hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
結合領域モデルによるサブミクロン膜界面のクリープき裂成長予測

電子デバイスはサブミクロン・ナノメートル厚の多層膜からできており、異材界面が多数存在している。異材では変形のミスマッチによって界面端に応力が集中し、き裂発生場所となりやすいことが知られている。き裂伝ぱに対しては従来の破壊力学概念が有効であったが、微小な材料のき裂発生についてはその適用性を検討する必要がある。とくに、Cohesive Zone Model(CZM)は有力な方法である。一方、負荷後の応力再分布に大きな特徴のあるクリープ条件においては研究例自体が少なく、基本的な知見に欠けている。また、はんだのように低融点を有する金属材料や高分子材料は室温でもクリープ変形するため、界面端におけるき裂発生も時間に依存すると考えられる。この場合には、Cohesive Zone Modelの拡張概念が考えられるが、それについて検討した例はない。本研究は、クリープを含む複雑な負荷条件における微小材料界面端き裂発生・伝ぱ挙動へのCohesive Zone Modelの適用性の検討を目的としてしている。昨年度は、応力場の異なるCu/TiN微小材料における単純負荷による界面端き裂発生の実験結果を参考に、Cohesive Zone Modelの有効性と異なる界面端形状におけるき裂発生への適用性を解明した。本年度は、室温でクリープ変形を生じるSnに着目し、Sn/Si微小材料の界面端クリープき裂発生についてCohesive Zone Modelに基づく解析を行い、その有効性を解明した。さらに、き裂発生について他の破壊力学に基づくクライテリオンと比較した結果、Cohesive Zone Modelが最も一般性を有することが明らかにした。この成果は、既に国際誌(Materials and Design)に投稿済みである。き裂伝ぱに対しては従来の破壊力学概念が有効であったが、微小な材料のき裂発生についはその適用性について検討する必要がある。とくに、cohesive zone modelは有力な方法である。一方、はんだのように低融点の金属材料や高分子材料は室温でもクリープするため、界面端におけるき裂発生も時間に依存すると考えられる。この場合には、cohesive zone modelの拡張概念が考えられるが、それについて検討した例はない。本研究は、クリープを含む複雑な負荷条件における微小材料界面端き裂発生・伝ぱ挙動へのcohesive zone modelの適用性の検討を目的としている。本年度は、まず応力場の異なるCu/TiN微小材料における単純負荷による界面端き裂発生の実験結果を参考に、cohesive zone modelに基づく解析を行い、その概念の有効性と異なる界面端形状におけるき裂発生への適用性を解明した。さらに、Snが室温でクリープすることに着目し、Sn/Si微小材料の界面端クリープき裂発生についてcohesive zone modelの適用性の検討を進あている。とくに、cohesive zone modelの考え方は概念的に損傷力学と類似性があるため、両者を融合した解析手法の開発に力を入れている。
脱水と体温上昇の相違が陸上競技のパフォーマンスと各種パワー発揮能力に及ぼす影響

夏季運動中の体温上昇に伴う発汗による脱水の進行は,運動パフォーマンスに影響を与える.本研究では,低い脱水率であっても持久的運動だけでなく,無酸素パワー運動のパフォーマンスにおいても影響を及ぼすと考え,暑熱環境下における運動時の脱水の程度がハイパー・ミドルパワー発揮能力に及ぼす影響を陸上競技の瞬発系・持久系種目を対象に検討した.すなわち,環境制御室における75分間の運動中(トレッドミル,バイク)の飲水量を調整し(50ml,300ml),2種類の脱水状態(脱水率:1%以下,2%)を異なる日に設定し,その直後に,2種類のパフォーマンステストを(無酸素パワーテストおよびウインゲートテスト)を続けて実施し,種目間の比較をした.運動終了後の直腸温及び心拍数は,瞬発系・持久系種目とも通常条件に比べ脱水条件の方が有意に高かく,心拍数において有意な種目間差が見られた.ハイパワー・ミドルパワーの2種類のパフォーマンステストでは,種目間による差はなかった.以上の結果,ハイパワー・ミドルパワーの発揮能力に及ぼす脱水の影響には,陸上競技の種目間差は見られないことが示唆された.さらに,本年度は2016年度に実施した夏季フィールド実験と同様の内容について,春季におけるフィールド実験も実施した.飲水量を調整し2種類の脱水状況を設定したが,脱水率が1%以下になってしまったことからパフォーマンステストでは顕著な有意差は見られなかった.本研究では夏季陸上競技練習時の脱水の程度がミドルパワー・ハイパワー発揮能力に及ぼす影響を検討するため,実際のグラウンドにおける練習中の飲水量を調整し,2種類の脱水状態(0.8%と2.0%脱水)を異なる日に設定した後に,グラウンドにおけるパフォーマンステストとして1周25 mの方向転換走を10周させた時の通過タイムについて比較検討した.練習後のグラウンドにおけるパフォーマンステストでは,ハイパワーの指標である25 mの方向転換走の1周目のタイムは,脱水条件と通常条件の間には有意な差はみられなかった.しかし,ミドルパワーの指標である25 mの方向転換走の10周目のタイムの比較では,脱水条件の方が通常条件よりも有意に遅かった.以上の結果,夏季陸上練習時において脱水がパフォーマンスに影響し,その影響の程度は発揮能力ごとに異なることが示唆された.すなわち,0.8%程度の脱水と比較し,2.0%程度の脱水はハイパワーに影響しなかったものの,ミドルパワーは低下することが示唆された.平成28年度はほぼ研究計画通り,夏季陸上競技練習時の2種類の脱水の程度がミドルパワー・ハイパワー発揮能力に及ぼす影響について検討でき,2%程度の脱水であってもミドルパワーへ影響することが示唆された.計画当初では,脱水の程度を3種類、パフォーマンステストにローパワーを入れて3種類と計画していたが,実際のフィールドテストにおける暑熱環境下では,厳しい条件であったため条件を減らした.本研究では暑熱環境下における運動時の脱水の程度がハイパワー・ミドルパワー発揮能力に及ぼす影響を検討するため,環境制御室における運動(トレッドミル,バイク)中の飲水量を調整し,2種類の脱水状態(脱水率:1%以下,2%)を異なる日に設定し,その直後に,2種類のパフォーマンステスト(無酸素パワーテストおよびウィンゲートテスト)を続けて実施し比較した.通常条件に比し脱水条件の方が,運動終了時の直腸温および心拍数が高く,無酸素パワーおよび平均パワーは低値を示した.以上の結果,2.0%程度の脱水は,0.9%程度の脱水と比し,ハイパワーおよびミドルパワー発揮能力を低下させることが示唆された.平成29年度は,平成28年度に実施した脱水の程度とパワー発揮能力におけるフィールド実験をもとに,環境制御室において実施した.2%程度の脱水であってもパワー発揮に影響することが示唆された.計画では,3種類のパフォーマンステスト(ハイパワー,ミドルパワー,ローパワー)について検討する予定であったが,ローパワーテストは被験者に負担がかかるためため,条件を減らした.夏季運動中の体温上昇に伴う発汗による脱水の進行は,運動パフォーマンスに影響を与える.本研究では,低い脱水率であっても持久的運動だけでなく,無酸素パワー運動のパフォーマンスにおいても影響を及ぼすと考え,暑熱環境下における運動時の脱水の程度がハイパー・ミドルパワー発揮能力に及ぼす影響を陸上競技の瞬発系・持久系種目を対象に検討した.すなわち,環境制御室における75分間の運動中(トレッドミル,バイク)の飲水量を調整し(50ml,300ml),2種類の脱水状態(脱水率:1%以下,2%)を異なる日に設定し,その直後に,2種類のパフォーマンステストを(無酸素パワーテストおよびウインゲートテスト)を続けて実施し,種目間の比較をした.運動終了後の直腸温及び心拍数は,瞬発系・持久系種目とも通常条件に比べ脱水条件の方が有意に高かく,心拍数において有意な種目間差が見られた.ハイパワー・ミドルパワーの2種類のパフォーマンステストでは,種目間による差はなかった.以上の結果,ハイパワー・ミドルパワーの発揮能力に及ぼす脱水の影響には,陸上競技の種目間差は見られないことが示唆された.さらに,本年度は2016年度に実施した夏季フィールド実験と同様の内容について,春季におけるフィールド実験も実施した.飲水量を調整し2種類の脱水状況を設定したが,脱水率が1%以下になってしまったことからパフォーマンステストでは顕著な有意差は見られなかった.暑熱環境下における脱水の程度がパワー発揮能力に及ぼす影響について実験室にて検討する。

陸上競技部学生を被験者とし,32°C環境下で15分間トレッドミル走を510分間の休息時間を挟み4回実施する.実験中,心拍数・直腸温を連続記録し,体重減少量を15分間の運動終了ごとに測定する.各被験者は暑熱下運動を異なる日に2回実施し,2回目と4回目の15分間運動終了時にミドルパワーまたはハイパワー発揮テストを実施する.ミドルパワーテストとして30秒間の全力ペダリング運動時の仕事量,ハイパワーテストとして7秒間の全力ペダリング運動時の仕事量をそれぞれ測定する.なお,ローパワーテストとしては,15分間トレッドミル走時の心拍数と速度との関係からPWC170を算出して検討する.平成30年度は,陸上競技部の短距離種目と中・長距離種目を専門にしている学生を被験者とし,29年度の実験とほぼ同様の内容で脱水状態を設定し,各種パワーにおけるパフォーマンステスを実施し,トレーニング種目差の影響について検討する.計画当初では,脱水の程度を3種類、パフォーマンステストにローパワーを入れて3種類と計画していたが,実際のフィールドテストにおける暑熱環境下では,被験者の安全確保を考慮すると厳しい条件であったため実施条件を減らし計測を簡略化した.そのため,物品の購入をせずに他の実験用に購入していた物品を使用した.また、それに伴って学会発表における旅費を使用できなかった.計画では,脱水の程度のよる条件を3種類,パフォーマンステストを3種類としていたが,被験者の負担や安全性を考え2種類ずつで実施した.そのため,直腸温センサーなどの消耗品や,被験者への謝礼金を使用できなかった.この後も,被験者の安全性を考慮し,実験の日程等を踏まえて実験を継続する予定であり,消耗品や謝礼金に使用する予定である.物品を新たに購入し、学会発表時の旅費として使用する.
発光-フラグメントイオンコインシデンス測定で見る超励起分子の解離ダイナミクス

本研究では種々の分子を電子衝撃により励起し、生じた発光とフラグメントイオンの相関を観測することによって発光を伴う解離性イオン化過程のダイナミクスについて理解を深めていくことを目的としている。本年度は科学研究費交付の最終年度である。研究課題遂行に必要な装置の開発は昨年度中に終了しており、本年度は、種々の試料(エチレン、メタン、アセチレン、四弗化メタン、三弗化メタン、亜酸化窒素、二酸化炭素)について測定を行った。その結果、多くの試料において、高励起親イオンが発光した後に解離を起こす過程を考えなければ説明できないスペクトルを観測した。このような発光はこれまでまったく報告されておらず、本研究によって初めて観測されたものである。これらの結果については、順次学会誌等への公表を進めている。本研究をさらに発展させるため、液体試料についても測定が行えるよう装置を改良した。そして、水分子について測定を行った。その結果、発光性イオンである、H_2O^+,OH^+イオンを観測した。光学フィルターを用い発光波長を限定して測定したところ、励起水素原子とOH^+イオンの相関はなく、観測されたOH^+イオンはすべてOH^+イオン自身からの発光と相関していることが明らかとなった。昨年度開発したモンテカルロシミュレーションプログラムを用いてOH^+バンドの線形をシミュレートし、並進エネルギー分布を求めることができた。以上のように、本研究によって高励起イオンの解離過程についてこれまでまったく知られていなかった過程を観測することに成功した。本研究費によって装置開発に必要な物品をほとんど揃えることができ、電子衝撃による発光-フラグメントイオンコインシデンス測定装置を世界で初めて完成させることができた。本装置ではイオンの引き込み電場が弱いために、コインシデンスバンドの線型解析からイオンの並進エネルギーを見積もることが容易であるという特色を持つ。一方、大きな並進エネルギーを持つイオンを取りこぼす割合が大きいが、この欠点はイオンの並進エネルギーと装置の幾何学的大きさを考慮したモンテカルロ計算によって補うことができ、既にプログラムの開発も終了している。この装置を用いてエチレン分子について測定し、CH(A-X)発光がH^+イオンやCH_2^+イオン、CH^+イオン、C^+イオンと相関していることを実証した。さらに、バンドの線型を解析することによって各イオンの平均並進エネルギーを見積もり、これらの情報に基づいてエチレンの発光を伴う解離性イオン化について議論した。この結果の一部は現在投稿中である。エチレン以外にもメタン、アセチレン、四弗化メタン、亜酸化窒素について測定しており、今回開発した装置が種々の分子に適用できることを確認すると同時に、これらの分子の発光を伴うイオン化過程についても次々と新しい実験事実を得ている。本研究は予定通り順調に進行している。
エンドセリン受容体の遺伝子発現調節機構に関する研究

エンドセリンファミリーは3種類のリガンド(ET-1,ET-2,ET-3)と2種類の受容体(ET-A,ET-B)かなる生体内調節系で、血管収縮の他、細胞増殖作用等多彩な生物作用を惹起する。これらの生作用はリガンドのみならず受容体の発現が調節されていると考えられるが、今回我々は、ヒトE A受容体遺伝子の転写調節、およびalternative splicingによる転写産物の差に関して検討を加えた1)5′隣接領域の転写調節に関する検討また、ヒトET-A遺伝子の5′隣接領域をリポーター遺伝子に結合しルシフェラーゼアッセイて検討すると、上記のコンセンサス以外のET-A受容体遺伝子の正の転写領域ETA-P1を同定したこのフュージョン遺伝子を血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、COS7細胞にトランスフェクシンしても、この領域は同様に正の転写調節を担っており、この領域はET-A遺伝子の基本的な転調節を行っていると考えられた。さらにこの領域が細胞内で実際に働いていることをさらに確するために、上述したETA-P1に相同的な配列を4個直列に連結したDNA断片をDecoyとして滑筋細胞にトランスフェクションすると内因性のET-A受容体mRNAは経時的に減少コントロルの30%となり、このETA-P1領域が細胞内で正に転写調節していることが確認された。ET-A遺伝子には8個のエクソンからなっているが、RT-PCR法とRNAaseプロテクションアッイにて、エクソン3がsplice outされているcDNAとエクソン3と4の両方がsplice outされていcDNAの少なくとも3種類のcDNAが存在すること、それらが各種の組織に分布していることを認した。
肥満と炎症のクロストークに対するマクロファージ分化制御機構:生活習慣病への応用

脂肪細胞においてエネルギー代謝に関与しているアドレナリン受容体(β2AR)はマクロファージにおいて炎症反応を抑制しているが、Toll様受容体刺激はβ2ARの発現を抑制し炎症反応を増強することが示された。高脂肪食肥満に対して、運動トレーニングには炎症性マクロファージの誘導抑制作用が認められた。そのメカニズムとして、マクロファージに発現している摂食調節分子・グレリンの関与が示唆された。脂肪細胞においてエネルギー代謝に関与しているアドレナリン受容体(β_2AR)は、マクロファージにも発現が認められる。そこで、β_2ARと炎症反応を誘導するToll様受容体とのクロストークを検討した。RAW264をLPS刺激し,β_2ARのmRNAとタンパク質レベルを解析した。いずれも著しい低下が認められ,これはLPS刺激による誘導型NO合成酵素(NOS II)の発現誘導と逆相関していた。LPS刺激によるβ_2ARの発現抑制機構の存在と,β_2ARのNO産生調節への関与が示唆された。そこで、β_2AR強発現細胞株(RAWar)を樹立し,LPS応答におけるβ_2AR発現抑制の役割を検索した。RAWar細胞にはNF-κBの活性化抑制とNOS II発現量の著しい低下が認められた。β_2ARの発現抑制はβ-arrestin2の発現抑制を伴っていた。一方、β-arrestin2は、細胞質のIκBαを安定化し分解を阻害することによってNF-κBの活性化を抑制していることが示唆された。TLR4の下流には少なくとも2つの情報伝達系(MyD88依存性とTRIF依存性)の存在が知られている。そこで、それぞれのsiRNAによりその発現をノックダウンしたRAW264細胞をLPS刺激し、β_2AR発現量変化を解析した結果、β_2AR発現抑制がTRIF依存性情報伝達系により制御されていることが明らかとなった。以上の結果から、1)β_2ARはIκBαの安定化と分解阻害を行っているβ-arrestin2の発現調節を行うことによってNF-κBの活性化を調節していること、2)TRIF依存性のβ_2ARとβ-arrestin2の発現抑制は、NF-κBの活性化を促進することで、生体防御能の増強に関与していることが示唆された。肥満に伴うマクロファージ(Mφ)の機能変化と炎症反応への関与を解析するため、C57BL/6Jマウスを普通食または高脂肪食で6週間飼育した。また、肥満による炎症反応への運動の効果を検討するため、高脂肪食マウスを2群にに分け、一方に自走回転ケージによる運動トレーニングを実施した。高脂肪食群のマウスは普通食群のマウスに比べて3週目から体重の有意な増加が認められた。一方、高脂肪食運動トレーニング群では6週目に普通食群と比べて有意な体重の増加が認められたが、高脂肪食非運動群に比べて有意に低かった。高脂肪食群の脂肪組織では、MφのマーカーであるF4/80の遺伝子発現は普通食群の2倍になり、運動トレーニング群では普通食群と有意差は認められなかった。さらに、炎症性サイトカインや誘導型一酸化窒素合成酵素(iNos)の発現も高脂肪食群で増大するが、運動トレーニングにより普通食群と同レベルまで抑制された。腹腔Mφを用いて、LPS刺激に対する応答を検討した結果、高脂肪食群では、炎症性サイトカインやiNosなどの発現が普通食群と比べ増強されたが、高脂肪食運動トレーニング群ではそれが有意に抑制された。即ち、高脂肪食により脂肪組織のみでなく全身性に炎症性Mφが誘導されるが、運動トレーニングはそれを抑制することが示された。以上から、脂肪組織と全身性の炎症反応が2型糖尿病におけるインシュリン抵抗性の引き金となると考えられているが、運動トレーニングには抗炎症作用があり、そのメカニズムとして、運動トレーニングによる炎症性Mφの抑制効果が示唆された。炎症反応は感染防御に働く重要な生体防御反応である一方で、炎症性サイトカインや活性酸素種の産生により様々な組織機能を損傷する。従って、炎症反応には厳密なコントロールが必要であり、これまでに様々な制御機構の存在が示されて来た。ごく最近、胃から分泌される摂食促進ホルモンとして発見されたグレリンが、免疫系細胞にも発現していて炎症反応の制御に関与していることが示唆された。そこで本研究では、マクロファージの炎症反応制御機構におけるグレリンの役割を解析した。肥満に起因する様々な病態の根底にある慢性炎症反応には、マクロファージが重要な役割を担っている。そこで、C57BL/6Jマウスを普通食または高脂肪食で6週間飼育した。また、肥満による炎症反応への運動の効果を検討するため、高脂肪食マウスを2群に分け、一方に自走回転ケージによる運動トレーニングを実施した。マウスの体重は、普通食群に比べて高脂肪食群で有意な増加が認められ、高脂肪食運動トレーニングは高脂肪食群より有意に低値を示した。肥満マウス腹腔マクロファージではグレリン発現量が低下し、運動トレーニングにより回復した。一方、炎症性サイトカインTNFα産生能は肥満マウス腹腔

マクロファージで上昇し、運動トレーニングにより低下した。腹腔マクロファージまたはマクロファージ細胞株RAW264細胞の培養系にグレリンを添加すると、LPS刺激によるTNFα産生能は抑制された。さらに、RNAi法によりRAW264細胞のグレリン発現量を低下させると、TNFα産生能は増強された。以上から、1)高脂肪食肥満はマクロファージのグレリン発現量を低下させ炎症反応を増強し、2)運動トレーニングにはそれを抑制する作用があることが示唆された。従って、肥満に伴うインシュリン抵抗性に対する運動トレーニングの改善効果には、マクロファージのグレリンの関与が示唆された。
Identification of new therapeutic targets to sensitize chemoresistant tumor microenvironment to chemotherapy

抗がん剤耐性となったヒト肺がん細胞がIL-34を産生することを発見。IL34はがん組織内に免疫抑制型マクロファージを増加させるとともに、がん細胞自身にも働き、がん細胞の抗がん剤耐性を強めていることを発見。IL34を高発現するヒト肺がん患者では低発現である場合に比べ生命予後が不良であることを発見。IL34阻害により抗がん剤耐性となったがんに対しても奏功する治療として期待できる。腫瘍免疫学分野当初予定していた研究計画に遅れが生じ、予定していた消耗品等を購入しなかったため。遅れが生じていた分について早めに遂行して当初予定していた研究計画を完了させる。
Pathway 解析による微重力環境下筋萎縮メカニズムの解明と原因療法の開発

ゼブラフィッシュを用いた長期宇宙滞在実験により、微重力環境下での筋萎縮に関して解析を進めてきた。しかし、長期宇宙滞在実験によって確認された発現変動遺伝子が、微重力依存的であるのか、宇宙放射線等の他の要因も関与するのかが不明であった。そこで、長期宇宙滞在実験を模擬した低線量γ線照射実験を実施したところ、宇宙滞在によって発現変動する遺伝子には、放射線によって発現変動するものが含まれていた。より詳細な解析のために、ISS内で1G環境を設定し、これを対照群として短期宇宙滞在実験を実施した。これらの全ての結果を統合的に解析することによって、微重力環境感受性の遺伝子を同定することが可能になると考えられる。「宇宙滞在ゼブラフィッシュの行動生理学的および組織化学的解析」「宇宙滞在ゼブラフィッシュの筋組織トランスクリプトーム/Pathway解析」「宇宙滞在/運動抑制/加齢による変動遺伝子群の比較」「腱細胞・筋細胞それぞれの特異的発現遺伝子の同定」を中心に実施した。特に「宇宙滞在/運動抑制/加齢による変動遺伝子群の比較」により、宇宙滞在がゼブラフィッシュの骨格筋に及ぼす影響が、これまで宇宙滞在による筋萎縮として報告されている廃用性筋萎縮とは異なるものであることを示唆する結果が得られた。これらの結果から宇宙滞在がゼブラフィッシュの骨格筋に及ぼす影響が微重力環境依存的のみに依存的ではないことを示唆していると考えられ、新たに宇宙線等の影響を考慮する必要があると考えられる。そこでゼブラフィッシュへの低線量放射線の長期照射実験を行う計画を追加した。平成27年度内に計画していた「宇宙滞在ゼブラフィッシュの行動生理学的および組織化学的解析」「宇宙滞在ゼブラフィッシュの筋組織トランスクリプトーム/Pathway解析」「宇宙滞在/運動抑制/加齢による変動遺伝子群の比較」「腱細胞・筋細胞それぞれの特異的発現遺伝子の同定」を全て実施することができた。また、平成28年度以降に計画していた「運動抑制・加齢条件下におけるproMSTN過剰発現トランスジェニックゼブラフィッシュの筋組織トランスクリプトーム/Pathway解析」に関しても一部実施することができた。これまでの「宇宙滞在/運動抑制/加齢による変動遺伝子群の比較」により、宇宙滞在がゼブラフィッシュの骨格筋に及ぼす影響はこれまで宇宙滞在による筋萎縮として報告されている廃用性筋萎縮とは異なる部分があることを示す結果が得られた。これらの結果は宇宙滞在がゼブラフィッシュの骨格筋に及ぼす影響は微重力環境のみに依存的ではないことを示唆していると考え、新たに宇宙線の影響を模擬したゼブラフィッシュへの低線量放射線(γ線、0.3mGy/day)の長期照射実験を実施した。宇宙滞在と同様のスケジュールで筋組織をサンプリングしNGSによるトランスクリプトーム解析を実施した。その結果、宇宙滞在と運動抑制では明らかに異なる変動を示していた遺伝子群において低線量放射線の長期照射においては宇宙滞在と同様の変動が認められるものがあることが確認された。また、「宇宙滞在ゼブラフィッシュの筋組織トランスクリプトーム/Pathway解析から新たに原因療法の候補遺伝子として同定された遺伝子の機能解析」としてゲノム編集技術を用いた新規候補因子のノックイン(蛍光タンパク質)ゼブラフィッシュの作製を実施した。しかし標的遺伝子のノックインを得ることができなかったためノックアウトと過剰発現トランスジェニックゼブラフィッシュ作製に計画を変更した。その結果、標的とする遺伝子のノックアウトゼブラフィッシュと過剰発現トランスジェニックゼブラフィッシュを作製することができた。長期的な実験となる低線量放射線の長期照射実験によるトランスクリプトーム解析を実施することができた。ゲノム編集技術を用いた新規候補因子のノックイン(蛍光タンパク質)ゼブラフィッシュの作製に関してはノックインを作製することはできなかったが、ノックアウトと過剰発現トランスジェニックゼブラフィッシュを作製することにより対応した。これまでゼブラフィッシュ長期宇宙滞在実験(Zebrafish Muscle)から得られた骨格筋トランスクリプトーム解析の結果を基に、微重力環境依存的な筋萎縮メカニズムに関して解析を進めてきた。しかし、長期宇宙滞在実験によって発現変動が確認された遺伝子が、微重力環境依存的であるのか、宇宙放射線等の他の要因も関与するのかが不明であった。そこで、長期宇宙滞在実験を模擬した低線量γ線照射実験を実施したところ、宇宙滞在によって発現変動する遺伝子の中には、放射線のみにも依存して発現変動する遺伝子も多数含まれていることを示唆する結果が得られた。そこで、より微重力環境特異的な筋萎縮メカニズムの解析を進めるために2回目の宇宙滞在実験として、ISS内で1G環境を設定し、これを対照群としてゼブラフィッシュ短期宇宙滞在実験(Zebrafish Muscle2)を実施した。この実験により、長期宇宙滞在実験の再現実験を実施するとともに、宇宙滞在によって発現変動が確認された遺伝子の中から、微重力環境感受性の遺伝子を抽出することが可能になると考えられる。Zebrafish MuscleおよびZebrafish Muscle2と2回の宇宙滞在実験の解析結果と、これまで実施してきた、運動抑制による廃用性筋萎縮モデルの解析や低線量γ線照射実験の解析結果を統合的に解析することによって、宇宙滞在における微重力環境特異的な感受性遺伝子を同定し、その筋萎縮メカニズムの解明、筋萎縮阻害薬の開発に繋げていきたい。

より詳細な解析のために、ISS内で1G環境を設定し、これを対照群として短期宇宙滞在実験を実施した。これらの全ての結果を統合的に解析することによって、微重力環境感受性の遺伝子を同定することが可能になると考えられる。申請時の計画通り「宇宙滞在ゼブラフィッシュの筋組織トランスクリプトーム/Pathway解析から新たに原因療法の候補遺伝子として同定された遺伝子の機能解析」としてゲノム編集技術を用いた新規候補因子のノックイン(蛍光タンパク質)ゼブラフィッシュの作製を行う。また、当初の計画には含まれてはいなかったが宇宙滞在の骨格筋への影響の一つとして宇宙線が考えられることから、ゼブラフィッシュ低線量放射線の長期照射実験を行う予定である。作製したノックアウトゼブラフィッシュ、過剰発現トランスジェニックゼブラフィッシュを用いて筋萎縮への影響(トランスクリプトーム解析を含む)を調べる。筋萎縮誘導の方法は運動抑制による廃用性筋萎縮だけではなく、低線量放射線照射も実施したいと考えている。このことにより対象とする遺伝子の筋萎縮への関与を明らかにする。また、今後の予定として2回目のゼブラフィッシュ宇宙実験を予定している。この実験は軌道上ISSにおいて人工重力装置(1G)を用いたもので、重力以外の条件(宇宙線等)を全て同じにすることにより厳密に重力の影響を調べる計画である。分子生物学、発生生物学
メカニカルアロイングによる光端耐熱アルミナイド金属間化合物の開発

近年、実用的に有望な超耐熱材料として遷移金属アルミナイドが注目されている。優れた高温特性を有する遷移金属アルミナイドを実用化するにあたり加工性を補うためには、第3元素の添加による延性の改善に加えて、粉末冶金法による製造が有効であると考えられる。本研究の目的は合金設計法およびメカニカルアロイングを組み入れた粉末冶金法を駆使して、従来のニッケル基耐熱合金より優れた性能を有する超耐熱遷移金属アルミナイドを開発することであった。遷移金属アルミナイドの製造法についてこれまでの主流である溶解法でなく、メカニカルアロイングをベ-スとした粉末冶金法を適用した。これにより超塑性変形の適用の可能性が生じた。代表的なニッケルアルミナイドであるNi_3Al,NiAl,NiAlNb,Ni_3Nb,Ni_2AlNbについて、合金化学的な立場からデ-タの蓄積を行った。粉末冶金法によるニッケル系アルミナイドの製造については、Ni_3Al金属間化合物をY_2O_3あるいはAl_2O_3粒子で強化するという従来に無い新しい発想に基づく酸化物分散強化型Ni_3Al金属間化合物の開発研究、あるいはB2型化合物であるNiAlの微細組織化による形状記憶特性の改善に関する研究、(NiA1+Ni_3A1)2相合金の超塑性の発現に関する研究を通してメカニカルアロイング法、ホットプレス(あるいはHIP)による焼結法などの技術を確立した。本研究の目的は合金設計法およびメカニカルアロイング(MA)を組み入れた粉末冶金法を駆使して、優れた性能を有する超耐熱遷移金属アルミナイドを開発することである。この目的を遂行するため、平成2年度は以下に成果の概要を示す計4項目の達成を目指して研究を進めた。1項『基礎的デ-タの蓄積』:将来の耐熱材料として有望視され、且つ従来多くの研究報告がなされたNi_3 Al、NiAlを中心にベ-スとなるデ-タを収集し、整理・解析を行なった。その結果、単相状態で用いるとする従来の考え方と異なり、むしろ2相状態とした方が常温のみならず耐クリ-プ性など高温での機械的性質において更に優れた材料が得られる可能性があることを指摘した。2項『合金設計法の確立』:これまで各単相のアルミナイドに対し構築されてきた合金設計思想を複合化することで、多相系に適用できる合金設計の確立を図った。1項で得られた第3元素に関するデ-タ(固溶限、格子定数、固溶強化など)を用いこの合金設計思想に照したところ、NiーNb系2相アルミナイドが先端的耐熱アルミナイドとして1つの有力な候補になることが見出された。3項『MAを組み合わせた粉末冶金による製造』:種々あるNiーNb系2相アルミナイドのうち、(Ni_3Al+Ni_3Nb),(NiAl+NiAlNb),(NiAl+Ni_3Al)に着目し、MAーHP(HIP)法による製造を試みた。また、比較材としてNiAl、Ni_3Alについても同様に作成を行なった。4項『多元系遷移金属アルミナイド焼結体の特性評価』:3項で製造した各アルミナイドは平均結晶粒径5μm以下の微細組織となること、通常の溶解材に比べて常温での強度が著しく増大すること、NiAlを除いて高温では超塑性的な巨大変形が容易となることなどが明らかとなった。以上のことは、本研究の目的にそった成果が得られつつあることを示している。本年度は、MA法を適用した粉末冶金法によりNi-Nb系アルミナイドを製造し、その焼結体についての組織および機械的性質について調査を行った。以下研究結果を示す。1.3.6ks(10h)までのMA処理では、X線回折試験によれば、処理粉末にはタンクおよびボ-ルからの汚染は観察されなかった。しかしながらNiAl合金粉末を出発原料とした各合金粉末には検出されなかったが、粗粉末混合法で行った(e)NiAlには微量のアルミナが検出された。

3.圧縮試験によって求められた歪速度感受性指数m値は全ての合金において0.3以上の値が得られた。特に(c)Ni_3Al+Ni_3Nbと(d)NiAl+Ni_3Alにおいて0.4以上の高い値が得られ、超塑性変形の可能性が十分考えられる。4.圧縮試験後の組織観察から動的再結晶が期待される(c)Ni_3Al+Ni_3Nb,(d)NiAl+Ni_3Alおよび(e)NiAlの粒径は、圧縮試験後それぞれ小さくなっており動的再結晶による微細化が確認された。5.圧縮試験においてm値がの高い値を示した(c)Ni_3Al+Ni_3Nbおよび(d)NiAl+Ni_3Alについて、高温引張試験を行った結果、(c)Ni_3Al+Ni_3NbのHIP処理材の伸びが、1223Kにおいて、86%と比較的大きな伸びを示した。このことは、延性改善にMA処理が有効であるとともにHIP処理が有効に作用したといえる。
急性白血病でみられる染色体転座部位に座位する癌関連遺伝子の研究

t(1;19)-ALLで報告されているE2A-PBX1キメラmRNAを40例のALLで検討し、10例でみいだした。このt(1;19)-ALLでp53遺伝子の変異を検討したところ、初診時20例中2例、再発時4例中4例、また5細胞株中4株に変異がみられた。p53の変異は再発や進展と関連すると結論した。TAL1遺伝子の検討では99例の造血器腫瘍のうち10例にTAL1の異常を認め、これらの患者は同じ表面マーカーを有し、正常核型で予後良好であり、T-ALLの一亜型と思われた。TLS/FUS-ERGキメラmRNAを19例のt(16;21)-AMLでみいだし、これらの内18例は死亡した。t(16;21)-AMLは予後不良で、初回寛解期に幹細胞移植を行うべきと思われた。近年、11q23領域より単離されたMLL遺伝子を小児白血病で解析を行った。乳児白血病ではMLL再構成のある症例はない症例より予後不良であった(p=0.001)。MLLの新しい転座相手としてAF-5α(5q12),CBP(16p13),p300(22q13)を同定、単離し、現在これらの遺伝の詳細な解析を続けている。t(1;19)-ALL25例において、E2A遺伝子を用いたサザン解析による再構成の検討と、切断点をはさんだオリゴマーを作成したRT-PCR法による解析を行ない、t(1;19)-ALLはE2A遺伝子の再構成の有無により2型に分けられ、再構成のある例はpre-B形質を示し予後不良であるのに対し、再構成のない例はearly pre-B形質を示し、染色体数が50以上で予後良好であることをみいだした。19p13に転座を有するt(11;19)、t(3;19)、der(19)t(19;?)、t(17;19)についてもE2A遺伝子の解析を行ったが、t(17;19)のみ再構成がみられることが判明し、現在詳細な解析を行っている。またT-ALLと悪性リンパ腫で1p32より単離されたTAL1遺伝子の再構成の検討を行い、T-ALL40中10例でTAL1遺伝子の欠失をみいだしたが、悪性リンパ腫25例の検討では欠失はみられなかった。欠失はいずれもTAL1遺伝子の上流90kdの領域であり、欠失領域をはさんだオリゴマーを作成してPCR法により微量残存白血病細胞(MRD)の検討が可能であり、化学療法と骨髄移植後の2例で白血病細胞の動態の追跡が可能であった。悪性リンパ腫で欠失はみられなかったことより、ALLと悪性リンパ腫の発癌機序が異なることが示唆され、今後更に詳細に検討する予定である。欠失のみられた10例の臨床像の解析では、欠失例は未熟なT細胞形質を示し、縦隔腫瘍等の腫留形成が少なく、染色体正常例が多く、欠失のない症例との比較では統計的に有意に予後良好であり(p<0.05)、T-ALLの亜型であることが示唆された。またこの欠失は成人のT-ALLと悪性リンパ腫40例では欠失がみられず、小児ALLにのみみられる(約25%)ことが判明した。さらにt(1;7)T-ALLの細胞株を用い、T細胞受容体の再構成を利用して1p13の癌関連遺伝子を単離するため、現在pulsed/field gel electrophoresisを行い、サザンの再構成バンドを切り出しプラズミドに組み込み、t(1;7)T-ALLの細胞株から作成したDNAライブラリーから陽性クローンをつり出しているところである。

11q23転座より単離されたMLL遺伝子の検討では、小児急性白血病42例中30例(71%),細胞株8株中1株(13%)に再構成を認め、うち乳児急性白血病では、27例中20例(74%)に再構成を認め、染色体分析結果より高頻度であった。また、主に検討した4種類の制限酵素ではBmHIでの検出率が最も高く,検討した再構成(+)例の27/30(90%)で再構成バンドを認めEcoRI,Xbal,BgIIIでの検出率はそれぞれ21/26(81%),21/27(78%),21/25(84%)であった。t(4;11)7例,t(9;11)6例,t(11;19)4例では全例に、染色体未分析の12例中5例に、11q23異常(一)の15例中1例に再構成が認められた。これまで報告の少ないt(1;11),t(5;11),t(8;11),t(11;15)での再構成が確認された。Etoposideによると思われる二次性白血病5例の検討では,11q23転座が認められた4例でMLL遺伝子の再構成を認めた。RT-PCRを行なったt(4;11),t(9;11),t(11;19)の8例でキメラcDNAの増幅を認め,t(11;19)とt(9;11)の各2例で経時的に微小残存腫瘍の有無を検討できた。t(8;11)とt(4;6)を有する白血病細胞よりRNAを抽出し,cDNAを作成し,cDNAライブラリーよりMLL遺伝子でハイブリダイズしてとった相手遺伝子は6q27の遺伝子であり,t(4;6;11;8)の4Way転座と考えられ、現在4q21,8q24の遺伝子をクローニング中である。我々は、11q23を含む複数の染色体に異常を持つ乳児急性単球性白血病細胞を用いてMLL遺伝子の転座相手遺伝子のクローニングを行った。末梢血白血病細胞よりcDNAライブラリーを作成し、切断点を含むMLLcDNAの0.9kb BamHI断片をプローブとしてスクリーニングを行った。その結果得られた2個のキメラクローンは、一方は5'側にエクソン6までのMLLcDNAと3'側にt(6;11)転座の6番の遺伝子として単離されたAF6が、もう一方は5'側に100bpの未知の塩基配列(AF-T)と、3'側にエクソン7より下流のMLLcDNAが融合していた。AF-Tはメッセージの大きさが約2kbで少なくとも269のアモノ酸をコードしていると考えられる。現在までにクローニングされている8つのMLL遺伝子の転座相手遺伝子とは今のところ共通点は見い出せず、また特別なモチーフも見つかっていない。Northern blotによる解析では、myeloid系、lymphoid系の白血病細胞株でひろく発現がみられ、またヒトの胎児組織でひろく発現していた。特に胎児期の造血の中心である肝組織での発現が強く、この遺伝子が乳児の白血病細胞からクローニングされたものであることと合わせ、血球系の未分化な段階で働く遺伝子である可能性が示唆される。現在さらにAF-Tの機能の解析を進めると共に、少なくとも3つの染色体が同時に転座を起こしていると考えられるこの細胞の持つ複雑な染色体転座について、FISH,genomeのクローニングなどを行い詳細な解析を進めている。
妊娠高血圧症候群に胎内で曝露した児の小児期血圧値の検討

胎内で妊娠高血圧症候群(Hypertensive disorders of pregnancy: HDP)に曝露した児(HDP児)の出生後の血圧を、幼児期・学童期と継時的に調査している。前年度までの研究で学童期(9歳)にはHDP児は正常血圧妊娠女性より出生した児(コントロール:C児)よりも拡張期血圧が有意に高いことが明らかとなった。本年度は出生後5年後健診を継続し、胎内で母体高血圧に曝露した児の幼児期血圧について、C児746名と比較検討した。今年度までにHDP既往女性87名が産後5年後健診を受診し、児は81名が5歳時健診を受診した。HDPのうちわけは妊娠高血圧腎症(PE)41名(児35名)、妊娠高血圧症(GH)46名(児46名)であった。出生時情報(以下PE/ GH/ C)は在胎週数35.5±3.8/ 37.9±2.2/ 39.2±1.6週、出生体重2069.1±842.7/ 2630.5±599.2/ 2985.9±403.3 gとPE、GHともに有意に在胎週数が短く出生体重が小さかった。5歳時の収縮期血圧(PE/GH/C)は100.3±13.1/ 100.9±9.8/ 102.4±10.8 mmHg、拡張期血圧は59.3±11.3/ 60.6±10.1/ 61.5±9.8 mmHgであり、各群に明らかな差は認められなかったが、5歳時に高血圧(収縮期血圧120 mmHg以上または拡張期血圧70 mmHg以上)を認めた児はHDP児が19名(23.5 %)[PE児で7名(20.0 %)、GH児で12名(26.1 %)]C児で154名(20.6%)でありHDP児、とくにGH児で高血圧症の割合が明らかに高かった。BMIは14.8±1.4/ 15.1±0.9/ 15.0±1.2、腹囲49.6±4.1/ 50.7±2.7/ 49.7±3.1 cmであり、GH児で腹囲が大きかった。産後5年後の母児健診を行っているが、母親は受診するものの児は未受診の場合があり、児の健診が当初の予定よりやや遅れている。その理由として、平日での健診を行っているために幼稚園や保育園を休んで受診することになること、妊娠高血圧症候群女性より出生した児が早産・低出生体重児であることが多いため、医学的に問題があり受診が困難であること等が予想される。5年後健診受診者は研究代表者が実際に分娩前後で診察を担当した女性であるため、健診案内を出した女性の受診率は比較的よい。そのため、健診可能な曜日を増やすなどの工夫を行い、受診者数増加を目指す方針である。近年になり、胎内環境が将来の生活習慣病の素因を形成するという説(DOHaD説)が提唱されている。妊娠高血圧症候群(Pregnancy induced hypertension: PIH)は、妊娠中期以降母体に高血圧を呈し、蛋白尿の有無によって妊娠高血圧腎症(Preeclampsia: PE)や妊娠高血圧(Gestational hypertension: GH)にわけられる。最近、欧米からのシステマティック・レビューでPIHを発症した女性から生まれた児、つまり胎内で母体の高血圧状態に曝露された児の血圧予後が明らかとなっている。しかし本邦においてPIH女性から産まれた児の小児期の血圧予後については報告がなく、本研究ではPIHの胎内環境が、生まれた児の血圧にどのように影響するかを幼児期・学童期と継時的に明らかにすること、また関連するリスク因子を選定することが目的である。以前より当院で行っているPIH母児の出産5年後母児健診を継続して行い、PE母児29組・GH母児43組を解析し、正常血圧妊娠であったコントロール746組と比較検討した。PE児の血圧(収縮期/拡張期)(mmHg)は101.0±14.3/59.2±10.8、GH児は100.6±9.7/61.5±9.8、コントロール児は102.4±10.8/61.5±9.8と有意差を認めなかった。背景因子として、出生児体重(g)(PE/GH/コントロール)は2135.6±829.8/2599.0±604.2/2985.9±403.4、在胎週数(週)は36.0±3.7/37.8±2.3/39.2±1.6とPE・GH児でコントロールと比較して有意に修正体重が軽く、在胎週数が短かった。健診時BMIと体脂肪率は有意差を認めなかったがHbA1cはPE・GH児で有意に高かった。出産5年後・5歳児母児健診は順調に進んでいるが、9年後・9歳児健診のデータ整理が予定通り進まず解析に至らなかった。来年度は5年後健診を継続しながら9年後・9歳児健診データの整理を中心に行う予定である。本年度はおもに産後9年母児健診の結果解析をおこなった。9年後健診には668名の母親、707名の児が参加した。

合併症妊娠(高血圧3名、糖尿病1名、腎疾患1名、膠原病4名)の母児を対象から除外した。698名の児のうち測定拒否3名、血圧測定拒否4名、採血不備13名(うち重複1名)をのぞいた679名の児を解析した。16名の児が胎内で妊娠高血圧症候群(Hypertensive disorders of pregnancy: HDP)に曝露されており、663名のコントロールと比較検討した。【児血圧】日本高血圧学会による高血圧治療ガイドライン2014では幼児の高血圧基準は120/70 mmHg、小学校低学年は130/80 mmHgである。9歳健診で高血圧を認めた児は22名で、そのうち1名がHDP曝露児であった。9歳時の高血圧はHDP曝露群で6.3%、正常血圧群で3.2%であった。また22名のうち、5歳健診時にすでに高血圧を認めていた児は4名で、HDP曝露児も含まれていた。HDP曝露児の9歳時の血圧平均は101±9/ 66±12 mmHg、正常血圧妊娠より出生した児の血圧平均は98±10/ 60±10 mmHgで拡張期血圧がHDP曝露群で有意に高かった。【母血圧】合併症妊娠を除外した663名の母親を対象とした。そのうち血圧測定拒否3名、1回のみの血圧測定4名、採血不備2名(検体量不足1名、採血拒否1名)を除外した654名を解析した。HDP女性15名とコントロール639名を比較した。9年後健診で新たに高血圧症と診断された女性は14名、5年後健診時にすでに高血圧と診断された女性を合わせると計30名の女性が高血圧症と診断された。そのうち4名がHDP女性(妊娠高血圧腎症1名、妊娠高血圧3名)であった。HDP女性のうち26.7%、正常血圧妊娠女性のうち4.1%が産後9年後健診で高血圧症と診断された。本年度は研究代表者が育休を取得したために、当初の計画よりも5年後健診が進行しなかった。産後9年健診の解析はおおむね順調に進んでいるが、背景因子の調整などこれから解析を進める部分も残っている。胎内で妊娠高血圧症候群(Hypertensive disorders of pregnancy: HDP)に曝露した児(HDP児)の出生後の血圧を、幼児期・学童期と継時的に調査している。前年度までの研究で学童期(9歳)にはHDP児は正常血圧妊娠女性より出生した児(コントロール:C児)よりも拡張期血圧が有意に高いことが明らかとなった。本年度は出生後5年後健診を継続し、胎内で母体高血圧に曝露した児の幼児期血圧について、C児746名と比較検討した。今年度までにHDP既往女性87名が産後5年後健診を受診し、児は81名が5歳時健診を受診した。HDPのうちわけは妊娠高血圧腎症(PE)41名(児35名)、妊娠高血圧症(GH)46名(児46名)であった。出生時情報(以下PE/ GH/ C)は在胎週数35.5±3.8/ 37.9±2.2/ 39.2±1.6週、出生体重2069.1±842.7/ 2630.5±599.2/ 2985.9±403.3 gとPE、GHともに有意に在胎週数が短く出生体重が小さかった。5歳時の収縮期血圧(PE/GH/C)は100.3±13.1/ 100.9±9.8/ 102.4±10.8 mmHg、拡張期血圧は59.3±11.3/ 60.6±10.1/ 61.5±9.8 mmHgであり、各群に明らかな差は認められなかったが、5歳時に高血圧(収縮期血圧120 mmHg以上または拡張期血圧70 mmHg以上)を認めた児はHDP児が19名(23.5 %)[PE児で7名(20.0 %)、GH児で12名(26.1 %)]C児で154名(20.6%)でありHDP児、とくにGH児で高血圧症の割合が明らかに高かった。BMIは14.8±1.4/ 15.1±0.9/ 15.0±1.2、腹囲49.6±4.1/ 50.7±2.7/ 49.7±3.1 cmであり、GH児で腹囲が大きかった。産後5年後の母児健診を行っているが、母親は受診するものの児は未受診の場合があり、児の健診が当初の予定よりやや遅れている。
細胞膜伸展刺激による心筋緩徐活性型遅延整流性K+電流調節機構

心筋活動電位の再分極過程を担う心筋緩徐活性型遅延整流性K^+電流(I_<Ks>)は,低浸透圧刺激や膜の機械刺激による細胞膜の伸展により増大する.本研究は,この背景となる細胞内機序を検討し,新しいI_<Ks>チャネル調節機構ならびにその分子基盤を明らかにしようとするものである.近年,膜構成リン脂質であるホスファチジルイノシトール二リン酸(PIP_2)は種々のイオンチャネルの機能を直接修飾することが知られており,また細胞膜の伸展刺激によりその局在が変化することが知られている.そこで本研究は,PIP_2による心筋I_<Ks>チャネルの調節機構について検討を行った.モルモット単離心筋細胞に全細胞型パッチクランプ法を適用し,I_<Ks>チャネル電流をリアルタイムで記録した.パッチ電極を介してPIP_2をモルモット心筋細胞に負荷すると,I_<Ks>チャネル電流は徐々に減弱した.一方,抗PIP_2抗体を細胞内へ投与するとI_<Ks>の増強が観察されたことから,細胞膜に内在するPIP_2がI_<Ks>チャネルに抑制性に作用していることが明らかとなった.また,外因性に投与したPIP_2は低浸透圧刺激によるI_<Ks>の増大反応を部分的に抑制し,膜の機械的伸展が膜PIP_2の減少によりI_<Ks>チャネルの活性を増強する可能性が示唆された.現在,I_<Ks>チャネルはKCNQ1ならびにKCNE1の2つのサブユニットで構成されると考えられている.本研究は,PIP_2によるI_<Ks>チャネル制御機構の分子基盤を明らかにするために,KCNQ1ならびにKCNE1により再構築したK^+チャネルを用いて,PIP_2による修飾機構を検討した.結果,細胞膜PIP_2を減少させると考えられるGq-PLC連関型受容体の刺激は心筋I_<Ks>を増強するものの,KCNQ1/KCNE1チャネル電流には反対に抑制作用を示すことが明らかになった.このことは,少なくともPIP_2による調節においてKCNQ1とKCNE1だけでは心筋I_<Ks>を完全に再構築できないことが示唆する。このように,本研究は心筋I_<Ks>チャネルの新しい修飾因子としての膜PIP_2の役割が明らかにするとともに,心筋I_<Ks>チャネルの分子基盤の解明に新たな展開の必要性を提示するすることができた.心筋緩徐活性型遅延整流性K^+電流(I_<Ks>)は正常な活動電位の再分極過程に必須の外向き電流で,I_<Ks>チャネルの機能不全は致死性不整脈の発生を引き起こす心電図QT延長症候群の原因となる.心筋細胞膜の機械的伸展によりは増大する.本研究はこの機序を明らかにすることで,I_<Ks>チャネルの新しい細胞内調節機構を見出すことを目的とする.近年,膜に含まれるホスファチジルイノシトール二リン酸(PIP_2)が種々のイオンチャネルの活性を修飾することが明らかにされるとともに,細胞膜の機械刺激により膜のPIP_2含量が変化することが報告されていることから,本研究はPIP_2によるI_<Ks>の両説機構について検討した.モルモット単離心筋細胞に全細胞型パッチクランプ法を適用し,I_<Ks>チャネル電流をリアルタイムで記録した.細胞膜に内在するPIP_2合成系の重要な酵素のひとつであるPI4キナーゼの阻害剤であるウォルトマンニンを記録電極経由で細胞内へ投与すると,数分オーダーでI_<Ks>チャネル電流が増大した.一方,PIP_2を同様に投与すると,I_<Ks>チャネル活性は減少した.このように,内在性のPIP_2を減少させる薬剤や外因的に投与したPIP_2そのものがI_<Ks>チャネル活性を大きく変化させることが明らかとなった.さらにPIP_2の減少を招くと考えられる生理的インターベンションのひとつである受容体刺激によるI_<Ks>の調節に膜PIP_2の動態が関与する可能性について検討した.心筋細胞膜に存在するアドレナリン(α1)受容体やATP(P2Y)受容体はG蛋白(Gq)ならびにPIP_2分解酵素であるホスホリパーゼC(PLC)に連関している.フェニレフリンやATPを細胞外から心筋細胞に投与すると,速やかにI_<Ks>チャネル電流が増大した.しかしながら,細胞内に過剰量のPIP_2を投与した状態でこれらのアゴニストで受容体を同予に刺激するとI_<Ks>チャネル電流の増大反応が明らかに抑制されていた.これらのことから,1)PIP_2はI_<Ks>チャネル活性に抑制的に作用していること,2)Gq-PLC連関型受容体刺激によるI_<Ks>の増大反応に内在性のPIP_2の減少が関与していること,が示唆された.しかしながら,I_<Ks>チャネルの構成蛋白として同定されているKCNQ1ならびにKCNE1で培養細胞に再構築したチャネルはPIP_2に対して全く反対の反応を示すことが報告されてきている.

このことは,I_<Ks>チャネルの構成蛋白としてKCNQ1ならびにKCNE1以外の調節性サブユニットが存在する可能性を示唆するものと考えられる.心筋活動電位の再分極過程を担う心筋緩徐活性型遅延整流性K^+電流(I_<Ks>)は,低浸透圧刺激や膜の機械刺激による細胞膜の伸展により増大する.本研究は,この背景となる細胞内機序を検討し,新しいI_<Ks>チャネル調節機構ならびにその分子基盤を明らかにしようとするものである.近年,膜構成リン脂質であるホスファチジルイノシトール二リン酸(PIP_2)は種々のイオンチャネルの機能を直接修飾することが知られており,また細胞膜の伸展刺激によりその局在が変化することが知られている.そこで本研究は,PIP_2による心筋I_<Ks>チャネルの調節機構について検討を行った.モルモット単離心筋細胞に全細胞型パッチクランプ法を適用し,I_<Ks>チャネル電流をリアルタイムで記録した.パッチ電極を介してPIP_2をモルモット心筋細胞に負荷すると,I_<Ks>チャネル電流は徐々に減弱した.一方,抗PIP_2抗体を細胞内へ投与するとI_<Ks>の増強が観察されたことから,細胞膜に内在するPIP_2がI_<Ks>チャネルに抑制性に作用していることが明らかとなった.また,外因性に投与したPIP_2は低浸透圧刺激によるI_<Ks>の増大反応を部分的に抑制し,膜の機械的伸展が膜PIP_2の減少によりI_<Ks>チャネルの活性を増強する可能性が示唆された.現在,I_<Ks>チャネルはKCNQ1ならびにKCNE1の2つのサブユニットで構成されると考えられている.本研究は,PIP_2によるI_<Ks>チャネル制御機構の分子基盤を明らかにするために,KCNQ1ならびにKCNE1により再構築したK^+チャネルを用いて,PIP_2による修飾機構を検討した.結果,細胞膜PIP_2を減少させると考えられるGq-PLC連関型受容体の刺激は心筋I_<Ks>を増強するものの,KCNQ1/KCNE1チャネル電流には反対に抑制作用を示すことが明らかになった.このことは,少なくともPIP_2による調節においてKCNQ1とKCNE1だけでは心筋I_<Ks>を完全に再構築できないことが示唆する。このように,本研究は心筋I_<Ks>チャネルの新しい修飾因子としての膜PIP_2の役割が明らかにするとともに,心筋I_<Ks>チャネルの分子基盤の解明に新たな展開の必要性を提示するすることができた.