hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
雑草の種子休眠機構の解明と休眠覚醒物質の生態的雑草防除への応用

我が国水田の代表的な雑草タイヌビエを対象として、種子休眠機構に関する生理・生化学的、分子生物学的解析と休眠覚醒物質石灰窒素肥料の利用による生態的雑草防除の圃場試験を行った結果、次のような知見が得られた。1.種子休眠機構(1)タイヌビエの種子(小穂)は、成熟したときすでに頴果は発芽能力を有するにも関わらず、種子自身は自発的休眠状態にあった。したがって、頴果を包む穎、苞穎に発芽抑制因子が存在するか、あるいは、穎果内に外皮除去によって拡散あるいは分解され易い発芽抑制因子が存在することが示唆された。また、脱粒後の種子を水田土壌に埋土したとき、雑草型の種子は、抗酸化活性を維持し死滅しなかったのに対して、栽培型の種子は、急激に抗酸化活性を低下させ土壌中で死滅した。(3)種子休眠性をもつ雑草型と休眠性をもたない栽培型タイヌビエは、ともに多くのイネ科植物種子において休眠特異的とされている1-Cys peroxiredoxin遺伝子を有していた。しかし、雑草型の吸水種子が強いこの遺伝子発現を示すのに対して、栽培型タイヌビエの種子はこの遺伝子をほとんど発現させないことが示唆された。(4)雑草型と栽培型タイヌビエの交配実験によって、休眠導入と維持に関与する2対の相同遺伝子からなる遺伝様式モデルが提案された。2.石灰窒素肥料による生態的防除(1)石灰窒素の秋期処理は、埋土タイヌビエ種子を休眠覚醒させて発芽、発生を促し、発生した植物は冬季の低温で枯死した。また、春期処理は、埋土集団中の休眠覚醒不充分な種子を休眠覚醒させ、発生した幼植物葉植え代作業で機械的に故殺された。(2)石灰窒素は、休眠覚醒効果だけでなく埋土種子に対して殺種子効果ももち、とくに春期処理でこの効果が大きかった。したがって、石灰窒素は、窒素施肥と兼ね合わせて、水田におけるタイヌビエなど埋土雑草種子集団サイズを減少させることを目的とする生態的防除に利用できると考えられた。我が国水田の最も代表的な雑草種であるヒエ属雑草の種子休眠機構に関するこれまでの研究をさら進めるとともに、石灰窒素などの休眠覚醒物質を水田の雑草防除に応用することを目的とする3年間の研究の初年度における実績概要は以下のとおりである。1.ヒエ種子休眠性の生化学的、分子生物学的手法による休眠機構の解明:種子が成熟過程で生じる活性酸素に抗酸化作用をもつ蛋白質1-Cys peroxiredoxinが種子休眠性に関与するとする報告が多数ある。ヒエ属のタイヌビエについても、種子休眠性を遺伝的にもたない栽培型と種子休眠性をもつ雑草型を栽培、採種して、それらの1-Cys peroxiredoxinの遺伝子の単離、発現を調べた。その結果,雑草型、栽培型タイヌビエともに、ゲノム中に少なくとも2種類の1-Cys peroxiredoxin遺伝子配列が存在すること、また,これら2つの遺伝子にはORF配列間に36ケ所塩基置換が認められた。

一方,栽培型および雑草型の吸水種子の全RNAを用いて,RT-PCRを行ったところ,雑草型でより強い増幅産物のシグナルが検出され,1-Cys peroxiredoxin遺伝子が休眠種子で強く発現されると推察された.2.休眠覚醒物質の探索:タイヌビエ休眠種子に対する(CaCN_2)の至適濃度と温度を調べた結果、それぞれ2.5mM、2333°Cであった。現在、石灰窒素以外の現場の水田で使用できる可能性をもつハロゲンなど環境に有害な元素を含まない休眠覚醒物質を検討している。3.休眠覚醒物質の圃場での応用試験:土壌表層に260粒/m^2のタイヌビエ休眠種子を含む水田に9下旬石灰窒素肥料を600kg/haで散布した。夏生一年生雑草であるタイヌビエの親個体から脱粒、埋土された休眠種子は、無処理区で年内に全く発芽、発生しなかった。しかし、石灰窒素の600kg/ha施肥区では、11月下旬、タイヌビエ幼植物がそれぞれ199本発生し、これらの幼植物は冬季の低温で枯死した。また、石灰窒素施肥は、土壌中におけるのタイヌビエ種子集団の生理状態にも影響を与え、無処理区の種子が死滅種子8、休眠覚醒種子0、休眠種子92%であったのに対して、600kg/ha区では、それぞれ17,11,72%であった。本研究は、我が国水田の最も代表的な雑草種であるヒエ属雑草の種子休眠性機構を解析するとともに、圃場で利用できる石灰窒素などの休眠覚醒物質を水田の雑草防除に応用することを目的とする。研究2年目となる平成13年度には、前年同様に、(1)ヒエ属種子の休眠機帯解明ための実験と(2)休眠覚醒物質の圃場試験を進めた。1.ヒエ属種子の休眠機構の解明タイヌビエの雑草型と栽培型の種子成熟過程の休眠性導入期と脱粒後埋土期における活性酸素に対する種子内生坑酸化活性の変化をルミノールの化学発光法で調べた。栽培型タイヌビエの種子(小穂)は開花32日目の発芽試騨でほぼ100%の発芽率を示したが、雑草型の種子は成熟中、脱粒後も全く発芽せず、脱粒前のかなり早い成熟過程ですでに休眠に導入された。抗酸化活性は、雑草型、栽培型とも開花後徐々に減少し、雑草型の種子が脱粒し始める開花32日目に定常状態になり両型の差異は認められなかった。完熟した種子を秋期の水田土壌に埋土したとき、休眠性をもたない栽培型タイヌビエの種子は、抗酸化活性を急減させ、多くは土壌中で発芽し、他は種子のまま死滅した。一方、雑草型の種子は、大きい抗酸化活性を維持し、休眠状態を続けて冬期に環境休眠状態となった。2.休眠覚醒物質の圃場試験石灰窒素(CaCN_2)肥料は、ヒエ属雑草の種子休眠覚醒物質であり、水田のイネ刈り取り後と春期の植え代前の施肥は埋土種子を休眠覚醒させ、発芽、発生した幼植物を冬期の低温や植え代作業によって枯死させることができると考えられる。この観点から、水田に試験区を設け、2000年秋期から石灰窒素の秋期、春期処理を繰り返しヒエ属雑草発生数と埋土種子集団の動態を測定している。本年度(2年目)の春期処理においても、石灰窒素処理区では有意にタイヌビエの出芽数が増加し、埋土種子の休眠覚醒率も増加した。また、稲刈り後の秋期処理区でもタイヌビエの出芽数・休眠覚醒種子および死滅種子数が他区よりも多くなった。圃場試験を開始した2000年秋期のタイヌビエ埋土種子集団のサイズは2.7x10^4粒/m^2であったが、2001年秋期石灰窒素600kg/ha区で8.9x10^3粒に減少した。本研究は、我が国の水田の最も代表的な雑草種であるタイヌビエの種子休眠性機構を解析するとともに、石灰窒素などの休眠覚醒物質を水田の雑草防除に応用することを目的としたもので、平成14年度は研究3年間の最終年度である。1.ヒエ属種子における休眠性の遺伝様式の解析種子休眠性を遺伝的に欠損する栽培型タイヌビエと休眠性を顕著にもつ雑草型タイヌビエを交雑し、自殖F_2,F_3種子の休眠の強弱を調べたデータを解析した。
繰り返しアンケート法から見た現病歴、家族歴の再現性と信頼性の研究

本研究の目的は同一集団を対象者にした4回の繰り返しアンケート結果から、無回答者を含めた場合と除いた場合の既往歴、がんの家族歴及び飲酒と喫煙習慣の回答の再現性を評価することであった。対象者は1998年7-8月のベースライン調査(Q1)対象となったM県X町の40-69歳の男女492名のうち、4回の繰り返しアンケートすべてに回答した210名であった。アンケート内容は年齢、既往歴(脳卒中、心筋梗塞、糖尿病とがん)、がんの家族歴(実父、実母と兄弟姉妹)、飲酒と喫煙習慣及び食習慣などであった。分析は、調査間隔が2週間(Q2,Q3)、1年(Q3,Q4)、4.5年(Q1,Q3)、5.5年(Q1,Q4)と長くなるに伴い、既往歴、がんの家族歴と飲酒・喫煙習慣の回答の再現性が無回答者を含めた場合と除いた場合どう変化するかをカッパ値を用いて検討した。【結果】1、前後調査でいずれか答えなかった者の割合はがんの家族歴は最も高かった(45%)、既往歴はこれに次ぎ(35%)、飲酒・喫煙習慣は最も低かった(15%)。2、無回答者を除いた場合は、1年以内に限れば、既往歴は飲酒・喫煙習慣とほぼ同程度の高い再現性を示した。これに対し1年以内のがんの家族歴の再現性は飲酒・喫煙習慣の比べてカッパ値で12段階低下した。全体に見ると、再現性はがんの家族歴が最も低く、既往歴がこれに次ぎ、飲酒・喫煙習慣は最も高かったであった。3、無回答者を含めた場合の1年以内の再現性は、飲酒・喫煙ではわずかに低下したが0.62以上の高い値を示した。これに比べ、既往歴とがんの家族歴のカッパ値は2週間で0.44以下に低下し、1年の間隔があくと0.3程度にまで低下した。既往歴の再現性は4.5年以上経過すると全て不良となった。すなわち、再現性は無回答者を含めた場合著しく低下した。現病歴と家族歴の変化とその再現性を評価する目的で、同一対象者集団に対して同じ質問項目のアンケートを複数回実施した。なお、評価に際し、時間的変化が少ないと考えられる飲酒・喫煙習慣を再現性のレファランスとした。具対的には、40ー69歳の214名の対象者に対して、4回同じ質問のアンケートを実施した。質問内容は既往歴(脳卒中、糖尿病、心筋梗塞)、がんの家族歴(両親、兄弟姉妹)、運動、飲酒と喫煙、食習慣などであった。実施間隔は5.5年、4.5年、1年と2週間の4種類であった。各間隔に対応する既往歴、がん家族歴及び飲酒・喫煙習慣の回答の一致率をそれぞれ計算し、変化の有意差を検討した。この検討は無回答者を除外した場合と含めた場合の各々について行った。家族歴のがんは種類別に分けずに検討した。飲酒・喫煙習慣において以前の経験者は飲酒・喫煙習慣ありとして分析した。結果:(1)無回答者を除いた場合ほ二疾患の既往歴の一致率は全ての間隔について100%から96%の高率であった。1年,4.5年,5.5年の間隔をおいた場合の一致率は2週問おいた場合の一致率と比べ有意差がなかったこれに対して、無回答者を含めた場合は、既往歴の一致率は4.5年と5.5年間隔では60%程度であり2週間間隔の約80%に比べて有意に低かった。(2)がんの家族歴の一致率変化の傾向は既往歴のそれとほぼ同じ(99%ー87%)であったが、無回答者を除外した場合でも、4.5年経つと一致率が有意に低下した。(3)飲酒・喫煙習慣共に1年以内の回答は95%以上の一致率を示し、4.5年以上経過しても90%を越す高い値を維持した。無回答者を含めた場合は含めない場合と比べて低下したが、既往歴、家族歴より高い一致率で推移した。1年以内に限れば、既往歴と家族歴の回答の再現性1力圀酉・喫煙とほぼ同等かそれ以上と考えられた。同じ方法で、既往歴、家族歴と飲酒・喫煙習慣に対して、無回答者を除いた場合と含めた場合でそれぞれのカッパ値を計算し、変化の有意差を検討している。【結果】

1、前後調査でいずれか答えなかった者の割合はがんの家族歴は最も高かった(45%)、既往歴はこれに次ぎ(35%)、飲酒・喫煙習慣は最も低かった(15%)。2、無回答者を除いた場合は、1年以内に限れば、既往歴は飲酒・喫煙習慣とほぼ同程度の高い再現性を示した。これに対し1年以内のがんの家族歴の再現性は飲酒・喫煙習慣の比べてカッパ値で12段階低下した。全体に見ると、再現性はがんの家族歴が最も低く、既往歴がこれに次ぎ、飲酒・喫煙習慣は最も高かったであった。3、無回答者を含めた場合の1年以内の再現性は、飲酒・喫煙ではわずかに低下したが0.62以上の高い値を示した。これに比べ、既往歴とがんの家族歴のカッパ値は2週間で0.44以下に低下し、1年の間隔があくと0.3程度にまで低下した。既往歴の再現性は4.5年以上経過すると全て不良となった。すなわち、再現性は無回答者を含めた場合著しく低下した。
ロイシンリッチリピートをもつ受容体のリガンド結合部位の大腸菌での発現技術の活用

細胞外ドメイン(リガンド結合ドメイン)にロイシンリッチリピート(LRR)と呼ばれるロイシンを豊富に含む繰り返し配列を有する受容体が動植物の分化、成長、生殖、免疫などの現象で重要な役割を果たしている。そのため、これらの現象を分子レベルで理解するには、LRRをもつ受容体のリガンド認識機構を解明することが不可欠である。研究代表者は、LRRをもつ受容体のリガンド結合部位の大腸菌での発現技術を開発したが、研究の過程で、この技術で得られた組換えタンパク質の大部分が不活性であることが判明した。そこで、大腸菌の発現系の再検討を行ったところ、タグとなるタンパク質の種類と細胞の破砕条件を検討することで、活性を待った形で組換えタンパク質を得ることに成功した。この技術を用いて、トマトのLRRをもつ受容体BRI1/SR160について研究を行った。この受容体は植物の成長や分化を促進するステロイドホルモン、ブラシノライド(BL)と、葉の食害に対する防御機構を誘導するペプチドホルモン、システミンという全く性質の異なる2つのリガンドを認識し、異なる生理作用を誘導する。しかし、この1つの受容体がどのようにして、この2つの異なるリガンドを認識し、異なるシグナルを誘導するのかわかっていない。そこで、BRI1/SR160とシステミンおよびBLの相互作用機構の解析を行った。BRI1/SR160の細胞外ドメイン全長を大腸菌で発現させ、その領域がBLと結合することを確認した。さらに、過剰量のシステミンを加え、BLと競合するかどうかを調べたところ競合は見られなかった。このことから、BRI1/SR160におけるシステミンとBL結合部位は異なること、すなわち、BRI1/SR160は二つのリガンド認識機構をもつことが示唆された。また、この研究の過程で、この研究を円滑に遂行するために、新しいDNAクローニング法を開発した。この課題では、ロイシンリッチリピート(以下、LRR)というドメインをもつ細胞表面の受容体(以下、LRR型受容体)について研究を行ってきた。LRR型受容体は、動物および植物に幅広く存在し、免疫・発生・分化などで重要な役割をしている。盛んに研究されているLRR型受容体であるけれども、そのリガンド結合部位であるLRRドメインを大腸菌で大量に発現させることに成功したという報告は未だかつてない。最近、研究代表者はLRRドメインを大腸菌で大量に発現させることに成功した。この成功により、LRRドメインが生化学的研究の対象になった。この新たに開発した発現技術を活用して、植物及び動物のLRR型受容体に関して未解明であった問題を明らかにしていくことを目指した。トマトのLRR型受容体であるSR160とそのペプチドリガンドであるシステミンの結合をモデルケースとして、研究を行った。研究の途中で、大腸菌で作らせたタンパク質が極めて不安定であるという問題に直面し、研究は様々な過程で難渋したが、現在、トマトSR160のLRRドメインとシステミンの結合について、^<125>Iでラベルしたシステミンを用いて、結合の特異性、反応速度定数などを調べているところである。また、この課題を行う過程で「ハイスループットな組換えタンパク質生産技術」を開発した。タンパク質生産実験で、目的遺伝子を大腸菌発現ベクターに組み込み段階が律速となる。我々は、インビトロジェン社のGATEWAY^<TM>法などの既存法よりも高効率に遺伝子断片を発現ベクターに組み込むことができる技術を開発した(Biotechniques(2006)40,79-83)。

細胞外ドメイン(リガンド結合ドメイン)にロイシンリッチリピート(LRR)と呼ばれるロイシンを豊富に含む繰り返し配列を有する受容体が動植物の分化、成長、生殖、免疫などの現象で重要な役割を果たしている。そのため、これらの現象を分子レベルで理解するには、LRRをもつ受容体のリガンド認識機構を解明することが不可欠である。研究代表者は、LRRをもつ受容体のリガンド結合部位の大腸菌での発現技術を開発したが、研究の過程で、この技術で得られた組換えタンパク質の大部分が不活性であることが判明した。そこで、大腸菌の発現系の再検討を行ったところ、タグとなるタンパク質の種類と細胞の破砕条件を検討することで、活性を待った形で組換えタンパク質を得ることに成功した。この技術を用いて、トマトのLRRをもつ受容体BRI1/SR160について研究を行った。この受容体は植物の成長や分化を促進するステロイドホルモン、ブラシノライド(BL)と、葉の食害に対する防御機構を誘導するペプチドホルモン、システミンという全く性質の異なる2つのリガンドを認識し、異なる生理作用を誘導する。しかし、この1つの受容体がどのようにして、この2つの異なるリガンドを認識し、異なるシグナルを誘導するのかわかっていない。そこで、BRI1/SR160とシステミンおよびBLの相互作用機構の解析を行った。BRI1/SR160の細胞外ドメイン全長を大腸菌で発現させ、その領域がBLと結合することを確認した。さらに、過剰量のシステミンを加え、BLと競合するかどうかを調べたところ競合は見られなかった。このことから、BRI1/SR160おけるシステミンとBL結合部位は異なること、すなわち、BRI1/SR160は二つのリガンド認識機構をもつことが示唆された。この研究成果については、現在、論文にまとめているところである。
抗菌因子の高濃度暴露による難治性乳房炎治療プログラムの開発

エストロゲン(E)とショート乾乳(3日間のみ搾乳を停止する処理)を併用した時の乳汁中抗菌因子の変化を調べることにより、難治性の乳房炎を治療する新たなプログラムを開発することを目的とした。Eの投与またはショート乾乳を実施すると、乳量は一時的に減少し、抗菌因子の乳中濃度は有意に増加した。次にE投与とショート乾乳を同時に行うと、ショート乾乳だけに比べて乳中抗菌因子がさらに増加した。以上のことから、ショート乾乳中にEを投与すると、抗菌因子濃度が飛躍的に上昇し、乳腺の免疫機能が強化され、乳房炎治療に有効であることが示唆された。乳房炎による損害は国内で年間700億円以上であり,減少する兆しは全くない.したがって,乳房炎を防除することが酪農業界にとって急務である.乳房が黄色ブドウ球菌等に感染すると,細菌が組織に侵襲し,抗生物質の効果が弱まり慢性化する.このような慢性の難治性乳房炎が近年増えている.これらの乳房炎の治療は抗生物質を長期間用いる方法が主流であるが,牛乳の出荷ができず,耐性菌の出現も危惧される.したがって,抗生物質を使わない新たな治療法が期待される.そこで、抗菌因子に着目し、これを最大限に生かした治療法の確立を目指す。27年度はエストロゲン(E)が抗菌因子濃度に及ぼす影響について検討した。In vivo試験ではEを4日間筋中投与し,乳量及び乳汁成分を測定した。その結果、乳量がE投与により有意に減少した。乳中LAP濃度はEにより増加する傾向が認められた。In vitro試験において,牛乳から乳腺上皮細胞を単離し、Eを種々の濃度添加した培地で培養し,培地は抗菌因子の濃度を、上皮細胞は抗菌因子、水輸送蛋白であるアクアポリン、密着結合分子の遺伝子発現を調べた.その結果、培地にEを添加するとアクアポリン7および密着結合分子であるClaudin-1、6のmRNA発現が有意に減少したが、抗菌因子であるLAPやTAPの発現や培地中の濃度は減少しなかった。以上の結果から、Eによって水チャネル分子および密着結合分子の減少により、乳量が低下し、それによって乳中抗菌因子の濃度が増加すると推察された。したがって、Eを利用することにより乳房炎の予防・治療の可能性が示された。In vitro試験において,牛乳から直接乳腺上皮細胞を単離する方法を用い、これを増殖してE試験に用いた。Eを種々の濃度添加した培地で培養し,経時的に培地および細胞を採取した。培地は乳糖,乳蛋白,乳脂質および抗菌因子の濃度を測定し,細胞は全RNAを採取した後,定量PCRを行い,抗菌因子,水輸送蛋白であるアクアポリンおよび密着結合分子の発現を調べた。これらは計画書に記載した通りの内容であり、計画通り実験が遂行されたと判断できる。In vivo試験ではEを種々の日数筋中投与し,経時的に乳汁を採取した。乳汁は乳糖,乳蛋白,乳脂質および抗菌因子の濃度を測定した。これらは計画書通りの内容であった。しかし、E投与の後バイオプシーによって組織を採取する予定であったが、ウシの乳房からバイオプシーをすることが不可能であったため、実施できなかった。しかし、ヤギを用いた試験に切り替えて、同内容の試験を実施する予定である。乳房炎による被害は深刻であるが,予防・治療法が確立していないため発症率は低下していない.特に慢性乳房炎による被害が多く,これの防除は喫緊の課題である.我々は乳腺で抗菌因子が合成されることを見出した.乳は直接食品となる上に,脱抗生物質が望まれることから,感染細菌を排除するために抗菌因子を利用することを着想した.そこで,乳腺内での抗菌因子の濃度を最大限にすることで細菌を一網打尽にする革新的な手法を開発するため,抗菌因子の発現機能に着目した処理法の効果を検証する研究を実施している.平成28年度にはエストロゲン(E)投与により乳産生量を抑制し,乳中抗菌因子の濃度を上昇させることを発見した.本年度は、搾乳を3日間一時的に停止する(ショート乾乳)およびプロバイオティクス投与により、乳汁中抗菌因子の濃度が上昇するかどうかを検討した。まず、ショート乾乳を実施し定期的に乳汁を採取して、乳量、体細胞数(乳房炎の指標)、抗菌因子(ラクトペルオキシダーゼ活性、ラクトフェリン、カテリシジン-7)の濃度を測定した。その結果、ショート乾乳後に乳量は一時的に減少し、逆に体細胞数は増加した。抗菌因子であるラクトフェリン、カテリシジン-7の乳中濃度はショート乾乳後に有意に増加した。これらのことから、ショート乾乳することによって乳量が減少し、それによって抗菌因子の乳中濃度が増加すると考えられた。また、プロバイオティクスとして、酵母を乳房に注入し、経時的に乳汁を採取して、抗菌因子の濃度を測定した。酵母投与24時間後に乳量が一時的に増加したが、体細胞数およびカテリシジン-7の濃度は有意には変化しなかった。したがって、酵母の投与は抗菌因子濃度には影響しないと思われた。以上のように、ショート乾乳を実施することにより抗菌因子の乳中濃度を高めることが明らかとなり、この方法による乳房炎治療が可能と考えられた。プロバイオティクスを用いる方法およびショート乾乳法による試験を計画し、いずれも本年度中に終了できたため。乳房炎による被害は深刻であるが,予防・治療法が確立していないため発症率は低下していない.特に慢性乳房

炎による被害が多く,これの防除は喫緊の課題である.乳腺内での抗菌因子の濃度を最大限にすることで細菌を一網打尽にする革新的な手法を開発するため,抗菌因子の発現機能に着目した処理法を検証してきた.平成27度にはエストロゲン投与により乳産生量を抑制し,乳中抗菌因子の濃度を上昇させることができることを発見した.平成28年度は、搾乳を3日間一時的に停止する(ショート乾乳)を実施した結果、乳量は一時的に減少したが、体細胞数や抗菌因子であるラクトフェリン、カテリシジンの乳中濃度は有意に増加した。これらのことから、ショート乾乳することによって抗菌因子の乳中濃度が増加すると考えられた。平成29年度は、ショート乾乳実施時にエストロゲンを投与し、両者の効果を相乗的に獲得する方法を試みた。エストロゲンを投与した時、ショート乾乳後の搾乳再開後に乳量が非投与区と比較して有意に低くなり、搾乳再開後4日目の体細胞数(SCC)が非投与区と比較して有意に高くなった。また、乳中カテリシジンおよびIgA濃度はショート乾乳数日目において、ラクトフェリン濃度はショート乾乳中から搾乳再開後において非投与区と比較して有意に高くなった。以上のことから、ショート乾乳中にエストロゲンを投与すると、搾乳再開後、ショート乾乳とエストロゲンの相乗効果によって、乳量がさらに減少することで抗菌因子濃度が相対的に上昇し、一時的な自然免疫機能の強化がさらに向上することが示唆された。以上のように、ショート乾乳とエストロゲンを併用することにより抗菌因子の乳中濃度を高めることが明らかとなり、これによって,乳房炎の治療が効果的に実施できると期待できる。エストロゲン(E)とショート乾乳(3日間のみ搾乳を停止する処理)を併用した時の乳汁中抗菌因子の変化を調べることにより、難治性の乳房炎を治療する新たなプログラムを開発することを目的とした。Eの投与またはショート乾乳を実施すると、乳量は一時的に減少し、抗菌因子の乳中濃度は有意に増加した。次にE投与とショート乾乳を同時に行うと、ショート乾乳だけに比べて乳中抗菌因子がさらに増加した。以上のことから、ショート乾乳中にEを投与すると、抗菌因子濃度が飛躍的に上昇し、乳腺の免疫機能が強化され、乳房炎治療に有効であることが示唆された。抗菌因子の発現を増強させ乳中の抗菌因子の濃度を増加させるためのもう一つの手法として,細菌成分を乳房に投与する方法を試験する。サプリメントとして広く普及しているため安全性にも問題のないプロバイオティクスを経口投与することにより消化管抗菌因子の遺伝子発現が増加することが知られているので、本試験ではこのプロバイオティクスを乳房内に直接投与して、乳汁中の抗菌因子の濃度変化を調べる。プロバイオティクスを乳頭経由で乳腺に注入した後,経時的に乳サンプルを採取するとともにバイオプシーにより乳腺組織を採取する。乳サンプルの測定項目およびPCRのターゲット遺伝子は抗菌因子(lingual antimicrobial peptide;LAP, S100A7, lactoferrin, cathelicidin, lactoperoxidase)等である。抗菌因子の測定方法は酵素免疫測定法を用いる予定であり,これらの手法はすでに確立している。炎症の程度を調べるために体細胞数(somatic cell count: SCC)も調べる.プロバイオティクスはまず酵母を試す予定である。
教室・モバイル併用クラウド型遠隔学習コミュニティ環境の開発

本研究では、教室・モバイル環境の両者が連携したクラウド型遠隔学習環境を構築し、学習コミュニティの創出支援と検証を目的とした。すなわち、教室間を高精細映像で接続する遠隔教育・学習環境をテレビ会議システムで構築し、これにタブレット端末等から参加可能なクラウド型コミュニケーション・プラットフォームを組み合わせたシステムを開発すると共に、遠隔教室における授業参加者とタブレット端末を通した参加者のいずれにとっても有効な方法を開発した。本研究では、開発したシステムを大阪大学(吹田・豊中キャンパス)と大阪大学野田村サテライト(岩手県)間での遠隔セミナーで継続運用し、課題を抽出し検証した。本研究では、クラウド型テレビ会議プラットフォームを利用し、多くの参加者がテレビ会議やタブレット端末からでも参加可能なシステム(遠隔教室環境でありながら通常の教室環境に近づける学習環境)を開発し、実運用を通して課題を抽出し検証するものである。今年度は、まずクラウド型テレビ会議機能(画質や画面共有、従来のテレビ会議とタブレット端末等からの接続性・接続方法、多人数接続時の表示画面構成等)について検討し、遠隔教育・学習における仕様を検証した。くわえて、遠隔講義といった環境を実験的に構築し、Webカメラとマイク・スピーカーの仕様を確認し、検証した。その結果Webカメラでは、USB対応でデジタルズームとオートフォーカス、上下左右にパン・チルト、デジタルズーム(PTZ)と画質調整機能を有している必要がある。PTZ機能は、ローカルと遠隔から自然な動きで操作できる必要があるが、遠隔操作では、さらなる性能の向上が必要であることが分かった。また、マイクスピーカーでは、適用型エコーキャンセラー機能による自然な遠隔コミュニケーションを実現できたものの、ライブ演奏との両立には使用するマイク(エコーキャンセラー機能を有しないマイク)を切り替えることで対応したが、使用するマイクスピーカーに課題があることが分かった。さらに、本システムを利用した遠隔実践を大阪大学と大阪大学岩手県野田村サテライト間で12回実施し、学習環境が成立する条件を検証した。くわえて、クラウドコンピューティングや遠隔教育・学習に関連する学会における動向調査を行い、次年度への準備につなげた。初年度では、クラウド型テレビ会議プラットフォームの機能を検証し、それを利用した遠隔学習環境の構築をおこなった。初年度から実験的かつ実運用による検証を行えているものの、実運用を通して分かった課題もあるため、「おおむね順調に進展している」とした。研究では、クラウド型テレビ会議プラットフォームを利用し、多くの参加者がテレビ会議やタブレット端末からでも参加可能なシステムを開発した。本科研では、毎月11日に岩手県大阪大学野田村サテライトや野田村リメンバーホープヴィレッジと大阪大学間で遠隔セミナーを実施している。実運用を通して、Webカメラの視野角の課題が抽出された。つまり、一般的なWebカメラの視野角(60度から90度)では、カメラに映る範囲は限定的で左右に振らない限り、範囲外の様子は分からないが、Webカメラを広視野角化し人間の視界に近い形で撮影することの意義が見いだされた。そこで従来型Webカメラと次世代型HDパノラマカメラ、全方位360度カメラで比較検証を行い、それぞれの特徴を確認した。遠隔セミナーの様子を全方位撮影可能な360度カメラでライブ配信し,遠隔地からの参加者が,360度ライブ映像を自身の興味関心に応じて見る方向を選択できることについて,質問紙調査にて評価した.その結果,参加者は,カメラが向けられた先の映像だけでなく,発言者や参加者の様子,会場の雰囲気など,興味関心に応じて視点を変え,自由に見たい願望があることが確認された.また、遠隔学習・教育におけるコミュニケーションの特性を明らかにするために、遠隔視覚対話システムの一つである「超鏡」を用いて、通常の対面授業と「超鏡」下(正像・鏡像)でのコミュニケーションの比較検証実験を行い、それぞれの特性を掴むことができた。くわえて、クラウドコンピューティングや全方位360度カメラ、遠隔教育・学習に関連する学会における動向調査を行い、次年度への準備につなげた。初年度から引き続き、クラウド型テレビ会議プラットフォームの機能やカメラ(パノラマカメラや360度カメラ等)を検証しながら、遠隔学習環境の構築をおこなっている。クラウド型テレビ会議プラットフォームは、機能のアップデートが随時行われており、その検証を行っている。遠隔学習実践は、毎月実施し、その実運用を通して分かった課題を随時解決し、利用者にとって使いやすいシステムを構築する必要がある。本科研費プロジェクトでは、初年度より大学とサテライトやフィールドワーク間で高精細映像を用いたクラウド型遠隔学習・セミナーを前倒しで実施し、実運用を通してシステムの機能や課題を検証してきた。実運用を通して、教室など遠隔地と接続する上で、従来型カメラの視野角では、接続先の状況把握が十分できないことが明らかとなった。そこで、全方位対応カメラを利用した遠隔教育の可能性を探る必要性がでたため、次の内容(3映像ストリーミング視聴による遠隔学習コミュニティの検証)と合わせて検証した。ここでは、遠隔セミナーの様子を全方位撮影可能な360度カメラでストリーミング配信し、YouTubeで視聴できるようにした。そして、360度ライブ映像の意義と課題について、質問紙調査にて検討した。その結果、参加者は、自ら自由に視点を切り替えることにより、会場の雰囲気が分かることに意義を見出していた。さらに、ライブ配信を視聴する参加者は、会場にいる講師よりも参加者の様子を知ること、会場全体の様子よりもそこで発言している参加者を見たいという願望のあることが確認できた。

すなわち、教室間を高精細映像で接続する遠隔教育・学習環境をテレビ会議システムで構築し、これにタブレット端末等から参加可能なクラウド型コミュニケーション・プラットフォームを組み合わせたシステムを開発すると共に、遠隔教室における授業参加者とタブレット端末を通した参加者のいずれにとっても有効な方法を開発した。本研究では、開発したシステムを大阪大学(吹田・豊中キャンパス)と大阪大学野田村サテライト(岩手県)間での遠隔セミナーで継続運用し、課題を抽出し検証した。初年度に得られた結果をもとに今後は、引き続き授業形態に応じた遠隔学習環境を検証(例えば、楽器の生演奏と話し声の伝送)し、遠隔教室環境でありながら通常の教室環境に近づける学習環境について検証する。また、これまでの研究成果に関する学会発表と関連する学会における動向調査を行い、次年度への準備につなげる。本科研費プロジェクトでは、初年度より大学とサテライトやフィールドワーク間で高精細映像を用いたクラウド型遠隔学習・セミナーを前倒しして実施し、実運用を通してシステムの機能や課題を検証している。最終年度も引き続き、クラウド型テレビ会議プラットフォームの機能を検証しながら、遠隔学習環境の構築を行う予定である。遠隔学習実践は毎月実施し、その実運用を通して分かった課題(例えば、楽器の生演奏と話し声の伝送【エコーキャンセル機能の取り扱い】や、広視野角カメラの特性把握とその利用)を検証しているものの、セミナー内容に応じてシステムの使いやすさ等をさらに追求する必要がある。教育工学旅費交通費としての支出がなかったため、次年度に繰り越す。本研究では、大阪大学と岩手県大阪大学野田村サテライトやフィールドワーク等との間で毎月遠隔セミナーを行っている。フィールドワークにはインターネット環境がない、楽器の生演奏と話し声の適切な伝送等、遠隔学習内容に応じて現地でのサポートが必要な場合がある。その費用として確保していた。現地サポートが必要な回数を確認し、旅費交通費として使用する。
微生物脱硫酵素に関する研究

本申請者は石油中の有機硫黄化合物のモデルとして考えられているジベンゾチオフェン(DBT)を脱硫し、2-ヒドロキシビフェニルを生成する細菌R.erythropolis D-1が生産するDBT脱硫酵素系について研究を行っている。本年度は、DBT脱硫の第一、第二段階であるDBTからDBTスルホンおよびDBTスルホンから2'-ヒドロキシビフェニル2-スルフィン酸への転換を触媒する酵素について精製を行い、その性質を明らかにした。R.erythropolis D-1を唯一の硫黄源としてDBTを含む完全合成培地で培養し、これを超音波破砕し無細胞抽出液を得た.硫安分画(30-60%)後、DEAE-Sepharoseクロマトグラフィーに通すと両活性ともシングルフラクションでは見いだせなくなり、両活性とも2つの画分の存在下で初めて活性を検出できた。それぞれの一方の画分は共通しており、NADHにリンクし、人工電子受容体、dichlorophenolindophenolやcytochrome c、ferricyanideを基質とするreductase活性を有していた。DBT分解活性を有する画分を精製したところ、分子量270kDa、サブユニット分子量は45kDaの電気泳動的に均一な精製酵素標品が得られた。また、DBTスルホン分解活性を有する画分を精製したところ、分子量88kDa、サブユニット分子量50kDaのほぼ均一な精製酵素標品が得られた.両酵素とも金属キレーター、SH阻害剤によって阻害された。DBT分解酵素系はDBT骨格を有する化合物には作用したが、カルバゾール、フルオレンなどには働かなかった。
教育番組視聴時における生体反応情報のモデル化に関する研究

本研究は、テレビ番組視聴時における学習の客観的指標である瞳孔面積変化、瞬目反応と主観評価との関係を明らかにし、そのモデル化を行うことを目的とした。まず、瞳孔面積と瞬目率を時系列的に評価するためのニューラルフィルターを試作した。瞳孔面積を時系列的に処理する上で、瞳孔雑音と呼ばれる微小変動や瞬目による瞳孔面積値の欠損が問題となる。そこで、砂時計型ネットワークを用いて、瞳孔面積変化を特徴抽出と瞬目時の瞳孔面積変化を学習させ、平滑化と瞬目処理を同時に行えるモデルを構築した。次に、時系列的な主観評価を測定するために、アナログ値を入力できるデバイスを開発した。主観評価値の妥当性を検討するために、様々な番組に対する質問紙による結果と、時系列的な結果との対応関係を調べた。質問紙による評価から、番組に対する評価因子を抽出し、それらの因子との相関を調べ、教育用テレビ番組の総合的な評価の方法を検討した。
眼表面アレルギー治療を目標とした肥満細胞の分化・活性化機構の解明

肥満細胞のアレルギー性結膜炎への関与について、まず肥満細胞欠損を生じたマウスを用いて、肥満細胞の関与を養子移入モデルを用いて検討した。その結果、好酸球の浸潤は、肥満細胞の活性化による調節が必要であることが示された。肥満細胞の調節に関わる因子に関して、そのレセプターを結合組織型肥満細胞上で検索したところ、CCR1,CCR2,CCR3,CCR5,CXCR3の発現を認めた。とくにCCR1,CCR3,CXCR3は結膜肥満細胞上に顕著に発現していた。まず、それらのリガンドの中でCCL3に関してその役割の検討をおこなった。CCL3は、即時相の反応の際、特徴的にその発現は増大するが、我々は、CCL3が結膜肥満細胞の適切な脱顆粒反応にとって不可欠であるのみならず、in vivoにおいても肥満細胞によりmediateされる即時型過敏反応にとっても不可欠の因子であることを報告した。肥満細胞を制御しうる因子の解析を行うため、我々はアレルギー性結膜炎モデルのtranscriptomeとしての解析とin vitroにおける肥満細胞のシグナリングの制御の双方向からのアプローチを試みた。このため、種々の肥満細胞系の検討を行い、vivoに移入可能かっ、妥当な成熟型の表面レセプター、肥満細胞特異的プロテアーゼの発現を発現する結合組織型肥満細胞系の確立を行った次にCCR3のリガンドであるCCL11に関して、CCR3 antagonist,CCR3抗体投与、CCL11欠損マウスの解析を通じて、肥満細胞を介する即時型過敏反応にはCCL11/CCR3 axisが重要であることが判明した。特に、CCR3はIgEを介する脱顆粒に必要であり、結合組織型肥満細胞において活性化に必要とされるレセプターの中でdefaultと位置づけられるレセプターとなっていることが推察された。そこでCCR3の阻害によるtranscriptomeの詳細なnetwork解析を行った。その結果CCR3を介する副刺激経路にはPI3K, NFκB, MAPK経路が関与していることが判明してきた。現在、これらの解析を通じて浮かび上がってきたいくつかの治療候補分子に関して、in vitroおよびin vivoの両面から治療標的としての評価をめつつある。我々は、生体における肥満細胞のアレルギー性結膜炎への関与、次に肥満細胞の調節に関わる因子に関して解析をすすめてきた。まず、肥満細胞のアレルギー性結膜炎への関与についてはc-Kit欠損により肥満細胞欠損を生じたマウスにアレルギー性結膜炎を発症させ、肥満細胞の関与を検討した。その結果肥満細胞欠損マウスにおいては、即時相の反応の消失に加え、遅発相の好酸球、好中球浸潤も著明に減少した。このことは、肥満細胞の活性化のみで遅発相の多くを説明できることを示している。次に、我々は、この減少が肥満細胞によりmediateされているのかをさらに検証するため、分化させた肥満細胞を結膜に移入し、遅発相への影響を検討を行うため、分化状態の検討をおこなっている。肥満細胞の調節に関わる因子に関しては、現在最も有望な因子としてCCL3,CCL11が浮かびあがってきた。CCL3は、即時相の反応の際、特徴的にその発現は増大するが、我々は、CCL3が結膜肥満細胞の適切な脱顆粒反応にとって不可欠な因子であることを報告した。一方、CCL11に関しても同様に結膜局所の肥満細胞の脱顆粒にとって必須の因子であることも判明した。

免疫染色を用いた検討では結膜肥満細胞は結合組織型の特徴をもつ肥満細胞であり、CCR1,CCR3を発現するが、これらはCCR5は発現しなかった。また、CCR3の発現はアレルゲン点眼前の発現は結膜の場合、ほぼ肥満細胞に限局しており、結膜におけるCCL11の役割は、好酸球浸潤の主要なmediatorであるのみならず即時相反応の重要な調節因子であることが示された。これまでの研究からこれらCCケモカインを介する経路が肥満細胞の応答性を精緻に調節していることがわかってきたが、これらが高親和性IgEレセプターを介した下流シグナルをいったいどのように調節していのかをさらに検討するため、分離した結膜肥満細胞の系を用いて細胞骨格や細胞膜状のラフト構造との関連に関して検討を進めつつある。肥満細胞を制御しうる因子の解析を行うため、我々はアレルギー性結膜炎モデルのtranscriptomeとしての解析とin vitroにおける肥満細胞のシグナリングの制御の双方向からのアプローチを試みている。特に本プロジェクトの遂行にはin vitroで検証可能なモデル細胞系の確立が不可欠である。このため、その確立及び至適化を平行して進めてきた。もっとも重要な問題点は、結膜における生体内の肥満細胞と、確立された培養系の肥満細胞培養系は、大きく異なり、表面マーカーなど重要な特質を反映していないという点であった。この問題点をクリアするため、まず、肥満細胞を含む分離結膜のケモカインに対する反応性の検討を行った。その結果、肥満細胞脱顆粒は、IgEとアレルゲンの刺激だけでは十分おこらず、アレルゲン暴露と同時に分泌されるeotaxin-1などのβ-chemokineの作用が必要でありこの反応は肥満細胞上のCCR3を介することが判明した。この現象をさらに詳細に解析するため、次に種々の肥満細胞系の検討あるいは確立を行った。その結果、vivoに移入可能であり、かつ、前述と同様な反応性を占めす肥満細胞の培養系を確立することができた。この結膜由来肥満細胞は、CCR3,FcεRI,DX5などの表面マーカーを発現し、結合組織型肥満細胞の特徴を示した。このモデル細胞を用いて我々はin vivoの反応性を反映した状態でのシグナリングの解析をすすめつつある。結膜肥満細胞のsignal経路の詳細な解析は新規治療標的の探索に不可欠であるが、多量の成熟肥満細胞を必要とする。しかしながら結膜由来の肥満細胞を用いる場合、その収量の少なさは解析の支障となる。そこで前年度の純化方法をさらにrefineし、短期間で高収量の肥満細胞の分離法の開発をまず試みた。これまでの我々のデータにより、サイトカインに対する反応性、肥満細胞特異的プロテアーゼprofile,及び抗原に対する反応性から、皮膚由来の肥満細胞は結膜由来の肥満細胞とほぼ同様な性質を示すことが判明したため、結膜からの培養系のrefinementに加え、皮膚からの大量培養系の確立に着手した。
筋緊張性ジストロフィー症の原因遺伝子に関する研究

筋緊張性ジストロフィー症(以下DM)は以下の点で非常に興味ある疾患である。(1)遺伝性早老症の一つに分類され、白内障、前頭部禿頭、性腺機能低下、痴呆などの老化現象を示すことから、老化のメカニズム解明の糸口になりうる。(2)多組織性優性遺伝病のモデルとなる。(3)病気の重症度や発病年齢の幅が広い。(4)女性遺伝からくる先天性DM発生の問題。(5)世代を経る毎にDM患者の症状が重症化する表現促進現象(anticipation)がみられる。1992年初めに欧米のグループによってDMの原因となる不安定DNA配列が単離同定され、DM患者では(CTG)リピートが異常に長い事が判明した。これを契機として、上記病態の解明が期待されている。本研究では、日本人における(CTG)リピート数の分布、父性遺伝と母性遺伝における(CTG)増大の比較、さらに、多型性DNAマーカーを使ったハプロタイプ分析による創始者効果の検討を行った。その結果は以下の通りである。(A)正常人は、535回リピートをもち、13回のくり返しが最多、患者は例外なく50回3,000回と長かった。(B)全体として母性遺伝の方が父性遺伝より(CTG)リピートの増大が大きい傾向がみられたが個々については例外もあった。(C)日本人の異常染色体のパプロタイプは1つであり、DMにおける創始者染色体が想定された。筋緊張性ジストロフィー症(以下DM)は、常染色体優性の形式で遺伝し、全身の臓器が障害される難病で、成人の筋ジストロフィー症の中では最も頻度の高い疾患である。1992年初めに欧米のグループによって、DMの発症原因と考えられる(CTG)n繰り返し配列を3^7非翻訳部にもつcDNAが単離された。本研究では、日本人DM患者におけるこの(CTG)n繰り返し配列を含む不安定領域の遺伝子解析を行った。健常人とDM家系の構成員の高分子量DNAを制限酵素で消化後、DMの原因遺伝子と考えられるcDNA25とサザンハイブリダイゼーションを行った。また(CTG)n繰り返し配列の回数と長さは、PCRを利用して決定した。さらに、以前から解析していたDM座位に近接する多型性遺伝子マーカーとの間の連鎖不平衡の有無を調べた。サザンハイブリダイゼーションでは、DM患者において数100bpから6kbまでの遺伝子の拡張が証明された。重症患者と若年発症患者において、長さの増加は著明であった。また、世代を経るにつれて長さが増大する傾向にあった。これは、これまで確認されている表現促進の臨床症状と一致した。(CTG)n繰り返し配列は、健常人では5回から35回の繰り返しであったのに対し、患者ではPCR産物は一本のバンドしか検出できず、50回以上の繰り返しバンドは検出できなかった。健常人の(CTG)n繰り返しの回数は多型に富み、日本人では13回の繰り返しが、白人では5回の繰り返しの頻度が最も多く、遺伝子頻度において両民族間に統計学的な有意差が存在した。cDNA25から20-30kb動原体側に離れたDNAマーカーであるP37.1が、DM遺伝子と強い連鎖不平衡を示すことや、解析したDM家系全例において、(CTG)n繰り返し配列の拡張がEcoRI消化の9.8kbの対立遺伝子に発生することより、本邦のDM患者は共通の祖先をもつ可能性があると考えられた。筋緊張性ジストロフィー症(以下DM)の原因は、第19染色体長腕19q13.3に存在するDM蛋白キナーゼ(DMPK)遺伝子の3′非翻訳部にある(CTG)リピートの異常増幅である。このリピート数は、正常者が537回、DMが503,000回と報告されている。通常の遺伝病と異なり、この変異は動的突然変異と呼ばれ、世代を経る毎に、リピート数が増大する。

臨床遺伝学的には、発病年齢が早まり、重症化する表現促進現象と対応している。この(CTG)リピートの増大していくメカニズムを調べるため、家系を使ってリピート近傍の多型における連鎖不平衡を解析した。その結果、正常集団は、リピート数が5回、1113回、1418回、19回以上の4つに大別されることが判明し、DMは19回以上の集団に由来することが推測された。この(CTG)リピート19回以上の集団は、3550回までの前変異の予備軍として存在し、何世代か後に不安定度が増して、50回以上になるとDM患者として発病するという多段階モデルを立てた。また、3550回の前変異をもつ日本人DM家系を発見し、遺伝子解析の結果、5と44回のリピートをもつ祖母から29と46回のリピートをもつ父が生まれ、11と70回のリピートをもつ長男(DM未発症だが将来発病する可能性あり)と、11と470回リピートをもつ4男(DM発症)が生まれた事が判明した。この実例は、上記の多段階モデルを支持する根拠となる。
クモ膜下出血後の脳血管攣縮における炎症反応の関与に関する検討

私が今年度行なった研究は、イヌ大槽内へのタルク注入によって惹起される持続性且つ遅発性の血管収縮が真に脳血管攣縮と同一病態であるか否かを薬理学的手法を用いて検討したことと、注入されたタルクがどのようなメカニズムを介して血管収縮を誘発するかを特にフリーラヂカルに絞って検討した2点である。まず前者についてはこれまでに電子顕微鏡を用いた組織学的な検討を中心に脳血管攣縮との関連を検討し、タルクによる血管収縮と脳血管攣縮との病理組織学的特徴がよく類似することを既に報告した。一方脳血管攣縮時の脳血管は通常の血管と様々な薬理学的特性が異なることも既に知られており、今年度はこうした観点からタルク注入によって得られた収縮血管をin vitroにおいて、その薬理学的特性を検討した。その結果、タルク注入による収縮血管は内皮依存性の弛緩が極めて減弱している一方、内皮非依存性の弛緩反応は保たれていることが明らかになった。この血管特性は通常の脳血管攣縮におけるそれに酷似するものであり、タルクモデルの妥当性が示される結果である。次にfree radical scavengerとして、Superoxide dismutase(SOD)に着目し、これを大槽内に持続注入することによる治療効果を検討したところ、タルクモデルではその遅発性の収縮が著しく抑制されることが観察された。このことはタルクによる持続性の血管収縮とこれに伴う組織学的諸変化がsuperoxide anionによってmediateされることを意味する。一方クモ膜下出血モデルではこのSODの治療効果は観察されず、タルクモデルとの間に結果の相異が見られた。今後クモ膜下出血モデルにおけるsuperoxide anionの関与についてさらに検討を進める予定である。
mRNAキャッピングシステムの機能

真核細胞mRNAキャップ構造は,転写の極めて初期に形成され,その後のmRNA代謝や翻訳において重要なシグナルとして機能する.我々は,種々の生物ならびにウイルスのmRNAキャッピング機構について,酵素化学的ならびに分子遺伝学的手法を用いて解析している.これまでに我々は,酵母S.cerevisiaeのキャッピング酵素αサブユニット(mRNAグアニル酸転移酵素)遺伝子(CEG1)およびβサブユニット(RNA5'-トリホスファターゼ)遺伝子(CET1)のクローニングを行い,これらが酵母の生育にとって必須の遺伝子であることを示し,それぞれの機能部位について解析してきた(J.Biochem.118,1033,1995;BBRC239115,1997).今年度は,ヒトmRNAキャッピング酵素遺伝子(hCAP1)の単離を行い,組換え変異タンパク質の解析から,それがN末側にRNA5'-トリホスファターゼドメインを,C末側にmRNAグアニル酸転移酵素ドメインをもつ多機能酵素であることを証明した(BBRC243,101,1998).さらに,ヒトmRNAキャップメチル化酵素,mRNA(グアニン-7-)メチル基転移酵素の遺伝子(hCMT1)をクローニングし,同酵素の構造・機能相関について解析した(BBRC251,27,1998).また,hCAP1とhCMT1からはいずれも,選択的スプライシングにより少なくとも2種類のタンパク質が細胞内で発現していることが示唆された.polII転写開始複合体を活性状態で分離し,その中にmRNAキャッピング酵素およびmRNA(グアニン-7-)メチル基転移酵素が特異的に含まれていることを,それぞれの酵素に対する特異的抗体を用いて明らかにした.ウイルスmRNAキャッピングについては,センダイウイルスとインフルエンザウイルスについて検討した.センダイウイルスmRNAのin vitro合成はほぼ完全に宿主因子の存在に依存する.宿主因子を高度に精製し,それが3つの成分からなることを明らかにした.インフルエンザウイルスmRNAのキャップ構造は宿主mRNA断片を利用することによって付加される.とくに,この反応に関与するウイルスポリメラーゼPB2サブユニットについて,宿主キャップ構造の認識部位のマッピングを種々のモノクローナル抗体を利用して行った(Virology,in press).真核細胞mRNAキャップ構造は,転写の極めて初期に形成され,その後のmRNA代謝や翻訳において重要なシグナルとして機能する.我々は,種々の生物ならびにウイルスのmRNAキャッピング機構について,酵素化学的ならびに分子遺伝学的手法を用いて解析している.これまでに我々は,酵母S.cerevisiaeのキャッピング酵素αサブユニット(mRNAグアニル酸転移酵素)遺伝子(CEG1)およびβサブユニット(RNA5'-トリホスファターゼ)遺伝子(CET1)のクローニングを行い,これらが酵母の生育にとって必須の遺伝子であることを示し,それぞれの機能部位について解析してきた(J.Biochem.118,1033,1995;BBRC239115,1997).今年度は,ヒトmRNAキャッピング酵素遺伝子(hCAP1)の単離を行い,組換え変異タンパク質の解析から,それがN末側にRNA5'-トリホスファターゼドメインを,C末側にmRNAグアニル酸転移酵素ドメインをもつ多機能酵素であることを証明した(BBRC243,101,1998).さらに,ヒトmRNAキャップメチル化酵素,mRNA(グアニン-7-)メチル基転移酵素の遺伝子(hCMT1)をクローニングし,同酵素の構造・機能相関について解析した(BBRC251,27,1998).また,hCAP1とhCMT1からはいずれも,選択的スプライシングにより少なくとも2種類のタンパク質が細胞内で発現していることが示唆された.polII転写開始複合体を活性状態で分離し,その中にmRNAキャッピング酵素およびmRNA(グアニン-7-)メチル基転移酵素が特異的に含まれていることを,それぞれの酵素に対する特異的抗体を用いて明らかにした.ウイルスmRNAキャッピングについては,センダイウイルスとインフルエンザウイルスについて検討した.センダイウイルスmRNAのin vitro合成はほぼ完全に宿主因子の存在に依存する.宿主因子を高度に精製し,それが3つの成分からなることを明らかにした.インフルエンザウイルスmRNAのキャップ構造は宿主mRNA断片を利用することによって付加される.とくに,この反応に関与するウイルスポリメラーゼPB2サブユニットについて,宿主キャップ構造の認識部位のマッピングを種々のモノクローナル抗体を利用して行った(Virology,in press).
トロンビンとネキシン-1の神経系細胞の分化制御に関する研究

平成7年度の研究成果としては、各種神経系細胞株でのネキシン-1ならびにトロンビン機能的レセプターのmRNAの発現をRT-PCR法を用いて検討した。ネキシン-1については、プライマーの位置としてC末側の非翻訳領域を含む584bpを選ぶことにより、再現性の高い検出が可能となった。種を越えて、ヒト神経芽細胞腫株のGOTO,SKNSH,SY5Y、ヒト膠芽腫A172、ラット膠腫C6、さらにヒト脈絡叢乳頭腫CRL1600において、ネキシン-1のmRNA発現を確認できた。半定量では、GOTO株において最も多量の発現を確認した。トロンビン機能的レセプターについては、ヒトのcloningのみ報告されているため、翻訳領域内の856bpを増幅するようにプライマーを設定した。ネキシン-1と同様のPCR条件にて、GOTO,SKNSH,さらにCRL1600において発現を確認した。GOTOにおいては、かなり多量の発現を確認した。ラット膠腫C6では、種の違いからか、検出できなかった。以上の結果より、上記2種の蛋白の発現制御機構の解析には、ヒト神経芽細胞腫GOTO株が最適であると結論した。グリア系としてラット膠腫C6株を用いる予定であるため、ノザンプロット法にて種の違いを解決したい。さらに、トロンボモジュリンの発現を確認すべく、C末側の非翻訳領域を含む1200bpを増幅するようにプライマーを作成した。ネキシン-1、トロンビン機能的レセプター、さらにトロンボモジュリンと、トロンビンの受容体と成りうる3種の蛋白の発現制御を解明することで、今後セリンプロテアーゼであるトロンビンとそのインヒビターとのバランスが神経系の発達分化に及ぼす影響を解析していく予定である。