hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肝再生ならびに肝疾患時におけるビトロネクチンの糖鎖構造変化と組織修復の調節

肝再生時に産生されるビトロネクチン(VN)の糖鎖構造変化に伴う分子の高次構造変化が、細胞接着伸展活性や細胞周囲での局所的溶解反応に及ぼす影響を明らかにした。非手術(NO)、シャム手術(SH)、または部分肝切除手術から24時間後(PH)のラット血漿からVNを精製した。VNのGlu-C消化糖ペプチドをLC/MS^n解析した結果、VNと同様に肝臓で主に産生されるフィブロネクチンには見られない混成型糖鎖を含む部位特異的なN-型糖鎖付加と、タンデムなオリゴシアル酸構造を持つO-型糖鎖の存在を見出した。このオリゴシアル酸糖鎖がPH-VNで著しく減少することにより、分子の等電点が大きく塩基性シフトすることを見出した。これらのVN糖鎖変化か細胞接着に及ぼす影響を探るため、肝炎症時に活性化して細胞外マトリックスを産生する肝星細胞(RSC)を用いて細胞接着伸展活性測定とシグナル伝達活性測定を行った。その結果、NO-,SH-VNを基質とする場合と比較してPH-VN上での伸展が50%減少し、細胞内のFocal adhesion kinaseのチロシンリン酸化レベルが約60%に低下することを見出した。またノイラミニダーゼ処理VN上でも同様にRSC伸展が激減したことから、VN糖鎖中のシアル酸がRSCのインテグリン仲介性接着伸展に寄与することが示された。またVNと1型プラスミノゲン活性化因子阻害因子(PAI-1)の共存下におけるウロキナーゼ(uPA)有効活性はPH-VNで増加したが、さらに部分肝切除手術72時間後の血漿中のプラスミン活性はRSC存在下で著しく増強されることを見出した。これはRSC表面に存在するuPA受容体へのVNの結合活性の増強により、局所的な溶解反応が促進されるためと考えられた。VNの糖鎖変化による組織修復の調節機構を解明することは、正常な修復または線維化進展の制御に繋がると考えられる。肝再生時に産生されるビトロネクチン(VN)ならびにフィブロネクチン(FN)の糖鎖構造を質量分析法により詳細に決定し、正常時からの糖鎖変化を量的変動を含め解明した。さらに糖鎖変化に伴う分子の高次構造変化がリガンド結合に与える影響を定量的に解析した。VNには複合型と混成型のN-型糖鎖が部位特異的に付加していることが明らかになった。O-型糖鎖にはシアリル化コア1構造のほか、比較的大型の高度にシアリル化された糖鎖が含まれ、この糖鎖は直列のタンデムなオリゴシアル酸構造を持つことが示された。この高シアリル化O-型糖鎖はPH-VNで著減しており、この変化がPH-VNのシアル酸含量の減少と、それに伴う多量体形成能ならびにコラーゲン結合活性の増強(Sano K. et al, Glycobiology 17:784-94(2007))に大きく寄与すると考えられた。一方FNでは大部分がジシアロ二本鎖複合型であり、VNと同様にPH-FNでフコシル化の増加が見られたが、VNで見出されたハイブリッド型や直列のオリゴシアル酸糖鎖は確認されなかった(Sano K. et al, Carbohydr. Res. in press)。これらの結果から、肝再生における各々の分子の機能の差と関連し、それぞれの糖鎖変化が再生修復を制御することが考えられた。一方、肝再生時に産生されるVNの糖鎖の組織溶解への寄与を調べる為、SPR法により、重要な組織溶解系因子であるPAI-1、uPAとの結合の定量的解析を行った。VNのPAI-1の結合活性はSHおよびPHで減少し、特にPH-VNで著しく減少した。一方uPA結合活性はNO-VNと比較してSH-およびPH-VNで増大しており、VN,PAI-1,uPAの共存下におけるuPAの有効活性とプラスミン産生の増大と一致した。これらの結果はVNの糖鎖によって組織溶解反応を制御しうる可能性を示唆し、正常な組織修復の促進または肝硬変などの異常な線維化組織の積極的治療へ応用できる可能性を示している。

またノイラミニダーゼ処理VN上でも同様にRSC伸展が激減したことから、VN糖鎖中のシアル酸がRSCのインテグリン仲介性接着伸展に寄与することが示された。またVNと1型プラスミノゲン活性化因子阻害因子(PAI-1)の共存下におけるウロキナーゼ(uPA)有効活性はPH-VNで増加したが、さらに部分肝切除手術72時間後の血漿中のプラスミン活性はRSC存在下で著しく増強されることを見出した。これはRSC表面に存在するuPA受容体へのVNの結合活性の増強により、局所的な溶解反応が促進されるためと考えられた。VNの糖鎖変化による組織修復の調節機構を解明することは、正常な修復または線維化進展の制御に繋がると考えられる。
楽器におけるわざ学の伝承とグローバリゼーション

楽器というモノに込められたわざ学、すなわち意匠と具体的変容の過程に着目してさまざまな角度から観察・分析することによって、今まさに音楽に生じつつある西洋対非西洋および伝統文化と現代化のせめぎあいと伝播と変容の具体的諸現象を確認し、可能な限り資料化し公開した。主な研究成果としては、(1)日本の大正琴とその異形たるアジアの楽器群に関する研究、(2)インドのリードオルガンとその異形に関する研究、(3)ヨーロッパの楽器学と楽器制作の現状に関する研究、(4)19世紀末のインド楽器をめぐる東西交流史に関する研究があげられる。本研究は、演奏する人の特性に応じた多様な音楽表現の実現のために、楽器にこめられた有形・無形のさまざまなものつくりの技(わざ)をグローバルな視野から研究および資料化することを目指している。今年度行った具体的な研究活動および得られた成果は次のようなものである。1.MLを開設し緊密な情報交換を行う一方、5月(東京藝術大学)および12月(京都教育大学)の2度、研究会議を開催した。梅田英春、尾高暁子、塚原康子、横井雅子らが出席し情報交換および今後の調査方針や対象などについての検討を行ったほか、(1)「電子楽器開発からみえるもの」(田中健次)、(2)「楽器学の現在-The Galpin Societyの活動を中心に」(筒井はる香)などの研究助言を得た。2.8月下旬、インドで楽器製作関係者・楽器博物館などの調査を行い、伝統楽器や外来楽器の製作の現状などを明らかにした(田中多佳子・塚原康子)。3.9月、東京国立博物館にて特別観覧により19世紀末インド人学者から日本に寄贈された楽器の所在を確認(同)、塚原がこの件に関する論考を近く発表する予定。4.12月、インドネシア調査(梅田英春・田中)。日本からバリ島に伝わった数種類の大正琴についての実態の一部を初めてつかむとともに、復元演奏を撮影した。5.12月、愛知県の大正琴工場において詳細な製作過程の撮影を行った(金子敦子、田中)。撮影データを公開に向けて編集作業中。6.12月1月、20世紀初頭に台湾で発行された新聞から楽器関連データの抽出作業を行った(尾高暁子)。7.その後、各調査者が収集したデータをもとに研究を継続すると同時に、公開に向けての編集作業を進めている。沖花彰・田中多佳子を中心に、データのデータベース化、Webページ作成の検討をしているものの、まだ、内容的にいくつかの未解決の問題があり年度内の公開開始には至らなかった。本研究の目的は、演奏する人の特性に応じた多様な音楽表現の実現のために、楽器にこめられた有形・無形のさまざまなものつくりの技(わざ)をグローバルな視野から研究および資料化することである。1.関連する研究者間でMLにより緊密な情報交換を行いつつ、各自で調査・研究を進めた。2.国内では、6月に埼玉県で楽器職人からのインタヴュー調査(田中(多))、10月に沖縄県で伝統楽器製作現場の調査(田中(多))、11月に埼玉県でオルガン研究者へのインタヴュー調査(田中(多)、横井)、11月翌1月、国立国会図書館での台湾新聞調査(尾高)などを行った。3.国外では、7月にブルガリア、ルーマニアでの民俗音楽に関する調査(田中(多))、8月下旬9月初旬にイギリス、ドイツ、ベルギーでの楽器博物館等の調査(田中(多)、横井)、インドネシアのバリ島での大正琴に関する調査(梅田)、翌3月に台湾での現地調査(尾高、田中(多))などを行った。4. 12月には東京芸術大学にて研究会を開催、田中(多)、梅田、金子、塚原、横井、筒井、岡田恵美(東京芸術大学大学院生)らが参加し、研究報告や情報交換、今後の研究の方向性についての検討を行った。5.沖花・田中(多)を中心に、調査によって収集された諸データのデータベース化、映像資料作成、Webページ作成・開設の具体的作業を進め、次年度初頭に公開開始の見込みとなった。楽器にこめられた有形・無形のさまざまなものつくりの技(わざ)をグローバルな視野から研究および資料化することをめざした本研究の最終年次にあたり、今年度行った具体的な研究活動および成果は次のようなものである。1. 5月には、東京芸術大学にて第1回研究会を開催、田中(多)、梅田、金子、田中(健)、塚原、横井、筒井、岡田らが参加し、各自の研究報告やそれをめぐる議論と情報交換を行い、新たな課題の確認と本研究収斂の方向について検討した。

2. 12月には、名古屋芸術大学音楽学部にて開催された日本音楽学会中部支部例会にて「楽器の伝播とグローカリゼーション-大正琴の場合」と題したシンポジウムを開催し、司会兼パネリストとして金子が、パネリストとして尾高・田中(多)・梅田が、オブザーバーとして岡田・筒井が参加し、本研究による研究成果の一部を公開すると共に、そこから浮かび上がってきた事実や課題について公開の場で討議し、多くの示唆を得た。3. 12月には、沖花・田中(多)を中心に作成してきたWebページをアップした。本研究によって得られた成果(映像・図像資料を含む)は、可能な限り書誌データのみならず資料そのものを公開するよう努めた。本科研終了後も関連研究のデータは随時追加してゆく予定である。4. 2011年2月には、東京芸術大学にて第2回研究会を開催、田中(多)、梅田、金子、塚原、筒井が参加し、本研究の成果の総括と今後の研究の発展性について議論した。本研究のメンバーによる3年間の研究の諸成果は、ユーラシア大陸東西の鍵盤付楽器に関わるグローバリゼーションの諸相をめぐる研究として収斂されてきたようである。着眼点および地域的広がりにおいて他に例を見ないこのテーマは、今後も継続的に研究してゆくべき多くの課題と可能性を示唆するものである。
都市舗装面における蒸発冷却効果を利用した保水性バッシブクーニング・レンガの開発

本研究は塩化物の含浸により高性能の吸放湿性を有する室内調湿建材を製作する手法を街路舗装材料としてのレンガに適用することで、放射環境を含めて高温化しつつある都市内街路空間のパッシブ的な熱環境制御手法を提案することを目的としている。昨年度は、試験体を屋外気象条件下に暴露して経日的重量測定を行ったが、顕著な含浸の有効性を確認出来なかったので、本年度は実験手順を再考して新たに実験を行い、有意な結果を得た。基盤材料として用いたレンガは既製品の赤レンガと保水性レンガとして紹介されているセラミックレンガの2種、含浸薬剤としては塩化マグネシウム(MgCl_2・6H_2O),塩化カルシウム(CaCl_2・2H_2O),塩化ナトリウム(NaCl)を用いた。基本的には、含浸後、恒温恒湿槽内で温度,湿度ステップ変位に対する重量変化単位応答を測定する吸放湿実験を試験体の屋外暴露を挟んで前後2度行い、レンガへの塩化物含浸の耐候性を観ようと云う意図である。実験の結果、無含浸に比較して塩化物を含浸させた試験体は吸放湿水分量が格段に多くなっているのが確認された。含浸薬剤についてみると、塩化ナトリウムを含浸させた場合は、何れの実験条件においても、著しく大きな時間遅れが観察された。保水性レンガの性能指標として、単位体積当たりの単位絶対湿度変化に対する吸放湿量κ^1[kg/m^3(g/kg)]及び単位体積当たりの単位温度変化に対する吸放湿量ν^1[kg/m^3°C]による評価を試みたところ、プロットのばらつきは大きいが概ね含浸量とκ^1,ν^1は正の相関を示した。ただし、以前行った基盤材料がケイ酸カルシウム板である室内収蔵空間への適用を前提とした高性能調湿建材の場合に比較すると、その性能向上の程度は劣る傾向にあった。これは基盤材料であるレンガの空隙率がケイ酸カルシウム板に比較して小さいことに起因するものである。塩化物の含浸により高性能の吸放温性を有する室内調湿建材を製作する手法を街路舗装材料としてレンガに適用することで、放射環境を含めて高温化しつつある都市内街路空間のパッシブ的な熱環境調整手法を開発することがねらい。含浸薬剤としては塩化カルシウム,塩化マグネシウム,塩化ナトリウム、基盤材料としては赤レンガ,保水性セラミックレンガを取り上げ、恒温恒湿槽内で絶対湿度,温度ステップ変化に対する重量変化の単位応答を測定したところ、無含浸の試験体に比して格段の高含水性能が確認された。屋外での使用が前提であるので、屋外暴露の後も同様の性能を有し得るのか否かを検討することが次年度の課題である。
マルチプルサルファタ-ゼ欠損症(Msb)の病因に関する研究

マルチプルサルファタ-ゼ欠損症は、少くとも7種以上のサルファタ-ゼが欠損しておりその発症機序に関しては不明である。本研究では、アリルサルファタ-ゼA、B、C酵素のcーDNAを用いてマルチサンプルサルファタ-ゼ欠損症の病因の本態を明らかにすることを目的としている。即ちアリルサルファタ-ゼA,B,Cは構造的に極めて共通している遺伝子配列を示す。この遺伝子配列の内、特にアリルサルファタ-ゼA,B,Cの活性の調節を営み部分を明らかにする。その前段階として我々は、マルチプルサルファタ-ゼ欠損症以前に、異染性脳白質変性症の遺伝子解析の研究を特に日本人の異染性脳白質変性症について行った。日本人のGaucher病では、アルリサルファタ-ゼAのExn6の内Leucine→prolinの新しいmutationを見出した。このMutationはheteroalleleでありhomozygoteではない。我々はマルチプルサルファタ-ゼ欠損症の病因を明らかにする為に共通のアリルスルファタ-ゼA,B,Cのpromotionの部分を見出してこの病因の解明を行い、今後の研究課題として行う予定ある。特に最近明らかにされたことはアリルサルファタ-ゼA,B,C遺伝子の構造の相互間に高い構造上のhomologyがあることが本症の病因の解明と強い相関があることが示唆された。マルチプルサルファタ-ゼ欠損症(以下MSD)と略す)はアリルサルファタ-ゼA,B,Cの酵素欠損の他にムコ多糖サルファタ-ゼの欠損がみられる。本疾患の多酵素欠損の病因を明らかにする為にアリルサルアファタ-ゼAを精製しその抗体を作成し患者培養皮膚線維芽細胞に^<35>P-ATPを加えライソゾ-ム酵素をリン酸化する。この^<35>Pでラベルされたアリルサルファタ-ゼAを抗体で沈殿させ電気泳動でImmunoblotLこれをオ-トラジオグラムにより検出しそのradioactivityの強度によりリン酸化されたアリルサルファタ-ゼAを定量した。MSD患者培養線維芽細胞ではリン酸化されたアリルサルファタ-ゼAの含量は低下しており対照の2030%程度であった。従って、アリルサルファタ-ゼAの活性低下はリン酸化障害により、酵素の安定化が失なわれ活性が消失したものと推定された。現在アリルサルファタ-ゼA以外にアリルサルファタ-ゼB,Cを精製し同様のリン酸化障害があるかどうか検討中である。マルチプルサルファタ-ゼ欠損症は少なくとも7種以上のサルファタ-ゼが欠損しておりその発症機序に関しては不明である。本研究では、アリルサルファタ-ゼABC酵素のCーDNAを用いてマルチプルサルファタ-ゼ欠損症の病因の本態を明らかにすることを目的としている。即ちアリルサルファタ-ゼABCは、構造的に極めて共通している遣伝子配列を示す。この遣伝子配列のうち特にアリルサファタ-ゼABCの活性の調節を部分を明らかにする。その前段階として我々はマルチプルサルファタ-ゼ欠損症以前に異染性脳白質変性症の遣伝子解析の研究を特に日本人の異染性脳白質変性症について行った。日本人のGavcher病ではアリルサルファタ-ゼAのExonbー6の内levcine→prolineの新らしいmutationを見出した。このMutationはheteroallelicでありhomozygotoではない。我々は、マルチプルサルファタ-ゼの原因を明らかにする為に共通の、アリルサルファタ-ゼABCのpromotionの部分を見出してこの病因の解明を行い今後の研究課題として行う予定である。特に最近明らかにされたことは、アリルサルファタ-ゼABC遣伝子の構造の相互間に高い構造上のhomologyがあることが本症の病因の解明を強い相関があることが示唆された。
次世代宇宙輸送機の信頼性向上のための誘導制御系設計

本研究の目的は,次世代宇宙輸送機の飛行ミッションの信頼性を向上させるための,新たな飛行制御系を設計し,その有効性を検証することである.特に,2008,2009年度の研究では,宇宙から地球へ帰還する際の大気圏突入時の宇宙輸送機の基準軌道の生成方法を確立し,変動の激しい機体の特性に対処可能な適応機構を有する飛行制御システムを開発した.提案する誘導制御システムの有効性を,汎用計算機のシミュレーションとオンボード計算機によって検証した.本研究の目的は,次世代宇宙輸送機の飛行ミッションの信頼性を向上させるための,新たな飛行制御系を設計し,その有効性を検証することである.特に,2008,2009年度の研究では,宇宙から地球へ帰還する際の大気圏突入時の宇宙輸送機の基準軌道の生成方法を確立し,変動の激しい機体の特性に対処可能な適応機構を有する飛行制御システムを開発した.提案する誘導制御システムの有効性を,汎用計算機のシミュレーションとオンボード計算機によって検証した.本研究は,次世代の宇宙輸送機の信頼性を向上させ,ミッション成功率を高めるための誘導制御系を設計することが目的である.本年度は,研究課題の中で「自律的な飛行経路生成技術」の課題に主に取り組み,飛行中に新たな軌道を生成させることのできるシステムの検討を行ってきた.オンラインで軌道生成を可能にするシステムは,近年注目を集めている「厳密な線形化法」を用いて,最適制御問題を定式化する方法で,申請者が独自に開発してきた.このシステムを基盤として, (1)飛行不可能な領域の回避,(2)機体に課せられる拘束条件の考慮,を可能にするシステムへの拡張を検討した.(1)に関して,この問題は,自動車の制御分野で特に研究が進められている.文献調査による事前検討の結果から,この課題に関して応用可能な手法としては,前方障害物警報システム,近距離障害物警報システムが挙げられる.前者は,障害物認識センサを用いて前方障害物との距離と相対速度を検出し,危険判断情報処理システムによって衝突するか否かの判断を行うシステムであり,後者は前者に較べて低速で車両が移動している際に近距離の障害物を検知するシステムであり,障害物の検出角度が大きくなる.前者のシステムを応用して飛行禁止領域やミッションの妨げとなる雷雲等の回避,後者を用いて低速での飛行となる着陸フェーズでの予期できぬ障害の回避の検討を今後行う.また(2)に関して,厳密な線形化法を適用する際に,本来制御するべき物理量から,近似のない線形化を行うために非線形変換が必要である.そのため,機体に課せられる拘束条件で, 1対1で対応させられる拘束条件を表す関数を決定できるか否かが,鍵となる.この問題に関しては,得られた軌道に対する追従制御システムによって,拘束条件の影響を考慮する手法も検討しており,拘束条件付適応バックステッピング法によって,この課題の解決を目指している.本課題では,次世代宇宙輸送機の宇宙輸送ミッションの,信頼性向上のための誘導制御系の設計を行った.特に,本年度は,宇宙輸送機の宇宙空間から地球に帰還する際の再突入フェーズに関して,厳密な線形化法を用いた適応飛行制御システムの設計を行った.厳密な線形化法は,近似を用いずに変数の非線形変換と非線形要素を取り除くフィードバックによって線形化を行う手法であり,システムの大域的な安定性を保証可能である.本課題で設計した適応飛行制御システムでは,機体に生じる空力係数を未知として取り扱うことができ,飛行環境に応じて自律的に制御システムが対処して飛行ミッションを遂行することが可能である.また,機体に課せられる熱拘束,動圧拘束,荷重倍数,平行滑空などの各種の拘束条件を満たす極めて幅の狭い「突入回廊」の近傍を通過し飛行可能領域を自律的に飛行することが可能となった.特に軌道生成では,これまでの研究と異なり,基準軌道を関数形式で得ることに成功しており,1サイクルの計算によって,どの地点からでも目的地点に向けて基準軌道を生成することが可能になり,障害物の回避問題への拡張が見込まれる.また,汎用計算機だけでなく,本申請の予算で購入したオンボード計算機(シングルボードACE1104CLP USB)によって,設計した制御システムのリアルタイムでの計算時間,実用に供するかどうかの妥当性及び有効性を検証した.これらの成果を,2009年第27回宇宙科学と技術に関する国際会議(International Symposium on Space Technology and Science)及び第53回宇宙科学技術連合講演会にて発表を行い,一定の評価を得ることができた.特に,宇宙科学技術連合講演会では,本研究の発表予定の原稿が評価され,主催者側からの要請を受けて,オーガナイズドセッション「大学から見た将来型宇宙輸送」で本課題の成果を発表した.
αシヌクレイン最早期病変同定に向けた試み

我々は凍結浮遊切片を用いた免疫組織染色にて、最早期から進行期までのレヴィ小体病における心筋内交感神経線維の可視化に初めて成功した。またαシヌクレイン凝集が交感神経脱落よりも先行して起こることを明らかにした。レヴィ小体病であるパーキンソン病やレヴィ小体型認知症では心臓交感神経が脱落し、生前にMIBG心筋シンチグラフィーでの取り込み低下として捉えることができる。そこで我々は全国から剖検例を集積し、MIBG取り込み率と残存軸索面積の間に密な相関があることを、世界に先駆けて定量的に証明した。これらの研究成果を通じて、MIBG心筋シンチグラフィーの臨床的有用性と、その病理学的基盤を確立した。我々はこれまでの研究で,αシヌクレインが神経軸索の遠位から起始し,より近位に進展しつ,最終的な細胞脱落に至るという病変形成過程を明らかにした.この変化は心臓交感神経で早期から顕著であり,臨床的にMIBG心筋シンチグラフィーの取り込み低下として捉えれば診断的価値が高く有用である.臨床現場でのMIBG心筋シンチグラフィーの普及につれ,今年度本研究においても生前に撮像された剖検例が蓄積されてきた.我々は既にヒト剖検例において心筋の凍結浮遊切片を用いて,これまで観察できなかった心筋内自律神経線維の可視化に成功している.現在この蓄積例について,疾病経過や神経学的所見,および神経放射線学的検査等の臨床情報の解析を行いつつ,軸索最末端に最早期病変が存在することを念頭に広い範囲での軸索病変を追跡している.中枢神経系とは異なり,心筋内自律神経線維はorientationが明瞭であるため,そこに焦点をあてる本研究を通してレヴィー小体病の病変形成過程を明確に捉えることが可能となると期待できる.また本年度の進展により脳病理,心臓交感神経病理,MIBG心筋シンチグラフィー所見との多数例の比較が可能になったことから,本解析を引き続き進展させることで,パーキンソン病を代表とする神経難病であるレヴィー小体病の原因の解明と,臨床診断の適正化,さらに将来のより早期からの疾病修飾薬による治療開始への基盤となる知見を得ることが期待できる.我々はこれまでの研究で,αシヌクレインが神経軸索の遠位から起始し,より近位に進展しつつ,最終的な細胞脱落に至るという病変形成過程を明らかにした.この変化は心臓交感神経で早期から顕著で,臨床的にMIBG心筋シンチグラフィーの取り込み低下として捉えれば診断的価値が高く有用である.臨床現場でのMIBG心筋シンチグラフィーの普及につれ,今年度の本研究においても生前に撮像された剖検例が蓄積されてきた.我々は既にヒト剖検例において心筋の凍結浮遊切片を用い,これまでパラフィン包埋薄切切片では観察できなかった心筋内自律神経線維の可視化に成功した.現在この蓄積例について,臨床経過や神経学的所見,神経放射線学的検査結果等の臨床情報の解析を行いつつ,軸索最末端に最早期病変が存在することを念頭に広い範囲の軸索病変を追跡している.中枢神経系とは異なり,心筋内自律神経線維はorientationが明瞭である.そこに焦点をあてる本研究を通じ,早期病変の進行を病変の広がりとして把握すれば,病態を反映した適正な特異的早期診断と,将来のより早期からの疾病修飾薬による治療開始への基盤となる知見を得ることが期待できる.我々はこれまでの研究で,αシヌクレインが神経軸索の遠位から起始し,より近位に進展しつつ,最終的な細胞脱落に至るという病変形成過程を明らかにしてきた.この変化はとくに心臓交感神経において早期から顕著で,臨床的にMIBG心筋シンチグラフィーの取り込み低下として捉えれば診断的価値が高く有用である.臨床現場でのMIBG心筋シンチグラフィーの普及につれ,今年度の本研究においても引き続き,生前に撮像された剖検例が蓄積されてきた.我々は既にヒト剖検例において心筋の凍結浮遊切片を用い,これまでパラフィン包埋薄切切片では観察できなかった心筋内自律神経線維の可視化に成功している.現在これまでの蓄積例について,臨床経過や神経学的所見,神経放射線学的検査結果などの臨床情報の解析を引き続き行いつつ,軸索最末端に最早期病変が存在することを念頭に広い範囲の軸索病変を追跡している.中枢神経系とは異なり,心筋内自律神経線維はorientationが明瞭である.そこに焦点をあてる本研究を通じて,早期病変の進行を病変の広がりとして把握することで,病態を反映した適切な特異的早期診断と,将来のより早期からの疾病修飾薬による治療開始への基盤となる知見を得ることが期待できる.生前の臨床経過と,心臓交感神経および脳病理のいずれも解析可能な剖検例を,現在まで50例程度まで蓄積することができた.各例について心筋のより厚い凍結浮遊切片を作成し免疫染色したうえ,バーチャルスライドシステムを使用して広範囲を定量的に解析する手法も確立することができている.MIBG心筋シンチグラフィーの結果と心臓交感神経の脱落の程度とが定量的相関をもつことを世界で初めて明らかにし,論文発表した.(J Neurol Neurosurg Psychiatry, 2015;86:939-44)ただしαシヌクレインの軸索最末端の病変の可視化はまだ達成できておらず,その克服が現在の課題である.

我々はこれまでの研究で、αシヌクレインが神経軸索の遠位から起始し、近位へ向かって進展しつつ、最終的な細胞脱落に至るという病変形成過程を明らかにしてきた。この変化は特に心臓交感神経において早期から顕著で、臨床的にMIBG心筋シンチグラフィーの取り込み低下として捉えれば診断的価値が高く有用で、パーキンソン病やレヴィー小体型認知症の国際臨床診断基準に採用されている。臨床現場でのMIBG心筋シンチグラフィーの普及につれ、生前にMIBG心筋シンチグラフィーが撮像された剖検例が蓄積されてきた。これらの剖検例で、もし軸索最遠位の病変をとらえられれば、それこそがαシヌクレイン沈着の最早期病変と想定される。本研究ではこれまでに以下の実績を得た。実績1:心筋内交感神経軸索最末端の検索:心筋内αシヌクレインやneurofilamentの局在を高感度に網羅するために、厚切りパラフィン切片全体をvirtual slideでとりこみ検討した。Neurofilament陽性の軸索を一部追跡できたが、αシヌクレイン陽性構造は乏しい。実績2:高齢カニクイザル心臓の軸索病変の検討:ヒト心臓交感神経軸索がαシヌクレイン沈着の好発部位であるとすれば、高齢サルの心臓でも同様の変化が期待される。そこで死亡時30歳代までのカニクイザルの心臓を入手し、αシヌクレイン、neurofilament免疫染色、より感度の高いCampbell-Switzer染色で封入体の有無を検索した。αシヌクレイン陽性構造を認めない例でも一部にCampbell-Switzer陽性像を認めた。実績3:進行性核上性麻痺例で、心筋のMIBGとりこみが低下した4例で、心臓交感神経は保たれ、Lewy病理が見当たらない4例を見いだした。軸索最末端の軸索病変か、機能的変化によりMIBG取り込み低下が起こりえる場合があることを初めて明らかにした。我々は凍結浮遊切片を用いた免疫組織染色にて、最早期から進行期までのレヴィ小体病における心筋内交感神経線維の可視化に初めて成功した。またαシヌクレイン凝集が交感神経脱落よりも先行して起こることを明らかにした。レヴィ小体病であるパーキンソン病やレヴィ小体型認知症では心臓交感神経が脱落し、生前にMIBG心筋シンチグラフィーでの取り込み低下として捉えることができる。そこで我々は全国から剖検例を集積し、MIBG取り込み率と残存軸索面積の間に密な相関があることを、世界に先駆けて定量的に証明した。これらの研究成果を通じて、MIBG心筋シンチグラフィーの臨床的有用性と、その病理学的基盤を確立した。生前の臨床経過と,心臓交感神経および脳病理のいずれも解析可能な剖検例を,現在まで20例を蓄積することができた.各例について心筋のより厚い凍結浮遊切片を作成し免疫染色したうえ,バーチャルスライドシステムを使用して広範囲を定量的に解析する手法を確立することができた.MIBG心筋シンチグラフィーの結果と心臓交感神経脱落の程度が相関することを世界に先駆けて示し,本年度の日本神経学会学術総会での最優秀ポスター賞として表彰され,Jornal of Neurology, Neurosurgery, Psychiatry誌上にアクセプトされた.さらに同一部位を光顕像および電顕像とで解析することが可能となる新たな免疫電顕の手法を開発し,Acta Neuropathologica Communicationsに発表した.
譲渡制限株式の売買価格の決定の在り方に関する法的研究

本年度(平成30年度)は、米国における州会社法上の株式価値評価に関する裁判例および学説の議論状況を分析する作業を行った上で、わが国における譲渡制限株式の売買価格の決定に係る規範的価値評価のあり方について検討を加えた。より具体的に、伝統的に重視されてきたのは、株主間の公正な利害調整という観点であったが、本研究では、それを敷衍し、事前の観点を重視した上で、株主間の利害対立を調整するという観点からの検討を行った。本研究が特に重視したのは、株主のインセンティブの歪みを生じさせないという観点である。事後に裁判所が決定する売買価格(株式評価方法)は、当事者の事前のインセンティブに影響を与える。通常、譲渡等承認請求を行うのは少数株主であり、会社が当該譲渡を承認しない場合は、当該少数株主の保有株式については、支配株主(もしくはその関係者)を指定買取人にして、その指定買取人による買取りが行われるか、または、会社による買取りが行われることになるであろう。その場合、仮に裁判所が決定する売買価格が低すぎると、支配株主は低い価格で株式を取得できるようになるため、少数株主を抑圧して、少数株主が譲渡等承認請求をして保有株式を売却するよう仕向けるという行動をとる危険が小さくない。逆に、裁判所が決定する売買価格が高すぎると、少数株主は不必要に譲渡等承認請求をして保有株式の買取りを求めてくる危険がある。そのため、裁判所が通常の株式取引の場合と同じように譲渡制限株式の売買価格を決定すること(取引価格をもって売買価格とすること)で、こうした株主のインセンティブの歪みが生じないかどうかが問題とされるべきであろう。このような観点から、望ましい株式価値評価のあり方について具体的に検討を加えた上で、その研究成果の一部を論文として公表した。昨年度(平成29年度)の研究の遅れも取り戻し、当初の研究計画どおりに研究を進めることができているうえに、研究成果を論文として公表することもできたためである。来年度も本年度の研究を継続するとともに,さらに、「株式価値評価が問題となる場面ごとに株式価値評価の在り方が変わるとみるべきかどうか」という問題の検討も行う。本研究の目的は,最新のファイナンス理論や比較的考察をも踏まえながら,1株式評価が問題となる一場面である,裁判所による譲渡制限株式の売買価格の決定の場面を取り上げ,マイノリティディスカウントや非流動性ディスカウントの当否を中心に再検討を加えたうえで,2かかる再検討の成果を踏まえ,「株式価値評価が問題となる様々な場面ごとに株式評価の在り方が変わるとみるべきかどうか」という場面横断的な問題を解明する契機を得ることにある。こうした目的を達成するため,研究初年度である平成29年度では,以下の3つの作業を行った。第1に,株式価値評価に関するファイナンス理論について文献を精査するとともに,法的分析に関係する部分とそうでない部分とを切り分ける作業を行った。その際には,最新のファイナンス理論だけでなく,ファイナンス理論の議論の系譜を明らかにするため,過去の議論も対象にして分析を行うよう心がけた。第2に,我が国の譲渡制限株式の売買価格の決定に関する裁判例の分析を行った。我が国の裁判例は豊富であるが,それらの裁判例において株式価値評価が問題となった背景として,どのような株主間の対立が生じているのか,裁判所はどのような観点から,どのような理由により,どのような手法を用いて株式価値評価を行っているのか,マイノリティディスカウントや非流動性ディスカウントを加えているか,またそれらのディスカウントをどの程度加えているか等について,事案ごとの分析を行ったうえで,事案の類型化を行った。第3に,株式評価が問題となる場面の1つとして,キャッシュアウトに際して株主が株式買取請求を行う場面を挙げることができるところ,かかる株式買取請求を含めて,キャッシュアウトをめぐる法律問題について研究し,その成果の一部を法律雑誌に公表した。平成29年度は,米国における州会社法上の株式価値評価に関する裁判例および学説の議論状況の分析も行う予定であったが,かかる分析は十分に行うことができなかった。その意味で,研究の進捗状況はやや遅れているといわざるを得ないが,現在,鋭意,かかる分析に取り組んでいるところであり,平成30年度に十分遅れを取り戻すことができると考えている。

逆に、裁判所が決定する売買価格が高すぎると、少数株主は不必要に譲渡等承認請求をして保有株式の買取りを求めてくる危険がある。そのため、裁判所が通常の株式取引の場合と同じように譲渡制限株式の売買価格を決定すること(取引価格をもって売買価格とすること)で、こうした株主のインセンティブの歪みが生じないかどうかが問題とされるべきであろう。このような観点から、望ましい株式価値評価のあり方について具体的に検討を加えた上で、その研究成果の一部を論文として公表した。昨年度(平成29年度)の研究の遅れも取り戻し、当初の研究計画どおりに研究を進めることができているうえに、研究成果を論文として公表することもできたためである。平成30年度は,平成29年度に行った作業を継続するとともに,米国における州会社法上の株式価値評価に関する裁判例および学説の議論状況の分析も行う。そうした研究成果の一部は,平成30年度中に公表したいと考えている。さらに,研究最終年度である平成31年度には,株式買取請求に係る「公正な価格」決定に関する裁判例・学説の分析を行うとともに,株式価値評価が問題となる場面ごとに株式価値評価の在り方が変わるとみるべきかどうかという問題の検討を行い,その研究成果を公表することを予定している。来年度も本年度の研究を継続するとともに,さらに、「株式価値評価が問題となる場面ごとに株式価値評価の在り方が変わるとみるべきかどうか」という問題の検討も行う。研究の若干の遅れに伴い,若干の未使用額が生じた。平成30年度に,未使用額は,物品費(書籍代)として全額利用する予定である。購入を予定していた書籍の刊行が遅れたことにより、若干の未使用額が生じた。来年度に、未使用額は、物品費(書籍代)として全額利用する予定である。
気管支喘息における気道リモデリングと気道炎症および生理学的・形態学的変化の検討

気管支喘息患者における不可逆的な気管支の構造的変化、すなわちリモデリングとして、気管支粘膜上皮細胞の杯細胞化生がリモデリングの初期に、さらに粘膜下腺の肥大増生といった変化がみられる。この上皮細胞の杯細胞化生を含む気道粘液産生亢進に気道上皮のCl-チャンネルを介したCl-のトランスポートを制御する蛋白の一つであるCa2+ activated chloridechannel(CLCA)1の関与が示唆されている。我々は気管支喘息患者21名を対象として誘発喀疾細胞におけるCLCA1遺伝子発現を検討した。誘発喀痰はβ_2刺激薬吸入後、高張食塩水10分間のネブライザー吸入にて採取。DTTにて粘液を溶解後、細胞成分を分離。細胞成分にISOGENを加えRNAを抽出・精製、RNA量を測定した後、100ngRNAを用いて、RT-PCRにてcDNAを作成し、RNA10ng相当量をABI PRISM 7700シークエンスディテクターを用いたTaqManPCR法にてCLCA1mRNA発現量を定量化した。非喫煙健常人と比較して、気管支喘息患者では喀痰中の総細胞数およびリンパ球、好酸球比率の有意な増加がみられた。非喫煙健常人と比較して、気管支喘息患者では喀痰細胞のCLCA1遺伝子発現は増加傾向を示したが有意な差は認められなかった。CLCA1遺伝子発現量と肺機能検査あるいは喀疫中の好酸球比率との間にも有意な差は認められなかった。また、喘息患者を罹患年数が10年以下と10年以上に分けて検討したが、有意な差は認められなかった。今回の誘発喀痰細胞を用いた検討では有意な発現増強を認めなかった。その理由として、CLCA1が発現しているであろう気道上皮細胞が誘発喀痰細胞に占める割合が一定でなく、少ないことが原因かもしれない。今後は組織学的検討を加えて検討したい。1.気管支喘息におけるHRCTを用いた気管支リモデリングの評価。外来通院中の安定期にある気管支喘息患者30名を対象として、ヘリカルCTを用いてHRCTを深吸気・呼気で撮影し、右B1気管支の壁肥厚および深吸気・呼気に伴う肺野CT値の変化でAir Trapを評価した。気管支拡張剤吸入後にても%FEV1<80%またはFEV1%<70%を示す喘息患者では壁肥厚は顕著であり、Air Trapも有意に高度であった。また、壁肥厚およびAir Trapと気管支拡張剤吸入後の%FEV1との間には有意な負の相関が認められた。以上より、不可逆性の気流閉塞を示す気管支喘息患者、おそらく気道リモデリングが生じていると考えられるが、この気道リモデリングの非侵襲的評価として、HRCTを用いた壁肥厚およびAir Trapの評価が有用であること、またB1の壁肥厚のみの評価では末梢気道の変化が不明である欠点を有しているが、Air Trapは末梢気道病変を反映しており、中枢気道と同様に末梢気道においても気道狭窄の変化が認められ、お互いに相関関係が認められた点が興味深い。2.慢性の不可逆性気流閉塞を示す気管支喘息患者の誘発喀痰中のmatrix metaroprotease(MMP)濃度および気管支壁におけるMMPの発現、および杯細胞発現と関連のあるCACC1のmRNA遺伝子発現の検討をおこなっているが結果はまだ公表出来ない。

この上皮細胞の杯細胞化生を含む気道粘液産生亢進に気道上皮のCl-チャンネルを介したCl-のトランスポートを制御する蛋白の一つであるCa2+ activated chloridechannel(CLCA)1の関与が示唆されている。我々は気管支喘息患者21名を対象として誘発喀痰細胞におけるCLCA1遺伝子発現を検討した。誘発喀痰はβ_2刺激薬吸入後、高張食塩水10分間のネブライザー吸入にて採取。DTTにて粘液を溶解後、細胞成分を分離。細胞成分にISOGENを加えRNAを抽出・精製、RNA量を測定した後、100ng RNAを用いて、RT-PCRにてcDNAを作成し、RNA10ng相当量をABI PRISM 7700シークエンスディテクターを用いたTaqMan PCR法にてCLCA1 mRNA発現量を定量化した。非喫煙健常人と比較して、気管支喘息患者では喀痰中の総細胞数およびリンパ球、好酸球比率の有意な増加がみられた。非喫煙健常人と比較して、気管支喘息患者では喀痰細胞のCLCA1遺伝子発現は増加傾向を示したが有意な差は認められなかった。CLCA1遺伝子発現量と肺機能検査あるいは喀痰中の好酸球比率との間にも有意な差は認められなかった。また、喘息患者を罹患年数が10年以下と10年以上に分けて検討したが、有意な差は認められなかった。今回の誘発喀痰細胞を用いた検討では有意な発現増強を認めなかった。その理由として、CLCA1が発現しているであろう気道上皮細胞が誘発喀痰細胞に占める割合が一定でなく、少ないことが原因かもしれない。今後は組織学的検討を加えて検討したい。
分子モーターで自己駆動するナノシート液晶

キネシン/微小管固定化ナノシート合成の第1ステップとして、ストレプトアビジンの固定化にむけた検討を行った。シランカップリング剤とナノシートの反応自体が進行していることは赤外分光スペクトル等で確認された。しかし、反応過程でのナノシートの凝集を抑制できず、修飾密度も大きくできないという問題が生じた。この問題をペンディングにしたまま、キネシン/微小管固定化ナノシート合成の次ステップに進むことも考えたが、最終的なアクティブナノシート系構築という目標を達成するには、理想的な剥離状態を維持しながら修飾密度を制御した合成を行う事が極めて重要である。そこで、合成の第1ステップの課題を可能な限りクリアしていくことに重点を置いて、さらなる検討を進めてきた。具体的には、溶媒の選択や、反応条件の検討を行うことで、剥離状態や修飾密度の制御が可能になることがわかってきた。今後さらなる条件検討を行っていく。また、高分子ゲルにナノシートを固定化したあとに、シリル化反応を行い、後にゲルを分解してナノシートを取り出すという、新しい合成法の開発にも取りかかった。高分子ゲルの架橋点に酸分解性基を導入することで、後処理によるゲルの除去が可能となることが分かった。また、この分解性ゲルにナノシートを完全に分散させて固定化する事にも成功した。これらの結果に基づき、今後、実際にナノシートにストレプトアビジンなどを固定化することを試みる予定である。キネシン/微小管固定化ナノシート合成の第1ステップとして、ストレプトアビジンの固定化を試みた。しかし、反応過程でのナノシートの凝集を抑制できず、修飾密度も大きくできないという問題が生じている。この問題をペンディングにしたまま、キネシン/微小管固定化ナノシート合成のステップに進むことも考えたが、最終的なアクティブナノシート系構築という目標を達成するには、理想的な剥離状態を維持しながら修飾密度を制御した合成を行う事が極めて重要である。このため本年度は、合成の第1ステップの課題を可能な限りクリアしていくことに重点を置いて検討を進めてきた。具体的には、溶媒の選択や、反応条件の検討に加え、高分子ゲルを利用した新しい合成法の開発にも取りかかっている。しかしながら、ナノシートへのキネシン/微小管固定化は、この研究の重要なポイントかつチャレンジの1つであり、当初から困難が予想されていた。したがって、現在の進捗状況は想定内の範囲であり、「概ね順調/やや遅れている」と判断している。昨年に引き続き、まずは第1ステップの反応を理想的に進行させるための検討をしっかりと行う。とくに、高分子ゲルを利用した新しい合成法開発は、他の研究への波及も期待できるため、重点的にコストをかけて取り組んでいく。完全に理想的な合成を実現するのは難しいかもしれないが、ある程度のレベルにまで達した段階で、キネシンや微小管固定化などの、以降の研究ステップにも進んでいく予定である。

昨年に引き続き、まずは第1ステップの反応を理想的に進行させるための検討をしっかりと行う。とくに、高分子ゲルを利用した新しい合成法開発は、他の研究への波及も期待できるため、重点的にコストをかけて取り組んでいく。完全に理想的な合成を実現するのは難しいかもしれないが、ある程度のレベルにまで達した段階で、キネシンや微小管固定化などの、以降の研究ステップにも進んでいく予定である。計上していた予算の大部分は、合成の第1ステップが完了したあとに必要なものであった。本研究の第1ステップの合成を理想的に進行させるために時間を要したため、2018年度での予算使用は限定的となった。第1ステップでは、これまで当研究室で行っていた研究との共通点もあり、既存の装置、器具、薬品等で検討が可能であったので、予算を繰り越し次年度に使用することにした。次年度は、研究の次のステップに入り、当初想定していた備品等を購入して研究を進めていく予定である。
脂肪滴膜で機能するドーフマン-チャナリン症候群の原因因子CGI-58の解析

・CGI-58複合体の成分"MADP"の角析----CGI-58がペリリピン以外にどのようなタンパク質と相互作用するのか、免疫沈降法による複合体の同定を試み、80kDaのWDドメインを有するタンパク質を同定し、これをMADPと名付けた。本年度はMADPの機能についてRNAi法により検討した。結果としてMADPのノックダウンは3T3-L1脂肪細胞への分化促進を引き起こし、MADPが脂肪細胞の分化を抑制する因子であることがわかった。・新規脂肪滴局在タンパク質"MLDP"の機能解析----心臓に高発現し、脂肪滴に局在する新規のPATドメインタンパク質MLDPを見出した。本年度はMLDPのin vivoでの機能を探るため、そのノックアウトマウスの作製を行った。ターゲッティングベクターの構築からキメラマウスの作製まで過程は順調に進み、現在ヘテロマウスの作製に成功している。今後、ノックアウトマウスを作製し表現型の解析を行う。・皮膚肝臓由来の細胞でのCGI-58の役割----前年度までに、脂肪細胞の脂肪分解におけるCGI-58の役割を検討し、CGI-58自身にはリパーゼ活性はないが、脂肪細胞のリパーゼであるATGLのアクチベーターとして機能することを見出した。本年度は、皮膚や肝臓由来の細胞におけるCGI-58の役割について検討を行った。肝臓由来のHepal細胞でRNAiによりCGI-58をノックダウンすると、脂肪細胞の場合と同様に脂肪滴の異常な蓄積が認められた。RNAiの細胞ではグリセロールの培地中への放出が抑制されており、脂肪分解が促進されていることが示唆された。また、CGI-58はB16メラノサイト細胞でも発現しており、CGI-58は脂肪細胞だけでなく、全身の細胞で脂肪分解に寄与することが示唆された。本研究により、CGI-58が新たなリポリシスの制御因子であることが明らかとなった。脂肪滴は真核細胞内に普遍的に存在するオルガネラであり、細胞内の脂質の代謝や貯蔵において重要な役割を果たしている。我々はこれまでに脂肪滴に局在する機能タンパク質としてCGI-58を同定し、さらにこれがPATドメインファミリーの1つペリリピンと相互作用することを見出した。CGI-58は、中性脂肪蓄積症であるChanarin-Dorfman症候群(CDS)の原因遺伝子として報告されているが、変異により細胞機能にどのように影響し発症するのか、その分子メカニズムは不明である。そこで今回、CGI-58の細胞レベルでの機能解析を行った。CDSにはこれまでに3種類の点変異が報告されており、それらに相当する変異を組み込んだGFP-CGI-58を3T3-L1細胞に発現させると、2つの変異体(Q132P、E262K)において、脂肪滴への標的化が阻害されていた。これらの変異体では野生型に比べペリリピンとの結合能力が減弱していることがGST-Pulldown法により確認された。以上の結果は、CDSの発症にはCGI-58の脂肪滴への標的化が関与していることを示唆している。次に、CGI-58の脂肪滴局在化に必要なドメインの検討を行い、N末端の約10残基を除くほぼ全長の領域が必要でることが分かった。また、CGI-58の組織分布をノザンブロット法およびReal-time PCR法で検討したところ、基本的に全身の組織にmRNA発現が見られたが、特に脂肪組織、副腎、精巣に高発現していた。次にCGI-58の細胞内での機能解析のためRNAiによるノックダウンを行った。分化前の3T3-L1細胞でCGI-58をノックダウンすると、正常細胞に比べ明らかな脂肪滴の増加が認められた。さらにRNAiにより脂肪細胞の分化の進行にも異常が認められた。よってCGI-58が脂肪滴形成や脂肪細胞分化に関与していることが示唆された。脂肪滴は真核細胞に普遍的に存在する細胞小器官であり、細胞内の脂質の貯蔵や代謝に重要な役割を果たしている。脂肪滴膜には多数のタンパク質が局在しており、特に哺乳動物細胞においては、PATドメインファミリーと呼ばれるタンパク質群が存在している。我々はこれまでに脂肪滴に局在する機能タンパク質としてCGI-58を同定し、これがPATドメインファミリーの1つペリリピンと相互作用することを見出した。CGI-58は、中性脂肪蓄積症であるChanarin-Dorfman症候群(CDS)の原因遺伝子として報告されていることからも、生体内で脂質代謝に関与していることが示唆される。我々は前年度までにCGI-58の組織分布、細胞内分布、さらにCDSの発症の分子メカニズムについて研究を行ってきた。しかし、CGI-58の脂肪滴における役割については未だ不明である。本研究では、CGI-58の生理的機能の解明を目的として、まずRNAiによりCGI-58をノックダウンしたときの脂肪滴への影響について検討した。分化前の3T3-L1細胞において、CGI-58ノックダウンにより脂肪滴の顕著な肥大化が確認された。RNAiは3T3-L1細胞の脂肪細胞分化には影響を与えなかった。しかし、RNAi細胞では、脂肪分解活性が顕著に低下していることがわかった。また、肝臓癌細胞であるHepa1においても、CGI-58ノックダウンにより脂肪滴の顕著な肥大化が確認された。次に、in vitroの実験系で、CGI-58のリパーゼ活性について検討したが、それ自身にはリパーゼ活性は認められなかった。

しかし、脂肪細胞のリパーゼであるATGLやHSLとCGI-58を混合すると、リパーゼ単独の場合に比べ、脂肪分解活性が上昇することを見出した。よってCGI-58は細胞内でこれらのリパーゼと協調して脂肪分解を促進する働きを有することが示唆される。・CGI-58複合体の成分"MADP"の角析----CGI-58がペリリピン以外にどのようなタンパク質と相互作用するのか、免疫沈降法による複合体の同定を試み、80kDaのWDドメインを有するタンパク質を同定し、これをMADPと名付けた。本年度はMADPの機能についてRNAi法により検討した。結果としてMADPのノックダウンは3T3-L1脂肪細胞への分化促進を引き起こし、MADPが脂肪細胞の分化を抑制する因子であることがわかった。・新規脂肪滴局在タンパク質"MLDP"の機能解析----心臓に高発現し、脂肪滴に局在する新規のPATドメインタンパク質MLDPを見出した。本年度はMLDPのin vivoでの機能を探るため、そのノックアウトマウスの作製を行った。ターゲッティングベクターの構築からキメラマウスの作製まで過程は順調に進み、現在ヘテロマウスの作製に成功している。今後、ノックアウトマウスを作製し表現型の解析を行う。・皮膚肝臓由来の細胞でのCGI-58の役割----前年度までに、脂肪細胞の脂肪分解におけるCGI-58の役割を検討し、CGI-58自身にはリパーゼ活性はないが、脂肪細胞のリパーゼであるATGLのアクチベーターとして機能することを見出した。本年度は、皮膚や肝臓由来の細胞におけるCGI-58の役割について検討を行った。肝臓由来のHepal細胞でRNAiによりCGI-58をノックダウンすると、脂肪細胞の場合と同様に脂肪滴の異常な蓄積が認められた。RNAiの細胞ではグリセロールの培地中への放出が抑制されており、脂肪分解が促進されていることが示唆された。また、CGI-58はB16メラノサイト細胞でも発現しており、CGI-58は脂肪細胞だけでなく、全身の細胞で脂肪分解に寄与することが示唆された。本研究により、CGI-58が新たなリポリシスの制御因子であることが明らかとなった。