hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
組み合せ構造を持つ確率モデル構築のための学習理論

1.MCMC(Markov chain Monte-Carlo)法においてモンテカルロ積分を速く収束させる手法を提案した.本手法はマルコフ連鎖の推移において系が同じ状態をなるべく取らないように推移行列を設計するものである.本手法の優位性を理論と実験の両面から示した.2.MCMC法の一種であるGibbssampler法は状態推移において1つの変数のみを更新するが,複数の変数を同時に更新する手法を提案した.本手法は単一変数更新の通常のGibbs sampler法に比べ,分布の収束の速さや得られる乱数列の独立性において優位であり,計算量も同じオーダーである.さらに数値実験により本手法の優位性を示した.3.複数の確率分布があるとき,これらを最も良く近似する低次元のパラメータのなす多様体を求める手法を提案した.多様体をe-平坦なものに取るe-PCAとm-平坦なものに取るm-PCAが考えられる.本手法では反復法により多様体を変形し近似する多様体を求める.これは大域的最適解に至る保証は無いものの,初期の多様体をうまく選ぶ方法を与え,実験的にも良い結果が得られた.4.複素ニューラルネットワークの計算能力を落とさずにネットワークの大きさを小さくするための十分条件を明らかにした.項目「抽象概念を表す隠れ変数を持つモデルに関する研究」において本年度は,観測データから対象の持つ確率モデルを推定する統計的手法としてemアルゴリズムを使う場合の理論的検討を行った.その結果emアルゴリズムによる学習が従来手法のAPN (Adaptive Probabilistic Network)と同様に局所最適解にトラップされてしまう例があるというネガティブな結果が得られた.また確率モデルとして昨今話題となっているグラフィカルモデルの中でMCMC (Markov Chain Monte Carlo)法の持つ意味を情報幾何学的見地から考察し理論的知見を得た.項目「順序構造を扱うモデルに関する研究」において本年度は,順序構造扱うモデルの研究として新たに「順序例からの学習」の枠組みを提案した.他の学習・予測問題がカテゴリ変数や数値変数を扱うのに対し,この問題では,価格や嗜好といった基準について,どちらの対象が上位にあるかという順序を扱った.問題の枠組みとしては,順位を付与した対象列を訓練事例として,任意の対象集合を順序付けできる規則を獲得する.この順序は,嗜好や感覚などを扱う官能検査などの解析に適しており,人々の嗜好の傾向の予測や解析への適用を行った.またこれらの項目以外でも当研究「組合せ構造を持つ確率モデルのための学習理論」の要素技術として複素ニューラルネットの理論的解析を行った.複素ニューラルネットにおけるパラメータの冗長性(異なるパラメータに対して入出力応答が一致する性質),危点(パラメータの微小変化に対してシステム応答が不変となる点)の理論的解析,及び判別問題に複素ニューラルネットを用いた場合の判定領域の性質について理論的知見が得られた.項目「抽象概念を表す隠れ変数を持つモデルに関する研究」において本年度は,確率モデルとして昨今話題となっているグラフィカルモデルの中でMCMC(Markov Chain Monte Carlo)法について情報幾何学的見地から考察した.特にMCMCの一種であるGibbs samplerが系の持つ分布と目標となる分布の間のある種の擬距離(KLダイバージェンス)を各状態遷移ごとになるべく小さくするように振舞うある種の貪欲算法と解釈できるという理論的知見を得た.項目「順序構造を扱うモデルに関する研究」において本年度は,順序応答を用いたフィルタリング技術と順序のクラスタリング手法を開発した.嗜好や感覚などの主観的な量を計測するのに順序は適している.この特徴を利用して,嗜好の類似したグループの意見を集約することでユーザが好むものを見つけ出す協調フィルタリングを行うことで,大きく予測精度を改善した.また,嗜好を順序を用いて測り,その順序をクラスタリングによって分類する手法を提案した.この手法によって,同じ傾向の嗜好を持つグループの検出や,各グループの嗜好の特徴を抽出できた.またこれらの項目以外でも当研究「組合せ構造を持つ確率モデルのための学習理論」の要素技術として複素ニューラルネットの計算能力の一端を明らかにした.まず,通常の実数型の単一ニューロンでは解くことができない排他的論理和問題(XOR問題)と対称性検出問題を,単一複素ニューロンを使って解くことができることを示した.その際,複素ニューロンの決定表面が直交した2つの超平面から構成されていることを利用した.次に,具体的な応用例として,通信分野におけるフェージング等化問題が単一複素ニューロンを使うことによって,うまく解けることを示した.その際にも直交した決定表面がうまく活用した.1.MCMC(Markov chain Monte-Carlo)法においてモンテカルロ積分を速く収束させる手法を提案した.本手法はマルコフ連鎖の推移において系が同じ状態をなるべく取らないように推移行列を設計するものである.本手法の優位性を理論と実験の両面から示した.2.MCMC法の一種であるGibbssampler法は状態推移において1つの変数のみを更新するが,複数の変数を同時に更新する手法を提案した.本手法は単一変数更新の通常のGibbs sampler法に比べ,分布の収束の速さや得られる乱数列の独立性において優位であり,計算量も同じオーダーである.さらに数値実験により本手法の優位性を示した.3.複数の確率分布があるとき,これらを最も良く近似する低次元のパラメータのなす多様体を求める手法を提案した.多様体をe-平坦なものに取るe-PCAとm-平坦なものに取るm-PCAが考えられる.本手法では反復法により多様体を変形し近似する多様体を求める.これは大域的最適解に至る保証は無いものの,初期の多様体をうまく選ぶ方法を与え,実験的にも良い結果が得られた.
最適な選択的組立法に関する統計学的研究

選択的組立法は寸法のばらつきが大きい部品から高精度な組立品を得るために用いられている.まず各部品はそれぞれその寸法に応じていくつかのクラスに分けられる.そして各部品を対応するクラス同士から取り出して組み合わせることで高品質な組立品を得ることができる.この手法はピストンとシリンダーの組立など主に自動車のエンジンの組立に用いられている.近年,エンジンの高出力化に向けて,より一層,高精度な組立が求められてきており,その状況を踏まえて,本研究は選択的組立法において生じる統計学的または数学的な品質最適化問題を解明することを目的としている.重要な課題の一つとして,組み合わせる部品の寸法が従う確率分布に応じてどのようにクラス分けの基準を決定するべきか,というものがあり,各クラスが等しい幅を持つように寸法分布を分割する等幅分割法が従来より用いられている.当年度において,組立品の品質特性の目標値からのずれの2乗が損失となる状況(2乗誤差損失関数)における平均損失を最小化する分割法を様々な場合で明らかにした.さらに,損失関数をより一般化し,凸損失関数のもとでの最適分割法を求め,従来の等幅分割法と比較して大幅に平均損失を減らすことができることを示した.また,もう一つの重要な課題として,現場においては組み合わせる部品の寸法のばらつきが異なる場合が多いことがあげられる.このとき,対応するクラスに入る部品の数が異なり,余る部品が大量に出てしまうことが問題となっている.そこで当年度において,ばらつきが小さい方の部品を異なる3種類の工程平均で製造しそれらを混合することで,あえて寸法のばらつきを大きくして,もともとばらつきの大きい部品とのマッチングを良くする,という方法に着目し,部品の余りを最小化する工程平均の求め方を明らかにした.これらの成果は全て査読付きの学術雑誌に掲載済または掲載決定済である.選択的組立法は寸法のばらつきが大きい部品から高精度な組立品を得るために用いられている.まず各部品はそれぞれその寸法に応じていくつかのクラスに分けられる.そして各部品を対応するクラス同士から取り出して組み合わせることで高品質な組立品を得ることができる.この手法はピストンとシリンダーの組立など主に自動車エンジンの構成要素の組立に用いられている.本研究は現場の意見を聞きながら,選択的組立法において生じる統計学的または数学的問題を解明することを目的としている,重要な課題の一つとして,組み合わせる部品の寸法が従う確率分布に応じてどのようにクラス分けの基準を決定するべきか,というものがある.各クラスが等しい幅を持つように寸法分布を分割する等幅分割法が従来より用いられているが,これはなんらかの規準で最適性を保証するものではない.当年度において,組立品の品質特性の分散を最小化する分割法の求め方を測定誤差が存在する場合,および許容誤差が与えられている場合のそれぞれについて明らかにした.また,もう一つの重要な問題として,現場においては組み合わせる部品の寸法のばらつきが異なる場合が少なくないことがあげられる.このとき,ばらつきが小さい方の部品を異なる2種類の工程平均で製造しそれらを混合することで,あえて寸法のばらつきを大きくして,もともとばらつきの大きい部品とのマッチングを良くする,という方法が従来より提案されている.当年度において,品質特性の分散を最小にする工程平均の求め方を明らかにした.これらの成果は全て査読付きの学術雑誌に掲載済または掲載決定済である.今後も理論的(統計学的または数学的)な裏付けを与えながら,実際の現場で役立つような手法を提案していくことを目指している.選択的組立法は寸法のばらつきが大きい部品から高精度な組立品を得るために用いられている.まず各部品はそれぞれその寸法に応じていくつかのクラスに分けられる.そして各部品を対応するクラス同士から取り出して組み合わせることで高品質な組立品を得ることができる.この手法はピストンとシリンダーの組立など主に自動車のエンジンの組立に用いられている.近年,エンジンの高出力化に向けて,より一層,高精度な組立が求められてきており,その状況を踏まえて,本研究は選択的組立法において生じる統計学的または数学的な品質最適化問題を解明することを目的としている.重要な課題の一つとして,組み合わせる部品の寸法が従う確率分布に応じてどのようにクラス分けの基準を決定するべきか,というものがあり,各クラスが等しい幅を持つように寸法分布を分割する等幅分割法が従来より用いられている.当年度において,組立品の品質特性の目標値からのずれの2乗が損失となる状況(2乗誤差損失関数)における平均損失を最小化する分割法を様々な場合で明らかにした.さらに,損失関数をより一般化し,凸損失関数のもとでの最適分割法を求め,従来の等幅分割法と比較して大幅に平均損失を減らすことができることを示した.また,もう一つの重要な課題として,現場においては組み合わせる部品の寸法のばらつきが異なる場合が多いことがあげられる.このとき,対応するクラスに入る部品の数が異なり,余る部品が大量に出てしまうことが問題となっている.そこで当年度において,ばらつきが小さい方の部品を異なる3種類の工程平均で製造しそれらを混合することで,あえて寸法のばらつきを大きくして,もともとばらつきの大きい部品とのマッチングを良くする,という方法に着目し,部品の余りを最小化する工程平均の求め方を明らかにした.これらの成果は全て査読付きの学術雑誌に掲載済または掲載決定済である.
心の健康の保持増進のための国際支援プログラム評価指標の開発

支援専門職や家族などの支援関係者からの支援は、心の支援を必要とする要支援者が疾病や障害などの困難を克服する上で重要である。しかし支援関係者らは、要支援者との関係性において、固有の重篤なストレスに直面する可能性がある。そのため支援関係者らが心理支援を円滑に行うには、支援関係者ら自身の心の健康の保持増進を図る必要がある。そこで、本研究では支援関係者の心の健康・生きがい増進モデルを構築し、国際社会で活用可能な支援関係者用支援プログラムおよび評価指標を開発し、その妥当性を検証することを目ざしている。今年度は、研究の中核拠点とするオーストリアのシュタイアーマルク州にあるグラーツ大学で、キックオフミィーティングを行い、4名の研究協力者らとともに今後の取り組みの内容を明確化した。また、グラーツの2か所の心理支援施設に赴きインタビューを行った。その結果、オーストリアの支援関係者を取り巻く社会制度、社会規範といった社会資源、心の健康やストレスマネージメントなどの心理資源に関する理解を深めることができ、次の調査を行うための基礎資料を収集することができた。また、あわせて文献調査を行っている。これまでの文献調査の成果として、心の健康を支援する心理職独自のストレッサーやストレスマネージメント関連要因について、予備的な調査を行うことができた。そしてこれらの研究の成果は、今後、海外でインタビュー調査や質問紙調査を行うための重要な基礎資料として不可欠である。またこの研究成果は、心の健康の支援に関与する他の専門職を対象とした研究に広げることができる。予定通りオーストリアでキックオフミィーティングを行うとともに、文献調査に取り組むことができた。さらに、平成31年度に行う予定であったインタビュー調査にも着手できたので。中核共同研究拠点であるオーストリアでの研究協力体制を強化し、先進的な心理支援に取り組んでいる海外の研究者との協力関係を深め国際ネットワークの構築を推進する。そのための事前準備として、文献研究による情報の収集を進めるとともに、国内において予備調査を計画実施する。これらの情報に基づき、海外の研究協力者への提案を進めていく。次年度使用額が生じた一つ目の理由は、当初、物品費として、研究代表者と研究補助員が使用するパーソナルコンピュータ2台とプリンターを購入する予定であったが、研究補助員を雇用しなかったのでパーソナルコンピュータ1台のみを購入したため。二つめの理由として、研究代表者と研究分担者で研究に着手し、研究補助員の雇用を行わなかった。計上していた人件費については、オーストリアでの会議の開催にあたって専門職からの支援を得るためにのみ使用したため。主に以上の理由から次年度使用額が生じた。次年度の使用計画として、文献検索や海外での調査の準備のために研究補助員だけではなく、専門職を雇用し、より高度な助言を得る計画である。また、研究補助員が使用するパーソナルコンピュータやプリンターを購入する予定である。
ネットワーク導入がもたらす教師意識の変化に関する研究

本研究は,ネットワーク環境が導入された学校で,教師のネットワークに対する意識がどのように変化するか,また,ネットワークを利用した教育がどのような背景を持つと推進されるか,という点に関する研究である.英国北アイルランドの教育機関と共同で,ネットワークを活用しながら学生間交流を行い,その実践をもとに分析を行った.1.電子メールやWWW等の利用に際して,教師個人での利用頻度には教師によってある程度違いがあるものの,教育への利用は積極的な教師が多いことがわかった.2.教師がネットワーク活用に対して肯定的な意識を持ち,積極的に利用するためには,教師や学生へのサポートシステムが必要であることがわかった.実践校同士が自由に読み書きできるホームページの作成や統一内容での実践など,いくつかの実践を通して教師・学生意欲の向上を試みた.さらに,テクノロジーには初心者であるが,ネットワーク環境を有効に利用することによって教育効果を上げることのできる教師が多いことに着目し,初心者のためのインターネット技術習得のための学習プログラムを開発した.3.教師が教育活動の場で,どのネットワークツールを使うのが効果的であったかについて事後評価を行うことと,教師の意識向上との相関についての知見を得た.授業をいくつかの場面に区切り,それぞれの場面で利用したツールの効用を自己評価する方法を提案した.4.テレビ会議システムなどを使って外国の教育機関と交流をすることに対する意欲は非常に高いが,通信費用が問題となっていることがわかった.そこで,複数の学校が参加してテレビ会議を行う場合に,発生する通信費用をどのように分担するのが望ましいか,という問題について提案を行った.本研究は,ネットワーク環境が導入された学校で,教師のネットワークに対する意識がどのように変化するか,また,ネットワークを利用した教育がどのような背景を持つと推進されるか,という点に関する研究である.英国北アイルランドの教育機関と共同で,ネットワークを活用しながら学生間交流を行い,その実践をもとに分析を行った.1.電子メールやWWW等の利用に際して,教師個人での利用頻度には教師によってある程度違いがあるものの,教育への利用は積極的な教師が多いことがわかった.2.教師がネットワーク活用に対して肯定的な意識を持ち,積極的に利用するためには,教師や学生へのサポートシステムが必要であることがわかった.実践校同士が自由に読み書きできるホームページの作成や統一内容での実践など,いくつかの実践を通して教師・学生意欲の向上を試みた.さらに,テクノロジーには初心者であるが,ネットワーク環境を有効に利用することによって教育効果を上げることのできる教師が多いことに着目し,初心者のためのインターネット技術習得のための学習プログラムを開発した.3.教師が教育活動の場で,どのネットワークツールを使うのが効果的であったかについて事後評価を行うことと,教師の意識向上との相関についての知見を得た.授業をいくつかの場面に区切り,それぞれの場面で利用したツールの効用を自己評価する方法を提案した.4.テレビ会議システムなどを使って外国の教育機関と交流をすることに対する意欲は非常に高いが,通信費用が問題となっていることがわかった.そこで,複数の学校が参加してテレビ会議を行う場合に,発生する通信費用をどのように分担するのが望ましいか,という問題について提案を行った.ネットワークの導入が教育現場に進む中,特に外国の教育機関との交流を進めることを考えた場合,この新しいツールをどのような場面で利用するのが望ましいのか,また,教師の意識はどのように変わるのかを研究した.まず,本校および協力校(富山県内高等学校)と,英国北アイルランドのハイスクール(Glengormley High School)との交流プログラムを策定し,学生間交流を促進させるための基礎条件について各方面と議論を行った.その結果,日本と北アイルランドの教師・学生間で,いくつかの点で意識の違いが明確になった.その中でも一番大きな違いは,自国の文化の認識度と他国の文化へ興味関心度であった.これがネットワークの教育利用に対する意識の違いにもつながることがわかった.この問題を解決するために,担当教師同士で定期的に議論を行う必要が出てきた.その結果,教師にもネットワークに対する意識の変化が見られ,指導する姿勢も変わってきた.次に,北アイルランド側の担当者と共同で,新しい交流内容を提案した.具体的には,学生の国際理解の意識を高めるために,WWW上で意見交流を行うように設定したこと,英語力の不足を補うために,翻訳のサポート体制を整えたこと,テレビ会議の実施によって学生の交流意欲を高める工夫をしたこと,等が挙げられる.今年度はそのプランを元に学生間交流を行った.また,ネットワークを積極的に活用した場合にかかる費用面での調査研究を行い,費用を協力して負担する費用分担モデルを作成した.これには協力ゲーム理論を用いた.外国の教育機関とのネットワークを活用した共同学習モデルについて,実践を通して検討した.インタラクティブ性の高いツールとして,電子メール,WWWのほかに,ビデオメール,テレビ会議システムを視野に入れて研究を進めた.1.ネットワークを利用した共同学習モデルの検討教師が教育活動の場で,どのネットワークツールを使うのが効果的であったかについて事後評価を行うことと,教師の意識向上との関連についての知見を得た.授業をいくつかの場面に区切り,それぞれの場面で利用したツールの効用を自己評価する方法を提案した.また,テクノロジーには初心者であるが,ネットワーク環境を有効に利用することによって教育効果を上げることのできる教師が多いことに着目し,初心者のためのインターネット技術習得のための学習プログラムを開発した.これによって,テクノロジーに対する不安感をとり,積極的活用を支援できるようになった.2.ネットワーク利用教育に必要な教育環境の提案ネットワークに対する教師の意識を,アンケート調査などを通して考察した結果,電子メールやWWW等の利用に際して,教師個人の利用頻度には教師によってある程度違いがあるものの,教育への利用は積極的な教師が多いことがわかった.

また,テレビ会議システムなどを使って外国の教育機関と交流をすることに対する意欲は非常に高いが,通信費用が問題となっていることがわかった.そこで,複数の学校が参加してテレビ会議を行う場合に,発生する通信費用をどのように分担するのが望ましいか,について前年度に作成したモデルを改良した.
アジア地域における布工芸品の生産・流通・消費をめぐる文化人類学的研究

日本を含むアジア各地で、伝統的な手法を用い、主として手作業で製作される布工芸品(染め・織り・編みなどの技法による工芸品)を対象に、メンバー各自による個別フィールド調査のほか、グループ調査を日本国内外で実施した。各地域の生活世界の文脈に根ざした多様な素材、製作技法、製品の用途には、文化遺産をめぐる国際機関のイニシアチブや国家政策、グローバルな市場形成の下で、顕著な変化が生じつつあるが、そこには日本人仲介者及び消費者の動向も密接なつながりを持つことが明らかになった。本研究は、日本を含むアジア地域を主たる研究対象とし、各地域・民族の生活文化や慣習に根ざした広義の布工芸品の生産・流通・消費が、グローバル・ネットワークの進展に伴ってどのような変化を遂げてきたかを明らかにするものである。初年度となる平成26年度は、研究代表者、研究分担者5名、連携研究者4名、および海外研究協力者1名が、インド、インドネシア、中国、オーストラリア、パプアニューギニア、日本においてフィールド調査を実施し、各地での布工芸品生産の現状と変化、マーケティングのあり方などに関する詳細な情報を収集した。このうち、インド・アッサム州およびブータンにおける調査(2014年8月)は、インドネシア、インド、中国での調査経験を持つ研究メンバー4名による共同調査である。布が自家生産・自家消費の文脈を離れる中で、威信財としての価値が多少残りつつも、素材の生産と流通に変化が生じ、また商品化が急速に進んでいるブータンの現状から多くの示唆を受けた。また、2015年1月に行った沖縄本島での共同調査には、10名が参加し、産地ごとの生産体制や組合組織のバリエーションを確認すると同時に、縮小しつつある着物産業を主たるターゲットとした沖縄地域の布生産が直面する課題が明らかになった。3回にわたって実施した研究打ち合わせでは、各メンバーによる個別のフィールド調査の成果の概要を共有すると同時に、個別のテーマに関する研究発表も行い、議論を深めることができた。このように共同調査を挟みつつ、共通の参照枠組みと各自の調査による個別事例を重ね合わせることにより、全体での問題意識の深化を達成することができた。平成27年度には、各メンバーがインド、インドネシア、中国、オーストラリア、日本においてフィールド調査を実施し、各地での布工芸品生産の現状、販売方法や市場の変化などに関する詳細な情報を収集した。2015年4月の研究打ち合わせでは、昨年1月に実施した沖縄での共同調査との連続性を念頭に置き、雑誌メディアにおける着物や民藝、布を含むアジアン雑貨の表象や、国境を超えた工芸品の流通と意匠の伝播状況から浮かび上がる布製品の特質といったテーマを取り上げた。2015年11月には、「布とその作り手を買い手・使い手につなぐということ」というテーマのもとに、外部から活字及び映像メディア、布の制作者と消費者をつなぐ活動などに従事する専門家5名を招き、3日間にわたってワークショップを開催した。当初の予定通り、オーストラリアでの国際学会において分科会を組織し、研究成果の一部を報告した。国際共同調査については、先方の受け入れスケジュールおよび経費の関係上、申請当初今年度に予定していたインドネシア調査を来年度に繰り延べることにしたが、ゲストスピーカーを予定より大幅に増やしたワークショップを開催し、論点別の集中討議を行うことができた。これによって、昨年度の沖縄共同調査に続き、日本国内の布工芸品産地を取り巻く状況や流通・消費をめぐる問題点に関して、研究メンバー全員の認識が深まったため、来年度以降の海外での共同調査をより効率的に進める素地が出来上がったといえる。本年度は、3回にわたって研究会を開催したほか、国際学会での分科会主催・報告、メンバー全員での海外共同調査に加え、3名の研究分担者・連携研究者による個別調査をアゼルバイジャン、パプアニューギニア、マダガスカルにおいて実施した。4月の第1回研究会では、2015年度の個別調査と共同調査、ワークショップの成果を共有し、とくに沖縄での共同調査によって明らかになった事項を踏まえて全体としての研究課題に含まれるテーマ群を洗い出すとともに、個別の分担課題の今後の進め方について確認を行った。8月に国外研究協力者のWilliam Ingram, Jean Howe(Threads of Life共同主宰者)の協力の下にインドネシア、西チモールで実施した共同調査では、国の文化政策、開発実践、女性の就業支援といったさまざまな要因を背景としつつ、布工芸品の製作現場が地域ごとに異なる状況にあることが具体的に明らかになった。この共同調査を通じてメンバー各自が設定した課題の暫定的分析結果を12月開催の第3回研究会において共有し、最終年度である2017年度の成果とりまとめに向けての議論を行った。当初計画に盛り込んでいたインドネシアでの共同調査を実施し、対象地域・テーマの異なるメンバーがそれぞれの観点と経験を生かした貢献をすることができたほか、共同調査ならではの充実した議論が可能となった。2015年度の沖縄共同調査に協力した国内連携研究者(平良次子南風原町文化センター学芸員)が第1回研究会に参加したほか、インドネシア調査ではフェアトレード団体Threads of Lifeの共同主宰者とスタッフと充実した意見交換が実施でき、研究者側の視点のみでなく、布工芸品の生産現場で様々な活動を展開している当事者の視点を組み込んだ形で、調査の実施・分析が進んでいる。また、2015年度のICAS(オーストラリア・アデレード)に続き、今年度も国際会議において研究課題に関する分科会を組織し、国外研究者とのネットワーク形成も進展した。

研究成果のとりまとめ方法に関する議論も予定通り進行している。本研究の最終年度である今年度は、研究成果の取りまとめに向けた活動を中心とした。2017年12月には京都において国際シンポジウムを開催し、「Textiles and Fashion in Asian Context」というテーマのもとに、インド(所属はオランダ)、スイス及び韓国よりスピーカー及びディスカッサントとして海外研究協力者を招聘し、研究報告及び研究分担者・連携研究者全員参加による討論を実施した。2018年1月には最終研究会を開催し、これまでの調査成果を全員が発表するとともに、成果とりまとめに向けて、和文・英文論文集の構想案が各自から出され、主要な論点を確認した。ここでの議論を基礎として、まずは英文による論文集「Fashionable Traditions」(仮題)の構想を練り、海外の出版社に提出したところ、すでに採用との通知を受けとっている。この成果論文集には、本研究の分担者・連携研究者のほか、IUAES中間会議、京都での国際シンポジウム及び代表者が出席したアメリカでのシンポジウム参加者も含まれており、これまでの国際連携の成果が反映されることとなった。日本を含むアジア各地で、伝統的な手法を用い、主として手作業で製作される布工芸品(染め・織り・編みなどの技法による工芸品)を対象に、メンバー各自による個別フィールド調査のほか、グループ調査を日本国内外で実施した。各地域の生活世界の文脈に根ざした多様な素材、製作技法、製品の用途には、文化遺産をめぐる国際機関のイニシアチブや国家政策、グローバルな市場形成の下で、顕著な変化が生じつつあるが、そこには日本人仲介者及び消費者の動向も密接なつながりを持つことが明らかになった。当初の計画通り、国内で4回の研究打ち合わせを実施したばかりでなく、うち1回の沖縄での打ち合わせは実質的に共同調査に発展させることができた。また、初年度には海外での共同調査は予定していなかったが、従来の調査地域での知見を活かし、インド・ブータンでの共同調査を実施することができた。今年度変更した計画通り、インドネシアでの共同調査については、先方の受け入れスケジュールおよび経費の観点から来年度に繰り延べすることとなった。この調査に向けて、さらに研究メンバー間で問題意識と論点の共有をはかるため、来年度前半には、平成26年度、27年度に行った各メンバーの個別調査の成果を報告する打ち合わせを実施する。また、全体としての成果発表の方法に関する議論を開始する予定である。2017年度は最終年度となるため、研究成果公開への取り組みが中心となる。複数のメンバーによる国際学会での分科会報告を予定するほか、研究成果とりまとめに向けて、英語による論文集の構成など、具体的な議論を行う。また、当初計画にある通り、国際シンポジウムを開催予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。
人工代用骨としてのアパタイト-コラ-ゲン複合化

コラ-ゲンにフォスビチンを架橋したものをβグリセロリン酸カルシウム溶液に浸漬することにより、コラ-ゲン繊維上に優先的に骨様アパタイトを析出させることが可能となり、無機物としてのアパタイトと有機物としてのコラ-ゲンを複合化できることが明らかとなった。再繊維化コラ-ゲンゲルを用いると、アパタイトはゲル表面及び内部でのみ析出し、このように得られた複合体は弾力性を有し、約65wt%のアパタイトを含有することが明らかとなった。この複合体を骨置換材として動物実験で評価すると、血液及び組織液とのなじみに優れ、生体親和性、形態付与性および維持安定性に優れていることが示された。また、アパタイトセメントとの併用を試み、アパタイト部の相対密度を高めたアパタイトーコラ-ゲン複合体も試作した。コラ-ゲンとしてシ-トコラ-ゲンを用い、上述の方法でアパタイトを析出させ、アパタイトセメント粉中に積層し、油圧下(600MPa)で圧粉体を作製し、その後この圧粉体を水中浸漬し、セメント部をアパタイトに転換し、最終的なアパタイトーコラ-ゲン複合体を得た。この複合体の相対密度は2.48g/cm^3と、上述のコラ-ゲンゲルを用いた複合体のも(0.5g/cm^3)に比べ約5倍と高くなった。シ-トコラ-ゲンを含まないアパタイト単味の硬化体との4点曲げ強度の比較より、シ-トコラ-ゲンは靭性を約10倍向上させることが明らかとなった。シ-トコラ-ゲンの弾性率を無視し、試料の大きさより算出した強度は3.3±0.7MPaで、ヒト新鮮湿潤緻密骨の173.6MPa並びにウシ新鮮大腿骨の352.3MPaに比べ著しく小さかった。近い将来、シ-トコラ-ゲンの積層方向、積層枚数、厚さ並びに密度を種々検討することにより、より強度、及び靭性に優れた人工代用骨が製作できるものと期待できる。再線維化したコラ-ゲンにリン蛋白を架橋し、アルカリフォスファタ-ゼ処理したものをβ-グリセロリン酸カルシウム溶液に浸すと、コラ-ゲン線維近傍の無機リン酸濃度を他の部位に比べ相対的に高めることができ、コラ-ゲン線維上にアパタイトを優先的に析出させ得ることが明らかとなった。β-グリセロリン酸カルシュ-ム溶液とアルカリフォスファタ-ゼ溶液にコラ-ゲン架橋体を日々、二週間交互に浸漬して得た試作品としてのアパタイト-コラ-ゲン複合体の諸性質を調べると、析出したアパタイトの性状は種々の点(結晶子の大きさ、形状、炭酸イオン含有量等)で骨アパタイトに酷似しており、重量比で約60%のアパタイトを含むことが示された。しかしながら。この重量比は平均的な値を示したもので、走査型電顕等で複合体を観察すると微視的視野においてはアパタイトが大部分の部位もあり必ずしも均一に分布していないことが示された。現在この点を克服するために、浸漬時間を短くし、一度できた複合体に再びコラ-ゲンを含浸させ、上述の操作を繰り返し、コラ-ゲンとアパタイトの分布が均一になるように努力している。

さらに、従来まで研究を続けてきた自己硬化型アパタイトセメントより多孔体アパタイト硬化体を成形し、これにコラ-ゲン線維を含浸させ、上述と同様の実験を試み複合化を進めている。多孔体アパタイトに含浸されたコラ-ゲンにリン蛋白を架橋し、このコラ-ゲン線維上に析出したアパタイトと既存のアパタイトの結晶融合を図り得れば、機械的強度に優れた、しかも生体親和性に優れたアパタイト-コラ-ゲン複合体を試作し得るものと思われる。前年度までの研究により,コラ-ゲンにリン蛋白を架橋し,アルカリフォスファタ-ゼ処理したものをβーグリセロリン酸カルシウム溶液に浸すと,コラ-ゲン近傍の無機リン酸濃度を他の部位に比べ相対的に高めることができ,コラ-ゲン線維上にアパタイトを優先的に折出し得ることが明らかとなった。本年度では、シ-ト状コラ-ゲンに同様の方法を試み,先ずアパタイトをコラ-ゲンシ-トに析出させ,自己硬化型アパタイトセメントの硬化促進材として,このコラ-ゲンシ-トを利用し,アパタイトセメントを人工組織液中でアパタイトに変換し,最終的にはアパタイト含有量を増大した。アパタイトーコラ-ゲン複合体を試作し種々の機械的諸性質を検討した。アパタイト析出処理をしたシ-トコラ-ゲンを2枚積層した試料を4点曲げ試験に供すると,曲げ強度それ自身は大きく変わらないもの,破壊に用するエネルギ-は510倍以上高くなることが明らかとなり,かなり靭性に當んだ複合体を試作することができた。さらに,複合体としてのアパタイトは,種々の点(結晶子の大きさ,形状,炭酸イオン含有など)で骨アパタイトに極めて類似していることも示された。アパタイトを析出させたコラ-ゲンシ-トを積層させる方法に改良の余地(例えば,積層枚数,積層方向ー水平,垂直)があり,現在検討中である。また,通常の再線維化コラ-ゲンより作制したアパタイトーコラ-ゲン複合体も動物実験に供し,生体親和性などについて調べている。この複合体は,アパタイト含有量がそれ程多くないため,複合体全体が弾力性を有し,填入時の操作性が優れているとの見解もあるが,詳細については,現在検討中である。コラ-ゲンとしてシ-ト状アテロコラ-ゲンを用い、前年度と同じ手法でフォスビチンを架橋し、βグリセロリン酸カルシウム溶液に浸漬し、アパタイトを析出したものを、自己硬化型アパタイトセメントの硬化促進材として利用し、アパタイト部の相対密度を高めたアパタイト-コラ-ゲン複合体を開発した。アパタイトを析出させたシ-トコラ-ゲン3枚を金型中で自己硬化型アパタイトセメント粉中に、50MPaの予備成型圧で積層したものを、ささに油圧下にて600MPaで加圧成型して圧粉体を得た。この圧粉体を2週間水中浸漬してセメント部をアパタイトに転換することにより最終目的物としてのアパタイト-コラ-ゲン複合体を試作した。この複合体の相対密度は2.48g/cm^3と、再繊維化コラ-ゲンを用いて作製した複合体のもの(0.5g/cm^3)に比べると約5倍高くなっている。4点曲げ強度は、最大荷重表示で2.3±0.4MPaで、シ-トコラ-ゲンの弾性率を無視し、試料の大きさから強度を概算すると3.3±0.7MPaとなった。試料片が同じ大きさのアパタイト-単味の強度は11.1±2.1MPaで、複合体のもに比べ約3倍となり、強度に関しては積層したコラ-ゲンシ-トが何らの役目も果たしていないことが示唆された。
担子菌由来の糖質分解酵素を用いた機能性オリゴ糖の開発

担子菌類により形成される子実体(キノコ)中には、強力な糖質分解酵素が含まれている。本研究では、シイタケ中の新規β-グルカナーゼを用いて、食品・医薬品等へ応用できる機能性グルカンオリゴ糖を開発することを目的とした。シイタケからβ-1,3グルカナーゼ(GLU1)およびβ-1,6グルカナーゼ(LePUS30A)を精製することに成功した。両酵素ともエンド型の分解様式を有し、様々な長さのβ-グルカンオリゴ糖を生産できた。β-1,6グルカンオリゴ糖によるマクロファージ活性化作用を確認した。バイオマスからの機能性材料開発が活発化する中で、多糖の低分子化物であるオリゴ糖の機能が注目されている。本研究では、食用キノコであるシイタケの抽出液中に含まれる糖質加水分解酵素(グルカナーゼ)群を用いて各種バイオマス多糖を低分子化し、食品・医薬品等へ応用可能な機能性グルカンオリゴ糖を開発することを目的とした。まずはシイタケ子実体中に含まれるグルカナーゼ群の同定、および特性解析を行った。シイタケ子実体を採取後、25°C、湿度80%にて保存した。4日目に回収しグルカナーゼ活性について検討したところ、シイタケ菌は多種類のグルカナーゼ群を子実体中に分泌し、これらはシイタケ細胞壁成分の自己分解に関与することが明らかとなった。その中の1つGLU1(26kDa)は他の糖質関連酵素とアミノ酸配列において相同性を持たないことから新規糖質加水分解酵素ファミリーに属することが示唆された。また、GLU1遺伝子をメタノール資化酵母Pichia pastorisに導入し組み換え酵素を得ることに成功した。詳細な機能解析を進めたところ、本酵素はマコンブ由来のβ-1,3/1,6グルカンであるラミナリン(β-1,3:1,6=7:1)に対して最も高い分解活性を示すβ-1,3グルカナーゼであり、その分解様式はエンド型であることが判明した。ラミナリン分解反応より得られる生成物として、重合度2-4のβ-1,3グルカンオリゴ糖を確認した。本酵素は側鎖を高頻度に有するレンチナン(β-1,3:1,6=3:2)や、カルボキシル化したβ-1,3グルカン(CM-パキマン、CM-カードラン)に対する活性が低いことから、β-1,3鎖のみからなる部分を特異的に分解し、β-1,6グルカン側鎖や官能基によってその反応が阻害されることが予想された。このGLU1の厳密かつ狭い基質特異性は新規のオリゴ糖を合成する上でも有効であると考えられる。本年度は、食用キノコ由来酵素を利用した安心かつ安全なオリゴ糖開発を目指し、シイタケの抽出液中に含まれるβ-1,6グルカナーゼを新たに単離し、食用地衣類イワタケが構造組織として有するβ-1,6グルカンを低分子化することで新規オリゴ糖を開発した。収穫後4日目のシイタケ子実体抽出液からβ-1,6グルカナーゼを精製した。本酵素はキノコ類から初めて単離されたβ-1,6グルカナーゼである。精製酵素のcDNAをクローニングしたところ、本酵素は糖質加水分解酵素ファミリー30に属することが判明した。数種類のグルカンを用いて、本酵素の基質特異性について検討した結果、β-1,6グルカン多糖に対する高い基質特異性が明らかになった。また、海藻類由来のβ-1,3/1,6グルカン分子中のβ-1,6結合(側鎖)も部分的に解離できることが示唆された。本酵素によるβ-1,6グルカン(市販プスツランおよびイワタケ熱水抽出物)分解生成物をTLCおよびLC/MS分析したところ、反応様式はエンド型であると考えられ(EC:3.2.1.75)、分解反応の過程で1-6糖の生成が確認された。β-1,6グルカンおよびその酵素分解物の免疫賦活性を評価するため、RAW246.3細胞におけるTNFα発現を分析した。その結果、β-1,6グルカンはマクロファージを活性化し、本酵素で低分子化処理しても活性が維持されることが判明した。一般的にグルカンの免疫賦活性は低分子化により消失する。一方で、腸管粘膜を通過させるためには低分子である方が有利であることから、本検討課題で開発した低分子化β-1,6グルカンは新規機能性材料としての応用が期待できる。
水痘・帯状疱疹ウイルス糖蛋白質gHの新規レセプターの同定

抗gH抗体カラムにVZV感染細胞抽出液をアプライ後溶出し、抗gH抗体と反応性のある蛋白質を精製した。この精製画分からgHアフィニティカラムを作成した。VZV感染HEL細胞の抽出液をアプライし溶出を精製を試みた。9種類の抗体の内、3種類は相互にavi-tag抗体の結合がブロックされた。他のクローンはホモでのみブロックがかかり、ヘテロではブロックされなかった。また、いずれの抗体の組み合わせも中和活性に関して相乗的に作用するものは認めず、相加的または阻害的に作用した。上記の結果より、4つのクローンのエピトープは極めて接近していると考えられる。他の5つのクローンはホモでのみにブロックがかかり、ヘテロではブロックされなかったことから、これらの抗体の認識エピトープは異なる事が示された。水痘帯状ウイルスのgHの中和の標的domainは1カ所で、少なくとも5カ所のエピトープより構成されていることが予想された。VZV感染後に抗gHヒト型モノクローナル抗体を培地中に添加することにより、約1週間で感染性が消失することが明らかとなった。抗体存在下ではVZV特有の細胞変性も、感染細胞数の増加も認めなかった。VZV-HBs感染28日後にVZV野生株を感染させ、一旦ウイルスを増殖させた後、cell-freevirusをHEL上に重層したところ、アシクロビル存在下でVZV-HBsによるプラーク形成が認められた。このことはVZV-HBsが潜伏感染していたことを示唆する。感染細胞を抗gH中和抗体で処理することにより、やがて感染性は完全に消失し、種々の刺激でも容易に復帰しない状態へと移行した。これは潜伏感染に類似した状態であることが示唆された。それゆえ、抗gH抗体は水痘および帯状疱疹の予防・治療に極めて有用であるといえる。水痘・帯状疱疹ウイルス(VZV)ま単純ヘルペスウイルス(HSV)と遺伝子産物の類似性は高いが、HSVの侵入に必須なglycoprotein D(gD)をVZVはコードしていない。HSV gDはglycoprotein H(gH)と複合体を形成し、宿主細胞膜上に存在するHVEMと結合することで侵入するが、VZVのgHの役割はまだ不明な点が多い。またVZV gBはHSV gB同様ヘパラン硫酸に結合するが、Fcレセプター活性を有するgEと複合体を形成して初めてその機能を持つ点が異なる。さらにgB,gE,gllは抗体による中和活性という点から臨床医学的にも重要視さており、糖蛋白質ワクチンは動物実験で試行され有効性が報告されている。gHはgLと複合体を形成し、gLはgHの分子シャペロンとして機能している。VZV gEと結合しウイルスの中和や細胞間の感染の広がりを抑制する分子としてinsulin degrading enzymeについて報告がなされた。本研究はHSVとVZVの違いに着目しながら、HSVで近年非常に注目されているエンベロープ糖蛋白質と細胞側レセプターの研究で、VZVの独自の役割を解明することを目的とした。VZV gHの精製に先立ち、抗gHモノクローナル抗体を結合させたカラムを作成し、これにVZV感染細胞抽出液をアプライ後溶出し、抗gH抗体と反応性のある蛋白質を精製した。

精製画分の電気泳動パターンから分子量約100kDa付近のgHと思われるメジャーバンドと、15kDa付近にも蛋白質が検出され、こちらはgHと複合体を形成するgLと考えられた。この精製画分をEAHセファロースに結合させgHアフィニティーカラムを作成した。VZV感染HEL細胞の抽出液をgHアフィニティーカラムにアプライし、1M NaCl,1.5M NaCl,グリシンHCl(pH2.8),50%エチレングリコールを含む緩衝液で溶出を試みた。SDS-PAGEの解析により、50kDa80kDaにかけて複数の蛋白質のバンドが検出された。またウエスダンプロッティンクから60k,65k,80kの各バンドが反応性を示し、これらがウイルス由来蛋白質(gB,gE)である可能性が示唆された。さらにこれらの蛋白質はS-S結合で複合体を形成し、非還元状態では200kDaといった大きな複合体を形成していることがわかった。現在これらのウイルス由来蛋白質の発現系を作成し、相互作用ならび共局在性について解析している。宿主由来の蛋白質でgHと相互作用を持つものを分離精製し同定を行うため、非感染HEL細胞の抽出液をgHカラムにアプライし水痘・帯状庖疹ウイルス(VZV)は単純ヘルペスウイルス(HSV)と遺伝子産物の類似性は高いが、HSVの侵入に必須なgDをVZVはコードしていない。HSV gDはgHと複合体を形成し、宿主細胞膜上に存在するHVEMと結合することで侵入する。一方、VZV gHは抗体によりウイルス感染を中和できることから、医学的にも重要視さている。VZV gHの精製に際し、抗gHモノクローナル抗体を結合させたカラムを作成し、これにVZV感染細胞抽出液をアプライ後溶出し、抗gH抗体と反応性のある蛋白質を精製した。精製画分の電気泳動パターンから分子量約100kDa付近のgHと思われるメジャーバンドと、15kDa付近にも蛋白質が検出され、後者はgHと複合体を形成するgLと考えられた。VZV感染HEL細胞の抽出液をこのカラムにアプライし、1M NaCl, 1.5M NaCl,グリシンHCl (pH2,8), 50%エチレングリコールを含む緩衝液で溶出を試みた。SDS-PAGEの解析により、50kDa-80kDaにかけて複数の蛋白質のバンドが検出された。また、ウエスタンブロッティングから60k, 65k, 80kの各バンドが反応性を示し、これらがウイルス由来蛋白質(gB,gE)である可能性が示唆された。宿主由来の蛋白質でgHと相互作用を持つものを分離精製し同定を行うため、非感染HEL細胞の抽出液をgHカラムにアプライしVZV gHと反応性のある蛋白質を分離精製した。このカラムから溶出されてきた100kDaと45kDaの蛋白質についてペプチドシークエンサーに供し同定を試みたが解析できなかった。この原因はN末端のブロッキングによるものと考えられため、0.6N HCl処理にてN末端Formyl基のデブロッキング後、解読を試みたが解析不能であった。そこでDIGEのシステムで2次元電気泳動を行い解析した。
磁性空間制御された新規二次元四角格子錯体系の構築

多様な配位構造とスピン状態をとる金属錯体よりなる集合体、配位高分子は、固体物性発現の鍵となる電子相関、電子-格子相互作用が次元性制御により自在に変え得るため、単純な系では実現しない物性が発現すると考えられる。しかし、どの様な分子間相互作用が格子設計、物性発現に有用であるか明らかではない。本研究では、この様な系における格子設計、物性設計法の確立を目的とし、錯体分子ユニットを、配位結合あるいは水素結合等の分子間力を用いて多次元化した系の構築を目指した。特に、クロラニル酸(H_2CA)が遷移金属と一次元状配位高分子を形成することに注目して、これらをビルディングブロックとした種々の多次元格子:{[M(CA)(H_2O)_2](Guest)}_n(M=Cu^<2+>,Fe^<2+>;Mn^<2+>;Guest=H_2O,phenazine,2,5-dimethylpyrazinc)の合成を行った。これらの化合物は金属にCA2分子がキレート配位し、さらに水分子が配位した八面体構造をとり、それぞれが連結した一次元鎖となっている。配位水は近傍の一次元鎖内のCAの酸素と水素結合することにより2次元シートを作っている。その層間には、ゲスト分子が挿入され水素結合ネットワークを形成している。これら配位高分子のシート構造は、ゲスト分子の水素結合様式の違いにより大きく変化している。すなわち、フェナジンおよびジメチルピラジンはプロトンアクセプターとして働き、シート間と一つの水素結合のみを形成することでそのシートはフラットな構造を示すが、水系では、ドナーおよびアクセプター両方として働くことで数種の水素結合を形成し、シート構造を複雑化している。以上のように、[M(CA)(H_2O)_2]_nをユニットとした配位高分子は、二次元シートの層間に種々のゲスト分子の挿入が可能である。また、フェナジン系では、最近接のフェナジン-フェナジン間距離は3.2Åと非常に近いことから、電荷移動型分子等を挿入することにより、伝導性と磁性が絡んだ系の構築をも期待できる系である。
プロテインメモリー現象によるタンパク質の構造変化と保持機構の解明

本課題では、金属エキソペプチダーゼであるアエロモナスアミノペプチダーゼにおいてプロテインメモリー現象を引き起こす分子内シャペロンの特性を解析するとともに、分子内シャペロンの変異によって生じる成熟体部分の立体構造の変化を原子レベルで解明することが目的である。本年度は下記1、2の研究結果が得られた。1、アエロモナスアミノペプチダーゼと同じファミリーに属し、約60%のアミノ酸配列の相同性を持つビブリオアミノペプチダーゼを用いて分子内シャペロン部位を交換したキメラ酵素を対象に、X線結晶構造解析および立体構造モデルの構築、精密化を行った。その結果、キメラアミノペプチダーゼプロ体について、R=20.1%の構造モデルを得た。金属エキソペプチダーゼにおいて、分子内シャペロン部位の立体構造を明らかにしたのは、これが初めてである。さらに、構造モデルの解析の結果、分子内シャペロン部位はCys77を介して金属原子と相互作用していること、分子内シャペロンのプロセシング部位が分子表面に存在していること、分子内シャペロン部位の疎水性アミノ酸が疎水コアを形成していることが推定できた。2、分子内シャペロン部位の各種アミノ酸変異体を取得した結果、Trp24、Ile25、His71、Glu72、Cys77の各アミノ酸残基が酵素全体のフォールディングに重要な役割を担っていることが明らかになった。本年度は下記13の研究結果が得られ、当初の研究実施計画を達成した。1、アエロモナスアミノペプチダーゼと同じファミリーに属し、約60%のアミノ酸配列の相同性を持つビブリオアミノペプチダーゼを用いて分子内シャペロン部位を交換したキメラ酵素を作成し、大腸菌においてこれらを発現させた。その結果、活性酵素を得ることに成功した。2、アエロモナスおよびビブリオアミノペプチダーゼのN末端プロペプチドにおいて保存されているアミノ酸残基のうち、Trp24、Ile25、His71、Glu72、Arg76、Cys77を、それぞれAlaに変異させた6種類のアエロモナスアミノペプチダーゼ変異体を作製し、その性質を調べた。Arg76、Cys77変異体は野生型と同様にプロセシングプロテアーゼにより成熟化したが、Trp24、Ile25、His71、Glu72変異体はプロセシングプロテアーゼにより成熟領域も加水分解された。以上の結果から、Trp24、Ile25、His71、Glu72変異体の立体構造の折り畳みは野生型のそれと異なることが推測された。3、キラメ酵素について結晶化条件を検討し、結晶を得ることに成功した。1、アエロモナスアミノペプチダーゼと同じファミリーに属し、約60%のアミノ酸配列の相同性を持つビブリオアミノペプチダーゼを用いて分子内シャペロン部位を交換したキメラ酵素を対象に、酵素の結晶化およびそれらのX線結晶構造解析を行った。まず、キメラアミノペプチダーゼプロ体結晶について、SPring-8にてX線回折データの測定を行った。分解能2.3Åまでの回折強度データより、本結晶の空間群はC222_1、格子定数はa=81.9、b=193.9、c=134.4Åであることが明らかになった。つづいて、分子置換法により初期位相を求め、立体構造モデルの構築および精密化を行い、R=20.1%の構造モデルを得た。2、1で得られた立体構造の結果から、分子内シャペロン部位と金属原子の相互作用に関与していると推測されるCys77をAla、Asp、Glu、Ser、Hisに変異させた5種類のキメラアミノペプチダーゼ変異体遺伝子を構築し、大腸菌において発現させた。その結果、いずれの変異体もアミノペプチダーゼ活性を示したが、分子内シャペロン部位は大腸菌体内のプロテアーゼによって分解を受けていた。また、Cys77Asp変異体について、in vitroリフォールディング実験を行った結果、活性型変異酵素プロ体を得ることに成功した。

金属エキソペプチダーゼにおいて、分子内シャペロン部位の立体構造を明らかにしたのは、これが初めてである。さらに、構造モデルの解析の結果、分子内シャペロン部位はCys77を介して金属原子と相互作用していること、分子内シャペロンのプロセシング部位が分子表面に存在していること、分子内シャペロン部位の疎水性アミノ酸が疎水コアを形成していることが推定できた。2、分子内シャペロン部位の各種アミノ酸変異体を取得した結果、Trp24、Ile25、His71、Glu72、Cys77の各アミノ酸残基が酵素全体のフォールディングに重要な役割を担っていることが明らかになった。
生体内カフェイン様物質サイクリックADPリボースの副腎髄質細胞における合成経路の存在とCa2^+動員作用

1.副腎髄質におけるcADPR合成経路の存在.ウニ卵ホモジネートからのCa^<2+>放出を指標としてcADPR活性を測定した(後述)。ウシ副腎髄質ホモジネートとbeta-NADのインキュベート上清は、ラットの各臓器とともにcADPR活性を示した。alpha-NADでは活性は見られなかった。2.カテコールアミン分泌刺激によるcADPRの産生アセチールコリン(100muM)はカテコールアミン分泌およびCa^<2+>放出の最大反応を起こしたが、ウニ卵ホモジネートからのCa^<2+>放出を指標とした時のcADPR活性は認められなかった。3.cADPRのCa^<2+>放出作用とその性質.副腎髄質ホモジネートは時間および温度依存性に^<45>Caを取り込んだ。^<45>Ca取込みはATP濃度依存性(0-1mM,ED50 0.5mM)であったが、ATP非存在下でも有意な取込みがあった。50muMまでのIP3およびcADPRは^<45>Ca取込みに顕著な影響を与えなかった。IP3やcADPRにより放出されるCa^<2+>量が取り込まれたもののごく一部であれば^<45>Caトレーサー法では検出されない可能性があるので、Fura2を用いて、ホモジネートから放出されるCa^<2+>放出を測定した。IP3は濃度依存性(10-20000nM,ED50 500nM)にCa^<2+>放出を起こし、その程度は負荷したCa^<2+>量に依存していた。IP3の効果はthapsigarginの前投与により消失し、ヘパリンにより濃度依存性(0-200mug/ml,IC50 10mug/ml)に抑制された。しかし、cADPRは1muMの高濃度でも全く影響を与えなかった。同様に、ラット大脳ホモジネートにおいても、IP3はCa^<2+>を放出させたが、cADPRは効果が見られなかった。一方、cADPRの作用が最初に報告されたウニ卵のホモジネートでは、同濃度のcADPRはCa^<2+>を放出させた。以上の成績より、ウシ副腎髄質にはbeta-NADをcADPRに変換する酵素は存在するが、アセチールコリンによりcADPRは産生されず、またcADPRにより作動するCa^<2+>放出系も存在しないことが示唆された。また、ラットの各臓器における成績を考慮すれば、cADPRが細胞内セカンドメッセンジャーとして哺乳類細胞内のCa^<2+>放出を制御している可能性は低いものと想像される。

また、ラットの各臓器における成績を考慮すれば、cADPRが細胞内セカンドメッセンジャーとして哺乳類細胞内のCa^<2+>放出を制御している可能性は低いものと想像される。