hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
X線CTスキャナによる中国古代青銅器の構造技法解析

本研究は、九州国立博物館に設置した文化財用の大型X線CTおよび精密三次元デジタイザを活用し、非接触非破壊で中国古代青銅器の構造を解析することによって、製作技法の研究を飛躍的に進めることを目的にしている。これを達成するために、世界有数の中国古代青銅器を保有する泉屋博古館(住友コレクション180点)と協力し、中国古代青銅器の内部構造データを系統的に集積した三次元デジタルアーカイブを構築した。研究成果として、国内外の学会で研究発表を行った。また、一般市民への研究成果公開として、アジアが誇る卓越した古代技術を分かり易く紹介する展示会を開催した。本研究は、X線CTスキャナならびに3次元計測器を使用して取得したデジタルデータを蓄積したアーカイブの構築と、そのデータを活用した共同研究・博物館展示の可能性を探るものである。X線CT調査では複雑な形状の青銅器の内部構造の分析を行った。また、3次元計測器では青銅器表面に施文された精緻な文様の記録した。考古学者・鋳造技術研究者との共同研究では3次元データの相互比較から製作技法や同笵関係、地域的な製作技法の抽出などを行った。さらに、博物館展示では、3次元出力によるハンズオン展示の可能性を模索した。平成21年度は以下のように研究成果をあげた。1.X線CTスキャナ調査についてこれまでに40点以上の中国古代青銅彝器について、計測作業と構造解析を行った。新たに泉屋博古館に3Dデータの構造解析用64bit PCと3D解析用ソフトウェア(VG-Studio Max)を設置した。2.3次元計測について青銅器表面に施文された表面情報などは、X線CTスキャナと併用して、より微細な凹凸を記録できる3次元計測器によってデジタル化を行った。3.研究成果の公開について本研究の成果として文化交流展示においてトピック展『進化する博物館II』した。この展示会では3DデジタルデータをCGや3Dプリンタ等の最新機器で加工して本物と共に触れる複製品を展示した。また、上海・北京・南京から中国の専門家を招聘し、国内研究者を集めて研究会を開催した。さらに、北京の中国科学院自然科学研究所にて研究成果を公開する講演会を行った。平成22年度は、前年度に引き続いて、X線CT調査と3次元計測を積極的に推進すると同時に、これまでに得られた研究成果を、調査や実験を通して検証した。文化財を精密に記録した三次元データの蓄積は、文化財の保存をはじめ、調査・研究・展示への活用に飛躍的な発展をもたらす可能性がある。文化財の内部構造を記録するX線CTスキャナや複雑な凹凸や文様などの表面情報を詳細に記録する3Dデジタイザ、三次元情報を造形できる3Dプリンタなどの精密三次元機器を使った活用の可能性について研究を実施した。1. X線CTスキャナ調査平成22年度は、約30点の中国古代青銅器についてX線CTスキャナによる構造解析を行った。研究成果として、日本文化財科学会、アジア鋳造技術史学会、日本中国考古学会等で研究発表した。2. 3次元計測X線CTスキャナと併用して、青銅器表面に施文された表面情報を精密三次元計測器によって計測してデジタル化した。本研究の成果をハンズオン展示として博物館の展示に役立てると共に文化財科学会で研究発表した。3.実験による仮説の検証X線CT調査で得られた研究成果を検証するために、芦屋町教育委員会と芦屋釜の里の鋳造工房の協力を得て、実際に鋳造実験を実施した。実験には三次元精密計測とX線CTスキャナのデジタルデータから三次元プリンタに出力したデジタル複製品を用いた。また、全国から研究者を集めて研究成果の検討会を開催した。本研究の総合的な成果として、『泉屋博古館紀要』、『中国考古学』、『映像情報メデチィア学会誌』に論文を発表した。殷周青銅器に代表される中国古代青銅器は、東アジアの金工史上非常に重要な意義を持つにも関わらず製作技法に関する研究が進展しなかった。これは殷周青銅器の内部構造を観察することが困難なためである。本研究では、九州国立博物館に設置した文化財用としては世界最大級の大型X線を活用し、非接触非破壊で中国古代青銅器の内部構造を解析して製作技法の研究を進めた。そこで、日本国内で最も優れた中国古代青銅器コレクションとして知られる住友コレクションを所蔵する泉屋博古館の所蔵品180点を中心に、中国古代青銅器の内部構造データを系統的に集積したデジタルアーカイブを作成することを目標として研究を進めた。殷周青銅器の内部構造を非破壊で把握するには、X線CT装置による三次元断面像が最適の方法である。さらに、細かな表面情報については精密三次元計測装置を用いて計測を実施しながら調査を進めた。また、デジタル化された3Dデータは、研究だけでなく博物館でも大きな展示効果を発揮する。

3DデジタルデータをCGや3Dプリンタ等の最新機器で加工したデジタル複製品を用いて展示に活用した。本研究の成果は、日本文化財科学会・東アジア文化遺産保存学会などの国内外の学会で研究発表した。最終的に、3年間の研究成果をまとめた報告書を刊行した。また、一般市民への研究成果の還元として、泉屋博古館東京分館特別展『神秘のデザイン-中国古代青銅芸術の粋-』および京都泉屋博古館常設展で、研究成果を分かり易く公開した。一般市民から分かり易い展示として好評を得ている。
要介護者の口腔状態・ADL・QOL向上を目的とした地域包括ケアシステムの開発

要介護者に対する歯科治療や口腔ケアがADL・QOLの向上に貢献できることがいわれている。歯科訪問診療は要介護高齢者が受療するための機会であるが、まだ受療率は低く、よりよいシステムの構築が期待される。そのためには、医科歯科連携だけでなく、栄養分野や福祉・介護分野との連携が必要である。そこで、本研究では、「要介護者の口腔状態の改善によるADL・QOL向上を目的とした地域包括ケアシステムの開発を地域の医療機関、福祉・介護の関係機関等と協働して行うこと」を目的とした。岡山県美作保健所と協働し、保健所管内の高齢期歯科保健関係団体(歯科医師会、歯科衛生士会、介護保険関連団体、健康づくりボランティア、市町、市町地域包括支援センター等)の歯科担当に集まってもらい、高齢期における歯科保健環境整備を検討するため、歯科保健推進会議を開催した。県行政からは県全体の現状を、歯科医師会や歯科衛生士会からは在宅歯科医療や高齢者の口腔機能についての現状を、各市町、包括支援センター、その他各団体からは現在取り組んでいる歯科保健施策について情報提供してもらい、代表者同士で今後の取組や、問題点について話し合った。そこでは口腔ケアの必要性は分かっているが、実態がよく分からないといった意見が出た。地域全体の課題を抽出するため、関係団体へアンケート調査、高齢者の口腔状態の現状の調査を行うことで同意を得た。ケアマネージャー、高齢者施設、健康づくりボランティア対象のアンケートによる実態調査を行った。また、高齢者施設の入所者、利用者の口腔内調査も行った。ケアマネージャーや高齢者施設に関する問題点は、歯科保健に対する知識不足や歯科専門職との連携不足があげられた。これらの問題点や高齢者の歯科保健の現状について、歯科保健推進会議で代表者と情報を共有し、今後について検討した。実態調査と集計に時間がかった。また各団体代表者が集まって開催する会議の日程調整にも時間がかかり、開催が年度後半になってしまった。各関係団体へ調査結果説明を行い、連携を行うための協議を行う。各団体の動きがみられ、時間が経過してから変化を確認するため、最終年度での高齢者本人の再評価は妥当ではない。よって、関係団体に関する変化のみ評価を行うこととする。地域全体の課題を見える化するため、関係団体へアンケート調査、高齢者の口腔状態の現状の調査を行うことで同意を得た。現在関係団体へのアンケート調査では、ケアマネージャー対象が終了している。また、高齢者施設へ聞き取りを行い、入所者、利用者の口腔内調査の依頼が終了し、日程調整後に実態調査を行う予定である。また、その他関係団体へのアンケート調査については、質問項目が確定次第、実施する予定である。地域の歯科保健について現状把握が行われていなかったため、会議を開催する前に関連団体へ個別に聞き取り調査を行った。また、調査内容についても施設関係者と入念に話し合いを行っており、調査実施前の段取りに時間がかかった。

ケアマネージャー、高齢者施設、健康づくりボランティア対象のアンケートによる実態調査を行った。また、高齢者施設の入所者、利用者の口腔内調査も行った。ケアマネージャーや高齢者施設に関する問題点は、歯科保健に対する知識不足や歯科専門職との連携不足があげられた。これらの問題点や高齢者の歯科保健の現状について、歯科保健推進会議で代表者と情報を共有し、今後について検討した。実態調査と集計に時間がかった。また各団体代表者が集まって開催する会議の日程調整にも時間がかかり、開催が年度後半になってしまった。地域の実態調査を行い、その結果をまとめ、再度歯科保健推進会議で具体的な解決方法を探っていく。各関係団体へ調査結果説明を行い、連携を行うための協議を行う。各団体の動きがみられ、時間が経過してから変化を確認するため、最終年度での高齢者本人の再評価は妥当ではない。よって、関係団体に関する変化のみ評価を行うこととする。実態調査の時期が次年度にずれたため、実態調査に必要な人件費、物品費が繰り越し予定です。金額が少数額のため、次年度分と一緒に使用することとした。
分子間相互作用に基づくシグナル伝達網解析のための無細胞プロテオーム技術の開発

ヒトがもつ2万種のタンパク質を54枚の384穴プレートに取り揃えプロテインアレイ(20K-HUPA)を用いて、計画班を中心に細胞内シグナル伝達経路に関わるタンパク質と相互作用するタンパク質をアルファスクリーン法により大規模同定を行った。前年度に、申請者が見出したNF-kBシグナルに関与するCUBL1と相互作用するタンパク質の大規模解析により同定した因子の細胞内解析を行った。20K-HUPAにより得られたMAPKおよびNF-kBシグナル伝達経路に関与するタンパク質の大規模相互作用データを、A02班へ提供し、数理モデル構築に向けた既存データベースとの融合を試みた。上記の状況から、平成29年度は下記の2つの研究項目を進めた。I. 20K-HUPAを用いて見出したCUBL1と相互作用するタンパク質のin vitro解析および細胞内解析: 20K-HUPAの中から、CUBL1と相互作用するタンパク質を新たに4種類見出し、その中で本領域では対象としていなかったTGF-βシグナル伝達経路に関与する可能性が示唆された1種類のタンパク質に焦点を絞り解析を行い、CULB1がTGF-βシグナル伝達経路を正に制御していることが明らかとなった。II.計画班を中心とした新たな細胞シグナル伝達を対象とした20K-HUPAを用いた大規模タンパク質-タンパク質相互作用解析: A01班の先生がこれまで研究対象としてきた新たに2種類のタンパク質に対して、20K-HUPAを用いて相互作用解析を行った結果、複数種類の新規相互作用タンパク質を見出すことに成功した。ヒトがもつ2万種のタンパク質を54枚の384穴プレートに取り揃えプロテインアレイ(20K-HUPA)を用いて、CUBL1の相互作用タンパク質基質の細胞内解析が順調に進み、他の領域班の標的タンパク質の相互作用タンパク質基質を取得することができたため。平成29年度に細胞内解析できたCUBL1との相互作用タンパク質の解析を、1) TGF-βでの生物学的役割の明らかにするための解析、2) CUBL1ノックアウトマウスを用いたin vivo解析を行うための部位特異的欠損マウスの作製に着手するの2つを中心に行う。ユビキチン化の数理モデル解析への試みを行う。ヒトがもつ2万種のタンパク質を54枚の384穴プレートに取り揃えプロテインアレイ(20K-HUPA)を用いて、細胞内シグナル伝達経路に関わるタンパク質と相互作用するタンパク質をアルファスクリーン法により大規模同定を行った。申請者が見出したNF-kBシグナルに関与するCUBL1と相互作用するタンパク質の大規模同定をモデル実験的に行い、20K-HUPA技術の問題点・改良点、系のコストダウンの方向性を探った。改良・コストダウンを測った20K-HUPA技術を用いて、A01班を中心とした計画班が研究対象にしているMAPKおよびNF-kBシグナル伝達経路に関与するタンパク質の大規模相互作用解析を、次に公募班を中心とした様々な細胞内シグナル伝達経路に関与するタンパク質の大規模相互作用解析を行い、得られたデータをA02班へ提供した。A01班およびA02班と協力して、相互作用ビックデータから“数理シグナル"学術アプローチに向けた方法論の構築を目指して研究を行った。上記の状況から、平成28年度は下記の2つの研究項目を進めた。I. 20K-HUPAを用いたCUBL1と相互作用するタンパク質の大規模解析:20K-HUPAの中から、CUBL1と相互作用するタンパク質を新たに4種類見出した。その中の少なくとも2種類は、細胞内でCUBL1依存的にユビキチン化していることが示唆された。II.計画班を中心としたMAPKおよびNF-kBシグナル伝達を対象とした20K-HUPAを用いた大規模タンパク質-タンパク質相互作用解析:A01班の先生がこれまで研究対象としてきた2種類のタンパク質に対して、20K-HUPAを用いて相互作用解析を行った結果、複数種類の新規相互作用タンパク質を見出すことに成功した。ヒトがもつ2万種のタンパク質を54枚の384穴プレートに取り揃えプロテインアレイ(20K-HUPA)を用いて、CUBL1の相互作用タンパク質基質、他の領域班の標的タンパク質の相互作用タンパク質基質を取得することができたため。

II.計画班を中心とした新たな細胞シグナル伝達を対象とした20K-HUPAを用いた大規模タンパク質-タンパク質相互作用解析: A01班の先生がこれまで研究対象としてきた新たに2種類のタンパク質に対して、20K-HUPAを用いて相互作用解析を行った結果、複数種類の新規相互作用タンパク質を見出すことに成功した。ヒトがもつ2万種のタンパク質を54枚の384穴プレートに取り揃えプロテインアレイ(20K-HUPA)を用いて、CUBL1の相互作用タンパク質基質の細胞内解析が順調に進み、他の領域班の標的タンパク質の相互作用タンパク質基質を取得することができたため。平成28年度に見出したCUBL1との相互作用タンパク質の解析は、1)共発現・免疫沈降による細胞内での相互作用解析、2)in vitroでのCUBL1による相互作用タンパク質のユビキチン化解析、3)siRNA処理により内在相互作用タンパク質の安定性解析の3つを中心に行う。平成29年度から新たに公募班が加わるため、公募班との密接な連携を進め、相互作用プロテオミクスを行う。平成29年度に細胞内解析できたCUBL1との相互作用タンパク質の解析を、1) TGF-βでの生物学的役割の明らかにするための解析、2) CUBL1ノックアウトマウスを用いたin vivo解析を行うための部位特異的欠損マウスの作製に着手するの2つを中心に行う。ユビキチン化の数理モデル解析への試みを行う。
腎尿細管間質線維化を促進または抑制する調節分子機構

毛髪・鼻・指節異形成症の原因遺伝子であるTRPS1は腎ネフロンの発生には不可欠で骨形成因子Bmp7の下流で働く。Bmp7は上皮細胞が間葉細胞に分化転換すること(上皮間葉移行)を抑制して慢性腎障害を元に戻すので、我々は腎線維化におけるTrps1の機能を検索した。実験の結果、Trps1欠損はユビキチンを介するプロテオソーム分解酵素であるArkadiaによるSmad7の量を調節することにより、TGF-b1で誘導される上皮間葉移行と腎間質尿細管線維化を亢進することを示した。片側尿管を結紮して(UUO)腎臓に尿細管間質線維化を起こすモデルを用いて実験を行った。線維化の程度を検索するためにI型コラーゲンの免疫染色を行うとTrps1欠損ヘテロマウス(HT)では野生型マウス(WT)に比較して、その量が増加していた。TGF-βシグナルの亢進の有無をリン酸化Smad3抗体で調べると、WTに比較してHTで陽性細胞の数が増加していた。HTマウスにおいて腎間質線維化の亢進するメカニズムを検索するため、TGF-βシグナルに関与する遺伝子の発現およびタンパク量を検索した。その結果、HTではSmad7のmRNAがUUOの時間と共に増加したが、タンパク量はそれとは逆に減少した。これはSmad7タンパクの分解系が亢進しているためではないかと考え、プロテオソームのユビキチンカイネースのSmarf1/2およびArkadiaのmRNAおよびタンパク量ともにHTではWTの約2倍に増加していた。また尿細管上皮を腎臓から単離し、培養系にTGF-βを添加して上皮・間葉移行(EMT)を検索した。培養系においてもUUO腎と同様にHTではWTと比較してa-SMAの発現は亢進し、E-cadの発現は減少した。またArkadiaの発現はHTではWTの約2倍亢進していた。これらのことよりTrps1はArkadiaの発現を調節することによりSmad7タンパク量を調節し、Samd3リン酸化をコントロールすることによりTGF-βシグナルに関与することが明らかになった。毛髪鼻指節異形成症(TRPS)の原因遺伝子であるTRPS1のノックアウトマウスを用いて片側尿管を結紮して(UUO)腎臓に尿細管間質線維化を起こすモデルを用いて実験を行った。ホモのノックアウトマウスは生後24時間以内に死亡するため、野生型マウス(WT)とヘテロマウスとの間で線維化の程度を比較した。線維化の程度を検索するためにI型コラーゲンの免疫染色を行うと、HTマウスではWTマウスに比較して、その量が有意に増加していた。TGF-βシグナルの亢進を疑いリン酸化Smad3抗体での免疫組織化学を行うと、WTマウスに比較してHTマウスで陽性尿細管上皮細胞の数が増加していた。その結果、HTマウスではSmad7のmRNAがUUOの時間と共に増加したが、タンパク量はそれとは逆に減少した。これはSmad7タンパクの分解系の亢進によるものと考え、プロテオソームのユビキチンカイネースであるArkadiaのmRNA、タンパク量ともにHTマウスではWTマウスの約2倍に増加していた。また尿細管上皮を腎臓から単離培養しTGF-βを添加して上皮・間葉移行(EMT)を検索した。培養系においてもUUO腎と同様にHTではWTと比較してα-SMAの発現は亢進し、E-cadherinの発現は減少した。これらのことよりTrps1はArkadiaの発現を負に調節することによりSmad7タンパク量を増加させ、Samd3リン酸化をコントロールすることを明らかにした。この論文は2010年JASN10月号のThis Month's Highlightsで取り上げられ紹介された。毛髪・鼻・指節骨異形成症(TRPS)の原因遺伝子であるTRPS1は主として軟骨で発現するが、その他内臓器においても発現することより、我々は腎臓におけるTRPS1の局在と機能について検索した。以前の研究において我々は成人マウスではTrps1が腎尿細管上皮細胞に局在することを示したことより、Trps1と上皮・間葉転換(EMT)との関係を調べる目的でTrps1の腎尿細管間質線維化における機能を解析した。Trps1欠損ヘテロ(HT)

マウスと野生型マウスの腎臓から尿細管上皮を培養して、そのTrps1、α-SMA、E-cadherinの局在を調べた結果、HTマウス腎尿細管上皮ではE-cadherinの発現は半分に減少していた。これらの培養細胞にTGF-βを作用させるとHTではEMTが亢進していた。免疫組織化学およびウエスタンブロットによる解析の結果、HTマウス腎尿細管上皮ではリン酸化Smad3が野生型に比べて高度に亢進し、E-cadherinの発現が低下し、α-SMAの発現が亢進した。またそれに伴ってSmad7が低下し、Samd7の分解酵素であるArkadiaの発現が亢進していた。以上よりHTマウスではArkadiaの発現が亢進することよりSmad7レベルが低下し、リン酸化Smad3が増加してTGF-βシグナルが亢進つまりEMTが亢進することにより腎尿細管間質の線維化が亢進するという分子機構を解明した。
体細胞クローン動物由来腎臓移植モデルによるマイナー組織適合性抗原の評価

クローン動物を用いて体細胞を提供したドナーへの臓器移植を行うことにより、相違するミトコンドリアDNAの影響について検討した。本研究において、移植臓器の基となるクローン産子を得ることができなかったが、異種間クローン胚(ネコ体細胞と除核ブタもしくはウシ卵子を融合)の発育におけるトリコスタチンAの効果を調べた結果、ウシとの異種間クローン胚作製には効果はあったが、ブタとのクローン胚作製には効果がなかったことから、ミトコンドリアDNAの相違がクローン胚の発育にも影響を与えることが示唆された。体細胞クローン産子においては、ドナー細胞由来のミトコンドリアDNA(mtDNA)は消失し、ほぼレシピエント卵子由来となる。すなわち、ドナーとクローン産子のmtDNA型が一致しないこととなる。近年、わずかなmtDNAの突然変異により、宿主の自然免疫系による選択的排除の発生が報告された。腎臓のような複雑な構造を持つ臓器を、体細胞クローン動物から体細胞を提供したドナーへ移植した報告はなく、ドナーと異なるmtDNAの影響は不明である。本研究は、体細胞クローンネコの腎臓を取り出し体細胞提供ネコであるドナーに移植し、移植臓器の細胞中に混在するmtDNAによる影響(拒絶反応)を評価することを目的としている。(1)移植後の拒絶反応評価:本年度は作出した体細胞クローンネコから体細胞を提供したドナーへ腎臓を移植する前に、手技的な対照として同じ個体への腎摘出後の再移植による腎組織への影響を調べた。再移植直後の腎機能は低下したが、1週間後には摘出再移植腎機能の回復を確認できた。今後、作出した体細胞クローンネコから体細胞を提供したドナーへ腎臓を移植して、移植後の拒絶反応について評価する。(2)mtDNA比の違いによる胚発育の検討:本年度は、レシピエント細胞質とドナー培養細胞由来のミトコンドリアが全く異なる異種間での再構築胚の発育について検討した。特に再構築胚の作製時に細胞周期の同期化が重要であるが、異種間での再構築胚において化学的処置による同期化は効果がないことが示された。体細胞クローン産子においては、ドナー細胞由来のmtDNAは消失し、ほぼレシピエント卵子由来となる。本研究は、体細胞クローンネコの腎臓を取り出し体細胞提供ネコであるドナーに移植し、移植臓器の細胞中に混在するミトコンドリアDNA(mtDNA)による影響(拒絶反応)を評価することを目的としている。1.mtDNA比の違いによる胚発育の検討:本年度は、レシピエント細胞質とドナー培養細胞由来のミトコンドリアが全く異なる異種間での再構築胚の発育について詳細な検討を行った。今回、ドナー細胞としてネコ由来繊維芽細胞もちい、除核ブタ卵母細胞と融合後、50nM TSAで24時間処理を行い、その後の異種間での体細胞クローン胚の発育能およびアセチル化状態について検討した。その結果、胚盤胞発生率は、TSA処理区(0.7%)、無処理区(8.0%)となり、アセチル化を示すH3k9値にも差が認められなかった。このことは、ウシ卵母細胞を用いた異種間での体細胞クローン胚に観察されるTSAの効果がブタにおいて認められず、TSA処理効果はレシピエント卵子の品種間により異なることが示された。2.移植後の拒絶反応評価:本年度も、手技的な対照として同じ個体への腎摘出後の再移植による腎組織への影響を調べた結果、再移植直後の腎機能は低下したが、1週間後には摘出再移植腎機能の回復を確認している。本年度は、ミトコンドリアが全く異なる異種間での再構築胚の発育について検討し、TSA処理効果はレシピエント卵子の品種間により異なることを明らかにした。一方、同じ個体への腎摘出後の再移植による腎組織への影響を調べることにより、移植手技の確認を行い、1週間後には摘出再移植腎機能の回復を確認できた。これまでに、1、移植後の拒絶反応評価として、同じ個体への腎摘出後の再移植による腎組織への影響を調べた。

2、mtDNA比の違いによる胚発育の検討として、レシピエント細胞質とドナー培養細胞由来のミトコンドリアが全く異なる異種間での再構築胚において化学的処置による同期化は効果がないことを明らかにしたほか、ウシ卵母細胞を用いた異種間での体細胞クローン胚に観察されるTSAの効果がブタ卵母細胞において認められず、TSA処理効果はレシピエント卵子の品種間により異なることを明らかにした。本年度までに29頭の受胚雌ネコに体細胞クローン胚(40ー50個/頭)を移植した結果、1頭妊娠したが流産したため、ドナー腎臓を得ることができなかった。クローン動物を用いて体細胞を提供したドナーへの臓器移植を行うことにより、相違するミトコンドリアDNAの影響について検討した。本研究において、移植臓器の基となるクローン産子を得ることができなかったが、異種間クローン胚(ネコ体細胞と除核ブタもしくはウシ卵子を融合)の発育におけるトリコスタチンAの効果を調べた結果、ウシとの異種間クローン胚作製には効果はあったが、ブタとのクローン胚作製には効果がなかったことから、ミトコンドリアDNAの相違がクローン胚の発育にも影響を与えることが示唆された。初年度は、同じ個体への腎摘出後の再移植による腎組織への影響を調べることにより、移植手技の確認を行い、1週間後には再移植した腎機能の回復を確認できた。また、ミトコンドリアが全く異なる異種間での再構築胚の発育について検討し、細胞周期の同期化は胚発育に影響を与えないことを明らかにした。(1)移植後の拒絶反応評価:昨年度と同様に、同じ個体への腎摘出後の再移植による腎組織への影響を調べることにより、移植手技・移植による炎症反応等の確認を行うと同時に、今後作出する体細胞クローンネコから体細胞を提供したドナーへの腎臓移植を目指し、移植後の拒絶反応について評価する系を確立する。(2)mtDNA比の違いによる胚発育の検討:異種間核移植を行う際にレシピエント細胞質へドナー培養細胞由来のミトコンドリアを注入して再構築胚を作製し、mtDNA比の違いによる胚発育について検討する生殖工学今後は、これまでの成果をもとに(1)移植後の拒絶反応評価:作出した体細胞クローンネコから体細胞を提供したドナーへ腎臓を移植して、移植後の拒絶反応について評価し、mtDNA由来のマイナー組織適合性抗原に対する宿主自然免疫系による拒絶反応を解明する。(2)mtDNA比の違いによる胚発育の検討:核移植を行う際にレシピエント細胞質へドナー培養細胞由来のミトコンドリアを注入して再構築胚を作製し、mtDNA比の違いによる胚発育および腎移植後の拒絶反応について検討する本年度は、体細胞クローン胚の移植に必要な受卵ネコの確保ができず、それに係る移植等の消耗品等の残額が生じた。本年度は、同じ個体への腎摘出後の再移植による腎組織への影響を調べることにより、移植手技の確認を行ったため、mtDNA量測定試薬等の消耗品費用の残額が生じた。本年度は、特に体細胞クローン胚の移植および腎移植に必要なネコを確保するために消耗品等を使用する予定である。本年度は、mtDNA比の違いによる胚発育および腎移植後の拒絶反応について検討するための試薬品購入に使用する。
粒内高密度転位配列による結晶粒微細化を必要としない新たな巨大ひずみ材強化法の確立

純度の異なるアルミニウムに対し,室温下で形状不変プロセスの一種である多軸鍛造を施し,負荷ひずみ量の増加に伴う流動応力および組織変化に関する調査を行った.アルミニウムの多軸鍛造に伴う流動応力は純度の増加に伴って低下する.また,加工応力は累積ひずみの比較的小さな段階(約2.0程度)で飽和するが,加工応力の飽和後の組織変化は著しく,明瞭な結晶粒の微細化が開始されるのは2N(99%)アルミニウムで累積ひずみ3程度, 4N(99.99%)アルミニウムで累積ひずみ4以上である.また,室温で著しい静的再結晶を生じる5N(99.999%)アルミニウムと4Nアルミニウムでの飽和応力が同程度であることも併せ,室温多軸鍛造においては組織と定常(飽和)応力との関係は一対一ではない.また,多軸鍛造ではひずみ負荷方向を加工毎に90度ずつ変化させるが,加工初期に応力が低下するが,この現象は累積ひずみの値にかかわらず認められる.この現象の説明としてひずみ負荷方向の変化に伴って活動するすべり系が変化することが大きく寄与していると考えられる.一方,累積ひずみが増加すると一回の加工中に応力が僅かに低下する現象が認められるが,これは変形中の動的回復と関係している可能性がある.多軸鍛造中の結晶粒微細化過程としては,加工中に生じるマイクロせん断帯の発達が重要であると考えられる.多軸鍛造の場合,ひずみ負荷方向を変化させることから,結晶粒内部で複数の方向にマイクロせん断帯が発達するが,これらの交差部分で粒界の大角化が生じていることがわかった.また,一回の加工ひずみを小さくすると,マイクロせん断帯の発達は遅延するため,多軸鍛造においてはマイクロせん断帯を粒内部に導入することが重要であると考えられる.特定領域共通試料である純度の異なるアルミニウム金属およびマグネシウム合金に対し,形状不変プロセスの一種である多軸鍛造を種々の条件で室温下で行い,負荷ひずみ量の増加に伴う流動応力変化および組織変化を調査した.アルミニウムの多軸鍛造に伴う流動応力や組織の変化は純度に大きく依存する.これはARBやECAP等の他の形状不変加エプロセスの結果と同様の結果である.特に純度が5Nを越える場合は室温で著しい静的再結晶挙動を示す.一方,純度が低い(2N)の場合は,再結晶挙動は認められなかったが,鍛造中に大きな流動応力の低下が認められた.このような現象はCu等の低積層欠陥エネルギー材では認められておらおらず,積層欠陥エネルギーが高く,交差すべりによる回復(転位の合一消滅)が可能な材料の場合,応力軸の変化に伴って強度が低下する傾向があることがわかった.また,アルミニウムの多軸鍛造の場合は,他の形状加工プロセスよりも微細粒形成が遅れる傾向があり,この現象も応力負荷方向の変化と関連する可能性がある.一方,アルミニウムと比べ,大きく加工性の劣るマグネシウム合金Mg-Y過飽和固溶体に対して上記と同様に室温で多軸鍛造を行った結果,一軸圧縮に比べ,5倍程度の累積ひずみを付加出来ることがわかった.このことは難加工材の巨大ひずみ付加方法として,多軸鍛造法は有力な方法であることを示唆している.また,加工組織内には双晶とともに非底面上に高密度の転位が導入されており,室温での多軸鍛造と熱処理を組み合わせることで,粒内に非底面上高密度転位を導入出来る可能性があることがわかった.純度の異なるアルミニウムに対し,室温下で形状不変プロセスの一種である多軸鍛造を施し,負荷ひずみ量の増加に伴う流動応力および組織変化に関する調査を行った.アルミニウムの多軸鍛造に伴う流動応力は純度の増加に伴って低下する.また,加工応力は累積ひずみの比較的小さな段階(約2.0程度)で飽和するが,加工応力の飽和後の組織変化は著しく,明瞭な結晶粒の微細化が開始されるのは2N(99%)アルミニウムで累積ひずみ3程度, 4N(99.99%)アルミニウムで累積ひずみ4以上である.また,室温で著しい静的再結晶を生じる5N(99.999%)アルミニウムと4Nアルミニウムでの飽和応力が同程度であることも併せ,室温多軸鍛造においては組織と定常(飽和)応力との関係は一対一ではない.また,多軸鍛造ではひずみ負荷方向を加工毎に90度ずつ変化させるが,加工初期に応力が低下するが,この現象は累積ひずみの値にかかわらず認められる.この現象の説明としてひずみ負荷方向の変化に伴って活動するすべり系が変化することが大きく寄与していると考えられる.一方,累積ひずみが増加すると一回の加工中に応力が僅かに低下する現象が認められるが,これは変形中の動的回復と関係している可能性がある.多軸鍛造中の結晶粒微細化過程としては,加工中に生じるマイクロせん断帯の発達が重要であると考えられる.多軸鍛造の場合,ひずみ負荷方向を変化させることから,結晶粒内部で複数の方向にマイクロせん断帯が発達するが,これらの交差部分で粒界の大角化が生じていることがわかった.また,一回の加工ひずみを小さくすると,マイクロせん断帯の発達は遅延するため,多軸鍛造においてはマイクロせん断帯を粒内部に導入することが重要であると考えられる.
褐色脂肪細胞の化学誘導技術の開発と糖尿病の再生治療

褐色脂肪細胞は余剰エネルギーを熱として散逸し、糖脂質代謝や体温調節を司るが、糖尿病患者ではほぼ消失している。糖尿病患者の体細胞から褐色脂肪細胞を作出して自家移植できれば、新しい原理に基づく再生医療を提供できる可能性がある。我々は、ヒト線維芽細胞を特定の小分子化合物を添加して培養し、褐色脂肪細胞を誘導する技術を開発した。本技術は遺伝子を導入しない等の多くの利点があるが、未解明の点が多い。本研究では、誘導技術の最適化、作出した細胞の遺伝子発現とフェノタイプの解析、生体内生着性と造腫瘍性の評価を行った。その結果、作出した細胞の性状、再生医療への応用における重要な知見が得られた。[I]小分子化合物添加培養法の最適化小分子化合物添加期間の検討。ヒト正常皮膚由来線維芽細胞を、小分子化合物を種々の濃度で種々の期間添加した培地中で培養し、real time RT-PCR法ならびに蛍光免疫染色法を用いてUCP1遺伝子mRNAおよびタンパク質の発現を評価し、比較を行った。その結果、最適な濃度と添加期間、培養期間を明らかにすることができた。さらに、種々の小分子化合物を添加して同様の培養を行い、評価と比較を行った。その結果、最も高いUCP1発現を誘導できる条件が分かった。また、誘導培地中の各成分についても、real time RT-PCR法による同様の検討を行い、最適な組成を決定した。[II]褐色脂肪特異的遺伝子群の発現および転換効率の評価上記[I]で求められた条件によって培養し、real time RT-PCR法を用いて、褐色脂肪細胞特異的遺伝子群(CIDEA、KCNK3、およびUCP1)のmRNA発現を評価した。その結果、培養された細胞は褐色脂肪特異的遺伝子群を発現していた。また、蛍光免疫染色法を用いて、UCP1の発現を可視化し、陽性細胞の割合の算出を行った。そこでこの化合物が線維芽細胞を褐色脂肪細胞に誘導するということが示され、褐色脂肪細胞への転換効率はおよそ70%であることが分かった。以上の結果より、化合物添加培養による褐色脂肪細胞の誘導の効率を高めることに成功し、得られた褐色脂肪細胞の性状の一部が明らかになった。小分子化合物を用いた褐色脂肪細胞への誘導方法の最適条件(培地成分、小分子化合物の種類、濃度、添加期間等)を決定した。また、褐色脂肪細胞特異的遺伝子群(CIDEA、KCNK3、UCP1等)の発現を確認し、褐色脂肪細胞へと誘導されていることを確かめた。さらに、転換効率の算出により多くの線維芽細胞が褐色脂肪細胞へと転換していることを示した。これらのことから、本研究は大変順調に進展していると考える。[I]小分子化合物により誘導した褐色脂肪細胞様細胞の分化多能性および生体内動態の評価前年度に決定した小分子化合物を用いた培養条件をもとに、ヒト正常皮膚由来線維芽細胞を培養し、real time RT-PCR法を用いて、分化多能性マーカーNANOGのmRNAを経時的に測定してiPS細胞との比較を行った。その結果、経時的なmRNA発現の上昇は認められず、分化多能性を経由しないことを示した。また、同様の培地を用いて種々の期間培養したヒト線維芽細胞、およびHeLa細胞を免疫不全マウスに移植し、作出した細胞の造腫瘍性についての評価を行った。その結果、移植した細胞の増大は認められず、本方法によって作出した細胞は造腫瘍性を持たないことが強く示唆された。さらに、ヒト正常皮膚由来線維芽細胞にウイルスベクターを用いてGFP遺伝子を導入し、上記[I]と同様の培地を用いて一定期間培養した後、免疫不全マウスに移植した。続いて、移植後1か月目に移植部位を摘出して蛍光観察を行って生体内生着性の評価を行った。その結果、細胞塊およびGFP蛍光を確認し、本方法によって作出した細胞の生体内生着性を示した。[II]線維芽細胞以外の細胞に対する誘導能の評価ヒト正常表皮角化細胞、臍帯静脈内皮細胞、および末梢血単核球を、上記[I]あるいは血球培養用培地に上記[I]と同様の各成分を添加した培地を用いて培養し、real time RT-PCR法を用いてUCP-1のmRNAを測定し、線維芽細胞以外の細胞からの褐色脂肪細胞への転換についての評価を行った。その結果、本法によるダイレクト・リプログラミングは細胞によって効率等が異なる可能性が示唆された。以上の結果より、本法および本法により作出した褐色脂肪細胞の再生医療への応用にとって重要な多くの知見が得られた。

呼吸機能評価、ゲノムワイドな遺伝子発現プロファイリング解析、エピゲノム解析等を行うとともに、小分子化合物による線維芽細胞から褐色脂肪細胞へのコンヴァージョンのメカニズムを解析する予定である。免疫学29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。
大規模計算によるタンパク質切断解析データベースの構築

質量分析法を使用したタンパク質構造やその翻訳後修飾に関する情報を取得するトップダウン・プロテオミクスやグライコミクスでは、消化酵素を用いることなく解析処理高速化を実現する方法としてタンパク質の全体の情報をはじめに取得し、光や衝突プロセスを用いることで得られた断片化イオンの質量その構造を得る実験が行われている。これらの実験ではイオン化された生体高分子に外部よりエネルギーを与えることで(主に赤外多光子吸収や衝突誘起)生成したフラグメントを同定している。本研究では非経験的・半経験的な分子軌道法によるペプチド結合の評価やプロトン誘起による反応解析のためプロトン付加位置の大規模計算を行った。一般的に低エネルギー解離実験ではアミノ酸主鎖のC'-N結合で切断されたフラグメントが主に生成されることが知られているので、N末端やC末端を考慮したジペプチドに対しペプチド結合のボンドエネルギー計算を行った。また質量分析計を用いた実験によりタンパク質やペプチドをソフトイオン化し断片化する際は、プロトン付加したフラグメントイオンが主に観測できことが知られている。このイオン化に伴うモデル計算としてプロトンの付加し易さを決定するため、プロトンをジペプチド主鎖の酸素や窒素に付加し網羅的にプロトンアフィニティ計算を実行した。これらの計算結果はデータベース(DB)として整理することで、実験で得られたスペクトルの効率的な解析に繋がると考え分子軌道計算DBを構築した。ここで開発しているDBはJAVAとSQLの言語を用いており汎用性の高いLinux上で動作でき、ボンドエネルギーやアフィニティ計算をDBに組み込んでの質量分析支援DBの動作確認を終えた。また振動計算を実行することで、分子のvibrational degree of freedomが増えることにより内部エネルギーの変化が計算できる機能を加え、与える外部エネルギーの妥当性を考察した。DBの計算スペクトラ解析機能としてはIRやUVスペクトラを表示できる。質量分析法を使用したタンパク質解析では、消化酵素を用いることなく解析処理高速化を実現する方法としてタンパク質の全体の情報をはじめに取得し、光や衝突プロセスを用いることで得られた断片化イオンの質量からタンパク質構造やその翻訳後修飾に関する情報を取得するトップダウンプロテオミクスが提案されている。一般的に低エネルギー解離実験ではアミノ酸主鎖のC' -N結合で切断されたフラグメントが主に生成されることが知られているので、N末端やC末端を考慮したジペプチドに対しペプチド結合のボンドエネルギー計算を行った。これらの計算結果はデータベース(DB)として整理することで、実験で得られたスペクトルの効率的な解析に繋がると考え分子軌道計算DBを構築中である。ここで開発しているDBはVisual BasicとSQLの言語を用いており汎用性の高いウィンドウズOS上で動作でき、ボンドエネルギー計算をDBに組み込んでの質量分析支援DBの動作確認を終えた。
朝鮮総督府の言語政策と言語教育が現代韓国語の形成に及ぼした影響に関する実証的研究

本研究では朝鮮総督府の言語政策及び当時の言語教育が現代韓国語の形成に及ぼした影響を正書法を中心にコーパスを用いて分析する。(1)1890年代1945年代の文献のコーパスの分析を通して実証的に検討し、現代韓国語の正書法の確立過程を明らかにする。(2)日本植民地期の韓国の言語政策と教育を担当していた朝鮮総督府の学務局により定められた「普通学校用諺文綴字法」(1912年)などの規定が韓国語の正書法の形成に及ぼした影響を分析する。本研究では朝鮮総督府の言語政策及び当時の言語教育が現代韓国語の形成に及ぼした影響を分析する。(1) 1890年代1945年代の文献のコーパスの分析を通して実証的に検討し、現代韓国語の形成過程を明らかにする.(2)言語政策と教育を担当していた朝鮮総督府学務局の文書資料を発掘し、当時の朝鮮語教育の実態とその影響、言語政策の決定過程(言語政策の決定における韓国人学者の役割も含めて調査)とその成果などを明らかにする.本研究では朝鮮総督府の言語政策及び当時の言語教育が現代韓国語の形成に及ぼした影響を正書法を中心にコーパスを用いて分析する。本研究では朝鮮総督府の言語政策及び当時の言語教育が現代韓国語の形成に及ぼした影響を1)1890年代1945年代の文献のコーパスの分析を通して実証的に検討し、現代韓国語の形成過程を明らかにすることと、2)言語政策と教育を担当していた朝鮮総督府学務局の文書資料を発掘し、当時の朝鮮語教育の実態とその影響、言語政策の決定過程(言語政策の決定における韓国人学者の役割も含めて調査)とその成果などを明らかにすることを目的とする。平成18年度には、1)朝鮮総督府資料の発掘と確認作業のために、韓国の現地調査を4回行なった。また、2)開花期(19世紀末20世紀始め)における韓国語の綴字法と日本の植民地初期の韓国語の綴字法の実態に関する研究に取り組み、キリスト教文書の『新約全書』(1900)と『演經座談』(1923)におけるハングル綴字法を計量的に分析し、当時の韓国のハングル綴字法に大きな影響を及ぼしていたキリスト教文書のハングル綴字法の実態を「キリスト教文書のハングル綴字法と朝鮮総督府のハングル綴字法規定」という論文にまとめた。朝鮮総督府の「普通学校用諺文綴字法」(1912年)は、キリスト教文書のハングル綴字法より、幾つか進んでいる点もみられるが、その適用範囲には限度があり、キリスト教の文書には聖書綴字法と呼ばれる綴字法が使われ、『新約全書』(1900)と『演經座談』(1923)のハングル綴字法は「普通学校用諺文綴字法」(1912年)の規定とは異なる点が多いことが分かった。今後、新聞・小説・雑誌・聖書・教科書など、より多くの文献を時代別に分析し、韓国語の綴字法の変遷過程を計量的・統計的に考察していく必要がある。平成19年度には、1)朝鮮総督府資料の発掘と確認作業のために、韓国の現地調査を3回行なった。また、2)開花期(19世紀末20世紀始め)における韓国語の綴字法と日本の植民地初期(1910年代)の韓国語の綴字法の実態に関する研究に取り組み、主に新聞などの刊行物におけるハングル綴字法とその変遷過程を分析し、朝鮮総督府の「普通学校用諺文綴字法」(1912年)の規定との違いなどを考察した。今後、新聞・小説・雑誌・聖書・教科書など、より多くの文献を時代別・分野別に分析し、韓国語の綴字法の変遷過程を計量的・統計的に考察していく必要がある。分析対象は次の通りである。1)獨立新聞(1896-1899)2)協成會會報(1898)3)毎日新聞(1898)4)共立新報・新韓民報(1907-1915)5)神學月報(1900-1910)本研究では朝鮮総督府の言語政策及び当時の言語教育が現代韓国語の形成に及ぼした影響を1)1890年代1945年代の文献のコーパスの分析を通して実証的に検討し、現代韓国語の形成過程を明らかにすることと、2)言語政策と教育を担当していた朝鮮総督府学務局の文書資料を発掘し、当時の朝鮮語教育の実態とその影響、言語政策の決定過程(言語政策の決定における韓国人学者の役割も含めて調査)とその成果などを明らかにすることを目的とする。

平成20年度には、1)朝鮮総督府資料の発掘と確認作業のほかに2)1920年代における韓国語の綴字法と日本の植民地初期の韓国語の綴字法の実態に関する分析に重点的に取り組んだ。また、韓国語で発刊されたキリスト教の雑誌である『神学月報』(1900-1909)におけるハングル綴字法を分析し、当時ハングル綴字法に大きな影響を及ぼしていたキリスト教文献におけるハングル綴字法の実態と変化を概観し、論文にまとめた。『神学月報』は「・」や口蓋音の表記などでキリスト教文献におけるハングル綴字法の変遷過程をよく表している。このような表記法は朝鮮総督府の「普通学校用諺文綴字法」(1912年)の制定にも影響を及ぼしたと思われる。今後、新聞・小説・雑誌・聖書・教科書など、より多くの文献を時代別に分析し、韓国語の綴字法の変遷過程を計量的・統計的に考察していく必要がある。本研究では朝鮮総督府の言語政策及び当時の言語教育が現代韓国語の形成に及ぼした影響を1)1890年代1945年代の文献のコーパスの分析を通して実証的に検討し、現代韓国語の形成過程を明らかにすることと、2)言語政策と教育を担当していた朝鮮総督府学務局の文書資料を発掘し、当時の朝鮮語教育の実態とその影響、言語政策の決定過程(言語政策の決定における韓国人学者の役割も含めて調査)とその成果などを明らかにすることを目的とする。平成21年度には、1)朝鮮総督府資料の発掘と確認作業のほかに2)韓国の開化期におけるハングル新聞の綴字法の実態に関する分析に重点的に取り組んだ。1898年から発行された「毎日新聞」と1907年から発行された「京〓新聞」、また京〓新聞の付録として発行された「寳鑑」の分析を通して、当時の新聞におけるハングル綴字法の特徴及び実態を概観し、ハングル綴字法の変遷過程を考察し、論文と発表した。分析結果をまとめると当時の韓国の新聞は全般的に伝統的・慣習的な表記法に従っているが、変化もみられる。今後、19世紀後半からの開化期と日本の植民地時代における韓国語の音声・音韻・語彙・文体などの変化を分析・検証し、朝鮮総督府の言語政策と言語教育と照らしながら現代韓国語の形成過程を明らかするとともに、朝鮮総督府の教科書をはじめ、新聞・雑誌・小説などのコーパスをジャンル別・時代別に網羅的に分析し、新たな語彙・文体などの定着過程を実証的に究明する必要がある。
選択的基質を用いた簡便で特異的なアセチルコリンエステラーゼ測定法の開発

【目的】アセチルコリンエステラーゼ(AChE)は、神経組織や赤血球に存在し、神経伝達物質であるアセチルコリンを分解し神経伝達系を制御する重要な酵素である。これまで我々は、選択的基質MATP+(同仁化学)を用いて全血中AChE測定法を検討してきた。今回、溶血機能付自動分析装置を用いて溶血操作を含めた完全自動化の簡便で特異的な赤血球AChE測定法を開発することを目的とした。【方法】(測定機器)溶血機能付自動分析装置は日本電子(株)製JCA-BM9130を用いた。(試薬) AChE測定試薬は0.1%Tween 20リン酸緩衝液(0.1M, pH7.4)を用いて基質液(MATP+、3.5mM)および発色液(DTNB、0.875mM)を作製した。ヘモグロビン濃度(Hgb)はヘモグロビンB-テストワコー(和光)を用いて測定した。(試料)健常者ボランティアのヘパリン血を用いた。(測定概要)自動分析装置の溶血機能を用いて遠心血球5μLと前処理液(0.1% Triton X-100リン酸緩衝液)95μLを混和し、溶血試料を作製する。AChEは、溶血試料4.4μLと発色液70μLを混和し37°C5分間加温後、基質液17.5μL加え、451/694nmで反応速度を測定し、活性値(U/L)を算出する。同時に測定した溶血試のHgb値を用いてAChE(U/g Hgb)を計算する。【成績】1)電気ウナギ由来AChEおよびHgb標準液(ウマ赤血球)を用いて希釈直線性を検討すると、AChEは913 U/L、Hgbは4.6 g/dlまで直線性を確認した。2) 10回測定の同時再現性(CV)を検討すると、AChEは1.2%(平均170.4 U/L)、1.9%(198.3 U/L)、Hgbは1.4%(1.48g/dl)、2.0%(1.47g/dl)であったが、AChE(U/g Hgb)では0.6%(平均11.5)および0.5%(13.5)と1%以下に低下した。3)常者5例で用手溶血法(全血10倍希釈)と自動溶血法(遠心血球20倍希釈)のAChE(U/g Hgb)を比較すると、それぞれの平均値±SDは、11.9±1.40、12.2±1.11であり、溶血方法による差を認めなかった。さらに、血漿ChEを含む全血と遠心血球での測定値に差を認めないため、本法がAChEに特異的な測定法であることが確認された。【結論】自動分析装置の溶血機能を用いることにより、簡便で再現性の良い赤血球AChE測定が可能であり、今後、有機リン中毒の直接的な暴露指標やアルツハイマー型認知症でのAChE阻害剤による治療効果の判定や予測としての臨床応用が期待される。

2) 10回測定の同時再現性(CV)を検討すると、AChEは1.2%(平均170.4 U/L)、1.9%(198.3 U/L)、Hgbは1.4%(1.48g/dl)、2.0%(1.47g/dl)であったが、AChE(U/g Hgb)では0.6%(平均11.5)および0.5%(13.5)と1%以下に低下した。3)常者5例で用手溶血法(全血10倍希釈)と自動溶血法(遠心血球20倍希釈)のAChE(U/g Hgb)を比較すると、それぞれの平均値±SDは、11.9±1.40、12.2±1.11であり、溶血方法による差を認めなかった。さらに、血漿ChEを含む全血と遠心血球での測定値に差を認めないため、本法がAChEに特異的な測定法であることが確認された。【結論】自動分析装置の溶血機能を用いることにより、簡便で再現性の良い赤血球AChE測定が可能であり、今後、有機リン中毒の直接的な暴露指標やアルツハイマー型認知症でのAChE阻害剤による治療効果の判定や予測としての臨床応用が期待される。
CrmA及びFas-Lの遺伝子導入を用いた肝移植拒絶反応抑制効果に関する研究

本研究では、(1)loxP配列を持つon/off系FasL、CrmAアデノウイルスベクターをCOS-TPC法を用いて作製した。loxP配列を持つ各遺伝子の発現アデノウイルスベクターの蛋白発現の割合はCre組み換え酵素発現ベクターの感染量に依存していた。また生体内の肝臓での各遺伝子の発現も認められた。(2)FasL機能的な発現によるHepG2細胞へのアポトーシスの誘導について検討を行った。AxCANCreの感染濃度依存的にHepG2細胞に細胞死が観察された。Westernblottingによる解析はAxCANCreの感染量がMOI0ではFasLは検出されなかったが、AxCANCreの感染濃度依存的にFasLに相当するシグナルの増強が認められた。(3)CrmA発現によるHepG2細胞のアポトーシスの抑制について検討した。CrmAを遺伝子導入したHepG2細胞では抗Fas抗体によるアポトーシスは劇的に抑制され。アポトーシスの抑制効果はAxCANCreの感染濃度の増加に伴って増加した。(4)Fasリガンド、CrmAの各遺伝子を導入したラット同種肝移植における生存延長効果について検討した。Fasリガンドを発現させたドナー肝を同種移植したところ、生存期間の中央値が29日と有意に延長していた。アポトーシスのシグナル伝達の抑制を意図し、CrmA遺伝子をドナー肝に導入することを行った。その肝を同種移植して、レシピエントの生存期間を検討したところ、21日まで生存期間が延びた。肝にFasリガンドを強発現させると好中球をよびよせ劇症肝炎を発症させる。そこで、CrmAを発現させることによって、Fasリガンドによる肝炎を防止し、Fasリガンドの強発現を可能にできると考え、検討を加えたが、さらなる生存延長効果は認められなかった本研究では、(1)loxP配列を持つon/off系FasL、CrmAアデノウイルスベクターをCOS-TPC法を用いて作製した。そこで、CrmAを発現させることによって、Fasリガンドによる肝炎を防止し、Fasリガンドの強発現を可能にできると考え、検討を加えたが、さらなる生存延長効果は認められなかった本研究では、(1)loxP配列を持つON/OFF系FasL、CrmAアデノウイルスベクターをCOS-TPC法を用いて作製した。この系は標的細胞内で外来遺伝子を発現する為には外来遺伝子を発現するベクターとCre組み換え酵素を発現するベクターとを共感染させる必要がある。作製したCre/loxP系を用いたアデノウイルスベクターAxCALNFasL、AxCALNCrmAおよびCre組み換え酵素発現用ベクターAxCANCreを共感染させたCOS-7細胞ではラットFasL、CrmAがWestern blottingで検出されたが、AxCALNFasLのみを感染させた細胞ではFasL、CrmAの発現は認められなかった。HepG2細胞にAxCALNFasLをMOI6で、AxCANCreをMOI0からMOI1までの範囲で共感染させた。その後24時間培養したHepG2細胞を位相差顕微鏡下にて観察した。また蛋白質を抽出し、Western blottingによって解析した。その結果AxCANCreの感染濃度依存的にHepG2細胞に細胞死が観察された。

更にカスペース3と8の活性はCrmA導入細胞においては有意に抑制されていた。これらの結果はCrmAがFas/FasL介在性のアポトーシスを抑制するための効果的な遺伝子産物であることを示した。本研究では、昨年の結果を踏まえて、Fasリガンド、CrmAの各遺伝子を導入したラット同種肝移植における生存延長効果について検討した。同種異系の臓器移植における拒絶反応の主体は活性化細胞障害性リンパ球(CTL)である。活性化したリンパ球はFas抗原を多量に発現していることから、移植肝にFasリガンドを発現させることにより浸潤リンパ球にアポトーシスを誘導することが可能と考えられる。Fasリガンドを発現させたドナー肝を同種移植したところ、生存期間の中央値が29日と有意に延長していた。一方、拒絶反応においてはCTLの活性化により移植片細胞がアポトーシスに陥る。移植細胞内においてはアポトーシスのシグナルが伝わっていく。その経路として、Fas/Fasリガンド系、パーフォリン/グランザイム系があることか明らかにされている。アポトーシスのシグナル伝達の抑制を意図し、CrmA遺伝子をドナー肝に導入することを行った。その肝を同種移植して、レシピエントの生存期間を検討したところ、21日まで生存期間が延びた。肝にFasリガンドを強発現させると好中球をよびよせ劇症肝炎を発症させる。そこで、CrmAを発現させることによって、Fasリガンドによる肝炎を防止し、Fasリガンドの強発現を可能にできると考え、検討を加えたが、さらなる生存延長効果は認められなかった。組織学的検討では移植後5日目の組織所見では、対照群(LacZ導入群)では単核球の浸潤や門脈周囲の出血壊死が認められるが、Fasリガンド遺伝子導入群及びCrmA遺伝子導入群ではいずれも、それらの所見は軽減されている。免疫染色による組織像では、2導入群でCD2陽性のTリンパ球浸潤が門脈周囲及び肝組織間質のいずれも対照群に比べて有意に減少していた。また、両群ともTUNEL染色にて肝細胞アポトーシス像は減少しており、Fasリガンド導入群では門脈周囲浸潤単核球のアポトーシスも観察された。