hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
自然共鳴損失機構に基づくハイパーサーミアの提案

一方、発熱特性測定装置に関しては、発生する交流磁場の強度を当初の予定よりも格段に高めることができる装置構成についての論文が最近発表され、当初計画した装置と比較してこの装置を用いた方が研究の遂行に適当であると判断したため、設計を見直した。このため開発が遅れている。現在装置開発のための部品調達などの準備はほぼ終わり、装置の組み立てを行う段階にある。1年目の計画で未達成の部分について研究を進める。まず、Fe3O4微粒子クラスターの作成を進める。さらに、磁性微粒子としてより磁化の大きなCo系の微粒子についてもクラスター作成を進める。次に、発熱特性測定装置の組み立てを完了させ、その装置特性を評価する。1年目の計画が達成された段階で、2年目に計画されている研究に進む。まず、作成した磁性微粒子クラスターを用いて直流および交流磁化率の測定を行い、ヒステリシスの温度依存性および交流磁化率の周波数依存性から試料が超強磁性に期待される軟磁気特性を有することを確認する。低温での保磁力から有効磁気異方性定数を評価し、10^210^3 J/m3程度の値が得られることを確認する。次に、試料の高周波領域における交流磁化率の周波数依存性を測定する。また、これにより10 MHz以下の共鳴周波数が実現することを確認する。また、集合体サイズが異なる試料について測定を行い、共鳴周波数がサイズに依存しないことを確認する。構築した測定系を用いて、微粒子クラスターの発熱特性を測定し、発熱量を見積もる。この測定を集合体サイズが異なる複数の試料に対して行い、発熱量とサイズの関係を求めて、発熱量が粒径に依存しないという当初の予測の正当性を確認する。これらの結果が得られたのち、測定した発熱量データを従来の緩和損失によるデータと比較することで、提案する手法の有効性を評価し、多面的に自然共鳴損失を用いたハイパーサーミアの実現性を検討する。まず、磁性微粒子クラスター作成のための試薬類に100千円を使用する。また、粒子評価のための電子顕微鏡の使用料として100千円を使用する。発熱特性測定装置の開発に必要な部品はほぼ購入済みであるが、今後回路部品の購入が必要であり、50千円を用いる。磁性微粒子クラスターの磁気測定にはSQUID磁力計を用いるが、その測定に500千円を用いる。高周波領域における交流磁化率の周波数依存性の測定は東北大において行う予定であることから、旅費を150千円、実験補助の謝金として150千円を使用する。さらに70千円余を学会発表のための旅費として使用する予定である。なお、本年度は25千円余が残が生じたが、これは当初より旅費の使用が少なかったためである。次年度はこの予算を学会発表等の旅費として使用する予定である。
液晶デイスプレイのコストダウンを目的とした液晶注入解析用ソフトウェアの開発

本研究の目的は,液晶ディスプレイ(Liquid Crystal Display : LCD)製造の一工程である液晶注入プロセスを数値的に解析できる,汎用性の高いソフトウェアの開発である.このソフトウェアが完成すれば,任意の大きさおよび形状のLCDに対して注入時間の大幅な短縮が実現できるので,LCDの生産性は飛躍的に向上し,それがそのまま製造コストダウンに繋がる.また,新しいサイズと形状のLCDの製造ラインを設計する際に,有用なデータを迅速に提供することも可能となる.まずLeslie-Ericksen理論を構成方程式に選択し,運動方程式と構成方程式にHele-Shaw近似を施して定式化を行った.式の離散化には有限差分法を用いた.今回の研究では,表面張力と注入時のセルギャップの変化を如何に考慮するかということに主眼を置いてモデリングを行った.表面張力に関しては,自由表面全体にわたってメニスカスの形状は一様であり,且つ接触角は非常に小さいのでこれを0度と仮定することで,表面張力の効果を注入の推進力である圧力差の増加量,Δp=2γ/h(γ:表面張力,:h:セルギャップ)として表現できることを導いた.セルギャップの変化に関しては,セル内圧力とギャップ剤の弾性定数からヘルツの公式によって局所的セルギャップを時々刻々計算することにした.ソフトウェアの開発と同時に注入実験を行った.すなわち,75mm×100mm×4.5μmのセルを用いて,液晶注入時における自由表面位置をビデオ撮影した.その結果,計算結果は実験結果と満足に一致し,高精度,且つ,汎用性の高い液晶注入ソフトウェアを完成することができた.本研究の目的は,液晶ディスプレイ(Liquid Crystal Display : LCD)製造の一工程である液晶注入プロセスを数値的に解析できる,汎用性の高いソフトウェアの開発である.このソフトウェアが完成すれば,任意の大きさおよび形状のLCDに対して注入時間の大幅な短縮が実現できるので,LCDの生産性は飛躍的に向上し,それがそのまま製造コストダウンに繋がる.また,新しいサイズと形状のLCDの製造ラインを設計する際に,有用なデータを迅速に提供することも可能となる.まずLeslie-Ericksen理論を構成方程式に選択し,運動方程式と構成方程式にHele-Shaw近似を施して定式化を行った.式の離散化には有限差分法を用いた.今回の研究では,表面張力と注入時のセルギャップの変化を如何に考慮するかということに主眼を置いてモデリングを行った.表面張力に関しては,自由表面全体にわたってメニスカスの形状は一様であり,且つ接触角は非常に小さいのでこれを0度と仮定することで,表面張力の効果を注入の推進力である圧力差の増加量,Δp=2γ/h(γ:表面張力,:h:セルギャップ)として表現できることを導いた.セルギャップの変化に関しては,セル内圧力とギャップ剤の弾性定数からヘルツの公式によって局所的セルギャップを時々刻々計算することにした.ソフトウェアの開発と同時に注入実験を行った.すなわち,75mm×100mm×4.5μmのセルを用いて,液晶注入時における自由表面位置をビデオ撮影した.その結果,計算結果は実験結果と満足に一致し,高精度,且つ,汎用性の高い液晶注入ソフトウェアを完成することができた.本研究の目的は,液晶ディスプレイ(Liquid Crystal Display : LCD)製造の一工程である液晶注入プロセスを数値的に解析できる,汎用性の高いソフトウェアの開発である.このソフトウェアが完成すれば,任意の大きさおよび形状のLCDに対して注入時間の大幅な短縮が実現できるので,LCDの生産性は飛躍的に向上し,それがそのまま製造コストダウンに繋がる.また,新しいサイズと形状のLCDの製造ラインを設計する際に,有用なデータを迅速に提供することも可能となる.まずLeslie-Ericksen理論を構成方程式に選択し,運動方程式と構成方程式にHele-Shaw近似を施して定式化を行った.式の離散化には有限差分法を用いた.今回の研究では,表面張力と注入時のセルギャップの変化を如何に考慮するかということに主眼を置いて注入のモデリングを行った.その中で今年度は,表面張力の取り扱い方について検討した,自由表面全体にわたってメニスカスの形状は一様であり,且つ接触角は非常に小さいのでこれを0度と仮定すれば,次式のように表面張力の効果を注入の推進力である圧力差の増加量として表現できることがわかった.Δρ=2γ/h(γ:表面張力,h:セルギャップ)いくつかの代表的な条件で計算を実施した結果,液晶のスムーズな流動・注入が模擬されており,満足なプログラムが完成したと考えられる.また表面張力が注入完了時間に及ぼす影響を定量的に明らかにすることができた.注入時のセルギャップの変化をモデリングに織り込むことが,次年度に残された課題である.本研究の目的は,液晶ディスプレイ(Liquid Crystal Display : LCD)製造の一工程である液晶注入プロセスを数値的に解析できる,汎用性の高いソフトウェアの開発である.このソフトウェアが完成すれば,任意の大きさおよび形状のLCDに対して注入時間の大幅な短縮が実現できるので,LCDの生産性は飛躍的に向上し,それがそのまま製造コストダウンに繋がる.また,新しいサイズと形状のLCDの製造ラインを設計する際に,有用なデータを迅速に提供することも可能となる.まずLeslie-Ericksen理論を構成方程式に選択し,運動方程式と構成方程式にHele-Shaw近似を施して定式化を行った.式の離散化には有限差分法を用いた.

今回の研究では,表面張力と注入時のセルギャップの変化を如何に考慮するかということに主眼を置いてモデリングを行った・表面張力に関しては,自由表面全体にわたってメニスカスの形状は一様であり,且つ接触角は非常に小さいのでこれを0度と仮定することで,表面張力の効果を注入の推進力である圧力差の増加量,Δp=2γ/h(γ:表面張力,h:セルギャップ)として表現できることを導いた.セルギャップの変化に関しては,セル内圧力とギャップ剤の弾性定数からヘルツの公式によって局所的セルギャップを時々刻々計算することにした.ソフトウェアの開発と同時に注入実験を行った.すなわち,75mm×100mm×4.5μmのセルを用いて,液晶注入時における自由表面位置をビデオ撮影した.その結果,計算結果は実験結果と満足に一致し,高精度,且つ,汎用性の高い液晶注入ソフトウェアを完成することができた.
BMIの推移から見る虚弱高齢者における終末期の特徴と適切な栄養量の検討

介護保険施設等で、点滴等の医療処置が行われず死亡した高齢者131名を対象とし、入居時から死亡時までのBMI(Body Mass Index;体格指数)、食事摂食量(kcal)および水分摂取量(ml)、飲食に対する高齢者の反応を調査・分析した。その結果、BMIは死亡5年前から死亡時まで漸減する一方、食事摂取量は死の約6ヵ月前から、水分摂取量は約1ヵ月前になって不可逆的に急減した。また食事摂取量が減少する頃より嚥下困難さらに飲食を拒絶する反応が顕著となり、終末期の特徴と考えられた。こうした反応の不可逆的増加にあわせ、終末期には栄養量を積極的に減少させることが妥当であると考えられた。本研究の目的は、近年看取り件数が増加している介護保険施設等で過ごす虚弱高齢者における日常の栄養摂取量と、その評価指標であるBMI(Body Mass Index)を中心に継時的にモニタリングし分析することで、生活の場で最期を迎える高齢者の終末期における適切な栄養量とBMIを根拠とした虚弱高齢者の終末期看護のあり方を明らかにすることにある。現在までに施設において自然な経過(延命のための医療、特に人工的水分・栄養補給法が行われない)において死亡した、約100名のデータ収集を完了している。これらの自然死の経過をたどる高齢者において、死の時期が近づくにつれて体重が減少することが観察される。主観的包括的アセスメント(SGA)では、体重が1ヵ月で5%、3ヵ月で7.5%、6ヵ月で10%以上減少する場合、病的な体重減少と定義される。こうした病的体重減少の状態が、特に死の時期の数か月前から顕在するようになる。同時に、BMI(体重kg/身長m×m)が死が間近に迫ると減少し、健常者においては測定されることのない低値となる。こうした体重減少は一定の食事量が摂れていても進行することがある一方、一般に自然死に向かう高齢者においては徐々に摂取量が減少する。また、食事摂取量が一定せず食べられる時とそうでない時のムラが顕著となる。これは水分摂取量にも言えることであり、死亡前のある時期から摂取できる水分量が大きく減少し、少ない水分摂取量で停滞しながら死に至る傾向が見えている。これらの傾向から、自然な経過をたどり死に至る高齢者の死の時期について推定が可能となるとともに、そうした経過をたどる高齢者に対し、負担が少ない食事または栄養の量、適当な水分の提供量が明らかになると考えられる。本研究の目的は、まず病院以外の場で死に至った虚弱高齢者について、数か月から年単位にわたる体重、摂取栄養量、飲水量のデータを収集し、その長い経過の中でのそれらのデータの変化を明らかにすることにある。2015年3月末までに、経口から摂れる食事や水分のみで死に至った高齢者約150症例のデータを得ている。その高齢者について得られたデータから、死の時期に近づくにつれ体重が減少するだけでなく、低体重(やせ)が顕著になってくることが体重と身長から得られたBMI(Body Mass Index体格指数)によって明らかになった。そして、死の1年前のBMIとそのさらに6ヵ月前のBMIを比較すると顕著に低減していることが明らかとなっていた。死の時期とは思われない死の1年前においても、すでにその6ヵ月前とのBMIを比較することによって、死への変化の客観的事象が見えてくると考えられる。次に、そうした死に至る経過における栄養量について明らかにすることが、本研究の目的でもある。死に至る高齢者はその4年ほど前からBMIが徐々に低減することが見えてくる。しかし、摂取されている栄養量については大きな変化はない。摂取量が顕著に減るのは、死の前6ヵ月くらいからである。つまり死に至る高齢者は、体重またはBMIは低減していく傾向があるものの、死の前の6ヵ月より前においては摂取している栄養量に変化は見られないことが分析されつつある。今後、BMIの低減と摂取栄養量の変化の関係から、BMIの低減に応じた適切な栄養摂取量が明らかにされるかどうかを分析・考察する予定である。病院以外の介護保険施設、ホームホスピス、在宅等、高齢者のあらゆる暮らしの場において、死亡した約200名の高齢者を対象とし、死亡前5年以上にわたって記録された月次の体重からBMI(Body Mass Index、体格指数)について、データを収集・分析した。また、同様に毎日提供されている食事量(kcal)から実際に摂食された食事量(kcal)を算出するとともに、食事以外に摂取された日々の水分量から、月次の平均食事摂取量(kcal)および水分摂取量を算出し、BMI値の推移と共にデータ分析を行った。さらにケアギバーらにより飲食に関する記録に記載されたキーワーズの変化について、データを収集・分析した。その結果、死亡した高齢者において、死亡5年前より時間の経過とともにBMIの平均値は減少し(p<0.001)、死亡直近時のBMIの平均値は「やせ」の基準値以下の16.5(±3.5)であることが明らかとなった。また食事摂取量は死亡約6ヵ月前から前月に比較し有意に減少し(p<0.001)、水分摂取量は死亡約1ヵ月前から前月に比較し有意に減少した(p<0.001)。さらに、死亡約6ヵ月前より「口腔内の溜め込み」、「ムセ込み」といった嚥下困難に関するキーワーズ、約1ヵ月前から「摂食拒否」、「欠食」といったキーワーズが各々前月と比較し有意に増加した。

これらの死亡前の推移から、BMIに加え食事摂取量や水分摂取量の減少は、死亡時期の推定のエビデンスになると考えられた。また、それらの減少と共に観察記録され死亡前に頻出するキーワーズから、看取りの時期における適切な食事量や水分量を裏づけるエビデンスとなることが示唆された。介護保険施設等で、点滴等の医療処置が行われず死亡した高齢者131名を対象とし、入居時から死亡時までのBMI(Body Mass Index;体格指数)、食事摂食量(kcal)および水分摂取量(ml)、飲食に対する高齢者の反応を調査・分析した。その結果、BMIは死亡5年前から死亡時まで漸減する一方、食事摂取量は死の約6ヵ月前から、水分摂取量は約1ヵ月前になって不可逆的に急減した。また食事摂取量が減少する頃より嚥下困難さらに飲食を拒絶する反応が顕著となり、終末期の特徴と考えられた。こうした反応の不可逆的増加にあわせ、終末期には栄養量を積極的に減少させることが妥当であると考えられた。データ収集をしている対象施設において、データ入力管理をするシステム変更を行ったため、やや遅れている。高齢者看護ほぼ必要なデータ量が収集されており、今後はデータの整理、分析、そして論文投稿、学会発表等を行う。対象となるサンプル数が100例ほど収集でき、分析が進められている。今後もその数は増加し、さらに計画に近い例数が収集され、適切な分析ができるものと予測される。データ収集の対象としていた施設内において、研究に必要とするデータの入力に関するシステム変更がなされたため、そのデータを取り込む新たなソフトウエアが必要となり、その開発・設置によって計画が遅れた。さらに対象となるサンプル数を収集する。現在までの対象を分析することによって、研究において重要となる変数により注目し、観察を継続する。データ収集をしている対象施設への旅費、および投稿する論文の英文化等に使用する予定である。データ収集の対象となる施設に設置予定のPCについて、当初予定より選定した施設数がすくないため、PCの予定台数を購入していない。データ収集処理ソフトについて、初期開発されたものを使用しており、開発のコストが掛けられていない。データを収集している施設に対し、委託費が未払いとなっている。今後研究対象となる施設が増えるため、設置PCの追加購入を計画している。また、これまでの研究成果からデータ処理ソフトのバージョンアップを計画している。データ収集をしている施設に対し、委託費を支払う計画である。
培養細胞を用いたinvitroでの腎糸球体の再構築に関する研究

糸球体足細胞は、分裂能を失って高度に分化した細胞であり、血液を濾過し原尿を生成するために重要な役割を演じている。申請者らはこれまでにSV40T抗原遺伝子を導入したトランスジェニックラットより糸球体を単離し、そこから糸球体構成細胞の不死化培養株を樹立した。本研究においては、それらの培養細胞株を用いてin vitroで糸球体構造を三次元的に構築することを目的としている。本年度は、スクリーニングした毛細血管内皮細胞培養株がマトリゲル内で管腔形成能を有し、外側に基底膜様構造を作ることを電子顕微鏡で確認した。毛細血管様構造を作った後に、足細胞培養株を加えることにより、血管の外側に足細胞が結合するため、in vivoと同じ位置関係に2つの細胞を置くことができる。この条件で足細胞はフラットな構造から、本来の細胞体が盛り上がったたこ足構造を有し、コンフォーカル顕微鏡を用いて、ディッシュ培養下で発現が見られなかった中間径線維関連分子p250の発現が細胞質に確認できた。さらに、得られた足細胞培養株についてスリット膜関連分子の発現を調べた結果、いくつかのクローンについてネフリン、Neph1の安定した発現をPCRにて確認した。33度と37度で比較したところ、ネフリンの発現は37度で増加した。ネフリンの発現を有していないC7クローンについてポドカリキシンの遺伝子を導入したところ、ネフリンの発現が認められた。特にD7クローンにおいては、免疫組織化学により細胞膜にネフリンの局在を観察した。しかしながら、電顕観察でスリット膜の存在は確認できていない。いずれのクローンにおいてもポドシンの発現が認められないことから、ポドシン遺伝子を導入してネフリンの発現変化を調べたが、ネフリンの発現量および局在に変化は認められなかった。これらの結果の一部は日本解剖学会総会、日本腎臓学会総会および東京大学におけるセミナーで発表した。糸球体の足細胞は、分裂能を失って高度に分化した細胞であり、血液を濾過し原尿を生成するために重要な役割を演じている。この細胞の障害は糸球体の機能障害に直接結びつく。そのため、足細胞は糸球体の再生を考える上で、極めて重要な細胞である。本研究においては、それらの培養細胞株を用いてin vitroで糸球体構成細胞を三次元構築することを目的としている。本年度は、まず毛細血管内皮細胞の培養株をマトリゲル内での管腔形成能を指標としてスクリーニングした。その結果、内皮細胞培養株として単離した一部の細胞においてマトリゲル内で血管様に延びた管腔を形成することを見いだした。この細胞が内皮細胞であることは酸化LDLの取り込みでも確認した。次に足細胞培養株と内皮細胞との共培養の条件について検討した。足細胞と内皮細胞をディッシュに培養するとそれぞれの細胞は単独でコロニーを形成し、決して混在しないことを確認し、その後2種類の細胞を3次元で培養する条件を検討した。その結果、まず、内皮細胞が管腔を形成した後に、足細胞をゲル中に加えて培養することにより、in vivoに近い状態での培養が可能となった。内皮細胞が形成した血管様の管腔の基底側に張り付いた足細胞は通常のディッシュでの培養と異なり、細胞体が大きく膨らんで突起を出した形態をとることがコンフォーカル顕微鏡を用いた3次元像の解析により明らかとなった。また、通常の培養では発現の低い一部の蛋白について3次元培養で発現の上昇も確認された。
光で充電できる新型色素増感太陽電池の開発

太陽電池の利用拡大は重要な課題である。最近、低コスト高性能太陽電池として「色素増感太陽電池」が発表され、次世代太陽電池として期待されるようになった。色素増感太陽電池は、多孔性酸化チタンの表面に吸着した色素からの高効率光誘起電子移動と、電解質中の酸化還元とを組合せたものであり、形状自由度の高さやカラフルな太陽電池作成も可能なことから、高付加価値太陽電池としても期待されている。しかしながら、太陽電池には本質的に光強度に依存する出力変動があり、色素増感太陽電池ではその変動が大きいことが指摘されている。このため、実際の使用形態として二次電池との組み合わせが必要である。われわれは、湿式太陽電池の一つである色素増感太陽電池の主要な過程が光エネルギーの化学エネルギーへの変換反応であるという特徴を活かせば、太陽電池そのものに二次電池の機能(エネルギー貯蔵機能)を付与することもできると考えた。本研究では、この考えを実現する目的で、充放電が可能な光エネルギー貯蔵型色素増感太陽電池を開発した。最終年度である今年度は、光エネルギー貯蔵型色素増感太陽電池に用いる電荷蓄積電極の大容量化を研究した。電荷蓄積電極には、酸化チタンの伝導帯とのエネルギー順位の関係から導電性高分子のポリピロールを検討した。また、基板にはステンレスメッシュならびにチタンメッシュを用いた。さらに、ナフィオンのコーティングについても検討した。その結果これまでよりはるかに高性能の光充電セルを実現することができた。本研究では、充放電が可能な光エネルギー貯蔵型色素増感太陽電池を開発した。まず、平成16年度は、光エネルギー貯蔵型色素増感太陽電池の基本原理を確立した。電荷蓄積電極部分には導電性高分子が最も良い特性を与えることを明らかにした。電荷蓄積電極にホールドープした導電性高分子を用いた場合には、電子は脱ドープによって蓄積される。光アノードと対極を含む部分は、低抵抗カチオン交換膜を介して電荷蓄積電極と接続する必要があることがわかった。また、電解質と溶媒についてはDSSCやカチオン交換膜の特性を損なわないように選択する必要があることがわかった。本年度は、光エネルギー貯蔵型色素増感太陽電池の大容量化と高効率化を研究した。また、光充電の高速化なども検討した。色素増感太陽電池は、多孔性酸化チタンの表面に吸着したルテニウム系色素からの高効率光誘起電子移動を利用するものである。しかしながら、これまで高効率の電子移動を実現できる色素はカルボン酸基のついたルテニウム系色素だけであり、重金属を使わない高効率色素の開発が望まれている。われわれは、これまでポルフィリン分子集合体を用いた光エネルギー移動や電子移動を詳細に検討しており、従来のルテニウム系色素に代わるポルフィリン系増感色素を開発した。

本研究では、この考えを実現する目的で、充放電が可能な光エネルギー貯蔵型色素増感太陽電池を開発した。最終年度である今年度は、光エネルギー貯蔵型色素増感太陽電池に用いる電荷蓄積電極の大容量化を研究した。電荷蓄積電極には、酸化チタンの伝導帯とのエネルギー順位の関係から導電性高分子のポリピロールを検討した。また、基板にはステンレスメッシュならびにチタンメッシュを用いた。さらに、ナフィオンのコーティングについても検討した。その結果これまでよりはるかに高性能の光充電セルを実現することができた。
地球規模の海洋変化に対する社会的対応策のあり方に関する研究：北東アジアを中心に

平成30年度は、課題2である「問題解決仕組みを構築するためのシステム・ハーモナイゼイションの分析」に該当するサブ課題Cを継続的に進めてきた。すなわち、各国における問題解決の仕組みとその有効性・限界について、IMBeR-ADApT(Assessment based on Description and responses and Appraisal for a Typology)フレームワーク分析枠組みを用い、海域関連の問題点、システム・仕組み(自然、社会、管理)、要因(自然的、人為的)、変化・インパクト、変化への対応、対応の目標、対応の効果等に関する事例分析を継続して行った。平成30年度では主な事例地として、日本では静岡県伊豆半島、沖縄県石垣島など、中国では遼寧省大連市、上海市、浙江省舟山市など、韓国では慶尚南道釜山広域市、済州島、台湾では屏東県の東港地域などを取上げた。このようなフィールドワーク及び事例分析を通して、北東アジアでは、制度という土台の上で、それぞれの特徴のある管理組織が多岐にわたる管理手段を用いながら海洋問題への社会的対等を行っていることが判った。また、北東アジア地域における海洋・沿岸域利用調整システムの実態を把握できるとともに、地球規模の海洋変化への有効な社会的対応策を提示するための準備が整った。平成30年度の研究計画は、フィールドワークやアンケート調査等による事例分析が中心となっており、多くの事例地域については、これまでの研究対象地域として多く通っている地域であることにより協力が得られやすかったため、基本的に予定通り実施することができた。最終年度は、これまでの分析を踏まえて、課題2の問題解決仕組みを構築するためのシステム・ハーモナイゼイションの分析に該当するサブ課題D、及び課題3の持続可能な利用を実現するための具体策の提示に該当するサブ課題E及びサブ課題Fの三つを中心に研究を進める。比較分析を通じて、海域に関する問題解決システムの共通点・相違点を抽出するとともに、その他の国との比較分析を重ねることを通じて、北東アジア海域の持続可能な利用のためのプロセスを析出し、それらを踏まえて地球規模の海洋変化に対する社会的対応策のあり方について提示する。平成29年度は、本研究の課題1である「資源利用と管理システムの実態分析」に該当するサブ課題A、サブ課題B、及び課題2である「問題解決仕組みを構築するためのシステム・ハーモナイゼイションの分析」に該当するサブ課題Cの一部、の三つを中心に研究を進めてきた。北東アジア海域における重層的ガバナンスの分析枠組みを確立し、ぺティクラーク法則・持続可能性理論を用いて、北東アジアにおける海域産業の展開特質及び海域利用の問題点・課題を抽出するとともに、IMBeR-ADApT分析枠組みを用いて、アンケート調査・フィールドワークを中心に各国の事例分析を行った。具体的には、まず、資源利用の実態について、1中国、日本、韓国それぞれの国における海域産業の構造変化の実態や国民経済に占める地位及び今日的特徴をペティ・クラークの法則などに照らしながら分析し、それらが持続可能な利用であるかについて持続可能性理論を用いて検証するとともに、2産業発展に伴う海域利用の問題点及び管理システムの実態について明らかにした。次に、各国における問題解決の仕組みとその有効性・限界については、1IMBeR-ADApT分析枠組みを用い、海域関連の問題点、システム・仕組み(自然、社会、管理)、要因(自然的、人為的)、変化・インパクト、変化への対応、対応の目標、対応の効果等に関する事例分析を行った。平成29年度は、日本の志津川湾、三河湾、駿河湾等における地域を中心に進めた。平成29年度の研究計画は、既存文献・資料分析と統計分析にもとづく定量分析が中心となっており、研究開始の前から研究に必要な基本的データや資料入手済みであったため、基本的には計画通りに実施することができた。平成30年度は、平成29年度の補足調査を実施しつつ、本研究のサブ課題CであるIMBeR-ADApT分析枠組みを用いての事例分析を継続的に実施する。

主な事例地として、日本では北海道根室市、三重県志摩市、愛知県西尾市の幡豆地区、沖縄県石垣島など、中国では山東省青島市、遼寧省大連市、上海市、浙江省舟山市など、韓国では江原道束草市、慶尚南道釜山広域市、全羅南道莞島郡、済州島など、海域利用が盛んであるとともに、多様な利用主体がかかわっている沿岸地域を調査する予定である。最終年度は、これまでの分析を踏まえて、課題2の問題解決仕組みを構築するためのシステム・ハーモナイゼイションの分析に該当するサブ課題D、及び課題3の持続可能な利用を実現するための具体策の提示に該当するサブ課題E及びサブ課題Fの三つを中心に研究を進める。比較分析を通じて、海域に関する問題解決システムの共通点・相違点を抽出するとともに、その他の国との比較分析を重ねることを通じて、北東アジア海域の持続可能な利用のためのプロセスを析出し、それらを踏まえて地球規模の海洋変化に対する社会的対応策のあり方について提示する。平成29年度における一部のフィールワーク調査を他予算で実施したことや、当初計画していたフィールドワークが、現地受け入れ先との調整等の関係で、一部実施できていないためである。平成30年度は、平成29年度の補足調査も併せて実施する予定である。フィールド調査現地での諸事情により、一部の地域で移動手段に変化が生じたためである。次年度は、当該使用額も併せて実施する予定である。
尿路上皮を中心とした膀胱機能調節の分子機構の研究

本研究は尿路上皮への刺激入力により産生される物質による膀胱機能調節機構の解明を目的とした。従来中心とされてきた薬理生理学的手法に加え分子細胞生物学的方法論およびマウスの排尿行動解析を導入することで、尿路上皮の生理的役割および尿路上皮の機能異常に関連した膀胱疾患の病態を解明した。我々はこれまで、下部尿路閉塞状態で尿路上皮が産生する増殖因子であるbFGF(FGF-2)が膀胱平滑筋に及ぼす影響を報告してきたが、(1)今年度はその中で、bFGFが平滑筋間のgap junctionの主要な構成タンパクであるコネキシン43 (Cx43)のレベルを上昇させることをin vitroの細胞培養系とin vivoでの局所徐放系の二つの系を用いて確認した。bFGF刺激を受けた膀胱平滑筋はムスカリン刺激に対する感受性が上昇するが、この効果はコネキシン阻害薬により消失することも証明し、第97回日本泌尿器科学会総会で報告する予定である。(2)一方、間質性膀胱炎自然発症モデルを用いた検討では、発病マウスの血清を腹腔内注射することで正常マウスに同様の病態を引き起こせることが明らかになっており、その過程においてTNFαが果たす役割を引き続き解析中である。マウスの排尿行動解析系についても、自動記録装置化に向けた基礎実験と機器の開発を順調に進めつつある。(3)また、研究室へのヒト正常尿路上皮細胞株の導入は進んでおり、培養と解析の基礎データを積み重ねつつある。今後cDNAマイクロアレイやプロテオミクスを用いた解析系を用いて、上皮刺激シグナルによって上皮が産生する物質の検討を進めていく計画である。それと並行して、臨床検体の上皮由来物質の尿中マーカーとしての有用性の解明も進めていく予定である。尿路上皮が産生する因子が、尿路上皮、膀胱平滑筋に及ぼす影響について、今年度は(2)一方、間質性膀胱炎自然発症モデルを用いた検討では、発病マウスの血清の腹腔内注射によるマウス発症モデルをTNFαノックアウトマウスに対して応用し、行動解析実験を施行した。現在結果解析を進めており、解析が終了次第論文投稿予定である。またマウスの排尿行動解析系については排尿量自動記録装置の試作が完了し、既に実験に使用されているが、自動化によって初めて得られる極めて興味深い結果を得つつある。現在は一部手作業の過程が残存しているため完全自動化を進めるとともに、より高精度かつハイスループット化に向けてさらなる改良を進めている。(3)ヒト正常尿路上皮細胞株の解析に関しては、増殖、分化、外部刺激によるmRNAlevel,蛋白レベルの解析が進行している。(4)過活動膀胱患者や正常者の尿中マーカーの解析にも着手しており、現在検体採取中である。尿路上皮が産生する因子が、尿路上皮、膀胱平滑筋に及ぼす影響について、今年度は(1)bFGFで膀胱を直接刺激したラットの排尿行動解析で頻尿を来す事を確認できた。さらに一日の時間によってbFGFの効果に差があることが発見されたため、影響を裏付ける蛋白レベルの解析を行い、The Journal of UrologyにAcceptされた。(2)一方、間質性膀胱炎自然発症モデルを用いた検討では、発病マウスの血清の腹腔内注射によるマウス発症モデルをTNFαノックアウトマウスに対して応用し、行動解析実験を施行した。現在結果解析が終了し、論文投稿中である。またマウスの排尿行動解析系については排尿量自動記録装置の試作が完了し、既に実験に使用中であるが、自動化によって初めて得られる極めて興味深い結果を得つつある。(4)過活動膀胱患者や正常者の尿中マーカーの解析のため、検体採取中である。現在順調にその数を増している。
バゾプレッシンⅤ１ａ受容体によるアルドステロン受容体核内輸送機構の解明

腎集合尿細管間在細胞由来のcell line(INーIC cell)を用いて、アルドステロンの核内受容体であるミネラルコルチコイド受容体(MR)が細胞質から核内への輸送を免疫組織学的に証明し、その輸送には、アルドステロンによるRegulator of chromosome condensation-1 (RCC-1)の活性化とバゾプレッシンV1a受容体の存在が必須であることを明らかにした。一方、バゾプレッシンはRan Gap1の活性化を抑えることで、MRの核外への輸送を抑制していることも明らかにした。また、アルドステロンとバゾプレッシンによるPKC活性化は、異なる経路であることも明らかにした。腎臓は、水、ナトリウム代謝だけでなく、酸塩基平衡の調節をも司る臓器である。心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)は、腎臓の尿細管のほぼすべての部位に作用し、セカンドメッセンジャーであるcGMP産生を介して、強力な利尿作用を示すことを、我々は以前報告したが、ANPの髄質部ヘンレの太い上行脚(MAL)における重炭酸イオン(HCO3-)再吸収に対する作用を、microperfusion法で検討した。バゾプレッシンは、MALにおいて重炭酸イオン再吸収を抑制したが、ANPはその作用を阻害した。ただ、ANP単独では効果は見られなかった。以上より、ANPはバゾプレッシンの作用を阻害することで、MALでの重炭酸イオン再吸収を促すことで、水、ナトリウムだけでなく、酸塩基平衡に影響することが判明した(Plos Oneに掲載)。また、腎臓では、造血ホルモンであるエリスロポエチンが産生され、腎不全の進行とともに、腎性貧血が見られることが知られているが、これまでは、間質の繊維芽細胞で産生されると考えられてきた。我々は、北里大学生理学教室との共同研究で、高感度in situ hybridization法を用いて、集合尿細管間在細胞で産生されることを明らかにした。繊維芽細胞でのエリスロポエチン産生は、ヘマトクリット15%以下の、極度の貧血でないと認められず、生理的な意義が少ない事も明らかにした。また、Western blot, real time PCRなどの手法も用いて、間在細胞におけるエリスロポエチン産生は、低酸素刺激だけでなく、アルドステロンによっても制御されており、PHD2の活性化とバゾプレッシンV1a受容体の存在が必須であることも明らかにした。現在は、論文投稿中である。現在、ミネラルコルチコイド受容体の核内輸送との関連について、検討中である。腎臓での水、ナトリウム再吸収と酸排泄を司るホルモンであるバゾプレッシンにはV2, V1aの2種類の受容体があり、ともに腎に発現しているが、V2受容体は水、ナトリウム輸送に関連し、V1a受容体(V1aR)は酸塩基平衡と関連すると考えらえてきた。バゾプレッシンV1a受容体欠損マウスは、アルドステロンの作用低下から4型腎尿細管性アシドーシスになることを私達は報告したが、その機構について検討した。アルドステロンの受容体であるミネラルコルチコイド受容体(MR)は、核内受容体であり、細胞質から核内へ輸送されて、genomicな変化を起こすことが知られている。そこで、MRの細胞質核内輸送を、細胞質と核分画に分けたWestern blot法と免疫染色法の二つで検討した。腎臓での主たる酸排泄部位である腎集合尿細管間在細胞であるIN-IC cellにアルドステロンを投与すると、30分後にはMRの核内への輸送が見られた。siRNAにより、V1aR遺伝子をノックダウンすると、その作用は完全に消失した。アルドステロン投与30分後には、MR発現は増加しておらず、non-genomicな作用であった。バゾプレッシンでも、同様に、MRの核内への輸送が見られた。その際のMR輸送蛋白やRan cycleの変化を見ると、アルドステロンによるRCC-1の核内での発現増加と、バゾプレッシンによるRan Gap1の発現低下が認められた。この二つの変化は、核内のGTP型Ranの増加からMRの核内への輸送を刺激すると考えられた。以上の結果より、腎での酸排泄部位である腎集合尿細管間在細胞における酸排泄を行うアルドステロンの作用には、バゾプレッシンV1a受容体の存在が必須であることが判明した。その機序としては、V1aRが細胞骨格形成に与し、それが破たんするためにMRの核内輸送が障害される可能性が考えられる。腎臓は、電解質代謝、酸塩基平衡の調節を司る臓器だけでなく、造血ホルモンであるエリスロポエチン(Epo)の産生の場でもある。これまでEpoは、腎尿細管ではなく、腎間質の繊維芽細胞で産生されると考えられてきた。

我々は、高感度in situ hybridization法を用いて、正常状態においては、腎皮質部の尿細管、中でも集合尿細管間在細胞で特に産生されることを明らかにした。マウスを1%の低酸素4時間にすると、腎間質でのEpo産生が著明に増加した。尿細管でも増加を認めたが、2倍程度であった。低酸素刺激では、Hypoxia inducible factor 2α発現が増加することが知られているが、その代謝に重要なHIF prolyl hydroxylase 2がEpo産生が認められる皮質部尿細管に広く発現し、低酸素で遺伝子発現が増加することも明らかにした。Epo産生が認められた腎集合尿細管間在細胞のcell line (IN-IC cell)にアルドステロンを投与すると、PHD2発現を刺激し、Epo産生が増加することを見出した。コントロールマウスでは、外因性アルドステロンであるフロリネフによるHIF2α刺激が、バゾプレッシンV1aR-KOマウスでは認められず、アルドステロンによるEpo産生制御においてもV1aRの存在が必須であることが確認された。腎生理心房性ナトリウム利尿ペプチドのヘンレの太い上行脚での作用については、論文化することができて、一応の区切りをつけることが出来た。重炭酸イオンは、ヘンレの太い上行脚において、バゾプレッシンにより再吸収が抑制されるが、心房性ナトリウム利尿ペプチドはバゾプレッシンの作用を抑制することで、再吸収を促進することが判明した。また、バゾプレッシン非存在下では、心房性ナトリウム利尿ペプチドの作用は認められなかった。心房性ナトリウム利尿ペプチドの作用は、そのセカンドメッセンジャーであるcGMPによっても確認された。我々は、心房性ナトリウム利尿ペプチドがヘンレの太い上行脚では、バゾプレッシンによるcAMP産生を抑制しないことを報告しており、心房性ナトリウム利尿ペプチドの作用は、バゾプレッシンによるcAMP産生よりも先の過程においておこなわれるものと推定した。心房性ナトリウム利尿ホルモンにも、バゾプレッシンと同様に、酸塩基平衡調節作用があることが分かった意義が大きいと考えられる。腎臓におけるエリスロポエチン産生は、間質のfibroblastで行われると考えられてきた。しかし、その間質での産生を見るには、ヘマトクリット15%以下の極度の貧血状態にすることが必須であり、生理的な意味合いに疑問を持ち、in situ hybridization法で、尿細管、特に集合尿細管間在細胞で、正常状態では産生されることを明らかにした。尿細管では、腎臓の皮質部で産生され、近位尿細管、ヘンレの太い上行脚、遠位尿細管、集合尿細管での発現を検討したが、集合尿細管間在細胞で主に産生されることが分かった。アルドステロンの酸排泄に対する作用を考える上で、酸塩基関連輸送体への効果を個々に見てきたが、もっと上流に位置するアルドステロンの受容体であるミネラルコルチコイドレセプター(MR)の核内受容体としての役割の面からの検討を行い、私たちにとって、未知の分野ではあったが、おおむね、満足の行く結果が得られたと考えている。核内受容体の核内輸送は、cheperoneと呼ばれる輸送関連蛋白が関与するとされているが、非常に多くの蛋白が報告されており、さらに詳しく検討するとなると、たくさんの抗体を使用する必要があり、どこまで検討すべきかを考慮中である。
障害乳幼児を抱えて就労している保護者に対する地域の特色を生かした教育的サポート

本研究は、障害乳幼児を抱えて就労している母親に視点をあて、「母親の生活スタイル」「障害乳幼児を育てていく上でのストレス」「必要な教育的サポート」について明らかにするものである。平成15年度に障害乳幼児を育てている母親に対して8地区382名(回収率46%)にアンケート調査を行い、平成1617年度には障害乳幼児を養育しながら就労している母親66名に対して個別の面接調査を行い情報収集するとともに、地域の支援システムの実状も調査した。アンケート調査の結果で明らかに差の見られる地域の特性は、「同居家族の有無」や「交通の便」といった生活スタイル及び環境の違いであった。一方、インタビュー調査の結果からは地域の特性と密接に関係している内容は明確にはならなかった。このことから、地域状況が整備されていても、未整備であっても、その如何に関わらず、保護者はさらによりよい、状況を求めているということが考えられた。地域の支援システムとしては、「母子保健・幼保・学校の現場レベルで連携のとれている地域」「母子保健・幼保・学校が独立している地域」「行政レベルで明確なシステムのある地域」に整理された。また、障害乳幼児を養育している保護者は、小さなことにイライラしたり、日々の生活から解放されたいという気持ちを日常的に持っていたりする一方で、生活に頑張り甲斐や楽しさも感じていた。そして、就労している保護者よりも、就労していない保護者の方が子育てに関する悩みを感じており、特に「孤立感や孤独感」に差が見られた。これらのことから、障害乳幼児を抱えている保護者を支援していく視点として、就労の有無や同居家族の有無よって悩みの内容が異なることや、保護者一人ひとりのライフスタイルを尊重した上での支援が重要であると考えられた。なお、本研究の成果報告書を作成し、関係機関等に配布した。本研究は、障害のある乳幼児を育てている保護者を対象にその生活の実態を把握し、支援のあり方を検討することが目的である。北海道旭川市・福島県いわき市・群馬県藤岡市・横浜市・富山県黒部市・静岡県沼津市・山口県山口市・福岡県古賀市にある8ヵ所の障害児関係機関に所属する職員に研究協力を依頼し、アンケート用紙の配布を依頼した。アンケート調査の対象は、その地域に在住する10歳以下の障害乳幼児を抱えている保護者(養育者)であり、アンケートの内容は(1)養育者の生活スタイル、(2)障害乳幼児を育てていく上でのストレス、(3)必要な教育的サポートに関する29項目からなる「養育者の生活スタイル調査」である。アンケートは、831通発送し、382通(回収率46%)の回収があった。アンケート結果については、現在、集計・分析中であるが、これまでに分かったこととして次のようなことが挙げられる。アンケートの記入者や子どもと関わる時間の多いのは、母親が多く、その結果はどの地域も共通しているが、同居している人数や近隣に住んでいる親族数等は、地域によって差があった。この結果は「地域の特色を生かした」サポートということの重要性をあらためて考えさせられた。また、養育者の生活は、食事・入浴・睡眠などをゆったりととることはあまりなく、日々、疲れている状況であることが結果から示されている。また、子どもの障害の違いによって、子育てに対する気持ちやイメージに違いがあることが予想された。この集計・分析は、来年度も継続して行う予定である。さらに、来年度は、個別のインタビュー調査で保護者に直接会って、調査では分かりにくい生の声を聞き、アンケート調査の内容をより実態の見えるものにしていく計画である。

1)昨年度実施した「障害児の主たる養育者の生活スタイル調査」の結果を分析し、日本特殊教育学会第42回大会(平成16年9月)及び、日本発達心理学会第16回大会(平成17年3月)において発表した。主な結果として、子育て中の悩みとしては、仕事や趣味を制約されるとか、話し合える人がいない等の状況が明らかになった。また、就労している母親についてみると、その職種は、パートやアルバイトが最も多かった。2)6月に研究協議会を開催し、調査結果についての協議を研究協力者とともに行った。3)就労している母親を対象に個別のインタビュー調査を実施するために、調査項目の作成を行った。4)研究協力者に地域で就労して障害乳幼児を抱えている保護者の紹介を依頼し、8月から平成17年2月にかけて7地区で個別のインタビュー調査を実施した。5)2月に研究協議会を開催し、インタビュー調査に関する中間報告を行い、研究協力者から、地域の支援システムの情報を求めた。なお、今年度実施したインタビュー調査は、調査に了解の得られた保護者を対象とし、記録用紙には個人名を記載しない等プライバシーの保護には十分配慮した。1)6月に山口市を訪問し、研究協力者から紹介された障害児を抱えて就労している保護者12名に対してインタビュー調査を行った。この調査で予定していた8地区のインタビュー調査をすべて終了し、合計66名の保護者から回答を得た。2)16年度から実施してきた「障害児を抱えて就労している保護者へのインタビュー調査」の結果を検討・分析し、日本特殊教育学会第43回大会(平成17年9月)において発表した。就労しながら障害児を養育している保護者が必要としている支援としては、公的なサービスの充実、職場環境の改善、子どもの受け入れ場の設置、職員・機関の資質向上等であることが明らかになった。3)本研究をまとめるにあたり、初年度に実施した「養育者の生活スタイル調査」(アンケート調査)の結果と上述のインタビュー調査との結果の関連性について、所内研究分担者と協議を重ねた。4)1月に研究協議会を開催し、本研究の考察及びまとめの方向性について提案し、研究協力者からの意見を聴取し、協議を行った。5)研究協議会の結果を踏まえ、研究報告書を作成した。なお、報告書は全国都道府県の教育委員会、関係機関等に配布する予定である。今年度実施したインタビュー調査は、調査に了解の得られた保護者を対象とし、インタビューの記録用紙には個人名を記載しない等プライバシーの保護には十分配慮した。また、学会発表の内容も個人が特定できないように配慮した。
DNAメチル化異常のナノ分解能１分子標本検査デバイスの開発

本研究では、近年がん診断マーカーとしての有用性が報告されているDNAメチル化異常を検出対象として、DNAの病理検査デバイスの開発を実施した。実験的にメチル化を発生させたDNAを早期がん由来のメチル化異常を持つDNAのモデルとして使用し、DNAメチル化部位の染色、メチル化DNAの伸長、及び画像解析を行う微小流体デバイスを開発した結果、血液1mL中に数十ng程度含まれる腫瘍由来の血中遊離DNAに相当するサンプルからDNAを標本化し、DNAメチル化異常を画像検査する技術を確立することに成功した。本研究は、DNAメチル化異常を持つがん細胞を対象に、分子・細胞レベルの病理検査デバイスの開発を実施するものであり、本年度は、DNAメチル化部位の染色、メチル化DNAの1分子伸長、及びメチル化DNAの1分子画像検出を行った。DNAメチル化部位の染色は、Methyl Binding Domain Protein-Biotin (MBD)を介してFluoronanogold-Streptavidin Alexa Fluor 546(FNG)を標識することで達成した。メチル化DNAの1分子伸長は、DNA溶液送液用マイクロ流路チップとDNA固定用ジグザグ溝構造チップの二種類のシリコーン樹脂製チップを張り合わせて作製したデバイスによって達成した。メチル化DNAの1分子画像検出は、メチル化部位を染色したDNA溶液をシリンジポンプによってデバイス中に流した後、ジグザグ形状の溝構造のパターン上に固定されたDNAを全反射蛍光顕微鏡で観察することで達成した。DNA固定用の溝構造に関しては、ジグザグの形状・寸法を検討し、最も固定化率の高いパターンを実験的に求めることに成功した。MBDを介したFNGによる標識に関しては、MBDとFNGの最適混合比を検討し、メチル化DNAの染色のプロセスを確立した。デバイスのDNA分子に対する捕捉率は約70%を達成し、一度に約1,500本のDNA分子を伸長固定することに成功した。本研究は、DNAメチル化異常を持つがん細胞を対象に、分子・細胞レベルの病理検査デバイスの開発を実施するものであり、本年度は昨年度のメチル化DNAを伸長固定するデバイスの研究実績を発展させた研究として、本デバイスを用いた1分子レベルの測長によるメチル化DNAと非メチル化DNAの同定試験を行った。メチル化DNAと非メチル化DNAの測長は、インターカレーター色素YOYO-1で染色したDNA分子をデバイス上で並列伸長し、全反射蛍光顕微鏡で観察することにより達成した。測長によるメチル化DNAの同定は、200分子の計測結果を統計解析することで達成した。メチル化DNAは非メチル化DNAに比べて分子の剛性がアップし、伸長が20%程度抑制されることを明らかにした。同様の1分子レベルの測長を48.5kbpと17kbpの非メチル化DNAに適用した実験により、非メチル化DNAのサイズ分離検出を達成した。また、メチル化DNAを伸長固定する本デバイスを細胞向けにカスタマイズし、メチル化DNAを含むがん細胞を1細胞ずつ並べて捕捉する技術開発を進めた。がん細胞用の捕捉構造に関しては、溝構造の形状・寸法を検討し、単一細胞の捕捉率が最も高いパターンを実験的に求めることに成功した。がん細胞を含む懸濁液の導入に関しては、ピペッティングと重力沈降を組み合わせた手法を新たに検討し、従来のポンプを用いた手法を大幅に簡易化したプロトコルを確立した。本研究の目的は、がん細胞やがん細胞由来の診断マーカーを固定化(標本化)するデバイスを作製することにより、がん細胞が増殖を開始する前の段階から実施可能な細胞・分子計測技術を新たに構築し、早期がんに関連する病理検査学的進展を達成することである。本年度は、昨年度の研究実績の応用開発により、メチル化DNA分子の測長技術、メチル化DNAと非メチル化DNAの分離・同定技術、及びがん細胞の1細胞捕捉技術を開発できており、現在までの達成度はおおむね順調に進展している。本研究は、DNAメチル化異常を持つがん細胞を対象に、分子・細胞レベルの病理検査デバイスの開発を実施するものであり、本年度は昨年度のメチル化DNAを含むがん細胞を1細胞ずつ並べて捕捉する技術開発の研究実績を発展させた研究として、本技術を市販の樹脂フィルムとシーリングチャンバーで実現する実用化デバイスのプロトタイピングを行った。樹脂フィルムにはフォトリソグラフィーとドライエッチングにより数万から数十万の微細孔加工を施し、プラズマによる親水化処理を行うことで樹脂フィルム表面の濡れ性を向上させ、これをシーリングチャンバーと組み合わせて使用することで、ピペッティング操作のみにより細胞懸濁液を微細孔へほぼ100%導入することを実現した。一方、プラズマによる親水化処理は、市販の高分子剤を用いたコーティング処理で代用可能なことを明らかにし、微細孔内にがん細胞を1細胞ずつ捕捉する確率を向上させた。コーティング処理後の表面上では、がん細胞を容易に操作することが可能となり、微小標的の吸引・採取システムを利用することで、1細胞捕捉したがん細胞の回収に成功した。また、回収後のがん細胞に対する1細胞由来のDNAからメチル化異常を遺伝子解析し、1細胞から培養する技術開発に向けて、がん細胞表面の染色技術の開発を進めた。染色液の希釈率や染色用抗体の条件を実験的に検証し、樹脂フィルムがもつバックグラウンドノイズと区別可能な染色プロトコルを確立した。

本年度は、メチル化DNAを含むがん細胞を1細胞ずつ並べて捕捉するデバイスのプロトタイピング、1細胞捕捉したがん細胞の回収、がん細胞表面の染色技術を開発できているが、主な実験を担当する大学院生が年度後半に膿瘍治療のため長期入院する事態が起こり、当初計画していた1細胞由来のDNAからメチル化異常を遺伝子解析する技術開発や、回収後のがん細胞を1細胞から培養する技術開発に遅れが生じた。本研究は、DNAメチル化異常を持つがん細胞を対象に分子・細胞レベルの病理検査デバイスの開発を実施するものであり、本年度は昨年度に生じた遅れを補完する実験実施に向けて補助事業期間を1年間延長し、当初計画していた1細胞由来のDNAからメチル化異常を遺伝子解析する技術開発を進めた。これまでの研究により、メチル化DNAを含むがん細胞を1細胞ずつ並べて捕捉するデバイスのプロトタイピング、1細胞捕捉したがん細胞の回収、がん細胞表面の染色技術を開発できていたため、本年度はリアルタイムPCRによる核酸成分の微量検出と変異検出を通じて、がん細胞のDNAを遺伝子解析するプロトコルの開発を行った。微小標的の吸引・採取システムの利用に加え、がん細胞を捕捉した樹脂フィルムから直接DNA抽出とDNA増幅を行った後に定量PCRを行う試験を実施し、がんに関連した細胞株(H1975)が持つ上皮成長因子に対応する二種の遺伝子(T790M、L858R)を対象にPCR条件を検証した結果、樹脂フィルム上に捕捉したがん細胞からターゲットの遺伝子変異を検出することに成功した。さらに、メチル化および非メチル化されている塩基を特異的に増幅してメチル化の状態を分析するMSP解析を行った。CpG配列のメチル化状態に応じて配列が変わる塩基部位に対して、メチル化DNA検出用プライマーと非メチル化DNA検出用プライマーを設計してPCRを行った結果、増幅の有無によりメチル化または非メチル化が識別できることを確認した。本研究では、近年がん診断マーカーとしての有用性が報告されているDNAメチル化異常を検出対象として、DNAの病理検査デバイスの開発を実施した。実験的にメチル化を発生させたDNAを早期がん由来のメチル化異常を持つDNAのモデルとして使用し、DNAメチル化部位の染色、メチル化DNAの伸長、及び画像解析を行う微小流体デバイスを開発した結果、血液1mL中に数十ng程度含まれる腫瘍由来の血中遊離DNAに相当するサンプルからDNAを標本化し、DNAメチル化異常を画像検査する技術を確立することに成功した。本研究の目的は、がん細胞やがん細胞由来の診断マーカーを固定化(標本化)するデバイスを作製することにより、がん細胞が増殖を開始する前の段階から実施可能な細胞・分子計測技術を新たに構築し、早期がんに関連する病理検査学的進展を達成することである。本年度は、実験的にメチル化を発生させたDNAを早期がん由来のメチル化異常を持つDNAのモデルとして使用し、DNAメチル化部位の染色技術、メチル化DNAの1分子伸長技術、及び1分子画像検出技術を予定通り開発できており、現在までの達成度はおおむね順調に進展している。