hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腫瘍におけるインスリン様成長因子の役割の解明と受容体活性の測定法の確立

腫瘍におけるインスリン様成長因子(insulin-like growth factor; IGF)の役割の解明として、分化型腫瘍である甲状腺乳頭癌組織における1型IGF受容体(IGFIR)タンパクおよび核酸発現について検討した。対象は手術時に得られたヒト甲状腺組織である。IGFIRタンパク量は非腫瘍部に比し、乳頭癌では1.42.5倍に増加しており、血中成長ホルモン(GH)およびIGF-1値が高値である先端巨大症に合併した甲状腺の癌および良性腫瘍でも同程度のIGFIRタンパクを有していた。ただし先端巨大症症例からの甲状腺組織では、非腫瘍部ではIGF1R発現量は低下していた。またmRNA発現量は、全ての症例で非腫瘍部に比し腫瘍部で1.34.5倍と検体間差を認めた。次にIGF1Rの機能解析として、外因性IGF-I刺激に対するIGFIRリン酸化能をin vitroで検討したところ、非腫瘍部および腫瘍部ともに無刺激の状態の1.31.8倍のリン酸化を認めた。これに対して先端巨大症に合併した良性腫瘍ではIGF-1刺激によりIGFIRは3.8倍に増加した。さらにラット株化甲状腺細胞を用いて、外因性IGF-I添加によるIGF1RmRNA発現の変化を検討したところ1nM1000nM IGF-Iは用量依存性、時間依存性にIGF1R量を減少させた。以上のことから甲状腺乳頭癌の腫瘍発生・発育にIGF1Rの発現増加が関与している可能性が示唆された。また慢性的に高レベルのIGF-Iにさらされた先端巨大症における甲状腺組織ではIGF1Rはnegative regulationを受けていたが、in vitroの結果もこれを裏付けるものであった。先端巨大症の腫瘍部におけるIGF1Rの増強と良性腫瘍におけるIGF1Rの機能亢進は、甲状腺分化癌および良性腫瘍の発生機序へのIGF/IGF1Rシステムの関与を示唆した。またIGF-Iの生理作用および生物活性を解析する系として、IGF1Rの活性化を定量分析する方法の確立を試みた。IGF-I刺激に対する初期応答遺伝子のひとつであるc-fosの発現を検討するため、c-fosプロモーター部位をレポーターであるルシフェラーゼcDNAの上流に組み込んだDNA constructを作成し、ヒトIGF1Rを過剰発現させたマウス線維芽細胞株に遺伝子導入させた。この細胞をクローニングし、IGF-1用量依存性にルシフェラーゼ活性が上昇することを確認した。今後はこの系を用いて、低血糖を呈するIGF-II産生膵外腫瘍(non-islet cell tumor hypoglycemia; NICTH)をはじめとして、IGFの作用異常が考えられる病態の解明を行う予定である。腫瘍におけるインスリン様成長因子(insulin-like growth factor ; IGF)の役割の解明として、分化型腫瘍である甲状腺乳頭癌組織におけるタイプ1IGF受容体(IGF1R)の発現について検討した。手術時に得られた腫瘍部と非腫瘍部の組織からタンパクを抽出した。IGF1Rタンパクの定量とin vitroでのIGF-I添加刺激によるIGF1Rのチロシンリン酸化を解析した。また組織からmRNAを抽出しcDNAを作成後、real-time PCRにてIGF1Rを定量した。血中成長ホルモン(GH)およびIGF-Iが高値である先端巨大症に合併した甲状腺乳頭癌および良性の腺腫様甲状腺腫についても検討した。IGF1Rタンパク量は非腫瘍部に比し、乳頭癌では1.42.5倍に増加しており、先端巨大症の癌および良性腫瘍でも同程度のIGF1Rを有していた。外因性IGF-I刺激に対するIGF1Rリン酸化は、非腫瘍部および腫瘍部ともに無刺激の状態の1.31.8倍であった。これに対して先端巨大症に合併した良性腫瘍ではIGF-I刺激によりIGF1Rは3.8倍に増加した。またreal-time PCRによるRNA発現量の解析では、非腫瘍部に比し腫瘍部では1.34.5倍と検体間差を認めた。以上のことから高分化癌である甲状腺乳頭癌の腫瘍発生・発育にIGF1Rの発現増加が関与している可能性が示唆された。また慢性的に高レベルのIGF-Iにさらされた末端肥大症に合併した良性腫瘍ではIGF1Rの機能亢進が認められ、IGF-IおよびIGF1Rの甲状腺腫瘍の発生への関与が示唆された。現在IGF-Iによる甲状腺細胞のIGF1R発現の調節について検討中である。この細胞をクローニングし、IGF-I用量依存性にルシフェラーゼ活性が上昇することを確認した。今後はこの系を用いて、低血糖を呈するIGF-II産生膵外腫瘍(non-islet cell tumor hypoglycemia ; NICTH)をはじめとして、IGFの作用異常が考えられる病態の解明を行う予定である。IGFIR

タンパク量は非腫瘍部に比し、乳頭癌では1.42.5倍に増加しており、血中成長ホルモン(GH)およびIGF-1値が高値である先端巨大症に合併した甲状腺の癌および良性腫瘍でも同程度のIGFIRタンパクを有していた。ただし先端巨大症症例からの甲状腺組織では、非腫瘍部ではIGF1R発現量は低下していた。またmRNA発現量は、全ての症例で非腫瘍部に比し腫瘍部で1.34.5倍と検体間差を認めた。次にIGF1Rの機能解析として、外因性IGF-I刺激に対するIGFIRリン酸化能をin vitroで検討したところ、非腫瘍部および腫瘍部ともに無刺激の状態の1.31.8倍のリン酸化を認めた。これに対して先端巨大症に合併した良性腫瘍ではIGF-1刺激によりIGFIRは3.8倍に増加した。さらにラット株化甲状腺細胞を用いて、外因性IGF-I添加によるIGF1RmRNA発現の変化を検討したところ1nM1000nM IGF-Iは用量依存性、時間依存性にIGF1R量を減少させた。以上のことから甲状腺乳頭癌の腫瘍発生・発育にIGF1Rの発現増加が関与している可能性が示唆された。また慢性的に高レベルのIGF-Iにさらされた先端巨大症における甲状腺組織ではIGF1Rはnegative regulationを受けていたが、in vitroの結果もこれを裏付けるものであった。先端巨大症の腫瘍部におけるIGF1Rの増強と良性腫瘍におけるIGF1Rの機能亢進は、甲状腺分化癌および良性腫瘍の発生機序へのIGF/IGF1Rシステムの関与を示唆した。またIGF-Iの生理作用および生物活性を解析する系として、IGF1Rの活性化を定量分析する方法の確立を試みた。IGF-I刺激に対する初期応答遺伝子のひとつであるc-fosの発現を検討するため、c-fosプロモーター部位をレポーターであるルシフェラーゼcDNAの上流に組み込んだDNA constructを作成し、ヒトIGF1Rを過剰発現させたマウス線維芽細胞株に遺伝子導入させた。この細胞をクローニングし、IGF-1用量依存性にルシフェラーゼ活性が上昇することを確認した。今後はこの系を用いて、低血糖を呈するIGF-II産生膵外腫瘍(non-islet cell tumor hypoglycemia; NICTH)をはじめとして、IGFの作用異常が考えられる病態の解明を行う予定である。
大脳基底核・視床における虚血性脳障害後の神経再生誘導

脳の一過性虚血後には、海馬、線条体、第3脳室近傍にて神経幹細胞の増殖応答が得られ、成長因子投与によってさらに増殖能は更新する。しかし、部位による成長因子応答性は異なることが判明した。線条体においては、成長因子投与によって20%近くの神経再生を得ることが可能であり、電気生理学的、個体機能としても改善が認められた。一方、Notchの発現もこれらの神経前駆細胞で更新し、亜急性期にその情報伝達系を遮断することで神経への分化を促進させることが可能であった。内在性神経幹細胞を用いた様々な神経再生修飾療法の今後の発展への知見を得ることができた。本研究は、霊長類における実験計画を変更して行ったものである。平成18年度の研究により、霊長類(カニクイザル)の海馬虚血モデル作成として血管内手術によるバルーン閉塞モデルの限界が判明した。そこで、本年度は開胸による胸部直接閉塞モデルを用いて、海馬CAl領域の神経細胞死のモデル確立と、認知機能および神経再生の効果を検証した。胸部血管閉塞モデルとして、低血圧下に虚血時間を8分から20分まで延長して至適虚血時間を探った。8分では十分な海馬神経細胞死が得られず、虚血時間を20分まで順次延長したが、12分以降の長時間虚血では心停止を来す頻度が高く、全身的影響を排除する必要が生じた。そこで、文献的にニホンザルで用いられている正常血圧下での20分虚血を試みたが、海馬CAl領域の神経細胞死を誘導できなかった。一方、記憶力課題としての食物回収試験では、一部で成績の悪化が認められたが、海馬の神経細胞損傷とは一定の関係を見いだすことができなかった。未治療状態ではあるが、BrdUを投与して神経再生の評価を行ったが、自然経過の中で再生神経細胞を確認することはできなかった。このような、虚血侵襲時における全身状態、海馬神経細胞死の不安定性の原因としては、今回の実験で用いたいカニクイザルの特性、また年齢や性、体重を一定化できなかったこと等が考えられる。画期的方法論が考案されるまで、霊長類実験は凍結する方針とした。一方齧歯類を用いた再生実験では、線条体において再生神経細胞を確認すると同時に、これらの神経細胞の電気生理学的成熟過程を、単一神経細胞のレベルで確認することができた。また、線条体特異的神経細胞への分化、再生現象が非常に長期にわたる現象であることなどを解明することができた。今後は、神経細胞の分化過程の修飾が如何に長期にわたる神経再生に影響を及ぼすか否か等を検討する予定である。線条体における脳虚血後の内在性神経幹細胞からの神経再生は,成長因子の虚血後投与(3日間)によって15%の再生が得られること,またそれらの再生神経細胞は前脳室下帯に存在する神経前駆細胞に由来すること,昨年までに示した。本年度は,それらの再生細胞が線条体固有の神経表現型を示すか否かを検討したところ,免疫組織化学的にはDARRP-32陽性の投射神経細胞に多くが分化していることが確認された。さらにChAT,NPY,PARV等の介在神経細胞にも分化していることも判明し,すべての線条体固有の神経細胞への分化が示された。これらは,虚血後6-12週の間でも安定的に存在し,長期的神経再生の効果が示された。電気生理学的にも膜特性の成熟過程が示されていたが,これらは形態学的成熟より遅れ,20週以降に神経シナプス結合を形成し,成体神経細胞と同等の膜特性を獲得することも判明した。これらは,線条体での神経再生が長期的にも有効であることを示唆している。本年度は,さらに神経前駆細胞からの増殖,分化過程へのNotch情報伝達系の影響について検討した。海馬の神経再生モデルで検討したところ,Notch受容体刺激では成長因子投与を上回る増殖能の亢進は得られなかった。しかし,亜急性期のNotch受容体阻害にて神経幹細胞から神経細胞への分化促進効果が認められ,内在性神経再生療法への応用が可能であることを示すことができた。前年度から継続している霊長類全脳虚血モデルでは,様々な努力を続けたが虚血時間と神経細胞死との相関関係が得られず,定量的モデルを開発することができなかった。これは供給された個体間の体重,年齢の統一が得られなかったこと等が問題点であると考えられたが,当面は本実験系を凍結する最終判断を行った。線条体における脳虚血後の神経再生については、昨年度報告した通り、成長因子の投与によって、15%の形態学神経再生が得られ、電気生理学的にも成熟神経細胞の特徴を捉えることが可能であった。本年度は、Notch受容体刺激、および阻害剤が神経再生に及ぼす影響についてさらに検討を加えた。

その結果、虚血後3-5日では、神経前駆細胞が増殖段階にはいりNotch受容体を発現しているにもかかわらず、成長因子下にNotch受容体刺激剤(DLL4)を投与しても相加的増殖刺激作用は得られなかった。これは増殖因子によって増殖応答が最大限に達していた可能性を示唆する。一方、Notchの細胞内情報伝達因子であるNICDの活性化は亜急性期まで持続しており、これが神経前駆細胞の分化に影響を及ぼしている可能性が示唆された。そこで、この時期にNotch情報伝達阻害薬のガンマセクレターゼ阻害薬を投与して、NICDの活性を低下させたところ、1ヶ月後の神経再生の促進効果が得られた。Notch情報伝達系は、神経幹細胞、前駆細胞の増殖に促進的に作用していることが他からも報告されているが、一方では未分化状態の維持にも関与して分化を抑制していることが胎生期の研究などから報告されている。本研究では、Notch情報伝達系が成体脳における脳虚血後の再生過程において一定の役割を担っていることを示すことができた。特に、亜急性期の阻害薬の投与で神経分化への方向が促進されたことは、成体脳における神経再生療法を開発してゆく上で、Notch情報伝達系の操作が有用な治療手段の一つとして示唆されたと考えられた。
地熱関連岩石の比熱測定装置の開発と測定

地熱開発などと関連して、最近特に重要視されている岩石の熱物性のうち。最も測定例の少ない、高温下での比熱を、示差熱分析計で測定した。これと平行して、間接法で比熱を求めるため、高温下での岩石の熱伝導率と温度伝導率を測定した。熱伝導率と温度伝導率の測定は、細線加熱法によった。示差熱分析計による測定では、問題点として再現性があげられた。この解決法として、空容器、試料容器、標準試料容器の重量が一定範囲以内のものにつき限定して使用した。また、試料の粒度は小さいものほど安定した結果が得られるようであった。このような測定技術上の改善を試みたところ、昨年より安定したベ-スラインが得られるようになった。しかし、個々の測定による、測定誤差が10%以上で、再現性の面では完全なものとはならなかった。間接法に関しては、加熱線と岩石試料との接触に十分気を使い、岩石に溝を切り込んだところ、温度伝導率の測定で重要な、温度の対時間の立ち上がり部分が理論曲線にかなり一致した。熱伝導率に関しては、花崗岩、安山岩、砂岩、頁岩、石炭につき400ー600°Cの温度範囲で測定できた。比熱に関しては、常温での値しか求められなかったが、ほぼ妥当な値が求まった。しかし、前述のように直接法との比較はできなかった。地熱開発などと関連して、最近特に重要視されている岩石の熱物性のうち、最も測定例の少ない高温下での比熱を、示差熱分析計で測定した。これと平行して、間接法で比熱を求める準備として、高温下での熱伝導率の測定を行った。示差熱分析計による測定では、再現性が不十分であったのでその原因につき検討した。その結果、微少重量(約1mg)の測定に問題があり、空容器、試料容器、標準試料容器の重量の不揃いが原因であることが分かった。また、試料の粒度の不均一が測定値に大きく影響することも分かった。この点を改良しつつ、安定したベ-スラインを得るために最も適した容器の種類、昇温速度を求める実験を続行中である。熱伝導率に関しては、500°Cまでは測定出来ているが、それ以上の高温ではうまく測定出来ていない。使用している導線の耐熱性が無いためである。この点はすぐに解決できると考えている。温度伝導率に関しては熱線法の温度の立ち上がり部分から求めるようにしている。この温度の対時間変化が理論曲線から若干外れているので、その原因と対策を考慮中である。なお、測定に使用した岩石は花こう岩である。示差熱分析計による測定では、昨年の問題点として再現性があげられた。熱伝導率と温度伝導率は600°Cまで測定できている。これらの測定値から計算した比熱はほぼ妥当な値となったが、前述のように直接法との比較はできなかった。岩石試料は、昨年の花崗岩の他、さらに砂岩、石炭(400°Cまで)についても測定した。
視床痛の二次的脳形態変化を可視化する

難治性疼痛のなかでも最も激しいとされる視床痛について、その原因となる微細な脳形態変化と、客観的疼痛評価法を確立することを目的とした。知覚・痛覚定量分析装置を用いて、痛み度Pain Degree ; PDを算出し、疼痛の客観的評価法を確立することができた。視床痛に対する外科的治療法の一つである内包後脚(視床-感覚皮質の痛覚伝導路)脳深部刺激療法の手術前後において、PDおよび、従来の主観のみに頼った疼痛評価法であるvisual analog scale(VAS)の推移を追跡したところ、治療介入後、短期的(6ヶ月以内)には両者は並行して推移(改善)するが、長期的(36ヶ月までの追跡)にはPDが改善状態を維持するのに対し、VASは増悪方向に修飾・変容されやすく、両者が乖離していく傾向にあった。現在、ボクセル-ベイストモルフォメトリーvoxel-based morphometry(VBM)による微細な脳形態変化について明らかにすべく、その基礎となる視床痛患者の画像データを蓄積しつつある。視床痛は、脳卒中後遺症のひとつであり、患者の生活の質を著しく低下させる難治性疼痛であるが、形態上の変化はこれまでの技術では見出すことができなかった。この研究は、ボクセル-ベイストモルフォメトリーvoxel-based morphometry(VBM)という画像解析技術によって、視床痛における微細な脳形態の変化を見出すことを目的としている。この研究の対象患者は、熊本大学医学部附属病院あるいは関連施設を受診した脳卒中患者のうち、「視床出血gradela」に分類された患者で、発症より3ヶ月以上経過している症例である。このうち視床痛を続発した患者(視床痛群)と、視床痛のない患者(非視床痛群)の2群に分け、3.0テスラMRI scannerを用いて、3-dimensinal magnetization prepared rapid gradient echo(MRRAGE)sequencesによるT1強調ボリューム・データを取得し、両群間の微細脳形態の差異をVBMにより解析する予定であった。しかし、平成21年度において上記に該当する新規視床出血患者は1例のみであり、また視床痛を新規に発症した患者もなかった。今後、症例の蓄積が課題であるが、平成21年度は研究のための備品の整備および痛み度測定の技術が確立できたと考えている。痛み対応電流値と電流知覚閾値を測定し、痛み度を算出する装置を準備した。難治性疼痛に対し機能外科治療(脳深部刺激)を過去に施行している患者約10例に対し、日常診療においてPain Visionを用いて痛み度を測定しており、主観のみに頼ったvisual analogue scale(VAS)に比べ客観性が高いことが判明した。これは、定量化された客観的疼痛強度と二次的形態変化の関係、視床痛の性状と形態変化の関係について分析する上で必須の技術である。MPRAGEのみでなく、拡散テンソール画像、またPETやSPECTなどの複数画像データを融合し、形態変化と白質線維連絡・脳代謝・脳血流との関係など、より精細な解析を行うためのソフトウェアを購入した。この研究は、ボクセルーベイストモルフォメトリーvoxel-based morphometry(VBM)という画像解析技術によって、視床痛における微細な脳形態の変化を見出すことを目的としている。この研究の対象患者は、熊本大学医学部附属病院あるいは関運施設を受診した脳卒中患者のうち、「視床出血grade Ia」に分類された患者で、発症より3ヶ月以上経過している症例である。このうち視床痛を続発した患者(視床痛群)と、視床痛のない患者(非視床痛群)の2群に分け、3.0テスラMRI scannerを用いて、3-dimensinal magnetization prepared rapid gradient echo(MPRAGE)sequencesによるT1強調ボリューム・データを取得し、両群間の微細脳形態の差異をVBMにより解析する予定であった。1)平成21年度において上記に該当する視床出血患者を見出すことが出来なかった。当初の予定より症例数が少ない現実があるが、平成22年度においては、上記墓準を満たす2例の新規視床痛患者を見出し、MBIのボリューム・データを取得することができた。今後さらに「視床出血grade Ia」を満たす(1)視床蒲症例と、

(2)対照群としての非視床痛症例を蓄積することが課題である。上記2例については、昨年確立した技術であるPain Visionによる痛み度を測定している。従来の主観によるvisual analogue scale(VAS)も同時に測定している。定量化された客観的疼痛強度と二次的形態変化の関係、視床痛の性状と形態変化の関係について分析する上で有用である。この研究は、ボクセル-ベイストモルフォメトリーvoxel-based morphometry(VBM)という画像解析技術によって、視床痛における微細な脳形態の変化を見出すことを目的としてた。この研究の対象患者は、熊本大学医学部附属病院あるいは関連施設を受診した脳卒中患者のうち、「視床出血gradeIa」に分類された患者で、発症より3ヶ月以上経過している症例である。このうち視床痛を続発した患者(視床痛群)と、視床痛のない患者(非視床痛群)の2群に分け、3.0テスラMRI scannerを用いて、3-dimensinal magnetization prepared rapid gradient echo (MPRAGE) sequehcesによるT1強調ボリューム・データを取得し、両群間の微細脳形態の差異をVBMにより解析する予定であった。1.当初の予定より対象患者が極めて少数である現実があった。平成22年度においては、上記基準を満たす1例の新規視床痛患者を見出し、MRIのボリューム・データを取得することができた。また視床出血ではないが、視床梗塞の症例1例も付け加えることにした。平成23年度においでは、症例数の蓄積はなかった。「視床出血gradeIa」を満たす(1)視床痛症例と、(2)対照群としての非視床痛症例を蓄積することが課題である。視床梗塞例も対象に加える予定である。従来の主観によるvisual analogue soale (VAS)も同時に測定している。平成23年度には、これまで視床痛に対して内包後脚刺激療法が行われていた5症例について、術前と術後36カ月までのVASおよびPDの経時的変化の記録に基づき、その特徴について検討した。治療介入後、短期的(6ヶ月以内)には両者は並行して推移(改善)するが、長期的(36ヶ月までの追跡)にはPDが改善状態を維持するのに対し、VASは増悪方向に修飾・変容されやすく、両者が乖離していく傾向にあることが判明した。
顎関節症患者の筋収縮抑制機能に関する研究

顎関節症患者では本来備わっている、筋収縮抑制機能が障害されることにより、筋緊張が高まり種々の症状が発症するのではないかとの推定に基づいて、顎関節症患者のExterroceptive suppression (ES)を測定した。咀嚼筋症状を主とする顎関節症患者10名と対照群として心身共に健常な5名を対象に測定を行った。測定法は被験者に持続的に一定以上の力で噛みしめを行わせながら、上下口唇部に付着させた皿電極で0.1Hz(10秒間隔)の頻度で刺激した。刺激は持続時間0.1ms、25mAの強さで行った。記録は咬筋より行い、整流後、10回加算し、平均値を求めた。筋収縮抑制量の算出は電気刺激に先行した随意収縮による筋電をバックグラウンドとしてES2の80%抑制の持続時間から行った。健常な対照群ではES2は平均44.5msecであるのに対し、顎関節症群では値のばらつきがやや多いが平均26.8msecと明らかな低下を示すことが判った。健常者群は値にばらつきが少なく、顎関節症群ではばらつきが多いことから、顎関節症群の中に筋収縮抑制が障害されているものと障害されていないものが含まれている可能性が考えられ、今後、筋収縮抑制障害と顎関節症の発症の関連を詳細に検討する必要性が示唆された。
３細胞結合領域の細胞間隙バリアの分子機構と生理的意義の解明

1. MDCKII細胞からアンギュリン1をゲノム編集により欠失させ、内在性のアンギュリンファミリーを欠いた細胞(アンギュリンKO細胞。樹立済み)の細胞の凍結割断レプリカを電子顕微鏡観察したところ、トリセルラーコンタクトにおいて本来は接着している2本のタイトジャンクションストランドが明らかに分離していると解釈できる像が得られた。さらに、細胞シートに水平に薄切した超薄切片の電子顕微鏡観察では、本来完全に閉塞して見えるトリセルラーコンタクト領域がアンギュリンKO細胞では明らかに開いて隙間が存在していた。ゲノム編集法により、トリセルリン欠失MDCK細胞を樹立した。2.イヌ腎臓cDNAからイヌアンギュリン2cDNASをクローニングした。一方、アンギュリン3cDNAはまだ取得できていない。3.アンギュリン1(LSR)腸管上皮特異的欠失マウス(cKOマウス)の小腸の表現型として、小腸が雄で1.4倍、雌で1.2倍、有意に長くなっていることが確認された(23ー29週齢, n=3)。Ussingチャンバーを用いた電気生理学的測定では、小腸の特に上部で、経上皮電気コンダクタンスの低下が観察され、3H-Mannitolや14C-PEG4000の傍細胞透過はcKOマウスとコントロールで変化がないか、cKOマウスの方が低下していた(連携研究者との共同研究)。4. CRISPR/Cas9システムにより、アンギュリン3の遺伝子欠失マウスの作製に着手した。マウスゲノムに変異が導入できたことを確認しており、継続して系統の樹立を行っている。アンギュリン欠失上皮細胞株の電子顕微鏡レベルでの形態学的異常が観察できている。腸管上皮特異的アンギュリン1欠失マウスの腸管の電気生理学的解析から上皮輸送の異常の可能性を示唆するデータが得られている。また、アンギュリン3KOマウスの作出が予定通り進んでいる。以上の理由から、研究計画はおおむね順調に進展していると判断する。アンギュリン欠失上皮細胞株の表現型をさらに詳細に解析する。具体的には、アンギュリン欠失とトリセルリン欠失を比較し、さらには二重欠失の効果も検討して、アンギュリン欠失上皮細胞に見られる表現型がトリセルリンに依存するか否かを解明する。腸管特異的アンギュリン1欠失マウスについては、形態学的変化を更に例数をあげてデータを取得するとともに、前年度までに示唆された上皮輸送の以上のメカニズムの解析を共同研究により進める。アンギュリン3欠失マウスについては系統の樹立を進め、アンギュリン3欠失の確認および脳のバリアの解析を開始する。また、アンギュリンが3細胞結合部位に濃縮する仕組みは本研究とも関連が深いため、本研究に組み込んで論文化に向けて研究を推進する。アンギュリン3欠失マウスについては系統の樹立を進め、アンギュリン

3欠失の確認および脳のバリアの解析を開始する。また、アンギュリンが3細胞結合部位に濃縮する仕組みは本研究とも関連が深いため、本研究に組み込んで論文化に向けて研究を推進する。
FMT-PETによる線条体機能の解析

Parkinson病(PD)における芳香族アミノ酸脱炭酸酵素(AADC)活性の病態と,AADC遺伝子を搭載したアデノ随伴ウイルスベクターを被殻に注入した遺伝子治療の効果を,AADCトレーサーの6-[18F]fluoro-L-m-tyrosine (FMT)を使用したpositron emission tomography (PET)により解析した.PDでは初期から被殻背外側部のFMT集積が低下し,発症3年以降は被殻全域で低下していた.尾状核と側坐核の集積は比較的保たれていた.すくみ足重症度は青斑核FMT集積の低下と相関していた.遺伝子治療後から被殻のFMT集積が増加し5年後にも持続していた.パーキンソン病(PD)におけるすくみ足は,固縮・寡動・振戦などの運動症状とは独立した障害と考えられている.ノルアドレナリン神経系の関与も示唆されている.すくみ足と青斑核の関連を芳香族アミノ酸脱炭酸酵素(AADC)に対するリガンド6-[18F]fluoro-m-tyrosine (FMT)を使用した高解像度のpositronemission tomography (PET)計測により検討した.対象は特発性のPD患者で,運動症状はUPDRSのPart3により,すくみ足はFreezing of gait questionnaire (FOGQ)により評価した.FMTを静注後,PET-CT装置で撮影しvolume-of-interestを尾状核,被殻,青斑核,側坐核に設定した.各部位と小脳とのFMT集積比を計算し, FOGQとの関連を検討した.PD患者の青斑核のFMT集積は罹病年数と共に低下した.UPDRS運動スコアと青斑核FMT集積は逆相関を認めたが,被殻FMT集積でより強い相関を認めた.FOGQと青斑核FMT集積も逆相関を認めたが,被殻FMT集積と比べより強い負の相関が認められた.FMT-PETを使用したin vivo解析により, PDにおけるすくみ足の発現は,ノルアドレナリン機能を反映すると考えられる,青斑核AADC活性の低下と関連があることを明らかにした.また,PD患者において遂行機能障害や視覚認知機能障害をはじめとした認知機能障害が効率に合併することが知られており、尾状核機能との関連が推測されている.ハノイの塔などの神経心理検査及びPET解析を継続している.高解像度positron emission tomography (PET)とアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターによる遺伝子導入技術を応用して,ヒトにおける大脳基底核の機能を明らかにする目的で研究を行った.ドパミンの生合成に働く芳香族アミノ酸脱炭酸酵素aromatic L-amino acid decarboxylase (AADC)の脳内活性の大部分は,黒質緻密部ドパミン神経細胞から線条体に投射する軸索終末に存在する.また,青斑核ノルアドレナリン神経のノルアドレナリン,縫線核セロトニン神経のセロトニンの生合成にもAADCが必須である.AADCのトレーサーとして6-[18F]fluoro-L-m-tyrosine (FMT)を使用して, Parkinson病(PD)患者の脳内各部位のPET計測を実施した.遺伝子治療では,両側被殻にAADC遺伝子を発現するAAVベクターを注入し,治療前と遺伝子導入5年後までのFMT集積を経時的に評価した.運動症状はUnified Parkinson Disease Rating Scale (MDS-UPDRS)のPart IIIにより評価し歩行障害は, Freezing of gait questionnaire (FOGQ)で評価した.その結果, PDでは初期から被殻背外側部の集積低下が認められ,発症3年以降は被殻全域で低下していた.尾状核・側坐核の集積は被殻に比べ保たれていた.すくみ足の重症度は青斑核のFMT集積の低下と相関していた.遺伝子治療では,治療後から注入部位に一致して被殻のFMT集積が増加し5年後にも持続していた.被殻への遺伝子導入のみで運動症状に改善しており,運動の遂行においては被殻の役割が大きいと考えられる。Parkinson病(PD)における芳香族アミノ酸脱炭酸酵素(AADC)活性の病態と,AADC遺伝子を搭載したアデノ随伴ウイルスベクターを被殻に注入した遺伝子治療の効果を,AADCトレーサーの6-[18F]fluoro-L-m-tyrosine (FMT)を使用したpositron emission tomography (PET)により解析した.PDでは初期から被殻背外側部のFMT集積が低下し,発症3年以降は被殻全域で低下していた.尾状核と側坐核の集積は比較的保たれていた.すくみ足重症度は青斑核FMT集積の低下と相関していた.遺伝子治療後から被殻のFMT集積が増加し5年後にも持続していた.脳内のノルアドレナリン神経の起始核である青斑核の機能とPDにおけるすくみ足との関連について評価と検討を行い,学会発表を行うことができた。現在論文投稿に向けて準備している。解析については現在継続しており引き続き,尾状核と側坐核機能と認知機能との関連を検討を行ってゆく.医歯薬学PDにおける認知機能障害,衝動行動,歩行障害,睡眠障害などの周辺症状は,尾状核,側坐核を含む腹側線条体,脳幹の青斑核・縫線核との関連が推察されているが、これらの脳部位のドパミン機能の評価を引き続きPET解析ソフトであるPMODを用いて行ってゆく.神経心理検査を追加しより詳細にデータの収集と解析を行っている.費用面の負担が少ない検査であり次年度以降にFMT-PETの施行患者数や必要薬剤・PET解析費用が掛かる見込みである.前年度に続いてFMT-PET計測と神経心理学的評価を継続し、非運動症状と線条体各部位の関連を解析する。
神経細胞におけるERK5の新しい生理的意義の解明

本研究では、未分化神経細胞のモデル細胞であるPC12細胞の分化時のERK5の関与を解明することを目的とした。ERK5シグナルを抑制すると、NGFによるPC12細胞の分化が有意に抑制され、神経伝達物質合成酵素のチロシンヒドロキシラーゼの発現レベルが大幅に低下することが明らかになった。さらに、分化誘導時に発現される遺伝子群を調べたところ、ERK5選択的な遺伝子が57個同定された。ERK5は様々な遺伝子発現を引き起こし、神経細胞の分化を誘導していると示唆された。われわれは神経細胞におけるERK5の生理的な意義について検討を加えてきた。まず、神経細胞のモデル細胞のPC12細胞をNGFおよびジブチリルcAMPで刺激すると、両薬物によりERK1/2は持続的に活性化されたが、ERK5はNGFのみによって活性化された。PC12細胞の神経細胞への分化に関するERK5の関与を検討したところ、NGFによるPC12細胞の分化はERK5選択的阻害薬のBIX02188により顕著に抑制された。さらに、ERK5のキナーゼ活性を消失させた変異体やERK5活性化因子のMEK5のドミナントネガティブ体によっても、NGFによるPC12細胞の分化は有意に抑制されたが、ジブチリルcAMPによる分化に対しては全く影響を与えなかった。つまり、NGFはERK5を活性化させることにより、PC12細胞の形態的な分化を誘導していることが示唆された。一方、NGFによるERK5活性化機構を低分子量G蛋白質のRasやRap1の関与に焦点をあてて検討した。まず、Rasのドミナントネガティブ体をアデノウイルスを用いてPC12細胞に過剰発現させたところ、NGFやEGFによるERK1/2の活性化が顕著に抑制された一方、両薬物によるERK5の活性化は全く影響されなかった。また、恒常的に活性化しているRas変異体を過剰発現させたところ、ERK1/2の活性化が引き起こされたがERK5は全く活性化されなかった。また、Rap1を不活性化するRapGAPを細胞に過剰発現させても、NGFやEGFによるERK5の活性化は阻害されなかった。以上より、NGFによるERK5の活性化には低分子量G蛋白質のRasとRap1は関与しないことが明らかとなった(この低分子量G蛋白質に関した研究は、オレゴンヘルスサイエンス大学ボーラム研究所のPhilip Stork博士との共同研究によって行われた)。われわれは神経系細胞におけるERK5の生理的な意義について検討を加えてきた。まず、神経細胞のモデル細胞のPC12細胞をNGFで刺激しERK5あるいはERK1/2依存的に発現が誘導される遺伝子群をマイクロアレイ法で網羅的に調べた。その結果、NGF4時間刺激により482個の遺伝子の発現レベルが3倍以上促進された。さらにU0126でERK1/2シグナルを抑制すると、482個中360個の遺伝子(75%)の発現レベルが50%以上抑制された。また、BIX2189でERK5シグナルを抑制すると、482個中336個の遺伝子(70%)の発現が50%以上抑制された。ERK1/2非依存的かつERK5依存的に発現が誘導される遺伝子は57個(12%)だった。そこでわれわれはERK5選択的に誘導される遺伝子の一つ(gene X)に注目し研究を進めた。NGFは刺激後1時間をピークにgene Xの遺伝子発現を時間依存的かっ濃度依存的に誘導した。またsiRNA法によりERK5発現をノックダウンさせたところ、NGFによるgene Xの発現が抑制されることを確認した。さらにgene Xの遺伝子発現をsiRNA法でノックダウンしたところ、NGFによる神経突起伸展作用が部分的に抑制され、チロシンヒドロキシラーゼタンパク質やニューロフィラメントタンパク質の発現レベルも低下することが明らかになった。つまり、NGFはERK5を介してgene Xの発現を誘導し、神経細胞の分化を誘導しているものと思われる。
超高圧反応と固相有機反応の相関性の解明

高圧反応と固相有機反応の相関性の解明を目的として研究を行い,以下のような成果を得た。1.エポキシ化合物と種々の含窒素複素環化合物との反応をシリカゲル吸着の固相反応,及び高圧反応で達成した。2.1.の成果を天然物diolmycinA2のエナンチオ選択的合成に応用した。3.シルカゲル吸着による固想反応の展開として,ハロゲン化リチウム存在下でのエポキシドの対応するハロヒドリン誘導体への変換を達成した。4.1.の成果の応用として,キラルジアゾール系配位子合成を行った。ジエチル亜鉛の不斉アルキル化の際の有効な配位子となることを証明した。5.2.の成果に関連して,天然物合成に有効なアジド基の新規官能基変換の手法を開発した。
配偶者と死別した高齢男性の成長感に影響を与える要因

配偶者と死別した高齢男性の死別経験による成長感に影響を与える要因を明らかにするため、60歳以上の在宅高齢男性55名に訪問調査を実施した。対象者の属性と現在の状況、配偶者との死別前後の状況および死別経験による成長感(死別経験による成長感尺度:15項目5件法)の分析を行った。死別後の落ち込みや生活上の困難の有無および死別直後のサポートの受領有無は死別経験による成長感に影響と関連しておらず、現在の交友関係や外出頻度等が影響を与えていた。<研究の目的>1.配偶者と死別した高齢男性の死別経験による成長感の測定とそれに影響を与える要因の分析2.代表者が高齢女性を対象に行った先行研究の結果との比較3.地域看護における具体的な支援プログラムの開発のための基礎データを得ること。<19年度実施成果>本研究は、抽出が困難であったり、調査への協力が得られにくいとされている対象への研究調査のため、調査実施前準備として、倫理的配慮を含めた具体的な調査方法について、調査協力場所として同意が得られたA市高齢福祉担当者、同市内居宅支援事業所ケアマネージャとの検討を重ねた。質問紙についても同様とし、内容等を含めた検討を再度行った。また、支援プログラム開発のための基礎データを得るため、同意が得られた23名に対して、死別前後から現在までの心理的な変化やソーシャルサポートの受領についてのインタビュー調査を実施することとした。1.調査対象:配偶者と死別した60歳以上の在宅高齢男性100名程度2.調査方法および調査内容:A市の高齢福祉担当者、同市内の居宅介護支援事業所のケアマネージャー数十名の協力を得て、対象者の抽出を行い、説明後の同意に基づき、研究代表者が訪問調査を実施する。質問紙は、研究代表者による高齢女性への先行研究の質問紙をもとに検討を加え、作成した。調査内容は、対象者の属性と現在の状況、配偶者との死別前後の状況および死別経験による成長感(死別経験による成長感尺度:15項目5件法)である。3.倫理的配慮について:調査関係者間で倫理的な問題に配慮した調査方法を実施することとし、共通認識の上で調査が実施できるよう検討を重ねた。<目的>1)配偶者と死別した高齢男性の死別経験による成長感の測定とそれに影響を与える要因の分析、2)代表者が高齢女性を対象に行った先行研究の結果との比較、3)地域看護における具体的な支援プログラムの開発のための基礎データを得ること。<対象と方法>対象は配偶者と死別した60歳以上の在宅高齢男性で、同意が得られた55名に対して研究代表者が訪問調査を実施した。質問紙は、研究代表者による高齢女性への先行研究の質問紙をもとに検討を加え作成した。55名を分析対象とし、Mann-Whitney検定およびKruskal Wallis検定を行った。<結果>1)平均年齢は79.2歳(SD7.5)、55名中独居者33名、死別経過期間は平均9.8年(SD9.6)であった。死別経過期間と成長感尺度得点のSpearmanの相関係数は0.417で相関がみられた(p=0.002)。2)4人以上友人を持つ群は成長感が有意に高かった(p=0.012)。3)家庭内での自分の役割を「家事」と答えた者はそうでない者より成長感が有意に高かった(p=0.038)。4)独居者は楽しみのための外出頻度が多い者ほど成長感が高かった(p=0.028)。5)主観的健康状態・経済状態、現在および死別直後の情緒的・手段的サポートの受領有無、死別後の気分の落ち込みおよび生活上の困難の有無等と成長感との関連はいずれも見られなかった。6)配偶者と死別した高齢女性では、死別直後の落ち込みがあり、それに対する情緒的なサポートの受領が成長感につながっていたが、高齢男性では、死別直後の状況よりも現在の状況(交友関係や外出頻度等)が影響を与えていた。
正標数の環に値をとる指標に関する自己共役代数の研究

研究代表者は正標数の環Aで、そのあるエデアルIの加法群のAに値をとる指標がIと同型になるようなものを構成した。具体的には、有限体上代数閉包を含むような完備付値体Kを一つ取り、有限次元K-vector space Vを考える。Vのsymmetric algebraのgradeddual Aとその次数正の元からなるイデアルIはdivided power algebraの構造を持つ。A,Iの作用素ノルムによる完備化をそれぞれA,Iとすると、divided power algebraの構造はIにまで延びる。このときIのAに値を取る指標群はI自身と同型である。今後本研究で構成された環上の調和解析の研究、さらに、Drinfeld型保型形式への応用などの研究を進めて行きたい。
神経芽腫におけるミッドカインとMYCNの機能解析、及びブタ神経芽腫モデルの作成

1.個体レベルにおいて、神経芽腫誘導に対するMKの関与の検討前年度にMK^<-/->マウスにおいて、MYCNヘミ接合体マウスの神経芽腫発症率が低下する傾向を見い出した。今年度は更に個体数を増やした結果、有意な差を持って発症率が低下し、更には増殖速度も低下していることが明らかとなった。このことは、MKが神経芽腫の発生と進展の両方に関与している可能性を強く示唆している。また、神経芽腫が発生する時期と考えられる2週齢のMYCNヘミ接合体マウスから、原発組織である上腸間膜神経節を摘出する手技を確立した。その上腸間膜神経節からRNAを抽出して各遺伝子の発現を検討したところ、MKとその受容体群は、MYCNヘミ接合体マウスの上腸間膜神経節において発現が誘導されていることがわかった。上腸間膜神経節の一部分に局在するがん細胞がそれらを発現しているものと考えられる。2.分子レベルでのMYCNとMKの発現の検討培養細胞にMYCNを発現させると、MKプロモーターを組み込んだレポーターの発現がわずかではあるが誘導され、神経芽腫細胞株IMR-32を用いたクロマチン免疫沈降アッセイではMKのプロモーター領域にN-mycタンパク質が結合していることが明らかとなった。つまり転写因子であるMYCNがMidkineの発現を直接誘導している可能性が強く示唆される。3.神経芽腫のモデルとしてのMYCN Tgブタの作成農業生物資源研究所において、引き続き核移植を行って頂いている。一方、核移植に用いるクローンによってTgの表現型(がんが発生するかどうか)が異なる可能性が高いので、更に異なる数クローンを樹立した。1.個体レベルにおいて、神経芽腫誘導に対するMKの関与の検討MKノックアウトかつMYCNヘミ接合体マウスの表現型を検討したところ、まずMK^<+/+>マウスは10週齢過ぎで大部分が神経芽腫を発症し、20週齢時に生存していたのは20%足らずであった。一方MK^<+/->マウスは発症が3週ほど遅れ、最終的な生存率もMK^<+/+>マウスより2倍程度高かった。MK^<-/->のマウスについては評価数が少ないため結論を得るには至っていない。しかしここまでの結果から、MYCNによる神経芽腫の発症と進行にMKが関わっている可能性が強く示唆される。一方、MYCN Tgマウスで腫瘍が発生・増大する過程におけるMKの発現を調べたところ、MKは初期から末期に至る腫瘍で強く発現しており、MK受容体やMK標的遺伝子の発現も伴っていた。腫瘍化前の腹腔神経節においても既にMKが発現していたことを考え合わせると、やはりMKが神経芽腫の発生と進行の両方に関与している可能性が高く、これは先のマウスの表現型とよく一致している。2.分子レベルでのMYCNとMKの関係の検討両者のヒエラルキーを検討する為に神経芽腫細胞株を用いたリポーターアッセイを行ったが、トランスフェクション効率が悪い、元々MKのプロモーターがある程度活性化している細胞株が多いといった問題点から、明確な結論を得る事はできなかった。現在は、神経芽腫由来でない一般的な細胞株を試している。3.神経芽腫のモデルとしてのMYCN Tgブタの作成TH-MYCN遺伝子が組み込まれたブタ胎児由来の繊維芽細胞クローンを複数単離し、MYCN mRNAの発現と導入されたコピー数を確認した後、共同研究者である農業生物資源研究所の大西彰先生のもとで核移植を行った。まだ結果は出ていないが子供が生まれてこないこともあり得るため、引き続き別の繊維芽細胞クローンの作製を試みている。
短周期電場・磁場変調下の複合フェルミ粒子およびストライプ相の振る舞いの研究

周期100nm程度の短周期1次元変調を加えた2次元電子系、すなわち1次元平面超格子の低温・磁場中での振る舞いを、主として磁気抵抗の測定により実験的に調べた。2次元電子系基板の表面側にのせた電子ビームレジストの格子によりポテンシャル変調を導入し、背面側の金属ゲートで電子濃度を自在に制御できる試料を開発した。この試料を用い、その存在が理論的に予言されているストライプ相(電荷密度波状態)の、外部変調に対する応答を見ていると考えられる、高次ランダウ準位における異方的磁気抵抗を観測し、その磁場一電子濃度依存性を調べた。その結果、異方的抵抗は電子濃度に依らず、磁場一定に位置に現れることが判明した。ストライプ相の周期が磁気長により定まっていることを支持する結果である。また、電子濃度の増減に対する新たなヒステリシス現象を発見した。有効磁場0付近の複合フェルミ粒子と基本的に等価と考えて良い、0磁場付近の通常の電子の振る舞いを詳細に調べた。その結果、よく知られた正の磁気抵抗の起源は、主として散乱に阻まれ1周期完遂されない不完全サイクロトロン軌道によるドリフト速度であり、通説である「チャンネル軌道」の寄与は僅かであることが判明した。また、正の磁気抵抗が現れる低磁場領域で、新しい微細な磁気抵抗振動を発見した。振動位相の変調周期および電子濃度への依存性から、この振動は超格子からのブラック散乱による「開いた軌道」と変調周期との幾何学共鳴によるものであることが判明した。低磁場での電子の振る舞いに対応する、複合フェルミ粒子の振る舞いの観測は、今後の課題として残されたまた、測定に使用した平面超格子試料の基本的性質である、ポテンシャル変調振幅の電子濃度依存性を定量的に調べ、変調振幅への2次元電子系の有限の厚さの効果を明らかにした。2次元電子系基板の表面側に変調ポテンシャルを導入するための電子ビームリソグラフィー法による微細加工格子を、背面側に電子濃度を制御するための一様金属ゲートを取り付けた1次元平面超格子試料を作成し、低温・強磁場の量子ホール領域での抵抗の詳細な電子濃度-磁場依存性の測定を行った。その結果充填率が48の領域に於いて、僅かな電子濃度増による、量子ホール間遷移ピークの急激な増大、およびピークの分裂を見出した。また分裂したピークの谷間は熱活性型の温度依存を示し、また谷間の位置は電子濃度に依らず一定磁場の位置に現れることを見出した。さらに、電子濃度の増減に対するピークの特異なヒステリシス現象を発見した。これらは、理論的に存在が予言されているストライプ相(電荷密度波状態)の、外部変調への応答を見ているものと解釈できる。また、充填率1/2付近の複合フェルミ粒子の変調下での振る舞いを理解する上で不可欠な、ゼロ磁場付近での(電子の)磁気抵抗の振る舞いを、周期や変調振幅の異なる複数の平面超格子試料に対し種々の電子濃度で、詳細に定量的に調べた。その結果、現在まで信じられていたのとは異なり、低磁場での正の磁気抵抗に対するチャンネル軌道の寄与は小さく、主として、不完全なサイクロトロン軌道がその要因となっていることを明らかにした。また、磁気抵抗に現れる微細な構造をより正確に測定することが可能となるように、抵抗の磁場微分や、電子濃度微分を直接測定するための2重ロックイン測定法の最適条件の探索を行った。本研究の初年度にストライプ相を中心とする研究を行ったので、本年度は複合フェルミ粒子を主たるターゲットとする研究を試みた。充填率1/2付近の複合フェルミ粒子の軌道運動は、0磁場付近の電子の軌道運動にマッピングすることが可能である。

そこで、1次元周期的変調下の複合フェルミ粒子の振る舞いに対する理解への基礎として、平面超格子において、0磁場付近での電子の軌道運動がもたらす磁気抵抗を詳細に調べた。測定した磁気抵抗の数値微分を行う、あるいは、新たに開発したロックイン測定法により磁気抵抗の磁場微分を直接測定する、等の手法により、よく知られた正の磁気抵抗が現れる0.03テスラ程度以下の低磁場領域で、磁気抵抗に新しい微細な振動が重畳されていることを発見した。温度、電子濃度、および、平面超格子の変調周期への依存性を詳細に調べることにより、この新たな振動は、超格子によるブラッグ反射の結果生じる開いた軌道の幅と、変調周期との幾何学共鳴によりもたらされるものであることが明らかとなった。原理的には複合フェルミ粒子に対しても同様の振動は観測し得ると推定されるが、本研究内では観測することは出来なかった。このような、超格子のミニバンド構造に起因する現象の観測には、ミニギャップが散乱によるぼけで閉じてしまわないという要請により、不純物等による散乱効果が十分に小さいことが必要とされる。複合フェルミ粒子は電子と比較して散乱に対してはるかに敏感であることが、この新しい振動の観測を妨げている原因であると考えている。また本研究の実験的基礎となっている、2次元電子系に導入した変調の振幅が、電子濃度の増加により減少していることを見出し、それが2次元電子系の閉じ込め方向の厚みの変化で説明できることを明らかにした。
高角運動量基低関数の分子積分の漸化表式に基づく計算法

化学反応の量子化学的理論計算で必要になるd関数以上の高い角運動量関数を基低にした分子積分のうち多量の計算時間を要する電子反発積分とその原子座標に関する1次の微分の計算について漸化表式に基づく効率良い計算方法の開発とプログラム化のための作業を行なった。電子反発積分とその微分の計算に必要な誤差関数(不完全ガンマ関数)を区分求積法で求値する時に必要な分点とその重みをチェビシェフ補間法により最大16次の多項式にフィッティングしてこれをプログラム化した。作成した分点の最大数は13であり、軌道量子数の総和が25(例えばi関数の電子反発積分の1次微分)までの分子積分を計算できる。また、これで求値した誤差関数が相対誤差10^<-14>以下になることを確認した。通常の計算では充分な精度である。テーラー展開法と区分求積法のいずれの計算法においても垂直漸化関係式と水平漸化関係式の両者を使用したが、テーラー展開法による計算の方が求値すべき項数が区分求積法の約半分になった。前者の方が効率良い計算に適している。ただし、後者の方法でも重複する計算をまとめる等の修正を施せば前者との差を小さくすることができる。1次微分の計算では分子積分の大きさと密度行列要素の大きさの両者を考慮することにより時間を従来の半分に節約することができた。行列要素の大きさを同一シェル内の最大値により保存したので判定に多くの計算時間を要せず、また、計算精度が期待しているもの以上に減少することも防げた。豊富な基低関数系ほど小さな値の行列要素の数が多いので、このような場合ほど大きく計算時間を節減できることが期待できる。