hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多軌道強相関電子系の相図及び超伝導発現機構の解明

具体的には、HドープしたLaFeAsOにおける低ドープ領域と高ドープ領域において、それぞれ異なるタイプの構造相転移が現れ、その近傍で高い超伝導転移温度を持つ超伝導が現れることを我々が開発した高次多体効果を取りこんだ自己無撞着バーテックス補正(SC-VC)理論により説明することに成功した。また、このSC-VC理論に基づき、常圧でスピン秩序が存在しないFeSeにおけるネマティック相を説明することにも成功し、更にFeSeにおける軌道分極の波数依存性を計算した結果、角度分解光電子分光の実験結果と整合した結果を得ることに成功した。以上の結果から、鉄系超伝導体における、スピン秩序相、ネマティック相、超伝導をSC-VC理論により統一的に説明できることが明らかとなった。研究成果として、近年日本で発見され、高い超伝導転移温度を持つ、鉄系超伝導体の相図全体の統一的理解が著しく進んだことが挙げられる。具体的には、我々が開発した新しい計算手法である自己無撞着バーテックス補正(SC-VC)法を用いることで、スピンと軌道間の新しい相互作用が現れ、軌道揺らぎがスピン揺らぎと協奏的に増大することが明らかとなり、鉄系超伝導体の相図に現れるスピン秩序相、軌道秩序相、超伝導相等を物質によらず、統一的に説明することが可能となった。また、軌道秩序相における特異な軌道偏極エネルギーの波数依存性もこのSC-VC法に基づいて物質によらず、統一的に説明することに成功した。当初の計画ではH26年度はLaFeAsO1-xHxの相図全体の理解に費やす予定であり、その他の物質であるSr2RuO4の解析はH27年度以降に行う予定であったが、Sr2RuO4の超伝導状態の計算をH26年度中に完了することが出来た。我々が構築した軌道秩序理論の正当性を証明するために、様々な鉄系超伝導体で軌道偏極の波数依存性を計算し、それを用いて用いて、軌道偏極下の輸送係数の計算を行う予定である。軌道秩序状態において抵抗率や熱起電力等が特異な面内異方性を示すことが知られており、それらは物質群により異なる振る舞いを示すため、これらを統一的に説明することを目指す。物性理論鉄系超伝導体の相図全体の理解のために、軌道偏極下の輸送係数の計算を行う予定である。抵抗率や熱起電力の軌道偏極下の実験において、特異な面内異方性が現れることが知られているため、これを軌道揺らぎ理論で統一的に説明することを目指す。具体的には、ARPESで観測されている軌道分極を考慮したタイトバインディングモデルを用いて、線形応答理論により抵抗率や熱起電力の面内異方性を解析する予定である。基金であるため、無理に予算を使い切ることをしないことにした。しかし、ほとんど0にすることが出来たので問題がないと考えている。35120円増えただけであるので、特に使用計画に変化はない。
3-aza-Cope-Mannich連続反応によるアルカロイドの網羅的構築法開発

最終年度である本年度は、前年度までに開発した金触媒を用いた5-endo環化反応-3-aza-Cope転位-Mannich反応の連続反応に対して、基質一般性を広げることと、実際の天然物合成に応用することを目的とし、研究を展開した。開発した反応の基質一般性については、いくつかの基質でより複雑な骨格を有する化合物を得ることに成功するなど、一定の収穫を得た。また、Cepahlotaxinの全合成に向け、ベンゼン環と縮環した基質の合成を行い、開発した反応を応用したところ、目的の転位反応の進行と鍵となる四環性骨格を有する化合物を好収率で得ることに成功した。一方で、研究期間終了後、本研究をさらに発展させるため、TCCP塩を用いた第4級アンモニウム塩のイオン対抽出法の確立に向けての検討を開始した。その結果、TCCP-Na塩の脂溶性(分配係数LogD)と抽出できる第4級アンモニウム塩の計算上の脂溶性(CLogP)が良く相関していることを見出した。その結果を応用し、抽出によるアンモニウム塩の分離にも成功した。初年度に検討した、1,2,4-トリブロモブタンを用いた環化スピロ化-脱離反応-3-aza-Cope転位-Mannich反応のシステムは、これまで収率が低く、全合成研究への展開は困難であった。しかし、開発したイオン対抽出法を用いることで、鍵となる中間体スピロビニルアンモニウム塩の単離精製に成功し、単離した化合物を用いた転位-環化連続反応の条件をじっくり精査することが出来る様になった。その結果、アミンの添加によって大幅な収率改善にも成功し、研究期間終了後にNeostenine合成研究などへと展開できる可能性を新たに見出すことにも成功した。3-aza-Cope-Mannich連続反応の開発を目指し、L-プロリン、D-ピペコリン酸から、原料となるメチルビニルエーテル合成法を確立した。これをクロロエチル化したのち、様々なメチル化剤で第4級アンモニウム化の検討を行った結果、メチルトリフラートを用いた際に良好な収率選択性で第4級アンモニウムが得られることを明らかにした。また、その後の脱離反応に用いる塩基の検討により、ビニルアンモニウム化して、これを加熱条件化で転位させると目的の3-aza-Cope転位-Mannich連続反応が進行していることが確認された。各工程のアンモニウム塩は、我々が開発したテトラシアノシクロペンタジエニドアニオンを用いたアンモニウム塩の抽出法を用いて単離し、NMRでその生成と純度を確認した。また、トリブロミドを基質として、スピロ第4級アンモニウム塩を合成したが、これを経由する反応では、通算で収率が20%程度と改善の余地はあるものの、単一のジアステレオマーで期待通りの3環性含窒素化合物を得ることに成功した。また、単環性システムから一挙に連続反応をへて3環性骨格ができることも見いだしており、収率改善も目指しながら今年度も研究を継続する予定である。その他、本課題遂行中に、アンモニウム塩抽出の道具として独自に開発したテトラシアノシクロペンタジエニド類の物性についても調査を行い、3,3'位に置換基をもつBINOLエステルにおいて、珍しいC-O結合を軸とする回転異性体が生じることを明らかにした。この回転障壁を温度可変NMRを用いて測定し、C-O結合の不斉軸としての新たな可能性を見いだすことに成功した。1年目に目標にしていたのは、ビニルアンモニウム基質合成法単純なシステムでの転位-連続反応の実施とその確率である。基質合成については、立体選択性に未だ課題を残す部分はあるが、かなり確立されつつある。また、そこからの転位ーMannich連続反応についても、収率に課題は残っているものの選択性よく進行が確認されたため、1年目に予定していた目標はかなりの部分が達成できていると思う。また、テトラシアノシクロペンタジエニド類が、アンモニウム塩の抽出にかなり有効であることも同時に明らかになっているため、この観点からも新たな研究目標へと派生させることが可能になりつつあり、課題となっている研究については、おおむね順調に進展していると判断している。複雑な含窒素縮環骨格は、生理活性を有する多くの天然物に広く存在している。そのため、これらの複雑な骨格を一挙に構築する手法の開発は、天然物合成やそれに類似した医薬品探索研究に貢献する重要な研究である。我々は、本研究課題に於いて、従来よりほとんど報告例がない3-aza-Cope転位を含む連続反応について検討を行い、ピペコリン酸由来の6員環単環性基質から、7-5-5員環が縮環した含窒素三環性縮環システムを一工程で得る手法を開発した。1)2-(1-メトキシビニル)ピペリジンをアセトニトリル中、炭酸カリウム存在下、1,2,4-トリブロモブタンと反応させると、環化スピロ化-脱離反応-3-aza-Cope転位-Mannich反応という四種類の反応が一挙に進行し、デカヒドロ-4a-アザシクロペンタ[cd]アズレン骨格を有する化合物が生成した。収率は34%と中程度ながら、起きている連続反応の数を考えると十分な収率であると考えている。2)2-(1-メトキシビニル)-N-(ペンタ-4-イン-1-イル)

ピペリジンを、金触媒で処理すると5-exo-dig環化、3-aza-Cope転位-Mannichの三種類の反応が一挙に進行し、デカヒドロシクロペンタ[b]ピロロ[1,2-a]アゼピン骨格を有する化合物が生成することを見出した。この骨格は、ステモナミンやセファロタキシンなどのアルカロイドに多く見られる骨格であり、これらの短段階全合成への道を開くものである。当初は、反応性がやや低く多くの触媒量を必要としていたが、条件を精査した結果、基質に対して1%の触媒を用いただけで、7割以上の収率で連続反応を進行させることに成功している。今年度は、最適条件の確立および一定レベルの基質一般性の確立までを目指していた。非常に良い条件は見つかってきたものの、同条件下での基質一般性については、まだ二種類の基質でしか検討できておらず、やや遅れていると評価せざるを得ない。この原因の一つとして、生成物がビニルエーテルの位置異性体混合物となってしまい、反応の解析に予定外の時間を要してしまったことが挙げられる。今年度予定している基質一般性確立に向けて、位置異性体を共通の化合物に誘導する手法の開発も行いたい。その一方で、確立した条件においては、当初期待していたよりも遥かに少ない1 mol %という触媒量で、7割を超える好収率を達成できており、世界に印象づける良い反応の開発が行えているという自負はある。今年度、一層の巻き返しをはかりたい。最終年度である本年度は、前年度までに開発した金触媒を用いた5-endo環化反応-3-aza-Cope転位-Mannich反応の連続反応に対して、基質一般性を広げることと、実際の天然物合成に応用することを目的とし、研究を展開した。開発した反応の基質一般性については、いくつかの基質でより複雑な骨格を有する化合物を得ることに成功するなど、一定の収穫を得た。また、Cepahlotaxinの全合成に向け、ベンゼン環と縮環した基質の合成を行い、開発した反応を応用したところ、目的の転位反応の進行と鍵となる四環性骨格を有する化合物を好収率で得ることに成功した。一方で、研究期間終了後、本研究をさらに発展させるため、TCCP塩を用いた第4級アンモニウム塩のイオン対抽出法の確立に向けての検討を開始した。その結果、TCCP-Na塩の脂溶性(分配係数LogD)と抽出できる第4級アンモニウム塩の計算上の脂溶性(CLogP)が良く相関していることを見出した。その結果を応用し、抽出によるアンモニウム塩の分離にも成功した。初年度に検討した、1,2,4-トリブロモブタンを用いた環化スピロ化-脱離反応-3-aza-Cope転位-Mannich反応のシステムは、これまで収率が低く、全合成研究への展開は困難であった。しかし、開発したイオン対抽出法を用いることで、鍵となる中間体スピロビニルアンモニウム塩の単離精製に成功し、単離した化合物を用いた転位-環化連続反応の条件をじっくり精査することが出来る様になった。その結果、アミンの添加によって大幅な収率改善にも成功し、研究期間終了後にNeostenine合成研究などへと展開できる可能性を新たに見出すことにも成功した。これまでの検討において、スピロ第4級アンモニウム塩を経由する反応において、3環性含窒素複素環が得られることが明らかになっている。しかしながら、通算で収率が25%程度と未だ改善の余地があり、塩基、脱離基、酸素上官能基、溶媒などの検討を通じてこの収率改善を目指したい。収率が改善した後は、その条件を参考に、環サイズが異なる基質、エキソ型オレフィンを含む基質、ベンゼン環と縮環している基質などの検討を行う予定である。
ヒト前立腺癌の再燃におけるステロイドホルモン・オーファンレセプターの機能解析

ステロイドレセプターでリガンドの分かっていない、オーファンレセプターであるCOUP-TFIとTR3 receptorは転写因子として作用する事が報告されている。これまでに、その転写制御作用としては主に標的遺伝子の転写抑制および活性化のあることが多く報告されている。我々は、アンドロゲンレセプターの標的遺伝子である前立腺特異抗原(PSA)の転写制御を検討することによって、前立腺癌における両オーファンレセプターの生物学的特性を分子生物学的に解析することを目的とした。前立腺癌組織において、COUP-TFIの発現とPSA発現に逆相関がみられた。同様に、TR3 receptorとPSAの発現も逆相関のパターンを示した。これらの事象は、COUP-TFIあるいはTR3 receptorの発現がPSA発現を抑制することを示す。前立腺癌において、組織異型度が進むほどPSAの発現が少ない傾向があり、従ってCOUP-TFIやTR3 receptorが前立腺癌の組織異型に関与している可能性が推察された。また、COUP-TFIとTR3 receptorはともに転写因子であるが、COUP-TFIはTR3 receptorの結合部位(NBRE)にも結合して、TR3 receptorの標的遺伝子の転写活性にも影響を及ぼすことが予想された。ステロイドレセプターでリガンドの分かっていない、オーファンレセプターであるCOUP-TFIは転写因子として作用する事が報告されている。これまでに、その転写制御作用としては主に標的遺伝子の転写抑制が多く報告されている。今回、我々はアンドロゲンレセプターの標的遺伝子である前立腺特異抗原(PSA)の転写制御を検討し、以下の結果が得られた。方法としては、先ず始めにヒト前立腺癌細胞LNCaPでCOUP-TF1の安定発現した細胞(LNCaP-COUP)を樹立し細胞増殖を測定した。次に、6KbのPSA promoterを上流に連結したルシフェラーゼリポーターを、LNCaP細胞に遺伝子導入しアンドロゲン刺激した。同時に、COUP-TF1発現ベクターを導入してルシフェラーゼ活性を測定した。結果は、細胞増殖の点でsteroid free培養液ではLNCaP-COUPがwild-LNCaP cellsに比べ有意に多く増殖した。ところが、合成アンドロゲン剤(R1881:10nM)を含む培養液下ではLNCaP-COUP細胞の増殖は抑制された。ルシフェラーゼ活性では、アンドロゲン刺激によって有意に上昇したが、COUP一TF1を同時導入した場合はルシフェラーゼ活性の上昇は抑制された。さらに、COUP-TF1の導入量に比例してルシフェラーゼ活性は抑制された(dose-dependent manner)。以上の結果、COUP-TF1オーファンレセプターはPSA転写を抑制的に調節している事が推察された。#1ヒト前立腺癌細胞バイオアッセイ系(in vitro系)ヒト前立腺癌細胞でアンドロゲンレセプターを持つLNCaPと、それを持っていないPC-3細胞を用いて実験を行った。まず、TR3 receptorの結合配列をもつオリゴヌクレオチド(NBRE)をルシフェラーゼレポータープラスミドに組み込んだベクターを構築した(NBRE-Luc)。次に、このベクターとTR3 receptorあるいはCOUP-TFIの発現ベクターを前立腺癌細胞に遺伝子導入しルシフェラーゼ活性を測定した。さらに、NBREのオリゴマーをプローブとしてゲルシフトアッセイを行い、TR3 receptorあるいはCOUP-TFIがNBREに結合するかどうか確認した。結果(1)NBRE-Lucを用いたルシフェラーゼ活性は、COUP-TFIあるいはTR3 receptorを遺伝子導入した場合、両者とも活性の上昇を認め、それぞれがNBREに結合することが予想された。さらに、ゲルシフトアッセイを行うと、COUP-TFIあるいはTR3 receptorそれぞれともにNBREに結合するシフトバンドが認められた。これらの結果より、COUP-TFIはTR3 receptorのtarget genes発現に関与することが予想された。#2ヒト前立腺癌組織でのCOUP-TFIの発現の確認結果(1)前立腺癌組織において、COUP-TFIの発現とPSA発現に逆相関がみられた。

前立腺癌において、組織異型度が進むほどPSAの発現が少ない傾向があり、従ってCOUP-TFIやTR3 receptorが前立腺癌の組織異型に関与している可能性が推察された。ステロイドレセプターでリガンドの不明なCOUP-TFIは、ほかのステロイドレセプターであるRetinoic X receptor (RXR)と結合して標的遺伝子の結合領域につき、転写因子として作用していることが分かっている。今回のわれわれの一連の実験によると、COUP-TFIはアンドロゲンレセプターの標的遺伝子である前立腺特異抗原(PSA)の転写制御を抑制していることが、前年度までの研究で解析された。一方で、RXRはアンドロゲンレセプター(AR)と結合して(heterodimerを形成)、PSAの転写制御に関わっていることも分かっている。以上のことから判断すると、原始的なステロイドレセプター(多くのオーファンレセプターがそうであるといわれている)であるCOUP-TFIやTR3 orphan receptorなどがRXRとheterodimerを形成して、アンドロゲンやエストロゲンなどの標的遺伝子の転写制御に関係していることが予想される。前立腺癌は、男性ホルモンであるアンドロゲンに大きく作用される癌腫であるが、未分化な細胞形態を呈しかつ増殖盛んな変化を来たす癌化の過程において、上述した原始的なステロイドレセプターのCOUP-TFIやTR3 orphan receptorなどが深く関与していることが、これまでの我々の行った研究結果で予想された。したがって、COUP-TFIやTR3 orphan receptorなどのリガンドを見つけ出すことが、ホルモン性の癌腫(前立腺癌や乳癌など)の治療、とくに分子標的治療の突破口になる可能性を秘めていると考えられる。また、多くのステロイドレセプターとheterodimerを形成するRXRのリガンド(9-cis retinoic acid)を利用した、新たな分子標的治療の組み合わせも今後考慮していかねばならないであろう。
強い神経成長因子(NGF)合成促進作用を有するサイアタン類の不斉全合成研究

1.今年度の最重要課題であったerinacine Eの全合成研究において、生合成類似の二回の炭素-炭素結合形成反応を順次行うことで立体選択的に成功し、erinacine Eの世界初の全合成を達成した。その合成ルートの特徴として、保護されたstriatal誘導体から、分子内のBz基の転位を利用したretro-aldol反応の制御に成功し、本合成の最難関である歪んだE環の構築を達成している。このような分子内のアシル基の転位を利用したretro-aldol反応の制御は、研究代表者の知る限り報告例は無く、歪んだ環システムを有する他の天然物合成へも適用可能な強力な手法になると考えている。また、多様な構造を有する類縁体・誘導体の不斉全合成を戦略的に達成することができ、erinacine Eの生合成ルートを示唆すると共に、独自性が高い不斉全合成研究を提示することができた。2.scabronine Aの合成は、前年度にcyathane骨格の構築に成功したので、高度に酸素官能基化されたC環部位の構築手法の開発を行い、高立体立体選択的な酸素官能基導入に成功した。更に、生合成類似の合成ルートによりD環の構築に成功した。3.cyanthiwigin Fの合成は、新たな鎖状のキラルビルディングブロックを用いた収束的な合成ルートを検討し、所望の不斉四級炭素を有する二環性骨格の構築に成功した。Cyathane類は共通する5-6-7員環炭素骨格(cyathane骨格)を有し、その複雑な構造と非常に高い生物活性のため世界から注目されている。今年度は、erinacine B、scabronine Aとcyanthiwigin Fの不斉全合成研究を行い以下の研究成果をあげることができた。1.今年度の最重要課題であったerinacine Bの全合成研究において、アグリコン部位と糖部位のβ-グリコシド結合形成反応に続く、C11位の水酸基を脱離基として利用した生合成類似の分子内SN2'反応によるD環の立体選択的構築に成功し、erinacine Bの世界初の全合成を達成した。その合成ルートは、不斉触媒反応により不斉四級炭素を有する新規キラルビルディングブロックスを迅速かつ大量に創製する手法を含むため、その利用によりerinacine Bに加えerinacine A, C, Iやcyathin A3といったcyathane類及び多様な構造を有する類縁体・誘導体の不斉全合成を戦略的に達成することができ、独自性が高い不斉全合成研究を提示することができた。2. Scabronine Aの特徴であるカルボキシル基を有する不斉四級炭素の構築を、不斉四級炭素に酸素官能基を有するC1ユニットが二つ置換したキラルビルディングブロックを触媒的不斉分子内シクロプロパン化反応により創製することで解決した。その後、erinacine類と同様の変換を行いcyathane骨格の合成に成功した。現在、高度に酸素官能基化されたC環部位の構築を検討中である。3. Cyanthiwigin Fの合成は、cyathane類と同様の合成ルートを用いて三環性骨格の構築に成功したが、ケトン部位の官能基変換が困難であることがわかった。現在、新たな鎖状のキラルビルディングブロックを用いた収束的な合成ルートを検討中である。
ムスカリン受容体部分作動薬の探索研究

ムスカリン受容体は副交感神経を活性化する神経伝達物質アセチルコリンの受容体である。ムスカリン受容体にはM1-M5の5つのサブタイプがあり、M1受容体の活性化が認知機能を向上させる効果がある。本研究は、作動性と拮抗性を併せ持ち、適度にM1受容体を活性化する部分作動薬を創製し、副作用を低減した新たな精神神経疾患治療薬になりうる化合物を見出すことを目的とする。M1受容体およびM4受容体の両方を作動する化合物の構造を種々変換した結果、ムスカリンM1受容体選択的部分作動性を示す化合物を見出した。これらの化合物はアルツハイマー病等の精神神経疾患の改善薬への応用が期待できる。ムスカリン受容体は、副交感神経を活性化する神経伝達物質であるアセチルコリンの受容体である。ムスカリン受容体にはM1-M5の5つのサブタイプが知られており、M1受容体が認知機能に関与することが報告された報告を基盤として、認知症治療薬として種々のムスカリン受容体作動薬が探索された。しかし、それらの多くは選択性が低く、心臓のM2受容体や消化器のM3受容体も作動し、徐脈や嘔吐などの副作用で臨床試験は中断された。そこで、サブタイプ間で相同性が低いアロステリック部位に結合する化合物の研究が進められ、M1受容体に選択性が高い作動薬が見出された。しかしながら、臨床試験に進んだ化合物に発汗作用が報告され、治験は中断された。すなわち副作用を低減したM1受容体作動薬創製には、選択性を高める戦略に加え、M1受容体に由来する副作用を低減する化合物が必要である。本研究では、ムスカリンM1受容体の部分作動薬を探索し、課題解決を目指す。部分作動薬は単独で受容体に結合し活性化するが、その最大作用量は生体内リガンドよりも低いため、受容体のシグナルを「適度な活性化状態」に安定化できる。申請者は、これまでムスカリンM1/M4受容体作動薬の創製に従事してきた。見出されたM4受容体の「部分作動薬」がM4受容体の完全作動薬と同等の薬効を保持しつつ副作用が低減された知見を応用し、本研究では認知機能に関わるM1受容体の選択的部分作動薬の創製を目指す。M1およびM4の両受容体の部分作動薬をリード化合物とし、M4作動性発現に必須の鍵構造であるN-carbethoxy piperidine構造を変換することでM4受容体作動性のみを乖離し、M1受容体部分作動薬を見出す。本研究は、現在方法論が確立していないGタンパク結合型受容体の部分作動薬の探索に新たな手掛かりを提供し、創薬化学の活性化に寄与することも期待できる。(研究計画)ムスカリン受容体作動性を評価するアッセイ系の構築である。購入可能なM1-M5の各サブタイプを発現させた細胞株を購入し、作動薬の作用によって流入するCa2+を検出する。検出に使用する蛍光試薬は高感度のFLIPRCalcium Assay Kit(Molecular Device社)を用い、部分作動薬の比較的弱いシグナルを検出する。コントロールにはacetylcholineを用い、そのEmaxやEC50値と比較して部分作動性を数値化する。また、xanomeline等の既知リガンドをポジティブコントロール化合物として用いてアッセイ結果が妥当か否かを検証する。また、M2-M5受容体は1次スクリーニングをクリアした化合物についてのみ行う。蛍光を検出する装置は、京都大学薬学研究科に設置されているMolecular Device社製のFLIPRを利用する。これらの組み合わせは申請者も利用した一般的な方法であり、高い確度で系を構築できる。もし細胞によってバラツキがあり、作動性が安定しない場合、他社から購入可能な別の細胞やエクオリンを用いる蛍光法を検討する。(進捗状況)研究計画に従って、まずは化合物の薬理活性を評価するためのアッセイ系構築に取り組んでいる。ムスカリン受容体を強制発現したHEK細胞は高額であったため断念し、ムスカリンM1受容体を強制発現したCHO細胞を購入した。この細胞を十分量確保するために培養を行った。また、大阪大学で浜松ホトニクス社製FDSS7000を使用できたため、現在、培養したCHO細胞とこの装置の組み合わせで評価できるか検証している。ポジティブコントロールとして、2種類の既知ムスカリン受容体作動薬を合成するとともに、M1/M4受容体部分作動薬をリード化合物とし、合成展開を行った。ムスカリン受容体にはM1M5の5種類がある。中でもM1受容体を活性化すると認知機能が向上することが見出され、認知症治療薬の重要な標的の1つとされる。これまでに種々のムスカリン受容体作動薬が合成されてきたが、多くは心臓のM2受容体や消化器のM3受容体も活性化してしまうため、徐脈や嘔吐などの副作用がみられた。本課題を解決すべく、これまでの研究で見出したM1/M4受容体を選択的に作動する骨格を足掛かりに、M4作動性発現に必須の鍵構造であるN-carbethoxypiperidine構造を変換することでM4作動性のみを焼失させ、M1受容体に選択的な作動薬を見出すことを目的として本研究を開始した。まず、テトラヒドロピラン環を導入した化合物を合成したところ、期待通りM1受容体のみを選択的に作動した。

そこで、光学活性体をそれぞれ合成することとした。R体、S体それぞれの光学活性体を合成してM1受容体作動性を評価した結果、S体がR体に比べて高いM1受容体作動性祖示すことを明らかにした。また、R体はM1受容体の最大作動性が20%程度で部分的であったことから、M1受容体部分作動薬である可能性が示された。さらに低濃度から作動性を示す化合物を見出すべく、テトラヒドロピラン環に比べてM1受容体作動性が強いことが期待できるN-acetylpiperidine構造を導入した化合物をそれぞれ光学活性体で合成した。これらはテトラヒドロピラン体よりも高いM1受容体作動性を示した。本研究では、選択的M1受容体作動薬および部分作動薬を見出した。これらの知見は認知症およびパーキンソン病などの治療薬創出に貢献できる有用な知見になると期待する。ムスカリン受容体は副交感神経を活性化する神経伝達物質アセチルコリンの受容体である。ムスカリン受容体にはM1-M5の5つのサブタイプがあり、M1受容体の活性化が認知機能を向上させる効果がある。本研究は、作動性と拮抗性を併せ持ち、適度にM1受容体を活性化する部分作動薬を創製し、副作用を低減した新たな精神神経疾患治療薬になりうる化合物を見出すことを目的とする。M1受容体およびM4受容体の両方を作動する化合物の構造を種々変換した結果、ムスカリンM1受容体選択的部分作動性を示す化合物を見出した。これらの化合物はアルツハイマー病等の精神神経疾患の改善薬への応用が期待できる。(平成28年度の研究計画)今後は、化合物のスクリーニング、すなわち1ムスカリン受容体発現細胞を用いた薬効評価、2化合物合成に取り組む。化合物の合成後速やかに活性評価を実施する。また、これまでの研究においてM5作動性を有する化合物はほとんどないため、M5作動性の評価は有望化合物に絞って実施する。さらに、鍵中間体の合成に取り組み、得られた鍵中間体を用いてパラレル合成を行い、環状構造を有する各種置換基を導入する。得られた構造活性相関情報をM1/M4受容体作動薬の探索研究の結果と組み合わせて、最適化研究を行う。部分作動性が不十分な化合物しか得られない場合、立体的にかさ高い架橋複素環構造を検討する。それらの部分構造は合成に工程数がかかるがトロパン骨格などの合成方法を確立済の化合物を使用する。(今後の研究の推進方策)ムスカリン受容体のサブタイプであるM2-M5受容体に対する作動性評価を効率化する。一次スクリーニングはM1受容体作動性を指標として行うこととしている。しかし、4つのサブタイプすべての評価系を確立することは時間がかかるため、外部のスクリーニングを利用し、効率的なデータ取得を行うことを検討している。一次スクリーニングの基準をクリアした化合物に対する二次スクリーニング(M2-M5受容体に対する作動性評価)および化学合成の進捗状況に応じて、本研究課題に取り組む学生の増員を行い、研究をさらに推進する。創薬化学2月から論文投稿の準備をし、英文校正を依頼するつもりであったが、学内の期日内に依頼ができなかったため、英文校正依頼料に相当する金額を翌年度分として使用することとした。平成28年度は、学会出張に伴う国内旅費として10.1万円、参加費として9千円、論文校正依頼に6万円を人件費・謝費として使用する計画である。
マラリア感染に関わる赤血球膜の脂質ダイナミズムの解析

本研究は、マラリア原虫が赤血球に侵入する際の必要・十分条件について、赤血球膜の脂質ダイナミズムの観点から検証した。具体的には、1)膜脂質量を変化させずにラフト構造の有無を調節した赤血球(リドカイン(Lidocaine)処理およびリドカイン除去赤血球)、2)コレステロール量を減少させた赤血球(MBCD(methyl-β-cyclo dextrin)処理赤血球)、3)スフィンゴミエリン(Sphingomyelin)量を減少させた赤血球(スフィンゴミエリナーゼ(SMase)処理赤血球)を調製し、ラフト構造の有無、情報伝達系の機能を確認した上でマラリア原虫の侵入に対するラフトの効果を検討した。その結果、リドカイン効果は可逆的に、MBCDおよびスフィンゴミエリナーゼ処理によりラフト構造は不可逆的に調節された。リドカイン処理と除去によりラフト画分の有無を調節した赤血球を用いて、マラリア感染・増殖率を検討したところ、リドカイン処理(ラフト画分の消失)により感染・増殖率は低下し、リドカイン除去(ラフト画分の再構築)により感染・増殖率は回復した。さらに、分化段階を分裂体に同期した原虫を用いて赤血球への侵入効果を検討したところ、侵入は2mM以上のリドカイン処理でほぼ完全に阻止された。以上の結果から、マラリア原虫は赤血球に侵入する際に水平方向の脂質ダイナミズム(ラフト)に集積する情報伝達系を利用することが明らかになった。マラリア原虫は何らかの刺激によりGsαを介して膜骨格蛋白質をリン酸化し、水平方向の脂質ダイナミズムを利用して膜の内方陥没(原虫の侵入)を容易にすると考えられる。リドカインはすでに局所および全身麻酔に用いられている可逆的麻酔薬であり、本研究で新たに見出されたラフトに依存するGsαを介する情報伝達の可逆的作用がマラリア原虫の赤血球への侵入を阻止する可能性が期待される。本年度は水平方向のダイナミズム(脂質ラフト)について以下の4点について検討した。1赤血球膜からの脂質ラフト画分の分離2脂質ラフトの消失と再構築3脂質ラフトを場とする情報伝達系4マラリア原虫の赤血球への侵入とラフトの存在の関係「結果」「考察」1赤血球膜を非イオン性界面活性剤(TritonX,100)処理し、スクロースの濃度勾配下で遠心することにより密度の異なる画分を回収し、コレステロール量の分布、ラフトマーカー蛋白質(Flotillin-1)の分布を検討し、健常者の赤血球には低密度でコレステロールに富み、Flotillin-1が集積したラフト画分が存在することを明らかにした。2赤血球を局所麻酔剤であるリドカイン処理すると上記1で示したラフト画分は消失し、脱脂肪処理した牛血清アルブミンを用いて赤血球膜に取り込まれたリドカインを洗浄除去すると再びラフト画分の回収が可能になったことから、リドカインによってラフトの存在をコントロールすることを可能にした。3リドカイン処理の有無によりラフト画分の存在をコントロール(Gsαのラフト画分への集積で確認)した赤血球を調製し、アデノシン刺激による情報伝達系の活性化を(1)細胞内cAMP量の増加、(2)PKA活性化による基質蛋白質のリン酸化で確認した。リドカイン処理、すなわちラフト画分の消失により情報伝達は遮断されたが、リドカイン除去により情報伝達の回復を確認した。

4 3と同様に、リドカイン処理の有無によりラフト画分の存在をコントロールした赤血球を調製し、マラリア感染率を検討した。リドカイン処理により感染率は低下し、リドカイン除去により感染率は回復した。「考察」水平方向のダイナミズム(脂質ラフト)の存在はGsαを介する情報伝達とマラリア感染に必要であることが示された。本年度は水平方向のダイナミズム(脂質ラフト)について、昨年度のリドカイン処理(可逆的脂質ラフトの消失)に加えてスフィンゴミエリナーゼおよびMBCD処理(不可逆的脂質ラフトの消失)によるマラリア原虫の赤血球への侵入の効果について検討した。「結果」(1)まず、始めにスフィンゴミエリナーゼ処理条件を検討し、赤血球膜外表面のスフィンゴミエリンを最大限処理できる条件を見出した。その条件で赤血球膜をスフィンゴミエリナーゼ処理すると、スフィンゴミエリンが減少し、ラフト画分は消失した。また、MBCD処理は常法に従い処理し、コレステロールの減少に従いラフト画分は消失した。これらの結果は脂質ラフトの維持にはスフィンゴミエリンとコレステロールが必要であることを示している。(2)これらの処理の有無によりラフト画分の存在をコントロール(Gsαのラフト画分への集積で確認)した赤血球を調製し、アデノシン刺激による情報伝達系の活性化を1)細胞内cAMP量の増加、2)PKA活性化による基質蛋白質(膜骨格のひとつであるアドシン)のリン酸化で確認した。スフィンゴミエリナーゼまたはMBCD処理(すなわちラフト画分の消失)により情報伝達は遮断された。(3)上記(2)と同様に処理した赤血球へのマラリア感染率は著明に減少した。「考察」赤血球膜脂質ラフトの消失により、Gsαを介する情報伝達とマラリア原虫の侵入が抑制された。このことはマラリア原虫からの何らかの刺激がGsαを介して膜骨格蛋白質をリン酸化し、水平方向の脂質ダイナミズムを利用して膜の内方陥没(原虫の侵入)を容易にすることを示唆している。
機能性配位子を持つモリブデン窒素錯体による高効率な触媒的窒素固定法の開発

工業的な窒素固定法であるハーバーボッシュ法では酸化鉄が主触媒として用いられている。また、常温常下で大気中の窒素分子をアンモニアへと変換している窒素固定酵素ニトロゲナーゼの活性中心は鉄を含むクラスターであることが明らかにされている。このような背景のもと、鉄窒素錯体を用いた窒素固定法に関する研究が活発に検討されている。しかし、触媒反応の成功例は低温でのアンモニア生成反応の一例に限られていた。前年度までのPNP型ピンサー配位子を持つモリブデン窒素錯体が触媒的アンモニア生成反応に対して極めて有効な触媒として働いた研究成果を踏まえて、本研究ではPNP型ピンサー配位子を持つ鉄窒素錯体1を用いた触媒的窒素固定反応の検討を行った。検討に際して、鉄中心への配位力を高めるためピロールを母骨格とするアニオン性PNP型ピンサー配位子を用いることとした。検討の結果、目的のアニオン性PNP型ピンサー配位子を有する単核鉄窒素錯体の合成に成功した。この窒素錯体1を用いた窒素分子の触媒的還元反応を検討した。窒素錯体1を触媒として用いて、常圧の窒素ガスを還元剤およびプロトン源存在下反応させることで、最高で17.3当量のアンモニア及び2.4当量のヒドラジンが生成した。これらの結果は、アニオン性PNP型ピンサー配位子を持つ鉄窒素錯体が触媒的な窒素分子の還元反応において有効な触媒として働くことを示している。本反応系は、遷移金属窒素錯体を用いた窒素分子からのヒドラジンへの触媒的還元反応に成功した初めての例である。窒素固定酵素ニトロゲナーゼによる窒素分子のアンモニアへの還元反応においては、ヒドラジンが鍵中間体であると考えられている。この様な研究背景を鑑みると、本研究成果は窒素固定酵素ニトロゲナーゼによる窒素分子の触媒的還元反応に関する反応機構について新たな知見を与える極めて興味深い結果であると言える。27年度が最終年度であるため、記入しない。常温・常圧での窒素固定法の開発に向けた研究が盛んに行われているが、遷移金属錯体を用いた窒素分子からの直接的な触媒的アンモニア生成反応の例は限られている。最近私が所属する研究室において、PNP配位子を持つ二核モリブデン窒素錯体を用いた触媒的アンモニア生成反応の開発に成功した。この窒素分子からアンモニアへの変換過程では中心金属の酸化還元を伴うことから、配位子に酸化還元活性部位を導入した場合の影響に興味がもたれる。そこで私は可逆な1電子酸化を起こすフェロセンに着目し、昨年度までにPNP配位子にフェロセンを組み込んだ窒素錯体の合成に成功し、大幅に触媒活性が向上することを見出した。このような結果を踏まえて、今年度はフェロセン部位の構造を修飾することでフェロセンの役割について知見を得てさらなる触媒活性の向上に取り組んだ。はじめに、フェロセンの鉄原子とモリブデン原子との相互作用が触媒活性に与える影響を調べるために、PNP配位子とフェロセンをエチレン鎖、フェニレン鎖で架橋させた窒素錯体についてその触媒活性の検討を行った。その結果、架橋部位の導入によって鉄とモリブデン間の相互作用が弱くなるとフェロセンを導入した効果が発現しなくなることを見出した。続いて、メタロセン部位の還元力が与える影響を調べるため、還元力の強いペンタメチルフェロセンと還元力の弱いルテノセンを導入した窒素錯体について検討した。その結果、中程度の還元力を有するフェロセンを有する錯体が最も効果的な触媒として働くことを見出した。このように、適切な還元力を有しかつ鉄とモリブデン間の強い相互作用が重要であり、鉄からモリブデンへの分子内電子移動が触媒活性の向上に寄与していること示唆する結果を見出した。そこで私は酸化還元活性な分子であるフェロセンに着目し、既にPNP配位子にフェロセンを組み込んだ窒素錯体の合成に成功し、大幅に触媒活性が向上することを見出した。詳細な検討によって、鉄とモリブデン間の相互作用が触媒活性の向上に寄与していることを見出した。昨年度はこれまでの知見を踏まえて、より強く鉄とモリブデン間の相互作用が働くと期待されるアザフェロセン型ピンサー配位子を持つモリブデン窒素錯体を設計しその合成を試みた。その結果、アザフェロセン配位子を持つ単核モリブデン窒素錯体の合成に成功した。合成したアザフェロセン窒素錯体を用いて触媒的アンモニア生成反応を検討したところ、当初の予想に反して触媒活性を示さなかった。従来のPNP配位子を持つ二核モリブデン窒素錯体においては、窒素分子で架橋された二核構造を有していることが触媒活性の発現に重要なことが明らかになっている。アザフェロセン窒素錯体は固体・溶液中でも単核構造を保持していることが実験的に示唆されており、この錯体が触媒活性を持たなかったことは、その単核構造に由来していることが示唆された。

工業的な窒素固定法であるハーバーボッシュ法では酸化鉄が主触媒として用いられている。また、常温常下で大気中の窒素分子をアンモニアへと変換している窒素固定酵素ニトロゲナーゼの活性中心は鉄を含むクラスターであることが明らかにされている。このような背景のもと、鉄窒素錯体を用いた窒素固定法に関する研究が活発に検討されている。しかし、触媒反応の成功例は低温でのアンモニア生成反応の一例に限られていた。前年度までのPNP型ピンサー配位子を持つモリブデン窒素錯体が触媒的アンモニア生成反応に対して極めて有効な触媒として働いた研究成果を踏まえて、本研究ではPNP型ピンサー配位子を持つ鉄窒素錯体1を用いた触媒的窒素固定反応の検討を行った。検討に際して、鉄中心への配位力を高めるためピロールを母骨格とするアニオン性PNP型ピンサー配位子を用いることとした。検討の結果、目的のアニオン性PNP型ピンサー配位子を有する単核鉄窒素錯体の合成に成功した。この窒素錯体1を用いた窒素分子の触媒的還元反応を検討した。窒素錯体1を触媒として用いて、常圧の窒素ガスを還元剤およびプロトン源存在下反応させることで、最高で17.3当量のアンモニア及び2.4当量のヒドラジンが生成した。これらの結果は、アニオン性PNP型ピンサー配位子を持つ鉄窒素錯体が触媒的な窒素分子の還元反応において有効な触媒として働くことを示している。本反応系は、遷移金属窒素錯体を用いた窒素分子からのヒドラジンへの触媒的還元反応に成功した初めての例である。窒素固定酵素ニトロゲナーゼによる窒素分子のアンモニアへの還元反応においては、ヒドラジンが鍵中間体であると考えられている。この様な研究背景を鑑みると、本研究成果は窒素固定酵素ニトロゲナーゼによる窒素分子の触媒的還元反応に関する反応機構について新たな知見を与える極めて興味深い結果であると言える。昨年度においては、新規なアザフェロセン型ピンサー配位子およびその配位子を有する新規な単核モリブデン窒素錯体の合成に成功した。合成した単核モリブデン窒素錯体の類似の錯体の報告例は限られており、アザフェロセン配位子の特異な特性がその単離の鍵となったと考えられる。このアザフェロセン型ピンサー配位子の特異な配位環境は他の遷移金属錯体においても有効に働くと期待できる。さらに合成した窒素錯体のアンモニア生成反応に対する触媒活性の評価にも成功した。その結果、今後の触媒設計に対する重要な指針を得ることに成功した。27年度が最終年度であるため、記入しない。電子受容体となるフラーレンや、光増感剤として働くポルフィリン誘導体をPNP配位子の合成およびその配位子を持つモリブデン窒素錯体の合成を行い、光エネルギーを利用したアンモニア生成反応を検討する。さらに、モリブデンに代わりより安価な金属である鉄錯体を用いた触媒的アンモニア生成反応を検討する。具体的には、様々な多座配位子を持つ鉄窒素錯体の合成を試みその物性について評価する。さらに、触媒として用いて反応条件を検討することにより常温・常圧での触媒的アンモニア生成反応の達成を目指す。昨年度においては、様々なフェロセン・メタロセン部位を有する新規なモリブデン窒素錯体の合成に成功し、そのアンモニア生成反応に対する触媒活性の評価に成功した。その結果、フェロセン部位が触媒活性の向上に果たす役割について知見を得ることに成功した。
視床下部ー下垂体系ー性腺軸の機能と栄養の相関に関する神経内分泌学的研究

生殖腺を投統する繁殖機能系と、栄養素ならびにエネルギー動員を規制する栄養制御系とが視床において統合されていること、この統合に吸乳刺激が関与していることに注目し、両系の相互関系及び、それに対する吸乳刺激の修飾について神経内分泌学的立場より明らかにすることを目的とする。1.乳腺神経線維の電気的刺激を吸乳刺激に替わるものとし得るか否かを、オキシトシン(OT)分泌を指標としてその特異性の点から検討した。OT分泌は、乳腺神経のみならず伏在神経、正中神経線維の電気刺激によってもひき起こされた。クロールプロマジン投与はストレッサー暴露時に見られるOT分泌を抑制した。しかし、吸乳刺激に対するOT放出や、乳腺神経、正中神経の線維の電気刺激に対応するOT放出を抑制しなかった。従って、神経線維の電気刺激は単なるストレッサーとしてOT分泌を促すものではないが、吸乳刺激程OT分泌に対し特異性の高い刺激ではないことが明らかになった。2.雌ラットにおいて、LHの分泌様式には拍動型とサージ型との二型がある。この分泌型式に対する吸乳刺激の影響を卵巣除去泌乳ラットを用い検討した。吸乳刺激は、泌乳前半においてはLHの拍動的分泌を直接抑制した、乳子を母親より離し吸乳刺激を消失させると1218時間後に拍動的LH分泌が出現した。血漿中LH平均濃度、拍動振幅、頻度いずれも離乳後の時間に比例して増加した。発情周期を反覆する正常動物では、卵巣除去後LHの拍動的分泌の振幅、LH平均濃度は増加したが、頻度は変化しなかった。拍動型LH分泌抑制に関して、吸乳刺激と卵巣由来ステロイドとでは作用機序が異なることを示す。卵巣除去泌乳ラットにエスラジオールを投与すると、LHのサージ状分泌が毎日観察された。従って、ラットでは吸乳刺激はLHの拍動的分泌機序のみを抑制することが明白になった。生殖腺を統御する繁殖機能系と、栄養素ならびにエネルギー動員を規制する栄養制御系とが視床下部において統合されていることに着目し、両系の相互関係を神経内分泌学的立場より明らかにすることを目的とする。1.正常および長期泌乳ラットを用い、乳子吸乳時におけるプロラクチン(PRL)およびコルチコステロン(B)の分泌パタンの変化を乳期の進行を追って調べた。その結果PRL分泌反応は乳期の進行に伴い著しく低下するが、B分泌反応は正常泌乳期内では殆んど変化しなかった。この変化を母体成分の乳期中の変化と照合するとPRLの分泌パタンは脂肪蓄積量の減少パタンに、Bは蛋白蓄積量の変動パターンに似ることが知られた。2.上記の結果により、母体内の栄養蓄積の変動がPRL,Bの分泌に影響を与える可能性が示唆された。そこで絶食および体脂肪組織除去により体内栄養素蓄積量を変化させ吸乳時PRLおよびBの分泌反応を調べた。24時間の絶食では、体脂肪組織量に変化はなく、PRL分泌反応も対照群とほぼ同様であった。しかし、体脂肪除去群では除去後72時間で反応の出現率に大きな差が出てきた。B分泌反応については目下実験継続中である。3.泌乳動物において吸乳刺激はPRLの分泌を促すと共に性腺刺激ホルモン(GTH)の分泌を抑制している。そこでGTHのうちLHの吸乳刺激による抑制が、乳期の進行に伴って変化するか否かを検討した。妊娠後半期に見られるLHの拍動的分泌は、妊娠前半期では全く認められなかった。泌乳前半期の分泌抑制は卵巣除去動物でも見られ、かつ乳子を母親より離すと速やかに解除された。

この抑制は吸乳刺激が直接視床下部に作用しておこったものと解される。以上から、体内栄養分蓄積量の変動がPRLのみならずLHの分泌にも影響する可能性が示唆された。生殖腺を統御する繁殖機能系と,栄養素ならびにエネルギー動員を規制する栄養制御系とが視床下部において統合されていること,この統合に吸乳刺激が関与している可能性のあることに注目し,両系の相互関係及び,それに対する吸乳刺激の修飾について神経内分泌学的立場より明らかにすることを目的とする.1.吸乳刺激を定量化することを目的として,乳腺神経の電気的刺激を吸乳刺激に替わる刺激として用い得るか否かを検討した.乳腺神経の電気的刺激によりオキシトシンの分泌は促進され,血中平均黄体形成ホルモン(LH)濃度やLHパルスの頻度,振幅等が抑制された.これらの結果は,この刺激が吸乳刺激にかわるものとして用いられる可能性を示唆する.しかし,刺激の特異性に関して未だ検討の余地を残している.2.実験に用いた雌ラットにおいて,LH分泌様式に拍動型とサージ型の二型があり,前者は視床下部内側基底部により,後者は視床下部前部によって統御されていることが知られている.昨年度は泌乳前半期においては,吸乳刺激がLHの拍動的分泌を直接に抑制すること,この抑制は泌乳後半に解除されることを明らかにした(Maedaら1987).本年度は,LHの拍動的分泌抑制も乳子を母親より離すと速やかに解除されることを示し,吸乳刺激による抑制が直接的であることを明らかにした.さらに,LHのサージ的分泌は,泌乳前半期・後半期を問はず,卵巣除去泌乳ラットにおいてエストロジェンの投与により開始することを見出した.これらの結果は,吸乳刺激はLHの拍動的分泌機序を抑制するが,サージ的分泌制御機序に対しては影響を与えないことを示す.この結果は,報文にまとめ現在投稿中である(Tukamuraら,投稿中).生殖腺を統御する繁殖機能系と、栄養素ならびにエネルギー動員を規制する栄養制御系とが視床下部において統合されていること、この統合に吸乳刺激が関与していることに注目し、両系の相互関係及び、それに対する吸乳刺激の修飾について神経内分泌学的立場より明らかにすることを目的とする。1.昨年度にひき続き乳腺神経の電気的刺激を吸乳刺激に替わる刺激として用い得るか否かを、刺激に対応するオキシトシン(OT)分泌を指標にして検討した。乳腺神経線維の電気刺激により血漿OT濃度は上昇した。しかし、伏在神経や正中神経の刺激によってもOT放出が見られた。それ故、乳腺神経刺激はOT放出に関し特異的なものとは云えない。クロールプロマジン(CPZ)投与は、ストレッサー暴露時に見られるOT放出を抑制する。CPZ投与は吸乳刺激によるOT放出や、乳腺神経、正中神経線維の刺激に対するOT放出を抑制しなかった。従って、神経線維の電気刺激は特異性が少なく、吸乳刺激の代替として使える可能性は低い。2.卵巣除去泌乳ラットにおいて、乳子を母親より離すと、吸乳刺激による黄体形成ホルモン(LH)の拍動型分泌が1218時間後に出現する。LHの血漿中平均濃度、拍動頻度と振幅のいずれも離乳後の時間に比例して増加した。発情周期を反覆している正常動物では、卵巣除去後LHの血漿中平均値と拍動の振幅は増加するが、頻度には変化が見られなかった。この結果は、吸乳刺激と卵巣由来ステロイドとの間で拍動型LH分泌抑制機序に差異のあることを示す。
新奇な構造をもつ制限酵素のＤＮＡ切断ドメインを利用した人工制限酵素の創製

制限酵素はDNA上の特異的な配列を認識して切断することから,遺伝子マニピュレーションのツールとして汎用されるとともに, DNA結合タンパク質としても興味深い研究対象である.本研究ではこれまでに報告されていない新奇な立体構造をもつ制限酵素EcoT38Iの部位特異的変異酵素を作成して酵素学的な諸性質を解析した結果,アミノ酸を1残基変化させることで野生型(GPuGCPyC)とは異なる配列特異性を持つ酵素(GAGCTC)へと改変させることに成功した.制限酵素はDNA上の特異的な配列を認識して切断することから、遺伝子マニピュレーションのツールとして汎用されている。6塩基対のパリンドローム配列を認識する制限酵素であるEcoT38Iは4通りの配列を認識し、DNA認識ドメインと切断ドメインがリンカーを介して連結しているという一般的な制限酵素とは異なるユニークな性質を持つことを我々はこれまでに明らかにしている。そこで本研究では、立体構造情報をもとに様々な変異酵素を構築して、それらの機能について分子間相互作用に着目して解析を行った。得られた成果は以下の5点にまとめられる。(1)DNA切断ドメインだけではヌクレアーゼ活性を示さないが、DNA認識ドメインを共存させると微弱な制限酵素活性を示したことから、ドメイン間の相互作用が存在することを見出した。(2)本酵素が特異的な配列を認識して高い切断活性を維持するためには「適切な長さ」のリンカーが必要であることを見出した。(3)立体構造情報をもとにDNAと相互作用するアミノ酸残基を選択して変異酵素の特異性の変化を解析した結果、予想とは異なる残基が認識配列G(G/A)GC(C/T)Cの(G/A)と(C/T)の認識に重要な役割を果たしていることを見出した。(4)当該アミノ残基を他のアミノ酸残基に置換した結果、GAGCTCだけを特異的に切断する酵素に改変することに成功した。(5)変異酵素とDNAとの動的相互作用を解析した結果、当該アミノ酸残基は塩基の認識だけではなく、酵素とDNAとの親和性に深く関わっていることが示唆された。本研究により、新奇な構造を持つ制限酵素EcoT38IのDNA認識・切断メカニズムに関する基礎的知見ならびに、本酵素のDNA切断ドメインを利用した人工制限酵素構築のための分子基盤を得ることができた。さらなる変異導入により、ゲノム編集等に利用可能な人工制限酵素を創製することが可能であろう。制限酵素はDNA上の特異的な配列を認識して切断することから,遺伝子マニピュレーションのツールとして汎用されるとともに, DNA結合タンパク質としても興味深い研究対象である.本研究ではこれまでに報告されていない新奇な立体構造をもつ制限酵素EcoT38Iの部位特異的変異酵素を作成して酵素学的な諸性質を解析した結果,アミノ酸を1残基変化させることで野生型(GPuGCPyC)とは異なる配列特異性を持つ酵素(GAGCTC)へと改変させることに成功した.6塩基対のパリンドローム配列を認識する制限酵素EcoT38Iは、典型的な制限酵素とは異なり、DNA認識ドメインと切断ドメインから構成され、両ドメインがリンカーを介して結合しているユニークな構造を持つことを明らかにしている。リンカー領域の構造生物学的意義を明らかにすることを目的として、H24年度は以下の2つの項目について研究を行った。(1)リンカー領域のアミノ酸残基を改変した変異酵素の機能解析:リンカー領域のアミノ酸残基の数が、認識特異性に与える影響を明らかにするため、12種類の変異酵素を構築して酵素活性を調べた。その結果、3アミノ酸残基を欠失させた変異酵素は活性を消失したが、16アミノ酸残基を挿入した変異酵素は野生型と同じ認識特異性を示した。(2)DNA切断ドメインの相互作用の解析:DNA切断ドメインの機能を明らかにするために、His-tagを付加した組換え体タンパク質を精製して生化学的諸性質を解析した。その結果、DNA切断ドメインは野生型と同様に二量体を形成しているが、非特異的なヌクレアーゼ活性は示さないことを明らかにした。さらに、DNA認識ドメインと切断ドメインを等モル比になるように混合して、基質に対して大過剰量添加して反応を行った結果、野生型と同じ認識特異性を示すが、切断活性は1/100程度に低下することを見出した。以上の結果から、本酵素が特異的な塩基配列を認識して切断するためには、「適切な」長さを持つリンカー領域を必要とすること、DNA認識ドメインとDNAの相互作用だけではなく、DNA認識ドメイン間および両ドメイン間の分子間相互作用が重要な役割を果たすことが示唆された。研究計画調書のH24年度の計画に基づき、予定していた2つの項目について変異酵素の構築と解析を行うことができた。分子間相互作用については、引き続きより一層詳細な解析を行う必要がある。H24年度の研究成果をもとにさまざまな変異酵素を構築して、当初の予定どおり詳細な解析を継続する。また、H24年度には予想外の分子間相互作用の存在が示唆されたので、予定していなかった新たな変異酵素を構築することが必要となる。H25年度も研究の過程で予想外の結果が得られ研究計画を変更せざるを得ない可能性があるが、その都度柔軟に対応することで、所期の目的であるユニークな制限酵素であるEcoT38Iの構造機能相関の解析ならびに人工制限酵素の創製を行う予定である。H24年度は概ね計画通りに研究が進行しており、H25年度も研究計画書に記載した内容で研究を継続する予定である。

ただし、H24年度に予想外の結果が得られたことから、当初予定していた研究費を全額使用することができなかった。H25年度は予定していた計画に加えて新たな変異酵素の構築と解析を行うので、当初の申請額以上の経費が必要となるが、H24年度の未使用分を充てることで、予定していた研究の遂行に支障はないと考えている。