hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
臓器移植患者及び親のスピリチュアリティとスピリチュアリティを支えるための看護ケア

インタビューの回数は一人12回であり、1回のインタビュー時間は約60120分であった。今後は、図と地の関連の中で意味がより明確になるようにさらなるデータを蓄積した上で、個々のデータを丁寧に分析して行く予定である。本研究は、臓器移植患者の体験からスピリチュアリティを引き出し、スピリチュアリティを支える看護ケアについて検討することである。臓器移植患者に非構造的面接法により印象に残っている出来事や体験について自由に語ってもらった。面接回数は1人24回、1回の面接時間は約12時間であった。データ分析は、人間存在を時間性を基盤にして解釈する立場に立つ解釈学的方法論を用いて分析した。解釈の妥当性は分析結果を研究参加者に確認してもらった。ここでは2事例について報告する。事例1(腎機能獲得と喪失を体験し再透析になった女性):患者は喪失体験による実存的な苦しみに苦悩しているとき、大きな木に出会った。その大木に生命力を感じ、木も自分も同じ「命」を共にする存在であることを知覚し、木が木のために生きているように「自分は自分のために生きればいい」ことに気づいた。その木によってその人のスピリチュアリティは解き放たれ、木が「命」を共にする存在として見いだされた。事例2(心臓移植後にクローン病を再発した男性):患者は心臓移植で与えられた命によって生きる力が喚起された。カテーテル検査、クローン再発、失職などが繰り返されるなかで、ボランティア活動、結婚、仕事探し、就職と前向きに行動していた。生きることを励ます妻や友人や親など他者とのつながりが生きる力を与えていた。他者が「生きる」という目的に向かって共に進む存在として見いだされた。それらの結果から、スピリチュアリティを支えるには、患者と何かを共にする存在が重要であることが明らかになった。臨床の場で病む人間のスピリチュアリティを支える看護ケアには、「何かを共にする存在」としての看護者の存在が必要であると思われる。そのために、看護者は患者の求めている何かを共有できるように、まずは患者の語りをじっくり聴きことであり、そこからケアが始まることが示された。
センダイウイルスによる効率的な心筋直接誘導法の確立と分子メカニズムの解明

本研究で、我々は宿主遺伝子を改変しない心筋誘導センダイウイルスベクターを新たに開発し心筋誘導を行ったところ心筋作製効率は約10%と従来法の100倍に改善し、さらに拍動する心筋細胞を約10日間で作成することができた。次にマウス心筋梗塞モデルで3つの心筋誘導遺伝子をセンダイウイルスベクターでマウス心臓内に導入したところ心筋誘導効率が約1.5%に上昇した。さらに心筋誘導センダイウイルスベクターによる治療群では、無治療群と比較して、1か月後の心臓のポンプ機能が改善した。上記に示した本研究の成果を国際科学雑誌に発表した(Miyamoto et al., Cell Stem Cell 2017)。本年度は研究実施計画に基づき研究を継続し、センダイウイルスベクターを用いた心筋直接誘導法を検討することによりその誘導効率は飛躍的に改善し、また直接誘導促進の機序として自然免疫シグナルが関与していることを解明した。またマウスにおいて作成した心筋梗塞領域にセンダイウイルスを直接導入することにより、in vivoにおいて心筋細胞が線維芽細胞より誘導できることを確認した。また、センダイウイルスを心筋梗塞部位に直接導入することよりその心機能が改善し、心筋特異的遺伝子を発現する細胞が誘導されたことを確認した。次にセンダイウイルスより作成した心筋細胞の電気生理学的特徴の解明のためパッチクランプおよびCa電流波形の解析を行い、心筋細胞類似の電気生理学的特徴を有し、また薬物負荷による反応を有していることを確認した。さらにマウス皮膚線維芽細胞にセンダイウイルスを遺伝子導入することにより誘導心筋細胞の作製に成功し、同様の実験は成人マウス皮膚線維芽細胞を用いることでも心筋細胞が誘導可能であることもあわせて確認した。以上の結果について日本循環器学会、再生医療学会において新たに学会発表を行った。今後はin vivoにおいてセンダイウイルスを遺伝子導入することにより長期的な生存率の延長が可能かどうか、また腫瘍作成などの危険性の有無を確認するとともに、より高効率および安全な誘導心筋細胞の作製について検討を行う予定である。現段階において、センダイウイルスを用いてマウスおよびヒト線維芽細胞より心筋直接誘導は成功しており、また誘導心筋細胞の生理学的な働きや詳細な性質についての研究を進める事ができている。現在までにセンダイウイルスベクターを用いて3つの心筋特異的転写因子をマウス胎児線維芽細胞、マウス皮膚線維芽細胞、ヒト心筋線維芽細胞に遺伝子導入することで、培養皿において拍動心筋細胞の誘導に成功した。またマウス心筋梗塞モデルに直接導入することで生体内において心筋直接誘導に成功し、結果的に心機能の改善を示すことができた。これまでの予備実験を前提として実験を進めることにより上記結果を導くことができ、実験は概ね順調に進展していると考える。上記のとおり本研究は順調に遂行されている。今後は誘導心筋細胞の性質についてさらに解析を行い、またヒト線維芽細胞からの自己拍動能を有する誘導心筋細胞の作製について検討を重ね、再生医療実現化を目指す。上記の通り本研究の研究成果を国際的科学雑誌において発表することができた。しかし今後、本手法を臨床応用するには未だ問題点が残っている。具体的には人体へどのように投与するか、センダイウイルスベクターを導入する場合に引き起こされる免疫反応をいかにして軽減するか、などが考えられる。よって今後はマウス以外の大動物を用いて安全な投与方法の検討、また生体内での免疫反応をいかにして軽減するか、といった問題点を克服する必要がある。次年度使用額の発生は効率的な物品調達を行った結果である。本研究を進めるにあたり、消耗品は科研費費用から購入したが、実験器具は従来通りの器具を使用しており支出額が少なく抑えられたため次年度使用額が生じた。次年度使用額と合わせ主に実験に必須と考えられる消耗品購入目的に使用する計画である。心筋直接誘導法の更なる検討および作成した細胞の機能解析において使用する予定である。
ペプチド修飾型Ago2/miRNA複合体によるがん特異的デリバリーシステムの開発

microRNA(miRNA)はがんの発生や抑制に関与しており、血中のmiRNAはエクソソーム内に存在するだけでなくArgonaute 2 (Ago2)蛋白質と複合体を作ることでRNaseによる分解から逃れている。本研究では、miRNA/Ago2複合体を用いたmiRNAのデリバリー法を開発し、がん治療への実用化を目指した。細胞外に分泌されているAgo2は微量であったが、miR-27aを導入したAgo2高発現細胞培養上清を用いて乳がん細胞株(MCF-7)を培養するとコントロールに比べて細胞増殖を抑制した。以上より、miR-27a/Ago2複合体が乳がん細胞の増殖を抑制する可能性が示唆された。microRNA(miRNA)はがんの発生や抑制に関与しており、血中のmiRNAはエクソソーム内に存在することで、RNaseによる分解から逃れている。これまでに、がん特異的に結合するペプチドを発現させたエクソソームの作製に成功し、がん幹細胞の増殖を抑制するmiRNAを内包させ、腫瘍移植マウスの血中に投与すると、がんの増殖を抑制することを明らかにした。しかし、血中のmiRNAはエクソソーム内だけでなく、Argonaute 2 (Ago2)蛋白質と複合体を作ることで安定的に存在していることが報告された。本研究では、ペプチド修飾型Ago2/miRNA複合体を用いたがん特異的なmiRNAのデリバリー法を開発し、より効果的ながん治療への実用化を目指す。今年度は、miRNAとAgo2の複合体の精製方法を確立し、Ago2/miRNA複合体が細胞へ取り込まれるかどうかを確認することを目標とした。最終的には治療に必要な量のAgo2を精製する必要があるため、Ago2高発現細胞株を作製し精製することとした。一般的にAgo2の精製には抗Ago2抗体が用いられているが、本研究では抗体を外す必要があるため、GSTを用いてAgo2を精製する方法を確立する予定であったが、まずはFLAG/HAタグを持つhAgo2発現ベクター(pIRESneo-FLAG/HA-Ago2corrected,Addgene)を活用して、FLAGで精製を試みることとした。HEK293細胞にpIRESneo-FLAG/HA-Ago2correctedベクター、コントロールであるpIRESneo-FLAG/HA-EYFPベクターを導入し、ネオマイシンでセレクションすることによって恒常発現株の樹立を行った。コントロールベクターである、EYFPの発現は蛍光顕微鏡下にて確認済みである。現在Ago2の発現を確認中である。本研究では、ペプチド修飾型Ago2/miRNA複合体を用いたがん特異的なmiRNAデリバリー法を開発し、より効果的ながん治療への実用化を目指す。今年度の当初の目的はEGFR結合ペプチドであるGE11配列を結合させたAgo2-GE11/miRNAをレンチウイルスを使ってHEK293に感染させ、Ago2-GE11-GST/HEK293細胞を作製することであった。しかしながらレンチウイルスによって遺伝子導入を行った結果、細胞の形状に変化を与え、今後の実験結果に影響すると考えたため予定を変更し、レンチウイルスは使用しないこととした。しかしながら、当初治療として用いる予定であったlet-7aよりもより効果的に、がん幹細胞が化学療法や酸化ストレスに抵抗性を示す性質に対して影響を与えることによって、乳がん細胞の増殖を抑制することが示唆されるmiRNAを見出した。またin vivoでmiRNAのデリバリー効果とがん細胞増殖抑制効果を検討するための実験系の確立を行ってきた。当初の研究計画に忠実ではないが、がん幹細胞をターゲットとしたがん増殖抑制効果を持つmiRNAを明らかにしたことにより、GE11を使ってEGFR発現細胞をターゲットとする必要がなくなる可能性が示唆され、let-7aを用いるよりもさらに有用な治療となる可能性があるため。当初の計画では、EGFR結合ペプチドであるGE11配列を結合させたAgo2-GE11/miRNAをレンチウイルスを使ってHEK293に感染させ、Ago2-GE11-GST/HEK293細胞を作製することであった。

しかし、レンチウイルスを用いてAgo2を高発現させた結果、細胞の形状に変化を与え、以後の実験結果に影響すると考えたため予定を変更し、レンチウイルスは使用しないこととした。しかしながら、プラスミド導入によるAgo2高発現細胞株においても、コントロール細胞と比較して増殖速度が低下した。さらにAgo2/HEK293細胞の培養上清中に遊離しているAgo2複合体を抗Ago2抗体カラムによって精製した結果、細胞外Ago2複合体は非常に低いレベルでしか存在しないことが明らかとなった。一方で、当初治療として用いる予定であったlet-7aよりもはるかに効果的に、がん幹細胞が化学療法や酸化ストレスに抵抗性を示す性質に対して影響を与えることによって、乳がん細胞の増殖を抑制することが示唆されるmiRNAを見出した。microRNA(miRNA)はがんの発生や抑制に関与しており、血中のmiRNAはエクソソーム内に存在するだけでなくArgonaute 2 (Ago2)蛋白質と複合体を作ることでRNaseによる分解から逃れている。本研究では、miRNA/Ago2複合体を用いたmiRNAのデリバリー法を開発し、がん治療への実用化を目指した。細胞外に分泌されているAgo2は微量であったが、miR-27aを導入したAgo2高発現細胞培養上清を用いて乳がん細胞株(MCF-7)を培養するとコントロールに比べて細胞増殖を抑制した。以上より、miR-27a/Ago2複合体が乳がん細胞の増殖を抑制する可能性が示唆された。Ago2を恒常的に発現するHEK293細胞の樹立を行った。しかし、Ago2導入細胞はコントロール細胞に比べて細胞の増殖が非常に遅く、また形態も変化してしまっている。そのため発現確認など、Ago2発現細胞を用いた実験に必要な材料を得るのに時間がかかっているため、予定より遅れている。当初計画していたmiRNAよりも乳がん幹細胞に対する抑制効果が高いことが示唆されたmiRNAを明らかにした。このmiRNAをin vivoでどのようにしてがん細胞に到達させるかが本研究の課題であり、Ago2と結合させることによってmiRNAが細胞内に到達できるかどうかを確認する。まずはin vitroでの細胞増殖抑制効果を確認し、さらにin vivoでは移植マウスを用いたがん細胞増殖抑制効果を検討する予定である。医歯薬学これまでに我々はエクソソームを使ったmiRNAによるがん抑制研究を行ったきたが、この場合、HEK293のエクソソームを用いることで成功しているため、今回の研究においてもAgo2を発現させる細胞としてHEK293を用いた。しかしながら、Ago2は様々なmiRNAと結合するため、高発現すると細胞の正常なmiRNA発現調節機構が狂ってしまう。そのために増殖抑制や形態変化が認められたと考えられる。今回樹立したAgo2/HEK293細胞株において、Ago2の発現が認められない、または低い場合は、別な細胞株を用いることで回避できるかどうか、試してみる必要がある。Ago2発現細胞株が得られた後、miRNAを高発現させるか、あるいは合成したものを導入して、FLAGにてAgo2/miRNA複合体を精製し、がん細胞に取り込まれるかどうか確認する。
霊長類(ツパイ)を用いた糖尿病眼における血液眼内柵透過性機能変化に関する研究

実験をはじめるにあたり、ツパイの網脈絡膜循環と眼底像の特徴を検討した。そして、fluorophotomctryをツパイに用いるための測定条件の設定と手技を確立した。さらに、血液眼内柵透過性機能を評価するための係数を求めるcomputer simulation法をツパイ専用に改良した。また。この解析に必要な各固体の屈折要素の長さの測定方法も検討した。正常のツパイを用いてその血統値を測定した結果、平均血糖値は82.1±20.8mg/dlであった。つぎに、ツパイに実験的糖尿病を作製するために必要なストレプトゾトシン(STZ)の投与量を検討した。ラットに糖尿病を作る際に用いられている量を参考とし、STZを体重kgあたり50mg、60mg、100mg、200mg、300mg、そして400mgを投与して、投与前および投与後の血糖値の変化を検討した。200mg/kg以下の量を投与したものでは、一時的に高血糖を示したものも認められたが、全てのツパイで最終的に150mg/dl以下となった。300mg/kg、400mg/kg投与したものは、一部を除いて500mg/dl以上の高値となり、この高血糖は継続したため、これらのツパイに糖尿病が発症したと判断した。このようにして作製した糖尿病ツパイにおいて、STZ投与前および投与1週間後に、fluorophotometryと各屈折要素の測定を行った。その結果、角膜自然蛍光値は2.93±0.51ngEq/mlから3.43±0.33ngEq/mlへ有意な増加を示した。一方、水晶体自然蛍光値および血圧眼内柵透過性機能の評価値には有意な差は認めなかった。本実験系を通して、糖尿病発症早期の眼内変化として、角膜自然蛍光値のみが有意な変化を示すことが明らかとなり、糖尿病発症にともない、眼内の恒常性維持機構になんらかの障害が生じていることが推測された。今後これらの実験を継続することにより、糖尿病による慢性的な眼内変化をみていきたい。また。
光重合型審美修復材料と照射器の互換性について

LED照射器の開発当初,その欠点として光強度の低さが挙げられた.しかし第二世代ともいえるLED照射器の登場で,現在ではハロゲンランプ照射器に匹敵する光強度を得ている.また,LED照射器開発と時期を同じくして光重合型材料に含まれている重合開始材の改良が各社で検討されていたため,波長の範囲の狭いLED照射器では重合が開始されない材料が存在することとなった.しかし近年,広範囲な光の波長を持つ第三世代のLED照射器が製品化されている.さらに,光重合型材料おいてもLED照射器の波長の狭さに対応した製品が増えつつあることなど,それぞれに発展が認められる.そこで,現時点における各種LED照射器と光重合型材料との互換性を調べた.その結果,コンポジットレジンの多くでOPTILUX 500とL.E.Demetron Iで照射を行った場合には硬化深さに差は認められなかった.しかし,その他の照射器間では全てに有意差が認められ,全体の傾向としてG-Lightが最も硬化が深く,次いでOPTILUX 500とL.E.Demetron Iが同程度,Radiusが最も硬化深さが低かった.結論として,従来のLED照射器では硬化不足と思われる光重合型材料に対し,光強度や光の波長域を改善したLED照射器を使用する事により,ハロゲンランプ照射器と同等の硬化が認められた.LED照射器による充填用コンポジットレジンの硬化が良好な成績を示すことは既に報告されているが、ボンディング材などの中には全く硬化しないものも存在した。すなわち、充填時にLED照射器を用いると、接着システムによっては歯質への接着に問題を生じる可能性がある。本研究では、LED照射器を用いてコンポジットレジン充填を行った時の象牙質への接着について、照射光源がハロゲンランプあるいはキセノンランプの場合と比較した。実験方法として牛前歯象牙質を露出させて包埋した後、耐水研磨紙にて研磨した。直径4mmの円形にパンチングした両面テープを貼付し、内径4mmの金属製モールドを設置した。その後、業者指示に従って各接着システムにて象牙質面の処理を行った。その後モールド内にコンポジットレジンを充填し、各光照射器により照射を行った。試料は37°Cの水中に保管し、24時間後に煎断試験を行った。試料数は各条件につき10個ずつとし、得られた値はTukeyの多重比較にて統計処理を行った。その結果、メガボンドとAQボンドではLED照射器で照射を行った時に有意に接着強さが低くなった。フォトボンドとユニフィルボンドでは全ての照射器間で有意差は認められなかった。シングルボンドではLEDとキセノン照射器間にのみ有意差が認められた。全ての接着システムでハロゲンとキセノン照射器間の差は認められなかった。メガボンドとAQボンドにはカンファーキノンよりも低い波長に感応する光触媒が含まれている。そのため、光の波長幅が狭いLED照射器では低い接着強さを示したと考えられる。しかし、その他の接着システムでは照射器間の差が認められないことから、光触媒をカンファーキノンのみとした接着システムを使用した場合にはLED照射器でも問題のない接着強さが得られることが確認された。LED照射器の開発当初,その欠点として光強度の低さが挙げられた.しかし第二世代ともいえるLED照射器の登場で,現在ではハロゲンランプ照射器に匹敵する光強度を得ている.また,LED照射器開発と時期を同じくして光重合型材料に含まれている重合開始材の改良が各社で検討されていたため,波長の範囲の狭いLED照射器では重合が開始されない材料が存在することとなった.しかし近年,広範囲な光の波長を持つ第三世代のLED照射器が製品化されている.さらに,光重合型材料おいてもLED照射器の波長の狭さに対応した製品が増えつつあることなど,それぞれに発展が認められる.そこで,現時点における各種LED照射器と光重合型材料との互換性を調べた.その結果,コンポジットレジンの多くでOPTILUX 500とL.E.Demetron Iで照射を行った場合には硬化深さに差は認められなかった.しかし,その他の照射器間では全てに有意差が認められ,全体の傾向としてG-Lightが最も硬化が深く,次いでOPTILUX 500とL.E.Demetron Iが同程度,Radiusが最も硬化深さが低かった.結論として,従来のLED照射器では硬化不足と思われる光重合型材料に対し,光強度や光の波長域を改善したLED照射器を使用する事により,ハロゲンランプ照射器と同等の硬化が認められた.
遠近歪を有する指示器画像のシフトレンズ系による補正と画像認識による読み取りの研究

1.研究目的本研究は、水道メータのような表示器に対して、その表示器の辺縁部に配置した小型カメラによって、表示指針すなわち計量値を読み取る方法に関する研究である。カメラを周縁部に配置する理由は、表示器の中央部を空けておくことにより、目視による読み取りを常時可能にするためである。しかし周縁部から斜めに撮像することにより遠近歪が生じる。この歪はコンピュータによる画像処理によって補正可能ではあるが、コストや処理時間が掛かるという問題がある。そこで本研究では、シフトレンズと呼ばれる光学系を用いてこの遠近歪を補正し、撮像と同時に遠近歪が補正された画像が得られることを検証する。2.研究方法上記シフトレンズは特殊なレンズであり、小型カメラモジュールとして入手することは難しい。そこで汎用の小型カメラモジュールをレンズと画像センサ部とに分離し、これらを光学ステージおよび自作加工した部品と組み合わせてオリジナルの実験装置を製作した。この装置によってレンズのシフト量のみならず、被写体からの距離、中心軸からのオフセット量等を自由に変えて実験することができた。被写体は、φ50mmの円(表示器外形を模す)に内接するように配置したφ12.5mmの小円(水道メータの指針を模す)を紙に印刷して用いた。評価方法は、シフトレンズ系を用いた場合と、これを用いずに傾斜撮影した場合の、上記小円の扁平率を比較することによって行った。真円の扁平率は0であり、数値が大きくなるにつれてより潰れた楕円となる。3.研究成果シフトレンズを用いずに、45度傾けて撮影した場合の上述の真円の扁平率は0.54であった。一方、シフトレンズを用いて傾けないで測定した場合の扁平率は0.34であり、遠近歪の補正効果が得られることが確認できた。それでも0にならない理由は、広角レンズ特有の樽型歪が残存していたためと考えられる。
ゼノバイオティックス取り込み・排出輸送と化学変換がシンクロナイズした生体防御機構

研究代表者等がこれまでにクローニングしたOCTN2は、全身性カルニチン欠損症の原因遺伝子である。本年度我々はマウスよりOCTN2のホモログとして、OCTN1およびOCTN3のクローニングを行い、生理的物質の維持とゼノバイオティクスの排除への関与について検討を行った。OCTN1、OCTN2、OCTN3はいずれも腎臓に共通して発現が認められたが、OCTN3は精巣でもっとも高い発現を示した。各遺伝子産物について、カルニチンおよび有機カチオン性ゼノバイオティクス(TEA)の取り込み活性を測定した結果、OCTN1およびOCTN2はNa^+依存的に、OCTN3はNa^+非依存的にカルニチンを輸送された。またOCTN1およびOCTN2はTEAを輸送したのに対し、OCTN3は輸送しなかった。よって遺伝子の存在がマウスのみに確認されているOCTN3は、カルニチンに対して特異性が高い特徴的なトランスポーターであることが明らかとなった。OCTN3のカルニチン輸送はNa^+非依存的でその発現が精巣に特に強く認められることから、生理的には精巣での役割が主であると考えられた。OCTN1のカルニチン輸送活性はOCTN2、OCTN3と比べ非常に低いことから、OCTN1が有機カチオントランスポーターとして重要な役割を持つと考えられた。OCTN2はカルニチンおよびTEAのいずれも効率的に輸送するが、腎尿細管における輸送の方向性は、カルニチンがNa^+依存的に再吸収方向に輸送されるのに対して、TEAは分泌方向の輸送となる。すなわち、OCTN2は生体に必要なカルニチンの再吸収と生体異物である有機カチオンの分泌に働く多機能性トランスポーターであることが示された。これらの結果は、OCTN2によるカルニチンのinfluxとTEAのeffluxがシンクロナイズしていることを示すものであり、OCTN2が生理的物質の維持とゼノバイオティクスの排除とがシンクロナイズした生体防御機構の一部として機能している可能性が考えられた。・有機アニオントランスポーターNpt1については[^<14>C]benzylpenicillin,[^<14>C]faropenem,[^<14>C]foscarnetや, [^3H]mevalonic acidを基質とすることが分かった。また、抗Npt1抗体を用いた免疫組織化学的検討結果から、β-ラクタム抗生物質の肝からの排出に機能することが示唆された。・ヒトPEPT1の薬物輸送能について、パーキンソン病治療薬のL-DOPAの種々ジペプチド誘導体および抗ウイルス薬acyclovirの非ペプチド性プロドラックでL-valineエステルvalacyclovirについて検討したところ、いづれも良好な基質となることが明らかとなった。・アミノ酸残基数4以上の鎖長を持つ各種ペプチド誘導体を合成し、脳毛細血管内皮細胞の吸着介在性トランスサイトーシス機構の解析を行った結果、基質選択性や阻害剤に対する感受性等が小腸上皮細胞おけるそれとよく一致することが明らかとなり、中枢作用型薬物の経口デリバリー戦略に、その吸収バリアとなる小腸上皮細胞と脳におけるバリアとなる血液脳関門との間でシンクロナイズしたシステムが応用できる可能性を示唆するものと考えられた。・新規ニューキノロン抗菌薬(HSR-903)の胆汁排泄機構をmrp2/cMOAT遺伝子欠損ラットEHBRを用いて検討した結果、HSR-903のみならずその代謝物であるグルクロン酸抱合体が同一のトランスポーターを介して体内から排出されることが明らかとなり、化学変換と排出輸送によるゼノバイオティックス排除機構のシンクロナイゼーションを示すことができた。
肝細胞癌におけるp53遺伝子の機能異常と生物学的特性

Yeastfunctional assayとtransdominance assayを行い、最終的に肝癌症例計50例についてp53タンパクの機能解析を行った。また変異型p53タンパクの発現を調べるため、従来から行われている免疫組織化学を行い、機能異常との関係についても検討した。また機能異常と診断した症例についてはdirect sequenceを行い変異の詳細を調べた。結果50例のうち21例(42%)に20%以上の赤コロニーがみられyeast functional assayのうえではp53タンパクの機能異常があるものと診断された。赤コロニーの4ケ所からDNAを抽出してシークエンスしたところナンセンス変異が4例、フレームシフト変異5例、ミスセンス変異13例(1例には単一アレルにナンセンス変異とフレームシフト変異)がみられた。2.免疫組織化学との対比ミスセンス変異の症例は全例で変異型p53タンパクが陽性であった。ナンセンス変異やフレームシフト変異の症例ではすべて陰性であった。変異型p53のうち17例はrecessive mutantで、残り5例にトランスドミナンス活性があった。この5例についてはyeast functional assay上では機能異常と診断されたがtransdominance assayもあわせて考えるとタンパク全体としては機能を保持しているものと思われる。またナンセンス変異とフレームシフト変異の症例はすべてrecessive mutantであった。結論免疫組織化学でとらえられた変異型p53タンパクはすべてp53タンパクとしての機能が消失していると考えられた症例であり、免疫組織化学でとらえられなかった変異についてはなおp53タンパクの機能を保持している可能性が考えられた。今年度は肝細胞癌50症例を対象にして、P53蛋白の機能的な変異を、yeast functional assayを用いて解析した。さらに個々の症例につき、Ki-67免疫染色により増殖活性を、In situ end-labeling法によりアポトーシスの頻度を検討し、P53蛋白の機能的変異がどのような細胞生物学的特性と関連しているのかといった点についても検討した。また、従来から行われてきた抗P53モノクローナル抗体を用いた免疫組織化学法によっても変異型P53蛋白の発現を調べ、yeast functional assayの結果と比較した。その結果、P53蛋白が機能的に異常をきたしていた症例は50例中22例であり、従来の方法での結論と同様、組織学的分化度の低い症例に異常例が多い成績であった。しかし、この異常例のうち、免疫組織化学法で変異型P53蛋白陽性であったのは14例であった。このことから、yeast functional assayは従来からの免疫組織化学法に比較してより精度高くP53蛋白の異常を検出する方法と考えられた。Ki-67陽性率からみた増殖活性は、機能異常の症例で32.2±12.6%、正常例では22.2±11.3%と、機能異常例で有意に(p<0.001)高い成績であった。また、In situ end-labeling法でみたアポトーシスの頻度は、機能異常例で1.01±0.84%、正常例で0.84±0.85%と、両者に有意差は認められなかった。今後はさらにP53蛋白の機能異常とセントロソーム複製異常やDNAプロイディの異常など他の生物学的特性との関係についても検討していきたい。
歯科インプラント上部構造に付与する咬合接触が咬みしめ時の下顎微小偏位に及ぼす影響

現在,歯科臨床において欠損補綴への歯科インプラントの応用が増加している.天然歯と比較して歯科インプラントでは歯根膜組織が欠除するため,咬みしめ時には天然歯と異なる動きをすると考えられる.しかし,上部構造体に付与する咬合接触については科学的根拠に基づく基準がないのが現状である.本研究において,上部構造に付与する咬合接触が咬頭嵌合位の安定性に及ぼす影響を検討することを目的とした.そのためには,長期にわたる咬合接触およびインプラントの変化を客観的に捉える必要性があることから,既存の咬合診査法がインプラントの評価に用いることが可能かどうか検討を行った.また,インプラント症例における長期経過観察時にオッセオインテグレーションの状態の変化を評価していくために,IMチェッカの開発を行なった.その結果,咬合接触の診査にはadd画像法およびT-Scan IIの有用性が示され,また動揺度評価ではIMチェッカの有用性が示された.咬合診査機器を用いてインプラント患者の咬合接触状態を診査したところ,咬みしめ強度を上昇させた場合の咬合接触は安定しており,健常者と同様の傾向を示した.IMチェッカについては,模型実験においてインプラント体の直径および植立深さが動揺度指標であるIM値に及ぼす影響について検討を行った.モデルの作製は不飽和ポリエステル樹脂を用いた.測定はインプラント体に対して,水平方向および垂直方向の加振を行い評価した.その結果,IMチェッカはインプラントの動揺を測定することが可能であり,また,この動揺はオッセオインテグレーションの程度を評価することが可能であることが示唆された.現在,歯科臨床において欠損補綴への歯科インプラントの応用が増加している.天然歯と比較して歯科インプラントでは歯根膜組織が欠除するため,咬みしめ時には天然歯と異なる動きをすると考えられる.しかし,上部構造体に付与する咬合接触については科学的根拠に基づく基準がないのが現状である.本研究において,上部構造に付与する咬合接触が咬頭嵌合位の安定性に及ぼす影響を検討することを目的とした.そのためには,長期にわたる咬合接触およびインプラントの変化を客観的に捉える必要性があることから,既存の咬合診査法がインプラントの評価に用いることが可能かどうか検討を行った.また,インプラント症例における長期経過観察時にオッセオインテグレーションの状態の変化を評価していくために,IMチェッカの開発を行なった.その結果,咬合接触の診査にはadd画像法およびT-Scan IIの有用性が示され,また動揺度評価ではIMチェッカの有用性が示された.咬合診査機器を用いてインプラント患者の咬合接触状態を診査したところ,咬みしめ強度を上昇させた場合の咬合接触は安定しており,健常者と同様の傾向を示した.IMチェッカについては,模型実験においてインプラント体の直径および植立深さが動揺度指標であるIM値に及ぼす影響について検討を行った.モデルの作製は不飽和ポリエステル樹脂を用いた.測定はインプラント体に対して,水平方向および垂直方向の加振を行い評価した.その結果,IMチェッカはインプラントの動揺を測定することが可能であり,また,この動揺はオッセオインテグレーションの程度を評価することが可能であることが示唆された.現在,歯科臨床において欠損補綴への歯科インプラントの応用が増加している.天然歯と比較して歯科インプラントでは歯根膜組織が欠如するため,咬みしめ時には天然歯とは異なる動きをすると考えられる.しかし,上部構造体に付与する咬合接触については科学的根拠に基づく基準がないのが現状である.本研究では,上部構造に付与する咬合接触が咬頭嵌合位の安定性に及ぼす影響を検討することを目的とし,本年度は第1段階としてインプラント装着患者の咬合接触の評価法の検討を行った.測定にはadd画像法およびデンタルプレスケール法を用いた.被験者として下顎の片側あるいは両側遊離端欠損に対してIMZインプラントを植立し,固定性補綴処置を行った被験者を選択した.咬合接触の記録は,被験者に最大随意収縮(MVC)を行わせた際の咬筋筋電位のRMS値を100%としたときの5%,10%,20%,30%および100%MVCの5段階の咬みしめ強度で行った.その結果,add画像法ではすべての咬みしめ強度の記録で咬合接触が認められたのに対し,デンタルプレスケール法では,5%MVCの記録においてすべての被験者で咬合接触が認められなかった.また,天然歯列では咬みしめ強度の増加とともに咬合接触面積は増加すると報告されているが,インプラント装着患者においても天然歯側,インプラント装着側ともに接触面積の増加が両方法で確認できた.現在,歯科臨床において欠損補綴への歯科インプラントの応用が増加している.天然歯と比較して歯科インプラントでは歯根膜組織が欠除するため,咬みしめ時には天然歯と異なる動きをすると考えられる.しかし,上部構造体に付与する咬合接触については科学的根拠に基づく基準がないのが現状である.本年度は,インプラント症例における長期経過観察時にオッセオインテグレーションの状態の変化を評価していくために,IMチェッカの開発を行い,模型実験においてインプラント体の直径および植立深さが動揺度指標であるIM値に及ぼす影響について検討を行った.また,昨年度に引き続き,咬合接触の長期経過観察に適した咬合評価法の検討およびインプラント装着患者における咬合接触状態について観察を行った.IMチェッカの評価には不飽和ポリエステル樹脂を用いてモデルの製作を行なった.測定は,製作したインプラントモデルを万力にて固定後,開発したIMチェッカを用いて各モデルに対して5回の測定を行った.

また,測定はインプラント体に対して,水平方向および垂直方向の加振を行い評価した.その結果,同一モデルに対する測定の再現性は高く,coefficient of variationは0から2.4%であった.同一規格モデルに対する測定値のばらつきもIM値の平均値で0から3.6と小さかった.垂直方向の加振の場合,直径と植立深さで差が認められたのに対し,水平方向の加振では各植立条件間で差はほんとンど認められなかった.以上のことから,IMチェッカはインプラントの動揺を測定することが可能であり,また,この動揺はオッセオインテグレーションの程度を評価することが可能であることが示唆された.
超高感度SQUIDセンサーを用いた非侵襲的な腫瘍組織の活動磁場測定法の確立

SQUID(超伝導量子干渉素子)を用いて,生体に侵襲を加えることなく腫瘍組織の生命活動によって生じる活動磁場の測定を行った,用いたセンサーは分解能12fT/√<Hz>のgradiometerで,可動ステージとして超音波モーター駆動(周期約1Hz)の水平シフト型テーブルを用いた.測定は,磁気シールドルーム内で行った.ステージ移動1往復時間に変動を認めたため,水平シフトテーブルの1周期の違いを考慮した加算平均処理を行った,検体としてステージのみ,マウスのみ,腫瘍移植マウス,および安楽死した腫瘍移植マウスの磁場波形を正規化した同期加算の結果,腫瘍移植マウスにて活動磁場が検出された.ブーストラップ検定の結果,腫瘍移植マウスでは,他と比べ有意に予測磁場との相関係数が高かった,マウスを静止状態で計測した場合,腫瘍を移植した脚部からはシグナルらしきものは確認できなかったが,胴体部からなんらかの生体活動に基づくとみられるシグナルが検出された.意義...移植腫瘍組織の生命活動によって生じる活動磁場の測定には,検体あるいは測定器を動かせて誘導磁場を検出する必要があり,ハード面でのさらに有用なシステム構築が欠かせない.また,引き続き環境やステージの磁場ノイズを除去する解析システムと磁場検出の手法の向上に努める必要がある.重要性...活動磁場を検出するという手法を用いて,腫瘍の局在を非侵襲的に評価できる医療機器の開発にむけて,今後本研究結果が応用され,癌の早期発見と早期治療に寄与する研究分野として発展が期待される.SQUID(超伝導量子干渉素子)を用いて,生体に侵襲を加えることなく腫瘍細胞の生命活動によって生じる活動磁場の測定を行った.用いたセンサーは分解能12fT/√<Hz>のgradiometerで,可動ステージとして超音波モーター駆動(周期1Hz)の水平シフト型テーブルを用いた.測定は,磁気シールドルーム内で行った.培養骨肉腫細胞(悪性)をシャーレに充満した群と細胞のない群で活動磁場解析を行った結果,環境磁場ノイズやステージのノイズの影響で,リアルタイムの磁場波形上では有意な磁場変化が観測されなかった.これを正規化した同期加算処理を行うと,細胞ありの群で腫瘍細胞から生じたと判断される活動磁場の波形が確認された.腫瘍細胞をマウスに移植した群と対象マウス,さらに移植後安楽死させた群間で活動磁場変化を測定した結果,今回もリアルタイムの磁場波形上は有意な磁場変化を確認できなかった.しかし,データを同期加算し,さらにブートストラップ検定行った結果,腫瘍移植マウスで活動磁場の上昇に有意な相関係数の上昇を認めた.意義・・・腫瘍細胞の生命活動によって生じる活動磁場の変化が再度確認された.しかし,非常に微弱な磁場変化であるため,その検出には,環境やステージの磁場ノイズを除去する解析システムの構築や検定の手法などシステム工学系の手法を応用する必要がある.重要性・・・腫瘍細胞を非侵襲的に評価する手法が新たに開発されることにより,腫瘍細胞の早期発見,早期治療に寄与する研究分野となりえる.SQUID(超伝導量子干渉素子)を用いて,生体に侵襲を加えることなく腫瘍組織の生命活動によって生じる活動磁場の測定を行った,用いたセンサーは分解能12fT/√<Hz>のgradiometerで,可動ステージとして超音波モーター駆動(周期約1Hz)の水平シフト型テーブルを用いた.測定は,磁気シールドルーム内で行った.ステージ移動1往復時間に変動を認めたため,水平シフトテーブルの1周期の違いを考慮した加算平均処理を行った,検体としてステージのみ,マウスのみ,腫瘍移植マウス,および安楽死した腫瘍移植マウスの磁場波形を正規化した同期加算の結果,腫瘍移植マウスにて活動磁場が検出された.ブーストラップ検定の結果,腫瘍移植マウスでは,他と比べ有意に予測磁場との相関係数が高かった,マウスを静止状態で計測した場合,腫瘍を移植した脚部からはシグナルらしきものは確認できなかったが,胴体部からなんらかの生体活動に基づくとみられるシグナルが検出された.意義...移植腫瘍組織の生命活動によって生じる活動磁場の測定には,検体あるいは測定器を動かせて誘導磁場を検出する必要があり,ハード面でのさらに有用なシステム構築が欠かせない.また,引き続き環境やステージの磁場ノイズを除去する解析システムと磁場検出の手法の向上に努める必要がある.重要性...活動磁場を検出するという手法を用いて,腫瘍の局在を非侵襲的に評価できる医療機器の開発にむけて,今後本研究結果が応用され,癌の早期発見と早期治療に寄与する研究分野として発展が期待される.
アメリカ外交における非政府組識の関与に関する研究

本研究では、アメリカで発足し、人権問題の改善および民主化支援を国際的に展開しているNGO(フリーダム・ハウス[以下FHと略記]とヒューマン・ライツ・ウォッチ[以下HRWと略記])に焦点を絞り、その活動の歴史的展開の検討を通して、アメリカ外交における関与の実態についての考察を行った。主に、それぞれによる出版物や報告資料および本部や海外事務所でのインタビューに基づく研究を進めた。FHは、アメリカ国内で孤立主義が支配的だった1939年、ヒトラーの全体主義に対して民主主義諸国を守るために、世論への啓蒙キャンペーンや議会とローズベルト大統領へのロビー活動を通して武器貸与法の成立に貢献した前身組織を起源とする。以来、FHは人権や民主化の問題領域においてアメリカ外交を中枢と側面から補完あるいはリードする自発的かつ積極的なアクターとしての役割を果たし、その存在意義を保っていることが明らかとなった。FHと政府の人的つながりは歴史的に深い。FHの理事や代表に政府の要職を務めた人や大物議員が常に名を揃え、またFHから大統領指名で各要職に抜擢されて政策決定や対外交渉に寄与した人が多いという特徴は、FHが外交決定の仕組みに自動的に組み込まれていることを意味しないが、一定の政治的役割を果たしていることは明白といえる。NGOがアメリカ外交において自らの信念を実現するために、一方の政府関係者は対外政策の立案や目的を推進するために、人権および民主化の問題領域において協働関係をとる例としてFHを挙げることができよう。政府がどこまでNGO側の提言や要求を取り入れ、外交政策で考慮するようになっているのかについて、さらに具体的に検証する必要がある。FHよりも約30年後に登場したHWRもFHと類似した役割を果たしているが、こちらの詳細な分析とFHとの比較検討もあわせて今後も研究継続し、成果として公表することとしたい。研究初年度は、アメリカに本部を置く主な人権団体・民主化支援団体としてフリーダムハウス、ヒューマン・ライツ・ウォッチ、オープン・ソサエティを中心に据え、それらの設立の経緯・発展過程・活動状況・政策立案、およびアメリカ外交との関係について、日本国内および海外での情報収集に努め、それらの整理と分析を進めた。とくに、各団体のアメリカ本部とヨーロッパの海外事務所を訪問した際は、事務所代表やスタッフと意見交換する機会を得ることができ、今後の分析材料に欠かせない資料もいただいた。USAID(アメリカ国際開発庁)の助成も受けているこれらの非政府組織であるが、アメリカ政府の外交とは一線を画し、文字通り、独自の政策と活動を展開しているという自負とともに、アメリカ外交のソフト・パワーの担い手でもあるという自己意識も併せ持っていることが見受けられた。その具体的な検証材料となる、例えばフリーダムハウスのスタッフが語った、毎年出版される諸外国の自由レベルや民主化レベルについての報告書が作成される過程、アメリカ国務省やUSAIDでもその報告書が利用される事実、支援対象国の政府やマスコミへの影響力などの検討に取り組んだ。イラク戦争への対応をめぐってアメリカ外交が厳しい批判にさらされている近年、非政府組織による人権擁護活動や民主化支援はますます脚光を浴び、その重要度は高まっている。こうした側面は昨今に限られたものではなく、これら組織の設立の経緯を振り返ると、古くは第二次世界大戦当時からアメリカ政府との直接的・間接的な協力関係のなかに再確認できる。この点について、具体的な全容解明に試みることが今後の検討課題の一つである。
非プロテアソーム系β-catenin分解を誘導する化合物群の分子標的基盤研究

Wnt/β-カテニン経路は、多くの悪性腫瘍で活性化するシグナルで創薬標的として魅力的な経路である。本研究では、申請者らが同定したIMU14とその誘導体によるWnt経路阻害機構の解明を試みた。主に、「IMU化合物は、本来のプロテアソーム系によるβ-カテニンの分解を、リソソーム系にスイッチしてWntシグナルを抑制する。」という仮説の検証をおこなった。また、APCMin/+マウスのデキストラン硫酸誘導性大腸腫瘍モデルを用い、IMU誘導体による抗腫瘍作用を解析した。申請者らが同定したWnt/β-カテニン経路阻害剤活性を有する化合物IMU14とその誘導体の作用機構の解明を試みている。これまでの解析を基に「IMU化合物は、本来のプロテアソーム系によるβ-カテニンの分解を、リソソーム系にスイッチすることによってWntシグナルを抑制する。」という仮説をたてた。本研究は、この仮説の検証を主な目的としている。これまでに、IMU化合物がβ-カテニンやNotchと物理的に相互作用すること明らかにしている。他方、膜タンパク質であるNotchのエンドサイトーシス時に、β-カテニンのリソソームによる分解を誘導することが知られている。そこで、IMU化合物によるWnt/β-カテニン経路の阻害へのNotchの関与を想定し、siRNAによるNotchのノックダウンによるIMU化合物の薬効への影響を解析した。Notch1/2ダブルノックダウンを行ったところ、IMU化合物によるβ-カテニン/TCF依存的転写活性化の抑制作用が減弱された。すなわち、IMU化合物によるWnt/β-カテニン経路阻害は、Notch1/2に依存することが示唆された。IMU誘導体に由来する自家蛍光と蛍光性オルガネラマーカーとの2重染色を行った。IMU化合物が蓄積するオルガネラは、少なくとも部分的にはリソソームマーカーの分布と一致していた。さらに、IMU化合物処理によって、オルガネラの量やサイズに変化が見られるかについても検討したが、現在のところ際立った変化は認めていない。平成26年度以降に行う動物実験の予備実験も始めた。ゼノグラフト実験に加えて、Apc(Min)マウスを用いた大腸がんの発がん過程への影響も検討できる体制を築いた。Wnt/β-カテニン経路を阻害する活性を有する化合物として申請者らが同定したIMU14とその誘導体の作用機構の解明を試みている。これまでの解析から「IMU化合物が、本来のプロテアソーム系によるβ-カテニンの分解を、リソソーム系にスイッチすることによってWntシグナルを抑制する。」という仮説をたて、この検証を試みている。膜タンパク質Notchのエンドサイトーシス時に、β-カテニンのリソソームによる分解を誘導することが知られている。昨年度は、Notch1/2ダブルノックダウンを行い、IMU化合物によるβ-カテニン/TCF依存的転写活性化の抑制への影響を観察した。今年度は、V型ATPase阻害剤であるconcanamycin Aを用い、IMU化合物の作用発現へのリソソーム系の関与を検討した。コントロールとして用いたプロテアソーム阻害剤MG132やpan-caspase阻害剤Z-VAD存在化では、IMU化合物によるβ-カテニンの分解が観察された。一方で、concanamycin A存在化では、β-カテニンの分解が観察されなくなった。したがって、IMU化合物によるβ-カテニンの分解が、Notch1/2に加えてリソソームにも依存することが示唆された。ApcMin/+マウスにデキストラン硫酸ナトリウムを投与することで、大腸腫瘍を誘導することができる。このモデルを用い、IMU化合物の抗腫瘍効果の解析を試みた。100 mg/kgまでIMU化合物を経直腸投与したが、顕著な抗腫瘍効果は観察されなかった。IMU化合物はエステル結合を含むため、in vivoでの安定性の問題が考えられた。そこで、マウス血清を用いて耐分解能を確認したところ、血清によってIMU化合物の活性低下が観察された。エステルをアミドに変換した誘導体を含め、約50の誘導体の活性評価を行ったが、現在のところ活性と安定性が格段に改善された誘導体は得られていない。今後も引き続き、誘導体の探索を行う。Wnt/β-カテニン経路阻害剤として申請者らが同定したIMU14とその誘導体の作用機構の解明を試みた。」という仮説をたて、この検証を試みた。これまでに、IMU化合物によるβ-カテニン分解が、Notch1/2とリソソームに依存することを明らかにしてきた。今年度は、IMU化合物によるβ-カテニンとNotch1との物理的相互作用への影響について検討した。MycまたはFlagタグ付加Notch1変異体発現ベクターを用い、タグ抗体による免疫沈降を行った。共沈するβ-カテニンをウェスタンブロットによって解析したところ、Notch1細胞質領域と共沈するβ-カテニン量が、IMU化合物処理によって増加した。したがって、IMU化合物は、β-カテニンとNotch1間の結合を誘導し、Notchとリソソーム依存的にβ-カテニンを分解すると考えられる。今年度は新たな35誘導体を創成し構造活性相関解析を行った。

これらの誘導体のうち、IMU1003をはじめとする8誘導体が比較的高いWnt/β-カテニン経路阻害活性を維持していた。そこで、IMU1003を用いて、昨年度思わしい結果が得られなかった抗腫瘍効果の検討を再度試みた。ApcMin/+マウスを用いたデキストラン硫酸ナトリウム誘導性大腸腫瘍モデルへ、IMU1003を30 mg/kgで連日腹腔内投与した。その結果、コントロールに比較してIMU1003投与群では、発生腫瘍数や腫瘍サイズが有意に減少した。したがって、IMU1003はβ-カテニン依存性腫瘍に対して抗腫瘍効果が期待できる。Wnt/β-カテニン経路は、多くの悪性腫瘍で活性化するシグナルで創薬標的として魅力的な経路である。本研究では、申請者らが同定したIMU14とその誘導体によるWnt経路阻害機構の解明を試みた。主に、「IMU化合物は、本来のプロテアソーム系によるβ-カテニンの分解を、リソソーム系にスイッチしてWntシグナルを抑制する。」という仮説の検証をおこなった。また、APCMin/+マウスのデキストラン硫酸誘導性大腸腫瘍モデルを用い、IMU誘導体による抗腫瘍作用を解析した。in vitro解析は順調に進捗している。in vivoでの活性が検出できていないが、化合物の特性である可能性があるため、類縁誘導体を用いる方向で進める。生物系薬学in vivo活性が期待できる誘導体の探索を進めると同時に、投与方法や投与量を再度検討する。in vitro解析については、研究計画に従って推進する。平成25年度に予定していた内容に加え、平成26年度以降に行われる予定の動物実験の準備も行った。予想と異なる結果を得た部分もあるが、概ね順調に進捗している。納入業者による値引きやシンポジウムに招待されたことにより旅費の支払いが不要になったため。V型プロトンポンプ阻害剤バフィロマイシを用いたリソソームの酸性化阻害による、IMU化合物誘導性β-カテニン分解への影響についても計画書にしたがって検討した。しかし、バフィロマイシンとIMU化合物の併用による細胞毒性の影響が大きく結論には至っていない。今後、他のリソソーム機能制御因子に対する阻害剤やノックダウンを試みる。それ以外は、当初の研究計画に従って、研究を推進する。次年度の研究活動に有効利用する。研究試薬の価格の割引によって生じた差額分である。平成25年度に必要な試薬は購入済み。平成26年度の研究費として有効利用する。
コイ普通筋ミオシンの全一次構造の解明

魚肉タンパク質中、ミオシンは最も多い成分で、その性状は魚肉の加工適性や貯蔵適性に大きな影響を与えるが、一次構造の情報がほとんどないため、分子レベルの研究は困難をきわめている。そこで本研究は、コイ普通筋を対象に、遺伝子工学的手法を用いてミオシン重鎮および軽鎖サブユニットの全一次構造を解明することを目的とした。コイの普通筋ミオシンはサブユニット構造をとり、1分子は約200kDaの重鎮2本と、20kDa前後の軽鎖4本からなる。さらに、ミオシン1分子には、アルカリ条件下で重鎖から解離するアルカリ軽鎖2本と、5,5′-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)(DTNB)処理で重鎖から解離するDTNB軽鎖2本が含まれる。アルカリおよびDTNB軽鎖はそれぞれ、必須および調節軽鎖とも呼ばれている。そこでまず、コイ普通筋からL-メロミオシン(LMM)を単離し、N末端アミノ酸配列を解析した。次に、この配列をもとにDNAプライマーを合成し、PCRでLMMの一部領域をコードするDNAを増幅した。さらに、cDNAライブラリーを構築し、先の増幅DNA断片をプローブにスクリーニングを行った。その結果、10°Cおよび30°C馴化コイで主に発現するタイプと、両タイプの中間的な塩基配列を示す中間型の3つのミオシン重鎖アイソフォーム全長をコードするcDNAを単離し、全一次構造を決定した。いずれのタイプも1,8491,845アミノ酸をコードしていた。次に、前述のライブラリーから、申請者らが以前調製したカツオ普通筋に対するウサギのポリクローナル抗体を用いて、アルカリ軽鎖およびDTNB軽鎖の全長をコードするクローンを単離し、全一次構造を決定した。その結果、A1およびA2軽鎖はそれぞれ193および151アミノ酸からなることが示された。なお、両軽鎖のアミノ酸変異は分子全体にわたり、異なる遺伝子でコードされていることが示唆された。一方、DTNB軽鎖は、166アミノ酸からなることが明らかにされた。そこで本研究は、コイ普通筋を対象に、遺伝子工学的手法を用いてミオシン重鎖および軽鎖サブユニットの全一次構造を解明することを目的とした。まず、コイ普通筋からcDNAライブラリーを構築した。次いで、既報のコイL-メロミオシンをコードするDNA断片につき、DIGDNAラベリングキットを用いて標識化し、これをプローブとして、前述のcDNAライブラリーからミオシン重鎖のC末端側の種々の領域をコードするクローンを単離した。さらに、N末端側のコードするDNAは、PCRによって増幅した。上記の単離クローンおよび増幅DNA断片は、pBluescriptSK-プラスミドにサブクローニングし、その塩基配列をDNAシーケンサを用いて決定し、ミオシン重鎖の全一次構造を演繹した。一方、アルカリ軽鎖A1およびA2については、既報のカツオA1に対するウサギ抗体を用いて上記のcDNAライブラリーをスクリーニングし、得られたクローンにつき、塩基配列を決定し、全一次構造を演繹した。まず、ミオシン重鎖については、10°Cおよび30°C馴化コイで主に発現するタイプと、両タイプの中間的なアミノ酸配列を示す中間型の3つのアイソフォームの一次構造を決定することができた。いずれのタイプも18491845アミノ酸をコードしていた。