hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
電気刺激とボツリヌストキシンの併用による神経調整的治療体系の確立

慢性期上下肢麻痺患者の運動機能、脳卒中後の中枢性疼痛、難治性過活動膀胱を標的として、neuromodulationとしての電気刺激治療(ES)、ボツリヌス治療(BTX)、その併用治療の効果を比較検討した。上肢麻痺では併用治療が痙縮抑制と機能改善に良好な効果を示した。持続的ESや筋電トリガーESは、通常のリハ訓練以上の歩行機能改善効果を示した。中枢性疼痛へのBTXでは、自覚的改善はなかったが感覚閾値の正常化が示唆された。難治性過活動膀胱の2例では、単独治療よりも併用治療で尿失禁の消失期間が延長した。本研究では、電気刺激とボツリヌストキシン(BOT)投与をneuromodulation治療と位置づけ、この組合せ治療によって、相補的・相乗的治療効果が得られるかどうかを明らかにすることを目的とする。治療標的は慢性期の脳卒中や脊髄損傷を中心とした神経系疾患による、重度の麻痺上肢、重度の麻痺下肢、四肢の神経性疼痛と異常感覚、難治性の過活動性膀胱と泌尿器系臓器疾患とし、それぞれに対する上記治療によって、痙縮抑制と上下肢運動機能の改善、疼痛やしびれ感の緩和、膀胱機能の回復による症状の改善等を明らかにする。さらに電気刺激あるいはBOTの単独治療と、併用治療との比較を行い、治療適応を明確にする。また治療前後に運動学的解析、脳・脊髄を含めた神経生理学的解析および機能画像学的解析、尿水力学的解析を行い、治療効果発現の背景機構を解明する。本研究では、電気刺激とボツリヌストキシン投与をneuromodulation治療と位置づけ、それらを組み合わせた治療手法によって、相補的・相乗的治療効果が得られるかどうかを明らかにすることを目的とする。内容は以下の3点であり、本年度は同時に検討を始めたが、特に1)に関する研究が先行した。1)上下肢痙性麻痺に対する治療発症から6か月以上経過した中枢神経疾患による痙性片麻痺10名について、麻痺側上肢への電気刺激治療の導入を行い、1か月間の電気刺激単独治療の後、3か月毎に計2回、麻痺筋へのボツリヌストキシン投与を実施した。電気刺激単独でも脳卒中上肢機能テストのスコアに一定の改善がみられたが、ボツリヌストキシン投与後はさらに改善を示し、動作解析でも肘関節と手関節の随意伸展角度に改善がみられた。また片麻痺および痙性対麻痺患者計3名を対象に、麻痺下肢にも同様の治療を行い経過観察中である。2)神経性疼痛・異常感覚に対する治療脳卒中発症後6か月以上が経過した後も、麻痺側上肢に高度のしびれや疼痛が残存する患者1名に対し、1)と同様のスケジュールで治療を実施するための予備的検討を行った。ボツリヌストキシンの皮下投与3週間後に、末梢感覚神経機能を知覚神経自動検査システムによって検討したところ、感覚機能のスコアに改善がみられた。経過観察後に異常感覚に対する治療プロトコールを作成する予定である。3)神経因性膀胱に対する治療中枢神経疾患発症後に生じた過活動性膀胱のうち、薬物抵抗性の頻尿・尿失禁を呈する患者に対して、ボツリヌストキシンの膀胱粘膜への施注と仙骨部への電気刺激による症状改善を目的としているが、本年度はボツリヌストキシン施注のための手技の習得と、プロトコール作成、および仙骨部への電気刺激による生理学的効果の検証を行った。施注手技はほぼ習得でき、プロトコールもおおむね作成できた。仙骨部への電気刺激には、膀胱の収縮抑制効果のあることが知られているが、刺激前後の前立腺部尿道径をMRIで撮像したところ、尿道径の拡張も生じることが判明した。この結果は国際FES学会等で発表した。本年度は以下の3点について成果を得た。1)上下肢痙性麻痺に対する治療慢性期の痙性片麻痺患者10名の麻痺側上肢に行った併用治療について、その結果を日本リハ医学会および国際FES学会で発表した。電気刺激とボツリヌストキシンの併用治療は、慢性期であっても麻痺上肢に一定の機能改善をもたらすことが明らかとなった。また2名の麻痺側下肢に電気刺激とボツリヌストキシンの併用治療を、7名に電気刺激を用いた歩行訓練を実施した。さらに新しく開発した筋電駆動型電気刺激装置を用いた歩行訓練を試みた。電気刺激を用いた訓練が、通常の理学療法のみでは歩行不能な患者の歩行機能を改善することが明らかとなり、その概要を学術雑誌に掲載した。2)神経性疼痛・異常感覚に対する治療本年度はボツリヌストキシン単独の治療によって、異常感覚・疼痛が改善するかどうかを検証するために、麻痺側上肢に異常感覚・疼痛を有する慢性期脳卒中片麻痺患者3名について、麻痺上肢前腕にボツリヌストキシンを施注し、非施注部位と比較した。

異常感覚・疼痛の改善は十分ではないものの、知覚神経自動検査システムによる感覚閾値は施注部位で正常化する傾向がみられた。さらにデータの積み重ねが必要であるが、今後の展開が期待できる内容である。3)神経因性膀胱に対する治療電気刺激単独では頻尿・尿失禁の改善が十分ではない神経因性膀胱患者1名で、内視鏡下に膀胱粘膜および筋層ヘボツリヌストキシン200単位を施注した。電気刺激も併用して経過観察中であるが、これまでは得られなかった無抑制収縮と尿失禁の消失、および膀胱容量の拡大を認め、難治性の過活動膀胱患者でも併用治療が症状の改善をもたらす可能性が示唆された。また術後の骨盤底筋群の強化に仙骨表面電気刺激が有効であることも確認された。さらに仙骨表面電気による脳磁図の変化も明らかになり、神経調整効果のメカニズムの一旦が解明された。これらについて学術雑誌への投稿と学会発表を行った。本年度は以下の3点について成果を得た。1)上肢痙性麻痺に対する治療痙性片麻痺に対する電気刺激とボツリヌストキシンの併用治療が、慢性期であっても麻痺上肢に一定の機能改善をもたらすことが明らかとなったが、これに対するコントロールとしてのボツリヌストキシン単独治療例が不足していることから、単独治療を5名で実施した。臨床治療としての有効性を検証する上では、さらに数例での治療が必要な状況である。本研究で開発した筋電駆動型電気刺激装置を、近位筋力の低下が著しく肩関節の運動時痛を有する片麻痺の肩周囲筋に適用し、2週間の訓練を実施したところ、肩関節機能の速やかな改善と疼痛の軽減が得られた。この結果は、片麻痺上肢の新しい機能改善手法として、国際FES学会で報告した。2)下肢痙性麻痺に対する治療片麻痺下肢へのボツリヌストキシン単独治療、電気刺激との併用療法については、いずれも効果が十分ではなく、適応の再検討が必要と考えられた。一方下肢の痙性麻痺に対する電気刺激では、大腿四頭筋への刺激によって、同筋の筋活動減少とこれに伴う膝関節運動範囲の拡大が得られ、歩容の改善に有用であることが判明した。この結果は国際電気生理運動学会で報告した。また骨本生体医工学会誌に掲載予定である。3)神経因性膀胱に対する治療電気刺激単独では頻尿・尿失禁の改善が十分ではない神経因性膀胱患者1名で、内視鏡下に膀胱粘膜および筋層ヘボツリヌストキシン200単位を施注し、その後の経過を観察した。昨年度は電気刺激との併用での効果確認を行ったが、今年度はボツリヌストキシン単独投与での効果確認を行った。単独投与によっても、無抑制収縮と尿失禁の消失、膀胱容量の拡大は認めるもの、尿失禁を防止できる期間が併用時よりも短かく、併用療法の方が有用性が高いと考えられた。1)上肢痙性麻痺に対する治療昨年度に続いてボツリヌス単独治療を実施し、計6名でデータ収集を完了した。電気刺激との併用療法と比較した場合、痙縮は単独治療でも軽減するが、長期間における麻痺上肢の機能回復は、併用療法の場合にのみ得られることが判明した。この結果は2010年度の日本リハビリテーション医学会等で報告し、論文にまとめる予定である。片麻痺上肢の機能回復については、視覚入力と電気刺激による固有感覚入力が、上肢支配の脳内神経回路の再構築に強い影響をもたらすことを明らかにした。この結果は国際FES学会で報告し学会賞を受賞した。
近接場光励起領域近傍の空間分解分光イメージング

これまで波長の大きさに制限されてきた光学測定の空間分解能は、近接場光の利用により、飛躍的に向上した。通常、この近接場光による測定では、近接場光照明領域だけでなく、その影響が到達する領域全体からの総和的な光学応答情報を検出する。本研究では、この総和的に得られる光学応答情報を、近接場光でさらに空間的に分解・検出した。これにより、照明領域とその近傍に及ぶ光励起に対する応答の流れが可視化された。本研究により得られた知見をもとに、電子回路中の電子のように、光の流れを自在に操る新しい手法の創出を目指す。波長の大きさに制限されてきた光学測定の空間分解能は、近接場光の利用により、飛躍的に向上した。通常、この近接場光による測定では、近接場光が照明された領域だけでなく、直接近接場光により照明されていない周辺の領域からの光学応答情報も検出している。本研究では、その近接場光照明の影響が及ぶ領域内の光学応答の空間分布を、近接場測定で検出することにより明らかにし、照明した領域からその周辺へどのように応答が伝搬していくのかを調べる。たとえば、2次元π電子系薄膜であるグラフェンを光で励起すると、キャリアやフォノンが生成される。このキャリアは、通常の半導体のキャリアと比較すると有効質量がかなり小さく、光速の1/300という高速度で移動できる。また、ラマン散乱分光で観測されるG'バンドやDバンドは、遠方の寄与を含んでいると考えられる。したがって、その光励起した領域近傍の、電子状態やラマン散乱光を観測することにより、グラフェン中のキャリアやフォノンの挙動が、エッジの形状や欠陥などにより、どのように影響を受けるのかが分かる。将来的にはそれらの知見をもとに、回路中の電子のように、光励起による応答の流れを自在に扱えるようになるであろう。2年目にあたる当該年度は、初年度に作製した微小開口構造を持つ金属薄膜/ガラス基板の改良に努めた。これまで、金属薄膜としてアルミニウムを用い、収束イオンビームを中心に開口構造を作製したが、効率を改善するため、電子線描画装置を用いた方法にシフトした。その表面上に金ナノ微小球を配列させて行った実験では、相互作用が伝搬するイメージが得られるものの、基板との相互作用が影響するため、解釈を難しくしている。現在、金属基板表面と試料との間にスペーサ層(石英やITO)を挿入し、試料のみでの伝搬現象の抽出をするための改善を進めいている。波長の大きさに制限されてきた光学測定の空間分解能は,近接場光の利用により,飛躍的に向上した。通常,この近接場光による測定では,近接場光が照明された領域だけでなく,直接近接場光により照明されていない周辺の領域からの光学応答情報も検出している。本研究では,その近接場光照明の影響が及ぶ領域内の光学応答の空間分布を,近接場測定で検出することにより明らかにし,照明した領域からその周辺へどのように応答が伝搬していくのかを調べる。最終年度に当たる今年度では,いくつか当初の計画で想定していなかったアプローチの研究も行った。そのひとつとして,実験的な知見を解釈するために,電磁場シミュレーションをした。具体的には,金微小球のモデル系において,系全体を光励起した場合と局所的に励起した場合の違いや,局所励起に対する構造サイズの依存性などを調べた。もうひとつのアプローチとして,ナノ構造体の形状が誘起する光学活性に関する研究を行った。鏡像対称性を有しないキラル分子は,旋光性や円二色性といった光学活性を示すが,近年,卍型などに代表されるキラルな形状を有したナノ構造体においても光学活性の発現が報告されている。我々は,アキラルな(キラルでない)形状を有するC型のナノ構造体2つを段階的に接続することにより,キラルな形状を有するS型のナノ構造体を作成し,その構造遷移過程において,系が光学活性を獲得するプロセスを追跡する研究を行った。その結果,2つのアキラルな部分構造(C型)間の距離が,数百nm程度の長距離からキラルな相互作用を行い,光学活性を発現していく様子を明らかにした。この形状による光学活性は,キラルなナノ構造形状の内部における電磁気的相互作用により発現すると考えられる。本結果は,当初の計画にはなかったアプローチではあるが,別の視点から「光励起による応答の流れ」を実証したものと言える。本研究では、この総和的に得られる光学応答情報を、近接場光でさらに空間的に分解・検出し、光励起点からの関数として表現する。

これにより、照明領域とその近傍に及ぶ微視的な光励起に対する応答の流れが可視化され、伝搬・緩和過程、異方性等の問題を直接的に議論することが可能となる。さらには、これらの知見をもとに、電子回路中の電子のように、光の流れを自在に操る新しい手法の創出を目指す。初年度にあたる当該年度は、微小開口構造を持つ金属薄膜をガラス基板上に形成し、近接場光照射のために有効な開口テンプレートのデザインとノウハウの確立を行った。また、同時に検出プローブ走査用の三軸スキャナーステージを導入し、形成された開口からの近接場光照明領域とその近傍をイメージングする機構の開発も行った。このプローブ走査機構により照明用近接場光の評価を行い、試作した開口テンプレートの最適化を進めた。開口テンプレートの試作では、金属薄膜としてアルミニウムを用い、電子線リソグラフィ法に加えて収束イオンビームも利用した。微小開口を探すために利用するマーカーのデザインや配置を何度か再検討した結果、漏れ光の影響がない近接場光照明が行えるようになった。イメージング機構については、これまで用いてきたシェアフォース制御に加えて、トンネル電流を検出してSTM像を取得できるようにした。2年目にあたる当該年度は、初年度に作製した照明用近接場光を発生する微小開口テンプレート基板を用いて、実際の伝搬現象の測定を開始する予定であった。金ナノ微小球を配列した実験を行ったところ、当初は想定していなかった、開口テンプレート基板と試料の相互作用が、試料のみでの伝搬現象の抽出を難しくすることが分かった。現在のところ計画全体の遅延はないが、上記の問題をクリアすることが今後の計画の進行を左右すると思われる。現在、金属基板表面と試料との間にスペーサ層(石英やITO)を挿入し、相互作用の低減を行うための改善を進めている。また、開口テンプレートの作製を効率を改善するため、収束イオンビームで作成する方法から、電子線描画装置を用いた方法にシフトしたが、さらにこの電子線描画により、開口部に重ね合わせて、所望の金属ナノ構造が作製できるようになりつつある。これにより、より系統的に研究を進められると考えている。その他、STMによるプローブスキャン機構は、PIDフィードバックの部分を高速・デジタル化したことにより、本測定に十分な分解能を実現できている。初年度にあたる当該年度は、照明用近接場光を発生する開口テンプレートの試作・最適化と検出プローブ走査機構の開発が目的であった。上述の通り、当初予定していた目的はほぼ達成できたと考える。さらに、次年度以降に予定していた有機薄膜や二次元π電子系薄膜(グラフェンなど)について、すでに一部の測定をスタートしており、当初の計画よりも若干順調に進行していると考える。しかしながら、本研究は未知な部分も多分に含まれることから、試料によっては、都合の良い開口テンプレートを再度調整する必要があると予想する。今後(平成25年度)は、当該計画の最終年度に相当する。
モルフォゲンによる形態形成機構に内包される抑制機構の発現調節およびその役割

我々はキイロショウジョウバエの翅をモデル系として形態形成機構を調べている。翅パターン形成ではTGF-βfamilyに属するシグナル分子decapentaplegic (dpp)が重要な役割を演じている。そのメカニズムを調べるため、dppにより誘導される遺伝子dad(daughters against dpp)を単離し、dppシグナルに負のフィードバック制御が含まれることを明らかにした。更なる解析の為、dad変異株を用いた探索により強い遺伝的相互作用を示す変異株を樹立し、原因遺伝子Enhancer of dad(E(dad))同定した。新規当該遺伝子E(dad)とdadとの相関を調べた結果、dad変異株においてdpp enhancer依存でE(dad)の遺伝子欠損の表現型が見られることが分かり、観察された細胞死や成長速度の低下はdppシグナルに依存したE(dad)の部分変異による表現型であることが示された。E(dad)の相同遺伝子がヒト・線虫・米・シロイヌナズナ・酵母に存在することが示され、E(dad)遺伝子が進化および発生において重要であることが示唆されるものの、その機能に関しては分かっていない。線虫における相同遺伝子のRNAiを用いた解析でもE(dad)の部分変異による表現型と同じく成長の抑制が示され、種を越えて普遍的に似た機能を保持していると推定される。我々のE(dad)変異株を用いたクローン解析では体毛の欠失、細胞の増殖能低下現象を観察している。我々は、E(dad)はおそらく細胞増殖もしくは細胞分裂に重要な機能をはたすと考え、解析を進めている。翅パターン形成ではTGF-βfamilyに属するシグナル分子decapentaplegic(dpp)が重要な役割を演じている。独立した2系統のdad変異株は成長が遅く、翅成虫原基が肥大し、dpp活性の指標も野生株より広範囲で観察され、dpp活性の亢進により異常が観察されたと考えられる。しかし、成虫翅の大きさは野生株とほぼ等しく、成虫原基での肥大を修正する未知のサイズ制御機構が存在することを示唆している。一方、dad変異株の翅成虫原基では過剰の細胞死が観察され、その細胞死はdppシグナルにより誘導されることを観察した。同領域で細胞死関連遺伝子として知られるreaperが誘導されることも観察した。我々はおそらく新たな制御機構の一部に細胞死が関与するのではないかと予想している。細胞死抑制効果をもつウイルス由来のp35およびdiap遺伝子の機能獲得型を過剰発現、また細胞死関連遺伝子の欠失変異を導入しその効果を観察したが、若干の効果が認められるものの完全には復帰できなかった。おそらく未知の細胞死関連遺伝子が関与すると考え、dad変異株を用いた探索を行い、dadと強く相互作用する致死変異系統を独立して3系統樹立した。遺伝子配列解析より、GTP結合ドメインを有する新規遺伝子と考えられ、変異株ではスプライシングの異常やGTP結合ドメインに変異が見いだされた。当該遺伝子の変異クローンを作製したところ、体毛の欠失や重複が観察された。現在新規遺伝子のdadとの関連、および細胞死への関与を調べている。
統合失調症発症に関与するゲノムコピー数多型の解析

日本人統合失調症を対象に高解像度ゲノムコピー数変異(CNV)解析を実施した。既報の大規模CNVに加え、発症に関与しうる新規の小規模CNVを同定した。小規模CNVはリンパ芽球様細胞株で遺伝子発現に与える影響を確認した。VIPR2重複の関連解析を実施したが、関連は認めなかった。本研究は高解像度CNV解析と遺伝子発現解析を組み合わせ、統合失調症の遺伝学的理解に新たな知見をもたらした。1.研究目的統合失調症の発症に対して大きな効果を有するゲノムコピー数変異(CNV)を同定する。またこれらCNVを有する患者の臨床的特徴(身体疾患、発症年齢、等)について詳細に分析する。2.研究方法Comparative Genomic Hybridization (CGH)法を用いて、ゲノムワイドに統合失調症の発症リスクを高めるCNVを探索した。解析には統合失調症患者300名のゲノムサンプルを用いた。3.研究結果及び考察患者300名中、22q11.2の欠失3名、15q11.2の欠失4名、3q29の欠失1名、16p13.11の重複1名を同定した。欧米の大規模なゲノム解析研究により、これらCNVは統合失調症の強い遺伝リスクとして報告されている。各々は1Mbp以上のサイズがあり、中枢神経系に発現するものを含め、多数の遺伝子に強い機能的変化を及ぼすことが予想される。特に22q11.2の欠失は患者群で1%と高率に存在し、先天性心疾患や特異な顔貌などの典型的な表現型を有する者を同定した。上記4種類のCNVは患者群の3%で同定され、またこれらのCNVを有する患者の半分は発症年齢が早い(15歳以下)、あるいは精神遅滞を合併しており、CNVが神経発達障害の側面に関与していることを強く示唆する。本研究は、遺伝学的に異質性の高いと想定される統合失調症がCNVの観点から均質性の高い群に細分化される可能性を示した点で画期的な知見をもたらした。1.研究目的統合失調症の発症に関与する稀なゲノムコピー数変異(CNV)のスクリーニングを行い、統合失調症の発症リスクを高めるCNVを同定し、結果の再現性の確認と詳細な構造解析を行う。また同定されたCNVの多面発現性についても検討を加える。2.研究方法3.研究結果および考察患者群の解析から、既に報告のある大規模CNVとして染色体領域1q21.1欠失2名、2p16.3欠失1名、3q29欠失1名、22q11.21欠失5名、16p13.11重複2名、16p11.2重複2名を同定した。健常者では16p11.2重複が1名に同定されたのみで、患者群で有意に頻度が高い結果であった。また神経発達に関連する遺伝子(ADAM22、NLGN4X、GRM8.CHRNA7、ASTN2、RBFOX1)のエキソン領域と重なる稀なCNVを患者群のみで同定し、さらに高解像度のCGH法で再現性を確認した。CNVの多面発現性に関しては、同定された全ての大規模CNVが広汎性発達障害や知的障害の発症にも関与すると報告されている。3q29欠失と16p11.2重複は双極性障害患者でde novo CNVとして同定された。CHRNA7の重複は患者群のみで同定されたが、注意欠陥多動性障害との関連が最近報告された。以上から、統合失調症とそれ以外の精神疾患(知的障害・広汎性発達障害・ADHD・双極性障害)に共通の遺伝要因が関与していることが示唆された。前年度に引き続き、統合失調症を対象に全ゲノムCNV解析を実施したうえで、以下の点について検討を行った。1.同定されたCNVの高解像度解析では、CNVスクリーニングで同定されたCNVに関して、サンガー法を用いてその範囲を塩基レベルで決定した。統合失調症の病態への関与が想定されるCACNA1Cの欠失についてシーケンスを行い、CNVがコーディング領域を欠損させることを確認した。従って、CNVが各遺伝子に機能的影響を与える可能性が高い。2.既報の稀な大規模CNVの関連解析では、22q11.21欠失が統合失調症と遺伝統計学的に有意な関連を認めた。また、患者群で1q21.1欠失、2p16.3欠失、3q29欠失、16p11.2重複を同定したが、各CNVは頻度が極めて低いために、現時点では統計学的に有意な関連は認めなった。3.患者とその両親のゲノムが得られたサンプルは、de novo変異の確認を実施した。患者で同定された16p13.11重複、15q11.2-15q13.11重複について検討し、どちらも両親のいずれか一方が同一CNVを有していた。

4.患者由来リンパ芽球様細胞株を用いた遺伝子発現解析では、統合失調症へ関与が想定されたARHGAP10、CACNA1CのCNVについて検討し、mRNAの発現低下を認めた。この結果は各CNVが遺伝子の発現に影響を与えることで本疾患の病態に関与する可能性を示唆した。統合失調症のCNV解析を行い、既報の大規模CNVや神経発達関連遺伝子のCNVを多数同定した。この中には遺伝子機能に強い影響を与えるものが数多く含まれており、統合失調症のmissing heritabilityの解明に向けて重要な知見をもたらした。加えて、一部についてはCNVの多面発現的効果も確認できたため。24年度が最終年度であるため、記入しない。1.CNV解析の結果に基づいて細胞モデル・動物モデルを作成し、統合失調症の分子病態を明らかにする。2.CNVを有する患者の表現型(精神症状、薬剤反応性、脳画像、認知機能)を明確化する。3.CNVを有する患者の家族のゲノムを解析し、de novo変異の確認やCNVの表現型スペクトラムを検討する。
トキソプラズマ原虫に対する宿主免疫系におけるIRGB6の役割の解明

IRGB6はIRGの一つであり、トキソプラズマ原虫の寄生胞膜に動員された。そこで様々なIRGやGBPの遺伝子欠損マウス胎児由来線維芽細胞(MEF)を作成し、IRGB6の動員について検討した。その結果、IRGA6, IRGB10、GBP1、GBP2、GBPchr3欠損MEFにおいてはIRGB6の寄生胞膜への動員は正常であることを見出した。さらにユビキチンアダプター分子であるp62もトキソプラズマ原虫寄生胞膜へ動員されるが、p62欠損MEFにおいてもIRGB6の寄生胞膜動員は正常であった。しかし、制御性IRGであるIRGM1/IRGM3の二重欠損MEFではIRGB6の寄生胞膜動員は全く見られないことから、IRGB6の寄生胞膜動員はこれらのIRGやGBPの最上流で、IRGM1とIRGM3により制御されていることが示唆された。IRGB6はN末端部位にGTPaseドメインとC末端部位にヘリックス構造を有している。GTPaseドメインに変異を加え、GTPase活性を失ったK69A変異体をIRGB6欠損MEFに戻してもIRGB6は寄生胞膜に蓄積しないことから、IRGB6のGTPase活性が重要であることは既に分かった。一方、C末端部位のヘリックス構造について、IRGB6のファミリー分子のIRGB10のヘリックス構造がIRGB10の細菌の寄生胞膜動員に重要であることを示していたことから、IRGB6のヘリックス構造の重要性についても検討した。その結果、ヘリックス構造中の正帯電極性アミノ酸に点変異を加えたIRGB6変異体をIRGB6欠損細胞に戻し寄生胞膜への蓄積を検討した結果、それらのアミノ酸が重要であることが分かった。当初の計画通りに、目標を達成できているから。当初の計画に従って、1)IRGB6による生体レベルでのトキソプラズマ原虫排除のメカニズムの解明および2) IRGB6によるサルモネラ菌に対する殺菌機構及びインフラマソーム活性制御機構の解明を行う。所内の臨時の追加予算が付いたため、2018年度に予定していた消耗品費を使う必要がなくなった。2019年度は多種類の遺伝子改変マウスを作製する必要があるため、その分を次年度に持ち越した。
数学的モデリングを核とした科学教育カリキュラムに関する実証的な研究

本研究は,数学の応用,モデリングといった視座からの実践的な研究であり,とりわけ中学校の数学の授業のあり方に焦点をしぼり研究を推進している。これまで授業で取り扱いが困難であるとされた題材の教材化を目指し,現実世界における問題を,数学の授業で積極的に取り扱おうと試行している。また,研究の方法としては,いわゆるアクションリサーチを採用している。実際の授業研究に対し,研究者として単に参与観察の立場に留まらず,指導者(授業者)として授業の構想や展開に直接的に深く関わる方法を採用している。本研究で開発した主な教材は,「生活の中の数学(学校図書)」にまとめ発信している。そこでは次のような20の教材を具体的に紹介している。第1話鶏卵の重さを調べる第2話ひと裁ち折り紙:アルファベットの巻き第3話最適なバトンパスを求める第4話三角グラフの利用第5話群論を背景とした模様づくり第6話個人的な意志決定と社会的意思決定第7話じゃんけんに必勝法がある!?第8話2時+3時=?第9話ミカンの表面積を探る第10話日常的表現と数学的表現第11話スライドパズルの探究第12話フラクタル模様からの刺激第13話ISBNの秘密を探る第14話誤り訂正符号の教材化第15話数学で生け花を捉える第16話Kielaというアフリカの遊び第17話現代暗号に活きる数学第18話あみだくじのベクトル的な扱い第19話高度測定板による測量第20話πの探究本研究は,数学の応用,モデリングといった視座からの実践的な研究であり,とりわけ中学校の数学の授業のあり方に焦点をしぼり研究を推進している。第1話鶏卵の重さを調べる第2話ひと裁ち折り紙:アルファベットの巻き第3話最適なバトンパスを求める第4話三角グラフの利用第5話群論を背景とした模様づくり第6話個人的な意志決定と社会的意思決定第7話じゃんけんに必勝法がある!?第8話2時+3時=?第9話ミカンの表面積を探る第10話日常的表現と数学的表現第11話スライドパズルの探究第12話フラクタル模様からの刺激第13話ISBNの秘密を探る第14話誤り訂正符号の教材化第15話数学で生け花を捉える第16話Kielaというアフリカの遊び第17話現代暗号に活きる数学第18話あみだくじのベクトル的な扱い第19話高度測定板による測量第20話πの探究一連の本研究活動は,数学の応用,モデリングといった視座からの実践的な研究であり,主に中学校の数学の授業に関わって実施した。広く現実世界における生の問題をも,数学の授業で積極的に取り扱おうと試行した。また,研究の方法としては,いわゆるアクションリサーチを採用した。実際の授業研究に対し,研究者として単に参与観察の立場に留まらず,指導者(授業者)として授業の構想や展開に直接的に深く関わる方法を採用した。とりわけ,本研究の本年度の主たる成果として,2004年2月にドイツのドルトムントで開催されたICMIの国際会議(International Commission on Mathematical Instruction, Study14 : Application and Modelling in Mathematics Education)での講演や日本数学教育学会論文発表会等に論文を発表した。そこでは,モデリング過程を学習心理学的な視座から捉えようとする提案を行なっている。具体的には,数学の授業における問題解決に際し,学習者の保有する心理的実感と,解決場面における客観的事実とのギャップやズレに着目し,それらのギャップを積極的に捉えることで,モデリングの授業がより有機的なものになりうるという主張をしている。ギャップやズレについて,「ギャップやズレが,どこに起こりうるのか」という発生に関わる議論に留まらず,「ギャップやズレが,どのような状態なのか」その様相の詳細な把握まで踏み込んで分析・考察した。事前にそのようなギャップを詳細に整理しておくことで,教師が生徒の抱くであろうギャップをより明示的に予想し把握できうることを明らかにした。これまで授業で取り扱いが困難であるとされた題材の教材化を目指し,現実世界における問題を積極的に取り扱うべく試行している。実際の授業研究に対して,研究者として単に参与観察の立場に留まらず,指導者(授業者)として授業の構想や展開に直接的に深く関わる方法を採用している。本研究の本年度の主たる成果は,日本数学教育学会等で論文として発表している。具体的には,本研究を通し次のような成果(1)(3)を得た。(1)デジタル情報に関わる新教材の開発

デジタル情報について,情報の共有性,安全性・認証性,効率性,訂正・復元性といった各観点に注視し,中学校数学における新たな教材を開発した。(2)グラフ電卓の回帰機能を利用した授業の構想と実施鶏卵の重量が経過時間に伴って1次関数的に減少するという現象を捉え,グラフ電卓の回帰機能を利用し採卵時の重量を推定する活動を1次関数の授業例として提出した。(3)認知的葛藤の視座からのモデリング過程の捉えモデリング過程を学習者の心理的な立場から捉え直した。学習者が保有する経験や素朴な実感と解決場面における客観的事実とのギャップに着目し,それらのギャップを積極的に捉えることで,モデリングの授業がより有機的なものになりうるとの知見を得た。本研究は,数学の応用,モデリングといった視座からの実践的な研究であり,とりわけ中学校の数学の授業のあり方に焦点をしぼり研究を推進している。これまで授業で取り扱いが困難であるとされた題材の教材化を目指し,現実世界における問題を,数学の授業で積極的に取り扱おうと試行した。また,研究の方法としては,いわゆるアクションリサーチを採用している。実際の授業研究に対し,研究者として単に参与観察の立場に留まらず,指導者(授業者)として授業の構想や展開に直接的に深く関わる方法を採用する。本研究の成果をもとに博士学位論文にまとめた(平成18年3月に東北北大学より学位授与)。本研究を通して,『数学的な内容面のみならず,テクノロジーの利用,学習者の心理的な側面からの枠組みといった多元的な視点からの捉えによって,「現実世界の問題の教材化」の可能性は少なからず高まる。』を明らかにした。なお,博士学位論文の題目と目次は次の通りである。博士学位論文:数学教育における「現実世界の問題の教材化」に関する実践的研究<目次>序章数学教育上の課題と研究の意図第1章数学教育における現実世界の問題の教材化第2章現実世界の問題の解決過程におけるテクノロジーの利用第3章現実世界の問題の解決過程における学習者の活動第4章研究I:関数分野に関わる教材「リレーの問題(その1)」第5章研究II:関数分野に関わる教材「リレーの問題(その2)」第6章研究III:関数分野に関わる教材「卵の問題」第7章研究IV:統計分野に関わる教材「肥満度の問題」第8章研究V:代数分野に関わる教材「RSA暗号の問題」終章各章のまとめと得られた知見引用・参考文献および資料本研究は,数学の応用,モデリングといった視座からの実践的な研究であり,とりわけ中学校の数学の授業のあり方に焦点をしぼり研究を推進している。これまで授業で取り扱いが困難であるとされた題材の教材化を目指し,現実世界における問題を,数学の授業で積極的に取り扱おうと試行している。実際の授業研究に対し,研究者として単に参与観察の立場に留まらず,指導者(授業者)として授業の構想や展開に直接的に深く関わる方法を採用している。本研究で開発した主な教材は,「生活の中の数学(学校図書)」にまとめ発信している。そこでは次のような20の教材を具体的に紹介している。第1話鶏卵の重さを調べる
世界初の新規樹立細胞株による基礎的研究：乳房外ページェット病の抗男性ホルモン療法

乳房外ページェット病は細胞生物学的な解析がなく多くの点が不明である。申請者らは本疾患患者病変部由来の細胞株の樹立を世界に先駆けて成功した(EMPE cell)。今回、EMPE cellを用いて細胞生物学的な検討、特に増殖因子について検討した。EMPE cellは男性ホルモンレセプター(AR)を発現し、EMPE cellは男性ホルモン依存性の増殖を示した。またEGFが強い増殖促進効果を示した。EMPE cellにおいてはEGFなどの増殖因子による別経路のリガンド非依存的なARの活性化が主経路である可能性が示唆された。乳房外ページェット病は、その由来や、その他細胞生物学的な解析が現在まで多くの点が不明である。その理由として、がん研究に必須である、細胞株がこれまで存在しなかったことが大きな原因として挙げられる。研究代表者らは近年、乳房外ページェット病患者病変部由来の細胞株を樹立することに世界に先駆けて成功した。この細胞株は、培養開始から既に数年の期間を経ているが、安定して増殖している。現在のところ、乳房外ページェット病は皮膚付属器のアポクリン腺に由来する腺がんのひとつとされており、臨床の現場では、乳がんもしくは腺がんに準じた抗がん剤を用いる化学療法がなされている。しかし、乳がんその他腺がんに有効な抗がん剤は乳房外ページェット病に対しては有効率が低いことが問題となっている。すなわち、乳房外ページェット病は、腺がんのなかでも、特異な性質をもつがんと考えられる。今回、われわれが樹立した乳房外ページェット病細胞株を用いてその細胞生物学的な検討、特に増殖因子について検討をおこなった。本細胞株はEGF添加により増殖が促進されること、EGFリセプターを発現していることが確認された。前立腺がんにおいては男性ホルモンが腫瘍増殖作用を示し、男性ホルモン阻害剤が抗腫瘍作用を示すことが明らかとなり、臨床応用されている。乳房外ページェット病もその一部の症例は男性ホルモンリセプターを発現している。そのためin vitroの系で乳房外ページェット病腫瘍細胞における男性ホルモンの増殖活性の有無について検討した。乳房外ページェット病腫瘍細胞の男性ホルモン依存性についての検討はin vitroの系で本細胞株を抗アンドロゲン薬存在下に培養し、各濃度での細胞数および細胞周期の測定によりおこなった。またウエスタンブロットで細胞周期関連タンパク質の発現動態を経時的に定量し、詳細な検討をおこなった。1.乳房外ページェット病腫瘍細胞の男性ホルモン依存性についての検討:われわれが樹立した乳房外ページェット病由来細胞株が、細胞培養系において男性ホルモン依存性の増殖を示すか否かを検討をおこなった。乳がんと異なり、乳房外ページェット病は免疫組織化学的にエストロゲン・リセプターの発現はなく、あっても陽性率は低いことがすでに報告されている。われわれの細胞株におけるエストロゲン・レセプターの発現を免疫組織化学的とウエスタン・ブロットにて検索をしたが、本細胞株はエストロゲン・レセプターの発現は認めなかった。そのため、男性ホルモンに着目して検討をおこなった。われわれが樹立した乳房外ページェット病由来細胞株の男性ホルモン依存性について細胞培養系で検討した。免疫細胞染色にて本細胞株の核におけるアンドロゲン・レセプター(AR)の発現が認められた。また、ウエスタン・ブロットにてARの発現が確認された。培養細胞実験系において、本細胞株の男性ホルモン依存性増殖能が認められた。2.乳房外ページェット病腫瘍細胞に対する男性ホルモン阻害剤の増殖阻害作用についての検討:われわれが樹立した乳房外ページェット病由来細胞株を用い、細胞培養系にて男性ホルモン阻害剤の腫瘍細胞の増殖阻害効果があるかどうかの検討をおこなった。培養細胞実験系において、本細胞株は男性ホルモン阻害剤により、増殖抑制が認められた。3.乳房外ページェット病腫瘍細胞において男性ホルモンにより活性化される遺伝子についての検討:上記1, 2により本細胞株の男性ホルモン感受性が明らかとなれば、男性ホルモンで活性化をおこなった。遺伝子についてDNAマイクロアレイによる網羅的な検索をおこなった。その理由として、がん研究に必須である、細胞株がこれまで存在しなかったことが大きな原因である。申請者らは本疾患患者病変部由来の細胞株を樹立することに世界に先駆けて成功した(EMPE cell)。現在のところ本疾患はアポクリン腺由来の腺がんとされており、乳がんもしくは腺がんに準じた抗がん剤を用いる化学療法がなされている。しかし、乳がんその他腺がんに有効な抗がん剤は本疾患に対しては有効率が低いことが問題となっている。すなわち、本疾患は腺がんのなかでも、その他の腺がんとは異なる特異な性質をもつがんと考えられる。

本疾患はその一部の症例では男性ホルモンリセプター(AR)が発現しており、EMPE cellもARを発現している。そのためin vitroの系でEMPE cellにおける男性ホルモンの増殖活性の有無について検討した。その結果、EMPE cellは、細胞培養系において男性ホルモン依存性の増殖を示すことが、われわれの研究により確認された。EMPE cellは男性ホルモン依存性の増殖を示す一方、他の増殖因子、EGFについて検討した結果、EMPE cellはEGFの主たるレセプターであるEGFレセプターの発現がないにもかかわらず、EGFは強い増殖促進効果を示した。ARはリガンドである男性ホルモンにより活性化されるが、それとは別経路で、EGFなどの増殖因子がリガンド非依存的にARの活性化を起こすことが知られており、EMPE cellにおいてはEGFなどの増殖因子による別経路のリガンド非依存的なARの活性化が主経路である可能性が示唆された。皮膚科学in vitroの系での乳房外ページェット病腫瘍細胞の男性ホルモン依存性についての検討は、抗アンドロゲン薬を用いた系での細胞数、細胞周期の測定およびウエスタンブロットで細胞周期関連タンパク質の発現動態の経時的定量を終えた。現在、アンドロゲンによる細胞増殖刺激についての検討をおこなっており、おおむね順調に進展している。計画した実験の根幹であるところの乳房外ページェット病腫瘍細胞株の細胞培養系における男性ホルモン依存性についての検討を充分におこなえたこと、また、その他の実験もおおむね計画に沿っていること。今後、in vitroの系での乳房外ページェット病腫瘍細胞の男性ホルモン依存性についての検討をより詳細におこなう。すなわち、作用点の異なる抗アンドロゲン薬を用いた系での細胞数、細胞周期の測定およびウエスタンブロットで細胞周期関連タンパク質の発現動態の経時的定量を行い、作用点の異なる抗アンドロゲン薬を比較検討する予定である。今後はin vivoの系での検討をおこなう。ヌードマウス移植実験系を用いて、乳房外ページェット病腫瘍細胞株の男性ホルモン依存性について検討する。また、本細胞株の男性ホルモン感受性のメカニズムを明らかにするとした当初の計画のとおり、本細胞株において男性ホルモン刺激で活性化する遺伝子についてDNAマイクロアレイによる網羅的な検索をおこなう。細胞培養一般において必要な試薬および器具、そしてDNAマイクロアレイによる網羅的な検索に使用する予定である。
土砂災害予兆検知のための小型MT法探査装置の開発

シミュレーションを用いて、土砂災害を引き起こす地下水分布を比抵抗変化により把握するために必要な仕様を決定し、小型MT探査装置を試作する。安価で高性能な最新の半導体を積極的に採用し、磁場の測定はインダクションコイルではなく小型の磁場センサを採用し、小型化を行う。探査装置の耐ノイズ性を高め測定精度を向上する。複数の探査装置をワイヤレスセンサネットワークで接続し、探査システムを構築する。浸透水の分布を測定し、探査装置の問題点を洗い出し、測定回路やソフトウェアに改良を加えて、実用的な小型MT探査装置を開発する。
新規リゾホスファチジン酸受容体群による病態制御機構の解明

本研究で使用しているマウスと同じC57BL/6N遺伝背景を持つコンジェニックマウスであるLy5.1マウスより骨髄を採取した。これを野生型またはLPA4欠損レシピエントマウスに移植し、キメラマウスを作製した。これらキメラマウスに5-FUの投与を行い一時的な骨髄抑制ストレスを誘導したところ、野生型レシピエントマウスと比較してLPA4欠損レシピエントマウスは致死率が有意に高かった。一方、野生型またはLPA4欠損マウス由来の骨髄をLy5.1マウスに移植したキメラマウスでは、5-FUへの感受性に違いは認められなかった。以上の結果は骨髄造血細胞ではなく間質細胞が5-FUへの感受性を制御することを示唆しており、骨髄におけるLPA4の発現が血球系細胞よりもCD45-Ter119-CD31-間質細胞、特にPDGFRα+間葉系幹細胞で格段に高いことと矛盾しなかった。以上の結果から、間質細胞に発現するLPA4が造血幹細胞ニッチの機能をもたらす可能性が考えられた。骨髄抑制ストレス後の回復期において骨髄間質細胞が産生するSCF等のサイトカインは造血回復のための重要な因子である。5-FUを投与したマウス骨髄の細胞外液(組織間液)に含まれるSCF濃度は野生型マウスに比べLPA4欠損マウスで有意に低かった。また、培養したマウス骨髄由来の間質細胞でも、SCF mRNAの発現レベルが野生型マウスに比べLPA4欠損マウスで有意に低かった。以上の結果は、PDGFRα+間葉系幹細胞においてLPA4はSCFの産生を制御することによって、造血に寄与する可能性が考えられた。LPA4はGα12/13やGαqと共役することが知られているが、SCFの発現を調節する細胞内シグナルの解明は今後の課題と考える。26年度が最終年度であるため、記入しない。マウス骨髄中のLPA4の発現を確認した。FACSによって分取した骨髄間質細胞(CD45-Ter119-CD31-)および間葉系幹細胞(CD45-Ter119-CD31-PDGFRα+Sca-1+)、成熟血球細胞(Lineage+)、造血幹細胞(CD34-Lin-Sca-1+c-kit+)、造血前駆細胞(CD34+Lin-Sca-1+c-kit+)のLPA4のmRNAの発現量を測定したところ、血球系細胞にはLPA4はほとんど発現しておらず、骨髄間質細胞にLPA4が発現していることが明らかとなった。非常に興味深いことに間葉系幹細胞では更に高いレベルで発現していた。骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞、成熟血球細胞の解析を生理的条件下のマウスで行ったところ、LPA4欠損マウスの骨髄中の造血幹細胞数は変化していないにもかかわらず、造血前駆細胞は減少していた。しかし、骨髄造血幹細胞・前駆細胞の細胞周期には明らかな差異は認められなかった。骨髄細胞のコロニー形成能をin vitroで評価するCFCアッセイでは、LPA4欠損マウスの骨髄細胞由来のコロニーは野生型マウスと比較して減少しており、このデータはLPA4欠損マウスの造血前駆細胞が減少していることと相関すると考えられる。LPA4欠損マウスの造血幹細胞ニッチの長期骨髄再構築能を確認するために、C57BL/6N背景マウスのコンジェニックマウスであるLy5.1マウスの骨髄細胞をLPA4欠損マウスに移植し、骨髄キメラマウスを作製した。野生型マウスとLPA4欠損マウスとの間に長期骨髄再構築能に明らかな差異は認められなかった。次に骨髄抑制ストレス下でのLPA4欠損マウスの造血幹細胞ニッチの機能を評価した。マウスに5-FUの投与またはX線照射を行い一時的な骨髄抑制状態を誘導したところ、野生型マウスと比較してLPA4欠損マウスは致死率が有意に高かった。また、骨髄抑制後のLPA4欠損マウスの末梢血中の白血球数は野生型と比較し早期に減少し、骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞の数の回復が遅延していた。

5-FUを投与したマウス骨髄の細胞外液(組織間液)に含まれるSCF濃度は野生型マウスに比べLPA4欠損マウスで有意に低かった。また、培養したマウス骨髄由来の間質細胞でも、SCF mRNAの発現レベルが野生型マウスに比べLPA4欠損マウスで有意に低かった。以上の結果は、PDGFRα+間葉系幹細胞においてLPA4はSCFの産生を制御することによって、造血に寄与する可能性が考えられた。LPA4はGα12/13やGαqと共役することが知られているが、SCFの発現を調節する細胞内シグナルの解明は今後の課題と考える。26年度が最終年度であるため、記入しない。実験系の確立は順調であり、研究課題の達成に支障を来す問題は生じていない。今年度以降は、実験を繰り返し、論文発表に向けてデータを蓄積する予定である。骨髄抑制後の回復期において骨髄間質細胞が産生するCXCL12やSCF等のサイトカインは造血回復のための重要な因子であるが、これらのサイトカインの発現を調節するメカニズムは不明である。また、LPA4欠損マウスの表現系から、骨髄抑制後の回復期にLPA4の機能は重要であると考える。しかもLPA4が間葉系幹細胞に高発現しているという本研究で明らかになった知見より、同じ間葉系細胞であるCAR細胞にもLPA4が発現していることが想定される。以上のことから、H26年度はLPA4がCAR細胞においてCXCL12やSCFの発現を調節する重要な分子の1つではないかとの作業仮説を立てて研究を進める。
ファイトケミカルゲノミクス:植物化学的多様性のゲノム基盤

植物は20万種に及ぶ化学成分を生産していると考えられ、これらの植物化学成分は医薬品、食料、工業・エネルギー原料として用いられている。本研究では、メタボロミクスとトランスクリプトミクスという手法を用いて、これらの有用植物成分を生産する原理のゲノム基盤を解明した。特に、健康機能を有するフラボノイドや含硫黄植物成分、アルカロイドなどの生合成遺伝子や代謝的なネットワークを解明することができた。シロイヌナズナなどの高等植物のゲノム配列が解読され、その後のゲノム機能科学が重要なテーマとして注目されている。本研究では、メタボロミクスと分子生物学的手法を用いて植物の有する化学的多様性のゲノム基盤解明を目的とする。そのため、ゲノムモデル植物であるシロイヌナズナと薬用・健康機能植物を用いてファイトケミカルゲノミクス研究を行う。モデル植物であるシロイヌナズナのメタボロミクス研究において網羅的な代謝産物の単離,構造決定は必須である。そこで,植物メタボロミクスに応用することを目的としてシロイヌナズナの代謝物の同定を行った。シロイヌナズナの全草(20kg)をMeOHによって抽出し,得られた抽出物をH20に懸濁後,さらにn-hexane,EtOAc,CHCl_3及びn-BuOHで順次分配した。得られた粗抽出物のうちn-BuOH画分をHP20,Sephadex LH 20カラム,分取HPLCによって精製し,単離した化合物について各種機器分析によるスペクトルデータの解析を行った。その結果,新規化合物フラボノイドを含む33種の化合物を同定及び構造決定した。また,シロイヌナズナのフラボノイド生合成の包括的解明を目的として,メタボロミクス/トランスクリプトミクスに基づいたフラボノイド生合成遺伝子の網羅的同定を試みた。フラボノイドの多様性に寄与する配糖化酵素遺伝子をターゲットとした遺伝子共発現解析を行い,配糖化酵素遺伝子の絞り込みを行った。最も相関の高い遺伝子について,一次配列による候補遺伝子の機能推定,該当T-DNA挿入変異体のフラボノイドターゲット分析,組換え蛋白質を用いた生化学実験を行い,フラボノール7位配糖化酵素をコードしていることを明らかにした。さらに,より包括的な遺伝子機能同定を視野に入れ,シロイヌナズナに存在するフラボノイドの網羅的分析とノンターゲットでのフラボノイド代謝相関遺伝子の絞り込みを行っている。モデル植物であるシロイヌナズナのメタボロミクス研究において網羅的な代謝産物の単離・構造決定は必須である。そこで、植物メタボロミクスに応用することを目的としてシロイヌナズナの代謝物の同定を行った。シロイヌナズナにおけるアントシアニンおよびフラボノール生合成を制御する転写因子を2個同時発現したラインを作出し、そのフラボノイド成分の探索および遺伝子発現ネットワークを解析した。その結果、新規のフラボノイド成分の単離構造決定に成功した。また、シロイヌナズナのフラボノイド生合成の包括的解明を目的として、メタボロミクス/トランスクリプトミクスに基づいたフラボノイド生合成遺伝子の網羅的同定を試みた。フラボノイドの多様性に寄与する配糖化酵素遺伝子をターゲットとした遺伝子共発現解析を行い、配糖化酵素遺伝子およびその他の関連遺伝子の絞り込みを行った。相関の高い遺伝子について、一次配列による候補遺伝子の機能推定、該当T-DNA挿入変異体のフラボノイドターゲット分析、組換え蛋白質を用いた生化学実験を行い、フラボノール3位アラビノース配糖化酵素をコードしていることを明らかにした。また、システイン合成系に関与するセリンアセチル転移酵素の遺伝子群の網羅的な解析を多重挿入転移体を用いて行った。さらに、カンプトテシンアルカロイドを生産する細胞に特異的に発現する遺伝子の機能解析を、RNA干渉法を用いたin vivoアッセイで検討した。前年度に引き続き、シロイヌナズナにおけるアントシアニンおよびフラボノール生合成を制御する転写因子を2個同時発現したラインを作出し、そのフラボノイド成分の探索および遺伝子発現ネットワークを解析した。その結果、野生型株Col-0、過剰発現体MYB12OX、pap1-D、WOX1-1,2の5系統についてメタボローム及びトランスクリプトームの統合解析を行った結果、WOX1-1,2においてMYB12OXのフラボノール量とpap1-Dのアントシアニン量の加算的な過剰蓄積が認められた。一方、遺伝子発現においてはWOX1特異的に発現誘導を受けているストレス応答関連遺伝子が認められた。本結果はストレス応答におけるストレス応答段階のフラボノイド蓄積、抗酸化化合物高生産と関連するフィードフォワードな制御を考える上で重要な知見である。また、システイン合成系に関与するセリンアセチル転移酵素およびベータ-置換アラニン類合成酵素遺伝子群の網羅的な解析を多重挿入転移体や組換えタンパク質を用いて行った。さらに、カンプトテシンアルカロイドを生産する細胞に特異的に発現する遺伝子の機能解析を、RNA干渉法を用いたin vivoアッセイでその機能を検討した。今年度は特にチトクロームP45O遺伝子や転写因子について検討を行った。また、同様の手法でディファレンシャルスクリーニング法を用いて、マメ科植物でのキノリチジンアルカロイド生合成に関する遺伝子の取得と機能解析をすすめた。

本年度は、前年度までに得られたモデル植物シロイヌナズナの知見を元に、比較ゲノム機能科学と分子生物学的・生化学的解析によって、主に薬用および健康機能植物での二次代謝成分生産システム研究に展開した。臨床的に用いられている抗腫瘍性アルカロイドであるカンプトテシンの生産細胞の網羅的な遺伝子発現プロファイルとアルカロイド代謝プロファイリングから、その生合成に重要と考えられる転写制御因子およびP450酸素添加酵素をコードする遺伝子を絞り込んだ。これらの候補重要遺伝子をRNAi法により遺伝子発現を抑制した形質転換体および高発現形質転換体を作成し、その細胞のアルカロイド代謝プロファイリングによってアルカロイド生産と関連しているか否か検討した。同様の手法をマメ科植物のキノリチジンアルカロイドの生合成系に応用して、キノリチジンアルカロイド生合成の初発段階に関与する酵素遺伝子を始めて同定しその機能を確定した。同時にこれらの生合成酵素タンパク質をGFPに融合し、その細胞内局在性を検討した。また、含硫黄代謝成分についても同様の手法でシロイヌナズナおよびユリ科ネギ属の植物を用いて二次代謝成分生合成のゲノム機能探索を進めた。