hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
歯科治療の診断,予後における遺伝子情報の有用性-細胞死を規定するテロメアの解析-

ヒト正常細胞ゲノムの末端にあるテロメアDNAは、5'-(TTAGGG)-3'という6塩基の繰り返し配列からなり、染色体末端に1万塩基対くらいの長さで存在する。正常な体細胞では、加齢にともなって細胞分裂を繰り返しているうちに、テロメラーゼによって、テロメア末端が短くなり、次第に老化する。DMが複製されるとき、新生DNA鎖の5'端は鋳型に比べて短く、鋳型5'端は複製後に分解され、このようにして、DNAの複製毎に、鋳型鎖・新生鎖ともに5'末端が50150塩基ずつ短縮する。すなわち高齢者の細胞ほど短いテロメアDNAを持つ。テロメアサイズは細胞分裂(DNA複製)を計測するバロメータである。この原理を利用して、歯科領域では治療の対象となる口腔内各組織の生物学的活性、組織再生力あるいは個々の細胞の寿命が歯科治療の予後を規定すると考えられる。平成1213年度では、細胞よりゲノムDNAを抽出し、テロメア配列5'-(TTAGGG)_<10>-3'をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションによってテロメア長の分布を測定したが、上記の方法では最低でも細胞数が10万個以上あることが必要であることがわかり、歯髄のように極めて限られたDNA量しか採取できないサンプルの解析には最適ではないことがわかった。そこで14年度では新しいドットブロットーDNAサイズのスロープ解析法を考案した。この方法を用いて、若年者および高齢患者より採取した歯髄あるいは歯肉組織よりDNAを抽出し、テロメア解析を行った。その結果、高齢者では、若年者に比べてテロメア長が顕著に短くなり、DNAの断片化が起きることを、世界に先駆けて明らかにすることに成功した。歯科補綴・保存領域のみならず、口腔組織再生分野においても、患者の持つ遺伝子・分子情報に基づく診断や治療計画の作成、予後の判定に応用できる新しい道が開かれた。歯科治療の予後は患者の歯髄・歯周組織・歯槽骨の状態,すなわちそれらの組織の生物学的活性あるいは組織再生力によって大きく影響、さらに個々の細胞の寿命に規定される。細胞よりゲノムDNAを抽出し、テロメア配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションによってテロメア長の測定が可能となる。本年度は、まず培養細胞を用いて、実験条件の至適化を行った。ヒトWI38株細胞からゲノムDNAを抽出し、制限酵素Hinfで切断し、アガロースゲル電気泳動した後、脱プリン処理を行った。続いてDNAをナイロンメンブレンにブロットし、アルカリホスファターゼで標識したプローブ(60merの1本鎖テロメア配列DNA)を用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。メンブレンを洗浄した後、発光させ、オートラジオグラフィーにより検出した。その結果、同細胞について5x10^5個の細胞から30μgのDNA総量が抽出され、これを用いて細胞テロメア長を検出することができることが確認された。次に本研究実施に必要なサンプル採取条件について予備検討を行うため、口蓋粘膜より自然剥離した細胞を回収する作業を行った。日常行っている程度で1分間ブラッシングを行った後、使用した歯ブラシを生理的塩類溶液中で撹拌・振動させることによって歯ブラシに付着した約5x10^5個の粘膜上皮細胞を回収することができた。このことは、すなわち簡単なブラッシングによってテロメア長解析に十分な数量の粘膜細胞を得ることができることを意味する。

また1本の歯牙から抜去した歯髄には同程度の数の細胞が含まれることがわかっており、テロメア長を解析するために必要な数の歯髄細胞を供給することが可能であることが確認された。ヒト正常細胞ゲノムの末端にあるテロメアDNAは、5'-(TTAGGG)-3'という6塩基の繰り返し配列からなり、染色体末端に1万塩基対くらいの長さで存在する。正常な体細胞では、加齢にともなって細胞分裂を繰り返しているうちに、テロメラーゼによって、テロメア末端が短くなり、次第に老化する。DNAが複製されるとき、新生DNA鎖の5'端は鋳型に比べて短く、鋳型5'端は複製後に分解され、このようにして、DNAの複製毎に、鋳型鎖・新生鎖ともに5'末端が50150塩基ずつ短縮する。すなわち高齢者の細胞ほど短いテロメアDNAを持つ。テロメアサイズは細胞分裂(DNA複製)を計測するバロメータである。この原理を利用して、歯科領域では治療の対象となる口腔内各組織の生物学的活性、組織再生力あるいは個々の細胞の寿命が歯科治療の予後を規定すると考えられる。昨年度(研究初年度)より、細胞よりゲノムDNAを抽出し、テロメア配列5'-(TTAGGG)_<10>-3をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションによってテロメア長の分布を測定した。若年男性健常人の智歯歯髄よりDNAを抽出し、続いて制限酵素Hinfで切断し、アガロースゲル電気泳動した後、脱プリン処理を行った。続いてDNAをナイロンメンブレンにブロットし、アルカリホスファターゼで標識したプローブ(60merの1本鎖テロメア配列DNA)を用いてサザンハイブリダイゼーションを行い、テロメア長の検出を試みた。最終的に年齢をパラメータとした要因分析を行うためには、歯牙歯髄の症例が最低20は必要である。しかも、齲蝕感染のない歯髄が要求されるため、現在は試料標本の採集に努力している期間中であり、本年度の計画の一部は若干遅れ、次年度に繰り越し、合わせて解析結果を報告する予定である。ヒト正常細胞ゲノムの末端にあるテロメアDNAは、5'-TTAGGG)-3'という6塩基の繰り返し配列からなり、染色体末端に1万塩基対くらいの長さで存在する。DNAが複製されるとき、新生DNA鎖の5端は鋳型に比べて短く、鋳型5端は複製後に分解され、このようにして、DNAの複製毎に、鋳型鎖・新生鎖ともに5'末端が50150塩基ずつ短縮する。1213年度では、細胞よりゲノムDNAを抽出し、テロメア配列5、(TTAGGG)_<10>-3をプロープとしたサザンハイプリダイゼーションによってテロメア長の分布を測定したが、上記の従来の方法では最低でも細胞数が10万個以上あることが必要であることがわかり、歯髄などのように極めて限られたDNA量しか採取できないサンプルの解析には、最適な方法ではないことがわかった。
サイクリン制御因子の細胞周期及び分化における機能に関する研究

M期サイクリンの分解は細胞周期のM期進行制御に重要な役割を果たす。M期サイクリンに属するサイクリンAとサイクリンBはユビキチンに依存したプロテアソームによってM期に分解される。この分解過程にはM期サイクリンのN末端ドメインの機能が密接に関連している。本研究では、動物卵M期におけるA型サイクリンの分解機構を解析するため、サイクリンのN末端ドメインと相互作用する新規因子XDRP1をツメガエル卵からクローニングした。XDRP1をサイクリン分解がin vitroで進行する卵抽出液に加えると、サイクリンBの分解には影響がなかったが、サイクリンAの分解を抑制した。また、XDRP1をインジェクトすると、受精卵の分裂を阻害した。XDRP1はサイクリンAとは結合するが、サイクリンBとは結合しない。XDRP1はM期にリン酸化されるタンパク質で、in vitroでは、サイクリンAに依存したCDKキナーゼによりリン酸化されると考えられる。これらのことから、XDRP1はサイクリンAと特異的に結合してその分解を負に制御する抑制因子であることが示唆される。カエルの卵細胞から同定されたXDRP1はそのN末端側にユビキチン様配列を含み、かつ出芽酵母のDsk2タンパク質のC末端ドメインを共有している。これらの知見に基づいて、N末端ユビキチン関連蛋白質XDRP1/Dsk2のタンパク分解制御における機能を酵母システムを用いて解析した。XDRP1の過剰発現による生育阻止を抑圧する変異株を数株分離したところ、プロテアソームのコアユニットPre2と調節ユニットのRpn1の変異であることがわかった。これらの結果から、XDRP1とユビキチン-プロテアソーム経路との機能相関が示唆される。細胞周期M期の進行調節にはサイクリン依存症キナーゼとユビキチン化-プロテアソーム経路に依存したサイクリン分解が重要な役割を果たす。我々は、細胞周期におけるサイクリンAの生理機能と分解調節を解析する一手段として、サイクリンAのN末端ドメインを用いた2-ハイブリッド法によりアフリカツメガエルのXDRP1遺伝子をクローニングした(Xenopus Dsk2 Related Protein)。XDRP1は585アミノ酸からなる新規蛋白質であり、N末端領域はユビキチンと高い相同性を示し、出芽酵母のDsk2蛋白質とよく似ていた。XDRP1はサイクリンAのリン酸化部位を含むN末端ドメインと結合するが、分解ボックスやFxxxVDEモチーフとは結合しなかった。XDRP1はサイクリンA1,A2,さらに異種のヒトのサイクリンAとは結合したが、サイクリンBとは結合しないことから、A型サイクリンと特異的に結合する因子である。XDRP1はリン酸化蛋白質であり、サイクリンAキナーゼに依存してリン酸化され、XDRP1のリン酸化にはサイクリンA-CDKとの結合が必要である。XDRP1をインジェクトした受精卵の細胞分裂は阻害され、またXDRP1蛋白質を加えた卵抽出液中では、サイクリンAの分解が選択的に阻害された。これらの結果から、XDRP1はサイクリンのN末端ドメインに結合して、サイクリンAの分解を選択的に抑制する因子であることが示された。細胞周期を通じてのサイクリンAの分解パターンで特徴的なことは、M期中期に至るまで分解を抑制されている点である。XDRP1はサイクリンAに選択的な分解抑制とその解除の機構を制御する負の制御因子ではないかと推測している。細胞周期におけるサイクリン依存性キナーゼの活性はその調節サブユニトであるサイクリンの結合と分解により制御を受けている。M期サイクリンはユビキチンープロテアソーム経路により分解されるが、その分解制御については細胞周期チェッックポイントの観点から重要な研究課題となっている。本研究では、サイクリンと相互作用する新規の分解制御因子を分離同定し、その機能解析を行なった。

我々はまず、サイクリンAのN末端ドメインを用いた2-ハイブリッド法にを用いて、アフリカツメガエルのXDRP1遺伝子をクローニングした。XDRP1は585アミノ酸からなる蛋白質であり、N末端領域にユビキチンと高い相同性を示し、出芽酵母のDsk2蛋白質とよく似ていた。XDRP1はサイクリンAのリン酸化部位を含むN末端ドメインと結合する。XDRP1はA型サイクリンさらに異種のサイクリンA(ヒト)とは結合するが、サイクリンBとは結合しないことから、A型サイクリンと特異的に結合する因子である。XDRP1はリン酸化蛋白質であり、サイクリンAキナーゼに依存してリン酸化される。XDRP1のリン酸化にはサイクリンA-CDKとの結合が必要である。XDRP1をインジェクトした受精卵の細胞分裂は阻害され、XDRP1蛋白質を加えた卵抽出液中では、サイクリンAの分解が選択的に阻害された。また、XDRP1の出芽酵母ホモログDSK2発現による生育阻止を抑圧するサプレッサーを分離してその変異を同定したところ、プロテアソームのサブユニットのPRE2,PRE9,RPN1,NAS2であることが明らかになった。これらの結果から、XDRP1/DSK2は蛋白分解経路とユビキチン経路とプロテアソム間をリンクして、サイクリンAの分解を負に制御する抑制因子ではないかと推測される。
衝撃成形による金属製新規レプリカ標本制作の試みと技術応用の検討

植物標本に関しては、外形から葉脈、表面組織構造が微細に金属板上に転写された。指先で明瞭に転写の凹凸が確認でき、人間の指の2点識別距離基準を満たした。鳥の羽毛の転写は、視覚では転写された単独の羽毛が確認できるが、触覚ではほとんど変化が確認できなかった。原型の素材に寄らず、葉の重なりや、折り紙のような重なった構造をとる原型の衝撃成型レプリカは、その内部の立体構造を転写する。この場合は視覚によっても構造を把握しづらくなる。不特定多数が触る展示を前提とした博物館標本としては銅,アルミニウムが適する。走査型電子顕微鏡観察によりほぼすべての細胞壁ならびに細胞壁表面構造の68 %程度の転写を確認した。衝撃成形レプリカ原型試料について、植物葉(シダ、ササ、カエデ、イチョウ等)、昆虫(トンボ)翅、鳥類(キジバト)羽毛などの平面的な部位を原型試料とし、0.2mm厚のアルミニウム板を用い、衝撃波圧力120MPa程度による標本製作を行った。なお動物・昆虫に由来する原型試料については、生きている個体の採集は行わっておらず、羽毛や翅などの落下物等を採集したものである。標本作製にあたっては、金属板表面への試料の固定方法や、効果的な衝撃圧の利用のための真空パック処理が仕上がりに大きく影響することがわかった。特に、試料の固定に用いたノリまでもが金属板に転写されることが判明し、転写の細密さが伺えるものとなっている。前述の衝撃波成形レプリカ標本(雄型面ならびに雌型面)ならびに原型試料について、イチョウを試料としたサンプルを、走査型電子顕微鏡を用いて表面構造観察を行った。金属板にレプリカとして反映された細胞を計測・比較したところ、0.2mm厚アルミニウム板・120MPaの衝撃波圧力の場合は、レプリカの雌型面での細胞転写がほぼ80%であることが分かった。なお本内容は、2016年12月に横浜市にて開催され第26回日本MRS年次大会で「衝撃成形による金属製新規レプリカ標本制作New Replica Specimen Production using the Shock Wave Metal Molding」のタイトルで口頭発表を行った。衝撃成形による標本作製は順調に進行している。また走査型電子顕微鏡によるレプリカ標本の雄型面ならびに雌型面の表面観察も行い、変形状況の把握も進行している。データの統計処理による評価には、データ数をより蓄積する必要があるので、平成29年度に引き続き実施する。金属素材についてはアルミニウムと銅が主体となっているが、より展性の高い金などの比較的高価な金属素材は処理条件を絞り込んだ上で平成29年度に引き続き実施する。本研究課題では、主として次の条件でレプリカ標本製作実験を行った。原型試料:イチョウGinkgo biloba L., 1771またはカンヒザクラCerasus campanulata (Maxim.)Masam. & S.Suzukiの葉,成形金属板:厚さ0.1, 0.2, 0.3mmの銅またはアルミニウム、比較用に他14種類(チタン、バナジウム、クロム、鉄、ニッケル、亜鉛、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、パラジウム、銀、白金、金、鉛:厚さ0.1mm),衝撃波圧力123MPa(導爆線と試料との距離80mm、水中衝撃波)目視評価で0.3mm厚さは銅・アルミニウムいずれでも標本とするには転写性が低かった。0.2mm厚さでは葉脈等の構造が十分に転写され、走査型電子顕微鏡観察においても細胞壁や気孔等の表面構造が確認された。0.1mm厚さでは目視でも鮮やかな転写が確認された。標本への活用には0.1mmまたは0.2mm厚さの銅板またやアルミニウム板を用い、標本の歪みを防ぐためにホルダーを使用することで標本として活用できると判断される。人間の指の2点識別距離は3 5mm程度の触覚分解能(Nakada, M. J. Hand Therapy, 6, 23-28, 1993)であることから、植物葉を可触レプリカ標本とする場合、要求される転写性は葉脈の構造を識別できることが主な条件と考えられ、当該条件を満たす標本を制作することができた。今後は標本としての活用上、茎や根などの植物の全体像を触覚により確認することができるレプリカ標本を作るために、標本の大型化を検討する必要がある。昨年度に引き続き標本の作製を進行する。また、本研究の独自性を高めるために沖縄県固有種の標本を作製する。そのため外来種の多い沖縄本島だけでなく、久米島などの離島での原型試料採集を行う。細密に写し取られたレプリカ標本を原型としてアクリル樹脂等を素材とした二次加工の可能性を検討するため、試作を行う。

構造色の再現には微細な位置調整が必要なため時間を要すると考えられるが、構造色再現に関しても検討を行っていく。より厚みのある金属素材を使用することで、視覚障碍者が手に取り構造を知ることができるバリアフリー標本としての活用にも検討を行うため、爆轟による衝撃波を活用した標本作製の実験を重ねていく。これらの成果を、積極的に大概発表を行う。衝撃波利用学当初購入を予定していたハイビジョンマイクロスコープならびに微動スタンドについて、本研究ではより安価なHDMIデジタル顕微鏡で十分な情報が得られることが分かっため、購入内容を変更した。沖縄県固有種の試料採集のための旅費等の経費ならびに金属試料の塑性加工性を上げるためのなまし処理のための経費として使用する。
アレルギー性喘息肺での浸潤リンパ球のリアルタイムイメージング解析

本研究では申請者が独自に開発したリアルタイム可視化モニタリング系を用いて喘息肺でのTh2細胞の集積とfocus形成を制御する因子の同定を行ったところ、ICAM-1やVCAM-1の関与が明らかとなった。また、Th2細胞以外の機能的T細胞サブセットについて、炎症巣でのそれぞれの細胞の分布やその挙動、細胞間相互作用について解析を行ったところ、Th1細胞はTh2細胞のような明瞭なfocusを形成しないなど、T細胞サブセットによる集積様式の違いが明らかとなった。アレルギー性炎症疾患(花粉症、アレルギー性喘息など)の発症は、Th2細胞依存的であることが知られているが、数の上では浸潤細胞の数パーセント程度であり、Th2細胞が実際の肺の炎症の場でどのような機能を果たしているのか、特にTh2細胞が浸潤するタイミングや浸潤の様式、浸潤したTh2細胞の活性化状態などのダイナミックな細胞動態はほとんど明らかになっていない。本研究では蛍光を発するGFPトランスジェニックマウスのTh2細胞を移入するシステムを使って、気道炎症を起こしたマウスの肺でTh2細胞の浸潤を定量的に解析するためのリアルタイム可視化モニタリング系を独自に開発し、マウス喘息モデルにおいて抗原吸入後に起こるTh2細胞の浸潤の動態を時空間的に解析し、今年度に以下の結果を得た。1.Th2細胞の集積とfocus形成を制御する因子の同定OVA特異的TCRトランスジェニックマウス(OT-II)のナイーブCD4T細胞をin vitroで培養して分化させたTh2細胞の移入実験から、Th2細胞は抗原吸入後に肺に集積しfocusを形成してその後の好酸球浸潤や炎症巣形成を制御していることが明らかになった。次にTh2細胞集積やfocus形成を制御する分子の同定を行ったところ、気道炎症誘導前にICAM-1やVCAM-1に対する抗体を投与しておくと、Th2細胞集積やfocus形成が抑制されることが明らかとなった。また、ステロイド剤を投与した場合にもTh2細胞の浸潤が用量依存的に抑制された。2.T細胞サブセットの浸潤様式の比較Th2細胞以外の機能的T細胞サブセットについて抗原吸入後の肺への集積を調べたところ、Th1細胞も肺に集積することが明らかとなった。3.ライブマウス肺内イメージングシステムによる喘息肺でのTh2細胞の動的挙動解析マウスが生きた状態のまま肺の内部をビデオ撮影するイメージングシステムを独自に確立した。そしてこの系において左右の肺で血流量や細胞流入数に差がないことを確認した。これまでに喘息肺での蛍光Th2細胞のビデオ撮影を行い、Th2細胞の肺血管内でのrollingや組織内への浸潤の様子、focusの形成過程などの動的解析を行った。アレルギー性炎症疾患の発症はTh2細胞依存的であることが知られているが、数の上では浸潤細胞の数パーセント程度であり、Th2細胞が実際の肺の炎症の場でどのような機能を果たしているのかなど、ダイナミックな細胞動態はほとんど明らかになっていない。本研究では蛍光を発するTh2細胞を移入するシステムを使って、気道炎症を起こしたマウズの肺でTh2細胞の浸潤を定量的に解析するためのリアルタイム可視化モニタリング系を独自に開発し、マウス喘息モデルにおいて抗原吸入後に起こるTh2細胞の浸潤の動態を時空間的に解析した。また、Th2細胞以外の機能的T細胞サブセットについても炎症巣でのそれぞれの細胞分布や挙動を解析し、今年度こ以下の結果を得た。1.遺伝子操作マウスのT細胞を用いた浸潤様式のイメージング解析申請者のグループのこれまでの解析により、マウス喘息モデルで気道炎症が起きなし、または増悪することが示唆されている分子のノックアウトマウスのCD4T細胞を用いて実験を行い、イメージング解析によりその浸潤様式を調べた。その結果、喘息の発症が抑制されるCD69ノックアウトマウスのCD4T細胞は抗原吸入後の肺への集積が抑制されることが明らかとなった。2.マルチカラーモニタリングによる細胞間相互作用の解析GFPやRFPトランスジェニックマウスなどの細胞を用いてTh2細胞以外の機能的T細胞サブセットについて抗原吸入後の肺への集積を調べたところ、Th1細胞、Th17細胞、Th9細胞なども肺に集積することが明らかとなった。またこれらTh2細胞以外のT細胞サブセットの肺への浸潤様式はTh2細胞とは異なっていた。3.ライブマウス肺組織内におけるT細胞サブセットの動的挙動解析Th2細胞以外のT細胞サブセットについても喘息肺内部での動態をビデオ撮影し、浸潤様式の動的解析を行って活性化状態などをTh2細胞と比較検討した。

本研究では蛍光を発するTh2細胞を移入するシステムを使って、気道炎症を起こしたマウスの肺でTh2細胞の浸潤を定量的に解析するためのリアルタイム可視化モニタリング系を独自に開発し、マウス喘息モデルにおいて抗原吸入後に起こるTh2細胞の浸潤の動態を時空間的に解析した。また、樹状細胞の抗原取り込み過程の時間的定量的解析を行い、今年度に以下の結果を得た。1)樹状細胞の抗原分子取り込み過程の時間的定量的解析:抗原分子が肺組織内に取り込まれ、そこで炎症が誘導されるためには、まず抗原分子が樹状細胞などの抗原提示細胞に取り込まれてプロセシングを受ける必要がある。そこでGFP陽性の樹状細胞を移入し、蛍光標識した抗原分子を吸入させて肺組織内に取り込まれた抗原分子を取り込む過程の時間的定量的解析を行った。その結果、樹状細胞は抗原吸入20分後には抗原分子を取り込みはじめることが明らかとなった。2)ナイーブT細胞とエフェクターT細胞の浸潤の動態比較:ナイーブT細胞とエフェクターT細胞の浸潤様式を比較したところ、抗原吸入後エフェクターT細胞のみが肺に集積し、抗原特異的CD4T細胞であってもナイーブT細胞の場合には肺に集積しないことが明らかとなった。3)ライブマウス肺内イメージングシステムを用いた樹状細胞の抗原分子取り込み過程の動的挙動解析:GFP陽性の樹状細胞を移入し、抗原吸入後に樹状細胞が抗原を取り込む過程をビデオ撮影し、抗原取り込み過程の動的挙動解析を行った。また、マルチカラーイメージングによりTh2細胞のfocus形成との関わりを解析した。交付申請書に記載した研究の目的を達成するため研究実施計画に従って研究を遂行し、計画通りに研究が進んでいる。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでのところ、本研究課題は当初の研究計画通りに進んでおり、次年度も研究実施計画に従って研究を推進していく予定である。
ドイツ1920年代半ばのヒルファディングの景気政策と調査及び経済体制論

1920年代半ばにドイツでR.ヒルファディング(1877年-1941年)は、1925/26年恐慌時に、産業部門間の不均衡や技術的後進性など原因を分析し、財政通貨状況を考慮しつつ、金融緩和や公共事業など景気雇用政策を積極的に提起した。また彼は内政では、産業構造の変化に伴う企業家の協調的態度や、他党派の動向等も見すえながら、連立協議に尽力し、「社会的共和国」の理念と、組織された資本主義の民主的変革を説いた。同時に彼は経済調査のために、アンケート委員会の設置運営と聴取に中心的に参画し、企業経営の公開性やカルテルなど産業組織の利点と問題点、中央銀行による景気調整など重要な論点を提示し、総じて新たな注目すべき思想展開を示した。ドイツの1925年後半から1926年にかけてR.ヒルファディングの経済政策、特に景気政策論は、従来の研究では具体的に立ち入って論じられてこなかった。彼は相対的安定期の当初から早くも景気研究の必要性を説き、経済基盤の再生強化の観点から、政府の過大な公的支出と課税による「準備金政策」を批判した。1925年後半からの不況で彼は、戦時以来の経済の誤誘導や技術的後進性等をその原因と分析し、1926年には新ブルジョア中道政権のようなたんなる減税策でなく、住宅建設など積極的公共事業や金融緩和策、国際的経済政策及び協定、さらに合理化による失業の長期化への対応を説き、結局国会の雇用創出案決議に至った。同時に彼は産業構造の重工業から電機や化学工業への変化を確認し、階層的に組織された経済から民主主義的形態への移行を課題とした。1927年にはブルジョア右派政権誕生による予算の社会的支出削除に抗議し、工業独占の利害擁護の政策に対して「真の福祉国家、真の社会的共和国」を提起した。通商政策では彼は1926年に国際会議で過度の保護主義に反対して、包括的通商条約政策、国連を中心とした国際的関係の再建を訴えた。そして彼はスペイン通商協定ではワイン関税率の抑制を主張し、またスウェーデン通商条約では食糧関税の導入による生計費負担や、飼料関税の引き上げによる小農経営への圧迫を批判し、大地主のためでなく、農業の集約化と加工化に向けて、関税政策よりも生産及び信用政策の必要性を説いた。彼は現行関税率延長の社会民主党動議を提案するも否決され、条約成立となる。なお本年は学会誌からの委嘱により、ヒルファディングも関わったドイツ社会民主党の社会化論の書評も著した。ドイツで1920年代半ばにヒルファディングは経済政策の前提として経済実態の把握の必要性を説き、ドイツ経済生産販売条件調査委員会、いわゆるアンケート委員会の設置運営と聴き取り調査に自ら積極的に関わったが、従来の研究ではほとんど検討されてこなかった。1925年7月にヒルファディングら国会通商委員会は経済調査の委員会を求める動議を提案し、8月に国会本会議で可決に導いた。9月に暫定国家経済協議会で彼は設問準備委員会の設置を提案し、10月には作業計画を中心的に作成した。1926年3月にヒルファディングらの修正動議も入れてアンケート委員会設置法が国会で成立した後、彼は5月から準備委員として委員会構成を提案し、さらに6月から執行部として具体的な検討課題を提示した。彼は全般的経済構造を扱う第1小委員会の第3作業班で経済構造変化と株式法や産業集中、カルテル、第6作業班で国際債務収支、また産業を扱う第3小委員会では第6作業班の代表としてカリ工業、さらに通貨信用制度を扱う第5小委員会では委員長として中央銀行などを精力的に聴き取り調査した。彼は1928年6月から1929年12月まで財務大臣就任で委員会を離れたが、株式会社の公開性、販売シンジケートと価格、銀行カルテルと利鞘、割引政策と中央銀行の景気策、外債と公的資金の扱いなど、聴取の成果は報告書に生かされた。また通商政策では、彼は1927年4月のフランス暫定通商追加協定や7月の関税変更法について、国会通商委員会及び本会議で大衆賦課などの問題点を指摘したことが示された。なお本年度は経済学史学会全国大会において、関連テーマであるヴァイマル期ヒルファディングの活動と経済民主主義思想を扱った報告についてコメントを行った。ヒルファディングは1927年5月の社会民主党キール大会の基調報告で、「組織された資本主義」、企業経営の公共性、「経済民主主義」、ファシズムに対する民主主義擁護などを説き、党内左派に抗して、連立政策を含めた柔軟な戦術の決議を提案して採択に導いた。

彼の経済体制論は党の基本理念として政治的重要性を持っただけでなく、労働組合や共産党、オーストリア社会民主労働者党など党外からの反響の中で、その新たな独自性も示された。次いで通商政策については、彼はこの間1926年2月と5月の国際経済会議で、保護主義に対して最恵国通商条約の再建、ヨーロッパ関税同盟構想を主張し、その後6月にスウェーデン通商条約で食糧及び飼料関税引き上げ、また1927年4月にはフランス暫定通商協定で小麦粉関税引き上げを批判した。彼は5月のジュネーヴ世界経済会議を国際協力の動きとして歓迎し、同時に規制組織の必要性を訴えた。そして彼は7月の関税変更法では、まさに農民層のためにこそ関税引き上げを見合わせ、工業関税引き下げと共に安価な均衡をめざすよう主張した。さらに彼は9月にリオ国際通商会議で貿易障害の除去を訴え、国際カルテルとトラストを現代経済の特徴的な組織化傾向の産物と見なしつつ、独占阻止のために関税率軽減と公開性を求める決議を提起した。同時に彼は社会民主党内では農業綱領起草委員会委員長として、1月に大土地独占の撤廃と中小農民経営の生活保障、農業生産の促進、農産物販売の規制等を盛り込んだ草案を提案し、5月に論文で農地配分や価格形成の特殊性、農民経営の生産性向上を理論的に基礎づけ、そしてキール党大会で綱領を実現した。このように彼は新たな独自の経済体制論を積極的に展開すると共に、党内外のみならず広く国際的にも経済政策で重要な役割を果たしたことが明らかとなった。
生体内低分子を用いた組織接着剤の開発

現在臨床に用いられている医療用接着剤は、「シアノアクリレート系」、「ゼラチン-アルデヒド系」、「フィブリングルー系」接着剤に大別される。シアノアクリレート系とゼラチン-アルデヒド系は、もともと生体に存在しない合成接着剤であるため、接着強度は高いが、接着剤の反応・分解に関与するアルデヒド化合物が高い毒性を示し、疾患部位の治癒を阻害する。一方、フィブリングルー系は、血液凝固過程を用いる接着剤であるため、毒性は低いが同時に接着強度も低いという欠点がある。このように、臨床で用いられている接着剤はそれぞれ一長一短があり、高い接着強度と生体親和性を持つ医療用接着剤が強く求められている。そこで、クエン酸にスクシンイミジル基を導入した誘導体(CAD)を合成し、このCADを硬化成分とし、生体高分子のコラーゲンを硬化成分とする2成分系の接着剤を開発した。生体組織のモデル系としてコラーゲンを主成分とするケーシングを試験片に用い、開発した接着剤の接着強度を評価した。開発した接着剤のコラーゲンケーシングに対する接着強度はCAD濃度の増加に伴い100mMまでは増加し、その後減少した。本接着剤によるケーシングの接着は、CADが接着剤中のコラーゲンだけではなく、ケーシング中に含まれるコラーゲンとも反応することによるものと考えられる。一方、CAD濃度が100mMを超える条件では、コラーゲンのアミノ基に対して添加するCADの活性エステルの数が過剰になり、接着剤の架橋密度が低下することによって強度が低下すると考えられる。また、最大の接着強度は、フィブリン系接着剤と比べて約9倍高く、アルデヒド系接着剤とほぼ同等の値を示すことが明らかとなった。外科手術等による創傷部の閉鎖・接合を簡便に行うため、医療用接着剤が用いられている。現在、臨床に用いられている接着剤は、「シアノアクリレート系」、「ゼラチン-アルデヒド系」、「フィブリングルー系」接着剤に大別される。一方、フィブリングルー系は、血液凝固過程を用いる接着剤であるため毒性は低いが、同時に接着強度も低いという欠点がある。このように、現在臨床で用いられている接着剤はそれぞれ一長一短があり、高い接着強度と低い毒性を合わせ持つ医療用接着剤が強く求められている。そこで本研究では、クエン酸にスクシンイミジル基を導入した誘導体(CAD)を合成し、このCADを硬化成分とし、生体高分子のコラーゲンを硬化成分とする2成分系の接着剤を開発した。今回は、ブタ軟組織に対する接着強度および硬化成分の細胞毒性について評価を行った。カルボジイミド存在下でクエン酸とN-ヒドロキシスクシンイミド(HOSu)を反応させることにより、CADが収率約80%で得られた。^1H-NMRによりクエン酸のカルボキシル基がすべて活性エステル化されていることを確認した。接着強度は、CADおよびCol濃度の増加に伴い増加した。Col濃度50%、CAD濃度が100mMでは、元の組織の引き裂き強度にほぼ匹敵する高い接着強度を持つことが明らかとなった。CAD及びCol濃度の増加に伴う接着強度の増加は、ゲルの架橋密度が増加したことによるものであると考えられる。一方、細胞培養によりCADの細胞毒性を調べた結果、CADはクエン酸と同程度のIC50値を示し、毒性が低いことが明らかとなった。さらに、「ゼラチン-アルデヒド系」と比較すると毒性が1/10以下になることが明らかとなった。以上の結果から今回開発した医療用接着剤は、生体組織を引き裂くほどの高い接着強度を持ち、硬化成分であるCADの細胞毒性も非常に低いことが明らかとなった。
子どもの医療をめぐる法的・倫理的諸問題についての比較法制研究

イギリスにおいて裁判所のパレンス・パトリエ管轄権が子どもの医療上の決定に活用されるようになった経緯と同制度が果たしてきた役割を,おもに裁判例の分析を通じて検討した。その結果,以下のような知見を得た。イギリスにおいて子どもの治療に関する決定がはじめて司法の場に持ち込まれたのは,1981年のB事件においてである。この事件は,腸に先天的な障害のあるダウン症の新生児に対する手術を親が拒否したケースであり,裁判所は新生児に対する手術を許可する判決を下した。この事件以降,宗教上の理由に基づく輸血拒否など,子どもの治療に対する同意を親が拒否している場合に裁判所の決定を求めることが一般化した。1990年代後半から,子どもの治療をめぐる裁判例に新たな動きが見られるようになる。生命維持治療(とくに人工換気療法)の実施・継続を希望する親と,治療の差し控え・中止を提案する医療側との間で対立が生じ,医療側が治療の差し控え・中止の承認を裁判所に申し立てるケースが散見されるようになったのである。この種の裁判例の中でもとくに,2004年から2005年にかけて新生児に対する生命維持治療をめぐって裁判所で争われた2つのケースは,社会的にも大きな議論を引き起こすこととなった。Nuffield Council on Bioethicsはこれらの事件を契機として胎児・新生児の生命維持に関する倫理的問題を検討するためのワーキング・パーティを設置し,現在議論を行っている。また,これらの事件を契機に,子どもの医療に関する決定における裁判所の役割を見直すべきであるという議論も現れている。イギリスにおいては子どもの医療に関する決定をめぐる裁判所の役割が新たな局面を迎えつつあるといえる。
BCL6がん遺伝子とAPI2-MALT1融合遺伝子の機能解析と診断治療への応用

染色体転座関連がん遺伝子BCL6ならびに我々自身が単離したAPI2-MALT1融合遺伝子の機能を解明することにより、悪性リンパ腫の診断、治療への臨床応用を実現することを目的として以下の諸点を明らかにした。1)BCL6プロジェクトcDNAマイクロアレイによる標的遺伝子の探索。BA/F3細胞に樹立したBCL6発現誘導系と蛍光プローブを用いた大規模なcDNAマイクロアレイを組み合わせてBCL6の新規標的遺伝子を探索し、三つの標的遺伝子を同定した。同定した遺伝子の発現がBCL6の直接な制御下にあるかどうかレポーターアッセイ法やゲルシフト法を用いて検討するため、それぞれのプロモーターを含むゲノムを単離し、現在レポーターコンストラクトを作成中である。2)API2-MALT1プロジェクトMALTリンパ腫に高頻度に認められる染色体転座t(11;18)(q21;q21)の本体がAPI2-MALT1遺伝子融合であることを明らかにしてきた。API2-MALT1,API2,MALT1それぞれをtagを付加した発現ベクターを用いて各種細胞株にトランスフェクトし蛋白の安定性を検討したところ、API2,MALT1はproteasome阻害剤の添加により半減期の延長が観察された。一方、API2-MALT1キメラはproteasome阻害剤を添加しなくても半減期の延長がみられた。また、細胞内局在を検討したところ、API2は核と細胞質に局在したが、API2-MALT1キメラの形成によって局在は細胞質へ移動した。さらにAPI2,MALT1の機能ドメインをbaitにして結合タンパク質を解析して、Two-hybrid assayによって結合蛋白質の候補を単離した。さらに、API2-MALT1トランスジェニックマウスの作成し解析中である。
炎症性腸疾患におけるADAM分子を介した新規炎症機構の解明

本研究課題では炎症性腸疾患におけるADAM分子を介した新規炎症機構の解明を目的とし、(1)炎症性サイトカインにより血管内皮細胞で誘導されたADAM28が白血球-血管内皮細胞接着促進に関与すること、(2)ADAM17ノックアウトマウスを用いたDSS誘導性大腸炎モデルではADAM17は腸管上皮の再生に関与する可能性があることを明らかにした。ADAM(a disintegrin and metalloproteinase)は、ヘビ毒メタロプロテアーゼおよびディスインテグリンと相同なドメインを持つタンパク質群の総称である。本研究課題では、特発性炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎、クローン病)に焦点を当て、ADAM17による膜型TNF-αのshedding→血管内皮細胞でのADAM28の発現誘導→ADAM28/PSGL-1を介した白血球の血管外遊走促進というADAM分子を介した新規の炎症調節機構の可能性を検討した。はじめに、血管内皮細胞におけるADAM28の発現調節機構を明らかにするために、培養ヒト血管内皮細胞を種々のサイトカインで刺激し、ADAM28発現誘導因子を検索した。これまでに、我々はヒト培養血管内皮細胞でのADAM28発現誘導にTNF-α刺激が重要であることを明らかにしているが、ADAM28はTNF・αのほか,IL-1α、PMAといった炎症性サイトカイン刺激によりprotein kinaseCの活性化を介して発現誘導されることが明らかとなった。さらに、PSGL-1を発現する前骨髄性白血病細胞株HL-60細胞をこれらのADAM28発現誘導因子で刺激したHUVEC細胞由来の培養液とインキュベートし、固相化P-selectinへの接着実験を行うと、HL-60細胞の固相化P-selectinへの接着能はHUVEC細胞由来ADAM28に依存して特異的に促進した。以上のデータは、ADAM28が炎症部位の血管内皮細胞により発現され、炎症局所における白血球浸潤制御に関与している可能性を示唆している。
代謝系の自己組識化に基づく細胞行動における位置情報の生成

刺激応答および行動にともなう細胞内化学成分と細胞内構造形成の時間・空間的変動をしらべた。1.化学パタ-ンの形成と細胞骨格の再編成との対応。粘菌の生理的条件下における細胞骨格(複屈折繊維)形成のダイナミックスを、マイコン画像処理法を開発して解析した。走電性発現に伴って、陽極側で複屈折繊維が増加し、陰極側へうねりを伴いながら減少していった。このとき、ATP濃度の低いところで細胞骨格は多く形成されることがわかった。したがって、自己形成されたATP濃度分布に従ってアメ-バ運動がコントロ-ルされていると考えられる。2.細胞行動に伴うリン脂質の時間・空間分布。細胞膜の重要な構成成分であるリン脂質組成の刺激応答や行動発現に伴う変動を調べた。フォスファチジン酸は、忌避刺激により上昇し、誘引物質では減少した。一方向に移動している粘菌では、前端部で低く後部で高くなりるという極性分布をとることがわかった。3.Cellーfreeシステムでの新しい化学振動の発見。粘菌ホモジェネ-トのリン脂質組成が振動していることがわかった。4.紫外線および各種ホルモン刺激によりヒト表皮角化細胞のCa^<2+>濃度が上昇することがわかった。以上、細胞は非線形非平衡条件にあるダイナミックな化学反応系として、化学振動や空間パタ-ンと言った時間空間秩序を自己組織化しており、これが生物情報処理および位置情報生成と深く関係していることが明かとなった。
気泡塔に懸濁させたリポソーム内の光誘起電子移動反応による連続的二酸化炭素還元操作

酵素反応を用いて二酸化炭素を循環利用するために,脂質膜小胞(リポソーム)により酵素を安定化するとともに,連続反応のための脂質膜内光誘起電子移動反応系を構築する.リポソーム内酵素は高次構造が著しく安定化され,ガス通気を伴う反応器内で安定であった.また,クロロフィル複合化リポソームを調製して脂質膜系光化学反応の特徴を明らかにした.以上より二酸化炭素還元プロセス構築のための各要素に関する重要な知見を得た.酵素反応を用いて二酸化炭素を循環利用するために,脂質膜小胞(リポソーム)により酵素を安定化するとともに,連続反応のための脂質膜内光誘起電子移動反応系を構築する.リポソーム内酵素は高次構造が著しく安定化され,ガス通気を伴う反応器内で安定であった.また,クロロフィル複合化リポソームを調製して脂質膜系光化学反応の特徴を明らかにした.以上より二酸化炭素還元プロセス構築のための各要素に関する重要な知見を得た.本研究で用いる脱水素酵素系は,多量体構造を有するため,遊離状態では特に低濃度条件下と高温条件下においてサブユニットへの解離が促進され著しく不安定であることがわかった。そこで,四量体構造を有し,活性測定が比較的容易な酸化酵素カタラーゼを用いて,気泡塔バイオリアクターの条件下で機能する多量体酵素系の開発を行った。リポソームにカタラーゼを内包したところ,55°Cにおける酵素活性の保存安定性が遊離酵素系に比べて安定化された。これは,リポソーム内への酵素の濃縮効果と脂質膜との相互作用により酵素のサブユニットへの解離と3次構造の変化による凝集体の形成がともに抑制されるためであった。さらに,外部循環式エアリフト型気泡塔にカタラーゼ内包リポソームを懸濁して,40°C,最大ガス空塔速度を1.9cm/sで操作したところ,直径が約200nm以下のリボソームは,気泡塔内の気液流動場において脂質膜構造が安定であり,リポソーム内の酵素が安定化されることがわかった。これらの知見を基に,アルコール脱水素酵素(ADH)及び補酵素NAD+を共に内包した直径約100nmのリボソームを調製した。その結果,低分子量のNAD^+はリポソーム内に安定に内包された。また,遊離ADH/補酵素系は50°Cにおいて凝集体を形成して失活したが,リポソーム内では,脂質膜との相互作用下において熱安定性の高いADH-NAD^+複合体の形成が促進され,酵素活性が著しく安定化されることがわかった。蟻酸脱水素酵素系においても上述のリポソーム内封入による酵素活性の安定化効果がみられた。以上の結果より,リポソーム内に構築された脱水素酵素/補酵素系は酵素の多量体構造が著しく安定化され,酵素活性を持続できる触媒系であることを明らかにした。まず,脱水素酵素と補酵素を内包した直径約100nmのリポソームを調製して,内包酵素の安定性を検討した。脂質膜が存在しない場合,蟻酸脱水素酵素(FDH)の60°Cにおける安定性は,補酵素を共存させることにより増大した。また,還元型補酵素NADHと複合体を形成したFDHは酸化型NAD^+-FDHに比べて異なる構造と高い熱安定性を示すことを明らかにした。リポソーム内において,補酵素は同様にFDHの熱安定性を増大させた。リポソーム内では,脂質膜と補酵素の複合作用により,遊離酵素系に比べてさらに安定なFDH反応系が形成された。次いで, Chlorophyll α(Chl α)を脂質膜に複合化したリポソームを用いる光誘起電子移動反応系の構築について検討した。疎水性の高いChl αは高効率にリポソーム膜に複合化された。Chl α複合化リポソームと種々の電子伝達体間相互作用に及ぼすリポソーム膜内コレステロール,荷電脂質の影響を蛍光法により明らかにした。最適調製したChl α複合化リポソームを用いてMethylviologen (MV)を電子伝達体とする光誘起電子移動反応を行い,著しく低レベルではあるが,電子移動に伴う還元型MVの生成を確認した。さらに,外部循環式エアリフト型気泡塔にFDH/補酵素系を内包したリポソームを懸濁して,酵素の安定性に及ぼすガス空塔速度,補酵素の酸化還元状態及び酸化剤としての銅イオンの影響を検討した。その結果,気泡塔内気液流動場において,リポソーム内酵素は,銅イオンが共存する高ガス空塔速度条件下において遊離FDH/補酵素系と比較して高い安定性を示すことを明らかにした。補酵素は酸化還元状態に依存せず気液流動場において安定にリポソームに内包された。以上より,リポソーム内封入脱水素酵素・光誘起電子移動反応を用いる二酸化炭素還元反応の各要素技術に関する有用な知見が得られた。
本態性高血圧症および心不全発症機構に関する包括的ゲノム解析

(1)心筋細胞にはエンドセリン、エピネフリン、アンギオテンシンおよびカルジオトロフィンなど複数の肥大誘導因子が働くが、これら液性因子がどの様な細胞内シグナルを惹起するのかは明かにされていない。我々はラット培養心筋細胞を用いてこれらの液性因子によってどの様な細胞内系路が共通に、また各因子特異的に活性化されるかをDNAチップによる解析で検討した。その結果カルジオトロフィンは他の三因子とは極めて異なるセットの遺伝子発現を誘導することがわかり、また細胞死に関する制御もそれぞれの因子が特異的な系路を介していることが明らかになった。(2)食塩負荷により高血圧、心肥大、および心不全を比較的短期間の内に経過する遺伝性食塩感受性ラットDahl ratを用い、各ステージにおける心筋細胞の変化をGeneChipシステムを用いて解析した。その結果高血圧発症時、および心機能低下時に特異的に発現上昇・低下する遺伝子群が明らかになった。(3)自治医科大学は、卒業生が本邦の極めて広い地域に渡って実際の医療に従事し、大学を中心としたネットワークを形成しているという特色を有している。そのため本学は全国より様々なヒト検体を収集し、かつこれらを食塩摂取量、薬剤効果など様々な患者プロファイルの観点からグルーピング可能である。そこで本年度は全国よりの血液サンプリングのシステム構築を行い、来年度より家族性高血圧症に関与するSNPの同定を目指す。
新規開発・低速原子散乱による絶縁体表面三次元構造マッピング装置

電気的に中性な希ガスビームが、分析プローブとなっている。入射エネルギーは、3keV以下であり、100kHzにパルス化している。このパルス化された原子ビームを絶縁体表面に照射し後方散乱された粒子をMCPで検出した。実際には飛行時間を計測することで表面元素の同定が行える仕組みとなっている。試料を面内回転及び極軸回転することで絶縁体表面第1原子層から第3原子層までの情報が得られる。空間分解能は、0.1A以下である。この装置に係る計測制御系を全設計自作し、マッピングができるようにした。本研究を実施ている実験装置は、自作機に基づいている。長年かけて電子回路、計測用ソフトウエァー、試料用マニュピュレータを外部への依頼を行わずに自作した。このため他にない独創性がある装置開発が進んでいると考える。H20年度は、計測用ハードウエァである電子回路の実装を再度見直した。具体的にはプリアンプを電荷増幅型のものに変更した。飛行時間計測用計器の電子回路実装変更、複数のパルス信号が自由自在な時間タイミングで発生できるよう電子回路の変更、ステッピングモータ駆動用電源の変更などを実施した。その成果があり、飛行時間スペクトルは非常に優れたS/N比で取ることに成功した。かつデジタル・アナログ電子回路混在の計測用ハードウエァーがノイズの影響を受けなく安定して働くようになった。電子回路については実用新案を申請し権利化を図った。今後出願の変更も検討している(特46条の2)。早期権利化をはかったのは、自作電子回路をビジネスとして活用する旨の話があったからである。また検出器周辺では電場の掛け方を変更し検出効率を100%とした。検出器前に設置していた電子線除去用のメッシュを取り外すことができた。課題を遂行するにあたり基本となるハードウエァーについての十分な改良が行えたと考える。今後新たな問題が発生するかもしれないが一つの大きな壁を越えたと考える。これは大きな研究成果であると考える。さらなる機器、計測用ソフトウエァーの改良を加えて目標である絶縁体表面原子構造を計測の実施を行う。固体表面科学において絶縁体の表面構造はあまり知られていない。表面構造を解析するプローブは電子線、イオンビームが主に用いられてきた。これらのプローブを用いた場合、絶縁体表面上では電荷が蓄積されること(チャージアップ)が知られている。この効果を補償するためには表面上に蓄積される電荷を打ち消す手法が必要である。例えば、イオンビームを固体表面に入射させながら別途電子線を照射する方法もあるが補償効果は十分とはいえない。そこで今回は電荷を持たない低速原子散乱装置を開発することになった。入射プローブは電気的に中性であるので固体表面での電荷蓄積を考慮することはない。実際にはNe^0原子ビームを生成した。今回は、原子の飛行時間を測定するための計測計時装置が電気回路的に安定して働くように開発を行い特許出願を行った。この装置は、時間分解能が10nsecで4ch同時測定できる機能を要している。制御プログラムに改良を加えハードウエァの遊び時間を従前の1/2以下にすることができた。中性化効率は電荷交換反応を用いているために30-40%程度である。これは電荷交換反応による断面積を考慮して計算される値とよい一致を示している。しかしながら、より効率よく測定を行うために金属表面にイオンビームを一回散乱して試料に照射する方法を検討している。また超高真空チェンバーが、原子ビームラインによる圧力増加を防ぐために作動排気を見直した。まだ開発途中にはあるが、一歩一歩問題を解決し実用化に向けて着実に歩んでいる。表面科学において絶縁体の表面構造は未開拓研究領域である。現在に至るまで表面構造を解析するプローブは電子線、イオンビームが利用されている。荷電粒子を用いたプローブは、絶縁体表面上でチャージアップ現象を起こす。この現象を打ち消す実験的手法が必要となる。そこで、電荷を持たない低速原子散乱装置を開発してきた。平成22年度は3keV-^4He^0原子ビームを生成した。今回は、絶縁体結晶の表面原子マッピングによる原子構造イメージ像取得の開発を試みた。前年度に特許出願を行った原子の飛行時間を測定するための計測計時装置を活用した。計測制御プログラムは、マッピングが取れるよう試料ホルダーに付随しているステッピングモータとの連動ができるようにした。しかしながら、中性化効率は電荷交換反応を用いているために相変わらず30-40%程度である。

これは電荷交換反応による断面積を考慮して計算される値とよい一致を示しているが、より効率よく測定を行うために金属表面にイオンビームを一回散乱して中性化をはかる方法を考えている。以上に示す研究を重ねた結果、絶縁体表面原子構造のマッピング図が取れる装置となった。2次元的には、XY方向であるが、深さ方向をZ軸とすると、表面第1原子層から第5、6層付近までの原子配列を反映したイメージ像が取れるようになった。
呼吸器系のマルチスケール連成シミュレーション

ヒト鼻腔のCTスキャンの画像データを用いて鼻腔の実形状計算モデルを構築し,呼吸を模擬した気流の数値シミュレーションを行い,鼻腔内気流動態を解明した。また,喘息発症時における細気管支の狭窄現象を基底膜の動的座屈として理論モデルを構築し,実験と解析結果とを比較することにより理論の妥当性を示した。さらに,赤血球の変形に関する数値シミュレーションを行い,計算手法の妥当性と有効性を示した。3人の被験者に対する鼻腔の実形状モデルに対し,呼吸気流を模擬した数値シミュレーションを行った。その中で1人は左鼻腔に鼻閉を感じている被験者である。計算の結果,鼻閉を感じる被験者の左鼻弁部の壁せん断応力が局所的に大きく,同時にその部分で主流方向圧力勾配が高くなることを見出した。この特徴は鼻閉感のない他の2人の被験者には見られない特徴であった。この結果より,局所壁せん断応力と局所圧力勾配の値を用いて,鼻閉感の判定ができる可能性を示した。次に,鼻腔モデルの被験者の鼻腔抵抗を鼻腔通気度測定装置を用いて測定し,数値シミュレーションより求めた抵抗値と比較を行い計算結果の精度を検討した。肺気道は基底膜を含む剛性の高い内層と剛性が低い粘膜下組織(外層)からなるため,ヤング率の低いシリコーン・ポッティングゲルを用いて外層のみをモデル化した生体外気道モデルを製作した。そして喘息時の気道狭搾を模擬した実験を行い,座屈発生時における外層の挙動を調べた。そして周方向波数(ひだの数)が内外圧力差上昇速度を無次元パラメータとして整理できることを明らかにした。肺胞等に存在する毛細血管を模擬した流路内における赤血球の変形に関する数値シミュレーションを行った。計算方法はimmersed bounadry法である。計算結果として得られた赤血球の変形動態と実験や観察結果との比較により,計算モデルの妥当性を示した。同時に,マイクロチャンネルを通過した直後の赤血球の回復挙動を観察する実験を行い,赤血球をケルビンモデルとしてモデル化して形状回復過程における時定数を算出した。ヒト鼻腔のCTスキャンの画像データを用いて構築した鼻腔の実形状計算モデルに対し,呼吸を模擬した気流の数値シミュレーションを行った。その際,モデル構築の高速化・高精度化を行なうために,CTの2Dデータから直接3Dモデルを構築した。同時に,鼻腔の実形状モデルおよび水力平均直径モデルを製作して呼吸の模擬実験を行った。これらの結果より,鼻閉感治療において最適切除部位を決定し仮想手術シミュレーションを行うための基礎技術が確立された。細気管支における基底膜を薄肉粘弾性円筒とモデル化して,喘息発症時における細気管支の狭窄現象を動的座屈として理論モデルを構築した。同時に,生体外気道モデルに対する狭窄の模擬実験を実施した。そして座屈波数(周方向のひだの数)について実験と解析結果とを比較することにより理論の妥当性を示した。さらに,基底膜の外側に存在する粘膜下層など周囲組織の付加質量としての影響が座屈波数に及ぼす影響を明らかにした。また,基底膜と粘膜下層の両方をモデル化した気道の生体外二層モデルを作製して狭窄の模擬実験を行い,発生するひだの数に及ぼす外層の影響を実験的に明らかにした。以上の結果より喘息発症時の気道狭窄の力学的モデルを構築することができた。毛細血管における赤血球の変形に関する数値シミュレーションを行った。同時に,毛細血管を模擬したマイクロチャンネルを通過する赤血球の実験を行った。そして数値シミュレーションにより,赤血球がマイクロチャンネルを通過した後の形状回復の時定数を予測することが可能であることを示した。この時定数は赤血球の変形能と関連するため,この結果より赤血球の変形能を計算により求めることが可能であることを明らかにした。
職業癌の分子遺伝学的研究

癌抑制遺伝子の一種と考えられているp53遺伝子の変異の有無は、種々の悪性腫瘍について調べられてきた。しかし、まとまった症例数の悪性胸膜中皮腫のパラフィン包埋組織中のDNAを用いた解析結果は未だ報告されていない。そこでp53遺伝子の変異の有無を悪性胸膜中皮腫のパラフィン包埋組織中のDNAを直接解析することにより明らかにする目的で本研究を行なった。生前のアスベスト曝露歴が確認され、剖検後、病理医の診断によって悪性胸膜中皮腫と診断された7症例のパラフィン包埋組織の悪性胸膜中皮腫部位からDNAを抽出し、p53遺伝子の第59exon領域をPCR(polymerase chain reaction)法によって増幅し、各領域の遺伝子変異の有無をSSCP(single strand conformation polymorphism)法によって解析した。また、今回の7症例中1症例では、蛍光色素を用いたCycle Sequencing法をシークエンサーにより実施し、p53遺伝子の第59exon領域のDNAの全塩基配列を確認した。PCR-SSCP法では、今回の7症例のいずれにおいてもp53遺伝子の第59exon領域の変異を認めなかった。また、Cycle Sequencing法によって確認した症例のp53遺伝子の第59exon領域のDNAのいずれの塩基配列にも変異は認めなかった。今後、検討症例数を増すとともにp53遺伝子の変異が高頻度であるといわれている肺小細胞癌を陽性対照群として今回の実験系の精度を確認する予定である。また、同様の検討をH-ras癌遺伝子についても実施する予定である。