hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト型マウスを用いた実験的劇症型Ｇ群レンサ球菌感染モデルの構築

G群レンサ球菌による劇症型感染症のマウス感染モデル構築のため、劇症型感染症患者から分離されたRE378株を、ヒトCD46トランスジェニックマウス足蹠に皮下注射した。その結果、感染マウスは28日後も生存していたが、顕著な化膿性関節炎を発症していた。関節では骨、軟骨組織に異常が見られ、破骨細胞による骨破壊が活発に起きていることが明らかになった。RE378と強毒型A群レンサ球菌MTB313の比較ゲノム解析を行った結果、宿主への付着および免疫系からの回避に関わる遺伝子が、G群レンサ球菌感染に特有の病態を生み出している可能性が示唆された。【研究の目的】1,ヒトCD46Tgマウスを用いたG群レンサ球菌感染モデルを確立する2,患者由来の強毒株を用いて感染実験を行い、病態の観察及びそのメカニズムを解明する。【研究成果】hCD46TgマウスのfootpadへG群レンサ球菌を2x10^7CFU皮下注射により感染させた。致死性において有意な差はなかったものの、TgCD46マウスはWTに比べ明らかに重篤な感染症状が見られた。よって感染モデルの構築に成功したと考えられる。SDSE感染による多臓器不全で死亡した患者より分離された強毒株RE378を用いて、前述のように感染実験を行ったところ、hCD46Tgマウスの足において25日後に関節炎が認められた。対してWTマウスでは25日後の足部の病変は認めらなかった。また、感染組織の病理学的解析を行ったところ、hCD46Tgマウスの関節部で破骨細胞の活性が顕著に増加していることが示された。対して、同条件下でのWTマウス組織では破骨細胞の活性化は認められなかった。同時に感染部位の骨、及び膝下リンパ節より抽出したtotalRNAをReal-Time PCR法により定量したところ、hCD46Tgマウスでは、破骨細胞活性化に関わるRANKLの発現が非感染時に比べて増加しており、破骨細胞が活性化されていた病理学的解析の結果と一致した。またIL-6,TNFα等の炎症性サイトカインの発現も見られた。以上の結果から、hCD46を介したRE378感染によって宿主の免疫系に異常が生じ、関節炎を発症したのではないかと考えられる。(投稿準備中)【研究の目的】1,ヒトCD46Tgマウスを用いたG群レンサ球菌感染モデルを確立。患者由来の強毒株を用いて感染実験を行い、病態の観察及びそのメカニズムを解明する。2,A群レンサ球菌(GAS)感染モデルの病態と比較検討する。3,SDSEとGASの感染モデルの病態の違いを菌のゲノム構造の違いから類推する。【研究結果】侵襲性SDSEのRE378株をTgマウスのfootpadに1x10^7CFU投与したところ、致死率は低いものの、脚の関節炎が4週間後に観察された。これに対してWTのC57BL/6Jマウスでは、関節炎は起こらなかった。感染3日後以降で投与菌はTgおよびWTマウスとも、膝下リンパ節・脾臓・肝臓・腎臓から検出されなかった。感染4週間後のTgマウスの足の骨の組織化学から、pannus(破骨細胞の活性化による滑膜の炎症と、肉芽組織の形成)が認められた。また、足骨からRNAを調製し、定量リアルタイムRT-PCRを行ったところ、破骨細胞の活性化に係わるRANKLや、炎症性サイトカイン(IL-1β,TNFα)の発現が感染2週以降で認められた。以上の結果よりTgマウスへのSDSE感染では、菌が検出されなくなっても感染局所に慢性炎症を引き起こし、病態を惹起すると考えられる。hCD46トランスジェニックマウスを用いた感染実験の結果、G群レンサ球菌(SDSE)とA群レンサ球菌(GAS)ではその感染後の病態に大きな違いが認められた。そこで本年度はSDSEとGASのゲノム情報について解析し、比較した。SDSEは感染モデル構築に用いたRE378を、GASは感染モデルが既に存在するGAS472と髄膜炎由来株であるMTB313を選んだ。RE378はNCBIで公開中のデータを利用した。GAS472については二回の全ゲノムシークエンスでいずれも良好な結果を得られず、全配列の決定には至らなかったが、MTB313株については全ゲノムを決定し、DDBJに登録を完了した。

MTB313はマウス感染実験でGAS472同様高い致死率を示し骨壊死を伴う壊死性筋膜炎を起こす事を確認済みであり、当課題における比較対象として適当であると判断した。RE378とMTB313の全遺伝子を比較したところ、RE378に含まれMTB313に含まれない遺伝子の数は805であった。このうち、497については他のGASに相同性の高い遺伝子が存在することが示唆された。また、既知遺伝子との相同性が低く、機能が不明である遺伝子が179存在した。これらを除き、相同性検索によってRE378の病原性に関連する可能性があるものは43遺伝子であった。転写調節因子が20(2組のtwo-component regulatorを含む)、菌の宿主細胞への付着に関する因子が7、菌の増殖および適応に関する遺伝子が7つ、分泌タンパク質(DNase等)が2つであった。また、薬剤耐性に関わると考えられる遺伝子が7つ存在した。RE378感染モデルの特徴は低い死亡率と関節炎の惹起である。RE378と宿主細胞との相互作用に、遺伝子比較で差異として見いだされた遺伝子群が関与するかが今後の研究課題である。平成24年度の研究実施計画は、前年度までに確立したStreptococcus dysgalactiae subspecies equisimilis(SDSE)感染マウスモデルの病態をふまえ、SDSEのゲノム構造の特徴をA群レンサ球菌(GAS)と比較し、その違いを考察することであった。その実施のためには、SDSEとGASの2株のゲノム情報が必要である。まず比較対象として、GASの劇症型感染症分離株であるGAS472のゲノム解析に着手した。菌体より抽出したゲノムDNAをライブラリ化し、454GSJrシークエンスシステム(Roche社)を用いてゲノムDNA断片の塩基配列を決定後、全ゲノム配列が既に明らかになっている侵襲性感染症由来GAS分離株のMGAS5005株ゲノム配列を元に、アセンブルおよびアノテーションを行った。その後、MGAS5005のゲノム配列と一致せず不明領域(ギャップ)として示された部位、およびGAS472固有の配列と思われる領域を特定し、キャピラリシークエンサーを用いたプライマーウォーキング法によってその詳細な塩基配列を決定している。その結果、現在までにGAS472株に特有の領域、およびMGAS5005と異なる配列を持つ遺伝子などを複数特定することができている。GAS472株はヒトCD46トランスジェニックマウスのfootpadに皮下投与した場合、数日のうちに骨壊死・壊死性筋膜炎による足の組織破壊を起こし、死に至る株であることがわかっている。このGAS472株の強毒性がゲノム構造の特徴に関連するものであるかを解明することで、侵襲性感染症の発症メカニズム解明に繋がると考えられる。計画のうち、SDSEをhCD46Tgマウスに感染させた場合の病態観察及び病理学的解析は終了し、GAS感染モデルとの比較を行った。結果、SDSE感染マウスに特徴的な病態が高い再現性で観察された。また、免疫化学的解析によって宿主側因子の関連を発見、分子生物学的に遺伝子発現量を定量し、病態との関連を検討中である。ゲノム解析については、現在進行中である。25年度が最終年度であるため、記入しない。比較対象であるA群レンサ球菌の全ゲノム配列決定に予想より多くの労力が必要であり、やや遅れている。hCD46Tgマウスを用いたSDSE感染モデルでは、致死率は低いものの感染局所の関節部に炎症が認められた。この関節炎の発症がSDSE感染により、どのようなメカニズムで引き起こされるのかを解明する。
造血幹細胞不均等分裂の分子細胞生物学的解析

近年幹細胞の未分化性維持にかかわる分子が同定されつつあるにもかかわらず、幹細胞の最たる特徴のひとつである不均等分裂に関しては現象すら捉えられていないのが現状である。申請者は、ATM(ataxia telangiectasia mutated)欠失造血幹細胞の検討からATMが不均等分裂に必須であるという結果を得ていた。更なる詳細な制御機構を解明するため、抗酸化剤投与などの検討を行ったところ、ATMによる活性酸素産生調節が重要であることを見出した。申請者はすでに野生型造血幹細胞において、細胞内活性酸素産生調節を介したp38MAPK(mitogen activated protein kinase)活性化制御が造血幹細胞の静止状態維持に重要であることを見出している(Ito etal.NatureMed.in press)。現在p38MAPKの下流の候補分子として接着因子の重要性を見出している。そこで今後造血幹細胞とnicheの相互作用などの側面から、各種阻害剤、siRNAなどを用いてp38MAPKの下流に存在する制御機構の解明を進めていく。現在申請者はすでに他の細胞を用いてタイムラプスの手法を用いた観察を確立した。そこで、今後造血幹細胞の不均等分裂の様子を世界で初めてリアルタイムに捉えるとともに、ATM欠失幹細胞やp38MAPK阻害剤を用いて更なる詳細な制御機構の解明を検討している。この理解は幹細胞そのものを捉えることにつながり、幹細胞の自己複製と分化という幹細胞の根本となるメカニズムに迫れると確信している。
アレルギー性炎症が鼻副鼻腔炎の難治化に及ぼす影響についての分子生物学的解析

近年、副鼻腔炎の病態にも鼻腔のアレルギー性炎症の影響を受けていると考えられる症例が増加してきている。これらのものは粘膜への顕著な好酸球浸潤を特徴とし、薬物療法あるいは手術療法後の治癒過程にも抵抗性を示す場合が多く、疾患の難治化因子として大きな問題となっている。今回の研究において我々は、1)臨床的検討として鼻アレルギー合併の副鼻腔炎症例では、OMC(ostiomeatal complex)を中心とした領域のみならず、副鼻腔各洞全体に及ぶ粘膜病変を呈しやすく、かつ局所好酸球浸潤程度と深い関係が存在することを解明した。2)副鼻腔粘膜の分子生物学的解析では、これらの難治症例は炎症性サイトカインであるIFN-γmRNAの低下とGM-CSF、IL-5、eotaxin mRNA発現の亢進が観察されると同時に、CD4陽性Th細胞subsetの中でCCR4(Th2)陽性細胞数の増加と、CXCR3(Th1)細胞/CCR4細胞比の低下を確認した。3)好酸球を誘導する環境を形成する因子として粘膜構成細胞における転写因子活性に着目した。すなわちヒト培養副鼻腔上皮細胞モデルを用い、細胞内転写因子であるNF-κBの活性化応答の変化と、ステロイド剤による抑制効果について検討を行った。培養細胞をTNF-αで刺激することにより、早期に転写因子活性の有意な上昇が確認され、また本作用はステロイドの前投与により濃度依存的に抑制可能であった。免疫組織学的な観察でも、p50 subunit並びにglucocorticoid receptorの発現と核内移行の所見が観察された。これらの結果は、副鼻腔粘膜における上皮構成細胞がeffector cellとして好酸球浸潤に深く関与していることと、外用ステロイドなどによるその制御が病態治療に有用であることを示している。近年、副鼻腔炎の病態にもアレルギー性炎症の影響を受けていると考えられる症例が増加してきている。これらのものはマクロライド療法に抵抗性を示す場合が多く、副鼻腔炎の難治化・遷延化の因子として大きな問題となっている。本年度の研究において我々は、1)副鼻腔炎症例におけるアトピー素因と局所粘膜への好酸球浸潤の程度が、臨床的重症度へ及ぼす影響(冠状断CT画像を用いた重症度判定)、2)粘膜組織における浸潤helper Tリンパ球サブセットの解析、と局所サイトカイン・ケモカイン遺伝子発現との関連性、3)ヒト培養副鼻腔上皮細胞モデルを用いた、炎症性サイトカイン(TNF-α)刺激による細胞内転写因子NF-κBの活性化応答の変化、さらには外用ステロイド剤による抑制効果、について検討を行った。その結果、1)臨床的に鼻アレルギー合併の副鼻腔炎症例では、OMC(ostiomeatal complex)を中心とした領域のみならず、副鼻腔各洞全体に及ぶ粘膜病変を呈しやすく、かつ局所好酸球浸潤程度と深い関係が存在すること、2)副鼻腔粘膜の解析では、鼻アレルギー合併あるいは好酸球高密度症例でIFN-γmRNAの低下とGM-CSF、IL-5、eotaxin mRNA発現の亢進が観察された。同時にCD4陽性Th細胞subsetの解析でも、CCR4(Th2)陽性細胞数の増加と、CXCR3(Th1)細胞/CCR4細胞比の低下が認められた。3)培養細胞をTNF-αで刺激することにより、早期に細胞内のNF-κBの活性化が免疫組織学的に観察された。同時にTrans-AM assayを用いて定量したところ、単位核蛋白あたりの吸光度で約2.3倍に及ぶ上昇が確認された。さらにこの現象は外用ステロイド(fluticasone propionate)の前投与により有意に抑制されることが、明らかとなった。

これらのものは粘膜への顕著な好酸球浸潤を特徴とし、薬物療法に抵抗性を示す場合が多く、疾患の難治化因子として大きな問題となっている。これまでの研究において我々は、臨床的に鼻アレルギー合併の副鼻腔炎症例では、OMC(ostiomeatal complex)を中心とした領域のみならず、副鼻腔各洞全体に及ぶ粘膜病変を呈しやすく、かつ局所好酸球浸潤程度と深い関係が存在することを解明した。同時に分子生物学的にこれらの難治症例では、炎症性サイトカインであるIFN-γmRNAの低下とGM-CSF、IL-5、eotaxin mRNA発現の亢進が観察されると同時に、CD4陽性Th細胞subsetの中でCCR4(Th2)陽性細胞数の増加と、CXCR3(Th1)細胞/CCR4細胞比の低下を確認した。本年度の研究では、ヒト培養副鼻腔上皮細胞モデルを用い炎症性サイトカイン刺激により果たして、上記のような好酸球を誘導する環境が形成されるかどうか一連の検討を行った。特に細胞内転写因子であるNF-κBの活性化応答の変化と、ステロイド剤による抑制効果、に着目して実験を行った。その結果、培養細胞をTNF-αで刺激することにより、早期に転写因子活性の有意な上昇が確認された(Trans-AM assayによる定量実験)。またこの活性化はステロイドの前投与により濃度依存的に抑制が可能であった。同時に免疫組織学的な観察でも、p50 subunit並びにglucocorticoid receptorの発現と核内移行の所見が観察された。これらの結果は、副鼻腔粘膜における上皮構成細胞がeffector cellとして好酸球浸潤に深く関与していることと、外用ステロイドなどによるその制御が病態治療に有用であることを示している。
SiCパワー半導体デバイスにおけるマルチスケール・サーマルモデルの構築

本研究では、次世代のデバイスとして期待されているSiCパワー半導体デバイスの高信頼性を実現するため、半導体部であるSiCダイ内部に発生するナノ・マイクロスケールのホットスポットと、SiCダイ周囲のモールド樹脂なども含めたマクロスケールのホットスポットを同時に予測するマルチスケール・サーマルモデルの構築を目的としている。研究は主に、温度及び電気特性の計測実験、マクロスケールの温度分布を予測するためのCFD解析、ナノ・マイクロスケールの温度分布を予測するための熱・電気連成解析の三つで構成されている。H30年度は、SiCパワーデバイスの温度及び電気特性のデータを取得するための実験装置の準備と、ナノ・マイクロスケールのホットスポットを予測するための熱・電気連成解析の計算コードの構築を行った。実験装置に関しては、SiCパワー半導体デバイスとして広く用いられるSiCパワーMOSFETを実験対象として選定し、実デバイスの使用環境を考慮した上で、定常的な発熱が生じる場合と非定常発熱が生じる場合の両方を実現できる装置の準備を行っている。パワーMOSFETは、電流のオンオフを繰り返すスイッチング動作を行うため、選定したパワーMOSFETの適正なスイッチングを実現できる電源を選定した上で、電気回路の構築を行った。また、温度を計測するための熱電対、データロガー、サーモカメラの準備をした。熱・電気連成解析に関しては、これまで準備してきたコードの更なる改良を行い、いかなる条件でも安定した解析を行えるための準備を進めている。実験に関しては、デバイスの温度分布及び電気特性の実測を行う予定であったが、実験装置の準備に時間を要し、実測まで行うことができなかった。電源の準備の際に生じた不明点や回路の構築の際に生じた不具合を解消するため、電気回路の専門家にアドバイスを受けながら実験装置の準備を行ったが、想定している実験を行うための装置の動作確認に時間を要してしまい、遅れが生じた。解析に関しては、おおむね順調であるが、与える境界条件によって解析が不安になる現象が確認されており、改良を重ねている。以上より、やや遅れていると判断した。実験装置の準備がほぼ整ったため、デバイスの温度分布及び電気特性の実測を行う。また、比較のためのCFD解析を行い、デバイスにおけるマクロスケールの温度分布及び、ナノ・マイクロスケールのホットスポットを特定するためのSiCダイ周囲の熱環境の検証を行う。熱・電気連成解析に関しては、引き続き解析の安定性を高めるためのコードの改良を行う。また、熱的な境界条件にCFD解析から得られたSiCダイ周囲の条件を反映し、マイクロスケールでのSiCパワーMOSFETの温度分布の変化を検証する。サーモカメラが、アカデミックキャンペーンにより予定金額よりも安価で購入でき、またファンクションジェネレータは、予定していたものより安価なものを採用したため当該助成金が生じた。2019年度は、消耗品である熱電対の購入に使用させていただく予定である。
天然由来の新しいがん分子標的治療薬:TRAIL感受性増強物質

アポトーシス誘導サイトカインTRAILによるアポトーシスを増強する物質を未知の天然物質を含むライブラリーを用いて検索し、特に効果が認められた物質を2種類同定した。ひとつはタイ原産キク科植物Blumea balsamifera由来のフラボノイド(BB1と命名)であり、もうひとつは粘菌由来物質Cycloanthranilylproline-derivative(FCBと命名)であった。いずれの物質も多種の白血病細胞に対しTRAILとの併用による相乗効果を発揮した。相乗効果のメカニズムを詳細に解析し、それぞれに異なるメカニズムであることを解明した。その結果、将来的には抗がん剤として単剤で使用することも可能なポテンシャルと合理性をもつ物質であることがわかった。いずれの成果も定評ある雑誌に掲載された。我々は難治性白血病である成人T細胞白血病(ATL)に対する新しい分子標的治療法の開発に取り組んでいる。その成果は他の治療抵抗性の白血病細胞に対しても応用できる可能性がある。我々は生体内に存在するサイトカインの中で強いアポトーシス誘導作用をもつTRAIL (TNF related apoptosis inducing ligand)に着目した。TRAILはTRAILデスレセプターを発現する腫瘍細胞に対し特異的にアポトーシスを誘導する分子標的薬として期待されており、米国において第1/2相臨床試験が進行している。我々はTRAIL抵抗性を有するATL細胞株KOBを用いて様々な天然由来物質の中からTRAIL感受性増強物質の探索をおこなっている。この系を用いて得られたある種のフラボノイドが末梢血単核球には影響を与えずに多種類の白血病細胞のTRAIL感受性を高めることを発見し、その作用機序を明らかにして報告した(blood 2006;107:679-688)。さらに、我々はMyxomycete Fuligo candidaより単離された物質(FCB)がTRAIL感受性増強作用をもつことを発見した。その作用機序を検討したところ、FCBはCOX-2を活性化し、PGE_2,PGD_2,及び15d-PGJ_2の産生を増加させていた。FCBに代えて15d-PGJ_2をTRAILと併用すると同様の感受性増強が起こり、この増強は由来の異なる他の白血病細胞株においても認められた。また15d-PGJ_2はKOB細胞の抗アポトーシス因子を強力に抑制しており、この効果がTRAIL感受性増強をもたらすと考えられた。一方、核内レセプター(Peroxisome Proliferator-Activated Receptor gamma) PPARγに対する合成アゴニストは抗腫瘍効果をもつことが知られており、TRAIL感受性増強作用もあることが最近報告された。15d-PGJ_2は内因性のPPARγアゴニストであり、我々は15d-PGJ_2がPPARγに作用し感受性増強をもたらすと推測した。実際、FCBあるいは15d-PGJ_2処理によりKOB細胞のPPARγ発現は増強した。しかし、PPARγアンタゴニストによっても、またsiRNAによりPPARγ発現抑制を行ってもFCBや15d-PGJ_2によるTRAIL感受性増強作用は阻害されなかった。さらに他の白血病細胞について検討したところFCBや15d-PGJ_2による感受性増強作用はPPARγ発現と相関していなかった。よってFCBや15d-PGJ_2は、PPARγ非依存性にTRAIL感受性を増強する新しい物質であることが明らかとなった。これらの成果に関しては現在投稿中である。その成果はATLのみならず、他の白血病細胞に対しても応用できる可能性が高い。TNF related apoptosis inducing ligand (TRAIL)はTRAILデスレセプターを発現する腫瘍細胞に対し特異的にアポトーシスを誘導する分子標的薬として期待されており、海外においては第1/2相臨床試験が進行している。そこで、TRAIL抵抗性を有するATL細胞株KOBを用いて様々な天然由来物質の中からTRAIL感受性増強物質の探索をおこなった。この系を用いて得られたある種のフラボノイドガ末梢血単核球には影響を与えずに多種類の白血病細胞のTRAIL感受性を高めることを発見し、その作用機庁を明らかにして報告した(blood 2006;107:679-688)。その作用機序を検討したところ、FCBはCOX-2を活性化し、PGE_2、PGD_2、及び15d-PGJ_2の産生を増加させていた。

FCBに代えて15d-PGJ_2をTRAILと併用すると同様の感受性増強が起こり、この増強は由来の異なる他の白血病細胞株においても認められた。一方、核内レセプター(Peroxisome Proliferator-Activated Receptor gamma)PPARγに対する合成アゴニストは抗腫瘍效果をもつことが知られており、TRAIL感受性増強作用もあることが最近報告された。15d-PGJ_2は内因性のPPARγアゴニストであり、我々は15d-PGJ_2がPPARγに作用し感受性増強をもたらすと推測した。実際、FCBあるいは15d-PGJ_2処理によりKOB細胞のPPARγ発現は増強した。しかし、PPARγアンタゴニストによっても、またsiRNAによりPPARγ発現抑制を行ってもFCBや15d-PGJ_2によるTRAIL感受性増強作用は阻害されなかった。さらに他の白血病細胞について検討したところFCBや15d-PGJ_2による感受性増強作用はPPARγ発現と相関していなかった。よってFCBや15d-PGJ_2は、PPARγ非依存性にTRAIL感受性を増強する新しい物質であることが明らかとなった(blood2007;110:1664-1674)。難治性白血病である成人T細胞白血病(ATL)に対する新しい分子標的治療法の開発の成果はATLのみならず、他の白血病細胞に対しても応用できる可能性が高い。TNF related apoptosis inducing ligand(TRAIL)はTRAILデスレセプターを発現する腫瘍細胞に対し特異的にアポトーシスを誘導する分子標的薬として期待されており、海外においては第1/2相臨床試験が進行している。そこで、TRAIL抵抗性を有するATL細胞株KOBを用いて様々な天然由来物質の中からTRAIL感受性増強物質の探索をおこなった。この系を用いて得られたある種のフラボノイドが末梢血単核球には影響を与えずに多種類の白血病細胞のTRAIL感受性を高めることを発見し、その作用機序を明らかにして報告した(blood2006;107:679-688)。さらに、我々はMyxomycete Fuligo candidaより単離された物質(FCB)がTRAIL感受性増強作用をもっことを発見した。その作用機序は15d-PGJ_2の産生増強によっていた。同様の感受性増強は由来の異なる他の白血病細胞株においても認められた。
性ステロイド依存性腫瘍におけるestradiol局所調節機構の解析

1。浸潤性乳管癌では、59%の症例で腫瘍細胞に17β-HSD type 1の発現が見られたが、17β-HSD type 2の発現は認められなかった。2。17β-HSD type 1の発現が高い群ほど、腫瘍の形態学的分化度がよく、estrogen receptorやprogesterone receptorが多く発現し、またKi-67増殖関連抗原の発現が低い傾向が統計学的に示された。3。子宮類内膜腺癌では37%の症例において、腫瘍細胞に17β-HSD type 2の発現が見られたが、17β-HSD type 1の発現は見られなかった。4。腫瘍の形態学的分化度の良い症例ほど17β-HSD type 2の発現が高頻度で認められた。ヒト癌組織における17β-HSD isozymesの発現パターンは、平成9年度のin vitroの実験データと類似し、乳癌と子宮内膜癌では大きく異なっていた。すなはち癌組織におけるestradiolは、乳癌では合成によって制御されるものの、子宮内膜癌では逆に分解によって制御されていると推察された。以上の所見は、乳癌や子宮内膜癌におけるestradiolの局所的役割や腫瘍の増殖形態について考えるうえで大変重要な所見と思われた。17β-HSDの発現パターンは乳癌と子宮内膜癌では大きく異なっており、性ステロイド依存性腫瘍におけるestradiolの局所的役割について考えるうえで大変興味深い所見と思われた。平成10年度は、乳癌及び子宮内膜癌病理組織標本を用いて17β-HSD isozymeの組織内局在を明らかにするとともに、各症例における腫瘍組織内estradiol値、P450aromatase等他のステロイド合成酵素の発現パターン、estrogen及びprogesterone receptorの発現、臨床的予後等と比較し、癌化におけるestradiolの局所的役割について総合的に解析する。更にretinoic acid等種々の17β-HSD調節因子についても、腫瘍組織における発現について検索する予定である。1。2。3。4。
肺移植術後の気道過敏性亢進メカニズムの解明

肺移植術後に気道過敏性亢進をきたし呼吸管理に難渋することがある。肺移植後の気道過敏性変化に関する報告は散見されるが機序の解明に至ったものはない。移植された肺に気道過敏性亢進を生じさせうる膨大な因子の中から、周術期に使用される薬剤が与える影響を調べた。免疫抑制剤シクロスポリン、タクロリムスは移植術後に多用され血管平滑筋を収縮させるが、臨床使用濃度を上回る濃度を投与してもラット気道平滑筋に有意な収縮を生じなかった。また臨床における投与方法を再現すべく免疫抑制剤を連日投与した後の研究でも、アセチルコリンなどのアゴニストへの反応性は変わらなかった。さらに近年登場した筋弛緩拮抗薬スガマデクスについても気道平滑筋収縮を発生もしくは増強させることは無かった。以上より肺移植術後の気道過敏性亢進メカニズムは大変複雑で有り今回の研究で調べたもの以外の因子の関与が示唆された。肺移植の術後管理において,気道過敏性亢進により呼吸管理に難渋する症例がしばしば見られる。その原因として移植肺は脱神経という特異な状態にあることがあげられるが,この脱神経だけでなく,移植肺の局所において気道過敏性亢進を生じさせる機構が存在することを示唆する報告も散見される。本研究はこの肺移植術後の気道過敏性亢進のメカニズムを解明し,制御法を確立することを目的に行っている。肺移植術の周術期に投与される薬剤のうち,免疫抑制剤が気道平滑筋収縮に与える影響を,平成21年度交付申請時の研究実施計画書にそって遂行した。ラット気管支における等尺性張力に免疫抑制剤が与える影響Wistar系雄性ラットから左主気管支輪状標本を作製しorgan bath中に懸垂,等尺性張力を測定した。(1)シクロスポリンまたはタクロリムス(10μM,100μM)の投与では静止張力にいずれも影響を及ぼさなかった。また(2)シクロスポリンまたはタクロリムス(10μM,100μM)で前処置した後にアセチルコリン(0.1μM-1mM)を累積投与した。シクロスポリンの前処置はアセチルコリンによる収縮に有意な影響を及ぼさなかった。タクロリムスは10μMで有意な作用を見せなかったが,100μMではアセチルコリンによる濃度-反応曲線を右方移動させ有意な抑制作用を示した。これらの結果より免疫抑制剤は少なくとも臨床使用濃度(シクロスポリン;0.2μM,タクロリムス;0.02μM)では気道平滑筋収縮を発生,増強する作用は無いことを証明した(論文投稿準備中,平成22年6月日本麻酔科学会総会及び平成22年10月米国麻酔学会にて発表予定)。肺移植の術後管理において.気道過敏性亢進により呼吸管理に難渋する症例がしばしば見られる。その原因として移植肺は脱神経という特異な状態にあることがあげられるが,この脱神経だけでなく,移植肺の局所において気道過敏性亢進を生じさせる機構が存在することを示唆する報告も散見きれる。肺移植術の周術期に投与される薬剤のうち,免疫抑制剤が気道平滑筋収縮に与える影響を,平成22年度交付申請時の研究実施計画書にそって遂行した。免疫抑制剤反復与がラット気管支における等尺性張力に与える影響雄性Wistar系ラットを3群に分けシクロスポリン(10mg/kg)、タクロリムス(1mg/kg)、およびコントロール群としvehicleを皮下注射した。3日および7日間投与後のラットから左主気管支輪状切片(幅3mm)を作成しKrebs-Henseleit液を含むオーガンバス(容量5mL)に設置、安定静止張力(1g)を得だ後に以下のプロトコルで等尺性張力を測定した。(1)アセチルコリン(ACh)(0.1M-1mM)を累積投与した。(2)アトロピン(1M)、インドメタシン(1M)存在下にhight K+(2)溶液(10-90mM)を累積投与した。その結果、シクロスポリン、タクロリムス群ともに3、7日投与後のラット気管支において、ACh、high K+に対する反応性はいずれもコントロール群に対して有意差がみられなかった。

平成21年度の研究成果とあわせて考える、免疫抑制剤が単独でラット気道平滑筋収縮を発生、増強することは無いことを証明した。論文投稿準備中。平成23年5月日本麻酔科学会総会及び平成23年10月米国麻酔学会にて発表(予定)。肺移植の術後管理において,気道過敏性亢進により呼吸管理に難渋する症例がしばしば見られる。その原因として移植肺は脱神経という特異な状態にあることがあげられるが,それだけでなく,移植肺局所において気道過敏性亢進を生じさせる機構が存在することを示唆する報告も散見される。本研究はこの肺移植術後の気道過敏性亢進のメカニズムを解明し,制御法を確立することを目的に行っている。肺移植術後管理で投与される薬剤のうち,筋弛緩薬の新規拮抗薬スガマデクスに気道過敏性亢進の報告が見られるため,このスガマデクスが気道平滑筋収縮に与える影響を調べた。新規筋弛緩薬拮抗剤スマガデクスがラット気管支における等尺性張力に与える影響雄性Wistar系ラット(12週)から左主気管支輪状切片を作成しKrebs-Henseleit液を含むオーガンバス(10mL)に設置した。安定静止張力(1g)を得た後に以下のプロトコルで等尺性張力を測定した。(1)スガマデクス(0.01μM-1mM)を累積投与した(n=6)。(2)2標本を用い一方にスガマデクス(10μM)、他方に溶媒を与えた後、アセチルコリン(ACh)(0.1μM-1mM)を累積投与した(n=6)。(3)2標本を用い、ACh(30μM)による収縮に対して一方にスガマデクス(10 or 100μM)、他方に溶媒を与えた(n=6)。結果、(1)スガマデクス単独では有意な収縮は見られなかった。(2)スガマデクスはAChの濃度反応曲線に有意な影響を与えなかった。(3)スガマデクスはAChによる収縮に有意な影響を与えなかった。以上よりスガマデクス単独で気管支平滑筋収縮を発生、増強することはないと考えられた。論文投稿準備中。平成24年6月日本麻酔科学会総会(神戸)及び平成24年10月米国麻酔学会にて発表(予定)。
ヒト脳腫瘍の実験治療系開発のためのヒト型多剤耐性遺伝子導入マウスの作成・解析

グリオーマの抗癌剤耐性には間質血管内皮に発現するMDR1遺伝子/P-Gpおよびそれによる血液脳関門(BBB)様機能が密接に関与していると考えられている。本研究では、エンドセリンプロモーターで発現誘導したヒトMDR1遺伝子をマウスに遺伝子導入し、マウス毛細血管にヒトMDR1遺伝子を発現させたトランスジェニックマウスを作出、SCIDマウス化したヒトMDR1トランスジェニックSCIDマウスにヒトグリオーマXenograftを皮下移植し、抗癌剤に対するin vivo抗癌剤感受性を評価する。本研究の目的は、マウス皮下血管に発現させたヒト型P-GpによるBBB様の機能を利用したヒトグリオーマXenograftのin vivo抗癌剤実験治療系を開発し、ヒトグリオーマ抗癌剤耐性に対するP-Gpの関与を客観的かつ能動的に明らかにすることにある。研究では、まず平成7年度にマウスエンドセリンプロモーターにヒトMDR1遺伝子cDNAを結合したDNA分子mEND-MDR1を構築した。そして平成8年度には、このmEND-MDR1を胚細胞操作によりBALB/cマウスに遺伝子導入しトランスジェニックマウスを作出し、さらに分配によってSCID化した(MDR1-SCID)。マウス皮下結合組織毛細血管におけるヒト型MDR1遺伝子/PGpを発現、産生をRT-PCR法および免疫組織化学的手法により確認した。平成9年度にはヒトグリオーマXenograftのin vivo抗癌剤感受性の検討を行う目的で、トランスジェニックマウスMDR1-SCIDにヒトグリオーマXenograftを皮下移植し、臨床治療相当量の抗癌剤でin vivo化学療法を行い、相対腫瘍増殖率を算定した。この最終粘度の実験で、ヒトPGp発現がBBB様に機能し、ヒトグリオーマXenograftが抗癌剤耐性を示すかを評価する。グリオーマの抗癌剤耐性には腫瘍細胞ではなく脳内の間質血管内皮に発現するMDR1遺伝子/P-GpおよびそれによるBBB様機能が密接に関与していると考えられている。本研究では、エンドセリンプロモーターで発現誘導したヒトMDR1遺伝子をマウス(wild type, BALB/c)に遺伝子導入し、マウス皮下の毛細血管に特異的にヒトMDR1遺伝子を発現させたトランスジェニックマウスを作出する。これを交配によってSCID/nudeマウス化したヒトMDR1トランスジェニックSCID/ヌードマウス(MDR1-SCID, MDR1-nu)にヒトグリオーマXenograftを皮下移植し、脂溶性の抗癌剤(Vincristine, VCR; Doxorubicin, DOXなど)に対するin vivo抗癌剤感受性を評価する。本年度は、皮下血管内細胞にヒト型のMDR1遺伝子/P-Gpを発現するトランスジェニックSCID・nudeマウス(MDR1-SCID, MDR1-nu)の作成のために以下の実験を行った。まず初めに、マウスエンドセリンプロモーター(東京大学、栗原博士より供与)にヒトMDR1遺伝子cDNAを結合したDNA分子(mEND-MDR1)を作成した。このmEND-MDR1を胚細胞操作によりBALB/cマウスに遺伝子導入し、mEND-MDR1が所期の計画通りに導入されたトランスジェニックマウス(MDR1マウス)を現在スクリーニング中である。今後は、このMDR1マウスを交配によってSCIDあるいはヌードマウス化し(MDR1-SCID, MDR1-nu)、マウス皮下結合組織毛細血管におけるヒト型MDR1遺伝子/PGpを発現、産生をRT-PCR法および免疫組織化学的手法により確認する。現在までにMDR遺伝子発現はノーザンブロット法およびRT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)法によって検討できることを確認済みである。また、in situハイブリダイゼーション法およびin situ RT-PCR法によって、MDR遺伝子の発現の組織内局在を明らかにする予定である。

この最終粘度の実験で、ヒトPGp発現がBBB様に機能し、ヒトグリオーマXenograftが抗癌剤耐性を示すかを評価する。膜P糖蛋白(P-Gp)の脳血管内皮細胞における発現は血液脳関門(Blood Brarrier,BBB)との関連で注目され、グリオーマの抗癌剤耐性には間質血管内皮に発現するMDR1遺伝子/P-GpによるBBB様機能が密接に関与していると考えている。本研究では、エンドセリンプロモーターで発現誘導したヒトMDR1遺伝子をマウス(wild type,BALB/c)に遺伝子導入し、マウス毛細血管にヒトMDR1遺伝子を発現させたトランスジェニックマウスを作出、SCID/nudeマウス化したヒトMDR1トランスジェニックSCID/ヌードマウス(MDR1-SCID,MDR1-nu)にヒトグリオーマXenograftを皮下移植し、抗癌剤に対するin vivo抗癌剤感受性を評価し、ヒトグリオーマ抗癌剤耐性に対するP-Gpの関与を客観的かつ能動的に明らかにする。本年度の研究では、まずマウスエンドセリンプロモーターにヒトMDR1遺伝子cDNA分子(mEND-MDR1)を作成した。このmEND-MDR1をトランスジーンとして胚細胞操作によりBALB/cマウスに遺伝子導入しトランスジェニック(MDR1-Tgマウス)を作出した。マウス皮下結合組織毛細血管におけるヒト型MDR1遺伝子P-Gpを発現、産生をRT-PCR法および免疫組織化学的手法により確認した。現在、MDR1-TgマウスをSCIDマウスを交配することにより、MDR1-TgSCIDマウスの作出を続行している。グリオーマの抗癌剤耐性には間質血管内皮に発現するMDR1遺伝子/P-Gpおよびそれによる血液脳関門(Blood Brain Barrier,BBB)様機能が密接に関与していると考えられている。本研究では、エンドセリンプロモーターで発現誘導したヒトMDR1遺伝子をマウスに遺伝子導入し、マウス毛細血管にヒトMDR1遺伝子を発現させたトランスジェニックマウスを作出、SCIDマウス化したヒトMDR1トランスジェニックSCIDマウスにヒトグリオーマXenograftを皮下移植し、抗癌剤に対するin vivo抗癌剤感受性を評価する。本研究の目的は、マウス皮下血管に発現させたヒト型P-GpによるBBB様の機能を利用したヒトグリオーマXenograftのin vivoの抗癌剤実験治療系を開発し、ヒトグリオーマ抗癌剤耐性に対するP-Gpの関与を客観的かつ能動的に明らかにすることにある。平成9年度は以下の研究を行った。1.MDR1トランスジェニックSCIDマウスの作出:マウスエンドセリンプロモーターにヒトMDR1遺伝子cDNAを結合したDNA分子mEND-MDR1を胚細胞操作によりBALB/cマウスに遺伝子導入しトランスジェニックマウスを作出し、さらに交配によってSCID化した(MDR1-SCID)。マウス皮下結合組織
現代ヨーロッパ文学における数学と形而上学の学際的研究

本研究は、二十世紀の作家サミュエル・ベケットの不可思議な記述や主題群を、ライプニッツ形而上学のもとで、とらえ直すための全体構想をはじめて示したものである。その構想のもとで、ベケット/ライプニッツ的主題は、相互に関連しながら、全体として体系的なモナドの宇宙を形作るのである。この構想の正しさを証明するためには、ベケットがライプニッツを深く理解していたことが前提となるが、草稿研究により、その事実も確認できた。1.ベケットの草稿研究:出版された決定稿にはない、著者の隠された意図・情報(引用の出典、図、計算、表、イラスト等)が詰まっている手書きのノートや校正原稿などを通じて、ベケット文学における数学や形而上学の影響関係、とりわけライプニッツの影響関係を明らかにするのが目的である。その目的のために、貴重なベケット草稿を所蔵している下記の3つの研究所の資料を3年間かけて調査する。(1)米国テキサス大ハリー・ランサム人文研究センターからベケット草稿の複写(『ワット』ノートブック1-3)を2008年12月に入手し、すでに研究に着手している。引き続き、可能な限り複写を入手する予定。(2)英国レディング大学の国際ベケット・ファンデーションにおいて2008年7月末から3週間滞在し、若きベケットのノート「ドイツ日記」(1-6)を中心に研究を開始。しかし、手書きのノートの解読にはさらに多くの時間を必要とすることが判明し、再訪計画を立てている。(3)アイルランドのトリニティ・カレッジ・ダブリンが所蔵する草稿についても、今後調査する計画である。2.英国レディング大学における学会発表:国際ベケット・ファンデーション創設40周年を記念する展示会・学会(2009年9月27/28日)において、ベケットとライプニッツの関係について発表の要請があり、それに向けて準備中である。ベケット文学に表象された「動物」「動物性」が学会の主題ではあるが、近代ヨーロッパにおける機械論と生命論の問題からベケット文学における「動物性」をひもとくことにより、本研究の課題である「数学」「形而上学」の問題にひきよせたいと思っている。本課題の中心にあるサミュエル・ベケットとライプニッツの比較研究をするうえで、ひとつの見取り図的な視点を把握した。ライプニッツにおいて認識論、存在論、形而上学と数学はどれも連関している。ライプニッツが形而上学の基礎においた「充足理由律」とは、「すべてのものには理由がある」というものであり、すべてのものに理由が示されることなく展開されるベケット作品とは、一見対極にあるように見える。しかしながら、ベケットの草稿ノートSottisierには、ショーペンハウエルを経由したこの命題('Nichits ist ohne Grunde')が記されており、ベケットはその重要性を認識していたことが分かる。ではなぜベケット文学においては理由が提示されないのか?ここでもライプニッツの認識論はベケットによって応用されていると筆者は考える。ライプニッツにとって個々の存在(モナド)はその認識能力に応じて自己と世界を把握する。盲目であったり、未だ生まれていない存在であったりするベケットの登場人物たちにはそれなりの能力しか与えられていない。むしろベケットはあえて最底辺の、もっとも弱い存在を選び、彼らの存在、生の運動、存在のための闘争に光を当てているのである。そのときライプニッツの「共可能性」こそ、存在闘争の形而上学的・数学的根拠なのであるが、『事の次第』、『ワット』を初めとするベケット作品にも、「共可能性」の問題が根底にあり、彼らにとっては「なぜか分からぬ理由」ではあるが、実は数学と結びついた形而上学による見えない原理によって、彼らの生の運動、闘争が展開されていると読める。2010年8月31日-9月18日、ダブリンのトリニティ・カレッジ内に宿泊滞在し、バークリ図書館所蔵のベケット・コレクションを調査研究する。1930年代初期のベケットの知識欲は、文学、哲学のジャンル、英独仏伊の言語、さらには古代ギリシア哲学、中世の神学、ルネサンス、近代思想など時空を超えた、広く多岐にわたるものであった。筆者はそのなかでもサミュエル・ベケットの「哲学ノート」(1932-34)の研究に時間をかけた。これはドイツの哲学者ヴィンデルバントの『一般哲学史』をベケットが267頁にもおよぶノートに要約し直したもので、このノートの研究を通してベケットが西洋哲学史を、とりわけライプニッツ形而上学についてどこまで知っていたかを特定することができた。現代ヨーロッパ文学における数学と形而上学の関係を学際的に考察するという本研究の目的を展開する上でも、今後の基盤となる調査となり、早速その成果を次の発表に盛り込むことができた。同年11月14日に日本ライプニッツ協会第二回大会(学習院大学〉にて、「ベケット作品における微小表象」を発表。

『マロウンは死ぬ』の一節を例に、ベケットがいかにライプニッツ形而上学(魂の不死性、死者の記憶、微小表象)を踏まえて文学作品を創造していたかを論じ。
並列計算機上での資源予約に基づくジョブスケジューリング技術に関する研究

並列処理技術の向上とハードウェアの低価格化により、これまで特定の分野に限られていた並列計算機のユーザが拡大している。これに伴い、並列計算機上でより多くのユーザのプログラム(ジョブ)を効率よく実行するジョブスケジューリング技術がより重要となっている。本研究では、資源予約を用いたジョブスケジューリング技術の関する研究を行った。資源予約は、ユーザの計算資源要求(使用CPU数、メモリ使用量、ジョブ終了期限など)に対して、必要な計算資源を当該ユーザのジョブのために予約することにより、ジョブの応答性を保障する技術である。平成13年度は、資源予約の有無、ジョブの実行中断の有無などの方針が異なるスケジューリングアルゴリズムを考案し、これらのアルゴリズムを評価するためのシミュレーションモデルを構築した。また本モデルに基づくシミュレータを開発し、スケジューリングアルゴリズムの性能評価を行った。本評価の結果、単純な到着順によるアルゴリズムでは、資源予約を行うジョブ(予約ジョブ)の実行性能が低下するだけでなく、予約ジョブの影響により予約を行わないジョブの性能が著しく低下することがわかり、Backfillingといったより高度なアルゴリズムを用いる必要があることが確認された。平成14年度は、平成13年度に開発したシミュレータ上で、スケジューリングアルゴリズムのさらに詳細な評価を行った。特にスケジューリングオーバーヘッドおよびジョブの中断復帰に要するオーバーヘッドに関するモデル化を行い、より現実に近いモデル上での性能評価を行った。また現実の並列プログラムの特徴を解析することにより、より現実に近いワークロードモデルを構築し、本モデルによる性能評価を行った。本評価の結果、より現実に近いモデルにおいても、資源予約技術の有効性が確認された。平成13年度は、主に資源予約を用いるジョブスケジューリング方式に関する検討を行うとともに、ジョブスケジューリングアルゴリズムのシミュレーションによる性能評価を行った。ジョブスケジューリング方式の検討では、資源予約を行うジョブ(予約ジョブ)と資源予約を行わないジョブ(通常ジョブ)のプロセッサへのスケジューリングアルゴリズムを定義した。また両者のジョブの優先度および実行中断の可否等から、ジョブスケジューリングアルゴリズムの運用方式を分類した。シミュレーションによる性能評価では、まず各々のジョブスケジューリングアルゴリズムを評価するためのシミュレーションモデルを構築し、本モデルに基づくシミュレーションソフトウェア(シミュレータ)を開発した。また、予約ジョブおよび通常ジョブから構成されるジョブのワークロードモデルを構築した。次に本シミュレータおよびワークロードモデルを用い、平成13年度に購入した計算機上でシミュレーションを行うことにより、資源予約を用いたジョブスケジューリングアルゴリズムの性能を評価した。また、ジョブが資源予約を行う場合には、予約を行わないジョブの実行開始時刻が延期されることによりその応答時間が増大する可能性があるが、本シミュレーションでは資源予約により通常ジョブが受ける性能低下に関する評価も合わせて行った。本評価の結果、単純な到着順によるジョブスケジューリングアルゴリズムでは、予約ジョブの実行性能が低下するだけでなく、予約ジョブの影響により通常ジョブの性能が著しく低下することがわかり、Backfillingといったより高度なジョブスケジューリングアルゴリズムを用いる必要があることが確認された。
ショウジョウバエ母性RNA局在・翻訳制御の共役における細胞核・細胞質連携の解析

細胞質における因子の空間的制御に重要であるmRNAレベルでの制御、すなわちmRNA局在とそれに共役した翻訳制御には、核内におけるスプライシング等のイベントが重要であることが明らかになりつつあるが、その分子メカニズムはいまだ不明である。これまでに、核と細胞質をシャトルするRNA結合蛋白質の1つであるHrp48が、ショウジョウバエ卵母細胞の前後軸決定因子OskarのmRNAとRNP複合体を形成し、その細胞内局在と翻訳制御に必須であることを示してきた。本研究の目的は、Hrp48を含むRNP複合体構成因子の解析と、核内と細胞質でのOskar mRNA-Hrp48-RNP複合体の変化を解析することにより、mRNA局在・翻訳制御における細胞核-細胞質の連携メカニズムを明らかにすることである。本年度は、Oskar RNAにおいて翻訳領域の一部をコードする第1エキソン上へのHrp48の結合部位と、結合配列特異性の解析を行った。この部位は、Oskar mRNAの卵母細胞後極への局在に重要であることが示されているOskar RNA第1イントロンから数100ヌクレオチド以内の場所である。これまで、Hrp48は3'非翻訳領域の3カ所に特異的に結合することを示していたが、第1エキソン上の結合配列は、3'非翻訳領域における結合配列すべてと8塩基中5塩基一致していた。この結果を基に、Oskarタンパク質のアミノ酸配列を変化させない変異をこの結合領域に導入し、Hrp48結合をUVクロスリンク法とゲルシフト法で完全にノックアウトする変異をみつけ、in vivo解析に用いるために、この変異を持つOskar遺伝子導入ハエを作成した(国際シンポジウムRNA 2006 Izuにて報告)。これまでに、核と細胞質をシャトルするRNA結合蛋白質の1つであるHrp48が、ショウジョウバエ卵母細胞の前後軸決定因子oskarのmRNAとRNP複合体を形成し、その細胞内局在と翻訳制御に必須であることを示してきた。本研究の目的は、Hrp48を含むRNP複合体構成因子の解析と、核内と細胞質でのoskar mRNA-Hrp48-RNP複合体の変化を解析することにより、mRNA局在・翻訳制御における細胞核-細胞質の連携メカニズムを明らかにすることである。本年度は、ショウジョウバエ培養細胞であるS2細胞において、様々な欠損を有するHrp48蛋白質の発現系を構築し、その細胞内局在を免疫染色により検討することで、Hrp48における核移行シグナルの同定を行った。その結果、N末端から240番目から287番目のアミノ酸に、ヒトのRNA結合蛋白質hnRNP A1における核移行シグナルであるM9配列に類似した配列があり、この配列の一部のアミノ酸の変異によりHrp48が核移行しなくなることを明らかにした(第7回日本RNA学会大会、第78回日本生化学会大会にて報告)。さらに、Hrp48と卵母細胞内においてRNP複合体を形成する因子の単離同定のために必要な、タグのついたHrp48蛋白質、oskar mRNA局在に機能欠損のでる変異Hrp48蛋白質発現のための形質転換動物の作成を行った。
スキルス胃癌の病態と分子標的治療

スキルス胃癌細胞は,同所性である胃線維芽細胞が産生するKGFにより増殖促進をうけ,またCOX2シグナルにより浸潤促進をうけている。これらKGFをリガンドとする増殖因子レセプターFGF-R2やCOX2シグナルはスキルス胃癌細胞-間質細胞相互作用に関与している。このFGF-R2やCOX2シグナルを分子標的とした治療がスキルス胃癌に有用であることが明らかになった。スキルス胃癌の病態機序に立脚して、新しい分子標的治療法の開発を目的とした。スキルス胃癌は線維芽細胞の増生を伴った増殖進展を特徴とすることから,スキルス胃癌細胞の増殖進展には間質線維芽細胞の産生する増殖因子FGF-7が癌細胞のFGF-R2/K-samIIに作用していることを明らかにしたし、さらにスキルス胃癌細胞の転移にはTGF-βが関与することを明らかにした。これらの研究により、間質細胞の産生するFGF-7やTGFβがスキルス胃癌細胞の増殖進展に関与し、そのリガンドであるFGF-R2やTGFβRがスキルス胃癌細胞に強く発現していることが重要であることを明らかにした。これらのことからFGF-R2(K-samII)阻害剤Ki23057やTGFβシグナル阻害剤A-77のスキルス胃癌の増殖進展に対する有用性および、抗癌剤との併用効果を明らかにし、新規分子標的治療剤を本邦で開発することを計画した。現在いくつかの分子標的治療薬が悪性疾患に臨床応用されてきているが、胃癌に関しては分子標的治療薬の臨床応用は国内外において認められない。従って、今回検討する分子標的薬剤は胃癌の治療薬として新しい開拓面を有する研究と位置付けられる。K-samII阻害剤Ki23057は30nM以上濃度にてFGF-R2/K-samIIを発現するスキルス胃癌細胞株OCUM-2MD3、OCUM-8の増殖を有意に抑制した。一方、Ki23057は高分化型胃癌細胞の増殖を抑制しない。以上より、FGF-R2/K-samIIリン酸化阻害剤Ki23057はスキルス胃癌細胞の増殖を特異的に抑制する事が明らかになった。Ki23057投与によりスキルス胃癌細胞株のFFGF-R2/K-samIIのリン酸化が抑制されるが、非スキルス胃癌細胞は抑制されない。そこで次に、スキルス胃癌細胞株(OCUM-2MD3)に種々の濃度のKi23057を投与しFGF-R2の下流シグナルp-ERK、ERK1、p-AKT、AKTの発現の差をWestern blot法より検討すると、Ki23057はスキルス胃癌細胞の発現するMAPK経路のERKリン酸化、PI3K経路のAktリン酸化を抑制した。すなわち、スキルス胃癌細胞株(OCUM-2MD3)に種々の濃度のKi23057を投与しp-ERK、ERK、p-AKT、AKTの発現の差をWestern blot法で検討すると、リン酸化ERKのp-ERKは100nMのKi23057より抑制され1000nMで発現がほとんど認めないのに対し、totalのERKは発現変化しない。また、p-AKTも同様に1000nMでリン酸化が抑制されるのに対して、total AKTは変化しない。OCUM-8でも同様にKi23057によるリン酸化抑制がみられる。一方、非スキルス型胃癌細胞株(MKN-74、MKN-45)ではp-ERK、ERKともに抑制されない。これらのことより、Ki23057のFGF-R2リン酸化阻害作用が、MAPキナーゼ系やPI3キナーゼ系を抑制することでスキルス胃癌細胞の増殖を抑制していることが示唆される。COX-2阻害剤(JTE-522)を用いたスキルス胃癌の新しい治療腫瘍組織においてCOX-2は主に間質系細胞に認められ、線維芽細胞におけるCOX-2の発現が腫瘍細胞の増殖進展に関与することが報告されている。スキルス胃癌細胞と胃の線維芽細胞との相互作用の機序に基づいて、COX-2阻害剤によるスキルス胃癌の増殖進展抑制効果についてin vivo、in vitroにて検討を行った。材料にはスキルス胃癌細胞株、胃線維芽細胞株を用い、COX-2inhibitorとしてJTE522を用いた。方法は、in vitroではJTE522の処理を行った線維芽細胞および非処理の線維芽細胞の培養上清をそれぞれ添加し、スキルス胃癌細胞の増殖浸潤に及ぼす影響を検討した。また、in vivoの検討では、ヌードマウスの皮下にスキルス胃癌細胞を単独に接種した群とスキルス胃癌細胞と胃線維芽細胞を混合接種した群を作成し、JTE522の経口投与が各群の増殖に及ぼす影響を検討した。その結果、胃線維芽細胞は、スキルス胃癌細胞の増殖や浸潤を有意に促進させた。COX-2inhibitorは胃線維