hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
青果物の取引様式の変化に関する交渉分析

スーパーマーケットの台頭に対応して、青果物の取引は卸売市場におけるせる取引と平行して先取り、相対取引が活発化してきた。この取引様式の変化に対して産地サイドとして交渉面でいかに対応してきたのか。まず北海道の産地の販売戦略の交渉分析によって明らかにした。遠隔地主産地として急速に成長してきた、北海道の野菜産地を対象として、豊頃町のダイコン、芽室町のゴボウ、帯広川西のナガイモの販売戦略を実態調査によって分析を行った。その結果、産地が青果物を出荷する場合、産地が負担しなければならない交渉面での非効率を回避する(すなわち取引費用を節約する)と同時に、卸売会社、仲卸人、量販店などが負担しなければならない交渉面での非効率を、産地が協力して回避してやる(すなわち取引費用の節約に協力する)ことによって、販売戦略上優位な交渉力を実現してきたことがわかった。さらに、先進国ドイツの青果物流通を取り上げ、独語史料の文献研究によってドイツでの青果物取引様式の変化と産地の対応を明らかにした。ドイツでは市場外流通が主流になってきており、取引様式も相対取引がほとんどであることがわかった。相対取引でも産地が流通業者に協力することによって取引費用を節約させ、交渉力を発揮するような戦略もとられている。わが国の青果物流通は市場取引が主流であるが、相対取引ではドイツと共通した戦略展開が見られる。
補完代替医療素材の科学的評価とその機能性成分をシーズとする食品薬学研究

世界各地で疾病の予防や初期症状の緩和などの生体調節機能を期待して利用されている補完代替医療素材について,その機能の科学的評価と機能を発現する分子(機能性成分)の特定,およびその機能性成分をシーズとした医薬候補物質の創製を志向した食品薬学的研究を行う.とりわけ,メタボリックシンドロームおよびその成因基盤として認知されている内臓脂肪蓄積型肥満などに対する予防効果を有する薬用食品素材について,その機能性成分を探索・特定・評価するとともに,セルフメディケーションやセルフプリベンションに利用し得る,安全で有効な機能性食品の開発を志向した実学研究を行う.また,その機能性成分を鋳型とした高活性アナログの網羅的合成による創薬科学研究を併せて実施することを目的とする.事業最終年度である今年度は,これまでの継続研究であるサラシアに含有される顕著なα-グルコシダーゼ阻害活性を有するチオ糖スルホニウム化合物であるneokotalanolの効率的合成に成功した.また,ピオグリタゾンなどのインスリン抵抗性改善薬の標的であるPPARγアゴニスト活性を有する天然由来の環状デプシペプチド化合物であるhikiamide A-Cの全合成を達成した.加えて,新たな抗がん薬シーズの創成研究の一環として,Glycyrrhiza foetidaの根部より見いだされ,強力な抗腫瘍活性が認められているamorfrutin Cなどの全合成を達成した.世界各地で疾病の予防や初期症状の緩和などの生体調節機能を期待して利用されている補完代替医療素材について,その機能の科学的評価と機能を発現する分子(機能性成分)の特定,およびその機能性成分をシーズとした医薬候補物質の創製を志向した食品薬学的研究を行う.とりわけ,メタボリックシンドロームおよびその成因基盤として認知されている内臓脂肪蓄積型肥満などに対する予防効果を有する薬用食品素材について,その機能性成分を探索・特定・評価するとともに,セルフメディケーションやセルフプリベンションに利用し得る,安全で有効な機能性食品の開発を志向した実学研究を行う.また,その機能性成分を鋳型とした高活性アナログの網羅的合成による創薬科学研究を併せて実施することを目的とする.研究初年度である今年度は,おもに先行研究により有用な補完代替医療素材として見いだしているサラシアに含有される強力なα-グルコシダーゼ阻害活性を有するチオ糖スルホニウム化合物およびその類縁体の全合成やジアステレオ選択的合成などを達成した.また,同じくサラシアの含有成分であるキサントン配糖体成分のmangiferinに癌転移抑制作用およびそのアポトーシス誘導活性などを見いだした.また,その他の有望素材として,ニホンスイセン,,ハス花およびタイ天然薬物であるKaempferia parvifloraやAlpinia galangaにメラニン産生抑制活性を,Carapa guianensisおよびShorea roxburghiiにD-galactosamine / lipopolysaccharide誘発肝障害抑制作用を示す活性寄与成分などを見いだした.研究初年度である平成28年度はこれまでの先行研究により見いだされている有用素材のサラシアについて,α-グルコシダーゼ阻害活性を示すスルホニウム化合物の全合成およびその類縁体の網羅的合成を達成し,更なる構造活性相関に関する知見を得た.加えて,キサントン配糖体のmangiferinの新たな機能性として癌転移抑制作用をみいだすとともに,その他数種の有望素材のピックアップがなされた.以上のことから,本研究は当初の計画通り概ね順調に進展しているものと考える.世界各地で疾病の予防や初期症状の緩和などの生体調節機能を期待して利用されている補完代替医療素材について,その機能の科学的評価と機能を発現する分子(機能性成分)の特定,およびその機能性成分をシーズとした医薬候補物質の創製を志向した食品薬学的研究を行う.とりわけ,メタボリックシンドロームおよびその成因基盤として認知されている内臓脂肪蓄積型肥満などに対する予防効果を有する薬用食品素材について,その機能性成分を探索・特定・評価するとともに,セルフメディケーションやセルフプリベンションに利用し得る,安全で有効な機能性食品の開発を志向した実学研究を行う.また,その機能性成分を鋳型とした高活性アナログの網羅的合成による創薬科学研究を併せて実施することを目的とする.事業二年目である今年度は,昨年度からの継続研究であるサラシアに含有される顕著なα-グルコシダーゼ阻害活性を有するチオ糖スルホニウム化合物であるsalacinolの高活性アナログの効率的合成およびその活性評価を実施し,市販α-グルコシダーゼ阻害薬のvogliboseの10倍以上の活性増強に成功した.また,生物種の異なる由来のα-グルコシダーゼ酵素とリガンドとの親和性の違いを,一連のsalacinol類縁体での活性結果を用い,計算化学的手法による活性予測などを検証した.加えて,新たな抗がん薬シーズの創成研究の一環として,Glycyrrhiza acanthocarpaより見いだされ,強力な抗腫瘍活性が認められているpseudo-amorfrutin Aおよび海綿由来のbiakamide類の全合成を達成した.同様に強い抗腫瘍活性が報告されているショウガ科植物の大良姜の含有成分である1'S-

1'-acetoxychavicol acetateの高活性アナログACA-28を創製し,その作用メカニズムとしてERK-MAPKシグナルが関与することなどを見いだした.昨年度までに実施した抽出エキスライブラリーのスクリーニング試験により見いだした候補素材について,各種生物活性を指標に活性寄与成分の探索研究によりピックアップされている複数の医薬シーズについて,全合成および類縁体合成を達成するとともに,活性発現の必須構造や構造活性相関研究へと繋げ,医薬候補物質としての提案が実現した.以上のことから,本研究は当初の計画以上に進展しているものと考える.世界各地で疾病の予防や初期症状の緩和などの生体調節機能を期待して利用されている補完代替医療素材について,その機能の科学的評価と機能を発現する分子(機能性成分)の特定,およびその機能性成分をシーズとした医薬候補物質の創製を志向した食品薬学的研究を行う.とりわけ,メタボリックシンドロームおよびその成因基盤として認知されている内臓脂肪蓄積型肥満などに対する予防効果を有する薬用食品素材について,その機能性成分を探索・特定・評価するとともに,セルフメディケーションやセルフプリベンションに利用し得る,安全で有効な機能性食品の開発を志向した実学研究を行う.また,その機能性成分を鋳型とした高活性アナログの網羅的合成による創薬科学研究を併せて実施することを目的とする.事業最終年度である今年度は,これまでの継続研究であるサラシアに含有される顕著なα-グルコシダーゼ阻害活性を有するチオ糖スルホニウム化合物であるneokotalanolの効率的合成に成功した.また,ピオグリタゾンなどのインスリン抵抗性改善薬の標的であるPPARγアゴニスト活性を有する天然由来の環状デプシペプチド化合物であるhikiamide A-Cの全合成を達成した.加えて,新たな抗がん薬シーズの創成研究の一環として,Glycyrrhiza foetidaの根部より見いだされ,強力な抗腫瘍活性が認められているamorfrutin Cなどの全合成を達成した.平成28年度にピックアップされた有望素材より得られた活性寄与成分について合成および構造活性相関研究を実施するとともに,引き続き,生活習慣病やアレルギー疾患などの難治性疾患の予防や改善に資する補完代替医療素材の探索研究を実施する.これまでにピックアップされた有望素材より得られた活性寄与成分について,全合成および類縁体合成を継続しその構造活性相関研究を実施するとともに,引き続き,生活習慣病やアレルギー疾患などの難治性疾患の予防や改善に資する機能性低分子化合物の探索研究を実施する.
光照射装置を組み込んだ固体NMRによる構造解析の研究

本研究では固体NMR測定中に試料に対して選択的に光照射を行い、光活性化させた光受容膜タンパク質のNMR信号を解析し、その活性メカニズムを明らかにすることが目的である。光受容膜タンパク質内の発色団レチナールの光異性化をNMR信号の変化として観測することができ、NMR測定中に光活性化状態をコントロールできる光照射システムの構築に成功した。今後、発色団周りのタンパク質構造変化の観測に展開できる。レチナールを発色団にもつレチナール蛋白質はその異性化により、誘起される蛋白質構造変化によって機能を発現する。本研究ではタンパク質とレチナールの相互作用を調べ、その構造情報と機能の相関を明らかにすることが目的である。精度の高い局所的構造変化を観測するために、固体NMR測定中において試料を光励起できるシステムの構築などタンパク質中のレチナール異性化状態をコントロールする必要がある。そのため、本年度はIn situ光照射システムの構築とそれに関連する基礎的な構成の組み立て、および蛋白質のNMR信号の解析を行った。バクテリオロドプシンのレチナールを除去したバクテリオ-オプシンでは、BCループの信号が完全に消失し、野生型BRでもつ振幅が大きく、運動性の遅いBCループの運動が失われることがわかった。また、in vivoおよびin vitroでのレチナール再構成によって、BCループの構造が変化することがわかった。これらのことより、バクテリオロドプシンの正しいフォールディングにはそのBCループが関与し、レチナールとBCループの遠距離相互作用が示唆された。さらにバクテリオロドプシンおよびセンサリーロドプシンの^<13>C標識レチナールについてのNMR信号を観測した。特にセンサリーロドプシンでは、In situ光照射システムと組み合わせ、界面活性剤中と脂質二重膜中での光活性中間体の観測を試みた結果、そのレチナールの化学シフトを観測することができた。本研究では固体NMR測定中に光照射を行い、光活性化させた光受容膜タンパク質の構造解析を行うことが目的である。光照射-固体NMR測定が実現できれば、光受容膜タンパク質の発色団であるレチナールの光異性化と同期したNMR信号が観測でき、詳細な構造変化の情報が獲得できる。本年度はシステムの構築を行い、脂質二重膜環境中に存在するセンサリーロドプシンIIについて高い割合でレチナールの光異性化による信号変化を観測し、光照射システムの構築に成功した。信号のモニターには^<13>C標識レチナールを導入したセンサリーロドプシンで行い、直接的に光異性化情報を獲得した。特に、界面活性剤中で得られる光異性化の化学シフト値が異なることは細胞膜中での活性構造の重要性を示している。また、レチナール近傍の1アミノ酸残基-変異体を用いても光異性化による化学シフト値が異なることがわかったため、レチナール光異性化に伴うタンパク質の構造変化を観測することが今後重要となってくる。また、レチナール異性化をコントロールする手法に試料にかける圧力を利用することができることも明らかにしている。バクテリオロドプシンの暗順応状態ではAll-trans型と13-cis, 15-syn型が1:1の熱平衡状熊で存在し、比較的小さい圧力を印加することでこの平衡状態を変化させ、13-cis, 15-synの配座の割合を高めることに成功した。このバクテリオロドプシンの異性化状態に対応した特定部位のタンパク質構造変化が観測されたため、タンパク質の局所的な領域とカップルして異性化が起きていることが判明した。
フッ化物環境中で耐食性を有する歯科臨床用チタン合金の開発

近年,優れた耐食性を示すTiおよびTi合金が歯科医療用材料として注目されているが,虫歯防止に使用されるフッ化物水溶液中では耐食性を示さず,問題視されている.そこで研究代表者は, Tiに微量金属を添加することにより,フッ化物水溶液中で優れた耐食性を示す合金を開発することに取り組み, Ti-Mg合金がフッ化物水溶液中において高耐食性を示すことを見出した.本研究ではNiを微量添加したTi合金に注目し,フッ化物水溶液中における当該合金の耐食性について詳細に検討した.近年,優れた耐食性を示すTiおよびTi合金が歯科医療用材料として注目されているが,虫歯防止に使用されるフッ化物水溶液中では耐食性を示さず,問題視されている.そこで研究代表者は, Tiに微量金属を添加することにより,フッ化物水溶液中で優れた耐食性を示す合金を開発することに取り組み, Ti-Mg合金がフッ化物水溶液中において高耐食性を示すことを見出した.本研究ではNiを微量添加したTi合金に注目し,フッ化物水溶液中における当該合金の耐食性について詳細に検討した.近年優れた耐食性を示すチタンおよびその合金が歯科医療用材料として注目されているが,う食予防に使用されるフッ化物水溶液には耐食性を示さない,そこで,研究代表者はフッ化物水溶液中において耐食性を示すTi合金の開発を行い,Ti-Mg合金がフッ化物水溶液中で優れた耐食性を示すことを見出した.この成果を拡張するために,歯科医療材料として使用頻度の高いTi合金であるTiNiやTi-6Al-4VなどにMgを添加することで,フッ化物水溶液に対する耐食性の発現を検討すること,およびTi-Mg合金の耐食機構の解明を行うことを本研究の目的とした.平成19年度は上記研究の基礎研究として,TiNi超弾性合金のフッ化物水溶液中での耐食性能をTi,Niと比較検討した.使用するフッ化物水溶液は,フッ素添加歯磨剤中のフッ素濃度(約1000ppm)に相当する0.024kmol・m^<-3>のフッ素イオン濃度を含有し,pHが3.5,3.8,4.8になるようにフッ酸とフッ化ナトリウムと蒸留水で調整した水溶液である.試験30分前より窒素ガスを用いて脱気する.評価試験方法は,3電極式定電位電解装置を用いた電気化学的動電位分極法とした.参照電極には銀/塩化銀電極を,対極には白金電極を用いた.電位掃引速度は1.6mV・s^<-1>,-2.0Vから1.0Vの範囲を測定し,得られる電位一電流密度曲線(分極曲線)における活性態電流密度により,本合金の耐食性を評価した.pH4.8の水溶液中では,Niには活性態が現れ,顕著な溶解を示したが,TiおよびTiNiは活性態を示さず耐食性に優れることがわかった.pH3.8の水溶液中では,NiおよびTiに活性態が現れたが,TiNiは活性態を示さなかった.pH3.5の水溶液中ではすべての試料に活性態が認められ,Niの活性溶解がより抑制された.近年優れた耐食性を示すチタンおよびその合金が歯科医療用材料として注目されているが,う食予防に使用されるフッ化物水溶液には耐食性を示さない.そこで,研究代表者はフッ化物水溶液中において耐食性を示すTi合金の開発を行い,Ti-Mg合金がフッ化物水溶液中で優れた耐食性を示すことを見出した.また、昨年の研究から、TiNiがフッ化物水溶液中で優れた耐食性を示すことを明らかにした。そこで、今年度は種々のTi-Ni合金を作製し,フッ化物水溶液に対する耐食性の発現を検討することおよびその耐食機構の解明を行うことを本研究の目的とした.その結果、TiはpH3.8以上のHF+NaF([F^-]=0.024 kmol・m^<-3>)水溶液中で活性態が出現し耐食性が悪化した.一方,ほとんどのTi-Ni合金はpH3.4以上のHF+NaF([F^-]=0.024kmol・m^<-3>)水溶液中で活性態が出現したが,Ti-2.0mass%Niのみ活性態が出現せず不働態を維持していた.また,Ti-Ni合金の自然電位はTiに比べ高電位側にシフトしており,腐食速度もTiに比べ低下していた.特にTi-2.0mass%Niは,他のTi-Ni合金に比べ著しく自然電位は高電位側にシフトし,腐食速度は低下した.特に,Ti-2.0mass%Niはアノード電流密度が最も低下し,著しく自然電位が高電位側にシフト,腐食速度が低下したため最も優れた耐食性を示すことが明らかになった.TiにNiを添加すると,カソード電流密度は不変であったが,Tiに比べ活性態アノード電流密度が低下することで,自然電位はTiよりも高電位側にシフトし,腐食速度はTiよりも低下したと考えられる.
新たな環境資源評価法とエコトレイル整備計画による森林と人の共生

森林を環境面で価値評価するとともに、森林の環境的価値を損なうことなく、人が森林にふれあうことを可能にするエコトレイルの整備計画について指針を確立していかなければならない。森林の機能評価法としてPotential Up Method(PUM法)を提案した。木材生産機能、水土保全機能、生活環境保全機能の各ポテンシャル値を求め、合計値をもって森林の総合評価を行い、実際の路線選定のモデル提示を行った。また、森林がレクリエーションや保健休養、精神活動として人間活動に関わる場合、森林の場としての提供を明確にしておかなければならない。デンマークにおける国有林、私有林の立ち入り、利用と、アメリカのオレゴン州立大学演習林のボランティア活動によるトレイル整備の事例に基づいて、森林の場の提供について考察した。森林療法における森林内散策では、森林内道路の勾配と運動強度の関係を明らかにし、消費エネルギー地図の作成を試みた。さらに肉体負担の適正水準の検討を行い、快適さを維持して歩行移動する際には、縦断勾配を1015%、1523%とすることが適切であることを提示した。起伏量と傾斜から山岳森林エリアを特色づけ、登坂コースにモノレールを組み入れて、歩行登坂の負担を少なくするとともに、適切な時間で移動可能とするデザイン設計を行った。本研究課題は、森林を木材生産のみならず、環境資源として森林での生活の潤いとか休養、レクリエーションなどの面での公益的機能に対して従来より用いられている貨幣価値による評価に代わる新しい手法を提示し、その上で具体的な「エコトレイル」の計画法を提示することである。森林基盤計画に当たって森林の利用形態別の区分法についてGIS、GPS等の手法により行った。「エコトレイル」の概念を決め、設計法を見いだすが、この研究については、仁多見俊夫による「森林エコツーリズムにおける環境資源の利用と機能発揮に関する研究」を行った。さらに本年いついては実際に、林内の歩道、車道、林道に於いて心拍計を装着し、心拍、距離、道の傾斜を記録した。さらにその関係について分析した。当然のことながら勾配の急な地点では心拍数が上がる。この組み合わせを考察し新たなるエコトレイルの設計を行う。この評価法が確立されればこれに基づいた「エコトレイル」の路網計画を策定する手法も開発が可能である。この測定は、被験者の年齢、性別によって異なるがこの評価法について一定の見解を得ることが出来た。さらに、歩行時の周囲の景観、植生、によっても異なる。そのため新たなる評価方法の検討が必要になってくる。森林の機能評価法としてPotential Up Method (PUM法)を提案した。森林療法における森林内散策では、療養者の症状に合せて適切な運動量となるように散策コースを処方するが、森林内道路の勾配と運動強度の関係を明らかにし、消費エネルギー地図の作成を試みた。路盤下に間伐材の構造物を施工する路網作設工法について、支持力と盛土内部の強度について検証を行った。
アジア各地における密教図像と文献の比較研究

研究代表者の学位論文『インドにおける曼荼羅の成立と発展』(春秋社)の英訳は、全篇の約3分の2の翻訳と校閲を完了した。副論文『曼荼羅グラフィクス』(山川出版社)の英語版は、2013年にネパールで刊行された。ナーガボーディが著した曼荼羅に関する2篇の重要著作『秘密集会曼荼羅儀軌二十』と『安立次第論』の2篇は、助成期間中に全篇のローマ字化校訂テキストを完成させた。2012のムスタン調査と2013年のカリフォルニア調査においても大きな成果があり、その一端はすでに国内海外の学会において発表した。写真のデータベース化については、チベットで撮影された3100点のデータベース化を完了した。24年度は、創建当初(15世紀)の曼荼羅が残存するネパール・ムスタン地方のローマンタン・チャンパラカンの壁画を調査し、未比定の曼荼羅すべての同定に成功するなど、大きな成果があった。その成果の一部は、昨年8月25日に石川県立歴史博物館で開催された国際シンポジウム「チベット美術の過去現在未来」の席上(日本語)と、10月に北京市順義区で開催された「第五届西蔵考古与藝術国際学術討論会」の席上で発表(英語)した。いっぽうナーガボーディの『秘密集会曼荼羅二十儀軌』の原典研究は、すでに全テキストのローマ字化を完了し、24年度中に刊行された1篇と、25年度中に刊行予定の2篇の論文にまとめられた。インド・チベット・ネパールで撮影した写真のデジタル化と図像データベースは、研究代表者がチベットで撮影した写真すべてのデータベース化を完了した。将来的には研究代表者が副会長を務めるチベット文化研究会を通じて公開することを検討している。研究代表者の博士論文『インドにおける曼荼羅の成立と発展』(春秋社)の英訳作業は、24年度中に第2章までの英訳草稿が完成し、第1章までの英文校閲が完了した。この作業は25年度も継続中である。平成25年度は最終年度に当たるので、中国青海省ラジャ寺における砂曼荼羅制作と、漢蔵両仏教の図像が混淆している甘粛省炳霊寺の調査を予定していたが、ラジャ寺の砂曼荼羅調査は、蔵暦と西暦の換算ミスにより調査の機会を逸し、平成26年5月に延期となった。そこで代わりに25年5月に米国カリフォルニア州に所蔵されるチベット仏教美術の調査を実施し、大きな成果があった。その成果は、25年7月にモンゴル国ウランバートルで開催された国際チベット学会(IATS)で英語による発表を行い、さらに同年12月の密教図像学会(早稲田大学)でも、より詳しい発表を日本語で行った。これに対して炳霊寺調査は25年9月に実施し、その成果の一端は炳霊寺文物保存研究所で行った講演で明らかにした。代表者の博士論文『インドにおける曼荼羅の成立と発展』の第2部に収録したナーガボーディの『秘密集会曼荼羅儀軌二十』のローマ字化テキストの校訂テキストは、すでにナポリ東洋大学のF・スフェッラ教授のもとに原稿を送付している。平成26年3月の個人的な訪伊の際、スフェッラ教授に進行状況の説明を求めたところ、本年夏には初校ゲラが出る予定との報告を受けた。いっぽう『安立次第論』のローマ字化テキストは、高野山密教研究会『密教文化』と東京大学東洋文化研究所の紀要に論文を寄稿してきたが、ついに26年3月に全文のローマ字化テキストが揃った。またインド・オリッサ州の仏教遺跡に関しては、2013年2月にオリッサ州のウダヤギリで開催された国際学会で、新たに同定した陀羅尼碑文について発表した。これについては、26年度の東大東文研の紀要に論文を発表する予定である。また拙著『曼荼羅グラフィクス』(山川出版社)の英語版が、ネパールのVajra Publicationsから25年3月下旬に刊行された。博士論文の根幹をなす第1部については、第2章から第5章までの英訳とロルフギーブル氏による英文校閲を完了した。昨年夏に行ったネパール調査では、カトマンズのVajra PublicationsとCGを使用したチベット・ネパール系曼荼羅の図像データベースの英語版刊行の打ち合わせを行い、研究代表者が自ら翻訳した原稿の英文校閲費用を科学研究費から支弁した。3月末の時点では、すでにレイアウトの初校ゲラが出ている。いっぽうヒマラヤ地域のムスタンに遺される15世紀の貴重な仏教壁画の調査について、Royal Mustang ExcursionのJigme Bista氏と打ち合わせを行った。(調査自体は本年4月5月に実施)

いっぽうナポリ東洋大学、IsIao、ハンブルグ大学が共同で刊行しているManuscripta Buddhicaシリーズに、NagabodhiのVimsatividhiのサンスクリット校訂テキストと英訳を寄稿する件は、すでに英文校閲を終えているが、ナポリ東洋大学側の事情で、刊行が大幅に遅れている。ネパールのローマンタン調査は、予想以上の成果を挙げ、23年度以来の課題であったチベット系曼荼羅の図像データベースの英語版も刊行された。しかし博士論文の英訳作業は、英文校閲者が多忙のため、予定よりも遅れている。ただし同著の英文校閲は、サンスクリット・チベット・古典漢語の知識を有するNative Speakerでないと、正しく点検できないので、校閲者の交代等は考えていない。インド・チベット・ネパールで撮影した写真のデジタル化と図像データベースは、比較的点数が少ないネパール撮影の写真を優先的に進めているが、すべてのデータベース化には、まだ時間を要すると思われる。アジア各地の仏教美術と密教文献の調査・研究については、チベット文化圏の政治的事情により調査を見合わせた地方もあるが、おおむね順調に進んでいる。いっぽう「その成果を世界に発信」という点については、発表を予定していたManuscripta Buddhicaシリーズの刊行が大幅に遅れているため、現在のところ優先順位を後回しにせざるをえなくなっている。これに対して、CGを利用したチベット・ネパール系曼荼羅の図像データベースの英語版については、昨年秋にVajra Publicationsのレイアウト案が完成した。ただしコミュニケーションの不足から、レイアウトや校正にかなりのミスが見られるので、今後入念に点検を行い、なんとか平成24年度中の刊行を目指したい。いっぽう研究代表者が、これまでに撮影した美術品や遺跡の写真については、すでに数千点のフィルムのデジタル化を完了したが、いまだデータベース化するには至っていない。25年5月に行った米国カリフォルニア州の調査では、先に図像データベースを刊行したミトラ100種曼荼羅集の別のセットを実見し、その詳細なデジタル化データを入手することができた。本年は、23年に調査した豊岡市日本モンゴル民族博物館所蔵の資料等とあわせて分析を行い、25年7月にウランバートルで開催予定の国際チベット学会での発表を予定している。いっぽう24年の調査で、収蔵庫に収容されて実見できなかったインド・マディヤプラデシ州ギャラスプルの仏塔四仏については、本年秋に、インドの他の仏教遺跡や研究機関訪問と合わせて、再度調査を予定している。Manuscripta Buddhicaシリーズの刊行が、イタリア側の事情で大幅に遅れているため、今後はCGを利用したチベット・ネパール系曼荼羅の図像データベースの英語版に重点を置き、平成24年度中の刊行を目指したい。いっぽう研究代表者が、これまでに撮影した美術品や遺跡の写真については、すでに数千点のフィルムのデジタル化を完了しており、データベース化用のソフトウェアも購入したので、平成24年度から撮影した年次や調査別に、順次データベース化の作業を進めたい。いっぽうサンスクリット写本のマイクロフィルムについては、通常のフィルムスキャナではデジタル化できないため、現在種々の入力方法を検討している。旅費としては、すでに終了した米国カリフォルニア州調査に加え、ウランバートルで開催予定の国際チベット学会参加、秋に予定しているインド調査での使用を予定している。チベット自治区については、政治情勢が好転せず、外国の研究者が自由に調査できない状況が続いているので、現在のところ実施の予定が立たない。
オキサリプラチンの血液・神経毒性に対する人参養栄湯の臨床効果とその分子機構

オキサリプラチン(L-OHP)による末梢神経障害(PN)に対して現在有効な治療薬がない。軸索障害が主なタキサン系抗がん剤と異なり、プラチナ系抗がん剤は神経細胞障害がPNの主な原因である。漢方製剤である人参養栄湯(ninjin'yoeito: NYT)は神経細胞保護作用を有し、これまで我々は、神経培養細胞の神経突起伸長抑制作用をNYTが抑制し(J Nat Med 2015)、マウスモデルではL-OHPによるallodyniaをNYTが軽減させることを見出してきた(J Nat Med 2017)。これらを背景にNYTの臨床効果をランダム化比較試験(RCT)によって検証した。2014年3月1日から2017年12月31日までに進行大腸癌(StageIIIa, IIIb, high risk II, R0切除したIV)の術後補助化学療法としてXELOX (Xeloda&reg;+L-OHP)療法を受けた患者を対象とした。XELOX標準量を8サイクル施行するレジメンのサイクル1のday 1から、ツムラ人参養栄湯エキス顆粒の常用量9.0 g/日を併用するA群とNYTを併用しないB群(対照群)に無作為に割り付けた。主要評価項目はサイクル8の時点での蓄積性PNのgrade、副次的評価項目は積算L-OHP投与量とした。50例が登録され、8サイクル完遂した例は、A群20例、B群20例であった。8サイクル完遂時のPNのgradeは、A群はB群に比し、有意にgradeが低かった(P<0.05)。L-OHPの積算投与量では、A群(972±130 mg/m2)は、B群(833±163 mg/m2)に比しL-OHPの積算投与量が有意に高かった(P<0.001)。NYTは蓄積性PNのgradeを軽減し、L-OHPの積算投与量を標準量に近づけ、標準治療を完遂できる確率を高めた。HOPE-2として臨床試験を推進中である。2017年3月31日までに45例登録できた。現在追跡中である。末梢神経障害の予防効果については、グレード3に至る症例はなく、3例を除く42例で8サイクルの術後補助化学療法を完遂できている。神経障害の解析では、マウスの冷痛覚および機械的刺激に対する反応閾値は、L-OHP投与から35日目にかけて低下し、人参養栄湯エキスはそれぞれの痛覚過敏が緩和した。ラット褐色細胞腫由来PC12細胞または初代DRG培養細胞に対して、L-OHPと被検薬物を添加したところ、L-OHP濃度依存的に神経(様)突起の有意な短縮が見られ、人参養栄湯を併用することで、有意な改善を示した。各構成生薬ではニンジン、カンゾウ、オウギに有効性が認められた。マウスの冷痛覚および機械的刺激に対する反応閾値は、L-OHP投与から35日目にかけて低下し、末梢神経障害の発現が認められた。In vitro実験系から有効性が示唆されたニンジンについてヒト成人10倍量濃度の熱水抽出エキスを投与することで、それぞれの痛覚過敏が緩和された。血液学的解析では、マウスの骨髄細胞に対する人参養栄湯の添加培養により、miRNA合成に作用する酵素であるDroshaとDicerのmRNA発現が増加することが確認された。そこで、miRNAマイクロアレイ解析を実施して人参養栄湯添加によるmiRNAの網羅的な発現変化を評価した。その結果、検出されたmiRNAのうち65.3%が、コントロール群に比較して人参養栄湯添加群で発現増加していた。特に発現増加が顕著(コントロール群に比較して3倍以上の増加)であったmiRNAのうち、4種に関してリアルタイムPCR法による発現評価を行ったところ、hsa-miR-30b、26b、340において、有意な発現増加が確認された。症例登録がやや遅れているが、登録自体は進捗している。神経学的解析では動物実験・細胞実験が順調にできた。人参養栄湯は、配合されている生薬のうち特にニンジンにL-OHPによる神経障害性疼痛緩和作用があり、その活性成分はPPD系ginsenoside類であることが示唆された。血液学的解析でも遺伝子解析が進んだ。神経障害に対する人参養栄湯の効果に関しては、PC12神経培養細胞を用いた研究成果を論文発表した。すなわちオキサリプラチンによるPC12細胞の神経突起伸長抑制作用を人参養栄湯が抑制することを見出し、人参養栄湯の神経細胞保護作用を証明した。オキサリプラチンによるマウスの末梢神経障害モデル(寒冷刺激と機械刺激への過敏)に対して、人参養栄湯が有効であることをvon Freyテストによって明らかにした。臨床的には、大腸癌の術後補助化学療法としてのXELOXまたはFOLFOX療法に人参養栄湯を併用することにより、蓄積性末梢神経障害のグレードが軽減し、L-OHPの総投与量が多くなった。また化学療法の完遂率が人参養栄湯群の方が高かった。基礎研究ではマウスと培養細胞において研究成果が上げられた。血液についてはさらに検討中である。臨床的研究では、患者登録が一時減ったが、年度後半から増えだして、順調である。

軸索障害が主なタキサン系抗がん剤と異なり、プラチナ系抗がん剤は神経細胞障害がPNの主な原因である。漢方製剤である人参養栄湯(ninjin'yoeito: NYT)は神経細胞保護作用を有し、これまで我々は、神経培養細胞の神経突起伸長抑制作用をNYTが抑制し(J Nat Med 2015)、マウスモデルではL-OHPによるallodyniaをNYTが軽減させることを見出してきた(J Nat Med 2017)。これらを背景にNYTの臨床効果をランダム化比較試験(RCT)によって検証した。2014年3月1日から2017年12月31日までに進行大腸癌(StageIIIa, IIIb, high risk II, R0切除したIV)の術後補助化学療法としてXELOX (Xeloda&reg;+L-OHP)療法を受けた患者を対象とした。XELOX標準量を8サイクル施行するレジメンのサイクル1のday 1から、ツムラ人参養栄湯エキス顆粒の常用量9.0 g/日を併用するA群とNYTを併用しないB群(対照群)に無作為に割り付けた。主要評価項目はサイクル8の時点での蓄積性PNのgrade、副次的評価項目は積算L-OHP投与量とした。50例が登録され、8サイクル完遂した例は、A群20例、B群20例であった。8サイクル完遂時のPNのgradeは、A群はB群に比し、有意にgradeが低かった(P<0.05)。L-OHPの積算投与量では、A群(972±130 mg/m2)は、B群(833±163 mg/m2)に比しL-OHPの積算投与量が有意に高かった(P<0.001)。NYTは蓄積性PNのgradeを軽減し、L-OHPの積算投与量を標準量に近づけ、標準治療を完遂できる確率を高めた。さらなる症例登録を進める。患者登録を進め、解析を行う。プライマリ・エンドポイントである8サイクル終了時の末梢神経障害のグレードに加え、セカンダリ・エンドポイントとしては、とくに化学療法完遂率、オキサリプラチン積算投与量、手足症候群のグレードも検討する。物品費が増え、その他(英文校正費)が発生したが、旅費が安くできたので、この額の次年度使用額が生じた。適切な物品購入及び成果発表等の旅費に使用する。
アレン類のエナンチオ選択的合成法の開発とその合成反応としての展開

アルキノイルシランをキラルリチウムアミドで処理すると,Meerwin-Ponndorf-Varleyタイプの還元がおこった後,Brook転位/SE2'型の求電子置換反応が進行し,光学活性シロキシアレンがワンポットで得られることを見いだした.さらに,エニノイルシランを原料として用いた場合,得られたビニルアレンを系内で[4 + 2]環化付加反応によって捕捉することで,多官能性の縮環化合物を高い選択性で得ることに成功した.また,環化反応における面選択性は立体的要因から推測されるものと逆であるという興味深い知見が得られた.アルキノイルシランをキラルリチウムアミドで処理すると,Meerwin-Ponndorf-Varleyタイプの還元がおこった後,Brook転位/SE2'型の求電子置換反応が進行し,光学活性シロキシアレンがワンポットで得られることを見いだした.さらに,エニノイルシランを原料として用いた場合,得られたビニルアレンを系内で[4 + 2]環化付加反応によって捕捉することで,多官能性の縮環化合物を高い選択性で得ることに成功した.また,環化反応における面選択性は立体的要因から推測されるものと逆であるという興味深い知見が得られた.本年度は,光学活性アレン類の合成に関する研究を行い,以下のような成果を得た.(1)アルキニルシランの不斉還元以前われわれが開発したホモキラルなリチウムアミドを用いるMeerwein-Pondorf-Varley型の不斉還元を,アルキニルシランに適用したところほぼ完壁な選択性でホモキラルなα-シリルアルキニルアルコールを得ることができた.(2)α-シリルアルキニルアルコールの1-シロキシアレンへの変換ホモキラルなα-シリルアルキニルアルコールにtert-ブタノール中t-BuOLiを作用させたところ,シリケート中間体からBrook転位を経て光学活性アレンが高い不斉収率で生成することが判明した.また,本反応の立体過程がアンチ型で進行することもわかった(3)タンデム[不斉還元/シロキシアレンへの異性化]上記(1)の反応を低温下(-80°C)トルエン中で行い,その後THFを添加して-20°Cまで昇温することにより(1).(2)の反応を連続的に行なわせることに成功した.(4)タンデム[不斉還元/シロキシアレンへの異性化/[4+2]環化付加](3)の反応の基質としてエニノイルシラン(enynoylsilane)を用い,生成した光学活性1-シロキシビニルアレンに対し,ワンポットで無水マレイン酸のようなジエノフィルを添加し室温まで昇温したところ,不斉還元,Brook転位,イン-アレン異性化,[4+2]環化付加が連続的に進行し,高い光学純度で多官能性の環化付加成績体が得られた.ここで注目すべき点は,シロキシアレンへの付加環化が立体障害が大きいと考えられるシロキシ基の側からおこっていることで,これまでの常識を覆すもので極めて興味深い結果である,シロキシ基をメトキシ基にかえたもの(別経路で合成)を使用すると付加環化の選択性はなくなり,一方アルキル基の場合には,選択性が逆転した.前年度の検討において,キラルリチウムアミドによる不斉還元を利用することによりアルキニルシランを効率良くホモキラルな1-シロキシアレンに変換する方法論の開発に成功し,その成果を学術論文にて発表した.本年度は,本方法論の適用範囲のさらなる拡大を目指し検討を行った結果,以下のような成果が得られた.(1)インエノイルシランの光学活性アレンへの変換と[4+2]環化付加反応これまでの基質の二重結合と三重結合の位置関係を逆にした化合物であるインエノイルシランをキラルリチウムアミドで処理すると,エノールシリルエーテルを有するアレンが得られた.その際,E体の原料からはZ体の,Z体の原料からはE体のエノールシリルエーテルのみが生成することが明らかになった.そこでZ体の原料を用い,生成した光学活性アレンに対してワンポットでN-メチルモルホリン(NMM)を加えたところ,[4+2]環化付加が連続的に進行し,高い光学純度で多官能性の環化付加成績体が得られた.(2)α-ハロアクリロイルシランのシロキシアレンへの変換α位に脱離基であるハロゲンを有するアクリロイルシランをキラルリチウムアミドで処理すると,不斉還元/Brook転位/ハロゲンの脱離が連続的に進行し,シロキシアレンが得られた.(3)γ-ハロジエノイルシランの光学活性アレンへの変換(2)で用いた原料のアシルシランと脱離基の間に二重結合を導入した基質をキラルリチウムアミドで処理すると,アクリロイルシラン部位がE体の化合物からはZ体のエノールシリルエーテルを持つアレンが中程度の収率で得られた.脱離基の種類(Br,I,OTs)を検討したところ,化学収率は影響をうけるが,エナンチオマー比はほとんど変化しない(70:30)ことが明らかになった.

これまでに,アルキノイルシランをキラルリチウムアミドで処理することで,Meerwein-Ponndorf-Verley型の還元/Brook転位/SE2'反応が連続的に進行してシロキシアレンが高エナンチオ選択的に得られることを明らかにしたので,本年度は本不斉還元反応をシリルイミンに適用することを検討した.シリルイミンを還元することにより得られるα-シリルアミンは合成中間体としても,生理・薬理学的な観点からも重要な化合物であるが,光学活性体の合成報告例はほとんどない.また,三重結合を有する基質を用いた場合にaza-Brook転位が進行すれば光学活性イミノアレンが得られる可能性もある.まず,還元により生じたアニオンが安定化されることを期待して窒素原子上にトシル基を導入した種々のシリルイミン(R(C=NTs)SiR'3, R = Ph, TMSCH=CH, tBuCH=CH, TMSCC, PhCC, Ph(CH2)3C, SiR'3=TMS, TBS, SiMe2Ph)をTHF中-80 °Cにおいてキラルリチウムアミドで処理すると,収率58-91%,エナンチオマー比75:25-99:1で目的のα-シリルアミンが得られた.反応条件を精査する過程で,過剰のアミドを用いるかもしくは反応時間を延長することでラセミ化が起こることが明らかになった.また,イミノシランから反応系内で生成するリチウムアミドも還元剤として働く可能性があると考え,2種類の基質での交差実験を行ったが,交差化合物は得られなかった.このように,キラルリチウムアミドによる還元はイミノシランにも適用可能であり,高エナンチオ選択的にα-シリルイミンを合成可能であることが明らかになった.今後はaza-Brook転位を利用する光学活性イミノアレンの合成を検討していく予定である.当初の目的であるキラルリチウムアミドによる不斉還元を利用するシロキシアレンの合成を達成し,さらなる適用範囲の拡大を行うことができた.24年度が最終年度であるため、記入しない。現在取り組んでいるγ-ハロジエノイルシランの光学活性アレンへの変換において,化学種率,不斉収率の向上を目指す.また,さらに複雑な系への適用,また,天然物の合成も視野に入れて研究を行う.24年度が最終年度であるため、記入しない。
中心視野の再生に資する2光子励起イメージングを用いた新規機能解析法の確立

網膜変性疾患に対して脱落した視細胞を移植する網膜再生治療に期待が寄せられている。しかし現在、視細胞の再生の対象となっているのは網膜周辺部であり、高解像度の視覚を担う中心視野の再生は未だに手つかずである。その原因として、網膜中心領域の神経機能を正確に評価する方法がないことが挙げられる。本研究では、2光子顕微鏡システムおよびイメージングチャンバーなどを自作することで、網膜全層を撮影可能なこと、視細胞の核構造が発生・成熟とともに変化することを示した。以上より、本研究において網膜の発生過程および神経活動を細胞レベルで評価することが可能な2光子顕微鏡ライブイメージング法の確立に成功した。本年度は、網膜からのイメージング系の基盤を構築する目的で、2光子顕微鏡の導入、ウイルスベクターの作製、in vitroでのウイルス感染系の確立を行った。まず2光子顕微鏡のセットアップを行った。システムの主な導入ポイントを以下に挙げる。多色による標識と可視化を行うために、それが可能なデュアルレーザーおよび検出器、フィルターセットなどを整備した。網膜の水平方向および深さに対応できる対物レンズおよび光軸方向に高速移動が可能なピエゾ素子を導入した。網膜を静置・観察するチャンバーには2種類を検討した。混合ガス(酸素95%・二酸化炭素5%)をバブリングした緩衝液を灌流する実験系、および二酸化炭素に依存しない緩衝液を用いて灌流が不要な実験系を開発した。イメージング中に観察する網膜を固定するために、2種類の方法を検討した。単離網膜にアンカーを置いて固定する方法、および網膜をアガロース中に包埋する方法である。イメージングの時間や目的に応じて、緩衝液や灌流方法、固定法を選択するのが良いと考えられた。次に特定細胞を特異的に標識する目的で、マウス遺伝学を用いて遺伝子発現を行う方法と、ウイルスベクターによる導入方法を検討した。マウス遺伝学については複数のCre発現マウスおよびGFP発現マウスを導入した。ウイルスベクターにはHIV(Human Immunodeficiency Virus)を用い、ゲノムベクターの構築およびウイルスの作製を行った。ウイルスの感染にはin vivoで硝子体内投与および網膜下投与を検討し、in vitroでは単離網膜の感染・発現系を確立した。これまでに主に2光子顕微鏡の導入、ウイルスベクターの作製、in vitroでのウイルス感染系の確立を行った。次年度への基盤ができ、おおむね順調に進んでいると判断できる。多細胞生物の発生・分化過程において、一つの受精卵から、卵割、細胞増殖・分化を繰り返しながら、個体が形作られる。個体を形成するすべての細胞のゲノムは基本的には不変であるが、ゲノムを構成するDNAやタンパク質にさまざまな修飾が加わることにより、個々の細胞タイプに特異的な遺伝子セットが発現し、細胞形質や機能が規定される。細胞の発生・分化や生理状態により、細胞核や核内ヘテロクロマチンの形態・分布が変化することが知られている。杆体視細胞はヒトやサルの網膜では中心視野の黄斑部周辺にリング状に高密度に分布する。昼行性動物の杆体視細胞と夜行性動物の桿体視細胞とでは、核内構造が異なることが報告された。そこで本研究では、発生中のマウス網膜における桿体視細胞の核構造の変化を経時的に解析する目的で、2光子顕微鏡を用いた核内構造およびクロマチンのライブイメージング系の確立し、観察を行った。まず核を可視化する目的で、核を標識する色素および蛍光タンパク質を検討した。色素にはDAPI, Hoechst33342, Vybrant DyeCycke Orangeを用いた。蛍光タンパク質を導入するために、桿体視細胞特異的なプロモーターであるNrl promoterあるいはrhodopsin promoterの制御下にtdTomato-H2AあるいはH2B-GFPを発現させたレンチウイルスを作製した。これらを比較した結果、Hoechst33342が2光子顕微鏡下で830 nmにて核構造およびクロモセンターを最も綺麗に可視化することができた。前年度に確立したイメージングチャンバーを用いて、マウス網膜組織を2光子顕微鏡にて経時的に観察した。生後7日目のマウス網膜組織を単離し、核膜周辺にテロクロマチンが確認できた。核変形に伴いヘテロクロマチンが中心に集合し始め、発生と共にヘテロクロマチンが核内部、ユークロマチンが核膜周辺に位置するInvertedな構造へ移行した。より長期間のイメージングが可能な系への改良、視覚刺激との連動、データ解析法の開発を目指す。眼科学
新規β-ラクタムの工業的合成法に関する研究

Thienamycinに代表されるカルバペネム類、あるいはペネム類は新規なβ-ラクタム系抗生物質であり、それら化合物の有する広範な抗菌スペクトル及び選択毒性からその医薬品としての活用が望まれている。しかしながら天然界よりの産出が極めて微量であること、またあるものは非天然物であり、それら化合物の合成法の確立は極めて重要なことである。我々はまず4-acetoxy-3-hydroxyethylazetidin-2-oneの不斉合成法の検討を行った。本化合物はカルバペネム及びペネム系抗生物質合成の重要な共通原料となりうるものである。Benzyl crotonateとmenthyl glyoxylateとの1,3-双極子環状付加反応によりisoxazolidineを合成し、その還元的開環反応、次いで再閉環によるβ-ラクタム環合成により立体選択的に高い不斉収率で目的物を得ることに成功した。このように、1,3-双極子環状付加反応が3-hydroxyethylazetidinoneの合成に有用であることが判明したので、本反応をさらにthienamycin合成へと応用し、光学活性なnitroneとクロトン酸エステルとの反応を用い、数行程でthienamycinの不斉合成にも成功した。一方、ペネム合成においては6-aminopenicillanic acidを原料に使用し、カルベノイドを活性反応種として反応を行うことにより、ペニシリン骨格の1,2-結合が開裂して容易にsecopenicillinへと導くことが可能となった。得られた化合物のラクタム環窒素上の置換基を数行程でphosphoraneへと変換し、さらにazetidinoneの4位置換基をthioester誘導体に変換後、分子内Witting閉環反応に付することにより目的とするペネム化合物が収率良く光学活性体として得られることが判明した。以上のようにカルバペネム及びペネム骨格の立体選択的合成法の確立に成功したので現在それらの工業的合成への応用を検討する予定である。非古典的β-ラクタム系抗生物質の代表的な化合物であるチエナマイシンは幅広い抗菌活性を有することにより注目を集めているが菌よりの産出量が極めて微量であり、医薬品として供給するためには合成法の確立が必須の条件となっている。今回その合成にあたり種々の検討を行いその結果としてチエナマイシンの不斉合成に成功した。また、その間に以下の結論を得た。1.ベンジルクロトネートとニトロンの1、3-双極子環状付加反応を鍵反応に用いることによりチエナマイシンの5、6、8位の立体化学の制御が可能となった。2.ニトロンの窒素に光学活性な化合物をつけることにより、1、3-双極子環状付加反応において不斉誘起の起こることが判明した。また取られた付加体の光学純度も非常に高いものであった。3.中性条件下にイソキサゾリジン体を還元的に開裂し、次いで閉環反応を行うことにより容易にβ-ラクタム環の生成することが判明した。以上によりチエナマイシンの立体選択的不斉合成に成功したが、6位のヒドロキシエチル基を潜在的医薬品として期待されうるアミノ基へ変換することを検討した。すなわち二級水酸基を脱水したのち、オゾノリシス反応に付しケトン体へと導き、次いでオキシム化後接触還元反応を行った。この結果、本還元反応は立体選択的に進行し、望むべき3、4-シスの3-アミノアゼチジノンが生成することが明らかとなった。すなわち本還元反応においては4-位の置換基の逆側より水素の攻撃が起ったものである。
ParticleーImaging Velocimetryの実用化に関する調査研究

PIVは微細なトレ-サ粒子により可視化した流れ場の画像をディジタル画像処理して速度を計測する新らしい流体計測方法で瞬時の二次元三次元空間の多点の速度情報を採取できる特徴をもつ。この方法は流れ場の解析手段としてその有効性が認識されつつあり、流体計測手法としての確立が強く望まれている。本研究ではこのような観点から専門研究者の組織化を行い、この研究組織において、最新の技術情報を交換・比較することにより本手法の精度と性能向上に対する問題点を整理・統合した。PIVの実用化について、本調査研究では以下のような具体的な研究、討議を行い今後の指針を提示した。すなわち、まずPIVによる種々の流れ計測における不確かさ解析方法の開発が行われ本手法の計測精度や現状における計測の限界などが評価された。また、代表的な粒子画像の解析アルゴリズムについて、粒子追跡法、2値化相関法、濃度相関法、流跡線解析法、時空間微分法などの対する性能評価が行われいくつかの改善案が提示された。ついで、計測されたデ-タ処理に関して、流れ画像上に時間的、空間的に離散した速度デ-タ群から流れの統計諸量を求める方法あるいは流れの空間構造を認識するアルゴリズムなどの提案がなされた。同時に、計測された空間デ-タを定量的に比較し評価する方法についても検討がなされた。PIVの計測精度および性能を向上させるため、処理画像の時空間の高解像度化および大規模デ-タ群の処理の高効率化、高速化がハ-ドウエアとソフトウエアの双方から検討された。実用的でユ-ザフレンドリな計測システムを構成するための入力から出力までの種々の処理方式について検討が行われいくつかの実用化システムの構成例が示された。以上の成果の詳細は、今後の研究の指針として、成果報告あるいは論文等の形で公表される。
血漿PAFアセチルヒドロラーゼの活性調節機構の解明を目的とした遺伝生化学的研究

1.モルモット血漿PAFアセチルホドロラーゼのcDNAクローニング(初年度)精製モルモット血漿PAFアセチルヒドロラーゼ(分子量63kDa)をリジルエンドペプチダーゼ処理し、得られた9個のペプチド断片のアミノ酸配列を気相法シークエンサーにより決定した。この配列をもとに、モルモット肝臓mRNAから調製した1st strand cDNAをテンプレートとしてPCRを行い、約600bpの特異的フラグメントを得た。これをプローブとし、モルモット肝臓cDNAライブラリー30万pfuをスクリーニングした結果、4個のポジティブクローンを得た。ところがN末端部分が含まれていないことが判明したため、5′RACE法により欠損部分を得た。塩基配列より予想されるタンパクは436アミノ酸(推定分子量49kDa)から成り、セリンエステラーゼに典型的なモチーフとアスパラギン結合型糖類により修飾可能な配列3個所を有していた。2.組換モルモット血漿PAFアセチルヒドロラーゼの発現と特異的抗体の作製(最終年度)His tagを有する発現ベクターを用いて大腸菌に発現させ、本遺伝子産物が活性を持つことを確認した。リコンビナント酵素をNi^+カラムおよびSDS-PAGEによって精製した。リコンビナントタンパクをウサギに免疫して特異的抗体を得た。この抗体は血漿中の63kDaの蛋白質と反応することから、本酵素は糖鎖付加などの翻訳後修飾を受けている可能性が考えられる。この修飾の生理的意義については今後明らかにしていかなければならない。このほかヒト酵素のcDNAクローニングと、アデノウイルスペクターを用いた哺乳動物細胞での発現実験を行った。現在、ゲノムDNAのクローニングを実施中である。これまでに肝臓およびマクロファージでエストラジオールによって、またマスト細胞ではインターロイキンにより本酵素の発現調節が行われていることが示唆されている。今後、プロモーター領域の解析と免疫化学的手法を組みあわせることにより、分子レベルでこれらの発現調節機構を解析していく方針である。さらに病態への関与についても検討していきたい。我々はエンドトキシンショックを引き起こしたモルモット腹腔液よりPAF-アセチルハイドロラーゼを精製する方法を確立しており、今回のモルモット血漿からの精製は、この方法に従って行なった。その結果、血漿を酵素源とした場合にも電気泳動上単一性を示す酵素標品を得ることができた。またその分子量は63kDaと推定された。精製酵素のN末端アミノ酸配列分析を試みたところ、N末端部は何からの修飾を受けていると考えられ決定できなかった。そこで、リジンエンドペプチダーゼ処理を行うことにより酵素を断片化し、各々のペプチドフラグメントを逆層HPLCで分離した。分離されたペプチドフラグメントのうち、9個についてそのアミノ酸配列を気相法プロテインシークエンサーを用いて明らかにすることができた。部分アミノ酸配列に基づいて縮重オリゴヌクレオチドを合成し、モルモット肝臓mRNAより調整したFirst strand cDNAをテンプレートとしてPCRを行った結果、約600bpの特異的cDNAフラグメントが得られた。このPCR産物がモルモット血漿PAF-アセチルハイドロラーゼのcDNAの一部であることは、センスプライマーの合成に用いたアミノ酸配列を含むペプチドフラグメントが持つ別のアミノ酸配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとしてサザン解析を行なうことにより確かめられた。そこでこのPCR産物をプローブとしてモルモットおよびヒト肝臓のcDNAライブラリーを30万pfuおよび100万pfuスクリーニングした結果、それぞれ4クローンおよび2クローンのcDNAを単離することができた。