hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
遺伝性不整脈疾患の病態解明-疾患特異的ヒトiPS細胞を用いた解析

カテコラミン誘発性多形性心室頻拍(CPVT)は、運動や情動などのカテコラミン刺激によって、心室頻拍・細動による突然死を引き起こす遺伝性不整脈疾患である。我々は、リアノジン受容体(RyR2)遺伝子異常が同定されているCPVT患者より、ヒト人工多能性幹(iPS)細胞を作製し分化心筋の解析を行った。電気的ペーシング下にCa transient測定を行ったところ、CPVT患者由来分化心筋では、健常人由来分化心筋に比べて、カテコラミン負荷後に拡張期細胞内Ca増加(diastolic Ca wave)を生じる細胞が有意に多かった。本研究にて、CPVTの病態を細胞レベルで一部再現でき、今後、薬効評価などの疾患モデルとしての有用性が期待される。・不整脈患者ゲノムDNAの遺伝子解析・機能解析現在、全国の施設より、1500家系、2700症例の家族性不整脈患者ゲノムDNAを集積し、遺伝子解析・病態解明を進めている。(滋賀医科大学呼吸循環器内科との共同研究)特にQT短縮症候群(SQTS)は、心電図上、QT間隔短縮を特徴とし、心房細動や心室細動による突然死を引き起こす難治性心疾患として注目されている。我々は、SQTS患者、5家系中2家系にてKCNH2、KCNJ2遺伝子異常を検出した。その内QTc 194msと著明なQT短縮を認める患者にて、新規KCNJ2遺伝子異常(M301K)を同定し、パッチクランプ法を用いた機能解析の結果、新たなSQTS発症機序として、KCNJ2電流の内向き整流性の障害を報告した。(Hattori T, Makiyama T, et al.Cardiovasc Res 2012)・疾患特異的ヒトiPS細胞を用いた疾患発症メカニズムの解明カテコラミン誘発性多形性心室頻拍(CPVT)は、運動や情動などのカテコラミン刺激によって、心室頻拍・細動による突然死を引き起こす遺伝性不整脈疾患である。(Sasaki K, Makiyama T, et al.第77回日本循環器学会学術集会)カテコラミン誘発性多形性心室頻拍(CPVT)は、運動や情動などのカテコラミン刺激によって、心室頻拍・細動による突然死を引き起こす遺伝性不整脈疾患である。・不整脈患者ゲノムDNAの遺伝子解析・機能解析現在、全国の施設より1400家系、2400症例の家族性不整脈患者ゲノムDNAを集積し、遺伝子解析・病態解析を進めている。(滋賀医科大学呼吸循環器内科との共同研究)特に、QT短縮症候群(SQTS)は、心電図上、QT間隔短縮を特徴とし、心房細動や心室細動による突然死を引き起こす難治性心疾患として注目されている。我々は、SQTS患者、5家系中2家系にてKCNH2, KCNJ2遺伝子異常を検出した。その内、QTc 194msと著明なQT短縮を認める患者にて、新規KCNJ2遺伝子異常(M301K)を同定し、パッチクランプ法を用いた機能解析の結果、新たなSQTS発症機序として、KCNJ2電流の内向き整流性の障害を報告した。(Hattori T, Makiyama T, et al.Cardiovasc Res 2012)・新たな原因遺伝子の探索---遺伝性不整脈疾患の多くはまだ原因遺伝子が不明であり、次世代シーケンシングを用いたホールエクソーム解析を開始している。(解析中)・疾患特異ヒトiPS細胞を用いた疾患発症メカニズムの解明現在、51例の家族性心疾患患者より検体採取を行い、順次、疾患特異的ヒトiPS細胞を作製し、解析を進めている。ラミンA/C遺伝子は、核膜の裏打ち蛋白をコードし、その異常により進行性伝導障害、心機能低下、心室性不整脈による突然死を来たす。2塩基欠失によるフレームシフト変異(S303fsX25)のラミンA/C心筋症患者より、iPS細胞を作製し、分化心筋の解析を進めている。遺伝子発現は、患者由来心筋細胞で約半分になっており、病態としてhaplo-insufficiencyが考えられた。(Makiyama T etal.アメリカ心臓病学会2011)他、カテコラミン誘発性多形性心室頻拍についても解析中である。・不整脈患者ゲノムDNAの遺伝子解析

現在、全国の施設より1400家系、2400症例の家族性不整脈患者ゲノムDNAを集積し、遺伝子解析を進めている。検出された遺伝子変異に関しては、遺伝型・病型解析、変異蛋白の機能解析を行っており、進行も順調である。・疾患特異ヒトiPS細胞を用いた疾患発症メカニズムの解明現在、14例より疾患特異的ヒトiPS細胞の作製が終了し、順次分化心筋の解析組織学的解析(免疫染色、電顕観察)、分子生物学的解析(RNA、蛋白定量)、電気生理学的解析(活動電位や各イオンチャネル電流記録)を進めている。iPS細胞作製、心筋分化手技は確立されており順調と考える。・不整脈患者ゲノムDNAの遺伝子解析引き続き、家族性不整脈患者の解析をすすめるが、特に候補遺伝子解析にて異常の検出されない家系において、ホール・エクソーム解析を用い、新たな原因遺伝子の発見を目指す。・疾患特異ヒトiPS細胞を用いた疾患発症メカニズムの解明iPS細胞由来分化心筋の解析に際し、心筋の型が一様ではなく(心室型、心房型、洞結節型)、成人心筋に比べ、構造的、電気生理学的に未分化である点が課題となっている。組織特異的プロモーター用い心筋の型を可視化を導入し、心筋の型も考慮したより詳細な解析を目指す。また、疾患モデルとして確立した後、薬剤スクリーニングによる治療薬の検討を行う。・遺伝子異常の検出されない患者由来心筋細胞の解析既知の遺伝子異常の検出されない症例においてもiPS細胞作製をすすめ、マイクロアレイ、蛋白の機能解析などにより、異常を来たしている分子を探索する。分子が同定でき、遺伝子解析にて異常を認めれば新たな原因遺伝子の発見につながる。主に物品費(遺伝子解析やiPS細胞樹立、培養、心筋分化、免疫染色用抗体、パッチクランプ等に用いる試薬代、使い捨てプラスチック器具費等)への使用を予定している。また、成果発表のための旅費として、年間、国内5万円、海外15万円、論文関連費用(英語校閲費、投稿料、別刷り代)として年間本10万円程度を予定している。
新しい機能性複合型接着剤の構造と物性の解析

木材接着剤のなかでも溶剤、廃水性また使用の容易さの点から水系エマルジョン接着剤は大変重要であり、今後ますます需要が見込まれている。これらには接着性への要求度の多用性から種々の機能性を持たせるため従来にない複合型接着剤といえるものが開発されるであろう。本研究では水性高分子ーイソシアネート系接着剤と酸硬化型酢酸ビニルエマルジョン接着剤をとりあげてその構造と物性の解析をし、接着性についても言及した。水性高分子ーイソシアネート系接着剤の主成分には種々のポリマーがあるが、その中で2種類のものを選んで粘弾性測定を行なった結果、それぞれ主剤成分の粘弾性挙動は明らかに異なるが、イソシアネートを投入すると両者の粘弾性挙動は大変類似してくる。これはイソシアネートと水分の反応によってできる生成物が大量に接着剤中に生じ、これが物性に大きく影響するものと考えられる。一方、3種類の、酸触媒を投入し耐熱性樹脂を狙った変性酢酸ビニル樹脂は予め含有されている縮合型樹脂の作用で、それらが酢ビ樹脂と架橋して40°ー200°Cまで貯蔵弾性率が大きくなることを確認した。これらの両エマルジョン系接着剤で接着したカバ材接着試験を-25°から150°Cまでの範囲で行なった結果、両者とも従来の木工用酢酸ビニル樹脂接着剤よりも40°ー150°Cにおいて明らかに接着強さが大きくなり、また両接着剤を比較すると酸硬化型酢ビ樹脂よりも水性高分子ーイソシアネート系接着剤の方が80°C以上では耐熱接着強さが大きいことを認めた。またそれぞれの接着剤のなかでは物性面から見れば相違があるものの、接着強度値の差はそれほどみられない。複合型接着剤の物性は含有されるポリマー成分に強く依存し、また接着性能に影響を与えることを構造と物性および接着性との関係から明らかにできたが、この研究の成果は今後エマルジョン接着剤開発のための複合化の指針に貢献できるものと思われる。新しい機能性複合型接着剤として,水性高分子-イソシアネート系接着剤(以下APIレジンと略す)と酸硬化型の変性ポリ酢酸ビニル樹脂接着剤(M-PVACと略す)をそれぞれ数種類選んだ.接着剤のフイルムを作製し,これを用いて動的粘弾性を測定した結果,次のようなことが明らかとなった.APIはそ名前のとおり,水性で高分子とイソシアネート化合物を用いる二液型であるが,この高分子である主剤には次のようなポリマーがある.ポリビニルアルコール(DVA)とスチレン・ブタジエン共重合体のもの, PVAとポリ酢酸ビニル樹脂のもの,エチレン・酢酸ビニル共重合体のもの,スチレン・アクリルコポリマーのものなどがある.これに架橋剤(硬化剤)としてイソシアネートを用いる.内部構造を解析した結果,上記各ポリマーとイソシアネートが架橋構造を形成し,これが連続相を形成しているものが多い.一方, M-PVACはポリ酢酸ビニル樹脂が連続相を成し,硬化剤の有機酸によって主剤中に含有されているフェノール樹脂成分が架橋して,従来の酢酸ビニル樹脂に比較し,耐熱性のある接着剤であることを粘弾性測定結果により予想される.とくに50°C以上になると一般の酢ビは軟化しはじめ流動状態になるが,酸硬化型のM-PVACは50°Cを越えると10^<10>dyme/cm^2にあった貯蔵弾性率の値は低下するが, 10^9dyme/cm^2のオーダーにあり150°C付近まで余り変わらない弾性率の平坦部をみせる.APIの場合は架橋剤を添加した系では70-80°C付近から貯蔵弾性率は低下しはじめるが,それはゆるやかであり, 180-200°Cにはゴム状平坦部がみられる.フィルム引張試験の結果,いずれのAPIもM-PVACもその主剤ポリマーのガラス転移温度付近にフィルム引張強度のピークがある.一方,架橋剤(硬化剤)を添加した系になるとピークとはならずこの温度付近は横ばいの値となる.木材接着試験については次年度で主として行なう予定である.木材接着剤のなかでも溶剤、廃水性また使用の容易さの点から水系エマルジョン接着剤は大変重要であり、今後ますます需要が見込まれている。

これらの両エマルジョン系接着剤で接着したカバ材接着試験を-25°から150°Cまでの範囲で行なった結果、両者とも従来の木工用酢酸ビニル樹脂接着剤よりも40°ー150°Cにおいて明らかに接着強さが大きくなり、また両接着剤を比較すると酸硬化型酢ビ樹脂よりも水性高分子ーイソシアネート系接着剤の方が80°C以上では耐熱接着強さが大きいことを認めた。またそれぞれの接着剤のなかでは物性面から見れば相違があるものの、接着強度値の差はそれほどみられない。複合型接着剤の物性は含有されるポリマー成分に強く依存し、また接着性能に影響を与えることを構造と物性および接着性との関係から明らかにできたが、この研究の成果は今後エマルジョン接着剤開発のための複合化の指針に貢献できるものと思われる。機能性複合接着剤のうち2種類の水性高分子-イソシアネート系接着剤と3種類の酸硬化型酢酸ビニルエマルジョン接着剤をとりあげ、カバを接着して広い温度領域にわたって接着性能を検討した。水性高分子-イソシアネート系接着剤はその主成分ポリマーが異なってもイソシアネートを添加することによりそれらの粘弾性挙動は類似傾向を示し、接着強さの温度依存性も両者ともよく似た傾向であった。とくに80°Cにおいて比較したレゾルシノール樹脂接着剤の接着強さにはやや劣るものの、酢酸ビニル樹脂よりも明らかに耐熱性がある。また、酸触媒を投入して予め混合してあるフェノール樹脂と酢酸ビニル樹脂を架橋させるいわゆる酸硬化型酢酸ビニルエマルジョン樹脂はその粘弾性挙動の測定により、明らかに架橋構造を形成し、貯蔵弾性率が40°Cの領域では主剤に比べて大きくなることを確認した。また酸触媒により自己縮合する酢酸ビニル樹脂の耐熱性増強効果のあることも認められた。これらの酸効果型酢ビによる木材の接着強さの温度依存性をみると、従来のポリ酢酸ビニル樹脂に比べて40°C-100°Cにわたって全体に大きく、150°Cになってもせん断強さは30kgf/cm^2程度あった。3種類の酸硬化酢ビ間では、それらの粘弾性挙動はやや異なるものの、接着強さの温度依存性挙動はほとんど同様な傾向であった。これらの前述の水性高分子・イソシアネート系接着剤の接着強さの温度依存性を比較すると、60°C以上の温度領域では酸硬化型酢ビ樹脂の方が全体に強度値が低いが、木工用として多用されている酢酸ビニル樹脂よりは明らかに耐熱性が向上していることが認められた。無公害性、水系であることからエマルジョン系接着剤はますます使用される傾向にあるが、接着耐久性に対する要求度に応じて接着剤のポリマー組成はますます複雑化すると思われるが、本研究の結果はエマルジョン開発のための指針となりうるものと考えられる。
カドミウム汚染水田の浸透型と物質の動態

客土をもつカドミウム汚染水田模型を作製し、湛水条件下で、すき床層(汚染土)が開放浸透で酸化層となる閉鎖浸透模型において、稲体のカドミウム濃度および水稲の生育収量を調査した。カドミウムの濃度範囲は、玄米で0.0000.200mg/kgとなった。開放浸透層模型の値が閉鎖浸透模型より大きな値となった。浸透型の差により生育には大きな差異は認められなかった。穂数、玄米重は開放浸透模型より閉鎖浸透模型で上回った。カドミウムフ汚染水田のモデルを鉄箱に作製し、常時湛水条件のもとで浸透型の相違によるカドミウムの吸収量及び生育収量の相違を比較検討した。カドミウム汚染土は、約3mg/kgの濃度を持つ汚染田に指定された水田より採取し用いた。特に、客土層を持つ場合のモデルで、かつすき床層が開放浸透と閉鎖浸透に変えた場合の影響を検討したその結果、生育収量の統計処理結果より、草丈及び総藁重には、閉鎖浸透層を下層に持つモデルに比べ開放浸透層を下層に持つモデルが有意に高い結果となった。葉齢、茎数、SPAD値、出穂時期、穂数、粗籾重、粗籾数、精玄米数、精玄米重及び玄米千粒重に有意な差はみられなかった。根量は、開放浸透層の値が閉鎖浸透層の値を上回る結果となった。カドミウムの濃度は、玄米では開放浸透層を持つモデルの値が閉鎖浸透層を持つモデルに比べ高くなった。根中のカドミウムの濃度は、すき床層が開放浸透層の根の値が閉鎖浸透層の値に比べ高まる傾向となった。このことより、これまでのカドミウム汚染水田に対する常時湛水栽培という対策が、浸透型により、以ずしも絶対的安全な方法とならい可能性が示唆された。このことは、食の安全性に対する対策の見直しを示唆する貴重なデータと考えられる。カドミウム汚染地の水田より採取した土を用い、成層水田模型用の鉄箱を10個作製し、スキ床層及び心土層の浸透型を開放浸透、閉鎖浸透に変えることにより、汚染土層からのカドミウムの吸収の変化を検討した。なお、模型は常時湛水条件で、かつ模型に用いた土は、汚染土約3mg/kgの濃度の水田から採取した。各鉄箱には、約4葉の苗(品種:つがるうまん)を15本移植し、元肥のみの施肥とし、その生育収量の調査を行った。10月上旬に収穫後、玄米、茎葉、根のカドミウム含有量を分析した。土層内の酸化還元環境は、酸化還元電位測定センサを深度別にセットし、汚染土の環境を明確にしつつ実験を行った。その結果、汚染土層が開放浸透層では酸化層に、閉鎖浸透層では還元層になることを確認しつつ実験できた。生育は、開放浸透模型が閉鎖浸透模型に比べ、有意に低下する(5%)傾向が認められた。収量については、玄米千粒重などに傾向が認められなかった。玄米中のカドミウム濃度は、開放浸透層を持つ模型の値が高くなる傾向が確認された。茎葉についても同様の傾向が認められた。根の値は、開放浸透層中の根が閉鎖浸透層中の含有量に比べ、高まる傾向の値が得られた。濃度の高いと思われる風成土の土の分析をしたが、3mg/kg前後であまり高い値とはならなかった。また、違う地区の水成土からなる汚染水田土のカドミウム濃度を分析したが1.5mg/kg前後となり、カドミウムの濃度の高い汚染値の土を用いた実験は、今後の課題となった。カドミウム汚染水田の対策は、客土が中心で進められてきている。また、対処療法的方策として常時湛水栽培が実施されている。しかし、その値がバラツキその原因の解明が残された課題となっていた。こうした背景のもと、客土の効果を浸透型との関係で解明することを試みたのが本研究の目的である。下層が酸化層になるか還元層になるかは、浸透型の影響も大きく受ける。本研究では、実際の汚染水田土壌を用いて、客土厚、15cm、20cm、25cm、30cm及び40cmとした場合でかつ下層の汚染土層を浸透型を変え、開放浸透及び閉鎖浸透となる成層モデル水田を作製し、このモデルに稲(つがるロマン)を15本移植し実験を行った。各層の酸化還元電位は、ORP電極qを用い測定した。施肥は全層施肥とし、追肥は実施なかった。土層は、作土層12.5cm、すき床層10cm、心土層35cmとし、汚染土は客土層直下に15cm厚で存在すると仮定し、成層水田模型を作製した。減水深は20-30cm/dayを目標とした。

これらの稲の生育調査及び玄米中のカドミウム濃度および根の中のカドミウム濃度測定実験は、2009年から2011年までの3か年にわたり実施した。その結果、客土下層が開放浸透とした場合、同客土厚が閉鎖浸透となる場合に比べ、玄米中のカドミウム濃度が大きくなる結果が、客土厚1530cmのモデルで確認されたが、客土厚40cm深のモデルでは、有意差は認められなかった。カドミウム濃度の相違は、深度別に採取した根でも認められ、特に開放浸透層におけるカドミウム濃度が閉鎖浸透層における濃度よりも高まることが確認された。生育収量における有意差は、生育では認められなかったが、穂数、玄米重では開放浸透モデルに比べ閉鎖浸透モデルが大きくなった。以上のように、客土がある場合でかつ常時湛水栽培下でも浸透型の相違により、植物体のカドミウム濃度及び生育収量に影響を与える実態が明らかとなった。
大環状パイ共役系ナノフォトニクスシステムの創成

三次元光記録材料や深部がんの選択的光治療を可能とする二光子吸収材料を目指し、大環状パイ共役系ナノフォトニクスシステムの創成を行った。ポルフィリン色素とパイ共役色素とを三重結合を用いて環状で連結することで二光子吸収効率が大幅に向上することが明らかとなった。具体的にはパイ共役色素としてカルバゾールを導入した場合二光子吸収効率が三桁向上した。フルオレン架橋型巨大パイ共役分子の合成と機能評価を行った。160度の結合角を可能とするフルオレンのジョード体(化合物1)を既知法によって合成した。合成した化合物1とジブロモポルフィリン(化合物2)をPd(0)触媒を用いたカップリング反応でポルフィリン連鎖体の混合物を得た。この混合物をゲル濾過HPLCによって分離し、ポルフィリン3量体(化合物3)を単離した。構造決定はNMR、質量分析により行った。合成した連鎖体は単量体、2量体、3量体とパイ共役系が大きくなるに従い、Q-バンドの長波長シフトと吸収強度の増大が見られた。合成した構造体の二光子吸収断面積をOpen-apertureZ scan法(5ns)を用いて測定したところ、3量体は760nm付近において約2500000GMという非常に大きな値が得られた。また2量体、単量体は760nm付近においてそれぞれ約800000GM、300000GMであった。パイ共役系の拡張の効果とともにQ-バンドの長波長シフトと吸収強度の増大による共鳴増強効果が影響しているものと考察される。分子軌道計算から得られるパイ電子構造と測定から得られる非線形光学特性の相関が見られ、巨大パイ共役分子とした優位性を明らかにした。次の課題は大環状化である。以上、当初の計画通りナノフォトニクスシステムの開発に成功し、二光子吸収断面積の増大に及ぼす巨大パイ共役化の効果を明らかにした。カルバゾール架橋型環状パイ共役分子の合成と機能評価を行った。90度の結合角を可能とするカルバゾールのジヨード体(化合物1)を既知法によって合成した。この混合物をゲル濾過HPLCによって分離し、ポルフィリン環状4量体(化合物3)を単離した。構造決定はNMP質量分析により行った.合成した連鎖体は単量体と比べ、Q-バンドの長波長シフトと吸収強度の増大が見られたことからパイ共役系の拡張が示された。合成した構造体の二光子吸収断面積をOpen-aperture Z scal/法(5ns)を用いて測定したところ、4量体は760nm付近において約380000GMという非常に大きな値が得られた。パイ共役系の拡張の効果とともにQ-バンドの長波長シフトと吸収強度の増大による共鳴増強効果が影響しため、大きな増大が見られたと考えられる。分子軌道計算から得られるパイ電子構造と測定から得られる二光子吸収特性との開に相関が認められ、環状パイ共役分子とした優位性が示された。次の課題はカルバゾールのみで環状体を構築し、蛍光の弱いポルフィリン系では達成できない二光子蛍光材料の開発である。以上当初の計画通り環状ナノフォトニクスシステムの開発に成功し、二光子吸収断面積の増大に及ぼす環状パイ共役化の効果を明らかにした。
環境変化とクラゲ類の大量発生メカニズムとの関連

ミズクラゲの大量発生と環境変動との関連性を調べた結果、海域の富栄養化とそれに伴う貧酸素水域の拡大および餌生物の小型が大きく影響していることが判明した。また、人工構造物の増加もポリプの生育に大きく貢献していることが明らかとなった。本年度は、東京湾においてミズクラゲポリプの天然海域における調査、環境調査、成体クラゲの現存量調査、ポリプの呼吸速度測定等を実施した。現場海域におけるミズクラゲポリプの調査及び環境測定は、東京湾奥部において従来より実施している観測点(船の科学館内の岸壁及びその周辺)等で月1回の頻度で行った。環境測定の項目は、CTD(水温、塩分)、現場式DO測定装置、水中光量子計や採水によるクロロフィル濃度及び小型動物プランクトン現存量等である。底層近くの貧酸素水塊が発達する場所でのみ、ミズクラゲポリプの存在が認められた。東京湾奥部における貧酸素水塊の挙動等を把握するために、広い範囲において環境測定を実施した。環境測定は、東京海洋大学練習船"ひよどり"を用いて、東京湾奥部の海域で月12回の頻度で行った。特に、ミズクラゲ大量発生海域として知られ、かつ貧酸素水塊の頻発する北部・北東部沿岸域において多くの調査地点を設け、詳細な調査を行った。環境測定の項目は、ポリプ調査地点と同様である。現場海域における成体クラゲ類の現存量は、東京湾奥部における環境調査と同時に東京海洋大学練習船"ひよどり"を用いて、東京湾奥部の海域で月12回の頻度で主に目視によって行った。クラゲ類の採集は、特別に作成したクラゲ用大型ネット、またはたも網によって行い、傘径と性別を直ちに測定し、観測ごとの傘径頻度分布を求めた。動物プランクトンの分布調査は、プランクトンネットの鉛直曵またはニスキン採水器による定量採集によって、クラゲ類の採集と同地点で行った。採集したサンプルは直ちに、ホルマリンで固定し、種類組成の同定等に供した。雌成体クラゲに付着していたプラヌラ幼生の一部を実験室に持ち帰り、ポリプに付着・変態させた後、呼吸速度の測定に供した。呼吸速度は、ウィンクラー法によって測定した飼育海水内の溶存酸素濃度の差から求めた。本年度は、前年度に引き続き、東京湾においてミズクラゲポリプの天然海域における調査、環境調査、成体クラゲの現存量調査等を実施した。環境測定の項目は、多成分水質計(水温、塩分、DO、クロロフィル濃度、水中光量子束密度)、ニスキン採水器による小型動物プランクトン個体数密度と現存量、NORPACネットによる中型動物プランクトン個体数密度と現存量等である。調査の結果、ミズクラゲポリプは底層近くの貧酸素水塊が発達する場所でのみ観察された。東京湾奥部における貧酸素水塊の挙動等を把握するために、前年度に引き続き、広い範囲において環境測定を実施した。現場海域における成体クラゲ類の現存量は、前年度に引き続き、東京湾奥部における環境調査と同時に東京海洋大学練習船"ひよどり"を用いて、東京湾奥部の海域で月12回の頻度で主に目視によって行った。最終年度である本年度も、前年度に引き続き、東京湾においてミズクラゲポリプの天然海域における調査、環境調査、成体クラゲの現存量調査等を実施した。

現場海域における成体クラゲ類の現存量は、前年度に引き続き、東京湾奥部における環境調査と同時に東京海洋大学練習船"ひよどり"を用いて、東京湾奥部の海域で月12回の頻度で主に目視によって行った。クラゲ類の採集は、特別に作成したクラゲ用大型ネット、またはたも網によって行い、傘径と性別を直ちに測定し、観測ごとの傘径頻度分布を求めた。
βセクレターゼの異常亢進病態及び分子制御の解明

アルツハイマー認知症(AD)の脳において、アミロイドβタンパク(Aβ)の生成に必須なプロテアーゼであるβセクレターゼ(BACE1)の異常な発現増加がみられる。また、AβオリゴマーがAD病態の誘導因子であることが示唆されている。本研究では、初代培養神経細胞のモデル系を用いて、BACE1とAβの関連性を検討した。その結果、Aβオリゴマーは翻訳後メカニズムを介して、BACE1を神経突起内に増加させ、発現亢進を引き起こすことを明らかにした。さらに、BACE1の分子制御に関する研究において、LRP1がBACE1のエンドソーム輸送、リソソーム分解の調節を介して、BACE1発現を抑制することを見出した。βセクレターゼBACE1はアミロイドβペプチド(Aβ)の産生に必須な膜結合プロテアーゼであり、重要な治療標的とみなされている。本研究では、(1)アミロイドβペプチド(Aβ)により誘起されるβセクレターゼBACE1の発現亢進のメカニズムの解明と、(2)膜タンパクReticulon3(RTN3)によるBACE1の分子制御を、動物モデルなどを用いて実証することを主要課題とした。(1)ラット初代培養大脳皮質神経細胞を、比較的低濃度のAβ42(オリゴマー、フィブリル)で、長時間(23日間)処理する系を確立した。ウエスタン解析の結果、Aβ42オリゴマー処理細胞では、対照に比べて、BACE1タンパクレベルの有意な増加が認められた。同処理細胞では、APP C末断片のレベルの増加も認められたことから、APPのβ切断の促進が示唆された。さらに、Aβ42オリゴマー処理により、ストレス応答経路の重要な因子であるeIF2αの活性化、およびカスパーゼ3の活性化が起こることが示された。BACE1のmRNAレベルの変化があるかについては、RT-PCR法を用いた検討を行ったが、まだ結論には至っていない。(2)RTN3によるAβ産生抑制を介した防御的効果について、トランスジェニック(Tg)マウスモデルを用いた検討を開始した。独自に作製したRTN3 Tgマウスと、共同研究者より供与されたAPP Tgマウスとを飼育し、交配によりダブルTgマウスの作出を行ったが、得られた産仔数が少なかった。十分な産仔数を得られるまで、マウスの繁殖、飼育を行うこととした。RTN3がBACE1を抑制する細胞内部位と脂質ラフトの関連について解析するため、実験条件を検討した。予定を変更し、培養神経細胞ではなく、Swedish変異型APPを発現するHEK293細胞を用いて検討することとした。(1)アミロイドβペプチド(Aβ)により誘起されるβセクレターゼBACE1の発現亢進のメカニズムの解明ラット初代培養大脳皮質神経細胞を、比較的低濃度のAβ42(オリゴマー、フィブリル)で、長時間(23日間)処理する系を用いた研究を継続した。Aβオリゴマー処理細胞では、アミロイド前駆体タンパク(APP)のBACE1による切断が促進されることを、APP C末断片の詳細な解析により実証した。Aβオリゴマー処理により、BACE1のmRNAレベルは変化しないこと、アデノウイルスベクターで発現させた外因性BACE1のレベルも内因性BACE1と同様に増加したことから、AβオリゴマーはBACE1の翻訳後レベルの調節を介して、そのタンパク発現亢進を引き起こすことが判明した。次いで、免疫細胞化学によるBACE1の神経細胞内分布の解析を行い、興味深い知見が得られつつある。さらに、Aβオリゴマー処理による細胞応答は典型的な小胞体ストレス反応ではないことも示された。また、AβオリゴマーによるAβ産生悪循環の抑制効果を持つ物質の探索を、候補物質(抗酸化物質、Memantineなど)について実施したが、有効性の高いものを見出すには至っていない。トランスジェニック(Tg)マウスモデルを用いた検討を優先して実施した。RTN3 Tgマウスと、APP Tgマウスとを飼育し、交配によりnon-Tg、APP Tg、RTN3 Tg、APP/RTN3 Tgマウスを作出(計約50匹)した。さらに多くの産仔を得るため、同様の交配実験を実施中である。記憶学習能力の評価のため、恐怖条件付け試験を予備的に実施したが、異常の評価が困難であったため、他の試験での評価を行うこととした。アルツハイマー病(AD)の脳において、アミロイドβペプチド(Aβ)の産生プロテアーゼであるβセクレターゼ(BACE1)の増加が認められている。この異常とAβの関連性を解明するための研究を主体に実施した。まず、ラット初代培養大脳皮質神経細胞を、比較的低濃度のAβ42(オリゴマー、フィブリル)で、長時間(2-3日間)処理する実験系を樹立した。この系において、Aβオリゴマー処理により、内因性BACE1タンパク発現が有意に増加するが、アミロイド前駆体タンパク(APP)、αセクレターゼ(ADAM10)のレベルは変化しないこと、BACE1のmRNAレベルに有意な変化がないこと、アデノウイルスベクターで発現させた外因性BACE1のレベルも同様に増加することが判明した。従って、Aβオリゴマーは翻訳後レベルの調節を介してBACE1発現亢進を引き起こすと考えられた。次いで、その機序に関して、免疫細胞化学的検討の結果、AβオリゴマーによりBACE1の神経突起内蓄積が起こることが推定された。

さらに、AβオリゴマーはAPPのアミロイド産生性プロセシングの増加を引き起こすことが示唆された。以上から、Aβオリゴマー刺激により、BACE1の増加を介して、Aβ産生の増幅が起こること、この悪循環がAD病態に関与していることが示唆される。一方、Aβオリゴマーによる神経細胞障害に関して、典型的な小胞体ストレス反応ではないこと、タウの異常リン酸化及びカスパーゼ切断の増加を伴うことなどが示唆された。Aβによる神経細胞障害の保護作用を持つ物質の探索的研究も実施した。また、Reticulon 3 (RTN3)と呼ばれる膜タンパクがBACE1機能を抑制することが知られている。RTN3の神経防御的効果を、モデルマウスを用いて検証するため、APPトランスジェニック(Tg)マウス、RTN3 TgマウスからダブルTgマウスを作出して、バーンズ迷路試験などの行動試験を実施したが、明確な結論を得るには至っていない。アルツハイマー認知症(AD)の脳において、アミロイドβタンパク(Aβ)の生成に必須なプロテアーゼであるβセクレターゼ(BACE1)の異常な発現増加がみられる。また、AβオリゴマーがAD病態の誘導因子であることが示唆されている。本研究では、初代培養神経細胞のモデル系を用いて、BACE1とAβの関連性を検討した。その結果、Aβオリゴマーは翻訳後メカニズムを介して、BACE1を神経突起内に増加させ、発現亢進を引き起こすことを明らかにした。さらに、BACE1の分子制御に関する研究において、LRP1がBACE1のエンドソーム輸送、リソソーム分解の調節を介して、BACE1発現を抑制することを見出した。AβオリゴマーによるBACE1発現亢進の機序の解析が順調に進み、研究成果を論文化する準備段階に至っている。また、RTN3によるBACE1制御についてのin vivoの研究も、若干の問題点はあったが、ほぼ順調に進行している。神経分子病態学研究目的を達成するため、研究計画を予定通り推進していく。AβオリゴマーによるBACE1発現亢進のメカニズムに関する研究データを集約し、論文を準備、投稿する。さらに、生理的環境に近い条件(低濃度のAβ刺激)下におけるBACE1異常の検討、AβオリゴマーによるAβ産生悪循環の抑制効果を持つ物質の探索などを行う。BACE1の制御因子としてのRTN3の役割について、新知見を得るため、Tgマウスを用いた研究を継続する。AβオリゴマーによるBACE1発現亢進が明らかとなり、その機序の解析も進展しつつある。また、RTN3によるBACE1制御の実験計画もほぼ順調に進んだ。2000円未満の少額の残額については、適当な物品が購入できないため、次年度に繰り越すこととした。研究目的を達成するため、研究計画を予定通り推進していく。AβによるBACE1発現亢進のメカニズムについて、eIF2αの活性化経路を中心に調べるとともに、Aβ起因性の神経細胞異常を抑制する薬剤の探索なども行う予定である。消耗品費に充当する予定である。1000円未満の少額の残額については、適当な物品が購入できないため、次年度に繰り越すこととした。
ミトコンドリアタンパク質と性ホルモンによる代謝制御機構の研究

ミトコンドリア内膜に存在するプロヒビチン2(PHB2)はエストロゲン(E2)依存的に核に移行する。一方、E2の減少は閉経早期の閉経後肥満の原因となる。本研究では、E2によって核へ移行したPHB2が、PGC-1αを介してPPARγの転写活性を抑制することにより脂肪分化を負に制御することを示した。E2は脂肪前駆細胞において内在性のPHB2を核に移行させ、PHB2はPGC-1αに直接結合してPPARγの転写活性を抑制する。ミトコンドリア移行シグナルを欠失したPHB2変異体(PHB2C)を脂肪前駆細胞に発現させるミトコンドリア内膜に存在するプロヒビチン2(PHB2)はエストロゲン(E2)依存的に核に移行する。ミトコンドリア移行シグナルを欠失したPHB2変異体(PHB2C)を脂肪前駆細胞に発現させる当該研究の目的は、PHBタンパク質が性ホルモン依存的に核-ミトコンドリア間を移行するという新規な現象を踏まえ、この現象によりもたらされると予測されるミトコンドリア活性調節および核内における転写活性調節の二つを解析により、性ホルモンが肥満等の代謝調節に関与する分子メカニズムを生化学的に解明することである。平成22年度は、PHB2の各細胞内局在の相互作用分子の網羅的同定を行った。PHB2の細胞内移行の分子メカニズムや新規な核機能を同定する上で、相互作用分子を同定することは、重要なステップである。これまでの解析から、PHB2はN末端から50アミノ酸までの間にミトコンドリア移行シグナルを含んでいること、このN末端領域を欠失すると細胞質と核に局在することを同定している。PHB2の各細胞内局在において結合する相互作用分子を同定するために、C末端にタグを付加した野生型とN末端領域の欠失変異体のPHB2をヒト子宮頚癌由来細胞HeLa細胞に発現させた。これらの細胞から細胞抽出液を調整し、抗タグ抗体を用いて免疫沈降法を行い、それぞれの分子に相互作用する因子を共沈降した。これらのタンパク質を一次元電気泳動法で展開した後、タンパク質を染色・単離し、トリプシンにて前処理後、nano LC-MS/MSを用いた質量分析法にて、PHB2の相互作用分子を網羅的に同定した。その結果、ミトコンドリア移行シグナルを欠失した変異体では、クロマチン構成因子などが多く同定された。一方、全長のPHB2タンパク質を用いた場合では、ミトコンドリアに局在する各種の代謝に関連する酵素も多く同定された。以上から、PHB2は核とミトコンドリアでそれぞれに機能する多機能分子であると考えられた。当該研究の目的は、PHBタンパク質が性ホルモン依存的に核-ミトコンドリア間を移行するという新規な現象を踏まえ、この現象によりもたらされると予測されるミトコンドリア活性調節および核内における転写活性調節の二つを解析により、性ホルモンが肥満等の代謝調節に関与する分子メカニズムを生化学的に解明することである。平成23年度は、PHB2がエストロゲンによって細胞内局在を変化させるという現象の生理的意義を検討するために、脂肪前駆細胞3T3-L1細胞を用いた。当該細胞は、PHB2やエストロゲンレセプターを内在性に発現している。まず、当該細胞にエストロゲンを添加し脂肪分化させたところ、エストロゲンを添加しないときに比べ脂肪分化が抑制された。また、内在性のPHB2を染色する抗PHB2抗体を作製し、当該細胞の免疫染色を実施したところ、エストロゲン非存在下ではPHB2は主にミトコンドリアに局在したが、エストロゲン存在下ではPHB2の一部は核に移行した。脂肪分化のマスター遺伝子であるPPARγと上流にPPREを有するルシフェラーゼ遺伝子を用いてルシフェラーゼアッセイを行ったところ、PHB2はPGC1aコアクチベータ存在下で転写活性を抑制した。PHB2とPGC1aは直接結合することをGST pulldown assayにて証明した。以上から、核に移行したその結果PHB2は直接PGC1aに結合してPPARγの転写活性を抑制すると考えられた。その結果、脂肪分化を抑制すると考えられた。以上の仮説を証明するために、エストロゲン非依存的に核に移行するPHB2変異体(PHB2C)を、レンチウイルスベクターを用いて3T3-L1細胞に導入し、脂肪分化の誘導を実施したところ、PHB2C導入細胞では、脂肪分化が抑制された。以上から、核移行型PHB2はPGClaを介してPPARγの転写活性を抑制することで脂肪分化を抑制することを示した。当該研究の目的は、PHBタンパク質が性ホルモン依存的に核ーミトコンドリア間を移行するという新規な現象を踏まえ、この現象によりもたらされると予測されるミトコンドリア活性調節および核内における転写活性調節の二つを解析により、性ホルモンが肥満等の代謝調節に関与する分子メカニズムを生化学的に解明することである。

昨年度まで、ミトコンドリアに局在するPHB2が脂肪前駆細胞3T3-L1細胞においてエストロゲン(E2)の添加によって細胞内局在を変化させ、核に移行することを免疫染色にて示した。さらに、E2添加により脂肪が抑制されることを示した。ルシフェラーゼアッセイにより、脂肪分化のマスター遺伝子PPARγのコアクチベータであるPGC1aの活性を抑制し、結果としてPPARγの転写活性を抑制すること、GST pulldown assayにてPHB2とPGC1aは直接結合することを示した。さらに、E2非依存的に核に移行するPHB2変異体(PHB2C)を、レンチウイルスベクターを用いて3T3-L1細胞に導入したところ、脂肪分化が抑制されたことから、PHB2CはPGC1aを介してPPARγの転写活性を抑制することで脂肪分化を抑制することを示した。平成24年度は、以上の仮説がin vivoでも成立するかを検討するために、閉経後肥満のモデルマウスである卵巣切除(OVX)マウスを用いて検討を行った。OVXマウスでは白色脂肪組織が増大すること、E2投与マウスでは、その肥満が減少することを示した。さらに、白色脂肪組織の内在性のPHB2を免疫組織染色にて検討したところ、E2投与のOVXマウスの白色脂肪組織においては、非投与群に比べPHB2は核に局在していた。以上から、生体においても、E2依存的にPHB2は核に移行し、その結果、脂肪分化が抑制することが示された。これは新たな肥満調節の分子モデルである。(1)エストロゲン存在下でのPEB2の核内移行が、脂肪前駆細胞で確認できたこと、(2)核移行型PHB2の導入により、脂肪分化が抑制されたことを明らかにしたことにより、PHB2の核-ミトコンドリア間の移行が、肥満に関与することを実験的に示した。当初の目的にほぼ到達している。さらに、PHB2の作用分子を明らかにし、脂肪分化抑制の分子メカニズムを解明したことは、当初の計画以上である。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後、この分子機構を、動物モデルを用いて実証する。特に、閉経後肥満のモデルマウスを用いてその分子機構を解明する予定である。
石油・石炭系炭化水素類により汚染された土壌の新浄化方法の開発に関する研究

環境浄化に用いるための基礎として、白色腐朽菌P.chrysosporiumの増殖特性及び数種の難分解性物質に対する同菌の分解特性、リグニン分解酵素の発現条件、水系及び土壌系からの難分解性物質除去への白色腐朽菌の適用性について検討をおこなった。得られた主要な知見は以下の通りである。1) P.chrysosporiumの菌体増殖に対して大きく影響する因子として、培養温度とpHが挙げられる。増殖にはビタミン類、特にチアミンが必須因子であった。2) LiPは培地中の炭素源が消費されて後に発現し、MnPは炭素源または窒素源のいずれかが消費された後に発現することが分かった。高いLiP活性を得るにはある程度窒素濃度が高い方が有利であった。3) P.chrysosporiumが窒素源として利用できるものはアミノ酸、硝酸塩、アンモニア性窒素があげられるが、アンモニア性窒素が最も好ましい。4)固定化担体としては酵素活性の点から、付着担体としてのポリウレタンフォームが優れていることがわかった。アスペンチップを付着担体とした場合、培地を入れなくてもP.chrysosporiumの増殖が認められた。5)ポリウレタンフォームを付着担体とする固定床式回分装置では、処理培地を用いてリグニン分解酵素が発現した。6)液体培地中における石油系油分の分解実験では、リグニン分解酵素の発現を確認した後、A重油を1,000mg/Lになるように添加した結果、A重油は分解されたが、これはリグニン分解酵素の働きによるものと推定された。7)赤土および山砂にA重油を添加して模擬汚染土壌を作成し、ここへ白色腐朽菌を植菌した。土壌中のA重油濃度を経時的に測定したところ、液体培地中より速度が遅かったが、A重油分解の進行は認められた。土壌中での菌体増殖と酵素活性の発現は液体培地とはかなり異なることが予想された。以上の結果から、白色不朽菌は廃水処理や汚染土壌の浄化に利用できるものと期待された。油分による土壌汚染の機構を解明し、汚染土壌の浄化技術を確立することを目的として、本研究ではA重油を対象として、物理化学的処理法の基礎となる油分の土壌への吸・脱着現象の解明と油分分解微生物の訓養等について実験的検討を行った。重油のような高沸点有機化合物(芳香族炭化水素類等)を多く含むによる土壌汚染は今後ますます顕在化し、社会的にも大きな問題になると考えられている。得られた主な結果は以下の通りである。1.土壌に付着、吸着または共存している重油の総括的分析法としては、種々の文献的考察及び実験から、エタノール抽出跡に、分画(飽和画分、芳香族画分、レジン画分、アスファルテン画分)し、Polychlorotrifluoroethyleneを溶媒とする赤外分析法によるのが簡便かつ確実である。2.土壌含水率が増加すると、土壌表面を覆った水分子によってA重油が土壌と接触しにくくなる作用により、A重油の土壌内浸透速度と浸透距離が増加する。3.多量のA重油が土壌内を浸透する場合、重油の各画分が土壌に特異的吸着するというよりは土壌間隙における保持が浸透速度を減少させ、有機炭素の存在による土壌間隙構造の変化がこのような現象を促進させるものと考えられる。このような汚染機構を基礎とする汚染土壌の物理化学的浄化法については現在検討中である。

4.油分分解微生物の訓養、集積培養を試み、単離にはいたっていないが、分解活性の高い微生物が存在することを確認した。近年難分解性物質による河川水や土壌等の汚染問題が顕在化しつつあり、水系および土壌系におけるこれらの物質の処理を目的として種々の物理化学的方法のほか、生物処理法が研究されている。本研究では白色腐朽菌Phanerochatechrysosporiumを木材チップに固定化し、大規模な土壌・地下水汚染を起こしている石油系油分の一種であるA重油の水系・土壌系における分解実験をおこない次の結果を得た。液体培地中における石油系油分の分解実験では、炭素制限培地に胞子懸濁液を植菌したのちベラトリルアルコールを添加することによりリグニン分解酵素を発現させた。この酵素の発現を確認した後、A重油を1,000mg/Lになるように添加した。その結果、白色腐朽菌PhanerochatechrysosporiumはA重油を分解したが、これはリグニン分解酵素の働きによるものと推定された。さらに赤土および山砂にA重油を添加して模擬汚染土壌を作成し、ここへ白色腐朽菌を植菌した。土壌中のA重油濃度を経時的に測定したところ、土壌中におけるPhanerochate chrysosporiumによるA重油の分解は液体培地中より速度が遅かったが、分解の進行は認められた。土壌中での菌体増殖と酵素活性の発現は液体培地とはかなり異なることが予想された。以上の結果から、白色不朽菌は廃水処理や汚染土壌の浄化に利用できるものと期待された。本研究では大規模な土壌・地下水汚染を起こしている石油系油分の一種であるA重油を例として、白色腐朽菌PhanerochatechrysosporiumによるA重油の水系・土壌系における分解実験をおこない、前年度では本菌によるA重油の分解が確認され、これはリグニン分解酵素(LiP・-MnP)の働きによるものと推定された。そこでこのリグニン分解酵素の活性発現条件について検討をおこない、次の結果を得た。1.リグニン分解酵素のうち、LiPは培地中の炭素源が消費された後に発現していた。MnPでは炭素源または窒素源のいずれかが消費された後に発現していた。2.これらの酵素の発現には栄養制限条件以外の因子も関与していた。3.炭素制限条件下ではLiPの発現はVeratryl Alcoholの添加により、大きく促進された。このVeratryl Alcoholは二次代謝産物である。4. LiPの発現については界面活性剤Tween80の添加によって、発現が促進された。5.酸素のフラッシュによるリグニン分解酵素の大きな発現促進効果は認められなかった。6.適量のグルコースの添加により、リグニン分解酵素が発現する期間を延長できた。7.白色腐朽菌が窒素源として利用できるものはアミノ酸、硝酸塩、アンモニア性窒素があった。リグニン分解酵素の発現の点からは、アンモニア性窒素がもつとも好ましい結果が得られた。
量子センサーの電気的制御を室温で実現するランタノイド注入GaNダイオード

ランタノイド注入GaNダイオードの電流注入による光検出磁気共鳴(ODMR)を実現するためには、まずODMRの高周波印加条件を決定する必要がある。高周波印加条件を決定するためには、効率的な発光条件(共鳴励起条件)を知る必要があるため、2018年度は、GaNエピ膜にイオン注入したランタノイド(PrおよびNd)の共鳴励起波長を、波長可変レーザーを搭載した共焦点レーザー走査型蛍光顕微鏡(CFM)を用いて調べた。400800nmの範囲で励起光波長を掃引し、ランタノイドの発光強度が最大になる波長を明らかにした。また、共鳴励起波長での励起では、GaN結晶欠陥や不純物に起因するバックグラウンド発光が抑えられるため、非共鳴励起条件と比較すると極めて高い信号・バックグラウンド比が得られることがわかった。また、Pr注入GaNダイオードにおいて、順方向電圧印加によるPrの電流注入発光を観測するため、比較的構造がシンプルなn型ショットキーバリアダイオード(SBD)を作製した。照射損傷を可能な限り避けるため、GaN基板上n型GaNエピ膜上に電子ビーム描画装置を用いてイオン注入マスクを形成し、1μm×1μm未満の微小領域にのみPrをイオン注入した。その後、SiN被覆処理を行い、1250°C, 2分の高速熱処理によってPrを活性化させた。SiN被覆を除去し、最後に両面に金属電極を形成し、n型SBD構造を形成した。Pr注入n型SBDのダイオード特性評価およびエレクトロルミネセンス発光観測を現在進めている。2018年度では、ODMR計測条件の決定に必要となる、ランタノイドの共鳴励起条件を明らかにしたが、ODMRの計測には至っていない。また、微小領域にランタノイドを注入したGaNにダイオード構造を施したデバイスを作製したが、その電流・電圧特性評価や電流注入に基づく発光(エレクトロルミネセンス)の観測についてはまだ実施できていないため、進捗がやや遅れている。GaNにドープしたランタノイド(PrおよびNd)の光学的特性は2018年度で詳しく明らかにすることができたため、今後は「ランタノイド注入GaNのODMR観測」と「ランタノイド注入GaNダイオード量子センサーの設計・作製・評価」を中心に取り組んでいく。ダイオード構造を持たないGaNエピ膜に注入したランタノイドに対し、共鳴励起条件を利用したODMR測定を行う。共鳴励起条件ではランタノイドが選択的に励起、発光するため、高いコントラストでODMRを観測できると考えられる。これによりODMRの測定条件を明らかにし、その後、ランタノイド注入GaNダイオードのエレクトロルミネセンス発光に基づくODMR測定に挑戦する。2018年度に作製したPr注入n型SBDの電気特性評価およびエレクトロルミネセンス観測を行う。良好なダイオード特性が得られているかどうかを確認したのち、ランタノイド注入領域からのエレクトロルミネセンスをCFMを用いて観測し、検出可能な最小ドットサイズ、最小アンサンブル数を調べる。エレクトロルミネセンス強度と注入電流の関係性を明らかにし、最適発光条件を得るとともに、デバイス作製プロセスの改善を検討する。

共鳴励起条件ではランタノイドが選択的に励起、発光するため、高いコントラストでODMRを観測できると考えられる。これによりODMRの測定条件を明らかにし、その後、ランタノイド注入GaNダイオードのエレクトロルミネセンス発光に基づくODMR測定に挑戦する。2018年度に作製したPr注入n型SBDの電気特性評価およびエレクトロルミネセンス観測を行う。良好なダイオード特性が得られているかどうかを確認したのち、ランタノイド注入領域からのエレクトロルミネセンスをCFMを用いて観測し、検出可能な最小ドットサイズ、最小アンサンブル数を調べる。エレクトロルミネセンス強度と注入電流の関係性を明らかにし、最適発光条件を得るとともに、デバイス作製プロセスの改善を検討する。
中脳・後脳境界領域の神経回路形成における役割

脊椎動物の中枢神経系を構成する軸索の投射パターン形成には活性領域(オーガナイザー)が関係しており、その一つは腹側正中部にある底板である。いっぽう中脳と後脳の境界部の峡(isthmus)にもオーガナイザー活性が存在し、底板と同様に峡が脳の基本回路形成に重要な役割を果たしている可能性は十分に考えられる。本研究は、吻側部に向かう軸索伸展が、峡のオーガナイザー活性を担っているFgf8の制御下にある分子の勾配によって制御されているのではないかとの仮設を立てて、それを検証することを目的とする。昨年度は、Fgf8をしみこませたラテックスビーズをドーパミン作動性黒質ニューロン(DAN)の軸索走行路に移植し、その走行に異常が生じるか否かを検討し、その後、峡のオーガナイザー活性の、中脳ドーパミン作動性ニューロンの吻側部に向かう軸索伸展への関与の解析をおこなったが、本年度は、前年度に得られた知見をもとに、DANの軸索走行路の下流で働いていると思われるengrailedをはじめとする遺伝子の発現の検討を、in situ hybridizationを用いておこなった。また、DANのガイドに直接関与している分子の探索にも着手した。具体的にはEphrin-Ephファミリーの関与の可能性を強制発現系、ドミナントネガティブ体の発現を利用し、展開培養標本または全胚培養系に適用することによって検討をおこなった。なお、実験には、ラットの全胚培養系だけではなく、我々がこれまでに開発した発生期の軸索投射のメカニズムを解析するのに適した実験標本(2次元展開標本)を用いた。脊椎動物の中枢神経系を構成する軸索の投射パターン形成には活性領域(オーガナイザー)が関係しており、その一つは腹側正中部にある底板であり、いつぽう中脳と後脳の境界部の峡(isthmus)にもオーガナイザー活性が存在する。底板と同様に峡が脳の基本回路形成に重要な役割を果たしている可能性は十分に考えられ、本年度は中脳ドーパミン作動性ニューロンの吻側部に向かう軸索伸展への、峡のオーガナイザー活性を担っているFgf8の制御下にある分子勾配の関与を解析するために以下の実験をおこなった。我々がこれまでに開発した発生期の軸索投射のメカニズムを解析するのに適した実験標本(2次元展開標本)を用いて、Fgf8をしみこませたラテックスビーズをドーパミン作動性黒質ニューロン(DAN)の軸索走行路に移植し、その走行に異常が生じるか否かを検討した。また、応答性の維持には神経管以外の組織の存在も必要と考えられるため、ラットの全胚培養系を用いてラテックスビーズの移植をおこない数日間培養した。その後、DANの分子マーカーtyrosine hydroxylase(TH)に対する抗体によって染色をおこない、峡のオーガナイザー活性の、中脳ドーパミン作動性ニューロンの吻側部に向かう軸索伸展への関与の解析をおこなった。