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ペルオキシソームの形成・制御と障害

十数種のペルオキシソーム形成因子(PEX遺伝子産物、ペルオキシン)のオルガネラ形成過程における生化学的機能、とくにペルオキシソーム膜形成初期過程やマトリックスタンパク質輸入過程の分子機構、さらにはペルオキシソーム形態制御や分解(ペキソファジー)の分子機構の解明を目指した。その結果、ペルオキシソーム膜形成の機構解明、局在化シグナル受容体Pex5pのCys-ユビキチン化によるシトゾール-オルガネラ間リサイクル機構の解明と必須因子Awp1の発見など、多くの知見を得た。ペルオキシソーム形成機構の研究は、タンパク質の細胞内選別輸送、オルガネラ形成、生体膜形成など現代分子細胞生物学の課題の解明のみならず、形態形成・脳障害のメカニズム解明につながり医学領域への貢献も期待されている。高等動物ペルオキソームの形成機構の研究は我々が世界に先駆けて開拓した領域であり、オリジナリティの高い成果を発信してきている。本研究課題は真核細胞におけるオルガネラ、すなわち膜系という巨大かつ複雑な構造体を研究対象としており、扱う現象は遺伝子発現に伴うタンパク質の生合成とその細胞内での移動という時間的にも,空間的にも極めてダイナミックな現象である。このため種々の分子遺伝学的アプローチと細胞生物学および生化学的アプローチを併用する。これらのアプローチ法に共通な前提として、ペルオキシソーム形成にかかわる因子(PEX遺伝子)を残らず同定しなければならない。一方、ペルオキシソーム形成異常症の全相補性群病因遺伝子の解明と並行して、現在までに同定・単離した13種のPEX遺伝子(産物)の細胞生化学機能に関しては、PTS1受容体Pex5pをはじめマトリックスタンパク質の輸送・移入に関わる10種のペルオキシンとその機能の概要、Pex19pなど膜形成に必須な3つのペルオキシンと膜タンパク質輸送経路(Class IおよびClass II経路)を見出した。しかし、これらの分子機序や調節機構など全体像は明らかになっていない。従って、ペルオキシソームの形成と障害および機能発現制御を解明するためのより詳細な分子基盤を導き出すこと、さらにはオルガネラ形成・形態制御過程においてペルオキシン群がどのような時空間的遺伝子発現システムに基づいた分子動態調節システムを構築しているのかを解明することを本課題研究の目的とする。本年度は以下の研究項目に取り組み、分子レベルでの成果を得ることができた。1)ペルオキシソームの形態制御機構:形態制御因子Fis1の発見ペルオキシソームの形態制御因子としてCHO変異細胞ZP121を用いて見出したダイナミン様タンパク質DLP1のペルオキシソーム膜上レセプターとしてFis1を形態学的および生化学的手法により見出した。加えて、Fis1はDLP1のみならずPex11pとも結合することが観察されたことから、これら3者複合体の協奏的作用によりペルオキシソームの形態形成とくに分裂とその調節が行われているものと推察した。2)AAAATPaseフミリーPex1p-Pex6p複合体のリクルーターPex26pによるペルオキシソームへの局在化のダイナミズムとその生理的意義Pex1pとPex6pの分子解剖とPex26pとの3者複合体形成とペルオキシソーム形成時における機能、すなわちPTS1レセプターPex5pのシトゾール-ペルオキシソーム間のシャトリングに中心的役割を果たしており、その時空間的ダイナミズムについて提唱した。ペルオキシソーム膜アセンブリーに必須な因子として見出したPex19pは新規に合成されるペルオキシソーム膜タンパク質と細胞質ゾル中で複合体を形成、安定化し,次いで経時的に膜形成に依存して輸送,膜上レセプターPex3pを介して局在化させる。そのPex3pのPex19p結合領域配列中最も保存度の高いTrp104が必須であることを、複合体形成能とpex3 CHO変異細胞ZPG208に対する相補活性検定により明らかにした。4)ペルオキシソーム形成機構解明へ向けた新規変異細胞の分離CHO細胞より現在までに多くのペルオキシソーム形成異常を示す変異細胞株を分離してきた。今回、DNA変異剤としてICR191を用いて新規な表現型を呈する変異細胞、数株の分離に成功、その詳細を解析した。本年度は以下の研究項目に取り組み、細胞および分子レベルでの成果を得ることができた。1)ペルオキシソームマトリックスタンパク質の輸送・局在化機構の解明ペルオキシソーム移行シグナル1(PTS1)受容体、Pex5pの膜状ドッキング因子Pex14pのN-末側領域、Pex14p(25-70)の結晶構造解析に成功、3個のヘリックスからなるドメイン構造を明らかにした。また、保存性の高いPhe-35およびPhe-52が近傍の塩基性アミノ酸残基とで形成する結合部位(Sites 1 & 2)にPex5pペンタペプチドモチーフ、WXXXF/Yがすっぽりはまり込む構造をとっていることを見出した。Pex14pのPhe-35およびPhe-52の重要性を明らかにした。

2)ペルオキシソーム膜タンパク質の輸送と膜形成機構ペルオキシソーム膜形成因子、Pex3p、Pex16p、およびPex19pに関し、先にPex19pが新規合成ペルオキシソーム膜タンパク質と細胞質ゾルで複合体を形成、膜上のPex3pへ輸送・局在化させることにより、膜形成が起きること(Class I pathway)を明らかにしている。今回、Pex19pは同様に新規合成Pex3pと複合体を形成、膜上のPex16pへ標的化することにより、ペルオキシソームの膜形成が始まることを発見した(Class II pathway)。3)ペルオキシソームのホメオスタシス動物細胞でのペルオキシソーム恒常性の分子機構解明を目指している。今回、ペルオキシソーム特異的なオートファジーと思われる現象(リソゾームでの分解)が、LC3(Atg8)とペルオキシンPex14p依存的に起きることを、初めて見出した。この過程は、ほ乳動物細胞におけるペルオキシソームのホメオスタシス維持の一機構と推察される。4)エーテルリン脂質プラスマローゲンの機能と輸送機構ペルオキシソームは、重要なリン脂質プラスマローゲンの生合成経路のうち初期2段階反応をdihydroxyacetone-phosphate acyltransferase (DHAPAT)およびalkyl-dihydroxyacetonephosphate synthase (ADAPS)により担う。プラスマローゲンの機能と輸送機構の解明を目的とし、ADAPS障害性CHO変異細胞株ZPEG251の分離に成功した。プラスマローゲンのペルオキシソーム-小胞体での生合成終了後の膜への輸送経路を検討した結果、post-Golgi区画に局在化した。その輸送はATP依存性であるが、微小管形成や小胞輸送の阻害剤の影響は受けない経路を辿ることも見出した。本年度は以下の研究項目に取り組み、細胞および分子レベルでの成果を得ることができた。1)ペルオキシソームマトリックスタンパク質の輸送・局在化機構の解明ペルオキシソーム移行シグナル1(PTS1)受容体、Pex5pの膜状ドッキング因子Pex14pのN-末側領域、Pex14p(25-70)の結晶構造解析に成功、3個のヘリックスからなるドメイン構造を昨年明らかにした。現在、Pex14pのN-末端領域(アミノ酸配列20-70)の詳細な構造を明らかにすべく、その発現・精製と結晶化を試みている。同時に、その単量体-2量体間(Pex14p-Pex14pおよびPex14p-Pex5pすなわちホモおよびヘテロ2量体)変換の分子形状を明らかにした。2)マトリックスPTS2-タンパク質の輸送機構:プラスマローゲン生合成酵素、ADAPSをはじめペルオキシソーム局在化シグナルPTS2タンパク質のPTS2受容体Pex7pを介したペルオキシソームへの無細胞輸送系の確立に成功、PTS1受容体Pex5pおよびPex7pはATP非依存的にインポートされること、Pex5pとPex7pは化学量論的にそれぞれ異なった様式でペルオキシソーム膜上タンパク質輸送装置複合体間を遷移することなど、その基本的分子機構をほぼ明らかにした。3)ペルオキシソーム膜タンパク質の輸送と膜形成機構
下等脊索動物からみた脊索動物の基本的な発生システムとその変化

カタユウレイボヤの発生におけるHox遺伝子の機能の解析我々は、カタユウレイボヤのHox遺伝子のクラスター構造、およびメンバー遺伝子の発生過程における発現をFISHおよびWISHによって系統的に解析し(Ikuta et al., 2004)、カタユウレイボヤのHox遺伝子クラスターは崩壊しつつあること、コリニアリティも失われつつあること、さらに尾索動物亜門の成立とHox遺伝子のクラスター構造およびいくつかのメンバー遺伝子の欠失とが深く関わっていることを指摘した(Ikuta and Saiga, 2005)。さらに、カタユウレイボヤの発生におけるHox遺伝子の役割を明らかにするため、すべてのメンバー遺伝子について、アンチセンスモルフォリノオリゴヌクレオチドを用いた翻訳阻害により機能解析を試みた。この中で、Ci-Hox10およびCi-Hox12については、それぞれ、尾芽胚の尾の先端が正常胚のものに比べて丸くなる、幼若体の消化管の一部が形成されなくなる形態異常が認められた。ホヤのLhx3遺伝子の構造と発現制御機構の解析脊椎動物においては、LIMホメオドメイン遺伝子の1つLhx1遺伝子はシュペーマンオーガナイザーの機能因子として知られている。ホヤの原腸形成においてはLhx3遺伝子が主として内胚葉の系譜で発現する。我々は、マボヤのLhx3遺伝子について、以前にmRNAの塩基配列を調べていた尾芽胚期に加え、卵割期からのmRNAとファージゲノムクローンの塩基配列解析を行ってマボヤLhx3遺伝子のゲノム構造を明らかにした。カタユウレイボヤについても、2つの発生段階でのmRNAの配列を調べ、マボヤと同様な時期特異的転写産物があること、そして時期特異的に発現する2つのエクソンがあることを確認した。現在転写機構の解析を進めている。カタユウレイボヤのHox遺伝子のクラスター構造に関する研究:カタユウレイボヤのHox遺伝子のクラスター構造については、これまでゲノム解析(Dehal et al., 2002)でも明らかにできず、また、メンバー遺伝子の発現についても、ごく限られたデータしかなかった。そこで、Two color FISH、および受精卵から幼若個体まで、12の発生ステージについてWISHを行ない、Hox遺伝子のクラスター構造、およびメンバー遺伝子の発現との相関(コリニアリティ)を検討した。その結果、9つのメンバー遺伝子は2つの染色体に分かれて存在すること、染色体上の並び方には異常があること、にもかかわらず幼生の神経管と幼若個体の消化管において、メンバー遺伝子のいくつかが前後軸に沿って少しずつずれた発現を示すことが分かった。Hox遺伝子クラスターとコリニアリティは崩壊しつつあると結論した。マボヤのOtx遺伝子の転写調節機構の解析:系統的に遠いマボヤ(Hr)とカタユウレイボヤ(Ci)との間で、Otx遺伝子の転写調節機構の保存性について検討した。Ci-Otxの上流3.5kbを含むレポーターコンストラクトをマボヤ胚に導入すると、このコンストラクトはHrの発現パターンをほぼ再現する。2つのホヤで、Otx遺伝子の転写調節領域を同定すると、それぞれ細胞系列特異的な転写調節モジュールがあることが分かった。それらの塩基配列には、類似性は認められないが、細胞系列に特異的にLhx、Fox、T-box等の転写因子結合部位(TF-BS)が共通して見出された。Hrのモジュールについて、それらのTF-BSに突然変異を導入すると、転写を引き起こす活性が失われ、また、カタユウレイボヤ胚でも、マボヤでの結果がほぼ再現されたことから、少数のTF-BSが保存されていることが、発現パターン保存の基盤であることが示された。
チトクロームc酸化酵素欠損良性乳児型の分子病態解析

チトクロームc酸化酵素欠損良性乳児型の6例にミトコンドリアDNA上のtRNA-Glu(グルタミン酸特異的転移RNA)領域の同一塩基の点変異を見いだした。tRNA-Gluはaminoacylacceptor stemの末端にCCA配列が付加され、アンチコドンの転写後修飾をうけコドンの認識能力を獲得し、アミノアシル化転移酵素によりglutamateをチャージしてアミノアシル化が完成する。患者ではいずれかの過程に異常が生じていると考え、まず患者生検筋のtRNA量が低下していることを明らかにした。またアミノアシル化には異常がないことをacid PAGE等で示した。さらにtRNAをRNaseで部分消化しDNA変異が実際にtRNAの配列異常をもたらしていることを確認した。本年度は症例数をさらに増やしたうえで変異を確認し、同変異がtRNAの生合成、機能発現にもたらす異常を検出するために、以下の検討を行った。2.培養細胞を用いて、メチオニンラベルよるタンパク合成能解析を行い、電子伝達系タンパクの異常を示唆する結果をえた。以上より、発見した変異はアンチコドン修飾には影響を与えず、変異のもたらすtRNAの量的減少によりタンパク合成能の異常をきたすことが病因となっていると考えた。自然軽快する機序については検討中であるが、チトクロームc酸化酵素のアイソフォームの乳児型から成人型への変化の関与を想定している。臨床経過と筋病理所見より、チトクロームc酸化酵素欠損良性乳児型の6例を確定診断、ミトコンドリアDNAの塩基配列を決定し、6例全例のtRNA-Glu(グルタミン酸特異的転移RNA)領域の同一塩基(14674位)の点変異を見いだしていたが、新たに確定診断された1例にも同部位の変異を認めた。tRNA-Gluはaminoacylacceptor stemの末端にCCA配列が付加され、アミノアシル化転移酵素の働きでglutamateをチャージすることによりアミノアシル化が完成する。14674変異がtRNA分子の生合成・機能発現にもたらす異常の検出を目的として、平成17年度は以下の検討を行った。1.tRNAのアミノアシル化の検討同変異はtRNA-Gluのaminoacylacceptor stemの末端にあるため、アミノアシル化の異常を来している可能性がある。tRNAのoxidation, deacylation and circulation assayを行い、患者由来tRNAのアミノアシル化の有無を確認したところ、異常は見いだされなかった。次にtRNAにチャージされているアミノ酸が正しくglutamateであるか確認する目的で、acid PAGEノーザンブロットで検討したところ異常は見いだされず、glutamateによる正常なアミノアシル化を受けていることが示唆された。2.COX欠損良性乳児型の生検筋におけるtRNAの発現の確認患者2例に対し、筋病理に異常のない乳児2例の生検筋からRNAを抽出し、ミトコンドリアDNAにコードされた分子の対照をtRNA-Leu(UUR)、核DNAの産物の対照を5S rRNAとしてtRNA-Gluの発現をノーザンブロット解析で確認した。その結果、tRNA-Glu分子量には異常はないものの、患者生検筋においてはtRNA-Gluの量が明らかに低下していることが判明した。臨床経過と筋病理所見より、チトクロームc酸化酵素欠損良性乳児型の6例を確定診断、6例全例のtRNA-Glu(グルタミン酸特異的転移RNA)領域の同一塩基(14674位)の点変異を見いだした。見出された変異はtRNA-Gluのaminoacylacceptor stemの末端にあるため、アミノアシル化の異常を来している可能性があると考えたが、oxidation, deacylation and circulation assayを行い、患者由来tRNAのアミノアシル化の有無を確認したところ、異常は見いだされなかった。以上の結果から、DNA変異が実際にtRNAの配列異常をもたらしていることを確認する必要性があるため、平成18年度は患者細胞由来のtRNAをRNaseで部分消化し、DNA変異に相当するRNA変異があることを確認した。また、COX欠損良性乳児型の生検筋におけるtRNAの発現の確認したところ、患者生検筋においてはtRNA-Gluの量が明らかに低下していることが判明したため、量的問題が病態に重要な疫割を果たしていると考えている。

本年度は症例数をさらに増やしたうえで変異を確認し、同変異がtRNAの生合成、機能発現にもたらす異常を検出するために、以下の検討を行った。2.培養細胞を用いて、メチオニンラベルよるタンパク合成能解析を行い、電子伝達系タンパクの異常を示唆する結果をえた。以上より、発見した変異はアンチコドン修飾には影響を与えず、変異のもたらすtRNAの量的減少によりタンパク合成能の異常をきたすことが病因となっていると考えた。自然軽快する機序については検討中であるが、チトクロームc酸化酵素のアイソフォームの乳児型から成人型への変化の関与を想定している。
高窒素含有Niフリーオーステナイト系ステンレス鋼の高強度摩擦攪拌接合継手の作製

高窒素鋼(High nitrogen containing stainless steel : HNS)は機械的特性に優れた材料であるが、接合時の入熱によるブローホール、窒化物生成による、強度・靭性値の低下が指摘されている。本研究は、固相接合の新しい様式で、低入熱での接合が可能な、摩擦攪拌接合(Friction stir welding : FSW)を適用し、良好な接合継手を得ることを目的として研究を行った。1mass%窒素含有オーステナイト系ステンレス鋼に対し、いくつかの接合条件で摩擦攪拌接合を実施し、得られた継手を対象に、接合部組織観察、硬さ分布測定、および引張試験を実施しその継手特性を評価し、機械的特性に優れる高窒素鋼摩擦攪拌接合継手を作製するための条件を導出した。高窒素鋼に対しては、従来の技術では、摩擦接合時の入熱の影響による、溶接欠陥の発生を回避できていない。また、強靭な高窒素鋼に対し、これに耐えうる接合ツールの検討も望まれている。現在、高強度とされるPCBN(多結晶立方晶窒化ホウ素)でさえも、その強度は十分に保障されていない。本研究では、PCBNに変わる安価で強靭な接合ツールとして超鋼系おうよび窒化珪素系接合ツールの適用の可能性を検討し、入熱量の制御を目的各接合条件(接合速度、ツールの回転速度、荷重を任意に変化)を設定し、各条件における継手特性を評価した。初年度は、厚さ12m程度の薄板高窒素鋼を対象に、信頼性の高い健全な接合継手作成の可能性を検討した。摩擦攪拌接合時のツールの回転速度と、荷重を制御することで、超鋼系および窒化珪素系接合ツールの発熱量を適正な状態に維持し、強靭な高窒素鋼に対しても適用の可能性があるかについて検討した。また、適用が可能であった場合のツールの耐久性についても評価した。さらに、高窒素鋼の摩擦攪拌接合に有利な接合ツールの先端形状および直径についての知見を獲得した。いくつかの接合条件(接合速度、ツールの回転速度、荷重を任意に変化)ことに摩擦攪拌接合継手を作成し、目視、およびマクロ観察レベルで良好と判断される接合条件の候補を決定した。ビードの損傷や、キッシングホール、溶け込み不足、ブローホール、クロム窒化物の析出が見られる場合については、その原因を検証した。接合後の、組織観察および機械的特性の評価により、健全な継手をうるための諸条件を確立した。高窒素鋼は、従来の溶接技術では、摩擦接合時の入熱の影響による溶接欠陥の発生を誘起してしまうため、接合が難しい材料として知られている。本研究では、PCBNに変わる安価で強靭な接合ツールとして窒化珪素系接合ツールの適用の可能性を検討し、入熱量の制御を目的に各接合条件(接合速度、ツールの回転速度、荷重)を設定し、各条件における継手特性を評価した。本年度は、厚さ2mm程度の高窒素鋼を対象に、入熱量を計測しながら、信頼性の高い健全な接合継手作成の条件を、入熱量と機械的特性の関係について評価した。摩擦攪拌接合時のツールの回転速度と、荷重を制御することで、窒化珪素系接合ツールの発熱量を適正な状態に維持し、強靭な高窒素鋼に対しても適用の可能性がある範囲で、入熱量の異なる継手を何種類か作製した。目視、およびマクロ観察レベルで良好と判断される接合条件の候補に、ビッカース硬さ、降伏強度などの機械的特性と入熱量の関係を検討した。実験に供した材料の、温度状態図を作製し、実際に実験で得られた継手の金属学的な解析結果との整合性を評価した。さらに、EBSDを使用した接合継手の微細金属組織の相同定を実施し、入熱による結晶粒の微細化と、オーステナイト組織が保持される最適な接合条件の導出に成功した。
教員養成の在り方に関する教育実習現場からの考察

教育の本質を人間による人間の人間的教育にみるのか、教科内容の専門性における教科教育にみるのかという二者択一論に陥るのではなく、教師たる者、これらを総合的に身につけた教師でなければならないと思われる。教員養成の在り方を考察する際に、この問題をいかに課題化し、プログラム化するのか、これは今日的課題であると思われる。それはまさに、時代状況のなかで要請される改革、教員養成における「質保証」をいかに実現するのかという問題でもある。本研究の目的は、かかる問題を、教育実習現場での考察から見つめ直そうとするところにある。研究は、いくつか予定した中から、観察実習生に限定してアンケート調査を行い、それを分析するという方法をとった。アンケート結果の分析からは、以下の点が研究成果として明らかになっている。実際の実習を通し、「質保証」のために何が必要なのかについて、学生自身の意識変革が見てとれる。具体的には、「教材分析」「指導内容の理解」「発問」「指導過程と時間配分」などに課題意識を強く持つようになっている。また、入門期からの教育実習全般と、学部において受講したすべての講義・演習を相対化し、その意義を見つめ直し、特に、本実習までにほとんどが教科内容に関する専門科目の充実を図らなければならないという自己課題も明らかにされた。さらに実習現場で実感したこととしては、生徒との関係をいかに構築するのかという重要な問題がある。ここには、単なる技術論ではなく、教師としての人間性の陶冶をいかにするのかという課題も明らかとなる。本研究では、特定の教科には限定せず、教科全般というレベルにおいて、以上のことを確認・抽出することができた。ただ、予定として掲げた、教育実習に臨む生徒の意識や、他大学・他附属の教育実習現場との比較・検証をおこなうまでにはいたらなかった。
血小板受容体CLEC-2の敗血症病態との関連の解明及び新しい治療標的としての応用

本研究の目的は,血小板活性化受容体CLEC-2が敗血症治療の標的分子となることを見据え,敗血症病態におけるCLEC-2の役割を解明することである.平成30年度では,敗血症モデルマウスの検討の優先度を下げ,敗血症病態などにおいて感染防御のために病原体を捕獲して排除する好中球の能動的な細胞死であるNETsの放出と血小板CLEC-2の関与についての検証を進めた.方法は,健常者より得られた静脈血(倫理申請承認済)より好中球と血小板を単離し,好中球を前培養した後に,NETs形成陽性コントロールとしてPMA,大腸菌(0111:B4)由来LPS,血小板,およびCLEC-2ブロッカー(当講座で発見した低分子量化合物で特許出願済および論文化済)あるいはそれらの組み合わせたものを加えてさらに4時間培養し,核染色液DAPIあるいはSytoxGreen染色によってNETs形成を解析した.方法の見直しが必要な個所が複数あり,例えば,好中球の単離に際して一般的に行われる赤血球の溶血操作はNETs形成率を下げる傾向があることが判明した.この検証の結果,LPSあるいは血小板との共培養によっては,NETs形成はほとんど認めなかった.しかし,LPSと血小板とともに培養するとNETs形成を認め,さらにCLEC-2ブロッカーによって抑制されたことから,ヒト好中球のNETs形成に血小板CLEC-2が寄与していることを示唆した.今後,このメカニズムについての詳細を検証する予定である.平成30年度において,ヒト好中球が形成するNETsに血小板CLEC-2が関与することを示唆する結果を得た.しかしながら,敗血症マウスモデルの実験結果が安定していない状況が改善されておらず,進捗状況はやや遅れていると判断した.1敗血症マウスモデルにおけるCLEC-2の役割を解析する.平成29と30年度では,モデル構築がほとんどとなってしまったが,令和元年度では,敗血症マウスモデルに用いるLPSを大腸菌(0111:B4)由来LPSに絞って解析する.さらに,巨核球・血小板特異的CLEC-2欠損マウスを用いて,血清生化学検査および病理学的アプローチで検討する.2血小板によるNETs形成促進効果におけるCLEC-2の役割の解析する.平成30年度では,ヒト好中球においてもNETs形成促進に血小板CLEC-2が寄与していることが明らかとなったため,CLEC-2の役割の解析を,令和元年度も継続する.特に血小板CLEC-2が好中球と結合し,活性化しているかどうかをフローサイトメトリーで解析する.3NETs由来物質による血小板活性化におけるCLEC-2の役割の解析する.NETs由来タンパク質の大部分を占めるヒストンが血小板凝集惹起物質かどうかを,マウスおよびヒト血小板を用いて検証する.本研究の目的は,血小板活性化受容体CLEC-2が敗血症治療の標的分子となることを見据え,敗血症病態におけるCLEC-2の役割を解明することである.平成29年度の計画では,1敗血症マウスモデルにおけるCLEC-2の役割の解析,および2血小板によるNETs形成促進効果におけるCLEC-2の役割の解析を予定していたが,そのほとんどが1に関する敗血症マウスモデルの構築における実験条件の検証となった.敗血症マウスモデルとして,緑膿菌由来LPSの腹腔投与,あるいは盲腸穿刺法を行った.予備検討での盲腸穿刺法では,盲腸の端から1cmの部位を結紮し,19G針で穿刺する方法を標準法としていたが,死亡率が予備実験で得られた結果よりも極端に低いことという問題が発生し,結紮部位の変更や,穿刺法の変更などで再検討した.さらに,緑膿菌由来LPS以外に,大腸菌(0111:B4)由来LPSを用いた敗血症の誘発の検討も追加した.以上のように,敗血症モデルマウス構築の再検討が必要となり,結果として,LPSに対する感受性が供給元によって異なることが判明し,安定した敗血症マウスモデルの構築の目処が立った.平成30年度では継続して検証済の敗血症マウスモデルでCLEC-2の役割を解明するために,巨核球・血小板特異的CLEC-2欠損マウスや当講座で発見したCLEC-2ブロッカー(低分子量化合物および蛇毒ロドサイチン変異体,ともに特許出願済)を用いて検証する予定である.平成29年度において,敗血症マウスモデルの実験条件の検討がほとんどを占めてしまったため,進捗状況はやや遅れていると判断した.本研究の目的は,血小板活性化受容体CLEC-2が敗血症治療の標的分子となることを見据え,敗血症病態におけるCLEC-2の役割を解明することである.

平成30年度では,敗血症モデルマウスの検討の優先度を下げ,敗血症病態などにおいて感染防御のために病原体を捕獲して排除する好中球の能動的な細胞死であるNETsの放出と血小板CLEC-2の関与についての検証を進めた.方法は,健常者より得られた静脈血(倫理申請承認済)より好中球と血小板を単離し,好中球を前培養した後に,NETs形成陽性コントロールとしてPMA,大腸菌(0111:B4)由来LPS,血小板,およびCLEC-2ブロッカー(当講座で発見した低分子量化合物で特許出願済および論文化済)あるいはそれらの組み合わせたものを加えてさらに4時間培養し,核染色液DAPIあるいはSytoxGreen染色によってNETs形成を解析した.方法の見直しが必要な個所が複数あり,例えば,好中球の単離に際して一般的に行われる赤血球の溶血操作はNETs形成率を下げる傾向があることが判明した.この検証の結果,LPSあるいは血小板との共培養によっては,NETs形成はほとんど認めなかった.しかし,LPSと血小板とともに培養するとNETs形成を認め,さらにCLEC-2ブロッカーによって抑制されたことから,ヒト好中球のNETs形成に血小板CLEC-2が寄与していることを示唆した.今後,このメカニズムについての詳細を検証する予定である.平成30年度において,ヒト好中球が形成するNETsに血小板CLEC-2が関与することを示唆する結果を得た.しかしながら,敗血症マウスモデルの実験結果が安定していない状況が改善されておらず,進捗状況はやや遅れていると判断した.1敗血症マウスモデルにおけるCLEC-2の役割を解析する.平成29年度では,モデル構築がほとんどとなってしまったが,平成30年度では,条件検討の完了した敗血症マウスモデルにおいてCLEC-2の役割を解析する.そのために,巨核球・血小板特異的CLEC-2欠損マウスを用いて,血清生化学検査および病理学的アプローチで検討する.2血小板によるNETs形成促進効果におけるCLEC-2の役割を解析する.平成29年度に予定していた血小板によるNETs形成促進効果におけるCLEC-2の役割の解析は,平成30年度も継続する.特に血小板のCLEC-2が好中球と結合し,活性化しているかどうかをフローサイトメトリーで解析する.3NETs由来物質による血小板活性化におけるCLEC-2の役割を解析する.NETs由来タンパク質の大部分を占めるヒストンが血小板凝集惹起物質かどうかを,マウスおよびヒト血小板を用いて検証する.1敗血症マウスモデルにおけるCLEC-2の役割を解析する.平成29と30年度では,モデル構築がほとんどとなってしまったが,令和元年度では,敗血症マウスモデルに用いるLPSを大腸菌(0111:B4)由来LPSに絞って解析する.さらに,巨核球・血小板特異的CLEC-2欠損マウスを用いて,血清生化学検査および病理学的アプローチで検討する.2血小板によるNETs形成促進効果におけるCLEC-2の役割の解析する.平成30年度では,ヒト好中球においてもNETs形成促進に血小板CLEC-2が寄与していることが明らかとなったため,CLEC-2の役割の解析を,令和元年度も継続する.特に血小板CLEC-2が好中球と結合し,活性化しているかどうかをフローサイトメトリーで解析する.3NETs由来物質による血小板活性化におけるCLEC-2の役割の解析する.NETs由来タンパク質の大部分を占めるヒストンが血小板凝集惹起物質かどうかを,マウスおよびヒト血小板を用いて検証する.平成29年度は,予定よりも研究進捗がやや遅れたため,次年度使用額(197,774円)が生じた.これらは,平成30年度に研究試薬(抗体など)およびマウスの購入費のために使用する.
新規G蛋白質群を介したナンセンス変異をもつmRNAの分解経路の解析

真核生物には、転写・複製中のエラーや不適切なスプライシングによって生じたナンセンス変異をもつmRNAを選択的に分解する機構として、UPF因子群が介在するnonsense-mediated decay (NMD)経路が存在する。このNMDの作用によりナンセンス変異をもつ転写産物からC末端側が欠失した蛋白質が翻訳されることは通常ない。先に申請者らは、翻訳終結に関わるG蛋白質eRF3を単離し、このeRF3ファミリーに属する新規G蛋白質であるSki7が細胞質におけるmRNA分解の基本的因子であることを初めて明らかにした。本研究においては、以下に示すように、NMDには新規な分解経路が介在すること、さらにこの分解経路にはUPF因子群とSki7間の相互作用が必要であることを見出した。これは、UPF因子群とmRNA分解マシーナリーの機能的関連を示した初めての知見であり、ナンセンス変異がNMDを活性化する機構を理解する上で大きな手掛かりであると考える。1、既知のNMD分解経路を抑制してもナンセンス変異をもつmRNAの分解は促進する。2、新規な分解経路は、UPF因子群のみならずSki7も必要である。3、Ski7はUPF因子群と相互作用する。4、Ski7のUPF因子群相互作用部位の強制発現により、新規経路を介した分解のみが抑制される。多くの遺伝病はナンセンス変異が原因としており、そのmRNAはNMDによりが潜在化している。ナンセンス変異を含む転写産物をNMDから回避させることによって遺伝病原因遺伝子を同定し、より良い治療法を見出せる可能性もあり、上記の知見はNMD経路を標的とした新しい遺伝病の診断・治療法への応用にも有用である。
多文化経営組織における人的資源の創造的開発と管理に関する実証研究

本調査研究は、アジアを中心とする海外進出日系企業、ならびに当該国の地元企業を多文化経営組織とみなし、経営のグローバル化が進むなかで、言語の問題を改めて捉え直す問題意識に出立して実施されたものである。国際経営学における言語や文化の問題は、学問的調査研究をもって言及された先行研究が皆無に等しい。これは、普段の企業行動において、英語を中心とする異言語での経営が、多国籍企業にとってあまりにも当たり前の現実的課題として直面していることにも起因しているが、実は、この言語の問題をクリアすることこそが、競争優位の源泉を人的資源に求めてきた日本企業の今後の国際競争力の獲得の是非を分ける重要な論点にもなるのである。今年度の調査研究では、3種類の質問紙調査と、海外現地渡航調査を重ねることによって、多文化経営組織の人的資源管理、人材育成の問題を、言語投資策に焦点を当てて解明することに注力した。台湾、韓国に進出している日本企業、及び地元企業を対象に、それぞれの国際戦略における言語投資の状況を訪問調査によって詳細に検討した。質問紙は日本企業の人事部を対象に実施した、(1)語学研修に関する調査と、(2)経営者の英語に対する意識調査、(3)外資系企業の経営と英語に関する調査の3編を作成し、郵送法によって送付回収を行い、SPSSを用いた統計分析を実施した。それらの研究結果は、4団体の関連学会において口頭発表をし、ディスカッション・ペーパーや雑誌にも投稿発表した。本調査研究での知見は、日本企業の場合、アジアの後発組国の企業に比して、英語のできる人材を育成するコストへの意識が総じて低いことが明らかになった。国際人的資源管理戦略に語学投資という意識が薄いことは、各国の優れた人材を活用するという多国籍企業本来の優位性を享受できないことを意味する。国際経営を行う日本企業に対して、今後も分析結果を成果報告としてまとめていきたいと思う。日本企業の国際経営活動が、海外拠点の増加や現地化の進展に伴って多様化するなか、それぞれの経営体には日本人と各現地の人々、あるいは第3国の人材の往来によって多文化組織が形成される。本研究の目的は、これらの多文化経営組織における人的資源管理が、日常の組織内においてどのような問題に直面しているのかという視点に立脚し、その問題点の所在、およびそれらを解決するための方向性を模索することにある。本年度は、多文化社会と言語に着目し、在外企業の中でも、アジア地域の地域統括会社が集中し国際事業の展開が著しいシンガポールでのヒアリング調査を実施した。また、日本企業の海外事業に付随する経営と異文化間コミュニケーションの問題に論点をしぼり、とくに国際経営と言語コミュニケーションとの関係について3種類の質問紙を作成し、郵送法により、各質問紙につきそれぞれ1340社を対象に調査を実施した。本調査の基盤にある理論的フレームワークは、国際経営活動を行う際に生じる言語を原因とするミス・コミュニケーションや、翻訳、通訳、語学研修費などの有形無形の非効率性を、言語コストという点から捉えることに独自性がある。3種類の質問紙調査の結果は、現在、一部のデータを解析中である。現時点で得られた知見としては、(1)日本企業が、国際経営を行う上で、英語を主とする言語能力の獲得にはとりわけ重要性を痛感しているのにも拘わらず、総体的にはその具体的対応策にあまり積極的姿勢を示していないこと。(2)製造業と非製造業とでは、業務内容や組織の性格上、共有される組織文化の側面に違いが見られ、英語という異言語に対する必要性や度合いが異なること。(3)日本企業の場合、海外現地企業の現場の方が、英語の重要度をより体験的に意識しており、国際経営と言語における根源的な問題は、現地とのやり取りにおける本社側の日本語過多の意識が障害になっていること、などが挙げられる。次年度は、質問紙調査から得られたデータの詳細な統計分析と、日本以外のアジアの国々における異文化対応能力への意識調査を実施することによって、国際要員の育成と言語能力をとりまく人的資源管理の具体策について、国際比較の論点を織り交ぜて、探求を進めたいと考える。

本調査研究での知見は、日本企業の場合、アジアの後発組国の企業に比して、英語のできる人材を育成するコストへの意識が総じて低いことが明らかになった。国際人的資源管理戦略に語学投資という意識が薄いことは、各国の優れた人材を活用するという多国籍企業本来の優位性を享受できないことを意味する。国際経営を行う日本企業に対して、今後も分析結果を成果報告としてまとめていきたいと思う。
極限的低次元系における励起子のコヒーレンスと光学非線形性

1)グレーティング構造をもつ発光体の光学的性質電子ビーム露光と反応性イオンエッチングでグレーティング構造を刻んだ石英基板に、層状ペロブスカイト型化合物(C6H5C2H4NH3)2Pb14をスピンコートしてその透過特性および発光特性を調べた。この物質の励起子振動子強度が大きいため分布帰還型共振器モードと励起子遷移の強結合が生じ、共振器ポラリトンが形成されたことが観測された。共振器ポラリトンの分裂エネルギーは非常に大きく100meVにも達する。また発光には指向性が見られるが、これは等間隔に並んだ細線状の共鳴発光体が間隔に共鳴した光の吸収と発光を繰り返し、位相を揃える現象であると考えられる。通常のファブリペロ-型微小共振器において行われる自発放出制御は高反射鏡によりもたらされた発光層における時間的なコヒーレンスによるものであるのに対し、周期的にならんだ発光体による空間的なコヒーレンスによるものであると対応づけることができる。2)GaAs系量子井戸の反射型4光波混合信号のスペクトル分解2次元励起子の多体効果を調べるために130fsの光パルスで縮退4光波混合を行い、主として負の遅延時間領域においてそのスペクトルをCCD分光装置でスペクトル分解し、負の遅延時間が大きくなるとシフトする高次の非線形信号を見いだした。この信号をさらに時間分解するためにアップコンバージョン測定系を整備した。またその原因を探るために半導体Bloch方程式の数値計算を試みた。3)量子細胞線構造をもつ結晶の発光ダイナミクス量子細線アレー構造をもつC5H10NH2Pb13の発光を時間分解しそのダイナミクスを検討した。発光緩和定数は13Kから150Kに温度が上昇することにより2桁程度増加する。この原因としては低温で局在していた波動関数が拡がることが考えられる。
微細構造を有する蛍光板による高解像度中性子ラジオグラフィ技術の開発

本研究においては、微細な柱状構造を有する「高感度かつ高分解能な蛍光板」を開発し、本蛍光板を用いて中性子ラジオグラフィなどイメージング技術の高解像度化を実現することが目的である。具体的には、アスペクト比の高い微細加工が可能であるプロトンマイクロビームを利用した蛍光板作成方法と、周期的な細管構造を有するガラス基板であるキャピラリプレートを利用した方法を試みた。その結果、後者の方法が優れていることが確認でき、その手法で作製した蛍光板の特性評価を行った。その結果、細管ピッチと同程度である約30μmの空間分解能を達成できた。中性子による評価は、研究炉JRR-3の再稼働後に行う予定である。蛍光板は、X線・荷電粒子・中性子などの強度分布を可視光に変換する検出素子として広く利用されているが、その空間分解能は蛍光体自身の厚さによって大きく制限される。本研究においては、微細な柱状構造を有する「高感度かつ高分解能の蛍光板」を開発し、本蛍光板を用いて中性子ラジオグラフィなどイメージング技術の高解像度化を実現することが目的である。蛍光板の作成方法としては、イオンビームによる露光技術の利用を主に考えており、現在まで20μm程度の柱状構造を有する蛍光板の作成に成功している。また、より大面積の蛍光板を作成するため、ビーム走査とステージ駆動を組み合わせるため、PCによるプログラム制御で自動照射・位置調整を行うシステムの開発に成功した。さらには、マスクパターンを利用した露光技術の開発にも着手し、そのために必要な機材等の準備を整えた。作成した蛍光板の評価に関しては、従来まで行ってきた紫外線励起による蛍光を光学顕微鏡で観察する他、X線による特性の評価を行うべく、その準備を行い、必要な機材等の調達を終えた。平成27年度においては、イオンビーム露光技術を用いた柱状構造体の作製と平行して、細管構造を有するガラス基板であるキャプラリプレートに蛍光体粉末を充填した蛍光板の試作を行った。その結果、前者の方法では蛍光体層の厚さは利用するイオンビームの飛程(数100μm)に制限されるのに対して、後者の方法では使用するガラス基板の厚さで決まり、1mm程度まで厚くすることも可能であることが判った。また、細管の直径もφ1025μm程度のものを選択でき、比較的簡便な手法で大面積の蛍光板に加工する事が可能なことから、この手法で試験用の蛍光板を作製することにした。試作した蛍光板は、光学顕微鏡・走査型電子顕微鏡で表面・断面を観察し、蛍光体粉末が細管内に一様に充填されていることを確認した。さらに、小型X線源により空間分解能の評価を行った。その結果、細管ピッチと同程度の30μm程度の分解能を有することが確認できた。また、発光の一様性も良好で、高分解能の蛍光板として利用出来ることが確認できた。新たに、キャプラリプレートに蛍光体粉末を充填した蛍光板の試作を行い、良好な結果を得た。現在までに、研究炉JRR-3の再稼働が遅れているため、中性子による評価実験を行えていないが、代替にX線を用いることで、試作蛍光板の空間分解能評価を行った。その結果、目標とする10μmには届いていないが、細管ピッチと同程度の30μmを達成しており、より細かい細管ピッチのキャプラリプレートを利用することで高分解能化を達成する目処をつけた。また、中性子用蛍光板の作製に関しては、中性子補足体の入手を完了しており、最終年度中に作製・評価する予定である。平成28年度においては、ガラス材料に中性子捕捉体であるホウ素を含有するホウケイ酸ガラス製のキャピラリプレートを入手し、中性子に感度を有する蛍光板の開発を行った。使用したキャピラリプレートの形状は、有効径φ20mm、孔径25μm、細管ピッチ31μm、厚さ0.4mmである。蛍光体としては、分留済み(平均粒径7μm)硫化亜鉛ZnS(Ag)を使用した。蛍光体の充填率を評価するため、充填操作前後の質量差から見積りを行った。その結果、基板全体では、35%程度の充填率であることが判った。また、細管部だけに限れば、59%の充填率であり、蛍光板と使用するのに、充分な充填率であることが判った。さらに中性子に対する感度を向上させるため、蛍光体粉末の隙間にB-10濃縮のホウ酸水を含浸させる準備を行っている。このプロセス後、中性子によるイメージング実験を予定している。

また、入射放射線に対する発光量を向上させるため、キャピラリプレート細管内壁に金属メッキを施す加工を検討し、業者の選定・加工依頼を行ったが、細管内壁と金属膜の密着性が上がらず、一様なメッキ膜の作製には現状至っていない。本研究においては、微細な柱状構造を有する「高感度かつ高分解能な蛍光板」を開発し、本蛍光板を用いて中性子ラジオグラフィなどイメージング技術の高解像度化を実現することが目的である。具体的には、アスペクト比の高い微細加工が可能であるプロトンマイクロビームを利用した蛍光板作成方法と、周期的な細管構造を有するガラス基板であるキャピラリプレートを利用した方法を試みた。その結果、後者の方法が優れていることが確認でき、その手法で作製した蛍光板の特性評価を行った。その結果、細管ピッチと同程度である約30μmの空間分解能を達成できた。中性子による評価は、研究炉JRR-3の再稼働後に行う予定である。蛍光板の試作に関しては、ほぼ計画通りに進んでいる。また、キャピラリープレートを利用した新たな作成方法にも着手した。その他、作成した蛍光板の特性を評価する必要があるが、そのための準備も進めており、次年度以降に蛍光板の評価を行う目処が立った。さらには、応用研究を行うグループとの打ち合わせも開始し、おおむね順調に進んでいるといえる。引き続き、蛍光板の試作を続ける。具体的には平成28年度においては、中性子補足体であるホウ素を含むホウケイ酸ガラスを材料としたキャピラリプレートを基板とした蛍光板の作成を行う。さらに、10B濃縮のホウ酸水を蛍光体層に含浸させることで、中性子の検出効率向上を図る。作製した蛍光板に関しては、前年度と同様、小型X線源を用いて評価を行うほか、中性子ビームによる評価も行う。中性子源に関しては、研究炉JRR-3の再稼働が当初見込みよりも遅れているが、その他の中性子源(J-PARC/MLF, RANS, KUR)の利用も検討している。さらには、イメージングによる応用研究を行うグループとも連携して、さらなる研究の展開を図ってゆく。放射線計測学引き続き、イオンビームを利用した蛍光板の試作を進める。プロトンマイクロビームを利用した方法では、より分解能が高く、より発光効率の良い微細構造を見極めるため、複数のパターン(格子模様・ハニカム構造など)による蛍光板の作製を試み、その最適化を図る。マスクパターンによる露光で蛍光板の微細加工では、X線と高エネルギー重イオンビーム照射を試み、その結果を得て最適な方法・条件を詰める。そのほか、キャピラリープレートを利用した蛍光板の作成にも着手する。作成した蛍光板に関しては、X線発生装置を利用し、その一様性や発光特性等の評価を行うほか、イメージング実験への利用も開始する。中性子の利用に関しては、研究炉JRR-3に再稼働が待たれるが、その他の中性子源(J-PARC/MLFやRANS)の利用も積極的に行う予定である。さらには、イメージングによる応用研究を行うグループとも連携し、さらなる研究の展開を推進してゆく。購入を予定していた物品の仕様が変更になったため、その必要性を検討した結果、次年度に購入した方がより有効に利用出来ると判断したため。購入を予定していた一部の機器において仕様が変更になったため、その必要性を再検討し、次年度に購入した方がより的確に使用できると判断したため。平成28年度において、蛍光板の製作に必要な治具等の購入に利用する予定である。27年度においては、蛍光板の作成に・評価に必要な機器(電子天秤)の購入を追加で行う予定である。
癌早期発見のための呼気VOC計測法開発

【目的】ヘルスケア市場では低価格帯・持ち歩ける程度の大きさおよびバッテリー電源駆動仕様で癌診断ができるものの開発が期待されている。呼気で癌診断可能となれば胃カメラやX線検査による患者の体への負担軽減および医療費削減にもつながるため社会的効果が大きい。本研究では低価格で家庭でも導入しやすい簡易的癌早期検診を目指して市販ガスセンサなどと電子回路を組み合わせ呼気VOC計測方法の基礎検討を行うことを目的とする。【研究方法】計測用ハードウエアはArduinoを用いた。制御用ソフトウエアについても無料で入手可能であり開発費用が安価であることが導入理由である。呼気VOC計測用ガスセンサヘッドは市販品を購入した。メチルメルカプタン(CH_3SH)を対象ガスとして設定後、4種類のガスセンサヘッドを選定した。その中でもメチルメルカプタンに選択的感度が良好なセンサヘッドとしてフィガロ技研製ヘッド(TGS2450)を用い制御回路については電子部品を購入し自作にてシステムを構成した。呼気ガス濃度計測は呼気1Lの密閉容器にセンサヘッド入れ5分間計測、その後大気開放25分連続計測(合計計測時間30分)を行う方法とした。また、TGS2450ヘッドがCH_3SHガスに選択的ガス感度を示すことを確認するため、主な香気成分がCH_3SHガスである国産大根をサンプルとして用いた。サンプルはすりおろし直後の状態で3種類重量(0.1g, 1g, 10g)を準備しガス感度データを得た。【研究成果】大根重量0.1g=0. lppm以下、1g=約0.35ppm、10g=約0.55ppmのCH_3SHガス濃度換算値を示した。更に呼気分析結果よりCH_3SHガス濃度換算値0.1ppm以下であることが分かった。以上の結果から本システムは0. lppm以上の範囲では簡易的にCH_3SHガス濃度計測が可能であることが分かった。
包括的ゲノム解析による胃癌の発生・進展機構の解明

平成19年度実績1.胃癌臨床検体の採取胃癌臨床検体を当院の胃内視鏡検査を受ける患者もしくは手術を受ける患者から収集中である。採取時には倫理委員会ですでに承認の得られている同意説明文書にて本研究の主旨を十分に説明し文書同意を得た後、検体はホルマリン固定もしくはTissueTechに包埋後、直ちに液体窒素で凍結し保存した。2.高密度オリゴヌクレオチドアレイを用いたゲノム解析1.のごとく採取した検体からマイクロダイセクション(ライカ社)を用いて癌部・非癌部を選択的に切り出し、回収したサンプルよりゲノムDNAを抽出した。今後は複数の臨床検体で共通の遺伝子増幅および欠失領域やLOHの領域を網羅的に解析し、さらにその結果を臨床・病理学的パラメータと組み合わせることにより、癌の進展・予後予測との関連性を検討する。3.癌遺伝子および癌抑制遺伝子候補の分子生物学的解析2.のごとく胃癌細胞株35種を用いて解析した結果、ゲノム異常の頻度が高いなど胃癌の癌遺伝子および癌抑制遺伝子の候補と考えられる遺伝子について、臨床検体を用いて解析を行なった。細胞株で増幅やLOHが高頻度に起きている領域は、臨床検体でもその変化が高頻度に認められ、細胞株の異常が臨床検体の異常を反映していることが示唆された。今後これらの領域に含まれる遺伝子の胃癌におけるタンパク発現やその機能など、胃癌の発生や進展にかかわる生物学的な意義について解析を行なう。
金属セラミックス超微細結晶粒複合体の力学的性質の界面化学的制御

超微細結晶粒材料の諸性質の界面構造にもとずく解釈には近年2つの説が対立した。界面が母相の半分程度の低い密度になっているというGleiterらの解釈と,界面上にはボイドが存在しがちで,このため見かけ上低密度になって見えるだけで界面相自体は粗大晶のそれとそれほど変わらない密度の領域となっているとするSiegelらの解釈である。本年度は当該研究の最終年度でもあるため,超微細結晶粒材料の界面構造をめぐる最も基本的論点である,この界面密度問題を取り上げ,これまでの高分解能電子顕微鏡観察結果を基に検討した。論争の要点は高分解能電子顕微鏡で観察されるボイドを含む超微細組織が,すでに本来の材料のそれではなくなっている,あるいは,焼結性が良くないためにボイドがみられるにすぎない,という2つの主張の是非にある。前者は純金属の超微細粒組織に対して,また後者はセラミックスのそれに対してされた議論である。金属・セラミックス超微細結晶粒複合体は組織不安定性と難焼結性という2つの課題を一度に克服する都合のよい系である。ガス中蒸着法やボールミル法で達成された金属・セラミックス超微細粒複合体の高分解能電顕観察は,ボイドを含まず,かつ結晶粒界面の密度に異常のない状態が達成されたことを示した。結局,両説の対立は材料作成技術が不完全段階にあったことを象徴した事件であると結論された。一方,力学的性質の実験は新材料であるC_<60>およびC_<60>と銀との超微細結晶粒複合体に対して引張試験として行われ,C_<60>が常温で,超塑性の変形機構である粒界すべりによる延性促進効果を内蔵していることが見出された。C_<60>を材料化するうえで超微細結晶粒組織とし複合体として使用することが,きわめて有効であると結論された。
肝再生遅延を伴う温阻血脂肪肝に対するHO-1とHGFによる肝不全発症阻止効果

肝切除術や肝移植において不可避の事象である虚血・再灌流傷害が肝細胞内に脂肪滴や肝類洞構造の乱れを伴う脂肪肝では強く起こる危険性がある。しかし、脂肪肝の程度により肝切除術における虚血・再灌流傷害に違いがみられるのか明らかにされていない。今年度はheme oxygenase 1(HO-1)発現の面から、程度の異なる脂肪肝の肝切除における虚血・再灌流傷害について検討した。Wistar雄性ラット(4週齢)にportosystemic shuntを形成するため、左側腹部皮下に脾臓を固着させておいた。程度の異なる脂肪肝を作成するため、特殊配合飼料(Fat-enriched chow)を4週間あるいは12週間与えた。組織学的に4週間摂食ラットでは30-60%の中等度の脂肪肝が作成され、12週間摂食ラットでは60%以上の高度の脂肪肝が作成されることを確認した。肝門部で肝動脈・門脈・胆管を遮断し、60分間の全肝虚血を行った。虚血終了時に全肝の約70%にあたる肝正中葉と左外側葉を切除した。肝切除後7日間生存率に加えて、血漿AST・ALT値、肝組織HO-1発現(Western blot法)、肝組織像について検討した。7日間生存率は正常肝では50%、中等度脂肪肝では42%であったが、高度脂肪肝では25%にすぎなかった。再灌流後6時間での血漿AST・ALT値はすべての実験群で著しく上昇したが、特に高度脂肪肝では正常肝・中等度脂肪肝に比し、有意な増加(AST値:8305±2684IU/l)が観察された。肝組織HO-1発現はすべての実験群で肝虚血前にはほとんどみられなかった。再灌流6時間では高度脂肪肝ラットに比して、正常ラットおよび4週間摂食ラットの肝組織には強い発現が観察された。再灌流6時間の肝組織所見は、正常肝では類洞内にうっ血を伴うfocalな壊死が散在していたが、脂肪肝では壊死の範囲は広く、特に高度脂肪肝ではうっ血性変化も高度であった。高度脂肪肝では再灌流後に肝組織HO-1発現が抑制された状態にあることが、正常肝および中等度までの脂肪肝に比し肝虚血・再灌流傷害が強く起こる一因と考えられる。高度脂肪肝のmarginal donorとしての利用や安全な肝切除を考える上で、HO-1発現を高める手段が重要な治療戦略のひとつになるものと考える。脂肪肝の肝虚血・再灌流傷害では肝類洞の微小循環障害と脂質の変性が関連した肝細胞障害が起こることが予想され、脂肪肝の肝切除術では肝再生の遅延が指摘されている。このため、温阻血障害を受けた脂肪肝に肝切除を行うと、その後の肝再生は著しく障害され肝不全に陥る危険性が高くなることが想像される。