hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
NN,GP,GAを併用した等高線自律走行ロボットの設計

傾斜地においてトラクタによる農作業の無人化を実現するためには、傾斜地における移動ロボットの自律走行の実現が必要である。本研究では、この3年間の研究で次の5つのことを実施した。1)NN車両モデルの定式化:斜面上で農用トラクタの操舵と運動の関係を表す関係式(車両方程式)を非線形関係を表現するのに適しているニューラルネットワークを用いて定式化した。2)等高線に沿った自律走行のための最適操舵量の算出:斜面上の等高線に沿った自律走行を実現するフィードバック制御系を構築するため、横変位と姿勢角のずれを最小にする2次形式評価関数を作り、これを遺伝アルゴリズムで最適化し、最適操作量(ハンドル角)をlook-up tableの形にまとめた。3)斜面上での90度旋回方法の実現:斜面上で閉じたコースに沿った自律走行を実現するためには、旋回方法を定める必要がある。ここでは、90度旋回を自動的に行う方法を検討した。4)移動ロボットの製作:現有のトラクタに自動操縦装置、制御PCを搭載し、移動ロボットを自作した。5)矩形コースに沿った自律走行:斜面上に長辺が等高線に平行な矩形コースを設定し、これを希望進路としてそれにオントラッキングする無人走行実験を実施した。得られた主な結果は次ぎのとおりである。1)NN車両モデルは、等高線に沿ったナビゲーションプランナーが実現できたということで、単体車両では実用化の目途がついたと評価される。2)傾斜地の斜度は、0度5度、5度10度、10度から15度、15度から20度の4段階に分割し、それぞれの斜度でNNモデル、look-up tableを作成した。従っで、斜度が変化した場合、その斜度に対応する最適操舵角を利用すればいい。傾斜度が10度、15度の傾斜地(牧草収穫後の草地)では等高線に沿った矩形コースや、長辺が等高等高線と45度をなす方向の直線に対する直線走行は現在のところ不安定である。基本的には、教師信号取得実験で最大操舵角付近までの実験が必要であった。線と20度程度までの矩形コースでは、オントラッキング走行が実現できた。トラクタの等高線走行の自律化を実現するために,今年度は以下の4つの項目を実行した。(1)車両シミュレータの作成:傾斜地に於ける車両操舵と運動の非線形関係を記述可能な車両シミュレータを作成する必要がある。このため,岩手大学付属御明神農場の平均傾斜度10度の牧草地を利用して,振幅1と2(m)路面波長10と15(m)の正弦波コースを設定した。この軌道を人の操縦するトラクタ走行実験を実施した。与えられた正弦波を教師信号とするニューラルネットワーク手法を採用して,トラクタの操舵と運動の関係を記述する車両シミュレータ(車両方程式)を導出した。(2)トラクタ自動操舵装置の試作と改良:トラクタを無人・一定速度で走行させるため,ハンドルを回転させるDCモータを装備し,自動操舵を制御するコンピュータを実装した。(3)制御用ソフトウエアの作成:

自律走行させるために,車両の現在位置,姿勢角,操舵角等の状態量をそれぞれトータルステーション,光ファイバジャイロ,ポテンショメータで測定する。これらの信号をトラクタヘの入力信号とするためのソフトウエアーを作成した。(4)制御則の検討:ニューラルネットワーク手法で作成した車両シミュレータを実機に適用する際に当然入ってくる外乱の影響にロバスト性をもつニューラルネットワーク構造をシミュレーションで検討した。トラクタの等高線走行の自律化を実現するために,今年度は以下の4つの項目を実施した。(1)Al車両モデルの作成:昨年度に作成した傾斜地における車両の操舵と運動の関係を記述する車両シミュレータを,平均斜度0°(平坦地)と15°の傾斜牧草地にも拡張し,0,10,15°のそれぞれの斜面でのNN車両モデルを作成した(NNの構造の改良も含む)。(2)トラクタのロボット化とマイコンの入出力関係の調整:昨年度に引き続き,DCモータ等のハードウエア部分の調整を行った。また,車両自己位置を外界情報として取り込むトータルステーションと無線送信等のソフトウエア部の改良を行った。(3)制御則の改良:GAによる最適制御則の構成時のプログラミングのデバッグを行い,かつ操作量である操舵角を2段階に分け,より決めの細かい最適制御則を構築した。(4)等高線自律走行の実現:供試トラクタを用いて,平均斜度0,10,15°の各傾斜牧草地において,等高線を希望コースし,それに沿って走行する自律走行試験を実施した。各傾斜度において,30mの走行区間に於いて基準線からの横偏差は±5cm以内の直進走行が達成された。(5)任意方向の直線走行への拡張:特に,今年度は同一斜面であれば,任意方向の直線に沿った自律走行が実現できることを確かめた。次年度は同一斜面における周回コースの自律走行の実現を試みる予定である。傾斜地においてトラクタによる農作業の無人化を実現するためには、傾斜地における移動ロボットの自律走行の実現が必要である。本研究では、この3年間の研究で次の5つのことを実施した。1)NN車両モデルの定式化:斜面上で農用トラクタの操舵と運動の関係を表す関係式(車両方程式)を非線形関係を表現するのに適しているニューラルネットワークを用いて定式化した。2)等高線に沿った自律走行のための最適操舵量の算出:斜面上の等高線に沿った自律走行を実現するフィードバック制御系を構築するため、横変位と姿勢角のずれを最小にする2次形式評価関数を作り、これを遺伝アルゴリズムで最適化し、最適操作量(ハンドル角)をlook-up tableの形にまとめた。3)斜面上での90度旋回方法の実現:斜面上で閉じたコースに沿った自律走行を実現するためには、旋回方法を定める必要がある。ここでは、90度旋回を自動的に行う方法を検討した。4)移動ロポットの製作:現有のトラクタに自動操縦装置、制御PCを搭載し、移動ロポットを自作した。5)矩形コースに沿った自律走行:斜面上に長辺が等高線に平行な矩形コースを設定し、これを希望進路としてそれにオントラッキングする無人走行実験を実施した。得られた主な結果は次ぎのとおりである。1)NN車両モデルは、等高線に沿ったナビゲーションプランナーが実現できたということで、単体車両では実用化の目途がついたと評価される。2)傾斜地の斜度は、0度5度、5度10度、10度から15度、15度から20度の4段階に分割し、それぞれの斜度でNNモデル、look-up tableを作成した。従って、斜度が変化した場合、その斜度に対応する最適操舵角を利用すればいい。
クロロトルエン分子クラスターの老化学ダイナミックス

超音速ジェット中のレーザー誘起ケイ光(LIF)を測定する装置を新規に組み上げて、o-, m-,またはp-クロロトルエン分子のLIF励起スペクトルを測定した。即ち、クロロトルエン蒸気(320Kに加熱)をHe,Ne,Ar24気圧の背圧でパルスバルブ(オリフィス径0.5mm)から高真空中に噴出させ、超音速ジェットを生成し、このパルス分子線にNd: YAGレーザーで励起した色素レーザーの倍波をとり、275nmから260nm位の波長の光を照射した。レーザー光と直角方向からのケイ光を光電子増倍管で検出し、そのシグナルをボックスカ-積分器に取り込み、コンピューターで積算、解析した。m-およびp-クロロトルエンをArの背圧を3atmにして、0-0遷移付近のLIF励起スペクトルを高感度で測定して、Arとのクラスターを探した。オリジンより約25cm^<-1>長波長側に非常に微弱ではあるが、1:1クラスターと思われるピークが観測された。HeやNeでシ-ドした場合にはこのようなピークは観測されなかった。現在、Arはベンゼン環上に付いていると考えている。また、水あるいはメタノールとのクラスターの観測を試みた結果、それぞれ0^0_0より150cm^4、200cm^4長波長側にブロードなスペクトルが得られた。これは、1:1クラスターではなく、水分子やメタノール分子が何個か付いているためと考えられる。今後、クラスター内反応を試みる予定である。
原核藻類と原生動物の光共生に関する研究

本研究は、細胞内共生という現象の解明を目指し、貧栄養海域に生息する原生動物と原核藻類の共生関係を光合成に着目して明らかにするものである。本研究は、平成28年度から平成30年度までの3年間の計画で、最終年度である本年度は、引き続き、貧栄養海域での生物試料の採集・測定に取り組むとともに、研究全体のまとめを行った。平成30年78月に西太平洋亜熱帯循環域で、ラン藻をもつとされる放散虫(Dictyocoryne profunda)を採集し、高速フラッシュ励起蛍光光度計(FRRF)でその共生体の光合成活性の測定を試みた。前年に行った沖縄県瀨底島沿岸域での結果と同じく、光合成活性の指標となる可変蛍光は測定出来なかった。そこで、宿主内の藻類の有無を調べるため、D. profundaの細胞内から藻類由来の色素の抽出を試み、ラン藻がもつ色素であるゼアキサンチンが含まれることを確認した。同年12月に再び沖縄県瀨底島沿岸域でD. profundaを採集し、その細胞内から生きたラン藻を取り出し、試験管内で培養することに成功した。このラン藻の光吸収スペクトル測定と遺伝子解析を行い、本種がフィコビリン色素をもつSynechococcus sp.に分類されることが判明した。また、その培養株のFRRF測定を行い、本種が真核藻類の共生藻とは異なる光波長域で光合成能を有することを明らかにした。本研究の結果は、共生藻の種類が宿主原生動物の生息深度や生活史に関連することを示唆した。本研究は、細胞内共生という現象の解明を目指し、貧栄養海域で新たに発見した原核藻類のラン藻と宿主原生動物の関係を光合成に着目して明らかにするものである。本研究は、平成28年度から30年度までの3年間の計画で、初年度である本年度は、(1)宿主内ラン藻の光合成活性の測定法の確立、(2)ラン藻の生物量と光合成活性の定量的評価の2つのの研究課題に取り組んだ。以下にその具体的内容を示す。(1)高速フラッシュ励起蛍光法(FRR法)で、宿主細胞内のラン藻の光合成活性を測定するため、照射する励起光源を真核藻類の光吸収効率が高い青色LEDから、ラン藻の光吸収効率が高い色のLEDを選定・変更した。また、ラン藻から放射される微量の蛍光を精度よく測定するため検出器の改良を行った。これらの光源変更と検出器改良を行い、代表者がこれまで取り組んできた共生藻でのFRR法の測定プロトコル(励起光の強度や時間、検出器の感度調整等)を基に、ラン藻の光合成活性測定に適した測定プロトコルの検討を行った。(2)平成28年10月に横浜国立大学臨海環境センターに面した相模湾真鶴沿岸域(Sta.M)で、海域の現場環境の測定(現有機器を用いる)と共に、生物試料をネット採集した。この採集試料から、実体顕微鏡を用いて、ラン藻をもつ原生動物を単離し、FRR法でラン藻の光合成活性と生物量を測定した。また、原生動物とラン藻の種の分類・同定のため、検鏡用(光学顕微鏡と電子顕微鏡)とDNA解析用の試料を採集した。ラン藻の光合成活性測定に必要な機器の改良と測定プロトコルの決定を行った。また、相模湾真鶴沿岸域でラン藻をもつ原生動物を採集し、その光合成活性を測定することが出来た。本研究は、平成28年度から30年度までの3年間の計画で、2年目である本年は、ほぼ年間を通じてラン藻をもつ有孔虫と放散虫が出現する沖縄県瀨底島沿岸域(Sta.Sesoko)を研究対象海域として、原生動物の体内にいるラン藻の光合成活性と生物量の定量的評価と飼育実験に取り組んだ。試料は、Sta.Sesokoの現場環境(水温、日射量、栄養塩濃度等)の観測と共に、プランクトンネットを用いて採集した。この採集試料から、実体顕微鏡を用いて、ラン藻をもつとされる放散虫(Dictyocoryne profunda)と有孔虫(Globigerina bulloides)を単離し、体サイズを測長後、高速フラッシュ励起蛍光光度計(FRRF)でラン藻の光合成活性と生物量の測定および飼育実験を試みた。しかし、予想に反し、この2種の宿主細胞内からは、ラン藻特有のクロロフィル蛍光は検出されなかった。この原因を探るため、現在、FRRFの測定データのより詳細な解析と、この2種の細胞内にいるラン藻について、16SrRNAおよびDNAゲノム解析を行っている。また、あわせてTEMによる宿主原生動物の細胞切片観察用試料を作成し、電子顕微鏡を用いて、ラン藻の宿主細胞内での空間分布の特定を行っている。予定通り沖縄県瀨底島沿岸域で試料採集を実施し、前年度までに確立したラン藻の光合成活性測定に適したFRRFの測定プロトコルを基に、生物試料の測定と飼育実験を行った。本海域でラン藻をもつとされる2種の原生動物からは、ラン藻特有のクロロフィル蛍光が検出されず、予想と異なる測定結果を得た。

本研究は、平成28年度から平成30年度までの3年間の計画で、最終年度である本年度は、引き続き、貧栄養海域での生物試料の採集・測定に取り組むとともに、研究全体のまとめを行った。平成30年78月に西太平洋亜熱帯循環域で、ラン藻をもつとされる放散虫(Dictyocoryne profunda)を採集し、高速フラッシュ励起蛍光光度計(FRRF)でその共生体の光合成活性の測定を試みた。前年に行った沖縄県瀨底島沿岸域での結果と同じく、光合成活性の指標となる可変蛍光は測定出来なかった。そこで、宿主内の藻類の有無を調べるため、D. profundaの細胞内から藻類由来の色素の抽出を試み、ラン藻がもつ色素であるゼアキサンチンが含まれることを確認した。同年12月に再び沖縄県瀨底島沿岸域でD. profundaを採集し、その細胞内から生きたラン藻を取り出し、試験管内で培養することに成功した。このラン藻の光吸収スペクトル測定と遺伝子解析を行い、本種がフィコビリン色素をもつSynechococcus sp.に分類されることが判明した。また、その培養株のFRRF測定を行い、本種が真核藻類の共生藻とは異なる光波長域で光合成能を有することを明らかにした。本研究の結果は、共生藻の種類が宿主原生動物の生息深度や生活史に関連することを示唆した。引き続き、貧栄養海域での生物試料の採集・測定を行う。さらに、現場観測と飼育実験を行うことで、宿主内ラン藻の光合成活性の変動要因やラン藻が宿主原生動物の生存や生育に及ぼす影響を調べる。引き続き、貧栄養海域での生物試料の採集・測定を行なう。また、FRRFによる測定と併せて、ラン藻の遺伝子解析と電子顕微鏡観察を行ない、ラン藻の特定と原生動物の細胞内でのラン藻の役割を探る。本年度は、FRR法を用いた宿主内ラン藻の光合成活性測定法を確立するため、主に機器改良と測定プロトコルの検討に取り組み、現場観測は神奈川県の真鶴沿岸域のみで実施したため、当初計画していた沖縄県の瀬底沿岸域での観測に必要な物品費と旅費を使用しなかった。(理由)本年度は、夏季と冬季に沖縄県瀨底島沿岸域で生物試料採集を予定していたが、夏季の試料採集が天候不良のため中止となり、その分の生物試料の採集・測定に必要な物品費と旅費を使用しなかった。(使用計画)目的とする生物試料を採集するため、平成30年度78月に予定される海洋研究開発機構の海洋地球研究船「みらい」による西太平洋亜熱帯海域の研究航海に乗船し、生物試料の採集・測定に必要な消耗品と試薬の購入及び旅費に使用する。現場観測に必要な消耗品と試薬の購入及び旅費に使用する。
金属ナノ粒子触媒の活性サイトの集積化：酸化物クラスター含有錯体の前駆体応用

本研究では、予め酸化物クラスターに金属イオンを結合させた酸化物クラスター含有錯体に着目し、担体に担持後焼成することで金属ナノ粒子触媒を開発する。金属および酸化物の前駆体成分を独立に担持後焼成することで得られる従来の触媒とは異なり、この触媒では予め前駆体錯体中で酸化物と金属イオンが結合しているため、活性サイトとなる金属-酸化物界面が均一かつ高密度で形成される。目的とする触媒反応に応じて前駆体錯体の組成や構造を原子レベルで設計し、担体や焼成条件を最適化することで高活性な触媒を開発する。
プラスミドベクターを用いた遺伝子導入法による新規過排卵誘起法の開発

本研究では、血管内皮増殖因子(VEGF)の遺伝子を組み込んだ卵巣顆粒層細胞特異的発現ベクターを作製し、それを動物に導入することにより、顆粒層細胞で特異的にVEGFを発現させ、卵胞周囲の卵胞莢膜層に血管新生を誘起させることにより卵胞発育を促す新規過排卵誘起法の開発を目的としている。ベクターを細胞に導入して目的の遺伝子を細胞特異的に発現させるために、まず細胞特異的発現プロモーターの選択と発現プラスミドベクターの構築を行った。卵巣顆粒層細胞に特異的に発現していると考えられている3つの因子(FSH receptor、inhibin・subunit、p450 aromatase)のプロモーター領域を含む発現ベクターを卵巣顆粒層およびNIH/3T3細胞へのトランスフェクション後、ルシフェラーゼアッセイを行って、顆粒層細胞で特異的発現するかどうか調べてきたが、これらの活性レベルは高いとは言えず、更に特異性が高く、高いレベルで発現させることができる領域の検索が必要であると考えられる。この実験と平行して、ラットへのベクターの導入方法を検討した。導入したベクターが生体の細胞内で遺伝子発現させることができるかどうかを確かめるために、レポーター遺伝子としてLacZ遺伝子を組み込んだ強制発現用ベクターを用いて、導入方法の検討を行った。ラットの尾静脈よりLacZベクターを導入したところ、一部の組織(肝臓や筋肉)でLacZの発現が観察されたが、卵巣では発現が見られなかった。次に、in vitro electroporation法により、卵巣に直接ドベクターを投与し卵巣にパルス電流を流すことによって、ベクターが組織に取り込まれ、発現するかどうか調べた。その結果、LacZの発現は卵巣の間質細胞で見られたが、顆粒層細胞では見られなかった。今後、導入の条件検討や、他の導入方法を試す必要があると考えられる。本研究では、血管新生因子の中でも血管内皮細胞に特異的な増殖因子であり、血管新生に重要な因子である血管内皮増殖因子(VEGF)の遺伝子を組み込んだ卵巣顆粒層細胞特異的発現ベクターを作製し、それを動物に導入することにより、顆粒層細胞で特異的にVEGFを発現させ、卵胞周囲の卵胞莢膜層に血管新生を誘起させることにより卵胞発育を促す新規過排卵誘起法の開発を目的としている。ベクターを細胞に導入して目的の遺伝子を細胞特異的に発現させるには、その細胞に特異的に発現している因子の特異的発現に関わるプロモーター領域をベクターに組み込むことが必要であり、そのための実験として細胞特異的発現プロモーターの選択と発現プラスミドベクターの構築を行った。卵巣顆粒層細胞に特異的に発現していると考えられている3つの因子(FSH receptor、inhibin αsubunit、p450 aromatase)のプロモーター領域を、ルシフェラーゼ遺伝子を含む発現ベクターに組み込み、培養細胞(卵巣顆粒層細胞およびNIH/3T3細胞)へのトランスフェクション後、ルシフェラーゼアッセイを行った。その結果、ベクターに組み込んだinhibin αsubunitプロモーター領域とp450 aromataseプロモーター領域が、顆粒層細胞での活性を上昇させたのに対し、NIH/3T3 cellでは活性の上昇が見られなかったことから、これらのプロモーター領域が顆粒層細胞における特異的発現に関わっている可能性が示唆された。FSHRプロモーター領域を組み込んだものでは、NIH/3T3 cellでも顆粒層細胞と同様の活性が見られたことから、顆粒層細胞における特異的発現に関与しているとは考えにくい。これまで3種類の領域について顆粒層細胞での特異的発現に関与しているかどうかについて調べてきたが、これらの活性レベルは高いとは言えず、効率良く顆粒層細胞に発現させられるベクターを作製するためには、更に特異性が高く、高いレベルで発現させることができる領域の検索が必要であると考えられる。卵巣顆粒層細胞に特異的に発現していると考えられている3つの因子(FSH receptor、inhibin・subunit、p450 aromatase)のプロモーター領域を、ルシフェラーゼ遺伝子を含む発現ベクターに組み込み、培養細胞(卵巣顆粒層細胞およびNIH/3T3細胞)へのトランスフェクション後、ルシフェラーゼアッセイを行って、顆粒層細胞での特異的発現に関与しているかどうかについて調べてきたが、これらの活性レベルは高いとは言えず、効率良く顆粒層細胞に発現させられるベクターを作製するためには、更に特異性が高く、高いレベルで発現させることができる領域の検索が必要であると考えられる。この実験と平行して、ラットへのプラスミドベクターの導入方法を検討した。まずは、導入したプラスミドベクターが細胞に取り込まれ、その細胞内で遺伝子を発現させることができるかどうかを確かめるために、レポーター遺伝子としてLacZ遺伝子を組み込んだ強制発現用ベクター(SV40エンハンサーおよびプロモーターが組み込まれたベクター)を用いて、導入方法の検討を行った。

今後、導入の条件検討や、他の導入方法を試す必要があると考えられる。本研究では、血管内皮増殖因子(VEGF)の遺伝子を組み込んだ卵巣顆粒層細胞特異的発現ベクターを作製し、それを動物に導入することにより、顆粒層細胞で特異的にVEGFを発現させ、卵胞周囲の卵胞莢膜層に血管新生を誘起させることにより卵胞発育を促す新規過排卵誘起法の開発を目的としている。ベクターを細胞に導入して目的の遺伝子を細胞特異的に発現させるために、まず細胞特異的発現プロモーターの選択と発現プラスミドベクターの構築を行った。卵巣顆粒層細胞に特異的に発現していると考えられている3つの因子(FSH receptor、inhibin・subunit、p450 aromatase)のプロモーター領域を含む発現ベクターを卵巣顆粒層およびNIH/3T3細胞へのトランスフェクション後、ルシフェラーゼアッセイを行って、顆粒層細胞で特異的発現するかどうか調べてきたが、これらの活性レベルは高いとは言えず、更に特異性が高く、高いレベルで発現させることができる領域の検索が必要であると考えられる。この実験と平行して、ラットへのベクターの導入方法を検討した。導入したベクターが生体の細胞内で遺伝子発現させることができるかどうかを確かめるために、レポーター遺伝子としてLacZ遺伝子を組み込んだ強制発現用ベクターを用いて、導入方法の検討を行った。ラットの尾静脈よりLacZベクターを導入したところ、一部の組織(肝臓や筋肉)でLacZの発現が観察されたが、卵巣では発現が見られなかった。次に、in vitro electroporation法により、卵巣に直接ドベクターを投与し卵巣にパルス電流を流すことによって、ベクターが組織に取り込まれ、発現するかどうか調べた。その結果、LacZの発現は卵巣の間質細胞で見られたが、顆粒層細胞では見られなかった。
脂質成分のHIV感染における機能解明と新規抗エイズ治療薬開発のための基礎研究

細胞膜上には糖脂質やコレステロールに富んだ「ラフト」と呼ばれる微細領域が存在し,HIV-1感染において重要であると考えられている。これまでの当研究室の実験結果からラフト関連物質が新規HIV-1治療の標的となることが示唆された。本年度はラフトに影響を与える天然物由来の物質や,ラフト特異的に結合するコレラ毒素サブユニットB(CT-B)がHIV-1ベクター感染を抑制するかどうか,またラフトに存在する抗HIV-1細胞因子であるテザリンの感染抑制メカニズムを解析した。1. GGA,NIK-333,CT-BのHIV-1ベクター感染に及ぼす影響の検証レチノイド類似体は細胞膜上のセラミドレベルを変化させることによりHIV-1ベクター感染を抑制することが報告されているが,細胞毒性が強く臨床応用には至っていない。我々は細胞毒性がなく天然物由来の非環式レチノイドであるGGAや,それと類似した構造を持つNIK-333がHIV-1ベクター感染を効率よく抑制することを発見した。また,ラフト特異的に存在するガングリオシドGM1に結合するCT-Bも効率よくHIV-1感染を抑制した。これらの因子はHIV-1ベクターと標的細胞間の膜融合を抑制することによりHIV-1ベクター感染を抑制していることがわかった。また顕著な細胞毒性は見られなかったことから,これらの化合物が新規抗HIV-1治療薬の候補となりうることが示唆された。2.テザリンのHIV-1 cell-to-cell感染に及ぼす影響の検証HIV-1の感染様式はウイルス粒子によるcell-free感染,及びウイルス産生細胞と標的細胞の直接的な接触におけるcell-to-cell感染の2つが知られているが,生体内では主に後者が主要な感染経路であると考えられている。ラフト特異的に存在し,cell-free感染を抑制するテザリンがcell-to-cell感染も抑制するかどうか検証したところ,テザリンはcell-to-cell感染も効率よく抑制することがわかった。テザリンのHIV-1感染抑制メカニズムを利用したエイズ治療薬の可能性が示唆された。また本実験において,HIV-1 cell-to-cell感染は細胞融合と同時に進行するという,未だ知られていない興味深い特徴を発見した。細胞膜上には糖脂質やコレステロールに富んだ「ラフト」と呼はれる領域があり、HIV-1感染においても重要であると考えられている。これまでの当研究室の実験結果から細胞膜上のラフト構造を変化させる物質がHIV-1ベクター感染の新規治療薬となる可能性を示唆した。本研究ではこの可能性をさらに実証し、HIV-1感染におけるラフトの役割を明らかにすることを目的とし、(1)ラフト結合物質、(2)ラフト特異的に存在するタンパク質のHIV-1ベクター感染における影響を解析した。(1)ラフト結合物質のHIV-1ベクター感染における影響の検証実験に用いたコレラ毒素サブユニットB(CT-B)はラフト特異的に存在するガングリオシドGM1に結合する性質を持つ。CT-B処理した細胞にHIV-1ベクターを感染させた結果、約30%まで感染が抑制された。次に、ウイルス感染サイクルにおけるCT-Bの抑制段階を特定するため、Binding assayおよびFusion assayを行った。実験の結果より、CT-Bはウイルスが細胞と膜融合する段階を抑制していることがわかった。CT-B処理の細胞増殖への影響は見られなかった。以上のことから、CT-BがHIV-1ベクター感染抑制効果を持つことが実証され、ガングリオシドGM1が新規HIV治療薬のための標的となることが示された。(2)ラフト特異的に存在するタンパク質(エズリン)のHIV-1ベクター感染における影響の検証ラフトがHIV感染に重要であることをさらに確認するためラフト特異的に存在し、様々な膜タンパク質の機能に関与することが知られているエズリンのHIV-1ベクター感染における役割を解析した。エズリンはリン酸化されることで活性化することが知られている。エズリン・リシ酸化のHIV-1ベクター感染における働きを解明するためリン酸化部位に変異を導入したエズリン変異体を用い、HIV-1ベクター感染に及ぼす影響を解析した。実験の結果より標的細胞中の非リン酸化型エズリンの増加がHIV-1ベクター感染を抑制することが示された。以上のことよりラフト特異的に在するエズリンが新規HIV治療藥のための標的となることが示された。細胞膜上には糖脂質やコレステロールに富んだ「ラフト」と呼ばれる領域があり、HIV-1感染において重要であると考えられている。これまでの当研究室の実験結果から(1)ラフト結合物質(2)ラフト特異的に存在するタンパク質が新規HIV-1治療薬の標的となることが示された。本年度は1年目とは異なるラフト関連物質がHIV-1ベクター感染を抑制するかどうか、またそのメカニズムを解析した。(1)コレステロール類似体のHIV-1ベクター感染に及ぼす影響本実験で用いたコレステロール類似体であるシトステロール、エルゴステロール等植物ステロールはコレステロール吸収阻害作用を持つ物質である。これらが細胞膜上のラフト構造に何らかの影響を与えHIV-1ベクター感染を抑制するのではないかと考え、植物ステロール処理した細胞にHIV-1ベクターを感染させた。しかし顕著な抑制効果は認められなかった。(2)ラフト特異的に存在るタンパク質(テザリン)のHIV-1ベクターcell-cell transmissionにおける影響の検証HIV-1の感染様式はウイルス粒子によるcell-free

transmissionとウイルス産生細胞と標的細胞の直接的な接触によるcell-cell transmissionの2つが知られているが、生体内では主に後者が主要な感染様式だと考えられている。ラフト特異的に存在するテザリンはcell-freetransmissionを抑制することが知られているがcell-cell transmissionに及ぼす影響については様々な報告があり一貫していない。de novoの感染のみを検出する新規のHIV-1ベクターassay系を用いてテザリンのcell-cell transmissionに及ぼす影響を検証した結果、cell-freeと同様にcell-cell transmissionも抑制することがわかった。以上のことからラフト特異的に在するテザリンの抑制メカニズムの解明は新規HIV治療方法の開発につながるであろう。細胞膜上には糖脂質やコレステロールに富んだ「ラフト」と呼ばれる微細領域が存在し,HIV-1感染において重要であると考えられている。これまでの当研究室の実験結果からラフト関連物質が新規HIV-1治療の標的となることが示唆された。本年度はラフトに影響を与える天然物由来の物質や,ラフト特異的に結合するコレラ毒素サブユニットB(CT-B)がHIV-1ベクター感染を抑制するかどうか,またラフトに存在する抗HIV-1細胞因子であるテザリンの感染抑制メカニズムを解析した。1. GGA,NIK-333,CT-BのHIV-1ベクター感染に及ぼす影響の検証レチノイド類似体は細胞膜上のセラミドレベルを変化させることによりHIV-1ベクター感染を抑制することが報告されているが,細胞毒性が強く臨床応用には至っていない。我々は細胞毒性がなく天然物由来の非環式レチノイドであるGGAや,それと類似した構造を持つNIK-333がHIV-1ベクター感染を効率よく抑制することを発見した。また,ラフト特異的に存在するガングリオシドGM1に結合するCT-Bも効率よくHIV-1感染を抑制した。これらの因子はHIV-1ベクターと標的細胞間の膜融合を抑制することによりHIV-1ベクター感染を抑制していることがわかった。また顕著な細胞毒性は見られなかったことから,これらの化合物が新規抗HIV-1治療薬の候補となりうることが示唆された。2.テザリンのHIV-1 cell-to-cell感染に及ぼす影響の検証HIV-1の感染様式はウイルス粒子によるcell-free感染,及びウイルス産生細胞と標的細胞の直接的な接触におけるcell-to-cell感染の2つが知られているが,生体内では主に後者が主要な感染経路であると考えられている。ラフト特異的に存在し,cell-free感染を抑制するテザリンがcell-to-cell感染も抑制するかどうか検証したところ,テザリンはcell-to-cell感染も効率よく抑制することがわかった。テザリンのHIV-
脳梗塞後の上肢運動機能回復に伴う皮質可塑性においてリーリンは必要か?

リーリンは大脳皮質6層形成に必須のタンパクである。大脳皮質可塑性におけるこのリポタンパク質(リーリン: reelin)の機能に注目した。実験により、ヘテロ結合型(rl/+)の学習効果は、コントロール群ほど起きないことが分かった。大脳皮質での脳可塑性変化(Microtubule associated proteinsやsynaptophysin)はWT群の方が高い様である。皮質上肢運動野マップ領域も運動学習により変化が顕著であった。学習行動により起こる大脳皮質での変化には、リーリンが関与していると示唆される。脳梗塞後のリーリンの関与に関して再現実験等を行い結果をまとめている段階である。外傷や血管障害による中枢神経損傷は、神経細胞死・神経細胞機能低下を引き起こし、中枢神経回路網を断ち、損傷の場所や広がりによって、後遺症としてさまざまな障害をきたす。皮質運動野領域の再構築は、脳血管障害後の運動機能回復を可能にし、また促進する脳可塑的変化である。申請者は想定する複数の可塑性に関わる因子の中で、リーリン(reelin)に特に着目する。本申請書では、ヘテロリーラーモデル(hetero-reeler: rl/-)を使い、行動機能制御に伴う皮質運動野可塑性変化でのリーリンの役割解析を通じて、新たな脳血管障害後の回復機序の解明を目的とする。1.リーリンhaplodeficiencyによる運動機能学習能力への影響を解析する。2.ヘテロリーラー(rl/-)とワイルドタイプリーラー(rl/rl)で健常時と運動学習後では運動野上肢領域マップエリアの再構築があるかを解析する。3.運動野上肢領域マップの再構築に伴う組織的変化の評価を行う。大脳皮質可塑性分子リーリン発現レベルの確認と抑制神経細胞アクティビティレベルを定量する。4.内包梗塞モデルでの回復時期運動野可塑性においてリーリンの役割を検証する。内包でのフォーカル梗塞モデルを確立する。(rl/-)と(rl/rl)リーラーでそれぞれ、急性回復時と慢性回復時にリハビリテーショングループと自発的回復グループの運動回復と脳可塑的変化を解明する。1. (rl/-)と(rl/rl)の運動学習能力の違いを明らかにした。上肢スキルリーチタスクにおいて、ヘテロリーラー(rl/-)はワイルドタイプリーラーに比べて運動機能学習能力が低いようである。2.ヘテロリーラー(rl/-)とワイルドタイプリーラー(rl/rl)群のどちらともで、マウスが運動学習後、訓練された上肢と同側の皮質上肢運動野と、反対側の上肢運動野共に、上肢が司る面積が大きくなった。学習により、運動野でのシナプティックコネクティビティーが強まったためと考えられる。従って、ヘテロリーラー(rl/-)は、(1.で評価されたように)運動機能において、フィノタイプがワイルドタイプから差が出るものの、皮質可塑性が失われていないと考えられる。3.運動野領域の再構築に伴う組織的変化を評価するために、抑制性神経細胞発現量を定量した。運動野に関して、ワイルドタイプリーラー(rl/rl)では、パルバリュムミンが運動学習後減少し、ヘテロリーラー(rl/-)では特にカルビンディン抑制ニューロン数の変化を見出だした。脳全体でも抑制神経細胞の分布をヘテロリーラー(rl/-)とワイルドタイプリーラーで調べている。例えば両グループ比較で、外側中隔でのカルレティニンポジティブ細胞数の違いなどがみられた。これらの結果をもとに、リーリンタンパク質が神経系から半減した際の脳可塑性への影響を結論付けたい。さらに、cFOSとの共染色では、カルレティニン神経細胞が特異的にcFOSを運動学習後に発現していた。4.脳梗塞モデルを確立している。ファイバー損傷度などの定量を行っている。リーリンタンパク質発現量の損傷後回復期への影響を調べる。梗塞損傷範囲と影響(リージョンエフェクト)を急性回復時と慢性回復時に、(rl/-)と(rl/rl)リーラーでそれぞれ、リハビリテーショングループと自発的回復グループの運動回復と脳可塑的変化を解明する。本研究では、リーラーヘテロモデル(hetero-reeler: rl/-)を使い、行動機能制御に伴う皮質運動野可塑性変化でのリーリンの役割解析を通じて、脳血管障害後の新たな回復機序の解明を目的とした。実験により、ヘテロ結合型(rl/+)の学習効果は、コントロール群ほど起きないことが示された。運動学習後、パフォーマンス向上に伴い上肢領域マップの再構築がヘテロ結合型(rl/-)でもおこったが、特にWT群においては学習された上肢側と反対肢側でも上肢マップ領域が広範囲に及んだ。運動学習前の時点ではヘテロ結合型(rl/-)とコントロール(rl/rl)群では上肢運動野マップには差が見られなかった。そして両群でWestern blotと免疫染色では運動学習後、synaptophysinとMicrotubule associated proteinsの発現が強化された。さらに、ホモ接合型、ヘテロ結合型リーラーマウス、ワイルドタイプ(WT)の運動制御をつかさどる大脳皮質運動野マップをIntracortical microstimulation (ICMS)を用いて検討した。その結果、ホモ接合型では骨格筋を動かす際に、WTより高い皮質電気刺激閾値を要する事が明らかとなった。一方WTに近い層構造をもつヘテロ結合型では、比較的通常の皮質電気刺激閾値で骨格筋収縮の誘発が可能であった。

梢神経異常の有無を調べるために神経筋接合部の形態・アセチルコリン受容体の構成成分の比較を行ったが差は認められなかった。薬剤を使用した内包梗塞モデル作成に関しては、当初考えられた様に、再現性が高くマウスの死亡率も低い結果が得られた。損傷後の運動機能障害は顕著なものであり自発的回復も低かった。脳梗塞後のヘテロ結合型(rl/+)とントロール(rl/rl)群の上肢運動回復過程の結果はまとめている所である。リーリンは大脳皮質6層形成に必須のタンパクである。大脳皮質可塑性におけるこのリポタンパク質(リーリン: reelin)の機能に注目した。実験により、ヘテロ結合型(rl/+)の学習効果は、コントロール群ほど起きないことが分かった。大脳皮質での脳可塑性変化(Microtubule associated proteinsやsynaptophysin)はWT群の方が高い様である。皮質上肢運動野マップ領域も運動学習により変化が顕著であった。学習行動により起こる大脳皮質での変化には、リーリンが関与していると示唆される。脳梗塞後のリーリンの関与に関して再現実験等を行い結果をまとめている段階である。1.と2.に関しては当初の予定通りの実験計画を推進・完了する。統計学を用い、データを発表する。3.で導く抑制神経細胞変化においての重要な分子を1.と2.の結果に総合的にフィードバックする。データを発表していく。4.に関しては今年度の予定課題を早々に推進する。新たに、リーラーマウスを搬入し、梗塞を作成前後の可塑性変化の分析を進める。内包梗塞後の機能回復レスキュー実験も行う。神経科学
Neurovascular Unitに着目した血管内皮細胞障害動的評価系の構築

【方法】1ヒト脳血管内皮細胞と周皮細胞をトランスウェル膜の上部と下部にそれぞれ培養し、cellZscopeを用いて経内皮細胞電気抵抗(TER)を経時的に測定した。TERがプラトーになったことを確認し、in vitro血液脳関門モデルとした。段階希釈したTNF-αを添加してin vitroウイルス性急性脳症モデルを作成し、TER変化による血管透過性変化を経時的に観察した。2in vitroblood brain barrierモデルを用いて分子量の異なるフルオレセインナトリウムまたはFITC標識デキストランを添加し物質の細胞透過を蛍光マイクロプレートリーダーにより評価した。3TNF-α添加後の血管透過性変化に伴うclaudin-5とZO-1の局在変化を蛍光免疫染色により、またclaudin-5の蛋白発現変化をウェスタンブロット法によって観察した。【結果】1TER値はTNH-α濃度依存性に減少し、最小値に達した後、徐々に回復した。2溶質透過試験では、TNF-α添加後にすべての分子量の物質の透過性が亢進したが、その程度は分子量とTNF-α濃度に依存し、経時的に回復の傾向を認めた。3claudin-5の局在は、TNF-α添加後に変化し、TNF-α濃度依存的に回復した。一方、ZO-1の局在には変化がみられなかった。claudin-5の発現は、TNF-α添加24時間後にTNF-α濃度依存的に減少した。【結論】脳血管内皮細胞と周皮細胞を用いた血液脳関門モデルを用い、TNF-αを添加することによりin vitroのVAEモデルを作成した。TER測定と溶質透過試験はTNF-αによる血管内皮細胞障害による透過性亢進を評価するのに有用である。この評価方法は、ヒト脳血管内皮細胞と周皮細胞の共培養により、安定した血管透過性評価系を確立できた。さらにそこに炎症性サイトカインを添加することで急性ウイルス性脳症の病態モデルを確立することができた。ウイルス性急性脳症の病態解明だけではなく、血管透過性に焦点をあてた特異的治療法開発に有用と考えられる。最初にヒト脳血管内皮細胞不死化細胞株(HCMEC/D3)は、Merck MilliporeのSC066を購入し検討した。しかし、安定したTERの上昇が得られなかった。次にCELLutions Biosystems Inc.のCLU512を購入し検討した。安定したTERを得るための条件を検討し、TER上昇を確認後に、3次元細胞培養モデルを作成したが、単独のHCMEC/D3と比較し、TER上昇はみられず、溶質透過性の低下はみられず、タイト結合蛋白の局在変化はみられない状態であり、急性脳症時の血管内皮細胞モデルを作成するのに苦慮している。今後は、3次元培養モデルの条件検討を続け、有用な評価系の確立を目指す。その後は急性脳症患者血清中で上昇がみられる炎症性サイトカインであるTNF-α、IL-1β、IL-6を添加し、脳血管内皮細胞をTER測定試験、溶質透過性試験で検討する。また、蛍光免疫染色法によりタイトジャンクションの局在変化を観察し、さらにウェスタンブロット法やリアルタイムPCR法を用い、血管内皮障害時のタイトジャンクションとその関連蛋白について蛋白やmRNAの発現変化を検討する。端数が生じたため、次年度に繰越使用する予定とした。
時間分解スピン偏極STMによる強磁性ナノ構造におけるスピンダイナミクスの研究

走査型トンネル顕微鏡・分光法によるCoナノ構造内に形成された電子定在波の観察を行い、電子定在波を形成する波数ベクトル(または波長)を高速フーリエ変換解析により導出した。その波数ベクトルの電子エネルギー依存性からCoナノ構造の表面状態のバンド分散を明らかにした。Coナノ構造の表面状態がナノ構造への閉じ込め効果から量子化されていることを確認し、量子化された準位それぞれのエネルギー半値幅を求めた。そのエネルギー半値幅は、準位のエネルギーが大きくなるにつれて、大きくなることがわかった。この結果は、準位のエネルギーが大きいと、緩和時間が短くなることを示唆している。また、Coナノ構造をNiで囲んだ場合の実験に成功し、エネルギー半値幅やその準位エネルギー依存性が、Co単体の場合と比べてどのように変化したか、現在データ解析を行っている。エネルギー半値幅が大きく変化する場合、異種材料界面での電子散乱に関する知見が得られ、また緩和時間の制御につながることが期待される。非弾性トンネル分光(IETS)によりフェルミレベル近傍でスピン反転を伴うスピン緩和を捉えようと、Coナノ構造上でIETS測定を行った。Coナノ構造の表面状態は上記のように量子化されているため、フェルミレベル近傍の電子状態はCoナノ構造の大きさに強く依存する。そこで、さまざまな大きさのCoナノ構造を用いて実験を行った。しかし、スピン反転を示唆する結果は得られなかった。そこで、スピン反転を誘起することが期待される強磁性体材料でCoナノ構造を囲み、引き続き同様の実験を進めている。強磁性ナノ構造における量子化された表面状態の緩和時間について、実験的な知見が得られ、さらに強磁性ナノ構造を他の材料で囲んだ際の結果も得られ始めているため。(1)時間分解スピン偏極STMによるスピン緩和時間測定本研究で開発した時間分解スピン偏極STMを用いて、強磁性Coナノ構造の量子化されたスピン偏極準位のスピン緩和時間を測定する。また、強磁性Coナノ構造内におけるスピン緩和時間の場所依存性について明らかにする。(2)スピン分解バンド分散測定によるスピン緩和時間の導出スピン偏極STMによるバンド分散測定から、強磁性Coナノ構造の量子化されたスピン偏極準位のエネルギー幅を求め、スピン緩和時間を導出する。さらに、強磁性Coナノ構造を他の材料(NiまたはFe)で囲み、バンド分散測定から上記エネルギー幅の変化を明らかにし、スピン緩和時間への影響を議論する。これらの結果から、スピン緩和時間の制御について検討する。また、上記(1)との比較から、測定手法の違いによる緩和時間の違いについて検討する。(3)非弾性トンネル分光(IETS)測定によるマグノン励起の検出フェルミレベル近傍でのスピンフリップを伴うスピン緩和現象を明らかにするために、IETS測定によるマグノン励起の検出を試みる。特に、Coナノ構造をNiまたはFeなどの強磁性材料で囲んだ場合に注力する。(1)ファンクションジェネレータから出力した電圧パルスは、STMトンネルジャンクションに至るまでにその波形が変化してしまう。そこで、実際にSTMトンネルジャンクションに印加されている電圧パルスの波形を詳細に調べることが、電圧ポンプ・プローブを用いた時間分解スピン偏極STMの開発において重要となり、第一歩となる。先行研究で報告されているトンネル電流ー電圧特性からポンプ・プローブパルス電圧の相互相関を評価する手法(Science 262, 1029 (1993))を用いて、ポンプ・プローブ電圧パルスそれぞれの大きさとパルス幅の校正を行った。(2)スピン分解バンド分散測定により得られたCoナノ構造の量子化表面準位のエネルギー半値幅を求め、半値幅のエネルギー依存性を明らかにした。Coナノ構造のサイズを変化すると量子化した表面準位のエネルギーギャップ幅が変化するため、量子化準位のエネルギー半値幅とエネルギーギャップ幅との相関を調べる実験を行い、データ解析を行っている。(3)フェルミレベル近傍でスピン反転を伴うスピン緩和を捉えるため、Coナノ構造において非弾性トンネル分光測定を行った。これまでのところ、スピン反転を示す結果は得られていない。スピン反転とフェルレベル近傍の電子状態との関係を調べる必要があると考えられる。そこで、Coナノ構造のサイズを変化し、フェルミレベル近傍に量子化した表面準位がある場合に焦点をあてて測定を行うことを検討している。研究代表者の異動により、当初運用を予定してたものとは異なる低温STMを用いて、時間分解スピン偏極STMの開発を行うことになった。現在使用している低温STMには、高周波導入用の同軸ケーブルが配線されておらず、STMトンネルジャンクションに実際に印加されている電圧パルスの波形を再度評価する必要がある。その分、進捗が「やや遅れている」と評価した。

エネルギー半値幅が大きく変化する場合、異種材料界面での電子散乱に関する知見が得られ、また緩和時間の制御につながることが期待される。非弾性トンネル分光(IETS)によりフェルミレベル近傍でスピン反転を伴うスピン緩和を捉えようと、Coナノ構造上でIETS測定を行った。Coナノ構造の表面状態は上記のように量子化されているため、フェルミレベル近傍の電子状態はCoナノ構造の大きさに強く依存する。そこで、さまざまな大きさのCoナノ構造を用いて実験を行った。しかし、スピン反転を示唆する結果は得られなかった。そこで、スピン反転を誘起することが期待される強磁性体材料でCoナノ構造を囲み、引き続き同様の実験を進めている。強磁性ナノ構造における量子化された表面状態の緩和時間について、実験的な知見が得られ、さらに強磁性ナノ構造を他の材料で囲んだ際の結果も得られ始めているため。(1)時間分解測定のセットアップCoナノ構造のスピン偏極電子状態のスピン緩和時間を直接測定し、スピンの緩和過程を局所的に明らかにするため、電圧ポンプープローブを応用した時間分解スピン偏極STMの開発を引き続き行う。現在使用している超高真空・極低温・高磁場STM装置には高周波導入用のシールドが配線されていないため、STMトンネルジャンクションに実際に印加されているポンプ・プローブ電圧パルスの波形を再度評価する。先行研究で報告されているポンプ・プローブ電圧波形の相互相関をトンネル電流ー電圧特性から評価する手法を用いて行う。(2)時間分解スピン偏極STM測定上記(1)で開発する時間分解スピン偏極STMを用いて、Coナノ構造の量子化されたスピン偏極電子状態個々のスピン緩和時間を測定する。Coナノ構造内の場所依存性をメインに調べ、スピン分解バンド分散測定から推定されるスピン緩和時間との比較を行う。(3)非弾性トンネル分光(IETS)測定によるマグノン励起の検出フェルミレベル近傍でのスピン反転を伴うスピン緩和現象を明らかにするために、引き続き、IETS測定によるマグノン励起の検出を試みる。スピン分解測定の応用も検討する。(1)時間分解スピン偏極STMによるスピン緩和時間測定本研究で開発した時間分解スピン偏極STMを用いて、強磁性Coナノ構造の量子化されたスピン偏極準位のスピン緩和時間を測定する。また、強磁性Coナノ構造内におけるスピン緩和時間の場所依存性について明らかにする。(2)スピン分解バンド分散測定によるスピン緩和時間の導出スピン偏極STMによるバンド分散測定から、強磁性Coナノ構造の量子化されたスピン偏極準位のエネルギー幅を求め、スピン緩和時間を導出する。さらに、強磁性Coナノ構造を他の材料(NiまたはFe)で囲み、バンド分散測定から上記エネルギー幅の変化を明らかにし、スピン緩和時間への影響を議論する。これらの結果から、スピン緩和時間の制御について検討する。また、上記(1)との比較から、測定手法の違いによる緩和時間の違いについて検討する。
リグニン変換バイオリアクター構築のための白色腐朽菌の菌糸鞘の機能解明

白色腐朽菌を、リグニン分解酵素の生産条件で培養し、リグニン分解酵素活性と菌糸鞘の分布を組織化学的に解析した。培養後2-3日目に菌糸先端部にリグニン分解酵素反応がペルオキシダーゼ活性染色として認められ、培養3-4日目には菌糸鞘内部でもペルオキシダーゼ活性染色が認められた。ペルオキシダーゼ活性染色を生じた酵素がマンガンペルオキシダーゼ酵素であることを特定し、酵素タンパク質のN末端アミノ酸配列が、マンガンペルオキシダーゼ遺伝子配列と一致することを確認した。以上の結果より、白色腐朽菌の菌糸鞘内部ではマンガンペルオキシダーゼ酵素反応が生じており、リグニン分解バイオリアクターとして機能しうることを示した。リグニンはセルロースに次ぐ莫大なバイオマス資源の一つであるが、難分解性の複雑な構造をもつ芳香族高分子であるため、効率的に利用することが難しい。白色腐朽菌は、リグニンを常温常圧で、効率的に分解資化する能力を持ち、そのメカニズムを解明することで、リグニンの有効な利用法を開発できる。白色腐朽菌の菌体構造は、菌糸と菌糸外にある菌糸鞘と呼ばれるゲル状物質との混成体である。菌糸鞘は、以前から菌体外酵素の保持輸送の場としての重要性が指摘されてきたが、具体的な機能については明らかになっていなかった。本課題では、リグニン分解の反応場の可能性がある菌糸鞘のリグニン分解バイオリアクターとしての機能解明を行った。第一に、酵素活性染色法を利用した組織観察によって、菌糸鞘内部でリグニン分解酵素の反応が生じることを明らかにした。白色腐朽菌Phanerochaete crassaWD1694菌株を、リグニン分解条件と非リグニン分解条件下で液体しんとう培養し、リグニン分解酵素活性と菌糸鞘の分布を組織化学的に解析した。リグニン分解条件下では、培養後2ー3日目に菌糸先端部にペルオキシダーゼ活性染色としてリグニン分解酵素の反応が認められ、培養3-4日目には菌糸鞘内部でもペルオキシダーゼ活性染色が認められた。第二に、菌糸鞘内部で作用するリグニン分解酵素がマンガンペルオキシダーゼ酵素であることを特定した。また、Phanerochaete crassa WD1694菌株のマンガンペルオキシダーゼ遺伝子配列を決定し、その構造を分析した。菌糸鞘内部で反応を生じたマンガンペルオキシダーゼ酵素タンパク質のN末端アミノ酸配列は、マンガンペルオキシダーゼ遺伝子の配列の一つと一致した。以上の結果より、菌糸鞘内部でマンガンペルオキシダーゼを主体としたリグニン分解酵素の反応が生じることを明らかにした。菌糸鞘は、以前から菌体外酵素の保持濃縮の場としての重要性が指摘されてきたが、具体的な機能については明らかになっていなかった。本研究は、白色腐朽菌のリグニン分解において、菌糸鞘の持つ機能を解明することを目的とする。平成24年度は、菌糸鞘の生成とリグニン分解反応の相関について検討した。リグニン分解条件として、パルプ培地を設定し、白色腐朽菌P. crassa WD1694株の菌糸鞘の生成と分布の状態を位相差顕微鏡とフロキシンB染色による菌糸鞘染色法の併用によって分析した。その結果、菌糸鞘は、培養24時間後から培養2日目まで顕著に認められたが、培養3日目以降は、染色強度の低下とともに菌糸鞘の減少が認められた。対照実験として、非リグニン分解条件を設定し、同様に菌糸鞘の生成状態を観察した。非リグニン分解条件下では、リグニン分解条件下より菌体の生育量が多かったが、菌糸鞘の生成から減少に至る分布状態の変化にはリグニン分解条件との相違は認められなかった。次に、菌糸鞘の生成とリグニン分解ペルオキシダーゼ反応との相関を調べた。フロキシンBによる菌糸鞘の染色とペルオキシダーゼ活性染色の二重染色結果より、菌糸と菌糸鞘でパルプを凝集した菌糸塊内部で菌糸先端から菌糸に沿ったペルオキシダーゼ活性染色の生成が認められた。これらの結果より、菌糸鞘の生成はリグニン分解条件に限定されないこと、しかし、菌糸鞘の生成時期とリグニン分解酵素反応の時期が一致したことから、菌糸鞘には分泌されたリグニン分解酵素やその反応を保持する機能のあることが示唆された。本課題では、白色腐朽菌の菌糸鞘のリグニン分解における機能を解明することを目的としている。菌糸鞘は構造上定義される物質であるため、組織化学的な研究段階と、リグニン分解反応系を構成する酵素や酵素基質の特定を行う生化学的な研究段階から研究計画を構成している。平成24年度は、組織化学的な実験手法によって、菌糸鞘の生成保持減少に至る過程を追跡することに成功した。

菌糸鞘は無色透明の粘性物質であるため観察手法を確立し、培養条件を比較検討することで目標を達成した。次に、菌糸鞘の観察方法とリグニン分解酵素反応の活性染色を併用することで、リグニン分解酵素反応が菌糸鞘の生成時期に生じることを確認した。これらの結果より、平成24年度の目標である組織化学的な菌糸鞘の生成条件の確立と、リグニン分解酵素反応と菌糸鞘の関連性の確認を達成した。研究の全体計画では平成25年度はリグニン分解反応系に関与する酵素類の特定を予定している。平成24年度の研究成果より、菌糸鞘の機能としてリグニン分解酵素の輸送、保持機能と、基質になるパルプの凝集機能が推定された。菌糸鞘のこれらの機能について分析を進める。平成24年度の研究成果より、菌糸鞘の生成条件および菌糸鞘の生成保持減少過程が明らかになったため、可能であれば、菌糸鞘の構造解析を行う。繰越金125,000円を、リグニン分解酵素および菌糸鞘の分析試薬に使用する予定である。