hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
光学活性ビニルスルホキシドへの新規立体特異的求核付加反応

この性質を活用することによって高純度4級不斉炭素が収率良く構築できることが明らかになった。スルフィニルのα炭素はアニオン調製した後、あるいはカルボニル基に変換した後、炭素延長可能でありββージ置換ビニルスルホキシドへの求核付加生成物は4級不斉炭素を有する合成ブロックとして活用できる。これらの一連の研究によって、β位の置換基にかかわらずβ位に不斉誘導されること、E体ビニルスルホキシドではγδ位にも不斉誘導されること、コハク酸エステルのエノレ-ト反応では、光学活性シクロペンテノリ誘導体が収率良く合成出来ることなど数多くの事実を明らかに出来た。しかし、これらの特異性を明確に理由付けするには至っていない。これらの成果を基に、今後さらに多くの研究を継続し、スルフィニル基によって作られる反応場の統一的な考え方を示したい。また、本年度研究実施計画の1部であった分子内求核付加反応によるシクロアルカノンの合成は収率が悪いことが分かった。この理由は現在のところ明らかに出来ていない。
尿路結石症と脂質異常症、腎脂肪毒性との関連性についての研究

脂質異常症と尿路結石症の関連性についての臨床的検討においては、本学附属病院泌尿器科外来を受診した尿路結石症患者を登録し、脂質プロファイルや尿路結石重症度および24時間尿化学検査などのデータを収集中である。また、結石の診断のために撮影されたCTにおいて肝臓のCT値を測定しており、脂肪肝と尿路結石重症度や24時間尿化学検査との関連性を検討する予定である。また、健常人における脂質異常症と尿路結石症の関連性についての検討については、企業健診受診者を対象とした検討を計画しており、関連部署と計画について交渉中である。なお、2015年尿路結石症全国疫学調査データの解析については、日本尿路結石症学会による公開が遅れており、データが利用できない状況のあり、着手できていない。腎脂肪毒性による尿細管細胞機能傷害、尿路結石形成過程への影響についての基礎的検討においては、培養尿細管細胞にtriglycerideの沈着を惹起したモデルを作成し、この脂肪沈着モデルを用いてシュウ酸暴露による尿細管細胞傷害、炎症性サイトカインの産生、結石関連高分子物質の産生等について検討中である。また、メタボリックシンドロームモデルラットにおける腎脂肪沈着抑制による結石形成抑制効果の検討については、OLETEFラットにエチレングリコールを投与し、腎結晶沈着を惹起し、チアゾリジン系糖尿病薬による腎脂肪沈着量と結晶沈着抑制効果との関連性を検討中である。計画1-1に記載した2015年尿路結石症全国疫学調査データの解析については、日本尿路結石症学会による公開が遅れており、データが利用できない状況のあり、着手できていない。臨床研究においては、計画1-1に記載の尿路結石全国疫学調査のデータ公開を日本尿路結石症学会に申請し、研究に着手したい。他の臨床研究および基礎研究については計画書に記載の通り進める予定である。
多核金属活性点を有する固体超強酸上での低級アルカン選択酸化

プロパン酸化Cs_<2.5>H_<0.5>PMo_<12>O_<40>を用いてプロパンの酸化反応を行うと、反応生成物は主にアクリル酸,アクロレイン,プロペン,酢酸,CO,CO_2であった。Cs_<2.5>H_<0.5>PMo_<12>O_<40>に種々の金属イオンを添加すると、Ni^<2+>やFe^<3+>の添加で活性が向上し、Fe^<3+>でアクリル酸収率が最大となった。そこで、Cs_<2.5>Fe_<0.08>H_<x+0.26>PV_xMo_<12-x>O_<40>を触媒として反応を行いV^<5+>の置換効果を検討した。転化率はx=0-3でそれぞれ12,15,8,5%となり、x=1て最大となった。選択率もx=0-3でそれぞれ20,30,21,17%となり、x=1で最大となった。したがって、アクリル酸の収率はイソブタンの場合と同様にx=1で最大となった。さらに反応温度を360°Cから380°Cに上げるとアクリル酸収率は13%まで向上し、これまでにV_2O_<5->P_2O_<5->TeO_2触媒等で報告されている10.5%よりも高くなった。エタン,メタン酸化Cs_<2.5>Ni_<0.08>H_<1.34>PVMo_<11>O_<40>やCs_<2.5>Fe_<0.08>H_<1.26>PVMo_<11>O_<40>を用いてメタン,エタンの酸化反応を350-360°Cで行った。エタンの酸化反応の主生成物はエテン,COxで、酢酸は得られなかった。メタンは反応しなかった。反応性の序列は、Cs_<2.5>Ni_<0.08>H_<1.34>PVMo_<11>O_<40>,Cs_<2.5>Fe_<0.08>H_<1.26>PVMo_<11>O_<40>いずれの触媒でも、イソブタン>プロパン>エタン>メタンであった。
視覚系における周辺視特性および中心視と周辺視の相互関連に関する心理物理学的研究

本研究課題においては,Macintosh社のPower Macintosh 9500/132システムを利用した高解像度のカラー・ディスプレイによる色覚実験装置を構成し,実験を行ってきた。この一連の装置は,視知覚の実験を容易に,かつ精密に行えるという点で画期的なものであり,第1章から第3章までに述べたような結果を得ることができた。すなわち,網膜上の様様な感度特性と中心視・周辺視および異方性の関係および網膜中の黄斑色素濃度との関連,色刺激に対する検出反応時間と中心視・周辺視および異方性の関係,周辺視における色覚モデルの構築などである。本研究によって得られた以上のような結果は,基礎研究上で有意義であるだけでなく,報告書中で詳細に述べたように,応用的にも大きな意味を有するものと考えられる。これらの実験の遂行には適切な実験プログラムが不可欠であり,研究の成否は,いかにすぐれたコンピューター・プログラムを作成することができるかに大きく依存するといっても過言ではない。そのため,上述の実験を行うにあたり,プログラム作成とバグ除去等に膨大な時間と労力を費やすことを余儀なくされたという経過があった。今後の研究課題としては,提示刺激の大きさを,さらに大脳皮質視覚領の拡大率(M scaling)を考慮した条件で検討すること,中心視の周辺視における,本研究ではとりあげなかった遂行課題による差異のあらわれ方をみること,中心視と周辺視における課題遂行の精度の比較に注目すること,等がある。本年度は、平成6年度の科学研究補助金で新たに購入したMacintosh社のPower PC8100/80システムを、前年(平成5年)度の科学研究補助金で購入したMacintosh社のQuadra 800システムと組みあわせて効果的に実験ができるように組み上げた。現在まで、当初の予定通り、これらの実験装置を用いて、中心窩から視角で50°位までのこめかみ側、鼻側、中心窩上方・下方の主要4方向の網膜部位において、運動閾、速度知覚、CFFなどを測定し、それらが(1)刺激光の大きさ、(2)空間周波数、(3)刺激光の色などから受ける影響について予備的な実験を行っている。実験装置・刺激の較正は、分担社の日比野が平成3年度の科学研究補助金(奨励研究(A))で購入したミノルタの色彩色差計CL-100システムを用いて行ってきた。また、同時にこれまでのデータを基に周辺視色覚のモデルの構築も行ってきた。これに関しても順調に興味深い結果が得られつつある。その成果の一部は、論文『色:最近の研究動向』(Vision誌掲載)として発表される。現在まで、2°視野の等色関数と10°視野の等色関数とは、その色覚メカニズムとの関係という観点からほとんど考慮されてこなかった。しかし、この周辺視のモデルが完成すると、その両者の関係が色覚メカニズムの点から非常にうまく説明できるようになるものと予想される。このモデルの完成は、次年度の予定である。したがって、これらの点から、本件球には人間の色覚のメカニズムにおける中心視と周辺視の相違についての非常に大きな貢献が期待できる。本研究課題においては、Macintosh社のPowerPC8100/80システムを利用した高解像度のカラー・ディスプレイによる色覚実験装置を構成し、実験を行ってきた。この一連の装置は、視知覚の実験を非常に容易に、かつ精密に行えるという点で画期的なものであり、現在まで、本研究課題について、様々な興味深い結果を明らかにしつつある。特に、現在の色覚モデルでは、暗黙のうちに、中心窩色覚と周辺視色覚は本質的相違はないと考えられているが、yellow-blueの反対色過程は中心視と周辺視では変換式が異なることが明らかになってきた。そして、この結果を基に周辺視における色覚モデルを構築したが、このモデルは2°視野と10°視野の標準観測者の特性を統一的に説明できるものである。また、中心窩および網膜周辺部位における色刺激に対する反応時間の測定の結果、視方向による異方性なども明らかになりつつある。

本研究課題は、以上のような成果をあげ、現在も進行中であるが、最終的な成果を報告書として提出するにはもう少し時間が必要である。それは、現在行っている主要な実験が、実験プログラムのバグ等のために予定よりも遅れてしまい、未だ予備実験の段階に留まっているため、最終的な結論を導くに至っていないからである。しかし、今後は、中心窩および網膜周辺部位におけるCFF、運動閾、運動の速度知覚などの問題も扱う予定であり、今までの成果と合わせ、中心視と周辺視の特性の研究に大きな貢献が期待できるものと思われる。
政府機構改革の研究

本研究の成果として挙げられるのは、まず、中央省庁等改革関連立法、とりわけ内閣府設置法の制定と内閣法及び国家行政組織法の改正についての理論的検討である。そこでは、行政改革会議の最終報告や中央省庁等改革基本法の趣旨をふまえつつ、それらの立法が一連の行政改革においていかに位置付けられるかが検討された。内閣法、内閣府設置法及び国家行政組織法の整合的な逐条的検討がその成果の一つである。また、内閣法の理論的検討においては、内閣及び内閣総理大臣の権限強化といわゆる分担管理原則について、従来必ずしも相互交流的ではなかった、行政組織理論と憲法理論との双方に目配りをした考察をおこなった。もっとも、これは改革立法成立時点における検討であり、今後の運用をふまえてさらなる理輪的構築をすることが課題となる。他方、もう一つの本研究の成果は、政府機構の周辺的な組織と位置付けられる、特殊法人や独立行政法人といった公法人、さらには公的任務を遂行する私法人についての理論的検討である。まず第一に、行政改革の前提となる議論、すなわち国家と私人間の任務の分担ないしは協働の可否及び条件が検討され、次いで、法人の諸類型の性質決定をする作業をおこなった。最後に、それらをふまえた上で、行政改革の一環として制定された独立行政法人通則法についての実証的な検討がなされた。これについては、各法人についてその性質がどのように位置づけられるのかという個別的な検討が今後の課題として残されている。本研究をはじめるにあたって、研究の対象とした事項は,1.内閣及び内閣総理大臣の機能強化,2.内閣府による調整その他省間調整,3.政策評価の仕組み,4.独立行政法人制度の創設,5.大括り省編成のもつ諸般の意味であった。まず,4.については,山本が,「独立行政法人」(ジュリスト1161号,1999年127135頁)において検討したことを引き継ぎつつ,独立行政法人の行政組織上の位置付けを,主としてドイツ公法学における議論を参照しつつ,民主制原理との関係の分析を通じて明らかにした。3.については,2000年7月19日に講師として伊藤正次氏(日本学術振興会特別研究員)を招き,自治体における政策評価の制度・運用に関する検討を行った。それを踏まえ,先進的な自治体の一つである北海道の制度ないし運用を調査するため,北海道庁を訪問し(併せて,国の地方支分部局における取組みを調査するため,北海道行政監察局を訪問した),北海道における政策評価の仕組み「時のアセスメント制度」の制度・運用事例についてヒアリングを行った。最後に,相互に関連する1.2.5.の論点についても小早川,山本,太田の各々が検討を,別欄に掲げる論稿をものにした。内閣法、内閣府設置法及び国家行政組織法の整合的な遂条的検討がその成果の一つである。もっとも、これは改革立法成立時点における検討であり、今後の運用をふまえてさらなる理論的構築をすることが課題となる。他方、もう一つの本研究の成果は、政府機構の周辺的な組織と位置付けられている、特殊法人や独立行政法人といった公法人、さらには公的任務を遂行する私法人についての理論的検討である。まず第一に、行政改革の前提となる議論、すなわち国家と私人間の任務の分担ないしは協働の可否及び条件が検討され、次いで、法人の書類型の性質決定をする作業をおこなた。
ポリフィリン金属錯体固定化担体の人工固体酵素としての機能とその分析学的応用

(1)Tetraphenylporphine金属錯体から酸塩化物を合成した.ついで,ガラスビーズやシリカゲルに,スルフォナミドまたはアミド結合で,ポルフィリン金属錯体を固定化することができた.(2)上記(1)で得られた種々のMP担体のペルオキシダーゼ様機能を色素生成反応などを用いて検討した結果,人工固体酵素としてMP担体を用いることができること、および過酸化水素の定量法(バッチ法)に利用できることを明らかにできた.(3)最も高いペルオキシダーゼ様活性を持つMP担体やMP固定化イオン交換樹脂を固定化ペルオキシダーゼの代用として用いる過酸化水素のフロー分析法を開発できた.さらに,MP担体用いる有機過酸化物のフローインジェクション分析法も開発することができた.(4)Co^<3+>-ポルフィリン固定化シリカゲルのアスコルビン酸酸化触媒機能を利用するアスコルビン酸の定量法とアスコルビン酸のフローインジェクション分析法を開発した.(5)MP担体のグルタチオンに対する酸化触媒機能を検討した結果,多くのMP担体は,グルタチオンペルオキシダーゼ様機能を持つが,コバルトを含むMP担体は,グルタチオンオキシダーゼ様機能を持つことがわかった.(6)金属オクタブロモポルフィン誘導体を合成し,その共鳴ラマンスペクトルで検討した結果,ンガンイオンの酸化/還元サイクル(Mn^<3+>⇔Mn^<4+>)が,過酸化脂質に対するペルオキシダーゼ様酵素機能に大きく関与していることを明らかにした.(7)A)金属ポルフィリンのペルオキシダーゼ様機能を応用したI_2-イオン選択性電極を開発した.B)銅フタロシアニン固定化シリカゲルは,多環性芳香族化合物と強いπ-π電子相互作用を持ち,HPLC用充填剤として有用であることを見出した.(1)Tetraphenylporphine金属錯体から酸塩化物を合成した.ついで,ガラスビーズやシリカゲルに,スルフォナミドまたはアミド結合で,ポルフィリン金属錯体を固定化することができた.(2)上記(1)で得られた種々のMP担体のペルオキシダーゼ様機能を色素生成反応などを用いて検討した結果,人工固体酵素としてMP担体を用いることができること、および過酸化水素の定量法(バッチ法)に利用できることを明らかにできた.(3)最も高いペルオキシダーゼ様活性を持つMP担体やMP固定化イオン交換樹脂を固定化ペルオキシダーゼの代用として用いる過酸化水素のフロー分析法を開発できた.さらに,MP担体用いる有機過酸化物のフローインジェクション分析法も開発することができた.(4)Co^<3+>-ポルフィリン固定化シリカゲルのアスコルビン酸酸化触媒機能を利用するアスコルビン酸の定量法とアスコルビン酸のフローインジェクション分析法を開発した.(5)MP担体のグルタチオンに対する酸化触媒機能を検討した結果,多くのMP担体は,グルタチオンペルオキシダーゼ様機能を持つが,コバルトを含むMP担体は,グルタチオンオキシダーゼ様機能を持つことがわかった.(6)金属オクタブロモポルフィン誘導体を合成し,その共鳴ラマンスペクトルで検討した結果,ンガンイオンの酸化/還元サイクル(Mn^<3+>⇔Mn^<4+>)が,過酸化脂質に対するペルオキシダーゼ様酵素機能に大きく関与していることを明らかにした.(7)A)金属ポルフィリンのペルオキシダーゼ様機能を応用したI_2-イオン選択性電極を開発した.B)銅フタロシアニン固定化シリカゲルは,多環性芳香族化合物と強いπ-π電子相互作用を持ち,HPLC用充填剤として有用であることを見出した.金属ポルフィリン(MP)担体を酵素に代わる人工固体触媒として開発する研究全体の目的のうち,平成7年度には,下記の成果などを得た.(1)Tetrapheny1porphine金属錯体からクロルスルホン酸を用いてスルホニルクロライド化物を,Protoporphyrin金属錯体やTetrakis(carboxypheny1)porphine金属錯体からチオニールクロライドで酸クロライド化物を合成した.ついで,アミノ基を持つガラスビーズなどに,スルホンアミドまたはアミド結合で,銅,コバルト及びマンガン-ポルフィリン金属錯体を固定化することができた.(2)上記(1)で得られた種々のMP担体のペルオキシダーゼ様機能を,4-アミノアンチピリン・フェノール系による色素生成反応などを用いて,検討した.その結果,人工固体酵素としてMP担体を用いるることができることを明らかにし,さらに,過酸化水素の定量法(バッチ法)に利用できる可能性もあることを明らかにできた.(3)上記(2)の検討の結果を踏まえ,最も高いペルオキシダーゼ様活性を持つMP担体を固定化ペルオキシダーゼの代用として用いる過酸化水素のフロー分析法の開発を試みた.その結果,MP担体の固定化ペルオキシダーゼの代用として、利用できることがわかった.なお,この際に,購入したHPLC用のポンプをフロー用に代用した.なお,反応系としては,現在,4-アミノアンチピリン・フェノール系および4-アミノアンチピリン・ジエチルアニリン系による呈色反応を主に用いてた.(4)一方で,MP担体は,イオン交換樹脂に固定したもの(MP樹脂)の場合に比べ,目的成分や基質の吸着がほとんどないなどの利点を持っていたが,アルカリ性下でやや不安定であるなどの欠点も見付かった.今後,これらの点も踏まえ,研究を成し遂げたいと考えている.

(1)Tetraphenylporphine金属錯体からクロロスルホン酸を用いてスルホニルクロライド化物を,Protoporphyrin金属錯体やTetrakis(carboxyphenyl)porphine金属錯体からチオニールクロライドで酸クロライド化物を合成した.ついで,アミノ基を持つガラスビーズなどに,スルホンアミドまたはアミド結合で,銅,コバルト及びマンガン-ポルフィリン金属錯体を固定化することができた.(2)上記(1)で得られた種々の金属ポルフィリン個体化(MP)担体のペルオキシダーゼ様機能を,4-アミノアンチピリン・フェノール系による色素生成反応などを用いて,検討した.その結果,人工固体酵素としてMP担体を用いることができることを明らかにし,さらに,過酸化水素の定量法(バッチ法)に利用できる可能性もあることを明らかにできた.(3)上記(2)の検討の結果を踏まえ,最も高いペルオキシダーゼ様活性を持つMP担体を固定化ペルオキシダーゼの代用として用いる過酸化水素のフロー分析法の開発を試みた.この際,反応系としては,4-アミノアンチピリン・フェノール系による呈色反応を主に用いた.(4)金属ポルフィリンのペルオキシダーゼ様機能を応用したI_3-イオン選択性電極の利用を試み,この電極が過酸化水素選択性電極としても利用できることを明らかにした.(5)金属オクタブロモポルフィン誘導体を合成し,その過酸化脂質に対するペルオキシダーゼ様機能を検討し機能を持つことを明らかにした.(6)上記(5)の反応メカニズムを共鳴ラマンスペクトルで検討し,中心金属の酸化/還元が酵素機能に大きく関与していることを明らかにできた.なお,この手法をMP担体にも適用する予定である.(1)Tetraphenylporphine金属錯体のスルホニルクロライド化物およびProtoporphyrin金属錯体やTetrakis(carboxyphenyl)porphine金属錯体の酸クロライド化物を、スルホンアミドまたはアミド結合で,アミノ基を持つガラスビーズに固定化すれば、MP担体を合成できること明らかにしてきた。(2)昨年度の過酸化水素の定量法(バッチ法)開発結果を踏まえて、最も高いペルオキシダーゼ様活性を持つMP担体を固定化ペルオキシダーゼの代用として用いる過酸化水素のフロー分析法の開発を試みた.その結果、反応系として,4-アミノアンチピリン・フェノール系による呈色反応を用いれば、感度良く過酸化水素をフロー分析できることを明らかにできた.(3)昨年度合成した金属オクタブロモポルフィンを固定化した担体について,その過酸化脂質に対するペルオキシダーゼ様機能をより詳しく検討した.さらに、その触媒メカニズムを共鳴ラマンスペクトルで検討し,マンガン錯体の場合、マンガンイオンの酸化/還元サイクル(Mn^<3+>⇔Mn^<4+>)が、過酸化脂質に対するペルオキシダーゼ様酵素機能に大きく関与していることを明らかにした.(4)MP担体のグルタチオンに対する酸化触媒機能を検討した。その結果、多くのMP担体は、グルタチオンペルオキシダーゼ様機能を持つが、コバルトを含むMP担体は、グルタチオンオキシダーゼ様機能を持つことがわかった。さらに、この機能を用いれば、グルタチオンを定量できる可能性があることも明らかにできた。
複合災害予測手法に関する基礎的研究ー長崎県を例としてー

総合的な災害予測図を作成するための基礎となる複合災害について考えをまとめ、予測手法を構築することを目的として、最近複合災害が多く発生している長崎県を模式地として研究を行った。雲仙普賢岳噴火に伴う影響は、比較的大規模な火砕流の流下に基づくもの、比較的大規模な火砕流に伴われた火砕サージ、ブラーストによるもの、火砕流・火砕サージの噴煙からもたらされた火山灰によるもの、土石流によるものが主なものであった。火山灰の降下範囲や降灰量の特徴をつかむため、普賢岳を取り囲む多数の観測点を設定し、降灰量を経時的に調査し、時期別の降灰量分布図を作成した結果、季節的な降灰の特性と季節を越えての共通性があることが分かった。地震及び豪雨災害に起因した複合災害と総合的な災害予測手法を2つの観点から取り組んだ。1.地震入力、斜面崩壊危険度、液状危険度など複数の予測図をオーバーレイし、総合危険度として予測図を作成する方法の有効性を示した。そして、1982年長崎水害、1991年台風19号の被害を含め、長崎市における地域資料を収集し、各種のマップを作成し、それらのオーバーレイを試みた。2.地震及び豪雨による斜面崩壊予測に関する手法を収集整理し、比較検討を行った。その中で、地震力や降雨量の外的作用以外にも斜面形状などの要因が異なることを明らかにした。簡易方法による地震が襲った場合の斜面崩壊危険地区の検討を島原半島で行い、さらに詳細な方法による地震時に崩壊する可能性の高い斜面の抽出を眉山で行った。
活性酸素による前駆細胞を標的とした多発性骨髄腫に対する治療法開発のための基盤研究

難治性造血器腫瘍である多発性骨髄腫において、骨髄腫細胞および骨髄腫前駆細胞の増殖制御には、NF-κBシグナルが重要であり、骨髄腫前駆細胞では活性酸素(ROS)に対する感受性が高かった。新たに見出したNF-κB阻害活性を有するTM-233は、ROSの産生を介して骨髄腫細胞および前駆細胞の増殖を抑制し細胞死を誘導した。また、細胞周期チェックポイントキナーゼWEE-1阻害薬MK-1775は、DNA損傷を介して骨髄腫細胞の細胞死を誘導した。以上より、新規NF-κB阻害薬TM-233および細胞周期チェックポイント阻害薬MK-1775は骨髄腫に対する新たな治療薬となり得ると考えられた。概要多発性骨髄腫は治癒の難しい造血器腫瘍であるが、その分子病態に関する解析研究が進歩し、骨髄腫細胞の増殖に必要なシグナル伝達機構についての理解が進んできた。特に、転写因子NF-κBや骨髄間質細胞から産生されるIL-6, VEGFなどの造血因子は骨髄腫細胞の増殖に必須である。これらの転写制御に活性酸素(ROS)が関与していることが知られているが、ROSを介する転写因子や造血因子産生を制御することは多発性骨髄腫の根治を目指した新たな治療法開発に直結する重要な意義を有する。本研究は、生体侵襲の少ない生理活性物質などを用いてROSを介するヒト骨髄腫前駆細胞を標的にした新たな治療法を開発し、多発性骨髄腫の治療成績向上の基盤となることを目的とした。これまでに、われわれは新たなNF-κB阻害活性を有する化合物TM-233を東南アジアに自生する植物の根茎より抽出した1'-acetoxychavicol acetate (ACA)を構造展開することで合成した。今年度は、TM-233およびWnt/β-catenin, NF-κB, JAK/STATなどのシグナル伝達阻害物質の骨髄腫細胞および前駆細胞に及ぼす影響について検討した。本研究においては、最終的に生理活性物質を中心とした新たな骨髄腫治療の候補となる化合物を探索することも目的とするため、骨髄腫細胞の増殖に必須のシグナルを阻害した際の骨髄腫細胞の動態解析とROSとの関連にも注目し、その候補化合物を明らかにした。また、臨床的には大きな問題となっているプロテアソーム阻害薬ボルテゾミブ耐性のメカニズムの一端とTM-233による耐性克服の可能性について明らかにした。理由本研究は多発性骨髄腫の根治を目指した新たな治療法開発を目的とするために、治療の直接の標的となるのは骨髄腫前駆細胞である。骨髄腫前駆細胞を分離する系に関しては確立されたが、一般に骨髄腫前駆細胞の占める割合が極めて低いため、前駆細胞を用いた生理活性物質を用いた増殖制御機構やシグナル伝達機構の解析が遅れている。この点を克服するには骨髄腫前駆細胞の増幅方法を明らかにする必要があるが、前駆細胞の形質を維持したまま増幅する技術開発にはなお時間を要する。上記技術開発を進めるとともに、種々の骨髄腫細胞株および患者骨髄腫細胞を用いての解析研究を進めている。その結果、われわれが合成した新規NF-κB阻害物質TM-233はNF-κBおよびJAK/STAT系を阻害することにより強力に骨髄腫細胞の細胞死を誘導するとともに、ボルテゾミブ耐性細胞に対してもキモトリプシン様活性およびカスパーゼ活性を抑制し、耐性細胞の細胞死を誘導することを見出した。また、骨髄腫細胞の増殖に重要な役割を果たすWnt/β-cateninシグナルを特異的に阻害するICG-001を用いて検討したところ、c-Myc, survivinの発現低下を関して、ボルテゾミブ耐性細胞の細胞死が誘導された。また、T-LAK cell-originated protein kinase (TOPK)を特異的に阻害することにより、ボルテゾミブ感受性骨髄腫細胞のみならず耐性細胞の増殖を抑制し、細胞死を誘導することを明らかにした。興味深いことに、TOPK阻害薬は骨髄腫治療に大きな貢献を果たしている免疫調節薬レナリドミド耐性細胞に対しても、低濃度でその細胞死を誘導した。これらの結果は、当初予想していなかったものであり、今後もその分子作用機構の解明やROSとの関連性についての検討を進める予定である。多発性骨髄腫の分子病態を基盤にした新たな治療法を開発することを目的に研究を遂行している。今年度は、骨髄腫細胞の増殖・分化に必須なシグナル伝達分子としてのNF-κBシグナルと細胞周期のチェックポイントキナーゼであるWEE1を標的にした検討を行うとともに活性酸素(ROS)の関与について解析を行った。申請者により新たに合成されたNF-κB阻害剤TM-233を用いた昨年までの検討で、TM-233は骨髄腫細胞においてNF-κB p65に直接結合し、NF-κB活性を抑制することを明らかにした。今年度は、TM-233がプロテアソーム阻害薬ボルテゾミブ耐性骨髄腫細胞の細胞死を誘導することを明らかにしたが、TM-233はキモトリプシン様活性とともにカスペース様活性を抑制することがボルテゾミブ耐性骨髄腫細胞に対しても有効であることが明らかになった。骨髄腫前駆細胞への影響についてSP分画を用いて検討したところ、TM-233はROSを産生し骨髄腫前駆細胞の細胞死を誘導した。今年度は、細胞周期チェックポイントキナーゼであるWEE1に注目し、その特異的阻害薬MK-1775による骨髄腫細胞に対する効果を検討した。

MK-1775は種々の骨髄腫細胞の増殖を時間および濃度依存性に抑制し細胞死を誘導した。MK-1775は骨髄腫細胞のBCL-2およびMCL-1の発現を抑制し、caspase3を活性化した。さらに、H2AXの発現を増加することより、WEE1阻害は、骨髄腫細胞におけるROSを介した直接的なDNA損傷が関与していると考えられた。さらに、興味深いことに骨髄腫細胞のTP53の状況によってMK-1775の効果が異なり、TP53欠失細胞においてはより効果があることも明らかになった。また、ボルテゾミブ耐性骨髄腫細胞にも効果を有するために、TM-233との併用効果についても検討している。本研究はこれまでにない多発性骨髄腫の治療を開発するために、骨髄腫前駆細胞を直接の標的とした治療法開発を目的としている。研究の前段階としては、まず骨髄腫細胞そのものに効果を有する新規化合物を見出す必要があり、この点に関してはこれまでの申請者の実績も含めると概ね順調に進展していると考えている。骨髄腫細胞の増殖に必須の分子を標的にした多くの化合物や生理活性物質を明らかにすることができた。しかしながら、骨髄腫細胞株を用いた検討ではSP分画の分離などは再現性をもって実施できているが、患者検体からの前駆細胞の分離は、その割合が極めて低いために系の確立に遅れが生じている。今後は、細胞株のみならず患者検体においても前駆細胞分画の安定的な分離システムを確立する必要があると考えている。上記の問題の克服とともに、骨髄腫細胞に対する新規治療薬候補の解析研究は引き続き進めていく予定である。すでにNF-κB、JAK/STAT系、Wnt/β-cateninnシグナルに関してはそれらを阻害する新たな化合物を見出しており、今年度は新たに細胞周期チェックポイントキナーゼ阻害による研究にも着手しているので、これらの成果を当初の目的である骨髄腫前駆細胞にも応用すべく、研究を進展させる予定である。免疫チェックポイントキナーゼWEE1が直接DNA損傷をもたらしたことは、活性酸素(ROS)の関与を示唆しており、より詳細なROSのアッセイ系の確立と導入が必要であると考えている。研究実績の概要研究期間内に活性酸素(ROS)を介する多発性骨髄腫の増殖制御に必須な分子として転写因子NF-κBシグナルと細胞周期チェックポイントキナーゼWEE-1を標的とした解析が重要であることを明らかにした。申請者が新たに見出したNF-κB阻害活性を有するTM-233は、骨髄腫細胞のNF-κB p65サブユニットに直接結合して骨髄腫細胞の増殖を抑制し細胞死を誘導した。さらに、TM-233はROSの産生を介し、プロテアソーム活性のうちキモトリプシン様活性とともにカスパーゼ様活性を抑制し、種々の骨髄腫細胞のみならず、ボルテゾミブ耐性骨髄腫細胞の細胞死も誘導した。また、TM-233の骨髄腫前駆細胞に対する効果についてSP分画を用いて検討を行なった。細胞周期チェックポイントキナーゼWEE-1阻害剤MK-1775は骨髄腫細胞のmitosisを介して細胞死を誘導した。DNA損傷を誘導する種々の薬剤とMK-1775の併用効果について検討したところ、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤とMK-1775の併用により、骨髄腫細胞は効果的に細胞死が誘導された。WEE-1阻害は、骨髄腫細胞におけるROSを介した直接のDNA損傷効果が関与していると考えられた。
セマフォリン３Ｅ／プレキシンＤ１経路の制御による脈絡膜新生血管の治療法開発

セマフォリン3Eを投与することが、滲出型加齢黄斑変性の治療に応用出来るかを調べるため、動物モデルでその効果を検討した。対象にはこの疾患の動物モデルであるレーザー誘発脈絡膜新生血管を用いた。結果、セマフォリン3Eの投与で脈絡膜新生血管の拡大が抑制され、受容体であるプレキシンD1がなくなるとこの効果が消失することが分かった。この受容体は正常の組織にはほとんど発現がないことから、もし治療が実現した場合、現行の治療と比べてより異常な部位のみに作用するものとなることが期待出来る。Semaphorin3EはPlexinD1に結合することで、血管内皮細胞の糸状仮足の退縮を促し、特に発生期において血管系構成のガイダンスとして働くことが知られている。本研究ではこのSemaphorin3E/PlexinD1シグナル経路の加齢黄斑変性発症・進展への影響を、マウスでのレーザー誘発脈絡膜新生血管モデルを用いて検証した。結果、脈絡膜新生血管の組織中にPlexinD1が発現しており、レーザー誘発後5日目で有意に発現がupregulateされていること、Semaphorin3E投与により脈絡膜新生血管の面積が縮小すること、この効果はPlexinD1 KOマウスでは消失することを示し、関連学会での発表、論文の投稿を行った。この結果はSemaphorin3E/PlexinD1の経路が脈絡膜の血管新生にも関わっていることを初めて示したものである。現在当該疾患の治療に用いられている抗血管内皮増殖因子療法は頻回の治療、高額な費用に加え、長期投与による副作用も指摘されつつある。今回の研究対象であるPlexinD1は正常の血管にはほとんど発現していないことから、抗血管内皮増殖因子治療と比較して、病的な血管新生のみを抑制することで、より選択的な治療となる可能性がある。この効果がより高等の動物でも見られるかどうか、選択的な治療であることで副作用を抑制することにつながるのかどうかについては今後検討を重ねる必要がある。本研究の目的はSemaphorin3E/PlexinD1の経路が加齢黄斑変性の病態にも関与しているか、およびこの経路の制御によって加齢黄斑変性の発症、進行が抑制出来るか、を動物モデルを用いて検討するものである。動物モデルとしてはマウスでのレーザー脈絡膜新生血管モデルを用いた。我々はまず免疫組織染色を用いて脈絡膜新生血管組織中にPlexinD1が発現していることを確認し、RT-PCRを用いて、Semaphorin3E, PlexinDの発現はレーザー照射5日後にそれぞれ0.38倍、1.72倍と有意に変化していることを見い出した。次にレーザー照射直後にSemaphorin3E蛋白を様々な用量で硝子体内に投与し、脈絡膜新生血管の抑制効果があるかを調べたところ、0.05μg以上を投与するとコントロールと比較して脈絡膜新生血管の抑制効果が見られることを見いだした。最後にSemaphorin3E投与による脈絡膜新生血管抑制が、PlexinD1受容体を介したものか調べるため、PlexinD1コンディショナルノックアウトマウスを用いて、同じ実験を行ったところ、P=0.068とかろうじて有意ではないものの、野生型で見られた脈絡膜新生血管の抑制効果が失われる傾向を観察した。これらの結果は、当該経路が脈絡膜新生血管の形成過程に関与しており、この制御が治療につながるものと考え、厚生労働省の研究斑会議にて概要を発表した。2年間で考えていた実験計画のうち、大半を過年度中に遂行することが出来た。今後の実験は主にノックアウトマウスの維持、繁殖を要する系のため、これまでより多少長めの時間を要すると思われるが、本年度中には結果をまとめ投稿することが十分に可能と考える。有意差が出ていないPlexinD1ノックアウトマウスでの実験でnを追加する。reviseに備え、semaphorin3E, PlexinD1の発現をそれぞれWestern blottingを用いてタンパクレベルでも確認する。またSemaphorin3Eノックアウトマウスも既に入手、繁殖しておりこれも用いて脈絡膜新生血管が大きくなるか検証する。動物の管理費、免疫染色、硝子体投与に用いる試薬、Western blottingのキットなどが主な使途となる予定である。その他、成果を国際学会で発表するための出張費や、論文投稿時の英文校正などに使用する。
神経筋伝達を担うアセチルコリン受容体の発現制御シグナルの解明

神経筋シナプス(NMJ)は運動神経による骨格筋の制御に必須であり、その喪失は呼吸を含めた運動機能の喪失を招く。哺乳動物のNMJはアセチルコリン(ACh)を伝達物質とするシナプスであり、その機能には筋管細胞におけるACh受容体(AChR)遺伝子の発現が必須である。本研究では、数理解析とオミクス解析の手法を用いてAChR発現制御シグナルを統合的に理解するとともに、マウス個体におけるAChR発現制御シグナル分子群の機能解析と、NMJ関連疾患における当該分子群の異常の探索を推進し、その生理学的・病態生理学的な意義を解き明かす。
大規模計測データに対する正則化統計モデリング手法の開発

各個体が時間の経過などに応じて繰り返し計測値を得た経時測定データから,有効な情報を集約して抽出するための統計的モデリング手法の開発を行った.本研究では特に,経時測定データを関数として処理し解析対象とする関数データ解析において,モデル推定と同時に変数選択を行うことができるスパース正則化を適用するための推定,評価の手順を構築した.さらに,提案手法を実際のデータへ適用し,手法の有効性の検証や新たな知見獲得を行った.観測された高次元データに対して、有用な情報を抽出するための統計的モデリング手法を構築した。本研究では、下記の二つの内容に関して二本の論文を執筆し、論文誌に投稿中である。スパース正則化は、回帰モデルの係数パラメータにL1ノルムの制約を課した推定法で、制約の性質からモデル推定と変数選択を同時に行える手法として近年の統計科学の分野で最も多く利用されている手法の一つである。本研究では、ロジスティック回帰モデルに対して、すべての群の組み合わせに対する判別境界を選択できる制約を提案し、その制約に基づく推定のアルゴリズムと、推定モデルの評価法を導出した。提案手法をベンチマークデータに適用し、推定結果から各変数における判別能力の程度を示すことができた。一つの個体が時点や位置などに応じて複数の観測値を得た形式のデータは「繰り返し測定データ」とよばれている。繰り返し測定データに対するアプローチの一つである関数データ解析は、離散時点観測されたデータを関数化処理し、得られた関数をデータとして扱う解析方法であり、繰り返し測定データ解析における問題点を解消できる。本研究では、目的変数と複数の説明変数が共に関数データとして与えられたとき、これらの関係を表現するための回帰モデルを構築した。特にここでは、両変数間の時間の因果関係を考慮したモデルについて考察した。そして、スパース正則化に基づく推定を通して、関数データとして与えられた説明変数の選択を行った。提案した手法を気象学のデータに適用し、台風の進路に影響を与えている気象情報の選択を行った。観測された高次元データに対して、有用な情報を抽出するための統計的モデリング手法を構築した。本研究では、下記の内容に関して論文を執筆し、論文誌に投稿中である。スパース正則化は、回帰モデルの係数パラメータにL1ノルムの制約を課した推定法で、制約の性質からモデル推定と変数選択を同時に行うことができる手法として、近年の統計科学の分野で最も多く利用されている手法の一つである。本研究では、関数データとして与えられた説明変数と、スカラーとして与えられた目的変数がいずれも多変量データのとき、これらの関係性を包括的にモデル化する関数多変量回帰モデルに対して、スパース正則化を適用することで説明変数を選択する方法について研究した。関数多変量回帰モデルでは、一つの説明変数に関連するパラメータが複数与えられるため、スパース正則化を用いて変数選択を行う場合、その制約の形状が重要となる。本研究では、その形状を構築するとともに、パラメータの推定量を導出するためのアルゴリズム、および推定されたモデルを評価するための基準を導出した。また、スパース正則化に関する最近の研究に、bi-level selectionとよばれる手法がある。これは、説明変数がいくつかのグループに分割される場合、説明変数を個々に、かつグループとして一括して選択するための方法であり、遺伝子データ解析などに応用されている。本研究では、近年提唱されている複数のbi-level selectionの手法に対して、予測精度および正しい変数を選択する精度を数値的に比較、検証した。本研究では主として、データが経時的に測定された場合、これらを集約して関数として処理し解析を行う関数データ解析において、そのモデリング手法の開発や実際のデータへの適用を行った。データの関数化においては、基底関数展開に基づく混合効果モデルを適用する方法が有効である。本研究では、混合効果モデルによって関数化されたデータをクラスタリングする方法について検討し、気象学などのデータへ適用した。また、難病指定されている疾病に対する治療において、予後の良・不良に関連する遺伝子を選択するための方法論についても検討した。データとしては、遺伝子発現量が治療後に経時測定されているため、これらを関数データとして扱った。また、このような変数選択問題においては、スパース正則化とよばれる、モデル推定と変数選択を同時に行うことができる手法が有効に機能する。本研究においてスパース正則化を適用することで、生物学的に重要と考えられている遺伝子を、統計的モデリングによっても重要なものとして選択することに成功した。また、スパース正則化そのものに対する方法論についても研究を行った。スパース正則化の一種であるbi-level selectionを、判別問題に用いられるロジスティック回帰モデルに対して適用することで、変数と同時に決定境界の選択も行うことができる。本研究では、そのための正則化の形状および、推定アルゴリズムの構築を行った。そして、提案手法を実際のデータへ適用しその有効性を検証した。以上の研究は論文として採択済みである。このほか、目的変数が説明変数と同様に関数データとして与えられたとき、これらの因果関係を表した関数回帰モデルに対して、スパース正則化を適用することで変数選択を行う方法についても研究した。研究成果は論文として執筆し現在投稿中である。各個体が時間の経過などに応じて繰り返し計測値を得た経時測定データから,有効な情報を集約して抽出するための統計的モデリング手法の開発を行った.

本研究では特に,経時測定データを関数として処理し解析対象とする関数データ解析において,モデル推定と同時に変数選択を行うことができるスパース正則化を適用するための推定,評価の手順を構築した.さらに,提案手法を実際のデータへ適用し,手法の有効性の検証や新たな知見獲得を行った.関数多変量回帰モデルに対するスパース正則化に関しては、提案した推定法および評価法によって、既存手法に比べて,予測の観点や正しいモデルを選択するという観点から、既存の手法よりも優れた結果を得ることができた。この点から、本研究は順調に進展していると考えられる。提案手法を実際のデータに適用することでも、その効果を明確に示すことができた。一方で,関数多変量回帰モデルの推定量に対する理論評価を行いたかったが、この点は達成できなかった。また、bi-level selectionのための手法の数値比較に関しては、手法ごとの予測および変数選択の精度を様々な設定で比較することができた。しかし、bi-level selectionは特に近年多くの手法が提案されており、そのすべてを網羅することはできなかった。統計科学関数多変量回帰モデルの理論評価を完成させる。推定パラメータの漸近分布や、推定量が一致性を持つための条件を導出することで、推定量の性質を理論面から検証する。今年度の研究で扱った関数回帰モデルでは、説明変数間の相互作用を考慮していなかった。しかし近年、変数間の相互作用の情報を取り入れたモデリングがいくつか報告されている。本研究でも、変数間の相互作用を考慮に入れたモデルを想定し、スパース正則化を適用することで、データに内在する必要な情報を明らかにする。また、関数データに対する多群判別問題に対してbi-level selectionを適用することで、関数データの変数だけでなく、判別境界も同時に選択できるようになる。今後の方針として、関数ロジスティック回帰モデルに対してbi-level selectionを行うための制約を構築し、モデルを推定するためのアルゴリズムと、推定されたモデルを評価するためのモデル評価基準を導出する。さらに、手法の有効性を、シミュレーションデータの解析を通して検証する。ロジスティック回帰モデルに対するスパース正則化に関しては、提案した推定法および評価法によって、研究目的に即した結果を得られることが数値実験を通して検証できた。この結果を論文としてまとめることができた点から、本研究は順調に進展していると考えられる。提案手法を実際のデータに適用することでも、その効果を明確に示すことができたが、そこからデータに対する新たな知見などを得ることについては難しかったという点では、さらに進展の余地があったと考えられる。関数データに基づく回帰モデルの推定についても、モデルの推定、評価法を構築できた上、この結果を論文としてまとめることができた。一方で、このモデルの推定では時間の因果関係として、どの時点までをモデルに含めるかという点でのモデル選択の問題も残っている。この点については解決方法を得ることができなかった。
上皮・内皮細胞シートのバリアー機能におけるクローディンの役割:バリアー不全に基づく種々の病態の解明を目指して

多細胞生物では、皮膚や消化管内部を覆う上皮細胞シートが、外界との間を仕切るバリアーとして、自己防衛の最前線で働いている。また、多細胞生物の体は、いくつもの環境の異なる部屋に分かれているが、これらを仕切っているのも、上皮や内皮の細胞シートである。しかし、強く機械的に結合している細胞間でも物質は自由に通過できるので、何らかの細胞間を強力にシールする分子機構がなければ、多細胞生物の存在はあり得ない。細胞間をシールする構造として、上皮細胞間や内皮細胞間に広く見られるタイトジャンクション(TJ)と呼ばれる細胞間接着装置が知られている。TJでは、隣り合う細胞膜間の距離がゼロになっている。TJが上皮細胞の極性を決定維持する機能をも持ち合わせていることも考え合わせると、この細胞膜間の距離をゼロにする接着分子を同定することが、きわめて重要であることは明らかであるが、その実体は長い間謎に包まれていた。我々は、さまざまな試行錯誤の結果、TJの接着分子としてオクルディン、さらには、クローディンファミリーを発見し、この分野で大きなブレークスルーとなる貢献を行なってきた。今、TJの分子細胞生物学とでも言うべき、全く新しい分野が生まれつつある。本研究では、この新しい接着分子、特にクローディン遺伝子ファミリーの上皮・内皮細胞シートのバリアー機能における役割を分子レベルで詳細に検討するために、クローディン-1と-5のノックアウトマウスを作製し、その解析を行った。クローディン-1は皮膚に大量に発現しており、ノックアウトマウスは生後直後に皮膚からの水分の蒸散のために死亡した。クローディン-5は脳の血管内皮細胞に発現しており、ノックアウトマウスは脳血管関門が破壊され死亡した。このようなマウスの解析を通して、最終的にはクローデインの機能障害による種々の病態を解明したい。(1)単層上皮のバリアーとクローディン(担当:古瀬幹夫):これまで、単層上皮のタイトジャンクションがクローディンによって形成され、クローディンが単層上皮のバリアー機能を担っていることを示してきた。本研究では、個体の中で、いくつかの特殊な単層上皮に特異的に発現しているクローディンを同定し、そのノックアウトマウスを作製することを始めた。まず、小腸上皮に発現しているクローディン肺気管支に発現しているクローディンを同定することに成功し、それぞれターゲッティングベクターの作製までを行った。(2)重層上皮のバリアーとクローディン(担当:久保亮治):皮膚を含む扁平重層上皮では、これまで、そのバリアー機能にTJがかかわっていないと信じられてきた。しかし、我々は、クローディン-1のノックアウトマウスの予備的な解析から、この通説を疑うようになってきた。ホモのマウスは生まれて24時間以内には死んでいったので、このマウスの表皮を詳細に検討した結果、このバリアーが破壊されていることを見出した。(3)血管内皮のバリアーとクローディン(担当:月田承一郎):血管内皮の形成するバリアーもきわめて重要である。我々は、クローディン-5が血管に特異的に発現していることを示してきた。そこで、クローディン-5ノックアウトマウスを作製し、このマウスの血液脳関門が破壊されていることを見出した。(4)クローディンと細胞骨格との相互作用(担当:足立誠):クローディンはそのC末端がバリンで終わり、PDZドメインと結合できることが知られている。したがって、このC末端に結合するPDZ蛋白質をyeast two-hybrid法を用いて検索したところ、PDZドメインを13個も持つMUPP1を同定することに成功した。生細胞におけるクローディン分子の挙動の解析:クローディン分子が同定されて初めてTJを分子レベルで解析できるようになった。

本年度は、このクローディン分子とGFP(緑色蛍光蛋白質)の融合蛋白質を発現させた生細胞を観察することにより、生細胞におけるTJの動的な挙動を追うことに初めて成功した。まず、クローディン-1のN末端にGFPを融合させた蛋白質(Cld-1-GFP)を、もともとTJを持たないマウスL線維芽細胞に発現させた。このCld-1-GFPは細胞膜上に発現・重合し、隣合う細胞と接着して対合するストランドを形成した。このストランドはGFPで密にラベルされているため、その一本一本を生細胞下で蛍光顕微鏡観察することができた。TJストランドは、これまで凍結割断レプリカ法により電子顕微鏡によってのみ観察されてきたものであったが、このような方法で観察すると、驚いたことに極めて動的な構造であることが明らかになった。すなわち、これらのストランドは、しばしば断裂したり、端-端結合して融合したり、端-端側結合して枝分かれを作ったりという過程を繰り返していた。このようなストランドの動的な性質が、TJのバリア機能にとって重要ではないかと考え、今後、詳細な解析を続けることにした。種々のクローディンノックアウトマウスの作製:これまでに我々はクローディン-1と-5のノックアウトマウスを作製し、バリアーに関して興味深い結果を得た。今年度は、小腸上皮細胞特異的に発現しているクローディンのノックアウトマウス、肺胞上皮特異的なクローディンのノックアウトマウス、シュワン細胞特異的なクローディンのノックアウトマウスの作製等が進んでおり、これらのノックアウトマウスの解析より、発がんや転移とクローディンとの関係を明らかにすることができると考えている。1.クローディンノツクアウトマウスの作製:本年度は、脳血管特異的にクローディン-5遺伝子をノックアウトするための、コンディショナルノックアウトマウスの作製に着手し、ようやくターゲットされたES細胞を得ることができた。今後マウスの作製に進む予定である。さらに、クローディン-19がシュワン細胞だけに発現することを見出し、そのノックアウトマウスの作製に成功した。このマウスは末梢神経障害を示し、ヒトの疾患との関係が興味深い。2.タイトジャンクション裏打ち蛋白質の機能解析:マウスの培養上皮細胞(Eph4細胞)において、任意の遺伝子を相同組み換えによりノックアウトする方法を開発し、ZO-1遺伝子を欠くEph4細胞株を複数得ることに成功した。このZO-1の発現を完全に欠いた上皮細胞は、全くその増殖に異常を示さなかったし、コンフルエントな状態で培養すると、典型的な敷石状の形状を示し、その極性にも全く異常が見出せなかった。ただ、培養液のカルシウム濃度を変化させることで極性形成を誘導すると、極性が形成される速度が正常の細胞に較べて有意に遅いことが明らかになった。上皮細胞にはZO-1に似た蛋白質としてZO-2が発現しているが、このZO-2を過剰発現しても、ZO-1の欠失によるこのフェノタイプは回復しなかった。そこで、次に、このZO-1を欠く上皮細胞から、さらにZO-2遺伝子を欠く上皮細胞の樹立を試み、ごく最近成功した。
IgA 腎症における樹状細胞の役割

IgA腎症モデルマウスの脾臓細胞を用いて培養実験を行ったところ、B細胞を樹状細胞(DC)のみと共培養した場合においてもB細胞のIgA産生は増加した。つまり、このIgA腎症モデルにおいてはDCが直接B細胞に作用する自然免疫などの免疫応答が深く関与していることが示唆された。低亜鉛食を与えられたIgA腎症モデルマウスは血清IgAや尿中アルブミンが高いなど腎症が増悪する傾向を認めた。逆に高亜鉛食の群においては血清IgA値や尿中アルブミンが低い傾向を示し、腎症の増悪が抑制されていた。以上より亜鉛コンディションはこのモデルマウスのDCに作用することにより病因となるIgAの産生量を規定している可能性があると考えられた。IgA腎症自然発症モデルであるgrouped ddYマウスより脾臓細胞を抽出し、マイクロビーズ(Miltenyi Biotec)を用いて、B細胞、T細胞、DCを分離し、それぞれの細胞の働きについて検討した。まず、それぞれの細胞をさまざまな条件下で培養し、IgA腎症の病因となるIgAの産生にどのように関わるかを検討した。i:B細胞単独で培養、ii:B細胞およびT細胞の共培養、iii:B細胞およびDCの共培養、iv:B細胞、T細胞およびDCの共培養、の4条件で産生されるIgA量を検討したところ、産生量はi<ii≒iii<ivとなった。一般的に免疫応答の経路としてはDCなどの抗原提示細胞はT細胞を介してB細胞に作用することが知られているが、DC単独でもB細胞のIgA産生を促したことから、このIgA腎症モデルにおいてはDCが直接B細胞に作用する自然免疫などの免疫応答が深く関与していることが示唆された。また、それぞれの条件下における各種インターロイキンやTNF-αなどのサイトカインもELISAにて測定を試みたが、産生量が非常に微量であり、評価は困難であった。一方、亜鉛のコンディショニングはB細胞やT細胞の機能に加えて、近年DCの活動性に関与することも示唆されている。そこで、このモデルにおいて重要な役割を演じているDCおよびB細胞やT細胞との細胞間作用についても亜鉛コンディショニングが関与しているかを検討した。その結果、細胞培養時の亜鉛コンディションを調整したところ、低亜鉛条件下ではIgAの産生量が増加し、高亜鉛条件下ではIgAの産生量が低下することが明らかになった。そして、興味深いことにその産生量はDCが存在する場合に著明に変化することが観察された。つまり、亜鉛コンディショニングはこのモデルマウスの脾臓DCに作用することにより病因となるIgAの産生量を規定している可能性があると考えられる。IgA腎症自然発症モデルであるgrouped ddYマウスより脾臓細胞を抽出し、B細胞、T細胞、DCを分離し、それぞれの細胞の働きについて検討した。i:B細胞単独で培養ii:B細胞およびT細胞の共培養iii:B細胞およびDCの共培養iv:B細胞、T細胞およびDCの共培養上記4条件で産生されるIgA量を検討したところ、産生量はi<ii≒iii<ivとなった。一般的にDCなどの抗原提示細胞はT細胞を介してB細胞に作用することが知られているが、DC単独でもB細胞のIgA産生を促したことから、このIgA腎症モデルにおいてはDCが直接B細胞に作用する自然免疫などの免疫応答が深く関与していることが示唆された。また、それぞれの条件下における各種サイトカインもELISAにて測定を試みたが、産生量が非常に微量であり、評価は困難であった。疾患モデルマウスにおける免疫細胞の働きの検討を進めている。