hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
破骨細胞形成を促進する感作T 細胞の機能に関する研究

PGNで感作したマウスのT細胞(PGN-T細胞)はLPS存在下においてLPSで感作したマウスのT細胞(LPS-T細胞)と同程度にin vitroにおいて破骨細胞形成を促進した。さらに、この促進にTNF-αが必須であることが明らかになった。以上より、グラム陽性細菌のPGNはグラム陰性細菌のLPSと同様に歯周炎の初期において破骨細胞形成促進に関与することが示唆された。歯周炎は、炎症性細胞の浸潤および骨破壊を特徴とした慢性炎症であり、炎症性細胞の中でもT細胞の浸潤が顕著である。T細胞は慢性骨吸収疾患にみられる骨破壊・破骨細胞形成において重要な働きをする。当講座ではこれまでに、グラム陰性菌の構成成分であるLPSで感作したマウスのT細胞(LPS-T細胞)が、in vivoおよびin vitroにおいてLPS存在下における破骨細胞形成を促進することを報告した。しかし、LPS以外の抗原で感作されたT細胞が破骨細胞形成を促進できるかは不明なままであった。そこで我々はグラム陽性細菌の構成成分であるペプチドグリカン(PGN)で感作したマウスの脾臓からT細胞(PGN-T細胞)を採取し、LPS存在下における破骨細胞形成への影響を検討した。その結果、in vitroにおいてPGN-T細胞による破骨細胞形成促進が認められ、その促進はLPS-T細胞と同程度であった。このことから、低濃度LPSが存在する炎症局所にPGN-T細胞が浸潤すると破骨細胞形成が促進することが示唆された。しかし、PGN-T細胞による破骨細胞形成促進メカニズムの詳細は不明なままである。これまでに我々はLPS-T細胞上に発現したmCD40Lが破骨細胞形成促進に必須であることを報告しており、PGN-T細胞においても同様のメカニズムで破骨細胞形成が促進するのではないかと考えている。また、in vivoにおけるPGN-T細胞の破骨細胞形成促進能を検討することで、歯周炎の初期におけるT細胞と骨破壊メカニズムの関係を明らかにすることができる。現在、これらの点を明らかにするための研究を進めている。これまでに我々はE.coli LPSで感作したマウスのT細胞(LPS-T細胞)が、膜型CD40 Ligandの発現により破骨細胞形成を促進することを示した(Yokoyama et al. 2011)。しかし、これらがグラム陰性細菌のLPS特有の現象なのかは不明なままである。グラム陽性細菌は初期の歯周炎において優勢であり、またその細胞壁構成成分であるペプチドグリカン(PGN)は様々な生物学的活性を有している。このことから、PGNで感作されたマウスのT細胞が破骨細胞形成を促進する可能性も考えられるが、詳細は明らかでない。そこで今回我々はStaphylococcus aureus (S.a.) PGNによって感作されたマウスのT細胞(PGN-T細胞)が破骨細胞形成を促進するかを検討した。これまでの研究モデルと同様にLPSもしくはPGNを48時間おきに下顎歯肉に13回注入して感作したマウスのT細胞(LPS-T細胞、PGN-T細胞)とRANKLで48時間前刺激した骨髄マクロファージとを共培養後、破骨細胞形成状態を評価した。対照として未処置のマウスから採取したT細胞(control-T細胞)を用いた。また、TNF-&#61537;の関与を検討するため、抗TNF-&#61472;&#61537;抗体添加共培養群を作製した。その結果、PGN-T細胞は破骨細胞形成を有意に促進し、この促進にはTNF-&#61472;&#61537;が必須であった。また、PGN-T細胞による破骨細胞形成促進はLPS-T細胞と同程度であった。以上より、歯周炎初期においてPGNも破骨細胞形成に関与し得ることが示唆された。PGNで感作したマウスのT細胞(PGN-T細胞)がLPS存在下で破骨細胞形成を促進することを明らかにできた。24年度が最終年度であるため、記入しない。PGN-T細胞による破骨細胞形成促進メカニズムの詳細を明らかにするためにmGD40Lの関与を検討している。さらに、in vivoにおいてPGN-T細胞が破骨細胞形成を促進するかを確認する予定である。
DNAソフト界面の特性を活かしたバイオマテリアルの創製

独自に見出した、DNAを密に固定したナノ粒子の特異なコロイド安定性を、以下の応用範囲に拡張した。第1に、表面のDNAが完全二重鎖の金ナノ粒子の線形集合体が、基板上で円盤状に収縮してナノ粒子アレイを与えることを見出した。第2に、DNA担持ナノゲルを合成し、内包した薬物モデルを温度に応じて放出させることに成功した。第3に、完全二重鎖DNA層の間に引力が生じることをコロイドプローブAFM法で明らかにした。第4に、この界面特性を利用した遺伝子診断法とDNA親和性薬物探索法を開発した。以上の結果より、DNAが材料表面間の相互作用を自在に制御できる優れた表面修飾剤であることが実証された。1.DNAを担持した擬似ナノロッド構造の動的制御二重鎖DNA(16塩基対)で表面修飾した金ナノ粒子(直径5 nm)を、一本鎖DNA(200塩基)の上に等間隔で3つ配置したナノ構造体を高純度で作製することに成功した。この構造体内の金ナノ粒子が、塩化マグネシウムの存在下で自発的に接近して粒子間平均距離が短縮することを透過型電子顕微鏡による観察で実証した。これに対して、粒子表面上の二重鎖DNAの最末端が一塩基ミスマッチの場合は、この構造変化が強く抑制されることを明らかにした。2.刺激応答性を示すDNA担持ハイドロゲルの開発ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)(PNIPAAm)とDNAの二成分ブロック共重合体の作成法を開発した。この共重合体は温度上昇によりPNIPAAmセグメントが会合し、DNAが表層に密生したコアシェル型のナノミセルを形成する。このナノミセル形成は可逆的なため、温度低下でミセルは崩壊する。反応性の官能基を側鎖に有するモノマーを第三成分として導入したブロック共重合体を合成し、架橋剤により分子間を共有結合させると、ミセル構造が安定化した。このナノミセルは温度に応答してそのサイズを可逆的に変化させることができるなど興味深い物性を示すことがわかった。3.DNA界面の特性解析に基づく細胞培養基板の開発DNA界面の界面エントロピーを左右するDNA鎖末端の運動性・柔軟性を定量的に評価するための準備に着手した。具体的には、電子スピン共鳴法による当該評価に有効なプローブとなることが期待される有機安定ラジカルを、核酸塩基に直接導入する手法の検討をおこなった。アリールボロン酸ピナコールエステル部を有する有機安定ラジカル化合物を合成し、この化合物がPd触媒存在下、水/アセトニトリル混合溶媒中において、ハロゲン化ヌクレオチドと効率的にカップリングすることを確認した。1.DNA担持ナノ粒子組織体の動的構造制御:二重鎖DNAで修飾した金ナノ粒子を、ローリングサークル増幅法で調製した鋳型DNAの上に等間隔で数百個配置して、長鎖の糸ビーズ状ナノ構造体を作製した。鋳型DNAへの固定に架橋型人工核酸(LNA)を用いると、構造体の収率が向上した。さらに、各粒子に担持された二重鎖DNAの末端塩基対合に依存して、全体構造が劇的に変化することを見出した。二重鎖DNAが完全相補の場合は円盤状に収縮した構造を示し、末端一塩基ミスマッチの場合は線状に伸展した構造をとることが透過型電子顕微鏡で確認された。2.刺激応答性を示すDNA担持ハイドロゲルの開発:ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)(PNIPAAm)とDNA、ならびに反応性の官能基を有するモノマーを第三成分として導入した共重合体を創製し、DNAが表層に密生したコアシェル型のナノゲルの構造物性相関についての研究をおこなった。ナノゲルはPNIPAAm成分の水和・脱水和を駆動力とした構造の温度応答性を示す。疎水性低分子化合物をゲル内部へ包接する能力を有し、構造転移に応答して包接分子を放出する様子が捉えられた。3.DNA界面の特性解析に基づく細胞培養基板の開発:DNA界面の表層近傍にアゾベンゼン(Azo)を導入し、DNA界面の特性を光刺激によってスイッチングすることに成功した。この光応答性DNA界面では、Azo部位の構造(trans or cis)を反映してDNA界面の表層構造が局所的に変化し、完全相補的な塩基配列のDNA界面でもAzo部位のcis体への光異性化により末端ミスマッチ配列のDNA界面と同様の界面特性に変化することを、当該DNA界面で覆われた金ナノ粒子の光刺激に連動した分散挙動変化から実証した。また、このDNA界面特性の光スイッチングは可逆的であり、5サイクル以上繰り返し誘起することができた。1.DNA担持ナノ粒子組織体の動的構造制御:ローリングサークル増幅法の反応条件を改善して、長鎖の鋳型DNAを効率的に合成した。従来よりも大きい金ナノ粒子(粒径15 nm)を鋳型上に配置して糸ビーズ状集合体を作製し、透過型電子顕微鏡で観察した。予想通り、粒子表面のDNAが完全相補の場合のみ円盤状に収縮したが、従来の粒径5 nmのものに比べて円形度が著しく低くなるという興味深い結果が得られた。2.刺激応答性を示すDNA担持ハイドロゲルの開発:ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)(PNIPAAm)とDNAの共重合体の自己集積化によるナノ粒子形成のメカニズムを解明した。粒子形成の塩濃度依存性とDNA鎖構造依存性を調べた結果、DNA鎖間の相互作用を起点とするのではなく、PNIPAAm鎖同士の集積をきっかけにして粒子が形成されることを確認した。二重鎖DNAを有する共

重合体の濁度変化は、あくまで自己集積後の粒子同士の凝集によることを実証した。3.DNA界面の特性解析に基づく細胞培養基板の開発:DNA界面間に働く表面力に着目し、コロイドプローブAFM法による水中フォースカーブ測定を行った。その結果、相補的な表層のDNA界面間では溶液のNaCl濃度の上昇に伴って表面力が斥力から引力へ徐々に変化するのに対し、表層がミスマッチ配列のDNA界面間では溶液のNaCl濃度に関係なく斥力が観測されるという興味深い結果が得られた。4.DNA担持ナノ粒子を用いるバイオ分析法の開発:ヒト由来のシトクロムP450 2C19遺伝子を用いたSNP診断を実施した。3名の被験者の毛根細胞からゲノムを抽出し、標的遺伝子をPCR増幅した。これを鋳型として一塩基伸長反応を行い、高イオン強度下で非架橋凝集を誘起させた。鮮やかな色調変化が数分以内に生じ、SNPを迅速に目視判別することに成功した。1.DNA担持ナノ粒子組織体の動的構造制御: DNA担持金ナノ粒子の糸ビーズ状集合体の作製と構造変換については、計画通りに進んでいる。それ以外の成果として、DNA担持金ナノロッドについても非架橋凝集に基づくSNP診断が可能なことを実証した。さらに、水銀イオンが介在する非天然型塩基対合を活用して、DNA担持金ナノロッドの横並び集合体と縦並び集合体を相互変換することに世界で初めて成功した。2.刺激応答性を示すDNA担持ハイドロゲルの開発:温度応答性高分子のPNIPAAmをベースとした刺激応答性DNA担持ハイドロゲルの創製とともに、その前駆体となるナノ粒子の形成メカニズムを明らかにすることを目的とした。DNA構造に明敏に応答する粒子の分散安定性の変化は、粒子あるいは分子集合体ミセル特有の現象であり、分子鎖単体では生じないことが明らかになった。すなわち、DNA鎖同士の物理的な引力相互作用によってもたらされるものではないことが実証された。3.DNA界面の特性解析に基づく細胞培養基板の開発:本年度実施したコロイドプローブAFMによる水中フォースカーブ測定により、DNA界面間では表層塩基対合に依存した表面力が働くことを実験的に確認できた。このことは、DNA界面の特性が表層塩基対合に依存して変化することを意味する。今後、タンパク質などの異種生体材料の吸着特性に反映されることが期待できる。4.DNA担持ナノ粒子を用いるバイオ分析法の開発:モデル遺伝子(化学合成品)で示した精密な目視SNP診断法が、ヒト由来の遺伝子産物にも適用可能であることを実証した。被験者(3名)の毛根細胞から抽出したゲノムDNAのシトクロムP450遺伝子を鋳型としてジデオキシ鎖終結法を行ない、得られたサンプルを用いて比色分析を実施した。その結果、ヒト由来の遺伝子を用いても正確に目視SNP診断をすることができた。1.DNA担持ナノ粒子組織体の動的構造制御: DNA担持金ナノ粒子の糸ビーズ状集合体に非架橋凝集を誘起すると、基板表面上で円盤状に自己組織化して、金ナノ粒子の2次元アレイが自発的に生成することを明らかにしてきた。今年度は、集合体内部の粒子間距離や、粒子表面DNAの鎖長、金ナノ粒子の粒径などを変化させると、さまざまな形状の2次元アレイができることを見出した。2.刺激応答性を示すDNA担持ハイドロゲルの開発:
インフラマソームからみたバレット食道の発生ならびに発癌機序の解明と予防法の確立

昨年度までの検討で、ラットバレット食道モデル、ラット逆流性食道炎モデルの双方で、NLRP3インフラマソームの活性化にともなうと考えられるIL-1βの食道下部での上昇が認められている。また、インフラマソームの活性化にともない同時に上昇することがしばしば報告されているIL-18のmRNAに関しては食道下部組織にて上昇をみとめなかった。本年は、追加してこのメカニズムが本当にインフラマソーム依存的かどうかをノックアウトマウスを用いての検証を試みた。バレット食道炎モデル、逆流性食道炎モデル共に、コントロールであるワイルドタイプマウスならびに、NLRP3、Caspase1ノックアウトマウスにても術後致死率が100%であり、手技並びにモデルに問題があると考えられた。ラットでの致死率も両モデル共に50%を超えているが、同様の方法で生存がえられため、マウスモデルにおける死因を詳しく分析したところ、手術による腸管の穿孔などは認めず、手術によって作られた狭窄による逆流が主な死因であると考えられた。次に、別のアプローチからのバレット食道モデル制作として、ネオジウム磁石を用いた腸管吻合不要なバレット食道モデルの制作を試みた。まず既報通りラットで手術を行いネオジウム磁石の埋め込みを行いバレット食道が形成される腸管の形を形成したところ、手術自体は無事成功したが術後数日で致死率100%となった。死亡の原因としては、ネオジウム部に瘻孔形成されず腸管穿孔などがおこったものと推測された。そのため、期間内にノックアウトマウスをもちいた検討は行えなかった。今回の動物実験の研究の成果として、ラットバレット食道モデル、逆流性食道炎モデルともに、インフラマソームが関与しているということが明らかとなったが、追加実験でさらなる知見が得られる可能性が高いため、メカニズムの詳細な検討については現在さらに遂行中である。ヒトバレット食道細胞の培養での検討では、グラム陰性桿菌の構成分子であるLPSの刺激により、上流であるToll Like Receptor4 (TLR4)のパスウェイが、活性化することが明らかになった。また、このTLR4パスウェイの刺激により下流のインフラマソームシグナルも誘導されることが明らかとなった。活性化するインフラマソームの種類としてはApoptosis-associated speck-like protein containinga CARD(AIM)2 ,NLRC4など様々な種類のNOD-like receptors(NLR)インフラマソームのうち、NLRP3インフラマソームであることが明らかとなった。これにより食道発がんにおいて主に関わっているインフラマソームの種類はNLRP3インフラマソームであることが明らかとなった。また、ヒト正常細胞、バレット食道細胞、食道がんの培養細胞において、TLR4の反応性の違いを疑い遺伝子変異を比較しPCR後、シークエンスで検索したが、TLR4のmRNAに関しては明らかな遺伝子変異は検出されず、TLR4の遺伝子変異が発がん、バレット食道変異に関わっているわけではないことが明らかになった。ラット逆流性食道炎モデルでの検討においても、逆流性食道炎作成後3日という短期モデルで、NLRP3のmRNAの著明な上昇を認め、逆流性食道炎作成後約1ヶ月という長期モデルにおいてもNLRP3のmRNAの上昇は持続していた。今後ほかのインフラマソームの確認を含めた、再度の確認実験が必要であると考えており予定している。インフラマソームシグナルの下流に位置するIL-1betaのmRNAにおいても長期モデルにおいて、著明な上昇を認めた。よって、このラット逆流性食道炎モデルにおいても、ヒトバレット食道形成と同様に、炎症誘導にNLRP3インフラマソームが関与していると考えられた。現在動物モデルの作成は安定しないものの可能である。条件安定を目指して条件検討中である。ヒト培養細胞の検討では、グラム陰性桿菌の構成分子であるLipopolysaccharide(LPS)の添加により、インフラマソームの活性化が引き起こされることが明らかとなった。また、この時に誘導されるインフラマソームはNLRP3インフラマソームであった。NLRP3インフラマソームは活性化されることにより、Pro-caspase-1をcleaved-Caspase-1に変換する。このCleaved Caspase-1はPro-IL-1betaをActivated IL-1betaへ変換すると共に、Pro-IL-18をActvated IL-18に変換することが先行研究で明らかとなっている。今回我々の検討においてもヒト培養細胞のNLRP3をSiRNAでノックダウンし、LPSを添加したところ、下流のパスウェイであるCaspase-1の活性化とPro-IL-1betaがActivated IL-1betaに変換されるのを妨げた。IL-18に関しては明らかな影響を与えなかった。また、先行研究によると、このCaspase-1の活性化に対してはATPが重要な役割を果たしていることが明らかとなっている。我々のヒト培養細胞においても、ATPの役割を添加、ATPレセプターであるP2X受容体を阻害することによりATPの役割を検討したが明らかな差異を認めず、外因的なATPの添加は本バレットモデルにおいては必須ではないことが明らかとなった。前年度ラットで検討したインフラマソームのRODENT逆流性食道炎、バレット食道における役割についてであるが、本年度はさらなる検討を加えるために、ノックアウトマウスの使用を試みた。

ノックアウトマウスを用いるために、まずWildタイプのマウスにバレットモデル、前段階である逆流性食道炎モデルの作成を試みたが、サイズの小ささのため手術が非常に困難であった。それに加えて、一旦手術が完了しても致死率が高く現状では検討できる状態ではない。そのため、こんご最適なバレット食道の作成方法を含めマウスモデルの制作について検討する予定としている。マウスバレット食道モデルを作成する段階で手術の困難さ、致死率の高さのため実際の検討まですすめていないため。昨年度までの検討で、ラットバレット食道モデル、ラット逆流性食道炎モデルの双方で、NLRP3インフラマソームの活性化にともなうと考えられるIL-1βの食道下部での上昇が認められている。また、インフラマソームの活性化にともない同時に上昇することがしばしば報告されているIL-18のmRNAに関しては食道下部組織にて上昇をみとめなかった。本年は、追加してこのメカニズムが本当にインフラマソーム依存的かどうかをノックアウトマウスを用いての検証を試みた。バレット食道炎モデル、逆流性食道炎モデル共に、コントロールであるワイルドタイプマウスならびに、NLRP3、Caspase1ノックアウトマウスにても術後致死率が100%であり、手技並びにモデルに問題があると考えられた。ラットでの致死率も両モデル共に50%を超えているが、同様の方法で生存がえられため、マウスモデルにおける死因を詳しく分析したところ、手術による腸管の穿孔などは認めず、手術によって作られた狭窄による逆流が主な死因であると考えられた。次に、別のアプローチからのバレット食道モデル制作として、ネオジウム磁石を用いた腸管吻合不要なバレット食道モデルの制作を試みた。まず既報通りラットで手術を行いネオジウム磁石の埋め込みを行いバレット食道が形成される腸管の形を形成したところ、手術自体は無事成功したが術後数日で致死率100%となった。死亡の原因としては、ネオジウム部に瘻孔形成されず腸管穿孔などがおこったものと推測された。そのため、期間内にノックアウトマウスをもちいた検討は行えなかった。今回の動物実験の研究の成果として、ラットバレット食道モデル、逆流性食道炎モデルともに、インフラマソームが関与しているということが明らかとなったが、追加実験でさらなる知見が得られる可能性が高いため、メカニズムの詳細な検討については現在さらに遂行中である。ラットモデルに加えて、マウスモデルの可能性を検討し動物モデルの改良を図っていく予定である。また、ラットモデルにおいて、蛋白レベルの検討、薬剤投与などの検討を追加していく予定である。マウス逆流性食道炎モデルバレット食道モデルを安定して作成できるように条件検討を行い、今後ノックアウトマウスを用いた検討をおこなっていく予定としている。ラットやマウスでのモデルを使用し検討を行いました。来年度に経費のかかる実験を持ち越しています。マウスを用いたバレット食道モデル作成が現状うまくいっておらず試行段階であるため。
反水素生成計画を支援する反陽子ダイナミクスの理論研究

計画当初は時間依存波束法と動径部分のみ古典軌道とした半古典手法を用いて、反陽子と水素原子、水素様イオン、水素負イオン、ヘリウム原子、水素分子イオンの電離とプロトニウム生成機構を研究した。捕獲の全断面積は精度よく求めることが出来たが、各量子状態への個別の捕獲断面積はこの手法では求めることが出来なかった。これは関連するチャンネル数が数万にも及び計算機コードの規模と計算時間の両面に置いて実行不可能であったからである。研究期間途中でトンショウミンを分担者に迎え、トンと戸嶋の共同によって「因果律を利用した散乱問題の新手法」を開発した。これは散乱方程式のうちグリーン関数を含む散乱は部分のみを計算することにより、多チャンネル問題における境界条件にまつわる困難を回避するものである。この新手法によって反陽子捕獲の各量子状態への精密な部分断面積を求めるのに成功した。また、負のミューオン捕獲過程にも適用し、長年の課題であった重い負粒子の捕獲過程における未解決問題を一挙に解決した。反陽子ヘリウムの生成過程であるヘリウム原子と反陽子の散乱問題への適用にも成功し、長寿命ヘリウム生成過程の理論解析に大きな進歩を加えた。陽電子による原子の散乱過程では、独立な過程のように扱われてきた陽電子・原子衝突におけるポジトロニウム生成と陽電子消滅を、複素ポテンシャルの導入によって統一的に記述することに成功した。いくつかの共鳴が重なったエネルギー領域の共鳴状態の解析において、時間遅れ行列を利用することで、共鳴構造が把握でき、あいまいなく共鳴解析ができることをヘリウムとポジトロニウム負イオン系において示した。オージェ過程が起こるために必要な最小角運動量変化ΔLminがあるていど大きいとオージェ確率が極端に減ることが知られているので、反陽子Liの数多くの状態につきΔLminを計算し、実際に多くの状態が長寿命であることを確認した。これらの長寿命状態ができる断面積を古典軌道モンテカルロ法により計算し、かなり多くの長寿命状態を反陽子・リチウム衝突で生成可能であると結論した。反陽子による、水素原子、水素様オン、水素負イオン、ヘリウム原子の電離過程を、軌道の曲がりの効果やイオン化電子の吸収の効果を入れて計算し、これまでより低いエネルギーにおいて信頼できる断面積が得られるようになった。陽電子・原子衝突におけるポジトロニウム生成と陽電子消滅は独立な過程のように扱われていたが、本来、この二つの過程は区別すべきではない。複素ポテンシャルを用いて同時に扱う理論手法を提案し、水素標的について詳細な計算例を示した。反陽子と水素分子イオンとの衝突によるプロトニウム(反陽子水素原子)生成について調べた。まず、衝突における電子状態の変化の様子を正確に見るために、陽子と反陽子を共線配置に固定した計算を行った。これにより、化学反応の研究で用いられるボルンオッペンハイマー近似が本反応系にも妥当であることがわかった。それと同時に、反陽子水素生成は新しいタイプの化学反応と見なせることがわかった。反陽子と水素分子イオンの系の断熱ポテンシャルエネルギー曲面を計算し、古典軌道モンテカルロ法を用いて、このポテンシャル曲面上での反陽子原子生成反応の計算を行った。その結果、水素原子標的よりも分子標的の方が反陽子水素が生成されやすいことがわかった。反陽子と水素分子イオンとの衝突による反陽子水素原子(プロトニウム)生成について調べた。そのために、反陽子・水素分子イオン系の断熱ポテンシャルエネルギー曲面を計算し、古典軌道モンテカルロ法を用いて、このポテンシャル曲面上での反陽子水素原子生成反応計算を行った。また、衝突径数法を用いて反陽子と水素分子イオンの衝突による電離断面積を計算した。さらに、イオン衝突で反陽子水素原子にs状態が混ざること(l-mixing)による反陽子・陽子消滅過程を調べるために、緊密結合法による計算を開始した。共鳴エネルギー領域の原子衝突を扱うとき、バックグラウンド位相のエネルギー依存性を無視できないことがある。陽電子・ヘリウムイオン系とポジトロニウム負イオンの共鳴状態を、通常の固有位相和に加え、時間遅れ行列を用いて解析した。

時間遅れ行列は、強いバックグラウンドを伴う共鳴状態の解析にも有効であった。反陽子と水素原子の低エネルギー衝突に緊密結合法を適用し、生成されるプロトニウムの状態分布について知見を得た。状態分布は強いエネルギー依存性を示し、しきい値付近の主量子数の状態にプロトニウムが支配的に生成される。この依存性は低エネルギーほど顕著であった。人工原子・分子系とみなすことが出来る半導体ナノ構造における線形・非線形光学応答に関する研究を実施した。(1)半導体超格子の積層方向に静電場を印加したとき生成するWannier-Stark ladder系の擬2次元励起子のFano共鳴スペクトルを調べた。特に、印加電場が大きいときバンド間の強いZenerトンネリングによりスペクトルに特異性が発現することが見出された。(2)上記の系に更に強い単色レーザーを照射すると、新規な動的Zener効果が起こり、擬エネルギー間に顕著な分裂が観測された。1)衝突径数法を用いて反陽子と水素分子イオンの衝突による電離断面積を計算した。イオン衝突で反陽子水素原子にs状態が混ざること(I-mixing)による反陽子・陽子消滅過程を調べた。反陽子と水素原子衝突での反陽子水素原子生成過程を理論的に完全に理解するために、また、陽電子と反陽子水素原子衝突での反水素原子生成を調べるため、電子(陽電子)と反陽子水素原子衝突の波束伝搬による量子力学的計算を行った。反陽子とヘリウムイオン衝突による反陽子捕獲断面積の波束伝搬による量子力学的計算を行った。この衝突系では共鳴散乱が重要であることがわかった。2)多電子原子系の顕著な特徴であるFano共鳴は、低次元半導体における励起子系でも発現する。ここで静電場(F_0とする)下の半導体超格子(WSL)における励起子Fanoスペクトルを理論的に解析した。F_0が大きくなるに従い、超格子のミニバンド間のZener結合が支配的になり、スペクトル形状に特異な変調が現れた。特に、低エネルギー領域では吸収端の赤方遷移が、高エネルギー領域では不規則な形状の変化が見られた。3)反陽子と水素原子の衝突過程に超球座標緊密結合法を適用した。原子基底による緊密結合法と、プロトニウム生成断面積についてほぼ同様な結果が得られた。反水素の精密分光は反陽子科学の主要な課題であるが、高次補正を扱う上で、水素原子のDirac方程式の完全系が必要になる。その解析解は知られているが、離散的な擬完全系を使うとその計算はずっと容易になる。Dirac方程式は負のエネルギーの存在のために一般には変分原理は成り立たず、不用意な変分計算を行うと非物理的な状態(spurious states)がたくさん出てくる。今回の研究では、Dirac方程式の変分計算の処方箋として、適当な境界条件と変分基底の組により、きれいな擬完全系が作れることを、数値計算の例をもって示すことができた。
肺癌進展における細胞接着及びAnoikisに関わる新規遺伝子の解析

GeneBに関して、GeneBのノックダウン(KD)により、細胞接着欠失による細胞死anoikisが誘導されることを確認しているが、このGeneBとAnoikis制御との関連を解析するために、細胞表面に存在する接着分子インテグリンに注目した。インテグリンは細胞接着に直接関わり、細胞内キナーゼFAKにシグナルを伝達し、Anoikis抑制に作用する。GeneB-KDにより、細胞接着状態でもFAKリン酸化が低下し、FAK活性の低下が示唆された。またFAKシグナル下流分子のリン酸化も低下していた。これらはGeneBが機能的にインテグリンシグナルに関わり、anoikis制御において非常に重要な役割を果たしていることを示す重要な研究成果である。更に昨年度検討した、CRISPR-Cas9を用いたGeneBノックアウト(KO)の検討を、他の癌細胞株においても施行した。昨年度の結果と同様に、他の癌細胞株においても、やはり著明な増殖抑制が引き起こされ、細胞増殖制御におけるGeneBの重要な役割が示唆された。GeneAに関しては、この分子に結合する分子群の網羅的同定を目的として、Myc-tag付加したGeneA産物を発現するレンチウイルスコンストラクトを作成し、ウイルスを産生した。それを癌細胞株に感染させ、Myc-tag抗体で免疫沈降し、GeneA産物分子に結合し共沈降してくる分子を検索しており、種々実験条件を検討して実験を進めている。GeneBがAnoikis制御に関わる機序の解明は、本研究の重要な目的であるが、今年度の研究により、その機序としてGeneBが機能的にインテグリンシグナルに関わることを示す重要な研究成果が得られた。またCRISPR-Cas9を用いてのGeneB-KO実験も昨年度の研究成果を裏付ける結果が得られている。したがってGeneBに関する実験計画は順調に進んでいる。GeneAの機能解明のためのGeneA産物結合分子の探索に関しても、必要なコンストラクトを作成し、種々の条件を検討しながら探索的解析を進めており、GeneA結合分子の網羅的同定の計画は着実に進行している。ただ遺伝子導入されウイルスを産生する細胞内でもGeneA産物が発現し、それが強い増殖抑制作用を持つため、ウイルス産生効率が高くなく、更にウイルス産生条件を検討・調整して検討を進めている。おおむね順調に研究計画を遂行しており、大きな変更点は無く、当初の研究計画に基づき研究を進めていく。ノックダウン・ノックアウト等による機能抑制実験により、GeneA及びGeneBの機能を更に解析すると共に、その際の細胞接着制御・anoikis制御に関わる種々のシグナル活性の変化を検討していく。また、質量分析計を用いた解析を進め、GeneA及びGeneB遺伝子産物に結合する蛋白分子群の網羅的同定を進める。それら結合分子群の内で重要なシグナル伝達分子を見出し、そのシグナル伝達分子とGeneA及びGeneB遺伝子産物との間の機能的相互作用を探索していく。次年度使用額が生じたことにより、結合蛋白分子群の網羅的同定のため質量分析解析を予定よりも余裕を持って行なえることになった。質量分析解析の中で最適と考えられる解析法をいくつか選択し研究計画を進めていく。GeneBに関して、既にKRAS変異をdriver変異として持つ肺がん細胞株において、ノックダウンにより増殖抑制・運動能抑制・anoikis誘導が引き起こされることを確認している。このGeneBのanoikis誘導能とがん細胞が持つdriver変異との関連を更に検討するために、EGFR変異を有する肺がん細胞株を用いて検討した。GeneBの発現を完全に欠失させるために、GeneBに対するCRISPR-Cas9コンストラクトを作成し、GeneBのノックアウトを行なった。その結果非常に著明な増殖抑制・anoikis誘導が引き起こされる結果を得た。KRAS変異・EGFR変異はともにanoikis抵抗性に作用するが、GeneB機能を抑制すると、これらのdriver変異からのanoikis抵抗性シグナルを阻害して、anoikis誘導が起こることが確認され、GeneBがanoikisの制御シグナルにおいて非常に重要な抑制的機能を果たしていることが確認された。このGeneBのanoikis抑制シグナルの作用機序を解明するために、細胞内シグナル分子とGeneBとの相互作用を検討する必要がある。現在GeneBを免疫沈降し、GeneBと共沈降する蛋白分子を網羅的に同定するために、GeneBの細胞内ドメインの発現コンストラクトを作成して、免疫沈降の条件を種々検討し、最適な条件を見出した。これにより迅速確実に質量分析を用いた網羅的な同定を行なう準備が整った。GeneAについても、GeneBと同様のアプローチで機能解析を進めることを計画しており、GeneB研究の経験に基づいて、GeneAをノックアウトするCRISPR-Cas9コンストラクトや、質量分析によるGeneA結合分子の網羅的同定のためのコンストラクトを作成し、検討を進めている。

昨年度の結果と同様に、他の癌細胞株においても、やはり著明な増殖抑制が引き起こされ、細胞増殖制御におけるGeneBの重要な役割が示唆された。GeneAに関しては、この分子に結合する分子群の網羅的同定を目的として、Myc-tag付加したGeneA産物を発現するレンチウイルスコンストラクトを作成し、ウイルスを産生した。それを癌細胞株に感染させ、Myc-tag抗体で免疫沈降し、GeneA産物分子に結合し共沈降してくる分子を検索しており、種々実験条件を検討して実験を進めている。GeneBがAnoikis制御に関わる機序の解明は、本研究の重要な目的であるが、今年度の研究により、その機序としてGeneBが機能的にインテグリンシグナルに関わることを示す重要な研究成果が得られた。またCRISPR-Cas9を用いてのGeneB-KO実験も昨年度の研究成果を裏付ける結果が得られている。したがってGeneBに関する実験計画は順調に進んでいる。GeneAの機能解明のためのGeneA産物結合分子の探索に関しても、必要なコンストラクトを作成し、種々の条件を検討しながら探索的解析を進めており、GeneA結合分子の網羅的同定の計画は着実に進行している。ただ遺伝子導入されウイルスを産生する細胞内でもGeneA産物が発現し、それが強い増殖抑制作用を持つため、ウイルス産生効率が高くなく、更にウイルス産生条件を検討・調整して検討を進めている。遺伝子のノックダウン・ノックアウトを用いて機能を推察する計画であり、GeneBにおいては、CRISPR-Cas9のコンストラクトを使ってGeneBのノックアウトに成功し、GeneBの機能が明瞭に示された。この経験に基づきGeneAのノックアウトも進めており、機能解析の計画は順調に進んでいる。また、これら遺伝子産物と結合しシグナル伝達に関わる分子を網羅的に同定するために、免疫沈降産物を質量分析解析により網羅的に同定することを目指しており、この点に関してもコンストラクトを作成し、免疫沈降の最適な条件を見出しており、網羅的同定の計画は順調に進んでいる。おおむね順調に研究計画を遂行しており、大きな変更点は無く、当初の研究計画に基づき研究を進めていく。ノックダウン・ノックアウト等による機能抑制実験により、GeneA及びGeneBの機能を更に解析すると共に、その際の細胞接着制御・anoikis制御に関わる種々のシグナル活性の変化を検討していく。また、質量分析計を用いた解析を進め、GeneA及びGeneB遺伝子産物に結合する蛋白分子群の網羅的同定を進める。それら結合分子群の内で重要なシグナル伝達分子を見出し、そのシグナル伝達分子とGeneA及びGeneB遺伝子産物との間の機能的相互作用を探索していく。
in vitroで選択・誘導した抗原特異的抗体産生細胞による癌治療モデルの構築

本研究課題では、当研究室で新たに確立したiGB細胞培養系を応用することで、現在の癌ワクチン療法では行われていない、液性免疫を効果的に誘導する新たな治療型ワクチンの構築を目的としている。前年度までに行った、(1)抗原特異的iGB細胞を用いたプラズマ細胞療法によるメラノーマ転移抑制のマウスモデル実験、(2)抗原特異的B細胞選択系の構築、(3)(1)及び(2)を組み合わせたin vitroで選択した抗原特異的B細胞を用いた腫瘍転移抑制のマウスモデル実験、以上3点について論文にまとめ、国際学術誌に発表した。また上記のマウスモデルでの研究をさらに発展すべく、本年度は特にヒト末梢血B細胞の中から抗原特異的な細胞を選択濃縮する系を確立することを目標として研究に取り組んだ。まずはマウスモデルでの条件を基に、ヒト末梢血B細胞を濃縮できるかを試みた。しかしながら抗原特異的なB細胞は濃縮できなかった。その原因としてFasL細胞死刺激耐性の細胞の出現、及び適切な刺激時間がマウスとヒトのB細胞で異なるということが考えられた。そこでこの問題を解決すべく、様々な培養条件の検討を行った。その結果IL-21に代わりIL-24で培養することにより、ヒトiGB細胞のFasL耐性細胞への分化を抑制できることを見出した。これは選択濃縮の効率を上昇させるために重要である。また代替抗原として抗ヒトκ鎖抗体をCD16陽性フィーダー細胞上に固定し、κ鎖陽性ヒトiGB細胞を選択濃縮できることを示した。この結果は、ヒトiGB細胞を用いた抗原特異的な細胞を選択濃縮するモデル系ができたことを意味し、ヒトB細胞における最適刺激時間を検討することができることを意味する。以上の結果は、ヒト末梢血B細胞から抗原特異的B細胞を選択的に濃縮するために前進したことを示唆する。ヒトiGB細胞の培養法はマウスiGB細胞に比べると、まだまだ検討する点が多かったため、時間がかかってしまった。またマウスでの方法をそのままヒトに応用することができなかったため、一から検討しなくてはならない点が多かったことも遅れの原因と考えられる。しかし培養条件を検討するための新たな系を確立したことにより、この遅れは解消できると考えられる。マウスB細胞の刺激条件をそのままヒトB細胞に応用できないと言う問題を解決するべく、ヒトB細胞の刺激条件の検討を行うための新たな系を確立した。今後はこの系を用いて最適刺激条件を検討することにより、マウスモデルと同様に抗原特異的ヒトB細胞の選択濃縮する系の確立を試みる。本研究課題では、当研究室で確立したiGB細胞培養系を応用することで、現在行われている癌ワクチン療法とは異なる、液性免疫を効果的に誘導する新たな治療型ワクチンの構築を目的としている。現在構築している系を用いることで、肺への腫瘍転移は抑制するが生存期間の大幅な延長は認められなかった。そこでiGB細胞移入方法を経静脈注から腹腔注に変えたところ、10倍近い血中抗体価の上昇が認められた。さらに複数回iGB細胞を移入することにより、1回移入に比べ更なる血中抗体価の上昇が認められ、生存期間の延長が認められた。次に、抗原特異的B細胞を得るためのiGB細胞選択系について更なる検証を行った。この系はBCR刺激を受けた細胞はFasLからの細胞死シグナルを阻害することができるという報告を基に作製した。まず構築したiGB細胞選択系の検出限界について検証を行った。その結果初期細胞中に存在する抗原特異的B細胞が0.001%以上の場合に濃縮することが可能であることが分かった。さらに、未免疫マウスの正常レパートリーB細胞から抗原特異的B細胞を選択できるかを検証した。しかし現行の条件では全く濃縮されなかった。そこで刺激時間を変更し様々な条件で検証を行ったところ、BCR刺激時間を延長させることで正常レパートリーからも抗原特異的なB細胞を濃縮することに成功した。この結果は、ヒト末梢血B細胞から抗原特異的B細胞を濃縮する可能性があることを示唆しており、最終目標であるヒトプラズマ細胞療法への応用が大いに期待できる。

その結果IL-21に代わりIL-24で培養することにより、ヒトiGB細胞のFasL耐性細胞への分化を抑制できることを見出した。これは選択濃縮の効率を上昇させるために重要である。また代替抗原として抗ヒトκ鎖抗体をCD16陽性フィーダー細胞上に固定し、κ鎖陽性ヒトiGB細胞を選択濃縮できることを示した。この結果は、ヒトiGB細胞を用いた抗原特異的な細胞を選択濃縮するモデル系ができたことを意味し、ヒトB細胞における最適刺激時間を検討することができることを意味する。以上の結果は、ヒト末梢血B細胞から抗原特異的B細胞を選択的に濃縮するために前進したことを示唆する。iGB細胞を腹腔に移入することで経静脈注に比べ血中抗体価が一桁増大することが分かり、腫瘍に対するプラズマ細胞療法の効果の改善が大いに期待できる。また、in vitroiGB細胞選択系では0.001%とかなり低い割合の抗原特異的B細胞の濃縮に成功している。さらに困難だと思われた未免疫マウス脾臓B細胞のナイーブなB細胞集団から抗原特異的B細胞を濃縮することにも成功している。従ってこの方法はヒトへの応用が大いに期待できる。ヒトiGB細胞の培養法はマウスiGB細胞に比べると、まだまだ検討する点が多かったため、時間がかかってしまった。またマウスでの方法をそのままヒトに応用することができなかったため、一から検討しなくてはならない点が多かったことも遅れの原因と考えられる。しかし培養条件を検討するための新たな系を確立したことにより、この遅れは解消できると考えられる。未免疫マウスの正常レパートリーB細胞の中から抗原特異的なiGB細胞を濃縮することに成功したことから、この時の条件を基にヒト末梢血B細胞からの抗原特異的B細胞の濃縮を試みる。濃縮できない場合には、刺激時間の検討やフィーダー細胞に発現させる分子をヒトの分子に変えた新たなフィーダー細胞を作製し、検討する。マウスB細胞の刺激条件をそのままヒトB細胞に応用できないと言う問題を解決するべく、ヒトB細胞の刺激条件の検討を行うための新たな系を確立した。今後はこの系を用いて最適刺激条件を検討することにより、マウスモデルと同様に抗原特異的ヒトB細胞の選択濃縮する系の確立を試みる。
GaN系電子デバイスのモデリングに関する研究

GaN系FETにおいては、ドレイン電圧やゲート電圧を急激に変化させても緩やかな応答を示す「ドレインラグ」や「ゲートラグ」が見られ、回路応用上問題となっている。また、直流動作から期待されるパワーより実際に得られる交流パワーが著しく低くなる「パワースランプ」あるいは「電流コラプス」という現象が見られ、実用化の大きな障害となっている。これらの現象は深刻な問題であり、多くの実験的検討がなされてきた。しかしながら、これらの現象に理論的検討を加え、それらの物理機構を明確にすると共に、対策を講じる研究は殆どなされてこなかった。そこで、本研究では半絶縁バッファ層を有するGaN MESFETをとりあげ、その2次元過渡数値シミュレーションを行うことにより上述の現象を再現することを試みた。ここでは、半絶縁バッファ層のモデルとして浅いドナー、深いドナーおよび深いアクセプタを含む3準位モデルを用いた。ドレイン電圧V_Dを急激に上げたときの過渡応答を解析した所、ドレイン電流は定常値を一旦上回りその後緩やかに減少して定常値に達した。また、V_Dを急激に下げたときの過渡応答を解析した所、ドレイン電流は暫く定常値より低い値に留まりその後緩やかに定常値に向かうというドレインラグが再現された。これらは、深いドナーによる電子捕獲、電子放出過程を考慮することによりうまく解釈された。また、このドレインラグは電流コラプスの大きな要因となることが明らかになった。電流コラプスのバッファ層内不純物濃度依存性を解析した所、深いアクセプタ濃度が高いほど電流コラプスが顕著となることが示された。これは、電子トラップとして働くイオン化した深いドナーの濃度が、深いアクセプタ濃度が高いほど高くなることに起因する。以上より、ドレインラグ、電流コラプス等の異常現象を最小限にするには、バッファ層内のアクセプタ濃度を低減すべきと結論された。GaN系電子デバイスのモデル化を行うにあたり,まず,GaNやAlGaNの物質パラメータ,特に移動度などの輸送パラメータの不純物濃度依存性や組成依存性あるいは電界強度依存性に関する実験データ(や理論計算)を調査すると共に,それらの定式化について検討した.また,高電力デバイスとして応用するときに問題となるキャリアの衝突イオン化のモデル化手法についても検討し,これらをデバイスシミュレーションプログラムに組み入れられるようにした.また,GaN系電子デバイスにおいてしばしば見られる「電流コラプス」,「キンク」,「ゲートラグ」,「ドレインラグ」等に大きな影響を与える深い不純物準位の特定を行うため,広く文献調査し,主要な深い不純物準位を特定すると共に,シミュレーションプログラムに取り入れられるようモデル化した.一方,シミュレーションプログラムについては,基本的に,従来我々が独自に開発し活用してきたGaAs MESFET, HEMT, HBT等の2次元定常及び過渡シミュレーションプログラムを利用することと(し,一部市販のシミユレータを比較用に用いることと)した.これらのプログラムをGaN, AlGaN系に適用できるよう修正している.今後は,完成したプログラムを用い,GaN MESFET, AlGaN/GaN HEMT及びAlGaN/GaN HBT等の定常及び過渡解析を行い,上述の「電流コラプス」や「キンク」あるいは「ゲートラグ」や「ドレインラグ」等を再現し,それらの機構について検討していくつもりである.半絶縁バッファ層を有するGaN MESFETの2次元過渡シミュレーションを行い、ドレインラグ(ドレイン電圧を変化させたとき生じるドレイン電流の緩やかな応答)やパワーコンプレッション(AC状態で得られるパワーがDC状態から予測されるものよりかなり低くなる現象)がどう再現されるか検討した。半絶縁バッファ層は、深いドナー、深いアクセプタおよび浅いドナーからなる

3準位モデルによりモデル化した。半絶縁バッファ層を有するFETにおいて電流コラプス(パワーコンプレッション)が実験的に見られるが、伝導帯下端より2.85eVおよび1.75eVの準位の影響が指摘されている。そこで、深いアクセプタレベルを伝導帯下端より2.85eV(価電子帯上端より0.6eV)とし、深いドナーレベルを伝導帯下端より1.75eVとした。また、より浅いドナーレベルの存在が指摘されているため、このエネルギーをパラメータとして変化させた。まず、ゲート電圧を一定に保ち、ドレイン電圧を0Vから上げたときのドレイン電流のステップ応答を解析した。その結果、ドレイン電流は0.1ナノ秒程度で一旦一定となり、その後暫くして緩やかに減少するというドレインラグが見られた。また、ドレイン電圧を20Vから下げたときのステップ応答を解析した所、ドレイン電流はしばらく定常値より低い値に留まり、その後緩やかに上昇するというドレインラグが見られた。電流上昇は深いドナーからの電子放出と共に生じると解釈された。これらは、アンドープ半絶縁性基板を有するGaAs MESFETの場合と同様の機構によるものである。次に、オフ状態からオン状態になるようゲート電圧とドレイン電圧を共にステップ関数的に変化させたときのターンオン特性を計算した。これより模擬的なパルスI-V特性を求めた。その結果、パルスI-V特性におけるドレイン電流値は定常(DC)状態における電流値に比べてかなり低くなった。これは、バッファ層中のトラップによりパワーコンプレッションが生じうることを明確に示している。半絶縁バッファ層を有するGaN MESFETの2次元過渡シミュレーションを行い、特にバッファ層内トラップパラメータがいわゆる「電流コラプス」(パルスI-V特性における電流値が定常状態の値より著しく低下する現象)にどのような影響を与えるかを調べた。半絶縁バッファ層は深いドナー、深いアクセプタおよび浅いドナーからなる3準位モデルによりモデル化した。深いドナー濃度N_<DD>、深いアクセプタ濃度N_<DA>および深いドナーのエネルギーレベルをパラメータとして変化させた。オフ状態からオン状態になるようゲート電圧とドレイン電圧を共にステップ関数的に変化させたときのターンオン特性を計算し、これより模擬的なパルスI-V特性を求め、定常状態のI-V特性と比較した。その結果、半絶縁バッファ層内の深いアクセプタ濃度N_<DA>が高いほど、パルスI-V特性における電流値と定常状態の電流値の差が大きくなり、電流コラプスが顕著になった。これは、N_<DA>が高いほど、電子トラップとして働くイオン化した深いドナーの濃度N_<DD>^+が高くなり、トラップの影響が大きくなるためと解釈された。また、オフ状態のドレイン電圧V_<Doff>を20Vから100Vの間で変化させ同様の解析を行った。その結果V_<Doff>が高いほど電流コラプスが顕著となった。
太平洋亜熱帯域における揮発性有機化合物の海洋-大気間の収支評価

アセトンなどの含酸素揮発性有機化合物(OVOC)は、対流圏オゾンやエアロゾル生成に寄与することで、地球温暖化に影響を及ぼす。海洋は大気OVOCの収支に強く影響することが示唆されているが、海水中のOVOC濃度は海域や季節によって大きく変動するため、海洋がOVOCの放出源なのか吸収源なのか未だ把握できていない。本研究では、海洋表層のOVOC濃度分布の支配要因を解明するため、OVOCの生成分解プロセスの定量評価を行う。本年度は、海洋微生物によるOVOCの生成・分解過程を定量評価するために構築したモニタリング培養システムを用いて、バクテリアによって生成されるOVOCの種類の特定とそれぞれの生成量の推定を実施した。高精度で多種OVOCを測定できるオンライン質量分析計(PTR-MS)を検出器に用いることで、バクテリア由来のOVOCを網羅的に検出することを可能にした。対象海域である太平洋沿岸水にバクテリアの基質となるグルコースを添加し、暗所にて培養を実施した。その結果、グルコースを利用してバクテリアが活発に増殖を開始したときに、速やかにアセトアルデヒドが生成された。培養開始から4日目にバクテリア細胞数が減少し始めたときに、アセトンの緩やかな増加が確認された。これまでバクテリアはアセトンなどのOVOCの分解者と考えられてきたが、生成者としても重要な役割を担う可能性が示された。この成果は、本研究で構築したシステムを活用して得られた新しい知見であり、海洋表層におけるOVOCの動態解明に大きく寄与する。昨年度構築したモニタリング培養システムを用いた培養実験によって、バクテリアによるOVOC生成プロセスについて定性的および定量的に評価することができた。室内培養実験については方法が確立し、新しい知見を得ることができるまでになった。一方、育児中により長期出張が困難な状況のため、現場環境における培養実験を実施できなかった。2019年夏から3ヶ月おきに太平洋沿岸で採取した表層海水を用いて、国立環境研究所にて培養実験を実施し、OVOC生成分解速度の季節変動とそれを引き起こす生物的要因の解明を目指す。海洋表層におけるOVOC濃度の現場観測も同時に実施する計画であったが、幼児育児中で長期出張が困難であるため、現場環境における観測と培養実験を人工気象器を用いた室内実験に変更して研究を遂行する。具体的には、人工気象器とモニタリング培養システムを用いて、微生物活動と太陽光照射による生成分解速度を定量する。現場における培養では、培養環境が培養実施日の天気に大きく依存してしまうが、人工気象器では現場環境を代表する安定した状況で培養できる利点がある。培養期間中の植物プランクトンとバクテリアの生物量や種組成を測定し、OVOC動態を支配する生物的要因を明らかにする。アセトンなどの含酸素揮発性有機化合物(OVOC)は、対流圏オゾンやエアロゾル生成に寄与することで、地球温暖化に影響を及ぼしている。本研究では、現場観測と培養実験を実施することで、海洋表層のOVOC濃度分布の季節変動とその支配要因を解明することを目的としている。本年度は、海洋微生物によるOVOCの生成・分解過程を定量評価するため、高精度で多種OVOCを測定できるオンライン質量分析計(PTR-MS)を用いた「モニタリング培養システム」の構築を実施した。培養器中のOVOC濃度変化を精確に捉えるため、大気からのOVOCの汚染を防ぐ必要がある。そこで、培養器とPTR-MSまで密閉にし、培養器からバブリングガスによって抽出したOVOC濃度をPTR-MSで直接測定するシステムを確立した。次に、研究対象海域である太平洋亜熱帯域に面した静岡県下田市鍋田湾の表面海水を用いて、培養実験を実施した。OVOCの主要な成分であるアセトンについて、植物プランクトン・バクテリアによる生成速度とバクテリアによる分解速度、太陽光照射による生成速度をそれぞれ定量した。その結果、沿岸海水におけるアセトンの主要な生成プロセスは太陽光照射による光生成であり、分解は主にバクテリによる分解であることが示唆された。PTR-MSを用いたモニタリング培養システムの構築は、年度内に概ね完了した。また、自然海水を用いた培養実験を実施し、アセトンの生成分解プロセスの定量評価が可能であることを実証できた。しかし、本年度に開始予定であった下田湾沖における観測と培養実験が実行できなかった。その理由として、研究代表者の妊娠と出産のため船舶による観測を中止せざるを得なかった。

対象海域である太平洋沿岸水にバクテリアの基質となるグルコースを添加し、暗所にて培養を実施した。その結果、グルコースを利用してバクテリアが活発に増殖を開始したときに、速やかにアセトアルデヒドが生成された。培養開始から4日目にバクテリア細胞数が減少し始めたときに、アセトンの緩やかな増加が確認された。これまでバクテリアはアセトンなどのOVOCの分解者と考えられてきたが、生成者としても重要な役割を担う可能性が示された。この成果は、本研究で構築したシステムを活用して得られた新しい知見であり、海洋表層におけるOVOCの動態解明に大きく寄与する。昨年度構築したモニタリング培養システムを用いた培養実験によって、バクテリアによるOVOC生成プロセスについて定性的および定量的に評価することができた。室内培養実験については方法が確立し、新しい知見を得ることができるまでになった。一方、育児中により長期出張が困難な状況のため、現場環境における培養実験を実施できなかった。太平洋亜熱帯域に面した下田沖において、海洋表層におけるOVOC濃度の現場観測と培養実験を開始する。2018年秋から3ヶ月おきに1年間実施し、OVOC濃度の季節変動とその支配要因の解明を目指す。モニタリング培養システムを用いて、微生物活動と太陽光照射による生成分解速度を定量する。同時に、現場における植物プランクトンとバクテリアの生物量や種組成、水温や太陽光照射量といった環境パラメーターを測定し、海洋表層におけるOVOC濃度の季節変動を引き起こす要因を明らかにする。さらに、OVOC濃度の季節変動を再現する生物・環境パラメーターを用いたアルゴリズムの構築を目指す。2019年夏から3ヶ月おきに太平洋沿岸で採取した表層海水を用いて、国立環境研究所にて培養実験を実施し、OVOC生成分解速度の季節変動とそれを引き起こす生物的要因の解明を目指す。海洋表層におけるOVOC濃度の現場観測も同時に実施する計画であったが、幼児育児中で長期出張が困難であるため、現場環境における観測と培養実験を人工気象器を用いた室内実験に変更して研究を遂行する。具体的には、人工気象器とモニタリング培養システムを用いて、微生物活動と太陽光照射による生成分解速度を定量する。現場における培養では、培養環境が培養実施日の天気に大きく依存してしまうが、人工気象器では現場環境を代表する安定した状況で培養できる利点がある。培養期間中の植物プランクトンとバクテリアの生物量や種組成を測定し、OVOC動態を支配する生物的要因を明らかにする。研究代表者の妊娠と出産のため、本年度に開始予定であった下田湾沖における観測と培養実験を実施しなかった。2018年秋から観測および培養実験を開始するため、観測に掛かる費用および測定装置の運搬費を次年度に使用する。2018年度は9月まで育児休業であったため次年度使用額が生じた。育児休業中に延期した培養実験を2019年度に実施する予定である。