hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
次世代DNAシークエンサーを用いたゲノム解読のためのアルゴリズム開発

次世代DNAシークエンサーと呼ばれる高速・安価にDNA配列を読み取ることができる装置を用いてゲノム解読を行う場合には、解読・復元されたゲノム配列が断片化することが多く、各断片がどの染色体上のどの位置に存在するかは分からなかった。そこで、次世代DNAシークエンサーを用いて短期間に比較的少ない手間で遺伝学的地図を構築するアルゴリズムを開発し、染色体上に解読ゲノム断片配列を整列するシステムを開発した。従来のゲノムアセンブリアルゴリズムの中でも実用的な精度の良いアルゴリズムでは計算機上の主記憶にほとんどすべてのリードを格納する必要があるため、シークエンサー側の出力量急増に伴い1台の計算機で使用可能な主記憶量よりワーキングセットが遙かに大きくなり、並列分散計算が必要となった。このため、我々が以前から開発してきたRAMENアセンブラーのコア部分を並列分散計算フレームワークTiny Cloud Engine(TCE)上で走るように移植を試みた。この結果、分散並列ファイルシステムが計算の大きなボトルネックの一つとなることを分かり、TCEの開発に主な問題点をフィードバックした。移植が完成すれば、安価で高速に計算ができるクラスター型の計算機でゲノムアセンブリを行えるようになり、従来と比べてより大きなゲノム配列を決定できるようになる。また、次世代シークエンサーの中には出力塩基の精度が著しく低いものが見受けられるが、このようなリード配列とコンティグとのマッチングを取るために、穴あきシードとスライドソートを組み合わせた高速・高精度なシーディングアルゴリズムを開発し、理論的な精度を解析した。また、大規模ゲノムアセンブリでは長距離のコンティグ接続関係を保証するために遺伝学的地図が必要となることが多いが、次世代DNAシークエンサーを用いて遺伝学的地図を短時間・短期間に作製するためのアルゴリズムを開発した。ヒメツリガネゴケを試験対象として、分離集団のゲノムDNAをIllumina GAによりインデクシングを用いてショットガンシークエンシングし、得られたペアエンドシーケンスを参照ゲノム配列と比較してSNPを検出し、連鎖解析に耐えうる頻度・精度のSNPが検出できることを確認した。昨年度に開発した、穴あきシードとソートを組み合わせた高速高精度なアラインメントのシーディングアルゴリズムの実装において、ソートステップにおける並列化手法を工夫し、総実行命令数は増えるもののCPUのキャッシュメモリへのヒット率を上げる計算手法を採り入れることによって更に高速で実用的なアラインメントアルゴリズムとして用いることができることを確認した。また、大規模ゲノムアセンブリで染色体レベルの接続関係を保証するために遺伝学的地図を次世代シークエンサーで作成するためのアルゴリズムを去年度に引き続いて改良した。ヒメツリガネゴケのGransdenとVillersexelを掛け合わせた分離集団のゲノムDNAをショットガンシークエンシングした以前のデータを参照ゲノムへのアラインメント後に抽出したSNP情報から、アラインメントのアーティファクトによるものをインシリコで取り除くためのフィルターを条件検討し作成した。また、分離集団のアリルパターンをグラフィカルに表示するために、UTゲノムブラウザの拡張トラックを作成し、・UTゲノムブラウザの本家にマージした。各個体におけるジェノタイプ欠損値を周辺のジェノタイプからノイズを考慮しながら推定するアルゴリズムを開発した。また、このアルゴリズムによる推定結果をゲノムブラウザを用いて表示・検討したところ、既存のJGIによるヒメツリガネゴケアセンブリにはグローバルミスアセンブリが存在していることを見いだした。また、アセンブリへのコンタミ配列上には1:1に分離するSNPが検出されないために、アセンブリ中のコンタミ配列も発見することができるととを見いだした。超並列DNAシークエンサーはリード長が短いために、全ゲノムショットガンシークエンシングによって得られる解読したゲノム配列連続断片の長さが短くなりがちであり、染色体レベルの比較ゲノム解析やポジショナルクローニング等を行うことは難しかった。また、ゲノム配列連続断片と染色体との関連づけを行うためには長い期間を掛けて追加の実験を行い、染色体地図を別途作る必要があった。そこで本研究ではゲノム配列連続断の多くを染色体上にマップするために、超並列DNAシークエンサー(Illumina)を用いて従来比で極めて短期間に超高密度(平均数kb/マーカー)の遺伝学的地図を作成するアルゴリズムを開発した。実データとしてヒメツリガネゴケの異なる2系統を掛け合わせた分離集団のうち約200個体弱から抽出したゲノムDNAを薄く全ゲノムショットガンシークエンシングしたデータを用いた。本アルゴリズムでは参照ゲノムへのアラインメント後に様々なフィルター条件を用いて確度が高いと考えられるSNP情報を抽出し、その後シークエンシングエラーによるミスタイピングなどの補正を行ったのちに参照ゲノム上でミスアセンブルの疑いがある箇所を切断し、最後に反復的アルゴリズムによりウルトラコンティグの結合を繰り返して比較的少ない数の連鎖群を得る。実データを用いた解析では、連鎖群が知られている染色体数付近まで落ちてくるとともにウルトラコンティグの結合を行う際の距離が急激に長くなることが分かり、本アルゴリズムによる処理結果には一定の信憑性があることが示唆された。当初の研究計画と比べると目標が達成されていないようにも見えるかもしれないが、当初の研究立案時には現在のような急速なハイスループットシークエンサーのスペック向上を予測することは難しく、立案時の予測と比較するとの処理するべきデータの量が大きく増えている。

24年度が最終年度であるため、記入しない。遺伝多型とゲノムアセンブリを組み合わせるアルゴリズムについては、今後ジ土ノタイピング精度の改善とFO個体がinbredでない場合への拡張などが実用上は必要になってくるためにこれを開発していく。また、ユーザーインタフェースの開発が必要であり、既に着手しているUTGBへの拡張を更に推し進めていく。
シェーグレン症候群は涙腺・唾液腺を標的とする自己免疫疾患であるが、これまで種々の研究が行われてきたにもかかわらず、その発症機序の詳細は不明である。一方、オートファジーは近年様々な疾患との関連が報告されているが、自己免疫疾患の発症機序に対する明確な知見は未だ得られていない。本研究では、オートファジーを介したシェーグレン症候群発症機序の解明を行い、特異的治療薬の開発を目指す。正確かつ詳細な分子機序を明らかにするため、複数および多層におけるオミクス解析を統合したトランスオミクス解析を実施する。また有効な薬剤標的分子決定のため、オートファジーの直接制御分子に対する相互作用分子の同定も併せて行う。
ステロイド感受性低下を改善するための標的分子の同定と創薬理論の構築

初年度にステロイド性抗炎症薬の感受性低下にはプロテオソームによるグルココルチコイド受容体の分解が関与していることを示した。一般に,蛋白質がプロテオソームで分解されるためには、まずリン酸化が生じ、そのリン酸化部位を認識してユビキチン化がおきる。そこで、グルココルチコイド受容体のプロテオソームによる分解を抑制する方法として、グルココルチコイド受容体のリン酸化を阻害することを目指した。グルココルチコイド受容体をリン酸化することが報告されているp44/42 MAP kinase、p38 MAP kinase及びc-Jun N-terminal kinaseに対する阻害薬PD98059、SB203580、SP600125、ならびに非選択的なキナーゼ阻害薬staurosporineを用いて検討したが、これらの阻害薬はいずれもヒト気道上皮細胞NCI-H292細胞をdexamethasoneで処理した場合のグルココルチコイド受容体の分解を抑制しなかった。ラットマスト細胞株RBL-2H3細胞においても、dexamethasoneはグルココルチコイド受容体の分解を誘導したが、この分解は、抗原で刺激することにより種々のキナーゼを活性化した場合でも影響を受けなかった。このように、グルココルチコイド受容体の分解を抑制してその感受性低下を改善するための標的分子として受容体キナーゼについて解析したが、そのキナーゼを同定することはできなかった。しかし、初年度にはプロテアソーム阻害薬によりグルココルチコイド受容体の分解を抑制すると、ステロイド性抗炎症薬の感受性低下を抑制することが明らかになっておりグルココルチコイド受容体の分解を特異的に抑制する化合物が、ステロイド感受性低下を改善する薬物になると考えられる。本年度は、気道上皮細胞において、ステロイド性抗炎症薬の感受性が低下する生化学的機構について解析し、以下の成果が得られた。1.グルココルチコイド受容体レベルと感受性の変化の解析:ヒト気道上皮細胞NCI-H292細胞をステロイド性抗炎症薬dexamethasone(1μM)存在下で培養し、経時的にグルココルチコイド受容体(GR)及びエストロゲン受容体(ER)レベルをWestern blot法で解析した。Dexamethasone添加後2時間からGRレベルの低下が認められ、半減期は約6時間であった。この条件下ではERレベルに変化は認められず、GR選択的な分解が生じていることが確認された。このGRレベルの低下は、プロテアソーム阻害薬lactacystin及びMG-132で抑制された。NCI-H292細胞におけるインターフェロン-γ(IFN-γ)刺激による接着分子ICAM-1の発現は、dexamethasoneをIFN-γと同時に添加した場合に強く抑制されたが、dexamethasoneで8時間前処理した後、IFN-γで刺激した場合には、その抑制作用は同時添加の場合に比べて著しく減弱した。また、MG132共存下でdexamethasoneの前処理を行った場合には、抑制作用の減弱が一部回復した。したがって、プロテアソーム阻害薬によりGRの分解を抑制すると、dexamethasoneの感受性低下が抑制されることが明らかになった。2.細胞特異性の解析:ラットマスト細胞株RBL-2H3においてもdexamethasoneによりGRレベルの低下が生じるか解析した。Dexamethasone存在下で培養した結果、GR量は低下し、その半減期はNCI-H292とほぼ一致した。したがって、プロテアソームによるGRの分解機構は様々な細胞に存在することが示唆された。
パスカルの自然学およびそのレトリックに関する研究

本年度は、2つの観点からパスカルへアプローチした。(1)パスカルの流体静力学についてパスカルと非常に近しい関係にあったロベルヴァルは、さまざまな実験を通して、空気の弾性という性質を把握するに至った。パスカルは、この科学上の成果に対して、直接的に言及することはないが、しかしながら、これを自らの自然学体系の中で、適切に説明付けようと試みていたことを、とりわけ『流体の平衡と大気の重さ』にあらわれた概念装置やレトリック(説得術)に注目して分析した。この研究は、論文としてはいまだ公開していないが(6月刊行予定の研究成果報告書で公表予定)、すでに科学史学会の大会などで報告している。(2)近代初期におけるunite概念の研究16世紀後半から17世紀前半において、unite(単位)の概念がどのように再構築され、解析幾何学などの数学や、幾何学的自然観の基礎づけなどにむけて活用されたのかという関心のもと、ステーフィンからパスカルに至るunite概念を検討した。当初予期していた以上の問題の規模の大きさのため、本年度に公表した論文については、メルセンヌとデカルトを中心とした分析に、研究対象を絞らざるを得なかったが、これによって、より複雑なunite概念を保持していたと思われるパスカルにアプローチする、具体的な問題設定と議論の枠組みを構築することができたと考えている。いわゆる「パスカルの原理」を論証した『流体の平衡と大気の重さ』において、空気が重さをもつことを論じている箇所があるが、その論証プロセスはきわめて問題が多いといわれてきた。また、自らの意見を直截に述べるというよりも、他の諸説に対する反論を通して間接的に自説を展開するという、きわめてレトリカルな方法を用いているので、当時のさまざまな議論に精通していないと、論点をつかみ損ねてしまう恐れがある。本年度は、まず第1に空気の重さ(流体の重さ)に関する歴史的な諸議論を調査してパスカルの想論敵を正確に見極め、第2に、パスカルがいかなる視点からこれらの仮想論敵に対峙しているか、そのレトリックを分析することで、パスカルの重さに関する自説を浮き彫りにし、そして第3に、パスカルがなぜ重さの概念をこうした間接的なかたちでしか表明することができなかったのかその歴史的および内在的理由を明らかにし、別記の研究論文に報告した。これに対する本研究の結論は以下の通りである。(1)パスカルの仮想論敵は、アリストテレス主義者、デカルト主義者、そして「原子はそれ自体の中では重くない」と考えた、当時の大部分の原子論者たちである。(2)パスカルはこれら3つの立場に反論することで、「原子はそれ自体の中でも重い」という結論をレトリカルな方法で引き出した。またパスカルはこの自説を単に作業説として要求しているのではなく、実在のレベルにおける原理として請求している。(3)歴史的な背景としては、パスカルが組している原子論が、伝統的に無神論の疑いをかけられていたことと、当時の思潮であった科学的懐疑主義の影響を指摘した。内在的な理由としては、パスカルの重さの理論が、重力理論が確立していなかった17世紀中葉にあって、物理的に整合的な体系を十分に築き得ないことによる暫定的な処置であるとした。
労働市場の二極化の解消－派遣業の仲介機能に関するミクロ計量経済分析

本研究の目的は、労働市場の仲介者としての派遣業の役割に焦点を当て、労働市場の二極化を解消するための方策を探ることにある。分析により、派遣労働は少なくとも短期的には金銭的な貧困対策として機能してきた一方、正社員就業を希望する労働者の「踏み石」としての機能を果たしてこなかったことが明らかにされた。研究成果は国際査読誌に掲載されたほか、一般向けにも情報発信を行った。本研究は、3年間の計画を前提に、労働市場の二極化の解消と派遣業の仲介機能との関連を明らかにするものである。2年目は、より応用的な推定方法を用いて1年目の推定結果の頑健性を調べるとともに、どのような労働者が派遣を通じて就労することを選択したのかという派遣労働へのセルフ・セレクションのメカニズムを明らかにすることを目的としていた。本研究で用いているATT推定では「派遣を選択するような労働者は、仮に派遣就労をしなかったとしても正社員になれる(なれない)傾向を持つ」というセルフ・セレクションの仮定が成立しないことが前提条件となっている。派遣労働の効果を正しい因果関係に基づいて判断するためには、その仮定に対する頑健性を確かめる必要がある。最近では、セルフ・セレクションのメカニズムを敢えて明示化することにより、因果関係の推定を行うアプローチが採用されている。本研究では、Ichino, Mealli and Nannicini(2008)と同じ手法を用いて分析を行った。その結果、派遣労働へのセルフ・セレクションの可能性は大きくないことが明らかにされた。また、分析より、仮にセルフ・セレクションがあったとすれば、派遣労働は「仮に派遣就労をしなかったとしても正社員なれない傾向を持つ」人々を選択している可能性が示唆された。3年目は、労働市場の二極化を解消するための具体的な方策について探ることを目的としていた。2年目までの研究で行ったATT推定の頑健性分析の強みは、パートやアルバイトについたり、失業したまま求職活動をするのではなく、あえて派遣で働こうとする人達の特性を把握できる点にあった。もしも、派遣を選ぶ人たちの正規就業できない理由が、派遣という制度を利用したことではなく、その人達の本来の特性に由来するのであれば、労働市場の二極化を解消するためには、派遣制度の改革よりも職業訓練の充実が効果的になる。今年度は、この点について昨年度の枠組みを活用した分析を行い、労働者の学歴や割引率・家庭属性などの様々な特性(confounder)が派遣就労を促す効果について掘り下げて検証した。その結果、派遣労働者が正規就業しにくい理由は、労働者の特性ではなく、派遣という枠組みを利用したこと自体に由来する可能性が高いことが分かった。なお、平成25年度は、非正規労働者の働き方に影響を与えると考えられる最低賃金制度についても、計量経済学的な考察を行い、その成果をディスカッションペーパーとして公表した。主な分析対象は、派遣を通じて就労する人の生活状況や就業状態であり、これらの派遣労働者が仮に派遣を通じて就労していなかったとしたら、その後の賃金率や正規雇用率がどのように変化したかを最新の応用計量経済学の手法を用いて推定する。今年度は、派遣労働を利用することが労働者のその後の就労状況を改善させるかどうかをATT推定(Average Treatment Effect on the Treated Estimation)によって分析し、日本では派遣労働が正社員への踏み石とはならないことを明らかにした。このことは派遣労働が労働市場の仲介者として、十分なマッチング機能を果たしてこなかったことを意味する。本研究により、労働市場の二極化を解消するという観点から引き続き派遣労働法の見直しが必要であることが強く示唆される。なお、分析結果は国内の主要学会でのほか、複数の研究会やセミナーでも研究報告を行い、多くの研究者との議論をふまえて改訂を行った。この成果はディスカッション・ペーパーとして刊行し、国際査読誌に投稿した。編集者からの改定要求にしたがって現在改訂中である。セレクションの問題を考慮した研究が国際査読誌に採択されたため。研究成果をセミナーや学会等で報告し、既に国際査読誌から改訂要求を受けた点で、本研究は順調に進展していると判断される。今年度は、当初の研究計画の通り、労働市場の二極化を解消するための方策について検証する。次年度以降は、労働市場の二極化を解消するための具体的な方策に焦点を当てて研究を行う。また、平成23年度で得られた推定結果について、より正確な派遣労働の影響を識別するための発展的な推定を行う。該当なし次年度は当初の予定通り、国際学会で研究成果を報告する。その出張旅費が次年度の研究費の半分程度を占めることになる。残りは国内における研究成果報告のための旅費、および英文校正費等として利用予定である。
聴覚障害児の保有する聴覚を活用したドップラー効果の実験

1研究目的聴覚に障害のある生徒の保有する聴覚を活用し、ドップラー効果を体験的に理解させる。2研究方法(1)聞こえの状態の違う生徒個々の聞こえる音の大きさ、高さなどの違いによる可聴範囲を調べた。また近年増えている人工内耳の生徒の聞こえの様子を調べた。(2) (1)の調査を基にして、聴覚に障害のある生徒に対して、ドップラー効果を理解できるための実験器具を作成した。アFM補聴システムにアンプと指向性マイクをつなげて、離れた音でも補聴器でとらえることができるシステムを作成した。イ自動かき混ぜ器スターラーを使って、牛乳を入れたバッドの中のスターラーバーを回転させながら移動させ、同心円に近い波が移動することでドップラー効果をイメージさせる実験機器を作成した。(3)発音物体が動くことで音が変化するということを実験を通して理解できるようにした。ア1000Hz以下の正弦波音を発しているスピーカーを回転させ、それに(2)アのシステムのマイクを向けて補聴器で音の変化を聞き取れるようにした。イハイブリッドカーから正弦波音や救急車のサイレンを出し、それに(2)アのシステムのマイクを向けて補聴器で音の変化を聞き取れるようにした。ウ(2)イの実験機器を使い、聴覚活用が難しい生徒にドップラー効果をイメージさせる実験を行った。3研究の成果音の高さの変化と音の大きさの変化の違いを生徒に体験してもらった後にドップラー効果の実験を行うと多くの生徒は今まで感じることができなかった音の高さの変化を感じることができ、ドップラー効果を体験的に理解することができた。
ガリレオ・ガリレイの力学および関連諸分野における研究過程の実証的研究

ガリレオ・ガリレイの力学研究の過程については、1970年代のS・ドレイクによる手稿類の発掘を通じ、科学史的研究が飛躍的に前進した。しかし、その学説史的な詳細については、研究者の中でも見解が十分一致していない。この研究では従来等閑視される傾向があったガリレオ独自の力学体系の形式に注目し、その形成過程を跡付けることを試みた。今回はガリレオの手稿f.152rを詳しく分析し、彼が用いた運動学的定理の特殊性に焦点を当てて、前後の手稿を確定する作業を進行させた。その結果、ガリレオが落下運動の分析に際して、加速運動を等速運動の問題に還元するシステマティックな方法を持ていたことが明らかにされた。さらに、そのことを現代物理学の一般的な見地から再検討することによって、従来、しばしば誤って理解されてきた、ガリレオの等加速度運動の仮定から落下の時間二乗法則を導く数学的方法についても、新しい理解を提出することができた。とくにガリレオ独自の運動学の発展段階に注目することによって、手稿の順序づけを行う方法が提示された。また、この問題は、ガリレオの積分と連続量にたいする独自の概念と理解と、関係していることが明らかとなった。ガリレオの手稿の邦訳については、従来、未訳であったものの幾つかについて、進められた。その結果、ガリレオが落下運動の分析に際して、加速運動を等速運動の問題に還元するシステマティックな方法を持っていたことが明らかにされた。
セロトニン2A受容体を介するストレス応答性シナプス修飾機構の研究

単一発火活動やシナプス入力に対応した神経細胞の微弱なカルシウムシグナルを検出可能にするため、高性能な蛍光カルシウムプローブ(改良G-CaMPおよびR-CaMP)を開発した。また、光刺激プローブであるチャネルロドプシンをセロトニン(5-HT)作動性HSN神経に発現させ、かつGFP標識5-HT_<2A>受容体、または改良G-CaMPをHSN神経が投射する産卵筋細胞に発現させた線虫株の光刺激と蛍光可視化を同時に実施するための実験系を確立した。この研究は、ストレスから鬱病に至る分子機構の解明を目指すものである。特に鬱病との関連が深い中枢のセロトニン2A(5-HT_<2A>)受容体に注目し、線虫や哺乳動物の神経系へのストレス負荷に応じた5-HT_<2A>受容体細胞膜発現レベルの変化と中枢シナプス特性変化の関係を重点的に解析することを目的としている。22年度は受容体の発現制御蛋白質の各種遺伝子改変線虫株の作出、蛍光標識体の作製を行った。また、ストレスによるシナプス修飾を理解するために個々の神経細胞の神経活動と神経回路の働きを可視化し分子生理学的に解析する必要があるため、神経細胞の細胞体やシナプスでの活動に伴う細胞内カルシウムイオン濃度変化を検出できる改良GCaMP(我々が独自に開発した蛍光カルシウムプローブ蛋白質であり、細胞内カルシウムイオン濃度の上昇に応答して緑色蛍光強度が増大する)を作製した。改良GCaMPは、十分に高いカルシウム感受性を有しており、マウスの海馬スライスを用いた電気生理学的実験において1発の活動電位に応答した蛍光強度の増大が見られることを確認した。そしてこの改良GCaMPを適切なプロモーターを用いることにより種々の神経に発現させた線虫株を作出した。そこで改良GCaMPを神経に発現させた線虫をレーザー顕微鏡下にセットして蛍光測定を行ったところ、実際に線虫の各種行動に伴う神経活動を蛍光シグナルとして検出することができた。過剰なストレスは、ストレスホルモンの過剰分泌を伴い最終的には欝病等の精神疾患の発症を招くが、その分子機構は良くわかっていない。この研究は、ストレスから欝病に至る分子機構の解明を目指すものである。特に欝病との関連が深い中枢のセロトニン2A(5-HT_<2A>)受容体に注目し、線虫や哺乳動物の神経系へのストレス負荷に応じた5-HT_<2A>受容体細胞膜発現レベルの変化と中枢シナプス特性変化の関係を重点的に解析することを目的としている。23年度は前年度に引き続き、受容体の発現制御蛋白質の各種遺伝子改変線虫株の作出、蛍光標識体の作製を行った。またストレスによるシナプス修飾を理解するためにシナプス前・後の神経細胞活動を個別に可視化して分子生理学的に解析する必要があるため、昨年度開発した改良G-CaMP(細胞内カルシウムイオン濃度の上昇に応答して緑色蛍光強度が増大する)と異なる波長特性を示す蛍光カルシウムプローブ蛋白質R-CaMP(細胞内カルシウムイオン濃度の上昇に応答して赤色蛍光強度が増大する)を新たに作製した。R-CaMPは、改良G-CaMPと同程度に高いカルシウム感受性を有しており、マウスの海馬スライスを用いた電気生理学的実験において1発の活動電位に応答した蛍光強度の増大が見られることを確認した。R-CaMPと改良G-CaMPの励起及び蛍光波長はほとんど重複しないため、R-CaMPと改良G-CaMPを用いてシナプス前・後の神経活動性を異なる2波長で測定することが可能となった。また5-HT合成酵素(tph-1)を欠失した線虫株の5-HT作動性神経活動を検討し、5-HT作動性神経活動の阻害による筋活動への影響を評価した。過剰なストレスは、ストレスホルモンの過剰分泌を伴い最終的には鬱病等の精神疾患の発症を招くが、その分子機構は良くわかっていない。特に鬱病との関連が深い中枢のセロトニン2A(5-HT2A)受容体に注目し、線虫や哺乳動物の神経系へのストレス負荷に応じた5-HT2A受容体細胞膜発現レベルの変化と中枢シナプス特性変化の関係を重点的に解析することを目的としている。24年度はシナプス修飾を理解するために微弱なシナプス活動を個別に可視化して分子生理学的に解析する必要があるため、高感度な改良G-CaMP(細胞内カルシウムイオン濃度の上昇に応答して緑色蛍光強度が増大する)を新たに作製した。作製した改良G-CaMPはかなり高いカルシウム感受性を有しており、マウスの海馬スライスにおいて単一細胞レベルでの神経活動を高精度に検出できるだけでなく、単一シナプスレベルでの閾膜電位下における興奮性シナプス入力活動を検出できることが確認された。

また光刺激プローブであるチャネルロドプシンを5-HT作動性HSN神経に発現させ、かつGFPで緑色蛍光標識した5-HT2A受容体、または改良G-CaMPをHSN神経が投射する産卵筋細胞に発現させた線虫株の5-HT作動性神経活動を検討し、5-HT作動性神経活動の促進による5-HT2A受容体局在とシナプス活動への影響を評価した。各種遺伝子改変線虫株の作出、蛍光標識体の作製が順調に進んでおり、シナプス特性変化の解析用プローブも開発できたため。24年度が最終年度であるため、記入しない。最終年度は、これまでの研究実績に基づき、ストレスシグナルで5-HT_<2A>受容体発現神経のシナプス活動性がどう変化するのかを解析する。
遺伝子導入した培養骨格筋細胞移植による心筋梗塞治療

c-Junの転写活性部位の欠損したDNcJunは、内因性のc-Fos、c-Junとの結合やDNcJun複合体としてAP-1のpromotor領域に結合するが、転写活性を持たないことでAP-1活性を抑制する。このDNcJunをアデノウィルスベクターを用いて新生児ラット心筋細胞に過剰発現させ、心筋細胞肥大因子であるエンドセリン(100nM)で刺激した。DNcJunはエンドセリンによるAP-1活性を抑制し、^3H-フェニルアラニンの取り込みでみたエンドセリンによるタンパク合成の増加を完全に抑制した。また、DNcJunはANP、BNPのmRNAのエンドセリンによる発現増加を約40%有意に抑制した。またMAPKが炎症のシグナルに関係し、心不全の病態に炎症が深く関与することが示唆されていることより、アデノウィルスベクターを用いて新生児ラット心筋細胞にdominant negative mutantやwild-typeのapoptosis signaling kinase (ASK1)、MAPKを過剰発現させ、アンジオテンシンII(100nM)で刺激しmonocyte chemoattractant protein-1 (MCP1)の発現をみた。ASK1はアンジオテンシンIIによるMCP1発現を抑制し、これはp38MAPKを介する経路であることが判明した。結論として、肥大、増殖、ストレスに関与するJNK、p38MAPK、AP-1は一部アンジオテンシン系を介し心筋梗塞後心臓リモデリングに関与している可能性が示唆された。また、現在ラット骨髄単核球分画よりmesenchymal stem cellを培養しVEGFを遺伝子導入した細胞をラット心筋梗塞に移植し心臓リモデリングの抑制効果を得た。我々の検討では、ラットの心筋梗塞で細胞内情報伝達系であるmitogen-activated proteinkinase (MAPK)のERK、JNK、p38MAPKのすペてが、梗塞部位と非梗塞部位の両方で活性亢進が認められた。この結果より心筋でのMAPKの活性化が心筋梗塞後心臓リモデリングに関与していると考えられた。さらに、JNKの下流に位置するc-Junのdominant negative mutantをアデノウイルスベクターをもちいて培養心筋細胞に遺伝子導入し、シグナルを抑制することによりエンドセリンやフェニレフリンによる心筋肥大を検討した。その結果、c-Junのdominant negative mutantは転写因子activator protein-1 (AP-1)の活性化を抑制し、さらにcell sizeの増大、タンパク合成促進、ANP、BNPのmRNA発現亢進を抑制した。このことより、JNKの下流のc-Junを抑制することで、AP-1の転写活性を阻害し、生体でも心筋細胞肥大を抑制できる可能性があることが判明した。又、ACE阻害薬、アンギオテンシンI型受容体拮抗薬はJNK、AP-1の活性を阻害し心筋梗塞後心臓リモデリングの抑制に関与していると考えられた。現在、種々の培養細胞に遺伝子導入し、心筋梗塞部位に細胞移植を試み、心臓リモデリングの抑制効果を検討中である。
特殊なブレーズ形状を持つ太陽光集光フレネルレンズ

地球温暖化問題を解決するために、太陽光などの自然エネルギーの利用が強く望まれ、太陽光をファイバーやガラスロッドなどの光伝送路に効率良く導く光学系が要求されている。しかし、従来の集光光学系は必ずしも十分ではなく、従来の設計理論には不備があるという根本的問題に気付いた。両側ブレーズ型の太陽光集光フレネルレンズを提案しその特性を調べてきた。レンズ設計の観点から、正弦条件の微分形・積分形という新たな、少なくとも従来は注目されていなかった概念を積極的に用いて、この収差特性の原因を明確にしてきた。片側ブレーズ型DOEは太陽光集光レンズに限らず、顕微鏡対物レンズなど現在幅広く用いられてきている。そこで、片側ブレーズ型DOEの適用限界を検討し2017年度に海外発表した。2018年度には論文投稿に力を注いだ。正弦条件の微分形積分形に絡んだ幾何光学的な検討は明快で新たな知見である。高精細光学系での適用限界は、波動光学的評価が必要であり更に深く検討・吟味し、これら二つの内容を合わせて2019年2月に学術雑誌「光学」に投稿した。現在は査読結果を待っている。また、世界的に信頼されている光学設計ソフトCODE-Vの2018年10月特別セミナーでの招待講演として、本研究内容を発表した。本研究全体として、まず太陽光集光などに用いられる片側ブレーズ型のフレネルレンズの課題を示し、その解決策として両側ブレーズ型を提案した。次に幾何光学的な理論を構築して、収差発生機構を明確に理解できるようにした。さらに波動光学的な評価を試み高精細な光学系での適用限界を導いた。DOEはISO/TC172Optics&Photonics/SC1FundamentalOpticsでも議論が始まっており、これからの光学産業でますます重要になる。本研究は、太陽光集光に限らず光学産業全体に大きく貢献できると考える。地球温暖化問題を解決するために、太陽光などの自然エネルギーの利用が強く望まれている。太陽光をファイバーやガラスロッドなどの光伝送路に効率良く導く光学系が要求されている。しかしながら、従来の集光光学系は必ずしも十分なものではなく、設計理論には不備があった。我々はこの根本的な問題点を見出すとともに、太陽光が軸からずれた時にもより効率良く集光できるように、幾何光学の重要な法則である正弦条件を満足する“特殊なブレーズ形状を持つ太陽光集光フレネルレンズ"の基本解を理論的に見出し、光線追跡によってその正しさを確認している。本研究の目的は、効率的かつ実用的な太陽光集光光学系を、理論的考察および光学設計によって探索するものである。さらに、一般的なフレネルレンズ設計法の改良につなげ、光学技術の発展に寄与するものである。従来、高屈折率法から、軸上の物点に対して位相差変化が保存されるように、片側ブレーズ型フレネルレンズの具体的形状を決めている。しかしながら、この方法で実際に具体的形状を求めてみると、考慮した物点以外では、高屈折率法で得られた収差が再現しない。汎用光学設計ソフトにおいても、高屈折率法で設計されており、その実形状変換の一般的な手法は提供されていない。特許データも高屈折率法で記述されている。我々は、レンズ設計における基本的条件である正弦条件を満足するように両側ブレーズ形状を決めた。この結果、実形状において、光軸上物点だけでなく光軸近傍の物点の収差も十分に再現されている。さらに精密な設計評価を行うため、光学設計ソフトウエアのマクロコマンドの改良を行い。両側ブレーズ型フレネルレンズの設計評価を行った。その結果を学術論文誌光学に投稿し受理された。公開は2016年5月の予定である。また、太陽光集光に限らない一般的なフレネルレンズ実形状設計法の定式化も行った。基本的な考え方が正しいかを多重輪帯モデルをきちんと構築して確認した。数学的議論の吟味も行い、全体成果を学術雑誌「光学」に投稿し受理された。5月に公開されることになっている。論文投稿の段階では、太陽光フレネルレンズに特化して、高屈折率法からフレネル形状を決定する方法までが完成していたが、投稿後には、より一般的にフレネルレンズ形状を決定する手法を理論的に導出し、また理論的整合性を確認した。さらに、論文投稿の段階では幾何光学的な評価だけであったが、波動光学的な評価も行っている。このように基本的な評価の吟味は十分に達成できたと考える。実際に制作することを計画しているが、製造メーカーに打診を行い、概ね計画通りに制作できることを確認し、次年度の制作につなげられると考えている。さらに進んだ設計上の検討を行っている。理論的に解決したいいくつかの課題があり、上手く着手できていない物もあるが、成果の出ているものもある。一つには反射型のフレネルレンズについて理論的な検討を行い、妥当性を光学設計シミュレーションで確認を行った。像面湾曲も治るという面白い成果も見られ、新たな理論的課題が出てきた。このように成果は出ており、概ね順調に推移している。

従来、高屈折率法から、軸上の物点に対して位相差変化が保存されるように片側ブレーズ型フレネルレンズの具体的形状を決めているが、実際に具体的形状を求めてみると、考慮した物点から外れると収差が再現しない。汎用光学設計ソフトにおいても、高屈折率法で設計されており、その実形状変換の一般的な手法は提供されていない。我々は、正弦条件を満足するように両側ブレーズ形状を決めることで、光軸上物点の収差だけでなく、光軸近傍の物点の収差も十分に再現できることを示した。本研究の目的は、効率的かつ実用的な太陽光集光光学系を、理論的考察および光学設計によって探索するものである。さらに一般的なフレネルレンズ設計法の改良につなげ、光学技術の発展に寄与するものである。2015年度には、光学設計ソフトウエアのマクロコマンドの改良を行い、両側ブレーズ型フレネルレンズの全体的な設計評価を行った。また、一般的なフレネルレンズの実形状決定法の定式化を行った。さらに反射部材の場合の基本設計を完了した。2016年度には、両側ブレーズ設計の設計・評価ついて投稿し、学術雑誌「光学」5月号に掲載された。さらにフレネルレンズの一般的な実形状決定法の定式化を行い、それを含めて8月のSPIE年会で報告し評価を得た。両側ブレーズ型、片側ブレーズ型の試作を行った。新たに、面形状を2次曲面で評価する必要性を発見した。ブレーズの影響を検討する中で、「幾何光学的な正弦条件と波動光学的な正弦条件」という、フレネルレンズに限らずに光学系の基本的で重要な性質の本質が明確になった。2016年度には、全体的な評価を学術雑誌「光学」5月号に掲載し評価された。また、フレネルレンズの一般的な実形状決定法の定式化を含めて8月のSPIE年会で報告し評価を得た。さらに両側ブレーズ型、片側ブレーズ型、比較のため平面フレネルレンズの具体的な設計を行い、試作を行った。ただし結像性能の評価は進んでおらず2017年度に行う。反射型フレネルレンズの設計の吟味を行い、論文作成に着手した。波動光学と幾何光学の違いを検討する意味を含めて、輪帯数を変えた時の評価を行った。その中で、面形状を2次曲面で評価する必要性を発見し、その具体的な定式化のための基本方程式は導いたが、解の導出はまだできていない。さらに輪帯の細分化を行う中で、改めて幾何光学的な正弦条件(微分形式)と波動光学的な正弦条件(積分形式)の違いが鮮明になった。これは正弦条件の微分形式と積分形式の違いと捉えることができる。レンズ光学の基本であると考えられるが、我々を含め、多くの設計者研究者はこの違いの重要性に十分気づいていないと考える。フレネルレンズを題材にすることでこのような重要な事実を再認識することができたと考える。以上のように、試作評価は予定から少し遅れているが、外部発表を行い、新たな発見があり、研究はおおむね順調に推移していると考える。地球温暖化問題を解決するために、太陽光などの自然エネルギーの利用が強く望まれ、太陽光をファイバーやガラスロッドなどの光伝送路に効率良く導く光学系が要求されている。しかし、従来の集光光学系は必ずしも十分ではなく、従来の設計理論には不備があるという根本的問題に気付いた。
格差社会における紛争後の平和構築の実態と課題：ペルーの真実委員会と先住民

グローバル化が進行し、国家の平和構築のプロセスは説明責任を含め、国際社会と様々なかたちでかかわる。しかし、国内の多様性や格差は、国際社会からは往々にして不可視のものとなっている。本研究は、深刻な人権侵害等がおこった国において移行期正義と関係して設置される真実委員会と平和構築のプロセスが、人種・民族的要因とどのようにかかわっているか、ペルーの先住民に焦点をあて、フィールドワークをもとに明らかにした。研究への協力を依頼する海外の研究者との打ち合わせをするとともに、ペルー及びチリで調査研究を実施した紛争後の平和構築の一環として、ペルーでは真実和解委員会の提言を受けて集団補償、個人補償、国内避難民への集団補償が計画された。集団補償はほぼ終了し、現在個人補償及び国内避難民への集団補償の基盤となる登録作業がおこなわれている。これについて、政府機関、NGO、被害者へのインタビュー調査を実施し、その実態を現場の視点から把握するとともに、様々な課題があることが明らかにすることができた。さらに、紛争後の秘密墓地の発掘状況、裁判等の進捗状況に関してもインタビュー調査を実施した。別途真実委員会が設置された隣国チリの研究者に、先住民マプチェと独裁政権後の民主化のプロセス及び人権との関係について調査を依頼した。チリでは、民主化以降も軍事独裁政権下で制定された法が、多国籍企業等による土地の収奪に対するマプチェの人々の運動に適用されている例がみられることが明らかになった。ラテンアメリカ諸国は、相対的な政治的安定化を得た後、ネオリベラリズムの政策をとってきており、マクロレベルでの経済指標では、著しい経済成長を示している。しかし、ペルーの事例にもみられるように、この時期と平和構築のプロセスがほぼ並行したが故に、さらなる格差を招き、新たな政治的不安定化の要因を招きつつある。本研究を通じて、人種・民族、経済的に大きな格差をともなう社会において、紛争後の平和構築のプロセスが、国家単位の指標に還元できない、多くの課題を抱えていることを明らかしていく意義は大きい。ペルーの平和構築のプロセスについて、真実和解委員会(真実委員会)と先住民の関係、真実和解委員会による報告書提出後のペルー社会と先住民の関係について調査研究し、人種・民族的不平等及び経済的格差がある社会における平和構築のプロセスの実態と課題を明らかにすることに取り組んだ。紛争時に国内避難民となった人々が形成した地区で、以下に焦点をあてフィールドワークを実施した。調査研究の実施にあたってはペルー問題研究所の協力を得た。また昨年に引き続き、比較検討のため隣国チリの先住民マプチェと真実委員会及び平和構築のプロセスの関係について、チリ国立コンセプシオン大学の研究者に調査研究を依頼した。(1)紛争時の経験、国内避難民となった経緯(2)土地の取得、組織化、教育、インフラ整備のプロセス(3)真実和解委員会、政府機関、NGO等との関係国内避難民は紛争下の1980年代に先住民を中心に多数生じている。「国内避難民」という概念が国際社会で普及したのは80年代後半から90年代に入ってからであり、また被害者がペルー社会で周縁的地位にある先住民に集中していたため紛争当初国内の関心は低かった。このため、国内避難民は紛争下では「移民」として扱われ差別された。ペルーの国内避難民に関する先行研究は、主としてメンタル・ヘルスに焦点をあててきており、本研究は国内避難民の実態を歴史的に紛争後の平和構築との関係にいたるまで調査研究するはじめての試みという点で大きな意義がある。さらに、文化人類学が特異分野とする民族、人種的多様性を視野に入れて、平和構築のプロセスを長期視点から調査研究する本研究は、平和構築や移行期正義を実務及び理論的側面の双方から検討していくうえでの基礎研究として、国際社会への貢献が期待できる点で重要である。◎本年度(2013年)は、ペルー真実和解委員会の最終報告書提出10周年にあたった。このため、ペルー真実和解委員会及び平和構築の評価、進捗状況、記憶化について国際シンポジウム、記念行事等で資料収集をするとともに、研究者及びNGOや政府関係者との意見交換をおこなった。なかでも、移行期正義(transitional justice)の分野で国際的に主導的役割を果たしている国際移行期センター(ICTJ)と、ペルー真実和解委員会の委員であった故デグレゴリ博士が所長を務めていたペルー研究所(IEP)が共催した国際シンポジウムは重要であった。シンポジウムにはICTJの創立メンバーであるフアン・メンデス博士をはじめとする国内外の研究者、もと真実和解委員会委員等が参加した。この他、紛争の被害が最も深刻であったアヤクチョ県で、行方不明者の家族の会がオンブズマン事務所長、人権NGOの代表者等を招き国際会議及びメモリアル式典を開催した。さらに全米ラテンアメリカ学会(LASA)でもいくつかパネルが企画された。◎これまでおこなってきた、アヤクチョ県の国内避難民が形成したバリオ(居住区)の歴史に関する補足調査を実施した。国内避難民の土地取得プロセスに関して、支援にあたった弁護士から重要な証言を得るとともに、住民リーダーから貴重なドキュメントを入手した。インタビューの翻訳分析、資料の分析を進め、これらをもとに英文論文を執筆中である。

紛争後の平和構築については、これまで主にマクロレベルから研究されてきているが、一方で一旦平和構築がおこなわれた社会で再度紛争がおこることが、新たな課題となっている。このため本研究は、対面状況下でのミクロレベルの調査を主たる方法論とする文化人類学の手法を用いて、格差が存在する社会の平和構築の実態と課題について具体的な事例をもとに明らかにする。なかでも近年国際社会において紛争後の平和構築の一環として、移行期正義と関連して設置される例が増えている真実委員会(真実和解委員会は真実委員会として総称される)に焦点をあてている。本研究で事例として扱うペルーは、人種主義が根強く不平等が存在しており、紛争の被害も先住民に集中した。本年度は所属する大学で海外長期研修を取得することができたので、前半の4カ月間はペルーに滞在し、先住民と平和構築の関係について調査研究を実施した。新自由主義政策をとったペルーは、急速な経済成長を遂げている。その一方で、格差が拡大し、かつての紛争地域で麻薬業者とテロ組織が結託した紛争が拡大している。2013年はペルー真実和解委員会の最終報告書提出から10周年を迎えるが、継続的調査、裁判、秘密墓地の発掘調査、補償プログラムのどれもが進展していないことが調査から明らかになった。この背景には制度化の失敗や政治的要因がある。あわせてペルーの国内避難民の地域で継続してフィールドワークを実施してきている。ペルーの国内避難民に関する本格的調査は国際的にみてはじめての試みであり、データとして重要である。後半の8カ月間は、ハーバード大学ロースクール人権プログラムの客員研究員となり、冷戦後の国際社会の平和への取組、動向について、国際人権法、移行期正義に焦点をあて理論的研究をするとともに、国際刑事裁判所や米州人権裁判所と地域紛争の関係について研究をした。現地の機関ペルー問題研究所による協力が、調査研究活動を推進するうえで重要な役割を果たしている。また、研究者のみならず政府関係者、NGO等からも様々な支援を受けることができたことが、研究目的達成に向けて非常に大きな力となっている。25年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は所属する大学の海外長期研修制度を利用して、1年間海外で調査研究を実施することができたため、当初の研究計画を大幅に進展させることができた。前半4カ月はペルーで調査研究を実施し、後半8カ月はハーバード大学ロースクールの人権プログラムに客員研究員として所属し調査研究をおこなった。南米は日本から遠く当該国までの往復だけでも多大の時間と費用を要するが、特に人類学の調査の場合は首都からさらに地方の奥地までフィールドワークに行くことがあり、かつアンデス地域の山岳部での調査研究には高地順応のための時間が必要なので、これまでは大学の様々な業務の合間をぬってまとまった時間をとり調査研究を実施することが困難であった。それ故、今年度は長期研修制度を利用することで、研究計画を大きく進展することができた。
プロリン特異性ペプチダーゼの構造とプロリン特異性発現機構の解明

プロリン特異性酵素のプロリンへの選択的基質特異性発現とオリゴペプチダーゼの機構を、合成基質を使った解析および結晶解析の両面から解明することを計画した。合成基質による研究は、プロリンの5員環に相当する構造を持つ合成基質や阻害剤を作り酵素化学的に研究する。一方、酵素のX線結晶解析を行いプロリン特異性酵素の立体構造を初めて明らかにすることにある。このことにより、変性タンパク質には作用できず、低分子のオリゴペプチドにのみ作用するオリゴペプチダーゼの機構や、このユニークなプロリンへの特異性の機構が明らかになり、細胞内でのペプチドやタンパク質の代謝の生理学的研究や酵素の応用に大きく貢献できると思われる。本年は、(1)プロリンイミノペプチダーゼの結晶化とX線結晶解析を開始した。沈殿剤として20%PEG6000を用い蒸気拡散法で約0.7X0.3X0.3mm^3の正八面体の結晶を得た。結晶学的解析から、空間群はP41212またはP43212格子常数a=b=65.6,c=169.8Aであり、非対称単位中に酵素が1分子含まれることが明らかとなった。(2)合成基質プロリンへの特異性を調べるため、サルコシンやN-メチルアラニンなどプロリン骨格の一部を持つ化合物についてβ-ナフチルアミド基質を合成し、プロリンへの認識部位を検討した。その結果、プロリンの5員環の各辺を認識し、基質特異性が発現していることを明らかにした。(3)更に研究は広めるため、ヒト脳由来のプロリルエンドペプチダーゼをクローニングし、塩基配列を決定した。この遺伝子を大腸菌で発現させ、菌体から酵素を単一に精製した。この酵素を現在結晶化中である。
水圏における有機金属化合物のスペシエ-ションと循環に関する研究

本研究では、GeとAsのメチル化物に着的し、これらの化合物の海洋での動態を考察するための基礎として、水溶液内反応について検討し、スペシエ-ション法の開発を行った。1.モノメチルゲルマニウム(CH_3Ge(OH)_3)、ジメチルゲルマニウム((CH_3)_2Ge(OH)_2)、トリメチルゲルマニウム((CH_3)_3GeOH)および無機ゲルマニウムのハロゲン化物生成反応について詳細に検討し、メチル基が中心Ge原子の錯生成挙動に及ぼす影響を明らかにした。また、有機および無機ゲルマニウムの塩化物の溶媒抽出法による分離法を開発し、ICPー原子発光法によるゲルマニウムの高式度定量法を確立した。しかし、現在のところ海水の分析法を確立するには至っておらず、検討を続けている。2.生物による有機ヒ素合成の重要な中間体であり、還元環境下では化学反応によって生成する可能性があるにもかかわらず、従来分別定量されなかった、モノチメルアルソナス酸(MMA(III);CH_3As(OH)_2)、ジメチルアルシナス酸(DMA(III);(CH_3)_2AsOH)の水溶液内反応について検討した。MMA(III)、DMA(III)は無機As(III)に比べて空気酸化を受けやすいこと、AsーC結合は速度論的に安定であることが分かった。メチルヒ素化合物の水溶液中での溶存種について、NMRおよび液々抽出法によって検討した。その結果、MMA(III)、DMA(III)は、海水中に無電荷のヒドロキソ錯体の形で、一時的な溶存種として存在しうると推定された。さらに、ジエチルアンモニウム・ジエチルジチオカルバミン酸(DDDC)を用いる溶媒抽出法が、3価ヒ素化合物の分離濃縮法として有望であることを見い出した。現在は、DDDCによる分離濃縮と、水素化物発生ー原子吸光法を組み合わせた海水中の3価ヒ素のスペシエ-ション法を開発中である。
CD160を中心とするT細胞レセプター複合体のHVEMに対する新たな分子認識機構

T細胞の活性化は,T細胞上の補助刺激受容体と抗原提示細胞上の補助刺激分子との相互作用(補助刺激シグナル)により,複雑に制御されている.補助刺激分子であるHVEM(ヘルペスウイルス侵入仲介因子)は,活性型受容体であるLIGHT,抑制型受容体であるBTLAにより認識されることが知られている.近年,HVEMの新しい抑制型受容体としてCD160が同定され,CD160/BTLA/LIGHT/HVEM経路として注目されているが,その分子機構は不明であった.補助刺激シグナルは,自己免疫疾患における免疫抑制や腫瘍に対する免疫増強など,免疫療法のターゲットであるため,HVEMとその受容体のシグナルネットワークを明らかにすることは大変重要である.今年度は,表面プラズモン共鳴(SPR)法により,LIGHTとCD160およびBTLAの競合実験を行い,LIGHTがCD160とBTLAのHVEMへの結合に対して競合しないことを明らかにした.前年度までのSPRによる相互作用解析の結果と合わせると,HVEMのCD160とBTLAに対する結合領域は部分的に重なっていると考えられる.CD160単独の結晶化について,二次構造予測等を用いてフレキシブルなN末端あるいはC末端領域を除いて結晶化を試みたが,現在のところ良好な結晶は得られていない.今後,フリーのシステイン残基をセリンに置換したコンストラクトを用いる,糖修飾によるタンパク質の安定性向上を期待してヒト細胞発現系で発現させる,などの工夫をして引き続き結晶化を目指す予定である.抗原提示細胞上の補助刺激分子HVEM(ヘルペスウイルス侵入仲介因子)は,抑制型の補助刺激受容体であるCD160(BY55)とBTLA(B細胞・T細胞減弱因子),活性型の補助刺激受容体であるLIGHTにより認識され,抑制あるいは活性シグナルを伝達することが知られている.HVEMはこの他にも,LTαや単純ヘルペスウイルス(HSV)の表面抗原であるgDと相互作用することが知られており,多数の受容体または抗原により認識される非常に珍しい補助刺激分子であり,近年注目を集めつつある.今年度はHVEMとCD160/BTLA/LIGHTとの相互作用を分子レベルで詳細に解析し,HVEMが持つ多彩な相互作用機能を明らかにすることに取り組んできた.すでに報告されているBTLA結合活性を失ういくつかのHVEM変異体を精製し,CD160, BTLAに対するSPR相互作用解析を行った.その結果,若干の程度の差はあるものの、これらのHVEM変異体がCD160の結合にも影響を与えることを明らかにした.このことからCD160とBTLAのHVEM結合領域は,ある程度オーバーラップしていると考えられる.また,LIGHTを精製し,HVEMとの相互作用解析を行ったところ,LIGHTはCD160やBTLAに比べて強い結合を示した.今後はLIGHTとCD160/BTLAとの競合実験を進めていく予定である.また,CD160単独の結晶化,あるいはHVEMとの複合体結晶化について,これまでに化学修飾(メチル化)を含めて様々な条件下で結晶化を試みたが,現在のところ良好な結晶は得られていない.今後,フレキシブルなN末端・C末端領域を同定し,より結晶化に適したコンストラクトを作製し,結晶化を試みる予定である.T細胞の活性化は,T細胞上の補助刺激受容体と抗原提示細胞上の補助刺激分子との相互作用(補助刺激シグナル)により,複雑に制御されている.補助刺激分子であるHVEM(ヘルペスウイルス侵入仲介因子)は,活性型受容体であるLIGHT,抑制型受容体であるBTLAにより認識されることが知られている.近年,HVEMの新しい抑制型受容体としてCD160が同定され,CD160/BTLA/LIGHT/HVEM経路として注目されているが,その分子機構は不明であった.補助刺激シグナルは,自己免疫疾患における免疫抑制や腫瘍に対する免疫増強など,免疫療法のターゲットであるため,HVEMとその受容体のシグナルネットワークを明らかにすることは大変重要である.今年度は,表面プラズモン共鳴(SPR)法により,LIGHTとCD160およびBTLAの競合実験を行い,LIGHTがCD160とBTLAのHVEMへの結合に対して競合しないことを明らかにした.前年度までのSPRによる相互作用解析の結果と合わせると,HVEMのCD160とBTLAに対する結合領域は部分的に重なっていると考えられる.CD160単独の結晶化について,二次構造予測等を用いてフレキシブルなN末端あるいはC末端領域を除いて結晶化を試みたが,現在のところ良好な結晶は得られていない.今後,フリーのシステイン残基をセリンに置換したコンストラクトを用いる,糖修飾によるタンパク質の安定性向上を期待してヒト細胞発現系で発現させる,などの工夫をして引き続き結晶化を目指す予定である.