hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
５－ブロモウラシルを用いたＤＮＡ内電子移動のｉｎ　ｖｉｖｏ検知手法の確立

申請者が所属する研究室ではDNA鎖に5-ブロモウラシル(以下BrU)を組み込み、DNA内電子移動の検知やDNA-タンパク質相互作用の研究を行っている。BrUは電子移動によって還元されウラシルラジカルを生じるため、申請者は紫外線照射によって誘起されたDNA内電子移動をウラシルラジカルからの生成物(主にウラシル)として検知してきた。申請者は今年度の研究においてBrUを用いたDNA-タンパク質相互作用の解析に主眼を置き、ミトコンドリアのTFAMとDNAの相互作用を検討した。TFAMはミトコンドリアのDNAパッキングタンパク質であり、ミトコンドリアDNAの転写、複製、安定性付与に関わっている。TFAMとDNAの結晶構造は解析されておりTFAM中のいくつかの芳香族アミノ酸がDNAと近接することが報告されている。芳香族アミノ酸への光照射はDNAへの電子移動を誘起するため、申請者はBrUを含んだDNAとリコンビナントTFAMを用意しこれらの複合体を用いてTFAM-DNA間の電子移動を検討した。実験の結果、TFAMは配列非依存的にDNAと結合し光照射によって電子移動を起こすことが判明した。またDNA内電子移動は光損傷塩基、チミンダイマーの修復に関わることから、TFAMからの電子移動によるチミンダイマーの光修復を検討したところわずかながら修復効率の向上が確認された。ミトコンドリアにおけるチミンダイマーの修復経路はよくわかっておらずヌクレオチド除去修復は否定されている。本研究の結果からTFAMがチミンダイマーの修復を行っており、これによりミトコンドリアDNAの安定性に関与していることが示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。申請者はこれまで数百bp程度のDNAで行われてきたBrUによる電子移動検知を、ゲノムDNA(以下gDNA)で行うことを試みている。これにより生体機能にかかわる重要なDNA内電子移動の検知や細胞レベルでのDNA-タンパク質相互作用の確認ができるようになると期待される。申請者はgDNA中のウラシルを化学修飾し、精製した後にNGSで解析することでウラシル塩基生成部位の特定を行った。ウラシルの化学修飾はサンプルをUracil DNA Glycosylase(以下UDG)とAldehyde reactive probe(以下ARP)で処理しウラシル部位を選択的にビオチン化することで達成した。BrU置換gDNAに紫外線を照射しUDGとARP処理の後にビオチン化DNAの精製を行うと、紫外線照射を行わなかったgDNAと比べて有意にDNAが回収でき、これをNGSで解析するとgDNAの特定領域のDNAが高効率で回収されたことが判明した。モチーフ解析を行うとこれらの領域には5'-dCBrUBrUABrU(G/C)-3'という配列が含まれていることがわかった。興味深いことにあらかじめ断片化したDNAに紫外線照射を行った場合この配列は確認できず、またこの配列を含む8 bpのDNAオリゴでも際立ったウラシルラジカルの生成が確認できなかったことから、DNA鎖のねじれによる高次のらせん構造などgDNA特有の構造依存的なウラシルラジカル生成であることが予想される。申請時の計画では1年目においてBrU置換gDNAの調製、BrUが取り込まれないgDNA領域の特定およびgDNA中のウラシル生成部位特定方法の確立を目標とした。申請者はチミンの合成経路を欠損した大腸菌変異株HL946株にBrUを加えて培養し抽出することでチミンの80%がBrUで置換されたgDNAを得ることに成功した。またgDNA中のウラシル生成部位の特定に関してもウラシルをUDGによって除去してAP siteを生成し、これをARPで処理することによりビオチン化修飾を施し、NGSによるChem-seqで解析することで達成した。BrUが取り込まれない領域の特定に関しては達成されていないもののすでにBrUに対する抗体は用意しておりChIP-seqで解析をすることにより特定の目途はたっている。以上から目標はどれも達成、もしくは達成の目途が立っている状態であり、これらを踏まえて申請者の研究の現在までの進捗状況はおおむね順調に進展しているといえる。昨年度申請者はgDNA中5'-dCBrUBrUABrU(G/C)-3'という配列が高い光感受性を示しウラシルラジカルの生成が促進されることを示唆する結果を得た。この配列をputative sequenceと仮称する。この配列はあらかじめ断片化したgDNAにおいてはウラシルラジカルを効率的に生じなかったため、gDNAの負の超らせん構造下において光感受性を示すと仮定した。

同じ負の超らせん構造を示すものとしてDNAがヒストン八量体に巻き付いたヌクレオソームが挙げられる。このため申請者はputativesequenceを含んだDNAを用いてヌクレオソームを再構成し、光感受性を観察した。残念ながらヌクレオソーム中に挿入したputative sequenceは際立った光感受性は示さなかったが、一方でヌクレオソームから外れたlinker部分においては光感受性を示した。興味深いことにこの配列は直鎖状DNAにおいては全く光感受性を示さなかったが、linker部分においては高い光感受性を示しており、ヌクレオソーム構造がなんらかの影響を及ぼしていることが示唆された。申請者は2年目においてウラシルラジカルを生じたDNA領域の選択的な化学修飾とこれによるDNA断片の精製手法の検討、並びに次世代シーケンサーによるgDNA中のウラシルラジカル生成部位の特定を計画していた。現時点において申請者はラジカルから生じたウラシルをuracil DNA glycosylaseによってAPサイトへと誘導し、これをaldehyde reactiveprobeと反応させることで選択的なビオチン化修飾に成功している。またビオチン化したDNA断片をアビジンビーズで回収し次世代シーケンサーで解析することにより構造依存的に光感受性を示すputative sequenceの発見に至った。ヌクレオソームを利用したputative sequenceの特性検討については十分に考察が進められていない部分もあるが、研究はおおむね順調に進展している。これとは別に申請者はヌクレオソームに関連する派生研究を開始した。エピジェネティクスの観点から翻訳語修飾を受けたヒストン-DNAの複合体が注目を集める一方でsubnucleosomal particleと呼ばれる組み立て途中のヒストン-DNA複合体の研究はそれほど進んでいない。putative sequenceの特性検討の際、申請者は大腸菌を用いてヒストンタンパクの大量生成を行った。この余剰のヒストンとDNAを用いて申請者はsubnucleosomal particleの再構成を行い、これまでほとんど報告されていないH3-H4八量体とDNAの複合体の単離精製に成功した。現在この複合体について複数の特性確認実験が進行中である。これらの成果を踏まえると申請者の現在までの進捗状況は当初の計画以上に進展していると言える。申請者が所属する研究室ではDNA鎖に5-ブロモウラシル(以下BrU)を組み込み、DNA内電子移動の検知やDNA-タンパク質相互作用の研究を行っている。BrUは電子移動によって還元されウラシルラジカルを生じるため、申請者は紫外線照射によって誘起されたDNA内電子移動をウラシルラジカルからの生成物(主にウラシル)として検知してきた。申請者は今年度の研究においてBrUを用いたDNA-タンパク質相互作用の解析に主眼を置き、ミトコンドリアのTFAMとDNAの相互作用を検討した。
小学校教員と保護者を対象とした小学校低学年からの科学啓発システムの構築

家庭ぐるみで科学に対する興味・関心を高め,地域における理科ボランティアを育成する「保護者啓発プログラム」と小学校教員の科学・実験「苦手意識緩和プログラム」開発を目的とした以下の試みを開始した.1.保護者啓発プログラムの開発近年,小学校低学年の児童への指導の機会や親子参加の企画が増えてきた.そこで科学啓発活動が家庭や地域に拡がることを期待し,保護者を指導者として養成し「出前おもしろ実験室」を開催した.・開催時に保護者数名に,実験方法,原理,安全の確認を指導・その保護者がスタッフとともに指導者となり「出前おもしろ実験室」を支援4回開催したが,保護者への依頼実験は好評であった.実施後のアンケートから,普段家庭で子どもたちと工作などをしている保護者は稀有であり,本機会を積極的に作っていくことの必要性を再認識した.2.小学校教員対象苦手意識緩和プログラム小学校教員の中には理科実験に対して苦手意識や恐怖感があるという意見を聞くこともあり,そのため授業に実験が行われる機会が減少することが危惧される.そこで,苦手意識を克服することを目的とした講習会を開催した.講習会内容:1.身近な材料を使った実験〈丹松〉2.授業に使える実験と技〈福井大淺原〉設定開催日のためか参加者は少なかった.小学校教員に休日出向く形式の講習会に参加を募ることは難しいことがわかった.しかし参加者の反応から,実施内容は,ちょっとした工夫で子どもたちに理科の楽しさを伝えられる小ネタの提供,気軽にできる実験の指導,授業案の提示など十分満足のいくものであった。今後,2つのプログラムを「小学生向け出前おもしろ実験室」とリンクさせることで,「出前」啓発活動をその場限りで終わらせない,効果的な科学啓発システムへ展開できると考えている.更に,小学校理科授業での実験・体験不足を補うことに寄与する切り札となるものと期待している.家庭ぐるみで科学に対する興味・関心を高め,地域における理科ボランティアを育成する「保護者啓発プログラム」と小学校教員の科学・実験「苦手意識緩和プログラム」開発を目的とした以下の試みを開始した.1.保護者啓発プログラムの開発近年,小学校低学年の児童への指導の機会や親子参加の企画が増えてきた.そこで科学啓発活動が家庭や地域に拡がることを期待し,保護者を指導者として養成し「出前おもしろ実験室」を開催した.・開催時に保護者数名に,実験方法,原理,安全の確認を指導・その保護者がスタッフとともに指導者となり「出前おもしろ実験室」を支援4回開催したが,保護者への依頼実験は好評であった.実施後のアンケートから,普段家庭で子どもたちと工作などをしている保護者は稀有であり,本機会を積極的に作っていくことの必要性を再認識した.2.小学校教員対象苦手意識緩和プログラム小学校教員の中には理科実験に対して苦手意識や恐怖感があるという意見を聞くこともあり,そのため授業に実験が行われる機会が減少することが危惧される.そこで,苦手意識を克服することを目的とした講習会を開催した.講習会内容:1.身近な材料を使った実験〈丹松〉2.授業に使える実験と技〈福井大淺原〉設定開催日のためか参加者は少なかった.小学校教員に休日出向く形式の講習会に参加を募ることは難しいことがわかった.しかし参加者の反応から,実施内容は,ちょっとした工夫で子どもたちに理科の楽しさを伝えられる小ネタの提供,気軽にできる実験の指導,授業案の提示など十分満足のいくものであった。今後,2つのプログラムを「小学生向け出前おもしろ実験室」とリンクさせることで,「出前」啓発活動をその場限りで終わらせない,効果的な科学啓発システムへ展開できると考えている.更に,小学校理科授業での実験・体験不足を補うことに寄与する切り札となるものと期待している.
行動科学と発達段階を考慮した子どもの食育と教材開発に関する研究

本研究は,行動科学の観点を取入れた子どもの食育の確立と普及を目指し,発達段階に応じた子どもの食行動の検討と食育の教育内容および教材の開発を目的に研究を進めてきた。特に,本研究の主目的である行動科学を取り入れた食育プログラムについては,幼児を対象とした偏食の改善プログラムと小学生を対象とした給食の食べ残しに関するプログラムを教材と共に開発し,研修会等を通じ,教材およびプログラムの普及啓発も行った。本研究は,行動科学の観点を取り入れた子どもの食育の確立と普及を目指し,発達段階に応じた子どもの食行動の検討と食育の教育内容・教材の開発を目的としている.平成24年度は,昨年度に開発した教材の普及啓発研究と今後の教材研究につながる基礎的研究を行った.1.普及啓発研究:(1)保育関係者を対象とした幼児期の偏食に関する教材研修会:研修会に参加した全員(27名)が行動科学を理解したと回答し,ほとんどの者が教材を『活用できる・したい』と回答した.(2)栄養教諭による紙芝居の実践:昨年度実施した研修会参加者11人が各自の勤務校の児童を対象に,紙芝居教材を用いて食べ残しの指導を行った.その結果,各校での指導の有用性が評価された.2.基礎的研究:(1)3色食品群の活用の現状:「赤黄緑の3色食品群」分類について,学校栄養士237人に調査を行った.その結果,ふだんの分類と,正しいと考える分類が一致している者の割合が低い食品は,こんにゃく,わかめ,こんぶ,のり,ひじき等であった.(2)学校給食の献立の主食の違いによる栄養提供量の比較:都内小学校16校から,収集した給食献立から,米飯食群,パン食群の2群のエネルギー量等を調べた.その結果,米飯食群はパン食群に比べ,食塩相当量,総野菜量,エネルギーに対する脂質比が少なく,魚が含まれる頻度が高かった.(3)小学生の野菜摂取に関連する知識と嗜好:小学4年生128人を対象に,野菜摂取に知識と嗜好のどちらが関連しているか検討した結果,知識では差はみられなかったが,300g以上の野菜摂取群で野菜を「好き」と回答する子どもが多かった.(4)中学における食の課題の現状:中学生の食に関する課題を質的に収集することを目的に,中学校に勤務する学校栄養士4人を対象にグループインタビューを行った.その結果,学校の問題として,環境,生徒,先生,給食のカテゴリが得られた.本研究は,行動科学の観点を取入れた子どもの食育の確立と普及を目指し,発達段階に応じた子どもの食行動の検討と食育の教育内容および教材の開発を目的に研究を進めてきた.平成23年度は,1)幼児が食事を食べたがらないとき,母親がとる方法を研究し,結果をもとにパネルシアターを作成した.2)小学校低学年の給食の食べ残しに関する紙芝居教材を作成し,実際小学校で実施し,教材の実施可能性を確認した.3)発達段階を考慮した栄養に関する教育の研究では,栄養に関する教育に用いる教材を調査し,3色食品群がよく使われていることを報告した.平成24年度は,開発した教材の普及啓発を行い,今後の教材研究につながる基礎的研究として,3色食品群の活用状況調査,献立別の栄養提供量の調査,野菜摂取に関わる要因の検討,中学校における食べ残しの研究を行った.平成25年度は,1)幼児の食事を楽しんでいる様子を捉えるための,「子どもが食事を楽しむ様子」尺度の開発を行った.2)高学年の児童を対象に,給食の適量に関する教材を開発した. 3) 3色食品群の研究については,小学校から提供された256食の給食から,各栄養素量に寄与する食品群を調べ,食品群の分け方には提供量を加味する必要があること,また,1つの食品でも複数の食品群の栄養素に寄与することを報告した.4)給食委員会の活用について,小中学校の学校栄養士を対象に,委員会の現状を調査し,給食委員会の活動には幅があり,さらなる活用の可能性を示唆した.3年間を通して,15本の論文と21演題の学会発表を行った.さらに,開発した教材も出版等を通じ,一般に入手可能な形にし,研究成果を社会に発信してきた.研究目的は概ね達成できた.食育では生涯通じて必要な知識とスキルを身に付ける必要がある.今後は子どもに限らず,成人を含め,間断ない食育プログラムの開発研究が必要である.本研究は,行動科学の観点を取入れた子どもの食育の確立と普及を目指し,発達段階に応じた子どもの食行動の検討と食育の教育内容および教材の開発を目的に研究を進めてきた。本研究では「栄養バランスの良い食事を適量とる」をテーマに,これに関連する幼児期から学童期までの子どもの食に関わる問題(たとえば,偏食,好き嫌い,食べ残しなど)を扱い,3つのテーマに分けて研究を進めている.初年度である平成23年度の各研究実績は以下のとおりである.テーマ1:食事場面において幼児が食べたがらないときに母親がとる方法の研究.これまでの研究結果から,子どもの偏食に関する教材(パネルシアター「ほねくんとやさいスープ」)を,行動科学に基づきを開発した.平成23年度は,母親を対象にパネルシアターを含むプログラムを実施した.

その結果,参加した母親を対象にアンケートを行った結果,「興味ある」,「わかりやすかった」教材の内容について肯定的な意見が得られた.テーマ2:小学校における給食の食べ残しに関する研究.平成22年度パイロット的に用いた学校給食の食べ残しに関する紙芝居教材を見直し,都内協力校において,対照群を設けた教育介入を行った.その結果,介入群において,10%有意確率で,残食率が有意に減少した.また,今年度は東京都の栄養教諭を対象に,紙芝居教材を用いた行動科学に基づいた食育の研修を行った.研修後の質問紙調査の結果,参加者の理解度,興味・関心,紙芝居教材を実践したいという意欲は高かった.テーマ3:発達段階を考慮した栄養に関する教育の研究.食物の栄養について教育することは重要であるが,発達段階を考慮した教育についての研究はされていない.平成23年度は栄養に関する教育の現状把握を行う目的で,東京都学校栄養職員を対象に,これまで行った栄養に関する教育を調査した.その結果,栄養に関する教育には三色食品群が最も用いられており,低学年においても実施されていることがわかった.平成24年度も複数の研究を実施し,学会・論文発表を行い研究成果を残し,おおむね順調に進展しているが,平成25年度を最終年度と考えると,若干の遅れは否めない.本研究では最終的に,食育キットと呼ばれる発達段階に応じた食育教材のセットを完成させることであるが,実際研究を始めると,教材のコンテンツとなる基礎的研究が少なく,平成24年度の半分は,教材の基礎的研究に費やした.平成25年度は,足りない基礎的研究を実施するとともに,教材開発の研究を進めたい.それまで進めてきた研究を継続して行ってきたため,平成23年度は初年度であったが計画通り進めることができた.研究費をいただいたおかげで,教材を印刷することができ,現場の栄養士の先生方からの教材活用に対する調査も実施できた.平成25年度は,平成24年度に実施した研究成果について,学会および論文発表を行い,さらに,各発達段階の研究を発展させ,系統立てた研究へと進展させる.1.幼児期の子どもの楽しい食事に関する研究:幼児期の食生活では,「楽しく」食べることが重視される.しかしながら,子どもが楽しんでいる様子を捉えることは難しく,研究が進んでいない.子どもが「楽しく食べる」様子を測る指標の検討を進める.さらに,偏食の継続について,縦断的データを用いて検討する.2.学校給食の食べ残しに関する研究:給食の食べ残しの研究は,これまで低学年を中心に行ってきた.この研究を,高学年,中学生といった発達段階を広げるとともに,食べ残しの要因にあがる給食献立や給食指導などの改善に向けて,研究をさらに発展させる.3.3色食品群の活用状況に関する研究:3色食品群の分類の妥当性を調べるため,今年度収集した学校給食の栄養提供量から,各栄養素量に寄与する食品群を調べる.さらに,献立表での3色食品群の分類について調べる.各研究テーマの今後の研究推進予定は以下のとおりである.テーマ1:食事場面において幼児が食べたがらないときに母親がとる方法の研究.平成23年度実施した実践の結果から,教材を見直し,教材を冊子の形にした.平成24年度はこれを用いて,幼稚園教諭,保育士,栄養士等を対象とした研修会を開催し,プログラムを普及させる予定である.プログラムを実施した実践者から実施報告書を回収し,プログラムに対する意見をまとめる.
廻国供養塔データベースの構築と分析

2年間にわたって全国の廻国供養塔データの収集に努め,最終的に6079件を収めるデータベースを作成した。情報源の主体は石造物調査報告書などの地域刊行物である。データはすべて一定のフォーマットでコンピュータに入力した。ファイルはCSV形式とした。以下,収録データの概要を記す。まず地域的分布は,東日本と西日本でほぼ3:2となっており,とくに関東とその周辺に稠密に分布している。年代的には,14世紀に出現し,16世紀にも若干の造立例がみられるものの,大半は18世紀から19世紀半ばの江戸時代中後期に造立されている。とくに18世紀初頭の大量出現は注目される。銘文から知られる造立目的は,(1)廻国成就の供養,(2)中供養,(3)死没廻国者の供養,(4)施宿・施行の供養,(5)廻国者による作善の供養,(6)道標,(7)六十六部納経所の勧請の7つである。「六十六部供養」「日本廻国供養」など典型的な銘文を刻む事例は原則的には(1)に属すと考えられ,最多を占める。このなかには,一字一石経や納経帳の埋納,造仏,勧進など,廻国供養の内容にかかわる情報を刻んだものもある。(2)は銘文に明記する事例は98にとどまるが,実質的にこれに属すものは(1)に次ぐ割合を占めるとみられる。(3)は150200例ほどで,通常の墓塔とみなしてよいものと,一種の願果たしのために廻国成就の供養塔に準じて立てられたものの2種がある。(4)も百数十例認められ,千人宿の慣行が知られる。(5)(6)はいずれも数十例あるが,独立した造塔ではなく,(1)や(2)のために造立された塔が(5)(6)を兼ねる事例が多い。(5)では架橋が半数以上を占めている。(7)は確実なものは1例のみである。検討の結果,収録データは,狭義の廻国供養塔((1)(2)および(3)の一部),広義の廻国供養塔(前記のものに(4)(5)を加える),関連石造物の3つの範疇に分けることが適当と考える。データベースは,これを機にすべて公開して利用に供する。これまで研究代表者および研究分担者のもとには約2000件の廻国供養塔データが蓄積されていたが、本年度はいまだデータの乏しかった地方、具体的には東北・東海・四国・九州を重点的に対象として資料の収集を図った。方法は、市町村史・文化財調査報告書等の刊行物の調査を主体とし、一部、市町村教育委員会などから未刊行資料の提供を受け、またごく限られた地域ではあるが実査もおこなった。その結果、約1000件の情報を入手し、データベースに追加した。追加されたデータ量は計画に比して十分なものとは言えないが、これは石造物調査の進捗および調査結果の公開状況に、府県ごと・地方ごとにかなり大きな懸隔があったためである。

徳島県・宮城県・山口県などは比較的調査が進んでおり、既存刊行物によって各県100件前後のデータが得られた。他方、北九州各県などは、精査にもかかわらず、入手しえたデータはごく少数にとどまった。ただ、情報の乏しいことがただちに廻国供養塔が少ないことを意味しないことは実査によっても確認しており、次年度は未刊行資料の収集も積極的に進めたい。収集データの本格的な分析は次年度の作業となるが、造立件数の推移などにはかなり明瞭な地域差が認められた。簡単に述べれば、東日本では近世中期のピークに比して後期はあきらかな衰退を示すの対して、西日本では中期のピークはむしろ小さく、反対に後期になっても衰えずに造立が続いている。また、後期の供養塔に願主行者以外の助力者が刻まれ、しかも彼らがしばしば複数の供養塔に重出することから六十六部廻国者の組織性の問題が浮上するのであるが、これもそうした現象が顕著な地域と、かなりの数の供養塔が確認されながら認めにくい地域とに分かれた。全国規模の巡礼ではあるが、その受容の地域性の問題も視野に入れてゆく必要があろう。昨年度までに研究代表者・研究分担者両名が収集した廻国供養塔データは、約3000件であった。今年度は、データ件数を当初計画(500010000件)にできる限り近づけ、また地域的な偏りを縮小することを目標に、継続して資料収集に努めた。方法としては、昨年度同様、各県立図書館などにおいて市町村史・文化財(石造物)調査報告書等を調査したほか、一部、現地の石造物研究者・民俗学研究者や市町村教育委員会などから未刊行の調査資料の提供を受けた。その結果、山形・新潟・神奈川・静岡・愛知・岐阜各県など、あらたに100300件のデータを入手できた県が数県あり、データ総数は5000を超える数に達した。もっとも、地域的偏差の完全な解消には至らず、概して東日本に厚く西日本に薄い結果となり、東西の比率は3:2となった。ことに、宮崎県を除く九州地方、北陸地方、東北地方北部については、本研究課題終了後もデータ収集を継続する必要を残した。5000件余のデータからは、まずその造立年代が特徴的な推移を示すことが指摘できる。すなわち全体の約97%が1700年以降1867年までの江戸時代中後期に属しており、ことに17101720年代という、本格的出現後まもない時期にほとんどピークに達するのは注目される。これは単に石造物造立の流行としてではなく、六十六部日本廻国という遍歴の様式そのものの消長として考察する必要がある。また、銘文の分析からは、数種の造立目的のうち廻国成就の供養が大半を占めることも確認された。廻国供養塔の総件数および造立年代とあわせみて、近世中後期の六十六部廻国成就者が相当数にのぼったことが知られる。このほか、地蔵信仰や阿弥陀信仰との結合、近世後期における女性廻国者の増加、助力者(すなわち廻国者ネットワーク)の存在等々、いくつもの論点が、廻国供養塔資料の集積によってはじめて浮上してきたと考える。
高選択的な分子識別能を有する固定化シクロデキストリン単分子膜の合成

シクロデキストリンはグルコースが68個環状に結合したオリゴ糖であり、空洞内に種々のゲスト化合物を取り込み包接化合物を形成する。シクロデキストリンの包接化合物の安定性は、ゲスト化合物の立体構造および化学構造を顕著に反映する。したがって、シクロデキストリンの超薄膜が合成できれば、有用なセンサ材料となることが期待される。本研究では、シクロデキストリン薄膜の合成方法を検討するとともに、薄膜中のシクロデキストリンの分子認識能を評価し、新規なセンサ材料を開発することを目的とする。今年度は、センサ材料開発のための基礎的知見を得る目的で、β-シクロデキストリンに種々の官能基を導入した修飾β-シクロデキストリンの、分子認識能ならびに単分子膜形成能に関して検討した。β-シクロデキストリンのすべての水酸基をアセチル基またはフェニルカルバモイル基で置換した修飾β-シクロデキストリンが、クロロホルム中で、2,4,6-トリニトロフェノールをはじめとする各種の有機酸の塩と錯体を形成することを見出した。錯体形成能の大きさは、有機酸塩のカチオン部分に顕著に依存し、【Ca^(2+)】>【Li^+】>【Ba^(2+)】>【Na^+】>【K^+】>【Cs^+】である。この序列は、18-クラウン-6の取り込みの順序(【Li^+】<【Na^+】<【Cs^+】)とは逆の順序になっている。すなわち、修飾シクロデキストリンが特異的な錯体形成能を有することが明らかになった。また、7個の一級水酸基をすべてドデシル基で置換した修飾β-シクロデキストリンが、水面展開法により、安定な単分子膜を形成することを見出した。シクロデキストリン一分子当たりの専有面積が約2.5n【m^2】であることより、単分子膜内で、シクロデキストリン分子は、その空洞の7回対称軸を水面に対してほぼ垂直に立てたコンホメーションを取っているものと推定される。
ミエリン異常ミュータントラットを用いたミエリン再生メカニズムの解明

本研究は,ミエリン再生メカニズムを明らかにする目的で,ミエリン異常ミュータントラットに対して,鼻粘膜由来の神経幹細胞を移植し,移植細胞の分化,分化因子の発現パターン,各種サイトカインの発現パターンを明らかにするとともに,ミエリン異常ミュータントラットにおけるグリア細胞動態,ミエリン関連遺伝子・蛋白の発現動態,各種サイトカインのミエリン病変発現への役割を解析した.PLPおよびPDGF-αRに対するプローブを用いたin situ hybridisation法を行った。mvおよび対照ラット間において,オリゴデンドロサイトおよびその前駆細胞数に明らかな差異は認められず,mvラットのミエリン病変は,ミエリン形成細胞の直接的障害ではない可能性が示唆された.mvラットの脊髄におけるミクログリア関連因子の発現動態を調べた.4,6週齢のmvラットにおいて,TGF-β1mRNA発現量の増加傾向が認められ,アストロサイト・ミクログリアの活性化と関連する変化と考えられた.6,10週齢のmvラットにおいて,iNOSのmRNAおよび蛋白の発現量が上昇した.iNOS発現の上昇は,活性化ミクログリアの出現時期と一致することから,ミクログリアの活性化と関連する変化と考えられた.mvラットにおけるミエリン関連遺伝子および蛋白の発現動態を調べた.PLP mRNAおよび蛋白の発現量は,4週齢から有意に低下した.MBP mRNA発現量は4,6週齢で低下傾向を示し,MBP蛋白発現量は10週齢で有意に低下した.CNP mRNA発現量は4,6週で低下傾向にあり,CNP蛋白発現量は4週齢で有意に低下した.ミエリン遺伝子および蛋白の発現量の低下は,mvラットにおけるオリゴデンドロサイトの機能異常を示唆し,発症メカニズムとして重要と考えられた.末梢神経再生における鼻粘膜由来の神経幹細胞の有用性を検討する目的で,ラットの坐骨神経切断モデルを作製し,ラットの鼻粘膜より分離した神経幹細胞を投与した.神経幹細胞移植群では,対照群に比べてより高頻度に神経再生が認められた.本研究は,ミエリン再生メカニズムを明らかにする目的で,ミエリン異常ミュータントラットに対して,鼻粘膜由来の神経幹細胞を移植し,移植細胞の分化,分化因子の発現パターン,各種サイトカインの発現パターンを明らかにするとともに,ミエリン異常ミュータントラットにおけるグリア細胞動態,ミエリン関連遺伝子・蛋白の発現動態,各種サイトカインのミエリン病変発現への役割を解析した.PLPおよびPDGF-αRに対するプローブを用いたin situ hybridisation法を行った。mvおよび対照ラット間において,オリゴデンドロサイトおよびその前駆細胞数に明らかな差異は認められず,mvラットのミエリン病変は,ミエリン形成細胞の直接的障害ではない可能性が示唆された.mvラットの脊髄におけるミクログリア関連因子の発現動態を調べた.4,6週齢のmvラットにおいて,TGF-β1mRNA発現量の増加傾向が認められ,アストロサイト・ミクログリアの活性化と関連する変化と考えられた.6,10週齢のmvラットにおいて,iNOSのmRNAおよび蛋白の発現量が上昇した.iNOS発現の上昇は,活性化ミクログリアの出現時期と一致することから,ミクログリアの活性化と関連する変化と考えられた.mvラットにおけるミエリン関連遺伝子および蛋白の発現動態を調べた.PLP mRNAおよび蛋白の発現量は,4週齢から有意に低下した.MBP mRNA発現量は4,6週齢で低下傾向を示し,MBP蛋白発現量は10週齢で有意に低下した.CNP mRNA発現量は4,6週で低下傾向にあり,CNP蛋白発現量は4週齢で有意に低下した.ミエリン遺伝子および蛋白の発現量の低下は,mvラットにおけるオリゴデンドロサイトの機能異常を示唆し,発症メカニズムとして重要と考えられた.末梢神経再生における鼻粘膜由来の神経幹細胞の有用性を検討する目的で,ラットの坐骨神経切断モデルを作製し,ラットの鼻粘膜より分離した神経幹細胞を投与した.神経幹細胞移植群では,対照群に比べてより高頻度に神経再生が認められた.アトラクチン欠損ラットmvラットのオリゴデンドロサイトおよびその前駆細胞の動態を把握するために、Proteolipid protein (PLP)およびPlatelet derived growthfactor alpha receptor (PDGF-aR)に対するプローブを用いたin situ hybridisation法を行い、それぞれの陽性細胞数をカウントした。mvおよび対照ラット間において,オリゴデンドロサイトおよびその前駆細胞数に明らかな差異は認められず、mvラットのミエリン病変は、ミエリン形成細胞の直接的障害ではない可能性が示唆された。また、ホモ型(27週齢)、ヘテロ型(34週齢)、および野生型(15週齢)ラットの脳から常法に従ってRNAを抽出し、mvラットと対照ラットのTNF-a、IL-b、iNOSのmRNA発現量をRT-PCR法にて検討したところ、これらのmRNA発現量に明らかな差異は認められなかった。今後、他のミエリン異常ミュータントであるdmyラットについても同様の検討を行うとともに、ミエリン形成初期におけるミエリン形成細胞動態、サイトカイン発現を経時的に解析する予定である。また、末梢神経再生における鼻粘膜由来の神経幹細胞の有用性を検討する目的で、ラットの坐骨神経切断モデルを作製し、ラットの鼻粘膜より分離した神経幹細胞を投与し、末梢神経の再生に対する治療効果を病理学的に解析した。投与された病変部では細胞密度が高く、移植細胞の生着が示唆された。現在、経時的に末梢神経再生を評価している。さらに、dmyラットの脊髄に鼻粘膜由来の神経幹細胞を投与し、2週齢後に採材した。エポン包埋およびパラフィン包埋サンプルを採材し、ミエリン再生を形態的に評価している。mv(myelin vacuolation)

ラットは中枢神経系のミエリン形成異常を特徴とするミュータントで,その病態は膜蛋白アトラクチン(Atrn)の欠損による.mvラットの脊髄では,病変の進行に伴ってアストロサイトとミクログリアの活性化が認められる.今回mvラットの脊髄におけるミクログリア関連因子の発現動態を調べた.各週齢のmvおよび野生型ラット間において,TNF-α,IL-1β,IL-6のmRNA発現量に明らかな変化はみられなかった.4,6週齢のmvラットにおいて,TGF-β1 mRNA発現量の増加傾向が認められ,アストロサイト・ミクログリアの活性化と関連する変化と考えられた.6,10週齢のmvラットにおいて,iNOSのmRNAおよび蛋白の発現量が上昇した.iNOS発現の上昇は,活性化ミクログリアの出現時期と一致することから,ミクログリアの活性化と関連する変化と考えられた.また、末梢神経再生における鼻粘膜由来の神経幹細胞の有用性を検討する目的で、ラットの坐骨神経切断モデルを作製し、ラットの鼻粘膜より分離した神経幹細胞を投与し、末梢神経の再生に対する治療効果を病理学的に解析した。ラットの坐骨神経を外科的に切断し、末梢神経障害モデルを作製し、障害部位の遠位側に鼻粘膜神経幹細胞を移植し、病理組織学的に末梢神経再生を評価した。神経幹細胞移植群では、対照群に比べてより高頻度に神経再生が認められた。【目的】mv(myelin vacuolation)ラットは中枢神経系のミエリン低形成とミエリンの解離を特徴とするミュータントで,その病態は膜蛋白アトラクチンの欠損による.mvラットのミエリン病変は2週齢から認められるが、病変が進展する2週齢から8週齢においてオリゴデンドロサイトの細胞数および形態に著変はみられない。今回、mvラットにおけるオリゴデンドロサイトのミエリン形成能を評価する目的で、ミエリン関連遺伝子および蛋白の発現動態を調べた。【結果・考察】全ての週齢において、PLPおよびMBPの免疫染色性が低下していた。PLP mRNAおよび蛋白の発現量は、4週齢から有意に低下した。MBP mRNA発現量は4、6週齢で低下傾向を示し、MBP蛋白発現量は10週齢で有意に低下した。CNP mRNA発現量は4、6週で低下傾向にあり、CNP蛋白発現量は4週齢で有意に低下した。これらミエリン遺伝子および蛋白の発現量の低下は、mvラットにおけるオリゴデンドロサイトの機能異常を示唆し、発症メカニズムとして重要と考えられた。
非小細胞肺癌・細胞診検体の新規EGFR変異蛋白検出法および検査アルゴリズムの開発

【研究目的】肺癌領域においては分子標的治療の適応が進み,とりわけ進行性の非小細胞肺癌を対象とした治療では,EGFR阻害薬(gefitinibおよびerlotinib)の適応は標準的一次治療として要になりつつある.これに伴い,この治療対象患者を選択するEGFR遺伝子変異検査は今後増加が見込まれているが,本検査は検査コストが高額なうえ,検査に要する時間が長いことが課題となっている.近年,変異EGFR遺伝子により合成されたEGFR変異タンパクを,抗体によって捉えることが可能となり,比較的低コストで簡便に行える免疫組織化学検査の応用が期待されている.本研究は気管支鏡検査や喀痰、胸水など、肺癌診療において診断上重要性が高く,またEGFR遺伝子変異検査へも利用されている細胞診検体を対象とし,EGFR変異タンパク抗体を用いた免疫組織化学検査の開発を行うと共に,医療経済性を念頭においたEGFR遺伝子変異検査とを組み合わせた検査アルゴリズムの構築を目的としたものである.【研究成果】変異型および野生型の確認ができている非小細胞肺癌由来培養細胞株を用いてルーチン検体と同様の方法により、細胞診標本を作製、細胞転写法を行った.高感度免疫細胞化学染色法(ICC法)を用いることによって、各細胞株の変異に一致し,且つルーチン検査に十分耐えうる良好な染色強度が得られた。高感度ICC法の染色バリデーションが確立したうえで,EGFR遺伝子変異が確認され組織切片と細胞診標本での検討が可能な18症例について高感度ICC法を用いたEGFR遺伝子変異タンパク(抗del E746-A750抗体および抗L858R抗体)の染色強度を確認した.同症例におけるICC法検索の結果,両抗体において感度,特異度とも100%であり各変異の有無に一致した良好な染色結果が得られた.IHC法検索ではICC法と比べるとやや劣る結果であるものの,良好な染色結果であると思われた.肺癌遺伝子変異のうち90%以上がエクソン19 E746-A750およびエクソン21 L858Rの遺伝子変異であることから、ICC法またはIHC法がEGFR遺伝子変異検索の一次検査として有用であり、ICC法またはIHC法を組み込んだで検査アルゴリズムの構築はコンパニオン診断の検査コスト削減に大いに貢献できるものと思われる。
関節リウマチの治療応用を目標とした炎症収束性脂質因子及び受容体の機能解析

関節炎におけるFPR2 (formyl peptide receptor2)の機能について:2018年度の研究において、T細胞表面上のFPR2陽性細胞がごく少数であったことが明らかとなった。すなわちT細胞ではなく、既報通り単球・マクロファージ系においてFPR2の機能が重要であると考えられたため、関節炎の発症の時間的経過とFPR2の発現量の解析を行った。実験1:ウシType IIコラーゲンにて誘導される実験的関節炎において、FPR2のリガンドであるResolvin D1(RvD1)を抗原投与後より合計8日間、100μgずつ腹腔内投与を行った。その後の関節炎の変化についてコントロール群と比較したが、関節腫脹の程度に関して有意な違いは認められなかった。また、関節炎誘導マウスにおいて抗原刺激前後における脾細胞およびリンパ節内のFPR2蛋白発現量をウエスタンブロッティング法を用いて確認したところ、FPR2はリンパ節では蛋白発現が認められず、脾細胞においては抗原刺激前には発現を認めたのに対して抗原刺激後7日以後より発現が消失することが判明した。実験2:2017年に発表された大石らの報告(Cell Metabolism 25, 412-427, 2017)では、転写因子の一つであるSterol regulatory element-binding protein (SREBP)-1がTLR4刺激に応答してRvD1の基質であるドコサヘキサエン酸発現を誘導することが明らかとなった。我々は、ヒト変形性関節症(OA)もしくは関節リウマチ(RA)の手術時に獲得し得た脂肪組織を用いて、組織内マクロファージにおけるSREBP1の発現量を検討した。その結果、SREBP1はOA, RAともに皮下脂肪と比較して、より炎症局所に近い膝蓋下脂肪組織において発現量が低下していることが明らかとなった。FPR2が関節炎の病態に関わる影響について:コラーゲン誘導性関節炎モデルマウスにおいて、我々の検討ではRvD1投与による関節炎の重症度が抑制されることを期待したが、コントロール群と比較して有意な差は得られなかった。その理由として、RvD1の1回投与量、あるいは投与期間が不足していた可能性が考えられた。また、本検討では抗原刺激と同時にRvD1投与を行ったが、刺激前の数日間においてRvD1を前投与するほうが効果を示すことができた可能性もある。RvD1は脂質分子であり、繊細な管理が必要であることも遠因かもしれない。さらに、本検討内でも示したとおり、この関節炎モデルにおいては炎症誘導に伴いFPR2の発現が著しく抑制されていた。受容体が細胞表面に表出されなかったためにRvD1の機能が最大化されなかった可能性も考慮するべきである。SREBP1が関節炎の病態に関わる影響について:本年度はヒト手術検体を用いて、脂肪酸合成に重要な転写因子であるSREBP1の発現量を解析することから開始した。マクロファージにおけるSREBP1発現量を比較する上で皮下脂肪組織と膝蓋下脂肪組織の両者を同一患者で獲得できることにが可能であったため、同じ組織においても炎症環境の高低によってSREBP1の発現量に差異が生まれることを示すことができた。この知見を踏まえ、SREBP1の機能についてモデル動物を用いて検証を行う予定である。FPR2研究においては、以下に示す2点を研究課題とする。課題1.FPR2蛋白の強制発現系を用いた関節炎への影響の探索:2018年度の研究において、FPR2遺伝子発現プラスミドベクターが確立済みである。この遺伝子をアデノウイルスベクターにサブクローニングして、in vivoにおけるgain of functionを試みる。FPR2発現が十分に高いことを確認した後、実験的関節炎を誘導すると同時にRvD1を十分量投与して、関節炎の収束について検討を進める。課題2.血清アミロイドA蛋白(SAA)とRvD1のFPR2に対する拮抗作用の検討:既報により、FPR2のリガンドとしてSAAも同定されている。SAAは、RvD1とは異なりFPR2に結合すると炎症性サイトカインの発現が誘導されることから、SAAとRvD1は拮抗的に作用している可能性がある。SAAはTh17誘導について重要な役割を果たす急性期炎症性蛋白であるため、FPR2の機能解析においてSAAとRvD1の関係性を明らかにする必要があると考えられる。単球・マクロファージ系を用いたin vitro実験、あるいは炎症局所への単球遊走を検討するin vivo実験によりFPR2の関節炎における役割を明らかにしたい。SREBP1シグナルが関節炎の病態に及ぼす影響については、ヒト検体を用いた観察研究については一定の結果を得ることができているため、マウス関節炎モデルを用いた検証を予定している。具体的には、SREBP1シグナルの阻害剤を用いた研究や、SREBP1遺伝子欠損マウスに関節炎誘導を試みて、炎症反応増悪の有無とその病態・機序を明らかにする予定である。FPR2陽性ヘルパーT細胞の機能解析について:健常人10例および関節リウマチ(RA)患者20例で検討を行った。結果として、末梢血単核球(PBMC)由来FPR2+CD4+T細胞は、ごく少数であった。本検討でのRA患者は高疾患活動性症例が少ないという限定はあるが、臨床的活動性との相関はみられなかった。いっぽう、赤血球沈降速度がFPR2陽性T細胞が発現しているRA症例でやや高値である傾向を認めた。

以上より、末梢血由来のCD4+ T細胞では、FPR2の発現は炎症の活動性が高い患者以外にはほぼ認めなかったと考えられた。そこで、活性化状態のCD4+ T細胞でFPR2が発現しているのではないかと考え、RA患者由来PBMCをTh1条件、Th17条件へ分化させ、FPR2陽性細胞の発現を検討したが、特にナイーブT細胞(Th0)から分化誘導を施した場合にはFPR2発現を認めることは無かった。一方、T細胞にFPR2のリガンドであるResolvin D1 (RvD1)を添加したin vitroでの検討では、Resolvin D1がインターフェロンγの分泌を抑制することが確認された。また、上記の結果を踏まえ、今年度はFPR2強制発現T細胞の作成は保留した。破骨細胞分化におけるFPR2の影響について:マウスマクロファージ細胞株であるRAW 264.7細胞を用いてRANKL, M-CSFで刺激を行い破骨細胞様多核細胞への分化を試みたが、十分な多核巨細胞を得られることができなかった。また、FPR2遺伝子挿入プラスミドベクターRAW細胞に遺伝子導入をさせて蛋白の強制発現を施した。遺伝子導入の可否はウエスタンブロット法により確認した。FPR2陽性ヘルパーT細胞の機能解析について:ヒトT細胞におけるFPR2は予想以上に発現量が少なく、研究を発展させることが困難であった。また、RA患者からの血液検体について、予想よりも回収可能であった患者数が少なかったことも研究が滞った要因の一つと考えられる。これらの結果を踏まえ、FPR2の遺伝子導入実験は一時保留することとした。破骨細胞分化におけるFPR2の影響について:RAW264.7細胞から破骨細胞への誘導が困難であった原因として、仔牛由来血清の品質やRAW細胞の状態、培養器の品質状況などが疑われたが、明確な理由は明らかにできなかった。関節炎におけるFPR2 (formyl peptide receptor2)の機能について:2018年度の研究において、T細胞表面上のFPR2陽性細胞がごく少数であったことが明らかとなった。すなわちT細胞ではなく、既報通り単球・マクロファージ系においてFPR2の機能が重要であると考えられたため、関節炎の発症の時間的経過とFPR2の発現量の解析を行った。実験1:ウシType IIコラーゲンにて誘導される実験的関節炎において、FPR2のリガンドであるResolvin D1(RvD1)を抗原投与後より合計8日間、100μgずつ腹腔内投与を行った。その後の関節炎の変化についてコントロール群と比較したが、関節腫脹の程度に関して有意な違いは認められなかった。また、関節炎誘導マウスにおいて抗原刺激前後における脾細胞およびリンパ節内のFPR2蛋白発現量をウエスタンブロッティング法を用いて確認したところ、FPR2はリンパ節では蛋白発現が認められず、脾細胞においては抗原刺激前には発現を認めたのに対して抗原刺激後7日以後より発現が消失することが判明した。実験2:2017年に発表された大石らの報告(Cell Metabolism 25, 412-427, 2017)では、転写因子の一つであるSterol regulatory element-binding protein (SREBP)-1がTLR4刺激に応答してRvD1の基質であるドコサヘキサエン酸発現を誘導することが明らかとなった。
香りの質感予測システムの構築

人間や,生体の嗅覚応答をより定量的に予測することは,生活のさまざまな面において有用である.本研究では,匂い物質の物理化学的な特徴を定量的に分析することによって,匂いの知覚を予測する方法論を検討した.特に複合臭の知覚について検討した.それぞれの匂い物質の物理化学的特徴を示す分子記述子を分析することで,両者をある程度の精度で判別可能であることを示した.続いて,分子記述子を用いて嗅覚受容体の応答の予測を行った.嗅覚受容体応答が類似している場合,知覚は安定であり,多様な要素臭を含む場合に,濃度に対する知覚の変化が大きいことが分かった.この安定性は,複合臭を構成する要素臭の組み合わせで決まる可能性があることを示唆する.分子の物理化学的特徴に基づく,生体応答の予測が有用であることが分かった.また複合臭の知覚を予測することが可能である例を示した.人間や,生体の嗅覚応答をより定量的に予測することは,生活のさまざまな面において有用である.本研究では,匂い物質の物理化学的な特徴を定量的に分析することによって,匂いの知覚を予測する方法論を検討した.特に複合臭の知覚について検討した.それぞれの匂い物質の物理化学的特徴を示す分子記述子を分析することで,両者をある程度の精度で判別可能であることを示した.続いて,分子記述子を用いて嗅覚受容体の応答の予測を行った.嗅覚受容体応答が類似している場合,知覚は安定であり,多様な要素臭を含む場合に,濃度に対する知覚の変化が大きいことが分かった.この安定性は,複合臭を構成する要素臭の組み合わせで決まる可能性があることを示唆する.分子の物理化学的特徴に基づく,生体応答の予測が有用であることが分かった.また複合臭の知覚を予測することが可能である例を示した.本年度は複合臭の知覚の安定性について評価を行った.構成成分が類似する複合臭と,構成成分が多様な複合臭について,濃度変化に伴う知覚の変化を比較すると,前者でより安定,後者でより不安定な知覚が得られる.心理学実験を行って,複合臭の快適性の安定性を評価した.分子の物理化学的特徴を計算し,複合臭の多様性の尺度として,特徴空間上での平均距離を求めたところ,安定性とは無相関であった.次に,人間の知覚は嗅覚受容体細胞群の入力パターンに規定されると考え,嗅覚受容体の応答パターンによって,複合臭の多様性の評価を試みた.現在までに,一動物種において嗅覚受容体の匂い-応答パターンの関係が体系的に調査されているのはショウジョウバエのみである.人間も昆虫も同じ環境で生息するために,処理する匂いのスペクトルも重複する部分があると考え,昆虫の嗅覚受容体応答データを解析した.まず,現在データベース上で公開されているデータを基に,ニューラルネットワークによる学習器を構築した.分子の物理化学的特徴を入力とし,嗅覚受容体細胞の発火率の予測を行った.いかなる匂い物質でも物理化学的特徴は一意に定まるため,テストデータに無い匂い物質の嗅覚受容体応答も予測することができる.さらに感度解析によって,予測に要する特徴を選抜することができた.複合臭を構成する各成分に対して,嗅覚受容体応答パターンを再構築し,応答パターンの平均距離を多様性の尺度として用いたところ,匂い知覚の安定性との間に相関関係が見られた.すなわち,学習器による嗅覚受容体の応答パターンによって濃度変化にたいする知覚の安定性をある程度予測することができた.本年度得られた成果は将来的にヒトの嗅覚受容体の応答パターンが体系的に調査された際に,同様の手法を適用することができ,将来の匂い知覚予測システム構築のためのテストベッドとなる.人間や、生体の嗅覚応答をより定量的に予測することは、生活のさまざまな面において有用である。本研究では、匂い物質の物理化学的な特徴を定量的に分析することによって、匂いの知覚を予測する方法論を検討した。まず、前年度にニューラルネットワークを用いて行った嗅覚受容体応答の予測法をさらに検討した結果、サポートベクトル回帰によって、予測の精度を向上させることに成功した。続いて香料成分として用いられる化合物と、自然に多く存在し、動物が一般的に利用している化合物の物性について、それぞれの物理化学的特徴を示す分子記述子を分析することで、両者をある程度の精度で判別可能であることを示した。また、香料の構成成分の多様性を評価する指標を提案した。最後に複合臭の構成成分数と、匂い物質の強度の関係について検討し、複合臭では、単一成分から構成される匂いに対して、濃度の変化に対し、匂いの快適性がより安定であることが分かった。前述の嗅覚受容体応答の予測器を用いて嗅覚受容体応答を評価したところ、類似した嗅覚受容体セットが活性化される場合、知覚は安定的であり、多様な嗅覚受容体が活性化される場合、濃度に対する快適性の変化が大きいことが分かった。複合臭を構成する要素臭の組み合わせのパターンが、知覚の安定性を決定するメカニズムを提案した。本年度は,匂いの類似度を,物理化学的特徴だけでなく,予測された嗅覚受容体応答に基づいて計算することで,匂いの知覚を考慮した類似度を定義することができた.比較的単純な匂いに対して,これを定量的に取り扱う方法を確立した.当初,分子情報に基づく手法のみで予測を試みていたが,適切な指標が見つからず,予測精度が十分でない状況であったが,嗅覚受容体の応答空間上で定義した距離を用いることによってこれを解決した.一方で本年度の結果は一部の嗅覚受容体について,応答を予測できなかったり,受容体応答に貢献する物理化学的

特徴を選抜することができなかった.現在データベースで公開されているデータのうち,嗅覚受容体細胞を十分に活性化させる匂いが無いデータがあり,こうした嗅覚受容体細胞について,予測精度が小さいことから,嗅覚受容体のリガンドとなる物質が特定されていないことが原因であると考えられた.これは,新しい匂い応答データの取得を行うとともに,他の機械学習の手法(サポートベクトルマシンおよびブースティング)を用いて,認識精度の高い学習器を検討する.現在,サポートベクトルマシンを用いて,識別能力が上昇するという予備的な結果を得ている.次年度は,文化・芸道に用いられるような複雑な匂いの評価を試みる.工学的なセンサシステムにおいて様々な複合臭の構成比を分析し,官能評価値と対応付ける.以下2つのアプローチによって分析する.まず,分子情報に基づき,快適性を予測する.快適性の高い匂いとして,香木香気成分や,構成成分が既知の香水を分析し,'よい香り'に共通するルールを探索する.この際複合臭の指標として,どのようなものを用いるかが課題となる.本年度用いた分子情報の平均距離および,分子情報空間上での各構成成分の分布パターンなどを評価する.続いて,官能評価実験を行い,嗅覚受容体応答パターンと人間の官能評価値と対応する特徴を探索する.嗅覚受容体では,複合臭に対する応答を直接評価できるので,応答パターンと官能評価値との対応を取り,官能値の予測手法を作成する.また本年度,受容体応答を学習器で予測できない例があった.今後は個々の学習器について,さらに検討を行う.具体的にはサポートベクターマシーンと,ブースティングを評価する.また適切な予測ができるような匂い刺激を行って教師データを得る.研究成果発表のための旅費に400千円,英文校閲など謝金に250千円,学会誌投稿料金に100千円を計上する.残り約1,000千円を,物品購入にあてる.データ解析用PC,解析ソフトウェアおよび香水などを含む実験用の匂い物質を購入する.
接着分子の障害心筋における病態生理学的意義-実験および臨床的検討-

接着分子のひとつであるICMA-1は、LFA-1のリガンドで、血管内皮細胞・線維芽細胞など多くの細胞表面上での発現が確認されており、炎症反応の進展や増悪に重要な役割を果たしている。今回ICMA-1が炎症のみならず、虚血や薬物(アドリアマイシン・モノクロタリン)などによる心筋細胞障害にも関与しているかどうかを実験的に検討した。また、臨床例では心筋炎・心筋症・虚血性心疾患などの症状の心内膜心筋生検、手術、剖検組織を用いて検討した。1)mRNAレベルでの検討:心筋組織内のICMA-1の局在を、Northern blotting法およびin situ hybridization法にて検討したところ、これらの病的心においてICAM-1mRNAの増加を認めた。2)蛋白レベルでの検討:ICAM-1に対する抗体を用いて心筋組織内の蛋白レベルでの局在を、免疫組織化学的手法、RI標識抗体による集積率・オートラジオグラフィーによるイメージング化により検討たところ、心筋内毛細血管の内皮細胞、間質の単核細胞(線維芽細胞・マクロファージなど)、変性心筋細胞に一致して、ICAM-1の免疫活性を認めた。3)in vivoでの抗体投与による細胞障害の抑制:ICAM-1に対するモノクローナル抗体を障害心モデルラットに投与し、心筋細胞障害が抑制されるかどうかを現在検討中である。4)さらにサイトカインとの関係も詳しく調べていきたい。