hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
重度変形性顎関節症治療のための軟骨由来軟骨成長因子(CTGF)の遺伝子導入

本研究では重度変形性顎関節症の発症機序の解明と関節軟骨修復に遺伝子導入を応用することを目的に,(1)実験的変形性顎関節症モデルの作製した.(2)CTGF遺伝子を組み込んだアデノウイルスを培養軟骨細胞に導入してその影響を検討した.1.日本白色ウサギに強制開口行うことにより,ウサギ顎関節部に変形性顎関節様の変化を引き起こした.すなわち,関節頭の中央部から後方部の軟骨層に軟骨組織の象牙化や,軟骨細胞の異常な集積が認められた.特に中央部では,軟骨層の消失が認められた.また,関節頭の前方部では軟骨組織の破壊が起きており,骨棘形成が認められ,その周辺部では軟骨細胞の異常な増殖が認められた.2.軟骨細胞にCTGFを遺伝子導入すると,CTGFの遺伝子発現は上昇し,感染後7日目でピークに達した.3.導入されたCTGF遺伝子により,軟骨細胞においてCTGFタンパクが産生されることが明らかとなった.4.CTGFの遺伝子導入により,軟骨細胞のプロテオグリカン合成は有意に上昇した.以上の結果より,軟骨細胞にCTGF遺伝子をアデノウイルスベクターを用いて遺伝子導入することにより,軟骨細胞の分化および増殖が促進されることが明らかとなり,軟骨修復へのCTGF遺伝子の遺伝子導入の有用性が示唆された.さらに,本研究で作製した変形性顎関節症モデルが,in vivoでの遺伝子導入による関節軟骨修復研究の進歩につながると推測される.本研究では重度変形性顎関節症の発症機序の解明と関節軟骨修復に遺伝子導入を応用することを目的に,(1)実験的変形性顎関節症モデルの作製した.(2)CTGF遺伝子を組み込んだアデノウイルスを培養軟骨細胞に導入してその影響を検討した.1.日本白色ウサギに強制開口行うことにより,ウサギ顎関節部に変形性顎関節様の変化を引き起こした.すなわち,関節頭の中央部から後方部の軟骨層に軟骨組織の象牙化や,軟骨細胞の異常な集積が認められた.特に中央部では,軟骨層の消失が認められた.また,関節頭の前方部では軟骨組織の破壊が起きており,骨棘形成が認められ,その周辺部では軟骨細胞の異常な増殖が認められた.2.軟骨細胞にCTGFを遺伝子導入すると,CTGFの遺伝子発現は上昇し,感染後7日目でピークに達した.3.導入されたCTGF遺伝子により,軟骨細胞においてCTGFタンパクが産生されることが明らかとなった.4.CTGFの遺伝子導入により,軟骨細胞のプロテオグリカン合成は有意に上昇した.以上の結果より,軟骨細胞にCTGF遺伝子をアデノウイルスベクターを用いて遺伝子導入することにより,軟骨細胞の分化および増殖が促進されることが明らかとなり,軟骨修復へのCTGF遺伝子の遺伝子導入の有用性が示唆された.さらに,本研究で作製した変形性顎関節症モデルが,in vivoでの遺伝子導入による関節軟骨修復研究の進歩につながると推測される.遺伝子導入には,E1A,E1B,E3領域を欠失させた組換えアデノウイルス(5型)を用い,このアデノウイルスの欠失させた部位にCAG promotorと軟骨細胞の増殖,分化を促進する遺伝子として知られている結合組織成長因子(CTGF)の遺伝子を組み込んだAx1CACTGFを作製した。作製した遺伝子組換えアデノウイルスを軟骨肉腫由来軟骨細胞様細胞株HCS-2/8細胞(Takigawa et al.,Cancer Res,1989)およびウサギ肋軟骨,膝関節,顎関節から単離した初代培養軟骨細胞に感染させ,CTGFの遺伝子発現および軟骨細胞に対する作用を検討し,以下の知見を得た。1.骨細胞にアデノウイルスベクターAx1CACTGFを感染させることによりCTGFを遺伝子導入すると,CTGFの遺伝子発現は上昇し,感染後7日目でピークに達した。2.導入されたCTGF遺伝子により,軟骨細胞においてCTGFタンパクが産生されることが明らかとなった。3.CTGFの遺伝子導入により,軟骨細胞のDNA合成ならびに細胞増殖は有意に上昇した。4.CTGFの遺伝子導入により,アグリカンならびにX型コラーゲンの遺伝子発現が上昇した。以上の結果より,軟骨細胞にCTGF遺伝子をアデノウイルスベクターを用いて遺伝子導入することにより,軟骨細胞の分化および増殖が促進されることが明らかとなった。前年度に作製した組み換えアデノウイルスを用いたCTGFの遺伝子導入による欠損軟骨に対する修復効果をin vivoで検討するために,実験的軟骨欠損モデルを作製した。[方法]1.実験動物には体重2.53.0kgの日本白色ウサギを用いた。2.ネンブタールによる全身麻酔下にて,歯科用開口器による強制開口(開口量:35mm)を1日3時間,5日間行った。3.強制開口終了後1日目(開口群1),7日目(開口群2)に顎関節部を摘出し,通法に従い固定,脱灰,パラフィン包埋を行い,切片を作製した。作製した切片を用いて顎関節部の組織変化をヘマトキシリン・エオジン染色ならびにサフラニンO染色にて検討した。[結果]1.開口群1においては,対照群と比較して関節頭表層の明らかな繊維化が認められた。また,サフラニン染色の染色性の低下,すなわちプロテオグリカンの減少が認められた。しかし,形態的な変化はほとんど認められなかった。2.開口群2においては関節頭の中央部から後方部の軟骨層に軟骨組織の象牙化や,軟骨細胞の異常な集積が認められた。特に中央部では,軟骨層の消失が認められた。

また,関節頭の前方部では軟骨組織の破壊が起きており,骨辣形成が認められ,その周辺部では軟骨細胞の異常な増殖が認められた。以上の結果より,ウサギに強制開口させることにより,顎関節部に変形性顎関節症様の組織変化が引き起こされることが明らかとなり,このモデルが,in vivoでの遺伝子導入による関節軟骨修復研究の進歩につながると推測される。前年度の作製したウサギ変形性顎関節症の発症メカニズムについて解析した.[方法]1.実験動物には体重2.53.0kgの日本白色ウサギを用いた。2.ネンブタールによる全身麻酔下にて,歯科用開口器による強制開口(開口量:35mm)を1日3時間,5日間行った。3.強制開口終了後1日目(開口群1),7日目(開口群2)に顎関節部を摘出し,通法に従い固定,脱灰,パラフィン包埋を行い,切片を作製した。作製した切片を用いて顎関節部の組織変化をTUNEL染色にて軟骨細胞のアポトーシスの有無を検討するとともに,ニトロチロシンならびにMMP-3抗体を用いた免疫染色にて軟骨基質破壊に及ぼすメカニカルストレスの影響を検討した。[結果]1.開口群2においては関節頭前方部の骨棘形成周囲の肥大軟骨細胞にTUNEL陽性細胞が認められた.2.対照群ならびに開口群1においてはニトロチロシン陽性細胞は認められなかったのに対し,開口群2においてはTUNEL陽性細胞が認められた部位とほぼ同じ部位にニトロチロシン陽性細胞が認められた.また,MMP-3陽性細胞も同様に認められた.以上の結果より,ウサギに強制開口させることにより,顎関節部に変形性顎関節症様の組織変化が引き起こされることが明らかとなり,また,その軟骨基質破壊にはメカニカルストレスにより産生が誘導された一酸化窒素ならびにタンパク分解酵素であるMMP-3が関与している可能性が示唆された.
脳における酸化的ストレス状態のインビボ評価のための新規放射性標識抗酸化剤の開発

前年度に引き続き,新規放射性標識AsA誘導体の開発研究を進めた。今年度は脳移行性の向上を期待してデザインした高脂溶性AsA誘導体のうち2-IBAの標識合成と基礎評価および6-IPAの合成と基礎評価を行った。前年度標識合成を達成し基礎評価を行った化合物はその後の詳細な構造解析の結果,2-IBAではなく3-IBAであることが判明した。2-IBAについて,前年度に生じていたヨウ素125標識合成の低放射化学的収率の問題点は,HPLC条件検討を重ねることで解決し45%で得ることが可能となった。インビボ評価として,2-IBAについて実験腫瘍マウスを用いた生体内分布を調べた結果,脳移行と腫瘍集積は小さかった。甲状腺の集積は脱ヨウ素によるヨウ素の集積ではなく2-IBAかその代謝産物である可能性が考えられるなどの知見を得た。これらの事からアスコルビン酸の2,3位の置換基導入や脂溶性基については,さらなる検討を要すると考えられる。また当初計画していた6-IBAの合成は達成されていない。しかしながら代わりに6位にヨードフェニル基を導入した新たなアスコルビン酸誘導体6-IPAの合成に成功した。これは脂溶性の増大とヨウ素導入という当初の目的を達しているため6-IBAの代用になると考えている。6-IPAのインビトロ還元活性は72%であり,ある程度活性が保持されていた。またlogP値は-0.42とアスコルビン酸に比べて幾分高い値を示した。6-IPA標識合成については現在検討中であるが基礎評価を急ぎそれらの結果を解析してさらなる最適なドラッグデザインを行っていく予定である。優れた脳機能診断薬としての放射性標識抗酸化剤の開発を目的に,新規放射性標識AsA誘導体の開発に着手した。本研究では特に薬物の脳移行性に深く関わる脂溶性に注目し,脳移行性の向上を期待してデザインした高脂溶性AsA誘導体2-IBA,3-IBA,6-IBAのうち,AsAの2位または3位OH基にm-iodobenzyl基を有する2-IBAと3-IBAの合成に成功した。本年度はそれらの標識合成法の開発と基礎評価を行った。インビトロ評価において,DPPHに対する還元活性については2-IBAはアスコルビン酸としての還元活性が60%であり,ある程度活性が保持されていた。またlogP値0.78の脂溶性を示した。3-IBAは92%の還元活性を持つことが明らかとなった。標識合成については2-IBAはmelt法によって放射化学的収率45%でヨウ素125標識合成ならびに単離精製に成功した。3-IBAも同様にmelt法によってヨウ素125標識合成が可能であったが,放射化学的収率6%と低かった。しかしながら反応標識率は82%であったため,精製過程の改善により単離収率の改善は可能であると考え現在検討を行っている。インビボ評価として,2-IBAについて,健常ラットを用いた生体内分布を調べた結果,脳への移行は著しく小さかった。さらに派生的な研究としてマウス固形腫瘍への分布も調べたが,AsAとは異なり腫瘍への集積は小さかった。脱ヨウ素代謝の指標となる甲状腺への集積が高かったことから,2位へのm-iodobenzyl基の導入は生体内で不安定である可能性が考えられる。また,投与後短時間で肝臓および腎臓に分布することから,網内系にトラップされた可能性もある。3-IBAのインビボ評価を急ぐとともに,6-IBAの合成および評価を検討中である。
嚥下および嘔吐における上気道運動出力の中枢制御機構に関する研究

嚥下と嘔吐は上部消化管においては逆方向の運動であるが、咽頭および内外喉頭を含めた上気道筋群のそれらの運動時の活動には類似性と相違点がある。本研究では、まず嘔吐と嚥下時における各上気道筋およびその支配神経の運動出力パターンを系統的に除脳動物をもちいて観察し、その生理的意義とこれら2つの運動の中枢制御の関連性を解明することを目的とした。その結果、嚥下は嘔吐に比し末梢知覚のフィードバックの有無によらず、よりステレオタイプな出力パターンを示すことが明らかになった。また、嘔吐の最終段階でみられる上気道筋群の活動は嚥下とは本質的に異なること、嘔吐と嚥下のパターン形成機構は中枢内で密接に連係していることなどが明らかとなった。そこで、これら2つの運動における運動ニューロン、呼吸ニューロンおよびパターン形成器を構成していると考えられるインターニューロンについて検討した。無麻酔除脳ネコで筋弛緩剤により動物を非動化した'fictive'運動モデルを用いた実験の結果、舌下神経核内で単一ニューロンの活動についてみると、運動ニューロンの多くは、多機能性ではあるが均一ではないことが判明した。また、嚥下および嘔吐に重要な役割をもつ疑核内の咽頭および喉頭の運動ニューロンの細胞内記録の結果からも、これら2つの運動のパターン形成器から共通に入力を受ける細胞の存在が明らかとなった。さらに、嚥下は呼吸システムに深く関わる協調運動であることから、ニューロンネットワークのダイナミックな統合機構の存在が示唆された。嚥下および嘔吐時の上気道運動筋群への出力パターンを解析するために、無麻酔除脳ネコを用いそれぞれの筋電図活動を記録し分析した。嚥下は上喉頭神経の電気刺激により、嘔吐は催吐剤の投与ならびに迷走神経の電気刺激により誘発した。反射性に惹起される咽頭期嚥下は、喉頭の挙上および閉鎖、鼻咽腔の閉鎖、咽頭管の蠕動的収縮ならびに食道入口部を形成する輪状咽頭筋の弛緩開大により特徴づけられた。一方嘔吐は、律動的な横隔膜と腹筋の共縮によって特徴づけられるretch期と最終的に胃内容物を口腔より吐出するexpulsion期に分けることができた。またretch期には喉頭の声門閉鎖筋にも横隔膜と同期した活動が認められた。すなわち、声門閉鎖による胸腔の閉鎖腔化と同期して横隔膜および腹筋が共縮することにより胸腔には陰圧を、腹腔には陽圧を発生し、嚥下とは逆向きの推進力を生じているものと考えられた。さらにexpulsion期の後半期には咽頭収縮筋群は一斉に収縮活動を示し、嚥下と類似の活動が認められた。これら嚥下および嘔吐の運動出力が、脳幹のパターン形成器により中枢性に発生していることを確認するために、動物を筋弛緩剤により完全に非動化し実際の運動とそれによる固有知覚のフィードバックを排除した'fictive'運動モデルを用いて各上気道筋を支配する運動神経線維よりneurogramを選択的に導出しその出力パターンを解析した。前年度までの研究により嘔吐と嚥下のパターン形成機構は中枢内で密接に連係していることなどが明らかとなったので、これら2つの運動における運動ニューロン、呼吸ニューロンおよびパターン形成器を構成していると考えられるインターニューロンについて検討した。舌骨上下に付着するオトガイ舌骨筋geniohyoid(GH)muscleおよび甲状舌骨筋thyrohyoid(TH)muscleは、嚥下時に共同運動することにより喉頭を前上方へ挙上させ

喉頭前庭を閉鎖する役割を果たしている。無麻酔除脳ネコで筋弛緩剤により動物を非動化した'fictive'運動モデルを用いた実験の結果、TH、GHのいずれの運動ニューロンも上喉頭神経からの入力を認めなかったが、嚥下時にはほぼ同期した著しい活動増強を認め、嘔吐の吐出期の後半期にも同様の活動増強を認めた。それぞれの単一ニューロンの活動についてみると、これら2つの運動に共通に動員される運動ニューロンとそうではないものとが存在した。また、2つの運動に共通に動員される運動ニューロンにおいても、その活動様式は必ずしも一様ではなかった。すなわちこれらの運動ニューロンの多くは、多機能性ではあるが均一はないことが判明した。また、嚥下および嘔吐に重要な役割をもつ疑核内の咽頭および咽頭の運動ニューロンの細胞内記録の結果からも、これら2つの運動パターン形成器から共通に入力を受ける細胞の存在が明らかとなった。さらに、嚥下は呼吸システムに深く関わる協調運動であることから、ニューロンネットワークのダイナミックな統合機構の存在が示唆された。そこでこれら2つの運動に共通のインターニューロンの存在の検索を行った結果、多くの嚥下ニューロンは嘔吐の吐出期にも一定の活動様式を示した。嚥下、嘔吐の2つのパターン形成器に共通のインターニューロンの存在が確認された。
絶妙なルイス酸性を活用したエノール誘導体を求電子剤とするカップリング反応の確立

クロスカップリング反応は有機化学において、炭素ー炭素結合を形成するためのもっとも重要な手法の一つである。一般的に、求電子的なカップリングパートナーは有機ハロゲン化物が用いられているが、有機ハロゲン化物は高価であり、潜在的な毒性も危惧されるために、アルコールやエノール誘導体の利用が望まれている。そのような背景の中、本研究では、臭化ガリウム触媒存在下、様々なエノール誘導体とシリルケテンアセタールとのカップリング反応が進行することを見出した。また、臭化インジウムを用いることで、シリルケテンイミンとエノールエーテルとのカップリングが進行することも見出した。絶妙なルイス酸性を有する典型金属塩を活用し、基幹原料のエノール誘導体の革新的利用法の開発を目的として、現在でも未達成であるエノール誘導体と金属エノラート等の官能性有機金属化合物とのカップリング反応の確立を行い、新規官能性オレフィンを開発して新たな高機能性ポリマーの原料ならびに合成試剤の開発を行った。その結果、エノールエーテルやエノールエステル、ビニルカーバマート、エノールシリルエーテルなどの様々なエノール誘導体とシリルエノラートとの臭化ガリウム触媒によるカップリング反応を達成した。触媒としては臭化ガリウムが最適であり、フッ化ホウ素や塩化アルミニウム、塩化チタンなどの一般的なルイス酸や塩化パラジウム等の遷移金属触媒では目的生成物は得られなかった。中間体の観測により、本反応はエノール誘導体へのカルボガリウムを鍵段階とした付加-脱離機構で進行していることを明らかとした。また、反応速度の解析により、エノール誘導体の脱離基が律速段階に大きな影響を及ぼしていることが判明し、エノールエーテルでは脱離段階が、エノールエステルでは付加段階が律速段階であった。本反応を工業的な規模へとスケールアップできれば、基幹原料かつ環境調和型のエノール誘導体から直截的に高機能オレフィンの合成が可能となり、資源の枯渇が危惧される化石燃料の利用において高効率化・省エネルギー化・低コスト化と環境負荷低減化に革新的な発展が見込める。本反応の要は絶妙にルイス酸性を制御した典型金属塩を用いる点にあり、希少な遷移金属触媒を凌駕する新規典型金属触媒の開発は元素戦略の観点からも大きな意義のある結果が得られた。クロスカップリング反応は有機化学において、炭素ー炭素結合を形成させるための最も重要な手法の一つであり、様々な医薬品や機能性材料の合成に利用されている。一般的に、求電子的なカップリングパートナーは有機ハロゲン化物が用いられるが、有機ハロゲン化物は高価であり、潜在的な毒性も危惧されるために、アルコールやエノール誘導体の利用が望まれてきている。そのような背景の中、本研究ではエノール誘導体の一つであるエノールエーテルを用いたカップリング反応の確立を目指し、検討を行った。その結果、臭化インジウム触媒存在下、エノールエーテルとシリルケテンイミンとのカップリング反応が効率よく進行することを見出した。本反応には、様々なエノールエーテルとシリルケテンイミンが適用可能であり、一般性の高いαーアルケニル化ニトリルの合成法として確立できた。触媒としてはインジウム塩が特異的に効果があり、他の典型的なルイス酸であるフッ化ホウ素や塩化アルミニウムなどは触媒能を示さなかった。また、反応機構の解明も行った。添加剤として、トリメチルシリルブロミドが非常に効果的であり、これは触媒再生を加速しているということがわかった。さらに、反応速度実験から、この触媒再生が律速段階であることも明らかにした。本研究で開発したカップリング反応を利用して、医薬品の一つである抗高血圧症薬ベラパミルの形式全合成を行った。市販のニトリルから二段階で合成したシリルケテンイミンを用いることで容易に鍵中間体の合成が可能であった。当初の目標であったエノール誘導体を用いたカップリング反応を達成できたために、研究は順調に進展している。しかし、反応機構解明等をさらに詳細に行う必要があるため、研究期間延長を申請した。クロスカップリング反応は有機合成において、炭素ー炭素結合を形成させるための最も重要な手法の一つであり、様々な医薬品や機能性材料の合成に利用されている。一般的に、有機ハロゲン化物と有機金属化合物とのカップリング反応が一般的であるが、その有機ハロゲン化物は高価であり、潜在的な毒性も危惧されるために、アルコール誘導体やエノール誘導体の利用が求められている。このような背景の中、本研究ではエノール誘導体の一つであるエノール誘導体の一つであるエノールエーテルを用いたカップリング反応の確立を目指し、検討を行った。その結果、臭化ガリウム触媒により、エノールエーテルとシリルケテンアセタールとのカップリング反応が効率よく進行することを見出した。また、反応速度解析、計算化学、および中間体の観察などの詳細な反応機構の解明を行うことで、本反応がエノールエーテルへのカルボガリウム化を鍵とした付加・脱離機構で進行していることを明らかにした。本反応には、様々なシリルケテンアセタールとエノールエーテルが適用可能であった。また、エノールエーテル以外にもエノールアセテートも利用できた。また、シリルケテンイミンを求核種としたカップリング反応も臭化インジウム触媒によって進行することを見出した。トリメチルシリルブロミドの添加が重要であり、この添加効果により触媒的なカップリング反応が進行した。また、本反応を利用することにより、医薬品の一つである抗高血圧症薬ベラパミルの形式全合成を達成した。

一般的に、求電子的なカップリングパートナーは有機ハロゲン化物が用いられているが、有機ハロゲン化物は高価であり、潜在的な毒性も危惧されるために、アルコールやエノール誘導体の利用が望まれている。そのような背景の中、本研究では、臭化ガリウム触媒存在下、様々なエノール誘導体とシリルケテンアセタールとのカップリング反応が進行することを見出した。また、臭化インジウムを用いることで、シリルケテンイミンとエノールエーテルとのカップリングが進行することも見出した。エノール誘導体として、モデル反応のエノールエーテル以外にもエノールエステルやビニルカーバマート、エノールシリルエーテルが計画通り利用可能であることが判明したため。エノール誘導体とシリルエノラートのカップリング反応の詳細な機構解明を行う。有機化学中間体の観測は成功しているので、その中間体を単離し、各種分光学的手法を用いて、同定・評価を行う。また、シリルエノラート以外の求核種も順次検討を行う予定である。開発したエノール誘導体とシリルケテンアセタールのカップリング反応の反応機構の解明やその後の展開を行う必要が生じたため。求核種の基質展開を行っていたところ、意外にもシリルケテンイミンを用いた場合に、高効率で反応が進行したことが判明した。そこで、その反応系を予定以上に詳細に検討したために、次年度使用額が生じた。エノール誘導体とシリルケテンアセタールのカップリング反応の検討のための消耗品購入に充てる予定である。シリルケテンイミンを用いたカップリング反応の詳細な条件検討の続きを行っていく。残りの研究費はそれらに使用する試薬等の消耗品に充てる予定である。
PKNファミリーの細胞内伝達機構における機能解析

これまで蛋白リン酸化酵素PKNファミリーのメンバーとして、各組織に普遍的に存在するPKNαとPRK2の二つのアイソフォームの存在が明らかになっていたが、申請者らは、本年度の研究により、PKNの新たなアイソフォームを同定しPKNβと名づけた。PKNβは、PKNαやPRK2と同様、低分子量GTP結合蛋白質Rhoとの結合性を有していたが、さらにその制御領域内に、SH3蛋白質の結合コンセンサス配列を含むプロリンの豊富なストレッチを有しており、増殖因子受容体の下流で、Rhoとは異なるシグナルも同時に受けている可能性が考えられた。ノーザーンブロットおよび免疫化学的解析から、PKNβは、正常組織にはほとんど発現が認められず、腹瘍細胞系列において有意な発現を認めることがわかった。また、PKNβは、PKNαと異なって種々の腫瘍細胞系列において、核あるいは核周囲のゴルジ体に局在することも明らかになった。酵素学的解析から、PKNβは他のPKNファミリーのメンバー同様、自己リン酸化活性およびPKCと比較的似た基質特異性を示したが、しかしながら不飽和脂肪酸に対する反応性が他のメンバーに比べて乏しかった。これらの事実は、PKNファミリーの多様性を示すものであり、今後PKNβの生理機能に関する研究をすすめることにより、種々の増殖因子シグナルのクロストークや、転写制御、癌化のメカニズムの解明に寄与する可能性もあると考えられた。これらのデータは、Biochem.Biophys.Res.Commun.261,808-814,(1999)に報告した。
概日リズムの外環境への応答における時計蛋白質の翻訳後修飾の役割

ヒトを含む多くの生物は、睡眠/覚醒やホルモン分泌といった生理機能の日周期を外環境周期に同調させることで恒常性を維持している。この生理機能の日周的な変動は概日リズムと呼ばれ生物に内在する約24時間の周期性を有するフィードバックループ(分子時計)により形成される。マウスなどのモデル生物やヒトを対象とした解析により、分子時計の周期性制御や外環境周期への同調機構の異常が、発癌、代謝異常、躁鬱病などの疾患の病態に関連することが報告されている。現在までの研究は、細胞レベルの解析から、哺乳動物培養細胞を用いた解析より分子時計制御におけるSumo化、アセチル化、およびリン酸化といった翻訳後修飾を介した時計蛋白質の機能調節の重要性を見出してきた。特に、ストレス応答性MKK7シグナル経路が分子時計制御因子のリン酸化を介して、分子時計の周期を制御することを見出している。行動リズムといった個体レベルの概日リズムは脳の視交叉上核に存在する分子時計(中枢時計)により制御される。興味深いことに、視交叉上核においてMKK7シグナルは恒常的に活性化されており、またこの活性化が日周変動することが報告されている。この背景より、本研究は、MKK7シグナルが中枢時計制御を担う可能性を考え、神経成熟後の神経細胞特異的にMkk7を欠損するマウスを作出した。このマウスの行動解析を行った結果、リズム周期の伸長が観察され、MKK7シグナルが個体レベルの概日リズム制御に関わることが強く示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。ヒトを含む多くの生物は、睡眠/覚醒やホルモン分泌といった生理機能の日周期を外環境周期に同調させることで恒常性を維持しているが、この生理機能の日周的な変動は概日リズムと呼ばれる。マウスなどのモデル生物やヒトを対象とした解析により、概日リズムの周期性制御や外環境周期への同調機構の異常が、躁鬱病、代謝異常、発癌などの疾患の病態に関連することが報告されている。概日リズムは、転写・翻訳に依存した約24時間の周期性を持ったフィードバックループである分子時計により制御される。特に哺乳動物の分子時計は、転写活性化因子CLOCK、BMALおよび転写抑制因子CRY (CRY1及び2)、PER (PER1, 2,及び3)の時計蛋白質により構成される。CLOCKはBMALと二量体を形成しCry及びPer遺伝子の転写を活性化し、一方CRYとPERはCLOCK:BMAL1二量体に直接結合しその転写活性を抑制する。分子時計の転写の活性化と抑制の周期は約24時間になるように調節されており、従ってその標的遺伝子の発現および標的遺伝子の制御する生理機能には日周性が与えられる。現在までに、分子時計の日周性形成にリン酸化修飾といった翻訳後修飾を介した時計蛋白質の機能調節が重要な役割を担うことが報告されている。本研究は、分子時計の周期調節を担う翻訳後修飾が様々な刺激に応答することに注目し、「時計蛋白質の翻訳後修飾が分子時計の外界周期への同調の分子機構として機能する」可能性を検討した。特に、ストレス応答性キナーゼMKK7の概日リズム制御における役割に関してマウス個体を用いて解析し、MKK7が個体レベルの概日リズムの外環境への同調制御を担うことを支持する知見を得た。概日リズムを制御する分子時計は細胞自律的に制御されるため培養細胞に存在する。本研究は、分子時計の標的遺伝子のプロモーター下で発光酵素Luciferaseを発現するレポーターを用いてLuciferase活性の変動をリアルタイムでモニターすることにより胎児繊維芽細胞の分子時計を可視化した。

次に、既知のMKK7シグナル経路の活性化刺激である酸化ストレス、紫外線、浸透圧変化などの分子時計の周期性および振幅への影響を解析し、分子時計の位相を変化させるシグナル(同調シグナル)を探索し、分子時計制御に影響を与える新規の同調刺激を同定した。本年度の研究は、概日リズムの外環境への同調メカニズムを個体レベルで解析するための遺伝子改変マウスの準備を完成させ、解析を進めている。また、新規ゲノム編集技術および行動解析を導入し、迅速に遺伝子改変個体の作出およびその概日リズム解析を行うシステムを確立した。今後の研究は、同定した同調シグナルが分子時計に影響を与えるメカニズムについて、特に時計蛋白質の翻訳後修飾に注目し解析を進める。また、同定した同調シグナルによる分子時計または時計蛋白質の翻訳後修飾の調節へのMKK7シグナルの関与を検討するために、分子時計の可視化を用いた解析をMkk7-KO MEFを用いて行う。上記の生化学的解析に加えて、マウスをモデル生物として用いた概日リズムの外環境への同調メカニズムの解析を継続する。また、細胞レベルの解析により同定した同調シグナルが個体レベルの概日リズムに与える影響およびその分子メカニズムに関してゼブラフィッシュをモデル生物として解析を進める。
二次元励起子系の非線形光学応答

非線形光学応答を考える上で、結晶の配列や次元は非常に大きな影響を及ぼすと考えられ、より高効率、高速な光非線形光学応答を実現する上で重要な要素である。そこで、本研究では二次元励起子系を対象に、励起子輻射緩和や非線形光学応答に、系の次元性がどのように反映されるかを実験的に解明することを目的としている。物質系として、分子性結晶アントラセンの表面励起子、および半導体GaAs単一量子井戸を取り上げた。アントラセン単結晶は気相成長法により作成した。まず反射スペクトル測定を行い、十分良質な結晶が作成されたことが確認された。次に、フェムト秒ポンププローブ分光法を行った結果、非線形信号が表面第1層、第2層励起子共鳴で強く増強されることが観測された。また、実験結果から励起子の位相緩和時間を評価した結果、表面第1層の励起子の位相緩和が第2層励起子に比べ3倍程度速いことがわかった。これは、励起子の面内への閉じ込めの度合いが、第1層の方が第2層より強いことを反映したものと考えられ、系の次元性の効果が観測されたものと考えられる。二次元フレンケル励起子系の位相緩和を、時間軸上で直接測定したのは本研究が初めてである。次に、半導体二次元励起子系としてGaAs単一量子井戸微小共振器取り上げた。半導体量子井戸構造では、励起子の閉じ込めを反映してその非線形光学応答が、バルクに比べ大きくなることが知られている。本研究ではこのGaAs単一量子井戸を光の波長程度の微小共振器構造にすることで、光との相互作用を強め、実効的な非線形性をより増強することを試みた。測定手法として、自己励起型位相共役波発生を試み、共振器-励起子二重共鳴で非線形応答が非常に強く増強される(1000倍程度)のがわかった。
心筋組織酸素飽和度の光学的測定による常温心筋保護法の研究

常温心筋保護法における冠潅流停止中の心筋酸素代謝および潅流停止許容時間を解明する目的で、大動脈遮断中の常温心筋保護の実験モデルを作成し、心筋組織酸素代謝を光学的に測定した。成犬で人工心肺装置を用いて常温完全体外循環を開始した。酸化および還元ヘモグロビンの近赤外光に対する吸収変化を利用した、組織酸素飽和度および組織ヘモグロビン量測定装置用センサーを心臓に貼付し、これらを連続測定した。晶質性心筋保護液と人工心肺回路血を混合してカリウムを加え37°Cに加温した心筋保護液を作成し、これを大動脈基部から毎分100mlで5分間冠潅流した。ついで冠潅流を10分、15分、および20分間停止させ、これを3回繰り返した。大動脈遮断を解除し心拍動を再開させ、30分間の補助循環ののち体外循環から離脱させた。心筋保護液潅流停止直前と潅流再開直前に心筋を生検し、心筋内ヌクレオチド含量を測定した。また術前後の心機能を測定した。心筋酸素飽和度は冠潅流と同時に上昇し1-2分でプラトーに達し、冠潅流停止後3分で底値に達した。15分と20分停止群では3回目の冠潅流時に心筋酸素飽和度の上昇は緩除となり、微小冠循環系の異常が推測された。組織ヘモグロビン量も同様の傾向を示した。術後心機能は10分停止群では低下しなかったが、15分と20分停止群では低下した。アデノシン三燐酸は10分停止群では低下しなかったが、20分停止群では低下した。心筋酸素代謝諸指標の経時的変化、心筋内ヌクレオチド含量および術後心機能の検討から、常温心筋保護中の冠潅流停止許容時間は10分と結論された。本研究によって常温心筋保護中の光学的心筋モニタリング法が確立され、心臓手術成績の向上が期待される。
邦銀のアジア進出と国際競争力

邦銀の競争力を、中国市場における経営効率の比較、シンジケートローン市場における貸出行動の特徴、インドネシアにおけるプロジェクトファイナンス市場でのネットワークから分析することができた。経営効率の観点から邦銀の効率性はHSBCやStandard Chartered Bankといった上位行よりも高かったものの、日系企業に特化した業務展開では業容拡大に限界がある。シ・ローン市場での邦銀の特徴としては、日系企業・外資系企業が主な貸出先であり、短期資金の供給を選好していることであった。インフラ金融における邦銀の特徴は、外国銀行とシンジケートを組成していること、外貨建て貸出を選好していることであった。本研究は邦銀の国際競争力を対象とした分析であり、注目が集まる国際インフラ金融の分野における競争を取り上げた。分析課題は邦銀がインドネシアのプロジェクトファイナンス市場でどのような位置を占めるかをシンジケート組成の観点から明らかにすることであった。この課題に答えるために分析手法としてネットワーク分析を採用し、ソシオグラムによるネットワーク構造の図示を試みた。また、クラスターの抽出によるグループ分けは従来にない切り口から市場構造を描く作業であった。分析の結果、シンジケートの組成が邦銀を中心とする外国銀行のグループと国有銀行を中心とする現地銀行のグループとに分断されていることが観察できた。一般的な想定とは異なり、高度な金融スキルが必要だと考えられているプロジェクトファイナンスに現地銀行が積極的に参加している実情が明らかになった。また、グループ間の差異を案件の属性から確認したところ建値通貨に違いがあることが分かった。本研究は国際銀行業、とりわけ邦銀が展開する国際競争について従来にない切り口から構造を明らかにした点で学術上の貢献があると評価できよう。また、インフラ輸出は日本の成長戦略の1つであり、その促進に向けた基礎資料を提供したことに本稿の社会的な意義がある。ただし、ここで示した市場構造はインドネシア一国で観察されたもので、シンジケートの組成が分断されているという構造が一般的な傾向なのかどうかは、他国についての検証を重ねる必要がある。邦銀のアジア進出について、シンジケートローン市場における競争動向を調査、分析した。調査対象とした国はメガバンクの店舗展開が著しい中国とした。分析のためにトムソン・ロイター社のデータベースDealScanを購入し、このデータベースが提供する貸出案件の条件や借り手の属性についてのミクロ・データを利用して邦銀の中国における貸出行動を実証分析した。分析に際して設定した課題は、邦銀がアレンジャーとして参加する貸出案件にはどのような特徴があるかである。この課題に答えるため、融資金額、融資期間、建値通貨といった融資条件や、借り手については日系企業、外資系企業、上場企業、上場企業の子会社といった属性についてデータセットを構築して、邦銀が参加していない案件との比較分析をMann-WhittneyのU検定によって差異を析出した。次に、邦銀が参加した案件の特徴を複数の要因を制御した上で明らかにする作業を行った。この作業は、邦銀参加の有無についてのダミー変数を被説明変数とし、上述の融資条件や借り手の属性を説明変数として回帰させるプロビット・モデルを用いた。また、説明変数の中で被説明変数への影響が大きいものを特定するため限界効果も算出した。分析の結果、邦銀が参加するシンジケートローンは融資金額が大きく、融資期間が短い。また、米ドル建て貸出、運転資金の比率が高いことが分かった。さらに、借り手の属性として最も顕著なものは日系企業への貸出の比率が高いことであった。こうした研究結果は日本の成長戦略における戦略的分野である金融業のアジア進出の実態を解明するための基礎資料を提供するものである。また、国際銀行業の競争構造を従来にない切り口から明らかにしたという学術的貢献もある。最終年度は大きな注目を集めている地方銀行の国際業務を分析した。国際業務は地銀の成長戦略と密接な関わりがあるため、このトピックは地銀にとって高い重要性を持つ。国際業務の中でも収益への貢献が期待される国際シンジケートローンを取り上げた。地銀の第一次国際化と第二次国際化とについて参加案件を比較し、国際シ・ローン市場における地銀の貸出構造の特徴を探った。具体的には2つの課題に取り組んだ。第一の課題として、2つの期間において地銀の参加案件にどのような違いがあるかを調査した。分析の結果、地銀の国際シ・ローンへの参加状況と参加案件にいくつかの違いを観察した。まず、第一次国際化における地銀の活動は第二次国際化を凌駕していた。第一次国際化は地銀の幅広い参加という特徴を持つ。次に、借り手の国籍に大きな変化が確認できた。アジア諸国の借り手への融資は第二次国際化では半減し、その存在感を低下させた。建値通貨については、第二次国際化において円建て貸出が大幅に増加したことを観察した。

参加行数で捕捉するシンジケート規模は第一次国際化の方がかなり大きかった。第二の課題は、地銀が参加を選好する国際シ・ローンはどのようなタイプのものかを調査した。この課題に答えるためプロビット分析を採用し、限界効果を算出した。推計結果は地銀の貸出行動は2つの期間で似通っていることを示すものであった。地銀の参加を促進する案件の特徴は小さな融資額、大きなシンジケート規模、資金使途が通常業務であることが観察された。こうした選好は地方銀行のリスク負担能力や審査能力が限定的であることを反映していると推察される。一方、貸出行動に2つの差異が確認できた。1つには、第二次国際化において円の存在感が増大したことである。もう1つは、地銀の参加に対する格付けの影響が大きくなったことであり、背景には市場環境や借り手の行動の変化があると推測できる。国際金融論研究計画調書に記載した研究計画では平成25年度に邦銀の貸出行動についての分析を進めることを掲げている。研究計画のとおり、インドネシアのプロジェクトファイナンス市場を取り上げて邦銀の市場における競争的位置づけの分析を完了している。この研究成果は平成25年9月に日本金融学会秋期大会において学会報告を済ませた。さらに論文は平成26年2月に学会誌で発表済みである。このため、現在までの達成度を、おおむね順調に進展している、と評価した。交付申請書に記載した「研究の目的」には3年間の研究期間に2つの分析を実施することを掲げた。平成24年度はそのうちの1つである、シンジケートローン市場を取り上げて邦銀と外国銀行との競合関係を探り、貸出行動の違いを取引案件のデータから統計的に析出して競争構造を浮き彫りにする、というものであった。上述した研究実績の概要から分かるように、平成24年度は1つ目の分析を着実に実行し、すでに、研究結果を論文としてまとめ、学会誌に投稿を済ませている。邦銀の国際競争力を検証するもう1つの分析視角である経営効率の比較に取り掛かる。比較に際しては事前に収集・整理した進出状況に関連する定性情報を踏まえた上で比較の枠組みを構築する。なお、効率の差異を説明する要因を特定するために費用関数の推定といった追加的な分析も計画している。経営効率の比較に使用するデータはビューローバンダイク社の銀行情報データベースBankScopeを購入してデータセットを構築する。手法とソフトウェアについて応募者は既に使用した経験があり速やかに分析に取り掛かることが可能である。また、効率性測定にはoperatingアプローチとvalue-addedアプローチの2つの手法を採用して計測の失敗を回避する安全策を取る。万一、データ包絡分析が不調に終わる場合は財務比率を用いて邦銀と外国銀行とを比較するという代替策を用意している。平成24年度の研究対象がシンジケートローンという特定の貸出
クロマチン修飾反応を制御する新規天然物質の探索と構造解析

イトマキヒトデの胚発生において,細胞分化の開始と呼応して中期胞胚期でヒストンの架橋二量体が初めて出現する。ヒストンの架橋二量化によって遺伝子発現が制御され,胚細胞の分化が進行すると考えられる。この仮説を実証するためのツールとして,ヒストンの架橋二量化の選択的阻害剤の開発が切望されていた。本研究では,イトマキヒトデの胚発生を初期原腸胚の段階で選択的に停止させる活性及びヒストン二量体の生成を阻害する活性を指標として,500株の放線菌の培養液から生理活性物質を探索した。その結果,2種の未同定放線菌から2種の新規Piericidine類及び2種の新規アセチルアミド類を単離構造決定した。さらに,Micromonospora属の放線菌のブタノール抽出物中から選択的で非常に強い阻害活性を示す3種の新規生理活性物質を見出し,Micromonospolides A, B, Cと命名した。一次元および二次元NMRスペクトルデータ等からバフィロマイシン型の16員環ラクトンを持った新規マクロライド類と構造決定した。絶対配置は,改良Mosher法および化学変換によって決定した。これら新規マクロライド類はいずれも,イトマキヒトデの胚発生を初期原腸胚の段階で停止させる活性を示した。イトマキヒトデ胚では中期胞胚期にヒストンが架橋二量化することが見出されている。Micromonospolide A (0.1μg/mL)の存在下で発生停止したイトマキヒトデ胚について,ヒストン二量体の有無を調べた結果,ヒストン二量体は生起していなかった。これらのことから,Micromonospolide Aは,イトマキヒトデ胚の中期胞胚期でヒストン二量体の形成を妨げることによって,胚発生を停止させたものと考えられた。また,微量成分としてMonosporinと命名したMicromonospolide A関連化合物を単離し,Inositol, Glucosamine, Cysteineから構成される部分構造を有することを明らかにした。イトマキヒトデの胚発生を初期原腸胚の段階で選択的に停止させる活性およびヒストン2量体の生成を阻害する活性を指標として,放線菌の培養液から生理活性物質を探索した結果,Micromonospora属の放線菌のブタノール抽出物中から3種の新規生理活性物質を見出し,Micromonospolides A, B, Cと命名した。イトマキヒトデ胚では中期胞胚期にヒストンが架橋2量化することが見出されている。Micromonospolide A(0.1μg/mL)の存在下で発生停止したイトマキヒトデ胚について,ヒストン2量体の有無を調べた結果,ヒストン2量体p28は生起していなかった。Micromonospolide AのnTGaseに対する効果を調べた結果,Micromonospolide AはnTGaseを阻害しなかった。nTGaseを特異的に認識する抗体を用いてWestern blotting解析を行った結果,Micromonospolide Aを0.1μg/mLの濃度で添加した海水中で発生したイトマキヒトデ胚にはnTGaseが検出されなかった。これらのことから,Micromonospolide Aは,イトマキヒトデ胚の中期胞胚期でnTGaseの合成を阻害することによってヒストン2量体の形成を妨げ,胚発生を停止させたものと考えられた。

イトマキヒトデの胚発生において,細胞分化の開始と呼応して中期胞胚期でヒストンの架橋2量体が初めて出現する。ヒストンの架橋2量化によって遺伝子発現が制御され,胚細胞の分化が進行すると考えられる。この仮説を実証するためのツールとして,ヒストンの架橋2量化の選択的阻害剤の開発が切望されていた。本研究では,イトマキヒトデの胚発生を初期原腸胚の段階で選択的に停止させる活性及びヒストン2量体の生成を阻害する活性を指標として,500株の放線菌の培養液から生理活性物質を探索した。その結果,2種の未同定放線菌から2種の新規Piericidine類及び2種の新規アセチルアミド類を単離構造決定した。さらに,Micromonospora属の放線菌のブタノール抽出物中から選択的で非常に強い阻害活性を示す3種の新規生理活性物質を見出し,Micromonospolides A, B, Cと命名した。一次元および二次元NMRスペクトルデータ等からバフィロマイシン型の16員環ラクトンを持った新規マクロライド類と構造決定した。絶対配置は,改良Mosher法および化学変換によって決定した。これら新規マクロライド類はいずれも,イトマキヒトデの胚発生を初期原腸胚の段階で停止させる活性を示した。イトマキヒトデ胚では中期胞胚期にヒストンが架橋2量化することが見出されている。Micromonospolide A (0.1μg/mL)の存在下で発生停止したイトマキヒトデ胚について,ヒストン2量体の有無を調べた結果,ヒストン2量体は生起していなかった。これらのことから,Micromonospolide Aは,イトマキヒトデ胚の中期胞胚期でヒストン2量体の形成を妨げることによって,胚発生を停止させたものと考えられた。また,微量成分としてMonosporinと命名したMicromonospolide A関連化合物を単離し,Inositol, Glucosamine, Cysteineから構成される部分構造を有することを明らかにした。
外部刺激に応答して薬物の放出を制御するマイクロカプセルの開発

外部刺激に応答して薬物の放出を制御できる新規なマイクロカプセルを作製した。平成3年度においては、(A)光感応性基を組み込んだポリアクリル酸ーポリエチレンイミンコンプレックスカプセルの物質透過性の光による制御、および(B)薬物に対して高結合性を有する高分子を封入したカプセルからの薬物の放出挙動に関する研究を行った。(A)4ーブロモスチレンとミヒラ-ズケトンよりグリニャ-ル反応によって、4ービニルトリフェニルメタンロイコヒドロキシド(VTL)を合成し、これをアクリル酸(AA)と共重合させて、VTLーAA共重合体を得た。このVTLーAA共重合体とポリアクリル酸ナトリウムの1:1混合溶液をポリエチレンイミン水溶液に滴下し、さらに水溶性カルボジイミドを用いて架橋することによって、光応答性基をカプセル膜に組み込んだポリアクリル酸ーポリエチレンイミンコンプレックスカプセル(直径5mm)を調製した。透過物質としてpートルエンスルホン酸(TSA)を用い、カプセルからの放出の光応答性を調べた。その結果、紫外光を照射しない場合、透過係数が9.8x10^<ー7>cm s^<ー1>であるのに対して、照射下においては9.4x10^<ー6>cm s^<ー1>に増大することがわかった。またカプセルからのTSAの放出速度は紫外光照射on,offによって可逆的に変化することがわかった。(B)抗癌剤メトトレキセ-ト(MTX)に対して高結合性を有するN,Nージメチルアミノプロピルアクリルアミド4級塩ースチレン共重合体を封入したポリテレフタロイルピペラジンカプセル(直径5mm)を調製し、内部に取り込ませたMTXの放出を調べた。その結果、高分子のMTXに対する結合定数が大きくなるほど放出速度が小さくなること、またカプセルからのMTX放出速度はイオン強度や温度によって制御できることがわかった。
胸腺におけるT細胞レパトワ決定機構の解明

免疫応答は、生体にとって感染に対する必須の防御機構であり、それはT細胞受容体(TCR)が自己の主要組織適合抗原(MHC)に結合した病原体由来の抗原ペプチドを認識することにより惹起される。病原体の高度な多様性に対応すべく、TCR遺伝子は遺伝子の再構成及びat randomな塩基の挿入、欠失により理論上10^<16>を越える多様性を獲得することが可能である。しかしながら、実際には、末梢で免疫応答に寄与するTCRは・自己抗原ペプチドに反応しない(免疫寛容)、および外来抗原ペプチドを自己MHCに結合した形でのみ認識する(MHC拘束)という特徴を有し高度に選択されている。これは、主に胸腺内T細胞分化過程において、TCR-MHC-自己抗原ペプチド相互作用の結果もたらされる正と負の選択を介してなされる。未熟胸腺細胞に'生'と'死'という相反する運命を課す分子機構は免疫学の最大の疑問であった。特に、正の選択における自己抗原ペプチドの関与に関しては多くの仮説が提唱されてきた。しかしながら、MHCには数千の自己抗原ペプチドが結合しているため、分子レベルでの解析は困難であった。この問題を克服するために、我々は、1種類の抗原ペプチドのみを結合したMHCを発現する遺伝子改変マウスを作製することで、1)同じMHC/自己抗原ペプチド複合体が胸腺での発現量に応じて正の選択のリガンドにも負の選択のリガンドにもなり得ること、及び2)正の選択においても特異的なTCR-ペプチド相互作用が関与し得るが、その際3)TCRと直接相互作用を持つアミノ酸残基の側鎖の大きさや荷電の有無が、選択されるT細胞レパートリーの多様性に影響することを明らかにすると共に、4)この複合体の胸腺での発現が著しく低い場合、不完全な負の選択の結果、全身性の自己反応性が惹起され、その結果臓器特異的自己免疫疾患が起こることを示した。T細胞は胸腺での分化過程において、そのTCRによるMHC/自己抗原ペプチド複合体認識の結果、正及び負の選択を受け、免疫応答に寄与するT細胞レパートリーが決定される。我々は、これまでにI-A^b/Eα52-68複合体を単一MHCクラスII/ペプチド複合体として発現するトランスジェニック-ノックアウトマウス(Tg-KOo)を樹立し、TCRβ導入遺伝子の存在下でそのTCRαレパートリーを解析することで、正の選択においても特異的TCR-ペプチド相互作用が関与し得ることを明らかにした。そこで、ペプチドの構造が正の選択に及ぼす影響を解析する目的でEα52-68のTCRコンタクト部位を詳細に解析し、これに相当する60位のロイシンをリジンに置換したアナログペプチド(60K)を単一I-A^b/ペプチド複合体として発現するマウスを樹立し、TCRα鎖、β鎖共に自由度を有する生理的条件下で、CD4^+T細胞分化を比較解析した。I-A^b/Eα52-68複合体上で、極めて多様なTCRを発現する多くのCD4^+T細胞が分化するのに対して、I-A^b/60K複合体を発現する2系統のTg-KOにおいては、胸腺における複合体発現がI-A^b/Eα52-68複合体のそれと同程度であるにもかかわらず、CD4^+T細胞の分化は極端に減少しており、またそのTCRはCDR3ループの長さやアミノ酸組成の点で極めて制限されていた。以上より、抗原ペプチドの構造そのものが、正の選択の効率に影響することを世界に先駆けて明らかにするとともに、正の選択における'degeneracy'と'specificity'が選択に関与する抗原ペプチドによって決定されるというモデルを提唱した。

T細胞は胸腺での分化過程において、そのTCRによるMHC/自己抗原ペプチド複合体の認識の結果、正及び負の選択を受け、免疫応答に寄与するT細胞レパートリーが形成される。我々は2つのアプローチを用いてT細胞レパートリー形成の分子機構の解明を試みた。第1に、1アミノ酸残基のみ異なる2種類の自己抗原ペプチド上で分化したT細胞レパートリーを比較することにより、自己抗原ペプチドのアミノ酸残基の側鎖の大きさや荷電の有無がT細胞レパートリーの多様性に影響を与えることを明らかにした。第2に、TCRα鎖のミニジーンを導入したトランスジェニックマウスの様々な分化段階の胸腺細胞上で発現するTCRを詳細に解析することにより、正の選択を経てある特定のTCRα鎖の頻度が増加することを見出した。以上の結果より、正の選択において自己抗原ペプチドが重要であり、特異的TCR-ペプチド相互作用を通じてT細胞レパートリーの偏りが生じる可能性が示唆された。また、研究分担者であるD.Mathis教授の研究室よりC.Benoist教授が2月末に九州大学・生体防御医学研究所を訪れ、セミナーを行うと同時に、今後の共同研究についての討議を行った。免疫応答は、生体にとって感染に対する必須の防御機構であり、それはT細胞受容体(TCR)が自己の主要組織適合抗原(MHC)に結合した病原体由来の抗原ペプチドを認識することにより惹起される。病原体の高度な多様性に対応すべく、TCR遺伝子は遺伝子の再構成及びat randomな塩基の挿入、欠失により理論上10^<16>を越える多様性を獲得することが可能である。しかしながら、実際には、末梢で免疫応答に寄与するTCRは、自己抗原ペプチドに反応しない(免疫寛容)、および外来抗原ペプチドを自己MHCに結合した形でのみ認識する(MHC拘束)という特徴を有し高度に選択されている。これは、主に胸腺内T細胞分化過程において、TCR-MHC-自己抗原ペプチド相互作用の結果もたらされる正と負の選択を介してなされる。臓器特異的自己免疫疾患の感受性がある特定のMHC対立遺伝子と相関することが知られている。この相関のメカニズムとして疾患感受性MHC分子が臓器由来の抗原ペプチドをT細胞に提示することで疾患発症に至るというモデルが一般的である。しかしながら一方、自己免疫を惹起するT細胞は疾患感受性MHC上で分化することより、胸腺でのT細胞レパートリー形成がMHCによる疾患感受性を規定している可能性も考えられるが、末梢での抗原提示と胸腺でのレパートリー形成を分断して解析する事が不可能なため、この可能性につき検討されていない。我々は、1種類の抗原ペプチドのみを結合したMHC分子を発現するtransgenic-knockout mouseのうち、胸腺での発現が著しく低い1系統において、negative selectionが不十分であり、その結果、選択に関わったMHC-ペプチド複合体に対する全身性の自己反応性が惹起され、最終的に臓器特異的自己免疫疾患発症に至ることを示した。このことは、MHCがT細胞レパートリー形成を介して自己免疫病発症に関与する可能性を示唆するもめである。