hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
フィラグリン欠損マウスを用いた、低湿度環境によるアトピー性皮膚炎発症機序の解明

フィラグリンの機能喪失変異がアトピー性皮膚炎の発症因子として注目されている。乾燥環境がフィラグリン欠損皮膚に与える影響を評価することで、アトピー性皮膚炎発症機序の解明を試みた。生後より低湿度環境下で飼育したフィラグリン欠損マウスは、通常湿度環境下で飼育するのに比べ、尋常性魚鱗癬の表現型が増悪した。低湿度環境下で飼育したフィラグリン欠損マウスは、同腹の野生型マウス及び通常湿度環境下で飼育したマウスに比べ、異常な角質形成がみられ、角層の物質透過性が亢進していることがわかった。本研究より、フィラグリン欠損皮膚は、乾燥環境という因子が加わることでバリア機能がより増悪することがわかった。フィラグリンの機能喪失変異がアトピー性皮膚炎の発症因子として注目されているが、フィラグリン変異を有するだけでアトピー性皮膚炎を発症するわけではなく、発症機序には不明な点が多い。本研究では、フィラグリン欠損マウスを低湿度環境下で飼育し、乾燥環境がフィラグリン欠損皮膚に与える影響を構造、機能的に評価すると共に、各種抗原を塗布することでアトピー性皮膚炎様マウスモデルの作成を試みた。通常湿度環境下(湿度40-60%)で飼育したフィラグリン欠損マウスは、日齢3頃からドライスキン様の外観と著しい落屑を認め、フィラグリンが原因遺伝子である尋常性魚鱗癬に類似した表現型を示すが、皮膚が体毛に覆われるとこれらの表現型は消失する。一方、生後より低湿度環境下(湿度20%以下)で飼育したフィラグリン欠損マウスは、通常環境下で飼育するのに比べ尋常性魚鱗癬の表現型が増悪し、アダルトマウスまで症状が遷延することがわかった。低湿度環境下で飼育したフィラグリン欠損マウスの皮膚バリア機能を評価したところ、同腹の野生型マウス及び通常飼育環境下で飼育したフィラグリン欠損マウスに比べ、経皮水分蒸散量の著しい増加が認められ、外界から角層内への蛍光物質の浸透性の亢進が観察された。低湿度環境下のフィラグリン欠損皮膚を組織学的に観察すると、異常な角質形成がみられ、亀裂が生じやすく、物理的に脆弱である可能性が示唆された。しかし、生後より低湿度環境下で飼育したフィラグリン欠損マウスが皮膚炎を自然発症することはなく、血清総IgE値も上昇しなかった。OVAを用いて外来抗原に対する経皮免疫応答能を評価したところ、通常湿度環境下で飼育したマウスに比べ、低湿度環境下で飼育したマウスでは経皮免疫応答が亢進する可能性が示唆された。本研究結果より、フィラグリン欠損皮膚は、乾燥環境という因子が加わることでバリア機能がより増悪することがわかった。アトピー性皮膚炎の主要な発症因子であり、角層の構成タンパク質であるフィラグリンの発現を完全に欠損したマウスを低湿度環境下で飼育し、乾燥環境がフィラグリン欠損皮膚に与える影響を解析した。まず、飲水や糞尿の影響があっても、マウス飼育ケージ内の湿度を20%以下に維持できるしくみを確立した。続いて、C57BL/6バックグラウンドのフィラグリン欠損マウスを生後より低湿度環境下(湿度20%以下)で飼育した。通常環境下(湿度40-60%)で飼育したフィラグリン欠損マウスは、日齢4-5をピークにドライスキン様の外観と著しい落屑を認め、フィラグリンが原因遺伝子である尋常性魚鱗癬に類似した表現型を示すが、皮膚が体毛に覆われるとこれらの表現型は消失する。低湿度環境下で生後より飼育したフィラグリン欠損マウスでは、通常環境下で飼育するのに比べ尋常性魚鱗癬の表現型が増悪し、その症状がアダルトマウスまで遷延することがわかった。さらに同腹の野生型マウスに比べ、明らかな成長障害を観察した。低湿度環境下で飼育したフィラグリン欠損マウスの皮膚バリア機能を評価したところ、同腹の野生型マウス及び通常飼育環境下で飼育したフィラグリン欠損マウスに比べ、経皮水分蒸散量の著しい増加が認められ、角層内への蛍光物質の浸透性の亢進が観察された。ここまでの結果は、フィラグリン欠損という遺伝的な角層機能異常を有するマウスに、低湿度環境という環境因子が加わることでさらに皮膚バリア機能が障害され、種々の抗原物質の皮膚透過性が亢進することでアトピー性皮膚炎の発症が導かれるという研究者の作業仮説に合致するものである。今後、種々の抗原物質を経皮的に塗布することでアトピー性皮膚炎様マウスモデルを作成し、アトピー性皮膚炎発症機序の解明を目指す予定である。過去のいくつかの知見から、フィラグリン欠損により生じる角層バリア機能異常の増悪因子として“乾燥環境"が想起されたものの、フィラグリン欠損マウスを低湿度環境下で飼育することにより、本当に皮膚バリアの増悪・破綻が起こるのかどうか、という部分が本研究の最大の懸案事項であった。

したがって、今年度いくつかの試行錯誤を経て、低湿度環境下で同様に飼育した野生型マウスや通常環境下で飼育したフィラグリン欠損マウスに比べ、低湿度環境下で飼育したフィラグリン欠損マウスで上述のように顕著な皮膚バリア障害を観察したことは、来年度に本研究から多方面への発展が期待できるという点で、“おおむね順調に進展している"と評価してよいものと考える。研究者は、これまでにフィラグリン欠損マウスを用いた研究を継続して行っており、皮膚バリア機能の解析や皮膚表面構造の観察に関する豊富な研究手技と研究実績(Kawasaki H et al. J Allergy Clin Immunol. 2012)を有したことが実験を順調に進めたものと思われる。計画を上回るまでの成果と言えないのは、まだアトピー性皮膚炎様の病態を安定して再現しうるマウスモデルの確立に至っていないからである。しかし、低湿度環境下で飼育したフィラグリン欠損マウスでは、既に組織レベルで表皮肥厚、真皮浅層の血管拡張、細胞浸潤の増加等、皮膚炎形成を示唆する像を観察しており、今後適切な抗原物質を経皮的に塗布することでアトピー性皮膚炎に特徴的な病態をとるマウスモデルの作成に至るものと期待される。これまでの研究から、フィラグリン欠損皮膚で生じる皮膚バリア機能の破綻に乾燥環境が影響することがわかった。今後は計画通りに、低湿度環境下で飼育したフィラグリン欠損マウスに適切な抗原物質を塗布することでアトピー性皮膚炎様マウスモデルの作成を目指す。そして本マウスの解析を通じて、フィラグリン欠損に起因するアトピー性皮膚炎発症機序の解明を目指すと共に、保湿剤外用による皮膚炎発症抑制効果の検討を行う。アトピー性皮膚炎様マウスモデル作成に関して、研究者にはこれまで複数の抗原物質を様々な手法でマウスに経皮塗布し、解析した豊富な経験がある。過去の手法や抗原液、アジュバント使用等の知識、経験を十分に生かし、最適なマウスモデルの確立をできるだけ迅速に進めていく予定である。また、疾患発症過程の解析を円滑に進めるために、乾燥環境がもたらす皮膚バリア障害を詳細に解析検討する目的でフィラグリン欠損ヘアレスマウスを、皮膚炎発症過程でのランゲルハンス細胞による抗原取り込みの意義を明らかにする目的でフィラグリン欠損langerin-DTAマウスを、既に作成している。さらに、乾燥環境下でのフィラグリンの機能をより詳細に解析する目的で、フィラグリンが天然保湿因子に分解される過程で重要なブレオマイシン加水分解酵素を欠損するマウスの飼育を開始している。保湿剤外用効果の検討に関しては、どの時期からどういう形で保湿剤塗布をすれば乾燥環境の影響を緩和できるかに関する研究協力者との議論、予備検討を既に開始している。また、次年度はいくつかの国内・国際学会に参加し、成果を発表すると共に今後の研究発展のために情報収集、他の研究者との情報交換を行う予定である。本研究は、主に研究者が所属する施設の既存の研究機器を利用し、新たな機器を購入することなく遂行していく予定である。本研究の大部分がマウスを用いたin vivoの実験となるため、研究費はマウスの購入・飼育費に多くを充てる予定である。また、次年度は皮膚炎発症機構の解析にも力を入れる計画のため、ELISA解析やフローサイトメトリー解析、共焦点顕微鏡、電子顕微鏡観察等の実験に用いる各種試薬、抗体、器具、解析ソフト等の購入費が昨年以上に必要となる。
十八世紀ウィーンにおけるイタリア・オペラの上演状況

オペラ・セリアの台本を分析することを通じて、十八世紀の劇場におけるジェンダーの諸相を明らかにした。今年度はメタスタジオのオペラ『シーロのアキッレ』を取り上げた。従来の音楽史においては、メタスタジオの「台本改革」によって、オペラから異装という要素は排除されたと説明されてきた。しかしこの作品において、主人公である若きアキレウスはほとんどの場面で女装しており、しかもその姿は魅力的なものとして描かれる。この作品はマリア・テレジアの婚礼のために1736年に初演されて大成功を収め、その後92年間にわたって欧州各地で再演された。この「女装オペラ」が広く受け入れられた要因は、当時のオペラでは英雄役の音域がヒロインと重なっており、さらに劇場の花形であるカストラートの容貌が女性的なものであったことが挙げられる。観客たちは舞台上で男女の境界が曖昧になり、時に入れ替わる様子に魅了されていたのである。実際、当時のローマでは、オペラでも演劇でも「女形」が一般的であった。したがって「国民を教化する詩人」となることを目指したお堅いメタスタジオですら、美貌の歌手・サリンベーニの出演が決まった時点で「女装」をテーマとする誘惑に抗えなかったのである。現代のオペラハウスで定番となっている「ソプラノのヒロインがテノールのヒーローを愛して死ぬ」というパターンは1830年以降に成立したものに過ぎない。アンシャン・レジームの観客は両性具有の魅力に惹かれて劇場に足を運んでいたのである。十八世紀のウィーンで上演されたオペラの台本を分析することを通じて、イタリア語の音楽劇が宮廷社会で果たした役割について考察した。主として取り扱うのは、カール六世とマリア・テレジアの治世に宮廷詩人として活躍したピエトロ・メタスタジオ(1698-1782年)の音楽劇である。今年度は第1に、オペラ・セリアの台本と、歌手の声域との関係に着目して、オペラで描かれるジェンダーの様相について分析した。現代の我々が「オペラ」として連想する演目はロマン主義以降の産物であり、「男らしい」テノールと「か弱い」ソプラノの悲恋を描いたものである。しかし十八世紀にはそのようなパターンは主流ではなかった。宮廷オペラのヒーローはカストラートー(去勢歌手)が歌う習慣であり、彼らは女性とほぼ同じか、それよりも高い音域で歌った。非日常的な高い声は気高さや性的な魅力のコードであり、「自然な」男声は若くない役柄(父親など)に追いやられていた。また、物語の中では性差よりも血統が重んじられ、結末のカギを握るのは常に王族であった。以上の点については、平成18年11月に口頭発表(於・東京音楽大学)を行った。第2に十八世紀に出版されたメタスタジオの作品集を調査することを通じて、当時のオペラ台本(リブレット)が宮廷社会でどのようなステイタスを持って流通していたのかを考察した。1780年からパリで出版された全集は、冒頭に王妃マリーアントワネットへの献辞があり、協賛者として各国の王侯の名前が連なっている。また、作品の選び方や順序も現代の全集とは異なっている。当時の書籍は高額な贅沢品であり、それを出版すること、手に入れることの意味は現代とは大きく違っていたのだ。このような、舞台で上演されるものとは別の「書籍」としての台本の受容については、来年度の発表を予定して現在原稿を準備中である。
半導体ナノ微結晶の表面エネルギー制御による結晶系遷移

1.超微結晶調製法の探索と表面修飾化学種の検討を行った。CdS,ZnS半導体の種々の有機溶媒中での調製法を確立し、温度、濃度によって決定される微結晶の成長速度の特徴を明らかとした。ついで、系内に微結晶表面と強く相互作用する無機カウンターアニオン、表面修飾化学種による表面改質法を確立した。2.溶液内での微結晶の表面原子配列構造ならびに溶液内化学種の配位構造の詳細をX線吸収分光(XAFS)によって検討した。微結晶の成長過程における表面の原子配列と化学種との相互作用の相関を明確化し、先の調製条件との対応を検討した。また、真空中にて単離後、形状と粒径については透過型電子顕微鏡(TEM)、原子間力顕微鏡(AFM)によって、結晶系については電子線、X線回折によって検討し、表面状態の変化と結晶系の相関を明らかとした。3.超微結晶の光学特性と結晶系、表面エネルギーの相関を検討した。上記の実験結果に基づき結晶系を決定する表面エネルギー実体を密度汎関数法による理論計算により明確化した。さらに調製された微結晶を用い、可視光領域での吸収特性、発光量子収率ならびに励起子の寿命などの基礎的な光学特性を検討し、これらの特徴と微結晶の構造との相関を明らかとした。
神経-免疫連関による神経幹細胞の活動制御機構の解明

近年、神経幹細胞の増殖、分化を制御する因子として免疫系が強く寄与していることが注目されている。しかし、その詳細な分子メカニズムは解明されていなかった。本研究では、免疫系細胞が神経幹細胞の挙動にどのような影響を及ぼすのかを解明した。発達期の脳に存在する免疫系細胞の割合を調べたところ、B-1細胞が豊富に存在していることがわかった。B-1細胞は自然抗体を産生し、オリゴデンドロサイトの発達に寄与することで、軸索の髄鞘化を制御していることを明らかにした。神経幹細胞は脳発達期の側脳室周囲(増殖帯)に位置し、自己増殖をしながら神経細胞、グリア細胞に分化して脳に細胞を供給する。近年、神経幹細胞の増殖、分化を制御する因子として免疫系が強く寄与していることが明らかになっているが、その詳細なメカニズムは解明されていない。未成熟期での免疫系の異常が、様々な神経発達障害や精神疾患の原因になり得ることが指摘されているため、脳発達期における免疫系の機能解明は同疾患の病態解明のために極めて重要である。本研究では、末梢の免疫系細胞が神経幹細胞の挙動にどのような影響を及ぼすのかを解明する。これまでの研究により、脳発達期には自然免疫系に関わるNK細胞(Natural Killer細胞)とB-1細胞が多く存在していることを明らかにした。そこで、発達期の脳よりこれらの細胞を除去したときに、神経幹細胞の挙動に変化が生じるのかを検証した。その結果、NK細胞を除去した際には神経前駆細胞の数が減少し、B-1細胞を除去した際にはオリゴデンドロサイト前駆細胞の数が減少することを見出した。B-1細胞とオリゴデンドロサイト前駆細胞との共培養実験を行った結果、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖が促進された。これらの結果は、各免疫系細胞はそれぞれ異なる形で神経系細胞の発生に寄与していることを示唆している。今後は、NK細胞とB-1細胞による脳発達の分子メカニズムを解明することを目的に研究を遂行する。研究開始当初は、発達期脳内の免疫系細胞数は少ないだろうと考えていた。しかし、実際に解析したところ発達期の脳では成熟期よりも格段に免疫系細胞の数が多く、機能を阻害したときの影響も大きかった。多く検出された免疫系細胞のうち、B-1細胞は成熟期では腹腔などの限られた箇所にしか存在しないタイプの免疫系細胞であり、発達期の脳に存在していたことは非常に興味深い。B-1細胞を抗体処理により除去すると、オリゴデンドロサイト前駆細胞の数が減少した。この結果は、B-1細胞がオリゴデンドロサイト前駆細胞の発生に寄与していることを示唆する。オリゴデンドロサイト前駆細胞は神経幹細胞から発生するとともに、自己増殖を繰り返すことでその数を制御している。B-1細胞がどのようにしてオリゴデンドロサイト前駆細胞の発生に関与しているのかを細胞培養実験により検討したところ、B-1細胞はオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進することが明らかになった。以上のことから、当初の計画から想定していなかった脳内の免疫系細胞を同定することができ、その機能を明らかにできたことから当初の計画以上に進展していると考えている。近年、神経幹細胞の増殖、分化を制御する因子として免疫系が強く寄与していることが明らかになっているが、その詳細なメカニズムは解明されていなかった。本研究では、免疫系細胞が神経幹細胞の挙動にどのような影響を及ぼすのかを解明する。それぞれの細胞を発達期の脳から除去する処置を施すと、NK細胞を除去した際には神経前駆細胞の数が減少し、B-1細胞を除去した際にはオリゴデンドロサイト前駆細胞の数が減少することを見出した。本年度は、B-1細胞がオリゴデンドロサイト前駆細胞の数を制御している分子メカニズムを追究した。遺伝子発現解析や機能阻害実験により、B-1細胞は自然抗体を産生して、オリゴデンドロサイト前駆細胞が発現しているFca/mRを通して増殖を促進していることが明らかとなった。本研究は、脳発達期におけるリンパ球の機能とその分子機序を初めて明らかにした研究である。今後、病態モデルやヒトを対象にした研究により、脳神経疾患との関与が明らかになっていくことが期待される。B-1細胞がオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進することは明らかにした。今後はその分子メカニズムを明らかにする。

B-1細胞は自然抗体を産生することで異物の除去にあたる自然免疫系の細胞である。B-1細胞が自然抗体を通じてオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進している可能性に着目する。実際、B-1細胞とオリゴデンドロサイト前駆細胞の共培養実験により、自然抗体を機能阻害するとオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖効果が抑制される予備的実験結果を得た。今後は、in vivoで自然抗体の機能を阻害し、B-1細胞が自然抗体によりオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖を促進するのかを検証する。また、NK細胞は神経前駆細胞の増殖を促進する。遺伝子発現解析により、増殖を促進する候補因子を同定した。今後は、遺伝子組み換えマウスを用いてこの候補因子が神経前駆細胞の増殖に寄与しているのかを検証する。神経科学
中世天台寺院における児灌頂儀礼の生成と流伝に関する研究

本研究は、中世の天台寺院で稚児を対象にして行われた密教儀礼「児灌頂」に関する総体的考究を試みるものである。児灌頂とは、稚児を観音菩薩の化身へと変化させ聖性を発現させることを目的として中世の天台僧が修した儀礼である。今東光『稚児』(1936)がきっかけとなり一般に知られ、近年では稚児のセクシュアリティを強調する形で拡大されている。申請者はこれまで児灌頂の諸本研究に取り組み、テキストに則して儀礼を分析することで「児灌頂とは何か」という根本的な問い対する答えを提示してきた。これを承けて本研究では、近世以前の談義所寺院における児灌頂伝本の書写活動に焦点を当て、児灌頂儀礼の生成と流伝の解明を目指す。
味覚の発達を支える島皮質における摂食促進因子のシナプス伝達修飾作用

パッチクランプ法を用いて、摂食促進因子であるオレキシンまたはMCHの島皮質における局所神経回路に対する修飾作用を明らかにすることを目的とした。オレキシンAを投与することにより、Fast spiking cell(FS)→Pyramidalcell(Pyr)における単一性抑制性後シナプス電流(uIPSCs)の振幅が増加した。また、オレキシンBの投与でもFS→Pyrで生じるuIPSCsの振幅を増加された。オレキシン受容体1アンタゴニストとオレキシンの共投与にてuIPSCの振幅の変化はみられなかった。以上よりオレキシンは島皮質の局所回路に抑制的に働くことが示唆された。健全な食習慣の獲得には、正常な味覚の発達が不可欠である。味覚の修飾因子の一つとして食欲が挙げられる。一次味覚野として知られる大脳皮質島領野(島皮質)は摂食中枢である視床下部と密な神経連絡が存在する。したがって、味覚と食欲の情報は島皮質にて統合されている可能性がある。そこで本研究では、摂食促進因子であるオレキシンおよびMeranin concentrating hormon(MCH)の島皮質における局所神経回路に対する修飾作用を明かにすることを目的とする。H26年度は島皮質局所神経回路に対するオレキシンの修飾作用の解析を目標とした。GABA作動性ニューロンにVenus蛍光タンパクを発現させたVenus蛍光タンパク遺伝子ノックインラットを用い、島皮質を含む急性脳スライス標本を作製する。島皮質の複数のニューロンからパッチクランプ法によって同時記録し、シナプス結合が存在するニューロンペアを見つける。次にシナプス前ニューロンに脱分極生パルスを与え活動電位を発生させる。この活動電位によって誘発した単一性興奮性シナプス後電流(EPSC)ならびに抑制性シナプス後電流(IPSC)を記録し、その振幅がオレキシンの投与によりどのように変化したか検討した。オレキシンにはオレキシンAとオレキシンBの2種類のイソペプチドが存在する。本研究の結果、100 nMオレキシンAの投与によりFast spiking cell(FS)→Pyramidalcell(Pyr)におけるIPSCの振幅は増加した。また、100 nMオレキシンBの投与によってFS→PyrのIPSCの振幅も増加した。大脳皮質島領野(島皮質)は一次味覚野として知られている。島皮質は摂食中枢である視床下部と密な神経連絡が存在する。したがって、味覚と食欲の情報は島皮質で統合されていると考えられる。そこで、本研究では、主要な摂食促進因子であるオレキシンおよびMeranin concentrating hormon(MCH)の島皮質における局所神経回路に対する修飾作用を明らかにすることを目標とする。Venus蛍光タンパク遺伝子ノックインラット、いわゆるVenus発現ラットから島皮質を含む脳スライス標本を通法によって作製する。複数のニューロンからパッチクランプ法によって同時に記録し、シナプス結合が存在するニューロンペアを見つける。シナプス前ニューロンに脱分極性パルスを与え活動電位を発生させることによって誘発した単一性興奮性シナプス後電流(EPSC)ならびに抑制性シナプス後電流(IPSC)を記録し、その振幅がオレキシン投与によってどのように変化するか検討した。オレキシンAを100 nM投与した際にFast spiking cell(FS)→Pyramidalcell(Pyr)で発生したIPSCの振幅は増加した。また300 nMのオレキシンA投与でもFS→PyrでのIPSC振幅は増加傾向であった。オレキシンBを100 nM投与した際もFS→PyrでのIPSCの振幅は増加した。上記の結果より、オレキシンは島皮質の局所神経回路において抑制的に作用する可能性が示唆された。本研究は多チャンネル同時ホールセル・パッチクランプ法を用い、摂食促進因子であるオレキシンンおよびMCHの大脳皮質島領野(島皮質)における局所神経回路に対する修飾作用の解明をの目的とする。島皮質の複数ニューロンから同時記録を行い、シナプス前ニューロンへの刺激によりシナプス後電流を誘発させてオレキシン投与によりその振幅がどのように変化するを検討する。オレキシン投与により抑制性シナプス後電流の振幅が増加することが確認できた。しかし、オレキシン受容体のアンタゴ二ストであるSB334867とJNK10397049それぞれとオレキシンを共投与した際にオレキシン単独投与でみられた振幅の増加が発現するかについては現在検討中である。オレキシンによるシナプス後電流の変化がどちらの受容体を介して生じているかが解明できていないため、平成26・27年度の研究実施計画である「島皮質におけるオレキシンよる局所神経回路への修飾作用の解明」は現段階では遅れていると考える。健全な食習慣を獲得するための重要な因子として味覚が挙げられる。味覚を修飾するものとして食欲があり、島皮質は摂食中枢である視床下部と密な神経連絡が存在すると報告されている。そこで、本研究ではパッチクランプ法にて摂食促進因子であるオレキシンを用いることで、摂食促進因子の島皮質における局所神経回路に対する修飾作用を検討する。これにより味覚と摂食関連ホルモンとの関係について神経回路レベルで明らかにすることを目的とした。実験には生後24週齢のVGAT-Venusノックインラットから島皮質を含む急性脳スライス標本を作製した。複数のニューロンより同時ホールセル記録し、シナプス結合が存在するニューロンペアを見つける。

シナプス前ニューロンに脱分極性パルスを与え単一性シナプス後電流を記録し、オレキシン投与による振幅の変化を検討した。100 nMオレキシンAの投与によりFast spiking cell(FS)→Pyramidalcell(Pyr)で発生した抑制性単一性シナプス後電流(uIPSC)の振幅は増加した。300 nMオレキシンA投与でも同様の結果が得られた。そのため、オレキシンAは濃度依存的に島皮質の局所神経回路に対して抑制的に作用する可能性が示唆された。また、オレキシンンB投与によりFS→Pyrで発生するuIPSCの振幅を増加させた。オレキシンA・BともにFS→PryにおけるuIPSCの振幅を増大させた。上記の結果より、オレキシンAは一次味覚野である島皮質における局所神経回路に対して抑制的に作用することが示唆され、味覚と食欲には神経回路レベルにて関連があることが明らかとなった。パッチクランプ法を用いて、摂食促進因子であるオレキシンまたはMCHの島皮質における局所神経回路に対する修飾作用を明らかにすることを目的とした。オレキシンAを投与することにより、Fast spiking cell(FS)→Pyramidalcell(Pyr)における単一性抑制性後シナプス電流(uIPSCs)の振幅が増加した。また、オレキシンBの投与でもFS→Pyrで生じるuIPSCsの振幅を増加された。オレキシン受容体1アンタゴニストとオレキシンの共投与にてuIPSCの振幅の変化はみられなかった。以上よりオレキシンは島皮質の局所回路に抑制的に働くことが示唆された。本研究は多チャンネル同時ホールセル・パッチクランプ法を用い、摂食促進因子であるオレキシンおよびMeranin concentratinghormon(MCH)の大脳皮質島領野(島皮質)における局所神経回路に対する修飾作用の解明を目的とする。島皮質のニューロンから同時ホールセル記録し、シナプス前ニューロンに脱分極性パルスを与え活動電位を発生させることで誘発される単一性興奮性シナプス後電流(EPSC)および抑制性シナプス後電流(IPSC)を記録し、オレキシンによりシナプス後電流の振幅がどのように変化するか検討した。結果、オレキシンA・オレキシンBともにFast spiking cell(FS)→Pyramidalcell(Pyr)における抑制性シナプス後電流の振幅を増大させた。オレキシンA・Bともに抑制性シナプス後電流への修飾作用について検討がついたが、興奮性シナプス後電流への修飾作用については結果が出ていない。また、シナプス前ニューロンがFS以外の抑制性ニューロンについても検討出来ていない。そのため平成26年度の達成目標である「島皮質におけるオレキシンの局所神経回路への修飾作用の解明」はやや遅れていると考える。本研究の目標が「味覚の発達を支える島皮質における摂食促進因子のシナプス伝達修飾作用の解明」である。
ヘルペスウイルスゲノム非コード領域のウイルス増殖における機能解明

ウイルスゲノムは一般に効率的遺伝子配置が見られる.しかし,ヘルペスウイルスゲノムでは部分的に長い非コード領域が存在する.この研究ではウマヘルペスウイルス1型(EHV-1)をモデルとし,ウイルス増殖における非コード領域の機能解明を目的とした.その結果,この非コード領域から1028塩基長(lncRNA-X1)及び679塩基長(lncRNA-X2)の長鎖非コードRNAが転写されていることを明らかにした.lncRNA-X1/X2非発現EHV-1は神経細胞増殖において一部の遺伝子発現が低下していることがわかり,lncRNAはEHV-1の神経細胞増殖において何らかの役割を担っていることが示唆された.真核生物ゲノムには長大な非コード領域が存在しているが,その機能は不明である.一方,ウイルスのゲノムは2本鎖DNAの両鎖に遺伝子がコードされたり,部分的に重複するなど,ウイルスゲノム上に遺伝子が効率的に配置されている.ヘルペスウイルスにおいても,このような効率的な遺伝子の配置がみられるが,部分的に遺伝子がコードされていない長い非コード領域が存在する.この領域の機能は不明である.我々のウマヘルペスウイルス1型(EHV-1)の転写解析による予備的な研究から,この領域からロングノンコーディングRNA (lncRNA)が転写されていること,この領域に外来遺伝子を挿入すると神経病原性が減弱することが示された.そこで,本研究では,lncRNA解析などによりEHV-1非コード領域の機能を明らかにし,真核生物における非コード領域の機能を解明する基礎を得ることを目的としている.今年度はEHV-1非コード領域のうちORF62とORF63の間の領域を研究対象とした.この領域には互いに向き合うように2カ所の転写開始領域(ここではX1, X2とする)が存在することが予備的な解析からわかっている.そこで,X1とX2を5'-RACE法により解析したところ,予備的な解析結果と同様の結果が得られ,実際に転写がなされていることを確認した.合わせて3'-RACEにより3'末端を明らかにしようとしたが,一般に行われている3'-RACEでは結果が得られなかった.他の生物における解析でポリA鎖をもたないlncRNAも知られていることから,EHV-1のORF62-ORF63間にコードされているlncRNAもポリA鎖を持たない可能性が示された.ついで,このX1とX2の間の塩基配列を赤色蛍光タンパク質(mCherry)遺伝子で置換したウイルスを構築した.ゲノム上のコード領域からの転写産物(mRNA)のみならず、非コード(nc)領域からの転写産物(非コードRNA、ncRNA)が様々な機能を担っていることが明らかになりつつあり、細胞生物学的にRNAの機能に対する関心が高まっている。我々はウマヘルペスウイルス1型のハムスターに対する神経病原性に寄与する可能性のある新規lncRNA候補となる2つの転写産物lncRNA-X1およびlncRNA-X2を発見した。昨年度は5'末端を同定できたが,3'末端は同定できなかった.一方,lncRNAの発現を解析するためlncRNAの内部を赤色蛍光タンパク質(mCherry)遺伝子に置換したウイルス(EHV-1 lncRNA-mCherry)を構築した.今年度は,mCherryをマーカーとしてlncRNA-X1, -X2の発現を調べるとともに,lncRNA全長の同定、特異的検出系の構築、および機能的破壊による他のウイルス遺伝子転写動態解析を行った。EHV-1 lncRNA-mCherryを細胞に感染させたところ,mCherryを含むRNAの発現がみられたが,赤色蛍光は観察されなかった.単純なmCherry ORFによる置換ではタンパク質発現には至らなかったと推察した.lncRNA-X1および-X2について再度3'末端の同定をおこない,ポリA付加部位を同定することができた.lncRNA-X1は1028塩基長,lncRNA-X2は679塩基長であった.lncRNA-X1/X2を発現しないウイルスをマウス培養神経細胞に感染させたところ,数種類のウイルス遺伝子発現が減少ないし検出限界以下に低下していることがわかった.馬胎児腎臓細胞感染ではこの減少はみられなかった.lncRNAがウマヘルペスウイルス1型の神経細胞における増殖になんらかの役割を担っている可能性を明らかにできた.ウイルスゲノムは一般に効率的遺伝子配置が見られる.しかし,ヘルペスウイルスゲノムでは部分的に長い非コード領域が存在する.この研究ではウマヘルペスウイルス1型(EHV-1)をモデルとし,ウイルス増殖における非コード領域の機能解明を目的とした.その結果,この非コード領域から1028塩基長(lncRNA-X1)及び679塩基長(lncRNA-X2)の長鎖非コードRNAが転写されていることを明らかにした.lncRNA-X1/X2非発現EHV-1は神経細胞増殖において一部の遺伝子発現が低下していることがわかり,lncRNAはEHV-1の神経細胞増殖において何らかの役割を担っていることが示唆された.平成26年度はlncRNAの5'末端および3'末端の同定に時間を要したため,蛍光タンパク質置換ウイルスの構築までを行った.研究計画では変異体ウイルスを用いた網羅的転写動態解析を行う予定であったが,変異ウイルス構築が遅れた.その理由の一つは実験計画を変更し,平成27年度に行う予定であった標的lncRNAをクローニングし,真核細胞における単独発現の影響を調べる実験をはじめに行うこととしたためである.しかしながら,クローニングができなかった.

3'-RACE解析から標的lncRNAにはポリA鎖がついていない可能性が示された.これらの実験作業に時間を要したため,計画が遅れた.獣医ウイルス学実験計画を部分的に変更する.平成26年度に構築できなかった転写欠損ウイルスの構築を引き続き行う.これらの変異ウイルスを構築したのち,ウマ腎臓細胞およびマウス神経細胞における増殖動態を解析する.変異ウイルスの増殖動態に変化がみられることを確認できた場合,網羅的転写解析を行う.これらの実験結果にもとづき,ORF62とORF63の間に存在するlncRNAのウイルス学的意義を考察する.実験計画の実行に遅れが生じたため,実験経費に余剰が生じた.遅れた実験計画は平成27年度に実施するため,経費が必要となる.
化学反応に基づく油滴の内部対流を使った自走制御と水上物体搬送への適用

無水オレイン酸を主成分とする油滴を界面活性剤の水溶液に滴下すると,油滴界面に溶液の濃度差ができ,その内部にマランゴニ対流が発生して自走を始める.自走のエネルギーは油滴界面における界面活性剤の濃度差に起因し,これは油滴内の無水オレイン酸が加水分解反応を起こすことによって保たれる.本研究では,微細な形状記憶合金ワイヤアクチュエータを油滴の外骨格として与えることで,油滴の自走方向と速度の動的制御に挑戦する.外骨格による油滴の自律変形は,対流発生の境界条件を変化させる.電気などの外部エネルギーを必要としない化学反応に起因する自律自走の制御は,ミリ・マイクロスケールにおける有力な物体移動法となり得る.無水オレイン酸を主成分とする油滴を界面活性剤の水溶液に滴下すると,油滴界面に溶液の濃度差ができ,その内部にマランゴニ対流が発生して自走を始める.自走のエネルギーは油滴界面における界面活性剤の濃度差に起因し,これは油滴内の無水オレイン酸が加水分解反応を起こすことによって保たれる.本研究では,微細な形状記憶合金ワイヤアクチュエータを油滴の外骨格として与えることで,油滴の自走方向と速度の動的制御に挑戦する.外骨格による油滴の自律変形は,対流発生の境界条件を変化させる.電気などの外部エネルギーを必要としない化学反応に起因する自律自走の制御は,ミリ・マイクロスケールにおける有力な物体移動法となり得る.
階層的集合振動体としての生物時計機構のモデル化

脳の視交叉上核(SCN)に存在するニューロン群は日周振動子の生理学的実体と考えられる。(1)時計遺伝子を含む哺乳類の振動機構をモデル化した。これは、Per,Clock,Cry,Bmal1,Decからなる転写・翻訳フィードバックループの酵素反応系からなっている。このモデルは、Per,Cry,DecとBmal1とが逆位相関係を保ちながら振動しており、また、、Per,Clock,Cry,Bmal1のノックアウト実験の結果を再現した。また、Decをノックアウトした場合について振舞いを予測した。さらにCREBのリン酸化レベルの日周変動を転写・翻訳ループの外部に結合し、光変換機構のモデル化を行った。これにより、位相反応曲線に不感領域が現れ、実際の位相反応性を再現するものとなった。(2)分子レベルからSCN全体をモデル化するために、分子レベルの振動モデルを15変数から4変数へ縮約し、その振動解の振舞いや位相反応性について調べた。その結果、この縮約は詳細な記述によるモデルの力学的な性質を定性的には保存していることが明らかになった。さらに縮約モデルを拡散で結合した系についてそのダイナミクスを調べた。その結果、Perあるいはそれと同相で動いている変数に関連した拡散が系全体での同期性に支配的な役割を担っていることが明らかになった。(3)行動レベルから振動子への適応的なフィードバックを有する位相振動子モデルに新たに光応答性を導入し、時差飛行時の日周振動子の振舞いをシミュレーションした。それにより、順行性、逆行性、分離再同調が生じる条件を明らかにした。また、運動によって分離再同調が防止されることが明らかになった。以上は階層的集合振動体としてのSCNの生体リズム機構から、行動レベルまでを見通した統合的なモデル化による独自の成果である。
ショウジョウバエDNA修復酵素の発現様式と機能解析

色素性乾皮症(xeroderma pigmentosum:XP)は、DNAの除去修復機構に異常をもつ常染色体劣性のヒト遺伝病で、患者は紫外線に高感受性を示し高頻度で皮膚癌を発症し、しばしば神経学的異常を併発することが知られており、日本人に多いA群(XPA)は、除去修復能も一番低く重い症状を示す。我々は、トリ・カエル・ショウジョウバエ(Dxpa)にもXPA遺伝子が存在し転写発現されていること、さらにこれらホモログのアミノ酸一次配列の比較から、N末側約3分の1の領域は核移行シグナルとして働く部位を除いては保存度が低いこと、残りのC末側約170アミノ酸からなるZnフィンガーモチーフを含む領域はよく保存されていることを明らかにし、C末側の保存された領域がDNA修復にとり重要な機能をになっていることを示してきた。さらにヒトA群XP細胞でこのDxpa遺伝子を強制発現させると紫外線に対し抵抗性を回復すること、ショウジョウバエの抽出液を用いたin vitroのDNA修復系を作成し、Dxpa遺伝子がショウジョウバエのホモの系でDNA修復に働き得る新しい遺伝子であることなどを明らかにした。Dxpa遺伝子の発現を発生の各段階で調べたところ、胚、幼虫、蛹、成虫と発生の段階に従ってその発現が上昇すること、成虫においては頭部よりも胸腹部での発現が高いことがわかった。また成虫各組織での蛋白の発現は、どの組織でも発現しているが特に視神経や筋肉での発現が高く、またステージ14の胚の時期には、神経索で強く発現していることが明らかとなった。これらの発現量の高さの生理的意味については、今後の検討が必要である。
バナールな事柄に着目したコミュニティのエートス変容に関する研究

山本は、2009年の東北哲学会第59回大会で、現代の日本社会がこれまでにない、質の違ったイラ立ちに満たされていることを指摘し、それが起こる背景・エートスを分析した上で、どうすればよいかの提案を試みたが、その内容を論文(「現代の倫理的なイラ立ちについて共生と寛容の手前で」)にまとめ、『東北哲学年報』No.26に発表した。井上は、2つの質問紙調査:【子ども調査】(2009年11月、サンプル数327)、【保護者調査】(2010年1-3月、サンプル数275)の結果を分析し、報告書『都市部のコミュニティ・スクールに通う子どもと保護者の地域とのかかわりに関する調査研究』(2011年3月発行、全98頁)をまとめた。本調査の特徴は、都市部のコミュニティ・スクールに指定された4つの学校区で、ありふれた(バナールな)事柄に着目し、そのコミュニティの子どもと保護者の意識と行動を探る点にある。調査結果からは、地理的にそれほど離れていないに関わらず、人々の地域へのかかわりや教育への意識が大きく異なっており、「地域とともに子どもを育てる」ためには、地域の実情や特性を重視すべきことが改めて確認された。千田は、井上の調査をもとにして、都市部のコミュニティで必要とされるのは、これまでのコミュニティとは異なった新しい「共に生きている」という感覚ではないかということを心理学的見地から助言した。岡山は、バナールな生活景の中に見出されていた「意味」が景観の中で失われてゆくことが、コミュニティのエートス形成とどのような影響関係にあるのかを考察するべく、神奈川県川崎市のショッピングセンター(ラゾーナ川崎)周辺地域、東京タワー周辺地区と建設中のスカイツリー周辺地区の比較調査を行った。また、本研究に関わる4人がベースとなって『世界を読み解くリテラシー』萌書房を編集・発刊した。このテキストは、コミュニティのエートス変容にはリテラシーの問題が深く関与しているという観点のもとにつくられている.バナールな(ありふれた)コミュニティのエートス変容を目指す本研究の理論的意義を明確にするため、山本史華が「バナールな現象としてのエートスコミュニティ・スクールの新たな可能性を探して」(『MORALIA』第15号)を執筆した。現代倫理学がエートスを離れている点を批判し、バナールな事柄への回帰を主張した。と同時に、コミュニティ変容には、価値の多元化を認める寛容さが不可欠であることを指摘した。井上健は、自らが学校運営委員会(法律上の名称は学校運営協議会)の委員長を務める世田谷区立A小学校をフィールドに研究を進めている。20年度は、同校6年生を対象にプリテストを実施し、子どもと近所の大人との関わり、地域での活動、地域イメージなどを探った。その結果、「親切な人がたくさんいる」の数値が高く(「とても+わりとそう」68.6%)、「みんな忙しそうにしている」の数値が低い(同23.2%)など興味深いデータが得られた。21年度は、他地域でも調査を実施し、それがA校児童に特有のものなのか、何に因るものなのか等を考察しながら、コミュニティのエートスを測定する方法の開発を目指す。岡山理香は、コミュニティと景観の関係性について考究すべく、都市の景観を構成する要素として、特に重要だと思われる3つの項目(1)パス(2)ディストリクト(3)ランドマークについて実地調査をした。今後、特に景観が改良された場合のコミュニティのエートス変容について注目していく予定である。山本は、現代のコミユニティを覆う負のエートスとして、「倫理的なイラ立ち」を問題に取り上け、学会発表(第59回東北哲学会)を行った。現代の日本人は、なぜ相異なる価値観/倫理観に対して寛容でなくなったのか、どうして簡単にイラ立ちが暴走するのかを分析し、それをもとに、ローカル・コミュニティにフロネーシスを根づかせることがイラ立ちの処方にたることを主張した。井上は、昨年度のプレ・テストで有用性が確認できた質問項目をベースに、改良を加えた調査票をもちいて東京都S区の4小学校で「子どもと地域(まち)の関わり」を探るための質問紙調査を行った(調査対象:小学5年生、実施時期:11月から12月、主な調査項目:地域(まち)での体験、近所の大人との関係、地域(まさ)に対するイメージなど)。さらに、「子どもの地域(まち)の関わり」には「保護者の地域での活動や地域観」が大きな影響を与えていると考えられるので、保護者調査実施した(調査対象:小学5年生の保護者、実施時期:1月から2月、主な調査項目:近所のづきあい、町会活動、地域への愛着、価値観など)。回収したデータは、現在、集計・分析中である。岡山は、コミユニティと景観の関係性について考究すべく、昨年度から引き続き都市の景観を構成する要素として、特に重要だと考えられる3つの項目(1)パス(2)ディストリクト(3)ランドマークについて実地調査をした。今年度は、特に(1)パスに重点存おいた。具体的には、東京都:渋谷川と暗渠となった地域周辺、東京都:日本橋川と日本橋周辺、京都府:堀川と東堀川通り周辺。以上の調査結果として、、パスの計画的変更によって形成された景観が、コミュニテイが作り出していった生活景を凌駕したさいに、そのコミュニティのエートスに変化が顕れたことが判明した。本研究に関わる四人がベースとなって、リテラシー変容の契機となるテキストを編纂した。

平成22年度中に刑行の予定である。山本は、2009年の東北哲学会第59回大会で、現代の日本社会がこれまでにない、質の違ったイラ立ちに満たされていることを指摘し、それが起こる背景・エートスを分析した上で、どうすればよいかの提案を試みたが、その内容を論文(「現代の倫理的なイラ立ちについて共生と寛容の手前で」)にまとめ、『東北哲学年報』No.26に発表した。井上は、2つの質問紙調査:【子ども調査】(2009年11月、サンプル数327)、【保護者調査】(2010年1-3月、サンプル数275)の結果を分析し、報告書『都市部のコミュニティ・スクールに通う子どもと保護者の地域とのかかわりに関する調査研究』(2011年3月発行、全98頁)をまとめた。本調査の特徴は、都市部のコミュニティ・スクールに指定された4つの学校区で、ありふれた(バナールな)事柄に着目し、そのコミュニティの子どもと保護者の意識と行動を探る点にある。調査結果からは、地理的にそれほど離れていないに関わらず、人々の地域へのかかわりや教育への意識が大きく異なっており、「地域とともに子どもを育てる」ためには、地域の実情や特性を重視すべきことが改めて確認された。千田は、井上の調査をもとにして、都市部のコミュニティで必要とされるのは、これまでのコミュニティとは異なった新しい「共に生きている」という感覚ではないかということを心理学的見地から助言した。岡山は、バナールな生活景の中に見出されていた「意味」が景観の中で失われてゆくことが、コミュニティのエートス形成とどのような影響関係にあるのかを考察するべく、神奈川県川崎市のショッピングセンター(ラゾーナ川崎)周辺地域、東京タワー周辺地区と建設中のスカイツリー周辺地区の比較調査を行った。また、本研究に関わる4人がベースとなって『世界を読み解くリテラシー』萌書房を編集・発刊した。このテキストは、コミュニティのエートス変容にはリテラシーの問題が深く関与しているという観点のもとにつくられている.
ラミニソペプチド抗体によるエライサーキットの開発と髄液解析による痴呆早期診断法

我々は各種ラミニンサブユニット抗体(α1、γ1、β1)、wholeラミニン抗体ならびにラミニンペプチド抗体(α1鎖のペプチドYFQRYLI)を用いた簡便なELISA法を確立し、アルツハイマー型痴呆(ATD:早発性ADと遅発性SDATを含む)とVaDを中心とする痴呆性疾患患者髄液と非痴呆疾患患者髄液のラミニン解析を行った。ラミニンγ1鎖はATD群で有意な低値を示しかつAD群においてのみ加齢に伴う急激な減少を示した。ラミニンペプチド(YFQRYLI)は正常群に比べSDAT群で有意に高値を示した。ラミニンβ1鎖とwholeラミニン-1はVaD群で有意に高値を示した。α5鎖は正常群に比べ全ての疾患群で有意に低値を示した。これらの結果は各種ラミニンサブユニット動態が疾患によって異なりラミニンが各病態に関与していることを示唆している。疾患による髄液ラミニン動態の違いを利用し、各疾患の生物学的診断マーカーへの有用性を検討した。ATD診断に「タウ濃度/wholeラミニン濃度」を指標とすると、感度85%と特異性81%を示し、ATD診断マーカーとしての有用性が示唆された。VaD診断にβ1を指標とすると感度88%を示し、β1のVaD早期診断マーカーとしての有用が示唆された。α5鎖は全疾患群で低値を示し、非特異的な脳障害の有無の判定に利用できることが示唆された。さらに、ATD群の脳でγ1鎖の産生が増加しているという報告と今回我々が得たATD群における髄液中γ1鎖の低値ならびにα1ペプタイド鎖の高値という結果はATDとSDAT脳における特定のラミニン分解(ATD群ではγ1鎖、SDAT群ではα1鎖)の亢進を示唆するものである。ラミニンならびにラミニンペプタイドがAβの凝集と細胞毒性を抑制するとの報告から、これらのラミニン分解の抑制が有効なAD治療法の開発につながる可能性も示唆された。今回、ラミニンγ1鎖抗体とwholeラミニン鎖抗体を用いたELISA法を確立し、アルツハイマー病(以下AD)と脳血管性痴呆(以下VaD)を含む痴呆患者群と非痴呆患者群の髄液を解析し以下の結果を得た。1)髄液中ラミニンγ鎖について(1)全髄液サンプルを対象として解析した結果、髄液ラミニンγ鎖は加齢に伴う有意な減少を示した。(2)加齢に伴う髄液ラミニンγ鎖の減少は他群に比べ、AD群で急激であった。(3)AD群の髄液ラミニンγ鎖は他群に比べ有意に低値を示した。2)髄液中wholeラミニン鎖について(1)全髄液サンプルを対象として解析した結果、髄液wholeラミニン鎖は有意ではないが加齢に伴い増加傾向を示した。(2)VaD群の髄液wholeラミニン鎖は他群に比べ有意に高値を示した。これまで、ラミニンやラミニン関連ペプチドがβアミロイドの凝集や毒性を抑制するとの報告がなされており、今回の結果はラミニンγ鎖がADの病態進行に関連している可能性を示唆するものと考えられる。一方、VaDにおいてはwholeラミニン鎖の高値を認め、これも本疾患の病態像を反映していることが示唆された。

これらの結果はADとVaDの病態解明の基礎的資料になりうる他、生物学的診断マーカーとしての可能性をも示唆すると考える。最近、βアミロイドの細胞毒性の抑制にラミニンα鎖が関与していることが報告され、ADとラミニンα鎖との関与が注目されるところである。今回、我々はさらに改良を加えラミニンα・β鎖抗体、さらにラミニンペプチド抗体を用いたELISA法を開発し、髄液中のラミニンα・β鎖とラミニンペプチド関連物質の定量が可能となった。今後、本法を用い、髄液中のラミニンα鎖・β鎖とラミニンペプチドの関連物質の定量を行う予定である。我々は各種ラミニンサブユニット抗体(α1、γ1、β1)、wholeラミニン抗体ならびにラミニンペプチド抗体(α1鎖のペプチドYFQRYLI)を用いた簡便なELISA法を確立し、アルツハイマー型痴呆(ATD:早発性ADと遅発性SDATを含む)とVaDを中心とする痴呆性疾患患者髄液と非痴呆疾患患者髄液のラミニン解析を行った。ラミニンγ1鎖はATD群で有意な低値を示しかつAD群においてのみ加齢に伴う急激な減少を示した。ラミニンペプチド(YFQRYLI)は正常群に比べSDAT群で有意に高値を示した。ラミニンβ1鎖とwholeラミニン-1はVaD群で有意に高値を示した。α5鎖は正常群に比べ全ての疾患群で有意に低値を示した。これらの結果は各種ラミニンサブユニット動態が疾患によって異なりラミニンが各病態に関与していることを示唆している。疾患による髄液ラミニン動態の違いを利用し、各疾患の生物学的診断マーカーへの有用性を検討した。ATD診断に「タウ濃度/wholeラミニン濃度」を指標とすると、感度85%と特異性81%を示し、ATD診断マーカーとしての有用性が示唆された。VaD診断にβ1を指標とすると感度88%を示し、β1のVaD早期診断マーカーとしての有用が示唆された。α5鎖は全疾患群で低値を示し、非特異的な脳障害の有無の判定に利用できることが示唆された。さらに、ATD群の脳でγ1鎖の産生が増加しているという報告と今回我々が得たATD群における髄液中γ1鎖の低値ならびにα1ペプタイド鎖の高値という結果はATDとSDAT脳における特定のラミニン分解(ATD群ではγ1鎖、SDAT群ではα1鎖)の亢進を示唆するものである。ラミニンならびにラミニンペプタイドがAβの凝集と細胞毒性を抑制するとの報告から、これらのラミニン分解の抑制が有効なAD治療法の開発につながる可能性も示唆された。
自己免疫疾患の病態における新規炎症マーカータンパク質(LRG)の機能解析

本研究では、機能不明分子であるマーカータンパク質LRGの、免疫疾患病態における機能解析を行った。プロテオミクス及びツーハイブリット手法を用いてLRGと相互作用する蛋白(受容体等)の候補分子を同定した。LRG欠損マウスを作製し、本マウスが正常に出生・発育するも、免疫疾患等の疾患誘導により表現型が変化することを見出した。LRGは創薬標的として有望と考えられ、製薬企業との共同研究を開始することとなった。(1)LRG KOマウスの作成:LRGのin vivoでの機能を解析するにはLRG KOマウスの作成が重要である。平成22年度においてヘテロKOマウスの作製が完了したが、その交配からKOマウスが得られなかった。この原因としてKOマウスが胎生致死である可能性が考えられ、現在、コンディショナルKOマウスの作成を進めている。(2)LRGのin vitroでの機能解析:LRGは血液中に分泌されるタンパク質であり、平成22年度の実験の結果、LRGがある種の細胞内シグナル伝達経路を活性化することが明らかになってきている。しかしながら、LRGの受容体や結合タンパク質はこれまで全く不明であった。そこで精製LRGタンパク質を細胞表面に作用させ、蛋白をクロスリンクさせた後に蛋白を回収し、LRGとともに共沈する結合タンパクを質量分析計で同定した。同定した蛋白から有力候補となる膜蛋白をすでに選定ずみであり、この候補蛋白が実際にLRGと結合するかどうか、受容体として機能するかに関して現在検討中である。(3)LRGの炎症における機能の解析:腸炎モデルマウスや関節炎モデルマウスを用いた解析の結果、マウス血清LRGはヒトLRGと同様に炎症によって発現が増加することが明らかになった。また、その産生は肝臓のみにとどまらず、炎症を起こした臓器において上昇することが明らかになっている。現在準備中のLRG KOマウスの作成と繁殖が終了すれば、KOマウスに関節炎や腸炎などを誘導し、LRG欠損によって病状がどのように修飾されるかを明らかにすることで、LRGの疾患病態における関与を明らかにする。LRG(Leucine rich alpha2 glycoprotein)は、以前の挑戦的萌芽研究「プロテオミクス手法による抗体医薬品奏功性を予測する血清バイオマーカーの探索」にて申請者らが同定した新規炎症マーカータンパク質で、関節リウマチ等の種々の自己免疫性炎症性疾患において上昇することが明らかになっている。LRGの役割はこれまで不明であったが、申請者らはLRGが機能的分子であり炎症制御に直接関わる可能性を見出している。本研究の目的は、LRGの生理機能および疾患病態への関与を明らかにし、治療標的としてのLRGの意義を検討することで、難病の新規治療法の開発へとつなげることである。申請者らの検討により、精製LRGを細胞に作用させると、特定の細胞内シグナル伝達経路が活性化することが明らかになっている。しかし、LRGの受容体や結合タンパク質はこれまで同定されていない。本年度の検討の結果、LRGによる細胞内シグナル伝達経路の活性化はある受容体に対する中和抗体の存在下で抑制されることが明らかになった。この受容体はLRGのシグナル伝達に必須と考えられるが、この受容体を発現する細胞であっても必ずしもLRGによる細胞内シグナル活性化が認められないことから、LRGシグナルには他の受容体の共存が必要であると予想され、LRGシグナルに必須の別の受容体の探索を開始している。LRGの生体での機能を明らかにするにはノックアウトマウスの作製が必須である。本年度においてLRGのコンディショナルKOマウスを作製し、Cre発現マウスとの交配を完了した。また、このマウスを元にLRGを完全に欠損するマウスの作製を試み、予想に反してLRG欠損マウスの生体を得ることができた。現在、LRG完全欠損マウスを対象に自己免疫性疾患など各種の疾患モデルを作製しており、LRG欠損によって病状がどのように修飾されるかを解明し、LRGの難病における関与を明らかにしていく。LRG(Leucine rich alpha2 glycoprotein)は、以前申請者らが免疫疾患患者血清より同定した新規炎症マーカー蛋白質である。関節リウマチ等のヒト自己免疫疾患において上昇するが、その役割はこれまで不明であった。本研究の目的は、LRGの生理機能および疾患病態への関与を解明し、治療標的としての意義を検討することで、難病の新規治療法開発へとつなげる事である。平成23年度に得られたLRG KOマウスを繁殖に用いたところ、子のKOマウスも正常に出生し、健康に成長して交配可能となり、加齢による特別な変化も認められなかった。本年度は繁殖したKOマウスを用いて種々の疾患モデルの作製を行った。具体的には、LPS投与(菌血症モデル)、関節炎・腸炎・ぶどう膜炎等の自己免疫疾患誘導、加齢性黄斑変性症様の血管新生誘導、癌細胞移植(担癌モデル)などを行い、野生型マウスとの比較を行った。この結果、いくつかの疾患モデルにおいて、LRGの重要性を示唆する結果が得られた。