hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
最適とろみ濃度決定のための口腔・咽頭機能アセスメント

健常若年者28名(男性21名,女性7名,22-26歳)を対象にVEについて水と1%(中濃ソース程度)および3%(サウザンアイランドドレッシング程度)のとろみ水各5mlを用いて,またALS患者18名(男性9名,女性9名,38歳-70歳)に対しては同試験食品各3mlを用いてVFを実施し,嚥下機能と最適とろみ濃度との関連性を検討した.健常若年者においてはとろみ濃度が高くなるにつれ咽頭内残留が増加し,過去の報告と同様であった.ALS患者においては最大舌圧と口腔内残留との間に関連性を認め,舌圧が10kPa未満となった重度嚥下障害患者では3%とろみ水で誤嚥のリスクを回避できることが明らかとなった.本年度は広島大学病院にて得られた嚥下内視鏡検査(VE)のデータに加えて,協力施設における嚥下造影検査(VF)データを用い研究を実施した。<研究1>健常若年者における口腔・咽頭機能ととろみ濃度との関連性を検討することを目的とし、健常若年者(男性14名,女性5名,年齢22ー26歳)でいずれの者も個性自由咬合を有し摂食・嚥下障害の自覚症状のない者を対象とした。液体5ccならびにとろみ水5cc(0.5,1,2,3%)をランダムに嚥下させ,その様子をビデオ嚥下内視鏡を用いて評価した。嚥下機能の主観的評価(誤嚥、口腔・咽頭内残留、早期咽頭流入)および客観的評価(嚥下指示ーホワイトアウト間の時間計測)を実施した。その結果、各被験者で誤嚥を認めなかったものの、内視鏡の存在により早期咽頭流入を示すものが大半であった。粘性の違いと、嚥下指示からホワイトアウトまでの所要時間については有意差を認めなかったが、咽頭内残留に関しては液体ととろみ1,2,3%を比較すると各々有意差を認めた。<研究2>ALS患者における口腔・咽頭機能ととろみ濃度との関連性を検討することを目的とし、ALS患者(男性2名、女性3名、年齢45ー70歳)を被験者として液体3ccならびにとろみ水3cc(1%,3%)をランダムに嚥下させ、その様子をVFを用いて評価した。嚥下機能の主観的評価(誤嚥、口腔・咽頭内残留、早期咽頭流入)および客観的評価(口腔通過時間、食道開大時間、咽頭反射時間、咽頭通過時間)を実施した。その結果、各被験者とも誤嚥を認めなかったが、すべての被験者で早期咽頭流入を認めた。客観的評価においては粘性の違いで所要時間に有意差を認めなかった。被験者の疾患進行レベルが異なるため嚥下障害にも差異を認めたが、全般的には舌運動・咽頭収縮力の低下や喉頭挙上量の減少等で口腔・咽頭内残留量が多くなる傾向を認めた。方法:発症初・中期のALS患者13名(男性7名,女性6名,38-70歳)の計27回のVF検査について,水3ml,1%(中濃ソースと同レベル)と3%(サウザンアイランドドレッシングと同レベル)のとろみ水各3mlを用いて嚥下機能と最適とろみ濃度との関連性を検討した.定性評価(誤嚥,喉頭侵入,口腔・咽頭内残留,AsRスケール,喉頭侵入・誤嚥の重症度スケール)を行った.造影剤にはビジパーク270TM(第一三共,東京)を用い2倍希釈の水溶液を作成し,とろみ調整剤にはつるりんこQuicklyTM(クリニコ,東京)を使用した.加えて,反復唾液飲みテスト(RSST),最大舌圧測定,ディアドコキネシス,発話明瞭度検査を実施した.結果:RSST,最大舌圧,ディアドコキネシス,発話明瞭度(最大舌圧4.8-39.7kPa, /pa/1.4-7.6回/sec, /ta/1.2-8.0回/sec, /ka/1.2-6.8回/sec,明瞭度1-5)など嚥下機能のレベルはさまざまだった.最大舌圧と口腔内残留との間に関連性が示され,20kPa未満を示した者の多くで口腔内残留を認め,トロミ濃度が高くなるにつれ奥舌から舌根部にかけての付着が顕著となり,その残留量も増加傾向であった.10kPa未満を示した者では食塊保持が困難となり,とろみ0%と1%では早期咽頭流入が起こっていた.とろみ3%では同様の場面でも,物性の影響で早期咽頭流入には至らず喉頭侵入や嚥下前誤嚥を回避できた.加えて,最大舌圧,ディアドコキネシス,発話明瞭度等はある程度維持できているものの,喉頭拳上量の低下に伴う喉頭閉鎖不全を認める者も存在した.考察:口腔機能,とくに最大舌圧と舌軟口蓋閉鎖との間に関連があり,食塊保持困難や早期咽頭流入から影響を受ける嚥下前誤嚥や咽頭内残留による嚥下後誤嚥を鑑みると,ある程度高濃度のトロミも必要であることが示された.

健常若年者28名(男性21名,女性7名,22-26歳)を対象にVEについて水と1%(中濃ソース程度)および3%(サウザンアイランドドレッシング程度)のとろみ水各5mlを用いて,またALS患者18名(男性9名,女性9名,38歳-70歳)に対しては同試験食品各3mlを用いてVFを実施し,嚥下機能と最適とろみ濃度との関連性を検討した.健常若年者においてはとろみ濃度が高くなるにつれ咽頭内残留が増加し,過去の報告と同様であった.ALS患者においては最大舌圧と口腔内残留との間に関連性を認め,舌圧が10kPa未満となった重度嚥下障害患者では3%とろみ水で誤嚥のリスクを回避できることが明らかとなった.本年度は広島大学病院にて得られたVEデータを用い研究を実施した.●目的健常若年者における口腔・咽頭機能ととろみ濃度との関連性を検討すること●方法健常若年者(男性7名,女性2名,年齢22ー26歳)を被験者とし,いずれの者も個性自由咬合で摂食・嚥下障害の自覚症状のない者とした.液体5cc,10ccならびにとろみ水5cc(5, 10, 15, 20, 30%濃度)をランダムに嚥下させ,その様子を表面筋電図(Myotrac InfinitiTM,Thought Technology Ltd., USA)とビデオ嚥下内視鏡(VE)(Naso-Pharyngo-laryngo FiberscopesTM, Pentax, Japan)を用いて評価した.嚥下反射時の顎二腹筋前腹および舌骨下筋群における筋活動量ならびに嚥下機能の主観的評価(誤嚥,口腔・咽頭内残留,早期咽頭流入)および客観的評価(嚥下指示-ホワイトアウト間の時間計測)を実施した.●結果各被験者で誤嚥を認めなかったものの,内視鏡の存在により早期咽頭流入を示す者が大半であった.粘性が高くなるにつれ,嚥下指示からホワイトアウトまでの所要時間は延長する傾向を認めた.●考察健常若年者であっても,粘性が高くなるにつれ,口腔内や咽頭内の残留が増え,同じ5ccでも残留のせいで追加嚥下する者が大半を占め,stage II transport様の固形物の飲み方を呈する傾向を認めた.また,とろみが強くなるにつれ舌骨・喉頭挙上における筋活動は増加傾向を示したものの,有意差を認めなかった.摂食・嚥下障害を有する者では舌運動や咽頭収縮力の低下,喉頭挙上量の減少等でますます口腔内残留や咽頭内残留のリスクが高くなるため,とろみを強く付け過ぎることも嚥下後誤嚥を引き起こすリスクに繋がることが示唆された.交付初年度に代表者の吉川が海外留学を行っていたため、データ採取の遅れを認める。患者臨床データの採取では、協力施設における記録システムの構築に時間を要しており、患者データ採取が予定より遅れている。学内倫理委員会の承認に時間がかかり,研究代表の吉川峰加が短期海外留学を行ったため.健常成人におけるデータ採取を継続するとともに、パーキンソン病や筋委縮性側索硬化症などの進行性神経筋疾患患者に加えて、頭頸部ガン患者や慢性期脳血管障害患者、認知症患者などのデータ採取を行っていく。とくにトロミの物性変化に対応する嚥下動態の変化や嚥下音の変化なども確認できはじめているため、より詳細な解析を実施予定である。健常若年者に加えて,健常高齢者や軽度摂食・嚥下障害患者の研究協力者を募り,データ採集を積極的に行っていく.ビデオ嚥下造影検査やビデオ内視鏡検査によるデータ解析にて、より詳細な嚥下動態をとらえるべく画像解析のソフト等の使用が必要となってきており申請予定である。さらに、患者データの採取のため、研究施設への出張が必要となるとともに、学会発表や論文投稿も予定しているため、旅費等の申請を予定している。引き続き,データを採集するため試料作製やデータ解析のための物品を購入するのみならず,健常若年者におけるデータについて学会発表や論文発表等を順次行っていく予定であるために,資料作成代や旅費を必要とする.
先天色覚異常者における色の見え方と適切な表示色に関する研究

1.先天色覚異常者におけるLED式道路交通信号灯色の見え方について、LED式および電球式信号灯のシミュレーション装置を試作し、色覚正常者5名、先天色覚異常者18名に対し検査を施行した。その結果、先天色覚異常者では11名(61.0%)に誤答がみられた。誤答率は赤および黄で、電球式に比べてLED式で高い傾向がみられた。2.色覚正常者5名と先天色覚異常者51名に対し、3色表示LEDディスプレイの文字色の色弁別能検査を施行し、パネルD-15テストの結果と比較した。先天色覚異常者では51名中46名(90.2%)に誤答がみられ、パネルD-15テストpass群と比較してfail群で誤答が多かった。3.先天色覚異常者における、色チョークで黒板上に書かれた文字色の弁別能を検討した。先天色覚異常者では51名中37名(72.5%)に誤答がみられた。4.先天色覚異常者16名に対して、8°および10°視野の色票を用いたパネルD-15を施行し、色票を大きくした場合の改善を検討した。その結果、8°では5名(31.3%)、10°では8名(50.0%)に改善がみられた。5.小学校で使用されている教科書における色表示の、先天色覚異常者における見え方についての評価検討を行った。教科書324冊について調達し、その結果、小学校で使用されている教科書の色表示には先天色覚異常者にとって判別しにくい色の組合せがあることが確認された。平成13年度1.本邦の小学校16年生において使用されている教科書324冊の内、142冊について、表示色の調査・解析を行い、先天色覚異常者にとって判別しにくいと考えられる色表示68箇所を抽出した。これらの色表示の色度を、ミノルタ製分光測色計CM-3600dを用いて測色し、CIE1931表色系色度図上にプロットし、さらに第1および第2色盲の混同色軌跡との検討を行った。その結果、先天色覚異常者にとって識別困難と考えられる色表示の組合せが確認された。平成13年度は、教科書の下巻の入手が遅れたため、324冊中142冊について調査したが、今後、引き続き、残りの182冊についても調査・解析を継続する予定である。2.赤・黄・緑色の従来の電球式信号用フィルターおよび発光ダイオード(以下、LED)を用いた道路交通信号灯のシミュレーション装置を試作し、色覚正常者5名、第1色覚異常5名、第2色覚異常13名に対し、黒、灰、白の各背景野下に色弁別能検査およびパネルD-15テストを施行し、結果を検討した。また、波長の異なるLED式緑信号の見え方についても調査した。その結果、電球式信号用フィルターとLED式共に、色覚異常のタイプ別では、第2異常で、パネルD-15の結果では、fail群で誤答率が高い傾向が認められた。誤答色は、電球式信号用フィルターでは、赤を黄、黄を赤と、LED式では、赤を黄、黄を緑または赤と誤答する傾向がみられた。赤および黄では、電球式信号用フィルターと比較して、LED式において、誤答率が高い傾向がみられた。LED式緑信号の見え方調査では、先天色覚異常者では波長505nm以上で見にくい場合があることが示唆された。平成14年度1.本邦の小学校16年生において使用されている教科書324冊の内、107冊について、表示色の調査・解析を行い、先天色覚異常者にとって判別しにくいと考えられる色表示28箇所を抽出した。

これらの色表示の色度を、ミノルタ製分光測色計CM-3600dを用いて測色し、CIE1931表色系色度図上にプロットし、さらに第1および第2色盲の混同色軌跡との検討を行った。その結果、先天色覚異常者にとって識別困難と考えられる色表示の組合せが確認された。平成13年度および平成14年度で、324冊中249冊について調査したが、今後、引き続き、残りの75冊についても調査・解析を継続する予定である。2.先天色覚異常者における、白、赤、黄、緑、青の5色の色チョークで黒板上に書かれた文字色の見え方について検討する目的で、色覚正常者5名と先天色覚異常者51名に対し、シミュレーション検査を施行した。その結果、色覚正常者では誤答はみられなかった。先天色覚異常者では51名中37名(72.5%)に誤答がみられた。先天色覚異常者では黒板上に色チョークで書かれた文字色の色弁別が困難な場合があることが示された。3.検査視標が8度および10度のパネルD-15を試作し、16先天色覚異常者に対して検査を行い、2度視標のパネルD-15の結果と比較検討した。その結果、検査視標の拡大により色識別能が変化することが確認された。今後、検査視標の面積をさらに大きくし、検査条件としての照度も変化させて、杵体機能や錐体機能の色覚への関与について、さらに検討して行きたい。平成15年度1.本邦の小学校16年生において平成13年度に使用された教科書324冊のうち、平成13年度および平成14年度に調査を行った249冊を除いた、残りの75冊について、表示色の調査・解析を行い、先天色覚異常者にとって判別しにくいと考えられる色表示24箇所を抽出した。これらの色表示の色度を、ミノルタ製分光測色計CM-3600dを用いて測色し、CIE1931表色系色度図上にプロットし、第1および第2色盲の混同色軌跡との検討を行った。これらの結果を、平成13年度および平成14年度の結果とあわせて、解析を行った。2.今年度は、さらに、本邦の小学校16年生で使用されている教科書324冊において、色表示以外の補助表示は併記されているものの色表示の色の組合せが先天色覚異常者にとって判別しにくいもの、および、色に関する設問や課題が先天色覚異常者にとっては不適当と考えられるものについても調査・解析を行い、先天色覚異常者にとって判別しにくいと考えられる色表示や設問・課題を、それぞれ166箇所および58箇所抽出した。
フェムト秒蛍光分光法を用いた超高速電子移動・エネルギー移動に関する研究

フェムト秒蛍光アップコンバージョン法を用いて、ポルフィリン環状多量体、ポルフィリンアレー、ポルフィリン風車型多量体のフェムト秒時間分解蛍光スペクトルの測定を行った。これらの分子配列系ではポルフィリン間の相互作用が強く、内部転換・振動緩和と競合しながら、100フェムト秒前後で励起エネルギー移動・励起の非局在化が起こることがわかった。ポルフィリン配列分子の光機能材料としての可能性を検討した。種々のカロテノイドのフェムト秒時間分解蛍光スペクトルを、295Kおよび77Kにおいて測定した。カロテノイドに与えられた余剰エネルギーが緩和していく過程およびその時定数を明らかにした。炭化水素からなるカロテノイドでは振動再分配がクロロフィルへのエネルギー移動と競合するのに対して、ケトカルボニル基を有するカロテノイドでは振動再分配は30フェムト秒以内で起こることがわかった。カロテノイドの構造と光合成系における役割との関連を励起緩和ダイナミクスの観点から検討した。シングルチョッパー法を発展させたデュアルチョッパーロックイン検出法を新たに開発し、プローブレーザー光に由来するノイズと励起レーザー光に由来するノイズとを同時に削除し、ノイズフリーの条件下での測定を可能とした。これまでS/N比を向上させるためには光学系の念入りな調整が必要であったが、この方法により、容易にノイズとシグナルを分離することが可能となった。これに伴い励起波長範囲が拡大され、多種多様なサンプルについての測定が可能となった。種々のカロテノイドのフェムト秒蛍光減衰曲線を測定した。カロテノイドの共役2重結合鎖長とS_2→S_1内部転換速度定数との関係が理論的に予想されたものとは全く異なることがわかった。共役2重結合鎖長の長いカロテノイド、例えばリコペン(トマトより抽出)では、励起状態(S_2状態、S_1状態)の寿命が著しく短く、光集光アンテナとしては機能しないことを実験的に明らかにした。これまでS/N比を向上させるためには光学系の念入リな調整が必要であったが、この方法により、容易にノイズとシグナルを分離することが可能となった。
三価の超原子価ハロゲン化合物を用いた二原子炭素の発生反応の開発およびその応用

高反応性中間体には、構造・物性・反応性について、今日でも活発な議論が続いているものが数多く存在する。その中でも、特に二原子炭素(C2)は1炭素-炭素間には“四重結合"が存在しうるのか?2炭素同素体(フラーレン、カーボンナノチューブ、グラフェン、ダイヤモンドなど)の最小起源たりうるかなど、化学全体において重要な疑問を秘めた興味深い研究対象である。しかし、C2は約3600度以上の高温でしか安定に存在できないと考えられているため、物理・化学的性質の詳細な解析は困難であり、それらの問いへの答えは、一世紀半以上もの間、大きな謎のまま残されてきた。申請者は、β位にシリル基を有するアルキニルヨーダンにフッ化物イオンを作用させることにより、温和な条件下にC2を発生させることに成功した。発生したC2は、ラジカルとして振舞い、ラジカル捕捉剤や水素原子供与体と反応する一方、過酷な方法で発生させたC2とは異なり、共役アルケンとは反応しなかった。これは理論計算により予想された、"四重結合性を帯びた、一重項ビラジカル"の性質と矛盾しない。温和な条件で化学的手法により発生させることによって、本質的な基底状態の挙動を初めて明らかにすることができたと考えられる。一方で、溶媒や捕捉剤なしでこのC2を固相で発生させた場合、さまざまな炭素同素体(C60、カーボンナノチューブ、グラファイト、アモルファス炭素など)が得られることがわかった。自然界の炭素同素体がどのようにできているかについては、さまざまな説があるものの、今回得られた知見は、基底状態のC2がこれらの生成にかかわることを強く示唆していると考えられる。高反応性のアルキニルヨーダンを用いることにより、選択性良くC2を発生出来る条件を見出し、その化学的性質を明らかにすることができた。また、期待していた炭素同素体への誘導にも成功し、特定の炭素同素体が得られやすい条件を見出しつつある。これらは、当初の予想よりも早く研究が進捗していると考えられる。今年度は、発生した二原子炭素の直接観測や、得られた炭素同素体の評価をさらに詳細に検討する。具体的には、結晶化度合や混成を調べることができるXRD測定や、13Cで標識した原料を用いた13C NMRスペクトル測定、ラマンスペクトル測定などを実施し、どのような同素体が有利に生成するか、また反応条件との関連を調べたい。得られた同素体の単離や材質評価も重要と考えており、それらも併せて実施していく。二原子炭素の発生反応に当初用いる予定であった種々の高価な試薬(たとえば、ニフッ化キセノンなど)は、より安価な超原子価ヨウ素試薬による発生法の開発に伴い、優先度は低下した。また、当初予定していた外部機関に委託予定であった様々な物性評価にともなう費用は学内の共用施設での実験を行うことにより、低減した。

次年度は、活性種の発生をさらに実証するために、13C標識試薬を用いる予定であるが、それらは比較的高価であるため(例えば、13C標識されたトリメチルシリルアセチレンは1gで40万円を要する)、今年度の予算はその購入に充当したいと考えている。
FAKシグナルを標的とした癌誘発骨破壊病変に対する新たな治療戦略の開発

Focaladhesion kinase(FAK)は様々な悪性腫瘍において過剰発現し,特に浸潤・転移能の高い細胞において高発現することが報告されているものの,癌骨破壊巣におけるその役割は今だ不明な点が多い。そこで本研究では癌骨破壊病変におけるFAKの役割について検討し, FAKシグナルは破骨細胞形成,骨吸収能に大きく関与し,癌骨破壊病変に対し標的となる可能性が示唆された。癌骨転移患者に対して,ビスフォスフォネート(BP)製剤の使用が世界的に用いられているが,近年BP投与患者にしばしば顎骨壊死が報告されている(Marx R.E. J Oral Maxillofac Surg., 2005)。そこで申請者等は骨に半永久的に取り込まれるBP製剤に対し,"破骨細胞を標的とした薬剤"で骨代謝機能を可逆的に保持させたままで,癌骨破壊をコントロールできるのではないかと考えた。申請者は心腔内投与癌骨転移モデルを用い,FAK (focal adhesion kinase)397番目のチロシン残基を選択的に阻害する新規分子標的治療薬TAE226投与から21日目のX線透過像として現れてくる骨破壊像を比較した。X線学的な骨破壊をおこしている骨透過像面積はコントロール群と比較してTAE226投与群では有意に減少していた。また組織学的に比較するとコントロール群では骨の髄腔内がほぼ腫瘍細胞で置換されており,既存の骨梁はほぼ破壊されていたが,TAE226投与群では髄腔内での腫瘍増殖面積は有意に減少しており既存の骨梁構造の維持が認められた。破骨細胞特異的マーカーであるTRAP(石酸抵抗性酸性ホスファターゼ)染色を行うと,コントロール群では腫瘍に隣接する骨面上に破骨細胞様の多核の巨細胞が著明に観察されたが,TAE226投与群では腫瘍と隣接する骨面での単位距離あたりの破骨細胞数が有意に減少することがわかった。これらの結果よりFAKシグナルは癌細胞における腫瘍増大のみならず,破骨細胞形成にも関与することが示唆され,癌骨破壊巣におけるFAKの生物学的な重要性の一端が明らかとなった。これまで心腔内投与癌骨転移モデルを用い,FAK(focal adhesion kinase)397番目のチロシン残基を選択的に阻害する新規分子標的治療薬TAE226投与を行うと,コントロール群では腫瘍に隣接する骨面上に破骨細胞様の多核の巨細胞が著明に観察されたが,TAE226投与群では腫瘍と隣接する骨面での単位距離あたりの破骨細胞数が有意に減少することを明らかとしてきた。このメカニズムをより詳細に検討するため,FAKの破骨細胞の機能に関して検討をおこなった。破骨細胞前駆細胞としてRAW264.7細胞とI型コラーゲンとの接着能はFAK阻害により有意に低下し,同様にオステオポンチンとRAW264.7細胞との結合も同様に減少することが明らかとなった。RANKLによって誘導されたRAW264.1細胞の破骨細胞分化能,骨吸収能ともにFAK阻害により有意に抑制され,アクチンリングの崩壊を認めることが明らかとなった。血清によって誘導されたERK,p38MAPK,IkB alphaのリン酸化はTAE226処理により抑制され,RANKLによって誘導されたNFATc1,Cathepsin K,TRAP発現はTAE226処理により抑制された。さらに,PTHrPを用いた高カルシウム血症マウスにおいて,TAE226投与群では血中カルシウム濃度が有意に低下した。また,高カルシウム血症によって誘導されたマウス体重減少がTAE226投与により,体重が回復することが明らかとなった。これらの結果より癌骨転移巣における腫瘍増大は,破骨細胞接着,分化,吸収にかかわるFAKシグナルが多いに関与することが示唆された。これまで志茂等はFocal adhesion kinase(FAK)397番目のチロシン残基を選択的に阻害すると,転移性癌骨破壊が抑制することを新規分子標的治療薬TAE226を用いて明らかにしてきた(Experimental Cell Research 2011)。さらに,このメカニズムを口腔癌で詳細に検討を行った。当科における口腔扁平上皮癌切除標本を用いた,FAK Tyr397の発現は癌浸潤部で発現を認めると同時に,癌新生血管に高発現を認めることが明らかとなった。口腔扁平上皮癌マウス移植モデルにFAK Tyr397を選択的に阻害すると,腫瘍増大と同時に癌新生血管が著しく抑制されることが明らかとなった。このメカニズムを明らかとするため,口腔扁平上皮癌細胞におけるFAK Tyr397選択的に阻害すると,口腔扁平上皮癌の増殖能,遊走能,接着能,浸潤能が有意に抑制されると同時に,AKT,ERK,caspase-3経路でアポトーシスを誘導することが明らかとなった。さらに,破骨細胞分化,活性に重要な骨芽細胞におけるFAKを抑制すると,増殖能のみならず,遊走能,分化能を抑制することが明らかとなった。

これらのことより口腔癌骨浸潤においてFAK Tyr397のリン酸化は口腔癌のみならず,腫瘍血管の誘導,骨吸収をサポートする骨芽細胞の生存,増殖,分化に重要な役割をもち,口腔癌顎骨破壊病変の標的となる可能性が示唆された。
PIP2依存性ArfGAPタンパク質による形質膜制御機構の解明

本研究では、AMAP-1-Paxillin-Cortactinの複合体の三次元立体構造を解明することにより、リサイクリング機能と細胞膜および細胞骨格制御機能を明らかにし、さらにAMAP-1-Paxillin-Cortactinを標的とした癌細胞浸潤・転移抑制剤の開発のための基礎研究を行うことを目的とした。我々はすでに、乳癌転移を抑制する低分子化合物(UCS15A)を見いだしていた。UCS15A(Streptomyces sp.産生物質)はAMAP1とCortactinの相互作用を抑制することにより、乳癌細胞の形質膜伸展を抑制し、乳癌細胞の浸潤・転移を阻害する。また、我々は昨年度AMAP1のプロリンリッチ領域(KRPPPPPPG)とCortactin-SH3ドメインの複合体の構造を明らかにした。その構造は、AMAP1のプロリンリッチ領域を挟み込む形で二つのCortactin-SH3ドメインが結合した極めてユニークな複合体を形成していることが明らかにした。しかし、AMAP-1-Cortactin複合体とUCS15Aとの相互作用について、詳細な解析はなされていなかった。本年度は、女性の癌の羅漢率上位である乳癌の浸潤・転移抑制剤の開発の基礎研究を行うため、UCS15Aとプロリンリッチペプチドの相互作用について構造学的に明らかにすることを試みた。すなわち、UCS15Aおよび数種類のUCS15A類縁化合物(2b,2cなど)とプロリンリッチペプチドとの相互作用について、NMRおよび生化学実験により解析を行った。その結果、UCS15Aは極めて低濃度でAMAP1のプロリンリッチ領域およびプロリンのみから成るポリペプチドに直接結合することが分かった。さらに、UCS15Aのエポキシ基を含む6員環部位およびアルデヒド基がAMAP1のプロリンリッチ領域との相互作用に寄与している可能性が示唆された。これまでに、共同研究者等は乳癌細胞が浸潤仮足部位でAMAP1-Paxillin-Cortactinの複合体を作り、この複合体が細胞浸潤に寄与することを見いだしている。本研究では、AMAP1-Paxillin-Cortactinの複合体の立体構造を理解することにより、リサイクリング機能と細胞膜および細胞骨格制御機能を明らかにし、さらにAMAP1-Paxillin-Cortactinを標的とした癌細胞浸潤・転移抑制剤の開発のための基礎研究を行う。我々は、すでに、AMAP1とCortactinの相互作用を抑制する低分子化合物(リード化合物)を発見していた。本年度は、リード化合物の癌細胞の浸潤・転移阻害活性についてin vitroの浸潤阻害実験およびマウスを用いた癌転移実験を用いて検討を行い、さらにリード化合物の作用部位について詳細な解析を試みた。その結果、リード化合物は、AMAP1のプロリンリッチ領域とCortactin-SH3ドメインとの結合を阻害し、乳癌細胞の形質膜伸展を抑制し、乳癌細胞の浸潤・転移を阻害することが示唆された。一方、AMAP1のプロリンリッチ領域とCortactin-SH3ドメインの複合体をX線結晶構造解析したところ、AMAP1のプロリンリッチ領域を挟み込む形で二つのCortactin-SH3ドメインが結合し、複合体を形成していることが明らかとなった。動的光散乱、ゲル濾過およびpull-down実験の結果は、X線結晶構造解析の結果を裏付けるものであった。さらに、リード化合物とAMAP1のプロリンリッチ領域の相互作用部位を明らかにする目的で、質量分析およびNMRにより解析を行った。その結果、リード化合物はAMAP1のプロリンリッチ領域に直接結合し、この時、AMAP1のプロリン残基と考えられるアミノ酸が影響を受けることがわかった。また、リード化合物の結合阻害活性の特異性を調べるために、数種類のタンパク質のSH3ドメインを用いた結合阻害実験の結果から、リード化合物はAMAP1のプロリンリッチ領域とCortactin-SH3ドメインの結合を特異的に阻害することが示唆された。

その結果、UCS15Aは極めて低濃度でAMAP1のプロリンリッチ領域およびプロリンのみから成るポリペプチドに直接結合することが分かった。さらに、UCS15Aのエポキシ基を含む6員環部位およびアルデヒド基がAMAP1のプロリンリッチ領域との相互作用に寄与している可能性が示唆された。
楽譜出版活動揺籃期のイングランドにおける作品伝達の変容

本年度は、16世紀前半のイングランドで編纂された手稿譜集の調査を行った上で、16世紀全体の手稿譜集と印刷譜集の比較考察を行った。(1)16世紀前半に成立したとみられる現存の手稿譜集17点について、手稿譜集の内容(音楽ジャンルや作曲家名など)について検証した。(2)上記17点のうち、現物を調査することのできた14点について、楽譜集の形態(大きさ、フォリオ数、手書き/印刷譜集、装丁状態など)、写譜の状態(写譜者の人数、写譜の順序、写譜技術の甲乙、装飾性、修正状況など)を検証した。(3)昨年度調査した16世紀後半の手稿譜集との比較考察を行った。その結果、16世紀前半から後半にかけて、写譜が煩雑で装飾のない簡素な作りの手稿譜集が急増していることが明らかとなった。これらの手稿譜集は、全体に統一性がなく、成立までに長時間を要したとみられることから、献呈用ではなく演奏用など自らのために楽譜を書きためた結果成立した楽譜集と考えられた。(4)手稿譜集の特徴を印刷譜集のそれと比較考察した。その結果、手稿譜、印刷譜という2つのメディアにおいて、作曲家の位置づけが大きく変化していることが明らかとなった。(5)さらに、2つのメディアの位置づけを、楽譜受容の場、とりわけ宗教改革の旧教徒(カトリック教徒)の活動において考察した。その結果、カトリック教徒は楽譜というメディアを信仰生活の維持やネットワーク作りにおいて利用していることが明らかとなった。同時に、手稿譜、印刷譜という異なるメディアそれぞれの特性の相違も浮かび上がった。本年度は、印刷楽譜集と手稿譜集との相違を明確にするべく、手稿譜集の特徴を明らかにするため、イギリスとアイルランド共和国に赴いて現存の手稿譜集を対象に以下の調査を行い考察した。(1)16世紀後半に成立したとみられる現存の手稿譜集93点について、手稿譜集の内容-手稿譜集に収められた曲の作曲家やジャンル-について検証した。(2)上記93点うち、現物(マイクロフィルムを含む)を調査することのできた70点について、写譜の状態-筆記、余白とレイアウト、タイトルと作曲家名の記載-を検証した。(3)検証の結果、16世紀後半のイングランドで成立した手稿譜集には、手稿譜集全体を通じてその内容や写譜の状態に統一性のある場合とない場合があることが明らかとなった。(4)さらに、16世紀後半のイングランドで成立した手稿譜集には3つのタイプが存在することを明らかにした。a)写本全体を貫く意図はないが、長年の間に書きためられた結果、成立したもの、b)コレクションとして作成されたもの、c)献呈・贈呈用に作成されたもの。このうち最も多いのは、最初のタイプである。(5)以上のことから、印刷楽譜集と手稿譜集の間には、a)楽譜集として成立するまでの時間の長さ、b)楽譜集全体を貫く意図の有無、という2点において相違がみられる可能性を指摘した。来年度は、16世紀前半に成立した手稿譜集をも調査することによって、上記の考察をさらに深めるとともに、印刷楽譜集と手稿譜集の特徴を比較することによって、両者の意義を明確にしたい。
核膜と転写境界領域の制御機構の解析

Tafsの一つである出芽酵母タンパク質のBdf1の機能解析を行った。酵母TAF1はヒトTAF1のN末側領域に相同するが、C末側領域を欠損している。酵母Bdf1は高等真核細胞のTAF1のC末側領域に相同する。Bdf1はアセチル化Histoneに結合するといった特有の機能を持ち合わせており、多くの転写因子の中でも重要な役割を担っていると考えられている。ヒトTAF1と酵母Bdf1はリン酸化の修飾を受けるが、そのメカニズムや重要性については不明な点が多く残されていた。私は様々なIn vivo,In vitroの実験を行い、ヒトTAF1と酵母Bdf1がCKIIによってリン酸化されること、Bdf1のリン酸化領域は酵母の生育に必須であることを明らかにした。現時点ではBdf1のリン酸化はTFIID複合体の安定性、またHistone結合性との関与は見いだしていなく、リン酸化機能を含めBdf1のメカニズムついてなお不明な点が多く残されている。なぜならBdf1は酵母の生育において必須の遺伝子であり、高等真核細胞Taf1のC末側領域に相同するにもかかわらず、TFIID複合体の精製の際などではごく僅かにしか検出されないことなど、Bdf1は他のTFIIDサブユニットとは異なる性質を持ち、特異的な役割が示唆されてきた。さらにDNA microarrayの結果、Bdf1はテロメア付近を含む転写不活性遺伝子の多くに影響を及ぼしている可能性が示唆され、Bdf1はヘテロクロマチンとユークロマチンの境界線上で転写制御に関わっている、バウンダリー活性を持ち可能性が考えられている。さらにBdf1がクロマチンリモデリングの機能をもつSwrl Complexとして精製され、H2A VariantのHtz1と結合することを明らかにし、Swrl Complexが染色体安定に関わることも明らかにした。未だに詳細なメカニズムは未知であるが、Bdf1はTFIID複合体としてだけでなく、染色体の構造変換を制御する機能を持ち合わせていると考えられている。Tafsの一つである出芽酵母タンパク質のBdf1の機能解析を行っている。酵母TAF1はヒトTAF1のN未側領域に相同するが、C未側領域を欠損している。酵母Bdf1は高等真核細胞のTAF1のC未側領域に相同する。なぜならBdf1は酵母の生育において必須の遺伝子であり、高等真核細胞Taf1のC未側領域に相同するにのもかかわらず、TFIID複合体の精製の際などではごく僅かにしか検出されないことなど、Bdf1は他のTFIIDサブユニットとは異なる性質を持ち、特異的な役割が示唆されてきた。DNA microarrayの結果、Bdf1はテロメア付近を含む転写不活性遺伝子の多くに影響を及ぼしている可能性が示唆され、Bdf1はヘテロクロマチンとユークロマチンの境界線上で転写制御に関わっている、バウンダリー活性を持ち可能性が考えられている。さらにBdf1がクロマチンリモデリングの機能をもつSwr1 Complexとして精製され、H2A VariantのHtz1と結合することを明らかにし、Swr1 Complexが染色体安定に関わることも明らかにした。

さらにDNA microarrayの結果、Bdf1はテロメア付近を含む転写不活性遺伝子の多くに影響を及ぼしている可能性が示唆され、Bdf1はヘテロクロマチンとユークロマチンの境界線上で転写制御に関わっている、バウンダリー活性を持ち可能性が考えられている。さらにBdf1がクロマチンリモデリングの機能をもつSwrl Complexとして精製され、H2A VariantのHtz1と結合することを明らかにし、Swrl Complexが染色体安定に関わることも明らかにした。未だに詳細なメカニズムは未知であるが、Bdf1はTFIID複合体としてだけでなく、染色体の構造変換を制御する機能を持ち合わせていると考えられている。
新古典・乱流輸送理論シミュレーションによる核融合プラズマ性能の解明と予測

本研究では、核融合プラズマ性能の向上に適した磁場配位、プラズマ密度・温度や電場分布等の条件を明らかにするため、荷電粒子の位相(位置・速度)空間上の分布関数を扱うプラズマ運動論に基づいて、磁場閉じ込めプラズマにおける粒子・熱エネルギー・運動量の輸送現象の物理機構解明とその定量的予測を行うことができる高精度の理論モデルとシミュレーションコードの構築および改良を進める。
多言語辞書と金属活字印刷から探るキリシタン文献の文字・語彙同定の過程

1617世紀にキリスト教布教に伴って印欧語と系統的に無関係の言語とが初めて接触する。この過程を言語学史として扱う「宣教に伴う言語学」の情報資源の整備は進捗が著しいが、それらを統合して扱うための基礎研究,中でも「語の同定の問題」の研究は著しく不足している。本研究は、「時代別国語大辞典データベース」のようなこれまでに構築した情報資源も活用しながら、当時のポルトガル語の異綴りの同定、日本語漢字表記語彙の同語彙表記・異体字の同定の問題を、対訳文献という他には無い特徴を生かし、情報資源の構築を進めつつ、その同定の原理を明らかにしようとしたものである。1.過年度までに構築した諸データベース類の整理・補正,及び増補すべき文献資料の調査過年度までに日本キリシタン文献の日本語版本(ローマ字本・漢字仮名交じり本双方),日本語を含む多言語の版本,コンカニ語宣教文献の主要写本・版本のデータベース(DB)類を構築済であり,又,平成21年度日本学術振興会「先端学術研究人材養成事業」としての「大航海時代の「宣教に伴う言語学」研究のための非一極集中型研究環境の構築」による分散リソース構築の成果も保持しているため,それに基づくDB類の整理・補正を行なった。又,国際的な共同研究を進めているUTAD(トラーズ・ウズ・モンテス・イ・アルト・ドウロ大学,ポルトガル)が編纂した文献学的データを受領して,DBに組み込み,試験的に公開した。http://joao-roiz.jp/LGRP/。関連して,今後増補すべき文献の原本調査を行なったが,マノエル・バレト自筆「葡羅辞書」(リスボン科学アカデミー)は,調査日程の調整が難しく,来年度以降へ送る事とした。2.データベース類の統合のための,キー言語となるポルトガル語・ラテン語項目の正規化上記のUTAD編纂した文献学的データから異形態を取り出して,ポルトガル語・ラテン語項目の正規化用DBを作成し,上記の試験公開(LGRP)で試用に供した。3.江戸初期の日本語漢宇語彙集成の正規化のための「時代別国語大辞典データベース」活用ここで「漢字(表記)語彙」とは,必ずしも漢語ではなく,漢字表記を一般とする大和言葉・他言語からの借用語類をも含む。代表者(豊島)が,平成20・21年度科学研究費研究成果公開促進費(データベース)によりDB化した三省堂「時代別国語大辞典」上代編・室町時代編(全五巻)の全文のソースデータから,漢字表記語彙を抽出し,「時代別国語大辞典」の見出し語認定を参考として,日本語漢字表記語彙のバリアント(異表記・異形態など)の正規化データを試作した。4.日本キリシタン版漢字仮名行草体金属活字のレパートリ画定現存全てのキリシタン版の漢字・仮名行草金属活字の一字単位でのDB化を完了した。但し,具体字認定等の方針にかなりの揺れが残っているため,今後校正を繰り返す必要がある。5.国際学会での成果発表2011年9月のMissionary Linguistics国際ワークショップ(サン・パウロ大学,ブラジル)へ代表者(豊島)が招待されて講演を行なった他,2012年3月のMissionary Linguistics国際学会(ブレーメン大学,ドイツ)で,代表者・分担者が成果発表を行なった。6.研究に関連する単行本の出版代表者・分担者らの共著による単行本「ひですの経」(八木書店)を出版し,本研究の研究題目に関連する最新の知見を要約して掲載した。又、コンカニ語公教要理の研究書等を出版した。1.調査・増補した文献資料類の多言語データベース(DB)への編入:ラテン語をベースとする文献に就き,対照すべき他文献と共に,DB編入を進めた。又、キー言語であるポルトガル語・ラテン語の正規化用データベースを再度検証し,多言語のリレーションが取れるように修正を重ね,データベースの運用試験を重ね、部分的には一般への供用も行なっている。http://joao-roiz.jp/LGRM/, http://joao-roiz.jp/LGRP/など(丸山・豊島)2日本キリシタン版漢字仮名行草体文献の原本調査:「ぎやどぺかどる」(ミュンヘン・バイエルン州立図書館蔵)などの原本を現地で精査し,書誌学的・文献学的な記述を進展させた。(白井・丸山)3.日本キリシタン版漢字仮名行草体金属活字のレパートリ確定:昨年度にほぼ完了した後期キリシタン版単字(一字又は連綿一コマ)レベルの行草体金属活字集成データベースに就き,上記の「ぎやどぺかどる」も含めた原本調査に基づき更に編集・校正を進めて精度を向上させ,日本イエズス会の仮名漢字活字レパートリをほぼ確定した。(白井・豊島)

4.日本語漢字語彙集成への慶長寛永期古活字版類の漢字表記語彙の追加:一昨年度に構築を開始した慶長寛永期古活字版類のテキスト・文字単字画像データベース(DB)は,大部分が昨年度に入力終了したので,若干の増補を行いつつ校正を進めている。(豊島)5.研究成果を国際学会で発表した他、有数の国内貴重書専門図書館である東洋文庫での書誌学講習会にて招待講演を行った。(岸本・白井・豊島)。又、今年度までの研究成果を単行本「キリシタンと出版」(八木書店刊行)として刊行したが、その後、本書は、今年度(平成25年度)第35回「日本出版学会賞」を受賞した。(2014年5月)(全員)1.文献資料類の調査・増補:書誌情報が未紹介のキリシタン版「ナバルスの懺悔」(1597)、及び「サカラメンタ提要」(1605)の新出本を、原本に基づき詳細に調査し、データベースへ編入して増補した。2.日本キリシタン版漢字仮名行草体金属活字のレパートリ画定:昨年度にほぼ入力完了した後期キリシタン版単字(一字又は連綿一コマ)レベルの行草体金属活字集成に就き,原本調査に基づき編集・校正を進め,日本イエズス会の仮名漢字活字レパートリをほぼ画定した。3.キー言語(ポルトガル語・ラテン語)項目の正規化の検証とリレーション構築の試験:昨年度に当代多言語データベース(DB)のキー言語として正規化したポルトガル語・ラテン語項目を用いて,実際に日本・ポ・ラテン・コンカニ語等の多言語DB類のリレーション(相互関連付け)構築を試行し,その結果に基づく正規化を行なった。これに伴い、兼ねてから整備して来た同時代ポルトガル語正書法データベースを、一般に公開した。(http://joao-roiz.jp/LGRM/)4.日本語漢字語彙集成への慶長寛永期古活字版類の漢字表記語彙の追加(25年度まで続く) :昨年度に構築を開始した慶長寛永期古活字版類のテキスト・画像データベース(DB)に就て,更に追加入力を外注し,編集・校正を進めて整理し,「日本語漢字語彙集成」の構築を進めた。来年度(25年度)に完成予定。5.研究成果に基づく共著論文集は、2013年前半の公刊に向けて既に全ての原稿は入稿済であり、現在組版中である。本研究は,イエズス会が16世紀17世紀に布教現地で作成した日本語及びコンカニ語(インド)語彙集とその印刷出版活動を,同時代語彙集及びイエズス会の言語記録を総合するデータベースによって通覧可能とした上で,対訳辞書編纂に伴う語の同定(同語・別語の認識),及び漢字仮名行草体金属活字印刷の創始に伴う語としての漢字の同定(同字・別字の認識)の形成過程を精密に跡付けるものである。最終年度に当たる今年度は、1)宣教に伴う言語学関連の文献原本調査を分担して行なった他、過去の調査で集積した書誌学的・文献学的な記述の取りまとめを行なった。2)調査・増補した文献資料類の多言語データベース(DB)の拡張を進める過程で、相互の自動検索を行なって、正書法の異なり(正書法の不在)によって対応が取れない別綴りの同語のリンクを取るべく、綴字同一視の参照表の整備を進めた。これによって、DB検索時にユーザが様々な綴りで検索しても当該項目にヒットする様に改善する事が出来た。3)日本キリシタン版漢字仮名行草体金属活字のレパートリを確定させ、前期・後期キリシタン版を通しての漢字用法が通覧出来る様になった。
超高磁場３テスラ磁気共鳴装置による冠動脈病変の解剖・機能的早期検出方法の確立

心臓生理的指標である心筋血流定量のゴールドスタンダードであるO15標識水PETの結果を参照し、高磁場3テスラ(3T)核磁気共鳴画像(MRI)による心筋血流計測方法を開発するため研究を行った。まず、健常人10人に対して、同時期にMRIの撮像及びO15標識水PETの検査を行った。安静時および、血管拡張薬投与時の検査を行い、Renkin-Crone modelを応用し、関係式を算出した。その後、その計算式の妥当性を、他の10人の健常人で確認した。また、冠動脈疾患患者で応用するために、心筋全体ではなく、冠動脈領域毎の心筋血流量が定量できるよう改良した。平成24年度に行ってきた研究内容を発展させ、MRIでも冠動脈領域毎の心筋血流量を測定できるように改良した。それぞれの領域毎の検討でも操作者間で高い再現性を認め、心筋血流定量のゴールドスタンダードであるO15標識水PETと高い相関を示した。次に、今まで主流として使われてきたPatlak plotmodelによる測定法との比較を行い、我々が開発したsingle tissue compartment modelを改良した定量方法の有用性を示した。学会発表を通して、討論から得られた結果を合わせて、英文論文化し、国際誌に投稿中である。また、冠動脈疾患疑い患者を対象とした検討も始めており、他検査(冠動脈造影など)との比較を行い、学会報告を踏まえて、その結果も国際誌への投稿を目指している。まず最適なデータ収集を行うため、血液とMRI用造影剤の濃度比を変え、in vitroでphantom実験を行い、得られた信号値と造影剤の濃度比の関係を求めた。MRIでの検査方法の確認を行った。その後、研究に参加してくれる健常者を募集し、安静時・薬剤負荷時のO-15標識水PETおよび、MRI検査を同時期に行い、データの蓄積を行った。MRIでは造影剤の検査を行うため、事前に腎機能の測定を行い、腎機能が低いと考えられた1人は除外した。負荷に用いたATPやMRIの造影剤で重篤な副作用は発生しなかった。更に他の10人の健常者のデータを用いて、今回用いた方法および、計算式の妥当性を確認した。MRIから得られた心筋血流量は安静時・負荷時ともに、過去の健常人のPET検査で得られた値と比較し、妥当と考えられた。また、同時期に行われたO-15標識水PETから得られた値と良い相関を示し、妥当性が確認された。inter-observer correlationを確認するため、2人の操作者による検討をおこなったところ、非常に高い再現性が得られた。まずMRIの撮像プロトコールの作成を行い、phantom実験を行った。健常者のリクルートが予定通り行われ、目標の20人の検査が達成できた。検査から得られたデータを抽出し、プログラミングソフトの開発が行われ、MRIによる心筋血流量の測定が可能となった。今回の方法や結果の妥当性の確認を行い、高いinter-observer correlationが得られた。今までは健常者が対象ということで、左室心筋全体に関心領域を置くことで、心筋血流量の測定を行ってきたが、冠動脈疾患患者に結果を還元するため、少なくとも冠動脈領域毎の心筋血流量測定を行っていく予定である。健常者で得られた結果を論文にし、国際誌への投稿を行う。検査で用いられる負荷薬剤・造影剤・注射器・ルート器具等。患者のデータを解析・データ保管のためのコンピューターおよびハードディスク、CD等。検査、データ管理、資料作成のための人件費。得られた研究結果を発表や最先端の研究内容をいち早く把握するための学会参加。論文投稿をするための、英文校正費用や掲載料。尚、3月に購入した物品については4月に支払いがなされるため、未使用額が生じています。
多成分蛍光寿命測定による細胞イオン濃度定量測定法の開発

位相分解蛍光寿命測定法を用いてカルシウムイオン濃度を測定した。蛍光色素にはCalcium Orangeを用いた。細胞内のカルシウムイオン濃度10. 2000nMで、本手法が適用できることが分かった。さらに、カルシウムイオン測定におけるタンパク質の影響を測定した。細胞内のタンパク質濃度(65-90mg/g)において、蛍光寿命は、タンパク質の濃度に依存して変化しないことが分かった。位相分解蛍光寿命測定法のための光学系を構築した。光源には、高速に光強度を変調可能な青色半導体レーザー(中心波長488nm)を用いた。半導体レーザーからのレーザー光は、蛍光励起用と参照信号測定用にビームスプリッターで分離した。励起光は、ダイクロイックミラーで反射させ、蛍光プローブとカルシウムイオンを混合したサンプルに照射した。発生した蛍光と励起光は、ダイクロイックミラーとロングパスフィルターで分離した。分離した蛍光は、光電子増倍管で検出した。オシロスコープで、参照信号と蛍光信号の位相遅れと強度を検出した。参照信号光と蛍光は、検出系による位相の変化が起こらないように全く同じ検出系で検出した。さらに、コンピュータから発振器とオシロスコープを制御できるシステムを構築した。カルシウム蛍光プロープ(Calcium Orange)とカルシウムイオンを混合して標準サンプルを作製した。カルシウムイオン濃度の調整には、Calibrated Calcium Buffer Kit II (Molecular Probes社製)を用いた。カルシウムイオン濃度は、039μMとした。これは、細胞内のカルシウム濃度と同等である。構築した光学系を用いて、これら標準サンプルの蛍光寿命を測定した。半導体レーザーの強度は、周波数120MHzの正弦波で変調した。その結果、位相差の変化は、46から73度であった。カルシウムイオン濃度が低いと蛍光寿命が短くなり、カルシウムイオン濃度が高いと、蛍光寿命が長くなることが分かった。カルシウムイオン濃度が102000nMのときに、位相差が大きく変った。これは、生体のカルシウムイオン濃度と同程度である。そのため、Calcium Orangeは、本手法によるカルシウムイオン濃度測定に適していることが分かった。昨年度のカルシウムイオン濃度の測定を実際の細胞に応用するため、カルシウムイオン測定におけるタンパク質の影響を測定した。ウシ血清アルブミン(BSA)を含む緩衝溶液で蛍光プローブcalciumorangeの蛍光寿命とカルシウムイオン濃度の関係を測定した。その結果、細胞内のタンパク質濃度(65-90mg/g)では、カルシウムイオン濃度と蛍光寿命との関係は、BSA濃度に依存していないことが分かった。さらに、NG108-15細胞のカルシウムイオン濃度を測定した。細胞をブラジキニンで刺激を与え、そのときの細胞内のカルシウム濃度変化を測定することができた。次にマグネシウムイオンの測定を行った。蛍光プローブにmagnesium greenとmag-fluo-4を用いた。MgCl_2(純水溶媒)をレコーディングメディウムに加えて蛍光寿命の測定を行った。Mg^<2+>濃度は0.5から250mMとした。実験結果から、上記の2つの蛍光指示薬で20から250mMのMg^<2+>濃度を測定することができることが分かった。カルシウムイオン測定と同様に、マグネシウムイオン測定に対するカルシウムイオンとタンパク質の影響を調べた。カルシウムイオンを加えると、蛍光寿命が変化した。その変化は、magnesium greenの方がmag-fluo-4に比べ大きかった。タンパク質(BSA)を加えると、magnesium greenの蛍光寿命が変化した。タンパク質の濃度を上げると、蛍光寿命は徐々に短くなった。それに対して、mag-fluo-4の蛍光寿命は、タンパク質を加えてもほとんど変化しなかった。本手法により、カルシウムイオンとマグネシウムイオンが測定出来ることが分かった。タンパク質や他のイオンの影響を補正することで、細胞内のイオン濃度の高精度な測定が可能である。
抗白血病薬によるTRAIL発現誘導と薬剤感受性

FKHRL1(FOXO3a)はForkhead転写因子のFOXOサブファミリーに属し、線虫のもつ寿命関連分子DAF-16のヒトオルソログである。FKHRL1は細胞内でPI3K/Akt/Gskシグナル伝達経路の下流に存在し、Akt/Gskによる直接的なリン酸化によって細胞質内に留まり、転写因子としての機能を喪失している。FKHRL1のリン酸化による不活化は前立腺癌や慢性骨髄性白血病(CML)などでみられ、我々はこれまでの研究によって、1)CML細胞のBCR-ABLからのシグナル伝達経路の下流にFKHRL1が存在し、恒常的にリン酸化を受けて不活化されていること、2)これらの細胞にBCR-ABLの特異的inhibitorであるイマチニブを投与するとBCR-ABLからのシグナルが遮断され、FKHRL1は脱リン酸化されて転写因子としての機能を発揮し、アポトーシスを誘導すること、3)イマチニブ耐性のCML細胞ではイマチニブ投与によってもFKHRL1のリン酸化は解除されず、アポトーシスの誘導が観察されないこと、4)イマチニブ耐性CML細胞株に活性型FKHRL1を核内で発現誘導するとアポトーシスが生じること、5)FKHRL1の標的分子を同定するためにDNAチップを用いて、タモキシフェン添加後の遺伝子発現パターンを添加前と比較検討し、両者で発現の異なる遺伝子を検出したところ、TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)が同定され、イマチニブ耐性CML細胞株にTRAILを強制発現させたところ、アポトーシスが誘導されることを明らかにした。これらの結果はFKHRL1が転写因子としての機能を喪失することがイマチニブ耐性の機序に深く関与しており、イマチニブ耐性CML細胞にFKHRL1やその下流分子であるTRAILを発現させることによってイマチニブ耐性を克服できることを示唆している。