hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
前近代東アジアにおける文書とその伝来に関する比較史的研究

ないし公表予定である。平成21年10月13日に開催された国際ワークショップップ「文書のかたち」は、昨年に引き続き日中韓三国の前近代の文書史科について、三国の研究者の相互理解と分析手法の開発・深化を目指して開かれたが、特に今回は、三国において文書の観察を実践している方々を招き、「文書」の形態に焦点を当てた報告を揃えた。国立扶余博物館の李鎔賢氏からは、氏自らが解読に当たった百済木簡の報告があり、形態に着目しつつ日韓を比較した議論が交わされた。韓国学中央研究院の沈泳渙氏の「高麗時代の中書門下牒の可能性」は、唐代中書門下牒の形態の特異性や元代の勅類に到るまでの変遷を踏まえ、高麗に中書門下牒というべき文書が存在したことを証した。中国社会科学院の劉暁氏の報告「元代道教公文書初探」は、石刻資料研究の最新の成果が盛り込みつつ監督官庁・道観の文書処理システムを明らかにし、北海道大学の橋本雄氏の「勘合のかたち」は、陳述史料を用いた文書形態研究のモデルを示すもので、文書の保存と活用とが形態論に及ぼす影響にまで注意が喚起された点も注目に値する。朝鮮王朝時代に置かれていた「倭館」を巡って、九州大学の岩崎義則氏から「館主日記」の伝来論についての研究報告があり、その「館主日記」を用いた紛争処理研究の一例がソウル大学校の金?廷氏より報告されるなど、当該日記を用いた研究の幅の広がりを予期させるものがあった。以上、本国際ワークショツプは、文書史料分析法の多様性が示され、それは素材とする文書残存の状況の多様性に対応するものであり、ひいてはこれまでの研究史の多様性にも拘束されることが示されたとともに、しかしながら国際的、あるいは通時代的対話が十分に可能であり、その成果も豊穣であることが予感された点において大きな成果が上がったと評価できる。この他、北部九州地域新出土木簡や韓国古代出土木簡、更には中国出土木簡の釈読研討会などを通じて、古代東アジア世界における木簡の形態の相互比較研究に取り組み、また前記三国における文書研究の文献目録については、中国の宋代以後、日本中世、朝鮮前近代の部分がほぼ揃い、最終年度における完成への目途が立つ状況となった。本年度は、本科研の最終年度に当たるため、この3年間の研究の総括と反省の上に立った国際ワークショップの開催と、前近代東アジア文書関係文献目録の作成に重点を置いた。ワークショップは「前近代東アジア公文書の比較史的研究-文書の伝来-」と題し、これまで比較的検討の薄かった伝来論を主軸に据えた報告を並べた。そのプログラムは、I劉迎勝(南京大学)「《元典章・吏部・官制・資品》考」、II伊藤幸司(山口県立大学)「朝鮮国の外交文書原本とその特徴」、III郭万平(浙江工商大学日本文化研究所)「宋代官文書的廃棄及其流向-以現存宋代公文紙印本、抄本為中心」(中島楽章代読)、IV金東哲(釜山大学)「朝鮮後期釜山倭館の東莱商人関係文書について」、V安承俊(韓国学中央研究院)「韓国古文書の知識情報化の現況と課題」であり、坂上の司会で討論され、それぞれの国による文書の残存のあり方の違いに関心が集まったが、特に中・韓においては、近代化の過程で失われたものが多いことが確認された。中国においては文革よりむしろ49年以降の土地改革の過程での地主文書の処分が大きい。
MMP活性抑制剤を配合した新規接着剤の研究

脱灰象牙質に対するMMPs活性抑制剤の影響およびセルフエッチングシステムのボンディングレジンにMMPs活性抑制剤を配合した試作ボンディング材について検討を行った。1).機械的性質への影響:脱灰象牙質にMMPs活性抑制剤を処理することで、機械的性質の向上が認められた。2).象牙質接着における影響:初期の接着試験において、1%までのタンニン酸の配合では接着性の低下は認められなかった。6か月間の水中保管では、タンニン酸を配合することで、接着性の低下が抑制された。タンニン酸・サホライドでは歯質の変色が認められるため、変色を起こさないMMPs活性抑制剤の開発が必要である。1.MMP活性抑制剤による象牙質MMP活性への影響:フッ化ジアンミン銀、タンニン酸、の2種を用いMMP活性への影響を検討した。1MMP活性抑制剤の濃度とMMP活性および象牙質コラーゲン強度の関連:エナメル質・セメント質・歯髄を完全に除去したヒト抜去歯象牙質を凍結粉砕し、得られた象牙質粉末を、各種濃度のMMP活性抑制剤で処理し、ゼラチナーゼアッセイキット等を用いてMMP酵素活性を測定した。その結果、サホライドを処理することでMMP活性の低下を測定できたが、タンニン酸を用いた場合、残留あるいは処理後の象牙質粉末より溶出するタンニン酸の影響によりMMP活性の測定が行えなかった。処理方法あるいはMMP活性の測定方法を検討する必要がある。2完全に脱灰した象牙質を各種濃度のMMP活性抑制剤で処理し、その物性・機械的強度を測定した。サホライドおよびタンニン酸にて処理を行った結果、脱灰象牙質の物性の向上が確認された。2.接着材への各種MMP活性抑制剤を配合することによる機械的性質および象牙質接着における影響:MMP活性抑制剤を試作ボンディング材に配合し、その機械的強度、接着強さ、MMPおよび象牙質への影響の検討を行った。1MMP活性抑制剤の配合濃度とMMP活性および象牙質コラーゲン強度の関連:MMP活性抑制剤配合試作ボンディング材で脱灰象牙質を処理あるいはコーティングしその物性・機械的強度を測定する。タンニン酸を添加することで接着強さの低下が確認された。脱灰象牙質の機械的強度の測定や接着強さについては予定通りである。その一方、予定していた酵素活性の測定がタンニン酸の影響で行えていないため、やや遅れている。1MMP活性抑制剤の濃度とMMP活性および象牙質コラーゲン強度の関連:岡山大学より鹿児島大学に異動したことにより蛍光マイクロプレートリーダーが使用できず、これまで行っていた酵素活性の測定が困難となった。現在、別の評価方法を検討中である。DCC、ATA、METMAC処理を行った結果、脱灰象牙質の著明な物性の変化は確認できなかった。現在、別の導入方法・資料作成方法を検討中である。前年に引き続き、より低濃度で接着性を低下させない範囲での濃度を検索した。今後、長期耐久性測定用試料を作成して、引張試験を行う予定である。DCCはボンディング材に溶解せず、別途材料を検討中。その一方、予定していた酵素活性の測定が異動により機器が使用できなくなり、行えていないため計画の変更が必要である。現在,接着性材料の長期耐久性を向上させるため、様々な研究が行われている。その中でも、象牙質に内在するコラーゲン線維を加水分解し接着界面の劣化の要因の一つであるMMPs(Matrix Metalloproteinases)を抑制する薬剤について申請者は着目した。本研究では脱灰象牙質に対するMMPs活性抑制剤の影響およびセルフエッチングシステムのボンディングレジンにMMPs活性抑制剤を配合した試作ボンディング材について検討を行った。本研究で用いる試作接着システムは、これまでにないMMPs活性抑制剤を配合した新規の接着性材料であり、象牙質への短期接着性を維持したうえで、接着界面の長期安定性の向上を目的とするものである。1).機械的性質への影響:脱灰象牙質にMMPs活性抑制剤を処理することで、硬度や引張強さなどの機械的強度や、MMPs活性促進液に長期浸漬した際の乾燥重量の比較による重量減少の抑制など、機械的性質の向上およびMMPs活性の抑制が認められた。2).象牙質接着における影響:初期の接着試験において、1%までのタンニン酸の配合では接着性の低下は認められず、2%の配合で接着性は低下した。

接着試料の6か月間の水中保管では、タンニン酸を配合することで、無配合のボンディング材と比較して、接着性の低下が抑制された。また、電子顕微鏡上では接着界面などに明らかな違いは観察されなかった。タンニン酸・サホライドでは歯質の変色が認められるため、変色を起こさないMMPs活性抑制剤の開発が必要である。脱灰象牙質に対するMMPs活性抑制剤の影響およびセルフエッチングシステムのボンディングレジンにMMPs活性抑制剤を配合した試作ボンディング材について検討を行った。1).機械的性質への影響:脱灰象牙質にMMPs活性抑制剤を処理することで、機械的性質の向上が認められた。2).象牙質接着における影響:初期の接着試験において、1%までのタンニン酸の配合では接着性の低下は認められなかった。6か月間の水中保管では、タンニン酸を配合することで、接着性の低下が抑制された。引き続き実験を行い、サンプル数の増加、長期経過後の試料の測定を予定している。平成28年度より、岡山大学より鹿児島大学に異動したことにより実験環境が異なることから、まず実験環境の構築を行い、環境により実験手法の変更が行われる可能性がある。岡山大学より鹿児島大学に異動したことにより実験環境の構築を行ったが、使用できなくなった手法もあり、他キャンパスの施設を借りる、別の手法で評価することを検討している。歯科保存学
環状トポロジカル高分子の精密合成と粘弾性

今年度は、線状鎖の両端に環状鎖が連結した「ダンベル型高分子」の精密合成と、その粘弾性挙動の調査を行った。試料はアニオン重合法により、環化連結点にジフェニルエチレン型ビニル基を有する環状ポリスチレン(分子量3万)に、両末端リビング線状ポリスチレン(分子量8万あるいは24万)を反応させた後、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)と相互作用クロマトグラフィー(IC)による多段階の分取精製を行うことで、高純度試料を調製した。得られた試料は、SECに多角度光散乱(MALS)検出器を取り付けたSEC-MALS測定により絶対分子量を見積もり、またIC測定により純度を定量的に見積もることで、分子特性を評価した。これらの測定により、本研究で得られたダンベル型高分子試料が分子設計通りかつ高純度に調製できていることを確認した。得られたダンベル型高分子試料のうち、中央線状鎖の分子量が24万と分子量の大きな試料の粘弾性測定を行った。その結果、中央線状鎖単体では分子間の絡み合いに起因したゴム状平坦領域を示した後に、終端緩和挙動が見られたのに対し、線状鎖の両端に小さな環状鎖が連結したダンベル型試料では、著しく長いゴム状平坦領域を示し、観測の範囲内において流動挙動をほとんど示さないことが明らかとなった。この結果は、ダンベル型高分子において、通常の線状鎖には生じえないような特徴的な分子間相互作用が生じていることを強く示唆している。これまでの実験的知見から考察すると、この著しい緩和の遅延は、ダンベル型高分子の末端の環状鎖部に別の分子が貫入することにより生じていると考えられる。27年度が最終年度であるため、記入しない。環状高分子に多数の線状鎖がランダムに連結した「環状くし型高分子」の精密合成とその粘弾性挙動の調査を行った。試料はアニオン重合により、グラフト化のための反応点を約20点持つ環状ポリスチレン(分子量7万)を高純度に調製した後、そこに線状ポリスチレンをグラフト化する手法により、目的試料を合成した。グラフトする枝鎖には分子量2万、4万、8万の3種類を用い、試料を系統的に調製した。対照試料として、線状幹鎖(分子量7万)に同分子量、同本数の枝鎖をグラフト化した「線状くし型高分子」を同様の手法により合成した。得られた試料の分子特性は、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)に多角度光散乱(MALS)検出器を取り付けたSEC-MALS測定により評価した。得られた環状くし型試料の分子運動性を調べるために、動的粘弾性測定を行った。まず、枝鎖の短い線状および環状の両くし型試料では、枝鎖と幹鎖の緩和に由来した二段階の緩和を示すことが明らかとなった。特に、枝鎖由来の早い緩和は両者で類似しているのに対し、幹鎖由来の遅い緩和は、幹鎖の分子構造の違いを反映して、環状くし型鎖の方が線状くし型鎖よりも早いことが明らかになった。得られた粘弾性スペクトルに対して、非絡み合い鎖の運動様式を表わすラウズモデルを組み合わせて解析を行うことで、その挙動がよく記述できることが分かった。一方枝鎖の長い環状くし型試料では、幹鎖の寄与が極めて小さく、見かけ上枝鎖由来の緩和のみが観察された。対照となる線状くし型試料では、上記の枝鎖の短い試料と同じく、枝鎖と幹鎖の二段階の緩和が観察され、両者に明確な違いが見られた。以上より、くし型高分子の幹鎖構造の違いが、粘弾性緩和に明確な違いを与えることを明らかにした。

上記の通り、環状くし型高分子試料を枝鎖の長さを変えて系統的に調製した後、その粘弾性挙動を調査し、線状くし型試料とは明確に異なる粘弾性挙動を示すことが明らかとなったことから、本研究課題がおおむね順調に進展していると考えられる。27年度が最終年度であるため、記入しない。線状鎖の両末端に環状鎖が連結した「ダンベル型高分子」をアニオン重合によって精密合成し、その粘弾性挙動を調査する。これにより、線状高分子の分子運動における末端の影響を詳細に検討する。
CED技術を用いた局所免疫誘導による悪性神経膠腫治療法の開発

中枢神経系への新規薬剤送達技術であるconvection-enhanced delivery(CED)を用いた局所治療により全身性免疫を誘導する方法を探ることを目的に研究を開始した.まず,化学療法剤ACNUを局所投与した際に生じる組織変化の検討を行い,局所毒性が無視できる低容量でACNUを脳内へCED法を用いて投与した後,一過性に血液-脳関門の透過性が亢進することを発見した.この発見を受けて,まず全身性化学療法との併用を試みた.ラット脳腫瘍モデルを用いた研究で,ACNU投与後7-12日にドキソルビシンリポソームの全身投与を行うと腫瘍モデルの生存が延長することが示された.続いて,局所に免疫関連タンパクOX-40をコードするアデノウイルスをCED法を用いて局所投与し,免疫を誘導する方法での抗腫瘍効果を確認した.中枢神経系への新規薬剤送達技術であるconvection-enhanced delivery(CED)を用いた局所治療により全身性免疫を誘導する方法を探ることを目的に研究を開始した.まず,化学療法剤ACNUを局所投与した際に生じる組織変化の検討を行い,局所毒性が無視できる低容量でACNUを脳内へCED法を用いて投与した後,一過性に血液-脳関門の透過性が亢進することを発見した.この発見を受けて,まず全身性化学療法との併用を試みた.ラット脳腫瘍モデルを用いた研究で,ACNU投与後7-12日にドキソルビシンリポソームの全身投与を行うと腫瘍モデルの生存が延長することが示された.続いて,局所に免疫関連タンパクOX-40をコードするアデノウイルスをCED法を用いて局所投与し,免疫を誘導する方法での抗腫瘍効果を確認した.平成21年度、化学療法剤ACNUを脳内・脳腫瘍内へ局所投与した際に生じる組織変化の検討を行った。その結果、局所毒性が無視できる低容量でACNUを脳内へCED法を用いて投与した後、7-12日の間に一時的に脳血液関門が開くことが判明した。具体的にはACNUをCED法を用いて正常ラット脳内へ投与した3,7,12,30日後に色素エバンス・ブルーを尾静脈より注入。直後に脳を摘出し切片を作成。ACNU注入局所での色素漏出は7-12日の間のみ認められ、この時期に脳血液関門が一時的に破綻していることが判明した。この発見を受けてまず全身化学療法をこの時期に併用することにより、より強い抗腫瘍効果が得られると過程してACNUのCED投与とドキソルビシンリポソームの尾静脈投与を併用する抗腫瘍効果を検討した。ラット脳腫瘍モデルを用いた研究で、腫瘍内のACNUを投与した部位にドキソルビシンがより強く漏出していることが判明し、さらにこの併用により腫瘍モデルの生存が延長することが示された(論文発表準備中)。この一時的な脳血液関門の破綻には薬剤分布範囲に誘発される炎症が関与していると考えられ、現在局所への炎症細胞の浸潤、局所でのサイトカイン産生を研究おり、この機序解明により有効な抗腫瘍免疫へつなげることができると考えられる。さらに局所で免疫誘導を図るタンパクとしてOX40 ligandに注目している。本学呼吸器内科ではこのOX40 ligand発現アデノウイルスベクターを用いた肺癌の免疫遺伝子治療の研究がなされており(Cancer Res 64 : 3281-3287, 2004)、同グループよりベクターの供給を受けた。OX40 ligand発現アデノウイルスベクターを脳腫瘍内へ直接CED法を用いて投与しその抗腫瘍効果を研究、さらにCED法によるACNU脳腫瘍内投与との併用でさらに有効な免疫治療を目指す研究を進めている。化学療法剤ACNUを脳内・脳腫瘍内へ局所投与した際に生じる組織変化の検討を行い、局所毒性が無視できる低容量でACNUを脳内へCED法を用いて投与した後、7-12日の間に一時的に脳血液関門が開くことを示した。この発見を受けて全身化学療法をこの時期に併用することにより、より強い抗腫瘍効果が得られることをACNUのCED投与とドキソルビシンリポソームの尾静脈投与の併用により証明した。ラット脳腫瘍モデルを用いた研究で、腫瘍内のACNUを投与した部位にドキソルビシンがより強く漏出していることが判明し、さらにこの併用により腫瘍モデルの生存が延長することが示された(論文投稿中)。この一時的な脳血液関門の破綻には薬剤分布範囲に誘発される炎症・浮腫が関与していることが判明した。さらにACNU投与により腫瘍細胞ではFasの発現が誘導されることがわかり、免疫治療との併用効果を検討している。さらに局所で免疫誘導を図るタンパクとしてOX40 ligandに注目し(本学呼吸器内科ではこのOX40 ligand発現アデノウイルスベクターを用いた肺癌の免疫遺伝子治療の研究がなされており(Cancer Res 64:3281-3287,2004)、同グループよりベクターの供給を受けた)、OX40 ligand発現アデノウイルスベクターを脳腫瘍内へ直接CED法を用いて投与しその抗腫瘍効果を示した。CED法によるACNU脳腫瘍内投与との併用でさらに有効な免疫治療を目指す研究を進めている。
痒疹モデルマウスの樹立と解析による治療方法の研究

抗原特異的IgE存在下に抗原を反復投与すると、肉眼的には孤立性の丘疹が出現し、組織学的には、表皮の不規則な肥厚と真皮の細胞浸潤を伴っており、これはヒトにおける痒疹と類似していた。さらに、この病変内には好塩基球が多数浸潤していた。この病変はそう痒を伴い、病変部には表皮内神経伸張が確認された。この制御因子として、病変部でのnerve growthfactorやそう痒惹起サイトカインIL-31の産生増強が確認された。また、免疫組織学的に、表皮細胞には神経伸長因子であるnervegrowthfactorやamphiregulinの発現が増強し、神経反発因子であるsemaphorin 3Aの発現が低下していた。さらに、病変部ではIL-4,13,17,22といった、Th2型、Th17型サイトカインの産生も増強していた。これらの特徴はヒトの痒疹病変をよく模倣しており、痒疹のモデルマウスを樹立できた、と判断した。また、このモデルマウスに好塩基球除去抗体を投与すると、病変部の好塩基球が消失するとともに、病変も減弱した。すなわち、この病変は好塩基球依存性である、といえる。Th2サイトカインの増強が本モデルマウスで見られたことから、Th2を阻害すると、病変も減弱することが考えられた。そこで、Th2サイトカインのシグナル伝達に必須であるSTAT6を欠損させたマウスに痒疹類似病変を惹起すると、この病変は予想に反して増強した。病変部ではM2マクロファージマーカーであるCD163、CD206陽性細胞がSTAT6欠損マウスでは減弱しており、M2マクロファージ遺伝子マーカーであるArg1のmRNA発現も減弱していた。単球は好塩基球由来のIL-4によりM2マクロファージに分化し抗炎症作用を発現する、とされており、STAT6阻害によりM2マクロファージ分化が阻害され、病変が悪化する機序が考えられた。マウスのIgE依存性慢性皮膚アレルギー炎症を改変することにより、痒疹類似病変を作成することができた。これは、肉眼的にヒトにおける痒疹結節と同様の結節が惹起され、組織学的にも表皮の肥厚とともにリンパ球や組織球、好酸球、好塩基球の浸潤が見られ、ヒトの結節性痒疹と類似していた。この病変はIgE依存性、好塩基球依存性であり、サイトカインプロファイルはTh2環境、Th17環境優位であり、ヒト痒疹のサイトカインプロファイルと同様の傾向を示した。Th2環境優位であることから、Th2伝達シグナルであるSTAT6を欠損したマウスを用いて痒疹類似病変を惹起したところ、予想に反して反応は増悪した。この機序として、野生型マウスではTh2サイトカイン(IL-4、IL-13)により血液中炎症性サイトカインがM2マクロファージに分化して炎症を抑制すること、STAT6欠損状態では、Th2サイトカインのシグナルが伝達されず、炎症性サイトカインがM2マクロファージに分化できないため、炎症抑制機構が機能せずに炎症が増悪することが確認された。痒疹モデルマウスの作成に成功し、免疫学的応答の解析を行った。ヒトの痒疹と同様にこのモデルはTh2とTh17の免疫応答環境にあることが判明したが、驚く事に、マウスでTh2を阻害すると、この免疫応答は軽減するどころか、極めて増悪した。これは、Th2環境によりM2マクロファージが誘導され、行き過ぎた炎症を沈静化するためであることが判明した。この結果はthe Journal of Immunologyに掲載された。

当初計画していた痒疹モデルの樹立に成功した。また、その免疫学的応答を精査することにより、痒疹におけるTh2型免疫応答の防御機構についても確認する事ができ、その成果をthe Journal of Immunologyに発表できたため。本実験で樹立した痒疹モデルのTh17免疫応答についてはまだ不明な点も多く、そもそも、本モデルマウスと好塩基球との関連、そのイフェクターなど未解明な部分が多く、検討が必要となる。痒疹モデルマウスの樹立から始まり、その病変におけるサイトカインプロファイルの確認、好塩基球による炎症増悪機構やTh2シグナル伝達系を介したM2マクロファージによる炎症抑制機構が相当にわたり解明されたことから、本研究はおおむね順調に進展している、と評価する。使用購入予定の端数が生じたため。本研究では既に痒疹モデルマウスの作成とその炎症増強機構・炎症抑制機構の解明が進んでいる。これに対して病変部のそう痒の成因については、現在まだ検討中である。そう痒の成因として、そう痒関連サイトカインの増加や病変部表皮内神経伸長などが確認されているが、その制御機構についてはまだあきらかでは無い。とくに好塩基球と表皮内神経伸長との関連、とくに神経伸長因子であるNerve growthfactorやAmphiregulin、神経反発因子であるSemaphorin 3Aの表皮細胞での発現が本モデルマウスでどのように制御されているのか、その制御機構と好塩基球、そう痒性サイトカインとはどのように連関しているのか、を、次年度以降の研究で解明していく。具体的に、モデルマウスでの上述の蛋白やmRNAの発現を確認し、その制御機構をシグナル伝達経路や細胞応答レベルで検討する。次年度に繰り越して物品購入などに使用する予定である。本学では入札制度により物品を調達しており,予想価格と入札価格に差があったため次年度使用額が生じた。適宜必要な物品、試薬などを購入する。
唾液腺の漿液性および粘液性細胞における生化学的・薬理学的特性に関する研究

ラットの三大唾液腺の漿液性および粘液性細胞における生化学的および薬理学的特性について、microdissecion法で採取した分泌性分節細胞と各種の薬物刺激により分泌した唾液に含有する中性と酸性の糖蛋白分子種を比較観察する方法を用いて研究した。結果:1.分泌性分節細胞の糖蛋白泳動像;(1)顎下腺では、腺房細胞は、130KDaの糖蛋白(顎下腺ムチン)を、顆粒管細胞は、31KDaの糖蛋白(カリクレイン)が大部分であった。これらの糖蛋白は、いずれもalcian blue(A.B.)で染色されず、PASで染色された。(2)耳下腺腺房細胞は、PASで染色され、A.B.で染色されない94、51、43および31KDaの糖蛋白を含んだ。(3)舌下腺腺房細胞は、PASとA.B.で染色される舌下腺ムチンと、A.B.で染色されず、PASで染色される6ー7種の糖蛋白を含んだ。2.刺激分泌唾液の糖蛋白泳動像;(1)顎下腺では、腺房の糖蛋白は、isoproterenol、dobutamine、bethanechol、substance P、SP Cーterminal hexapeptide analogs、physalamineでの刺激分泌唾液で、顆粒管の糖蛋白は、methoxamine、phenylephrineでの刺激分泌唾液で観察された。(2)耳下腺腺房の糖蛋白は、isoproterenol、dobutamine、methoxamine、phenylephrine、substance Pでの刺激分泌唾液で観察された。(3)舌下腺腺房の糖蛋白は、pilocarpine、carbachol、bethanecholおよびsubstance Pでの刺激分泌唾液で観察された。本成績より、ラットの三大唾液腺の分泌性細胞は、それぞれに特徴的な中性または酸性の糖蛋白分子種を含み、分泌に関与する受容体の主なサブタイプは、顎下腺の腺房細胞がムスカリン性M_3、アドレナリン性β_1、NK_1、顆粒管の漿液性細胞が、アドレナリン性α_1、耳下腺の漿液性細胞がムスカリン性M_3、アドレナリン性のα_1およびβ_1、NK_1、舌下腺の粘液性と漿液性細胞がムスカリン性M_3およびNK_1であることが明らかとなった。微量の生体試料の分離が可能である4-40% SDS polyacrylamide microdiscgel電気泳動系における酸性糖蛋白の検出法を確立し、ラット舌下腺の腺房細胞と刺激分泌唾液の中性および酸性糖蛋白分子種について検索した。結果:1.シアル酸を多量に含むhuman α_1-acid glycoproteinの電気泳動後、2-propranolでgelからSDSを除去し、0.5% Alcian blue(A.B.)で染色すると1本のBlue BandがPASおよびCoomassie blue(C.B.)Bandと同じ位置に出現した。ゲルにアプライしたα_1-acid glycoproteinの量とdensitometric areaの相関係数は、0.96であった。

2.正常成熟雄性ラットの舌下腺をcollagenaseで消化しmicridissectionにより分取した腺房試料の泳動像では、高分子領域の蛋白はA.B.とPASの双方に陽性であり、低分子領域の蛋白はPASに陽性、A.B.に陰性であった。3.(1)舌下腺からの唾液分泌は、アドレナリン性のαおよびβ作動薬の投与でみられず、carbachol(CR)およびsubstance P(SP)の投与でみられた。これらの唾液では、ゲルにアプライする最適蛋白量は、A.B.とC.B.染色の場合で0.125μg、PAS染色の場合で0.25μgであった。CRとSPによる刺激分泌唾液のC.B.、A.B.およびPAS泳動像は類似し、Band数はC.B.染色で15-16本、A.B.染色で12-13本、PAS染色で14-15本であった。また、C.B.で染色性の強い18KDaと26KDaの双方の蛋白はPASに陽性、A.B.に陰性であり、次に染色性の強い155KDaの蛋白はA.B.とPASの双方に陽性であった。(2)舌下腺の腺房からの中性と酸性糖蛋白の分泌に対する能力と持続力は、SPよりもCRで大であった。また、CR投与による唾液分泌はatropineの前投与で、SP投与による分泌はatropineとspantideの前投与で強い抑制効果を示した。以上の成績より、ラット舌下腺の粘液性腺房細胞に含まれている中性および酸性の糖蛋白の分泌は、ムスカリン受容体とSP受容体の双方が関与することが明らかとなった。ラット舌下腺の粘液性腺房細胞と漿液性半月細胞の糖蛋白分泌に関与するサブスタンスP(SP)受容体とムスカリン受容体のサブタイプについて,各受容体に高親和性の作動薬と遮断薬を用いて検討した。以上の成績より,ラットの舌下腺は,SPおよびムスカリン受容体の刺激で粘液性腺房細胞から酸性糖蛋白を,漿液性半月細胞から中性糖蛋白を分泌するが,これらに関与する主なサブタイプは,SP受容体はNK_1で,ムスカリン受容体はM_3であることが明らかとなった。成熟雄性ラット舌下腺の唾液と粘液性および漿液性分泌細胞含有の糖蛋白分子種の分泌に関与するムスカリン性受容体のサブタイプについて、partial agonistのpilocarpine(PIL)、full agonistのcarbachol(CAR)およびM_1agonistのMcNーAー343(McN)と各種のantagonistsを用いて検討した。結果:1.唾液分泌作用:(1)CAR(3ー100μg/kg)およびPIL(0.1ー2mg/kg)の1回腹腔内注射では、用量依存の唾液分泌がみられ、ED_<50>値は、CARで37μg/kg、PILで660μg/kgであった。しかし、McN(0.3ー1mg/kg)の1回静脈注射では、唾液分泌がみられなかった。一方、CARおよびPILの投与では、唾液分泌のflow rateは、いずれも5ー15の間で最高となり、その後、しだいに減少した。(2)唾液分泌に対するatropine,4ーDAMPおよびpirenzepineのID_<50>値は、CAR投与の場合で、それぞれ1.9,4.1および205μg/kg、PIL投与の場合で、それぞれ3.6,8.2および215μg/kgであった。
臨床に向けて顎骨欠損への適切な再生代替骨の選択

頭蓋骨欠損モデルの動物実験では、その骨形成量はscaffold<hBMCの上清+scaffold<hBMCの上清(10X) +scaffold<hBMC+scaffoldの順となった.この結果から間葉系細胞を移植することによる骨再生医療は持続的な成長因子が必要とされる移植床に限定されることになると思われる.Recipient側の骨組織欠損の病態(全身状態、年齢、母床条件等)により、hybird型人工骨に加える因子を組み替え、骨組織の必要性に応じて、scaffoldに培養上清のみを、または濃縮培養上清を、さらにhBMCを添加するなどが考えられた.10年以上-80°Cで凍結保存した腸骨由来間葉系細胞70検体のうち無作為に選んだ9検体を対象とした。凍結保存ヒト骨組織由来間葉系細胞を再培養し、安全性の評価としてG-band法による染色体検査、アレイ化CGH法による遺伝子検査を行ったほか、real-timePCRによるhTERT遺伝子の異常発現を確認した。さらにin vivoではHybrid型人工骨を作成しマウス背部皮下に検体を移植し、6ヶ月後腫瘍化の有無を確認した。結果:G-band法による染色体検査で1例に第2染色体長腕側の先端に逆位を認め、アレイ化CGH法による遺伝子検査でも第2染色体に逆位を認めた症例の同部位に欠失を認めた。またhTERT遺伝子の測定ではすべてに異常は認められなかった。さらにin vivoの腫瘍化検査では6検体中3検体に明らかな骨形成を認めた。形成された骨組織は成熟した骨組織で、その骨組織の一部にマクロファージによる吸収・線維化像を認めた。またコントロール群には骨形成は認めず、組織学的に新生骨以外に腫瘍形成は認めなかった。考察:我々の用いている長期凍結保存されたヒト骨組織由来間葉系細胞はその優れた骨形成能を報告してきている。臨床応用するにおいてはその安全性を確認することが重要である。平成26年度は安全性評価としてG-band法とCGH法による評価とhTERT遺伝子の発現の有無及びin vivo動物実験において移植6ヶ月後の代替骨に異常な組織増殖や腫瘍化像の確認を行ない、明らかな造腫瘍性は認められなかったが、一方でG-band法による染色体形態検査とCGH法による染色体異常検査において同一症例に異常所見を認めた。このことは骨形成等、臨床的に優位な間葉系細胞でも臨床に使用する前段階であらかじめ各検体ごとにG-band法による染色体形態検査とCGH法による染色体異常検査が最低限必要と考えられた。平成27年度の研究計画は予定通り、凍結保存間葉系細胞を無血清培養により再培養し間葉系細胞と培養上清を分離した。その後に生物科学的活性と骨形成能の比較確認(in vitro, in vivo)をした。1) in vitro:培養上清の成長因子測定としてIGF-1, VEGF, HGF等をエライザー法で行ない、2) in vivo:Scaffoldはコラーゲンアパタイト(Refit)を使用した。scaffold、hBMCの上清+scaffold、hBMC+scaffold、hBMCの培養上清+hBMC+scaffoldをそれぞれ動物頭蓋骨欠損モデル(ヌードラット)に移植し、骨形成を組織学的に検討した。その結果【in vitro】成長因子の発現はIGF-1は検出されなかったが、VEGF、HGFは検出された。10倍濃縮において高い値が検出された。【in vivo】コントロールにおいては欠損部が残存し、明らかな骨形成を認めなかった。一方、培養上清では一部骨形成を認めるが骨欠損部が残存していた。しかし10倍濃縮においては欠損部が新生骨により閉鎖されていた。この結果から凍結保存されたヒト骨組織由来間葉系細胞の培養上清によっても骨形成が確認され、また培養上清の濃縮が骨形成を増強することが示唆された。間葉系細胞を移植することなしに骨再生医療が可能であれば、間葉系細胞の腫瘍化の懸念が払拭され、再生医療の安全性をさらに担保することになると考えられる。したがって間葉系細胞を移植することによる骨再生医療は持続的な成長因子が必要とされる移植床に限定されることになると思われる。おおむね計画通りに進捗しているが、しかしin vivo研究でデータの一部にばらつきが見られるため平成28年度は実験動物をヌードマウスに変更して追試を行う予定である。提供された骨組織(腸骨および顎骨)・骨髄血(腸骨)を無血清培地で初代培養し,得られた間葉系細胞(hBMC)を凍結保存、研究に併せて解凍後その間葉系細胞および培養上清を使用し,前年度は骨組織由来間葉系細胞の培養上清によっても骨形成が確認され、また培養上清の濃縮が骨形成をさらに増強することを明かにした。今年度はそれにより顎顔面骨欠損に対して代替骨の選択基準作成した。その結果、Recipient側の骨組織欠損の病態(全身状態、年齢、母床条件等)により、hybird型人工骨に加える因子を組み替え、骨組織の必要性に応じて、scaffoldに培養上清のみを、濃縮培養上清を、さらにhBMCを添加するなど各種選択枝の存在が明かとなった。また前年度までの研究で骨組織由来間葉系細胞の再生骨組織量は検体により大きな差異がみられた。これは間葉系細胞に存在する前駆骨芽細胞がその発生母地により細胞ポテンシャルに制限があることに起因すると我々は考えた。

そこで追加研究として顎骨組織と腸骨組織との由来間葉系細胞の生物学的検討として骨誘導培地に対する細胞動態と脂肪誘導培地に対する細胞動態との差異をin vitroで行った。その結果、それぞれ由来の間葉系細胞は骨誘導培地により経時的に強く石灰化を示す検体、中等度に石灰化を示す検体、石灰化の弱い検体の3群に分かれ、それぞれ腸骨由来、下顎骨由来、上顎骨由来となった。次に骨誘導培地で培養後に脂肪誘導培地に置換した場合は、殆ど脂肪誘導されない検体、僅かに脂肪誘導される検体、強く脂肪誘導される検体の3群に別れ、それぞれ上顎骨由来、下顎骨由来、腸骨由来となった。したがって骨組織由来間葉系細胞はその発生母地により細胞ポテンシャルが制限されていると考えられた。頭蓋骨欠損モデルの動物実験では、その骨形成量はscaffold<hBMCの上清+scaffold<hBMCの上清(10X) +scaffold<hBMC+scaffoldの順となった.この結果から間葉系細胞を移植することによる骨再生医療は持続的な成長因子が必要とされる移植床に限定されることになると思われる.Recipient側の骨組織欠損の病態(全身状態、年齢、母床条件等)により、hybird型人工骨に加える因子を組み替え、骨組織の必要性に応じて、scaffoldに培養上清のみを、または濃縮培養上清を、さらにhBMCを添加するなどが考えられた.我々の臨床応用の独自性はヒト間葉系細胞の凍結保存にある。そのため凍結保存細胞の安全性確認は最も重要課題の一つである。そこでまず初めに10年以上凍結保存された間葉系細胞の染色体の形態学的検討、腫瘍化過程に出現するhTERT遺伝子発現、またにCGH法による遺伝子検索、さらに6か月間動物移植下の腫瘍形成の有無を行った。結果は9症例中1例に染色体の形態検索とCGH法で同一検体に異常所見を認めた。このことから実際に凍結保存細胞の安全を確保するためには、それぞれの検体ごとに必要で有り、臨床移植前検査として染色体の形態学的検索、CGH法による遺伝子検索、腫瘍化過程に出現するテロメアーゼ活性、hTERT遺伝子発現等を調べる必要があるとの結論を得た。現在は他の研究課題にすでに着手しており順調に進行している。In vivo研究でデータの一部にばらつきが見られるため平成28年度は実験動物をヌードラットからヌードマウスに変更して追試を行う予定である。その後、立案通りに平成28年度の研究実施計画として「3.顎顔面骨欠損に対して適材適所な代替骨の選択基準作成ー平成27年度のin vitro, in vivoの結果を踏まえ、実際の臨床応用への選択基準作成を文献的考察を参考に作成するー」を行う。口腔外科学凍結保存間葉系細胞を無血清培養により再培養し間葉系細胞と培養上清を分離する。その後に生物科学的活性と骨形成能の比較確認(in vitro, in vivo)をする。1) in vitro:培養上清の成長因子測定としてIGF-1, VEGF, HGF等をエライザー法で行う。本年度は凍結保存間葉系細胞の安全性に関する研究が中心となり、予定していた凍結保存間葉系細胞のin vitro, in vivoの研究が一部開始のみとなったため。次年度は凍結保存間葉系細胞のin vitro, in vivoの研究が中心となるため本年度の研究の不足分も合わせて遂行出来ると考えている。
腱組織修復とその促進に関する基礎的研究―細胞増殖因子発現の解明と局所投与による修復促進―

近年、細胞工学の進歩により組織再生の研究が盛んに行われている。腱組織は豊富なコラーゲン線維からなる強靭な結合組織であるが、血流は豊富ではなく、治癒過程もいまだ完全に解明されてはいない。我々は腱組織修復を人為的にコントロールして再生を促進するために細胞増殖因子に注目している。本研究においては、まず腱の治癒過程において損傷部に集積する細胞および細胞増殖因子の由来、発現時期、その役割を免疫染色とin situ hybridizationを用いて明らかにし、その相互作用を明らかにする。今年度は腱損傷部位におけるTGF-βおよびFGF、type collagenとtype collagenの発現とその時期を解析した。ラットアキレス腱を用いて、TGF-βおよびFGF、type collagenとtype collagenの発現時期について免疫染色を用いて解析した。その結果、TGF-βは術後1週から2週で最大の発現を示し、引き続いてFGFの発現が最大となった。また、同時期にtype collagenの発現が最大となり、引き続きtype collagenが最大の発現を示した。以上の結果をふまえて、生体内での各細胞増殖因子の至適濃度や至適投与部位、そして至適投与方法を確立する必要があると考えられる。また、担体としてコラーゲンやゼラチンなどが報告されているが、我々の開発しているリポソームは新しいDrug Delivery Systemとして注目されており、全身投与のみならず、サイトカインを局所に投与する方法としても有用であると思われる。また腱の修復方法が縫合糸に頼っている現状を考えると、縫合糸に細胞増殖因子が包埋されて、修復部分に作用することが最も理想的と考えられる。これらの手法の比較検討により、腱組織修復における至適細胞増殖因子を至適濃度で局所に投与する方法を開発する。本研究により、腱縫合後の修復過程が短縮され、早期のリハビリテーションが可能となり、患者の機能的予後を大きく改善することができると考えている。今年度は腱損傷部位におけるTGF-βおよびFGF、type I collagenとtypeIII collagenの発現とその時期を解析した。ラットアキレス腱を用いて、TGF-βおよびFGF、typeI collagenとtypeIII collagenの発現時期について免疫染色を用いて解析した。また、同時期にtypeIII collagenの発現が最大となり、引き続きtypeI collagenが最大の発現を示した。

これらの手法の比較・検討により、腱組織修復における至適細胞増殖因子を至適濃度で局所に投与する方法を開発する。本研究により、腱縫合後の修復過程が短縮され、早期のリハビリテーションが可能となり、患者の機能的予後を大きく改善することができると考えている。腱組織は豊富なコラーゲン線維からなる強靭な結合組織であるが、血流は豊富ではなく、治癒過程もいまだ完全に解明されてはいない。我々は腱組織修復を人為的にコントロールして再生を促進するために細胞増殖因子に注目している。本研究においては、腱損傷部位におけるTGF-βおよびFGF、type I collagenとtype III collagenの発現とその時期を解析した。ラットアキレス腱を用いて、TGF-βおよびFGF、type I collagenとtype III collagenの発現時期について免疫染色を用いて解析した。その結果、TGF-βは術後1週から2週で最大の発現を示し、引き続いてFGFの発現が最大となった。また、同時期にtype III collagenの発現が最大となり、引き続きtype I collagenが最大の発現を示した。以上の結果をふまえて、治癒過程早期に出現するTGF-βが損傷腱修復過程に大きな影響を与えると考えられた。そこで、今後は生体内でのTGF-βの至適濃度や至適投与部位、そして至適投与方法を確立する必要があると考えられる。また、担体としてコラーゲンやゼラチンなどが報告されているが、我々の開発しているリポソームは新しいDrug Delivery Systemとして注目されており、全身投与のみならず、サイトカインを局所に投与する方法としても有用であると思われる。また腱の修復方法が縫合糸に頼っている現状を考えると、縫合糸に細胞増殖因子が包埋されて、修復部分に作用することが最も理想的と考えられる。
プロモントリーテストに替わる外耳道/鼓膜電気刺激聴覚検査法の開発

これまで,人工内耳候補者への後迷路機能評価は,聴覚心理学的評価法として電気刺激聴覚検査(プロモントリーテスト)が行われてきた。しかし、プロモントリーテストに用いる機器として世界中で使用されてきたコクレア社製promontory stimulatorの製造販売・修理が中止された結果、現在ではプロモントリーテストが実施できない施設が多数存在する。本研究では、既に末梢神経誘発電位検査として本邦で薬事承認されており,臨床使用されている携帯型末梢神経刺激装置(以下、PNS-7000)を電気刺激聴覚検査に応用し、後迷路機能評価の臨床検査ツールとして実用化を目指す。本研究は1PNS-7000の電気刺激聴覚検査を行うための至適設定の確立,2至適設定を施したPNS-7000を用いた電気刺激聴覚検査の妥当性評価,3低侵襲電極の開発を行う事により,PNS-7000を用いた低侵襲な電気刺激聴覚検査による後迷路機能評価の臨床実用化を目指す。本年度は、引き続き前年度までに作成した,電気刺激聴覚検査用にプログラムしたPNS-7000および,PNS-7000に連結可能で、かつ鼓膜近傍の電気刺激に有利な電極を用い,両側高度から重度難聴の14例に対し電気刺激聴覚検査を行った.前年度までの12例と合わせて,計26例の結果解析により,PNS-7000と鼓膜近傍電極を用いた電気刺激聴覚検査は、コクレア社製Promontory stimulatorに近似した音感覚が得られた。また、両測定結果間には相関を認める結果が得られた。以上より、PNS-7000は従来のコクレア社製promontory stimulatorの代用となり得る可能性が確認できた。今年度はさらに低侵襲かつ設置が簡便な電極の開発も同時に行っている.今後は電気刺激聴覚検査機器としての実用化を念頭に、開発中のさらに低侵襲かつ設置が簡便な電極を用いた検査条件の検討を探索する。本年度は、前年度までにソフトウェアの改良を行ったPNS-7000と鼓膜近傍電極を用いて,両側高度から重度難聴の14例に対し電気刺激聴覚検査を実施した.これまでに行った26例の結果解析により,PNS-7000と鼓膜近傍電極を用いた電気刺激聴覚検査は、コクレア社製Promontory stimulatorに近似した音感覚が得られた。PNSおよび、非侵襲型鼓室外電極の有用性が確認できた一方で,さらなる低侵襲電極の開発は検査実施に至っておらず,やや遅れていると進捗評価した。今後は電気刺激聴覚検査機器としての実用化を念頭に、開発中のさらに低侵襲かつ設置が簡便な電極を用いた検査条件の検討を探索する。今後の本研究は推進のために、PNSのソフトウェア調整や新規の低侵襲電極開発において,日本光電担当部署との連携を蜜に行う。また、症例のリクルートにおいても両側高度重度難聴のみでなく、片側聾例や、高音急墜型感音難聴例なども加えることにより、さらなる症例の集積を行う。これまで人工内耳候補者への後迷路機能評価には蝸牛電気刺激による聴覚心理学的評価法として電気刺激聴覚検査が行われてきた。しかし、検査装置として世界中で使用されてきたコクレア社製promontory stimulatorの製造販売・修理が中止されたことから、プロモントリーテストが実施できない施設が多数存在する。本研究では、既に末梢神経誘発電位検査として本邦で臨床使用が開始された携帯型末梢神経刺激装置(以下、PNS-7000)を電気刺激聴覚検査に応用し、後迷路機能評価の臨床検査ツールとして実用化を目指す。本年度は、まずPNS-7000に連結可能で、かつ外耳道または鼓膜の電気刺激に有利な電極を作成した。鼓室外電極の留置部位は骨部外耳道または鼓膜臍部とした。高度から重度難聴の14例に対し、PNS-7000を用いて電気刺激聴覚検査を行い、どのような知覚が誘発されるかを評価するとともに音感については、聴覚閾値、快適閾値、不快閾値の測定を行った。同時にコクレア社製Promontory stimulatorを用いて、電気刺激聴覚検査を行い、測定値と比較した。その結果、非侵襲型鼓室外電極を用いたPNS-7000による電気刺激聴覚検査により、コクレア社製Promontory stimulatorに近似した音感覚が得られた。このことから、PNS-7000は従来のコクレア社製promontory stimulatorの代用となり得る可能性が確認できた。今後は電気刺激聴覚検査機器として実用を化を念頭に、鼓室外電極の使用において聴覚知覚を得るために至適位置の検討や電気刺激パルス時間の調整による効率的刺激パターンを探索する。本年度内に14例に対して、携帯型末梢神経刺激装置(以下、PNS)を用いた電気刺激聴覚検査を施行し、PNSおよび、非侵襲型鼓室外電極の有用性が確認できた。その一方で、電気刺激閾値だけでは、従来のpromontory stimulatorで測定可能であったgap detection level(2音として判定できる最小刺激感覚)を測定するためのPNSソフトウェアの改良は十分に行えておらず、やや遅れていると進捗評価した。

これまで,人工内耳候補者への後迷路機能評価は,聴覚心理学的評価法として電気刺激聴覚検査(プロモントリーテスト)が行われてきた。しかし、プロモントリーテストに用いる機器として世界中で使用されてきたコクレア社製promontory stimulatorの製造販売・修理が中止された結果、現在ではプロモントリーテストが実施できない施設が多数存在する。本研究では、既に末梢神経誘発電位検査として本邦で薬事承認されており,臨床使用されている携帯型末梢神経刺激装置(以下、PNS-7000)を電気刺激聴覚検査に応用し、後迷路機能評価の臨床検査ツールとして実用化を目指す。本研究は1PNS-7000の電気刺激聴覚検査を行うための至適設定の確立,2至適設定を施したPNS-7000を用いた電気刺激聴覚検査の妥当性評価,3低侵襲電極の開発を行う事により,PNS-7000を用いた低侵襲な電気刺激聴覚検査による後迷路機能評価の臨床実用化を目指す。本年度は、引き続き前年度までに作成した,電気刺激聴覚検査用にプログラムしたPNS-7000および,PNS-7000に連結可能で、かつ鼓膜近傍の電気刺激に有利な電極を用い,両側高度から重度難聴の14例に対し電気刺激聴覚検査を行った.前年度までの12例と合わせて,計26例の結果解析により,PNS-7000と鼓膜近傍電極を用いた電気刺激聴覚検査は、コクレア社製Promontory stimulatorに近似した音感覚が得られた。また、両測定結果間には相関を認める結果が得られた。以上より、PNS-7000は従来のコクレア社製promontory stimulatorの代用となり得る可能性が確認できた。今年度はさらに低侵襲かつ設置が簡便な電極の開発も同時に行っている.今後は電気刺激聴覚検査機器としての実用化を念頭に、開発中のさらに低侵襲かつ設置が簡便な電極を用いた検査条件の検討を探索する。本年度は、前年度までにソフトウェアの改良を行ったPNS-7000と鼓膜近傍電極を用いて,両側高度から重度難聴の14例に対し電気刺激聴覚検査を実施した.これまでに行った26例の結果解析により,PNS-7000と鼓膜近傍電極を用いた電気刺激聴覚検査は、コクレア社製Promontory stimulatorに近似した音感覚が得られた。PNSおよび、非侵襲型鼓室外電極の有用性が確認できた一方で,さらなる低侵襲電極の開発は検査実施に至っておらず,やや遅れていると進捗評価した。今後、今後の本研究は推進のために、PNSソフトウェアの改変による電気刺激パターンの調整を依頼している日本光電担当部署との連携を蜜に行う。また、症例のリクルートにおいても両側高度重度難聴のみでなく、片側聾例や、高音急墜型感音難聴例なども加えることにより、さらなる症例の集積を行う。今後は電気刺激聴覚検査機器としての実用化を念頭に、開発中のさらに低侵襲かつ設置が簡便な電極を用いた検査条件の検討を探索する。今後の本研究は推進のために、PNSのソフトウェア調整や新規の低侵襲電極開発において,日本光電担当部署との連携を蜜に行う。
アミド結合の効率的かつ触媒的な官能基変換反応の開発

アルコールとアミンの脱水素カップリング反応は、縮合剤や酸化剤を必要としない環境調和性に優れたイミンまたはアミドの合成法である。用いる配位子や添加剤、その他の条件によりイミンとアミドを作り分ける手法は魅力的な合成法のひとつであるが、わずか二例が報告されているのみである。私は独自に開発したルテニウム-亜鉛塩複合触媒系がアミドの水素化反応に高い活性を示すことを報告している。脱水素カップリング反応は水素化反応の逆反応であることから、独自に開発したルテニウム-亜鉛塩複合触媒系が脱水素カップリング反応に活性を示すのではないかと考え検討を行った。用いるPーN配位子のわずかな立体の違いによってアルコールとアミンからイミン・アミドを作り分けることに成功している。前年度に報告した通りイミン合成の基質適用範囲の検討を行い、20種類以上のイミンを得ることに成功した。また、同様の触媒系においてルテニウム上の配位子を変更することで生成物をイミンではなくアミドへと誘導することに成功した。アミド合成における反応条件検討を行った上でイミン合成の場合と同様に基質適用範囲の検討を行い、20種類以上のアミドを得ることに成功している。反応機構を解明するためにそれぞれの反応において経時変化の測定、ハメットプロットの作成、速度論的同位体効果の測定を行った。その結果、用いるPーN配位子のヘミレーバイルな性質が、イミンが生成するか、アミドが生成するか、の制御に重要であること、イミン合成ではアルコールのα位の炭素-水素結合の脱水素過程が律速段階であり、アミド合成では配位したアルデヒドへのアミンの求核攻撃が律速段階であることを明らかにした。28年度が最終年度であるため、記入しない。アミド化合物の触媒的水素化反応により対応するアルコールを得る反応は、ごく最近均一系触媒反応が、数例報告されているが、これらの触媒は触媒活性がまだ不十分であることや基質一般性が狭いなどの問題点を有しており、より活性の高い新たな触媒系の開発が求められている。エステルの水素化に活性のあることが知られていたルテニウム錯体とトリフルオロ酢酸亜鉛を組み合わせることによって、より水素化の困難なアミド結合の水素化が進行し対応するアルコールが生成することを見出している。亜鉛塩の効果を調べるため様々な検討を行ったところ、上のルテニウム錯体と2倍モル量のトリフルオロ酢酸亜鉛を塩基存在下、反応させるとクロロがトリフルオロアセテートに置換した新規ルテニウム錯体が高収率で得られた。本錯体は、亜鉛塩の添加なしでもアミドの水素化に活性を示すが、最適条件と比べやや活性が低く亜鉛塩を添加することで最適条件以上の活性を示したことから、添加した亜鉛塩は1トリフルオロアセテート配位子源、2亜鉛イオンによるアミドの活性化の二つの効果があることが分かった。以上の結果をChemical Communication誌に発表した(Chem. Commun. 2014, 50, 11211.)。アルコールとアミンを原料とした触媒的脱水素カップリングアミド化合物の合成は、副生成物が水素ガスのみと環境調和性およびアトムエコノミーに優れた反応である。アミド結合の水素化触媒系が逆反応である脱水素カップリングの触媒となる可能性があることに着目し、独自に開発したルテニウム-亜鉛複合触媒系を用いてアルコールとアミンの脱水素カップリング反応を行ったところ、申請時に想定していたアミドではなくイミン化合物が高収率で生成することを見いだした。反応条件の最適化を行い、同条件において、アルコールの適用範囲を調べた。本申請者は、独自に開発したルテニウム-亜鉛複合触媒系を用いて、アミド化合物の水素化反応によるアルコール合成に成功している。この成果を基に、アミド結合より水素化の困難なカーボネート、カーバメート、尿素の水素化反応へと展開する計画であった。しかしながら、同触媒系によるカーボネート、カーバメート、尿素の水素化反応では高い活性を得ることができなかった。そこで、配位子を窒素-リンの二座配位子からリンの三座配位子に変更して水素化反応の検討を行った。三座のリン配位子を二段階で合成し、ルテニウム二核錯体を得た。得られた二核錯体を触媒としてアミドの水素化反応を行ったところ対応するアルコールはわずか25%収率であった。この結果からアミド結合より水素化の困難なカーボネート、カーバメート、尿素の水素化に本二核錯体は適していないことが分かった。前年度に報告した通りルテニウム-亜鉛塩複合触媒系を用いて得られる生成物はアミドではなくイミンであった。本年度はイミン合成の基質適用範囲の検討を引き続き行い、20種類以上のイミンを得ることに成功した。アミド合成における反応条件検討を行った上でイミン合成の場合と同様に基質適用範囲の検討を行い、現時点で15種類以上のアミドを得ることに成功している。今後は基質適用範囲の拡大および脱水素カップリング反応の反応機構研究を行った上で学術論文として投稿する予定である。