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ケンペル研究の新展開

ケンペルの著書『今日の日本』(ドイツ語新版)に基づき、ケンペル日本論の分析を行った。またとりわけ、この新版と、18世紀末以降底本と見なされて来たドーム版(旧版)『日本誌』との文献対比作業を行い、ドーム版の文献学的価値を究明した。その結果、ドーム版には編者ドームによる書き換え箇所が散見されるものの、難解なスタイルのドイツ文で書かれたケンペルの日本論を、一定の読みやすさに直して提供した功績も認められる、との結論を得た。日本論の分析は、3年の研究期間中継続して行われるが、18年度はケンペルが日本の宗教について論じた部分(第3巻)を集中的に検討し、この巻においてケンペルがどのような宗教論を展開しているか、また後世の編集者であるドームが、ケンペルの日本宗教論をどのように書き換えているかという問題について、文献対比の方法により調査を行った。その結果、ケンペルが日本の宗教に対して好意的な評価を与えていること、それに反し18世紀の編者であるドームは、日本の宗教に対するケンペルの好意的な評価を多少弱めるように書き換えた上で編集を行ったことが明らかになった。またケンペルの伝記的事実について、主にBodart-Bailey教授の研究に依拠しつつ、来日以前のケンペルがどのような関心を有していたのか、またどのような経緯で来日したのかを調査した。その結果、ケンペルは当初より日本を目指していたのではなく、むしろアジア全般に興味を有していたこと、そしてペルシャおよびインドで、はかばかしい研究成果が得られなかったことから、日本を研究の目的地に定めた事が明らかになった。18年度はさらに、ケンペルが日本の大都市をどのように見ていたのかという問題について、おもに京都と大阪(当時の表記で大坂)を中心に現地調査を行った。とくに京都に関しては、ケンペルが訪問した京都の寺社を研究代表者が訪問し、ケンペルが『今日の日本』で記載している内容の真偽確定のための写真撮影・実地調査を行った。その結果、ケンペルの記載に信憑性があり、17世紀の爾余の日本論(多くは空想に基づく日本紹介を行っている)とは異なり、彼の日本論が非常に学術的価値の高いものであることが確認された。本研究の目的は、ケンペルの旧版『日本誌』と新版『今日の日本』の文献対比作業を行うことであるが、平成19年度においては、まず江戸参府紀行(第5巻)を分析対象とした。この巻は、『日本誌』から切り離されて『ケンペル江戸参府紀行』として邦訳が刊行されている部分でもあり、ケンペルの日本論の中でも、日本においてとりわけ言及されることの多い巻である。それだけに、この巻については綿密な調査を行った結果、旧版がある程度の信頼性を有するものであることが判明した。またケンペル日本論の第1巻は、それぞれ異なる3つの部分に分かれるため、平成19年度においては、そのうち地勢論(第1巻の第15章)の部分、および日本人起源論(第67章)を検討の対象とした。また、為政者を論じた第2巻は、従来研究者の注目をさほど引かなかった部分であるが、この部分に関して新版とドーム編集の旧版との間には少なからぬ相違が見られることが判明した。また、ケンペルの日本論を「日独文化交流」の全体的枠組みに位置づけるため、平成19年度においては日独文化交流に関する貴重資料をスキャナーで読み込み、いつでも情報として取り出せるようにデータ・ベース化する作業も行った。本研究は、日本誌の新旧両版を対比研究するものである。平成20年度においては、ケンペル新版『日本誌』の第4巻を扱った。この部分は、ケンペルが長崎を中心とする日蘭貿易・日清貿易について紹介している部分である。旧版においては編集者ドームの原稿解読ミスにより「歌がうまい」となっていたが、新版による確認の結果、「格闘がうまい」となっている等のことが確認された。この巻については従来より比較的研究が進められていたため、研究代表者の研究においては重要度という点に関して最優先の課題ではなく、研究遂行を最終年度に配分した次第である。また第1巻に関しては、日本博物学の部分の検討をおこなった。本研究はケンペルが執筆した日本論を研究の対象とするものであるが、平成20年度は、平成19年度に引き続き、「ケンペルは日本の何を見なかったのか」という側面についても検討を進めた。調査の結果、ケンペルは日本の同時代(元禄時代)の文学、および芸術(歌舞伎等)についてほとんど注意を払っておらず、後の時代のツユンベリーやシーボルトと対照的であることが解明された。
変温マウスを用いた生物時計温度補償性の検証

概日リズムは温度変化に関わらず、ほぼ一定の周期を保つ“温度補償性"がある。これまで哺乳類個体の体温を変化させて概日時計の温度補償性を検証することは不可能であったが、我々の作製したNRDc欠損マウス(KO)は変温マウスであったことから、この変温マウスを用いた概日時計の温度補償性の検証を目的とした。環境温変化とKOの体温変化の相関関係を検討するため、KOを高温域(38°C)、および、低温域(10°C)で飼育したところ、短期的にはKOの体温はそれぞれ高温(約38°C)、および、低温(約35°C)になったが、長期間安定して維持することは困難であることが分かった。概日時計は哺乳類では、睡眠・覚醒、体温調節、ホルモン分泌などの基本的生理機能を約24時間周期のリズム(概日リズム)で維持するために重要な機構である。概日リズムは温度変化に関わらず、ほぼ一定の周期を保てるという“温度補償性"があり、シアノバクテリアから哺乳類培養細胞に至るまで広く認められているが、詳細なメカニズムは明らかにされていない。一方、哺乳類は恒温動物であるため、環境温を変化させても体温をほぼ一定に保てることから、実際、哺乳類個体の体温を変化させて、概日時計の温度補償性を検証することは実験的に不可能であった。我々の同定したメタロプロテアーゼnardilysin(N-arginine dibasic convertase;NRDc:NRDc)は、細胞局在に依存した多機能性(細胞外:シェディング活性化因子、核内:転写調節因子など)を有し、その欠損マウス(NRDc-/-)は、成長遅延や行動異常など多彩な表現型を呈した。さらに、NRDc-/-の驚くべき表現型の一つは低体温であり(室温で野生型マウスNRDc+/+:38.0°C、NRDc-/-:36.5°C)、寒冷環境下(4°C)では体温を維持できないという、恒温動物の最大の特徴を欠失した“変温マウス"であることが分かった。したがって、本研究では、この変温マウスを用いて、哺乳類個体における概日時計の温度補償性を検証し、そのメカニズムの解明を目的とした。生物には概日時計が備わっており、約24時間周期のリズム(概日リズム)を刻んでいる。概日リズムは温度変化に関わらず、ほぼ一定の周期を保つ“温度補償性"があり、バクテリアから哺乳類培養細胞で認められている生物時計の特徴の一つである。しかし、哺乳類は環境温が変化しても体温を一定に保てることから、哺乳類個体の体温を変化させて、概日時計の温度補償性を検証することは不可能であった。今回、我々の作製したメタロプロテアーゼNRDc欠損マウス(NRDc-/-)は、環境温の変化に伴い体温の変化する"変温マウス“であったことから、本研究は、この変温マウスを用いた、哺乳類個体における概日時計の温度補償性の検証を目的とした。NRDc-/-を用いた哺乳類個体における概日時計温度補償性の検証に向け、まず、環境温変化とNRDc-/-の体温変化の相関関係の検討を行った。1高温域の検討;NRDc-/-は室温で既に低体温(野生型マウス(NRDc+/+):38.0°C、NRDc-/-:36.5°C)であることから、NRDc-/-がNRDc+/+と同じ体温を維持できる環境温の検討を行った。環境温38°Cで飼育したところ、体温も38°C前後になったが、38°Cでの飼育は一週間が限度であり、概日リズムの測定は不可能であった。2低温域の検討;NRDc-/-は寒冷環境下(4°C)では体温を維持することができない変温マウスであった。しかし、4°Cという厳しい寒冷環境では、体温が下がり続けてしまうため、NRDc-/-が低体温(3435°C)を長期に維持できる環境温の検討を行った。環境温を1012°Cにした場合、1224時間後に体温が35°C前後になる結果を得ているが、それ以上維持すると体温が急激に低下することが分かった。以上の結果から、NRDc-/-の体温を高温および低温域で長期間安定して維持することは極めて困難であることが示唆された。細胞生物学、分子生物学NRDc-/-を用いた哺乳類個体における概日時計温度補償性の検証に向け、本年度は、環境温変化とNRDc-/-の体温変化の相関関係の検討を行った。

具体的には、1NRDc+/+と同じ体温(38°C)になる環境温、2高い体温(3940°C)になる環境温、3低い体温(3435°C)になる環境温、の3条件を検討し、NRDc-/-の体温が長期間(少なくとも1ヶ月)安定する環境温の設定を試みた。高温側の条件検討はほぼ完了しているが、低温側で体温が長期間安定する環境温はいまだ設定できていないため、さらなる条件検討が必要である。今後は、低温側の条件設定が出来次第、各温度条件下で、NRDc-/-の概日リズム周期を測定し、温度補償性を検討する。同時に、各温度条件下での、NRDc-/-の体重、食餌摂取量、運動量、酸素消費量など、各温度における基本生理の違いも合わせて検討する。
土壌等の重金属汚染の原因究明と地球化学的視野からの対策

国内有数の米産地である秋田県の早産の米の一部のカドミウム汚染問題が報じられ,日本人の主食である米の重金属類汚染は深刻である.汚染米が発生した土地の土壌の入れ替え,カドミウム吸収剤の検討,また改善の対策の指針となるための地質学的研究であり,重金属汚染と汚染原因との関係究明が主たる目的である.その研究の結果以下のことを導いた.1.単純な作物と土壌の分析のはか,農業水の水田に入り込む上流域と,河川への流出域の農業水,土壌中の重金属類の含有量変化の追跡を仙台市愛子地区を中心に行った.流入域と流出域の水・土壌の成分を分析,おもに流入域で活発に作物に遷移金属を中心とした微量成分が吸収されることが明確になった.2.土壌の供給源としての後背地域の重金属類等の含有量の高いと予想される鉱床地域の相内や花岡地域の土壌には多くの銅,亜鉛などの卑金属に富むことが明らかになった.さらに基礎的データの集積を続ける必要がある.3.稲の生育と合わせて,各稲の部位(根,茎下部,茎上部,笹の葉の各部,籾,米本体)などにわけて,微量成分の分析をおこなった.植物の発生や分化に関連していると推定され,玄米にはほとんどの有害微量元素(ヒ素,鉛,セレンなど)は含まれず,根や葉に濃集していることが判明した.4.重金属汚染の実情と汚染原因究明によって得られた知見を総括しH16年公表する.国内でも有数の米産地である秋田県の県産の米の一部のカドミウム汚染問題が報じられ,日本人の主食である米の重金属類汚染は深刻である.汚染米が発生した土地の土壌の入れ替え,カドミウム吸収剤,栽培方法変更の改善され対策の指針となるための地質学的研究である.秋田県は黒鉱鉱床などで知られる鉱産県でもあった.土壌汚染地域はごく限られているのであるが,汚染米の風評被害を防ぎ,汚染の現状把握と,その原因究明を進めるには,地質学的,地球化学的,変質作用と関連しての鉱床学的取り組みと検討が本研究の目的である.平成14年度の取り組み1.米一粒一粒に指定有害物質のカドミウム,銅及び砒素の他の重金属類の量をいかに迅速かつ正確に分析するかの方法を開発する.2.鉱床地域下流域での河川堆積物,田畑の土壌の分析とその重金属分布図の作成.3.イネのどの部分にどの様に濃集するか,生物化学的濃縮作用の検討.平成14年度の成果(1)米一粒をアルゴンガスを満たした試料室に置き,直接分析する方法を開発した.レーザー・アブレーションICP-MSで極く微量成分の分析が可能であることが判明した.現在のところ約5秒でレーザービームが貫通するため10元素ほどの同時分析にとどまっている.(2)秋田県北部の太良鉱山およびその下流域で河川堆積物,土壌のサンプル採集を行った.現在,その分析を継続中である.これまでの結果ではカドミウム汚染などの重金属の濃集は見られていない.(3)イネの重金属濃縮作用の検討は,適切な協力が得られず,落ち穂などによるサンプルのみで,統計的なデータをまとめるには到っていない.平成15年度の最重点課題以下の重金属汚染の実情把握と汚染原因究明がある.(a)農業水の後背地としての河川水中の重金属類の含有量変化の追跡.(b)鉱床変質地域の広がりと汚染土壌地域との関連性,汚染元素の拡散に関する検討.国内有数の米産地である秋田県の早産の米の一部のカドミウム汚染問題が報じられ,日本人の主食である米の重金属類汚染は深刻である.汚染米が発生した土地の土壌の入れ替え,カドミウム吸収剤の検討,また改善の対策の指針となるための地質学的研究であり,重金属汚染と汚染原因との関係究明が主たる目的である.その研究の結果以下のことを導いた.1.単純な作物と土壌の分析のはか,農業水の水田に入り込む上流域と,河川への流出域の農業水,土壌中の重金属類の含有量変化の追跡を仙台市愛子地区を中心に行った.流入域と流出域の水・土壌の成分を分析,おもに流入域で活発に作物に遷移金属を中心とした微量成分が吸収されることが明確になった.2.土壌の供給源としての後背地域の重金属類等の含有量の高いと予想される鉱床地域の相内や花岡地域の土壌には多くの銅,亜鉛などの卑金属に富むことが明らかになった.さらに基礎的データの集積を続ける必要がある.3.稲の生育と合わせて,各稲の部位(根,茎下部,茎上部,笹の葉の各部,籾,米本体)などにわけて,微量成分の分析をおこなった.植物の発生や分化に関連していると推定され,玄米にはほとんどの有害微量元素(ヒ素,鉛,セレンなど)は含まれず,根や葉に濃集していることが判明した.4.重金属汚染の実情と汚染原因究明によって得られた知見を総括しH16年公表する.
糖転移酵素POMGnT1の骨格筋、中枢神経系の発達と維持における役割の解析

糖転移酵素POMGnT1の変異マウスの解析により以下の研究成果が得られた。1.POMGnT1欠損による大脳皮質の層構造異常の分子メカニズムを解析する目的で、我々のラボで作出したPOMGnT1欠損マウスの大脳の層構造とニューロンの移動を調べた。更にPOMGnT1を発現するプラスミドベクターをE12あるいはE15のPOMGnT1変異マウス胎児の脳室内に投与し、エレクトロポレーション法でventricular zoneへ導入し、その後の細胞移動を調べる実験を行なった。POMGnT1が導入されたニューロンの移動は、改善しなかった。変異マウスの中枢ではglia limitansの異常が認められ、また、リーリンの発現が変異マウスにおいて広汎にup-regulationされている事から、ニューロンの移動障害はニューロン自身のPOMGnT1の活性低下によるのではなく、ニューロン移動の足場となる放射性グリアの異常による可能性が高い。2.POMGnT1変異マウスの骨格筋は筋変性・壊死、再生像が乏しく、この点はヒトmuscle-eye-brain病とは表現型が違っていた。特異的抗体とセルソーターで分離した筋衛星細胞のin vitroでの増殖能は低下していた。POMGnT1を発現するレトロウイルスベクターを野生型及びPOMGnT1変異マウスの筋衛星細胞に感染させ、増殖能が回復するか検討したところ、筋衛星細胞のα-ジストログリカンの糖鎖修飾は回復したが、増殖能は全く回復しなかった。インテグリンの発現、Aktのリン酸化には野生型とPOMGnT1変異マウスの筋衛星細胞の間に差異は無いことから、α-ジストログリカンの糖鎖修飾は直接細胞増殖には関係しておらず、むしろin vivoでの筋衛星細胞の維持に関係していると考えられた。POMGnT1の変異マウスの解析により以下の研究成果が得られた。1)POMGnT1変異マウスの中枢神経系の解析POMGnT1変異マウスの大脳皮質では著明な神経細胞の層構造の異常が認められた。BrdU法で、E12-15の神経細胞をラベルし、その移動を調べた結果、層構造の異常はリーラーマウスと類似した分子機序で起きていることが示唆された(論文準備中)。現在その分子機序を、リーリン分子との相互作用を中心に解析中である。2)POMGnT1変異マウスの骨格筋の解析POMGnT1が欠損したマウス骨格筋では、alpha-dystroglycan(α-DG)の糖鎖修飾に異常が認められ、ラミニン結合能が低下していた。しかし筋形質膜にはジストロフィン及びその結合タンパク質の発現が野生型マウスと同様に認められた。電顕では筋線維周囲に正常な基底膜の形成が認められた。HE染色ではほとんど筋変性壊死の所見はなかったが、血清CK値はわずかながら上昇していた。Evans Blueの筋線維への取り込みは軽度に認められたが,mdxで見られるEB陽性線維のクラスター像はみとめられず、POMGnT1が欠損したことによる筋膜の不安定化は軽度であると思われた。3)POMGnT1変異マウスの筋衛星細胞の増殖能と分化能の解析POMGnT1及び野生型マウスから筋衛星細胞をFACSで調整し、その増殖能をin vitroで解析した。ラミニンを主成分とするマトリゲルをコートした培養皿上で、野生型筋衛星細胞は良好な増殖能を示したが,変異マウスでは増殖能が低下していた。分化誘導した後の多核の筋管の形成能には差異は見いだされなかった。

ラミニンとα-DGの結合が筋衛星細胞の増殖に重要であることが示唆された。糖転移酵素POMGnT1の変異マウスの解析により以下の研究成果が得られた。1.POMGnT1の大脳皮質の層構造異常のメカニズムを解析する日的で、POMGnT1を発現するプラスミドベクターをE12あるいはE15のPOMGnT1変異マウス胎児の脳室内に投与し、エレクトロポレーション法でventricular zoneへ導入し、その後の細胞を調べるレスキュー実験を行なった。しかしPOMGnT1が導入されたニューロンの移動は、改善されなかった。変異マウスのglia limitansの異常が認められ、また、リーリンの発現は変異マウスにおいて広汎にup-regulationされている事から、ニューロンの移動障害はニューロン自身のPOMGnT1の活性低下によるのではなく、ニューロン移動の足場となる放射性グリアの構築の異常による可能性が高い。2.POMGnT1変異マウスの骨格筋から特異的抗体とセルソーターで分離した筋衛星細胞のin vitroでの増殖能は低下していた。そこでPOMGnT1を発現するレトロウイルスベクターを野生型及びPOMGnT1変異マウスの筋衛星細胞に感染させ、増殖能が回復するかを検討した。POMGnT1変異マウスの筋衛星細胞のα-ジストログリカンの糖鎖修飾は回復していたが、増殖能は低下したままであった。インテグリンの発現レベル、Aktのリン酸化状態には野生型及ぴPOMGnT1変異マウスの筋衛星細胞の間に差異はなかった。α-ジストログリカンの糖鎖修飾は直接細胞増殖には関係しておらず、in vivoでの筋衛星細胞の維持に関係していると考えられた。
ＳＬＥの自己抗体産生における脾臓Ｍａｒｇｉｎａｌ　ｚｏｎｅーＢ細胞の役割

本研究は、SLEモデルであるMRL/lprマウスの自己抗体産生、腎炎病態形成における脾臓Marginal zone-B(MZ-B)細胞の役割を明らかにすることを目的としている。平成30年度は、戻し交配によるMb1-Cre Notch2-floxMRL/lprマウスの作成を完了し、B細胞特異的なNotch2欠損による生理学的影響について調べた。さらに、抗dsDNA抗体産生ならびにループス様腎炎病態に対するMZ-B細胞欠損の影響を調べた。10週齢において脾臓各種細胞のフローサイトメトリー解析を行った結果、目的とするMb1(+/cre)且つNotch2(flox/flox)個体では、MZ-B前駆体細胞ならびにMZ-B細胞の欠損が認められた。同マウスにおける濾胞B細胞、B-1細胞、CD4陽性/CD8陽性T細胞、顆粒球、単球集団の細胞数は野生型と同等であり、本マウスがSLEに対するMZ-B細胞の機能の解析に有用であると考えられた。10週齢から24週齢まで2週毎に採血を行い、血清中の抗dsDNA抗体価を調べた。野生型・MZ-B細胞欠損型MRL/lprマウス間で、抗dsDNA IgG抗体価に差は認められなかったが、IgMクラスならびにIgG3クラスについては、MZ-B細胞欠損マウスで有意に低値であった。また、同マウスの24週齢における腎を採取して病理染色を行った結果、対象とする野生型マウス(n=4)で2個体に著明な糸球体病変が認められたのに対し、MZ-B細胞欠損マウス(n=2)では病変を認めなかった。以上の結果より、SLEモデルMRL/lprマウスにおいて、MZ-B細胞はIgG3・IgMクラスの自己抗体産生を促進し、本マウスにおけるループス様腎炎の病態形成に関与することが示唆された。本研究の主題材であるMb1-cre Notch2-floxMRL/lprマウスについて、戻し交配による作製を完了し、目的とするMZ-B細胞の欠損を確認した。さらに、少数であるが、同マウスにおける抗dsDNA抗体価・腎の病理組織学的解析を実施した。平成29年度より、当機関動物飼育施設での大幅な飼育制限が必要とされたため、繁殖に制限が必要であったことから目的個体を十分数得ることができず、本研究の進行はやや遅れている。平成31年度も引き続きMZ-B細胞欠損MRL/lprマウスの解析を実施していく予定である。平成31年度以降は、MZ-B細胞欠損MRL/lprマウスの解析を完了させると共に、同マウスへの野生型MRL/lprマウスMZ-B細胞の移入実験による再構築実験を実施する。また、メカニズム解明のための研究として、IFNGR1-KO MRL/lprマウスのMZ-B細胞を用いた上記移入実験を実施する。メカニズム解明の研究として後にTLR7-KO、TLR9-KO MRL/lprマウスが必要とされるため、平成31年度にこれらのマウス作成のための戻し交配を実施する。平成30年度の成果と合わせて、これらの成果を学会にて発表する。

平成29年度より、当機関動物飼育施設での大幅な飼育制限が必要とされたため、繁殖に制限が必要であったことから目的個体を十分数得ることができず、本研究の進行はやや遅れている。平成31年度も引き続きMZ-B細胞欠損MRL/lprマウスの解析を実施していく予定である。平成31年度以降は、MZ-B細胞欠損MRL/lprマウスの解析を完了させると共に、同マウスへの野生型MRL/lprマウスMZ-B細胞の移入実験による再構築実験を実施する。また、メカニズム解明のための研究として、IFNGR1-KO MRL/lprマウスのMZ-B細胞を用いた上記移入実験を実施する。メカニズム解明の研究として後にTLR7-KO、TLR9-KO MRL/lprマウスが必要とされるため、平成31年度にこれらのマウス作成のための戻し交配を実施する。平成30年度の成果と合わせて、これらの成果を学会にて発表する。
農地改革の実施過程における地主と耕作農民の動向

茨城・埼玉・大阪3府県の農地改革ならびに地主制に関する史料調査とその蒐集に努めると同時に、茨城県下の実証分析を進めた。この実証研究の主要テーマは、(1)個別地域における地主制の実態の解明、(2)茨城県の特質である畑作地帯の地主制の動向と農地改革との関連、の2点である。(1)では、鉾田地域を対象に隣接する数か村にみられる地主制展開の度合い(小作地率を基準とする)が相当に異なることを明らかにし(明治末の段階で、小作地率が32%の村から83%の村までが存在し、その格差の大きいことが確認できた)、県や郡レベルの平均小作地率からは読みとれない地域独自の構造を検出した。また、総和地域では旧香取村を取り上げ、同村における戦前の農業構造と地主制の動向(小作地率・土地所有規模・経営規模等々)を検討し、510町歩規模の土地を所有する地主と、15町歩規模の土地を所有する自作地主の存在が明らかとなり、同村が典型的な中小地主地区であることを検証した。(2)では、茨城県農業の地域的類型(稲作・畑作地帯別)を設定し、そこにおける畑作地帯(猿島・鹿島郡)の地主制の推移の特質と、農地改革の結果との関連を追求し、同時に、茨城県地主制の特質(中小地主の分厚い存在)が、農地改革後の残存小作地率の高さ(茨城県平均14.3%、全国平均9.9%)となって表れたことを検出した。また、(3)茨城県における農地の実施過程にみられた地主と耕作農民の動向を、農民組合運動と農地委員会システムに求めて分析し、農地委員会システムの定着が組合運動の衰退をもたらしたことを立証した。最後に、(4)戦後の農地改革を明治維新期の地租改正と対比し、その土地改革における共通点(旧体制)からの連続面)と異質点(地租改正=強固な土地所有権の創出、農地改革=土地所有権の一部否定と強固な耕作権の確立)とを明らかにすることで、農地改革の歴史的意義を確認した。平成7年度は、主に史料調査を中心として研究を進めた。調査地域を茨城・埼玉・大阪に設定し、茨城県の総和町役場・鉾田町役場、埼玉県の与野市公民館、大阪の大阪市史編纂所・大阪経済大学図書館の所蔵史料・文献を調査した。このうち、与野市公民館には、与野市農業委員会所蔵の農地改革関係史料が大量に残されていることが判明し、また、総和町・鉾田町の両役場にも農地改革関係史料の所在が明らかとなった。大阪市史編纂所には現在のところ当該関係史料を見出せないが、大阪経済大学には近畿地方の市町村・旧村レベルの「農地改革誌」が残されている。以上の史料の莵集と同時に、鉾田町における農地改革の前提となる地主制の展開過程を分析対象として、研究論文「鉾田町地主制史小論」を発表した。茨城・埼玉・大阪3府県の農地改革ならびに地主制に関する史料調査とその蒐集に努めると同時に、茨城県鉾田地域および総和地域の実証分析を進めた。この実証研究の主要テーマは、個別地域における地主制の実態を解明することである。

鉾田地域では、隣接する数か村にみられる地主制展開の度合い(小作地率を基準とする)が相当に異なることを明らかにし(明治末の段階で、小作地率が32%の村から83%の村までが存在し、その格差の大きいことが確認できた)、県や郡の平均小作地率からは読みとれない地域独自の構造を検出した。また、総和地域では旧香取村を取り上げ、同村における戦前の農業構造と地主制の動向(小作地率・土地所有規模・経営規模等々)を検討し、510町歩規模の土地を所有する地主と、15町歩規模の土地を所有する自作地主の存在が明らかとなり、同村が典型的な中小地主地区であることを検証した。今後は、上記の成果を受け継ぎつつ、地主制の解体を目指した農地改革が、それぞれの地域における地主制の展開度に対応しつつ、いかなる方法で進められていったかを検討したい。具体的には、農地改革の実施体制の組織化とその運営、そこにおける農民各層と地主層の動きを取り上げ、それが農地委員会や農民組合の動向にどのような影響をおよぼしたのかについての分析を行いたい。また、先の3府県に関する史料蒐集も、同時に進めて行く予定である。茨城・埼玉・大阪3府県の農地改革ならびに地主制に関する史料調査とその蒐集に努めると同時に、茨城県下の実証分析を進めた。この実証研究の主要テーマは、(1)個別地域における地主制の実態の解明、(2)茨城県の特質である畑作地帯の地主制の動向と農地改革との関連、の2点である。(1)では、鉾田地域を対象に隣接する数か村にみられる地主制展開の度合い(小作地率を基準とする)が相当に異なることを明らかにし(明治末の段階で、小作地率が32%の村から83%の村までが存在し、その格差の大きいことが確認できた)、県や郡レベルの平均小作地率からは読みとれない地域独自の構造を検出した。(2)では、茨城県農業の地域的類型(稲作・畑作地帯別)を設定し、そこにおける畑作地帯(猿島・鹿島郡)の地主制の推移の特質と、農地改革の結果との関連を追求し、同時に、茨城県地主制の特質(中小地主の分厚い存在)が、農地改革後の残存小作地率の高さ(茨城県平均14.3%、全国平均9.9%)となって表れたことを検出した。また、(3)戦後の農地改革を明治維新期の地祖改正と対比し、その土地改革における共通点(旧体制からの連続面)と異質点(地租改正=強固な土地所有権の創出、農地改革=土地所有権の一部否定と強固な耕作県の確立)とを明らかにすることで、農地改革の歴史的意義を確認した。
抗原提示、末梢トレランス修飾DR4Tgマウスモデルを用いたAIHの免疫病態解析

本研究はヒトHLAトランズジェニックマウスに免疫学的修飾を加えヒト自己免疫性肝炎(AIH)類似モデルを作製、AIHの発症、進展に関与する免疫病態の解析を目的とした。ヒトAIHの疾患感受性遺伝子HLA-DR4(DRB1^*0401)トランスジェニックマウス(DR4Tg)に対し1.肝細胞との融合により抗原提示機能を強化した融合樹状細胞移入、2.末梢性トレランス制御性CD25陽性細胞除去、という人為的免疫制御を加えAIHモデルの作製を試み、CD25KOマウスにDRB1^*0401遺伝子を導入したCD25KO/DR4Tgマウスの作製、その系への肝細胞融合樹状細胞の移入によるAIHモデル作製も試みた。初年度は免疫学的修飾の基礎的研究として、肝細胞と樹状細胞の融合細胞を抗原提示細胞として移入した際にAIH様の肝内病変が生ずるか検討し、1.C57/B1マウスに分離肝細胞と同系骨髄由来樹状細胞の融合細胞を皮下投与すると軽度のALT上昇、軽度の単核球浸潤を伴う肝障害が認められ、2.同系マウスを用い高分化型肝癌細胞Hepal-6と同系骨髄由来樹状細胞の融合細胞を皮下投与すると1.で施行した系よりもALTの上昇が著明で肝障害の程度も増強し、3.融合細胞投与後にIL-12を追加投与するとALT上昇、肝障害の程度はさらに増悪し、4.本モデルの脾臓リンパ球の正常マウスへの投与により肝障害が惹起出来ることを明らかにした。第2年度はDR4Tgに対し肝細胞融合樹状細胞の移入、CD25陽性細胞の除去を施行し、HLA-DR4Tgマウスへの融合樹状細胞移入前後にマウス抗CD25モノクローナル抗体を投与すると肝障害の増悪傾向を認め、特にCD25陽性細胞除去を融合樹状細胞移入前に施行した場合は後に施行した場合に比し肝障害増悪の程度が著しいことを示した。またIFN-γ、IL-12、IL-18、IL-4、IL-10、TGF-β特異的プライマーを用いたin situ PCR法により浸潤リンパ球のサイトカイン産生を検討したところ、IFN-γ、IL-12産生が増強していることが明らかになった。第3年はCD25KOマウスにDRB1^*0401遺伝子を導入したCD25KO/DR4Tgマウスを作製、その系への肝細胞融合樹状細胞の移入によるAIHモデル作製を試みたが、目的とするトランスジェニックマウスの作製が出来なかった。そのため初年度に作製した樹状細胞と高分化型肝癌細胞との融合細胞移入によるAIHモデルの肝細胞障害機序について解析を加え、融合細胞投与により自己肝細胞を認識しin vitroで肝細胞障害を示す自己反応性CD8陽性CTLが誘導されるが、肝炎発症にはIL-12の投与によるCTLの肝内浸潤誘導が必要なことが示された。IL-12投与により肝内の類洞内皮細胞上のICAM-1発現上昇、肝内mip-1遺伝子発現量の上昇が認ぬられることから、ヒトAIHにおいても自己反応性T細胞の活性化、IL-12等のサイトカインによる活性化T細胞の肝内浸潤誘導、という2段階機序が必要であることが示された。またIFN-γ、IL-12、IL-18、IL-4、IL-10、TGF-β

特異的プライマーを用いたin situ PCR法により浸潤リンパ球のサイトカイン産生を検討したところ、IFN-γ、IL-12産生が増強していることが明らかになった。第3年はCD25KOマウスにDRB1^*0401遺伝子を導入したCD25KO/DR4Tgマウスを作製、その系への肝細胞融合樹状細胞の移入によるAIHモデル作製を試みたが、目的とするトランスジェニックマウスの作製が出来なかった。そのため初年度に作製した樹状細胞と高分化型肝癌細胞との融合細胞移入によるAIHモデルの肝細胞障害機序について解析を加え、融合細胞投与により自己肝細胞を認識しin vitroで肝細胞障害を示す自己反応性CD8陽性CTLが誘導されるが、肝炎発症にはIL-12の投与によるCTLの肝内浸潤誘導が必要なことが示された。IL-12投与により肝内の類洞内皮細胞上のICAM-1発現上昇、肝内mip-1遺伝子発現量の上昇が認ぬられることから、ヒトAIHにおいても自己反応性T細胞の活性化、IL-12等のサイトカインによる活性化T細胞の肝内浸潤誘導、という2段階機序が必要であることが示された。本研究の目的は、ヒトHLAトランスジェニックマウスに免疫学的修飾を加え、ヒト自己免疫性肝炎(AIH)により類似したモデルを作製し、AIHの発症、進展に関与する免疫動態を解析することである。本年度は免疫学的修飾の基礎的検討として、肝細胞と樹状細胞の融合細胞を抗原提示細胞として移入した際に、AIH様の肝内病変が生ずるか検討し、以下の結果を得た。1.C57/Blマウスに、分離肝細胞と同系骨髄由来樹状細胞の融合細胞を皮下投与すると、軽度のALT上昇、軽度の単核球浸潤を伴う肝障害が認められた。2.同系マウスを用い、高分化型肝癌細胞Hepa1-6と同系骨髄由来樹状細胞の融合細胞を皮下投与すると、1.で施行した系よりもALTの上昇が著明で、肝障害の程度も増強していた。さらに、融合細胞投与後にIL-12を追加投与すると、ALT上昇、肝障害の程度はさらに増悪した。3.本モデルの肝内浸潤細胞は、CD4陽性T細胞、CD8陽性T細胞が主であった。4.本モデルの脾臓リンパ球は、融合に用いたHepa1-6に対する細胞障害性を有していた。5.本モデルの脾臓リンパ球を、正常マウスに投与することにより、肝障害を惹起することが出来た。以上より、免疫学的機序により肝細胞障害が惹起される新たな実験的マウス自己免疫性肝炎モデルを樹立することができた。今後、この系を用いて更なる解析を加えていく予定である。本研究の目的は、ヒトHLAトランスジェニックマウスに免疫学的修飾を加え、ヒト自己免疫性肝炎(AIH)により類似したマウスAIHモデルを作製し免疫病態解析を行うことである。そのために、ヒトAIHの疾患感受性遺伝子HLA-DR4(DRB1^*0401)トランスジェニックマウス(DR4Tg)に対し、肝細胞との融合により肝細胞抗原提示機能を強化した融合樹状細胞の移入、末梢性トレランスを制御するCD25陽性細胞の除去、という人為的免疫制御を加えAIHモデルの作製を試みた。1)融合樹状細胞移入HLA-DR4TgマウスからのCD25細胞除去による検討HLA-DR4Tgマウスへの融合樹状細胞移入前後にマウス抗CD25モノクローナル抗体を投与し、CD25陽性細胞の除去による肝障害の増悪の有無を検討したところ、肝障害の増悪傾向を認めた。特にCD25陽性細胞除去を融合樹状細胞移入前に施行した場合は、後に施行した場合に比し肝障害増悪の程度が著しいことが示された。2)CD25細胞除去した融合樹状細胞移入HLA-DR4Tgマウスの免疫動態の検討本研究の目的はヒト
摂食及びエネルギー代謝調節に関わる新規生理活性ペプチドの同定と機能解析

摂食行動やエネルギー代謝を制御する視床下部において、リガンドが不明なため機能が知られてない受容体(オーファン受容体)に作用する未知の生理活性ペプチドの探索を実施した。細胞の微小形態変化を指標とした活性検出系(CellKeyアッセイ)を新たに構築し、視床下部に発現の高い一つのオーファン受容体発現細胞において、ある組織抽出物のペプチド画分より明らかなインピーダンスの増加を検出した。この増加は標的受容体に特異的であり、この活性を指標に現在、精製を進めている。摂食行動やエネルギー代謝調節は、中枢神経系によって複雑でかつ多くの補償系の下に制御されている。中でも視床下部には制御を担う重要な神経核が多数存在し、ニューロペプチドY(NPY)、α-メラノサイト刺激ホルモン(α-MSH)、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン(CRH)等、多くの生理活性ペプチドとその受容体が機能制御に関与することが明らかにされている。本研究では、摂食行動やエネルギー代謝を制御する脳視床下部において、リガンドが不明なため機能が知られてない受容体(オーファン受容体)に作用する未知の生理活性ペプチドを同定し、機能解析することを目的に研究を実施した。(1)jurkat細胞を利用したリガンド探索:前年度に引き続き、内在する既知ペプチド受容体が少ないjurkat細胞に標的オーファンGPCRを発現させ、リガンド探索を実施した。様々な組織抽出物を発現細胞に作用させ、リガンド結合による特異的活性(細胞内Ca2+上昇活性、cAMP濃度変化等)を指標に探索したが、新たな活性検出には至らなかった。(2)CellKeyシステムを用いたリガンド探索:オーファンGPCR発現細胞にとある組織抽出物のゲルろ過サンプルを作用させることにより、明らかなインピーダンスの増加を検出した。この増加はオーファンGPCR特異的であったので、この活性を指標に現在、精製を進めている。(3)肥満動物からのペプチド探索:高脂肪食飼育ラットの各組織よりペプチド画分を作製し、オーファンGPCR発現細胞に作用させ、リガンド結合による特異的活性(細胞内Ca2+上昇活性、cAMP濃度変化等)を指標に探索したが、新たな活性検出には至らなかった。近年、肥満症や摂食障害患者の急増によって注目される摂食行動やエネルギー代謝調節は、中枢神経系によって複雑でかつ多くの補償系の下に制御されている。中でも視床下部には制御を担う重要な神経核が多数存在し、多くの生理活性ペプチドとその受容体が機能制御に関与することが明らかにされている。本研究では、摂食行動やエネルギー代謝を制御する視床下部において、リガンドが不明なため機能が知られてない受容体(オーファンGPCR)に作用する未知の生理活性ペプチドを同定し、機能解析することを目的に研究を遂行した。具体的には以下に示す方法を導入し、従来の探索法の改善を試みた。(1)生理活性ペプチドに作用する内因性受容体の少ない細胞の利用:既に申請者はT細胞由来のjurkat細胞に既知ペプチドを作用させ、内在する既知ペプチド受容体が少ないという結果を得ている。本研究では、標的となるオーファンGPCRをjurkat細胞に発現させ、内因性受容体由来のシグナルが少ない活性検出系を構築した。この系において、組織抽出物より抽出したペプチド画分からのリガンド結合による特異的活性(細胞内Ca2+上昇、cAMP濃度変化等)を指標に探索を行ったが、新たな活性検出は認めなかった。(2)新しい活性検出系の確立:細胞のインピーダンスの変化を検出するCellKeyシステム(Molecular device社)を用いて、リガンド既知の受容体に対してリガンドを添加し、活性を検出するための最適な条件を構築した。(3)肥満動物からのペプチド抽出:高脂肪食飼育ラットを作製し、肥満ラットの各組織より酢酸抽出し、イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーにて分画したペプチド画分を作製した。交付申請書に記載した平成23年度の研究実施計画の大部分は順調に進展している。平成23年度に引き続き、摂食行動やエネルギー代謝を制御する視床下部において、リガンドが不明なため機能が知られてない受容体(オーファンGPCR)に作用する未知の生理活性ペプチドを同定し、機能解析することを目的に研究を遂行する。平成23年度に引き続き、オーファンGPCRに作用する新規生理活性ペプチドの探索を継続する。標的GPCRに特異的な活性を検出次第、活性物質の精製を開始する。標的GPCRに特異的な活性を検出できない場合、新規ペプチドの組織含有量が低い可能性が考えられる。また、肥満によって摂食やエネルギー代謝調節に関わる内分泌因子の組織含有量の変化が予想される。平成24年度において、肥満ラットの組織より抽出したペプチド画分をリガンド探索の出発材料とする。特異的活性を検出できない原因として、オーファンGPCRが細胞表層膜に発現してない可能性も考えられる。上皮細胞や神経細胞由来の極性を有する細胞に内在する蛋白質がGPCRに結合し、細胞表層膜への輸送を促進することが報告されている。

標的GPCRと緑色蛍光蛋白質が融合した発現ベクターを極性の有するMDCK、PC12細胞等に導入する。蛍光顕微鏡を用いて、標的GPCRが細胞表層膜に安定発現した細胞を調製し、探索に用いる。
メカノエイジングによる心不全発症機序解明と治療法開発

心不全患者は世界的に増加している。また、心臓組織のリモデリングを背景に生じる心不全が増加しており、そのメカニズムの理解と治療法の開発は喫緊の課題である。本研究では、心臓に与えられる機械的・物理的な刺激と、加齢に伴う変化がお互いに関連し合いながら心不全をもたらすと考え、その解析から、新たな心不全のメカニズムの理解を進める。特に、細胞間の相互作用と、エピゲノムの制御に着目した研究を行う。
沈み込み帯の地震波異方性に関する研究

P波到着時刻データの逆解析やPs変換波のスプリッティング解析により,日本列島の地殻・上部マントルの地震波異方性構造を推定した。その結果,日本列島の下に沈み込んでいる海洋性プレートの運動と上部マントルの地震波異方性の間,プレートの沈み込みが日本列島に及ぼしている広域応力場と地殻の異方性の間に密接な関係があることが判明した。沈み込み帯の異方性構造はプレートの沈み込みに支配されていると考えられる。平成18年度は多くの地震波データを収集した。データは防災科学技術研究所(NIED)のHi-netやF-netで記録された地震波記録や気象庁、国立大学地震観測網、NIEDで得られたP波初動到達時刻である。まず、中国地方を南北に横切るように観測点(馬路、成羽、三野)を選び,それぞれの観測点の波形からレシーバ関数を計算し、その特徴を調べた。その結果、四国南部では、フィリピン海プレートと地殻下部が接触していることが明らかとなった。また、成羽観測点及び馬路観測点については、地震波異方性を起こす六法対称軸が下部地殻から海洋性地殻で北西-南東から南-北の方向に向いていることを示した。また三野観測点については、下部地殻では対称軸が北西-南東から南-北に向いた異方性、海洋性地殻では南-北に向いた異方性が存在することを示した。また、水平成層異方性速度構造を伝わる地震波のレシーバ関数を合成し、異方性がある場合、速度不連続面でのPs変換波の極性が逆転することがある事を確認した。これは、等方性速度構造で見られる変換波の極性が異方性速度構造では異なることがあることを意味する。また、レシーバ関数のPs変換波にS波スプリティング解析法を適用し、地殻内部の異方性を推定する方法を開発した。一方、初動到達時刻データの逆解析を行い、東海・関東地方の三次元P波異方性速度構造を推定した。その結果、糸魚川-静岡構造帯の地殻では南北系の異方性が顕著であることを示した。関東地方の深さ25kmから40kmでは東西系の異方性が見られ、これは、フィリピン海スラブの異方性であることが判明した。さらに、深さ55kmから70kmの上部マントルでは、南北系の異方性が現れ、これは太平洋スラブの異方性であると解釈した。さらに、九州地方に於いて、異方性速度構造の解析に影響を及ぼすと考えられる地殻内部の速度不連続面(コンラッド面やモホ面)の凸凹の形状をP波到着時刻データから推定した。平成19年度は、防災科学技術研究所のHi-netやF-netの地震波形データや気象庁一元化データからP波やS波の到達時刻データを収集した。地震波形データのレシーバ関数解析やP波到達時刻データのP波トモグラフィー解析により、地殻や最上部マントルのP波異方性及びS波異方性の3次元的構造を推定した。その結果、四国地方の上部地殻は東西方向に早いP波異方性を示し、中国地方では南北から北東-南西に早いP波異方性がみられることがわかった。中国地方にみられるP波異方性の特徴は、同地域の観測点のレシーバ関数解析やこれまのS波スプリティング解析で得られたS波異方性と調和的であった。一方、四国地方のP波異方性は、西南日本に作用している広域応力場の分布と矛盾していないことが示された。このことから、中国地方の地殻上部の地震波異方性は、線形的な地質構造に起因し、四国地方のそれは広域応力場によって地殻内部に発生した割れ目の配向または地質構造に起因するものと解釈した。最上部マントルのP波異方性については、フィリピン海プレート内の異方性と、マントルウエッヂ内の異方性に分けて推定した。マントルウエッジ内では、中国地方の日本海沿岸と瀬戸内海沿岸の間に存在する境界線を境に、前弧側の地域で南海トラフに直交する方向に速度が速いP波異方性と、背弧側の地域でトラフに平行な方向に速い異方性が検出された。フィリピン海プレート内では、P波が速く伝わる方向は、プレートの沈み込む方向とほぼ一致しているように見える。このような異方性の地域的変化は、プレートの沈み込みに関連した水の有無がオリビンの変形に作用した結果であると解釈した。さらに、P波トモグラフィー解析を用いて、日本列島全体の地殻異方性についても調べた。P波が速く伝わる方向は、日本列島の水平圧縮の主軸方向と概ね一致した。また、糸魚川-静岡構造線に沿う帯状の地域で、南北方向にP波速度が速い異方性が検出された。以上の結果の一部は、日本地震学会や学術専門誌に発表されている。平成20年度は,中国・四国,九州地方の下部地殻と同地域に沈み込むフィリピン海スラブ上部の海洋地殻の地震波異方性について調査を行った。

まず,遠地地震の記録から求めたレシーバ関数波形記録上で,大陸モホ面と海洋モホ面で発生したPs変換波を検出・同定した。トランスバース成分のレシーバ関数に現れるPs変換波は,震源の方位に依存してその振幅が変化する。この変化は,変換波を発生させたモホ面が傾いているか,または,モホ面直上の層に異方性が存在する場合に生じる。そこで,異方性が存在する地震波速度構造モデルと等方性の傾斜構造を持つ速度構造モデルを用いてレシーバ関数を合成し,それぞれの場合のPs変換波の波形の違いを調べた。その結果,異方性がある場合,変換波が描く水平面の粒子運動が閉曲線となり,傾斜構造の場合には直線となることが分かった。そこで,実際に記録されたPs変換波の粒子運動を調べたところ,Ps変換波はほぼ閉曲線を示した。従って,レシーバ関数に見られるPs変換波の振幅の方位変化はモホ面直上の層内に存在する地震波異方性によると解釈した。モホ面直上の層は,大陸モホの場合には下部地殻,海洋モホの場合には海洋地殻に対応する。これらの層が六方対称の異方性を持つと仮定し,観測されたPs変換波の重み付きスタッキング解析により,異方性層内の六方対称軸の方向を推定した。その結果,下部地殻の六方対称軸は南北方向の成分を強く持つ傾向を示し,広域応力場に支配される上部地殻の異方性とは必ずしも調和的でないことが分かった。このことは,広域応力場が異方性の形成に及ぼす役割が,下部地殻と上部地殻では異なることを意味する。一方,海洋地殻の対称軸の方向や向きは,フィリピン海スラブが沈み込んでいる形態と密接に関係していることが分かった。特に,海洋地殻の異方性は九州東部,四国,中国南部に見られるが,西南日本の日本海側では見られないことが分かった。以上のことから,南海トラフから沈み込み始めるフィリピン海スラブは日本海沿岸のマントルには達していない可能性があることを指摘した。
脂肪組織由来間葉系幹細胞を用いた培養皮膚の作製法の開発

脂肪由来間葉系幹細胞を培養したが、ケラチン陽性細胞が確認できなかった。I型コラーゲン液に脂肪由来間葉系幹細胞を加えてカルチャーインサートに添加し、ゲル化させ、その後10%FCS/DMEMを適量インサートの内と外に添加し培養した。ゲル上に播種し培養させ空気曝露を行い重層化させた。HE染色を行ったところ皮膚の三次元再構築が確認できた。従ってASC細胞が真皮線維芽細胞の代替細胞として機能しうることが確認できた。当研究は、皮膚再生医療を推進する目的のために三次元培養皮膚の作製法を目的としている。我々は、これまでに羊膜を併用して三次元培養皮膚を作製することにより、簡便に三次元培養皮膚を作製できる方法を確立できている。しかし、用いる細胞は皮膚由来の細胞であり、大量培養が困難であった。今回、脂肪組織からの間葉系幹細胞の分離培養を試みた。脂肪組織は皮膚に切開を入れることなく脂肪吸引法にて得ることができる組織であり、かつ採取量はかなり多くの組織を得ることができる。これは患者負担という点からすると大きなメリットであり、血液採取と同じような感覚で受け入れられる。まずは脂肪組織由来間葉系幹細胞が幹細胞としての増殖能力を有しているかについて明らかにしようと検討した。また、最適の増殖培養環境について培養液や添加因子、さらには培養条件を検討し、その培養法を確立する。間葉系幹細胞は形態が線維芽細胞と似ているため、間葉系幹細胞を線維芽細胞として使用可能かについて検討した。具体的には継代操作による細胞増殖能の検討、培養上清中に分泌されるサイトカイン、細胞成長因子の測定、サイトカイン、細胞成長因子刺激時の遺伝子発現などを検討した。また、コラーゲンゲル中での増殖、形態について線維芽細胞との比較検討した。三次元培養皮膚での表皮角化細胞へ分化できる条件を詳細に検討した。その際に添加因子、培養液、さらには他の細胞との供培養の実験系を用いて角化細胞への分化誘導法についても明らかにすることも試みた。さらに、現在、脂肪由来間葉系幹細胞と線維芽細胞をそれぞれ培養し、分化誘導培地に変更しその形態的変化も解析している。本研究の目的は、皮膚再生医療を推進し三次元培養皮膚の作製法を改良することを目的とする。我々はこれまでに羊膜を併用して三次元培養皮膚を作製することにより、簡便に三次元培養皮膚を作製できる方法を確立できているが、用いる細胞は皮膚由来の細胞であり、大量培養が困難であった。そこで、比較的大量に採取しやすい組織として脂肪組織に着目し、脂肪組織から間葉系幹細胞を分離培養し、分化誘導にて線維芽細胞と角化細胞を作製し、これら分化誘導細胞にて三次元培養皮膚を作製する方法を開発することを推進する。簡易作製方法については十分に有用であることが期待できるが、実際の三次元培養皮膚作製時に用いる細胞は従来のままである。生検皮膚から表皮と真皮を分離し、それぞれ表皮角化細胞と真皮線維芽細胞を分離培養、大量に増殖させたものを用いなければならない。従って細胞の確保、培養に多くの時間と労力を費やす。また、ある程度の大きさの皮膚を採取する必要があるため患者の負担は多大なものとなる。細胞の確保、培養法に関する開発についてはあまり進んでいない。それは角化細胞と線維芽細胞という、上皮系と間葉系の細胞を同時に大量に培養する技術が開発されていないことによる。この点を改良できる可能性として幹細胞が候補と成るであろう。胎性幹細胞から角化細胞を誘導し、その細胞を用いて三次元培養皮膚を作製することができたとの報告がすでになされており、iPS細胞や間葉系幹細胞からも角化細胞や線維芽細胞が誘導可能ではないかと考えた。このような学術的背景から本研究の発想に至っている。皮膚再生医療を推進する目的のために三次元培養皮膚の作製法を検討した。今回、比較的大量に採取するのが容易な脂肪組織を使い、分化誘導にて線維芽細胞と角化細胞を作製し、これら分化誘導細胞にて三次元培養皮膚の作製を試みた。まずは脂肪組織由来間葉系幹細胞が幹細胞としての増殖能力を有しているかについて明らかにした。詳細な条件は、今、検討中である。また、最適の増殖培養環境について培養液や添加因子、さらには培養条件を検討し、その培養法の確立を試みた。具体的には継代操作による細胞増殖能の検討、培養上清中に分泌されるサイトカイン、細胞成長因子の測定、サイトカイン、細胞成長因子刺激時の遺伝子発現などを示標にする。また、コラーゲンゲル中での増殖、形態について線維芽細胞と比較した。すなわち、脂肪由来間葉系幹細胞と線維芽細胞をそれぞれ培養し、経時的に培養上清を回収する。

培養上清中のサイトカイン・細胞成長因子についてELISA法を用いて解析する。さらに線維芽細胞に対して増殖促進、抑制する因子を数種類選び(bFGF, TGF-beta, PDGFなど)、培養液に添加し、刺激後のサイトカイン・細胞成長因子についてもELISA法を用いて解析する。現在、サイトカイン・細胞成長因子刺激後経時的にRNAを回収し、主にサイトカイン・細胞成長因子の遺伝子発現についてmicro array解析、real-time PCR法にて比較検討している。最終年度の今年度は、特に脂肪由来間葉系幹細胞の真皮構成成分としての検討を行なった。すなわち、ブタ腱由来I型コラーゲン液に脂肪由来間葉系幹細胞を加えてカルチャーインサートに添加し、ゲル化させた。その後10%FCS/DMEMを適量インサートの内と外に添加し、5日間5%CO2, 37°Cで培養した。5日後にゲルが収縮しているか確認した。ゲルの表面に羊膜を密着させ、数時間静置した。あらかじめ培養しておいたヒト表皮角化細胞を剥離し、羊膜の上に播種する。2日間培養後、空気曝露を行い重層化させた。経時的にサンプルを回収し、HE染色、免疫染色、電子顕微鏡にて検索する。正常な表皮が構築されていれば間葉系幹細胞が真皮を構成できることを確認した。脂肪由来間葉系幹細胞から分化誘導した角化細胞を用いた三次元培養皮膚の作製。確認できた真皮成分に脂肪由来間葉系幹細胞から分化誘導した角化細胞を播種し2日間培養後、空気曝露を行い重層化させた。経時的にサンプルを回収し、HE染色、免疫染色、電子顕微鏡にて検索した。具体的にはHE染色にて形態学的な特徴を解析し、免疫染色にて基底膜構成成分(ラミニン5,IV型コラーゲン、VII型コラーゲン、α6β4インテグリン)、細胞間接着因子(Eカドヘリン、デスモグレイン1,3,α2インテグリン)、細胞骨格(ケラチン5,14,I,10)、分化マーカー(インボルクリン、ロリクリン、トランスグルタミナーゼ)などの発現を比較した。脂肪由来間葉系幹細胞から作製した三次元培養皮膚のin vivoでの機能確認。作製できた三次元培養皮膚をヌードマウス背部に移植し、生着性について検討した。さらに経時的にサンプルを回収しHE染色、免疫染色、電子顕微鏡にて正常皮膚と比較検討し、その有用性、再現性について詳細に検討した。分子生物学皮膚再生医療を目的とした三次元培養皮膚の作製法を検討した。比較的大量に採取しやすい脂肪組織を用い、脂肪組織から間葉系幹細胞を分離培養し、分化誘導にて線維芽細胞と角化細胞を作製し、これら分化誘導細胞にて三次元培養皮膚を作製する方法を開発することを目的とした。手術時に得られた脂肪組織を生理食塩水にて洗浄し、ハサミやメスを用いて細切する。滅菌三角フラスコに移し、0.1%コラゲナーゼ/ダルベッコ変法MEM培地を注入し、37°Cにて60-90分反応させる。脂肪は上層に分離し、細胞は沈殿する。上清を除去し細胞を培養をする。培養4-7日後に細胞数を測定する。細胞数の測定結果をもって増殖能が高いか低いかを確認した。20回前後の回数で検討中である。