hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
グライコミクス技術による腫瘍関連糖タンパク質の探索と腫瘍マーカーへの応用

先に報告者らは,ヘテロ核リボ核酸タンパク質(hnRNP)が腫瘍マーカーとして知られるシアリルルイスx(sLe^x)の付加タンパク質であることを示唆する結果を得ている.本研究では, hnRNPファミリーの一部はsLe^xとゴルジ体で共局在しており,それらの発現レベルはDNA合成期から分裂準備期にかけて亢進していることを見出した.また, sLe^xの生合成は主にフコース転移酵素VIが関与しており,この酵素の発現を抑制することにより,大腸癌細胞の増殖が抑制されることを見出した.これらの結果より, sLe^xとhnRNPは,大腸癌の増殖に関係している可能性があり, hnRNPは新しい腫瘍マーカーとして利用できる可能性があることが示唆された.先に報告者らは,ヘテロ核リボ核酸タンパク質(hnRNP)が腫瘍マーカーとして知られるシアリルルイスx(sLe^x)の付加タンパク質であることを示唆する結果を得ている.本研究では, hnRNPファミリーの一部はsLe^xとゴルジ体で共局在しており,それらの発現レベルはDNA合成期から分裂準備期にかけて亢進していることを見出した.また, sLe^xの生合成は主にフコース転移酵素VIが関与しており,この酵素の発現を抑制することにより,大腸癌細胞の増殖が抑制されることを見出した.これらの結果より, sLe^xとhnRNPは,大腸癌の増殖に関係している可能性があり, hnRNPは新しい腫瘍マーカーとして利用できる可能性があることが示唆された.シアリルルイスxは,糖鎖癌抗原の一つであり,腫瘍マーカーとして臨床応用されている.しかし,シアリルルイスxをもつタンパク質として同定されている分子は少ない.報告者はこれまでに,大腸癌細胞株T84及びHT-29のグライコミクスを行い,シアリルルイスxをもつタンパク質の候補として,RNP A1, A2/B1, A3,及びLなどのヘテロ核リボ核酸タンパク質/RNA結合タンパク質(hnRNP)の一部を同定した.本研究では,シアリルルイスxとhnRNPファミリータンパク質にターゲットを絞って,発癌とhnRNPファミリータンパク質の発現の関係,発癌とhnRNPファミリータンパク質のシアリルルイスx修飾の関係,及び腫瘍マーカーとしての可能性を明らかにする.本年度は,まず,HT-29細胞におけるシアリルルイスx抗原の細胞内局在性を調べた.腫瘍マーカーSLXとして知られる抗シアリルルイスx抗体を用いて蛍光免疫染色を行ったところ,シアリルルイスx含有糖タンパク質は主として,核膜周辺部およびゴルジ体に存在することが確認された.そこで,ZR-75-30細胞(乳癌細胞),BxPC-3細胞及びCapan-1細胞(膵臓癌細胞),HepG2細胞(肝臓癌細胞),HL-60細胞(骨髄性白血病細胞),K562細胞(骨髄性白血病細胞),乳腺上皮正常細胞,気管支上皮正常細胞,血管内皮細胞,皮膚上皮細胞,間葉系幹細胞等から核タンパク質/ゴルジ体タンパク質画分を抽出し,抗シアリルルイスx抗体を用いたウエスタンブロット法を行ったところ,RNP A1, A2/B1, A3の分子量に相当する位置に,癌細胞特異的にシアリルルイスx含有糖タンパク質が確認された.糖鎖癌抗原であるシアリルルイスxは,現在,腫瘍マーカーとして臨床応用されているが,そのキャリアタンパク質はほとんど同定されていない.報告者はこれまでに,シアリルルイスxの新規キャリアタンパク質候補としてヘテロ核リボ核酸タンパク質(hnRNP)ファミリーの一部を同定してきた.本研究の目的は,発癌とhnRNPファミリータンパク質の発現の関係,発癌とhnRNPファミリータンパク質のシアリルルイスx修飾の関係,及び腫瘍マーカーとしての可能性を検討することである今年度は,まず,蛍光免疫染色により,大腸癌細胞株HT-29におけるhnRNP A1とA2/B1の細胞内局在を調べた.その結果,核内だけではなくゴルジ体部分への局在も認められ,昨年度解析したシアリルルイスxの細胞内分布と一部一致していた.つぎに,HT-29細胞株と胎児肺線維芽細胞TIG 1-20細胞株におけるフコース転移酵素(Fuc-T)の発現レベルを比較した.HT-29およびTIG 1-20細胞株より膜タンパク質画分を抽出し,シアリルルイスxの生合成過程に関与することが知られているFuc-T IIIFuc-T VIIについてウエスタンブロット法を行ったところ,HT-29におけるFuc-T IIIとVIの発現亢進が認められた.そこで,RNA干渉法によりHT-29における両遺伝子発現をノックダウンし,MTTアッセイにより細胞増殖能を測定したところ,Fuc-T VIのノックダウンによりHT-29の増殖能が有意(P<0.05)に低下した以上のことから,HT29細胞において,シアリルルイスx付加タンパク質候補であるhnRNPA1とA2/B1は,ゴルジ体にも存在する可能性があること,また,シアリルルイスx生合成に関与するFuc-T VI発現は,増殖に関与していることが示唆された糖鎖癌抗原であるシアリルルイスx(sLe^X)は,腫瘍マーカーとして臨床応用されているが,同定されているキャリアタンパク質は少ない.報告者はこれまでに,大腸癌細胞のグライコミクスにより,sLe^Xの新規キャリアタンパク質候補として,ヘテロ核リボ核酸タンパク質(hnRNP)ファミリータンパク質であるhnRNPA1,A2/B1,A3などを同定してきた.本研究の目的は,発癌とhnRNP

ファミリータンパク質の発現の関係,発癌とmRNPファミリータンパク質のsLe^X修飾の関係,及び腫瘍マーカーとしての可能性を検討することである.今年度は以下の課題について研究を実施した.1.hnRNPA1アイソフォームの同定2次元電気泳動により分離されたhnRNPA1をゲルから回収し,プロテアーゼ消化後,LC/MS^2によるペプチドマッピングを行った.その結果,大腸癌細胞株HT-29で発現している主要なアイソフォームは,一部のアミノ酸配列が欠落している"A1-A"であることが示唆された.2.細胞周期間における発現レベルの推移発癌とsLe^X修飾,及び発癌とhnRNPファミリータンパク質の関係を明らかにするために,異なる細胞周期間における発現レベルを解析した.その結果,抗sLe^X抗体に反応性を示すhnRNPファミリータンパク質の発現レベルは,DNA合成期から分裂準備期にかけて亢進することが明らかとなった.hnRNPがsLe^Xキャリアタンパク質か否かを検証するために,試料をシアリダーゼで消化した後,抗sLe^X抗体との反応性を確認し,抗sLe^X抗体と抗原との親和性は,ノイラミニダーゼ消化により低下することを確認した.つぎに,α1-3フコースと結合するヒイロチャワンタケレクチン(AAL)精製物のLC/MS^2解析を行ったところ,hnRNPファミリータンパク質が同定され,hnRNPにフコースが結合している可能性が示唆された.以上のことから,hnRNPがsLe^Xキャリアプロテインである可能性が引き続き示唆された.
有機金属化合物の湿式エピタキシー反応制御による圧電性LiNbO_3膜の作製

本研究は,表面弾性波素子,電圧機能素子,集積光学回路素子として注目されているLiNbO_3の結晶性配向膜の合成のための,有機金属化合物の溶液中での配位状態と結晶化過程の制御因子について研究することを目的としている.出発有機金属化合物として,リチウムエトキシド(LiOEt)とニオブエトキシド(Nb(OEt)_5)の等比組成試料を用いた.脱水,精製したエタノール中での溶解反応によって,中間化合物として,ダブルアルコキシドが生成することを見出した.この注意深い反応によって生成するダブルアルコキシドの加水分解によって, 250°Cの低温で化学量論性の結晶性LiNbO_3の合成が可能となった.有機金属アルコキシドの溶解中反応は, FTIR, NMRによって,逐次解析を行ない,反応過程を追跡しつつ,縮合反応を制御することが必要であった.LiNbO_3粉末の合成結果をもとにして,加水分解用の水の量を調節し,金属アルコキシドの縮合による溶液の粘性制御を行った.粘性を67cPに調節することによって,基板上に膜をデップコーテングすることが可能であることを見出した.この生成膜を250°C以上に加熱することによって,結晶性のLiNbO_3膜の合成が可能となった.シリコン基板上に生成させた結晶性のLiNbO_3膜は選択的配向を示さなかったが.サファイア基板上に生成させた膜は選択的配向を示し,サファイア(d-Al_2O_3)における酸素充テン層とLiNbO_3の酸素充てん層とのマッチングが,生成するLINbO_3結晶性膜の配向を規制することが明らかになった.この基板とLiNbO_3との界面制御によるエピタキシー反応によって,各方位に配向した結晶性のLiNbO_3選択配向膜の作製が可能であることを見出した.今後は溶液反応のより厳密な制御と結晶化過程の制御による材料創製のための反応制御因子を明らかにしていくことが必要である.本研究は,表面弾性波素子,電圧機能素子,集積光学回路素子として注目されているLiNbO_3の結晶性配向膜の合成のための,有機金属化合物の溶液中での配位状態と結晶化過程の制御因子について研究することを目的としている.出発有機金属化合物として,リチウムエトキシド(LiOEt)とニオブエトキシド(Nb(OEt)_5)の等比組成試料を用いた.脱水,精製したエタノール中での溶解反応によって,中間化合物として,ダブルアルコキシドが生成することを見出した.この注意深い反応によって生成するダブルアルコキシドの加水分解によって, 250°Cの低温で化学量論性の結晶性LiNbO_3の合成が可能となった.有機金属アルコキシドの溶解中反応は, FTIR, NMRによって,逐次解析を行ない,反応過程を追跡しつつ,縮合反応を制御することが必要であった.LiNbO_3粉末の合成結果をもとにして,加水分解用の水の量を調節し,金属アルコキシドの縮合による溶液の粘性制御を行った.粘性を67cPに調節することによって,基板上に膜をデップコーテングすることが可能であることを見出した.この生成膜を250°C以上に加熱することによって,結晶性のLiNbO_3膜の合成が可能となった.シリコン基板上に生成させた結晶性のLiNbO_3膜は選択的配向を示さなかったが.サファイア基板上に生成させた膜は選択的配向を示し,サファイア(d-Al_2O_3)における酸素充テン層とLiNbO_3の酸素充てん層とのマッチングが,生成するLINbO_3結晶性膜の配向を規制することが明らかになった.この基板とLiNbO_3との界面制御によるエピタキシー反応によって,各方位に配向した結晶性のLiNbO_3選択配向膜の作製が可能であることを見出した.今後は溶液反応のより厳密な制御と結晶化過程の制御による材料創製のための反応制御因子を明らかにしていくことが必要である.
過去と将来の気候における南極氷床の変動と力学的挙動に関する数値シミュレーション

本研究では、南極とグリーンランド氷床の過去と将来の変動を、数値モデルによって解析した。重要な成果として、最終氷期(2万年前)における南極氷床の棚氷が現在よりも小さかったにも関わらず、その底面融解量が現在よりも大きかったことが判明した。我々はこの数値モデルを用いて、様々な温暖化シナリオの下で将来の氷床変動を見積もる国際プロジェクトSeaRISEに参画した。その結果、最も大きな気候変動シナリオRCP8.5における100及び500年後の海水準上昇への寄与は、南極氷床が0.1及び1.5 m、グリーンランド氷床が0.2及び2.0 mと示された。これらの成果はIPCC AR5の記述に引用された。SeaRISE("Sea-level Response to Ice Sheet Evolution"; http://tinyurl.com/srise-lanl, http://tinyurl.com/srise-umt)によって提供された基本的な入力データ(氷床の表面と底面の標高、氷床表面の気温など)を組み合わせて、氷床モデルSICOPOLIS(SImulation COde for POLythermal Ice Sheets; http://sicopolis.greveweb.net/)を10、20および40kmの分解能で運用するデータセットを構築した。もっとも粗い40kmのメッシュを用いた初期的な実験を過去の気候条件の下で実施し、東南極・クィーンモードランド地域、ドームふじ基地とリュッツォホルム湾とを結ぶ宗谷流域としらせ流域の分氷嶺の変動シミュレーションを行った(Iizuka et al.2010)。さらに、博士課程大学院生である佐藤建が、棚氷の熱・動力学を取り扱う浅棚近似を使った数値手法を開発して、SICOPOLISと統合することに成功した。その結果、SICOPOLISによって氷床と棚氷の結合系を取り扱うことが可能となった。まずこの新しく開発したモデルのテストを主目的として、40kmの分解能で新しいSICOPOLISを用いた南極氷床変動実験を実施した。この実験では、過去の氷期間氷期の気候条件、および将来の温暖化シナリオが外部強制として用いられた。その他に、グリーンランド氷床(グリーンランド氷床の場合は棚氷の影響は余り重要でない)に関する実験は、SICOPOLISとフルストークスモデルElmer/Ice(http://www.csc.fi/elmer)のふたつのモデルによって実施した。南極およびグリーンランド両氷床の実験を完遂することによって、完全なデータセットをSeaRISEコンソーシアムに提供することが将来の目標である。Levermann et al. (2013)は上記の結果に線形反応理論を適用し、2100年までの南極氷床の氷損失を解析した。この解析は、19の気候モデルと2つの海洋モデルに基づいてEUプロジェクトIce2Seaが提供する海水温度と、IPCCが提唱する温暖化ガス排出シナリオ(RCP)を仮定して実施した。またKusahara et al.はSICOPOLISを使って、最終氷期における南極氷床の棚氷変動を再現した。その結果、最終氷期における棚氷面積は現在よりも小さく、その底面融解は現在よりも大きいことが明らかになった。さらに我々は海洋モデルを援用して、南極氷床の棚氷底面融解量を記述する物理的なパラメタライゼーションを開発した。この手法は南極氷床を6つの地域別に取り扱い、海水温度の変化が底面融解に与える影響を考慮したものである。その結果はAGU(R. Greve et al., 2013)その他の学会で発表された。東南極のしらせ流域ではElmer/Iceによる数値実験を継続し、フルストークスモデルと浅層近似モデルの違いを検討した。その成果をまとめた論文(H. Seddik et al.)を執筆中である。南極およびグリーンランド氷床に関して、SeaRISE(氷床変動に起因する海水面変化コミュニティー)が提唱する条件で、将来500年の変動予測を行った。実験条件は、一定気候条件の他、1IPCCのRCP8.5温暖化ガス排出シナリオに基づいた気候変動に、様々な底面すべりと棚氷融解を組み合わせた条件を用いた。2011年度の取り組みを発展させて、3つのモデル、SICOPOLIS(南極:佐藤、グリーンランド:Greve)、IcIES (グリーンランド:阿部および齋藤)、Elmer/Ice (グリーンランド:Seddik)による実験が完了した。南極氷床の変動が棚氷の底面融解に最も敏感であるのに対して、グリーンランド氷床は気温と降水量の変化に敏感であった点は興味深い。以上の成果をまとめ、SeaRISEの共同論文(Bindschadlerら、印刷中、Nowickiら、印刷中)にデータを提出した。

加えて、佐藤の博士論文(2012)、Herzfeldら(2012), Levermannら(2012)、Sato and Greve (2012)、およびSeddikら(2012)の論文としてまとめられた。SeddikによるElmer/Iceの成果は、欧州が主導するIce2seaプロジェクトに貢献した(Gillet-Chauletら、2012)。さらにGreveは、SICOPOLISを用いた気候と氷の力学条件に対するグリーンランド氷床変動研究(Applegateら、2012; Rogozhinaら、2012)に貢献した。Seddikと杉山は、Elmer/Iceを用いた東南極しらせ流域での研究を推進した。フルストークスモデルと浅層近似モデルとの差異に関する初期的な成果がSeddikによって国際学会にて発表され(米国地球物理連合)、2013年度も研究継続予定である。研究計画に記されている通り、過去および将来の気候条件下での南極氷床の変動を、高い空間分解能で計算することができた。それらの結果は、SeaRISEコンソーシアムに提出されている。同じ実験がグリーンランド氷床に関しても実施され、フルストークスモデルElmer/Iceによって実験を完了したことは大変意義深く、この分野における一里塚となるものである。一方で南極氷床に関してはElmer/Iceによる実験は進んでおらず、今後の課題である。25年度が最終年度であるため、記入しない。2012年度の重要な成果は、SeaRISEコミュニティーへの協力によって第5次IPCCレポート(AR5)に貢献した点である。その実現のために、課題として与えられた必要な数値実験を、南極氷床についてはSICOPOLIS、グリーンランド氷床についてはSICOPOLIS、IcIESおよびElmer/Iceの各モデルによって完了した。実験結果をコミュニティーに提供することで、SeaRISEによる3つの査読付き論文の出版に貢献することができた。これらの論文の出版時期は、AR5への掲載条件(2012年7月末投稿、2013年3月15日受理)を満たすものであり、その内容がAR5に掲載される予定である。一方Ice2seaプロジェクトは南極氷床を取り扱わないため、Elmer/Iceによるグリーンランド氷床に関する実験結果を提供した。このプロジェクトによる論文もAR5の掲載条件を満たす形で出版され、その内容がAR5に掲載の予定である。東南極のしらせ流域に関する数値実験がスタートし、いくつかの初期的な成果が出た。しかしながら、フルストークスモデルに起因する数値的な不安定性の問題が予想よりも深刻で、2013年度も継続してその解決取り組む予定である。将来500年にわたる南極およびグリーンランド氷床変動を予測するために、最近になってSeaRISEから新しい実験条件が示された。SeaRISEの実験を完遂するため、この実験を両氷床について実施する。SeaRISEと同様に、基準となる気候条件下で南極およびグリーンランド氷床の変動を予測する共同実験の計画が、ヨーロッパ主導のプロジェクトice2sea (http:/www.ice2sea.eu/)で進められている。
破骨細胞分化因子(RANKL)遺伝子発現調節機構の解析

骨芽細胞は、1)骨髄造血系細胞の増殖に必要なM-CSFなど液性因子の供給、2)破骨細胞への最終分化に不可欠な破骨細胞分化因子(RANKL)の発現を介して破骨細胞形成を支持する。マウスならびにヒトRANKL遺伝子5'上流プロモータ領域を解析して、RANKL発現を介するvitamin D3の破骨細胞形成促進作用を明らかにした。マウスプロモータでは1箇所のVDRE(-940)が機能的に有効であるが、ヒトプロモータについては3箇所の候補配列(-1584)、(-1418)、(-1383)のうち、最上流の(-1584)が機能的VDREであることを明らかにした。マウスとヒトのプロモータ構造は類似性が高く、VDREを介する制御機構は種を超えてよく保存されていることが示された。悪性腫瘍の溶骨性転移の機構をRANKL発現制御の観点から検討した、マウスおよびヒトRANKLに対する特異的なプローブを作成してin situ hybridization法を行い、病理解剖症例のPTHrP産生腫瘍の転移巣の組織標本にて骨芽細胞・骨髄間質細胞にRANKL mRNAを検出した。PTHrPによるRANKL発現制御の検討も継続して行った。マウス及びヒトのRANKL遺伝子プロモータコンストラクトを用いたtransfection系に、PTHrP処理を行うとともにPKAのagonist, antagonist投与を行い転写活性に及ぼす効果を検討した。マウス及びヒトRANKL遺伝子プロモータにおけるcAMP応答配列(CRE)の存在に関しては、マウス、ヒト各々数力所の候補配列に着目してEMSA assayや変異導入実験を行い、機能的CREの存在を明らかにした。プロモータ活性の検討に加えて、H3,H4ヒストンに対する抗体を用いてのCHIP assayを行い、PTHrPもしくはPKA agonistの作用でクロマチン活性化が起こることを確認した。以上の成果は、英文誌に報告した(BBRC2002,J Pathol 2002,J Cell Biochem 2003)。また、成果の一部は第91回92回日本病理学会総会、第20回21回日本骨代謝学会、第61回62回日本癌学会総会、第24回25回米国骨代謝学会議にて報告した。私どもはマウスならびにヒトRANKL遺伝子5'上流プロモータ領域を解析した。マウスプロモータでは1箇所のVDRE(940)が機能的に有効であることを証明し、ヒトプロモータについては3箇所の候補配列(-1584)、(-1418)、(-1383)について、変異導入を行った解析の結果、最上流の(-1584)が機能的VDREであることを明らかにした。さらに、悪性腫瘍骨転移巣におけるRANKL発現を検索するために、マウスおよびヒトRANKL遺伝子に対する高感度・特異的なプローブを作成してin situ hybridization法を行い、溶骨性病変局所において腫瘍におけるPTHrPと骨芽細胞/間質細胞系におけるRANKLmRNAを検出した。引き続いて、PTHrPがRANKL発現を制御する機構について検討した。

マウス及びヒトのRANKL遺伝子プロモータコンストラクトを用いたtransfection系に、PTHrP処理を行うとともにPKA, PKCのagonist, antagonist投与を行い転写活性に及ぼす効果を検討した。その結果、PTHrPの作用は短期的にはPKA経路、長期的にはPKC経路を介してRANKL転写を促進する可能性を示した。さらに、マウス及びヒトRANKL遺伝子プロモータにおけるcAMP応答配列(CRE)を検索した。マウス、ヒトいずれにも古典的なCREは存在しないが、各々数カ所の候補配列に着目してEMS Aassayや変異導入実験を行い、機能的CREの存在を明らかにした。以上の成果は、英文誌に報告した(BBRC2002,J Pathol 2002,J Cell Biochem投稿中)。また、成果の一部は第91回日本病理学会総会、第20回日本骨代謝学会、第61回日本癌学会総会、第24回米国骨代謝学会議にて報告した。骨芽細胞は、1)骨髄造血系細胞の増殖に必要なM-CSFなど液性因子の供給、2)破骨細胞への最終分化に不可欠な破骨細胞分化因子(RANKL)の発現を介して破骨細胞形成を支持する。私どもはマウスならびにヒトRANKL遺伝子5'上流プロモータ領域に関して、破骨細胞形成促進作用を示すVitamin D3や副甲状腺ホルモン関連蛋白(PTHrP)の転写促進機構を検討した。マウスプロモータではVDRE(-940)の解析、ヒトプロモータについては3箇所の候補配列(-1584)、(-1418)、(-1383)のうち、機能的VDREとして最上流の(-1584)を解析した。さらに、悪性腫瘍骨転移巣におけるRANKL発現を検索するために、マウスおよびヒトRANKL遺伝子に対する高感度・特異的なプローブを作成してin situ hybridization法を行い、病理解剖症例の転移性骨腫瘍におけるPTHrP発現と溶骨性骨病変において骨芽細胞・骨髄間質細胞にRANKL mRNAを検出した。PTHrPによるRANKL発現制御については、マウス及びヒトのRANKL遺伝子プロモータコンストラクトを用いたtransfection系に、PTHrP処理を行うとともにPKAのagonist,antagonist投与を行い転写活性に及ぼす効果を検討した。マウス及びヒトRANKL遺伝子プロモータにおけるcAMP応答配列(CRE)を検索した。マウス、ヒトいずれにも古典的なCREは存在しないが、各々数カ所の候補配列に着目してEMSA assayや変異導入実験を行い、機能的CREの存在を明らかにした。プロモータ活性の検討に加えて、H3,H4ヒストンに対する抗体を用いてのCHIP assayを行って、PTHrPもしくはPKA agonistの作用でクロマチン活性化が起こることを確認した。以上の成果は、英文誌に報告した(J Cell Biochem 2003)。また、成果の一部は第92回日本病理学会総会、第21回日本骨代謝学会、第62回日本癌学会総会、第25回米国骨代謝学会議にて報告した。
突然変異誘発過程におけるPP2Aリン酸化の役割とその機序

本研究では発がんイニシエーション期におけるPP2A不活性化の役割とその機序を明らかにすることを目的として、平成28年度はエストラゴール(ES)と同じ骨格を有するフェニルプロぺノイド化学物(PPCs)を用いてPP2Aのリン酸化ならびに肝細胞の増殖活性について構造活性相関を検討した。その結果、これらの変化は弱いながらもメチルオイゲノール(MEG)及びオイゲノール(EG)でも認められ、フェニルプロぺノイド化学物(PPCs)に共通した変化である可能性を見出した。更にDNAマイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析により、これらの投与によって共通して変動する遺伝子を明らかにした。平成29年度はPPCsの投与によって共通して変動した71の遺伝子(増加39、減少32)の中から、PP2Aのリン酸化に関連する遺伝子を精査した。平成30年度はPP2A阻害剤が突然変異誘発性に及ぼす影響を検討するため、F344 gpt deltaラットにESを30又は300 mg/kg/dayの用量で28日間強制経口投与するのと同時に、PP2A阻害剤として知られるマイクロシスチン(MC)を50 microg/kgの用量で週3回、腹腔内投与した。病理組織学的検索の結果、MC投与群では肝細胞の分裂像に加えて、アポトーシス像及び線維化が認められた。gpt assayにより肝臓における突然変異頻度を検索した結果、ES 300 mg/kg投与群において突然変異頻度は有意に上昇した。一方、MC併用投与による影響はES 30 mg/kg投与群、300 mg/kg投与群ともに認められず、本実験条件下においてESの突然変異誘発性におけるPP2A阻害の影響は明らかにならなかった。今後、PP2A活性化剤を用いた検討が必要と考えられた。これまでにフェニルプロぺノイド化合物(PPCs)の一つであるエストラゴール(ES)の突然変異誘発に、DNA付加体の形成に加えて細胞増殖活性が寄与することを明らかにしてきた。本研究ではESの細胞増殖活性機序を明らかにすることを目的とし、平成28年度はESに加え、PPCsのうち遺伝毒性を有するメチルオイゲノール(MEG)と、非遺伝毒性物質であるオイゲノール(EG)を用いて、細胞増殖活性の構造活性相関とその機序を検索した。雄性6週齢のF344ラットにES、MEG及びEGをそれぞれ300、100及び300 mg/kgの用量で28日間強制経口投与後、肝臓を採取した。肝臓における病理組織学検索の結果、遺伝毒性を有するES及びMEG投与群では肝細胞のアポトーシス像と核分裂像が散見された。一方、EG投与群においても肝細胞の核分裂像が認められたことから、細胞周期のS期に発現するPCNAの免疫組織化学染色法による検出を行った結果、PCNA陽性細胞は対照群に比していずれのPPCs投与群においても増加が認められた。リアルタイムRT-PCRにより細胞周期関連因子(Ccne1、Ccnb1及びCcna2)の遺伝子発現解析を行った結果、ES投与群ではいずれも有意な上昇が認められたものの、他のPPCs投与群において顕著な変化は認められなかった。ウエスタンブロット法によるタンパク質発現解析の結果、PPCs投与群ではPP2A及びErkのリン酸化タンパクの発現が増加することを明らかにした。これらの結果から、PPCsは遺伝毒性の有無に関わらず、PP2Aのリン酸化を介した細胞増殖活性作用を有する可能性が示唆された。また、抽出したDNAを用いてDNAマイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析を実施した結果、EG、MEG、ES投与群で共通して発現が上昇する39の遺伝子と、低下する32の遺伝子を明らかにした。平成28年度は、ES、MEG、EGを用いて細胞増殖活性がPPCsの骨格に共通した作用である可能性を見出した。また、これら3剤の投与によってラット肝臓で変動する計71の遺伝子の存在を明らかにした。これらの実験はいずれも当初の研究計画通り進行した。現在、網羅的遺伝子発現解析で認められた71の遺伝子からPP2Aリン酸化に関連する遺伝子の精査を行っている。これについては当初の予定よりも若干の遅れがみられるが、平成29年度に実施予定の実験と並行して実施できることから、当初の研究計画にある実施内容に変更の必要はない。しかしながら、これらの遺伝子の中にPP2Aのリン酸化に寄与する分子をコードする遺伝子は見つからず、原因分子の特定には至らなかった。次に、PP2Aの不活性化が遺伝子突然変異に及ぼす影響を検討するため、PP2A不活性化剤として知られるマイクロシスチンの用量設定試験を実施した。F344ラットにマイクロシスチンを10、20又は40 mg/kgの用量で週3回、2週間腹腔内投与した後、肝臓を採取した。病理組織学的検索の結果、肝臓において投与に起因した組織学的変化はみられなかった。

また、PCNAの免疫組織化学染色法を用いた検索により肝細胞の増殖活性を検索した結果、マイクロシスチン投与に起因した変化は見られず、マイクロシスチンのPP2A阻害作用を示す用量は明らかにならなかった。平成29年度は当初の予定通り、PP2A阻害作用を示すマイクロシスチンの投与量を明らかにするための用量設定試験を実施したものの、過去の文献を基に設定したマイクロシスチンの用量では十分なPP2A阻害作用を発現しないことが明らかになった。そのため、より高用量更での用量設定試験の実施が必要となったが、研究代表者が所属する国立医薬品食品衛生研究所の移転に伴い、長期間にわたり動物実験施設の使用ができず再度の用量設定試験が実施できなかったため、研究期間を一年延長し、平成30年度にマイクロシスチンの用量設定試験及び遺伝毒性物質との複合影響について検討することとした。なお、当初の研究計画にある実施内容に変更の必要はない。本研究では発がんイニシエーション期におけるPP2A不活性化の役割とその機序を明らかにすることを目的として、平成28年度はエストラゴール(ES)と同じ骨格を有するフェニルプロぺノイド化学物(PPCs)を用いてPP2Aのリン酸化ならびに肝細胞の増殖活性について構造活性相関を検討した。その結果、これらの変化は弱いながらもメチルオイゲノール(MEG)及びオイゲノール(EG)でも認められ、フェニルプロぺノイド化学物(PPCs)に共通した変化である可能性を見出した。更にDNAマイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析により、これらの投与によって共通して変動する遺伝子を明らかにした。平成29年度はPPCsの投与によって共通して変動した71の遺伝子(増加39、減少32)の中から、PP2Aのリン酸化に関連する遺伝子を精査した。平成30年度はPP2A阻害剤が突然変異誘発性に及ぼす影響を検討するため、F344 gpt deltaラットにESを30又は300 mg/kg/dayの用量で28日間強制経口投与するのと同時に、PP2A阻害剤として知られるマイクロシスチン(MC)を50 microg/kgの用量で週3回、腹腔内投与した。病理組織学的検索の結果、MC投与群では肝細胞の分裂像に加えて、アポトーシス像及び線維化が認められた。gpt assayにより肝臓における突然変異頻度を検索した結果、ES 300 mg/kg投与群において突然変異頻度は有意に上昇した。一方、MC併用投与による影響はES 30 mg/kg投与群、300 mg/kg投与群ともに認められず、本実験条件下においてESの突然変異誘発性におけるPP2A阻害の影響は明らかにならなかった。今後、PP2A活性化剤を用いた検討が必要と考えられた。平成28年度に実施した網羅的遺伝子発現解析の結果から、PPCsに共通して変動した71の遺伝子(増加39、減少32)からPP2Aのリン酸化に関連する遺伝子を抽出する。それらについてリアルタイムRT-PCRによる半定量解析を実施する。また、それらの遺伝子の発現に寄与する分子についても遺伝子又はタンパク質発現解析を実施し、そのシグナル経路を検討する。
磁気電気化学マイクロ渦流における対称性の破れとキラル界面形成の研究

本研究では,磁場中での電析(磁気電析)がキラル界面を生成することに着目し,ローレンツ力により励起されるマイクロMHD渦流の自己組織化状態とキラル界面形成との関係を研究した.さらに,多様な磁気電析条件でキラル対称性が破れる可能性を探索し,生体分子のホモキラリティの起源を探求した.下記に研究成果を列挙する.1)マイクロサイズのミラーとして働くグアニン微結晶をトレーサーとして用い,磁気電析で発生するマイクロMHD渦流の直接観察に成功した.その結果,電極界面のゆらぎがマイクロMHD渦流を生じさせ,垂直MHD対流下で,自己組織化した渦流状態を形成することが判明した.このような渦流状態の中で,物質移動の対称性が破れキラル界面が形成される.2)垂直MHD対流がキラル界面形成に果たす役割を調べた.電極を筒のなかに埋め込み,銅の磁気電析を試みた.筒が十分に長いと,垂直MHD対流は電極界面まで到達することができないため,キラル界面が生成しない.この結果は,垂直MHD対流下のキラル界面形成のモデルが正しいことを意味している.3)垂直MHD対流が強く作用する微小電極を用いて,銅の磁気電析,磁気電解エッチングを行い,界面キラリティを調べた.磁気電気化学キラリティは,印可磁場の方向を反転するとキラリティも反転する.ところが,100, 25マイクロmの微小電極においては,磁場を反転してもキラリティが変化しないという特異な結果が得られた.4)磁気電気キラリティにおよぼす特異吸着効果の研究も行った.塩化物イオンは代表的な吸着剤であり,マイクロ渦流の自己組織化構造を変化させるものと期待される.結果は,ここでも磁場反転に対しキラリティは変わらないというものであった.これら結果はキラル対称性の破れを意味し,重要な発見であり,生体分子のホモキラリティ解明への手掛りになりうる.キラル界面形成の研究は,製薬プロセスにおける不斉触媒開発の基盤となるだけでなく,生命誕生に向かう分子進化において生体分子のホモキラリティの起源に関わる極めて重要なテーマである.本研究では,磁場中での電析(磁気電析)がキラル界面を生成することに着目し,ローレンツ力により励起されるマイクロ渦流の自己組織化状態とキラル界面形成との関係を研究する.さらに,多様な磁気電析条件を創出することにより,キラル対称性が破れる可能性を探索し,生体分子のホモキラリティの起源を,独自の視点で探求する.本年度は,マイクロ渦流にマクロな電磁対流(MHD対流)が強く作用する微小電極を用いて,硫酸銅水溶液中で銅の磁気電析,磁気電解エッチングを行い,界面キラリティの測定を行った.磁気電気化学キラリティは,印可磁場の方向を反転するとキラリティも反転することが,これまでの研究で明らかになっている.ところが,100, 25マイクロmの微小電極においては,磁場を反転してもキラリティが変化しないという特異な結果が得られた.さらに,磁気電気化学キラリティにおよぼす特異吸着の効果の研究も行った.塩化物イオンは代表的な吸着剤であり,塩化物イオンが銅の成長界面の特異サイトに吸着して,マイクロ渦流の自己組織化構造が変化し,キラル界面形成に影響をおよぼすものと期待した.結果は,ここでも磁場反転に対しキラリティは変わらないというものであった.これら微小電極と特異吸着の効果はキラル対称性の破れを意味し,極めて重要な発見であり,生体のホモキラリティ発現とも関連して興味深い結果である.そのメカニズムの解明が重要な研究目標に浮上した.今年度の研究計画とその達成度は以下のとおりである.計画1.磁気電析過程では,電極界面のマイクロMHD渦流と外側の垂直MHD対流が自己組織化状態を作り,マイクロMHD渦流の対称性が破れ,キラルな界面が生成する.電極径がミリメートル以下に小さくなると,垂直MHD対流が強くマイクロMHD渦流に作用するため,渦流の自己組織化状態が変化し,キラル界面形成が影響を受けるものと期待される.そこで,100, 25, 10マイクロmの微小電極を用いて,銅の磁気電析実験を行いキラリティの発現を確かめてみた.この実験では,ナノアンペア以下での電流測定が必要になるため,それに対応したポテンショ・ガルバノスタット(Metrohm Autolab社, model:PGSTAT204)を設備備品として購入して測定を行った.100, 25マイクロmの微小電極においては,磁場を反転してもキラリティが変化しないという特異な結果が得られた.さらに微小な10マイクロmの電極では,マイクロMHD渦流と垂直MHD対流が一体化するため,キラリティは消失した.このように微小電極の効果を明瞭に確かめることができた.計画2.銅の電析において塩化物イオンCl-は代表的な添加剤で, Cl-が銅の成長界面に吸着して表面の凹凸をなくす.Cl-を添加して銅の磁気電析を行うと,マイクロ渦流の対称的な自己組織化構造が乱され,キラル界面形成の増幅効果が期待された.そこで,キラリティのCl-濃度依存性を調べてみた.Cl-濃度が0.2モル/Lで,磁場方向に依存しないキラル界面形成が観察され,特異吸着効果によるキラル対称性の破れが明らかになった.キラル対称性が破れる条件を探索することは,本研究の到達目標の一つであったので,初年度でそれが見つかったことにより,そのメカニズムの解明というさらなる高い目標に向かうことができる.

キラル界面形成の研究は,製薬プロセスにおける不斉触媒開発の基盤となるだけでなく,生命誕生に向かう分子進化において生体分子のホモキラリティの起源に関わる極めて重要なテーマである.本研究では,磁場中での電析(磁気電析)がキラル界面を生成することに着目し,ローレンツ力により励起されるマイクロ渦流の自己組織化状態とキラル界面形成との関係を研究する.さらに,多様な磁気電析条件を創出することにより,キラル対称性が破れる可能性を探索し,生体分子のホモキラリティの起源を,独自の視点で探求する.本年度はまず,マイクロサイズのミラーとして働くグアニン微結晶を流体観察のトレーサーとして用い,磁気電析で発生するマイクロMHD渦流の直接観察を試みた.超電導マグネット中で硝酸銀溶液の磁気電析を行い,デジタル顕微鏡でグアニン粒子の運動を観察した.その結果,下記のような結論に至った.電流値が小さいときには,一様な垂直MHD対流が支配的である.電流値が大きくなるにつれ,垂直MHD対流に不安定性が現れ,電析界面の揺らぎが増幅される.界面のゆらぎはマイクロMHD渦流を生じさせ,垂直MHD対流からの干渉作用を受けながら,自己組織化した渦流状態を形成する.このような渦流状態の中で,物質移動の対称性が破れキラル界面が形成される.さらに,新しい磁気電析法として開発してきた回転磁気電析法の装置を,より広い周波数範囲で安定に回転磁気電析を行えるように改良を行った.これにより,キラリティの周波数および磁場依存性の研究を行い,よりキラル選択性の高い界面を作製することに成功した.今年度の研究計画とその達成度は以下のとおりである.(計画1)魚の鱗から採取したグアニン微結晶が良好なトレーサーとして機能することが分かってきたので,これを利用して,磁気電析過程でのマイクロMHD渦流の可視化を試みる.これにより,垂直MHD対流の影響や渦流の自己組織化構造,対称性の破れなどを明らかにする.(成果1)上述したように,実際にこのような実験を行い,マイクロMHD渦流の明瞭な観察に成功し,その発生過程についての考察を行うことができた.(計画2)別のキラル界面作製法として,回転磁気電析法の開発を進める.回転装置の改良を重ね,周波数を変えて磁気電析を行えるようにする.これにより,力学的回転とマイクロMHD渦流の歳差運動との共鳴条件が分かり,より選択性の高いキラル界面を形成する方法が見つかるものと期待できる.(成果2)回転装置の改良に成功し,様々な磁場,回転数で実験を行うことができた.その結果,特定の磁場と周波数において,磁場極性と回転方向および界面キラリティの間に美しい対称性が存在することが判明した.本研究では,磁場中での電析(磁気電析)がキラル界面を生成することに着目し,ローレンツ力により励起されるマイクロMHD渦流の自己組織化状態とキラル界面形成との関係を研究した.さらに,多様な磁気電析条件でキラル対称性が破れる可能性を探索し,生体分子のホモキラリティの起源を探求した.下記に研究成果を列挙する.1)マイクロサイズのミラーとして働くグアニン微結晶をトレーサーとして用い,磁気電析で発生するマイクロMHD渦流の直接観察に成功した.その結果,電極界面のゆらぎがマイクロMHD渦流を生じさせ,垂直MHD対流下で,自己組織化した渦流状態を形成することが判明した.このような渦流状態の中で,物質移動の対称性が破れキラル界面が形成される.
扁桃体ノルアドレナリン神経伝達による情動記憶再生の神経機構

脳内に貯蔵された記憶の再生(表出)の脳機構には依然として未解明の部分が多く、記憶再生を媒介する神経回路網の同定やそれに介在する分子・細胞機構の解明が必要である。先行研究から、マウスの味覚嫌悪学習における再固定化された記憶の再生にはノルアドレナリン神経伝達が促進的役割を担うことが示唆された。そこで本研究では、マウスにおける味覚嫌悪学習を実験モデル系として、味覚嫌悪記憶の再生に対するノルアドレナリン性神経伝達の機能を解明するために、ノルアドレナリン性神経投射の起始核や投射先である扁桃体内の受容体を同定することを目的とした。味覚嫌悪学習の再固定化された記憶の再生テストの直前にノルアドレナリン再吸収阻害剤やアドレナリン受容体のα1およびβサブタイプの作動薬をそれぞれ扁桃体に投与すると、再生障害を示すチロシン水酸化酵素遺伝子ヘテロ欠損マウスや野生型マウスでの味覚嫌悪記憶の再生が改善ならびに促進された。橋青斑核ニューロンは、再固定化された味覚嫌悪学習の記憶再生時にFosタンパク免疫シグナル陽性となることから、同部位のノルアドレナリン性ニューロンが記憶再生時に活性化されることが判った。野生型マウスにおいて、再固定化された記憶の再生テスト時に青斑核にα2アドレナリン受容体作動薬を投与して青斑核ニューロン活動を抑制すると、記憶再生までの潜時が遅延した。以上のことから、青斑核から扁桃体へのノルアドレナリン神経投射は、扁桃体内でα1およびβアドレナリン受容体を介して作用することによって味覚嫌悪学習における再固定化された記憶の再生を促進することが示唆された。以上の成果は、第28回日本神経科学学会大会ならびに日本味と匂学会第39回大会において発表し、成果論文を国際学術誌に投稿中である。脳内に貯蔵された記憶の再生・表出機構、すなわち、記憶再生を媒介する神経回路網やその動作原理には未解明な部分が多い。さらに、その神経回路の動作を修飾する神経修飾物質であるノルアドレナリン(NA)が、脳内のどの部位でどのように記憶再生機構を修飾するのかは明らかではない。先行研究において、カテコールアミン合成の律速酵素であるチロシン水酸化酵素(TH)をコードする遺伝子のヘテロ変異マウスにおいて味覚嫌悪学習(CTA)によって獲得された味覚記憶の長期保持に障害があることを示した(Kobayashi et al., 2000)。この記憶保持障害は記憶再生時に脳内NAを増加させるNA再吸収阻害剤(デシプラミン)を腹腔内投与することで改善することが示唆された(Yasoshima et al., 2002)。本研究では、先行研究の結果に基づき、扁桃体に着目し、CTA記憶再生に対する扁桃体NA伝達系の役割について検討した。LiCl投与を無条件刺激として獲得させたCTAを試験する前に、無拘束・覚醒状態の変異マウスの扁桃体内に、アドレナリン受容体(AR)サブタイプ(α1、α2、β)のそれぞれの作動薬を脳内微量投与し、条件味刺激(CS)を呈示し、CSを摂取するか否かを測定することで記憶再生成績を評価した。対照である溶媒注入群の変異マウスに比べて、α1、α2、β型それぞれの作動薬を脳内投与された変異マウスは、野生型マウスと同程度の記憶再生成績に改善された。一方、野生型マウスの扁桃体に同様の薬物を投与すると、野生型マウスの記憶再生も促進されることが示唆された。これらの結果から、扁桃体NA系は、味覚嫌悪記憶の再生に対して促進作用があり、その作用には、α1、α2、β型の各ARが介在することが示唆された。現在、扁桃体NA系の起始核(青斑核、延髄孤束核)の機能がCTA再生に関与するか否かを検討している。
固定化微生物による都市下水処理に関する研究

固定化微生物の都市下水処理への適用にあたり,本研究では以下の点を中心に検討した.1)都市下水中の固形性有機物は物理化学処理によって除去し,残りの溶解性有機物に関して固定化微生物を適用する.2)固定化微生物法の有する高分子ゲルによる固定化の際の薬剤の消費をできる限り軽減する固定化法を考える.3)微生物の増殖により生じた余剰汚泥を,資源の形として回収できること.4)返送汚泥工程は必要としない.以上の点から,次の3種の実験を試みた.1)数種の微生物の包括固定化法による処理実験2)真菌-後生動物系による人工基質処理3)真菌-輪虫系による実下水処理実験.ポリエチレンネット上に,アルギン酸カルシウムでAxnet bacter calcoaceticusを固定化して,グルコース基質を連続的に40日間与えたが, 40日後ほぼ流出し,固定化膜は劣化した.一方,真菌の胞子を固定化したところ,菌糸による強固な膜が形成できた.そこで,真菌と後生動物の系をつくり,人工基質を与えた結果, CODcrで約10mg/l,除去率8090%の好成績を約330日にわたって得られた.実下水の凝集沈澱上澄水に対して,同様の系で処理した結果, CODcrで約20mg/lの処理水が得られた.これは滞留時間約5時間,水温約1015°Cの比較的低水温下における実験であり,流出水中の後生動物(余剰汚泥)を食餌として魚類の飼育が可能であった.固定化微生物の都市下水処理への適用にあたり,本研究では以下の点を中心に検討した.1)都市下水中の固形性有機物は物理化学処理によって除去し,残りの溶解性有機物に関して固定化微生物を適用する.2)固定化微生物法の有する高分子ゲルによる固定化の際の薬剤の消費をできる限り軽減する固定化法を考える.3)微生物の増殖により生じた余剰汚泥を,資源の形として回収できること.4)返送汚泥工程は必要としない.以上の点から,次の3種の実験を試みた.1)数種の微生物の包括固定化法による処理実験2)真菌-後生動物系による人工基質処理3)真菌-輪虫系による実下水処理実験.ポリエチレンネット上に,アルギン酸カルシウムでAxnet bacter calcoaceticusを固定化して,グルコース基質を連続的に40日間与えたが, 40日後ほぼ流出し,固定化膜は劣化した.一方,真菌の胞子を固定化したところ,菌糸による強固な膜が形成できた.そこで,真菌と後生動物の系をつくり,人工基質を与えた結果, CODcrで約10mg/l,除去率8090%の好成績を約330日にわたって得られた.実下水の凝集沈澱上澄水に対して,同様の系で処理した結果, CODcrで約20mg/lの処理水が得られた.これは滞留時間約5時間,水温約1015°Cの比較的低水温下における実験であり,流出水中の後生動物(余剰汚泥)を食餌として魚類の飼育が可能であった.排水処理のバイオリアクターで固定化微生物を適用する研究の展開中で本研究では糸状菌の固定化膜に焦点をあてた。本法は、糸状菌を菌糸を十分伸長するまで前培養した固定化膜をリアクター内で排水と接触させる。すなわち本法では固定化膜の劣化がおこることなく、かつ濁質を捕食する輪虫をリアクター内に共存させることにより、余剰汚泥の発生を防いだ。ベンチスケールの実験1では通水後15日で、人工基質の流入水CODが68.8mg/lに対して、流出水のT-CODが17.1mg/l(除去率75.2%),S-CODが10.0mg/l(除去率85.5%)の処理能力を示した。さらに輪虫を植種した36日目からリアクター内で糸状菌と共生し、濁質を捕食したため処理能力はさらに高まり、それぞれ9.9mg/l(徐去率85.4%),6.9mg/l(除去率89.8%)になった。また59日目から流入負面を上昇させたところ、輪虫の大量発生がみられた。本リアクターでは余剰汚泥を輪虫として回収できたことになる。実験2は、十分な前培養を実施したため、菌糸はあまりはく離せず、メッシュ全体に安定した膜を形成した。流出水のT-CODが9.4mg/l(除去率87.1%),S-COD7.4mg/l(除去率89.9%)の処理能力を示した。流出水のSSも平均3.4mg/lで、顕微鏡観察でも菌糸が多少みられる程度であることからしても、COD-容積負荷率(0.36kg/【m^3】.日)においては浮遊性の有機物はほとんどないといってよい。固定化微生物の都市下水処理への適用にあたり,本研究では以下の点を中心に検討した.1)都市下水中の固形性有機物は物理化学処理によって除去し,残りの溶解性有機物に関して固定化微生物を適用する.2)固定化微生物法の有する高分子ゲルによる固定化の際の薬剤の消費をできる限り軽減する固定化法を考える.3)微生物の増殖により生じた余剰汚泥を,資源の形として回収できること.4)返送汚泥工程は必要としない.以上の点から,次の3種の実験を試みた.

1)数種の微生物の包括固定化法による処理実験2)真菌-後生動物系による人工基質処理3)真菌-輪虫系による実下水処理実験.ポリエチレンネット上に,アルギン酸カルシウムでAcinet bacter calcoaceticusを固定化して,グルコース基質を連続的に40日間与えたが, 40日後ほぼ流出し,固定化膜は劣化した.一方,真菌の胞子を固定化したところ,菌糸による強固な膜が形成できた.そこで,真菌と後生動物の系をつくり,人工基質を与えた結果, CODcrで約10mg/l,除去率8690%の好成績を約330日にわたって得られた.実下水の凝集沈澱上澄水に対して,同様の系で処理した結果, CODcrで約20mg/lの処理水が得られた.これは滞留時間約5時間,水温約1015°Cの比較的低水温下における実験であり,流出水中の後生動物(余剰汚泥)を食餌として魚類の飼育が可能であった.
細胞間相互作用ネットワークによる維管束形成の制御機構

植物の肥大成長を支える分裂組織として、形成層が知られている。形成層は、維管束幹細胞を有しており、分化・分裂を繰り返すことで、維管束領域の拡大に貢献している。継続的な肥大成長の実現にあたっては、これら幹細胞が維持され続ける必要があり、そのためには幹細胞の分化・分裂の制御は極めて重要となってくる。維管束幹細胞の維持に関わる因子として、CLEペプチドの一種であるTDIFとその受容体TDRが知られている。TDIF-TDRは幹細胞の自己複製の促進と分化の抑制という二つの異なる生理的な機能をもつことがわかっているが、それらがどのようにして維管束幹細胞の維持に貢献しているのか、その詳しい分子メカニズムはよく分かっていない。そこで、本研究では、TDIF-TDRのシグナル伝達経路に着目をし、幹細胞の維持機構にせまることにした。まずはじめに、Y2Hスクリーニングより、あるキナーゼ群(TDR-Interacting-Kinases》がTDRと特異的に結合することを明らかにした。遺伝学的解析から、TIKがTDIF/TDRのシグナル伝達において、幹細胞の分化の抑制の経路にのみ関与し、自己複製促進の経路には関与しないことが示唆され、TDIFの二つの機能は下流経路に分けられる可能性が考えられた。これまでにTDIF下流の自己複製促進には、WOX4と呼ばれる転写因子が関わることが知られている。そこで、次にTIKとWOX4の遺伝学的解析を明らかにするため、TIKの阻害剤及びwox4変異体を用いて、胚軸の維管束の表現型を解析した。TIK阻害剤処理単独では、木部と節部の間に存在する幹細胞が維持されなくなるtdr表現型が約3割程度でみられるのに対し、wox4変異体背景でTIK阻害剤を処理すると、約8割程度の個体でtdr表現型が観察された。以上の結果から、幹細胞の維持においては、幹細胞自身の増殖の制御と分化の制御の両方が重要であることが示唆され、植物幹細胞維持の制御機構を分子レベルで明らかにしたはじめての例である。幹細胞の分化の制御だけでなく、分裂の制御との関係に関しても、興味深い新しい知見が得られた。これらの結果をもとに、幹細胞維持の新たな概念を提唱できたと考えている。植物幹細胞の働きを明確にしていくために、幹細胞の維持機構をもとにして、幹細胞の分化多能性に関しても今後知見を得ていく必要がある。維管束形成の制御に関して、オーキシンやサイトカイニン、ブラシノステロイドといった植物ホルモンの重要性が明らかとなっている。また近年では、低分子からなるCLEペプチドが維管束形成時の細胞間相互作用に関与することが報告されてきている。そこで私は、CLEペプチドを中心として、これらの細胞内シグナリング機構を調べ、植物ホルモンや他の細胞間相互作用因子との相互作用を明らかにすることで、維管束形成を支配する細胞外因子のネットワークの統合的理解を目指している。CLEペプチドの網羅的投与実験から、あるペプチド群が根の原生木部形成を阻害することを明らかにした。マイクロアレイを用いたトランスクリプトーム解析からCLEペプチドと植物ホルモンサイトカイニンとのクロストークが原生木部形成の領域決定に重要であることを見出した。以上の成果は国際誌Plant and Cell Physiology2011年1月号に掲載され、clv2の根の三次元構築写真が表紙を飾った。他にも、道管分化の制御機構を明らかにするため、TDIF-TDRシグナル伝達経路の解明を目指した。TDIF(CLE41/44)の受容体であるTDRの細胞内キナーゼドメインを用いた酵母ツーハイブリットスクリーニングにより、あるキナーゼ群(TDR-Interacting-Kinases)がTDRと特異的に結合することを見出した。これらの細胞内局在を調べるため、N.benthamianaを用いたアグロ形質転換法により、CFP及びYFPを融合させたTDR及びTIKを一過的に発現させた。TDRは35sプロモーターを用いた発現系では、うまく発現しなかったので、エストラジオール誘導発現系に変えたところ、誘導後24時間目に細胞膜に安定して強い発現がみられた。一方でTIKは細胞膜、細胞質、核において蛍光のシグナルが観察された。この条件下でYFP-CFP間のFRETを観察したところ、TDRとTIKは細胞膜において相互作用することが明らかとなった。実際にTIKの機能欠損多重変異体では、TDIF応答が低下することから、TIKがTDIFシグナル伝達において重要な役割を果たしている可能性が示唆された。維管束形成の制御に関して、オーキシンやサイトカイニン、ブラシノステロイドといった植物ホルモンの重要性が明らかとなってきている。また近年では、低分子のペプチドホルモンであるCLEペプチドが維管束形成過程における細胞間相互作用を担うことが報告されているが、今のところその詳細な分子メカニズムは不明な点が多い。そこで本研究では、CLEペプチドを中心として、植物ホルモンをはじめとする他の細胞間シグナル分子との関係性を明らかにすることで、維管束形成を支配する制御ネットワークの統合的な理解を目指している。本年度は特に、維管束幹細胞の分化制御機構を明らかにするため、TDIF/TDRシグナルに着目をし、シグナル伝達機構の解明を目指した。まず、TDIF(CLE41/44)の受容体であるTDRの細胞内キナーゼドメインを用いた酵母ツーハイブリットスクリーニングにより、TDRと特異的に相互作用する因子としてTIK(TDR-Interacting-Kinases)を単離した。