hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
癌遺伝子および癌関連抗原の発現に基づく乳癌進展の3次元的解析:乳房部分切除術への応用

また、免疫化学的な解析により乳管内進展病巣がmalignant potentialを有することを明らかにした。さらに癌の乳管内進展を乳管腺葉系との関連で定義することで、より正確な癌の進展状態を把握することが可能となった。一方、臨床的には33例の乳房温存術標本の解析で、8例に癌の乳管内進展を認め、うち1例にのちに乳癌の再発を認めたが、乳管内進展なしの25例では癌の再発を認めていない。また、乳癌の多中心発生と乳管内進展の間に強い相関を認めた。従って、今後は乳管内進展を示す乳癌に対する内分泌療法、化学療法または照射療法などの治療反応性を検討する必要がある。本年度は先ず乳房温存療法を施した乳癌手術標本約30例を材料としてハム・スライサーを用いて3mm幅で組織を全割し、癌の進展・分布の2次元的なマッピングを行った。その結果、癌の乳管内進展(Extensive Intraductal Component:EIC)は浸潤癌の約3割に認められ、乳頭側における癌遺残の原因となっていることも確かめられた。また、EICは比較的高率に癌の多発や異型上皮(ADH)と併存する可能性が示唆された。次にEIC(十)の症例を対象にコンピュータ支援下に準連続切片による3次元マッピングを試みた。その結果、一見単一の癌とみなされた症例も実は多中心発生の乳管内癌から成り立っていることが判明した。これらの癌は同一乳管系において1)広範かつ樹枝状に多数の末梢乳管に癌を認める形式、あるいは2)多発性ではあるが比較的限局した範囲内にとどまり、主に末梢-乳頭方向に進展していく形式に大別された。いずれにせよ、EICと呼称されるものはあくまでも乳管内を進展する癌そのものであり、浸潤癌に派生するものではない、ということを可視的に証明できた。また乳房温存療法においてEIC(十)乳癌の術後再発率が高い理由が単に癌の乳管内進展の程度(広がり)のみならず、EIC(十)乳癌がそもそも発生において多発性であるという点からも裏付けられた。今後解析症例数を増やしていくとともに、このような同一乳管系内の癌の多発性と、さらに広い意味での多発性との関連を観るために、whole breastの検索を準備中である。一方癌遺伝子産物等に関する免疫組織化学的検索は未だpreliminaryな段階であるが、異型上皮(ADH)および乳管内癌(DCIS)症例を対象に現在検討中である。1.コンピュータグラフィックスによる乳癌組織の三次元復構コンピュータグラフィックスを用いた乳癌の三次元復構により、乳癌が末梢乳管から発生することを明らかにした。さらにその進展様式について、末梢で発生した乳癌が連続的に、または非連続的に乳管内を進展することを示した。この結果に基づき、従来曖昧であった癌の乳管内進展の定義を「非浸潤癌巣が末梢乳管域を超え、中心乳管へ進展していること、または中心乳管域に明らかな非浸潤癌巣を認めること(intraductal spreading of carcinoma,ISC)」とした。癌の乳管内進展は乳房温存療法における再発の危険因子であることが次第に明らかになりつつあり、乳管腺葉系の構造に立脚した癌の乳管内進展の解析は極めて重要である。2.癌遺伝子産物および癌関連抗原の発現に基づく乳管内進展病変の解析抗
振動二次元柱状物体からの境界層剥離流れ・渦構造に関する研究

曳航水槽実験装置を用いて、固定円柱および流れ方向に強制的に振動している円柱からの渦放出特性について、可視化および流体力測定実験を行った。円柱表面上スパン方向に設けられた小孔から可視化インクの浸出を行い、アルゴンガスレーザを光源とした可視化光源などを用いて境界層はく離流れの計測を行い、三次元的なはく離流れの特徴を把握した。次に流れ方向に強制的に振動させた円柱からの渦放出特性について、振動振幅比2a/d=0.2、振動周波数比f/f_Kが1.6から2.6の範囲で、境界層はく離流れ、スパン方向の三次元性、揚力・抗力特性、渦放出特性などについて調査を行った。その結果以下の事柄が得られた。(1)交互渦放出と双子渦放出が間欠的に発生する領域はf/f_Kが1.9から2.4の範囲であり、f/f_Kが1.8以下ではすべて交互渦放出であり、f/f_Kが2.5以上ではすべて双子渦放出であり間欠的に入れ替わって放出されることはなかった。(2)交互渦放出と双子渦放出が間欠的に起こっている状況での流れの可視化より、双子渦放出が比較的長く続く時には円柱から双子渦を放出している領域がスパン方向に長くなっていることが確認された。(3)ロックイン領域であっても、交互渦放出の場合には渦放出に三次元的な構造が確認された。(4)流体力の加振変位に対する位相差はf/f_K=2.2から2.6において若干の進み位相となることが観測された。しかしながら本条件の計測手法ではデータ処理方法が困難なため、より詳細な計測システムやデータ処理を必要とする。
新規プリオン類似蛋白の生理機能解明と病原性(第2のプリオンの可能性)の追求

プリオン蛋白(PrP)欠損マウス(Ngsk-Prnp^<0/0>)に惹起される小脳Purkinje細胞変性におけるプリオン類似蛋白PrPLP/Dplの役割を明らかにするため、PrP^cの機能は消失しているがPrPLP/Dplを発現しない別系統のマウスZrchI-Prnp^<0/0>の遺伝的背景に、神経細胞またはPurkinje細胞特異的にPrPLP/Dplを発現するトランスジェニックマウスTg(PrPLP/DDl)Zrch-Prnp^<0/0>を作製した。その結果、全てのTg(PrPLP/Dpl)Zrch-Prnp^<0/0>マウスは小脳失調を来しPurkinje細胞変性死を呈した。また、これに遅れて、Tg(PrPLP/Dpl)Zrch-Prnp^<+/+>マウスの一部でもPurkinje細胞変性死が認められた。しかし、Tg(PrPLP/Dpl)Zrch-PrnP^<0/+>マウスではPurkinje細胞変性死は認められなかった。つまり、これらの結果は、Ngsk-Prnp^<0/0>マウスに認められたPurkinje細胞変性死が細胞それ自身におけるPrPLP/Dplの過剰発現によって起こり、またPrP^cが発現量依存的にPrPLP/Dplの神経細胞変性作用を阻害することを意味している。次に、PrPLP/Dplの神経毒性とそれに拮抗するPrP^cの防御作用の分子機構解明のために、いくつかのキメラあるいは変異型PrP遺伝子トランスジーンをNgsk-Prnp^<0/0>に再導入した。そのうちN末66アミノ酸(residues 23-88)を欠く欠失変異型PrPはNgsk-PrnP^<0/0>の神経変性を防御することができなかった。従来PrP^cはCu^<++>細胞内取り込みや代謝に関与するとの説があったが、この領域はCu^<+/+>結合部位とされるOcta-repeat領域に相当する。PrP^cの神経変性防御作用にはCu^<+/+>か関与することが示唆された。PrPとの相同性から、PrPLP/Dplの神経細胞における発現がプリオン病におけるPrPScの蓄積あるいは病態に影響を与える可能性があり、遺伝子改変マウスを用いて検討した。先ず、神経細胞でPrPLP/Dplを異所性に発現するマウス(Ngsk-Prnp0/+)にプリオン(Fukuoka-1株)を脳内に接種し、発症までの潜伏期、病理変化、PrPSc蓄積を解析し、PrPを同等レベルに発現するがPrPLP/Dplは発現しないマウス(Zrch-Prnp0/+)と比較検討した。両者の潜伏期の平均は各々282±23及び286±27日と有意差を認めず、病理学的にも同様の部位(大脳皮質と海馬)に同レベルの海綿状変性とグリオーシスが検出された。また蓄積したPrPSc量にも差はなく、糖鎖付加パターンも同様であった。

即ち、PrPLP/Dplはプリオン病マウスモデルにおいては、その病態を正にも負にも修飾しないと結論された。またプリオン接種Ngsk-Prnp0/+マウス脳内にはプロテアーゼ抵抗性PrPLP/Dplは検出されず、プリオンによるPrPLP/Dpl構造変換を示唆する証拠は得られなかった。さらにプリオン接種Ngsk-Prnp0/+マウス脳乳剤をPrPは発現せずPrPLP/Dplのみを発現するNgsk-Prnp0/0マウスに脳内接種したが接種後400日以上経過しても発症は見られていない。即ち、プリオンによってはPrPLP/Dplの構造変換を誘導することはできず、病原性も獲得しないことが示唆された。我々が作成したプリオン蛋白欠損(Ngsk Prnp^<0/0>)マウスは、生後約1年すると小脳プルキンエ細胞変性を伴う失調性歩行を呈する。しかし、他で作成されたZrch I Prnp^<0/0>マウスではプルキンエ細胞変性死は認められず、なぜこのような差異が生じるか不明であった。最近、我々はPrP遺伝子の下流にPrP類似蛋白(PrP-like protein, PrPLP/Dpl)をコードする遺伝子を発見した。興味深いことに、PrPLP/Dpl遺伝子がNgsk Prnp^<0/0>マウスでは過剰発現するが、Zrch I Prnp^<0/0>マウスでは発現は認められなかった。これらの結果から、Ngsk Prnp^<0/0>マウスに認められた小脳プルキンエ細胞変性死には、プリオン蛋白(PrP^c)の正常機能消失とPrP類似蛋白(PrP-like protein, PrPLP/Dpl)の過剰発現の両者が関与していると考えるに至った。そこで、PrP^cは消失しているがPrPLP/Dplを発現しないZrch I Prnp^<0/0>に、神経細胞またはプルキンエ細胞特異的にPrPLP/Dplを発現させ、プルキンエ細胞変性死がおこるかどうかを検討した。その結果、これらのTg(PrPLP/Dpl).Zrch I Prnp^<0/0>マウスは全て小脳失調性歩行を来しプルキンエ細胞変性死を呈した。また、これに遅れて、Tg(PrPLP/Dpl).Zrch I Prnp^<0/+>マウスでもプルキンエ細胞変性死が認められた。しかし、Tg(PrPLP/Dpl).Zrch I Prnp^<+/+>マウスでは現在のところプルキンエ細胞変性死は認められていない。これらの結果は、Prnp^<0/0>マウスに認められたプルキンエ細胞変性死がPrPLP/Dplの過剰発現によって起こり、またPrP^cが発現量依存的にPrPLP/Dplの神経変性作用を阻害することを示している。Purkinje細胞変性を来すプリオン蛋白(PrP)欠損マウス(Ngsk-Prnp^<0/0>)の神経細胞で異所性に発現するプリオン類似蛋白(PrPLP/Dp1)の機能解明を試み以下の知見を得た。(1)PrPLP/Dp1を発現しないZrchI-Prnp^<0/0>マウスのbackgroundに、Purkinje細胞特異的にPrPLP/Dp1を強制発現させることにより、Purkinje細胞変性が細胞それ自身におけるPrPLP/Dp1の過剰発現によって起こり、またPrP^cが発現量依存的にPrPLP/Dp1の神経細胞変性作用を阻害することが判明した。プリオン病では構成的PrP立体構造変換によりPrP^Cの機能消失が起り、蓄積したPrP^<Sc>がPrPLP/Dp1と同様の神経毒性を発揮すると仮定すれば、Ngsk-Prnp^<0/0>は有用なプリオン病神経変性モデルといえる。(2)変異型PrP遺伝子のNgsk-Prnp^<0/0>への再導入実験により、N末66アミノ酸(residues23-88)がPrP^Cの神経変性防御作用に必須であることを明らかにした。
聴覚障害児の言葉と心の発達を促すiPadアプリ教材の開発とその実践的応用

平成30年度は、29年度にバージョンアップに取り組んだアプリを公開し、このアプリを利用して「この星に生まれて」を課題曲とする「第2回手話うたコンテスト」をインターネット上で実施した。また、アプリの利用者にインタビュー調査をおこない、聴覚障害があり人工内耳と補聴器を装用している11歳男子から「このアプリは、歌声と一緒に、歌詞と音符が見えるので、歌いやすい」という意見が寄せられた。本アプリの利用者は、本教材アプリをダウンロードした人だけではなく、手話うたコンテストの応募作品をYouTubeで閲覧した不特定多数の人も含まれると考えられる。手話うたコンテストの応募作品をYouTubeで閲覧した人の総数は39,187人であった。インクルーシブ教育に関して、障害のある子とのポジティブな交流経験が大学生の共感性に与える影響について検討することを目的として調査研究をおこなった。大学生180名を対象に調査をおこなった結果、障害のある子との交流をただ経験するだけではなく,ポジティブに認知することが共感性に対して重要であることが示唆された。障害のある子との交流経験をポジティブに認知していることは,その子への理解だけでなく,自分とは違う他者を理解しようとする共感性といった特性にも影響を及ぼすことが考えられる。この成果は、北陸心理学会第53回大会にて報告した(荒木友希子・金澤萌恵2018障害のある子どもとのポジティブな交流経験が大学生の共感性に与える影響北陸心理学会第53回大会発表論文集、p45)。また、人工内耳装用者の音楽聴取やプロソディ知覚の認知心理学的実験をおこなった成果を2本の学術論文として報告した。前回の挑戦的萌芽研究で開発した漢字と手話の学習ドリル教材(iPadアプリ「手話えーもん」)を聴覚障害児に利用してもらい,この教材が漢字および手話を学習するのに有効な教材であったか,客観的でより深い実践的評価を実施し,その有効性を明らかにすることを目的とした。本年度は、石川県立ろう学校小学部に在籍する聴覚障害児2名を対象に,前回の挑戦的萌芽研究で開発した教材アプリ「手話えーもん」をインストールしたiPadを用いて,各子どもの学習ニーズに合わせてアプリを使用してもらった。なお,ろう学校での教育場面だけではなく,家庭生活を中心として使ってもらった。対象となった聴覚障害児の特徴にあわせてアプリをカスタマイズして利用してもらった。教員や保護者には,教材アプリを使用した際には,使用した課題,所要時間,使用した感想,ことばの発達の様子の評定などに関する記録をつけるように依頼した。教材アプリを導入する前,および,導入の途中,導入して半年経過後の三回にわたって,それぞれの聴覚障害児を受け持っているろう学校の教員,および,保護者に対してインタビュー調査をおこなった。その結果、前回の挑戦的萌芽研究で開発した教材アプリを使用することによって学習意欲が高まったことが報告された。特に、石川県立ろう学校で独自に実施している助詞検定の試験勉強に本アプリ「手話えーもん」を使用することによって、助詞検定にスムーズに合格することが可能になったことが示された。当初の計画通り、関係機関から協力を得て研究を遂行中のため。歌詞や音符、リズムを視覚的に提示することによって,聴覚障害のある子どもが音楽の聴取をよりスムーズにおこなうことを支援するiPad教材アプリ「手話うたアプリ」を開発し,その実践的応用をおこなった。具体的には,全国の聴覚特別支援学校やろう学校,手話サークルなどへ周知して,「手話うたアプリ」を用いて課題曲「ビリーブ」(作詞作曲:杉本竜一)の手話歌をおこなっている様子を撮影して投稿する手話うたコンテストをインターネット上で実施した。その結果,聴覚障害のある子ども達や関係者計53名が「手話うたアプリ」を用いてさまざまな工夫をこらした手話歌をおこなった動画をインターネットのyouTubeにデータベースとして蓄積することができた。また,先天性重度聴覚障害のある子どもに対して幼少期に人工内耳埋め込み手術を施行することを決断した母親2名に対して,インタビュー調査を実施した。その結果は,日本特殊教育学会第54回大会にて報告をおこなった。(荒木友希子・新井瑠夏2016小さな子どもに人工内耳手術を受けさせた母親の思いとは日本特殊教育学会第54回大会発表論文集)音声言語を獲得した人工内耳装用者がより満足のいく聞こえを得るために,人工内耳装用者のQOLの向上をめざし,人工内耳シュミレーターにおける言語・非言語情報の伝達に関する認知心理学的実験もおこなった。人工内耳装用者は音楽聴取や感情のプロソディ知覚において困難さがあることが認められた。当初の計画通り,関係機関から協力を得て研究を遂行中のため。平成28年度の研究として開発をおこなった音楽アプリ「手話うたアプリ」に関して、楽曲の追加をおこなう改訂版を作成したことが29年度の主な研究成果である。具体的には、平成28年度に開発したアプリに収録されている楽曲は「ビリーブ」だけであったが、29年度に追加する楽曲の選定を詳細に実施し、最終的には「この星にうまれて」という楽曲の歌詞や映像、楽譜、音源を作成し、28年度に開発したアプリの改訂版として楽曲の追加をおこなった。アプリの公開手続きをおこなっているところであり、平成29年度内には公開ができなかったが、平成29年度のはじめにはAppStoreでの無料公開をおこない、ろう学校においてこのアプリを用いた実践的応用研究をおこなう予定である。また研究成果の報告実績としては、平成28年度に実施したインタビュー研究を査読付き学術論文として刊行した(荒木友希子・荒井瑠夏2017

幼児期に人工内耳埋め込み手術を施行した聴覚障害児のアイデンティティ形成について心理学の諸領域, 6, 49-59.)具体的には、先天性重度聴覚障がいのある人工内耳装用児2名を対象に、自身の障がいや人工内耳についてどのように受け止めているかインタビューを実施た。人工内耳装用児本人の障がい受容、精神的健康、アイデンティティ形成に対して、居場所と物語という観点から質的分析をおこない、人工内耳が聞こえる保護者とのコミュニケーション手段として機能することが重要であることを明らかにした。聞こえる子どもと聞こえない子どもが一緒に使って音楽を楽しむことができることをめざした、これまでにない新しい手話歌音楽アプリの第一弾を平成28年度に開発し、それをふまえて29年度には改訂してさらにバージョンアップすることができたことから、順調に新調していると考えられる。平成30年度は、29年度にバージョンアップに取り組んだアプリを公開し、このアプリを利用して「この星に生まれて」を課題曲とする「第2回手話うたコンテスト」をインターネット上で実施した。また、アプリの利用者にインタビュー調査をおこない、聴覚障害があり人工内耳と補聴器を装用している11歳男子から「このアプリは、歌声と一緒に、歌詞と音符が見えるので、歌いやすい」という意見が寄せられた。本アプリの利用者は、本教材アプリをダウンロードした人だけではなく、手話うたコンテストの応募作品をYouTubeで閲覧した不特定多数の人も含まれると考えられる。手話うたコンテストの応募作品をYouTubeで閲覧した人の総数は39,187人であった。インクルーシブ教育に関して、障害のある子とのポジティブな交流経験が大学生の共感性に与える影響について検討することを目的として調査研究をおこなった。大学生180名を対象に調査をおこなった結果、障害のある子との交流をただ経験するだけではなく,ポジティブに認知することが共感性に対して重要であることが示唆された。障害のある子との交流経験をポジティブに認知していることは,その子への理解だけでなく,自分とは違う他者を理解しようとする共感性といった特性にも影響を及ぼすことが考えられる。この成果は、北陸心理学会第53回大会にて報告した(荒木友希子・金澤萌恵2018障害のある子どもとのポジティブな交流経験が大学生の共感性に与える影響北陸心理学会第53回大会発表論文集、p45)。また、人工内耳装用者の音楽聴取やプロソディ知覚の認知心理学的実験をおこなった成果を2本の学術論文として報告した。研究代表者の荒木、および、分担者の武居がメンバーとなっている「聴覚障害児のためのアプリ教材開発研究会」が、平成27年度子どもゆめ基金(独立行政法人国立青少年教育振興機構)の助成金の交付を受け、開発した「手話うたアプリ」をさらに発展させる形で、人工内耳装用児を対象に,視覚的情報を用いて音楽の聴取をよりスムーズにおこなえることを支援する教材アプリを開発、応用的実践をおこなう。開発したiPad教材アプリ「手話うたアプリ」の問題点を分析し,さらに実践的応用をおこなう。
腫瘍AMPKの血管新生阻害剤耐性への関与及び治療効果予測と治療標的としての可能性

本研究は肝細胞癌に対する血管新生抑制治療に対する耐性メカニズムについてエネルギー代謝の観点から研究を行ったものである。細胞が飢餓状態に陥るとAMPKが活性化する事で、細胞の危機的状況を回避する事が知られている。我々の研究では癌細胞においても血管新生抑制治療を行うと、腫瘍のAMPKが活性化する事が分かった。癌細胞のAMPKの役割を知る為に、AMPKを欠損した肝癌細胞株を作製し、実験培養及び実験マウスを用いて検証したが、AMPKは血管新生抑制治療に対する耐性には関与していなかった。一方、癌細胞の低酸素誘導蛋白(HIF)の抑制は肝細胞癌に対する抗腫瘍効果を示した。本研究は癌治療における血管新生阻害剤の耐性メカニズムについてエネルギー代謝を中心に研究しているものである。肝癌皮下腫瘍モデルを用いて血管新生阻害剤を投与した癌組織を採取した。治療後癌組織をエネルギー恒常性の中核因子であるAMPKを免疫染色法で評価したところ、血管新生阻害剤の投与により癌組織内のAMPKが活性化する事を明らかにした。AMPKが血管新生阻害剤耐性メカニズムに関与するか否かについて検証する為、3種類の肝癌細胞株のAMPK安定的欠失細胞株を作製した。これらの確認の為に、ウェスタンブロット法、リアルタイムPCR法を用いてAMPKの発現レベルをそれぞれの癌細胞で評価し、発現レベルが低下している事を確認した。AMPK欠失肝癌細胞株の作成に成功したため、次にこれらの癌細胞が血管新生阻害剤に対してどのように反応するかを検証する事とした。それぞれの細胞株を培養し、増殖アッセイを行った。増殖アッセイは正常酸素下、低酸素下、飢餓条件下の種々の培養環境で行った。種々の培養環境下で行ったのは、血管新生阻害治療により起こり得る腫瘍の環境を想定し、低酸素、飢餓条件により増殖アッセイを行った。AMPK欠失肝癌細胞は対照となる肝癌細胞と比べても種々の環境による細胞培養においても明らかな脆弱性は認めなかった。in vitroの系ではAMPKが明らかに血管新生阻害剤耐性に関与する事は証明できなかった。確認の為、in vivoでの評価も行った。皮下肝癌モデルを用いてAMPK欠失肝癌細胞に対し血管新生阻害剤を投与したが、対照となる肝癌細胞と比べて抗腫瘍効果において明らかな違いは現れなかった。これまでの検証ではAMPKが血管新生阻害剤の耐性に関与するという事は証明できなかった。次に、AMPK以外の腫瘍エネルギー代謝に関わる重要な因子を抽出し血管新生阻害剤体制への関与を検証していく。初年度の計画は1血管新生阻害剤により肝癌細胞でAMPKが活性化する事の証明、2AMPK欠失肝癌細胞をshRNAを用いて作製する事、3AMPK欠失肝癌細胞が血管新生阻害剤耐性に関与するかどうかをin vitro、in vivoの実験系で検証するまでを予定していた。初年度はこれら予定した全ての検証を行う事ができた。従って、計画の遂行としては順調に進んだと言える。しかし、これまでの検証によりAMPKは血管新生阻害剤の耐性メカニズムには明らかに関与していない事が残念ながら示唆された。従って、実験開始時に立てた仮説は否定的と考えられた。そのため、AMPK以外のエネルギー代謝に関わる分子が血管新生阻害の耐性メカニズムに関与するという新たな仮説を立て、次年度に検証を行う方針としている。従って、次に、癌細胞のエネルギー代謝に関わるとされる複数の遺伝子を選定し、それらが血管新生阻害剤耐性に関与するかどうかについて検証した。癌細胞の解糖系エネルギー代謝に関わるピルビン酸キナーゼ(PKM2)、癌細胞の乳酸排泄に関わるMCT1,MCT4の発現調整を行っているCD147を標的とし、それらを欠失させた癌細胞を用いてin vitro、in vivoの系で血管新生阻害剤に対する耐性メカニズムに関与するか検証した。癌細胞はPKM2をノックダウンする事により、それだけで強いアポトーシスが引き起こされた。PKM2は癌細胞の生存に大きく関与する分子である事が明らかになり、今後の治療標的分子として有望であると考えられた。次にCD147をノックダウンした癌細胞では、リアルタイムPCRによる遺伝子発現の検証ではMCT1が有意に低下、MCT4は低下が見られなかった。PKM2、CD147欠失癌細胞をマウス皮下に接種し血管新生阻害剤の効果の違いについて評価したが、どちらの癌細胞も対照群と大きな差は見られなかった。今回、エネルギー代謝に関わる分子を癌細胞で欠失させ、血管新生阻害剤耐性について検証したが、標的とした分子が明らかに関与しているとは言えない結果であった。次に血管新生阻害剤では、虚血にともなう低酸素が引き起こされ低酸素誘導蛋白(HIF1)が増加する事が報告されている。また、HIF1の下流蛋白には血管内皮増殖因子(VEGF)があり、これらが癌の血管新生の鍵とされている。HIF1及びVEGFを標的とする薬剤の効果について検証し、それらを報告した。

一方、癌細胞の低酸素誘導蛋白(HIF)の抑制は肝細胞癌に対する抗腫瘍効果を示した。次年度では、まず血管新生阻害剤において活性化されるエネルギー代謝の検索を行う。癌細胞のエネルギー代謝として、PKM2を介した解糖系の活性化、CD147を介した乳酸の排泄経路が重要である事が他の文献では報告されており、これらを中心に検証していく予定である。また、血管新生阻害剤では腫瘍内に著明な低酸素が引き起こされる事はこれまでの文献で明らかであり、低酸素に関わる分子の耐性メカニズムについても同時に検証し、血管新生阻害剤耐性に関わるエネルギー代謝の分子を発見する。そして、活性化している分子の欠失肝癌細胞株を作製し、増殖アッセイと肝癌皮下腫瘍モデルを用いて血管新生阻害剤耐性に関与している事を明らかにしていく。また、エネルギー代謝に関わる分子を標的とする抑制剤を用いた薬理学的検証も行う事としている。肝細胞癌初年度に購入予定としていた種々の抗体などが実験計画の一部変更により購入せずに行う事が出来たため、予定した購入金額より少額の使用となった。また、その他に挙げていたマイクロアレイによる網羅的解析費用が次年度に移行したため次年度使用額が生じた。初年度に予定していたマイクロアレイによる網羅的解析費用が次年度に移行する。初年度その他の項目に予定していた通りの金額になる事が予測される。次年度は実験計画の変更を余儀なくされているため、追加の抗体、sh-RNA、実験関連試薬の購入が必要となり次年度使用額の物品購入費がかかる事が予測される。
有害化学物質の真核微生物に及ぼす複合作用とその評価に関する研究

有害化学物質による環境汚染は人間を含むあらゆる生命体の存亡に関わる問題である。本研究は有害化学物質の生態系に及ぼす毒性作用を評価するため、単細胞生物でありながら、高等生物と同じ核構造を有する真核生物である酵母と植物プランクトンを毒性試験の供試生物として用いた。植物プランクトン及び酵母の野生株を用い、増殖特性を解析する事によって有害化学物質の細胞毒性を評価した。本研究では特に複数の化学物質を同時に投与したときの毒性の相互作用の起こる様式を、確率モデル、多変量解析、等効果線法の手法によって解析した。これらの方法により、重金属と有機化学物質のそれぞれ及び相互の間の毒性は物質の組み合わせや濃度範囲によって、相加作用、相乗作用、拮抗作用の3つの様式が認められた。また酵母の3種のDNA修復機能欠損株から2重欠損株のisogenic株を作出し、これらの株を用いて有害化学物質によるDNA損傷性を検出する実験系について検討した。変異原性の明かな4NQOAF2を供試したところ、上記の変異は野生株と比較してDNAの損傷に起因すると思われる明確な増殖阻害がみられた。実験結果から、真核生物である酵母を用いて簡便にDNA損傷性を検出する試験系が開発された。本研究ではまた、かび集物質を産生するラン藻類の増殖特性に及ぼすヒ素の影響について検討した。4種のラン藻類について調べたが、種によってその増殖に及ぼすヒ素の毒性強度には差異が認められた。かび臭物質の産生量は藻類の増殖量とほぼ比例していた。これらの化学物質の微生物増殖阻害に及ぼす影響の強さは細胞内への取り込み量と高い相関がみられた。また重金属の場合には、これらの化学種によっても毒性の強さは、100倍以上にも及ぶ場合のある事が観察された。重金属の生態系における移行と汚染が最終的には人間に及ぼす影響を評価する観点から、土壌中からイネへの吸収移行についても実験的な検討を行った。微生物を用いた有害化学物質(重金属)の毒性試験法を比較検討するために、植物プランクトンと酵母を用いた。実験に用いた植物プランクトンはChlorella ellipsoidea Gernecで、供試した重金属はカドミウム(Cd)とクロミウム(Cr)で、両金属の植物プランクトンの増殖に及ぼす相互作用と、毒性の作用機構を研究するために、生物濃縮について検討した。実験の結果、両金属は生物濃縮の点でも、増殖阻害にみられる毒性の点でも相乗的に作用する事が判明した。つまり、細胞内に取り込まれた一方の金属は他方の金属が培地中に共存する事によって増加し、また増殖阻害も一層強められた。藻細胞をフレンチプレスで破砕し、遠心分離して、各画分毎の重金属濃度を測定した。この結果、Cdの可溶性画分と膜画分中の存在比は、全量に対して、それぞれ50%及び20%であった。これにCrが加わると、両画分中の存在比はともに40%に変化した。両金属が共存することによって、細胞内の濃縮部位の存在比が変化した。有機水銀は無機水銀に比べて、毒性が強い事が過去に明らかにされてきたが、ここでは2種の有機、4種の無機水銀を用いて、酵母を用いた毒性試験法の可能性を探ると共に、生物濃縮の点からこの問題について検討した。ここでの酵母の毒性評価の指標として生存率と比増殖速度定数を用いた。毒性の強度をEC_<50>値で比較すると有機水銀は無機水銀より約100200倍高かった。

有機水銀の中でもCH_3HgClの方がCH_3HgOHより毒性が強く、無機水銀では化学形の違い(HgCl_2、HgSO_4、Hg(NO_3)_2、Hg_2(NO_3)_2)による大きな差異は認められなかった。酵母細胞内への水銀の取り込み量を分析し、比較すると、無機水銀より有機水銀の方が100倍異常高い濃縮係数が得られた。これらの事から、有機水銀の毒性の強さは、単に化学形態の違いだけでなく、細胞内への濃縮性の違いも大きく関与している事が推測された。本研究は真核微生物である酵母を用いて、重金属を含む有害化学物質の細胞毒性及び遺伝毒性に関与するDNAの損傷性を評価するための毒性試験法を確立することを目的とする。そのために以下の研究を行う。1.DNA修復機能欠損株の作出酵母には3種のDNA修復機能があるが、その突然変異体に修復機能を欠損した株がある。これらの株と野性株とを戻し交雑を行うことによって、また欠損株同志をかけ合わせることによって、1種及び2種の修復機能を欠損するisogenic株を作出した。これらの株を用いて、化学物質のDNA損傷性が検出できるかどうかを検討した。明らかに変異原物質として知られている4NQOと変異原物質でないカナマイシンとの酵母の増殖特性に及ぼす影響を比較すると有意な差異が認められた。2.重金属の増殖阻害作用と生体濃縮重金属による細胞毒性を評価するために、酵母の増殖阻害特性を増殖速度係数を指標としてEC_<50>値を算出することによって検討した。有機水銀と無機水銀の毒性をEC_<50>値で比較すると、前者は後者より約2桁低かった。つまり100倍毒性の強いことがわかった。しかし両者の生体内濃縮量をみると、前者は後者より2桁多いことが認められた。つまり有機水銀の毒性の強さは無機水銀より細胞内にとり込まれ易いことによる。3.重金属毒性の相互作用化学物質の毒性の相互作用を定量的に評価するための数学モデルを検討した。ここでのモデルは、個々の化学物質の細胞に与える毒性は独立事象であると仮定して、2つもしくはそれ以上の物質が同時に作用したときの毒性の強さは、独立事象の和である同時確率で表わされるものとして表現された。このモデルを用い、統計的な有意差を考慮して、相互作用を評価すると、多くの場合に相加作用となることがわかった。今年度は酵母を供試生物として、重金属及び有害化学物質の細胞毒性、及び変異原性を評価するため次の2つの課題を重点的に研究を行った。(1)有害化学物質の細胞毒性に及ぼす相互作用に関する研究本研究は重金属としてTl、Coを、化学物質にはPCP、TCPを対象として、酵母の野生株の増殖特性を指標として、細胞毒性に及ぼす相互作用の様式を明らかにする事を目的としている。相互作用の様式を判断する手法として、多変量解析、Gowing & Colbyの方法、Isoblogram法を用いた。これら4種の化学物質を単独に投与したときの毒性の強さの順位は、PCP>TCP>Co>Tlであった。TlとCoの2種の重金属を同時に投与したとき、両者は相乗的な相互作用がみられた。これにPCPを添加すると、その相乗作用は一層強まる傾向がみられた。更にTCPを加えたときも同様であった。(2)酵母を用いた有害物質のDNA損傷性と修復作用様式に関する研究
微量測定法を用いた母乳のエネルギー量・蛋白質量・脂質量・糖質量

母乳中の成分測定法として血液測定用ドライケミストリー法の有用性を検討した。微量の母乳中の乳糖、蛋白質、脂質量をドライケミストリー法により測定を試みたところ、乳糖量及び蛋白質量の測定結果は従来法による測定値の間に有意な正の相関が認められた。以上より、ドライケミストリー法は微量母乳中の乳糖量およびたんぱく質濃度の簡便で迅速な測定法として有用であることが示唆された。本年度の研究実績としては、ドライケム法で測定した母乳中の乳糖量5.44±0.63g/dL(n=30)は、酵素法により測定した乳糖量4.96±0.57g/dL(n=30)に比較して有意に高値を示した(p<0.05)。ドライケム法で測定した乳糖量と酵素法により測定した乳糖量は強い相関関係が認められた(y=0.7694x+0.776、r=0.84、p<0.05)。乳児の健やかな成長を担う母乳中の成分の微量測定法の検討により、母乳中の成分地の基礎的なデータを得たことに意義がある。これは測定機器としてドライケムがあれば、母乳哺育の推進につながるなど、授乳婦を対象とした栄養指導において、母乳成分の変動などの科学的根拠につながるため重要であると考えられる。本年度の研究実績としては、ドライケミストリー法により測定した母乳中のタンパク質量1.6±0.5g/dL(1.14.3g/dL、n=64)に比べて、ケルダール法により測定したタンパク質量2.0±0.5g/dL(1.54.4 g/dL、n=64)は有意に高値(p<0.05)であった。ドライケミストリー法により測定したタンパク質量とケルダール法により測定したタンパク質量の間には強い相関関係が認められた(y=0.9267x+0.5421,r=0.968,p<0.05)。このようにドライケミストリー法とケルダール法とは測定原理が異なってはいるものの、両者の測定値を直線回帰分析により比較検討すると、r=0.968ときわめて強い正の相関を示した。このことは、ドライケミストリー法で求めたタンパク質量は、補正(y=0.9267x+0.5421)を行なうことで、日本食品標準成分表のケルダール法で求めたタンパク質量と同様な評価を行うことができることを示した。乳児の健やかな成育を担う母乳中の成分の微量測定法を検討することで、母乳中の成分を栄養学的に検討するための基礎的データが得られたことに意義がある。これは測定機器のドライケムがあれば、検診などで来院した授乳婦が測定された自己の母乳中のタンパク質量に基づいたアドバイスなどを受けることができ、母乳哺育を推進することにつながるなど、授乳婦を対象とした栄養指導において母乳成分の変動などの科学的根拠の蓄積につながるため重要であると考えられる。本年度の研究実績としては、母乳中の脂質の測定法としてドライケム法を検討したところ、母乳中のT-cho濃度は17.6±6.6mg/dL、TG濃度は11.1±14.4g/dLと、母乳中のT-choおよびTg濃度はドライケム法により測定が可能であった。乳児の健やかな成長を担う母乳中の成分の微量測定法を検討することは、母子ともに負担をかけることなく、貴重な母乳の基礎データを得ることができる。これにより、母乳中の成分の測定機器としてドライケムがあれば、迅速かつ簡便に母乳中の成分を測定することができる。これにより授乳婦を対象とした栄養食事指導では、より現実的な栄養指導が可能となる。臨床栄養学本年度の研究実績としては、ドライケム法で測定した母乳中の乳糖量5.44±0.63g/dL(n=30)は、酵素法により測定した乳糖量4.96±0.57g/dL(n=30)に比較して有意に高値を示した(p<0.05)。このようにデータが蓄積されつつある。ドライケミストリー法により測定した母乳中のタンパク質量1.6±0.5g/dL(1.14.3g/dL、n=64)に比べて、ケルダール法により測定したタンパク質量2.0±0.5g/dL(1.54.4 g/dL、n=64)は有意に高値(p<0.05)であった。このように様々なデータが順調に蓄積されつつある。母乳成分には季節感変動があることなどを考慮し、昨年度と同様にデータの蓄積を行う。

また、過去2年間に蓄積された母乳中の各項目の測定値および日本人を対象とした文献等のデータと照合基準値を確定する。また、母乳の測定値のデータを要求する授乳婦にデータを提供し、乳児の母乳による栄養摂取状況等の説明を行う。母乳成分には季節感変動があるため、本年度は条件設定等を考慮すると、年間を通しての母乳成分値の変動を検討する。その後は過去2年間に蓄積された母乳中の各項目の測定値および日本人を対象とした文献等のデータと照合し基準値を確定する。この際、授乳婦に対してアンケート調査を行い、授乳婦の栄養指導に対する満足度を評価する。当該年度において、予定していた研究データの蓄積に必要なスライドや試薬の購入代金は支出額累計相当額で充足したため。次年度の研究費の使用計画としては、季節感変動の観察などデータを蓄積するため、富士ドライケムの測定用スライドを購入するほか、実際に使用する試薬、ガラス器具、プラスチック器具などを購入する。次年度の研究費の使用計画としては、季節間変動を観察するため、富士ドライケムの測定用スライドを購入するほか、実験に使用する試薬、ガラス器具、プラスチック器具などを購入する。
「利他行動」を制御する新規化合物の探索とその作用機構の解明

社会性昆虫などで見られる「利他行動」を、社会性アメーバである細胞性粘菌をモデルとして、その分子機構を理解することをめざした。2008年の大規模変異体解析に基づき2つのポリケタイド合成酵素(PKS2, PKS26)に着目し、その遺伝子破壊株の欠損がもたらす表現型としての利他行動を観察した。その結果PKS2は遺伝子を失うと「裏切り者」となり、PKS26は「敗者」になった。本研究でPKS2の産物は細胞とその環境とのコミュニケーション分子の上流を制御するシグナル分子であることが示唆され、PKS26についてはこれまでに報告のない敗者であることが実験的に証明された。本研究の目的は、社会性昆虫などで見られる自分を犠牲にして仲間を助ける「利他行動」を、社会性アメーバである細胞性粘菌をモデルとして、この行動を制御する分子機構を理解することにある。25年度は前年から引き続きpks2遺伝子の欠損株を用いた利他行動の制御機構を解析した。当初、利他行動の制御については1)細胞サイズの調整、2)発生のタイミング変更、3)細胞型比率の変更による異なる細胞型への再分化、の可能性を検討していた。24年度の変異株を使った実験結果から発生初期の細胞型の決定に何らかの異常が想定されたので、25年度はこの点について中心に解析を行った。25年度にはこれまで解析に適した細胞型マーカーがなかった予定柄の主要な部分のマーカーが開発され、これを入手することができたのでこのマーカーの発現パターンの詳細を検討した。その結果、遺伝子破壊株は予定柄細胞に分化した細胞が、その運命に従わず予定胞子になることによって柄細胞になることを回避することを示す結果が得られた。しかもその特徴は胞子細胞に分化しやすい条件であるバクテリアを餌にした場合に顕著であることが分かった。PKS2酵素の産物については25年度から来年度にかけて引き続き精製を行うこととした。具体的内容:研究目的は社会性昆虫などで見られる自分を犠牲にして仲間を助ける「利他行動」を、社会性アメーバである細胞性粘菌をモデルとして、この行動を制御する分子機構を理解すことにある。社会性アメーバ・細胞性粘菌ではポリケタイド合成酵素(PKS)遺伝子がそれぞれの種で独自のグループを形成している。その中で種を超えて保存されているpks2遺伝子の挿入変異体は協調性を失い、周辺の野生型株を柄細胞にして、自らは胞子細胞として生き残る「裏切り者」になることが示された。つまり、pks2は利他行動に関わると考えられる。そこでまずこの遺伝子破壊株を作製した。この株は、単一クローンでは協調的な行動がとれること、発生過程で見られる欠損が他の株の存在によっても回復しない細胞自律的変異であることを確認した。また裏切り者になるかどうかの検証では、pks2遺伝子破壊株は一度予定柄細胞に分化した後、予定胞子細胞として挙動することがわかった。このことは遺伝子破壊株が裏切り者であることを示唆している。そこでもしpks2遺伝子破壊株が裏切り者ならば野生型株とキメラ子実体を作った場合、遺伝子破壊株は野生株より多くの胞子を形成するはずであると考え胞子数をカウントした。しかし、実際にはむしろ胞子数は少ないということがわかった。つまりpks2遺伝子の挿入変異体は単純な裏切り者ではなく、発生初期のバイアスの違いによりパターン形成に大きな変化が認められる変異体と考えられた。意義・重要性:本研究の特色は社会性生物に見られる「利他行動」という生物現象に着目し、これまで解明することが困難であった物質レベルでの理解をはかる点にある。これまでの研究で、pks2遺伝子による利他行動制御は発生過程に入る前のバイアスの形成に関わっていると考えられ、次年度の分子レベルでの解析のターゲットが明らかになった。本研究の目的は、社会性昆虫にみられる自分を犠牲にして仲間を助ける「利他行動」を、社会性アメーバである細胞性粘菌をモデルとして、この行動を制御する分子機構を理解することにある。2008年Santorelli等によるREMI変異体の大規模解析によって利他行動にかかわることが示唆されたポリケタイド合成酵素はpks2とpks26の二つが報告されている。26年度は裏切り者になるpks2遺伝子破壊株の解析と更に、pks26の解析も並行して行った。26年度はpks2を遺伝子破壊すると裏切り者(cheater)として胞子に分化しやすくなることを定量的に明らかにすることができた。これは野生型株とキメラを作って継代培養してできた胞子の中に含まれる遺伝子破壊株の割合の変化をQ-PCRを用いて調べることによって明らかにした。pks2

遺伝子破壊株は単独では胞子分化が抑制され、生存には不利であり、裏切り者を抑制するtrade offの関係があることが示された。産物については予想以上に微量であり解析には更に時間がかかると考えられる。一方Pks26については遺伝子破壊をすると積極的に柄細胞に分化するLoserとなることが分かった。この株についても野生型株とキメラを作って継代培養してできた胞子の中に含まれる遺伝子破壊株の割合をQ-PCRで解析したところ代を重ねるごとに減少することからLoserであることを明らかにした。この二つの遺伝子破壊株の挙動解析から利他行動には発生のタイミングがかかわっていることが示唆された。生物分子科学pks2遺伝子破壊株を用いた利他行動に関する観察では、利他行動は柄分化と密接な関係があることが分かった。柄細胞に分化するかのように振る舞っていた細胞が、発生のきわめて初期の段階で予定胞子に分化転換をするというモデルが考えられた。つまり一度柄細胞に分化する道を選択してもpks2に欠損があれば柄に分化せず胞子に分化転換することによって利他行動をとらなくなると考えられる。上記のモデルを導きだすことができたことは予想以上の進展であった。しかし、一方でPKS2酵素の産物の精製は今後の継続課題となっている。これはpks2遺伝子の発現量が低く産物が少ないことによると考えている。これを改善するため重金属などのストレスを与えてpks2遺伝子の発現量を増加させることができる条件を見つけ出すことができたので、この条件を用いて精製をすすめたい。次年度の研究目的は、PKS2がどのように「利他行動」を制御しているのかについての仮説を導き、これを検証することにある。pks2遺伝子の発現時期の限定から次の3つのメカニズムにより、Cheaterは「利他行動」をやめて利己的な行動をとるのではないかと当初は考えていた。1)細胞のサイズの調整2)発生のタイミングの変更3)細胞型比率の変更と異なる細胞型へ再分化これまでの研究から、仮説の1、3を支持するデータは得られていない。むしろ2の発生タイミングを変更することによる予定胞子細胞に分化しやすくなるバイアスがあるのではないかと言う仮説を指示するデータが多く、次年度はどのようにバイアスを変化させているのか、単細胞期のアメーバを中心に研究を進める。現在までの研究で利他行動制御のメカニズムの仮説を限定することができ、順調に研究は進んでいると考えている。また、利他行動における緑髭効果に関与している可能性を示唆するデータを得ており、この可能性についても今後は検証したい。これまで緑髭遺伝子はわずか1例しか報告されておらず、もしポリケタイドが制御する遺伝子が緑髭遺伝子であれば、緑髭効果についての新たな発見につながると考えている。今後の研究の進め方としては、以下の2点を中心に研究を進める。1)裏切り行動の多面的な角度からの検証2)化学物質の精製利他行動をさける裏切り行動については、それを示唆する定性的なデータにとどまっているが、利他行動と柄細胞分化を関連づける結果を得ることができた。今後はできるだけ実験結果を定量化できるようにするため、qRT-PCRを応用した方法を用いることを検討している。化学物質の同定の難しさは、化合物の量が予想以上に少ないことに起因している。
B細胞性慢性リンパ性白血病におけるB1細胞腫瘍化の分子機構の解析

B細胞性慢性リンパ性白血病(BCLL)は、複数の感受性遺伝子が関与する遺伝性癌の一つと考えられ、自己免疫疾患との関連が指摘されている。BCLLは、B1細胞と呼ばれる特異なB細胞系の腫瘍である。B1細胞は本来自己抗体産生能を有し、B1細胞の異常分化と異常増殖に関わる遺伝子群の組み合わせにより、病態表現としてBCLLあるいは自己免疫疾患が発症すると考えられる。我々は、New Zealand White(NZW)マウス系がBCLLを自然発症することを見出し、連鎖解析によりBCLL前駆細胞の増殖に関わる3つの感受性遺伝子領域を明らかにした(Blood 92 : 3772, 1998)。さらにこれら前がん状態の細胞が悪性細胞へと変異する際に、多段階発癌機構が働いている可能性が示唆された。本研究では、発がんに関わる変異遺伝子群を明らかにするため、BCLLを発症したNZWマウスから白血病細胞を分離し、マイクロアレイで528個の遺伝子の発現レベルを白血病を発症しないB10マウスの脾臓B細胞のそれと比較した。その結果、BCLL細胞においては、Igf1・Fosなどの成長因子・癌遺伝子が正常B細胞に比べ発現が亢進しており、また、Brca2・Tsg101・Rb1などの癌抑制遺伝子やTnfr1・Tgfb1・Il2rgなどの免疫調節遺伝子の発現が低下していることが判明した。一方、我々はNZWの素因を受けて発症する(NZWxB10.NZW)F1マウスのBCLLを染色体のloss of heterozygosity(LOH)を利用して解析したところ、第7染色体テロメア側に複数の個体で共通領域にLOHが認められた。興味深いことに癌抑制遺伝子Tsg101及び免疫抑制性遺伝子Tgfb1はマウス第7染色体上にマップされており、マイクロアレイの所見と一致した。今後、これらの遺伝子を含め、LOHとマイクロアレイを対応させつつBCLL発症機構を総合的に解明していきたい。B細胞性慢性リンパ性白血病(BCLL)は、複数の感受性遺伝子が関与する遺伝性癌の一つと考えられている。一方、BCLL患者やその家族には高率に自己免疫疾患が発症することが報告されている。我々は、New Zealand White(NZW)マウス系がBCLLを自然発症することを見出し、連鎖解析によりBCLL前駆細胞の増殖に関わる3つの感受性遺伝子領域を明らかにした(Blood 92:3772,1998)。本研究では、発がんに関わる変異遺伝子群を明らかにするため、BCLLを発症したNZWマウスから白血病細胞をFACSソーティングにより分離し、マイクロアレイで528個の遺伝子の発現レベルを白血病を発症しないB10マウスの脾臓B細胞のそれと比較した。このうちFos・Brca・Rb1・Tgfb1については、ヒトBCLLにおける関与が指摘され、本モデルにおいても、ヒトと共通の発癌機構を介して腫瘍化することが示唆された。今後、発現に差の認められたこれらの遺伝子について、ゲノムでの遺伝子変異の有無や、BCLL細胞のalellic deletion解析で見出される変異遺伝子との関連を解析し、BCLL発症機構を総合的に解明していきたい。

一方、我々はNZWの素因を受けて発症する(NZWxB10.NZW)F1マウスのBCLLを染色体のloss of heterozygosity(LOH)を利用して解析したところ、第7染色体テロメア側に複数の個体で共通領域にLOHが認められた。興味深いことに癌抑制遺伝子Tsg101及び免疫抑制性遺伝子Tgfb1はマウス第7染色体上にマップされており、マイクロアレイの所見と一致した。今後、これらの遺伝子を含め、LOHとマイクロアレイを対応させつつBCLL発症機構を総合的に解明していきたい。
音響特性データベースを用いたび漫性肝疾患の定量診断技術の開発

今年度は、昨年度までの結果を基に、脂肪酸エタノール溶液、および臨床検体を対象とした音響特性解析の2点に主眼を置いた検討を行った。計測は、中心周波数80 MHzのPVDF-TrFE膜単振動子を搭載した超音波顕微鏡(AMS-50SI改、本多電子株式会社)を用い、音響インピーダンスおよび音速を指標とした評価を行った。(1)脂肪酸溶液の計測においては、脂肪酸11種(炭素数1622)のエタノール溶液を調整し、音響インピーダンスを指標とした評価を行った。脂肪酸種によって有意に音響インピーダンスが異なることが確認された(p < 0.01)。炭素数と二重結合数に着目すると、炭素数16および18の脂肪酸は、二重結合数が多くなるほど音響インピーダンスが低くなる傾向にあった一方で、炭素数20の脂肪酸は逆の傾向となった。また、炭素数18の脂肪酸に関しては、昨年度実施した培養細胞での実験結果と逆の傾向を示した。これらの多くは細胞内で代謝されやすい脂肪酸種であるため、細胞内で脂肪酸種が変化した可能性が示唆される。(2)これまでに取得した結果から得られた知見を統合し、臨床へ応用するために、摘出検体を対象とした検討を実施した。肝摘出術で摘出された検体における非癌部を対象とし、摘出直後の未固定標本を用いて音響インピーダンス評価、およびGCによる脂肪酸分析も行った。NASH群では単純性脂肪肝群に比べて組織インピーダンス値が有意に低値であった(1.76±0.01 vs 1.84 ±0.02, p=0.011)。なお、NASH肝組織での脂肪酸組成が高かった脂肪酸単体の音響インピーダンスは基準より有意に低値であり、NASH肝組織における音響特性の要因であることが示唆された。すなわち、脂肪酸の音響特性と組成が、脂肪肝での高インピーダンス所見とNASHでの低インピーダンス所見を説明しうるものと考えられた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)の病態と音響特性との関係性を解明することを目的とし、(1)マウス肝、脂肪酸、および脂肪酸処理を施した培養細胞の音響インピーダンス計測、および(2)疾患モデルラットを対象とした病理学的特性を踏まえた音速計測を実施項目とした。項目(1):異なる症例モデルマウス(正常肝、脂肪肝、NASH、担癌)を対象とし、中心周波数80MHzの単振動子を用いた音響インピーダンス計測およびガスクロマトグラフィを用いた摘出マウス肝組織の脂肪酸分析を実施した。結果として、NASH肝の音響インピーダンスが有意に低値となり、かつNASHに特異的な脂肪酸(オレイン酸、アラキドン酸、パルミトオレイン酸)の含有量がNASHで優位に多いことが示された。以上を踏まえ、高分化型ヒト肝がん由来細胞(HuH7)に対して、ガスクロマトグラフィ分析において検出感度以上であった7種の脂肪酸(アラキドン酸・ドコサヘキサエン酸・エイコサペンタエン酸・オレイン酸・パルミチン酸・パルミトオレイン酸・ステアリン酸)処理を行った細胞、および脂肪酸溶液単体の音響インピーダンス計測を行った。結果として、NASHに特異的な脂肪酸の音響インピーダンスが低く、マウス肝組織計測における傾向の妥当性が確認された。項目(2):組織の病理学的特性と、音響学的特性との関係性を評価するために、疾患モデルラットを対象として、中心周波数250 MHzの超音波を用いて、7 μm薄切組織の計測を行った。細胞核、細胞質、および線維組織(肝線維症およびNASH肝のみ)の音速解析を行った結果、全ての細胞小器官の計測結果においてNASHの音速が有意に低く(p<0.01)なり、肝病変によって肝臓の音速が異なること、およびNASH肝における音速が低くなることをミクロな視点で示した。マウス肝臓の音響インピーダンス解析では、各疾患モデルについて、これまでの検討結果と併せることで十分な標本数を確保し、計測・解析の妥当性を担保した状態での解析結果の蓄積ができている。また、培養細胞と脂肪酸の混合培地における音響インピーダンス解析では、計測条件の統一などによる解析精度の向上もあり、これまでに理解できていなかった新規の脂肪酸と肝臓における音響インピーダンスの関係性についての知見も得られている。また、肝臓の音速解析においてもデータの蓄積面では進展があったが、精度の向上が認められていない。これに関しては新規の計測技術の開発を進めており、次年度の課題としたい。