hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ハンディキャップ集団による都市空間の認知とナヴィゲーションに関する研究

本研究は、地理学者と心理学者による共同研究の日本における初めての試みである。2年間の共同研究を経て、互いの研究風土の違いを認識するとともに、空間認知研究の目的・概念・方法論に関し、ある程度の共通理解を深めることができた。共通理解の鍵となるのは生態学的アプローチである。これは、心理学における近年の生態学的アプローチの台頭により、もともと生態的環境をフィールドとする地理学と対話の糸口が見えてきた。問題は、こうした地理的な環境のなかの何がいかにして人の空間認知やナヴィゲーションに影響を与えるかである。本研究では、この点を実証的に追求するために、特にハンディキャップ集団に着目した。ここでハンディキャップ集団とは、日本の都市空間で空間認知や空間行動を行う際に何らかのハンディキャップを負っている人々であり、障害者、外国人、子どもなどである。また、本研究では、空間認知能力の男女差にも着目した。研究活動の一環として、日本地理学会2000年度春季学術大会でシンポジウムを開催し、本研究の内容について討議する予定である。シンポジウムのテーマは「道をあるく、街にすむ-都市空間における認知と行動に関する地理学と心理学のコラボレーション-」、研究代表者・分担者による発表タイトルは以下のとおりである。「実りある地理学と心理学の共同研究を求めて」「ハンディキャップをもつ人達の空間認知と空間行動への視点-地理学者と心理学者の対話に向けて-」「女性は道に迷いやすいか?:空間認知の性差とその起源」「見えない空間を歩く:視覚障害者の空間認知と歩行」「在日外国人の日常生活の移動における困難について」「子どもから見た市街地路上におけるバリアー写真投影法による場所の認知-」本研究は、地理学者と心理学者による共同研究の日本における初めての試みである。「実りある地理学と心理学の共同研究を求めて」「ハンディキャップをもつ人達の空間認知と空間行動への視点-地理学者と心理学者の対話に向けて-」「女性は道に迷いやすいか?:空間認知の性差とその起源」「見えない空間を歩く:視覚障害者の空間認知と歩行」「在日外国人の日常生活の移動における困難について」「子どもから見た市街地路上におけるバリアー写真投影法による場所の認知-」次の3つのテーマを設けて、研究を遂行した。1)障害者の空間認知まず、障害者の空間認知に関する近年の研究動向を整理した。これまでの研究の多くは、視覚障害者を対象としてきた。しかし、視覚障害者の空間認知は依然として不明な点が多い。そこで、視覚障害者を対象として研究を行うこととした。方法としては、視覚障害者とともに都市のあちこちを歩き回り、障害者に歩きながら感じることを語ってもらい、そのプロトコルをテープレコーダーに記録するとともに、ポイントとなる場所を写真に収めた。2)外国人の空間認知このテーマに関する従来の研究はほとんどない。日本にやってきた外国人は、日本の環境に関するスキーマ的知識がないため、戸惑うことになる。このスキーマ的知識の内容、構造、獲得過程を明らかにするのが課題である。方法としては、日系ブラジル人を対象として、面接調査と手書き地図の採集を行った。また、留学生と日本人学生の探索行動の比較調査も行った。3)子供の空間認知子供は、目線が低く奥行き知覚が不得意であること、太陽光線による定位が不得意であること、標識に書かれた社会的な言語が理解できないこと、などから空間認知についてのハンディキャップ集団だと言える。研究方法としては、小学生を対象に、道に迷った体験談の収集、手書き地図から見た道路形態の知覚の検討、などを行った。また、親の教育観が子供の活動範囲にどのような影響を与え、それが空間認知のスキルとどのように関係するかについても検討した。昨年度に引き続き、3つテーマを中心に研究を遂行した。1)障害者の空間認知とナヴィゲーションナヴィゲーションに際し人々は様々な情報を利用するが、その多くは視覚からもたらされる情報である。しかがって、視覚障害者はナヴィゲーションに際して他の感覚障害に比べても多大な不利を被っている。聴覚や触覚など視覚以外の体性感覚をもとにナヴィゲーションを行うが、それら感覚が及ぶ範囲は視覚の及ぶ範囲に比べて極めて狭い。したがって、視覚障害者にとっては、狭い間隔で連続するランドマークをいかに利用できるかがナヴィゲーションの遂行にとって重要である。

歩道の表面の肌理などへの配慮が都市計画でなされるべきである。2)外国人の空間認知とナヴィゲーション日本での居住歴の浅い在日外国人は、日本語の表記が読めないため、母国でなじみのあった商業施設のロゴ(マクドナルド・シェル石油など)が、ナヴィゲーションの際に参照される重要なランドマークである。彼らにとって、日本の住居表記の仕方は、経路探索を困難にさせている大きな原因である。多くの国では街路を基準に住居表記がなされるのに対し、日本では街区単位となっている。3)子どもの空間認知とナヴィゲーション調査者の予想以上に、子どもたちは日常利用している市街地路上において障害を感じていた。視界の悪さや路面の凸凹は、身長や視野、足の安定度などから生じる子ども独特のハンディキャップと関連する。交通標識の意味などを理解できないという点では、外国人と同様のハンディキャップを被っている。
法治主義の観点からみた公務員養成・研修と法務事務処理の日独比較

本年度は、まず、日本の全都道府県、6道府県の全市町村を対象として実施した自治体法務の組織と現状に関するアンケート調査の総合的分析を行った。これは、本研究代表者が代表をつとめる札幌地方自治法研究会に参加する自治体職員および研究者等による共同研究であるから、行政実務の観点が十分に活かされており、今後の自治体法務のあり方を論ずる際の基礎的データになろう。分析の結果、日本の自治体では、法務担当職員も一般職員も、制度的に十分ねられた法的教育を受けておらず、市民に奉仕する法的事務処理にかなりの問題があることが明らかとなった。他方で、ドイツには公務員の養成制度があり、2年間ないし3年間の学校教育を経て事務職員が養成され、その後に行政現場に配属されること、養成教育の中心部分は行政実務と密着した法律教育であること、事務職員は自ら不服審査の裁決書などを起案する能力を身につけていることから法的な処理を避けることがなく、結果として市民の不服は行政不服審査や行政訴訟として多数発生すること、それが法治主義的行政運営の当然のこととされていること等を調査研究した。ドイツの公務員の養成・研修制度を最初から体系的に研究することは容易ではないため、私は、この点に関するドイツの権威者であるシュパイヤー行政大学のブリューメル教授に包括的な論文執筆を依頼し、これに私が現地調査によって入手した諸資料を解説として付することによって、短い研究期間の中で最大限効率的な研究を行うことができた。今後の研究に残された課題は、今少し詳細なドイツの養成・研修制度の紹介と、日本の公務員の養成・研修制度全体の中で、公務員の法的(行政法的)能力の育成・開発をどのように行うべきかを具体的に提言することである。
ヨーロッパ腐蛆病感染時の細胞外マトリックス結合因子の役割解明と感染モデルの確立

ヨーロッパ腐蛆病はミツバチの法定伝染病に指定される獣医学分野のみならず農学分野においても重要な感染症であるが、その感染の機構は明らかになっていない。申請者はヨーロッパ腐蛆病菌のゲノム情報から見出した病原性関連遺伝子の1つであるコラーゲン結合蛋白質の遺伝子に着目し、当該遺伝子の機能解析、特に本菌の病原性発揮への関与を明らかにすることを目的に本研究課題を進めている。本菌は病原性の違いから、1)弱病原性株(CC13)、2)中度病原性株(CC3)、3)強病原性株(CC12)に分類される。これら3群間でコラーゲン結合蛋白質の遺伝子配列を比較したところ、CC12のそれは他の群CC13およびCC3と顕著に異なっており、CC13およびCC3の遺伝子は約2 kbであるのに対し、CC12の遺伝子は8.7 kbと非常に長かった。また、アミノ酸レベルの比較でも、コラーゲン結合ドメインBの繰り返し構造がCC13・CC3で4回、CC12で11回みられ、その構造は大きな違いが認められた。当該蛋白質のコラーゲン結合能を確認するため、当該遺伝子をHisタグ融合蛋白質として大腸菌内で発現させた後、リコンビナント蛋白質の精製を試みた。研究計画当初は各CC群由来の当該遺伝子を発現させることを予定していたが、まずは分子量の小さいCC13由来遺伝子を発現させた大腸菌の細胞破砕液を用いてコラーゲンとの結合能をELISA法にて解析する実験系の構築に注力した。具体的には、コラーゲンを固相化した96穴プレートを用意し、精製したコラーゲン結合蛋白質と反応させた後、洗浄し、抗His抗体を用いてコラーゲン結合蛋白質を定量する方法である。初年度は予備的実験のみで終了したが、実験系を確立する一定の目処が立った。研究実績の概要にも示したように、初年度は当該蛋白質のコラーゲン結合能を確認するための実験系の構築や各CC群に由来するゲノム配列の確認を行った。これらは本研究を進める上で基盤となるデータであり、重要な作業工程といえる。また、解析対象であるコラーゲン結合蛋白質の遺伝子をHisタグ融合蛋白質として大腸菌内で発現させる系も確立した。以上のことから、今後の解析を推進する上で必要なツールの準備が順調に進められた。腐蛆病菌感染時におけるコラーゲン結合蛋白質の役割を明らかにするため、当該蛋白質のコラーゲンとの結合能を評価する。また、コラーゲン結合蛋白質の遺伝子破壊株等を用いて感染実験を実施する。
長崎県五島市住民コホートのHTLV-1感染率とHTLV-1関連疾患有病率

日本にはヒトT細胞白血病ウイルス1型(HTLV-1)に感染されている方が108万130万人おられる。そのうち5%は成人T細胞白血病・リンパ腫(ATL)を、0.3%はHTLV-1関連脊髄症(HAM)を発症され、確率は不明だがHTLV-1ぶどう膜炎(HU)を発症する方もおられる。ATLを発症すると、半数の方は1年以内に亡くなられる。HAMやHUには直接命の危険はないが、生活の質を大きく損なう。本研究では、HTLV-1感染率が21.5%と高い長崎県五島市の住民を対象にこれらHTLV-1関連疾患を調査し、感染者の方々の健康管理を行うとともに、疾患の予防法や治療法につながる情報を収集する。
非線形バネ機構ロボットのための実環境適応型モーション制御システムの開発

人間環境内でも``使える・役立つ"モーションコントロールを実現するために、(1)柔軟で安全なマニピュレータの開発、(2)環境の不確定性や変動に強い制御法の開発、(3)環境に適応した動きの獲得、の各テーマの研究を行った。(1)ではキャッチング動作を目指した、非線形バネSATを用いたマニピュレータの開発と実験を行い、(2)に関しては手先剛性制御手法の開発と2関節アームでの実験等、(3)に関してはニューラルネットワークや強化学習を用いた手法の応用を行った。1.マニピュレータの製作本年度に完成した三リンク柔軟関節ロボットは非線形バネ要素を意図的に各リンク周辺に配置した.この構造は非線形バネSATを多リンクロボットアームに適用する効果を視覚的に表す上では有効だが構造は大掛かりになる.今年度は非線形バネ要素をロボット本体側に集約する構造の三リンク柔軟関節ロボットを新規に設計開始し,完了した.必要となる中間プーリ数が半減する効果がある.2.SATのモデリングSATはヒステリシス特性を持つため、そのモデリングが難しい。そこで、ヒステリシスを表現する関数を含んだ数式を用意し、SATの実験結果からその係数を決定した。本結果から、SATの特性を表現するのに一番重要なのは指数関数であることが判明した。今後は本モデルを制御系設計や解析に利用する。3.マニピュレータの制御実験では1関節2本腱のロボットを用いていたが、2関節6本腱のマニピュレータを新たに製作し、これまで開発してきた制御法を適用しているところである。シミュレーションにおいては2関節6本腱のマニピュレータで位置と力のハイブリッド制御を実現した。4.学習による環境適応能力の獲得本マニピュレータに対して強化学習を適用し、タスクに適した関節剛性を獲得できるシステムを開発し、衝撃的外力に対する性能の向上をシミュレーションにより確認した。今後は、より有効性の高いタスクへ適用と実験による検証を行っていく。1.剛性可変腱駆動機構に対する改善現在の三リンク柔軟関節ロボッドアームの軽量化・高剛性化と同時に,関節剛性調整機構のレイアウトをロボットアーム側よりロボット本体内へ移動するメリットを検証した.併せて,現在の関節剛性調整機構では関節剛性を高剛性化した際に,関節剛性調整機構の要素部品である非線形バネSATが過度なストレスを受けて塑性変形し,特性が大きく変化してしまう問題点を,機械式重力補償機構およびコンプライアンスリミッターと名付けた関節剛性を柔軟な状態と高剛性な状態に不連続に切り替えるシンプルな機械式機構の開発により改善することを目指し,解析および試作を行った.2.剛性可変腱駆動機構の制御手法の開発制御系で用いられる関節トルク指令と関節剛性指令の腱張力への変換においては、腱張力の上下限を考慮しなければならない。ここでは、肢の生体筋骨格に近い構造の2開節腱駆動機構に対して、代数計算により腱張力の下限を考慮し、できるだけ指令値を実現可能な変換を開発した。これにより、腱張力の制限がある場合にできるだけ元の指令値に近い応答を実現でき、座標変換の計算時間を短縮可能なことから短い制御周期を実現できる。タスクの実現に向けた改善として、手先の硬さを表現した任意の剛性楕円を機械的と制御的の両方で実現できるハイブリッド剛性楕円制御手法を開発した。これにより機械剛性と制御剛性は応答の初期と終盤のそれぞれで支配的であることを示した。1.剛性可変腱駆動機構に対する改善非線形バネ要素SATには、過大な張力を長時間受け続けていると内部の弾性体が塑性変形して特性が悪化する問題点があった。一定値を超える張力が印加された場合は弾性体ではなくワイヤが張力を引き受けるコンプライアンスリミッター機能を内蔵した新しいSATを実際に開発・改良して最終形態のSATを完成した。伸び始めは柔らかく、張力が増えるに従って非線形にバネ剛性が増加し、その後、完全にワイヤ駆動方式の動力伝達系と同等の高剛性化を実現できる。関節剛性調整機構にこのコンプライアンスリミッタ機能付きSATを導入することで関節剛性を柔らかい状態から完全に高剛性の状態まで実現可能となり、実用性が一気に向上した。三リンク柔軟関節ロボットも新規開発し直し、旧来の機構にあったガタツキを無くし、さらに軽量化が実現できた。2.剛性可変腱駆動機構の制御手法の開発前年度に引き続き非線形バネを用いた腱駆動機構アームの制御系の張力分配手法を開発した。ここでは、生体の肢の筋骨格系を模した構造の腱駆動アームを対象として、アクチュエータにトルク制限のある状況での代数計算による簡易な張力分配法の開発を行った。生体の肢の筋骨格系を採用することで、腱の干渉が最小限に抑えられることで、計算の簡易化が可能となった。今年度は特に、アーム先端の極座標において力指令と剛性指令に対してトルク制限を満たす中で最大限これら指令を達成するようにしている。これにより、昨年度まで行っていた関節の場合に比べ、アーム先端で作業が行い易くなる。3.多指ハンドへの応用に向けた研究ここでは、多指ロボットハンドの把持配置範囲計画のための新たな手法を開発した。
損傷後の脳における組織修復と神経再生のメカニズムの解明

われわれは中枢神経系で再生を阻害する因子として、損傷部の組織修復過程で形成されるIV型コラーゲンを含む繊維性瘢痕に注目してきた。その理由は、(1)神経再生が起こる新生仔マウスでは繊維性瘢痕の形成が見られず、また、(2)IV型コラーゲンの合成を阻害するDPYを注入すると繊維性瘢痕が消失するとともに神経再生が起こるからである(Kawano et al.,2005)。そこで、(3)脳内でも例外的に神経再生が起こること報告されている視床下部弓状核のNPYニューロンの軸索を切断ししたところ、NPYニューロンの軸索が損傷部を越えて再生し、この場合にも損傷部に繊維性瘢痕は形成されていなかった(Homma,Kawano et al.,J.Comp.Neurol.,2006)。一般には、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンが中枢神経系における主要な再生阻害因子と考えられている。その有力な根拠はコンドロイチン硫酸を分解する酵素であるコンドロイチナーゼABCを損傷部に投与すると軸索再生が起こるからである。そこで、(4)コンドロイチナーゼABCをマウス脳の損傷部に投与したところ、軸索再生が起こることを観察したが、同時に繊維性瘢痕が消失することを見いだした(Li,Kawano et al., J. Neurosci. Res., 2007)。以上、4種の脳損傷モデルでは、いずれも繊維性瘢痕が形成されない状況で神経再生が起こっていた(Kawano et al., 2007)。この一連の研究成果は、繊維性瘢痕が中枢神経系における主要な再生阻害因子であることを示している。本年度は二種類の中枢神経系の損傷モデルマウスを用いて軸索再生の研究を行った。1.視床下部弓状核における神経再生金硫化グルコース(GTG)をマウス腹腔内に投与すると、視床下部内側底部が破壊される。GTGの破壊によって、弓状核のNPYニューロンの軸索は切断されるが、2週問後には損傷部を越えて再生するNPY線維が観察された。GTG投与動物では損傷部周辺で反応性アストロサイトは増加していたが、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの増加や繊維性癒痕の形成は見られなかった。視床下部弓状核は中枢神経系で例外的に軸索再生が起こる領域であるが、その理由は再生阻害因子である繊維性癩痕が形成されないことにあると考えられた(Homma, Kawano et al., J.Comp.Neruol.,499:120-131,2006)。2.コンドロイチン硫酸プロテオグリカンは再生阻害因子か?中枢神経系では損傷後の軸索再生は困難である。その理由として、損傷部周辺にコンドロイチン硫酸プロテオグリカンが増加し、再生を妨げることが一般に信じられている。そこで、コンドロイチン硫酸(CS)を分解する酵素であるコンドロイチナーゼABC (ChABC)を黒質線条体ドーパミン神経路を切断したマウスの損傷部に注入した。すると今までの報告通り、損傷部周辺のCSの増加が抑えられるとともに、中脳ドーパミン線維が損傷部を越えて再生した。しかし、損傷部における繊維性癩痕の形成について調べると、ChABC投与動物では繊維性癒痕が形成されないことを見いだした。損傷部で増加するCSは、神経再生に阻害的に働く繊維性癩痕の形成に関与することが示唆された(Li, Sango, Kawano et al., J.Neruol.Res.,85:536-547,2007)。

以上の研究結果は、以前われわれ(Kawano et al., J.Neurosci.Res.,80:191-202,2005)が提唱した、「繊維性癒痕が中枢神経系における軸索再生の阻害因子である」ことを支持している。本年度は二種類の中枢神経系の損傷モデルラットを用いて軸索再生の研究を行った。1.脳の損傷部への細胞移植による神経再生の促進ラットの黒質線条体ドーパミン神経路を幅2mmのナイフで切断し、新生仔ラット嗅球より採取し、培養した髄鞘化グリア細胞(OEC)を損傷部に移植した。損傷後2週間の脳では、切断されたドーパミン線維は損傷部を越えて再生することはなく、損傷部にIV型コラーゲンを含む繊維性瘢痕が形成されていた。それに対し、OECを移植した脳では多くの再生線維が損傷部を越えて伸長していた。損傷部はOECで満たされており、繊維性瘢痕は形成されていなかった(Teng et al.,2008印刷中)。2.下位胸髄のレベルでラット脊髄に損傷を加え、OECを移植した。OEC移植により下肢の運動機能に著しい改善がみられた。組織的には脊髄の下行性(運動性)および上行性(知覚性)の線維が損傷部を越えて再生していた。さらに損傷部では通常形成される繊維牲瘢痕の形成が抑制されていた。OEC細胞の移植はもっとも有望な脊髄損傷の臨床的治療法と考えられ、すでに世界各国でヒトへの応用が始まっている。しかしこれまで、OECの移植による神経再生促進のメカニズムは不明であった。今回の結果は、以前からわれわれが提唱している「繊維性瘢痕が中枢神経系における軸索再生の阻害因子である」こと(Kawano et al.,2005;2007;Li, et al.,2007)を支持するとともに、OEC移植による脊髄損傷の治療法に理論的根拠を与える意味でも極めて重要な意味がある。
光機能性生体分子によるアポトーシスの誘導と癌治療への応用

アポトーシス(プログラムされた細胞死)の誘導による癌細胞の除去を目的とし、最終段階で働くプロテアーゼであるcaspase-3を光機能化し、その活性を光照射によって制御すること方法の確立を行った。Caspase-3はアポトーシスシグナル伝達の上流にあるプロテアーゼcaspase-8による特異的な切断(セリン176残基)により活性化されたため、この特異的な切断位置に光分解性の2-nitrophenylglycine(Npg)をペプチド主鎖に導入し光化学反応により活性の発現を試みた。ヒトcaspase-3のS176への位置特異的なNpg基の導入は、4塩基コドンと細胞外翻訳反応によって行った。Npgを導入したcaspase-3を用いて、光照射(366nm、0°C)を行い、基質であるDEVD(Asp-Glu-Val-Asp)の分解[(DEVD)2-rhodamine110で測定]を用いて活性を見た。光照射前(0min)では活性は見られないが、1分間の光照射で酵素活性の回復が見られた。caspase-3阻害剤(DEVD-CHO)の添加によってその活性が抑制されたことからこれらの活性がcaspase-3に由来することが確認された。次にcaspase-3の持つ自己切断と活性化の抑制について検討した。天然型では時間に依存して徐々に活性が増加するが、Npg-caspase-3では自己活性化は抑制され、光照射によって天然型と同様の自己活性化能を回復することが明らかとなった。このことから、Npgの位置選択的な導入によって、caspase-3の活性の制御が可能であることが明らかとなった。この結果、細胞内への光機能性caspase-3が導入と光照射によって、アポトーシスの誘導が可能性となると考えられる。これらの光機能化したcaspase-3を細胞に侵入可能にするため、HIV(ヒト免疫不全ウィルス)のTAT配列(YGRKKRRQRRR)をNまたはC末端に導入した光機能性caspase-3を上記と同じ方法で合成した。Npg導入によるcaspase-3活性の抑制及び光照射による活性化は、TAT配列を導入していないものと同様に制御できることが明らかとなった。これらの合成したTAT配列の導入されたNpg-caspase-3をヒトのT細胞(Jurkat T cell)内に効率よく取り込ませる実験と光照射によるアポトーシスの誘導を行うことができる環境が現在までの研究で整った。ヒト由来のcaspase-3は細胞内で前駆体として不活性な状態で存在するが、アポトーシスシグナル伝達の上流にあるプロテアーゼであるcaspase-8による特異的な切断で活性のある4量体が形成される。caspase-3への特異的な切断を光反応で行うため、ペプチド鎖を解裂させる光反応性アミノ酸2-nitrophenylglycine(Npg)を特異的な切断位置(セリン176番目)に導入した。光反応性のcaspase-3の合成法は、光反応性アミノ酸Npgと核酸2量体pdCpAを有機合成し、それらをカップリンさせることでpdCpA-Npgを合成した。次にアミノアシルーtRNA (Npg-tRNA)を合成した。Caspase-3遺伝子の176番目のコドンを4塩基コドンに変異し、Npg-tRNAを添加して細胞外翻訳反応を行うことで、光反応性caspase-3の合成に成功した。光照射は高圧水銀ランプ(500W)にモノクロメーターを使用し、365nmの光によって行った。Npg単体では光照射によって速やかに分解される。合成した光機能性caspaser-3に光照射したところ、照射時間に伴って分解消失した。光照射後のcaspase-3が酵素活性を回復したか見るため、蛍光性分子を結合した特異的なペプチドDEVD (Asp-Glu-Val-Asp)を基質として反応性をみた。その結果、0°Cで光照射わずか1分間で酵素活性を回復し、以降の光照射時間では酵素活性の増加は見られなかった。つまり、短時間でほぼ活性を回復できたことになる。また、caspase-3の阻害剤であるDEVD-CHOを光照射後、同じタンパクに添加すると活性が完全に抑えられたことから、DEVDの切断はcaspase-3の活性によるものであることが確かめられた。このことから、光反応性caspase-3は光照射とペプチド鎖の切断とそれに伴う活性なcaspase-3複合体が形成され、Npgによる修飾は活性に影響を与えないことが明らかとなった。また、Npgの導入でcaspase-8の認識配列でなくなるため、細胞中で上流からのシグナル伝達に反応せず、光照射のみで活性化を行うことができる。この結果、細胞内への光機能性caspase-3が導入されれば、アポトーシスの誘導が可能性となると考えられる。現在、これらの光機能化したcaspase-3を細胞に侵入可能なHIV(ヒト免疫不全ウィルス)のTAT配列(YGRKKRRQRRR)のペプチドに結合し、ヒトのT細胞(Jurkat T cell)内に効率よく取り込ませる実験に移行する段階である。caspase-3はアポトーシス(プログラムされた細胞死)の最終段階で働くプロテアーゼであり、本研究ではこれを光機能化し活性を光化学的に制御することで、人為的なアポトーシスの誘導を行うことを目的とした。Caspase-3はアポトーシスシグナル伝達の上流にあるプロテアーゼcaspase-8による特異的な切断(セリン176残基)により活性化される。

この特異的な切断位置に光分解性の2-nitrophenylglycine(Npg)をペプチド主鎖に導入し光照射により活性化の制御を試みた。ヒトcaspase-3のS176への特異的なNpg基の導入は、4塩基コドンと細胞外翻訳反応によって行った。Npgの176残基への取り込みの効率は15%であった。Npgを導入したcaspase-3を用いて、光照射(500W高圧水銀灯、366nm、0°C)を行い、基質であるDEVD(Asp-Glu-Val-Asp)の分解[(DEVD)_2-rhodamine110で測定]を用いて活性を見た。光照射前(Omin)では活性は見られないが、1分間の光照射で明らかな酵素活性の回復が見られた。caspase-3阻害剤(DEVD-CHO)の添加によってその活性が抑制されたことからこれらの活性がcaspase-3に由来することが確認された。また^<35>S-ラベルしたNpgを導入したcaspase-3への光照射を見ると5分以上の光照射でタンパク自体の分解が見られた。これは長時間の光照射(15分以上)での活性の減少に対応した。次にcaspase-3の持つ自己切断と活性化の抑制について検討した。天然型では時間に依存して徐々に活性が増加するが、Npg-caspase-3では自己活性化は抑制され、光照射によって天然型と同様の自己活性化能を回復することが明らかとなった。このことから、Npgの位置選択的な導入によって、caspase-3の活性を制御することに成功した。この結果、細胞内への光機能性caspase-3が導入されれば、アポトーシスの誘導が可能性となると考えられる。これらの光機能化したcaspase-3を細胞に侵入可能にするため、HIV(ヒト免疫不全ウィルス)のTAT配列(YGRKKRRQRRR)をNまたはC末端に導入した光機能性caspase-3を合成した。これによって、ヒトのT細胞(Jurkat T cell)内に効率よく取り込ませる実験を行う計画である。アポトーシス(プログラムされた細胞死)の誘導による癌細胞の除去を目的とし、最終段階で働くプロテアーゼであるcaspase-3を光機能化し、その活性を光照射によって制御すること方法の確立を行った。Caspase-3はアポトーシスシグナル伝達の上流にあるプロテアーゼcaspase-8による特異的な切断(セリン176残基)により活性化されたため、この特異的な切断位置に光分解性の2-nitrophenylglycine(Npg)をペプチド主鎖に導入し光化学反応により活性の発現を試みた。ヒトcaspase-3のS176への位置特異的なNpg基の導入は、4塩基コドンと細胞外翻訳反応によって行った。Npgを導入したcaspase-3を用いて、光照射(366nm、0°C)を行い、基質であるDEVD(Asp-Glu-Val-Asp)の分解[(DEVD)2-rhodamine110で測定]を用いて活性を見た。光照射前(0min)では活性は見られないが、1分間の光照射で酵素活性の回復が見られた。
リボザイムライブラリーを用いた神経芽腫in vivoジーンディスカバリー

研究の最終目標は、進行神経芽腫に特異的に発現する(予後と関連のある)遺伝子の発見であり、その手法としてリボザイムライブラリーを用いた方法を選択した。しかし、この方法による研究が困難であったため、特異的に発現するマイクロRNAを新たに検出することに変更した。神経芽腫細胞を東北大学加齢研究所細胞供給センターおよび千葉県がんセンターより、供与を受け、継代培養を施行した(ただし、これらの細胞培養に関わる経費は、所属外科教室費より拠出した。)。神経芽腫細胞は、予後不良とされているN-mycが増幅している細胞4種類と増幅していない細胞4種類細胞を用いた。そして、それぞれの細胞に発現するマイクロRNAを比較検討した。この結果、特定のマイクロRNAがN-myc増幅細胞群で認められた。さらに、予後不良な細胞は、低酸素状態でも細胞が活発に活動することが予想されたので、低酸素状況下で培養した神経芽腫細胞のマイクロRNAがどのように変化するかを見出することを試みた。培養神経芽腫細胞を酸素濃度調節可能な培養器で、1%の酸素条件下で48時間培養して、Hypoxyprobel(pimonidazole hydrochloride)を用いて染色するとともに、マイクロRNAの発現の変化を比較検討した結果、低酸素条件下では、多くの細胞がHypoxyprobelで染色され、また異なったマイクロRNAの発現が認められた。今年度は、in vivoにおいても低酸素状態の状況を比較検討する予定であったが、これについては、行うことができなかった。研究結果は、英文雑誌投稿予定である。しかし、リボゾームライブラリーの作成に時間を用紙、今年度は、培養細胞ヘリボザイムを導入することはできなかった。そこで、このリボザイムライブラリーを用いて発見された転写に関与するマイクロRNAの存在をフナコシmiRNA Isolation KitおよびmiRNA Detection Kitを用いて検出した。マイクロRNAは現在200種類が発見されており、どの遺伝子の発現が進行神経芽腫と関連があるのかを検討中である。また、低酸素状態におかれた細胞の中に、薬剤抵抗性の遺伝子の発現した細胞が出現するという報告から、培養神経芽腫細胞を低酸素状態で培養して、マイクロRNAの出現との関係を見出すために、培養神経芽腫細胞を酸素濃度の異なる条件下で培養して、Hypoxyprobe1(pimonidazolehydrochloride)を用いて染色した。今後は、低酸素状態にあることを確認した細胞におけるマイクロRNAの発現の変化を比較検討したいと考えている。低酸素状態におかれた腫瘍細胞は、その環境に適応するためのさまざまな変化をする。宿主にとっては、この変化の意味するところは、腫瘍細胞の悪性度が増すことを意味している。すなわち、低酸素環境に耐性のある、劣悪な環境に耐えられる細胞に変貌するのである。平成17年度低酸素環境を設定可能な細胞培養器で、酸素濃度を1%としてマウス神経芽腫細胞(C-1300)およびヒト神経芽腫細胞(IMR)を24時間培養した。21%酸素下の神経芽腫細胞は、神経突起を伸ばし培養器の底に付着しているが、1%酸素下で培養した細胞には神経突起がなく、培養液中に浮遊した状態になる。低酸素細胞に特異的に取り込まれるpimonidazoleをこれらの細胞培養液中に200μmolの濃度で投与して、さらに24時間培養した。免疫組織染色法を用いて、pimonidazoleをDABで染色すると、酸素濃度1%の神経芽腫細胞は、ほとんどの細胞でpimonidazoleの取り込みを示す陽性染色が認められた。細胞が低酸素下で変化していることが確認できた実験1と同じ条件下でmicroRNAの変化をみるために、2種類の神経芽腫細胞(C-1300、IMR)を24時間培養した。培養後、細胞はトリゾール液中に回収して、microRNAArray法を用いて解析した結果、ある特定のmicroRNAが増加することが判明した。そこで、平成18年度には、この増幅したmicroRNAの変化を他の神経芽腫細胞においてリアルタイムPCR法を用いて解析して、低酸素状態下の細胞の変化をRNAレベルで解析して、腫瘍細胞の悪性化のメカニズムを解析する予定である。)。

培養神経芽腫細胞を酸素濃度調節可能な培養器で、1%の酸素条件下で48時間培養して、Hypoxyprobel(pimonidazole hydrochloride)を用いて染色するとともに、マイクロRNAの発現の変化を比較検討した結果、低酸素条件下では、多くの細胞がHypoxyprobelで染色され、また異なったマイクロRNAの発現が認められた。今年度は、in vivoにおいても低酸素状態の状況を比較検討する予定であったが、これについては、行うことができなかった。研究結果は、英文雑誌投稿予定である。
中国雲南省少数民族とタイ北部山岳民族の遺伝的起源と系統関係

アジア諸地域の人類集団の遺伝的特性を知ることは、日本人の成立を知る上でもきわめて重要である。中国雲南省周辺には、20種族を超える少数民族が知られ独自の風俗文化を有しているが、各種族の起源や種族間の遺伝的関係に関してはほとんど知られていない。またタイにも各種少数民族がいるが、雲南省と共通した種族名をもつ人々もおり、その遺伝的起源は興味深く、それらを明らかにする必要性がある。本学術調査では(1)中国医科学院(中国・雲南省昆明)及びコンケン大学(タイ・コンケン)を拠点として採取した各種少数民族のDNA試料について、最新のDNA多型マーカー(ミトコンドリアDNA、HLA遺伝子座、血液型、Y染色体DNA、常染色体マイクロサテライト座、グロビン遺伝子座など)を用いて多型検索を行った。(2)各種遺伝マーカーの分析により得たデータを個別及び総合的に評価し、周辺の他人類集団(中国漢民族、タイ人、日本人など)でのデータも加味した人類遺伝学的研究を行った結果、各種族の遺伝的特性及び相互の系統関係を明らかにした。(3)雲南省とタイの少数民族で得たデータの比較解析により、中国南部と東南アジア地域間で引き起こされた過去の移住を明らかにした。(4)雲南省及びタイの少数民族より採取した末梢血由来リンパ球をセルライン化し、それらの貴重な遺伝資源を永久保存した。これにより、将来において新たな研究手法が開拓された場合にも対処できる。本学術調査では(1)雲南省及びタイの少数民族を最新のDNAマーカーを用いて調べることにより、各種族の遺伝的特性及び相互の系統関係が明らかにする。(2)雲南省とタイの少数民族で得られたデータを比較することにより、中国南部と東南アジア地域間の過去の移住を明らかにできる。(3)9貴重な少数民族の遺伝資源をリンパ球のセルライン化のよって永久保存する。平成11年度の研究概要:(1)中国雲南省での調査では、昆明市の中国医科学院を拠点として、周辺山岳部にて血液試料を採取した(2)タイの山岳民族の調査では、コンケン大学を拠点とし、タイ東北部の調査地に入り、血液試料を採取した。(3)採取した血液試料は迅速に現地拠点に持ち返り、生リンパ球を分離し、凍結保存した。さらに、血小板や顆粒球より、DNAを分離精製した。(4)凍結リンパ球は、一部を現地拠点に保管し、日本に持ち返り総合研究大学院大学で、セルライン化して永久保存を行っている。(5)DNA試料は、各種遺伝マーカーの専門である分担研究者に分配して、ミトコンドリアDNAの塩基配列による多型検索、DNAタイピングによる各種HLA遺伝子座の検索、DNAタイピングによる血液型の検索、Y染色体DNA多型の検索、常染色体マイクロサテライト座の多型検索、グロビン遺伝子座の多型検索などを行った。(6)各種遺伝マーカーで得られたデータを個別及び総合的に評価し、他人類集団でのデータも加味した人類遺伝学的研究を継続中である。

(2)雲南省とタイの少数民族で得られたデータを比較することにより、中国南部と東南アジア地域間の過去の移住を明らかにできる。(3)貴重な少数民族の遺伝資源をリンパ球のセルライン化のよって永久保存する。平成12年度の研究概要:(1)中国雲南省での調査では、昆明市の中国医科学院を拠点として、周辺山岳部にて血液試料を採取した(2)タイの山岳民族の調査では、コンケン大学を拠点とし、タイ東北部の調査地に入り、血液試料を採取した。(3)採取した血液試料は迅速に現地拠点に持ち返り、生リンパ球を分離し、凍結保存した。さらに、血小板や顆粒球より、DNAを分離精製した。(4)凍結リンパ球は、一部を現地拠点に保管し、日本に持ち返り総合研究大学院大学で、セルライン化して永久保存を行っている。(5)DNA試料は、各種遺伝マーカーの専門である分担研究者に分配して、ミトコンドリアDNAの塩基配列による多型検索、DNAタイピングによる各種HLA遺伝子座の検索、DNAタイピングによる血液型の検索、Y染色体DNA多型の検索、常染色体マイクロサテライト座の多型検索、グロビン遺伝子座の多型検索などを行った。(6)各種遺伝マーカーで得られたデータを個別及び総合的に評価し、他人類集団でのデータも加味した人類遺伝学的研究を継続中である。アジア諸地域の人類集団の遺伝的特性を知ることは、日本人の成立を知る上でもきわめて重要である。中国雲南省周辺には、20種族を超える少数民族が知られ独自の風俗文化を有しているが、各種族の起源や種族間の遺伝的関係に関してはほとんど知られていない。またタイにも各種少数民族がいるが、雲南省と共通した種族名をもつ人々もおり、その遺伝的起源は興味深く、それらを明らかにする必要性がある。本学術調査では(1)雲南省及びタイの少数民族を最新のDNAマーカーを用いて調べることにより、各種族の遺伝的特性及び相互の系統関係を明らかにする。(2)雲南省とタイの少数民族で得られたデータを比較することにより、中国南部と東南アジア地域間の過去の移住を明らかにする。(3)貴重な少数民族の遺伝資源をリンパ球のセルライン化によって永久保存する。平成13年度の研究概要:(1)中国雲南省での調査では、昆明市の中国医科学院を拠点として、周辺山岳部にて血液試料を採取した(2)タイの山岳民族の調査では、コンケン大学を拠点とし、タイ東北部の調査地に入り、血液試料を採取した。(6)各種遺伝マーカーで得られたデータを個別及び総合的に評価し、他人類集団でのデータも加味した人類遺伝学的研究を行った。
バクテリアのべん毛モーター・トルク発生装置の構造解析

バクテリアのべん毛モーターはプロトン駆動力、すなわち細胞外から細胞内に流れ込む水素イオンによって回転する。本研究はべん毛モーターのトルク発生装置の構造を明らかにするために、急速凍結/ディープエッチ法を用いて、ペリプラズマ空間に存在するはずのトルク発生器の構造を視覚化することを目的とする。本年度は、実験計画に沿って急速凍結/ディープエッチ法を3回試みたが、トルク発生器の構造を明らかに視覚化することはできなかった。すなわち、野生株からはトルク発生器であるCリングそのものがほとんど見つからなかった。これと平行して行った分泌タンパク質の解析実験において、通常大量に分泌されている病原性因子SipAなどがモット変異体では異常に少なくなることが観察された。さらに、それはSipAがきわめて酸化されやすいことから起こる現象であることがわかった。このことはトルク発生装置のプロトン導入路Motタンパク質の有無で細胞表面の酸化状態が変化することを示している。これらのことから、Motタンパク質の在り方そのものが現在考えられているようなものでないことを示唆している。したがって、トルク発生装置の存在様式の他の可能性を再検討する必要があると思われる。このエネルギー変換にATPはいっさい関与していない。水素イオンがべん毛モーターのどの部位とどのように相互作用するのか?本研究はべん毛モーターのトルク発生装置の構造を明らかにするために、急速凍結/ディープエッチ法を用いて、ペリプラズマ空間に存在するはずのトルク発生器の構造を視覚化することを目的とする。本年度は、急速凍結法に供する前の試料の良否を判定するための予備実験として、通常の負染色法による電子顕微鏡観察を行った。サルモネラ菌SJW1103を浸透圧ショック法により処理した細胞のうち、細胞質が透けて見えるもの(浸透圧ショック細胞)は通常数%である。この値はショ糖濃度と希釈倍率を変えても大きくは変化しない。そこで、対数増殖期初期の細胞に対して浸透圧ショック法を行い、低速・高速遠心法を組み合わせによって、未処理細胞の除去を試みたところ、50%以上の高率で浸透圧ショック細胞が得られるようになった。このような試料は急速凍結法に適していると期待される。さらに、スフェロプラスト法によってトルク発生装置の回転子と思われるCリングのついたべん毛の単離も行った。通常、サルモネラ菌では界面活性剤を用いるために固定子であるモット複合体は分解してしまう。ところが、グラム陽性菌の枯草菌ではスフェロプラストを生成すると、Cリングのついたままのべん毛が菌体から分離することが明らかになった。このべん毛にはまだモット複合体が残存している可能性があるので、急速凍結法で観察を試みる。これと平行して行った分泌タンパク質の解析実験において、通常大量に分泌されている病原性因子SipAなどがモット変異体では異常に少なるなることが観察された。
ナス科植物が産生する植物エフェクターの機能解析

ジャガイモ疫病菌は、世界4大作物の1つであるジャガイモの重要病原菌である。これまで、Solanum属植物由来の様々なジャガイモ疫病菌に対する真性抵抗性遺伝子が単離され、疫病菌のエフェクター認識を介した抵抗性誘導に機能することが報告されている。また、疫病菌が産生する多様なエフェクターが宿主の抵抗性機構の様々な過程を阻害することで感染成立に貢献することが示されている。私たちは、これまでにジャガイモと同じナス科のモデル植物であるベンサミアナがジャガイモ疫病菌に非宿主抵抗性を示すこと、ベンサミアナの疫病菌抵抗性には、エチレン情報伝達を介したファイトアレキシン合成誘導が必須であることを明らかとしている。遺伝子サイレンシングを用いたスクリーニングから、疫病菌抵抗性に必須な新規遺伝子として分泌タンパク質をコードするSAR8.2m遺伝子を単離した。SAR8.2mサイレンシング株では、ジャガイモ疫病菌の感染が植物全体に進展したが、植物病原性の糸状菌や細菌に対する抵抗性は野生株と同等であった。また、疫病菌由来のエリシタータンパク質であるINF1に対する応答を野生株とSAR8.2mサイレンシング株で比較したところ、活性酸素生成、ファイトアレキシン蓄積、過敏感細胞死の誘導などの応答に全く差異は認められない一方で、疫病菌感染時の活性酸素生成や過敏感細胞死誘導はSAR8.2mサイレンシング株で顕著に低下していることが示された。またSAR8.2mに抗菌活性は認められず、SAR8.2mが疫病菌の感染行動を抑制することで、抵抗性に寄与していることが示唆された。また、SAR8.2m-GPFを発現するベンサミアナに疫病菌を接種すると、GFP蛍光の病原菌内への移行が観察された。これらの結果から、SAR8.2mはジャガイモ疫病菌に作用し病原力を特異的に抑制する植物エフェクターである可能性が示された。平成30年度は、CRISPR/Cas9システムを用いたSAR8.2m遺伝子破壊株の作出に成功した。作出したSAR8.2m遺伝子破壊株の表現型を確認したところ、ジャガイモ疫病菌に対する抵抗性が著しく低下することが確認された。また、ジャガイモ疫病菌以外の病原菌に対する抵抗性への影響を明らかにするため、新たにナス科植物に病原性を示す4種の糸状菌を接種したが、抵抗性の低下は認められなかった。一方で、ジャガイモ疫病菌以外のPhytophthora属菌接種の結果、SAR8.2mは遠縁な多種のPhytophthora属菌に対する抵抗性に機能していることが明らかとなった。Phytophthora属菌は世界中で約120種同定されており、宿主を異とする多数の病原菌が含まれている。異なるクレードに属する14種のPhytophthora属菌に対するSAR8.2m遺伝子サイレンシング株の抵抗性を調べた結果、ショウガ、チューリップ、セイヨウキヅタおよびイチジク疫病菌において抵抗性が顕著に低下した。以上の結果から、SAR8.2mは広範なPhytophthora属菌に対する非宿主抵抗性に関与することが示唆された。また、ジャガイモ疫病菌の遊走子、発芽した胞子、菌糸などから調製したcDNAからYeast two hybridライブラリーを作成し、SAR8.2mをBaitにした結合因子のスクリーニングを行った。その結果、疫病菌の病原性因子であるエフェクタータンパク質が候補因子として単離された。また、ベンサミアナの抵抗性応答を可視化するため、いくつかの病害抵抗性遺伝子プロモーターにGFP遺伝子を結合した形質転換体を得た。このように、今年度はSAR8.2mが広範な病原性卵菌に対する抵抗性に関与することを証明し、さらに今後の解析に必要な新たな進展が得られたことより、本研究はおおむね順調に進展していると考えられる。(2)疫病菌感染時のSAR8.2m遺伝子の発現影響の調査平成30年度にSAR8.2mのプロモーターにGFPを付与した形質転換体の作出が完了した。平成31年度は形質転換体にジャガイモ疫病菌あるいは他のPhytophthora属菌を接種し、感染時のSAR8.2m遺伝子発現部位を、GFP蛍光によって観察する。(3)疫病菌感染時のSAR8.2mサイレンシング株における抵抗性関連遺伝子の発現解析平成30年度にファイトアレキシン合成の鍵酵素EASと過敏感細胞死において重要な役割を持つPR-1のプロモーターにGFPを付与したベンサミアナの形質転換体を得た。そこで、形質転換体を用いてSAR8.2mサイレンシング株を作製し、疫病菌感染時の抵抗性関連遺伝子の発現を、GFP蛍光を利用して野生株と比較解析する。(4)SAR8.2mと結合するP.infestansタンパク質の機能解析平成30年度に、Yeast two hybridスクリーニングにより、SAR8.2mと結合するジャガイモ疫病菌の因子の候補を得た。平成31年度は、この疫病菌のエフェクターの機能解析、野生株およびSAR8.2m破壊株における疫病菌エフェクターの機能比較などをおこなうとともに、Yeast two hybridスクリーニングを継続し、新たな結合因子の探索を進める。

私たちは、これまでにジャガイモと同じナス科のモデル植物であるベンサミアナがジャガイモ疫病菌に非宿主抵抗性を示すこと、ベンサミアナの疫病菌抵抗性には、エチレン情報伝達を介したファイトアレキシン合成誘導が必須であることを明らかとしている。遺伝子サイレンシングを用いたスクリーニングから、疫病菌抵抗性に必須な新規遺伝子として分泌タンパク質をコードするSAR8.2m遺伝子を単離した。SAR8.2mサイレンシング株では、ジャガイモ疫病菌の感染が植物全体に進展したが、植物病原性の糸状菌や細菌に対する抵抗性は野生株と同等であった。また、疫病菌由来のエリシタータンパク質であるINF1に対する応答を野生株とSAR8.2mサイレンシング株で比較したところ、活性酸素生成、ファイトアレキシン蓄積、過敏感細胞死の誘導などの応答に全く差異は認められない一方で、疫病菌感染時の活性酸素生成や過敏感細胞死誘導はSAR8.2mサイレンシング株で顕著に低下していることが示された。またSAR8.2mに抗菌活性は認められず、SAR8.2mが疫病菌の感染行動を抑制することで、抵抗性に寄与していることが示唆された。また、SAR8.2m-GPFを発現するベンサミアナに疫病菌を接種すると、GFP蛍光の病原菌内への移行が観察された。これらの結果から、SAR8.2mはジャガイモ疫病菌に作用し病原力を特異的に抑制する植物エフェクターである可能性が示された。平成30年度は、CRISPR/Cas9システムを用いたSAR8.2m遺伝子破壊株の作出に成功した。作出したSAR8.2m遺伝子破壊株の表現型を確認したところ、ジャガイモ疫病菌に対する抵抗性が著しく低下することが確認された。また、ジャガイモ疫病菌以外の病原菌に対する抵抗性への影響を明らかにするため、新たにナス科植物に病原性を示す4種の糸状菌を接種したが、抵抗性の低下は認められなかった。一方で、ジャガイモ疫病菌以外のPhytophthora属菌接種の結果、SAR8.2mは遠縁な多種のPhytophthora属菌に対する抵抗性に機能していることが明らかとなった。Phytophthora属菌は世界中で約120種同定されており、宿主を異とする多数の病原菌が含まれている。異なるクレードに属する14種のPhytophthora属菌に対するSAR8.2m遺伝子サイレンシング株の抵抗性を調べた結果、ショウガ、チューリップ、セイヨウキヅタおよびイチジク疫病菌において抵抗性が顕著に低下した。以上の結果から、SAR8.2mは広範なPhytophthora属菌に対する非宿主抵抗性に関与することが示唆された。また、ジャガイモ疫病菌の遊走子、発芽した胞子、菌糸などから調製したcDNAからYeast two hybridライブラリーを作成し、SAR8.2mをBaitにした結合因子のスクリーニングを行った。その結果、疫病菌の病原性因子であるエフェクタータンパク質が候補因子として単離された。また、ベンサミアナの抵抗性応答を可視化するため、いくつかの病害抵抗性遺伝子プロモーターにGFP遺伝子を結合した形質転換体を得た。
唾液腺前駆細胞を用いた放射線誘導性口腔乾燥症の治療

放射線誘導性口腔乾燥症は、頭頸部腫瘍の放射線治療でほぼ必発であり、唾液腺前駆細胞の傷害による腺細胞の増殖障害がその原因と言われている。唾液の分泌が減少すると、単に口腔の乾燥感のみならず、咀嚼・嚥下・発声障害、口腔粘膜の感染・炎症、齲歯、味覚障害など多様な症状を呈し、二次的には食欲不振による栄養不良をも引き起こして原疾患の治療にも悪影響を及ぼし、患者のQOLを著しく低下させる。今回の課題では、げっ歯類での旺盛な唾液腺再生能に着目し、唾液腺前駆細胞を単離して、放射線傷害唾液腺に移植することで、機能的な腺組織を再生させることを目標として研究を行った。まず、マウスの顎下腺管を結紮し、萎縮した顎下腺が、管を再開通させることにより再生することを確認した。次に無処理顎下腺を摘出した後、コラゲナーゼ・ヒアルロニダーゼ・ディスパーゼを用いて細胞を分散しプレートにまいて、唾液腺前駆細胞のコロニーが形成されるかどうか観察したがそれらしきコロニーは見られなかった。そこで、抗c-kit抗体を用いて、顎下腺分散細胞からc-kit陽性細胞を濃縮し培養すると、唾液腺前駆細胞様のコロニーが観察された。しかし、このコロニーは増殖があまり盛んではなく、表現型を解析できるだけの数に至らなかった。ラットの顎下腺も用いて、培養を試みたが、同様に、多くの唾液腺前駆細胞を得ることが難しかった。そこで、これらの培養系にFGFやEGFなどの成長因子を添加してみたが、それでも移植に十分な数の前駆細胞を得ることができなかった。また、無処理でなく、結紮萎縮唾液腺中に残存している唾液腺前駆細胞を単離し培養を試みたが、無処理唾液腺と同様に増殖能が低く、十分な数を得ることは難しかった。更なる培養系の改善が必要と考えられる。唾液の分泌が減少すると、単に口腔の乾燥感のみならず、咀噛・嚥下・発声障害、口腔粘膜の感染・炎症、齲歯、味覚障害など多様な症状を呈し、二次的には食欲不振による栄養不良をも引き起こして原疾患の治療にも悪影響を及ぼし、患者のQOLを著しく低下させる。今回の課題では、げっ歯類での旺盛な唾液腺再生能に着目し、唾液腺前駆細胞を単離して、放射線傷害唾液腺に移植することで、機能的な腺組織の再生を試みている。今後、十分な数の唾液腺前駆細胞を得るために、培養系の改善が必要であると考えられる。現在これらの培養系に、各種の成長因子を添加して、最適化を行っている。また、無処理でなく、結紮萎縮唾液腺中に残存している唾液腺前駆細胞を単離する方法が報告されているので、それに倣って試みる予定である。

また、無処理でなく、結紮萎縮唾液腺中に残存している唾液腺前駆細胞を単離し培養を試みたが、無処理唾液腺と同様に増殖能が低く、十分な数を得ることは難しかった。更なる培養系の改善が必要と考えられる。
糖尿病性腎症の代謝変容の解明とその改善を基軸とした発症・進展予防

糖尿病性腎症の病理学的変化は糖尿病初期から認め,その進展抑制には早期診断及び長期にわたる治療戦略が必要である。我々は,糖尿病性腎症の臓器連関の解明を目的とした網羅的メタボローム解析から多臓器連関を持つトリプトファン(TRP)代謝経路が糖尿病性腎症の発症進展に関わることを見出した。そこで,本研究では2型糖尿病におけるTRP代謝変容の腎症における役割の解明とTRP代謝物のバイオマーカー応用を目指す。
アルカリ溶融分解法による生体試料中の微量ホウ素の迅速定量

中性子捕捉療法は予め腫瘍部に選択的に^<10>Bを集めておき、原子炉で発生する中性子を照射し、核反応をおこさせ、その時に発生するエネルギ-で腫瘍を破壊しようとする治療法である。本療法においては、腫瘍部に^<10>Bを集積させる性質のある^<10>B化合物を患者に投与した後の、腫瘍部、周辺の正常組織、血液等の^<10>B濃度を迅速に知ることが重要である。本研究では、既に報告者が開発したアルカリ溶融法で試料を分解し、メチレンブル-比色法で微量ホウ素を定量する方法を見直し、その迅速化を行なった。迅速化を妨げていたのは次の3点である。1.試料にアルカリ水溶液を添加した後の水分の除去。2.分解して得られたホウ酸をテトラフルオロホウ酸にするのに要する時間。3.2回抽出を行なうが、抽出後に2層を分離するのに要する時間。1.に対してはいままで分解してきた試料量である1から2グラムを1/10に減らして、0.1から0.2グラムとし、加えるアルカリの量も減らすことにより、約10分で蒸発乾固させることができることとなった。2.に対しては反応溶液の温度を35°Cにすることにより、今までかかっていた30分以上を10分に短縮できるようになった。3.に対しては、円心分離機を用いることにより大幅に時間を短縮することが可能となった。また、補助金で購入した分光器、島津UV2200本体は、2次曲線の検量線プログラムを内蔵しており、それを利用することで、より速く結果が得られることとなった。