hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
網羅的自己抗体検出系による血清胃癌マーカーの開発と臨床応用

癌の細胞株を抗原とし、血清を網羅的にウェスタンブロットすることによって血中の自己抗体をスクリーニングするプロテオーム解析の系を確立した。次に低分化胃癌の細胞株から抽出したタンパク質を電気泳動し、胃癌患者血清と健常人血清を一次抗体とした網羅的ウェスタンブロッティングを行った。その結果、複数のバンドが検出され、質量分析計によってタンパク質を同定したところ、30種類のタンパク質が同定された。合成タンパク質を用いた検証実験において、2種類のタンパク質の検証に成功した。これらは新規の低分化胃癌マーカーと考えられる。1.胃がん培養細胞株からの抗原候補タンパクの抽出:すでに当研究室にて購入した、4種類の低分化胃癌細胞株(OCUM1, NUGC3, NUGC4, MKN45)を培養し、タンパク質を抽出した。2.抽出した細胞株由来のタンパク質をSDS-PAGEによって分離し、そのタンパク質をPVDF膜に転写した。続いて、そのPVDF膜に対して低分化胃癌(por1, por2, sig)の3種類の血清を16症例ずつスクリーナブロッター(サンプラテック社製)を用いてアプライし、血清中に存在すると予想される自己抗体をWestern blotの一次抗体として反応させた。さらに抗ヒトIgG抗体(二次抗体)を反応させ、Western blotを行った。3. 4種類の細胞と3種類の血清検体の組織型、合計12回のWestern blotを行い、より多くのレーンにおいて、共通して検出されたバンドをタンパク質同定の候補としてピックアップした。4.アガロース二次元電気泳動を行い、低分化胃癌細胞株のタンパク質抽出液を分離し、特に3.において反応するバンドが数多く認められた血清検体を一次抗体としてアプライし、再度Western blot(二次元ウェスタン)を行った。3.のバンドと同じ分子量と予測される二次元ウェスタンのスポットをピックアップした。再度同じアガロース二次元電気泳動を行い、二次元ウェスタンでピックアップできたスポットに該当するゲル上のスポットを切り出し、トリプシンを用いてin-gel digestionを行った。これらを複数箇所のスポットにおいて実施した。5.得られたサンプルを用いて質量分析を行い、タンパク質を同定した。転写因子、細胞骨格系タンパク質、シグナル伝達系等のタンパク質でこれまでに癌との関連が報告されているタンパク質が30種類程度同定された。1.前年度までに低分化胃癌細胞株4種類からタンパク質を抽出し、これらに対して16症例ずつの胃癌血清をアプライし、自己抗体スクリーニングのウェスタンブロットを行った。反応するバンドを切り出してタンパク質を質量分析計で同定した。2.質量分析計を用いて同定に成功したタンパク質は約30種類あり、これらに対する自己抗体が新規の低分化胃癌マーカー候補として考えられた。これらのうち(1)転写因子、細胞骨格系タンパク質、シグナル伝達系タンパク質等、発癌や癌の浸潤・転移に関係していると推定されるタンパク質であること、(2)複数の低分化胃癌細胞株にまたがって同定されているタンパク質であること、(3)低分化胃癌でも3種類の組織型のうち2種類以上の患者で反応しているタンパク質であること、(4)リコンビナントの合成タンパク質がコマーシャルに得られるタンパク質であること、を優先条件として絞込みを行った。絞込みの作業によって8種類のタンパク質を選んだ。3.選んだ8種類のタンパク質を電気泳動し、最初のスクリーニングに用いた胃癌16症例の血清と反応させ、バリデーションを行った。その結果、8種類のうち3種類のタンパク質でバリデーションに成功した。4.バリデーションに成功した3種類のタンパク質を抗原としたウェスタンブロットを再度行った。この際に用いた患者血清は最初のスクリーニングに用いた血清とは別セットの32例、および性別・年齢をマッチさせた健常コントロール32例であった。その結果、3種類のタンパク質のうち2種類に対する自己抗体が新規の低分化胃癌マーカー候補として確認されるに至った。
3価イオンを可動種とする新しい、高電荷密度型の固体電解質の開発

組成の異なるYのタングステンブロンを電極に、また、Sc_2(WO_4)_3型構造を有するY_2(WO_4)_3を固体電解質として用いてY^<3+>イオンの濃淡電池を構成し、超電力を測定した。超電力は測定温度に達した後、一定値に達するまで約12時間要した。まず、Y^<3+>の活量が同じY_<0.10>WO_3を両電極として用いたところ、超電力ほぼOmVであった。一方、片側のブロンズ電極をそれぞれY_<0.12>WO_3、Y_<0.14>WO_3に変えて測定したところ、生成する超電力値は24mV、47mVであった。また、Y_<0.12>WO_3およびY_<0.14>WO_3を両電極として用いたところ超電力値は約24mVであり3種の異なるブロンズ間で加算性がほぼ成立した。さらに、ブロンズ電極の組成比の自然対数に対し、超電力値は直線となり、Nernst式の比例関数に良く対応していることもわかる。また、Y_2(WO_4)_3、Er_2(WO_4)_3を固体電解質としてY_<85>Er_<15>、Y_<10>Er_<90>を電極として用いてY、Erそれぞれの濃淡電池を作製し、超電力を測定した。Y_<85>Er_<15>、Y_<10>Er_<90>をそれぞれ左極、右極に、また、固体電解質としてY_2(WO_4)_3を用いた場合には左極に対し+10mV、また、Er_2(WO_4)_3の場合には逆に左極に対し-10mV程度の超電力を生じた。このことにより、Y_2(WO_4)_3は合金中のY濃度の濃淡に対して、また、Er_2(WO_4)_3は合金中のEr濃度の濃淡に対して超電力を生じていることがわかる。以上のことから、Y_2(WO_4)_3、Er_2(WO_4)_3はY、Erの活量差を設けた濃淡電池測定で超電力を生じており、それぞれY^<3+>、Er^<3+>イオン伝導体であることがわかった。
機能を同定した咀嚼筋筋紡錘線維の形態

咀嚼筋筋紡錘求心線維をSChの作用を利用して、筋伸張に対する応答を機能的に分類したのち、それらの中枢投射様態と運動ニューロンにおけるシナプス接合の配列様式をHRP軸索内注入法を併用して光学ならび電子顕微鏡学的に観察し、形態の違いと機能との関連性について検討した。SCh投与後の伸張応答から筋紡錘線維は2群に分類でき、それぞれIa群線維とII群線維に属すると判断した。光学顕微鏡学的には両群線維とも単極型細胞に属し、その幹線維は三叉神経中脳路を下行し、三叉神経運動核(Vmo)の背側にてProbst路を下行する線維と運動根に加わる線維に分岐した。側副枝はそれぞれの線維から分岐し、Vmo、三叉神経上核(Vsup)またはregionhに終止した。側副枝の投射はIa群線維とII群線維で異なった。すなわち、Ia群線維はVsupよりVmoに有意に分布頻度が高いのに対し、II群線維はVmoよりVsupに有意に分布頻度が高かった。またVmoでは、Ia群が中心部に投射したのに対し、II群は辺縁部に終止した。電子顕微鏡学的には両群の運動ニューロンにおけるシナプス接合の分布頻度が異なっていた。Ia群線維は幹樹状突起と遠位樹状突起に分布する頻度が同程度であったが、II群線維の大部分は遠位樹状突起に分布した。以上から、咀嚼筋筋紡錘求心線維は、SCh投与後の伸張応答を分析することにより2群(Ia群線維とII群線維)に分けることができ、両群の筋紡錘線維における中枢投射様態と咀嚼筋運動ニューロンにおけるシナプス接合の配列様式に違いが認められた。
空洞膨張論を用いたジオグリッド補強土の応力・変形分布の予測に関する研究

本年度は,昨年度に引続いて,初期鉛直応力および補強材形状の異なる引抜き試験を実施し,補強材の引抜きに伴う鉛直応力の増加特性について検討した.そして,引抜きに伴うすべり面上の垂直応力増加に起因する補強メカニズムを提案した.提案メカニズムを検証するために,補強材を引抜きながら供試体の二軸圧縮を行う二軸圧縮・引抜き試験を実施した.試験結果に基づいて,引抜きが生じる場合のせん断強度の増分を定量的に評価した.その結果,得られた主な知見は以下の通りである.1.初期鉛直応力および補強材形状が異なる場合においても,補強材の引抜きに伴う鉛直応力増分は,補強材から離れるほど小さくなる指数関数で近似することができる.2.二軸圧縮・引抜き試験におけるせん断強度は,無補強,補強材を敷設しただけの場合,補強材を引抜いた場合の順で大きくなる.本試験においては,補強材の引張り力が供試体のすべり面に直接影響しないように敷設したため,破壊線は原点を通る直線として得られた.3.補強材を引抜いた場合の破壊時における補強材とアルミ棒積層体の平均相対変位は,引抜き試験の破壊時の引抜き変位よりも大きく,二軸圧縮・引抜き試験の破壊時においてもすべり面上の垂直応力は十分に増加していると考えられる.一方,補強材を敷設しただけの場合のせん断強度も,無補強の場合よりも大きい.ただし,平均相対変位が小さいにもかかわらず,せん断強度の増分は比較的大きい.4.提案した補強メカニズムに基づいて,引抜き試験の結果からせん断強度の増分を予測した.リブ有り補強材の場合には,提案した補強メカニズムによりせん断強度の増加を評価することができる.本年度は,まず,既存の二軸圧縮引抜き試験装置を用いて,供試体初期高さ,応力・変形状態および補強材の種類を変えた引抜き試験を実施し,鉛直応力の分布を測定してデータの蓄積を行った.そして,空洞膨張論を用いて鉛直応力分布を予測する手法について検討した.次に,補強材を敷設したアルミ棒積層体の供試体に対して,補強材を引抜きながら供試体の二軸圧縮を行う二軸圧縮・引抜き試験を考案し,試験方法の確立について検討した.得られた主な知見は以下の通りである.1.ジオグリッドなどの横リブを模擬したリブ有り補強材とリブ無し補強材の2種類の補強材を用いた.リブ有り補強材の方がリブ無し補強材よりも鉛直応力の増加が大きい.2.初期供試体高さの異なる引抜き試験において,高さが小さい供試体ほど鉛直応力増分が大きく,高さが小さいほど増分は小さくなった.このことから,補強材近傍において鉛直応力が局所的に増加し,補強材から離れるほど鉛直応力増分は小さくなると考えられる.3.引抜き試験結果に空洞膨張論を適用するために,応力伝播を算定する際のパラメータの一つである肉厚円筒の内径の大きさをフィッティングパラメータとすることを提案し,試験結果と比較することによりその手法の有効性を示した.4.二軸圧縮・引抜き試験を実施するにあたり,アルミ棒積層体の内部摩擦角はφ'=21.9°であり,すべり面の角度はα=45°+φ'/2=56.0°と求まる.そこで,すべり面に及ぼす補強材の影響を小さくするために,補強材は下端面から5cmの位置に敷設することを考案した.本年度は,昨年度に引続いて,初期鉛直応力および補強材形状の異なる引抜き試験を実施し,補強材の引抜きに伴う鉛直応力の増加特性について検討した.そして,引抜きに伴うすべり面上の垂直応力増加に起因する補強メカニズムを提案した.提案メカニズムを検証するために,補強材を引抜きながら供試体の二軸圧縮を行う二軸圧縮・引抜き試験を実施した.試験結果に基づいて,引抜きが生じる場合のせん断強度の増分を定量的に評価した.その結果,得られた主な知見は以下の通りである.1.初期鉛直応力および補強材形状が異なる場合においても,補強材の引抜きに伴う鉛直応力増分は,補強材から離れるほど小さくなる指数関数で近似することができる.2.二軸圧縮・引抜き試験におけるせん断強度は,無補強,補強材を敷設しただけの場合,補強材を引抜いた場合の順で大きくなる.本試験においては,補強材の引張り力が供試体のすべり面に直接影響しないように敷設したため,破壊線は原点を通る直線として得られた.3.補強材を引抜いた場合の破壊時における補強材とアルミ棒積層体の平均相対変位は,引抜き試験の破壊時の引抜き変位よりも大きく,二軸圧縮・引抜き試験の破壊時においてもすべり面上の垂直応力は十分に増加していると考えられる.一方,補強材を敷設しただけの場合のせん断強度も,無補強の場合よりも大きい.ただし,平均相対変位が小さいにもかかわらず,せん断強度の増分は比較的大きい.4.提案した補強メカニズムに基づいて,引抜き試験の結果からせん断強度の増分を予測した.リブ有り補強材の場合には,提案した補強メカニズムによりせん断強度の増加を評価することができる.
ダイズの葉における窒素の蓄積容態および再転流が子実生産への影響の解明

ダイズの葉においては、窒素濃度は子実肥大開始期に最大に達し、以降減少していくことから減少分の窒素は子実に再転流されたと考えられた。このように葉からの再転流窒素は、品種によって大きく異なったが、再転流窒素量多くても必ずしも子実収量が高いとは限らなかった。逆に品種タマホマレにように、再転流窒素がもっとも少なかったが、子実収量は比較的高かったことから、タマホマレでは子実肥大開始後の窒素どうか能力が高いことが示唆された。この仮説を確かめるため、培養液栽培実験より開花後及び子実肥大開始後に培養液の窒素濃度を高めた結果、再転流窒素に依存性の高いサチユタカでは、開花期の高窒素処理により、また、再転流窒素に依存性の低いタマホマレでは子実肥大開始後の高窒素処理によって子実収量が有意に増加した。このような品種間差異は、圃場実験における追肥実験でも同様な結果が確認された。したがって、本研究課題の成果により、ダイズの窒素同化及び利用機構の品種間差を考慮し、今後のダイズの多収栽培における窒素肥料管理に応用できると期待される。本年度では、ダイズの葉における窒素の貯蓄形態、およびその転流が子実生産に及ぼす役割を解析した。葉の全窒素含量が最も高いR5期における葉内窒素の形態は80%エタノール不溶性窒素(主にタンパク態)が最も多く、その割合は80%以上であった。次にアミノ酸態窒素(約7%)、硝酸態窒素(3%)及びウレイド態窒素(3%)の順であった。次に、供試した4品種において、葉内全窒素濃度は開花期(R1)から子実肥大開始期(R5)まで高く維持されたが、その後徐徐に減少し、子実肥大中期(R6)以降は急速に低下した。品種間ではタマホマレの葉内全窒素濃度は他の三品種よりかなり低かった。各品種葉内全窒素濃度の最高値と最低値の差を葉から子実に転流した窒素分であると考えた場合、子実内の全窒素量に占める葉から転流した窒素の割合はフクユタカ、アキヨシおよびサチユタカでは18%以上であったのに対し、タマホマレでは明らかに低く約14.50%であった。このことから、タマホマレでは葉の窒素含量が低く、子実肥大期において葉からの転流窒素よりも土壌からの吸収窒素への依存度が高いと考えられた。以上の結果を要約すると、ダイズの葉においては、子実肥大開始までは多くの窒素が蓄積され、子実肥大の進行に伴って、その蓄積窒素は、子実に転流されていると考えられた。このように葉から転流した窒素が子実に集積された全窒素の約1726%と品種によってかなり異なったが、転流量の少ない品種では、必ずしも子実収量は低くないことから、子実肥大期間中に土壌から多くの窒素を吸収しているものと推察された。前年度では、ダイズにおいて子実肥大期までに並に葉に窒素を蓄積し、その蓄積量には品種間差がみられた。また、葉への窒素蓄積量が少なくても高収量が得られたのは、子実肥大期において窒素の吸収能力が高いのではないかと考えられた。そこで、本年度では子実肥大前に葉への窒素蓄積の多少が対照的な2品種を用い、ポット栽培ダイズ植物に開花後種々窒素濃度の培養液を給与した。その結果、子実肥大開始前の窒素給与に対し、窒素をよく蓄積する品種サチユタカでは莢数および子実重は窒素濃度の増加に従って増加したが、窒素蓄積が低いタマホマレでは明瞭な反応が見られなかった。しかし、子実肥大開始後の窒素給与に対し、タマホマレでは莢数および子実収量は窒素濃度の増加に従って著しく増加した。サチユタカは子実肥大前に給与された窒素を吸収・蓄積し、子実肥大開始後に子実への転流によって収量増加をもたらしたのに対し、タマホマレは、子実肥大開始後に給与された窒素を効率よく吸収し子実肥大に利用したものと推察された。最終的な子実収量は前年度の圃場実験同様、タマホマレの方で高かったことから、葉に窒素を多く蓄積する品種が多収になるとは限らなかった。

今後、子実肥大前の窒素蓄積能力、ならびに子実肥大開始後の窒素吸収能力の両方が高い素質を持ち備える品種で収量ポテンシャルが高いのではないかと仮説を立て、多くの栽培品種を使って確かめていきたい。前年度までは、ダイズにおいて子実肥大のための窒素供給は、それまでに葉に蓄積された窒素の再転流および子実肥大期間中に根による窒素の吸収によって満たされていることを明らかにし、また、葉への窒素蓄積には品種間差があり、窒素蓄積量が少なくても高収量が得られた品種は、子実肥大期において窒素の吸収能力が高いのではないかと考えられた。そこで、子実肥大期に高濃度の窒素溶液を供給したところ、子実肥大期に窒素同化能力の高いと思われる品種タマホマレにおいては著しい収量の増加が確認された。本年度では、ダイズ開花後の窒素同化能力と子実収量の関係をより明らかにするため、国内外のダイズ10品種を圃場で栽培し、葉よりの窒素の再転流と子実収量の関係を解析した。同時に窒素同化パターンの異なるサチユタカとタマホマレについて、開花期および子実肥大開始期に窒素追肥を行い、子実収量への効果を調査した。その結果、ダイズの子実収量は、子実肥大開始時の葉の窒素含量とは相関がなく、その後の葉より子実への転流量とは高い正の相関関係がみとめられた。また、子実肥大前の窒素追肥は主に栄養成長に、子実肥大開始後の窒素追肥は主に子実成長に影響があったことから、これまでの開花期追肥の低効率性を説明できるのではないかと考えられた。なお、子実肥大期の窒素追肥は、その時期に窒素同化能力の高い品種においてより高い効果を期待されたが、今回用いた両品種には明瞭な差はみられなかった。この点について今後さらに検証していく必要があると考えられた。葉における窒素蓄積の実態を突き止められ、それが収量に対する影響も明らかになった。24年度が最終年度であるため、記入しない。異なる時期の窒素給与試験により、ダイズでは品種によって効果的に窒素を同化する時期が異なることを明らかにした。この結果の応用として、今後のダイズ栽培において品種の特性に応じた施肥技術につながることが期待される。
CRISPRによるB型肝炎ウイルスの排除

B型肝炎ウイルス(HBV)は、世界に3億5千万人のキャリアが存在し、B型肝炎や肝硬変、肝癌に進展する。肝細胞核内に存在しているHBV covalenty closed circular DNA (cccDNA)を駆除する治療薬、治療法は確立されていない。CRISPR/Cas9システムは、HBV cccDNAの排除を達成するために有効な治療技術となる可能性がある。本研究では、CRISPR/Cas9システムだけでなく、CRISPRiによってHBVプレゲノムRNAの転写、HBs抗原, HBe抗原の産生を抑制できることを明らかにした。B型肝炎は、B型肝炎ウイルス(Hepatitis B Virus, HBV)の感染によって引き起こされる。慢性B型肝炎の治療としては、現在抗ウイルス薬やインターフェロンによる治療が行われているが、HBs抗原陰性、HBV DNA陰性になった場合でも、核内にHBV cccDNAが存在するような潜伏感染が報告されている。そこで本研究では、HBV DNAの完全排除、複製・粒子形成の抑制を目的として、ゲノムエディティングツール(CRISPR/CAS9)によるHBV DNAの切断、配列特異的転写抑制システム(CRISPRi)によるHBV遺伝子の発現抑制を試みた。本年度は、初めにCRISPRベクターの構築を行った。切断のためのCAS9を発現するベクターに、HBV pregenome (pg) promoter、polymeraseの領域で、ジェノタイプ間で保存性の高い配列を4か所ずつ選択し挿入した。転写抑制のためのdCAS9を発現するベクターには、HBV pg promoterに8か所、Enh1/Xpに2か所、PreS1 promoterに2か所、PreS2/S promoterに1か所を選択した。次に、HBVへの効果および細胞障害性を検討した。HBV発現プラスミドを導入したHuH-7細胞、HBV持続感染細胞(HepG2.215, HuH-7/pEB-HBV)にCRISPRベクターのトランフェクションを試みた。その結果、pg RNAコピー数がコントロールに比べて2割程度に減少する配列を見出した。また、イムノブロット、ELISAによりHBs、HBe抗原の消失または有意な減少が認められた。Luciferase reporterによるpg promoter転写活性を解析したところ、genotypeによらず効果的に転写抑制できる配列を明らかにした。これらのCRISPRシステムによる細胞障害性はみられなかった。慢性B型肝炎の治療として、現在抗ウイルス薬やインターフェロンによる治療が行われているが、血中のHBs抗原陰性、HBV DNA陰性になった場合でも、核内にHBV covalenty closed circular DNA (cccDNA)が存在するような潜伏感染が報告されており(オカルトHBV)、cccDNAを駆除する治療薬、治療法は確立されていない。そこで、cccDNAの完全排除、複製・粒子産生の抑制を目的として、CRISPR/Cas9およびCRISPRiによるHBVウイルス排除の試みた。昨年度はCRISPR/Cas9による切断によりpregenome (pg)RNAコピーを1520%に低下させ、pgプロモーター活性を2028%に低下できることを明らかにした。本年度は、CRISPRiによるHBV RNA転写抑制を試みた結果、pgRNAコピーを約38%に、pgプロモーター活性を418%に低下させるできた。またEnh1/Xプロモーターの転写抑制により培養上清中のHBs抗原は36%、HBe抗原は48%に低下させることができた。また、HuH7/pEB-HBV、HepG2.2.15細胞に組換えレンチウイルスを感染させ検証した結果、HBV pgRNAコピーを43%(GT Ae)、38%(GT Bj)、60%(GT Ce)、34%(GT D)に減少させることができた。本研究では、CRISPR/Cas9システムだけでなく、CRISPRiによるHBV RNAの転写抑制、HBs抗原, HBe抗原の産生抑制を示した。今後、肝臓への遺伝子デリバリー技術革新、CRISPR/Cas9システムの改良により、より効果的で安全な治療法となることが期待される。本年度は、1)CRISPRベクターの構築、2)ノックアウト効率の検討、3)細胞障害性の検討、4)宿主の遺伝子発現への影響の解析、5)染色体への影響、の5項目を計画していた。1、2、3について予定通り達成できた。4、5については到達できなかったが、次年度に予定していた転写抑制のためのdCAS9のベクターについても13の項目を行うことができた。研究期間全体での実施項目の達成度、また成果は着実に得られている。ウイルス学次年度は、1)宿主の遺伝子発現への影響の解析として、CRISPRベクターの細胞内導入、発現が宿主の遺伝子発現にどのような影響があるの検討を行う。

そのためにHepG2およびHepG2.215細胞にCRISPRベクターを遺伝子導入し、宿主のmRNA(non-codingを含む)およびmiRNAなどの発現プロファイルをマイクロアレイ解析により比較検討する。2)染色体への影響の解析として、トランスファクション後に、HBV DNAではなく宿主ゲノムに変異が導入されているか否かを次世代シーケンサーにより解析する。3)他の細胞種および動物実験による効果の検討として、HBVが持続的に感染するヒト初代肝細胞(PHH)およびHepaRG細胞を用いて、HBV cccDNAのノックアウト、HBV遺伝子の転写抑制の効果を確認する。将来的には、HBV感染ヒト肝臓キメラマウスにおいて、hydrodynamic injectionによりベクターを導入し、in vivoにおいてHBV cccDNAの効果的な除去が可能かどうかを検討する。
疫病菌交配ホルモンの受容体探索とシグナル伝達の解析

作物感染性の疫病菌は有性生殖を行うことで耐久性と遺伝的多様性を獲得した有性胞子を作るため、その有性生殖の分子メカニズムの解明は農林業分野にとつて疫病菌制御に繋がる重要課題である。疫病菌の有性生殖は交配ホルモンにより誘導されるので、ホルモンの受容体と生合成酵素の同定は疫病菌有性生殖の分子基盤の確立に繋がる極めて重要な課題である。これまでの生化学的研究(タンパク質レベル)では、ホルモン受容体候補となる特異的に結合するタンパク質の検出、ホルモン合成酵素の抽出は、いずれも成功しなかった。そこで、この課題を解決するためトランスクリプトーム解析を基盤にした研究を進めた。2種の疫病菌Phytophthora nicotianae, P. capsiciの6菌株について、ホルモン応答性(受容体探索用実験)およびホルモン生産性(生合成酵素探索用実験)を調べ、発現解析に適した菌株を選抜した。これら菌株からRNAを抽出し、次世代シーケンサーを用いたRNA-Seqを行った。発現差解析によりホルモン感受性の高いサンプルで発現量が数倍高い遺伝子を探索した結果、数百の受容体候補遺伝子がヒットした。そこで、ホルモンの脂溶性から受容体のタイプが核内受容体(転写因子)であると仮定してさらに絞り込んだ結果、受容体候補を数個に絞込むことができた。一方、ホルモンを多量に分泌する株、ホルモンを産生しない株で発現差解析を行い数百の候補遺伝子がヒットした。生合成酵素はシトクロームP450(CYP)の可能性が高いので、ホモロジー検索で候補遺伝子をさらに絞り込み、有望なく保遺伝子を数個特定した。今後、リアルタイムPCR、遺伝子ノックダウン、候補遺伝子異種発現などの実験により受容体、生合成酵素の特定を目指す。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。1.疫病菌交配ホルモン受容体の探索前年度までに2種のα1蛍光プローブで受容体分布の観測を試みたが成功しなかった。そこで当該年度は、脂溶性の低い第3のプローブα1-PEG-Alexa488を合成して同様の実験を行ったが、やはり菌体全体(おそらく細胞壁)が非特異的に染色された。さらに消化酵素を使って菌体からプロトプラストを作成して全てのプローブで蛍光染色を試みたがA2交配型選択的な染色は観測できなかった。次に蛍光プローブの受容体に対する親和性が低いことが原因と考え(実際ホルモン活性は低い)、光親和性プローブを合成し、菌体から抽出したタンパク質と反応させ、電気泳動で解析した。しかし、やはり特異的結合タンパクを見出すことはできなかった。2.交配ホルモン生合成酵素の特定交配ホルモンα2はA2交配型がphytolを原料に生合成することが判明しているので、A2交配型はα2生合成酵素(おそらく水酸化酵素)をもつ。そこで、A2交配型の菌体からタンパク質を粗抽出し、phytolを添加してα2の生成を高感度LC/MSにより解析した。しかし、その生成は検出限界以下(液体培養時の約1/10以下)であった。そこで、粗タンパク液の代わりに菌体そのものを用いて生合成酵素活性を調べた。様々な条件を検討した結果、菌体を純粋中でphytolとインキュベートすると通常培地を凌ぐ高率でα2を生成することがわかった。したがって今後、菌体破砕物から粗抽出タンパクへと生合成酵素を絞り込むことができると期待される。さらに、生合成中間体と考えられる2種のモノ水酸化phytolの生成をLC/MSで観測できたことから、α1はphytolの2段階の水酸化で生成することが示唆された。1.疫病菌交配ホルモン受容体の探索前年度までに3種のα1蛍光プローブ、アフィニティー精製用ビーズ、光親和性プローブを合成して受容体の探索を試みたが、α1受容体をもつA2交配型特異的なタンパク質を検出できなかった。この要因として受容体タンパク質の発現量の低さが考えられたので、戦略を転写レベルでの発現解析に変更した。これまでに、保有する約70株の疫病菌の対峙培養試験の結果からホルモン感受性・非感受性株を6種類選定し、大量培養、RNA抽出・精製を進めている。一方、α1のホルモン活性がα2により阻害される、すなわちα2はα1のアンタゴニストである、ことを偶然発見し、α2もα1と同等の強さでα1受容体に認識されるというモデルを提唱した。このことはα2プローブを用いてα1受容体を探索できることを示唆する。2.交配ホルモン生合成酵素の特定前年度までに、α2生合成酵素をもつと考えられるA2交配型からタンパク質を粗抽出し、phytolからα2の生成を高感度LC/MSにより解析したが、成功しなかった。そこで、菌株を精査した結果、phytolを直接α1まで高効率で変換する株が見つかった。そこで、この株から粗タンパク質を抽出してこの変換をin vitroで確認したが、α1の生成は検出できなかったものの、粗タンパク液にα2を添加すると極微量ではあるがα1の生成を確認できた。ただ、その活性は菌体そのものを用いた時の数%しかないため酵素の精製には至っていない。また、菌体を純水や緩衝液中でphytolとインキュベートするだけで高率でα2を生成するのに対し、菌体をわずか数回すりつぶ程度のホモジナイズで失活したことから、生化学的解析は断念することとした。現在は受容体探索と同様に転写レベルでの発現解析を進めるべく菌株の選定作業を進めている。

交配ホルモン受容体に関しては、α1受容体の同定を目的にα1蛍光プローブ、アフィニティー精製プローブ、光親和性プローブを合成し、菌体抽出タンパク質中の受容体の検出を前年度同様試みてきたが、いずれの実験でも残念ながら受容体の存在自体を確認できておらず、達成度は満足のいくものではない。こうような結果を受けて、下記のように今後の戦略の練り直しを行い、準備を開始している状況である。生合成酵素の探索では、菌体抽出粗タンパクにα2合成活性は見出しておらず、菌体を少しでもすりつぶすと酵素活性が失活することが判明したので、達成度は満足のいくものではない。また、菌株を変更することで僅かではあるがα2からα1への変換、すなわちα1生合成酵素活性をin vitroで確認できたものの、この低い変換効率では酵素精製の見込みは低いと判断しており、このような結果を受けて下記のような方策で引き続き生合成酵素探索を継続する。作物感染性の疫病菌の多くは有性生殖を行い、薬剤耐性化など悪性化の要因とされる。この有性生殖は交配ホルモン(α1とα2)により開始されることから、本研究課題ではホルモン受容体の同定と下流シグナル伝達機構、ホルモン生合成機構を解明することで、疫病菌有性生殖の分子基盤の確立を目指す。これまで生化学的アプローチによりα1受容体の探索とα2生合成酵素について検討してきたが成功しなかった。そこで平成29年度はトランスクリプトーム解析を基盤にした研究を進めた。(1)菌株の選択:疫病菌保存株約70について、ペーパーディスク法によるホルモン応答性(受容体の発現レベルの指標)と液体培養とLC/MS定量法によるホルモン生産性(生合成酵素の発現レベルの指標)を継時的に調べた。その結果、ゲノム情報が入手できる2種についてホルモン応答性・生産性の高低に着目して、P. nicotianaeの4株とP.capsiciの3株を選択した。(2)次世代シーケンサーによるRNA-Seq解析:培養日数の違いも含めてP. nicotianaeの菌体7点とP.capsiciの菌体6点からtotal RNAを抽出し、計13試料のRNA-Seq解析を行った(理研へ依頼)。シーケンシングにおけるリード数は1試料あたり2,400万-3,200万、ゲノムへのマッピング率は86-92%であった。また、発現比較解析は21ペアについて行い、その内訳はP. nicotianaeでα1応答の有無4ペア、α2応答の有無7ペア、α1生産性の有無1ペア、α2生産性の有無1ペア、P. capsiciでα1応答の有無2ペア、α2応答の有無2ペア、α1生産性の有無2ペア、α2生産性の有無2ペアであった。現在、受容体・生合成酵素の候補遺伝子の絞込みを進めている。研究期間の前半2年間において、受容体タンパク質および生合成酵素を直接捉えるべく研究を進めてきたが、おそらくタンパク質の発現量の低さや不安定さが原因で生化学的アプローチは極めて困難であることが判ってきた。そこで、平成28年度の途中でトランスクリプトーム解析へと大きく方針転換をした。最近、次世代シーケンサーによる1回目のRNA-Seq解析を達成し、受容体・生合成酵素の候補遺伝子の絞込みがスタートしたばかりである。
ボールエンドミル加工における表面キャラクタリゼーションに関する研究

ボールエンドミル加工における表面粗さ生成メカニズムを理論解析するとともに、垂直切削、傾斜切削時に工具切刃の諸元・工具軸傾斜方向・傾斜角度・切削条件・切削油などが表面粗さに及ぼす影響を実験的に研究し、次の結論を得た。1.被削材が転写性に及ぼす影響:被削材の種類によって表面粗さ、加工面の紋様が大きく異なる。最も転写度、表面粗さが良好であったMg合金が理論解析の検証用材料としては最適な材質で,黄銅、アルミニュウムがこれに次ぐ。2.垂直軸切削:切削送り速度、ピックフィード量により表面粗さが異なる。中心切刃軌跡から僅かに離れた点で最も悪くなる。加工面の紋様はボールエンドミルの種類で異なり、表面粗さと相関性がある。ピックフィード方向は左がよい。3.傾斜軸切削:切削送り方向表面粗さは工具傾斜方向が前頃斜、後傾斜時によく、ピックフィード方向の表面粗さは左傾斜、右傾斜が良好。工具傾斜角度が大きくなると、切削送り方向表面粗さは前傾斜、後傾斜がよくなり、左傾斜、右頃斜は悪くなる。ピックフィード方向表面粗さは、この逆となる。また,ねじれ角の大きい工具ほど表面粗さがよい。4.工具切刃の位相差が及ぼす影響:工具切刃の位相差が表面粗さに及ぼす影響は垂直軸切削では低い。5.切屑生成について:切屑のカール直径が小さく、巻き数が多い切刃諸元ほど良好な表面粗さが得られる。6.退行切削現象について:退行現象はMg合金より、プリハードン鋼で鮮明になる。切削送り速度が2.0mm/revになるとMg合金でも退行現象によるムシレが発生する。プリハードン鋼では、バニッシ作用の痕跡も認められる。7.一方向切削と双方向切削との比較:切削方向表面粗さは、双方向送り切削の方がよい。ピックフィード方向表面粗さは、Mg合金では双方向送り切削がよいが、プリハードン鋼では一方向切削がよかった。8.MQL切削の適用効果:ブレードル油を12cc/min供給してプリハードン鋼を切削し、工具寿命が約1.4倍延びた。当初計画ではシミュレーション後切削実験を行うことにしていたが、実際に切削を行わないと切削現象を明確に捉えられないと考え、順序を変更し第一ステップは垂直軸加工で従来被削性がよいと言われている被削材を7種類選定し直径10mmのボールエンドミル工具で平面加工を行い、表面粗さ、むしれ、工具軌跡の鮮明度を測定し、転写性を定義して転写性の定量化を試みた。被削材(1)マグネシュウム合金(AZ31)、(2)快削黄銅(C3713)、(3)黄銅(C2801)、(4)無酸素銅(C1020)、(5)ジュラルミン(A2017)、(6)ジュラルミン(A2017T-351)、(7)高力アルミニュウム(A5052)を旋盤の刃物台上に取り付け、旋盤主軸にボールエンドミル工具を装着して切削実験を行った。

この結果、転写性は上記序列の如くマグネシュウム合金が最もよく高力アルミニュムが最も悪いことが判明した。また、むしれ、工具軌跡の鮮明度の感性評価を基にした転写度と表面粗さは相関度が高いことが分かった。従来このような実験用材料として快削黄銅やアルミニュウムが使用されるケースが多かったが、理論解析と対比するにはマグネシュウム合金が最適と思われる。第二ステップは、傾斜軸加工を採り上げ工具傾斜方向、傾斜角度、ピックフィード方向が切削方向及び切削送り方向の表面粗さに及ぼす影響を旋盤主軸にユニバーサルアタッチメントを装着して切削実験を行った。被削材は、第一ステップで最適材料と判定したマグネシュウム合金とプラスチック金型にもっともよく使用されているプリハードン鋼(商品名NAK55)を被削材を使用した。実験結果は、(1)切削送り方向の表面粗さは、工具軸傾斜方向は前傾斜がもっともよく、傾斜角は大きい方がよかった。(2)ピックフィード方向の表面粗さは、工具軸傾斜方向は、右傾斜が左傾斜よりややよく、傾斜角は10゚程度がよかった。(3)ピックフィード方向は、切削送り方向、ピックフィード方向とも切削送り方向にたいして左方向がよかった。(4)マグネシュウム合金とプリハードン鋼とも同様の傾向であった。シミュレーション及び加工変質層は結果を出すまでに到っていない。平成12年度の研究で理論解析結果を切削実験で実証するには転写性が良好なマグネシュウム合金が適していることを報告した。本年度はこのマグネシュウム合金とプラスチック金型に多用されるプリハードン鋼を被削材とし、旋盤主軸にユニバーサルアタッチメントを装着してボールエンドミル工具軸を垂直乃至傾斜させて一方向切削した場合の表面粗さについて研究した。また、マシニングセンタで高速切削して同様の実験を行い、シミュレーションとも対比した。この結果、切削方向の表面粗さを最小にするのは、工具傾斜方向は前傾斜乃至は後傾斜で、工具軸傾斜角度が5°前後に最適傾斜角があることが分った。また、ピックフィード方向の表面粗さが最小になるのは、工具軸傾斜方向は左傾斜乃至右傾斜で、工具軸傾斜角度は切削方向表面粗さと同様5°位に最適傾斜角がある。ピックフィード方向は、従来報告されているように左ピックフィード方向切削が右ピックフィードよりも良好であるが、切削ポイントにおける真のすくい角が大きくなるためと考えられる。工具切刃部形状も3種類変えて実験したが、切刃部の形状・チップポケットの大きさなど切屑生成がスムースなものほど表面粗さが良好なことが分った。また、垂直軸切削と傾斜軸切削の場合では、表面粗さが最小になる工具形状が異なることも分った。このことは、切屑のカール半径が小さいほど流れ形切削となり、表面粗さが良好となる結果と符合しており、切屑生成機構が鍵を握っている。ボールエンドミル切削は三次元切削なので複雑であるが、サイドカッターを用いた二次元切削における切屑生成機構より類推できる。加工変質層については、プリハードン鋼でも顕著に観察できず、今後の課題としたい。平成13年度の研究で、プラスチック金型に多用されるプリハードン鋼のボールエンドミル工具軸を傾斜させた一方向切削の場合、切削方向の表面粗さとピックフィード方向の表面粗さとも最適傾斜方向と最適傾斜角が存在し、工具の中心切刃形状・シンニング量など表面粗さに及ぼす因子の効果がかなり明らかになった。本年度は従来の研究成果を同時5軸加工に適用する際ベースデータとなる双方向切削、即ち往復切削において被削材をMg合金、プリハードン鋼とした場合に、工具傾斜方向、傾斜角度を変えて切削を行い表面粗さなどの表面特性を一方向切削と双方向切削に対し比較検討した。この結果、切削送り方向
グラフェンを用いたGaN表面安定化の研究

未結合手をもたない原子層オーダーの薄いグラフェン表面保護膜をGaN表面に形成する構造を提案し、GaN系電子デバイスの高駆動力化、高速化、高集積化を推進すること目的とする検討を行った。SiC基板上から転写することによる数ミリ角の大面積高品質グラフェン膜の形成、および酸素プラズマを用いたエッチング技術の確立を達成し、グラフェンを介在したショットキー電極で障壁高さが低下することを示した。H21年度は炭素薄膜を電子ビーム蒸着法により堆積することに注力した。蒸着源にHOPG(Highly Oriented Poly Graphite),及びアモルファスカーボンを用いた場合、いずれも0.1Åの低レートで蒸着が可能であることが分かった。電気的測定の結果から、少なくとも膜厚10Å以上で連続した膜を堆積出来る事が確認できた。膜質はas-depositedで高抵抗なアモルファスカーボンである。熱処理によって結晶化が進み導電性を示した。700°Cの熱処理で炭素膜のシート抵抗が極小値となった。金属/炭素薄膜界面の接触はTi,Ni共にオーミック特性を示した。金属/炭素薄膜/GaN,AlGaN/GaN HEMT構造では整流特性を示しNi電極での障壁高さは0.525eVであった。電流-電圧特性に金属の仕事関数依存性がみられ、炭素薄膜のバンド構造が金属に近いものであると推測された。一方、デバイス特性の評価においては、AlGaN/GaN HEMTのチャネル近傍に炭素が存在する場合、電流コラプスへの影響を測定した。炭素はGaN層の高抵抗化を実現するが。電流コラプスを増大させるという結果を得た。今後はさらにこのデバイスを炭素で表面保護し同様な評価を進める。これらの結果を、応用物理学会講演会、International Conference Nitride Semiconductors-8(ICNS-8)で報告した。H22年度はグラフェン膜をGaN基板上に転写法で堆積することに注力した。SiC基板を真空中で加熱し表面にグラフェン膜が形成された試料にTi薄膜、およびPMMA膜を形成しグラフェン膜を引きはがした。その後、グラフェン膜をn-GaN基板上に圧着し、Ti,及びPMMA膜を除去することにより、世界で初めてGaN上転写に成功した。ラマン分光法測定により、転写されたグラフェンの厚さは1-2原子層であり、良好な膜質が得られた。転写されたグラフェン膜の大きさは50μm大であり、簡易的な膜評価、素子形成が可能なレベルに達した。この結果を受けて、Ni電極を蒸着し、Ni/グラフェン/n-GaN構造のショットキーダイオードを作製した。Niとn-GaN界面にグラフェンが挿入されることによりエネルギー障壁高さが0.38eVも低下した。この結果は低接触抵抗オーミック電極を形成できる可能性を示すものである。この結果をグラフェンで初めての国際会議であるグラフェン2011(スペイン・ビルバオ4月11-14日)に投稿し、採択された。また、継続して行っている金属/半導体の光電評価、炭素原子がGaN結晶中で形成する欠陥についても応用物理学会講演会、SiC及び関連ワイドギャップ研究会で研究成果の発表を行った。高濃度にドーピングされた電極界面でも光応答法が有効に障壁高さを評価できることが分かり、グラフェン/GaN界面にも応用する予定である。H23年度はグラフェン膜転写の大面積化、電極形成の量産化、加工技術の確立に注力した。(1)大面積化:従来法に加えて、結晶性が良好なキッシュグラファイトを剥離しGaN上に転写する方法も検討した。粘着シートで簡易的にグラフェンがキッシュグラファイトから剥離できるという利点があるが、転写される面積が50μm大であり、本検討にはこの手法は適さないことが判明した。従来法ではPMMAをベーク中に気泡が入り、大面積転写を妨げることが問題になっていた。そこで、PMMの代わりにフォトレジストを用いて低温でベークを行うことにより、この問題を解決した。最大2x4mmのグラフェン膜をSiCから剥離することに成功した。(2)電極形成の量産化:昨年度までは転写されたグラフェンに狙いをつけて、アルミ箔にピンホールを設け、電極を蒸着していた。この手法では1つのドメインに1-2個の電極しか形成できず、面積も大きい。そこで、直径100μmの径の小さな電極を密に並べたメタルマスクを用いて蒸着を行った。この結果、10個程度の電極が同一ドメインに形成できた。(3)加工技術:この結果、酸素プラズマによるグラフェン膜の除去をラマン測定だけでなく、電極間の電気的特性を測定することにより評価が可能となった。電流-電圧特性、容量測定において、1分間の酸素プラズマ処理で電極間の分離が確認された。この結果を平成23年度電気関係学会北陸支部連合大会で発表し、優秀発表賞を受賞した。

また、継続して行っている金属/半導体の光電評価、炭素原子がGaN結晶中で形成する欠陥についても応用物理学会講演会、SiC及び関連ワイドギャップ研究会、国内外の国際学会で研究成果の発表を行った。p-GaN表面のストイキオメトリー、ドライエッチングによるダメージが電極に影響を及ぼすことが分かり、電極界面へのグラフェン挿入を適応する価値がある系であると考えられる。
ヒト肝癌の転移および増殖に関わるケモカイン・ケモカインレセプターの解析

5種類の肝癌細胞株に表出されるケモカインレセプターの検討:5種類の肝癌細胞株で18種類のケモカインレセプターの発現をreal time PCR法およびflow cytometryで検討し、ケモカインレセプターのCCR6表出が複数も肝癌細胞株で増強していることが明らかとなった。肝癌細胞株の産生するケモカインの検討:肝癌細胞株Huh7はCCR6を表出するのみならず、CCR6のリガンドであるMIP-3αを産生することも判明した。MIP-3α添加によるHuh7細胞の増殖におけるシグナルトランスダクションの解析:MIP-3α刺激下のHuh7細胞の増殖がMAPKの阻害剤であるPD98059により濃度依存性に阻害されることより、この増殖のシグナルはMAPKを介していることが判明した。さらに、Huh7細胞においてPD98059を添加することでP44/42 MAPKのリン酸化のみが阻害され、SAPK/JUNやp38 MAPKのリン酸化の亢進がみられなかったことより、MIP-3α刺激下のHuh7細胞の増殖はP44/42 MAPKのリン酸化を介していることが明らかとなった。ヒト肝癌組織におけるCCR6の検討:現在、ヒト肝癌組織におけるCCR6の表出を免疫組織化学の手法やin situ hybridizationを用いて検討している。5種類の肝癌細胞株とChang liver cellを用いて、10種類のCCケモカインレセプター、6種類のCXCケモカインレセプター、XC, CX3Cケモカインレセプターの合計18種類のケモカインレセプターのmRNA発現をreal time PCR法で検討した。その中で、CXCケモカインレセプターCXCR4はChang liver cellとPLC/PRF/5(Al)で強く発現しており、CCケモカインレセプターCCR6はHuH7、Al、HepG2で強く発現していた。次に、細胞表面に表出されたレセプターをflow cytometerで検討した。real time PCRでCXCR4 mRNA発現の多かったChang liver cellとAlではCXCR4が強く表出されており、HuH7やHepG2でもCXCR4の表出が確認できたが、HLEやHLFでは表出は見られなかった。2)ケモカインレセプターの表出とケモカインの産生CXCR4のリガンドであるSDF-1をRT-PCR法で検討したところ、HuH7、Al、HepG2の三種類の細胞でSDF-1のmRNAの発現がみられた。さらに、Alの培養上清ではSDF-1がELISAで確認された。同様に、CCR6のリガンドであるMIP-3αのmRNAの発現はHuH7、Al、HepG2の三種類の細胞で確認され、その三種類のcell lineの培養上清ではMIP-3αがELISAで確認された。以上より、HuH7では、MIP-3αとそのレセプターCCR6が発現していることが示されたので、HuH7をMIP-3α存在下で培養し、MTT assayを行うと、濃度依存性に細胞増殖の亢進がみられ、肝癌細胞でもCCR6-MIP-3αを介してケモカインがautoまたはparacrineに働き、細胞増殖に働く可能性があると考えれた。昨年度の研究において、5種類の肝癌細胞株で18種類のケモカインレセブターの発現を検討した。結果、ケモカインレセプターCCR6の表出が増強していることが明らかとなった。また、肝癌細胞株Huh7はCCR6を表出するのみならず、CCR6のリガンドであるMIP-3αを産生することも判明した。MIP-3α添加によるHuh7細胞の増殖におけるシグナルトランスダクションの解析MIP-3α刺激下のHuh7細胞の増殖がMAPKの阻害剤であるPD98059により濃度依存性に阻害されることより、この増殖のシグナルはMAPKを介していることが判明した。

さらに、Huh7細胞においてPD98059を添加することでP44/42 MAPKのリン酸化のみが阻害され、SAPK/JUNやp38MAPKのリン酸化の亢進がみられなかったことより、MIP-3α刺激下のHuh7細胞の増殖はP44/42 MAPKのリン酸化を介していることが明らかとなった。ヒト肝癌組織におけるCCR6の検討現在、ヒト肝癌組織におけるCCR6の表出を免疫組織化学の手法やin situ hybridizationを用いて検討している。
コンクリートにおけるアルカリシリカ反応生成物と骨材の適合性

本研究において得られた成果は、鉱物混和材のASR抑制のメカニズム、ゲルの組成におけるCa(OH)_2の役割、リチウム塩の添加がゲルの組成に及ぼす影響および超高強度コンクリートにおけるASRの4つに分類できる。各テーマにおいて解明された事項をまとめると以下のようである。(1)膨張を示さないフライアッシュモルタルにおいても、反応性骨材粒子内部にゲルが生成する。(2)高炉スラグ添加モルタルでは、細孔溶液のOH^-イオン濃度の低減は小さく、セメントペーストの緻密化による各種イオンや細孔溶液の移動度の低下によって、ASR膨張が抑制される。(3)シリカフユーム添加モルタルでは、細孔溶液のOH^-イオン濃度の低下が大きく、そのためにASR膨張が抑制される。(4)本実験において使用した焼成フリント骨材では、細孔溶液が、元々骨材粒子中に存在するひび割れに侵入し、ひび割れに沿うシリカ表面においてASRが進行する。(5)リチウム塩を添加したモルタルにいて、その添加量を増加させるとゲルの組成が均質なものになる。しかし、このことは、リチウム塩のASR抑制効果のメカニズムとは直接関係はないようである。(6)極端に低い水セメント比のモルタルにおいては、生成したゲルはゾル化した後、セメントペースト相に浸透することなく、ペースト中のひび割れ内部に滞留する。本年度においては、混和材無添加モルタルとシリカフュームおよびフライアッシュ含有モルタルの0.6 NaOH溶液および飽和Ca(OH)^2NaOH溶液中における膨張挙動を明らかにするとともに、BSE-EDS分析によってそれらモルタル中に生成するASRゲルの組成の定量分析を行なった。その結果によって解明された事項をまとめると以下のようである。(1)モルタル中のCa(OH)^2量を減少させたシリカフュームおよびフライアッシュ添加供試体は外部からNaOH溶液がモルタル内部へ十分浸透しても、膨張性のASRゲルが生成し難いことが分かり、膨張性のゲルの生成には、Ca(OH)^2の存在が必要であることを確認した。(2)外部からアルカリが供給される場合には、ASRゲル中のアルカリ量の増加はモルタルの膨張量を減少させるのに対し、ゲル中のカルシウムの膨張量におよぼす影響は顕著ではない。(3)高温(38°C)においては、Ca(OH)^2の存在はASRゲルの膨張性にほとんど影響をおよぼさない。(4)高温では、反応の初期段階で、Na+やCa++イオンの拡散なしに吸水膨張が活発に進行した。本年度においては、シリカフューム、フライアッシュおよび高炉スラグを添加したモルタルについて、細孔溶液のイオン濃度や生成したASRゲルの化学組成から、異なる鉱物混和材によるASR膨張抑制メカニズムの相違を検討した結果、以下のような結論が得られた。1.膨張を示さないフライアッシュ20%添加モルタルにおいても、反応性骨材粒子内部のひび割れにASRゲルが生成する。2.フライアッシュ添加では、細孔溶液のOH^-イオン濃度低減効果に加え、生成するASRゲルのCaO含量が少なくアルカリ量が高いため、ゲルの粘性が低下しASR膨張が抑制される。3.高炉スラグ20%添加モルタルにおいて生成するASRゲルは、骨材とセメントペースト相との界面から200μm以内の範囲に限定される。4.高炉スラグ添加では、細孔溶液のOH^-イオン濃度の低減効果は小さく、セメントペーストの緻密化により各種イオンや細孔溶液の移動度が低下し、ASR膨張が抑制される。5.シリカフューム添加では、細孔溶液のOH^-イオン濃度の低減効果が大きく、アルカリシリカ反応が抑制される。本研究においては,NaOH溶液に浸漬したフライアッシュやシリカフュームを添加したモルタル供試体より作製された研磨試料に対するSEM観察およびBSE-EDS分析より,アルカリシリカ反応におけるCa(OH)_2の役割について検討した。得られた結果および結論をまとめると以下のようである。(1)本実験において使用した元々微細なひびわれを有する反応性骨材においては,細孔溶液が微細なひびわれに侵入するにしたがって,ひびわれに沿うシリカ表面においてASR反応が進行する。

元々存在するひびわれ中に生成されるゲルの膨張によってひびわれ幅が拡大し,それがモルタル全体の膨張に繋がったと推定される。(2)モルタル中のCa(OH)_2量を減少させた鉱物混和材添加モルタルにおいては,外部からNaOHが侵入しても,膨張性のゲルが生成し難く,膨張性ゲルの生成にはCa(OH)_2の存在が必要であることが確認された。(3)外部からアルカリが供給される場合には,ゲル中のアルカリ量の増加はモルタルの膨張量を減少させるのに対して,ゲル中のカルシウム量の膨張量に及ぼす影響は顕著ではない。本年度においては、リチウム塩のアルカリシリカ反応抑制効果のメカニズムを解明することおよび超高強度コンクリートにおけるアルカリシリカ反応の特徴を把握することを目的として、膨張試験を実施し、モルタル供試体より作製された研摩試料に対するSEM観察およびBSE-EDS分析より、アルカリシリカゲルの組成と膨張量との関係について検討した。得られた結果および結論をまとめると以下のようである。(1)リチウム塩を添加したモルタルにおいて、その添加量を増加させるとゲルのCaO/Si0_2比の平均値が低下するとともに、ゲルの組成が均質なものになった。しかし、このことは、リチウム塩のアルカリシリカ反応抑制効果とは直接関係はないようである。(2)アルカリシリカ膨張を示さなくなる程度の量のリチウム塩を添加したモルタルにおいては、SEM観察においてマッシブなゲル領域は見られなかった。しかし、酢酸ウラニルを塗布した試料に対する蛍光顕微鏡観察によって、これらのモルタルにおいてもゲルが生成していることが明らかとなった。(3)アルカリシリカ反応を抑制するリチウム塩の限界量は、塩の種類に関係なく、練りまぜ水における濃度として0.75mol/lであることが示された。(4)極めて低い水セメント比(=0.23)においては、通常の水セメント比(=0.5)においてアルカリシリカ反応による膨張が発生しない骨材を使用したモルタルにおいて顕著な膨張が見られた。(5)低水セメント比のモルタルにおいて生成したアルカリシリカゲルはゾル化した後、セメントペースト相に浸透することなく、ペースト中のひびわれ内部に存在していた。(6)セメントペーストのひびわれ中に存在していたアルカリシリカゲルには周囲からCa^<2+>イオンが拡散・侵入していることが確認された。