hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
鋼コンクリート合成構造建築物の変形性能評価システムの開発

2.研究計画初年度の成果を踏まえ,CFT部材の変動軸力の下での変形性能とエネルギー吸収性能の評価法について検討するため,地震時を想定した圧縮-引張の軸力変動下におけるCFT柱の正負交番曲げせん断実験を行うとともに,既往の実験資料に基づいたデータベースを作成し,一定軸力を受ける場合の評価法が適用可能か否かを検討した。また,剛体-バネモデルによるSRC造建物の弾塑性静解析を行い,耐震壁およびスラブのモデル化における各種パラメータが,建物の力学的挙動に及ぼす影響について検討した。3.結果変動軸力を受けるCFT部材の変形性能とエネルギー吸収性能について,最大圧縮軸力をパラメータとし,SRC部材に関する一定軸力を受ける場合の評価法を援用することにより概ね評価可能であることが明らかとなった。また,剛体-バネモデルによる骨組解析により,平面が不整形なSRC造建物の大変形領域を中心とした地震時挙動について,より適切な評価を可能とする各種パラメータの設定法が明らかとなった。さらに,鋼コンクリート合成構造の性能設計のための変形性能とエネルギー吸収性能の評価システム構築のための基礎資料を得ることができた。4.まとめCFT部材について,変動軸力を受ける場合の変形性能とエネルギー吸収性能の評価法について検討し,SRC部材における評価法が概ね適用可能であることが明らかとなった。また,剛体バネモデルによる骨組解析について,大変形域を中心とするSRC造の地震時挙動を,より適切な評価を可能とすることが可能となった。さらに,鋼コンクリート合成構造の性能評価システム構築のための基礎資料を得ることができた。
花粉症発症における花粉暴露と環境汚染物質等の複合作用に関する疫学的・免疫学的解析

富山県内および隣接県において,花粉症発症の危険因子等の背景要因を明らかにするために,家族単位に疫学調査を実施した。自覚症状調査には,437世帯999人より解答が得られた。解析の結果,花粉症有症率の最も高いのは男女とも30才代の者で,スギIgE抗体陽性率と良く一致することが明らかになった。環境調査として浮遊粉じん(PM10,PM2.5)測定に関する研究を行ったが,現在の手法では多数のサンプルを同時に測定することは困難で,地域差を十分明らかに示すことはできなかった。花粉発生源であるスギ林の植生と関連し,花粉症有症率の高率化はおこることが示されたが,更に詳細に検討するには局地汚染を加味した花粉飛散モデル化の必要性が示唆された。家族単位の食事調査応より,油脂摂取と男性の花粉症有症率変動との関連性が示された。今回の調査では紅花油使用家族において,男性の花粉症有症率が低下するという興味深い結果が得られた。このことは季節野菜や雑魚などを調理する際,紅花油を使用する生活習慣が全体として花粉症発症に抑制的に働くことを示していた。富山県内および隣接県の花粉症高率地域および低率地域の花粉症発症危険因子等の背景を明らかにするために,545世帯を対象に家族単位に調査を行った。自覚症状に関するアンケートと調査等を実施し,検診の同意を得られた120人を対象に血液検査,アレルギー学的検査等を行った。117人の成績について見ると,花粉症高率地域ではスギIgE抗体陽性率は強陽性者が15%を占め,弱陽性者を含めると50%に近い抗体保有率を示していた。また,今回スギ抗体測定を蛍光ELISA法で行ったが,CAP・RAST法ときわめて高い相関関係(r=0.82)を示し信頼性の高い測定法であることが示された。栄養・食品調査,空中花粉調査とともにスギ林からの花粉飛散調査等も実施した。その結果,IgE抗体にみられる地域差は,部落レベルでも明らかで,小地域の花粉飛散等のみじかな環境要因が大きな作用を及ぼしている可能性が示された。今後,地域別に見たアレルゲン評価,スギ花粉等の飛散状況推定・予測法の開発等が重要な課題と考えられた。環境中アレルゲンとしては,メタセコイア等スギ以外の花粉とともに天然ゴム等に由来するラテックス・アレルゲン粒子の重要性が示唆された。またスギ花粉主要Cry j 1について検討し,スギ品種間の個体差の存在することを証明した。空中スギ花粉と花粉症患者発生の関係を検討し,経年的患者発生数の推移に空中花粉量が大きな影響を与えていることを証明した。しかし,花粉症の地域疫学的検討では,スギ花粉量だけでは花粉症有病率の増加は十分説明できず,その他の要因の複合作用を含め,環境要因を更に詳しく分析することが課題となっている。環境調査として浮遊粉じん(PM10,PM2.5)測定に関する研究を行なったが,現在の手法では多数のサンプルを同時に測定することは困難で,地域差を十分明らかに示すことはできなかった。家族単位の食事調査により,油脂摂取と男性の花粉症有症率変動との関連性が示された。
水田湛水層におけるエネルギおよび物質輸送動態の解明

これまで水田湛水層は、平常は静止し,物質輸送は拡散によると考えられてきた.しかし,著者らは水田の湛水層が昼夜を問わず対流していることを見出し,この対流速度を測定することを試みた.そのために水田湛水層の対流速度測定法を開発し,実際の圃場における対流速度を測定した.具体的には土壌の熱伝導率を測定する双子型非定常ヒートプローブ法を応用し,水田の特徴である不均一な流れを考慮に入れた平均対流速度を求める方法として確立した.この結果,対流速度は日周変化し,最大は太陽放射が最大となる時刻であり,約0.1cm/s,最低は日の出前であった.この値は拡散による輸送速度の約1万倍にも相当し,湛水層でダイナミックな物質輸送現象が生じていることを明らかにすることができた.湛水層の対流にともなって移動する溶存物質のなかで,とくに重要な酸素および炭酸ガスについて日変化を自動計測した.酸素は水中の光合成細菌によって生成されており,日中は過飽和に夜間は不飽和になっていること,これに対応して炭酸ガスは酸素とは逆の濃度変化をしていることを見出した.しかし,完全に1:1の関係になく,ヒステリシス・ループを描いていた.この原因が,2つのガスの放出速度と吸収速度に差のあること,これらの速度が対流速度とも関係していることを明らかにした.これらの関係を用いて解析することにより,湛水層中における光合成速度,呼吸速度,ガス交換速度を分離することができた.また,湛水層のpHが710の間で日周変化していること,この原因が炭酸ガス濃度によること,これに対応して酸化還元電位も大きく日周変化していることを見いだした.これまで水田湛水層は、平常は静止し,物質輸送は拡散によると考えられてきた.しかし,著者らは水田の湛水層が昼夜を問わず対流していることを見出し,この対流速度を測定することを試みた.そのために水田湛水層の対流速度測定法を開発し,実際の圃場における対流速度を測定した.具体的には土壌の熱伝導率を測定する双子型非定常ヒートプローブ法を応用し,水田の特徴である不均一な流れを考慮に入れた平均対流速度を求める方法として確立した.この結果,対流速度は日周変化し,最大は太陽放射が最大となる時刻であり,約0.1cm/s,最低は日の出前であった.この値は拡散による輸送速度の約1万倍にも相当し,湛水層でダイナミックな物質輸送現象が生じていることを明らかにすることができた.湛水層の対流にともなって移動する溶存物質のなかで,とくに重要な酸素および炭酸ガスについて日変化を自動計測した.酸素は水中の光合成細菌によって生成されており,日中は過飽和に夜間は不飽和になっていること,これに対応して炭酸ガスは酸素とは逆の濃度変化をしていることを見出した.しかし,完全に1:1の関係になく,ヒステリシス・ループを描いていた.この原因が,2つのガスの放出速度と吸収速度に差のあること,これらの速度が対流速度とも関係していることを明らかにした.これらの関係を用いて解析することにより,湛水層中における光合成速度,呼吸速度,ガス交換速度を分離することができた.また,湛水層のpHが710の間で日周変化していること,この原因が炭酸ガス濃度によること,これに対応して酸化還元電位も大きく日周変化していることを見いだした.著者らはこれまでに水田の湛水層が昼夜を問わず対流していることを見出しているが,対流速度については計測法が確立されていなかった.そこで,水田湛水層の対流速度を測定する方法を開発し,実際の圃場で対流速度を測定した.具体的には土壌の熱伝導率を測定する双子型非定常ヒートプローブ法を応用し,水田の特徴である不均一な流れを考慮に入れた平均対流速度を求める方法として確立した.この結果,対流速度は日周変化し,最大は太陽放射が最大となる時刻であり,約0.1cm/s,最低は日の出前であった.また,これと同時に湛水層の最上層,すなわち,水面と最下層である土壌表面との間の温度差と対流速度との間に相関関係を見出した.湛水層の対流にともなって移動する溶存物質のなかで,とくに重要な酸素および炭酸ガスについて日変化を自動計測した.酸素は水中の光合成細菌によって生成されており,日中は過飽和に夜間は不飽和になっていること,これに対応して炭酸ガスは酸素とは逆の濃度変化をしていることを見出した.しかし,完全に1:1の関係になく,ヒステリシス・ループを描いていた.この原因が,2つのガスの放出速度と吸収速度の差にあること,これらの速度が対流速度とも関係していることを明らかにした.これらの関係を用いて解析することにより,湛水層中における光合成速度,呼吸速度,ガス交換速度を分離することができた.また,これらの関係から得られた酸素の発生速度と炭酸ガスの消費速度とは,1:1の関係にあることを明らかにした.これまで長い間,水田湛水層は静止していると考えられ,物質輸送は拡散によると考えられてきた.しかし,著者らは水田の湛水層が昼夜を問わず対流していることを見出し,この対流速度を測定することを試みた.そのために水田湛水層の対流速度測定法を開発し,実際の圃場における対流速度を測定した.

具体的には土壌の熱伝導率を測定する双子型非定常ヒートプローブ法を応用し,水田の特徴である不均一な流れを考慮に入れた平均対流速度を求める方法として確立した.この結果,対流速度は日周変化し,最大は太陽放射が最大となる時刻であり,約0.1cm/s,最低は日の出前であった.この値は拡散による輸送速度の約1万倍にも相当し,湛水層でダイナミックな物質輸送現象が生じていることを明らかにすることができた.湛水層の対流にともなって移動する溶存物質のなかで,とくに重要な酸素および炭酸ガスについて日変化を自動計測した.酸素は水中の光合成細菌によって生成されており,日中は過飽和に夜間は不飽和になっていること,これに対応して炭酸ガスは酸素とは逆の濃度変化をしていることを見出した.しかし,完全に1:1の関係になく,ヒステリシス・ループを描いていた.この原因が,2つのガスの放出速度と吸収速度に差のあること,これらの速度が対流速度とも関係していることを明らかにした.これらの関係を用いて解析することにより,湛水層中における光合成速度,呼吸速度,ガス交換速度を分離することができた.また,湛水層のpHが710の間で日周変化していること,この原因が炭酸ガス濃度によること,これに対応して酸化還元電位も大きく日周変化していることを見いだした.
自閉スペクトラム症の運動障害と社会性障害に共通の脳内メカニズムは存在するか？

自閉スペクトラム症は、社会性障害を中核症状とする発達障害である。自閉スペクトラム症児の多くが運動の苦手さを呈するが、運動障害と社会性障害に共通の生理学メカニズムがあるか、それとも異なる生理学的メカニズムがそれぞれの症状を引き超すかは不明である。本研究は、自閉スペクトラム症の運動障害と社会性障害が共通のメカニズムによって生じるか、fMRI研究を用いて検証することを目的としている。今年度は、自閉スペクトラム症群の比較対象となる、定型発達者の身体認知に関わる脳機能の発達過程をfMRIを用いて調査した。その結果、人を見た時に強く反応する高次視覚野(lateral occipito-temporal cortex LOTC)の体積が学童期から青年期にかけて増加することが分かった。一方で、さまざまな身体部位を見た時の空間的な脳活動パターンを表象類似度解析にて検討した結果、LOTCの空間的な脳活動パターンは学童期から青年期まで変わらないという結果が得られた。この結果は、同じ身体認知に関わる脳機能でも発達過程の異なるメカニズムが存在する事を意味している。本研究では、各実験参加者の社会能力・運動能力の計測も終了しており、脳機能と各スキルとの関係性を検討する予定である。さらに脳情報デコーディングと領域間結合解析を用いた解析によって、LOTCと低次視覚野の間で身体自己認識に関わるbody identityとbody perspectiveの統合がなされていることが明らかになった。昨年度、定型発達群での検証は順調に進め、自閉スペクトラム症群の実験へとつなげる結果が得られている。自閉スペクトラム症群を対象にした研究を開始できる段階である。1つ目の課題については、各実験参加者の社会能力・運動能力を計測しており、脳機能との関連性を調べる予定である。さらに同課題を自閉スペクトラム症者へと適用し、自閉スペクトラム症の運動障害と社会性障害の共通のメカニズムを検討する予定である。2017年度は、以下2つの研究で運動と対人コミュニケーションの両者に関連する模倣の脳活動を調べることで、「定型発達児では運動と社会性に関連する神経基盤がどのように発達し自閉スペクトラム症者でどのように異なるか」検証した。研究1では、大人の自閉スペクトラム症(18名)と定型発達者(18名)を対象に、身体の視点(自己視点と他者視点)に関わる脳活動を計測した。その結果、定型発達者と比べて、自閉スペクトラム症ではLOTCとmPFCの活動が一貫して低かった。さらに自閉スペクトラム症者中でも模倣の苦手な実験参加者はCerebellumとIPLの活動が低いことが分かった。本研究の結果から、今後自閉スペクトラム症者の中でのheterogeneity (異質性)の評価と、LOTCに加えてIPL、Cerebellumの活動を検証する必要性が示された。本研究成果は国際学会で発表後、英文誌に投稿した(2018年4月に受理)。研究2では、大人と子どもの定型発達者(各18名)を対象に、実際に模倣したり模倣されている時の脳活動を計測した。その結果、大人と比べて子どもでは、LOTCと機能的結合を持つIFGの活動が低く、機能的結合自体も減弱していることが分かった。この結果は、定型発達者内でも、発達に伴い脳活動とその機能的結合が変わりうる可能性を示しており、今後発達的視点を加えて自閉スペクトラム症者の脳活動を評価する必要性が示された。本研究成果は、2018年度に国内学会で発表を行うことを予定している。所属研究機関変更に伴う準備により研究計画の見直しを行ったが、本研究課題の目的を達成するために必要な検証が完了し、次の研究に生かすことが出来る発見も得られた。研究成果の発表も順調に進んでいることからも、おおむね順調に進展しているといえる。

昨年度、定型発達群での検証は順調に進め、自閉スペクトラム症群の実験へとつなげる結果が得られている。自閉スペクトラム症群を対象にした研究を開始できる段階である。今後、以下の3点について研究を進める。1.研究実績の概要にある研究2について、学会発表と論文作成を行う。2. 2017年度は模倣能力との関連性の検証に留まり、運動スキルや社会スキルと脳活動の関係性まで検証することが出来なかったため、2018年度に検証を進める。3.近年、機械学習を用いたMVPAという手法によって、脳機能をより詳細に検討できることが分かってきた。2018年度はこの手法を用いた新たな実験を行う予定である。1つ目の課題については、各実験参加者の社会能力・運動能力を計測しており、脳機能との関連性を調べる予定である。さらに同課題を自閉スペクトラム症者へと適用し、自閉スペクトラム症の運動障害と社会性障害の共通のメカニズムを検討する予定である。次年度使用額が生じたのは、実験計画の見直しを行うにあたり、当初予定していたfMRI実験が後倒しになったためである。次年度使用額はfMRI実験の実施に使用する予定である。自閉スペクトラム症群のデータ取得を2019年度に持ち越したため、繰越が生じた。
高感度な核酸-蛋白質相互作用評価法の開発と核酸医薬への展開

がん等の疾病に関与しているmicroRNA(miRNA)を標的とした核酸医薬が期待され、miRNA活性を阻害するオリゴ核酸,anti-miRNA oligonucleotide (AMO),の開発が行われている。しかしながら、その作用機序の理解は進んでいない。本研究では、電極上に固定化したオリゴ核酸のダイナミクスを指標とすることで高感度な核酸-蛋白質相互作用評価法を開発し、これを応用してmiRNA-蛋白質複合体に対するAMOの作用機序を解明することを目的とする。本年度(3年目)は、Ago蛋白質とmiRNAの複合体の大量調製を目指し、発現プラスミドの設計から再検討を行い当該蛋白質の取得量を向上させることができた。しかしながら、miRNAとの複合体形成については、高純度な複合体の収率向上には至らなかったため、次年度も引き続き精製条件等の検討を実施することとした。一方、前記と並行して、これまでに開発した高いmiRNA阻害活性を有するAMOを用いて、がん細胞の抑制効果も調査した。miR-21の発現上昇が確認されている脳腫瘍の一つである神経膠芽腫細胞(A172細胞)に、種々条件にてanti-miR-21 AMOを添加したところ、従来よりも少ない量のAMOにて有意な細胞増殖抑制効果を確認でき、効果的に作用することが示された。また、昨年度に見出した「電極の前処理条件が核酸ー蛋白質相互作用の検出に大きく影響すること」について、調査を進めたところ、該前処理条件が電極界面の構造に影響を与えていることを示唆するデータを得ることができた。想定外に得られた成果、電極の前処理条件が核酸ー蛋白質相互作用の電気化学検出に与える影響、を明らかにすることは、本研究目的達成のために重要であり、この検討に時間を費やしたため、当初予定していた様々なオリゴ核酸と核酸結合蛋白質の相互作用評価に遅延が生じている。ターゲット試料(Ago・miRNA)の高純度調整法を確立し、これまでに得た系を用いて様々なオリゴ核酸との相互作用評価を実施し、その相関を明確にする。また、電極の界面状態がアッセイ感度等に与える影響を明らかにする。更に並行して、今年度得られたAMOを用いたがん細胞の増殖抑制効果について、そのメカニズム解析を行う。本年度(1年目)はまず、argonaute蛋白質(Ago)とmiRNAの複合体(Ago・miRNA)の調製を進めた。HeLa細胞から特定のmiRNAを含むAgo・miRNAを免疫沈降等により取得したが十分な収量は得られなかった。そこで、ペプチドtagを導入したAgo蛋白質の発現ベクターを準備し、HEK293T細胞を活用したAgo蛋白質の調製法を検討し、十分量の蛋白質を得ることに成功した。更に、導入したtagを利用した精製を行い純度の高いAgo蛋白質試料を調製できた。得られたAgo蛋白質に、2本鎖および1本鎖のmiRNAを作用させ、目的のAgo・miRNA複合体を得ることができたものの、該反応の効率が低く更なる改善を目指した反応条件等の検討が必要と考えている。また、核酸分子を電極上に効率的に固定化するための官能基を導入したオリゴ核酸を合成した。該オリゴ核酸を種々条件下にて金電極上に固定化し、電気化学マーカーの電圧-電流応答特性等から固定化密度の異なるオリゴ核酸電極を構築できることを明らかにした。Ago・miRNA複合体の調製に時間を要したものの、今年度に計画していた検討内容を順調に進めることができ、次年度の計画実施に対して十分な成果・知見を得た。本年度(2年目)は、まずAgo蛋白質とmiRNAの反応(Ago・miRNA複合体生成)効率の向上を目指して、様々な条件下での検討を行い収率を2倍程度向上させることができた。また、検討過程において、miRNA結合によるAgo蛋白質の構造変化を示唆する新しい結果も得られ興味深いと考えている。しかしながら、前記反応効率は未だ十分ではなく網羅的解析に資する複合体試料取得には至っておらず、更なる改善が必要と考え、引き続き次年度も検討を予定している。一方、得られたAgo・miRNA複合体を用いて、昨年度に確立した手法で作製したオリゴ核酸固定化電極上での電気化学応答を種々条件にて評価したところ、最適条件下においてAgo・miRNA複合体の添加前後で、電気化学マーカーの電流応答が大きく変化した。

また、Ago蛋白質(非複合体)を添加した場合、電流は変化しなかった。これらの結果から、オリゴ核酸(AMO)とAgo・miRNA複合体との相互作用を高感度に検出できることがわかった。Ago・miRNA複合体の調製反応の効率を2倍程度ではあるが向上させることができ、得られた試料を用いて、今年度に計画していた検討内容を進め次年度の計画実施に対して十分な成果・知見を得た。がん等の疾病に関与しているmicroRNA(miRNA)を標的とした核酸医薬が期待され、miRNA活性を阻害するオリゴ核酸,anti-miRNA oligonucleotide (AMO),の開発が行われている。しかしながら、その作用機序の理解は進んでいない。本研究では、電極上に固定化したオリゴ核酸のダイナミクスを指標とすることで高感度な核酸-蛋白質相互作用評価法を開発し、これを応用してmiRNA-蛋白質複合体に対するAMOの作用機序を解明することを目的とする。本年度(3年目)は、Ago蛋白質とmiRNAの複合体の大量調製を目指し、発現プラスミドの設計から再検討を行い当該蛋白質の取得量を向上させることができた。しかしながら、miRNAとの複合体形成については、高純度な複合体の収率向上には至らなかったため、次年度も引き続き精製条件等の検討を実施することとした。一方、前記と並行して、これまでに開発した高いmiRNA阻害活性を有するAMOを用いて、がん細胞の抑制効果も調査した。miR-21の発現上昇が確認されている脳腫瘍の一つである神経膠芽腫細胞(A172細胞)に、種々条件にてanti-miR-21 AMOを添加したところ、従来よりも少ない量のAMOにて有意な細胞増殖抑制効果を確認でき、効果的に作用することが示された。また、昨年度に見出した「電極の前処理条件が核酸ー蛋白質相互作用の検出に大きく影響すること」について、調査を進めたところ、該前処理条件が電極界面の構造に影響を与えていることを示唆するデータを得ることができた。想定外に得られた成果、電極の前処理条件が核酸ー蛋白質相互作用の電気化学検出に与える影響、を明らかにすることは、本研究目的達成のために重要であり、この検討に時間を費やしたため、当初予定していた様々なオリゴ核酸と核酸結合蛋白質の相互作用評価に遅延が生じている。今年度に得られた知見を基に、様々なオリゴ核酸固定化電極およびAgo・miRNA複合体を調製し、該オリゴ核酸(AMO)と該複合体との相互作用評価に最適な系の構築を目指す。ターゲット試料(Ago・miRNA)の大量調整法を確立し、今年度に得られた系を基盤とした高感度な核酸-蛋白質相互作用評価法を開発する。また、複数種のAMOを用いた解析を行いmiRNA-蛋白質複合体に対するAMOの作用機序に関する知見を得る。更に並行して、AMOを用いたがん細胞の増殖抑制効果の調査も進める。ターゲット試料(Ago・miRNA)の高純度調整法を確立し、これまでに得た系を用いて様々なオリゴ核酸との相互作用評価を実施し、その相関を明確にする。また、電極の界面状態がアッセイ感度等に与える影響を明らかにする。更に並行して、今年度得られたAMOを用いたがん細胞の増殖抑制効果について、そのメカニズム解析を行う。目的の蛋白質・核酸複合体(Ago・miRNA)
胎児赤芽球を用いた出生前DNA診断における胎児細胞と母体細胞の識別

胎児の出生前DNA診断に、母体末梢血中に混入してくる胎児赤芽球を使用する場合、極微量しか採取できない胎児赤芽球の中に母体由来の細胞が混入していないことを確認することが不可欠である。そのためには、実際に採取した細胞由来のDNAを遺伝的多型の大きな遺伝子でタイピングし、母体と胎児の遺伝型の違いから両者を識別する必要がある。本研究では、顕微鏡下でシングルセルマニュプレーション法で精製した一個の細胞よりDNAを調製し、そのDNAを遺伝的多型の大きなHLA抗原型タイピング法により識別する方法を開発することを目的とした。一個の細胞からのDNAの調製法は、アルカリ融解法による粗精製のみとし、この際の総液量を5μl以下に抑えることが必要である。このDNAにランダムな塩基配列を持つ15merの合成DNAをプライマーとして加え、50サイクルのPCRを行う。このPCRにより単一細胞由来のDNAの全領域が約50倍程度に増幅されるものと期待される。増幅されたDNAの半量をHLAタイピング用に、他の半分をDNA診断用に取り分ける。HLAタイピング用の試料にはHLA-DRB1遺伝子増幅用のプライマーを加え、PCRにより増幅する。増幅の結果はアガロースゲル電気泳動で確認する。実際にこの増幅を行うと60%以上の確率でHLA-DRB1遺伝子の増幅が単一電気泳動バンドとして確認される。他の場合には増幅の結果がスメア-状の泳動パターンとなるが、タイピング上は問題無い。増幅されたDNAを最終的にもう一度通常のHLAクラスIIタイピング法でPCRし、SSO法でタイピングする。SSO法のタイピングには通常のリバースドット法とマイクロプレート法の双方を使用したが、どちらの方法でも、予想されたHLA抗原型が検出確認された。母胎内の胎児の出生前DNA診断において、母体への影響を極力軽減する為、検査材料として母体末梢血中に混入する胎児赤芽球を用いる方法が考案されたが、このためには胎児赤芽球と母体リンパ球を確実に識別する技術が不可欠である。そのため、本研究では、単一の細胞ごとに遺伝的多型を調べる方法として、単一細胞由来の極微量のDNAを遺伝的多型の大きなHLA抗原型でタイピングすることを試みた。ヒト末梢血より、シングルセルマニュプレーション法により、単一細胞を得てDNAを粗精製した後、ランダムな塩基配列を持つ15merのプライマーを用いてPCR法によりDNA全体を増幅した(PEP法)。本研究では、通常のPEP法を更に改良し、アニーリング温度を低く抑えることによりDNA全体を満遍なく増幅すること、dNTPの量を増やして増幅量を増加させること、及びそれに伴う反応条件の改良を行った。PEP法により増幅されたDNAを、更にHLA-DRB1遺伝子に対応したプライマーで再度PCRを行い、通常のPCR-SSO法によるHLA-DRタイピングを行った。HLA-DRB1プライマーによるPCRでは、ほとんどの場合電気泳動で目的の長さに相当するDNAが検出されたが、時として泳動結果がスメア-状となる場合もあった。しかし、どちらの場合でもその後PCR-SSO法によるHLA-DR抗原型のDNAタイピングが可能であり、タイプ既知の試料の結果は正確に判定できた。今後はHLA-DRB1遺伝子用プライマーを改良して、スメア-の発生を抑える方法の開発を行った後、実際の胎児赤芽球のタイピングを行う予定である。

そのためには、実際に採取した細胞由来のDNAを遺伝的多型の大きな遺伝子でタイピングし、母体と胎児の遺伝型の違いから両者を識別する必要がある。本研究では、顕微鏡下でシングルセルマニュプレーション法で精製した一個の細胞よりDNAを調製し、そのDNAを遺伝的多型の大きなHLA抗原型タイピング法により識別する方法を開発することを目的とした。一個の細胞からのDNAの調製法は、アルカリ融解法による粗精製のみとし、この際の総液量を5μl以下に抑えることが必要である。このDNAにランダムな塩基配列を持つ15merの合成DNAをプライマーとして加え、50サイクルのPCRを行う。このPCRにより単一細胞由来のDNAの全領域が約50倍程度に増幅されるものと期待される。増幅されたDNAの半量をHLAタイピング用に、他の半分をDNA診断用に取り分ける。HLAタイピング用の試料にはHLA-DRB1遺伝子増幅用のプライマーを加え、PCRにより増幅する。増幅の結果はアガロースゲル電気泳動で確認する。実際にこの増幅を行うと60%以上の確率でHLA-DRB1遺伝子の増幅が単一電気泳動バンドとして確認される。他の場合には増幅の結果がスメア-状の泳動パターンとなるが、タイピング上は問題無い。増幅されたDNAを最終的にもう一度通常のHLAクラスIIタイピング法でPCRし、SSP法でタイピングする。SSP法のタイピングには通常のリバースドット法とマイクロプレート法の双方を使用したが、どちらの方法でも、予想されたHLA抗原型が検出確認された。
ウイルス・卵菌類複合抵抗性遺伝子座ＲＣＹ１／ＲＰＰ８の転写後発現制御機構の解明

本研究では,キュウリモザイクウイルス(CMV)に対する抵抗性の強さを制御する新規植物因子を探索した.前年度までに,CMV(Y)系統に対する抵抗性遺伝子RCY1を10コピー有するシロイヌナズナを材料として,9系統のsuppressor of RCY1-mediated resistance to CMV(Y) (src)変異体を単離し,特徴付けを行なった.9系統は,実質的に類似した表現型を示したため,代表的な5系統の解析について,本年度に原著論文としてまとめて報告した.src変異の形質はエピジェネティックに現れることから,原因変異をマッピングするためには解析母数を極端に増やす必要が考えられ,本年度に作業を完了することが難しいと考えた.そこで本年度は,srcの原因変異の同定には着手せず,逆遺伝学的解析に着手した.具体的には本年度に,RCY1を内因的に有するシロイヌナズナエコタイプC24をバックグラウンドとした,既報のDNAメチル化制御や遺伝子発現制御に関わる因子の変異体を取り寄せ,CMV(Y)抵抗性応答を解析した.DNAの脱メチル化を制御するDNAグリコシラーゼの変異体ros1-1にCMV(Y)を接種したところ,野生型に比べてCMV(Y)抵抗性の強さに差は認められなかった.一方で,RNAポリメラーゼIIのC末端ドメイン脱リン酸化酵素の変異体であるcpl3-1や,翻訳伸長因子の変異体であるlos1-1において,RCY1を介したCMV(Y)抵抗性が亢進していることが見出された.cpl3-1やlos1-1において,RCY1遺伝子の発現量は野生型と比べて変化が認められなかったことから,RCY1下流のシグナル伝達経路に影響が生じていると考えられた.本年度には,以上のようにNB-LRRタンパク質を介したウイルス抵抗性機構を逆遺伝学的に解析する一連の手法について,実験書への寄稿も行った.29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。これまでに,キュウリモザイクウイルス黄斑系統[CMV(Y)]抵抗性遺伝子RCY1発現におけるイントロンのスプライシングは, RCY1タンパク質高蓄積およびCMV(Y)抵抗性の増強に必要であることを明らかにした.本申請研究では,植物においてRCY1タンパク質高蓄積およびRCY1を介したCMV(Y)抵抗性増強に関与する新たな因子の同定を目指している.イントロンを介したRCY1タンパク質蓄積増強はRCY1イントロン配列に依存しない.一方, RCY1エキソンにシス配列が存在することを想定し, RCY1エキソンdeletionシリーズを用いて,イントロンを介したRCY1タンパク質蓄積量上昇に必要不可欠となる配列を探索した.この実験の結果,イントロンの存在に依存してRCY1タンパク質蓄積量を上昇させる特定のシス配列は存在しない可能性が高いことが考えられた.このため,生化学的手法によりRCY1タンパク質蓄積増強に関与する因子を単離することは難しいと考え,以降は遺伝学的スクリーニングによって同因子を探索している.RCY1トランスジーンを10コピー有するシロイヌナズナ系統Col::pRCY1-HA#13は, RCY1タンパク質の過剰蓄積により細胞レベルのCMV(Y)抵抗性を示す.突然変異を誘発したCol::pRCY1-HA#13後代20000株にCMV(Y)を接種し,組織レベルでウイルスが感染する変異株を選抜した.現在までに独立変異株6系統を確立したほか,候補株12系統を得た.3系統について先行して詳細に表現型を解析しているが,いずれにおいてもRCY1転写産物量, RCY1タンパク質蓄積量がCol::pRCY1-HA#13系統に比べ1/10以下に減少していた.現在この3系統においてRCY1転写産物量およびRCY1タンパク質蓄積量の激減を引き起こす原因変異のマッピングに着手している.同原因変異を同定することで,植物における抵抗性遺伝子を介した高度なウイルス抵抗性誘導に必要な因子を見出すことが期待される.当初,生化学的手法によってイントロンを介したRCY1タンパク質蓄積増強機構に関与するRCY1相互作用因子を単離することを計画していたが,同機構に必要なRCY1シス配列が特定の領域に存在しない可能性が高いことが考えられたため,生化学的手法による同定は困難と考えた.そこで,遺伝学的にRCY1蓄積およびCMV(Y)抵抗性増強に関与する因子をスクリーニングする実験を本格化した.本年度夏に人工気象室の冷却機異常により,シロイヌナズナ数千個体が全て枯死し採種予定の種子が不活化するトラブルが発生したものの,本年度末までには当初の計画通り,遺伝学的スクリーニングによって本研究のねらいに合致する表現型を有する変異株を複数系統見出すことができた.本年度は同変異系統の遺伝学的特性の解析のほか,原因変異のマッピングにも着手している.本年度は,次年度にRCY1による抵抗性誘導に関わる新たな因子を同定しその機能を解明するための変異系統資源を確立するという,今後の研究の発展につながる成果を得た.前年度に選抜したキュウリモザイクウイルス[CMV(Y)]高度抵抗性を喪失する突然変異誘発Col::pRCY1-HA#13 (以下,#13)系統をsuppressor of RCY1-mediated resistance to CMV(Y)(src)変異体と名付けた.本年度は,#13をバックグラウンドとするsrc変異体9系統の表現型の特徴づけと原因変異の遺伝分析を行った.

src1-src8系統ではCMV(Y)接種葉において過敏感細胞死が誘導されずCMV(Y)が全身移行した.一方src9系統では細胞死が誘導され,CMV(Y)感染はその周辺部のみに留まった.src1-src8系統ではCMV(Y)抵抗性遺伝子RCY1 mRNAとそのコードするタンパク質RCY1蓄積量ともに#13の1/100前後,src9系統では1/10程度に減少していた.以上より,変異株におけるCMV(Y)高度抵抗性の喪失は,RCY1 mRNA蓄積量の低下を介したRCY1タンパク質蓄積量の減少が原因と考えられた.各src系統とCol::pRCY1-HA#13間の交配後代F2において,src1-src8系統の場合には1-6%,src9系統の場合には98%の個体がCMV(Y)に対してERを示した.これはsrc変異がメンデル遺伝すると仮定した場合の分離比と大きく異なる.その解釈の一つとして,本現象にエピジェネティックな調節が関与する可能性を考えた.実際に,RCY1プロモーター領域のメチル化シトシン(mC)は,#13に比べsrc9系統において増加し,src1-src8系統でさらに増加していた.また#13とsrc間の交配後代F2においても,RCY1蓄積量減少とmCレベルが相関していた.一般的にメチル化により制御される植物遺伝子のSUPERMANや遺伝子スペーサー領域MEA-ISRのメチル化率を#13とsrc間で比較したときに,RCY1プロモーター領域のような劇的なレベルの変動は認められなかった.src系統におけるRCY1発現減少は,メチル化阻害剤処理によって抑制された.以上よりsrc独立9系統において,RCY1プロモーター領域のメチル化が,RCY1発現減少とCMV(Y)抵抗性レベルの低下に関与している可能性が示唆された.本申請研究では,RCY1におけるイントロンの存在を介した転写後制御によるRCY1タンパク質高蓄積およびCMV(Y)抵抗性増強の分子機構解明を視野に入れて実験を開始した.順遺伝学的スクリーニングの結果,RCY1の転写後発現制御に関わる因子の変異体は見いだせなかった一方,メチル化を介したRCY1転写発現制御に欠損を生じるsrc変異体を独立に9系統単離することができた.本変異体の原因変異は,RCY1プロモーター領域メチル化の抑制によるRCY1タンパク室蓄積上昇とCMV(Y)高度抵抗性に必要な因子であると推測されたため,抵抗性の強さを量的に制御する機構・手段を見出す上で追究する価値は大きく,研究に進展があったと考えている.本研究では,キュウリモザイクウイルス(CMV)に対する抵抗性の強さを制御する新規植物因子を探索した.前年度までに,CMV(Y)系統に対する抵抗性遺伝子RCY1を10コピー有するシロイヌナズナを材料として,9系統のsuppressor of RCY1-mediated resistance to CMV(Y) (src)変異体を単離し,特徴付けを行なった.9系統は,実質的に類似した表現型を示したため,代表的な5系統の解析について,本年度に原著論文としてまとめて報告した.src変異の形質はエピジェネティックに現れることから,原因変異をマッピングするためには解析母数を極端に増やす必要が考えられ,本年度に作業を完了することが難しいと考えた.
膜型バイオリアクタ-による排水処理の高能率化に関する研究

限外ろ過膜を排水処理に適用して、高能率化を図るために以下の研究を行ない、一定の成果を得るにいたった。1.限外ろ過膜の活性汚泥によるファウリング物質について、その抽出分離方法を確立した。ファウリング物質は膜表面では分子量数百万の糖タンパクと分子量数千のペプチドと予想された。ポア内では分子量が数千で膜表面と同じペプチドと予想された。2.高能率化の重要な課題として、単一反応槽内で有機物・窒素が同時に除去されることが好ましい。実際に単一反応槽内では連続反応が進行している。本研究では理論的に何故可能であるのかを熱力学的に明らかにした。有機物分解の標準酸化還元電位は極めて低く、アンモニア酸化と脱窒反応が同時に進行可能な標準酸化還元電位は430747mVの範囲にあり、普通に観察される電位に非常に近い。このため、単一反応槽内では有機物除去、脱窒の同時進行は理論的に十分に可能である。3.高能率化を図るためにはエアレ-ションと装置内攪拌が重要となる。このため、微細気泡の発生と攪拌を同時に行うための基礎的知見を得た。5060μm程度の気泡を作ることにより良好な結果を得た。4.膜に負担をかけないためには反応槽内の微生物濃度を高くして、膜による固液分離工程での微生物濃度を低くすることが好ましい。多孔性セラミックス担体に高濃度に微生物を付着させる反応槽について検討した。下水を原水として試験した結果、CODについては標準活性汚泥法と同程度の成績を得た。窒素リン除去にも効果があり、装置のコンパクト化、膜分離による下水の再利用が可能となるものと考えられる。以上のように、膜を利用した排水処理装置に関する基礎的知見を得ることができた。1.膜分離活性汚泥法で汚泥の高濃度化を試みた。その結果、3万mg/lの高濃度化を達成することができた。一方、高濃度化にともない活性汚泥の活性度が幾分か低下したものの、その程度は小さく高濃度化によるメリットを損わない程度であった。高負荷産業排水の一つである写真廃液に対して膜分離活性汚泥法を適用した。従来法より格段にすぐれた方法であることが明らかとなった。活性汚泥濃度は6万mg/lに達した。2.限外ろ過膜の目詰り物質の抽出分離法を確立し、高速液クロマトグラファ-で検出を試み、目詰り物質を明らかにした。膜表面目詰り物質は分子量数百万の糖タンパクと分子量数千のペプチドであり、ポア内目詰り物質は分子量数千のペプチドと考えられる。3.亜硝酸脱腔に関する基礎的研究を行った。その結果、(1)アンモニア酸化反応の最適pH値は8であり、有機物汚泥負荷によりその速度は影響を受ける。これは反応初期において有機物酸化が優先され、ORPが急激に下がるためである。(2)アンモニア酸化反応がO次反応であることをアンモニアの消失速度,亜硝酸の生成速度から明らかにした。(3)亜硝酸脱腔は硝酸脱腔よりも2倍程度速く、内性脱腔は有機物存在下の脱腔の約10分の1の速度であった。いずれもO次反応であった。4.膜面近傍の流れの状態を知るため、壁面流路における乱流の平均流速分布特性と組織構造を調べた。その結果、流速分布は底壁により近いところで最大となり、その粘性底層外端と最大流速点の間に高剪断層が形成されることがわかった。
CRISPR/Cas9システムを用いた成体腎臓での後天的遺伝子改変法の確立

In Vivoにおける遺伝子改変を試みるにあたり、当初の予定であった超音波法を用いたgRNAの導入では遺伝子改変効率が極めて不十分であったため、昨年度よりAAVを用いたgRNAの導入法へ切り替えた。また改変する遺伝子に関しても、少量の細胞でも遺伝子改変を確認されるように、発癌を誘導するような遺伝子改変へと切り替えた。具体的にはがん抑制遺伝子であるLkb1、p53を機能消失させ、癌促進遺伝子であるKRASを持続活性化するようなAAVを作成し、腎盂内投与を行った。結果、5か月の経過で異型細胞の集簇を複数認めていた。本年度はまず同様の実験を複数回行い、異型細胞の集簇の存在が再度確認された。また投与するAAVのコピー数なども増加させたが、異型細胞の集簇の数に変化を認めなかった。腎組織内で認められた異型細胞の集簇がCRISPR/Cas9により遺伝子改変されたものであることを確認するために、組織よりDNAを抽出し、予想される遺伝子改変部位を含むPCR産物に対して、T7エンドヌクレアーゼアッセイを行った。しかし遺伝子改変が生じた細胞の割合が低いためと考えられ、確認が困難であったため、パラフィン切片から腎組織の異型細胞を認める部位をmicrodissectionにより採取し、そこからDNAを抽出した。T7エンドヌクレアーゼアッセイを行い、ミスマッチ変異を生じていたことが確認された。また異型細胞はCytokeratin陽性であり、尿細管上皮細胞由来であることが確認された。本研究では、新規遺伝子改変方法であるCRISPR/Cas9システムに従来のCre-LoxPシステムを組み合わせることにより、成体の腎臓で後天的かつ組織特異的に複数遺伝子の改変を行う方法の確立を目的として計画された。昨年度の研究計画は、Vitroにおいては蛍光色素であるtdTomatoに対するgRNAの設計と、それが実際に機能するかどうかを確認すること、Vivoにおいては腎臓特異的にCas9蛋白、tdTomatoを発現する遺伝子改変マウスを作成すること、であった。tdTomatoに対するgRNAを3種類作成し、各々の遺伝子改変効率をFACSにより確認し、最も効率の良かった配列を決定した。そしてそのgRNA配列をCas9発現レンチウィルスベクターに挿入し、最終的にレンチウィルス液を得た。当初はレンチウィルスを用いて、Cas9蛋白とtdTomato蛋白を発現するHEK293細胞を作成する予定であったが、上述のCas9蛋白とgRNAを発現するレンチウィルスを作成できたこと、他研究者よりtdTomato蛋白を恒常的に発現しているラット尿細管上皮細胞を譲渡されたことから、この細胞株にレンチウィルスを感染させ、gRNAの機能確認を行った。FACSを用いた解析では、tdTomatoの発現の消失を認めた。また塩基配列を確認したところ、tdTomato遺伝子内に1塩基挿入変異を認めた。Vivoでは近位尿細管上皮特異的Tamoxifen誘導性Cre発現マウス、Cre依存的にCas9を発現するマウス、Cre依存的にtdTomatoを発現するマウスを相互に交配し、現在3つの遺伝子変異を有する改変マウスを作成中である。以上のことから、tdTomatoに対するgRNAは作成できており、今後はマウスの完成を待って、Vivoでの後天的遺伝子改変実験を行う予定である。平成28年度の研究計画では、In Vitroの実験においてtdTomatoに対するgRNAの設計、そしてその機能確認を行う予定であった。レンチウィルスを用いてgRNAを細胞に導入し、tdTomato蛋白の発現の消失をFACSで確認しており、また塩基配列の検討でもCRISPR/Cas9システムによりtdTomato遺伝子が改変されていることを確認している。これらのことからVitroの研究における当初の研究計画は達成されたと判断される。またVivoの研究計画では、近位尿細管上皮特異的Tamoxifen誘導性Cre発現遺伝子、Cre依存性Cas9発現遺伝子、Cre依存性tdTomato発現遺伝子の3つの遺伝子変異を有する改変マウスを作成予定であったため、当初より交配し作成するには1年以上時間を有することを予定していた。現在、3つの変異遺伝子を有するマウス仔を既に得ており、今後それらの成長を待ってTamoxifenの投与を行い、Cas9蛋白やtdTomato蛋白の発現解析を行う予定である。当初計画していた昨年度の研究計画では腎臓にtdTomatoおよびCas9を発現しているマウスにtdTomatoに対するgRNAを投与し、遺伝子改変を誘導する予定であった。前年までのVitroでの研究において、tdTomatoレポーターに対するgRNAの作成は終了している。また遺伝子改変動物も交配を重ね、完成している。今年度経過であるが、Vivoの実験では腎尿細管にtdTomatoとCas9を発現するマウスを得たが、gRNAの投与のみではtdTomatoの発現の消失を認めず、遺伝子改変を誘導することができなかった。その理由としてgRNAの細胞内への導入効率が低いこと、導入されたgRNAが長期間細胞内で残存しないこと、結果として遺伝子改変のために必要な十分な量のgRNAを細胞内で維持できないことが考えられた。上記の問題を解決するために、gRNAの導入にアデノ随伴ウイルスを用いることとした。

また遺伝子導入効率も低いことが予想されることから、少数の細胞での遺伝子改変をより可視化するためにがん抑制遺伝子であるLkb1、p53を機能消失させ、癌促進遺伝子であるKRASを持続活性化することで発癌を誘導する遺伝子改変を行うこととした。実験方法の変更を行った結果、腎内に遺伝子改変に由来すると考えられる異型細胞の集簇を複数認め、今後この細胞群がCRISPR/Cas9により遺伝子改変された結果によるものか、そしてその細胞の由来に関する検討を行う予定である。In Vitroの研究は達成されており、平成29年度の研究計画ではVivoの実験を中心に行う予定であった。まず近位尿細管上皮特異的Tamoxifen誘導性Cre発現遺伝子、Cre依存性Cas9発現遺伝子、Cre依存性tdTomato発現遺伝子の3つの遺伝子変異を有する改変マウスを作成し、Tamoxifenの投与を行ったところCas9蛋白、tdTomato蛋白とも発現を認めた。そこで当初予定していたように、tdTomatoに対するgRNA(1nmol)とマイクロバブルの混合液を下大静脈より投与し、その直後に右腎に超音波プローベを押し当て1分間の超音波照射を行い、gRNAが効率的に細胞内に取り込まれるように誘導した。しかしながらgRNAは一旦細胞内に取り込まれたが、遺伝子改変を誘導することはできなかった。理由として、取り込まれたRNAが長時間細胞内に存在しないこと、そしてCRISPR/Cas9システムが作動する十分なgRNAの量を細胞内に取り込めないことが考えられた。そこでgRNAのdeliveryする方法として、アデノ随伴ウィルス(AAV)を用いることとした。そして発現しているtdTomatoレポーターを消失させるよりも、少数の細胞でも遺伝子改変されれば可視化できるように、癌を誘導する遺伝子改変を行うことに計画を変更した。既報にあるように、がん抑制遺伝子であるLkb1、p53を機能消失させ、癌促進遺伝子であるKRASを持続活性化するようなAAVを作成し、腎盂内投与を行った。標的遺伝子が改変され腫瘍を形成するのに時間が必要と考えられたため、投与後5ヶ月待機した結果、腎組織内に複数の異型細胞の集簇を認め、In vivoでCRISPR/Cas9システムにより遺伝子が改変されたものと考えられた。In Vivoにおける遺伝子改変を試みるにあたり、当初の予定であった超音波法を用いたgRNAの導入では遺伝子改変効率が極めて不十分であったため、昨年度よりAAVを用いたgRNAの導入法へ切り替えた。また改変する遺伝子に関しても、少量の細胞でも遺伝子改変を確認されるように、発癌を誘導するような遺伝子改変へと切り替えた。具体的にはがん抑制遺伝子であるLkb1、p53を機能消失させ、癌促進遺伝子であるKRASを持続活性化するようなAAVを作成し、腎盂内投与を行った。結果、5か月の経過で異型細胞の集簇を複数認めていた。本年度はまず同様の実験を複数回行い、異型細胞の集簇の存在が再度確認された。また投与するAAVのコピー数なども増加させたが、異型細胞の集簇の数に変化を認めなかった。
マイクロマシン電極を用いた味神経線維にみられる味応答特性の時間依存性変動の研究

味覚神経における情報コーディングの動的特性を研究する目的で、マイクロマシン工学で作成したSieve電極をラットの鼓索神経に慢性的に埋め込み、味覚神経線維からの長期記録を試みた。研究は、ミシガン大学から提供を受けたSieve電極を用いて行なった。本研究の目標のひとつは、Sieve電極を改良して神経活動の記録の成功率を上げ、さらに記録期間の長期化を実現することである。従来の電極の問題点は電極記録部位表面のコーティング金属(金)が剥離することであったが、この問題はコーティング金属をイリジウムに変更して強度を増すことで改善された。改良された電極を用いて、味刺激応答を示す弁別可能な単一味神経線維からの記録を行なうことが出来た。記録期間は、数日から数週間であった。記録されたすべてのみ神経線維について、時間依存性の味応答特性の変動がみられた。しかしそれらは従来の四基本味(あるいは五基本味)Labeled Line(専用ライン)仮説に基づく味神経線維の型の間を越えるものではなかった。一時的に分類の型をはずれる応答がみられる場合もあったが、それは味刺激に対する応答全体が低下した場合に限られた。さらに、例えばNaベスト線維にみられた変動はHCIベスト線維にみられる変動よりも大きく、このことからも今回の研究の結果は、Labeled Line仮説にもとづく味覚情報のコーディング理論の正当性を支持するものとなった。一方、専用ライン仮説に対立するAcross Fiber仮説に対しては、その仮説の正立が各味神経線維の応答特性の不変を前提とする必要があることから、本研究の結果はその正当性を否定するものであった。味神経線維の機能的分類は、結局は膝状神経節における感覚ニューロンのタイプおよびサブタイプの存在を明らかにする研究に帰着する。したがって今後の研究は焦点を膝状神経節に移行し、本研究の成果を生かした研究を続行していく計画である。味覚神経における情報コーディングのダイナミクスを研究する目的で、マイクロマシン工学で作成したSieve電極をラットの鼓索神経に埋め込み、味覚神経線維からの長期記録を試みた。研究はまず、ミシガン大学からすでに提供済みのSieve電極を用いて慢性実験を行なった。その結果、味応答の時間的変化を示すデータを数例記録することができた。当研究の成否は電極の性能に寄るところが大きい。従来のSieve電極は埋め込み例数に対して記録成功例が約20%と低かった。電極を埋め込んだ神経組織を埋め込み手術約3ヶ月後、神経が十分に再生した後に電極先端ごと切除して光学顕微鏡観察で検討した結果、電極記録部位表面のコーティング金属(金)が剥離する問題があることが判明した。そこで実験計画に基づいて2003年にミシガン大学にて歯学部(R.M.Bradley)、工学部(K.Najafi)の研究室と共同で電極の新しいデザインを開発し、性能の改良を行った。改良点は、12チャネル型の電極デザインを見直して記録孔の間隔を若干広くしたことと、電極の製造過程を見直して、電極表面のコーティング強度を増したことである。これらの電極はすでに製造済みで、順次ラットの鼓索神経への埋め込みを行っている。埋め込み手術後神経が再生して味応答記録が可能になるまでは2ヶ月程度かかるため、まだ記録例は数例である。そのため改良した電極の性能を評価するには例数がまだ足りないが、今後実験を重ねることによって改良の効果が明らかになるものと期待される。味応答特性のダイナミクスについては、記録例のほとんどで応答特性の変動が見られた。今のところ従来の味神経線維の機能的分類をまたいで移行するといった例は得られていない。

しかし前述のようにまだ記録例数が少なく、最終的結論を出すには至っていない。舌の味細胞は約10日間の寿命しかなく、味蕾内ではつねに味細胞のターンオーバーが生じている。そのため、味細胞と味神経間では常に古いシナプスが消失し、新しいシナプスが形成されている。本研究の目的は、このような動的なシナプス形成環境において、味情報のコーディングがどのような形式で行なわれているかを知ることであり、そのために個々の味神経ニューロンの活動を、味細胞の寿命をこえる長期にわたって記録し、そのニューロンが伝える味覚情報がどのように変化するかを調べた。単一ニューロンからの長期記録を実現するために、Sieve電極という、多孔性の微小電極アレイの製作をミシガン大学と共同で行なった。今回の改良では特に金属電極の材質を変更し、従来は金蒸着に金メッキを行なっていたものを、イリジウムに変更した。この改良によって金属電極部の強度が増し、ポリイミド基板から金属が剥離しにくくなった。このSieve電極をラットの鼓索神経に埋め込んで実験を行なったところ、電極孔を通過して再生した味神経ニューロンから、味刺激に対する応答を記録することに成功した。そのうち、単一ニューロンの記録には数例しか成功しなかったが、いずれの記録においても各味溶液刺激に対する応答の特性は、数日にわたる記録期間中に変動を示した。また、膝状神経節における味神経ニューロン細胞体の分布と形態学的な特徴を調べ、生理学的実験結果との関連性について検討した。