hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト呼吸器細胞におけるＨ５Ｎ１インフルエンザウイルス感染動態のバイオイメージング

高病原性鳥インフルエンザウイルスH5N1は、現在もなおヒトへの致死的な感染例が報告されている。その一方で、従来の鳥インフルエンザウイルスは、ヒトに対する病原性は極めて低い。そこで、バイオイメージング技術等を用いて、ウイルスのヒト呼吸器上皮細胞への感染初期過程について検討した。その結果、H5N1ウイルスと従来型の鳥インフルエンザウイルスは細胞侵入後、エンドソーム内で膜融合を起こす際にそれぞれ異なるpH感受性閾値を持つことが示唆された。したがって、H5N1ウイルスと従来型の鳥インフルエンザウイルスのヒト呼吸器上皮細胞に対する感染様式の違いは、細胞侵入後の膜融合過程と関係している可能性が考えられた。平成25年度はこれまでに得られた知見を投稿論文として発表するための準備に充てた。ヒトへの致死率が50%を超える高病原性鳥インフルエンザウイルス(H5N1)の病原性を解明するために、ヒト呼吸器上皮細胞を用いてH5N1ウイルスの感染動態をリアルタイムで解析する新しいバイオイメージングシステムを構築することを研究の目的とした。インフルエンザウイルスを脂質染色性の色素(DiI、octadecyl rhodamine B chloride等)で染色し、ウイルスが細胞表面に吸着後、内部に移行していく様子を共焦点レーザー顕微鏡で観察するシステムを確立し、種々の鳥インフルエンザウイルスにおける感染動態について比較検討した。その結果、(従来のH5亜型ウイルスとして)2000年以前に分離された鳥インフルエンザウイルス(H5N2、H5N3、H5N9、H7N7、H9N2)に比べ、H5N1では膜融合におけるpH感受性(レンジ)が高いことを見出し、H5N1は従来の鳥インフルエンザに比べてより効率にヒト上皮細胞に感染し、増殖できることが示唆された。以上の結果をまとめた投稿論文作成に伴い、詳細な実験データの集積と再現性の確認が必要であり、最終年度はHAの細胞膜融合試験と上皮細胞株への感染試験を中心に再試を続けた。ヒトへの致死率が50%を超える高病原性鳥インフルエンザウイルス(H5N1)の病原性を解明するために、ヒト呼吸器上皮細胞を用いてH5N1ウイルスの感染動態をリアルタイムで解析する新しいバイオイメージングシステムを構築することを研究の目的としている。これまでに、インフルエンザウイルスを脂質染色性の色素(DiI、octadecyl rhodamine B chloride等)で染色し、ウイルスが細胞表面に吸着後、内部に移行していく様子を共焦点レーザー顕微鏡で観察するシステムを確立してきた。平成24年度はこれらの技術をもとに、種々の鳥インフルエンザウイルスにおける感染のイメージングを行い、その動態について比較検討した。インフルエンザウイルスは、細胞にエンドサイトーシスで侵入後、エンドソームpHの低下によりウイルスHAタンパク質が構造変化を起こし、その結果、HAとエンドソーム膜間で膜融合が生じ、脱殻を起こす。そこで、ヒト呼吸器上皮細胞を用い、ウイルス侵入後の早期および後期エンドソームを可視化し、併せてpH感受性のエンドソーム特異的マーカーを使って、侵入後のウイルスとエンドソームの動態およびpH変化について経時的な解析を行った。その結果、(従来のH5亜型ウイルスとして)2000年以前に分離された鳥インフルエンザウイルス(H5N2、H5N3、H5N9、H7N7、H9N2)に比べ、高病原性鳥インフルエンザウイルス(Asian-H5N1)では膜融合におけるpH感受性(レンジ)が高いことを見出した。これらの結果より、従来の鳥インフルエンザに比べてAsian-H5N1はより効率にヒト上皮細胞に感染し、増殖できることが示唆された。ヒト呼吸器上皮細胞におけるインフルエンザウイルスのバイオイメージングシステムを構築し、H5N1ウイルスのヒトへの病原性の新しい分子メカニズムに迫ることができたと考えられるため。得られた成果を発展させ、投稿論文の発表に向けた準備を進める。さらに、宿主細胞のトランスクリプトームとの関連性についても検討したいと考えている。研究遂行に必要な物品費に1,000,000円、成果発表等のための旅費に1000,000円、人件費・謝金等に200,000円、その他として100,000円を計上している。さらに前年度の未使用分600,000円を主に物品費と人件費・謝金に計上している。
生理活性脂質2ccPAを用いたLPA受容体によるTRPチャネル活性制御機構の解明

本研究課題では、我々がinvivo系の実験で明らかにしている環状ホスファチジン酸(cPA)とその誘導体(2ccPA)の持つ鎮痛作用について、その作用機序を明らかにすることを目指した。解析の結果、2ccPAによるLPA5受容体の活性化はTRPV1の活性化には影響を与えないことが示唆された。今後、他のTRPチャネル活性化に与える2ccPAの影響を調べて行く。本研究課題では、我々がin vivo系の実験で明らかにしている環状ホスファチジン酸(cPA)とその誘導体(2ccPA)の持つ鎮痛作用について、その作用機序を明らかにすることを目指している。本年度は、まず細胞レベルで痛みの応答を測定する方法の確立を目指した。TRPチャネルを発現させた細胞にチャネル活性測定用イオンインジケーター(pH感受性蛍光色素)を取り込ませ、痛み刺激(カプサイシン、熱等)に伴うチャネルの活性化を、刺激前後の蛍光量の変化で測定する方法を確立した。今後、この方法を用いて、2ccPAで細胞を刺激した場合、痛み刺激が引き起こすTRPチャネルの活性化に与える影響を調べていく予定である。本研究課題の最終目的は、2ccPAを疼痛治療へ応用させることである。これまでに我々が用いていた2ccPAはラセミ体であり、光学純粋ではなかった。しかし、創薬の観点からは、2ccPAの光学活性の違いがin vivoの鎮痛作用へ影響するか、またその効果に違いがあるのかを検討する必要があると考えられた。そこで、まず、光学純粋な2ccPAの合成法を開発し、純粋な(R)体、(S)体の2ccPAの合成を行った。得られた光学純粋な2ccPAを用いて、in vivoにおいて鎮痛作用に差があるか調べた。結果、2ccPAは(R)体、(S)体、ともに同様の鎮痛作用を示し、2ccPAの示す鎮痛作用機構に光学活性が関与する可能性は低いことが示唆された。さらに、鎮痛作用以外の2ccPAの持つ生理活性についても2ccPAの光学活性が顕著な差を示すことはなかった。これらの結果から、今後の実験には合成が簡単なラセミ体を用いる予定である。本研究課題では、我々がinvivo系の実験で明らかにしている環状ホスファチジン酸(cPA)とその誘導体(2ccPA)の持つ鎮痛作用について、その作用機序を明らかにすることを目指している。TRPチャネルを発現させた細胞にチャネル活性測定用イオンインジケーターを取り込ませ、痛み刺激(カプサイシン)に伴うチャネルの活性化を、刺激前後の蛍光量の変化で測定する方法を用いて、2ccPAが痛み刺激が引き起こすTRPチャネルの活性化に与える影響を調べた。このとき、2ccPAはリゾホスファチジン酸5レセプター(LPA5)を活性化することが知られていることから、TRPチャネルを発現させた細胞にLPA5を共発現させた。解析の結果、2ccPAによるLPA5レセプターの活性化はTRPV1の活性化には影響を与えないことが示唆された。今後TRPV1以外のTRPチャネル活性化に与える2ccPAの影響を調べて行く予定である。また、2ccPAが既知のLPAレセプター以外を標的としている可能性も考えられるため、2ccPAと相互作用するタンパク質の単離・精製も行っていく。本研究課題の最終目的は、cPA誘導体を疼痛治療へ応用させることである。これまでに我々は種々のcPA誘導体を合成してきた。今回は、2ccPAのほかに3ScPAを合成し、3ScPAの痛み抑制効果の有無、またその強度についても検討した。3ScPAはcPAと同様に痛み抑制効果を持つことが明らかになった。しかしながら、その効果は2ccPAには及ばなかったことから2ccPAが現在のところ最も痛み抑制効果が強いcPA誘導体であることが示された。今後2ccPAを中心に研究を進めて行く。本研究課題では、我々がin vivo系の実験で明らかにしている環状ホスファチジン酸(cPA)とその誘導体(2ccPA)の持つ鎮痛作用について、その作用機序を明らかにすることを目指した。TRPチャネルを発現させた細胞にチャネル活性測定用イオンインジケーターを取り込ませ、痛み刺激(カプサイシン)に伴うチャネルの活性化を、刺激前後の蛍光量の変化で測定する方法を用いて、痛み刺激が引き起こすTRPチャネルの活性化に与える2ccPAの影響を調べた。このとき、2ccPAはリゾホスファチジン酸(LPA)受容体を活性化することが知られていることから、TRPV1チャネルを発現させた細胞にLPA受容体を共発現させた。解析の結果、2ccPAによるLPA受容体の活性化はTRPV1の活性化には影響を与えないことが示唆された。TRPV1以外のTRPチャネル活性化に与える2ccPAの影響を調べるために、まずTRPV4のクローニングを行った。TRPV4を強制発現させた細胞はリガンドである4alphaPDDで活性化されることを確認した。その細胞にLPA受容体を共発現させ、TRPV4に与える2ccPAの影響を調べた。

その結果、2ccPAによるLPA受容体の活性化はTRPV4の活性化にも影響を与えないことが示唆された。今後2ccPAと炎症の関連を検討していく予定である。本研究課題の最終目的は、cPA誘導体を疼痛治療へ応用させることである。これまでに我々は種々のcPA誘導体を合成してきたが、その中でも2ccPAが最も痛み抑制効果が強いことが示された。また、2ccPAの光学活性の違いがin vivoの鎮痛作用へ影響しないことを示した。しかしながら、創薬の観点からは光学純粋な化合物を大量に合成する必要性も考えられるため、2ccPAの純粋な光学異性体を合成する方法を検討し、合成方法の確立に成功した。研究の目的に記載した、LPAR5活性化に伴うTRPチャネルの活性への影響解析を順調に進め、LPAR5はTRPチャネルのうちTRPV1の活性化には影響がないことを示唆する結果を得た。24年度が最終年度であるため、記入しない。2ccPAによるLPA5活性化はTRPV1の活性には影響がないことが示唆されたことから、今後は、TRPV1以外のTRPチャネルへの影響を調べていく。また既知のLPAレセプター以外のcPAに結合するタンパク質の単離・精製を行っていく予定である。
平成30年北海道胆振東部地震とその災害に関する総合調査

平成30年北海道胆振東部地震とその災害に関する総合調査を実施した。多くの人的被害を出した厚真町の同時多発斜面崩壊では、隣接する樽前山や恵庭岳などの活火山の最近数万年間の噴火による降下火砕物堆積物の粘土化した底面がすべり面となった事例が多数確認された。また、シミュレーションから斜面崩壊土砂の流動速度が速く避難の時間はほとんどなかった可能性が示された。むかわ町で見られた1階崩壊型建物倒壊は店舗併用住宅が多く、未明の地震で店舗に人間が不在であったため人的被害が発生しなかった可能性が示された。室蘭市民へのアンケートでは、若年層ほど災害時の要支援者の存在の認知度が低いことが明らかになった。ブラックアウトの影響はインフラや社会経済活動の広範囲に及び、創業能力の回復には1週間以上を要していたいたことが示された。札幌市内の宅地液状化地域では、密度の小さい火山灰での盛土に地下水位が高い状態にあったことが確認された。今回の地震動は、震源に近い領域では距離減衰式を上回る最大速度や加速度であったことが示された。むかわ町で建物倒壊が多かったのは、地盤構造に起因する地震動の増幅であった可能性が地下構造探査から示唆された。今回の地震の破壊開始点は深さ40km弱と内陸で発生する地震としては深かかったが、大きな断層すべりはより浅い深さ20-30km付近で発生していたことが示された。また、今回の震源を含む石狩低地東縁断層の周辺では、定常的なひずみ速度が大きいことが確認された。一般住民も対象とした研究成果報告会を苫小牧市で開催し150名の参加者があった。
オリゴデンドロサイト前駆細胞による脳内炎症制御機構の解明

中枢神経疾患の病態増悪につながる重要な因子として脳内炎症が注目されている。これまで、脳内炎症に関わる細胞種としてミクログリア・アストロサイトが幅広く研究されてきたが、オリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)はほとんど着目されていなかった。本研究では、病態モデルを用いてOPCの脳内炎症への関与とその制御分子を明らかにすることを目的とする。そのために、複数の炎症性中枢神経疾患モデル由来OPCにおける遺伝子発現解析や、初代培養OPCを用いた検討によりOPCの炎症応答経路を明らかにするとともに、OPC特異的に標的遺伝子を欠損させたマウスを用いて脳内炎症レベルと病態に対する影響を経時的に精査する。
低温領域における雪結晶の成長プロセスの研究とその教材化

ペルチェ素子を使用した対流型の人工雪生成装置を製作し、この水冷部に冷却水循環装置を付加するなどの工夫により、室温で-45°Cまで冷却できるように改良した。これにより、低温領域でも様々な条件で雪結晶の生成が可能になり、雪結晶の生成実験と行った。特に-35°C以下の領域においては装置の改良により、砲弾型、あるいは砲弾集合、ごへい結晶など、従来拡散型での実験に見られるような雪結晶が同様に生成することが判明した。さらに、この領域では多結晶が多く生成することも判明した。また、従来-40°C以下では過冷却水滴(あるいは氷晶)の影響で単独の結晶を作ることが困難であったが、装置内部の改良によって単独の結晶を生成することが可能になった。この領域でも上記のような特殊な形状の結晶が見られるが、現状ではその特性をつかむまでには至っておらず、来年度以降の自身の研究への課題となっている。砲弾集合結晶に注目すると、自然に見られるような対称形をした結晶に成長することは少なく、砲弾口が下向きに成長していくものが多かった。つまり、砲弾口は水蒸気供給方向に成長すると考えられ、これから、砲弾集合結晶の成長には水蒸気の供給と昇華熱の拡散の効果が影響していると考えられる。砲弾結晶は2つのタイプがあることが知られているが、-35°C前後を境界に形状が変化する結果が見られているが、これについてはさらなる検証が必要であると考えている。
ヒドロキシアパタイト形成に関わる微生物タンパク質の取得とその抑制に関する研究

歯垢から分離されたCorynebacterium matruchotiiは、主にヒドロキシアパタイトからなる歯石形成に関与する。C.matruchotiiは生物の石灰化の機構を探る上で非常に重要であると考えられる。その石灰化に関連するリポタンパク質を脂質成分から精製した結果、1分子に少なくとも8分子のカルシウムを結合させることのできるリポタンパク質であることが判明した。おそらくこれが核になって、リン酸が結合し、やがてヒドロキシアパタイト結晶核へ成長するのではないかと考えられた。cpIXをコードするDNA断片をPCRで増幅し、p-BADベクターに接続して大腸菌へ導入した。大腸菌で発現させること成功したが、大腸菌を石灰化させるまでには至らなかった。リポタンパク質の性質をさらに調べた結果、脂肪酸の修飾が石灰化に必要であることが予想された。現在のところ、Corynebacterium内でCLPXのどのアミノ酸に、どのような脂肪酸が結合しているのか全く不明である。今後の課題として、大腸菌、Corynebacterium内でのCLPXの脂肪酸の修飾に関連するところを調べていくことが、最終的に微生物の石灰化のメカニズムを明らかにする上で非常に重要であると考えられた。バイオミネラリゼーションとは生物が鉱物化することであり、身近な例では貝殻や真珠などがあげられる。微生物の中でも石灰化を行うものがいる。例えば我々の歯に歯垢を作り自らの住み家としている微生物(Corynebacterium matruchotii)は、リポタンパク質を核としてヒドロキシアパタイト(リン酸カルシウム)を沈着させていくことが報告されている。ヒドロキシアパタイトは生体適合性が非常に高いことから、医療の分野でも注目されている。ヒドロキシアパタイト結晶核形成の分子制御について研究することによって、例えば将来(1)結晶形成促進リポタンパク質によるヒドロキシアパタイトの生産、(2)カルシウム吸収促進剤の開発、(3)虫歯予防剤の開発、(4)結石形成阻害剤の開発、(5)結晶形成促進リポタンパク質を発現させた微生物による排水からのリン除去等につながる可能性がある。C.matruchotiiのクロロホルム抽出液にはヒドロキシアパタイト結晶形成促進リポタンパク質が含まれている。これを有機溶媒耐性カラムを用いて部分的に精製できることはすでに高添らにより報告されている。現在このタンパク質を、さらに精製中である。このタンパク質を用いてヒドロキシアパタイト結晶形成の原理解明を行う。またC.matruchotiiは菌体内にポリリン酸を作っている間はヒドロキシアパタイトの形成は起こらないことから、ポリリン酸自体にヒドロキシアパタイト形成阻害作用があるかもしれないと考えられる。そこでポリリン酸のヒドロキシアパタイト結晶形成への影響を調べたところ、阻害効果があることが確認できた。さらにトリメタリン酸によって、サイクロデキストリンのポリリン酸化を行い、ヒドロキシアパタイト形成阻害作用を調べたところ、さらに強いヒドロキシアパタイト結晶阻害効果があることがわかった。cplXをコードするDNA断片をPCRで増幅し、p-BADベクターに接続して大腸菌へ導入した。
スフィンゴ脂質生合成を律速するセリンパルミトイルトランスフェラーゼの活性発現機構

Sphingomonas paicimobilis由来セリンパルミトイルトランスフェラーゼ(SPT)の結晶化条件を検索する過程で、保存中の精製標品がN末端近傍で切断されていくことが観察され、これが本タンパク質の結晶化を妨げているのではないかと考えられた。そこで、切断部位を同定し、この残基を含むN末領域を欠損させた組換えSPTの大腸菌内発現系を構築した。N末欠損型SPTは野生型SPTと同様の方法で精製することができ、調べた範囲内において両者の酵素学的諸性質に差は認められなかった。N末欠損タンパク質を用いたSPTの結晶化に成功し、X線回折の測定とデータの解析を試みたが、立体構造決定には至っていない。現在、さらに良好な結晶を得るため、詳細な結晶化の条件検討とX線回折の測定を続けている。補酵素PLPに起因する特徴的なスペクトルを指標として、SPTと一連の基質・生成物誘導体や阻害剤との反応機構の解析を行った。精製酵素に基質であるL-セリンを添加すると、external aldimine中間体生成を示唆するスペクトル変化が観察された。一方、L-セリンのアミノ基を欠く構造を有する3-hydroxypropionateはSPTに結合したものの、上述のスペクトル変化を全く示さなかった。さらに、種々のL-セリン誘導体の結合性を調べた結果、SPTの基質認識にはアミノ酸のα-カルボキシル基が必須ではないかと考えられた。SPT特異的阻害剤のmyriocinやsphingofunginBは、SPTに対して基質よりも非常に高い親和性を示した。β-Chloro-L-alanineとL-cycloserineは不可逆的に補酵素と反応して不活性な付加物を形成した。以上のように、細菌由来水溶性SPTを用いて従来より知られる阻害剤の反応機構を分子レベルで解析することが可能となり、本酵素が真核生物SPTのモデル系となりうることを示した。結晶化に適した標品を得るため、大腸菌で大量発現させたセリンパルミトイルトランスフェラーゼ(SPT)の精製法を改良し、共雑タンパク質のより少ない精製酵素を得た。この精製酵素を用いることにより、酵素タンパク質の結晶化に成功し、再現性も良好である。現在、X線解析に適した良好な結晶を得るため、詳細な結晶化の条件検討を続けている。本酵素の生化学的性質を明らかにする目的で、補酵素であるピリドキサールリン酸(PLP)に起因する吸収スペクトルを指標として分光学的解析を行った。SPTにおいて、補酵素PLPはタンパク質分子の265番目のリシン残基との間でシッフ塩基(intemal aldamine)を形成している。その分子構造は、吸収スペクトルにおいて330mmに吸収極大を示すenolimine型と420mmに吸収極大を不すketoenamine型の平衡状態にあることが分かった。pH滴定を行った結果、これら2つの吸収極大の強度に顕著な変化が観測されなかったことから、本酵素のシッフ塩基のpKa値は8.5以上である、ことが明らかになった。基質であるL-セリンをSPTに添加すると、基質濃度依存的に330mmの吸収極大が減少し、420nmの吸収極大が増加するのが観察され、セリンの解離定数Kdは約1.7mMと見積もられた。さらに、PLPに由来する波長領域の円二色性スペクトルを測定したところ、基質の結合による吸収極大の符号の逆転が観察された。これは基質分子のアミノ基と補酵素PLPとの間でのexternal aldimine形成を示唆するものである。以上の結果から、酵素への基質の結合によって酵素反応の第一段階であるアミノ基転位反応が進行することが実験的に確かめられ、本酵素の触媒機構の一端が明かとなった。

以上のように、細菌由来水溶性SPTを用いて従来より知られる阻害剤の反応機構を分子レベルで解析することが可能となり、本酵素が真核生物SPTのモデル系となりうることを示した。
抗菌性ペプチドミュータシンMT6223の抗う触剤としての開発研究

1.(1)Streptococcus sobrinusMT6223株の培養条件の検討により,dTTY, BHI, Eagle培地でのミュータシンの産生が確認され,その産生性はdTTY=BHI>>Eagleであった.(2)dTTY培地での培養上清を硫安塩析後,その透析物を用いてミュータシンのゲルろ過担体に対する吸着性を検討した.その結果,Sepharose>Bio-Gel>>Sephadexの順に活性回収率がよく,Sepharose CL-6Bクロマトグラフィーではは分子量1000kDa以上の位置に回収率100%で溶出されることが明らかとなった.また,SDS-PAGEの結果と比較することによりミュータシンの会合性が示唆された.2.(1)dTTY培地を用いたStreptococcus sobrinusMT6223株の培養上清から,硫安分画,Sepharose CL-6Bクロマトグラフィー,Develosil ODS-HG-5カラムとResource RPCカラムを用いた逆相HPLCにより純粋なミュータシンMT6223を単離した.本精製法における活性回収率は硫安分画から起算して6.3%であった.(2)ミュータシンは熱および酸に対して安定であることが明らかとなった.また,ミュータシンはパパインによって失活することよりペプチド性抗生物質であることが確かめられた.(3)FAB/MS分析によりミュータシンの分子量は2716と決定した.この結果とSepharose CL-6Bクロマトグラフィーでvoid volume (>2000kDa)に溶出されてくることより,ミュータシンは溶液中で高度に会合していることが確認された.(4)アミノ酸配列分析により,ミュータシンのN末端アミノ酸配列はAla-Val-と決定されたが,3ステップ以降のPTH-アミノ酸は全く検出することができなかった.アミノ酸組成分析の結果,ミュータシンにはGlyとAlaが多く,酸性アミノ酸を全く含んでいないことが明らかとなり,アミノ酸組成比と分子量の比較から異常アミノ酸を含んでいることが示唆された.3.(1)FAB MS分析同様,MALDI-TOF MS法においても,ミュータシンMT6223は分子量2700付近にイオンピークを示し,それ以上の高分子量イオンピークは検出されなかった.(2)50%酢酸を溶出液とするSepharose CL-6B Chromatographyを用いたとき,ミュータシンがナイシン(3.4kDa)とトリプトファン(0.2kDa)の間に溶出されることから,MS分析におけるミュータシンの分子量の結果が支持された.1.(1)Streptococcus sobrinusMT6223株の培養条件の検討により,dTTY, BHI, Eagle培地でのミュータシンの産生が確認され,その産生性はdTTY=BHI>>Eagleであった.(2)dTTY培地での培養上清を硫安塩析後,その透析物を用いてミュータシンのゲルろ過担体に対する吸着性を検討した.その結果,Sepharose>Bio-Gel>>Sephadexの順に活性回収率がよく,Sepharose CL-6Bクロマトグラフィーではは分子量1000kDa以上の位置に回収率100%で溶出されることが明らかとなった.また,SDS-PAGEの結果と比較することによりミュータシンの会合性が示唆された.2.(1)dTTY培地を用いたStreptococcus sobrinusMT6223株の培養上清から,硫安分画,Sepharose CL-6Bクロマトグラフィー,Develosil ODS-HG-5カラムとResource RPCカラムを用いた逆相HPLCにより純粋なミュータシンMT6223を単離した.本精製法における活性回収率は硫安分画から起算して6.3%であった.(2)ミュータシンは熱および酸に対して安定であることが明らかとなった.また,ミュータシンはパパインによって失活することよりペプチド性抗生物質であることが確かめられた.(3)FAB/MS分析によりミュータシンの分子量は2716と決定した.この結果とSepharose CL-6Bクロマトグラフィーでvoid volume (>2000kDa)に溶出されてくることより,ミュータシンは溶液中で高度に会合していることが確認された.(4)アミノ酸配列分析により,ミュータシンのN末端アミノ酸配列はAla-Val-と決定されたが,3ステップ以降のPTH-アミノ酸は全く検出することができなかった.アミノ酸組成分析の結果,ミュータシンにはGlyとAlaが多く,酸性アミノ酸を全く含んでいないことが明らかとなり,アミノ酸組成比と分子量の比較から異常アミノ酸を含んでいることが示唆された.3.(1)FAB MS分析同様,MALDI-TOF MS法においても,ミュータシンMT6223は分子量2700付近にイオンピークを示し,それ以上の高分子量イオンピークは検出されなかった.(2)50%酢酸を溶出液とするSepharose CL-6B Chromatographyを用いたとき,ミュータシンがナイシン(3.4kDa)とトリプトファン(0.2kDa)の間に溶出されることから,MS分析におけるミュータシンの分子量の結果が支持された.2.dTTY培地での培養上清を硫安塩析後、その透析物を用いてミュータシンのゲルろ過

担体に対する吸着性を検討した。その結果、Sepharose>Bio-Gel≫Sephadexの順に活性回収率がよく、Sepharose CL-6Bクロマトグラフィーでは分子量1000K以上の位置に回収率100%で溶出されることが明らかとなった。また、SDS-PAGEの結果と比較することによりミュータシンの会合性が示唆された。3.ゲルろ過での活性画分について逆相HPLCによる精製法を検討した結果、タンパク質分離用Develosil 300C4-HG-5カラムが最も分離能がよく、ミュータシンはTFA-CH3CN系溶出法により220nm/280nm比の異なる2本の単一な活性ピークとして回収された。4.精製したPureなミュータシン活性ピークは酸により分解されやすく、再HPLCによりその一部は異なる溶出位置に活性のないピークとして現われる。また、この活性ピークはパパイン消化によっても失活する。逆相HPLCにより精製したミュータシン約20units分を用いてもFAB/MS(検出限界1μg以下)で有意なイオンピークが検出されなかったことよりミュータシンはごく微量でその生理活性を発揮するものと考えられる。2.アミノ酸配列分析により、MutacinのN末端アミノ酸配列はAla-Val-と決定されたが、3ステップ以降のPTH-アミノ酸は全く検出することができなかった。FA/MS分析によりミュータシンの分子量は2716と決定した。この結果とSepharose CL-6BクロマトグラフィーでVoid volume(>2000K Da)に溶出されてくることよりミュータシンは溶液中で高度に会合していることが確認された。4.アミノ酸組成分析の結果、ミュータシンにはGlyとAlaが多く、酸性アミノ酸を全く含んでいないことが明らかとなった。ミュータシンの会合性は分子中にGly、Alaを多く含んでいることに起因するものと考えられる。5.アミノ酸組成比と分子量の比較からミュータシンは異常アミノ酸を含んでいることが示唆されるが、アミノ酸分析の結果はミュータシンがランチオニンを含むいわゆるランチバイオティクスではないことを示唆している。6.1分子中にArgを1個含んでいるとすると、ミュータシンはStreptococcus mutans MT8148Rに対して約40nMという極めて抵濃度で抗菌活性を有することが示された。7.現時点における遺伝子解析では、ミュータシンがプラスミドコントロールにより発現制御されているのではないと考えられる。1.FAB MS分析同様,MALDI-TOF MS法においても,ミュータシンMT6223は分子量2700付近にイオンピークを示し,それ以上の高分子量イオンピークは検出されなかった.2.50%酢酸を溶出液とするSepharose CL-6B Chromatographyを用いたとき,ミュータシンがナイシン(3.4kD)とトリプトファン(0.2kD)の間に溶出されることから、MS分析におけるミュータシンの分子量の結果が支持された.3.150AUのミュータシンを用いたMS/MS分析の結果,フラグメントピークによる配列解析を行うのに十分なスペクトルは得ることができなかった.4.文献検索上では,ミュータシンのN末端アミノ酸配列(Ala-Val-)に相当するバクテリオシンは未だ報告されていない.
組織特異的転写因子群、基本転写装置の生体内クロマチンへの結合状態の時間的解析

遺伝情報発現制御機構の解明には時間生物学の観点を取り入れた解析が必要不可欠である。個体発生における組織・細胞の分化や、種々の細胞内情報伝達応答等に対応した遺伝情報発現制御は、厳密な時間軸を有するDNAと蛋白質の相互作用である。本研究では、細胞分化系で協調的に働く複数の因子(分化、組織特異的因子群およびそれらが作用する基本転写装置を構成する因子群)が作用する順番、すなわちどの時期にどの因子とともに作用しているのか、を解析することにより時間軸を取り入れた遺伝子転写制御機構の解明を目標とした。モデル系としてMyoDを誘導的に活性化することにより筋肉に分化する、マウス繊維芽細胞株を用いた。筋肉特異的に発現するmuscle creatine kinase、myogenin、desmin、p21、myosin light chain、tublin alpha遺伝子の発現をRT-PCRおよびノザン法にて分化誘導後異なる時間で発現の消長を示すことを観察した。この発現の消長が転写因子の結合と関連しているかどうかをみるためにMyoD抗体を用いたCHIPアッセイを行い、遺伝子の発現は転写因子の結合時間と一致していることを見出した。免疫染色法によりMyoDは誘導的に活性化した直後より核内に見出されるため、遺伝子の時間的発現差異はMyoD蛋白質の存在のみでは説明できない。そこでこれらの遺伝子動態を3DFISHにて観察した。遺伝子発現に伴いクロマチンがほどけていく像が観察された。さらに染色体の動態は転写因子の結合より前におこることも確認した。以上の結果は、遺伝子発現の際、転写因子結合のみならず、発現する遺伝子領域を含む染色体が何らかの原因で動的にほどけていくことを示唆する。研究目的遺伝子情報発現機構の解明には時間生物学の観点を取り入れた解析が必要不可欠である。個体発生における組織・細胞の分化や、細胞内情報伝達応答に呼応した遺伝子発現制御は厳密な時間軸を有するDNAと蛋白質の相互作用である。本研究では、モデル系として筋肉培養細胞株を用い、分化刺激後種々のtime pointで筋分化特異的遺伝子(Myogenin遺伝子等)の発現と、制御因子の結合・因子の修飾とDNAの動態との相関を明らかにする。なお、これらの遺伝子発現を制御する転写因子は共通のMyoD、MEF2C、Six、Eyaである。研究実施計画と成果当初の計画ではマウス筋芽細胞株C2C12を用いる予定であった。しかしC2C12細胞では時間をおった分化後の形態や遺伝子発現(ノザン解析による)で再現性ある結果が得られなかったため、マウス繊維芽細胞にエストロゲンレセプタとMyoDの融合蛋白質が恒常的に導入されている細胞株を用いることとした。同細胞は、エストロゲン刺激後、MyoDが標的遺伝子に結合し、筋分化を開始し、種々の筋分化特異的遺伝子は再現性をよく発現した。同細胞からNuclear Suspensionを調製した。2各種抗体の作成3 CHIPアッセイ分化刺激後種々のtime pointで調製したNuclear Suspensionを用いMyoD、Six、Eya、MEF2C抗体を用いたCHIPアッセイをおこなった。さらに数回確認実験を予定している。遺伝子側の動態を知るために、分化刺激後種々のtime pointでMyogenin遺伝子等の3 dimension FISHの系をたちあげた。分化に伴う遺伝子DNAの動態についての新たな知見が得られた。

本研究では、細胞分化系で協調的に働く複数の因子(分化、組織特異的因子群およびそれらが作用する基本転写装置を構成する因子群)が作用する順番、すなわちどの時期にどの因子とともに作用しているのか、を解析することにより時間軸を取り入れた遺伝子転写制御機構の解明を目標とした。モデル系としてMyoDを誘導的に活性化することにより筋肉に分化する、マウス繊維芽細胞株を用いた。筋肉特異的に発現するmuscle creatine kinase、myogenin、desmin、p21、myosin light chain、tublin alpha遺伝子の発現をRT-PCRおよびノザン法にて分化誘導後異なる時間で発現の消長を示すことを観察した。この発現の消長が転写因子の結合と関連しているかどうかをみるためにMyoD抗体を用いたCHIPアッセイを行い、遺伝子の発現は転写因子の結合時間と一致していることを見出した。免疫染色法によりMyoDは誘導的に活性化した直後より核内に見出されるため、遺伝子の時間的発現差異はMyoD蛋白質の存在のみでは説明できない。そこでこれらの遺伝子動態を3DFISHにて観察した。遺伝子発現に伴いクロマチンがほどけていく像が観察された。さらに染色体の動態は転写因子の結合より前におこることも確認した。以上の結果は、遺伝子発現の際、転写因子結合のみならず、発現する遺伝子領域を含む染色体が何らかの原因で動的にほどけていくことを示唆する。
記憶障害改善薬リード化合物創製を目的とするリコポジウムアルカロイドの探索と全合成

高齢化社会となった現在、有効かつ安全な記憶障害改善薬の開発が急務となっている。ヒカゲノカズラ科リコポジウム属植物に含有されるアルカロイド(含窒素化合物)には、アセチルコリンエステラーゼという酵素を阻害することにより、記憶障害を改善できることが報告されている。本研究では、リコポジウム属植物からのアルカロイドの単離・構造決定と化学合成により、記憶障害改善作用をもつ有用なアルカロイドを見出すことを目的とした。その結果、数多くの新規アルカロイドを単離・構造決定するとともに、数種のアルカロイドの効率的全合成を達成した。新規アルカロイドLycoposerramine-Rのラセミ体での全合成を不斉全合成へ展開すべく、Diels-Alder反応の不斉化を検討した。反応溶媒、不斉補助基、添加剤、反応温度など詳細な検討を行なったが、最高でも収率53%、80%eeという結果に終わった。また再現性にも問題があったため、合成経路の再検討を行うこととした。すなわち、出発原料として安価で購入可能な光学活性化合物(R)-Pulegoneを用い、不斉全合成を試みることとした。これまでにラセミ体で確立した全合成ルートにおける中間体を光学活性体として得ることに成功している。今後は、ラセミ体での全合成において低収率であったピリドン環の構築について収率の改善を検討し、Lycoposerramine-Rの不斉全合成を達成する予定である。2)代表的リコポジウムアルカロイドLycodineの生合成模擬的合成。Evansの不斉補助基を用いた細見ー桜井アリル化により導入した不斉炭素を有する、Lycodineの全炭素(16炭素)を有する直鎖化合物から、生合成模擬的連続環化反応の検討を行なった。酸、反応溶媒等の検討を行なった結果、CSA(カンファースルホン酸)を用いたところ、望みの連続環化反応が進行し、収率61%(立体選択性3.1:1)で目的の4環性化合物を与えた。環化体の立体化学については、誘導体化したのち結晶化し、X線結晶解析により決定した。望みの立体化学を有する4環性化合物より、ピリジン環を構築することによりLycodineの短段階不斉全合成を達成した。さらに、共通の4環性化合物中間体よりFlabellidineの初の全合成を達成した。1)不斉Diels-Alder反応を鍵反応としたLycoposerramine-Rの不斉全合成:昨年度に確立した合成ルートにより、不斉全合成を達成した。3)AChE阻害作用を有する植物性リコポジウムアルカロイドの徹底的追求:タイ産Lycopodium属植物(L. nummularifolium, L. dalhousianum, L. carinata)について含有アルカロイドを精査を行っている。これまでにL. nummularifoliumからは新規アルカロイド7種を含む15種のリコポジウムアルカロイドを単離・構造決定した。L. dalhousianumにはリコポジウムアルカロイドの含有は確認できなかった。現在、L. carinataについて含有成分を精査中である。今後、薬理活性試験を行い、構造活性相関の検討を行う予定である。4)Huperzine-Hの全合成による立体化学の解明:Huperzine-Hは、ピロール環と隣接した9員環と6員環の3環性骨格を有しており、これまでにない新規骨格をもつ平面構造が提出されている。しかし、7位、12位、15位の立体化学は全く解明されていないため、その立体化学の決定および活性評価を目的として、Huperzine-Hの全合成を計画した。メチルシクロヘキセノンに対し、ピロールユニットを立体選択的1,4ー付加反応により縮合した。その後、12位にアリル基を導入し、Ring-Closing-Metathesisによる9員環の構築を検討したが目的物は得られなかった。さらに光延反応による9員環の構築も検討したが、目的の環化体は得られなかった。そこで、最後にピロール環を構築する合成ルートに変更し、Ring-Closing-Metathesisにより12員環の構築に成功した。今後、ピロール環を構築してHuperzine-Hの全合成を達成する予定である。ヒカゲノカズラ科リコポジウム属植物に含有されるアルカロイド類の単離・構造決定および不斉全合成研究を実施した。具体的には、1)当研究室にて単離・構造決定した新規アルカロイドLycoposerramine-Rの不斉全合成研究:研究計画通りDiels-Alder反応を鍵段階とするLycoposerramine-Rの全合成を達成した。原料として光学活性なpulegoneを用いることにより、初の不斉全合成も達成した。2)代表的リコポジウムアルカロイドLycodineの生合成模擬的合成:生合成経路を模擬した短段階でのLycodineの不斉全合成を達成した。それと同様の連続的環化反応を用い、リコポジウムアルカロイドFlabellidineの初の不斉全合成も達成した。4)Huperzine-Hの全合成による立体化学の解明:鍵となる9員環の構築は困難であったため、12員環を構築した後、渡環反応により9員環と5員環を構築する合成法を試みることとした。これまでに12員環の構築には成功しており、渡環反応により9員環を構築し、全合成を達成する予定である。

5)Fawcettimine型アルカロイドの全合成研究:当研究室にて確立した細見ー桜井反応、Pauson-Khand反応を鍵段階としたリコポジウムアルカロイドの全合成法を活用することにより、当研究室で単離・構造決定した新しいタイプのアルカロイド(Lycopoclavamine-A、LPN)の全合成を目指している。鍵となる4級不斉炭素の構築には成功しており、今後全合成を達成する予定である。高齢化社会となった現在、有効かつ安全な記憶障害改善薬の開発が急務となっている。ヒカゲノカズラ科リコポジウム属植物に含有されるアルカロイド(含窒素化合物)には、アセチルコリンエステラーゼという酵素を阻害することにより、記憶障害を改善できることが報告されている。本研究では、リコポジウム属植物からのアルカロイドの単離・構造決定と化学合成により、記憶障害改善作用をもつ有用なアルカロイドを見出すことを目的とした。その結果、数多くの新規アルカロイドを単離・構造決定するとともに、数種のアルカロイドの効率的全合成を達成した。1)当初は25年度に達成する予定であったLycoposerramine-Rの不斉全合成について、今年度無事達成することができた。2)26年度に達成予定であったHuperzine-Hの全合成はできなかったが、27年度には達成できると考えられる。天然物化学おおむね順調に進展しているので、当初の計画通りに研究を遂行していく。1)不斉Diels-Alder反応を鍵反応としたLycoposerramine-Rの不斉全合成については当初の計画より多少進度が遅れているものの、光学活性体においてラセミ体における全合成ルートへ合流することができたことから、26年度に不斉全合成を達成することは確実と言える。2)代表的リコポジウムアルカロイドLycodineの生合成模擬的合成については当初の計画以上に進展しており、Lycodineの短段階不斉全合成だけでなく、同様の骨格を有するアルカロイド、Flabellidineの初の全合成にも成功した。当初マグネチックスターラー付低温恒温水槽東京理化PSL-2000の購入を予定していたが、当研究室所有の装置で代用することができたため、購入の必要がなくなった。これまでおおむね順調に進展しているので、今後も当初の計画通りに研究を遂行する。本年度は研究計画の通り全合成を達成するべく試薬・溶媒・備品等の大量購入が予想される。当初購入を予定していたパーソナル有機合成装置(ゾディアック)について、他社の装置や新しい装置との比較検討を行った結果、購入を見合わせたため。26年度は合成計画通りの研究の遂行に向け、試薬、溶媒、備品等の大量購入が必要となると予想される。
ZnOの表面現象解明とYAP:Ce/ZnOシンチレーション放射線検出器の開発

本研究では、酸化亜鉛(ZnO)単結晶の光導電特性に及ぼす結晶表面の影響を明らかにしZnO UVセンサの特性改善を目指す。また、放射線耐性が高くUV光を発光するYAP:CeシンチレータをZnO UVセンサ表面へ直接積層することで表面の不活性化を図り、光導電型ZnO UVセンサの特性を改善するとともに、放射線耐性の高い高感度YAP:Ce/ZnOシンチレーション放射線検出器を実現する。
環状ジアデニル酸の生理活性探索

バクテリアの二次情報伝達物質として注目されている環状ジアデニル酸(c-di-AMP)の効率的な化学合成法を確立した。この手法を基盤として生理活性探索を行ったところ、c-di-AMPが淡水域に生息する緑藻類の一種であるクラミドモナスの細胞分裂を促進することがわかった。さらに、2'位に種々の置換基を有するc-di-AMP誘導体も同様の生理活性を示すことが明らかとなった。平成22年度の研究実績の概要は、次のとおりである。(1)環状ビス(3'-5')ジアデニル酸(以下、c-di-AMPと略す)の液相合成法を開発した。まず、市販のホスホロアミダイトを出発原料として、5'-水酸基が無保護のヌクレオチドとの縮合反応を検討した。その結果、活性化剤として酸・アゾール複合体を、ホスファイトトリエステルの酸化剤として、tert-ヒドロペルオキシドを用いると、高い収率で鎖状二量体が得られることが明らかとなった。次に、鎖状二量体の3'-末端のリン酸トリエステル基の部分的脱保護を行い、それによって生じた3'-末端リン酸ジエステルと5'-末端水酸基との縮合(分子内環化反応)をトリエステル法により行い、c-di-AMP保護体を得た。最後に、このものの脱保護を行い、標的化合物を合成した。所期目標を達成することができた。(2)c-di-AMP中のリン酸ジエステル基をジチオリン酸ジエステル基に変換した誘導体の合成に向け、その構築単位となる3'-H-ホスホノチオエート体の合成を検討した。まず、アデノシンから4段階で、基質となる3'-水酸基が無保護のヌクレオシドを合成した。ついで、このヌクレオシドから3'-H-ホスホノチオエート体への変換の条件検討を行った。その結果、ピリジン中、塩化ピバロイルを縮合剤に用い、トリエチルアンモニウムホスフィネートを作用させた後、硫黄と反応させることにより、目的化合物が得られることが明らかとなった。今後、関連化合物の生理活性探索を推進する上で、重要な結果を得ることができた。平成23年度の研究実績の概要は、次のとおりである。(1)前年度までに確立した環状ビス(3'-5')ジアデニル酸(以下、c-di-AMPと略す)の液相合成法を用いて、生理活性研究を実施するのに十分なc.di-AMPを合成した。この過程で、脂溶性の高い人工誘導体2'-O-TBDMS-c-di-AMPのキャラクタリゼーションにも成功した。(2)ヌクレオチドのリボースの置換基は、ヌクレオチドの細胞膜透過性、ホスホジエステラーゼに対する安定性、活性部位との親和性と密接な関係があり、それが生理活性に影響を及ぼすことが知られている。そこで前年度開発した方法を基盤として、種々のc-di-AMP誘導体の合成をおこなった。合成効率は、c-di-AMPの場合とほぼ同等で、前年度までに確立した合成方法の汎用性が高いことがわかった。(3)c-di-AMPの生理活性を、枯草菌の芽胞形成率で評価するために条件検討を、共同研究者とともに行った。Bacillus細胞を栄養欠乏培地で培養し、芽胞形成を誘導した後、芽胞形成しなかった細胞を熱処理で殺し、寒天培地で培養して芽胞由来のコロニーの数を測定した。この手法により、芽胞形成率を評価できることが明らかとなった。環状ビス(3'-5')ジアデニル酸(c-di-AMP)の生理活性探索として、淡水域に生息する緑藻類の一種であるクラミドモナスの細胞分裂に焦点をあて、c-di-AMPが細胞分裂に及ぼす効果を調査した。光を照射しながらクラミドモナスを種々の濃度のc-di-AMPを含む標準的な条件下で培養したところ、培養後の細胞数がc-di-AMPの濃度10 μMのときに最大となり、0 μM (コントロール)の条件と比較すると、42%の増殖促進効果が見られた。同一条件下、5'-AMP (5'-アデニル酸)およびcAMP (環状アデノシン一リン酸)の促進効果は、それぞれわずか14%および17%であった。次に、2'位が水素、メトキシ、フッ素で置換されたc-di-AMP誘導体を、これまでに開発した方法により市販のアデノシンホスホロアミダイトから9段階、通算収率28-32%で合成した。これらの誘導体を、先に確立した培養条件で生理活性を調査した。その結果、メトキシ体(45%の増加)> c-di-AMP (41%)>デオキシ体(28%)>フルオロ体(26%)の順に、増殖が促進された。いずれの誘導体も細胞増殖を促進することが明らかとなった。HPLC分析における保持時間から、脂溶性(細胞膜透過性)はメトキシ体がc-di-AMPよりも高いが、生理活性はほぼ同等である。

増殖促進効果には、脂溶性だけではなく、ホスホジエステラーゼとの反応性、受容体との親和性なども影響を与えているものと推測される。所期目標である環状ジアデニル酸の効率的合成法を確立した。さらに、この方法を基盤として、種々の誘導体の合成へと展開することができた。また、枯草菌の芽胞形成率の測定法も確立した。以上のように、多様なc-di-AMP誘導体の合成法およびその生理活性の評価法を確立することができたため。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでに化学合成したc-di-AMPおよびその誘導体を用いて、種々の微生物(バクテリア、カビなど)に対する生物機能・生理活性探索実験を共同研究者とともに実施する。合成化学的には、c-di-AMPの(1)細胞膜透過性の向上および(2)酵素耐性の向上を指向したc-di-AMP人工修飾体の合成を行う。生物機能・生理活性探索研究の結果を参考にして、有用機能を有すると期待されるc-di-AMP人工修飾体の分子設計と創製を行う。加えて、有用な機能を有するc-di-AMP人工誘導体の設計を論理的に行うためには不可欠な、c-di-AMPの機能発現機構の解明に向けて、c-di-AMPと、同物質が作用する受容体タンパク質との複合体を入手するために必要なc-di-AMP人工修飾体も合成する.24年度が最終年度であるため、記入しない。
地球環境情報の高次処理に関する研究

本課題は人工衛星地球観測デ-タの情報処理に対して、(1)解析的手法をにもとづく統合的判読システムの開発(下田)、(2)環境現象の時空間記述モデル及びシミュレ-ション手法の開発(横山)、(3)地球観測情報のデ-タベ-スシステムの開発(高木、安田)、を実施しているものであり、本年度は研究開始から第2年目にあたる。横山はリモ-トセンシングデ-タ及び地理情報を利用したメッシュ型流出モデルを提案し、今年度は解析システムの開発及び北上川の洪水事例(約40例)について評価実験をおこなった。メッシュ型流出モデルでは空間的に変化する流出特性を直接表現できる。結果は貯留関数法などの従来型モデルに比べて、非常に優れた結果を示した。最適流出パラメ-タの決定法について、さらに改良すべき点が残った。高木はNOAA衛星のAVHRR画像から得られる海表面温度分布図のデ-タベ-ス構築の前提として、図毎に観測領域、雲の種類及び広がり、温度分布状態など、分布図が含んでいる情報の特徴を知的情報処理手法を利用して自動抽出する方法を開発し、抽出の評価をおこなった。画像によって特徴を簡略に取出せるものとそうでないものがあり、アルゴリズムの問題点が明らかにされた。安田は主成分分析によるリモ-トセンシング画像のデ-タ圧縮アリゴリズムの開発をおこなっており、植物繁茂状態を観察する目的の利用した事例についての評価をおこなった。下田はリモ-トセンシング画像に対して土地利用分類をおこなうために、クラスタ-分析をもとにした手法を提案して、ランドサット画像についての評価実験をおこなった。分類結果は設定するクラスタ-の数に依存する。解析対象領域の大まかな土地利用状況の特徴を予じめ知識とすることによって、分類精度の改善及び計算時間の短縮が期待され、アルゴリズムの改良をおこなっている。本課題は人工衛星リモートセンシングから得られた地球観測データの情報処理に対して、3つの視点、即ち、(1)解析的手法にもとづく統合的判読システムの開発(下田)、(2)環境現象の時空間記述モデル及びシミュレーション手法の開発(横山)、(3)地球観測情報のデータデースシステムの開発(高木、安田)、から研究を実施しているものである。平成元年度は3ケ年計画の第1年目にあたり、解析処理システムの基本設計を中心にした課題に取り組んた。下田は新しい構想の解析処理システムをワークステーション上で稼動させるシステムの基本設計をおこない、また多時期画像の利用とともに空間情報をも加味して分類精度を向上させる新しいアルゴリズムの開発をおこなった。横山は衛星画像から検出した地表被覆及び積雪域の情報と地理情報システムから得られる情報を総合した流出モデルとして、メッシュ型流出モデルを開発している。従来の流出モでルでは貯留量を記述する変数が流域に対して高々数個であり、流出特性が地形や地表被覆の影響で空間的に変化している効果を必ずしも適切に表現していなかったことに対して、新しいモデルは流域をメッシュに細分化して、流出特性の空間依存性を十分に反映したものとなっている。また衛星から観察した地表温度と各種環境要素との因果関係の新しいモデルの開発もおこなっている。高木及び安田は、衛星観測情報のデータベースを構築するための準備として、利用者からみたときにデータベースに保存すべき情報の内容及び効率的なデータ圧縮の方法に関する手法などの基本的検討をおこないそれらを実現するためのシステムの基本設計を実施した。