hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大腿骨頭壊死症における痛みの可視化と新規治療戦略の開発

大腿骨頭壊死症の疼痛機序を可視化し、新規治療戦略を開発するために、高磁場MRIによるT2マッピング法を用いて関節軟骨の質的評価、拡散強調MRIによる股関節周囲の坐骨神経と大腿神経を可視化した。過去30年間のステロイド性骨壊死のMRI研究のシステマティックリビューを行った。大腿骨頭壊死症の疼痛発現部位を明らかにした。有限要素法と新鮮凍結屍体による力学試験により、Keller vertebraの予測式の妥当性を検証し、この予測式を用いて大腿骨頭壊死症の応力分布を求めた。体外衝撃波照射による新規治療を開発した。大腿骨頭壊死症の疼痛機序を可視化し、新規治療戦略を開発するために、高磁場MRIによる関節軟骨の質的評価を行った。T2マッピング法を用いて大腿骨頭壊死と臼蓋形成不全の股関節軟骨を比較した。対象は圧潰のない無症候性ステロイド性大腿骨頭壊死17股及び臼蓋形成不全4股である。年齢、性別、center-edge angle、Sharpangle、acetabular head indexに有意差を認めなかった。大腿骨頭壊死は臼蓋形成不全より骨頭全層T2値(35.9msec vs 32.3msec, p=0.0122)及び表層T2値(37.3msec vs 32.4msec, p=0.0031)が有意に高く、臼蓋T2値(37.4msec vs 38.7msec, p=0.3244)が低い傾向を示した。大腿骨頭壊死において、骨頭表層T2値は全層T2値より有意に高かった(p=0.0049)。臼蓋形成不全では骨頭表層T2値と全層T2値に有意差を認めなかった。また、これまでのステロイド性骨壊死のMRI研究の成果を振り返り、今後の動向を予測するために、PubMed検索によるシステマティックリビューを行った。「osteonecrosis」、「steroid」、「MRI」をキーワードで検索すると194件が該当し、このうち、外傷とreview articleを除外した原著論文数は142件であった。1983年から、10年毎の論文数、国、研究デザインについて調査した。論文数は過去30年間で、1983-1992年13件、1993-2002年46件、2003-2012年83件と飛躍的に伸びていた。国別に見ると、1位日本、2位アメリカ、3位中国であった。研究デザインではヒトを対象とした臨床研究が多いが、遺伝子や動物実験の基礎研究が増加傾向であった。高磁場MRIによるT2マッピング法を用いた股関節軟骨の質的評価を行った。全身性エリテマトーデスにおいて大腿骨頭壊死無し群(17股)と大腿骨頭壊死有り群(26股)はともに健常群(12股)より骨頭T2値が有意に高かった(それぞれ40.3msec、35.2msec、30.1msec、p=0.001)。多変量解析にてステロイド投与と骨密度低下が骨頭T2値上昇の予測因子であることが明らかになった。本成果は英文雑誌に投稿中である。次に、過去30年間のステロイド性骨壊死のMRI研究のシステマティックリビューを行った。1983年から2013年までの英文原著は165編であり、1983-1993年25編、1993-2003年55編、2003-2013年85編と飛躍的に伸びていた。国別には1位日本(49編)、2位アメリカ(44編)、3位中国(18編)であった。国内では千葉大学が16編で1位だった。大腿骨頭壊死症の疼痛発現部位を調査したところ、鼠径部92%、膝72%、大腿前面34%、殿部33%、下腿22%、大転子10%、腰8%の順であった。大腿骨頭壊死症では変形性股関節節症と比較して、膝及び下腿の疼痛頻度が有意に高く、腰痛の頻度が有意に低かった。本成果は和文雑誌に投稿中である。全身性エリテマトーデスにおける大腿骨頭壊死無群(17股)と大腿骨頭壊死有群(26股)は健常群(12股)より骨頭T2値が有意に高く、骨密度低下が骨頭T2値上昇の予測因子であることが明らかになった。J. Magn. Reson. Imagingに掲載された。過去30年間のステロイド性骨壊死のMRI研究のシステマティックリビューは1983-1993年25編、1993-2003年55編、2003-2013年85編であり、1位日本(49編)、特に千葉大学が16編で1位だった。Chiba Medical J.に掲載された。大腿骨頭壊死症の疼痛発現部位は、鼠径部92%、膝72%、大腿前面34%、殿部33%、下腿22%、大転子10%、腰8%の順であり、変形性股関節節症と比し、膝及び下腿の頻度が高く、腰の頻度が低かった。

本成果はHip Jointに掲載された。体外衝撃波照射による新規治療の開発は、衝撃波群28股と自然経過群28股の第一相臨床試験を行い、合併症なく疼痛と機能改善が得られた。拡散強調MRIによる股関節周囲の神経支配の可視化は健常人24例(男性12例、女性12例)に行い、坐骨神経と大腿神経を描出した。有限要素法と新鮮凍結屍体による力学試験は12例24股(男性6例、女性6例)に行い、Keller vertebraの予測式の妥当性を検証した。以上の研究成果は英文誌に投稿中である。体外衝撃波照射による新規治療の開発については、英文雑誌に投稿中であるが、Arthritis Rheum、Ann Rheum Dis、Rheumatology (Oxford)、に却下され、Medicineに投稿中である。三次元実体模型と三次元ソフトウェアによる手術支援は先進医療の改定により、計画の変更を余儀なくされている。磁気共鳴スペクトロスコピーによる疼痛の可視化と生物学的製剤による新規治療の開発は準備を進めている。大腿骨頭壊死症の疼痛機序を可視化し、新規治療戦略を開発するために、高磁場MRIによる関節軟骨の質的評価を行った。T2マッピング法を用いて大腿骨頭壊死と臼蓋形成不全の股関節軟骨を比較した。全身性エリテマトーデスにおける大腿骨頭壊死無群(17股)と大腿骨頭壊死有群(26股)は健常群(12股)より骨頭T2値が有意に高く、骨密度低下が骨頭T2値上昇の予測因子であることが明らかになった。J. Magn. Reson. Imagingに掲載された。過去30年間のステロイド性骨壊死のMRI研究のシステマティックリビューは1983-1993年25編、1993-2003年55編、2003-2013年85編であり、1位日本(49編)、特に千葉大学が16編で1位だった。Chiba Medical J.に掲載された。大腿骨頭壊死症の疼痛発現部位は、鼠径部92%、膝72%、大腿前面34%、殿部33%、下腿22%、大転子10%、腰8%の順であり、変形性股関節節症と比し、膝及び下腿の頻度が高く、腰の頻度が低かった。本成果はModern Rheumatol.に掲載された。研究成果はChiba Medical Journalに採択された。さらに大腿骨頭壊死症の片側罹患例に対して、健側と患側の坐骨神経と大腿神経を描出し、FA値とADC値を比較した。この予測式を用いて、腿骨頭壊死症の片側罹患例に対して、健側と患側の応力分布を比較した。大腿骨頭壊死症の疼痛機序を可視化し、新規治療戦略を開発するために、高磁場MRIによるT2マッピング法を用いて関節軟骨の質的評価、拡散強調MRIによる股関節周囲の坐骨神経と大腿神経を可視化した。過去30年間のステロイド性骨壊死のMRI研究のシステマティックリビューを行った。大腿骨頭壊死症の疼痛発現部位を明らかにした。有限要素法と新鮮凍結屍体による力学試験により、Keller vertebraの予測式の妥当性を検証し、この予測式を用いて大腿骨頭壊死症の応力分布を求めた。体外衝撃波照射による新規治療を開発した。ステロイド性骨壊死のMRI研究のシステマティックリビューについては、英文雑誌に投稿中であるが、これまでにMod Rheumatolに却下され、現在Chiba Medical Journalに投稿中である。大腿骨頭壊死症の疼痛発現部位は興味深い知見が得られた。より症例を増やしてより深く検討した上で英文雑誌への投稿準備を進めていく。
国際社会における日本語についての総合的研究

各班の進捗状況の概要は以下のとおりである。総括班:公開講演会,研究報告会を実施するとともに,総括班会議(2回),研究班代表者会議(4回)を召集し,本プロジェクトの評価および企画推進に努めた。研究班1:中核となる「日本語国際センサス」のための調査票原案を作成し,日本語観等に関する予備調査を行った。また,欧米及びアジア各国で日本語の普及状況に関する観察・聴取の事例調査を行うとともに,中国・韓国で面接調査を実施した。この他,国内外でメディアにおける日本語の出現・接触状況調査を行った。研究班2:ヒトと文化の国際化が盛んな一方,各国社会における文化的・言語的同化の強制が弱まっている今日の世界において,言語変容と複数言語の共存の諸相とその条件を,共同研究によって解明することを目的として計画を立てた。日本語の歴史における多言語状況を古代・明治期それぞれについて解明すること,他文化への適応状況を理論化すること,さらに国内の諸地域間,および日本語非母語話者と日本人間の言語伝達状況を調査することが具体化しつつある。研究班3:文字言語チームは心理学的手法により日本語表記の認知的特質を探る一方,心理学の文献目録を作成した。音声言語チームは韻律学習用プログラムを開発し,日仏人を対象に有効性を検討した。計算機言語チームは言語表記変換プログラムや機械辞書を作成した。研究班4:同時通訳チームは日英・英日同時通訳訳出過程解明の実験,および研究動向の調査を行った。漢字符号チームは統合漢字符号の通信試行を行うとともに,インターネットにおける日本語送受信時の変換エラーのデータを収集した。コーパスチームはコーパス研究資料の収集を開始した。言語教育チームは言語教育政策懇談会とインターナショナル・スクール日本語教育予備調査の実施,および豪州初等中等レベルの第二言語教育シラバスの収集を行った。
運動時における活性酸素の代謝および抗酸化物質による制御機構の解明

本年度は、若年男性を対象として抗酸化物質の一つである高吸収クルクミン摂取が運動時の酸化ストレスならびに抗酸化能力の変動に及ぼす影響について検討した。本研究で用いるクルクミンは、従来の研究に用いられてきた様々な抗酸化サプリメントと比較して生体内への吸収率が高くなるように改良されている。定期的な運動習慣のない被験者(18-30歳)10名を対象に、高吸収クルクミン摂取しない条件(プラセボ)、単回摂取条件(運動前)、複数回摂取条件(運動前および運動後)の3つの条件で、最大酸素摂取量の65%強度で60分間の持久性運動を実施した。なお、高吸収クルクミンおよびプラセボ摂取は、運動開始2時間前に規定食とともに摂取することとした。各施行は、ランダムに実施し、ダブルブラインド方式で実施した。血液サンプルは、運動前、運動後、運動終了2時間後に採取し、酸化ストレス指標ならびに抗酸化能力指標を評価した。本研究の主な知見としては、高吸収クルクミン摂取は、運動直後の酸化ストレス指標の上昇を有意に抑制した。また、高吸収クルクミン摂取は、運動時における抗酸化能力を高めることが示された。本研究の結果は、酸化ストレスに起因する運動時の筋力低下予防や運動パフォーマンスの改善に高吸収クルクミン摂取が有効である可能性を示唆している。今後は、実際の運動やスポーツ現場において高吸収クルクミン摂取が筋力低下や運動パフォーマンスに及ぼす影響について検討する必要がある。本年度の研究課題は、交付申請書に記載した「研究の目的・方法」に沿って実施した。現在、血液分析を終了し論文投稿準備中である。したがって、本年度の研究は、おおむね順調に進展していると考えられる。今後は、本研究課題の結果を学会発表・論文化することが課題となる。また、追加分析として筋損傷マーカーや代謝関連指標を測定し、酸化ストレス指標との関連性を検討することにより生理学的意義を明確化できる可能性がある。酸化ストレスは、蛋白質、脂質ならびにDNAなどを損傷しメタボリックシンドロームをはじめとする種々の疾患の発症に関与することが報告されている。従って、酸化ストレスの予防を目的とした抗酸化物質と運動介入を併用した研究が実施されており、抗酸化物質(特にビタミンE)投与によって安静時ならびに運動時における酸化ストレスが軽減されることが報告されている。一方で、高齢者を対象とした研究は少なく、加齢に伴い抗酸化能力が低下し、酸化ストレスが増大することが報告されている。したがって高齢者を対象にビタミンEサプリメント摂取と運動介入の併用が生体内の酸化ストレス指標に与える影響を検討することは重要であると考えられる。本研究では、身体活動量が少ない高齢者を対象に、対照群、ビタミンE摂取(S)群、ウォーキング(Ex)群ならびにビタミンE+ウォーキング(S+Ex)群の4群を設定し、ウォーキング実践・抗酸化サプリメント摂取介入プログラムの有効性を検証した。高齢者における12週間のビタミンE摂取ならびにウォーキング実践は、安静時における抗酸化能力を高め、酸化ストレスを抑制することを確認した。一方で、ビタミンE摂取とウォーキング実践の相加効果はみられなかった。さらに、DNAの酸化損傷を示す8-hydroxy-2'-deoxyguanosine(8-OHdG)は、12週間のビタミンE摂取ならびにウォーキング実践により有意な変化を示さなかった。当該年度は、高齢者を対象とした身体活動や抗酸化サプリメント摂取が生体内における酸化ストレスや抗酸化能力に与える影響について検討した。その結果は、国内外の雑誌に投稿済みであり、国内外での学会でも発表を行ってきた。したがって、研究の進捗状況はおおむね期待通り進展したと自己評価している。今後は、身体活動や抗酸化サプリメント摂取が実験動物やヒトの組織(筋肉、免疫細胞など)における酸化ストレス状態にどのような影響を及ぼすのかについて、より基礎的な研究を実施したいと考えている。

今後は、本研究課題の結果を学会発表・論文化することが課題となる。また、追加分析として筋損傷マーカーや代謝関連指標を測定し、酸化ストレス指標との関連性を検討することにより生理学的意義を明確化できる可能性がある。
人体影響に関する基礎班

1.研究目的環境科学特別研究における人体影響研究領域(通称R-20)を運営し、研究遂行について協議して各研究組織に指針を与えるとともに研究成果のとりまとめを行なうことをめざす。主として計画研究代表者から成る幹事会において協議し、どのような研究を、どのように進めるべきかを検討する。特に将来起きるであろう影響を予測し、それに対処して影響の発生を予防するための研究に重点をおく。2.研究成果(1)幹事会を2回開催して研究の進め方について協議するとともに、年度末の研究とりまとめについて打合せた。(2)研究代表者が隨時研究分担者を訪問して打合せた。(3)人体影響研究領域の研究発表会を昭和61年1月10日、11日の両日、京都市、京大会館において開催した。人体影響研究領域に属するすべての研究組織から研究報告が行なわれた。その内容については、幹事会および評価委員によって評価を行なった。(4)研究代表者会議を昭和61年1月10日に開催し、人体影響研究領域の全研究組織相互の情報交換と、研究成果のとりまとめについて協議した。(5)人体影響研究領域の研究報告書「人体影響,9」を発行し、全班員および関係者に配付した。(6)昭和61年度の研究の進め方について協議し、計画研究組織の案を作成した。昭和61年度も環境毒性,環境疫学の2課題とし、研究代表者武部啓で基礎班を申請することが了承された。
ＡＭＰキナーゼの活性化による網膜色素上皮細胞の老化防止：加齢黄斑変性治療への展開

網膜色素上皮細胞(RPE)は網膜の恒常性を維持する多彩な生理機能を有しており、加齢黄斑変性では、加齢に伴うRPEの機能低下によって網膜の恒常性が破綻し、血管新生、網膜障害が起こり、視力が低下する。本研究では、ARPE-19とヒトiPS由来RPEに対して、慢性酸化ストレス負荷によってRPEの老化を誘導し、老化に伴うRPEの機能の変化を明らかにした。また、炎症モデルを用いてRPEの上皮間葉転換を誘導し、AMPKの活性化がRPEの上皮間葉転換を阻害することを明らかにした。加齢黄斑変性の最大の背景因子は加齢であり、加齢に伴う網膜色素上皮細胞(RPE)の機能低下を原因として網膜の恒常性が破綻し、血管新生や網膜障害が起こる。本研究ではRPEの機能低下をAMPKの活性化によって防止できるかどうかについて検討する。平成24年度に培養実験系におけるRPEの老化の誘導法として、培養細胞の継代を繰り返す方法と過酸化水素を用いて酸化ストレスを負荷する方法を行った。これらの方法で老化を誘導することができたが、加齢黄斑変性の重要な細胞変化であるドルーゼンの蓄積に関わるのネプリライシンの発現について、老化を誘導しても有意差が得られなかった。平成25年度はこれらの結果を鑑み、酸化ストレス負荷の方法として、新たな方法を試みた。この方法は慢性的な酸化ストレスを細胞に与える方法であり、より加齢黄斑変性の病態に近いと考えられた。具体的にはtert-BHPを用いて約1週間かけて細胞に酸化ストレスを与えた。この方法を試みた結果、細胞の扁平、肥大化、増殖能の低下がみられた。なお死亡する細胞はほぼみられなかった。新たな酸化ストレスモデルを確立する一方で、網膜色素上皮細胞の細胞機能の評価方法の確立に取り組んだ。特に、網膜色素上皮細胞の貪食能とタイトジャンクション形成能について取り組み、それぞれ蛍光ビーズを用いて細胞内に取り込まれるビーズを定量化する方法、また2層式細胞培養系において網膜色素上皮細胞のタイトジャンクションの形成を蛍光染色法で評価する方法に成功した。これらの成果を基盤に、次年度は酸化ストレスが網膜色素上皮細胞の機能に及ぼす影響を評価し、またAMPキナーゼの活性化が与える効果を評価する予定である。平成24年度は、培養実験系においてRPEに老化を誘導し、老化が細胞の機能に及ぼす影響を検討した。まず、RPEの老化誘導については、培養細胞の継代を繰り返す方法と酸化ストレスを負荷する方法を行った。老化の判定はSA-b-gal染色によって行った。RPEの継代を繰り返すと細胞の形態が変化し、SA-b-gal染色陽性となり老化を誘導することが出来た。また酸化ストレスを負荷する方法については、過酸化水素を用いて酸化ストレスを負荷した結果、一定の濃度、作用時間で細胞の形態が変化とSA-b-gal染色陽性となることがわかった。加齢黄斑変性ではRPEの貪食能が低下し、処理しきれない老廃物がドルーゼンとしてRPEの下に蓄積する。ドルーゼンはやがてRPEのさらなる機能低下や血管新生を誘導するので加齢黄斑変性の前駆病変であると考えられている。また、RPEによる老廃物の貪食には細胞エネルギーが必要である。そこで、ドルーゼンの主成分のアミロイドβの分解酵素であるネプリライシンの発現と細胞エネルギー代謝に重要なグルコースの取り込み能が老化誘導によってどのように変化するかについて検討した。その結果、ネプリライシンについてはこれまでに用いた抗体による検出では老化による影響は明らかではなかった。グルコースの細胞内への取り込みについては、老化とともに減少することが明らかになった。これらの成果は、次年度以降の研究の基盤となる重要な成果であるといえる。本研究では加齢に伴うRPEの機能低下をAMPKの活性化によって防止できるかどうかを検討した。平成25年度までに、細胞に慢性の酸化ストレスを与えて、細胞に老化を誘導する方法を確立していたので、平成26年度はこの方法を用いて、網膜色素上皮細胞に加齢を誘導し、加齢による網膜色素上皮細胞の機能の変化を検討した。また、加齢黄斑変性の後期にみられる病的な線維化を網膜色素上皮細胞に誘導し、これらに対するAMPKの活性化の影響について検討した。その結果、加齢変化に伴い、網膜の細胞外基質の増減に関与するMMP-2の発現が減少することが明らかとなった。

また、網膜色素上皮細胞の上皮間葉転換がAMPKの活性化によって有意に抑制されることが明らかとなった。これらの結果から、加齢に伴う網膜色素上皮の機能の低下や、上皮間葉転換の治療において、AMPKが新たな治療標的となる可能性が示唆された。医歯薬学現在のところ、AMPキナーゼの抗酸化ストレス作用を明らかにするまでは至っていないが、慢性酸化ストレスモデルの確立に成功したこと、網膜色素上皮細胞の細胞機能の評価法の準備が整いつつあることから、今後重要な結果が得られる可能性が高いと考え、概ね順調とした。網膜色素上皮細胞の老化誘導の確立に時間を要したが、平成24年度の成果は次年度以降の研究の基盤となる重要な成果であるといえる。また、細胞機能の内、グルコースの細胞内への取り込みという重要な機能について老化の影響を確認することが出来た。ネプリライシンについては評価方法の変更を要するが可能性のある評価方法は存在するため次年度以降の課題としたい。今回確立した慢性酸化ストレスモデルを用いて、酸化ストレスが網膜色素上皮細胞の増殖能、貪食能、バリア形成能(タイトジャンクション)、黄色色素取り込み能に及ぼす影響を検討する。その上で、AMPキナーゼが酸化ストレス耐性を網膜色素上皮細胞に与えうるかどうかを検討する。研究計画書に則って、予定通り研究を進める。具体的には老化誘導後の細胞機能について、より多くの評価項目を検討する。評価項目のうち、有意差が認められた機能については、遺伝子導入や薬理学的手法を用いてAMPKを変化させその効果を検討する。また、眼内レーザー照射による血管新生モデルやネプリライシンKOマウスにおけるAMPK活性化の効果についても検討する。網膜色素上皮細胞の老化誘導の方法の確立については、予定していたよりも研究費を必要としなかったため、次年度に繰越した。次年度以降は、細胞へのAMPKの遺伝子導入、様々な細胞機能評価を計画しており、これらに研究費を使用する予定である。次年度以降は、細胞や動物眼へのAMPKの遺伝子導入を計画しており、これらに研究費を使用する予定である。
造礁サンゴ培養細胞の分裂を促進する藻類成分の探索

海洋の生物多様性を支える重要な役割を果たす造礁サンゴの培養細胞の作成を促す藻類成分の探索を試みた。胚の電子顕微鏡観察により,電子密度の高い粒子が集まった領域,油分の多い領域や核が明確に観察される領域が観察され,分離して培養するとそれぞれ壁様構造を持つ細胞,油滴に満ちた細胞や付着細胞になると推測された。付着細胞を用いて藻類抽出液等の分裂促進作用を検討したが,適切なものは見出されなかった。造礁サンゴ胚の採取の機会は毎年1,2回しかないことから,胚の長期保存を試みたところ,20°C前後に維持した海水中であれば半年以上生存すること,その胚からも付着細胞が分離できることを確認した。平成27年度は,造礁サンゴから成体ポリプ細胞および受精後24時間前後の胚、プラヌラより安定的に初代培養細胞を得る条件の検討を試みた。成体細胞については,ハナヤサイサンゴの枝を切断し,スライドグラスに固定して飼育した際に切断面付近からスライドグラス上に増殖する細胞を対象とした。スライドグラス上に増殖伸長した細胞を物理的に剥離し,抗生物質添加した滅菌海水で数回洗浄した後,細胞培養用フラスコに入れて滅菌海水で培養した。塩の析出が認められることから,一般的な培地成分や血清は加えず,滅菌海水を用いた。1週間に1回程度半分量の海水を交換することにより,1ヶ月以上の細胞の維持が可能であった。胚・プラヌラについては,受精後約1日3日後のエンタクミドリイシを用いた。抗生物質添加した滅菌海水中で物理的に破砕した後,体細胞同様の手順で培養を試みたところ,こちらも1ヶ月以上の維持が可能であった。体細胞は大きさが比較的揃ったものの1つの枝から得られる細胞数が少なめであったのに対し,胚の場合は多くの細胞が得られるが,細胞の大きさは極めて多様であった。ヒトBリンパ細胞の増殖促進作用を示すレクチン(phytohemeagglutininやpokeweed mitogen)に加え,海藻由来成分としてフコイダン,スピルリナ抽出液やアルギン酸を1100 ug/mLの濃度で添加したが,未添加と比較して顕著な増殖促進は観察されなかった。高知県沿岸で比較的安定的に採取できるハナヤサイサンゴやエンタクミドリイシより,体細胞や胚から最低1ヶ月程度は維持できる細胞を分離できたことから,初年度については概ね順調に進行していると考えている。細胞増殖が期待される成分の添加により,顕著な増殖促進が観察できていないが,生体試料からの細胞分離のタイミング,培養密度,添加濃度、培養液などの検討により適切な条件を見出せるものと思われる。サンゴの遺伝解析には培養細胞が必須である。培養細胞の樹立で分類に必要な分子的データ、染色体データ等非常に有益である。サンゴではいまだ世界中でなされていない。本研究室では、海藻から抽出した成分を利用し、サンゴの培養細胞樹立を目指している。活発に分裂を繰り返している初期胚は24時間までであり、その後はプラウンチップ状になり、その後、プラヌラとして海水中を遊泳する。外骨格が出来上がったポリプでは、細胞の分離が難しいため、初期発生の時期を選択した。材料には、初期胚、プラウンチップ期、プラヌラ期から細胞を単離し、利用した。それぞれの細胞の海藻抽出物および種々のレクチン(細胞分裂誘発物質)に対する反応を調べた。また、液体窒素での細胞保存を試みている。また、細胞分裂の様子をビデオ録画して、その様子を観察している。添加剤の種類を増やして検討した。分裂誘発に試した物質は、PHA(ファイトヘムアグルチニン)、PWM(ブタクサ分裂誘発物質)、Allo-A(カブトムシ由来レクチン)、LPS(細菌由来リポタンパク質)、スピルリナ抽出物、海藻由来フコイダン、アルギン酸(褐藻類由来アニオン系糖タンパク質)、ハバノリ抽出物、コンカナバリンAを使用した。無菌人工海水または海水をフィルターろ過滅菌したものを使って培養を行った。材料に使ったサンゴは、ポリプ(成体)は細胞単離時の死亡率が高いことが判明し、初期胚からプラヌラ期の単離細胞を標的とした。ほぼすべての試薬でシャーレに上皮系の細胞(線維芽細胞様)が現れた。3カ月以上生存は確認されたが、増殖には至らなかった。しかし、中でもPHAが最も多くの上皮性細胞が観察され、細胞の分裂刺激に可能性があることが分かった。現在、添加物の濃度の設定、温度の設定、分離する細胞の発生ステージといった条件設定を細かく検討している。また、物理的に胚から単離した細胞の液体窒素またはディープフリーザー(-80°C)での保存条件についても、抗凍結剤とともに検討している。生存率はパリカメノコキクメイシ、ゴカクキクメイシがエンタクミドリイシより高いことが判明している。ミドリイシ科の胚は培養の難易度が高い。また、培養液の浸透圧の重要性が示唆される結果を得ているので、培養液の塩濃度についても検討する。胚を直接培養すると、微生物のコンタミネーションが頻発し、培養の継続が困難となる。細胞培養時に頻発する鞭毛藻類の増殖が大きな問題の一つ。振盪培養の有用性を探る;細胞がシャーレやフラスコの壁面に接着すると分裂が阻害される可能性があるので、振盪培養を試みる。培養細胞の樹立で分類に必要な分子的データ,染色体データ等

非常に有益である。サンゴではいまだ世界中でなされていない。本研究室では,海藻から抽出した成分を利用し,サンゴの培養細胞樹立を目指している。活発に分裂を繰り返している初期胚は24時間までであり,その後はプラウンチップ状になり,その後,プラヌラとして海水中を遊泳する。外骨格が出来上がったポリプでは,細胞の分離が難しいため,初期発生の時期を選択した。そこで,材料には初期胚、プラウンチップ期、プラヌラ期から細胞を単離し、利用し,それぞれの細胞の海藻抽出物および種々のレクチン(細胞分裂誘発物質)に対する反応を調べてきた。サンゴ胚は,各種ごとに年に一度か二度の産卵時にしか試料収集ができないが,2016年度および2017年度は想定された産卵日が荒天のため,思うように収集することができなかった。このことは,培養細胞の樹立方法が確立した後でも,試料採取が天候に左右されることがボトルネックになることを示唆していた。そこで,2017年度は,培養細胞の樹立方法の検討に必要な胚試料のストック方法についても検討した。産卵試料を入手できたエダミドリイシの胚を材料とした。その結果,海水中で低温培養することにより半年以上の胚(プラヌラ幼生)の維持が可能であった。具体的には、25°Cで維持した場合には,12週間しか生存できなかったが,15°Cまで下げることにより,25%が半年後も残存していた。試した温度帯の中では,21°Cが最も生存率が高く75%に上った。海洋の生物多様性を支える重要な役割を果たす造礁サンゴの培養細胞の作成を促す藻類成分の探索を試みた。胚の電子顕微鏡観察により,電子密度の高い粒子が集まった領域,油分の多い領域や核が明確に観察される領域が観察され,分離して培養するとそれぞれ壁様構造を持つ細胞,油滴に満ちた細胞や付着細胞になると推測された。付着細胞を用いて藻類抽出液等の分裂促進作用を検討したが,適切なものは見出されなかった。造礁サンゴ胚の採取の機会は毎年1,2回しかないことから,胚の長期保存を試みたところ,20°C前後に維持した海水中であれば半年以上生存すること,その胚からも付着細胞が分離できることを確認した。平成27年度と同様の条件で,安定的に培養細胞の分離・維持が可能かを検討した上で,細胞の生存活性の測定法を検討する。また,ヒト細胞の増殖促進効果を持つ物質や海藻抽出液等について,添加のタイミングや添加濃度について適正な条件について調べる。平成29年度は、キクメイシ科のサンゴを中心に培養条件を決定する。今年度の実験により、最適種、温度、培養液、浸透圧、pH等の条件がほぼ決まってきたので、さらにその条件を詰めるように実験を行う。6月から8月にできるだけサンプリングを重ねて、培養実験を行うとともに、胚からの単離細胞を液体窒素で保存できる条件を検討する。保存が可能となれば、実験の時間的制約(サンプリングの時期が夏場に限られている)から解放されるため。細胞の分裂をビデオ観察する。振盪培養の有用性を探る;細胞がシャーレやフラスコの壁面に接着すると付着固定され、分裂が阻害される可能性があるので、振盪培養を行う。渦鞭毛藻のコンタミを防ぐため、胚を1個ずつ個別に分けて培養を試みる。
中近東・北アフリカにおけるビザンティン建築遺産の記録、保存、公開に関する研究

中近東と北アフリカにおいて、ユスティニアヌス1世期(6世紀)の主要な教会堂建築を対象として基礎研究、考古学調査、工学、保存科学、遺産公開の5領域で研究を行う。リビアのトクラ遺跡では「西教会堂」の発掘で、アプシスが出土、ヨルダンのジェラシュ遺跡では「三連教会堂」の詳細実測を終え、アトリウムの一部発掘を実施し、先行建築を確認した。対象国の政情不安と騒乱で一部研究が未完となったが、研究期間後半ではハギア・ソフィア大聖堂(トルコ、イスタンブール)を主対象として、上部構造の形状と微動を計測し、劣化の主因となる壁体への水分浸透を解析した。構造と保存科学の視点から、同大聖堂の保存と公開への基本指針を得た。リビアでは発掘計画を考古学庁に説明し、研究作業開始の準備を進めた。しかし、作業開始直前の9月にリビア考古学庁のアナーグ長官が更迭され、アガーブ新長官に調査計画を最初から説明し、リビア側の都合で第1フェーズの発掘調査予定地をプトレマイスからトクラに変更した。研究計画に明記したプトレマイスの発掘は第2フェーズで実施の予定である。シリア、ヨルダンについては、考古学庁での研究計画説明を行った。ヨルダンの調査予定地は、計画通りウム・アル・ラッスス、ウム・アル・ジマル両遺跡で、第1フェーズでは前者に着手する。ヨルダン考古学庁に説明を行い、現地状況の確認を終えた。本年度はリビアでの研究準備を優先して進あ、出土品の収蔵庫、発掘メンバーの宿泊施設、研究スペース等を確保したが、その一部は修復の必要がある。3次元レーザースキャナーを購入し、国内でその作動確認、実測演習を行い、次年度の実測作業(ハギア・ソフィア大聖堂)に備えて準備を進めた。構造班は構造解析と組石造構造の力学実験準備を進めた。保存科学班は雨水浸透モデルの作成についてドレスデン工科大学メンバーと共同研究の態勢を整えた。考古班はトクラ遺跡に関する先行研究の収集,および専門研究者との意見交換を行った。国内でトクラ遺跡に関する資料を収集するとともに,3月にローマのブリティッシュ・スクールにおいて,1960年代のレプティス・マグナ発掘,さらに1950年代に実施されたトクラ遺跡の部分発掘に関する資料を収集するとともに,連合王国,オックスフォード大学にて,古代ローマ後期の都市形成史を専門とするジャネット・ディレーン講師と,地中海沿岸,とくにレプティス・マグナに代表されるリビア西部と,プトレマイス,トクラに代表されるキレナイカと呼ばれるリビア東部の都市群の相違点,考古学的な位置づけについて意見交換を行った。本年度で予備的な資料の収集は完了し,次年度の試掘,表土の除去を開始するための十分な情報を得た。トルコのハギアソフィア大聖堂では、側廊ヴォールトの実測、上部半ドーム、ドームコーニスの劣化調査を行った。漆喰で覆われたモザイク面の試験探査を実施、23年度からの本探査に向けて機材準備を進めた。堂内微気候の長期自動計測システムを構成し、計測を開始した。ヨルダンでは考古庁と研究契約署名を行い、ジェラシュ遺跡の調査を開始、サイトの地表面特性の把握と発掘前の地勢記録のため、ラジコンヘリによる空撮を実施、帰国後に正射影画像を作成した。当初計画で予定していたウム・アル・ラッサス遺跡とウム・アル・ジュマル遺跡については、アメリカ・ヨルダン合同隊による調査許可が下りてしまい、サイトの変更を求められた。しかし、ジェラシュ遺跡はこれら2遺跡に勝るとも劣らぬ重要遺跡で、特に3連教会堂は初期ビザンティン遺跡の特異な構造として注目されるため、検討の結果、ジェラシュ遺跡を選定した。研究対象地域の一部であるチュニジア、リビア、シリア、エジプトで民主化運動による騒乱が続き、研究作業に影響が生じたが、情勢安定化と共に研究再開の準備を進めた。リビアでは、トクラ遺跡の発掘を開始し、サイトの表面整備に続き、発掘を行って東教会のアプシスの一部分が出土した。同時に、サイト敷設の博物館について、日本側の構想を提示し、リビア当局が予算措置を進めることとなった。しかしその直後民主化運動の騒乱で発掘の中断を余儀なくされた。現地情勢の悪化により海外発掘調査には遅れが見られるが、ハギア・ソフィア大聖堂モザイク探査、チュニジアからアルジェリアに到るローマ街道沿いの集落遺跡について、国内外の研究機関で精力的に文献研究を進めた。ハギア・ソフィア大聖堂(トルコ)では堂内外の環境調査ステーションを設置し、微気象モニタリングを開始した。同時に壁体表面の含水率を測定し、雨水浸透モデルを作成、水分移動のシミュレーションを行った。モザイク探査では、漆喰層透過と金属成分検出精度に関して国内実験を行った結果、ミリ波による探査が有効である可能性が体ことを確認し、次年度に向けて準備を整えた。

ハギア・ソフィア当局から、博物館としての公開支援と危機管理(災害時の観光客誘導法、避難経路確保)に関する提案を強く要請されたので、博物館学の視点から堂内動線の調査分析を行い、避難計画を提示した。チュニジアではハイドラ遺跡の調査開始を目指したが、すでにフランス隊が調査を開始したこともあり、政府考古庁と協議の結果、同等の遺跡である、ル・ケフのサンピエール聖堂を調査対象とすることで合意し、研究許可書の署名を終え、熟覧調査を開始した。テベッサ遺跡に関するアルジェリア政府との協議を開始した。特に、過去の修復評価という研究目的に対し、アルジェリア政府が過去の同国専門家による修復作業への批判を過大に恐れたため、難航し、同国の事務機構硬直化の影響で進展が見られなかった。リビアではトクラ遺跡の東教会堂の発掘を開始した。ブッシュと表土の除去により、東端のアプシスに相当する円弧上の壁面が確認できた。作業は次年度に継続する。シリアのルサファ遺跡内にある教会堂遺構調査では、アレッポ大学の研究協力者がシリア政府との研究調査契約締結を進めたが、政情不安のため、年度内の研究再開を断念した。この結果、契約締結と、研究作業開始に充当する研究資金を次年度に繰り越すこととし、必要な事務手続きを行った。1)ジェラシュ遺跡:西側アトリウムの表土を除去し全体形状を確認、実測。ナルテックス内での試掘を進め、過去の修復の目視調査を行った。ナルテックスでは、地下約70cm付近で先行建築の基礎遺構と舗床モザイクが出土。発掘当時の写真を参考に現状との比較を行い、三次元オルソ画像上に劣化状況を記録。聖ゲオルギオス聖堂の南側に積み上げられた過去の発掘・修復作業の土砂や石の堆積表土を除去、教会堂の南側の街路面全体を明らかにし、ポーチ跡と推定される大理石の敷石と柱の跡および障壁の土台を確認。2)ハギア・ソフィア大聖堂:壁面モザイクの非破壊探査手法の確立を目的とする作業を継続。マルチパス・リニアアレイ・レーダーを使用し、南階上廊の東ベイの壁面、南ティンパヌム基部の壁面においてミリ波レーダーによる被覆モザイクの探査、画像化の実験を行って一部領域で表層背後のモザイクの存在を捉えることができた。並行して実施した環境調査では、2建築外環境計測ステーション、建築内環境計測のための無線センサノードおよびデータロガーの計測データの収集および内壁析出塩の採取、内外壁モルタルおよびレンガ試料の採取をおこなった。ハギア・ソフィア当局に報告書を提出し、外壁面からの雨水の浸透により、内壁面の含水率が上昇すること、外壁面の修復を行うのは、壁体内部の含水率が低くなる時期(8月10月)に行うことが望ましいことを指摘。3)サン・ピエール聖堂:3次元レーザースキャナーによる遺構の実測調査を行い、チュニスル・ケフで調査結果の報告を行った。上部架構および双柱形式について、過去の修復と現存状況の詳細比較調査を実施した。4)トクラ遺跡発掘調査:東の教会堂の発掘継続。サイト東半分のブッシュ除去とアプシスの発掘、半円壁面および散乱する外壁石材、内部円柱断片の実測を行った。リビア側の要請に応じて、遺跡が面する海岸浸食の状況も並行して実施。シリア、リビアで政情不安と治安悪化が加速したため、ハギア・ソフィア大聖堂に関する研究を集中的に進めた。
地震前駆電磁放射観測を応用した火山活動と噴火予知の研究

本研究は平成5・6年度に噴火中の雲仙普賢岳火口の北西2.3kmの九州国立大学共同研修センターの構内に設置した観測装置により、3・4・5年度に引続き36Hz、1525Hzおよび82kHzの3周波数帯に於ける普賢岳火山のマグマ移動に関連した電磁放射の観測を行った。観測は前年度までに既に5回にわたり支給された科研費(重点領域)によって改良を加えた観測器および電場・磁場検出センターを用いたため、感度と測定確度が格段に向上している。普賢岳は観測開始直後の1991年6月に火砕流、噴火等の多数の興味ある現象が発生し、特に噴火にによって生じた大気重力波が火口から音速で上向きに伝播し、下部電離層に達して地上の電場の変動を発生する機構を世界に先駆けて発見する成果を挙げた。しかし1992年以降は火山性地震の震源は頂上ドーム内に集中し、6年度は放射波形の変化を観測して噴火の終焉時期の予測を行った。火山観測と同時に5年度より今年度に至る2年間は、かねてよりの懸案であった地震の場合に震源で発生する電磁エネルギーが地中を伝送して地表に達する機構を解明するため、長野市西麓の東大地震研の地震予知用観測トンネルを用いてトンネル間のエネルギー地中伝送の測定を行った結果、初めて磁場エネルギーが地中を通過しても常に自由空間値より5dB程度の観測値を示し、減衰が極めて少ない事を実証した。この結果から震源から震央に至るエネルギー伝送の実態が判明した。本研究において得られた幾多の成果は、今後の災害科学の発展に大きな寄与をもたらす事が期待される。平成5年度は、平成3・4年度科研費に引続き雲仙普賢岳においての観測を継続した。今年度早々、1991年以来観測を続けた普賢岳の火口の北東2.3kmの千々石断層上の国見町田代原が、観測電源供給の不調、新たな電磁妨害雑音が発生し始めたため、国見地点の西北西2.8kmの九州国立大学共同研究センター敷地内に移動し、先年度までに購入した新製機器を設置した結果観測精度が各段に改善され、36Hz、1525Hzおよび82kHzの3周波数帯において観測を継続した。普賢岳は観測開始直後の1991年6月には火砕流、噴火等の多数の興味あるイベントが発生し、特に火山噴火に際して、噴火後約5分後に火口附近の電界が突然変動する現象を発見し、これが噴火によって生じた大気重力波が音速で上方に伝播して下部電離層に達して発生する事を証明する世界で初の成果を挙げた。しかし92年以降の普賢岳の活動は粘性に富んだマグマが徐々に押し上げられてか火口上にドームを形成し、以後の火山性地震の震源はこの頂上ドーム内に集中しており、火山性地震のゆっくりした増減を繰り返したのみで、火砕流の発生頻度もこれに従って増減した。これに伴い電磁放射も独特の波形の放射が行われている事を確認した。しかし今年度には2回のやや大きな地震が有り、その際時前に電磁放射が有る事を認めたが、これは次年度に更に観測して確認する必要がある。また平成5年度には、この電磁放射の発生機構を追及するため、我々は震源に於ける岩石破砕で磁界が発生し、震央の地表上に至るエネルギーは磁場によって伝送されると考えた。これを検証するために今年度は長野市の地震予知用観測トンネルを用いてトンネル間の低周波磁界の地中伝播測定を行い、初めて磁場の地中に於ける減衰が極めて少ない事を実証する事が出来た。これは今後の災害科学発展上に大きな寄与をする発見であった。

平成5年度に引続き普賢岳の火口の北西2.3kmの九州国立大学共同研究センターの敷地内に設値されている観測装置を用いて、3.4.5年度に引続き36Hz、1525Hzおよび82KHzの3周波数帯によって雲仙普賢岳の火山のマグマ移動に関連した電磁放射の観測を行った。観測は前年度までに改良を加えた観測器および電場検出センサー、磁場検出センサーを用いたため、感度が格段に向上している。普賢岳は観測開始直後の1991年6月には火砕流、噴火等の多数の興味ある現象が発生し、特に火山噴火に際して、噴火によって生じた大気重力波が音速で上向きに伝播し、下部電離層に達して発生する機構を世界に先駆けて発見する成果を挙げた。しかし1992年以降は普賢岳の火山性地震の震源は頂上ドーム内に集中し、6年度は放射波形の変化を観測して噴火の終焉時期の予測を行った。同時に5年度より今年度に至る2年間、震源で発生する電磁エネルギーが地中を伝送して地表に達する機構を解明するため、長野市の地震予知用観測トンネルを用いてトンネル間のエネルギー伝送モードの測定を行った結果、初めて磁場エネルギーが地中を通過しても自由空間値より5dB程度と減衰が極めて少ない事を実証した。これにより初めて震源から震央にいたるエネルギー伝送の実態が判明した。本研究において得られた幾多の成果は、今後の災害科学の発展に大きな寄与をもたらす事が期待される。
複合構造データベースからの関連パターン発見手法の開発

本研究では、構造データの組み合わせである複合構造データからの知識発見に関し、(1)複合構造グラフや(2)グラフ系列、(3)多次元構造データ、(4)定量的区間系列などを対象に、特徴的な共通パターンを発見するための効率的な手法の開発を行った。またこれらの研究を通じ、従来技術の問題点である質の低いパターンの生成を抑制し、有意義で特徴的かつ解釈容易なパターンを効率的に発見するための基礎的な方法論について一定の知見を得た。本年度は,(1)グラフ系列及び(2)多次元構造データを対象とした新たな関連パターン発見手法の開発を行った.また,複合構造データマイニングの拡張として,数値情報を含む構造データである,(a)数値属性集合を頂点に持つネットワークデータ,(b)時間情報を伴う区間イベント系列データ,(c)グラフとその構成要素に重みが付与されたグラフ,のそれぞれを対象に,特徴的パターン発見アルゴリズムの開発を行った.グラフ系列からの関連複合構造パターン発見に関しては,パターンの評価基準として,(a)系列パターンの各構成要素の大きさ,(b)互いに関連しあう構成要素数,(c)関連の強さを表す相関係数の3つのパラメタからなる関連性基準を提案した.なおこの基準は,各構成要素を頂点,それらの関連性を辺とする関連性グラフにおけるK-plexの概念に相当するものであり,これまでに開発したクリークに基づく関連性基準の一種の緩和となっている.また,この新たな関連性基準に基づく特徴的部分グラフ系列発見アルゴリズムCorSSSを開発した.CorSSSでは,パターン間の一般・特殊の関係に着目した木データ構造を用いることで,効果的なパターン発見を実現している.一方,多次元構造データを対象とした関連パターン集合発見に関しては,グラフデータを対象としたアルゴリズムHSGを多次元構造データへと拡張するとともに,より特徴的なパターン集合のみを抽出するために,飽和性(パターンの大きさに関する極大性)を満たすパターン集合のみを発見するアルゴリズムCHPMSを開発した.CHPMSでは,パターン間及びパターン集合間の一般・特殊の関係を考慮した木データ構造を用いるとともに,頻度,関連性,飽和性のそれぞれに着目した枝刈りを導入することで,効率的なパターン集合発見を実現している.本年度は、1、定量的区間系列からのパターン発見技術の開発、2.動的クラフからの特徴的パターン発見技術の開発、及び3.内部及び外部重み付きグラフデータベースからの関連パターン発見技術の高機能化を行った。1.に関しては、事象の区間長と時間差といった定量的情報に加え、事象が観測されない(出現しない)という否定的情報を含む、正負定量的区間パターンを提案すると共に、その効率的な導出手法の開発を行った。加えて、開発した手法を、定量的区間系列を象とした分類問題へと適用することで、その有効性を評価した。2.に関しては、動的グラフ(グラフ系列)からの特徴的パターンとして、粒度の異なる3種の変化パターンを定義すると共に、それらの効率的な列挙手法の開発を行った。また、(1)パターンの構造の類似性及び説明範囲に着目したパターン選択技術の開発、及び(2)パターン集合の構造化(ネットワーク化)技術を新たに開発することで、(従来手法で用いられる)頻度とは異なる基準による特徴的なパターンの絞込み及びパターンのランキングを実現した。3.に関しては、より特徴的なパターン集合のみを抽出するため、飽和性(パターンの大きさに関する極大性)を満たすパターン集合のみを発見するアルゴリズムを開発した。加えて、より柔軟なパターン発見の実現を目指し、(1)内部重みに関する評価基準、及び(2)内部と外部重みに関する評価の統合基準のそれぞれに関し、複数の基準を新たに提案した。またこれら複数の基準に対し、上界値を利用した統一的な枠組みでのパターン列挙手法を開発した。
PNHのクローン性造血機序の解明

発作性夜間ヘモグロビン尿症(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: PNH)は、PIGA遺伝子に後天的変異を持った造血幹細胞がクローン性に拡大する造血幹細胞疾患である。どのくらいの数の造血幹細胞が、またどのくらいの期間、造血を支持できるのかという知見は乏しい。PIGA遺伝子の発見から25年を経て、遺伝子発見初期に同定されているPNHクローンが、その後25年に渡り造血を支持しているのか、それともクローンの交代現象が起こっているのかを検証し、幹細胞造血のダイナミズムを明らかにする。
トランスジェニックマウスを用いた肝細胞増殖因子(HGF)の胃における役割の検討

結論:HGFは胃粘膜の組織修復に深く関与していると考えられる。なお、HGFトランスジェニックマウスを用いた研究は現在進行中である。即ち、マウスH^+/K^+-ATPase βsubunit遺伝子のエンハンサー/プロモーターの下流にHGF cDNA,ポリAシグナルを含むヒト成長ホルモン遺伝子の3′非翻訳領域をつなぎ、これらをプラスミドpBluescript SKのmulticloning siteに組み込んだHGF発現ペクターが得られており、マウスの受精卵にマイクロインジェクション出来る段階まで進んでいる。
細胞内mRNAの定量的分布解析と細胞へのmRNA導入技術の開発

我々は、ナノニードルを用いた低侵襲な細胞操作技術の開発を行っている。本研究では、モレキュラービーコンを修飾したナノニードルを用いた生細胞のmRNA検出技術を開発した。細胞内でmRNAとナノニードル表面のモレキュラービーコンのハイブリダイゼーションによって起こるFRET解消を共焦点レーザー顕微鏡によって検出した。これにより迅速かつ精度の高いGAPDHのmRNA検出が可能であることが示された。生きた細胞内におけるmRNA発現をネイティブな状態を維持しつつ観察する、あるいはmRNAを細胞に導入する技術を開発する。細胞内は、様々な生体分子、小器官が密集し、混在した空間であり、試験管内とは全く違った分子の挙動が観察される場である。このような細胞内という特殊な環境において、その細胞の状態を最も端的に表現する分子種であるmRNAを検出する手法を開発する。mRNAは微小管に沿って運搬され、細胞内の適正な位置に局在して翻訳されるなどの報告もあるが、1個の細胞内でmRNAがどのような挙動をしているかについては不明な点も多い。本研究では、細胞に対して非常に侵襲性が小さく、その挿入によって転写阻害をしない直径200nmのナノ針を用いて、細胞内のmRNAを定量的に評価する手法を確立することを目的としている。モレキュラービーコン修飾ナノ針を用いて細胞内のGAPDH、βアクチンのmRNAの検出を試み、細胞内でのモレキュラービーコンへのmRNAの結合について解析を行う。また細胞外へmRNAを抽出していないかどうか、転写阻害剤を用いた試験等によって調査を行う。mRNAの導入では、化学修飾によりカチオンを導入したナノ針を用いて静電的な相互作用による吸着で導入を検討する。本研究の目的はナノ針を用いた単一細胞内からのmRNA抽出技術の開発である。poly(A)を標的としてpoly T鎖修飾ナノ針を細胞内に挿入し、一定時間保持した後に抜去し、SYBRGreenを用いてmRNA回収量を評価する方法を考案した。まず、mRNAとpoly T鎖の二本鎖形成に必要な時間の検討を溶液中で行った。細胎内の組成を模擬したバッファーを用いてpoly-T鎖溶液とSYBRGreen溶液を調製し、混合した後、mRNAを添加し、共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)を用いて蛍光強度の経時変化を観察した。mRNA添加6分後から蛍光強度が上昇し、10分以内に一定となった。探針をSPMとAPMを用いて洗浄し、APTESでシラン化反応を行い、Sulfo-NHS-LC-LC-Biotinを架橋剤としてストレプトアビジンを固定化した。その後、50merのビオチン化poly-T鎖を修飾した。この探針をmRNA溶液に37°Cで10分間反応させた。その結果、針表面積当たりのmRNA回収量は約3000分子/μm^2と見積もられた。また、poly-T鎖修飾ナノ針の細胞への挿入確率を調査した結果、無修飾ナノ針で83%、ストレプトアビジン修飾ナノ針で83%、poly-T鎖修飾ナノ針で75%であった。poly-T鎖修飾されたナノ針表面は細胞と接触する表面積が増大し、挿入時の力学的抵抗の増加が起こるため、挿入確率が低下したと考えられる。挿入後のナノ針をSYBRGreenによって染色し、CLSMで蛍光観察した結果、明瞭な蛍光が観察され、mRNA目収が可能であることが示唆された。平成20年度は、モレキュラービーコン固定化ナノ針の挿入によって生細胞内のmRNAの検出を行うことを検討した。mRNAがナノ針表面のモレキュラービーコンにハイブリダイスすれば、モレキュラービーコンのFRETが解消され、ナノ針表面で蛍光強度の上昇が観察される。Hela細胞にモレキュラービーコン固定化ナノ針を挿入することによって、GAPDH、βアクチンのmRNAの検出を検討した結果、ナノ針表面において共焦点レーザー走査顕微鏡の観察から、蛍光強度の上昇を確認することが出来、mRNAが検出可能であることが示された。設計したモレキュラービーコンのmRNA認識配列は、ヒトとマウスの間で、GAPDHで3塩基、βアクチンで2塩基の違いがある。これらモレキュラービーコン固定化ナノ針は、マウス細胞に挿入しても蛍光強度の上昇が観察されず、応答しないことから、僅か23塩基の差を識別出来ることが示唆された。また、GAPDH検出モレキュラービーコンでは、細胞に針を抜き差しすることによって、ナノ針表面の蛍光強度の上昇と低下が繰り返し起こることが示された。すなわち、細胞から抜去されたモレキュラービーコンはmRNAをリリースし、再び、分子内でステム形成を行い蛍光分子が消光していることを示している。また、ナノ針表面では10,000100,000分子程度しか固定化出来ないにもかかわらず、非常に迅速なmRNAの結合がナノ針表面という局所的な空間で起こっている。

細胞内は、様々な生体分子、小器官が密集し、混在した空間であり、試験管内とは全く違った分子の挙動が観察される場である。このような細胞内という特殊な環境において、その細胞の状態を最も端的に表現する分子種であるmRNAを検出する手法を開発する。mRNAは微小管に沿って運搬され、細胞内の適正な位置に局在して翻訳されるなどの報告もあるが、1個の細胞内でmRNAがどのような挙動をしているかについては不明な点も多い。本研究では、細胞に対して非常に侵襲性が小さく、その挿入によって転写阻害をしない直径200nmのナノ針を用いて、細胞内のmRNAを定量的に評価する手法を確立することを目的としている。挿入されたナノ針表面のモレキュラービーコンにmRNAがハイブリダイズすれば、モレキュラービーコンのFRETが解消され、ナノ針表面で蛍光強度の上昇が観察される。ヒトのGAPDHで設計されたモレキュラービーコンのmRNA認識配列は、ヒトとマウスの間で3塩基の違いがあるために、ヒト細胞であるHeLaでは蛍光強度の上昇が見られるが、マウス小芽細胞であるC3H10T1/2では見られなかった。また、細胞内で上昇した蛍光強度は、針を細胞外へ抜き去り、培地中で測定すると減少し、複数の細胞で連続的に測定することが出来た。モレキュラービーコン修飾ナノ針の引き抜き動作によって、細胞外へmRNAを抽出していないことを示唆する結果が得られている。このことは、モレキュラービーコンという分子ツールを利用して細胞外から内へmRNAを導入する手法は機械的に不可能であることを同時に示唆している。我々は、シリコンAFM探針を集束イオンビームで加工し先鋭化した探針(ナノニードル)を用いて、低侵襲に細胞への物質導入、または細胞内の物質を検出する技術の開発を行っている。昨年度までにおいて、ナノニードルを用いた生細胞内のmRNA検出を試み、アミノシラン修飾を介してモレキュラービーコンを固定化したナノニードルを用いて生細胞内においてmRNAの検出が可能であることを報告した。しかしながら、この検出系においてS/N比が低い問題があった。より高いS/N比での生細胞内mRNAの検出を実現するために、自己組織化単分子膜(SAM)を介してモレキュラービーコンを固定化した金コートナノニードルの利用を検討した。単結晶シリコンからなるナノニードルにクロム、及び金を順に蒸着し、金コートナノニードルを作製した。ビオチン修飾アルカンチオールを用いて金表面にビオチンが提示されたSAMを形成後、表面にストレプトアビジン、次いでビオチン修飾モレキュラービーコンを固定化することで、モレキュラービーコン固定化金コートナノニードルを作製した。モレキュラービーコンはHuman GAPDH mRNAを認識するものを使用した。AFMを用いてモレキュラービーコン固定化金コートナノニードルを培養2日目のHeLa細胞に挿入し、共焦点レーザー走査型顕微鏡による金コートナノニードルの蛍光観察を行った。得られた蛍光像の蛍光強度を算出した結果、挿入前と比較して約9倍の蛍光強度の増大が観察された。