hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経幹細胞の細胞周期制御機構の解明

/M期に発現するmCherry-hGem (pNes-mCherry-hGem)をつないだコンストラクトを持つトランスジェニックマウスを作製した。さらにHes1 promoter/enhancer下にd2EGFPを発現するトランスジェニックマウスと掛け合わせることで、G0/G1期の胎児神経幹細胞およびS/G2/M期の胎児神経幹細胞をFACSによって別々に集めた。また、Nestin promoter/enhancer下にmCherryを、GFAP promoter下にd2EGFPを発現するトランスジェニックマウスの成体脳から神経幹細胞を採取した。それぞれの細胞について網羅的RNAシークエンスを行ったところ、胎児神経幹細胞と成体神経幹細胞とで2倍以上の発現差のある遺伝子を約1000種類同定した。我々の以前の解析から、Hes1やMash1の発現振動が活性化状態に重要な役割を担うことを明らかにしてきた。しかし、今回同定した遺伝子群には、Hes1やMash1によって制御されない遺伝子群も多く含まれることがわかった。本データは、今後、Hes1やMash1と協調して静止状態の神経幹細胞培養を活性化する因子を探索する上で重要な基盤となる。26年度が最終年度であるため、記入しない。分子生物学26年度が最終年度であるため、記入しない。光応答性の転写因子であるhGAVPOを用いて、青色光照射依存的にAscl1の発現動態を人工的にコントロールできる実験系を開発した。この技術は脳内の神経幹細胞の制御にも応用でき、今後の再生医療への実用化が期待される。これらの成果は、Science誌にResearch Articleとして発表し、神経科学分野の研究の発展に大きな貢献をした。マイクロRNAであるmiR-9はHes1の発現振動を引き起こすことによって神経幹細胞の増殖・維持に重要な役割を担うこと、しかしその発現が高くなりすぎると神経幹細胞は維持されなくなることを明らかにし、Hes1の発現動態の制御機構の一端を明らかにすることができた。。成体脳にも神経幹細胞は存在するが、胎児の神経幹細胞に比べて増殖能や分化能が異なる。今後、成体脳におけるAscl1やHes1の発現動態をタイムラプスイメージング系で解析する。もし、発現動態が成体脳と胎児脳で異なれば、光遺伝学的方法を用いて成体脳神経幹細胞における発現動態を胎児型に変え、胎児神経幹細胞のような性質を獲得するかどうかを解析する。今後、胎児脳および成体脳の神経幹細胞におけるHes1やプロニューラル遺伝子の発現動態をしらべ、細胞周期との関係を明らかにする。
近世末期国学者の知識形成と交流－西日本における文人ネットワークを中心に－

本年度は、昨年度に引き続き、中島広足周辺の国学者の資料を調査収集することに専念した。また、集めた資料をもとに今年度の研究課題として示した二つのテーマに取り組んだ。以下にその詳細を記す。まず一つ目のテーマである中島広足と幕末の国学者の交流の模様に関して。今年度研究業績の図書に示した『近世後期長崎和歌撰集集成』において、広足が中央の著名な人物と親交を深める際には肥前諏訪神社宮司青木永章、長崎会所請払役近藤光輔の両人を介していたことを明らかにした。そしてさらに、永章と光輔の文事を明らかにすることに主眼を置き、研究を進めた。結果、現時点までに永章の文事の実態を明らかにしつつある。同人が長崎文壇の中心人物の一人であったこと、また京都の綾小路家より雅楽の伝授を受け、その雅楽を長崎の地に広めていたこと、さらに江戸の歌人と長崎の歌人の交流の仲立ちをしていたことを明確にした。結果、永章は中央の文化を長崎の地に伝え、長崎の文化的興隆に多大な役割を果たした人物であることを明示し得たかと思う。次に二つ目のテーマである幕末国学者の歌作の実体に関して。歌語「神風」は地名の伊勢にかかる枕詞として上代より近世後期に至るまで詠まれてきた。一方、幕末の国学者の間においては、神に仇するものを滅ぼす意味に詠じられていたことも事実である。そこで、何故かく歌語「神風」が変容して和歌に詠まれるに至ったか、広足とその周辺の国学者の歌、ならびに歌学を検証した。結果、近世後期に折しも『蒙古襲来絵詞』が復元され、折柄の外圧の高まりを受けて外寇史の考証が盛んに行われる過程において、神風に護られた国とする神国史観が構築されたこと、また万葉集の柿本人麻呂詠の高市皇子の挽歌を証歌として、歌語「神風」を神に仇するものを滅ぼす意味ととる解釈が幕末の国学者の間において盛んになされていたこと、神風は神国の象徴であり、挙国一致を図る上で欠かせないイデオロギーとして和歌に詠まれていたことを明らかにした。なお、その成果は、すでに学会発表として公にしている。以上、本年度は上記の二点に関して、研究を進め、近日中に論文に取り纏める予定である.本年度は、中島広足の文事の当代文苑・思想界における位置を見極めることに主眼を置きく広足周辺の文人の著述、またその動向を把握し得る資料の収集に専念した。結果、以下の二点を主たる研究成果として示しておく。先ず一点目は、『蒙古襲来絵詞』をめぐるもの。昨年度に引き続き、残存する同絵巻の収集に努め、それらの比較検討作業を通じて、広足もまた文政年間の同絵巻の復元考証に関与していることが明らかとなってきた。同絵巻の復完考証の詳細に関しては、従来美学・国史学の領域において研究が進められ、肥後の国学者長瀬真幸と絵師福田太華の関与が論じられている。しかしながら、私が調べる限り、両人のみならず、より多数の国学者・絵師の参与が種々の関連資料より認められる。そして、その修復作業を通じて得た見地を自らの文事に活かしていることもまた、従来検証されることのなかった大きな特徴である。ゆえに、次年度においては、以上の事柄を複数の論攷に取り纏め、その成果を明らかにしたい。次に二点目は、広足が平田篤胤の学問を如何に継承しているものか、その内実に関するもの。従来、平田篤胤が『霊の真柱』において示した宇宙観は、国学者は無論のこと、儒学者、蘭学者等を巻き込んで賛否様々な反響の生じたことが論じられている。殊に儒学者が国学者の世界観を蘭学の説に牽強附会したものであると批判していることは、中野三敏「二つの世界の一交点-篤胤と松斎と大方と-」(中川久定編『「一つの世界」の成立とその条件』所収、国際高等研究所、2007年)が示すところである。かかる儒学者の批判に対して、反駁を試みた広足『なやらひ』なる著述がある。同書をもとに広足の世界観を当代、後代の国学者のそれと比較検証する作業を通じて、その説の思想史上の位置を明らかにしつつあり、次年度において論攷として取り纏めることを目標としたい。

結果、永章は中央の文化を長崎の地に伝え、長崎の文化的興隆に多大な役割を果たした人物であることを明示し得たかと思う。次に二つ目のテーマである幕末国学者の歌作の実体に関して。歌語「神風」は地名の伊勢にかかる枕詞として上代より近世後期に至るまで詠まれてきた。一方、幕末の国学者の間においては、神に仇するものを滅ぼす意味に詠じられていたことも事実である。そこで、何故かく歌語「神風」が変容して和歌に詠まれるに至ったか、広足とその周辺の国学者の歌、ならびに歌学を検証した。結果、近世後期に折しも『蒙古襲来絵詞』が復元され、折柄の外圧の高まりを受けて外寇史の考証が盛んに行われる過程において、神風に護られた国とする神国史観が構築されたこと、また万葉集の柿本人麻呂詠の高市皇子の挽歌を証歌として、歌語「神風」を神に仇するものを滅ぼす意味ととる解釈が幕末の国学者の間において盛んになされていたこと、神風は神国の象徴であり、挙国一致を図る上で欠かせないイデオロギーとして和歌に詠まれていたことを明らかにした。なお、その成果は、すでに学会発表として公にしている。以上、本年度は上記の二点に関して、研究を進め、近日中に論文に取り纏める予定である.当年度の研究計画として掲げている(1)文献調査の実施(2)近世後期より明治初期にかけての歌集資料の収集とデータベースの作成(3)『蒙古襲来絵詞』模写と国学者の文事(4)青木永章と中島広足の文事、以上四つの目標に関して、おおむね達成しつつある。現在までの達成度において示した四つの目標の成果を形にすることに次年度の主眼を置きたい。先ず文献調査の成果に関しては、「鎮西大社諏訪神往所蔵中島広足自筆稿本解題」と題して、その資料の詳細を解題の形式にて発表したい。また、青木永章と広足の関連に関しても、その詳細を論じるうえでかかすことのできない『後之東路記』を翻刻したい。さらに、『蒙古襲来絵詞』に関しては、その復元考証過程を再度検証するもの、ならびに歌語「神風」の変容との関連を示したもの、以上の二編を論攷に取り纏め、その成果を公にしたい。
税関行政に見る条約改正史

明治日本の条約改正史は、幕末に日本が西洋諸国と締結した修好通商条約中の不平等な条項、特に領事裁判権の規定と関税自主権の喪失、を撤廃する交渉過程としてイメージされて来た。しかしこれらの条項が日本の国家形成にとってどれほどの阻害要因であったかが明確ではなかったため、条約改正史を日本の近代史の中にどう位置づけるかは未決の問題であった。本研究によってまず明らかとなったのは、日本政府に一貫して問題視されていたのが、日常的な個別の行政活動に対する外国側の介入であったということである。この介入は条約には明記されていないまま既成事実化した外国側の特権であった。日本の国家形成は立法・司法と未分離な状態で行政を中心に進展しており、だからこそ政府は行政権への介入に最大の痛痒を感じたのである。さらに本研究では、こうした知見を元に、条約改正史全体の再構成を試みた。1880年代初頭までの条約改正交渉は、まさに行政権への介入を撤廃させることを企図したものであった。条約の改正よりは、適正な運用をむしろ求めたものといえよう。これが外国側の抵抗によって難航し、かつ司法が一定の発達を見た80年代後半、井上馨外務卿は一挙に領事裁判権の撤廃を求める方針に転換する。しかし行政の独立という課題も政府内外に継承されていく。第一に、大蔵省・農商務省といった個別官庁が、自らの管轄する行政領域の対外独立への目配りが弱いとして井上・大隈重信外相期の外務省案に懐疑的な立場をとった。そのため条約改正交渉に対する政府内部の支持は脆弱であった。第二に、在野勢力は条約の適正な運用によって外国の既得権益を剥奪することで有利な条約改正交渉が行えると主張し、いわゆる条約励行運動によって陸奥宗光外相期の政府を窮地に立たせたのである。以上のようにして、条約改正史を近代政治外交史の中核に位置づけ直すことができたと考える。従来、条約改正交渉の展開は、関税自主権の回復から領事裁判権の撤廃へと、交渉争点の変遷によって主に理解されていた。そのため、条約改正が最大の外交課題であったことは周知でありながら、内政との連関が明確とならず、条約改正の必要から内政の改革が急がれたことが場当たり的に指摘されたり、せいぜい領事裁判権撤廃交渉の進展・停滞が法典編纂の進展・停滞と対比されるに過ぎなかった。それが、近代日本の内政と外交を統一的に理解することを困難にしていた。これに対して、本年度の研究の結果、条約改正交渉はその中心的動機に即して、行政権の対外的自立を目指す時代(そのスローガンが、関税に重きを置いたものになる場合もあれば、法権に重きを置いたものになる場合もある)から、司法の対外的自立を明確に目指した時代への変遷として、国家形成の段階に組み込む形で明確に位置づけられるにいたった。そして、かかる一般的知見への道を開いたのが、税関行政の進展に定位した本研究の分析視角であった。すなわち、上述の行政権回復期においては、日本の大蔵省は税関行政サーヴィスの提供と、提供を通じた行政権の回復に熱心であったのに対し、司法権回復期においては、条約改正への直接的な関心を減退させ、むしろ横浜税関長の有島武などは財政支出を抑えるという防衛的な観点から、サーヴィスの水準を抑制していたことが明らかになった。以上から、前者と後者との間に時期区分を設けることの正当性が明らかになったとともに、後者の時期については内政の発達が条約改正問題に促されたという通念を再検討する必要性が浮かび上がって来たといえよう。以上の分析は、特に税関上屋行政については簡潔な要約を公表しているが、来年度は条約改正一般の展開を外交史的に裏付ける作業を完了させたい。

第二に、在野勢力は条約の適正な運用によって外国の既得権益を剥奪することで有利な条約改正交渉が行えると主張し、いわゆる条約励行運動によって陸奥宗光外相期の政府を窮地に立たせたのである。以上のようにして、条約改正史を近代政治外交史の中核に位置づけ直すことができたと考える。
薬剤耐性を誘導しない膜活性抗菌剤のデザイン

本研究課題では、細菌の細胞膜を選択的に認識し、膜構造を破壊することで作用する新しい膜活性抗菌剤の開発を行うことを目的とする。多くの生物は、細菌の細胞膜を攻撃することで作用する抗菌性ペプチドを先天的に有しており、多様な細菌に有効かつ薬剤耐性を誘導しないことが知られている。本研究では、抗菌ペプチドの構造をヒントに、よりシンプルな分子骨格を用いた抗菌剤のミニマル・デザインを行うことで、膜活性抗菌剤に求められる本質的な設計指針を明らかにする。抗菌剤の分子ライブラリを構築し、生物活性(抗菌・毒性)および作用機構の評価にもとづいた構造最適化を行うことで、薬剤耐性を誘導しない次世代型の抗菌性分子を実現する。本年度は、膜活性抗菌剤の候補分子として、大環状分子を基本骨格とした膜活性抗菌剤をデザインした。具体的には、杯型のカリックスアレーンを基本骨格とし、負に帯電した細菌の細胞膜を静電相互作用によって認識するためのカチオン性基を複数個導入した分子を合成した。また、同時にカチオン性側鎖を有する両親媒性ポリマーも比較対象として合成を行った。ここでは構造バリエーションとして、環サイズ、カチオン性基の種類と個数、末端までのスペーサー長、環骨格のコンフォメーションに起因する側鎖の空間配置、分子全体における環骨格位置などの異なる分子を合成し、ライブラリ化を行った。また、候補分子ライブラリの抗菌活性については、最小発育阻害濃度(MIC)測定によって網羅的に評価した。本年度当初予定していた抗菌剤分子のライブラリ合成およびスクリーニングを完了しており、高い抗菌活性を得られる分子の構造がすでに明らかになった。今後の予定に大きな変更はなく、次年度は活性の評価対象となる菌種の拡大および毒性試験を実施する。また、モデル膜を用いた各種評価により、作用メカニズムに関する詳細な検討も同時に実施する。
巨大な酵素複合体の構築を指向したＰＣＮＡナノチューブの創成

リング状のヘテロ3量体を形成する核内増殖抗原(PCNA)を足場として、Pseudomonas putida由来のシトクロムP450電子伝達系の構成タンパク質(プチダレドキシン還元酵素(PdR)、プチダレドキシン(PdX)及びP450cam)を集積させることで、PdRからPdXを経由してP450camへ効率的に電子が伝達されることが先行研究により明らかにされている。前年度、PCNA上のPdXの分子数を1分子から2分子に増やすだけでなく、PdRの分子数を1分子から2分子に増やすことでもPdR/PdX/P450cam酵素複合体の触媒活性が増大することが見いだされた。本年度は、酵素複合体のPdRの数を2分子から3分子に増やした。その結果、触媒活性は期待通りさらに増大し、PdRを3分子とPdXを2分子もつ酵素複合体の活性はP450camの最大触媒活性の約90%もあった。この結果より、酵素複合体のすべての酸化還元タンパク質の分子数を向上させることで、触媒ドメインへの電子伝達活性をほぼ最大まで向上しうることが示された。さらに、数理モデルによる解析の結果、酸化還元タンパク質の分子数の増大は電子伝達複合体の形成を促進し、その結果触媒ドメインへの電子伝達活性が向上したことが示唆された。次に、より簡便に多数の酸化還元タンパク質を有する酵素複合体を得るため、中空のカプセル状タンパク質複合体であるB型肝炎ウイルスのカプシドへPdR、PdX及びP450camを共内包させることを試みた。前年度は、カプシドに多数のPdRが内包されたことを示唆する結果を得ていた。本年度は、PdR-PdX融合タンパク質とP450camが共内包されたことが示唆される結果を得た。この酵素複合体は触媒活性を示さなかったが、内包条件の最適化により内包数を向上させることで、効率的な電子伝達が達成されると期待される。27年度が最終年度であるため、記入しない。Sulfolobus solfataricus由来の核内増殖抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen ; PCNA)はリング状のヘテロ3量体タンパク質であり、これを多数会合させることで巨大な多酵素複合体の足場を構築することを目指している。本年度は、1. PCNAを足場とした酵素複合体の改良と高機能化、及び2. PCNA超分子複合体の構築を行った。(1. PCNAを足場とした酵素複合体の改良と高機能化)先行研究により、P450camとその電子伝達パートナータンパク質をモデル酵素として、PCNAを足場とした酵素複合体が構築されている。また、PCNAサブユニット間にジスルフィド結合を導入することで低濃度でも安定なPCNAヘテロ3量体が構築されている。本研究ではまず、ジスルフィド結合の形成条件を検討し、酵素複合体の活性に悪影響を与えず、かつ効率的にジスルフィド結合を形成する条件を見出した。さらに、PCNA上の電子伝達タンパク質の数を検討し、酵素複合体の活性を向上させることに成功した。(2. PCNA超分子複合体の構築)PIP-box (PCNA-interacting protein box)と呼ばれるPCNAに特異的に結合するペプチド配列に着目し、PCNA1のN末端にPCNA2を認識するPIP-boxを、PCNA2のN末端にPCNA3を認識するPIP-boxを、PCNA3のN末端にPCNA1を認識するPIP-boxをそれぞれ遺伝子工学的に融合した。PIP-boxを融合したPCNA各サブユニットは、大腸菌により可溶性タンパク質として発現し、カラムクロマトグラフィーにより高純度に精製できた。そしてPIP-boxを融合した各PCNAサブユニットを混合し、これをゲル濾過クロマトカラムに通したところ、PIP-boxを融合しない場合と比較して、約4倍の推定分子量の位置に溶出した。このことから、PIP-boxを融合したPCNAヘテロ3量体同士は会合し、PCNA超分子複合体が形成されたことが示唆された。しかし、ゲル濾過クロマトグラフィーから推定した会合度は4程度であり、さほど大きな複合体はできていないことが示唆された。先行研究において、Pseudomonas putida由来のシトクロムP450(P450cam)とその酸化還元パートナー(PdR、PdX)を、Sulfolobus solfataricus由来の核内増殖抗原(PCNA)を足場として近接させることで、効率的な多酵素反応を実現している。本研究は、より効率的な多酵素反応を行う多酵素複合体の構築を目的としている。本年度はまず、PdR/PdX/P450cam電子伝達系をモデルとして、PCNA上の酸化還元パートナーの分子数が全体の触媒活性に与える影響を評価した。その結果、電子伝達カスケードの中で律速に関わるPdXの分子数だけでなく、律速に関わらないPdRの分子数もまた、全体の触媒活性に影響を与えることが分かった。従って、より効率的な多酵素反応のためには、多酵素複合体内のすべての酵素の分子数の最適化が必要な場合があるといえる。より多くの分子数の酵素を有する巨大な酵素複合体の構築のために、前年度は、PCNAを多数会合したタンパク質複合体の形成方法を検討していたが、さほど大きな複合体は得られなかった。

本年度は次に、中空の巨大なタンパク質複合体であるB型肝炎ウイルスカプシド中に多くの分子数のPdR/PdX/P450camを内包した酵素複合体の構築を試みることにした。まず、カプシドのC末端に融合したペプチドタグを、PdRのN末端に融合したタンパク質タグが認識し、多数のPdRがカプシドに内包されたことを示唆する結果を得た。また、タンパク質タグと酵素を刺激依存的に自己切断されるリンカーで結び、酵素が内包後に外部刺激によって自由に運動できるようにすることにしたが、自己切断反応は酵素活性に影響を与えないことが分かった。これらの結果は、カプシドを用いた巨大な酵素複合体が実現可能であること示している。リング状のヘテロ3量体を形成する核内増殖抗原(PCNA)を足場として、Pseudomonas putida由来のシトクロムP450電子伝達系の構成タンパク質(プチダレドキシン還元酵素(PdR)、プチダレドキシン(PdX)及びP450cam)を集積させることで、PdRからPdXを経由してP450camへ効率的に電子が伝達されることが先行研究により明らかにされている。前年度、PCNA上のPdXの分子数を1分子から2分子に増やすだけでなく、PdRの分子数を1分子から2分子に増やすことでもPdR/PdX/P450cam酵素複合体の触媒活性が増大することが見いだされた。本年度は、酵素複合体のPdRの数を2分子から3分子に増やした。その結果、触媒活性は期待通りさらに増大し、PdRを3分子とPdXを2分子もつ酵素複合体の活性はP450camの最大触媒活性の約90%もあった。この結果より、酵素複合体のすべての酸化還元タンパク質の分子数を向上させることで、触媒ドメインへの電子伝達活性をほぼ最大まで向上しうることが示された。さらに、数理モデルによる解析の結果、酸化還元タンパク質の分子数の増大は電子伝達複合体の形成を促進し、その結果触媒ドメインへの電子伝達活性が向上したことが示唆された。次に、より簡便に多数の酸化還元タンパク質を有する酵素複合体を得るため、中空のカプセル状タンパク質複合体であるB型肝炎ウイルスのカプシドへPdR、PdX及びP450camを共内包させることを試みた。前年度は、カプシドに多数のPdRが内包されたことを示唆する結果を得ていた。本年度は、PdR-PdX融合タンパク質とP450camが共内包されたことが示唆される結果を得た。この酵素複合体は触媒活性を示さなかったが、内包条件の最適化により内包数を向上させることで、効率的な電子伝達が達成されると期待される。ウイルスカプシド中に多数の酵素を内包できることが示唆され、巨大な酵素複合体の実現可能性を示す結果が得られたため。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度PdRがウイルスカプシド中に内包されることが示唆されたが、今後はPdX、P450camについても内包できることを示す。また、内包条件を最適化し、内包効率の向上を目指す。その後、同一カプシド中にPdR、PdX、P450camを内包し、カプシド内で電子伝達反応が起こるかを見る。PIP-boxを融合したPCNAを発現・精製することに成功し、PIP-boxを融合したPCNAヘテロ3量体同士が会合することが判明したものの、会合度は小さく巨大な複合体は実現できていないことから、「やや遅れている」とした。
ヒト下垂体腺腫におけるForkhead転写因子FOXL2の発現と機能解析

転写因子FOXL2はヒト正常下垂体において、そのほとんどがゴナドトロフ細胞の核に陽性であった。下垂体腺腫においてFOXL2はゴナドトロピン産生腺腫およびNull cell腺腫の多くに確認された。また、下垂体腺腫におけるFOXL2タンパク質の発現量は免疫組織化学によるFOXL2陽性率に相関した。よって、ヒト下垂体においてFOXL2はゴナドトロフ細胞に特異的に発現し機能することが考えられた。Forkhead転写因子ファミリーは胎児発生のキーとなる制御機能を持つことで知られている。FOXL2変異に起因するBPES(眼瞼裂狭小症侯群)は眼瞼の形成異常および卵巣の成熟欠損を呈し、Fox12ノックアウトマウスの検討でも同様に眼瞼不形成・卵巣欠損を起こすことが知られていた。しかし、下垂体においてその発現は確認されているものの、その役割は明確になっていなかった。これまで米国ミシガン大学Dr.Catnperとの共同研究により、マウス下垂体におけるFox12の局在および機能的な解析を行ってきた。その結果において、Fx12は一貫してαGSUと共発現しており、αGSUおよびPRLの発現制御への関与を示唆した。さらにFox12発現ベクターを用いたTrarisient transfectionによりαGSU遺伝子プロモーター上にFox12制御領域が存在することも確認している。以上を踏まえ、本研究ではヒト正常下垂体および下垂体腺腫におけるFOXL2発現を検討し、その機能的役割を明らかにしたいと考えた。まずヒト正常下垂体・下垂体腺腫におけるFOXL2の発現パターンを抗FOXL2抗体(abcam; Cambridge, UK)を用いて免疫組織化学的に検討した。経蝶形骨洞下垂体手術により得られたヒトGH産生腺腫19例、PRL産生腺腫9例、TSH産生腺腫5例、ACTH産生腺腫7例、ゴナドトロピン産生腺腫14例、Null cell adenoma12例を含む下垂体腺腫計66例および内分泌異常のない閉経後の患者より、死後4時間以内に採取されたヒト正常下垂体2例を10%ホルマリン固定、パラフィン包埋した試料を用いた。正常下垂体ではFOXL2と各ホルモンとの免疫二重染色を、腺腫ではFOXL2発現と形態的な機能分化パターンとの相関を検討した。さらに、免疫組織化学染色によりFOXL2発現を解析したヒト下垂体腺腫についてFOXL2発現をSDS-PAGE、ウエスタンブロッティング法により解析した。その結果、転写因子FOXL2はヒト正常下垂体において2割の前葉細胞の核に陽性であり、そのほとんどがゴナドトロフ細胞(LH/FSH陽性細胞)であった。下垂体腺腫においてFOXL2発現はゴナドトロフ細胞由来とされるゴナドトロピン陽性腺腫およびNull cell腺腫の多くの症例に確認された。以上より、ヒト下垂体においてFOXL2はゴナドトロフ細胞に特異的に発現し機能することが示唆された。『FOXL2遺伝子導入によるホルモン産生能のリカバリー』については今後の課題として残った。これまでに、胎児発生のキーとなる制御機能を持つForkhead転写因子ファミリーのうちFOXL2がマウス下垂体においてLH/FSH産生細胞およびTSH産生細胞に発現することを見出してきたさらに、FOXL2がLH/FSH, TSHの共通α-glycoprotein subunit(αGsu)と共発現し、FOXL2がαGSU発現に関与することが予測される。一方、ヒト正常下垂体においてはFOXL2がゴナドトロフ細胞(LHIFSH産生細胞)に特異的に発現することは明らかにしているが、ヒト下垂体および下垂体腺腫におけるFOXL2の転写標的遺伝子はαGSUも含め明らかになっておらず、下垂体機II能への関与が不明なままであった。初年度は、ヒト正常下垂体、下垂体腺腫におけるFoxLzの発現パターンを抗FOXL2抗体を用いて免疫組織化学的に検討した。経蝶形骨洞下垂体手術により得られたヒトGH産生腺腫19例、PRL産生腺腫9例、TSH産生腺腫5例、ACTH産生腺腫7例、ゴナドトロピン産生腺腫14例、Null cell adenoma 12例を含む下垂体腺腫計66例および内分泌異常のない閉経後の患者より、死後4時間以内に採取されたヒト正常下垂体2例を10%ホルマリン固定、パラフィン包埋した試料を用いた。その結果、FOXL2はヒト正常下垂体において2割の前葉細胞の核に陽性であり、そのほとんどがゴナドトロフ細胞(LH/ FSH陽性細胞)であった。下垂体腺腫においてFOXL

2発現はゴナドトロフ細胞由来とされるゴナドトロピン産生腺腫およびNull cell腺腫の多くの症例に確認された。さらにαGSU遺伝子プロモーター上流で、FOXL2結合領域の近位に同じく結合領域をもつ転写因子MSX1のヒト下垂体における発現は、FOXL2と同様にゴナドトロピン産生腺腫にみられることも確認した。以上より、ヒト下垂体においてFOXL2はゴナドトロフ細胞に特異的に発現し、MSXLと共役して機能する可能性が示唆された。
日本に現存する中国の書画家印・鑑蔵印・落款の比較研究

日本に現存する中国絵画、中国書跡の内、本研究にとり重要である作品を選定し、諸作品に押印されている書画家印、落款を、原則として6×4.5判カメラによる原寸大の白黒写真撮影、必要に応じて6×4.5判カメラによる原寸大のカラー写真、また印色の記録の為に35ミリカラースライド撮影により調査を実施した。今回の調査と対象としては東京国立博物館に保管されている中国書画作品に重点をおいて実施した。調査により収集することの出来た諸印、落款の原寸大焼付写真資料を、従来、収集整理した写真資料と同様にB6判のカードに貼り、原則として、それぞれに印文、落款、書画家名、賞鑑家名、用印年代、作品名、作品の制作年代、所蔵者、作品登録番号、ネガ番号、撮影年月日等の基礎データを記入し、画家、書家、賞鑑家別に分類整理をおこなった。また、諸資料の整理にあたっては、落款および諸印の真偽の問題等について、日本国外に現存する作品の諸印の関係資料も、出来る限り比較して検討する作業を実施し、諸印と落款に関するいくつかの個別的問題について具体的に検討を加えた。さらに、今後の課題として、収集した写真資料のデジタル化の問題についても検討をした。日本に現存する中国絵画、中国書跡のコレクションの内、本研究にとり重要である東京国立博物館、大阪市立美術館、京都国立博物館などに所蔵される作品を選定し、諸作品に押捺されている書画家印、鑑蔵印、落款の調査を基本的に従来の調査方法を用いて実施した。本年度は、特に東京国立博物館の所蔵品のうち、画巻、書巻の調査に重点をおいた。本研究にとって基本資料とすべき諸印、落款を原則として、6×4.5判カメラによる原寸大の白黒写真(特に重要なものはカラー写真)、また印色の記録の為に、それぞれ35ミリカラースライドを併用して撮影した。また、款識上の必要に応じて、作品の素材となっている絹、紙を、35ミリカメラによる拡大写真撮影を実施した。調査により収集することの出来た諸印、落款の原寸大の焼付写真資料を、従来、収集整理した写真資料と同様にB6判のカードに貼り、それぞれに基礎データを記入し、画家、書家、収集家、賞鑑家別に分類整理した。この際、基礎データとして、従来の作者、作品、印文、使用時期等の諸印に関する各要素に加えて落款に関する項目を追加し、データベースにくわえることにした。なお、諸資料を整理するにあたっては、落款および諸印の真偽の問題等について、日本国外に現存する作品の諸印の資料をも参照しながら検証する作業を実施した。本年度は前年度に引続き、日本に現存する中国絵画、中国書跡のコレクションの内、本研究にとり最も重要なコレクションであり作品数の多い東京国立博物館所蔵品の未撮影ものを中心に、それらの作品に押捺されている書画家印、鑑蔵印、落款の撮影を従来の調査方法を用いて実施した。すなわち、基本資料とすべき諸印、落款を原則として、6×4.5判カメラによる原寸大の白黒写真撮影をおこない、必要に応じて6×4.5判カメラによるカラー写真、また印色の記録の為に35ミリカラースライド撮影等を実施した。調査により収集することの出来た諸印、落款の原寸大の焼付写真資料を、従来、収集整理した写真資料と同様にB6判のカードに貼り、それぞれに印文、落款、書画家名、賞鑑家名、用印年代、作品名、作品の制作時代、所蔵者、作品登録番号、ネガ番号、撮影年月日等の基礎データを記入し、画家、書家、賞鑑家別に、従来の整理法について検討を加えながら、分類整理をおこなった。また、諸資料の整理にあたっては、落款および諸印の真偽の問題等について、日本国外に現存する作品の諸印の関係資料をも比較しながら検証する作業も出来る限り実施し、今後の報告書作成の作業に備えた。本年度も前年度に引続き、日本に現存する中国絵画、中国書跡のコレクションの内、本研究にとり最も重要な資料が多く含まれている東京国立博物館保管の作品を中心に、未撮影のものについて、それらの作品に押捺されている落款、書画家印、鑑蔵印の撮影を従来の調査方法を用いて実施した。

すなわち、基本資料とすべき落款、諸印を原則として、6×4.5判カメラによる原寸大の白黒写真撮影をおこない、また、必要に応じて、印印の記録の為に35ミリカラースライド撮影等を実施した。調査にあたっては、特に年記のある落款、使用した年の明らかな印を重視した。調査により収集した諸印、落款の原寸大の焼付写真資料は、これまで収集整理した資料と同様に、B6判のカードに貼り、それぞれに印文、落款、書画家印、賞鑑家名、用印年代、作品名、作品の制作時代、所蔵者、作品登録番号、ネガ番号、撮影年月日等の基礎データを記入し、画家、書家、賞鑑家別に、従来の整理法について検討を加えながら、分類整理をおこなった。諸資料の整理にあたっては、落款および諸印の真偽の問題等について検証をおこない、さらに、本研究課題である諸印と落款について、特に使用年の明らかな印、年記のある落款に注意をはらいながら、国外にある作品の書画家印・鑑蔵印・落款等の関係資料をも比較しながら編年の問題を含めて検証することに努めた。なお、今後の課題として、収集資料のデジタル化の問題についても検討をした。
道徳教育において育成される「コンピテンシー」とカリキュラム開発に関する研究

平成30年度は道徳のコンピテンシーについて、その内実を明らかにすること、ならびに道徳のコンピテンシーに基づいたカリキュラム原案を構築することを主として行った。第一点目の道徳のコンピテンシーの内実を明らかにするという研究は、本研究を貫く大きなテーマであるために昨年から引き続いての研究課題となっているが、今年度はOECDのCCRのモデルを参考にしながら、新たな道徳性の定義をおこなった。ここにおいて、学校教育全体で育成する道徳性と、道徳科において育成する道徳性を分け、かつそれらの相互連関について論じた。(荒木寿友「コンピテンシーの育成と人格の形成ー道徳のコンピテンシーから導かれる<道徳性>の再定義」グループ・ディダクティカ編『深い学びを紡ぎだす』勁草書房、2019年1月)第二点目は、新たに位置づけた道徳性をいかにして学校教育で育んでいくのかということについて、カリキュラムの原案を考察した。たとえば、批判的な思考に基づいた道徳教育を展開するのであれば、道徳的価値そのものについて徹底的に考えるという授業スタイルが考えられる(荒木寿友編著『道徳的知の探究』明治図書、2019年7月頃出版予定)。また現行の学習指導要領では内容項目が並置されているが、生命の価値や人間尊重という価値、幸福や自由といった価値を上位項目に据え、内容項目の全体構成を捉える必要があるのではないかという提案を行った(荒木寿友、藤井基貴編著『道徳教育』ミネルヴァ書房、2019年5月、あるいは荒木寿友、藤澤文編著、荒木紀幸監修『新道徳教育はこうすればおもしろい』北大路書房、2019年10月頃出版予定)当初計画においては、以下の予定を考えていた。すなわち、第一に、道徳性の再規定に基づいたカリキュラム開発、第二に、研究協力校における道徳授業の実践と道徳のコンピテンシー調査、第三に、現職教員を中心とした一般向け講座の展開である。第一の点は、前年度のコンピテンシーならびに道徳性の研究に基づき、カリキュラム開発をおこなうことを予定していた。その原型については研究が進み、ある程度の方向性がまとまってきた。この研究成果については、荒木寿友(2019)や荒木寿友、藤井基貴編著(2019)においてまとめられている。また第三の点についても、小中学校での研修や講演において、道徳のコンピテンシーについて、またそれを促していくための教育方法の提示を行うことができた。しかし、二点目の道徳授業の実践と調査については不十分なままであることは否めない。その理由として、教科化がなされたことによって、学校現場では主たる教材としての教科書の使用がかなり切迫した課題としてあげられていること、それによって独自教材を用いるというハードルが高いことがあげられる。また道徳のコンピテンシー調査のための指標が作成されておらず、道徳性を評価するための指標について早急に研究を進める必要がある。研究全体を通じて言えることだが、新しい枠組みで道徳性の定義を提示したとしても、学校現場においては学習指導要領の縛りがあるために、学習指導要領の枠組みにおいてどのように実施するのかという課題が見られることが明らかとなった。2019年度は研究の最終年度であるために、これまでの研究の総括を中心に研究を行っていく予定である。具体的には、カリキュラム開発の原案を作成することが昨年度までにほぼ完成したために、その原案に基づいてカリキュラムの精緻化を行っていくこと、ならびにそのカリキュラムに基づいた授業方法を提示することである。この際に、現行の学習指導要領から逸脱しないという点を強調することによって、各学校での実践を円滑に進めていけるようにしたい。道徳性を評価するための指標としては、現在ドイツの道徳心理学者LindのHow toteachmoralityの翻訳に着手しており、そこで取り上げられている道徳性の測定を参考にしながら、研究を進めていくことを考えている。また、Association for Moral Education 2019において発表する予定にしており、すでにエントリーが終わり採択待ちの状況である。この学会では“How to make a curriculum based on moral competency"というタイトルで、カリキュラム開発について発表する。2017年度は、道徳のコンピテンシーを明らかにするにあたり、以下の2点を中心に研究を行った。第一に、道徳教育における教材の分析である。道徳の授業において用いられている教材は価値伝達型の教材が多数を占めていることが明らかになった。資質・能力の育成のためには、従来の伝達型の教材ではなく、児童生徒がいかに考えるかをサポートする教材が求められるが、教科化を迎えて出版された小学校教科書は道徳的価値が実現された姿が描かれる読み物教材がほとんどである。資質・能力を育成していくための教材づくりが急務であることが明らかになった(日本道徳教育学会紀要に発表済み)。第二に、学習指導要領において道徳の資質・能力がどのように捉えられているのか明らかにし、その矛盾点を示した上で、道徳の資質・能力を提示した。道徳の学習指導要領は学習指導要領本体の改定がなされる前に、一部改定という形で提示された。そのために、中教審における十分な議論が加えられておらず、また資質・能力の議論が熟する前に告示されたために、本体とのズレが生じてしまっている。具体的には、「知識・技能」、「思考力、判断力、表現力等」、「学びに向かう力、人間性等」という3つの柱で資質・能力が捉えられたが、道徳の資質・能力は「道徳的判断力、心情、実践意欲と態度」というまとめがなされている。道徳における「知識・技能」は考慮されていない。

そこで、3つの柱に基づいて、道徳の資質・能力を再定義し、学校教育全体に位置づくような提案を行った(2018年内に勁草書房より出版予定)。平成29年度は、当初の予定においては、以下の三点を考えていた。すなわち、第一点目としては、「日本の道徳教育が抱える内在的な問題を明らかにすること」、二点目に「国内外のコンピテンシー研究の整理と道徳性の再定義」、そして三点目として、「汎用的な力としての道徳のコンピテンシー調査」である。第一点目、第二点目についてはほぼ予定通り研究活動を遂行し、論文の執筆も行うことができた。しかし、三点目については、前者2つのことが明らかにされない限り実行することができなかったため、授業見学は多数行ったものの、目的に基づいて調査する段階には至っていない。平成30年度からは具体的に調査も進めていくことができればと考えている。平成30年度は道徳のコンピテンシーについて、その内実を明らかにすること、ならびに道徳のコンピテンシーに基づいたカリキュラム原案を構築することを主として行った。第一点目の道徳のコンピテンシーの内実を明らかにするという研究は、本研究を貫く大きなテーマであるために昨年から引き続いての研究課題となっているが、今年度はOECDのCCRのモデルを参考にしながら、新たな道徳性の定義をおこなった。ここにおいて、学校教育全体で育成する道徳性と、道徳科において育成する道徳性を分け、かつそれらの相互連関について論じた。(荒木寿友「コンピテンシーの育成と人格の形成ー道徳のコンピテンシーから導かれる<道徳性>の再定義」グループ・ディダクティカ編『深い学びを紡ぎだす』勁草書房、2019年1月)第二点目は、新たに位置づけた道徳性をいかにして学校教育で育んでいくのかということについて、カリキュラムの原案を考察した。たとえば、批判的な思考に基づいた道徳教育を展開するのであれば、道徳的価値そのものについて徹底的に考えるという授業スタイルが考えられる(荒木寿友編著『道徳的知の探究』明治図書、2019年7月頃出版予定)。また現行の学習指導要領では内容項目が並置されているが、生命の価値や人間尊重という価値、幸福や自由といった価値を上位項目に据え、内容項目の全体構成を捉える必要があるのではないかという提案を行った(荒木寿友、藤井基貴編著『道徳教育』ミネルヴァ書房、2019年5月、あるいは荒木寿友、藤澤文編著、荒木紀幸監修『新道徳教育はこうすればおもしろい』北大路書房、2019年10月頃出版予定)当初計画においては、以下の予定を考えていた。すなわち、第一に、道徳性の再規定に基づいたカリキュラム開発、第二に、研究協力校における道徳授業の実践と道徳のコンピテンシー調査、第三に、現職教員を中心とした一般向け講座の展開である。第一の点は、前年度のコンピテンシーならびに道徳性の研究に基づき、カリキュラム開発をおこなうことを予定していた。その原型については研究が進み、ある程度の方向性がまとまってきた。
埋め込み型知覚皮弁と脂肪組織由来間葉系幹細胞を用いた再建乳房知覚化の試み

乳癌切除後、乳房皮膚知覚は障害される。再建乳房の知覚向上には、損傷知覚神経による皮膚再支配が必要である。過去に、移植皮弁を知覚皮弁とする試み(皮弁の知覚神経を乳房側の損傷神経と縫合)を行った。一方、近年、皮下乳腺全摘が普及し、皮弁皮膚を体表に露出せず、皮下へ埋め込むことが多くなった結果、知覚皮弁が使用頻度は減少した。しかし、埋め込み型知覚皮弁において、少なくとも皮弁の表面までは再生神経は到達する。本研究では、埋め込み型皮弁の知覚化が皮膚知覚回復向上に寄与するかを検討する。さらに、末梢神経再生を促進する脂肪組織由来間葉系幹細胞移植を併用することで、柔らかく知覚も兼ね備えた乳房の再建を目指す。
歯内歯周疾患の病態形成機序-新規疾患モデルを用いた樹状細胞の動態解析

樹状細胞は生体内で最も有力な抗原提示細胞であり、この機能を通じて外来抗原刺激に対する免疫応答の発動と質の決定という重要な役割を演じる。これらの細胞が根分岐部における生体防御機構の発動様式の特異性に密接に関連すると推定されるが、根分岐部病変に対する適切な動物モデルは現在まで開発されておらず、根分岐部歯根膜で営まれる免疫防御機構の実態は不明のままである。本研究ではこの点に着目し、新たな実験的根分岐部病変誘発法を採用し、樹状細胞を中心とする各種免疫担当細胞の動態の検索を通じて根分岐部病変の成立・持続過程で営まれる免疫機構の解明をはかることを目的とするものである。本年度は先ず、ラット臼歯歯根膜の種々の部位(根分岐部,根尖部,近心側,遠心側)における抗原提示細胞の成熟度,活性化度の相違を検索することを目的として,major histocompatibility complex(MHC)クラスII分子,CD86,CD83およびToll-like receptor(TLR)4のmRNA発現をリアルタイムPCR法を用いて定量解析した.その結果,全ての検索対象遺伝子とも、最も口腔環境に近接した部位である根分岐部において発現レベルが著明に高く,根尖部においては低レベルであった.従って、ラット正常歯根膜の各部位には,細菌刺激の多寡などの微小環境の相違に応じて、成熟度,活性化度の異なる抗原提示細胞が存在することが示唆された.さらに、ラット臼歯を1日間露髄開放し,正常時と露髄開放後の分岐部歯根膜における上記mRNA発現をリアルタイムPCR法を用いて定量,比較したところ,各遺伝子とも開放1日経過後で有意に増加した.従って、ラット臼歯の根分岐部歯根膜に存在する抗原提示細胞が,歯髄の感染に起因する細菌刺激侵襲に応じて,速やかに成熟度や活性化度を増加させることが示唆された.樹状細胞は生体内で最も有力な抗原提示細胞であり、この機能を通じて外来抗原刺激に対する免疫応答の発動と質の決定という重要な役割を演じる。本年度は先ず、正常な歯根膜における樹状細胞の分布様式について、光顕、電顕免疫組織化学的検討を実施した。すなわち、ラット下顎第一臼歯を検索対象とし、根分岐部に加えて根側(近心、遠心)、根尖部について、MHC class II分子、ED1(抗ラットマクロファージ/樹状細胞)、CD11cあるいはCD86発現細胞の検出を行った。その結果、各マーカー陽性の樹状細胞の密度が部位により異なること、また根分岐部では近心部に次いで高密度に樹状細胞が分布するとともにCD86陽性細胞の割合が他部位と比較して高いことが明らかとなった。さらに露髄開放により髄管経由の根分岐部病変を誘発させたところ、術後24時間ではMHC class II分子、ED1、CD11c陽性細胞数に有意な変化は見られなかったものの、CD86陽性細胞は有意な増加を示した。従って、髄管経由の根分岐部病変の初期成立過程において、樹状細胞の活性化が生じる事が推定された。本年度は先ず、ラット臼歯歯根膜の種々の部位(根分岐部,根尖部,近心側,遠心側)における抗原提示細胞の成熟度,活性化度の相違を検索することを目的として,major histocompatibility complex(MHC)クラスII分子,CD86,CD83およびToll-like receptor(TLR)4のmRNA発現をリアルタイムPCR法を用いて定量解析した.その結果,全ての検索対象遺伝子とも、最も口腔環境に近接した部位である根分岐部において発現レベルが著明に高く,根尖部においては低レベルであった.従って、ラット正常歯根膜の各部位には,細菌刺激の多寡などの微小環境の相違に応じて、成熟度,活性化度の異なる抗原提示細胞が存在することが示唆された.さらに、ラット臼歯を1日間露髄開放し,正常時と露髄開放後の分岐部歯根膜における上記mRNA発現をリアルタイムPCR法を用いて定量,比較したところ,各遺伝子とも開放1日経過後で有意に増加した.従って、ラット臼歯の根分岐部歯根膜に存在する抗原提示細胞が,歯髄の感染に起因する細菌刺激侵襲に応じて,速やかに成熟度や活性化度を増加させることが示唆された.
新規細胞株と画像解析を用いた植物細胞分裂・形態形成における細胞骨格機能の比較解析

本申請研究では、シダ植物およびコケ植物において細胞研究の多様な解析ニーズに適した実験細胞株(standard cell line:SCL)を新規に確立し、それらを用いた細胞分裂・形態形成様式の比較解析を行うことで、植物が進化の過程で獲得してきた増殖システムに迫ろうと試みた。具体的には、シダ植物のリチャードミズワラビとコケ植物のゼニゴケに着目し、各植物種において新規の懸濁培養細胞を作成し、分裂増殖の解析に適したSCLの確立を目指した。一方、これらの細胞を用いて細胞骨格などの比較解析を行い得るイメージング画像定量解析のツールを目指し、独自のシングルセル解析システムの開発を行った。最終的には、タバコBY-2細胞などのデータと照合することで、被子植物、シダ植物、コケ植物の比較解析を目指している。最終年度である平成30年度は、2829年度に引き続き以下の検討を行った。1)これまでに得られたfine cell cultureであるSCL候補のcell lineをさらに改良し、より増殖速度や分裂頻度を高めるべく再検討した。特にシダの培養細胞は、SCLとして配布できるように培養条件についても再検討し、理研バイオリソースに委託した。また、それを用いた実用的なプロトプラストの作成と培養の実験系を確立し、短報として公表した。2)細胞核(染色体)、微小管などに着目して、シダ、コケ、タバコ細胞の細胞分裂様式の分裂期を通した経時観察を行い、3者の比較解析を試行した。3)シングルセル解析システムを独自に開発し、自動判定ツールの応用を試みた。具体的には、細胞の蛍光および明視野像などをもとにして、画像解析ソフトウェアImageJ上の独自に開発したplug-inにより画像特徴を抽出して、細胞形態等の自動分類器を作成し、論文として発表するとともに関連製品の開発も行った。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本申請研究では、シダ植物およびコケ植物において細胞研究の多様な解析ニーズに適した実験細胞株(standard cell line:SCL)を新規に確立し、それらを用いた細胞分裂・形態形成様式の比較解析を行うことで、植物が進化の過程で獲得してきた増殖システムに迫ろうと試みている。具体的には、シダ植物のリチャードミズワラビとコケ植物のゼニゴケに着目し、各植物種において新規の懸濁培養細胞を作成し、分裂増殖の解析に適したSCLの確立を目指す。次に、これらの細胞を用いて細胞骨格などの可視化や独自開発のイメージング画像定量解析を行い、タバコBY-2細胞などのデータと照合することで、被子植物、シダ植物、コケ植物の比較解析を可能とすべく、先ず以下の検討を行った。1)無菌的に成育したリチャードミズワラビおよびゼニゴケ植物体よりカルスを誘導し、生長のよいカルスをもとに懸濁培養細胞を作成した。植物ホルモンなど様々な条件の液体培地の入ったフラスコへの定期的な移植でシェーカーでの振盪培養が安定した時期を見計らって、移植毎にステンレスの金属フィルターに目の粗いものから順次通して、なるべく小さな細胞集団(fine cell culture)を選抜した。2)これらのfine cell cultureを暫定的な候補とし、増殖速度を早めるべく培養条件を再検討した。具体的には、植物ホルモン濃度(なるべく低濃度に慣らしていく)、振盪培養条件(培養温度、回転速度・半径、液体培地の量、シェーカーの機種など)、ミネラル組成(ベースはMS培地でも追加のミネラル)などである。3)リチャードミズワラビについて、増殖速度が早く、かなりfine cell cultureであるSCL候補のcell lineが得られたので、それを用いて、細胞分裂様式の観察やプロトプラスト作成の検討を始めた。いくつかの機器の故障により一部の計画に遅延がみられたなどの理由で繰越申請を行ったが、全体的には概ね順調に推移していると言える。具体的には、リチャードミズワラビのSCL候補は以前に取得したものより実験的な使用に耐えるものが得られており、ゼニゴケについても一応の候補が得られている。また、それらを用いて、細胞分裂や形態形成の様式の観察やプロトプラスト作成についても検討を開始した。次に、これらの細胞を用いて細胞骨格などの可視化や独自開発のイメージング画像定量解析を行い、タバコBY-2細胞などのデータと照合することで、被子植物、シダ植物、コケ植物の比較解析を目指している。平成29年度は28年度に引き続き、以下の検討を行った。1)昨年度に得られたfine cell cultureであるSCL候補のcell lineをさらに改良し、より増殖速度や分裂頻度を高めるとともに、細胞形態形成のスタートツールとなる実用的なプロトプラストの作成と培養系の開発を行い、かなり完成度の高い実験系を確立した。2)細胞分裂時の細胞核(染色体)、微小管などの可視化を目指し、ヒストンやチューブリンとGFPやRFPの融合遺伝子の導入による可視化細胞の作成と蛍光抗体染色の2法により、分裂様式の分裂期を通した経時観察を試みた。前者については未だアグロバクテリウムの感染条件など検討が必要であるが、後者については実用に耐える染色像が得られた。

3)我々が独自に開発した細胞状態の自動判定ツールの応用を試みた。具体的には、BY-2細胞の蛍光および明視野像をもとにして、画像解析ソフトウェアImageJ上の独自に開発したplug-inにより画像特徴を抽出して、教師つき学習を用いた細胞周期の自動分類器を作成しており、これをシダ植物およびコケ植物の細胞の蛍光像および明視野像に応用することを検討した。研究実績の概要に記載したように全体的には概ね順調に推移していると言える。SCL候補の改良、実用的なプロトプラスト作成と培養法の確立、蛍光抗体染色による細胞分裂装置の観察、画像解析ソフトウェアの試行の各々について見るべき成果があったと言える。本申請研究では、シダ植物およびコケ植物において細胞研究の多様な解析ニーズに適した実験細胞株(standard cell line:SCL)を新規に確立し、それらを用いた細胞分裂・形態形成様式の比較解析を行うことで、植物が進化の過程で獲得してきた増殖システムに迫ろうと試みた。具体的には、シダ植物のリチャードミズワラビとコケ植物のゼニゴケに着目し、各植物種において新規の懸濁培養細胞を作成し、分裂増殖の解析に適したSCLの確立を目指した。一方、これらの細胞を用いて細胞骨格などの比較解析を行い得るイメージング画像定量解析のツールを目指し、独自のシングルセル解析システムの開発を行った。最終的には、タバコBY-2細胞などのデータと照合することで、被子植物、シダ植物、コケ植物の比較解析を目指している。最終年度である平成30年度は、2829年度に引き続き以下の検討を行った。1)これまでに得られたfine cell cultureであるSCL候補のcell lineをさらに改良し、より増殖速度や分裂頻度を高めるべく再検討した。特にシダの培養細胞は、SCLとして配布できるように培養条件についても再検討し、理研バイオリソースに委託した。また、それを用いた実用的なプロトプラストの作成と培養の実験系を確立し、短報として公表した。2)細胞核(染色体)、微小管などに着目して、シダ、コケ、タバコ細胞の細胞分裂様式の分裂期を通した経時観察を行い、3者の比較解析を試行した。3)シングルセル解析システムを独自に開発し、自動判定ツールの応用を試みた。具体的には、細胞の蛍光および明視野像などをもとにして、画像解析ソフトウェアImageJ上の独自に開発したplug-inにより画像特徴を抽出して、細胞形態等の自動分類器を作成し、論文として発表するとともに関連製品の開発も行った。上記のように得られたSCL候補を用いて以下の点について検討する。1)シダ植物のプロトプラストの作成と培養系の確立およびそれを用いた細胞形態形成の解析を行う。球形のプロトプラストからの細胞分裂および細胞伸張系の確立を試みる。2)シダ植物等における可視化細胞の開発を目指し、まずアグロバクテリウムを用いた形質転換を試みる。それが難しい場合には蛍光抗体染色なども試みる。(ゼニゴケについては河内研から分与して頂いた微小管等の可視化植物よりcell lineを作成している。)