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マット溶練スラグへの銅の硫化および酸化溶解損失の定量に関する研究

マットと平衡するスラグ中の銅の硫化損失と酸化損失量を測定するため,下記の平衡実験を行い,基礎データを集積するとともに,銅のスラグ損失と銅製練に要する熱収支計算結果からマット溶練炉で製造するマット中の最適銅品を推定した。1.FeO_X-CaO-SiO_2-Cu_2O系スラグと溶銅間の平衡実験を行いCuO_<0.5>の活量係数とスラグ組成、酸素分圧、温度の関係を調べることにより、この系のスラグに酸化溶解する銅の量を、1200から1400°Cの温度範囲で、鉄飽和からCu_2O飽和に至る範囲で推定可能になった。本系のスラグ中のCuO_<0.5>の活量係数は、スラグ組成に応じ1から15まで変動する。2.鉄飽和下でスラグ、マット、溶銅の3融体間の平衡実験を行い、スラグ中の流下銅、CuS_<0.5>の活量係数とスラグ中の硫黄濃度の関係式およびマット中のCuS_<0.5>の活量係数とCU-Fe-S-O系マット組成の関係式を導いた。3.10%SO_2気流下で、FeO_X-CaO-SiO_2スラグとマット間の平衡実験により、マットと平衡するスラグへの銅の溶解量を求め、上記1、2の実験結果を利用することにより、この実験の製練に近い条件にけるスラグへの銅の硫化損失と酸化損失量を求めた。4.本研究で得られたスラグへの銅損失データを考慮し、銅製練の熱収支計算を行い、マット溶練炉で70%Cuのマットを製造するのが、銅損失と熱利用の見地から、最適であると推定した。銅マット溶錬スラグへの銅の溶解損失を定量するため、アルゴンガス気流中でスラグ-マット-溶銅間の平衡実験と、実際の溶錬条件に近い10%SO_2気流中におけるスラグとマット間の平衡実験を1300°Cで行った。実験に際し、鉱石に含まれ銅製錬において副産物として回収される銀の分配挙動も同時に調べた。それらの結果を以下に示す。1.FeO_X-CaO-SiO_2系スラグ-マット-溶銅間の平衡実験を行い、各相を構成する成分間の関係を明らかにした。この実験において、酸素、硫黄、二酸化硫黄の分圧と金属銅の活量を実測あるいは計算により求めた。実験結果から、スラグ中の硫化銅の活量係数とスラグ中の硫黄濃度の関係式を導いた。この式はスラグへの硫化銅の溶解量を推定するさい有用となる。2.FeO_X-CaO-SiO_2系スラグとマット間の平衡実験を行ったが、実験条件下における酸素及び硫黄分圧を実測出来なかったので、熱力学的解析は十分に行えない。この測定が次年度以降の課題の一つになる。この実験で、スラグに溶解する銅の量とスラグ組成及びマット組成の関係が明らかにされた。3.銀の分配挙動も調べたが、銀は元々酸化しにくい金属であるので、銅に最も濃縮しやすい。スラグ-マット間の分配において、銀はマットに濃縮し易いが、マット中の鉄濃度の増加に伴いスラグ中の硫黄濃度が増すと、スラグに銀が硫化溶解しやすくなる。またマット中の銅濃度が増加すると、銀はスラグ中に酸化溶解しやすくなる。この酸化溶解はスラグ中のシリカ及び酸化銅の濃度が高くなるほど著しい。銅マット溶錬スラグへの銅の溶解損失を定量するため、実際の溶錬条件に近い10%SO_2気流中においてスラグ-マット間の平衡実験を1300°Cで行った。

またマット中の酸素を分析する装置を作成し、一昨年以来行って得られたマット試料中の酸素を分析し、マット中のCuS_<0.5>の活量に及ぼす酸素の影響を調べた。それらの結果を下に示す。1.10%SO_2気流下、1300°CにおいてFeO_x-CaO-SiO_2系スラグとマット間の平衡実験を行い、スラグ中に溶解する銅、硫黄量とスラグ組成、マット組成の関係を調べた。この実験において、スラグ試料中にはマット粒子が懸垂し、この粒子の分離が難しく実験データに大きなばらつきをもたらした。実験を繰り返し、数多くの試料を採取し分析することにより、どうにかスラグへの銅、硫黄の真の溶解量を求め得るようになった。スラグへの銅の硫化溶解量は、スラグ中の硫黄濃度と正の相関関係があり、またスラグへの硫黄の溶解度はスラグ中のSiO_2濃度及びマット中のFe濃度と密接に相関していることが判明し、今後これらの相関関係を定量化することが課題となる。2.スラグと共存するマット中には酸素が溶解し、Cu-Fe-S-Oのマットとなる。これまでCu-Fe-Sの3成分系についてはよく調べられているが、この4成分系については明らかにされていなかった。固体鉄飽和下でスラグ、マット、溶銅の三融体間の平衡実験で得られたマット中の酸素を分析し、マット中に酸素が入るとマット中の硫化銅の活量係数が増大することが判明し、活量係数と酸素濃度の関係を定量的に明らかにした。硫化銅の活量係数はスラグに硫化溶解する銅の量を求める際に利用される。前年度まで、FeO_x-CaO-SiO_2系スラグと溶銅間及びスラグとマット間の平衡実験により、スラグへの銅の酸化溶解損失と、マット共存下におけるこの系のスラグに溶解する銅濃度を明らかにした。本年度は10%SO_2気流下でスラグとマットが平衡する際の系の酸素ポテンンシャルを、酸素センサーにより直接測定し、測定した酸素ポテンシャルと熱力学値により系の硫黄ポテンシャルを計算により求めた。これらのポテンシャルは銅の硫化損失と酸化損失を推定する際に必要となる。またこれまでの実験で得られたデータと銅製錬に要する熱収支を計算することにより、マット溶錬炉においてどの程度の銅品位のマットを製造したら、銅の損失及び熱的に効率的であるか推定した。その結果の概要を以下に記す。1.10%SO_2-スラグ-マット平衡下の酸素ポテンシャルこれまでSO_2気流下でスラグとマットが平衡する際の酸素ポテンシャルを実測することは、酸素センサー構成材料の浸食等実験上の難しさから出来なかった。従ってこの値は熱力学的に推定したものを利用していた。本研究において、種々の試行錯誤の上、測定することに成功した。マット中の銅品位が0%(Fe-S-O系マット)と80%(Cu-S系マット)のマットが平衡する際の酸素ポテンシャルは、推定値と実測値はほぼ一致するが、マット中の銅品位がその間にあるときは両者の間にはかなりの相違がある。この実測された酸素ポテンシャルは、スラグへの銅損失を解析するうえで重要な意味を持つ。マット溶錬炉で製造されるマット中の銅品位の最適化本研究で得られた、スラグへの銅損失データと銅製錬の熱収支の計算結果から、マット溶錬炉で70%Cuのマットを製造するのが、銅の損失及び熱的にみて最適であると推定される。マット溶錬炉で高い銅品位のマットを造ると転炉の負荷が低減出来、転炉から出るスラグは銅を回収するため再処理が必要であり、この再処理の必要なスラグ量が低減出来る。70%Cuより銅品位が高くなると、スラグへの銅が急激に増大する。
脂質の経口摂取後の摂食抑制:正常ラット及び遺伝性肥満ラットでの検討

食欲の調節に関しては,グルコース,各種の代謝物質,ペプチドやホルモン,神経伝達物質等が調節物質として働いていることが解明されてきた.その中で,脂質も重要な調節因子と考えられてきた.実際,グルセロール,遊離脂肪酸等の脂質の代謝物質は食欲の調節に重要であることが明らかとなっている.しかし,一番単純で重要な“経口的に脂質を摂取した後の,満腹感がなぜ生じるか?"という点に関しては,解決されていない点が多い.その満腹機構については,吸収前に十二指腸粘膜の受容体を介する,摂取した脂質のエネルギー量に応ずる等の報告がなされているが,いずれもそれだけでは十分な説明ができない.我々は以前に脂質の吸収後に小腸内の合成とリンパ管への移送が増加するアポ蛋白A-IVが,摂食中枢を介して脂質の経口摂取後の食欲抑制に重要な働きをする可能性を示してきた.このことは,脂質摂取後の食欲抑制が,従来考えられてきたように吸収前の因子や摂取エネルギーにのみ依存するのでなくて,脂質が吸収された後の因子が食欲抑制に重要であることを示唆している.本研究において脂質吸収後の摂食抑制に吸収後の因子が重要であることが判明した.なかでも脂質摂取後に小腸での合成とリンパ管への移送が増加するアポ蛋白A-VIが重要な働きをすることを解明した.作用部位としては食欲中枢である視床下部介する可能性が高いことが判明した.さらに,遺伝性肥満ラットであるZucker肥満ラットではアポ蛋白A-IVによる摂食抑制効果が正常ラットに比して減弱することが判明し,遺伝性肥満の一因として脂質摂取後の食欲抑制機能の異常が関与する可能性が考えられた.食欲の調節に関しては,グルコース,各種の代謝物質,ペプチドやホルモン,神経伝達物質等が調節物質として働いていることが解明されてきた.その中で,脂質も重要な調節因子と考えられてきた.実際,グルセロール,遊離脂肪酸等の脂質の代謝物質は食欲の調節に重要であることが明らかとなっている.しかし,一番単純で重要な“経口的に脂質を摂取した後の,満腹感がなぜ生じるか?"という点に関しては,解決されていない点が多い.その満腹機構については,吸収前に十二指腸粘膜の受容体を介する,摂取した脂質のエネルギー量に応ずる等の報告がなされているが,いずれもそれだけでは十分な説明ができない.我々は以前に脂質の吸収後に小腸内の合成とリンパ管への移送が増加するアポ蛋白A-IVが,摂食中枢を介して脂質の経口摂取後の食欲抑制に重要な働きをする可能性を示してきた.このことは,脂質摂取後の食欲抑制が,従来考えられてきたように吸収前の因子や摂取エネルギーにのみ依存するのでなくて,脂質が吸収された後の因子が食欲抑制に重要であることを示唆している.本研究において脂質吸収後の摂食抑制に吸収後の因子が重要であることが判明した.なかでも脂質摂取後に小腸での合成とリンパ管への移送が増加するアポ蛋白A-VIが重要な働きをすることを解明した.作用部位としては食欲中枢である視床下部介する可能性が高いことが判明した.さらに,遺伝性肥満ラットであるZucker肥満ラットではアポ蛋白A-IVによる摂食抑制効果が正常ラットに比して減弱することが判明し,遺伝性肥満の一因として脂質摂取後の食欲抑制機能の異常が関与する可能性が考えられた.食欲の調節に関しては,グルコース,各種の代謝物質,ペプチドやホルモン,神経伝達物質等が調節物質として働いていることが解明されてきた.その中で,脂質も重要な調節因子と考えてきた.脂質の経口摂取後の食欲抑制機構に関しては,吸収前に十二指腸粘膜の受容体を介する,摂取した脂質のエネルギー量に応ずる等の報告がなされているが,いずれもそれだけでは十分な説明ができない.平成7年度の研究において,(1)脂質の吸収後の因子が食欲抑制に重要であること,(2)脂質の吸収後の小腸内の合成とリンパ管への移送が増加するアポ蛋白A-IVが,摂食中枢を介して脂質の経口摂取後の食欲抑制に重要な働きをすること,等を証明した.平成7年度の研究で脂質の経口摂取後の食欲抑制に吸収後の因子が重要であり,そのなかでもアポ蛋白A-IVが重要であることを示した.当初、計画していた実験は遂行でき,ほぼ予想通りの結果を得た.平成8年度は,以上の平成7年度の実績にもとずき、遺伝性肥満ラットにおける摂食調節機構における脂質吸収後の因子,特にアポ蛋白A-IVの関与を解明する.そのことで脂質吸収機構の肥満症発症機構に及ぼす影響を検討する。食欲の調節に関しては,グルコース,各種の代謝物質,ペプチドやホルモン,神経伝達物質等が調節物質として働いていることが解明されてきた.その中で,脂質も重要な調節因子と考えられてきた.実際,グルセロール,遊離脂質酸等の脂質の代謝物質は食欲の調節に重要であることが明らかとなっている.しかし,一番単純で重要な“経口的に脂質を摂取した後の,満腹感がなぜ生じるか?"という点に関しては,解決されていない点が多い.その満腹機構については,吸収前に十二脂腸粘膜の受容体を介する.摂取した脂質のエネルギー量に応ずる等の報告がなされているか,いずれもそれだけでは十分な説明ができない.我々は以前に脂質の吸収後に小腸内の合成とリンパ管への移送が増加するアポ蛋白A-IVが,摂食中枢を介して脂質の経口摂取後の食欲抑制に重要な働きをする可能性を示してきた.

このことは,脂質摂取後の食欲抑制が,従来考えられてきたように吸収前の因子や摂取エネルギーにのみ依存するのではなくて,脂質が吸収された後の因子が食欲抑制に重要であることを示唆している.本研究において脂質吸収後の摂取抑制に吸収後の因子が重要であることが判明した.なかでも脂質摂取後に小腸での合成とリンパ管への移送が増加するアポ蛋白A-IVが重要な働きをすることを解明した.作用部位としては食欲中枢である視床下部介する可能性が高いことが判明した.さらに,遺伝性肥満ラットであるZucker肥満ラットではアポ蛋白A-IVによる摂取抑制効果が正常ラットに比して減弱することが判明し,遺伝性肥満の一因として脂質摂取後の食欲抑制機能の異常が関与する可能性が考えられた.
視線運動における前頭眼野後部領域滑動性眼球運動ニューロンの応答特性

視覚対象が前額面でゆっくり動く場合、滑動性追跡眼球運動が使われる。視覚対象の動きは日常生活では多くの場合に頭部運動を伴って追跡される。前頭眼野後部領域が滑動性追跡眼球運動の指令信号を持つことが、国内外の多数の研究により報告されている。しかし、これまでの研究では頭部を固定した条件でのみ調べられ、他動的に回転刺激が加えられるとこれらニューロンの大多数の応答は、視線(眼窩内眼球運動+頭部運動)速度に対応することが明らかになっているが、アクティブに頭部運動を伴う追跡運動の場合、これらニューロンが実際に視線指令信号を持つかどうかについては答えることが出来ない。本研究は、レーザースポット視標と報酬であるジュースのフィーダーを同期あるいは乖離させて動かすことにより、視線追跡、眼球追跡、および頭部追跡を同期或いは乖離させて行わせ、サル前頭眼野追跡ニューロンの応答特性を調べた。視標とフィーダーの両者に対する視線追跡に応答した99個の前頭眼野追跡ニューロンの大多数(62%)は、フィーダーを静止させ、視標のみに対する眼球追跡にも、また、視標を静止させ、フィーダーのみに対する頭部追跡にも同様に応答した。これらの大多数は視標を提示しなくともフィーダーに対する頭部追跡に応答したが、その多くは他動的頭部回転に応答しなかったため、頭部追跡に対する応答は前庭入力によるものではなく、頭部運動指令を反映するものと解釈される。第二の群(25%)は視線追跡の応答と同様に眼球追跡に応答したが、視線が動かない頭部追跡に対する応答は弱く、この応答は他動的頭部回転に対する視線速度ニューロンの応答と類似した。少数のニューロンが頭部追跡のみ(8%)、或いは視線追跡のみ(5%)に応答した。以上の結果は、アクティブな視線追跡に応答した前頭眼野追跡ニューロンの大多数は眼球と頭部の追跡運動指令をもつことが示唆される。
酵素免疫測定法を用いた免疫の特性理解のための実習教材の開発

高等学校生物の免疫分野における実験・実習の教材化は難しく,ほとんど実践例がない。一方,研究者の間では,免疫現象の解明や,タンパク質の測定に,酵素免疫測定法(ELISA法)が用いられている。このELISA法の利点は, 1)特異性の高さと定量性の正確さ2)多様なタンパク質が検出可能であること3)検出するタンパク質が独自で設定可能であることなどがあげられる。さらに検出反応そのものが,免疫現象の理解につながる。そこで,本研究では, ELISA法を活用することで,免疫特に,免疫反応の特異性の高さや反応の特性の理解のための高校生向けの実験・実習の教材の開発を試みた。具体的には, BioRad社のExplorer Kitを用いて,高等学校での実践の可能性を検証した。直接吸着法,サンドウィッチ法,競合法を行い, 1定性的な検証実験での活用の可能性2低価格のマイクロプレートリーダーを活用して,定量的な検証実験での活用の可能性を検証した。定性的な分析においては,実験操作に不慣れな高校生においても,十分に実施可能であり,肉眼で反応の有無が十分に確認することができた。一方,低価格のマイクロプレートリーダーを用いた定量的な分析では,十分な精度が得られることが確認され,高校生でも検量線から濃度を求めることが可能であった。実習後,フローサイトメーターの原理についてのアンケートにより教育的効果を調査した結果,理解度だけでなく関心度においても高く, ELISA法による教材が有効であることがわかった。一方,実習に要する時間が多く,授業展開する上では,解決する必要がある。さらに, ELISA法の利点である多様なタンパク質が検出可能であること,検出するタンパク質が独自で設定可能であることは,探究活動で活用できる。今後この点についても教材開発する必要がある。
精巣上体の生後機能分化および性ホルモンによるその制御の分子機構

精巣上体は形態学的に頭部、体部、尾部に区分され、各部位ごとに特有の管腔内環境が保たれている。本研究では、精巣上体の各部位における機能的分化の分子機構を探るため、マウス精巣上体の生後発達過程における遺伝子発現変化を調べた。DNAマイクロアレイ解析の結果、生後1週から3週にかけて遺伝子発現が大きく変化し、3週でほぼ成熟の域に達することが明らかになった。またそれらの遺伝子発現は、精巣上体の頭、体、尾において大きく異なることが明らかになった。次に、性ホルモンが精巣上体の生後発達にどのように作用するかを調べるため、雄マウス新生児を合成女性ホルモンdiethylstilbestrolに曝露した。その結果、精巣上体の間質の相対的増加とTypeIcollagen遺伝子(colla1,colla2)の発現上昇が確認され、過剰なエストロゲンによる相対的間質増加は、個々の間質細胞におけるcolla1およびcolla2の発現上昇と関係が深いと考えられた。さらにDNAマイクロアレイおよびリアルタイムRT-PCRにより、精巣上体で強くあるいは特異的に発現する新規の遺伝子1種(Serpina1f)、および精巣上体での機能が不明な4種の遺伝子(Lcp1,Cuzd1,Teddm1,Wfdc16)を同定し、これらの発現が思春期の頃に急増することを確かめた。また精巣上体におけるそれらの発現部位、ホルモンによる発現制御パターンを明らかにし、DES曝露により発現が低下することを明らかにした。また水チャネル蛋白質アクアポリン(AQP)の発現を解析した。マウス精巣上体ではAQp1-9およびAQp11の10種類が発現しており、エストロゲンの過剰により多くのAQPの発現が低下することが明らかになった。精巣上体は著しく迂曲した1本の精巣上体管から成り、その中を通過する精子の成熟に寄与している。このような部位ごとの機能的分化は生後から思春期までの間に獲得されると考えられている。生後7日、21日、35日、56日のICR雄マウスの精巣上体よりRNAを抽出し、DNAマイクロアレイを用いて各日齢間で遺伝子発現の差を解析した。その結果、生後7日から21日にかけて、発現上昇する遺伝子が227種、発現低下する遺伝子が75種同定され、この時期に遺伝子発現が大きく変化することが明らかになった。一方、21日から35日にかけて上昇する遺伝子は23種、低下する遺伝子は2種であり、また35日から56日にかけてはそれぞれ1種、5種の遺伝子が上昇または低下することが明らかになった。さらに生後56日のマウス精巣上体で頭、体、尾における遺伝子発現の差を調べたところ、頭で発現が優位なもの186種、頭と体で優位なもの8種、体で優位なもの108種、体と尾で優位なもの86種、尾で優位なもの80種、頭と尾で優位なもの9種が同定された。今後、これらの差と機能分化の関連性について解析を進める予定である。昨年度、マイクロアレイ解析によってピックアップされた、精巣上体の生後発達に伴って発現が大きく変化する遺伝子について、そのいくつか(cauxin、Itmap1、Crisp1、Adam7)の発現状況をリアルタイムRT-PCRにより定量解析した。その結果、マイクロアレイによるデータと良く一致することが確認された。

また遺伝子発現変化は、生後1週、3週、5週、8週で調べると、1週から3週の間で変化が大きく、その後はあまり変化しないことから、マウスにおける精巣上体は、遺伝子発現レベルでは生後3週でほぼ成熟の域に達していると考えられた。次に、性ホルモンが精巣上体の生後発達にどのように作用するかを調べるため、雄マウス新生児を合成女性ホルモンであるジエチルスチルベストロール(DES)に曝露させ、精巣上体の形態変化および遺伝子発現変化について調べた。その結果、形態変化としては、DES曝露により精巣上体管上皮細胞の高さの減少、管腔の拡張、間質の相対的増加が確認された。遺伝子発現変化としては、DES曝露によりタイプIコラーゲン遺伝子のcol1a1およびcol1a2の発現上昇がリアルタイムRT-PCRにより確認された。しかしタイプIコラーゲンと共存するタイプIIIコラーゲンのcol3a1遺伝子には発現変化は見られなかった。タイプIコラーゲンは、DES曝露によりタンパク質レベルでも増加することがウェスタンブロットにより確認された。またin situハイブリダイゼーションにより、col1a1を発現する細胞の数はDES曝露によりあまり変化しないことが確認された。これらのことから、過剰なエストロゲンによる精巣上体の相対的間質増加は、個々の間質細胞におけるcol1a1およびcol1a2の発現上昇と関係が深いと考えられた。DNAマイクロアレイおよびリアルタイムRT-PCRにより、精巣上体で強くあるいは特異的に発現する新規の遺伝子1種(Serpinalf)、および精巣上体での機能が不明な4種の遺伝子(Lcpl, Cuzdl, Teddml, Wfdcl6)を同定し、これらの発現が思春期の頃に急増することを確かめた。In situ hybridizationにより、LcplおよびWfdc16は間質で、Teddmlはinitial segmentの上皮で、Cuzd1は全域の上皮で、Serpinalfは頭から尾の上皮で発現することを明らかにした。去勢およびその後のホルモン補充実験により、Lcplの発現にホルモンは関与しないこと、Teddmlは去勢により発現が下がるが、ホルモンを補充しても回復しないこと、その他(Cuzdl, Wfdc16,Serpinalf)はアンドロゲンの有無により発現制御を受けることを明らかにした。また、これらの遺伝子は新生児期にdiethylstilbestrol (DES)に曝露することにより、発現が低下することを明らかにした。次に水チャネル蛋白質であるアクアポリン(AQP)に注目し、その発現を解析した。正常マウスの精巣上体では、現在知られている13種類のアイソフォームのうちAQP1-9およびAQP11の10種類が発現しており、AQP5は体部、AQP6は頭部および体部、AQP9と11は体部および尾部で強く発現することが確認された。新生児期DES曝露により頭部におけるAQP6の低下、体部と尾部におけるAQP9の低下、尾部におけるAQP11の低下が見られたが、AQP5は変化しなかった。このように、新生仔期DES曝露は成獣マウス精巣上体内での水輸送に影響を及ぼす可能性が示唆された。またその影響は精巣上体の部位ごとに異なることが分かった。
「共生糸状菌」の二次代謝産物：ゲノムからの発掘と生物間相互作用における役割の解明

本年度は、二次代謝活性化による共生糸状菌からの化合物発掘と活性化メカニズムの解析を行った。NPD938は我々が理研天然化合物バンクNPDepoの化合物ライブラリーから取得したテヌアゾン酸生産誘導化合物である。NPD938による二次代謝活性化が既知の制御因子を介しているかどうかを明らかにした。二次代謝のグローバルレギュレーターLAE1及びMAPキナーゼOSM1の遺伝子破壊株を用いた解析により、NPD938によるテヌアゾン酸生産誘導はこれらの因子がなくても引き起こされることが明らかになった。また、LAE1の遺伝子破壊株では、生産誘導が抑制されていたことから、LAE1を介する経路も存在することが示唆された。RNA-seqによる解析により、NPD938処理によりテヌアゾン酸の生合成遺伝子TAS1の発現誘導が確認できた。また、同時にメラニンの生合成に関与する遺伝子群の発現抑制が観察された。次に、二次代謝制御メカニズムの一般性を明らかにするため、イネいもち病菌で有効な二次代謝活性化法が、他の糸状菌でも有効かどうかを解析した。その結果、Tolypocladium album(かび毒の生産菌)でも、NPD938は二次代謝産物の生産誘導能を示した。生産誘導された化合物はピリドキサチン及びその類縁化合物であることが明らかになった。RNA-seqによる解析により、NPD938処理により発現誘導される遺伝子クラスターを見出した。この遺伝子クラスターの中の生合成の鍵遺伝子(PKS-NRPS遺伝子)の破壊株ではこれらの化合物の生産が消失したことから、この遺伝子クラスターが生合成に関与することが示唆された。本年度は、二次代謝活性化による共生糸状菌からの化合物発掘と活性化メカニズムの解析を行うことを目的とした。理研天然化合物バンクNPDepoから取得した二次代謝活性化化合物NPD938のイネいもち病菌における作用に関与する因子(LAE1)を同定することに成功した。また、NPD938が転写レベルでテヌアゾン酸とメラニンの生産を制御することを明らかにした。更に、NPD938がかび毒生産菌であるT. albumでも二次代謝を活性化する活性を示すことから、二次代謝制御メカニズムの共通性を示すことができ、生産誘導されるピリドキサチン類の生合成遺伝子クラスターの同定に成功した。以上のように、おおむね順調に研究が進展していると考える。今後は本年度の続きの研究を行うとともに、共生糸状菌の宿主を用いた二次代謝産物の役割の解析を行う。まず、グループAとDのTAS1ホモログに関して、宿主を用いた活性評価を行う。発掘した化合物あるいは遺伝子破壊株等を用いて、感染における役割を明らかにする。グループAのホモログを持つ糸状菌として、イネいもち病菌とCordyceps militaris(冬虫夏草菌)を用いる。グループDを持つ糸状菌として、F. oxysporum等を用いる。次に、イネいもち病菌を用いてテヌアゾン酸以外の二次代謝産物の活性評価を行う。イネいもち病菌のゲノム中に存在する約30の推定生合成遺伝子クラスターの中から選択したクラスターに関して、イネとの相互作用における役割を解析する。二次代謝産物の基本骨格を生合成する鍵酵素の遺伝子破壊株を作製し、イネへの病原性を解析し、生物間相互作用への関与を明らかにする。化合物発掘に成功した場合は、化合物を用いて感染への関与を解析する。更に、発掘した化合物を用いて宿主生物以外の生物に対する生育阻害活性を解析する。非宿主生物として、バクテリア、酵母、糸状菌、動物細胞等を用いる。本年度は、新しいタイプの二次代謝酵素TAS1のホモログを用いて、共生糸状菌からの化合物発掘を行った。TAS1は我々がイネいもち病菌(Pyricularia oryzae)から発見した新しいタイプの二次代謝酵素であり、一つの酵素でテヌアゾン酸を生合成する。TAS1はC-A-PCP-KSのユニークなドメイン構造を持ち、KSドメインがユニークな環化反応を行う。C-A-PCP-KSのドメイン構造を持つホモログは糸状菌に特異的である。TAS1ホモログを持つのはほとんどが共生菌(植物病原菌、昆虫と線虫の病原菌、キノコ)であり、共生への関与が期待される。TAS1ホモログはAからDの4グループに分類できる。まず、共生糸状菌のTAS1ホモログが生合成する化合物を明らかにし、二次代謝産物を発掘することを目指した研究を行なった。1つの酵素で生合成することが予想されるため、プロモーター交換で大量生産させ、化合物を精製し、構造決定することにした。グループAは全てテヌアゾン酸をつくることが予想されるため、グループA以外を対象にした。グループCからGloeophyllum trabeum(キノコ、植物病原菌)のホモログ、グループDからTolypocladium album(かび毒の生産菌)とFusarium oxysporum(植物病原菌)とBeauveria bassiana(昆虫病原菌)のホモログを使用して、全てでテヌアゾン酸ではない化合物の生産誘導に成功した。更に、テヌアゾン酸以外の化合物をつくるTAS1ホモログの生合成メカニズムの解析を行うため、タンパク質の異種発現を行った。T. albumとF. oxysporumのホモログをコムギ無細胞発現系を用いて可溶性で発現させることに成功した。

本年度は、新しいタイプの二次代謝酵素TAS1のホモログを用いて、共生糸状菌からの化合物発掘を行うことを目的とした。グループCからG. trabeumのホモログ、グループDからT. albumとF. oxysporumとB. bassianaのホモログを使用して、プロモーター交換により大量発現させ、全てでテヌアゾン酸ではない化合物を生産誘導させることに成功した。また、テヌアゾン酸以外の化合物をつくるTAS1ホモログの生合成メカニズムの解析を行うため、T. albumとF. oxysporumのTAS1ホモログをコムギ無細胞発現系を用いて異種発現させ、可溶性のタンパク質を得ることに成功した。以上のように、おおむね順調に研究が進展していると考える。本年度は、二次代謝活性化による共生糸状菌からの化合物発掘と活性化メカニズムの解析を行った。NPD938は我々が理研天然化合物バンクNPDepoの化合物ライブラリーから取得したテヌアゾン酸生産誘導化合物である。NPD938による二次代謝活性化が既知の制御因子を介しているかどうかを明らかにした。二次代謝のグローバルレギュレーターLAE1及びMAPキナーゼOSM1の遺伝子破壊株を用いた解析により、NPD938によるテヌアゾン酸生産誘導はこれらの因子がなくても引き起こされることが明らかになった。また、LAE1の遺伝子破壊株では、生産誘導が抑制されていたことから、LAE1を介する経路も存在することが示唆された。RNA-seqによる解析により、NPD938処理によりテヌアゾン酸の生合成遺伝子TAS1の発現誘導が確認できた。また、同時にメラニンの生合成に関与する遺伝子群の発現抑制が観察された。次に、二次代謝制御メカニズムの一般性を明らかにするため、イネいもち病菌で有効な二次代謝活性化法が、他の糸状菌でも有効かどうかを解析した。その結果、Tolypocladium album(かび毒の生産菌)でも、NPD938は二次代謝産物の生産誘導能を示した。生産誘導された化合物はピリドキサチン及びその類縁化合物であることが明らかになった。RNA-seqによる解析により、NPD938処理により発現誘導される遺伝子クラスターを見出した。この遺伝子クラスターの中の生合成の鍵遺伝子(PKS-NRPS遺伝子)の破壊株ではこれらの化合物の生産が消失したことから、この遺伝子クラスターが生合成に関与することが示唆された。本年度は、二次代謝活性化による共生糸状菌からの化合物発掘と活性化メカニズムの解析を行うことを目的とした。理研天然化合物バンクNPDepoから取得した二次代謝活性化化合物NPD938のイネいもち病菌における作用に関与する因子(LAE1)を同定することに成功した。また、NPD938が転写レベルでテヌアゾン酸とメラニンの生産を制御することを明らかにした。更に、NPD938がかび毒生産菌であるT. albumでも二次代謝を活性化する活性を示すことから、二次代謝制御メカニズムの共通性を示すことができ、生産誘導されるピリドキサチン類の生合成遺伝子クラスターの同定に成功した。今後は本年度の続きの研究を行うとともに、二次代謝活性化による共生糸状菌からの化合物発掘と活性化メカニズムの解析を行う。
超高解像高温AFMによる化学反応のその場観察法の開発

単分子の化学反応を観察することは化学の長年の夢である。今回、有機分子が基板から力を受けて促進される新しい化学反応を原子間力顕微鏡(AFM)によって可視化することに成功した。自由空間で本来ねじれている有機分子が、金属表面に吸着することによって、平坦化することを直接観察した。AFMによる分子骨格イメージングによって、分子が平坦化していることを原子分解能で確認した。この有機分子を加熱したところ、アズレン部位がフルバレンに変換する化学反応が起こっていることを直接観察した。このような化学反応は従来観察されておらず、分子が表面から力を受け、その歪みが化学反応を促進したと考えられる。単分子の化学反応をその場で観察することは化学の長年の夢である。本研究では、固体表面に吸着した個々の有機分子の化学反応を実空間で可視化することを目的とする。原子間力顕微鏡(AFM)を用いると有機分子の形を可視化することができるので、化学反応による構造変化を直接捉える事ができる。反応中間体、反応生成物の構造の同定、さらに個々の反応経路の活性化障壁の測定を行う。これにより、例えば触媒反応場で起こる化学反応など、ローカルで起こる化学反応を理解することにつながる。今回、AFMを用いて表面に吸着することで誘起される新しい化学反応を可視化することに成功した。個々の有機分子は探針との斥力によりイメージングすることができ、それぞれの分子を化学反応物も含めて同定することができた。この化学反応は表面への吸着構造が重要な役割を果たしていることを明らかにした。そして、一部の化学反応において活性化障壁の見積もりにも成功した。一方、化学反応の場となる二酸化チタン表面上のプラチナ単原子の電荷状態をケルビンプローブ顕微鏡法(KPFM)で調べた。プラチナの単原子は正に帯電することが実験的にわかり、第一原理計算によってそれを再現することができた。また、KPFM測定のメカニズムの解明を行い、正しい測定を行うための条件を明らかにした。具体的には、AFMの探針が表面に接近するにつれて、探針にダイポールが誘起され、表面本来の情報を得ることができないことが判明した。金属基板に有機分子を吸着させて、AFM観察を行ったところ、有機分子の形状、吸着サイト、吸着状態を同定できるほど高分解能な画像の取得に成功した。さらに、加熱によって新しい分子が観察され、化学反応物を同定することができた。一方、化学反応の場として重要な二酸化チタン表面においてプラチナ単原子の電荷状態を同定することにも成功した。今回、有機分子が基板から力を受けて促進される新しい化学反応をAFMによって可視化することに成功した。実際、アズレン部位を持つもののねじれがほとんどない有機分子を用いて比較実験を行ったところ、そちらではフルバレンへの転位は観察されなかった。また、加熱する温度を変化させながら、反応生成物を単一分子レベルでカウントすることによって、反応の経路も推定した。引き続き、表面化学反応の可視化の実験を行っていく。特に、有機分子を吸着させる基板を様々に変えて実験を行い、吸着サイトや吸着様式による影響を詳しく調べる。走査プローブ顕微原子間力顕微鏡の観測室で試料を加熱する機構について、試行錯誤をしていたため。試料加熱の機構と合わせて測温できるシステムを構築していく予定である。
生物資源の探索と利用に関する共同研究

1.園芸植物資源1)ラン科植物の自生地調査と栽培種の入手(.加古舜治,Y.Paisooksantivatana,C.Piluek.7月11日7月24日).タイ国の中央部(パ-ヒンガムとフ-ヒンロンクラ国立公園),西北部(タクシンマハラト国立公園),西部(カンチャナブリ),東南部(チャコエンサオ)他,計7カ所を探索し,Coelogyne属3種,Cymbidium属3種,Dendrobium属6種,Doritis属1種,Habenaria属3種,Thunia属1種の分布と植生を調査した.Vanda属4種,Ascocentrum属3種並びにAerides属5種はKasetsart大学と種苗業者所有のものを入手した.2)日本におけるVanda属の栽培適否の調査(加古舜治,C.Piluek,N.Sinchaisri.10月4日10月10日).本調査は1993年より3年間すでに継続し観察調査を行ってきた.その結果,(a)温度光条件は他の一般のランと同じような条件でよく,(b)植込みに用いる鉢にはプラスチックポットの使用が可能で,特にタイの栽培方法である木製バスケットを必要としないと判断された.3) Neofinetia falcata(フウラン)の自生と発育の調査(加古舜治,C.Piluek.10月4日10月10日).フウランは日本産のVandaに近縁な属で,Vandaやそれ以外の属との属間交配が可能で,耐寒性で小形種の育種用によい.本種とタイのVanda類との発育と開花の習性を比較するため栽培調査を行った.その結果,本種は主軸分枝と仮軸分枝の両方の性質を持つこと,年間3枚出葉し,2,3枚枯死すること,開花期は7月8月,種子の飛散時期は11月12月であること,山口県下にも自生することなどを明らかにし,今後タイ産種との交配育種に利用が可能である.5)ショウガ科植物の自生地と植生の調査(加古舜治,Y.Paisooksantivatana,C.Piluek.7月11日7月24日).1)で示した場所と同一地域にてショウガ科の分布と各種植物の植生を調査した.その結果は以下に示すとおりである。調査地[植物種]タイ中央部タイ西部タイ東南部2.種子蛋白資源(松富直利,C.Piluek.9月24日10月1日)(2)この結合体はダイズ蛋白の乳濁化を促し,酸性条件下でも乳濁状態を維持することが確かめられた.(3)この結合物は食品の高温加工の場において実用性が高く,有用であるものと判断された.3.植物性土壌有機資源(丸本卓哉.S.Vangnai.9月24日10月1日)(1)土壌の微生物圏は土壌中の有機物から養分を得ているため,土壌微生物は土壌から養分低下をもたらすが土壌と土壌中に保存される.しかし土壌微生物の量や活性が小さい場合には,微生物以外の要因(溶脱等)が土壌養分減少の原因となる.微生物自体は養分を吸収し作物への養分供給源となりうる.(2)暖帯地区では,土壌中の有機物含量が多いため土壌微生物圏のレベルは高い.熱帯圏でも土壌への有機物の投入は土壌微生物圏のレベルを高めることを確かめた.(3)Azollaや稲藁は有用で,azollaはNの供給源として有用で,稲藁は土壌有機物資源として有効期間が長く有用であった.4.微生物資源(足立収生.G.Theeragool.10月4日10月10日)(2)これらのうち,高温条件下での酢酸生産に有用なものが数種確認された.1.園芸植物資源1)ラン科植物の自生地調査と栽培種の入手(.加古舜治,Y.Paisooksantivatana,C.Piluek.7月11日7月24日).タイ国の中央部(パ-ヒンガムとフ-ヒンロンクラ国立公園),西北部(タクシンマハラト国立公園),西部(カンチャナブリ),東南部(チャコエンサオ)他,計7カ所を探索し,Coelogyne属3種,Cymbidium属3種,Dendrobium属6種,Doritis属1種,Habenaria属3種,Thunia属1種の分布と植生を調査した.Vanda属4種,Ascocentrum属3種並びにAerides属5種はKasetsart大学と種苗業者所有のものを入手した.2)日本におけるVanda属の栽培適否の調査(加古舜治,C.Piluek,N.Sinchaisri.10月4日10月10日).本調査は1993年より3年間すでに継続し観察調査を行ってきた.その結果,(a)温度光条件は他の一般のランと同じような条件でよく,(b)植込みに用いる鉢にはプラスチックポットの使用が可能で,特にタイの栽培方法である木製バスケットを必要としないと判断された.3) Neofinetia falcata(フウラン)の自生と発育の調査(加古舜治,C.Piluek.10月4日10月10日).フウランは日本産のVandaに近縁な属で,Vandaやそれ以外の属との属間交配が可能で,耐寒性で小形種の育種用によい.本種とタイのVanda類との発育と開花の習性を比較するため栽培調査を行った.

その結果,本種は主軸分枝と仮軸分枝の両方の性質を持つこと,年間3枚出葉し,2,3枚枯死すること,開花期は7月8月,種子の飛散時期は11月12月であること,山口県下にも自生することなどを明らかにし,今後タイ産種との交配育種に利用が可能である.5)ショウガ科植物の自生地と植生の調査(加古舜治,Y.Paisooksantivatana,C.Piluek.7月11日7月24日).1)で示した場所と同一地域にてショウガ科の分布と各種植物の植生を調査した.その結果は以下に示すとおりである。調査地[植物種]タイ中央部タイ西部タイ東南部2.種子蛋白資源(松富直利,C.Piluek.9月24日10月1日)(2)この結合体はダイズ蛋白の乳濁化を促し,酸性条件下でも乳濁状態を維持することが確かめられた.(3)この結合物は食品の高温加工の場において実用性が高く,有用であるものと判断された.3.植物性土壌有機資源(丸本卓哉.S.Vangnai.9月24日10月1日)(1)土壌の微生物圏は土壌中の有機物から養分を得ているため,土壌微生物は土壌から養分低下をもたらすが土壌と土壌中に保存される.しかし土壌微生物の量や活性が小さい場合には,微生物以外の要因(溶脱等)が土壌養分減少の原因となる.微生物自体は養分を吸収し作物への養分供給源となりうる.(2)暖帯地区では,土壌中の有機物含量が多いため土壌微生物圏のレベルは高い.熱帯圏でも土壌への有機物の投入は土壌微生物圏のレベルを高めることを確かめた.(3)Azollaや稲藁は有用で,azollaはNの供給源として有用で,稲藁は土壌有機物資源として有効期間が長く有用であった.4.微生物資源(足立収生.G.Theeragool.10月4日10月10日)(2)これらのうち,高温条件下での酢酸生産に有用なものが数種確認された.(1).園芸と種子蛋白の資源植物の探索と調査.タイ国北部の山間部自生地に入り,種の自生状況調査を行い,以下の結果を得た.1)マエホンソン地区(調査地点=標高220m,440m,700mの3カ所):ラン科(Vanda5種,Dendrobium属4種,Cymbidium属1種),ショウガ科(Curcuma属他,約5種).2)チェンマイ地区(調査地点=標高450mの2カ所):ラン科(Vanda類1種),ショウガ科3種.マメ科(木本性2種).3)チェンライ地区(調査地点=標高400m,1300mの2カ所):ラン科(Phaius属1種),Curcuma属(約2種).ラン科植物は乱採取され自生調査が不可能なものがある.そのような採取株はラン園で販売されていた.日本人を含め世界中から購入に来るようであり,遺伝資源の保護保存方法に研究課題があるとみなされた.Curcuma属の分布調査がないため,今後その共同研究も進める.(2).土壌有機物資源の探索と調査.1)タイ国西部,バンコク近郊並びにタイ国北部を視察調査した結果,堆肥等の施用は,バンコク近郊の園芸地帯で一部行われていた.有機堆肥の施用の実態調査や試験成績も少ない.(3).有用微生物資源の探索と利用.今回の研究交流でタイ国から導入した酢酸菌から,1)高温下の酢酸生成活性の優れた系統の選抜(3株),2)酢酸の特異的な過酸化活性株(1株),以上の成果を得た.前者は酢酸発酵の有用な資源として,後者は酢酸過酸化の防止機構の解明のために有益な成果であり,今後これらの課題を中心に共同研究を進める.(1)園芸植物資源の探索と利用.2)ラン科植物の探索と利用(1994年4月1995年3月実施.加古舜治,N.Sinchaisri).Vanda
血液脳関門機能障害と精神疾患に関する生体膜輸送生理学的研究

本研究は、血液脳関門輸送機能を脳機能維持の観点から解明し、さらに、その輸送機能の制御や病態における変動を解明することで、精神疾患を含めた中枢疾患における血液脳関門輸送機能とその障害の役割を明らかにすることを目的とした。興奮性神経伝達物質、中性アミノ酸、神経伝達物質の代謝物の脳からの排出機構が血液脳関門に存在し、関与する分子を明らかにすることによって、血液脳関門の排出輸送機構が中枢機能維持に重要な役割を果たしている可能性を示すことができた。また、血液脳関門には神経保護作用を発揮する物質の輸送系が存在し、その輸送系の発現と機能が、神経障害と関連するシグナルによって制御を受けていることを明らかにした。この機構は、血液脳関門の輸送機構が積極的に脳を異常から防御するシステムとして、非常に興味深い。また、中枢にグルコースを供給する輸送系として重要な役割を果たしているGLUT1のノックアウトマウスを作成し、GLUT1遺伝子のホモ変異体は胎性致死であること、さらにGLUT1遺伝子の欠失がGLUT1遺伝子の発現だけではなく乳酸やケトン体の脳への供給に関わるMCT1の発現にも影響を与えることを明らかにした。この知見は、今後、中枢のエネルギー恒常性を考える上で重要な知見である。また、血液脳関門における輸送系を解析する技術として、siRNAをもちいてin vivo及びin vitroで血液脳関門輸送担体の発現と機能を抑制することに成功した。本技術は、今後の脳関門研究において重要な技術である。本研究成果は、ドラッグデリバリーの経路として主に解析が行われてきた血液脳関門輸送系の生理機能と疾患との関連という新たな一面を明らかにした。抗てんかん薬のバルプロ酸が血液脳関門を血流律速の担体輸送系で排出されることを明らかにした。血液脳関門障害モデルとして、ジエチルマレイン酸処理による酸化的ストレス効果を解析したところ、グルタチオンの前駆体であるシスチン輸送担体system Xc^-が顕著に誘導されることを明らかにした。輸送活性の増加だけでなく、mRNAも顕著に誘導された。一方、血液脳関門障害モデルとして高浸透圧処理を行ったところ、神経伝達物質の一種であるプロリンの輸送系system Aの輸送活性が増加することが明らかになった。さらに、定量的PCR法を用いてsystem Aの候補遺伝子ATA1,ATA2,ATA3の誘導効果を解析したところ、ATA2が最も顕著に誘導されることが明らかになった。この輸送系の活性化は、脳内浸透圧調節と脳毛細血管内皮細胞の構造維持に重要な役割を果たしていると推察される。一方、脳神経保護効果が知られるbasic FGFの血液脳関門輸送機構を解析した。その結果、脳側細胞膜にbasic FGFを内在化する機構が存在することが示唆された。basic FGFは星状膠細胞で生成されることから、この輸送機構の知見は、脳毛細血管内皮細胞に対する栄養因子効果の解析において有用である。脳内エネルギー蓄積物質としてクレアチンは非常に重要な役割を果たしている。血液中のクレアチンは血液脳関門のクレアチン輸送担体によって、脳内へ供給されることが明らかになった。神経保護効果が注目されている脳内クレアチンの主要供給経路が明らかになったことから、クレアチン代謝異常が関係する精神神経疾患の治療に有用な示唆を与えるものである。脳毛細血管内皮細胞の脳側膜に有機アニオン輸送担体OAT3が局在することを明らかにした。バルプロ酸最終代謝物であるホモバニリン酸は、主としてOAT3の働きによって脳から血液方向へ輸送される。この輸送速度は、バニリルマンデリン酸などの他の神経伝達物質代謝物によって顕著に阻害され、血液脳関門は神経伝達物質の代謝物を脳内に蓄積しないように排出する働きを有することが明らかになった。尿毒症時の中枢障害などの原因と治療に関して新しい知見がえられた。一方、神経調節因子としてL-アスパラギン酸(L-Asp)は脳内で重要な働きをしている。

既に、血液脳関門はL-Aspを脳から速やかに排出するが、D-Aspは脳内に保持する働きを有していることを明らかにしてきた。ASCT2は、D-Aspを輸送しないが、L-Aspを輸送することが分かった。さらに、脳毛細血管内皮細胞の脳側膜にASCT2が局在することを明らかにした。これらの結果から、血液脳関門を介したL体選択的Asp輸送にASCT2が最も重要な役割を果たしていることが示唆された。アルツハイマー病などで脳内D-Asp濃度が変動することが報告されており、今回の成果は中枢機能障害との関連で有用な知見を与えるものと考えられる。これまで、血液脳関門を構成する細胞の一つとして周皮細胞が知られてきた。しかし、その脳関門機能調節における役割はほとんど不明であった。温度感受性SV40large T抗原遺伝子導入ラットから条件的不死化ラット周皮細胞株を樹立することができた。本研究成果によって、今後、血液脳関門機能維持における周皮細胞の生理的役割を解明する研究において新展開が十分に期待できる。血液脳関門の最も重要な構造的特徴である密着結合は、脳関門破綻と密接に関わり重要である。脳毛細血管内皮細胞の密着結合蛋白の一種であるoccludinの発現の少なくとも一部は、周皮細胞から分泌されるangiopoietin-1 multimeric complexが内皮細胞膜のTie2のリン酸化によって促進されることが明らかになった。脳毛細血管内皮細胞の血液側膜にABCG2/BCRPが発現機能していることを明らかにした。さらに、この発現は周皮細胞からの分泌因子で影響されず、星状膠細胞によって顕著に誘導されることが明らかになった。脳関門の密着結合と排出輸送機能が内皮細胞だけでなく星状膠細胞や周皮細胞によって誘導されることから、血液脳関門の機能障害にはこれら関連細胞からの活性化機構の低下も重要であることが示唆された。アルツハイマー病は精神疾患で最も重要な一つである。その原因と考えられているアミロイド蛋白が、ラット大脳から血液脳関門を介して半減期50分で排出輸送されることが明らかになった。この排出輸送は飽和性を示し、LRP-1の関与が低いことが示唆された。インスリンでアミロイド蛋白の排出は阻害されたことから、脳内インスリン濃度とアミロイド蓄積との関連は今後の大きな研究課題である。これまでアミロイド蛋白の脳からの消失経路は代謝酵素が主であると考えられており、また、排出輸送機構としたLRP-1の関与が示唆されてきた。本研究成果は、これらの知見と異なることから、アミロイド蛋白輸送の分子機構の解明は新たな重要な研究課題である。
モデル生物を用いたバルプロ酸新規標的遺伝子の同定

バルプロ酸(VPA)は、抗てんかん薬として広く用いられている。近年、iPS細胞の作製効率を上昇させること、脊髄損傷マウスの治癒を促進することが報告されている。VPAの多彩な作用の標的分子の正体は不明である。我々は、分裂酵母モデル生物を用いて、分子遺伝学的研究を進め、以下の結果を得た。VPA超感受性株の原因遺伝子としてVrg4遺伝子を同定できた。その人ホモログは蝸牛様骨盤異形成症である。我々はVrg4がゴルジに局在していた。また、vrg4変異体細胞を用いて多コピー抑圧遺伝子数種類を同定できた。また、VPAで処理した野生細胞では多くの遺伝子の発現は上昇していることをCAGE法にて明らかにした。臨床ではバルプロ酸は、抗てんかん薬、抗躁薬、抗ガン薬として用いられている。近年、iPS細胞の作製効率を上昇させることや神経幹細胞による移植治療効果を改善させることが報告されている。しかしその分子メカニズムには不明な点が多いである。本年度にバルプロ酸超感受性株の原因遺伝子としてVrg4遺伝子を同定できた。Vrg4はGolgi GDP-mannosetransmembrane transporterをコードしている。その哺乳類ホモログは出産直後に死亡してしまう「蝸牛様骨盤異形成症」といった骨格異常疾患の原因遺伝子で、小胞体での糖ヌクレオチドの輸送および軟骨でのコンドロイチン硫酸鎖の合成に関与していることが知られている。我々はVrg4の細胞内局在を確認したところ、ゴルジに局在していた。Vrg4遺伝子は必須遺伝子で、この貴重な変異体細胞を用いて多コピー抑圧遺伝子数種類を同定できた。これらの結果はVrg4が多くの分子標的を有する可能性を強く示唆している。また、バルプロ酸で処理した野生細胞では多くの遺伝子の発現は上昇していることをCAGE(Cap Analysis of Gene Expression)法を用いて、明らかにした。一部のデータをルシフェラーゼレポーターやqRT-PCRにより確認した。現在、転写開始点の決定におけるバルプロ酸の作用とそのメカニズムを解明しているところである。バルプロ酸は、抗てんかん薬、抗躁薬として広く用いられ、抗がん薬の作用を増強することも知られている。バルプロ酸未処理とバルプロ酸1時間処理の野生細胞から抽出したmRNAを用いてCAGE解析(Cap Analysis of Gene Expression)を行った。バルプロ酸に応答する遺伝子を約1000個同定した。これらの分裂酵母遺伝子の哺乳類ホモログの一部に関して哺乳類細胞でもバルプロ酸による発現変化が確認できた。また、哺乳類mTORC1酵母ホモログTORC1活性はアミノ酸トラスポーターAgp3のゴルジへの局在制御に極めて重要であることを明らかにした(Liu et al. 2015)。さらにTORC1はGATA転写因子Gaf1を介しその他のアミノ酸トラスポーターIsp5、Per1、Put4とSPBPB2B2.01の転写を制御していることを明らかにした(Ma et al. 2015)。我々の結果はTORC1は転写レベルと局在制御レベルで異なるアミノ酸トラスポーターの機能を調節していることが示唆している。モデル生物の分裂酵母を用いてきた応募者と協力者の大学院生は、哺乳類細胞を扱う古屋敷智之博士より哺乳類細胞の培養技術やRNA抽出技術を計画以上早く習得できた。平成28年度に予定していた実験「5.哺乳動物細胞における相同遺伝子の解析」を、平成27年度後半に順調に実施できた。具体的にはバルプロ酸を用いていくつかの遺伝子の転写に対し、タイムコースや用量依存性を調べた。本年度に栄養培地ではΔnpr2細胞もΔnpr3細胞もΔlam2細胞も生育が阻害されるが、古典的なmTOR阻害剤ラパマイシンも新規のmTOR阻害剤Torinもこの生育阻害を回復させたことを見つけた。TORC1の下流基質蛋白Rps6のリン酸化、転写因子Gaf1の局在、複数のアミノ酸トランスポーターの転写を指標にし、分裂酵母ではこの3つの分子はTORC1経路を負に制御していることを証明できた。さらに3つの分子はTORC1の正の制御因子Rag GTPase Gtr1とGtr2の局在制御と蛋白安定性に関わっていることを明らかにした。驚くことに哺乳類ではNpr2とNpr3ホモログはmTORC1経路を負に制御し、Lam2ホモログはmTORC1経路を正に制御していることが報告されている。本年度の研究結果は高度に保存されている細胞成長に極める重要なTORC1経路の制御メカニズムの解明にヒントをもたらす極めて重要な結果である。