hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
少子高齢化の移行期におけるニュータウンレベルの住民参加型まちづくり活動組織の役割

また、これらの活動には、ニュータウンレベルの活動組織に一時的に参加していた居住者が構成員になっている場合が多いことも明らかになった。さらに、ニュータウン全体レベルのまちづくり活動は、基本的には無償のボランティアとして事業に関わることを前提としており、このことがニュータウン内の事業者との連携を促進できない要因になっていた。この課題を解決するために、アクションリサーチとして、事業者とまちづくりの連携を図るNPO法人を2013年8月に設立し、実験的に事業を実施することで、タウンセンターにおける買い物支援サービス、コワーキングスペースの開設、ニュータウン周辺地域との連携拠点という、タウンセンターの付加価値向上に資する空間やサービスの提供が始動するに至ったプロセスを明らかにした。本研究課題の目的は、ニュータウレレベルにおける住民参加型まちづくり組織の役割について、(1)ニュータウンレベルでのまちづくり活動の連携、(2)ニュータウンレベルでの個人のネットワークの形成、という2点から明らかにすることが目的である。これまでの研究において、(1)についての検討は順調に進展しており、(1)の成果を踏まえて2012年度は、(2)についての検討を重点的に実施する予定である。25年度が最終年度であるため、記入しない。洛西ニュータウンにおけるニュータウンレベルでの住民参加型まちづくり組織は、2007年2012年の5年間においては、自然資源を活用した事業を通じて組織形成を図ってきた。今年度は、少子高齢化という本研究課題に対応した検討をより重点的に行うために、自然資源だけではなく、人工資源の再生にむけて、組織が果たすべき役割を具体的に検討する。さらに、組織の構成員が、5年間の活動を通じて、近隣住区内で完結しない多様で選択的な個人のネットワークを形成することができたのか、また、こうした活動はニュータウンに居住する個人にとってネットワーク形成以外にどのような効果があったのか、構成員に対するインタビュー調査を通じて分析を行う。
外科手術による癒着・線維形成過程の分子機構解析と制御法開発と探索

マウス及びヒトでの肝切除後の癒着形成について解明した。肝切除後には肝内のNKT細胞が肝切除部位近傍に集簇し、これらが肝内でのIFN-γを産生した。IFNγ依存性に、肝細胞から線溶系因子であるPAI-1が産生された。これらが癒着形成に重要な因子であることが判明した。マウスにHGFを投与することにより、IFN-γ及びPAI-1の産生を抑制し癒着を軽減でき、今後ヒトにおける癒着予防法の応用が期待される。マウスにおいて、バイポーラ型電気メスを用いた肝切除を行い癒着モデルを作成した。まずCD4+T細胞の関与が既報の論文で証明されており、当モデルにおいても確認した。抗CD4+抗体をマウスに投与したところ、コントロールマウスと比較すると癒着の程度が軽減された。マウス肝にはNKT細胞が多く存在し、それらはCD4+のT細胞マーカーを多く持つ。NKTノックアウトマウスを用いて肝切除を行うとWTマウスに比較して癒着が軽減された。以上より癒着形成にはCD4+のNKT細胞が関与していることが分かった。NKT細胞は活性化するとIFNγを産生する。肝切除後のIFNγについて解析すると、残肝では約3時間後に発現が増加していた。またIFNγ抗体を投与したマウス及びIFNγノックアウトマウスでの癒着の程度はコントロールマウスに比較して軽減された。肝切除後のNKTノックアウトマウスでのIFNγ発現量はWTに比較して減少していた。以上より癒着にはNKT細胞によるIFNγも必要であることが証明された。また線溶系因子であるPAI-1の関与を確認した。PAI-1は肝切除後に肝内での発現が6時間後にピークを迎えた。PAI-1ノックアウトマウスでの癒着も軽減された。IFNγノックアウトマウスにおいて肝切後6時間でのPAI-1の発現量は滅少していた。癒着形成にはPAI-1は重要であることが分かったが、それはIFN-γにより制御されていることが分かった。HGFは抗炎症作用や抗線維化作用があるが、肝切モデルに投与したところ癒着が軽減された。またその機序はIFNγ・PAI-1の発現を抑制していることによることが証明された。IN VIVOにて、肝切除後の癒着形成にはIFN-γおよびPAI-1が必要であることが示された。マウスの肝切除後において3時間でIFNγが、6時間でPAI-1が、残肝において発現が上昇していたことより、humanのサンプルでも確認することとした。humanの肝切除開始直前の肝サンプルをコントロール(0時間)として、その後1時間ごとに肝切離面の肝サンプルを採取した。サンプルは液体窒素で急速冷凍し保存した。同サンプルよりRNAを採取し、RT-PCRを行った後real time PCRで肝切除開始後の肝におけるIFN-γ及びPAI-1の発現を解析した。実際のサンプル採取は、肝切除開始から4時間くらいまでしか採取できないため、1検体に対しコントロールを含めると数個までしか採取できないがそれらについて解析を行っている。IFN-γは2及び3時間後には肝内の発現量は上昇傾向にあったが有意差は認めなかった。しかしPAI-1に関しては3時間後に有意差をもって上昇していることが確認された。肝切除後1時間後のサンプルにおいては、いずれの因子も上昇傾向は認めなかった。同サンプルを用いてELISAでの解析を行うこととした。サンプル組織を組織溶解液で溶解し同溶液をELISA解析したが、IFN-γ及びPAI-1ともに上昇傾向は示さなかった。以上よりhumanでもPAI-1に関して関与している可能性が示唆された。Humanサンプルを用いて、肝切除後のNKT細胞およびPAI-1の関与を証明すべく免疫染色を行った。肝切除後3時間のサンプルにおいて、肝切離面近くにNKT細胞が集簇していることが確認され、また肝実質でのPAI-1発現の増強を認めた。強拡大ではPAI-1は肝細胞に発現していることが確認された。前年度までの結果と合わせて考慮すると、肝切除による物理的ダメージによりNKT細胞が増加・活性化してIFN-γを産生し、直接的か間接的かはまだ分からないが、肝細胞におけるPAI-1産生を刺激させ、切離面における癒着形成に関与している可能性が示唆された。前年度までの結果から、PAI-1発現は切離近傍の肝臓のみならず血中(ELISA)でも増加していることが確認された。肝切モデルは左葉外側を切除しているが、この際右葉でのPAI-1を測定したところ同部でも上昇しているのが確認された。また、小坂らによる腸管焼灼後癒着モデルにおいて癒着腸管および血中でのPAI-1上昇が確認されたが、肝でのPAI-1産生

について検討した。すると、肝でのPAI-1発現が増強していた。以上より、腸管への物理的刺激や肝切後での癒着形成過程において、局所のみならず肝全体ででも産生され血中に放出され、全身反応として癒着が形成されている可能性が示唆された。つまり、癒着制御には局所だけでは不十分で、全身的制御も必要であることが示唆された。なお、これまでの研究結果については、現在欧文誌である"British Journal of Surgery"に投稿しRevise中(再提出)である。ヒト肝切除サンプルを用いてIFN-γ及びPAI-1の発現解析を開始したため。24年度が最終年度であるため、記入しない。humanサンプルにおける肝切後のNKT細胞及びPAI-1の免疫染色を行い肝切除においてどの部分に強く発現しているかを確認する。我々は、肝切除後近傍にNKT細胞が集簇していると仮定している。PAI-1に関してはどの細胞が産生に関与しているかを証明したい。
シトリン欠損症の臨症像の解明-発症予防・治療法の開発に向けて-

[緒言]シトリン欠損による新生児肝内胆汁うっ滞症(NICCD)の症状は多彩で、診断に苦慮する場合が多い。その長期予後も不明であり早急にその臨床像を明らかにし治療・予防法を確立する必要がある。[研究方法]SLC25A13遺伝子異常が確認されたNICCD症例の主治医に対してアンケートを行ない69名より回答を得た。その内、新生児マススクリーニングを契機に発見された27名につき解析した。[結果]精密検査対象となった検査項目はガラクトース、メチオニンがそれぞれ7名、5名であったが、両者同時に陽性となったものが9名と最多であった。また、複数項目での陽性や初回と再検時の陽性項目が異なるなどの特徴がみられた。生化学的検査ではγGTP(291±136IU/L)、総胆汁酸(259±117nmol/mL)の著増、低蛋白血症(4.64±0.54g/dL)、高ガラクトース血症(44.3±33mg/dL)、軽度の高アンモニア血症(120±43μg/dL)が特徴であった。測定したほとんどの症例(15/17)でヘパプラスチンテストが低下していた。アミノ酸分析では測定された24例で異常がみられ、特にシトルリン(10.2±6.1mg/dL)、メチオニン(5.83±3.9mg/dL)が著増していた。全例特殊ミルクによる治療が行なわれていた。主なものは乳糖除去ミルク(18例)、低Metミルク(3例)、MCTミルク(4例)、蛋白除去ミルク(3例)であった。脂溶性ビタミンは半数に投与されていた。[考察]今回のアンケート調査で回答のあったNICCD症例69例中27例(39%)がマススクリーニングを契機に発見されており、マススクリーニング陽性例の鑑別診断の際には必ずNICCDを念頭におかなくてはならない。特にガラクトースとメチオニンなど異なる複数の項目で陽性となる場合や初回と再検時の陽性項目が異なるなど予想外の結果が出た場合には注意が必要である。現時点(最年長23才)では肝不全やII型シトルリン血症を発症したものはないが、今後発症する可能性もあり注意深い経過観察が必要である。

また、複数項目での陽性や初回と再検時の陽性項目が異なるなどの特徴がみられた。生化学的検査ではγGTP(291±136IU/L)、総胆汁酸(259±117nmol/mL)の著増、低蛋白血症(4.64±0.54g/dL)、高ガラクトース血症(44.3±33mg/dL)、軽度の高アンモニア血症(120±43μg/dL)が特徴であった。測定したほとんどの症例(15/17)でヘパプラスチンテストが低下していた。アミノ酸分析では測定された24例で異常がみられ、特にシトルリン(10.2±6.1mg/dL)、メチオニン(5.83±3.9mg/dL)が著増していた。全例特殊ミルクによる治療が行なわれていた。主なものは乳糖除去ミルク(18例)、低Metミルク(3例)、MCTミルク(4例)、蛋白除去ミルク(3例)であった。脂溶性ビタミンは半数に投与されていた。[考察]今回のアンケート調査で回答のあったNICCD症例69例中27例(39%)がマススクリーニングを契機に発見されており、マススクリーニング陽性例の鑑別診断の際には必ずNICCDを念頭におかなくてはならない。特にガラクトースとメチオニンなど異なる複数の項目で陽性となる場合や初回と再検時の陽性項目が異なるなど予想外の結果が出た場合には注意が必要である。現時点(最年長23才)では肝不全やII型シトルリン血症を発症したものはないが、今後発症する可能性もあり注意深い経過観察が必要である。【緒言】シトリン欠損症では新生児乳児期に肝内胆汁うっ滞症状(NICCD)を呈し、その後見かけ上健康な時期(適応期、代償期)を経て、何らかの原因で代償不全に陥った場合に重篤な成人発症2型シトルリン血症(CTLN2)を発症すると考えられている。CTLN2患者では以前より豆類などの高蛋白質食を好み糖質を嫌うことが報告されているが、今回我々はNICCDと診断された7症例について食事調査を行いその食嗜好について検討したので報告する。【症例】症例は調査時年齢115歳の7症例で性別は男児3例、女児4例。全例遺伝子診断にてSLC25A13遺伝子の変異が確認されている。【方法】母親に1日分の食事献立内容を食品ごとにグラム単位で記入をお願いし、1人に付き1週間分を提出してもらった。その調査表をもとに管理栄養士が各栄養素の摂取量を計算した。【結果】1週間の摂取熱量、蛋白質、糖質、脂質の平均値を求め、摂取エネルギー比率を計算した。摂取カロリーは症例1,2,4,7で本邦の平均値より多く、症例3,5,6で低値であった。7名の脂肪エネルギー比率の平均は46.2±6.0%であり本邦の標準値27-29%をはるかに越えていた。逆に7名の炭水化物エネルギー比率の平均は34.9±6.3%で標準値の55-57%より低値であった。【考察】多くのNICCD患児は1歳までに肝機能は正常化し、見かけ上無症状となる。しかし、離乳食が開始されると甘いジュースや米飯を嫌い、豆類や卵、乳製品、揚物など高蛋白質、高脂肪食品を好むという特徴的な食嗜好が現れる。患児は細胞質内にNADHを産生する糖質を嫌い、細胞質のアスパラギン酸を増やすと同時にNADHの再酸化を促進する蛋白質の摂取を好み、エネルギーを獲得しやすい脂質を摂取することにより代償期を維持しているものと推察された。今後ピルビン酸やクエン酸などの投与により食嗜好が変化の有無を調査し、治療薬となりうるか検討を重ねたい。
下垂体後葉ホルモン-オキシトシン-の機能的多様性の解析

神経分泌ホルモンの一つであるオキシトシン(OXT)が子宮収縮作用をもっていることはよく知られているがその他の作用を調べる目的で実験をおこなった。1)SD系ラット(雄、雌)脳において免疫組織科学的にOXT含有細胞及び線維を検討した。OXT含有線維は従来より言われている視床下部-下垂体後葉路や、視床下部-脊髄路の他に大脳辺縁系とくに扁桃体に濃厚に分布していることが光学顕微鏡レベルで確認された。2)扁桃体におけるOXT含有線維終末を電子顕微鏡的に観察したところシナプス小胞を有するOXT含有終末は扁桃体神経の樹枝状突起にシナプスを有しているのが認められた。3)OXT含有細胞の分布を光学顕微鏡で観察すると細胞体は視床下部室傍核及び視索上核の他にも視床下部内に広く分布することがわかった。このうち視床下部貫通血管壁にOXT含有細胞がまとわりつくように分布している一群について電子顕微鏡的に検討を加えた。4)3)の視床下部貫通血管は脳底部動脈からの分枝であり、視索上核の部より視床下部に貫入し、前部視床下部外側を通過してOXT含有細胞の存在する室傍核に流入している。この血管をOXT含有細胞体及びそれより出た多数の突起が鞘状にとり囲んでいる。OXT陽性物質は小動脈の基底膜及び内皮細胞の一部にも強く認められた。以上動物における光学及び電顕免疫組織化学の成績から以下の推論を行った。A)1)2)よりOXTは神経伝達物質としての作用を有することが示唆された。B)3)4)よりOXTは視床下部貫通血管に直接分泌され、その血管が支配する室傍核にフィールドバックをかけている事が示唆された。ヒト女性においては黄体機能不全と血中OXT量の関係が示唆されている。しかしながら黄体機能不全の診断が混乱している。この正確な診断の為内分泌検査に加えて子宮鏡による内膜日付診を行い正常月経周期の子宮内膜変化を解明したところである。今後この所見をもとにして黄体機能不全を正確に診断しOXTの関連を検討する。オキシトシン(OXT)は神経分泌ホルモンの一つであり,子宮収縮作用や射乳効果をもつことが知られているが,それ以外の作用に関してはよく知られていない.今回我々はこのOXTが上記以外の作用をもつかどうかを動物において検討した.1.OXTの脳脊髄における分布はSD系, SHR系ラットにおいて免疫組織化学的に検索した.OXT含有細胞は従来より報告のある如く,視床下部の視索上核及び室傍核に主として存在する.又その線維も視床下部-下垂体後葉路の他に大脳皮質や扁桃の前脳部に技射しているものと,中脳,橋,延髄脊髄に広く分布していた.これらのOXT含有細胞対及び線維の分布はSD系, SHR系ラット間ではほぼ同様であった.2.Radio immuno assayで上記の脳の各部を測定したところ,視床下部においては210μu/ラット±10μuであった.中脳,橋,延髄ではそれぞれ500μu/ラット±150, 480μu/ラット±160, 1000μu/ラット±250となっていた.脊髄では頚髄胸髄及び腰仙髄でそれぞれ500±110μuラット, 730±125μu/ラット, 1350±163μu/ラットとなっていた.これは視床下部の破壊でほとんど消失するところから,視床下部より脊髄にモノシナプティックに線維が送られていることがわかった.3.妊娠5日及び20日目のSDラットの腰髄を免疫組織化学的に検索したところ,妊娠20日目において明らかなOXT陽性線維の増加が認められた.現在これをRadio immmuno assayにて測定中である.4.4日間周期を有するSD系雌ラットの延髄にOXTを150μu注入しても性周期の変動はみられなかった.5.OXTと性周期の関連をヒトにおいて検討するため,卵胞期,排卵期,黄体期での血中及び卵胞液中のOXT量の測定を行っている.神経分泌ホルモンの一つであるオキシトシン(OXT)が子宮収縮作用をもっていることはよく知られているがその他の作用を調べる目的で実験をおこなった。

OXT陽性物質は小動脈の基底膜及び内皮細胞の一部にも強く認められた。以上動物における光学及び電顕免疫組織化学の成績から以下の推論を行った。A)1)2)よりOXTは神経伝達物質としての作用を有することが示唆された。B)3)4)よりOXTは視床下部貫通血管に直接分泌され、その血管が支配する室傍核にフィールドバックをかけている事が示唆された。ヒト女性においては黄体機能不全と血中OXT量の関係が示唆されている。しかしながら黄体機能不全の診断が混乱している。この正確な診断の為内分泌検査に加えて子宮鏡による内膜日付診を行い正常月経周期の子宮内膜変化を解明したところである。今後この所見をもとにして黄体機能不全を正確に診断しOXTの関連を検討する。
海洋プランクトン幼生の成長：摂餌の消化・吸収と栄養素の伝播・受容

棘皮動物イトマキヒトデの発生過程において、母性栄養に依存して形態形成を進行させる胚期と比べ、自身で摂餌して成長する幼生期にはどのような形態的特性が認められるかという視点から解析した。開口直後の時期から、珪藻(Chaetoceros calcitrans)をビピンナリア幼生(BP幼生)に給餌し、非給餌個体と比較しつつ、個体サイズと1個体当たりの細胞数を測定した。給餌12日では、非給餌個体より給餌個体の体長は有意に短かった。一方、細胞数は給餌個体の方が明らかに多かった。この事実は、摂餌を開始した初期には、BP幼生は身体を凝縮させていることを示唆する。Bp幼生初期の形態形成を観察したところ、非給餌個体とくらべ、給餌個体では、(1)体腔嚢の融合が完了すること、(2)繊毛帯は肥厚し、この領域で単位長あたりの細胞数が多いこと、(3)繊毛帯領域での神経細胞の配置は緩やかに進行すること、(4)一部の神経細胞は、間充織細胞に特異的なメタロプロテアーゼを発現していることが観察された。以降、給餌下でのBP幼生は神経回路を梯子状に構築しつつ、身体のサイズを増加させ変態可能なブラキオラリア幼生(Br幼生)に成長した。一方、非給餌下のBP幼生は、神経回路を発達させることが出来ずに、Br幼生に到ることはなかった。給餌下に成長する異なった時期のBP幼生、ならびに成長に必須な餌の消化吸収の要となる胃細胞において、それらに発現する遺伝子パターンの解析用のサンプル調整を始めた。種々の発生段階のBp幼生(2日、5日、8日、12日)からRNA抽出の準備を整えた。一方、1,8-ANSで処理した5日幼生をグリシン処理し、解離された蛍光発色性の胃細胞をセルソータにアプライした。予想通りの細胞数割合で機械のチャネルを通過していることは認められたが、チャネル分離後に細胞破損が生じRNA抽出ができない状況である。給餌による身体のサイズ増加や形態的な神経細胞の状態解析は、凝縮作用の発見など興味深い現象も見出しており、順調に推移していると評価できる。本データを公表し、研究推進に向けて有意義な議論を行う目的で、日本動物学会89回大会の口頭発表にエントリーしていたが、北海道肝振東部地震の発生により、当目的は達せられていない。本研究課題の一つの柱である、「セルソータを用いた胃細胞の分画、ならびにその発現遺伝子情報の解析」のアプローチが暗礁に乗り上げている。1,8-ANSで前処理した5日幼生は、蛍光顕微鏡下において紫外光で胃領域のみが発色する。受精後5日目のビピンナリア幼生に1,8-ANS処理を施し、グリシン溶液を用いて個々の細胞にまで解離して、申請者らが所属する慶應大学共同解析室に配備されているセルソータにアプライした。海水に浮遊する生きたままの解離細胞に対して、セルソータは稼働し、予想する割合で蛍光標識された胃細胞がセルソータ内の細いノズルを通過していることは確認された。ここまでは期待どおりの結果であるが、最終的に胃細胞を分離回収した際に、視認できるはずの量の胃細胞を取得できなかった。これは、ノズル通過後の分離過程で、細胞を包括していた海水が、一挙に生理食塩水と混ざり合い、海産生動物の細胞の背景となる液の浸透圧が減少し、目的の胃細胞は膨潤して構造が脆弱になり、遠心操作で破砕され、発現遺伝子の採取に必要なRNAが上清中に四散してしまった推測される。今後、胃細胞を健常な状態で集めることに関して、ハードルを乗り越える必要が認められる。摂餌による成長における神経細胞の関与については、神経細胞に特異的に発現する遺伝子に着目して、その遺伝子の単離を進め、部分配列は取得できている。今後、遺伝子単離を完遂し、全長の配列情報を取得した後、モルフォリノオリゴをデザインして、神経細胞の機能阻害を解析する。全長の塩基情報が取得できない場合には、部分情報からモルフォリノオリゴをデザインせざるを得ないが、当遺伝子の抗体を持っているため、原因と結果に整合性を得る実験を成立させ得ると考えられる。単離完遂までの推移にかかる時間をみながらではあるが、より完璧な状態で実験を遂行していく。一方、1,8-ANS処理により標識された胃細胞の分離に関して、回収に時間が掛からない、より迅速な方法として、胃細胞の割合を50%近くまであげて、多くの割合の胃細胞を短時間に集めるアプローチを考えている(原腸単離法)。一方、現在の実験状況でも胃細胞を分画することはできているので、セルソータを稼働させる際に生理食塩水でなく海水の使用が可能な環境を探すことも考えている。両アプローチとも成功しない場合には、次善の策として原腸単離法で胃細胞の割合が50%程度にまで上がったサンプルからRNA分取を行う。また、蛍光物質の注入による栄養成分の拡散に関しては、今年度から着手する。

給餌12日では、非給餌個体より給餌個体の体長は有意に短かった。一方、細胞数は給餌個体の方が明らかに多かった。この事実は、摂餌を開始した初期には、BP幼生は身体を凝縮させていることを示唆する。Bp幼生初期の形態形成を観察したところ、非給餌個体とくらべ、給餌個体では、(1)体腔嚢の融合が完了すること、(2)繊毛帯は肥厚し、この領域で単位長あたりの細胞数が多いこと、(3)繊毛帯領域での神経細胞の配置は緩やかに進行すること、(4)一部の神経細胞は、間充織細胞に特異的なメタロプロテアーゼを発現していることが観察された。以降、給餌下でのBP幼生は神経回路を梯子状に構築しつつ、身体のサイズを増加させ変態可能なブラキオラリア幼生(Br幼生)に成長した。一方、非給餌下のBP幼生は、神経回路を発達させることが出来ずに、Br幼生に到ることはなかった。給餌下に成長する異なった時期のBP幼生、ならびに成長に必須な餌の消化吸収の要となる胃細胞において、それらに発現する遺伝子パターンの解析用のサンプル調整を始めた。種々の発生段階のBp幼生(2日、5日、8日、12日)からRNA抽出の準備を整えた。一方、1,8-ANSで処理した5日幼生をグリシン処理し、解離された蛍光発色性の胃細胞をセルソータにアプライした。予想通りの細胞数割合で機械のチャネルを通過していることは認められたが、チャネル分離後に細胞破損が生じRNA抽出ができない状況である。給餌による身体のサイズ増加や形態的な神経細胞の状態解析は、凝縮作用の発見など興味深い現象も見出しており、順調に推移していると評価できる。本データを公表し、研究推進に向けて有意義な議論を行う目的で、日本動物学会89回大会の口頭発表にエントリーしていたが、北海道肝振東部地震の発生により、当目的は達せられていない。本研究課題の一つの柱である、「セルソータを用いた胃細胞の分画、ならびにその発現遺伝子情報の解析」のアプローチが暗礁に乗り上げている。1,8-ANSで前処理した5日幼生は、蛍光顕微鏡下において紫外光で胃領域のみが発色する。受精後5日目のビピンナリア幼生に1,8-ANS処理を施し、グリシン溶液を用いて個々の細胞にまで解離して、申請者らが所属する慶應大学共同解析室に配備されているセルソータにアプライした。海水に浮遊する生きたままの解離細胞に対して、セルソータは稼働し、予想する割合で蛍光標識された胃細胞がセルソータ内の細いノズルを通過していることは確認された。ここまでは期待どおりの結果であるが、最終的に胃細胞を分離回収した際に、視認できるはずの量の胃細胞を取得できなかった。これは、ノズル通過後の分離過程で、細胞を包括していた海水が、一挙に生理食塩水と混ざり合い、海産生動物の細胞の背景となる液の浸透圧が減少し、目的の胃細胞は膨潤して構造が脆弱になり、遠心操作で破砕され、発現遺伝子の採取に必要なRNAが上清中に四散してしまった推測される。今後、胃細胞を健常な状態で集めることに関して、ハードルを乗り越える必要が認められる。摂餌による成長における神経細胞の関与については、神経細胞に特異的に発現する遺伝子に着目して、その遺伝子の単離を進め、部分配列は取得できている。今後、遺伝子単離を完遂し、全長の配列情報を取得した後、モルフォリノオリゴをデザインして、神経細胞の機能阻害を解析する。全長の塩基情報が取得できない場合には、部分情報からモルフォリノオリゴをデザインせざるを得ないが、当遺伝子の抗体を持っているため、原因と結果に整合性を得る実験を成立させ得ると考えられる。
悪性骨軟部腫瘍肺転移成立における骨髄由来細胞によるニッチの形成とその役割

LM8マウス骨肉腫モデルを用い、初期肺転移巣形成に重要な働きを担うNF-κB活性化に関わる新規ユビキチンリガーゼLUBACの機能解析を行った。本リガーゼは高肺転移株LM8では親株に比べ、その発現が亢進し、機能抑制にて細胞増殖・運動能・マトリックス分解能が有意に抑制され肺転移は有意に抑制された。LUBACを抑制した場合、尾静注後のLM8は肺血管床への接着が抑制されておりこの作用は細胞接着に関与するICAM-1を介していた。我々が樹立したマウス骨肉腫高肺転移株LM8を用いたin vitro解析を中心に研究計画をスタートした。すでに肺転移成立過程に核内因子kB(NF-kB)が重要な働きをすることを明らかにしていたが、肺・肝・腎・脾臓の各器官培養上清によるLM8におけるNF-kB活性の変化を検討したところ、肺の培養上清で有意に活性促進が認められた。またII型肺胞上皮細胞、肺胞マクロファージの各細胞株培養上清でも活性促進効果がみられ、これに呼応して血管内皮細胞増殖因子(VEGF),マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)など転移関連遺伝子の発現が亢進していたことから、骨肉腫細胞は宿主肺細胞が形成する微小環境(ニッチ)からNF-kB促進作用を介して転移の臓器特異性を獲得していることが示唆された。マクロファージはNF-kBの活性促進作用を持つ腫瘍壊死因子(TNF-a),オステオポンチンを多量に産生しこれらに対する中和抗体にてNF-kB活性は抑制されたことから、とくに肺胞マクロファージがLM8肺転移形成に重要であることが明らかとなった。これら肺微小環境のin vitro解析に加え、ヒト骨軟部腫瘍患者からの血中骨髄由来細胞検出のため、本年度倫理委員会申請を行ない平成21年1月26日臨床研究の承認を得た(大阪大学承認番号08189)。また系統の異なるLM8細胞(C3H系)を用いたin vivo解析に供するためGFPマウス(C57BL系)のバッククロスを開始するため、遺伝子組換え実験申請や動物実験申請をおこないいずれも今年度承認を得ることができた。前年度肺胞マクロファージ細胞株の培養上清がLM8マウス骨肉腫細胞株のNF-kB活性を促進する知見を得たことから、in vivoにおいてアレンドロネート含有リポソームをエアロゾル化して吸入させ肺胞マクロファージ数を特異的に減少させる系を確立してLM8肺転移抑制実験を試みた。しかし肺胞内に比較して肺間質に存在するマクロファージを十分に減少させることができないため、肺転移成立初期における本宿主細胞の重要性を示すには至らなかった。現時点では肺間質内のマクロファージを機能的に抑制する系を確立するのは困難と考え、本年度は肺に到達した骨肉腫細胞におけるNF-kB活性化を分子レベルで解析するため、NF-kBの古典的活性化経路の一つとして近年明らかにされたLUBACユビキチンリガーゼの関与を中心に解析を行なった。LUBACはHOIL-1LとHOIPからなり、これらの蛋白発現がNF-kB活性と同様にLM8においてその親株Dunnに比して亢進していることをまず明らかにした。またHOIPをノックダウンするとin vitroにおける細胞増殖に有意な差は認めなかったが、NF-kB活性の抑制とともにIkB、MMP-9発現の抑制が観察された。10^6個の細胞を皮下に移植するモデルでは移植腫瘍の体積には有意差はなかったが、肺転移数は有意に抑制された。LUBACユビキチンリガーゼは、腫瘍の転移形成を含めた臨床的意義は未だ明らかにされておらず、本年度はこれらの新しい知見を得ることがより重要と考え、この点を重点的に研究を実施した。骨肉腫肺転移成立に直鎖状ポリユビキチン鎖を生成してNF-kB活性化を行なうLUBACが関与しているものと考え解析を進めている。昨年度の研究実績を踏まえNF-kBの活性化を行なう新規ユビキチンリガーゼのマウス肺転移モデルにおける役割をさらに解析した。このリガーゼの機能を抑制する実験では肺転移が有意に抑制されていたが、尾静注後の細胞を生体イメージングにて観察したところ、肺組織に捕捉された腫瘍細胞は本リガーゼの抑制がかかった状態では、肺微小血管にとどまることはできないことが明らかとなった。またNF-kBの活性化により高発現し、細胞接着に関与するICAM-1の機能を抑制するとやはり肺転移は有意に減少した。さらにユギキチンリガーゼ機能抑制後にICAM-1を強発現させたところ、肺転移能は回復することが明らかとなった。

これらの結果から、骨肉腫肺転移においてはNF-kBの活性化が起こり、ICAM-1の発現を介して肺微小血管への接着性が高まり初期転移巣が形成され、さらには増殖や細胞運動能、細胞間マトリックスの分解亢進を伴って、転移巣が完成するものと考えられた。またNF-kBの抗アポトーシス作用に着目し、NF-kBの阻害剤パルテノライドによる放射線感受性増強試験を実施した。NF-kBが抑制されたマウス骨肉腫細胞では、放射線感受性の増強が確認され、背部皮下移植モデルでは生存も有意に延長した。本プロジェクトでは、当初計画したニッチの解析から初期肺転移巣におけるNF-kBの重要性を見出し、従来、蛋白の分解シグナルとして知られてきたユビキチンリガーゼが疾患と関連するシグナル伝達に直接関わっていることを初めて明らかにした。本リガーゼ特異的阻害剤の開発が行われており、治療への応用のための基礎的データとなった。
花崗岩中に残された地殻溶融反応と岩体の熱履歴の解析

花崗岩マグマは一般に粘性度が高く,マグマ形成時の情報を残している可能性がある.そこで,いくつかの花崗岩体に焦点を絞り,産状,鉱物組み合わせ,鉱物組織,鉱物化学組成,岩石化学組成および同位体組成を中心にデータの取りまとめを行い,花崗岩体中に残された部分溶融過程の解析を実施した.研究対象とした試料は主に中部ベトナムに産するコンツム地塊の花崗岩体,北海度日高変成帯の花崗岩体および北部九州の変成岩類である.さらに,Sm-Ndザクロ石年代測定を東南極ナピア岩体に適応した.ベトナムコンツム地塊の花崗岩は,泥質グラニュライトの部分溶融によって生じたと予想される.花崗岩中には2種類の異なる産状を示すザクロ石が含まれる.組織と化学組成の検討からこのザクロ石は泥室岩の部分溶融時に形成されたものと,花崗岩マグマから晶出したものであることがわかった.さらに,これらのNdモデル年代を算出したところ,マントルから分離した起源物質の形成年代は中期原生代であることも明らかとなった.また,これまで報告されている年代値からみて,コンツム地塊のグラニュライト帯は下部地殻から断熱的に急上昇した熱履歴をもち,その冷却史は地殻上昇後急冷したものと推察される.このような冷却史は,地殻の上昇速度の極めて早い大陸-大陸の衝突による地質事変によって可能となる.日高変成帯では,変成帯の上昇期にマントル起源のマグマが貫入することで,既存の岩石が再溶融し,花崗岩体を形成した.この際の溶融過程が火成岩中の捕獲岩に記録されている.また,北部九州の変成岩類は,泥質岩の部分溶融によって生じた花崗岩と溶け残り岩および起源となった泥質変成岩が分布する.これらの同位体組成から,泥質変成岩が部分溶融を起こした時期は,ペルム紀後期であった可能性が示された.東南極ナピア岩体は太古代の地質体として知られている.この岩体の超高温変成岩類からSm-Ndザクロ石年代の算出を試み,これまで報告されていなかった前期原生代の地質事変の抽出に成功した.花崗岩マグマは一般に粘性度が高く,マグマ形成時の情報を残している可能性がある.そこで,いくつかの花崗岩体に焦点を絞り,産状,鉱物組み合わせ,鉱物組織,鉱物化学組成,岩石化学組成および同位体組成を中心にデータの取りまとめを行い,花崗岩体中に残された部分溶融過程の解析を実施した.研究対象とした試料は主に中部ベトナムに産するコンツム地塊の花崗岩体,北海度日高変成帯の花崗岩体および北部九州の変成岩類である.さらに,Sm-Ndザクロ石年代測定を東南極ナピア岩体に適応した.ベトナムコンツム地塊の花崗岩は,泥質グラニュライトの部分溶融によって生じたと予想される.花崗岩中には2種類の異なる産状を示すザクロ石が含まれる.組織と化学組成の検討からこのザクロ石は泥室岩の部分溶融時に形成されたものと,花崗岩マグマから晶出したものであることがわかった.さらに,これらのNdモデル年代を算出したところ,マントルから分離した起源物質の形成年代は中期原生代であることも明らかとなった.また,これまで報告されている年代値からみて,コンツム地塊のグラニュライト帯は下部地殻から断熱的に急上昇した熱履歴をもち,その冷却史は地殻上昇後急冷したものと推察される.このような冷却史は,地殻の上昇速度の極めて早い大陸-大陸の衝突による地質事変によって可能となる.日高変成帯では,変成帯の上昇期にマントル起源のマグマが貫入することで,既存の岩石が再溶融し,花崗岩体を形成した.この際の溶融過程が火成岩中の捕獲岩に記録されている.また,北部九州の変成岩類は,泥質岩の部分溶融によって生じた花崗岩と溶け残り岩および起源となった泥質変成岩が分布する.これらの同位体組成から,泥質変成岩が部分溶融を起こした時期は,ペルム紀後期であった可能性が示された.東南極ナピア岩体は太古代の地質体として知られている.この岩体の超高温変成岩類からSm-Ndザクロ石年代の算出を試み,これまで報告されていなかった前期原生代の地質事変の抽出に成功した.今年度は,2カ年計画の初年度に当たる.そこで,解析するために条件のよい花崗岩体に焦点を絞り,産状,鉱物組み合わせ,鉱物組織,鉱物化学組成および岩石化学組成を中心にデータの収集を行ってきた.また,年代測定に用いる岩石・鉱物試料から,Sm, Ndを抽出するラインを山口大学のクリーン実験室において組み上げた.そして,花崗岩と成因的に関連のある変成岩の同位体比の測定を行った.研究対象とした試料は主に中部ベトナムに産するコンツム地塊の花崗岩体である.ベトナムコンツム地塊の試料は,グラニュライト帯の泥質変成岩中にレンズまたはストック状に産する.また,一部,ミグマタイト状の岩相を示す.このような産状から,花崗岩マグマの成因は泥質グラニュライトの部分溶融によって生じたと予想される.

花崗岩中には2種類の異なる産状を示すザクロ石が含まれる.組織と化学組成の検討からこのザクロ石は泥室岩の部分溶融時に形成されたものと,花崗岩マグマから晶出したものであることがわかった.また,部分溶融時に形成されたザクロ石にはフッ素に富む黒雲母が包有されることから,花崗岩マグマの形成には黒雲母の分解溶融反応が関与した可能性が示された.泥質グラニュライトと花崗岩の同位体比組成を検討した結果,上記の説を支持することが明らかになった.さらに,これらのNdモデル年代を算出したところ,マントルから分離した起源物質の形成年代は中期原生代であることも明らかとなった.同様のモデル年代は中部ベトナムの各地から報告されている.このことは,ベトナムの基盤地質であるインドチャイナクラトンの形成年代はこれまで述べられてきたような太古代に形成されたものではなく,大部分は原生代地殻であることを意味する.また,これまで報告されている年代値からみて,コンツム地塊のグラニュライト帯は下部地殻から断熱的に急上昇した熱履歴をもち,その冷却史は地殻上昇後急冷したものと推察される.このような冷却史は,地殻の上昇速度の極めて早い大陸-大陸の衝突による地質事変によって可能となる.今年度は,2カ年計画の最終年度に当たる,そこで,前年度に解析した花崗岩体に焦点を絞り,産状,鉱物組み合わせ,鉱物組織,鉱物化学組成,岩石化学組成および同位体組成を中心にデータの取りまとめを行った.また,上述した岩体とそれに関連した変成岩類の形成年代の算出を試みた.研究対象とした試料は主に中部ベトナムに産するコンツム地塊の花崗岩体,北海度日高変成帯の花崗岩体および北部九州の変成岩類である.ベトナムコンツム地塊の試料は,グラニュライト帯の泥質変成岩中にレンズまたはストック状に産する.また,一部,ミグマタイト状の岩相を示す.このような産状から,花崗岩マグマの成因は泥質グラニュライトの部分溶融によって生じたと予想される.花崗岩中には2種類の異なる産状を示すザクロ石が含まれる.組織と化学組成の検討からこのザクロ石は泥室岩の部分溶融時に形成されたものと,花崗岩マグマから晶出したものであることがわかった.また,部分溶融時に形成されたザクロ石にはフッ素に富む黒雲母が包有されることから,花崗岩マグマの形成には黒雲母の分解溶融反応が関与した可能性が示された.泥質グラニュライトと花崗岩の同位体比組成を検討した結果,上記の説を支持することが明らかになった.さらに,これらのNdモデル年代を算出したところ,マントルから分離した起源物質の形成年代は中期原生代であることも明らかとなった.また,これまで報告されている年代値からみて,コンツム地塊のグラニュライト帯は下部地殻から断熱的に急上昇した熱履歴をもち,その冷却史は地殻上昇後急冷したものと推察される.このような冷却史は,地殻の上昇速度の極めて早い大陸-大陸の衝突による地質事変によって可能となる.日高変成帯では,変成帯の上昇期にマントル起源のマグマが貫入することで,既存の岩石が再溶融し,花崗岩体を形成した.この際の溶融過程が火成岩中の捕獲岩に記録されている.また,北部九州の変成岩類は,泥質岩の部分溶融によって生じた花崗岩と溶け残り岩および起源となった泥質変成岩が分布する.これらの同位体組成から,泥質変成岩が部分溶融を起こした時期は,ペルム紀後期であった可能性が示された.
成人間インタラクションの認知科学的分析とモデル化

以下の3つの研究を実施した。【研究1】コミュニケーション場の成立に関わる他者の情動状態推定に関する研究:相手に対する情動的な内部状態に基づく主体感の距離と位置関係の動的な変化を伴う原初的なインタラクションに注目し、シンボリックな情報を排除した環境で観察された人同士のインタラクションの状態(互恵的状態,接触忌避的状態など)の推移を、2つの変数(他者に対して自ら作用する態度、他者の作用を受け入れる態度)をもつ認知モデルにより説明した。その結果、インタラクション開始時における自他間の内的状態に基づく空間的接近行動のモデル化と、インタラクションの各行動からの他者の内的状態の推定可能性を示した。【研究2】コミュニケーションを通した他者の価値選好推定に関する研究【研究2-1】対面販売状況における顧客の意図推定を可能にする他者モデルの分析:昨年度に引き続き、旅行代理店の店員が顧客の要望を聞き出してプランを提案する際の対話とその際に表出される行動や非言語情報を分析した。特に、対話中に観察された言語・非言語情報により定義されるインタラクション状態の時間的な推移をHidden Markov Modelにより分析することで、上手くいった対話といかなかった対話の違いを検討し、インタラクションの成否に与える言語・非言語情報の時間的な推移の影響を明らかにした。【研究2-2】非母語コミュニケーションを対象とした訛りに起因するミス・コミュニケーションの分析と訛りに対する選好度の自動計測:非母語コミュニケーションを対象とし、1)母語聴取者のシャドーイング音声の崩れに対する音響分析と深層学習ベースの音声認識技術を使って訛りを定量化し、2)顔の表情筋の動きを4チャンネル計測するなどシャドワーの挙動を多角的な観点からセンシングし、訛りに起因する主観的な「聴き取りにくさ」を客観的に予測した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では,非言語情報を利用した他者の内部状態推定の動的な過程の分析を通して,他者の内部状態推定を行う際に人が利用している認知モデル,すなわち他者モデルの解明を行う.特に,特に成人同士および成人と人工物の間のインタラクションを対象にする.本年度は以下の通り研究を実施した.【研究1】相手に対する情動的な内部状態に基づく主体間の距離と位置関係の動的な変化を伴う原初的なインタラクションに注目し,各主体のコミュニケーション場の成立欲求を推定するための認知モデルを構築する.そのための,インタラクションの主体の視覚的情報(アピアランス),言語やジェスチャー,ポスチャーなどのシンボリックな情報を排除し,可能な限りミニマムなインタラクションを行える実験環境を構築し,データの計測・分析方法を確立した.【研究2】【研究2-1】旅行代理店の店員が客の要望を聞き出してプランを提案する際の対話を分析し,客の潜在的な欲求や意図の推定を可能にしている店員側の他者モデルを解明する.このようなデータ取得が可能な環境(店員と客役がテーブルを挟んで向かい合って座り,両者の姿勢と顔方向計測ならびに韻律計測が可能な環境)およびそのための計測ツールを構築し,簡単な予備実験を行った.また,実際の店員と客の対話を分析対象とするためにいくつかの旅行代理店と交渉し,共同研究相手となる代理店を決定した.【研究2-2】1.日本人と遭遇したことがない米国人150名を対象にした大規模な日本人英語書き取り実験結果を用いて,どのような発音をすると聞き取ってもらえないのかについて分析し,2.日本人が英語を読み上げる(話す)場合に,どの部分が聞き取り難くなってしまうのかを自動予測する技術を開発した.以下の3つの研究を実施した.【研究1】コミュニケーション場の成立に関わる他者の情動状態推定に関する研究:関係性が構築されていない2者が他者を互いに有意味な存在として認知し合うのに必要なインタラクション過程を明らかにするための実験を実施した.その結果,コミュニケーション欲求が高い人物では,相手の振る舞いに対して同期的に行動することで,自分がコミュニケーション可能な存在であることを意図的に表示しているのに対して,低い人物では,追従的に行動することで,相手が自分に関心を有しているのかどうかを検証している可能性が示唆された.【研究2】コミュニケーションを通した他者の価値選好推定に関する研究【研究2-1】対面販売状況における顧客の意図推定を可能にする他者モデルの分析:旅行代理店の顧客が店員に対面で旅行相談を行うというできるだけ現実場面に近い状況での実験を実施し,顧客の表出するどのような非言語情報からその顧客の潜在的な欲求を推定できるのかを分析した.具体的には,顧客の非言語行動と旅行プランに対する顧客の選好との関係を回帰分析により調べた.その結果,顧客の体勢と視線という二つの非言語行動から選好が最もよく推定できる可能性が示された.【研究2-2】非母語コミュニケーションを対象とした訛りに起因するミス・コミュニケーションの分析と訛りに対する選好度の自動計測:聞き取りやすい日本語を話すための韻律指導法に基づき,任意の日本語文を共通語として読み上げる場合に必要な韻律制御を分かり易く可視化し,合成音声を提供するシステムを構築した.システム利用による発声の自然性向上を,80名の中国人学習者を対象に実験的に確認した.また,世界各地で様々な訛りと共に使われている世界諸英語の話者を単位としたクラスタリングを目標に,雑音耐性の向上と予測すべき対象となる参照発音距離の計算方法の精度向上を実現した.研究項目

1,2-1,2-2のいずれにおいても,当初予定していた実験を順調に実施し,分析も進んでいる.研究成果の発表も順調に行われている.そのため,上記のように判断した.以下の3つを実施した.【研究1】コミュニケーション場の成立に関わる他者の情動状態推定:別室にいて目視できない人の位置を同室にいるロボットの位置に対応させた実験環境を2部屋用意し,一方の部屋の参加者が別の部屋の参加者とロボットを介してインタラクションを行う過程を観察した.その結果,ロボットが記録された動きだけを行っている場合と比べて,ロボットが逃げて参加者が追いかけるという関係性が生じやすく,参加者とロボットの間で「追うー逃げる」の役割交代が生じる場合が観察された.これは,インタラクションにおける随伴性が関係性の構築に影響することを示唆する.【研究2】コミュニケーションを通した他者の価値選好推定【研究2-1】対面販売状況における顧客の意図推定を可能にする他者モデルの分析:旅行代理店の顧客が販売員に対面で旅行相談を行うという実場面に近い状況での実験を実施し,顧客の表出するどのような非言語情報からその顧客の潜在的な欲求を推定できるのか分析した.特に,販売員のランク(キャリアと実績)の高低による違いを分析した結果,高ランク販売員のほうが顧客の魅力度を適切に予測できており,かつ魅力度を予測する手がかりとなる顧客の非言語情報をより高い頻度で表出させていることがわかった.【研究2-2】非母語コミュニケーションを対象とした訛りに起因するミス・コミュニケーションの分析と訛りに対する選好度の自動計測:外国語を話してインタラクションする場合,外国語訛りに起因するコミュニケーションエラーが頻発する.本研究では先行研究にて構築した,日本語学習者が日本人にとって聞き取り易い発声を学ぶ教育インフラを拡張し,諸外国での講習会を通して世界的普及を行ない,80名の中国人学習者を対象にその効果を実験的に検証した.また,聞き取り難い音声を聞いた時の嫌悪感・選好度を,簡易脳波計等を通して計測する予備実験を行なった.研究項目1,2-1,2-2のいずれにおいても,当初予定していた実験を順調に実施し,分析も進んでいる.研究成果の発表も順調に行われている.そのため,上記のように判断した.以下の3つの研究を実施した.【研究1】コミュニケーション場の成立に関わる他者の情動状態推定に関する研究:相手に対する情動的な内部状態に基づく主体感の距離と位置関係の動的な変化を伴う原初的なインタラクションに注目し,各個体のコミュニケーション場の成立欲求を推定するための認知モデルのプロトタイプを構築した.具体的には,コミュニケーション開始場面における内部状態(2変数)と身体配置・向きを対応付ける効用関数を定義し,実験により得られた人の行動変化をその効用値の変化により説明できることを示した.【研究2】コミュニケーションを通した他者の価値選好推定に関する研究【研究2-1】対面販売状況における顧客の意図推定を可能にする他者モデルの分析:旅行代理店の店員が顧客の要望を聞き出して旅行プランを提案する際の対話を分析し,提案したプランに顧客が感じた魅力度を店員が予測可能なことを示した.特に経歴の長い店員ほどそのような予測を正確に行えることを明らかにした.
葉老化制御によるイネ収量性の遺伝的制御と分子メカニズム

本課題では老化誘導時も葉の緑色が保たれるイネstay-green突然変異体nyc3、nyc4、fsg1の原因遺伝子のマップベースクローニング法による単離を試みた。その結果、NYC3は新奇のα/βhydrolase-foldfamily proteinをコードしており、クロロフィル代謝に関わる酵素であると考えられることがわかった。またNYC4はシロイヌナズナTHYLAKOID FORMATION1に対応する遺伝子をコードしており、光化学系IIの分解に重要な役割を果たしていることが明らかになった。またFSG1に関しては200kbまで候補領域を狭めることに成功したが、遺伝子単離には至らなかった。登熟期の葉老化抑制はソース増大に繋がることでイネ収量性の向上に結びつくと考えられる。一方、葉老化は窒素源の転流に重要であることから、光合成産物を生産した後は速やかに老化が進むことが求められる。本研究は葉老化遅延(stay-green)突然変異の責任遺伝子の単離・機能解析等により葉の老化メカニズム解析およびその制御を目指すものである。本年度はイネstay-green突然変異体のうちのひとつ、dsn1のマッピングを行った。京都大学より分譲を受けたMITEが爆発的に転移しているジャポニカ品種銀坊主とのF2、100個体を圃場にて栽培した。秋の収穫期に葉の老化遅延が見られる系統を23個体選抜し、銀坊主-日本晴間で使用可能なSCARマーカーを利用しマッピングを試みた。その結果、第7染色体上にマッピングされることが明らかになった。さらに高精度マッピングを行うため、第7染色体がカサラースに置き換えられているコシヒカリ-カサラースの染色体部分置換系統との交配を行っている。また他のstay-green突然変異体nyc4についても解析を進めている。Nyc4突然変異体自体は正常な稔性を示すのに対し、カサラースとのF2の稔性が低いことから、この突然変異体は相互転座を起こしている可能性を考えた。コースマッピングにより第3染色体と第7染色体の2カ所に原因遺伝子がマッピングされたことはこの推察に合致する。相互転座による突然変異体の原因遺伝子の単離を高精度マッピングにより単離することは困難であることが考えられるので、発現解析等による候補遺伝子の同定を試みている。本年度はイネstay-green突然変異体のうちのひとつ、dsn2のマッピングを行った。京都大学より分譲を受けたジャポニカ品種銀坊主とのF2、50個体を圃場にて栽培した。秋の収穫期に葉の老化遅延が見られる系統を9個体選抜し、銀坊主-日本晴間で使用可能なSCARマーカーを利用しマッピングを試みた。その結果、第8染色体上にマッピングされることが明らかになった。さらに高精度マッピングを行うため、第8染色体がカサラースに置き換えられているコシヒカリ-カサラースの染色体部分置換系統との交配を行っている。nyc4突然変異体は第3染色体と第7染色体との間で相互転座を起こしている可能性を考えている。種子稔性の低さなどから相互転座による突然変異体の原因遺伝子の単離を高精度マッピングにより単離することは困難である可能性を考え、マイクロアレイによる発現解析により候補遺伝子の同定を試みたところ、第7染色体上にnyc4において極めて発現量が低下している遺伝子を同定した。これを候補遺伝子と考え、解析を進めている。コースマッピングによる解析の結果、ステイグリーン突然変異体nyc4の原因遺伝子は第3染色体と第7染色体にマップされることが分かった。このことは両方の領域が突然変異体型ホモであることがステイグリーン表現型に必要であることを示す。加えて野生型とnyc4のF1が稔性が低いことから、nyc4は相互転座により引き起こされたと考えた。nyc4の葉を用いてマイクロアレイを試みたところ、第7染色体上に極めて発現が低下している遺伝子を見出した。この遺伝子の周辺配列をInverse PCRにより増幅し、塩基配列を検討したところ、nyc4ではこの遺伝子が第3染色体上の遺伝子と融合していることが分かった。このことから、nyc4ではこの遺伝子と第3染色体上の遺伝子の間で相互転座を起こし、両遺伝子の機能が喪失していると推察された。イネ品種日本晴由来のステイグリーン突然変異fsg1は、日本型品種銀坊主とのF2交雑集団を用いたコース

マッピングにより、第7染色体上にマップされることが明らかになっている。昨年度までに第7染色体が日本型に置き換わったKasalath/コシヒカリ染色体部分置換系統とfsg1の交配系統F2系統を作成し、本年度はそれらの集団を用いて高精度マッピングを開始した。しかしこの形質は出穂期の影響を受けるため、高精度マッピングには出穂期が揃った集団を用いることが必要と判断し、F2個体のうち、第7染色体がヘテロになっている系統からF3種子を採種した。本格的な高精度マッピングは平成24年度にこの集団を用いて行うこととしたイネ品種日本晴由来のステイグリーン突然変異fsg1は、第7染色体上にマッピングされることが明らかになっている。この形質は出穂期の影響を受けるため、本年度は第7染色体がインディカ型に置き換わったKasalath/コシヒカリ染色体部分置換系統とfsg1の交配系統の交雑後代のうち、出穂期の比較的そろった分離集団を用いて高精度マッピングを行った。約2000系統を圃場に展開し、秋の収穫時の葉色の観察により、突然変異ホモと思われる系統を選抜した。新たに開発した種々のDNAマーカーを用いて検定することで最終的に約200kbに候補領域を絞ることが出来た。この領域には既知のステイグリーン関連遺伝子は存在しなかったことから、fsg1はシロイヌナズナを含めて新規のステイグリーン遺伝子と考えられた。また、イネにおいて収量性の重要な要因であるシンクサイズが大きいモミロマンとの戻し交雑も進めたが、原因遺伝子が単離できていないことから、交雑後、後代においてステイグリーン形質が出る個体を確認する作業が必要であり、シンクサイズが十分大きいステイグリーン系統を得るには至らなかった。形質転換による相補性試験によりステイグリーン突然変異体nyc4の原因遺伝子はシロイヌナズナTHF1のオーソログであることが証明された。NYC4は健常葉での発現が高いが、暗黒処理により一旦発現が低下し、老化進行とともに発現量が上昇することが分かった。NYC4は強光ストレス回避にも機能していることも明らかになったが、このことはその知見に符合する。高精度マッピングについては高い精度での表現型判定が必要である。そのために、一部計画を来年度に行うこととしたが、それ以外はおおむね順調に推移しており、ステイグリーン突然変異体のひとつに関しては原因遺伝子の単離もほぼ成功した。24年度が最終年度であるため、記入しない。nyc4に関しては相補性検定などを進め、原因遺伝子の確定をするとともに遺伝子機能解析を進める。fsg1に関しては出穂期が斉一化した分離集団を用いて高精度マッピングを行う。