hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
モデル生物を用いた血液脳関門の分子機構の解析

遺伝子やシグナル伝達経路が進化的に保存された優れたモデル生物であるショウジョウバエを用いて、血液脳関門(Blood-Brain Barrier)の形成や形成後の機能維持に不可欠である遺伝子の解析を行った。過去に申請者が立案・実行したin vivoスクリーニングでは複数の目的遺伝子を得ることに成功している。一連の遺伝子のうち、本研究では主に、バリア機能の形成に関して新たな概念を提唱する遺伝子、BBBの機能制御における時間軸の概念を提唱する遺伝子、及び、BBBの新たな生理的意義を提唱する分子に着目して解析を行った。その結果、いずれもこれまでに報告されていない分子機構を見出している。これまでのin vivoスクリーニングにおいて、我々は血液脳関門(BBB)の形成と維持に不可欠である遺伝子の探索と解析を行ってきた。スクリーニングで得られた遺伝子は、表現型の特徴から以下の3グループに大別できる事が分かった。1BBBを構成する細胞の発生、分化、移動、生存には異常が認められないが、BBB機能が低下している。2バリア機能が一度は正常に形成されるが、加齢と共にその機能が低下する。3BBBを構成する細胞の発生、分化、移動のいずれかに異常がある為にSJが正常に形成されない。これらのうち、2の表現型を示す変異体の原因遺伝子についてBBB機能との関連を解析している。この系統の原因遺伝子は脂質代謝酵素をコードしており、BBBの形成時から成虫に至るまで、BBBを形成する細胞自身を含めて中枢神経系で広く発現していることを見い正した。また、機能欠失型変異体は成虫まで生存可能であるが4週間程度で全てが死滅した。蛍光標識したトレーサーを変異体の成虫の腹腔に微量注入し、中枢神経系内に到達する蛍光強度を測定すると、羽化後1日ではコントロールとの差は約1.5倍程度であるのに対して、羽化後10日目には約14倍となった。このことは、変異体においては一旦BBB機能が確立し、加齢とともにその機能が低下することを示唆している。この遺伝子は進化的に保存されていること、およびヒトのBBB機能も加齢とともに低下することから、今後の解析を通じて生理的なBBB機能を制御する分子機構が明らかにしたいと考えている。本研究の目的は、ショウジョウバエをモデル系として、血液脳関門(Blood-Brain Barrier: BBB)の強度を規定する分子機構を明らかにすることである。特に、細胞内外のコミュニケーションの意義に焦点を当てて解析を進めている。前年度までの研究から、BBBの形成と機能維持に必要な遺伝子を生体レベルで探索する事に成功している。今年度は、このスクリーニングで得られた遺伝子の1つについてさらに解析を進めた。着目している分子は酵素であり、複数の基質候補分子が存在する。実際に、変異体においては、これらの基質候補分子の発現量が多くなる事を既に確認している事から、これらの蓄積が表現型を誘導する基軸となっている可能性がある。そこで、これらの候補分子について、着目する分子との関連を遺伝学的な手法を用いて解析を行った結果、その中の少なくとも1つは本分子と遺伝学的な相互作用があることを見出した。また、本変異体の機能欠失型変異体脳内では、発生過程において、特定のサブタイプの細胞が減少していることを見出した。BBBの機能維持に関連する事が既に報告されている別の遺伝子の変異体においても同様の表現型が認められることから、中枢神経系の発生におけるBBBの生理的意義との関連が示唆される。今後の解析を通じて、BBBの形成・維持に関わる分子基盤を明らかにすると同時に、BBBが担うバリア機能そのものの生理学的な意義についても解き明かしていきたいと考えている。これまでの研究から得られた仮説を検証した結果、それが正しいことを示す結果を得た。また、目的遺伝子の機能から予想される関連遺伝子について遺伝学的な相互作用を解析した結果、同様に、仮説を支持する結果を得ている。昨年度までに引き続き、これまでのin vivoスクリーニングで得た分子の解析を行った。今年度は組織特異的なRNAiを誘導する事で、BBBを形成する細胞に自律的な機能について解析を進めた。その結果、本分子は全身に発現するにも関わらず、本実験条件下においてもBBB機能が顕著に低下することから、BBB機能の制御は細胞自律的である事が確認できた。同時に、変異体の解析ではBBBの形成後に細胞の生存率が経時的に低下し、さらに脳内の特定の細胞の生存率も低下することを確認済みであったが、BBB特異的なRNAiではこれらの細胞毒性は認められなかった。従って、本分子はBBBを形成する細胞の生存率には影響を与えることなくバリア機能そのものを制御している事が明らかとなった。また、通常幼虫期のBBB構造の異常を確認するためには電子顕微鏡による構造解析が不可欠であるが、目的遺伝子と各種遺伝子との遺伝学的な相互作用を解析する全ての過程でこの確認を行う事は極めて煩雑であり、現実的ではない。そこで、今年度は蛍光レポーター系統を用いてこれに代替し得る解析法を開発した。本法においては蛍光顕微鏡下で表現型を確認できることから、解析の速度を飛躍的に向上させることに成功した。本法を用いた解析の結果、目的分子の下流で機能する複数の候補遺伝子を得ることに成功した。さらに、本分子の発現を転写レベルで調節する上流分子の探索を行う目的で、目的遺伝子やシグナル伝達経路を遺伝学的に活性化できる系統の樹立、入手を行った。今後は一連の系統を用いて網羅的に解析を進める。

また、本分子の発現を抑制するとBBB形成時の細胞に形態の異常が認められることから、今後はライブイメージングによって発生初期のイベントを解析する実験を計画している。遺伝子やシグナル伝達経路が進化的に保存された優れたモデル生物であるショウジョウバエを用いて、血液脳関門(Blood-Brain Barrier)の形成や形成後の機能維持に不可欠である遺伝子の解析を行った。過去に申請者が立案・実行したin vivoスクリーニングでは複数の目的遺伝子を得ることに成功している。一連の遺伝子のうち、本研究では主に、バリア機能の形成に関して新たな概念を提唱する遺伝子、BBBの機能制御における時間軸の概念を提唱する遺伝子、及び、BBBの新たな生理的意義を提唱する分子に着目して解析を行った。その結果、いずれもこれまでに報告されていない分子機構を見出している。解析は当初の計画通り進んでおり、表現型を説明しうる下流分子の候補を見出しているため。本遺伝子の下流シグナルとして働く遺伝子は複数存在する可能性がある。今後はこれらの遺伝子を強制発現、ノックダウンし、表現型を解析する。また、電子顕微鏡を用いた構造学的な解析がやや難航していることから、サンプル調整や解析法を検討することで改善を図る。同時に、電顕を用いた解剖学的な手法に依存しない方法で血液脳関門の構造及び強度を解析する手法を検討する。神経科学、神経発生学、遺伝学当初の計画に従って遺伝学的手法を用いた解析を進める。平成27年度に得た結果から、平成28年度に大規模な解析が予想されたため、その人件費を確保する目的で27年度は消耗品の購入を再検討し、使用額を抑制したため。実験計画が概ね順調に進み、予期せぬ結果を得た際に計画していた実験を行う必要がなくなったため。本来27年度に使用予定だった費用の大半は28年度の人件費にあてる。主に平成28年度に多くの確認実験を行う必要があると考えられるため、その為の人件費に充てる予定である。
磁性形状記憶合金の電磁・熱・機械連成モデリングとアクチュエータ材料としての検討

本研究では、温度や応力のみでなく第3の外部因子として磁場により変態を生じるNi-Mn-Ga系形状記憶合金を対象として、材料設計および材料評価という観点から、実験および理論的考察を行い、アクチュエータヘ応用するための基礎的なデータを取得することを目的とする。得られた成果を以下に示す。1.バルク材については、組成、熱処理、加工技術について新しい方法を試み以下の成果を得た。(1)アーク溶解法を用い、NiとMnの組成を変えることにより、変態点とキュリー点が変化することを示差走査熱量測定により確認した。また、磁化測定及び電気抵抗測定によってもこの現象を確認した。(3)従来のアーク溶解により作製したNi-Mn-Ga系合金を微細粉末に加工し、放電プラズマ焼結法を用いて試料加工した。このプロセスを加えることによって結晶粒径が微細化し、材料強度が向上した。(4)放電プラズマ焼結法で作製した試料について超音波パルスエコー法により動弾性率を測定した。従来のアーク溶解により得られた合金と比べて約4倍のヤング率を持つことを見いだした。(5)これまで、多結晶Ni-Mn-Ga系合金の弾性定数の温度依存性は明らかにされていなかった。本研究では、-2090度の温度範囲を超音波パルスエコー法により連続的に測定し、構造相変態に伴ってヤング率が大きく変化することを明らかにした。2.薄膜については,膜厚、急冷条件などを制御することにより、形状記憶効果を確認した。結晶粒が大きくなる熱処理条件下で成膜した薄膜において、示差走査熱量計によって求めた構造相変態温度で熱弾性型の形状記憶効果が生じていることを確認した。この現象は同じ条件下で作製された2つの異なる試料で確認され、特異な現象ではないことを明らかにした。Ni_2MnGaはホイスラ-型の結晶構造をもつ規則格子合金である。高温では立方晶であるが、冷却に伴いマルテンサイト変態を起こして正方晶となる。また、この合金は強磁性体で立方晶の存在する温度範囲にキューリ-温度をもつ。正方晶における磁化は強い異方性を示し,立方晶の温度範囲での磁化には異方性が見られない。単結晶において圧縮による残留歪みは加熱により容易に消失する。これは形状記憶効果が存在することを示している。このようにNi_2MnGaは強磁性形状記憶合金であり、種々の特性が報告されている。本研究の目的はこのような強磁性形状記憶合金Ni_2MnGaの各元素の組成を変えた場合、物理的・機械的特性がどのように変化するかを明らかにすることである。高純度のNi、MnおよびGa元素を原料とし、アーク炉で熔解した。得られたインゴットは規則化のため石英管に真空封入し、1100Kで9日間熱処理をした後氷水中に焼き入れた。X線回折によりこれらのインゴットはホイスラ-型の結晶構造をもつことを確認した。合金の組成はNi_<2+X>Mn_<1-X>Ga(X=00.19)とした。冷却に伴い、発熱によるピークが観測され、これよりMsおよびMfが求められた。一方、加熱によって吸熱ピーク観測され、これよりAsおよびAfが求められた。Ni_<2+X>Mn_<1-X>Gaの変態温度はNi組成の増加に伴い、ほぼ直線的に上昇した。非化学量論組成の試料に室温で圧縮応力をかけ、それに伴う歪みを測定した。除荷することにより、残留歪みが生じたがこの歪みは加熱により消失した。

これより非化学量論組成の試料においても形状記憶効果が存在することが明らかになった。高純度ニッケル、マンガンおよびガリウムを用い、アーク溶解炉により化学量論Ni_2MnGaおよび非化学量論Ni_<2+x>Mn_<1-x>Ga(00.20)の試料を作製した。得られたインゴットは真空中で1,100Kで9日間熱処理した。合金組成の分析はX線マイクロアナライザーで行い、所定の組成であることを確認した。温室でのX線回折により結晶構造を決定した。それぞれの試料についてマルテンサイト変態開始と終了温度、逆マルテンサイト(オーステナイト)変態開始と終了温度、およびキューリー温度の測定を行った。熱機械的特性として三点曲げ試験、および圧縮試験を行った。三点曲げ試験は厚さ0.3mm、幅2mm、支点間距離5mmの試料を用いた。変位は恒温槽内部の渦電流変位計で、荷重は恒温槽上部のロードセルにより測定した。各温度における荷重-たわみ曲線の傾きからヤング率を求めた。圧縮試験は、5mm×5mm×5mmの試料を用いた。変位は変位計で、荷重はロードセルにより測定した。5Tまでの磁場による残留ひずみの磁場方向の回復量をホトニックセンサーにより室温で測定した。Ni_<2.18>Mn_<0.82>Gaの室温における圧縮による応力除荷後、残留ひずみは約0.007であった。残留ひずみは加熱により消失した。この現象は非化学量論Ni_<2+x>Mn_<1-x>Gaにおいても形状記憶効果があることを示すものである。同じひずみ量を与える応力の値は組成によって異なり、この原因は結晶粒によるものと考えられる。磁場による変態温度の移動は約5Kと見積もられた。磁場によるひずみ量の変化はNi_<2.14>Mn_<0.86>Gaにおいて観測された。この磁場によるひずみ量の変化は磁歪の量よりも大きく、磁場による形状回復現象の可能性を示している。本研究では、温度や応力のみでなく第3の外部因子として磁場により変態を生じるNi-Mn-Ga系形状記憶合金を対象として、材料設計および材料評価という観点から、実験および理論的考察を行い、アクチュエータへ応用するための基礎的なデータを取得することを目的とする。今年度得られた成果を以下に示す.1.バルク材については、添加元素による材料評価に加え、熱処理、加工技術について新しい方法を試み以下の成果を得た。(1)従来のアーク溶解により作製したNi-Mn-Ga系合金を微細粉末に加工し、放電プラズマ焼結法を用いて試料加工した。このプロセスを加えることによって結晶粒径が微細化、材料強度が向上した。(2)放電プラズマ焼結法で作製した試料について超音波パルスエコー法による動弾性率を測定した。従来のアーク溶解により得られた合金と比べて約4倍のヤング率を持つことを見いだした。(3)これまで、多結晶Ni-Mn-Ga系合金の弾性定数の温度依存性は明らかにされていなかった。本研究では、-2090度の温度範囲を超音波パルスエコー法により連続的に測定し、構造相変態に伴ってヤング率が大きく変化することを明らかにした。2.薄膜については,膜厚、急冷条件などを制御することによる特性向上技術を開発した.結晶粒が大きくなる熱処理条件下で成膜した薄膜において、示差走査熱量計によって求めた構造相変態温度で熱弾性型の形状
がん関連遺伝子の3'UTRを介した新たな発現制御機構の解明

本研究の目的は、がん関連遺伝子の3'UTRを介した新たな発現制御機構の解明である。応募者はがん関連遺伝子の3'UTRを介した制御機構が、低分子化合物によって選択的に抑制できることを発見した。本提案では、化合物の作用機序解明を通じ、特定の遺伝子発現をその転写後に制御する未知のメカニズムを明らかにすることを目指す。さらに、3'UTRを介した制御を標的とした低分子化合物探索の有用性を検証する。
アジアにおける再生産領域のグローバル化とジェンダー再配置

本研究では、東・東南アジアにおける移住家事・介護労働者や結婚移民の送り出しと受け入れの実態と政策、また各社会におけるジェンダー再配置との関係把握を試み、(1)「国際移動の女性化」の背景にある再生産労働の国際移転とその諸パターン、および日本の事例の検討、(2)移住労働の回路(サーキット)と国家の関係、(3)家族/世帯の越境的再生産と国家との関係、(4)女性移住者自身の再生産と権利保障をめぐる課題群等を検討し、再生産領域のグローバル化の現状に関する一定の知見を得た。本研究は、アジアにおける再生産領域のグローバル化の実態と各国におけるジェンダー(再)配置との関連を解明することを目的とし、初年度の2005年度は、以下のような研究活動を展開した。1.再生産領域のグローバル化に関する理論的枠組や実態に関する認識の共有。再生産領域のグローバル化のうち、日本を含むアジア諸国の高齢化傾向に鑑みて、高齢者ケアの国際分業と同時に、移動者としての高齢者をも視野の範囲に入れることを確認した。2.調査活動(ア)国内調査:関東地域、愛知県の2ヵ所で、介護施設、自治体行政、社会福祉協議会、派遣業者等を訪問し、ヒアリング調査を行い、高齢者介護のローカルな制度枠組、介護労働の実態、フィリピン人介護労働者導入にかかわる各アクターの見解の把握に努めた。また、日本人配偶者として在住する移住女性によるケア労働への参入についても調査を行った。(イ)海外調査:アジアにおける移住介護労働者の受け入れ地域として、今年度は台湾で調査を行った。1992年以降、外国人労働者を導入している台湾では、介護・家事労働分野で多くの移住女性労働者を受け入れているが、介護保険制度の導入に関しては日本を一つのモデルとして検討中である。また、民主化の進展のなかで女性の社会参加が拡大しており、このことと移住女性労働者導入の関連を、ジェンダー再配置の視点から問う必要がある。このほか、移住介護・家事労働者の受け入れ地域として、カナダ、米国、また送り出し地域としてフィリピン、ならびにブラジルで調査を行った。昨年度に引き続き、再生産領域のグローバル化に関する理論的枠組や実態について資料収集を行うとともに、研究会活動を展開した(計7回、及び合宿1回)。このほか以下のように研究活動を実施した。1.調査活動(ア)国内調査:高齢者介護のローカルな制度枠組等についての調査を続けるとともに、共同研究を進めているシンガポール国立大学チームと協力して、日比経済連携協定署名後の国内状況について関係省庁、職業団体、労組、施設等に対してヒアリングを行った。(イ)海外調査:今年度は2月に韓国調査を実施した。韓国では1993年より産業研修生制度を導入して外国人労働者を受け入れてきたが、同制度は2007年度より雇用許可制度に切り替わるため制度的移行期にある。また、政府は2006年に外国人政策と結婚移民受け入れ政策について新たな取り組みを発表している。本研究とのかかわりでは、特に後者の結婚移民の拡大が重要である。また、韓国の女性政策は2005年に女性家族省が設置されて以降、移民政策にも積極的に関与を深め、再生産領域のグローバル化が女性政策の展開に直接的な影響を与えている事例として注目される。このほかカナダでの移住介護・家事労働者についての個別調査研究を実施。プロジェクト3年目にあたる2007年度は、調査研究を継続的に進めるとともに、研究成果を中間報告的に発表し意見交換を行うため、国内外の研究者(国外からは韓国、台湾、シンガポール、米国)を招き、国際シンポジウム「再生産領域のグローバル化とアジア-移住者、家族、国家、資本」(於一橋大学、プレシンポ「映画で観る<アジアにおける国際結婚、そして再生産労働の国際移転>」:2007年12月7日、国際シンポ:12月8日9日)を開催した。シンポジウムは「移民政策と再生産領域」、「再生産労働の国際移転と移住労働者の権利」、「親密圏における越境と商業化」、「高齢者ケアの制度化と移住労働者(1)シンガポール」、「高齢者ケアの制度化と移住労働者(2)日本」、「総括討論」の6つのセッションから構成され、全部で14本の報告がなされた。シンポジウムは意見交換を可能とするため先着50名で一般にも公開した。本シンポジウムでの議論の特色、ならびに成果は、概略3点に要約することができる。1.労働力の再生産を担う労働という意味での「再生産労働(家事、子育てなど)」だけでなく、再生産システムそれ自体の再生産の「危機」に関わる多様な諸事象(国際結婚の商業化、高齢者ケアの制度化など)を包括的に「再生産領域」の問題群と捉えたこと。2.近年のアジア地域に見られる国際移動の傾向(国際移動の女性化、セックスワークの越境化、国際移動の拡大によって促進される越境的婚姻市場の形成、ヘルスケア労働者の労働移動など)をつうじて「再生産領域のグローバル化」を把握し、新しい研究領域を切り拓いていること。

3.高齢者ケアを担う移住労働者の位置づけをめぐる交渉には、移住者、家族、国家、資本など複数のアクターが加わるが、その交渉モデルの把握に向けて計量調査結果も踏まえた、予備的検討が行ったこと。なお、本国際シンポジウムでの報告、コメント、討論内容は中間報告書としてまとめた。最終年度は、韓国と日本での補充調査のほか、有数の移住労働者送り出し国であり、日本でも看護師と介護福祉士候補生の受け入れが開始したインドネシアで調査を実施した。現地では、関連省庁、職業関連団体、労働者を支援するNGO等でインタビュー調査を行った。その結果、以下のような傾向がつかめた。1.インドネシアは1979年以降、目標数を定めて海外雇用の拡大を推進し、近年ではフィリピンに倣って、海外雇用行政を整備しているが、省庁間、あるいは中央/地方間で意思疎通が必ずしも十分ではなく、仲介業者をはじめ「移住労働産業」の影響力が強い。2. 1.を背景として、移住労働者の7割から8割を占める女性(多くは家事労働者)が仲介業者に前借金を負わされ、就労先でも賃金未払い、虐待等の劣悪な労働条件のもとに置かれる傾向にある。3.経済連携協定による日本への派遣は、「専門職」でもあることから、これを機に現在の「不熟練労働」中心の海外雇用を転換できるのではないかとの期待が担当省庁にはある。だが、その可能性は不透明である。4.看護師は広く知られた職種であるのに対して、高齢者介護の概念は一般には知られていない。5.看護職は女性職のイメージが強い職種だが、海外就労という文脈ではこの職に異なった価値が付与され、送り出し側では男性の進出が高まる傾向がある。インドネシアの海外雇用政策は多くの面でフィリピンとの共通点をもつが、政治構造や政治文化の違いも際だち、とくに仲介業者の影響力の強さが注目される。再生産労働を担う女性移住労働者の人権保障という点で受け入れ国が果たすべき役割も大きく、送り出し、受け入れ双方で政策的課題を共有していく必要がある。このほか、4年間の調査研究の当面のまとめとして報告書『アジアにおける再生産領域のグローバル化とジェンダー再配置』(総頁数312)を作成した。
海洋における微生物代謝と高分子溶存態有機物の動態

海洋の有機物の90%以上は溶存態として存在しており,その大部分は化学的な性質が不明である.放射性同位元素を用いた年代測定によると,太平洋の溶存態有機物の平均年齢は数千年のオーダーにもなり,これらの有機物の代謝速度の規定要因の解明は海洋全体あるいは地球上での有機物代謝の実態を明らかにする上で,極めて重要である.ここで個々の有機物が何らかの原因で分解を開始する時の状況を考えると,ほぼ必ず他の生体成分と会合した状態にあることが想定される.これらの会合はしばしばサブミクロンサイズの微小粒子を形成しており,こうした粒子の動態が物質代謝の重要な側面をなしていることが容易に推定される.本研究では,高分子有機物の代謝速度を規定する要因の一つとして他の高分子との会合状態が果たす役割を定性的,定量的に明らかにしようとするものである.具体的には放射性同位元素でラベルした海洋細菌起源の有機物を調製し,これをモデル基質としてその分解プロセスを追跡した.また,さらに他の手法を組み合わせてデラウェア湾内の微生物群集の分解活性を明らかにすることを試みた.海洋細菌,Vivrio alginolyticus(138-2)の培養液に[^3H]あるいは[^<14>C]でラベルしたロイシンを添加した後,超音波処理によって破砕し,超遠心,限外ろ過などによって膜および可溶性のフラクションに分けた.これにより,膜および可溶性それぞれのフラクション中のタンパクが[^3H]および[^<14>C]でラベルされた人工基質が調製された.それぞれのフラクションをデラウェア湾の海水に添加し,天然の細菌群集による分解速度を求めた.一方,デラウェア大学の研究船によるデラウェア湾内の航海に参加し,湾内の物理化学的諸要因,微生物および動植物プランクトン群集のバイオマスに関する各種パラメータを取った.さらに,[methyl-^3H]thymidineのTCA不溶性分画への移行速度から細菌群集の増殖速度を,蛍光基質の添加による菌体外分解酵素の酵素活性の測定などを行い,有機物代謝に対する寄与を推定した.本研究では膜および可溶性のそれぞれのフラクションのタンパクを選択的に放射性同位元素でラベルしたものの調製を狙っている.そこで第一にこうして得られた人工基質の性質を検討した結果,タンパク以外の高分子へのラベルの移行は相対的に小さく,結果の解釈に問題を与えるとは考えられないことがわかった.第二に,それぞれのフラクションを基質として用いた分解実験の具体的な系を検討した結果,実際に天然海水中の細菌群集を用いて実験を行った結果,可溶性フラクションは膜フラクションよりも常により速く分解され,条件によってはその無機化速度に約3倍の差が出ることが明らかになった.これは膜中のタンパクが脂質,多糖などの高分子と会合して存在するため,これらの高分子が速やかな分解を遅らせるよう働いたためと考えられる.さらに,条件を変えてこの分解速度に与える影響を考察すると共に,数か月から年単位の長期実験を続行中である.第三に,95年夏にデラウェア湾で行った航海で得られた現場のデータを解析しているとともに,上記の分解実験との関連について検討を行っている.このためにアメリカ側の研究者と結果のやりとりを続行しているとともに,96年度早々にアメリカ側の研究者を呼んで研究打合せを行うことが確定している.本研究の結果は,海洋に存在する様々な高分子の分解速度を決める要因として他の分子との相互作用,会合が大きな役割を果たしていることを明らかにし,有機物の代謝速度の規定要因として新たな知見を加えたものである.海洋の有機物の90%以上は溶存態として存在しており,その大部分は化学的な性質が不明である.放射性同位元素を用いた年代測定によると,太平洋の溶存態有機物の平均年齢は数千年のオーダーにもなり,これらの有機物の代謝速度の規定要因の解明は海洋全体あるいは地球上での有機物代謝の実態を明らかにする上で,極めて重要である.ここで個々の有機物が何らかの原因で分解を開始する時の状況を考えると,ほぼ必ず他の生体成分と会合した状態にあることが想定される.これらの会合はしばしばサブミクロンサイズの微小粒子を形成しており,こうした粒子の動態が物質代謝の重要な側面をなしていることが容易に推定される.本研究では,高分子有機物の代謝速度を規定する要因の一つとして他の高分子との会合状態が果たす役割を定性的,定量的に明らかにしようとするものである.具体的には放射性同位元素でラベルした海洋細菌起源の有機物を調製し,これをモデル基質としてその分解プロセスを追跡した.また,さらに他の手法を組み合わせてデラウェア湾内の微生物群集の分解活性を明らかにすることを試みた.海洋細菌,Vivrio alginolyticus(138-2)の培養液に[^3H]あるいは[^<14>C]でラベルしたロイシンを添加した後,超音波処理によって破砕し,超遠心,限外ろ過などによって膜および可溶性のフラクションに分けた.これにより,膜および可溶性それぞれのフラクション中のタンパクが[^3H]および[^<14>C]でラベルされた人工基質が調製された.それぞれのフラクションをデラウェア湾の海水に添加し,天然の細菌群集による分解速度を求めた.一方,デラウェア大学の研究船によるデラウェア湾内の航海に参加し,湾内の物理化学的諸要因,微生物および動植物プランクトン群集のバイオマスに関する各種パラメータを取った.さらに,[methyl-^3H]

thymidineのTCA不溶性分画への移行速度から細菌群集の増殖速度を,蛍光基質の添加による菌体外分解酵素の酵素活性の測定などを行い,有機物代謝に対する寄与を推定した.本研究では膜および可溶性のそれぞれのフラクションのタンパクを選択的に放射性同位元素でラベルしたものの調製を狙っている.そこで第一にこうして得られた人工基質の性質を検討した結果,タンパク以外の高分子へのラベルの移行は相対的に小さく,結果の解釈に問題を与えるとは考えられないことがわかった.第二に,それぞれのフラクションを基質として用いた分解実験の具体的な系を検討した結果,実際に天然海水中の細菌群集を用いて実験を行った結果,可溶性フラクションは膜フラクションよりも常により速く分解され,条件によってはその無機化速度に約3倍の差が出ることが明らかになった.これは膜中のタンパクが脂質,多糖などの高分子と会合して存在するため,これらの高分子が速やかな分解を遅らせるよう働いたためと考えられる.さらに,条件を変えてこの分解速度に与える影響を考察すると共に,数か月から年単位の長期実験を続行中である.第三に,95年夏にデラウェア湾で行った航海で得られた現場のデータを解析しているとともに,上記の分解実験との関連について検討を行っている.このためにアメリカ側の研究者と結果のやりとりを続行しているとともに,96年度早々にアメリカ側の研究者を呼んで研究打合せを行うことが確定している.本研究の結果は,海洋に存在する様々な高分子の分解速度を決める要因として他の分子との相互作用,会合が大きな役割を果たしていることを明らかにし,有機物の代謝速度の規定要因として新たな知見を加えたものである.本研究は海洋の高分子有機物の生化学的性状や分子量の相違などがその微生物分解にどのように関わっているかを実験的に明らかにすることを目的としている。このためにまず、海洋細菌、Vibrio alginolyticusをグルコースとL-[^<14>C-U]leucineの存在下で培養したもの、海産珪藻、Skeletonema costatumを、[^<14>C]Na_2CO_3の存在下で培養したものそれぞれから膜および可溶性分画を得、これを分解実験の標品として用いうるかどうかにつき検討した。その結果、V.alginolyticusについては(1)可溶性分画中の放射能のうち、核酸に移行したものはわずかである、(2)膜分画中の放射能のうち、脂質に移行したものはわずかである、(3)いずれの分画も、タンパク当たりの比活性はほぼ同じである、(4)可溶性分画は85%がプロテアーゼで容易に加水分解されたが、膜分画では20%にとどまる、ことなどがわかった。また、S.costatum二ついては可溶性分画中を分子量分画し、それぞれの分画中の放射能のマスバランスを求めた。これらの結果から、今回得た高分子標品が分解実験に用いるのに適していることが明らかになった。V.alginolyticusから得た標品を用い、Delaware湾の海水中の微生物による分解実験を行い、経時的に^<14>C-CO_2の生成量を測定した。この結果、可溶分画からのCO_2生成量が膜分画からのそれを大きく上回ることがわかり、同じ細菌由来のタンパクでも、その種類や存在状態によってその分解速度が大きく異なることが明らかとなった。
音声理解手法の高度化に関する研究

1.連続発声された文章から, 6個の韻律情報に関するパラメータを使って,句境界の候補を抽出した.その結果,連続音声を句単位に認識し,正解を指摘してもらって,次の句を認識してゆく文章入力システムの性能が向上し,完全な連続音声認識システムを語彙500単語の場合にも動作させうるようになった.更に,文末の述語をまず認識して,文頭に向って認識してゆくシステムを稼働させることができた.その他自動話者適応を高速化し,物語理解のレベルを向上させた.2.音声によるマンマシンの対話システムを構築するための基礎研究を行うことを目的として,システムと利用者の双方が会話の手動権を握ることのできるmixed-initiativeな音声対話システムの構成法について検討した.具体的には利用者がシステムとの対話を通じて,ある都市を1日ないし,数日間刊観光するための計画をたてるような状況での対話の理解を考え,このようなシステムにおける対話制御部の基本設計行った.そしてフレーム駆動型の対話制御方式, AND-OR木を用いた話題管理の方法,それに基づいたキーワード(利用者の発話に現われる話題)のトップダウン的に予測する方法等を提案した.3.音節を標準パターンとする連続音声認識システムを構築した.本システムは,音節ラティス生成部,単語ラティス生成部,文節ラティス生成部,および文選択部からなっている.これらを実現するために,オートマトン制御拡張連続DPマッチング法と動詞の格構造を組み込んだ,逆時間向きフレーム同期型係り受け解析法を考案した.また,品詞の3つ組の確率を連続音声認識システムに組み込む方法を考案した.さらに左から右方向への下降型構文解析法と島駆動上昇型構文解析法を比較検討した.雑音を含まない音声に対しては,左から右方向への解析法は島駆動解析法よりも,処理時間と認識率の点で優れていることが明らかとなった.1.連続発声された文章から, 6個の韻律情報に関するパラメータを使って,句境界の候補を抽出した.その結果,連続音声を句単位に認識し,正解を指摘してもらって,次の句を認識してゆく文章入力システムの性能が向上し,完全な連続音声認識システムを語彙500単語の場合にも動作させうるようになった.更に,文末の述語をまず認識して,文頭に向って認識してゆくシステムを稼働させることができた.その他自動話者適応を高速化し,物語理解のレベルを向上させた.2.音声によるマンマシンの対話システムを構築するための基礎研究を行うことを目的として,システムと利用者の双方が会話の手動権を握ることのできるmixed-initiativeな音声対話システムの構成法について検討した.具体的には利用者がシステムとの対話を通じて,ある都市を1日ないし,数日間刊観光するための計画をたてるような状況での対話の理解を考え,このようなシステムにおける対話制御部の基本設計行った.そしてフレーム駆動型の対話制御方式, AND-OR木を用いた話題管理の方法,それに基づいたキーワード(利用者の発話に現われる話題)のトップダウン的に予測する方法等を提案した.3.音節を標準パターンとする連続音声認識システムを構築した.本システムは,音節ラティス生成部,単語ラティス生成部,文節ラティス生成部,および文選択部からなっている.これらを実現するために,オートマトン制御拡張連続DPマッチング法と動詞の格構造を組み込んだ,逆時間向きフレーム同期型係り受け解析法を考案した.また,品詞の3つ組の確率を連続音声認識システムに組み込む方法を考案した.さらに左から右方向への下降型構文解析法と島駆動上昇型構文解析法を比較検討した.雑音を含まない音声に対しては,左から右方向への解析法は島駆動解析法よりも,処理時間と認識率の点で優れていることが明らかとなった.
地域再生に資する環境色彩デザイン手法－日本特有の環境色彩と歴史的変遷を考慮して－

景観色彩の誘導方法は数値で彩度の上限を決めるにとどまることが多く、画一的な傾向にある。本研究の目的は景観法の趣旨である地域再生を目論み、日本の景観を色彩から捉えた「環境色彩」を中長期的に改良する手法を開発することである。景観計画の収集分析やシミュレーションを用いた印象評価実験を行った結果、環境色彩のコントロールには、周囲の現実の色をもとにしたコントロール手法のほかに、その街並の持つ文脈や歴史的背景を考慮した色彩コントロール手法が有効であり、それは一律に色相や彩度の数値のみで行うのではなく、色相ごとに面積も考慮すべきであることを示した。景観法が制定されて以降、我が国における景観団体数は増加の一途であり一見進展しているようであるが、景観色彩の誘導方法は数値で彩度の上限を決めるにとどまることが多く、画一的な傾向にあり、地方の歴史・文化性、住民の受容を考慮するまでに至っていない。本研究は景観法の趣旨である地域再生を目論み、日本の景観を色彩から捉えた「環境色彩」を中長期的に改良する手法を開発することを目的としている。平成27年度は以下の研究を行った。1.歴史性アプローチ:歴史的町並みに見合う色彩誘導方法の検討を行った。屋外広告を対象とし、その大きさと色彩の許容度に着目し、被験者実験を行った結果、大きさと色相・明度・彩度の許容値を得た。具体的には、日本の京都と中国の周庄の街並みそれぞれについて、一つの建物の壁面広告の面積や色彩を変化したものをシミュレートした画像を作成し、被験者80名に印象評価実験を行った。刺激枚数は各街並み26枚である。この結果、色相R系であれば彩度6以下が外壁に対する面積10%まで許容できるが、一方で、G系やP系は彩度3、面積5%までが許容できることを明らかにした。2.現状分析アプローチ、諸外国先進事例アプローチ:国内外の研究者と各都市の環境色彩に関する情報交換を行い、各地域の色彩計画の特徴を把握した。また、これらの事例をもとに、実際に学生宿舎や教育施設の色彩計画に応用した。これらの研究成果を、国際色彩学会大会や日本建築学会で発表し、さらに日本デザイン学会、日本建築学会の次年度の年次大会などに投稿した。歴史性アプローチについて、当初計画どおり現地調査を行った上で、平成29年に行う予定であったシミュレーション画像を用いた被験者実験まで行い、一定の条件付きではあるものの、歴史的町並みにおける屋外広告の調和する色彩や大きさの結果を得ることができ、よく進展しているため。また、現状分析アプローチ、諸外国先進事例アプローチについても、国際学会で研究成果を発表し、国外の研究者と意見交換をしたことによって、先進事例の情報を得ることができたなどおおむね予定どおりに進展しているため。平成28年度は以下の研究を行った。1.歴史性アプローチ:歴史的町並みに見合う屋外広告のデザインと色彩の許容度に着目し、被験者実験を行った。日本の京都、高山、妻籠の建物3件の街並みを対象とし、一つの建物の広告の板面のデザインと、文字と背景色の色彩を変化させた画像を使用した。被験者は20代と50代以上である。この結果、デザインは木の自然な形を利用した横長の形が望ましく、背景色は茶系が最も許容度が高く、その場合は白の文字および黒の文字色が許容度が高かった。50代以上の被験者は誘目性が高い広告の方が許容度が高かったが、20代では誘目性と許容度の関係は低かった。これらの研究成果を日本デザイン学会、日本建築学会の論文誌、日本色彩学会年次発表大会などに投稿した。歴史性アプローチがよく進展し、歴史的町並みにおいて許容できる屋外広告のデザイン・色彩の傾向を明らかにするなど結果を得ている。現状分析アプローチ、諸外国先進事例アプローチにおいては、色彩計画の事例を収集し、また色彩設計の実践を行い、現在にふさわしい色彩計画を考察した。以上のように進展しているため、概ね順調に進展していると考える。平成29年度は以下の研究を行った。1.歴史性アプローチ:昨年度に行った歴史的町並みにおける屋外広告の色と形に関する評価実験の分析をさらに進めた。

この結果、3つの街並み「妻籠」「京都」「高山」のどの街並にも共通して次の傾向がみられた。例えば許容される看板の背景色はRY系の低明度低彩度が高かった。このとき、看板の文字色は同系色であるRY系の明度差3の色と、無彩色の白と黒の許容が高かった。対比色のB系の文字色は許容が低かった。被験者の属性を見ると20代の方が60代以上よりも評価の差が大きかった。これらを査読論文誌に投稿し、掲載された。2.現状分析アプローチ、諸外国先進事例アプローチ:国際学会において色彩計画について講演し、国内外の研究者と各都市の環境色彩に関する情報交換を行った。また、設計業務を行っている設計者に対しても色彩計画について講演し、実務における色彩計画の問題点などを抽出した。これらの結果をもとに、実際に学生宿舎や教育施設の色彩計画に応用した。以上、国際学会での招待講演や、専門誌への掲載、日本建築学会、日本色彩学会等に論文掲載や口頭発表を行った。景観色彩の誘導方法は数値で彩度の上限を決めるにとどまることが多く、画一的な傾向にある。本研究の目的は景観法の趣旨である地域再生を目論み、日本の景観を色彩から捉えた「環境色彩」を中長期的に改良する手法を開発することである。景観計画の収集分析やシミュレーションを用いた印象評価実験を行った結果、環境色彩のコントロールには、周囲の現実の色をもとにしたコントロール手法のほかに、その街並の持つ文脈や歴史的背景を考慮した色彩コントロール手法が有効であり、それは一律に色相や彩度の数値のみで行うのではなく、色相ごとに面積も考慮すべきであることを示した。平成27年度に引き続き、3つのアプローチにより調査と実験を行う。1.歴史的アプローチについては、歴史的町並みにおける屋外広告について、色彩と大きさに加えプロポーションも検討項目に加え被験者実験を行い、調和する条件を明らかにする。2.現状分析アプローチについては、国内における環境色彩の誘導方法について分析を進める。3.諸外国の先進事例アプローチについては、平成27年度にテロ事件により行えなかった現地調査を含め、安全に配慮して調査を行う予定である。以上の結果をまとめ、成果を学会で発表する。平成28年度に引き続き、歴史的町並みおよび現代の町並みにふさわしい色彩の調査と実験、さらに色彩計画の実践を行い、総括を行う。環境色彩、色彩デザイン諸外国先進事例アプローチで予定していた欧州における色彩事例の調査を、フランスパリのテロ事件により見合わせたため使用額の変更が生じた。諸外国先進事例アプローチで予定していた欧州における色彩事例の調査を、欧州でのテロ事件が続発していたことにより見合わせたため使用額の変更が生じた。平成28年度は欧州の安全情報を考慮しつつ、色彩事例の調査を実施する。平成29年度は欧州の安全情報を考慮しつつ、調査を実施する。
胎仔外科手術によるマウス遺伝性四肢奇形の発現制御

先天性の奇形を胎生期に発見し、この奇形および、それによって惹起される病態を予防するための胎児治療を目標としてきた。その基礎実験として、マウスの遺伝性多指症(Polydactyly Nagoya,Pdn)胎仔に胎仔外科手術を行い、奇形の防御をしうるかどうかを検討してきた。胎仔外科手術には、子宮切開法を用いるが、従来より行ってきた電極による手術では羊水の漏出や羊水中の気泡発生などが原因で、手術胎仔の死亡が多かった。レ-ザ-の場合には、集光点にエネルギ-が集中するので、卵黄嚢膜、羊膜を破壊することなく、胎仔組織を破壊できるので、その利用が本研究の主要なポイントとなった。数種のレ-ザ-光線を試した結果、アルゴンレ-ザ-がマウス胎仔外科に適していることがわかった。子宮切開法のもとで、妊娠13日のICRマウス胎仔の後肢第1指にアルゴンレ-ザ-2W、0.3秒を照射した。胎生18日に、再び開腹し、子宮外で育った胎仔を調べてみると、10例中6例は完全に第1指を消失し、残る4例でも、第1指は痕跡的であった。そこで、遺伝性多指症マウスのホモ接合体(Pdn/Pdn)の胎生13日に、その後肢の過剰指原基に2W、03秒照射した。その結果、11例中5例では、過剰指が完全に消失し、5本の指を形成した。残る6例は不完全多指症を示した。過剰指が完全に消失し、5本の指を形成したものを骨・軟骨重染色で染めると、第1指は三節母指を示していた。本実験で、レ-ザ-による胎仔外科手術が、生後に過剰指を切断するのに比べて、優越しているとは考えていない。しかし、レ-ザ-を胎児鏡や超音波診断装置と組み合わせることによって、ヒトの多指症や合指症のみならず、一卵性双生児の寄生体や奇形腫の除去を目的とした胎児外科にレ-ザ-を使うことは、近い将来に可能になると思われる。遺伝性多指症マウス(Pdn)のホモ接合体胎仔では、胎生11.5日の肢芽軸前側深部中胚葉のプログラム細胞死が起きない。このことが、過剰指を形成するメカニズムと考えてきた(Naruse & Kameyama,'82'83'86'86)。この深部中胚葉組織を、子宮切開法のもとで、微小電極(日進医療器K.K.)を用いて破壊し、多指の発現を制御する試みをした。その結果、多指になる運命にあるホモ接合体にもかかわらず、5本の指を形成した胎仔を数例得ることができた(日本先天異常学会第28回大会、'88)。しかし、この方法では、電極を卵黄嚢膜、羊膜を通して胎仔に挿入するために、羊水の漏出が多く、また、電気焼灼による組織破壊のため、羊水中に、プラズマ(イオンと電子の混合ガス体)が発生した。これらの原因で、多くの胎仔が死亡するものと考え、次に、レーザーメスの利用を考えた。レーザーの場合には、集光点にエネルギーが集中するので、卵黄嚢膜、羊膜を破壊することなく胎仔組織を破壊できる。

細胞破壊性のYAGレーザー(波長1067nm)を用いたところ、Free Running方式では長・短時間照射とも胎仔組織を破壊することができなかった。Qスイッチ方式を用いることで組織破壊が可能となったが、血管が破壊され、多量の出血を伴い、手術胎仔の生存が期待できず、目的とする胎仔手術には不適当であると判断した。波長647.1nmのクリプトンレーザーでも全く胎仔組織を破壊できなかった。蛋白凝固反応を起こすアルゴンレーザーのグリーンの波長(514.5nm)あるいはブルーとグリーンの波長(488nm)を試みたところ、中胚葉細胞が破壊され、出血もなかったので、アルゴンレーザーを採用することとなった。(ニデック社)。現在のところ、1W、0.2-0.3secが最適条件と考えている。アルゴンレーザーによって破壊された細胞の組織像は核よりも細胞質が先にダメージを受けた。昨年度は、マウス胎仔外科に適したレ-ザ-光の選択をし、アルゴンレ-ザ-が最適であると判断した。ニデック社のアルゴンレ-ザ-(AC2000)を改造し、レ-ザ-発射部を特別設計した。つまり、入射角度を大きくすることで、焦点を合わせた胎仔組織は破壊されるが、それを包んでいる卵黄嚢膜と羊膜は破壊されにくくした。妊娠11日のICRマウスの母体腹腔の中央部を開き、子宮を取り出し、子宮壁から卵黄嚢を取り出した。卵黄嚢膜を通して胎仔の後肢軸前側中胚葉にアルゴンレ-ザ-2W、0.3秒照射すると、照射部に細胞変性を示す白い斑点ができた。照射1時間後には、照射部の中心に胎仔性赤血球が集積し、血腫が形成された。その周囲は凝固壊死像を示し、そのまた外側は浮腫像を示した。照射24時間後には、照射部全体が空洞上の組織欠損を示す血腫になり、血球と細胞屑が浮いていた。この条件でレ-ザ-を照射し、胎生18日に胎仔を観察すると、一部の個体では、第一指が欠損し、大きな血腫が残存していた。次に、胎生11日の同部分に2W,0.1秒照射すると、胎生18日の胎仔の後肢には、第1指が欠損する例はなくなったが、血腫は残存した。照射部に組織欠損を惹起し、しかも血腫を残さない条件を探索中である。胎生13月のマウス胎仔では、すでに5本の指原基ができている。その第1指原基に2W、0.3秒のアルゴンレ-ザ-を照射した。その後、胎生18日に手術胎仔を調べると、第1指が完全に欠損していた。この場合には血腫を伴う場合と、伴わない場合があった。そこで、遺伝性多指症マウスのホモ接合体Pdn/Pdnの胎生13日の後肢過剰部分に2W、0.3秒のレ-ザ-照射し、胎生18日に調べると、過剰指が消失し、5本の指が形成されたものがあった。
プロテオロドプシンのプロトン輸送方向の制御メカニズムの解明

海洋微生物がもつ光駆動H+ポンプであるプロテオロドプシン(PR)のH+輸送方向のpH変化(中性→アルカリ性)による変換の機構を探り、最終的には微生物型ロドプシンのH+輸送方向を決める仕組みの理解へと繋げることが本研究のねらいである。H+を細胞内(CP)から細胞外(EC)へ一方向に輸送するバクテリオロドプシン(BR)では、活性中心であるH+化レチナールシッフ塩基からCP側へはH+が放出されず、輸送の向きの逆転を防ぐための機構が次のように提案されている。それはCP側の膜貫通領域が暗状態では疎水的な状態になっているが、光中間体形成時に構造変化することで、この領域の親水性を高め、H+がCP側からタンパク質内部へと取り込まれるというものである。そこで、CP側の膜貫通領域がPRでは親水性・疎水性のどちらの状態をとっているのかを探ることがBRのような一方向のポンプとの違いを明らかにするための1つの手掛かりになると考え、ヒドロキシルアミン(HA)による発色団の退色反応を暗状態下・光照射下の両方で調べた。一般に、微生物型ロドプシンは、暗状態ではCP側が疎水的、EC側は比較的親水的な環境となっているため、ミセル形成時は、水溶性試薬のHAは、主に親水的なEC側の領域から侵入し、発色団と反応する。一方、光照射下では、光中間体形成時にFへリックスのCP側の領域が開くような構造変化が起こり、水が流入するため、HAによる退色反応が暗状態下と比べてさらに促進されるという特徴がある。一方、PRにおいて同実験を行うと、暗状態でもHAによる退色反応が速やかに進行し、さらに光照射下でも退色速度は暗状態と大きく変わらなかった。このことから、PRではCP側が暗状態下でもすでに親水的な状態となっていることが予測され、この性質によりpHがアルカリ性のときにH+移動の逆流が起こるのを可能にしているのではないかと推測した。本研究では、海洋微生物から発見された光駆動プロトンポンプであるプロテオロドプシン(PR)のプロトン輸送方向が、アルカリ性の条件下で通常の外向きから内向きへと変換されるという現象が、どのような分子メカニズムで起こるのかを明らかにすることを目的とする。この目的を達成するために、まずはアルカリ性条件下でどのような光化学反応(フォトサイクル)が起きているのかを明確にする目的で、閃光光分解法による過渡吸収変化測定を行った。測定の結果、アルカリ性では通常のフォトサイクルで形成されるM中間体に加えて、Mに吸収波長が類似するもう1つのM様中間体(Ma)が形成されることが分かった。反応速度論に基づく解析の結果、Ma中間体はフォトサイクルの反応初期で起こる分岐反応によって生じることが分かった。さらにその反応はpHに依存し、pHが高くなるに従いMa中間体の形成量も増大することが分かった。Ma中間体の生成・崩壊速度は、塩化ナトリウムの存在の有無で異なることが明らかになった。したがって、どちらのイオン種に依存するかは明確ではないが、ナトリウムイオンもしくは塩化物イオンが結合し、Maの形成速度がコントロールされていることが示唆された。結合するイオン種の同定は、今後行う必要がある。また、アルカリ性でのフォトサイクル時におけるプロトン移動について調べるため、インジウム・酸化スズ(ITO)透明電極を用いた実験を行った。閃光照射時の実験結果から、Ma生成時にプロトンを吐き出して、崩壊時に取り込むというPRの通常のフォトサイクルとは逆の順番でプロトン移動が起こることが明らかになった。ここまでの実験から、PRのアルカリ性で起こるフォトサイクルとその過程で起こるプロトン移動については、予測スキームを確立することができた。しかしながら、Ma中間体と通常のM中間体との形成反応における活性化エネルギーの違いを見積もるために、閃光光分光法による温度依存性の実験を当初計画していたが、現在所有する実験装置では、室温付近から高温側での温度調節しか行えず、低温側での実験が行えないという問題に直面した。そこで、現有する測定装置に取り付けるためにアレンジした低温セルを現在構築中であり、翌年度初旬ごろには納入できる予定である。本研究では、海洋真正細菌由来の光駆動H+ポンプであるプロテオロドプシン(PR)のアルカリ性条件下におけるH+輸送方向の逆転のメカニズムを探ることを目的としている。本年度は、この機構についてアミノ酸レベルまで掘り下げて考察するために、部位特異的にアミノ酸に変異を導入し、フォトサイクルおよびH+移動に及ぼす影響について調べた。変異を導入した箇所は、7本の膜貫通αへリックスの内のCへリックス上にあるD97残基である。この残基は、PRの膜貫通領域の細胞外側に位置し、レチナールシッフ塩基のH+アクセプターと呼ばれる残基で、H+移動および外向きのH+輸送が起こるために不可欠な残基として知られている。この残基を中性のAsnに置換したD97Nのフォトサイクルについて、閃光光分解法を用いて調べた。中性のpH条件下における常温での実験の結果、フォトサイクル時にシッフ塩基からD97へとH+が移動したことを表すM中間体の形成がこの変異体では見られなかった。一方、pH 7よりもアルカリ性にしたところ、M様の中間体の生成が観測された。しかも、同条件下においてインジウム・酸化スズ(ITO)透明電極を用いた実験により、H+移動が起こるかどうかについて調べたところ、H+が最初に放出され、次いで取り込まれることがわかった。

このH+移動の順番は、野生型PRのアルカリ性条件下で見られたH+移動の順番とよく合致する。このことから、野生型PRとD97N変異体では、ともにアルカリ性条件下でのM様中間体の形成およびそのときに起こるH+移動機構が類似することが示唆された。この結果は、PRではアルカリ性になると、シッフ塩基のH+が細胞外側に位置するD97ではなく、細胞内側の何かのアミノ酸残基に移動するかもしくは直接、細胞内側の溶液中へと放出されること、またそれによって内向きのH+輸送を誘発させる可能性があることを示している。PRの外向きH+輸送に重要だと考えられている2つのアミノ酸残基の内、D97に関しては変異体による実験から、アルカリ性条件下でのH+移動がこの残基を介して起きていないことを示唆する結果を得ることができた。しかしながら、細胞内側の膜貫通領域に存在するもう1つの重要残基E108については、そのアミノ酸置換体の光反応について十分な測定・解析を行うことができなかった。この残基を様々なアミノ酸(Ala、Asp、Gln、Tyr、Cys、Lys、Arg、Hisなど)に置換した変異体の作製はすでに終了しているため、これらの変異体については引き続き実験を進める予定である。海洋微生物がもつ光駆動H+ポンプであるプロテオロドプシン(PR)のH+輸送方向のpH変化(中性→アルカリ性)による変換の機構を探り、最終的には微生物型ロドプシンのH+輸送方向を決める仕組みの理解へと繋げることが本研究のねらいである。H+を細胞内(CP)から細胞外(EC)へ一方向に輸送するバクテリオロドプシン(BR)では、活性中心であるH+化レチナールシッフ塩基からCP側へはH+が放出されず、輸送の向きの逆転を防ぐための機構が次のように提案されている。それはCP側の膜貫通領域が暗状態では疎水的な状態になっているが、光中間体形成時に構造変化することで、この領域の親水性を高め、H+がCP側からタンパク質内部へと取り込まれるというものである。そこで、CP側の膜貫通領域がPRでは親水性・疎水性のどちらの状態をとっているのかを探ることがBRのような一方向のポンプとの違いを明らかにするための1つの手掛かりになると考え、ヒドロキシルアミン(HA)による発色団の退色反応を暗状態下・光照射下の両方で調べた。一般に、微生物型ロドプシンは、暗状態ではCP側が疎水的、EC側は比較的親水的な環境となっているため、ミセル形成時は、水溶性試薬のHAは、主に親水的なEC側の領域から侵入し、発色団と反応する。一方、光照射下では、光中間体形成時にFへリックスのCP側の領域が開くような構造変化が起こり、水が流入するため、HAによる退色反応が暗状態下と比べてさらに促進されるという特徴がある。一方、PRにおいて同実験を行うと、暗状態でもHAによる退色反応が速やかに進行し、さらに光照射下でも退色速度は暗状態と大きく変わらなかった。このことから、PRではCP側が暗状態下でもすでに親水的な状態となっていることが予測され、この性質によりpHがアルカリ性のときにH+移動の逆流が起こるのを可能にしているのではないかと推測した。初年度でやり残した温度依存性の実験を行い、M中間体とMa中間体との形成反応の違いを熱力学的な観点からも考察することを試みる。加えて、上で述べたMa中間体の反応速度に関与する結合イオン種を明らかにするため、硫酸ナトリウム存在下での実験も行う。