hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
セミステイブルな対数的スムース退化上の混合ホッジ構造の研究

平成29年度当初は、平成28年度に得られた等式L=W(N)の証明のミスを再検討する過程で、L=W(N)のヴァリアントである等式L(I)=W(N_I)を証明することに成功した。ここでは、El Zeinのフィルター付き混合ホッジ複体の理論を巧妙に適用して、ウェイト・スペクトル系列のE_2退化を示すことが証明の鍵である。これにレフシェッツ加群の議論を組合せることにより、L(I)=W(N_I)を得る。次に相対対数的ドラームコホモロジー群上の偏極について研究を進めた。単体的な対象(K,W,F)およびその上の積・トレース射を構成し、さらにAとKを結び付る擬同型A ---> Kを用いて(A,L,F)が定めるコホモロジー群上の偏極を得るという当初の方針は、計算が極めて複雑で実行不可能であることが判明した。そこで、(A,L,F)上に直接偏極を定義することを試み、現在この新しい方針について、ほぼ見通しを立てることに成功した。ここでは、(K,W,F)を単体的な対数的ド・ラーム複体(Omega, W, F)におきかえることが鍵となる。この(Omega, W, F)上では、積やトレース射の計算は簡略化され、また射A ---> Omegaの構成もより簡明になる。(K,W,F)とは異なり、射A ---> Omegaは擬同型にはなり得ないが、(A,L,F)から得られる混合ホッジ構造に偏極を定めるだけの十分に良い性質を持っていることが判明しつつある。現在、細部の議論を詳細に検討している。平成29年度当初、平成28年度に得られていた等式L=W(N)の証明において、多重レフシェッツ加群に関する議論の中にミスを発見し、再考を余儀なくされた。しかし、従来のレフシェッツ加群の議論を詳細に再検討することによりL=W(N)を正しく証明することに成功した。この再証明に時間を要したため、平成29年度中には相対対数的ドラームコホモロジー群上の偏極の構成まで終えるという当初の計画よりも遅れ、現在は偏極の構成の途中段階に留まっている。しかしながら、上述の再証明の過程でL=W(N)のヴァリアントであるL(I)=W(N_I)が証明できたことは、大変重要な成果である。この結果によって、相対対数的ドラームコホモロジー群上のフィルトレーションの族L(I)に関して、より詳細かつ深い理解が得られたことは特筆すべき成果であると考える。さらに、この再証明の過程で多重レフシェッツ加群の理論に当初予期していた以上の困難があることが判明したが、研究対象としてより一層興味深いものであることも明らかになった。現在、この方向の研究は休止状態であるが、折をみて再開して行くつもりである。一方、当初予定していた、偏極の構成についてであるが、「研究実績の概要」にも記したように、手法に関して多少の方針変更が生じたものの、早期に新しい方法を見出したことにより、偏極の構成という所期の目的を達成できることが十二分に期待される状況まで進展した。現在、細部にわたって議論の詰めを行なっているところであるが、見通しは明るいものと考えている。この様に、当初の予定からは多少遅れているものの、予期していなかった重要な成果を得たこと等を総合し、研究は概ね順調に進んでいるものと認識している。射影的かつセミステイブルな対数的スムース退化X ---> *の相対対数的ドラームコホモロジー群が持つ混合ホッジ構造が、カタニ・カプラン・シュミットの偏極混合ホッジ構造と一致することを示すことが本研究の中心目標であった。
認識機能を有する脂質膜の強相関的な集合構造の動的制御と機能解析

本研究では生体膜モデルである単分子膜を用いた糖脂質あるいはペプチド脂質のドメイン構造の形成機構の要因である非共有結合について解析し、脂質膜構造と受容体機能との関連を解析した。スフィンゴ糖脂質を含んだ脂質組成の気-液界面単分子膜を作製し、マイカ基板などに累積して、脂質膜組成に依存したドメイン構造について原子間力顕微鏡(AFM)を用いて直接観察を行った。脂質の組成や単分子膜を形成する温度などの影響により特徴的なトポロジーが観察された。リン脂質のみの膜でも二つの相状態の混合膜になっていることが示された。ここにガングリオシドGM1を加えるとゲル相と思われる領域に集まっている様子が観察された。さらに、B16メラノーマ細胞から抽出した脂質膜を累積してAFM観察したところ、糖脂質と思われる集合構造が観察された。これにより、モデル膜で示された糖脂質の集合構造は生体膜でも形成されていることが示された。糖鎖の認識はペプチドで置き換えることができる。インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに結合できる糖鎖レプリカペプチドをファージ提示ペプチドライブラリーから検索した。ヘマグルチニンに結合したファージを溶出する糖鎖の種類により異なるペプチド配列を得ることが出来た。得られたペプチドは異なる亜型のインフルエンザウイルスのヘマグルチニンに結合し、細胞へのウイルスの感染を阻害することが示された。1.糖脂質含有単分子膜の構造解析スフィンゴ糖脂質を含んだ脂質組成の気-液界面単分子膜を作製し、マイカ基板などに累積して、脂質膜組成に依存したドメイン構造について原子間力顕微鏡(AFM)を用いて直接観察を行う。本実験では、マイカ基板に単分子膜を2層累積することで、脂質膜の親水基表面の溶液中での脂質のトポロジーをAFMで観察した。マイカ基板に接する脂質はリン脂質を用いて、2層目には糖脂質を含んだリン脂質との混合膜を用いた。ガングリオシドGM1とリン脂質の混合膜では、リン脂質の種類に応じて異なる集合構造が見られた。さらに、そのような集合構造はコレラ毒素のBサブユニットの結合挙動に影響を与えていることを明らかにした。2.糖鎖レプリカペプチド脂質の作成とその機能糖鎖の認識はペプチドで置き換えることができる。インフルエンザウイルスのヘマグルチニン(HA)は、宿主細胞の細胞膜のGM3やシアル化ルイスX等の糖脂質を受容体としている。HAは遺伝子交雑による抗原性の変化に伴う亜型が生じるために、亜型間にまたがる広域薬剤の開発が望まれている。多種のオリゴ糖鎖の活性を検討することは糖鎖の供給の問題で現実的に難しい。そこでヘマグルチニンに結合できる糖鎖レプリカペプチドを15アミノ酸のランダム配列を有するファージライブラリーから検索した。得られたペプチドは亜型の異なるヘマグルチニンに結合する能力を有していた。得られたHAに結合性を有するペプチドをリポソーム表面に固定化したところ、両亜型のインフルエンザウイルスのMDCK細胞への感染をin vitroで阻害することが見いだされた。さらに、動物実験に置いても感染阻害実験にも成功した。
枯草菌イノシトールオペロンの遺伝子構造と発現調節機構の解明

枯草菌イノシトールオペロンの遺伝子構造と発現制御機構を明らかとするため以下の研究を行った。本オペロンはiolABCDEFGHIJの10個の遺伝子より構成されるものと推定され、またその上流に逆向きに存在する遺伝子がリプレッサー遺伝子iolRであることが分かっていた。1.イノシトールオペロンのプロモーターの解析イノシトールの添加により転写誘導される本オペロンのプロモーターとiolRのプロモーターを同定した。iolRはその下流のiolSと共に約2kbの転写産物として発現していた。2.オペロンの転写終結点の同定転写終結点をiolJ遺伝子の直後に同定した。この位置で終結する転写は本オペロンプロモーターからの転写であり、従って本オペロンは10個のiol遺伝子をコードする約11.5kbの非常に長い転写単位として発現していることが分かった。(平成8年3月現在、以上2点に関する論文を執筆中である。)3.IolRの認識するオペレーターの解析大腸菌内でIolRを生産しDNase I footprintでプロモーターDNAとの結合を調べた結果、IolRは特異的にプロモーター領域に結合し約100bpもの長い領域をカバーする事が分かった。またDNA二重螺旋のほぼ1周期ごとに切断が増強された。IolRを精製し詳細な解析を試みている。4.イノシトールオペロン遺伝子の機能解析枯草菌のイノシトール分解系は未だ不明である。各遺伝子の機能を同定し分解系の詳細を明らかにする第一歩として10種の変異株の変異点を同定し、変異株の取れない遺伝子は遺伝子破壊を行った。これら変異株、破壊株を利用して各遺伝子の機能解析を進めている。
低重力空間での液体と薄肉構造物の動的連成非線形挙動

本研究では、低重力空間における弾性構造物と液体の動的連成挙動問題について、弾性フレーム構造物とそれに付着した液滴という基本システムの連成振動問題を例に取り上げ、その振動特性を地上でできる範囲内で主に実験的に解明した。本研究では、次の2つの問題に分けて研究を進めた。I部分的に拘東された液滴の固有振動解析部分的に拘束された球状液滴の固有振動解析を行った。また液体として水を用いて対応する実験を行い,両者の結果を比較した。その結果,両者は定性的には良い傾向であるが,定量的な一致は今後の課題として残った。II液滴が付着した柔軟弾性フレームの動的挙動に関する実験a.擬似的な字宙空間の創設プラスティック製の柔軟弾性フレームを組み合わせて,平面状試験構造物とトラス状試験構造物を作り,ばね又はゴムを介して糸で吊し、空間内を自由に運動できるようにすることで、擬似的な宇宙空間を作った。付加液滴は,「ばね-質量」系又は「梁-質量」系としてモデル化した。b.試験体の加振電磁小型加振器を用いて正弦波加振を行い、柔軟弾性フレームの周波数応答を測定するシステムを確立した。更に試験体を回転できる装置を製作した。c.応答の測定と運動の解析「3次元運動解析システム」を用いて,柔軟弾生フレームの3次元運動を測定できるシステムを確立した。また、3軸方向の加震度計を用いて加速度応答を計測した。本研究では、低重力空間における弾性構造物と液体の連成挙動問題について、液体が液滴状態で、柔軟弾性フレームに付着したシステムを例に取り上げ、柔軟構造物の運動に及ぼす付着液滴の影響について、地上でできる範囲内での基礎実験を行った。特に液滴の移動又は離脱に関する非線形現象の解明を行う。本年度は具体的に以下の事項について研究を行った。I液滴が付着した柔軟弾性フレームの動的挙動に関する実験a.擬似的な宇宙空間の創設プラスティック製の柔軟弾性フレームを組み合わせて試験構造物を作り,ばねを介して糸で吊し、空間内を自由に運動できるようにすることで、擬似的な宇宙空間を作った。付加液滴は,「ばね-質量」系としてモデル化した。c.応答の測定と運動の解析「3次元運動解析システム」を用いて,柔軟弾性フレームの3次元運動を測定できるシステムを確立した。II部分的に拘束された液滴の固有振動解析部分的に拘束された球状液滴の固有振動解析を行った。また対応する実験を行い,両者の結果を比較した。I液滴が付着したトラス状柔軟弾性フレームの動的挙動に関する実験a.擬似的な宇宙空間の創設昨年度は、プラスティック製の柔軟弾性フレームを平面的に組み合わせて試験構造物を作った。本年度はトラス状の試験構造物を作り、ゴムを介して糸で吊し、空間内を自由に運動できるようにすることで、擬似的な宇宙空間を作った。付加液滴は、「梁-質量」系(昨年度は「ばね-質量」系)としてモデル化した。また、試験体を回転できる装置を製作した。また、3軸方向の加速度計を用いて、試験構造物が回転運動を行った場合の過渡加速度応答を計測した。
パーキンソン病に対する脳深部刺激療法と薬物療法を融合した適正な治療戦略の検討

パーキンソン病に対する視床下核脳深部刺激療法(STN-DBS)の予後に影響を与える因子として、薬物療法と体感幻覚様症状との関係および術前のうつの存在について重要な知見を得た。体感幻覚様症状はL-dopaの投与量と深く関係しており、dopa調節異常に基づくものなのではないかと考えられた。また術前のうつ傾向がSTN-DBS後の機能改善に影響を与えることも明らかとなった。術後3年目の改善率は、on時(p=0.012)、off時(p=0.037)ともに術前うつ傾向のある群で有意に不良だった。これに加え術後3年目の認知機能もうつ傾向にあった群では有意に低下していた(p=0.006)。パーキンソン病に対する脳深部刺激療法は治療選択肢の一つとして確立したものであるといえる。しかし、良好な効果を示す症例が数多くいる反面、長期的にみると十分な効果が引き出せない症例が少なからず存在することも事実である。本研究では、よりよい効果が期待できる要因は何かということについて検討した。初年度は、視床下核脳深部刺激療法(STN-DBS)後にしばしば生じる体感幻覚様の症状と術前の薬物療法の内容について検討した。その結果から精神症状や情動の変化が患者のQOLと密接に関係していることを実感した。パーキンソン病患者には、幸福感の喪失状態(アンヘドニア)など気分の落ち込みやうつ傾向が高頻度にみられる。本研究では術前のうつ傾向がSTN-DBS後の機能改善にいかなる影響を与えるか、長期的な経過も含め検討した。その結果、術前にうつ傾向がみられる症例はそうでない症例に比較して長期的な運動機能の回復がよくないことがわかった。認知機能についてもうつ傾向がない症例の方がよい状態が維持される傾向にあった。パーキンソン病に対する脳深部刺激療法のよりよい効果が期待できる因子について検討した。とくに薬物療法との関係を重視している。具体的には、術前にどのように抗パーキンソン病薬が投与されていた症例において術後改善効果が高かったか、あるいは術後の副作用の出現頻度が低かったかを検討する。副作用については、体感幻覚のような精神症状がしばしば重大なADL阻害因子となることを、これまでの経験から認識している。我々は自身の経験から、脳深部刺激療法導入後、急速かつ大量に抗パーキンソン病薬を減量した症例に多く発生する傾向があると推測している。術後に体感幻覚様の症状が出現し治療に難渋した症例を抽出し、こうした問題が生じなかった症例群と比較し関連する因子を検討した。この結果から術前のLEDとくにL-dopaの投与量の多い症例にはこうした副作用が発現する傾向が高く注意が喚起された。この成果は、すでに第52回定位・機能神経外科学会のシンポジウムで発表され優秀演題として採択されている。さらに国際定位・機能神経外科学会および国際ニューロモデュレーション学会に演題登録し本年5月と6月に発表する予定である。近年、DBSを早期に導入した症例において、薬物療法を長期に継続した症例より機能予後が良好であったことを示すcontrolled randomized trialが発表され、早期手術の意義が注目されている。本研究では、比較的早期にSTN-DBSを導入した群と平均的な罹病期間を有する群の予後を比較し、罹病期間が手術効果に与える影響について検討した。対象は、当院にてSTN-DBSを施行し、術前から術後3年目まで、UPDRSおよび神経心理学的検査のfollow-upがなされている症例とした。これらの症例を術前の罹病期間が9年未満のグループ(A群、n=34)と9年以上のグループ(B群、n=67)に分け、機能予後の違いについて検討した。まず術前のUPDRS、MMSE(Mini-Mental State Examination)およびHDS(Hamillton Depression Scale)をA群B群間で比較した。さらに術後1年と3年目に評価されたこれらのスコアの変化率を、オン時とオフ時において比較した。結果として術前のUPDRS、MMSEおよびHDSにはAB群間で有意な差は認められなかった。術後1年以内に評価されたUPDRS total scoreの改善率は、オン時A群が42.7±29.7%、B群が33.2±25.2%で有意にA群の方が良好であった(p<0.05)。しかしオフ時に関しては有意な差は認められなかった(p=0.20)。術後3年目の比較では、オン時A群が55.5±28.6%、B群が37.5±35.5%でA群の方が有意に改善がよかった(p=0.02)。オフ時にもA群が良好な傾向はみられたもののその差は有意ではなかった(p=0.06)。

結論としてパーキンソン病発症後9年未満でSTN-DBSを導入した群の方が、9年以上の罹病期間を有する群より良好な改善率が維持される傾向にあった。とくにオン時に有意であり、また比較的早期(術後1年以内)より3年目の評価にてその差ははっきりとしていた。機能的脳神経外科初年度は、とくに視床下核脳深部刺激療法(STN-DBS)の予後に影響を与える因子として体感幻覚様症状について検討を行った。本年度の研究では、術前のうつ傾向がSTN-DBS後の機能改善にいかなる影響を与えるか検討した。対象は、当院にてSTN-DBSを施行し、術前のHamilton depression scale (HDS)と術前および術後3年目までのUPDRSが把握できている症例である。これらの症例を術前のHDSによって2群に分類した。術前HDSが5点以下のグループをA群(n=41)とし15点以上のグループをB群(n=27)とした。両群間のUPDRSの改善率を術直後と術後3年目にて比較した。両群間で手術時年齢、罹病期間、術前LED、術前UPDRSには有意差は認められなかった。術直後のUPDRS total scoreの改善率には、on時とoff時ともに有意差は認められなかったが、術後3年目の改善率はon時(p=0.012)、off時(p=0.037)ともA群の方が有意に良好であった。サブスコアでみるとpart IIIのon時(p=0.02)とpart IVのon時(p=0.001)およびoff時(p=0.002)において有意にA群の改善率が良好であった。また、術後3年目のMMSEでは、B群にて有意な低下が認められた(p=0.006)。これに対しA群には低下は見られず有意ではないが、わずかながら中央値の上昇が認められた。上記のごとくほぼ予定通りに研究は進行し、予想されたとおりの意義のある成果が出ている。成果については当初の予測よりやや実り多いものとなっているといってもよいと考える。示した詳細な結果は、臨床の場で直ちに役立つ可能性の高いものである。初年度は、とくに視床下核脳深部刺激療法(STN-DBS)の予後に影響を与える因子として体感幻覚様症状について検討を行った。STN-DBS後に「喉が詰まる」、「胃がつきあげられる」などの症状を訴える症例にときに遭遇する。こうした症状は、器質的な異常を伴わず著しい不快感を示し、体感幻覚(セネストパチー)に酷似する。本研究では、体感幻覚様症状の発生原因を術前の薬物療法を中心に検討した。対象は、当院にてSTN-DBS後に体感幻覚様の症状を訴えた18例である(A群)。いずれも器質的な障害は検出されなかった。これらの症例と同時期に手術を行った64例をコントール群(B群)として両群間の術前状態の違いについて検討した。結果として、術前S&E、HDS、MMSEに有意差は認められなかった。UPDRSはpart IVでA群の方が有意に高かった(p<0.01)。術前の薬物療法に関しては、A群にてLEDとL-dopa投与量が有意に高かった(LED: p<0.01)(L-ドパ: p<0.05)。アゴニストのみのLEDでは両群間に有意差は認められなかった。体感幻覚様の症状は術前の薬物療法、とくにL-dopaの投与量と関係があると考えられた。本来、体感幻覚は統合失調症や麻薬の禁断症状でみられる。
複合外来語の短縮過程に見られる現代日本語の音韻特性

本研究は,日本語の短縮語形成を制御する音韻的機構の諸相について明らかにすることを目的とする。本研究における2年目の成果は,次の2点にまとめられる。1.基体の音節構造が,短縮語形成に影響する重要な音韻的要因の1つであること。まず,1つ目の成果について述べる。本研究では,基体の音節構造が短縮語形成に与える影響について,実在語の分析および語形成実験を通して明らかにした。複合語由来の短縮語データベースの中には,前部要素が一定のパターンとして短縮されやすい例も含まれていることから,データに偏りが生じやすい。この問題を解消するためには,音韻条件をコントロールした語形成実験を行う必要がある。実験の結果,初頭2音節がHL(Hは重音節,Lは軽音節)で始まると保持形として短縮されやすい一方で,HHで始まると補完形として短縮されやすいことが明らかになった。本研究から,基体の音節構造が短縮語形成に影響する重要な音韻的要因の1つであるという新たな知見が得られたと言える。次に,2つ目の成果について述べる。複合語由来の短縮語データベースの分析結果により,補完形の形態素境界部に同音連続が生じると,OCP制約の違反を回避するために補完形が出力されにくい傾向が確認された。しかし,数少ない実在語データだけでは説明が不十分であるという点から,音韻条件をコントロールした語形成実験を行った。その結果,「OCP-labial > OCP-coronal, OCP-dorsal」の順にOCP制約が強く働くことが明らかになった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究における1年目の成果は,次の2点にまとめられる。1.短縮現象に影響する言語外的要因のひとつとして,言語運用者の世代による影響を明らかにしたこと。2.短縮現象に影響する言語内的要因のひとつとして,子音が持つ素性による影響を明らかにしたこと。一つ目の成果について述べる。日本語母語話者を対象とした実態調査から,典型的な短縮形である4拍形は高年齢層に支持されやすく,一方で3拍形は若年齢層に支持されやすいという結果が得られた。4拍形は元の語の分節音を可能な限り多く残すため,元の語との関連付けをしやすくなるような音韻情報が多い(例:メール・アドレス→メルアド)。一方で,若年齢層では原形への手がかりが少ない3拍形を好むことが明らかになった(例:メール・アドレス→メアド)。言語運用に見られるこのような世代差は,以前の世代と異なるストラテジーを志向した結果であり,短縮語形成の方略が世代間で変容しつつあることを示唆している。二つ目の成果について述べる。調音点に関するOCP制約のうち,違反が許されやすい制約とそうでない制約が存在するという仮説を検証するために,子音が持つ素性のうち調音点による影響を調べた。実験では,それぞれ両唇,舌頂,舌背の素性が連続する語形の自然度を被験者に評価してもらうことで,OCP制約により抵触しやすい素性を明らかにすることができた。同一あるいは類似音の連続を忌避する振る舞いは,生成音韻論において見出されたOCP制約が予測する事象である。本研究は,長年の理論研究を通じて示された音韻規則や制約の妥当性を検証し得るという点,短縮現象の仕組みを韻律的側面から見た従来の観点とは異なり,素性レベルでの影響をも更に解き明かそうとする新たな試みであるという点,短縮語形成のメカニズムを実験的に解明する初めての研究であるという点で,大きな成果が得られた。当初,本研究では平成29年度から30年度までの目標として,(1)短縮過程に影響する言語内的要因(2)短縮メカニズムに影響する言語外的要因を明らかにするという二つのゴールを設定していた。まず,平成29年度には,短縮現象に影響する言語内的要因のひとつとして挙げられる音韻素性が,短縮パターンの選択にどのように関わるかについて実験による検証ならびに理論分析の両面から明らかにすることができた。1年目の前半にはデータベースを収集・分析を,1年目の後半には世代差に関する予備調査を行った。加えて,2年目に行い予定であった言語外的要因(世代差による影響)の影響についても明らかにすることができた。

複合語由来の短縮語データベースの分析結果により,補完形の形態素境界部に同音連続が生じると,OCP制約の違反を回避するために補完形が出力されにくい傾向が確認された。しかし,数少ない実在語データだけでは説明が不十分であるという点から,音韻条件をコントロールした語形成実験を行った。その結果,「OCP-labial > OCP-coronal, OCP-dorsal」の順にOCP制約が強く働くことが明らかになった。平成29年度には,短縮語のアウトプットを決定する要因を特定するために,独自に作成したデータベースの定量分析を通じて理論的モデルを構築した。しかし,そこには解決すべき次のような問題がまだ残されている。一つ目の問題は,個々の語にまつわる特異性が排除できないということである。このような特異性を持つ事例はデータの傾向に歪みを与えており,全体の傾向を不透明にしている。二つ目の問題として,これまでの研究により,類似した子音の連続を回避するOCP制約が提案されてきたが,短縮語内においてもそのような傾向が観察されるかどうかについては,まだ十分な検討がなされていないという点が挙げられる。今後は,連続する音の類似性を音韻素性から判断し,どのような素性が連続すると,より補完形の選択が阻止されやすいかを明らかにする。これらの問題を解決するためには,既に定着した実在語の分析だけでなく,語形成が持つ生産的側面に着目した実験的アプローチが必要である。音韻現象に対する実験的アプローチは,従来の理論研究が提案した制約の妥当性が検証できるという点,および,実在データだけでは説明しきれないことを明らかにすることができるという点で,有効性の高い手法であると言える。今後は,実験研究と理論研究を柱とし,短縮語形成を制御する音韻的メカニズムを解明していく予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
魚類個体群の遺伝的多様性を網羅的に分析する新手法の確立と現場応用への展開

個体群内の遺伝的多様性は、希少種保全や水産資源管理には不可欠の情報であるが、生息密度が低い種や活動性が極めて高い種などは1個体ずつ捕獲して遺伝情報を取得するのに相当な労力が必要である。本研究では、水中を漂う環境DNAを分析することによって、対象個体群が持つ遺伝的多様性を個体を捕獲することなく解析し、捕獲では収集困難な多数の個体由来のDNAから遺伝的多様性の情報を簡便かつ大量に取得する技術的基盤を開発した。個体群内の遺伝的多様性は、感染症等の攪乱への耐性など、個体群の存続可能性に大きく影響する。希少種保全や産業上有用な種の資源管理には不可欠の情報であるが、生息密度が低い種や活動性が極めて高い種などは1個体ずつ捕獲して遺伝情報を取得するのに相当な労力が必要で、また、捕獲行為が対象種の生息環境を人為的に攪乱してしまう恐れもある。そこで本研究では、水中を漂う環境DNAを分析することによって、対象個体群が持つ遺伝的多様性を、個体を捕獲することなく解析する新手法を確立する。現在の技術では種を識別するだけに留まっている環境DNA分析をさらに進化させ、捕獲では収集困難な多数の個体由来のDNAを網羅的に分析して、個体群の保全に有用な遺伝的多様性の情報を簡便かつ大量に取得する技術を開発する。全国の陸水面で有用魚種にあげられるアユを対象とし、各個体のD-loop領域の塩基配列を環境DNA試料から分析可能かを試行した。増幅の対象とする領域はアユのD-loopの塩基配列に基づいたハプロタイプについての先行研究を参考にしながら決定し、環境DNA中からアユの対象領域(約200bp)のみをPCRで増幅できるプライマーセットを開発した。まず水槽で1個体ずつを飼育し、各水槽水から得られた環境DNA試料から得た対象領域の塩基配列と、飼育個体の肉片由来のDNA試料から得た対象領域の塩基配列を決定し、両者が完全に一致することを確認した。また、滋賀県の河川水から得た環境DNA試料から同じ対象領域を増幅できることも確認でき、「種より細かな解像度」を持つD-loopの塩基配列に基づいた遺伝的多様性の分析が、環境DNAを対象に実施できることを実証した。現在、次世代シーケンサーによってアユの個体群内のハプロタイプを網羅的に解析できる分析・解析手法の精緻化を進めている。本研究の目的は、水試料から回収可能な環境DNA試料を用いて、個体ごとの解析では取得が困難な多数の個体由来のDNAを取得し、個体群内の遺伝的多様性を明らかにする新規の手法を確立することである。また、この手法の応用実例として複数の希少淡水魚類を対象として広域調査を実施する。まず初年度の課題として、水槽で1個体ずつを飼育し、各水槽水から得られた環境DNA試料から得た対象領域の塩基配列と、飼育個体の肉片由来のDNA試料から得た対象領域の塩基配列を決定し、両者が完全に一致することを確認した。これによって、種内の遺伝的多型も環境DNA分析により解析できることが示せた。次に、アユを対象として次世代シーケンサーによる解析の安定的な実施体制と、膨大な出力データの妥当な解析(エラーシーケンスのクリーニング)手法の確立を行った。次世代シーケンサーによる分析手法の確立を目指して、アユのD-loop領域をターゲットとした次世代シーケンスに利用できるプライマーセットを設計した。ただ、次世代シーケンサーでは類似した塩基配列の試料をシーケンスするときにエラーを含んだデータが生成されるため、膨大に出てくるデータの中から効率的にPCRエラーやシーケンスエラーによる誤読を排除する実験ステップとデータクリーニングの手法を模索する必行があった。実験ステップについては複数のPCR反復を設定することでランダムに生成されるエラーと、どの反復からも得られる真に存在する塩基配列とを区別しやすくする工夫を行った。また、研究協力者によってクリーニング手法の解析的な手法もおおよそのめどが立った。これまでの成果をまとめ、環境DNAから非侵襲的に魚類の遺伝的多様性を分析する技術を報じる論文を現在執筆中である。本研究は捕獲を伴わずに多数の個体由来のDNAを回収して魚類個体群の遺伝的多様性を網羅的に分析すべく、近年発展してきた環境DNA分析によってそれを可能にする技術の開発を目的として実施した。一つ目の課題であった環境DNA分析によって野外環境水から対象個体群内のハプロタイプを網羅的に検出できる技術の確立には、分析に用いる次世代シーケンサーから出力される膨大なデータの中から効率的にPCRエラーやシーケンスエラーによる誤読を排除できる有効な実験ステップとデータクリーニングの方法が必要になる。これらについては水槽水試料を用いて平成28年度に実施した基礎研究でかなり進んだ。しかし、データクリーニング(denoising)の解析手法として新規に報告された方法論を本研究でも利用できることが判明し、29年度にはその検証を進めた。結果として、新たなdenoisingアルゴリズムであるDADA2は環境DNAに基づくハプロタイプ評価の場面でも適切なデータクリーニングが可能であることが明らかになった。本研究ではアユ(Plecoglossus altivelis altivelis)を対象種としており、ハプロタイプ情報について既存の知見がある琵琶湖への流入河川から得た環境DNA試料の分析に用いて、本研究で確立した方法が野外試料に応用できるかを試した。まだ改善の余地は残されているものの、本研究で目指していた環境DNA分析によるハプロタイプ多様性の評価の実施が十分可能な手法が確立できた。

二つ目の課題である希少種への本分析手法の展開であるが、これは実地での応用まで進むことはできなかったが、カワバタモロコ(Hemigrammocypris rasborella)を対象として遺伝的多様性を評価するためのプライマーセットを完成させた。今後、野外試料をもちいた分析を試みたい。個体群内の遺伝的多様性は、希少種保全や水産資源管理には不可欠の情報であるが、生息密度が低い種や活動性が極めて高い種などは1個体ずつ捕獲して遺伝情報を取得するのに相当な労力が必要である。本研究では、水中を漂う環境DNAを分析することによって、対象個体群が持つ遺伝的多様性を個体を捕獲することなく解析し、捕獲では収集困難な多数の個体由来のDNAから遺伝的多様性の情報を簡便かつ大量に取得する技術的基盤を開発した。今後はアユを対象として、琵琶湖周辺等、ハプロタイプの分布について既存の知見がある水域で本分析手法の評価を行う。これと同時に、カワバタモロコやオオサンショウウオ等の希少淡水生物を対象として他種へ技術の展開を図り、滋賀県、京都府、兵庫県などの生息域で遺伝的多様性の広域調査を進める予定である。アユのハプロタイプ情報について既存の知見がある琵琶湖周辺の調査地から得た環境DNA試料の分析を行い、本手法での分析結果と照らし合わせて検出能力の比較を行う。また、滋賀県、京都府、兵庫県、などでのアユおよび上述の希少種の広域調査を行えばこれまでに知られていなかったハプロタイプが検出される可能性が高く、これまでにない広域かつ詳細な種内多様性の空間分布情報が得られると考えられる。ハビタットの特徴や空間配置等各種条件との関係解析などにも展開していくつもりである。種の検出を目的とした環境DNA分析は生物モニタリングの現場で既に実用化プロセスに入っている。これに加えて本研究で提案する「環境DNAからの遺伝的多様性の分析技術」が実用化できれば、希少種保全や水産資源管理に計り知れない恩恵がある。例えばイタセンパラなど、生息域外保全が行われているようなレッドリスト種については、野生個体群の遺伝的な構成を網羅的に知ることで、追加放流予定の飼育個体群とのマッチングの確認等に即座に寄与できる。こうした保全生物学的なテーマについて、本技術を適用できる機会を常に求め、適宜共同研究として更に実用的応用を進めていく。水域生態学当初見込んでいたよりも相当に順調に研究が進行したため、試行錯誤によって消耗する想定をしていた実験消耗品が少なく済んだこと、また、所属機関独自の補助が得られたため、消耗品費が更に大きな額で削減されたため。順調に進んでいるため、広域調査を積極的に実施すること、また、本研究で初年度に確立した技術を求めている保全生物学的な活動を行っている研究者との共同研究を積極的に進めることに予算を活用したい。また、対外的な研究発表も資金的な余裕が生じたためにより積極的に行いたい。
術中蛍光イメージングを用いた頭頸部癌ナビゲーションサージャリーの確立

頭頸部癌に対する外科的治療は確実な腫瘍摘出と臓器機能温存の両者を達成することが理想であり、低侵襲手術の一つとして経口的内視鏡手術が発展してきた。本研究は腫瘍の可視化により安全域をぎりぎりまで少なくし腫瘍を確実にかつ機能温存も達成することを目標としている。本年度は現状の内視鏡手術の術式および摘出検体の検討を行うとともに、マウスを用いた実験を行う整備、準備を行うことになった。頭頸部癌内視鏡手術は2016年4月から32件行われ、それぞれの患者背景、術前術後の機能(特に嚥下機能、構音機能)を評価した。さらに摘出検体の病理学的評価、現状での安全域の確認を行った。安全域を評価したところ、水平断端が陽性になった症例は1例のみであったが、深部断端が陽性であった症例は5例存在した。水平断端の設定はルゴール染色とNBIを用いて行っているが、深部断端の設定は通常の内視鏡下の所見により設定しているが、ICGによる腫瘍の可視化が可能になれば、より断端の陰性率は上がることになる。しかし内視鏡下経口切除の欠点は視野が得られにくいことと、ワーキングスペースの確保が困難であることである。現在佐藤式彎曲型喉頭鏡やFKretractorなどが実臨床にて用いられているが、より確実にかつ中咽頭から下咽頭、喉頭と全体が展開できる開口器も開発する必要がある。当初の腫瘍可視化の実現に加えて、より大きく視野が得られるdeviceの開発も行っていく。計画書に記載している動物実験に関して、実行が遅れている。動物の扱いと発癌モデルについてはおおむね確立したものとなった。今後倫理面と研究時間および研究者(研究協力者)の確保ができれば順調に進むものと考えている。現在臨床にて使用可能であるインドシアニングリーンにて咽頭後リンパ節(ルビエールリンパ節)摘出時の口腔内からの局在確認を行っている。癌に特異的なマーカーを付与することで、より感度、特異度ともに向上させることが可能になる。安全性を実証するために倫理面に配慮して動物実験にて確認するとともに、今後の実臨床においてより確実にかつ広く視野が得られる開口器の開発に加え、今後導入されるロボット手術含めて応用可能になることが期待される。頭頸部癌内視鏡手術は2016年4月から15件行われ、それぞれの患者背景、術前術後の機能(特に嚥下機能、構音機能)を評価した。マウスを用いた実験の準備がやや遅れている。比較対象となる現状での内視鏡手術とその成績、機能解析の蓄積は順調に進んでいる。安全域を評価したところ、水平断端が陽性になった症例は1例のみであったが、深部断端が陽性であった症例は3例存在した。計画書に記載している動物実験に関して、準備と実行が遅れている。動物の扱いと発癌モデルについて、倫理面と研究時間および研究者(研究協力者)の確保ができれば順調に進むものと考えている。

水平断端の設定はルゴール染色とNBIを用いて行っているが、深部断端の設定は通常の内視鏡下の所見により設定しているが、ICGによる腫瘍の可視化が可能になれば、より断端の陰性率は上がることになる。しかし内視鏡下経口切除の欠点は視野が得られにくいことと、ワーキングスペースの確保が困難であることである。現在佐藤式彎曲型喉頭鏡やFKretractorなどが実臨床にて用いられているが、より確実にかつ中咽頭から下咽頭、喉頭と全体が展開できる開口器も開発する必要がある。当初の腫瘍可視化の実現に加えて、より大きく視野が得られるdeviceの開発も行っていく。計画書に記載している動物実験に関して、実行が遅れている。動物の扱いと発癌モデルについてはおおむね確立したものとなった。今後倫理面と研究時間および研究者(研究協力者)の確保ができれば順調に進むものと考えている。動物実験の準備が整えば、計画書通りに進めていく。研究遂行に必要なスタッフを増員確保する必要があるため、当教室内で調整を行う。引き続き現臨床での症例の蓄積も継続して行っていく。現在臨床にて使用可能であるインドシアニングリーンにて咽頭後リンパ節(ルビエールリンパ節)摘出時の口腔内からの局在確認を行っている。癌に特異的なマーカーを付与することで、より感度、特異度ともに向上させることが可能になる。安全性を実証するために倫理面に配慮して動物実験にて確認していく。安全性を実証するために倫理面に配慮して動物実験にて確認するとともに、今後の実臨床においてより確実にかつ広く視野が得られる開口器の開発に加え、今後導入されるロボット手術含めて応用可能になることが期待される。研究の遅れが生じた為、当初予定していた消耗品等の購入を見送った為。研究若干の遅れ、変更が生じて消耗品、備品の購入を見送った。実験に必要な器具類の購入と成果発表のための旅費、論文投稿料に使用する研究若干の遅れ、変更が生じて消耗品、備品の購入を見送った。実験に必要な器具類の購入と成果発表のための旅費、論文投稿料に使用する。動物実験の整備を早急に行う為、実験に必要な器具類の購入、研究成果発表の為の旅費、論文投稿料に使用し、成果を上げる。
癌患者自身の膜小胞体エキソソームを用いた新規癌治療法の開発

ヒト血液T細胞を効率的に培養し培養上清からT細胞が産生するエキソソームを効率的に回収する方法を検討した。T細胞産生エキソソームの表面分子への抗体を用いエキソソーム量を正確に定量する方法の開発を行った。エキソソームにがん細胞に結合する分子を発現させ、がん細胞を標的とするエクソソーム作製を検討し、ヒト肺癌細胞、肉腫細胞の移植マウスにmiRNA含有エクソソームを投与し腫瘍の増殖抑制を検証した。Luciferaseの全身発現マウスにLuciferaseを抑えるmiRNA含有エキソソームを投与し各臓器での発現抑制を検証した。また、HBV由来表面マーカーで肝細胞にエキソソームをとりこませる技術を検討した。ヒト血液のT細胞を効率的に培養し、その培養上清からT細胞が産生するエキソソームを効率的に回収する方法について検討した。T細胞の産生するエキソソームの表面に発現する分子に対する抗体を用いて、エキソソームの量をより正確に定量できるELISA法の開発を行った。さらに、エキソソームに、がん特異的に結合する分子を発現させ、がん細胞特にがん幹細胞を標的とするエクソソームの作製を検討した。さらに、HBV由来の表面マーカーにより、肝細胞特異的にエキソソームをとりこませる技術の検討を行った。エキソソーム表面に発現するテトラスパニンを用いることで、特異的にEGFR(多くのがんで高発現)発現細胞にエキソソームを導入する手法の開発を行った。また、ヒト肺がん培養細胞株、ユーイング肉腫細胞株を移植したRAGマウスに、HEK293T細胞より作製したmiR-34a、EWS-Fli-1 siRNA含有エクソソームを全身投与することによる腫瘍増殖抑制効果を検証した。また、Luciferaseを全身に発現するマウスに、Luciferase siRNAを含有したエクソソームを投与することによる、各臓器でのLuciferaseの発現抑制効果を検証した。本研究は、患者血液を採取し、患者の体外でT細胞を増殖させてそのT細胞の産生するヒトエキソソームを精製する。このように体外で増やしたエキソソームに癌を抑制するmicroRNAを内包させて、そのエキソソームの表面を、癌細胞にとりこまれやすくするようにペプチドで加工して、体内に導入しそれががんを抑制するようにするという治療法の開発を目的にしている。申請者らは、ヒト血液から効率よくT細胞を増殖させて、そのT細胞からエキソソームを効率よく回収する技術を確立した。具体的には、ヒト血液を抗CD3抗体とIL-2で刺激を行うことで効率よく増殖させる過程で得られた培養上清からエキソソームを大量に回収する方法を検討た。また、エキソソームは、それまでタンパク量を測定することで定量していたが、エキソソームの表面抗原を用いたサンドイッチELISA法について検討し、正確に定量する技術を開発し、エキソソームの定量に役立てている。エキソソームが癌細胞にとりこまれやすくするように、表面に特異的にエキソソームを加工するということを計画している。ヒト血液を採血し、体外で効率よく培養し、そこからエキソソームを効率よく回収するという基本技術はほぼ基礎固めを行った。また、サンドイッチELISAによるエキソソームの定量法の開発により、従来に比べてより正確にエキソソームを定量できる方法も確立されている。このようにエキソソームの産生過程では研究が進んでいる。一方、エキソソームの表面を加工してそれらが癌細胞に効率よく取り込まれる方法、癌細胞の内部に癌を抑制するmicroRNAを内包させる方法についてはまだ研究・開発が十分に進んでおらず、本年度以降はこれらの開発を重点的に行う予定である。上記に記したように、エキソソームの表面を加工してそれらが癌細胞に効率よく取り込まれる方法、癌細胞の内部に癌を抑制するmicroRNAを内包させる方法の開発を行っていく予定である。具体的には、表面を加工したエキソソームがマウスに移植した癌細胞に効率よく取り込まれているかどうかについてなど研究開発を進めていく。また、microRNAをエキソソームに内包させることに関しては、エレクトロポーレーションにより直接microRNAをエキソソーム内部に導入する、あるいはT細胞にベクターを導入して目的のmicroRNAを発現させてそのエキソソームを回収するという方法などについて引き続き研究を推進していく。上記のように、エキソソームの表面を加工してそれらが癌細胞に効率よく取り込まれる方法、癌細胞の内部に癌を抑制するmicroRNAを内包させる方法の開発に使用する予定である。
希土類金属イオン親和性を示すフォトクロミック配位子の分子設計と応用

すでに、光イオン可化可能なスピロベンゾピラン部位を含むフォトクロミッククラウン化合物(クラウン化スピロベンゾピラン)では、アルカリ金属やアルカリ土類金属イオンのような1価および2価金属イオンに対する顕著な錯形成光制御能が見いだされ、分離・分析化学への応用が展開されている。希土類金属イオンのような3価金属イオンに親和性を示すクラウン化スピロベンゾピランは、分析化学や材料化学的に興味が持たれ、その出現が待たされている。本研究では、希土類金属イオンに高い親和性を示す光応答性イオンフォアとして新規なクラウン化スピロベンゾピランを分子設計し、その希土類金属イオンに対する錯形成能ならびに錯体の光物性を調べ、分析化学や材料化学へのの応用研究を行う。今年度は、希土類金属イオン(3価金属イオン)に対する高い親和性をクラウン化スピロベンゾピランに付与するために、複数個のカルボキシルメチル基と1個のスピロベンゾピラン部位を有するテトラアザクラウン化スピロベンゾピラン誘導体を分子設計することにした。スピロベンゾピラシ部位とカルボキシメチル基を導入したテトラアザ12-クラウン-4誘導体(化合物1)とテトラアザ-14-クラウン-4誘導体(化合物2)を新規に合成し,これらとランタニドイオン(Eu^<3+>またはTb^<3+>)との錯体の発光挙動とその光制御について検討を行った。暗時における吸収スペクトル測定を行ったところ,どちらの化合物を用いた場合でも,ランタニドイオンとの錯形成により吸収極大波長は短波長シフトした。一方,蛍光スペクトル測定を行ったところ,化合物2のEu^<3+>錯体においてのみ,Eu^<3+>由来の発光強度の増大が観察された。これは,アンテナ部位であるスピロベンゾピラン部位からEu^<3+>へのエネルギー移動に依存していることを示唆している。
dysplastic wartsをヒト乳頭腫ウィルスの関連性

ヒトパピローマウィルス(Human papilomavirus:HPV)は種々の疣贅の原因ウィルスとして古くから知られている。そのなかで、表皮内癌の1つであるBowen病からHPVの検出が相次いで報告され、HPV感染が表皮細胞の癌化への関与する可能性が示唆されている。我々は、Bowen病の前駆段階としてdysplastic wartsという皮膚疾患を新しく提唱した。この皮膚疾患は、臨床的にはウィルス疣贅様の腫瘤を形成し、組織学的にウィルス性疣贅に特徴的な表皮細胞の空胞変性を認めながら、細胞の異型がある。さらに我々のDNA解析による検討では、この皮膚疾患からHPVをSouthern blot hydridization法により検出しており、表皮細胞の癌化へのHPVが関与している可能性が示唆される疾患であると考えられた。そこで今回、表皮の癌化におけるHPVの役割の詳細を明らかにするために、東京女子医大皮膚科外来において生検時にdysplastic wartsの9例について、病理組織診断にあわせてDNA解析についても行った。DNA解析はHPVの存在をSouthern blot hybridization法とPCR法で調べ、さらに陽性例についてはHPVの遺伝子型をRFLP法とdirect sequence法により同定した。その結果、子宮頸部癌において頻度が高く検出されていると考えられているHPVの遺伝子型が検出された。in situ hybridization法により組織学的に病変内のHPV DNAの局在が明らかとなり、この皮膚疾患におけるHPVの役割が明らかにされた。症例数が少ないので、今後さらに症例数を増やして解析する必要があるとともに、HPVと表皮の癌化について機能的な面も含めた解析が必要である。ヒトパピローマウィルス(HPV)は種々の洸贅疣の原因ウィルスとして古くから知られている。我々はすでにBowen病の前駆段階としてdysplastic warttsという皮膚疾患を新しく提唱した。さるに我々のDNA解析による検討では、この皮膚疾患からHPVをSouthern blothybridization法により検出しており、表皮細胞の癌化へのHPVが関与している可能性が示唆される疾患であると考えられた。DNA解析はHPVの存在をSouthern blothybridization法とPCR法で調べ、さらに陽性例についてはHPVの遺伝子型をRFLP法とdirect sequence法により同定した。その結果、子宮頚部癌において頻度が高く検出されていると考えられているHPVの遺伝子型が検出された。in situhybridization法により組織学的に病変内のHPV DNAの局在が明らかとなり、この皮膚疾患におけるHPVの役割が明らかにされた。
N型糖鎖を用いた膵臓癌特異的癌腫瘍マーカーの開発

膵臓癌患者を対象とし、血清中の糖鎖の網羅的解析を行い、膵臓癌に特異的な糖鎖マーカーを検索した。健常者群と膵臓癌患者群との間でOPLS法による層別化が有意に可能であった。膵臓癌患者17例と健常者の11例の血漿から、タンパク質と修飾N型糖鎖の質量分析を行った。膵臓癌患者のおける血清中の糖鎖の網羅的解析を行い、6糖鎖を抽出し、そのうち4糖鎖は再現可能であった.今後これらの糖鎖測定により膵臓癌の早期発見や再発の発見に有用になることが示唆された.「糖鎖はがん化に伴い糖鎖構造が変化し,血漿中の糖鎖を腫瘍マーカーとして臨床応用できる」という知見から,「血漿中の臓器特異度が高い糖鎖マーカーの測定により,早期がんの発見,転移,再発の早期予測が可能となる」という仮説をたて,難治性の膵臓がんに関して高い精度で本仮説を検証するものである.申請者らはヒドラジド基(NHNH2)高密度含有ポリマー微粒子であるBlotGycoを用いて,糖鎖を効率よく捕捉回収する方法を行っている(特願2010-82438号)今回,膵臓がん患者血清と健常者血清)に含まれる糖鎖を「糖鎖精製キットBlotGlyco&reg;」を用いて精製・ラベル化し、MALDI-TOF-MSで測定・解析した。その結果,6個の質量電荷比(その内糖鎖に帰属:5個)が候補として挙がった。これらの各糖鎖について膵臓がん患者と健常者でのデータを解析した結果,すべての糖鎖で有意差が認められた.6個の糖鎖のうち,健常者と比べ,膵臓がん患者で低値を示した糖鎖が3個,逆に高値を示したものが3個みられた.今回の研究で抽出された糖鎖の中で,膵臓がんに特異的な糖鎖があると考えられた.他のがん種との比較で膵臓がんとの関連性について検討が必要であると考えられた.今回のPilot studyで膵臓がん患者と健常者との2群間で糖鎖を測定し,有意に存在量が変化しているN型糖鎖を同定することが可能であった.当初は健常人に比し,有意な糖鎖が認められるか懸念があったが,6種類の糖鎖を同定することが可能であった.これまでの実験方法から,本研究方法はBlotGlycoを用いた新しい概念に基ずくN型糖鎖の同定方法である.この手法はわずか5時間で結果を得ることができ,操作は平易であり正確な精製と多検体を並列に処理できる利点がある.新たな臓器特異的な癌に対するN型糖鎖の発見は,検診をはじめ消化器癌の早期発見に有用になると思われる.現在有意差の見られた糖鎖の中で,どの糖鎖が最も膵臓がんに特異的であるか検討中である.健常人と比して,腫瘍で高値を呈するものが理想的と考えらるが,そのような糖鎖が最も有意差が大きいわけではないため,さらなる解析を進行中である.基礎的な実験経過はほぼ良好に進んでいると考えられるが,膵臓がん患者の血液サンプルの集積がやや当初の計画より少ないと考えられる.膵癌は早期発見が困難であり、発見された時には進行癌で切除不能な症例が少なくない。また、放射線治療・化学療法など集学的治療の発達により徐々に治療成績の向上はみられるが、膵臓癌の腫瘍マーカーは、現在CEA,CA19-9,Dupan-2,Span-1などで、進行癌でも陽性率は高くない。糖鎖は、タンパク質の翻訳後修飾をなす重要な生体分子の一つで、発生・分化・増殖・がん化などに伴い糖鎖構造が変化し、すでにCA19-9やSLXがシリアルLeグループの糖鎖抗原として臨床応用されている。最近、肝癌でフコシル化AFPが悪性度を示すバイオマーカーとして注目されるようになった。今回、膵臓癌患者を対象とし、血清中の糖鎖の網羅的解析を行い、膵臓癌に特異的な糖鎖マーカーを検索した。得られた糖鎖発現プロファイル解析で、診断の可能性を検討した。同意の得られた膵臓癌患者17例と健常者の11例の血漿から、タンパク質と修飾N型糖鎖を遊離、ヒドラジド基を有するビーズで遊離N型糖鎖を標識した後に精製分離、質量分析を行った。糖鎖を調整してMALDI-TOFから多変量解析という方法は定量性に乏しいと考えられたため、定量性のあるLC-MSで再測定を実施した。得られたデータをSIMCA-P+を使用し多変量解析した。網羅的解析を実施し、802個のイオン中9個のイオンが糖鎖マーカー候補として挙がった。得られた糖鎖の発現パターンをもとに、健常者群と膵臓癌患者群との間でOPLS法による層別化が有意に可能であった。また、健常者群と膵臓癌患者群間で、両者の層別化が可能な発現糖鎖が9つ抽出可能であった。以前に検討した6個の候補糖鎖のうち,今回のLC-MSで再測定解析では5個は有意差が認められ、再現性が確認された.膵臓癌患者のおける血清中の糖鎖の網羅的解析を行い、6糖鎖を抽出し、そのうち4糖鎖は再現可能であった。

健常者群と膵臓癌患者群との間でOPLS法による層別化が有意に可能であった。膵臓癌患者17例と健常者の11例の血漿から、タンパク質と修飾N型糖鎖の質量分析を行った。膵臓癌患者のおける血清中の糖鎖の網羅的解析を行い、6糖鎖を抽出し、そのうち4糖鎖は再現可能であった.今後これらの糖鎖測定により膵臓癌の早期発見や再発の発見に有用になることが示唆された.今回同定された6個の糖鎖に関して膵臓がんに特異的な糖鎖を探索していく.その方法として,膵臓がん患者に関して,経時的に血漿の糖鎖の発現パターンを解析し,病理組織学的因子と転移ならびに治療効果について検索する.さらに対象症例を経時的に糖鎖発現パターンを解析し,行った治療の効果判定で,治療効果のある症例と治療効果のなかった症例との間での糖鎖発現パターンを解析する.特に根治切除を施行例については,治療前と糖鎖発現パターンについて比較検討する.症例の集積を行い,統計解析ソフト(SIMCA P+ ver.12, Umetrics社製)を使用し,健健常者と膵臓がんの2群間に対して,再度T-testを行い,最も有意差(p<0.01)を示す糖鎖を特定する.特定された糖鎖から,判別モデルを作成し,ランダムに抽出したサンプルが,健常者のものか,消化器癌患者のものかを判別し,そのSensitivity, Accuracy, Specificityについて検討する.さらに他がんで同定される糖鎖との共同性の有無について解析を行い,膵臓がんに特異的であることの確認作業を進めていく.画像検査により,再発を認める症例について,画像所見より以前に糖鎖に変化が認められなかったかどうかについて検索し,より早期に再発診断可能となる糖鎖の検索を行う.消化器外科
受容体を介した平滑筋収縮におけるCa^<2+>感受性増強機構と細胞内情報伝達系の研究

受容体を介したCa^<2+>感受性調節機構に関与する細胞内情報伝達系研究の一環として、α_1-アドレナリン受容体サブタイプ(α_<1A>およびα_<1B>)を介した収縮におけるCa^<2+>感受性増加機構を明らかにした。本年度は特に血管平滑筋に焦点をしぼって実験を行った。1.家兎胸部大動脈摘出切片を用いた細胞内Ca^<2+>濃度の測定および収縮実験細胞内Ca^<2+>濃度([Ca^<2+>]i)と収縮張力との関係をfura-2/AMを取り込ませた標本を用いて調べた。完全活性薬のノルエピネフリン(NE)および部分活性薬のクロニジン(Clon)で[Ca^<2+>]i(R340/380)と張力の間にはそれぞれ直線性が得られ、収縮に対するCa^<2+>利用率はNEよりもClonの方が大きかった。さらに、クロロエチルクロニジン処理標本(α_<1A>-受容体のみが存在する標本)ではNEのCa^<2+>利用率は未処理標本に比べ有意に大きかった。ミオシン軽鎖キナーゼ阻害薬のKT5926(10^<-5>M)およびK252a(10^<-6>M)はClon(3×10^<-6>M)よりもNE(3×10^<-8>M)の収縮を強く抑制した。クロロエチルクロニジン処理標本ではKT5926およびK252aによる抑制は未処理標本と比較して有意に小さかった。2,ミオシン軽鎖のリン酸化量の測定NE(10^<-5>M)によって45.2%のミオシン軽鎖がリン酸化され、一方Clon(10^<-4>M)は24.8%のミオシン軽鎖がリン酸化され、完全活性薬の方がリン酸化量が多かった。これらの結果より、NEはα_<1A>-およびα_<1B>-受容体サブタイプを介してミオシン軽鎖のリン酸化に依存しない経路とミオシン軽鎖のリン酸化に依存した経路の両方を活性化して収縮に対するCa^<2+>感受性増加を起こすのに対し、Clonは主にα_<1A>-受容体サブタイプを介してミオシン軽鎖のリン酸化に依存しない調節経路をより活性化して収縮に対するCa^<2+>感受性増加を起こしていることを明らかにした。