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サツマイモ野生種における自家不和合性の分子遺伝学的機構に関する研究

本研究は,サツマイモ近縁野生種における胞子体型自家不和合性の分子遺伝学的機構を明らかにすることを目的としている.この自家不和合性は,1遺伝子座の複対立遺伝子(S遺伝子)によって支配されており,雌蕊と花粉との相互作用の結果,自己花粉の発芽阻害を引き起こし自家受粉が抑制される遺伝的機構である.本研究では,S遺伝子座周辺の連鎖地図を作成するため,S遺伝子型分離集団のRFLP分析によりS遺伝子座に連鎖するDNAマーカーの同定とマッピングを行なった.その結果,6種類のDNAマーカーはS遺伝子座から1cM以内に位置すること,およびこのうちのひとつ(AAM-68)はS遺伝子座と0cMで最も緊密に連鎖していることが明らかになり,S遺伝子座近辺の精密な遺伝子地図を構築した.この遺伝子地図に基づいてS遺伝子をクローニングするため,約4万個のクローンから成るBACライブラリーを作成した.このライブラリーから,S遺伝子座周辺の4種類のDNAマーカーをプローブとしてBACクローンのスクリーニングを行ない,各プローブに対して強いシグナルを示す310個の独立クローンを得た.これらのクローンの解析から,S遺伝子座両末端の範囲を0.1cM以内に限定することができ,この領域をカバーする約100kbのBACクローンを得た.またラムダファージのゲノムライブラリーも作成し、S遺伝子座近辺のクローンを得た。本研究によって,S遺伝子座とその周辺領域のゲノム構造を明らかにするための実験的基盤が確立され,今後塩基配列の解析によってS遺伝子の同定へと研究を発展させる予定である.また本研究では,自然界で見出された自家和合性突然変異体と放射線照射により誘発した自家和合性突然変異体について遺伝学的解析を行なった.その結果,自然変異体ではS遺伝子座の変異遺伝子がドミナントネガティブ作用によって自家和合性を示すこと,,放射線誘発変異体はS遺伝子座を中心とする染色体領域の欠失によって自家和合性に変異したことを明らかにした.さらに,S遺伝子座に連鎖する柱頭蛋白質遺伝子(SSP)のプロモーター領域をクローニングし,GUS遺伝子を用いた形質転換体における発現解析から,雌蕊特異的発現制御部位を明らかにした.本研究は,サツマイモ近縁野生種における胞子体型自家不和合性の分子遺伝学的機構を明らかにすることを目的としている.この自家不和合性は,1遺伝子座の複対立遺伝子(S遺伝子)によって支配されており,雌蕊と花粉との相互作用の結果,自己花粉の発芽阻害を引き起こし自家受粉が抑制される遺伝的機構である.本研究では,S遺伝子座周辺の連鎖地図を作成するため,S遺伝子型分離集団のRFLP分析によりS遺伝子座に連鎖するDNAマーカーの同定とマッピングを行なった.その結果,6種類のDNAマーカーはS遺伝子座から1cM以内に位置すること,およびこのうちのひとつ(AAM-68)はS遺伝子座と0cMで最も緊密に連鎖していることが明らかになり,S遺伝子座近辺の精密な遺伝子地図を構築した.この遺伝子地図に基づいてS遺伝子をクローニングするため,約4万個のクローンから成るBACライブラリーを作成した.このライブラリーから,S遺伝子座周辺の4種類のDNAマーカーをプローブとしてBACクローンのスクリーニングを行ない,各プローブに対して強いシグナルを示す310個の独立クローンを得た.これらのクローンの解析から,S遺伝子座両末端の範囲を0.1cM以内に限定することができ,この領域をカバーする約100kbのBACクローンを得た.またラムダファージのゲノムライブラリーも作成し、S遺伝子座近辺のクローンを得た。本研究によって,S遺伝子座とその周辺領域のゲノム構造を明らかにするための実験的基盤が確立され,今後塩基配列の解析によってS遺伝子の同定へと研究を発展させる予定である.また本研究では,自然界で見出された自家和合性突然変異体と放射線照射により誘発した自家和合性突然変異体について遺伝学的解析を行なった.その結果,自然変異体ではS遺伝子座の変異遺伝子がドミナントネガティブ作用によって自家和合性を示すこと,,放射線誘発変異体はS遺伝子座を中心とする染色体領域の欠失によって自家和合性に変異したことを明らかにした.さらに,S遺伝子座に連鎖する柱頭蛋白質遺伝子(SSP)のプロモーター領域をクローニングし,GUS遺伝子を用いた形質転換体における発現解析から,雌蕊特異的発現制御部位を明らかにした.本研究は,サツマイモとその近縁野生種が有する胞子体型自家不和合性の分子遺伝学的機構を明らかにする事を目的としている.自家不和合性遺伝子(S遺伝子)に特異的な柱頭蛋白質(SSP)を我々は2次元電気泳動法によりすでに同定していることから,本年度は6種類のS遺伝子ホモ型個体から得た柱頭cDNAライブラリーを作成し,SSPをコードするcDNAクローンを得た.これらのクローンの塩基配列の解析から,SSP蛋白質のアミノ酸配列はS遺伝子ホモ型個体間で高度に保存されていることが明らかとなった.サツマイモ野生種の自然集団から見出された自家和合性変異体からもSSPをコードするcDNAクローンを得て解析した結果,C末端のアミノ酸配列が自家不和合性個体とは顕著に異なることが判明した.SSP遺伝子は雌蕊の柱頭や花柱で特異的に発現していることを明らかにした.データベースにおけるホモロジーサーチによって,SSP蛋白質はshort-chainalcohol dehydrogenase familyと高い相同性が認められ,このfamilyに属するバクテリアの20-beta hydroxysteroid dehydrogenaseと構造的類似性があることから,SSP蛋白質の基質としてBrassinosteroidなどの植物ホルモンが関与していると推察された.

このようなSSP蛋白質の特徴から,サツマイモ野生種の雌蕊において花粉が発芽し花粉管が伸長する過程において,SSP蛋白質が機能しているものと考えられた.さらに自家不和合性との関連を明らかにするため,S遺伝子型に関して分離する交雑後代系統(A36系統)を作出し,この系統の約130個体についてそれぞれの個体のS遺伝子型を決定するとともに,各個体がらゲノミックDNAを抽出しRFLP分析を行なった.その結果,S遺伝子とSSP遺伝子との間で組換えを起こした3個体の組換え体が検出された.このことから,SSP遺伝子は遺伝子から約1.2cMの距離にマップされ,緊密に連鎖していることが明らかになった.本研究は,サツマイモとその近縁野生種が有する胞子体型自家不和合性の分子遺伝子学的機構を明らかにすることを目的としている.この自家不和合性は,1遺伝子座の複対立遺伝子(S遺伝子)によって支配されており,雌蕊と花粉との相互作用の結果,自己花粉の発芽阻害を引き起こし自家受粉が抑制される遺伝的機構である.本年度は,雌蕊の柱頭と花粉で発現するS遺伝子の転写産物を探索するため,これらの組織からmRNAを抽出しAMF(AFLP-based mRNA fingerprinting)法によって解析した.その結果,S遺伝子型に特異的と考えられるPCR増幅DNA断片を,柱頭から11本および花粉から9本得た.これらのDNA断片がS遺伝子座に連鎖しているかどうかを明らかにするため,4種類のS遺伝子型が分離する交配後代の植物集団の約200個体を用いて,RFLP分析を行なった.その結果,5本のDNA断片がS遺伝子座に連鎖していることが判明し,そのうちのひとつ(AAM-68)では組換え体が検出されなかったことから,AAM-68はS遺伝子座に最も緊密に連鎖しているか,またはS遺伝子座内に位置する遺伝子であると推定された.さらにそれぞれの組換え頻度に基づいてS遺伝子座からの連鎖距離が求められ,遺伝子地図を作成することができた.これらのDNA断片クローンについて塩基配列を決定し,データベースにおける相同性検索を行なった結果,既知の遺伝子を有意な相同性が認められた.このうちAAM-68は,Glucosyl transferaseと相同性があり,またノーザン分析から開花前日の雄蕊で特異的に発現していることが明らかになった.このようなことから,AAM-68クローンは雄蕊で発現するS遺伝子の候補であることが示唆された.以上のように,本研究においてS遺伝子座近辺の遺伝子地図が作成され,さらにS遺伝子の候補が見出されたことから,これらの情報をもとに染色体歩行法などによって,今後さらに詳細な分子的解析を行う予定である.本研究は,サツマイモ近縁野生種における自家不和合性の分子生物学的機構を明らかにすることを目的として,次のような研究成果を得た.1.S遺伝子座近辺の精密連鎖地図の作成S遺伝子型分離集団の調査個体数をさらに増やしてRFLP分析を行ない,より正確な組換え頻度を求めた.前年度の調査個体数と合わせて571個体を用いた分析結果から,S遺伝子座近辺の精密な遺伝子地図を作成した.
解剖学的適合性を有するらせん流入路遠心血液ポンプによる全置換型人工心臓

急性動物実験において市販後遠心型左心補助人工心臓をもちいて全置換型循環モデルを作成し定常流血液ポンプ全置換型人工心臓の実現可能性を示した。全置換型人工心臓動物実験モデルにおいて心房拍動が温存され自律神経系制御による生理的制御が実現可能であることを見出した。3Dプリンターを用いて全置換型人工心臓のコンセプトモデルを作成し、犠牲死後の成ヤギににてフィティングスタディを行った。血液ポンプを小型化することで左右独立の全置換型人工心臓コンセプトを示した。低コスト、長寿命を目指したワンポイント転がり軸受を考案し、プロトタイプポンプにて動作を確認した。本研究の目標である超小型、軽量の全置換型人工心臓(TAH)を実現するため人工心肺を用いたTAHの装着方法の検討行った。市販の遠心型定常流血液ポンプを用い構築しTAHの循環維持が可能かを評価した。実験動物として健常成ヤギを全身麻酔下に正中切開し心臓を露出させた。上大静脈、下大静脈脱血、上行大動脈送血として、人工心肺(CPB)を開始した。心停止下に心室を切除し、三尖弁、僧帽弁後尖を切除し、左室流出路を僧帽弁前尖で閉鎖した。肺動脈を離団し、心臓側を閉鎖、心室断端にカフを介し市販の2台の補助人工心臓を装着した。右心系ポンプの送血管を肺動脈に、左心系ポンプ送血管をCPB送血管に接続し、徐々にTAH側ポンプの回転数を上げ、CPBを離脱し、TAHを構築した。心房収縮のTAH運転下における大動脈圧、左心房圧、肺動脈圧、右房圧、最適な左右バランスの回転数を測定した。また、純粋な心室機能を排除した心房機能を測定した。4症例で安定した循環を得ることができた。心房を温存したTAHの実験では、心電図、肺動脈圧、ポンプ回転数のすべてに心房収縮による波形を確認することができた。成ヤギ(80kg)の実験の最大流量値として、右心系ポンプ回転数1350rpm下に平均流量5.2L/min、右心房圧8/0mmHg、肺動脈圧35/28mmHg、左心系ポンプ回転数2500rpm、平均流量5.2L/min、左心房圧18/3mmHg、大動脈圧114/102mmHgを得ることができた。遠心ポンプではポンプ前後の差圧で大きな流量変化を生じるため、心房収縮のような小さな圧変化でも拍動波が生じる。遠心型血液ポンプは前負荷が上昇すると流量が大きく増加し、左右のポンプのバランスが取りやすかった。また、肺動脈圧も低値に抑えることができた。心房を温存した遠心血液ポンプ型TAHにおいて心房収縮を残存させ心房波を残すことができた。本研究の目標である超小型、軽量の全置換型人工心臓(TAH)を実現するため実際の埋込手技に基づく動物実験を本年度は2例実施した。実験では適切なポンプ特性を明らかにするため性能評価が確立している市販の遠心血液ポンプを用いた。健常成ヤギを用い全身麻酔科に正中切開し人工心肺を施行した。そののち心室をを切除しその断端にカフを介し2台のポンプを接続した。結果、循環を維持することができ、血圧、血流は正常範囲内であった。TAHにおいては肺動脈に過剰な圧力が生じた際に肺水腫が起こり、ガス交換が不良となる問題がある。しかし遠心ポンプでは圧力が一定特性となるため、この問題が生じにくいことが明らかになった。他方、体循環側では末梢血管抵抗が変化した場合、血流量が大きく変化する問題が明らかになった。したがって左心用ポンプは適切なポンプ内部抵抗を持たせ、緩やかな圧流量特性を持たせることが望ましいと考えられた。これらの結果からポンプの再設計を行った。動圧軸受については高い加工精度が要求されためコスト高になることは明らかで、低コストで幅広く使用できる人工心臓を目指す社会的要求を満たすことは困難である。そこで新しい構造のモノピボットを考案し試作を行った。ポンプ羽根形状については数値流体解析を行い、十分なポンプ性能を得ることを確認したのち試作を行った。試作したポンプのインペラ外径は38 mmで毎分2200回転で5 L/min、100 mmHgの出力を達成した。このポンプを駆動するためのモータも設計試作を行い、毎分3000回転, 20 mNmの出力を実現しておりポンプの要求仕様を満たしている。経皮的電力伝送システムについては定電流定電圧モードを周波数制御にて実現し、体内埋込の充電回路を省略できる新しい構成を考案した。前年度までに行った急性動物実験における知見をもとに全置換型人工心臓のコンセプトを見直し血液ポンプの再設計を行った。とくにサクリスファイス後の成ヤギを用いたフィッティングスタディーにおいて3Dプリンターを用いて数種のコンセプトモデルを植え込み形状について検討を行った。一体構造としていた左心、右心の血液ポンプは埋め込みの容易さの観点から別々のポンプとしたほうが望ましく、両心補助人工心臓への応用や小児心奇形症例に対しても有利であると考えられた。軸受については動圧軸受とピボット軸受がスタンダードとなっているが動圧軸受では加工精度のために高コストとなり、軸受剛性のために重量増となるデメリットがある。

ピボット軸受では機械寿命と血液適合性に課題がある。これらを解決する一方法としてワンポイント転がり軸受を考案し試作を行った。ワンポイント転がり軸受は外輪に収められた複数の公転球の上にピン上の回転軸をのせ、電磁石と磁石の吸引力により一点に拘束される。種々の検討を重ねた結果、公転球の数と外輪ジオメトリーの最適化を行った。転がり軸受の問題点として公転球同士の衝突があげられ、これを避けために公転球は保持具に収められ互いにクリアランスを確保するように構成されているが、この保持具は血栓生成の原因になることは明らかで公転球の自律分散が本軸受の成否のカギを握ると考えられた。軸受に対して公転面を傾けることで自律分散が達成されることを確認し、試作ポンプにて動作を確認した。始動時ステータとローターの吸引反発により軸受が破たんすることが確認され今後の課題と解決方法の検討を行った。急性動物実験において市販後遠心型左心補助人工心臓をもちいて全置換型循環モデルを作成し定常流血液ポンプ全置換型人工心臓の実現可能性を示した。全置換型人工心臓動物実験モデルにおいて心房拍動が温存され自律神経系制御による生理的制御が実現可能であることを見出した。3Dプリンターを用いて全置換型人工心臓のコンセプトモデルを作成し、犠牲死後の成ヤギににてフィティングスタディを行った。血液ポンプを小型化することで左右独立の全置換型人工心臓コンセプトを示した。低コスト、長寿命を目指したワンポイント転がり軸受を考案し、プロトタイプポンプにて動作を確認した。本研究の目標である超小型、軽量の全置換型人工心臓(TAH)を実現するためには様々な技術要素を解決する必要がある。埋込手技については動物実験を2例実施した。健常成ヤギを用い全身麻酔科に正中切開し人工心肺を施行したそののち心室をを切除しその断端にカフを介し2台のポンプを接続した。結果、循環を維持することができTAHを埋めこむ方法がを確立できた。左心右心ポンプの適切な特性を明らかにすることができた。右心については肺動脈に過剰な圧力が生じないように遠心ポンプのような圧力が一定の特性が好ましい。他方、左心ポンプでは末梢血管抵抗が変化した場合、血流量が変化するため一定流量に特性に近いポンプが望ましい。血液ポンプの開発については動圧軸受は高い加工精度が要求されためコスト高であること、軸受けクリアランスに高いせん断応力が発生しフォン・ビルブラント因子の減退により消化管出血の問題があることから、低コスト化、せん断応力の低減を図るべく新しい構造のピボット軸受を考案した。数値流体解析を導入し、ポンプ羽根形状について十分なポンプ性能を得ることを確認したのちに試作ができるようになった。試作したポンプではTAHとして必要な出力を得ると同時に遠心ポンプに過流ポンプの原理を組み合わせることによりインペラを30 mm程度まで小さくでき、更には回転数をより低くできること明らかにした。このポンプを駆動するためのモータも仮定磁路法により設計試作を行い、磁気回路の断面積を最適化するなどして要求仕様を満たしつつ小型化を実現した。経皮的電力伝送システムについては定電流定電圧モードを周波数制御にて実現し、体内埋込の充電回路を省略できる新しい構成を試作し充電実験を行った。このように種々の研究の要素技術について解決を進めているため、研究はおおむね順調に進展していると考えられる。人工臓器医工学今年度はデバイスの要素技術研究の進展と統合を図り最終的な完全埋込システムの完成を目指す。
ユーイング肉腫におけるSkp2遺伝子発現制御機構の解析と分子標的治療への応用

ユーイング肉腫は悪性骨軟部腫瘍の中で最も生命予後不良な腫瘍の一つである。ユーイング肉腫症例の多くで染色体転座t(11:22)の結果、異常な融合遺伝子EWS-Fli1が生じる。EWS-Fli1は強力な転写因子として働き、ユーイング肉腫の発がん原因と考えられている。これまでに我々は、EWS-Fli1が癌抑制遺伝子Rbに関係した細胞周期制御因子(p27,p21,cyclin E)を標的とし、このRb経路の阻害がユーイング肉腫発がんに深く関与していることを明らかにした。これらのEWS-Fli1の標的遺伝子の中で、臨床的予後と相関するものについて調べた結果、p27発現レベルの低下がユーイング肉腫患者の最も強い予後予測因子であることが判明した。さらに、EWS-Fli1によるp27発現抑制には、ユビキチン・プロテオソーム経路が関与しており、p27をユビキチン化して蛋白質分解を引き起こすユビキチンリガーゼSkp2の関与が示唆された。しかし、EWS-Fli1がいかにしてSkp2によるp27分解を促進しているのか、その分子機構はいまだ不明である。そこで、本研究の目的は、1)EWS-Fli1によるp27発現抑制に関与するSkp2の活性化機構を明らかにし、2)その機構を抑制することでユーイング肉腫の増殖を制御できるか検証し、ユーイング肉腫の新しい分子標的治療法の開発につなげることである。本年度は、ヒトSkp2遺伝子プロモーター領域をクローニング、ルシフェラーゼに連結したレポーターコンストラクトを作成し、これを用いてEWS-Fli1によるSkp2プロモーターの活性化が起こることを確認した。また各種の欠失コンストラクトによる詳細な解析を行い、EWS-Fli1が結合しうるDNA領域まで特定した。
嚥下運動の非侵襲的測定法の開発平成25年6月13日現在

非侵襲的な嚥下運動の測定法を確立することを目的として、嚥下筋の筋電図、声門の閉鎖状況、嚥下音を測定した。これらのデータから、嚥下の口腔期の開始から声門が閉じるまでの時間、声門が閉じている時間を計測し、嚥下運動の数値化を試みた。粘度の異なる食品を嚥下したときのデータを集め比較したところ、粘度に応じて食品の飲み込みやすさが変わることを示す結果が得られた。また、食品の味で誤嚥の起こりやすさが異なるが、それを裏付ける結果が本測定法で得られた。本研究は、ベッドサイドで行える嚥下運動の非侵襲的測定法の開発を目的とするもので、嚥下時の嚥下筋の筋電図、嚥下音、声帯の動きを経時的に測定することで嚥下運動を数値化することを試みている。1最終年度(平成24年度)に実施した内容と成果平成23年度と同様、粘度の異なる食品を嚥下したときのデータを集めた。また、本測定法の応用として、味覚の嚥下に対する効果を調べた。具体的には水、塩化ナトリウム溶液、レモン水、全がゆ、梅がゆ、塩がゆを嚥下したときの本測定法でのデータを解析したところ、塩味の水溶液、粥共に無味の食品に比べ飲み込み始めてから声門が閉じるまでの時間が長く、誤嚥の危険性が高くなると考えられた。この結果は、塩化ナトリウム溶液は嚥下反射を起こしにくいという報告と一致する。2申請期間全体で実施した内容と成果嚥下の口腔期の開始から声門が閉じるまでの時間、声門が閉じている時間などを測定し、嚥下運動の数値化と評価方法の探索を試みた。粘度の異なる食品、すなわち液体、とろみ剤でゲル化した液体食品、固形食品を嚥下したときのデータを本測定法を用いて集め比較したところ、液体の飲み込みにくさ、とろみを付けた食品の飲み込みやすさを示すデータが得られた。また、食品の味で誤嚥の起こりやすさが異なるが、それを裏付ける結果が本測定法で得られている。すなわち、本測定法で実際の嚥下運動の状態を非侵襲的に測定できる可能性が得られた。今後はさらにデータを蓄積し、測定の標準化と有効性の検証を進める予定である。本研究は、ベッドサイドで行える嚥下運動の非侵襲的測定法の開発を目的とするもので、嚥下時の嚥下筋の筋電図、嚥下音、声帯の動きを測定し、嚥下能力の数値化を試みた。液体、ゲル化した食品、固形物を嚥下したときの嚥下筋の筋電図、嚥下音、声帯の動きを測定し、波形間の時間と持続時間、インピーダンス、音の周波数解析を申請書に記述した通りに行った。その結果、液体、ゲル化した食品、固形物の嚥下運動の差異を、筋電図と声帯の開閉の記録から区別ができるようになりつつある。しかし、嚥下音の測定に関しては、音をとらえる振動子を被験者の頚部に装着して記録するため嚥下音以外のノイズが混入すること、記録した嚥下音の周波数解析ソフトの方法がFFTのみのため、嚥下という短い時間の解析には向かないことなどから、振動子を使用することを断念し、バイノーラル録音様のマイクを耳に装着して嚥下音の骨導音をとらえる方法を試みている。加えて、ウェブレット解析が可能なアプリケーションとデータ解析ソフトBIOMAS(当該研究費で購入)を購入し、それに関連して必要になった生体信号を記録するA/Dコンバータ(当該研究費以外の研究費で購入)とデータ収録用ソフト(当該研究費以外の研究費で購入)、これまで他の装置で記録したデータを購入したアプリケーションで解析可能にするためのデータコンバージョンソフト(当該研究費で購入)を使用して、筋電図、声帯の開閉、嚥下音を総合的に記録し、さらなる詳細なデータを収集、解析している。これらのデータをもとに、非侵襲的で特別な機器を必要としない、施設を選ばない嚥下運動の測定法の開発を目指している。遅れている理由の第一は、クリアな嚥下音の収集が困難であったことである。ノイズが収集音に混入し解析が困難であったこと、加えて手持ちのアプリケーションの機能不足のため、正確で詳細な解析ができなかったことがあり、データ収集システムと解析方法の手直しをしている。もう一つの理由は、研究に割く時間が少なかったことである。授業、大学の業務などに追われたためである。嚥下音の記録を確実にし、その解析を周波数、時間の視点から行う。

同時に記録している嚥下筋の筋電図と声帯の開閉の記録と合わせ、嚥下する食物の固さ、粘性などによる嚥下記録の差異を検出し、標準化できることを目標に、総合的に解析を行う予定である。研究時間の不足であるが、研究協力者を得ているのでこれまでに比べ、進行は速くなると考えている。23年度の当該研究費は備品にのみ使用しているが、研究に使用した消耗品は、別の研究費から購入している。また、被験者への謝金は、被験者には23年度から継続して次年度も参加していただくため、支払いは研究への参加が終わった時点となる。そのため、23年度の謝金はなかった。次年度は、機器類を新規に購入する予定は今のところなく、研究費は嚥下用の食材、とろみ材、機器ケーブル、データ保存用媒体等の消耗品及び被験者の謝礼に使用する。本年度までに協力をいただいた被験者だけではなく、できる限り多くの被験者を募り、できる限り多くのデータを収集する予定である。
脊椎動物細胞におけるDNA蛋白クロスリンク損傷修復過程の解析とその生物影響評価

細胞レベルでのDNA蛋臼クロスリンク(DPC)修復を明らかにする目的で、ニワトリDT40細胞を用いて、修復経路に関わる遺伝子群の逆遺伝学的に解析を行った。そのDPCの発生に深く関わると考えられている細胞内での活性酸素種の除去に関わる遺伝子の破壊を行い、細胞内での活性酸素除去機構の解析を進めた。さらにマウスを用いて特異的にDPCを導入できる薬剤(HMTA)の臨床応用へ、とくに癌組織への集中的デリバリーの可能性を示唆する基礎データを集積した。これらの結果は全て研究期間内に投稿発表を行った。1) DPCs修復における除去修復系と相同組み換え系路の遺伝学的相互作用を調べるため、除去修復及び相同組み替え修復二重欠損株を作成した。主に感受性をもとに解析を行った。現時点では、除去修復系よりは相同組み替え修復に依存している可能性が示唆されている。さらに、ミスマッチ修復の種々のサブユニット遺伝子をノックアウトした細胞を構築した。これらのミスマッチ修復遺伝子サブユニットの損傷認識は、強い損傷認識特異性があることを生細胞のレベルで明らかにしつつある。2) DPC修復が複製を伴う相同組み替えに依存していることから、DPC修復過程での複製鎖の挙動を解析することを試みてきた。Molecular Combing法を用いて解析する系の改善を行った。基礎実験として、ロングパッチ修復欠損のFEN1遺伝子破壊株を用いて酸化損傷後の複製鎖維持について解析を行い、FEN1の複製鎖維持に関わる役割を可視化することができた。3) DPCを生み出すフォルムアルデヒドは野生株では感受性が低く、修復欠損株では感受性が高い。このことは、フォルムアルデヒドあるいはその類似化合物を制ガン剤として利用できる可能性を示唆する。そのような化合物の中で、HMTAを見い出し、腫瘍移植マウス系を用いてHMTAの制ガン剤あるいは増刊剤としての作用を確認した。また、その組織へのデリバリーシステムを開発する意味からリポソーム封入HMTAを作成した。1)DPCsを生み出すフォルムアルデヒド系薬剤であるHMTAの抗がん作用、他の抗がん剤への増感作用について移植腫瘍系を用いて解析し、有効性を明らかにした。HMTAは、既に抗炎剤として使用されており安全性には問題がない。BrcaあるいはFancノックアウト細胞が、フォルムアルデヒドに対して感受性を示すことを明らかにしているので、これら由来の腫瘍細胞への選択的な有効性が示唆される。2)DPSs修復過程での複製鎖の挙動を解析するために、Molecular Combing法の改善を行ってきた(20年度)。この解析系は損傷修復過程、特に修復後の複製を視覚化出来る。Fen1ノックアウト細胞を用いて行い解析を行い発表した。以上2点については投稿、掲載が完了している。活性酸素種(ROS)は、種々のDNA塩基損傷を生じさせるが、DPCs(DNA蛋白クロスリンク)を生じる因子としても知られている。活性酸素種は正常な生理作用でも生じる事から、内因的なDPC誘発因子の一つと考えられる。外的要因に関係なく、内在性ROSのDPC生成への関与を評価するために、トリDT40細胞を用いてROSの消去に関わる2つの遺伝子、SOD1とSOD2のコンデショナルノックアウト細胞を作成し解析した。細胞質や核に存在するSOD1のノックアウト細胞は、細胞内SOD1枯渇状態で細胞死が誘導された。また塩基損傷に指標である脱塩基サイトの上昇が認められ、さらにDPCsが原因損傷の一つである娘染色体交差(SCE)の上昇が認められた。さらにSOD1をそれぞれ細胞質、或は核に局在強制発現させる細胞を作成して解析した結果、核内強制発現した細胞の方が、細胞質強制発現細胞よりSCEの産生が抑制された。一方、ミトコンドリアに局在するSOD2のノックアウト細胞では、SOD2枯渇下でも細胞死が見いだされないが、顕著な増殖遅延が観察された。しかしながら娘染色体交差の上昇は認められなかった。以上のことから、1)内在的なROSによるDPCsの原因になり得ること。2)ROSの細胞内での局在性の違いで、DPCを生じる様なDNA損傷を与える場合と与えない場合が明確に区別出来ることが明らかになった。特に強制発現細胞の解析からROSの半減期を考慮すると、染色体DNAのより近傍でROSが存在する必用あることを明らかにした。以上の結果は既に投稿、掲載されている。
勤労者の身体活動とコミュニケーションを高めるオフィス環境：自然の実験による検討

勤労者における座りすぎは、身体的・精神的な健康状態および労働生産性と関係することから、その解決が課題となっている。このような座りすぎへの対策として、立って作業できる上下昇降デスクの設置やオフィスレイアウトの工夫など環境的介入が有効とされている。しかし、これまでの研究では、環境的介入による座位時間の減少がオフィス内のどのような場面でどのような行動の増加によって生じているかといった詳細について、技術的な課題があり明らかになっていない。そこで本研究では、近年注目されているAI(人工知能)による物体検出技術を応用し、人の行動を定量化・可視化し、オフィス環境への介入の効果を詳細に検証する。
糖尿病網膜症の線維血管性増殖膜形成過程と硝子体手術時期の検索

同一術者(岡野)の糖尿病網膜症硝子体手術例211眼を検索し、術後12カ月以上追跡した。線維血管性増殖膜形成過程は5期に分類できた。I:検眼鏡的裸新生血管に混濁が生じた時期。II:半透明の幼弱な混濁膜状物形成。III:線維化が生じ、まだ収縮はない。まだ新鮮で新生血管が顕性で、いわゆる赤い膜。IV:より発達して、線維化が顕著で収縮が生じ、牽引性出血がしばしば旺盛。いわゆる白い膜の新鮮な時期。V:収縮した陳旧化し線維増殖膜で、新生血管は目立たなくなる。いわゆる白い膜の陳旧期。しばしば網膜剥離を伴い牽引性出血は目立たなくなる。術後の改善・不変・悪化のうち、改善:悪化の%は、IとIIで90:0、IIIで73:17、IVで34:49%であった。成績から、手術適応はIIIIが望ましく、IV以上では遅かった。網膜を牽引している増殖膜は、発達しないうちに、強く収縮する前に、黄斑が牽引されぬうちに切除すべきである。増殖性変化の型からは、進行したdiffuse型が最も悪く、table-top型がそれに次ぐ。hammockやtent型は良成績であった。初回牽引性硝子体出血後1年以上追跡した161眼では、初回出血後6カ月以内に50%が硝子体手術を要した。また、増殖膜初発から半年以内に75%例が手術適応となった。出血や増殖膜初発から追跡できると治療時期を外れないで手術ができるため、成績が向上することがわかった。重症例での成績や手技の向上に、粘弾液分層法が極めて有効で、重症線維血管増殖膜が関与した本症牽引性網膜剥離182眼では、粘弾液分層法併用で改善75%、不変14%、悪化11%と、重症の割に良成績を得た。また、眼内ファイバースコープの併用で、従来の手術不能困難例での有効処理が可能になった。増殖組織の時期、病型、黄斑剥離の有無、粘弾液分層法や内視鏡の併用などを適切に配慮・選択すれば、手技の安全性と術後成績を極めて向上させることができることがわかった。糖尿病網膜症硝子体手術456眼を検索し、同一術者(岡野)の106眼で術後12カ月追跡した。I:検眼鏡的裸新生血管に増殖膜に前駆して混濁が生じる。II:半透明の幼弱な網膜前混濁膜状物となる。III:線維化が生じるが、まだ新鮮で新生血管が顕性で、いわゆる赤い膜である。まだ収縮はない。IV:より発達して、強い線維化が顕著で収縮が生じ、牽引性出血がしばしば旺盛。いわゆる白い膜のうち新鮮な時期である。V:収縮し陳旧化した線維性増殖膜で、新生血管はあるが目立たなくなる。いわゆる白い膜の陳旧な時期である。しばしば軽重の網膜剥離を伴い牽引性出血はすでに目立たなくなる。成績は、改善/悪化は、IとIIで90%/0%。IIIで73%/17%、IVで33%/50%、Vは適期過ぎだった。

結果として、手術適応はIIIIが望ましく、IV以上は遅かった。別のHutton分類での型検討では、進行したdiffuseが最も悪く、table-topがそれに次いだ。hammockやtentは良い成績であった。網膜を広い面で牽引している増殖膜は、あまり発達しないうちに、強く収縮する前に、黄斑部が牽引されぬうちに切除すべきことがわかった。別の本症治験群で、初回牽引性硝子体出血後1年以上追跡した110眼では、初回出血後7カ月以内に50%例が硝子体手術を要した。また、増殖膜初発から半年以内に72%例が手術適応となった。その適応期から2週経過で手遅れに至った例が4眼あった。初回出血や初回増殖膜発生から追跡できると、治療時期を大きく外れないで手術が適用でき、そのため成績の向上に役立つことが具体的にわかった。また、適期は勿論、重症例での成績や手技の向上に、粘弾液分層法が極めて有益であった。因みに、重症線維血管性増殖膜が関与した本症牽引性網膜剥離126例では、粘弾液分層法併用で、改善76%不変13%、悪化11%で、重症の割に良成績を得た。前年に続き、術者岡野の糖尿病網膜症硝子体手術例211眼を検索し、術後12カ月以上追跡した。線維血管性増殖膜形成過程を5期に分類した。I:検眼鏡的裸新生血管に混濁が生じた時期。II:半透明の幼弱な混濁膜状物形成。III:線維化が生じ、まだ収縮はない。まだ新鮮で新生血管が顕性で、いわゆる赤い膜。IV:より発達して、線維化が顕著で収縮が生じ、牽引性出血がしばしば旺盛。いわゆる白い膜の新鮮な時期。V:収縮し陳旧化した線維増殖膜で、新生血管は目立たなくなる。いわゆる白い膜の陳旧期。しばしば網膜剥離を伴い牽引性出血は目立たなくなる。術後の改善・不変・悪化のうち、改善:悪化の%は、IとIIで90:0、IIIで73:17、IVで34:49%であった。成績から、手術適応はIIIIが望ましく、IV以上では遅かった。増殖性い変化の型からは、進行したdiffuse型が最も悪く、table-top型がそれに次ぐ。hammockやtent型は良成績であった。網膜を牽引している増殖膜は、発達しないうちに、強く収縮する前に、黄斑が牽引されぬうちに切除すべきである。初回牽引性硝子体出血後1年以上追跡した161眼では、初回出血後6カ月以内に50%が硝子体手術を要した。また、増殖膜初発から半年以内に75%例が手術適応となった。出血や増殖膜初発から追跡できると治療時期を外れないで手術ができるため、成績が向上することがわかった。また、重症例での成績や手技の向上に、粘弾液分層法が極めて有効で、重症線維血管増殖膜が関与した本症牽引性網膜剥離182眼では、粘弾液分層法併用で改善75%、不変14%、悪化11%と、重症の割に良成績を得た。また、眼内ファイバースコープの併用で、従来の手術不能困難例での有効処理が可能になった。増殖組織の時期、病型、黄斑剥離の有無、粘弾液分層法や内視鏡の併用などを適切に配慮・選択すれば、手技の安全性と術後成績を極めて向上させることができる。
消化管分化の観点に立った胃癌の発症・進展・組織型決定の分子基盤の解明

胃sig/por癌由来細胞株で強く発現し、胃tub1/tub2/muc癌由来株で欠失し易いCTSEを同定した。胃癌手術症例の検討から、CTSEは胃形質、かつ、胃sig癌のマーカーと考えられた。内視鏡切除した腺腫/tub1/tub2症例では、胃マーカー発現は腫瘍部:tub2>tub1>腺腫、周辺部:腺腫>tub1>tub2、腸マーカー発現は腫瘍・周辺部のいずれも腺腫>tub1>tub2であった。一方、胃sig癌症例では癌・周辺部のいずれも胃マーカー発現が高く、腸マーカー発現が低かった。腺腫/tub1/tub2では『胃形質を失い、かつ、腸への分化が不十分な背景粘膜から、分化度の低い腫瘍が発生し』易く、sigでは『背景の胃形質を反映して発癌する』傾向が、示された。【結果】胃癌の分化型・未分化型で発現が異なると報告された約50遺伝子について、胃・大腸癌由来細胞30株で発現解析を行なった。胃印環細胞癌sig由来株・低分化腺癌por由来株で強発現し、高中分化型管状腺癌tub1/tub2由来株で発現の弱いCathepsinE(CTSE)に注目して、胃sig癌外科切除51検体を調べたところ、全症例で癌部のCTSE発現を認めた。他組織型の外科切除67検体では、tub1 30%(3/10例)、tub2 39%(7/18例)、乳頭腺癌pap 40%(4/10例)、por 58%(15/26例)、粘液癌muc0%(0/3例)と発現は様々であったが、sigのような高いCTSE発現は認めなかった。次に胃癌・胃腺腫の内視鏡治療切除検体におけるCTSE発現スコア(04点)を調べると、sig:3.6±0.4、adenoma:1.3±0.2、tub1:1.7±0.1、tub2:2.3±0.3、pap:2.1±0.3と、sig>tub2≒pap>tub1>adenomaの順にCTSE発現が低下していた。一方、病変周囲の正常胃粘膜におけるCTSE発現スコアは、sig:3.9±0.1、adenoma:3.2±0.3、tub1:3.0±0.1、tub2:2.2±0.1、pap:2.6±0.2であった。【結論】CTSEは胃印環細胞癌の有用なマーカーであり、胃印環細胞癌は『胃型形質が保たれ、腸型形質の発現が少ない』背景粘膜から、同じように『胃型形質が保たれ、腸型形質の発現が少ない』癌として発生することが示唆された。一方、胃分化型管状腺癌・胃腺腫は『胃型形質発現が失われた』背景粘膜であるほど『胃型形質発現が強く、分化度の低い』癌(腺腫)が発生し、『腸型形質の発現が強い』背景粘膜であるほど、『腸型形質発現が強く、分化度の高い』癌(腺腫)が発生することが示唆された。胃癌の発症や悪性度、あるいは組織型と関連して発現変動が報告されている約50の遺伝子について、32種類の消化管癌由来細胞株での発現解析を行ない、特に胃癌の組織型と関連しているものとして、CTSE遺伝子を同定した。5'-RACE法・Primer Walking RT-PCR・ESTパターン情報を組み合わせて、正確な転写開始部位を同定後に、その転写開始点の上流配列を増幅し、欠失変移を作製してLuciferase reporter assayを行ない、プロモーター領域を絞り込むことに成功した。複数の転写因子予測プログラムを組み合わせ、結合が想定される転写因子をリストアップしたが、候補遺伝子の制御に実際に関わっている転写因子の同定を現在も継続している。胃癌の外科手術切除・内視鏡的治療検体を用いて、CTSEの発現解析までを終了した。胃癌の組織型ならびに消化管分化のキー遺伝子としてCTSEの同定に成功し、その上流のプロモーター領域の絞り込みにも概ね成功している。また、CTSE遺伝子の発現制御におけるメチル化やヒストン修飾などエピジェネティックな機序の関与の解析についても、ほぼ終了した。しかし、これまで試行した幾つかの転写因子予測プログラムではCTSE発現の制御を担う転写因子は同定出来ておらず、難航している。一方、当初は平成24年度に予定していた胃癌の外科手術切除検体を用いたCTSE遺伝子の発現解析については早めに着手し、約120症例での発現解析を終了した。結果として、ほぼ予定通りの進捗状況である。

CTSE遺伝子の発現を制御する転写因子の同定を目指し、より新しい転写因子予測プログラムの使用を試みるととともに、様々な哺乳類動物のCTSE遺伝子上流配列の比較解析から、より重要なプロモーター領域の絞り込みを目指す予定である。また、当初の予定通り、より早期の段階での胃癌発症メカニズムの解明を目指し、内視鏡治療検体を用いたCTSE遺伝子の発現解析を行なう。この際には、CTSEのみではなく、MUC5AC・MUC2・MUC6・Cdx2・villinなどの様々な消化管分化マーカーの発現解析を同時に行なう予定である。各種試薬代:135万円実験機器代:30万円その他(印刷費、投稿費など):25万円学会発表のための出張費:12万円免疫染色ほかの実験助手の雇用のための謝金:78万円
広島原爆中性子に誘導された長寿命放射性同位元素の抽出

これまでの残留放射能測定を詳細に検討した結果、同位体比の測定値と計算値の間の食い違いは地上距離が1kmを超えるところにあった試料において顕著であった。これまで加速器質量分析を用いた我々の研究で用いてきた塩素抽出方法を改良し海水塩による希釈なく岩石から塩素を抽出することが可能になった。それは地上距離kmをこえた所の被爆岩石試料中の^<36>cl/cl加速器質量分析に役立つものである。塩素抽出は地上距離1kmを超える所で被爆した岩石試料を入手してから行う予定である。コンクリート試料は100ppm以上の塩素を含んでいた。雨水から混入した塩素は1g試料あたり8mlの純水を使って洗浄することを2回繰り返して除去した。コンクリートから抽出して作成したAgcl試料は、しかしながら別の元素を含んでいた。その元素の除去を現在行っている。タイルは20ppm以下の塩素しか含まず、その塩素に対する加速器質量分析は困難であった。^<41>Ca加速器質量分析を行うためのCa試料は地上距離1kmを超える所で被爆したコンクリートとタイルから作成した。その測定には^<41>Ca加速器質量分析における検出効率が向上することが必要である。^<152>Eu/Eu測定のために現在、1kgのコンクリートからEu元素を抽出中である。^<152>Eu放射能を測定するための予備的な研究を行った結果、簡便なNaI(Tl)検出器を用いて抽出したEu試料からの^<152>Euγ線を測定することができた。これは抽出したEu試料に測定の妨害となる自然放射性同位元素が含まれないことによる。中性子フル-エンスは、我々のこれまでの研究で示したように、同位体比測定とモンテカルロ計算によって評価していく予定である。^<*)>これまでの残留放射能測定を詳細に検討した結果、同位体比の測定値と計算値の間の食い違いは地上距離が1kmを超えるところにあった試料において顕著であった。^<*)>広島原爆・被爆岩石中の^<36>Cl/Clならびに^<41>Ca/Caの加速器質量分析試料を作成するために岩石試料からのこれらの元素の回収率を求めた。岩石試料(日本地質調査所製、JG-la)からのClとCaの回収率は過去の報告値^<1,2)>の誤差内で100%ならびに81%であった。この結果、現有設備で岩石試料中のClとCaを定量的に回収できると考えられる。広島原爆・被爆材中の残留放射能測定結果はいずれも線量評価システム1986(DS86)の中性子フル-エンスによる計算値を爆心付近で下回り、1km以遠で逆に上回る傾向を示している。しかし、個々の測定結果はばらつきが大きくどこで計算値と測定値が一致しているのか特定できない。Straumeら^<3)>のコンクリート中の^<36>Cl/Cl測定値は爆心から676mでもまだ計算値を下回っている。この付近で被爆岩石試料を入手できなかったため、爆心から約500mの位置にあったタイルからClとCaを取り出すことを試みた。タイルおよびコンクリート中の^<36>Clの一部は外部のClと入れ替わっている可能性がある。実験に用いた被爆タイルの粉末試料中のCl含有率は最初、約60ppmであったが純水による洗浄によって約20ppmにまで減少した。これは主にタイル中の有機物に付着していたClが流出したためと考えられる。このように用いたタイル試料中の安定なClの含有率は花崗岩試料よりも少なかった。これらの結果をふまえて加速器質量分析で十分な^<36>Clの計数が得られると予想されるCl試料を作成した。同時にCa試料も作成した。今後、さらに遠方の試料を作成していく予定である。

残留放射能の測定による中性子フル-エンスの測定を行いDosimetry System 1986(DS86)における中性子線量評価を検証することを目的に広島原爆被爆材中の中性子誘導放射性同位元素の抽出を試みた。同位体比^<36>Cl/Clの加速器質量分析による測定では^<36>Clの検出限界が低く、バックグランドのない測定が可能である。このことから爆心から離れた位置での中性子フル-エンスの測定に有利である。また、本研究者ら^<1)>が爆心付近で測定、計算してきた中性子スペクトルが遠方でどうなるかを知る上で重要な知見が得られる元素である。本研究者ら^<2)>が測定した被爆試料からの塩化銀試料中の^<36>Cl/Clの最小値は^<36>Cl/Cl=6・10^<-13>であり、これは地上距離1[km]においてDS86から推定される同位体比にほぼ同じである。そうした遠方試料について十分な精度で質量分析するには海水塩などで希釈せずに必要量の塩素を抽出できる試料が必要である。また、長年の風化に耐えて安定して存在している塩素のみを抽出しなければならない。そこで塩素含有量の高いコンクリート中に安定に存在していた塩素を回収する方法を実験的に検討した。実験では、ある被爆コンクリート試料を粉末化し100gあたり1000cm^3の純水で5時間攪拌洗浄した。これを5回繰り返した場合、洗浄水中に洗い流される塩素は無視できる濃度にまで低下し、試料中の塩素含有量は安定していることが確かめられた。その安定して存在する塩素含有量は140±4ppmであった。試料は爆心から約1kmで被爆しており、希釈なく塩素を回収することによって充分質量分析できる。質量分析に必要な塩化銀は2[mg]であるが、長時間の反復測定によって精度良く測定できるように10[mg]塩化銀試料を希釈無くコンクリート試料から抽出した。
先天奇形症候群におけるゲノム・エピゲノム連関

最近、エピジェネティックス制御分子の遺伝子異常が先天奇形症候群の原因であることが明らかになってきた。本研究では、これまで収集したRAS/MAPK症候群と類縁疾患の患者を対象にデスクトップ型次世代シークエンサーを用いて網羅的にエピゲノム関連遺伝子の検索を行った。これまでの解析にて3例にて既知のエピゲノム関連遺伝子の変異が同定された。また、申請者らが作製した、BRAF変異を発現するCFC症候群モデルマウス治療実験においてヒストン修飾酵素阻害剤の効果があることを明らかにし、そのメカニズムを明らかにするために蛋白レベルやRNAレベルでの遺伝子の変化について解析を行った。これまで収集したRAS/MAPK症候群患者のうち変異陰性患者96例について、デスクトップ次世代シークエンサーを用いて網羅的にエピゲノム関連遺伝子(DNAメチル化酵素、ヒストン修飾酵素、クロマチンリモデリング因子)を検索した。そのうち一例で既知のクロマチンリモデリング因子の変異が同定されたほかに、今までに報告の無い4種のバリアントが同定されている。現在これらのバリアントのサンガー法にて確認するとともに、サンプルの数を増やして解析を行っている。申請者らは最近CFC症候群モデルマウス作製に成功した。CFC症候群モデルマウス治療実験においてヒストン脱メチル化酵素阻害剤2剤(NCDM-32b, GSK-J4)の単剤投与と、GSK-J4とMEK阻害剤(PD0325901)との併用療法が、変異マウスの胎生致死を回避することが明らかになった。さらに、PD0325901以外のMEK阻害薬の効果や、それらとヒストン脱メチル化酵素阻害剤の効果も検討した。またヒストン脱メチル化酵素阻害剤とMEK阻害剤を投与したときの心表現型の変化、遺伝子・蛋白の発現を検討した。変異マウスの心臓において、ヒストン脱メチル化酵素の活性は野生型マウスと同等であった。また薬剤投与前後のヒストン脱メチル化酵素の蛋白量を検討したが、差は見られなかった。現在は薬剤投与前後のヒストン脱メチル化酵素mRNA量の変動の有無を検討している。デスクトップ型次世代シークエンサーを用いたRAS/MAPK症候群の診断システムの構築を開始した。これまでにRAS/MAPK症候群で同定されて遺伝子のみならず、その解析遺伝子としてDNAメチル化酵素、ヒストン修飾酵素、クロマチンリモデリング因子などを加えた系を構築した。今回構築したのは、既存の網羅的解析系の2つの方法であり、2つの方法の長所と短所も比較可能であった。これまでにRASopathiesと臨床診断された患者のうち、上記のエピゲノム修飾酵素・因子の既知の遺伝子変異が同定されたのは2人である。その他、これまでに報告のないバリアントも多数同定されてきた。今後これらのバリアントをSanger法で検証したのちにその臨床症状の検討を行なった。申請者らはすでにCFC症候群モデルマウスの胎生致死の回避にエピゲノム制御に関与する薬剤の効果について結果を得ている。薬剤投与前後のヒストン脱メチル化酵素阻害剤のmRNAの発現を解析したが、そのmRNAは投与前後での発現変動は認められなかった。CFC症候群モデルマウスにおける個々の遺伝子発現変動を明らかにするために、同腹の野生型マウスと変異マウスにおいて、胎生16日の心臓を取り出し、それらのマイクロアレイにてRNAの発現を網羅群的に解析した。マイクロアレイの解析の結果、RAS/MAPKシグナル伝達経路に関与する転写因子や、RAS/MAPKシグナル伝達経路のfeedbackに関与する酵素などが発現上昇することが明らかになり、アレイのデータをqPCRにて検証した。今回抽出した遺伝子の変化が、病態や阻害剤の効果に関与している可能性があると考えられた。デスクトップ型シークエンサーを用いた網羅的遺伝子解析の系が順調に構築でき、多くの症例に対して複数の遺伝子スクリーニングが可能になった。エピゲノム関連遺伝子のバリアントも検出もできた。CFC症候群モデルマウスにおいて、ヒストン脱メチル化酵素阻害剤単剤、あるいはMEK阻害薬との併用が効果を示すことが明らかになった。そのメカニズムの解明を目指し胎仔の心臓サンプルにおけるヒストン脱メチル化酵素活性測定や蛋白の解析を行った。分子遺伝学デスクトップ型シークエンサーを用いた網羅的遺伝子解析の系が順調に構築でき、多くの症例に対して複数の遺伝子スクリーニングが可能になった。今後は同定されてきたバリアントのSanger法での確認とその機能について検証していくとと共に、解析症例を増やして新たなバリアントの検出を試みる。なぜヒストン脱メチル化酵素阻害剤がBRAF活性化を示すCFC症候群モデルマウスの表現型改善に効果を示すのかはいまだに不明である。CFC症候群モデルマウスの臓器におけるエピゲノムの変化や遺伝子発現の網羅的解析を継続して行っていく。
赤血球特異的転写因子NF-E2とMaf関連蛋白質との会合による転写制御

本研究では、赤血球系転写因子であるNF-E2p45の機能が、Maf関連蛋白質との会合によりどのように調節されるのか、並びに、赤血球分化におけるMaf関連蛋白質とp45の機能とその作用機作を明らかにすることを目的とした。本年度は以下の成果をあげた。1.小Maf群蛋白質のうち、MafKをコードするマウスcDNAを単離した。すでに報告されているニワトリMafKとのアミノ酸配列の比較から、機能上重要と考えられる領域が明らかになった。2.mafK遺伝子の発現様式の詳細な解析を、正常骨髄細胞とマウス胚を材料に用いて行った。その結果、mafK遺伝子は血球細胞の分化に加え、間葉系細胞と神経細胞の分化にも深く関与することが推察された。3.MafKとp45のcDNAを培養細胞内で発現させ、転写因子としての機能を解析した。その結果、MafKは単独では転写抑制因子として機能すること、そしてp45それ自体のDNA結合活性は非常に低いことが明らかになった。一方、MafKとp45とのヘテロ二量体(NF-E2)は強くDNAに結合し、転写を活性化することも明らかになった。さらに、NF-E2による転写活性化に必須の領域を、p45分子上に同定した。4.マウス赤白血病細胞株を用いて、mafK遺伝子を亜鉛依存性に過剰発現する細胞株を樹立した。この細胞の解析から、MafKは赤血球の分化を促進することが明らかになった。また,MafKとヘテロ二量体を形成する未知の蛋白質の存在が明らかになった。
インターバンドラシュバを用いたスピン軌道ブロケードの最適化

今年度は、昨年度の研究を引継ぎ、以下のことを行った。(1)昨年度は、(001)InP基板上のエピ成長されたInGaAs二重量子井戸のエピ面をエピレディ(001)Siウェハ表面に接合し、(001)InP基板をおおよそ3umの厚さになるまで結晶研磨することに成功していた。今年度は、(001)InP基板を完全に除去するべく更なる化学機械研磨を行ったが、残念ながら剥離が激しく、測定に耐えうるデバイスを完成させることはできなかった。(2)昨年度修理した希釈冷凍機を用いて、歪のかかったInGaAs量子井戸試料の弱局在ー弱反局在転移を観察することに成功した。予備的な実験結果からすると、当初予想したドレッセルハウス効果の増大は顕著には見られていないようである。最終的な結論を得るには、今後の詳細な解析および追加の実験が必要である。(3)メソスコピック・リング配列構造で見られていた、時間反転経路間の干渉効果(AAS振動)の実験結果を定量的に再現する理論数値モデルの構築に成功し、論文を投稿した。(4)昨年度、海外共同研究加速化基金の援助を受けてブラジルサンパウロ大、米国パデュー大と議論を重ねた、二重量子井戸(DQW)デバイスにおけるインターバンド・ラシュバ効果を用いたエデルシュタイン効果増大法に関して、1年かけて計算手法を洗練させた。その結果、単一量子井戸で期待されるエデルシュタイン効果に比べ、DQWデバイスにおいては、40倍以上の大きさのエデルシュタイン効果を発生させられるという理論予測結果を得た。29年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、当初の研究計画に沿って、以下のことを行った。(1)(001)InP基板上のエピ成長されたInGaAs二重量子井戸のエピ面をエピレディ(001)Siウェハ表面に接合した。この実験は、シクロテンという樹脂を用い、北海道大学大学で仮接合を行った試料を、東北大学理学部所有のウェハー接合装置を用いてシンター(焼結)するという手順で進めた。(2)このウェハ接合体のSiウェハ側を結晶研磨器の試料貼り付け板にエレクトロワックスで固定し、元々630umの厚さがあった(001)InP基板をおおよそ3umの厚さになるまで結晶研磨した。(1)-(2)の実験1サイクルには12ヶ月の時間がかかるが、3度目のトライでようやく成功した。この試料に関しては、平成29年度に実験を引き継ぎ、デバイス作製を試みる。(3)今後の研究に必要な希釈冷凍機の修理を専門業者に依頼して行った。修理は2017年2月に完了し、2月末に専門業者と本研究代表者で、代表者の研究室にて動作確認を行った。(4)弱局在ー弱反局在効果を実空間シミュレーションで数値的に計算する手法を学生と共に開発し、論文発表を行った。(5)InGaAs二重量子井戸をスピン選択散乱体と考えてエデルシュタイン効果(電流誘起のバルクスピン偏極効果)をエンハンスする手法を考察した。この件に関しては、海外共同研究加速化基金の援助を受けてブラジルサンパウロ大の教授を招聘すると共に米国パデュー大学を訪問し、議論を重ねた。ウェハ接合は本研究での新たな試みであったが、事前の情報収集を念入りに行うことにより、試行錯誤の回数を少なく抑えて、結晶研磨に耐えうる接合強度を得ることができた。結晶研磨も過去に数回の試行実験を行ったことはあるが、実質的に今回新たに試みた実験であると言える。均一性や平坦性が、当初の目論見通りの精度で得られないことも考えられたが、目標とするレベルに達するものが得られた。希釈冷凍機の修理も、専門業者への発注であったが、必ずなおるという保証はなく、否定的な想定もしていたが、2017年2月末に専門業者と共に行った動作確認で、規定通りの冷却能力が回復したことを確認し、平成29年度の実験に使用することができる状態となった。