hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ショウジョウバエの近縁種比較に基づく遺伝子量補償機構の分子進化過程の解明

X染色体においても常染色体に比べても偽遺伝子化の速度が上昇していること、(2)Neo-Y遺伝子が偽遺伝子だとNeo-X上の相同遺伝子が発現上昇する傾向にあること、が改めて明らかになった。また、Neo-X染色体上に存在し精巣で発現する遺伝子は偽遺伝子になりやすいこと、逆に卵巣で発現する遺伝子は偽遺伝子になりにくい傾向があることも明らかになった。このことはNeo-X染色体がメス化していることを示唆する。これらの成果の一部を論文としてNature Communications誌に発表した。一方で、H27年度に作成した遺伝子量補償複合体の抗体2つに関しては、その質を確認する予定であったが、研究機関の異動に伴い予定通りに実験できなかった。そのためChIP-seqに関しては進展させることができなかった。また同様の理由から、D. mirandaにおけるMSLノックアウト変異体の作成も進めることができなかった。以上の理由から1年間の補助期間延長を申請し、了承していただいた。H28年4月1日付で首都大学東京に異動し、研究環境のセットアップに時間を要した。その結果、ChIP-seqの実験を進めることができなかった。また、D. mirandaにおけるMSLノックアウト変異体の作成も進めることができなかった。H29年度はH27年度に作成した遺伝子量補償複合体の抗体2つ(ポリクローナル抗体)に関して、ウェスタンブロッティングなどにより抗体の質を確認した。その結果、どちらの抗体も特異性という点において不十分な点があり、ChIP-seqに使用するのは難しいと判断した。そこで、ショウジョウバエの免疫沈降(ChIP)用抗体として市販されている3つのクロマチン修飾抗体(転写活性化領域のクロマチン修飾マーカーであるH3K4me3、転写不活性化領域のクロマチン修飾マーカーであるH3K27me3、遺伝子量補償領域のクロマチン修飾マーカーであるH4K16Ac)を購入した。Neo性染色体を持つDrosophila mirandaの3齢幼虫のオスをサンプルとし、これらの抗体を用いてChIPを行い、ChIP-PCRにより濃縮率を計算した。その結果、H3K4me4抗体に関しては200倍程度の濃縮率となり、良好な結果であったものの、残り2つの抗体には濃縮率が5倍程度であり、ChIPがうまくいっているか判定できなかった。しかし、本年度が最終年度であったため、これらのChIPサンプルとコントロールサンプルを用いてライブラリ作成を行いイルミナHiSeqを用いてシーケンスした。しかし、やはりChIPサンプルが良好でなかったためかレプリケート間でのばらつきが大きく、あまり有用な情報は得られなかった。本研究課題5年間の結果をまとめ、Neo-Y染色体の退化とNeo-X染色体に生じる遺伝子量補償に関する論文をまとめ、現在投稿中である。性染色体が一対の常染色体から進化すると、通常Y染色体は組換えの機会を失い退化する。
鼻・副鼻腔内翻性乳頭腫の発生とその癌化に関する分子生物学的研究

1.鼻・副鼻腔内翻性乳頭腫の癌化例、癌合併症例の臨床病理学的検討当科において過去20年間に経験した鼻・副鼻腔内翻性乳頭腫の癌合併例・癌化例は11例であった。その内、初発時に癌を合併していた症例が7例、再発を繰り返すうちに癌化した症例が4例であった。これらの症例を病理学的に調べたところ、癌合併例では全例に乳頭腫から異型上皮を経て扁平上皮癌に移行する像が認められた。癌化例では4例中3例において、癌化する前の乳頭腫組織に異型上皮が部分的に認められていた。このことより、鼻・副鼻腔内翻性乳頭腫は、異型上皮を経て癌化する前癌病変とみなされ、鼻副鼻腔癌の発生のメカニズムを遺伝子レベルで解析する上でよい対象となることが確認された。2.鼻・副鼻腔内翻性乳頭腫の癌化例、癌合併症例におけるp53遺伝子異常発現の検索上記の乳頭腫の癌化例、癌合併症例について、癌抑制遺伝子であるp53の異常発現の有無を免疫組織学的に調べた。乳頭腫組織では11例中8例の上皮基底層にのみにp53陽性所見がみられた。異型上皮では10例中8例においてp53陽性所見が上皮の2/3以上にわたりみられるようになり、扁平上皮癌では11例中8例においてp53が異常発現していた。p53の異常発現は鼻・副鼻腔内翻性乳頭腫の癌化の初期の段階で関与している可能性が示唆された。3.鼻・副鼻腔内翻性乳頭腫において過剰に発現しているmRNAの検索まず、鼻・副鼻腔内翻性乳頭腫の手術時に得られた腫瘍組織及び正常組織よりmRNAを抽出後、逆転写酵素によりcDNAを作製した。ランダムプライマーによるPCR法でcDNAを増幅した後,fluorescent differential display法にて両組織で発現変化の認められるcDNAを複数検出した。このcDNAの塩基配列を決定し、両組織における遺伝子発現のパターンを現在調べているところである。
光ファイバセンサを用いた複合材料・構造のヘルスモニタリングシステム

本研究では、複合材料積層板の内部に光ファイバセンサを埋込み、複合材料中に発生するき裂、とくにトランスバースクラックや層間剥離などを監視する知的複合材料クラック発生・進展モニタリングシステムを構築する試みを行った。埋込む光ファイバセンサとしては、、光ファイバブラックグレーティングセンサ(FBG)を用いた。被覆のある通常のFBGセンサに加え、被覆を除去して感度を良くしたFBGセンサも用いた。また、従来より細い直径をもつ光ファイバ(クラッド径40ミクロン、被覆径52ミクロン)を用いた、プリプレグ1層内に埋込み可能であるFBGセンサも使用し、比較を行った。(1)光ファイバが埋込まれた材料にトランスバースクラックが発生したときの、光ファイバ周辺のひずみ分布を理論的、数値解析的に明らかにした。その場合、光ファイバの埋め込み位置、積層構成についても検討し、ひずみ分布に与える影響を体系的に明らかにした。(2)光ファイバセンサを複合材料に埋めて、クラックによる集中ひずみが光ファイバセンサの出力に与える影響を実験的に明らかにするとともに、理論との比較を行った。(3)センサによって測定される内部ひずみや反射光の周波数分布とクラック位置や発生数との関係を体系的に求めた。(4)埋め込み位置、埋め込み手法、積層構成と出力との関係も同時に検討し、クラック検出に最適な光ファイバセンサの埋め込み構成を明らかにした。(5)細径光ファイバ(クラッド径40ミクロン、被覆径52ミクロン)を複合材料中に埋め込む技術、光コネクタ技術の開発を行った。(6)トランスバースクラック発生に伴い生じる反射光の周波数分布は、トランスバースクラック発生・進展プロセスを定量的に評価する指標として有用であることを示した。本研究では、複合材料板の内部に光ファイバセンサを埋め込み、複合材料中に発生するき裂、とくにトランスバースクラックや層間剥離を監視する知的複合材料クラック発生・進展モニタリングシステムを構築する試みを行っている。埋め込む光ファイバセンサとして、損失変化型プラスチック光ファイバセンサ、光ファイバブラックグレーティングセンサ(FBG)、光ファイバファブリー・ペローセンサ(FPI)を用いた。本年度は、以下の手順で研究を進めた。(1)光ファイバが埋め込まれた材料にトランスバースクラックが発生したときの、光ファイバ周辺のひずみ分布を理論的に明らかにするために、3次元有限要素法を用いて検討した。その場合、光ファイバの埋め込み位置、積層構成についても検討し、ひずみ分布に与える影響を求めた。(2)光ファイバセンサを複合材料に埋めて、クラックによる集中ひずみが光ファイバセンサの出力に与える影響を実験的に明らかにした。(3)損失変化型プラスチック光ファイバセンサについては、光強度損失量とトランスバースクラック発生数およびクラックによる内部ひずみとの関係を明らかにした。(4) FBGおよびFPIに関しては、センサによって測定される内部ひずみや反射光の周波数分布とクラック位置や発生数との関係を明らかにした。(5)また、埋め込み位置、埋め込み手法、積層構成と出力との関係も同時に検討し、クラック検出に最適な光ファイバセンサの埋め込み構成を明らかにした。本研究では、複合材料板の内部に光ファイバセンサを埋込み、複合材料中に発生するき裂、とくにトランスバースクラックや層間剥離を監視する知的複合材料クラック発生・進展モニタリングシステムを構築する試みを行っている。埋込む光ファイバセンサとして、損失変化型プラスチック光ファイバセンサ、光ファイバブラックグレーティングセンサ(FBG)、光ファイバファブリー・ペローセンサ(FPI)を用いた。また、従来より細い直径をもつ光ファイバを用いた研究も行っている。(3)損失変化型プラスチック光ファイバセンサについては、光強度損失量とトランスバースクラック発生数およびクラックによる内部ひずみとの関係を体系的に求めた。(4)FBGおよびFPIに関しては、センサによって測定される内部ひずみや反射光の周波数分布とクラック位置や発生数との関係を体系的に求めた。(5)埋め込み位置、埋め込み手法、積層構成と出力との関係も同時に検討し、クラック検出に最適な光ファイバセンサの埋め込み構成を明らかにした。(6)細径光ファイバ(クラッド径40ミクロン、被覆径52ミクロン)を複合材料中に埋め込む技術、光コネクタ技術の開発を行った。

(1)光ファイバが埋込まれた材料にトランスバースクラックが発生したときの、光ファイバ周辺のひずみ分布を理論的、数値解析的に明らかにした。その場合、光ファイバの埋め込み位置、積層構成についても検討し、ひずみ分布に与える影響を体系的に明らかにした。(2)光ファイバセンサを複合材料に埋めて、クラックによる集中ひずみが光ファイバセンサの出力に与える影響を実験的に明らかにするとともに、理論との比較を行った。(3)センサによって測定される内部ひずみや反射光の周波数分布とクラック位置や発生数との関係を体系的に求めた。(4)埋め込み位置、埋め込み手法、積層構成と出力との関係も同時に検討し、クラック検出に最適な光ファイバセンサの埋め込み構成を明らかにした。(5)細径光ファイバ(クラッド径40ミクロン、被覆径52ミクロン)を複合材料中に埋め込む技術、光コネクタ技術の開発を行った。(6)トランスバースクラック発生に伴い生じる反射光の周波数分布は、トランスバースクラック発生・進展プロセスを定量的に評価する指標として有用であることを示した。
発達障害の胎児期診断にむけた行動学的アプローチ

REM睡眠中にみられる眼球運動は、中枢神経系機能の評価指標としても用いられている。32-36週の早産児の研究では、REM睡眠の活動性が6か月時の認知発達と相関しており、予後予測の指標になると報告されている。本研究では、EM密度、EM burstといったREM活動性に関する妊娠週数による推移を検討した。対象は、24週から40週までの単胎胎児である。超音波断層装置を用い60分間胎児眼球運動の観察を行った。解析の結果、EM密度、EM Burst密度は妊娠週数の経過とともに増加し、複数の変曲点が認められた。これらの結果をもとに、今後胎児REM活動と中枢神経系機能予後との関連について検討を行っていく。発達障害は、近年その数が急増し社会問題化している。発症原因の多くは胎児期にあることが、疫学研究、動物実験により指摘されている。しかしながら、ヒトの発達障害に関する研究は主として幼児期以降に行われており、胎児を対象とした行動生理学的研究はこれまで報告されていない。本研究では、胎児期の行動観察による定量的指標を作成し、生後発達との関連さらには発達障害につながる行動特性を明らかにすることを目的としている。平成26年度には、研究への協力の同意を文書で得られた症例約50例において胎児期の眼球運動、口唇運動の観察を行った。現在、次の4項目について解析を行っている。a.眼球運動期、無眼球運動期の持続時間、b.眼球運動期に出現した眼球運動の累積度数、c.眼球運動の上下、左右、斜め方向への運動数の全眼球運動数に占める割合、d.口唇運動の頻度、リズム、眼球運動期との関連性。また、胎児の姿勢制御に関して、チルト台を用いて母体を立位から仰臥位まで変化させることで、胎児の姿勢変化および運動に関して3例からデータ採取を行った。今後症例数を増やし解析を行う予定である。発症原因の多くは胎児期にあることが疫学研究、動物実験により指摘されている。本研究では、胎児期の行動観察による定量的指標を作成し、生後発達との関連さらには発達障害に繋がる行動特性を明らかにすることを目的としている。平成27年度には、研究同意を文書で得た症例約40例、前年度と合計すると約90例について、胎児眼球・口唇運動の観察・解析、母体の姿勢変化に伴う胎児姿勢変化の観察、音刺激に対する反応、馴化・脱馴化反応を観察するための音刺激システムの開発を行った。胎児期データを採取した症例の出生後の睡眠覚醒状況等、発達に関する情報収集を質問票にて行っている。胎児眼球運動(EM)に関して、REM期の活動性の指標であるEM密度、EM burst密度を週数毎に測定した。EM密度は、眼球運動期1分あたりのEM数である。EM burstは個々の眼球運動から次の眼球運動までが1秒未満で2回以上連続して出現した場合と定義した。その結果、EM密度は、妊娠24-26週; 5.6±1.4(mean±SD),妊娠27-29週; 8.2±2.4,妊娠30-32週; 9.9±2.2,妊娠33-35週; 9.8±3.8,妊娠36-38週; 10.6±3.7と増加傾向を認め、EM Burst密度においても、妊娠24-26週; 1.06±0.38,妊娠27-29週; 1.87±0.64,妊娠30-32週; 2.22±0.52,妊娠33-35週; 2.24±0.90,妊娠36-38週; 2.35±0.91と増加傾向を認めた。いずれも妊娠24-26週、妊娠27-29週で、有意に増加していた。発達各段階のREM期の活動性が神経系の予後と関係しており、REM活動性の変曲点、各週数の最適なREM活動を知ることは極めて重要と考える。今後、予後評価を行っていく。胎児期に行う観察項目として6項目、症例数は各々50例を予定している。本年度においてすでに1項目で50例の観察を行っているが、その他の項目では症例数が不足しており、この点において達成度としてはやや遅れている。胎児医学予定している、胎児の観察項目は6項目あり症例数は各々50例を予定している。1項目については、研究目的を達成しつつある。その他の項目について症例数を増やし、解析を同時にすすめていく予定である。

解析および解析に用いるソフトウェアを開発するための人件費が、予定より減額したこと、研究の進捗がやや遅れたことによる物品購入費の減額が次年度使用額が生じた理由である。研究の進捗にともない物品購入を行い、解析のために人件費の使用を行っていく予定である。
トロピカルトーリック多様体上の交点理論

平成20年度は,おもにトロピカル非特異トーリック多様体内の超曲面が固有に交わる場合の交点重複度のトロピカルな公式,および,固有に交わらない場合を含めて交叉積を扱う研究を実施した.トロピカル非特異トーリック多様体内のいくつかの超曲面が固有に交わり,かつ,0次元の交叉をもつときに,交点重複度の一般的な公式の予想を得た.これは前年度に,3次元トロピカルトーリック多様体に関して得られた公式の拡張になっている.3次元の場合には,ヒューリステイクな証明は得られたが,数学的な証明について現在,検討を続けている.4次元までは3次元と同様に議論できるが,5次元以上では,超曲面の固有な交わりが0次元になる場合でさえも,交わりの多様性から3,4次元の議論では不十分であり,2次元の場合に利用した射影公式に代わる方法を研究中である.一方,中間次元のサイクルを含めた交叉積の定式化において,代数幾何におけるサイクルの交わりと,そのサイクルのトロピカル化における交わりに生じる,固有性の違いについて焦点をあてて研究した.交点理論を考えるには,トロピカル射影トーリック多様体のようなコンパクトな多様体で考える必要があり,従来の安定な交叉だけでは交点理論を展開するには十分でなく,トーラス軌道が稠密な領域で固有でない交わりにおける交点重複度の定式化についていくつか候補を得た.平成19年度では,主に3次元トロピカルトーリック多様体上の交点重複度,およびトロピカルトーリック多様体の計算方法とグレブナー扇に関する研究を行った.3次元射影トロピカルトーリック多様体内の3つの一般の曲面の交叉に関して,トロピカルトーリック多様体の境界の頂点における交点重複度を定式化することができ,公式を予想した.この公式に関して発見的証明は与えたものの,厳密な証明をするためには場合分けが煩雑となるため,現在は他の証明方法を検討している.この予想される公式は,計算機を利用して多くの例の場合に正しいことが確かめられた.また,この公式を導く過程で,トロピカルトーラス部分多様体上での交点重複度の公式から,トロピカルトーリック多様体の境界部での公式を導く原理が見えてきた.この原理は3つの一般の曲面の交わりの場合には確かめられているが,高次元のトロピカルトーリック多様体内の交叉についてはまだ未確認であり,来年度の課題として引き続き研究を進める予定である.トロピカル多様体はグレブナー扇の部分扇であるため,計算に直接利用できなくてもグレブナー扇の観点からトロピカル多様体を考察することは有用である.グレブナー扇を求めるアルゴリズムを調べる目的で,サイクルグラフに付随するある種のイデアルについて,組合せ論的にグレブナー基底を求めるアルゴリズムを与えることができた.その応用として,そのイデアルに関するグレブナー扇を求めた.今年度は,研究の過程でトロピカル幾何に関する論文,書籍などの資料収集,および専門家との研究討論を行なった.今年度はトロピカル幾何の専門家であるミハルキン氏の来日もあり,有意義な討論ができた.平成20年度は,おもにトロピカル非特異トーリック多様体内の超曲面が固有に交わる場合の交点重複度のトロピカルな公式,および,固有に交わらない場合を含めて交叉積を扱う研究を実施した.トロピカル非特異トーリック多様体内のいくつかの超曲面が固有に交わり,かつ,0次元の交叉をもつときに,交点重複度の一般的な公式の予想を得た.これは前年度に,3次元トロピカルトーリック多様体に関して得られた公式の拡張になっている.3次元の場合には,ヒューリステイクな証明は得られたが,数学的な証明について現在,検討を続けている.4次元までは3次元と同様に議論できるが,5次元以上では,超曲面の固有な交わりが0次元になる場合でさえも,交わりの多様性から3,4次元の議論では不十分であり,2次元の場合に利用した射影公式に代わる方法を研究中である.一方,中間次元のサイクルを含めた交叉積の定式化において,代数幾何におけるサイクルの交わりと,そのサイクルのトロピカル化における交わりに生じる,固有性の違いについて焦点をあてて研究した.交点理論を考えるには,トロピカル射影トーリック多様体のようなコンパクトな多様体で考える必要があり,従来の安定な交叉だけでは交点理論を展開するには十分でなく,トーラス軌道が稠密な領域で固有でない交わりにおける交点重複度の定式化についていくつか候補を得た.
血小板-癌細胞相互認識による細胞内Ca^<2+>シグナリングの研究

血小板による癌細胞傷害反応初期段階における標的癌細胞、血小板両者の細胞内Ca^<2+>濃度の変動を経時的に測定し、細胞内Ca^<2+>濃度の変動が細胞傷害と如何なる関わりを持つかを検討した。標的細胞として血小板感受性株K562、LU99A、非感受性株MIA-PaCa2、Molt4の4細胞株を用いガラス底ディッシュに付着させた。ある実験では血小板をガラス底ディッシュに付着させた。付着癌細胞、付着血小板にはFluo-3を負荷し細胞内Ca^<2+>濃度の指標とした。Ca^<2+>濃度の変動はACAS570レーザーサイトメーターを用い単一細胞レベルで測定した。Fluo-3負荷標的細胞に血小板を加えると4種類の癌細胞のどれにも急激な細胞内Ca^<2+>濃度の上昇がみられた。K562の場合は瞬間的な上昇の後、元に戻ったが、LU99A、MLA-PaCa2、Molt4では100秒以上上昇した状態が持続した後、もとに戻った。外液にEGTAを加えても、どの癌細胞においても細胞内Ca^<2+>濃度は上昇した。thapsigaginで標的癌細胞を前処理すると4種類の細胞とも血小板を加えてももはや細胞内Ca^<2+>濃度の上昇はみられなかった。標的細胞をthapsigargin処理すると血小板の細胞傷害活性に対してK562は影響を受けず、LU99Aは感受性が低下し、元々非感受性のMolt4は感受性になった。Fluo-3負荷血小板に癌細胞を加えるとどの癌細胞でも血小板内Ca^<2+>濃度の上昇がみられ、この上昇は血小板をthapsigargin処理することにより抑えられた。thapsigargin処理血小板の細胞傷害活性は無処理に比べK562に対しては低下したがLU99Aでは変わらなかった。以上の結果から、(1)血小板刺激に伴う標的癌細胞内Ca^<2+>濃度上昇は小胞体からのCa^<2+>遊離によるものであるが、標的癌細胞によってCa^<2+>遊離が細胞傷害反応と直接関わりを持つ場合とそうでない場合のあること、(2)標的細胞により血小板小胞体内Ca^<2+>が細胞傷害活性に必要な場合と不必要な場合のあることが明らかとなった。
モノクロナール抗体によるウエルシュ菌ε毒素の構造と機能の解析

1.ε-毒素に対するモノクロナール抗体を作製し、ε-毒素の機能と相関するエピトープを明らかにすることを試みた。ε-毒素は強い致死活性を持つため、抗原として、まず、ε-毒素前駆体をホルマリンでトキソイド化したものを用いた。12クローンのハイブリドーマからモノクロナール抗体を得た。そのうち7種類の抗体がε-毒素の細胞毒性に対して中和活性を示したが、これらの抗体はいずれもε-毒素の高次構造を認識しており、phage peptide display cloningsystemによるエピトープの決定は明確な結果が得られなかった。そこで、N末端側領域(Lys-14Gly-139)、およびC末端側領域(Met-77Lys-296)からなるレコンビナント毒素を抗原として使用した。その結果、Ser-2Met-47、Met-47-Met-77、Met-77Asn-109、Gly-139Ala-173、Ile-206Lys-296の各領域と反応するモノクロナール抗体を産生するクローン細胞がそれぞれ4クローン、4クローン、22クローン、16クローン、34クローン得られた。それらのクローン細胞が産生するモノクロナール抗体を精製し、ε-毒素分子上のエピトープを検討している。すでに11箇所のエピトープを明らかにした。2.ε-毒素は、MDCK細胞膜上の非イオン界面活性剤不溶性膜領域(DRMs)に結合し、71量体を形成する。MDCK細胞をスフィンゴ脂質やスフィンゴ糖脂質の合成を阻害するfumonisin B1やPDMPで処理することによってε-毒素の細胞毒素活性が増加すること、スフィンゴミエリン合成の阻害剤であるD609や、G_<M1>ガングリオシドを添加することによって細胞毒素活性が減少すること、などからDRMsのスフィンゴ糖脂質がε-毒素の細胞毒性に影響を与えることを明らかにした。ウエルシュ菌(type BとD)の産生する致死毒素であるε毒素は、脳のシナプトソームやMDCK細胞膜上で7量体のporeを形成する。Poreの形成が毒素の活性発現に重要と考えられているが、膜上のレセプターやε毒素のレセプターとの結合領域は明らかにされていない。平成15年度の本研究では、ε毒素に対するモノクロナール抗体を作製し、得られた抗体の中から、ε毒素に対する中和活性を持つものを選択し、pore形成阻害、レセプターとの結合阻害、致死活性阻害の有無を明らかにするための実験を行った。ε毒素をホルマリンでトキソイド化して抗原とし、12クローンのハイブリドーマから。モノクローン抗体を得た。そのうち7種煩の抗体が毒素に対する中和活性を示したが、これらの抗体はいずれも毒素の高次構造を認識しており、そのエピトープ決定には至らなかった。そこで、ε毒素のN末端部分および、C末端部分を分断して致死活性を消失させ、さらに尿素で変性させたのち、それぞれを抗原としてマウスに免疫した。その結果ε毒素の一次構造を認識する抗ε毒素抗体を産生するハイブリドーマを約180個得ることができた。現在ハイブリドーマのサブクローニングと、毒素に対する中和活性を持つモノクロナール抗体を検索中である。今後引き続き中和活性を持つ抗体のエピトープを明らかにすることにより、ε毒素の機能ドメインの決定を行っていく。エピトープの決定はphage peptide display cloningsystemによって行う。また、エピトープのアミノ酸を部位

特異的変異導入法によって変異させたリコンビナント毒素を作製することにより、ε毒素の構造と機能の関係を明らかにしていく。1.ε-毒素に対するモノクロナール抗体を作製し、ε-毒素の機能と相関するエピトープを明らかにすることを試みた。ε-毒素は強い致死活性を持つため、抗原として、まず、ε-毒素前駆体(prototoxin)をホルマリンでトキソイド化したものを用いた。12クローンのハイブリドーマからモノクロナール抗体を得た。そのうち7種類の抗体がε-毒素の細胞毒性に対して中和活性を示したが、これらの抗体はいずれもε-毒素の高次構造を認識しており、phage peptide display cloningsystemによるエピトープの決定は明確な結果が得られなかった。そこで、N末端側領域(Lys-14Gly-139)、およびC末端側領域(Met-77Lys-296)からなるレコンビナント毒素を抗原として使用した。その結果、Ser-12Met-47、Met-47Met-77、Met-77Asn-109、Gly-139Ala-173、Ile-206Lys-296の各領域と反応するモノクロナール抗体を産生するクローン細胞がそれぞれ4クローン、4クローン、22クローン、16クローン、34クローン得られた。それらのクローン細胞が産生するモノクロナール抗体を精製し、ε-毒素分子上のエピトープを検討している。すでに11箇所のエピトープを明らかにした。2.ε-毒素は、細胞膜上の非イオン界面活性剤不溶性膜領域(DRMs)に結合する。MDCK細胞をスフィンゴ脂質やスフィンゴ糖脂質の合成を阻害するfumonisin B1やPDMPで処理することによってε-毒素の細胞毒素活性が増加すること、スフィンゴミエリン合成の阻害剤であるD609や、G_<M1>ガングリオシドを添加することによって細胞毒素活性が減少すること、などからDRMsの微小環境の変化がε-毒素の細胞毒性に影響を与えることを明らかにした。
電流検出型DNAチップによる実験動物病原体の病原遺伝子探索と定量検出系の構築

Helicobacterを属および菌種レベルで特異に検知可能な「LAMP/PCR増幅-DNAチップ検出系」を確立、再現よく短時間(1時間以内)に検知できることを確認した。野外材料(約600検体)を使った実用性評価でも、精度・感度・特異性などの点から、既存法(PCR法)と同等の特性が得られたのみならず、既存法では難しかった近縁菌種との区別が可能であった。以上の結果から、新しい実験動物微生物モニタリングシステムを構築できたと考えられた。本年度は電流検出型DNAチップの系を構築するため、従来PCR法を用いて行ってきたヘリコバクター検査についてPCR法で利用している16SrRNAの塩基配列をもとにチップの配列を設計し、さらに方法を簡便化するためにチップ検出前の核酸増幅をLAMP法にておこなうべく、検出系の構築を行い、従来法であるPCR法との比較を行った。対象ヘリコバクターはH.hepaticus,H.bilis,H.typhloniusおよびH.pyloriである。これらはマウスまたはヒトに病気を起こすことが知られている病原体であり、前者3種はそのうちマウスの微生物モニタリングでで特に問題となるものである。Helicobacterを属および4菌種レベルで特異に検知可能な「LAMP増幅-DNAチップ検出系」を確立、再現よく短時間(1時間以内)に検知できることを確認した。野外材料(約400検体)を使った実用性評価では一部PCR法と結果が不一致であった。これはPCR法において検出限界付近にあるものがLAMP-DNAチップの系で検出できないものであり、感度に関してはPCR法と比べ10倍ほど低いことが確かめられた。しかしこれらの菌数またはDNA量は野外材料ではほとんど得られない量(野外材料では十分量の菌数、DNA量が得られていた)であることから、既存法(PCR法)と同等の特性が得られたのみならず、既存法では難しかった近縁菌種との区別が可能であった。これまで実験動物の病原体としてMycoplasma pulmonis, Mouse hepatits virus, Tyzzer菌およびヘリコバクター属菌の検出を電流検出型DNAチップで行いこれら病原体の検出感度および特異性が、従来法であるPCR法とほぼ同等であることを示した。今年度はあたらな病原体としてMurine Norovirus(MNV)に着目し、本ウイルスのDNAチップによる検出を目指した。本ウイルスは2003年に最初の報告がなされたが、本邦における実験用マウスでの汚染率や検査法の検証も行われていない。我々はDNAチップによる検出法の確立に先立って、本ウイルスの本邦での汚染状況、従来のウイルス検査法であるPCR法の有用性、および本ウイルス検査に用いる至適な検査材料の検討を感染実験により明らかにした。その結果、野外材料からランダムに検体を選択し、RNA polymerase遺伝子部分を増幅するRT-PCRでは1検体から増幅バンドが得られ、塩基配列解析からもMNVであることが確認された。本材料を感染材料とした感染実験では、感染マウスに同居させたICRおよびscidマウスともに56日まで糞便から核酸が検出された。また、同感染scidマウス由来胎児からは本ウイルスは検出されず、帝王切開によるウイルス除去が可能であることも明らかとなった。疫学調査の結果では59の実験動物施設中15施設(25.4%)、245のマウス盲腸検体のうち33検体13.5%)でMNV陽性を示した。このことからMNV診断にはマウス糞便が有用であること、およびMNV感染は本邦においても広くみられることが明らかとなり、DNAチップを用いた本ウイルス検出系の確立はこれまで検討してきた他の病原体と同様に有用であり、本法が利用価値のあるものになりうることが示された。これまで電流検出型DNAチップによる診断法を確立した。今年度の研究ではこれら病原体診断以外、特に腸内細菌の検出および宿主の免疫応答迅速診断のためLactobacillus casei、Bacillus subtilisを用いて宿主マウスの免疫応答および菌の動態を調るため乳酸菌および納豆菌の経口投与がダニ抗原によるアレルギー性皮膚炎軽減に及ぼす影響をアトピー性皮膚炎好発マウスであるNC/Ngaマウスを用いて検討した。10週齢♀NC/NgaTnd Crjマウスの背部と耳介の毛を除毛し、ダニ抗原由来の軟膏(ビオスタAD)を週2回塗布してアトピー性皮膚炎を誘発させた。塗布開始と同時にLactobacillus casei(LC ; JCM1134株)またはBacillus subtilis ver natto(BS ; JCM20036)を1-3×10^<17>CFUを週6回、各5匹のマウスに経口投与した。陽性コントロールとしてアレルギー誘発・菌非投与群3匹、陰性コントロールとしてアレルギー非誘発群3匹を用いた。

実験開始4週後、皮膚肉眼病変の程度を発赤・出血、痂皮形成の程度、浮腫の程度および擦傷の程度をもとにスコア化し、および病理学的検索(HE染色およびトルイジンブルー染色)を行い皮膚の肥厚の計測、および肥満細胞の数を算定した。1.肉眼病変では陽性コントロールに比べて菌投与群ではいずれも病変の軽減が認められた。2,病理学的検索では菌投与群では皮膚の厚さが平均31.2μm(LC投与群)および34.3μm(BS投与群)であったのに対し、陽性コントロール群64.0μmではであり、陰性コントロール群では32.8μmであり、菌投与群では陽性コントロール群と比較し、有意に肥厚が軽減されていることが示された。3,肥満細胞数はHPFの5視野中にLC投与群では平均68 cell、BS投与群では69 cellおよび陽性コントロール群では139 cell、陰性コントロール群では49 cellであり、菌投与群では陽性コントロール群と比較し有意に肥満細胞の減少が認められた。以上の結果からダニ抗原によるアレルギー性皮膚炎はLCまたはBSの経口投与によって軽減されることが示された
腸管上皮リンパ球間クロストークによる免疫調節機構の解析

本研究は申請者がこれまで見出してきた「腸管組織の恒常性維持に必須の免疫調節機構は、上皮細胞と粘膜内リンパ球間における連鎖・協調によって制御される」という独自の概念や知見を基盤として、腸管上皮細胞とリンパ球とのクロストーク、およびそれによる粘膜内のサイトカイン分泌など免疫学的変動につて着目した。その結果、当該研究期間に得られた成果からCD66aの特異的シグナルがT細胞機能を変調させる事実が暗示された。すなわちこの分子によるT細胞受容体(TCR)シグナル調節の分子メカニズム、さらに恒常的な腸管粘膜の細胞間クロストークを介した免疫調節メカニズムの存在が示唆された。本研究は申請者らがこれまで見出してきた「腸管組織の恒常性維持に必須の免疫調節機構は、上皮細胞と粘膜内リンパ球間における連鎖・協調によって制御される」という独自の概念や知見を基盤として、腸管上皮細胞と粘膜内リンパ球とのクロストーク、およびそれによる粘膜内のサイトカイン分泌など免疫学的変動について着目している。その結果、本研究では当該研究期間に以下のような成果が得られた。1)レトロウイルスベクターGFP-RVおよびDsRed-RVを用いてマウスT細胞株における接着因子CD66aの各splice variantの過剰発現系を構築し、機能的解析を行った。これらのウイルスを感染させGFP+あるいはDsRed+細胞をsortingし、T細胞受容体(TCR)シグナル依存的な細胞増殖能を解析した結果、細胞内ドメインにチロシン残基を有するCD66aの過剰発現によってのみこれが抑制されることを確認した。2)野生型マウスから単離したCD4+T細胞に上記と同様の過剰発現を誘導した結果、TCR依存的な細胞増殖能のほか、IFN-γなどのサイトカイン産生能、またCD69などの活性化マーカーの発現も、やはり細胞内ドメインのチロシン存在下でのみ抑制されることを明らかにした。これらの研究結果はin vivoにおける生理的なT細胞機能をCD66aシグナルが変調させる事実を示唆している。さらに現在、この分子メカニズムがトランスジェニックマウスや疾患モデルにおいていかなる影響を与えるのか解析を進めている。1)テトラサイクリン応答制御システムを用いてT細胞株における接着因子CD66aの過剰発現系を構築し、生化学的解析を行った。その結果、in vivoにおけるT細胞受容体(TCR)の刺激によって誘導される特異的シグナルはCD66aの過剰発現によって有意に抑制されることが明らかになった。2)またそれと相関して、リコンビナントサイトカイン存在下においてTCRを刺激したときに誘導されるT細胞内のSTAT-4およびT-betの活性化もCD66aの過剰発現とリガンドによるその刺激によって有意に抑制されることが明らかになった。3)さらにこうした反応はCD66aの細胞内ドメインのある特定のtruncate変異株もしくはチロシン残基の過剰発現によってむしろ阻害されることが確認された。これらの研究結果はT細胞におけるCD66aの特異的シグナルが、少なくともin vitroにおけるTh1の誘導に対して抑制的に働く事実を暗示するものと思われる。さらにこの分子メカニズムがin vivoにおいて再現されるか否かについて現在解析を進めている。1)野生型マウスから単離したCD4+T細胞にレトロウイルスベクターGFP-RVおよびDsRed-RVを用いて接着因子CD66aの過剰発現を誘導してGFP+あるいはDsRed+細胞をsortingし、T細胞受容体(TCR)シグナルを解析した結果、細胞内ドメインの2つのチロシン残基に依存してTCRシグナルが抑制されることを確認した。2)T細胞特異的なCD66aトランスジェニックマウスから単離したCD4+T細胞の解析を行った結果も、上記と同様にTCR依存的な細胞増殖能のほか、IFN-γなどのサイトカイン産生能、またCD69などの活性化マーカーの発現が、やはり細胞内ドメインのチロシン残基の存在下で抑制され、さらに上皮細胞に発現する生理的リガンドやagonisticな抗体による細胞外ドメインの刺激によって、こうした反応が一層顕著になることが明らかとなった。

これらの研究結果はin vivoにおける生理的なT細胞機能をCD66aシグナルが実際に変調させている事実を示唆する。さらに現在、この分子メカニズムが関連すると考えられる異種細胞間とのクロストークに着目し、その解析を進めている。消化器内科学腸管粘膜の免疫調節機構は上皮細胞とリンパ球のクロストークが根幹にあり、CD66aがその中枢を担っていることに着目しているが、生理的なin vivoにおけるT細胞の機能解析もCD66aによって調節され得ることが実証されたことは大きな成果であるといえる。われわれが提唱する腸管粘膜の免疫調節機構は上皮細胞とリンパ球のクロストークが根幹にあり、CD66aがその中枢を担っていることに着目している。今回T細胞内におけるそのシグナルを解析した結果、in vitroで実証されたことは大きな躍進である。今後はさらに詳細にT細胞におけるCD66aの機能を解析するとともに、遺伝子改変動物や疾患モデルを用いてin vivoにおけるダイナミックな表現系の解析を行う予定である。今後はさらに詳細な分子メカニズムを解析するとともに、遺伝子改変動物を用いてin vivoにおけるダイナミックな表現系の解析を行う予定である。平成25年度末時点で、当該年度の機器保守契約費用の支払が完了していないため。また、試薬等が計画当初より廉価で購入可能であったため。検討する数・種類を拡大して解析を行うため、試薬を増量して購入する予定である。次年度はさらに詳細な分子メカニズムを解析するために、ウイルスベクターに関連する培養、分子生物学関連試薬、および遺伝子改変動物の交配、維持に必要な経費に使用する予定である。
糖脂質欠損マウスで強発現する遺伝子産物の神経系における新規機能の解析

昨年度に引き続き、α2,8-SiaTとβ1,4-GalNAcTをダブルノックアウトしたGM3-onlyマウスの中枢神経系において強発現する2つの遺伝子、S3-12とWisp2について解析を進めた。S3-12について・GM3-onlyマウスでは加齢に伴う神経変性がみられることから、アポトーシスが過剰に引き起こされていると推測し、週齢を追った小脳のcDNAサンプルを用いてqRT-PCRを行い、Fas、Fas-Lの遺伝子発現レベルを解析した。結果、GM3-onlyマウスではWTマウスに比べ、Fasの発現レベルが有意に上昇していた。・小脳の凍結切片を作製し、TUNEL法にてアポトーシス細胞を検出したところ、GM3-onlyマウスにおいて多くのアポトーシス細胞が観察された。・マウスミクログリア細胞株MG5に発現ベクターを導入してS3-12を過剰発現させ、Phagocytosis assayやBacterial assayを行ったところ、シリカビーズの貪食能や大腸菌の消化能力の亢進がみられた。・新生マウスの脳より初代培養ミクログリアを樹立し、免疫蛍光染色法よりS3-12のリソソームへの局在を、またqRT-PCR法よりLPS添加に基づくS3-12の発現上昇を観察した。Wisp2について・Wisp2を安定発現させたマウス神経芽腫細胞株Neuro2aでは、Aktのリン酸化レベルが有意に上昇しており、過酸化水素に対するアポトーシスが抑制された(MTT assayにより検出)。PI3KやAktの特異的な阻害剤であるLY294002やAkt-I-1/2存在化においては、Wisp2の過剰発現によるアポトーシス耐性がみられなくなることを観察した。・Neuro2a細胞においてWisp2は、Integrin-Aktシグナルを介してNeurite-outgrowthを促進し、また抗アポトーシス因子として働くことを明らかにして、論文として報告した.糖脂質合成遺伝子であるα2,8-SiaTとβ1,4-GalNAcTをダブルノックアウトしたGM3 onlyマウスの中枢神経系において強発現する2つの遺伝子、S3-12とwisp2の意義について研究を進めた。S3-12について神経系での解析がなされていないため、まず神経系における発現部位(細胞)の同定を行った。・野生型マウス、GM3 onlyマウス、各3匹の小脳・脊髄からmRNAを抽出し、S3-12遺伝子の発現レベルをqRT-PCRにて検討したところ、GM3 onlyマウスにおいて野生型マウスに比べ有意な遺伝子発現上昇が観察された。・発現部位(細胞)を同定するために、免疫組織染色を行った。S3-12のシグナルがミクログリアマーカーであるF4/80と重なったためS3-12の発現細胞はミクログリァであると同定した。Wisp2についてS3-12遺伝子と同様に、神経系では解析がなされていないため、まず基礎的情報の獲得を行った。・S3-12と同様に神経組織(小脳・脊髄)からmRNA抽出し、Wisp2遺伝子の発現レベルをqRT-PCRで検討したところ、野生型マウスに比べGM3 onlyマウスにおいて、有意な遺伝子発現上昇を観察した。・Wisp2遺伝子の発現細胞を神経細胞と予想し、マウス神経芽腫細胞株であるNeuro2a細胞を神経細胞のモデルとし、Wisp2安定発現株を樹立した。強制発現株では、顕著にAkt、ERKのリン酸化レベルが上昇しており、それに並行して、突起伸長亢進が観察された。糖脂質合成遺伝子であるα2,8-SiaTとβ1,4-GalNAcTをダブルノックアウトしたGM3 onlyマウスの中枢神経系において強発現する2つの遺伝子、S3-12とWisp2の機能解析を行った。S3-12について・神経系における発現細胞を免疫組織染色法よりミクリグリアと同定した。・マウスミクログリア細胞株であるMG5細胞に、GFPタグ付きのS3-12タンパク質を強制発現し、S3-12タンパク質のリソソームへの局在を観察した。またPercollを用いた密度勾配遠心法によりリソソーム分画を回収し、ウエスタンブロット法にてS3-12タンパク質のリソソームへの局在を確認した。・MG5細胞に活性化刺激(LPSやlFN-Yを添加)を与えることによる、S3-12遺伝子の発現誘導をqRT-PCR法で観察した。・蛍光標識したシリカビーズをMG5細胞に貧食させた際のGFPタグ付きS3-12タンパク質の挙動をタイムラプス観察した。貧食されたビーズとS3-12シグナルが融合する様子を観察した。Wisp2について・神経系における発現細胞を免疫組織染色法により神経細胞と同定した。・Wisp2は分泌タンパク質である。バキュロウイルスを用いてWisp2組換えタンパク質を精製し、Neuro2a細胞(マウス神経芽腫細胞)に添加したところ、Aktの有意なリン酸化レベルの上昇を観察し、それに伴う神経突起伸長の亢進を観察した。・Wisp2の一次構造より、その受容体はインテグリンであると予測した。抗インテグリン抗体を用いた免疫沈降法より、インテグリンとWisp2が共沈されることを明らかにした。

S3-12について・GM3-onlyマウスでは加齢に伴う神経変性がみられることから、アポトーシスが過剰に引き起こされていると推測し、週齢を追った小脳のcDNAサンプルを用いてqRT-PCRを行い、Fas、Fas-Lの遺伝子発現レベルを解析した。結果、GM3-onlyマウスではWTマウスに比べ、Fasの発現レベルが有意に上昇していた。・小脳の凍結切片を作製し、TUNEL法にてアポトーシス細胞を検出したところ、GM3-onlyマウスにおいて多くのアポトーシス細胞が観察された。・マウスミクログリア細胞株MG5に発現ベクターを導入してS3-12を過剰発現させ、Phagocytosis assayやBacterial assayを行ったところ、シリカビーズの貪食能や大腸菌の消化能力の亢進がみられた。・新生マウスの脳より初代培養ミクログリアを樹立し、免疫蛍光染色法よりS3-12のリソソームへの局在を、またqRT-PCR法よりLPS添加に基づくS3-12の発現上昇を観察した。Wisp2について・Wisp2を安定発現させたマウス神経芽腫細胞株Neuro2aでは、Aktのリン酸化レベルが有意に上昇しており、過酸化水素に対するアポトーシスが抑制された(MTT assayにより検出)。PI3KやAktの特異的な阻害剤であるLY294002やAkt-I-1/2存在化においては、Wisp2の過剰発現によるアポトーシス耐性がみられなくなることを観察した。・Neuro2a細胞においてWisp2は、Integrin-Aktシグナルを介してNeurite-outgrowthを促進し、また抗アポトーシス因子として働くことを明らかにして、論文として報告した.
腸内細菌におけるプラズマローゲン生合成機構の解明と応用展開

近年、プラズマローゲンリン脂質が、生体の恒常性維持に重要な機能を担うことが明らかにされ注目を集めている。しかし、その体内動態や具体的な生理機能は不明である。そこで微生物由来プラズマローゲンに着目し、分布、形態、組成を精査し、さらに生合成経路の解明に取り組む。前年度までに、微生物のプラズマローゲン生産能をOrbitrap-LC/MSによる定性分析にて評価していたが、定量分析系は確立していなかった。そこで本年度は、三連四重極型LC/MS/MSによる多重反応モニタリング(MRM)プログラムを用いて、エタノールアミン型プラズマローゲン(PlsEtn)の定量分析を試みた。前年度に見い出したプラズマローゲン生産菌を対象に、sn-1、sn-2位それぞれのアシル基の炭素鎖長1230、不飽和度05の組み合わせからなるPlsEtn約3000種について測定したところ、PlsEtn32:0(16:0/16:0)やPlsEtn34:1(16:0/18:1)など、上位10種のPlsEtnが全PlsEtnの約90%を占めていることが明らかとなった。また、この結果は、前年度に行なったOrbitrap-LC/MSによる分析結果とも合致した。MRMによる測定では、一度に検出できる分子種の数に限りがあるため、効率的な分析のためには測定対象となる分子種を絞る必要がある。そこで、上記の結果をもとに、存在比率の高いPlsEtnを対象とするMRMプログラムを構築することで、微生物PlsEtnのLC/MS/MSによる効率的な半定量定性分析が可能となった。プラズマローゲン生産菌の探索に有用な分析系を確立し、プラズマローゲン生産菌を多数見い出し、属レベルでの同定を行なうとともに、生産されるプラズマローゲンの分子種を詳細に分析し、細菌におけるプラズマローゲンの組成分布をある程度明らかにした。前年度までに、微生物のプラズマローゲン生産能をOrbitrap-LC/MSによる定性分析にて評価していたが、定量分析系は確立していなかったが、三連四重極型LC/MS/MSによる多重反応モニタリング(MRM)プログラムを用いて、エタノールアミン型プラズマローゲン(PlsEtn)の定量分析が可能になった。・生合成経路上の想定される中間体と蓄積菌を用いた休止菌体反応により生合成経路の推定を行う。脂質合成系阻害剤や、合成中間体として想定されるホスファチジン酸、リン脂質合成中間体、リゾリン脂質など様々な脂質や、通常蓄積しない奇数鎖脂肪酸や、多価不飽和脂肪酸、また、酸化系、還元系の経路からのプラズマローゲン生成の可能性も考慮し、多様な基質を添加し、生成するプラズマローゲン組成・中間体から生合成経路を推定する。・ゲノムが公開されているもの、分子育種法が確立している種からプラズマローゲン蓄積株を選抜し、種々の条件下、蓄積時と非蓄積時のオミックス解析を行い、生合成に関与する遺伝子群、酵素群を明らかにする。・生合成経路推定解析、オミックス解析、ランダム変異解析、破壊遺伝子相補解析情報を統合し、生合成の関与するシグナル伝達系、転写因子、また、関連酵素群と生合成経路を明らかにする。また、鍵酵素であるアルケニル基生成に関与する酵素群の大腸菌による発現・精製を試み、先の検討で想定した生合成経路の中間体を活用し酵素の特徴づけを行う。さらに、解析対象の微生物と同属のプラズマローゲンを蓄積しない菌を対象に、プラズマローゲン生合成関連遺伝子群を導入し、プラズマローゲン蓄積能の付与を試みる。本年度は、プラズマローゲンの分析系の立ち上げとスクリーニングに取り組んだ。菌体中の総脂質に対して酸性条件下でメタノールを反応させると、プラズマローゲンのビニルエーテル構造由来のジメチルアセタール(DMA)が生じることが予想できる。そこで、菌体からの脂質抽出およびメタノール処理の各ステップについて条件検討を行なった。結果、菌体を凍結乾燥破砕し、Bligh-Dyer法にて総脂質を抽出した後、10%塩酸-メタノール溶液を作用させ、GC-MS分析条件を最適化することにより、DMAを高感度で検出できる分析系を確立した。さらに、本手法を用いて、プラズマローゲン生産菌の探索を行なった。研究室保存菌867株(真菌154株、担子菌54株、嫌気性菌および乳酸菌660株)および自然界からの新規単離細菌187株の合計1055株についてGC-MS分析を行なったところ、236株(真菌類5株、嫌気性細菌161株、新規単離細菌70株)からDMAが検出された。この236株のうち、特に高いDMA値を示した60株をLC-MS分析に供したところ、Clostridium属、Megasphaera属、Bifidobacterium属をはじめとする嫌気性細菌25株において、プラズマローゲン型リン脂質が検出された。さらに、25株をLTQ Orbitrapに供し、プラズマローゲン脂質中の分子種について詳細な分析を行なった。その結果、sn-1位、sn-2位ともに、主に炭素数1620の飽和脂肪酸または一価不飽和脂肪酸から構成されていることを明らかにした。

プラズマローゲン生産菌の探索に有用な分析系を確立し、プラズマローゲン生産菌を多数見い出し、属レベルでの同定を行なうとともに、生産されるプラズマローゲンの分子種を詳細に分析し、細菌におけるプラズマローゲンの組成分布をある程度明らかにした。研究の進捗は順調である。近年、プラズマローゲンリン脂質が、生体の恒常性維持に重要な機能を担うことが明らかにされ注目を集めている。しかし、その体内動態や具体的な生理機能は不明である。そこで微生物由来プラズマローゲンに着目し、分布、形態、組成を精査し、さらに生合成経路の解明に取り組む。前年度までに、微生物のプラズマローゲン生産能をOrbitrap-LC/MSによる定性分析にて評価していたが、定量分析系は確立していなかった。そこで本年度は、三連四重極型LC/MS/MSによる多重反応モニタリング(MRM)プログラムを用いて、エタノールアミン型プラズマローゲン(PlsEtn)の定量分析を試みた。前年度に見い出したプラズマローゲン生産菌を対象に、sn-1、sn-2位それぞれのアシル基の炭素鎖長1230、不飽和度05の組み合わせからなるPlsEtn約3000種について測定したところ、PlsEtn32:0(16:0/16:0)やPlsEtn34:1(16:0/18:1)など、上位10種のPlsEtnが全PlsEtnの約90%を占めていることが明らかとなった。また、この結果は、前年度に行なったOrbitrap-LC/MSによる分析結果とも合致した。MRMによる測定では、一度に検出できる分子種の数に限りがあるため、効率的な分析のためには測定対象となる分子種を絞る必要がある。そこで、上記の結果をもとに、存在比率の高いPlsEtnを対象とするMRMプログラムを構築することで、微生物PlsEtnのLC/MS/MSによる効率的な半定量定性分析が可能となった。前年度までに、微生物のプラズマローゲン生産能をOrbitrap-LC/MSによる定性分析にて評価していたが、定量分析系は確立していなかったが、三連四重極型LC/MS/MSによる多重反応モニタリング(MRM)プログラムを用いて、エタノールアミン型プラズマローゲン(PlsEtn)の定量分析が可能になった。・LCMSMSにより、定量的なプラズマローゲンの解析法を構築する。・生合成経路上の想定される中間体と蓄積菌を用いた休止菌体反応により生合成経路の推定を行う。脂質合成系阻害剤や、合成中間体として想定されるホスファチジン酸、リン脂質合成中間体、リゾリン脂質など様々な脂質や、通常蓄積しない奇数鎖脂肪酸や、多価不飽和脂肪酸、また、酸化系、還元系の経路からのプラズマローゲン生成の可能性も考慮し、各種長鎖アルコール、アルデヒドを基質として添加し、生成するプラズマローゲン組成・中間体から生合成経路を推定する。・ゲノムが公開されているもの、分子育種法が確立している種からプラズマローゲン蓄積株を選抜し、種々の条件下、蓄積時と非蓄積時のオミックス解析を行い、生合成に関与する遺伝子群、酵素群を明らかにする。・生合成経路推定解析、オミックス解析、ランダム変異解析、破壊遺伝子相補解析情報を統合し、生合成の関与するシグナル伝達系、転写因子、また、関連酵素群と生合成経路を明らかにする。
ビタミンD受容体機能異常における脱毛に関与する因子について

ヒトビタミンD依存性くる病の動物モデルであるビタミンD受容体ノックアウトマウス(VDR KO)は低カルシウム血症、低リン血症、副甲状腺機能亢進症、くる病、骨軟化症と脱毛(毛再生障害)を示すが、血漿電解質の値を補正することにより、脱毛以外の異常はほぼ正常化する。このことは、毛髪の維持には、VDRの存在が不可欠であることを示している。我々は、これまで、VDR KOにおいては、初回の発毛は正常であるが、毛周期に特異的な異常が存在し毛髪を維持できない、という際だった特徴を認め、脱毛のi山VIVOでの責任細胞が表皮細胞であることを示し,さらにこの脱毛は、既知のリガンドであるビタミンD非依存性の受容体機能異常の結果であることを明らかにしてきたが、表皮細胞におけるVDRのターゲットジーンは不明のままである.脱毛の原因となるVDRのターゲット遺伝子の同定は、毛周期維持の機序の解明に繋がり臨床的に癌化学療法に伴う脱毛や、一般的な脱毛の予防あるいは治療の糸口となり得る。また我々の研究は、核内受容体の一つであるVitamin D受容体の新しい作用機序、リガンド非依存性の生理作用の解明に繋がる可能性がある。今回、毛周期の維持に不可欠な、VDRのターゲットジーンを同定すると共に、VDRのビタミンD非依存性の生理的役割を明らかにすることを目的とし、VDR KOを用い、以下のin vivoでの検討を行った。生後20日のVDR KOおよび正常マウスに対し、機械的脱毛刺激により発毛誘導を行った。24時間後に各皮膚組織を採取し、RNAを抽出した。cDNAマイクロアレイ(1回)および、オリゴマイクロアレイ(2回)を用いることにより、両者で発現量の違う複数の因子を同定した。今後、発現量の違う因子のin situ hybridization等、さらに詳細に検討していく予定である。我々は、これまで、VDR KOにおいては、初回の発毛は正常であるが、毛周期に選択的な異常が存在し毛髪を維持できない、という際だった特徴を認め、脱毛のin vivoでの責任細胞が表皮細胞であることを示し、さらにこの脱毛は、既知のリガンドであるビタミンD非依存性の受容体機能異常の結果であることを明らかにしてきたが、表皮細胞におけるVDRのターゲットジーンは不明のままである。脱毛の原因となるVDRのターゲット遺伝子の同定は、毛周期維持の機序の解明に繋がり臨床的に癌化学療法に伴う脱毛や、一般的な脱毛の予防あるいは治療の糸口となり得る。cDNAマイクロアレイを用いることにより、両者で発現量の違う複数の因子を同定した。