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ハイパーカードを用いた社会科教材開発の基礎的研究

本研究は、ハイパーカードを用いた社会科の教材開発を目的として、以下の研究成果をえた。1.平成6年度は、アメリカでハイパーカード及び類似のコンセプトによって高等学校の生徒用に開発された2つの教材を取り上げて検討した。『地理への挑戦』は、4カテゴリーからなる3レベルの地理的な知識を、コンビネーション構造をもつゲーム的教材として組織したものであることを明らかにした。『ベトナム戦争』は、ネットワーク構造をもつ教科書的教材であることを明らかにした。2.平成7年度は、同様に、『ベルサイユ条約』は、生徒の独習に向くリニア的構造をもつ既習知識テスト教材であることを明らかにした。『羊の角II』は、ネットワーク構造をもつシュミレーション教材であることを明らかにした。『19世紀の歴史発見』は、ランダム構造をもつゲーム的学習教材兼既習知識確認拡大教材であることを明らかにした。最後に、『アンデスの世界』は、ツリー構造をもつ教科書的教材であることを明らかにした。これらの教材は、相互に他のタイプの教材の形態で内容構成することが可能であることもあきらかになった。3.平成8年度は、高等学校「日本史」での使用を想定した具体的な教材開発をハイパーカードを用いて行った。先行研究をふまえ、単に教科書と資料集を電子的に置き換えた教材開発ではなく、その内容からもその時代の捉え直しが可能なものにした。開発された「室町時代の人々の一日」(トライアングルコース)は、室町時代の人々の日常生活へ衣食住の3つの視角からアプローチする教材であり、ハイパーカードの特性をいかして、各種ボタンの設定によるカード相互のリンク機能、フィールドのスクロール機能、そしてカード移動時の視覚的効果をいかした教材モデルとなった。本年度の研究は、ハイパーカードを用いた社会科教材の開発を目指しての一連の研究の最初の段階として、アメリカで高等学校の生徒用に開発された『地理への挑戦』と『ベトナム戦争』の2つの教材を取り上げ、その教材構成の論理を解明するとともに、ハイパーカード教材のメディアとしての特性についても、検討した。成果は以下の通りである。(1)『挑戦』は、位置/方向、土地/気候、資源/経済、文化/人口の4カテゴリーから成る3レベルの地理的な知識を、それらに関する質問をランダムに与えられ、正解すれば双六でレベルに応じて進み得点を与えられ、誤答すれば戻らされ、ヒントはあるが減点を伴うと言ったように、ゲーム感覚で地理の知識を獲得出来るものとなっている。獲得される知識のレベルは高くないが、地理教育に対する取り組みが十分ではないアメリカの高校の現状からすれば、生徒に地理に関心をもたせ基礎的知識を与えるという意義はある。だが、地理学の5大テーマとそれに対応した地理的な見方や考え方からなる地理教育ガイドラインンなどと比べるならば、かなりオールド・ファッションな点は否めない。(2)『戦争』は、ベトナム戦争に関する、通史的なトピックス、一般的なトピックス、そして人物の3つのカテゴリーに分類された、61のテーマから構成されている。それぞれが117枚のカードとそれからボタンで呼び出す事が出来る資料群から成る。カードの形で提示されるテキストそのものがハイパーメディアとしての特性を持つ。即ち、本文中の重要な語句は太字で示されそれ自体が1つのボタンと成っている。この結果、『戦争』は、ベトナム戦争についてハイパーカードの特性を活かし関連ある情報を縦横に駆使出来るものになっており、かつ、歴史教育の3つのアプローチをリンクさせて歴史のテーマ学習として内容構成を考える上で大変意義あるものと成っている。本年度は、昨年度に引き続き、ハイパーカード及び類似のコンセプトによってアメリカで開発された4つの教材について分析を行い、併せて、ハイパーカードを使用した社会系教科用の教材開発に着手した。1)取り上げた教材とその分析結果...(1)リニア構造に基づく既習知識テスト教材の例として『ベルサイユ条約』を取り上げ考察した。

このタイプの教材は生徒が独習で一定の知識を確実に習得できるが、ドリル的な学習になりやすい。(2)ネットワーク構造に基づくシミュレーション教材の例として『羊の角II』を取り上げ考察した。このタイプの教材はその展開が無数に開かれており、それ自体が論争的な題材を取り上げての学習に適している。ただし、実在する国家や集団などを取り上げることは、それらに対する偏見を助長するおそれがある。(3)ランダム構造をもつゲーム的学習教材兼既習知識確認拡大教材の例として『19世紀の歴史発見』を取り上げ考察した。(4)ツリー構造に基づく教科書的教材として『アンデスの世界』を取り上げ考察した。(3)と(4)から、これらはいずれも主題学習に適した教材であり課題はそれらをいかにして年間の指導計画に組み込んでいくかということであることが明らかになった。また、これらの教材は、相互に他のタイプの教材の形態で内容構成することが可能であることも明確になった。また、どちらも音声を組み込んでいるが媒体であるフロッピ-ディスクの容量による制約のため、大容量をもつ媒体による教材の開発が課題として指摘できる。2)教材開発への取り組み...昨年度よりの研究を踏まえ、特定の内容についてハイパーカードを使用した教材を開発すべく、試作に着手しており、来年度には報告書として一定のまとめを行いたい。本年度は、平成6年度及び平成7年度の研究を継続させながら、以下の研究を実施した。1.ハイパーカードで作成された、もしくは類似した関連ソフトを、いわゆるエデュテイメント・ソフトにまで拡げて収集し、検討した。2.ハイパーカードを用いた教材開発を具体的なレベルで行うため、校種は高等学校、教科は地理歴史科、科目は日本史、大単元は特定の時代に対象を限定した。そして、教材研究は、現職の教員が、他の任意の大単元で追試的に試行する可能性を示し、なおかつ、日本史に関する歴史学的研究の発展の一定の反映をはかるため、ほぼ10年毎に出版された日本史のシリーズを中心に関連文献を収集し検討した。3.具体的には、狭義の「室町時代」についての教材開発をハイパーカードを用いて試みた。アメリカと日本の先行研究をふまえ、単に教科書と資料集を電子的に置き換えた教材開発ではなく、その内容についてはユニークな視角からのこの時代の捉え直しが可能なものとした。また、その方法については、ハイパーカードの特性をいかして、特定の用語や画像に各種のボタンを設定し、他のカードとリンクさせ、さらに、フィールドのスクロール機能、カード間の移動時の視覚的効果を取り入れることを行った。こうして、「室町時代の人々の一日/一月/一年/一生」の構想を練った。そして、この大単元のすべてをハイパーカードで開発するには、莫大な媒体などを必要とするという限界も判明したので、本年度は、「室町時代の人々の一日」(トライアングルコース)という、室町時代の人々の毎日の日常生活へ衣・食・住の3つの視角からアプローチする教材を開発し、報告書としてまとめた。
脂質代謝とオートファジーに着目した乳腺アポクリン癌の代謝機構の解明

癌細胞増殖や細胞の癌化に代謝関連因子が関わることが明らかになってきている。乳腺特殊型であるアポクリン癌における脂質代謝とオートファジーの状況、さらに細胞増殖へのかかわりについて検索した。アポクリン癌と非アポクリン癌におけるPGC1αとp62との発現比較検討より、アポクリン癌では脂質代謝亢進、オートファジー不全が存在する可能性が示された。また、免疫組織染色によるp62蛋白発現検索が、アポクリン癌とアポクリン化生上皮との鑑別に有用である可能性が示された。乳腺アポクリン癌培養細胞において、p62のノックダウンが細胞増殖を抑制したことより、p62はアポクリン癌細胞の治療標的となる可能性が示された。【本研究の目的】乳癌の代謝異常を解明することにより,従来鑑別困難であった病変の病理診断法の確立,および,個別化治療のための新たな標的分子を探索することを目的とする.【本年度の検討内容および研究成果】1.乳腺アポクリン癌、乳腺非アポクリン癌のティシューマイクロアレイ(TMA)ブロックを作成し、アポクリン化生細胞、正常乳腺細胞のホルマリン固定パラフィン包埋ブロックもちい、組織切片を作成した。得られた組織切片をもちいてホルモンレセプター(estrogen receptor, progesterone receptor, androgen receptor)、HER2蛋白質の発現状況を確認した。2. 1で作成した組織切片をもちい、脂質代謝(PGC1α)とオートファジー関連物質(p62)の免疫組織化学染色を行った。3. PGC1αの陽性率は、アポクリン癌(21%)、非アポクリン癌(3%)、アポクリン化生細胞(0%)、正常乳腺細胞(0%)であり、アポクリン癌で有意に高い発現を認めた(P>0.01)。p62はアポクリン癌、非アポクリン癌、アポクリン化生細胞に様々な陽性像を示し、現在結果検討中である。4. 1で作成した組織切片をもちい、レーザーマイクロダイセクション(Laser assisted microdissection, LAMD)法で癌成分あるいは上皮成分のみを切削回収し,サンプルからtotal RNA抽出後,cDNAの合成を行った。TaqManプローブ法による内因性コントロール遺伝子(ACTB)のリアルタイムPCR法を施行し、ほぼすべての症例でACTB遺伝子が検出できた。PGC1α、p62に関して、TaqManプローブによるリアルタイムPCR法で遺伝子発現の検索を施行中である。【本研究の目的】乳癌の代謝異常を解明することにより、従来鑑別困難であった病変の病理診断法の確立、および個別化治療のための新たな標的分子を探索することを目的とした。【本年度の検討内容および研究成果】1.アポクリン癌と非アポクリン癌の乳癌組織をもちい、免疫組織化学法(IHC法)によるPGC1α、p62発現検討と、RT-PCR法によるPGC1α、p62 mRNA発現量測定を行った。アポクリン癌は非アポクリン癌に対し、PGC1αの陽性率、mRNA発現量がともに有意に高かった結果より、乳腺アポクリン癌におけるミトコンドリアや脂肪滴の貯留には、PGC1α発現が関与する可能性が示された(IHC: p<0.01, mRNA: p<0.01)。また、アポクリン癌は非アポクリン癌に対し、p62の陽性率が有意に高かった一方、p62 mRNA発現量には差が見られなかった結果より、アポクリン癌におけるp62蛋白貯留が考えられ、アポクリン癌ではオートファジー不全が存在する可能性が示された(IHC: p<0.05, mRNA: p=0.63)。2.さらにアポクリン化成細胞(良性)に対してIHC法によるPGC1α、p62発現を検索し、アポクリン癌との発現様式を比較した。アポクリン癌はアポクリン化生上皮に比べ、p62陽性率が有意に高かった(p<0.01)。この結果より、p62はアポクリン化生上皮とアポクリン癌の鑑別に有用である可能性が示された。3.乳腺アポクリン癌モデル培養細胞である、MDA-MB-453、MFM223をもちいたp62遺伝子のノックダウン実験を行い、BrdU法による細胞増殖能の評価を行った。p62 siRNA導入により、MDA-MB-453、MFM223におけるp62のmRNA、蛋白発現は抑制され、細胞増殖が有意に抑制された(MDA-MB-453: p<0.01, MFM223: p<0.05)。乳腺アポクリン癌培養細胞において、p62のノックダウンにより細胞増殖が抑制されたことより、p62はアポクリン癌細胞の治療標的となる可能性が示された。

病理学乳腺アポクリン癌、乳腺非アポクリン癌のTMAブロック、アポクリン化生細胞、正常乳腺細胞のホルマリン固定パラフィン包埋ブロックもちいた免疫組織化学染色は予定通り終了し、アポクリン癌、非アポクリン癌、アポクリン化生細胞、正常乳腺細胞におけるPGC1α蛋白発現の解析は終了しているが、TMAブロック作成に想定以上の時間を要したため、p62蛋白発現解析にやや遅れが生じている。遺伝子検索に関しては、実験期間中にLAMD機械の不具合が生じたことより、mRNA抽出、cDNA合成完了までに想定以上の時間を要した。また、内因性コントロール遺伝子(ACTB)発現解析は予定通り終了しているが、PGC1α, p62の遺伝子発現検索に関しては、適切なTaqManプローブの選択とPCR条件検討に時間を要したため、実験にやや遅れが生じている。リアルタイムPCR法をもちい、アポクリン癌、非アポクリン癌、アポクリン化生細胞、正常乳腺細胞におけるPGC1αとp62の遺伝子発現状況を検出する。アポクリン癌、アポクリン化生細胞(良性)、非アポクリン癌におけるPGC1αとp62蛋白発現、遺伝子発現の差を用いて、病理鑑別診断に応用する。ヒト乳癌培養細胞(アポクリン癌)でのPGC1α,p62阻害による,ミトコンドリア数と脂肪滴量の変化,細胞増殖抑制効果を検討する。平成25年度では、乳腺アポクリン癌、乳腺非アポクリン癌のTMAブロック作成に想定以上の時間がかかったこと、またLAMD機械の不具合が生じたことより、遺伝子発現解析実験に遅れが生じているために、次年度使用額が生じた。生じた次年度使用額は、遅れが生じている遺伝子発現解析実験のために使用する計画である。
内部共生による宿主-オルガネラ間の遺伝子発現協調機構の成立

葉緑体は原始シアノバクテリアの細胞内共生によって誕生したと考えられているが、共生関係の成立に際して、光合成機能を維持し守るためには、核と葉緑体間で光に応答した遺伝子発現を協調させることが宿主・共生体の両者にとって必須であったと考えられる。本研究では、内部共生起源に近い葉緑体を持つ原始紅藻Cyanidioschyzon merolae(シゾン)を用いて、葉緑体ではたらくヒスチジンキナーゼ(CmHIK)による宿主遺伝子の調節機構を明らかにすることで、核とオルガネラ間の遺伝子発現協調機構の成立を理解することを目的とした。これまでの研究から、暗条件で活性化し転写を抑制するCmHIKを薬剤Signermycin Bによって阻害すると、暗条件にもかかわらずCMK296Cなど一部の核コード光応答遺伝子の発現が誘導され、CmHIKに依存した葉緑体から核への光情報伝達経路の存在が示唆されたため、今年度においてはこの情報伝達経路の詳細について検討を行った。まず、ストレスなど細胞内の様々なシグナルを核に伝える働きをもつMAPKに着目し、明条件下でMAPK活性を促進・阻害する処理を行ったところ、CMK296Cの発現量がそれぞれ誘導・抑制されることが分かった。また、レトログレードシグナルの1つと考えられているテトラピロール中間体のヘムを暗条件下で添加したところ、同じくCMK296Cの発現が誘導された。これらの結果から、CmHIKにより葉緑体で認識された光情報は、MAPKやヘムを介して核に伝達され、特定の転写因子によりターゲット遺伝子の発現を調節している可能性が示唆された。このように、宿主細胞が従来より持っていた細胞内シグナル伝達経路の上流にオルガネラ由来の情報を「入力」することが、共生関係の成立において重要なステップであるという新しい考え方を提案することができた。27年度が最終年度であるため、記入しない。葉緑体は原始シアノバクテリアの細胞内共生により誕生したと考えられている。共生関係の成立にあたり、光合成機能を維持し守っていくためには、核と葉緑体間で光に応答した遺伝子発現を協調させることが宿主・共生体の両者にとって必須であったと考えられる。本研究では、内部共生起源に近い葉緑体を持つ原始紅藻シゾンの葉緑体で機能するヒスチジンキナーゼ(HIK)に着目し、葉緑体を中心とした光応答系の分子機構、および葉緑体による宿主遺伝子の調節機構を明らかにすることで、内部共生に基づく植物進化の実体を明確にすることを目的とした。植物の赤色光受容体フィトクロムのGAFドメインには、発色団として開環テトラピロール化合物であるフィトクロモビリンが結合している。シゾンHIKのGAFドメインにも類似した発色団が結合している可能性を検討するため、シゾン細胞から全タンパク質を抽出してZinc-blot解析を行った結果、開環テトラピロール分子の結合を示す蛍光が得られた。シゾンの代謝系から考察すると、フィコシアノビリン、或いはそれに類似した化合物が発色団として機能している可能性が示唆された。一方、様々な光条件下でのシゾンの遺伝子発現を調べたところ、光による多くの遺伝子の発現誘導は1530分程度の短い時間で起こるが、一部の遺伝子については60分以上の長い時間を要することが分かった。この一群の遺伝子の発現はHIKの特異的阻害剤を添加した際にも変化が見られ、さらに赤色光により特異的に発現が誘導されることも示されたことから、HIKは赤色領域の光に応答し活性が調節され、一群のターゲット遺伝子の発現制御に関与することが示唆された。HIKに依存する遺伝子を網羅的に調べたところ、光合成関連遺伝子に加え、ストレス応答に関わる遺伝子も多数同定されたことから、HIKは光に加えて葉緑体内のストレスにも応答する可能性が示唆された。

このように、宿主細胞が従来より持っていた細胞内シグナル伝達経路の上流にオルガネラ由来の情報を「入力」することが、共生関係の成立において重要なステップであるという新しい考え方を提案することができた。初年度の研究内容として計画した項目はほぼ終了しており、葉緑体を中心とした光応答システム、および葉緑体による宿主核の遺伝子発現調節メカニズムの解明、さらにそれらを踏まえた共生進化モデルの提案に向けて、順調に研究が進行しているものと考えられる。27年度が最終年度であるため、記入しない。当初の研究目的・研究計画にしたがって、2年目の研究を進める。現状で大きな問題はないが、HIKの生化学的・分光学的解析は質の高いタンパク質の確保が必須であるため、集中的に取り組む。当初の計画に従いつつ、それらを上回る成果を挙げられるよう、効率的かつ効果的な研究推進に努める。
筋収縮制御とサルコメア心筋症に関わるC-タンパク質の新たな分子機能の解明

C-タンパク質は横紋筋特異的なミオシン結合タンパク質で、C端側領域でミオシン線維の安定化に寄与する。本研究は心筋型、速筋型、遅筋型C-タンパク質のN端側領域を大腸菌発現系で作製し、F-アクチンとの相互作用を調べた。その結果、速筋型>心筋型>遅筋型の順に結合が強かった。また、速筋型と心筋型はアクトミオシンATPase活性を抑制することを明らかにした。このことから、C-タンパク質はN端側領域でミオシンとアクチンに結合することで筋収縮の制御を行うという、新しい機能モデルを示すことができた。C-タンパク質(MyBP-C)は横紋筋に特異的なミオシン結合タンパク質で,心筋型,速筋型,遅筋型の3種類のアイソフォームが存在する。これまでの研究によりC-タンパク質のC末端側領域にミオシンロッドとコネクチンに対する結合部位が,またN末端側にもミオシンのS2領域に結合部位が存在することがあきらかにされ,C-タンパク質はコネクチンと結合しミオシン線維束をタガのように巻くことでその束の形成と安定化に寄与すると考えられていた。一方,アクチン線維とも相互作用する事が知られていたが,その結合領域や生理的意味は不明であった。そこで本研究はサルコメアの維持、安定化や筋収縮におけるC-タンパク質の役割を明らかにするために,第1に心筋型,速筋型,遅筋型C-タンパク質のN端側ドメインを大腸菌発現系を用いて作製し,共沈実験法によりアクチン線維との相互作用を調べた。その結果,速筋型>心筋型>遅筋型の順にアクチン線維との結合が強いことが明らかとなった。次に,心筋型と速筋型のC-タンパク質のN端側領域をさらに断片化してアクチン結合の機能的最小単位を解析した。その結果,心筋型では最もN末端側のドメイン0からプロリン、アラニンに富む領域を経てドメイン1の間の領域がアクチン結合部位の候補になった。一方,速筋型ではドメイン1とドメイン2の間のリンカー部位からドメイン2の一部を含む95アミノ酸の領域が結合部位であることがわかった。これらのことから,C-タンパク質のアイソフォームにより,それぞれアクチン結合部位が異なることが明らかとなった。サルコメアの維持・安定化や筋収縮におけるC-タンパク質の役割を明らかにするために、心筋型、速筋型、遅筋型C-タンパク質のN端側ドメインを大腸菌を用いて作製し、共沈実験法によりアクチン線維との相互作用を調べた。その結果、速筋型>心筋型>遅筋型の順にアクチン繊維との結合が強いことが明らかとなった。次に、心筋型と速筋型のC-タンパク質のN端側領域をさらに断片化してアクチン結合の機能的最小単位を共沈実敦法とHis-tag pull down法により解析した。その結果、心筋型はN末端側のドメイン1からリン酸化領域を含むリンカー領域を経てドメイン2の間の領域がアクチン結合部位の候補になった。速筋型はドメイン1とドメイン2の間のリンカー部位からドメイン2の一部を含む額域が結合部位であることがわかった。これらのことから、トロポニンIのアクチン結合部位と相同性を持つ領域がC-タンパク質のアクチン結合部位であることが予想された。一方、筋収縮の主要な制御因子トロポニン(TN)は脊椎動物では横紋筋にのみ存在し、収縮のブレーキとして働くが、原索動物マボヤでは平滑筋にも存在し、収縮のアクセルとして働く。原索動物から脊椎動物における収縮制御機構を明らかにするために、カタユウレイボヤ(Ci)とナメクジウオ(Amp)の組み換え体を作製して機能を解析した。その結果Ciでは骨格筋と平滑筋のTNが共にアクセル型の機能を示し尾索類で一般的な特性であることがわかった。Ampは脊椎動物と同様にブレーキ型の特性を持つことが明らかになった。遺伝子による系統解析の結果は頭索類のTNが祖先型で、尾索類TNが進化の過程でユニークな機能特性を獲得したことがわかった。この成果は第9回国際細胞生物学会(2008年、韓国)で報告しExcellent Poster Awardを受賞した。サルコメアの維持・安定化や筋収縮におけるC-タンパク質の役割を明らかにするために、ニワトリ心筋型C-タンパク質のドメイン0-4と、マウス速筋型と遅筋型C-タンパク質のドメイン1-4を大腸菌発現系により作製した。これらフラグメントの筋収縮に対する作用を明らかにするため、アクトミオシンATPase活性への影響を解析した。その結果遅筋型フラグメントはアクチンとミオシンのみのコントロールとほとんど違いが無く、アクトミオシンATPase活性に影響を与えなかった。一方、速筋型C-タンパク質のN端側領域はアクトミオシンATPase活性を50%以上抑制した。このような抑制効果は心筋型でも見られた。

アクチン線維に対する結合が速筋型と心筋型で強いことから、これらのC-タンパク質はN端側領域でアクチンと強固に結合することで、アクトミオシンATPase活性を抑制していると考えられる。心筋型C-タンパク質のアクチン結合領域がドメイン1-2のリンカー領域で、そこには心筋型特異的なリン酸化部位も含まれることから、心筋ではC-タンパク質のリン酸化によリアクチン-ミオシン相互作用が制御されている事が示唆される。一方、速筋型のアクチン結合領域もドメイン1-2のリンカー領域だが、リン酸化部位が無いことより、骨格筋において速筋型は恒常的にアクチン-ミオシン相互作用に影響を与えることが示唆された。また、ニワトリの心筋型C-タンパク質には、特異的なリン酸化領域を持つtype Iと持たないtype IIの二つのアイソフォームが存在する。筋発生とこれらのアイソフォームの関係を明らかにするため、type I特異的抗体を作製し、解析した。その結果、心臓では発生段階を通してtype Iが発現していることがわかった。一方、type IIは心筋ではほとんど発現せず、発生中の幼弱な骨格筋に発現することがわかった。
遺伝情報場形成に関わるテトラヒメナの選択的核輸送システムの解明

繊毛虫であるテトラヒメナは、ひとつの細胞内に大核・小核という構造と機能の異なる2つの細胞核を持つという特徴がある。本研究課題は、その特性を活かして、テトラヒメナが大核・小核へのタンパク質の核輸送をどのように使い分けているかを検討し、大核・小核の遺伝情報場形成に関与する因子とその仕組みを明らかにするものである。具体的には、項目1)大小核特異的な核輸送システムの同定と、項目2)核分化における核輸送関連因子の動態の解析を行う。項目1に関しては、核輸送システムのうち、核膜孔複合体を構成するヌクレオポリン(大小核のそれぞれに約30種類存在すると想定される)の同定を行った。前年度までに発見したヌクレオポリンNup98およびNup93にGFPを融合して融合遺伝子をテトラヒメナで発現させ、GFP抗体で沈降してきたタンパク質群をプロテオミクスの手法を用いて解析し、新たに5種類のヌクレオポリンの同定に成功した。その中には、大核・小核のそれぞれに特異的に局在するもの、両者に局在するものがあった。項目2については、項目1で見つかったヌクレオポリンについて、受精核が核分化する過程を生きた細胞で、time-lapse法、FRAP法、ライブクレム法を用いて観察した。その結果、受精核(元々は、小核)が大核へ分化するのに先だって、大核タイプのヌクレオポリンが特定の核に出現すること、そしてその核だけが大核分化することが明らかとなった。一方、この大核分化予定核では、小核タイプのヌクレオポリンは、大核タイプのヌクレオポリンと置き換わるように減少していくことが分かった。これらの結果は、核膜孔複合体が、核分化を決定付ける要因であることを示している。これらの成果を国内外の学会や研究会で発表した。24年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、主に項目1について検討した。まず大小核に特異的な核移行シグナルの同定を試みた。大核特異的なヒストンタンパク質(histone H1)と小核特異的なリンカーヒストンタンパク質(MLH)の断片それぞれにGFPを融合させたものをテトラヒメナ細胞で発現させ、その断片の大小核への局在性から、大小核局在に必要な最小ペプチドを決定した。さらに、大小核特異的あるいは共通のヌクレオポリン(例えば、Nup98,Nup96,Nup93など)に結合するタンパク質をプロテオミクスの方法で網羅的に解析することによって、大小核特異的なヌクレオポリンあるいは輸送因子であるインポーティンβの解明を進めた。現在までのところ、核膜孔複合体に関しては、大小核それぞれに特異的なヌクレオポリンとしてNup153やNup214を、共通のものとしてNup85,Nup54など、新規に複数のヌクレオポリンを同定した。核輸送因子については大小核にそれぞれ特異的なimportin βを一つずつ同定した。項目2については、項目1で見つかったNup98,Nup93について、核分化過程をtime-lapseとFRAP法、ライブクレム法で観察した。これらの成果は国内外の学会や研究会で発表した。

これらの結果は、核膜孔複合体が、核分化を決定付ける要因であることを示している。これらの成果を国内外の学会や研究会で発表した。24年度が最終年度であるため、記入しない。核輸送システムの解明には、核移行シグナル、輸送因子、核膜孔複合体の3者を同定する必要があるが、そのうち大小核特異的な核移行シグナルの同定は終了した。輸送因子については大小核特異的な因子を少なくとも1つずつ同定した。現在、核膜孔複合体を構成するヌクレオポリンの同定を進めており全容を解明しつつある。核輸送システムのうち、核膜孔複合体を構成するヌクレオポリン(大小核のそれぞれに約30種類)の全構成因子の同定を行い、核膜孔複合体構造の全容の解明を進める。1年目で同定した大小核特異的な核移行シグナル・輸送因子・核膜孔複合体タンパク質のそれぞれが、どのように協調して大小核特異的な核移行を実現しているか検討する。そのためには、大小核に特異的な因子同士が相互作用するかどうかを検討する。受精核から大小核に分化する過程で、これらの輸送因子の挙動を生きた細胞で観察し、核特異的な輸送システムが大小核に分化に及ぼす影響・役割を検討する。
難治がん克服を目指したNKp44-キメラ型受容体と新規NK細胞増幅法の開発

前年度から引き続き、第1世代CARおよび第2世代CARそれぞれにおいて、各種の検討を行った。第1世代CAR-T細胞と活性化NK細胞との比較においては、短時間アッセイ系では細胞障害活性は活性化NK細胞のほうが有意に強力であったが、低いエフェクター:ターゲット比で長期間のアッセイ系での比較においては、NKp44-CARを遺伝子導入したCAR-T細胞において抗腫瘍効果が明らかに優っていた。さらに、Natural Cytotoxicity Receptor (NCR)ファミリー、あるいはC-typeレクチン様受容体ファミリーの分子をベースにそれぞれ新規CARを作成し、NKp44-CARと比較した。そのうちで、NKp30をベースに新規作成したNKp30-CARとの多種類のがん細胞株を用いた比較検討において、NKp44-CARは常に有意に優れていた。第1世代NKp44キメラ抗原受容体(CAR)遺伝子をベースに、4-1BBシグナルドメインあるいはCD28シグナルドメインを加えたいわゆる第2世代NKp44-CARをそれぞれ数パターン作成した。ヒト初代培養T細胞に遺伝子導入し、表面のCAR発現、抗原刺激後の増幅能、腫瘍細胞にNKp44-CARの最適な構造が決定され、その強力な抗腫瘍効果が確認された。このCAR遺伝子を使った遺伝子改変細胞療法は、白血病(骨髄性、T細胞性、B細胞性)や各種の肉腫や固形がんに有効である可能性があり、広汎な対象疾患を有するCAR-T療法の開発の基礎となり得る。NKp44の特異性を用いたキメラ抗原受容体(CAR)遺伝子を複数作成した。K562-mb15-41BBLにより増幅培養したヒト活性化NK細胞からNKp44 cDNAをクローニングし、CD8などのT細胞に発現する膜受容体分子の各ドメインと組み合わせて、様々なデザインのCARを作成した。また、発現量はT細胞とNK細胞で異なる可能性があり、両者でそれぞれ検討した。Jurkat-T細胞に前述の様々なNKp44-CARコンストラクトを遺伝子導入し、その発現パターンを確認した。NKp44-CARのヒト初代培養T細胞における機能評価では、ヒトprimary T細胞をIL-2存在下(200単位/ml)で抗CD3/抗CD28ビーズにより刺激し、レトロネクチン(Takara)存在下に48-72時間後にレトロウイルス液に暴露することでCAR-T細胞を作成した。ヒト活性化NK細胞への遺伝子導入は、K562-mb15-41BBLを用いた増幅培養系を用いて行った。T細胞、NK細胞のいずれにおいても、高い効率で(通常70%以上)遺伝子導入を達成できた。各種の腫瘍細胞株のNKp44-Lの発現の有無をフローサイトメトリーにより解析し、多くのがん細胞における発現を確認した。CAR-T細胞は、各種の腫瘍細胞株と共培養し、細胞障害活性、CD107aアッセイ、サイトカイン産生能、活性化能(CD69, CD25)を比較した。ドナー間の個人差が生じやすいことから、複数の健常ドナーリンパ球を用いた実験を基本とした。NK細胞体外増幅条件の改良とNK細胞増幅を促進する因子の探索に向けて、培養液(主として無血清培地)の種類、サイトカインの種類、Feeder cell lineへの照射量、照射後のインキュベーション時間などを比較検討している。CAR遺伝子作成は計画通りか、むしろ予定よりも早く進んでいる。ただし、NK細胞培養系の新規開発はやや遅れ気味である。総合的に判断し、「おおむね順調に進展している」と判断した。当初の計画にしたがって進める。購入のタイミングなどの事務的理由で若干予定額を下回った。当初の研究計画通りに研究を遂行することで、およそ予定通りの支出額となる予定である。
Ⅲ族窒化物ナノラミネート特異構造を用いたダイヤモンド電子デバイスの開発

本研究では窒化物半導体のナノラミネート薄膜特異構造(膜厚1nm以下に制御した極薄膜2次元多層膜特異構造)を作製しダイヤモンド電界効果トランジスタ(FET)のゲート絶縁膜に応用し大電流のスイッチング動作を実現することを目指す。具体的には絶縁体AlN(iーAlN)と導電体GaN(cーGaN)を用いたiーAlN/cーGaNナノラミネート特異構造を形成し、その微細構造及び電気的特性を評価するとともにダイヤモンドFETのゲート絶縁膜に応用する。H29年度成果は以下の通りである。(1)O. Auciello教授(米国テキサス大ダラス校)との共同研究を劉研究分担者が2018/9/1210/11まで1ヵ月滞在にすることによって進め、テキサス大でのALD装置を用いてAl2O3/TiO2ナノラミネート構造ゲートを作製し、比誘電率150を達成した。同時にNIMSプロセスとテキサス大プロセスを融合させたMOSFETを作製しトランジスタ動作を実証した。その後ナノラミネート構造の最適構造をNIMSーALDプロセスに適用し、全NIMSプロセスによってMOSFETを作製しチャネル電流が大きな高性能化に成功した。(2)昨年度立ち上げたその場膜厚モニターを装備させたALD-MOVPE成長装置を用いて、TMAlとNH3を用いたAlN、TMGaとNH3を用いたGaNのALDモードMOVPE成長を確認し、AlN/GaNナノラミネート構造を作製するための成長条件を確立した。初年度購入したIII族窒化物AlNおよびGaNを成長させるALD-MOVPE装置は、その場膜厚モニター用エリプソメータを装備する形で立ち上げを完了し、AlNおよびGaNのALDモードMOVPE成長に成功しており、AlN/GaNナノラミネート構造の試作が可能となった。昨年度米国テキサス大ダラス校のOrlandAuchiello教授グループに研究分担者である劉独立研究者が一か月間滞在することによって、ALD装置を用いてTiO2/Al2O3ナノラミネート膜ゲート構造を作製し、NIMSに帰ってからMOSトランジスタを完成させるプロセス共同研究を実施した。酸化物ナノラミネート構造条件の最適化と誘電率の増大化を確認するとともに、酸化物ナノラミネートゲート構造によるMOSFETの動作実証にも成功した。1周期1nm以下とする酸化物ナノラミートゲート構造条件を利用して、AlN/GaNナノラミネート構造作製に適用することによって誘電率増大効果を確認する。その場エリプメータモニターによる1分子層成長制御は確立していることから、ナノラミネート構造の層厚制御に展開する。ラミネート構造の誘電率測定と微細構造解析を進める。平成28年度は申請設備であったガスソース原子層堆積装置を購入するとともに立ち上げることが第一目標であり導入することができた。研究成果は以下の通りである。(1)グループとしてこれまでに進めてきたスパッタリング法および原子層堆積法によるAlN/Al2O3積層膜をゲート構造に用いたキャパシタおよびFETを開発し、酸化膜ゲートMOSFETに較べて同等なドレイン電流を得られることを実証した。Arおよび窒素を含む化成スパッタリング法によるAlN堆積条件の最適化が鍵となった。(2)有機金属化合物成長(MOVPE)法を用いて水素終端ダイヤモンド表面上にAlNをエピタキシャル成長させ、単一ドメイン単結晶AlN薄膜を直接成長させることに成功した。(3)およびAl2O3/HfO2ナノラミネート薄膜をゲート絶縁膜としたダイヤモンドFETを試作したが、ゲート酸化膜のキャパシタンスの向上は得られかった。初年度に計画した提案する特異構造を作製する装置を予定通り購入し設置することができ次年度以降への実験に進むことができる。更に窒化物半導体とダイヤモンドのハイブリッド電子デバイスの試作を進め性能向上を達成することができた。(1)その場膜厚モニターを装備させたALDーMOVPE成長装置の立ち上げを完了し、TMAlとNH3を用いたAlNのALDモードMOVPE成長が可能であることを確認した。(2)酸化膜シングル層および酸化膜2層

スタック層をそれぞれゲートに用いた2種類のダイヤモンドMOSトランジスタをオンチップ上で組わせることによって、しきい値制御された論理集積回路の作製に成功するとともに、同時に300°Cまでの熱安定性を実証した。(3)シリコン酸化膜ゲートの可能性を探索するためにA01班藤岡代表グループとの連携研究開始し、NIMSでのデバイスプロセシングと東大でのALDプロセスを組み合わせたデバイス作製プロセス試作に着手した。(4)O.Auciello米国テキサス大ダラス校教授との共同研究に着手し、共同分担者を派遣して酸化物ナノラミネートゲート構造を作製する双方向プロセスを利用してデバイス作製を行う連携を開始した。初年度購入したIII族窒化物AlNおよびGaNを成長させるALD-MOVPE装置は、その場膜厚モニター用エリプソメータを装備する形で立ち上げを完了し、AlNのALDモードMOVPE成長に成功している。H30年度においては、AlN/GaNナノラミネート構造の試作が可能になる予定である。一方、酸化物スタックゲート構造を用いたダイヤモンドMOSトランジスタは、ノーマリオン/オフ制御原理を発見するとともに論理回路の試作に成功し、300°Cまでの熱安定性を実証しており、H29年度の主要成果として登録した。本研究では窒化物半導体のナノラミネート薄膜特異構造(膜厚1nm以下に制御した極薄膜2次元多層膜特異構造)を作製しダイヤモンド電界効果トランジスタ(FET)のゲート絶縁膜に応用し大電流のスイッチング動作を実現することを目指す。具体的には絶縁体AlN(iーAlN)と導電体GaN(cーGaN)を用いたiーAlN/cーGaNナノラミネート特異構造を形成し、その微細構造及び電気的特性を評価するとともにダイヤモンドFETのゲート絶縁膜に応用する。H29年度成果は以下の通りである。(1)O. Auciello教授(米国テキサス大ダラス校)との共同研究を劉研究分担者が2018/9/1210/11まで1ヵ月滞在にすることによって進め、テキサス大でのALD装置を用いてAl2O3/TiO2ナノラミネート構造ゲートを作製し、比誘電率150を達成した。同時にNIMSプロセスとテキサス大プロセスを融合させたMOSFETを作製しトランジスタ動作を実証した。その後ナノラミネート構造の最適構造をNIMSーALDプロセスに適用し、全NIMSプロセスによってMOSFETを作製しチャネル電流が大きな高性能化に成功した。(2)昨年度立ち上げたその場膜厚モニターを装備させたALD-MOVPE成長装置を用いて、TMAlとNH3を用いたAlN、TMGaとNH3を用いたGaNのALDモードMOVPE成長を確認し、AlN/GaNナノラミネート構造を作製するための成長条件を確立した。初年度購入したIII族窒化物AlNおよびGaNを成長させるALD-MOVPE装置は、その場膜厚モニター用エリプソメータを装備する形で立ち上げを完了し、AlNおよびGaNのALDモードMOVPE成長に成功しており、AlN/GaNナノラミネート構造の試作が可能となった。昨年度米国テキサス大ダラス校のOrland
二員培養下でのナラタケの生物学的種の病原性と接種法の開発

ナラタケ病被害林の調査では従来少なかった尾根部での被害発生を中心に調べた。対象ヒノキ林に少なくとも3種以上生物学的種のArmillaria属菌が生息していることが分かった。7年生被害林分で被害木と良く重なった分布を示したのはA. melleaであったが、別の被害調査地ではこの菌株が存在しないこともあった。国内で未報告のユ-カリ林の被害発生を新たに確認したゴムバンド法による接種後の苗についてP-V曲線法で求めた水分特性値から被害葉は水ポテンシャルの低下が緩やかで萎凋点も高く吸水能の低下が推察された。ヒノキ無菌苗に対するゲル内での二員培養による接種試験では18菌株を用いて枯死した苗はなかった。野外での接種試験で病原性があるとされた菌株も、ゲル内では茎に菌糸が巻いてさえも苗に影響を与えられないことが分かった。本病の感染で重要視される根状菌糸束は尾根発生タイプのA. mellea菌株で-1.5MPaまで発生でき、他の菌株ではcrustoseな菌糸形成のみで、この菌株の戦略的優位性が推察された。過去に根状菌糸束形成は栄養面から研究されていたが、本研究では水分による制御が大きいことが判明した。高い菌糸発光はどの菌株でも-0.8MPa以上の高い水ポテンシャルで観察された。麦芽エキス培地上での水分要求は菌株間差はあるが-6MPa以下の水ポテンシャルで成長可能な菌株はなかったが、尾根に発生タイプと同等な下限を有する沢発生タイプの株もあった。このことは単純な乾燥ではなく、高濃度溶液のような水分活性値の低い木材の状態に対する適応と考えられ、ここで用いた水分調整培養による実験法の今後の展開が期待できる。また菌株間差異は成長の絶対量よりはコロニー形態形成で大きいことが判明した。無菌培養した苗とナラタケの透明ゲル中における二員培養での接種試験では発病は認められなかった。実験に用いたヒノキ苗の発根速度よりも菌の生長速度が遅いので接種の時間をずらしたが、その影響も認められなかった。ヒノキ種子に高い汚染頻度のPestalotia属菌の接種でも、葉が菌糸で覆われて光合成が阻害されるまで枯れないので、有傷による菌糸侵入を想定した実験設定で今後試験する予定である。野外における菌株の収集ではナラタケ病被害木の調査および分離を行った。被害地は6年生ヒノキ林、30年生ユーカリ林で、マッピングなどの調査から被害は未だ拡大の方向に推移しつつあるとみられ、罹病木の葉の水ポテンシャルの測定を行い、その特性を調査した。さらに被害の進展に伴う水分特性の変化を追跡する予定である。一方、ゲル中のヒノキ苗は茎径が細く、着葉部も脆く、プレッシャー・チェンバーでの測定に難しさがあり、広葉樹など他の材料の使用を検討する。使用した各菌株は培地の水ポテンシャルが-5MPa位から菌糸生長が落ち、低い水ポテンシャルほど根状菌糸束が発達する傾向が認められた。これまで菌糸束の発達促進物質に目が向けられていたが、水分活性が大きな因子であることを認めた。今後は根系接触時のナラタケ菌糸の生物発光の測定化を進め、菌側の反応を追跡する。ナラタケ病被害林の調査から対象林の被害は未だ拡大の方向に推移しつつあるとみられ、P-V曲線法による被害樹の葉の水分特性値を月毎に測定・集積し、被害葉の生理的な変化を調べた。発生子実体の分布と被害樹の分布は必ずしも一致しなかった。

被害地は6年生ヒノキ林で、この他に3年生ヒノキ林、30年生ユ-カリ林なども調査中である。ユ-カリについては国内ではまだ病害が報告されていない。子実体発生場所が尾根、沢、平坦地と異なる菌株の培地水ポテンシャルに対する成長とその菌糸形態への影響を調べた。-0.3MPaから-0.6MPaでは成長の低減は見られなかったが、一部の菌株で培地の着色があった。これ以下の水ポテンシャルでは成長は漸減した。使用菌株中、2菌株で-1.5MPaまで根状菌糸束が発生した。また、fluffyな菌糸からcrustoseな菌糸に変化するのは-0.65MPaから-1.8MPaと菌株間で著しい差異が認められた。成長の下限やこれらの菌糸形態の変化から判断して、本菌が他の土壌性の腐朽菌と比べて乾燥に強いとは言えないことが分かった。また、2菌株では感染の主要な役割をする根状菌糸束が-1.5MPaと低い水ポテンシャルまで形成され病原性との関係が示唆された。過去の内外の研究では菌糸束の発達促進物質に目が向けられていたが、水分活性が大きな因子であり、それに対する菌株間差異があることが判明した。ナラタケ病被害林の調査では従来少なかった尾根部での被害発生を中心に調べた。対象ヒノキ林に少なくとも3種以上生物学的Armillaria属菌が生息していることが分かった。7年生被害林分で被害木と良く重なった分布を示したのはA.melleaであったが、別の被害調査地ではこの菌株が存在しないこともあった。国内で未報告のユ-カリ林の被害発生を新たに確認した。ゴムバンド法による接種後の苗についてP-V曲線法で求めた水分特性値から被害葉は水ポテンシャルの低下が穏やかで萎凋点も高く吸水能の低下が推察された。ヒノキ無菌苗に対するゲル内での二員培養による接種試験では18菌株を用いて枯死した苗はなかった。野外での接種試験で病原性があるとされた菌株も、ゲル内では茎に菌糸が巻いてさえも苗に影響を与えられないことが分かった。本病の感染で重要視される根状菌糸束は尾根発生タイプのA.mellea菌株で-1.5MPaまで発生でき、他の菌株ではcrustoseな菌糸形成のみで、この菌株の戦略的優位性が推察された。過去に根状菌糸束形成は栄養面から研究されていたが、本研究では水分による制御が大きいことが判明した。高い菌糸発光はどの菌株でも-0.8MPa以上の高い水ポテンシャルで観察された。麦芽エキス培地上での水分要求は菌株間差はあるが-6MPa以下の水ポテンシャルで成長可能な菌株はなかったが、尾根に発生タイプと同等な下限を有する沢発生タイプの株もあった。このことは単純な乾燥ではなく、高濃度溶液のような水分特性値の低い木材の状態に対する適応と考えられ、ここで用いた水分調整培養による実験法の今後の展開が期待できる。また菌株間差異は成長の絶対量よりはコロニー形態形勢で大きいことが判明した。
可逆的な遺伝子ノックダウンシステムを用いた霊長類での認知記憶形成機構の解明

本研究は、視覚性対連合課題遂行中のサルを被験体として、記憶関連分子の可逆的ノックダウンまたはK+channel等の遺伝子導入による神経細胞活動の制御(不活性化・活性化)を行なうことで、認知記憶形成過程における分子・細胞・神経回路の役割を個体レベルで明らかにすることを目的としている。これまでに、霊長類への応用に向けたレンチウイルスベクターの開発及び作製法の検討、ラットを用いた予備実験を行なってきたが、当該年度においては、1.ラットを対象とした神経回路解析法の開発、2.レンチウイルスベクターを用いた霊長類大脳高次機能解明に向けた前段階としての、ラットを対象とした神経細胞活動制御方法の検討、3.レンチウイルスベクターを用いた霊長類大脳皮質への遺伝子導入システムの確立を行なった。以下、個別に記載する。1.においては、WGA及びGFP遺伝子の共発現が可能なレンチウイルスベクターを開発し、これによりラット小脳出力経路の可視化を可能にした。また、GFP発現により、一次及び二次ニューロンの区別が可能であった。この成果は、第39回北米神経科学学会(2009年10月19日、シカゴ)及び、GCOEプログラム「生体シグナルを基盤とする統合生命学」第3回リトリート(2010年3月5日、東京大学)にて発表された。2.においては、レンチウイルスベクターにより光受容蛋白(ChR-2,NpHR)をラットの大脳及び小脳皮質の神経細胞に発現させ、レーザー照射下にてその神経細胞活動制御(活性化・不活性化)を実現した。3.においては、これまでラットを用いて蓄積してきた技術を霊長類であるマカクザルへと応用し、その大脳皮質への遺伝子導入システムの確立を目指した。現在までに計64回の霊長類大脳皮質への遺伝子導入を行ない、また遺伝子導入用内部プロモーターに関するデータも集まりつつある。この成果は、GCOEプログラム「生体シグナルを基盤とする統合生命学」第3回リトリート(2010年3月5日、東京大学)にて発表された。本研究は、視覚性対連合課題遂行中のサルを被験体として、レンチウイルスベクターを用いて記憶関連分子の可逆的ノックダウンまたはK+channel等の遺伝子導入による神経細胞の不活性化を行うことで、認知記憶形成過程における分子や細胞の役割を個体レベルで明らかにすることを目的としている。本年度は、レンチウイルスベクターを作製できる実験系の確立と、サルへの応用の前段階としてラットを用いた予備実験を行った。レンチウイルスベクターは、三好浩之博士(理化学研究所バイオリソースセンター)が開発したレンチウイルスベクターシステムを用いており、現在までに10^9(TU/ml)オーダーの高力価ウイルスを得ることが可能になっている。次に、EGFP遺伝子を発現するレンチウイルスベクターをラットの小脳第6小葉に接種し、遺伝子導入効率を検討した。接種後7-14日目に、灌流固定し、小脳の薄切切片を作製しEGFPの発現を観察したところ、プルキンエ細胞を主として、顕著なEGFPの蛍光が観察できた。プルキンエ細胞におけるEGFPの蛍光は軸索においても顕著で、特定の領域のプルキンエ細胞の集団から小脳核に至るまでの軸索の走行を可視化することも可能であった。また、EGFP遺伝子の発現が認められた領域は、傍矢状断切片において小脳第6小葉の約1/3-1/2の範囲であった。一方、経シナプス性に神経細胞間を輸送されるWGA遺伝子を発現するレンチウイルスベクターも作製し、上記同様にラット小脳第6小葉に接種を行っている。小脳皮質の特定領域のプルキンエ細胞において発現したWGAは、シナプスを越えて、小脳核の細胞体にまで輸送されていることを確認している。また、レンチウイルスベクターに細胞・脳部位特異的プロモーターを組み込むことにより、特定の細胞集団のみにおいて遺伝子発現を実現することも遂行中である。本研究は、視覚性対連合課題遂行中のサルを被験体として、レンチウイルスベクターを用いて記憶関連分子の可逆的ノックダウンまたはK+ channel等の遺伝子導入による神経細胞活動の制御を行なうことで、認知記憶形成過程における分子や細胞の役割を個体レベルで明らかにすることを目的としている。当該年度においては、レンチウイルスベクターの霊長類への応用に向け培養系及びラットを用いて、次のような検討を主に行なった。1.レンチウイルスベクターのインターナルプロモーター及び調節因子の検討、2.高力価レンチウイルスベクターの作製検討、3.バイシストロニックレンチウイルスベクターの開発、4.レンチウイルスベクター濃縮液の組織毒性軽減へ向けた検討、5.ラット脳へのレンチウイルスベクター感染範囲の検討である。霊長類(サル)では実験に使用できる頭数に限りがあるため、げっ歯類を用いた条件検討は必須である。上記の条件検討では、それぞれにおいて目的を達成することが出来たが、特に大きな進展が「2.高力価レンチウイルスベクターの作製検討」で得られた。レンチウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター等と比べて力価が上がり難いことが欠点と言えるが、当該年度は、高力価レンチウイルスベクターを作製するため、St.Jude Children's Research Hospitalで開発されたレンチウイルスベクターシステム(Hanawa et al.,2002)の使用を検討した。超遠心による濃縮精製後の力価は、10^<10>-10^<11>(TU/ml)と高力価であり、これは昨年度に作製したレンチウイルスベクターの10-100倍の力価であった。

上記以外にも、経シナプス性に神経細胞間を輸送されるWGA遺伝子を発現するレンチウイルスベクターを用いたラット脳の解析、霊長類にレンチウイルスベクターを使用することが可能なP2A設備の導入等を行なった。本研究は、視覚性対連合課題遂行中のサルを被験体として、記憶関連分子の可逆的ノックダウンまたはK+channel等の遺伝子導入による神経細胞活動の制御(不活性化・活性化)を行なうことで、認知記憶形成過程における分子・細胞・神経回路の役割を個体レベルで明らかにすることを目的としている。これまでに、霊長類への応用に向けたレンチウイルスベクターの開発及び作製法の検討、ラットを用いた予備実験を行なってきたが、当該年度においては、1.ラットを対象とした神経回路解析法の開発、2.レンチウイルスベクターを用いた霊長類大脳高次機能解明に向けた前段階としての、ラットを対象とした神経細胞活動制御方法の検討、3.レンチウイルスベクターを用いた霊長類大脳皮質への遺伝子導入システムの確立を行なった。以下、個別に記載する。1.においては、WGA及びGFP遺伝子の共発現が可能なレンチウイルスベクターを開発し、これによりラット小脳出力経路の可視化を可能にした。また、GFP発現により、一次及び二次ニューロンの区別が可能であった。この成果は、第39回北米神経科学学会(2009年10月19日、シカゴ)及び、GCOEプログラム「生体シグナルを基盤とする統合生命学」第3回リトリート(2010年3月5日、東京大学)にて発表された。2.においては、レンチウイルスベクターにより光受容蛋白(ChR-2,NpHR)をラットの大脳及び小脳皮質の神経細胞に発現させ、レーザー照射下にてその神経細胞活動制御(活性化・不活性化)を実現した。3.においては、これまでラットを用いて蓄積してきた技術を霊長類であるマカクザルへと応用し、その大脳皮質への遺伝子導入システムの確立を目指した。現在までに計64回の霊長類大脳皮質への遺伝子導入を行ない、また遺伝子導入用内部プロモーターに関するデータも集まりつつある。この成果は、GCOEプログラム「生体シグナルを基盤とする統合生命学」第3回リトリート(2010年3月5日、東京大学)にて発表された。