hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
個人識別のためのDNAフィンガ-プリントの簡便法の開発

まず、ヒト末梢血から抽出したDNAをサザントランスファ-を行ってDNA結合フィルタ-を作製した。次に、市販のキットによりプロ-ブ(おもに“myo")の標識とDNAの検出を行った。本年度は、スルフォン化標識(宝酒造)およびビオチン標識(コスモ)プロ-ブを用いた検出法に加え、ジゴキシゲニン標識(ベ-リンガ-)プロ-ブを用いた検出法でもDNAフィガ-プリントを作成することができた。これらの方法はいずれも免疫学的手法を利用した方法であるが、最近蛍光反応を利用したECLキット(アマシャム)が発売された。この方法ではプロ-ブDNAに直接パ-オキシタ-ゼを結合し、エンハンスドケミルミネッセンスを発生させ、フィルム上にバンドを検出する。このECL法の実用性を検討したところ、他のキットに比べ価格は高いものの、(1)アイソト-プ法とほゞ同程度の感度でDNAフィンガ-プリントが得られる、(2)デ-タをフィルム上に記録できる、(3)脱プロ-ブしないでフィルタ-を再利用できる、などの利点を有しており利用価値の高いことがうかがわれた。実際の親子鑑定や卵性診断にECL法を応用したところ、明確なバンドを示すDNAフィンガ-プリントが得られ、鑑定や診断を行うに十分な資料となり得ることがわかった。特に双生児の卵性診断においてはバンドパタ-ンが同じ場合には一卵性、異った場合では二卵性とその診断は容易であった。本研究では、アイソト-プを使用せずにDNAフインガ-プリントを作成する方法(コ-ルド法)を確立するために、市販されている4種類のキットを用い、各々の実用性を検討した。まず、ヒト末梢血から抽出したDNAを制限酵素(HaeIII)で切断し、アガロ-スゲル電気泳動を行った後、DNAをナイロンメンブランに転写した。次に各々のキットの方法で、myoプロ-ブを標識し、メンブラン上のDNAにハイブリさせ、バンドパタ-ンを検出した。その結果、1)スルフオン化標識(宝酒造)、2)ビオチン標識(コスモ)3)ジゴキシゲニン標識(ベ-リンガ-)、4)パ-オキシタ-ゼ標識(アマシャム)の4種類のキットのいずれからもDNAフインガ-プリントを作成することが出来た。このうち、4)の方法はエンハンスドケミルミネツセンス(ECL)を発生させるもので、他のキットに比べて価格は高いものの、(1)アイソト-プ法とほぼ同程度の感度でDNAフインガ-プリントが得られる。(2)デ-タをフイルム上に記録できる。(3)脱プロ-ブしないで、フイルタ-を再利用できる、(4)検出操作が容易である。などの利点を有しており、DNAフインガ-プリント作成に利用価値が高いことが分かった。ECLキットを用いたコ-ルド法を、実際の親子鑑定、双生児の卵性診断、骨髄移植の生着確認に応用したところ、そのバンドパタ-ンは、いずれも鑑定や診断を行うために十分な資料となることが確認できた。DNAフインガ-プリント法は、十分なゲノムDNAを確保できる場合、個人識別に極めて、有用であり、コ-ルドプロ-ブを用いることにより、一般の研究室や検査室でも比較的容易に作成できる。4種類のキットのいずれを用いてもDNAフインガ-プリントが作成可能であったが、ECLキットを用いた方法の利用価値が高く、その手技を確立した。
ファシリテーターの育成を通した教育力向上プログラムの開発

本研究では、企業等で重要視されているファシリテーター的な役割を、グループ学習に加えることで、グループ学習におこりがちな知識の偏りを避けることや、グループ構成員すべてが活発にディスカッションできる状況をつくり出せる教育力向上プログラムを開発した。これを用いた実践の結果、ファシリテーターを事前に訓練させることで、ディスカッションの進行や意見の整理が進み、リーダーの負担感が軽減され、それぞれの役割が明確になり、ディスカッション全体が活性化するなど、プログラムの有効性が検証できた。(1)高校までに経験してきたグループ学習の状況調査(リーダー、ファシリテーターなどの役割分担の実態など)本研究対象としている本学の学生に対し、高校までに経験してきたグループ学習の状況や学習の仕方(グループ内の役割分担、学習のタイプや方法など)を調査し、おもな結果として、課題解決型と集約型のグループ学習が多いことが分かった。交流型は上級学年になるにつれ若干増加するが、全体の10%を少し越える程度であった。中学校から高等学校になるにつれ意見獲得型や理解深化型が少しずつ増えていることも分かった。また、リーダーやファシリテーターといった役割は明確ではなく、教員による指導も十分ではないことも分かった。(2)大学生を対象とした授業実践研究研究計画にそって、学生が主体的に課題を選択し、課題解決のための情報収集、議論、成果発表(プレゼンテーションなど)の形での学習活動とともに、学生自身が学習の成果を発表する手法として模擬パネルディスカッションを取り入れた授業デザインを作成してグループ学習を行った。そのなかで、リーダー、ファシリテーター、プレゼンテーターなどのグループ学習における具体的な役割の仕事内容を十分説明し、学生の希望で選択させたが、リーダーを希望したのが30名中1名、ファシリテーターでは2名となり、進んでこうした力を身に付けようとする学生は少ないことが分かった。高校までの学習過程において、こうした学習方法に慣れていないことが前述のアンケートからも裏付けられたと言える。また、実践結果から、実際の学習過程のなかでは、リーダーとファシリテーターの仕事の内容を混同していた傾向が強く、グループ学習を活発にし、学習が深まるようにするには、熟議の手法なども取り入れた、ファシリテーター育成のための教育プログラムの構築が必要であることで、本研究の目的が明確になった。これまでに実施した調査(本研究対象としている本学の学生に対する高校までに経験してきたグループ学習の状況や学習の仕方)の結果、協調性やコミュニケーションの力は付いたものの、学習内容が深まらない、多様な学びへと発展しないことが多いこと、そして、実践研究では、リーダーやファシリテーターの役割についての重要性や仕事内容は認識できていても、ファシリテーターが存在するグループ学習を過去に経験したことがないため、リーダーがファシリテーターの仕事も担い負担が増した。また、具体的なファシリテーターのやり方が分からず戸惑ったケースもあったため、平成23年度では、(1)グループ学習の効果を高めるための教育プログラム(ファシリテーター育成のための体験型学習)を実践した。これらの実践結果から、想定していたほど、リーダーの負担感は軽減しなかったものの、グループ学習における学習効果を大きくするファシリテーターの役割が重要なことが、実践事後調査等から明らかになったとともに、学生個々の学習の深まりが見られた。ただし、一斉型の講義と異なるこうした学習成果について、学生個々の成績評価が正しく行えたかに関しては、客観的な指標が明確でなかった。この点を24年度での実践研究のなかで解決を図っていく。また、(2)課題制作型授業においては、ファシリテーターとリーダーの役割を明確にしたグループ討議とファシリテーターを設定しないグループ討議の比較調査をした。ファシリテーターを置くことで、リーダーとファシリテーターともに負担感があるが、討議への参加度が高く、役割の理解が進んだ。役割を担うことでグループ討議への参加意識の高まりが見られた。リーダーやファシリテーターが機能しているグループは、討議の満足度が高く、参加度が良い結果が得られた。平成24年度は23年度までの研究成果の検証を主な目的として、グループ学習の活性化などを目的とした本研究対象の学生に対し、研究計画にそって実践した。学生が主体的に課題を選択し、その解決のための情報収集、議論、成果発表(プレゼンテーションなど)の形での学習活動とともに、学生自身が学習の成果を発表する手法としてプレゼンテーションや作品制作、模擬授業を取り入れた授業デザインを、昨年度の課題をもとに改良し、グループ学習を行った。そのなかで、本研究主題であるリーダー、ファシリテーターのグループ学習における具体的な役割の仕事内容について、学生の希望と適性で選択させた実践結果から、実際の学習過程のなかでは、リーダーとファシリテーターの仕事の内容の明確化が進み、グループ学習が活発になった。ファシリテーター育成のための教育プログラムの構築などへの有効性が検証できた。具体的には、1グループ学習の効果を高めるための教育プログラム(ファシリテーター育成のための体験型学習)の実践である。

リーダーの負担感はあまり軽減しなかったものの、グループ学習における学習効果を大きくするファシリテーターの役割が重要なことが、実践事後調査等から、昨年同様明らかになったとともに、学生個々の学習の深まりや達成感が見られた。また、2課題制作型授業においては、ファシリテーターを配置するクラスと配置しないクラスのグループ学習の状況を比較し、ファシリテーターの配置でグループ学習が活性化するかを検証した。ファシリテーターを配置し、リーダーとの役割を明確にすることにより次の3つの効果が認められた。i)どのグループもグループ討論が活性化し失敗に終わるような状況がなかった。ii)意見交換が促進され、振り返りレポートにおいて多くの言葉で学習内容を記述でき学習の深まりが見られた。iii)成果物にグループ討論での意見交換の成果が反映されていた。平成22年度で実施したグループ学習における学生アンケート調査結果、そして、23年度に実施した教育プログラム(ファシリテーター育成のための体験型学習)などから得られた結果の整理がおおむね順調に進んでいるため。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成23年度までの計画として、おおむね順調に進んでいるので、これまでの研究成果、および、明らかになった課題を検証しつつ、最終年度の「まとめ」を行う。平成23年度に実践研究を行った結果、グループ学習における学習効果を大きくするファシリテーターの役割は大きいことが、実践事後調査等から明らかになったが、一斉型の講義と異なるこうした学習成果について、学生個々の成績評価における客観的な指標が明確でなかった。この点を24年度での実践研究のなかで考察し、本教育プログラムの開発に活かしていく。また、課題制作型授業においては、特に「満足度」という指標について検討を進め、学習の深化を図る指標について研究を進める。
VP22fusion proteinを用いた非ウイルス膵癌遺伝子治療ベクターの開発

治療遺伝子が導入された標的細胞と同時に周囲に存在する遺伝子非導入細胞を同時に抑制する治療遺伝子を構築することを目的として、VP-22遺伝子とアポトーシス誘導遺伝子を融合させた治療遺伝子を構築した。制限酵素切断部位を導入した相補的プライマーを用いて、GFP(レポーター用)、p53、Bax遺伝子をPCR法で増幅させ、VP-22遺伝子の下流に組み込んだ。VP-22-GFPは発現細胞の周囲においても発光が確認され、VP-22融合による効果が確認された。VP-22-p53は細胞抑制効果はみられたものの、比較対照用として用いたp53との間に有意な差は認められなかった。VP-22-Bax発現ベクターは各種のプロモーターを用いたが、構築することは不可能であった。一方で、DNA結合ドメインと細胞膜通過ドメインを同時に有するペプチドを合成し、これがDNAと電気的に結合してヒト培養細胞株に遺伝子を輸送し、レポーター遺伝子であるGFP遺伝子を発現させることを明らかにした。さらに、この機序がエンドサイトーシスであること、遺伝子導入効果がクロロキンや塩化アンモニウムによって増幅されることをみいだした。また、この効果は多くの細胞株(ヒト正常細胞株、肺癌細胞株、膵癌細胞株、食道癌細胞株)で、従来の遺伝子導入方法であるリポフェクション法と比較して高いことが明らかとなったほか、使用濃度での細胞毒性はほとんど観察されなかった。このポリペプチドの細胞膜通過ドメインを他の接着因子(RGD)などに置換したペプチドでは高い遺伝子導入は確認されなかった。さらにペプチドに核移行シグナルが存在することが重要であることが示唆された。(論文投稿中)治療遺伝子が導入された標的細胞と周囲に存在する遺伝子非導入細胞を同時に抑制する治療遺伝子を構築することを目的として、VP-22遺伝子とアポトーシス誘導遺伝子を融合させた治療遺伝子を構築した。VP-22-GFPは遺伝子導入細胞の周囲においても発光が確認され、VP-22融合による効果が確認された。(論文投稿中)治療遺伝子が導入された標的細胞と同時に周囲に存在する遺伝子非導入細胞を同時に抑制する治療遺伝子を構築することを目的として、VP-22遺伝子とアポトーシス誘導遺伝子を融合させた治療遺伝子を構築した。(論文投稿中)
各種測定法による有機質中微量フッ素定量の検討

本研究は生体試料(血液、硬軟組織)中微量フッ素(F)測定のため、簡易で精度の高いtotal Fとionic Fの測定法を検索する事を目的とした。比較検討を行った測定法は6種、すなわち従来我々が検討してきたイオン電極法、微量拡散ーガスクロマトグラフ法(Dif-GC)。AIF分子吸光法(AIF)、低温灰化ーGC法(LTA-GC)に加え、新たに検討したパイロハイドロリシスーGC法(PyH-GC)、直接抽出ーGC法(DE-GD)である。それらによる測定成績を比較し、その応用上の問題点、長所などを明らかにした。なお、検討に用いた試料は有機F化合物およびFを投与されたラットの血液と組織である。1.有機F化合物に対する4種の測定法を実施した成績ー(1)Dif-GC法では有機F化合物は全く測定されない。(2)AIF法は低融点化合物には回収率が悪く、適用しがたい。(3)LTA-GC法、PyH-GC法は各化合物に対して好成績を示したが、必ずしもすべての有機Fに有効であるとは云い難い。2.有機F化合物を投与されたラットの血液および軟組織中total FをLTA-GC法、PyH-GC法で測定した値の相関は高く、両方法とも有機Fを含む試料のtotal F測定に適当である事が示唆された。しかし、LTA-GC法は灰化に要する時間が長い事、試料のマトリックスが変化した場合灰化の条件がかなり変動するなどの欠点がある。3.以上種々な検討の結果から、血液および軟組織中total Fには比較的簡易なPyH-GC法、ionic FにはDif-GC法が至適F測定法と考える。4.硬組織中ionic F測定には、微量拡散を行わずに測定できるDE-GC法が簡易であり、同時に精度の高い方法として推奨できる。近年、歯学の分野においても生体試料や食品中フッ素(F)の正確な定量法の確立が望まれている。この研究の目的はionic Fばかりではなく、total F(ionic+non-ionic F)の簡易で正確な測定法を検索することである。各種の前処理法およびF測定法を組合せて比較し、その応用上の問題点、長所などを明らかにする。本年度は主に以下の3項目を検討。1.前処理法としてパイロハイドロリシス(PyH)を新たに実施、そのF測定にはガスクロマトグラフィー(GC)を使用。PyHの操作条件(酸素流量、採取液量、適応試料量etc.)の検討を行い、NH_4F、有機F(数種)の標準液および牛血清、ラット血漿、ラット肝などについて検討。2.有機Fのラット投与実験ー2種の有機F(6ーフルオロトリプトファン,ジフルニサル)をラットに投与し、その血漿、肝についてtotal Fは低温灰化ーGC法、PyH-GC法、ionic Fは直接イオン電極法(IE法)、微量拡散ーGC法を実施した。歯と大腿骨は直接抽出{トリメチルクロルシラン(TMCS)}と微量拡散ーGC法を行い、両者の結果を比較した。3.牛血清およびF投与ラット血漿にゲル濾過(セファデックスG75)を試み、蛋白画分におけるFの存在を検索。〔結果〕1.PyHーGC法ではNH_4F、有機Fの牛血清への添加回収率は、95100%、その変動率は23.5%と好成績を得た。

他法との測定成績の一致率もよく、迅速に灰化でき、外部汚染や損失も少ない本法は有機質中Fの測定には非常に有効であった。2.有機F投与ラットの血漿および軟組織中Fの測定成績は、低温灰化ーGC法とPyHーGC法とがよく一致した。硬組織はTMCSによる直接抽出も有効であり、簡易な方法として実用できることが判明した。3.分離した蛋白画分に微量であるが結合型Fの存在を認めた。無機Fと有機F投与の血漿中における蛋白とFの結合には差が見られた。多有機質中フッ素(F)については、イオン型(ionic F)と非イオン型(bound F)の割合なども明らかでないことが多い。この研究は生体試料中のF測定のために、簡易で精度の高いtotal F(ionic+bound F)およびionic F測定法を検索し、それを実際の試料に応用することを目的として行った。前年度は従来我々が検討して来た方法に加えて、新たにパイロハイドロリシス-ガスクロマトグラフ法(PyH-GC法)を検討し、好成績を得た。今年度はこれらの測定法を用いて、動物実験の結果の評価なども行った。『実験』(1)ラットへのF投与:低F飼料(F=0.5ppm)と通常飼料(F=30ppm)を用い、NaF投与を行い、その血液、硬軟組織中FをPyH-GC法、微量拡散-GC法(Dif-GC法)、直接抽出-GC法(DE-GC法)を実施して、その実用性を検討した。(2)6種の有機F化合物にDif-GC法、AlF分子吸光法(AlF法)、PyH-GC法、低温灰化-GC法(LTA-GC法)の4方法を実施して、それらの添加回収率を検討し、各方法の有機F化合物への対応を明らかにした。『結果』(1)低F飼料を用いることにより、対照群のFレベルを非常に低下させることが出来ることが明らかになった。このことにより生体組織中のF濃度に関して、きめ細かい情報が得られ、この場合精度が高く簡易なF測定法(PyH-GC法、DE-GC法)は非常に有効であることが確認された。(2)比較した4種の測定法のうち、Dif-GC法では有機F化合物は全く回収されなかった。AlF法は低融点化合物に対しては有効でなかった。PyH-GC法は4-fluorobenzophenone(m.p:45-47)に対して低回収率を示したが、その他に対しては有効であった。LTA-GC法は殆どの有機F化合物に有効であった。
メタン酸化細菌のシャペロニンと生物処理技術への応用

我々はバイオレメディエーション技術によるトリクロロエチレン浄化を行うため、メタン酸化細菌Methylocystis sp.strainM(M株)を単離したが、M株は生体触媒としては比較的寿命が短く今後の解決すべき課題であることを明らかにした。本研究ではこの問題を解決するために、分解酵素である可溶性メタンモノオキシゲナーゼ(sMMO)遺伝子上流域にコードされているシャペロニン様遺伝子に注目し、この全塩基配列を決定すると共にメタンモノオキシゲナーゼ発現との関連性を明らかにする事を目的とした。この結果、以下の点が明らかになった。1.sMMO遺伝子群の約450bp上流部に2つのオープンリーディングフレームが認められ、それぞれをCpn10、Cpn60と命名した。Cpn10領域にはロイシンジッパーモチーフが認められ、一方、Cpn60領域にはシャペロニン60シグニチャーが観察され、シャペロニンであることが示唆された。1.E.coliにてM株のsMMO遺伝子群の発現化を検討した。ヒドロキシラーゼのα、βサブユニットが大量に産生されたが封入体を形成し、また、Cpn10、Cpn60をGST融合タンパクとして発現化を試みたが、Cpn10は可溶性であったがCpn60は不溶性として大量に生産された。2.Pseudomonas putidaの系でも同様にsMMO遺伝子群の発現を試みたが、sMMO各コンポーネント遺伝子の転写および一部コンポーネントの翻訳は認められたものの、sMMO活性は見られなかった。3.上記実験で見られた封入体形成を解決するために、シャペロン発現ベクターシステムを用いた共発現効果を検討したが、解決することは出来ず、また、培養温度等の検討による解決を図ったが改善されなかった。以上より、当初の目的であったM株のトリクロロエチレン分解活性の長期持続化までは達成できなかったが、未だ未知のsMMO遺伝子群の調節機構の存在が示唆され、この解明並びに封入体形成の解決が今後まず取り組むべき問題点であることが明らかとなった。申請者らはバイオレメディエーション技術によるトリクロロエチレン浄化を行うため、トリクロロエチレン分解菌メタン酸化細菌Methylocystis sp.strainM(M株)を単離・同定した。これまでに、M株は分解中間産物によって阻害を受け、その結果、生体解媒としては比較的寿命が短く今後の実用化に向けて解決すべき課題であることが明らかとなった。本研究ではこの問題を解決するために、分解酵素である可溶性メタンモノオキシゲナーゼ(sMMO)遺伝子上流域にコードされているシャペロニン様遺伝子に注目し、この全塩基配列を決定すると共にメタンモノオキシゲナーゼのアセンブリーとの関連性を明らかにする。また、トリクロロエチレン特異的なストレスタンパクの解析も行う。本年度は、以下の点を明らかにした。1.sMMO遺伝子群の上流域をシーケンスした結果、約450bp上流部に2つのオープンリーディングフレームが認められ、それぞれをCpu10,Cpn60と仮称した。2.それぞれの塩基配列を解析した結果、Cpn10領域にはロイシンジッパーモチーフが認められ、Cpn60領域にはシャペロニン60シグニチャーが観察された。3.データベースを用いて相同性検索を行った結果、Cpn10とホモロジーを有すタンパクは見いだされず、一方、Cpn60ともっとも高い相同性を示したのはRhodobocter capsulayusのCpn60で、約40%であった。4.Cpn10、Cpn60をそれぞれ発現ベクターと連結してE.coliに導入した結果、Cpn10タンパクを多量に調製することが出来たが、Cpn60タンパクはインクルージョンボディーを形成したため、他のシャペロニン共存下での発現化を試みている。

以上より、当初の目的であったM株のトリクロロエチレン分解活性の長期持続化までは達成できなかったが、未だ未知のsMMO遺伝子群の調節機構の存在が示唆され、この解明並びに封入体形成の解決が今後まず取り組むべき問題点であることが明らかとなった。我々はバイオレメディエーション技術によるトリクロロエチレン浄化を行うため、メタン酸化細菌Methylocystis sp.strainM(M株)を単離したが、M株は生体触媒としては比較的寿命が短く今後の解決すべき課題であることを明らかにした。本研究ではこの問題を解決するために、分解酵素である可溶性メタンモノオキシゲナーゼ(sMMO)遺伝子上流域にコードされているシャペロニン様遺伝子に注目し、この全塩基配列を決定すると共にメタンモノオキシゲナーゼ発現との関連性を明らかにする。本年度は、以下の点を明らかにした。1.M株のsMMO遺伝子群をE.coliで発現させるための各種発現コンストラクトを作成し、検討した。プロモーター領域およびその上流のシャペロニンCpn10、Cpn60全てを含まない、構造遺伝子部分のみの形質転換株で、ヒドロキシラーゼのα、βサブユニットが大量に産生されたが、封入体を形成した。また、Cpn10、Cpn60をGST融合タンパクとしてそれぞれ発現させることを試みた結果、Cpn10は可溶性であったがCpn60は不溶性として大量に生産された。2.Pseudomonas pudidaの系にて同様に各種発現コンストラクトを作成してsMMO遺伝子群の発現を試みたが、sMMO各コンポーネント遺伝子の転写および一部コンポーネントの翻訳は認められたものの、sMMO活性は見られなかった。3.上記実験で見られた封入体形成を解決するために、シャペロン発現ベクターを用いた共発現効果を検討したが、解決することは出来ず、また、培養温度等の検討による解決を図ったが改善されなかった。以上より、当初の目的であったM株のトリクロロエチレン分解活性の長期持続化は達成できなかったが、未だ不明であるsMMO遺伝子群の調節機構の解明および封入体形成の解決が今後まず取り組むべき問題点であることが明らかとなった。
ラセミ混合物の結晶化過程の解明とクリスタルエンジニアリング

キラルアミンはアキラルなカルボン酸との塩に導くことによりラセミ混合物として結晶化する場合がある。本研究はその要因の解明とラセミ混合物化させるための指針の確立を目的とする。そのため,カルボン酸第一アンモニウム塩の結晶構造解析を広範に行ない,ラセミ混合物結晶に特有な構造的普遍性の抽出を試みた。その結果,多くの場合カルボン酸とアミンは水素結合ネットワークにより成り立つカラムを形成し,塩の結晶はそのカラムの集合体となっていることが明かとなった。このカラムは大別すると2回らせん軸を持つものと対称心を持つものの二通りの様式に分類できる。ジアステレオマー塩,ラセミ混合物塩では当然前者の様式しか存在しないが,アキラル塩,ラセミ化合物塩では両者がほぼ拮抗する確率で出現する。即ち,ラセミ化合物塩にはカラムそのものがラセミ体である場合と,一本のカラムは光学活性であるが,逆の符号のカラムと1:1でパッキングするために全体としてラセミ体となる二種類の結晶構造が存在することを見出した。以上を総合すると,ラセミ体の塩では,結晶化の際形成されるカラムが対称心型の場合必然的にラセミ化合物塩になり,また,2回らせん型の場合ラセミ混合物になるかラセミ化合物になるかは同符号および異符号のカラム同士のパッキングポテンシャルの大小によって決定される。これを支配するのはカラムの外形とカラム間に働くvan der Waals力であり,分子力学法などの計算化学的手法によりある程度の予測は可能であると考えられる。以上のように,キラルアミンがアキラルなカルボン酸との塩に導くことによりラセミ混合物を形成しやすくなるのは,光学活性な2回らせん型のカラムをかなりの高確率で形成することが第一の要因であることが判明した。さらに計算化学的手法を利用するラセミ混合物の予測に関する検討は今後の課題である。まず、ラセミ混合物となる塩結晶とジアステレオマー塩との構造的類似性を調べるため、マンデル酸・1-フェニルエチルアミン塩およびマンデル酸・1-(3-メトキシフェニル)エチルアミン塩のX線結晶構造解析を行なった。その結果、いずれの場合にも2分子の酸と2分子のアミンが水素結合してユニットを形成し、さらに別の水素結合によってそのユニットがらせん状のカラムを形成していることが分かった。この水素結合ネットワークは、基本的にラセミ混合物となる酸・塩基塩と全く同じであり、この水素結合ネットワークが塩結晶生成に重要な役割を果していることが強く示唆される。さらに、上述の2つのジアステレオマー塩形成によってそれぞれのアミンが極めて効率よく光学分割できるのは、カラム間にマンデル酸の水酸基と隣接カラム中のマンデル酸のカルボニルとの水素結合があり、これによってより堅固なパッキングが可能であるためと結論した。次に、ラセミ混合物結晶の構造相関に関して提案した仮説を検証するため、1-フェニルエチルアミン・2-メチル-3-フェニルプロペン酸(α-メチルケイ皮酸)塩を調製したところ、予期したように、この結晶はラセミ混合物であることが分かった。さらに、従前の1-フェニルエチルアミン・ケイ皮酸塩および1-(4-イソプロピルフェニル)エチルアミン・ケイ皮酸塩のX線結晶構造解析結果を参考に構造相関に関する仮説に基づいて、1-フェニルエチルアミンのフェニル基は水素結合ユニット平面の方向を向くと予想した。そこで、この塩のX線結晶構造解析を行なったところ、予想通りの配置をとっていることが明らかとなった。以上の結果は、我々の提案したラセミ混合物結晶の構造相関に関する仮説が妥当であることを示している。

キラルアミンはアキラルなカルボン酸との塩に導くことによりラセミ混合物として結晶化する場合がある。本研究はその要因の解明とラセミ混合物化させるための指針の確立を目的とする。そのため,カルボン酸第-アンモニウム塩の結晶構造解析を広範に行い,ラセミ混合物結晶に特有な構造的普遍性の抽出を試みた。その結果,多くの場合カルボン酸とアミンは水素結合ネットワークにより成り立つカラムを形成し,塩の結晶はそのカラムの集合体となっていることが明らかとなった。このカラムは大別すると2回らせん軸を持つものと対称心を持つものの二通りの様式に分類できる。ジアステレオマー塩(光学活性体),ラセミ混合物塩では当然前者の様式しか存在しないが,アキラル塩,ラセミ化合物塩では両者がほぼ拮抗する確率で出現する。すなわち,ラセミ化合物塩にはカラムそのものがラセミ体である場合と,一本のカラムは光学活性であるが,逆の符号のカラムと1:1でパッキングするために全体としてラセミ体となる二種類の結晶構造が存在することを見出した。以上を総合すると,ラセミ体の塩では,結晶化の際形成されるカラムが対称心型の場合必然的にラセミ化合物塩になり,また,2回らせん型の場合ラセミ混合物になるかラセミ化合物になるかは同符号および異符号のカラム同士のパッキングポテンシャルの大小によって決定される。これを支配するのはカラムの外形とカラム間に働くvan der Waals力であり,分子力学法などの計算化学的手法によりある程度の予測は可能であると考えられる。以上のように,キラルアミンがアキラルなカルボン酸との塩に導くことによりラセミ混合物を形成しやすくなるのは,光学活性な2回らせん型のカラムをかなりの高確率で形成することが第一の要因であることが判明した。さらに計算化学的手法を利用するラセミ混合物化の予測に関する検討は今後の課題である。
複合材料用単結晶セルロ-スフイラ-の製造

1.複合材料化試験:バクテリアセルロ-ス(BC)の膜およびミクロフィブリル(MF)化したものに、疎水性マトリックスポリマ-との親和性を与えるために、各種の修飾っをおない複合化した。最も良い結果を示したのはステアリン酸エテル化したものをエポキシ樹脂で複合したもので、比重標準化の引っ張り強度は、樹脂のみの時を1.0とした時、無処理BC膜を12%フィラ-として含む複合材では2.0、置換度2にエステル化しものを13%含むものでは3.5であった。2.BC生産菌の低コスト培養法:バイオマス酵素糖化液をそのまま培養液として用いるための基礎実験をおこなった。グルコ-スにマンノ-スとガラクト-スが適当量加わると、BCの生産量が増加する。しかし培養液の単糖成分として単独に加えた場合はこれらの生産性は低く、代謝系についての一層の解明の重要性が示唆された。糖化液中の分解酵素セルラ-ゼの熱変成物がBC生産性を約2倍と、著しく高めることを見いだした。セルラ-ゼは複合酵素なので分離して試験した。βグルコシダ-ゼの寄与が最も高く、セロビオ-スの分解にかかわるこの酵素の寄与は、この合成促進効果が二つのグルコ-スを定位置に固定して連結を容易にすることを示唆した。セルロ-ス生産菌のセルロ-ス合成遺伝子組み替えによる大量培養を目的に、大腸菌への宿主ーベクタ-系PUF106(4.8KB)を開発した。これは生産菌のプラスミドであるPFF6(2.1K)と大腸菌からのPUC18(2.7K)を連結したもので、外来DNA断片の挿入に適し、形質転換効率も10^4個以上/μgと高かった。3.セルロ-ス誘導体の新合成法:修飾反応の研究において、トシルクロライド/有機酸orその塩/ピリジンorDMF系による新エステル化を開発した。特殊な酸のエステル化に極めて有効である。1.セルロ-ス膜のミクロフィブリル化:セルロ-ス膜は水中で形成されるにもかかわらず、ミクロフィブリル間の水素結合が強く、ミクロフィブリル表面不均一反応と溶剤処理によるミクロフィブリル分散は不十分なものに終わった。そこでネバ-ドライの膜をホモジナイザ-で機械的に分散させた。また生成短時間の薄膜を凍結乾燥させ、これに樹脂を含浸、積層させて複合材料にした。この方法ではミクロフィブリルが特定結晶面(水素結合面)で接合しているため、この結晶面が材料表面に面配向することになり、物性上の利点が得られた。2.ミクロフィブリルの表面修飾:セルロ-スをトシルクロライド、各種有機酸およびDMFまたはピリジンで反応させ、表面エステル化に成功した。浸透律速を強調し表面反応にするには非膨潤第三溶媒による希釈およびトシルクロライドと有機酸のモル比を等モル関係からずらすことが望ましいことがわかった。また表面シヤノエチル化反応にも成功。3.セルロ-ス生産菌の遺伝子組換による大量培養:セルロ-合成遺伝子のクロ-ニング用の宿主ーベクタ-系PUF106(4.8KB)を開発した。これは酢酸菌のプラスミドであるPFF6(2.1K)と大腸菌からのPUC18(2.7K)を連結して作成した。この系は外来DNA断片の挿入に適していた。

またこの系は1ug当たり10^4個以上の形質転換効率を持ち実用水準にある。4.低コスト培養液の開発:バイオマスの酵素糖化液をそのまま培養液として利用するための各種条件を検討した。糖化液はグルコ-ス以外の単糖を含むが、ある糖構成比において純グルコ-スの場合よりかえって生産性が高くなることがわかった。望ましい糖構成比はGLC:MAN:GAL=25:1:0.1ー0.6であった、糖化液はおおよそこの構成比を持つ。また糖化液中に含まれる熱変性を受けたセルラ-ゼの存在が、含まないものの10倍も生産性を向上させることが見出された。1.複合材料化試験:バクテリアセルロ-ス(BC)の膜およびミクロフィブリル(MF)化したものに、疏水性マトリックスポリマ-との親和性を与えるために、ベンジル化、トシル化、ステアリン酸化等のエステル化と、メタクリル酸メチル(MMA)、スチレン、アクロニトリル等のグラフト化をおこなった。マトリックスポリマ-にはエポキシ樹脂ポリアクロニトリルを用いた。最も良い結果を示したのはステアリン酸化したものをエポキシ樹脂で複合したもので、比重標準化の引っ張り強度は、樹脂のみの時を1.0とした時、無処理BC膜を12%フィラ-として含む複合材では2.0、置換度2にエステル化したものを13%含むものでは3.5であり、修飾の効果を顕著に示した。MMA化したMF化BCとエポキシ樹脂の系では、無処理物に較べMMA化で50%の強度増があった。2.BC生産菌の低コスト培養法:バイオマス酵素糖化液をそのまま培養液として用いるための基礎実験をおこなった。グルコ-スにマンノ-スとガラクト-スが適当量加わると、BCの生産量が増加する。しかし培養液の単糖成分として単独に加えた場合はこれらの生産性は低く、一方フラクト-ス、マンニト-ルでは、菌種にもよるがグルコ-スに匹敵する生産性を示し、代謝系についての一層の解明の重要性が示唆された。糖化液中の分解酵素セルラ-ゼの熱変成物がBC生産性を著しく高めるが、セルラ-ゼは複合酵素なので、イオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィ-で分離して有効部分を検索した。その結果βオキシダ-ゼの寄与が最も高く、セロビオ-スの分解にかかわるこの酵素の寄与は、この合成促進効果が二つのグルコ-スを定位置に固定して連結を容易にすることによるとの予測を支援した。
Lowe症候群の病因に関する生化学的研究

重篤な遺伝性疾患であり、わが国を含めて全世界に相当数の患者が発生しているLOWE症候群について全世界で唯一の本格的な分子生物学的病因解明研究を行なってきた。患者の皮膚繊維芽細胞を用いた生化学的研究から本症患者細胞ではグリコサミノグリカン代謝、とくに硫酸化に異常が見出された。この異常は硫酸基の供与体である活性硫酸(PAPS)の細胞内濃度が、これを分解するヌクレオチドピロホスファタ-ゼ(NPPア-ゼ)の活性の昂進によって著しく低下するためであることが明らかとなり、本症の生化学的病因はNPPア-ゼ活性昂進の機作を解明することによって明らかになると推定された。NPPア-ゼは、従来から知られている、ホスホジエステラ-ゼIと同種のものである。ヒト胎盤から、単クロ-ン抗体の使用を含む、効率的な精製法によってNPPア-ゼは均一状態にまで精製された。抗体を用いる解析によって、患者細胞では、正常細胞と同じ酵素タンパク質が活性に比例して増量していることが分った。酵素タンパク質量の増加の原因を遺伝子レベル、転写、翻訳のレベルで明らかにするため、先ず患者繊維芽細胞を用いて酵素タンパク質に対応するcDNAの作成を行なった。その5′末端をさらに上流に延長して酵素タンパク質の全領域をカバ-するcDNAの塩基配列を決定した。N末端部で膜を貫通し、C末端の広い範囲に亘って糖鎖を有するという特徴をもつ、酵素タンパク質の一次構造が明らかとなった。cDNAを用いてmRNAを解析したところ、患者細胞では正常細胞に比べてmRNA量が多かった。N末端部分からさらに上流の遺伝子構造を明らかにするため、cDNAのほか、ゲノムDNAを単離して解析を進めている。本症が伴性劣性遺伝であることから、cDNAを用いてNPPア-ゼの染色体局在性を調べているところである。われわれはすでにLowe症候群の皮膚繊維芽細胞が正常者に比して10倍以上の高いヌクレオチドピロホスファターゼ活性を有することを明らかにしている。その原因を解明することによって本症の原因が明らかにされると考え、以下のような実験を行った。先ず、ヒト胎盤のヌクレオチドピロホスファターゼを精製し、酵素化学的諸性質を明らかにすると同時に、これに対する抗体を調製して、培養皮膚繊維芽細胞のヌクレオチドピロホスファターゼの解析に用いた。酵素の精製には、粗製標品を抗原として作製した単クローン抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーが極めて有効であった。精製標品は130Kのモノマーより成る糖タンパク質であった。その糖鎖構造の解析のために、他の糖タンパク質を用いて、糖鎖構造解析のためのNMRを用いる超微量分析の諸条件に検討を加えた。精製酵素およびその変性標品に対する多クローン抗体を作製した。未変性標品に対する抗体を用い、精製胎盤酵素を標準標品として、繊維芽細胞のヌクレオチドピロホスファターゼの酵素タンパク量および比活性を求めた。その結果、Lowe症候群に於ては、比活性を同じくする酵素が多量に存在することが明らかになった。次に、変性酵素に対する抗体を用いて、患者および正常者の培養皮膚繊維芽細胞のヌクレオチドピロホスファターゼのゲル電気泳動上の挙動をウエスタンブロッティング法によって解析し、患者と正常者の酵素に関して電気泳動上差異の無いことを明らかにすることができた。これらの知見から、Lowe症候群に於ては何らかの原因により、多量のヌクレオチドピロホスファターゼが合成されていると結論した。その機作としては、転写、あるいは翻訳レベルでの何らかの変異が考えられる。現在、遺伝子レベルでの解明を進めている。

Lowe症候群に於てはヌクレオチドピロホスファターゼ活性が異常に昴進していること,また,二の昴進が酵素タンパク量に比例していることは前年度までの研究で明らかにされている.本年度は酵素タンパク量の増大の原因を明らかにするために,本酵素の遺伝子レベルでの解析を行った.先ず,ヒト胎盤から均一状態に精製したヌクレオチドピロホスファターゼをピリジルエチル化したのち,リジルエンドペプチダーゼで分解し,分解産物を高速液体クロマトグラフィーで分画した. 51個のピークが観察され,そのうち14個が均一であった.これらのペプチドのアミノ酸配列を決定したのち,プローブとして適当と思われるものを選び,対応する合成デオキシリボヌクレオチドを調製した.一方,患者皮膚より得た線維芽細胞を培養し,mRNA画分を調製し,これより平滑末端をもつ2本鎖DNAを調製した.これをメチル化したのち,EcoRIリンカーに継ぎ,さらにλgt11に結合させた.これを大腸菌(Y1090γ株)に感染させ,増殖したコロニーを上記の合成プローブを用いてスクリーニングした.その結果,プローブとして用いた18マー,23マー,26マーとハイブリダイズする計8個のクローンを得た.そのうち,23マーとハイブリダイズしたクローン,λhー5とλhー6は約3kbのcDNAインサートを含み,両者のcDNAインサートのサイズは僅かながら異っていた.18マーとハイブリダイズした2つのクローン,λhー7とλhー8のうち前者は約2kbのcDNAインサートを含んでいた. λhー8のインサート,および,26マーとハイブリダイズする4つのクローンの独立性,インサートの大きさについては現在解析中である.今後,得られたクローンのインサートcDNAのヌクレオチド配列を決定する計画である.Lowe症候群に於てはヌクレオチドピロホスファターゼ活性が異常に亢進していること、また、この亢進が酵素タンパク量に比例していることは既に明らかにした。本年度は酵素タンパク量の増大の原因を明らかにするために前年度に引き続き遺伝子レベルでの解析を行ない、本酵素のmRNAの構造を明らかにした。構造解析に用いたcDNAは患者繊維芽細胞のポリ(A)^+RNAを鋳型とし、オリゴdTをプライマーとして合成したが、全翻訳領域をコードするクローンを得ることができなかった。そこでプライマー伸長法により、さらにmRNAの5′ー末端測に対応するcDNAクローンを得て、合せて3.5KbのcDNAのヌクレオチド配列を決定した。得られた配列は925残基のアミノ酸をコードするオープンリーディングフレームを含んでいたが、これは分子量約10万5千のタンパク質に相当する。この値はヒト胎盤のヌクレオチドピロホスファターゼのポリペプチド鎖部分の分子量とよく一致している。ヌクレオチド配列の解析から酵素タンパク質の構造上の特徴のいくつかが明らかとなった。先ず、本酵素は膜タンパク質であるにもかかわらず、N末端の先導配列が存在しない。また、膜結合部分はC末端側にはなく、N末端近くに存在していた。この酵素にはNーグリコシド型糖鎖結合可能部位が10ケ所存在するが、いずれも膜結合部よりC末端側に存在していた。従って、本酵素は膜上ではN末端を細胞質側に向け、C末端を細胞の外に向けているものと考えられる。
新規クローズドコロニー系統メダカを用いた不安様行動における個性の分子神経基盤解析

オープンフィールドテストは様々な動物種で不安様行動における個性の定量に用いられているが、当該個性の創発に必要な遺伝子同定には至っていない。本研究では、共に西瀬戸内地方生まれであり、遺伝的には近いにもかかわらず、オープンフィールドテストにおいては逆の行動を示す2種類のメダカを用いて、行動の違いをもたらす遺伝子を捜索する。本研究により、不安様行動における個性を決定するメカニズムを明らかになることが期待される。
ドイツの教育の個別化に関する実証的研究‐教育の標準化と子どもの多様性の観点から‐

本研究はドイツにおける教育の「個別化」について、教育政策とその理論的背景、教育実践を検証することを目的にしており、平成30年度は、移民を含めた多様な子どもへの支援について、より具体的な実践を把握するために、特に「個別支援」に力点をおいている教育機関や学校の訪問調査を行った。2018年9月には、フランクフルト大学教育学部にある「個別支援オフィスArbeitsstelle fuer Diversitaet und Unterrichtsentwicklung - Didaktische Werkstatt (Didaktischen Werkstatt zur individuellen Foerderung)」を訪問し、インタビュー調査を行うことにより、教員のための「個別支援」に関する研修や助言の具体的な活動を把握することができた。また、昨年の調査で訪問したバーデン・ヴュルテンベルク州学校開発研究所の紹介により、基礎学校と中等教育段階を合わせた学校であるElise vonKoenig Gemeinschaftsschuleを訪問し、インタビュー調査と授業見学を行った。さらに、2019年3月にはビーレフェルト大学を訪問し、インクルージョンと個別支援に関する理論的な枠組みについて助言を得ることができた。また、ビーレフェルト大学附属実験学校を訪問し参与観察を行うとともに、個別支援の実態についてインタビュー調査を行った。さらに、近隣の基礎学校と中等教育段階を合わせた学校であるGesamtschule Aspe Bad Salzuflenにおいて、移民の子どもの教育現場を参与観察し、具体的な支援の在り方について検証した。このように教育の「個別化」という観点から、多様な子どもの教育の実態把握が進めば、今後の日本の教育を考える上でも示唆深いと思われる。平成30年度は本研究の2年目にあたり、前年の海外調査の結果を踏まえて、「個別支援」の理論的背景を再検討し、かつ調査の設計を必要に応じて修正し、移民を含めた低学力層や特別なニーズのある子どもへの教育実践を調査するとともに、教育の「個別化」を具体的に把握することを目的にして調査を行った。理論的背景については、ビーレフェルト大学の専門家との話し合いのなかで、個別支援の理論的背景にインクルーシブ教育が関連していること及び、ドイツにおいてその理論がどのように具体化してきたのか知見を得ることができた。また、教育実践については、バーデン・ヴュルテンベルク州、ノルトライン・ヴェストファーレン州の学校において、移民や特別なニーズのある子どもが多く在籍する教育現場を訪れ、参与観察を行うとともに教員にインタビュー調査を行うことで、教育実践や学習方法等における教育の「個別化」の実態について把握することができた。さらに、学校実践をささえるための研修や助言を行う「個別支援オフィス」を訪問調査することで、「個別支援」の研修や、専門家と教員のネットワークの広がりを把握することができた。以上のように、「個別支援」の理論的背景や教育実践についての把握が進め。当初の目的を達成したと判断できる。本研究の今後の推進方策に関しては、昨年度に引き続きドイツの教育の「個別化」に関連する資料・文献を収集整理し、その分析を行うとともに、移民を含めた多様な子どもに対する「個別支援」に焦点を合わせ、「個別支援」に関わる教育課題がどのように議論され実践に結びついているのか、インクルージョンの理論や実践との関連について調査を実施する。また、教員養成や教師教育において「個別支援」がどのような理念や実践として教授されているのか、引き続き教員養成機関の資料や文献を収集整理するとともに、教員養成機関や研修機関において海外調査を行う。次年度は本研究の最終年度であるため、本研究で得られた知見をまとめて比較教育学会等で発表する。本研究は、PISA以降、教育スタンダードや全国学力調査の導入など「教育の標準化」が進む一方で、児童・生徒の多様化(移民背景や低い社会・経済的背景、特別なニーズのある子ども)が進んでいるドイツにおいて、教育スタンダードに裏打ちされた「コンピテンシー志向」のカリキュラムと、多様性に応じた教育の「個別化」はどのように捉えられ、具体化されているのか、その理論的枠組みや教育政策について、また学校教育実践において検証するものである。平成29年度の調査では、ドイツの教育の「コンピテンシー志向」や「個別化」に関す教育理念や教育実践に関する文献調査及び、子どもの多様性に関する教育理念やインクルーシブに関する文献・資料の収集を行い、それがどのように教育政策に反映しているのか、バーデン・ヴュルテンベルク州の公的教育機関でのインタビュー調査を実施した。具体的には、ドイツ国際教育研究所(Deutsches Institut fuer Internationale Paedagogische Forschung)において、ドイツにおける教育の「個別化」と子どもの「多様性」に関する文献収集と文献調査を行うとともに、公的機関における教育政策を検証するためにバーデン・ヴュルテンベルク州の学校開発研究所(Das Landesinstitut fuer Schulentwicklung)を訪問し、Dr. Ulrike Philipps氏等へのインタビュー調査を実施した。バーデン・ヴュルテンベルク州においては、学校開発研究所を中心に「コンピテンシー志向」と「個別支援」に焦点をあわせた学習が模索されており、教師教育にも影響を与えていることがわかった。本研究は、教育スタンダードに裏打ちされた「コンピテンシー志向」のカリキュラムと、多様性に応じた教育の「個別化」の関連を明らかにし、その理論的枠組みや教育政策について、また学校教育実践において具体的に検証するものであるが、初年度においては理論的枠組みや教育政策について文献調査を行うととともに、公的機関を訪れインタビュー調査を実施することを目的にしていた。ドイツ国際教育研究所での文献調査及びバーデン・ヴュルテンベルク州の学校開発研究所において教育政策についてのインタビュー調査を行うことで、「コンピテンシー志向」と、多様性に応じた「個別支援」が教育政策の核として重視されていることがわかり、初年度の目的がおおよそ達成されたと判断される。

本研究はドイツにおける教育の「個別化」について、教育政策とその理論的背景、教育実践を検証することを目的にしており、平成30年度は、移民を含めた多様な子どもへの支援について、より具体的な実践を把握するために、特に「個別支援」に力点をおいている教育機関や学校の訪問調査を行った。2018年9月には、フランクフルト大学教育学部にある「個別支援オフィスArbeitsstelle fuer Diversitaet und Unterrichtsentwicklung - Didaktische Werkstatt (Didaktischen Werkstatt zur individuellen Foerderung)」を訪問し、インタビュー調査を行うことにより、教員のための「個別支援」に関する研修や助言の具体的な活動を把握することができた。また、昨年の調査で訪問したバーデン・ヴュルテンベルク州学校開発研究所の紹介により、基礎学校と中等教育段階を合わせた学校であるElise vonKoenig Gemeinschaftsschuleを訪問し、インタビュー調査と授業見学を行った。さらに、2019年3月にはビーレフェルト大学を訪問し、インクルージョンと個別支援に関する理論的な枠組みについて助言を得ることができた。また、ビーレフェルト大学附属実験学校を訪問し参与観察を行うとともに、個別支援の実態についてインタビュー調査を行った。さらに、近隣の基礎学校と中等教育段階を合わせた学校であるGesamtschule Aspe Bad Salzuflenにおいて、移民の子どもの教育現場を参与観察し、具体的な支援の在り方について検証した。このように教育の「個別化」という観点から、多様な子どもの教育の実態把握が進めば、今後の日本の教育を考える上でも示唆深いと思われる。平成30年度は本研究の2年目にあたり、前年の海外調査の結果を踏まえて、「個別支援」の理論的背景を再検討し、かつ調査の設計を必要に応じて修正し、移民を含めた低学力層や特別なニーズのある子どもへの教育実践を調査するとともに、教育の「個別化」を具体的に把握することを目的にして調査を行った。理論的背景については、ビーレフェルト大学の専門家との話し合いのなかで、個別支援の理論的背景にインクルーシブ教育が関連していること及び、ドイツにおいてその理論がどのように具体化してきたのか知見を得ることができた。
食品・医薬品における副作用の予防:ヒトABCトランスポーター遺伝子多型の機能解析

ヒトの小腸に発現しているABCG2は生体異物の体内侵入を阻止する防御システムの1つである。植物性クロロフィルの代謝物フェオフォルバイドaが小腸から吸収されて血液循環系に侵入すると光線過敏症の症状を引き起こすが、正常人ではABCG2がその侵入に対する防御機能を果たしている。フェオフォルバイドaとABCG2を阻害する化合物とを同時に摂取した場合、光線過敏症のリスクが高まると考えられる。本研究では、ABCG2と光線過敏症の因果関係の解明と光線過敏症のリスクを予測するシステムの確立を目的としている。初年度は、ABCG2の輸送阻害スクリーニング系及び光毒性アッセイ系の確立を行い、2年目は、この評価系を用いて様々な化合物・薬物を試験し、ABCG2の阻害に関与する化合物・薬物に共通する化学構造因子を見出した。3年目となる当該年度は、ABCG2と光線過敏症の因果関係について、臨床レベルでの解明を目的として研究を行った。ABCG2と光線過敏症の因果関係を臨床的に解明する手始めとして、遺伝性ポルフィリン症患者とその家族のABCG2 cDNAのシークエンス解析に焦点を絞った。前年度に、ABCG2 cDNAのシークエンス解析のためのプライマーのデザイン、シークエンス条件の検討を行い、ABCG2 cDNAの増幅、シークエンス解析に最適なプライマーを設計した。本年度は、これらのプライマーを用いて、遺伝性ポルフィリン症患者とその家族のABCG2 cDNAのシークエンス解析を行った。解析の結果、臨床サンプルの中で、ABCG2タンパク質の発現量が野生型の約半分に低下する一塩基多型(SNP ; single nucleotide polymorphism)を発見した。このポルフィリン症患者では、ポルフィリンの排出を担うABCG2タンパク質の存在量が野生型に比べ有意に減少しているために、重篤なポルフィリン症を引き起こしたと推測される。今後、この患者のゲノムを用いて更なる確証を得る必要があるが、遺伝性ポルフィリン症の発症や症状の重篤度の個人差の一因としてABCG2の遺伝子多型が関与している可能性を裏付ける結果となった。当該年度は、ABCG2の輸送阻害スクリーニング系及び光毒性アッセイ系の確立を行った。Sf9細胞膜ベジクルを用いたポルフィリン輸送阻害スクリーニング系まず、ABCG2のポルフィリン輸送阻害スクリーニング系を開発した。ヒトABCG2を発現させたSf9昆虫細胞から形質膜ベジクルを調整し、ABCG2依存のポルフィリン輸送量を測定した。測定の結果、イマチニブ、ケルセチン、ノボビオシンはABCG2のポルフィリン輸送を強く阻害した。哺乳類細胞を用いた光毒性アッセイ系次に、ポルフィリン輸送を強く阻害した化合物の光毒性を細胞レベルで検証するため、哺乳類細胞を用いたアッセイ系を構築した。ABCG2発現HEK293細胞にフェオフォルバイドaを添加して暗室で培養し、光を照射した。細胞生存率はMTTアッセイにより評価した。ABCG2発現細胞はフェオフォルバイドa依存の光毒性に耐性を示したが、イマチニブ、ノボビオシン存在下では光感受性が有意に増強した。イマチニブとノボビオシンはそれ自体では光毒性を示さないが、ABCG2を阻害することにより結果的に光線過敏のリスクを上昇させることが示唆された(Drug Metab Pharmacokinet,22(6),428-440,2007)。初年度は、ABCG2の輸送阻害スクリーニング系及び光毒性アッセイ系の確立を行った。2年目となる当該年度は、この評価系を用いて様々な化合物・薬物を試験し、ABCG2の阻害に関与する化合物・薬物に共通する化学構造因子を見出すことを目的として以下の項目を行った。ABCG2ポルフィリン輪送を阻害し、光毒性のリスクを上昇させるCDK inhibiorの構造的特徴の解析今回試験した5種類のCDK inhibitorは、化学式は類似しているが、ABCG2の阻害活性には相違が見られた。分子軌道計算による3D構造解析の結果、より平面構造をとりやすいCDK inhibitorほど、ABCG2のポルフィリン輸送を強く阻害することが明らかとなった(Pharm Res.26(2),449-458,2009)。遺伝性ポルフィリン症患者のABCG2 cDNAシークエンス解析用プライマー検討