hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
IL-12併用投与IL-18遺伝子治療実験における免疫細胞浸潤動態についての検討

本研究グループは抗腫瘍免疫の誘導型の免疫遺伝子療法の確立を目指し、口腔癌細胞に対する細胞障害活性を誘導するケモカインおよびサイトカイン遺伝子を口腔癌由来の扁平上皮癌細胞株に遺伝子導入を行い導入遺伝子発現、タンパク発現、エフェクター細胞への作用および腫瘍原性などについて検討をおこなった。2)将来の遺伝子治療を想定し、導入遺伝子の感染効率および操作性を考え、INFgやIL-2産生誘導誘導をするIL-18をadenovirus vectorに導入し、NK cellやmacrophagesを活性化させることで抗腫瘍活性を発現させる免疫遺伝子治療を目標に研究を行った。Adeno virusvectorを用いても抗腫瘍effecter cellを誘導することが確認でき、腫湯volumeの現象効果を認めたが、完全に消失することはなかった。ついでrecombinant IL-12を併用投与し縮小効果の増大をはかった。一連の研究により、免疫原生の低いヒトロ腔癌へ遺伝子治療によりinnate immunityの増強をはかることで抗腫瘍効果をえることが明らかになった。今後、さらなる研究により腫瘍免疫ワクチン療法への展開を図る。口腔は多くの外来抗原にさらされることから,癌が発生した場合にも胞巣の周囲に多くの炎症性細胞の浸潤が認められる特徴が口腔癌の特徴として明らかとなっている。この性格を利用しIL-18遺伝子を導入することで,腫瘍胞巣周囲に浸潤したマクロファージを活性化させ持続的なIFN-γの産生を促し,NK細胞による腫瘍細胞融解作用の上昇やFasリガンドの発現増強によるapoptosisの誘導によって殺細胞効果が期待する治療実験を計画した。本年度は、C3H/HeNの脾臓より抽出したtotal RNA1μg、oligo (dT) 15 Primer、RAV2 Reverse Transcriptase (Takara)を用いて作製し、下記のプライマ?とKOD -Plus- (TOYOBO)を用いてPCR(94°C15sec,60°C30sec,68°Clmin.35cycle)を行ない、完全長マウスproIL-18(約680bp)およびICE(約1280bp)のcDNAを作製した。それぞれのPCR productをpENTR/D-TOPO (Invitrogen)に組み込み、サブクローニングを行なった(pENTR-mIL-18、pENTR-mICE)。GATEWAY法(Invitrogen)により得られたpENTR-mIL-18、pENTR-mICEからpAd-DEST vectorにinsert(完全長マウスproIL-18およびICEのcDNA)を移入させ、サブクローニングを行ない、それぞれの治療用発現ベクターを作製した(pAd-DEST-mIL-18、pAd-DEST-mICE)。ついで、promIL-18、mICE cDNAをクローニングした発現ベクターを制限酵素pacIで切断して直鎖状にし、293A細胞にLipofectamine 2000(Invitrogen)を用いて導入した。導入した293A細胞の培養中にplaqueの出現を確認してから、細胞を集め、クルードウイルスライセートを作り、さらに293A細胞に感染させて、ウイルスの増幅を行なった。力価が十分だと判断されたところで、promIL-18、mICE発現ベクターをマウス扁平上皮癌細胞にtransfectionを行い、IL-18産生の検討を続けている。現在のところtransfection効率を上げるための基礎的検討を繰り返している。口腔は多くの外来抗原にさらされることから,癌胞胞巣の周囲に多くの炎症性細胞の浸潤が認められる特徴が明らかとなっている。この口腔癌の特徴を活かし,IL-18遺伝子を導入することで,腫瘍胞巣周囲に浸潤したマクロファージを活性化させ持続的なIFN-γの産生を促し,NK細胞やTcellによる腫瘍細胞融解作用の上昇やFasリガンドの発現増強によるapoptosisの誘導によって殺細胞効果が期待できる。さらにIL-12併用投与を行うことで相乗的にIFN-γ産生をより強力に誘導し,NK活性の増強を図り,より侵襲の少ない新たな治療法の一つとして,口腔癌遺伝子治療の開発を目標としてる。BALB/CマウスにPAM212/IL-18またはPAM212/vectorを移植した後,以下の投与群において,経日的に腫瘍系を測定し推定腫瘍体積を求め,腫瘍増殖曲線を作成し腫瘍増殖の抑制効果を7日から14日まで経時的観察した。PAM212/vector移植のみでは腫瘍は縮小しなかった。

PAM212/vector移植+移植後PBS(-)を腹腔内投与する群でも腫瘍縮小はみなかった。PAM212/vector移植+移植後7日14日にreconbinant-IL-12(0.05μg)を腹腔内投与する群では30%に縮小効果をみた。PAM212/IL-18移植群では20%に縮小効果をみた。PAM212/IL-18移植+にreconbinant-IL-12(0.05μg)を腹腔内投与する群では60%に腫瘍縮小効果を認めた。免疫組織学的検討により縮小効果をみとめた病巣においては,マクロファージ,CD8陽性細胞の多量の浸潤が見られたことからIL-18遺伝子導入により抗腫瘍細胞の誘導がおこり,腫瘍縮小効果をもたらしたと考えられ,口腔扁平上皮癌への遺伝子治療の可能性を示した。
血流ストレスと血管内皮から見たもやもや病の病態解析

もやもや病患者剖検例の病理組織学的検討により、もやもや病では血管内皮細胞の細胞外マトリックスが正常と変化していることを見出した。このことから、もやもや病では血管内皮細胞の血流剪断力に対する脆弱性があり、狭窄病変は血管内皮細胞傷害に起因するのではないかとの病態仮説をたて、それを証明する目的でもやもや病患者由来の多能性幹細胞(iPS細胞)を用いて、血管内皮細胞の細胞外マトリックスを正常人と比較検討した。その結果、もやもや病患者由来の血管内皮細胞では、正常に比しコンドロイチン硫酸の量が低下しており、硫酸化も低下していることが明らかになった。コンドロイチン硫酸の合成に係る酵素や硫酸化に係る酵素のRNA発現も低下していた。内皮細胞の細胞外マトリックスは、血流剪断力の刺激を感知して細胞内に伝え、NO産生などの反応を惹起するのに関与するといわれており、血流剪断ストレスに対する脆弱性の原因となっている可能性が考えられる。また、もやもや病の病変ができる部位と血流剪断力の関係を明らかにする目的で、数値流体力学による血流剪断ストレスのシミュレーションを作成し、実際の症例での狭窄病変の継時的変化との比較検討を行った。その結果、もやもや病好発部位である内頚動脈終末部の壁面剪断応力値が最大値,平均値ともに総頚動脈終末部の3.5倍であることが示された。また、内頚動脈終末部でも特に前大脳動脈への分岐部直前と直後の部位の剪断応力が最も大きいことが分かった。また,内頚動脈終末部の流れでは,高速な流体が壁面のごく近くを通過するという特徴があり,これが壁面せん断応力の上昇の原因となっていることが分かった。実際の症例の継時的な狭窄進行部位も血流剪断応力の分布に近似していた。もやもや病の病変は、血流剪断応力の大きな部位に存在していることから、血流剪断応力による血管内皮障害が病変の形成に寄与している可能性が考えられた。今年度は樹立した3例のもやもや病患者のiPS細胞と正常コントロールのiPS細胞の血管内皮細胞への分化誘導を行った。既報のプロトコールに従って試みたが、分化度が不十分であったり、分析に十分な収量が得られるにに至っていない。現在、培養条件やコロニーの選択などで収量の増加をはかっている。血流ストレスモデルについては、モデルとなる造影CT画像をもとにした3D再構築に成功し、現在解析結果のマッピング作業に取り掛かっている。樹立したもやもや病患者のiPS細胞と正常コントロールのiPS細胞の血管内皮細胞への分化誘導を既報のプロトコールに従って試みたが、分化度が不十分であったり、分析に十分な収量が得られるにに至っていないため。今年度は樹立した3例のもやもや病患者のiPS細胞と正常コントロール2例のiPS細胞の血管内皮細胞への分化誘導を行い、遺伝子発現、細胞表面マーカーの発現で内皮細胞への分化を確認した。細胞外マトリックスの組成を解析したところ、もやもや病患者群では正常コントロールに比して、コンドロイチン硫酸の硫酸化パターンが変化していることが明らかになった。すなわち、患者群では、正常に比し低硫酸化の傾向を認めた。このことは、もやもや病患者の血管内皮では、細胞外マトリックスの組成が変化していることを示している。血管内皮細胞表面のマトリックスは、血流ストレスや細胞接着因子からの刺激を細胞に伝え、血管の拡張性、細胞の接着、血管壁への細胞の侵入にも関係していることが知られている。

したがって、本研究結果は、もやもや病の発症要因としての細胞表面マトリックスの関与を示唆している。また、血流ストレスモデルの解析では、内頸動脈終末部と総頸動脈終末部の壁面せん断応力分布を比較した.その結果,もやもや病好発部位である内頚動脈終末部の壁面せん断応力値が最大値,平均値ともに3.5倍であることが示された.また,内頚動脈終末部の流れでは,高速な流体が壁面のごく近くを通過するという特徴があり,これが壁面せん断応力の上昇の原因となっていることが分かった.血管内皮細胞への分化誘導で解析に必要な細胞数を確保するのに時間を要した。また、研究機関の途中で、研究補助員の退職、交代があり、研究が滞った時期があった。現在、培養条件やコロニーの選択などで収量の増加をはかっている。血流ストレスモデルについては、モデルとなる造影CT画像をもとにした3D再構築に成功したため、解析結果のマッピング作業を今後行っていく。細胞外マトリックス分析について、再現性を確認する。再現性が確認された場合は、もやもや病の原因遺伝子と細胞外マトリックスの関係を明らかにするため、遺伝子発現を抑制したり、変異を導入した細胞でのマトリックスの変化について解析する。今年度はiPS細胞から血管内皮細胞への分化誘導が予定通りに進まなかったため、内皮細胞の分析までに至らず、研究費に剰余が生じた。研究の遂行上必要が生じたため、80万円を前倒して請求したが、予定より使用が少なく済んだため余剰が生じた。次年度は、初年度うまくいかなかった分化誘導とその確認を行い、初年度に予定していた内皮細胞の細胞外マトリックスの分析を行う予定である。
重金属同位体を利用した森林生態系における大気沈着負荷量の推定と物質循環変動の解明

越境大気汚染物質の流入による森林生態系の物質循環への悪影響が懸念されており、森林の衰退兆候を早期に検出することが求められている。本研究では大気沈着物質に含まれて流入した重金属が森林の林床有機物や土壌に蓄積していることや、同位体比によりその起源を推定することができる点に着目し、国内の多地点で採取された林床有機物や土壌の重金属の安定同位体比の測定を行う。重金属の濃度や同位体比の地理的分布特性と、調査対象地において既に得られている樹木成長の長期的モニタリングデータや土壌の化学特性や窒素無機化特性などとの関係を検討することにより、土壌や樹木成長に大気沈着影響が顕著に現れる閾値の設定を目指す。
変位電流法による分子膜ナノ界面の誘電・電子的構造の解析と分子形態記録

ほぼ当初の計画を達成できたと考えている。具体的な研究成果を要約すると以下のようになる。[1]双極性分子を構成する分子膜のナノ界面電子物性評価一軸性分子モデルを採用して、水面上に形成された分子膜の状態をブラウン運動方程式を基礎として記述し、単分子膜の誘電緩和時間や配向度の変化を理論的に導くことができ、シアノビフェニル系液晶分子や脂質分子膜の変位電流波形を、上述の分子モデルを採用して、解析することができた。また、等方性ならびに非等方性分子により構成される分子膜の誘電率を、界面効果を考慮して理論解析することができた。また、単分子膜のSA-Sc相転移現象を理論的に予測できた。[2]電子性ナノ界面電子物性評価金属と分子膜界面に移動電荷により形成されるナノ界面の空間的電荷分布およびエネルギー準位分布を理論的に評価できた。また、ポリイミドLB膜、フタロシアニンLB膜について、実験的にこれらの分布を求めることができた。[3]界面を利用したエレクトロニクスへの展開(1)光異性化によるアゾベンゼン分子の形態変化の記録に関し、脂質分子膜とアゾベンゼンとの混合分子膜について研究した。可視光および紫外光の交互照射によって得られる変位電流波形を計測し,脂質分子の側鎖の飽和・非飽和の違いにより、変位電流波形および水面上の表面圧力変化に著しい違いが現れることが明らかとすることができた。また、アゾベンゼンの光異性化の刺激を液晶性極性分子の配向変化に関する基礎的な知見を得る事ができた。弾性体理論を用いて界面分子の液晶への伝搬の様子を理論的に解析し、光透過率と容量の同時測定からこの様子を実験的に明らかにすることができた。(2)分子膜整流素子の基礎的な特性評価をすることができた。本研究は、申請者の提案した単分子膜の電気物性の評価法である変位電流法を基礎として、各種の外部刺激を分子膜に加えた時に発生するナノ有機膜界面における電子移動による電子状態変化と分子の形態変化に着目して、こうした変化を変位電流や表面電位法により計測して、誘電体電子物性の立場から、双極性分子の物質界面での誘電性、さらには分子膜界面のナノ領域のナノ界面電子移動現象を解き明かす手法を開発することを目的としている。また、この目的より物質界面での電子の微視的移動や分子形態変化の様が定量的に明かとなるので、この結果を踏まえて、超構造分子膜内での電子の微視的変位および双極性分子の形態変化に基づく光・変位電流変換型の記録素子の試作などを行う事を狙って計画されたものである。具体的に、下記のような成果が得られている。(l)双極性ナノ界面電子物性評価ブラウン運動方程式を基礎として、分子膜の誘電緩和時間や配向度の変化を理論的かつ実験的に評価することができた。また、双極性分子膜の相転移温度の評価、基板効果を考慮した誘電異方性を持つ分子の誘電的構造を理論及び実験的に明らかにできた。(2)電子性ナノ界面電子物性評価(1)超構造分子膜内での電子の移動電荷量および移動速度を評価できた。(2)金属と分子膜界面での移動電荷により形成されるナノ界面の空間的電荷分布およびエネルギー準位分布を実験的かつ理論羽的に評価できた。(3)界面を利用したエレクトロニクスヘの展開(l)光異性化による分子の形態変化の記録と液晶性極性分子の配向変化に関する基礎的な知見を得た。

[1]双極性分子を構成する分子膜のナノ界面電子物性評価一軸性分子モデルを採用して、水面上に形成された分子膜の状態をブラウン運動方程式を基礎として記述し、単分子膜の誘電緩和時間や配向度の変化を理論的に導くことができ、シアノビフェニル系液晶分子や脂質分子膜の変位電流波形を、上述の分子モデルを採用して、解析することができた。また、等方性ならびに非等方性分子により構成される分子膜の誘電率を、界面効果を考慮して理論解析することができた。また、単分子膜のSA-Sc相転移現象を理論的に予測できた。[2]電子性ナノ界面電子物性評価金属と分子膜界面に移動電荷により形成されるナノ界面の空間的電荷分布およびエネルギー準位分布を理論的に評価できた。また、ポリイミドLB膜、フタロシアニンLB膜について、実験的にこれらの分布を求めることができた。[3]界面を利用したエレクトロニクスへの展開(1)光異性化によるアゾベンゼン分子の形態変化の記録に関し、脂質分子膜とアゾベンゼンとの混合分子膜について研究した。可視光および紫外光の交互照射によって得られる変位電流波形を計測し,脂質分子の側鎖の飽和・非飽和の違いにより、変位電流波形および水面上の表面圧力変化に著しい違いが現れることが明らかとすることができた。また、アゾベンゼンの光異性化の刺激を液晶性極性分子の配向変化に関する基礎的な知見を得る事ができた。弾性体理論を用いて界面分子の液晶への伝搬の様子を理論的に解析し、光透過率と容量の同時測定からこの様子を実験的に明らかにすることができた。(2)分子膜整流素子の基礎的な特性評価をすることができた。
喘息予備軍の発症要因に関する細胞内シグナルクロストークに基づいた多遺伝子同時解析

気管支喘息の発病には、気道過敏性亢進(刺激に容易に気道が細くなる性質)が伴う。アレルギー体質を有し呼吸器症状のない若年成人にも亢進者が存在し、小児期に喘鳴症状を有したが成人期に無症状である者と同様に、将来成人喘息を発病する危険群が潜む。この未病危険群の発生要因を新しい遺伝統計学手法で調べた結果、上皮増殖因子受容体とプロテアーゼ活性化受容体-1の遺伝子型の違いが危険群と非危険群の間で認められた。気管支喘息の遺伝子学的な原因探索のために、Genome-wides tudy(GWAS)を含む大規模な研究が盛んに行なわれているが、喘息の厳密な臨床的な定義がなく個々の喘息患者はさまざまな臨床的特徴(phenotype)を種々の程度で併せ持つために、患者(研究対象)の定義が研究間で一定ではなく曖昧で、研究間で一貫したデータが得られないことも多い。アレルギー素因を有するが気管支喘息の症状がない若年成人の10-30%程度が、有症状喘息患者と同様にメサコリン吸入刺激に対する気道過敏性(無症候性気道過敏性)を有しており、疫学的調査では将来の成人発症喘息のハイリスク群と考えられている。彼らは完成された喘息患者のように様々な病像をまだ示しておらず、phenotypeも無症候性気道過敏性という一定の指標で定義できるため、当研究では、このような対象に焦点を絞った。また、解析する候補遺伝子は、気道構成細胞の細胞内シグナルクロストークの知識を踏まえた上で複数個選択することとし、今回は上皮増殖因子受容体(EGFR)とProteaseactiv ating receptor-1(PAR-1)を選んだ。本年度は準備段階として、<アレルギー性素因と無症候性気道過敏性>を有する若年成人の被験者を募集し、その基礎データとともにDNAサンプルの収集を行なった。呼吸器症状のない一般大学生に広く参加を募り、合計261名の協力者からスクリーニングデータとDNAサンプルを得た。(1)問診:喘息以外のアレルギー性疾患の有無(専門科によるアトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎の診断)や小児期の喘鳴や気管支炎の既往、(2)血液:血液好酸球や特異的免疫グロブリンE、(3)呼吸機能:1秒量(FEV1(%predicted)など)、(4)メサコリン吸入に対する気道過敏性閾値(PC_<20>)を測定した。この結果から、募集した大学生261名の中で、アレルギー性素因を有する対象者(アレルギー疾患を有するか、血液検査で何らかのアレルギー素因を認めるもの)は189例であった。さらに189名のうち、PO_<20>がアメリカ胸部疾患学会公認の過敏性陽性の閾値である8.0mg/mlを下回るもの(無症候性気道過敏群)は72例(38%)存在した。平成20年度は、将来の成人発症喘息のハイリスク群と考えられている<アレルギー性素因と無症候性気道過敏性>のある若年成人の被験者を募集し、その基礎データとともにDNAサンプルの収集を行なった。その結果、呼吸器症状のない一般大学生に広く参加を募り、合計261名の協力者からスクリーニングデータとDNAサンプルを得、その中で、アレルギー性素因を有する対象者(アレルギー疾患を有するか、血液検査で何らかのアレルギー素因を認めるもの)は189例、さらにそのうち、メサコリン吸入に対する気道過敏性閾値(PC_<20>)がアメリカ胸部疾患学会公認の過敏性陽性の閾値(8.0mg/ml)を下回るもの(無症候性気道過敏群)が72例(38%)、過敏性陰性例が117例であった。そこで、平成21年度は、この189例を対象に上皮増殖因子受容体(epidemal growth factor receptor (EGFR))とプロテアーゼ活性化受容体-1 (protease activating receptor-1 (PAR-1))遺伝子上の20個の候補SNPに関して遺伝子タイピングを行ない、これらの遺伝子の変異が無症候性気道過敏性の有無に影響するかに関して、ケース(過敏例72例)・コントロール(非過敏例117例)の比較研究を行った。PAR-1遺伝子に関してはケース・コントロール間で有意な差をもつSNP部位は存在しなかったが、EGFR遺伝子上ではイントロン上のrs4947972とrs12718945、エクソン上のrs2072454、rs2227983、rs2293347から構成されるハプロタイプブロックにおいて、その塩基変異パターンがケース対コントロールの間で有意な差を認めた。以上より、EGFRとPAR-1の2遺伝子間の相互作用は認められなかったが、EGFR単独でも、今回注目したアレルギー性素因と無症候性気道過敏性の有無を決定する要因となることを見出した。

完成された有症状気管支喘息患者では、アトピーの有無や発作誘因(運動、アスピリン、アレルゲン、感染などの)、呼吸機能低下の進行速度、重症度、気腫性変化(COPD)の合併などの違う複数の形質(phenotype)がオーバーラップして、形質同士が相互に関係し合い、かつ患者毎にその形質の有無が不均一である。また、進行度に応じて関与する遺伝子数やその相互関係も増加し複雑になることも考えられる。従来の喘息の遺伝子研究は、このような患者群が一群として包括されて検討されてきたが、今回の研究では、完成された喘息患者のように様々な病像をまだ示しておらず、phenotypeも無症候性気道過敏性という一定の指標で定義できるため、遺伝子とphenotypeのつながりがより簡素化されて説明しやすい。このデザインで浮び上がったEGFR遺伝子はより早期の気管支喘息の出現のカギとなることが予想される。平成22年度は、現在は呼吸器症状を有しない若年成人群から、小児喘息の既往者(past-asthmatics;将来の成人喘息発症の危険群のひとつ)、小児喘息と診断されていないが喘鳴症状を小児期に経験した者(self-reported past-wheezers ;小児喘息既往者とは近い存在と予想される群)などを抽出して、それ以外の群(喘鳴症状の既往のない群;never-wheezers)との間の、遺伝子学的、呼吸生理学的、アレルギー感作的な差異や類似点を検討した。さらに、past-Wheezersを気道過敏性のある群(with AHR)とない群(without AHR)に分けて検討した。past-wheezersはnever-wheezersとは異なる遺伝子的背景をEGFRとPAR-1上に同時に有している可能性が示唆された。3)アレルギー感作面での検討:past-asthmaticsやpast-wheezers with AHRは、血液好酸球や血清IgE、とくにハウスダストに対するIgE抗体量が、never-wheezersやpast-wheezers without AHR群に比べて高かった。以上より、昨年度までの研究で、現在無症状なアトピー素因を有する若年成人に気道過敏性(Asymptomatic AHR)の有無を決定する要因として、EGFR遺伝子の関与を認められた一方、本年度に行ったpast-asthmaticsやpast-wheezers(いずれも喘息症状を生じるような気道病態にまで過去に-過性に至ったことが考えられる)群の遺伝子学的、呼吸機能的、血清学的な面からの観察結果から、過去の症状の有無を決定した要因には、EGFR+PAR-1のような別の遺伝子学的背景が考えられ、またこうした過去の症状を有した群では呼吸機能の潜在的な低下やアレルギー感作の亢進が認められ、将来の成人気管支喘息の発症の温床になる可能性が示唆された。
敗血症の多臓器不全に関連する細胞傷害シグナル経路を主要臓器系毎に解析する

敗血症性多臓器不全の病態生理を明らかにするために、培養細胞に炎症性mediatorを投与し、惹起される細胞障害シグナルを検討し、以下の知見を得た。炎症性mediatorにより細胞死が起こり、そのメカニズムにアポトーシス機構が関与している.細胞障害性シグナルはNO依存性やMAP kinaseの依存性などにおいて、細胞種により異なる要素がある.細胞種により有効な薬剤が異なるが、抗炎症作用薬、抗酸化薬に細胞保護作用がある.アポトーシスの阻害のみでは細胞死を抑制できず、それ以外の細胞死の関与が示唆された.敗血症性多臓器不全の病態生理を明らかにするために、培養細胞に炎症性mediatorを投与し、惹起される細胞障害シグナルを検討し、以下の知見を得た。炎症性mediatorにより細胞死が起こり、そのメカニズムにアポトーシス機構が関与している.細胞障害性シグナルはNO依存性やMAP kinaseの依存性などにおいて、細胞種により異なる要素がある.細胞種により有効な薬剤が異なるが、抗炎症作用薬、抗酸化薬に細胞保護作用がある.アポトーシスの阻害のみでは細胞死を抑制できず、それ以外の細胞死の関与が示唆された.敗血症における多臓器不全のメカニズムを解析するために、各種の培養細胞系に炎症性メディエーター(inflamix : LPS/TNFα/IFN_Y)を投与し、その際、活性化される細胞傷害性シグナルを解析し、in-vitro敗血症モデルを作成した。特に敗血症における急性尿細管障害のモデルとしてラット近位尿細管細胞(IRPTC)を採用し、以下のような知見を得た。2.特異的iNOS阻害剤はこの細胞傷害性を効果的に抑制したが、完全抑制ではなく、NO非依存性の細胞傷害の存在が示された。3.iNOS阻害剤以外にこの細胞傷害性を減弱する薬剤として、dexamethasone、melatonin、spironolactoneがあげられた。これらはどれもiNOSを介するNOの産生を部分的には抑制していたが、iNOSに特異的な抑制というより、MAP kinaseやNF-kBなどの系を抑制することで、炎症反応全体を修飾している可能性が重要と考えられた。4.さらに、iNOS阻害剤によるrescue効果には時間依存性が認められ、すなわち、inflamixによる早期の細胞傷害性を著明に抑制したが、後期の細胞傷害性に対する効果は弱いか、むしろ細胞傷害性を増悪した。この知見は、重症炎症におけるiNOS阻害剤の効果が一定しない現象への分子的基盤を与える新しい知見であった。5.以上のデータをもとに、成果を現在投稿準備中である。これまでに、ラット近位尿細管細胞(IRPTC)を用いて、以下の知見を得ていた。同様の敗血症in-vitroモデルにおいて、炎症性メディエータの投与によって引き起こされる細胞死のシグナル経路に関して、IRPTC以外の多様な細胞系(H9c2;心筋筋芽細胞、C2C12;骨格筋細胞、A549;肺胞上皮細胞)で引き続き検討した。細胞死においてはアポトーシスの関与は強く疑われたが、他の細胞死の形態も検討する余地が示唆された。上記細胞死を抑制する薬剤として、まずIRPTCにおいてdexamethasoneが有効とわかっていたが、他の全ての細胞系においても同様に有効であった。また、それ以外にアンギオテンシン受容体阻害薬も有効であることがわかり、その作用機序として、酸化ストレスの軽減効果が強く示唆された。以後様々な抗酸化薬の効果を検討したが、一部の抗酸化薬がやはり同様に有効であることが示された。現在、これらの抗酸化薬がどのような作用点で効いているのかを検討中である。本研究課題においては、平成22年度までに、主にラット近位尿細管細胞を用いて、1.炎症性mediatorにより細胞死が起こり、そのメカニズムにナポトーシス機構が関与している.2.NOS依存性及び非依存性の細胞死が関与している.4.等の知見を得ていた。当該年度においては、ヒト肺胞上皮細胸を用いて、同様の検討を行い、1.本細胞系では炎症性刺激によってもiNOSの上昇は軽度であり、細胞種によって惹起される細胞傷害性シグナルが顕著に異なる.2.炎症性mediatorにより細胞死が生じ、アポトーシス機構の活性化も確認したが、アポトーシスの抑制のみでは細胞死の抑制効果は限定的であり、それ以外の細胞死機構の関与も重要である.3.炎症性mediatorにより全てのMAP kinaseが活性化し、その中でJNKの活性化が細胞死に一部関与している.4細胞死を軽減する薬剤として、糖質グルチコイド、アンギオテンシン受容体阻害薬、DMSO以外に、免疫抑制薬、mitoKATP channel開口薬、cyclic AMP,ω3脂肪酸等が同定できた.等の知見を得た。以上、炎症性細胞傷害の分子機構に関して新しい知見を得る一方、抗炎症・抗酸化薬を治療に応用する際の分子基盤を提示するなど、意義深い成果を得た。
外生殖器発生を制御する泌尿生殖系構築過程の解析

哺乳類外生殖器形成に関わる細胞増殖因子系の機能を世界で初めて明らかにした。胎児後端において総排泄腔近傍から発生する外生殖器の組織系譜を解明し、生殖器官が協調して発生するメカニズム解明を行なった。細胞増殖因子群として重要なWnt群の機能解析を行なった。本プロジェクトにより初めて哺乳類外生殖器の器官形成カスケードが解明され、有力国際学術雑誌に発表を行ない世界の研究をリードした。高等動物の泌尿生殖系形成は、排泄物を出す器官を作り、交接に必要な精子、卵子を排出、受け取る系を胎児後部に協調的に構築する遺伝子ネットワークを必要とする。これまでそうした遺伝子ネットワークについてはほとんど解明されていなかった。本年度は、マウス外性器形成の伸長に必要な遺伝子群、さらに尿道、海綿体、亀頭部などに分化していく際に必要な遺伝子群を網羅的にインサイチュハイブリダイゼーションによってスクリーニングを行い、1.外生殖器ができる前の発生場として総排泄腔膜に発現する遺伝子、その近傍間葉に発現する遺伝子群(これらは将来の腹壁、膀胱、膣形成プロセスにも関連する)2.外生殖器が伸長する際の、我々が世界で初めて同定した先端上皮(DUE)において発現する遺伝子群3.外生殖器が伸長、分化する際、尿道が取り込まれる上皮-間葉において発現する遺伝子群4.外生殖器が胎生後期に性ホルモン影響下に性分化を行う際に、男性器、女性器において異なる形で発現制御を受ける遺伝子群の各々の遺伝子群の同定を試みた。その結果総計で300種以上の遺伝子発現パターンスクリーニングし、以上のカテゴリーいずれにも相当する遺伝子群、細胞増殖因子群、転写因子群を同定した。この中の数十個に関して現在ノックアウトマウスやOrgan cultureを用いた機能解析系において現在解析を進めている(一部現在投稿準備中)。以上のような解析は近年生殖器の発生異常や不妊などの頻度がヒトにおいて上昇していることが報告されていること、さらに分子発生生物学的観点からも重要な情報を提供すると期待される。高等動物の泌尿生殖系形成は、排泄器官を作り、交接に必要な精子、卵子を排出、受け取る器官群を胎児後部に構築する遺伝子ネットワークを必要とする。本年度は実績として1.外生殖器が出来る以前の発生場として総排泄腔の重要性並びに総排泄腔形成と協調して膀胱、下腹部、骨盤などが発生する過程について知見を得た。細胞増殖因子として重要なヘッジホッグシグナル(Shh)及び転写因子ALX4との相互作用が重要である事を見い出した(論文投稿中)。2.鳥類胚がユニークな生殖腺形生することが知られているが、世界で初めてchickアンドロジェンレセプター(AR)をクローンし、アンドロジェンがchick胚卵巣発生に重要である事を示した。3.外生殖器が伸長する際の先端の上皮(DUE)の重要性並びに先端形成に関連して転写因子Dlx遺伝子の解析を進め、同Dlx5,6のダブルノックアウトマウスが尿道下裂を引き起こす事、更に外生殖器先端の異常を引き起こす事を見い出した(投稿準備中)。4.HAI1は種々の器官形成に機能している事が推察されていたが、ノックアウトマウス解析によって初めて胎盤形成に重要である事を見い出した。1)器官群が協調して発生するメカニズムはこれまでほとんどまったく分かっていなかった。我々はこの問題に取り組み、泌尿生殖系器官群(外内生殖器群、骨盤内尿道、膀胱、前立腺)などがいかに協調して発生するのかを解明した。未分化な間葉(PCM)がソニックヘッジホッグやインディアンヘッジホッグ(Shh,Ihh)を発現するこをと見出した。またこうした発現シグナルを受容して未分化間葉が骨盤内尿道間葉や膀胱平滑筋に分化することを見出した。未分化間葉は本研究において初めて性質の異なる複数の組織、即ちSMM陽性の平滑筋組織や男性ホルモンレセプター(AR)陽性組織に分化できることが明らかになった。本研究は分子医学的にも将来の移植医学的にも大きな知見を提供するものである。2)近年の分子発生医学のマウスにおける進展を受けて、マウスの生殖系器官の発生、解剖学、及び分子発生的知見を統合したオントロジーマップの作成が世界的レベルにおいて企画された。我々はこの国際コンソーシアムに日本から招へいされ、泌尿生殖系組織のオントロジーの記載を行った(2007 in press)。3)細胞増殖因子群としてFgf系がリダンダントに作用して総排泄腔、尾部、外生殖器形成に寄与することをコンディショナルKOマウスの解析によって見出した。Fgf系遺伝子群は協調して尾部の発生に重要であることがダブルノックアウトマウス解析によって判明しつつある(未発表データ)。平成19年度はいくつかの懸案であった業績をまとめることが出来た。泌尿生殖系器官が協調して発生するが、その協調発生メカニズムに細胞増殖因子ヘッジホッグ系が効いている事、さらに膀胱などを含む泌尿生殖系器官の協調発生機構を遺伝学的な追跡実験によって世界で初めて証明した(Haraguchi, et. al., Development, 2007)。さらにEMT(上皮間葉転換)はこれまで体節の形成やガンなどいくつかの生物現象に関与している事は知られていた。

我々は胎児後端の協調発生機構において後肢、外生殖器、尾部を含む協調発生機構にBmpシグナルを介したEMTの適正な制御が重要である事を示した(Ohta, et. Al., Development, 2007)。本成果は後肢、生殖系に重大な異常を示すマーメイド症候群の理解に役立つと期待される。さらに器官形成一般においても先駆的モデル系となる事が期待される。またDlx遺伝子は形態形成に関与することが知られている制御因子であるが、Dlx遺伝子は細胞分化の制御においても機能を有し、胎児精巣におけるライディッヒ細胞でのアンドロゲン産生を制御することが初めて証明された(Nishida, et. al., Endocrinology, 2008)。以上のように世界的に有意な業績を挙げる事が出来た。平成20年度においてはこれまでの研究を踏まえ、多くの成果を重要な国際学術雑誌に発表した。上皮組織の適正な分化は生殖器官形成や他の器官にとって重要である。Wnt/βカテニンシグナルを過剰に発現する遺伝子改変マウス、並びにWntシグナルとクロスしうるBmp(骨形成因子)、ヘッジホッグシグナルの複合変異体マウスを解析した。上記過剰発現マウス解析から、皮膚においては毛包の過剰形成が見られる事、子宮内膜においては子宮腺の過剰形成が見られる事が判明した(Development2009、並びに未発表データ)。現在子宮腺の過剰形成において細胞増殖因子の相互作用を解析中である。またWnt/βカテニンシグナルが外生殖器において、その雌雄形成プロセスに深く関わっている事が判明した。雄の外生殖器においてWnt/βカテニンシグナルの信号入力が雌に比べて亢進している事、また雌においては同シグナルのアンタゴニストであるDkk2などが過剰発現していることを見出した。複合遺伝子改変マウスの解析によって、Wnt/βカテニンシグナルの操作によって、外生殖器の"性"をホルモンに依存しない形で改変できることが初めて明らかとなった(Molecular Endocrinology印刷中)。これら論文を含めて現在、外生殖器の先端において我々が見出した尿道先端上皮(DUE)の意義と外生殖器発生におけるWnt、ヘッジホッグ、Fgfシグナルを含めた細胞増殖因子のクロストークの意義を現在さらに論文執筆中である。
超伝導マグネットのミクロ安定性の体系的研究

1.密巻超伝導マグネットのミクロ安定性(1)密巻超伝導マグネットの安定性理論(表面雑誌論文No.1)の適用範囲の確認を目的として、巻線内径90mmの非含浸密巻コイル2種を、超伝導素線のCu-SC比をパラメータとして作成した。クエンチ試験とヒ-タ加熱試験を行い、それらコイルの巻線電流密度と限界熱擾乱量を測定した。(2)密巻超伝導マグネットのGFRP巻枠の熱膨張係数(常温・極低温間)を測定した。このデータとコイルの巻線・冷却・励磁時の歪測定値を用い、密巻マグネットの安定性の解析を今後行う。2.CICCマグネットのミクロ安定性(1)密巻超伝導マグネットの安定性理論をCICCマグネットに適用して提案した実用的設計基準(論文No.4)に基づいて、核融合科学研究所の大型ヘリカル装置(LHD)用ポロイダルコイル3種(IV、IS、OVコイル)を設計製作した。IVコイル1台(IV-L)の第1回冷却励磁試験では冷却不十分のため2.2kAの励磁にとどめたが(論文No.5、No.6)、第2回試験を1995年12月に行い、SHe冷却したIV-Lをクエンチなしに定格電流20.8kAまで通電し、この設計基準と絶縁なし銅基材超伝導素線採用の妥当性を実証した。その成果は1996年5月のICEC16で口頭発表した。(2)LHDポロイダルコイル用CICC短試料と16ターンコイルにおいて、素線数本および素線全数をパルス加熱した場合の安定化特性を測定し、限界熱擾乱量を求めた(論文No.2、No.3)。(3)CICC内の電流分布不安定性に関する基礎実験を2本撚線にて行い、ヒ-タ加熱によるクエンチと電流転流の定量的データを取得し、その限界熱擾乱量を見いだした(論文No.7)。3.LHe直接冷却超伝導マグネットのミクロ安定性LHe直接冷却超伝導マグネットの限界擾乱発熱密度の解析を行い、安定化基準として擾乱等価電流を提案し、96ASCで発表した。4.超伝導マグネットのスケーリング則密巻、LHe直接冷却、CICCの各超伝導マグネットの巻線電流密度iと安定率の蓄積エネルギーE依存性をまとめた。測定データからはi∝E^kにおいてk=-1/5-1/7が得られた。LHe直接冷却超伝導マグネットについては、完全安定性とコイル保護の条件からk=-1/7が計算された。1.密巻超伝導マグネットのミクロ安定性この研究成果は、理論解析と3種類の密卷マブネットの特性評価について雑誌論文1(次ページ記載の1番目)に発表された。

さらに各種文献に記載された特性についての調査と分析、超伝導線・卷枠など使用材料特性の調査を続行中である。6年度はモデル実験について検討する。2.CICCマグネットのミクロ安定性(1)密卷マグネット安定性理論の応用として、CICCの素線周囲の非冷却条件を想定した場合の最適化設計基準を導出し、コイル平均電流密度の蓄積エネルギー・スケーリング則とともに、核融合科学研究所の大型ヘリカル装置(LHD)のポロイダルコイル3対の設計に適用した。本基準は、6年10月の応用超伝導会議において報告する予定である。(雑誌論文5)。(2)ポロイダルコイルのうち内則垂直磁界(IV)コイルについては、CICC短試料特性が素線特性の本数倍という電流低下なしの良好な結果を得た(雑誌論文2)。IVコイル2台は既に制作完了しており、うち1台の単体冷却励磁試験を平成6年6月に実施する計画であり、その結果も本研究のバックアップデータとなる。(3)CICC短試料サンプルと16ターンコイルを制作し、素線数本および素線全数をパルス加熱した場合の安定化特性を測定した(雑誌論文3、4)。実験と理論の比較検討を現在行っている。(4)1本の素線がクエンチしたときに他の素線へ電流が転流する安定性の解析を行い、実験装置を作成し(星野、高畑、三戸、佐藤、他:1993年度春季・秋季低温工学超伝導学会、E2-9(May 1993)219・(November 1993)220)、その実験を平成5年11月に開始した。しかし、電流転流時の超伝導線の電圧変化は測定できたが、ピックアップコイルによる電流転流状況測定はノイズのため不十分であったので、サンプルと測定装置を改良中である。1.CICCマグネット安定性(1)密巻マグネット安定性理論の応用として、CICCの素線周囲の非冷却条件とコイル平均電流密度の蓄積エネルギー・スケーリング則を用いて実用的設計基準を導出し、核融合科学研究所の大型ヘリカル装置(LHD)のポロイダルコイル3種の設計に適用した(雑誌論文5(次ページ記載の1番目))。(2)さらに、CICC素線表面のHe熱伝達特性と臨界電流マージンを考慮した高電流密度化設計基準を提案した(佐藤、高畑、三戸、山本:1994年度秋季低温工学・超電導学会、A3-8(Nov.1994)227)。この解析においては、素線回復電流と臨界電流マージンの与え方として、設計者の経験や感覚で決定しうる設計裕度系数K_RとK_Cを導入し、それらが式の中に含まれた素線Cu-SC比の解析解を得ることができた。(3)ポロイダルコイルのうち内側垂直磁界(IV)コイルについては、IV-Lコイル1台(蓄積エネルギー68MJ)の単体冷却励磁試験を平成7年1月から3月初めにかけて実施した。コイル冷却特性はほぼ設計どおりのデータを測定できたが、ヘリウム冷却系内の不純物除去で難点があり、安定な冷却運転ができず、定格電流20.8KAに対してコイル励磁を2.2KAにとどめた(雑誌論文6)。不純物除去フィルタと冷却関連装置の改良を行い、再試験する予定である。(4)1本の素線がクエンチしたときに他の素線へ電流が転流する安定性の解析と実験を実施した(星野、佐藤、高畑、三戸、他:1994年度春季・秋季低温工学超電導学会、D3-5(Apr.1994)246・B1-14(Nov.1994)35)。電流転流時の過度現象をピックアップコイルによって測定することができた。データと解析の比較検討を実施中である。2.密巻超伝導マグネットのミクロ安定性密巻マグネットの安定性評価法(雑誌論文1)の適用妥当範囲を確認することを目的として、内径90mmの密巻コイル2台の試作を開始した。
都市の水害脆弱性と水害の危機管理システムに関する研究

都市水害の発生機構に関して,山地からの流出解析,河川網における洪水追跡,堤内地における氾濫解析および下水道による排水過程解析を統合したモデルを構築した.京都市および寝屋川流域について適用を確かめ,また後者について戦後最大の実績降雨に対するシミュレーション解析により内水氾濫の危険域や各種治水施設の効果を考察した.地下浸水に関しては,種々の検討を重ねた結果,地下空間を貯水槽の連結からなる空間とし,流量公式によって流れを表現する実用的なモデルを提示した.大阪梅田の地下街・地下鉄空間や京都御池地下街への適用結果から,このモデルにより浸水解析が可能なことを示すとともに,地下鉄空間を通じた浸水伝播などを明らかにした.傾斜地都市における土砂災害に関して,都市背後地の山地からの土砂の生産・流出を雨水流出に土砂輸送を含めることによりモデル化した.これを神戸市に適用して実際との比較を行い,土砂堆積の分布では定性的に一致する結果を得た.このモデルでは,渓流沿いの土砂輸送能力に等しい土砂生産があると仮定しており,土砂の供給源については今後の検討が必要である.都市水害の危機管理あるいは安全対策に関して,福岡水害や東海水害の事例から都市水害の特徴をまとめた.わが国多くの都市は自然条件的にも社会条件的にも氾濫災害を受けやすい宿命にあること,これに急速な都市化が重なり水害脆弱性が増加していることなどを指摘した.また,治水施設の整備というハード対策とともに,予警報システムと情報伝達,避難計画,ハザードマップによる啓発と予備知識の充実など,ソフト対策が都市水害の危機管理・被害軽減にとって重要な課題であることを論じた.都市水害の発生機構に関して,山地からの流出解析,河川網における洪水追跡,堤内地における氾濫解析および下水道による排水過程解析を統合したモデルを構築した.京都市および寝屋川流域について適用を確かめ,また後者について戦後最大の実績降雨に対するシミュレーション解析により内水氾濫の危険域や各種治水施設の効果を考察した.地下浸水に関しては,種々の検討を重ねた結果,地下空間を貯水槽の連結からなる空間とし,流量公式によって流れを表現する実用的なモデルを提示した.大阪梅田の地下街・地下鉄空間や京都御池地下街への適用結果から,このモデルにより浸水解析が可能なことを示すとともに,地下鉄空間を通じた浸水伝播などを明らかにした.傾斜地都市における土砂災害に関して,都市背後地の山地からの土砂の生産・流出を雨水流出に土砂輸送を含めることによりモデル化した.これを神戸市に適用して実際との比較を行い,土砂堆積の分布では定性的に一致する結果を得た.このモデルでは,渓流沿いの土砂輸送能力に等しい土砂生産があると仮定しており,土砂の供給源については今後の検討が必要である.都市水害の危機管理あるいは安全対策に関して,福岡水害や東海水害の事例から都市水害の特徴をまとめた.わが国多くの都市は自然条件的にも社会条件的にも氾濫災害を受けやすい宿命にあること,これに急速な都市化が重なり水害脆弱性が増加していることなどを指摘した.また,治水施設の整備というハード対策とともに,予警報システムと情報伝達,避難計画,ハザードマップによる啓発と予備知識の充実など,ソフト対策が都市水害の危機管理・被害軽減にとって重要な課題であることを論じた.都市水害の発生機構に関して,山地からの洪水流出と市街地での氾濫解析を組み合わせ,洪水氾濫についての流域モデルを構築した.流出解析においては落水線モデルおよびキネマティックウェーブ・モデルを適用した.市街地においては,ネットワークモデルによる街路・市内河川網の洪水解析および非構造格子モデルによる平面的氾濫解析を構築した.下水道による雨水排除については,下水道の容積による制約を連続式に加味した簡易モデルを展開した.これらを京都市および寝屋川流域の適用し,過去の事例と比較し都市における水害発生機構を論じた.都市水害として危険性が指摘されている地下空間の浸水に関して,地下街に街路ネットワークモデルを適用したときの問題点を考察した.解析においては,開水路状態と管路状態の共存・遷移を一体的に扱う方法が大きな課題であるが,広い汎用性を得るには至っていない.地下街の空間規模から,水路ネットワークに比較的小さい死水域を附随させるモデル化が現実的と考えている.傾斜地都市における土砂災害に関して,都市背後地の山地からの土砂の生産・流出を雨水流出に土砂輸送を含めることによりモデル化した.これを神戸市に適用して実際との比較を行い,土砂堆積の分布では定性的に一致する結果を得た.このモデルでは,渓流沿いの土砂輸送能力に等しい土砂生産があると仮定しており,土砂の供給源についてさらに検討を進めなければならない.水害時の危機管理に関しては,昨年発生した東海水害の資料を数多く収集し,危機管理に当たっての多くの問題点を見いだした.氾濫防御および被害軽減という点からは,流域全体としての面的な対策の重要性を強調した.前年度の開発した都市水害に関する氾濫解析モデルを適用して,わが国の代表的都市河川であり低平地河川である寝屋川(大阪府)流域における氾濫災害の発生機構を考察した.この解析では,対象領域を山地部,河川網,下水道網,堤内地に分割し,それぞれの部分領域にキネマティック・ウェーブモデルによる流出解析,特性曲線法による一次元不定流解析,下水道の流下能力の上限を考慮した連続式のみによる解析,非構造格子モデルによる二次元氾濫解析を用いている.主な水害実績と解析結果を比較し氾濫特性の再現性を確かめるとともに,戦後最大の実績降雨に対するシミュレーション解析により,内水氾濫の危険域や各種治水施設の効果を論じた.地下浸水に関しては,地下鉄および地下街を複数の貯水槽が連なっている空間としてモデル化するとともに,運動方程式に代わって越流公式などの流量公式を用いて簡易化した.このモデルを大阪梅田の地下街・地下鉄空間に適用し,複雑な地下空間の浸水過程の解析が可能なことを示した.

また,地上の地盤高(浸水位)などが地下の浸水形態に及ぼす影響や,地下鉄空間を通じた浸水伝播のおそれなどを明らかにした.都市水害の危機管理あるいは安全対策に関して,福岡水害や東海水害の事例から都市水害の特徴をまとめた.わが国多くの都市は,自然的条件および杜会的条件からみて外水(河川,海)および内水による氾濫災害を受けやすい宿命にあること,都市化の進行とともにますます水害脆弱性が増加していることなどを指摘した.また,治水施設の整備というハード対策とともに,予警報システムと情報伝達,避難計画,ハザードマップによる啓発と予備知識の充実など,ソフト対策が都市水害の被害軽減にとって重要な課題であることを論じた.
腎尿細管間質の線維化を抑制する新規microRNAの同定および機能解明

本研究の研究代表者が所属する研究室では、慢性腎臓病の進行に寄与する機序について研究を進めている。ヒストン修飾酵素は様々な種類がこれまでに同定されているが、代表研究者は、ヒストン抑制マークであるH3K27me3の阻害薬の一つであるDznep (3-deazaneplanocin A)を慢性腎不全モデルに投与すると、線維化が抑制されることを見出した。Dznepを投与した障害腎について、遺伝子発現を網羅的に解析した結果、障害腎で発現が上昇するものの、Dznep投与により発現が減少するパターンの遺伝子群には線維化を促進させる遺伝子群が多く含まれていた。腎尿細管細胞株を低酸素刺激に暴露した際、Dznepを投与したときに発現が抑制される遺伝子群について網羅的に解析した。これらの実験の結果、Timp2(tissue inhibitor of metalloproteinase 2)は腎障害が惹起されることによって発現が上昇し、Dznepを投与することにより発現が低下する変動パターンを示すことを見出した。以上より、腎線維化の進行をDznepが抑制するメカニズムとして、線維化促進遺伝子群の発現を抑制する可能性が示唆された。次に、Dznepにより発現が抑制される遺伝子メカニズムとして、研究代表者はmicroRNAに着目した。In vitroの実験で、HK2細胞を1%低酸素下で培養した際に発現が抑制されるmicroRNAを網羅的にsmall RNA-seqにより解析したところ、338個のmicroRNAが同定された。一方で、142個のmicroRNAがDznepにより発現が上昇した。この中にTIMP2に結合することでTIMP2の発現を抑制する働きをもつmicroRNAが存在すると想定された。研究代表者は同じテーマで引き続き、研究を継続している。Small RNA-seqという新しい手法を用いて、低酸素下において変動するmicroRNAsを網羅的に解析している。Small RNA-seqにより見出した新規のmicroRNAがDznepによってTIMP2の発現を抑制するかどうかを検討していく。本研究の研究代表者はヒストン修飾酵素阻害薬の一つであるDznep (3-deazaneplanocin A)を慢性腎不全モデル(片側の虚血再灌流障害モデル)に投与すると、線維化が抑制されることを見出した。In vivoのサンプルからLaser Capture microdissectionによって尿細管細胞のみを切り出し、Vehicleを投与した対側腎、Vehicleを投与した虚血再灌流腎(障害腎)、Dznepを投与した障害腎について、遺伝子発現を網羅的に解析した。その結果、発現パターンは3つに分類されることを見出した。研究代表者はその中でも特に、障害腎で発現が上昇するものの、Dznep投与により発現が減少するパターンの遺伝子群に着目して解析した。その結果、線維化を促進させる遺伝子群が多く含まれていることを見出した。さらに、in vitroの実験で腎尿細管細胞株(HK2:human kidney-2およびRPTEC: renal proximal tubular epithelial cells)を用いて、低酸素刺激に暴露した際、Dznepを投与したときに発現が抑制される遺伝子群についても網羅的に解析した。その結果、in vivoおよびin vitroの両方で、Timp2(tissue inhibitor of metalloproteinase 2)は腎障害が惹起されることによって発現が上昇し、Dznepを投与することにより発現が低下する変動パターンを示すことを見出した。網羅解析によって得られた結果はqPCR実験により結果を検証し、結果が合致することを確認した。以上の結果から、腎線維化の進行をDznepが抑制するメカニズムとして、線維化促進遺伝子群の発現を抑制する可能性が示唆された。研究代表者は上記に述べた研究実績を論文の形で業績としてまとめた。

DnzepによりTimp2の発現が抑制されるエピジェネティックな分子メカニズムについて、microRNAに着目しながら研究を進める予定である。Small RNA-seqにより見出した新規のmicroRNAがDznepによってTIMP2の発現を抑制するかどうかを検討していく。