hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
EBウイルス関連胃癌の発生機構.病原体・宿主相互DNAメチル化を軸として

このようなメチル化異常を高頻度に起こしている胃癌は高CIMP型胃癌と呼ばれている,我々は,EBウイルス関連胃癌が高CIMP型胃癌であることを明らかにしたが,今年度は,さらに癌抑制遺伝子p73のプロモーター領域にEBウイルス関連胃癌特異的にメチル化が起きていることを明らかにした(Ushiku, et. al. Int JCancer 120:60,2007)。さらに,EBウイルス関連胃癌の周囲胃粘膜でDNAメチル化の頻度を検索したが,陰性胃癌の周囲胃粘膜と差はなく,いずれも低頻度であった。EBウイルス胃癌の場合には,DNAメチル化の亢進はEBウイルス感染に伴って引き起こされる異常であると,考えられた。EBウイルス感染系による解析:組みかえEBV持続感染胃癌細胞株と親株との比較で,EBウイルス関連胃癌の特徴であるアポトーシス抵抗性が,複数のEBV感染胃癌細胞株において再現されていた(Hino, et. al. Cancer Res68:1427,2008)。この系を用いることによって,潜在期ウイルス蛋白LMP2AがNF_KBを活性化し,抗アポトーシス蛋白の発現を亢進させていることを見出した。EBウイルス潜在期蛋白トランスジェニックマウスによるメチル化促進機構の解析:EBウイルス潜在期蛋白を胃特異的に発現させるため,胃壁細胞特異的H^+K^+-ATPaseプロモーターを用い,その下流にLMP2a,EBNA1遺伝子を結合させた組み換えベクターを構築した。これを用いて,トランスジェニックマウスを作製し,胃上皮細胞にEBウイルス潜在期蛋白の発現を確認した。EBウイルス関連胃癌の発癌過程モデル作製の突破口になると期待される。
実験的冠状動脈攣縮期における内皮特殊顆粒の動態

狭心症の主因である冠動脈攣縮が種々の薬物で実験的に誘発されることは報告されてきたが,攣縮期の形態学的変化は殆ど観察されていない.また,他種血管でヒスタミン含有顆粒であると考えられてきた内皮特殊顆粒(Weibel-Palade body)の冠血管における意義も解明されていない.我々はブタ冠動脈で行った実験から以下の結果を得た.1)ブタ冠動脈前室間枝(1mm2mm長)をKrebs Ringer内にワイヤーで懸垂し,動ひずみ測定機に接続したのち,種々の血管収縮物質を濃度を変えて添加した結果,アセチルコリン(10^<-3>M)とヒスタミン(10^<-3>M)で強い収縮曲線を得た.2)ヒスタミン誘発冠動脈攣縮期の血管壁は中膜平滑筋細胞の収縮による内皮の管腔内突出,内弾性板の屈曲,内皮と内弾性板との離開,さらに内皮細胞間隙の空胞状拡大などがみられ,内皮細胞内にも多数の空胞が出現した.3)HRP標識実験で,攣縮期には標識が内皮細胞間隙,内皮下層,内弾性板などに,対照群と比べて有意の差を以って沈着しており,動脈攣縮で著しい血管内皮透過性を亢進していることが明らかとなった.4)内皮特殊顆粒の動脈攣縮に及ぼす影響を検索するため,ヒスタミン遊離剤であるcompound 48/80(500μg1mg/ml)を添加した結果,微弱ではあるが,収縮曲線が得られた.この時期の内皮細胞を電顕で観察した結果,内皮特殊顆粒の著明な脱芯を生じていたが, 2)で述べたような内皮の形態学的変化は殆ど認められなかった.5)以上の結果はヒスタミン誘発によるブタ冠動脈攣縮期には血管内膜の著明な損傷が生じ,それが攣縮を増幅することが示唆された.内皮特殊顆粒はブタ冠動脈においてもヒスタミン含有顆粒であり,その放出は血管中膜の収縮を誘発させることが明らかとなった.狭心症の主因である冠動脈攣縮が種々の薬物で実験的に誘発されることは報告されてきたが,攣縮期の形態学的変化は殆ど観察されていない.また,他種血管でヒスタミン含有顆粒であると考えられてきた内皮特殊顆粒(Weibel-Palade body)の冠血管における意義も解明されていない.我々はブタ冠動脈で行った実験から以下の結果を得た.1)ブタ冠動脈前室間枝(1mm2mm長)をKrebs Ringer内にワイヤーで懸垂し,動ひずみ測定機に接続したのち,種々の血管収縮物質を濃度を変えて添加した結果,アセチルコリン(10^<-3>M)とヒスタミン(10^<-3>M)で強い収縮曲線を得た.2)ヒスタミン誘発冠動脈攣縮期の血管壁は中膜平滑筋細胞の収縮による内皮の管腔内突出,内弾性板の屈曲,内皮と内弾性板との離開,さらに内皮細胞間隙の空胞状拡大などがみられ,内皮細胞内にも多数の空胞が出現した.3)HRP標識実験で,攣縮期には標識が内皮細胞間隙,内皮下層,内弾性板などに,対照群と比べて有意の差を以って沈着しており,動脈攣縮で著しい血管内皮透過性を亢進していることが明らかとなった.4)内皮特殊顆粒の動脈攣縮に及ぼす影響を検索するため,ヒスタミン遊離剤であるcompound 48/80(500μg1mg/ml)を添加した結果,微弱ではあるが,収縮曲線が得られた.この時期の内皮細胞を電顕で観察した結果,内皮特殊顆粒の著明な脱芯を生じていたが, 2)で述べたような内皮の形態学的変化は殆ど認められなかった.5)以上の結果はヒスタミン誘発によるブタ冠動脈攣縮期には血管内膜の著明な損傷が生じ,それが攣縮を増幅することが示唆された.内皮特殊顆粒はブタ冠動脈においてもヒスタミン含有顆粒であり,その放出は血管中膜の収縮を誘発させることが明らかとなった.各種血管収縮因子投与による実験的冠動脈攣縮期における形態学的変化を観察して以下の結果を得た。ブタ冠状動脈前室間枝(23mm長)を37°CKrebs Ringer液中にワイヤーで懸垂し、それを動ひずみ測定機に接続した。リンゲル液中に10%KGI液を添加し、動脈攣縮の誘発を確認したのち、収縮誘発物質としてエルゴノヴィン、ヒスタミン、セロトニン、アセチルコリンおよびノルアドレナリンを添加し、これらの薬物による動脈攣縮を動ひずみ測定機による張力変化として記録した。実験の結果、エルゴノヴィンとセロトニンは用いた濃度(【10^(-8)】【10^(-3)】M)では動脈攣縮を全く生じなかったのに対し、ヒスタミンとアセチルコリンでは【10^(-3)】M添加で著明な攣縮を記録した。これらの攣縮期の形態学的変化を観察するため、2分、5分、30分後にリンゲル液をKarnovsky固定液に交換し、電子顕微鏡試料を作成した。また、攣縮期にペルオキシダーゼ(HRP)を灌流した試料も併せて観察した。ヒスタミン投与によって中膜は対照例に比べて著明な収縮を示し、それに伴う内弾性板の屈曲によって内皮細胞核部の管腔内への突出が認められた。

また、内皮細胞間や内皮細胞と内弾性板との間に大小さまざまの空胞が出現し、その数はヒスタミン添加例にとくに多かった。HRPは対照例では内皮細胞間に沈着するのみで、内弾性板や内皮下結合組織への浸潤は殆どみられなかったのに対し、ヒスタミン添加例では細胞間空胞や内弾性板への沈着が著明であった。このような血管壁の形態変化はアセチルコリン添加例では顕著でなく、このことは同薬物による張力変化が僅かに2分程度しか持続しなかったという実験結果にも一致する。以上の結果はヒスタミンによる冠動脈攣縮が血管内膜に著明な損傷を与えることを示唆している。
頭頸部扁平上皮癌に対するサイトカイン免疫遺伝子治療の開発

さらに平成22年度には、治療後マウスのspleencellを回収し、クロムで標識したSCCVIIと4時間co-cultureし、放出されるクロムをガンマ線シンチレーションカウンターで測定し、CTL活性を、また、クロムで標識したYAC-1細胞と4時間co-cultureして放出されるクロムを測定しNK細胞活性を評価することで、IL-27による腫瘍増殖抑制効果が主にNK細胞の細胞傷害活性によるものであることを示した。また、IL-21およびIL-27の腫瘍増殖抑制効果はCDDPによるelectrochemotherapyと併用することで相加的に腫瘍増殖を抑制できることを示した。また、IL-28もCDDPと相乗的に働きSCCを抑制することを報告した(J. immunother 2011)。平成23年度はCD4・CD8・NKを除去したマウスに治療し、抗腫瘍効果を比較検討する実験を行ってきたが現在までのところ再現性のある結果が得られていない。2) electrochemotherapyとの併用による相乗効果の検討IL-21遺伝子治療ではCTL・NK細胞の細胞障害活性が増強され、IL-27遺伝子治療ではNK細胞の細胞傷害活性が増強されたが、CDDPとの併用によりそれらの増強作用は影響されなかった。平成22年度には、治療後マウスのspleencellを回収し、^<51>Crで標識したSCCVIIと4時間co-cultureし、放出される^<51>Crをガンマ線シンチレーションカウンターにて測定し、CTL活性を、また、^<51>Crで標識したYAC-1 cellと4時間co-cultureし、放出される^<51>Crを測定しNK細胞活性を測定することで、IL-27による腫瘍増殖抑制効果が主にNK細胞の細胞傷害活性によるものであることを示した。また、IL-28もCDDPと相乗的に働きSCCを抑制することを報告した(J.immunother 2011)さらに平成22年度には、治療後マウスのspleencellを回収し、クロムで標識したSCCVIIと4時間co-cultureし、放出されるクロムをガンマ線シンチレーションカウンターで測定し、CTL活性を、また、クロムで標識したYAC-1細胞と4時間co-cultureして放出されるクロムを測定しNK細胞活性を評価することで、IL-27による腫瘍増殖抑制効果が主にNK細胞の細胞傷害活性によるものであることを示した。また、IL-28もCDDPと相乗的に働きSCCを抑制することを報告した(J.immunother 2011)。
ニッチによる幹細胞の運命制御

本研究を平成22年6月からスタートさせたが、新学術領域研究(研究領域提案型)「ニッチによるがん幹細胞制御機構の解析」(平成22年度26年度)の採択に伴い、重複禁止の規定により、本研究を終了することになった。1)造血ニッチの組織学的解析in vivo imaging、超微細形態3次元の構造解析法を確立し、造血幹細胞とこれらのニッチ細胞との関連を明らかにする。また、我々は、静止期幹細胞は、成体になって出現し、胎生期や生後の成長期には存在しないことを提唱してきた。その後、多くの研究が、成長期の造血と成体維持期の造血の違いを指摘している。そこで、成長期と成体維持期の造血幹細胞とそのニッチの経時的変化を、詳細に検討する。すなわち、胎児肝、あるいは乳児期の骨髄では、造血幹細胞の多くが細胞回転をしている。また骨端にも血管内皮細胞が多く、成体に近づくにつれて減少する。このように幹細胞の状態およびニッチは、個体発生に伴い変化すると考える。我々は、すでに、出生後、造血幹細胞においてN-cadherinの発現は増加し、VE-cadherinは減少することを見出している。この際、網羅的なMicroarrayではなく、すでに集積されている造血幹細胞のデータベースをもとにFluidigm社のBiomark Systemを用いて、FACSで分取した幹細胞あるいはニッチ細胞をシングルセルレベルでの解析に着手した。2)ニッチ細胞の分離、ニッチ分子の同定とその機能解析すでに我々は、骨髄に存在する非血液細胞、非血管内皮細胞分画をこのように分類することに成功している。興味深いことに、成熟骨芽細胞は主としてN-cadherin, Osteopontinのような接着分子を、間葉系前駆細胞はAng-1,TPOのようなサイトカインを分泌していることが明らかとなりつつある。これをさらに詳細に解析し、重要ニッチ分子を絞り込んだ。
金属安定同位体から予測する化学風化によるレアメタル濃集

平成30年度は、インドネシア、スラウェシ島の複数の母岩および風化層厚の異なるNiラテライト鉱床において、風化断面の詳細な調査および試料採取を行った。化学分析の結果から、風化の進行度やレアメタルの濃集程度を比較したところ、風化の進行度が高いサイトにおいて高いNi濃集が見られた。また、元素移動量の計算結果から、NiとFeの付加量には正の相関が見られた。さらに、鉄同位体の分析結果から、深部にNiが高濃集しているプロファイルの表層部では、Fe同位体比が負の方向にシフトしており、これは表層部における鉄の還元溶解がNi濃集の重要な要因の一つである事を示唆している。NiとFeの濃集に関係があることは先行研究でも述べられていたが、そのメカニズムについて、より直接的な証拠に基づき明らかにしたのは本研究が初めてである。今後は、表層部のみの同位体マップの作成を行い、Ni濃集の新探査指標として有効性を検証する。また、本年度は高精度Cr同位体分析手法の開発を行った。まず溶解方法の検討を行い、難溶解性の試料についてはステンレスジャケットを用いた高温高圧分解法が最も高いCr回収率を達成できることが分かった。さらに、分析条件の検討とダブルスパイク法を採用することで、標準試料(JP-1)の同位体比分析における分析精度を向上させることに成功した。また、ダブルスパイクの添加量を再検討するとともに、複数の標準物質のCr同位体比の繰り返し測定を行い分析精度の向上を目指す。以上の成果については、日本地球惑星科学連合2018年大会、Goldschmidt Conference 2018、同位体環境学シンポジウム2018において発表を行った。日本地球惑星科学連合2018年大会では学生講演賞を受賞した。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
電子分光電子顕微鏡法によるSi中の酸素析出物の微細構造評価

昨年度はsiウエハー中に1000°Cで形成される板状酸素析出物SiO_2が非晶質ではなく、α-クリストバライト型結晶であることを明らかにした。この析出物はSiデバイスプロセス中の不純物ゲッタリングシンクとして導入されたものである。ゲッタリング機構を解明するために、今年度はその板状酸素析出物周辺の格子歪みを最新鋭の電子分光型電子顕微鏡を使って調べた。局所的歪みを定量的に評価するために、収束電子回折(CBED)の高次ラウエゾーン(HOLZ)線を利用した。新しい電子顕微鏡は電界放射電子銃を備えているので輝度が高く、照射プロープを従来より一桁細く絞ってもHOLZ線を観察できる。さらに、Ω型エネルギー分光装置を内蔵しているので電子の非弾性散乱成分を除去できる。そうするとバックグランド強度が低下し、従来に比べて厚い試料からでも明瞭なHOLZ線が得られる。また、記録装置としてイメージングプレートやスロースキャンCCDを使うと微弱な回折強度も記録できる。以上の結果、厚さ450nmのSiに直径12nmのプローブを照射しても格子定数を測定できるような明瞭なHOLZ線を観察することができた。Si母相の(001)面に平行な板状酸素析出物の周辺で[510]晶帯軸入射CBEDパターンを観察した結果、板面に垂直方向にはSi格子が圧縮応力を受け正方晶に歪んでいること、板面から垂直方向に0.2μm離れた所ではC軸長が約0.5%収縮していること、0.1μm離れた所では歪み0.01%以下であることがわかった。回折線の分裂から見積もった最大格子湾曲は約5度であった。
わが国の野生鹿における志賀毒素産生大腸菌の保菌状況と分離株の病原性評価

わが国の鹿323頭の直腸便から志賀毒素産生大腸菌(STEC)の分離を行ったところ、38頭(11.8%)から49株のSTECが、9頭(2.8%)から9株のO157が分離された。分離株は志賀毒素遺伝子や細胞接着因子などの病原関連遺伝子を保有していた。O157株の系統解析では、1株は出血性下痢患者由来株が多く含まれるClade7に、8株は水様性下痢の患者由来株が多く含まれるClade12にそれぞれ分類された。鹿由来STEC 31株について、24種類の病原関連遺伝子の保有パターンにより系統解析を行ったところ、O5 STEC2株は人患者由来株と類似したパターンであり、人に病原性を示す可能性が示唆された。平成26年度は、従来より収集を開始している検体を含め、平成25年10月から平成27年3月までに、わが国の10道府県より得られた計114検体の鹿糞便材料のうち、90検体を用いた。10%糞便乳剤を作成し、直接マッコンキー培地に接種して志賀毒素産生大腸菌(以下STECとする)の分離培養を試みた。さらには同材料をmEC培地に接種して増菌培養をした後、クロモアガーO157、ならびにCT-SMAC寒天培地にて分離培養を行った。得られた大腸菌について、PCRによりstx遺伝子の検出された株をSTECとした。その結果、全体では16検体(17.8%)からSTECが分離された。鹿の性別では、雄で7.5%(3/40)、雌で26.3%(10/38)、性別不明で25%(3/12)であった。季節別では、秋で6.3%(1/16)、冬で19.4%(12/62)、および春で25%(3/12)であった。地域別では、北海道で0%(0/13)、関東で36.4%(4/11)、中部で37.5%(3/8)、関西で0%(0/32)、四国で31.3%(5/16)、九州で40%(4/10)であった。さらに得られたSTEC分離株について、O157血清を用いた血清凝集試験を実施したところ、1検体(1.1%)が陽性となった。今後、O157以外の血清型についてはO-genotypingを実施した後、想定される血清を購入し、血清凝集試験により確認を行う。現在、さらに病原関連遺伝子として、各種接着因子、ならびに志賀毒素遺伝子バリアント、および系統型別を実施している。平成27年度は、2014年9月から2016年3月までに、わが国の13道府県より得られた計305頭(うち平成27年度は191検体)の鹿糞便材料を用いた。10%糞便乳剤を作成し、志賀毒素産生大腸菌(以下STECとする)ならびに血清型O157 STECの分離培養を行った。得られた大腸菌分離株について、PCRによりstx遺伝子の検出された株をSTECとした。その結果、全体では38検体(12.5%)からSTECが分離された。季節別のSTEC陽性率は、春で13.2%(9/68)、夏で24.1%(20/83)、秋で2.7%(2/75)、および冬で8.9%(7/79)であり、夏の陽性率は秋と冬に比べ有意(P<0.05)に高い値を示した。地域別では、北海道で0%(0/13)、関東(千葉、神奈川、山梨)で11.5%(6/52)、中部(静岡)で9.4%(5/53)、関西(三重、京都、奈良、和歌山)で20.5%(18/88)、四国(徳島)で19.4%(7/36)、九州(長崎、熊本、宮崎)で3.2%(2/63)であった。さらに38検体から得られた50株のSTEC分離株のうち、9検体から得られた9株(18.0%)は、O157血清を用いた血清凝集試験により血清型O157であることが確認された。分離株の志賀毒素遺伝子のバリアント別では、stx2c+2dが15株(30.0%)、stx2cが11株(22.0%)、stx2dが6株(12.0%)、stx1aが4株(8.0%)、stx1a+stx2cが3株(6.0%)、stx2aが2株(4.0%)、stx1c+stx2c+stx2dが2株(4.0%)であった(残りの9株は現在検討中)。その他の病原因子としてはeae陽性が15株(28.0)、hlyA陽性が39株(78.0%)であった。本研究では、日本全国で捕獲された野生鹿を対象として志賀毒素産生大腸菌(STEC)の分離を行い、得られた鹿由来STEC分離株について、1)O-genotypingによる血清型別、2)24種類の病原関連遺伝子を総合的に解析するPCR-binary typing system(P-BIT)による病原性評価、ならびに3)全ゲノム解析による人ならびに牛由来STECとの比較ゲノム解析、以上3点に絞って研究を実施する計画である。

これらの目的のため、平成27年度では、さらなる検体数を増やすことにより、より多様性に富む鹿由来STECを分離することができた。特に、鹿由来O157STEC分離株は昨年度まで1検体由来1株のみであったが、本年度はこれを含め、9検体由来9株得られたことから、最終年度に実施を計画しているゲノム解析に利用できる。来年度以降の病原性解析に使用できる。これまでに得られた50株については、生化学性状試験、ならびに病原関連遺伝子の一部については解析が終了した。以上から、本研究課題の研究目的に対して、概ね順調に進展していると考えた。2013年9月から2016年5月までに、13県の鹿323頭から収集した直腸便を採取した。各糞便の5倍乳剤を作製し、クロモアガーSTEC培地またはMacConkey培地を用い、37°C、24時間でSTECを分離した。また、同乳剤をノボビオシン加mEC培地で42°C、18時間で増菌培養後、クロモアガーO157培地、CT-SMAC培地に接種して、STECと同様の条件でO157の分離を行った。各培地上の大腸菌のうちstx遺伝子を保有する株をSTECとした。STECと同定された株は、stxバリアント、病原関連遺伝子(eaeA、hlyAの有無を検討した。O157分離株(過去に分離された1株を含む)は、PFGE解析、ならびにLSPA-6解析およびARMS-PCR解析による系統解析を行った。本研究では、38頭の鹿から49株のSTECが、9頭から9株のO157が分離された。STEC株のstxの内訳は、stx1のみが3株、stx2のみが43株、stx1+stx2が3株であった。さらにeaeA (+)は13株、hlyA (+)は36株であった。一方O157株は、stx2cが8株、stx1a+stx2cが1株で、全ての株はeaeA (+)、hlyA (+)であった。O157株のPFGE解析では、同地域で捕獲された5頭の鹿由来O157 5株は同じパターンを示し、合計6パターンが示された。O157株の系統解析では、1株は主症状が出血性下痢患者由来株が多く含まれるClade7に、8株は主症状が水様性下痢の患者由来株が多く含まれるClade12にそれぞれ分類された。わが国の野生鹿には、STECが広く分布しており、低率ながらO157も分布していることが明らかとなった。PFGE解析の成績から、特定のO157クローンが同一地域で分布していることも明らかとなった。O157株の系統解析においてClade7および12に分類される株は、わが国のO157感染症患者から多く検出されることから、鹿は人へのO157感染源となる可能性が示唆された。わが国の鹿323頭の直腸便から志賀毒素産生大腸菌(STEC)の分離を行ったところ、38頭(11.8%)から49株のSTECが、9頭(2.8%)から9株のO157が分離された。分離株は志賀毒素遺伝子や細胞接着因子などの病原関連遺伝子を保有していた。O157株の系統解析では、1株は出血性下痢患者由来株が多く含まれるClade7に、8株は水様性下痢の患者由来株が多く含まれるClade12にそれぞれ分類された。鹿由来STEC 31株について、24種類の病原関連遺伝子の保有パターンにより系統解析を行ったところ、O5 STEC2株は人患者由来株と類似したパターンであり、人に病原性を示す可能性が示唆された。本研究では、日本全国で捕獲された野生鹿を対象として志賀毒素産生大腸菌(STEC)の分離を行い、得られた鹿由来STEC分離株について、1)O-genotypingによる血清型別、2)24種類の病原関連遺伝子を総合的に解析するPCR-binary typing system(P-BIT)による病原性評価、ならびに3)全ゲノム解析による人ならびに牛由来STECとの比較ゲノム解析、以上3点に絞って研究を実施する計画である。これらの目的のため、平成26年度では、1検体の収集、2STECの分離培養、3生化学性状解析、および4STEC分離株のO-genotypingを実施する計画であった。
白血病及び正常造血幹細胞におけるWT1遺伝子の発現様態の解析

全ての白血病で、Wilms腫瘍の原因遺伝子であるWT1遺伝子が異常高発現しており、RT-PCR法でこれを定量することにより、微小残存白血病(MRD)の測定が可能である。一方、正常造血幹細胞分画をCD34,CD33,CD38などでFACS sortingして、幹細胞分画におけるWT1遺伝子発現を調べたところ、CD34^+CD33^-分画にのみ、発現が認められた。しかし、白血病細胞における発現より10倍以上低いものであった。白血病再発の早期診断を行うには、この正常造血幹細胞亜分画における発現は、骨髄でのMRD検出の感度を下げることになる。そこで、コントロールとして、WT1を発現しない悪性リンパ腫の患者で、同種骨髄移植後の幹細胞分画のFACSでの解析とWT1遺伝子発現の定量を、経時的に同一検体で行ったところ、移植後45カ月間、CD34分画の減少が観察され、それに伴ってWT1値が1オーダー以上低下することが判明した。一方、白血病患者では、再発時は白血病細胞当たりのWT1発現量が上昇することが観察されているので、両者を合わせると、移植後の再発早期診断は、従来考えられていたよりも、より早期に行えることが判明した。これらのデータを基に、骨髄移植を受け、その後再発を来した6人の白血病患者で、寛解状態より再発へのステップに至るturning pointを解析したところ、中央値49日(22-104日)であり、それを過ぎると、指数関数的に腫瘍量が増加していくことが判明した。したがって、骨髄移植後の再発へのfirst stepは移植後極めて早期に生じており、移植後の免疫抑制剤の調節を移植早期より行う必要があると考えられた。小児の腎腫瘍であるWilms腫瘍の原因遺伝子であるWT1遺伝子が、ほとんど全ての白血病で高発現していることを明かにし、WT1が、ほとんど全ての白血病の新しい腫瘍マーカーであることを世界に先駆けて発見した。WT1の発現量の定量法(WT1アッセイ)を用いて、骨髄では、正常細胞1,00010,000コに1コの感度で、末梢血では、正常細胞10万コに1コの感度で、白血病細胞を検出しうる方法を確立した。骨髄で感度が末梢血に比べて低いのは、正常造血幹細胞のCD34^+分画がわずかにWT1を発現することによるbackgroundが存在するためである。K562のWT1の発現レベルを1.00とすると、正常骨髄では10^<-4>代のbackgroundとなるので、骨髄検体では1/10^31/10^4が白血病細胞の検出限界と考えられた。これは、白血病の増殖の主たる場が骨髄であることを考えると、好ましくない。しかし、この検出限界は正常骨髄検体を基に解析したものであった。そこで、WT1を全く発現していない悪性リンパ腫の患者で、同種骨髄移植後の骨髄検体におけるCD34^+細胞数とWT1値を経時的に測定した結果、移植後有意にCD34^+分画が減少すること、それに比例して、WT1値も低く抑えられていることを見い出した。このことは、同種骨髄移植後の造血能の回復のbiologyの解明に新知見を与えるものであると同時に、移植後にWT1 assayを用いて、微小残存白血病を測定する場合、骨髄も末梢血と同程度に高い検出感度が得られるということを示す。化学療法患者でも、同様のことがいえるが検討中である。さらに、現在正常造血幹細胞におけるWT1の発現様態を詳細に調べることを目的として、CD34^+ lineage^-分画をFACS sortingし、single cell PCRを行うことにより、解析を進めている。全ての白血病で、Wilms腫瘍の原因遺伝子であるWT

1遺伝子が異常高発現しており、RT-PCR法でこれを定量することにより、微小残存白血病(MRD)の測定が可能である。一方、正常造血幹細胞分画をCD34,CD33,CD38などでFACSsortingして、幹細胞分画におけるWT1遺伝子発現を調べたところ、CD34^+CD33^-分画にのみ、発現が認められた。しかし、白血病細胞における発現より10倍以上低いものであった。白血病再発の早期診断を行うには、この正常造血幹細胞亜分画における発現は、骨髄でのMRD検出の感度を下げることになる。そこで、コントロールとして、WT1を発現しない悪性リンパ腫の患者で、同種骨髄移植後の幹細胞分画のFACSでの解析とWT1遺伝子発現の定量を、経時的に同一検体で行ったところ、移植後45カ月間、CD34分画の減少が観察され、それに伴ってWT1値が1オーダー以上低下することが判明した。一方、白血病患者では、再発時は白血病細胞当たりのWT1発現量が上昇することが観察されているので、両者を合わせると、移植後の再発早期診断は、従来考えられていたよりも、より早期に行えることが判明した。これらのデータを基に、骨髄移植を受け、その後再発を来した6人の白血病患者で、寛解状態より再発ヘのステップに至るturningpointを解析したところ、中央値49日(22-104日)であり、それを過ぎると、指数関数的に腫瘍量が増加していくことが判明した。したがって、骨髄移植後の再発へのfirststepは移植後極めて早期に生じており、移植後の免疫抑制剤の調節を移植早期より行う必要があると考えられた。
中世談義所寺院の知的交流と言説形成

中世の天台教学は、その内容については多くの研究があったが、それがどのように広がりを見せたかに関する研究は乏しかった。関心を持たれることの少なかった、地域における天台教学受容の実態について、1960年以降、尾上寛仲氏が研究を始めた。その際に注目されたのが談義所(中世に多く見られた地方の学問寺院)であった。尾上氏は十本以上の論文を発表し、談義所が地方における学僧教育の場であったこと、西日本より東日本(特に関東地方)に多かったこと、各地の談義所の間で活発な交流の存在したこと、などを明らかにした。また、尾上氏が住職を勤める成菩提院は、代表的な談義所寺院の一つであった。そこで尾上氏は、関東の談義所寺院研究の一方で、成菩提院の調査も行なった。その後、1994年以降、福田栄次郎氏を中心とする調査団が発足し、成菩提院の所蔵史料を調査し、寺内法度の解明などで新たな成果を挙げた。本研究では、そうした従来の成果をもとに、中世の天台教学受容の実態解明に向けて、新たな資料の発掘と分析を進めた。その結果、仏教教学にとどまらず、仏教史、神道史、地域文化史、さらには談義、説法、唱導などに関する新史料、新知見が解明された。そうした成果は、2004年11月に学会でのシンポジウムという形で報告され、さらに2006年3月に学会誌に掲載され、研究者間で共有された。また、一般市民対象の報告も二度行い、研究者以外の人々とも情報を共有することが出来た。平成14年度の研究活動とその成果は、以下の通りである。1代表的な談義所寺院の一つとして知られている成菩提院(現滋賀県坂田郡山東町)について、昨年までに引き続き、8月20-23日で史料調査を行った。研究代表者・分担者計5名、研究協力者2名が従事し、その他学生アルバイト3名の協力を得た。今年度の調査の主な成果として、未整理分の大半について仮目録を作成できたこと、『阿裟縛抄』の断片と思われる史料の撮影を進められたこと、などが挙げられる。その成果は、2003年度版のDBや、より詳細な書誌カード、CDなどに整理されてまとめられている。15年度も同程度の日程で調査を進める予定である。2成菩提院の史料調査の補助作業として、同院の歴代住職とその事跡一覧作成に着手した。3成菩提院をはじめとする談義所寺院の調査を有効に進めるため、研究会を催した。まず、平成14年10月14日に横浜で4名の研究報告会を行った。その成果は、平成15年度に刊行予定の論集に論文として収められる予定である。次に、同15年1月18-19日に仙台で、関連文献の輪読会を催した。輪読会については、15年度にも継続する予定である。4その他、各自で各地の談義所寺院やその旧蔵史料の調査を行った。曽根原は、木原談義所(現熊本県下益城郡富合町)や、三途台談義所(現千葉県長生郡長南町)を実見した。平成15年度の研究活動とその成果は、以下の通りである。1代表的な談義所寺院の一つとして知られている成菩提院(現滋賀県坂田郡山東町)について、昨年までに引き続き、8月18-21日で史料調査を行った。研究代表者・分担者計4名、研究協力者2名が従事し、その他学生アルバイト4名の協力を得た。

今年度の調査の主な成果として、未整理分の仮目録作成を進めたこと、『阿娑縛抄』の断片と思われる史料の撮影をほぼ完了したこと、『行用抄』や『悟抄』などの新たな書目の撮影を進められたこと、などが挙げられる。その成果は、2004年度版のDBや、より詳細な書誌カード、CDなどに整理されてまとめられている。16年度も同程度の日程で調査を進める予定である。2成菩提院の史料調査の補助作業として、同院の歴代住職事跡一覧と旧蔵書一覧作成に着手した。3成菩提院をはじめとする談義所寺院の調査を有効に進めるため、昨年度に続き輪読会を催した。6月9日に大阪、10月5日に横浜、1月11日に東京で開催し、輪読を進めるとともに、大島・牧野が成菩提院資料に関する調査報告を行った。こうした研究会を、16年度も継続する予定である。4研究会の成果として、16年度に関連学会でシンポジウムと資料展観を行うこととなり、準備を進めている。平成16年度の研究活動とその成果は、以下の通りである。1)代表的な談義所寺院め一つとして知られる成菩提院(滋賀県坂田郡山東町)において、昨年度に引き続き8月1821日に現地調査を行なった。概要把握の段階が過ぎたことから、特に資料的価値の高い中世写本などについて統一した調査カードを作成し、書誌などを記録した。研究代表者・分担者4名、研究協力者2名に加え、学生アルバイトの数を8名に増やし、巻子装本の法量調査などを進めた。こうした本格的な調査は、なお年数を要するが、基本的な方針は今年の活動を通じて見通しを得た。また、近世写本の束の中から平安時代末の写本(1120年写『金剛界儀軌』)が発見された。2)調査の成果の中間報告を学会報告として行なうため、仏教文学会に提案し、11月2021日の本部・支部合同例会(近江大会、於彦根周辺)において、第1日目学術シンポジウム、第2日目資料展示と関連地見学旅行を企画した。学術シンポジウムにおいては、研究分担者・協力者の5名が個別報告を行い、研究代表者曽根原が趣旨説明と討論司会をつとめた。個別報告の内容等は、展示資料の解説とともに、平成18年発行予定の学会誌『仏教文学』に掲載される予定である。3)研究代表者曽根原は、4月17日の仏教文学会本部例会(於京都・龍谷大学)において、上記近江大会の準備報告を行なった。また、11月21日には地元の一般市民に対する講演会を行い、あわせて学会用の展示を公開した。4)昨年度に引き続き輪読会を、6月6日(東京)と17年3月20日(於京都)に行い、談義所教学について研究した。また10月23日(於東京)には、上記近江大会シンポジウムの予行を行なった。5)成菩提院以外の寺院資料調査も実施した。平成17年度の研究活動とその成果は、以下の通りである。1)代表的な談義所寺院の一つとして知られる成菩提院(滋賀県米原市)において、昨年度に引き続き8月2124日に現地調査を行なった。研究代表者・分担者3名、研究協力者5名に加え、学生アルバイト4名を加え、巻子本の法量調査などを進めた。2)報告書作成のため成菩提院において、11月2223日に研究代表者・分担者・協力者のうち都合のつく4名で追加調査を行なった。3)成菩提院所蔵史料の保存や修復の見通しをつけるため、地元の博物館の指導と援助により、史料を保管している蔵内部の温度・湿度調査を実施し、今後の指針を検討した。また、専門の職人に依頼し、貼り付いて閲覧不能の状態となっている一部聖教を補修し、調査を行なった。4)昨年度の仏教文学会近江大会の報告原稿に基づき、報告を担当した者のうち5名が論考を作成し、平成18年3月発行の『仏教文学』30号に掲載される。5)昨年度に引き続き、関連文献の輪読と調査を11月24日と平成18年3月17日に実施した。6)日光輪王寺、三河本證寺などの成菩提院旧蔵書についても、調査を実施した。7)4年間の活動の成果として、報告書を作成する。
遺伝的背景とCa2+/NFAT経路活性化に基づいた川崎病への新治療戦略構築の試み

近年、川崎病(KD)の罹患感受性や重症化に7遺伝子の一塩基多型(SNP)の関与が報告されている。この内、3遺伝子(ITPKC, CASP3, ORAI1)のSNPは、Nuclear Factor of Activated T Cells(Ca2+/NFAT)経路活性化に関与し、この経路がKD発症や重症度に強く関与することが示唆される。我々はこれまでに、ガンマグロブリン静注療法(IVIG)不応の重症KDに、この経路に抑制作用を持つシクロスポリンA(CsA)の有用性を報告し(Pediatr Infect Dis J. 2011)、効果機序の一端に、細胞内シグナル伝達経路のJAK-STAT経路が関与することも報告している。しかしながら、CsA投与にも十分な治療反応をしない治療抵抗例が存在する。今回、KDに対する新たな治療戦略を構築することを目的として、1KD症例の上記3遺伝子多型の検索、2治療プロトコール(1st-,2nd-,3rd-,4th-line:それぞれIVIG, IVIG, CsA, IVIG)に対する治療反応性、3細胞内シグナル伝達経路(NFAT、JAK-STAT各経路)関連蛋白や遺伝子発現の定量、4各種サイトカイン(IL-2,6,10,18,sIL-2R,TNF-α等)と遺伝子発現の定量を計画することとした。現在、当院に入院するKD患者から、本研究への症例のエントリーを行い、解析に必要な血液検体の収集を開始した。今年度の症例エントリー数が、当初の予定よりやや少なく、検体数がまだ不足している状況である。平成31年度は、検体数の増加を目的として、積極的に症例エントリー数を増やすべく説明等に十分な時間をとるようにする。収集できた検体を用いて、当初の予定通りの解析を進める予定である。当初購入を予定していたThermal Cycler Diceが、当科に現有する機器の使用が可能となり、購入を見送ったため、助成金に余剰ができた。
新規なカルシウム-ガリウム酸化物系蛍光体を用いる薄膜ELデバイスの研究

本研究は新規なEL素子用発光層材料であるCaO-Ga_2O_3酸化物系蛍光体薄膜を用いることによってフルカラー発光EL素子の実現を目的としている。平成10年度および平成11年度を通じて、以下に述べる研究実績を上げることができた。(1)新規な発光層母体材料であるCaO-Ga_2O_3に発光中心としてMn、Cr、Pbもしくは希土類元素を添加した蛍光体ターゲットの作製技術およびCaO-Ga_2O_3蛍光体薄膜の最適発光層作製条件を確立した。具体的には、前者に対してはCaO-Ga_2O_3の材料混合比、発光中心導入量および焼成温度をパラメータとして変化させた。後者に対してはスパッタ成膜時の基板温度、スパッタガス圧、基板-ターゲット間距離、スパッタ投入電力をパラメータとして変化させた。これらのEL素子作製条件と作製した素子のEL特性との関係を明らかにした結果、発光中心としてMnを添加した(CaO-Ga_2O_3):Mnターゲットを用い、基板温度275°C、スパッタガス圧6Pa、基板-ターゲット間距離25mm、スパッタ投入電力100Wの成膜条件下で作製した発光層を用いた素子において、1018cd/m^2の高輝度緑色発光を実現できた。また、母体材料である(CaO-Ga_2O_3)の組成を制御することにより、赤から緑色の間で発光色を可変できることを明らかにした。さらに、各種発光中心を添加したそれぞれの場合についても、素子作製条件の最適化を行い、遷移金属元素および希土類元素を添加した、CaO-Ga_2O_3系蛍光体薄膜を用いて、カラーフィルタを用いることなくフルカラー発光を実現できた。(2)EL特性の経時安定性について詳細に検討し、特別な封止処理を一切ほどこさないCaO-Ga_2O_3系蛍光体薄膜ELにおいて、室温、大気中で、100kHz駆動時において、1万時間以上の安定動作を実現できた。この値は、60Hz駆動に換算すると100万時間を超える超長寿命を達成したことに相当する。以上の成果から、本研究は目的を十分に達成できたと言える。平成10年度は、以下に述べる成果を上げることができた。後者に対してはスバッタ成膜時の基板温度、スパッタガス圧、基板ーターゲット間距離、スパッタ投入電力をパラメータとして変化させた。

また、母体材料である(CaO-Ga_2O_3)の組成を制御することにより、赤から緑色の間で発光色を可変できることを明らかにした。(2) EL特性の改善に対して極めて重要である発光層の高温熱処理について検討し、熱処理雰囲気、熱処理温度、熱処理時間について詳細に検討した結果、アルゴン雰囲気中、熱処理温度1020°C、5時間の熱処理条件において最も優れたしEL特性を実現できることを明らかにした。本研究は新規なEL素子用発光層材料であるCaO-Ga_2O_3酸化物系蛍光体薄膜を用いることによってフルカラー発光EL素子の実現を目的としている。平成10年度の成果をベースに平成11年度は、以下に述べる研究実績を上げることができた。(1)新規な発光層母体材料であるCaO-Ga_2O_3に発光中心としてMn、Cr、Pbもしく希土類元素を添加した蛍光体ターゲットの作製技術およびCaO-Ga_2O_3蛍光体薄膜の最適発光層作製条件を確立した。具体的には、前者に対してはCaO-Ga_2O_3の材料混合比、発光中心導入量および焼成温度をパラメータとして変化させた。後者に対してはスパッタの成膜時の基板温度、スパッタガス圧、基板-ターゲット間距離、スパッタ投入電力をパラメータとして変化させた。これらのEL素子作製条件と作製した素子のEL特性との関係を明らかにした結果、発光中心としてMnを添加した(CaO-Ga_2O_3):Mnターゲットを用い、基板温度275°C、スパッタガス圧6Pa、基板-ターゲット間距離25mm、スパッタ投入電力100Wの成膜条件下で作製した発光層を用いた素子において、1018cd/m^2の高輝度緑色発光を実現できた。さらに、各種発光中心を添加したそれぞれの場合についても、素子作製条件の最適化を行い、遷移金属元素および希土類元素を添加した。CaO-Ga_2O_3系蛍光体薄膜を用いて、カラーフィルタを用いることなくフルカラー発光を実現できた。(2)EL特性の経時安定性について詳細に検討し、特別な封止処理を一切ほどこさないCaO-Ga_2O_3系蛍光体薄膜ELにおいて、室温、大気中で、10kHz駆動時において、1万時間以上の安定動作を実現できた。この値は、60Hz駆動に換算すると100万時間を超えると超長寿命を達成したことに相当する。
脳虚血再灌流時の内頚静脈血中血管ホルモン動態解析による脳血流自動調節機構の解明

頚部内頚動脈狭窄症の外科的治療(頚動脈内膜剥離術)の有効性が確立されているが、術中の脳虚血の強度を近赤外線分光法(near-infrared spectroscopy:NIRS)を用いて、非侵襲的に脳表の酸素飽和度(rSO2)を持続的に計測し、術前に脳循環予備能が著しく障害された症例の中には、遮断解放後のrSO2が前値へと収束せず、高値のまま遷延することを確認した。過灌流と呼ばれる病態で、脳血流自動調節能が破綻している状態である。「心血管ホルモン」と呼ばれる各種の生理活性ペプチドが発見され、一酸化窒素(NO)、心房性Na利尿ペプチド(ANP)、エンドセリン(ET)、アドレノメデュリン(AM)、サルーシン(SAL)などが挙げられる。本研究では、頚部頚動脈内膜剥離術を行う患者を対象とし、術中の頚静脈血内の生理活性ペプチドを解析することにより、脳血流自動調節能や過灌流と血管ホルモンとの関連を明らかにすること目的としており、初年度は症例数の蓄積とサンプリングを行った。これらの患者の、術前・術中・術後のパラメーターの解析において、頚動脈内膜剥離術術中の新規脳虚血病変の出現の有無は、外頚動脈の閉塞の影響を強く受けること。種々の生理活性物質の産生は、脳循環代謝の影響を強く受けることが予想されるが、術前の脳温イメージングによる解析で、不完全な側副血行路による脳温の変動は、術中の新規脳虚血病変出現の予知因子となり得ること。頚部頚動脈狭窄による脳循環の低下がもたらす低酸素脳組織を、1-(2-18F-fluoro-1-[hydroxymethyl]ethoxy) methyl-2-nitroimidazole (18F-FRP170)を用いて同定した検討では、頚動脈内膜剥離術により18F-FRP170の代謝経路が改善し、さらには認知機能の改善に関与していることが明らかとなり、論文報告を行った。頚部頚動脈内膜剥離術を行う患者を対象とし研究を行っている。内膜剥離術中に露出される内頚静脈に小児用の中心静脈カテーテルを留置し、手術中経時的に採血を行う。採血のタイミングは、1頚動脈遮断前、2頚動脈遮断20分後、3頚動脈遮断を解放し血流再開後1分、4血流再開後5分、5血流再開後20分の5点とし、手術操作に関連しない研究協力者が行う。得られた血液は直ちにEDTA入りの採決管に入れ、4°Cで20分間遠心し血漿を分離する。得られた血漿をクライオチューブに分注し液体窒素で急速冷凍後に-80°Cで保存する。初年度で、20例の手術を行い、術中のモニタリングと、頸静脈血サンプリングを行った。症例数としては、ほぼ予定通りであり、経過中に過灌流を示した症例が含まれており、対象比較研究として成立可能と判断している。平成30年度同様に、頚部頚動脈内膜剥離術対象患者からのデータ収集と頚静脈血サンプリングを行い、症例数を増やしていく。平成30年度からの繰り越し研究費を平成31年度予算に上乗せし、頸静脈血中の生理活性物質について解析を予定している。具体的には、一酸化窒素(NO)、心房性Na利尿ペプチド(ANP)、エンドセリン(ET)、アドレノメデュリン(AM)、サルーシン(SAL)等について検討し、術前の脳循環予備能、術中脳表の酸素飽和度による虚血強度、及び術後の脳血流SPECTによる過灌流の有無と対比検討を行う。

頚部頚動脈狭窄による脳循環の低下がもたらす低酸素脳組織を、1-(2-18F-fluoro-1-[hydroxymethyl]ethoxy) methyl-2-nitroimidazole (18F-FRP170)を用いて同定した検討では、頚動脈内膜剥離術により18F-FRP170の代謝経路が改善し、さらには認知機能の改善に関与していることが明らかとなり、論文報告を行った。頚部頚動脈内膜剥離術を行う患者を対象とし研究を行っている。内膜剥離術中に露出される内頚静脈に小児用の中心静脈カテーテルを留置し、手術中経時的に採血を行う。採血のタイミングは、1頚動脈遮断前、2頚動脈遮断20分後、3頚動脈遮断を解放し血流再開後1分、4血流再開後5分、5血流再開後20分の5点とし、手術操作に関連しない研究協力者が行う。得られた血液は直ちにEDTA入りの採決管に入れ、4°Cで20分間遠心し血漿を分離する。得られた血漿をクライオチューブに分注し液体窒素で急速冷凍後に-80°Cで保存する。初年度で、20例の手術を行い、術中のモニタリングと、頸静脈血サンプリングを行った。症例数としては、ほぼ予定通りであり、経過中に過灌流を示した症例が含まれており、対象比較研究として成立可能と判断している。平成30年度同様に、頚部頚動脈内膜剥離術対象患者からのデータ収集と頚静脈血サンプリングを行い、症例数を増やしていく。平成30年度からの繰り越し研究費を平成31年度予算に上乗せし、頸静脈血中の生理活性物質について解析を予定している。具体的には、一酸化窒素(NO)、心房性Na利尿ペプチド(ANP)、エンドセリン(ET)、アドレノメデュリン(AM)、サルーシン(SAL)等について検討し、術前の脳循環予備能、術中脳表の酸素飽和度による虚血強度、及び術後の脳血流SPECTによる過灌流の有無と対比検討を行う。頚部頚動脈内膜剥離術を行う患者を対象とし、術前のSPECT検査を行った。内膜剥離術中に露出される内頚静脈に小児用の中心静脈カテーテルを留置し、手術中経時的に採血を行った。得られた血漿をクライオチューブに分注し液体窒素で急速冷凍後に-80°Cで保存した。初年度で、20例のサンプリングが完了した。静脈血中の生理活性物質の解析も検討したが、まとまった量での解析に、初年度予定していた費用では不足するため、未使用予算を繰り越しし、次年度の予算と合算した上で解析費用に回すことととしたために次年度使用額を発生させた。
ヒト肝におけるGSTの分布様式ー正常および各種肝疾患の免疫組織化学的検討ー

薬物代謝系酵素の1つであるglutathione Sーtransferase(GST)のヒト肝における分布様式を免疫組織化学的方法により検索した結果、とくに原発性肝癌腫瘍マ-カ-の観点からGSTの意義を明らかにしえたため、研究成果を学会誌「肝臓」に発表した。以下概要を述べる。正常肝,非特異的肝炎,うっ血肝,肝硬変,原発性および転移性肝癌材料のホルマリン固定,パラフィン包埋の薄切切片について,抗ヒトGSTーπポリクロ-ナル抗体を用いて酸性GSTを,抗上ヒト塩基性GSTポリクロ-ナル抗体を用いて塩基性GSTを,間接酵素抗体法で検出した。その結果、酸性GSTは正常肝では肝細胞には陽性を示さず、門脈域の胆管上皮細胞や細胆管上皮細胞の細胞質の陽性を示し、肝炎やうっ血肝でも同様であったが、肝硬変ではいわゆる偽胆管も陽性を示した。癌組織では大多数の胆管細胞癌とくに分化型に陽性を示したが、ほとんどの肝細胞癌と半数の転移性肝癌には陽性を示さなかった。一方、塩基性GSTは正常肝では肝小葉内にほぼ均一に、肝細胞の細胞質と一部の核に陽性を示し、また胆管上皮細胞にも一部陽性であった。肝炎やうっ血肝でも同様であったが、肝硬変では偽小葉内での陽性反応は不均一となり、偽小葉によっては極めて減弱していた。またいわゆるliver cell dysplasiaでは陽性反応は減弱ないし陰性化する傾向にあった。また偽胆管でも陽性反応の減弱傾向がみられた。癌組織では過半数の肝飽胞癌で陽性であったが、その多くは比較的弱い反応であった。以上より、酸性GSTは原発性肝癌にうち胆管細胞癌のよい免疫組織化学的腫瘍マ-カ-になることが明らかとなった。一方塩基性GSTは腫瘍マ-カ-としての意義にい乏しいが、肝細胞癌の前癌病変解析などのマ-カ-になる可能性が示唆された。以下概要を述べる。
発光細菌は何色に光るのか？発光色を通じて解明する、発光細菌の光利用生態！

本研究では、様々な海洋環境から分離した発光細菌の発光色を詳細に調べ、発光細菌発光色の生態学的意義の解明を目指した。発光色を調べた結果、発光細菌の放つ光の色は単一ではなく、複数のバリエーションがあることが分かった。また、極大波長が480 nm以下の発光色を持つ株は細胞内に発光色を変化させる蛍光タンパク質を持つことが明らかになった。発光細菌は、沿岸から外洋の海水などから広く分離される、一方で海洋中に無数に漂うマリンスノー(海中懸濁物:主に海産生物の糞や死骸から構成される)の約70%が発光細菌の活動により発光している事が報告されており、発光細菌の生態とどの様に関係しているのかが注目されている(Andrews et al., 1984)。本研究では、「発光細菌はマリンスノー上で発光することにより高次生物(魚等)に認識・捕食され、腸管内で増殖しそのニッチを維持している」という仮説を立て、発光細菌発光色の詳細な解析を行うことで仮説の検証を行うことを目的とする。平成25年度は、発光色を変化させる蛍光タンパク質を持つと予想される発光細菌5株および持たないと予想される3株、合計8株のゲノムシーケンスを実施し、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質と発光色の関係の解析を行った。具体的には、ゲノムデータから蛍光タンパク質の有無を調べ、蛍光タンパク質およびルシフェラーゼ遺伝子の系統関係の比較を行った。また、ルシフェラーゼ遺伝子の系統と、発光細菌発光色の関係を調べた。ゲノム未決定の株に関しては、新規に設計したルシフェラーゼ遺伝子検出用プライマーを用いて遺伝子配列を決定し、比較を行った。その結果、発光細菌の放つ光の色はルシフェラーゼ遺伝子の系統によって概ね決定していること、発光スペクトルの極大波長が480 nm以下にあるものは細胞内蛍光タンパク質を持つ事が分かった。これまでに蛍光タンパク質を持つ発光細菌は3種でしか報告されていないが、本研究により蛍光タンパク質を持つ種が新たに見つかった。現在、ゲノム解析と平行して、それらの発光細菌が分離された海洋環境と発光色の関係およびルシフェラーゼ遺伝子系統との関係を解析中である。平成24年度は、発光色のバリエーションの解明および発光色変化に関与する蛍光タンパク質の解析を行った。また、蛍光タンパク質を持つと予想される株のゲノム解析を現在実施中である。具体的には、これまでに分離した発光細菌(約700株)の発光色を分光蛍光光度計を用いてnmオーダで詳細に測定した。その結果、分離株の発光色は473-535nmの間にピーク波長を持つこと、同種の発光細菌は同じ色の光を放つことが明らかになった。これまで発光細菌の放つ光は、青緑色(約480nm)もしくは黄色(約530nm)の2タイプしか無いと考えられてきたが、本研究結果からこれまで考えられていた以上にバリエーションがあることが分かった。現在、それらの発光細菌が分離された海洋環境と発光色の関係を解析中である。また、細胞内に青色蛍光タンパク質を持ち、発光色を変化させる発光細菌種(Vibrio azureus)が見つかり、現在ゲノム解析を実施中である。これまでに分離した発光細菌の発光色の詳細な測定を行い、想定していたデータをおおむね取得することができた。現在は、発光細菌が分離された海洋環境と発光色の関係を解析中である。解析に必要なデータはこれまでの研究で取得済みである。また、これまで光の色を変化させる蛍光タンパク質を持つ事が知られていなかった細菌種から蛍光タンパク質を見つけ、現在ゲノム解析を実施中である。本年度(H25)に予定している、発光に関わる遺伝子解析を問題無く実施できると考えられる。これまでの研究で、発光細菌の放つ光の色および生息水塊の環境データを取得済みである。本年度は、発光色測定済分離株の発光関連遺伝子の決定を行い、発光色、生息環境データ、遺伝子データを用いて発光と生息環境の関係および発光色の進化機構を明らかにする予定である。該当なし