることを目的とした。全体で土壌を13サンプル(森林5箇所、砂地等を4箇所)採取した。そのサンプルを用いてハクサイ、ナスを約30日間温室内で育苗した。育苗後、植物の根を採取し、0.005%Tween20で洗浄した。その根を1/2CM培地(Cornmeal, Agar)上に乗せて培養し、コロニーが伸びてきたものを1/2CMMY培地(Cornmeal, Molts extract, East extract.Agar)に移植して菌株を確立した。分離した菌株をコロニーの形態によってグループ分けを行い、各グループより代表菌株を選出し、各グループより代表菌株を選出し、次の実験を行った。・分離菌株の病原性試験OM培地(Oatmeal,NaNO_3,KH_2PO_4,MgSO_4・7H_2O)で菌株を培養し、その上に無菌的に発芽させたハクサイ苗を直にのせ、滅菌したポット内で約2週間育苗した。外観により、葉茎の色や大きさ等にて病害の有無を判定した。・同定について顕微鏡下での形態観察および分子生物学的手法(rDNAのITS領域シーケンスデータの相同性)にて選抜した菌株の同定を行った。その結果、Cryptosporiopsis属菌が15菌株分離され、その他DSEとして最も報告例の認められるPhialocephala fortiniiも数菌株分離された。DSE-バクテリア共生体の網羅的な解析新たに分離し、特性評価で選抜されたエンドファイト種Heteroconiumchaetospira, Cadophora finlandica, Meliniomyces variabilis, Phialocephara fortinii, Helminthosporium velutinum, Veronaeopsis simplex等を供試して、蛍光顕微鏡および透過型電子顕微鏡による形態観察の他、低酸素環境下での生育調査を行った。各菌株をそれぞれポテトデキストロースアガー(PDA)培地に移植した後、嫌気条件(0.1%>O_2)、微好気条件(8%O_2)および好気条件下で2週間培養した後、コロニー長径を測定した。その結果、微好気条件下においてP.fortiniiおよびV.simplexをふくむ6菌株の生育が確認された。しかし、嫌気条件下では供試菌株全てで生育が確認されなかった。この結果に基づき、1)エンドトキシン(グラム陰性細菌の細胞膜成分)を用いた糸状菌内生細菌の検出、および2)PCR法による糸状菌内生バクテリアの16SrRNA遺伝子の検出により菌類に内生するバクテリアの存在の有無を確認したところ、微好気条件で生育出来なかった菌株のみエンドトキシンが検出限界以下であった。さらに、バクテリア特異的プライマーによりPCR増幅されたことによって内生バクテリアの存在が確認されたのは、V.simplexであった。

次に、生育促進効果のメカニズムを検討したところ、van Tieghm法処理前のV.simplexに植物ホルモンであるIAA産生が確認された。このIAA産生もvan Tieghm法処理により減少した。一方、外部に認められたPseudomonas属細菌などからは、van Tieghm法処理前のV.simplexとほぼ同等のIAA産生が確認された。
場の量子論における位相幾何学的側面

場の量子論の位相幾何学的側面を二つの方向から研究した。一つは高次元空間に埋め込まれた曲がった空間上の量子力学を展開し、その空間上に出現するゲージ構造(一般に非アーベル的な)の研究である。今一つは、場の理論の位相的非自明解であるカイラルソリトンの研究である。多様体上の量子力学に関しては、1次元ながら任意の曲がった空間、即ち任意の閉曲線上の量子力学を展開した。また、議論を2n次元球面にまで一般化して、そのゲージ構造が、非アーベル的ゲージ場理論の自己双対解であるところのモノポール解やインスタントン解であることを示した。これは、有限次元の量子力学から無限次元の場の理論へ議論を拡張することによって、ゲージ場の起源を追求するための手がかりになる。(3+1)次元時空におけるカイラルソリトンの研究では、QCDにおける(1/N)展開によるバリオンの性質に関していくつかの面白い結果を得た。その一つはN=無限大におけるカイラルソリトンの描像がどのようにしてN=3のモデルにつながっているかのを調べるためF/DのN一依存性を計算したことである。これにより(3+1)次元時空のカイラルソリトンとしてのバリオンについて、その描像がかなりはっきりしてきた。次の目標は(1/N)の高次の展開である。それによって有限のNにおけるバリオンがどのような群で記述されているかが分かるはずである。本年度は当該研究の2年目になるが、場の量子論の位相幾何学的側面の研究においては、任意のD次元の球面上で量子化した場合に現れるゲージ構造を研究した。Dが偶数の時は自明でないトポロジーを反映して、ゲージ・ポテンシャルはBPSTインスタントンになり、トポロジーは自明であるが、D>1の奇数の時も類似のゲージ・ポテンシャルになることを示した。論文にすでにまとめ投稿中である。カイラルソリトンに関する研究においては、クォーク模型との関連を明らかにする方向での研究の前進があった。クォークの強い相互作用を記述する基本理論は量子色力学であるが、この量子色力学に基づいてクォークから重粒子をどのように構成するかは、低エネルギーにおける量子色力学の非摂動的効果が重要になるため、直接量子色力学を解くことはできない。そこで、量子色力学のカラー自由度Ncは現実には3であるが、これを十分大きいとして、1/Ncを展開パラメーターとする方法によって、低エネルギーの有効理論を探るアプローチがなされてきた。ところで、最近、量子色力学における1/Nc展開法に基づいて、重粒子の頂点に関する整合性条件がえられ、これによって、量子色力学の低エネルギーにおける模型によらない比較検討法が新しく開発された。そこで、研究代表者と分担者は大学院性である高村明氏と共同して、カイラルソリトン模型と非相対論的クォーク模型の両方について、重粒子のスピン-フリップ頂点のF/D比を任意のNcについて求めることに成功し、これを論文としてまとめた。この仕事は高村氏によって学会発表を行い、また論文としてProgress of Theoretical Physics誌に掲載されることが決まっている。現在、重粒子のスピン-フリップ頂点についても研究をすすめている。我々は場の量子論の位相幾何学的側面を二つの方向から研究した。多様体上の量子力学の研究とカイラルソリトンの研究である。多様体上の量子力学の研究では、議論を2n次元球面にまで一般化して、これが一般化されたBPSTインスタントンのゲージ構造を持つことを示した。このことは、場の理論のself dualな解が、多様体上の量子力学から簡単に導けることを意味すると同時に、多様体上の量子力学が持つゲージ構造から、場の理論におけるゲージ場の起源を探る手がかりを与えるものである。(3+1)次元時空におけるカイラルソリトンの研究ではQCDにおける(1+N)展開によるバリオンの性質に関していくつかの面白い結果を得た。その一つはN=無限大におけるカイラルソリトンの描像がどのようにしてN=3のさまざまなモデルにつながっているかを調べるためF/DのN一依存性を計算したことである。これにより(3+1)次元時空のカイラルソリトンとしてのバイオリンについて、その描像がかなりはっきりしてきたと言うことが出来る。

また、このF/Dを用いて質量や磁気モーメントのN-依存性に関するいくつかの規則性を導き出すことが出来た。これらの結果を実験値と比較するのが次の目標である。又(1/N)の高次の項を求めることによって有限のNにおけるバリオンがどのような群で記述されているかを追求したい。
脳におけるischemic preconditioningに関する研究

胎生16日のラットから大脳皮質を取り出し、neuronの初代培養を行った。IP24時間後のneuronの初代培養からmRNAを抽出し、RT-PCR法を用いてGAPDH、HSP70のmRNAの変化を対照群と比較することによって、IPが確立されていることを証明した。またLDH測定法により、IPによるneuron死が認められないことも確認した。さらに180分間のOGDを負荷し、細胞外デルタミン酸濃度測定とLDH測定法および細胞生存試験によるneuron死測定を行い、IPの効果を確認した。
喉頭癌における細胞周期関連因子の病理学的研究

我々はこれまで、喉頭扁平上皮癌において組織学的悪性度が高い症例、および腫瘍の進展が高度な症例に、癌抑制遺伝子産物の一つであるRbタンパク(pRb)の発現消失が高率に認められ、またpRb発現消失例では再発率が高く再発予測因子になり得る可能性があることを明らかにしてきた。臨床的に、頭頚部早期癌、特に舌癌において、頚部リンパ節転移の有無が予後を大きく左右する重要な因子であり、転移の予知因子の解明が必要である。早期舌癌において、治療前には認められない頚部リンパ節転移が臨床経過中に出現する、いわゆる遅発性頚部リンパ節転移の発生頻度は30%前後と高率である。そこで、手術切除標本を用いて病理組織学的検討を行い、原発巣と遅発性リンパ節転移との関係について検討した。腫瘍側因子として、角化、核異型、Ki-67labelling indexを、宿主側因子としては腫瘍の浸潤様式、浸潤深度、およびtype IV collagenの発現様式を検討した。その結果、組織学的悪性度と遅発性リンパ節転移の間に相関関係が得られた。また、癌の浸潤様式および浸潤の深さが悪性度を最もよく反映していると考えられた。Ki-67、type IV collagenの免疫染色も予後を予測する上で有用であると考えられた。これらは治療法選択や予後の推測にあたっては重要視すべき事項であると考えられた。今後、pRbも含め癌抑制遺伝子についても検討が必要であると思われる。
造血幹細胞を維持する微小環境（ニッチ）の形成と作用の分子機構の解明

(A-2)CAR細胞の形成に必須の新規分子の同定。CAR細胞の形成に重要な新規の分子(Foxc1の発現を誘導する分子を含む)を同定するために、Prx1-Cre/Foxc1 flox/floxマウスの新生児期のCAR前駆細胞と野生型マウスの骨芽細胞を分離し、遺伝子発現量をマイクロアレイと次世代シークエンサーにより比較した。(B)CAR細胞の細胞突起が作るネットワークの役割の解明。CAR細胞は、カドヘリンファミリー分子のうち、N-カドヘリンとカドヘリン-11を高発現する。そこで、カドヘリン-11欠損マウスとN-カドヘリンflox/floxマウスの作製を進めた。(C)CAR細胞の未分化性の維持と、骨芽細胞や脂肪細胞への分化の調節機構の解明。Wntファミリー分子に注目し、そのシグナル伝達に必須のβ-カテニン遺伝子を成体のCAR細胞特異的に欠損するマウスと、骨芽細胞特異的に欠損するマウスの作製を進めた。また、Wnt4または、Wnt5aとWnt5bの両方をCAR細胞または骨芽細胞で欠損するマウスの作製を進めた。(D)主な共同研究。小野らと、胎生期でのCAR細胞の起源の一つとして胎生期のPTHrP陽性軟骨幹細胞を同定した。また、Bhatiaらと、正常造血幹細胞の維持に必須のCXCL12が慢性骨髄性白血病のがん幹細胞の増殖を抑制することを明らかにした。発生過程でCAR細胞が形成される分子機構、CAR細胞の細胞突起のネットワークの役割と作用機構、CAR細胞の大部分で未分化性が維持されて一部が骨芽細胞や脂肪細胞に分化する分子機構の解明に向けて、順調に遺伝子検索、遺伝子変異マウスの作製、入手が進んでいる。引き続き、CAR細胞におけるカドヘリンの役割を検討するため、カドヘリン-11欠損マウスとN-カドヘリンのfloxマウスを作製する。骨と骨髄の全ての非血球細胞分画の詳細な解析より、他のカドヘリンの発現はほとんど認められなかったため、これらのマウスの解析のあと、α-カテニンflox/floxマウスの入手を検討したい。引き続き、Wntファミリー分子に注目し、β-カテニン遺伝子を成体のCAR細胞特異的に欠損するマウスと骨芽細胞特異的に欠損するマウス(Col1a2.3-Creマウスと交配)を作製する。また、Wnt4または、Wnt5aとWnt5bの両方をCAR細胞または骨芽細胞で欠損するマウスを作製する。(D)主な共同研究。
薬毒物の作用機序の解析に有用な新しい質量分析法

覚醒剤をはじめとする乱用薬物は、神経系のドーパミンレセプター等の受容体に作用し、下流の情報伝達系に作用すると考えられており、種々のタンパクがリン酸化等の修飾を受けると考えられている。また、リンやヒ素のような無機薬毒物は、タンパクのSH基に結合して毒性を発揮すると考えられている。これら修飾タンパクの解析に関し、多くの方法が提案されている。しかし、細胞内情報伝達機構の解析には、超微量の生体高分子を検出・同定する必要があり、従来法では対応できない可能性がある。従って薬毒物の作用機序をプロテオミクスから明らかにする場合、例えば従来のエレクトロスプレー(ESI)法よりイオン化効率が高く、よりソフトなイオン化法が望まれ、本研究においては、レーザースプレー法による修飾ペプチド等の高感度分析を試みている。昨年度より問題となっていた、レーザーシステムの問題については、日本電子と共同して、新たにスプレーヤーを改造し、レーザー光路を延長して、CCDカメラによるモニターを行うことにより、キャピラリーへのレーザー照射がより容易になった。改造したシステムでは、レーザーによるイオン強度は、従来のシステムよりより安定していた。このシステムを用いてリン酸化ペプチドの検出を試みたところ、従来のESI法の3ないし4倍程度の感度の上昇が得られた。また、特記すべきことは、レーザースプレーの場合多価イオンだけでなく、1価イオンも検出することが出来、その原因としてはS/N比の上昇が可能性として考えられる。条件の最適化を行えば、修飾ペプチドをさらに高感度に検出することが期待される。今回の改造で、レーザースプレーシステムがかなり安定になったため、今後は多の修飾ペプチドの検出及び、昨年度に予備実験を行った、プロピオン酸系の消炎鎮痛剤の高感度分析法がほぼ完成し、これら高感度検出法は、法医学領域及び生物学領域において応用可能であることが示された。これら修飾タンパクの解析に関し、多くの方法が応用されている。しかし、近年は超微量の目的分子を検出することが求められて、従来の方法では対応しきれなくなっているのが現状である。しかし、薬毒物の作用機序をプロテオミクスから明らかにする場合、従来法よりイオン化効率が高く、よりソフトなイオン化法を用いた新しい質量分析法の開発が望まれるが、現在、ESI及びMALDIを越えるイオン化法はまだなく、発想の転換が求められている。今回我々は修飾ペプチド解析のための新しい方法論の開発を目指したい。まず、我々は、レーザースプレー-飛行時間型(LS-TOF)質量分析計(MS)を用いて、リン酸化ペプチドの高感度検出及び定量法の確立を試みる。その際、モデルとして、チロシン水酸化酵素(TH)のN末端部分のペプチドを用いる予定である。その理由としては、当酵素がカテコールアミン系の律速段階の酵素であり、覚醒剤やコカイン等の乱用薬物の影響を受けやすいこと、かつN末端にリン酸化部位が多数あり、複数個のリン酸化修飾の解析モデルとして有効であると考えられることが挙げられる。THのリン酸化部位は、主に19,31,40番目のセリン残基であると考えられている。まず、19番目のセリン残基を含む20mer程度のペプチドを合成し、リン酸化ペプチドと非リン酸化ペプチドについてLC上での分離条件の検討を行い、次いでLC-TOF-MSによるイオン化効率を検討する。このとき、レーザーの出力、移動相の検討と共に、正・負イオンの両モードで検討し、最適なイオン化効率を検討する。従って薬毒物の作用機序をプロテオミクスから明らかにする場合、例えば従来のエレクトロスプレー(ESI)法よりイオン化効率が高く、よりソフトなイオン化法が望まれる。今回、我々はレーザースプレー等の方法を用いて、修飾ペプチド解析のための新しい方法の開発を試みた。本年度は、昨年に引き続いてリン酸化ペプチドの高感度分析を試みたが、インフュージョンモードでは高感度が得られるものの、感度のばらつきが大きく、オンラインで目的ペプチドが溶出された際に、同様な高感度が得られるか疑問であった。この問題点を解決するために、我々はレーザー光路の延長及びCCDカメラによるモニターにより、問題点を解決することを試みている。実際、改良が施された山梨大学のレーザースプレーシステムにおいては、プロピオン酸系の消炎鎮痛剤が、負イオンモードにおいて、ESI法の10倍から50倍程度の高感度が得られた。

また、リンやヒ素のような無機薬毒物は、タンパクのSH基に結合して毒性を発揮すると考えられている。これら修飾タンパクの解析に関し、多くの方法が提案されている。しかし、細胞内情報伝達機構の解析には、超微量の生体高分子を検出・同定する必要があり、従来法では対応できない可能性がある。従って薬毒物の作用機序をプロテオミクスから明らかにする場合、例えば従来のエレクトロスプレー(ESI)法よりイオン化効率が高く、よりソフトなイオン化法が望まれ、本研究においては、レーザースプレー法による修飾ペプチド等の高感度分析を試みている。昨年度より問題となっていた、レーザーシステムの問題については、日本電子と共同して、新たにスプレーヤーを改造し、レーザー光路を延長して、CCDカメラによるモニターを行うことにより、キャピラリーへのレーザー照射がより容易になった。改造したシステムでは、レーザーによるイオン強度は、従来のシステムよりより安定していた。このシステムを用いてリン酸化ペプチドの検出を試みたところ、従来のESI法の3ないし4倍程度の感度の上昇が得られた。また、特記すべきことは、レーザースプレーの場合多価イオンだけでなく、1価イオンも検出することが出来、その原因としてはS/N比の上昇が可能性として考えられる。条件の最適化を行えば、修飾ペプチドをさらに高感度に検出することが期待される。今回の改造で、レーザースプレーシステムがかなり安定になったため、今後は多の修飾ペプチドの検出及び、昨年度に予備実験を行った、プロピオン酸系の消炎鎮痛剤の高感度分析法がほぼ完成し、これら高感度検出法は、法医学領域及び生物学領域において応用可能であることが示された。
誘発耳音響放射の他覚的聴力検査への応用に関する研究

蝸牛内微小機械系の振動に基因すると考えられる誘発耳音響放射(OAE)を各種の感音難聴をもつ耳から記録し、その最良周波数、潜時、見かけの閾値、入出力の関係、反応の持続性などについて検討した。OAEの測定には所有の発振器、減衰器、濾波器およびシグナルプロセッサを用いた。外耳道に挿入した音響プローブには2連のプラスチック管のそれぞれにサブマイナーイヤホンとミニアチュアマイクロホンを結合し、純音バースト刺激後20ミリ秒の音響現象の記録を行った。刺激音の較正ならびにOAEの正確な音圧の測定に今回補助金を受けた音響測定装置(BCK、4170、2610A)を使用した。研究成果は次の通りである。1)正常な聴力をもつ106耳において、1.0kHzから1.4kHzに最良周波数をもつOAEが認められ、刺激開始後20msの間にOAEの2つの成分が識別できた。速い成分の平均潜時は9.4msであり、平均の見かけの閾値は10.3dBnHLであった。遅い成分は潜時13.6ms、閾値は3.8dBnHLであった。遅い成分の入出力曲線の勾配はより緩やかであった。2)一側性高度感音難聴のOAEの見かけの閾値は内耳奇形やムンプス難聴などの内耳障害で有意に上昇しており、心因性難聴や一部の小脳橋角部腫瘍では、閾値は正常耳の範囲内にあった。3)突発性難聴260耳で純音聴力域値とOAEの見かけの閾値が両耳差で比較された。両者の間には統計的に有意な相関がみられ、相関係数は0.72であった。4) OAEの速い成分の発現率は正常聴力耳で72.6%であったが突発性難聴耳では聴力域値の上昇にしたがい低下し、高度難聴で消失した。5) OAEは蝸牛機能の他覚的検査として十分役立つ指標である。特にその潜時が14ms近辺の遅い成分は、外毛細胞機能に連係した代謝依存性の微小機械系振動をより敏感に示す指標として有用である。
高齢化社会に対応した消臭機能オムツ素材の開発

消臭機能を持つ,高機能オムツ素材の開発に関する基礎的な研究を行った.オムツ素材モデル物質としてポリビニルアルコール(PVA)を選び,膜状と円柱状のヒドロゲルを調製した.ゲル膜を用いて単純な塩の収着挙動を調べ,膜中水の状態との関係を考察した.また,綿布を直接染料と銅塩を用いて媒染染色し,その消臭特性を速度論的に調べた.また,消臭機能をゲル材料に付与するための基礎となる,銅塩とPVAとの相互作用を,銅塩水溶液中でのゲル膨潤挙動の観察より検討した.本年度は,「吸水にともなうゲル膨潤を溶液に含まれる塩の種類,濃度などを変えて測定し,ゲルの膨潤特性を詳細に調べること」,「示差走査熱量(DSC)分析も引き続き行い,ゲル中の水とゲルの網目構造に着目して考察を進めること」,「調製したゲルから適切なものをいくつか選択し,その系に対して,遷移金属塩と染料などの収着性を測定すること」,「遷移金属や含金属染料で処理したゲルに対して,気相中での消臭特性を検知管法およびガスクロマトグラフ法で調べること」などを,研究実施計画として設定していた.以下にこれらの研究実績について述べる.1.ポリビニルアルコール(PVA)ゲルに対して,酢酸銅水溶液中における膨潤挙動を観察した.溶液は,塩酸と水酸化ナトリウム,または,緩衝溶液を用いてpHを調製した.PVAゲルは酢酸銅溶液中で収縮する場合が観察された.しかし,pHが約5.6よりも小さく,かつ,酢酸イオン濃度が高い場合には,収縮が見られなかった.結果より,銅イオンとPVA鎖間の架橋がゲルの収縮に関係するのではないかと推察した.2.膜中水の凍結融解過程のDSCによる観察を行い,昨年度に引き続き,ゲルの自由水分率について検討を行った.3.PVAゲルの直接染料コンゴーレッド(CR)の収着量の測定法を再検討し,PVAゲルのCR収着量を求め,ゲルの膨潤との関係について検討を進めた.CR収着量が多いほどゲルが膨潤するとは限らず,CRによるPVA鎖の架橋なども考えられた.4.上述の1と3の研究実績よりPVAゲルと銅塩,PVAゲルと直接染料CRとの相互作用など,ゲルに消臭機能を付与する基礎的知見が得られてきた.そこでまずは前段階として,PVAゲルではなく,綿布や羊毛布を銅塩とCRで媒染染色した布について,消臭過程を検知管法とガスクロマトグラフ法によって調べ,消臭機構について検討を開始した.消臭機能を持つ,高機能オムツ素材の開発に関する基礎的な研究を行った.オムツ素材モデル物質としてポリビニルアルコール(PVA)を選び,膜状と円柱状のヒドロゲルを調製した.ゲル膜を用いて単純な塩の収着挙動を調べ,膜中水の状態との関係を考察した.また,綿布を直接染料と銅塩を用いて媒染染色し,その消臭特性を速度論的に調べた.また,消臭機能をゲル材料に付与するための基礎となる,銅塩とPVAとの相互作用を,銅塩水溶液中でのゲル膨潤挙動の観察より検討した.本年度は,「オムツ素材モデルとして高分子ゲルを調製し,塩水溶液などに対する吸水性を測定すること」,「調製したゲルのキャラクタリゼーションとして示差走査熱量(DSC)分析を行うこと」,「ゲル材料に消臭機能付加するため,ゲルに吸着する染料の溶液などを用いて染料収着性と溶液吸収性の検討を行うこと」などを,研究実施計画として設定していた.以下にこれらの研究実績について述べる.1.放射線照射架橋により調製したポリビニルアルコール(PVA)ゲルに対して,銅,ニッケル,コバルトなどの遷移金属塩水溶液中における膨潤挙動を観察した.PVAゲルは用いた遷移金属塩の種類により,それぞれ,特徴的な膨潤度の塩濃度依存を示した.特に,銅塩溶液中では,膨潤度は塩濃度の増加に伴い極小を示した.この興味深い事実は,すでに知られているホウ酸水溶液中の挙動と類似しており,結果を銅イオンとPVAのヒドロキシ基との間の相互作用の観点から考察を行った.2.放射線架橋PVAゲルの有効架橋密度の評価とDSC測定を行った.放射線架橋ゲルの架橋密度を,ゲルの圧縮弾性率を測定し,フローリーのゲル膨潤の理論に基づいて有効架橋密度を測定した.重合度約2000のPVA試料では架橋点間分子量は約300から600となり,アミノ酸などの比較的大きな溶質が容易に透過可能な大きな網目構造を持つことが明らかになった.膜中水の凍結融解過程のDSCによる観察によりゲルの自由水分率についても検討を行った.3.PVAゲルの直接染料コンゴーレッド(CR)の収着量の測定法を検討した.PVAゲルをCR水溶液に浸せきして膨潤させ,外部溶液のCR濃度の減少から収着量を求めた.CR濃度の決定は,本助成金で購入した紫外・可視分光光度計により行った.まだ最適な測定方法は得られておらず,今後も検討を続けることにする.本年度の研究実績は以下の通りである.1.ポリビニルアルコール(PVA)ゲルに対して,酢酸銅水溶液中における膨潤挙動を検討した.銅塩溶液には,水酸化ナトリウム,または,塩化ナトリウムを添加した場合も調べた.その結果,酢酸銅(II)水溶液中におけるPVAゲルの収縮と膨潤は,PVAを配位子とするPVA-Cu錯体の生成と解離によると推察された.

2.PVA膜中水の凍結融解過程のDSCによる観察を行い,ゲルの自由水分率について検討を行った.本年度は,特に鹸化度の異なるPVAゲルを用いて,高分子基質の疎水性-親水性バランスが膜中水に与える影響を調べた.3.綿布を銅塩と直接染料コンゴーレッド(CR)で媒染染色した布について,エタンチオール消臭初期速度がラングミュア-ヒンシェルウッド(L-H)機構に従うことが,研究代表者ら研究ですでに明らかになっているが,今回は,初期段階ではなく,エタンチオールとその酸化生成物であるジエチルジスルフィドの両方を含む混合気体中で消臭過程を調べた.その結果,媒染染色布によるエタンチオールおよび混合気体の消臭はL-H型であるが,銅塩処理のみの布による消臭は酸化段階律速のL-H型ではないことが示唆された.研究期間全体の結果より,溶質と相互作用がある含水高分子ゲル系における,膨潤収縮に対応した物質収着特性の変化や吸水メカニズムが明らかになった.消臭特性に関する知見と組み合わせることにより,消臭機能を付与しつつも吸水性能を維持できる新たな高機能オムツ素材の可能性が示されたと考える.衣生活材料学本研究は,ゲル材料からなり,尿量が乳児よりも多い高齢者などに適し,かつ,消臭機能性をも付与した高機能オムツ素材の設計指針を得ること目的としている.本年度の研究実施計画に設定されていた,ゲルの膨潤特性を詳細に調べること,示差走査熱量(DSC)分析を引き続き行い,ゲル中の水とゲルの網目構造に着目して考察を進めること,調製したゲルの染料収着性を測定すること,遷移金属や含金属染料で媒染処理した布で,気相中での消臭特性を検知管法およびガスクロマトグラフ法で調べることが実施された.以上より,本研究の目的とする結果を得るための実験的手法の確立がほぼ完了し,考察を進める段階に入ったと考えられるところから,本研究はおおむね順調に進展しているといえる.本研究は,ゲル材料からなり,尿量が乳児よりも多い高齢者などに適し,かつ,消臭機能性をも付与した高機能オムツ素材の設計指針を得ること目的としている.本年度の研究実施計画に設定されていた,ゲル構成高分子と遷移金属イオンとの相互作用が関わるゲル膨潤挙動の把握,圧縮弾性率やDSCによる高分子ゲルの基本的性質の把握,そして消臭機能化にも関わる,ゲル構成高分子への染料収着量測定の検討の3点が,本年度内にすべて行われ,基礎的なデータを得ることができた.3つめの染料収着量測定については,最適な方法が見いだされてはいないが,次年度でのさらなる実験的検討で可能になると思われる.以上より,本研究の目的とする結果を得るための実験的手法の確立が,8割程度は完了したと考えられるところから,本研究はおおむね順調に進展しているといえる.平成26年度は最終年度であるが,平成24年度と25年度に得られた知見に基づき,ゲルの膨潤収縮に対応した物質収着特性の変化などを検討し,吸水メカニズムの詳細な検討を行う.その際,特にゲルとそれに含まれる水との関わりに注意する.そして,平成25年度に行った消臭特性の結果に基づき,消臭機能を付与しつつも高い吸水性能を維持できる新たな高機能オムツ素材の可能性とそれに向けての設計指針を見出し.本研究を総括する.次年度以降は,吸水にともなうゲル膨潤に関して,溶液に含まれる塩の種類,濃度,pH,温度依存などを広範に測定し,ゲルの膨潤特性を詳細に調べる.そして,示差走査熱量分析も引き続き行い,ゲル中の水とゲルの網目構造に着目して考察を進める.調製したゲルから適切なものをいくつか選択し,その系に対して,遷移金属塩と染料の収着性を測定する.遷移金属や染料で処理したゲルに対して,気相中での消臭特性を検知管法およびガスクロマトグラフ法で調べる.においモデル物質としてはエチルメルカプタンなどを用いる予定である.
二酸化炭素の還元によるグリーン燃料製造のための不均一系電極触媒の開発

二酸化炭素の化学的転換が世界的に注目を浴びている。最も広く研究されてきたのは二酸化炭素の水素化によるメタノール合成であるが、最近は、より付加価値の高いエタノール合成が注目されている。エタノールには炭素原子が2原子含まれ、二酸化炭素からどのようにしてエタノールが生成されるか全くわかっていない。我々は反応メカニズムにおいて電気化学的過程が含まれていると仮定している。本研究では高圧の二酸化炭素と水素に電解質を少量添加して触媒的にエタノールを合成することを目的にしている。本研究は2018年11月に開始し、初年度は種々の不均一系触媒を調製し二酸化炭素の水素化によるエタノール合成の研究を行った。はじめに触媒調製を行い、バッチ式反応器を用いた触媒活性試験を行った。Cu系では活性の高い触媒は見出されなかった。Pd系合金触媒を用いた実験においてわずかなエタノール生成を確認したが、コバルト系触媒においてより高活性な触媒を見出した。メタノールの副生も確認している。その一方でモデル触媒反応システム装置の試作を開始した。アノードとカソードの反応室に分けて電気化学的にエタノールが生成することを立証する装置である。このモデル触媒試験システムで活性な触媒種を探索する予定である。また、二酸化炭素の水素化によるエタノール合成に関する論文の調査を行った。多くの論文において、Cu系触媒が用いられていることを確認し、添加する電解質の種類を把握した。4か月を経過した段階で実験は順調に進展している。エタノール合成に対する活性な触媒も見出され始めている。触媒探索および反応条件最適化に関する実験を行う。特に反応温度の低温化が目的である。電気化学的反応機構によってエタノールが生成するとの仮説で研究を進める。低温でエタノールが生成すれば、電気化学的機構が立証できる。さらに、モデル触媒反応システム装置を完成させる。完成後にはアノードとカソードの反応室に分けて電気化学的にエタノールが生成することを立証する。さらに、モデル触媒試験システムで活性な触媒種を探索する。
ヘリウムからローレンシウムまでの標準原子波動関数表の作成

原子のRoothaan-Hartree-Fock(RHF)波動関数は、それ自身、原子の電子状態の解明に基本的情報を与えるだけでなく、分子や分子系の電子状態研究の基礎となっている。ヘリウム(原子番号2)からキセノン(原子番号54)までの53個の原子に対するRHF波動関数は、1974年、Clementi Roettiによって報告された。また、セシウム(原子番号55)からウラン(原子番号92)までの38個の原子に対する波動関数は、1981年、McLeanとMcLeanによって出版された。原子番号93以降の原子に対する波動関数はいまだ報告されていない。Clementi-RoettiとMcLean-McLeanの波動関数は、今日まで長い間、標準的な原子波動関数として原子分子の研究分野において幅広く国際的に利用され続けている。しかしながら、これらの波動関数には、(i)原子の正しい基底状態に対応していないものがある、(ii)開設を持つ原子で、結合定数を誤っているものがある、(iii)変分パラメータの最適化が不十分である、(iv)正確な電子状態の記述に必要な基底の大きさが検討されていない、といった数多くの問題があることも知られている。本研究の目的は、これらの問題をすべて解決し、信頼できる正しい原子波動関数表をヘリウム(原子番号2)からローレンシウム(原子番号103)までの102個の原子に対して作成する事であった。ヘリウムからキセノンまでの原子に対しては、必要な基底の大きさを検討した上で、基底関数の変分パラメータの十分な最適化を行い、改良された波動関数を作成した。これらの波動関数の全エネルギーは数値的Hartree-Fock(NHF)法のそれをほとんど再現している。しかし、波動関数の性質を詳細に調べてみると、例えば、軌道動径関数の原子核近傍での挙動(カスブ挙動)や原子核から離れた点での挙動(遠距離漸近挙動)などに正しいHartree-Fock原子軌道の振る舞いからの誤差が見られた。そこで、さらに、真のHartree-Fock原子軌道が満たすべきいくつかの性質を制約条件として、変分パラメータの最適化をやり直し、真にnear-Hartree-Fockと呼べるRHF原子波動関数の開発も行った。セシウムからローレンシウムまでの原子に対しては、正しい基底状態の検討から始め、必要な基底の大きさを決定した。McLeanとMcLeanの結果は、特に、dとfの対称性で基底が不足していることが明らかになった。パラメータの徹底した最適化により、波動関数の精度が格段に向上した。本研究で開発した一連の高精度な原子波動関数は、今後の原子・分子の電子構造の研究に基本的な情報を提供する重要な研究成果といえる。

ヘリウム(原子番号2)からキセノン(原子番号54)までの53個の原子に対するRHF波動関数は、1974年、ClementiとRoettiによって報告された。また、セシウム(原子番号55)からウラン(原子番号92)までの38個の原子に対する波動関数は、1981年、McLeanとMcLeanによって出版された。原子番号93以降の原子に対する波動関数はいまだ報告されていない。Clementi-RoettiとMcLean-McLeanの波動関数は、今日まで長い間、標準的な原子波動関数として原子分子の研究分野において幅広く国際的に利用され続けている。しかしながら、これらの波動関数には、(i)原子の正しい基底状態に対応していないものがある、(ii)開殻を持つ原子で、結合定数を誤っているものがある、(iii)変分パラメータの最適化が不十分である、(iv)正確な電子状態の記述に必要な基底の大きさが検討されていない、といった数多くの問題があることも知られている。本研究の目的は、これらの問題をすべて解決し、信頼できる正しい原子波動関数表をヘリウム(原子番号2)からローレンシウム(原子番号103)までの102個の原子に対して作成する事であった。ヘリウムからキセノンまでの原子に対しては、必要な基底の大きさを検討した上で、基底関数の変分パラメータの十分な最適化を行い、改良された波動関数を作成した。これらの波動関数の全エネルギーは数値的Hartree-Fock(NHF)法のそれをほとんど再現している。しかし、波動関数の性質を詳細に調べてみると、例えば、軌道動径関数の原子核近傍での挙動(カスプ挙動)や原子核から離れた点での挙動(遠距離漸近挙動)などに正しいHartree-Fock原子軌道の振る舞いからの誤差が見られた。そこで、さらに、真のHartree-Fock原子軌道が満たすべきいくつかの性質を制約条件として、変分パラメータの最適化をやり直し、真にnear-Hartree-Fockと呼べるRHF原子波動関数の開発も行った。セシウムからローレンシウムまでの原子に対しては、正しい基底状態の検討から始め、必要な基底の大きさを決定した。McLeanとMcLeanの結果は、特に、dとfの対称性で基底が不足していることが明らかになった。パラメータの徹底した最適化により、波動関数の精度が格段に向上した。重い原子の波動関数の開発は現在も進行中であるが、次年度には完成の見込みである。本研究で開発した一連の高精度な原子波動関数は、今後の原子・分子の電子構造の研究に基本的な情報を提供する重要な研究成果といえる。原子のRoothaan-Hartree-Fock(RHF)波動関数は、それ自身、原子の電子状態の解明に基本的情報を与えるだけでなく、分子や分子系の電子状態研究の基礎となっている。
肺癌におけるRASA1遺伝子変異の機能解析

肺癌では多数のドライバー遺伝子異常が同定され,個別化治療の拡大が試みられている.TCGAのデータセットでは、RASA1の遺伝子変異は2.2%と報告されており、1000例中1030症例程度RASA1遺伝子変異を有する症例を同定できると仮定していたが, RASA1遺伝子変異陽性の患者は同定されなかった。本検討で得られた肺腺癌のドライバー遺伝子異常情報と臨床病理学的特徴の関連を評価した.順天堂大学附属順天堂医院で切除された肺腺癌996例に対してPCR clump法によるEGFR, KRAS変異検索, NanoString nCounterによる融合遺伝子検索及びこれら解析結果陰性非喫煙者121例に対してwhole exon及びRNA sequenceを施行. WHOの基準に基づき病理組織学的検討を施行.679例(68.2%)でドライバー遺伝子異常: EGFR (46%), KRAS (12%), ERBB2 (1.6%), BRAF (1.5%), MAP2K1 (7%)遺伝子変異, MET exon14 skipping (METex14) (1.3%), ALK (2%), RET (1%), ROS1 (0.9%)融合遺伝子を同定した.これら遺伝子異常は各組織亜型に広く分布していたが, BRAF (56%), MAP2K1 (57%)陽性例は上皮内癌に多くみられた.ERBB2変異は若年者に多く, 33%の症例で微小乳頭状構造を認めた.METex14は高齢者に多く, 38%の症例でpleomorphic cellsの混在を認めた. EGFR (L858R)compound mutation陽性39例とL858R単独156例との間に組織学的差異は認めなかった.ERBB2, METex14, BRAF, MAP2K1陽性肺腺癌は各々特徴的な臨床病理像を呈していた.肺腺癌では、EGFR, KRAS, NRAS, HER2, BRAF, MAP2K1遺伝子変異の他、ALK, RET, ROS融合遺伝子が、発生・進展に直接的に重要な役割を果たすドライバー遺伝子として分子治療の標的に成り得ると報告されているが、全肺腺癌の中でドライバー遺伝子変異が占める割合は64%程度であり、未だ30%以上の肺腺癌においてドライバー遺伝子及び分子治療標的が不明である。本研究では、肺腺癌においてRASA1遺伝子変異の大部分がtruncating mutationであり、さらにEGFR, KRAS, HER2といったドライバー遺伝子変異と相互排他的な傾向を示していることから(TCGA, http://cancergenome.nih.gov)、RASA1遺伝子異常は肺癌の発生・進展に重要な役割を果たしている可能性があると考え、昨年度までに肺癌におけるRASA1遺伝子変異の機能解析を行い、以下の結果を得た。1) RASA1遺伝子ノックダウン細胞ではMEK, ERK, AKTのリン酸化が亢進する。2)RASA1タンパクは肺癌細胞株では通常発現しており、EPLC272H, RERFLCKJといったRASA1遺伝子変異を有する肺癌細胞株のみで発現が低下している。3) RASA1遺伝子変異を有するヒト肺癌細胞株では、Trametinibに感受性を示した。本年土は、本邦におけるRASA1遺伝子変異頻度同定の為、順天堂大学附属順天堂医院で切除された肺腺癌996例に対してPCR clump法によるEGFR, KRAS変異検索, NanoString nCounterによる融合遺伝子検索及びこれら解析結果陰性非喫煙者121例に対してwhole exon及びRNA sequenceを施行したが、RASA1変異陽性症例は同定されなかった。TCGAのデータセットでは、RASA1の遺伝子変異は2.2%と報告されており、約1000例の解析で1030症例程度RASA1遺伝子変異を有する症例を同定できると推定しているが、現時点でRASA1遺伝子変異陽性症例は同定されていない。本検討で得られた肺腺癌のドライバー遺伝子異常情報と臨床病理学的特徴の関連を評価した.順天堂大学附属順天堂医院で切除された肺腺癌996例に対してPCR clump法によるEGFR, KRAS変異検索, NanoString nCounterによる融合遺伝子検索及びこれら解析結果陰性非喫煙者121例に対してwhole exon及びRNA sequenceを施行. WHOの基準に基づき病理組織学的検討を施行.679例(68.2%)でドライバー遺伝子異常: EGFR (46%), KRAS (12%), ERBB2 (1.6%), BRAF (1.5%), MAP2K1 (7%)遺伝子変異, MET exon14 skipping (METex14) (1.3%), ALK (2%), RET (1%), ROS1 (0.9%)融合遺伝子を同定した.これら遺伝子異常は各組織亜型に広く分布していたが, BRAF (56%), MAP2K1 (57%)陽性例は上皮内癌に多くみられた.ERBB2変異は若年者に多く, 33%の症例で微小乳頭状構造を認めた.

METex14は高齢者に多く, 38%の症例でpleomorphic cellsの混在を認めた. EGFR (L858R)compound mutation陽性39例とL858R単独156例との間に組織学的差異は認めなかった.ERBB2, METex14, BRAF, MAP2K1陽性肺腺癌は各々特徴的な臨床病理像を呈していた.In vitroでの実験とともに、順天堂大学附属順天堂医院で手術された肺腺癌コホートにおけるドライバー遺伝子異常を網羅的に解析する。症例数は1000例を予定している。TCGAのデータセットでは、RASA1の遺伝子変異は2.2%と報告されており、1030症例程度RASA1遺伝子変異を有する症例を同定できると推定している。KRASを除くドライバー遺伝子変異の多くが非喫煙者に同定されることから、非喫煙者に対して網羅的に遺伝子解析を施行したが、RASA1遺伝子変異陽性患者はみられなかった。その為、今後は喫煙者に対して遺伝子解析対象を拡大する。また、肺癌細胞株を用いた検討ではRASA1 truncating mutationを有する細胞はタンパク発現もみられない事から、Tissue microarray及びRASA1抗体を用いた免疫染色によるスクリーニングによりRASA1 truncating mutation陽性症例の抽出を施行する。尚、KRAS同様にRas/RAF/MAP2K1シグナルにおける遺伝子の頻度は本邦と欧米で差異がある可能性を考慮して研究を進める。