hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
球状RFPにおけるヘリカル配位への遷移とプラズマ閉じ込めの高性能化

球状RFPではヘリカル配位に遷移する確率が高いことを明らかにした.このヘリカルRFP配位で磁気計測と軟X線イメージング計測を実施し,高温//高密度のヘリカルコアの存在と電子エネルギー輸送障壁に対応する放射強度分布の勾配形成を確認した.さらにm/n=1/2キンク不安定性(RWM)のフィードバック安定化により,放電時間を50%以上伸長させた.トムソン散乱電子温度測定により,Ip120kAで200eV,電子ベータ値が10%程度のRFPプラズマ生成を確認した.電子系に関してRELAXの目標値を達成した.球状RFPではヘリカル配位に遷移する確率が高いことを明らかにした.このヘリカルRFP配位で磁気計測と軟X線イメージング計測を実施し,高温//高密度のヘリカルコアの存在と電子エネルギー輸送障壁に対応する放射強度分布の勾配形成を確認した.さらにm/n=1/2キンク不安定性(RWM)のフィードバック安定化により,放電時間を50%以上伸長させた.トムソン散乱電子温度測定により,Ip120kAで200eV,電子ベータ値が10%程度のRFPプラズマ生成を確認した.電子系に関してRELAXの目標値を達成した.低アスペクト比RFP装置RELAXにおいて見出されたヘリカル平衡RFP配位(立体磁気軸をもつRPP配位)への遷移現象のダイナミクスを解明するために,軟X線(SXR)計測器を開発した.従来可視光領域で確認された(準)単一ヘリカル構造がSXR領域でも確認され,RELAXのヘリカル配位で電子密度,電子温度が周辺よりも高いヘリカルコアが存在することが確認された.低アスペクト比RFPでは低電流((100kA)で外部磁場よる制御ななくてもヘリカル配位が得られることが示された.さらに,低アスペクト比に特有の運転領域の探索により,従来よりも磁場反転が深い領域で磁場揺動レベルが低下することを見出した.これは新しい閉じ込め改善領域の開拓に結び付く可能性をもつ.磁力線追跡コード(ORBIT)を用いた解析によると,RELAXのヘリカル配位では,RFX-modで発見された単一ヘリカル軸配位(Single Helical Axis,SHAx)と同様に立体磁気軸配位となり,一方深い反転領域では中心付近に軸対称磁気面領域が形成されて,いずれの場合にも磁気カオスの修復が起こっていることが示唆された.計測器の開発に関しては,コア領域の閉じ込め特性を明らかにするために電子温度測定用トムソン散乱測定装置を製作して動作確認を行った.RFPプラズマの性能改善のために抵抗性壁不安定性のフィードバック制御系を整備した.これらを駆使して平成23年度はこれらを駆使して高性能RFPプラズマの実現を目指す低アスペクト比RFP装置RELAXにおいて見出されたヘリカル平衡RFP配位(立体磁気軸をもつRFP配位)への遷移現象のダイナミクスを解明しプラズマの性能評価を行うために,多チャンネル軟X線(SXR)検出器アレイからなるSXR放射強度分布計測器を開発した.RELAXのヘリカルRFP配位でSXR放射強度が周辺よりも高いヘリカルコアが存在し,放射強度分布の勾配が大きい輸送障壁の存在を示唆する結果が得られた.プラズマのコア領域の電子閉じ込め特性を解明するためにYAGレーザーを用いたトムソン散乱測定装置を開発し,中心電子温度の測定を行った.プラズマ電流が60-100kAの領域において中心電子温度は電流値とともに上昇し,プラズマ電流100kAで100-150eVに達した.電子密度は1019m-3の領域にある電子密度の計測精度をあげるために,140GHzミリ波干渉計の開発を進めている.これらの計測器によりプラズマ閉じ込め特性の評価が可能となった.RFPプラズマの高性能化のために,真空容器の真空シールとポロイダルギャップ部を兼ねるフランジの形状を改造してポロイダル抵抗を約2倍に上げて,特にトロイダル磁場反転時にフランジを流れる(局所的)ポロイダル電流の低減化を図った.さらに,抵抗性壁不安定性(RWM)のフィードバック制御系を整備し,電源の増設を行った.フランジの改造によってトロイダル磁場の軸対称性が改善され,ヘリカル平衡RFP配位の持続時間が大幅に伸長した.RWMの安定化実験に着手し,初期実験で放電持続時間の伸長(20%)を観測している.これらの磁気的境界条件の改善・制御によって,高プラズマ電流放電(125kA)が可能となった.平成24年度はこれらを駆使して高性能の低アスペクト比RFPプラズマの実現を目指す.低アスペクト比逆磁場ピンチ実験装置RELAXにおいて見出されたヘリカル平衡RFP配位(立体磁気軸をもつRFP平衡配位)への遷移現象のダイナミクスを解明し,これを外部から制御することにより,プラズマの高性能化へと展開するために,2011年度までに整備された計測器と制御システムを駆使して,以下の性能をもつRFPプラズマを達成し,そのダイナミクス解明を目指した.球状RFPに特徴的な深い反転領域で外部磁場による磁気的境界条件のアクティブ制御を行い,30Vを下回る周回電圧で100kAを超えるプラズマ電流,3msに近いフラットトップ維持が可能となった.トムソン散乱測定により,中心電子温度がプラズマ電流とともに増加して100kAでは150ー200eVに達することが確かめられた.

この領域のプラズマでは,中心電子ベータ値は10%程度に達する.一方,反転が浅い放電領域では,ヘリカル平衡配位(QSH)への遷移が起こりやすいことが見出され,また遷移を駆動する主要モードのトロイダルモード数と反転の深さおよび配位維持時間の間に相関があることも見出された.SXRイメージング計測によりQSH配位の内部磁場構造を明らかにするとともに,輸送障壁に対応する急峻な圧力勾配の領域が自発的に形成されることを確認した.SXR計測ではCTによる磁気面再構成の初期結果が得られ,主要モードに対応するm=1磁気島構造形成が確認された.磁場の軸対称性を改善するために,磁気的境界条件制御の初期実験を開始したが,この放電領域ではさらに制御スキームの最適化が必要である.QSHからヘリカル軸RFP配位に至る従来の緩和モデルの枠組みを越える高次MHD緩和現象の機構を解明することは今後の課題である.低アスペクト比RFPプラズマの閉じ込め性能評価のために必要な計測器がほぼ順調に整備され,初期結果が得られた.プラズマ高性能化の鍵となる制御系も整備が進み,初期実験が開始された.24年度が最終年度であるため、記入しない。RFPプラズマのヘリカル平衡配位への遷移過程の研究は,平成23年度に整備されたSXR放射強度分布計測器と,現在解析プログラムを作成中のCTの手法を組み合わせ,さらに核融合科学研究所(NIFS)のLHD計画共同研究として研究開発を進めている3次元SXR画像計測法を併用することにより,推進する.プラズマの高性能化のための能動的制御法では,磁場境界条件制御の最適化を引き続き推進するとともに,平成23年度にハードウェアを整備した超音速ガスパフによる高密度化実験を推進する予定である.プラズマ性能評価に必要な140GHzミリ波干渉計は,NIFS共同研究の一環として整備を進め,データ採取を可能とする予定である.24年度が最終年度であるため、記入しない。
急性冠症候群の発症における補体とC反応性蛋白の関与

急性冠症候群の患者の血中でC反応性蛋白(ORP)、IL-6値が上昇していることが報告されており、動脈硬化巣の発生・進展過程における炎症の関与が検討がされてきている。本研究では、狭心症患者の冠動脈アテレクトミー(DCA)標本を用いて、冠動脈硬化巣における補体系、CRPの蛋白局在とそのmRNA発現を検討し、病理組織所見と臨床所見と併せて解析した。その結果、動脈硬化巣では、補体(C3)とCRPの強い遣伝子発現が観察された。これらの分子は、免疫組織化学において、動脈硬化巣内のマクロファージと平滑筋細胞に陽性所見を認め、特にマクロファージにおいて非常に強い発現を認めた。臨床所見との検討において、不安定狭心症患者のDCA標本では安定狭心症患者に比べて、CRP陽性細胞の比率とCRP発現量が有意に高かった。またCRP陽性細胞の比率はDCA後再狭窄率と正の相関を示した。血中CRPの由来を検討する目的で、冠動脈流入側(バルサルバ洞)と流出側(冠静脈洞)でのCRP濃度を計測したところ、流入側に比して流出側でCRP値は高く、狭心症患者では有意な高値を示した。以上のことから、(1)冠動脈硬化巣の主にマクロファージにおいてCRPが産生され、冠循環に流出していること、(2)動脈硬化巣で産生されたCRPが動脈硬化巣の不安定化に関与し、不安定狭心症ならびに急性心筋梗塞の発症に関わっている可能性があること、(3)またCRP陽性細胞比がDCA後再狭窄率と相関することより、DCA標本の検討は、心血管イベントと再狭窄の予測因子の一つとなりえると期待された。本研究の結果は急性冠症候群の病態解明ならびに術後再狭窄予防に直結するもので、非常に意義のある結果と考えている。現在、さらに症例を重ねたデータの解析を進めており、他の炎症性サイトカイン類についての検討も始めている。動脈硬化の発生・進展における炎症の関与が注目されており、高感度C反応性タンパク質(CRP)測定の開発に伴い、血中CRP値が心血管イベント発症の予測因子となることが報告されてきている。本研究では、狭心症患者から採取された冠動脈アテレクトミー(DCA)標本を用いて、冠動脈プラークにおけるCRP発現と、狭心症の病型およびDCA後の再狭窄との関与について検討した。安定狭心症患者(SAP)12例,不安定狭心症患者(UAP)15例より得られたDCA標本を用いてCRP蛋白発現について免疫染色により検討し、CRPmRNA発現はRT-PCR法により解析した。また22例についてはfollow-upの血管造影により再狭窄の有無を観察した。その結果、SAPのDCA標本は主に平滑筋細胞と線維性細胞外基質から成り、UAPの標本は多数のマクロファージと平滑筋細胞から成っていた。CRPmRNA発現は検索しえたすべての標本で認められ、CRP蛋白はマクロファージ、平滑筋細胞および細胞外基質に分布していた。CRP陽性細胞はマクロファージに特に多く観察され、CRP陽性細胞率はSAPに比してUAPで有意に高値を示した。また陽性細胞率は再狭窄例で有意な高値を示し、血管狭窄度とも正の相関が認められた。

以上の結果より、DCA標本でのCRPの解析が、狭心症患者のプラーク内における炎症反応の程度とプラークの不安定性、およびDCA後の再狭窄の予測に有用であることが示唆された。さらに症例を加えて検討を進める予定である。急性冠症候群の患者の血中でC反応性蛋白(CRP)、IL-6値が上昇していることが報告されており、動脈硬化巣の発生・進展過程における炎症の関与が検討がされてきている。本研究では、狭心症患者の冠動脈アテレクトミー(DCA)標本を用いて、冠動脈硬化巣における補体系、CRPの蛋白局在とそのmRNA発現を検討し、病理組織所見と臨床所見と併せて解析した。その結果、動脈硬化巣では、補体(C3)とCRPの強い遺伝子発現が観察された。これらの分子は、免疫組織化学において、動脈硬化巣内のマクロファージと平滑筋細胞に陽性所見を認め、特にマクロファージにおいて非常に強い発現を認めた。臨床所見との検討において、不安定狭心症患者のDCA標本では安定狭心症患者に比べて、CRP陽性細胞の比率とCRP発現量が有意に高かった。またCRP陽性細胞の比率はDCA後再狭窄率と正の相関を示した。血中CRPの由来を検討する目的で、冠動脈流入側(バルサルバ洞)と流出側(冠静脈洞)でのCRP濃度を計測したところ、流入側に比して流出側でCRP値は高く、狭心症患者では有意な高値を示した。以上のことから、(1)冠動脈硬化巣の主にマクロファージにおいてCRPが産生され、冠循環に流出していること、(2)動脈硬化巣で産生されたCRPが動脈硬化巣の不安定化に関与し、不安定狭心症ならびに急性心筋梗塞の発症に関わっている可能性があること、(3)またCRP陽性細胞比がDCA後再狭窄率と相関することより、DCA標本の検討は、心血管イベントと再狭窄の予測因子の一つとなりえると期待された。本研究の結果は急性冠症候群の病態解明ならびに術後再狭窄予防に直結するもので、非常に意義のある結果と考えている。現在、さらに症例を重ねたデータの解析を進めており、他の炎症性サイトカイン類についての検討も始めている。
能動的力覚インタラクションによる情報伝達

(1)モデル計算手法の開発計測された作用力からフレームに与える加速度を決定するためのモデルとして、(a)剛体モデル、(b)バネ-マス-ダンパ系モデル、(c)固形粒モデル、(d)振り子モデルを実装した。モデルパラメータは、これが発現する運動がデバイスの提示能力の範囲内であること、また実時間での計算が可能であることなどを考慮して決定した。当初予定していた流体モデルについては、計算量が検討していたよりも大きいことが明らかとなり、解決方法を引き続き検討している。上記の4つのモデルについては、4kHzでの計算を行い、デバイスを通して得られる間隔の主観的評価からも妥当なものとなっている事を確認した。(2)提示能力と認識特性の評価以上で開発されたシステムの力提示の特性を評価した。操作-力関係(すなわち、加速度-力関係)の提示精度については、力センサをもつ弾性押し棒(指のモデル)を介した操作を行い、両者の関係性を確認した。固体粒モデルのように、衝撃力を生じる場合にモータ出力の限界から一時的に誤差が生じるものの、昨年度に構築した重心位置の追従補正により、機構の状態が速やかにモデルの状態に戻る事を確認した。対象物表現の忠実度については、被験者による知覚・認識に関する実験をおこなって評価した。バネ-マス-ダンパ系モデルおよび振り子モデルについて、これらに含まれるパラメータ(バネ定数、ダンパ定数)などに関する弁別の可能性を確認した。以上の実験を通して、能動的力覚インタラクションを通してモデルパラメータの情報を伝達できることを確認した。本年度は主に計測手法関係する以下の2点について検討を行った。1.デバイスの設計と試作慣性力を発生するデバイスの設計と試作を行った。把持して使用することを前提とした非接地型のデバイスを想定し、デバイスのフレームに対して平行リンクにより錘を移動させることで、1自由度の慣性力を発生する装置について検討した。設計として、錘とフレームの重量比を大きくとることが望ましい事から、アクチュエータ(モータ)の質量を錘の一部として利用する構成を考案した。アクチュエータに求められるトルクは、ユーザからの作用力により発生するトルクを相殺できる必要がある。また、錘の可動範囲は仮想の内容物質量および移動範囲とデバイスの錘質量とから決定される。これらの要素を考慮した設計をおこない、実装に反映させた。2.制御手法の開発仮想の対象物とデバイスとで質量が等しい場合には、デバイスは重心移動を表現するデバイスと考えることができる。したがって、ユーザの操作に対して仮想の内容物の挙動を計算し、これに伴う重心移動を表現する。多くの力覚提示装置は、ユーザの位置(運動)を計測し力を出力する制御を行っているが、本研究で検討するデバイスはユーザの手などに柔軟に支えられており、このためトルクにより直ちに力を制御することができない。本研究では、デバイスの運動をもとにユーザの作用する力を推定し、同時にデバイスの加速度を出力として制御するフレームワークを提案した。実装を通じて、この手法の可能性を確認した。
ADHD児と自閉症児の前頭葉機能特性および薬物と療育効果による変化

注意欠如・多動性障害(ADHD)群、自閉症スペクトラム障害(ASD)群、定型発達(TD)群を対象に、前頭葉機能評価バッテリー(CANTAB)を課題とし、課題遂行中の脳活動について、機能的近赤外分光法(NIRS)を用いて評価し、各障害における前頭葉機能の特徴を調べた。両障害群はspatial working memory(SWM)およびverbal fluency test(VFT)の課題で左前頭葉の賦活が低く、ADHD群ではSWMの課題で、ASD群ではVFTの課題で、賦活がより低く、鑑別に有用な可能性がある。注意欠如・多動性障害(ADHD)と自閉症スペクトラム障害(ASD)は高率に合併し、両障害において前頭葉機能障害が指摘されているが、早期診断の観点から、各障害における前頭葉機能の特徴を明らかにすることが本研究の目的である。ADHD男児30名(9.5 ±1.6歳)、定型発達男児35名(9.0 ±1.6歳)を対象として、前頭葉機能評価バッテリー(CANTAB)のSpatial Working Memory(SWM)課題施行時の脳活動変化をNear-infrared spectroscopy (NIRS)により計測した。課題のエラー数に群間差は認めなかった(ADHD群25.2±11.3、定型発達群21.1±12.3、p =0.171)。発達的変化を検討するため、年齢と課題成績、年齢と脳活動変化の相関分析を各群で行った。その後、両群の発達的変化の比較を行うため、課題成績、および脳活動における回帰係数の傾きの差の検定を行った。両群ともに年齢とエラー数に負の相関を認め(ADHD: r(28) = -0.37, p = 0.040;定型発達: r(33) = -0.59, p < 0.001)、年齢に伴う課題成績の向上を示したが、定型発達群は両側の外側前頭前野(4ch,13ch)と前頭極(10ch,11ch)の活動が年齢とともに増大していたのに比べて、ADHD群は年齢と脳活動に有意な相関は認めなかった。したがって、ADHD児は前頭前野の発達が不十分であることが先行研究により示されており、そのため、他の領域による代償的な活動によって課題成績を補っている可能性が示唆される。本研究内容を英文論文として発表した。ADHD群と定型発達群の前頭葉機能の発達的変化を測定し、両群の差を確認し、英文論文として報告した。おおむね順調に進んでいると考えられる。注意欠如・多動性障害(Attention-Deficit Hyperactivity Disorder: ADHD)と自閉症スペクトラム障害(Autism Spectrum Disorder: ASD)は高率に合併し、鑑別が困難である。両障害ともに、発達早期からの障害特性に合わせた養育や治療的介入が予後の改善に重要である。両障害の合併が高率に認められる要因の一つとして、両障害に共通して存在する前頭葉機能障害が指摘されており、早期診断の観点から、それぞれの障害に特有の前頭葉機能障害を特定することが急務である。本研究では、ADHD群、ASD群、定型発達群を対象に、前頭葉機能評価バッテリー(CANTAB)を課題とし、課題遂行中の脳活動を機能的近赤外分光法(NIRS)を用いて評価する。この試みにより各障害における前頭葉機能の特徴を明らかにする。本研究に関連したADHD男児の前頭葉機能をCANTABと脳活動NIRSにて同時測定した結果を論文化している段階である。また、ADHD児14名、ASD児11名、定型発達児19名の3群での前頭葉機能の比較検討も行った。その結果は、定型発達群と比較して両障害群は左前頭葉の賦活が不十分で、ADHD群ではspatial working memory時に、ASD群ではverbal fluency task時に顕著であった。これらの結果をまとめているところである。被験者に対して安全に検査は行えている。本研究に関連したADHD男児の前頭葉機能を前頭葉機能評価バッテリー(CANTAB)と脳活動NIRSにて同時測定した結果を論文化している。ADHD群、ASD群、定型発達(TD)群を対象に、前頭葉機能評価バッテリー(CANTAB)を課題とし、課題遂行中の脳活動を機能的近赤外分光法(NIRS)を用いて評価する。ADHD児14名、ASD児11名、TD児19名の3群での比較検討を行った。TD群に比較して両障害群はspatial working memoryおよびverval fluency testの課題で左前頭葉の賦活が低かった。両障害群の鑑別に関しては、ADHD群ではspatial working memoryの課題で、ASD群ではverval fluency testの課題で、賦活がより低い傾向があった。今後の発達障害や前頭葉機能の研究において、CANTABおよびNIRSが有用な検査であることが評価できた。

これらの結果について、論文作成し投稿しているが未受理の段階である。注意欠如・多動性障害(ADHD)群、自閉症スペクトラム障害(ASD)群、定型発達(TD)群を対象に、前頭葉機能評価バッテリー(CANTAB)を課題とし、課題遂行中の脳活動について、機能的近赤外分光法(NIRS)を用いて評価し、各障害における前頭葉機能の特徴を調べた。両障害群はspatial working memory(SWM)およびverbal fluency test(VFT)の課題で左前頭葉の賦活が低く、ADHD群ではSWMの課題で、ASD群ではVFTの課題で、賦活がより低く、鑑別に有用な可能性がある。今後はASD群や合併群での検討に着手する予定である。得られた結果については、学会発表および論文投稿により発信していきたいと考えている。引き続き、安全性に留意しながら、研究を遂行していく。研究結果を論文化していく。医歯薬学計画よりも諸費用が少なかったため。被験者謝金等が計画時より少なくすんだことによる。解析に必要なPCソフトの購入など、計画以外の費用が生じた場合に使用する。消耗品の購入、実験補助者への人件費・被験者謝金、オキシトシン濃度測定に使用し、遅滞なく研究計画を遂行する予定である。
生理学的アプローチによるヒト全能性幹細胞由来ペースメーカ細胞作製と再生医療応用

ヒトES細胞ならびにiPS細胞からイオンチャネルを指標としてペースメーカ細胞の作製を試みた。BACのHCN4のプロモーター領域にGFP遺伝子を導入したベクターをヒトES細胞に導入し、心筋分化誘導しGFP発現が最も高いクローンを複数選別採取した。分化細胞の5%にGFP陽性細胞の存在を確認した。HCN4-GFP陽性細胞を採取し、心筋特異的な収縮蛋白とHCN4チャネルを特異的に発現し、自動能ならびに自動能を生成するイオンチャネルを発現したpacemaking細胞であることを確認した。CaトランジェントによりそのHCN4-GFP細胞からの自動能が心房筋へ伝搬した。以上からHCN4-GFP BACベクター搭載ヒトES細胞株を樹立し、ペースメーカ細胞を選択的に採取できることが判明した。ヒトHCN4チャネルのプロモーター領域を含むBACにGFP遺伝子を連結し、電気穿孔法でヒトESに遺伝子導入し、Neomycinにより耐性クローンを選択しBAC搭載ヒトES細胞株を得た。ヒトESおよびiPS細胞からペースメーカ細胞を含む心筋細胞を分化誘導するために、ヒトES細胞をコンフルエントの状態にし、酵素処理により小型の細胞塊を作成し、マトリゲル上で培養し、Wntシグナルの阻害薬とBMPシグナルの阻害物質を添加して、分化誘導を開始し、4日間培養する。引き続き酵素処理により単一細胞を作成後、96 well dishの各wellに10000個の細胞を巻き凝集塊を作製して、BMP4とFGF2を添加することで分化誘導した。ヒトES細胞の分化効率は最大2030%であり分化誘導法を確立した。分化誘導によりフローサイトメータ状でHCN4-GFP発現の強い8株を樹立し、その中でクローン1(#1)を解析した。#1は正常な核型と未分化マーカーの正常な発現を確認した。分化誘導により全細胞の5%にHCN4-GFPの発現を認めた。HCN4-GFP陽性細胞をソーティングし、単一細胞ならびにその凝集塊の自律拍動を確認した。ペースメーカ細胞の電気特性の検討をシュミレーションモデルとの比較を用いて検討した。ES細胞からの心筋分化誘導効率の改善の為に、エピジェネティクス因子の一つであるHP1-γの作用を検討し、その効果を検証した。さらに、ES細胞の未分化性を維持する細胞としてマウス線維芽細胞に変えて脂肪由来幹細胞を検討した。これらの多能性幹細胞から遺伝子改変なく表面抗原であるプリオンを用いて心筋を単離出来ることを確認した。現在ヒトiPS細胞には同様の検討を予定している。(1)ヒト全能性幹細胞からのペースメーカ細胞分化誘導技術の確立:ヒトES細胞は京都ヒトES細胞株3番を用い、ヒトiPS細胞はヒトTリンパ球に山中4因子をセンダイウィルスベクターを用いて導入し樹立した。これらの細胞からペースメーカ細胞を含む心筋細胞を分化誘導するために、ヒトES細胞ならびにヒトiPS細胞をコンフルエントの状態にし、酵素処理により小型の細胞塊を作成し、マトリゲル上で培養し、Wntシグナルの阻害薬(CHIR99021)とBMPシグナルの阻害物質(Noggin)を添加して、分化誘導を開始し、4日間培養する。CHIR99021(3μM)とNoggin(100ng/ml)でday4でstageIIへ移行し、FGFを添加することで、凝集塊が100%拍動し、分化誘導法を確立した。(2)BAC改変ヒト全能性幹細胞の樹立:ヒトHCN4チャネルのプロモーター領域を含む5kbの5'-側と3kbの3'-側をPCRで増幅した後、GFPのcDNAを持ちNeomycine耐性遺伝子とジフテリア毒素遺伝子を有する真核細胞発現ベクターのmulti-cloning siteに挿入したノックインベクターを作成する。制限酵素でベクターをlinearizeしたのち電気穿孔法でヒトESおよびiPS細胞に遺伝子導入し、Neomycinにより耐性クローンを選択した。ノックイン株が得られないために、ヒトHCN4チャネルのプロモーター領域にGFPを連結したBACベクターを構築し、ヒトES細胞に導入し、マウスES細胞に導入し、心筋分化誘導し、GFPの発現を拍動心筋に確認してBACベクターが作動することを確かめた。本年度の第一目標であるヒトES細胞からのペースメーカ細胞を含む心筋細胞への分化誘導条件はCHIR99021(3μM)とNoggin(100ng/ml)でday4でstageIIへ移行し、FGFを添加することで最適化が完了した。また、ヒトTリンパ球細胞よりヒトiPS細胞の作製に成功しており、順調に進展している。

一方で、ヒトES細胞由来心筋細胞からペースメーカ細胞をGFPにより選別する技術に関しては当初予定していたノックインES細胞作製が不成功に終わったために、HCN4のプロモーター領域を搭載したBACベクターを作製し、これをヒトES細胞に導入することでGFPによりペースメーカ細胞を選別できる予定であり、BACベクターを用いたHCN4陽性細胞の選別採取法が確立できる。さらに現在単離心筋細胞を得るための酵素処理の最適化を行っている。前述のBACベクターを用いたGFP陽性のヒトES細胞ならびにiPS細胞由来ペースメーカ細胞を選別採取する。これを用いてヒト全能性幹細胞由来ペースメーカ細胞の組織化ならびに徐脈モデル動物へのペースメーカ組織移植とその性能評価を行い、外部評価委員による研究進捗の検証することで研究期間中に遅滞なく目標を達成出来るようにする。次年度の研究費の使用計画:12,663円の発注が間に合わないために残額が生じた。これを含めて次年度の本研究を完成させるために消耗品に研究費を使用する計画である。
脈絡叢の神経回路形成における新機能:拡散性分子分泌による軸索伸長・細胞移動の制御

前年度の研究成果により、反発分子であるSemaphorin 3FおよびSlit2が脈絡叢に発現し、それらから反発を受ける嗅球、視床上部、海馬の3種の軸索がレセプター分子であるNeuropilin2、Roboを発現することが明らかとなった。また、コラーゲンゲル内共培養法により、視床上部および海馬の軸索はSemaphorin 3Fより反発され、嗅球の軸索はSlit2により反発されることが明らかとなり、これらの分子が反発分子として寄与する可能性が示唆された。そこで本年度は、これらのリガンド分子が実際に脈絡叢由来の反発分子として優位に機能しているかどうか検討を行った。レセプター分子の細胞外ドメインとヒトIgG Fc領域よりなる分泌型キメラタンパク質(Neuropilin2-FcおよびRobo2-Fc)を調製し、これらを、嗅球、視床上部、海馬と脈絡叢との共培養系の培地中に加えて、脈絡叢から分泌されるSemaphorin 3FあるいはSlit2分子による軸索に対する反発作用が阻害されるかどうか調べた。その結果、視床上部からの軸索、および、海馬からの軸索に対する脈絡叢組織の反発作用は、Neuropilin2-Fcタンパク質の存在下で消失したが、Robo2-Fcタンパク質の存在下では影響を受けなかった。一方、嗅球からの軸索に対する脈絡叢組織の反発作用は、Neuropilin2-Fcタンパク質の存在下では影響を受けなかったが、Robo2-Fcタンパク質の存在下で消失した。これらの実験結果は、脈絡叢が、Semaphorin 3Fを介して視床上部および海馬の軸索を、Slit2を介して嗅球の軸索を、それぞれ反発することを示唆する。本研究課題の成果により、脈絡叢がSemaphoin 3FおよびSlit2を介して種々の軸索を反発することにより神経回路形成にも寄与するという新たな概念が提唱される。申請者は、側脳室、第3脳室、第4脳室内に存在する脈絡叢が拡散性軸索反発分子を分泌し、第3脳室脈絡叢近傍の視床上部の手綱核、側脳室脈絡叢近傍の海馬、生体内では終脳間脳境界を越えることの全くない嗅球僧帽細胞の軸索に対し強い反発作用を持つことを明らかにした。しかし、脈絡叢が拡散性反発分子を分泌することは分かったが、その分子の実体は未解決であった。本研究ではこの分子の同定を試みることを1つの目的としている。今年度は、既知分子について拡散性分子として働くかどうかの検討を行った。まず、候補分子として考えられるsemaphorin3Fおよびslit2°の2分子およびそれらのレセプターであるneuropilin-2,robo1,robo2の各分子の回路形成期での発現パターンをmRNA in situハイブリダイゼーション法により解析し、リガンドが胎生期の脈絡叢に、レセプターが脈絡叢により反発されるニューロンに発現するかどうかチェックした。その結果、リガンドとレセプターの発現パターンが予想と一致していたので、次に、semaphorin3Fあるいはslit2分子が実際に軸索に対し反発活性を持つかどうかを検討した。全長のsemaphorin3F,slit2のcDNAを供与あるいはRT-PCRによるクローニングにより得て、発現ベクターに組み込み、これを哺乳類株細胞にリポフェクション法により導入し、リガンド分子を強制発現させた。この細胞をハンギングドロップ法により凝集塊にして、脈絡叢により反発されるニューロンを含む組織と、拡散性分子の濃度勾配を検出できるコラーゲンゲル内で共培養しアッセイした。その結果、視床上部の組織から伸長する軸索がSema3Fにより反発されることが明らかとなった。
都市における家庭養育支援に関する研究

<研究目的>核家族化や少子化が進み、地域社会の連帯も失われつつある現在、子育て中の家族が孤立化し、育児不安や養育困難な問題が生じ、児童虐待も深刻な社会問題となっている。本研究は乳児院や児童養護施設などの基幹児童福祉施設が要保護児童の保護や自立支援など従来の役割に加えて、地域社会の家庭養育支援施設としてどのように機能を拡大し、地域社会のネットワークを形成していくことができるか、またその課題を明らかにすることを目的とした。平成9年の児童福祉法改正により新設された「児童家庭支援センター」に焦点を絞り、センターがどのように設置運営され利用されていくかそのプロセスを調査し、地域におけるセンターの役割機能と地域子育て支援ネットワークの実態を明らかにして、これからの児童家庭支援センターの充実発展、さらにセンター制度改革への提言を行う。<研究成果>1.児童家庭支援センター構想とセンター制度が制定された経緯を検証した。2.児童家庭支援センター制度創設から5年間のセンター設置プロセスを明らかにした。児童家庭支援センターが発足して今年度で5年が経過した。平成14年度末現在、全国に36センターが設置されている。そのうち25センター(実質1年以上の活動実績があるセンター)を訪問し、運営方針、活動内容、利用状況、地域の関連機関との連携・ネットワークの形成、今後の課題などを聞き取り調査した。そのほか全国児童家庭支援センター会議で情報、資料収集を行い全センターの状況を把握した。3.児童家庭支援センターは付設されている本体施設の機能を活用し、地域の子育て支援機能を果たしていることは実証できた。しかし地域偏在、センター間の活動内容、利用状況の差が大きいこと、児童相談機関としての位置づけが明確でないこと、本体施設の運営、養護実践自体が厳しい状況下でセンター付置が容易でないことなど、多くの課題が明らかとなった。<研究目的>核家族化や少子化が進み、地域の連帯も失われつつある現在、子育て中の家族、とくに母親が孤立し、育児不安や多様な養育問題が発生している。児童虐待なども社会問題化している。これらの状況は全国的な現象ではあるが、都市において顕著に見られる。そこで、本研究は都市に設置されている児童福祉施設(児童養護施設、情緒障害児短期治療施設など)が、従来の施設機能に加えて地域の家庭養育支援施設として地域住民にどのように利用され、子育て支援に役立っているかを検証する。そして児童福祉施設が地域の児童家庭福祉サービスを実践する拠点の一つとしてその機能を拡大し、地域の家庭養育支援ネットワークづくりを推進していく方法を研究することを目的としている。<研究成果>1.児童家庭支援センターの聞き取り調査実施本年の研究は平成9年の児童福祉法改正により新設された「児童家庭支援センター」がどのように設置運営され、利用されていくかそのプロセスを調査することを中心とした。本年度までにセンターを設置して1年以上経過した12施設に関して、センター設置の目的、活動内容、利用状況、本体施設との関係、地域の関連機関との連携、条件整備、これからの課題などを現地調査しその概要を把握した。2.家庭養育支援に関する文献資料のリスト化を進めている。3.聞き取り調査の結果を参考にして、来年度実施予定の職員意識調査の準備を進めている。<研究目的>核家族化や少子化が進み、地域の連帯も失われつつある現在、子育て中の家族、とくに母親の孤立や育児不安が増大し、都市においてその傾向が顕著に見られる。都市にはさまざまな相談機関や援助サービスがあるものの、不安を抱きながら子育てをしている親にとってそれらは身近な存在ではなく、また相互の連携もなく利用しにくい。昨年度に引き続き「児童家庭支援センター」の設置運営・利用状況の調査を行い、地域におけるセンターの役割機能と課題を明確にすることを目的とする。

さらに、センター設置地域においてセンター以外でどのような家庭養育支援サービスが実施されているか、地域の支援ネットワーク化がどのように進められているか、地域関連機関の調査を行い実態と課題を明らかにする。<研究成果>1.児童家庭支援センターの聞き取り調査平成12年度に新しく設置された7センターを訪問し、地域の状況、センター設置の目的、活動内容、利用状況、本体施設との関係などを聞き取り調査した。昨年度に実施した12センター調査と合わせて、全国のセンター設置、活動状況がかなり明らかとなった。2.児童家庭支援センターを設置している地域の子育て支援に関する調査2カ所のセンターを中心に、地域の子育てに関する問題状況の把握、行政の子育て支援施策、サービス実施施設や機関の活動状況、地域の支援ネットワークについて調査を開始した。これにより来年度本格的に調査するための基礎データの収集ができた。3.児童福祉法改正による児童家庭支援センター制度化に関する資料検討により、当初からの問題点が明らかになった。<研究目的>本年は3年継続研究の最終年である。3年間の調査結果の分析、考察を行い、児童家庭支援センターの実態を明らかにするとともに課題を整理し、今後のセンター制度改革への提言をまとめる。<研究成果>1.児童家庭支援センター5年間の設置過程と活動実態の把握平成13年度に設置されたセンターを訪問し、地域の状況、センター設置の目的、活動内容、利用状況、本体施設との関係、地域の関連機関との連携などを調査した。前年度までのセンター調査結果と総合して、児童家庭支援センター発足から5年間の経過が明らかとなった。2.センターの事例調査として地域の関連機関との関係形成のプロセス、ネットワークの現状を考察した。3.児童家庭支援センターは付設されている本体施設の機能を活用し、地域の子育て支援機能を果たしていることを実証した。しかし地域偏在、センター間の活動内容、利用状況の差が大きいこと、児童相談・支援施設としての位置づけが明確でないこと、市町村行政との関係、本体施設の運営、養護自体が厳しい状況下でセンター付置が容易でないことなど、問題点を整理し、提言をまとめた。
カオス振動子の集団的振舞いとパターン形成

カオス振動子を用いた振動形反応拡散系の計算機シミュレーションによる研究を行った。振動子としては、典型的な微分方程式系のレスラ-モデルを用いた。系は二次元系である。この研究の主眼点として以下のことが挙げられる。1巨視的パターン、特にうず巻きパターンが形成可能か。2うず巻きパターンが形成された場合に、系はカオス状態であるか。すなわち、パターンとカオスは共存するか。3カオス状態は、系の大きさに依存するか。これに対応する結果として、1うず巻きパターンは形成され、安定に存在し続けることが分かった。2またこの際に、系の最大リアプノフ数は正であることが観測され、パターンとカオスは共存することが確かめられた。3系の大きさを変化させた場合に、あるサイズの系においては、最大リアプノフ数がゼロとなることが判明した。以下1、2、3の結果を補足する。うず巻きパターンは、通常よく存在する一腕パターンのみならず、より複雑な二腕から四つ腕パターンまで安定に存在することが判明した。また、うず巻きパターンは互いの衝突に対して安定であることも分かった。最大リアプノフ数は、うず巻きパターンが形成されるような比較的大きな系の場合には、0.05程度であり、単体のレスラ-振動子の値0.072に比べて減少していることが分かった。さらに系を小さくして行くと、リアプノフ数がゼロになる場合があるが、この現象は、この二次元系の中に生ずる周期的定在波と関係あり、系の大きさを調節することにより、振動状態を制御でき得ることが判明した。系は二次元系である。
虚弱高齢者と家族の寝たきり恐怖の実態の解明と心身機能に応じた安全な生活の指導

平成18年度までの研究により、寝たきりを過度に恐れる気持ち「寝たきり恐怖」は高齢者が明確に自覚しているものではなく、調査票等による把握は困難であることがわかった。そして寝たきり恐怖の自覚の有無にかかわらず虚弱高齢者に普遍的なアプローチすること、高齢者自身が日常生活の中で転倒の危険要因に自ら気づき、自ら適切な対応をとれるようになることが有効と示唆された。そこで本年度の本研究の目的は、中山間地域の地域高齢者を対象に、日常生活(環境)の転倒の危険要因に気づく力を高めるためのプログラム「転倒の危険予知訓練」を実施し、その効果を明らかにすることとした。本研究に同意した中山間地域在住の認知症を認めない特定高齢者60名を対象とし、小冊子学習群、KYT学習群に同数ずつ振分け、20分間学習してもらった。小冊子学習群は、研究者が作成した住環境整備の対策が書かれた小冊子を配布し、それを熟読してもらった。KYT学習群は、研究者が作成したKYTシートを用い、KYT基礎4ラウンド法を用いて実施した両教材とも文献を参考に同じ内容を含むよう筆者が作成した。転倒危険箇所を描いた住環境のイラストについて、対象者が指摘した危険箇所の個数を成績とし、学習実施直前および直後、1ヵ月後に判定を実施した。その結果、両群とも学習直後で有意な成績向上を示し、1ヵ月後も維持されていたが、2群間に有意差はなかった。向上した者は、転倒不安、活動の減少の訴えがあった。学習後に住環境整備を実施した者は、学習の継続を希望した。以上より、住環境整備の実施には意欲等の心理要因、活動等の身体要因が関与していることが示唆された。東京都、長野県、島根県の総合病院で下肢の受傷により整形外科的治療を受け、半年から1年程度経過した在宅高齢者29名(男性9名、女性20名、平均年齢79.2±6.5才)を対象にした訪問面接調査の逐語録から内容分析を行った。高齢者にとって手術を要する下肢の外傷は、移動能力の喪失、すなわち寝たきり状態となることを想起させるものであった。たとえ予後が良好な外傷や手術であっても、全事例が受傷をきっかけに寝たきりは嫌だという思いを強くしていた。病気で辛い治療を受けるくらいなら死んだ方がましと言う一方で寝たきりによる死亡を強く否定するなど、高齢者にとって寝たきりは「惨めな死に方」であった。このような惨めな状態を避けるために、「寝たきりになるよりはまし」と、たとえ転倒などの事故の危険があっても活動量を維持・拡大することを重視し、日々こなすべき運動のメニューを独自に考え、取り組んでいた。「(自ら考えた日課を)今日もやる」ことが寝たきり予防として最も効果的な手段であると捉えられていた。また、高齢者は様々な思いを家族や友人にすら話すことはなく、抱え込んでいた。特に骨折の治療をしてくれた医療者に対しては、回復した姿を見せたい、弱音を吐きたくないという思いを抱いていた。以上の結果から、医療者は寝たきりを予防したいと願う高齢者のありのままの気持ちや生活の様子を把握し、リハビリテーション効果の高い運動や活動を日課に採り入れられるような働きかけを考える必要性が示された。寝たきりを恐れるあまりに転倒などの事故の危険を顧みずにリハビリテーションを試行錯誤する虚弱高齢者を、移動能力と転倒予防自己効力感によってスクリーニングを試みた。長野県T市の高齢者基本健康診査の結果と転倒予防自己効力感の測定結果を用いて、身体機能と転倒予防自己効力感の側面から対象者を分類し、寝たきり恐怖の有無や寝たきり恐怖に伴う事故リスクの有無との関連を明らかにすることを目的とした。対象は、長野県T市で2005年に高齢者健診を受診した地域高齢者803名のうち、面接調査に同意した16名(男性1名、女性15名)であった。高齢者基本健康診査の一部として実施されている10m全力歩行時間を6.0秒以上/未満と転倒予防自己効力感を30点以上/未満で4群に分け、各群から任意に対象者が選出され、説明と同意の手続きの後、訪問し、寝たきり恐怖、寝たきり恐怖に伴う事故リスク、閉じこもりの有無、日常行動をインタビュー・観察した。その結果、4群のいずれでも寝たきり恐怖があると答え、歩行時間が遅く・自己効力感が低い群に特徴的に寝たきり恐怖が現れるということはなかった。また高齢者は草取りひとつをとってもそれぞれの身体機能に応じたやり方を工夫しており、たとえば虚弱高齢者は這うようにして畑の中を移動しており、寝たきり恐怖によって転倒などの事故リスクを高めるような試行錯誤が見られるかどうかを12回の訪問・観察で定義することはできなかった。結論として、寝たきりを過度に恐れる気持ち「寝たきり恐怖」は高齢者が明確に自覚しているものではなく、調査票等による把握は困難であることがわかった。寝たきり恐怖の自覚の有無にかかわらず虚弱高齢者に普遍的なアプローチを行うことにより、自己判断による高齢者の身体機能を超えた行動を予防し、転倒などの事故のリスクにさらされることを防ぐプログラムを作ることが有効と考える。

そして寝たきり恐怖の自覚の有無にかかわらず虚弱高齢者に普遍的なアプローチすること、高齢者自身が日常生活の中で転倒の危険要因に自ら気づき、自ら適切な対応をとれるようになることが有効と示唆された。そこで本年度の本研究の目的は、中山間地域の地域高齢者を対象に、日常生活(環境)の転倒の危険要因に気づく力を高めるためのプログラム「転倒の危険予知訓練」を実施し、その効果を明らかにすることとした。本研究に同意した中山間地域在住の認知症を認めない特定高齢者60名を対象とし、小冊子学習群、KYT学習群に同数ずつ振分け、20分間学習してもらった。小冊子学習群は、研究者が作成した住環境整備の対策が書かれた小冊子を配布し、それを熟読してもらった。KYT学習群は、研究者が作成したKYTシートを用い、KYT基礎4ラウンド法を用いて実施した両教材とも文献を参考に同じ内容を含むよう筆者が作成した。転倒危険箇所を描いた住環境のイラストについて、対象者が指摘した危険箇所の個数を成績とし、学習実施直前および直後、1ヵ月後に判定を実施した。その結果、両群とも学習直後で有意な成績向上を示し、1ヵ月後も維持されていたが、2群間に有意差はなかった。向上した者は、転倒不安、活動の減少の訴えがあった。学習後に住環境整備を実施した者は、学習の継続を希望した。以上より、住環境整備の実施には意欲等の心理要因、活動等の身体要因が関与していることが示唆された。
ラジアルフロー型バイオリアクターを用いた培養ヒト肝細胞でのHCV増殖機構の解析

まずはじめに、人工肝感染実験に用いる感染性クローンの構築のため、ヒトに輸血後肝炎を発症させ、しかもチンパンジーに対する感染価も高い、一人のC型肝炎患者血清より完全長のcDNA(NIHJ1)を作製した。このNIHJ1のバキュロウイルス発現系を用いてHCV全長の遺伝子を昆虫細胞で発現させたところ、蛍光抗体法や免疫沈降法で全てのHCV蛋白の発現が認められ、前駆体蛋白のプロセッシングも完全に行われていることが確認できた。次に人工肝感染実験に用いるのに適した細胞を調べる目的で以下の実験を行った。AdexCAT7を各種細胞に感染させイムノブロット法とポリメラーゼ活性を指標にしてT7ポリメラーゼの発現を確認した。調べたほとんどの細胞で、EMCVのIRESを持つpT7EMCLucが最も高い活性を示したが、唯一,FLC4細胞のみでHCVのIRESを持ったpT7HCVLucが最も高い活性を示した。このように、EMCVに比べ効率の低いHCVのIRESを持ったpT7HCVLucの活性がFLC4細胞のみで高い価を示したことは、FLC4細胞には、HCVのミニジーンRNAを特異的に安定化させ翻訳効率を上昇させる何らかの宿主因子が存在することが示唆された。単層培養での慢性C型肝炎患者血清を用いた感染実験の結果もFLC4のみHCVRNAの検出が持続したことからも考え会わせ、このFLC4細胞を人工肝の感染実験に用いることに決定した。そして高密度培養用のバイオリアクターを用いて6O日以上にわたり、安定的に細胞培養が可能であることが示されただけでなく、低温培養により細胞の増殖速度をコントロールすることに成功した。そこでこの人工肝にまず前述のC型肝炎患者血清を感染材料として用い、人工肝から流出する培養液をサンプリングしてHCVRNAをRT-PCRで検出したところ、感染開始後1-2日まではHCVRNAは陽性であったものの、それ以降陰性であった。残念ながら培養液からは感染の確証は得られなかった。現在、我々が作製した全長のクローンおよびUSAより供与されたチンパンジーに感染を成立させた感染性クローンを用いた感染実験を継続中である。In vitroでHepatitis C Virus(HCV)を感染増殖させるシステムの確立は、HCVの感染増殖のメカニズムの解析、ワクチンの開発などに応用でき、有意義である。まず肝由来細胞をラジアルフロー型バイオリアクターで培養の条件を培養液の種類、血清濃度、酸素供給量、グルコース供給量につき検討し良好に培養可能となった。この条件下で培養される肝由来細胞株(JHH細胞)はそれぞれ肝特異蛋白であるアルブミンやAFPを産生を確認しており、肝本来の機能を有していることが明らかとなった。一方JHH細胞株からはのHBV、HCVは培養液、細胞内に存在しないことを確認している。以上のようにこの細胞培養系がin vitroでのHCV感染増殖系としての基本的能力を有していることが確認された。またHCVについては感染症研究所においてC型肝炎患者血清を使用しチンパンジー感染性とin vivoでの増殖性を確認した。さらにこのHCVの全塩基配列を決定しており、ウイルスの同一性の確実な確認が可能である。以上のように培養系の準備、さらにHCVの性質の解析は終了している。人工肝でのin vitroによる感染増殖性の検討を開始している。前年度までに、人工肝感染実験に用いる感染材料の検討が終了している。

すなわち、人工肝感染実験に用いる感染性クローンの構築のため、ヒトに輸血後肝炎を発症させ、しかもチンパンジーに対する感染価も高い、一人のC型肝炎患者血清より完全長のcDNAを作製した。今年度はまず最初に、人工肝感染実験に用いるのに適した細胞を調べる目的で以下の実験を行った。AdexCAT7を各種細胞に感染させイムノブロット法とポリメラーゼ活性を指標にしてT7ポリメラーゼの発現を確認した。調べたほとんどの細胞で、EMCVのIRESを持つpT7EMCLucが最も高い活性を示したが、唯一,FLC4細胞のみでHCVのIRESを持ったpT7HCVLucが最も高い活性を示した。このように、EMCVに比べ効率の低いHCVのIRESを持ったpT7HCVLucの活性がFLC4細胞のみで高い価を示したことは、FLC4細胞には、HCVのミニジーンRNAを特異的に安定化させ翻訳効率を上昇させる何らかの宿主因子が存在することが示唆された。単層培養での慢性C型肝炎患者血清を用いた感染実験の結果もFLC4のみHCVRNAの検出が持続したことからも考え会わせ、このFLC4細胞を人工肝の感染実験に用いることに決定した。そして高密度培養用のバイオリアクターを用いて60日以上にわたり、安定的に細胞培養が可能であることが示されただけでなく、低温培養により細胞の増殖速度をコントロールすることに成功した。そこでこの人工肝にまず前述のC型肝炎患者血清を感染材料として用い、人工肝から流出する培養液をサンプリングしてHCVRNAをRT-PCRで検出したところ、感染開始後1-2日まではHCVRNAは陽性であったものの、それ以降陰性であった。残念ながら培養液からは感染の確証は得られなかった。現在、我々が作製した全長のクローンおよびUSAより供与されたチンパンジーに感染を成立させた感染性クローンを用いた感染実験を継続中である。
骨肉腫肺転移症例に対する遺伝子治療に関する研究

具体的には次の様な実験を行なった。(1)腫瘍壊死因子遺伝子しを、マウス白血病ウイルスをベクターとしてリンパ球に導入する方法を確率し、インビトロの系でこの導入細胞による骨肉腫細胞増殖抑制効果を調べる。(2)遺伝子治療のターゲットとなる遺伝子の探索、すなわち骨肉腫において患者の予後(肺転移の有無)と関連性を持つ遺伝子の同定を行なう。(1)については、腫瘍壊死因子遺伝子をレトロウイルスベクターに組み込みマウス白血病ウイルスパッケージング細胞株PA317に導入する基礎実験を行なった。さらに、腫瘍壊死因子遺伝子発現レトロウイルスベクターを骨肉腫細胞に導入し発現をみる予定であったが、これに先立ちマーカージーンをレトロウイルスベクターに組み込み、骨肉腫細胞に導入する予備実験を試みた。しかしながらこれまでのレトロウイルスベクターによる遺伝子導入・発現では実用的な導入効果が得られず、そのため有用な結果は得られなかった。(2)については、手術時に採取した骨肉腫組織に癌遺伝子産物・ErbB-F2蛋白質が発現していることを見いだし、その発現強度と肺転移症例とは関連があることを明らかにした。そのため、ErbB-2蛋白質をターゲットとする遺伝子治療は有用である可能性が見いだされた。さらに、ErbB-2蛋白質は膜貫通型チロシンキナーゼであり細胞表面に局在しているため、骨肉腫細胞の有力なマーカーとなりうる。今後、骨肉腫におけるErbB-2蛋白質の研究が進み、骨肉腫の病態解明に役立つ事を期待するものである。本研究の目的は骨肉腫肺転移症例に対して遺伝子治療による方法を応用できるかどうかの可能性を探ることである。本年度は、準備として以下の3点を行なってきた。1.確立された骨肉腫細胞株をもちいて、細胞培養法、継代法、細胞凍結保存法を安定して行なえるようになった。2.手術時に採取した患者骨肉腫細胞を培養、増殖、継代し、一部凍結保存してきた。3.代表的な細胞増殖測定法であるMTT法を骨肉腫細胞系に用いる場合、注意すべき測定条件(1)1ウェル中の至適細胞数、(2)培養日数、(3)培養液がMTT法に与える影響などを検討した。上記の準備に加え、さらに以下の実験を行なった。4.インビトロの系で各種の濃度での腫瘍壊死因子による骨肉腫細胞増殖抑制効果の判定を行なった。各種濃度の腫瘍壊死因子存在下で骨肉腫細胞を培養し、細胞数の経時的変化を測定した。その結果、腫瘍壊死因子の骨肉腫細胞に対する増殖抑制効果を確認した。5.腫瘍壊死因子遺伝子をレトロウィルスベクターに組み込み(アンホトロピック)マウス白血病ウイルスパッケージ細胞株PA317に導入する基礎実験を行なった。本年度は、確立された骨肉腫細胞株(HOSおよびUMR)、それぞれの細胞株について、細胞増殖(抑制)評価法であるMTT法を用いて細胞増殖(成長)曲線を求め、それぞれの細胞の(1)1ウェル中の初回散布細胞数、(2)至適培養日数、(3)その他の培養条件を決定した。さらに本年度は腫瘍壊死因子をレトロウイルスベクターに組み込みマウス白血病ウイルスパッケージング細胞株PA317に導入する基礎実験を行った。また腫瘍壊死因子遺伝子をレトロウイルスをベクターとして骨肉腫細胞に導入し発現をみる予定であったが、これに先立ちマーカージーンをレトロウイルスをベクターとして骨肉腫細胞に導入する予備実験を試みた。しかしながらこれまでのレトロウイルスベクターによる遺伝子導入・発現ではその効率の点が問題でいまだ改良すべきところが多く現在も検討中である。

これまで確立された骨肉腫細胞株(HOSおよびUMR)、それぞれの細胞株について、細胞増殖(抑制)評価法であるMTT法を用いて細胞増殖(成長)曲線を求め、それぞれの細胞の1ウェル中の初回散布細胞数、至適培養日数、その他の培養条件を決定した。さらに腫瘍壊死因子遺伝子をレトロウイルスベクターに組み込みマウス白血病ウイルスパッケージング細胞株PA317に導入する基礎実験を行った。マーカージーンをレトロウイルスをベクターとして骨肉腫細胞に導入する予備実験を試みた。しかしながら用いたレトロウイルスベクターによる遺伝子導入・発現では効率が低く、腫瘍壊死因子遺伝子の導入するまでには至らなかった。