hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Diisopropanolnitrosamine誘発胆管細胞癌発生と胆汁酸負荷

この研究は、胆管細胞癌の発生増殖におよぼす胆汁酸負荷の促進効果を明らかにするために、ハムスターを用い、実験的に行われた。体重100g前後の雄性syrian golden hamsterの腰部皮下に、発癌物質としてdiisopropanolnitrosamine(DIPN)50mg/kg体重を週1回の頻度で10週間投与した。これらのハムスターを標準固型飼料投与のDIPN対照群、0.5%タウロコール酸ナトリウム含有飼料投与のDIPN-TCA群および0.5%デオキシコール酸ナトリウム含有飼料投与のDIPN-DCA群に分け、10-20週目の各種検索を行った。1.15週目以降に0.1-1.5cm大の結節状腫瘍の発生が各群の肝臓にみられ、いずれも異型性の強い緻密な結合織性間質を伴う胆管細胞癌であった。20週目の胆管細胞癌発生率はDIPN対照群が23%、DIPN-TCA群が60%およびDIPN-DCA群が59%であった。対照群と胆汁酸負荷両群との間に有意差をみた(p<0.05)。2.10および15週目の細胆管増生と胆管上皮の乳頭状増生の発生率や、それらの部位の上皮細胞におけるbromodeoxyuridine標識率およびmitotic indexは、胆汁酸負荷の両群に高く、対照群との間で一部に有意差があった(p<0.05,0.01)。3.10-20週における胆管胆汁中の胆汁酸組成比率についてみると、胆汁酸負荷の両群では一次胆汁酸の減少と二次胆汁酸のDCAの増加が認められ、特にDCA組成比率では対照群の値との間に有意差をみた(p<0.01)。以上の成績は、経口投与されたTCAおよびDCAが、DIPN誘発胆管細胞癌の発生増殖に促進効果を有することを示唆する。近年、発癌に対する胆汁酸の影響が注目されているが、胆管細胞癌においても発癌と胆汁酸の関連について検討した報告が散見される。しかし、一次胆汁酸が促進的に働くとするもの、二次胆汁酸が促進的に働くとするもの、胆汁酸の影響はないものなど、この課題には一定の見解をみない。本研究では、ハムスターに一次胆汁酸あるいは二次胆汁酸を経口投与し、これら胆汁酸負荷の胆管細胞癌発生増殖に及ぼす影響を、また、胆汁酸経口投与に基因する病態と発癌との関連を検索する。初年度に得られた成績は以下の如くである。1.体重:DIPN対照群の体重は20週まで漸次直線的に増加したが、DIPN-TCA群およびDIPN-DCA群の体重は10週目まで増加し以後減少し、20週目には処置前値に比し有意に低下した(p<0.05,0.01)。2.飼料摂取量:ハムスター1匹当りの1日の平均飼料摂取量についてみると、胆汁酸投与の両群の摂取量は対照群に比し有意に少なかった(p<0.01)。3.胆管細胞癌の発生増殖:実験開始後15週以後に腫瘍の発生をみた。15週目の胆管細胞癌発生率はDIPN対照群が0%,DIPN-TCA群が13%,DIPN-DCA群が29%で、20週目の発生率は各々23%,60%,59%であった。20週目に対照群と胆汁酸投与両群との間に有意差をみた(p<0.05)。

腫瘍個数も胆汁酸投与両群は対照群に比し多く20週目に有意差をみたが、腫瘍径には有意差が両者間でなかった。1.10-20週目のDIPN対照群の肝表面は正常ハムスターと同様であったが、胆汁酸投与群の胆臓は黄褐色、光沢を減じ、肝縁も鈍化していた。また、15週目以降では直径0.1-1.5cm大の乳白色結節状腫瘍の発生がみられ、異型性の強い、緻密な結合組織性間質を伴う胆管細胞癌が認められた。一方、同時期に嚢胞状を含む細胆管増生、胆管上皮の乳頭状増生、goblet cell metaplasiaなどの組織学的変化がみられたが、DIPN対照群と胆汁酸投与群との間でそれらの発生率に有意差はなかった。2.15週目におけるBrdU標識率をみると、胆汁酸投与両群の細胆管増生と乳頭状増生部の上皮細胞は、各々3.0または6.6%、および3.3または2.4%であり、DIPN対照群の1.4%および0.9%に比し有意に高率を示し、胆管細胞癌の標識率は胆管上皮細胞より更に高率であった。3.15週および20週目のmitotic indexをみると、胆汁酸投与両群の細胆管増生と乳頭状増生部の上皮細胞は、DIPN対照群に比し、明らかに高かった。また、胆管細胞癌のindexは胆管上皮より著しく高率であった。平成6年度に得られた成績は以下の如くである。10,15および20週目におけるDIPN-TCA群とDIPN-DCA群の胆管胆汁中のcholic asid組成比率は、DIPN対照群に比し、いずれの週でも明らかに低下し、一部において両者間に有意差がみられた(p<0.05)。deoxycholic acid組成比率はDIPN対照群が各々3.9,4.1および6.9%で、DIPN-TCA群が16.6,35.1および34.7%であり、DIPN-DCA群が26.9,35.4および40.3%であった。いずれの週においても胆汁酸負荷両群に比率は対照群に比し有意に高率であった(p<0.01)。2.その他胆汁酸組成比率3.一次あるいは二次胆汁酸のいずれを負荷しても胆管胆汁中では一次胆汁酸(CA)の減少と二次胆汁酸(DCA)の増加が生ずることから、二次胆汁酸(DCA)の胆管細胞癌発生に対する関与が推察された。
iPS細胞から肝細胞の製造を目指した肝細胞分化の解明

ヒトinduced pluripotent stem(iPS)細胞から肝細胞への分化する方法の開発を試みた。ブドウ糖、アルギニンを除きガラクトース、オルニチンを添加した培地にoncostatin M,アポトーシス阻害剤(M50054)等を添加した培地(hepatocyte differentiation inducer, HDI)を開発した。HDIで培養するとiPS細胞では未分化な肝細胞のマーカーであるalpha-feto protein(AFP)の発現が亢進した。HDIはiPS細胞から肝細胞への分化を促進する可能性が示唆された。ブドウ糖、アルギニンを除き、ガラクトースとオルニチンを添加し、oncostatin M等を添加したhepatocytee differentiation inducer(HDI)でヒトinduced pluripotent stem(iPS)細胞を培養すると肝細胞への分化を開始する。しかし7日で細胞は死滅する。そこで今年度はHDIと組み合わせて使用する市販培地を検討した。またiPS細胞から肝細胞への分化を促進する転写因子の組み合わせを検討した。iPS細胞をHDIで2日培養後市販培地に変更後7日培養し、RNAを抽出してリアルタイム定量PCR(qPCR)にて未分化な肝細胞のマーカーであるalpha-feto protein(AFP)の発現量を解析した。iPS細胞とヒト肝臓から抽出したRNA(Clontech)でcDNAマイクロアレイ解析を行い、肝細胞に特異的に発現している転写因子の解明を試みた。これらの転写因子の発現プラスミドを作成し、iPS細胞に導入後RNAを抽出してqPCRにてAFPの発現量を解析した。HDIに続いてWilliams' E(WE)培地で培養するとAFPの発現量が最も亢進することが判明した。HDIにつづけて使用する培地が比較的早期に明らかになった。cDNAマイクロアレイにおいて既存の文献を用いた絞り込みが比較的早期に終了した。本研究はヒトinduced pluripotent stem(iPS)細胞から肝細胞への分化誘導法の開発を目的としている。ブドウ糖とアルギニンは細胞の生存に必須である。肝細胞ではブドウ糖とアルギニンはガラクトース、オルニチンからそれぞれ解糖系、尿素サイクルを介して合成される。そこでブドウ糖とアルギニンがなく、ガラクトースとオルニチンを添加した培地にoncostatin M、アポトーシスインヒビター等を添加した培地(hepatocyte differentiation inducer、HDI)でiPS細胞を培養したところ、肝細胞への分化を開始していることが判明した。しかしHDIで培養後7日で細胞は死滅してしまう。そこでiPS細胞をHDIで培養後、市販の15種類の培地に交換後培養を継続し、肝細胞のマーカーであるalpha-feto protein(AFP)、albuminの発現量をリアルタイム定量PCR(qPCR)で解析したところ、Williams' E medium(WE)が最も両遺伝子の発現が亢進していることが判明した。HDIに続けてWEにて培養するとiPS細胞は肝細胞への分化を開始することが明らかになった。またiPS細胞にCEBPA、CEBPB、FOXA1、FOXA3を導入すると肝細胞への分化を開始することが明らかになった。HDIの問題は7日で細胞が死滅するので細胞の収穫が困難な点にあった。今回の検討では培地をWEに交換することで効率的に細胞の収穫が可能になった。HDIの問題を克服したと考えられる。今後培地をHDIからWEに交換後も成熟した肝細胞が得られない可能性はある。今回の検討ではCEBPA、CEBPB、FOXA1、FOXA3を導入すると肝細胞への分化がさらに促進されることが判明した。したがって現在までの進捗状況は概ね順調であると考えられる。ブドウ糖とアルギニンは細胞の生存に必須で、培地にこれらがないと細胞は死滅する。しかし肝細胞ではブドウ糖はガラクトースから糖新生、アルギニンはオルニチンから尿素サイクルを介して産生される。さらにoncstatinM、アポトーシス阻害剤(M50054)等を添加した培地hepatocyedifferentiation inducer(HDI)を作成した。ヒトinduced pluripotent stem(iPS)細胞をHDIで培養すると2日で未分化な肝細胞のマーカーであるalpha-feto protein(AFP)、肝細胞のマーカーであるalbuminの発現が亢進することを見いだした。HDIはiPS細胞から肝細胞への分化を促進する可能性が示された。しかし7日で細胞は死滅してしまう。そのためさらに長期に細胞が生存する方法の開発が必要であった。HDIで培養したiPS細胞をメタボローム解析すると乳酸が低下していた。乳酸を添加すると細胞は14日まで生存することが判明した。さらにAFP、albuminの発現が亢進していることが明らかになった。乳酸はブドウ糖とアルギニンがない環境でiPS細胞の生存を促し、肝細胞への分化を促進する可能性が示唆された。乳酸は解糖系の最終代謝産物である。運動により乳酸が筋肉に蓄積し疲労の原因となっている。乳酸はCoriサイクルによってブドウ糖に変換される。全身の細胞でCoriサイクルを有するのは肝細胞のみである。したがってブドウ糖とアルギニンがない環境では、iPS細胞はCoriサイクルを介して乳酸をブドウ糖に変換して生存する可能性がある。Coriサイクルを獲得する過程で肝細胞への分化が促進されると考えられる。

乳酸がCoriサイクルを介してiPS細胞の肝細胞への分化を促進することはこれまで報告がない。ヒトinduced pluripotent stem(iPS)細胞から肝細胞への分化する方法の開発を試みた。ブドウ糖、アルギニンを除きガラクトース、オルニチンを添加した培地にoncostatin M,アポトーシス阻害剤(M50054)等を添加した培地(hepatocyte differentiation inducer, HDI)を開発した。HDIで培養するとiPS細胞では未分化な肝細胞のマーカーであるalpha-feto protein(AFP)の発現が亢進した。HDIはiPS細胞から肝細胞への分化を促進する可能性が示唆された。ブドウ糖、アルギニンがなく、ガラクトースとオルニチンを添加した培地で長期間培養すると効率的にiPS細胞が肝細胞に分化することが期待される。そこで解糖系の阻害剤である3-bormopyruvate, 2-deoxy-d-glucoseをWEに添加してiPS細胞から肝細胞への分化誘導を試みる。今後は、HDIで肝細胞への分化が促進されるメカニズムの解明を試みる方針である。消化器内科学
ある種の差分方程式の性質解明と数値計算の活用

本課題は,延長により本年度が最終年度となったが,時間遅れをもつ感染症の数理モデルに関する研究として重要な2本の英論文(研究発表欄)が掲載された。これらはいずれも時間遅れを考慮した数理モデルに関する議論ではあるが,方向性が大きく異なる。1つ目は,時間遅れとフィードバック項を含むSIS感染症モデルの平衡点の大域漸近安定性について,アルバイトの大学院生の積極的な協力と共著者のアドバイスにより,連続型モデルでの解析と差分型モデルでの安定性の解明まで期限内に行うことができた。代表者が参加できなかった国際会議等では共著者が本成果を含む内容を発表している。2つ目は,代表的なSIR感染症モデルの時間遅れをもつ場合に対し,差分方程式を経由して導出した超離散方程式の解の安定性を議論することで,連続・離散・超離散モデルにおける相関性を新たに見つめ直したものである。これらの成果は後継の研究課題において,さらなる拡張や応用に役立つものと考える。本年度は数理モデルに関連する幾つかの差分方程式についての解明を進めた。先行研究の離散ハングリー・ロトカボルテラ系に基づく固有値計算手順をうまく活用することで、新たに複素固有ベクトルの計算方法まで大学院生の協力によって導出できた。また、超離散型病理モデルの漸近挙動などの解明については、数値実験の活用で、時間遅れを含む場合にまで拡張することができた。遅れを含まない場合の結果はすでに、本年度の国際会議や研究集会で発表しているが、遅れを含む場合の成果は、次年度の国際会議や国内の研究集会で発表する予定である。次年度にかけて、これらの最終的な成果を英文論文にまとめ、投稿する準備を進めている。一方、本年度から新たに着手した時間遅れを持つ離散ロジスティック方程式の安定領域について、可視化することで不安定領域の解明が進んでいる。これまで離散可積分系の問題に携わってきて、昨年度からは特に、超離散型モデルの性質に注目した新たな検証を進めている。具体的に昨年度は、インフルエンザなどの感染伝播を表す病理モデルの超離散型方程式について、時間遅れがない場合での安定性の十分条件や解の漸近挙動の証明を与えている。今年度にかけて、これらについて、ようやく時間遅れをもつ場合まで証明することができた。初期条件の与え方と十分条件との関連性に関しては、現在も検証を続けている。得られた成果は、中国・日本・韓国の数理生物学会の合同開催による国際会議や、可積分系の定例の研究集会にて発表したが、現状の証明過程があまりにも煩雑であるため、論文化にむけて、記号の付け方や証明過程を簡略化かつ明確化する作業を進めている。次年度にかけて、まずは論文を完成させて、異なる病理モデルに対しても同様に応用ができるか確認する。一方で、今年度は新たにロジスティック方程式について、時間遅れをもつ場合の超離散型モデルを導出して解挙動などを調べた。病理モデルでの結果と異なり、面白い周期性が見られたことから、研究集会で発表するに至っている。次年度は引き続き、遅れの大きさ・個数と解挙動との関連について検証を進める。なお、継続課題である離散可積分系に基づく固有対の数値計算アルゴリズムについて、共同研究として得られた成果を国際ワークショップにて発表し、proceedings用の英論文を投稿中である。本年度の前半は他の業務に時間を大幅に取られ、作業がなかなか進まなかった。後半にかけて、成果発表はできたが、論文化までは到達できなかった。ただし、昨年度から検討してきた証明の見通しが得られたことは重要であり、致命的な遅れとまではいえない。本研究課題で重要なテーマとなる時間遅れを持つ問題について、当該年度は、感染症モデルの超離散方程式での時間遅れの影響の解析を進めた。その結果として、連続・離散・超離散型モデルで、安定性解析の条件等の共通性を明示することができた。本件に関する論文を投稿していたが、2つの分野の境界領域のようでもあり、証明が煩雑で読みづらいこともあってか、査読プロセスが進みづらいことがあった。そこで、夏までに証明の手順を大幅に見直し、できるだけ簡略化したものを再投稿した。一方、一昨年の学会で既に実験的に得られた性質をポスター発表した超離散ロジスティック方程式に関する性質は、周期性が時間遅れの大きさに関与する理論的な裏付けが部分的には見えており、完全な証明を目指して解析を進めている。加えて、今までの継続課題として、被捕食を表す離散可積分系に基づく固有対の計算法の提案については、投稿していた論文がようやく掲載決定となった(印刷中)。次年度は、こちらの方程式にも時間遅れを想定し、新たな性質を見出せないか解明を続ける。継続課題に関して投稿していた論文が採録決定されたが(雑誌論文)、超離散型感染症モデルに時間遅れを考慮した論文は、雑誌のスコープに合わず投稿し直したことで、残念ながら年度内には採録に至らなかった。ただ、違うモデルに対する別論文を並行して完成させたので、致命的な遅れとまではいえない。今年度は,可積分系特有の手続きである超離散化に着目し,時間遅れをもつ感染症モデルの超離散型モデルを導出,連続型モデルと同等の定性的性質が保たれることを明示するに至った。また,この成果に関する論文が掲載された(雑誌論文1番目)。時間遅れをもつ方程式は渋滞のモデルなどで以前から知られてはいたが,超離散型モデルへの時間遅れの考慮や,遅れの大きさによる影響を具体的に記したものはあまり見受けられない。よって,今年度に得られた成果は超離散方程式において遅れの大きさまで言及した重要な成果といえる。

超離散型モデルは解挙動が単純化されて見えるので,遅れの与え方による時間発展の様子などを具体的に把握できる。そこで,今年度には実施しきれなかった適用範囲の拡張を次年度にかけて進めたい。また,解析がやや難しいと言われる,免疫を持たずに感受性保持者に戻る時間遅れ付きSIS感染症モデルに対し,連続型モデルと同等の解の正値性を保証する離散型モデルの導出や大域的性質まで,大学院生の協力も得て見出すことができた。この成果は数値実験も含めて,英論文として投稿しており,次年度は現実的なモデルに同じ手順を応用できるか検討する。一方,これまでに離散可積分系の共同研究として,被捕食を表す数理生物モデルの漸近挙動と固有値計算との関連を調べてきた。その一環として,複素固有ベクトルの計算方法や収束性について言及した成果が,今年度にようやく論文として掲載された(雑誌論文2番目)。平成29年度は論文が掲載されるに至ったので順調に進んでいるようにもみえるが,本申請課題の開始当初から,学内業務の多忙さによる遂行の遅れや,体調不良と世界情勢に依る出張キャンセルなどがあったため,計画全体が遅れている。本課題は,延長により本年度が最終年度となったが,時間遅れをもつ感染症の数理モデルに関する研究として重要な2本の英論文(研究発表欄)が掲載された。これらはいずれも時間遅れを考慮した数理モデルに関する議論ではあるが,方向性が大きく異なる。1つ目は,時間遅れとフィードバック項を含むSIS感染症モデルの平衡点の大域漸近安定性について,アルバイトの大学院生の積極的な協力と共著者のアドバイスにより,連続型モデルでの解析と差分型モデルでの安定性の解明まで期限内に行うことができた。代表者が参加できなかった国際会議等では共著者が本成果を含む内容を発表している。2つ目は,代表的なSIR感染症モデルの時間遅れをもつ場合に対し,差分方程式を経由して導出した超離散方程式の解の安定性を議論することで,連続・離散・超離散モデルにおける相関性を新たに見つめ直したものである。これらの成果は後継の研究課題において,さらなる拡張や応用に役立つものと考える。先行研究を見直すことで新たな計算手順を導くことに成功し、また、数値計算を活用することで差分方程式の理論的な性質を見通し良く検証することができた。今年度は、昨年度中に仕上げられなかった、時間遅れをもつ超離散型モデルに関する論文を完成させ、投稿することを最優先で行う。なお、証明過程の確認のために平衡点への収束履歴をグラフで表したところ、特有の動き方をするように見受けられたので、次年度にかけて精査する。また、この手順を非線形性の強いモデルにも応用できないか検討する。ある種の病理モデルに対し、連続型・離散型・超離散型での安定性の十分条件はほぼ同じになることがこの2年で解明された。そこで、まだ性質が解明されていない時間遅れをもつ数理モデルに対し、超離散化したときの挙動や安定性の十分条件等を探りたい。一方、昨年度に少し兆しが見えていた超離散型ロジスティック方程式については、研究集会での反応も大きかったため、解の周期性と時間遅れの大きさや個数との関連づけをさらに明確にできるよう検証を進める。
写像類群の部分群のコホモロジーの研究

平成23年度は以下の3種類の研究を行った.(1)Torelli群の3次のコホモロジー群について(河澄響矢東大准教授との共同研究)(2)超楕円的単純特異レフシェッツ束の位相構造について(早野健太氏との共同研究)(3)超楕円写像類群におけるDehnツイストの安定交換子長について(Danny Calegariカリフォルニア工科大教授,門田直之氏との共同研究)(1)(2)(3)のいずれも,写像類群,および,それに関係する群の構造に関する研究である.(1)においては,写像類群の最も重要な部分群の1つであるTorelli群に関して,その3次コホモロジー類であるねじれ係数森田-Mumford類を調べた.特にこのコホモロジー類が自明であるならば,Torelli群の2次コホモロジー群の次元が無限次元であることを示した.(2)においては,超楕円的単純特異レフシェッツ束という4次元多様体のもつ曲面ファイバー構造に関して2種類の結果を得た.1つはこのファイバー構造には自然な対合作用が存在する,という結果である.もう1つは,この曲面ファイバー構造をもつ4次元多様体の符号数公式の記述である.以上の結果に関してプレプリントを発表した.また,単純特異レフシェッツ束は具体例すら多くは知られていなかったが,特に多くの具体例を得ることもできた.(3)については,超楕円的写像類群という写像類群の部分群において,Dehnツイストの安定交換子長の計算を行った.特に,球面の写像類群上の擬準同型を複数構成することにより,その値の下からの評価を得た,これに関するプレプリントは現在執筆中である,本年度は主に、写像類群の部分群であるTorelli群の低次(コ)ホモロジー群について研究を行った。Torelli群は写像類群の正規部分群であり、整ホモロジー3球面の有限型不変量がこの群上の関数として現れるなど、低次元トポロジーにとっても基本的な対象である。Torelli群の1次(コ)ホモロジー群は決定されているが、2次以上の(コ)ホモロジー群は、有限階数をもつかどうかすらわかっていない。なお、特にTorelli群が有限表示可能であれば、2次コホモロジー群が有限生成であることが知られている。自身と河澄響矢東京大学准教授との共同研究において、Torelli群の2次コホモロジー群が有限次元有理シンプレクティック表現であれば、写像類群の3次コホモロジー類である(2,1)-ねじれ森田-Mumford類のTorelli群への制限が非自明であることが示されていたが、この類について以下で述べる3通りのアプローチを行った。1つ目に、A.Putmanにより得られたTorelli群の無限表示を用いて、この群の3次のサイクルを構成することを試みた。2つ目に、曲面の基本群に定まる、C. D. Papakyriakopoulosの交叉形式を用いて得られるこの群の2-コサイクルについて、その代表するコホモロジー類を調べた。しかし、以上の研究においてアーベリアンサイクルを除く非自明なホモロジー類、コホモロジー類は得られなかった。3つ目に、コホモロジー群の構造を調べることが可能である、Mess群などのいくつかのTorelli群の部分群において、(2,1)-ねじれ森田-Mumford類を調べた。その結果、これらの部分群においては自明であることがわかった。しかし、未だTorelli群の(2,1)-ねじれ森田-Mumford類が非自明であるかどうかは不明であり、より大きな部分群において、この類を評価する必要がある。平成23年度は以下の3種類の研究を行った.(1)Torelli群の3次のコホモロジー群について(河澄響矢東大准教授との共同研究)(2)超楕円的単純特異レフシェッツ束の位相構造について(早野健太氏との共同研究)(3)超楕円写像類群におけるDehnツイストの安定交換子長について(Danny Calegariカリフォルニア工科大教授,門田直之氏との共同研究)(1)(2)(3)のいずれも,写像類群,および,それに関係する群の構造に関する研究である.(1)においては,写像類群の最も重要な部分群の1つであるTorelli群に関して,その3次コホモロジー類であるねじれ係数森田-Mumford類を調べた.特にこのコホモロジー類が自明であるならば,Torelli群の2次コホモロジー群の次元が無限次元であることを示した.(2)においては,超楕円的単純特異レフシェッツ束という4次元多様体のもつ曲面ファイバー構造に関して2種類の結果を得た.1つはこのファイバー構造には自然な対合作用が存在する,という結果である.もう1つは,この曲面ファイバー構造をもつ4次元多様体の符号数公式の記述である.以上の結果に関してプレプリントを発表した.また,単純特異レフシェッツ束は具体例すら多くは知られていなかったが,特に多くの具体例を得ることもできた.(3)については,超楕円的写像類群という写像類群の部分群において,Dehnツイストの安定交換子長の計算を行った.特に,球面の写像類群上の擬準同型を複数構成することにより,その値の下からの評価を得た,これに関するプレプリントは現在執筆中である,
火砕流の流動・堆積に関する数値シミュレーション

本研究では火砕流による被害範囲を高精度に予測するため、以下のような検討を行った。まず、雲仙普賢岳で発生した火砕流に関する資料を基に、メラピ型火砕流の発生から流下に至る過程を調べてみた。その結果、流下開始直後の火砕流は、大きな溶岩ブロックで形成される粒状体流れとなっていること、その粒子が自爆や衝突などによってガスを噴出しながら細粒化するにつれて流動化現象(fluidization)が起こることなどが分かった。そこで、粒状体流れや流動化流れに関する研究をもとに、模擬火砕流に関する流路実験の結果を用いて、火砕流の抵抗則を導いた。粒子の細粒化過程に関しては、粒子の崩壊過程で生じる層流せん断がその主たる要因であると考え、粒子の衝突回数を速度勾配と粒子数密度を用いて評価した。これにより、粒子数の増加率を計算し、粒径、粒子数の時間的変化を表すことが可能となった。ついで、火砕流の堆積過程に関する流路実験の結果を基に、流動化流れにおける火砕流の堆積速度を求めた。この速度は堆積過程が静的な釣り合い条件から決定されると仮定した結果、得られたものである。以上のような検討をもとに、火砕流の流動・堆積現象に関する2次元数値シミュレーションモデルを構築した。このモデルを1991年6月3日に雲仙普賢岳において発生した火砕流に適用してみた。火砕流の供給量を50万m^3とし、流動化流れが生じる限界の粒径を1mmとして計算を行った結果、火砕流の堆積範囲をかなり良好に再現できることが判明した。
樹状細胞免疫療法における細胞導入法に関する実験的研究:生体顕微鏡による動態解析

超常磁性酸化鉄製剤により細胞標識したラット樹状細胞を塞栓物質とともに経門脈的に注入し、経時的にMRIを撮像ところ、塞栓物質を併用しなかったものより標識樹状細胞の肝臓への停滞に向上がみられた。塞栓物質を併用して細胞を経血管的に注入することにより、導入樹状細胞の肝内分布を向上できる可能性があると考えられるが、本研究では対象数が少ないことなどからさらなる検討が必要である。将来の臨床応用が期待される細胞や遺伝子の導入を用いた再生医療や癌免疫療法・遺伝子治療における有効な生体内細胞導入法の開発を目指し、本研究課題では肝癌に対する樹状細胞療法における生体への樹状細胞導入法を用いて研究する。従来の皮下注入、経静脈的注入、局所注入と異なる経動脈的(あるいは経門脈的)注入に種々のインターベンショナルラジオロジー技術を組み合わせた細胞導入法について、生体内での導入細胞の動態を巨視的および微視的(標的細胞との関わりを含めて)に明らかにする。それにより導入細胞の標的組織へ集積率を向上させ、かつそこで有効に機能させられる新しい細胞導入法の開発を行うことを目的とする。血管造影手技を用いた実験の遂行のため、家兎での樹状細胞の精製・培養、細胞標識を行必要がある。そのため、樹状細胞の精製ならびに培養のための条件検討を行っている。また、同時に生体顕微鏡にて肝内の血流状態を観察、記録する必要があるため、その条件検討もおこなっている。これらが確立したところで、今後、正常家兎を用いた生体顕微鏡観察により、肝血流動態の解析、樹状細胞の動脈内注入および門脈内注入時の動態解析を行う予定である。また、同時に臨床的にも多発性肝細胞癌を有する患者に対して、末梢血より単離・培養された樹状細胞を動注によって導入する治療を行っている。血管造影の手法を用いて肝癌の栄養動脈に選択的にマイクロカテーテルを挿入し、まず、リピオドールによる塞栓を施行して末梢流出路をブロックした後、樹状細胞を同じく肝癌の栄養動脈より注入し、ゼラチンスポンジ細片で塞栓することにより、肝癌への選択的な樹状細胞注入とともに血流のブロックを行う方法である。樹状細胞注入手技に際して合併症の発生は認めず、術後にも特に合併症の発生は認めていない。本研究課題では肝癌に対する樹状細胞療法における生体への樹状細胞導入法を用いて研究する。従来の皮下注入、経静脈的注入、局所注入と異なる経動脈的(あるいは経門脈的)注入に種々のインターベンショナルラジオロジー技術を組み合わせた細胞導入法について、生体内での導入細胞の動態を巨視的および微視的(標的細胞との関わりを含めて)に明らかにし、それにより導入細胞の標的組織へ集積率を向上させられる細胞導入法の開発を行うことを目的とする。血管造影手技を用いた実験を行うためには、家兎を用いて樹状細胞の精製・培養、細胞標識を行うことが望ましい。そのため、樹状細胞の精製ならびに培養のための条件検討を行っているが、安定して家兎樹状細胞を精製ならびに培養する条件設定には至らなかった。また、生体顕微鏡にて肝内の血流状態を観察、記録する必要があるため、その条件検討もおこなっているが、我々が現有する生体顕微鏡での家兎肝内血流の観察が難しいことが判明した。今後、これらの条件を再検討し、家兎を用いた生体顕微鏡観察により、肝血流動態の解析、樹状細胞の動脈内注入および門脈内注入時の動態解析を行う予定であるが、技術的に観察が困難である場合には、観察可能なラットを用いた検討への変更も考慮する。また、生体顕微鏡で十分な観察が行えない場合は、樹状細胞を超常磁性酸化鉄製剤で標識し、MRIを用いて動態を観察する方法も考慮する。同時に臨床的にも多発性肝細胞癌を有する患者に対して、末梢血より単離・培養された樹状細胞を動注によって導入する治療を継続して行っていく。本研究課題では、肝癌に対する樹状細胞療法における生体への樹状細胞の導入について、インターベンショナルラジオロジー技術を組み合わせた細胞導入法の有効性を検証することを目的として、実験的検討に取り組んだ。当初、家兎での樹状細胞の精製・培養、細胞標識、そして生体顕微鏡観察による樹状細胞の動態解析を計画したが、実験環境、設備、薬品等の問題により家兎樹状細胞の精製、培養、生体顕微鏡による観察が困難と考えられた。また、その一方で施設に動物実験が可能なMRI装置が導入され、MRIを用いた動物実験を行うことが可能な環境が整った。そこで、ラットを用いて樹状細胞の動態をMRIを用いて観察することにした。ラット全血を採取後、密度勾配遠心分離にて単球相を回収し、GM-CSF、IL-4を添加した培地で培養することにより樹状細胞を誘導・単離した。この樹状細胞の培養液に超常磁性酸化鉄製剤およびトランフェクション試薬を添加することにより、樹状細胞を磁性的に標識した。その後、ラットを全身麻酔下に開腹し、標識樹状細胞を経門脈的に注入した。

その際、標識樹状細胞を単独注入するラットと塞栓物質(リピオドール、ゼラチンスポンジ細片)を併用して標識樹状細胞を注入ラットを設定した。樹状細胞門脈注入後は、経時的にMRI T2強調像、T2^*強調像を撮像し、磁性的に標識された樹状細胞の肝内動態を観察した。その結果、樹状細胞門脈注入直後の標識樹状細胞の分布は、塞栓物質を併用したラットのほうが良好であった。塞栓物質を併用して経血管的に導入することにより、導入樹状細胞の肝内分布が改善する可能性があることが期待されるが、本研究では対象の数が少ないこと、経動脈的注入ではないことなどから、ただちに臨床的な効果を予測することはできない。今後、数を増やし、経動脈的注入についても評価するが臨床応用を目指す上では必要となる。
腸炎ビブリオの迅速な現場即応型検査法の開発

本研究では,腸炎ビブリオATP合成酵素δサブユニットに対する2種類の単抗体(MAb-VP34とMAb-VP109)を用いて、イムノクロマト法による腸炎ビブリオの迅速同定法(VP-ICA法)を構築した。VP-ICA法は、試験に供した腸炎ビブリオ124株全てに陽性反応を示す一方で、腸炎ビブリオ以外の菌種93株(ビブリオ属菌27菌種53株、非ビブリオ属菌35菌種40株)には陰性反応を示した。VP-ICA法による分離菌の同定にかかる時間は30分程度で,特別な機器も必要としないことから,VP-ICA法は腸炎ビブリオの迅速・簡便な同定法として有用であると考えられた。本研究は、腸炎ビブリオの迅速な現場即応型の検査法(イムノクロマト法;ICA法)の開発を目的とする。すでに申請者らは、腸炎ビブリオに高い特異性を示すモノクローナル抗体(MAb)(MAb-VP34と命名)を保有しており、さらにこのMAbはF0F1-ATP合成酵素デルタサブユニットを認識していることが判明している。本年度は、MAb-VP34と昨年度作出したMAbのうち「MAb-VP109」と命名したMAbを組み合わせたICA法による腸炎ビブリオの迅速同定法を構築した。本ICA法は、試験に供した腸炎ビブリオ124株全てに陽性反応を示し、腸炎ビブリオ以外の菌種93株(ビブリオ属菌27菌種53株、非ビブリオ属菌35菌種40株)に対しては全て陰性反応を示したことから、腸炎ビブリオの同定に十分な精度を有していると考えられた。生化学的性状試験による従来法(培養法)では、分離平板上の腸炎ビブリオのコロニーを同定するのに3日間を必要とするが、本ICA法は直接「分離平板上のコロニー」から試験を行うことが可能であるため、同定にかかる時間は30分程度である。さらに、本ICA法は特別な機器を必要としないことから、規模が小さい検査場でも導入が容易である。そのため、本ICA法は腸炎ビブリオの迅速・簡便な同定法として有用であると考えられた。本研究の目的は、腸炎ビブリオの迅速な現場即応型の検査法(イムノクロマト法;ICA法)の開発である。すでに申請者らは,腸炎ビブリオに高い特異性を示すモノクローナル抗体(MAb)(MAb-VP34と命名)を保有しており、さらにこのMAbはATP合成酵素δサブユニットを認識していることが判明している。本年度は、ICA法を開発するため、大腸菌で発現誘導させたリコンビナントATP合成酵素のδサブユニットを免疫抗原に用いて、本抗原をMAb-VP34と挟みこめるMAbを複数作出した。作出したMAbのうち「MAb-VP16」と命名したMAbと、MAb-VP34とを組み合わせて構築したICA法は、特異性を検討した結果、試験に供した腸炎ビブリオ全てとV. natriegensに陽性反応を示し、腸炎ビブリオ以外の菌種に対しては,V. natriegensを除いて,陰性反応を示した。本ICA法では、V. natriegensに対して交叉反応を示したため、食品の増菌培養液からの腸炎ビブリオの検出に応用するのは難しい。しかし、V. natriegensはTCBS寒天培地上で白糖分解性の黄色コロニーを形成し、緑色コロニーを形成する腸炎ビブリオとは容易に鑑別可能であることから、本法は分離平板上の腸炎ビブリオのコロニーの同定に応用可能であると考えられた。分離平板上の腸炎ビブリオのコロニーを同定するのには、生化学的性状試験による従来法では3日かかるが、本ICA法による同定にかかる時間は30分程度で、特別な機器も必要としないことから、本ICA法は腸炎ビブリオの迅速・簡便な同定法として有用である。本年度は、MAb-VP34を用いて、サンドイッチ検出系であるICA法を開発するために,ATP合成酵素をこのMAb-VP34と挟みこめるもう一つのMAbを作出することを目的に研究を行った。その結果、大腸菌で発現誘導させたリコンビナントATP合成酵素のδサブユニットを免疫抗原に用いて、本抗原をMAb-VP34と挟みこめるMAbを複数作出した。そのうちの1つのMAb(MAb-VP16)を用いて作製したICA法では、分離平板上の腸炎ビブリオのコロニーを簡便に同定することが可能であった。

また、現在検討を行っている「MAb-VP109と命名したMAbとMAb-VP34を用いて作製したICA法」では、検討している範囲で腸炎ビブリオに特異的であることが判明しており、平成25年度はこれを用いて、食品増菌培養液からの腸炎ビブリオの検出について検討を行う予定である。本年度に予定していたMAbのエピトープ解析は未実施だが、その他は研究計画どおりに進んでいる。現在検討を行っている「MAb-VP109とMAb-VP34を用いて作製したICA法」では、検討している範囲で腸炎ビブリオに特異的であることが判明しており、平成25年度はこれを用いて、食品増菌培養液からの腸炎ビブリオの検出について検討を行う予定である。しかし、現在構築中のこのICA法の感度は10の7乗CFU/ml程度であり、食品の増菌培養液から腸炎ビブリオを検出するためには、10の6乗CFU/ml程度の感度が要求されることから、課題を達成するためには現在検討中の系よりも少なくとも10倍以上系の検出感度を上げなければならない。そのため、研究計画を一部変更し、MAbを標識する粒子に、金コロイドだけでなく、金コロイドよりも10倍程度粒径が大きい着色ラテックス粒子を加え、系の感度上昇を図る。MAbのエピトープ解析は、本年度での実施を計画していたが、未実施である。そのため、エピトープ解析分の費用を平成25年度に繰り越し、平成25年度にエピトープ解析を実施する。その他は、当初の研究費の使用計画に大きな変更はない。
嗅覚入力を行動出力へと変換する神経回路基盤の解明

ゼブラフィッシュの嗅覚行動を担う神経回路基盤の解析を行った。性フェロモンであるプロスタグランジンF2α(PGF2α)の嗅覚受容体を同定し、受容体機能を欠損したオス変異体は、メスに対する求愛行動の持続時間が短くなることを見出した。また、PGF2αの嗅覚入力によって、終脳腹側部腹側核および視床下部の複数の領域が活性化されることが明らかとなった。一方、食物に由来するATPやアラニンはゼブラフィッシュの誘引行動を引き起こし、嗅球-視床下部直接経路を構成する後方結節など、複数の共通した脳領域を活性化することが明らかとなった。さらに、異なる匂いによって特異的に活性化される脳領域を同定した。研究代表者らはこれまでに、ゼブラフィッシュの嗅球と間脳を直接結ぶ2つの嗅覚経路(手綱核経路,視床下部経路)の存在を見いだした。これらの神経回路素子は感覚入力から運動出力への迅速な変換を司る可能性が示唆される。本研究では、「嗅球-間脳」直接経路をモデルシステムとして、嗅覚入力から行動出力に至る神経回路メカニズムの解明にアプローチした。1手綱核経路を活性化する匂い分子群の同定手綱核に投射する嗅球出力ニューロンは、特定の糸球体群(内背側および内腹側)と接続していることが明らかとなっている。また最近、MAPキナーゼのリン酸化(pErk)が、活性化された糸球体を同定するための良いマーカーになることを見いだした。各種化学物質単体および生命活動と関連した未精製組織抽出物によって、ゼブラフィッシュの嗅細胞を刺激し、pErk免疫組織化学法で活性化された糸球体を解析した。その結果、これまで知られていた匂い物質とは全く異なる刺激によって、内背側糸球体が活性化されることが明らかとなった。2視床下部領域の三次嗅覚ニューロンの同定視床下部領域の後方結節で嗅覚情報を受け取る三次ニューロンを同定するために、シナプス前部に局在する蛍光タンパク質(Synaptophysin-GFP)や、経シナプス性トレーサーWGAなどのレポーター分子を、嗅球出力ニューロンで発現するトランスジェニック系統を樹立した。視床下部領域におけるレポーター分子の局在を解析したところ、Synaptophysin-GFPシグナルの一部は、ドパミンニューロンの神経線維に近接して存在していた。また、ドパミンニューロンの一部で、嗅球出力ニューロンに由来するWGAの取り込みが観察された。これらの結果から、後方結節ドパミンニューロンが嗅覚情報を受け取ることが示唆された。1嗅覚行動出力に対する手綱核経路の役割の解析前年度までの解析から、手綱核に投射する嗅球出力ニューロンは内背側糸球体群(mdG)と接続し、これまで知られていた匂い物質とは全く異なる化学物質によって活性化されることが明らかとなっている。また、これらの化学物質は嗅覚系だけでなく他の感覚系も同時に活性化する可能性が示唆されている。したがって、嗅球-手綱核経路の役割を解析するためには、mdGに入力する嗅細胞のみを特異的に活性化して、その出力行動を解析する必要がある。そこで、薬理遺伝学的に特定のニューロンを活性化できるトランスジェニックゼブラフィッシュ系統の樹立を行った。哺乳動物のTRPV1はカプサイシンや熱によって活性化される陽イオンチャネルであるが、最近、ゼブラフィッシュのTRPV1はカプサイシンに非感受性であることが示された。すなわち、哺乳動物のTRPV1をゼブラフィッシュに発現させると、カプサイシン依存的に特定のニューロンを活性化することが可能となる。そこで、ラットのTRPV1をGal4/UASシステムを介して発現するトランスジェニック系統を樹立した。2嗅覚行動出力に対する視床下部経路の役割の解析前年度までの解析から、ゼブラフィッシュ視床下部の後方結節に存在するドパミン作動性ニューロンが嗅覚情報を受け取る三次ニューロンであることが示唆された。嗅覚行動出力に対する役割を解析するために、嗅球-視床下部経路の機能を遺伝子工学的に操作するツールの開発を行った。視床下部ドパミンニューロンのシナプス伝達の阻害を目的として、テトラサイクリン制御性遺伝子発現システムを介してテタヌス毒素軽鎖を発現するトランスジェニック系統を樹立した。また、視床下部ドパミンニューロンの選択的除去を目的として、Gal4/UASシステムにより弱毒型ジフテリア毒素を発現するトランスジーンを構築した。前年度までに、嗅覚行動出力に対する手綱核経路および視床下部経路の役割を解析する遺伝学的ツールとして、特定のニューロンサブセットを賦活、抑制、除去するためのトランスジェニックゼブラフィッシュ系統を樹立している。これらのトランスジェニック系統が実際に嗅覚行動に関わる神経回路素子の解析に有用であるかどうかを検証するためには、様々な視点から嗅覚行動を解析できる行動実験システムの確立が必須である。研究代表者らはこれまでに、食物に由来するアミノ酸に対する誘引行動や、ゼブラフィッシュ皮膚抽出物中の警報フェロモンに対する恐怖反応を解析する行動実験システムを確立している。本年度はさらに、多様な匂いに対する行動応答の検出を目的として、流水式2チャンネル選択水路装置を構築し、匂いに対する誘引および忌避反応を同時に解析可能な行動実験システムを確立した。また、嗅覚を介した生殖行動を詳細に解析するために、メスに対するオスの求愛行動に3つのパラメーター(追尾、つつき、回り込み)を設定し、その時間と回数を測定することで、求愛行動の定量的解析法を確立した。

この過程において、排卵期のメスから放出される性フェロモンであるプロスタグランジンF2aの嗅覚受容体を同定し、その受容体の機能を欠損したゼブラフィッシュ変異体をゲノム編集技術によって作製した。前述の求愛行動の定量解析システムを用いてオス変異体の行動を解析したところ、3つのパラメータによって規定されるメスへの求愛行動の持続時間が著しく減少することが明らかになった。使用を予定していたトランスジェニックゼブラフィッシュ系統の樹立に想定以上の時間を要した。さらに、そのうちの一部の系統に寄生虫感染が認められ、系統清浄化が必要となり実験の実施が延期となった。ゼブラフィッシュの嗅覚行動出力における嗅球-間脳直接経路の役割を解析するために、前年度までに様々な行動実験システムの確立を行ってきた。本年度は、食物に由来する匂い成分と考えられるATPについて、ゼブラフィッシュの行動応答とその神経回路メカニズムに注目して解析を行った。ゼブラフィッシュはATPに対して誘引行動を示し、その行動応答は、同じく食物に由来するアミノ酸の一種であるアラニンよりも低濃度で誘起された。嗅上皮におけるATPの受容メカニズムを解析したところ、魚類や両生類のゲノムに特異的に存在する新規アデノシン受容体A2cが嗅覚受容体として機能することが明らかとなった。さらに、ATPは鼻腔内で細胞外核酸加水分解酵素によって積極的かつ速やかに分解され、産生されたアデノシンがA2c受容体を活性化して嗅覚応答を誘起することを見出した。また、ATPに対する行動応答にともなって活性化する高次脳領域をc-fos遺伝子の発現によって解析したところ、終脳および視床下部の複数の領域が活性化されることが明らかになった。視床下部の後方結節は嗅球-間脳直接経路を構成するが、ATPとアラニンのどちらの嗅覚入力でも活性化されることから、匂いによって誘起される誘引行動と密接な関連があることが示唆された。さらに、ATPのみによって活性化する領域が視床下部に存在することも明らかとなり、アミノ酸とは異なるATPの嗅覚入力に特異的な行動学的・生理学的機能の存在が示唆された。ゼブラフィッシュの嗅覚行動を担う神経回路基盤の解析を行った。性フェロモンであるプロスタグランジンF2α(PGF2α)の嗅覚受容体を同定し、受容体機能を欠損したオス変異体は、メスに対する求愛行動の持続時間が短くなることを見出した。また、PGF2αの嗅覚入力によって、終脳腹側部腹側核および視床下部の複数の領域が活性化されることが明らかとなった。一方、食物に由来するATPやアラニンはゼブラフィッシュの誘引行動を引き起こし、嗅球-視床下部直接経路を構成する後方結節など、複数の共通した脳領域を活性化することが明らかとなった。さらに、異なる匂いによって特異的に活性化される脳領域を同定した。研究開始当初の予想に反して、手綱核経路を活性化する化学物質(匂い物質)が他の感覚系も同時に活性化する可能性が示唆されたため、特定の神経回路のみを活性化できる薬理遺伝学的ツールの作製が必要となった。また、視床下部経路の解析用に予定していた突然変異体が入手できず、視床下部経路の機能操作のための遺伝子工学的ツールの作製が新たに必要となった。
ヘパリンコファクターIIの新規動脈硬化・血栓症抑制作用の発見と臨床応用に関する研究

我々は二つの臨床研究を行い、ヘパリンコファクターII(HCII)の生理機能を初めて明らかにしてきた。即ち,(1)PCIを受けた134症例について解析した結果、PCI後のステント再狭窄率はHCII活性が110%以上の患者では6.7%(3/45)、80-110%では18.5%(15/81)、さらに80%未満では30.0%(12/40)と、110%以上の患者では80%未満の患者に比べ有意に(p=0.0039)再狭窄率が低下すること(Circulation,2004;109:481-486)、(2)既に何らかの動脈硬化の危険因子を有する40-91歳の306名についてHCII活性と頚動脈内膜中膜肥厚度(IMT)でみた動脈硬化病変進行度との関連性について解析した結果、HCII活性が低下するにつれてIMTの厚さが強くなるという負の相関を認め、多変量解析でもHCIIはIMTを抑制させる因子であること(Circulation,2004;109:2761-2765)、である。一方、HCIIノックアウトマウスを用いて大腿動脈カフ傷害モデルを作製し、惹起された動脈硬化がヒト純化HCIIの補充で抑制できるか、について解析を進めた。その結果、ヘテロHCIIノックアウトマウスはカフ傷害により内膜・中膜比が0.78±0.22と野生型マウスでの0.25±0.06に比べ著明に増加し、また外膜・中膜比も2.55±0.41と野生型の1.33±0.18に比べ有意に増加しており、HCIIの低下によりカフ傷害により動脈の内膜と外膜の著明な肥厚が惹起されることが示された。さらに、これらの大腿動脈カフ傷害モデルマウスにヒト純化HCII(45mg/kg)を腹腔内投与することによりヘテロHCIIノックアウトマウスでの血中HCII活性は直後には約200%にまで増加し、48時間以上HCII活性を100%以上に維持できる結果を得た。我々は、従来より考えられてきたHCIIの機能としての静脈血栓抑制作用はその主たるものではなく、HCIIは動脈血管壁において産生されたトロンビンを迅速に不活化し、血管平滑筋細胞の形質転換を抑制することにより血管リモデリング進行さらに動脈硬化病変形成を制御していると考えた。この仮説の基に、血管平滑筋細胞の増殖が主病変を占める経皮的冠動脈形成術(PCI)後のステント再狭窄率について血中HCII活性が80%未満の群、80-110%の群、および110%以上の群の3群間で比較した結果、110%以上の群では80%未満の群よりも有意に(p=0.0039)再狭窄率が抑制されることを明らかにした(Circulation,2004;109:481-486)。

さらに、血中HCII活性と頸動脈内膜中膜肥厚度(IMT)の関連性について306名の高齢患者で解析した結果、HCII活性が上昇する程IMT値が低下することを見いだし、HCII活性は頸動脈硬化を抑制する新たな予測因子であることを明らかにした(Circulation,2004;109:2761-2765)。このように、我々はHCIIの新規機能として新生内膜肥厚および粥状動脈硬化を抑制する新規血漿蛋白であることを明らかにした。このHCIIの病態生理的機能をさらに解明するため、HCII欠損マウスの作製を行い、ホモ欠損マウスは胎生致死であることを見いだした。そこで、ヘテロ欠損マウスを用いて大腿動脈カフ傷害モデルでの血管リモデリングの変化を野生型マウスと比較した。その結果、傷害4週後において野生型マウスでは新生内膜肥厚および外膜肥厚は軽度であるが、ヘテロマウスでは両者とも著明に増加している成績を得た(内膜/中膜比、野生型0.25;ヘテロ0.78,p<0.01、外膜/中膜比、野生型1.4;ヘテロ2,6、p<0.01)。今後、HCIIの補充効果について解析を進める予定である。我々は二つの臨床研究を行い、ヘパリンコファクターII(HCII)の生理機能を初めて明らかにしてきた。即ち、(1)PCIを受けた134症例について解析した結果、PCI後のステント再狭窄率はHCII活性が110%以上の患者では6.7%(3/45)、80-110%では18.5%(15/81)、さらに80%未満では30.0%(12/40)と、110%以上の患者では80%未満の患者に比べ有意に(p=0.0039)再狭窄率が低下すること(Circulation,2004;109:481-486)、(2)既に何らかの動脈硬化の危険因子を有する40-91歳の306名についてHCII活性と頚動脈内膜中膜肥厚度(IMT)でみた動脈硬化病変進行度との関連性について解析した結果、HCII活性が低下するにつれてIMTの厚さが強くなるという負の相関を認め、多変量解析でもHCIIはIMTを抑制させる因子であること(Circulation,2004;109:2761-2765)、である。一方、HCIIノックアウトマウスを用いて大腿動脈カフ傷害モデルを作製し、惹起された動脈硬化がヒト純化HCIIの補充で抑制できるか、について解析を進めた。その結果、ヘテロHCIIノックアウトマウスはカフ傷害により内膜・中膜比が0.78±0.22と野生型マウスでの0.25±0.06に比べ著明に増加し、また外膜・中膜比も2.55±0.41と野生型の1.33±0.18に比べ有意に増加しており、HCIIの低下によりカフ傷害により動脈の内膜と外膜の著明な肥厚が惹起されることが示された。さらに、これらの大腿動脈カフ傷害モデルマウスにヒト純化HCII(45mg/kg)を腹腔内投与することによりヘテロHCIIノックアウトマウスでの血中HCII活性は直後には約200%にまで増加し、48時間以上HCII活性を100%以上に維持できる結果を得た。