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理論的枠組みと調査法の再構築による日本語諸方言アスペクトの研究

本年度は、各地方言における地理的調査の結果から、アスペクト形式の表す意味を確認・比較し、そこからどのように日本語のアスペクトを捉えるべきかについて考察した。1.アスペクト形式の意味検討:各地方言の調査結果より、標準語を含む各地方言における「動詞連用形+テ+存在動詞」形式の類似性を考えると、ヨル形(西日本)やイタ形(長野県)の存在が非常に特異なものであることを示した。さらに、西日本諸方言のヨル形はアスペクト形式だけでなく待遇表現やムード形式として使用されることから、なぜそれらの意味を表すのかについて考察した。その結果、ヨル形が内包する存在動詞「おる」の意味「(主体的に)存在を描写する」から解釈可能であることがわかった。2.日本語のアスペクトをどのように捉えるか日本語アスペクト研究において、アスペクトをどのように捉えるべきかが問題であった。海外言語学でのアスペクトの規定を参考に、広義のアスペクト(アスペクチュアリティ)として捉えることが妥当であることを指摘した。これはつまり、テイル形がアスペクト形式の代表として体系立てられるものではないということである。また、文法カテゴリとして、そこに含まれる形式たちが対立的でなく、あくまでも時間的局面を切り出せるという共通点を持つ集合体として認識すべきであることを述べた。3.被災地における危機的なアスペクト形式の把握東日本大震災を受けて、被災地の方言が消滅する可能性もあることから、所属機関の文化庁委託事業「東日本大震災において危機的状況が危惧される方言の実態に関する調査研究(宮城県)」の一環として方言談話の作成などに協力し、そこから被災地にみられるアスペクト形式の把握を行った。本年度は、進行と結果というアスペクト的意味にとらわれない新しい理論的枠組みを構築するために、より細かな調査文での地理的調査を行い、次年度の日本語としてのアスペクト体系構築のための準備とした。1.各地での地理的調査:これまで行った南九州地方、青森県での調査より、地域によって形式の多様性がみられる場面が異なり、アスペクトの捉え方に差異があることが分かった。南九州地方ではカタ・ゴッといった形式もアスペクト的意味を表わすことが明らかであり、これらの出自と表す意味については『言語科学論集』に論文化し公表した。また、これらの形式は琉球方言への連続性も認められるため、鹿児島県島嶼域や奄美大島での調査を新たに行った。その結果、ヨル・トル・カタ・ゴッは、一見進行や結果の枠の中に乱立しているが、それぞれ細かな使用の場面差があることが明らかになった。詳しくは論文執筆中である。青森県では、起こった事態と現在との関係に焦点があり、この点において形式が多様化している。これは東北諸方言に通じるものと考えられる。この結果は『東北文化研究室紀要』に論文化して公表した。2.新しい理論的枠組み:各地での地理的調査より、南九州地方では動作過程において形式が多様であり、東北諸方言では事態と現在との関係において形式が多様となることがわかった。また、その中で標準語テイルとそれに相当する各地の形式においては、基本的には同一の場面で使用されることから、表わす意味にほぼ差異がみられないことがわかった。これは日本語としてのアスペクト体系構築のための大きな足掛かりとなる。そのため、この標準語テイルの意味を詳細に把握するための研究を進めた。さらに、その結果を各地方言へと還元していき、進行・結果にとらわれない新しい理論的枠組みでのアスペクト体系構築を進めた。本年度は、新しい理論的枠組みを構築するために、前年度から引き続き、より細かな調査文での地理的調査を行い、また標準語のテイル形の表す意味を再検討し、新しい枠組みでのアスペクト体系構築を目指した。1.理論的枠組みと調査法の再検討:まず、具体的な調査文や理論面から西日本諸方言の既存の体系をみていくことで、従来型の進行-結果という2項対立に疑問を呈した、具体的には、「進行」という用語の認識に関し、それが「場面的なもの」か「話者の判断的なもの」かで表す場面が異なることを指摘し、そこから調査文自体の精査が必要なことを『文化』で述べた。また、山形県、宮城県をつなぐ陸羽東線沿線のグロットグラム調査より、現在とは切り離された過去の状態を表すカッタ形式(スッカッタ、シタガッタなど)について『宮城県・山形県陸羽東線沿岸地域方言の研究』で論じ、徳島県下全域の地理的調査から、ヨル形がアクチュアルな事態を主観的に把握する形式、トル形が動作・変化が起こり継続していることを客観的に表す形式であることを『徳島大学国語国文学』に示した。標準語においても、テイル形が継続相というアスペクト的意味を示すものではなく、事態が生起し基準時まで続いているという基本的な意味からアスペクト的意味を表しうる形式であることを『言語科学論集』で述べた。2.理論的枠組みの再構築のために:前年度からの成果と標準語の結果を合わせ、報告書『理論的枠組みの再構築のための日本語諸方言アスペクトの捉え方』としてまとめた。その中で、言語的発想法という視点から、アスペクト表現の多様性の地域差を示した。これは、未だ構想段階ではあるが、日本語のアスペクトを考える上での手助けとなる可能性がある。新たな理論的枠組みを提示するまでには至らなかったが、既存の枠組みの問題点を示し、新たな可能性を見出すことはできた。

本年度は、各地方言における地理的調査の結果から、アスペクト形式の表す意味を確認・比較し、そこからどのように日本語のアスペクトを捉えるべきかについて考察した。1.アスペクト形式の意味検討:各地方言の調査結果より、標準語を含む各地方言における「動詞連用形+テ+存在動詞」形式の類似性を考えると、ヨル形(西日本)やイタ形(長野県)の存在が非常に特異なものであることを示した。さらに、西日本諸方言のヨル形はアスペクト形式だけでなく待遇表現やムード形式として使用されることから、なぜそれらの意味を表すのかについて考察した。その結果、ヨル形が内包する存在動詞「おる」の意味「(主体的に)存在を描写する」から解釈可能であることがわかった。2.日本語のアスペクトをどのように捉えるか日本語アスペクト研究において、アスペクトをどのように捉えるべきかが問題であった。海外言語学でのアスペクトの規定を参考に、広義のアスペクト(アスペクチュアリティ)として捉えることが妥当であることを指摘した。これはつまり、テイル形がアスペクト形式の代表として体系立てられるものではないということである。また、文法カテゴリとして、そこに含まれる形式たちが対立的でなく、あくまでも時間的局面を切り出せるという共通点を持つ集合体として認識すべきであることを述べた。3.被災地における危機的なアスペクト形式の把握東日本大震災を受けて、被災地の方言が消滅する可能性もあることから、所属機関の文化庁委託事業「東日本大震災において危機的状況が危惧される方言の実態に関する調査研究(宮城県)」の一環として方言談話の作成などに協力し、そこから被災地にみられるアスペクト形式の把握を行った。東日本大震災の影響により大学を利用できない期間があり、文献・資料等利用が制限される期間が続いた。また、当初計画していた調査が行えなかった。一部、長野県での調査は時期を移行し行ったが、方言学的に特徴的な地域である長野県栄村での調査が実施できず、十分に資料が得られたとは言い難い。以上のように、震災の影響によって全体的に進捗が遅れてしまった。今後は、各地の地理的調査により得られた形式の個別の意味を追求し、そこから各地方言、標準語を比較し、日本語のアスペクト形式の形態的特徴と共通性、及び各地方言と標準語のアスペクトの捉え方の相違点を示していく必要がある。これはつまり、形式の多様性を通して各地の時間的な場面の捉え方の地域差と共通性を見出すことである。また、そこから、これまで行われてきたような、進行や結果といった枠組みではなく、より各地方言の形式の多様性を反映した体系立てを行っていかなければならない。当面は、現段階で形式の多様性や他地域と異なる形式のみられる地域を中心に使用される形式をみていき、各地域の時間的な場面の捉え方について考察を深めていくことが必要である。
アパタイトパテの顎骨再建材料としての有用性

本研究目的は,ビーグル犬下顎骨に作成した骨欠損部に補填したアパタイトパテを長期間(6か月,12ヶ月)埋入後の組織学的評価をおこない,さらに骨の新生速度の検討,アパタイトパテのアパタイトへの変換量の測定を行なうことにより,研究申請者らによって開発したアパタイトパテの新しい骨再建・補填材料としての臨床における有用性を検討することであった.(結果)顎骨欠損部にに充填したアパタイトパテは埋入12ヶ月後においても埋入6ヶ月と同様大部分吸収せずに残存しており,既存骨と接している周囲のみ骨に置換していた.すなわち6ヶ月以降骨の新生が起こっていないと考えられた.また症例によってはアパタイトパテ埋入時の不備により亀裂が生じていたが,その亀裂内に一部骨の新生が認められた.またアパタイトパテ周辺の組織は12ヶ月経過しても6が月後と同じように炎症反応や異物反応は認められなかった.テトラサイクリンを投与して骨のラベリングを行ない骨新生の状態を解析したが,アパタイトパテ埋入初期にテトラサイクリンの取りこみが見られただけであった.粉末X線回析による非崩壊型アパタイトセメントからアパタイトへの変換量の測定では、短期間(24時間,4週間)での実験結果に比べて1年後では残存しているTTCPの量が減少し相対的にアパタイトへの変換量が増量していた.(考察)アパタイトパテは,生体親和性に優れた生体材料であり生体内に埋入することにより早期にアパタイトに変換されることは証明された.しかし,アパタイトパテが早期にアパタイトに変換されても骨への置換はわずかに既存骨と接している部位でのみ起こっているに過ぎず,それ以上の骨への置換はおこらずそのままアパタイトとして骨欠損部に残存すると考えられる.すなわちアパタイトが骨に置換するするためには間葉系細胞との接触が必要である.よってこのアパタイトパテは臨床応用可能と考えるが使用するにあたっては適応部位をさらに検討する必要があると思われた.本研究目的は,ビーグル犬下顎骨に作成した骨欠損部に補填したアパタイトパテを長期間(6か月,12ヶ月)埋入後の組織学的評価をおこない,さらに骨の新生速度の検討,アパタイトパテのアパタイトへの変換量の測定を行なうことにより,研究申請者らによって開発したアパタイトパテの新しい骨再建・補填材料としての臨床における有用性を検討することであった.(結果)顎骨欠損部にに充填したアパタイトパテは埋入12ヶ月後においても埋入6ヶ月と同様大部分吸収せずに残存しており,既存骨と接している周囲のみ骨に置換していた.すなわち6ヶ月以降骨の新生が起こっていないと考えられた.また症例によってはアパタイトパテ埋入時の不備により亀裂が生じていたが,その亀裂内に一部骨の新生が認められた.またアパタイトパテ周辺の組織は12ヶ月経過しても6が月後と同じように炎症反応や異物反応は認められなかった.テトラサイクリンを投与して骨のラベリングを行ない骨新生の状態を解析したが,アパタイトパテ埋入初期にテトラサイクリンの取りこみが見られただけであった.粉末X線回析による非崩壊型アパタイトセメントからアパタイトへの変換量の測定では、短期間(24時間,4週間)での実験結果に比べて1年後では残存しているTTCPの量が減少し相対的にアパタイトへの変換量が増量していた.(考察)アパタイトパテは,生体親和性に優れた生体材料であり生体内に埋入することにより早期にアパタイトに変換されることは証明された.しかし,アパタイトパテが早期にアパタイトに変換されても骨への置換はわずかに既存骨と接している部位でのみ起こっているに過ぎず,それ以上の骨への置換はおこらずそのままアパタイトとして骨欠損部に残存すると考えられる.すなわちアパタイトが骨に置換するするためには間葉系細胞との接触が必要である.よってこのアパタイトパテは臨床応用可能と考えるが使用するにあたっては適応部位をさらに検討する必要があると思われた.本研究は、パテ状の形態を示し、硬化してアパタイトになるアパタイトパテの顎骨再建材料としての有用性を検討することをを目的としている。本年度は1)アパタイトパテの調整、2)小実験動物を用いたアパタイトパテの組織親和性の検討、3)ビーグル犬への試料のインプラントを行う予定であった。アパタイトパテの調整については本実験に必要量の調整を完了した。ラット口蓋部に歯科用ラウンドバーで骨欠損を形成、同骨欠損をアパタイトパテおよびコントロールとして用いた従来型アパタイトセメントで再建した。術後4週目においてアパタイトパテ周囲には炎症反応が認められず、両側骨断端部には多数の骨芽細胞を確認した。概して口腔側では繊維性結合組織で被包化されており、鼻腔側では直接骨と接していた。術後8週目において、口蓋側骨欠損部は骨による修復過程が認められた。なお、新生骨とアパタイトパテの間には結合性組織の介在が認められなかった。一方、従来型アパタイトセメントの場合は術後4週の時点でアパタイトパテに比較して明らかに多くの異物細胞が認められた。従来型アパタイトセメントは充填時に血液と接触して一部流失しており、このことが、従来型アパタイトセメントの炎症反応惹起の原因であると考えられた。なお、術後8週においてはアパタイトパテと同様な組織反応を示した。ビーグル犬へのアパタイトパテのインプラントは6、12月用の試料に関してインプラントを終了した。

前年度行った動物実験ーすなわちビーグル犬の下顎骨に形成した区域切除にパテ状の非崩壊型アパタイトセメントを充填しその上からチタンメッシュプレートで被覆ーで1年経過したものに対し灌琉固定を行ない,脱灰・非脱灰切片を作製した.作製した切片をH-E染色,Movat's Pentachrome染色を行なって病理組織学的にアパタイトセメントと周囲硬組織,軟組織の状態を観察,検討した.その結果,セメント埋入1年後では顎骨欠損部に充填したアパタイトが大部分吸収せずに残存していた.また症例によっては埋入されたアパタイトセメントに一部亀裂がはいって結合組織の侵入が認められた.これに関してはセメント充填時の手技により生じた亀裂と考えられる.セメント周辺には炎症症状は全くみられず,また短期動物実験で認められた異物反応も存在しなかった.Movat's Pentachrome染色では,埋入したアパタイトセメント周囲に骨が新生し黄褐色に染色された成熟骨が結合組織を介さずに直接セメントと接しているのが確認された.粉末X線回折による非崩壊型アパタイトセメントからアパタイトへの変換量の測定では、短期間(24時間,4週間)での実験結果に比べて1年後では残存しているTTCPの量が減少し相対的にアパタイトヘの変換量が増量していた.今年度の実験結果より,われわれが開発した非崩壊型アパタイトセメントは長期実験においても生体親和性に優れほぼアパタイトに変換していることが確認できた.さらにアパタイトの骨誘導能により新生した骨はアパタイトに直接接しており同セメントは骨欠損部の補填材として機能していると考える.ただ1年経過してもほとんどセメントは骨に置換せず残存していることより今後もセメントが骨に完全に置換する可能性はほとんどないと思われた.本年度の研究目的は,ビーグル犬下顎骨に作成した骨欠損部に補填したアパタイトパテの埋入後12ヶ月の組織学的評価を埋入後6ヶ月のそれと比較検討し,さらに骨の新生速度の検討,アパタイトパテのアパタイトへの変換量の測定を行なうことにより,研究申請者らによって開発したアパタイトパテの新しい骨再建・補填材料としての臨床における有用性を検討した.その結果,顎骨欠損部にに充填したアパタイトパテは埋入12ヶ月後においても埋入6ヶ月と同様大部分吸収せずに残存しており,既存骨と接している周囲のみ骨に置換していた.すなわち6ヶ月以降骨の新生が起こっていないと考えられた.また症例によってはアパタイトパテ埋入時の不備により亀裂が生じていたが,その亀裂内に一部骨の新生が認められた.またアパタイトパテ周辺の組織は12ヶ月経過しても6が月後と同じように炎症反応や異物反応は認められなかった.テトラサイクリンを投与して骨のラベリングを行ない骨新生の状態を解析したが,アパタイトパテ埋入初期にテトラサイクリンの取りこみが見られただけであった.粉末X線回析による非崩壊型アパタイトセメントからアパタイトへの変換量の測定では、短期間(24時間,4週間)での実験結果に比べて1年後では残存しているTTCPの量が減少し相対的にアパタイトへの変換量が増量していた.以上の結果から,われわれ申請者らが開発したアパタイトパテは,今回の中型動物に長期埋入した実験結果より,生体親和性に優れた生体材料であり生体内に埋入することにより早期にアパタイトに変換されることは証明された.
セット論・生産流通論からみた古代国家成立期の馬装体系の変化に関する研究

古代国家成立期の7世紀後半の倭の馬具については不明な点が多い。本研究では基礎的な資料集成をおこない、どのようなセットで馬装を構成していたのかを明らかにする。さらにこのセット論の視点を踏まえて、彫金などの金工技術や有機質構造に注目し、どのように当該期の馬具の生産と流通がおこなわれていたのかを明らかにする。これまで7世紀を代表する毛彫馬具の一部については、文様の共通性から百済との関係が指摘されてきたが、セットを構成する馬具をみてみると、セットとして百済に系譜がたどれるとは言い切れない。申請者がこれまで進めてきた7世紀以前の馬具研究を基礎として、これらの系譜についても明らかにする。本研究は古墳時代と古代の馬具研究の狭間にあり、十分に進んでいない7世紀後半を中心とする倭の馬具について、生産、使用の実態を資料に即して明らかにする。それに基づき、馬装体系と呼称される馬具の種類と組み合わせにより様々な社会関係を表示するシステムが当該期には存在したのか、存在したのであれば、前段階の馬装体系とどのように異なるのかを明らかにする。本年度は、7世紀の倭の馬具資料と関連資料を発掘調査報告書などにより集成し、修正カードを作成した。また、毛彫の棘付花弁形杏葉や飾金具などの良好なセットを保つ群馬県御門1号墳、同県鍛屋地2号墳、山梨県御崎古墳、同県寺ノ前古墳などの資料調査を実施し、実測図の作成や写真撮影をおこなった。これらの調査により、毛彫などの彫金による施文装飾の工程分析が、技術系譜の追跡や分類編年研究に有効であるという見通しを得た。また、雲珠や辻金具として用いられる飾金具の調査により、先行研究でおこなわれてきた形態や文様に注目した分類に加えて、飾金具そのものの材質と製作技法の分析が分類編年研究に有効であるという見通しを得た。また、これまで研究を進めてきた障泥に関する論文を公表した。金属製の吊金具を用いた障泥は6世紀から本研究で主要な対象とする7世紀まで、使われ続ける馬具である。7世紀代の馬装を構成する馬具の一器種について体系的な分類案編年案を示し、系譜や変遷の特質まで明らかにすることができたのは、本研究を進めるにあたっても重要な成果である。加えて、本務の中で古代寺院の風鐸の整理に携わる機会を得て、古代を中心とする風鐸の資料集成をおこない、編年研究の見通しを得た。古墳時代の馬鐸との関係、鋳造馬具生産との関係、さらには馬具生産と寺院の荘厳具などの生産との関係性を探る視点を得ることができた。馬具と関係の深い、寺院の建築用装飾金具などの資料集成にも着手できた。資料の集成はおおむね完了させることができたが、それに基づく各馬具の分類編年案の作成完了には今しばらく研究の時間が必要である。また、国内の資料調査は順調に進められているが、韓国での関連資料の調査を実施することが初年度はできなかった。今後も、国内の資料調査を進め、データの収集に努める。また、韓国や中国などにおける関連資料の資料調査も実施する。7世紀代の馬具編年については、本研究開始前後に体系的な案が他の研究者により公表されたが、この編年案の妥当性を検証し、修正する必要があれば、自身の集成資料と資料調査等に基づき、研究の基軸となる編年案を早急に作成する。

金属製の吊金具を用いた障泥は6世紀から本研究で主要な対象とする7世紀まで、使われ続ける馬具である。7世紀代の馬装を構成する馬具の一器種について体系的な分類案編年案を示し、系譜や変遷の特質まで明らかにすることができたのは、本研究を進めるにあたっても重要な成果である。加えて、本務の中で古代寺院の風鐸の整理に携わる機会を得て、古代を中心とする風鐸の資料集成をおこない、編年研究の見通しを得た。古墳時代の馬鐸との関係、鋳造馬具生産との関係、さらには馬具生産と寺院の荘厳具などの生産との関係性を探る視点を得ることができた。馬具と関係の深い、寺院の建築用装飾金具などの資料集成にも着手できた。資料の集成はおおむね完了させることができたが、それに基づく各馬具の分類編年案の作成完了には今しばらく研究の時間が必要である。また、国内の資料調査は順調に進められているが、韓国での関連資料の調査を実施することが初年度はできなかった。今後も、国内の資料調査を進め、データの収集に努める。また、韓国や中国などにおける関連資料の資料調査も実施する。7世紀代の馬具編年については、本研究開始前後に体系的な案が他の研究者により公表されたが、この編年案の妥当性を検証し、修正する必要があれば、自身の集成資料と資料調査等に基づき、研究の基軸となる編年案を早急に作成する。
温度応答性ポリマーを用いた環境汚染物質暴露評価

温度応答性ポリマーは、下限臨界溶解温度以下では溶解度が増し、下限臨界溶解温度以上では溶解度が減少して凝集する性質を持つ。本研究では、温度応答性ポリマーの性質を利用して、化学物質に暴露した細胞が発現誘導を増減させるタンパク質を指標とし、環境汚染物質の有害影響を検討することを目的とした。温度応答性ポリマーは、側鎖にブチルメタクリレート(BMA)又はN,N-ジメチルアミノプロピルアクリルアミド(DMAPAAm)を導入したN-イソプロピルアクリルアミド(PNIPAAm)を共重合させて作製した。PNIPAAm(分子量:10,000)、P(NIPAAm95%-co-BMA5%)(分子量:5,000)、P(NIPAAm95%-co-BMA5%-DMAPAAm5%)(分子量:5,000)、P(NIPAAm85%-co-BMA5%-co-DMAPAAm10%)(分子量:5,000)の4種の温度応答性ポリマーを比較検討した結果、PNIPAAm(分子量:10,000)が結合能および結合性において最も優れていることが明らかとなった。ヒト白血病由来浮遊細胞HL60株を好中球様細胞へ選択的に分化誘導する培養系を用い、分化時に特異的に誘導されるCD18(インテグリン)を指標タンパク質として、環境汚染物質の分化誘導に対する影響を検討した。4日間暴露後の細胞致死率が約20%となる濃度で分化誘導開始時から継続暴露した結果、検討した51物質の中で、ベンゾ[a]ピレン等数物質の暴露により発現誘導量の低下が認められた。しかし、有機リン系農薬オキソン体や内分泌をかく乱する恐れのある化学物質、消毒副生成物等、低濃度の環境汚染物質の暴露により発現誘導量が増加することが明らかとなった。これらのことより、環境汚染化学物質の多くが、免疫系への分化誘導時に作用して免疫応答亢進作用を示唆する結果を得ることができた。温度応答性ポリマーは、相分離を起こす温度である下限臨界溶解温度(LCST)以下では溶解度が増加し、LCST以上では溶解度が減少する性質を持つ。本研究は、この性質を利用し、環境汚染化学物質に暴露した細胞で誘導される特異タンパク質を選択的に分離同定し、その量比により環境汚染有害物質の影響負荷を検討することを目的とする。温度応答性ポリマーは、側鎖にブチルメタクリレート(BMA)またはN,N-ジメチルナミノプロピルアクリルアミド(DMAPAAm)を導入したN-イソプロピルアクリルアミド(PNIPAAm)を共重合させて作製した。PNIPAAm(分子量:10,000)、P(NIPAAm95%-co-BMA5%)(分子量:5000)、P(NIPAAm95%-co-BMA5%-co-DMAPAAm5%)(分子量:5000)、P(NIPAAm85%-co-BMA5%-co-DMAPAAm10%)(分子量:5000)の4極の温度応答性ポリマーを比較検討した。LCST以上である40°Cで温度応答性ポリマーに、HepG2細胞由来塩抽出タンパク質もしくはカエル血清タンパク質を結合させ、特異的に結合するタンパク質の有無と量をSDS-ポリアクリルアミド電気泳動で比較検討した。タンパク質が結合した温度応答性ポリマーは、40°Cで白濁非溶解状態にした後、室温、12,000rpm、15分の遠心により回収することができることが明らかとなった。1M NaCl

以下の塩濃度の条件下では、温度応答性ポリマーとタンパク質の結合親和性に影響は認められなかった。4種の温度応答性ポリマーでは、PNIPAAm(分子量:10,000)が特異的なタンパク質を結合しており、その結合能および結合量において最も優れていることが明らかとなった。環境汚染物質暴露影響を評価する系に関して、体内に取り込まれた際に最初に接触する組織として血球系への影響を検討した。ヒト白血病由来浮遊細胞HL60に2.5%ジメチルスルホキシドおよび10ng/mlヒトG-CSFを作用させることにより、45日後、好中球様細胞へ選択的に分化誘導することができた。環境汚染物質に暴露することにより変動する指標タンパク質として、分化時に特異的に誘導されるCD18(インテグリンタンパク質)を対象として検討を行った。環境汚染物質として、17β-エストラジオール、ビスフェノールA、トリブチルスズ、ベンゾ[a]ピレンなどの内分泌系かく乱化学物質、ハロ酢酸類、塩素化フェノール類、有機リン系殺虫剤やアトラジン等の農薬類、50物質について、4日間暴露後の細胞致死率が約20%となる濃度で分化誘導開始時から継続暴露した結果、全ての化学物質でCD18の発現量としてタンパク量当たりで評価した場合、有意な増減は認められなかった。これらの結果は、PU.1転写因子を介する好中球様細胞への分化時には、検討した環境汚染化学物質の影響は少ないと考えられる。今後、化学物質暴露後に分化誘導を開始した場合や致死影響の出ない暴露濃度の応答について検討を進める。マウス幹細胞について、心筋細胞への分化誘導のための無血清培地での培養条件を確定した。環境汚染物質に暴露することにより変動する指標タンパク質として、分化時に特異的に誘導されるタンパク質GATA4(転写因子)を同定し、前述の50物質の暴露による変動の検討を進めた。一方、マウス幹細胞から神経細胞への分化誘導を行う培養条件の検討を進めた。さらに、マウス10T1/2細胞から脂肪細胞への分化誘導時への影響、マウス視床下部癌化神経細胞に対する影響を評価するための培養条件と、対象とするタンパク質の同定を進めた。比較検討した4種の温度応答性ポリマーの中で、N-イソプロピルアクリルアミド(分子量:10,000)が、タンパク質の結合量および結合能が最も高いことが明らかとなった。細胞溶解液中のタンパク質を結合させた温度応答性ポリマーは、下限臨界溶解温度以上である40°Cで白濁非溶解状態にした後、12,000rpm、15分の遠心により回収した。この沈殿を4°Cにすることで、温度応答性ポリマーを溶解状態に戻し、対象とするタンパク質を効率よく濃縮回収することができることが明らかとなった。ヒト白血病由来細胞HL60株の好中球への分化を示す指標タンパク質であるCD18について、環境汚染物質51種を、4日間の暴露後の細胞致死率が約20%となる比較的低濃度における濃度で、10ng/mlヒトG-CSFおよび2.5%ジメチルスルホキシドにより分化誘導を開始してから継続的に暴露し、発現誘導に及ぼす影響を比較検討した。ベンゾ[a]ピレンなど数物質の暴露により発現誘導量の低下が認められたが、ビスフェノールA、4-tert-オクチルフェノール、17β-エストラジオール、ハロアセトニトリルや有機リン系農薬のオキソン体など多種多用な環境汚染物質により誘導量が増加することを明らかにした。これらの環境汚染物質による発現誘導亢進は、免疫系の応答亢進作用を示唆する結果と考えられる。
PD-1欠損マウスを用いた自己免疫疾患感受性遺伝子の網羅的探索

自己免疫疾患は多遺伝子疾患であるため、一つの遺伝子に注目するのではなく、複数の遺伝子による協調的な制御機構を解明することが必須である。最近我々は、免疫抑制受容体PD-1を欠損させたマウスが、マウスの系統により異なる種類の自己免疫疾患を発症することを見出した。そこでPD-1欠損を用いることにより自己免疫疾患感受性遺伝子が効果的に解析できると予測し、PD-1欠損マウスを用いて連鎖解析を行っている。今年度はI型糖尿病を高頻度に発症するNOD-PD-1欠損マウスを用いてI型糖尿病感受性遺伝子の連鎖解析を行った。NOD-PD-1欠損マウスとC57BL/6-PD-1欠損マウスの交雑F2マウス、及びBC1マウスを各々200匹作成したところ、15週齢までにF2マウスの約20%、及びBC1マウスの約40%が糖尿病を発症した。74個のマイクロサテライトマーカーを用いて遺伝子型を決定し、糖尿病発症との連鎖解析を行ったところ、BC1マウスの解析では既報の28種類の遺伝子座のうち、3領域のみが有為な相関を示した。また、F2マウスの解析から優性に働く新規遺伝子座を2領域同定し、Iddp1、及びIddp2と命名した。NODマウスを用いたI型糖尿病の連鎖解析は世界中で広く行われているが、そのほとんどが劣性遺伝子座しか解析できないBC1マウスを用いており、今回の解析が初めての全染色体を対象とした優性遺伝子の連鎖解析と言える。また、I型糖尿病発症がPD-1欠損と合わせて6種類の遺伝子変異のみで説明できる可能性があり、分子病態の解明に大きく近づいたと期待される。今後複数遺伝子による自己免疫疾患制御機構を解明する上で、PD-1そのものの機能をより詳細に解析することは重要である。PD-1がCTLA-4と協調してCD8陽性T細胞の自己寛容成立に必須の役割を果たしていることを解明し、論文報告した(研究発表-1)。
倍数レベルの異なるニガナ属植物(キク科)間における浸透性交雑の解析

ミヤコジシバリlxerisnakazonei(キク科)のゲノム内に、推定母種であるハマニガナl.repensとオオジシバリl.debilisの核DNAが共に含まれていることを、核DNA(ETS領域)のPCR-RFLP解析を用いて明らかにした。これにより、ミヤコジシバリがハマニガナとオオジシバリの雑種起源であることが明らかとなった。さらに、四倍体と六倍体ミヤコジシバリの両方にハマニガナ(二倍体)とオオジシバリ(六倍体)の核ゲノムが取り込まれていたことから、同所的に生育する六倍体ミヤコジシバリとオオジシバリの間の交雑を通じて、ハマニガナの核ゲノムが部分的にオオジシバリに浸透している可能性が強く示唆された。琉球列島の砂浜海岸に出現するオオジシバリ(六倍体ミヤコジシバリを含む)には、葉の形態に著しい変異が見られるが、ハマニガナからの遺伝子浸透がその一因である可能性が高い。また今回の解析により、核のETS領域が低次分類群間の分子系統学的解析に有効であることが示された。これら一連の結果は、現在論文に取りまとめ投稿中である。葉緑体DNAについてrbcLとatpBの遺伝子間領域のPCR-RFLP解析をおこなった結果、四倍体ミヤコジシバリの母親が産地によって異なることが明らかとなった。このことから、ハマニガナとオオジシバリの交雑はそれぞれの産地において、独立に複数回起こっていると考えられる。また、ミヤコジシバリは琉球列島の固有種とされていたが、九州以北において分布調査をおこなった結果、愛知県渥美半島に四倍体ミヤコジシバリが出現することが確認された。伊豆半島や四国南部においてもオオジシバリが砂浜海岸に生育する場所が確認されたことから、ハマニガナとオオジシバリの交雑による四倍体ミヤコジシバリの形成は、琉球列島以外の広い地域においておこる可能性があると考えられる。平成11年度は、ミヤコジシバリlxeris nakazonei(キク科)の推定母種であるハマニガナl.repensおよびオオジシバリl.debilisのそれぞれに特異的なDNAマーカーの探索を主目的とした。核DNAについては、全国19産地より採集したハマニガナ、および、20産地より採集したオオジシバリを用い、5SrDNAスペーサー領域のPCR-RFLP解析により種特異的マーカーの探索を試みたが、有効なマーカーを得ることができなかった。このため、現在、IGS領域(約4kb)のPCR-RFLP解析をおこなっている。ハマニガナとオオジシバリ各4産地の材料を用いて解析をおこなった結果、制限酵素Rsalによる処理により種特異的なRFLPパターンが得られた。今後さらにサンプル数を増やし、種特異的マーカーとして利用可能かどうかを確認する予定である。葉緑体DNAについては、rbcLとatpBの遺伝子間領域のPCR-RFLP解析により、ハマニガナとオオジシバリについて種特異的なマーカーを得ており、現在、この分子マーカーを用いてミヤコジシバリについての解析を進めている。沖縄県糸満市米須海岸に生育するミヤコジシバリの四倍体10個体、および、六倍体8個体について解析をおこなった結果、1)四倍体はハマニガナを母親としていること、2)六倍体のRFLPパターンはオオジシバリと一致すること、が明らかとなった。四倍体のミヤコジシバリはハマニガナを母親、オオジシバリを花粉親として生じた可能性が高いが、六倍体については、六倍体は雑種であり、これを通じてハマニガナとオオジシバリ間に浸透性交雑が生じているのか、あるいは、六倍体は特殊な生育環境におけるオオジシバリの形態変異であるのかの判断はできない。今後さらに個体数ならびに産地数を増やして解析を進めると共に、核DNAマーカーを用いた解析をおこなう必要がある。

また、ミヤコジシバリは琉球列島の固有種とされていたが、九州以北において分布調査をおこなった結果、愛知県渥美半島に四倍体ミヤコジシバリが出現することが確認された。伊豆半島や四国南部においてもオオジシバリが砂浜海岸に生育する場所が確認されたことから、ハマニガナとオオジシバリの交雑による四倍体ミヤコジシバリの形成は、琉球列島以外の広い地域においておこる可能性があると考えられる。
蛍光遺伝子を用いた頭頸部癌性疼痛緩和へのオキシトシン系関与の新規解明

オキシトシン-mRFP1トランスジェニックラットの口腔内粘膜に酢酸含有濾紙を接触させて作成した口内炎モデルラットを用いて、視床下部視索上核および室傍核に局在するオキシトシンニューロンの活性化を、mRFP1赤色蛍光強度を指標にオキシトシン遺伝子の発現変化として観察した。口内炎モデルラット群では、室傍核大細胞領域および小細胞領域に局在するオキシトシンニューロンのmRFP1赤色蛍光強度がコントロール群と比較して有意に増加しており、口腔内の疼痛刺激によってオキシトシンニューロンが活性化したことが示された。今後、頭頸部の炎症・癌性疼痛制御に視床下部オキシトシン系が関与しているかどうかについて検討したい。本研究課題では、下垂体後葉ホルモンの一つであるオキシトシンの疼痛・ストレス緩和作用に着目して、頭頸部疼痛緩和におけるオキシトシンの関与について検討している。平成25年度は、オキシトシン遺伝子に赤色蛍光タンパク(mRFP1)遺伝子を挿入した融合遺伝子を用いて作出したオキシトシン-mRFP1トランスジェニックラットを用いて、口内炎モデルを作成し、mRFP1蛍光の発現変化を観察した。口内炎モデル群は、ラットの口腔内粘膜に酢酸含有濾紙を60秒間接触させることで作成した。コントロール群は生理食塩水含有濾紙を用いた。5日後に深麻酔下で灌流固定し、脳および下垂体を取り出し、後固定後に薄切切片を作成して蛍光顕微鏡下で室傍核および視索上核におけるmRFP1蛍光強度を定量評価した。その結果、口内炎モデル群では、室傍核のmRFP1蛍光強度がコントロール群と比較して有意に増加していた。以上より、口内炎モデルラットにおいて室傍核に局在するオキシトシンニューロンが口腔内炎症における疼痛発現において何らかの関与が示唆された。本研究課題では、下垂体後葉ホルモンの一つであるオキシトシンの疼痛・ストレス緩和作用に着目して、頭頸部疼痛緩和におけるオキシトシンの関与について検討する事を目的とした。具体的にはオキシトシン-mRFP1トランスジェニックラットの口腔内粘膜に酢酸含有濾紙を60秒間接触させることで作成した口内炎モデルラットを用いた。作成したモデルラットを5日後に深麻酔下で灌流固定し、脳および下垂体を取り出し、後固定後に切片を作成して蛍光顕微鏡下で下垂体およびオキシトシンニューロンを含む視床下部視索上核(SON)および室傍核(PVN)の賦活化を、mRFP1蛍光を指標にオキシトシン遺伝子の発現として観察した。その結果、口内炎モデルラット群では、PVNのmRFP1蛍光強度が有意に増加していた。したがって、口腔内の疼痛(口内炎)制御に視床下部PVNを起点とするオキシトシン系が関与している可能性がある。今後、口腔内および頭頸部癌モデルを作成して癌性疼痛におけるオキシトシン系の関与を検討したい。医歯薬学計画1年次においては、オキシトシン-mRFP1トランスジェニックラットを用いて口内炎モデルを作成し、視床下部に局在するオキシトシンニューロンでのmRFP1蛍光の発現変化を観察した。今回の実験にて、室傍核でのオキシトシンニューロンと口内炎(炎症性疼痛)との何らかの関与が示唆された。本研究の成果は、平成26年度第36回日本疼痛学会(大阪)にて発表予定である。計画2年次においては、上述の実験結果をもとに口内炎とオキシトシン、mRFP1蛍光およびmRNAの変化のタイムコースをとること、口腔内の疼痛伝達経路(三叉神経系)について検討すること、および担癌モデルを作成して癌性疼痛におけるオキシトシン、mRFP1蛍光およびmRNAの変化を検討する。さらに、オキシトシンが口腔内疼痛緩和の役割をもとかどうかの検討のためにオキシトシン受容体アンタゴニストの投与を行う。次年度の研究費については、交配のための実験動物(ラット)の購入とトランスジェニックラットの飼育に必要な経費を使用する。主に使用する試薬等は、抗体を含む免疫組織化学的染色用試薬、in situハイブリダイゼーション試薬等、であり、これらの購入に研究費を使用予定である。また、in situハイブリダイゼーション法に使用するラジオアイソトープ(35S)に必要な経費を研究費から使用する。本研究の成果は、本疼痛学会などの疼痛関連の国内学会にて積極的に発表し、国際専門雑誌に英文論文として発表する予定である。これらに必要な経費を使用する。
動的ペプチド金属錯体からなる超分子集合体の秩序創生と動的変換プログラミング

配位金属錯体は特異な立体化学と動的な配位子交換特性をもち、それらを精密に組み合わせると、方向性のある空間の創出と時間発展の同時プログラミングが期待される。本研究では、キラルなペプチド配位子と置換活性な金属イオンにより構築される動的らせん型錯体を基盤として、らせん型金属錯体や生体高分子の集積プログラミングを行い、動的な構造変換系の創出と多元的な高次機能の探索を目指し、以下の成果が得られた。(1)動的らせん錯体の集積化と動的秩序形成研究グループで開発したらせん構造の反転や伸縮が可能な単核らせん錯体の集積化による動的挙動の相乗効果発現を目指して、単核らせん錯体を連結し、多核らせん錯体の外部刺激による構造変換挙動を検討した。しかし、単核錯体を単に連結して多核化を施しても溶解度が低下し応答性を詳細に検討できなかった。そこで、疎水性の長鎖アルキル鎖を導入した配位子を新たに合成し金属錯体化を行った。合成したCo(II)錯体は様々な有機溶媒に可溶であり、例えばアセトニトリル中よりもクロロホルム中の方がアニオンに対するレスポンスは顕著に向上した。(2)マレイミド末端を持つキラル錯体の合成と機能性官能基の秩序創生と動的変換マレイミド基を導入した動的金属錯体に、機能性チオール化合物や天然ペプチド鎖を導入し、それらの相対位置制御によるらせん情報の増幅と分光学的特性や集合状態の動的変換スイッチングを目指した。マレイミド基を含む光学活性な配位子をd.e. 98%以上で収率よく得た。非配位性アニオンを持つCo(II)やZn(II)イオンとの錯体は左巻きらせん構造であった。塩基および酸の交互添加による可逆的伸縮変換も可能であった。さらにマレイミド末端へのチオール含有官能基の導入条件を最適化するとともに、金属錯体の可逆的な伸縮構造変換を末端へ導入した発色団における誘起CDシグナルとして検出できた。29年度が最終年度であるため、記入しない。配位金属錯体は、特異な立体化学と動的な配位子交換特性をもち、それらを精密に組み合わせると、方向性のある空間の創出と時間発展の同時プログラミングが可能である。それらを刺激応答により自在にコントロールできれば、生体系で見られるような多段階の動的秩序形成の実現が期待できる。本学術領域研究では、キラルなペプチド配位子と置換活性な金属イオンにより構築されるらせん型配位錯体が多段階の動的構造変換を達成できることを基盤として、らせん型金属錯体や生体高分子の集積プログラミングを行い、共有結合のみから形成されるらせん分子では見られない、動的な構造変換過程の創出と、多元的な高次機能の探索を目指す。また、複数の外部シグナルに応答する動的構造変換系を超分子レベルで集積化し、自律的な時間発展を自在に操るタイムプログラミングも目指している。その過程において、本年度は以下の成果が得られた。(1)動的らせん錯体を集積化した巨大らせん分子の創出と秩序形成コレステロール側鎖を含むアミド型サイクレン錯体を種々合成し、それらの集積化スイッチングによるらせん型分子の創出とキラル空間を活用した分子認識を実現した。(2)マレイミド末端を持つキラル錯体の合成と機能性官能基の相対秩序創生と動的変換伸縮とらせん反転からなる多段階のスイッチングが可能なキラル錯体にマレイミド基を導入し、機能性チオール化合物の相対位置の秩序制御を行い、らせん情報の増幅と光物性などの動的変換スイッチングを目指している。配位子の合成およびナフタレンチオールの導入に成功を収め、円二色性挙動のスイッチングを確認した。動的なペプチド金属錯体からなる超分子集合体の秩序創生と動的変換について、研究計画に沿った具体的な成果が得られた。

マレイミド基を含む光学活性な配位子をd.e. 98%以上で収率よく得た。非配位性アニオンを持つCo(II)やZn(II)イオンとの錯体は左巻きらせん構造であった。塩基および酸の交互添加による可逆的伸縮変換も可能であった。さらにマレイミド末端へのチオール含有官能基の導入条件を最適化するとともに、金属錯体の可逆的な伸縮構造変換を末端へ導入した発色団における誘起CDシグナルとして検出できた。本研究では、研究代表者が独自に開発した、キラルなペプチド金属錯体の外部刺激による動的らせん反転スイッチングや、伸縮ーらせん反転連続スイッチングを活用して、生体分子やらせん超分子錯体の集積化と構造変換プログラミング、さらにその過程におけるキラリティー情報の伝達・増幅システムの構築を目指している。そのために次年度は以下のアプローチを主として展開し、さらに、個々のアプローチにおいて速度論的研究を進め、指導原理の解明を目指す。(1)動的らせん錯体の集積化と動的秩序形成研究グループではこれまでに動的らせん錯体を活用して、外部刺激によるらせん構造の反転や伸縮運動を実現してきた。それら単核らせん錯体ユニットの集積化による動的挙動の相乗効果発現を目指して、単核らせん錯体を連結した多核金属錯体を新たに合成し、らせん錯体の外部刺激による構造変換挙動を詳細に検討する。先に合成した四核錯体では溶解性の問題のため外部刺激による弱い相互作用を効果的に活用できなかった。そのため配位子末端に疎水性の長鎖アルキル鎖を導入し、疎水性溶媒中における外部刺激応答性能を検討する。次年度は合成した金属錯体を用いて、化学量論的、および速度論的検討を行い、構造変換挙動を詳細に検討する。(2)マレイミド末端を持つキラル錯体の合成と機能性官能基の秩序創生と動的変換伸縮とらせん反転からなる多段階のスイッチングが可能なキラル錯体の両末端にマレイミド基を導入し、機能性チオール化合物の導入とそれらの相対位置制御によるらせん情報の増幅と分光学的特性の動的変換、および天然ペプチド鎖の集合状態の動的秩序変換スイッチングを目指す。マレイミド末端にはチオール基が特異的、かつ定量的に反応するので、らせん金属錯体の構造異性体とその動的変換により、導入した2つの官能基間のねじれた空間配置の固定化や動的変換を行う。29年度が最終年度であるため、記入しない。
造血システムにおける腫瘍性幹細胞およびその悪性化に関与する遺伝子の同定

造血器腫瘍における腫瘍性幹細胞を同定しその生物学的特性の解析を通して,腫瘍化原因の遺伝子異常の検索を試みた.急性骨髄性白血病(AML)幹細胞に特異的に発現する抗原TIM3を同定し,抗TIM3抗体がAML幹細胞に選択性が高く,正常幹細胞には影響しない理想的標的抗原であることを示した.また,AML幹細胞の生存維持には抗アポトーシ遺伝子Mcl-1が重要な役割を担っており,Mcl-1およびその上流シグナ分子FLT3,Stat5を標的とした新たな治療法開発の可能性を示した.慢性リンパ性白血病は成熟B細胞の腫瘍性疾患と想定されていたが,その発症起源を造血幹細胞に遡り,幹細胞に由来する疾患である概念を提唱した.造血器腫瘍における腫瘍性幹細胞を同定しその生物学的特性の解析を通して,腫瘍化原因の遺伝子異常の検索を試みた.急性骨髄性白血病(AML)幹細胞に特異的に発現する抗原TIM3を同定し,抗TIM3抗体がAML幹細胞に選択性が高く,正常幹細胞には影響しない理想的標的抗原であることを示した.また,AML幹細胞の生存維持には抗アポトーシ遺伝子Mcl-1が重要な役割を担っており,Mcl-1およびその上流シグナ分子FLT3,Stat5を標的とした新たな治療法開発の可能性を示した.慢性リンパ性白血病は成熟B細胞の腫瘍性疾患と想定されていたが,その発症起源を造血幹細胞に遡り,幹細胞に由来する疾患である概念を提唱した.造血器腫瘍の幹細胞検索を主として骨髄異形成症候群,急性骨髄性白血病と慢性リンパ性白血病について行った.骨髄異形成症候群の患者ではCD34陽性,CD38陽性,IL-3R陽性CD45RA陰性の骨髄性共通前駆細胞段階で強い分化抑制が見られるのに対し,急性白血病症例ではややそれより分化した顆粒球・単球系前駆細胞の段階で白血病化が起こっていることが判明した.この分画をNOD-SCID-IL2gnullの重症複合免疫不全マウスに移植したところ白血病を発症したことから白血病幹細胞分画であることが判明した.現在この分画と正常の顆粒球・単球系前駆細胞とを純化し,マイクロアレイを用いて発現遺伝子の差異を調べている.また,慢性リンパ性白血病においては,CD34陽性,CD10陽性の非常に未分化なリンパ球分画が存在することを発見した.この分画は多くの成熟したリンパ性白血病細胞と同じ免疫グロブリン鎖遺伝子再構成パターンを有していることから,腫瘍性幹細胞であることが強く考えられる.この分画を純化し,重症免疫不全マウスに移植する予定である.さらに同様の腫瘍分画が,悪性リンパ腫のリンパ節外転移巣にもみつかることから多くのリンパ球系の腫瘍性幹細胞が同じ表面形質を有している可能性があり,現在この点にも重点をおいてさらに症例を重ねて研究中である.我々は,新しく開発した免疫不全マウス(IL-2Rg-null NOD/SCIDマウス: Blood 106,2005)の系を用いて,ヒトの免疫システムの分化過程を詳細に調べ,幹細胞から免疫・造血システムを再構築する技術を確立・整備した.現在,リンパ系腫瘍性幹細胞:慢性リンパ性白血病,悪性リンパ腫幹細胞の純化,および純化した細胞の遺伝子発現を調べることによって腫瘍化に関わる重要な遺伝子の同定を試みている.本年度は慢性リンパ性白血病(CLL)の幹細胞分画を絞り込むことに成功した.我々の解析した15症例全例において,末梢血中のCLL細胞集団内でpro-B/pre-Bに相当する未分化なB前駆細胞が増加していた.ところがその分画による腫瘍の生着は認められず,より上流の骨髄CD34^+CD38^-幹細胞分画を10^3個レベルで移植したところ,正常造血では認められない,CLLに特徴的なヒトCD5^+19^+細胞の増殖をマウス内に認めた.この細胞集団は,患者由来CLLと同一のIgH遺伝子再構成パターンを示した.以上の結果よりCLL幹細胞は,当初想定していたpro-B/pre-B分画よりも,さらに上流の造血幹細胞レベルにあることが明らかとなった.悪性リンパ腫症例についても同様の解析を進め,同様の未熟なB細胞集団を認めており,悪性リンパ腫の腫瘍性幹細胞の候補分画と考えている.また.白血病幹細胞分画候補において,白血病幹細胞化を獲得するのに重要な増殖能・自己複製能獲得に関与する遺伝子群を抽出している.我々は,抗アポトーシス蛋白bcl-2ファミリーの中でMcl-1が,白血病幹細胞分画において有意に高発現していることを発見した.Mcl-1の発現制御はFLT3シグナルを介していた.AMLの予後不良因子の一つとしてFLT3のinternal tandem duplication(ITD)異常が報告され,FLT3/ITD変異により恒常的にFLT3シグナルが活性化されることがFLT3/ITD変異AMLの発症原因と考えられている.そこで,FLT3/ITD変異AML症例でMcl-1の発現を検討したところ,FLT3/ITD陰性AMLと比較して有意にMcl-1の高発現を認めた.今後検体数を集積し,FLT3シグナルからの細胞内刺激伝達系(Srcファミリー/STATなど)とMcl-1との関与について検討する予定である.さらに遺伝子プロファイリングを継続し白血病幹細胞が使用している増殖および分化抑制メカニズムを明らかにする予定である.

我々は,免疫不全NOGマウス(Blood 106,2005)を用いて,ヒト造血幹細胞から免疫・造血システムを再構築する技術を確立した.現在,急性骨髄性白血病(AML)やリンパ系腫瘍(慢性リンパ性白血病(CLL)や悪性リンパ腫)における腫瘍性幹細胞の純化,および腫瘍化に関わる遺伝子の同定を試みている,我々は,抗アポトーシス蛋白bc1-2ファミリーの中で,Mcl-1が正常造血幹細胞で,下流の前駆細胞群と比較し,その発現レベルが極めて亢進していることを見出し,Mcl-1が造血幹細胞の生存強化に重要であることに注目している.そこでAML検体においてMcl-1の発現を検証したところ,白血病芽球と比較して,白血病幹細胞において有意にMcl-1の高値を認めた.またMcl-1の発現制御はFLT3シグナルを介しているが,AMLの予後不良因子としてFLT3のinternal tandem duplication(ITD)異常が報告され,FLT3/ITD変異により恒常的にFLT3シグナルが活性化されることがFLT3/ITD変異AMLの発症原因と考えられている.そこで,FLT3/ITD変異AML症例でMcl-1の発現を検討したところ,FLT3/ITD陰性AMLと比較して有意にMcl-1の高発現を認めた.さらにFLT3/ITD変異AMLにおけるCD34^+CD38^-AML幹細胞ではCD34^+CD38^+芽球と比較して,Mcl-1の発現量は有意に上昇していた.正常造血と同様にAML発症,特にFLT3/ITD変異AMLにおいて,Mcl-1が重要な役割を果たしている可能性が高い.引き続きMcl-1のAML発症に及ぼす役割について詳細に検討している.CLL症例でもCLL幹細胞の解析を進めている.CLL患者末梢血中にpro-Bに相当する未分化なCD34^+CD10^+CD19^+B前駆細胞集団を認め,CLL芽球と同一のIgH再構成パターンを示した.このCD34^+CD10^+CD19^+B細胞をNOG新生仔マウスへ移植したが,ヒト細胞の生着を認めないまま,マウスは6ヶ月以上生存した.一方,CLL患者骨髄幹細胞分画をNOGマウスへ移植したところ,すべてのマウスでヒト骨髄系とリンパ系の生着を認めるも,リンパ増殖性疾患を呈し死亡した.このことは,CLL幹細胞候補はCD34^+CD10^+CD19^-IL-7R^+分画ではなく,さらに上流の造血幹細胞レベルに存在する可能性が考えられる現在,幹細胞分画内にCLL幹細胞候補を探索している.我々は、造血器腫瘍の中で急性骨髄性白血病(AML)と慢性リンパ性白血病(CLL)の白血病幹細胞の純化と白血化に関わる遺伝子の同定を試みている。正常造血幹細胞の生存強化に抗アポトーシス蛋白Mcl-1が特異的に重要なことを見いだし、白血病幹細胞における意義について検討している。AML検体では、造血幹細胞およびCD34^+CD38^+AML芽球と比較して、CD34^+CD38^-AML幹細胞において有意にMcl-1の高発現を認めた。またMcl-1の発現制御はFLT3シグナルを介して調節されるが、AMLの予後不良因子としてFLT3のinternal tandem duplication(ITD)異常が報告され、FLT3/ITD変異により恒常的にFLT3シグナルが活性化されることがAMLの発症原因と考えられている。FLT3/ITD変異AML幹細胞分画ではMcl-1は著しく高発現していること、純化した正常造血幹細胞にFLT3/ITDを遺伝子導入するとMcl-1の高発現が誘導されること、Mcl-1を強発現させたFLT3/ITD変異細胞株にFLT3シグナル阻害剤を添加してもアポトーシスを回避することを確認した。
土壌圏の拡大に関する研究

乾燥地アルカリ土壌,とりわけ石灰(CaCO_3)集積土壌において,植物の顕著な生育制限要因である「欽欠乏」に対し,示本科植物が持つ主要な「欽欠乏耐性因子」である,ムギネ酸類の合成分泌能について,その機作を解明すべく研究を行ってきた。(1)本年は,ここ4年間に恒る研究の成果として,世界に駆けて,メチオニン→Sーアデノシルメチオニン→ニコチアナミン→デオキシムギネ酸→ムギネ酸→エピハイドロキシムギネ酸(又はハイドロキシムギネ酸に至る生合成経路を明らかにすることができた。現在,Sーアデノシルメチオニン→ニコチアナミンを司る酸素およびニコチアナミン→デオキシムギネ酸を司する酵素を單離精製している。(2)また,以上の研究と平行して,Fe欠乏時に時異的に発現する,遺伝子をFe欠乏mRNAから作成したcDNAと,Fe処理mRNAから作成したcDNAの,デファレンシャルハイブリダイゼ-ション法でスクリ-ニングし,数種のクロ-ンを單離した。現在これらの塩基配列と,鉄欠乏特異的発現性について検討している。(3)また,Fe欠乏時に大麦根に特異的に発現する,蛋白質を二次元電気泳動上で單離精製した。この蛋白はN末端がブロックされていたので,クリ-ブランド法(V8酵素使用)を用いてフラグメントに分解し,各ペプチド断片のN末のアミノ酸配列数残査を決めた。現在この配列に相同する合成DNAを用いてcDNAライブラリ-からクロ-ニングを行っている。将来はFe欠乏耐性遺伝子を導入した・トランスジェニック作物を育成するつもりである。