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Anti-Drug Antibodies 産生を抑制する抗体医薬品創製基盤の確立

抗体医薬品には往々にして中和抗体(Anti-Drug Antibodies:ADAs)が産生され、その機能が消失する場合がある。医療費削減の観点から、ADAsの産生を抑制する方法の開発は喫緊の課題である。普遍的に抗体医薬品に対するADAsを抑制するため、本研究では、抗体医薬品(ヒト型)のFabの定常部(全てのヒト型Fabに共通した部位)を修飾し、その構造安定性を変動させ、ADAsの産生を抑制できるかどうかの研究を実施した。我々の研究室では、既にヒト型Fabの定常部のH鎖とL鎖の間を分子内架橋した変異型Fabを調製している。今年度は、X線結晶解析法により分子内架橋が形成していることを実証した。また、分子内架橋している周辺部位の構造情報も入手した。安定なヒト型Fabを調製するために、ヒト型Fab変異体を迅速かつ効率的に作成する系を確立した。すなわち、研究分担者の九大農学研究院の日下部の協力を得て、カイコを用いることにより変異体作成を開始して2ヶ月以内にmg単位の変異型Fabを作成する方法を確立した。上述したように分子内架橋FabのX線結晶解析は終了したので、その構造情報を踏まえ、変異部位のデザインは終了した。カイコを複数頭用いることにより、並行して多くの変異体を調製できるので、来年度に向け変異体Fabを多数調製することができる準備が整った。一方、安定性が変動した蛋白質を用いて、抗原性の違いを評価できるかどうかについて調べた。一つは研究分担者の東北大宗の協力を得て、安定性が低下したヒト型Fabの抗原性を評価する予備実験を行った。また、既に植田らの研究室では、安定性向上したダニアレルゲンDerp2の抗原性を評価する対照実験を実施しており、今年度それらが蛋白質の安定性と相関しているという結果を確認し、この結果を取りまとめた論文が国際誌に採択されることで、蛋白質の安定性と抗原性に相関があるという知見は科学的評価を得た。本研究目的はヒト型Fabの定常部位を安定化することで、マウスに対する抗原性が低下するかどうかを明らかにし、臨床試験中などに報告されているヒト型抗体の不都合な抗原性低下を目指すものである。今年度はヒト型Fabの定常部のH鎖とL鎖の間に施した分子内架橋の構造情報をX線結晶解析により明らかした。又、迅速に変異型ヒト型Fabを調製する発現系を調製した。これらの結果は来年度、安定化したヒト型Fab変異体の調製の可能性を広げるものである。予備実験ならびに対照実験から、安定なヒト型Fabが調製できれば免疫原性の評価は可能である。従って、本研究目的遂行は順調に進展していると考えられる。平成27年度に引き続きFab定常部に焦点を絞り安定性の向上を行った。昆虫学が専門である研究分担者の協力の下、当研究室で実施したX線結晶解析結果に基づき、13種のヒト型Fabの変異体をデザインし、カイコを用いて発現、精製した。PCR装置を用いた熱シフトアッセイ法により、それぞれの変異体Fabの安定性を評価したがいずれも野生型より不安定であった。共同研究者により供与された、ヒト型FabのC末シスチン欠損体(ΔSSFab)を土台として、定常部に新規ジスルフィド結合を導入した変異体(ΔSSFabCL)はpH6.5において、ΔSSFabより5°C熱安定性が高い。免疫学が専門である研究分担者はこれらの2つの生理食塩水に溶解したFabを5匹のマウスに免疫した。17日後、38日後のそれぞれの抗原に対する抗体価をELISAにより評価した。その結果有意な差は認められなかった。ヒト型Fabのモデル蛋白質として、マウス型FabのL鎖定常部のGlu123をCysに、Thr180をCysに変異した2種のL鎖変異体を調製し、H鎖と試験管内でFujiiらの報告(J.Biochem.2007)に従い再生した。精製後、二価性架橋試薬であるN-(4マレイミドブチリロイル)スクシニミドとpH5で反応させた後、試薬を除き、蛋白質溶液をpH8まで上げた。その後イオン交換樹脂で精製した。生成物を還元、非還元でSDS-PAGEを行ったところ、分子間架橋が形成していることがわかった。示差走査熱量計を用いて熱安定性を比較したところ、分子間架橋によりいずれの変異体も安定性が約10°C向上していた。L鎖のGlu123、Thr180のCysへの変異が、不安定化を引き起こしていたため、分子内架橋体は野生型より12°Cしか安定化しなかったが、Fabの定常部位の分子間架橋が格段の安定化を引き起こす実験報告はなく、本架橋法はFabに広く応用できる架橋法となると期待される。現在、安定なヒト型Fabを調製するために、現在はヒト型Fabの定常部のH鎖とL鎖の間の分子内架橋を基盤として、変異型ヒト型Fabをデザインしている。

本方法により安定化ヒト型Fabが調製できる可能性は高いが、バックアップ実験として、ヒト型Fabの定常部の反応性の高いアミノ酸残基に反応性の高い二価性架橋試薬を用いて分子間架橋を実施する。また、ヒト型Fabの定常部に今年度確立した変異導入法により、新たに反応性の高いアミノ酸残基(システイン残基、ヒスチジン残基等)を持つ変異型ヒト型Fabを調製して、化学修飾法によりヒト型Fabの安定化を実施する。応用薬理学、抗体工学年度をまたいで投稿している論文があり、掲載費用、別刷り費用を確保するため。幸い報告書を記載する段階で受理されたので、論文の掲載費用、別刷り費用に充てる。
mRNAキャッピング酵素分子とその遺伝子の構造と機能

mRNAキャッピング酵素はmRNAグアニル酸転移酵素活性とRNA5'ートリホスファターゼ活性から構成されている。動物細胞からの酵素は単一ポリペプチド鎖からなるのに対して、酵母のキャッピング酵素はサブユニット構造を有する。キャッピング酵素の構造と機能をさらに解明するために、本年度の研究実施計画に基いて研究を行い、以下の成果を得た。(1)Artemia salina(brine shrimp)の胚よりキャッピング酵素を均一標品となる迄精製し、そのドメイン構造を解析した。精製酵素(73KDa)はトリプシンによる限定分解で44KDaのグアニル酸転移酵素ドメインと32KDaのトリホスファターゼドメインにそれぞれ活性をもった状態で分離された。両ドメインとも基質特異性やRNA鎮認識能においてインタクトな酵素と大きな差違は認められず、それぞれがかなり独立したドメイン構造を形成していると推定された。(2)酵母よりキャッピング酵素を高度に、かつ大量に精製する方法を確立した。精製酵素は80KDaと52KDaのサブユニットから成り、SDS-ゲル電気泳動後のin situアッセイによって前者がトリホスファターゼ,後者がグアニル酸転移酵素活性を有する事を証明した。(3)酵母の精製酵素でモルモットを免疫し、同酵素に対する抗体を得た。本抗体は酵母の酵素に特異的であり、ラット肝,A.salina,ワクシニアウイルスからのキャッピング酵素とは反応しなかった。又、Western blot法からこの抗体は酵母酵素の両サブユニットを認識した。(4)λgt11を発現ベクターとする酵母遺伝子ライブラリーを上記抗体を用いてスクリーニングし、グアニル酸転移酵素遺伝子を含むクローンを分離した。このクローンは約3.5Kbの酵母遺伝子を含み、目下、その構造を解析している。(5)in vitro転写系を用いてRNAポリメラーゼ【II】による転写開始反応を解析した。キャッピング酵素が転写開始複合体中に特異的に含まれることを見出した。
ガソリンエンジンの燃焼変動低減を目的とした高精度シリンダ内状態予測法の開発

エンジン燃焼室の壁温およびガス温度推定法の構築を目的として,ポート部熱伝達率および冷却水側熱伝達率の定式化およびその検証を行った.両モデルは,いずれも円管内乱流熱伝達として考え,ヌセルト数とレイノルズ数との関係を導出することで,冷却水流量から熱伝達率を求められるように定式化した.ただし,ポート部に関しては,温度境界層の発達と間欠流であることを考慮する必要があるため,レイノルズ数に加えてグレツ数およびストローハル数を変数とした式として定式化を行った.ポート部熱伝達モデルおよび冷却水側熱伝達モデルの検証は,熱損失推定モデルを構築した場合と同様に,ポート部および冷却水周りに熱流束センサーや表面温度計を設置することにより壁面熱流束を実測することにより実施した.その結果,構築したポート部熱伝達モデルと冷却水側熱伝達モデルは十分妥当な推定精度であることを明らかにした.さらに,上記の熱伝達モデルと熱損失推定モデルから導出された各部(ポート部,ピストン頂部,ピストンキャビディ側壁、ピストンキャビディ底部、ヘッド部など)の熱伝達率を用いて,エンジン燃焼室から冷却水までの熱通過率を求めることで壁温・ガス温度推定法を構築した.さらに、研究成果はジャーナルペーパーを7編(内3編は掲載予定)、国内会議での講演を6回、国際会議での講演を6回行うことにより公開した.また,次年度行う予定であるエンジン制御ECUへの実装のための簡略化モデルの開発にも着手することができた.当該研究により、ジャーナルペーパーを7編(内3編は掲載予定)、国内会議での講演を6回、国際会議での講演を6回行うことができたことや、次年度行う予定である内容に関しても、前倒しで行うことができていることから、当初の予定以上に進展していると考えられる。前年度までに構築した熱損失推定モデルおよび壁温・ガス温度推定法を,エンジン制御ECUでも計算可能な簡易計算モデルへ展開するとともに,過渡運転条件に適用可能なモデルに展開する.簡易計算モデルへの展開方法は,時系列に変化するガス流動の乱れ,壁温,ガス温度に対し,行程ごとに特徴的な時刻のみを計算することで予測可能なモデルに展開する.これにより,離散時刻での熱損失および温度推定となるため,実測値との比較により離散データの補完関数を検討し導入する.また,過渡運転と定常運転を比較すると,乱流エネルギーの散逸率が異なることが予想されることから,モデルの過渡運転への適用に関しては,散逸率に相当する乱れの減衰係数を導入することとする.減衰係数の同定には,単気筒エンジンでのPIVおよび熱流束測定結果より検討する予定である.ガス流動モデルの構築およびCFD, PIVを用いたモデルの検証を行った.計算を簡略化するため,シリンダ内の流れ方向に基づき,1スキッシュ領域と燃焼室領域の双方向流動による乱れ成分,2スワール方向の流動による乱れ成分,3軸方向の流動による乱れ成分,4燃料噴霧による乱れ成分という4種の乱れ成分に分類し,それぞれの定式化を行った.1はスキッシュ領域と燃焼室領域の質量保存則を解くことで各領域から吹き出す速度を評価し,乱れ成分を定式化した.2は角運動量の保存則を解くことで,乱れ成分を定式化した.3はピストン運動を基本とした軸方向速度のうち,乱れ成分の割合を実験的に導出した.4は広安ら(1980)による確率密度関数を用いた噴霧モデルを適用した.ガス流動モデルの検証は,CFDによる計算およびPIVによるシリンダ内の速度分布測定により行った.CFDでは,運転条件ごとの空間的な乱れ分布を評価した.乱流熱伝達の一般論から,小径渦よりも大径渦が圧倒的に熱伝達に影響を及ぼすことがわかっているため,大径渦の乱流エネルギーの評価が可能なLarge Eddy Simulation (LES)を採用し,回転数などの運転条件と大径渦がもたらす乱流エネルギーとの相関関係を明らかにした.一方,PIVでは,シリンダ内の乱れ成分のうち,1,2,3に対して検証する.当該研究機関には,可視化単気筒エンジン(石英ガラス製のシリンダを設置)およびPIV装置が導入されているため,シリンダ内の流動測定は問題ない.ただし,ガス流動と相互関係を有する燃焼状態は,別途測定する必要があるため,燃焼解析システムを導入した.最終的に,PIVによる速度計測結果を元に評価した乱れ成分と,ガス流動モデルによる計算結果を比較検討を行った.両者に差異が見られたことから,CFDの結果も鑑み,ガス流動モデルに補正係数を導入した.2017年5月に行われる公益社団法人・自動車技術会・2017春季大会にて下記の論文発表を行うレベルに達していることから、当初の計画以上に進展していると考えられる。「ディーゼル機関におけるオンボード用壁温推定のための筒内ガス流動モデルの開発」、「ディーゼル機関におけるオンボード用ポリトロープ指数予測モデルの開発」熱損失推定モデルの構築および熱流束測定によるモデルの検証を行った.熱損失推定モデルは,エネルギー方程式を基盤として構築し,温度,速度,圧力,密度に対し,平均値と変動成分に分解することで,乱れ成分を考慮した方程式に展開した.方程式を直接解いた場合,温度境界層内の状態量をCFDなどにより計算する必要があるが,本申請研究では,温度境界層内に対して,以下のモデル化を行うことで式を簡略化し,CFDを必要としないモデルを構築した.1温度と速度の乱れの変動成分に対して,壁と垂直方向にエンタルピと運動量が輸送されると仮定する.2レイノルズ応力に対して運動量輸送理論を適用し,また流体塊が混合のために移動する距離はプラントルの仮定(混合距離理論)を適用する.

3温度境界層内の速度分布は,プラントルの仮定に基づき対数速度分布と仮定する.4主流における渦の角運動量は保存されると仮定する.上記の仮定を用いると,エネルギー方程式はベッセルの微分方程式と変形されるため,解析解から熱伝達率を求める一般式を導出した.ここで,シリンダ内壁を6領域(1スキッシュ領域上部のシリンダヘッド,2燃焼室領域上部のシリンダヘッド,3シリンダライナ,4ピストン頂面,5ピストン側壁,6ピストン底面)に分割しガス流動のモデル化を行った.各部位の乱れの影響因子ごとにガス流動モデルを組み合わせる(例えば,ピストン底面はスキッシュ,スワール,噴霧の3種の乱れ要素,ピストン側壁はスワール,噴霧の2種の乱れ要素で構成されていると仮定)ことで,空間位置ごとの熱伝達率を求めた.熱損失推定モデルの検証は,燃焼室壁面の熱流束を実測することにより行った.各部位での熱流束を測定するため,単気筒エンジンのシリンダをガラス製からアルミ製に変更し,熱流束センサーの設置およびデータ取得し,熱損失推定モデルの検証を行った.研究成果を、原著論文の投稿ならびに学術講演会にて発表を行うことが出来たため、当初の計画通りに進展していると考えられる。エンジン燃焼室の壁温およびガス温度推定法の構築を目的として,ポート部熱伝達率および冷却水側熱伝達率の定式化およびその検証を行った.両モデルは,いずれも円管内乱流熱伝達として考え,ヌセルト数とレイノルズ数との関係を導出することで,冷却水流量から熱伝達率を求められるように定式化した.ただし,ポート部に関しては,温度境界層の発達と間欠流であることを考慮する必要があるため,レイノルズ数に加えてグレツ数およびストローハル数を変数とした式として定式化を行った.ポート部熱伝達モデルおよび冷却水側熱伝達モデルの検証は,熱損失推定モデルを構築した場合と同様に,ポート部および冷却水周りに熱流束センサーや表面温度計を設置することにより壁面熱流束を実測することにより実施した.その結果,構築したポート部熱伝達モデルと冷却水側熱伝達モデルは十分妥当な推定精度であることを明らかにした.さらに,上記の熱伝達モデルと熱損失推定モデルから導出された各部(ポート部,ピストン頂部,ピストンキャビディ側壁、ピストンキャビディ底部、ヘッド部など)の熱伝達率を用いて,エンジン燃焼室から冷却水までの熱通過率を求めることで壁温・ガス温度推定法を構築した.さらに、研究成果はジャーナルペーパーを7編(内3編は掲載予定)、国内会議での講演を6回、国際会議での講演を6回行うことにより公開した.また,次年度行う予定であるエンジン制御ECUへの実装のための簡略化モデルの開発にも着手することができた.当該研究により、ジャーナルペーパーを7編(内3編は掲載予定)、国内会議での講演を6回、国際会議での講演を6回行うことができたことや、次年度行う予定である内容に関しても、前倒しで行うことができていることから、当初の予定以上に進展していると考えられる。熱損失推定モデルの構築および熱流束測定によりモデルの検証を行う.熱損失推定モデルは,エネルギー方程式を基盤として構築する.
高機能性を付与した温度応答性培養皿の創製と組織再生への応用

筆者の所属研究室では、臨床応用に向けた温度応答性表面上での細胞シート構築の高速化およびウシ血清などの異種動物由来成分を不要とする新規培養法の確立を目指し、RGDS固定化、Insulin(INS)固定化、あるいはRGDS-INS共固定化表面をそれぞれ作製した。これらを用いた血清非存在下での細胞接着、増殖能の賦活化に成功している。本研究では、温度応答性表面上にRGDS-INSを共固定化したドメインのパターン化構造を作製し、リガンドドメイン(LD)選択的な細胞接着、増殖活性の向上を検討するとともに、微細な三次元組織構築に向けたパターン状細胞シートの構築、回収を目指した。血清存在下での細胞接着、増殖挙動を解析した結果、血清中の接着タンパクや増殖因子などが表面全体に吸着し、細胞は表面全体に接着、増殖した。培養後、降温処理(37°C→20°C)に伴う細胞脱着挙動を追跡すると、すべての接着細胞は脱着するが、LD上の固定化RGDSと細胞膜上の受容体との相互作用の影響で脱着が抑制され、非LD上の細胞が優先的に脱着した。血清非存在下での細胞接着、増殖挙動を解析した結果、LD上の固定化RGDSとINSによる顕著な細胞接着性の向上と細胞増殖の加速化が認められ、細胞はLD上に優先的に接着、増殖した。LD上で長期培養すると、細胞は次第に非LD上へと遊走し、表面全体でコンフルエントまで増殖した。一方、LD選択的に培養後、パターン形状を維持した細胞シートを剥離・回収できた。本研究で作製したリガンドパターン化温度応答性表面は、LD選択的に細胞接着、増殖能を賦活化しうる高機能性を有することが示唆された。血清非存在下、細胞をLD選択的に培養後、パターン形状を維持した細胞シートを剥離・回収できた。本研究結果から、再生医療に向けた微細な三次元組織構築法の確立に対し、極めて重要な基盤技術を構築したといえる。我々は、無血清培養下での組織再生を目指し、接着ペプチドのRGDS、増殖因子のインスリン(INS)をそれぞれ単独で固定した温度応答性表面を作製し、これを用いて細胞接着・増殖挙動を亢進しうることを明らかにしている。本研究では、カルボキシル基を導入した温度応答性高分子のポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)(PIPAAm)の超薄層修飾表面にRGDSとINSを共固定した表面を新規に調製し、この表面上での細胞接着・増殖の加速化を検討した。血管内皮細胞(EC)を播種し経時的に接着・増殖挙動を解析した結果、RGDS固定量が多いほどECの初期接着を促進し、INS固定化は細胞増殖に強く作用した。表面へのINS固定化は、培地へのINS添加と比較してより少量のINSで高い増殖活性を示し、この効果はRGDSとの共固定により増強された。この結果は、固定化INSから誘起された連続的な刺激により細胞増殖能が亢進していることを示唆している。ECを24時間培養後、培養温度を20°Cに下げると、表面固定PIP舳n分子の水和に伴い表面が親水性化し、伸展細胞は表面から自発的に脱着した。経時的に観察した結果、RGDS固定量が多いほど脱着が遅延し、INS固定化は脱着にほとんど影響しなかった。ECをコンフルエントまで培養後、低温処理のみでシート状の単層組織として剥離でき、単一細胞と比較して短時間で回収できた。この結果から、表面の親水性化による接着性の低下に加え、細胞-細胞間結合を維持した組織が足場を失うことで、細胞の骨格タンパクの再構築に起因する組織自体の収縮が関与していると考えられた。以上の結果、細胞接着・増殖を促進しつつ温度変化で細胞の接着/脱着を動的に制御し、培養細胞を単層組織として回収しうる温度応答性ナノバイオ表面が調製できた。本研究結果は、動物由来成分を不要とする新規培養法の確立に極めて重要な知見である。申請者の研究室では、無血清培養下での組織再生を目指し、接着ペプチドのRGDS、あるいは増殖因子のインスリン(INS)を固定した温度応答性表面を作製し、これを用いて細胞接着・増殖挙動を賦活化しうることを明らかにしてきた。本研究では、カルボキシル基を導入した温度応答性表面にRGDSとINSをパターン状に共固定した表面を新規に調製し、本培養皿上での細胞接着・増殖および脱着挙動の時空間制御を検討した。RGDS-INSパターン表面にNIH3T3細胞(3T3)を播種し、細胞接着・増殖挙動を経時的に観察したところ、血清存在下では表面全体に接着・増殖したが、血清非存在下ではRGDS-INSパターン選択的に接着・増殖した。これは、血清中に存在する接着タンパクや増殖因子がRGDS-INSの非固定部位にも吸着した結果、表面全体での細胞接着・増殖を促進したためと考えられた。さらに、血清非存在下、RGDS-INSパターン表面上で長期培養したところ、RGDS-INS非固定領域上にも3T3が接着・伸展し、コンフルエントまで増殖した。血清存在下、RGDS-INSパターン表面上で3T3をコンフルエントまで培養後、低温処理を行い、細胞脱着挙動を経時的に追跡したところ、脱着時間を制御しつつRGDS-INS非固定領域の接着細胞を優先的に脱着させることが可能であった。さらに、血清非存在下、RGDS-INSパターン表面上で3T3をパターン状に培養後、低温処理を行い、網目構造を有する単層組織として回収できた。本研究で調製したバイオ機能化

温度応答性表面は、生理活性物質のパターン固定化で細胞接着/脱着領域を空間的に制御しつつ、細胞接着/脱着速度を時間的に制御しうる高機能性を有することが示唆された。本結果は、特定細胞の増殖・分化機能のみを特異的かつ効率的に賦活化させた培養組織の再構築に向けた極めて重要な知見といえる。筆者の所属研究室では、臨床応用に向けた温度応答性表面上での細胞シート構築の高速化およびウシ血清などの異種動物由来成分を不要とする新規培養法の確立を目指し、RGDS固定化、Insulin(INS)固定化、あるいはRGDS-INS共固定化表面をそれぞれ作製した。これらを用いた血清非存在下での細胞接着、増殖能の賦活化に成功している。本研究では、温度応答性表面上にRGDS-INSを共固定化したドメインのパターン化構造を作製し、リガンドドメイン(LD)選択的な細胞接着、増殖活性の向上を検討するとともに、微細な三次元組織構築に向けたパターン状細胞シートの構築、回収を目指した。血清存在下での細胞接着、増殖挙動を解析した結果、血清中の接着タンパクや増殖因子などが表面全体に吸着し、細胞は表面全体に接着、増殖した。培養後、降温処理(37°C→20°C)に伴う細胞脱着挙動を追跡すると、すべての接着細胞は脱着するが、LD上の固定化RGDSと細胞膜上の受容体との相互作用の影響で脱着が抑制され、非LD上の細胞が優先的に脱着した。血清非存在下での細胞接着、増殖挙動を解析した結果、LD上の固定化RGDSとINSによる顕著な細胞接着性の向上と細胞増殖の加速化が認められ、細胞はLD上に優先的に接着、増殖した。LD上で長期培養すると、細胞は次第に非LD上へと遊走し、表面全体でコンフルエントまで増殖した。一方、LD選択的に培養後、パターン形状を維持した細胞シートを剥離・回収できた。本研究で作製したリガンドパターン化温度応答性表面は、LD選択的に細胞接着、増殖能を賦活化しうる高機能性を有することが示唆された。血清非存在下、細胞をLD選択的に培養後、パターン形状を維持した細胞シートを剥離・回収できた。本研究結果から、再生医療に向けた微細な三次元組織構築法の確立に対し、極めて重要な基盤技術を構築したといえる。
窒素氷、メタン氷、二酸化炭素氷の弾性・非弾性的性質の研究

外惑星系衛星のうち土星以遠のものは、表面がH_2Oの氷ではなく、窒素・メタン・二酸化炭素の氷であることが米国のボイジャー衛星や地上からの光学的観測でわかっている。このようなノンウォータアイスはその物性がほとんどわかっておらず、光学的性質・結晶の融点・晶系がわかっているのみである。探査機の至近距離からの映像は表面に特徴的なテクトニックな構造があることを示しているため、本研究の課題であるノンウォータアイスの弾性的・非弾性的性質を明らかにする必要がある。上記のノンウォータアイスは旧ソ連の研究者によって作成例と音速(弾性的性質)の測定例が報告されているが、データを吟味するとそれらの試料が空隙率の大きな、霜のかたまりのようなものであると判断される。本研究ではまず、良質で空隙率の小さい試料を作成する装置の立ち上げと変形実験装置の設計・製作を行った。窒素・メタン・二酸化炭素について透明な多結晶試料を作成することができた。これらの試料が良質なことは試料が透明であることのみならず、超音波測定でも従来より高い音速を記録したことからも十分に判断できた。これらの試料はヘリウム温度までの極低温下で生成した後、一定荷重をかけ、変形による歪を測定した。固体窒素の変形メカニズムは転移温度35.6Kを境にして大きく異なり、粘性率は29×10^8Pa secであった。固体メタンでもα相からβ相への転移に伴って変形様式が変化する。粘性率は10^<10>Pa・s(45K)であった。これらの値はH_2O氷のものに比べ、45桁小さなものであり、極低温下でも極めて変形しやすいものであることを示した。二酸化炭素の氷は、融点近傍では10^8Pa・s程度あるが、これ以下では急激に硬くなり脆性破壊をするようになる。従ってノンウォータアイス衛星では地質学的に長いタイムスケールで地形を維持するにはメタンや窒素の表層の下にH_2Oの氷や二酸化炭素の氷があると結論できる。外惑星系の衛星の多くは、表面がH2Oの氷ではなく、窒素・メタン・二酸化炭素の氷であることが、ボイジャー衛星や地球からの光学観測でわかっている。従来、このようなノンウォータアイスの物性はほとんど分かっておらず、融点・結晶系・光的反射率程度の性質のみが知られているに過ぎない。しかし、これらの物質が固体惑星・衛星の表面を構成していることからそれらの弾性的・非弾性的性質を知って地質学的な進化過程を明らかにする必要がある。研究課題を遂行するため変形実験を低温下で行うこととし、本研究を開始した。この実験研究では良質の空隙率の小さい試料を作ることがまず必要であり、初年度として試料作成装置の立ち上げと変形実験装置の設計・製作を行った。試料には二酸化炭素をまず、試み、市販のドライアイスのような空隙率の大きなものではなく、透明な多結晶試料を製作できた。気体から直接固体に凍らせるのではなく、10気圧程度に加圧して冷却し、固体を生成させる。この試料の質は弾性波速度の測定により、チエックし、変形実験を開始した。まだ、予備的な結果ではあるが、二酸化炭素の氷は、融点近傍ではアスファルト程度のものであるが、温度の低下とともに急激に硬くなる、粘性率が増大することが明らかになった。これは窒素氷・メタン氷とは異なった性質である。以上の成果は11年11月の惑星科学会秋期講演会で発表した。

外惑星系衛星のうち土星以遠のものは、表面がH_2Oの氷ではなく、窒素・メタン・二酸化炭素の氷であることが米国のボイジャー衛星や地上からの光学的観測でわかっている。このようなノンウォークアイスはその物性がほとんどわかっておらず、光学的性質・結晶の融点・晶系がわかっているのみである。探査機の至近距離からの映像は表面に特徴的なテクトニックな構造があることを示しているため、本研究の課題であるノンウォータアイスの弾性的・非弾性的性質を明らかにする必要がある。上記のノンウォータアイスは旧ソ連の研究者によって作成例と音速(弾性的性質)の測定例が報告されているが、データを吟味するとそれらの試料が空隙率の大きな、霜のかたまりのようなものであると判断される。本研究ではまず、良質で空隙率の小さい試料を作成する装置の立ち上げと変形実験装置の設計・製作を行った。窒素・メタン・二酸化炭素について透明な多結晶試料を作成することができた。これらの試料が良質なことは試料が透明であることのみならず、超音波測定でも従来より高い音速を記録したことからも十分に判断できた。これらの試料はヘリウム温度までの極低温下で生成した後、一定荷重をかけ、変形による歪を測定した。固体窒素の変形メカニズムは転移温度35.6Kを境にして大きく異なり、粘性率は29×10^8Pa secであった。固体メタンでもα相からβ相への転移に伴って変形様式が変化する。粘性率は10^<10>Pa・s(45K)であった。これらの値はH_2O氷のものに比べ、45桁小さなものであり、極低温下でも極めて変形しやすいものであることを示した。二酸化炭素の氷は、融点近傍では10^8Pa・s程度あるが、これ以下では急激に硬くなり脆性破壊をするようになる。従ってノンウォータアイス衛星では地質学的に長いタイムスケールで地形を維持するにはメタンや窒素の表層の下にH_2Oの氷や二酸化炭素の氷があると結論できる。
線溶系(PA-plasmin cascade)調節機構の解析

2)IL-1β遺伝子欠損マウスを用いて急性期におけるPAI-1誘導のメディエーターとしてIL-1が重要であること、肝実質細胞が主たるPAI-1の発現細胞種であることを明らかにした。3)脂肪細胞の分化にともなってPAI-1,uPA発現量が増大すること相反的にtPAが減少することを明らかにし線溶系因子が細胞の分化機能と密接に関連することを明らかにした。4)TGFβによるPAI-1転写誘導機構について検討し、amad3とグルココルチコイド受容体のクロストークによる調節機構を明らかにした。5)サイクリックヌクレチオドによるPAI-1mRNAのdown-regulationは、3'-非翻訳領域の134ntが重要であること、この領域に結合する38-76kDaのタンパク質がmRNAの不安定性に関与することを明らかにした。これらのタンパク質の1つをクローニングし解析したところ新規たんぱく質であることが明らかとなりPAI-RBP1と命名した。PAI-RBP1はFGG box,2つのarginine-rich regionを有することを明らかにした。1)マウス肝細胞株AML12を用いてPAI-1遺伝子発現のサイトカインによる調節調節について検討しIL-1、TNFαがPAI-1mRNA発現を誘導することを明らかにした。IL-1はPAI-1mRNAの安定性にはほとんど影響を及ぼさず転写を顕著に活性化した。2) IL-1β遺伝子欠損マウスの急性期モデルにおけるPAI-1遺伝子発現の特徴について検討を行い、テルペン油による局所炎症モデルにおけるPAI-1誘導にIL-1がメディエーターとして重要な役割を果たしている可能性が示唆された。3) PAI-1遺伝子の転写後調節機構について検討しサイクリックヌクレオチドにより調節を受けるcis-エレメントを同定した。またTGFβによるPAI-1転写誘導機構についで検討しsmedの役割を明らかにした。4) PAI-1遺伝子欠損マウスを用いて、PAI-1の異なるエピトープを認織するモノクローナル抗体の作成に成功しELISAを構築した。1)マウス肝細胞株AML12を用いて培養液中の線溶活性の調節とPAI-1遺伝子発現の関連について検討した。その結果、IL-1やTNFαによる線溶活性の低下がPAI-1mRNA発現の誘導に加え、tPAのクリアランス機構の活性化によることが明らかとなった。2)IL-1β遺伝子欠損マウスの急性期モデルにおけるPAI-1遺伝子発現の特徴について検討を行い、テルペン油による局所炎症モデルにおけるPAI-1誘導にIL-1がメディエーターとして重要な役割を果たしている可能性が示唆された。特に肝組織におけるPAI-1発現細胞種について検討し肝実質細胞がPAI-1の発現を担う重要な細胞種であることが示唆された。3)TGFβによるPAI-1転写誘導機構について検討しPAI-1転写誘導にかかわるTGFβの情報伝達機構においてsmad3の役割を明らかにした。4)活性型PAI-1と潜在型PAI-1の活性中心についてX線回折により検討した。5)初代培養肝細胞系を用いて肝細胞の増殖機構について検討したところ非実質細胞が分泌する液性因子が実質細胞の増殖機構に重要であること、これらの因子の活性化機構にプラスミン様酵素が重要であることが明らかになった。1)培養肝細胞を用いて線溶活性の調節とPA,PAI-1遺伝子発現の関連について検討した。すでにIL-1やTNFαによる線溶活性の低下がPAI-1mRNA発現の誘導に加え、tissue-type PA(tPA)の産生量の低下によることを明らかにしたが、本年度はtPAのクリアランスに係わる受容体の動態について検討し、low density lipoprotein related/α_2-macroglobulin receptor(LRP)が肝細胞においてtPAの取りこみに係わる主要な受容体であること、LRP遺伝子発現がIL-1により増大することを明らかにした。2)TGFβによるPAI-1転写誘導機構について検討し、smad3とグルココルチコイド受容体のクロストークによる調節機構を明らかにした。3)サイクリックヌクレオチドによるPAI-1mRNAのdown-regulationは、3'-非翻訳領域の134ntが重要であること、この領域に結合する38-76kDaのタンパク質がmRNAの不安定性に関与することを明らかにした。

これらのタンパク質の1つをクローニングし解析したところ新規たんぱく質であることが明らかとなりPAI-RBP1と命名した。PAI-RBP1はRGG box,2つのarginine-rich regionを有することを明らかにした。4)活性型PAI-1と潜在型PAI-1の活性中心についてX線回折により検討した。
逆転写酵素遺伝子を含むレトロンによるコレラ菌の病原性発現調節機構の解析

細菌逆転写酵素は,RNA-DNA複合体(msDNA)の合成を行っている。逆転写酵素遺伝子(ret)は,ゲノム上でmsDNAをコードする領域(msr-msd)とともにレトロンと呼ばれるオペロンを形成しており,一種の可動性遺伝因子だと考えられている。これまでにゲルシフト法によってコレラ菌由来のmsDNA-Vc95と特異的に結合するタンパク質が見つかっており,コレラ菌の病原性発現調節との関与が示唆されている。今年度の研究では,レトロンの発現状況を簡便にモニタリングすることを目的として,コレラ菌が保有しないβ-グルクロニダーゼ遺伝子(gusA)をレポーター遺伝子としてレトロンのプロモーター下に挿入したレポーター系を構築した。今後,様々な培養条件下でのレトロン誘導条件を検討する。レトロンが大量発現または発現抑制されるような条件が見つかれば,msDNAの合成からデコイDNA(またはDNAアプタマー)としての機能を介したコレラ菌の新たな病原性発現ネットワークの一端を明らかにすることができる。また,レトロンの逆転写酵素遺伝子(ret)以外の遺伝子産物との関与が示唆されているArcABについても解析を行った。ArcABは,二成分制御系の一種であり,コレラ菌の好気または嫌気条件に反応する遺伝子群の発現調節に関与していると考えられている。arcABそれぞれの遺伝子欠損株を作製し,カイコに対する病原性を野生株と比較したところ,病原性の低下が認められた。また,response regulatorであるArcAと標的遺伝子のプロモーター領域との結合をゲルシフト法で解析し,標的遺伝子との関係を明らかにした。当初予定していたレトロンのレポーター系について,gusA遺伝子をレトロンプロモーター下に挿入し,SXT elementのインテグラーゼ遺伝子(int)に組み込むことができた。また,ArcABの機能解析については,それぞれの遺伝子の欠損株を作製し,カイコに対する病原性の違いを野生株と比較することができた。これらの研究結果は,おおむね当初の計画どおりに進行している。今後は,構築したコレラ菌のレトロンのレポーター株を用いて,様々な培養条件でレトロンの発現状況を調べる。特に,コレラ菌が感染する腸管内は極端な嫌気条件となっており,またArcABとの関係も示唆されていることから,嫌気条件下でのレトロンの発現状況には注目する必要がある。その他に,他のレトロンで発現誘導が起こる飢餓状態にも注目する。さらに,コレラ菌のレトロン内にコードされているORF540タンパク質とArcABとの関係を明らかにし,ORF540の機能解析を進めるとともに病原性発現との関係を明らかにする。また,コレラ菌以外のビブリオ属細菌(特にコレラ菌類似のVibrio mimicus)の保有する新たなレトロンについても解析し,コレラ菌のレトロンと比較解析を行う。

研究計画が比較的順調に進んだため,当初の予定よりも消耗品の購入が少なかったことに加え,旅費の使用も当初の予定より少なかった。コレラ菌のレポーター系の測定に必須のマイクロプレートリーダーが故障のため使用不可となってしまい,次年度の予算で急遽購入の必要が生じた。次年度の当初予算がほぼ機器の購入費用で使い切ってしまうため,残予算は次年度研究計画の消耗品購入費用として使用する予定である。
スギ花粉アレルギーの発症を防止する免疫抑制遺伝子の解析

我々はこれまでに、スギ花粉症に対する抵抗性、およびスギ花粉抗原(CPAg)に対するIgE低応答性はHLAと連鎖した遺伝子によりCPAg特異的サプレッサーT細胞を介して発現される単純優性遺伝形質であり、HLA-DRは免疫応答遺伝子産物として、またHLA-DQは免疫抑制遺伝子産物として機能していることを明らかにしてきた。今年度は、HLA-DQが関与する免疫抑制のメカニズムをより詳細に解析するために、第3回国際白血球分化抗原ワークショップで得られた約50種の活性化T細胞に関わる単クローン抗体が免疫抑制におよぼす影響について検討した。非応答者の末梢リンパ球をB+M0,【CD4^+】T細胞,【CD8^+】T細胞に分画し、その組みあわせをCPAg,PWMおよび各種単クローン抗体と共培養した。その結果、免疫応答を直接刺激することなく、免疫抑制を阻止することで、非応答者のIgE免疫応答を回復させる単クローン抗体4B4を見い出した。この4B4分子はヘルパーT細胞上に表現されているが、サプレッサーT細胞上には表現されていなかった。また、培養開始時に細胞を抗4B4で処理しても免疫抑制は阻止されないことから、培養期間中のある特定の時期にこの抗体が存在することが、免疫抑制の阻止に必須であるものと考えられた。さらに免疫化学的な解析から、この分子は、125Kdと145Kdのポリペプチドからなるヘテロダイマーであり、HLAやT細胞レセプターとは物理的近距離には存在しないことが明らかとなった。さらに、CPAg特異的ヘルパーT細胞株から免疫沈降してくる4B4分子は、静止期T細胞のそれに比べて、新たに3種のポリペプチドを有していた。これらの結果から、活性化T細胞上の4B4分子が、サプレッサーT細胞やサプレッサー因子の標的分子として機能していることが推測された。特異性を担うHLA分子のみならず4B4のような分子も非特異的に免疫抑制に関与していることが明らかとなった。
革新的な細胞ゲノム改変技術を用いたウイルス増殖制御因子の同定

ウイルスの増殖には宿主細胞の様々な細胞性因子が必須である。本研究では、新規のゲノム編集テクノロジーであるCRISPR/Cas9システムとウイルスベクターを融合させ、ウイルス増殖を制御する細胞性因子の探索を試みた。ランダム標的gRNA/Cas9発現レトロウイルスベクターライブラリーを培養細胞に感染させた後、インフルエンザおよびアカバネウイルスの感染に耐性となる細胞を樹立した。インフルエンザウイルスの新規の増殖関連因子の同定には至らなかったが、アカバネウイルスの細胞への侵入に関与する耐性細胞の解析から、ヘパラン硫酸プロテオグリカンが重要な役割を果たしていることが明らかとなった。偏性細胞内寄生体であるウイルスの増殖には、宿主細胞の様々な細胞性因子が必須である。これら宿主因子の同定と詳細な解析は、ウイルスの生活環、病原性を理解するうえで欠かせない。しかし、一部のウイルスで同定された因子は氷山の一角に過ぎず、その機能も予想の範疇に収まる。そこで本研究では、新規のゲノム編集テクノロジーであるCRISPR/Cas9システムとレトロウイルスベクターを融合させ、ウイルス増殖を制御する細胞性因子の網羅的探索に応用する。本年度は、ランダム標的gRNA発現カセット(PolIIIプロモーター・20塩基ランダムゲノム認識配列)およびCas9発現カセット(CAGプロモーター)を組込んだレトロウイルスベクター作製用プラスミドを構築した。さらにプラスミドをパッケージング細胞に導入して、ランダム標的gRNA・Cas9同時発現レトロウイルスベクターライブラリーを作製した。ウイルスベクターライブラリーを293T、Vero、およびHmLu-1細胞に感染させ、宿主遺伝子ノックアウト細胞ライブラリーを作製した。またCRISPS/Cas発現コンストラクトが細胞にインテグレートされているかをシークエンス解析で確認した。これら宿主因子の同定と詳細な解析は、ウイルスの生活環、病原性を理解する上で欠かせない。昨年度構築したランダム標的gRNA・Cas9発現レトロウイルスベクターライブラリーを各種培養細胞に感染させた後、インフルエンザウイルス実験室株の感染に耐性となる細胞をスクリーニングした。その結果、耐性細胞株がいくつか樹立されたが、そのいずれもシアル酸レセプターの発現を抑制する表現系を示し、新規のウイルス増殖関連因子の同定には到達しなかった。一方、ブニヤウイルス科アカバネウイルスは家畜に繁殖障害を引き起こす重要なウイルスであるが、その細胞侵入機構の詳細は不明である。いくつかの他のウイルスの侵入に関与するヘパラン硫酸プロテオグリカンのアカバネウイルスの細胞侵入への関与を調べる目的で、その合成酵素EXT2をCRISPR/Cas9によってノックアウトKOした細胞を樹立した。このKO細胞にアカバネウイルスを感染させると、その増殖は野生型細胞と比較して1/10以下に減少することがわかった。この結果から、ヘパラン硫酸プロテオグリカンがアカバネウイルスの細胞への接着に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。本年度は、計画書に従い研究を実施した。研究は、ほぼ予定通り進捗した。獣医ウイルス学これまで予定通り進捗しているので、当初の計画通りに研究を進める。本年度は、インフルエンザウイルス感染耐性細胞クローンを選択する予定である。耐性細胞が得られた場合には、インフルエンザウイルスの増殖に必須な細胞性因子の同定と解析として、(1)ターゲット配列の決定、(2)Add back試験、(3)同定した細胞性因子の細胞内局在などの性状、ウイルスタンパク質との相互作用などの性状を解析する。またインフルエンザウイルス以外のウイルスへの適応も検討する。
タンパク質新規合成法によるリボゾームタンパク質の合成

タンパク質化学合成を困難とする最大の問題点は、ペプチド鎖長の増加に伴い、タンパク質中間体の溶解性が極端に低下することである。本研究では、筆者らによって提案されたペプチドおよびタンパク質中間体の溶解性予測法および溶解性向上法に基づいて、タンパク質合成ルートをデザインし、アミノ酸120残基からなる大腸菌リボゾーム酸性タンパク質のN端より30番目から71番目までのタンパク質中間体の合成を行った。まず、アミノ酸42残基からなる酸性タンパク質中間体をアミノ酸10残基程度の4個のペプチドフラグメントに分けて合成し、これらの構造をFT-IRスペクトルを用いて固体状態および溶液状態で解析した。また、これらペプチド中間体の有機溶媒に対する溶解性を調べて、先に提案した溶解性予測法の仮説の妥当性を実証した。さらに、不溶化するペプチド中間体に対して、アラニン残基などをα-アミノイソ酪酸残基に置換することによって、α-ヘリックス構造が安定化され溶解性が著しく向上することを確認し、先に提案した溶解性向上法の普遍性を実証した。また、筆者らは先にプロリン残基の主鎖二面体角の規制がヘリックス形成を促進することを明らかにしたが、これに着目したプロリン残基を含むペプチド中間体の合成ルートのデザインを行い、この中間体が各種溶媒に易溶となることなどを明らかにした。これまで、筆者らによって提案された溶解性予測法および向上法は、主に疎水性ペプチド中間体においてその有用性が確められてきたが、本研究において極性アミノ酸残基を多く含むペプチド中間体においても、その有用性と普遍性が実証された。また、これらに基づくタンパク質合成ルートのデザインが、これまでのタンパク質合成における試行錯誤性を打破する有用な概念であることが実証された。なお、ペプチド中間体の同定に新規購入した高速液体クロマトグラフィーを活用した。
マキャベリアニズムが社会的不適応を引き起こすメカニズムの検討

Christie & Geis(1970)は、対人関係における他者操作的な側面には個人差が存在することを指摘し、それを記述するものとしてマキャベリアニズム(以下Mach)というパーソナリティ概念を導入した。Machの高い個人は、自己の目的のために他者を効果的に操作し社会的な成功を収めやすいように一見思えるが、社会的に適応していなくメンタルヘルスに問題を抱える可能性がある。この可能性をこれまでの研究ではMachと抑うつや状態怒りの関連を検討することで検証してきた。今年度の研究ではこれまでの研究知見をより一般的なものにするために扱う変数を「Machから反社会的パーソナリティ」、「抑うつから内在化問題傾向」、「状態怒りから外在化問題傾向」というように拡張して研究を行った。また申請者が採用1年度目の研究で検討した行動の抑制能力との関係についても検討をした。そのために大学生を対象にして質問紙調査(Mach尺度日本語版、DTDD日本語版、エフォートフル・コントロール尺度日本語版、自己評価式抑うつ性尺度、状態不安尺度、社会不安尺度、Buss-Perry攻撃性質問紙)を実施した。その結果、反社会的パーソナリティは行動の抑制能力(の低さ)・内在化問題傾向・外在化問題傾向のそれぞれと関連が見られた。この結果と内在化問題傾向と外在化問題傾向が関連する原因として行動の抑制能力の低さが挙げられる(山形他,2006)ことから、「反社会的パーソナリティの高い個人は行動の抑制能力が低く、その結果として内在化問題傾向と外在化問題傾向の両方が高くなる」という仮説が考えられる。今後、今年度採取したデータに対して共分散構造分析を実施することによりこの仮説を検討し、反社会的パーソナリティ・行動の抑制能力・内在化問題傾向・外在化問題傾向に関する一般性が高く、かつ包括的なモデルを作成することを目標とする。27年度が最終年度であるため、記入しない。Christie & Geis (1970)は、対人関係における他者操作的な側面の個人差を記述するために、マキャベリアニズム(以下Mach)というパーソナリティ概念を導入した。Machの高い個人(以下高Mach者)は、自己の目的のために他者を操作し社会的な成功を収めやすいように一見思えるが、実際は社会的に適応していなくメンタルヘルスに問題を抱える可能性が示されている。Machが社会的不適応を引き起こすメカニズムが明らかになればメンタルヘルス管理の上でも重要性が高いため、そのメカニズムを以下の2点から検討した。1、相手の心的状態を理解する能力を心の理論能力と呼ぶ。高Mach者は心の理論能力が高い必要があるが、先行研究では心の理論課題(感情認知課題)においてMachと課題成績は負に関連した。そのため心の理論能力の低さが高Mach者の社会的不適応を起こす可能性がある。そこで別の心の理論課題(視点取得課題)とMachの関連を検討するために、Dumontheil et al. (2010)により作成された課題の日本語版を作成し、実験を実施した。その結果、先行研究と同様の結果が得られ日本語版の妥当性が示された。現在の所、課題成績とMachの関連は見られておらず、実験参加者数を増やした検討が必要である。(研究1)2、高Mach者は行動の抑制能力が高い必要があるが、質問紙研究によるとMachと行動の抑制能力は負に関連する。そのため行動の抑制能力の低さが高Mach者の社会的不適応可能性を起こす可能性がある。しかし先行研究では質問紙を指標としているため、結果が自己に対する認知を反映しているだけの可能性がある。そこで研究2では行動指標(ストループ課題)により実際の認知能力を測定し、Machとの関連を検討した。その結果、高Mach者は低Mach者よりも行動の抑制能力が低いことが示された。(研究2)Christie & Geis(1970)は、対人関係における他者操作的な側面の個人差を記述するために、マキャベリアニズムというパーソナリティ概念を導入した。マキャベリアニズムの高い個人は、自己の目的のために他者を操作し社会的な成功を収めやすいように一見思えるが、実際は社会的に適応していなくメンタルヘルスに問題を抱える可能性がこれまでの申請者の研究で示されてきた。しかし申請者のこれまでの研究だけでは「マキャベリアニズムと抑うつの関連が怒りによる偽相関の可能性がある」、「マキャベリアニズムと抑うつの間の因果関係が明確でない」という2点の問題点が解決されていないために、今年度はこれらの問題点を解決するための研究を行なった。怒りは抑うつとの併存性が指摘されている外在性問題傾向であり、マキャベリアニズムとも関連する可能性がある。そこで怒りを制御変数にした偏相関分析を行なったところ、怒りの効果を制御してもマキャベリアニズムと抑うつの間には有意な相関が見られた。この結果からマキャベリアニズムと抑うつの関連は怒りを媒介した偽相関ではないことが示された(研究1)。次に交差遅延効果モデル(高比良他,2006)を用いた分析によりマキャベリアニズムと抑うつの間の因果関係を検討するために縦断質問紙調査を行った。しかし実際に調査を行なったところ、第1時点では見られたマキャベリアニズムと抑うつの間の有意な相関が第2時点では見られず、交差遅延効果モデルを用いた分析を行なうことができなかった。この結果から測定の信頼性が十分ではない可能性が考えられる。

そのため今後はより信頼性の高い測定方法を用いて追試を行なっていく必要がある(研究2)。Christie & Geis(1970)は、対人関係における他者操作的な側面には個人差が存在することを指摘し、それを記述するものとしてマキャベリアニズム(以下Mach)というパーソナリティ概念を導入した。Machの高い個人は、自己の目的のために他者を効果的に操作し社会的な成功を収めやすいように一見思えるが、社会的に適応していなくメンタルヘルスに問題を抱える可能性がある。この可能性をこれまでの研究ではMachと抑うつや状態怒りの関連を検討することで検証してきた。今年度の研究ではこれまでの研究知見をより一般的なものにするために扱う変数を「Machから反社会的パーソナリティ」、「抑うつから内在化問題傾向」、「状態怒りから外在化問題傾向」というように拡張して研究を行った。また申請者が採用1年度目の研究で検討した行動の抑制能力との関係についても検討をした。そのために大学生を対象にして質問紙調査(Mach尺度日本語版、DTDD日本語版、エフォートフル・コントロール尺度日本語版、自己評価式抑うつ性尺度、状態不安尺度、社会不安尺度、Buss-Perry攻撃性質問紙)を実施した。その結果、反社会的パーソナリティは行動の抑制能力(の低さ)・内在化問題傾向・外在化問題傾向のそれぞれと関連が見られた。この結果と内在化問題傾向と外在化問題傾向が関連する原因として行動の抑制能力の低さが挙げられる(山形他,2006)ことから、「反社会的パーソナリティの高い個人は行動の抑制能力が低く、その結果として内在化問題傾向と外在化問題傾向の両方が高くなる」という仮説が考えられる。今後、今年度採取したデータに対して共分散構造分析を実施することによりこの仮説を検討し、反社会的パーソナリティ・行動の抑制能力・内在化問題傾向・外在化問題傾向に関する一般性が高く、かつ包括的なモデルを作成することを目標とする。研究1においてはマキャベリアニズムと抑うつの関連は他の変数を介した偽相関ではないことを示すことができた。また研究2では当初予定した交差遅延効果モデルを用いた検討を行なうことができなかったが、変数間の関連を複数回確認することができる縦断質問紙調査を行なったことで、測定方法の信頼性が低いことを発見することができた。これらの知見を基に今後、より精確なモデルを作成し、より頑健性の高い知見を提供することができると考える。27年度が最終年度であるため、記入しない。今後はマキャベリアニズムと抑うつの関連について、より信頼性の高い測定方法を用いて追試を行なっていく必要がある。具体的には高橋・繁桝(2008)の方法論に従い、マキャベリアニズム尺度に加えてサイコパシー傾向尺度やセルフモニタリング尺度といったマキャベリアニズムと類似の概念を測定している複数の尺度を組み合わせた測定を行う計画である。これによりマキャベリアニズムと抑うつの関連について信頼性の高い測定方法を確立した後には、これまでの大学生を対象とした研究ではなく、Web調査による一般サンプルを対象とした研究を行なうことでより一般性の高い知見を獲得できることを目的とする。研究1では海外の研究者が考案した心の理論課題の日本語版を作成し、その妥当性を示した。