hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
線維芽細胞凝集塊形成による幹細胞形成機構の解明

C57BL/6Jマウス新生仔の皮膚より間葉系細胞を採取・培養したのち、非接着性培養皿で無血清培地を用いて細胞凝集塊を形成した。凝集塊は比較的長期に生存可能であり、その間いわゆる冬眠状態である可能性が示唆された。また細胞凝集塊の性質について遺伝子学的、免疫組織学的検討を行ったところ、凝集塊形成により毛包誘導や毛周期に関わりの深いWnt関連因子や、細胞の未分化性を示すSox-2、Oct-4、CD133、cxcr4などの遺伝子発現が相対的上昇することが判明したが、これら因子の分布は必ずしも凝集塊内で均一でなく、一部の細胞の性質が変化した結果なのか、もしくは細胞の選択が行われたのかは今後要検討である。これまでの研究で、C57bl/6J新生仔マウス由来の皮膚と、同系マウス成獣由来の肺組織から線維芽細胞を採取・培養し、のちに非接着培養の条件に移し細胞凝集塊を形成すると、これらが表皮細胞との混合移植によりマウスで毛包を再生させ得ることを確認した。このことは、本来分化した状態の線維芽細胞からは毛包は誘導できないが、細胞凝集塊の状態にすることで細胞の性質が変化し、ある種の未分化性を獲得する可能性があることを示している。凝集塊を形成する細胞は、非接着かつ無血清の状態でも長期間生存しており、real time PCRでも幾つかの未分化性を示すマーカーの発現上昇が証明されている。線維芽細胞から作成した細胞凝集塊の免疫組織学的検討では、confocal microscopeによる観察にて、Skin derived precursorsなどで発現しているSca-1やNestin陽性の細胞が多数認められたが、それらは各々異なる分布を示していた。この結果より興味深いことに、凝集塊の中の未分化性を示す細胞が非対称性に変化していることが予測された。この現象が、凝集塊中の細胞の不均等な脱分化によるものなのか、あるいはmuse cellのような細胞のselectionの結果なのかは今のところ不明であるが、線維芽細胞自体が培養条件の変化によって性質変化を来たしたことを証明するためには、これらの細胞がselectionによるものではなく、単一細胞由来であることを示す必要がある。現在これを証明するために、細胞のクローニングを行い、同様の方法で凝集塊を形成させたうえで毛包誘導が可能かどうかの検証を行っている段階である。クローニングにあたっては二次元培養の状態の線維芽細胞を限界希釈によって単一細胞を分離し、増殖・継代させる方法を用いている。なお本年度の期間中、出産に伴う産休および育休により、平成25年10月9日から平成26年1月31日までは研究を中断している。これまでの研究で、成獣オスC57bl/6Jマウスの皮膚、および肺由来の間葉系細胞は、非接着培養を行い細胞凝集塊の状態とすることで、表皮細胞との混合移植でマウスにおいて毛包を再生できることが分かっている。今回この細胞凝集塊について、未分化性との関連などにつき更なる検討を行った。細胞凝集塊の生存の有無については、非接着培養開始後3週間での凝集塊のTUNEL染色およびPI染色にて、95%以上の細胞の生存が確認できた。また実際に移植に用いた細胞よりさらに長期に非接着培養を行い、約4か月経過した段階で細胞凝集塊を二次元培養に戻し、細胞の生存の有無と分裂速度を調べた。細胞の形態は、経時的に徐々に細胞質の割合が少なくなることで形が小さくなりながらも、凝集塊を形成したままであった。二次元培養に戻すと、細胞は増殖を開始し生存が確認できた。培養再開初期の細胞は非常に小型で分裂能が遅かったが、継代とともに通常のサイズ・増殖能ともに回復し、7継代目頃には通常の線維芽細胞と同程度になった。このことは細胞が凝集塊を作成することで、ある種の冬眠状態になることを示唆していた。細胞の未分化性を確認するために、種々の未分化マーカーの発現に関してreal time PCRを施行したところ、凝集塊形成後に二次元培養に比べ、特にSox-2やCD133が経時的に上昇し、cxcr4、Oct4も相対的発現の上昇を認めた。一方で、Nanog、myc、Klf-4などのマーカーは細胞凝集塊の形成とともに発現が漸減し、一部の未分化マーカーのみ発現が上昇することが分かった。免疫組織学的検討では、confocal microscopeでの観察にてこれまでにSca-1、Nestinの発現が確認されていたが、さらに造血幹細胞などで認められるNotch1やCD34の発現が確認され、これらは前述の細胞の冬眠とも関連がある可能性が示唆された。C57bl/6J新生仔マウス背部皮膚より線維芽

細胞を採取、接着培養にて数継代培養したのち細胞を回収し、寒天でコーティングした超親水性の非接着性培養皿上で、無血清培地を用いて培養を行い、細胞凝集塊を作成した。細胞の生存に関する検討では、凝集塊形成1週間の段階で95%以上の細胞が生存していた。その後も細胞は培養皿に接着しないながらも長期間生存可能であった。他の凝集塊を作る細胞が、低栄養や低酸素状態で培養することで長期生存が可能であるとの報告もあり、細胞を取り囲む環境の関与が大きく、この際細胞はいわゆる「冬眠」状態であることが予測された。凝集塊の免疫組織学的検討では、真皮の幹細胞とされるSkpsなどで発現しているSca-1、Nestinなどに関し、細胞凝集塊をhole mountで染色したところいずれの発現も確認されたが、confocal microscopeで観察した切片画像では、マーカーの分布が必ずしも一致しなかった。するとこれらの細胞群は不均等な集団から成ることになるが、これは培養条件により一部の細胞が未分化状態へと移行するのか、もしくは細胞が選択された結果なのか、いずれの可能性も考えられる。今後この解明のために、単一の集団からなる細胞を用いて再検討予定である。凝集塊の遺伝子発現の検討では、経時的に得たサンプル間で、定量的RT-PCRを用いて相対的な発現変化を調べた。様々な幹細胞において発現が確認されている未分化性を表す膜表面マーカーや転写因子を調べたところ、iPSやMSCなどにおいて認められるSox-2、Oct-4、CD133、cxcr4、などが、細胞凝集塊形成後に二次元培養細胞と比較し、著明に発現上昇した。また毛包再生において重要とされるWntシグナル関連遺伝子の中では、Wnt5a、Wnt5b、βcatenin、Lef-1などの発現が上昇しており、さらに表皮細胞との混合培養を行うとWnt5a、Wnt5bについては凝集塊単独の状態よりも発現上昇することが判明した。形成外科学これまでの成果を確実にするための、単一細胞を用いた実験に関しては、細胞の安定した確保が難しく数回再実験を行ってる状態である。また個人的理由ではあるが、今年度中に産休・育休を取得したため、実験に費やせる全体の時間が少なくなっている。目標としたもののうち一部の免疫染色、PCRでの検討は行えているが、安定した細胞凝集塊を得るために期間を要するため、決まったポイントでの経時的なサンプル採取や、多重染色などはまだ行えていない部分がある。平成25年度の研究目標として掲げた項目に関し、足りない項目は引き続き検討を行う。併せて平成26年度の研究目標も遂行していくことを予定している。本研究室内での設備では不十分な実験については、本大学が保有している中央機器管理部門の設備を用いて行う。平成24年度の研究目標として掲げた項目に関し、足りない項目は引き続き検討を行う。併せて平成25年度の研究目標も遂行していくことを予定している。本研究室内での設備では不十分な実験については、本大学が所有している中央機器管理部門の設備を用いて行う。今年度未使用額の発生は、効率的な物品調達を行った結果であるが、概ね予定通りである。次年度の研究費は、今年度同様、主に実験に使用する試薬類や器具類の購入、また動物(主にマウス)の購入および飼育に使用する予定である。現段階では特に大きな機器の購入予定はない。
意識の構造についての神経現象学的研究

本研究の目的は、神経科学の三人称的観点と現象学の一人称的観点を融合させた「神経現象学」の手法を中核にして、意識の構造を科学的に探究するための研究枠組みを確立することである。本年度は、「現象学的トレーニング方法の開発・改良」と「両眼視野闘争の現象学的特徴の解明」の二つのテーマについて研究を行った。以下ではそれぞれの研究について記述していく。科学的な意識研究においては実験参加者から意識経験の諸特徴についての報告を得る必要がある。しかし、環境内の事物の記述と区別できる仕方で意識経験を記述するのは簡単ではない。特に、次の二点が課題となっていた。(1)注意を環境内の事物から経験そのものへと向け替えること、(2)経験そのものへの豊かで分かりやすい記述を与えること。そこで私たちは、これらの課題を達成するための一時間程度のトレーニングを開発し、その効果を検討した。その結果、いくつかの問題点が発見された(トレーニングのマニュアル化が難しい、トレーニングの効果があるタイプの経験が限定されている、等)。今後の研究では、その問題点を解決した新たなトレーニングプログラムを開発する予定である。両眼視野闘争はこれまでの科学的な意識研究で非常によく使用されてきた。だが、両眼視野闘争の現象学的特徴についてはまだ十全な研究がされていない。本研究では、両眼視野闘争の現象学的特徴を解明するための実験を行った。その結果、両眼視野闘争は通常の知覚経験と比較して「時空間的不確定性(いつどこで経験の変化が生じているかはっきりしない)」、「空間的非統合性(経験が空間的に統合されていない)」、「注意依存性(経験の変化が注意に依存する)」の三つの特徴があることが分かった。今後の研究では、両眼視野闘争がこうした特徴をもつことが科学的な意識研究に対してどういう含意をもつかを検討していくこととなる。本研究の成果をいくつかの国際会議で発表することができ、そこでのフィードバックをもとに研究成果を論文化することができた。この論文は今後別の国際学会でも発表する予定である。今後は次の三つの課題を中心に研究を行う予定である。(1)ヴァーチャルリアリティの現象学的特徴の研究、(2)現象学的トレーニングのさらなる改良、(3)両眼視野闘争を用いた意識の構造の解明。我々が日常生活のなかでもつ「現実感」は私たちの意識経験の重要な構造的特徴である。現実感の神経基盤を探求するためには、「現実感」についての詳細な現象学的特徴づけが不可欠である。したがって本研究では、ヴァーチャルリアリティを用いて現実感の諸特徴を解明することを目指す。これまでの研究で設計した現象学的トレーニング方法にはいくつかの課題があった。こうした課題を解消しつつ、現象学的トレーニングを実際の実験的意識研究において使用できるレベルまで改良することを目指す。これまでの研究で両眼視野闘争の現象学的特徴を明らかにした。それに引き続き、両眼視野闘争を用いて「意識経験の時空間的な確定性」にかかわる神経メカニズムの研究を行う予定である。

現実感の神経基盤を探求するためには、「現実感」についての詳細な現象学的特徴づけが不可欠である。したがって本研究では、ヴァーチャルリアリティを用いて現実感の諸特徴を解明することを目指す。これまでの研究で設計した現象学的トレーニング方法にはいくつかの課題があった。こうした課題を解消しつつ、現象学的トレーニングを実際の実験的意識研究において使用できるレベルまで改良することを目指す。これまでの研究で両眼視野闘争の現象学的特徴を明らかにした。それに引き続き、両眼視野闘争を用いて「意識経験の時空間的な確定性」にかかわる神経メカニズムの研究を行う予定である。研究分担者である宮原が異動に伴う多忙のため、予定していた学会発表の一部を中止したことにより、出張費・学会参加費に剰余が生じた(40万円相当)。また、予定していた論文の投稿が先延ばしになったため、英文校閲費・出版費の剰余が生じた(15万円相当)。昨年度に実施できなかった学会発表と論文投稿については、本年度に繰り越して実施する予定である。
被災地の視点での原子力災害に対する補償問題

福島第一原子力発電所の事故はさまざまな法的問題が発生させた。とりわけこの事故によって生命・財産に対する膨大な損害が発生した。損害賠償を求めて、東京電力に対する直接賠償請求、ADRセンターによる和解あっせん、民事裁判などが行われている。その他、原発事故に起因する労働災害とか雇用問題、応急仮設住宅の問題なども発生している。本研究は、「福島」という被災地の視点から見た賠償問題等を検討したものである。2013年度の研究計画として、第1に、被害の実態の把握を掲げた。これについては、メンバーが分担して、被災者、被災地の自治体関係者、損害賠償請求における原告および原告弁護団等への聴き取り、および現地視察を行った。主な調査先として、福島県内では、相馬市(2013年8月)、浪江町(2013年10月)、いわき市・富岡町・双葉町・楢葉町(2013年11月)、県外では、宮城県亘理町(2014年1月)など。その他、原子力損害賠償紛争解決センター(ADRセンター)からの資料提供・聴き取りに努めた。また韓国における原子力政策および原発問題を調査するることを目的として2名を韓国のソウルに派遣し、大学関係者および政府関係者に対して聴き取りを行った(2014年3月)。第2に、各種の研究会およびシンポジウムに参加し、資料収集・意見交換に努めた。とりわけ福島原発事故賠償問題研究会は、大学関係者のほか、各種の原告弁護団の弁護士が多数参加し、損害賠償請求における損害論・責任論につき認識を深めた。また2013年の秋に福島大学内に「原発ADRに関する研究会」を立ち上げ、2014年3月にはADRセンター・福島事務所の所長を迎えて、同センターの和解斡旋の実態について研究会を行った。これには大学関係者のほか、多数の弁護士・司法書士・行政書士・土地家屋調査士等の実務家の参加があった。第3に、2012年度の福島大学プロジェクト研究推進事業「被災地の法的支援とADRの役割」については、この科研費での共同研究への吸収・発展という形になった。この継続事業として、司法書士、行政書士との交流、意見交換を通じて、被害の実態の把握に努めている。また4つの事故調査委員会の報告書(民間事故調・政府事故調・国会事故調・東電事故調)の問題点の洗い出しなど検討作業を続けている。2014年度においては、前年度を受けて、文献収集とそれの分析を中心に行った。とりわけ以下の点につき、成果があがっている。第1に、原子力損害賠償紛争解決センター(ADRセンター)の活動状況および同センターによる和解あっせん事例の検討についてである。2013年度末に開催したADR関連のシンポジウムにつき、その成果の取りまとめを行っている。現在、同センターによる約1000件の和解あっせん事例を文部科学省のホームページで見ることができ、これの分析を行っているところである。とくに民事訴訟との相違に着目して分析を進めている。第2に、民事訴訟については、福島県内で判決が出されたケースを中心に検討を進めている。たとえば平成26年8月26日の福島地裁判決の分析・検討等である。同判決は原発事故と自死者との因果関係をめぐる争いであり、請求額の約8割を認容したのであるが、因果関係の立証につき、過労自殺等の労災ケースの手法を取り込んでいるところが注目される。第3に、現在、福島まで行われている除染作業に関する調査・検討である。除染の手法およびその効果については、さまざまな見解が出されているが、被害者・被災者の視点からの検討が必要であると考える。さらに国・地方自治体による除染のほか、任意の除染も問題となっており、これも対象となる。第4に、アメリカにおける原子力規制に関する立法政策との比較・検討を行った点である。原子力発電所の再稼動が問題となっている今日、重要な課題である。2015年度は、本研究の最終年度であるため、研究成果報告書の作成に力を注ぎ、年度末に『被災地の視点での原子力損害に対する賠償問題』というA4版94頁の冊子を刊行することができた。内容および形式については自由としたが、論文形式のものとして、研究代表者である富田哲「原発事故に対する損害賠償のゆくえー賠償問題にかけているものは何かー」、長谷川珠子「震災・原発事故後の福島における労働問題」、山崎暁彦「東日本大震災後の住まいの退去をめぐるトラブル」の3本を掲載し、清水晶紀「研究成果報告」として、3年間の業績に対する自己による解題をとりあげている。自己の専門分野と直結した業績としてまとめることができた。個々の論文の内容についてはとりあげることはしないが、各人の専門分野から見た東北地方・福島県における震災・原発事故の法的問題の原状を取り扱ったものとなっている。なお、この研究成果報告書の末尾に各人の3年間の研究成果一覧を掲載してある。この研究成果報告書は、研究期間終了後も継続している研究会とか関連する全国規模の研究会を通じて、大学の研究者および実務家の弁護士等に配布し、福島県・福島市等の審議会・審査会の際に関連している部局に配布しているが、その他各種の研修の機会に関係者に配布する予定である。原発事故に関する訴訟はこれから判決・決定等を出されるものがほとんどである。またADRの申請件数もいまなおかなりの数に上っている。ここでの研究成果を将来につなげていきたい。

損害賠償を求めて、東京電力に対する直接賠償請求、ADRセンターによる和解あっせん、民事裁判などが行われている。その他、原発事故に起因する労働災害とか雇用問題、応急仮設住宅の問題なども発生している。本研究は、「福島」という被災地の視点から見た賠償問題等を検討したものである。本研究における研究手法として、文献研究と実態調査等のフィールドワークとの結合を掲げていたが、この両分野につき、進捗状況につきアンバランスがみられる。第1に、判例研究であるとか、原子力損害賠償紛争解決センター等の行政関係の文献資料にもとづく研究は、ほぼ順調に行われているのに対して、実態調査等については、あまり習熟していないこともあって、その整理・取りまとめに時間を要することとなり、たとえ実態調査を実施しても、個々人によるメモ等の形で原資料のまま手付かずの状況となっているものも多く見られる。第2に、研究メンバー相互間の交流が不活発であった。当初予定していた全員参加の研究会の開催も少なく、それゆえ、個々のメンバーが自己と関連する全国規模の研究会に参加することが多くなってしまった。それゆえ、本研究を全体として活性化させることが不十分であった。ただし、個々により集積された資料を授業であるとか、各種の研修会等で利用していることは多い。民法学2015年度は、本研究の最終年度であるので、この2年間の出遅れを取り戻し、社会貢献につながるような成果を出せるような年度としたい。第1に、内部での研究会を活性化させ、相互に其進捗状況を確認しあうことによって、研究を進めていくことにしたい。第2に、実務家(弁護士、司法書士、行政書士等)との連携のもとに研究を進めていくことを予定していたが、実際には、個々の関係者からの聴き取り等ですませたことも多く、この点に関しても、組織的な研究体制を再構築することにしたい。第3に、研究成果の公開方法はこの2年間、個人任せであったが、最終的な報告書については、以下の点を考慮して作成していきたい。1個々人の研究であっても、それを出版できるような水準を確保すること、2実務家(裁判官および弁護士等)にとっても、有益な報告書となることを目指すこと、3教育重視の人材育成大学として、学士課程および大学院における教育にも資するような報告書をつくること、等を考えている。被災地の中心が福島県内ということもあるが、被害の実態の把握に関しては順調に進んでいる。すなわち、第1に、被災者、被災地自治体の関係者、原告、原告弁護団の弁護士等から、かなりの聴き取りを行った。さらに福島県(とりわけ浜通り)における弁護士過疎の実態を反映して、実質的に法律問題を取り扱かっている司法書士・行政書士からの事情聴取も進んでいる。それゆえ、法的な損害として構成できる実態(事実関係)の把握については順調であると評価できる。第2に、各種の原告弁護団が多くが集まってくる研究会において、現実における訴訟上の問題点について理解が進んできた。すなわち、被害(損害)を法的な賠償のルールに乗せる理論作りの準備に取り掛かる段階である。またこれらを通じて、原子力損害賠償審査会が提示した「中間指針」(2011年8月)の理解も進んだ。この点からすると、順調に進んですると評価することができる。
インスリン製剤に代わる経口可能な海苔由来作用物質の探索および作用機序解明

糖尿病の予防に寄与する食品の中に水溶性食物繊維があげられる。昨年度の研究では、海苔より水溶性食物繊維の粗画分を抽出し、品質による比較をおこなった。その結果、品質の低い海苔に多く含まれることが明らかになった。また、水溶性食物繊維を分離する際に得られる分画物であるインスリン様作用成分についても同様に品質の低い海苔に多く含まれることを明らかにしてきた。このインスリン様作用の同定を行うために、品質の低い海苔に多い成分を探索することで、その手掛かりとすべく研究を行ってきた。そんな中、昨年度は海苔に一般的に多いたんぱく質について比較を行ったが、品質が高い方がより含有量が多いことが明らかになった。そこで、本年度はインスリン様作用成分の成分同定の新たな指標を探索するために、抗酸化作用(H-ORAC値)を挙げ、品質による違いによる検討を行った。なお、抗酸化作用は糖尿病の改善だけでなく、動脈硬化改善にも資することが報告されている。本年度の実験の結果、抗酸化能は品質が高い方が高くなる傾向を示すことが明らかになり、インスリン様作用成分とは異なる可能性が示された。今後新たな指標を探索したいと考えている。一方、先の研究では、我々が用いている海苔抽出分子量1000未満画分がラットにおける糖負荷試験でも食後血糖値を下げ、2型糖尿病モデルマウスでも血中インスリン濃度を下げる結果を得ている。そこで、その血糖降下作用が消化酵素活性阻害作用であるかを確認するために、4等級(1,3,5,7)の海苔より抽出した75%エタノール抽出液を用いて2種類の糖質消化酵素活性への影響を検討した。その結果、いずれの等級においても糖質消化酵素阻害作用は見られなかった。これらのことから、我々がインスリン様作用成分としている海苔由来低分子画分は、糖質消化酵素阻害作用を介さないで血糖値をコントロールしている可能性が明らかになった。本年度の研究では、インスリン様作用成分は抗酸化作用を示す成分と一致しない可能性が示された。また、これまでの研究で示してきた実験動物における血糖降下作用や高インスリン血症改善作用が消化酵素阻害作用によらないことが明らかになった。このことは、本実験の成分がインスリン様に働いている可能性がより深まったと考えられる。また、昨年度の研究で、作用成分抽出には品質の低い海苔が適していることも明らかにした。このようなことから、本年度は効率よくインスリン様作用成分を抽出し、分離・精製を行うことで、物質同定につなげていきたいと考えている。以上のことから、本研究はおおむね順調に進展しているものと考えている。研究計画を大幅に変更することなく、下記の方針で進めていく予定である。これまでに引き続き、インスリン様作用物質の分離・精製を進めて、動物での評価につなげていきたいと考えている。インスリン様作用のスクリーニングには、これまで同様に正常ラットより摘出した脂肪組織を用いて脂肪分解抑制作用を指標として評価する。先の研究でインスリン様作用成分の抽出には品質の低い海苔が適していることが明らかになっている。したがって、漁連より提供いただいた廃棄同等の低品質海苔を活用して研究を進めていきたいと考えている。作用物質の分離・精製については、まず熱水・75%エタノール抽出を行ったのちに、分画分子量1000の分離膜で分けた画分を調製する。この画分をさらにオープンカラムにより分画し、吸光度測定、TLCによる物質同定を行うことで活性画分を得たいと考えている。作用画分のスクリーニングは上記方法を用いて、さらなる絞り込みを行う。オープンカラムによる精製は再現性の確認が行われてこなかったため、再現性ならびに分離条件も含めて検討していきたいと考えている。この方法により精製が進めば、この成分について糖尿病モデル動物での評価を行い、抗糖尿病効果を発揮するか、糖負荷試験、長期摂取等も試験を行い明らかにしていく予定である。本年度は、主に海苔の品質差によるインスリン様作用の比較およびその作用成分探索を進めた。海苔の品質は、各地域の漁連において専門の検査員が格付けを行っているが、主観的な検査であるため、全国統一の基準はない。そこで、まず格付けの客観的指標としてすでに報告されているたんぱく質含量を指標として、17等級の海苔15種類について測定した。その結果、本研究でも既報と同様に、高い等級ほどたんぱく質含有量が高くなる傾向を示した。なお、相関係数は0.87を示していたため、一部等級に合わないものも見られた。次に、17等級の海苔より抽出した画分(熱水抽出可溶性画分、75%エタノール抽出溶性画分)を用いて、インスリン様作用を比較した。先の研究で、熱水抽出可溶性画分にエタノールを添加して得られた75%エタノール抽出溶性画分に活性が集まっていることが明らかになっていたことから、先の2画分を用いて実験を行った。その結果、熱水抽出可溶性画分では品質が低いほど作用が強い傾向を示した。熱水抽出可溶性画分中から抽出した75%エタノール抽出溶性画分は、等級が低いほど含有量が多くなる傾向を示したことから、その濃度に依存して強い活性を示した可能性が考えられた、次に活性成分について検討を行った。海苔に多く含まれる成分として食物繊維とたんぱく質があげられ、この関与について検討した。この中で、熱水で抽出される成分に水溶性食物繊維と熱水可溶性のたんぱく質が考えられる。水溶性食物

繊維は75%エタノール抽出不溶性画分に多く含まることがわかっており、この画分は活性を示さないことは明らかである。一方熱水抽出溶性画分中のたんぱく質含有量は、品質が低いほど低下傾向を示している。これらのことから活性成分はたんぱく質由来成分でもないことが明らかになった。以上のことから、インスリン様作用物質の探索には等級の低い海苔の方が適していることがわかった。本年度の研究では、インスリン様作用が品質差によりどの程度影響を受けるかを明らかにすることができ、廃棄されるような品質の低い海苔の方が効率よく作用成分を抽出できる可能性を見出した点で大きな成果を得たと考えている。また、たんぱく質の分析を各画分で進めることで、品質差との関連から、たんぱく質由来成分が作用成分と関連が薄いことも見出すことができた。次年度は効率よく抽出できることが分かった品質の低い海苔から高効率で作用成分を抽出することで、次の研究につなげていきたいと考えている。以上のことから、本研究はおおむね順調に進展しているものと考えている。糖尿病の予防に寄与する食品の中に水溶性食物繊維があげられる。昨年度の研究では、海苔より水溶性食物繊維の粗画分を抽出し、品質による比較をおこなった。その結果、品質の低い海苔に多く含まれることが明らかになった。また、水溶性食物繊維を分離する際に得られる分画物であるインスリン様作用成分についても同様に品質の低い海苔に多く含まれることを明らかにしてきた。このインスリン様作用の同定を行うために、品質の低い海苔に多い成分を探索することで、その手掛かりとすべく研究を行ってきた。そんな中、昨年度は海苔に一般的に多いたんぱく質について比較を行ったが、品質が高い方がより含有量が多いことが明らかになった。そこで、本年度はインスリン様作用成分の成分同定の新たな指標を探索するために、抗酸化作用(H-ORAC値)を挙げ、品質による違いによる検討を行った。なお、抗酸化作用は糖尿病の改善だけでなく、動脈硬化改善にも資することが報告されている。本年度の実験の結果、抗酸化能は品質が高い方が高くなる傾向を示すことが明らかになり、インスリン様作用成分とは異なる可能性が示された。今後新たな指標を探索したいと考えている。一方、先の研究では、我々が用いている海苔抽出分子量1000未満画分がラットにおける糖負荷試験でも食後血糖値を下げ、2型糖尿病モデルマウスでも血中インスリン濃度を下げる結果を得ている。そこで、その血糖降下作用が消化酵素活性阻害作用であるかを確認するために、4等級(1,3,5,7)の海苔より抽出した75%エタノール抽出液を用いて2種類の糖質消化酵素活性への影響を検討した。その結果、いずれの等級においても糖質消化酵素阻害作用は見られなかった。これらのことから、我々がインスリン様作用成分としている海苔由来低分子画分は、糖質消化酵素阻害作用を介さないで血糖値をコントロールしている可能性が明らかになった。本年度の研究では、インスリン様作用成分は抗酸化作用を示す成分と一致しない可能性が示された。また、これまでの研究で示してきた実験動物における血糖降下作用や高インスリン血症改善作用が消化酵素阻害作用によらないことが明らかになった。
チトクロームP450IIE1遺伝子の多型性とアルコール代謝能およびその法医学的応用

1.PCR産物を制限酵素Pst1と作用後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い型判定をした場合は結果が非常に明瞭であったが、制限酵素Rsa1と作用させた場合、切れた1つが短いので染色しにくかった。P450II Elの遺伝子型のうちC_1/C_1、C_1/C_2の場合にはPst1のみで充分であるが、C_2/C_2の判定を下す場合、両制限酵素を用いた方がよい。2.アルコール症患者124名、健常人54名のP450II Elの遺伝子型の判定を行ったところ、C_1/C_1、C_1/C_2、C_2/C_2がアルコール症患者では75例、43例、6例であるのに対し健常人では、28例、25例、1例であった。遺伝子頻度は、アルコール症患者ではC_1=0.75、C_2=0.22であるのに対し健常人では、C_1=0.75、C_2=0.25であり遺伝子の分布に差はなかった。3.アルコール代謝速度と遺伝子型との関連アルコール症患者65例の代謝速度を計算した。C_1/C_1群で血中アルコール濃度とβ値が有意に高かった。すなわちアルコール濃度が高くなるとβ値は高くなった。また、血中アルコール濃度が2.5mg/ml以上では、C_1/C_1型群のβ値がC_1/C_1型群よりも大きかった。C_2遺伝子を持つ群では代謝能が高くなる傾向が見られた。4.健常人のAlDH2遺伝子型を判定し、その上でP450II El遺伝子型別に代謝速度を調べた。ALDH2*1/2*1型群とALDH2*1/2*2型群の各々においてアルコール代謝速度はC_1/C_1型群の方がC_1/C_2型群よりも高かった。血中アルコール濃度が0.5mg/mlと低いのでC_2遺伝子の効果が現れていないものと考えられた。5.アルコール症患者52名の血清アルブミン値、コリンエステラーゼ活性、総ビリルピン値を調べ、これらとアルコール代謝速度およびP450II El遺伝子型との関係を調べた。肝機能障害との関連は不明であった。1.被験者の白血球からDNAの抽出は充分検討できた。2.PCR産物を制限酵素Pst1と作用後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、切断パターンにより型判定を行つた場合は非常に明瞭な結果が得られた。一方、制限酵素Rsa1と作用させた場合、2本に切れた1つが短いため、電気泳動後にエチジルブロマイドで染色した時に染まりにくかった。P450IIE1の遺伝子型でC_2/C_2の判定を下すには、両制限酵素を用いて確かめた方がよいが、C_1/C_1、C_1/C_2の場合にはPst1のみでも充分であると考えられた。

3.常習飲酒者48名、健常人46名のP450IIE1の遺伝子型の判定を行なつたところ、C_1/C_1、C_1/C_2、C_2/C_2が常習飲酒者では、30例、16例、2例に対し健常人では、25例、21例、0例で遺伝子の分布に差はなかった。4.健常人被験者に、空腹時にアルコールを経口摂取させた。一方、酩酊状態で入院した多数の常習飲酒者につき、入院時と2時間後の2回採血した。両者とも血中アルコール濃度を測定し、アルコール代謝速度を計算した。常習飲酒者は健常人よりアルコール代謝能は高かった。さらに、常習飲酒者においてP450IIE1遺伝子型の間でアルコール代謝能を比べると、C_2遺伝子を持つ群で代謝能が高くなる傾向が見られた。1.昨年度に引続き末梢血から常法に従ってDNAを抽出し、P450II E1遺伝子型を判定した。アルコール症患者は昨年48名から124名にふやした。そのうちC_1/C_1は75例、C_1/C_2は43例、C_2/C_2は6例であるのに対し、健常人54名のうち、C_1/C_1は28例、C_1/C_2は25例、C_2/C_2は1例であった。遺伝子頻度は、アルコール症患者ではC_1=0.78、C_2=0.22であるのに対し健常人では、C_1=0.75、C_2=0.25であり遺伝子の分布に差はなかった。2.健常人被験者に、体重1Kg当たり0.4gのアルコールを空腹時に経口摂取させた。血中アルコール濃度曲線の消失過程を直線回帰して計算した。健常人のAlDH2遺伝子型を判定し、そのAlDH2遺伝子型で分類した上で、P450 II El遺伝子型別に代謝速度を調べた。最高血中アルコール濃度の平均値は0.5mg/mlである。ALDH2*1/2*1型群とALDH2*1/2*2型群の各々においてアルコール代謝速度(β値)はC_1/C_1群の方がC_1/C_2型群よりも高かった。この結果は血中アルコール濃度が低い場合に、C_2遺伝子の効果が現れていないことを示している。3.アルコール症患者65名の血清アルブミン値、コリンエステラーゼ活性、総ビリルビン値を調べ、これらとアルコール代謝速度との関連を調べた。血清アルブミン値やコリンエステラーゼ活性はβ値およびP450 II E1遺伝子型と関係がなかった。総ビリルビン値2.0mg/dl(肝硬変の予後不良とされる値)の11名とその他の群の2群に分けて検討を行ったが、特に差異はなかった。肝機能障害と代謝速度との関連は不明であった。
超均質ガラス作製に向けてのガラス融液のソレー効果解明

レー効果は温度勾配を駆動力とした物質の拡散現象であり、様々なガラスの溶融プロセスにおいて融液組成の不均一を生じさせる因子であるため、その機構の解明は工業的に重要である。ガラス融液のソレー効果を解明するため、実験・分子動力学計算・理論の三つの定量的アプローチを行い下記の成果を得た。1Na2O-SiO2系、Na2O-GeO2系、Na2O-B2O3系のガラス融液において、縦型電気管状炉を用いた自然対流抑制下での実験を行いソレー係数を得た。ソレー係数の解析の際には測定誤差を評価した。2それらに対して、我々が提案した修正Kempersモデルを適応したところ、実験値と符号が一致し、かつ絶対値がオーダーレベルで合うことがわかった。この内、Na2O-B2O3系に関しては国際的な論文誌に掲載された。3熱力学パラメータを再現可能なポテンシャルセットを用いて、CaO-SiO2融液系で非平衡分子動力学計算によってソレー係数を算出した。一方で平衡分子動力学で求めた熱力学パラメータを用いて、修正Kempersモデルからソレー係数を算出した。符号が一致し、絶対値がオーダーレベルで合うことがわかった。この結果は国際的に著名な論文誌に掲載された。以上の実績は、温度勾配下における多成分ガラス融液の拡散挙動を予測・理解するための学術的な基礎であり、溶融炉内の組成分布をより精密に予測することにつながることから工業的に意義がある。今後の展開としては、3成分系以上への拡張や移流拡散方程式による炉内元素分布へのソレー効果の影響評価が挙げられる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。ガラス融液のソレー効果を解明するためには、実験・分子動力学計算・理論の三つの定量的アプローチが必要である。当該年度にはこれらを並行して進めた。高温特殊温度勾配炉を電気炉メーカーと共同で開発した。当該炉は既に納品され、試運転済みである。当該炉は最高1500°Cまで昇温可能であり、ガラス融液の自然対流を低減するため、垂直上方から加熱可能である。設置予定のSiO2系サンプルを液相温度以上で100時間以上の熱処理が可能である。分子動力学計算のCPUコア間並列化をOpenMPで行い成功した。これにより、3000粒子系でのソレー効果のシミュレーションが可能になった。並行して、京都大学スーパーコンピュータで自作の分子動力学計算を走らせることに成功した。これにより、来年度以降にさらに多粒子系での計算が可能になった。CaO-SiO2系における分子動力学計算において、低温側1800°Cをとし、高温側2200°Cとして温度勾配をかけると、低温側でCaOのモル分率が高くなり、高温側でSiO2のモル分率が高くなった。このモル分率分布は、定性的ではあるが2011年に我々が報告したレーザーによるガラス内部の局所加熱実験結果と一致していた。ガラス融液のソレー効果の再現に初めて成功するとともに、今後、分子動力学計算により、ソレー効果に寄与する因子を議論できるようになった。一方、SiO2系と比べてより低融点のGeO2系およびB2O3系におけるソレー効果の実験を行い、両者ともアルカリ金属酸化物が低温側で高いモル分率となった。両者に関して熱力学的な考察を行い、移動方向を説明することに成功した。実験・分子動力学計算・理論的考察それぞれにおいて進展があったから。ガラス融液のソレー効果を解明するためには、実験・分子動力学計算・理論の三つの定量的アプローチをおこなう必要がある。CaO-SiO2系における非平衡分子動力学計算と我々が新たに提案した修正Kempersモデルを比較すると、ソレー係数の組成依存性が両者でおおまかに一致することがわかった。ソレー効果のメカニズムにおいて、部分モルエンタルピーが重要なファクターであることが示唆された。特に、CaO-SiO2系においてSiO2モル分率が少ない組成域において酸化物の移動方向が逆転するというシミュレーション結果およびモデル予測結果が得られた。これらの結果について、現在国際的な学術誌に投稿中である。実験においては、正確なソレー係数を得るための条件として、自然対流の低減が重要であることがわかった。ナトリウムホウ酸塩ガラス融液に対して、縦型電気管状炉を用いた実験と横型電気管状炉を用いた実験によって得られたソレー係数を比較することで明らかになった。さらに、系が定常状態に到達するのにかかる時間とソレー係数の定常状態における値を予測する手法を提案した。これらの結果について、現在、国際的な学術誌に投稿するために論文を執筆中である。今後、修正Kempersモデルの妥当性を確認するために、移動方向の逆転現象を実証する方針で研究を進める。さらに、産業的に重要ではあるが、粘度が高く実験が難しいシリケート融液系でのソレー係数測定実験を進める。実験、分子動力学計算、理論の全ての面で成果が出ているため。1Na2O-SiO2系、Na2O-

GeO2系、Na2O-B2O3系のガラス融液において、縦型電気管状炉を用いた自然対流抑制下での実験を行いソレー係数を得た。ソレー係数の解析の際には測定誤差を評価した。2それらに対して、我々が提案した修正Kempersモデルを適応したところ、実験値と符号が一致し、かつ絶対値がオーダーレベルで合うことがわかった。この内、Na2O-B2O3系に関しては国際的な論文誌に掲載された。3熱力学パラメータを再現可能なポテンシャルセットを用いて、CaO-SiO2融液系で非平衡分子動力学計算によってソレー係数を算出した。一方で平衡分子動力学で求めた熱力学パラメータを用いて、修正Kempersモデルからソレー係数を算出した。符号が一致し、絶対値がオーダーレベルで合うことがわかった。この結果は国際的に著名な論文誌に掲載された。以上の実績は、温度勾配下における多成分ガラス融液の拡散挙動を予測・理解するための学術的な基礎であり、溶融炉内の組成分布をより精密に予測することにつながることから工業的に意義がある。今後の展開としては、3成分系以上への拡張や移流拡散方程式による炉内元素分布へのソレー効果の影響評価が挙げられる。Na2O-SiO2系、Na2O-CaO-SiO2系、CaO-Al2O3-SiO2系の3つの系で実験・分子動力学計算・理論によりソレー係数を算出し、比較する。特に、分子動力学計算および理論から、拡散種の重さ・大きさ・結合強度および系の自由エネルギーとソレー係数との関係を議論する。並行して、液相温度の低いGeO2系、B2O3系で同じ方針で研究を進める。Na2O-SiO2系、Na2O-GeO2系、およびM2O-B2O3(M=Li,Na,K)系、で対流の自然対流の影響を低減した実験を行い、その結果を修正Kempersモデルと比較することでモデルの妥当性を評価する。また、分子動力学計算および理論で予測されたソレー係数の符号逆転現象(移動方向逆転現象)を実証する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
新たな実験系を用いた視細胞死のメカニズムの解明とその阻止

我々はZebrafishをモデルとして眼疾患の病態の研究を行っている。本課題においては先進国での失明の第一位の原因である加齢黄斑変性の強力な疾患感受性遺伝子HTRA1が視細胞死を引き起こすメカニズムについて明らかにすることを目的としている。加齢黄斑変性においてこの疾患感受性変異や加齢といった発症要因が、このHTRA1の発現の亢進を引き起こし、これが視細胞死を引き起こすこと。そして、この発現亢進により、ヒト加齢黄斑変性と同様の表現型を示すこと示した。その下流としてTGFβシグナルについてRh1::HTRA1トランスジェニック魚視細胞と正常魚視細胞における実際には5日目胚の眼球の比較によりTGFβisoforms (TGFβ1a, TGFβ2, TGFβ3)、TGFβprecursorおよびlatency associated peptide (LAP)の発現量の差を免疫組織化学において確認し、TGFβシグナルがし視細胞死と関連していることを示した。さらに31年度の予定であった研究であったが、その代表的下流のシグナルであるPI3K/Akt、そしてその下流に存在するFOXOについて検討も同様の方法によって行った。これにより、Akt-FOXO3の系が視細胞死に関連があることが示された。これらの結果は学術雑誌への論文掲載にいたった(Am. J. Pathology)この研究においては、CRISPRによるHTRA1のノックアウト魚、および、HTRA1の活性中心を破壊したHTRA1強制発現魚をを作成しその表現型解析を行っている。また、これも31年度の予定であったが、さらにERp44介した視細胞死を検討した。我々はまず、視細胞におけるIP3受容体の発現をRT-PCR,免疫組織化学を用いて解析し、視細胞においてERp44のターゲットであるIP3R1の発現があることを確認した。31年度に行う予定であった検討を行うことができたこと。また、HTRA1について、学術誌に掲載させることができたため。唯一行われていない検討がHTRA1の下流の網羅的解析である。実際は着手したのであるが、300匹の眼抽出RNAが保管の際に予想以上に変性しており、RNAseqを見送ったためである。これについてはこの時間を利用してHTRA1ノックアウト魚を作成しており、これを検討に加えることでさらに高精度の検討が行えるものと思われる。その他の検討については順調に進んでいる。本年度は目標の論文掲載に到達することができ研究の進捗はよかったが、研究代表者は同じ大阪大学医学系研究科であっても2018年4月に医学科視覚再生医学寄附講座教授より、保健学科生体情報学の教授に就任した。これに伴い、研究が一時中断したこととによる。計画上の遅れはない状態であるが、2019年度においてはより、多くの研究成果を上げるべく、予算を多く使用する予定である。
毛嚢のバルジ細胞の成長調節における血小板由来成長因子の役割の解明

1,形態学的観察用および免疫染色用のヒト胎児皮膚材料の準備皮膚に異常が及ばない他の臓器の障害により自然流産、または、人工中絶されたヒト胎児のなかで、皮膚組織の研究への利用について両親の同意が得られた胎児(胎生90日から140日)より、四肢、躯幹、頭部の皮膚の組織材料を採取した。採取した皮膚組織材料を直ちに細切し、形態学的観察用および免疫組織化学・蛍光抗体法用に分けて、それぞれ処理を行なった。毛嚢のバルジが明瞭な時期のヒト胎児数例の皮膚材料を入手した。2,血小板由来成長因子(PDGF)A鎖、B鎖、およびその受容体(α受容体、β受容体)の局在の免疫組織化学法および免疫蛍光抗体法による解明凍結切片を、avidin-biotin complex法にて、PDGFA鎖、B鎖それぞれに対するポリクローナル抗体を用いて染色した。その結果、内毛根鞘およびバルジにPDGFA鎖、B鎖とも陽性であった。さらに、PDGFαβ受容体に対するモノクローナル抗体を用いて観察した。その結果、毛嚢周囲の真皮にPDGF受容体は、局在していた。これは、種々の報告されているデータを支持するものであった。3,今後の研究の展開に関する計画PDGFおよびその受容体が、毛嚢上皮およびその周囲の真皮にそれぞれ存在しているのが、免疫染色の結果より明らかになった。この局在が確認されたPDGFが、外来性のものか、バルジの細胞によって実際に合成、分泌されているものかが、今後のIn situハイブリダイゼーション法にて明らかになる。この結果、バルジとその関連組織の成長調節に、PDGFが、どこで、どのように働いているかの解明をめざす。
ヒト胚性癌細胞の増殖・分化・アポトーシスにおけるHSP90の機能

ヒト胎児性癌細胞(EC細胞)はレチノイン酸(RA)により多彩な細胞分化を遂げ、かつapoptosisが誘導される.これらEC細胞(G3細胞,NT2細胞)では,RAによる分化誘導の際,未分化な状態ではストレス蛋白であるHSP90の極めて高い発現がみられ、分化誘導後その発現は急激に減少する。またEC細胞へのHSP90遺伝子導入はRAによる細胞分化を抑制する。我々はEC細胞の分化・apoptosisにおけるHSP90の機能を解析する目的で,その会合する分子の同定をおこなった.HSP90の標的分子として,cdc2,c-srcに着目し,EC細胞の分化誘導前後でWestern bolt法,免疫沈降法によりHSP90とedc2,c-srcの発現・会合を解析したところ,未分化なEC細胞ではHSP90とともにcdc2,c-srcの共沈がみられ,RA処理後48時間以内にそれらの会合は解離することが明らかとなった.その際,RA処理前後でcdc2,c-src蛋白の発現量に変化はなかった。この時のcdc2,c-srcとのkinase活性をin vitro kinase assayにより検討したところcdc2,c-srcとも未分化な状態でそのkinase活性が高く,RA処理後48時間以内に急速に低下が見られた.このことからHSP90は,cdc,c-srcといった細胞周期に関連する分子と相互作用をおこない。これらを機能的に制御していることを示唆している.さらにこれらのHSP90の機能を詳細に解析するため,PCRを用いた点突然変異導入により,HSP90 dominant negative変異体の作成を試みた.in vivoでの変異体をその発現確認をも容易にするため,gree fluorescent protein (GFP)との融合発現ベクターに挿入した.現在,この変異遺伝子をヒトEC細胞ならびにNIH3T3細胞,COS細胞といった体細胞に遺伝子導入し,主にその細胞周期の点からそのdominant negative分子としての機能を解析している.ヒト胎児性癌細胞(EC細胞)はレチノイン酸(RA)により多彩な細胞分化を遂げ、かつapoptosisが誘導される.これらEC細胞(G3細胞,NT2細胞)では,RAによる分化誘導の際,未分化な状態ではストレス蛋白であるHSP90の極めて高い発現がみられ、分化誘導後その発現は急激に減少する。これらを機能的に制御していることを示唆している.さらにこれらのHSP90の機能を詳細に解析するため,PCRを用いた点突然変異導入により,HSP90 dominant negative変異体の作成を試みた.in vivoでの変異体をその発現確認をも容易にするため,gree fluorescent protein (GFP)との融合発現ベクターに挿入した.現在,この変異遺伝子をヒトEC細胞ならびにNIH3T3細胞,COS細胞といった体細胞に遺伝子導入し,主にその細胞周期の点からそのdominant negative分子としての機能を解析している.
Werner症候群におけるアデノシンデアミナーゼアイソザイム　ー炎症の視点から

Werner症候群(以下WS)は、代表的な遺伝性早老症であり、血中に炎症性タンパク質が増加していることから、WSの病態が慢性炎症を基盤とすることが示唆されている。一方、プリンヌクレオチド代謝酵素として知られるアデノシンデアミナーゼ(以下ADA)にはADA1とADA2のアイソザイムが存在し、健常人血中のADA活性はADA2が60 - 70%を占めている。また、ADA2欠損症は全身性の炎症や血管障害に関する劣性遺伝性自己炎症疾患であることが近年明らかとなった。本研究では、共に炎症に関与するWSとADA2欠損症の病態解明に寄与することを目的として、WS血中のADAアイソザイムを明らかにするとともに、ADA2のタンパク質としての機能解析を行っている。1)平成30年度に実施予定であったWS患者および健常者(0歳- 100歳)血中のADA活性の測定は終了した。健常者においては、年齢層によってADA活性のなかでもADA2活性に特徴的な違いが見られることが明らかとなり、炎症マーカーであるC反応性タンパク質(CRP)やマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)-9など他の因子も含めてWS患者のADA活性と現在比較解析を進めている。WS患者血中のADAアイソザイムの存在比率や、健常者においても0歳- 100歳までの幅広い年齢層でのADAアイソザイムについての報告例はない。今年度中に、学会発表、論文化に繋げる予定である。2) ADA2の糖鎖解析については、当初平成31年度以降に実施を予定していたが、研究の遂行上、平成30年度に繰り上げて実施した。その結果、ADA2欠損症に関連する各種変異体を作成し、変異体の糖鎖修飾の違いにより、ADA2の酵素活性や分泌に差がでることが明らかとなった。現在、論文化を進めている。1)平成30年度に実施予定であった、Werner症候群患者血中のADA活性の測定並びに健常者血中のADA活性測定が終了した点、2)ADA2の糖鎖解析を繰り上げて実施し、成果が得られた点が評価できる。一方、当初平成30年度に完成予定であったADA2定量法の開発については、現在、種々の条件を検討している段階であり、結果がまだ得られていない状況にある。また、2)についても平成30年度の終わりころに結果が出たために、論文化を進めてはいるものの、年度内には学会発表には間に合わず、このため全体としては、おおむね順調に進展しているとした。1)酵素活性測定結果をもとに、Werner症候群患者におけるADAアイソザイムと健常者のADAアイソザイムを比較して解析を進め、ADAが病態にどのように関与しているのかを明らかにする。2) ADA2定量法の開発は、ADA2の立体構造も含めて考えなければならない状況にあり、タンパク質構造に詳しい他の研究者の協力も得て、検討していく予定である。3) ADA2変異体を作成できたことから、今後、ADA2の分泌と細胞内発現の解析も進めていく予定である。

1)酵素活性測定結果をもとに、Werner症候群患者におけるADAアイソザイムと健常者のADAアイソザイムを比較して解析を進め、ADAが病態にどのように関与しているのかを明らかにする。2) ADA2定量法の開発は、ADA2の立体構造も含めて考えなければならない状況にあり、タンパク質構造に詳しい他の研究者の協力も得て、検討していく予定である。3) ADA2変異体を作成できたことから、今後、ADA2の分泌と細胞内発現の解析も進めていく予定である。発注を予定していた試薬が生産中止になり、代替品を見つけるのに年度内には間に合わなかったため残額が生じた。残金は、今年度の物品購入費と合わせて使用する予定である。
GCP364およびGCP170に相互作用を持つゴルジ装置タンパク質の検索

ゴルジ装置局在タンパク質GCP364/giantin、ヒトGCP170は長いcoiled-coil構造を持っており、これらのタンパク質がゴルジ装置の構造維持に関与している可能性が推測される。本研究はGCP364/giantinおよびGCP170のゴルジ局在に細胞質ドメインが重要な働きをしている事と、両タンパク質の機能解析の一歩として、GCP364とGCP170それぞれのゴルジ局在に必須な細胞質ドメインの解析およびそれと相互作用を持つタンパク質の検索をおこなった。C末に疎水性膜結合ドメインを持つII型膜蛋白質であるGCP364はその膜ドメインよりもアミノ酸2938-3116の領域がゴルジ局在に強く関与していた。この領域と相互作用を持つタンパク質の検索の結果60kDaの新規ゴルジ体局在タンパク質を見いだし、このタンパク質をGCP60と名付けた。GCP60はそのC末半分にGCP364との結合ドメインを持ち、このドメインを過剰発現すると、ゴルジ体の崩壊が観察された。一方GCP170はhead領域(アミノ酸1410)とlodの後半とtailを含む領域(アミノ酸10451498)のそれぞれに本タンパク質をゴルジ装置に局在化させるドメインを見いだした。この2つのドメインはそれぞれ独立にゴルジ装置局在化能をもっていた。head領域の最小のゴルジ装置局在能を持つ領域はアミノ酸159から230であった。この領域をbaitに用いてHeLa細胞のcDNA libraryをスクリーニングした結果、この領域と相互作用を持つ新規ゴルジ局在タンパク質を見いだし解析中である。以上の結果からゴルジ細胞質側局在coiled-coilタンパク質は他のタンパク質との相互作用によりゴルジ装置をとりまくタンパク質のネットワークを構築し、これは単にゴルジ装置の構造の支えとなっているだけではなく機能的なネットワークを構築していると考えられる。ゴルジ装置局在II型膜蛋白質GCP364/giantinとゴルジ装置ペリフェラル膜蛋白質GCP170それぞれの局在化に必要なドメインを用い、酵母のTwo-Hybrid系で相互作用を持つタンパク質の検索を行った。1)GCP364は細胞質C末側1/3の部分、特に2938-3116領域が強いゴルジ装置局在能を示す。2804-3116のをbaitに用いてHeLa細胞cDNA libraryをscreeningした結果、新規ゴルジ装置局在タンパク質GCP60と膜裏打ちタンパク質Dystrobrevin B1がGCP364と相互作用を示した。GCP60はゴルジ装置細胞質側に存在するペリフェラルな膜タンパク質であった。免疫電顕による観察ではゴルジ装置cisternaに存在しており、GCP364と同じ分布をしめた。in vitro結合実験でもGCP364とGCP60の結合は特異的であった。GCP60を過剰発現したCOS-1細胞でゴルジ装置が崩壊することから、GCP60はGCP364と共にゴルジ装置形成を担うと考えられる。一方形質膜裏打ちタンパク質DystrobrevinのB1アイソフォームがGCP364と相互作用を示した。cDNAをCOS-1細胞に導入発現したところ、DystrobrevinB1はゴルジ装置と細胞骨格に分布した。DystrobrevinB1のゴルジ装置局在は細胞骨格とゴルジ装置との関係に新しい局面を示す。2)GCP170はそのN-末から約400アミノ酸の領域のリン酸化がゴルジ装置局在に大きな働きをしている。この領域をbaitにしてTwo-Hybrid Screeningをおこなった。その結果数種類の未知のタンパク質が相互作用を持つ数種類の未知のタンパク質が検出された。