hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
放射線治療新規非コードRNAマーカー開発研究

非侵襲性の特徴がある放射線治療はがん治療で重要性が増しています。本研究は、タンパク質の鋳型とならない非コードRNA(non-coding RNA; ncRNA)をターゲットにして放射線治療の新規マーカー研究確立を目的としました。治療モデルとして、放射線を照射した各種がん由来培養細胞を用いました。まず定量PCRを用いた解析により、発現変動するncRNAをいくつか同定しました。また、FISH法やIF法を用いて、局在変化するncRNAやタンパク質も同定出来ました。ただ、免疫沈降法やフィルター結合法を用いたものの、これらのncRNAとタンパク質間での相互作用を確認することは出来ませんでした。近年のがん治療分野の進歩において、非侵襲性という特徴をもち、かつ外科的手術が困難な患者にも適応可能な放射線治療が注目されている。治療成績自体も外科的手術と放射線治療で次第に変わらなくなってきてもいるためさらに注目を集めている治療法でもある。その反面、放射線の効果は個人差を有することもまた事実であり、放射線治療が利きずらい方、放射線の副作用が強く出てしまう方も一定数出てきてしまうこともある。こういった方々への放射線治療はできるだけ前もって避けることでより効果のある違う治療法を選択することができ、より効率的にがん治療を進めることが可能となる。そのため、治療前にあらかじめ治療効果を予測できるようなバイオマーカーの確立が急務である。これまでは主にタンパク質マーカーの確立研究が推進されてきた。本研究においては、タンパク質の鋳型とならない非コードRNA、その中でも機能がほとんどまだわかっていない長塩基長非コードRNAをターゲットとしてこれまでになかった斬新な観点からバイオマーカー確立を志向した。近年のゲノム研究によって、DNA上のタンパク質をコードする部分ではない領域から大量の非コードRNAが作られてきており、それらがタンパク質とならずにRNAのままで生体内に存在し、重要な生理機能に関わっていることが徐々に明らかになってきた。そのため、本研究によって得られたこれまでになかった視点からの成果につながることが期待される。本年度においては培養細胞に放射線を照射し、定量PCR法を用いて放射線照射によって発現様式が変化する長塩基長非コードRNAを探索することを目指した。その結果、放射線に応答する長塩基長非コードRNAをいくつか同定できた。さらにその中のいくつかは放射線に特異的に反応する可能性が示唆された。放射線照射前後で発現変化する長塩基長非コードRNAをいくつか同定することができたので、点段階ではおおむね順調に進んでいるものと考えられたため。本研究はがんの放射線治療の新規メカニズムをタンパク質の鋳型とならない非コードRNA(non-coding RNA: ncRNA)をターゲットとして明らかにすることを目的として行いました。特にncRNAの中でも機能がまだよくわかっている長塩基長ncRNA(long ncRNA:lncRNA)に焦点を当てて行いました。まず初手として、ストレスマーカータンパク質である熱ショックタンパク質発現を指標にして、適切な放射線照射条件を決定し、その線量の放射線と用いて、各種がん由来培養細胞(子宮頸がん由来のHeLa細胞、肺がん由来のA549細胞、乳がん由来のMCF7細胞)に照射を行い、これらのがん由来細胞において発現変動をするlncRNAを定量PCRにて探索しました。その結果、放射線照射前後で発現が変化するlncRNAをいくつか同定することが出来ました。また、同様に、ウェスタンブロット法や定量PCRを用いて、転写レベルと翻訳レベルどちらにおいても発現変化するタンパク質因子もいくつか同定しました。また、RNA FISH法と蛍光免疫染色を持ちいて、照射前後でのncRNAとタンパク質の細胞内局在変化を確認しました。その結果いくつかの局在変化を確認することが出来ました。そして同定されたncRNAとタンパク質の相互作用を確認すべく、免疫沈降法を用いたin vivoレベルでの検出とフィルター結合法を用いたin vitroレベルでの解析を、何度も条件検討を繰り返しつつ試みたものの、うまく検出できずに、結果として相互作用同定までには至りませんでした。さらなる条件検討が必要と考えます。放射線照射前後で発現変化する長塩基長非コードRNAを引き続きいくつか同定していく予定である。できるだけ多種類同定することで幅広い観点でのメカニズム解明につながることが期待される。こういった発現変化する長塩基長非コードRNAの同定がある程度進んだ時点で、その発現変化した長塩基長非コードRNAに対して蛍光in situ hybridization法を適用することで細胞内局在変化を調べる予定である。分子生物学、細胞生物学、放射線生物学
細胞の自然死(アポプトーシス)に伴う糖鎖抗原の変化とその遺伝子的背景の研究

本研究の目的は、細胞がアポプトーシスをおこす際に、細胞表層の糖鎖抗原がどのように変化するかを解析し、その変化の制御機構を明らかにすることにある。特に糖鎖抗原の中でも、シアリルLe^X抗原やシアリルLe^a抗原のように、すでに細胞接着のリガンドであることが判明している糖鎖の変化の検索に重点をおいた。ヒト大腸癌培養細胞株HT-29およびColo201を実験対象に選んだが、これらの細胞にアポプトーシスを引き起こすには、抗FAS抗体処理のみでは不十分であったので、抗FAS抗体とIFNγによる刺激を併用してアポトーシスを誘発した。これに伴う細胞表面糖鎖の変化を各種抗糖鎖モノクローナル抗体を用いたフローサイトメイトリ-で検索したところ、アポトーシス誘発後に両細胞でLe^XおよびLe^y糖鎖の発現の上昇が認められた。この変化は、IFNγによる単独刺激では観察されなかった。合成糖鎖を基質として、α1→2フコシルトランスフェラーゼ、α1→3フコシルトランスフェラーゼ、α1→4フコシルトランスフェラーゼおよびβ1→4ガラクトシルトランスフェラーゼの酵素活性を測定したところ、アポトーシス誘発後の両細胞株において、α1→3フコシルトランスフェラーゼの活性の増加が認められた。現在までにα1→3フコシルトラスフェラーゼは5種類(Fuc-TIII,IV,V,VI,VII)の分子種が存在することが知られている。Northern BlottingおよびRT-PCR法を用いてα1→3フコシルトランスフェラーゼmRNA発現を検討した結果、アポトーシス誘発後にFuc-TIV(Myeloid型)の発現上昇とFuc-TIII,VIの発現低下が認められた。Fuc-TV,VIIIは検出感度以下であった。以上の結果より、活性の増加が認められたα1→3フコシルトランスフェラーゼ分子種は、ミエロイド型のFuc-TIVである可能性が高いと考えられた。
歯髄炎に伴う神経・グリア細胞の相互作用に関する総合的研究

私達はこれまでに、歯髄炎によってラットの視床におけるニューロンとグリア細胞間に相互作用がみられることを報告したが、その詳細はあまり解析されていない。本研究では、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼであるp38MAPKがラットの視床におけるニューロンとグリア細胞間の相互作用に関与していることを示唆した。具体的には、露髄後の72時間までニューロン等に発現するp38MAPKとアストロサイトに発現するGFAPの免疫応答発現が上昇し、また、MAPK 13とMAPK 14のmRNA発現も上昇することを解析した。“歯科基礎医学的研究"では、実験的歯髄炎を惹起させた動物実験において歯髄神経の持続的興奮に伴う中枢神経系内の動態に対して生理学的解析・免疫組織学的解析・遺伝子発現解析(NMDAR、MK801、p38MAPK等)を行い、さらに、中枢神経系内の歯髄駆動ニューロンとその周囲に存在するグリア細胞(ミクログリアやアストロサイトなど)の相互作用に対しても同様に解析を行った(GFAP、p38MAPK、P2X4受容体、IBA-1、MHCclassII、CD80、Toll様受容体等)。また、“臨床歯科医学的研究"では、歯髄疾患、特に不可逆性歯髄炎や根尖性歯周炎に罹患していると診断された患者で顎顔面領域に難治性の痛みを訴える者について、その原因の解明並びに痛みの除去に必要とした治療法の種類と治療期間、さらには疼痛消失前後における患者心理の変化(Visual Analogue Scale、Numerical Rating Scale等を使用)、患者の呈する症状の変化と診療行為との関係を調査し、必要に応じて、歯科用CBCT撮像を行い臨床的総合的に分析した。しかしまだ、歯髄疾患に伴う痛みの中枢細胞間の相互作用については十分に解明されているとはいえず、引き続き、難治性疼痛の病態を詳細に分析し、ひいては有効な治療方法を解明する必要がある。今後は、特に歯科基礎医学的研究において、生体警告系である痛みを難治性疼痛へと移行させる重要な役割を担っていることが解明されてきたミクログリアに注目し、活性化したミクログリアに特異的に発現増加する複数の因子について解析を行う予定である(炎症応答に必要とされる様々な遺伝子群の発現誘導など)。“歯科基礎医学的研究"では、実験的歯髄炎を惹起させた動物実験において歯髄神経の持続的興奮に伴う中枢神経系内の動態に対して免疫組織学的解析・遺伝子発現解析(NMDAR、MK801、p38MAPK等)を行い、さらに、中枢神経系内の歯髄駆動ニューロンとその周囲に存在するグリア細胞(ミクログリアやアストロサイト等)の相互作用に対しても同様に解析を行った(GFAP、p38MAPK、P2X4受容体、IBA-1、IRF5、IRF8等)。しかしまだ、歯髄疾患に伴う痛みの中枢細胞間の相互作用については十分に解明されているとはいえず、引き続き、難治性疼痛の病態を詳細に分析し、有効な治療方法を解明する必要がある。今後は、特に歯科基礎医学的研究において、生体警告系である痛みを難治性疼痛へと移行させる重要な役割を担っていることが解明されてきたグリア細胞に注目し、ニューロンとの相互作用を詳細に解析していく。また、活性化したアストロサイトやミクログリアに特異的に発現増加する複数の因子について解析を行う予定である(炎症応答に必要とされる様々な遺伝子群の発現誘導等)。“歯科基礎医学的研究"では、実験動物として糖尿病モデルのラットを主に用いて、実験的歯髄炎を誘発し、歯髄神経の持続的興奮に伴う中枢神経系内の動態を解析すために生理学的解析・免疫組織学的解析・遺伝子発現解析(NMDAR、MK801、p38MAPK等)を行った。具体的には、中枢神経系内の歯髄駆動ニューロンとその周囲に存在するグリア細胞(ミクログリアやアストロサイトなど)の相互作用を解析をした(GFAP、p38MAPK、P2X4受容体、IBA-1、MHCclassII、CD80、Toll様受容体等)。さらに生体警告系である痛みを難治性疼痛へと移行させる重要な役割を担っていることが解明されてきたミクログリアに注目し、これまで通り、疾患モデルではない通常のラットを用いて、活性化したミクログリアに特異的に発現増加する複数の因子についても解析を行った。

しかしまだ、歯髄疾患に伴う痛みの中枢細胞間の相互作用については十分に解明されているとはいえず、引き続き、難治性疼痛の病態を詳細に分析し、ひいては有効な治療方法を解明する必要がある。私達はこれまでに、歯髄炎によってラットの視床におけるニューロンとグリア細胞間に相互作用がみられることを報告したが、その詳細はあまり解析されていない。本研究では、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼであるp38MAPKがラットの視床におけるニューロンとグリア細胞間の相互作用に関与していることを示唆した。具体的には、露髄後の72時間までニューロン等に発現するp38MAPKとアストロサイトに発現するGFAPの免疫応答発現が上昇し、また、MAPK 13とMAPK 14のmRNA発現も上昇することを解析した。実験的歯髄炎を惹起させた動物実験において歯髄神経の持続的興奮に伴う中枢神経系内の動態に対して免疫組織学的解析、遺伝子発現解析を行うことで、中枢神経系内の歯髄駆動ニューロンとその周囲に存在するグリア細胞(ミクログリアやアストロサイト等)の相互作用を解析することができた。そして、研究成果を国際学会(13th INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON DENDRITIC CELLS)において発表した。歯内療法学来年度は、実験動物として糖尿病モデルのラットを主に用いて、実験的歯髄炎を誘発し、平成26年度と同様の検索を行う予定であったが、生体警告系である痛みを難治性疼痛へと移行させる重要な役割を担っていることが解明されてきたミクログリアに注目し、これまで通り、疾患モデルではない通常のラットを用いて、活性化したミクログリアに特異的に発現増加する複数の因子について解析を行う(炎症応答に必要とされる様々な遺伝子群の発現誘導など)ことを検討している。また、引き続き、ニューロンとアストロサイトとの相互作用に関する解析も行っていく。実験的歯髄炎を惹起させた動物実験において歯髄神経の持続的興奮に伴う中枢神経系内の動態に対して免疫組織学的解析、遺伝子発現解析を行うことで、中枢神経系内の歯髄駆動ニューロンとその周囲に存在するグリア細胞(ミクログリアやアストロサイトなど)の相互作用を解析することができた。そして、研究成果を国内外の学会(日本歯科保存学会、IADR-ASIA)において発表するとともに、得られた結果をJournal of Endodonticsに共著者として論文掲載された。26年度に、病態モデルラットを用いて、中枢性疼痛処理機構と関係があるとされているミクログリアとアストロサイトの活性化について免疫組織化学的解析と遺伝子発現を行い、その結果をもとに分子動態のシミュレーションを行うとともにシンポジウムにおいて発表する予定であったが、アストロサイトでの遺伝子発現解析の結果が詳細に現れなかったため、計画を変更しウェスタンブロットを行うこととしたため、未使用額が生じた。今年度は、実験動物として糖尿病モデルのラットを主に用いて、実験的歯髄炎を誘発し、平成25年度と同様の検索を行う予定であったが、生体警告系である痛みを難治性疼痛へと移行させる重要な役割を担っていることが解明されてきたミクログリアに注目し、これまで通り、疾患モデルではない通常のラットも用いて、活性化したミクログリアに特異的に発現増加する複数の因子について解析を行う(炎症応答に必要とされる様々な遺伝子群の発現誘導など)ことを検討している。このため、病態モデルラットを用いて、アストロサイトに関するウェスタンブロットを行い、その結果をもとに分子動態のシミュレーションを行うとともにシンポジウムでの発表を行う。
日系多国籍企業の情報処理システムと人的資源管理-アジア地域統括拠点における人材育成支援戦略を中心に-

本年度の資料研究およびシンガポール現地調査による研究成果は以下の2点である。第一は、シンガポール政府によるRHQ政策の展開を整理し、それ以外の知識集約ハブとなるための支援政策について時系列的に整理した。第二は現地日系RHQおよび大型小売業企業のヒアリングを行い、現地における域内人材育成支援政策の実際と情報交流について検討した。シンガポールのRHQ政策は2000年ごろから再編成が進められ、外資系企業のみならず、地元企業であっても、アジアパシフィック地域のビジネス統括や知識交流のハブとなる際には税制面での優遇を受けられるというものになっており、域内の知識・情報交流の中心となることによって、知識労働者への需要を生み出し、同政府が目指す知識集約型労働を中心とした国づくりを目指すという意味での一定の効果を挙げている。その一方で、ビジネススクールを中心とした高度職業教育、リストラによる失業者への短期集中IT教育などを通じて、労働供給面での支援を目指している。そうした意味では、労働政策が産業政策と連携して進められ、時宜に応じて選択と集中を図るという構図は依然継続しているものと考えられた。一方日系RHQについては、マネジメント教育については支援政策が進みつつあるが、専門教育についてはそれぞれのアジア地域戦略および親会社事業戦略によって対応が極めてばらついており、現段階では事例研究によって一定の傾向性を見出すことはできない。過去5年間の対応に大きく影響を与えているのは、日本本社による事業戦略の大きな変動である。マネジメント教育に関しては、現段階で地域単位のプログラムを開発中である企業も複数見られ、地域統括拠点のひとつの機能として人材育成支援が定着しつつあり、そこを中心とする担当者レベルでの活発な情報交流が継続しているものと理解された。反面、事業間の技術的距離が大きい場合には、シンガポールを舞台とした職能訓練支援が行われることは少なく、むしろ本社あるいは親事業部との連携が重視されるものと思われた。シンガポールを舞台とした職能訓練を目指すとすれば、現地社会貢献としての意義も含めながら、現地労働界へ訓練を開放する道が残されているが、これを行う企業はきわめて限定される。多国籍企業の人材開発における情報交流パターンとその規定要因については、HRDについて単独で扱う文献の数が少なく、HRMをふくめて再検討した。HRM、HRDに関する管理システムの異同と子会社が利用する本社情報リソースの影響力の関連についての研究は主に2種類の理論的枠組みから構成される。第一は、社会学の制度学派による組織同形化の理論であり、多国籍企業の親会社-子会社が形成する組織フィールド内部での同形化圧力と、子会社が現地社会で形成するフィールド内での同形化圧力とのバランスで同形化の程度が左右されるとしている。第二は戦略的HRMの研究であり、子会社事業戦略と親会社のHRMシステムが不適合な場合、親会社からのシステム移管圧力が弱まると結論している。これらの理論には共通点も多く統合の可能性もあるが、親会社-子会社間の戦略的連係の程度や子会社の組織フィールドの内容によって理論的統合の可能性が左右されるため、多国籍企業の全体での戦略パターンや各子会社の戦略ポジションと関連付けた精査が必要である。また組織の公式構造、非公式構造という点から組織の情報処理アプローチに依拠すると、非公式構造がより迅速かつ経済的ではあるが具体的な組織行動という点では人材、資金の調達などで公式構造に劣るため、組織は内部の非公式調整メカニズムを制度的に支援することでこの問題を補う必要があることが指摘される。日系多国籍企業はその多くが世界的製品事業部制を取っているため、特定の地域内に設立される地域統括本部(RHQs)の役割は「緩やかな統括」であるとされる。この場合、RHQsには子会社の戦略決定や人事管理に介入する権限はなく、地域単位での情報収集やコーディネーションを担当する。そのため、従来の理論研究が扱ってきた公式構造に関する知見が全てのRHQsに当てはまるのかどうか、RHQsの個別特性との関連で精査する必要が明らかになった。本年度の研究成果は以下の2点である。第一は、IT通信技術の進展が企業内の人材育成に与える影響について、Eラーニングの進展という側面から考察した。第二はシンガポールの現地調査を行い現地日系企業の地域統括をめぐる動向とシンガポール政府の人材育成に関わる支援政策の動向の把握に努めた。EラーニングはITネットワークを通じた学習システムの総称である。現在、多くの企業が人材育成の効率化を目指して導入している。また、ITネットワークを使用する企業大学(corporate university)は、企業戦略に合致した人材の育成、ナレッジマネジメントと育成の連動というニーズから多くの欧米系多国籍企業で設立されており、このトレンドは日本企業にも及んでいる。多国籍企業がその企業ネットワーク内でナレッジマネジメントを効果的に行おうとするならば、ITを活用した人材開発プログラムの活用は不可避であると考えられる。しかしながらEラーニングが内容を充実させ、より深い情報交流を目指す場合に、その成否にはITを通じた学習のコミュニティ形成が必要である。したがって、今後多国籍企業の地域統括拠点によるHRD支援策を検討する場合には、このコミュニティ形成にはたすRHQの役割を明らかにしなくてはならないと考えられる。シンガポールにおいては日系多国籍企業のRHQ設立あるいは維持とその機能進化が進んでおり、その一方で製造拠点の他国への移動がますます進展している。そのため、日系企業、特に製造業の場合、RHQの主たる機能は周辺国へ立地する製造拠点の統括および支援・調整がとなると考えられる。

一方、政府は高度なビジネスサービス提供のための企業誘致・支援策、および高度な人材育成のための環境整備策(たとえばビジネススクールの誘致、人材管理・育成を主たる業務とするコンサルティング企業の積極的誘致など)を推進している。そこで両者の関係については、シンガポール政府が整えようとしている支援環境がRHQの機能に直結するのではなく、そうした環境から生み出されてくる現地人材によって日系企業の担当マネジャーが現地化しその現地マネジャーが地域支援のためのシステムを内製するという方向になることも考えられる。本年度の資料研究およびシンガポール現地調査による研究成果は以下の2点である。第一は、シンガポール政府によるRHQ政策の展開を整理し、それ以外の知識集約ハブとなるための支援政策について時系列的に整理した。第二は現地日系RHQおよび大型小売業企業のヒアリングを行い、現地における域内人材育成支援政策の実際と情報交流について検討した。シンガポールのRHQ政策は2000年ごろから再編成が進められ、外資系企業のみならず、地元企業であっても、アジアパシフィック地域のビジネス統括や知識交流のハブとなる際には税制面での優遇を受けられるというものになっており、域内の知識・情報交流の中心となることによって、知識労働者への需要を生み出し、同政府が目指す知識集約型労働を中心とした国づくりを目指すという意味での一定の効果を挙げている。その一方で、ビジネススクールを中心とした高度職業教育、リストラによる失業者への短期集中IT教育などを通じて、労働供給面での支援を目指している。そうした意味では、労働政策が産業政策と連携して進められ、時宜に応じて選択と集中を図るという構図は依然継続しているものと考えられた。一方日系RHQについては、マネジメント教育については支援政策が進みつつあるが、専門教育についてはそれぞれのアジア地域戦略および親会社事業戦略によって対応が極めてばらついており、現段階では事例研究によって一定の傾向性を見出すことはできない。過去5年間の対応に大きく影響を与えているのは、日本本社による事業戦略の大きな変動である。マネジメント教育に関しては、現段階で地域単位のプログラムを開発中である企業も複数見られ、地域統括拠点のひとつの機能として人材育成支援が定着しつつあり、そこを中心とする担当者レベルでの活発な情報交流が継続しているものと理解された。反面、事業間の技術的距離が大きい場合には、シンガポールを舞台とした職能訓練支援が行われることは少なく、むしろ本社あるいは親事業部との連携が重視されるものと思われた。シンガポールを舞台とした職能訓練を目指すとすれば、現地社会貢献としての意義も含めながら、現地労働界へ訓練を開放する道が残されているが、これを行う企業はきわめて限定される。
実測結果に基づく岩盤空洞掘削時の応力再配置に関する研究

地下岩盤内に空洞を掘削すると,空洞周辺岩盤に応力再配置が生じる.この応力再配置に関する理論は,通常,岩盤を等方均質な連続体と仮定した弾性解析結果を基礎に組み立てられている.これによれば,例えば,円形断面空洞掘削時の接線方向応力の増大は空洞壁面で最大であり,空洞から遠ざかるにつれて低減するとするのが定説である.しかし,このような応力再配置が現実の岩盤で実測されたことは少なく,この点でこの定説は十分実証されているとはいえない.本研究では,応力再配置挙動の実態を把握するため,AEと岩盤内の微小ひずみの変化の測定に着目し,まずこれらの測定手法の開発と原位置測定への適用性の検討を行った.次にこの結果に基づき,3地点の揚水式地下発電所空洞建設地点で,空洞掘削時に周辺岩盤から発生するAEと微小ひずみの変化の測定を行い,必要に応じ電力各社が施行管理のために行った岩盤変位等の各種測定結果と比較し,節理や既存亀裂を含む現実の不均質な岩盤における応力再配置挙動を検討した.その結果,空洞掘削に伴う周辺岩盤内の応力の増大が,節理などの不連続面の噛み合いや岩盤剛性の不均質性のために,岩盤中に2本の柱を形成するような形で支えられる場合があることがわかった.また,空洞周辺岩盤中にAEセンサーを3次元的に配置してAE測定を行い,そのメカニズム解を求めて発生機構を調べた結果,AEの発生原因となった破壊面の方向や破壊時の主応力の作用方向は,岩盤の卓越節理の方向,空洞形状,初期地圧と岩盤変位の測定結果と合理的に対応し,この手法が地下空洞の安定性評価にきわめて有用であることがわかった.地下岩盤内に空洞を掘削すると,空洞周辺岩盤に応力再配置が生じる.この応力再配置に関する理論は,通常,岩盤を等方均質な連続体と仮定した弾性解析結果を基礎に組み立てられている.これによれば,例えば,円形断面空洞掘削時の接線方向応力の増大は空洞壁面で最大であり,空洞から遠ざかるにつれて低減するとするのが定説である.しかし,このような応力再配置が現実の岩盤で実測されたことは少なく,この点でこの定説は十分実証されているとはいえない.本研究では,応力再配置挙動の実態を把握するため,AEと岩盤内の微小ひずみの変化の測定に着目し,まずこれらの測定手法の開発と原位置測定への適用性の検討を行った.次にこの結果に基づき,3地点の揚水式地下発電所空洞建設地点で,空洞掘削時に周辺岩盤から発生するAEと微小ひずみの変化の測定を行い,必要に応じ電力各社が施行管理のために行った岩盤変位等の各種測定結果と比較し,節理や既存亀裂を含む現実の不均質な岩盤における応力再配置挙動を検討した.その結果,空洞掘削に伴う周辺岩盤内の応力の増大が,節理などの不連続面の噛み合いや岩盤剛性の不均質性のために,岩盤中に2本の柱を形成するような形で支えられる場合があることがわかった.また,空洞周辺岩盤中にAEセンサーを3次元的に配置してAE測定を行い,そのメカニズム解を求めて発生機構を調べた結果,AEの発生原因となった破壊面の方向や破壊時の主応力の作用方向は,岩盤の卓越節理の方向,空洞形状,初期地圧と岩盤変位の測定結果と合理的に対応し,この手法が地下空洞の安定性評価にきわめて有用であることがわかった.地下岩盤内に空洞を掘削すると、空洞周辺岩盤に応力再配置が生じる。この応力再配置挙動は、岩盤が均質等方な連続体である場合には、弾性論に基づいて比較的容易に予測することができる。しかし現実の岩盤は、程度の差こそあれ節理や既存亀裂を含み、一般に不均質である。従って事前の予測に反して部分的な応力集中が生じ、岩盤の破壊に至ることがしばしばあり、その原因の解明も容易でないことが多い。本研究は、大規模地下空洞における各種の測定データに基づいて、節理や既存亀裂を含む現実の不均質な岩盤における応力再配置の実態を明らかにし、岩盤挙動予測手法の改良の方向性を明示することを目的としている。本年度は、申請者が(財)電力中央研究所在職中に測定した、東京電力(株)蛇尾川、関西電力(株)大河内、中部電力(株)奥美濃の3地点のAEデータ及び微小ひずみデータの整理分析を進めた。また、申請者の側から空洞掘削を行った電力各社に積極的に働きかけ、現地調査や現場担当者との十分な議論を行い、現地で観察された掘削時の空洞の変状などのデータを入手し、AEや微小ひずみのデータと比較検討した。そして、これらの各地点毎の検討結果や調査結果に基づいて、3地点の地下発電所建設地点に共通する岩盤挙動を抽出し、節理や既存亀裂を含む現実の不均質な岩盤でどのような応力再配置が生じたかの検討を進めた。これらのうち、関西電力(株)大河内地点での微小ひずみデータについては、成果をとりまとめ、土木学会論文集に投稿して発表した。地下岩盤内に空洞を掘削すると,空洞周辺岩盤に応力再配置が生じる。この応力配置に関する理論は,通常,岩盤を等方均質な連続体と仮定した弾性解析結果を基礎に組み立てられている.これによれば,例えば,円形断面空洞掘削時の接線方向

応力の増大は空洞壁面で最大であり,空洞から遠ざかるにつれて低減するとするのが定説である.しかし,このような応力再配置が現実の岩盤で実測されたことは少なく,この点でこの定説は十分実証されているとはいえない.本研究では,応力再配置挙動の実態を把握するため,AEと岩盤内の微小ひずみの変化の測定に着目し,まずこれらの測定手法の開発と原位置測定への適用性の検討を行った.次にこの結果に基づき,3地点の揚水式地下発電所空洞建設地点で,空洞掘削時に周辺岩盤から発生するAEと微小ひずみの変化の測定を行い,必要に応じ電力各社が施工管理のために行った岩盤変位等の各種測定結果と比較し,節理や既存亀裂を含む現実の不均質な岩盤における応力再配置挙動を検討した.その結果,空洞掘削に伴う周辺岩盤内の応力の増大が,節理などの不連続面の噛み合いや岩盤剛性の不均質性のために,岩盤中に2本の柱を形成するような形で支えられる場合があることがわかった.また,空洞周辺岩盤中にAEセンサーを3次元的に配置してAE測定を行い,そのメカニズム解を求めて発生機構を調べた結果,AEの発生原因となった破壊面の方向や破壊時の主応力の作用方向は,岩盤の卓越節理の方向,空洞形状,初期地圧と岩盤変位の測定結果と合理的に対応し,この手法が地下空洞の安定性評価にきわめて有用であることがわかった.
ホウ素輸送の制御を通じた作物の改良

ホウ素は植物の必須元素の一つである。世界にはホウ素欠乏や過剰の土壌がパキスタンを含めて広く分布しており、農業生産の阻害要因となっている。本研究は、植物におけるホウ素輸送の中心的な役割を担っているBOR1相同遺伝子を各種植物から単離し、機能解析を行うと共に、BOR1遺伝子の改変や作物への導入を通じて、ホウ素欠乏や過剰に耐性な植物を作出することを目的とする。ホウ素の輸送に関しては、これまで、トランスポーターが同定されていなかったために、研究は進展していなかった。本研究は、トランスポーターの単離と機能解析、およびその利用という、世界に他に例のない研究であり、世界の農業生産に寄与する研究である。本年度の成果としては以下をあげることができる。ヒメツリガネゴケのシロイヌナズナのホウ素トランスポーターBOR1の相同遺伝子を酵母で発現させ、その輸送活性を、過剰のホウ酸に対する耐性を指標に調べた。ヒメツリガネゴケの遺伝子はホウ酸耐性を付与する傾向が見られた。今後、吸収実験を行うなどして、活性を確認していきたいと考えている。BOR1を過剰発現させることで、シロイヌナズナの生育改善に成功していたが、同様の過剰発現を行うナタネやトマトの作出を進めた。ナタネでは数系統、トマトでは1系統の薬剤耐性を持つと思われる形質転換植物が得られている。BOR1に様々な変異を導入し、ホウ素輸送活性を失ったと思われるクローンを得た。変異のおこった配列が輸送活性の発現に重要な配列であることが明らかになった。本研究は植物の必須元素の一つであるホウ素の輸送の中心的な役割を担っているBOR1相同遺伝子を各種作物から単離し、酵母等を用いて機能解析を行うと共に、BOR1遺伝子の改変や作物への導入を通じて、ホウ素欠乏や過剰に耐性な植物を作出することを目的として行なっている。シロイヌナズナのホウ素トランスポーターBOR1の相同遺伝子を全てクローニングした。また、ナタネの相同遺伝子の部分配列、ヒメツリガネゴケの相同遺伝子の部分配列を得た。イネについても相同遺伝子をクローニングした。これらのトランスポーターを酵母で発現させる実験を進めている。これまでにシロイヌナズナやイネの相同遺伝子についてホウ素輸送活性を確認した。また、動物の相同遺伝子でもホウ素輸送活性があることを示唆する結果を得ている。また、これらの発現の様式をRT-PCRや形質転換植物を用いて解析した。それぞれの遺伝子には特徴的な組織特異性やホウ素栄養に対する応答性が見られることを明らかにした。さらに、これらの相同遺伝子の遺伝子破壊株や発現を変化させた植物体の作成を進めており、これまでにこの目的に利用できる組み換え遺伝子を作成し、一部植物に導入している。また、相同遺伝子の細胞内局在についても調査を進めており、多くのものが細胞膜に局在していることを明らかにした。また、ホウ素の輸送を担う、BOR1とは相同性の無い遺伝子を同定した。BOR1はホウ素の細胞からの排出を担っているが、この遺伝子はホウ素の取込みに重要な役割を担っている。
DNA損傷応答における細胞運命振り分け機構の解明

本研究では、DNA損傷応答における細胞運命決定の分子機構の解明を試みた。まず、DNA修復経路を抑制したところ、Chk1を介したG2期チェックポイントの活性化の持続が延長するとともに、細胞老化誘導が促進された。次に、遺伝子操作によりG2期チェックポイント活性化の持続時間を調節した結果、細胞老化の誘導は持続時間の長さに依存して促進されることを見出した。さらに、早老症患者由来の細胞では、G2期チェックポイントの活性化の持続延長とともに、細胞老化誘導の促進が認められた。この成果により、Chk1を介したG2期チェックポイントの活性化の持続時間が細胞老化への運命決定を制御することが明らかになった。がん遺伝子の活性化や加齢によって生じるDNA損傷応答は、一時的な細胞周期の停止、もしくは不可逆的な細胞周期の停止である細胞老化を誘導することが知られている。しかし、どのようなメカニズムでこれらの細胞運命が決定されるかについては不明である。申請者は、細胞周期G2期におけるがん抑制遺伝子p53の活性化が細胞老化誘導に必要かつ十分であることを見出した。そこで本研究では、DNA損傷応答におけるG2/M期チェックポイントの活性化とp53の活性化による情報伝達ネットワークについて細胞・個体レベルで解析することによって、DNA損傷応答における細胞運命の振り分け機構を解明し、発ガン防御や老化の分子基盤を明らかにすることを目指している。26年度までの当該研究では、DNA損傷応答におけるG2/M期チェックポイント活性化とp53の活性化のタイミングの解析を行った。その結果、低レベルのDNA損傷では15分程度でATR-Chk1依存的チェックポイントの活性化を介して細胞をG2期に蓄積し、10時間以内にDNA損傷が修復されG2期チェックポイントが解除されれば細胞はM期を経てG1期に移行して、細胞老化が回避されることが分かった。一方、高レベルのDNA損傷では約24時間までATR-Chk1依存的チェックポイントの活性化が持続し、その間にp53-p21経路の活性化が起こることによって分裂回避を生じ、細胞老化が誘導されることが分かった。さらに、DNA損傷応答関連因子であるTopBP1活性化ドメインやClaspinの非分解型変異体をヒト正常線維芽細胞に導入したところ、低レベルのDNA損傷下においても有意にG2期停止の延長が認められ、細胞老化誘導を促進した。この結果は、p53-p21経路とATR-Chk1経路の活性化の時間差が細胞老化誘導の鍵となることを示している。本研究では、DNA損傷応答における細胞運命の振り分け機構には、G2期チェックポイントの活性化とp53の活性化のタイミングが重要な鍵となると考え、G2期チェックポイントの要であるATR-Chk1経路の活性化とp53の活性化による情報伝達ネットワークについて解析し、今まで不明であったDNA損傷応答における細胞運命決定の分子メカニズムの解明を試みた。DNA損傷応答制御因子であるClaspin非分解型変異体やTopBP1構成的活性化変異体を正常ヒト線維芽細胞に導入し、通常は細胞老化をほとんど誘導しないような低レベルの放射線照射によるDNA損傷を与えたところ、対照群と比較して細胞老化の誘導が促進されることを見出した。ライブセルイメージングを用いた一細胞レベルでの細胞周期解析、およびChk1の活性化状態の解析から、この老化促進には、Chk1を介したG2期チェックポイントの延長と、それに伴ったG2期でのp53の活性化により誘導される分裂期回避が重要であることを明らかにした。また、その他の低レベルの老化ストレスで処理した場合も対照群と比較して、細胞老化誘導の促進やG2期チェックポイントの延長・分裂期回避が認められた。一方、DNA損傷修復を促進するSirt6過剰発現細胞やOtub2発現抑制細胞に、中程度に細胞老化を起こすようなDNA損傷を与えたところ、対照群と比較して細胞老化の誘導が抑制されることを見出した。このとき、ライブセルイメージングを用いた一細胞レベルでの細胞周期解析、およびChk1の活性化状態の解析を行った結果、同程度の損傷を与えた対照群と比較して、G2期チェックポイントが短縮し、分裂期回避を起こす細胞の割合が減少することが分かった。本研究により、DNA損傷において、Chk1を介したG2期チェックポイントの持続時間が細胞老化への運命決定を制御することが明らかになった。26年度までの当該研究により、当初の予定であったDNA損傷応答におけるG2/M期チェックポイントの活性化とp53の活性化による情報伝達ネットワークの詳細を明らかにし、p53-p21経路とATR-Chk1経路の活性化の時間差が細胞老化誘導の鍵となることを見出した。本研究により、これまで不明であった細胞老化誘導機構の詳細の一端が解明され、細胞老化が深く関与する老年病やがんといった疾病の研究に大きな貢献をすることが期待されることから、本研究はおおむね順調に推移していると考えられる。

分子細胞生物学26年度までの当該研究において、p53-p21経路とATR-Chk1経路の活性化の時間差が細胞老化誘導の鍵になることが明らかとなった。しかしながら、細胞老化が個体老化に与える影響については、未だ不明な点が多い。そこで、細胞レベルで確立した人工的G2期チェックポイント延長による細胞老化促進の系をマウス個体レベルに応用し、細胞老化の個体内での役割について明らかにする。具体的には、全身の細胞への発現を可能にするCAGプロモーターの下流に非分解型Claspin遺伝子を挿入したカセット遺伝子を用いてトランスジェニックマウスを作製し、細胞老化と個体老化の関連ついて解析する予定である。所属研究室が有する試薬、器具および装置等を効率良く利用したことにより、当初予想していたよりも少ない予算で当該研究の目標を達成できたため。27年度の研究計画ではトランスジェニックマウスの作製および解析を計画しているため、マウスの作製費用や系統維持等に多くの予算が必要である。そこで26年度の未使用予算については主に動物実験費用に充てる予定である。
海産ポリエーテルマクロライド天然物の全合成と立体構造決定法の開発

新規構造と顕著な生物活性を有する海産ポリエーテルマクロライド天然物の全合成と絶対配置決定を目的として研究を展開した。渦鞭毛藻由来の貝毒で殺癌細胞活性を有するペクテノトキシン2を合成標的として、全合成研究を行った。また、別種の渦鞭毛藻から単離されたアクトミオシンATPase活性制御物質であるゴニオドミンAの絶対配置決定を目指した合成研究を行った。ペクテノトキシン2の合成では、標的化合物を4つのフラグメントから収束的に合成する経路を立案し、それぞれのフラグメントを別個に合成した。続いてスルホンカップリングとエステル化を用いて全てのセグメントを連結し、最後に閉環オレフィンメタセシス反応により環化して、全体のマクロライド構造を構築した。その結果、官能基を保護した7-epi-ペクテノトキシン2を合成する事ができた。なお、スピロアセタール部に隣接する酸素官能基上の保護基の選択が本合成では非常に重要であった。当初、ベンジル基を保護基として用いてスピロアセタール形成からマクロラクトン構造構築に至る過程を実現できたが、保護基の除去に難点があった。そこで、この保護基をパラブロモベンジル基およびパラメトキシベンジル基に変えて合成を検討した所、いずれも最終的な除去が可能となり、ペクテノトキシン2の全合成達成に不可欠の知見を得る事ができた。ゴニオドミンAは相対および絶対配置が未決定なので、その究明を目的として合成経路設計と部分構造の合成法の開拓を行った。,ゴニオドミンAの全体構造をA環部、BC環部、DE環部、F環部、C26-C30部の5つのセグメントに分割し、それぞれを合成した後に、天然物のスペクトルデータと比較検討する方法を採る事にした。実際に、これらセグメントのうち、環状エーテル構造を含む4つの部分の合成法を確立する事ができた。その結果、立体化学決定と全合成の両方に有益な知見を得ることができた。平成14年度は、主に、渦鞭毛藻由来の貝毒で殺癌細胞活性を有するペクテノートキシン2を合成標的として、全合成研究を行った。ペクテノトキシン2を4つのフラグメントから収束的に合成する経路を立案し、それぞれのフラグメントを個別に合成した。続いて、スルホンカップリングとエステル化を用いて全てのセグメントを連結し、最後に閉環オレフィンメタセシスを鍵反応として環化して、全体のマクロライド構造を構築した。これにより、官能基を保護したペクテノトキシンのC7位のエピ体を合成することができた。しかし、その脱保護は、詳細な検討を加えたが、不成功に終わった。そこで、保護基と合成経路を再検討し、これまでの合成経路に立脚しつつ、段階的な保護基の変換を経る全合成経路を新たに考案した。この計画に基づいて、4つのフラグメントを合成し直し、大幅な経路の短縮と収率の向上に成功した。さらに、それぞれの連結と、保護基の変換にも成功している。ここで、保護基の変換には、多官能性化合物の多段階合成を考慮して、穏和な条件下で行うことのできる方法を新たに開発し採用している。この保護基変換法は、シガトキシン部分構造の構築を通じて、関連する縮合型ポリエーテル骨格構築に利用可能であることも明らかにできた。

今年度の目標のペクテノトキシン2の全合成には至らなかったが、合成上新たに生じた課題は解決できており、来年度早期にはその全合成が完了できる見通しである。新規構造と顕著な生物活性を有する海産ポリエーテルマクロライド天然物の全合成と絶対配置決定を目的として研究を展開した。平成15年度は、渦鞭毛藻由来の貝毒で殺癌細胞活性を有するペクテノトキシン2を合成標的として、全合成研究を行った。また、別種の渦鞭毛藻から単離されたアクトミオシンATPase活性制御物質であるゴニオドミンAの合成研究を行った。ペクテノトキシン2の合成においては、スピロアセタール部の組み替わりを防ぐ目的で、隣接する水酸基上を保護する必要があった。この保護基の選択が実際の合成では非常に重要であった。当初、ベンジル基を保護基として用いたところ、スピロアセタール形成から全体のマクロラクトン構造構築に至る過程を実現できたが、保護基の除去に難点があった。そこで、この保護基をパラブロモベンジル基およびパラメトキシベンジル基に変えて合成を検討したところ、いずれも最終的な除去が可能であった。以上、ペクテノトキシン2の全合成の達成に不可欠の知見を得ることができた。ゴニオドミンAは相対および絶対配置が未決定なので、その立体化学を究明を目的として合成経路設計と部分構造の合成法の開拓を行った。ゴニオドミンAの全体構造をA環部、BC環部、DE環部、F環部、C26-C30部の5つのセグメントに分割し、それぞれを合成した後に、天然物のスペクトルデータと比較検討する方法を採ることにした。実際に、これらセグメントのうち、環状エーテル構造を含む4つの部分の合成法を確立することができた。これにより、立体化学決定と全合成の両方に有益な知見を得ることができた。
新たな癌抑制遺伝子P130の口腔扁平上皮癌分子診断法への応用

昨年、口腔癌細胞株においてRbは高度にリン酸化されており、リン酸化型p107がみられる細胞はp130が低リン酸化、逆にp107が低リン酸化の細胞はp130が高リン酸化の傾向にあり、G1サイクリンとの関係では、リン酸化型p107の細胞にD1の高発現、p130高リン酸化型細胞にD2の高発現がみられ、p130,p107の発現とそのリン酸化はサイクリンD1,D2,Eに制御されている可能性を示唆した。さらに今年、p130とE2Fとの結合能を確認した。また今回、p130の機能解析を目的として、CDK以外のプロテインカイネースによるリン酸化部位の固定を試みた。ラットp130cDNAを制限酵素切断により小フラグメントに分割して、それぞれをGST融合ベクターに組み替えた。大腸菌にて発現したGST融合蛋白を精製して基質とし、CK2およびPKAによるin vitroのリン酸化を試みたところ、それぞれ少なくとも1カ所をリン酸化することが示された。そこでN末端領域のCK2部位1カ所とPKA部位1カ所ずつ、スペーサー領域のPKA部位1カ所およびBポケット領域のCK2部位1カ所について、セリンあるいはスレオニンを他のアミノ酸に置換する変異を導入し、GST融合変異蛋白を調製した。これらの変異のうち1つはin vitroのリン酸化を受けなくなることが明らかとなった。以上より、E2F結合ドメイン以外の領域で蛋白の修飾か、または遺伝子の構造変化が起きている可能性が示唆された。110例の口腔扁平上皮癌症例より得られた癌組織を対象に、抗RBならびに抗p130抗体を用いて免疫染色を行なった。Rb陽性症例、p130陽性症例ともに高分化型の症例に多くみられ、これよりRb遺伝子、p130遺伝子が高分化型扁平上皮癌に出現することが示唆された。口腔扁平上皮癌症例におけるp130遺伝子の変化をみる前段階として比較対照を行なうp53遺伝子異常について検討した。その結果、p53蛋白は正常口腔粘膜上皮にはみられず、口腔癌症例の約半数で過剰発現していた。さらにp53のmutationについてPCR-SSCP法を用いて検索したところ、mutationは78.9%の症例で認められた。口腔扁平上皮癌115例に対してMIB-1,RB,p53,nm23,cyclnD1,bc1-2について免疫組織学的に検索し、臨床病理所見との関係について検討した。その結果転移の有無と,RB,p53,nm23,bc1-2の発現が、病理組織学的な湿潤様式とRB,bc1-2の発現が相関していることが判明した。p130の類似遺伝子であるRBが発現に口腔癌の臨床病理所見と強く相関したことはp130が口腔癌の分子診断法への応用の可能性示唆させるものであった。E-カドヘリンの発現についても検索したところ臨床的にstageが高く、病理組織学的に頸部リンパ節に転移のみられなかった症例ではE-カドヘリンの発現は顕著ではなかった。口腔扁平上皮癌細胞株については従来より当教室にある細胞株に加えて口底癌、舌癌より各々培養癌細胞を得、現在1年以上保持し50代以上のpassageを行っており、これらの細胞の生物学的性状を明らかにし、本実験に使用する予定である。口腔扁平上皮癌細胞においてp130がRb,p107と比較し、どのような機能的な差異があるのか、癌化とどのように関わるかについて検討した。8つの口腔細胞癌株におけるRbファミリー蛋白の発現を調べたところ、いずれの細胞株もRbは高度にリン酸化されていた。

p107,p130のリン酸化のパターンは、p107が高リン酸化されている細胞はp130が低リン酸化の傾向にあり、逆にp107が低リン酸化されている細胞ではp130が高リン酸化の傾向にあった。次にRbファミリーのリン酸化の制御因子であるG1サイクリンの発現を検討した。p107がリン酸化されている細胞ではサイクリンD1が高発現しており、p130が高度にリン酸化されている細胞ではサイクリンD2の発現が高かった。サイクリンD3,Eは全ての細胞株に認められ、後者は特にp130が高度にリン酸化されている細胞で高い発現がみられた。以上より、p130,p170の発現とそのリン酸化はサイクリンD1,D2,Eに制御されている可能性が示唆された。正常扁平上皮由来の細胞株(HaCaT)にTGFBを添加し、その増殖活性を抑制したところp130の高リン酸化のバンドの消失がみられたが、口腔癌細胞株では同様の処置を施してもリン酸化のパターンの明らかな変化は認められなかった。このことから口腔癌においてP130の制御に何らの異常が生じていることが示唆された。32例の口腔扁平上皮癌症例より得られた癌組織を対象に、抗RBならびに抗p130抗体を用いて免疫染色を行なった。Rb陽性症例、p130陽性症例ともに高分化型の症例に多くみられ、これよりRb遺伝子、p130遺伝子が高分化型扁平上皮癌に出現することが示唆された。昨年、口腔癌細胞株においてRbは高度にリン酸化されており、リン酸化型p107がみられる細胞はp130が低リン酸化、逆にp107が低リン酸化の細胞はp130が高リン酸化の傾向にあり、G1サイクリンとの関係では、リン酸化型p107の細胞にD1の高発現、p130高リン酸化型細胞にD2の高発現がみられ、p130,p107の発現とそのリン酸化はサイクリンD1,D2,Eに制御されている可能性を示唆した。さらに今年、p130とE2Fとの結合能を確認した。また今回、p130の機能解析を目的として、CDK以外のプロテインカイネースによるリン酸化部位の固定を試みた。ラットp130cDNAを制限酵素切断により小フラグメントに分割して、それぞれをGST融合ベクターに組み替えた。大腸菌にて発現したGST融合蛋白を精製して基質とし、CK2およびPKAによるin vitroのリン酸化を試みたところ、それぞれ少なくとも1カ所をリン酸化することが示された。そこでN末端領域のCK2部位1カ所とPKA部位1カ所ずつ、スペーサー領域のPKA部位1カ所およびBポケット領域のCK2部位1カ所について、セリンあるいはスレオニンを他のアミノ酸に置換する変異を導入し、GST融合変異蛋白を調製した。これらの変異のうち1つはin vitroのリン酸化を受けなくなることが明らかとなった。以上より、E2F結合ドメイン以外の領域で蛋白の修飾か、または遺伝子の構造変化が起きている可能性が示唆された。110例の口腔扁平上皮癌症例より得られた癌組織を対象に、抗RBならびに抗p130抗体を用いて免疫染色を行なった。
看護師のスキルタイプ別コミュニケーショントレーニングプログラムの開発

2018年7月に、科研費採択に伴う研究計画の確認を研究チームで共有した。その後、これまで収集した学生を対象としたデータを基に、論文の作成に着手した。論文は「看護学科初年次生の基本的コミュニケーション・スキルの類型論的特長ーENDCOREsを用いたスキル・タイプの判定法を通してー」とし、これまでのデータから、コミュニケーション・スキルのタイプ判定方法の有効性を確認し、今後新人看護師のスキル判定につながること、各タイプ別コミュニケーショントレーニングの有効性をを確認した。本論文は、日本看護学教育学会誌に投稿し、査読を受けた結果、研究論文として掲載予定となった。(論文番号No.642-2)また看護師のデータ収集において、当初3箇所の総合病院を調査対象としていたが、同じ医療機関で、入職3年未満のアンケート調査とインタビューの実施可能か、医療機関による差が出ないかについて検討を行った。その結果、医療機関を5箇所に増やし、実施することとした。更に、研究会における報告会で、専門的コミュニケーション・スキルと看護師の状態(やりがい、ストレス度、職務満足)が影響するとの知見が得られたことから、コミュニケーション・スキルと経験との関係を明らかにする必要があることが明らかとなった。次年度は、入職3年未満の看護師のアンケート調査およびベテラン看護師のインタビュー調査を最優先で実施する予定である。これについては、活水女子大学看護学部の倫理審査を受けて実施する予定である。協力医療機関の再選定を行う必要があったこと、メンバーの一人が病気により研究メンバーから離脱したことによる調整等が必要であったため。2019年度は、1入職3年未満の看護師へのアンケート調査2ベテラン看護師へのインタビュー調査3アンケート調査及びインタビュー調査から、看護師の状態把握尺度を開発する。2020年、2021年度には、123を分析するとともに、インタビューの内容分析を行う。2022年、2023年度は、予定通り、トレーニングプログラムを開発し、効果判定を行う予定である。予定していた調査が2018年度実施できなかった。2019年度は、2018年度予定していた調査を実施する。加えて2019年度は予定通り、インタビュー調査を実施するため、其々通信費や研究員の旅費、インタビュー協力者への謝礼、更に論文投稿を2本予定しており、そのための関係図書購入費、研究会開催費用として、使用計画をたてている。
糸状菌A.nidulansにおける分泌過程遺伝子usoAの機能解析

酵母のタンパク質分泌装置の構成成分の中で、筆者らが1991年に報告したUso1pは約700アミノ酸のHead domainと1,000アミノ酸あまりのcoiled-coil構造の尾部からなり、分泌過程の中で小胞体から出芽した分泌小胞がゴルジ体膜に係留される(tethering)の段階に関与していることが明らかとなりつつある。筆者らは、高いタンパク質分泌能を有するAspergillus属糸状菌の中で、A. nidulansの染色体DNAからUSO1相同遺伝子usoAを単離解析した。予想されるUsoAタンパク質は1,103アミノ酸からなり、酵母Uso1pおよび動物細胞の相同タンパク質p115とは25-30%相同であり、Head domainとcoiled-coil領域からなる共通の構造を有していることを明らかにした。A. nidulans染色体上のusoA遺伝子のプロモーターを培地のC源により制御可能なalcAプロモーターと置換した、usoA遺伝子条件発現株を作製し、usoA遺伝子の機能について解析を行った。usoA発現抑制条件下ではA. nidulansの生育が停止し、液胞タンパク質CpyAの小胞体型前駆体の蓄積を観察したことから、UsoAがA. nidulans細胞の生育に必須であり、細胞内タンパク質輸送に関与していることを明らかにした。さらに、usoA発現抑制条件下では、分生子出芽異常、菌糸体の膨潤、不均一な核分配・隔壁形成など、細胞極性の異常を示す数々の形質を見いだした。細胞学的解析により、細胞骨格に関連するアクチン繊維およびキチンの局在の異常も観察し、UsoAが細胞極性の形成維持に重要な役割を果たしていることを明らかにした。真核微生物の中では複雑な形態を有する糸状菌のUsoAタンパク質に着目することにより、タンパク質の細胞内輸送の方向性を決定する細胞極性について解析する新規のシステムを構築して成果をあげた。下等真核微生物の中でも、酵母は培養液中にほとんど蛋白質を分泌しないが、A.nidulansおよび近縁の麹菌など糸状菌の多くは大量の蛋白質を分泌する。また、糸状菌は長大な菌糸体の中で蛋白質の大半を伸長先端ら分泌することが知られており、酵母に比較して発達した細胞内の蛋白質輸送系と細胞極性を有すると考えられる。酵母の分泌装置を形成する蛋白質群の中で、Usolpは780アミノ酸の頭部と約1,000アミノ酸のcoiled-coil構造の尾部からなる特異な構造を有し、小胞体から出芽した分泌小胞をゴルジ体膜に係留する過程に関与ると考えられている。糸状菌A.Nidulansから、Uso1pの相同蛋白質をコードする遺伝子を単離しusoAと命名した。cDNAの配列との比較により、usoA遺伝子は5つのイントロンを有し1,103アミノ酸からなる蛋白質をコードしているこが推定された。予想されるusoAp蛋白質はuso1pとは25%、動物細胞の相同蛋白質P115とは28%の相同を示し、球状の頭部構造とcoiled-coi1構造の尾部およびC末端の酸性アミノ酸クラスターなどの構造的特徴に保存されていた。A.nidulansにおけるusoA遺伝子の破壊株は取得できず、usoA遺伝子を誘導可能なプロモーターalcAに連結したalcA-usoAを染色体上のusoA遺伝子と置換したところ、alcA抑制培地での生育が認められなかったことからusoA遺伝子はA.nidulansの生育に必須と考えられる。alcA-usoA置換