hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ドナー細胞由来白血病発症機構への細胞外小胞の関与の検討

BCR-ABL発現白血病幹細胞(LIC)を接種することで、慢性骨髄性白血病(CML)を発症させたマウスに対して、X線照射・骨髄移植を行うと、レシピエント由来の白血病細胞が消失し、血球系細胞がドナー由来の血球系細胞に置換された。しかし、その後Pseudo-Pelger Huet細胞様の顆粒球の出現とともに、重篤な貧血を呈する骨髄異形成症候群を発症し、死に至る、いわゆるドナー細胞由来白血病(DCL)に類似した病態が発症した。この病態モデルを解析したところ、レシピエントCML細胞由来の細胞外小胞がBCR-ABL遺伝子を始めとした、二本鎖DNAを大量に含有していることを見出した。さらに、これらの細胞外小胞を介して、ドナー細胞にレシピエント細胞由来の二本鎖DNAが水平伝播することも見出した。STING経路を介して、二本鎖DNAを認識することで、インターフェロン経路が活性化される結果、ドナー由来の造血幹細胞のvitroでの複製能が低下した。さらに、CML発症マウスに対して、X線照射後に、STING欠損マウス由来の骨髄細胞を移植しても、DCL様の病態の出現が認められなかった。以上の結果から、CML細胞由来の細胞外小胞がSTING経路を介して、ドナー由来の骨髄幹細胞に対して抑制的に作用することによって、DCLが発症する可能性が強く示唆されることから、STING経路の抑制によってDCL発症が予防できる可能性も示唆された。白血病の治療として行われる骨髄移植では、X線照射後も残存する白血病幹細胞(LIC)からの再発以外に、移植した正常細胞からの白血病、いわゆるドナー細胞由来白血病(DCL)の発症が、骨髄移植患者の約1%で認められる。DCLは通常の再発白血病に比べて悪性度が高いが、適切な動物モデルがなく、発症機構は不明な点が多い。本研究計画開始時にBCR-ABL発現LICを接種して、CMLを発症させたマウスが、X線照射・骨髄移植を行った後に、重篤な貧血を発症し、死亡することを見出している。CML発症マウスをCD45.2陽性BALB/cマウス、骨髄移植に用いるドナー・マウスをCD45.1陽性BALB/cマウスとする組み合わせによる検討を行った。その結果、骨髄移植後にはCD45.2陽性のCML細胞が消滅する一方で、血球系細胞はドナー由来のCD45.1陽性細胞に置換され、その後Pseudo-Pelger Huet細胞様の顆粒球が出現するとともに、重篤な貧血を発症し、死に至ることから、骨髄異形成症候群を発症したと考えられた。したがって、この現象はDCLの疾患モデルとして妥当であると考えられた。一方で、レシピエントCML細胞由来の細胞外小胞がBCR-ABL遺伝子を二本鎖DNAとして大量に含有している可能性が示唆され、この病態が発生する際に、ドナー由来細胞がレシピエント細胞由来のBCR-ABL遺伝子のみならずタンパクも発現していることも明らかとなった。今後は、CML細胞由来の細胞外小胞に含有されているBCR-ABL遺伝子を含む種々の分子の、この病態の形成過程への関与について検討を加える予定である。CD45.2陽性のBALB/cマウスの骨髄から得られた正常造血幹/前駆細胞(HSPC)に、レトロウイルスベクターを用いてヒトBCR-ABL遺伝子を導入し、白血病幹細胞(LIC)を作製した。LICをX線照射したレシピエントマウスに骨髄移植し、慢性骨髄性白血病(CML)を発症させた後にX線照射し、CD45.1陽性のコンジェニックマウスから採取した骨髄単核球を骨髄移植した。骨髄移植療法後に、末梢血白血球数・脾臓の大きさ・脾臓内のLIC数・残存白血病細胞数・BCR-ABL発現ドナー細胞数などを、経時的に検討した。その結果、4Gy以下の放射線照射後に骨髄移植を行うと、LICが残存しCMLが再発した一方で、5Gyの放射線照射後に骨髄移植を行うと、LICが根絶し、ドナー由来のCD45.1陽性細胞に血球系細胞に置換されることを確認した。しかし、その後にPseudo-Pelger Huet細胞様の顆粒球が出現するとともに、重篤な貧血が発症し、死に至ることから、骨髄異形成症候群を発症したと考えられた。したがって、この現象のDCLの疾患モデルとしての妥当性の検証という当初の目標は達成されたと考えられる。さらに、レシピエントCML細胞由来の細胞外小胞がBCR-ABL遺伝子を二本鎖DNAとして大量に含有している可能性が示唆されるうえに、この病態が発生する際に、ドナー由来細胞がレシピエント細胞由来のBCR-ABL遺伝子のみならずタンパクも発現していることも明らかとなった。このことから、レシピエント由来白血病細胞からドナー由来正常血球系細胞へ、細胞外小胞を介した水平伝播が生じている可能性が示唆されるなど、新たな発展につながる研究成果も得られた。

この病態モデルを解析したところ、レシピエントCML細胞由来の細胞外小胞がBCR-ABL遺伝子を始めとした、二本鎖DNAを大量に含有していることを見出した。さらに、これらの細胞外小胞を介して、ドナー細胞にレシピエント細胞由来の二本鎖DNAが水平伝播することも見出した。STING経路を介して、二本鎖DNAを認識することで、インターフェロン経路が活性化される結果、ドナー由来の造血幹細胞のvitroでの複製能が低下した。さらに、CML発症マウスに対して、X線照射後に、STING欠損マウス由来の骨髄細胞を移植しても、DCL様の病態の出現が認められなかった。以上の結果から、CML細胞由来の細胞外小胞がSTING経路を介して、ドナー由来の骨髄幹細胞に対して抑制的に作用することによって、DCLが発症する可能性が強く示唆されることから、STING経路の抑制によってDCL発症が予防できる可能性も示唆された。これまでの検討から、研究代表者らのグループが見出した現象は、これまで報告されたことがないDCLの疾患モデルとしての妥当性が明らかになった。レシピエントCML細胞由来の細胞外小胞がBCR-ABL遺伝子を二本鎖DNAとして大量に含有していて、この病態が発生する際に、ドナー由来細胞がレシピエント細胞由来のBCR-ABL遺伝子のみならずタンパクも発現していることも明らかとなったことから、レシピエント由来白血病細胞からドナー由来正常血球系細胞へ、細胞外小胞を介した水平伝播が生じている可能性も示唆されている。今後は、細胞外小胞を介した水平伝播の可能性をより詳細に検証する。さらに、水平伝播の存在が確認された場合には、水平伝播にかかわる分子機構ならびに水平伝播後のドナー細胞における変化を、分子レベルで解明する。これらの点の検討を通して、DCL発症の細胞・分子機構を解明し、現時点では有効な治療・予防法のないDCLに対する治療・予防法の開発のための基盤を形成することを目指す。29年度に予定していた、成果発表を目的とした海外の国際学会への出席が、国内開催の国際学会への出席となり、海外旅費分に相当する額が支出されなかったため、30年度使用額とすることとした。次年度使用額については、成果発表を目的とした海外開催の国際学会への出席のための旅費に充てる予定である。
細胞壁再構成をともなう離生細胞間隙形成の分子機構

NOP1の標的タンパク質や制御タンパク質を単離することを目的として、NOP1結合タンパク質を探索し、得られた候補遺伝子について機能欠損変異株を作出し、表現型を解析することで関連遺伝子の同定を試みた。まずNOP1結合タンパク質を同定するため、U-boxドメインを欠失した不活性型NOP1-Citrineを発現する形質転換体を用いて免疫沈降を行い、沈殿物に対して質量分析を行った。その結果、数百に及ぶNOP1結合タンパク質候補が単離された。得られたNOP1結合タンパク質候補に対して様々な情報をもとに、細胞間隙形成と関連のありそうな候補を絞り込んだ。選抜したNOP1相互作用因子候補には微小管や細胞骨格関連因子、セルロース合成酵素関連因子、膜交通関連因子、受容体キナーゼなどが含まれていた。これらのNOP1相互作用因子候補についてCRISPR/Cas9ゲノム編集システムによって機能欠損株の作出を行い、表現型の観察を行ったところ、複数の機能欠損株で基質形成に異常が確認され、NOP1と協働して気室形成に関与する可能性のある因子が複数単離された。その中でも、微小管とセルロース合成酵素の双方に結合して働くことが示唆されているCSI1(CELLULOSE SYNTHASE-INTERACTIVE1)遺伝子のオーソログに着目し、更なる解析を行った。その結果、ゼニゴケCSIの機能欠損株では、気室形成密度が低下すること、気室形成が起こる領域でも形態の異常な気室や気室孔が形成されることが明らかとなった。このことからCSIは正常な気室形成に必要な因子であると考えられ、CSIは微小管と細胞壁合成酵素の制御を介して気室形成を正に制御することが示唆された。28年度が最終年度であるため、記入しない。NOP1-Citrineをnop1変異体に導入し気室形成が回復した相補株と、NOP1のE3リガーゼ活性に必要なU-boxドメインを欠失した⊿UboxNOP1-Citrineを導入したnop1変異体と用いてNOP1と相互作用するタンパク質およびNOP1と相互作用しプロテアソームによる分解を受けるタンパク質候補を免疫沈降実験とLC-MSMSによるプロテオーム技術により解析した。候補となるタンパク質候補は数百にも及んだが、細胞内局在や機能ドメイン予測などの情報を併せて解析対象を28個にまで絞り込んだ。絞り込んだNOP1相互作用因子候補には、微小管や細胞骨格関連因子、セルロース合成酵素関連因子、膜交通関連因子、受容体キナーゼなどが含まれている。これらのNOP1相互作用因子候補をコードする遺伝子について、CRISPR/Cas9によるノックアウト株の作出を進めており、現在のところ2つの遺伝子について、気室形成に関連する表現形が見えている。そのうち、キネシン様カルモジュリン結合タンパク質ZWICHELの相同遺伝子CUFF.4329を破壊すると表面から気室孔が観察されず正常な気室形成が確認できない。CUFF.4329の破壊株は、気室の他にも仮根や葉状体の形態に異常が認められる(NOP1は野生株と変わらない)。また表層微小管とCESA複合体を連結するCELLULOSE SYNTHASE-INTERACTIVE1遺伝子の相同遺伝子CUFF.11924を破壊すると気室形成頻度が著しく減少し、形成された気室も異常な形態を示した。今後、これらの候補遺伝子の機能解析を進めるとともに、NOP1との相互作用について複数の手法を用いて確認し、ゼニゴケにおける離生細胞間隙形成にともなう気室形成機構を明らかにする。本研究は、基部陸上植物ゼニゴケの気室形成をモデルに、植物の離生細胞間隙形成の制御メカニズムを解明することを目的としている。ゼニゴケの離生細胞間隙形成を制御するE3リガーゼNOP1の相互作用因子候補を絞込み、更にその中から気室形成に関わる制御因子の同定にトライしてきた。プロテオミクス解析では、解析対象となる相互作用因子候補が多すぎること、実験毎のバラつきが大きいことが問題となった。しかしながら、CRISPR/Cas9による新しい変異体作出法を導入することにより、当初の想定よりもハイスループットな遺伝子機能解析系が確立された。この技術の導入により、離生細胞間隙形成の関連因子が複数見つかりつつある。

その結果、ゼニゴケCSIの機能欠損株では、気室形成密度が低下すること、気室形成が起こる領域でも形態の異常な気室や気室孔が形成されることが明らかとなった。このことからCSIは正常な気室形成に必要な因子であると考えられ、CSIは微小管と細胞壁合成酵素の制御を介して気室形成を正に制御することが示唆された。現在進めている、相互作用因子候補の機能解析については、CRISPR/Cas9系によるゲノム編集系による機能欠損変異体の作出と表現形解析を行っていく。機能欠損変異体について、気室形成に異常が確認され、気室形成に関連する機能が考えられる遺伝子については、発現組織やNOP1との相互作用について詳細な検証を行う。以上の情報を統合し、ゼニゴケにおける離生細胞間隙形成にともなう気室形成制御機構を明らかにする。28年度が最終年度であるため、記入しない。
老化にともなうEPH/ephrinシグナルの骨リモデリング機構変化の解明

若いラットと高齢ラットを用いて歯周組織の変化を比較検討した。歯根根尖部に多くみられていた神経ペプチドの一つのCGRPは、加齢により発現が減少し骨芽細胞、破骨細胞の活性を低下させていると考えられた。また歯根膜におけるbFGFの産生の低下が認められ、歯根膜の再生を遅延させることにより、高齢者における矯正治療に影響を与えることが考えられた。近年、矯正治療を希望される成人の患者が増えており、矯正力に対する応答が子供のそれとは異なることが臨床的に認められている。しかし、老化による歯周組織の退行性変化の詳細な検討はいまだ不十分である。口腔内においては咬合力などのmechanical stressが、骨を含めた歯周組織の恒常性の維持に関与している。歯科矯正分野では歯に矯正力を付与することによりその歯根周囲の歯根膜に圧迫側、牽引側が生じ、骨芽細胞、破骨細胞による歯槽骨の骨形成、骨吸収という骨の新鮮化を伴いながら歯の移動を起こしている。そこで、矯正の分野で重要な骨の代謝のメカニズムにおける老化の影響を明らかにすることを目的に、本年度は6、12、24ヶ月の加齢ラットを用い歯周組織にどのような変化が起こるか組織学的に検討し成果を上げた。加齢が進む従い歯髄腔、歯根膜腔の狭窄、さらにセメント質の増加が生じ、破骨細胞の増加による歯槽骨の吸収による歯髄腔の拡大、歯槽骨レベルの低下が認められた。また、歯周組織のremodelinに影響を与える、神経ペプチドの一つであるCGRPの発現が減少していた。5、9、15週の成長期ラットの根尖部において発現が増加し、その発現パターンが加齢によって全く異なることを明らかにした。この発現の減少が骨芽細胞、破骨細胞の活性を低下させると考えられる。近年、矯正治療を希望される成人の患者が増えており、矯正力に対する応答が子供とは異なることが臨床的に認められている。そこで、矯正の分野で重要な骨の代謝のメカニズムにおける老化の影響を明らかにすることを目的に、6、12、18ヶ月の加齢ラットを用い細胞の増殖や、分裂、アポトーシスを調節し、歯周組織のremodelingに影響を与える線維芽細胞増殖因子(bFGF)にどのような変化が起こるか組織学的に検討し成果を上げた。bFGFは、歯根膜において、破骨細胞の活動を増強し、I型コラーゲンの産生を減少させ、アルカリフォスファターゼ活性を抑制する。遠心根近心側中央部歯根膜におけるbFGFの産生は加齢に伴い、低下し、根尖部においては変化が無く、歯根の部位によりその発現パターンが異なることを明らかにした。加齢によるbFGFの産生の低下は、歯根膜の再生を遅延させことに関連していることが示唆され、高齢者における矯正治療に影響を与えることが考えられた。今後さらなる高齢化社会を迎えるにあたり、健康的な生活を送るために歯科矯正治療の果たす役割は大きくなっている。高齢者における歯科矯正治療の矯正力に対する生物学的応答が子供とは異なることが臨床的に認められている。しかし、これまで老化による歯周組織の退行性変化の詳細な検討は未だ不十分である。歯科矯正分野では歯に矯正力を付与することによりその歯根周囲の歯根膜に、圧迫側、牽引側が生じ、骨芽細胞、彼骨細胞による歯槽骨の骨形成、骨吸収という骨の新鮮化を伴いながら歯の移動を起こしている。そこで、矯正分野で重要な骨の代謝メカニズムにおける老化の影響を明らかにすることを目的に6、12、18ヶ月の加齢ラットを用い細胞の増殖や、分裂、アポトーシスを調整し、歯周組織のremodelingに影響を与える線維芽細胞増殖因子(bFGF)にどのような変化が起こるか組織学的に検討し、成果を上げた。bFGFは歯根膜において破骨細胞の活動を増強し、I型コラーゲンの産生を減少させ、アルカリフォスファターゼ活性を抑制する。遠心根近心側中央部歯根膜におけるbFGFの産生は加齢に伴い、低下し、根尖部において変化がなく、歯根の部位によりその発現パターンが異なることを明らかにした,加齢によるbFGFの産生の低下は、歯根膜の再生を遅延させることに関連していることが示唆され、高齢者における矯正治療に影響を与えることが考えられ、今年度はこれらを論文投稿し成果を上げた。
宿主・ウイルスを標的とした抗HCV薬剤・化合物の大規模スクリーニング

我々はHCV増殖に関連する宿主因子の探索を遂行し、以下の結果を得た。(1) replicon細胞を用いて8, 000種の化合物ライブラリーから5個のエポキシ誘導体を同定した。(2) 4, 000種の化合物をスクリーニングし、HCV感染を抑制する5種の化合物を同定した。(3) SRタンパクキナーゼを標的とした抗HCV分子4個を同定した。以上の知見より、新規クラス抗HCV療法薬剤の開発を目標に引き続き研究を遂行する。当該研究期間において我々は、HCV感染・増殖細胞モデルを用いて薬剤・生理活性化合物・短鎖ペプチドの抗ウイルス作用の網羅的スクリーニング、およびHCV増殖に関連する宿主因子の探索を遂行し、以下の結果を得た。(1)HCV-Feo replicon細胞を用いてDiversity-Oriented Synthesis(DOS)法で合成した8,000種の化合物のスクリーニングを施行し、HCV増殖を抑制する41種の化合物を同定し、構造活性相関解析にIC50の優れた5個のエポキシ誘導体を同定した。(2)HCV複製増殖に関与する代謝・シグナルネットワークの網羅的解析により、脂質・コレステロール代謝に関わる代謝・シグナルネットワークの関与、関連薬剤の効果を確認した。(3)SRタンパク質特異的キナーゼを標的とした小分子ライブラリーのスクリーニングを行い、特異的な抗HCV活性を持つ分子4個を同定した。今後これらの知見を統合し、HCV感染サイクルにおけるウイルスおよび宿主蛋白相互作用の細胞・分子レベルでの理解を深め、新規クラス抗HCV療法薬剤の開発・実用化に必要な基盤情報の蓄積を到達目標とし引き続き研究を遂行する。本研究で同定された化合物の作用機構の解析、小動物モデルを用いた効果・安全性の検証を進めることにより新たな抗ウイルス薬剤の開発につながると思われる。さらに新たな化学合成ライブラリーの4,000種の化合物をスクリーニングし、HCV replicon増殖、HCV-JFH1感染を抑制する5種の化合物を同定し、構造類似化合物のスクリーニングを追加し構造活性相関があることを確認した。
高速リビングイモータル重合の開発と応用

嵩高い置換基を有する有機アルミニウム化合物は、溶液中で単量体として存在し、高いルイス酸性を示すことが知られている。我々は、嵩高い有機アルミニウムと、アンモニウム塩やホスホニウム塩等のオニウム塩を組み合わせた単純な系により、オキセタンやエポキシドの重合が進行し、分子量の揃ったポリマーが得られることを見いだした。その際、オニウム塩とルイス酸から嵩高いアート錯体が生成していることをX線結晶構造解析により確認した。重合はアート錯体のみでは進行せず、重合が進行するためには、オニウム塩に対して過剰量のルイス酸が必須であることが分かった。しかも、オニウム塩に対するルイス酸の量を増やすことにより、生成ポリマーの分子量、及び分子量分布の値を保ったまま、より高速に重合させることが可能であった。このことから、本重合では、フリーのルイス酸がモノマーを活性化し、それに対して嵩高いアート錯体が求核攻撃することにより制御された重合が実現しているものと考えられる(求核種とルイス酸との共同作業)。また最近、我々は求核サイトとルイス酸サイトを同一分子上にもつ多核ルイス酸を設計し、これをオニウム塩と組み合わせた系においては、求核種とルイス酸とのより効率的な共同効果により、重合が加速することを見いだしている。高分子材料の基本的性質は、分子量によって大きく異なる。しかし、通常、合成高分子は様々な分子量の高分子の混合物として生成し、これまでは、構造形成材料としてそれらがそのままの形で利用されてきた。しかし、次世代の、より高機能・高性能な高分子材料の開発においては、分子量のばらつき(基礎物性のばらつき)は重大な問題となる。申請者らは、金属ポルフィリン錯体が様々なタイプのモノマーのアニオンリビング重合を引き起こし、分子量の揃った多様な高分子を合成できることを見いだした。更に最近、ルイス酸を添加すると重合が著しく加速されることも見い出した。本研究では、求核剤とルイス酸からなる優れた開始剤の実用化を目指すべく、モノマーの適用範囲や重合条件等に関する更なる検討を行い、さらに、高分子に共有結合的に固定化された金属ポルフィリン錯体の分子設計を行ない、回収/再利用可能なはじめてのリビング重合開始剤の開発を目的としている。本年度は、特に求核剤とルイス酸からなる開始剤の探索を中心に研究を進めた。その中で、求核剤となるポリフィリン錯体のみならず、より安価で工業的にも使用可能、シッフ塩基錯体やフタロシアニン錯体をルイス酸とを組み合わせた開始剤系を用いた場合にも、エポキシドの高速アニオンリビング重合が進行し、分子量が揃ったポリマーが得られることがわかった。さらに、ルイス酸についても種々の検討を重ねた結果、アルミニウムのフェノキシドのほかに、トリフェニルボロンなどのホウ素化合物も有効であることがわかった。また、上記のリビング重合において、工業レベルのモノマをアルミナカラムを通すだけの前処理で用いても、分子量分布の狭いポリマーが得られることを見いだした。
細胞が非対称性を獲得する原理の分子レベルおよび数理・数式レベルでのモデル構築

組織や細胞は発生・分化に伴って非対称性(極性)を獲得して固有の形態を形づくる。生体がどの様にして非対称性を獲得するかという問題は重要な研究テーマである。我々は、これまでの大規模なプロテオーム解析により、神経極性形成タンパク質Shootinlを見出した。本研究では、Shootinlの実験計測データを条件とした自立的に極性を獲得することができるモデルニューロンの構築を行う。そして、数理解析の結果を実験科学にフィードバックして研究を推進するアプローチを通して、細胞が非対称性を獲得するしくみの原理を分子レベルおよび数理・数式レベルで解き明かすことを目指す。本年度は、神経極性形成に伴うShootinlの発現上昇、神経突起先端におけるShootinlの濃縮が引き起こす神経突起伸長、およびShootinlの細胞体から神経突起先端への能動輸送の計測を行い、これらの定量的な計測データを得ることに成功した。また、これらのデータを用いて完成型のモデルニューロンを構築し、培養神経細胞と極めてよく似た自立的な極性形成を起こすニューロンの構築にほぼ成功した。現在、いくつかのパラメータに関してさらに詳細な数値の調整中である。以上の研究成果に加えて、昨年度までに作成した基本モデルニューロンおよび培養ニューロンを用いてさまざまな実験パラメータに変動を与えて、極性形成過程への影響を調べた。その結果、すべての条件下で培養ニューロンとモデルニューロンが一致した挙動を示したため、モデルニューロンが概ね正しく神経極性形成を再現することが示唆された。今後は、今回構築したモデルニューロンのパラメータを実験計測データに基づいてさらに調整することにより、最終的な完成型のモデルニューロンを構築する。我々は、これまでの大規模なプロテオーム解析により、神経極性形成タンパク質Shootin1を見出した。本研究では、Shootin1の実験計測データを条件とした自立的に極性を獲得することができるモデルニューロンの構築を行う。本年度は、神経極性形成に伴うShootin1の細胞内挙動を計測し、それをもとに基本モデルニューロンを構築した。このモデルニューロンは、培養ニューロンと同様に自立的に極性を獲得するのみならず、その軸索形成曲線は培養ニューロンと同様に2相性の曲線を描いた。このことは、神経細胞の非対称性の獲得のためにShootin1が中心的な働きを担っていることを示唆するのみならず、Shootin1の観測データが神経細胞の非対称性の獲得ための基本条件を構築しうることを示唆している。また、基本モデルおよび培養ニューロンの3種類の実験パラメータに変動を与えて両ニューロンの極性形成過程を比較した結果、すべての場合において培養ニューロンと基本モデルニューロンが一致した挙動を示した。このことから、本年度に構築した基本モデルニューロンが概ね正しく神経極性形成を再現することができると考えられた。今後の課題として、実験結果から考えられた「長い突起ほどShootin1が突起に濃縮しやすい」という仮説を実験で証明することが今回得られた基本モデルを検証する上で重要と考えている。また、計測データの定量性をさらに向上させてモデルに組み入れる。以上の実験と数理解析を積み重ね、基本モデルの検証と修正を行うことにより、より優れたモデルニューロンの構築を目指す。
ＳＯＦＣのクロム被毒劣化を解決する「電極反応場にクロムを固定化しない材料と運転」

SOFCのクロム被毒を抑制する研究を実施し、以下のことを明らかにした。過電圧増加による、電極反応場の電解質上へのクロム析出は、カソード材料によらない本質的な現象である。クロム蒸気との反応性の高いカソード材料(LSCF, BSCF等)では、電極表面でクロム蒸気をトラップする場合もある。電解質上に析出したクロムは、その後の過電圧の変化により、消失したり凝集したりするが、詳細なメカニズム解明につながる有益な情報を与える。クロム被毒によるカソード劣化を抑制する独自コンセプトの実現のため、(1)過電圧によるクロムの移動定量化(⇒クロム再蒸発を促進する最適制御)、(2)カソード/クロム分子相互作用の解明(⇒カソードの最適表面組成・構造概念設計)、(3)クロムを固定化しないカソード材料の探索(⇒耐被毒性カソード材料の開発)に取り組んでいる。(3)については、6種類のカソード材料LSM,LSCF,LNF,BSCF,PrSM,NdSMを比較した結果、電解質近傍にクロムが析出するタイプ(LSM, LNF, PrSM, NdSM)と、カソード表面にクロムが析出するタイプ(LSCF, BSCF)に分かれた。カソード過電圧の上昇によって析出速度が増加する(カソード過電圧がクロム析出を支配する)傾向は共通であった。LSCF, BSCFは、カソード過電圧によりクロム蒸気との反応性が上昇すると考えられ、混合伝導性との関連で調べる必要がある。このような反応性の差異による影響はあるものの、カソード過電圧によって電極反応場、特に電解質(ジルコニア等)表面に生成する酸素空孔がクロム析出を促進する機構は、カソード材料によらず共通と考えられる。(2)については、高分解能の走査透過電子顕微鏡(S-TEM)を用いて、ナノ領域におけるクロム析出分布を、特に電解質表面に析出したクロムに注目して観察した。電子エネルギー損失分光(EELS)によって、析出クロム近傍における酸素濃度低下を確認し、酸素空孔がクロム析出を促進する機構を確認した。ジルコニアは本来電子伝導性を示さないため、カソード材料から分離した元素の酸化物(Mn, Ni, Ndなど)が電解質表面を薄く覆うことにより、ジルコニア表面に酸素空孔を生成させる。(1)については、ジルコニア表面に析出したクロムは、過電圧をゼロに戻すことにより部分的に成長し、セリア表面に析出したクロムは過電圧をゼロに戻すことにより消失する現象を確認した。(1)については、性能低下に直接影響する「電極反応場近傍へのクロム析出」はカソード過電圧に影響され、カソード過電圧を小さくすれば、クロム移動量や析出量も小さくなることを明らかにした。これが劣化抑制の1つのポイントになる。カソード過電圧の変化によるクロムの再蒸発の明確化や定量には着手し、現在多数の実験を実施中である。(2)については、LSMカソード、LSCFカソード、LNFカソードについてSTEM-EDXにより、析出したクロムの位置を詳細に分析した。その結果、ミクロなクロム析出の場所は、電極反応場と推測される場所とほぼ一致し、基本的なメカニズムとして、「電極反応に伴う過電圧により電極材料表面に生成する酸素空孔がクロム蒸気と反応すること、及びその過程が律速になること」が明らかになりつつある。今後は、原子分解能での超微細観察も適用し、析出したクロムの状態を確認することよって、メカニズムを明確化していく。(3)については、同一過電圧条件においてLa系以外の複数のカソード材料を、LSM等と比較することによってスクリーニングを実施中である。今後、クロムとの反応性が低い材料、過電圧状態で酸素欠損の少ない材料なども再考し、(1)(2)の検討と合わせて耐被毒性カソード材料の開発につなげていく。クロム被毒によるカソード劣化を抑制する独自コンセプトの実現のため、(1)過電圧によるクロムの移動定量化(⇒クロム再蒸発を促進する最適制御)、(2)カソード/クロム分子相互作用の解明(⇒カソードの最適表面組成・構造概念設計)、(3)クロムを固定化しないカソード材料の探索(⇒耐被毒性カソード材料の開発)に取り組んだ。

(3)については、6種類のカソード材料LSM,LSCF,LNF,BSCF,PrSM,NdSMを比較し、電解質近傍にクロムが析出するタイプ(LSM, LNF, PrSM, NdSM)と、カソード表面にクロムが析出するタイプ(LSCF, BSCF)に分類できることを示した。LSCF, BSCFは、カソード過電圧によりクロム蒸気との反応性が上昇すると考えられ、このような反応性の差異による影響はあるものの、カソード過電圧によって電極反応場、特に電解質(ジルコニア等)表面に生成する酸素空孔がクロム析出を促進する機構は、カソード材料によらず共通と考えられる。(1)(2)については、カソード材料に従来用いられることがなかったNiOを用いてメカニズム研究を行った。高分解能電子顕微鏡(S-TEM)観察により、NiOをカソード材料に用いた場合、ジルコニアやセリアなどの電解質材料表面のみにクロムが析出することを確認した。電子エネルギー損失分光(EELS)によって、析出クロム中の酸素濃度低下を確認し、表面に吸着したクロム分子から電解質側へ酸素が抜かれて析出が進行する機構を推定した。カソード材料に用いたNiOが電解質表面を薄く覆い、電解質表面に電子を供給して酸素空孔を生成させると感がられる。また、過電圧を200 mVから0 mVやマイナス200 mVへ変化させることによって、析出したクロムが部分的に消失したり、逆に成長(凝集)したりするなどメカニズム解明につながる挙動を確認し、過電圧変化とクロム析出分布の変化を対応させることによりクロム析出メカニズムをよりクリアにする手法の有効性を確認した。工学1カソード材料によらず、過電圧がクロム析出を促進し、電極反応場近傍の電解質表面にも析出させた。このことから、クロム析出を抑制するためには、カソード材料を変更するよりも、カソード過電圧を低減する方策が有効であることを明らかにした。2LSCF, BSCFについては、過電圧によりクロム蒸気との反応性が高くなり、カソード表面でクロム蒸気をトラップすることによって、電極反応場へのクロム析出を遅らせる効果があると考えられる。長期的な持続性については検証する必要があるが、この種の材料は長寿命化に有効である可能性がある。3過電圧印加によって、電極反応場近傍の電解質表面にクロムが析出することが最も懸念すべき性能低下の要因と考えられる。この現象は、過電圧によって誘発され、カソード材料とは無関係に起るため、過電圧を極小に抑える方策を除いて、析出自体を避けることはできないことが判明した。そこで、過電圧印加により析出したクロムを、過電圧をゼロに戻すなどの操作を加えることによって、蒸発、消失させられるかが重要なポイントになる。この実験により、セリア上ではクロムの消失が確認され、ジルコニア上では逆に一部分が結晶成長する現象が明らかになった。今後、この差が生じるメカニズムを詳細に解明することによって、期間内に、耐クロム被毒カソード創製のための3つ目の対策を見出すことができる。すでに「カソード過電圧低減によるクロム析出量の低減が有効」であること、「電極反応に伴う過電圧により電極材料表面に生成する酸素空孔がクロム蒸気と反応すること、及びその過程が律速」になることを明らかにしている。現在、材料のスクリーニング、原子分解能観察によるメカニズム詳細解明を実施しており、期間内の目標達成が期待される。次年度(最終年度)は、過電圧印加によって、電極反応場近傍の電解質表面に析出したクロムに注目して、析出のメカニズム、過電圧変化によるクロム分布の変化(蒸発や結晶成長など)、電解質材料(ジルコニア、セリア)による差異をより明確にする。
アルツハイマー病「プロテオグリカン仮説」の検証:老化脳のプロテオグリカン

本研究の目的は、脳に存在するプロテオグリカン(PG)やその多糖側鎖であるグリコサミノグリカン(GAG)が、アルツハイマー病の脳内蓄積物質の形成に、どのような役割を果たしているのかを調べることである。アルツハイマー脳においては、PG/GAGの構造および組成における加齢変化に異常が起きていることが予想される。そこで、まず、生後1週より2年までのラット脳を用い、正常加齢に伴う脳内GAG組成の変化を調べた。いずれの年齢においても、脳にはコンドロイチン硫酸(CS)、ヘパラン硫酸(HS)、ヒアルロン酸(HA)が存在することが分かった。3者の相対量には、著変はみられなかった。アルツハイマー脳2例と対照脳3例について、GAGの量と組成を調べた。GAGの総量は、アルツハイマー脳でわずかに高い傾向が得られた。ヒト老化脳には、ラットでみられた3つのGAG以外に、微量のデルマタン硫酸が検出される試料があったが、アルツハイマー脳特有の現象ではなかった。また、アルツハイマー脳では、ヘパラン硫酸の総量が減少している傾向が認められた。現在、CSおよびHSの繰返2糖組成を、HPLCにより測定している。ラット脳における可溶性PG組成の加齢変化を調べたところ、幼若脳の主成分であった220kDaのコア蛋白を持つコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG-220)が成熟脳では消失していること、かわってCSPG-93が増加していることなどがわかった。これらのPG/GAGを認識するモノクローナル抗体の作製を行っているが、対応するヒトの脳のPG/GAGを認識する抗体は有用である。2H6と名づけた抗体は、成獣ラット脳およびヒト対照脳の一部の領域に存在するCSを認識することが明らかとなった。今後、この抗体が認識するCSのアルツハイマー脳における量や存在について調べる予定である。
不定方程式及び生成多項式を用いた代数体のイデアル類群の研究

巡回群でないようなイデアル類群を持つ代数体の構成のため,生成多項式及びある種の不定方程式の分析を行った.その結果, 4を法として3と合同な素数pに対し,イデアル類群のp-rankが2以上となるようなpー1次の虚巡回体の無限族を明示的な形で与えた.また, p=3の場合の鏡映関係の精密化を与え, 3-rankが2以上のイデアル類群を持つ虚2次体の新たな無限族を得た.本研究は、生成多項式及び不定方程式の分析により、ある種のイデアル類群を持つような代数体の構成を目的としている。本年度は以下に述べる成果があった。1.「4を法として3と合同な素数pに対し、イデアル類群のp-rankが2以上となるようなp-1次の虚巡回体の無限族を明示的に構成する」という結果が、Publ. Math. Debrecen vol.81 (2012)に掲載された。この結果は、研究代表者が徳島大学の片山真一氏との共同研究として、4を法として1と合同な素数pに対して与えた同様の結果(Tsinghua Sci. Technol. vol.12 (2007)に掲載)の類似となっている。2.昨年度、福岡教育大学の田尻彩華氏、吉塚健一郎氏との共同研究により、4以上の任意の自然数nに対して、周期nの極小型自然数の無数の存在性を明らかにした。この研究を進展させ、本年度は学習院大学の河本史紀氏、名城大学の冨田耕史氏と連携して、『末尾急増型』と呼ばれる連分数展開に現れる部分商に関する性質を定義し、末尾急増型の連分数展開を持つような2次無理数の持つ性質やその構成法などの研究を行った。その結果、与えられた整数以上の類数を持ち、かつ末尾急増型の連分数展開を持つ2次無理数から作られる極小型実2次体の無限族を6以上の各偶数周期毎に与えることに成功した。この結果について、いくつかの研究集会で口頭発表を行った。本研究は、生成多項式及び不定方程式の分析により、ある種のイデアル類群を持つような代数体の構成を目的としている。本年度得た結果は次の通りである。1.昨年度より連携をしている学習院大学の河本史紀氏、名城大学の冨田耕史氏に名古屋大学の鈴木浩志氏を加え、末尾急増型の連分数展開を持つような2次無理数に関する共同研究を進展させた。主な結果は次の2つである。1つ目は、末尾急増型の連分数展開を持つような2次無理数の特徴づけを行ったことである。このことは1990年代になされたE. P. Golubeva氏の結果を大いに利用している。2つ目は、末尾急増型となるための条件から1つを抽出し、その条件を分析することにより、末尾急増型の2次無理数の構成に関する原理を解明したことである。その結果、末尾急増型の2次無理数をすべて与える構成法を得ることに成功した。これらのことは論文としてまとめ、現在投稿中である。2.島根大学の青木美穂氏との共同研究として、定数項が1となる整数係数を持つあるパラメトリックな4次多項式の分析を行った。その結果、ある条件の下で、4次多項式の根を添加した4次体の基本単数を、多項式の根を用いて具体的に記述した。これは類数が5で割れる2次体の族を与える足掛かりとなる結果と考えるが、そこまでの進展は得ることができなかった。今後の研究課題としている。なお、上記結果の4次体が総実になる場合については、ある種の不定方程式を解くことにより結果を得ている。巡回群でないようなイデアル類群を持つ代数体の構成のため,生成多項式及びある種の不定方程式の分析を行った.その結果, 4を法として3と合同な素数pに対し,イデアル類群のp-rankが2以上となるようなpー1次の虚巡回体の無限族を明示的な形で与えた.また, p=3の場合の鏡映関係の精密化を与え, 3-rankが2以上のイデアル類群を持つ虚2次体の新たな無限族を得た.pを4を法として3と合同な素数とする。p-1次の虚巡回体上にp次巡回拡大を与えるような整数係数のp-1次多項式の分析、及び、ある実2次体の単数とそれに付随する不定方程式の整数解の個数の考察により、イデアル類群のp-rankが2以上となるようなp-1次の虚巡回体の無限族を明示的な形で与えた。この結果は、研究代表者が徳島大学の片山真一氏との共同研究として、4を法として1と合同な素数に対して与えた同様の結果(2007年公刊)の類似となっている。今回得られた結果は、間もなく公刊予定である。実2次体の類数問題の1つである「ガウスの類数1問題」に関連して、ある2次無理数の連分数展開に付随する極小型自然数という概念が、学習院大学の河本史紀氏、名城大学の冨田耕史氏によって近年導入されている。研究代表者は類数及び単数の問題を扱うためこの問題に取り組み、福岡教育大学の田尻彩華氏、吉塚健一郎氏との共同研究により、連分数展開の極小型にまつわる様々な性質を明らかにした。そして、任意の自然数nに対して周期nの極小型自然数が無数に存在することの証明に成功した。

この結果については、いくつかの研究集会で口頭発表を行い、「ある2次無理数の連分数展開について」と題して報告集に発表済みである。また、同内容の査読付き論文が間もなく公刊される。なお、この結果は本研究の目標である代数体の類数の可除性に関する結果ではないが、今後の研究において参考になると思われる。昨年度と同様、いくつかの不定方程式に対して解くことができずに滞っている問題がある。しかしながら、連分数を用いた手法により、一定の定数以上の類数を持つ実2次体存在など想定外の結果がいくつか得られているため、全体としてはやや遅れているという評価とする。鏡映関係の考察は計画以上に進展が見られているが、いくつかの不定方程式に対して解くことができず、発表ができないでいる結果がある。不定方程式の問題が当初想定した以上に難しい問題となっている。不定方程式の研究が滞っているため、今年度も不定方程式の研究に重点を置きたいと考える。このことについては、ハリスチャンドラ研究所のK. Chakraborty氏との連携を図る予定である。さらに、学習院大学の河本史紀氏、名古屋大学の鈴木浩志氏、名城大学の冨田耕史氏との共同研究により、実2次体のいわゆる『類数1問題』に関連する問題に取り組んでいく。また、情報収集のため研究集会「第8回福岡数論研究集会」を九州大学の金子昌信氏、権寧魯氏と共同で開催する。「現在までの達成度」で述べた通り、不定方程式の研究が滞っているため、今年度は特に不定方程式の研究に重点を置きたいと考える。このことに関して、昨年度に引き続き、ハリスチャンドラ研究所のK. Chakraborty氏や名古屋大学の伊東杏希子氏との連携を図る予定である。また、情報収集のため研究集会「第7回福岡数論研究集会」を九州大学の金子昌信氏、権寧魯氏と共同で開催する。該当なし情報収集のため、京都大学で行われる学会への参加、九州大学、早稲田大学で行われる研究集会への参加を予定している。さらに、可能であれば昨年度と同様、インドのハリスチャンドラ研究所でK. Chakraborty氏との研究打合せを行う。また、研究成果が得られれば、国内外の主要な研究集会で随時発表する。消耗品費により数論の専門書及び計算機ソフト(Maple14)を購入する予定である。
ヒトＯＲＣ結合性ＲＮＡの構造と作用機作

ヒト複製開始因子であるORCに関する生化学的な解析を行った。その結果、ヒトORCがグアニン四重鎖を形成する配列(G4モチーフ)をもつRNAあるいはssDNAに優先的に結合する活性を見出した。さらに、その活性をもつORC1にG4モチーフ結合ドメインがあることを見出し、ドメイン中の結合に重要なアミノ酸の同定を行った。また、ORCのG4モチーフ結合には特異性があることを明らかにした。G4モチーフは複製開始点の多くの近傍にあることから、ORCのG4モチーフ結合活性は、複製開始点の確立に関与している可能性が考えられる。これまでは、ヒトORCのGU-richなRNAへの結合に関する解析を行ってきた。2013年度は、さらに一本鎖DNAを含めた解析を進めた。この方向での研究の展開は当初の予定にはなかったことである。これは、近年フランスの研究グループが報告した、ヒト複製開始点の多くにグアニン四重鎖(G4)の形成可能なDNA配列(G4モチーフ)が存在するという結果を受けて、この結果とこれまでの我々の解析結果との関連性を先行して調べることが重要と判断したためである。過去の解析結果と一致するように、我々の解析からもヒトORCがG4モチーフをもつ二本鎖DNAに選択的に結合することを示す結果は得られなかった。つまり、二本鎖DNAへの結合に関してはヒトORCには明瞭な特異性はない。ところが、一本鎖DNAを用いた結合解析から、G4モチーフ配列をもつG-richな一本鎖DNAにヒトORCが選択的に結合することを見出した。この結合条件下でG4モチーフが実際にG4を形成することも確認できたことから、ヒトORCがG4構造に結合する可能性が示唆された。以上のように、ヒトORCの一本鎖DNAへの結合特異性がヒト複製開始点の特徴と一致したことから、我々の研究成果はこれまで長い間解決されてこなかった高等真核生物の複製開始点の確立機構のしくみを明らかにするきっかけとなる可能性がある。ヒトORCに関する解析をさらに進めた結果、ORC1サブユニットがG-richな配列への特異的な結合活性を有すること、そして、ORC1の結合ドメインの同定に成功した。そのドメインの立体構造予測をした結果、興味深いことにDNAメチルトランスフェラーゼのドメインと類似することが分かった。今後は、ORCの構造解析も取り入れながら、研究を進めていく必要があると考えている。ヒト複製開始因子であるORCがGU-richなRNAにin vitroで結合することを踏まえ、ORCが結合する内在性RNAの同定を目指した。まず、ORCを構成する6種のサブユニットのうち、RNA結合活性を有するORC1に着目し、FlagタグをつけたORC1をヒト培養細胞で発現させた。そして、Flagタグを利用した免疫沈降、Flagペプチドによる溶出を行い、ORC1と共沈降するRNAの同定を目指した。しかし、発現させた細胞から穏やかな条件下ですべてのORC1を抽出する方法を確立することはまだできていないため、ORC1特異的なRNAの同定には至っていない。RNAを分解するヌクレアーゼを併用した抽出条件を試みるなど、ORC結合性RNAの同定を今後も続けていく。上記に加えて、SELEX法を用いたORC結合性RNAの解析を進めた。今年度は、ORC複合体を使うのではなく、ORC1のRNA結合ドメインのみをGSTに融合させたタンパク質を使って、それに結合するRNA(40塩基のランダム配列を含む約100塩基)について6回の結合サイクルを行った。1、3および6サイクル後に回収されたRNAのcDNAをクローニングし、幾つかのクローンについて塩基配列の解析を行った結果、1サイクル後のRNAにおいて、G-richのRNAが高い頻度で回収されたことが分かった。これは、すでに明らかになっていたORCのRNA結合の配列特異性と一致するものである。ところが、サイクル数を重ねるにつれて回収されたRNAの塩基組成が均一化する傾向がみられた。均一化の原因として、結合反応で使用するRNAの調製の際に行う転写反応において、G-richなRNAが選択的に除去されている可能性が考えられる。そこで、今後は転写の反応条件を工夫し、さらにORC複合体を使用したSELEXを行う。ORCは、複製の開始において、はじめに複製開始点に結合して機能するタンパク質複合体である。25年度は、ヒトORCがもつG-rich一本鎖核酸結合活性の生物学的な役割を明らかにすることを目的に、ヒトORC1サブユニットのグアニン四重鎖(G4)モチーフ結合活性に関する解析を進めた。25年度までの解析からORC1のアミノ酸413-511の領域(ドメインA)がG4モチーフ結合活性を示すことを見いだしたが、26年度にさらにORC1のドメイン解析を進めた結果、ドメインAよりもさらにN末端側の領域にも、G-rich1本鎖核酸結合活性が存在することが明らかになった。

この新たに同定した領域(ドメインB)について、配列特異性を解析したところ、ドメインAと同様なG4モチーフに対する結合特異性が示された。このドメインBについても、G4モチーフ結合に必要なアミノ酸残基を同定し、G4結合活性を失った変異ドメインの作出を行った。今後は、ドメインAおよびドメインBに変異を導入した変異ORC1を細胞に発現させて、ORC1のもつG4モチーフ結合活性の生物学的な意義を探りたい。上記に加えて26年度は、ヒトORCのもつG4モチーフ結合活性の特異性についてのさらなる検討を行った。G4構造にはパラレル型やアンチパラレル型など、様々な構造がある。そこで、ORCはこれらのG4構造に対し特異性を示すかを検討した。c-myc遺伝子由来のG4モチーフ、テロメア由来のG4モチーフ、そしてこれまで使用してきた(GGGTT)繰り返し配列について、ORC結合を解析した結果、ヒトORCは、(GGGTT)繰り返し配列とc-mycG4モチーフには結合したが、テロメアG4モチーフには強い結合性を示さなかった。この特異性が、G4構造のどの部分に起因するかを明らかにするため、今後は構造生物学的な手法も取り入れて研究を進めていきたい。分子生物学本研究の中で明らかとなったヒトORCのG-richなRNAへの特異的な結合というORCのもつ新しい性質に関連して、解析対象を一本鎖DNAに広げて進めることによって、ORCのG-rich配列への結合が生物学的に重要な意味をもつ可能性が高くなってきた。このような展開はまったく予想外であったが、研究は大きく前進したと考えている。特に、ヒト複製開始点はどのような仕組みで確立されていくか、という長い間未解決である重要な問題を解く鍵となり得る知見を得られたことは大きな研究成果である。細胞内の発現ORCの抽出が当初予想された以上に困難であったために、ORC結合性RNAの単離・同定に関してはやや遅れがあるが、SELEXなどの解析については順調に進んでいると判断している。ヒトの複製開始点の形成機構は未だ解明されていない重要な問題の一つである。その問題解決につながる可能性のあるORCのG4モチーフへの結合という特質について、今後さらに詳細な解析を進めていく。特に、ORCが実際に何を認識して結合するのかについては、ORC1とその結合するDNAに関する構造生物学的な解析を進めていく。また、ORCのG4モチーフへの結合の生物学的な意義を明らかにするために、G4モチーフに結合できない変異ORCを作製し解析を進めていく。以上を当初の予定と合わせて進めていく。今年度の発現ORCの抽出操作を通じて、ORCはいくつかの異なる様式でクロマチンなどの細胞内の構造や標的分子に結合していることが明らかとなった。ORCの抽出に関して様々な方策を試しながら、基本的には当初の計画通りにORC結合性RNAの解析を進めていく。一方、ヒト複製開始点の多くでG4構造を形成し得る配列が存在することが近年報告された。この配列はヒトORCが優先的に結合するRNAの配列と一致する。
子宮癌肉腫由来の癌幹細胞の分子制御機構の解明：病理組織での可視化とその臨床応用

子宮内膜癌細胞を間葉系幹細胞培養液で処理することで上皮間葉転換(EMT)/がん幹細胞(CSC)化が誘導され、この分子過程にSox4,Sox7, Sox9、β-catenin、Slugが大きく寄与した。EMT誘導のkey分子であるSlug発現は、Sox4とβ-catenin/p300による転写複合体により転写レベルで制御された。臨床検体で、β-cateninとSlug発現は肉腫部で有意に高く、Sox4, Sox7,及びSox9と正の相関を示した。Soxファミリーはβ-catenin/p300シグナル系と協調して癌肉腫の肉腫成分の派生過程において重要な役割を演じる。本研究は、子宮癌肉腫の癌幹細胞化の分子機構を、1申請者が継続的に行ってきたβ-カテニン系や上皮間質転換(EMT)機構を制御するシグナルネットワークの観点から解明し、2子宮内膜癌の癌幹細胞化機構との相違(関連性)を明らかにする。さらに、3病理組織での癌幹細胞の可視化や遺伝子発現プロファイル解析による予後予測システムの確立及び新しい治療パラダイムの構築へ展開するを目的とする。本年度は、癌幹細胞化とEMT機構との関連を検索した。その結果、子宮内膜癌細胞のEMT誘導過程で、Sox遺伝子ファミリーの発現誘導が生じる。同時に、Slug遺伝子発現誘導が生じる。Slug遺伝子はE-cadherin遺伝子発現を抑制し、結果としてEMTが生じる。また、この過程で癌幹細胞で高発現する様々な癌幹細胞マーカーの発現増加が確認できた。前年度に引き続き、Soxファミリーとβーカテニンシグナル系がSlug遺伝子発現に及ぼす影響を検索した。その結果、Sox4, Sox7,及びSox9がSlug遺伝子のプロモーター活性を増強させた。とくにSox4の効果が著明であった。Slug遺伝子のプロモーター配列を解析すると4個のSox4結合配列を認めた。そこで、各配列の4塩基を置換してそのプロモーター活性の変化を検索すると、4カ所全てを不活性化することにより、Sox4のSlug遺伝子発現効果は消失した。また、ChIPアッセイで、これらの結合配列にSox4が結合することを証明した。さらに、Sox4はβーカテニンと間接的に結合してその転写活性を増強する可能性を得た。予定通りに進んでいる。今回の研究では、子宮内膜癌細胞において上皮間葉転換(EMT)と癌幹細胞(CSC)との関連があることが明確となった。STK2で培養した子宮内膜癌細胞が線維芽細胞様の紡錘形へと形態が変化し、E-cadherinの発現低下とSlugの発現上昇によってEMTが誘導された。臨床検体の免疫染色でも、Slugのスコアは癌成分に比べて肉腫成分で有意に高かった。また、STK2で培養した細胞がCSC化した状態であることは、それはALDH1活性の高い細胞の増加とスフェロイド形態を示す細胞の増加によって証明された。癌細胞由来の間葉系幹細胞が子宮癌肉腫における肉腫成分の確立に必要である可能性がある。STK2で培養した細胞はSox4、Sox7及びSox9の発現を促進した。Sox4遺伝子のプロモーター活性は、Sox7により著明に上昇し、免疫染色においてSox4とSox7に強い正の相関がみられた。STK2で培養した子宮内膜癌細胞ではSlugとSox4が共に過剰発現している。Sox4を一時的にトランスフェクトすることでSlugのmRNA発現が増加し、プロモーター活性にも同様のことが証明された。Sox4はSlug遺伝子のプロモーター領域の-2125-813bpの間にある4つの結合領域を認識し、Slug発現を促進させる。この3つの効果は、Sox9やSox7との共発現によってさらに強調された。Sox4はβ-cateninを介してSlug遺伝子の転写活性を上昇させており、β-catenin、Sox4及びp300との転写複合体を形成していた。Sox4によるSlug遺伝子のプロモーター活性の上昇は、TCF4陰性優位の状態でも棄却されなかった。このことは、このプロモーター活性にTCF4の結合領域は必要とされないことを意味していると考えられた。当初の計画通りに研究が進行している。Sox4とβーカテニン系の直接的な関係を証明する。得られた結果について、人体例での検証を行う。分子病理学EMT誘導過程におけるSox遺伝子ファミリーとβーカテニンシグナル系の関連性を明らかにする。また、癌幹細胞化誘導機構との関連性も検索する。物品の節約や予想以上に実験が順調で、費用を節約できた。ほぼ、当初の予定通りに研究費を使用した。余剰の費用で、予定外の実験も組み込み、より内容の濃い研究にする。