hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
カルシウムポンプ異常症ダリエー病の抗紫外線治療への試み

ダリエー病患者が自然界の紫外線(UV)暴露により症状悪化に至るメカニズムを解明するため、培養表皮細胞を用い、プロスタグランジンE(PGE)・PGE受容体(EP1-4)刺激を介する本疾患責任遺伝子ATP2A2遺伝子の発現制御を調べた。siRNA導入によるEP1-4発現の抑制下でUV照射を行った。UV照射によりEP4発現は増加し、UV誘発性のATP2A2抑制はsiRNAによるEP4ノックダウンで解除されATP2A2発現量が回復した。EP4作用薬・拮抗薬での効果は確認されず、臨床的応用には効果的なノックダウン方法の探索が必要だが、EP4がUV照射時のATP2A2発現に抑制的に関与する事が示唆された。ダリエー病では、表皮細胞小胞体に分布するカルシウムポンプであるATP2A2遺伝子産物の低下が、皮膚症状を引き起こすと考えられている。本症患者で自然界の紫外線(UV)暴露から症状悪化に至るメカニズムを解明し、抗UV効果のある治療法を明らかにするため、平成26年度は培養表皮細胞において、PGE受容体の作用薬投与下、拮抗薬投与およぴプロスタグランジンE(以下PGE)受容体siRNA導入によるPGE受容体(EP1-4)発現の抑制下でUV照射を行い、ATP2A2発現の変化を明らかにした。測定はReal-time PCRでのPGE受容体mRNA定量、ATP2A2mRNA定量、ウエスタンブロット法によるATP2A2タンパク定量、Flow cytomeryによるPGE受容体タンパク定量により行った。その結果、UV照射によってPGE受容体mRNA発現量が増加すること、PGE受容体siRNA導入によってUV照射なし/あり両者でPGE受容体mRNA発現量が低下することを、Real-timePCRにより確認した。Flow cytometryによるPGE受容体のタンパク定量においても、同様の結果が得られた。次に、siRNA導入によりEP1-4ノックダウンを行った培養表皮細胞において、UV照射を行い、UV誘発性のATP2A2発現抑制の変化を調べた。その結果、EP1-4のうち、ノックダウンによってATP2A2mRNAレベルが回復する、すなわちUV誘発性のATP2A2発現低下が抑えられるPGE受容体があることが、Real-time PCRでのATP2A2mRNA定量によって見出された。ウエスタンブロット法によるATP2A2遺伝子発現タンパク(SERCA2)定量においても、同様の結果が得られた。これらの結果から、UV照射時のATP2A2発現に抑制的に関与することが示唆されるPGE受容体を選定を進めている。平成27年度はUV照射によるPGE産生から、関与の示唆されたPGE受容体のシグナル回路、小胞体カルシウムポンプの異常へと至るメカニズムを解明する計画である。ダリエー病では、表皮角化細胞小胞体に分布するカルシウムポンプであるATP2A2遺伝子産物の低下が、皮膚症状を引き起こすと考えられている。本症患者で自然界の紫外線(UV)暴露から症状悪化に至るメカニズムを解明し、抗UV効果のある治療法を明らかにするため、培養表皮細胞において、PGE受容体の作用薬投与下、拮抗薬投与下およびプロスタグランジンE(PGE)受容体siRNA導入によるPGE受容体(EP1-4)発現の抑制下でUV照射を行い、ATP2A2発現の変化を明らかにした。その結果、UV照射によってEP4mRNA発現量が増加すること、EP4siRNA導入によってUV照射なし/あり両者でEP4mRNA発現量が低下することを、Real-time PCRにより確認した。Flow cytometryによるEP4タンパク定量においても、同様の結果が得られた。次に、siRNA導入によってEP1-4ノックダウンを行った培養表皮細胞において、UV照射を行い、UV誘発性のATP2A2発現抑制の変化を調べた結果、EP4ノックダウンによってUV誘発性のATP2A2発現低下が抑えられること、またUV照射なしの表皮細胞においてもEP4siRNA導入のみでATP2A2発現量が増加することが、Real-timePCRでのATP2A2mRNA定量によって見出された。しかし、EP4作用薬投与下でのATP2A2発現量低下はみられず、またEP4拮抗薬投与下での紫外線照射でUV誘発性のATP2A2発現抑制は解除されなかった。これらの結果から、臨床的に応用するにはEP4発現を効果的にノックダウンする方法の探索が必要であるが、EP4がUV照射時のATP2A2発現に抑制的に関与する事が強く示唆された。ATP2A2発現に関連があると考えられるPGE受容体の選定のため投与実験を行った薬剤については、ATP2A2発現に明らかな変化が見られなかった。

受容体阻害薬・拮抗薬の作用が、RNA発現段階でおきるのか、タンパク発現段階でおきるのか、発現後におきるのか、機序が不明であり、薬剤の効果を定量することが困難であった。投与効果の増強・減弱など時間毎の経過も考慮し、薬剤効果が不充分なのか、薬剤効果はあるがATP2A2発現に影響を及ぼしていないのかを、薬剤調整、実験条件を変更し結果を検証する作業を繰り返したため、時間を要した。そのため、計画を変更し、siRNA導入によるPGE受容体のノックダウン実験を行った。その結果、siRNAによるノックダウンが十分なされていたかを、RNAレベル、タンパクレベルで確認することができ、またATP2A2発現に関連が強いと考えられるPGE受容体の選定について、関連があると考えられるプロスタグランジン受容体を見出すことができた。UV照射やsiRNA導入に伴うPGE受容体(EP1-4)発現量の変化については、Real-timePCRによるmRNA定量によって明らかにした。PGE受容体タンパク発現量の変化については、ウエスタンブロットにより測定したが、Flow cytometryによる測定も行って比較したところ、後者のほうがより明瞭にタンパク発現量の変化を示していた。当初の計画と異なる手法を用いることにより、実験の準備等に時間を要したが、それにより新たな実験結果を得ることができた。平成26年度の実験結果から、PGE受容体のうち、ATP2A2発現に関与のある受容体があること、その受容体を選択的にノックダウンすることによりATP2A2発現が回復し、本症のUV照射による悪化が抑えられる可能性が示唆された。角化異常症平成27年度は、4種のPGE受容体のうち、各受容体ノックダウン下でのUV誘発性ATP2A2発現変化の評価が進行中のものについて、まずこれらを推進し、ATP2A2発現への関与がもっとも強いPGE受容体を同定する計画である。ノックダウンの手法については、平成26年度の実験結果から、培養表皮細胞へのsiRNA導入による方法を優先する。また、測定方法については、UV照射後のPGE受容体ンパク定量が、Flow Cytometryによって明瞭に示されたため、今年度も引き続きFlowcytometryを目的タンパク発現量の評価に用いる。ATP2A2発現に関して、阻害による抗UV効果の明らかなPGE受容体については、UV照射時にPGE産生から小胞体カルシウムポンプの異常へ至るメカニズムを解明するため、PGEシグナル回路を担うタンパク質のmRNA、タンパク質定量、細胞質カルシウム濃度勾配の変化を測定し、ダリエー病悪化時の疾患病態に迫る。ATP2A2発現への関与があると考えられるPGE受容体についてはsiRNA導入による抑制下でUV照射を行い、細胞内カルシウム濃度の回復状況を明らかにする。平行してATP2A2遺伝子の転写調節因子Sp1の作用を探索する。Sp1はATP2A2遺伝子の転写調節に促進的な役割を担うとの報告、PGEにより活性化されるとの報告、PGE受容体EP4の活性化への関与などの報告があるため、Sp1のUV照射下での発現状況を明らかにする。
細胞性粘菌のオーガナイザー領域形成メカニズムの解明

下等真核生物であるモデル生物「細胞性粘菌」の移動体先端部は、他の移動体に移植するとあらたな移動体を形成する能力を持つのでオーガナイザーである。本研究は、細胞性粘菌のオーガナイザー形成メカニズムを解明することを目的とし、移動体先端部を構成するpstA領域の発生・分化を解析した。pstA領域には少なくとも2種の細胞群(pstA1、pstA2)が存在することを明らかにし、それぞれの細胞群の発生における起源と、細胞分化に関わる転写因子MrfA(Myelin-gene Regulatory Factor A)を同定し解析した。粘菌オーガナイザーの機能が欠失していると考えられるマルチチップ株(mt変異体)について、変異遺伝子を同定するためLibrarycomplementation、REMIによるサプレッサースクリーニングを行い、20株ほどの候補に対してシークエンス解析により遺伝子を同定、さらに遺伝子破壊等によって解析を行ったが、結果的にターゲットは同定できなかった。しかしながら、その過程で調べた遺伝子の一つであるtgrB1遺伝子がmt変異体でほとんど発現がないことをつきとめた。tgrB1は細胞表面に存在する細胞識別因子である。サプレッサーのほとんどでtgrB1の発現が回復していることから、mt変異体ではtgrB1の発現制御に欠陥があることが示唆された。変異遺伝子の同定には全ゲノムシークエンスが必要と判断し、平成22年度は基礎生物学研究所との共同利用研究で実施する予定である。pstA細胞で特異的に発現するecmA遺伝子のプロモーター解析により同定したシス領域(R3R4)について、結合因子を精製しマス分析により候補転写因子を数種類同定した。そのなかで、すでにecmAのリプレッサーとして報告したStatCと、新規転写因子のRcdKについて、遺伝子破壊や一分子蛍光分析システムによる相互作用などを解析中である。pstA2マーカー候補遺伝子のSSK861(omt12)については、GFP/RFPによる発現系が構築でき、pstA1とのダブルラベルにより、pstA1とpstA2はことなる細胞群であることを明らかにできた。さらにpstA2はすでに増殖期で分化していることも明らかになった。これはいままで粘菌の分化は飢餓処理後であるという常識を覆す大発見である。pstA2の増殖期での分化は、娘細胞、孫細胞にomt12の発現がうけつがれることから、エピジェネティックな転写制御が関わっていることが予測された。粘菌オーガナイザーの機能が欠失していると考えられるマルチチップ株(mt変異体)について、mt変異体の欠陥を回復させる因子について実験を行い、野生株とmt変異体の混合培養で欠陥が相補されることを見いだした。さらに、この相補作用は野生株の培養上清をmt変異体に処理することによっておこることが明らかになった。これらの結果は、発生初期におけるオーガナイザー機能の一つであるチップドミナンスの制御が、分泌性の物質により担われていることを示唆しており、今後の研究展開が期待できる。これまでで基本的な実験はほぼ終えたので、今年度は論文作成用のデータの取得を行った。また、変異遺伝子の同定のため、基礎生物学研究所との共同利用研究でゲノムのリシークエンスを昨年度から継続して遂行中である。pstA1マーカー遺伝子のecmAの転写制御に関わるrcdK遺伝子の破壊株は作成が完了し、分化マーカーによる解析や、リコンビナントタンパク質の作成とバンドシフト実験などの基本的なデータ取得は完了した。現在論文作成にむけて準備中である。さらにGFPタグによる解析で、シグナルが細胞膜にある細胞と、核にある細胞とに別れていたため、局在による制御が予想された。よって、ポリクローナル抗体を作製し、この現象を調べている。pstA2細胞の増殖期での分化は、娘細胞、孫細胞にマーカー遺伝子omt12の発現がうけつがれることから、エピジェネティックな転写制御が関わっていることが予測されたが、今年度はプロモーター解析を中心に研究を進め、制御に重要なシス配列を同定した。また、DNAのメチル化によって転写制御を受けている証拠が得られている。粘菌オーガナイザーの機能が欠失していると考えられるマルチチップ株(mt変異体)について、野生株とmt変異体の混合培養で欠陥が相補されることが昨年度までにわかっていたが、今年度は回復させる因子についてさらに追究した所、野生株が存在しなくても、低濃度(1microM)のアデノシンの添加のみでmt変異体の欠陥が相補されることを見いだした。走化性物質のcAMPを用いたニードルアッセイにおいては、周期的な細胞運動の逆転が観察されるが、これもアデノシンの添加で正常に戻った。これらの結果は、発生初期におけるオーガナイザー機能の一つであるチップドミナンスの制御にアデノシンシグナルが関わっていることを示唆している。

いままでに知られていたアデノシンの効果は2mMという高い濃度でみられることから、mt変異体ではアデノシンに対する感受性がかなり高くなっていると思われ、データがそろい次第論文発表する予定である。mt変異体における変異遺伝子の同定のためのゲノムリシークエンスは終了したので、H24年度は基礎生物学研究所との共同利用研究でデータ解析を行っている。pstA1マーカー遺伝子のecmAの転写制御に関わるrcdK遺伝子については、現在論文投稿後のリバイス中である。さらにFRAGとMYCのダブルタグによる解析で、rcdKは他にあまり例が知られていない膜拘束型転写因子であり、特定の部位の切断による局在制御があることがわかったので、今後の研究により詳細を明らかにしていく。pstA2細胞の増殖期での分化は、エピジェネティックな転写制御をうけるが、今年度はひきつづきポイントミューテーションなどのプロモーター解析を進めた。また、セルソーターで分離したVSCとpstA2をもちいて高速シークエンサーによる解析を計画し、今後の新たな研究展開の準備を行っている。
NOと活性酸素の発がんにおける役割

慢性感染や慢性炎症のある組織では、活性化したマクロファージや好中球からスーパーオキシド(O_2)^-のみならず一酸化窒素(NO)が生成されており、NOの発がんへの関与が考えられる。本研究ではNOおよび酸素ラジカルによる酸化的DNA損傷およびその機構について以下の諸点を明らかにした。(1)NO、O_2^-同時発生試薬では細胞内の酸化的DNA損傷(8-OH-dG)が増大したが、NO発生試薬だけでは変化しなかった。種々の発がん性ニッケル化合物は好中球および活性化マクロファージからのO_2^-、NO生成を促進した。ニッケル化合物で活性化したマクロファージとセルセパレーターを用いてニッケルを直接暴露させない様にco-incubationした細胞内で8-OH-dG生成が増加した。8-OH-dG生成量と炎症細胞からのNOおよびO_2^-生成量が相関したため、この細胞内8-OH-dG生成増加に、NOとO_2^-の関与が与えられた。ニッケル化合物の発がん機構として炎症を介した酸化的DNA損傷の関与が示唆された。(2)単離DNAを用いた実験では、NO発生試薬とO_2^-発生系の共存下においてDNAは酸化的に損傷され、8-OH-dGも生成した。DNA損傷の塩基特異性は無く、活性種は、NOとO_2^-が反応して生成したペルオキシナイトレイト(ONOO^-)関連の物質と考えられた。(3)発がん性が指摘されているAmesテスト陰性の環境化学物質が、金属や生体内還元物質の存在下において活性酸素を生成しDNAを損傷した。このような環境化学物質の直接的な酸化的ストレスによるDNA損傷のみならず、環境化学物質により活性化された炎症細胞由来の活性種による間接的なDNA損傷およびそれらの相互作用によるDNA損傷の検討も必要である。現在、様々なO_2^-生成系と活性化マクロファージからのNOを用いてNOとO_2^-およびONOO^-による細胞傷害性を検討中である。
陰茎勃起を司る中枢機能の加齢による変化

従来、加齢による勃起能の低下は陰茎海綿体における機能低下が主たる要因と考えられてきた。この要因の関与は無視できないが、しかし、勃起能は脳、脊髄の高次機能による統合的調節を受けていることは明らかであり、加齢による勃起能の低下もこの調節との関係は無視できないと思われる。しかし、加齢によう勃起能の低下に中枢機能がどのようにかかわっているのかは詳細には検討されていない。この詳細が部分的にでも明らかになれば新しい勃起能低下治療薬の開発にも結びつく可能性がある。中枢機能に影響される勃起能の研究が発展してこなかった原因の1つは、この関係を的確に評価できる実験モデルがなかったことである。最近、われわれは性機能の中枢である視床下部の内側視索前野(MPOA)の電気刺激により陰茎勃起を誘発するラットモデルを確立した。本研究では、1)陰茎勃起能の評価方法としての海綿体内圧測定の妥当性検証と加齢による変化2)除睾あるいはテストステロン補充などによる内分泌環境の変化と勃起能、の2点を中心に検討を行った。除睾によるテストステロン低下により、勃起能の指標である電気刺激による陰茎海綿体内圧は著明に低下した。この低下の程度は中枢を介した勃起のほうが、末梢を介した勃起より大きかった。テストステロンの補充により、中枢および末梢を介した勃起能の回復が認められた。以上の結果から、加齢による勃起能の低下には中枢を介した機序の関与が無視できず、この機序をターゲットとした治療方法の開発が必要ではないかと推測された。本年度においては、まず中枢電気刺激モデルの確立を行った。これは、視床下部内側視索前野(MPOA)の電気刺激により、陰茎勃起を誘発し、海綿体内圧を測定するものである。また同時に、海綿体神経の電気刺激による勃起反応の測定も可能である。このラットモデルを用い、本年度は男性ホルモンの中枢及び末梢神経電気刺激による勃起反応に対する影響を検討した。まず本年度は若年ラットを用い去勢後、経時的に中枢(MPOA)及び末梢(海綿体神経)神経刺激を行い勃起(海綿体内圧)の推移を検討した。去勢後、海綿体神経電気刺激により勃起反応は、2、4,8週後と徐々にその反応が低下した(去勢前0.57±0.05、2週後0.35±0.05、8週後0.30±0.05:海綿体内圧/血圧比)。去勢後8週においても非刺激時と比較し有意な上昇を認めていた。それに対し、中枢(MPOA)電気刺激による勃起反応は、2週後より著明に低下した(去勢前0.68±0.04、2週後0.12±0.02、8週後0.12±0.02:海綿体内圧/血圧比))。2、8週後では非刺激時と刺激時において有意差を認めず、つまり中枢刺激においては全く勃起反応が生じなかった。つまり去勢の影響は中枢刺激をを介した勃起反応に対しより強く現れた。これらの結果より、MPOAに始まる勃起反応を司る神経経路を介した勃起反応が性ホルモンに依存的であることが示唆された。逆に海綿体神経の刺激による勃起反応では、性ホルモンに非依存性な部分があることが示唆された。これまで、去勢の影響は雄の性行動において多くの検討がなされてきた。しかし純粋な勃起反応に対する影響を検討した報告は少なく、本年の我々の研究成果は、勃起を司る中枢への男性ホルモンの影響を解明する第一歩であると考えられる。さらにホルモン補充によるモデルを作成し、性ホルモンの勃起中枢への影響をさらに詳細に検討中である。本年度は我々が確立した内側視索前野(MPOA)電気刺激モデルを用いて、男性ホルモン(testosterone)補充による勃起反応に対する影響を検討した。

加齢は勃起障害の最も重要な要因のひとつである。しかし加齢は多くの要因が関与する現象であり、加齢による勃起障害の要因を明らかにすることは容易ではない。加齢による勃起機能低下の要因としてtestosteroneの低下などの内分泌学的変化が推測されている。しかしtestosteroneレベルと勃起機能の関連はいまだ明らかではない。本年度我々が明らかにしたデーターはtestosteroneが中枢の電気刺激による勃起反応(陰茎海綿体内圧)に直接的に関与していることを示した。20週齢のコントロールラットのMPOA及び海綿体神経電気刺激による、海綿体内圧/血圧比は0.73±0.05、0.65±0.03、(平均±標準誤差)であった。20週齢のラットを去勢後2週、4週、8週においてMPOAの電気刺激による海綿体内圧は刺激前と比較し有意な上昇を認めず(ICP/BP比2週、4週、8週,0.14±0.01、0.13±0.01,0.12±0.02)、勃起反応は消失した。しかしながら海綿体電気刺激による海綿体内圧は、非去勢群と比較すると有意に低下するものの、刺激前と比較し有意に上昇していた(ICP/BP比2週、4週、8週,0.37±0.03、0.32±0.03,0.30±0.02)。これは去勢の影響が中枢においてより強く出現するものと思われた。持続注入ポンプを皮下に埋め込み100μ/dayのtestosteroneの補充を行うと中枢性の勃起反応の改善が認められた(ICP/BP比0.68±0.11)。現在検討中であるが50μ/dayのtestosteroneの補充ラットにおいては、MPOAの電気刺激による海綿体内圧は、100μ/dayのtestosteroneの補充と比較し低下が認められている。さらに勃起機能を維持するために、必要なtestosteroneレベルを検討中である。これらの結果は今後、加齢による男性性機能の低下に対するホルモン補充療法の有用性を検討する上で、貴重な実験的根拠となるであろう。特に勃起能を維持するためのtestosterone閾値を明らかにすることは、ホルモン補充療法の適応を明確にすると共に、治療をより安全にするものと思われる。これまでのわれわれの検討において、加齢ラット内側視索前野(性中枢)の電気刺激による一計海綿体内圧がテストステロン(T)補充による上昇することを見出した。そこで、本年度はこの結果の再現性を検討するとともに、性中枢への刺激と末梢(海綿体神経)との刺激による勃起反応(海綿体内圧)が、去勢およびT補充によりどのような変化受けるかを同じ実験モデルで検討した。20週齢のラットを去勢し、去勢後2、4、8週後に中枢および末梢の電気刺激を行い海面内圧の変化(海綿体内圧/血圧比=ICP/BP ratio)を検討した。さらに、8週齢のラットを去勢後6週目からテストステロンペレット(50mg)の皮下投与によるT補充を行い投与後2週目に上記と同様の検討を行った。血中T値は去勢前の79.1ng/dlであったが、去勢2週後では5ng/dlに著明に低下した。テストステロンペレットの移植後8日目では血中T値は838ng/mlと顕著に増加した。中枢刺激では対照群のICP/BP ratioは0.750±0.134であったが、去勢後2週目:0.138±0.035、4週目:0.131±0.081、8週目:0.123±0.049と有意に低下した。しかし、T補充群では0.676±0.103と対照群とほぼ同じでT補充による海綿体内圧の回復が観察された。
実験的水腎症ラットにおける腎カリクレイン-キニン系についての研究

水腎症における腎カリクレイン-キニン系の役割について研究する目的で下記の実験を行った。1片側性水腎症モデルとして8週のWistar系雄性ラットを用い、エーテル麻酔下に開腹し、左尿管下端を2-0絹糸にて吊り上げ皮膚にに固定し尿管を完全閉塞させ左水腎症を作成した(片側性水腎症群)。48時間後に固定していた絹糸を除去し閉塞を解除した。偽手術として左尿管の剥離のみを行った(コントロール群)。2手術前日より術後7日間まで毎日24時間蓄尿を行った。24時間尿量を測定後遠沈し上清を-80度Cに凍結保存した。採取した尿についてMCA蛍光法により尿中カリクレインを測定した。以下のような結果を得た。1)術前の尿中カリクレインはコントロール群、片側性水腎症群それぞれ1.739、1.912U/dayで有意差は認めなかった。2)手術後1日目ではそれぞれ1.188と0.609U/dayと片側性水腎症群で低下していた。3)手術後7日目ではそれぞれ0.955と1.156U/dayと片側性水腎症群の方が若干高かった。3下部尿路通過障害による両側性水腎症モデルとして8週のWistar系雄性ラットを用い、エーテル麻酔下に開腹し、膀胱頚部を2-0絹糸にて吊り上げ皮膚に固定し尿道を完全閉塞させ両側性水腎症を作成した。24時間目(A群)および48時間目(B群)に固定していた絹糸を除去し閉塞を解除した。偽手術として膀胱頚部の剥離のみ(C群)を行った。4上記と同様に尿中カリクレインを測定し、以下のような結果を得た。1)術前の尿中カリクレインはA群B群C群それぞれ1.235、1.210、1.455で有意差は認めなかった。2)手術後7日目ではA群B群C群それぞれ1.272、0.318、0.955で、B群で有意に低下していた。以上から片側性の場合や閉塞時間が短い場合には尿中カリクレインは上昇する傾向が認められるが、閉塞時間が長くなると低下することが示唆された。1.後天性水腎症モデルとして10週のWistar系雄性ラットを用い、左尿管に対して下記のような片側性水腎症モデルを作製した。A群:完全閉塞、B群:部分的狭窄、C群:偽手術2.急性期の実験として術後1、7日目に開腹し、分腎尿を採取後、両側腎摘出を行い、水腎症の程度を評価分類した。3.採取した尿は直ちに遠沈後、上清を-80度に凍結保存した。4.摘出した腎は直ちに皮質を約100mg採取し、0.1M Tris-HCL bufferで調整した1%トリトン液でhomogenizeした。0度C 3000rpm 20分間遠沈後、上清を-80度に凍結保存した。

1.術後1日目の腎にはABC群ともに形態的有意な変化を認めなかった。2.術後1日目の尿および腎組織カリクレイン活性に有意な差は認められなかった。3.術後7日目の腎ではA群は大部分に腎盂の拡大を認めたが、B群においては水腎症の程度にばらつきが多かった。以上より、完全閉塞の場合にはカリクレイン活性は増加する傾向が示唆された。しかし、B群については一定の傾向を見い出すには至っておらず、Ulm and Miller法による尿管の部分的狭窄の作製方法に若干の工夫が必要と思われる。水腎症における腎カリクレイン-キニン系の役割について研究する目的で下記の実験を行った。1片側性水腎症モデルとして8週のWistar系雄性ラットを用い、エーテル麻酔下に開腹し、左尿管下端を2-0絹糸にて吊り上げ皮膚にに固定し尿管を完全閉塞させ左水腎症を作成した(片側性水腎症群)。48時間後に固定していた絹糸を除去し閉塞を解除した。偽手術として左尿管の剥離のみを行った(コントロール群)。2手術前日より術後7日間まで毎日24時間蓄尿を行った。24時間尿量を測定後遠沈し上清を-80度Cに凍結保存した。採取した尿についてMCA蛍光法により尿中カリクレインを測定した。以下のような結果を得た。1)術前の尿中カリクレインはコントロール群、片側性水腎症群それぞれ1.739、1.912U/dayで有意差は認めなかった。2)手術後1日目ではそれぞれ1.188と0.609U/dayと片側性水腎症群で低下していた。3)手術後7日目ではそれぞれ0.955と1.156U/dayと片側性水腎症群の方が若干高かった。3下部尿路通過障害による両側性水腎症モデルとして8週のWistar系雄性ラットを用い、エーテル麻酔下に開腹し、膀胱頸部を2-0絹糸にて吊り上げ皮膚に固定し尿道を完全閉塞させ両側性水腎症を作成した。24時間目(A群)および48時間目(B群)に固定していた絹糸を除去し閉塞を解除した。偽手術として膀胱頸部の剥離のみ(C群)を行った。4上記と同様に尿中カリクレインを測定し、以下のような結果を得た。1)術前の尿中カリクレインはA群B群C群それぞれ1.235、1.210、1.455で有意差は認めなかった。2)手術後7日目ではA群B群C群それぞれ1.272、0.318、0.955で、B群で有意に低下していた。以上から片側性の場合や閉塞時間が短い場合には尿中カリクレインは上昇する蛍光が認められるが、閉塞時間が長くなると低下することが示唆された。
低学力児の学習過程の分析と治療学習に関する研究

能力との関係で捉えられるいわゆる学業不振児ではなく、教室で大きな比率を占める相対的に学力の低い子供を、「低学力児」と規定し、その教育に資する目的で、彼らの学習過程の分析と治療学習の研究を取り進めた。1.低学力児は、特定の教科にとどまらず、どの教科の学習にも困難を示すのが一般的であるが、中でも抵抗の大きいのが、数学関連の学習である。そこで、本研究では、算数教科を中心に、小学校児童を対象に、臨床的方法によって、個別の指導を徹底する形で検討した。2.学習過程に関して結論的にいえば、彼らの理解・習得過程は、基本的には他の児童と変わるところはない。即ち、具体的には、彼らの学習過程におけるつまずきの性質(つまずく箇所)は、学力的に優れた児童のそれと同じである。違いは、そのつまずきの程度として現れる。従って、その指導、ないし、治療的指導の原則は、ステップを細かくし、より多くの時間を掛けることにあるといえる。3.従って、そこで重要となるのは、児童の学習の最小単位を確定しながら、指導内容を細分化し体系化していくことである。その目的を具体化する取り組みとして、ここでは、治療学習の現実的の課題の一つとしての初期の数の学習に関する以下の内容について、新しい観点と原理に基づいての分析と徹底した体系化を行った。(1)一桁加法の難易分析(2)一桁乗法の難易分析(3)二桁加法の類型化と体系化(4)二桁、三桁減法の類型化と体系化(5)二桁×一桁乗法、三桁×一桁乗法の類型化と体系化さらに、治療学習へのコンピュータの活用も試み、問題点を指摘した。
インフォームド・コンセントの法社会学―動態分析に基づく行動規律モデル

インフォームド・コンセントはその基盤を法に置きつつも倫理的に有効な同意プロセスであり、和田・中西の三極のナラティヴメディエーションモデルによるShared Decision Making過程の関係構築が効果的であった。このモデルの検証を、患者・家族、医師、医学生教育、医療有害事象等の調査で有効性を確認した。また、被害と感情について、原発事故の浪江町の調査も実施した。本研究の成果で強調したい点は、このモデルは政策的に評価を受け、2012年1月、厚生労働省の診療報酬政策の患者サポート支援体制のため基本策定資料として採用され、同年(2012年)4月より、医療対話推進教育として公布施行された点である。22年度は研究の初年度であり、その計画は、当初の計画通り実施できた。主として文献や資料、統計、判例など、医療における自己決定にかかわる文献の検討を中心に実施した。質的学会への参加も実施し、質的検討をし、関連学会で「ナラティヴベイスドセイフティマネジメントの提案」として発表した。上記、先行研究と文献などの検討と並行して、国内外での次年度以降の本格的参与観察研究の準備のため、実施病院候補になるような施設の医療事故・インフォームド・コンセントの実態に対する医療者のインタヴュー調査を実施した。具体的には、山形大学付属病院、市立敦賀病院、大阪警察病院、石巻赤十字病院、国立循環器病センター、岩手千厩病院、北里大学病院、複数の産科クリニックなどと既に非公式の折衝で肯定的回答を得た。その結果から、わかりやすい言葉によるリスク認知や、解釈による認知のリスク、インフォームド・コンセントにおける対話の在り方に、本研究の意義、思考過程の方向性が妥当的であることを実感し、メディエーション概念の有効性の示唆を得た。医学生についても医学教育の面から、山形大学の医学部生に、当事者の同意を得て、質的インタビューを実施し、データ調査中である。また、米国での研究計画については、ほぼ実施でき、9月に、コロンビア大学Law SchoolのCarol Liebman教授、ペンシルバニア大学のCenter for BioethicsのArthur L.Caplan、Edward J.Bergman両教授と、関連病院のMagee Rehabilitation Hospitalで、Caroline Cupp(Levy),M.Div氏、Emily Askin氏Ethics Consultationと、Consultationに関してはその欠点を、メディエーションアプローチによって改善しようとしている人とインタヴュー調査ができ、発表講演も実施した。次年度は、更なる文献研究により理論仮説を構築し、かつ研究実施準備が整い次第、研究を実施したい。次年度の計画に向けて、次の研究計画の準備はできていると考えている。平成23年度の研究実施計画の9項目のうち、6項目を達成した。そのほかの3項目は、当初の計画通り平成25年まで継続計画実施の予定である。以下、実施した項目について、報告する。1.不快情動における紛争の情動因子について、患者・家族に質問紙調査を計画し実施した。IC文献や関連する学問分野の先行研究を参考に、研究調査し解析した。その回答結果を元に否定的対人感情の形成における「認知経路」と「情動経路」の影響力を比較し、「認知経路」において否定的対人感情の形成に影響を及ぼす責任帰属要因を示した。データの検証と解析の結果、情報報共有による認知再構成を得られる可能性が示唆され、医療メディエーションの否定的感情を伴うコンフリクト場面での役割が示唆された。以上の結果を、日本医療マネジメント学会で発表した。2.同意と承諾を得たうえで、倫理規定に基づきながら、参与観察による質的対象とのデータの収集の策定を開始した(平成25年まで計画実施の予定)。1.と2.のデータ結果等からIC過程に影響するファクターを抽出し、いくつかの要因関連モデルを構築することを試みて、生理学的な変化に着目し、自律神経系の研究に着手した。今後は、それらモデルの構造と規定要因を探索するために、医療機関の医師、患者を対象に更なる研究や調査を実施して、IC過程の複数のパターンを抽出し各要因を構築している要因を明らかにしていこうと検討を継続中である。3.文化的影響の比較検証のため海外の患者団体・医療制度の情報収集をした(報告予定あり)。4.医療者における謝罪と司法と医療安全と有害事象について、そのデータを解析し、日本医療・病院管理学会で発表した。組織横断的研究のため、日本医療コンフリクトマネジメント学会を設立した。5.医学教育での共感についての既存尺度を用いた研究調査を実施分析し、国立病院機構医学会総会の学術集会で発表した。平成24年度の研究実施計画の9項目は、当初の計画以上に達成した。収集したデータについて分析、要因連関のパターンモデルを抽出するための研究調査、海外の情報・文献収集の検討から、ICとはどのような要因によって規定されるのかについての調査を進め、学会発表や論文作成を実施した。

1フランス、中国の医療制度調査など、文献・判例等の基礎研究を実施し、2012年6月Law and Societyで、演題名「Preventing Medical Malpractice: An International Comparison」で発表した。27月「有害事象への対応(国際比較)」としてトヨタ財団シンポジウムで発表した。3医療者の職種別ストレスと医療安全の関係について解析し10月日本医療・病院管理学会で発表した。4医療コンフリクトマネジメント学会で健康概念との関連を発表した。5生理学的な変化に着目した自律神経系の研究結果を10月自律神経学会で発表した。また、11月臨床麻酔科学会でも別の観点からICに及ぼす影響としてポスター発表した。6前年度学会発表した医学教育での共感研究の一部を論文にまとめ公刊された。72013年3月中国の上海交通大学で開催されたEast Asia Law and Societyで、「Promise of Mediation Approach in Healthcare Settings in Japan」を発表した。また、上海法政学院大学で医師と患者の信頼関係について学生講義を実施した。8診療報酬政策の患者サポート支援体制の医師患者関係の対話モデルとして、2012年4月より医療メディエーションモデルの研究データが採用され、厚生労働省の基本策定資料として提示された。9共感とMediationモデル、医療メディエーションと有害事象対応など論文投稿中である。全国規模の学術集会で、研究に関連した調査を実施し、解析した結果について、3学会で発表できたこと。患者・家族・市民団体を対象にした「不快情動」における紛争の情動因子と医師の態度との関係において専門領域の医療メディエーションモデルとの影響を明らかにできそうな手応えを感じていること。医師と患者との生理学的実験の構想に着手したこと。著書を公刊したこと。25年度が最終年度であるため、記入しない。昨年度は、研究・調査・分析・学会発表・論文作成・論文発表と、非常に努力した。以下、5点に簡潔に述べることとする。1全国規模の学術集会で、研究に関連した調査を実施し、解析した結果について、国際学会2学会、国内学会3学会で発表できたこと。2医療政策として、診療報酬体制に、医療メディエーションモデルが基本策定資料として採用されたこと。3患者・家族・市民団体を対象にした「不快情動」における紛争の情動因子と医師の態度との関係において、医学生理学的実験研究や質的研究の検討から、専門領域の医療メディエーションモデルとの影響を明らかにできそうな手応えを感じていること。4英語論文2編、邦語論文3編を公刊できたこと。5まだまだ法社会学的には学究し進展させて行く必要があるが、インフォームド・コンセントとリスク認知の要因分析から、共感・意思決定と医療メディエーションモデルとの関係をあきらかにできたこと。
実環境下の損傷敏感試料に微細領域の動態観測技術をもたらす半導体電子ビーム源

次世代の電子顕微鏡技術には、電子線損傷に敏感な試料だけでなく、液中など実環境下でその動態や反応へ観測機能を拡張させることが求められている。このような要求に応えるには、従来を遥かに超える電流密度と単色性だけでなく、既存技術にはない高密度電子パルス特性が電子源に必要不可欠である。本課題では、既存とは異なる電子放出原理の光電効果を利用し半導体から電子ビームを取り出す半導体フォトカソードに着目し、半導体の材料・構造・表面の追求と半導体フォトカソードに適した電子銃装置の研究開発により、電子顕微鏡の観測機能の拡張に適した低単色・高密度のパルス電子ビーム生成の実現を目指す。熱電子放出型、電界放出型と進んできた電子顕微鏡の電子源として半導体フォトカソードによる電子ビーム源を実現しようとする課題である。フォトカソードの最適化により、高速、高強度ビームを実現して、ブラウン運動や観測対象の運動をより速く観測することを目指している。さらに、実環境下にある生体物質の高品質な観測も視野に入れている。電子顕微鏡にブレークスルーをもたらしうる研究課題である。電子ビームによる損傷に敏感な生体試料の高速動態計測を可能にするなど、次世代電子顕微鏡の実現を目指す研究で、液中にある生体物質の高品質な計測も可能になることが期待できる。電子源の半導体化は広い分野への応用性があり、波及効果も高い。
集積アルキニル化による機能性芳香族アセチレンの高効率合成

複数のエチニル化反応を集積することにより、機能性エチニルアントラセン誘導体の合成法の効率化に取り組んだ。発光および光応答機能が期待される非対称置換9,10-ビス(フェニルエチニル)アントラセン(BPEA)誘導体を標的化合物とした。10-プロモ-9-アントラアルデヒドに対してフェニルエチンとのSonogashiraカップリング続いてベンジルスルホン誘導体とのワンショット二重脱離反応(同一時空間集積)を行うと、高い全収率で目的化合物が得られた。反応の順番を逆にしても良好な結果が得られた。2つの反応をワンポット法(時間集積)で行うために反応条件を最適化した結果、Sonogashiraカップリングの反応溶液に二重脱離の試薬を一挙に加えると反応が円滑に進行した。以上の方法により、一方のフェニル基にメチル、ブロモ、ニトロ基などの置換基をもつ新規非対称BPEA誘導体を効率的に合成することに成功した。これらの反応をさらに組み合わせて、共役を伸長したBPEA誘導体およびBPEAオリゴマーを合成した。合成した芳香族アセチレンの紫外可視吸収スペクトル、蛍光スペクトルおよび蛍光量子収率を測定し、光学的な性質と機能性を関連化合物と比較した。アントラセンとアントラキノンを組み合わせたハイブリッド型環状アセチレン化合物を合成した。これらの化合物はパイ-パイ相互作用のために、溶液中で比較的強く会合して二量体を形成する。STM測定を行うと、液体/グラファイト界面において層状の規則的な分子配列が観測された。このような配列様式を決定する要因を、分子間相互作用の観点から考察した。新しい機能性物質を創成するために,芳香環とくにアントラセンへのアルキニル化および関連反応を集積して,機能性共役系化合物の実践的合成法の開発を行った。アントラセンへの位置選択的アルキニル化をモデルとして,ワンポットおよびワンショット法を用いた時間・空間反応集積を実現するために反応条件を最適化した.まず,発光性機能が期待される非対称置換9, 10-ビス(フェニルエチニル)アントラセン誘導体を行った.10-ブロモ-9-アントラアルデヒドとベンジルスルホン誘導体を用いてワンショット法(時空間集積)で二重脱離反応を行い,続いてフェニルエチン誘導体とのSonogashira反応により2つめのエチニル基を導入することにより,目的化合物が簡便な操作で得られた.これらの反応をさらに組み合わせて,9, 10-ビス(フェニルエチニル)アントラセンを基本構造にもつオリゴマーの合成に成功した.また,2-クロロアントラキノンまたはアントロンから出発して,金属アセチリドの付加反応とKumada-Tamao-Corriuカップリング反応を順次行い,シリルエチニル基を2つまたは3つもつアントラセン誘導体を合成した.クロスカップリング反応において配位子としてP^tBu_3を用いると,塩化物も比較的容易にエチニル化された.脱シリル化の条件検討およびカップリングによるジアセチレン誘導体の合成も行った.これらの新規多エチニル化合物の構造と分光学的性質を調べ,とくに蛍光性物質としての機能を評価した.複数のエチニル化反応を集積することにより、機能性エチニルアントラセン誘導体の合成法の効率化に取り組んだ。
高分子―液体間ナノ界面における高分子鎖シミュレーション解析

本研究では、粗視化シミュレーションを用いて高分子ー液体間ナノ界面における界面場中における高分子鎖のコンフォメーションとダイナミクスを明らかにし、1分子鎖のサイエンスの観点から、高分子ー液体間界面がソフト界面となりうるメカニズムを明らかにすることを目的として進めている。2012年度は、高分子鎖が部分的に溶けた状態について、高分子鎖の粗視化モデルを用いて構築し、シミュレーションを行った。部分溶解するポリマーとして、溶ける粒子と溶けない粒子のランダムコポリマーとして扱うこととし、DPDモデルで記述した。結果として、下記にあげる3つの状態、4種類の構造が得られた。1)Flat swelling surface、2)Fluctuating swelling surface、3)inhomogeneous Dissolved structure、4) homogeneous Dissolved structureである。1)は、界面近傍に溶ける成分が偏析して、分子鎖スケールで膨潤構造が生成する状態を表す。2)は、界面近傍に溶ける成分が偏析するが、界面に溶ける成分が偏析できる量よりより多い成分が偏析した際に、界面の面積を稼ぐために界面に揺らぎが現れてくる状態を表す。3)は、巨大なミセル状となり、不均一な状態ではあるが、ポリマーが溶けている状態を指す。4)は、ポリマーがほぼ液体の中で均一分布しながら溶けている状態を指す。また、溶ける成分の割合と溶ける成分における溶媒粒子との間の非結合相互作用を変えた際の相図についての作成も行い、これらの構造の生成について検証することができた。また、領域内での連携研究を目的に、粗視化シミュレーションにおける研修コースを実施し、多くの方の参加の中、将来的に連携を模索するための研修を行うことができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、粗視化シミュレーションを用いて、高分子-液体間ナノ界面における界面場中における高分子鎖のコンフォメーションとダイナミクスを明らかにし、1分子鎖のサイエンスの観点から、高分子-液体間界面がソフト界面となりうるメカニズムを明らかにすることである。実験として、九州大学の田中らの実験研究によって、本来水に溶けないポリメチルメタクリレート(PMMA)におけるPMMA-水界面において、厚さが10nmを超えるナノ膨潤層が報告されている。本研究では、高分子の粗視化モデルを用いたシミュレーション用い、高分子と液体の間の相互作用パラメータを変えることで、非溶解状態・膨潤状態・溶解状態の3つの状態の相境界について分子鎖がわかるシミュレーションを用いて明らかにすることにある。H23年度に実施した研究テーマは、以下の2つについて検討した。1)液体-高分子薄膜界面のモデル化を行う。2)1)で決定したモデルを用い、高分子の各粒子と溶媒との間の相互作用等を変えながら、非溶解状態から膨潤状態、溶解状態への状態の転移をシミュレーションで、記述する。この結果、平均場法を用いたモデル、及び散逸粒子動力学(DPD)法を用いたモデルの2つのプロトタイプのモデルを用いることで、非溶解状態、膨潤状態、溶解状態を記述できることが示された。平均場法を用いたモデルにおいては、密度分布によって、3つの状態の記述に成功した。また、DPD法を用いたモデル化においては、分子鎖で可視化できるものとして、3つの状態の記述に成功した。これらのモデルは、実際に九州大学で行われている実験に見られる非平衡な膨潤状態の記述をまとめの研究として行うことに適用できるものであり、研究における1つの段階をクリアすることができた。さらに、H23年度は、公募研究の1年目にあたるが、本新学術領域において行なわれている実験研究について情報収集を行い、理論・シミュレーションからのアプローチにより、ソフト界面で見られる構造・現象・物性等のメカニズム解析において貢献できる研究テーマについて検討し、複数の連携の候補を見つけることができた。

当初の研究計画どおり、初期のモデルの構築に成功し、また、領域内における連携テーマの探索も進めることができたため。24年度が最終年度であるため、記入しない。H24年度については、申請時には大規模計算を行なう予定であった。本年度は、より簡便かつ汎用性が高い手法をとる方法がいいと考え、研究室にある計算機でまかなえる中規模の計算を行い、モデル化とうまくハイブリッドさせることで、当初より目標としていた実験結果をうまく再現できる精度高いモデル化を目指すこととした。なお、以前より規模が大きな計算を行うために、並列化シミュレーションプログラムの導入のための準備も既に行っている。
実験動物および家畜における発生工学(クローン化,核移植)に関する基礎・応用的研究

本研究では、まず実験小動物であるマウスを用いて胚の切断2分離と割球の単離によりクローン胚を作出し、胚の発生能力を調べた。次にマウス卵子および胚を用いて核移植実験を行い、核移植の基礎技術を確立し、核移植胚の発生能力について検討した。同時にウシ卵子の体外成熟、体外受精および体外培養技術の改良を進め、得られたウシ卵子および胚を用いて核移植実験を実施し、核移植胚の体外および体内での発生能力など基礎的な検討を行った。その結果、以下のことが明らかとなった。1.マウス切断2分離胚の発生:マウス2分離胚の体内における消失、発育の遅延および大きさの減少とその後の胚発育の修復過程が明らかとなった。2.マウス4細胞期胚の単一割球の発生:2、4および8細胞期単為発生卵と4細胞期胚の割球の集合により毛色キメラ産子が得られた。3.マウス核移植胚における発生の初期化:成熟未受精卵細胞質はマウス28細胞期胚由来の核を初期化する能力を持っていることが判明した。また、核と細胞質との相互作用が核移植胚の初期化に非常に重要な要因であり、核移植胚の完全な初期化のためには、細胞周期の初期ステージにある胚の核を除核成熟未受精卵の細胞質に移植することが重要であることが明らかとなった。4.ウシの体外受精卵子と体外受精卵を用いた核移植:初期胚の発育に影響すると思われる各種の要因を検討することにより、化学的組成の明らかな限定培地を用いたウシ体外受精卵の培養が可能となり、胚盤胞を多数作出できた。体外成熟卵子と体外受精卵を用いたウシ核移植技術について検討した結果、ドナー胚にノコダゾール処理を行い、エタノールとシクロヘキシミドの複合活性化処理を加えた若齢卵子をレシピエントとして用いた場合、胚盤胞期への発育率が改善されることが明らかとなった。ウシ核移植胚をレシピエント牛に移植した結果、産子が得られた。マウス核移植胚の初期化について研究を行い、その内容は以下の5つに要約される。1.ドナー核(核体)とレシピエント卵細胞質の融合に有効な電気融合法について検討を行い、その最適条件を明らかにした。2.核移植の一つである核の前核置換を行い、核と細胞質の影響を調べた。その結果、前核置換胚の発育は、レシピエント由来によって影響され、F1マウスの細胞質がレシピエントとして適していることを明らかにした。3.レシピエントとして除核1細胞期胚を用いた場合、核胚移植の発育は細胞質の細胞周期ステージおよび細胞質量によって影響され、3040%の細胞質量を減少させた後期1細胞期胚の除核細胞質に2細胞期胚由来の核を移植することによって、発育が向上するが、4細胞期以降の核の初期化は難しいことを明らかにした。4.レシピエントとして成熟未受精卵細胞質を用いた場合、核移植胚の前核様構造の形成、染色質構造および核移植胚の発育は核の細胞周期ステージによって影響され、初期ステージの核を移植すると、1つの前核様構造を形成して、高い確率で初期化が起こり、核移植胚の発育が向上することを明らかにした。5.細胞周期の初期ステージにある2,4および8細胞期胚の核を移植することによって、胚盤胞への高い発育率と産子を得た。とくに、4および8細胞期胚由来の核移植では、世界で初めて産子を得ることに成功した。

以上のように、細胞周期の初期ステージにある核を成熟未受精卵の除核細胞質に移植することによって、核移植胚の初期化が高率に起ることを明らかにした。核移植では、ドナー胚割球の細胞分裂を同期化することができれば、特定の分裂時期(細胞周期)のドナー核が多く得られ有利である。そこで、今回ノコダゾール処理したウシ胚を用いて、ドナー胚割球の分離時期が割球の細胞分裂にどのような影響を与えるかを検討した。媒精99時間後の16-細胞期胚を10μMノコダゾールで12時間処理し、ノコダゾール解除後、1)直ちに0.5プロナーゼにより透明帯除去と割球分離を行って培養(3および5時間)した区(分離胚)、2)さらに、培養(3および5時間)を継続した後、透明帯除去と割球分離を行った区(全胚)について割球数と分裂率を調べた。3)核移植のドナー核としてノコダゾール解除後3時間目の割球を用いて作成した再構築胚の胚盤胞への発育率および細胞数を調べた。成熟培養22時間目のMII期卵子は、第1極体付近の卵子細胞質を約1/3吸引することにより除核を行った。ヘキスト染色によって除核されたことの確認された卵子は、成熟培養38時間目に7%エタノールによる5分間の活性化処理を施し、42時間目に融合を行った。核移植胚は、核融合147時間後まで培養した。ノコダゾール解除後、直ちに割球分離を施した分離胚に比べ、割球分離を行わなかった全胚の割球分裂率が有意に増加した(表1)。さらに、核移植のドナー核として用いて作成した再構築胚では、全胚を用いた場合、分離胚に比べ、分裂率と胚盤胞への発育率は有意に低下した。(表2)。以上の結果より、ノコダゾール解除後の割球分離時期が割球分裂に影響を与えることが明らかとなった。さらに、核移植後のドナー核として用いて作成した再構築胚の発育にも影響を及ぼすことが示唆された。発生工学的手法を用いた胚の体外操作は、家畜の改良・増殖および有用実験動物の作出を目的として行われている。本研究では、両生類および実験小動物で進められてきた核移植・クローン動物作成の技術をウシなどの家畜に応用し、その発生学的基礎知見を得るとともに、優良家畜の増殖と母性からの遺伝的改良法としてのクローニング技術の確立を目的とした。平成56年度は、ウシおよび実験小動物であるマウスを用いて核移植を実施しクローン動物を作出した。本年度は、マウスを用いて胚の切断2分離と割球の単離によりクローン胚を作出し、胚の発生能力を体内(in vivo)および体外(in vitro)で調べた。その結果、以下のことが明らかとなった。1.マウス切断2分離胚の発生:マウス2分離胚のin vivoにおける消失、発育の遅延および大きさの減少とその後の胚発育の修復過程が明らかとなった。また、桑実胚における細胞数の著しい減少は、胚の代償的な発育を調節する能力だけでなく、子宮の脱落膜反応やin vitroにおける原始内胚葉と卵円筒の形成に影響を及ぼすことが明らかとなった。2.マウス4細胞期胚の単一割球の発生:エタノール刺激によるマウス単為発生卵の発育は、卵子の老化、卵丘細胞の有無、エタノール処理時間および培養密度によって影響を受けることが明らかとなった。2、4および8細胞期単為発生卵と4細胞期胚の割球の集合により毛色キメラ産子が得られた。