hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
粘膜免疫機構の破綻を誘起する胸腺外分化T細胞の分子細胞生物学的解析

T細胞TCRVβ12、Vβ13サブセットに観察されたバイアスをDNA塩基配列レベルでも検討した.その結果,個体、系統、飼育環境を問わないパブリックな病態形成性T細胞はその抗原認識領域(CDR3 motif)としてSer-Ala-Thr-Gly-Asn-Tyr-Ala-Glu-GlnないしSer-X-Asp-Trp-Glyというアミノ酸配列を有することが明らかになった。今後このモチーフをシーズとしたヒトの粘膜標的型慢性炎症性疾患の治療ないし予防診断薬の開発に期待がもたれる.1993年以降,各種遺伝子欠損マウスに慢性腸炎が自然発症することが報告され,いずれも大腸粘膜を中心にヒトの炎症性腸疾患(IBD)に酷似した病変を認める.その一つであるIL-2 receptor γchain欠損マウスはサイトカインの共通信号伝達因子であるγchainを欠損しており,IL-4,IL-7,IL-9,IL-15の機能が不全となる(Disanto JP et al.Immunology 92,1995).このマウスはNK細胞の消失,T,B細胞の減少,胸腺や末梢リンパ組織の著明な低形成,パイエル板の消失,脾腫などを特徴とする.申請者らは,cγ^</Y>マウスではCD4T細胞の腸管への著明な浸潤に随伴して生後8週より大腸炎を自然発症することを見い出した.しかし無胸腺cγ^<2/Y>マウスではまったく腸炎の発症がみられなかった.このことよりIL-2レセプターγ鎖(cγ鎖)欠損マウスでの腸炎の発症機序としてcγ鎖欠損に起因するCD8ααT細胞の欠損と胸腺由来のCD4T細胞の機能異常の関与が強く示唆された.さらに申請者らはImmunoscope法ならびにFlow cytometryによる解析から病変部大腸に著明に浸潤するCD4^+T細胞はTCR Vβ6,Vβ8.1,Vβ8.2,Vβ14など限られたレパトアusageを示すことを確認し,IBDの病態形成に深く関わっていることを明らかにした.さらにこの病原性CD4^+T細胞は腸内環境抗原の刺激によってポリクローンレベルでの増殖,抗原認識を示すことが明らかになった.次年度はサイトカイン産生能,受身移入実験による腸炎発症能について検討する.さらにこれまでその生理的役割がかならずしも明確でなかった胸腺外分化CD8ααT細胞ないしγδT細胞の粘膜免疫での機能の一端を明らかにする.IL-10は抗炎症性の制御系サイトカインとして、各種炎症性細胞、特に活性化マクロファージやTh1型のCD4T細胞の過剰な反応を抑制し、免疫システムの生理学的な恒常性の維持に重要な役割を果たしてる。このことはIL-10遺伝子を欠損した遺伝子改変(KO)マウスにおいて自発的に消化管に限局したヒトの炎症性腸疾患のひとつであるCrohn病に酷似した慢性大腸炎をひき起こすことより明確に示された.このことから本マウスはヒトにおける炎症性腸疾患の病態解明に役立つモデルとして利用されている.IL-10 KOマウスの慢性腸炎の発症には、主としてTh1型のサイトカインを産生するCD4T細胞が病態形成性T細胞として深く関与していることが数多くの研究より明らかにされている。
フクロウ類の巣に生息する鱗翅目昆虫の系統地理学・進化生態学的研究

研究の結果、5種類のフクロウ種の巣の鱗翅類相が調査され、17種の蛾類が識別された。シマフクロウの巣からNiditinea striolella(Tineidae)(Agonopterix sp)、(Elachistidae)、フクロウの巣からはMonopis longella(=pavlovskii)、M. flavidorsalis、M. sp。M. congestella、Niditinea baryspilas、N. striolella、Tineidae sp。(Tineidae)、Martyringa ussuriella(Oecophoridae)、Mabra charonialis(Crambidae)、Pyralis regalis(Pyralidae);アオバズクの巣からTinea translucens, Niditinea baryspilas(Tineidae)、リュウキュウオオコノハズクの巣からOpogona sacchari(O. sp)、Phaeoses sp。ダイトウコノハズクの巣からOpogona sacchari、Phaeoses sp、Setomorpha sp。(Tineidae)、Endotricha theonalis(Pyralidae)、が発見された。これらのことから、フクロウおよび蛾の関係、生態系エンジニアとしての鳥の巣の役割が明らかになった。日本列島に生息するフクロウ類5種の巣に共生する鱗翅目昆虫相についての野外調査を行った。初年度の調査の結果、リュウキュウオオコノハズクの巣からは3種のヒロズコガ類、ダイトウコノハズクの巣からは2種のヒロズコガ類と1種のメイガが,フクロウの巣からは、クロスジイガが初めて確認された。シマフクロウの巣からは、クロスジイガとクサモグリガ科sp.,アオバズクの巣からは、イガとウスロイガが出現した。これらのどの種も日本未記録種もしくは新種である可能性が高く、このグループの蛾類の多様性を改めて証明するものになった。調べたフクロウ類の巣内は、動物性タンパク質が多量に堆積しているにもかかわらず、腐敗臭もなく、巣内のヒナの生息にとって清潔な環境に保たれていることがわかった。このことから、巣内共鱗翅目昆虫が、巣内の清掃者として、フクロウに相利共生的な利益をもたらす重要な役割を演じていることが推察された。これらの成果は、2010年3月に東京大学で開催された日本生態学会大会で「フクロウ類の巣に共生する鱗翅目昆虫相」というタイトルで発表した。またフクロウ以外の巣についても調べた結果、南大東島のモズの巣やウチヤマセンニュウの巣も蛾類が利用していることが判った。またコウノトリの巣からはアカマダラハナムグリと思われる幼虫を多数見つかった。樹洞性のブッポウソウからはウスグロイガが、同じくヤマガラの巣からはマエモンクロヒロズコガとフタモンヒロズコガが羽化した。これらの成果のうちコウノトリの巣に関するものについては、2009年12月に兵庫県立人と自然の博物館で開かれた日本昆虫学会と日本鱗翅学会の合同支部大会で発表し、日本昆虫学会誌「昆虫(ニューシリーズ)」に投稿した。さらに日本鳥学会誌、山階鳥研報などの鳥類学関係の雑誌と国際的な生態学関連の雑誌に投稿すべく、準備中である。今年度の調査の結果、リュウキュウオオコノハズクの巣からは3種のヒロズコガ類、ダイトウコノハズクの巣からは2種のヒロズコガ類と1種のメイガが,フクロウの巣からは、クロスジイガが初めて確認された。シマフクロウの巣からは、クロスジイガとクサモグリガ科sp.、アオバズクの巣からは、イガとウスロイガが出現した。またフクロウ以外の巣についても調べた結果、南大東島のモズの巣やウチヤマセンニュウの巣も、蛾類が利用していることが判った。

またコウノトリの巣からはアカマダラハナムグリと思われる幼虫を多数見つかった。樹洞性のブッポウソウからはウスグロイガが、同じくヤマガラの巣からはマエモンクロヒロズコガとフタモンヒロズコガが羽化した。調べたフクロウ類の巣内は、動物性タンパク質が多量に堆積しているにもかかわらず、腐敗臭もなく、巣内のヒナの生息にとって清潔な環境に保たれていることがわかった。このことから、巣内共生鱗翅目昆虫が、巣内の清掃者として、フクロウに相利共生的な利益をもたらす重要な役割を演じていることが推察された。これらの成果は、2010年9月に東邦大学で開催された日本鳥学会大会で「フクロウ類の巣に共生する鱗翅目昆虫相」というタイトルで発表した。また日本昆虫学会2010年度大会において、「南大東島のモズの自然巣から羽化した鱗翅類」を発表した。さらに総説と紹介を日本自然保護協会の機関誌『自然保護』2010年10月号に執筆した。さらに日本鳥学会誌、山階鳥研報などの鳥類学関係の雑誌と国際的な生態学関連の雑誌に投稿すべく、準備中である。23年度は、フクロウに加えて、コウノトリ(兵庫県)、カワウ(滋賀県)、ブッポウソウ(岡山県)、ルリカケス(奄美大島)の巣に共生する鱗翅目及び鞘翅目昆虫相について、広範な地域での野外調査を行った。今までに12科19種の鳥類の巣,202巣を調査したところ,10科29種の鱗翅類の生息を確認したリュウキュウオオコノハズクの巣からは3種のヒロズコガ類、ダイトウコノハズクの巣からは2種のヒロズコガ類と1種のメイガが,フクロウの巣からは、クロスジイガが初めて確認された。シマフクロウの巣からは、クロスジイガとクサモグリガ科sp.、アオバズクの巣からは、イガとウスロイガが出現した。これらのどの種も日本未記録種もしくは新種である可能性が高く、このグループの蛾類の多様性を改めて証明するものになった。また南大東島のモズの巣やウチヤマセンニュウの巣も、多くの蛾類が利用していることが判った。これらの成果は、2011年9月に大阪市大で開催された日本鳥学会大会で「鳥の巣に共生する昆虫相」というタイトルでシンポジウムを開催した。また日本昆虫学会2011年度大会において、発表した。さらに3つの論文をStrix,誘蛾灯、Zoological Journalに掲載した。現在、さらに数本の論文を、日本鳥学会誌、山階鳥研報などの鳥類学関係の雑誌と国際的な生態学関連の雑誌に投稿すべく、準備中である。
描画心理検査を適用した家族のだんらん像の分析と住居内集まり空間の計画再考

本研究は、描画心理検査「動的家族描画法」を適用して、家族に住居の集まり空間とだんらん生活がどのように意識されているか、そのだんらん像と形成要因を明らかにすることを目的としている。「あなたの家族のみんなについて、住宅内で何かしているところを絵に描いてください」という教示の描画検査を、大学・短大生102例(有効数、父親11、母親23、子ども115)で集団・個別施行を行い、併せて、住宅平面の実測・住まい方・一日断面の生活時間調査を行い、分析を行った結果、以下のような知見を得た。1.描画の特徴をみると、成員が全員同じ部屋4割、一部異なる部屋3割、全員異なる部屋3割で、同じ部屋はLとDがほとんどである。成員別で特徴的なことは、父親は全員で食事行為か、全員別々の部屋・行為を描く傾向が強いのに対し、母親は全員同じ場所・同じ行為を描く傾向が強いこと、子どもは行為・位置に関して成員の区別が比較的明瞭なのに対し、親は子どもの区別があいまいなことである。また、世帯ごとの成員間の相違では、描画は概ね成員間で同様の傾向を示し、対局的な描画は2割にすぎない。家族成員で描かれるだんらん像が異なるものの、生活実態、特に一日の生活の流れにおけるだんらんの時間帯の習慣による影響が大きい。2.住宅プランとの関連では、空間の規模や家具類・設備の充実したLやDに家族の豊かな行為の種類が描かれ、逆に、これが貧困な場合は限定的な行為が、さらに、個室が相対的に充実した場合は、個室での行為の描画が多くなるなど、特定の部屋の空間的充実を反映した描画の傾向がみられる。また、描画の中の成員の位置・行為関係は、部屋間の分節・連続の空間形態をよく反映しているが、全員異なる部屋・行為を描いている場合は、住宅プランとの関係はあまりみられない。
強誘電性高分子複合薄膜の機能設計と作成プロセスの研究

高効率の光電変換膜の構築を目的として,本年度は顕著な強誘電性高分子であるP(VDFーTrFE)に光導電性色素であるビニルカルバゾ-ルVKとトリニトロフルオレノンTNFをド-プした複合薄膜の光電導性に及ぼす分極の影響を調べた.また,効率のよい光電子発生分子系の開発を目的としていくつかの新しい分子系の開発を行った.さらに,焦電効果を利用する微小熱検出の可能性と,焦電性と圧電性の低温特性と高温特性のよい薄膜を検討した.P(VDFーTrFE)複合膜の光電導性に関して次のことが分かった.すなわち膜をポ-リングによって分極を一定方向に揃えた場合にはじめて大きい光電導性が生じ,光電流の大きさは分極Prが小さい場合にはほぼ分極量に比例し,大きい場合には一定となる.一方,低温での光誘起ESR吸収を与える電子と正孔の発生確率はポ-リングをの有無で大きい影響を受けない.これは,光によるキャリヤ-の発生初期過程(電子ー正孔対の発生)では局所的な電場に大きく影響されること,電子ー正孔対の分離,あるいは膜中の輸送過程で方向性のある強誘電性の内部電場に影響されることを示している.このような強誘電性高分子薄膜内の電子,正孔の動的挙動を今年度に導入した窒素ガスレ-ザ-によるパルス光照射とディジタル・オシロスコ-プによって定量的に調べている.興味ある光電物性をもつ複合薄膜を開発する目的で,芳香族ジアミン系ラジカル塩,可溶性フタロシアニン系金属錯体,ポリシランなどを合成し,複合薄膜の光学的,電気的,磁気的性質を調べた。今後,強誘電性高分子と色素複合薄膜の光電変換における電子の発生,消滅,輸送現象を動的に測定し,それぞれのメカニズムを明らかにするとともに,電荷の発生と薄膜表裏への電荷輸送を効率よく行うドナ-・アクセプタ-分子系の探索,複合膜の非線形光学効果の追求,複合薄膜の焦電効果の応用素子の研究を行う予定である.高効率の光電変換膜の構築を目的として,本年度は顕著な強誘電性高分子であるP(VDFーTrFE)に光導電性色素であるビニルカルバゾ-ルVKとトリニトロフルオレノンTNFをド-プした複合薄膜の光電導性に及ぼす分極の影響を調べた.また,効率のよい光電子発生分子系の開発を目的としていくつかの新しい分子系の開発を行った.さらに,焦電効果を利用する微小熱検出の可能性と,焦電性と圧電性の低温特性と高温特性のよい薄膜を検討した.P(VDFーTrFE)複合膜の光電導性に関して次のことが分かった.すなわち膜をポ-リングによって分極を一定方向に揃えた場合にはじめて大きい光電導性が生じ,光電流の大きさは分極Prが小さい場合にはほぼ分極量に比例し,大きい場合には一定となる.一方,低温での光誘起ESR吸収を与える電子と正孔の発生確率はポ-リングをの有無で大きい影響を受けない.これは,光によるキャリヤ-の発生初期過程(電子ー正孔対の発生)では局所的な電場に大きく影響されること,電子ー正孔対の分離,あるいは膜中の輸送過程で方向性のある強誘電性の内部電場に影響されることを示している.このような強誘電性高分子薄膜内の電子,正孔の動的挙動を今年度に導入した窒素ガスレ-ザ-によるパルス光照射とディジタル・オシロスコ-プによって定量的に調べている.興味ある光電物性をもつ複合薄膜を開発する目的で,芳香族ジアミン系ラジカル塩,可溶性フタロシアニン系金属錯体,ポリシランなどを合成し,複合薄膜の光学的,電気的,磁気的性質を調べた。今後,強誘電性高分子と色素複合薄膜の光電変換における電子の発生,消滅,輸送現象を動的に測定し,それぞれのメカニズムを明らかにするとともに,電荷の発生と薄膜表裏への電荷輸送を効率よく行うドナ-・アクセプタ-分子系の探索,複合膜の非線形光学効果の追求,複合薄膜の焦電効果の応用素子の研究を行う予定である.
エナメル芽細胞分化制御に関わる新しいWntシグナル経路の展開

Wntシグナル経路は歯の形態形成期に重要な役割を果たしている。これまでの研究で、歯の発生初期に特異的に発現する遺伝子を網羅的に解析し、Plakophilin 1 (PKP1)を同定した。PKP1はdesmosome結合の構成因子として細胞間接着に関与するとともに、Wntシグナル伝達因子beta-cateninと相同性をもつarmadillo repeatdomainを有する。本研究では歯の発生時期のPKP1の細胞内局在の変化を解析し、PKP1が歯の発生初期ではWntシグナル調節因子として歯の形態形成に関与し、エナメル芽細胞分化期になると細胞膜でエナメル芽細胞分化を制御している可能性を示した。外胚葉性異形成/皮膚脆弱症候群に関与するPlakophilin 1(Pkp1)は、細胞間接着に関与していることが知られているが、歯の発生における細胞接着分子としてのPKP1の役割は未だ不明である。本年度は、エナメル芽細胞分化におけるPkp1の役割を解明することを目的とした。マウス胎生11日齢(E11)、E13、E14、E15、E16、生後1日齢(P1)、P3およびP7マウスの歯胚からRNAを抽出し、RT-qPCR法および免疫染色法にて発現パターン解析を行った。Pkp1は、歯および皮膚に強く発現し、エナメル芽細胞分化につれて発現が増加した。器官培養系においてPkp1を抑制させると、歯胚の大きさが減少し、歯原性上皮細胞の増殖を抑制した。歯原性上皮細胞株をCa2+にて刺激すると、PKP1は細胞膜へとその局在を変化させた。我々はこれまでの研究で、PKP1はエナメル芽細胞においてtight junctionの構成分子の一つであるZona Occludens 1(ZO-1)と共局在していることを明らかにしている。そこで、siRNA ZO-1によりZO-1の発現を抑制すると、siRNA Pkp1と同様に細胞-細胞接着を阻害することを発見した。さらに、Pkp1抑制はtight junctionにおけるZO-1局在化を阻害し、エナメル芽細胞分化を抑制した。これらの2種類のタンパク質は、免疫沈降により直接的な相互作用を示した。以上の結果よりPKP1が、エナメル芽細胞分化段階において細胞接着分子を介して、エナメル芽細胞分化の中心的な役割を果たすことを示すことが判明した。エナメル芽細胞におけるPKP1とZO-1の細胞膜における機能の評価がある程度完了した。外胚葉異形成/皮膚脆弱症候群に関与するPlakophilin 1(PKP1)は細胞間接着に関与していることが知られているが、歯の発生における詳細な機能は不明である。これまでの研究で、PKP1はWnt刺激によって核内に移行し、転写調節因子として働く可能性を示してきた。今回は、Wntシグナル制御下でのPKP1の役割を解明することを目的として研究を開始した。本年度は、PKP1のWntシグナル制御下での細胞内での局在の変化を、リアルタイムに検出するために、PKP1-GFP融合発現ベクターを作製し、研究を行った。歯原性上皮細胞株であるCLDE細胞にPKP1-GFPを遺伝子導入し、Ca2+にて刺激すると、PKP1は細胞膜に局在した。Wnt刺激後、タイムラプス蛍光顕微鏡でPKP1の局在変化を観察したところ、細胞膜に局在したPKP1が核内に集積する様子が観察できた。以上の結果から、PKP1はWnt刺激により細胞膜から核内へと移行し、刺激を伝える可能性が示唆された。さらに、レポーターアッセイにより、PKP1はTCF/LEFプロモータ活性を持つことを発見した。これらの結果から、Wntシグナル伝達因子であるbeta-cateninと同様に、PKP1がWntシグナル伝達因子として働いている可能性が示された。以上の結果からTCF/LEF転写因子は転写調節因子であるbeta-cateninに結合するかPKP1に結合するかでその標的因子を変化させている可能性が示された。ZO-1は細胞膜に局在し、tight junction構成分子として機能するのに対し、PKP1はその局在を細胞膜から核内へと移行させる。今後はこの機能の違いを明らかにするため、PKP1の核内での役割と制御シグナルを明らかにする。29年度が最終年度であるため、記入しない。歯学29年度が最終年度であるため、記入しない。
血管内皮障害を基盤とする新規大動脈解離モデルの開発と分子病態の解明

野生型のC57Bl/6Jマウスに一酸化窒素合成酵素(NOS)阻害剤で内皮障害を惹起するL-NAME、血圧を上昇させるangiotensin II、リジルオキシダーゼ阻害剤で弾性線維の脆弱化を惹起するBAPNの3つの薬剤(以下LABと略記)を合わせて投与することで、高率に大動脈解離の発症を惹起し得る新規の薬剤誘発性大動脈解離モデルマウスを確立することに成功した。さらに、スタチンがLABモデルの大動脈解離発症を抑えること、その抑制効果には血管内皮細胞におけるERK5活性化が関与していることをマウスモデルおよびヒト臍帯静脈内皮細胞を用いて明らかにした。大動脈解離とは、血流が内膜の亀裂部より内膜と中膜の間に流れ込み、偽腔を形成した状態をいう。その発症には中膜の脆弱さや高血圧などが関与し、大動脈瘤の形成機序と一部共通であると考えられているため、これまで明確にその発症機序を区別し得る報告はなされていない。我々は、大動脈解離発症には中膜の脆弱化・血圧上昇に加え、内皮傷害が最終的な誘因として重要であると考えた。そこで、本研究では内皮機能障害を誘発する薬剤であるL-NAME(NOS阻害剤)を処置したマウスに対して大動脈瘤モデルとして利用されるAngiotensin II (AngII)+BAPN(リジルオキシダーゼ阻害剤)の投与を行うことで、新たな大動脈解離モデルマウスを作製することに成功した。C57Bl/6マウスに7週齢よりL-NAME (10mg/kg/day)の飲水投与を開始する。その後10週齢から6週間AngII+BAPNを浸透圧ポンプを用いて投与した。解離の有無は16週齢における大動脈組織切片のEVG染色にて評価した。その結果、大動脈解離発症率はAngII+BAPN投与群(AB群)に比べ、AngII+BAPN+L-NAME投与群(ABL群)で有意に上昇した。今回使用したL-NAME投与量においては両群間で血圧に有意な差は認められなかったが、10週齢ABL群ではeNOSの発現減少、NOの産生減少をそれぞれウエスタンブロッティング法、グリース法にて確認した。11週齢ABL群では、MMP2、MMP9の活性がAB群に比し有意に上昇していることがザイモグラフィーにて観察された。以上より、本モデルマウスは大動脈解離の病態メカニズムの解明に大変有用となると考えられる。本年度の研究目的はeNOS阻害薬(L-NAME)投与による薬物誘発性大動脈解離モデルを確立することであった。研究代表者らは内皮機能障害を誘発する薬剤であるL-NAME(NOS阻害剤)を処置したマウスに対して大動脈瘤モデルとして利用されるAngiotensin II (AngII)+BAPN(リジルオキシダーゼ阻害剤)の投与を行うことで、新たな大動脈解離モデルマウスを作製することに成功した。従って、当初の計画に従っておおむね順調に進展していると考えられる。大動脈解離は、大動脈壁が中膜レベルで二層に剥離し偽腔を形成した病態をいう。その発症機構は未だ解明されておらず、有効な治療法・予防法は確立されていない。その要因の一つとして、現時点では大動脈解離の適切なモデル動物が存在しないことが挙げられる。我々は、内皮機能障害を誘発する薬剤であるNω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)前投与により薬物誘発性血管内皮障害を惹起した後、Ang II + BAPNを投与する大動脈解離モデルの作製に成功した。一方、Extracellular signal-regulated protein kinase 5 (ERK5)は血管内皮細胞において抗アポトーシス作用、eNOS発現上昇、抗炎症作用等を有し、血管内皮保護シグナルの鍵分子として血管内皮機能の維持・保護に重要であることが報告されている。そこで我々は、ERK5-floxマウスをCdh5-Creマウスと掛け合わせて内皮特異的なERK5欠損マウスを作製した。flox/floxのホモ欠損マウスは胎生致死のためflox/-のヘテロ欠損マウスを使用する。ERK5欠損によって内皮機能が低下すると考えられるため、AngII + BAPN投与によってL-NAME負荷と同様な大動脈解離の発症を認めるか否か検討しているところである。少数の動物で行った基礎実験から、Cre-のコントロールマウスではAngII + BAPNで死亡例は認めなかったが、ERK5 flox/- Cre+の欠損マウスにAng II + BAPNを投与すると、投与開始後3週までに50%が大動脈破裂による死亡を認めた。現在、さらなる詳細な解析を進めているところである。本年度の研究目的は、ERK5-floxマウスをCdh5-Creマウスと掛け合わせて内皮特異的なERK5欠損マウスを作製することである。研究代表者らは内皮特異的なERK5欠損マウスの作製に成功した。さらにそのマウスに対して、解離誘発刺激(L-NAME + Ang II + BAPN)を与えて大動脈解離の解析を行っている。本研究課題において大動脈解離発症のリスクを高めると考えられている中膜の脆弱化・高血圧に加え、血管中膜へのエントリー、すなわち“血管内膜の破綻"を薬剤誘発性に惹起させることで大動脈解離を高率に発症するモデルマウスの確立に成功した。

最終年度では、ピタバスタチンと同様にERK5の活性化、一酸化窒素合成酵素(eNOS)発現上昇作用を有するポリフェノールの一種であるケルセチンが、LABモデルにおいて解離および大動脈破裂によるマウスの死亡率を有意に改善することを見出した。内皮細胞でのERK5活性化は、炎症性サイトカインであるtumornecrosis factor-αによる細胞接着分子(vascular cell adhesion molecule (VCAM)-1)の発現を抑制することがHUVECにおいて観察され、実際にLABマウスでもケルセチン投与によってVCAM-1発現の抑制が見られた。その結果、血管壁への炎症細胞浸潤が抑制されていることが、マクロファージ特異的マーカーであるMac-2の免疫染色およびF4/80のmRNA発現検討によって確認された。以上の結果から、内皮障害の存在が大動脈解離発症の鍵となっていることが明らかとなった。その分子メカニズムとしてeNOSによる内皮機能維持が重要であり、eNOSの低下が炎症細胞の浸潤、血管透過性の亢進などを惹起する。血管内皮細胞におけるERK5をピタバスタチンやケルセチンなど薬理学的手法によって活性化させることがeNOS発現の増加、すなわち内皮障害の改善による解離発症予防に有用である可能性が示唆された。野生型のC57Bl/6Jマウスに一酸化窒素合成酵素(NOS)阻害剤で内皮障害を惹起するL-NAME、血圧を上昇させるangiotensin II、リジルオキシダーゼ阻害剤で弾性線維の脆弱化を惹起するBAPNの3つの薬剤(以下LABと略記)を合わせて投与することで、高率に大動脈解離の発症を惹起し得る新規の薬剤誘発性大動脈解離モデルマウスを確立することに成功した。さらに、スタチンがLABモデルの大動脈解離発症を抑えること、その抑制効果には血管内皮細胞におけるERK5活性化が関与していることをマウスモデルおよびヒト臍帯静脈内皮細胞を用いて明らかにした。今後は新規大動脈解離モデルの病態機構を明らかにするため、大動脈解離における血管内皮障害・中膜脆弱化について組織学的・生化学的に評価する。さらに本モデルに対して、スタチン系薬物が大動脈解離病変、炎症反応、各種血液マーカー等に与える影響について組織学的、生化学的に検討する。ERK5-EKOマウスを用いて大動脈解離を誘発し、発症率及び病態悪化の有無を検討する。ERK5は血管内皮保護シグナルに重要な分子であるため、解離の誘導に際しl-NAMEによる血管内皮障害を必要としない可能性が考えられる。ゆえに、l-NAME非存在下でのERK5-EKOマウスの解離発症についても同時に検討を行う予定である。大動脈解離発症に関わる分子メカニズムを解析するため、培養血管内皮細胞及び培養血管平滑筋細胞を用いて詳細な解析を行う。またこれらのモデルに対するスタチンの効果を検討する。薬理学3月27日-29日にかけて開催された学会に参加したため、旅費の精算が間に合わず次年度への繰り越しが生じた。3月27日-29日の学会参加については、次年度に精算を行うこととする。
ナイジュリア人の歯科疾患実態調査(追跡調査)

調査隊は、ナイジェリアのイフI地区とその周辺住民についてProf.Hollist,Dr.Olusile,Dr.AjyaiーObe,Prof.Grillo,その他イフI大学歯学部スタッフの協力で、歯科疾患の疫学的追跡調査を行った。この調査は咀嚼システムの基礎的研究の一環であり、1980年の予備調査でスタ-トしてから1981年の本調査後、1986年に1回目の追跡調査を行い、今回、2回目の追跡調査が行われた。1981年の本調査以来追跡調査で実証されたイフI地区とその周辺住民における歯学的知的は次のようである。ナイジェリア人の子供は、歯垢、歯石沈着、歯肉炎が多く、口腔内の衛生状態は極めて悪いけれども、齲蝕罹患者率も齲蝕罹患歯率も低く、歯列の不正もなく、成人では、32本の歯には強い咬耗が見られた。今回の調査目的は、噛むことが咀嚼システムを構成している1)歯を含む末梢効果器系、2)効果器の感覚受容器から起こる感覚情報を脳に運び込む感覚入力系、3)効果器に咀嚼運動司令を送り出す中枢神経系などの生後の発達に影響するであろうという仮説を、ナイジェリア人の伝統的食生活を通じて検証することにあった。調査被検者と方法:本追跡調査は1991年10月28日から11月22日まで行われた。幼児学童は3、5、6、8、10、12歳の男女各30名づつ、それに5年前に調査された学童の追跡調査分を含めて1560名の小児と成人(14歳ー70歳まで)300名以上(農村部)が検診された。内訳は学童はイフI地区の農村部(アシパ、イヘIツモデ、モロ)で780名以上、都市部(イフI市内)で780名以上であった。成人では、歯の齲蝕、歯周疾患、歯及び歯列形態、咬合力、また歯の強い咬耗を伴って起こる顎関節の改造形態のX線関節撮影並びにデンタルX線検査が行われた。また、278名の上下顎の研究用顎模型が印象採得された。その他に130軒の家庭での食生活と育児並びに老人の実態が訪問調査された。19歳未満のX線被験者にはすべて両親の承諾書が提出された。調査結果:1.ナイジェリア人の子供の齲蝕については、都市部、農村部ともに10年前あるいは5年前と比べて齲蝕罹患者率は増加しておらず、成人でも口腔の清掃状態はよくないにも拘らず齲蝕は殆ど見られなかった。その詳細はコンピュ-タ入力のためマ-クシ-トを整理分析中。2.ナイジェリア人の歯、歯列弓及び顎顔面の形態の研究では、離乳後の食生活でよく噛んで食べると、咬合力の機械的刺激によって歯は咬耗し、顎の発育は促進させられるので、日本人と全く食文化の異なるナイジェリア人(学童、成人)の歯列弓、歯形態を精査し、頭部X線規格写真と照合しながら比較解析して、どのような相違が見られるかを検討する。278名の研究用顎模型をアルジネ-ト印象材で採得し、Hermanの歯齢で、IIa期89名,IIIa期44名,IVa期57名,Va期88名について犬歯間幅径、歯列長径、歯冠幅径を計測中。3.ナイジェリア人の食習慣に関する調査(窪田・大沢):130軒の家族の主婦に訪問してその食習慣と育児食、家族構成などを調査分析中。4.歯の咬耗に伴う顎関節頭形態の改造変形のX線写真像で解析中。5.顎顔面形態の頭部X線規格写真によって頭蓋の発達を咬合力測定結果とを対比させながら解析中。6.歯周疾患の実態調査とX線学的調査では、歯垢、歯石、歯肉炎の各項目とCPITNインデックスによる歯周疾患治療必要度を検索中。学童の口腔清掃状態は前回調査時より改善されておらず、歯垢、歯石沈着は著しく、歯肉炎は高頻度に見られたが歯周炎に移行しているものは極めて少なく、大部分が初期治療を必要とするものであった。永久歯列期の100名についてデンタルX線写真(10枚法)で検索中だが、歯槽骨吸収度には加齢的に増加する傾向が見られているが、歯周炎の発症率は強く抑制されている。子供では、過去10年間、齪蝕罹患者率は殆ど増えていない。その原因が何処に在るのか、その究明が将来必要である。

ナイジェリア人の子供は、歯垢、歯石沈着、歯肉炎が多く、口腔内の衛生状態は極めて悪いけれども、齲蝕罹患者率も齲蝕罹患歯率も低く、歯列の不正もなく、成人では、32本の歯には強い咬耗が見られた。今回の調査目的は、噛むことが咀嚼システムを構成している1)歯を含む末梢効果器系、2)効果器の感覚受容器から起こる感覚情報を脳に運び込む感覚入力系、3)効果器に咀嚼運動司令を送り出す中枢神経系などの生後の発達に影響するであろうという仮説を、ナイジェリア人の伝統的食生活を通じて検証することにあった。調査被検者と方法:本追跡調査は1991年10月28日から11月22日まで行われた。幼児学童は3、5、6、8、10、12歳の男女各30名づつ、それに5年前に調査された学童の追跡調査分を含めて1560名の小児と成人(14歳ー70歳まで)300名以上(農村部)が検診された。内訳は学童はイフI地区の農村部(アシパ、イヘIツモデ、モロ)で780名以上、都市部(イフI市内)で780名以上であった。成人では、歯の齲蝕、歯周疾患、歯及び歯列形態、咬合力、また歯の強い咬耗を伴って起こる顎関節の改造形態のX線関節撮影並びにデンタルX線検査が行われた。また、278名の上下顎の研究用顎模型が印象採得された。その他に130軒の家庭での食生活と育児並びに老人の実態が訪問調査された。19歳未満のX線被験者にはすべて両親の承諾書が提出された。調査結果:1.ナイジェリア人の子供の齲蝕については、都市部、農村部ともに10年前あるいは5年前と比べて齲蝕罹患者率は増加しておらず、成人でも口腔の清掃状態はよくないにも拘らず齲蝕は殆ど見られなかった。その詳細はコンピュ-タ入力のためマ-クシ-トを整理分析中。2.ナイジェリア人の歯、歯列弓及び顎顔面の形態の研究では、離乳後の食生活でよく噛んで食べると、咬合力の機械的刺激によって歯は咬耗し、顎の発育は促進させられるので、日本人と全く食文化の異なるナイジェリア人(学童、成人)の歯列弓、歯形態を精査し、頭部X線規格写真と照合しながら比較解析して、どのような相違が見られるかを検討する。278名の研究用顎模型をアルジネ-ト印象材で採得し、Hermanの歯齢で、IIa期89名,IIIa期44名,IVa期57名,Va期88名について犬歯間幅径、歯列長径、歯冠幅径を計測中。3.ナイジェリア人の食習慣に関する調査(窪田・大沢):130軒の家族の主婦に訪問してその食習慣と育児食、家族構成などを調査分析中。4.歯の咬耗に伴う顎関節頭形態の改造変形のX線写真像で解析中。5.顎顔面形態の頭部X線規格写真によって頭蓋の発達を咬合力測定結果とを対比させながら解析中。6.歯周疾患の実態調査とX線学的調査では、歯垢、歯石、歯肉炎の各項目とCPITNインデックスによる歯周疾患治療必要度を検索中。学童の口腔清掃状態は前回調査時より改善されておらず、歯垢、歯石沈着は著しく、歯肉炎は高頻度に見られたが歯周炎に移行しているものは極めて少なく、大部分が初期治療を必要とするものであった。永久歯列期の100名についてデンタルX線写真(10枚法)で検索中だが、歯槽骨吸収度には加齢的に増加する傾向が見られているが、歯周炎の発症率は強く抑制されている。子供では、過去10年間、齪蝕罹患者率は殆ど増えていない。その原因が何処に在るのか、その究明が将来必要である。
軟骨細胞のアルカリフォスファターゼ遺伝子の発現制御機構の解明

肥大軟骨細胞はアルカリフォスファターゼ(ALP)を発現する。ALPは3つのアイソザイムが存在して、各種臓器に幅広く存在するために、従来の研究は蛋白化学的な解析が主体であった。そこで本研究では、成長板軟骨細胞のALP遺伝子の発現制御機構を解明するために、ウサギ肋軟骨成長板軟骨細胞の初代無血清培養系を用いて以下の実験を行った。1)4種類の因子を添加した無血清培養系では軟骨細胞は活発に増殖するものの、ALP活性は出現しなかった。この培養系にさらに甲状腺ホルモンを添加すると軟骨細胞は非添加群の50-100倍ものALP活性を発現した。2)無血清培養系に甲状腺ホルモンを添加すると肥大軟骨細胞の指標であるX型コラーゲンが出現し、形態学的にも肥大化した。3)4種類の因子を添加した無血清培養した軟骨細胞はALPase mRNAを発現しなかった。培養系にさらに甲状腺ホルモン和添加すると24時間後にALPase mRNAが出現した。4)グルココルチコイド、1.25(OH)_2VitaminD_3は甲状腺ホルモンのALp活性促進作用を抑制した。これに対してレチノイン酸は甲状腺ホルモンの作用を増強した。4)蛋白質合成阻害剤はALP遺伝子の発現を抑制した。上記の結果は軟骨細胞のALP遺伝子の発現は甲状腺ホルモンによって制御されていること、および、グルココルチコイド、1.25(OH)_2VitaminD_3およびレチノイン酸は甲状腺ホルモンの働きを調節することを示唆している。さらに、甲状腺ホルモンによるALPase遺伝子発現調節には蛋白質合成が仲介していると考えられる。今後、甲状腺ホルモンの肥大化促進作用の分子機構を追求する。
インドシアニングリーン蛍光肝癌に対する近赤外レーザー光による光線力学療法の確立

肝癌に特異的に集積する光感受性物質「インドシアニングリーン(ICG)」と、組織透過性が高い励起光「近赤外レーザー光」により、肝癌に対して、腫瘍選択性を高めた、従来治療法とは異なった全く新しい治療法「光線力学療法」を開発する。既報のとおり動物モデルが完成しており、臨床応用に向けてICGが肝癌に集積する機序の解明、新規近赤外レーザー光装置の開発を含む近赤外レーザーの適切な出力と安全性の確認および具体的な照射方法について検討する。
自動他覚的聴力検査装置の開発

Multiplesimultaneousstimuliに用いる複合振幅変調音の作成は、汎用パソコン(NEC PC9821Xa7e)を用いて汎用プログラミングソフト(Labview)により作成した。解析法としてSynchrony measure法を用いた場合、複合振幅変調音の2つの変調周波数の差が10Hzある場合は、同時に2つの明瞭な反応を記録できることが判ったが、synchrony measure法とmagnitude-squared coherence法併用の解析プログラムを用いても、反応検出に要する時間は大差なかった。そこで検査時間短縮のために、反応波形と同時に変調波形を記録して変調波形の位相90゚のある点を基準として変調波形上でそこから続く10の同位相のポイントをトリガーとして、それぞれのトリガーポイントより記録波形上で512ポイントの10本の波形を切り出して、synchrony measure法ににより解析する方法を考案した。これにより検査時間を約1/3に短縮することできた。また、この手法を用いて正弦波的振幅変調音に対する短音のsimaltaneous maskingの効果を検討したところ、40HzAMFRより80HzAMFRで短音による遮蔽効果が大きく、周波数特異性が高いことが再確認された。(1)閾値判定プログラムの作製と検討正常聴力者を対象に80HzAMFRを検査し、SM法とMSC法により判定した結果を比較したが、MSC法の方が感度が若干良いことが判った。次に、難聴幼児125名を対象に1000Hzの聴力レベルと80HzAMFRの閾値(SM法を用いて判定)を比較した。両者の差は3.8dB(標準偏差12.9dB)で、相関係数は0.863と高い値を示し、80HzAMFRが正確に聴力レベルを反映していることが判った。また、難聴幼児26名を対象に搬送周波数を変えて80HzAMFRを検査しオ-ジオグラムと比較したが、80HzAMFR閾値はオ-ジオグラムと良く一致し、80HzAMFRは高い周波数特異性を有するものと判定された。更に、滲出性中耳炎と心因性難聴各2例により他覚的聴力検査方としての有用性を検討したが、臨床的に充分有用と判定された。複合振幅変調音、即ち、搬送周波数(5004000Hz)と変調周波数(80100Hz)を組み合わせた複合音を作成し、正常成人5名を対象に自覚聴取閾値を判定したのち、睡眠下に複合振幅変調音を用いてAMFR検査を行い、変調周波数と搬送周波数の組み合わせ、反応閾値(SM法により判定)について検討した。その結果、搬送周波数の高い方が反応閾値は低く、2つの搬送周波数の佐賀200400Hzの場合には反応の出現性を示すCSM値が低いことが判った。Multiplesimultaeous stimuliに用いる複合振幅変調音の作成は、汎用パソコン(NECPC9821Xa7e)を用いて汎用プログラミングソフト(Labview)により作成した。
移動境界を含む流れの数値計算法に関する研究

移動境界を有する流れの数値計算には,圧縮性流体に対しては一般座標系保存型表示式,非圧縮性流体に対してはALE法が通常用いられているが,これらには境界面が移動するごとに格子形成をし直さなければならない難点がある.この困難を解決するものに,研究代表者が提案した移動座標法がある.本研究の目的の一つは,それぞれの方法毎に個別に存在した移動境界を含む流れの数値計算法に統一的な導出を与えて学問としての展望を与えることであり,もう一つの目的は,現状の概観に留まらず,ALE法や移動座標法をより一般的なものに拡張して,物理的・工学的諸問題に適用し,上記困難により従来解けなかった問題も数値的に精度良く解けるようにすることである.平成12年度においては,移動境界を含む流れの数値計算法について,その支配方程式(一般座標保存系表示式,ALE(Alternative Lagrangean Eulerian)表示式,移動座標法表示式)を系統的に示し併せて幾何保存則の解析的意味を明らかにした.更に移動座標法の拡張を行った.この移動座標法の適用方法及び対象として,1.多領域法:バリスティックレンジ内で飛翔体が発射される時の流れ,2.カットセル法との組み合せによる単領域法:変電所などでガスを噴出させながら高圧電流を遮断する装置(複雑形状)内の流れ,を選び数値計算を行った結果,本方法の有効性が確認された.平成13年度においては,主にALE表示式を一般座標系へ拡張して,ガンタンネル流に適用した.数値計算では,より実現象に近い複雑な流れを模擬するという方向のほかに,モデル化(簡略化)を行って少ない計算時間で実用的な解を得ようとする方向がある.ここでは後者の例として,支配方程式として断面積の時間・空間変化を含む準一次元Euler方程式を導き出してALE法を正しく適用し,ピストン運動のモデル化や流体摩擦よる圧力損失のモデル化を行い組み込んだ.計算法やモデルの高精度化・高信頼化を行い実験との比較により本方法の有効性を確認した.平成14年度においては,今まで得られた結果に評価・検討を加えてJournalに発表した。また今後本研究を発展させていくための準備段階として,形状の任意化に向けた非構造格子ソルバーの開発や高精度数値計算法ADERのソース項付き非線形保存則への拡張などを行った.移動境界を有する流れの数値計算には,圧縮性流体に対しては一般座標系保存型表示式,非圧縮性流体に対してはALE法が通常用いられているが,これらには境界面が移動するごとに格子形成をし直さなければならない難点がある.この困難を解決するものに,研究代表者が提案した移動座標法がある.本研究の目的の一つは,それぞれの方法毎に個別に存在した移動境界を含む流れの数値計算法に統一的な導出を与えて学問としての展望を与えることであり,もう一つの目的は,現状の概観に留まらず,ALE法や移動座標法をより一般的なものに拡張して,物理的・工学的諸問題に適用し,上記困難により従来解けなかった問題も数値的に精度良く解けるようにすることである.平成12年度においては,移動境界を含む流れの数値計算法について,その支配方程式(一般座標保存系表示式,ALE(Alternative Lagrangean Eulerian)表示式,移動座標法表示式)を系統的に示し併せて幾何保存則の解析的意味を明らかにした.更に移動座標法の拡張を行った.この移動座標法の適用方法及び対象として,1.多領域法:バリスティックレンジ内で飛翔体が発射される時の流れ,2.カットセル法との組み合せによる単領域法:変電所などでガスを噴出させながら高圧電流を遮断する装置(複雑形状)内の流れ,を選び数値計算を行った結果,本方法の有効性が確認された.平成13年度においては,主にALE表示式を一般座標系へ拡張して,ガンタンネル流に適用した.数値計算では,より実現象に近い複雑な流れを模擬するという方向のほかに,モデル化(簡略化)を行って少ない計算時間で実用的な解を得ようとする方向がある.ここでは後者の例として,支配方程式として断面積の時間・空間変化を含む準一次元Euler方程式を導き出してALE法を正しく適用し,ピストン運動のモデル化や流体摩擦よる圧力損失のモデル化を行い組み込んだ.計算法やモデルの高精度化・高信頼化を行い実験との比較により本方法の有効性を確認した.平成14年度においては,今まで得られた結果に評価・検討を加えてJournalに発表した。また今後本研究を発展させていくための準備段階として,形状の任意化に向けた非構造格子ソルバーの開発や高精度数値計算法ADERのソース項付き非線形保存則への拡張などを行った.本科学研究費により以下に示すような研究を実施することが出来た。研究代表者である東野文男は日ソ数値流体力学シンポジウム2000と第4回アジア数値流体力学シンポジウムにおいて「辺アルゴリズムによる非構造格子解法と解適合化」について発表した。我々が開発したスキームを用いて「定常な超音速流中に置かれた楔周りの流れを非構造格子を用いて計算した」結果について報告したところ、日ソ数値流体力学シンポジウムではKorobeinikov教授(モスクワ大学CAD計算センター)が、衝撃波の発生位置と形状についてはよいが、エントロピの不連続面はどうかという質問を、また、アジア数値流体力学シンポジウムではJameson教授(現スタンフォード大)が、我々が用いた解適合化スキームは計算時間が長くなるのではないかという質問をしてきた。

マッハ反射を計算した例を見せて、エントロピ不連続面がはっきり見えること、および、我々が実際に用いたコンピュータは研究室にあるワークシュテーションであり、実用上問題がないことを説明した。分担研究者である高倉葉子は京都で開催された第1回国際数値流体力学会議と第39回アメリカ航空宇宙学会のシンポ中ムで「移動境界を含む流れの数値計算法」について発表した。この研究は日本数値流体力学会誌に発表された研究を発展したものであるが、移動座標法により複雑形状の物体を静止させ、単純形状物体が移動して行く問題に変換して解けば、各タイムステップごとの物体移動による格子形成の手間が各段に省けることを示した。実際に、京都の学会では本計算手法を詳細に説明したところ、多くの国外からの参加者の間で好評をえた。この計算手法を実際に「高圧ガス遮断機周りの流れに応用」しアメリカ航空宇宙学会で発表した。東芝で行われた実機に近い実験の圧力分布などの結果は極めて良い傾向を示した。本計算スキームは、今後、遮断機の設計等に大いに役立つものと期待できる。本科学研究費により、以下に記すような研究を実施することができた。初年度(平成12年度)において、研究分担者(高倉葉子)は、移動境界を含む流れの数値計算法について、その支配方程式(一般座標保存系表示式、ALE(Alternative Lagrangean Eulerian)表示式、移動座標法表示式)を系統的に示した。本年度(平成13年度)においては、ALE表示式を移動境界問題に適用して、ガンタンネル流の数値シミュレーションを行った。数値計算では、より実現象に近い複雑な流れを模擬するという方向のほかに、モデル化(簡略化)を行って少ない計算時間で実用的な解を得ようとする方向がある。ここでは後者の例として、支配方程式として断面積の時間・空間変化を含む準一次元Euler方程式を導き出し、粘性による圧力損失などをモデル化して組み込んだ。本方法の有効性が確認されたので、今後ガンタンネルの設計に役立てる予定である。また、移動座標法をバリスティックレンジ内飛翔体の数値計算に適用し、マッハ数が1に近い超音速飛行におけるソニックブームを実験で模試するためには、ある程度の飛翔体飛行距離(つまり装置の長さ)が必要であることを示した。数値計算法の開発の一環として、非構造格子ソルバーの基礎的な信頼性のチェックを行った。セル内における解の勾配の評価法と、衝撃波による非物理的な振動を抑えるためのリミターとの組み合わせによりいくつかの解法が考えられる。どの組み合わせがよいかを、斜め衝撃波の反射問題により検証し、また簡単な解適合格子法を提案した。物理モデルの開発・適用の一環として、既に研究代表者(東野文男)が提案した高温空気の解離モデルを爆風(Blast Wave)の伝播の数値計算に適用し、その有効性を確認した。本年度の研究実績を以下に記す.1.初年度(平成12年度)において,移動境界を含む流れの数値計算法について,その支配方程式(一般座標保存系表示式,ALE(Alternative Lagrangean Eulerian)表示式,移動座標法表示式)を系統的に示したが,本最終年度において更に適用例を加えたものを国際Journalに発表した.2.昨年度(平成13年度)以来,ALE表示式を移動境界問題に適用して,ガンタンネル流の数値シミュレーションを行ってきた.
受容体クラスター形成の光制御による細胞への人工的生体シグナル入力法の開発

本研究では、細胞内シグナル伝達における受容体クラスター形成の意義の理解を目的とした。この目的のため、シグナル伝達分子Aktの1分子動態観察と、受容体ナノクラスターの人工的形成法の開発を行った。前者では、細胞外からのシグナル入力により、Aktの細胞膜滞在時間が延びることを見出した。この結果は、Akt動態が細胞表面の受容体クラスターに影響されることを示している。後者では、光感応性タンパク質を融合した受容体および精製タンパク質の構築に成功し、クラスター形成の光制御を実現する道具の準備を整えた。以上のように、本研究では受容体クラスターがシグナル伝達に重要な機能を果たしていることを示し、その重要性を構成的に証明する礎を築いた。本研究課題では、細胞膜表面の受容体に対して光刺激により架橋できるツールを開発した。このツールを用いて、受容体クラスターを細胞膜上に人工的に形成させることで、生細胞へのシグナル入力を人為的に操作する手法の開発を行った。同時に細胞内にあるシグナル下流分子の、シグナル入力前後の動態を解析することで、受容体クラスター形成の細胞内シグナル伝達反応に対する生理的意義を理解することを目指した。本研究課題において、光感応性タンパク質CRY2を付加した受容体の発現および光活性化したCRY2と結合するタンパク質CIB1の精製に成功した。すなわち、光刺激により受容体を架橋するツールは、ほぼ完成に近づいている。また、対象としているシグナル下流分子(Aktキナーゼ)の生細胞1分子追跡には既に成功した。申請者は、Aktキナーゼの1分子動態解析の結果から、Aktの細胞膜滞在時間を刺激前後で算出した。細胞膜上の受容体クラスター形成が起こると、個々のAkt分子の細胞膜滞在時間が2倍に長くなることを明らかにした。この結果は従来の概念とは大きく異なる結果である。従来の概念では、リクルートされるAkt分子の数は増加するが、細胞膜滞在時間は変化しないと考えられていた。しかし実際にはAktの細胞膜滞在時間が延びたのである。これは従来の概念を覆し、受容体クラスターにより下流分子の動態が制御されていることを示唆する重要なデータである。以上のように、本研究では受容体クラスター形成の光制御法の開発に向けて大きな進歩を遂げた。また、受容体クラスターの生理的意義についての定量的な解析にも成功した。本研究は、細胞表面に存在する受容体の集合状態を光照射により人為的に制御することで、細胞に時空間的にバイアスのかかったシグナルを与え、細胞の生理機能をコントロールする手法の開発を目指している。H23年度は、この手法の開発に当たっての心臓部とも言える、光感応性蛋白質の単離精製法の開発を行った。具体的には、植物由来の光感応性タンパク質CRY2と、活性化されたCRY2と二量体を形成するタンパク質CIB1の遺伝子を入手した。続いてCIB1の遺伝子を大腸菌用発現ベクターに組み込んだ。このベクターを用いて大腸菌を形質転換し、低温で長時間培養することでリコンビナントのCIB1を得た。また、PCR法により、CIB1の機能ドメインのみから成るCIBNの遺伝子を作製した。これも大腸菌用発現ベクターに組み込み、形質転換した大腸菌を用いてリコンビナントCIBNを得た。CIB1、CIBNともに、ニッケルキレートアフィニティーカラムを用いた精製により単離することに成功した。一方、CRY2は、ターゲットとなる細胞表面の受容体分子CD59との融合タンパク質を形成させた。既に保有しているCD59のほ乳類細胞用発現ベクターにCRY2遺伝子を組み込み、CRY2-CD59融合タンパク質のほ乳類用発現ベクターを構築した。これをヒト由来細胞株であるHeLa細胞にトランスフェクションし、細胞内で発現させた。この細胞を1分子蛍光観察が可能な全反射蛍光顕微鏡を用いて観察すると、CRY2-CD59融合タンパク質が細胞膜上を自由拡散している様子が観察された。以上のことから、構築したCRY2-CD59融合タンパク質は、培養細胞上で適切に発言することに成功したと言える。H23年度は、本研究の目的である細胞内受容体の光制御を行うに当たって必要なツールを構築することに成功した。特に、1年間でCIB1およびCIBNタンパク質の大量発現系の構築、単離精製法の確立を行ったことは評価するに値する。通常、タンパク質の機能解析を行うための発現系構築と単離精製には非常に長期間の時間がかかることが多く、場合によっては数年の単位で時間がかかる。本研究では、既にCIBの単離精製まで成功し、非常に順調に研究が進展していると言える。また同時に、ターゲットとなる受容体分子側も、光感応性蛋白質との融合タンパク質を構築することに成功し、全反射蛍光顕微鏡を用いてその1分子動態解析まで成功している。

以上のことから、本研究は現在順調に進展していると評価できる。H24年度は、H23年度に構築したCIBをナノ粒子表面に修飾することで、光感応性分子修飾ナノ粒子を構築する。修飾の方法としては、ナノ粒子表面にストレプトアビジンを修飾したものを用意し、そこにビオチン化タグ抗体を結合する。一方CIB側にはその抗体に認識されるエピトープタグを付加しておく。抗体-ナノ粒子コンジュゲートとCIBを反応させることで、CIB修飾ナノ粒子を構築する。ただし、CIBをナノ粒子表面に集積させることで、本来の機能が失われる可能性がある。そこで新たな手法として、球状タンパク質フェリチンとCIBのコンジュゲートを作製し、直径約20nmのCIB修飾球状タンパク質を構築する。これらをCRY2-CD59を発現させた細胞に作用させることで、細胞内にカルシウム放出などの生理機能を作動させることを目指す。本研究は、継続的な遺伝子組み換え実験および細胞培養実験を必要とする。また、顕微鏡下で観察するため、顕微鏡の性能を維持するために光学部品を定期的に補充する必要がある。次年度の研究費の大部分は、これら消耗品費として使用する。残りについてはH24年度に得られた成果を発表するための学会に参加するための旅費として使用する。