hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ＨＩＶ－１複製制御に係わる宿主要因子の解析とＨＩＶ－１治療薬の探索

平成24年度において、Hsp70がvifによるAPOBE3G(APO3G)の分解を制御することで, HIV-1の感染性が抑制されることを明らかにした。平成25年度はHsp70によるAPO3G依存的なHIV-1感染抑制効果および内存性APO3G発現T細胞におけるvifのAPO3G分解に対するHsp70の分解抑制効果の解析を行ったところ、Hsp70はHIV-1粒子へのAPO3Gの取り込みを促進し、APO3G依存的にHIV-1感染性を抑制した。さらに、内在的にAPO3Gを発現している細胞においてもHsp70がvifによるAPO3Gの分解を抑制することを確認した。最終年度である平成26年度は前年度までの知見を基に、既存の抗HIV薬とは異なる作用点をもつ新規抗HIV-1創薬として宿主因子Hsp70の発現を誘導する低分子化合物の開発へと展開した。その結果、プロスタグラジン類に属するプロスタグラジンA1が宿主因子Hsp70を誘導し、HIV-1感染細胞でもAPO3Gの分解を抑制し、APO3GのHIV-1粒子への取り込みを促進することで、HIV-1の感染性が著しく減弱することを明らかにした。最終的に本研究では、既存の抗HIV薬とは異なる作用点をもつ新規抗HIV-1薬としてプロスタグラジンA1の開発に成功した。分子生物学、ウイルス学平成25年度の研究目的達成度2)Hsp70はAPOBEC3G依存的にHIV-1の感染性を抑制することを明らかにした。MAGI細胞に作製したHIV-1を感染させ,感染2日後にTCID50を算出した。その結果,APOBEC3G発現下においてHsp70発現量依存的にHIV-1の感染性を抑制した。この結果は,HIV-1粒子へのAPOBEC3Gの取り込み量に相関していることから,Hsp70はAPOBEC3G依存的にHIV-1の感染性を抑制することが示された。3)内在的にAPOBEC3Gを発現しているnon-permissive細胞下でもHsp70によるVifのAPOBEC3G分解抑制が確認できた。即ちVif-V5発現下においてはFLAG-Hsp70を発現させた場合においてAPOBEC3Gの発現が増加したことから,non-permissive細胞においてもHsp70はVifによるAPOBEC3G分解を抑制することが明らかとなった。以上平成25年度の研究目的はほぼ達成でき、一部平成26年度の研究計画を進めている。平成24年度の研究目的達成度(1)宿主細胞内におけるHsp70-AOPBEC3G(A3G)またはHIV-1vifとの相互作用を確認することが出来た。即ち、Hsp70はVifのN末端及びAC3Gの128-130番残基を含む領域に結合することでA3GとVifの結合を阻害し,VifによるA3Gの分解が抑制された。(2)HIV-1感染細胞でのHIV-1 vifによるAPOBEC3G分解抑制にHsp70が関与していることを明らかにした。pNL4-3をtransfectionした293T細胞中にHsp70を強発現するとHsp70発現量依存的にA3G発現量が増加した.また,vif遺伝子を欠損させたHIV-1感染性分子クローン発現プラスミドpNL4-3ΔVifをtransfectionした293T細胞では,Hsp70はAPOBEC3Gの発現に対して影響しなかったことから、HIV-1 vifによるAPOBEC3G分解を内依存性Hsp70が制御していた。
ニューロンの可視化、機能阻害及び変異体解析によるホヤ幼生の運動神経回路の解析

本研究課題は神経系を構成する細胞数の少なさに着目し、ホヤ幼生に存在するニューロンの機能、特に遊泳運動に関するニューロンの機能を解明することを目標にしている。本年度はニューロンの活動イメージング、遊泳運動に異常のある突然変異体を得ることを目的とした変異体のスクリーニングを行った。遊泳運動におけるニューロンの活動をイメージングすることを目的として、Ca^<2+>センサータンパク質である、GCaMP3,G-GECOをホヤ幼生の中枢神経系、及びモーターニューロンで発現させた。その結果、遊泳運動時の尾部の振りに合わせてG-CaMP3,G-GECOの蛍光が変化し、遊泳運動時における神経回路の活動をイメージングすることが出来た。今後、この実験系を用いて、様々なホヤ幼生の遊泳運動パターンを生み出す神経回路の活動パターンを明らかにする。遊泳運動に異常のある突然変異体を得ることを目的として、Gal4エンハンサートラップ系統のスクリーニングを行い、神経系でGal4を発現するGal4エンハンサートラップ系統を多数単離した。このGal4エンハンサートラップ系統において、トランスポゾンの挿入箇所を決定したところ、約83%と非常に高い確率でエキソンや遺伝子のごく近傍にトランスポゾンが挿入されており、突然変異体の可能性が高いことが示唆された。得られたエンハンサートラップ系統のうち、幼生の視細胞に特異的なGal4系統であるGal4 ET L5について解析を行った。Gal4 ET L5はRNA結合タンパク質であるCi-musashiの3'UTRにトランスポゾンが挿入されていた。Gal4 ET L5のホモ個体を作製したが明確な表現型を得ることが出来なかった。幼若体の中枢神経系で最も強く発現するGal4 ET L6について解析を行った。Gal4 ET L6はMAPKの脱リン酸化酵素であるCi-DUSP1の5'UTRにトランスポゾンが挿入されていた。Gal4 ET L6のホモ個体を作製したところ、幼生では明確な表現型が得ることが出来なかったが、幼若体において心臓の収縮機構に異常が見られた。現在までに、遊泳運動変異体は単離できていないが、この変異体スクリーニングを継続することにより遊泳運動の変異体を単離することが出来ると期待している。本年度はホヤ幼生の遊泳運動に関する神経回路網の解析とニューロンの機能解析を目的としたGa14-UASシステムの構築、遊泳運動に関与するニューロンの分化メカニズムの解析を行った。ホヤ幼生の各種神経伝達物質作動性ニューロンにおいて、蛍光タンパク質Kaedeを発現するトランスジェニック系統を作製した。これらのトランスジェニック系統を用いて、GABA/グリシン、コリン作動性ニューロンにより構成される神経回路の解析を行い、ホヤ幼生の尾部運動が10個のコリン作動性ニューロンと4個のGABA/グリシン作動性ニューロンにより生み出されることを明らかにした。各種神経伝達物質作動性ニューロンでGa14を発現するトランスジェニック系統を作製した。ニューロンの機能を阻害するテタヌス毒素、光によりニューロンの機能を興奮させることができるチャネルロドプシン、ChR2とは異なる波長絵でニューロンの活動を抑制することができるハロロドプシン(NpHR)、細胞死を誘導するBaxを発現するUAS系統の作製を開始した。来年度はこれらの外来遺伝子を発現する系統とGa14系統を掛け合わせ、ニューロンの機能解析を行う予定である。特定のニューロンで発現する転写因子の単離と機能解析を行い、ドーパミンニューロンの分化に必須の転写因子を同定した。来年度はドーパミンニューロンを欠損した個体の遊泳運動解析を行い、遊泳運動におけるドーパミン作動性ニューロンの機能を解析する予定である。本年度は生きたままニューロンを可視化したトランスジェニック系統を用いた神経系の構築過程の解析、ニューロンの分化メカニズム解析、遊泳運動に異常のある突然変異体を単離することを目的とした突然変異体の作製を行った。これらのトランスジェニック系統を用いて、成体の神経系が構築される過程について解析を行った。その結果、幼生の中枢神経系に存在する細胞のうち、ニューロンほとんどが消失してしまうが、グリア細胞である上衣細胞は維持され成体の中枢神経系を構築することが明らかにした。特定のニューロンで発現する転写因子の単離と機能解析を行い、ドーパミンニューロンの分化に必須の転写因子としてPtf1aを同定した。Ptf1aの機能を阻害したところ、ドーパミンニューロンが完全に欠損した。Ptf1の機能を阻害した幼生において遊泳運動を観察したところ、遊泳運動の頻度が低下しており、ドーパミンニューロンが遊泳運動に関与している可能性が示唆された。Gal4エンハンサートラップ系統のスクリーニングを行い、神経系でGal4を発現するエンハンサートラップ系統を多数単離した。

このGal4エンハンサートラップ系統において、トランスポゾンの挿入箇所を決定したところ、約83%の確率でエキソンや遺伝子のごく近傍にトランスポゾンが挿入されており、突然変異体の可能性が高いことが示された。本研究課題は神経系を構成する細胞数の少なさに着目し、ホヤ幼生に存在するニューロンの機能、特に遊泳運動に関するニューロンの機能を解明することを目標にしている。本年度はニューロンの活動イメージング、遊泳運動に異常のある突然変異体を得ることを目的とした変異体のスクリーニングを行った。遊泳運動におけるニューロンの活動をイメージングすることを目的として、Ca^<2+>センサータンパク質である、GCaMP3,G-GECOをホヤ幼生の中枢神経系、及びモーターニューロンで発現させた。その結果、遊泳運動時の尾部の振りに合わせてG-CaMP3,G-GECOの蛍光が変化し、遊泳運動時における神経回路の活動をイメージングすることが出来た。今後、この実験系を用いて、様々なホヤ幼生の遊泳運動パターンを生み出す神経回路の活動パターンを明らかにする。遊泳運動に異常のある突然変異体を得ることを目的として、Gal4エンハンサートラップ系統のスクリーニングを行い、神経系でGal4を発現するGal4エンハンサートラップ系統を多数単離した。このGal4エンハンサートラップ系統において、トランスポゾンの挿入箇所を決定したところ、約83%と非常に高い確率でエキソンや遺伝子のごく近傍にトランスポゾンが挿入されており、突然変異体の可能性が高いことが示唆された。得られたエンハンサートラップ系統のうち、幼生の視細胞に特異的なGal4系統であるGal4 ET L5について解析を行った。Gal4 ET L5はRNA結合タンパク質であるCi-musashiの3'UTRにトランスポゾンが挿入されていた。Gal4 ET L5のホモ個体を作製したが明確な表現型を得ることが出来なかった。幼若体の中枢神経系で最も強く発現するGal4 ET L6について解析を行った。Gal4 ET L6はMAPKの脱リン酸化酵素であるCi-DUSP1の5'UTRにトランスポゾンが挿入されていた。Gal4 ET L6のホモ個体を作製したところ、幼生では明確な表現型が得ることが出来なかったが、幼若体において心臓の収縮機構に異常が見られた。現在までに、遊泳運動変異体は単離できていないが、この変異体スクリーニングを継続することにより遊泳運動の変異体を単離することが出来ると期待している。
発癌物質の代謝活性化にかかわるPー450遺伝子群の誘導的発現機構

ベンツピレンなどの多環性炭化水素化合物の発癌物質の代謝的活性化に関与しているPー450lA1遺伝子のメチルコラントレンなどによる誘導的発現には2種類の制御DNAエレメントが必要であることが明らかにされている。誘導的制御領域XREと構成的発現に関与している制御領域BTEである。この遺伝子の発現制御機構を明らかにするために先ずBTE配列による作用因子のクロ-ニングをSouthーwestern法によって行った。その結果2つのクロ-ンが得られた。ジデオキシ法によって2つのクロ-ンの塩基配列を決定し、これまでに塩基配列の決定されているタンパク質のアミノ酸配列のデ-タベ-スを検索したところ一つはヒトの転写因子Sp1と90%以上のホモロジ-を示すことからラットのSp1であると結論したが、他のクロ-ンは新しいDNA結合タンパク質であることがわかった。2つのタンパク質は共にC末端付近にDNA結合タンパク質の特微の一つであるC_2H_2タイプのジンクフィンが一構造を3回くり返すドメインを持っており、両タンパク質のこの部分の類似性は75%の高いホモロジ-を示していた。しかし、それ以外の部分の塩基配列には両者間で殆んど有意なホモロジ-を示さない。今後invitroの転写系などによって、この2つのタンパク因子がPー450lA1遺伝子の発現にどのように関与するのかを検討する予定である。芳香族アミンあるいは異環性芳香族アミンなどの発癌物質の代謝的活性化に強い活性を示すPー450lA2遺伝子の発現についてはHepG2細胞を用いた発現系を開発し、遺伝子上流約2.0kbにメチルコラントレンに応答する誘導的エンハンサ-の存在を明らかにした。この部分の構造は独立して誘導的エンハンサ-活性を示し、Pー450lA1などの異種の遺伝子のプロモ-タ-に対してもその活性を示したが、その塩基配列はXREの構造とは類似性を示さず、ゲルシフトアッセイの結果もXREとは異ったDNA結合因子と相互作用する可能性が示された。
環境保全型耕地としての水田群システムの将来設計

水田は水管理が可能なシステムであり,微量化学物質による水質汚染と農薬流出,水域の富栄養化と栄養塩排出及び耕土の流亡等の関係を制御することが重要な課題である。水管理手法や水稲栽培手法の総合的な検討によって,立地環境状況に適合した最適な耕地管理システムの構築に向けて,以下のように研究を進め,その成果を得た。(1)農薬排出量と灌漑水管理方式の関係評価気象や土壌条件がほぼ同一として扱える流域面積147.4km^2の恋瀬川流域で,水管理方式の異なる上流域から下流域の水田群を対象に,灌漑期間を主とした4月下旬9月上旬の130日間に,流下方向6地点での47回と頻度の高い定時流出負荷量調査と,中流域での6回の降雨時流出負荷量調査を実施した。代表的水田の田面水農薬濃度レベル変化調査を上記47回の定時調査時に併せて行った。46月の平年値より少ない降水量,加えて,78月の異常低温・日照不足・月間降水量の多さ等の気象・水文条件下の調査となった。農薬の投入量,投入時期,投入方法,用水量,排水量,降水量等と,農薬の流出特性や流出率との関係の定量評価を行った。水稲移植・除草剤散布作業の集中に伴い,移植後1週間前後の降雨時流出により,除草剤は56月2ケ月間の総流出負荷量の20%に近いウエイトを占めた。農薬散布後の個々の農薬流出負荷量ピーク出現時で,その前後の農薬流出負荷量レベルの高い2週間における流出負荷量は,56月2ケ月間の総流出負荷量に占める比率は,Butachlorで83%,Mefenacetで55%,Esprocarbで64%と高かった。(2)栄養塩排出量と灌漑水管理方式の関係評価上記の農薬調査と併せて,窒素・リン・SSの流出負荷量調査を実施した。栄養塩や耕土の流出は,田植機による水稲移植のための田面水の一部落水による流出負荷量のウエイトが高く,農薬よりさらに早い時期の流出負荷量が著しく,降雨時流出も含む年間52回の定時負荷量調査の平均値を上回る高いウエイトを占めた。
人工衛生搭載超高周波電力変換器用薄膜磁心の開発と電力用磁気回路集積化に関する研究

人工衛生搭載電源器用磁心の小形軽量化を目標に薄膜磁心の開発を行ない、以下に列挙する成果を得た。1.薄膜磁心の開発:(1)2μm厚CoZrMo積層薄膜磁心の作成:作成条件を確定し、ポリイミド膜上にCoZrMOを2μmの厚さにスパッタ蒸着し、これを多数重ねて積層薄膜磁心を得た。この磁心の直流保磁力はHc=4.8A/m、10MHzに於ける鉄損は5μm厚Supermalloyの1/5,Mn-Znフェライトの1/8であった。(2)2μm厚CoZrMo巻磁心の作成:ポリイミドテ-プを真空槽内で回転させ、CoZrMO膜を2μm厚にスパッタ蒸着し、石英管をボビンとした巻磁心を作成した。直流保磁力として4A/mのものが得られた。(3)1μm厚人工層状環状磁心の作成:1μm厚のCoZrMo層と500AのSiO_2層を5層交互にスパッタ蒸着した人工層状環状磁心を作成した。直流保磁力は2.8A/mで、積層薄膜磁心の1/2という優れた値を達成できた。2.薄膜磁心評価装置の開発:(1)高周波鉄損計測装置の改良:磁心は方形波電圧で励磁されることが多いので、既存の装置をこの条件に適合するよう改良し、薄膜磁心の測定を行えるようにした。(2)磁区動画像観察装置の開発:磁心の損失を左右する磁区構造の観察用に、画像処理技術を応用した装置を開発した。3.多機能磁心の提案:フェライトの磁気的性質と誘電体的性質とを組み合せ、フェライトのみで、磁心のみならずコンデンサとしても動作し得る多機能素子を提案し試作した。4.磁心の等価損失抵抗の解明:磁心の動作を表現する一手法として用いられている等価損失抵抗を、等価ヒステリシス抵抗と等価過電流抵抗の合成で表し、その物理的意味を検討した。この結果、前者はスタインメッツ定数に、後者は磁区構造に強く依存することが明らかになった。1.改良したスパッタ装置により、極めて低損失の多層薄膜磁心を開発することに成功した。最初に低保磁力磁性材料を見いだすために、CoZrMoを検討し、組成並びにスパッタ条件を確立した。次に磁性層間を絶縁する材料として、12.5μm厚のポリイミドフィルムを用い、のフィルム上にCoZrMoを2μm厚にスパッタ蒸着し、積層した磁心を作製した。磁心の保磁力は、4.8A/m(0.06OOe)と極めて小さい値であった。損失の評価は、本研究で開発した鉄損計測システムで行った。スタインメッツ定数は1.59で、金属磁心の一般的な値1.6とほぼ一致した。鉄損は1MHz以上の周波数で、従来の磁心を凌ぎ、10MHzでは5μm厚スーパーマロイの1/3、MnZnフェライトの1/8、同じくうず電流損失は、1/5から1/10と極めて小さくすることができた。

2.既設の鉄損計測システム(上限周波数10MHz)は、正弦波電圧励磁専用であったが、スイッチングコンバータとしては、磁心は方形波電圧で駆動されることが多いので、このシステムを方形波電圧励磁できるよう改善した。方形波電圧の立ち上がり立ち下がり時間は、それぞれ約30nsで、動作の上限周波数は1MHzである。方形波は高調波を含むため、計測に際し、基本波の100倍の高調波まで処理し、測定精度の向上を図っている。このシステムを用い正弦波電圧励磁と方形波電圧励磁における鉄損を比較し、励磁電圧波形による損失の相違を見いだした。この原因は内部磁区構造によるものであることを明らかにすることができた。また方形波電圧励磁の方が低損失となる磁心材料を見いだし検討した結果、スイッチング電源用磁心材料選定の指針を得ることができた。ポリイミドフィルム上にCoZrMo膜をスパッタ蒸着し、多数重ねた積層薄膜磁心については前年度報告した。今年度は渦電流損を低減すると同時に、一工程で多層構造の磁心を作成する手法について検討した。まず、巻磁心の製法について検討した。ポリイミドテ-プを真空槽内で回転させ、CoZrMo膜を2μm厚さにスパッタ蒸着し、石英管をボビンとした巻磁心を作成した。その直流保磁力は4A/mのものが得られた。次に石英基板上にCoZrMo層とSiO_2層とを交互にスパッタ蒸着した人工層状磁心を作成した。その直流保磁力は2.8A/mで、前年度の積層環状薄膜磁心の1/2という極めて小さな値を達成でき、MH_Z帯に於ける電力変換用磁心の手がかりを得ることができた。高周波電力用磁気回路の解析や特性評価の一方法として、磁心を等価損失抵抗で表すと便利であることは良く知られている。従来磁心の損失抵抗の決定には、測定損失から逆算する方法が行なわれており、その物理的意味や周波数・磁束密度への依存性についてはほとんど知られていなかった。磁心の高周波特性評価のため、磁心の等価損失抵抗を等価ヒステリシス抵抗と等価渦電流抵抗に分け、おのおのについて、実験との対応から、それらの物理的意味を追求した。その結果、前者はスタインメッツ定数に、後者は磁区構造に強く依存することが明らかになった。この結果を薄膜磁心に適用することにより、高周波動作に適した薄膜磁心の選定基準、薄膜磁心の最小損失条件等が明らかになり、スイッチング電源用薄膜磁心設計の指針を得ることができるようになった。
フィリピン地域社会経済の学際的研究 -行為主体と制度的粋組の相互作用を中心として-

西村はイロイロ州一稲作農村において農村調査を行った。初年度は主に貧困層を対象に、次年度は比較的裕福な世帯を対象とした。その結果、農村の成長要因と阻害要因を特定することができた。また、イロイロ市内の統計資料機関で関連資物収集をおこなった。川田はセブにおけるラジオ聴取の様態を調査するとともに、ラジオを含むメディアの規制に関するKBPの制度的側面を検討、考察した。KBPラジオコードは、メディアの社会的責任、放送内容の公平性や倫理性の確保などの側面で、制度的規制が公的性格を帯びる。その一方で「フィリピン文化」の称揚などの文化政策に携わる面では、必ずしも拘束力を発揮せず、リスナーが個人的にメディアと関わる姿が明らかとなった。鈴木はフィリピン大学や国立図書館などで資料収集を行なった。とくに米国による植民地支配開始当初より1930年代までの米国軍政文書、および新聞・雑誌記事などを重点的に当り、その結果、米国植民地統治下におけるミンダナオ島の支配、とりわけ農業コロニーと学校教育制度に関わる1次資料を入手することができ、制度的支配の実態が解明できた。川中は、政治権力を規定する要因として国家資源の配分が重要と考え、特に、財政的な資源の配分を決定する予算過程を事例としで取りあげた。この際、予算過程を規定するものとして、憲法を中心とした法的な制度が果たす役割に着目した。調査としては、主にマニラにおいて予算策定に関わる公文書を収集するとともに、新聞記事を基にしたデータベースづくりを行った。長坂はマニラ市及びラグナ州において、イロコス地方出身者への聞き取り調査を行い、地方出身者の都市における企業活動の実態を把握した。また、東南アジアの都市化に関する諸文献の収集検討を行った。そうした作業を通して、地方出身者を農村と海外に広がるネットワークの中に位置づけた形での都市論の再構築の必要性が明らかとなった。西村は8月から9月にかけて約1ヶ月間、イロイロ州の米作農村における貧困層の実態調査を行ない、彼らが貧困の悪循環に陥るシステムを、おもに雇用制度や土地制度など経済に深く関わる制度について聞き取り調査を行なった。その結果、彼らは細かく分類することができ、なかでも最貧層は移動民的性格の農業労働者であることが明らかになった。川田は、当該都市圏において、ラジオ放送の実態調査を実施した。マスメディアをめぐる制度と行為主体についての基礎資料を収集し、補完的「制度」としての機能、セブアノという言語文化集団のひろい仮想連帯を生み出す様態、人文社会科学的知識の存在拘束性を規定する側面などを確認できた。川中は9月17日から10月8日の期間、マニラ首都圏において予算策定過程に関する資料収集を行った。行政官庁などで公文書の収集、フィリピン大学などで研究資料を収集した。予算策定の手続き、過去の実績などについてデータを手に入れ、中央に対する地方からの要求と中央から地方に対する賓源分配の仕組みを整理した。議会における利益の表出が顕著に認められ、行政と立法の関係を規定する制度的要因の重要性が確認された。長坂は11月に10日間、マニラ首都圏において印刷業を営む工場の調査を行った.調査対象は、以前長坂が行った調査対象の町出身者であった。調査賓料から、海外移住者が出身地、マニラに強固なネットワークを維持しながら、親族の経営するマニラの町工場へ資金援助を行うという、農村-都市移住という分析枠では捉えることのできない状況が明らかにされた。

鈴木は8月4日から24日まで、マニラ首都圏にて資料収集のための調査をフィリピン大学図書館などで行い、アメリカ植民地期における政治的・経済的要請に基づく「フロンティア」に対する関心の高まりにより、瘴癘の地とされたミンダナオ島への移住政策が積極的に推進され、制度化されていく過程を追った。西村はイロイロ州において農村調査を継続して行った。昨年度の調査対象は主に貧困層であったが、今年度は比較的裕福な世帯を対象とした。その結果、農村の成長要因と阻害要因を特定することができた。また、イロイロ市内の統計資料機関で関連資料の収集をおこなった。川田はセブにおけるラジオ聴取の様態を調査するとともに、ラジオを含むメディアの規制に関するKBPの制度的側面を検討、考察した。KBPラジオコードは、メディアの社会的責任、放送内容の公平性や倫理性の確保などの側面で、制度的規制が公的性格を帯びる。その一方で「フィリピン文化」の称揚などの文化政策に携わる面では、必ずしも拘束力を発揮せず、リスナーが個人的にメディアと関わる姿が明らかとなった。鈴木はマニラ首都圏において、資料収集をフィリピン大学や国立図書館などで行なった。とくに1930年代までの米国軍政文書、および新聞・雑誌記事などを重点的に当り、その結果、米国植民地統治下におけるミンダナオ島の政治的・文化的な支配の実態に関わる1次資料を入手することができた。川中は予算策定過程に関する資料収集および専門家・関係者への聞き取りのためマニラでの現地調査を実施した。また、現地新聞のデータベースを活用し、関連する新聞記事の収集整理を行った。長坂はマニラ市及びラグナ州において、イロコス地方出身者への聞き取り調査を行い、地方出身者の都市における企業活動の実態を把握した。現地調査と並行する形で、東南アジアの都市化に関する諸文献の収集検討を行った。そうした作業を通して、地方出身者を農村と海外に広がるネットワークの中に位置づけた形での都市論の再構築の必要性が明らかとなった。
傾斜機能材料の創製と諸性質

傾斜機能材料に関しては、日本における研究が一番進んでいる。それを反映し本研究グループ内での研究、討論ならびに調査は活発になされ、総研(B)の目的が達成された。また、この総合研究(B)は、次の重点申請を目的とした調査・研究であるが、重点研究でも充分な研究成果が得られるとの判断で班員の認識が一致した。この研究は6つのグループに分けられている。天然傾斜機能材料の班においては、生物界における種々の組織傾斜化による傾斜機能の発現機構の解明が進んでいることが報告され、これを基にした人口材料への応用が開始されている。機械的傾斜機能材料では、傾斜機能材料の製造方法を開発し、作製された材料について機械的性質の評価法と、残留応力の機械的性質におよぼす影響の基礎と応用の面からの検討がなされた。熱的傾斜機能材料については、その熱的安定性、熱流速の評価法の開発、ならびに、熱電特性を持った材料の高効率化を目的とする傾斜化の理論と、実現の可能性について研究、検討した結果が発表された。電気的・磁気的傾斜機能材料では、組織を傾斜し単結晶の作製の困難な光学材料のヘテロエピタキシャル成長と、垂直磁気記録媒体の傾斜組織による高機能化について成果が得られた。光学的傾斜機能材料では、高分子の界面ゲル重合法により傾斜組織の光ファイバーの合成をし、石英光ファイバーに代わる重金属フッ化物光ファイバーの基礎実験を行い、実用化の可能性を検討した。化学的傾斜機能材料では、主に生体材料、すなわち人工骨の製造とその人体での生体とのなじみがに関する研究が展開された。
ＡＤＨＤ病態におけるシナプス機能異常の電気生理学的検討および治療薬の探索

ADHDモデル動物と対照動物を用いて,ドーパミン(DA)とノルアドレナリン(NA)がGABA作動性抑制性シナプス後電流(IPSC)にもたらす修飾作用を前頭前野第五層錐体細胞と小脳プルキンエ細胞で検討した.その結果,DAの投与により前帯状回(anterior cingulate cortex)で記録したIPSCの振幅は増強されたが,その程度は対照動物では大きくADHDモデル動物では有意に小さかった.薬理学的実験からこの増強効果はD1様受容体を介していることがわかった.一方,NAによる修飾効果は錐体細胞とプルキンエ細胞ともに有意差を認められなかった.ADHD発症責任部位とされている領域(前頭前野・小脳虫部・大脳基底核)での変化を知るために,スライス標本にパッチクランプ法を用いてGABA応答がドパミンとノルアドレナリンにより受ける修飾の比率を検討した.ADHDモデルラットである自発性高血圧発症ラット(SHR)を定期的に入手するためにSHR等疾患モデル共同研究会に入会する必要があった.この手続きが終了するまでの時間浪費を避けるため,正常ラットの小脳プルキンエ細胞でのシナプス可塑性を調査した.誘発した抑制性シナプス後電流(eIPSC)を外向き電流として記録し,プルキンエ細胞を脱分極させるとeIPSCは内向き電流となった後,外向き電流に戻るものの振幅は減少した状態が20分間以上持続した.実験条件から過去に報告された逆行性の抑制や増強の影響ではないと確信し,この現象をDDIと名付けた.さらなる実験により,この現象はカルシウム依存性クロライドチャネルとクロライドトランスポーター(NKCC)によりCaMKII依存的に細胞内クロライドイオン濃度が上昇して起こっていることを解明し,論文として発表した(Satoh et al., 2013).また,この現象については第91回日本生理学会大会(鹿児島)で発表した.ADHDモデルラットとしてSHRの前頭前野内側部(medial prefrontal cortex; mPFC)の前辺縁皮質(prelimbic cortex; PL)の第五層錐体細胞よりeIPSCを記録してドパミン,ノルアドレナリン,セロトニンによる修飾効果を検討した.その結果,二週から四週齢においては有意差を見いだせなかった.しかし,前帯状回(anterior cingulate cortex; ACC)の第五層錐体細胞では対照ラットにおいてドパミンはeIPSCの振幅を増大させるが,SHRではその修飾効果が有意に減少していた.対して,ノルアドレナリンは両者間で修飾効果に差はなかった.ADHDモデル動物と対照動物を用いて,ドーパミン(DA)とノルアドレナリン(NA)がGABA作動性抑制性シナプス後電流(IPSC)にもたらす修飾作用を前頭前野第五層錐体細胞と小脳プルキンエ細胞で検討した.その結果,DAの投与により前帯状回(anterior cingulate cortex)で記録したIPSCの振幅は増強されたが,その程度は対照動物では大きくADHDモデル動物では有意に小さかった.薬理学的実験からこの増強効果はD1様受容体を介していることがわかった.一方,NAによる修飾効果は錐体細胞とプルキンエ細胞ともに有意差を認められなかった.臨床現場で用いられているADHDの症状改善薬はシナプス間隙のドーパミン濃度もしくはノルアドレナリン濃度を相対的に上昇させるものが多いことから,ADHDはドーパミンとノルアドレナリン神経伝達の機能的もしくは量的比率の変化に起因するとの仮説を立てた.これを検討するために,ADHDモデルラットと対照ラットにおいてADHD発症責任部位とされている領域(前頭前野・小脳虫部・大脳基底核)でのドーパミン濃度とノルアドレナリン濃度を測定する.また,症状改善薬投与前後で対照ラットと比較してADHDモデルラットではこれらの濃度がどう変化しているのかを検討すると共に,スライス標本にパッチクランプ法を用いることでGABA由来のIPSCがドーパミンとノルアドレナリンにより受ける修飾の比率が変化しているかを検討する.最終的に新たな治療薬を探索する.ADHDモデルラットである自発性高血圧発症ラット(SHR)を定期的に入手するためにSHR等疾患モデル共同研究会に入会する必要があった.この手続きが終了するまでの時間浪費を避けるため,正常ラットの小脳プルキンエ細胞でのシナプス可塑性を調査した.誘発した抑制性シナプス後電流(eIPSC)を外向き電流として記録し,プルキンエ細胞を脱分極させるとeIPSCは内向き電流となった後,外向き電流に戻るものの振幅は減少した状態が20分間以上持続した.細胞外溶液にはグルタミン酸受容体拮抗薬とGABAB受容体拮抗薬,CB1受容体拮抗薬を添加してあるので過去に報告された逆行性の抑制や増強の影響ではないと確信した.そこで,この現象をDDIと名付けた.さらなる実験により,この現象はカルシウム依存性クロライドチャネルとクロライドトランスポーター(NKCC)によって細胞内クロライドイオン濃度が上昇して起こっていることを解明したので論文として投稿中である.本研究課題はADHDにおけるシナプスレベルでの変異を探り,それをもとに治療薬を提案することを最終目標とした.ADHDモデル動物として自発性高血圧発症ラット(SHR)を対照ラットとしてWKYを用いた.責任部位とされている領域(前頭前野・小脳虫部)からスライス標本を作製し,神経細胞にホールセルパッチクランプ法を適用した.GABA応答として誘発した抑制性シナプス後電流(eIPSC)を記録し,ドーパミンとノルアドレナリン,セロトニンにより受ける修飾効果を検討した.

前頭前野内側部(medial prefrontal cortex; mPFC)では前辺縁皮質(prelimbic cortex; PL)と前帯状回(anterior cingulate cortex; ACC)の第五層錐体細胞から記録した.一方,小脳ではプルキンエ細胞から記録した.四週齢の小脳プルキンエ細胞ではアドレナリンβ作動薬の投与によりeIPSCの振幅増大効果が見られたが,SHRとWKYの間で有意差を認められなかった.また,PLでは二週から四週齢において修飾効果はSHRとWKYの間に有意差を見いだせなかった.しかし,ACCでは四週齢でドーパミンの投与によりWKYではeIPSCの振幅を増大させるが,SHRではその修飾効果が有意に減少していた.対して,同部位でのノルアドレナリンとセロトニンによる修飾効果はSHRとWKYの間で差はなかった.さらなる実験から,ドーパミンD1様受容体遮断薬存在下ではドーパミン投与によるeIPSCの振幅増大効果は見られず,ドーパミンD2様受容体遮断薬存在下ではドーパミン投与によりeIPSCの振幅増大効果が見られた.また,ドーパミンD1様受容体作動薬の単独投与によりeIPSCの振幅増大効果が見られ,ドーパミンD2様受容体作動薬の単独投与ではeIPSCの振幅増大効果は見られなかった.これらの結果からドーパミン投与によるeIPSCの増大効果はドーパミンD1様受容体を介していると考えられた.この振幅増大効果の違いが何に起因するのかを解明する必要がある.精神神経科学予定外であったがDDIの機序を解明し学会・論文発表できた.現在の所,ACCでみられたeIPSCに対するドパミンの修飾効果の違いがどのような機序で生じているのかを検討しているところである.予定外であったがDDIの機序を解明し投稿することができた.現在の所,生後二週間までは前頭前野の錐体細胞で記録されるeIPSCに対するドーパミンの修飾効果は,ADHDモデルラットと対照ラットの間で有意差がないことを見出している.本年度は生後四週齢以降の動物を用いて電気生理実験と行動実験を平行して推進していく.また,eIPSCに対するドパミンの修飾効果だけではなく,ACCにおけるセロトニンの修飾効果も検討する.行動実験は対照ラットにドパミン受容体遮断薬をACCに微少投与してADHD様症状が引き起こされるのかを検討する.併せてモデルラットにADHD治療薬やドパミン受容体作動薬をACCに微少投与してADHD様症状が改善するのかを検討する.DDIが論文発表できたのでADHDモデルラットと対照ラットで違いがあるかを検討することも視野に入れて推進していく.本年度は生後三週齢以降の動物を用いて電気生理実験を中心に推進していく.また,eIPSCに対するドーパミンの修飾効果だけではなく,ノルアドレナリンの修飾効果も検討する.さらに,ドーパミン・ノルアドレナリンのバランス異常により副次的にセロトニン系が変異している可能性があるので,セロトニンの修飾効果も検討する.
在宅高齢者に対するピエゾセンサーを用いた遠隔嚥下機能評価訓練システムの開発

咽頭期嚥下の観察にVF検査は有用であるが,被曝や造影剤誤嚥の危険,装置が高価なため臨床応用に制限がある.我々は,非侵襲的にかつ簡便に嚥下機能を評価する方法として,PPTを頸部に貼付して嚥下運動を解析する方法を考案した.この結果から,在宅患者用の小型でピエゾセンサーを用いた嚥下機能評価訓練装置を試作し,正常者の嚥下機能が評価可能か検討した.試作機を用いたRSSTでの嚥下運動の検出率は91.5(%)であり、ピエゾセンサーの湾曲による電圧値によって,嚥下機能の評価ができる可能性が示された。在宅患者に対するインターネットを介した遠隔医療の基礎実験も行った。顎機能と体幹の動きについても関連を研究した。嚥下機能評価について,咀嚼能力評価法・嚥下能力評価法について検討した。過去の研究をもとに既に購入した携帯型超音波診断装置にて,ボランティアの正常者に対して嚥下時の舌エコー画像について検討し,分析可能であることを確認した。ピエゾフィルムを用いた簡易型嚥下機能評価装置を開発し,この装置の出力波形パターンと超音波画像が同時測定可能であることを明らかにした。このデータ解析にはPowerLabシステムを用いて舌骨移動の波形を解析し,ピエゾフィルムによる嚥下分析が,ある程度可能であることを明らかにした。さらに追加実験により,このピエゾフィルムによる簡易型嚥下機能評価装置の出力波形パターンと超音波画像および咬筋筋電図は同時測定可能であることが明らかになった。嚥下内視鏡については,予備実験を開始した。遠隔医療の基礎実験としてIPTV電話を応用した実証実験を行い,音声と動画が臨床応用可能なレベルであることを実証した。この実験研究と同時に,高齢者の顎関節症状についても研究した。高齢者において,顎関節症状が重篤な者がほんどみられず,咀嚼能力に顎関節の影響はほとんどないことも明らかになった。また,インプラント義歯についても嚥下機能との関連を分析するため基礎研究を開始した。咽頭期の嚥下運動の観察にVideofluorography(以下VF)による透視検査は有用である。しかし、VF装置は、被曝や造影剤誤嚥の危険、さらに撮影装置が高価なため臨床応用には制限がある。我々は、非侵襲的にかつ簡便に嚥下機能を評価する方法として、Piezoelectric Pulse Transeducer(以下PPT)を頸部に貼付して同部の動きを電気信号として出力し、咽頭期の嚥下運動を解析する方法を考案した。PPTから出力された電圧とVF画像とを同時比較して、PPTの嚥下機能評価についてその有用性を報告してきた。本開発研究では、PPTのセンサー部分がフィルム状になったピエゾフィルム(東京センサー社)を使用した。ピエゾフィルムとは柔軟性のある圧電素子の一種である。ピエゾフィルムの嚥下機能評価についても報告があり、我々は嚥下時にPPTとピエゾフィルムは近似した電圧波形が記録できることを報告した。以上の先行研究の結果から、在宅の患者自身での使用を考慮し、小型でピエゾフィルムを用いた嚥下機能評価訓練装置を試作した。正常者の嚥下機能がこの試作機で評価可能か検討した。この嚥下機能評価訓練装置を用いた反復唾液嚥下テスト(RSST)での嚥下運動の検出率は91.5(%)であった。よって本試作機では、ピエゾフィルムの湾曲の大きさから出力される電圧値によって、嚥下機能の評価ができる可能性が示された。今後、本試作機とX線テレビのデータと比較していく予定である。本結果は、「ピエゾフィルムを応用した嚥下機能評価訓練装置の試作」という演題で、2012年5月26,27日に横浜市で開催される日本補綴歯科学会で報告予定である。インターネットでデータを送るシステムについても開発に着手した。また、インプラント義歯についても嚥下機能との関連を分析するため基礎研究を開始した。顎機能と体幹の動きの協調について分析し、両者の相関がみられ、嚥下運動と体幹の動きについても関連が示唆された。しかし、VF装置は、被曝や造影剤誤嚥の危険性がある。さらに撮影装置が高価なため臨床応用には制限がある。

我々は、非侵襲的にかつ簡便に嚥下機能を評価する方法として、Piezoelectric Pulse Transeducer(以下PPT)を頸部に貼付して同部の動きを電気信号として出力し、咽頭期の嚥下運動を解析する方法を考案した。我々は、既にPPTから出力された電圧とVF画像とを同時比較して、PPTの嚥下機能評価についてその有用性を報告しした。本開発研究では、PPTのセンサー部分がフィルム状になったピエゾセンサーを選択し、使用目的に最も適合したピエゾフィルム(東京センサー社)を使用した。ピエゾフィルムとは柔軟性のある圧電素子の一種である。ピエゾフィルムの嚥下機能評価についても、我々は、既に嚥下時にPPTとピエゾフィルムは近似した電圧波形が記録できることを報告済みである。以上の先行研究の結果から、在宅の患者自身での使用を考慮し、小型でピエゾフィルムを用いた嚥下機能評価訓練装置を試作した。正常者の嚥下機能がこの試作機で評価可能か検討した。この嚥下機能評価訓練装置を用いた反復唾液嚥下テスト(RSST)での嚥下運動の検出率は91.5(%)であった。よって本試作機では、ピエゾフィルムの湾曲の大きさから出力される電圧値によって、嚥下機能の評価ができる可能性が示された。本結果は、「ピエゾフィルムを応用した嚥下機能評価訓練装置の試作」という演題で、日本補綴歯科学会で報告した。インプラント義歯についても嚥下機能との関連を分析するため基礎研究を開始した。顎機能と体幹の動きの協調について分析し、両者の相関がみられ、嚥下運動と体幹の動きについても関連が示唆された。4年間の研究の2年目で、正常者を対象とした嚥下機能評価装置を試作することができたから。24年度が最終年度であるため、記入しない。単体の機械としての嚥下機能評価装置を試作し、ある程度利用可能であることが確認できた。今後は在宅での利用を想定してシステムを構築していく予定である。
光老化による一酸化窒素合成酵素欠損時酸化ストレスマーカーの変動

神経型一酸化窒素合成酵素が欠損したマウス(nNOSKO)と欠損していないマウスの尿中8-OH-dG量(酸化ストレスマーカー)を測定した。また、短波長紫外線(UVB)照射前後の尿中8-OH-dG量も測定した。nNOSKOマウスは、活性酸素を生じさせにくく酸化ストレスがかかりにくいと思われたが、他種マウスより尿中8-OH-dG量が高い傾向であった。紫外線照射前後の差異は認めなかった。マウス(NOS非欠損マウス)に繰り返し紫外線を照射し,光老化皮膚を作成するする前に,短波長紫外線(UVB)1回照射によるマウスにおける影響を測定した。3種類のNOS(iNOS,eNOS,nNOS)欠損マウスのうち,nNOS欠損マウスにまずは焦点をしぼり測定を行った。紫外線を照射する前に,129/sv,C57/BL6,nNOSKO(神経型一酸化窒素合成酵素nNOSノックアウトマウス)のマウスそれぞれの尿を24時間貯留させ採取した尿より,高速液体クロマトグラフィー(HPLC)と電気化学検出器(ECD)を組み合わせ,尿中8-OH-dG量を測定した。さらに,マウスの腹部全体を剃毛した後,280-320n血を含む短波長紫外線(UVB)150mJ/cm2の紫外線をそれぞれにマウスに照射し,直後に24時間尿を貯留させ採取し,HPLCとECDにより尿中8-OH-dG量を測定した。得られた結果より,マウス種別や一回紫外線照射前後による酸化的DNA損傷に差が生じるかどうかを検討した。129/sv,C57/BL6マウスはnNOSKOマウス作成上交配に用いるマウスであるため,nNOSKOマウスのコントロールとして適当と考えた。紫外線照射前のマウス種別の尿中8-OH-dG量には有意な差を生じ,マウス種別間に酸化ストレス耐性に差が生じていることが示唆された。特にnNOSKOマウスは尿中8-OH-dG量が他種のマウスより尿中8-OH-dG量が高い傾向があり,体内酸化ストレス傾向が高い,もしくは体内酸化修復機構が強く働いている可能性が示唆された。紫外線照射前後では尿中8-OI+dG間の有意な差を認めず,1回のみでは紫外線照射による尿中8-OH-dG量に差を生じさせないことが示唆された。1回紫外線照射では,酸化ストレス修復機構が働き,紫外線により酸化ストレス耐性に差を生じさせないことが考えられた。短波長紫外線(UVB)1回照射によるマウスにおける影響を測定した。3種類のNOS (iNOS, eNOS, nNOS)欠損マウスのうち、nNOS欠損マウス(神経型一酸化窒素合成酵素nNOSノックアウトマウス:nNOSKO)に焦点をしぼり測定を続けた。紫外線を照射する前に、129/sv、C57/BL6、nNOSKOのマウス各々の尿を24時間貯留させ、採取尿より、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)と電気化学検出器(ECD)を組み合わせ、尿中8-OH-dG量を測定した。マウスの腹部全体を剃毛し、280-320nmを含む短波長紫外線(UVB)150mJ/cm2の紫外線をそれぞれのマウスに照射し、直後に24時間尿を貯留させ採取し、HPLCとECDにより尿中8-OH-dG量を測定した。マウス種別や一回紫外線照射前後による酸化的DNA損傷に差が生じるかどうかを引き続き検討した。129/sv、C57/BL6マウスはnNOSKOマウス作成上交配に用いるマウスであるため、nNOSKOマウスのコントロールとして用いたが、紫外線照射前のマウス種別の尿中8-OH-dG量には有意な差を生じ、マウス種別間の酸化ストレス耐性に差が生じていた。特にnNOSKOマウスは尿中8-OH-dG量が他種のマウスより尿中8-OH-dG量が高い傾向があり、体内酸化ストレス傾向が高い、または体内酸化修復機構が強き働きやすく、除去されたマーカーが出現した可能性が示唆された。いずれのマウスでも、紫外線照射前後では尿中8-OH-dG間の有意な差を認めず、1回のみでは紫外線照射による尿中8-OH-dG量に差を生じさせなかった。1回紫外線照射では、酸化ストレス修復機構が働き、紫外線により酸化ストレス耐性に差を生じさせなかった。また、特殊飼料生育環境下ではnNOSKOマウスが短命傾向であった。
銅酸化物高温超伝導体の量子揺らぎに関する研究

本研究では銅酸化物高温超伝導の理解に重要である、擬ギヤップのドープ量依存性について実験的に明らかにする目的で、Bi系高温超伝導体単結晶のc軸層間トンネル特性の測定を行った。特に擬ギャップが最適ドープ近辺(量子臨界点)で消失して過剰ドープ領域では通常の超伝導体となっているかどうか、解釈が混沌としている。この過剰ドープ領域の超伝導について新しい知見を得るに至った。転移温度が60K(ホール濃度0.225)の良質な単結晶の作製に成功し、米国立高磁場研(NHMFL)の60テスラパルス磁場を用いて低温・高磁場でのc軸トンネル抵抗の振る舞いを明らかにした。c軸トンネル抵抗から、1)抵抗が出現する磁場、2)抵抗がピークを持つ磁場、3)擬ギャップが完全に消失する磁場をそれぞれ決定し、その温度変化を求めた。2)のピーク磁場については、超伝導が消失する上部臨界磁場の下限と考えることができるが、低温極限ではこのピーク磁場と擬ギャップが閉じる磁場がおよそ70テスラにほぼ一致して収束することがわかった。それに対し、抵抗が出現する磁場は低温極限でも30テスラ程度であり、非常に大きな磁場範囲において、ギャップが存在しつつ有限抵抗があるということが明らかになった。この結果は、通常の2次元超伝導体における量子揺らぎの理論的な予測から比ベ、非常に大きいという異常なものである。このように過剰ドープ領域においても、高温超伝導の異常性はかなり残っており、むしろ擬ギャップが超伝導領域全般を支配していると考えた方が実験結果を理解しやすいという結論が得られた。この結果は高温超伝導の理解に重要なものであると考えている。
小児がん診断のためのMYC系がんタンパク定量法の確立および診断への応用

ヒトmyc系がん遺伝子はc-myc,N-myc,L-mycの3種が知られており、多くの腫瘍ではこれらmyc系遺伝子の異常発現が起こっている。神経芽腫ではN-myc遺伝子の増幅度と悪性度との間に相関があることから、腫瘍マーカーとして重要である。また、遺伝子増幅がなく、N-Mycタンパクを発現している予後不良例も知られており、遺伝子増幅の測定とともにN-Mycタンパクの測定も重要であると考えられている。本研究ではmyc系遺伝子産物、特に、N-myc遺伝子産物であるN-Mycタンパクに着目し、本タンパクの高感度定量法の開発と臨床応用を目的として研究を行なった。平成5年度は、遺伝子工学的手法を用いて作製した2種のN-Myc融合タンパクを抗原として、N-Mycタンパクの異なるエピトープを認識する2種のポリクローナル抗体(抗N-Myc抗体および抗pan-Myc抗体)を作製した。これら抗体の特異性をウェスタンブロット法で調べたところ抗N-Mycポリクローナル抗体は3種のMycタンパクのうちN-Mycタンパクのみを認識し、抗pan-Myc抗体はN-Mycタンパクおよびc-Mycタンパクを認識することが明らかになった。また、抗原タンパクと同様の手法でELISA用N-Myc標準タンパクを作製し、精製した。平成6年度には主としてサンドイッチ型ELISA法の確立のための条件検討およびモノクロナール抗体の作製を行った。上記N-Myc抗原を用いて3種のモノクロナール抗体(抗N-Myc抗体)を得たが、いずれのモノクロナール抗体もELISA法には不適であった。前年度に作製した2種のポリクローナル抗体を用い、標準タンパクの検量曲線を作成したところ10200ng/mlの範囲での検量に成功した。そこで、N-myc遺伝子増幅神経芽腫細胞株5種および非増幅神経芽腫細胞株3種や非発現細胞株3種を用いて試料の調製法等の諸条件を検討し、それら細胞株のN-Mycタンパク量を測定した。神経芽腫細胞株ではN-myc遺伝子増幅非増幅に関わらず高値を示した。今後、感度を上げるための測定系の改良が必要と思われるが、これまでに達成し得た測定系で、臨床検体中のN-Mycタンパク量を求め、予後判定等への有用性について検討していきたい。myc系ガン遺伝子のうち、N-myc遺伝子は特定の小児がんにのみ発現しており、その発現の有無を調べることによりがんの診断が可能となる。我々はこれまで遺伝子工学的に、感度と特異性の高い抗N-Myc抗体を作成している。今年度は、抗N-Myc抗体の認識するN-Mycタンパクのエピトープとは異なる領域、即ち、myc系タンパク相同領域を認識する抗co-Myc抗体の作製及びサンドウィッチ型ELISA用標準タンパクの作製並びにサンドウィッチ型ELISAの確立を目的として研究を行った。まず、co-Myc融合タンパクを遺伝子工学的に作製し精製を行った。精製co-Myc融合タンパクを家兎に免疫し抗co-Mcy血清を得、本血清よりIgG画分に精製した。精製co-Myc抗体はco-Mycタンパク抗原と反応しかつ細胞由来のN-Mycタンパクを認識することを免疫組織化学染色法およびウェスタンブロット法により確認した。

更に、本抗体はN-Mycタンパクのみならずc-Mycタンパクをも認識することをウェスタンブロット法やRT-PCR法を用いて明らかにした。次に、標準タンパクとして、抗N-Myc抗体および抗co-Myc抗体の両者に反応するN-Myc融合タンパクを遺伝子工学的手法を用いて作製し精製した。精製N-co-Myc融合タンパクが抗N-co-Myc抗体および抗co-Myc抗体と反応することをウエスタンブロット法で確認した。標準タンパクおよび異なるエピトープを認識する2種の抗体を得たので、サンドウィッチ型ELISAによるN-Mycタンパク定量法確立のための諸条件の検討を行った。これまでのところ、検量線を引くに至っていない。この理由としては、標準タンパクの可溶化に問題があると思われるので、新たな標準タンパクの設計を含め可溶化の条件を更に吟味する必要があると思われる。ヒトmyc系がん遺伝子(c-myc,N-myc,L-myc)のうちN-myc遺伝子は特定の小児がんにのみ発現しており、その発現の有無を調べることによりがんの診断が可能となる。我々は、前年度までに、高感度で特異性の高い抗N-Mycポリクローナル抗体および抗pan-Mycポリクローナル抗体とELISA用標準タンパクN-pan-Myc融合タンパクを作製した。今年度は、主としてサンドイッチ型ELISA法の確立のための条件検討およびモノクロナール抗体の作製を行った。遺伝子工学的手法により作製したN-Myc抗原を用いて3種のモノクロナール抗体(抗N-Myc抗体)を得、ウェスタンブロット法によりそれら抗体の特異性を検討したところ、いずれのモノクロナール抗体もELISA法には不適であった。そこで、前年度に作製した2種のポリクローナル抗体を用い、標準タンパクの検量曲線を作成したところ10200ng/mlの範囲での検量に成功した。つぎに、N-myc遺伝子増幅神経芽腫細胞株5種および非増幅神経芽腫細胞株3種や非発現細胞株3種を用いて試料の調製法等の諸条件を検討し、それら細胞株のN-Mycタンパク量を測定した。神経芽腫細胞株ではN-myc遺伝子増幅非増幅に関わらず高値を示した。今後、感度を上げるための測定系の改良が思われるが、これまでに達成し得た測定系で、臨床検体中のN-Mycタンパク量を求め、予後判定等への有用性について検討していきたい。