hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腎系球体・尿細管間質障害におけるミッドカインの関与

この結果、虚血再還流障害発生24時間後からの治療実験においても高度の尿細管障害の抑制効果が確認され、尿細管間質障害の治療戦略として、抗MK療法の臨床応用が強く期待される。この結果に関して、現在論文作成中である。「加速型馬杉腎炎モデル」:野生型及びノックアウトマウスの尾静脈から家兔抗マウスGBM抗体(0.2mg)を静注し加速型馬杉腎炎モデルを作成する。増殖性糸球体腎炎の程度及び蛋白尿/腎機能/腹水の差を比較検討する。腹水の量は、ノックアウトマウスにおける腹水量は野生型に比べ有意に軽度であることが確認された。現在、その他のパラメーターについて検討中である。腎の虚血最還流モデルでの尿細管間質障害及び加速型馬杉腎炎モデルでの増殖性糸球体腎炎におけるミッドカインの関与に関する研究の進捗状況「虚血再還流モデル」:平成14年度は、腎の虚血再還流モデルでの尿細管間質障害におけるMKアンチセンス療法の有効性について中心に検討した。MKアンチセンス療法は、予防的投与のみならず、尿細管・間質障害発症後に投与しても、有効性が確認された。この結果、尿細管間質障害の治療戦略として、抗MK療法の臨床応用が強く期待される。現在論文を投稿中である。「シスプラチン腎症モデル」:虚血再還流障害の場合、尿細管での明かなMKの発現の増強が見られたが、シスプラチン腎症では、薬剤投与後、MKの一過性の発現減少が見られた。しかし、尿細管・間質障害の程度、炎症細胞浸潤、アポトーシス誘導、さらに死亡率において、野生型のほうがMKノックアウトマウスに比べて有意に程度が重いことを確認した。以上の尿細管間質障害の2つのモデルから、尿細管においてはMKは組織障害性に作用していることが確認された。「加速型馬杉腎炎モデル」:一方、加速型馬杉腎炎でみられる糸球体腎炎においては、野生型ではsubnephritogenicな条件下で、MKノックアウトマウスでは血栓形成・半月体形成を中心とした著しい糸球体障害が見られた。その原因として、毛細血管内ではMKはPAI-1発現を抑制し、その結果抗炎症性に働くことが考えられ、MKの持つ炎症細胞への走化性とのバランスで腎炎の進行がコントロールされていること、さらに、MKは、Th1/Th2 balanceに関わるサイトカイン発現に直接関与し、尿細管・間質とは逆に組織保護性に作用することが考えられる。
骨カップリング因子として働く骨基質中のTGF-βの研究

骨組織では破骨細胞が古い骨を溶解する骨吸収と、骨芽細胞が新しい骨を作る骨形成が行われているが、どのようなメカニズムで両者のバランスをとり正常な骨量を維持されているか明らかではない。本研究では骨組織に蓄積されているTGF-βに着目し、細胞培養系を用いて、骨吸収の際に放出・活性化されたTGF-βが破骨細胞に及ぼす影響を検討する。最終的にTGF-βがどのように骨量のバランス維持に関与しているか明らかにする。
白金製剤による難聴発症の易感受性遺伝子解析に関する研究

小児固形腫瘍に使用される白金製剤は難聴を生じ、小児の言語発達遅滞などの原因となっている。近年海外で白金製剤による難聴は薬剤の累積投与量などの影響ではなく易感受性遺伝子による可能性があることが報告されたが、日本人における遺伝子変異はまだ明らかではない。本研究では白金製剤による難聴の易感受性遺伝子変異を発見し、従来の化学療法ではなく難聴を生じさせない新たなオーダーメイドの化学療法を提案することを目的とする。本研究により、小児固形腫瘍症例に対する化学療法において、白金製剤を用いた後の難聴の発症およびそれにともなうQOLの低下などを念頭においた薬物の選択が可能になること、さらに予想される臨床型に応じて早期に難聴および言語指導などの介入が可能となる。遺伝子変異が明らかになることで加療が難聴を生じる可能性が事前に知らされることは患者にとってより良い治療を選択するための有益な情報となると共に、薬剤性難聴のメカニズムを明らかにし、予防法と治療法の開発につながる。現在得られている報告は海外で報告されているのみであるため、人種差なども考慮するとより網羅的な遺伝子解析方法として全ゲノム解析を行い、薬剤起因性難聴に関連すると考えられるすべての遺伝子を解析することで原因解明を促進する。現在までに白金製剤を使用した患者さんの血清検体、及びその家族よりの血清検体もしくは唾液検体からの遺伝子解析を順次施行し学会発表を行った。今後論文発表などを行う予定である。研究代表者の施設移動に伴い科研費の移管作業に時間を要したことなどもあり1年の延長申請を行ったが概ね検体解析は順調であるため。学会報告した内容を再度吟味検討した上で火以外発表、英文論文作成を行う予定である。現在までに白金製剤を使用した患者さんの血清検体、及びその家族よりの血清検体もしくは唾液検体からの遺伝子解析を順次施行している。解析が終了しているもので24症例(家族検体を合わせると約80検体)ほどである。今後も症例集積と解析作業を続けていく予定である。現時点での解析では報告されている遺伝子変異は明らかではない。人種差などがある可能性があるため、現在協議中である。昨年度に引き続き検体の解析を行っている。現時点での解析結果からは報告されている遺伝子変異は日本人では明らかではなさそうである。

本研究により、小児固形腫瘍症例に対する化学療法において、白金製剤を用いた後の難聴の発症およびそれにともなうQOLの低下などを念頭においた薬物の選択が可能になること、さらに予想される臨床型に応じて早期に難聴および言語指導などの介入が可能となる。遺伝子変異が明らかになることで加療が難聴を生じる可能性が事前に知らされることは患者にとってより良い治療を選択するための有益な情報となると共に、薬剤性難聴のメカニズムを明らかにし、予防法と治療法の開発につながる。現在得られている報告は海外で報告されているのみであるため、人種差なども考慮するとより網羅的な遺伝子解析方法として全ゲノム解析を行い、薬剤起因性難聴に関連すると考えられるすべての遺伝子を解析することで原因解明を促進する。現在までに白金製剤を使用した患者さんの血清検体、及びその家族よりの血清検体もしくは唾液検体からの遺伝子解析を順次施行し学会発表を行った。今後論文発表などを行う予定である。研究代表者の施設移動に伴い科研費の移管作業に時間を要したことなどもあり1年の延長申請を行ったが概ね検体解析は順調であるため。症例数は比較的順調に集まっているため当初の計画のままで行っていく予定である。当初の計画の症例数までは解析を続ける予定である。学会報告した内容を再度吟味検討した上で火以外発表、英文論文作成を行う予定である。遺伝子解析に使用したジャポニカアレイの費用が比較的抑えられたため昨年度購入した試薬等がまだ使用できたことなどから今年度は特に予算を使用しませんでした。物品費・旅費を使用していないことが大きな原因である。来年度必要があれば使用するが大きな出費はない予定である。来年度以降できる限り歳出を抑えつつ、最大限の活用を行っていく予定である。
成熟Ｔ細胞腫瘍で強く発現するケモカイン受容体ＣＣＲ７の発現制御機構の解明

我々は、成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)でのCCR4発現に関わる転写因子としてAP-1ファミリーのFRA-2を同定し、FRA-2はJUNDと共同してATLの増殖を促進するとともにc-Myb、SOX4などの原癌遺伝子の発現を誘導することを明らかにした。本研究では、ATLおよび皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)でのCCR7発現に関与する転写因子を検討し、新規DNA結合配列GAGGAGを同定し、その部位にはZFYVE19が結合することを明らかにした。本研究から、ATLやCTCLでの新たな発がん遺伝子カスケードの存在が示唆され、これらの成熟型T細胞性腫瘍の診断や治療に有用な情報が提供された。これまでに我々は、成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)及び皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)におけるケモカイン受容体の発現とその役割について報告してきた(Blood 2002, Oncogene 2008,他4報)。我々の研究はATLの細胞起源や組織浸潤を説明するだけでなく、CCR4発現に関わる転写因子FRA-2がこれらの腫瘍細胞の増殖にも関与する新規発がん遺伝子であることも明らかにした。また我々はATLでのCCR7発現がリンパ節浸潤と相関することを報告したが(Blood 2000)、CCR7発現に関わる転写因子やその転写因子のATLやCTCLでの発がん機構との関係は不明なままであった。そこで昨年度は、ATL及びCTCLにおけるCCR7の転写活性化領域を決定した。しかしこの領域には既知の転写因子のDNA結合配列と高い相同性を示す部分がなかったことから、ATLでのCCR7発現を誘導する転写因子の同定には至らなかった。そこで本年度はこの新規DNA結合配列・GAGGAGに結合する転写因子の同定を試みた。まず、CCR7非発現細胞株を用いた転写因子の再構築実験では、Sp1、c-Myb、C/EBP&#61537;、C/EBPbはCCR7の転写活性を上げなかった。また、DNA pull-down assayとMALDI/TOFMSを用いたタンパク解析によって、zinc-finger proteinを含む数種類の転写因子が得られた。さらにATL及びCTCLとは異なるT細胞急性リンパ性白血病(T-ALL)の細胞株JurkatでのCCR7の発現には違う転写活性化領域が関与することも明らかにした。以上の解析から、ATLやCTCLでのCCR7発現にはT-ALLとは異なる転写因子が関与し、その転写因子はこれまでATLやCTCLで発現が知られている転写因子とは異なるものであることが示唆された。これまで我々は、成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)におけるケモカイン受容体の発現とその役割について報告してきた(Blood 2002,他5報)。我々の研究はATLの起源細胞や組織浸潤を説明するだけでなく、CCR4発現に関わる転写因子FRA-2がATLの新規発がん遺伝子であることも明らかにした。また我々はATLでのCCR7発現がリンパ節浸潤と相関することを報告したが(Blood 2000)、ATLでのCCR7発現に関わる転写因子やそのATL発がんとの関係は不明なままであった。昨年度までに我々は、ATLにおけるCCR7の転写活性化領域を決定し、その領域に存在する新規DNA結合配列GAGGAGに結合する転写因子の同定を試みた。その結果、zinc-finger proteinを含む数種類の転写因子が得られた。また、ATLとは異なるT細胞急性リンパ性白血病(T-ALL)細胞株JurkatでのCCR7の発現には違う転写活性化領域が関与することも明らかにした。本年度は、GAGGAG配列に作用する転写因子群のATLおよびATLと類似する皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)における発現解析を行った。その結果、ATLおよびCTCL細胞株では共通してZFYVE19が発現することを明らかにした。しかしながら、CCR7が発現していないT-ALL細胞株でもZFYVE19の発現が確認されたことから、ZFYVE19はさらに他の転写因子などと共同してATLおよびCTCLでのCCR7発現を誘導することが示唆され、その同定を目指して研究を続けている。また我々は、ATLやCTCLにおいてCCR4発現に関わる転写因子FRA-2の下流遺伝子としてSOX4を同定し、さらにSOX4が抗腫瘍薬の標的として近年注目されているHDACファミリーのひとつHDAC8の発現を誘導することを明らかにした(Blood 2013)。本研究で見出したZFYVE19とそれと共同する未知の転写因子も、FRA-2/SOX4と同様にATLおよびCTCLにおける新たな発がん遺伝子カスケードを形成する可能性があり、本研究はこれらの成熟型T細胞性腫瘍の診断・治療に有用な情報を提供すると考えられる。

これまでに我々は、成人T細胞白血病/リンパ腫(ATLL)及び皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)におけるケモカイン受容体発現とその役割について、多数の報告を行ってきた(Blood 2002, Oncogene 2008,他4報)。これらの報告はATLLで特徴的な組織浸潤を説明するだけでなく、ケモカイン受容体からのシグナルやケモカイン受容体発現に関わる転写因子(CCR4発現を誘導するFra-2)が細胞増殖を促進することも明らかにした。また我々は既にATLLでのCCR7発現がリンパ節浸潤と相関することを報告したが(Blood 2000)、CCR7発現に関わる転写因子やその転写因子のATLL発癌機構との関係は不明なままであった。本年度はこれらを解き明かす手始めとして、ATLL及びCTCLにおいてCCR7発現に関わる転写因子の同定を行った。その結果、1)患者由来ATLL細胞を用いた5 ́-RACE解析により、主なCCR7転写開始点は1カ所であること、2)CCR7の転写活性化エレメントは転写開始点の上流7190bpに存在すること、3)この領域には原癌遺伝子c-MybのDNA結合配列に類似した部位が存在し、c-Myb発現抑制によりCCR7が発現抑制されることを明らかにした。しかしながら、4)CCR7非発現細胞株を用いたc-Myb再構築解析では、CCR7プロモーターの十分な活性化がなかったこと、5)点変異解析により同定したコアとなる6 bpのDNA配列は、c-Mybを含む既知の転写因子のDNA結合配列とは高い相同性を示さないことも明らかとなった。これらのことは、ATLL及びCTCLにおけるCCR7発現には未知の転写因子による新規な制御系が寄与することを示唆する。また、成熟T細胞性腫瘍の発癌機構の一端を解明する上で、この転写因子の同定は一つの鍵となる可能性がある。本年度我々は、1)CCR7プロモーター上に存在する新規DNA結合配列・GAGGAGの特定、2)この配列に結合する転写因子の候補群の抽出、3)CCR7発現におけるこのエレメントのATL及びCTCL特異性を明らかにした。しかしながら、GAGGAG配列に結合する転写因子の同定の過程で、yeast one-hybrid法での転写因子の同定は今回のDNA結合配列には不向きであることがわかり、また、DNA pull-down assayにおいてはPyruvate kinase isozymes M1/M2など間接的には発現に関連する可能性をもつが転写因子そのものではないものが検出されるなど、実験系の安定化に多くの時間を費やさざるをえず、予定していたCCR7転写因子の同定までには至らなかった。したがって、次年度は本年度において十分に実行できなかった研究計画も含めて遂行する予定である。本年度我々は、1)CCR7プロモーターの活性化エレメントの同定、2)CCR7プロモーターの転写因子の結合解析、3)同定された転写因子のCCR7発現に与える影響の検討、4)同定された転写因子の発現解析、5)ATLLとCTCL臨床検体を用いたCCR7プロモーター転写活性化因子の発現とリンパ節浸潤との相関解析を計画し、実行した。その結果、CCR7プロモーターの活性化エレメントは転写開始点上流7277bpであることが明らかとなった。
地形図の地図記号の自動認識システムの開発

地形図の地図記号を認識するシステムを開発するためには,地図記号の特徴量を考慮して,認識要素を究明する必要がある。この認識要素の決定に対しては詳細な判定基準を実験的に求めなければならない。これらの研究を完成するに当り,下記の各項目について研究を実施した。1.地形図(縮尺:2万5千分1)の地図記号の中から定型記号50種類の製図とフォント画像デ-タを外注し,これらの画像化を行い,各地図記号のフオントの整飾を行った。このために画像入力装置を画像処理の周辺装置として整備した。2.入力画像から原画像の特徴量を算出するアルゴリズムの開発を試み,その稼動性を実験デ-タで検証することができた。3.原画像から2値化処理,細線化処理,ラベル画像処理などのアルゴリズムを開発し,細線化画像から特徴量を抽出するモジュ-ルを開発することができた。これらの処理のためにワ-クステ-ションを購入し処理システムの構築を計画仕様に準拠して,具体的に実施した。4.地図の定型記号を非分離記号と分離記号に大別し,非分離記号の認識要素を決め,この要素で認識実験を試みたところ,高認識となった。5.分離記号を認識するには1地図記号を複数の画像で定義する必要があるため,分離した画像を関係づけるための認識要素を求明し,方向指数,包含関係,分離度,成分比などの新しい認識要素を見い出した。6.分離記号の認識要素(上記4種)を適用するに当り,原画像サイズから発生するクラスタ基準の必要性を見い出したので,クラスタ基準を具体的に各認識要素ごとに実験的に算出し,これを用いることにより分離記号すべてを認識することができた。したがって,本研究により,地形図の定型記号50種類を認識できる認識要素を見い出すことができた。平成元年度は地図記号認識に適した地図を選定して地図記号認識の研究を遂行した。その研究経過と成果をまとめると次のようになる。1.地形図は全国で約6,000種存在するので、取捨選択して小田原地区をディジタルデ-タ化の対象とした。2.小田原地区の地形図の色彩認識を試験し、色分解基準で印刷物情報をどの程度区別できるかを調査した。この実験結果から色分解基準は市販装置で実用性があることが分かった。3.地形図のカラ-分離デ-タをデ-タ圧縮したところ約8分1にできることが判明した。4.地図記号の分離体系の概念図から実行形式に移行することを検討し、分離記号と非分離記号を区分することになった。5.地図記号の特徴点として端点、交点、分岐点などが判定要素になるが、これらの特徴点と距離や要素間の角度の特徴がどのような関係記述子で表現可能であるかを整理したところ、距離や方向の特徴を認識要素として見出すことができた。6.地図記号の基本パタ-ンをベクトル形式と画像形式で保存するための方針を定めた。まずベクトル形式では2値化、細線化等の画像処理により幾何学的特徴点を抽出して一部の地図記号の認識率を求めた。この認識率を求める処理過程とその結果を論文にまとめることができた。7.画像形式での地図記号認識では処理部のモジュ-ル化をワ-クステ-ションで開発し、分離記号の認識を行った。この結果、90%の地図記号は認識できるが、認識率を100%にするには認識要素を追加する必要性があることが判明した。昨年度は地形図の地図記号認識の要素を縮尺に依存しないことを条件にして研究し、主に幾何学的特徴点による認識要素を研究した。これらの認識要素は非分離地図記号によく適用することが実験的に明らかにされた。

本年度は分離記号に対して認識要素を追加して、地形図の地図記号全てに対して認識実験を試みることにした。地形図の縮尺1/25,000の地図記号を認識する実験用に地図記号のモデルを作成して(昨年度:67種類、本年度:77種類、合計144種類)、これを画像デ-タ化した。この画像デ-タを用いて、昨年究明した地図記号の認識・要素を改良して適用したところ、100%の認識率を得ることができた。この高認識率を得た主要因は『地形図の地図記号の認識に対する一考察』と題して発表したホ-ルの認識要素の追加が挙げられる(研究者:星)。次に地図記号だけからの認識は高精度であっても既存地図に存在する地図記号に対しては不十分であることが考えられるので、研究者(池辺)らは地図記号の認識システムとしての評価基準を導入することを提案して、本年度は地図記号に線画像が接続されている場合の問題を取り上げ、地図記号の認識要素の基準とその適用性について研究した。この結果、不用線画像の多段階削除の可能性を示唆することができた。来年度はこの判定基準を拡張して、線画像以外の接続された地図記号に対しても究明する予定である。このほか、地図記号の研究の中から等高線の情報抽出の可能性を見い出すこともでき、新たな研究材料が芽えたことは特記すベき事項と考えている。地形図の地図記号の認識要素として,a.ホ-ル数,b.面積,c.連結成分とホ-ルの占有率,d.連結成分の伸長度,e.端点数,f.交点と分岐点,gh.端点の方向,h.連結成分の線幅,i.細線化処理の反復回数,j.斜連結度,w.方向指数,x.包含関係,y.分離度,z.成分比の14種類を見い出した。この中でwzは分離記号の認識要素である。これらの認識要素の値が各地図記号に対して,どのような範囲にあり,その範囲を何種類のクラスに区分すべきか不明のため,クラス分けの必要性のない認識要素の範囲を抽出することにした。この結果,a≦1,e≦1,f≦1,g_1≦3,g_2≦4,g_3≦4,g_4≦4,w≦8,x≦1となった。次に,クラス分けの必要な認識要素についてはISODATA手法により,当初56クラスに分類する闘値を求め,各クラスによる地図記号の認識状態を解析者が検証し,試行錯誤的にクラス統合を試み,最終的には認識要素b,c,d,h,i,j,y,zに対して各々4クラスに区分すれば,本研究で対象にしていた50種の定型地図記号がすべて分類可能であることが判明した。したがって,本年度の研究成果としては,定型記号50種を判別分類するためにクラスタ基準の決定をすることができたので,各地図記号の認識要素の処理手順と判定基準を内蔵したアルゴリズムを開発することができた。
鉄合金液体からの常圧ダイヤモンド合成

Fe-C,Fe-C-X(X=Si,Mn,Mg,S,Cu)系合金(Cmass%=4.25.7,XmasS%=0.5,Smass%=0.05)を1650°Cで溶解させた後,双ローラー装置により超急冷した。透過型電子顕微鏡で観察した結果、全ての試料にα鉄と非平衡Fe_7C_3相が観察された。Fe_7C_3相は,通常の単ロール法やガン法では観察されておらず,本装置による超急冷により生成したと思われる。しかしカーボン相はどの試料中にも生成していない。そこで,Fe-C-X系合金中に1650°Cで気化する元素を添加したところ,水冷試料中に球状黒鉛が生成していることが確認された。気化元素の比較的大きな粒を添加した物と微粉を添加した物では生成した黒鉛球の大きさが異なっており,球状黒鉛の気泡による生成説を裏付ける結果がえられた。この試料を超急冷し,透過型電子顕微鏡で観察した結果,球状のカーボン相が生成していることが確認された。この球状のカーボンの多くは非常に微細な結晶相あるいはアモルファス相から構成されており,また,不安定で電子線照射により結晶型が変化する様子の物もある。微細な結晶相はリング状の電子線回折パターンを示す。その中に非平衡カーボン相と思われる微細な結晶が観察されたが,微細,微量のため,正確な同定は難しく,今後の課題である。Fe-C系状態図の共晶点組成に近い組成(C:3.61mass%,S:0.0427%)の溶鉄を1650°Cから超急冷した。この超急冷したリボン断片状の鉄試料を,FIB装置こより薄片化し,透過型電子顕微鏡で観察した。試料は十分の一から一ミクロンオーダーの細かい微細組織を示しており、先に晶出したFe_3C結晶粒とその周りを取り囲む様に配置したα-鉄相が観察された。α-鉄内部には細かい斑点状のナノオーダー程度の程度の析出物が無数あり,α-鉄凝固後に析出したカーボンと思われる。このカーボンは非常に微細に分散しているため,その結晶型を確かめる事は出来なかった。今後,Fe_3C相や鉄母相を酸で溶解し,残ったカーボンだけを観察するなどの工夫を行い,同定する必要がある。なお,この試料は黒鉛球状化を妨害すると言われる硫黄を含んでいたため,鉄液相からはFe_3C相が晶出したと考えられるが,γ-鉄を経由せず,直接にα-鉄が生成しておリ,本実験の超急冷装置は900°C以上の過冷却が可能であることがわかった。従って次年度は,球状黒鉛を生成する条件下で超急冷を行うことにより,非平衡状態のカーボンの晶出について検討する。なお,遊星型ボールミルにより,Fe-C-M(M:添加金属)系のアモルファス鉄が作製可能であることを確認した。今後この遊星型ボールミルを用いた試料の作成方法の検討,或いはアモルファス状態からのカーボン析出状況について調査を行う。Fe-C,Fe-C-X(X=Si,Mn,Mg,S,Cu)系合金(Cmass%=4.25.7,Xmass%=0.5,Smass%=0.05)を1650°Cで溶解させた後,,双ローラー装置により超急冷した。得られたリボン断片状薄片試料は表,裏面を研磨した後,イオンミーリーングにより,電子を透過できるまで薄片化させた。透過電子顕微鏡で観察した結果,全ての試料にα鉄とFe_7C_3相が観察され,Fe_3Cも僅かに観察された。X線回折の結果からは,α鉄の回折ピークがダブルピークを示さない事,求めた格子定数は純粋なα鉄のものとほぼ等しい事等が示された。これより,α鉄はCを微量含んだ平衡α鉄相で,γ鉄を経由して生成したマルテンサイトでは無いことがわかった。また,Fe_7C_3相は通常得られるFe_3C相よりC量が多い化合物である。これらのα鉄とFe_7C_3相は,通常の単ロール法やガン法では観察されておらず,本装置による超急冷により,溶鉄は平衡α鉄が生成する温度まで過冷却されたと考えられ,非平衡FC_7C_3相が生成したと思われる。全ての実験試料の組織は微細であり,その多くにおいて,α鉄とFe_7C_3相が数ナノから数百ナノの幅のラメラ相を構成しており,部分的に粒状Fe_7C_3相も観察された。ただし,Fe-C-S系のみは粒状Fe_7C_3相がα鉄中に生成しておりその組織が他と異なっている。今後他の種々の第3元素や第4元素等を添加して,組織や非平衡相の出現について調査し,非平衡カーボン結晶の生成の可能性について検討する。

しかしカーボン相はどの試料中にも生成していない。そこで,Fe-C-X系合金中に1650°Cで気化する元素を添加したところ,水冷試料中に球状黒鉛が生成していることが確認された。気化元素の比較的大きな粒を添加した物と微粉を添加した物では生成した黒鉛球の大きさが異なっており,球状黒鉛の気泡による生成説を裏付ける結果がえられた。この試料を超急冷し,透過型電子顕微鏡で観察した結果,球状のカーボン相が生成していることが確認された。この球状のカーボンの多くは非常に微細な結晶相あるいはアモルファス相から構成されており,また,不安定で電子線照射により結晶型が変化する様子の物もある。微細な結晶相はリング状の電子線回折パターンを示す。その中に非平衡カーボン相と思われる微細な結晶が観察されたが,微細,微量のため,正確な同定は難しく,今後の課題である。
肺腺癌におけるアクアポリン1の発現制御のメカニズム

アクアポリン(AQP) 1の発現メカニズムに関して、エピジェネティック機構のヒストン修飾に注目して研究を行った。AQP1とヒストン修飾に直接関連を認めなった。しかし、ヒストン修飾の一つであるDimethylated histone3 lysine4(H3K4dime)は肺癌の術後再発と病期と細胞分化で関連を認めた。H3K4dimeはHIF-1とも関連していた。H3K4dimeは、腫瘍の進展や悪性度と関連し、肺癌の予後因子として重要である。【in vivoでの遺伝子発現の比較検討】20012008年に、当施設において切除された種々の組織亜型を含む肺癌組織115症例(ホルマリン固定115組織)を対象とした。肺癌組織にアクアポリン1の免疫組織染色を行い、また癌関連マーカーとの関連性を調べるために、CEA・p53・Ki67の免疫組織染色を行った。アクアポリン1の過剰発現は、腫瘍細胞の10%以上認める場合、過剰発現と判断した。cEAは腫瘍細胞の60%以上を陽性、p53は腫瘍細胞の30%以上を陽性、Ki67は腫瘍細胞の10%以上を陽性と判断した。術後再発において、病期とアクアポリン1の過剰発現とKi67と腫瘍径は、単変量解析で有意差を認めたが、多変量解析では有意差を認めなった。また、アクアポリン1の過剰発現と癌関連マーカー(CEA・p53・Ki67)は統計学的に有意差を認めず、関連性が低いことが示唆された。アクアポリン1の過剰発現は、腫瘍の進展と関係がある癌細胞において、アクアポリン1の遺伝子調節の変化から生じる可能性があると考えられた。【in vivoでの発現と機能変化の検証】A549肺腺癌培養細胞は、Western blot法でアクアポリン1のタンパク発現が認められた。EBC-1肺扁平上皮癌培養細胞で、まだWestern blot法でアクアポリン1のタンパク発現を確認していない。今後は、アクアポリン1の高発現・高侵襲性細胞株とアクアポリン1低発現・低侵襲性細胞株を選別し、関係遺伝子の遺伝子導入、siRNAによるノックダウン、各MAPキナーゼ特異的阻害薬を加え、アクアポリン発現の変化と細胞移動・浸潤能をscratch法とmatdgel invasion assayで解析する予定である。今回の研究では、AQP1の発現メカニズムに関してはっきりとした成果は出せなかったものの、肺癌の術後転移にはヒストン修飾が強く関与していることを解明した。そして、術後転移に関わるAQP1とヒストン修飾に相関関係があるのではないかと強く示唆できるもであった。今後は、浸潤性局所制御のための標的分子をAQP1とヒストン修飾に置き、浸潤部局所in vivo/in situ及び培養肺癌細胞を用いたin vitro実験で検証することを目的として行っていく予定である。本研究は、さらなる肺癌克服に向けた新規治療法確立のための研究に連なるものと確信し、今後の肺癌の転移機構に関しての解明、及び、肺癌浸潤部の分子生物学的機構の解明に繋がる研究であったと考える。
腫瘍の形成と維持の機構

VEGFとその受容体のシグナル伝達機構をマウス個体レベルで解析し、(1)内皮細胞増殖の主なポジティブシグナルを発信するのはVEGF受容体2(KDR/Flk-1)であること、また自己リン酸化部位1173チロシンは血管発生・新生に必須であること、を明らかにした。すなわち、1173チロシンをフェニールアラニンに置換したマウス(1173F/Fマウス)を作出して解析したところ、この変異マウスは血管系をほとんど構築することができず、胎生8.5-9.0日で死亡することが明らかとなった。この部位はPLCgamma-PKC-MAPキナーゼ経路の開始点であり、腫瘍血管系制御の新規分子標的として利用できると期待される。(2)発生早期におけるVEGF受容体の役割をキナーゼ阻害剤などにより解析し、受容体発現細胞(ヘマンジオブラスト)をVEGF-A濃度勾配に依存して頭部へ遊走させるのが重要な機能であることを明らかにした。(3)FRS2ファミリードッキング分子FRS2αの変異マウスの解析より、FRS2αが、FGF受容体によって活性化することにより、胎盤及び網膜の幹細胞の維持、増殖に重要な役割を果たすことが明らかとなった。(4)FRS2βは、EGF受容体シグナル伝達を抑制的に制御することが示された。(5)上皮特異的な増殖抑制・分化誘導作用を有するPKCηは、cyclin D1の発現抑制とトランスグルタミナーゼ1の酵素活性上昇を伴って、E-cadherin、β/γ-cateninを発現するヒト食道扁平上皮癌細胞の増殖を抑制した。この増殖抑制能は、ヌードマウスを用いた皮膚担癌実験により、個体レベルでも確認された。本年度は、血管新生とその維持に最も基本的なシグナル系と考えられるVEGFとその受容体について、VEGF関連因子の性質、複数の受容体の使い分け、シグナル伝達の特徴などを検討した。(1)我々がVEGFR-2(KDR)とのみ結合することを明らかにしたVEGF-E(NZ-7)について、その個体レベルの役割を調べるため、トランスジェニックマウスを作成してその生物学的反応を解析した。K14-VEGF-EトランスジェニックマウスをPlGFのそれと比較したところ、PlGFでは弱い反応しか見られないのに対し、VEGF-Eではin vitroの内皮細胞増殖作用と平行してマウス皮下組織に極めて強い血管新生誘導が見られた。これらの毛細血管は基本的に正常形態を示し、VEGF-Aマウスにおける出血や浮腫などの副作用は観察されなかった。(2)VEGF-E(NZ-7)はVEGFと40%のホモロジジーしか持たないにも関わらずほぼ同程度のKDRとの結合活性を持つ。その結合に重要な領域を明らかにするためVEGF-EとPlGFのキメラタンパクを多数合成し、結合ドメイン解析を行ったところ、ループ1,3が重要であることが明らかとなった。(3)KDRのシグナル伝達について、KDRの自己リン酸化部位を2次元電気泳動で明らかにすると共に、そのフェニールアラニン変異を合成し、変異受容体からのシグナル伝達を詳しく解析した。その結果、単一の自己リン酸化部位が内皮細胞のDNA合成シグナルに必須であることを見出した。VEGFとその受容体ファミリーおよびAngiopoietin-Tie受容体について解析し、(1)Flt-1(VEGFR-1)遺伝子が哺乳類のみならず鳥類に正確に保存されていること、(2)Ang1-Tie2系は内皮細胞によるチューブ形成を促進するが、これはVEGF系に強く依存すること、(3)Ang-Tie2系の人為的阻害によりがん性腹水の貯留をある程度抑制できること、(4)黄班変性症モデル実験系における浮腫、血管新生はVEGF-VEGFR系に強く依存した現象であること、またそれにはKDR(VEGFR-2)のみならずはFlt-1(VEGFR-1)も重要な役割を果たすこと、(5)ヒト血管腫から樹立した内皮様細胞株がVEGFR-1,-2,-3を発現する興味ある性質を示すこと、などを明らかにした。さらに、Bcr-Ablがん遺伝子の作用を調べ、Rat1細胞のBcr-Ablによるsoft agarcolony形成能獲得にはPKCdeltaがポジティブに関与することを示した。VEGF受容体、PDGF受容体の機能やシグナル伝達の特徴を明らかにするためには、生化学的解析ととも1系統発生的解析を行い、比較することは重要である。今回のVEGFR-1(Flt-1)の鳥類における発見は、血管系の発生、造血系の発生、骨髄形成やマクロファージ系の機能とVEGF系の関連を調べる上で、よい手がかりになると考えられる。Ang系とVEGF系の相互関係について、in vivoにより近いHUVEC-fibroblast共チューブ形成においては、内因性のVEGF-VEGFRシステムが機能していることが極めて重要であり、その上でAng, FGF, HGFなどが作用しうることが明らかとなった。血管系の人為的抑制を考える場合、まずVEGF系を標的をすることが最も効果的であることを示している。

VEGFとその受容体のシグナル伝達、およびそのがん化過程への関与について解析し、(1).VEGFR-2(KDR)の1175部位自己リン酸化チロシンはC-キナーゼ、MAPキナーゼ系を介するDNA合成シグナルに非常に重要であること、(2).同部位をフェニールアラニンに変異させたマウスでは血管発生の段階で障害され致死となること、すなわち、個体レベルでも同部位は内皮細胞の増殖・分化シグナルに必須であること、(3).VEGFR-1チロシンキナーゼは、MMP9誘導を介してがんの肺転移を促進させること、これらの点を明らかにした。さらに、FGF,PKCに関して解析を行い、(4).FGF下流のFRS2遺伝子を破壊したマウス胎児は、前後軸ができず致死であり、原因は、extraembryonic ectoderm (ExE)の発育不全であること、すなわち、FGFを介する胎児の前後軸形成において、ExE部位で活性化するFGF4-FRS2-Bmp4 pathwayが必須であること、を明らかにした。(5).PKCの上皮系における役割を解析し、PKCηは上皮細胞の分化誘導のみならず、細胞接着因子に作用して増殖や細胞形態に影響を及ぼすことを見いだした。またPKCηは、紫外線誘導性アポトーシスを負に制御することも明らかにした。VEGFとその受容体のシグナル伝達、およびそのがん化過程への関与について解析し、(1)新規VEGF様タンパクをハブ毒より単離することに成功し、それをもとに、VEGFによる血管透過性の強さは、2つのVEGF受容体の活性化のバランスによって決定されていることを明らかにした。(2)VEGFR-1膜通過ドメインは、脊椎動物の胎生期血管構築に非常に重要であることを明らかにした。(3)血管新生因子のなかで、VEGF系が最も基本的なシグナル系として使われており、VEGF系が血管新生阻害の第一標的となりうることを示した。さらに、(4).胎盤組織の幹細胞内で活性化するFGF4-FRS2-Bmp4 pathwayを解析した結果、Bmp4遺伝子の5'-flanking regionにFGF4に反応するelementが存在した。また、FRS2変異マウスの解析より、FRS2が、胎盤及び神経の幹細胞の増殖ならびに眼の初期発生に重要な役割を果たしていることが明らかになった。(5)上皮特異的な増殖抑制・分化誘導作用を有するCキナーゼPKCηを解析し、この分子は接着関連因子の局在に影響を及ぼし、上皮細胞の細胞間接着構造の形成や細胞極性の決定にも関与することが明らかとなった。VEGFとその受容体のシグナル伝達機構をマウス個体レベルで解析し、(1)内皮細胞増殖の主なポジティブシグナルを発信するのはVEGF受容体2(KDR/Flk-1)であること、また自己リン酸化部位1173チロシンは血管発生・新生に必須であること、を明らかにした。すなわち、1173チロシンをフェニールアラニンに置換したマウス(1173F/Fマウス)を作出して解析したところ、この変異マウスは血管系をほとんど構築することができず、胎生8.5-9.0日で死亡することが明らかとなった。この部位はPLCgamma-PKC-MAPキナーゼ経路の開始点であり、腫瘍血管系制御の新規分子標的として利用できると期待される。(2)発生早期におけるVEGF受容体の役割をキナーゼ阻害剤などにより解析し、受容体発現細胞(ヘマンジオブラスト)をVEGF-A濃度勾配に依存して頭部へ遊走させるのが重要な機能であることを明らかにした。(3)FRS2ファミリードッキング分子FRS2αの変異マウスの解析より、FRS2αが、FGF受容体によって活性化することにより、胎盤及び網膜の幹細胞の維持、増殖に重要な役割を果たすことが明らかとなった。
自然免疫を制御するＴｏｌｌ様受容体シグナルによる骨軟骨破壊機序の解明

関節リウマチ(RA)滑膜組織におけるToll様受容体(TLR)の免疫組織学的検討ではTLR-2,-4の発現を認めたが、TLR-3, -7, -8, -9の明らかな発現は認められなかった。このためTLRシグナルによっても誘導される血中酸化ストレス(ROM)とRAの臨床検査パラメーターとの関連を検討した。RAおよび糖尿病(DM)患者の血中ROMの平均値はそれぞれ455.9, 390.7 U.CARR(正常値<300 U.CARR)であり、RAにおいて有意に高かった(P<0.001)。多変量解析の結果、血中ROM値はCRP, DAS28-ESRと関連することが明らかになった。本研究は関節リウマチ(RA)患者の関節手術時に得られる滑膜、関節軟骨、軟骨下骨を用いて、TLRシグナルの活性化による炎症誘発、骨軟骨破壊のメカニズムを解明し、RAに対してTLRを標的にした分子治療へと展開するための研究基盤を確立するのが目的である。平成23年度の報告書において滑膜組織におけるTLRの免疫組織学的検討を行い、TLR-2,-4の発現を認めたが、TLR-3, -7, -8, -9の明らかな発現は認められなかったことを報告した。これはウェスタンブロットでも同様の結果であった。平成23年度は滑膜細胞をTLR-2, -4の合成リガンドであるペプチドグリカン(PGN)とリポポリサッカライド(LPS)で刺激し、細胞内シグナル伝達系の活性化をウェスタンブロットにて検討したが、平成24年度はTNF-α, IL-1, IL-1, IL-17, IFN-γなどの炎症性サイトカインで刺激し、培養上清中のMMP3濃度を測定することで、これら主要なサイトカインによる関節破壊制御のメカニズムを検討した。結果としては、滑膜細胞からのMMP3産生はIL-17 (100 ng/mL)単独による刺激では変化がなかったが、IFN-γ(1 ng/mL)との共刺激によって有意に増加した。一方、TNF-α(10 ng/mL)単独刺激ではMMP3産生は有意に増加したが、IFN-γとの共刺激によってその増加はキャンセルされた。IL-1 (10 ng/mL)単独刺激ではMMP3は最も増加したが、TNF-αと異なり、IFN-γとの共刺激によるMMP3増加のキャンセル効果は認められなかった。本研究は関節リウマチ(RA)の関節手術時に得られる滑膜、関節軟骨、軟骨下骨を用いてTLRシグナルの活性化による炎症、骨軟骨破壊のメカニズムを解明し、RAに対してTLRを標的とした分子治療へと展開するための研究基盤を確立するのが目的である。当初、TLRシグナルと骨軟骨破壊に焦点を当てて研究を進める予定であったが、各組織においてTLR-2, -4以外の発現が認めれれず、TLR-2, -4の発現もサンプル間のバラツキが多く一定の傾向が得られなかったため、昨年度から炎症性サイトカインによる関節破壊のメカニズム解析に研究の方向を修正し、培養滑膜細胞(FLS)を用いたin vitroの実験を中心に行い、関節破壊の指標を培養上清中のマトリックス・メタロプロテアーゼ-3 (MMP-3)の濃度として検討した。FLSからのMMP-3産生はIL-17 (100ng/ml)単独による刺激では変化がなかったが、IFN-γ(1ng/ml)との共刺激によって有意に増加した。一方、TNF-α(10ng/ml)単独刺激ではMMP-3産生は有意に増加したが、IFN-γとの共刺激によってその増加はキャンセルされた。本研究はRA患者の関節手術時に得られる滑膜、関節軟骨、軟骨下骨を用いて、TLRシグナルの活性化による炎症誘発、骨軟骨破壊のメカニズムを解明し、RAに対してTLRを標的にした分子治療へと展開するための研究基盤を確立するのが目的である。本年度はRA手術症例からの滑膜組織の収集、細胞培養、保存など実験材料の確保に当初計画していたよりも時間と経費を要した。サンプル数が少ないため、確立されたデータはまだ得られていないが、以下にプレリミナリーなデータを示す。滑膜組織の免疫組織学的な検討では、TLR-2, TLR-4の発現を認めたが、TLR-3, -7, -8, -9の明らかな発現は認められなかった。また、ウェスタンブロットでも同様の結果であった。滑膜組織から抽出したRNAをもとに、TaqMan probeを用いたPCRによってTNF-α,IL-17の発現を検討したところ、TNF-

αは疾患活動性の高低に関わらず全般的に発現が認められる一方、IL-17は症例による発現量の差が非常に大きい(10ー20倍の開きが存在する)ことが分かった。初代培養後に液体窒素内で保存していた滑膜細胞を培養し、非血清存在下でTLR-2, TLR-4の合成リガンドであるペプチドグリカン(PGN)とリポポリサッカライド(LPS)で刺激し、細胞内シグナル伝達系の活性化をウェスタンブロットにて検討したところ、p38, ERKのリン酸化とNF-kBの活性化が認められた。興味深いことにこれらのシグナル伝達系の活性化は、RAの実臨床において使用されているインフリキシマブなどのTNF阻害剤によって減弱した。本年度は当初計画していた滑膜細胞におけるTLRシグナルの検討から炎症性サイトカインによる関節破壊のメカニズムに方向を修正した。国内の主要学会で研究成果を定期的に報告しており、第一報の投稿準備にかかれる段階にきている。このため、達成度は「概ね順調に伸展している」と評価した。本研究計画はRA患者の手術時に切除される骨軟骨、滑膜を実験材料に用いるものであるが、当初計画していたよりも手術症例が少なく、実験材料の入手が思うように進まなかった。このため、達成度は「やや遅れている」と評価した。研究内容に関しては、当初計画していた滑膜細胞のTLRシグナル中心の研究から、炎症性サイトカインによる関節破壊制御のメカニズムへ方向転換し、培養滑膜細胞を用いたin vitroの実験を中心に行う予定である。炎症性サイトカインとTLRシグナルのクロストークについても解析を進めたいと考えている。昨年度は手術材料の不足から研究計画に遅延が生じたため、今後は多施設から手術材料を入手できるような体制を構築する予定である。同時に、手術材料の保存方法、収集手段を十分に検討しなければならない。また、多施設からの手術材料収集に当たっては、患者個人情報が尊守されるよう、十分な配慮がなされるような対策を講じていく。研究内容に関しては、研究計画に沿って培養滑膜細胞を用いたin vitroの実験を中心に行う予定である。IL-17とToll-like receptor(TLR)を介したシグナル伝達系の活性化について、プレリミナリーなデータではあるが興味深い結果を得ているので、当初の研究計画に加えて、滑膜細胞におけるIL-17とTLRシグナルのクロストークについても解析を進めたいと考えている。平成24年度中に行う予定であった滑膜培養細胞を用いた実験は、培養細胞の継代数が多くなってしまったために一部中断を余儀なくされた。このため未使用金が生じたが、平成25年度に行う予定であった細胞実験と合わせて研究を進めていく。よって今年度は細胞培養、遺伝子解析、生化学的解析に必要な試薬、器具を中心に研究費を使用する予定である。一部はデータ解析に必要なソフトウェア、研究成果発表のための学会準備・出張費に使用する予定である。最終年度となるので、論文投稿費にも使用する。当初の研究計画通り、細胞培養、遺伝子解析、生化学的解析に必要な試薬、器具を中心に研究費を使用する予定である。また、一部はデータ解析に必要なソフトウェア、研究成果発表のための学会準備・出張費に使用する予定である。
遠隔操縦式曵航・自航両用型海洋探査ロボットの開発

本年度は、前年度に引き続き、遠隔操縦式曵航・自航両用型海洋探査ロボットの流体力学的特性の研究と自航用推進装置、海洋探査用撮影装置等の設計・制作を行った。1.流体力学的特性の研究について(1)実験的研究前年度は、曵航時の索張力及びロボットの没水深度と翼面積、曵航速度の関係を求めるために、静的特性に重点を置いて実験的・理論的研究を行ったが、今年度は曵航及び自航時の運動性能推定の為に、回流水槽に於いてロボット模型の強制動揺実験を行った。強制動揺実験は水流の流速、上下揺の周波数を変化させて行ったものである。実験に使用した模型は実際のロボットに近い形状のものと、後に述べる理論計算と比較するための流体力学模型について行った。(2)理論的研究任意形状の3次元振動翼に加わる流体力の計算法を開発した。この計算法による結果と実験結果はよく一致した。またロボット模型による実験とは付加物の影響で若干の誤差はあるが、実用的には十分の精度で一致した。2.機器の設計・制作(1)自航用推進装置昨年度行った静的実験によって求めた抵抗値を使って、推進器の所要推力を推算した所、10Kgであったので、この仕様で推進器2台制作した。これによるロボットの自航速度は約2ノットであると推算される。(2)海洋探査用撮影装置小型、軽量を最優先としてシステムの構成を検討した所、ソニ-社製CCDカメラ(DXCー102)とキュ-アイ社製水中投光器(QAL208)の組み合わせが最適であるとの結論を得て採用した。以上の研究成果によって海洋探査ロボットを試作した。現在、特許の出願を準備中である。本年度は遠隔操縦式曳航・自航両用型海洋探査ロボットの仕様の決定、概略の設計、模型の製作を行った。ロボットの仕様は模型レベルで、潜航可能深度50m、最大曳航速度6ノット、自航速度4ノットで航走し、塔載機器として海中観測用水中テレビシステムを考える。また姿勢制御は縦揺と上下揺を自動制御することとする。数種類の海中航走体の代表的な形状について検討した結果、曳航中に要求される揚力が比較的大きいこと、縦方向には運動制御を行うが、横方向には無制限であるために横方向の慣動半径と運動減衰力が大きいこととが望ましい等の理由から、三角翼型で大きな下反角を持つものを採用した。また曳航点は曳航索の張力変動が海中ロボットの縦揺を誘起しない条件から理論的に定めた。観測用テレビシステム及び運動制御装置を収納するための円筒状の胴体を三角翼に付加することとし、所定の水圧に耐えられるように設計・製作した。三角翼型海中ロボットの流体力特性を調べる為に回流水槽において以下の実験を行った。1.静的流体力特性(1)流速を変化させて迎角一定(0°)の抵抗試験(2)流速を一定とし、迎角を変化させて抵抗及び揚力試験2.動的流体力特性(1)迎角をパラメータとし、Reduced Velocityを変化させて強制上下揺実験現在これらの実験結果をもとにして、海中ロボット、ケーブル、曳航母船の系の運動の理論モデルを作成中である。また自航用のスラスターの設計を行いつつある。
生理活性中員環歪み化合物の合成設計とその作用機構の解明

ネオカルチノスタチン(NCS)クロモフォア(1)は既知の天然物にはない新奇な構造と強い抗腫瘍活性から注目を集めている。この特異なエンジイン構造がビラジカルの発生を誘起しDNAを切断する。我々はNCSクロモフォアの構造をA,Bに分け、それぞれの役割を分子レベルで解明することを目的として、NCSクロモフォアモデルの合成研究に着手した。本年度は、A,B部位の役割を求めるため、トランスジオ-ル構造を有するNCSクロモフォアモデル6の合成を行った。トランスジオ-ル3はパラジウム触媒を用いたビニルエポキシド2の開環反応により立体選択的に導入した。アセチレン側鎖を5員環に1、2付加後、ブロモヒドリン4の分子内エ-テル化反応により、52%の収率で13員環エ-テル5を得た。3級水酸基をTMS基で保護し、tーBuLiで[2,3]ーwittig転位を行ったところ60%の収率で9員環エンジイン6を得た。現在ナフトエ-ト基、アミノ糖の導入について検討中である。
子宮体癌幹細胞形質獲得機構の解明と幹細胞マーカーの同定

本研究では子宮体癌細胞株を用いて癌幹細胞形質獲得機構における精巣特異的発現遺伝子dbpC/contrin (以下dbpC)の関与を解析した。まず、子宮体癌細胞株Ishikawa(IK)細胞株にdbpC発現ベクターを形質導入し、過剰発現株(IK-dbpC細胞)を樹立した。IK-dbpC細胞はmockに比べて幹細胞マーカーALDH1の発現亢進と、SP細胞の出現率増加をみとめた。Microarray解析でmockに比べIK-dbpC細胞、IK-dbpC-SP細胞ともに1つの精巣癌抗原(CTA)の発現が亢進していた。我々は様々な組織で幹細胞として機能していると報告されているsidepopulation細胞(SP細胞)を用いて子宮体癌幹細胞の研究を行っている。子宮体癌SP細胞は、未分化、自己複製能、少なくとも腫瘍細胞と間質細胞への2方向性分化能、造腫瘍能亢進を示し、癌幹細胞の特性を持つことを明らにした。更に、この子宮体癌SP細胞の形態を観察すると足突起を持ち、time-lapse videoscopeの解析で著明な運動能を持つこと示した。以上より、子宮体癌幹細胞には、自己複製能と間質への分化・運動能の亢進という2つの特性があり、前者は再発に、後者は転移に関与すると考えられる。がん幹細胞は既存の抗がん剤に対して抵抗性を持つことが示され、新規薬剤の開発が必要であることが示唆される。標的分子を探索するため、マイクロアレイで解析したところ、SP細胞においてNSP細胞に比べて増殖因子やサイトカインを含む多くの遺伝子の発現が亢進しており、子宮体癌幹細胞の増殖や維持には複数の因子やシグナルが関与していることが示唆された。よって、がん幹細胞を標的にした治療のためには、複数のシグナルを阻害する必要があると考えられる。本研究ではマイクロアレイ解析にて、SP細胞に発現が亢進しているSPARC (secreted protein acidic and rich in cysteine)について解析した。SPARCはSP細胞やSP細胞由来腫瘍の間質にも高発現していた。SPARC高発現細胞を樹立し解析したところ、低発現細胞に比較し、fibronectinの発現が増加、運動能が亢進し、間質の豊富な腫瘍を形成した。臨床検体では、低分化腺癌、漿液性腺癌、明細胞腺癌に強い発現が見られた。SPARCは幹細胞由来腫瘍や低分化腺癌のマーカーになることが示唆された。子宮体癌の癌幹細胞形質獲得機構における精巣特異的発現遺伝子dbpC/contrin(以下dbpC)の関与を検討するとともに、癌幹細胞マーカーの同定を試みた。1)子宮体癌細胞株Ishikawa(IK)細胞株にdbpC発現ベクターを形質導入し、過剰発現株(IK-dbpC細胞)を樹立し、幹細胞マーカーALDH1の発現とside-population (SP)細胞の出現率を解析したところ、IK-dbpC細胞はmock細胞に比べて幹細胞マーカーALDH1の発現が亢進し、約10倍のSP出現率をみとめた。dbpC-siRNAにより抑制するとSP出現率とALDH1の発現は低下した。2)Microarray解析を行い、dbpC発現細胞と非発現細胞間で発現量に差がある遺伝子群の解析を行ったところ、mock細胞に比べIK-dbpc細胞では癌精巣抗原CT45の発現が約1000倍亢進していた。4)発現が亢進した遺伝子について同意を得た子宮体癌100例の検体を用いて組織型、進行期、予後との相関の検討を行ったところ、低分化、臨床進行期が進むほどCT45の発現頻度が高くなる傾向を認めた。今までの研究成果により、dbpC/contrinは癌幹細胞の形質発現に関与しており、精巣癌抗原であるCT45は癌幹細胞のマーカーになる可能性が示すことができた。マイクロアレイやメチレーションアレイを用いて、CT45のほかにmock細胞に比べてIK-dbpC細胞やIK-dbpC-SP細胞に発現が亢進している遺伝子やメチレーションの状態を網羅的に検索する。3)1)で発現亢進が確認された遺伝子については、クローニングし、発現ベクターに組み込み、IKに形質導入し、幹細胞形質、造腫瘍能等を解析し、IK-dbpC細胞やmock細胞と比べる。また、そのsiRNAを作製し、発現抑制系での変化を解析する。4)上記解析にて、幹細胞マーカーの候補となった遺伝子はついては、他の子宮体癌細胞株のSP細胞、non-SP細胞や同意を得て採取された臨床検体を用いて、子宮体癌組織での発現を解析する。5)アレイからパスウエイ解析を行い、幹細胞形質に関与するシグナル経路を同定する。

1)IK-dbpC細胞とmock細胞の間で発現の差がある遺伝子やメチレーションのスクリーニングのため、アレイ解析を初年度に予定しておりこのための経費が必要である。(メチレーションアレイ解析:1000,000円、データ解析用PC:200,000円)細胞培養の培地、増殖因子、抗体、試薬等のための経費が必要である。(300,000円/2年)論文発表の際の英文校正・印刷代が必要である。(200,000円)