hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
東日本大震災及び原発事故後の福島県沿岸生態系の変化に関する実態と機構の解明

2018年56月に福島県、宮城県及び茨城県の7定点において方形枠を用いた付着生物調査を行い、種組成と種別の個体数密度及び重量密度を調べた。また、2018年4月に福島県浜通りの15定点でイボニシ分布状況調査を行った。また、福島県大熊町夫沢と富岡町冨岡漁港、茨城県ひたちなか市平磯(対照地点)で2018年4月以降、イボニシを毎月採集し、成熟状況を組織学的に評価し、生殖周期を調べた。2018年79月には、福島県の4定点と茨城県平磯でイボニシの産卵状況調査を行い、卵嚢を採取して孵化率も調べた。また、原発事故後の2017年4月に福島県浜通りの複数地点で採集したイボニシ試料と、同時期に対照地点(茨城県ひたちなか市平磯)で採集されたイボニシ試料のRNAとDNAの解析を行うべく、これらの個体からのRNAおよびDNAサンプルの抽出と、RNA解析を高い精度でかつ安価に行うための方法の条件検討を行った。その結果、RNAとDNAの抽出については、それぞれTrizolとCTABを用いた方法によって、解析に十分な量のサンプルを抽出できたことを確認した。また、RNAの配列解析については、従来の20-25%のコストで十分な制度のデータが得られる方法の開発を行っており、条件検討を継続して行っている。イボニシ成貝に対するヒドラジン曝露実験も予備的に進めた。一方、福島県沿岸における底棲魚介類の個体群動態と群集構造解析を行う一環として、観測定点をこれまでの9定点から16定点に増やし、また調査頻度を隔月とした新たなフィールド調査を2018年10月から開始した。今後、福島県沿岸における底棲魚介類代表種の生活史特性を解析し、明らかにする。そのうえで、それら魚介類の減少要因あるいは増殖阻害要因の究明を図る予定である。それぞれの研究が、概ね、研究計画に沿って順調に進捗しているため。現地調査を重点的に進めるとともに、試料解析や室内実験も順次進める予定である。
稲遺伝子源の分布調査と採集の可能性に関する調査

稲の増産対策は、基本的には環境改善、栽培技術の向上及び優秀な遺伝子を持つ品種の育成の三本柱より成り立つ。本調査は、最後の項目である優秀な品然を育成するために広く遺伝子源を探索し採取することを志向したものである。栽培種の一種Oryza sativaは、インド北東部において野生種より進化したのち、分化、伝播の一つのル-トをアフリカに記した。その後人為選抜を受けてアジアのそれとはかなり異った形質を示すに至った。他の栽培種であるOryza glaberrimaは、西アフリカにおいて野生種より進化し、西アフリカから中・東部アフリカにおいて湿潤地や乾燥地において広く栽培されるに至ったが、外来のO.sativaに比較してなお未分化の点が多くみられる。これら両栽培種は、アジアにおけるindicaやjaponicaよりもjavanicaに近い形質を備えた一種独特の存在であり、また、地理的・生態的環境の多様性に起因して、それらが示す形態的、生理的または遺伝的諸形質の変異性は驚くべき多様性を示しており、稲遺伝子源の宝庫というにふさわしい地域である。一方野生種に関しては、アフリカには、O.glaberrimaの直接的祖先型であるO.breviligulataをはじめ数種の分布が記録されているが、いずれも断片的記載に終始し、アフリカ全域における系統だてた報告には程遠いものである。全アフリカ的見地から正確に分布地点を確認し、記録するとともに、水分・光・土壌などの環境条件を明確にすることによって、稲遺伝子源の有効利用に供さねばならず。本現地調査の目的は正にここにあった。本研究は、上記現地調査で得た結果を基礎にしてとりまとめを行った結果を示し、それらを使用して生理学的、生態学的、遺伝学的及び作物学的調査を可能にすることを志向したものである。以下、本年度迄に得た栽培種、野生種及び生態学的調査の概要を述べる。栽培種の粒形調査から次のような地域特性が明らかになった。マダカスカル産では玄米長は6.47mm、幅は2.52mm、厚さは1.86mmの平均値を示した。長幅比は0.44であった。長・幅・及び幅・厚の間では正の相関が認められたが長・厚の間では認められなかった。一方チンザニア産ではそれぞれ6.94mm、2.56mm、1.83mmの平均値を示し、長幅比は0.30でありやや丸味を帯びていた。長・幅の間に相関が認められなかった。O.glaberrimaの分布が確認された。玄米のアミロ-ス含有の分析では、マダガスカル産では29.1%から12.4%の変異を示したが、タンザニア産では28.1%から7.2%の変異を示し、非常に低含量の系統が認められた。また、貯蔵蛋白質の分析ではマダガスカル産でAタイプ16%、Bタイプ84%、タンザニア産ではAタイプ24%、Bタイプ76%であった。いずれの形質についても国ごと、また国の中での地域特異性が確認された。野生種の種の同定を厳密に行った。また、粒形調査ではO.longistaminataはマダガスカル産で籾長7.93mm、幅2.26mm、厚1.52mm、長幅比は3.54、タンザニア産ではそれぞれ8.70mm、2.34mm、1.63mm、3.77を示し、タンザニア産が大型であった。一方、タンザニア産のO.puntataはそれぞれ5.96mm、2.29mm、1.51mm、2.62を示した。栽培種同様に地域特異性が認められた。野生種の分布は広く、且その生態的条件は極めて多岐に亘っている。すなわち湿潤氾濫原は勿論、サバンナにおいても、また光条件についても多様な適応現象を示している。自然交雑現象は少いが、栽培種と野生種の複合集団が見られた。前2回の調査を発展させた報告を6編発表した。栽培種については、現地採集系統を継代栽培中に多くの分化が確認され、種間及び種内、更には地域間の変異が拡がって見られた。しかしO.glaberrimaの変異はO.sativa変異よりも小さかった。伝統的農法の地域で採取した系統ほど丸味を帯びた籾型を示していることが注目された。前回得られた水文環境の結果から、陸稲とソルガムの水利用効率と農業生産力の関係を単植と混植について、アフリカの実態との整合性について論じた。

これら両栽培種は、アジアにおけるindicaやjaponicaよりもjavanicaに近い形質を備えた一種独特の存在であり、また、地理的・生態的環境の多様性に起因して、それらが示す形態的、生理的または遺伝的諸形質の変異性は驚くべき多様性を示しており、稲遺伝子源の宝庫というにふさわしい地域である。一方野生種に関しては、アフリカには、O.glaberrimaの直接的祖先型であるO.breviligulataをはじめ数種の分布が記録されているが、いずれも断片的記載に終始し、アフリカ全域における系統だてた報告には程遠いものである。全アフリカ的見地から正確に分布地点を確認し、記録するとともに、水分・光・土壌などの環境条件を明確にすることによって、稲遺伝子源の有効利用に供さねばならず。本現地調査の目的は正にここにあった。本研究は、上記現地調査で得た結果を基礎にしてとりまとめを行った結果を示し、それらを使用して生理学的、生態学的、遺伝学的及び作物学的調査を可能にすることを志向したものである。以下、本年度迄に得た栽培種、野生種及び生態学的調査の概要を述べる。栽培種の粒形調査から次のような地域特性が明らかになった。マダカスカル産では玄米長は6.47mm、幅は2.52mm、厚さは1.86mmの平均値を示した。長幅比は0.44であった。長・幅・及び幅・厚の間では正の相関が認められたが長・厚の間では認められなかった。一方チンザニア産ではそれぞれ6.94mm、2.56mm、1.83mmの平均値を示し、長幅比は0.30でありやや丸味を帯びていた。長・幅の間に相関が認められなかった。O.glaberrimaの分布が確認された。玄米のアミロ-ス含有の分析では、マダガスカル産では29.1%から12.4%の変異を示したが、タンザニア産では28.1%から7.2%の変異を示し、非常に低含量の系統が認められた。また、貯蔵蛋白質の分析ではマダガスカル産でAタイプ16%、Bタイプ84%、タンザニア産ではAタイプ24%、Bタイプ76%であった。いずれの形質についても国ごと、また国の中での地域特異性が確認された。野生種の種の同定を厳密に行った。また、粒形調査ではO.longistaminataはマダガスカル産で籾長7.93mm、幅2.26mm、厚1.52mm、長幅比は3.54、タンザニア産ではそれぞれ8.70mm、2.34mm、1.63mm、3.77を示し、タンザニア産が大型であった。一方、タンザニア産のO.puntataはそれぞれ5.96mm、2.29mm、1.51mm、2.62を示した。栽培種同様に地域特異性が認められた。野生種の分布は広く、且その生態的条件は極めて多岐に亘っている。すなわち湿潤氾濫原は勿論、サバンナにおいても、また光条件についても多様な適応現象を示している。自然交雑現象は少いが、栽培種と野生種の複合集団が見られた。前2回の調査を発展させた報告を6編発表した。栽培種については、現地採集系統を継代栽培中に多くの分化が確認され、種間及び種内、更には地域間の変異が拡がって見られた。しかしO.glaberrimaの変異はO.sativa変異よりも小さかった。伝統的農法の地域で採取した系統ほど丸味を帯びた籾型を示していることが注目された。前回得られた水文環境の結果から、陸稲とソルガムの水利用効率と農業生産力の関係を単植と混植について、アフリカの実態との整合性について論じた。
耐久財としての公共財とその厚生経済学的分析

公共財の耐久財という性質を考えてみるとき、基本的にはその消費財もしく生産活動への投入物という二つの側面が注目される。そのうち、今回の研究では、公共財の消費財という側面に焦点を限定することとした。まず最初に、公共財を含む多期間経済成長モデルを構築した。このモデルの基本的特徴は、消耗分をのぞき、公共財の供給量が時間が経過しても減少しないという特性(消費の垂直的同時性)を組み込んだことである。簡単な数値モデルを用いたシミュレーション分析の結果を参照にしつつ、そこから得られた成果のひとつは、第1世代が供給した公共財を、第2世代以降もそのまま消費し続けるという、いわば世代間にわたる「ただ乗り(free rider)」現象が生ずるということであった。これは、きわめて現実的側面を特徴づけるものと考えられる。むろん、このような資源配分の時間経路は、少なくとも公正という厚生経済学の要求に合致するものではない。そして、そのような帰結が得られる理由の一つは、世代間にわたる所得移転の方向が、過去から未来へという(この場合には公共財を通じた)一方向のみに限定されているためである。そこで、研究の第2段階として、未来から過去への所得移転の可能性をモデルの中に組み込んでみた。具体的には、公共財の初期供給時点において、建設国債を発行し、それを将来世代が順次償却していく。このような世界においては、初期時点での社会的初期付与量の制約を受けながらも、公共財の供給量が、最初のモデルでの供給量を上回り、効率性及び公正という二大基準により合致する時間経路がえられることがわかった。現時点では、以上に成果を論文として公表すべく、準備を進めているところである。しかし、残された課題も非常に多く、ひきつづき研究を進めたいと考えている。
センチネルリンパ節を特定する磁気プローブの開発

乳がんの治療法は、病巣周囲のリンパ節への転移の有無によって変わり、転移があった場合はリンパ節も併せて切除するため、むくみ等の合併症が発生する。不必要なリンパ節切除を避けるため、がんに最も近いリンパ節(センチネルリンパ節)を探して病理検査を行うことが求められる。本研究では、がん病巣からリンパ系へ導入した磁性流体を体外の磁気プローブによって検出し、センチネルリンパ節を特定するシステムを、開発した。従来法とは異なり放射線を使わず、永久磁石と小型磁気センサから成るシンプルな構造のため、患者を対象とした臨床研究が早期に開始され、従来法に対する優位性を示すことができた。乳がんの治療法は、病巣周囲のリンパ節への転移の有無によって変わり、転移があった場合はリンパ節も併せて切除するため、むくみ等の副作用が発生する。本研究では、がん病巣からリンパ系へ導入した磁性流体を体外の磁気プローブによって検出し、センチネルリンパ節を特定するシステムを、世界に先駆けて実用化することを目的としている。従来法とは異なり放射線を使わず、永久磁石と小型磁気センサから成るシンプルな構造のため、患者を対象とした臨床研究へ早期に移行できることが特徴である。平成25年度は、磁気プローブの原理検証を行った。磁気プローブは、体内の磁性流体を磁化させる永久磁石と、その磁化を検出する磁気センサによって、構成した。磁気センサはプローブ先端部に配置するのが重要であるとともに、磁気センサからの出力を高いゲインで増幅するためには、磁性流体が存在しない時のバイアス磁場がほぼゼロとなることが望ましい。リング型の永久磁石には、中心軸上に、磁束密度がゼロの点が存在する。その位置にセンサを配置することで、バイアス磁場を最小化した。また、永久磁石と体内の磁性流体とによって形成される磁場の分布を、数値解析によって評価した。磁性流体としては、MRI用造影剤として実用化された製品を利用するが、この薬剤の詳細な磁気特性に関する十分な資料が無いため、独自に磁気特性の測定を行って、解析に利用した。磁気プローブと磁性流体の距離を変化させて、センサ出力の変化を求めた。不必要なリンパ節切除を避けるために、がんに最も近いリンパ節(センチネルリンパ節)を探して病理検査を行う事が求められる。本研究では、がん病巣からリンパ系へ導入した磁性流体を対外の磁気プローブによって検出し、センチネルリンパ節を特定するシステムを、世界に先駆けて実用化することを目的としている。平成26年度は実使用量の磁性流体を検出する実験に取り組んだ。リング型のネオジム磁石とホール素子を使って、磁性流体を接近させたときにセンサ出力が変化することを確認する実験を行った。永久磁石と磁気センサとの相対的な位置を、マイクロメートルの精度で調整するための治具は、独自開発したものを使用した。センサの出力を観察しながら、それが最小になる位置に調整して、接着剤にて固定した。地磁気の影響を補償するために、もう1つの磁気センサを設けて差動増幅を行った。また、リンパ節の構造と、大きさを模擬したファントムを作成し、磁性流体を検出する実験を行った。平成27年度は、永久磁石及び周囲の鉄心について、これらの寸法を変化させ、様々なパラメータの組み合わせに対して数値解析を実施した。高い検出感度とセンサ出力の安定性とがバランスするような設計を探索した。駆動回路に必要な機能は、磁気センサからの出力をアンプで増幅し、ノイズ低減のための周波数選択フィルタを備え、温度や経時変化などによるセンサ出力の変動を補正し、センサ出力の変化を数値や音などで使用者に示すことである。これらの機能を実現する回路を設計・製作し、持ち運び可能なケースに収められるよう開発した。応答の速さと低ノイズを両立させるよう、フィルタ周波数に留意した。上述に従って作成した試作機の性能評価を、動物個体を用いて行った。犬を用いて前後肢の指間皮下に適量のリゾビストを皮下注射し、継時的に腋窩リンパ節及び膝下リンパ節への集積の検出能力を検討した。また本実験から、検出に必要な集積時間と集積量(リンパ節に集積した鉄の量で評価)の相関も検討した。交付申請書に記載した内容を順調に実行できた。研究成果について、国内会議2件の発表を行った。

乳がんの治療法は,病巣周囲のリンパ節への転移の有無によって変わり,転移があった場合はリンパ節も併せて切除するため,むくみ等の副作用が発生する.不必要なリンパ節切除を避けるため,がん細胞が最初に到達するリンパ節(センチネルリンパ節)を同定して病理検査を行うことが求められる.本研究では,がん病巣からリンパ系へ導入した磁性流体を体外の磁気プローブによって検出し,センチネルリンパ節を同定するシステムを,世界に先駆けて実用化することを目的としている.従来法とは異なり放射線を使わず,永久磁石と小型磁気センサから成るシンプルな構造のため,患者を対象とした臨床研究へ早期に移行できる.昨年度までに製作した磁気プローブは,センチネルリンパ節の探索において十分な感度を持っていることが示された.しかし,磁石先端径が大きいため,小径のリンパ節の測定に用いる場合には,磁気プローブが指し示す位置や方向が明確でないという課題があった.そこで,従来と同レベルの検知距離を確保しつつ,磁石先端の直径を縮小することによって,磁気プローブが指し示す位置を明確に視認できるように,新たな先端部のサイズを検討し,具体的設計案を示した.有限要素法を用いた電磁界の数値解析によって,磁石と磁性流体のモデルを作製し,磁場の空間的な分布とセンサに加わる磁場の強さを評価した.磁石の外径や長さを様々に変化させて,適した設計を見出した.さらに磁石の試作を行い,これを磁気プローブに実装して,所定の特性が達成されていることを確認した.乳がんの治療法は、病巣周囲のリンパ節への転移の有無によって変わり、転移があった場合はリンパ節も併せて切除するため、むくみ等の合併症が発生する。不必要なリンパ節切除を避けるため、がんに最も近いリンパ節(センチネルリンパ節)を探して病理検査を行うことが求められる。本研究では、がん病巣からリンパ系へ導入した磁性流体を体外の磁気プローブによって検出し、センチネルリンパ節を特定するシステムを、開発した。従来法とは異なり放射線を使わず、永久磁石と小型磁気センサから成るシンプルな構造のため、患者を対象とした臨床研究が早期に開始され、従来法に対する優位性を示すことができた。交付申請書に記載した内容を順調に実行できた。研究成果について、国際会議1件、国内会議4件の発表を行った。磁石先端径が大きいため、小径のリンパ節の測定に用いる場合には、磁気プローブが指し示す位置や方向が明確でないという課題があった。そこで、従来と同レベルの検知距離を確保しつつ、磁石先端を凸型形状とし、従来の円筒形状の課題であった指示方向の明確化、狭い手術創内でも検出リンパ節を視認ができるような磁石の試作を行う。試作後はこれを磁気プローブに実装し、実験的な性能評価を実施する。28年度が最終年度であるため、記入しない。生体医工学駆動回路に必要な機能として、磁気センサからの出力をアンプで増幅し、ノイズ低減のための周波数選択フィルタを備え、温度や経時変化などによるセンサ出力の変動を補正し、センサ出力の変化を数値や音などで使用者に示すことを実現する。このための回路を設計・製作し、持ち運び可能なケースに収める。動物個体を用いて性能を評価する。センチネルリンパ節は癌組織の近傍に投与された磁性流体がリンパ流によって最初に到達するリンパ節であるが、その大きさや部位は対象とする器官によって異なっている。
ロコモ予防を想定した痛みに対する指標の「見える化」による運動促進システムの開発

科学研究費助成事業(学術研究助成基金助成金)補助事業期間延長承認申請書に記載の通り,平成30年度は本務校でのカリキュラム改編に伴う大幅な業務増加に伴い,当初計画をしていた実機の作成および検証を行なうことができなかった。そのため,痛みの評価に対するアプローチの実験を追加,実機の検討を行なった。近年,脳機能研究の進展により,痛みを感情として捉え,外部からの刺激による痛覚とは区別して定義する提唱がなされてきている。本研究では,ロコモ予防という観点から,継続的に受ける外部からの刺激(痛覚への刺激)をトリガーとした個人的な情動経験による痛みを主観的な痛みと定義し,検討を行なってきた。本年度における実機の検討では,昨年度からの成果を受けてのポジティブな情動を喚起する方法とそれを維持する(運動促進に繋がる)方法として,衣服への装着を前提とした客観的指標の見える化に取り組んだ。その結果,外部から自身で見ることができる衣服への装置の装着は,他者からも見ることができるものであるため,その過程で生起する情動による影響も大きいことが示唆された。他方,ロコモに対する若年層への理解を促す啓発活動の一つとして,本年度も大学の文化祭での教科展示会場におけるアナウンスを実施した。同時に,現在の若年層の衣服と姿勢についての調査も実施した。これは,本来計画の変更およびスケジュール等から可能な範囲での研究として実施した本研究に関する予備的調査であったが,若年層における姿勢の悪化やその実態を把握できた。先述の理由に伴い,装置の検討や作成が断続的であること,一定期間で十分なデータを集める期間を設定することができなかった等から遅れている。また,実験に使用していた機器の故障による買い替えに伴う修正においても時間を要した。2019年度においても業務量は微増していることから,残りの研究期間内では実機を作成し,期間終了後も引き続き実験および検証を継続していくことを計画している。また,外部刺激をトリガーとする主観的痛み(個人的な情動経験による痛み)の変化について,これまでの結果を通したモデルの作成についても検討を行なう方針である。平成28年度は,インナー型ウェアラブルデバイス(以下WD)を用いて,主観的な「痛み」の「見える化」のための計測項目の検証と確認を中心に実験室実験を行なった。採択直後から予備実験を開始したが,実験協力者の若年層において,計画していたいずれの手続きにおいても主観的な痛み(その変化)を計測することは困難であった。そこで,他の様々な手続きを試行し,歩行を一定時間継続させ,その中で客観的な指標として呈示する情報を操作することで主観的な痛みの変化の計測に成功した。具体的には,WDで計測される実際の(客観的な)負担は同程度であっても,呈示される情報(Visual Analogue Scale (face)を用いて操作的に呈示した)によって実験協力者の主観的な痛みの回答(Visual Analogue Scale (線分)を指示することによって回答)に大きな差が出ることが示された。すなわち,主観的な痛みは,自身の身体内部情報にのみ基づくものではなく,(客観性が高いとされる)外部からの情報によっても評価されているものであることが確認された。本研究においては,過大評価される痛みに対して,外部からの情報によって一定の認知を保持することを目標とするため,本実験による確認は目標の達成可能性を逆説的に示唆するものであり,その意義は大きいものであった。一方,その際に情報の呈示の仕方および実験協力者の主観的痛みの回答方法などに工夫が必要とされると考えられたことから,VRおよび視線の利用を試行した。VRでの情報呈示には,歩行のリアリティ向上という側面も期待したが,装置を繋ぐケーブルの歩行への影響が大きく改善を検討中である。実験初期段階において,若年層の実験協力者では計画時の手続きによる主観的な痛み(その変化)の確認が困難であったため,本実験の成果達成は大幅に遅れることとなった。しかし,年度内には主観的な痛み(その変化)の計測と影響を確認できたことから,本研究におけるスモールゴールを達成し,順調に進展していると考えられる。一方,研究が達成された時点がH28年4Qであったことから成果報告についてはH29年度に実施する予定である。平成29年度は,前年度の実験成果について,学会発表ならびに論文報告を行なった。本内容は,ウェアラブルデバイスで計測される実際の(客観的な)負担は同程度であっても,呈示される情報(Face Rating Scale(FRS)を用いて操作的に呈示した)によって実験協力者の主観的な痛みの回答(Visual Analogue Scale (VAS)を指示することによって回答)に大きな差が出る点について,集計データおよび個人毎のデータから詳細な分析についての報告を行なったものであった。加えて,一般的な痛み刺激となる外部刺激による痛みの評価に対する呈示情報の影響について視線計測装置やVR等を用いたアプローチからの研究を実施した。その結果,痛みの評価における個人差は呈示刺激とそれに伴う情動変化によっても大きな影響を受けることが実験から示唆された。そのため,ロコモ予防および運動促進という観点から,外部からの情報を呈示する際には,ポジティブな情動を促すような方法が効果的であると考えられた。一方,ロコモに対する若年層への理解を促す啓発活動の一つとして,文化学園大学文化祭での教科展示会場におけるアナウンスを実施した。この中で,ロコモへの関心が極めて低い,将来的な当事者としての意識が全くない若年層に対して情報を提供する際の課題も見出された。

この問題においても,まずは,楽しみながら体験をしてもらうといった工夫の必要性があり,新たな呈示方法によっての検証を計画している。これまでの計画では,ロコモ予防・運動促進において,痛みの数値化による情報の呈示(スマートフォンもしくはタブレット等での画面表示)を計画していたが,H29年度実施の実験結果から数値情報の呈示だけではなく多角的なアプローチの必要性が検討された。そこで,痛みに対する指標についての検討を中断し,ポジティブな情動を促す効果を有しつつ,かつ,一定の客観性を保持した情報についての新たな呈示方法を検討することとした。その結果,課題であるロコモ予防を想定した(別指標の「見える化」によっての)運動促進システムの開発に重点を置く計画へ変更することを決定し,新たな呈示方法を用いた成果達成に向けての計画を進めている。科学研究費助成事業(学術研究助成基金助成金)補助事業期間延長承認申請書に記載の通り,平成30年度は本務校でのカリキュラム改編に伴う大幅な業務増加に伴い,当初計画をしていた実機の作成および検証を行なうことができなかった。そのため,痛みの評価に対するアプローチの実験を追加,実機の検討を行なった。近年,脳機能研究の進展により,痛みを感情として捉え,外部からの刺激による痛覚とは区別して定義する提唱がなされてきている。本研究では,ロコモ予防という観点から,継続的に受ける外部からの刺激(痛覚への刺激)をトリガーとした個人的な情動経験による痛みを主観的な痛みと定義し,検討を行なってきた。本年度における実機の検討では,昨年度からの成果を受けてのポジティブな情動を喚起する方法とそれを維持する(運動促進に繋がる)方法として,衣服への装着を前提とした客観的指標の見える化に取り組んだ。その結果,外部から自身で見ることができる衣服への装置の装着は,他者からも見ることができるものであるため,その過程で生起する情動による影響も大きいことが示唆された。他方,ロコモに対する若年層への理解を促す啓発活動の一つとして,本年度も大学の文化祭での教科展示会場におけるアナウンスを実施した。同時に,現在の若年層の衣服と姿勢についての調査も実施した。これは,本来計画の変更およびスケジュール等から可能な範囲での研究として実施した本研究に関する予備的調査であったが,若年層における姿勢の悪化やその実態を把握できた。先述の理由に伴い,装置の検討や作成が断続的であること,一定期間で十分なデータを集める期間を設定することができなかった等から遅れている。また,実験に使用していた機器の故障による買い替えに伴う修正においても時間を要した。本研究で作成を目指す安心指標の中で用いる変数について,H28年度の実施結果から当初計画の変更が必要であると考えられる。そこで,H29年度は代替となる指標の作成・確認を目指す。現在,ロコモ度テストの一つの指標である2ステップテストを利用した指標の作成を検討している。また,本年度導入した装置であるVRは,現在高齢者施設などでの利用も促進されていることから,本研究目的である運動促進システム,ロコモ予防,広くはQOLの向上に繋がる利用についても応用的に検討したい。
Notchシグナルに関与するO-フコース型糖鎖の細胞分化・臓器形成における役割

Notchシグナルは発生、細胞分化のさまざまな局面で重要な役割を担っており、その機能不全はまたT細胞性白血病やCADASILをはじめとする種々の疾患の原因であることが知られている。Notchの細胞外ドメインはO-フコース型糖鎖による修飾をうけており、この糖鎖修飾の第1段階を触媒するO-フコース転移酵素(O-Fut1)の欠損マウスはNotchと同様に胎生致死となる。研究代表者らはこの欠損マウスから樹立したES細胞を用いて、O-フコース型糖鎖の欠損によりリガンド結合能が失われること、また同欠損によりNotchの細胞表面発現はほとんど変化しないことを見いだしている。本年度はリガンド発現細胞との共培養によるNotchシグナリングアッセイを行い、O-フコース型糖鎖を欠損するES細胞ではリガンド依存的なNotch活性化がほぼ消失することを明らかにした。また、RNAiによりO-フコース転移酵素の発現をCHO細胞においてノックダウンしたところ、Notchリガンドの結合とリガンド依存的Notchの活性化の両者とも顕著な減弱が認められた。Notchのリガンド結合実験の特異性を確認する目的で、マウスNotch1の細胞外領域フラグメントをCHO細胞に発現させ、培地より回収精製することにより調製した。本フラグメントはマウスES細胞に対するNotchリガンドの結合を容量依存的に阻害した。また、特定のO-フコース修飾部位を改変した部分的糖鎖欠損型のNotch1細胞外領域フラグメントはマウスES細胞に対するNotchリガンドの結合をほとんど阻害しなかった。これらの結果から、Notch細胞外ドメインのO-フコース型糖鎖がリガンドの結合およびリガンド依存的Notchの活性化に必須であることが明確に示された。Notchシグナルは発生、細胞分化のさまざまな局面で重要な役割を担っており、その機能不全はまたT細胞性白血病やCADASIL(頭痛を主症状とする皮質下梗塞と白質脳症を伴った脳動脈疾患)をはじめとする種々の疾患の原因であることが知られており、現在幅広い生命医学分野から高い注目を集めている。研究代表者らはこの欠損マウスから樹立したES細胞を用いて、O-フコース型糖鎖の欠損によりリガンド結合能が失われることを示した。一方で岡島らはDrosophilaの細胞を用い、O-フコース型糖鎖がNotchの生合成輸送に関与することを最近発表した。そこで本年度はO-Fut1欠損ES細胞の細胞表面におけるNotchの発現についてさらに詳細に検討した。Notch1に関しては2種類、Notch2,3,4に関してはそれぞれ1種類の合計5種類の市販の抗体を用いて、FACSで解析したところ、いずれも野生型と同様に細胞表面における発現が認められた。さらに、fucose代謝欠損細胞株Lec13をフコースの存在あるいは非存在化で培養して、同様に検討したところ、フコース欠損下でもNotchの細胞表面発現はほとんど正常であった。なお、フコース欠損下ではリガンド結合は顕著に低下した。現在、細胞内におけるNotchの蓄積の可能性について検討を進めているところである。
レーザー駆動パルスデトネーションエンジン用固相爆薬混合物の製作と応用

本研究では取り扱いやすくかつ安全性も考慮した薄膜状の爆薬を製作した。膜作製方法、条件を変えた一連の実験を行った。具体的には起爆薬物質DDNP(ジアゾジニトロフェノール)を主成分とし、バインダーとしてCTA(セルローストリアセテート)を加える。溶剤としてジクロロメタンを用いた。バーコーター法もしくは、テフロンテープで隔壁を作製して流し込む方法を用いることにより50μmから500μmにおよぶ膜厚の混合物膜を作製した。製作した膜はパルスレーザー照射による反応試験を行った。バインダー物質の質量分率が小さいと製膜性がわるくなりDDNPの最大質量分率は90%程度であった。製作した膜を観察すると、DDNPの粒子が下方に沈みCTAが上に集まる構造となっていた。厚い膜を製作する場合には繰り返し溶液を足して作るため、上に述べた構造が繰り返され周期構造となると推測できた。本研究で試験した条件の範囲では爆轟性を失い爆燃となった。密閉した条件では大気中で行った実験と比較すると、反応速度が速く破壊力、音響とも激しくなる。したがってたとえ爆燃でも境界条件による反応過程の影響は多大である。本研究で行った大気中の実験からきわめてユニークな燃焼過程が観測された。すなわち、パルスレーザー照射によるナノ秒のエネルギー投入により膜のレーザーアブレーションが生じる。大気中であるので、空気中の強い衝撃波、プラズマプルーム、膜上面を上方への流れ場が生じる。(レーザー投入後100ms以内)この過程の後、アブレーションで膜からはがれた微粒子が着火し燃焼が始まる。(レーザー投入後1ms程度)最後に膜面が加熱されて着火する。この着火はレーザー照射点ではなく広範囲の表面が反応を始める。以上の3段階燃焼過程は本研究の発見である。当初バーコータ法を用いて比較的薄い膜を製作試験していた。反応過程が膜厚に依存するとの予測、厚ければ限界薬径効果が薄れるとの考えから厚い膜の試験へと写った。結果的には厚い膜の方がかえって反応持続が容易でなくなる。今後も詳細な検討が望まれる。パルスデトネーションエンジンは、燃焼ではなく爆轟を繰り返して推力を得る機構であり、高い効率を持つものとして期待されている。爆轟させる物質として、気体爆轟ではなく固相爆薬を用いれば、着火からのDDT距離が非常に小さくなりきわめて高周波の運転への道が開ける。本研究ではまず、取り扱いやすくかつ安全性も考慮して薄膜状の爆薬を製作した。燃料として薄膜を用いること自体が新しい試みである。薄くても爆轟性を失わないために、爆薬としては起爆薬を用い、成膜性をよくするために結合剤を加え、さらに、溶剤を加えて溶液としたものから成膜した。爆薬物質を用いるため、安全を考慮すれば、CVDやスピンコーター法のように材料が容器内外に散乱する成膜方法は好ましくないため、バーコーター法と呼ばれる方法を採用した。この方法では、意図した領域のみに膜が形成され、周囲に散逸することはない。材料を広げた後、溶剤が飛んで爆薬と結合剤との薄膜が残る。爆薬物質、結合剤、溶剤の質量分率を変化させ、また、成膜を行う基盤フィルムを変えて数種類の膜を製作した。

製作した膜に対して、現有の連続発振レーザーおよびパルスレーザーを用いて着火試験を行った。基盤フィルム上に成膜した試料に対しては、爆薬の質量分率を高くしたときのみ燃焼が持続する。爆轟には至らない。燃焼が持続するためには、基盤物質がない薄膜試料が有利である。この種の試料は、基盤物質としてテフロン紙をを用いた揚合、基盤物質と薄膜とが分離することから製作できた。パルスレーザーにより起爆を試みたが、爆燃には至るものの爆轟には達していない。これらの過程は、CCDカメラおよび高速度のゲート付きカメラにより撮影された。薄膜の厚み、各物質の質量分率を変えれば爆轟に至るのではないかとの感触を得ている。昨年に引き続き膜作製方法、条件を変えた一連の実験を行った。具体的には起爆薬物質DDNP(ジアゾジニトロフェノール)を主成分とし、バインダーとしてCTA(セルローストリアセテート)を加える。溶剤としてジクロロメタンを用いた。バーコーター法もしくは、テフロンテープで隔壁を作製して流し込む方法を用いることにより50μmから500μmにおよぶ膜厚の混合物膜を作製した。製作した膜はパルスレーザー照射による反応試験を行った。バインダー物質の質量分率が小さくなると製膜性がわるくなりDDNPの最大質量分率は90%程度であった。製作した膜を観察すると、DDNPの粒子が下方に沈みCTAが上に集まる構造となっていた。また、バーコーターを用いず厚い膜を製作する場合には繰り返し溶液を足して作るため、上に述べた構造が繰り返される周期構造となっていると推測できた。本研究で試験した条件の範囲では爆轟性を失い爆燃となった。アクリル材で密閉した条件では大気中で行った実験と比較すると、反応速度が速く破壊力、音響ともに激しくなる。したがってたとえ爆燃であっても境界条件による反応過程の影響は多大である。本研究で行った大気中の実験からきわめてユニークな燃焼過程が観測された。すなわち、パルスレーザー照射によるナノ秒のエネルギー投入により膜のレーザーアブレーションが生じる。大気中であるので、空気中の強い衝撃波、プラズマプルーム、膜上面を上方への流れ場が生じる。(レーザー投入後100ms以内)この過程の後、アブレーションで膜からはがれた微粒子が着火し燃焼が始まる。(レーザー投入後1ms程度)最後に膜面が加熱されて着火する。この着火はレーザー照射点ではなく広範囲の表面が反応を始める。以上の3段階燃焼過程は本研究の発見である。今後も詳細な検討が望まれる。
高磁場MRIを用いた位相差強調画像法による脳腫瘍内微細構造の分離画像化

転移性脳腫瘍11症例(64.3±13.9歳)、神経膠腫(WHO grading 2-4)31症例(49.6±21.9歳)のMRI画像dataに対して、位相差強調画像法による位相選択を行うことにより、血管強調画像、髄鞘強調画像を作製した。脳腫瘍が周囲血管および視放線を含む大脳白質線維(髄鞘)に及ぼす影響を4段階の画像所見(1:poor; 2: fair; 3:moderate; 4: good)で視覚的に評価し統計解析を行った。2群間で腫瘍周囲血管の描出に統計学的な有意差は認められなかったが(p=0.56)、視放線の描出に有意差が認められた(p=0.04)。脳腫瘍内部微細構造の分離画像化を実現するために、手術目的で入院となった脳腫瘍術前の連続30症例に対して、臨床用高磁場MRI装置(Philips Achieva 3.0T Quasar Dual)を用いた画像検査を施行した。通常のT1強調像、T2強調像、拡散強調像、造影T1強調像に追加して、我々が独自に開発した位相差強調画像(phase difference enhanced imaging: PADRE) (米田哲也, Routine Clinical MRI 2013 Book)を撮影した。得られたPADRE raw dataに対して、複数の位相フィルタをかけることにより、腫瘍内の血腫、石灰化、壊死といった各微細成分を強調した数種類の画像を取得した。また各々の症例については術前に頭部単純CTも施行し、石灰化の分布を調べた。手術で得られた脳腫瘍組織ついては、通常の病理組織診断の他に、血腫、石灰化、壊死の局在、程度についても評価した。このようにして、本年度については可能な限り多くのdata収集に努めることとし、統計学的な解析については、より十分なサイズの症例収集が見込まれる次年度以降に持ち越すことにした。対象患者のdata収集とは別に、石灰化のMRI強度情報と位相情報およびCT吸収値を患者群の検査における基準として用いるための微小石灰化ファントムを作成し、MRI, CT撮影を施行した。得られた結果については、画像化される微細石灰化粒子の個数、面積、信号値、吸収値について統計学的解析を行った。現在、専門国際学術誌への投稿準備中である。脳腫瘍内部微細構造の分離画像化を実現するために、手術目的で入院となった脳腫瘍術前の連続20症例に対して、臨床用高磁場MRI装置(Philips Achieva 3.0T Quasar Dual)を用いた画像検査を施行した。このようにして、本年度については可能な限り多くのdata収集に努めることとし、統計学的な解析については、次年度以降に持ち越すことにした。対象患者のdata収集とは別に、患者群の検査の基準として用いるために作成された微小石灰化ファントムのMRI, CT画像における微細石灰化粒子の個数、面積、信号値、吸収値について統計学的解析を行った。結果は、専門国際学術誌への投稿準備中である。脳腫瘍内部微細構造の分離画像化を実現するために、手術目的で入院となった脳腫瘍術前の連続10症例に対して、臨床用高磁場MRI装置(Philips Achieva 3.0T Quasar Dual)を用いた画像検査を施行した。このようにして、本年度はこれまでに収集した約50症例に追加して10症例のデータを収集し、目的とする脳腫瘍内の血腫、石灰化、壊死に特異的な位相情報の抽出を試みた。これまでに得られた全症例の位相情報を用いた統計学的解析は、次年度に持ち越すことにした。対象患者のdata収集とは別に、患者群の検査の基準として用いるために作成された微小石灰化ファントムのMRI, CT画像における微細石灰化粒子の個数、面積、信号値、吸収値について統計学的解析を行った結果は、専門国際学術誌への投稿準備中である。当初予定していた全研究期間内における脳腫瘍患者約60症例のdata収集を行うことができた。

全症例を対象とした統計解析を行い、国際専門誌への投稿、および国際学会への発表を行う予定であったが、目的とする脳腫瘍内の血腫、石灰化、壊死に特異的な位相情報の決定に予想以上に時間を要したために、これらを次年度に持ち越すこととした。(補助事業期間延長承認申請書提出、承認済み)脳腫瘍内部微細構造の分離画像化を実現するために、手術目的で入院となった脳腫瘍術前の連続60症例に対して、臨床用高磁場MRI装置(Philips Achieva 3.0T Quasar Dual)を用いた画像検査を施行した。通常のT1強調像、T2強調像、拡散強調像、造影T1強調像に追加して、我々が独自に開発した位相差強調画像(phase difference enhanced imaging: PADRE) (米田哲也, Routine Clinical MRI 2013 Book)を撮影した。得られたPADRE raw dataに対して、血管および髄鞘に特異的な位相フィルタを選択して適応することにより、脳内の血管構造、白質線維(髄鞘)を強調した画像を取得した。さらに、脳腫瘍と周囲の微細血管および大脳白質線維の関係の視覚的評価のために、血管強調画像、髄鞘強調画像をSPM (statistical parametric mapping)を用いて、同一のMRI画像上にcolor map表示した。60例の脳腫瘍のうち、WHO gradingで分類した神経膠腫、および転移性脳腫瘍に分類して、脳腫瘍が周囲血管および大脳白質線維に及ぼす影響を視覚的に評価して、統計学的解析を行った。解析の結果は、悪性度の高い神経膠腫(WHO grade III-IV)では大脳白質線維の描出が不明瞭となる傾向が認められ、腫瘍組織の脳内浸潤による髄鞘の破壊が示唆された。一方、悪性度の低い神経膠腫(WHO grade II)および転移性脳腫瘍においては、大脳白質線維の描出は保たれる傾向が認められた。また血管構造に関しては、悪性度の高い神経膠腫(WHO grade III-IV)では、腫瘍の栄養血管あるいは流出静脈と考えられる微細血管が多く認められる傾向が示された。転移性脳腫瘍11症例(64.3±13.9歳)、神経膠腫(WHO grading 2-4)31症例(49.6±21.9歳)のMRI画像dataに対して、位相差強調画像法による位相選択を行うことにより、血管強調画像、髄鞘強調画像を作製した。脳腫瘍が周囲血管および視放線を含む大脳白質線維(髄鞘)に及ぼす影響を4段階の画像所見(1:poor; 2: fair; 3:moderate; 4: good)で視覚的に評価し統計解析を行った。2群間で腫瘍周囲血管の描出に統計学的な有意差は認められなかったが(p=0.56)、視放線の描出に有意差が認められた(p=0.04)。当初予定していた脳腫瘍患者20症例のdata収集を行うことができた。当初国内学会への発表、および国内学術誌への投稿を予定していたが、これについては次年度以降に十分なサンプルサイズでの統計解析が終了した後に、国際専門誌への投稿を優先して行うことにした。平成28年度については、平成27年度までに収集した脳腫瘍患者合計60症例のdataの詳細な解析を行い、得られた結果を国際学術誌へ投稿し、国際学会で発表する予定である。
マウス細胞における低線量放射線による適応応答での生成突然変異の分子的解析

我々の研究室では、マウスm5S細胞に低線量の放射線を予め照射すると、その後の高線量の放射線照射による染色体異常や突然変異生成の誘発が低下し、細胞致死効果も低減することを見出した。DNA2本鎖切断は、染色体異常、突然変異、細胞致死に重要な役割を果たしていると考えられているDNA損傷であり、その修復と誘発される突然変異の解析は放射線適応応答の機構解析のために非常に重要である。そこで我々は、DNA2本鎖切断の再結合反応を試験管内で行い、再結合反応の効率及び正確度を解析する実験系を確立した。これは制限酵素によって特定の個所にDNA2本鎖切断を導入し、これに培養細胞から抽出した細胞核抽出液を加えて2本鎖切断の再結合反応を行わせ、再結合反応の効率とその正確度を同時に検討するものである。変異体プラスミドの塩基配列を解析したところ、数塩基対の短い反復配列部位間で欠失突然変異が生じており、細胞内遺伝子に生じる欠失突然変異の特徴と類似していることから、細胞内での欠失突然変異生成機構を反映しているものと考えられる。この実験系を用いてm5S細胞での放射線適応応答機構の研究のための条件設定を行った。細胞の遺伝子の突然変異の検出には、マウスヒポキサンチングアニンフォスフォリボシルトランスフェレース(Hprt)遺伝子に生じる突然変異による6チオグアニン(6TG)抵抗性を指標としているが、マウスHprt遺伝子は、エクソン部分の塩基配列は報告があるものの、イントロン領域の塩基配列は明らかでないため、本研究では、まずマウスHprt遺伝子の塩基配列の決定を試みた。マウスHprt遺伝子は全長33kb、9個のエクソンからなるが、このうちエクソン2、3、6、7、8及び9とその周辺の塩基配列を決定した。エクソン4、5については未だ塩基配列の最終的な決定に至っていない。我々の研究室では、マウスm5S細胞に低線量の放射線を予め照射すると、その後の高線量の放射線照射による染色体異常や突然変異生成の誘発が低下し、細胞致死効果も減少することを見いだした。この突然変異頻度の低下がどのような機構によるものかを明らかにすることは、放射線による適応応答の機構を解明する上で重要である。現在m5S細胞での突然変異の指標としてはヒポキサンチンフォスフォリボシルトランスフェレース(HPRT)遺伝子に生じる突然変異による6チオグアニン(6TG)抵抗性を用いている。マウスHPRT遺伝子はマウス細胞の突然変異の指標として多用されているが、エクソン部分の塩基配列は報告されているものの、イントロン領域の塩基配列は明らかにされておらず、電離放射線によって誘発される欠失突然変異の解析には十分ではない。そこで本研究ではまずマウスHPRT遺伝子の塩基配列を決定している。マウスHPRT遺伝子は、全長33kb、9個のエクソンからなる遺伝子であるが、これまでに5個のエクソンを含む領域の塩基配列を決定した。部分的に明らかにされているマウスHPRT遺伝子のエクソン-イントロン領域の配列にいくつかの誤りがあることが判明した。現在残りの部分の塩基配列を決定している。同時に、m5S細胞から6TG抵抗性突然変異体クローンの分離を行った。自然突然変異、2cGy照射細胞群、6Gy照射細胞群、2cGy照射し5時間後に6Gy照射した細胞群の各々から独立の変異体クローンを分離した。これら変異体クローンの6TG抵抗性とHAT感受性の確認を行い、自然突然変異体11クローン、2cGy照射群から10クローン、6Gy照射群から13クローン、2cGy照射後6Gy照射細胞群から10クローンの突然変異体を得た。

今後突然変異体クローンの数を増やすとともに、マウスHPRT遺伝子の塩基配列決定後、それを用いて多量PCR法による解析のための実験系を確立し、得られたm5S細胞突然変異クローンについて検討を行う予定である。我々の研究室では、マウスm5S細胞に低線量の放射線を予め照射すると、その後の高線量の放射線照射による染色体異常や突然変異生成の誘発が低下し、細胞致死効果も低減することを見出した。DNA2本鎖切断は、染色体異常、突然変異、細胞致死に重要な役割を果たしていると考えられているDNA損傷であり、その修復と誘発される突然変異の解析は放射線適応応答の機構解明のために非常に重要である。そこで我々は、DNA2本鎖切断の再結合反応を試験管内で行い、再結合反応の効率及び正確度を解析する実験系を確率した。これは制限酵素によって特定の個所にDNA2本鎖切断を導入し、これに培養細胞から抽出した細胞核抽出液を加えて2本鎖切断の再結合反応を行わせ、再結合反応の効率とその正確度を同時に検討するものである。変異体プラスミドの塩基配列を解析したところ、数塩基対の短い反復配列部位間で欠失突然変異が生じており、細胞内遺伝子に生じる欠失突然変異の特徴と類似していることから、細胞内での欠失突然変異生成機構を反映しているものと考えられる。この実験系を用いてm5S細胞での放射線適応応答機構の研究のための条件設定を行った。細胞の遺伝子上の突然変異の検出には、マウスヒポキサンチングアニンフォスフオリボシルトランスフェレース(Hprt)遺伝子に生じる突然変異による6チオグアニン(6TG)抵抗性を指標としているが、マウスHprt遺伝子は、エクソン部分の塩基配列は報告があるものの、イントロン領域の塩基配列は明らかでないため、本研究では、まずマウスHprt遺伝子の塩基配列の決定を試みた。マウスHprt遺伝子は全長33kb、9個のエクソンからなるが、このうちエクソン2、3、6、7、8及び9とその周辺の塩基配列を決定した。エクソン4、5については未だ塩基配列の最終的な決定に至っていない。
EF-handカルシウム結合モチーフを持つタンパク質のX-線結晶構造解析

EF-handモチーフは多くのタンパク質に存在するカルシウム結合ドメインであり、タンパク質の活性化及び他のタンパク質との相互作用に関わると考えられている。本研究では、EF-handモチーフを持つS100A13,S100A14,VILIP-1の機能を解明する為に、X-線結晶構造解析法によりタンパク質の三次構造の決定をめざした。S100A13タンパク質はカルシウム結合型の結晶化に成功し(2006年論文発表)、X-線回折データを得て結晶構造を決定した(投稿中)。S100A13は銅イオンとの結合も報告されており、S100A13の銅結合型の結晶化条件を決定し最適化を行った。S100A14はヒト腎臓cDNAライブラリーからクローニングし、pET42b(+)ベクターに挿入、BL21(DE3)発現用大腸菌をトランスフォーム後、発現を誘導した。S100A14は可溶性タンパク質として発現し、His-bindクロマトグラフィー、Ammonium sulfate沈殿、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーの順で精製を行った。結晶化はシッティングドロップ蒸気拡散法でCrystal Screen HT及びWizard I、IIを用いて行った。PEG8000を沈殿剤とした条件の最適化を行った。VILIP-1はヒト脳cDNAライブラリーからクローニングし、pET42b(+)ベクターに挿入、BL21(DE3)発現用大腸菌をトランスフォームした。発現した可溶性VILIP-1タンパク質はHis-bindクロマトグラフィー、陰イオンクロマトグラフィー、及びゲルろ過クロマトグラフィーの順で精製した。結晶化はシッティングドロップ蒸気拡散法でCrystal ScreenHT, Wizard I、IIを用いて条件検討を行った。得られた結晶化条件の最適化を行った。S100A13,S100A14,VILIP-1,CalumeninはEF-handモチーフを持ち、様々な機能に関わっている。本研究では、これらのタンパク質の機能を解明する為に、X-線結晶構造解析法によりタンパク質の三次構造の決定をめざす。S100A13、S100A14、VILIP、Calumeninの組み換え体を作成する為に、これらのタンパク質をエンコードする遺伝子のクローニングを行った。ヒトcDNAライブラリーを用いて特定のオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、遺伝子のクローニングをPCR法で行った。増幅された配列をDNAシークエンサーで塩基配列が正しいことを確認した。今年度はS100A13について更に実験を進め、クローニングされた遺伝子を発現用プラスミドに組み込みBL21(DE3)発現用大腸菌に形質転換し、S100A13タンパク質の発現を誘導した。SDS-ポリアクリアミドゲル電気泳動を用いて目的タンパク質の分子量が正しい事を確認し、S100A13を大量に発現させた。発現させたS100A13はタグとの融合タンパク質であるため、タグをターゲットとしたアフィニティークロマトグラフィーで部分精製を行い、タグを酵素消化で切り離した後、陰イオンクロマトグラフィーを用いてS100A13を精製した。共同研究を行っている東京大学農学部生命科学研究科食品工学研究室でS100A13の結晶化の実験を行った。ハンギングドロップ蒸気拡散法を用いて約200の結晶化条件を検討した。その内のいくつかの条件で結晶の析出が観察できた。結晶を回収し高エネルギー加速器研究機構Photon FactoryにてX-線回折データを収集し、構造の概要を決定した。本研究では、これらのタンパク質の機能を解明する為に、X線結晶構造解析法によりタンパク質の三次構造の決定をめざす。クローニング、発現、精製を行ったS100A13タンパク質の結晶化条件を検討した。20°C、22%(w/v)PEG 3350、0.1M HEPES-NaOH pH 7.5、1,2,3-heptanetriolの条件下で0.25×0.05×0.05mmのタンパク質の結晶が析出し最適条件とした。最適条件で得た良質のS100A13タンパク質の結晶について、高エネルギー加速研究機構Spring-8にて分解能1.8AのX-線回折データを収集した。S100A13の結晶はP2_12_12_1の空間群に属し単位格子はa=39.7,b=59.2,c=77.6であった。S100A13の三次構造モデルは、X-線回折で計算された電子密度図を分子置換法にてS100A8/S100A9のヘテロダイマーをモデルとして構築した。高分解能のS100A13X-線結晶構造を解析しEF-handモチーフのカルシウム結合アミノ酸残基の特定及び二量体の構成に関与する水素結合と疎水性相互作用に関わるアミノ酸残基を特定した。S100A13タンパク質のX-線結晶構造解析についての論文は現在投稿中である。

EF-handモチーフは多くのタンパク質に存在するカルシウム結合ドメインであり、タンパク質の活性化及び他のタンパク質との相互作用に関わると考えられている。本研究では、EF-handモチーフを持つS100A13,S100A14,VILIP-1の機能を解明する為に、X-線結晶構造解析法によりタンパク質の三次構造の決定をめざした。S100A13タンパク質はカルシウム結合型の結晶化に成功し(2006年論文発表)、X-線回折データを得て結晶構造を決定した(投稿中)。S100A13は銅イオンとの結合も報告されており、S100A13の銅結合型の結晶化条件を決定し最適化を行った。S100A14はヒト腎臓cDNAライブラリーからクローニングし、pET42b(+)ベクターに挿入、BL21(DE3)発現用大腸菌をトランスフォーム後、発現を誘導した。S100A14は可溶性タンパク質として発現し、His-bindクロマトグラフィー、Ammonium sulfate沈殿、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーの順で精製を行った。結晶化はシッティングドロップ蒸気拡散法でCrystal Screen HT及びWizard I、IIを用いて行った。PEG8000を沈殿剤とした条件の最適化を行った。VILIP-1はヒト脳cDNAライブラリーからクローニングし、pET42b(+)ベクターに挿入、BL21(DE3)発現用大腸菌をトランスフォームした。発現した可溶性VILIP-1タンパク質はHis-bindクロマトグラフィー、陰イオンクロマトグラフィー、及びゲルろ過クロマトグラフィーの順で精製した。結晶化はシッティングドロップ蒸気拡散法でCrystal ScreenHT, Wizard I、IIを用いて条件検討を行った。得られた結晶化条件の最適化を行った。