hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
平滑筋ミオシンとその遺伝子を用いた血管障害の新しい診断・治療法・病態モデルの開発

しかしこの領域はサル腎細胞であるCOS細胞では活性がなく、この部分に平滑筋特異的な転写を制御するシスエレメントが存在すると考えられた。この領域をゲルシフトアッセイ、DNaseIフットプリント法によって検討したところ、3種のシスエレメントが存在し、その中で特に重要な未知のシスエレメントTREMは、平滑筋細胞でのSMemb発現を正に調節していた。さらにTREM1に結合する蛋白を解析し、結合蛋白のcDNAクローニングを試みた。その結果、2種のcDNAの単離に成功した。この中の1種の遺伝子はウサギ大動脈平滑筋において、胎児期には多量に発現しているが、出生後発現が減少しており、平滑筋の分化・増殖に関与していると考えられた。SM1遺伝子の正の転写調節領域は-90bp付近に存在するSp1類似蛋白であることがSMembと同様な方法で結論された。一方、平滑筋ミオシン遺伝子の基礎的検討と平行して、SM1に特異的なイムノアッセイ系を開発し、血管炎や解離性大動脈瘤の血清学的診断方法を開発した。これによると、急性期には血中平滑筋ミオシンは正常値の3-10倍に上昇し、急性心筋梗塞との鑑別診断に有用であることが判明した。筋肉細胞に含まれる酵素や収縮蛋白は筋が壊死に陥ると血中に流出する。これは筋ジストロフィーや急性心筋梗塞などの診断に極めて有用な検査法となっている。本研究ではまず平滑筋特異的なミオシン重鎖を単離精製し、これに対する特異的モノクローナル抗体を作成し、イムノアッセイを確立した。平滑筋ミオシンは急性大動脈解離の症例で、発作の24時間後に血中で上昇し、診断の感度は85%、特異性は97%であった。一方、平滑筋ミオシン遺伝子を用いた疾患モデル動物の開発を行うため、SM1/2遺伝子を単離し、そのプロモーターを利用して平滑筋特異的に発現する遺伝子導入を行ったが、SM1/2遺伝子の5'末端のプロモーター領域だけでは、平滑筋特異的遺伝子発現を規定することはできないことが判明した。しかしながら、平滑筋増殖に関与するNa/H逆輸送担体のトランスジェニックマウスを作成したところ、導入遺伝子は染色体に組み込まれながらもmRNAが発現していないマウスをスクリーニングし、偶然、テロメア領域の何らかの単一遺伝子がノックアウトされた、いわゆる挿入変異insertional mutagenesisの系を樹立した。そのマウスを病理学的に解析すると、平滑筋増殖と石灰化を伴う著明な動脈硬化病変が認められ、挿入変異により生じた新しい血管障害のモデル動物であることが判明した。すでに原因遺伝子は数kbの範囲で同定されており、cDNAと蛋白を単離することによって、平滑筋分化や細胞老化、さらに血管の病態形成を抑制する内在性の分子機構の解析が可能になった。
北斎版本オンラインカタログ・レゾネ作成と公開

本プロジェクトは大英博物館の北斎の晩年プロジェクトと共同ですすめており、本年度4月には米国フィリアーアンドサックラー美術館での北斎肉筆画調査と旧プルヴェラー蔵およびフィリアー蔵書の北斎版本の調査を実施した。調査のうち、20世紀はじめに北斎作品をフィリアーに売却した小林文七のアーカイブスが美術館にあることが分かった。小林文七は北斎作品の複製をてがけており、複製制作にかかわることがアーカイブスに記述されているかどうかが期待される。版本については、両コレクションともにすでにデジタル・アーカイブ化されており、本研究プロジェクトですすめているカタログレゾネとも相互リンクによって情報を共有化させることを図書館スタッフおよび学芸員と相談している。また、立命館大学、学習院大学と大英博物館で定期的に実施している北斎版本の序文および『絵本彩色通』の講読については、1823年から1837年出版までの北斎序文の注釈、現代語訳および英訳をすすめることができた。また『絵本彩色通』については初編の7丁オモテまでを講読をすすめた。2019年度は以上の蓄積をWEBで閲覧、検索できるシステムを立命館大学アートリサーチセンターと協力してすすめていきたい。また、以上の研究結果については2019年2月25日に学習院大学でまとめのワークショプを実施し、これまでの業績と今後の課題について整理した。これまでにすすめている網羅的な調査報告および文章の講読によって特に北斎の1830年代の制作活動が研究の焦点となってきている。意欲的な『富嶽三十六景』シリーズの刊行以降、1835年ごろには北斎は一枚摺の制作をストップしており、また版本についても特に1830年代後半のものについては出版が遅れているなど不可解なことが多い。以上の問題提起および現在までの研究結果を2019年に大英博物館出版の書籍における論文にまとめ出版する予定である。大英博物館、立命館大学アートリサーチセンターおよび学習院大学の協力によって特に北斎の晩年に出版された版本の講読が飛躍的にすすんだ。特に最晩年北斎最後の作品である『絵本彩色通』の内容については、深く読み進めるために他の画法書の整理をすすめることが必要であり、特にJosiah Conder著Paintings and Studies by Kawanabe Kyosai (Tokyo: Maruzen Kabushiki Kaisha, 1911年)の、Glossary部分や、市川守静編『丹精指南』(東京美術学校々友会, 1926年)における絵の具および絵画技法の用語整理を同時にすすめた。また、エリス・ティニオス氏の協力によって北斎版本制作にかかわっていた版元西村屋与八、永楽屋東四郎、小林新兵衛についての調査をすすめている。特に永楽屋については天保後期より江戸の版元が所有していた版木を買い取り多くの版本を再版していることは、北斎版本についても例外ではなく、今後他の出版事例も含めて再版の経緯については入念に調査、整理される必要がある。今年度までに天保期の永楽屋の蔵版目録についてリスト化をすすめ、出版の状況について整理している。また、1823年に西村屋から出版された『今様櫛キン雛形』は1880年代に京都、大阪にて図様を敷き写しにしたものが版行されている。北斎版本の図様の流用を考える上で興味深い事例であり、明治期の北斎デザイン人気を裏付けるものとして位置づけられる。小林新兵衛については明治期に天保期の版木を使って出版された版本が国内外に何点か所蔵されており、また出版当時の蔵版目録が残されていることによって、北斎の死後幾年かたった後で北斎版本が出版される理由についてが明確になってきている。明治期の北斎版本の受容と広がりについてはあらためて論考としてまとめる必要がある。現在までに、北斎版本についてのカタログレゾネをデータベースとして作成し、公開をすすめた。一方で出版の背景を考えるための諸資料の調査を実施した。これまでの課題である近世期の版元一覧をデータベースとして整理し、公開すること。また版元と版本のデータを結びつけることで出版の諸相を版元ごとにデータベース上で視覚化できるようにすることが引き続き課題として残っている。また、エディションの前後関係についてもデータベース上でならべて表示できるようにしたい。また、立命館大学アートリサーチセンターでは、既存の版本データベースにイメージマッチングシステムを導入することを検討しており、前述したように北斎デザインが他の版本で流用されているような事例を発見できるようになることが期待される。また、2016年より立命館大学、学習院大学、大英博物館と共同して北斎版本の序文、書簡、『絵本彩色通』の内容についての講読と英訳とをすすめてきている。すでにアートリサーチセンターとは語釈、現代語訳、英訳をならべて表示できるようなシステムについてのアイデアについては話し合いを行ってきた。また、画法書のような関連する書籍についてもすぐに語彙検索できるようになること、また研究会が進むにつれて必要語彙を蓄積していけるようなシステムの内容についても検討されている。しかしながら、版本の基礎情報および画像を公開する版本データベースとの連携については未だ実現していない。今年度はこれまでの研究成果をweb上で公開するシステムを開発すること、またそれらの情報が版本のカタログレゾネと有機的に結びつくような方法を考案し、今年度中に実際に運用していくまですすめたい。以上のシステム開発にあたって、アートリサーチセンターのテクニカルサポートチームと密に相談し、実際の運用まですすめられるような研究計画がたてられるように相談をすすめている。

本研究では国内外に所蔵されている北斎版本の古典籍のデジタル化をすすめながら、北斎版本のカタログ・レゾネ(総目録)をオンライン上で作成することによって、それぞれの作品の異版や後摺りなどの出版行程を明らかにすることを目的としている。四年間の研究期間では、特に北斎晩年に多く出版されている絵手本類を中心に整理し、北斎版本の総合的なカタログレゾネを作成することを目指す。本年度は北斎版本の調査として、ベルギー王立美術歴史博物館(ベルギー)約110点、メイドストーン博物館(イギリス)約30点、国内個人コレクション10点のデジタル撮影を実施した。また、版本のカタログレゾネ作成に関連して大英博物館に所蔵されている北斎一枚摺のカタログレゾネ90冊のスキャニングをはじめており、3000作品のうち800点をデジタル化することができた。特に1823年に出版された『今様櫛(キン)雛形』は明治の後刷が何例かあり、『万職図式』(もくしくは図考)と京都、大阪で工芸のデザイン帳として出版されていることがわかっていたが、ベルギー王立美術歴史博物館では初版の体裁であった横本ではなく、半紙本の形式で異版が作られている。また1860年代のパリのオークションでも『万職図式』の書名がカタログに見られており、北斎のデザインがブランド化しそのデザインを広める手段として版本が機能しており、またそれらが海外にも早くから流出していることがわかった。今後またさらにデジタル化をすすめて同デザインの版を細かく比較、分析することで、版本の体裁、版の違いから時代関係がさらに明らかになってくると思われる。デジタル化の作業を一箇所につき2週間ごと集中的に実施し、順調にすすめることができた。それには各所蔵機関、コレクション所蔵者からの協力が得られたことが非常に大きい。また、大英博物館からはスタッフの協力を得て、関連する北斎一枚摺のスキャニング作業を予定通りすすめることができた。2-3月に代表者が日本に帰国することとなり博物館での作業をスタッフのみに任せることになってしまったが、11-1月の作業時間を増やすことで対処することができ、作業の遅れを未然に防ぐことができた。本年度より、大英博物館・ロンドン大学SOASの北斎研究プロジェクトと共同で、北斎版本の序文を読む研究会を実施している。北斎版本の序文から、北斎の文化圏、出版の背景を読み解くことを目的としており、また海外の研究者と協力して序文の文章を英訳することもあわせて実施している。今年度は『富嶽百景』の初編の序文からスタートしており、今後は北斎絵本の序文を中心に今後定期的に講読をすすめていく。研究会での成果を公開するために、立命館大学アート・リサーチセンターと共同でセンターの語彙索引検索システムを利用しながら、序文の翻刻、語釈、用例、現代語訳と和訳とが同時に検索、閲覧できるシステムを構築している。以上のシステムは版本カタログレゾネの画像閲覧システムとリンクさせ、画像とテキストデータベースの相互リンクができるようになる。また、大英博物館リサーチスペースとのセマンティックweb構築のプロジェクトに参加し、北斎一枚摺の整理をすすめた。
官能基非依存性固定化ビーズを用いた重症薬疹の初期発症メカニズムの解明

スティーブンスジョンソン症候群・中毒性壊死症(Stevens-Johnson Syndrome/ Toxic Epidermal Necrolysis: SJS/TEN)は、免疫系が関与する特異体質性の重篤副作用である。近年、原因薬毎にSJS/TEN発症に関連するヒト白血球抗原(HLA)型が存在することが明らかとなってきた。本研究では、複数の分子間相互作用解析系を検討し、医薬品とHLAタンパク質との分子間相互作用解析法を確立した。本研究成果は、副作用発症予測系の開発に貢献することが期待される。本研究は、1)重篤副作用との関連が認められたヒト白血球抗原と医薬品との分子的な相関を明らかにすること、また2)新規解析系を用いて、発症数は近年多いものの、未だ関連分子が明らかとなっていない抗てんかん薬ラモトリギンの標的分子を探索し、そのSJS/TEN発症の初期分子機構を明らかにすることを目的としている。27年度は、1)について検討を行った。これまでに重症眼障害を併発するアセトアミノフェン誘発性のスティーブンスジョンソン症候群・中毒性壊死症(SJS/TEN)の発症にHLA-A*02:06型のヒト白血球抗原が関連していることが明らかとなっている。そこでHLA-A*02:06とアセトアミノフェンが結合するのかを探索した。まずHLA-A*02:06とB型肝炎ウイルス抗原ペプチド及びβ2-microglobulinの複合体を精製し、放射線ラベルしたアセトアミノフェンに結合するかを検討した。その結果、アセトアミノフェンとすでにペプチドと結合した状態のHLA-A*02:06複合体との結合は検出できなかった。そこでアセトアミノフェンは、細胞の小胞内でペプチドと結合する前のHLA分子と結合するのではないかと考えた。そこでHLAα鎖を発現しないヒトB細胞株CIRにHLA-A*02:06遺伝子を導入し、HLA-A*02:06安定発現株を樹立し、実験を行うこととした。現在この細胞のクローン化を試みている。この細胞をアセトアミノフェン添加培地で培養し、HLAが提示するペプチドの種類を質量分析にて検討する予定である。当初はHLA-A*02:06がアセトアミノフェンに直接結合するモデルを想定していたが、放射線ラベルしたアセトアミノフェンを用いた実験で、少なくとも一度ペプチドと複合体形成した後のHLA複合体には結合しないことが示唆された。そのため、実験計画を見直し、小胞内での結合を検討する系を立ち上げることとした。また平成27年3月23日平成27年9月30日の期間、産前産後の休暇及び育児休業を取得したため、実験を一時中断した。スティーブンス・ジョンソン症候群/中毒性表皮壊死症(SJS/TEN)の原因薬の1つでるアセトアミノフェンと、発症に関連するヒト白血球抗原(HLA)との分子間相互作用を、薬物結合ビーズ、放射線ラベル体を用いた複数の手法で検討したが、アセトアミノフェンとHLA-A*02:06(またはHLA-B*44:03)との結合は非常に弱く、より高感度な分子間相互作用解析系を確立し検討する必要があることが分かった。そこで、最終年度には、バイオレイヤー干渉法に基づいた新規の相互作用解析装置OctetRedを用いた解析系の確立を試みた。HLA-B*15:02は、抗てんかん薬カルバマゼピン及びオキシカルバゼピン誘発性SJS/TENの発症と関連する事、またこれらの薬物に直接結合することが報告されている。そこで抗てんかん薬カルバマゼピン、オキシカルバゼピンとHLA-B*15:02との結合をポジティブコントロールとして、またカルバゼピンやオキシカルバゼピン誘発性SJS/TENの発症に関連しないHLA分子との結合をネガティブコントロールとして解析を行った。これまでにOctetRedを用いてHLA-B*15:02とカルバゼピン及びオキシカルバゼピンとの結合を検出し、KD値を明らかにした。また、アセトアミノフェンとHLA-A*02:06またはHLA-B*44:03とのKD値を明らかにした。SJS/TENの発症に関わる遺伝的因子についてはこれまでに明らかとなってきているが、ハイリスク遺伝子を保有しているすべての患者が被疑薬服用後にSJS/TENを発症するわけではない。このことから、発症に必要な何らかの環境因子が存在することが示唆される。そこで、免疫系を活性化させる環境因子として感染症に着目し、当部で集積しているSJS/TENの症例解析を行い、感染症がSJS/TEN重症化のリスク因子であることを見出した。HLAと薬剤が小胞内での結合するか否かを解析することを試みる。具体的には、HLA-A*02:06の安定発現株を得て、アセトアミノフェン共存下で培養した際に、提示されるペプチドのレパートリーが変化するかを質量分析を用いて解析する。

また、HLA-A*02:06の他にもアセトアミノフェン誘発性SJS/TENの発症に関連するHLAアリルについても同様の解析を行う。また、ラモトリギン誘発性SJS/TENの解析についてはHLA以外の分子との相互作用を薬剤結合ビーズを用いて探索する。医療系薬学当初想定していたように、すでにペプチドが結合したHLA-A*02:06にはアセトアミノフェンが結合しなかったため、薬剤結合ビーズの計画を変更することになった。そのため、薬剤結合ビーズの作製にかかる費用が予定よりも少なかった。HLA-A:02:06発現細胞がHLA上に提示するペプチドのレパートリー解析に使用する。具体的には、HPLCによるペプチド分離に必要なカラムや、質量分析に必要なチューブ等の消耗品を購入する。また、これまでにアバカビルがHLA-B*57:01に結合し、提示するペプチドの種類を変化させることが知られている。このことから、ポジティブコントロールとしてHLA-B*57:01発現細胞も作製するため、細胞培養に必要なディッシュやピペット等の消耗品を購入する。
縁起・霊験譚の生成と作品制作の実態的研究―生活の中の信仰と生業の解明を通して―

今年度は、中将姫物語を享受する場とそれに関わる人々の問題について、主に文化史的な観点から検討を進めた。物語を物語のなかでの事象として分析・検討するのではなく、物語を動態として捉え、物語の基層にある、物語を動かし、創りあげていく民衆のエネルギーを追いかけたいと考えているためである。そこで、今年度は、昨年度、仏教文学会、仏教史学会、説話・伝承学会で発表した、毛髪で曼荼羅などを縫う活動を行った空念や、彫刻で曼荼羅などの仏画を制作した光世ら、江戸時代前期に活躍した僧侶の実態について検討し、『MUSEUM』618号、『仏教史学研究』51-2号、『説話・伝承学』18号にまとめた。さらに、空念の活動については、一般の方に向けて『毛髪で縫った曼荼羅-漂泊僧空念の物語-』(新典社)を書き下ろし、今後の空念研究の一助となるよう努めた。このほか、2009年3月に、フリーア美術館で開催された奈良絵本・絵巻国際会議で、室町時代に制作されたと推定できる曼荼羅の左右に当麻曼荼羅縁起絵を付した掛幅絵を取り上げ、「当麻曼荼羅と中将姫物語-物語絵の享受-」と題した研究発表を行い、『日本文学』第58巻第7号にまとめた。また、2008・2009年度の2度に亘って個人調査を行った、ボストン美術館、ハーバード大学美術館での絵本・絵巻に関する研究については、来年度以降の発表に繋げていく予定である。2009年7月には、制作において袋中の関与があったと考えられる、檀王法林寺所蔵「当麻踟供養図」に関する研究発表を日本文学協会大会で行い、供養図の伝本を精査したうえで、その制作背景について検討した。その内容については、2010年2月に行ったミシガン大学美術館での供養図の追加調査の結果を加え、近日報告する予定である(投稿中)。本研究は、説話やお伽草子が生成される場としての寺院と、それに関わる信仰者の実態に注目し、室町期から江戸前期を中心とした寺院ネットワークと文芸活動の関係についての解明を目的とする。今年度は、まず『中世文学』52号掲載論文において、大阪府茨木市総持寺および常称寺が所蔵する「総持寺縁起絵巻」の伝本調査と内容的特徴について報告した。さらに、『古代中世文学論考』第19集掲載論文では、「総持寺縁起絵巻」の制作状況について論じた。これまで殆ど検証がなされてこなかった、常称寺所蔵絵巻を中心に、付属している書簡の解読および他資料との筆跡の確認を通して、絵巻の詞書が、芭蕉が書の手ほどきを受けたことで知られる北向雲竹によるものであること、書を通じての人的交流のなかで、常称寺所蔵絵巻の制作が企てられた可能性が考えられること、さらに、元禄期、常称寺の寺院再興の機運の中で制作された絵巻であると考えられることを指摘した。「総持寺縁起絵巻」を検討する際、比較検討した天理大学附属天理図書館蔵「新長谷寺縁起」は、藤原山蔭ゆかりの十一面観音像を安置する新長谷寺(現在、真如堂内にある)の由緒を記したもので、『人間文化研究』7号に伝本紹介と併せて翻刻を掲載した。また、藤原山蔭に関する諸縁起の調査と並行して、当麻曼荼羅に関する調査を進めている。10月に行われた伝承文学研究会大会では、愛知県江南市前飛保にある日輪山曼陀羅寺(西山浄土宗)の縁起について論じた。曼陀羅寺は、地域の風土や周辺の環境が、縁起や語りのなかに組み込まれていく実態を窺わせる古寺としても興味深い。報告では、伝本整理を踏まえ、「曼陀羅寺縁起」が、禅林寺所蔵の曼荼羅(正安本)の由来譚と近似することとその背景について検討し、縁起が在地の風土に根づきながら、生活空間のなかにいかに融和していたかについて述べた。このほか、8月に開催された西尾市岩瀬文庫所蔵の奈良絵本・絵巻展「絵ものがたりファンタジア」の企画に参加し、展示図録・解題図録の担当執筆を行った。来年度に向けて、現在調査を進めているのは、近世前期に当麻曼荼羅を携えて全国を行脚した一僧侶の足跡と、彼が縫いあげた髪縫仏、及び、影響を受け制作された繍仏の調査である。活動の実態を調査することにより、近世前期の庶民の浄土信仰と勧進活動の実態を明らかにすることを目指している。これらの調査報告として、来年度はより文化史的な位置から中将姫伝承の一端を論じていく。昨年度に続き、説話やお伽草子が生成される場と、そこに関わる信仰者の実態に注目しながら、本年度は、特に、文芸の基層にある信仰の在り方について具体的に検討することを試みてきた。まず、4月の説話・伝承学会大会において、藤原山蔭に関する新出の寺社縁起である「薬王寺縁起」に関する研究発表を行い、広く流布した藤原山蔭に関する伝承が、地域の寺社縁起のなかでどのように息づいているかについて検討した。また、6月の仏教文学会大会では、数年に亘り調査をすすめてきた髪繍当麻曼荼羅と制作に関与した聖空念に関する報告を行った(『MUSEUM』618号、2009年2月)。9月の仏教史学会では、仏教文学会で取りあげた聖空念の足跡を辿り、その活動の意義について検討した(『仏教史学研究』52巻1号、2009年10月刊行予定)。

また、1月の説話・伝承学会例会では、空念と同じく、近世前期に活躍した埼玉県春日部市円福寺の僧侶光世の活動に注目し、殆ど類例を見ない彫刻の当麻曼荼羅とその曼荼羅を介しての民衆信仰の在り方について検討した(『説話・伝承学』18号、2010年3月刊行予定)。また、3月の奈良絵本・絵巻国際会議(Freer Gallery of Art・Washington D.C.)では、室町前期制作と推察される当麻曼荼羅(個人蔵)について報告した(『日本文学』673号、2009年7月刊行予定)。3月の国際会議での渡米にあわせて、現地の諸機関で絵巻・絵本の個人調査を実施した。その調査で得られた成果については、次年度の報告に向け、調べを進めている。また、7月には日本文学協会大会での報告を予定している。近世前期に制作された中将姫物語に関する掛幅絵について、寺院の所蔵資料をもとに読みとき、そうした掛幅絵を用いて民衆教化に努めた僧侶の活動の実態に迫りたいと考えている。今年度は、中将姫物語を享受する場とそれに関わる人々の問題について、主に文化史的な観点から検討を進めた。物語を物語のなかでの事象として分析・検討するのではなく、物語を動態として捉え、物語の基層にある、物語を動かし、創りあげていく民衆のエネルギーを追いかけたいと考えているためである。そこで、今年度は、昨年度、仏教文学会、仏教史学会、説話・伝承学会で発表した、毛髪で曼荼羅などを縫う活動を行った空念や、彫刻で曼荼羅などの仏画を制作した光世ら、江戸時代前期に活躍した僧侶の実態について検討し、『MUSEUM』618号、『仏教史学研究』51-2号、『説話・伝承学』18号にまとめた。さらに、空念の活動については、一般の方に向けて『毛髪で縫った曼荼羅-漂泊僧空念の物語-』(新典社)を書き下ろし、今後の空念研究の一助となるよう努めた。このほか、2009年3月に、フリーア美術館で開催された奈良絵本・絵巻国際会議で、室町時代に制作されたと推定できる曼荼羅の左右に当麻曼荼羅縁起絵を付した掛幅絵を取り上げ、「当麻曼荼羅と中将姫物語-物語絵の享受-」と題した研究発表を行い、『日本文学』第58巻第7号にまとめた。また、2008・2009年度の2度に亘って個人調査を行った、ボストン美術館、ハーバード大学美術館での絵本・絵巻に関する研究については、来年度以降の発表に繋げていく予定である。2009年7月には、制作において袋中の関与があったと考えられる、檀王法林寺所蔵「当麻踟供養図」に関する研究発表を日本文学協会大会で行い、供養図の伝本を精査したうえで、その制作背景について検討した。その内容については、2010年2月に行ったミシガン大学美術館での供養図の追加調査の結果を加え、近日報告する予定である(投稿中)。
国際化時代における金融システム改革と日本型組織法・取引法の研究

1.近年のわが国の金融制度改革は、産業構造の転換や企業の効率的経営を強く要請する一方、その事態に対応できる取引主体をいかに形成し、あるいは経済的弱者をいかに保護するかという課題にも対応を迫った来た。その結果、企業組織のあり方や取引法のルール、さらには訴訟構造にも大きな影響が及んでいる。本研究では、当初、企業破産法制および経済規制法をも視野に入れて検討を始めたが、最終的には上述の三方面から検討を加えることとし、その成果の一部は以下に報告するように、すでに公表されている。2.まず、企業組織のあり方については、金融改革後の企業組織にかかわる先進的事例を豊富に有するアメリカ法との比較法的研究から検討を進め、とくに会社の資産譲渡の面について検討を深めた。そこでは、組織的財産の譲渡を中心に考え、経営破綻の著しい譲渡会社については、株主総会決議を不要とする場合がありうること、営業の継続的発展を目指した譲渡や譲渡担保の場合には総会決議を要しないこと、親子会社間の営業譲渡に総会決議を不要とするのは慎重に考えるべきことなど、今後の企業組織の再編上の課題について立法論的見地をも踏まえた解釈論を提示した。3.取引法の場面では、わが国でも消費者契約法、金融商品販売法などが成立し、その影響が現実のものとなっている。そこで、EU諸国の中からイギリスを取り上げ、金融商品の実例である保険契約の規制について、EUの統一的規制枠組みの中で、消費者保護が約款の透明性を確保する観点から追求されている点を考察し、そのことが約款解釈の体系的な方法に影響し、消費者の一般的理解を反映させることになっている点を指摘した。4.最後に、訴訟構造の面では、EU消費者保護との関係で、ドイツの団体訴訟の展開過程を追い、日本の民事訴訟法の改正に当たって、一定の政策目的に合致した公益重視の観点から消費者保護に限定した団体訴訟形態の導入が望ましいことを主張した。金融システム改革法の成立および金融再生委員会の設置などにより、わが国の金融制度改革は、具体化・現実化の速度と深度をいっそう現実の経済の動きに合わせてきている。同時に、自己責任にもとづく市場経済社会における取引にあたって、消費者の保護を図るため、消費者契約法等の立法が重要な課題として浮上している。本研究は、研究開始後に現れたかかる動向を踏まえ、本年度は、外国法制の研究と併せて、日本の新たな法制の展開や内容にも注意しながら、所期の計画を実施した。具体的には、金融関係機関の組織・取引方法の競争法上の問題点、金融関係機関の破綻に際してのセーフティ・ネットの問題、有価証券取引への改革の影響、会社組織の変動・変更に係る諸問題を重点的に取扱った。かなり研究が進んだものについては、アメリカでレヴューを受けることなどもできた。検討したこれらの問題は、まさに日々の経済事件と直結する様相を呈しており、わが国の新立法の実施が直ちに取引界に大きな影響を及ぼしている実態が明らかになりつつある。たとえば、保険契約者保護機構が保険会社の破綻に備えて設立されたが、その基金で十分に保険契約者が保護できるのか、保険業界がその負担に耐え切れるのかといった問題が指摘できる。同種の立法を行った外国の例を参考あるいは一つの指標にして、さらに本研究の課題を追求する予定である。本年度のところは、研究会などを開催し、共通の理解を得ながら各人の研究を進めたが、主として各人の担当分野に関する基礎的な資料の収集や分析が行われており、個別研究が中心となった。次年度以降に相互の研究の関連付けを含め、本研究全体をさらに具体化・深化させる計画である。

今年度は、本研究の第2年度にあたり、昨年度の成果を基礎に研究を進めた。まず、金融制度改革は、ペイオフの1年延期問題などがあったが、実態的には着々と進行しており、組織法の分野にも影響を及ぼし、商法の改正により持株会社のもとでの企業再編を容易にする株式交換制度などを成立させた。金融サービス法の制定に向けた動きも消費者契約法に続いてかなり進んできた。また、民事再生法の成立も、組織法・取引法のあり方に大きく影響を及ぼす最新の動きである。こうした中で、本年度は、金融商品の内容、とりわけ信託の問題を共同研究で取り上げて、共通して検討を深めてきた。また、各担当者は、各分野についてそれぞれ個別の分析検討を進め、これを研究会等で報告・検討することも行った。その結果、なお追求すべき課題が残された部分について研究を進め、その上で公表することとし、今年度には、まとまった形では公表しないこととした。次年度に向けては、会社分割法制の整備などが実際に行われようとしており、倒産法制の整備(国際倒産法の検討)も課題として浮上してきている。これらの現実の動きの中で、各人の研究課題をより明確にし、対象範囲を絞り込みながら、最終年度において、その段階、時点のものではあるが、まとめを行い、研究成果として公表する計画である。具体的には、各人の研究の進捗度合いに応じて、順次、研究会を開催して、研究報告を行い、共同研究の相互の関係付けと調整を行うこととする。その上で、さらに検討を深め、年度末に研究成果として公表する。1.わが国の金融制度改革は、産業構造の転換や企業の効率的経営を強く要請する一方、その事態に対応できる取引主体をいかに形成し、あるいは経済的弱者をいかに保護するかという課題にも対応を迫って来た。その結果、企業組織のあり方や取引法のルール、さらには訴訟構造にも大きな影響が及んでいる。したがって、本研究では、この3局面から検討を加えることとし、その成果の一部は以下に報告するように、すでに公表されている。2.まず、企業組織のあり方については、金融改革後の企業組織にかかわる先進的事例を豊富に有するアメリカ法との比較法的研究から検討を進め、とくに会社の資産譲渡の面について検討を深めた。そこでは、組織的財産の譲渡を中心に考え、経営破綻の著しい譲渡会社については、株主総会決議を不要とする場合がありうること、営業の継続的発展を目指した譲渡や譲渡担保の場合には総会決議を要しないこと、親子会社間の営業譲渡に総会決議を不要とするのは慎重に考えるべきことなど、今後の企業組織の再編上の課題について立法論的見地をも踏まえた解釈論を提示した。3.取引法の場面では、わが国でも消費者契約法、金融商品販売法などが成立し、その影響が現実のものとなっている。そこで、EU諸国の中からイギリスを取り上げ、金融商品の実例である保険契約の規制について、EUの統一的規制枠組みの中で、消費者保護が約款の透明性を確保する観点から追求されている点を考察し、そのことが約款解釈の体系的な方法に影響し、消費者の一般的理解を反映させることになっている点を指摘した。4.最後に、訴訟構造の面では、EU消費者保護との関係で、ドイツの団体訴訟の展開過程を追い、日本の民事訴訟法の改正に当たって、一定の政策目的に合致した公益重視の観点から消費者保護に限定した団体訴訟形態の導入が望ましいことを主張した。
マウス代償性肺成長におけるNotch/TTF-1シグナルの幹細胞ニッチへの関与

平成26年度はマウス左肺全摘モデルを用いて残存右肺の組織学的解析で術後12時間にはすでに肺胞道の拡張が起こっており、Ki-67の免疫染色によって2型肺胞上皮細胞の増加が術後48時間から起こることが確認された。残存肺の過膨張がおそらく肺報道領域の拡張によって起こっていること、それが気管支肺胞導管移行領域の増殖トリガーとなる可能性が考えられた。術後12時間から48時間にかけての短時間に遺伝子発現の大きな変化が起こるためにはmiRNAによる調節が大きな役割を担っている可能性が高いと考えられたため、術後24時間の肺胞領域の細胞から抽出したmiRNAの発現をマイクロアレイによって解析した。平成27年度は初めにマイクロアレイの結果からターゲット遺伝子の絞り込みを行ったところ、当初標的と考えていたNotchシグナルを標的としないmmu-let-7f-5pの優位な上昇が認められ、HIF-1αおよびIkappaB、NF-kBがターゲット遺伝子として候補に挙がったため、これらに標的を変更して、その代償性肺成長への関連を検討することとした。これらの候補遺伝子の発現をmRNAおよびタンパクレベルで確認するため、ウエスタンブロットおよびPCRを行ったところ、HIF-1αは術後12時間でmRNAレベルの上昇、p-IkB-αは術後24時間でタンパク発現上昇が認められた。さらに免疫染色によって、術後24時間でのNFkBの発現上昇、Pro-SPCとの共発現を認めた。以上より、マウス左肺全摘モデルにおける代償性肺成長において術後早期のHIF-1αおよびそれに関連するNFkB系シグナルが代償性肺成長においても重要な役割を担う可能性が高いことが示唆された。今回、研究の一時中止となってしまったが、今後はHIF-1αおよびNFkBのsiRNA投与による代償性肺成長の阻害実験によって代償性肺成長への関与を証明したい。本研究計画はマウス左肺全摘術後代償性肺成長モデルを用いて、Notch/TTF-1シグナルが代償性肺成長における肺幹細胞とニッチの改変に深く関与しているという仮説を検証することを研究目的としている。平成26年度はC57/BL6マウスを用いて、左肺全摘術を行い、左肺全摘術後、12時間、24時間、36時間、48時間、96時間、168時間後にそれぞれ残存右肺を摘出した。全摘術後モデルで、残存右肺の代償性成長が起きていることを肺容積、肺乾燥重量を測定することで確認した。組織学的解析によって、代償性肺成長早期相で肺胞道の拡張が認められることがわかった。この肺胞道の領域は一般的に肺の幹細胞と考えられている、週末細気管支との境界領域である気管支肺胞導管移行部(BADJ)にある、気管支肺胞幹細胞(BASCs)に隣接しており、肺胞道の一時的拡張が代償性成長のトリガーの一部となっている可能性が考えられた。それによって、即時に遺伝子発現の変化が起こる必要があるため、miRNAによってBADJ領域の遺伝子発現調節が起こるものと予想されたため、miRNAのマイクロアレイを行った。その結果をもとにして、Notch-1、CCSP、Wnt、NFkBの免疫染色を行っている。その解析はまだ結果を得られていない。来年度はその結果によって幹細胞分画へのアプローチ方法を検討する。具体的には、FACSでソーティングして、幹細胞としての性格を検討するのか、siRNA投与実験を先行するかを決定する予定である。動物実験および組織学的解析は順調に進んでいる。ただし、現時点では免疫組織化学の結果を解析できていないため、計画を先取りできているわけではない。BADJ

領域の構成細胞の分子発現の特徴を知るために、Notch-1、CCSP、Wnt、NFkBの免疫組織化学を行っている。その解析はまだ結果を得られていない。来年度はその結果によって幹細胞分画へのアプローチ方法を検討する。具体的には、FACSでソーティングして、幹細胞としての性格を検討するのか、siRNA投与実験を先行するかを決定する予定である。学会出張費を計上しなかったため来年度は今年度の繰越金を海外学会での情報収集と関連領域に関する研究発表の資金とする予定である。ほかについては今のところ使途の大きな変更の予定はない。
ユビキチンリガーゼFbxw7によるG0期維持機構と幹細胞制御に関する研究

近年、癌の発症や進展に関して『癌幹細胞』という概念が提唱され、癌は幹細胞性疾患として考えられるようになってきている。また、白血病幹細胞は造血幹細胞から発生するといわれており、白血病幹細胞と造血幹細胞は性質的に非常に類似している。正常幹細胞の維持に関わる分子が癌幹細胞の維持にも関わっていると考えられ、癌幹細胞においてこれらの分子の機能を抑えることが癌治療において役立つものと考えられる。Fbxw7は細胞周期を促進する分子を分解することで細胞周期を停止させる。われわれはFbxw7CKOマウスが、正常造血幹細胞が幹細胞としての機能を維持できず枯渇してしまうことを明らかにした。次にわれわれはこれらの分子が癌幹細胞の機能維持にかかわっているかどうかを検討するために、これらを検討する実験系の確立を行った。われわれは白血病のモデルとしで慢性骨髄性白血病(CML)を用いることにした。CMLの白血病幹細胞は正常幹細胞から生じると考えられており、CMLの白血病幹細胞は細胞周期が停止していることが知られている。われわれは実際にFbxw7 CKOマウスでは白血病幹細胞の細胞周期が亢進し、白血病幹細胞が枯渇してしまうことによりCMLの発症が抑えられることを明らかにした。さらに、白血病幹細胞ではc-Mycが異常に蓄積しており、c-Myc inhibitor処理により白血病幹細胞の異常な細胞周期の亢進が抑制されたため、Fbxw7の欠損による白血病幹細胞の枯渇はc-mycの異常な蓄積に起因することを明らかにした。われわれは昨年度までに正常造血幹細胞の維持にかかわるとされる分子のコンディショナルノックアウト(CKO)マウスを2種類作製した。またp57は直接細胞周期の抑制に関与していることが知られている。昨年度までにわれわれはこれら二つのCKOマウスが、正常造血幹細胞が幹細胞としての機能を維持できず枯渇してしまうことを明らかにした。次にわれわれはこれらの分子が癌幹細胞の機能維持にかかわっているかどうかを検討するために、これらを検討する実験系の確立を昨年度までに行った。われわれは白血病のモデルとして慢性骨髄性白血病(CML)を用いることにした。Bcr-Abl遺伝子を正常骨髄細胞に感染させて正常マウスに移植すると、移植後23週間で、全例CMLを発症して死亡することを昨年度までに確認した。本年度からは、Fbxw7やp57CKOマウスの骨髄細胞にCMLを誘導して、実際に白血病幹細胞の動態を確認していく。近年、癌の発症や進展に関して「癌幹細胞」という概念が提唱され、癌は幹細胞性疾患として考えられるようになってきている。われわれは実際にFbxw7 CKOマウスでは白血病幹細胞が枯渇しCMLの発症が抑えられることを明らかにした。今後、詳細な分子機構を解析すると同時に、p57 CKOマウスでも同様の現象が見られるかを確認していく。

次にわれわれはこれらの分子が癌幹細胞の機能維持にかかわっているかどうかを検討するために、これらを検討する実験系の確立を行った。われわれは白血病のモデルとしで慢性骨髄性白血病(CML)を用いることにした。CMLの白血病幹細胞は正常幹細胞から生じると考えられており、CMLの白血病幹細胞は細胞周期が停止していることが知られている。われわれは実際にFbxw7 CKOマウスでは白血病幹細胞の細胞周期が亢進し、白血病幹細胞が枯渇してしまうことによりCMLの発症が抑えられることを明らかにした。さらに、白血病幹細胞ではc-Mycが異常に蓄積しており、c-Myc inhibitor処理により白血病幹細胞の異常な細胞周期の亢進が抑制されたため、Fbxw7の欠損による白血病幹細胞の枯渇はc-mycの異常な蓄積に起因することを明らかにした。
大型木構造部材の破壊現象の亀裂伝播測定手法による解明

近年、わが国でも体育館をはじめとして大型木造構造物が普及しはじめ、地震や台風の時には集成材部材や接合部に大きな荷重が作用することが多くなり、破壊の危険性も増している。構造強度の計算や接合部の開発などは進んでいるが、実際に荷重を受けている集成材部材の破壊現象はほとんど解明されていない。破壊亀裂伝播の観察手法を用いて、接着層の位置や数あるいは種類が、破断強度や破壊亀裂の進行の様子に与える効果を調べ、破壊亀裂に対する抵抗力が高い接着層の構成や種類を考察し、大型木造構造物の安全性の確保に役立てる。その結果、次のことが明らかになった。接着層が1本の場合、亀裂伝播曲線の第2段階、つまり亀裂伝播の定常部分に接着層が位置する場合に、接着層の効果が大きいことが明らかになった。また、定常部分でも特に20%付近に最大があるように思われる。接着層の位置を、最も有効な位置にして接着層が1本の場合と、2本の場合を比較すると、2本の場合が非常に破壊回数が増加し、研究の予想が確認された。さらに、接着層を2本置いた場合に、亀裂が接着層を通過する様子が明らかになり、これが強度の増加につながることも確認された。以上の研究には、接着剤として耐水性が高いレゾルシノール樹脂接着層を使用してきたが、おなじく耐水性が高い水性高分子イソシアネート樹脂についても検討を行った。色々な大きさの繰り返し応力に対する破断までの繰り返し数は、水性高分子イソシアネート樹脂接着剤はレゾルシノール樹脂接着剤の強度のばらつきの中に含まれており、ほぼ両者は同程度の破壊強さを有することが明らかになった。以上のように大型木造構造物の集成材における接着層の破壊強度に対する研究の成果を上げることができた。近年、わが国でも体育館をはじめとして大型木造構造物が普及しはじめ、地震や台風の時には集成材部材や接合部に大きな荷重が作用することが多くなり、破壊の危険性も増しているが、実際に荷重を受けている集成材部材の破壊過課や亀裂伝播挙動はほとんど解明されていない。そこで、上記の研究課題を遂行することとなった。この研究は平成4年度から平成6年度までの研究で、本年度は下記の研究を行った。1.集成した時の接着層の位置が破壊強さへ与える影響の静的破壊試験及び動的繰り返し試験による解明接着層の位置が破壊強さへ与える影響を、接着位置の異なる数種の試験片について、動的疲労試験機を用いて、両振り繰り返し曲げ荷重を与えて解明した。その結果、年輪が存在しない木材における疲労破壊過程の第二部分(き裂伝ぱ定常部分)に接着層をおくとき、破壊強度が最大に増加することが明らかになった。接着層の位置が、応力集中部分(切欠先端付近)に位置すると、破壊強度の増加が少なくなることが明らかになった。他方、接着層の位置が切欠先端の反対側(試験片幅の約80%)にあるとき、接着層の存在によって破壊強度の増加はほとんど起こらないことが明らかになった。静的破壊試験は現在検討中である。2.亀裂伝播測定手法を用いて接着層が亀裂の進行に与える影響の解明年輪が存在しない木材におけるき裂伝播定常部分に接着層をおくとき、き裂の伝播に大きな停滞が起こる。これが強度の増加になって現れる。特に、この効果は接着層の位置が試験片幅の約20%において最大となった。このき裂の停滞は、接着層及び接着層の前と後において現れることが明らかになった。これらの知見は、平成5年8月に開催される第43回日本木材学会大会において発表する予定である。

近年、わが国でも体育館をはじめとして大型木造構造物が普及しはじめ、地震や台風の時には集成材部材や接合部に大きな荷重が作用することが多くなり、破壊の危険性も増しているが、実際に荷重を受けている集成材部材の破壊過程や亀裂伝播挙動はほとんど解明されていない。そこで、上記の研究課題を遂行することとなった。この研究は平成4年度から平成6年度までの研究で、前年度の研究成果をもとに本年度は下記の研究を行った。1.接着層の数が複数層の場合に、接着層の数が繰り返し荷重試験に及ぼす効果の解明前年度の研究により、年輪のない木材における疲労破壊過程の第二部分(き裂伝播定常部分)に接着層をおくとき、破壊強度が最大に増加することが明らかになっているので、二つの層の接着層の位置の郊果について検討した。その結果、接着層の位置が、第1層が切り欠き先端より約12パーセント、第2層目が約25パーセントの位置にあるとき繰り返し荷重に対する強度が大きくなることを明らかにした。2.亀裂伝播測定手法を用いた複数の接着層が亀裂の進行に与える影響の解明前記の強度の増加を亀裂伝播挙動の測定から解明した。詳細な亀裂伝播挙動の測定から、複数の接着層の場合も、亀裂の伝播の停滞は、接着層及び接着層の前後で生じていることが明らかになった。来年度は主に接着剤の種類を変えて検討を深める予定である。これらの知見は、平成6年4月に開催される第44回日本木材学会大会において発表する予定である。近年、わが国でも体育館をはじめとして大型木造構造物が普及しはじめ、地震や台風の時には集成材部材や接合部に大きな荷重が作用することが多くなり、破壊の危険性も増している。構造強度の計算や接合部の開発などは進んでいるが、実際に荷重を受けている集成材部材の破壊現象はほとんど解明されていない。破壊亀裂伝播の観察手法を用いて、接着層の位置や数あるいは種類が、破断強度や破壊亀裂の進行の様子に与える効果を調べ、破壊亀裂に対する抵抗力が高い接着層の構成や種類を考察し、大型木造構造物の安全性の確保に役立てる。その結果、次のことが明らかになった。接着層が1本の場合、亀裂伝播曲線の第2段階、つまり亀裂伝播の定常部分に接着層が位置する場合に、接着層の効果が大きいことが明らかになった。また、定常部分でも特に20%付近に最大があるように思われる。接着層の位置を、最も有効な位置にして接着層が1本の場合と、2本の場合を比較すると、2本の場合が非常に破壊回数が増加し、研究の予想が確認された。さらに、接着層を2本置いた場合に、亀裂が接着層を通過する様子が明らかになり、これが強度の増加につながることも確認された。以上の研究には、接着剤として耐水性が高いレゾルシノール樹脂接着層を使用してきたが、おなじく耐水性が高い水性高分子イソシアネート樹脂についても検討を行った。色々な大きさの繰り返し応力に対する破断までの繰り返し数は、水性高分子イソシアネート樹脂接着剤はレゾルシノール樹脂接着剤の強度のばらつきの中に含まれており、ほぼ両者は同程度の破壊強さを有することが明らかになった。以上のように大型木造構造物の集成材における接着層の破壊強度に対する研究の成果を上げることができた。
神経障害性疼痛による知覚過敏と骨密度低下に対する運動療法の効果に関する研究

神経障害性疼痛モデルを用いて、疼痛のシグナル入力部である脊髄後角浅層での遺伝子発現解析を網羅的に行い、神経障害性疼痛における運動療法による除痛のメカニズムを解明することを研究の目的とした。exercise群においては術後3週目以後でcontrol群に比較し、疼痛閾値の有意な改善がみられた。レーザーマイクロダイセクション法により脊髄後角浅層を切り出してRNA抽出を行ったサンプルで、疼痛に関与すると考えられる候補遺伝子としてRnf34とPacapに着目し、RT-PCRによって両群間の遺伝子発現変化を定量した。Rnf34の発現は、術後3週目においてexercise群で有意な減少を認めた。Pacapの発現は、1週目でexercise群での発現量は有意に上昇したが、3週目では逆に有意に減少し、6週目においてもexercise群で発現量は減少していた。RNF34はGABAA受容体のγ2サブユニットの分解を促進してGABAの鎮痛作用を弱め、痛みを増強する。RNF34発現抑制は、痛みのシグナルを抑制するGABAの作用を増強し、鎮痛効果をもたらした可能性がある。またPACAPは、脊髄後角やDRGに存在し、神経障害モデルで発現上昇し、さらにPACAPの阻害剤が痛みを抑制することが報告されている。PACAPの抑制が運動負荷の鎮痛効果に関与した可能性が考えられた。68週齢の雌Wister ratを用いて全身麻酔下に右L5根を結紮し神経因性疼痛モデルSNL modelを作製した。SNL modelに運動を負荷させた群をexercise群、運動を負荷しない群をcontrol群、神経根を結紮しないSham operationを行った群をSham群とした。術後翌日よりtreadmillによる運動負荷を10 m/minから開始し、一日10分、一日に1m/minずつ20m/minまで速度を増加させ、週に5回、術後最大6週まで行った。疼痛閾値はvon Frey testにて行った。術後1週、3週、6週に、脊髄組織を採取し凍結標本を作製した。レーザーマイクロダイセクション法により脊髄後角浅層を切り出してRNA抽出を行い、RNAシークエンスによる解析を行った。SNL modelにおける患側の疼痛閾値の評価の結果、健側と比較し術後3日目より有意に疼痛閾値の低下を認め、術後6週目まで継続して差を認めた。またexercise群の健側とcontrol群の比較では、両群とも術後3日目より疼痛閾値の低下を認めcontrol群ではこの傾向が6週まで継続していたが、exercise群において術後3週目から疼痛閾値の改善を有意に認めた。術後6週目のRNAシークエンスの結果、17314遺伝子のRNA配列が同定された。そのうち、Exercise群においてcontrol群よりも有意に発現上昇していたものが241遺伝子、有意に減少していたものが258遺伝子であった。Exercise群において発現上昇がみられた遺伝子のうち、海馬・脊髄に関連するものが17遺伝子、発現減少を示したものうち脳に関連するものが49遺伝子であった。現在、研究は順調に推移し、脊髄後角におけるいくつかの遺伝子レベルの変化がとらえられている。今後は定量的な計測を行い、遺伝子レベルでの変化を確定していく作業に入る。Exercise群の脊髄後角において発現上昇がみられた遺伝子のうち、海馬・脊髄に関連するものが17遺伝子、発現減少を示したものうち脳に関連するものが49遺伝子であった。この中で疼痛に関与すると思われる遺伝子に絞ってRT-PCRによる定量的な計測を行い、運動負荷が疼痛を軽減するメカニズムを探求していく。実際に使った消耗品代が少し安くついたことと、出張が大学の費用で認められ、その分が来年の研究に回せることになった。消耗品や旅費などでこの差額は使用する予定である。
多形性腺腫細胞の低酸素応答性細胞外基質改変における転移形質獲得機構

唾液腺多形性腺腫の間質表現は多彩かつ乏血管性であることから、低酸素環境下で細胞外基質(ECM)合成を亢進させて多彩な間質表現を実現し、生存・増殖を維持しているという仮説をたて、低酸素下でのECM合成能および細胞機能を検討した。HIF-1α遺伝子・蛋白質は48時間低酸素培養下で高発現・核移行し、腫瘍間質に豊富なECM分子のperlecan、fibronectinの合成が促進された。さらにsiRNA法でECM発現を抑制すると、細胞増殖が抑制された。以上より、多形性腺腫には低酸素刺激によってECM合成を亢進させることで、低酸素状態にも関わらず細胞増殖を維持する機構がそなわっていることが示唆された。1) SM-AP細胞系の細胞外基質(ECM)遺伝子・蛋白質発現解析:ヌードマウス移植腫瘍実験に先立ち、SM-AP1とSM-AP4におけるECM発現について試験管内で比較した。両細胞を通常の培養条件(10% FCS/5% CO2)と低酸素条件(1%O2/5%CO2/94%N2)とで48時間培養後に、RNAを抽出・精製し、cDNAを調整して定量的RT-PCR法にて比較した。その結果、両細胞間で、前年のfibronectinおよびtenascinのに加えて、perlecanおよびcollagen type IVの高発現も確認された。また同様に4%パラフォルムアルデヒドで固定後、各抗体をもちいて、その発現動態を蛍光抗体法にて検討したところ、両細胞間で、perlecanおよびcollagen type IVが高発現していることが確認された。以上のことから確認しえたECM分子はいずれも中長期低酸素培養条件下でその合成が促進されることが示された。2) SM-AP細胞系の細胞外基質(ECM)遺伝子発現抑制による細胞機能解析: 1)での低酸素下でのECM合成促進の結果をうけて、これらECMが細胞機能にどのように関わっているのかを検討するために、SM-AP細胞系にsiRNAを用いたECM発現抑制した系を作成し、増殖および遊走能の比較検討をおこなった。まず始めにperlecanについて検討した結果、siRNAでperlecanの発現抑制をおこなうことで、SM-AP1とSM-AP4ともに細胞増殖は抑制され、遊走能は亢進する結果が得られた。またsiRNAでperlecanの発現抑制してもHIF-1aの遺伝子発現レベルには変化がないことも確認され、perlecan遺伝子発現はHIF-1aの下流に位置していることも示唆された。1) HIF-1α遺伝子発現解析:低酸素培養条件下におけるSM-AP1とSM-AP4のHIF-1α遺伝子発現について試験管内で比較した。両細胞を通常の培養条件(10% FCS/5% CO2)で3日間培養の後、さらに通常の培養条件と低酸素条件(1%O2/5%CO2/94%N2)で5時間(短期低酸素培養)および48時間(中長期低酸素培養)培養の後、RNAを抽出・精製し、cDNAを調整して定量的RT-PCR法にて検討した。その結果、中長期低酸素培養下で、SM-AP1とSM-AP4ともに通常の培養条件下に比べて高発現が確認された。2) HIF-1α蛋白質発現解析:上記1)の結果をうけて、中長期低酸素培養条件下におけるSM-AP1とSM-AP4のHIF-1α蛋白質発現について検討した。培養後細胞層を可溶化して、核分画と細胞質の分画にわけて蛋白質を抽出し、ウエスタンブロッティング法にて確認したところ、SM-AP1とSM-AP4ともに通常の培養条件下でのHIF-1α蛋白質発現に比べて高発現が確認され、特に核分画に多くみとめられた。3) SM-AP細胞系の細胞外基質(ECM)遺伝子・蛋白質発現解析:ヌードマウス移植腫瘍実験に先立ち、SM-AP1とSM-AP4におけるECM発現について試験管内で比較した。その結果、両細胞間で、fibronectinおよびtenascinが高発現していることが確認された。また4%パラフォルムアルデヒドで固定後、各抗体をもちいて、その発現動態を蛍光抗体法にて検討したところ、両細胞間で、fibronectinおよびtenascinが高発現していることが確認された。1)SM-AP細胞系の細胞外基質(ECM)遺伝子発現抑制による細胞機能解析: H24年度の研究実績3)およびH25年度の研究実績