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宗教教育における情報リテラシーの日韓比較

宗教系の学校において、急速に進行する情報化の中で宗教教育を行っていく場合の教師の側の教材開発の困難さについて具体的に調べた。学校を経営する宗教団体側も、情報時代への対応が真剣に検討されていないのが一般的であることが分かった。日韓の学生に対するアンケート調査によって、情報リテラシーはかなり不十分で、メディアが発する宗教情報を無批判に受け入れる割合が無視できないほどであることが分かった宗教系の学校において、急速に進行する情報化の中で宗教教育を行っていく場合の教師の側の教材開発の困難さについて具体的に調べた。日韓の学生に対するアンケート調査によって、情報リテラシーはかなり不十分で、メディアが発する宗教情報を無批判に受け入れる割合が無視できないほどであることが分かった平成19年度は、日韓の学生に対するアンケート調査を実施した。日本の大学においては、35の大学から4,306名の有効回答を得ることができた。また韓国においては12の大学から1,385名の有効回答を得ることができた。回答結果はすべてデジタル化して入力し、日韓の比較を行ないながら、分析した。宗教教育に関する質問では、いのちの教育や宗教文化教育について、肯定的な意見が多かった。「いのちの大切さを教える授業を充実させた方がいい」という問いに対しては、日本では49.1%が「そう思う」、35.9%が「どちらかえいえばそう思う」と回答した。また「高校までに世界の宗教文化教育についての基礎的な知識を学んだ方がいい」という問いには、46.7%が「そう思う」、36.4%が「どちらかえいえばそう思う」と答えた。同じ質問に韓国では前者の問いがそれぞれ67.0%、23.6%、後者の問いが46.1%、28.5%であった。宗教情報リテラシーに関わる質問として、日本の学生に対しては、いわゆる霊能番組、あるいは占い番組に対する意識を質問したが、「オーラの泉」のような番組をやらせと思うかどうかという問いには、27,0%が「ほとんどやらせである」、53.1%がrときにやらせがある」、そして17.3%が「やらせはない」と回答した。多くがやらせの要素を感じているが、10数%はやらせではないと思ってみているということが分かった。宗教系の学校調査は、仏教系の高校において実施したが、教師の多くはネット上の宗教情報をどう生徒に説明するかについて、まだ体系だった教育法を見出すのが困難であるという現状が分かった。学校を経営している宗教団体のウェブ情報について調査したが、教育面での効果や利用を想定して作成されたサイトは、現時点ではほとんど見当たらないことが確認された。1.宗教系の学校における宗教教育の実態調査:札幌市及び函館市において、キリスト教系及び仏教系の高校における宗教教育で、情報リテラシーがどのように考慮されているかを教師への面談調査、参与観察を行い、現状を知ることができた。教員の側における意識は高まっているものの、それを中等教育においてどのように実践していくかについて、とくに教材の面で苦慮していることが明らかとなった。2.宗教系学校をもつ、宗教・宗派におけるウェブ情報に関する基本的方針についての調査:新宗教教団のうち、大本及び多くの学校を有する天理教について本部での面談調査を実施した。キリスト教系、仏教系、神道系の団体については、主にウェブ情報によって、自分たちの宗教・宗派に関する教育への考慮がどうなされているかを分析した。いずれにもおいても、系統だった教団からの学校教育への対応が十分なされていないことが明らかになった。3.19年度に実施したアンケート調査の分析:19年度には、日本の学生4,306名、また韓国の学生1,385名を対象にアンケート調査を実施したが、20年度にこの結果についての詳細な分析を行い、その一部は論文として成果を発表した。インターネットによって宗教情報に接する割合は日韓とも23%と低いが、日本では霊能者番組での霊の話を信じる割合は15%近くにのぼった。4.研究会議:平成20年11月2日に研究フォーラム「<宗教情報>とメディアリテラシー」を國學院大學で共催し、本研究代表者・分担者・連携研究者計4名が議論に加わった。平成21年2月7日には日韓国際研究会議「東アジア新宗教研究と情報リテラシー」を國學院大學で共催し、研究代表者、及び連携研究者1名が研究成果発表を行った。これらの会議により、宗教情報リテラシーに関する基本的問題点が示され、また日韓両国がきわめて類似した課題を共有していることが確認された。
癌幹細胞を制御する転写因子Ｂｒａｃｈｙｕｒｙを標的とした口腔癌分化誘導療法の開発

本研究では培養ヒト腺様嚢胞癌細胞株ACCSに緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を導入したACCS GFPより高転移性で癌幹細胞形質を示すACCS-M GFPを分離した。さらに、ACCS-M GFPの癌幹細胞形質の制御にT-box転写因子BrachyuryおよびSOX2が関与しており、特にBrachyuryはSOX2の発現も制御する癌幹細胞の制御因子であることを明らかにした。Brachyuryをノックダウンする事により、1癌幹細胞の浸潤抑制、2抗癌剤および放射線に対する耐性減弱、3造腫瘍性・転移能の抑制が可能であることが示唆された。癌幹細胞は、放射線治療や化学療法に耐性を示し、転移再発の原因となると考えられている。これまでの研究から、癌幹細胞の維持・制御に中心的に関わる転写因子Brachyuryを世界に先駆けて見出した。本研究では治療への展開の為に(1)Brachyuryを用いた口腔がん幹細胞を治療標的とする新しい治療概念を確立する(2)癌選択的なBrachyuryノックダウンの治療法を確立する。ことを目的としている。本年度は目的(1)を展開するために1.口腔癌組織におけるBrachyury発現と予後との相関の検討2.癌幹細胞の放射線および化学療法耐性のBrachyuryノックダウンによる克服について検討を行った。1.口腔癌組織におけるBrachyury発現と予後との相関の検討扁平上皮癌(SCC)152例の未治療生検組織におけるBrachyury、E-cadherin、Vimentinの発現様式を免疫組織化学的に検索した。Brachyury発現と関連を認めたものは、腫瘍の大きさ(T分類)、リンパ節転移、腫瘍の分化度、腫瘍の浸潤様式(いずれもp<0.05)であった。単変量解析において、リンパ節転移はすべての分子と相関し、特にBrachyury発現(p=0.001,オッズ比4.390)と最も強く相関していた。5年生存率、無病生存率はBrachyuryの発現と強い相関が認められた。2.癌幹細胞の放射線および化学療法耐性のBrachyuryノックダウンによる克服癌幹細胞様細胞ACCS-M GFPを用いて、癌幹細胞の化学療法、放射線治療に対する治療抵抗性が明らかになった。Brachyuryをノックダウンする事により、(1)放射線化学療法に対する感受性亢進(2)浸潤能の抑制、造腫瘍性抑制による転移巣形成の阻害を認め、癌幹細胞様細胞を標的とした遺伝子治療法を開発できる可能性が示唆された。さらに、ACCS-M GFPの癌幹細胞形質の制御にT-box転写因子BrachyuryおよびSOX2が関与しており、特にBrachyuryはSOX2の発現も制御する癌幹細胞の制御因子であることを明らかにしている。さらにACCS-M GFPのBrachyuryノックダウンにより以下について検討した。3.造腫瘍性、転移能に与える効果:ヌードマウスを用いた造腫瘍性・転移能実験においてACCS-M GFPと比較してACCS-M Br. sh GFPでは、造腫瘍性50%、転移能0%に減弱した。以上の結果から、Brachyuryをノックダウンする事により、1癌幹細胞の浸潤抑制、2抗癌剤および放射線に対する耐性減弱、3造腫瘍性・転移能の抑制が可能であることが示唆され、癌幹細胞を標的とした遺伝子治療の有用な標的分子となり得ること考えられた。腺様嚢胞癌は、その特徴である著明な浸潤増殖や肺などへの転移により悪性度の高い腫瘍であるが、その浸潤転移機構については不明な点が多い。当教室で樹立した高転移性造腫瘍性腺様嚢胞癌細胞株( ACCS-M GFP )と、その親株である低転移性腺様嚢胞癌細胞株( ACCS GFP )の比較を行うことにより、転移関連分子の同定及び転移機構の解析を行っている。ACCS-M GFPはE-cadherinの消失、Vimentinの発現亢進を特徴とする、上皮間葉移行(EMT)様形質を示しており、腺様嚢胞癌の転移機構におけるEMTの関与が示唆された。ACCS-M GFPの自己複製能および幹細胞マーカーの発現を検討したところ、ACCS-M GFPは親株のACCS-GFPと比較し、スフェア形成能が亢進しており、自己複製能を有することが確認された。さらにACCS-M GFPは、Nodal、Pax6、Rex1、Lefty(胚葉系幹細胞マーカー)、Brachyury、Sox2、AFP(幹細胞分化マーカー)のいずれのマーカーにおいても、親株の23倍の発現を示しており、癌幹細胞様細胞であると考えられた。このことからEMTにおける癌幹細胞の関与が示唆された。

EMTおよび幹細胞制御因子を探るため、T-box転写因子BrachyuryをshRNAによりノックダウンした。すると、ACCS-M GFPにおける全てのEMT関連マーカー及び、未分化マーカーの発現が著明に低下し、EMT形質およびスフェア形成能は消失した。以上より、腺様嚢胞癌の転移過程におけるEMTの関与が示されただけでなく、その現象には癌幹細胞が重要な役割を担っていることが明らかとなった。さらに、T-box転写因子BrachyuryはEMTにおける中心的制御因子であり、幹細胞を標的とする癌治療法の有効な標的分子になり得ることが示唆された。本年度の結果によりBrachyuryを用いた癌治療が可能であることが示唆された。当初の予定では治療概念の確立が本年度の目標であったためほぼ達成と考えてよいと考える。25年度が最終年度であるため、記入しない。本年度の目標として幹細胞の制御因子、つまり治療における標的因子としてBrachyuryが有効であるかを確認することであった。in vitroの実験系であるがこの事実が証明され、また、現在進行中であるがin vivoの系においても証明されつつある。治療への実際の展開について技術的な開発を行う予定である。遺伝子導入について効率のよい、副作用の少ない、選択性のある方法を検討する予定である。逆に癌幹細胞の分離技術については困難が多い。細胞種によって細胞膜表面分子の発現様式が異なる為と考えられる。現状ではin vivo selection法がin vivoとin vitroの両面で再現性の良い細胞集団を得ることが可能な方法であり、今後もこれを用いて検証を進める予定である。現在は癌幹細胞としては一種類しか樹立できていない為、他の癌幹細胞の樹立を目指す予定である。in vivoにおける癌浸潤転移に対するBrachuryノックダウンの有効性、および既存の放射線治療や化学療法に対する抵抗性Brachuryノックダウンの有効性については現在検討中である。さらに既存の腫瘍に対する遺伝子導入方法が課題となる。in vitroにおいてもBrachuryノックダウンの効率が十分ではなかった為、Brachyuryにより二次的に変化をおこし、直接癌幹細胞を制御する因子として現在miRNAに着目しスクリーニングを行っている。Brachyuryの標的miRNAが同定できれば導入や制御の仕方が容易になることが予想される。
戦前・戦時期日本における中東研究の現代的展開―「回教・猶太問題」からの視座

本研究は、戦前・戦時期の日本の戦略研究としての回教・猶太研究を積極的に再評価し、戦後展開した基礎的な地域研究としての中東イスラーム地域研究との継続性に力点を置いて検討した。そのような観点から、当該時期の研究、とりわけ雑誌『猶太研究』に関するデータベースを構築しつつ、戦後のイスラーム研究およびユダヤ研究に関する基礎研究と政策研究のバランスの上に立った、日本から発信できる新たな中東イスラーム地域研究のあるべき方向性を示した。本年度は(1)総括、(2)日本の回教研究、(3)対アフガニスタン関係、(4)対トルコ関係、(5)対エジプト関係、(6)対パレスチナ(ユダヤ)関係の6つの研究グループをベースとした合同研究会を個別に数回開催した。とりわけ(2)のテーマ「日本の回教研究」を中心に据えて、6グループの総括的共同事業の性格をもつ公開講演会「庄内からイスラームを考える」を、第二次世界大戦期を代表するイスラーム(回教)研究者である大川周明の出身地の山形県酒田市において、日本中東学会との共催で2011年11月12日に開催した。同講演会において、本研究プロジェクトの研究代表者の臼杵陽が「大川周明のイスラーム研究」、研究分担者である長沢栄治が「アラブ革命と日本」、同じく分担者の三沢伸生が「内藤智秀とイスラーム」と題する講演を行なった。100人以上の観客が参加したため、庄内地方のもつイスラームとの関係性が明らかとなり、その意味では啓蒙的な意義をもつ社会的還元となった。更にその講演会の模様はDVD2巻にまとめられた。また、大川周明家資料調査および大川塾関係者のインタビュー等に関しては継続して行われ、その成果の一端はDVD「大川周明大川塾塾生の足跡-加藤健四郎さんインタビュー」(ケイエムコンサルティングLLC制作)として刊行された。これは、現在2名の生き残りしかいない大川塾の元塾生が第二次世界大戦中の体験を証言したものであり、史料的価値を有するものである。また、大川周明が理事長を務めていた東亜経済調査局が発行していた『新亜細亜』復刻版の一部が不二出版より刊行され、その刊行に協力するとともに研究代表者の臼杵陽が「解題雑誌『新亜細亜』と大川周明」を寄稿した。(6)対パレスチナ(ユダヤ)関係に関するテーマについては、第二次世界大戦期ドイツにおけるパレスチナ人指導者ハーッジ・アミーン・アル・フサイニーとナチスの関係をめぐる研究および資料収集に着手した。最終年度においては、次の点において特記すべき研究実績があった。1総括班および対パレスチナ(ユダヤ)研究グループとして、イスラーム地域研究東大拠点パレスチナ研究班と密接な連携をとりつつ、2カ月に一度の定期的な研究会を開催した。また、国際ワークショップ「オスロ合意再考ーパレスチナとイスラエルに与えた影響と代理案ー」を2013年10月12日(土)と13日(日)の両日に東京大学東洋文化研究所で開催した。さらに、オスロ合意20年国際ワークショップII「オスロ合意の代案とは何かーパレスチナ/イスラエルをめぐる一国家・二国家論争ー」を10月14日にも開催した。その際、海外からの参加者のうちライラ・ファルサハ氏(マサチューセッツ大学准教授)を本科研によって招聘した。2日本の回教研究に関しては、2014年10月19日に山形県酒田市において開催された大川周明博士顕彰会主催碑前祭に科研分担者が参加して、顕彰会会員および大川塾第二期の終了生である山本哲朗氏および加藤健四郎氏とともに懇話会をもって、意見交換を行った。3データベース化に関しては、パレスチナ民族刺繍のモチーフを実際に250種類にわたって刺繍して、さらにその地域的、歴史的特徴について解説を加えた研究用データベースであるCD-ROM版「パレスチナ刺繍ーモチーフが語る小宇宙」300部を作成し、研究者を含めて関係者に研究用として配布した。また、アジア・太平洋戦争期に刊行されていた雑誌『猶太研究』全巻のスキャン作業を終了し、戦時期日本の猶太研究データベースの一環として近々データベースとして公表する予定である。さらに、エジプト革命関係のアラビア語刊行物330冊のデータベースを作成したが、目下、公開のための準備を鋭意行っている。本年度の研究実績に関しては、研究計画の2年度ということもあり、研究成果の海外へ発信という意図も込めて、英語で中間報告的なまとめを行なったことをまず特筆しておきたい。すなわち、『日本中東学会年報(Annals of Japan Association for Middle East Studies)』第28巻第2号、2013年3月刊、に特集「日本の中東研究における新たな潮流ーその起源を探る(New Trends in Japan's Study of the Middle East: Searching for Roots)」を組んだことである。分担者の加藤博が「序論」で特集の意図を説明し、同じく分担者の三沢伸生と連携研究者の大澤広嗣が「戦前・戦中期における日本人のイスラーム認識ー仏教系日刊新聞『中外日報』掲載イスラーム関係記事(193745年)」という史料紹介を行い、分担者の店田廣文が「戦中期日本における回教研究機関ー

『大日本回教協会寄託資料』の検討」を、さらに研究代表者の臼杵陽が「ある日本人アジア主義者のイスラム観ー大川周明の場合」を寄稿した。また、国際ワークショップ『戦前・戦時期日本における中東研究の現代的展開ー回教・猶太問題」からの視座』を2013年3月17日に熱海の東洋大学の施設において開催した。その際、トルコから招聘したA.Merthan DUNDAR(アンカラ大学准教授)が「日本・トルコ関係史」と題する講演を行うとともに、連携協力者の安藤潤一郎(東海大学)が「日中戦争期の中国大陸における日本の回教工作と回民社会ー華北を中心に」、同じく連携研究者の重親知佐子(兵庫大学)が「戦前日本のイスラームをめぐる思想と政策ー軍部と日本国教大道社を中心に」の報告を行った。山形県酒田市での公開講演会「庄内からイスラームを考える」の開催によって社会的還元がある程度達成された。また大川周明関係の史資料収集・整理・公開も継続して行なわれた。25年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は英語で中間報告的な特集を学術雑誌に掲載することができ、また国際ワークショップを開催できたため。今年度は海外研究協力者であるジェミル・アイディン氏がノースカロライナ大学に移って新たな職場で多忙を極めたために、アメリカ合衆国における東亜経済調査局に関する資料調査が予定より遅れることになった。来年度はこの点を改善して、同氏との関係を緊密にして戦時期日本の回教研究を国際的な環境の中で位置づける努力を行なう。本研究プロジェクトにおける研究テーマの一つである東亜経済調査局旧蔵資料調査についてはまだ十分なめどがついていないので、最終年度はこの点に留意したい。また、『猶太研究』のデータベース化を含めて本研究を推進してゆくとともに、研究成果刊行に向けて準備を進めていきたい。
WWWサーバを利用したリアルタイムアンケート調査システムの開発

本研究の目的は、インターネットを利用したアンケート調査が簡便に行えるようにするためのシステムを開発することである。具体的には、アンケートの様々な回答条件の設定に対応した調査フォームをHTML(Hyper Text Markup Language)文書として作成することができ、入力された回答データをリアルタイムにサーバ上に蓄積し、指定の形式で情報を取り出すことができる調査システムの開発を支援するシステムを開発することである。これにより、目的に応じた調査形式のアンケート調査が、インターネットを通して行えるようになり、調査における距離と時間と費用の問題を大幅に軽減できることになる。本研究では具体的に次のように研究を進めた。1.標準化案の決定データ形式、ファイル形式、文字種、回答方式、入力方式、データ格納形式、データ回収方法等について、現状のインターネット利用環境とサーバ側の処理システムを考慮し、できるだけ標準的な形式を定める。様々な分野で行われる調査に対応した設問及び回答データが取り扱えるように標準化案を決定した。2.システム仕様の決定標準化案を満たすシステムの仕様を決定する。その際、インターネット・ブラウザで表示できる言語仕様であるHTMLの文法規則に合わせ、より多くのブラウザに対応できるものとした。3.システムの開発パソコンの機種やオペレーティングシステムが異なっても、インターネット・ブラウザが利用できる環境ならば、だれもが回答できる画面を作り出すシステムを開発した。また、回答データは自動的にサーバに蓄積されるようにするとともに、過去のデータを参照して入力が可能となるようにした。4.調査の試験的試行平成10年度の国立教育研究所情報調査においてモニター試験を行った。5.システムの開発・改良前年度開発したシステムについた不具合な点を改良した。具体的には、サーバ上で管理する回答データファイルのバックアップ方法をより短時間で完了する方式に変更した。また、Netscapeブラウザによる入力が可能となるようにした。6.調査の試験的試行平成11年度国立教育研究所教育情報調査においてモニター試験を行い、当初の予定通り機能することを確認した。7.マニュアル及び報告書の作成利用者の便を考えて、操作マニュアルを作成し、報告書の中にマニュアルを含めた。本年度は、具体的に次の事項について研究を進めた。3.システムの開発パソコンの機種やオペレーティングシステムが異なっても、インターネット・ブラウザが利用できる環境ならば、だれでもが回答できる画面を作り出すシステムを開発した。

また、回答データは自動的にサーバに蓄積されるようにするとともに、過去のデータを参照して入力が可能となるようにした。4.調査の試験的試行平成10年度の国立教育研究所教育情報調査においてモニター試験を行った。5.システムの評価モニター試験の感想を回収し、システムの改良を行うことが来年度の課題である。本研究の目的は、インターネットを利用したアンケート値を簡便に行えるようにするためのシステムを開発することである。具体的には、アンケートの様々な回答条件の設定に対応した調査フォームをHTML(Hyper Text Markup Language)文書として作成することができ、入力された回答データをリアルタイムにサーバ上に蓄積し、指定の形式で情報を取り出すことができる調査システムの開発を支援するシステムを開発することである。これにより、目的に応じた調査形式のアンケート調査が、インターネットを通して行えるようになり、調査における距離と時間と費用の問題を大幅に軽減できることになる。本年度は、具体的に次の事項について研究を進めた。1.システムの開発・改良昨年度開発したシステムについて不具合な点を改良した。具体的には、サーバ上で管理する回答データファイルのバックアップ方法をより短時間で完了する方式に変更した。また、Netscapeブラウザによる入力が可能となるようにした。2.調査の試験的試行平成11年度の国立教育研究所教育情報調査においてモニター試験を行い、当初の予定通り機能することを確認した。3.マニュアルの作成利用者の便を考えて、操作マニュアルを作成した。4.報告書の作成研究のとりまとめとして報告書を作成し、その中に上記マニュアルを含めた。
単一構造単層カーボンナノチューブ固体への超精密キャリアドーピングおよび超伝導探索

本研究の目的は、単一構造を有する単層カーボンナノチューブ(SWCNT)固体へのキャリアドーピングおよび超伝導探索である。近年、急速な分離技術の発展により、極めて少量ではあるが単一構造を有するSWCNTの分離が可能となった。本研究では、化学的および物理的な精密ドーピング手法とインクジェット技術を組み合わせ、極少量試料の固体物性測定技術および精密フィリング制御方法を確立し、単一構造SWCNT固体の基礎物性を明らかにする。本目的を実現するために、以下の4項目を完遂する。(1)単一構造を有するSWCMの分離(2)極少量SWCMT分散液を用いた測定試料作製(3)上記測定試料の精密フィリング制御技術の確立(4)精密フィリング制御された単一構造SWCNT固体薄膜の低温物性研究および超伝導の探索申請段階においては、22年度には上記(1)-(3)を、平成23年度には(1)を継続しながら(4)を中心に研究を進める予定を立てていた。まず、項目(1)に関しては、単一構造を有するSWCNTの分離の第一段階として、密度勾配遠心分離法を用いた金属的舗CNTと半導体的SWCNTの分離を行った。本手法は、この数年間の間に産総研・片浦博士および首都大学東京・柳准教授によって大幅に発展した。そこで、単一構造を有するSWCNTの分離に関しては、柳准教授との共同研究として着実に進めている。並行して、項目(2)に関しては、極少量のSWCNT分散液を用いた測定試料のインクジェット法を用いた作製を行った。イオン液体やイオンゲルを用いた電気化学トランジスタをインクジェット法を用いて作製する事に成功している。また、項目(3)に関しては、精密フィリング制御方法の一つである、電気化学トランジスタ構造を用いたドーピング方法に力を入れ、光特性や伝導特性のその場観察に成功している。本研究課題は追加採択であったため研究期間が非常に短いが、順調に研究成果をあげている。
歯の細胞外環境因子としてのネフロネクチンの分子機能解析

エナメル芽細胞の分化制御においては、上皮-間葉相互作用を介して増殖因子や細胞外マトリックスなどがその分化を厳密に制御していると考えられている。これまでの研究で神経成長因子NT-4を用いてエナメルマトリックスの一つであるであるアメロブラスチンの発現誘導を行えることを明らかにした。しかしながら、NT-4刺激のみではエナメル芽細胞は最終分化まで至らず、他の因子が重要な役割を担っている可能性が考えられる。そこで、エナメル芽細胞の分化に影響を与えていると考えられる新規の基底膜分子ネフロネクチンに着目した。本研究では、エナメル芽細胞の分化メカニズムを明らかにするために、1)歯の発生におけるネフロネクチンの発現パターンの解明、2)ネフロネクチンによるエナメル芽細胞分化制御解明、3)ネフロネクチンを用いたエナメル芽細胞分化誘導法の開発を成し遂げることを主な目的としている。歯の発生におけるネフロネクチンの発現をin vivoにおいて確認したところ、歯胚形成時期にはその発現が基底膜上に認められるが、マトリックス分泌期になると基底膜の消失とともに発現が消失することが確認された。さらに歯原性上皮細胞株HAT-7を用いて本遺伝子の発現パターンを検討すると、未分化な時期にはネフロネクチンの発現が認められるが、分化が進んでエナメルマトリックスなどを分泌するに従ってその発現が抑制されることが分かっている。このことからネフロネクチンは、歯原性上皮細胞の初期分化過程と、その細胞増殖に何らかの影響を与えている可能性が推測される。この細胞外マトリックスの発現によるエナメル芽細胞の分化メカニズムを理解することで、エナメル芽細胞分化過程における基底膜の役割が詳細になる上に、増殖因子によるエナメル芽細胞の分化制御と併用することでより厳密なエナメル芽細胞分化誘導が行える可能性が考えられる。
鼻アレルギーにおける好酸球浸潤機序と炎症細胞、上皮細胞、血管内皮細胞の相互作用

1鼻粘膜上皮細胞接着分子E-カドヘリン、ZO-1発現に与える好酸球の影響。免疫電顕を用いたin vivo実験では、抗原誘発後の鼻粘膜上皮では好酸球浸潤部位に一致してE-カドヘリン及びZO-1の染色性が部分的に低下・消失していることを観察した。In vitroの実験では活性化好酸球の細胞間隙通過後に、培養鼻粘膜上皮E-カドヘリン免疫蛍光反応に有意な低下を認めた。活性化好酸球の上皮細胞間隙通過は上皮細胞のE-カドヘリン、ZO-1発現を低下させたものと考えられた。2鼻粘膜好酸球浸潤に与える各種ケモカインの影響とケモカイン細胞、産生刺激に関する検討1)transmigration assay法を用いてヒト鼻粘膜から分離・培養した微小血管内皮細胞間隙遊走に与える各種好酸球遊走因子の作用を検討した。最も作用が強いものはeotaxin2であり、以下eotaxin、PANTES、PAF、IL-5の順であった。次にヒト鼻粘膜ホモジネートを作成し、好酸球遊走因子が含まれることを確認した上で、ホモジネートを抗IL-5抗体、抗eotaxin抗体による前処理また好酸球をeotaxin、eotaxin2、RANTES、MCP-3、MCD-4の共通レセプターであるCCR-3抗体処理が好酸球の血管内皮細胞間隙遊走に与える影響を検討した。抗IL-5抗体処理によって10%が、抗eotaxin抗体処理によって20%、抗CCR-3抗体処理によって30%の好酸球遊走の抑制が認められた。2)ヒト鼻粘膜から分離・継代培養した上皮細胞、血管内皮細胞、線維芽細胞を種々のサイトカインで刺激し、eotaxin、RANTES、IL-8、IL-16LTB_4、PAFの産生量と至適刺激について検討した。RANTESの産生細胞は上皮細胞、血管内皮細胞及び線維芽細胞であり、最も重要な刺激はTNF-αとIFN-γの共同刺激であった。eotaxinの最も重要な産生細胞は線維芽細胞であり、次は血管内皮細胞と好酸球であった。最も重要な刺激はTNF-αとIL-4、又はTNF-αとIL-13の共同刺激であった。3ケモカインによる好酸球と血管内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞などの鼻粘膜構築細胞とのシグナル伝達の解析eotaxinのレセプターであるCCR3介したシグナル伝達を検討したが、Gi及びプロテインチロシンキナーゼを介する経路が主要経路と考えられた。さらに血管内皮細胞ではeotaxin刺激時に好酸球、線維芽細胞とは異なるCa動態を示し、シグナル伝達経路における差異が示唆された。

さらに血管内皮細胞ではeotaxin刺激時に好酸球、線維芽細胞とは異なるCa動態を示し、シグナル伝達経路における差異が示唆された。1.鼻アレルギー鼻粘膜における好酸球浸潤と上皮傷害に関する検討アレルギー疾患における好酸球浸潤と上皮傷害について、気管支喘息では比較的よく示されているが鼻粘膜においては十分に検討されていない。今回上皮細胞間結合をmediateしている主要な細胞接着分子E-カドヘリンに着目した。まずOA感作モルモット鼻アレルギーモデルを作成し、抗原点鼻誘発後の鼻粘膜上皮微細構造およびE-カドヘリン分布の変化について主に免疫組織化学を用いて観察した(in vivo)。次に培養ヒト鼻粘膜上皮において、ヒト末梢血から分離した炎症細胞を用いて通過実験を行い、好酸球の上皮細胞間隙通過がE-カドヘリン発現にあたえる影響について検討した(in vitro)。免疫電顕を用いたin vivoの実験では、点鼻誘発後の上皮で浸潤好酸球の介在部位に一致してE-カドヘリン染色性が部分的に低下・消失していることを観察した。さらにin vitroにおいて、アレルギー局所を想定した活性化好酸球の細胞通過後に、培養鼻粘膜上皮E-カドヘリン免疫蛍光反応有意な低下を認めた。これらの結果から、上皮細胞のE-カドヘリン反応の低下に活性化好酸球の上皮細胞間隙通過が影響を与えたことが考えらた。2.ヒト鼻粘膜における好酸球遊走因子とその受容体の検討transmigration assay法を用いてヒト末梢血から採取した好酸球の、ヒト鼻粘膜から分離・培養した微小血管内皮細胞間隙遊走に与える各種好酸球遊走因子の作用を検討した。最も作用が強いものはeeotaxin2であり、以下eotaxin、RANTES、PAF、IL-5の順であった。次にヒト鼻粘膜ホモジネートを作成し、好酸球遊走因子が含まれることを確認した上で、ホモジネートを抗IL-5抗体、抗eotaxin抗体で処理した群、また好酸球をeotaxin、eotaxin2、RANTES、MCP-3、MCD-4の共通レセプターであるCCR-3抗体で処理した群において、好酸球の血管内皮細胞間隙遊走はどのような影響を受けるのかを検討した。抗IL-5抗体処理によって約10%、抗eotaxin抗体処理によって20%、抗CCR-3抗体処理によって30%の好酸球遊走の抑制が認められた。ヒト鼻粘膜培養血管内皮細胞においてeotaxin受容体CCR-3が存在することをフローサイトメトリーを用いて確認し、eotaxin処理により血管内皮細胞にシグナルが入り細胞内のカルシウム濃度が変化することを明らかにした。ヒト鼻粘膜血管内皮細胞にeotaxin受容体が存在し機能していることを示す。3.各種ケモカイン産生細胞と産生刺激に関する検討ヒト鼻粘膜から分離・継代培養した上皮細胞、血管内皮細胞、線維芽細胞を種々のサイトカインで刺激し、eotaxin、RANTES、IL-8、IL-16、LTB_4、PAFの産生量と至適刺激について検討した。RANTESの産生細胞は上皮細胞、血管内皮細胞および線維芽細胞であり、最も重要な刺激はTNF-αとIFN-γの共同刺激であった。eotaxinの最も重要な産生細胞は線維芽細胞であり、次は血管内皮細胞と好酸球であった。最も重要な刺激はTNF-αとIL-4、又はTNF-αとIL-13の共同刺激であった。概要好酸球はアレルギー発症およびその病態維持にもっとも重要なeffector cellであるといえる。
治療標的あるいはバイオマーカーとしてのCGRPの可能性

本研究の目的は、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)の治療応用の可能性、血管内皮前駆細胞(EPC)と関連するCGRP作用メカニズムの解析による炎症性腸疾患(IBD)の病態の解明とバイオマーカー、治療選択マーカーとしてのCGRPの可能性の検討である。検討の結果、潰瘍性大腸炎(UC)の病態にCGRPが関与し, CGRPの投与はUCの新たな治療戦略となること, CGRPがUCのバイオマーカーとして有用であることが示唆された。CGRP(calcitonin gene-related peptide)は、強力な血流増加作用とともに、骨髄細胞の誘導、炎症性サイトカインの抑制作用をもつ神経ペプチドある。このような背景から、CGRPの投与がUCの新たな治療戦略となることが期待され、UCモデルを用いてCGRPの有効性とその作用メカニズムについて検討した。方法として正常ラットから末梢血単核細胞(PBMC)を分離し、CGRP添加培養後のサイトカインレベル(IL-1,IL-6,TNF-α)をRT-PCR法とELISAで測定した。DS S大腸炎ラットにCGRPを経静脈的に投与し、臨床スコア、内視鏡スコア、サイトカイン発現(IL-1,IL-6,TNF-α)、CGRP受容体発現(RAMP1,CRLR)、骨髄でのCFU-GMの誘導、末梢血での血管内皮前駆細胞(EPC)の動員、腸粘膜血流量の変化を検討した。ヒトUC患者および健常人からPBMCを分離し、CGRP発現をRT-PCR法で検討した。結果としてin vitroでCGRPを添加すると、PBMCの炎症性サイトカイン発現、産生は濃度依存的に抑制された。DSS大腸炎モデルの腸粘膜ではCGRP発現量は低下していた。CGRPを経静脈的投与すると、臨床スコアの改善、内視鏡スコアの改善、IL-1,IL-6,TNF-α発現の低下、RAMP1,CRLR発現の増加、骨髄でのCFU-GMの増加、末梢血でのEPCの増加、腸粘膜血流量の増加がみられた。ヒトUC患者では、健常人に比べてPBMCでのCGRP発現が低下していた。結論としてCGRPがUCの病態形成に関与していることが示唆された。CGRP投与は、腸粘膜血流の増加・骨髄細胞の誘導による組織修復効果と、炎症性サイトカイン産生抑制による抗炎症効果の両面からの腸炎改善効果を発揮し、UCの新たな治療戦略となる可能性が示唆された。CGRP(calcitonin gene-related peptide)は、強力な血流増加作用とともに、骨髄細胞の誘導、炎症性サイトカインの抑制作用をもつ神経ペプチドである。我々は、潰瘍性大腸炎(UC)動物モデルを用いた実験(急性モデルとしてデキストラン硫酸(DSS)大腸炎、慢性モデルとしてHLA B27トランスジェニックマウスを使用)で白血球除去療法(LCAP)の作用メカニズムを検討し、LCAPが内在性CGRPの産生誘導を介して腸炎改善効果を発揮することを報告してきた。一方、ヒトUCの病変局所ではCGRP発現量の低下がみられることが最近報告され、CGRPがUCの病態形成に直接関与していることが示唆されている。このような背景から、CGRPの投与がUCの新たな治療戦略となることが期待される。またバイオマーカーとしてのCGRPの可能性についても検討した.最終年度は, (1)引き続きヒトUC患者および健常人からPBMCを分離し、CGRP発現をRT-PCR法で検討した。(2)ヒトUC患者に対しLCAPを施行し、サイトカイン発現、CGRPの発現の変化を検討した.その結果, (1)ヒト活動期UC患者では、健常人に比べてPBMCでのCGRP発現が有意に低下していた。(2)ヒトUC患者に対するLCAPによりLCAP前後でIL-1,IL-6,TNF-α発現の低下、CGR発現量の改善がみられた.CGRPがUCの病態形成に関与していることが示唆された。結論として,前年度の結果と合わせ, CGRP投与は、腸粘膜血流の増加・骨髄細胞の誘導による組織修復効果と、炎症性サイトカイン産生抑制による抗炎症効果の両面からの腸炎改善効果を発揮し、UCの新たな治療戦略となる可能性があり、CGRPの測定がUCの診断・治療のバイオマーカーとなる可能性があることが示唆された。これらの研究により神経ペプチドCGRPとその関連薬剤が従来の薬剤と異なる作用メカニズムをもつUCの治療薬となる可能性があること、CGRPの測定がUCの診断・治療のバイオマーカーとなる可能性があることを初めて見出した。炎症性腸疾患初年度は、正常ラットから末梢血単核細胞(PBMC)を分離し、CGRP添加培養後のサイトカインレベル(IL-1,IL-6,TNF-α)をRT-PCR法とELISAで測定した。DSS大腸炎ラットにCGRPを7日間経静脈的に投与し、臨床スコア、内視鏡スコア、サイトカイン発現(IL-1,IL-6,TNF-α)、CGRP受容体発現(RAMP1,CRLR)、骨髄でのCFU-GMの誘導、末梢血での血管内皮前駆細胞(EPC)の動員、腸粘膜血流量の変化を検討した。

ヒトUC患者および健常人からPBMCを分離し、CGRP発現をRT-PCR法で検討した。急性モデルでの検討が順調に解析でき、in vitroでの解析でも良好な結果が得られたため、バイオマーカーとしての臨床応用も考えヒトでの検討に移行した。本研究の目標は、昨年度にIn vitroでの実験や動物実験で良好な結果が得られたため、ヒトでのバイオマーカー(治療選択あるいは疾患活動性マーカー)としてのCGRPの可能性の検討する。具体的には、潰瘍性大腸炎、クローン病患者および健常人、炎症性発癌患者より血清、末梢血単核球および腸管手術標本より単核球を分離し、ELISAやReal-time PCRにてCGRPの発現を解析する。発現増加が確認できた場合、免疫染色やフローサイトメトリーにて発現している細胞の特定を行う。さらに動物実験においては、研究計画でも予定していたClock geneと神経ペプチチドの関連について確認する。PCRプライマー購入予定であるが、金額が越えており購入不可能であったため。次年度にCGRP関連のPCRプライマー購入予定である。
ヒドロシリル化による超耐熱性を有するSiOCネットワーク設計と気体分離膜への応用

本研究では,Si前駆体にtriethoxysilane (TRIES),vinyltrimethoxysilane (VTMS)を用いて,ゾルーゲル法によりSi-O-Si結合を有するシリカネットワークを形成させ,熱架橋によりヒドロシリル化することでSiOC構造を形成し,気体分離膜への応用について検討した。ゾル調製時の前駆体比がSiOC膜のネットワークサイズおよび耐酸化性に及ぼす影響について評価した結果,前駆体比によりネットワークサイズの制御が可能で,従来のオルガノシリカ膜と比較して高い耐熱性,耐酸化性を有することが明らかになった。本研究では,in-situヒドロシリル化反応により超耐熱性を有するSiOC構造を形成させるため,silsesquioxane(SQ)ポリマー構造の制御が重要になる。ビニル基(SiCH=CH2)とヒドロシリル基(Si-H)をそれぞれ有するビニルトリメトキシシラン(Vinyltrimethoxysilane,VTMS),トリエトキシシラン(Triethoxysilane,TRIES)を共加水分解,縮重合させSi-O-Si結合をコアとするSQポリマーを調製した。VTMS,TRIESを共加水分解してネットワーク構造を形成させる際,それぞれの反応速度を把握しておく必要があり,加水分解速度の測定を行なった。また,VTMSとTRIESの混合比により,形成されるネットワーク構造が大きくことなることが明らかになり,thermal curingによりヒドロシリル化させる際,ヒドロシリル基をネットワーク構造内に分散させることがSiOC構造を形成させるために重要であった。初年度は,ビニル基(SiCH=CH2)とヒドロシリル基(Si-H)をそれぞれ有するビニルトリメトキシシラン(Vinyltrimethoxysilane,VTMS),トリエトキシシラン(Triethoxysilane,TRIES)を共加水分解,縮重合させSi-O-Si結合をコアとするSQポリマーを調製条件について詳細に検討を行なった。Thermal curingによりヒドロシリル化させる前のSiOC構造の制御に関する知見を把握することができ,次年度以降気体透過特性,耐熱性,耐水蒸気性に関する評価が可能になった。以上のように研究計画を順調に遂行できている。本研究では,従来のオルガノシリカ膜の課題であった耐熱性を向上させるために,in-situヒドロシリル化反応によりSiOC構造を形成させた。具体的には,ビニル基とヒドロシリル基をそれぞれ有するプレカーサーを共加水分解,縮重合させSi-O-Si結合をコアとするSQポリマーを調製後,多孔質支持体上にSQポリマーをコーティングして,所定の条件でビニル基(SiCH=CH2)とヒドロシリル基(Si-H)をin-situヒドロシリル化させ,Si-C-C-Siネットワークを形成した。本年度はthermal curingによるヒドロシリル化について検討した。KBr上にSQポリマーをコーティングしてFTIRにより反応性を評価した。酸化雰囲気ではビニル基の酸化,ヒドロシリル基がSi-OH基に変化することが明らかになった。そのため,不活性雰囲気(N2)で反応性を評価したところ,500°C以上でヒドロシリル化が進行した。ヒドロシリル化させたSiOCゲルを用いて耐酸化性について評価した。酸化処理前後の29Si-NMRを測定した結果,ヒドロシリル化によりネットワーク構造に形成されたSi-C-C-Si基は酸化処理後も残存する可能性が示された。次年度に実際に気体分離膜を作製し透過特性を評価する必要があるため,気体透過装置を整備した。純ガスの透過特性と水蒸気存在下における膜性能変化をモニタリングできるようにした。耐熱性評価のため透過セルを石英ガラスで作製した。本研究では,従来のオルガノシリカ膜の課題であった耐熱性を向上させるために,in-situヒドロシリル化反応によりSiOC構造を形成する。そのため,silsesquioxane(SQ)ポリマー構造の制御が重要になる。初年度にSQポリマー調製条件の検討を行ない,本年度はヒドロシリル化反応条件について検討を行なった。Thermal curingによりヒドロシリル化させる場合は,不活性雰囲気で反応温度500°C以上であることが明らかになり,製膜条件に関する知見を得た。最終年度に気体分離膜を作製し透過特性を評価する必要があるため,気体透過装置の整備も行なった。本研究では,同分子内にビニル基とヒドロシリル基を有するシルセスキオキサンポリマー(SQ)の架橋反応を応用したSiOC構造を設計し,気体分離膜への応用を目指した。また,SiOC構造の耐熱性,耐酸化性を評価した。Si前駆体には,triethoxysilane (TRIES),vinyltrimethoxysilane (VTMS)を用いて,ゾルーゲル法によりSi-O-Si結合を有するシリカネットワークを形成させ,熱架橋によりヒドロシリル化することでSiOC構造を形成した。ゾル調製時の前駆体比がSiOC膜のネットワークサイズおよび耐酸化性に及ぼす影響について評価した結果,前駆体におけるTRIESの割合が高くなるほどH2/N2選択性が増加した。TRIESの割合が高くなることで,未反応ヒドロシリル基とシラノール基が脱水素反応を起こし,ネットワークが緻密になったと考えられ,前駆体比により異なるネットワークサイズを有する膜の作製が可能であった。

このようにして設計したSiOC構造は,500°C,酸化雰囲気においても膜性能変化が小さく,従来のオルガノシリカ膜と比較して高い耐熱性,耐酸化性を有することが明らかになった。本研究では,Si前駆体にtriethoxysilane (TRIES),vinyltrimethoxysilane (VTMS)を用いて,ゾルーゲル法によりSi-O-Si結合を有するシリカネットワークを形成させ,熱架橋によりヒドロシリル化することでSiOC構造を形成し,気体分離膜への応用について検討した。ゾル調製時の前駆体比がSiOC膜のネットワークサイズおよび耐酸化性に及ぼす影響について評価した結果,前駆体比によりネットワークサイズの制御が可能で,従来のオルガノシリカ膜と比較して高い耐熱性,耐酸化性を有することが明らかになった。1silsesquioxane(SQ)ポリマーゾル調製条件の検討,それらに付随する特性評価は平成27年度に引き続き研究開発を継続するが,特に初年度研究計画に示した,2製膜およびヒドロシリル化反応条件の最適化,3気体透過特性および耐熱,耐水蒸気性の評価に重点を置く。ヒドロシリル化によるSiOC膜の気体透過性,耐熱性を評価することで,ヒドロシリル化反応条件,SQゾル調製条件の最適化を図る。1Silsesquioxane(SQ)ポリマーゾル調製条件の検討,またそれらに付随する特性評価(DLS,N2吸着,FTIR,29Si-NMR,13C-NMR etc)は昨年度に引き続き研究開発を継続するが,2製膜およびヒドロシリル化反応条件の最適化,3気体透過特性,耐熱性評価に重点を置いて研究遂行する。分離膜はこれまでに研究実績がある多孔質アルミナ管を用い,傾斜型構造を最適化することで製膜する。化学工学,膜分離工学本年度は,膜分離に関連する国際会議が7月に米国,奈良,11月に横浜でそれぞれ開催されるため,成果発表,最新の研究動向を調査するために出席予定である。出張旅費,学会参加費を前年度よりも多く計上する必要があったため。H29年度に膜分離に関連する国際会議が7月に米国,11月に韓国でそれぞれ開催されるため,成果発表,最新の研究動向を調査するため出席予定である。出張旅費,学会参加費を前年度よりも多く計上する必要がありH30年度に予算の一部を繰り越した。物品消耗品:128万,旅費:60万,その他:35万物品消耗品:103万,旅費:45万,その他(学会参加費):30万
寄生虫によるマガキ卵形成操作現象の解明とその応用

非産卵期にも卵巣が発達し卵母細胞形成が行われるマガキの卵巣肥大症は、卵母細胞内で胞子形成を行う原生動物寄生虫Marteilioideschungmuensisが宿主生殖サイクルを支配することにより発症すると推測される。本研究では寄生虫が宿主生殖サイクルを支配する因子を同定することはできなかったが、発現遺伝子解析結果より、感染したマガキでは通常の生殖サイクルが何らかの要因で途中から変化し、発症へつながることが強く示唆された。また得られた遺伝子解析結果は、二枚貝の性成熟機構を理解する上でも有用であると考えられた。マガキ卵巣が非生殖期にも肥大する卵巣肥大症は原生動物寄生虫の感染が原因であるとされるが、その生理学的メカニズムは不明である。この点を明らかにすることを目指す本研究課題では、今年度は二つのアプローチを試みた。一つ目は卵母細胞形成促進物質の同定であり、そのためのスクリーニング法の開発を試みた。手法として、原因寄生虫感染と卵巣肥大症状が確認できた個体の卵巣患部組織を切り出し、水溶性成分と難水溶性成分の抽出を行った。そして、原虫無感染を確認したマガキの卵巣組織片に各抽出成分を添加し培養を行い、培養期間終了後に組織切片観察を行い卵母細胞形成の有無を判断した。しかし、水溶性、難水溶性の両画分においても、卵母細胞形成の亢進を組織切片で確認することはできず、スクリーニング法は確立できなかった。二つ目のアプローチとして、卵巣形成患部で起きている現象の理解を発現遺伝子の観点より理解することを試みた。まず、卵形成が亢進している原虫感染組織をホルマリン固定し凍結ブロックを作成、薄切切片を作成した。レーザーマイクロダイセクション法を用い、活発な卵形成が観察されたろ胞上皮組織を切り出し、直ちにRNA抽出を行った。抽出RNAをIllumina Hiseq 2000によって網羅的にシーケンスしたところ約1億リードが得られ、一次的な解析では約33万のcontigと約14万のunigeneを含まれると見込まれる。機能が推定されたcontigは約6万で、その8割程度は宿主であるマガキ由来の配列であったが、残り2割程度は宿主以外の生物由来の配列である。従って、原因寄生虫が発現している遺伝子も含まれている可能性が高く、卵形成が促進される現象解明に有用と考えられる一時データが集積できた。研究年度2年目の平成27年度は、引き続き寄生虫Marteilioides chungmuensisによる宿主マガキの卵母形成促進因子の探索研究を行った。まず、前年度に実施した感染個体の卵巣上皮のトランスクリプトーム解析結果について精査したところ、宿主以外の生物由来の遺伝子群が多数検出された。中には細胞増殖因子ホモログ等も見られ、病巣で特異的に発現することで疾病と関連付けられるものもみられた。次に、感染卵巣と非感染卵巣よりRNAを抽出してトランスクリプトーム解析を行い、発現遺伝子比較を実施した。その結果、感染卵巣で特異的に発現が増加する遺伝子群をリストアップすることに成功した。概ね宿主マガキ由来の遺伝子であるが、中には原虫由来のものも見られたことから、卵巣肥大症に特徴的な宿主の異常な卵母細胞形成を寄生虫が促進するための因子である可能性が高いと考えている。現在、原因寄生虫M.chungmuensisのゲノム解析を行っており、寄生虫由来因子であることの確認作業を実施している。その他、通常のマガキ卵成熟で発現量が増加する遺伝子のいくつかが、感染卵巣では増加しないことがわかってきた。このことから、卵巣肥大症でみられる卵母細胞形成は通常のカスケードで起こるものではなく、カスケードの途中から始まることが強く示唆され、二枚貝の卵成熟、卵母細胞形成の解明につながる結果が得られた。一方、感染卵巣中の卵母細胞形成促進因子を探索するため、感染卵巣抽出物をex vivo条件で二枚貝卵巣組織に添加し、卵形成への影響評価を試みたが、明確な結果を得ることはできなかった。抽出法の改良、もしくは評価に供する二枚貝卵巣組織の発達段階について、今後も検討を行う必要があると考えられる。卵母細胞形成を促進する物質をスクリーニングするためには、卵母細胞が形成されるろ胞上皮細胞組織のみを長期間培養することが望ましい。しかし、これまでにそのような手法は開発されておらず、本研究では二枚貝の卵巣を用いることを試みた。しかし、明瞭な結果は得ることができなかった。これは卵巣を長期間の維持できないことが主な理由と考えられる。一方、患部における発現遺伝子群の網羅的解析は、以前、SSH法で行ったときよりも圧倒的に多いデータ量が得られた。内容については現在解析中であるが、興味深いライブラリーを構築できそうに思われ、この方向性に関しては計画2年目に向けて概ね順調と言える。魚病学研究計画二年目は、感染および未感染個体の卵巣における発現遺伝子群を解析することを予定している。

この結果を、本年度のライブラリーと組み合わせて比較・解析し、発症患部で特異的に発現する遺伝子および発現量の増加する遺伝子を特定することを第一目標とする。関心の高い遺伝子に関しては発症段階ごとに発現量を定量的に測定し、メカニズム解明を試みる。また、一年目に確立できなかった卵母細胞促進物質のスクリーニング法については、手法の確立は本研究課題にとって大きな進展になるため引き続き行う。検討する項目として、生殖巣の取扱がより容易なホタテガイ生殖腺を用いる、組織に添加する患部抽出液を増量するなどを考えている。スクリーニング法が確立され次第、精製を試み物質の同定を試みる予定である。
ラット大脳皮質初代培養上清中のアポトーシス抑制因子により誘発される遺伝子群の解析

ラット大脳皮質細胞を低密度で初代培養を行なうと、アポトーシスにより細胞死が起る。この細胞死は、高密度由来の培養上清の添加することにより、あるいは高密度で培養することにより抑制される。今回の研究において、1)培養上清中のアポトーシス抑制因子(AIF)の情報伝達および2)高密度特異的に発現する遺伝子群の解析を行なった。1)培養上清からAIF-20およびAIF-22を部分精製し、その情報伝達を薬理学的に解析したところ、フォスフォリパーゼC-プロテインキナーゼCの経路を介して作用することが明らかになった。さらに、両AIFは大脳皮質および中脳の神経細胞に対して生存効果を示したが、後根神経節およびPC12細胞の生存に対して影響を及ぼさなかった。これらの知見は、AIF-20およびAIF-22が新規の生存因子である可能性を示唆している。2)高密度培養下で認められる生存促進効果は、アクチノマイシンDあるいはシクロヘキシミドにより抑制された。AIFによる生存効果も同様にこれらの薬物により低下した。生存に関わる遺伝子群を解析するために、高密度および低密度培養由来のRNAを用いてDifferential Display法を行い、最終的に8個のクローンを単離した。このうち、新規遺伝子であるクローン4-4の発現を培養下において経時的に見たとき、低密度により発現が低下すること、この低下が高密度あるいはAIFにより抑制されることが分かった。これらの時間経過は細胞死のそれとよく一致していた。クローン4-4のセンスおよびアンチセンスのDNAをコードする欠損型ヘルペスウイルスを作成し初代培養系に感染させたところ、アンチセンスにより細胞死抑制分子のbcl-2遺伝子の発現が低下することが認められた。これらの結果は、クローン4-4がbcl-2の発現を介して神経細胞の生存に関与していることを示唆している。