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トマス・グレイと1760年代の古詩収集家(1)

イングランドのトマス・グレイ、ウェールズのエヴァン・エヴァンス、スコットランドのジェイムズ・マクファーソンによる古詩収集の活動を、ブリティッシュネスやケルトの起源説など文化人類学や歴史学の学際的な視点を加えて考察した。1760年代の三者の古詩復活の取り組みが統合後のイギリスにおける国民意識の高揚を反映する一方で、民族の伝統やアイデンティティ喪失の危機感と表裏一体であった点を明らかにした。平成21年度ではこれまでのグレイと古詩に関する研究成果を踏まえて、John Collis(The Celts,1999)、Eric HobsbawmやPrys Morgan(The Invention of Tradition,1983)、またLinda Colley(The Britons、1992)などを参照し、ウェールズのケルト民族起源論とナショナリズムの影響を18世紀後半からロマン派の詩人にかけて概観した。まず、ケルト民族起源論に関して、Henry Rowlands(Mona Antiqua Restaurata,1723)やAylett Sammes(Britannia Antiqua Illustrata,1676)などの第1次資料を整備した。18世紀ウェールズにおける「ケルトの再発見」と当時の好古的な知識がグレイやメイソンの作品に与えた影響を明らかにし、いかに作品に活用したかを民族意識や国民意識と関連させて考察した。成果として、D.Walford編Wales and the Romantic Imagination(Aberythtwyth,2007)の書評をロマン派学会の機関紙に公表した。この研究書は18-19世紀のケルト言説や、イオロ・モルガニッグの活動、イングランドの詩人によるウェールズ表象などを文化だけでなく政治的社会的背景から分析した論集である。ロマン派にかけてのケルト趣味の展開と、南北ウェールズの相違などウェールズ独自の視点を持ち新しい知見に富む。また年度末には、William Cowperの"Boadicea"におけるケルト趣味についてグレイ、メイソンと比較し、影響と独自性を考察し発表の準備を行った。出張では、大英図書館とオックスフォード大学図書館の貴重書と電子文献を閲覧し資料を収集した。平成22年度はまず、マクファーソンの『オシアン詩』をとりあげ、グレイをはじめとするイングランドの文人の対応とブレアなどスコットランド側との応酬を検討し、『オシアン詩』のケルト的性格付けに対する再評価を行った。(参考:H. Gaskill, Ossian Revisited)本研究では民族意識と民族起源論を継続して考察しているが、マクファーソンは『オシアン詩』の序論でケルトの末裔としての民族意識を打ち出している。一方でウェールズの古詩収集家は古詩の研究方法を批判し、両地域の隔たりが明らかとなった。また、William Cowperの"Boadicea"と18世紀後半のケルト趣味について関西コールリッジ研究会で口頭発表を行ない、加筆原稿がケルト学会誌に受理された。古代ブリテンの女王を歌った頒詩はグレイやメイソンのケルト趣味とオードの系譜に連なり、さらに1780年前後のアメリカ独立戦争を背景にした危機意識と連合王国の統合意識を反映している。当時のイングランドのケルト趣味は国民意識を高揚させる意図を持っていた。上記の他、2月に渡英し、コートールド美術館で17世紀末にHenry Cook(e)が描いたドルイドの3枚の絵画について、画像データの細部と画家名の確認などを行った。(参考:C. Brisby,"Druids at Daryton")ドルイドをイングランドの貴族や画家が注目していた証拠となる作品であり、依頼主の調査など今後も続けていきたい。またウェールズ大学のカーディフ校のE-Wyn James博士にクーパーの政治姿勢とケルト観について論文の概要を説明し助言を受けた。研究は17世紀から18世紀末にかけての長い期間と様々な作品と作家を扱うが、これはケルトの民族起源がウェールズやスコットランドなどに限らず、イングランド人によっても主張されていた時代から、次第に周縁の地域に収斂されていった推移を具体的に追跡している事情による。個々の作品を第1次資料として検討し、ケルト観の進展を肉付けしていく作業の意義は大きいと考える。平成23年度は課題研究「トマス・グレイと1760年代の古詩収集家(1)」のうち(イ)エヴァンスの『ウェールズ古詩集』とグレイの影響関係を検討した。グレイのピンダロース風オード「詩仙」はウェールズの古詩や文化再発見を鼓舞する役割を果たし、近年ウェールズの国民文学研究で注目されている。当時の古詩復活運動は連合王国の統合が進むなか、民族め歴史を振り返り、独自の文化を維持し、あるいは新しく統合された文化の創造を模索していた点で、異文化理解と政策の観点からも重要な意味をもつ。当該研究では、ケルト再発見とブリティッシュネスの議論を踏まえ、なぜグレイがイングランド王であるエドワード1世によるウェールズの詩人虐殺の伝説を「詩仙」の主題においたかを再検討した。特にウェールズ音韻論によってイギリス統合後の新しい詩歌を模索していたグレイの詩観を独自に考察した。(1)研究の成果は"Welsh warbling in English Poetry"と題してケルト研究バンガー学会で発表が決定している。

また(2)日本ケルト学会では、「クーパーの「頌詩ボアディシア」と18世紀後半のケルト趣味」と題し、クーパーのケルト主題の作品とイングランド中心的なブリティッシュネスの姿勢を考察した論文を学会誌に掲載した。他に(3)「ジェームズ・マクファーソンの『古詩断片集』覚書」と題して、『オシアン作品集』出版に重要な役割を担った『古詩断片集』の成立過程と、ブレアが叙事詩の存在を示唆した序文の文化背景を『大阪経大論集』で考察した。これまで補助金を得て渡英し、ウェールズ国立大学の研究者から指導と助言を受けてきた。今回は、新たに「ウェールズの英語作家によるPrydeindod(ブリティッシュネス)概念」を論じた研究者から、エヴァンスの古詩収集活動についての最新の研究成果を得た。今後もグレイと古詩収集家に関する後半の研究を継続して遂行していきたい。
カテプシン類阻害剤の分子設計ならびに合成開発

システインプロテアーゼは生理活性タンパク質やペプチドが機能を発現する際に必須の酵素であり、正常に作用しない場合には多くの疾病を惹起する。従って個々のプロテアーゼに対する特異的阻害剤の合成開発は、それらが分担している生理活性機序の解明や新規な医薬品の開発に寄与するものである。我々は先ず共役アレニルカルボニル化合物がSH基と化学選択的にマイケル型付加反応することに着目し、生体内で目的とする酵素阻害活性本体が生成する前駆体の分子設計と反応カスケードを設定した。前駆体としてジエチルα-アシルアミノ-α-アルキニルマロネート体をデザイン合成し、エステラーゼ酵素加水分解、アルカリ性緩衝液やアルカリ性含水エタノール中での生体模倣反応に付したところ期待通りのカスケード反応(加水分解・脱炭酸・共役アレニルエステル形成)が進行することが確認された。合成化合物はカテプシンBに対して弱いながら酵素阻害活性を示したがキモトリプシンのごときセリンプロテアーゼに対しては阻害活性を示さなかった。またSH化合物、OH化合物、NH_2化合物が混在する含水エタノール中での生体モデル実験ではSH化合物のみと化学選択的に反応することが明らかにされた。本反応カスケードを活用し合成開発したL-lle-L-ProOHを有する新規な5S-OH-3-ピロリン-2-オン誘導体は、カテ-クロルフェニル基を有する2S,3S-エポキシコハク酸L-lleピペラジン誘導体はμ-カルパインに対して強力な阻害活性を示し、カテプシンBに対する酵素阻害活性より40倍強い値を示した。別途の分子設計に従って合成した新規なビフェニル-L-Val-アミノアルデヒド体のカテプシンB、L、K、Sならびにμ-カルパインに対する酵素阻害実験を試みたところ全ての合成化合物は実験を試みた全システインプロテアーゼに対して強力な阻害活性を示した。なかでもL-シクロヘキシルアラニンアルデヒド体は、若干ながらカテプシンKに対してより強い阻害活性を示すことから特異的阻害剤開発へ向けてのリード化合物として注目している。システインプロテアーゼのカテプシン-B、-L、-K、-S及びμ-カルパインに対する新規低分子阻害剤の分子設計として、非ペプチド部位にはチオジグリコール酸スルホキシド(あるいはスルホン)及びビフェニルカルボン酸を採用し、アミノ酸部位としてはL-ロイシン、L-バリン、L-フェニルアラニン、各種キラルα置換セリン誘導体、L-ロイシンアルデヒド、L-フェニルアラニンアルデヒド、L-シクロヘキシルアラニンアルデヒド等を採用することにした。各種キラルなα置換セリン誘導体は3通りの方法によって合成した。すなわち、α-アルキル-α-アミノマロネート体を豚肝臓エステラーゼや兎肝臓エステラーゼ加水分解に付して高エナンチオ選択的にモノカルボン酸誘導体を得た。更にエナンチオ分岐的還元反応に付して各々R-及びS-αアルキル置換セリン誘導体を得ることができた。他の方法としては、アミノマロン酸ジエチルエステルとL-バリンから合成したキラルなビスラクチムジエチルエーテルカルボン酸エチルエステル体のNaH、n-BuLiならびにSn(II)及びMg(II)-アミン試薬を用いる不斉アルキル化あるいは不斉アルドール反応を駆使して各種キラルなαアルキル置換セリン誘導体の合成を達成した。キラルアミノ酸のアルデヒド体は、NaBH_4-I_2試薬による還元反応に付して得たアミノアルコール誘導体を用い、ペプチド結合形成後に酸化反応を行い目的のアルデヒド体を得た。

各種酵素阻害実験の結果、チオジグリコール酸のフェニルアラニン誘導体はカテプシン-Kに対して弱いながら阻害活性を示し、ビフェニルカルボン酸-L-バリン-アミノ酸アルデヒド体はμ-カルパイン及び各種カテプシンに対して強い阻害活性を示すことが明らかとなった。特にシクロヘキシルアラニンのアルデヒド体はカテプシン-Kに対して10^<-8>M濃度で阻害活性を示した。我々は各種カテプシン類ならびにμ-カルパイン等のシステインプロテアーゼに対する新規な特異的阻害剤の合成開発研究を実施展開している。先ず我々は、独自に開発したα-アルキニル置換マロン酸ジエステル体の加水分解・脱炭酸・クムレンあるいはアレン形成という一連の反応カスケードを利用し新規なジペプチドピロリノン誘導体の合成に成功した。それら新規ピロリノン誘導体をカテプシンBおよびLに対する酵素反応阻害実験に付したところ、L-lle-L-ProOHを有する5S-OH-3-ピロリン-2-オン体はカテプシンBに対して最も強力な阻害活性を示しカテプシンLに対して有意な阻害活性を示さなかった。また、各種2S,3S-エポキシコハク酸L-lleピペラジン誘導体を合成しμ-カルパイン及びカテプシンBに対する酵素反応阻害実験を行ったところ、ピペラジンの置換基として2-クロルフェニル基を有する化合物はμ-カルパインに対して最も強力な阻害活性を示し、カテプシンBに比べて40倍程度強い阻害活性を示すことが明らかとなった。次いで、3種の新規なビフェニルL-Val-アミノアルデヒド類を合成しカテプシンB、L、K、Sならびにμ-カルパインに対する酵素反応阻害実験に供したところ、使用した全てのSH酵素に対して強力な阻害活性を示した。なかでもL-シクロヘキシルアラニンアルデヒド体は若干ではあるが他のシステインプロテアーゼに対するよりもカテプシンKに対してより強い阻害活性を示すことが明らかとなり将来へ向けての有用なリード化合物となることが期待された。
色情報を利用する重粒子線治療に特化した生体内用マイクロ線量計開発

効果的ながん放射線治療の一つである重粒子線治療の適用症例拡大を目指して、重粒子線に特化した人体挿入可能な小型線量計開発に取り組んだ。シンチレータ特有の消光効果による精度劣化を補償するため、出力応答と発光色の異なる二種類のシンチレータを使用して高精度と小型の両立を目指した。網羅的調査からGAGGとYAPのシンチレータ結晶を用いたプロトタイプ線量計を製作したが、GAGG結晶の吸光・蓄光特性のために想定通りの応答が得られなかった。しかし問題を回避する方法は提案できており、あと一歩のところまで開発できた。本研究の目的は重粒子線治療に特化した生体内に挿入可能な小型線量計を開発することである。LET応答の異なる複数のシンチレータ結晶を使用し、光ファイバーを通して生体外へ信号を出し、蛍光波長分布の違いから各シンチレータの応答を弁別して消光効果(クエンチング)による精度劣化を補償する機構である。本年度は研究の第一歩ということでシンチレータ各種の波長分布とそのLET依存性を網羅的に調査した。前年度中に放射線医学総合研究所HIMACのマシンタイムを獲得していたため平成27年度に入ってすぐに4He, 12C, 40Arの重イオン線を照射する機会を得て、LET依存性と蛍光波長分布のデータを取得した。無機シンチレータにおいてLETに依存して蛍光波長分布の形がわずかに変化することを確認したが、この変化からLET情報に焼き直すには精度が不十分であると判断した。一方NaIの結晶に関しては、予想外に蛍光波長分布の形が変化することを確認した。当初はNaIの蛍光波長分布がLETに劇的に依存する可能性が疑われたが、異動先の東京女子医科大学のリニアックからの高エネルギーX線を照射することでこの可能性は否定された。次にNaI結晶の吸湿性による結晶劣化が疑われ、新鮮な結晶を購入し高エネルギーX線を用いて比較したところ、この劣化により波長分布が変化しその発光量が40%近く減少することを確認した。しかしながら、もしもNaI結晶の吸湿によりここまで発光量が減るのであれば大問題であることから、現在はNaI結晶を潮解から防ぐために密閉に使用している窓ガラスが重イオンによる大線量で劣化して着色したことが原因であると考えている。この点も含めて平成28年度のHIMACマシンタイムで調査する予定である。前年度より放射線医学総合研究所HIMACのマシンタイムを獲得していたため、シンチレータ結晶各種の波長分布とLET依存性のデータをスムーズに取得することができた。平成27年度中は研究代表者の所属が異動したことにより高エネルギーX線出力装置が気軽に使える環境になったおかげで、想定以上のデータが取得でき、また異動先で知り合った研究者から新素材のシンチレータ情報を得て網羅的調査の一つに含めるなど当初の想定以上の進展があった。その一方、異動による職務の変化等によって研究時間の確保が難しくなったこと、また研究実績の項で述べたようにNaIに劇的な波長分布変化が観測されたことから、もしもこの変化が本質的なものであれば本研究が大きく進展する可能性があったため27年度後半はその確認と原因究明に念入りな追加実験と調査を行った。その結果、当初予定していたシミュレーション計算と使用する結晶の選定ができず、プロトタイプ設計まで進展できなかった。よって27年度中に購入予定だったいくつかの備品と消耗品が未購入となった。NaIに関する詳細な調査は結果的には本研究には繋がらず遠回りとなったが、必要な調査であったと考えている。以上より想定以上に進んだ部分と進まなかった部分はあるが、全体としては順調に進んでいると判断した。最終年度は不足していたLET応答性に関するデータを追加測定した。NaIの波長分布変化の調査も行う予定であったが、加速器利用申請の都合で大強度照射が行えなかった。文献の調査から、NaIの潮解防止のために密閉に使用している材質が放射線損傷によって変色したと現在は理解している。これらの結果と蛍光波長の強度分布、LET応答性のデータ、取扱性に関する現実的な観点を考慮してGAGGとYAPの組合せが最適であろうとの判断に至り、以上について国際会議にてポスター発表した。後半はプロトタイプの設計と製作を行った。予算の有効利用を考えて二種類の大きさのプロトタイプを製作した。一つ目は波長分布測定に用いていた12.7ミリ角の結晶をそのまま使い大信号が得られるタイプと、体内挿入を見越した5ミリ角の小型タイプである。これらプロトタイプに対してリニアックからのX線と加速器からの炭素線を照射して性能評価に臨んだが、信号に関して2つの問題が発覚した。一つ目はYAPからの信号が予測よりもかなり小さいことである。紫外領域の透過性が不十分な光ガイド、光ファイバーを使用していたこととGAGG自身の吸光特性の二つが原因であったと考えており材質や結晶配置の変更で対応可能と考えている。二つ目の問題はプロトタイプ信号の時間構造がなまされて見えることであるが、こちらの原因はまだ理解できていない。LEDを使用した予備調査において光電子増倍管に関する回路系には問題がないことを確認しており、光ファイバーによる光学系で想定していないことが起こっていると考えている。現実問題としては粒子毎の測定ではなく電流量での測定によって回避は可能である。以上より科研費の期間中に予定していたプロトタイプの性能評価まで漕ぎつけずに時間がかかっていることは確かだが、研究としては着実に進んでおり当初の目標まではあと少しである。

シンチレータ特有の消光効果による精度劣化を補償するため、出力応答と発光色の異なる二種類のシンチレータを使用して高精度と小型の両立を目指した。網羅的調査からGAGGとYAPのシンチレータ結晶を用いたプロトタイプ線量計を製作したが、GAGG結晶の吸光・蓄光特性のために想定通りの応答が得られなかった。しかし問題を回避する方法は提案できており、あと一歩のところまで開発できた。今後の方針は1)シミュレーション計算と共に結晶と波長領域の最適な組合せを選定する、2)プロトタイプ線量計を設計する、3)プロトタイプの性能評価をする、である。以下で具体的に述べる:1)27年度中に得たデータを基に、発光量と波長分布そしてシミュレーション計算によるLET応答性を考慮して最も信号雑音比の良い組合せを選ぶ。;2)波長領域を考慮して適切な増幅器(光電子増倍管か、MPPCか、等)を選定し、プロトタイプ線量計を設計し、業者に製作依頼をする。;3)放射線医学総合研究所のHIMACのビームタイムを申請し、線形性、精度、大線量耐久性等を調査し、線量計としての性能を評価する。今年度はプロトタイプ制作のための設計費、製作費と、27年度に購入予定であった信号用の増幅器と高電圧電源を購入する。また成果発表と情報収集のため国際会議(PTCOG55)に参加するために旅費が必要である。最後に今年度中に成果をまとめて雑誌投稿につなげる。放射線物理学NaIに関しては、蛍光の波長分布の形が予想外に大きく変化をすることを観測したが、もしもこの変化がNaI結晶に由来するLET依存性であれば本研究が大きく進展する可能性があったため、今年度後半はこの点を重点的に調査した。このため開発するプロトタイプ線量計に使用する結晶と波長領域の組合せが決定できず、プロトタイプの設計に取り掛かれなかった。それに伴い、使用すべき信号増幅器やそのための(高)電圧電源の仕様が定まらず、平成27年度中にこれらの物品と波長フィルタ等の小物類が購入できずに残高が生じた。平成28年度はプロトタイプ制作のための設計費、製作費と、27年度に購入予定であった信号用の増幅器と高電圧電源を購入する。
らせん状ナノグラフェンの精密合成と分子コイル創出に向けた物性評価

本研究の目的は、らせん状ナノグラフェンの合成法を確立し、分子コイル実現への可能性を示すことである。具体的には、より長く、幅広いπ共役を有するらせん状ナノグラフェンの合成法の確立を行う。らせん骨格の拡張には、1らせん径の拡大2らせんに水平な方向へのπ拡張3分子長の伸長という3種類の方法が存在する。本研究では、3種類の拡張を行うための合成戦略を確立する。次に、電極と、らせん状ナノグラフェン、金ナノ粒子からなるネットワークを形成する。このネットワークに対して、交流電圧を印加することで、電気伝導度の周波数依存性、すなわち分子コイル特性についての調査を行う。
非侵襲脳動脈瘤治療への道を開く外部磁場駆動型医療マイクロ構造体の実現

脳動脈瘤治療を目標として,外部磁場によってマイクロ構造体を血管内で誘導する技術について研究を行った.小型のコイルを開発し,簡易な血管モデルを用いてマイクロ構造体の制御について研究を行った.血管分岐点における経路選択を行うための磁場制御手法を提案し,実験により経路選択を成功させた.これらの要素技術を統合することでマイクロ構造体の外部磁場誘導の研究を発展させ,より臨床的なシナリオに基づく開発へと発展させることができると考えられる.平成23年度の計算に基づき,数mmの拡大モデルの設計,製作を行った.脳動脈瘤付近の血管分岐の形状を模擬した3次元モデルと血流を模擬した循環装置を作成し,平成23年度に構築した理論に基づいて拡大モデルを駆動した.マイクロロボットを血管内で目的の位置に移動する際に必要な技術として,流体,特に拍動流中の制御,屈曲した血管内での移動,血管分岐点での進行方向の選択,マイクロロボットの位置情報取得によるナビゲーション・制御が挙げられる.平成23年度までに,拍動流中での制御,屈曲した血管内での移動手法が提案されているが,分岐選択については未着手であった.よって,平成24年度は分岐選択制御を対象とした.具体的には,血管内医用マイクロロボットの分岐選択制御について,磁力の大きさと方向の分岐点流速に対する依存性の検証の必要性を示した.分岐がない場合の理論値以上の磁場勾配が分岐選択には必要であることを確認した.分岐選択に2方向の磁力方向を提案した上で,磁力0.0-0.4×10^-3 N,流速0.1-0.7 m/sにおける必要条件を示した.結論として,到達経路垂直方向に磁力がかかる外部磁場は有効であるが,目標経路垂直方向に磁力がかかる外部磁場は磁力の影響が大きく,より効率的に分岐選択ができる.平成24年度に提案した手法に関して,制御実験を行う実験系に必要な仕様を検討した.脳動脈の内径,血流の流速,脳動脈瘤の大きさ,血液の物性(粘度,密度),また提案手法の機械的制約条件から,マイクロロボットを直径200μmの球形の形状とし,外部から磁場勾配を与えて磁力を発生させ,マイクロロボットを直接牽引するという方法を選択した.この際,マイクロロボットにかかる力として,磁力だけでなく流体の抗力,揚力を考慮に入れなければならない.そこで,計算モデルを作成してマイクロロボットに作用する磁力,抗力,揚力を比較した.マイクロロボットの駆動に必要な磁場勾配の大きさとして1.5 T/mという値を算出した.この計算に基づき,2軸方向に独立して磁場勾配を発生させる電磁石を設計し,その電流を操作することでマイクロロボットを行う.現在は実験系の設計を主として行っており,設計が完成次第,今後はその制御則の考案を行う.脳動脈瘤治療を目標として,外部磁場によってマイクロ構造体を血管内で誘導する技術について研究を行った.小型のコイルを開発し,簡易な血管モデルを用いてマイクロ構造体の制御について研究を行った.血管分岐点における経路選択を行うための磁場制御手法を提案し,実験により経路選択を成功させた.これらの要素技術を統合することでマイクロ構造体の外部磁場誘導の研究を発展させ,より臨床的なシナリオに基づく開発へと発展させることができると考えられる.平成23年度は,血管内でのマイクロロボットによる治療を実現するために,模擬血流内においてマイクロロボットの制御を試みた.そのために,マイクロロボットを壁面に拘束して駆動する方法を提案し,提案手法を用いて拍動する曲がり管の中でマイクロロボットを駆動した.本年度は,マイクロロボットを血管の管壁に拘束し,外部磁場により駆動する手法を提案した.自由空間であれば姿勢と位置の6自由度の制御が必要である.しかし,マイクロロボットを管壁に押し付けることにより,マイクロロボットが持つ自由度は管壁表面における位置2自由度,回転1自由度となる.幾何学的拘束を用いて対象が持つ自由度を減らし,制御を容易にすることが基本コンセプトである.マイクロロボットが壁面に拘束されて進行する条件は不等式で表されるので,定常流中においては,発生磁場の方向と強さを一定にしたままでもマイクロロボットはある区間を通過する.そこで,マイクロロボットをあるポイントまで到達させるために,磁場を一定にした状態で通過が保証される区間を繋げていく方法を提案した.これにより従来の位置制御よりも非振動的な制御を行うことが可能であった.拍動流中においても基準流速に対してこの方法を適用することができる.以上のように,血管内における壁面拘束を用いたマイクロロボットの外部磁場駆動を提案し,2次元の曲がり管において本手法を用いた実験を行い,乱れのある流れの中でのナビゲーションに有効であることを確認した.手術ロボットやカプセル内視鏡に続くイノベーションとして,血管内などの体内を移動して治療を行う外部磁場誘導型マイクロ構造体というコンセプトを提案した.血流を模擬した流れの中にあるマイク構造体を制御するため,血液の流速やレイノルズ数,マイクロ構造体に働く揚力,浮力,重力,抗力を考慮して,ロボットに与える磁力を決定するための理論について研究した.複雑に入り組んだ血管などのネットワークの中でマイクロ構造体をターゲットまで正確に誘導するためには,血管などの分岐点にて適切な経路選択を行うことが不可欠である.そこで,システムや制御を簡便にするため,血管壁に沿ってマイクロ構造体を誘導する手法を提案した.提案する手法の有用性を示すため,Maxwell CoilとHelmholtz Coilを組み合わせた2軸コイルを製作した.また,コイル内に血管を模擬した内径3 mmの流路を配置し,グルコース液を0.3 m/sの速度で流す設計とした.

流路内にはネオジウム磁石で製作した1 mmの球形のマイクロ構造体を配置し,CCDカメラを用いてリアルタイムに観察しながらその動きを外部磁場により制御した.一分岐の流路を用いて,分岐角度0度,30度,45度について,経路選択の実験を行った.実験の結果,30度の場合は10回の試行中9回で分岐選択に成功し,45度の場合は10回の試行中5回で分岐選択に成功した.成功率を上げるためには,応答性の向上が不可欠である.これらの研究実績は,複雑な血管ネットワークでの分岐選択制御の基礎となると期待される.医用工学平成24年度は,当初予定していた通り,血管内医用マイクロロボットの分岐選択制御について,磁力の大きさと方向の分岐点流速に対する依存性を検討し,実験的に示すことが可能であった.以上のように,申請書に記入した「研究の目的」を予定通りに達成することができた.平成24年度は,当初予定していた通り,制御実験を行う実験系に必要な仕様を検討した.マイクロロボットの駆動に必要な磁場勾配の大きさとして1.5 T/mという値を算出した.この計算に基づき,2軸方向に独立して磁場勾配を発生させる電磁石を設計た.以上のように,申請書に記入した「研究の目的」を予定通りに達成することができた.平成23年度は,当初予定していた通り,実験装置に傾斜磁場発生用コイルを追加することで姿勢と位置を制御可能な実験系を構築できた.また,血管内におけるマイクロ構造体に働く揚力,浮力,重力,抗力と,ロボットに与える磁力を計算することにより,血管内でマイクロ構造体を制御するための理論を構築した.以上のように,申請書に記入した「研究の目的」を予定通りに達成することができた.平成24年度に製作したマイクロ構造体の評価及び改良を行う.マイクロ構造体の速度,推進力を計測するための実験セットアップの設計,製作を行い,マイクロ構造体の位置を自動で検出・追跡するための画像処理を搭載する.また,平成24年度で開発した拡大モデルを微小化することでマイクロ構造体を設計,製作する.具体的には,静止流体内のマイクロ構造体用に開発したセットアップを用いて評価実験を行う.製作した実験セットアップを用いて,提案する駆動原理の基礎的な評価を行い,臨床応用の可能性について検討する.また,静止流体内・血流内用に開発したマイクロ構造体を使用した評価を行う.マイクロロボットの血流中での制御における問題を解決する.ワイヤレスでの制御そのものの困難さ,拍動により流れが乱れること,外部磁場の分布が非線形であること,また磁力に対して抗力のオーダーが大きくなってしまう状況が発生する,といった問題がある.特に,磁力と流体力の比較は重要な問題である.磁力はマイクロロボットの体積に比例するが,流体力はマイクロロボットの表面積に比例するため,マイクロロボットのサイズが小さくなると磁力よりも流体力の方がより大きな影響を与える.上記の問題点は,マイクロロボットが順流方向,逆流方向の各方向それぞれで駆動する際に解決方法が異なると考えられる.
精神保健福祉援助実習教育における評価の標準化に関する研究

平成15年度に,精神保健福祉援助実習教育における評価に関する先行研究をレビューし,それと平行して質的調査に必要な基礎データを収集した。収集したデータはカセットテープで40本(平成15年度)である。私たちは,平成15年度中に修正版グラウンデッド・セオリー・アプローチ(M-GTA)に基づいた分析を始め,次のようなことが発見できた。それらは,(1)実習項目に関しては,項目そのものがあいまいであり,実習指導者はその項目を十分に把握していない。(2)評価基準は明確ではなく,そのために学生にその基準が認知されていない。(3)評価項目と評価基準に加えて,評価について伝える方法や手順などを明らかにする必要がある。(4)評価項目,評価基準,評価方法は関連しており,全体像を実習指導者が十分理解しておく必要がある。(5)実習評価は,評価する者と評価される者との共同作業であり,上記のことを共有していることが求められる。の5つである。平成16年度は,平成15年度に収集した基礎データと合わせてM-GTAに基づいた分析を継続した。分析の結果,実習の評価項目を24項目抽出した。これらの項目は,大きくは3つのカテゴリーに属する。それぞれのカテゴリーは,(1)利用者とのコミュニケーションに関して,(2)スーパーバイザーとの関係に関して,(3)ソーシャルワークに関して,である。平成17年度は,これまでのデータ分析によって得られた評価に関して教員,実習指導者,学生の三者が評価について持つべき共通理解を明らかにした。そして,実習評価プロセス共有するために必要な手順を標準化することを目指した。実習学生を主体として,教員及び実習指導者がコミュニケーションにより相互関係を持ち,評価項目,評価基準,評価方法に関する共有をしていく作業に役立てるためのツールとその使用方法を作成した。このことにより,特に教員及び実習指導者がそのことを意識し,プロセスを明確に提示し,確認していくことができる。これらの作業により生成された概念の全体像の図式化及びストーリーラインを作成し,さらに実習評価をより実効性のあるものにするためにツールの活用プロセスを明らかにした。の5つである。平成15年度に計画していたように,精神保健福祉援助実習教育における評価に関して,先行研究をレビューした。その結果,実習に関する評価項目と評価基準に関する文献については,概説的なものはあるが,実証的なデータに基づくものに関しては,なかった。また,このことを受け,実習評価に関する項目と内容に関する質的研究を行うために,基礎データの収集を行った。グラウンデッド・セオリーにもとづいて調査を行うため,配属されている実習先で行われている実際の実習指導内容,並びに実習終了後に実習担当教員が行うフィードバックの内容を録音した。現時点で,録音したテープは約40本となっている。今後必要に応じて,録音を追加する予定である。これらのテープを逐語録にして,現在グラウンデッド・セオリーに基づく分析を継続中である。まだ一部分の分析しかできていないが,いくつかのことが発見できた。それらは,次のようなことである。(1)実習項目に関しては,項目そのものがあいまいであり,実習指導者はその項目を十分に把握していない。

(3)想定していなかったが,評価項目と評価基準に加えて,評価について伝える方法や手順などを明らかにする必要があることが分かった。(4)評価項目,評価基準,評価方法は関連しており,全体像を実習指導者が十分理解しておく必要がある。(5)実習評価は,評価する者と評価される者との共同作業であり,上記のことを共有していることが求められること。平成15年度には,精神保健福祉援助実習教育における評価に関する先行研究をレビューし,それと平行して質的調査に必要な基礎データを収集した。収集したデータはカセットテープで40本(平成15年度)である。平成15年度中に修正版グラウンデッド・セオリー・アプローチ(M-GTA)に基づいた分析を始め,次のようなことが発見できた。(1)実習項目に関しては,項目そのものがあいまいであり,実習指導者はその項目を十分に把握していない。(2)評価基準は明確ではなく,そのために学生にその基準が認知されていない。(3)想定していなかったが,評価項目と評価基準に加えて,評価について伝える方法や手順などを明らかにする必要がある。(5)実習評価は,評価する者と評価される者との共同作業であり,上記のことを共有していることが求められる。平成16年度は,基礎データをカセットテープで5本追加した。平成15年度に収集した基礎データと合わせて現在M-GTAに基づいた分析を継続中であり,追加した基礎資料からは新たな概念の発見はない。なお,これまでのデータ分析によって,先にあげた評価に関して教員,実習指導者,学生の三者が評価について共通理解を得ることの重要性の再確認を行った。そのうえで,実習評価におけるプロセスを明らかにすることの重要性が明確になった。評価という行為は,実習学生を主体として,教員及び実習指導者がコミュニケーションにより相互関係を持ち,評価項目,評価基準,評価方法に関する共有をしていく作業である。そのなかで,特に教員及び実習指導者がそのことを意識し,プロセスを明確に提示し,確認していくことが重要である。現在生成された概念の全体像の図式化及びストーリーラインの作成を行っている。今後はこれらの作業によって明らかになった全体像をもとに,実際の実習指導を行う際に活用することを通して,評価についてのプロセスをより明確なものにする予定である。それらは,(1)実習項目に関しては,項目そのものがあいまいであり,実習指導者はその項目を十分に把握していない。
卵巣機能の解体と卵子形成機能の抽出・再構築による卵母細胞発育培養系の開発

ウシおよびブタの原始卵胞は,体外培養によって一次卵胞を超えては発達しなかった。ウシの二次卵胞内の卵母細胞は,血漿を添加した培養液中で発育した。ウシの初期胞状卵胞より採取した卵母細胞をポリビニルピロリドン,エストラジオール17βおよびアンドロステンジオンを含む培養液中で培養すると,卵母細胞は高率に発育し,成熟能力を獲得した。ブタの初期胞状卵胞より採取した卵母細胞をFSH,dbcAMPおよびエストラジオール17β添加した培養液中で培養すると,卵母細胞は高率に発育し,成熟する能力を獲得した。哺乳類の卵巣の機能は胎生と関連した複雑な機能群で構成されており,その中には「卵子形成機能」と相反する機能も含まれると考えられる。本研究は,卵母細胞の体外培養技術を用いて,卵巣内の複雑な機能群を解体し,卵子形成に必須な機能を抽出し,再構築することを目的とした。材料としては,ウシおよびブタの卵巣を用い,1)原始卵胞二次卵胞(発育初期),2)二次卵胞初期胞状卵胞(発育中期)および3)初期胞状卵胞以降(発育後期)の3段階に分けて研究を開始した。1)発育初期:ブタおよびウシ原始卵胞内の卵母細胞(直径30μm)の発育開始を制御する分子機構について調べた。ウシ原始卵胞内の卵母細胞の発育開始は,ブタの原始卵胞と同様に,転写因子FOXO3によって抑制的に制御されることがウシFOXO3のsiRNA干渉実験によって示された。また,テストステロン処理によって,ブタ原始卵胞が発達を開始することが示唆された。2)発育中期:ウシの二次卵胞内の卵母細胞(直径5060μm)を種々の方法で培養したところ,二次卵胞から取り出した卵母細胞-顆粒膜細胞複合体を培養する方法に比べて,二次卵胞を丸ごとコラーベンゲルに包埋し,血漿を添加した培養液中で培養すると,卵母細胞の生存率は高率に維持され,4週間後に卵母細胞は直径90100μmへと発育した。3)発育後期:高濃度のポリビニルピロリドンを含む培養液を用いた開放型培養法を用いて,ウシの初期胞状卵胞より採取した卵母細胞(直径90100μm)-顆粒膜細胞複合体を2週間培養した。卵母細胞の発育培養には,複合体の下面からも培養液が到達するタイプの培養基質が有効であり,培養液にステロイドホルモンを添加すると高率に卵母細胞が生存し発育すること,また,アンドロステンジオンを添加すると50%以上の卵母細胞が成熟能力を獲得すること,が示唆された。本研究は,卵母細胞の体外培養技術を用いて,卵巣内の複雑な機能群を解体し,卵子形成に必須な機能を抽出し,再構築することを目的としている。ウシおよびブタの卵巣を材料として用い、研究を進めた。1)受容体型チロシンキナーゼKITのリガンド(KIT ligand)は,ブタ原始卵胞の生存性を維持したが,原始卵胞の発達開始には作用しなかった。2)ブタの初期胞状卵胞中の成熟能力のない卵母細胞(直径約110μm)をFSH添加培養液中で5日間培養すると,卵母細胞は顆粒膜細胞に包まれた状態で最終の直径へと発育したが,その後の成熟率は低かった(11%)。さらにdbcAMPを添加すると卵母細胞は発育し,その後の成熟培養によって高率に(68%)第二減数分裂中期へと成熟した。3)ポリビニルピロリドンを含む培養液を用いた開放型培養法によって,ウシの初期胞状卵胞より採取した卵母細胞(直径90100μm)-顆粒膜細胞複合体を2週間培養した。培養液にエストラジオール17βを添加すると卵母細胞が高率に生存し発育したが,その後の成熟率は低かった。一方,アンドロステンジオンを添加すると生存率は低いものの卵母細胞が成熟能力を獲得した。これら両ホルモンを組み合わせることによって,卵母細胞が高率に発育し,成熟能力を獲得する(7080%)系が構築された。4)体外で2週間培養したウシ体外発育卵母細胞はリプログラミング能力を獲得しうること,また,レシピエント卵子として核移植に利用できることが明らかとなった。5)体外で発育したウシおよびマウス卵母細胞は,体内で発育した卵母細胞よりも薄い透明帯を形成した。この薄い透明帯はポリビニルピロリドン添加培養液において顕著であったが,受精は正常に起こった。

哺乳類の卵巣の機能は胎生と関連した複雑な機能群で構成されており,その中には「卵子形成機能」と相反する機能も含まれると考えられる。本研究は,卵母細胞の体外培養技術を用いて,卵巣内の複雑な機能群を解体し,卵子形成に必須な機能を抽出し,再構築することを目的とした。ウシおよびブタの卵巣を材料として研究を進めた。1)原始卵胞を含むウシ卵巣組織片をGDF-9を添加した培養液中で1週間培養したところ,原始卵胞の割合の低下と一次卵胞の割合のわずかな上昇を認めたが,卵胞はそれ以上発達しなかった。2)1020日齢のブタ新生仔の原始卵胞を含む卵巣組織片を2週間体外で培養したが,原始卵胞の発達は起こらなかった。また,原始卵胞の発達に対してFGF-2は作用しなかった。3)ブタの初期胞状卵胞中の成熟能力のない卵母細胞(直径約110μm)をFSHおよびdbcAMPを添加した培養液中で5日間培養すると卵母細胞は発育し,その後の成熟培養によって高率に第二減数分裂中期へと成熟した。しかし,成熟過程で卵丘は膨潤化しなかった。発育培養液中にエストラジオール17βをさらに添加すると,卵母細胞の成熟に加えて卵丘の膨潤化が起こった。得られた成熟卵の一部は胚盤胞へと発生した。4)平均直径約100μmと105μmのウシ卵母細胞を2週間培養した結果,いずれも平均120μm以上へと発育したが,体外受精後の胚発生率は105μmの群がより高く(38% vs. 12%),胚発生能力の獲得には直径増大後の卵母細胞の変化も重要であることが明らかとなった。5)ポリビニルピロリドン(PVP)添加培養液中で発育させたウシ卵母細胞では,卵丘細胞から卵母細胞へ伸びてその先端でギャップ結合を形成するtranszonal projectionsの数が無添加の培養液におけるよりも多かった。これによりPVPの効果の理由の一つが初めて示唆された。卵子形成に関わる卵巣機能の解体と卵子形成機能の抽出に関して,原始卵胞二次卵胞(発育初期),二次卵胞初期胞状卵胞(発育中期)および初期胞状卵胞以降(発育後期)に分けて研究を進めている。発育初期に関する研究はやや遅れているが,発育中期以降に関してはいくかの因子の添加によって,高率に卵母細胞が最終の直径へと発育し,成熟する能力を獲得することが示され,研究は当初の計画以上に進展している。24年度が最終年度であるため、記入しない。卵母細胞の初期発育に関してさらに研究を進め,体外培養系を構築する。
植物群落の時空間機能情報の遠隔モニタリングと解析評価手法に関する研究

植物群落の時空間機能情報のモニタリングと解析評価手法の開発に関する研究を行った。例えば、関東地方や摩周湖周辺の衛星(LANDSAT)データから、蒸発散指標(iTVDI)を計算し、森林衰退の早期診断に有効であることを示した。また、大気酸素の吸収帯のO2Aバンドを利用して、太陽光下でクロロフィル蛍光パラメータを求める新しい方法(FLD-LISP法)やクロロフィル蛍光画像計測システムを開発し、光合成機能診断に適用した。さらに、地上やドローンなどから作物や樹木の3次元形状や植生指数、温度などを計測し、高精度で植物の形質評価を行う方法を開発した。植生指標と地表面温度画像を用いた蒸発散指標の開発と検証に関して、前年度に引き続き、MODISやLANDSATの衛星データと標高、気象データを用いて、蒸発散指標ETI(iTVDIなど)を改良するとともに、赤城山の森林衰退やカナダプレーリーの土壌水分の評価に適用した。赤城山では、アメダスの気温Taデータを標高補正し、空間的に補間することにより、0.5°C(RMSE)の精度で気温画像を作成し、衛星データから得た地表面温度Tsとの差(Ts-Ta)と正規化植生指数(NDVI)との特徴空間の値として定義したETI値と森林衰退との関係を調べたところ、森林衰退が著しい場所でETIが大きくなる傾向があった。また、カナダプレーリーでは、MODISAquaとTerraからTsを、さらに、NAAR Taデータとの統合により、(Ts-Ta)を求め、ETIを計算した。そして、ΔTsやAqua-DayNightから計算したETIと比較したところ、MODIS Aqua-dayとTerra-dayのデータを用いた方法がフィールドで計測した土壌水分との誤差が小さかった。一方、フラウンホーファー線による太陽光クロロフィル(Chl)蛍光の解析評価法の開発と検証に関して、大気酸素の吸収帯であるO2AバンドとO2Bバンドを用いて、太陽光Chl蛍光と人工光Chl蛍光を高精度波長分解能をもつ分光器で計測し、定常Chl蛍光においては、Chl含有量との関係が大きいことを明らかにした。また、O2AバンドではChl含有量が多いほど蛍光収率が大きくなり、逆に、O2Bバンドでは蛍光収率が小さくなる傾向があった。これは、Chlによる蛍光の再吸収と関係していた。さらに、O2Aバンドを用いて、Chl蛍光画像を計測するシステムを開発し、その特性について調べた。また、GOSAT衛星の分光データからChl蛍光情報を得る手法についても検討した。人工衛星ランドサットの摩周湖周辺の可視・近赤外バンドと熱赤外の画像データを用いて、蒸発散指標iTVDIについて検討した。蒸発散指標iTVDIは、正規化植生指数(NDVI)と地表面温度Tsから気温Taを引いた指標(Ts-Ta)の特徴空間上の値として定義した。その際、NDVIとTsはランドサットデータから求め、また、Taはアメダスデータを標高補正した値を用いた。14種類の植生タイプ毎に、NDVIとiTVDIを比較したところ、低木や草地では、NDVIが小さく、iTVDIが大きかった。また、高木ではその逆の結果になったが、ダケカンバだけは、NDVI、iTVDI共に、大きい値を示した。iTVDIは、土壌含水量と相関が高く、植生では蒸発散速度が大きいほど小さい値を示す傾向がある。一般に、大きいNDVIを示す植生は葉面積密度が大きく、最大蒸散速度も大きくなる傾向がある。しかし、ダケカンバはNDVIが他の高木と同じように大きかったにもかかわらず、iTVDIが相対的に大きな値を示した。このことは、ダケカンバの蒸散速度が少なくなっていることを示唆している。一方、フラウンホーファー線による太陽光クロロフィル蛍光の解析評価法の開発と検証に関しては、新たに購入した高波長分解能分光システムを用いて、O2AやO2Bなどのフラウンホーファー線の分光解析を行い、クロロフィル蛍光成分が抽出できることを確認した。また、光合成反応の指標といわれている光化学反射指標(PRI)について、メロンの生育ステージの違いによるPRIとクロロフィル蛍光パラメータ、植物色素含有量との関係を調べたところ、光合成反応に関係する光化学的及び非光化学的クエンチングのPRIへの影響は最大見積もっても20%以下で、植物色素、特に、クロロフィル含有量の影響が大きかった。今年度は、新たに購入したマルチコプター(UAV)に、同じく今年度購入したマルチスペクトルカメラと既存のサーマルカメラ、カラーカメラを同時搭載し、マルチコプターの飛行の安定度を調べるとともに、3台のカメラを用いた同時観測を行った。その結果、多方向から、これらの画像を安定して得られることが確かめられた。また、マルチコプターからのマルチステレオ法による観測画像をもとに、建物や農地、植物などの3次元モデルの構築が可能であることがわかった。また、実験室での3次元形状計測のためのマルチカメラシステムを製作し、実際に植物の3次元計測を行った。その結果、この手法の有効性が確かめられた。次年度以降、これらの精度検証を行う予定である。一方、フラウンホーファー線による太陽光クロロフィル蛍光計測の研究では、前年度に引き続きGOSAT衛星データの解析を行い、O2Aの近くの太陽光起源の幾つかのフラウンホーファー線が蛍光解析に使用できることを明らかにした。そして、フラウンホーファー線の深さが深いほど、蛍光計測の精度が向上することを明らかにした。

また、地上での高波長分解能分光システムを用いて、O2Aバンドでの飽和パルス法による計測により、太陽光下でのクロロフィル蛍光パラメータの解析を可能にした。次年度以降、その精度検証と生育状態の異なる植物の解析に適用する予定である。植生指標と地表面温度画像を用いた蒸発散指標の開発と検証に関しては、前年度に引き続き、関東平野北部の解析を行った。また、地上ライダーを用いた植物の3次元形状に関する野外計測を実施し、特に、広葉樹における葉傾斜角の解析を行った。フラウンホーファー線による太陽光クロロフィル(Chl)蛍光計測の研究では、前年度に引き続き、パプリカ葉を材料として、高波長分解能分光システムを用いてO2A(760nm)とO2B(686nm)バンドのFraunhofer line depth(FLD)解析を行った。その結果、FLD法によるO2AとO2Bバンドの蛍光収率比と従来法で得た蛍光収率比でR2=0.84の高い相関が確かめられた。また、レーザー光との併用により、光化学反応系IIの量子収率(ΦPSII)を推定したところ、従来法であるPAM法により得られた値とR2=0.74の相関が得られ、FLD法で精度のよいΦPSIIが得られることが明らかになった。画像計測については、太陽光下で予想しなかった光漏れが見つかり、その対策を行った。一方、植生指標については、新しいChl含有量指標の開発を行い、従来指標と比較検討を行った。その結果、MDATT=(R719-R726)/(R719-R743)(ここでRは分光反射率、数字は波長nm)が表裏の分光反射率が異なる白ポプラにおいてr2=0.94の最も高い推定精度を示した。今後、種々の植物種で、推定精度と最適波長について検討する予定である。乾燥度(蒸発散)指標iTVDIについては、Landsat TM画像を用いて、関東地域の土地被覆タイプの間のiTVDIとNDVIの関係を調べた。その結果、土地被覆タイプだけでなく、被覆率により、iTVDIやNDVIの値が変わることが明らかになった。例えば、水田ではNDVIが同程度の値であっても水があるとiTVDIが小さい値を示した。一方、草地や作物畑、果樹園では、被覆率の違いによりiTVDIの変化は小さかったが、NDVIは被覆率の違いにより大きく変化した。フラウンホーファー線による太陽光クロロフィル(Chl)蛍光計測では、、高波長分解能分光システムを用いた研究は順調に進捗した。しかし、FLD法によるChl蛍光の画像計測システムの開発において、太陽光下で予想しなかった光漏れが見つかり、その対策を行った結果、研究の進展に数ヶ月の遅れが生じた。一方、植生指標の研究については、新しいChl含有量指標の開発やiTVDI指標の土地被覆分類との関係も含めて順調に進展した。本研究において、新しく開発したフラウンホーファー線による太陽光クロロフィル(Chl)蛍光パラメータ計測法をFLD-LISP法と命名した。
神経損傷防御の基盤研究とトランスレーショナルリサーチ

PACAPはVIP/glucagon/secretinファミリーに属するペプチドであり3種類の受容体を持ち、神経系のみならず末梢臓器においてもPACAPは重要な機能を持つ。我々はすでにPACAPが遅発性神経細胞死を防御することをげっ歯類の脳・脊髄において証明した。我々は、PACAPがCRMP2という軸索伸長因子の発現を亢進させて運動機能を回復することが脊損モデル動物を使った研究で明らかにした。さらに我々は霊長類のマーモセットを用いて脳虚血後のPACAPの神経再生・新生の実験を現在行っている。ヒトにおいてPACAPは脳梗塞や脳虚血に対して有効な治療法として臨床応用される可能性がある。1)PACAP遺伝子欠損マウスを用いたPACAPによる細胞死抑制の分子基盤の解明PACAP KOマウスを用いて脳虚血、脊髄損傷、網膜障害モデル動物を作成し、神経細胞死の有無をTUNEL法、テトラゾリウム(TTC)染色などにより検出し、細胞計測を行った。さらにモデル動物にPACAPを静脈または脳室内投与を行い、神経細胞死抑制効果のあることが分かった。さらに、傷害後の神経組織からRNAおよびタンパク質を抽出し、傷害組織内におけるPACAPおよびPACAP受容体の発現および細胞死や炎症反応に関わる因子の発現動態を行い、既知および未知の遺伝子発現を確認した。さらに神経損傷後に生じる神経前駆細胞、活性化グリア細胞、軸索再生に関わる因子についても同様に解析し、軸索伸張遺伝子および遺伝子産物の同定に成功した。2)PACAPの神経保護作用に係る遺伝子およびタンパク質の網羅的解明PACAPによる神経保護作用には直接作用以外に間接的作用によることが証明されている。そこで脳虚血半球および正常半球を採取し液体窒素下で微粉末化したのちcDNAマイクロアレイ解析(アジレント社製)およびプロテオミックス解析(MALDI/TOFMS; Shimadzu社製)を行った。その結果新規軸索伸張関連因子をオミックス解析にて同定し、さらに抗体を作成して正常および損傷個体の脳内各部位のより詳細な発現動態と分布局在の同定を現在行っているところである。昨年までに行ったプロテオミクス解析により、マウスの中大脳動脈閉塞による脳虚血後にPACAPを脳室内投与することにより、CRMP2タンパク質の発現が投与6時間後で上昇し、CRMP2陽性反応が梗塞周囲のペナンブラ領域の神経細胞に強く認められることを明らかにした。CRMP2は軸索形成に重要な因子であることが知られている。そこで本年度はより運動機能や軸索新生を評価し易いマウスの脊髄損傷モデルを用いた機能解析を行った。インパクターにより脊髄を損傷させたマウスにPACAPを浸み込ませた徐放性ゲルを損傷脊髄に塗布し、その後の運動機能を経時的に評価したところ、PACAP10-12 M添加群では生理的食塩水添加群と比較して損傷後14日目において有意な運動機能の回復が認められた。損傷後の脊髄においてCRMP2 mRNA発現量を定量したところ、PACAP添加群では生理的食塩水添加群と比較して7日目で増加傾向を示し、14日目で有意差が認められた。CRMP2免疫陽性反応は脊髄の大型及び小型の神経細胞と一部のオリゴデンドロサイトに重なり、さらに傷害後では傷害部と正常部の境界領域において強い陽性反応が観察された。大脳皮質への順行性トレーサー投与実験により、PACAP添加群では損傷領域近傍部における軸索が多数観察された。以上の結果より、PACAPはCRMP2発現量を上昇させ、損傷後の軸索再生を誘導することにより運動機能の回復を促進していることが示唆された。また、本年度はアカゲザルを用いて中大脳動脈閉塞モデルを作出し、PACAPを静脈内持続投与する実験を行っている。現在までにPACAPが若干の血圧低下作用を示すこと、血糖値に作用するなどの現象を確認している。脳梗塞や運動機能の解析については現段階では有意差は得られておらず、個体数の増加または実験条件の最検討などが必要である。1 ) PACAP遺伝子欠損マウスを用いたPACAPによる細胞死抑制の分子基盤の解明PACAP KOマウスを用いて脳虚血、脊髄損傷、網膜障害モデル動物を作成し、神経細胞死の有無をTUNEL法、テトラゾリウム(TTC)染色などにより検出し、細胞計測を行った。さらにモデル動物にPACAPを静脈または脳室内投与を行い、PACAPには神経細胞死の顕著な抑制効果のあることが分かった。さらに、傷害後の神経組織からRNAおよびタンパク質を抽出し、傷害組織内におけるPACAPおよびPACAP受容体の発現および細胞死や炎症反応に関わる因子の発現動態をDNAアレイを行った。さらにPACAPの下流域にCtramという遺伝子の存在が明らかになり、その遺伝子産物がCrmp2というタンパクであり、神経軸索伸張促進作用のあることが分かった。2 ) PACAPの神経保護作用に係る遺伝子およびタンパク質の網羅的解明PACAPによる神経保護作用には直接作用以外に間接的作用によることが証明されている。そこで脳虚血半球および正常半球を採取し液体窒素下で微粉末化したのちcDNAマイクロアレイ解析(アジレント社製)およびプロテオミックス解析(MALDI/TOFMS;Shimadzu社製)を行った。その結果新規軸索伸張関連因子(Crmp2)をオミックス解析にて同定し、さらに抗体を作成して正常および損傷個体の脳内各部位のより詳細な発現動態をしらべたところ、虚血6時間で梗塞側にこのタンパクが神経細胞内に発現していることが明らかになった。霊長類であるアカゲサルを用いて永久虚血モデルを作成した。これは浜松医学研究所と共同で実験研究を行った。