hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
癌性変化を特異的に感知するE2Fによる新たな転写制御機構の解析

代表的な癌抑制遺伝子産物pRBの標的である転写因子E2Fの癌化抑制に関わる制御機構を解析した。E2Fは、pRBの機能が失われると、増殖刺激では活性化されないサイクリン依存性キナーゼ抑制因子p27Kip1など癌化抑制に関わる遺伝子の発現を誘導することを明らかにした。癌化抑制に関わる制御機構は、結合パートナーであるDPに対する依存性が極めて低く、細胞増殖制御に関わる機構とは異なることを明らかにした。我々は、転写因子E2Fが癌抑制遺伝子産物pRBの機能不全を特異的に感知し、癌抑制遺伝子産物p53の活性化に関わる癌抑制遺伝子p14^<ARF>の発現を誘導することを報告した。この転写制御機構はpRBの機能不全に伴う癌化の抑制に重要と考えられるので、その詳細を解析している。E2Fによる増殖関連遺伝子の制御にはパートナーであるDP分子が必須であるが、E2Fによるp14^<ARF>遺伝子の発現誘導にはDP分子が必要ないことを見出した。従って、E2Fは細胞増殖制御とは異なる転写制御機構で癌化抑制に関与していると考えられる。E2Fによる癌化抑制の具体的な制御機構を探る為に、E2F分子の受ける修飾の違いを検討した。アセチル化を受けない変異体E2Fは野生型E2Fと同等にp14^<ARF>プロモーターを活性化したことから、E2Fのアセチル化は関与していないことが示唆された。E2Fがリン酸化を受けうる部位二カ所に変異を導入したが、同様に変化は認められなかったのでこの部位のリン酸化も関与していないことが示唆された。他のリン酸化部位に関して検討中である。pRBによる制御を逸脱したE2Fと相互作用する因子を検索するために、二つの異なるタグを付けたE2Fを発現する組換えアデノウイルスを作成した。過剰発現したE2Fをタグに対する抗体で順次免疫沈降し、特異的に共沈する因子を検索中である。サイクリン依存性キナーゼp27^<Kipl>遺伝子と癌抑制遺伝子TP73もpRBの機能不全に特異的に反応することを見出した。pRBの機能不全を特異的に感知するE2F反応性配列のコンセンサスを求めるために、p27Kipl遺伝子のE2F反応性エレメントを同定した。その配列は増殖関連遺伝子の典型的なE2F反応性エレメントに近くコンセンサス配列は導けなかったので、TP73遺伝子のE2F反応性エレメントを検索中である。転写因子E2Fは癌抑制遺伝子産物pRBの標的で、増殖刺激による増殖関連遺伝子の発現を仲介する。一方pRBの機能が欠損すると、E2Fは癌抑制遺伝子産物p53を活性化するARF遺伝子の発現を誘導し癌化を抑制する。E2Fが増殖刺激による生理的なpRBの不活性化と癌化に伴うpRBの機能不全を識別する機構を検索した。我々は、ARF遺伝子が増殖刺激で誘導された生理的なE2F活性は感知せず、pRBの強制的な不活性化で生じた制御を外れたE2F活性を特異的に感知することを報告している。今回、RB経路の上流に位置するサイクリン依存性キナーゼ抑制因子p27遺伝子もARF遺伝子と同様の制御を受けることを見出した。従って、pRBの制御を外れたE2Fは、p53経路だけでなくRB経路も活性化することが明らかとなった。また、癌抑制遺伝子TP73も制御を外れたE2F活性を優先的に感知することを見出した。p27遺伝子とp73遺伝子のE2F反応性エレメントは、ARF遺伝子のそれと異なり典型的なE2F結合配列に類似していた。従って、制御を外れたE2F活性を特異的に感知するには、E2F結合配列の特異性のみでは不十分であり、プロモーター全体の構造が重要であることが示唆された。生理的なE2Fと制御を外れたE2Fの違いを検索するために、E2F活性に必須と考えられている結合パートナーであるDP分子の必要性を検討した。shRNAを用いたDPのノックダウン実験から、制御を外れたE2FによるARF遺伝子発現とアポトーシスの誘導にはDPを必要としないことが強く示唆された。従って、生理的なE2Fと制御を外れたE2Fには質的な差があることが予想された。E2Fの修飾の差を検討したが、調べた範囲ではリン酸化・ユビキチン化・SUMO化に明らかな差は見出されなかった。現在、生理的なE2Fと制御を外れたE2Fの修飾の差を更に検討している。
妊娠の成立と維持に関与する免疫担当細胞の新しい機能

非妊時および妊娠時末梢血そして非妊時子宮内膜および流産脱落膜を用いてそこに存在するNK細胞の妊娠の成立・維持に関する検討を行い、NK細胞表面に発現するNCRs、特にNKp46の発現が不育症や不妊症、あるいは妊娠糖尿病で変化していることを明らかにした。またNK細胞のサイトカイン産生異常はNK22細胞により制御をうけNK22細胞により是正される可能性が示された。またNK細胞はパートナーのリンパ球や精液により刺激することが可能であり、サイトカイン産生を来すことが明らかになった。子宮内膜および末梢血における免疫担当細胞の機能分担と機能発現、すなわちNK細胞におけるNatural CytotoxicityReceptor (NCR)発現、サイトカイン産生に焦点を絞り、これらの妊娠の成立および維持に関する役割を明らかにすることを目的として、NK細胞におけるNCR発現とサイトカイン産生とをつなぐNK22細胞の妊娠の成立・維持に対する役割について検討した。これまでもNKp46とサイトカイン産生との関連が示唆されていた。このNK細胞におけるNKp46発現とNK細胞によるサイトカイン産生とをつなぐ鍵はNK22細胞にあると考えられる。このNK22細胞を測定し、NK22細胞の生殖・特に妊娠の成立・維持への関与のさらなる解明を試みた。まず細胞刺激方法による違いを明らかにするために、PMA、イオノマイシンを用いた刺激法とIL-23を用いた刺激法によるNK22細胞陽性率を検討したところ、両刺激法によるNK22細胞陽性率は有意な正の相関を認めた。昨年度、不育症では子宮内膜、末梢血双方においてNCR22細胞の割合が高いという結果を得た。この意義を明らかにするためNK細胞のサイトカイン産生能を検討した。その結果、子宮内膜、末梢血双方においてNK22陽性細胞率とTNF-α、IFN-γ産生NK細胞との間に有意な負の相関を認めた。さらにNK22細胞陽性率とNCRの一つであるNKp46陽性NK細胞との間に有意な負の相関を認めた。また、真のNK細胞によるサイトカイン産生をみるために、男性リンパ球をもちいて、女性リンパ球を刺激し、フローサイトメトリーを用いてNK細胞のサイトカイン産生能を検討した。細胞同士は接触法、非接触法双方で検討したが、男性リンパ球を放射線照射により不活化した上での混合培養(接触法)により、NK細胞による良好なサイトカイン産生を測定し得た。本年度は、子宮内膜および全身を循環する末梢血における免疫担当細胞の機能分担と機能発現、すなわちNK細胞におけるNCR発現、NK細胞によるサイトカイン産生に焦点を絞り、これらの妊娠の成立および維持に関する役割および生理的現象の詳細を明らかにすることを目的として、NK細胞におけるNatural Cytotoxicity Receptor発現とサイトカイン産生とをつなぐNK-22細胞の妊娠の成立・維持に対する役割について検討した。このNCR22細胞を測定し、NCR22細胞の生殖・特に妊娠の成立・維持への関与の解明を試みた。その結果、不育症では子宮内膜、末梢血双方においてNCR22細胞の割合が高く、同時にCD56bright/TNF-α+NK細胞、CD56bright/IFN-γ+NK細胞が低下していることが明らかとなった。またCD56+/IL-22+細胞はTGF-β産生NK細胞との間に有意な正の相関があることも明らかとなった。これらはIL-22とNK細胞産生サイトカインとの関わりを示しているものと思われ、さらに検討を行い詳細を明らかにしていきたい。またIL-22陽性NK細胞細胞はこれまでの細胞刺激法では陽性率が高くないことも明らかとなった。さらに陽性率を高めるため別の細胞刺激法が適している可能性があるため、同時に別の細胞刺激法(IL-23による細胞刺激)も行い、現在陽性率の違いを検討中である。原因不明不妊症と不育症患者とにわけ、子宮内膜および末梢血NK細胞の産生するIL-22細胞、すなわちNK22細胞を測定した。その結果、子宮内膜NK細胞におけるIL-22産生は不育症群において原因不明不妊症群に比して、有意に高値であった。さらにNK22細胞は、TNF-α、IFN-γ産生NK細胞との間に有意な負の相関を認め、さらにNK22細胞陽性率とNCRの一つであるNKp46陽性NK細胞との間に有意な負の相関を認めた。NK細胞におけるNKp46発現は不育症患者で低下することをこれまでも報告しており、今回の結果から不育症ではNKp46が低下し、これによりNK22が増加、さらにTNF-α、IFN-γ産生NK細胞が低下する。すなわりNK22細胞が不育症においてサイトカイン産生の制御因子として働いている可能性を示唆した。

また、真のNK細胞によるサイトカイン産生をみるために、昨年は男性リンパ球を用いて、女性リンパ球を刺激し、フローサイトメトリーを用いてNK細胞のサイトカイン産生能を検討し、NK細胞による良好なサイトカイン産生を測定し得た。本年はさらに生理的な環境を創出するため、男性精液を用いて、女性リンパ球を刺激し、同様にNK細胞によるサイトカインを測定した。興味深いことに精子でもなく、精漿でもなく、精液による刺激により、NK細胞からのサイトカイン産生が増加する事が明らかとなった。子宮内膜および末梢血における免疫担当細胞が妊娠の成立および維持に関する役割を明らかにすることを目的として、以下の検討を行った。原因不明不妊症と不育症患者における子宮内膜および末梢血NK22細胞および細胞内に発現するROR-γtについて検討した。ROR-γt陽性NKp46陽性NK22細胞の割合は不育症群において高値であった。またROR-γt陽性NK22細胞と不育症で増加していると考えられるIFN-γ、TNF-α産生NK細胞との間には負の相関を認め、NK22は免疫制御的に働くことが考えられた。NK細胞におけるNatural Cytotoxicity Receptor発現と種々の血管増殖因子からみた妊娠高血圧症候群(PIH)の病態を解明するために妊娠12週における末梢血NK細胞NKp46発現およびサイトカイン産生(VEGF、IFN-γ、TNF-α、TGF-β)を測定した。その後のPIHの有無では差を認めなかったものの、妊娠糖尿病(GDM)を発症した群ではNKp46陽性NK細胞が有意に低値であり、さらにIFN-γ産生NK細胞、TNF-α産生NK細胞が高値、TGF-β産生NK細胞が低値であることが明らかとなった。これらは細胞傷害性の増加を示していると思われ、GDMにおける病態の一端を明らかにしたものと思われる。また、妊娠成立の場におけるNK細胞による生理的なサイトカイン産生をみるために、子宮NK細胞および末梢血NK細胞を男性精液および従来通りのPMA、Ionomycinを用いて刺激した。精液による子宮NK細胞刺激によりサイトカインが産生されることが明らかとなり、その産生量はPMA、Ionomycin刺激によるものと異なっていた。さらにNK細胞が産生するサイトカインの比(NK1/NK2比)も精液刺激とPMA、Ionomycin刺激では異なることが明らかとなった。やや遅れていると思われる。不育症患者、不妊症患者におけるNK22細胞、NK22細胞内ROR-γtの発現については論文作成中である。またNK細胞の新たなる細胞刺激法については、当初予定したELISPOT法ではなく、フローサイトメトリーを用いて、患者特異的なNK細胞によるサイトカイン産生異常を測定している。子宮内膜および末梢血を精液を用いて刺激しフローサイトメトリーを用いて測定することが可能であることが明らかとなったため、さらに不育症患者や着床不全患者でのデータ集積を行う必要があると思われる。NK細胞における血管新生因子については、妊娠各週数におけるデータをさらに集積中である。妊娠高血圧症候群、妊娠糖尿病について、今後結果が得られていくと考える。原因不明
呼気ガス中の一酸化窒素濃度測定法の確立とその臨床応用-心疾患、肺疾患、高血圧症、高脂血症、糖尿病患者における測定-

今年度は高血圧症、高脂血症、糖尿病患者、さらに慢性腎炎と慢性腎不全患者を対象として、これらの患者と正常者との呼気中の一酸化窒素(NO)排出量、血中一酸化窒素代謝産物(NOX)濃度の差異を検討した。高血圧症、高脂血症、糖尿病患者においては安静時および運動負荷中において、慢性腎炎と慢性腎不全患者においては安静時に呼気NO濃度測定を、呼気流量などの呼気ガス分析と共に行った。被験者はマスクないしマウスピースを装着し、chemilumincsccncc法によるNO濃度測定器で測定した呼気中のNO濃度と、呼気ガス分析器より呼気量を測定し、両者を乗じてNO排出量を求めた。1)高血圧症11例では正常例に比して、安静時の呼気NO濃度、排出量は差がなかった。一方呼気NO排出量は運動により正常例においては約3倍に増加したが、高血圧症例ではこの増加が少なかった。血中NOX濃度も高血圧症例では運動による増加は少なかった(現在投稿中)。同様に高脂血症、糖尿病患者においても正常例に比して、安静時の呼気NO濃度、排出量は差がなかった。一方高脂血症、糖尿病症例では運動による呼気NO排出量の増加が少なかった。血中NOX濃度も高脂血症、糖尿病症例では運動による増加は少なかった。その機序として運動時において安静時に比べて心拍出量は増加し、血管壁のshear stressが増加するが、そのshear stressの増加によるNOの産生が低下しており、内皮機能の異常を示唆した。2)21例慢性腎炎(Clin Nephr,in press)と40例慢性腎不全患者(Clin Sci,1999)においては安静時の呼気中のNO排出量、血中NOX濃度が正常者に比して高かった。その機序として、これらの患者では血中のサイトカイン濃度が増加しており、このサイトカインがNO産生を亢進させたと考えられた。今年度は慢性心不全例を中心とした心疾患、さらに肺病変を有する膠原病、慢性閉寒性肺疾患などの呼吸器疾患を対象として、これらの患者と正常者との呼気中の一酸化窒素(NO)排出量、血中一酸化窒素代謝産物(NOX)濃度の差異を検討した。安静時あるいは運動負荷中において、呼気NO濃度測定を、呼気流量などの呼気ガス分析と共に行った。被験者はマウスピースを装着し、chemiluminescence法によるNO濃度測定器(Sievers社製、NOA、米国製)で測定した呼気中のNO濃度と、呼気ガス分析器(ミナト社製、RM-280)より呼気量を測定し、real-time(10 msec毎)にNO排出量を求めた。安静時において、慢性心不全例(n=14)では正常例に比して、呼気NO濃度、排出量は共に約2倍に増加していた。一方呼気NO排出量は運動により正常例においては約3倍に増加したが、慢性心不全例ではこの増加が少なく、NYHA3度の重症例では全く増加しなかった。血中NOX濃度も慢性心不全例では安静時においては高値をとり、運動による増加は少なかった(現在投稿中)。呼吸器疾患(n=23)においては、安静時の呼気NO濃度、NO排出量は共に正常例に比して約2-3倍に増加していた。1回の呼気の初、中、後期のうち、特に初期のNO濃度が高値をとった。

慢性心不全例において、安静時の呼気中のNO排出量、血中NOX濃度が正常者に比して高かった機序として、本例では血中のサイトカイン濃度が増加しており、このサイトカインがNO産生を亢進させたと考えられた。一方、慢性心不全例では運動時における心拍出量の増加が少ないので、shear stressが正常者に比べて小さいので、呼気中のNO排出量及び血中NOX濃度の運動による増加が正常者に比して少なかったと考えられた。呼吸器疾患においては、炎症により局所のサイトカインが増加した結果、呼気中NOが高いと考えられた。今年度は高血圧症、高脂血症、糖尿病患者、さらに慢性腎炎と慢性腎不全患者を対象として、これらの患者と正常者との呼気中の一酸化窒素(NO)排出量、血中一酸化窒素代謝産物(NOX)濃度の差異を検討した。高血圧症、高脂血症、糖尿病患者においては安静時および運動負荷中において、慢性腎炎と慢性腎不全患者においては安静時に呼気NO濃度測定を、呼気流量などの呼気ガス分析と共に行った。被験者はマスクないしマウスピースを装着し、chemiluminescence法によるNO濃度測定器で測定した呼気中のNO濃度と、呼気ガス分析器より呼気量を測定し、両者を乗じてNO排出量を求めた。1)高血圧症11例では正常例に比して、安静時の呼気NO濃度、排出量は差がなかった。一方呼気NO排出量は運動により正常例においては約3倍に増加したが、高血圧症例ではこの増加が少なかった。血中NOX濃度も高血圧症例では運動による増加は少なかった(現在投稿中)。同様に高脂血症、糖尿病患者においても正常例に比して、安静時の呼気NO濃度、排出量は差がなかった。一方高脂血症、糖尿病症例では運動による呼気NO排出量の増加が少なかった。血中NOX濃度も高脂血症、糖尿病症例では運動による増加は少なかった。その機序として運動時において安静時に比べて心拍出量は増加し、血管壁のshear strcssが増加するが、そのshear stressの増加によるNOの産生が低下しており、内皮機能の異常を示唆した。2)21例慢性腎炎(Clin Ncphr,in press)と40例慢性腎不全患者(Clin Sci,1999)においては安静時の呼気中のNO排出量、血中NOX濃度が正常者に比して高かった。その機序として、これらの患者では血中のサイトカイン濃度が増加しており、このサイトカインがNO産生を亢進させたと考えられた。
骨格筋グルココルチコイド作用と体組成・エネルギー代謝制御に関する研究

本研究は、野生型マウスと、骨格筋特異的グルココルチコイド(GC)受容体(GR)欠損マウス(GRmKO)について、様々な条件(雌雄、週齢、栄養負荷)における、体組成や各種代謝指標、骨格筋・脂肪組織・肝臓・血液のメタボローム、トランスクリプトーム変容に関するトランスオミクス解析を行い、骨格筋におけるGC作用によるエネルギー貯蔵制御を担う重要分子・ネットワークを同定し、エネルギー過剰など種々の代謝変容への適応基盤機構解明を目指すものである。本研究により、エネルギー代謝異常を基盤とする疾患の病態形成過程において介入可能な機序が検証され、生活習慣病などに対する新たな治療戦略創成が期待される。
ICGによる蛍光診断を用いた遊離皮弁再建後の微小血行評価

口腔癌再建後の微小血管吻合術を用いた遊離組織移植において皮弁の生着は手術の成否を決定する大きな事項である。しかし、術後の吻合血管の血行不良は数%の確率で存在するため、早期に創を再び開け血行再開手術を行い、皮弁を救済する必要がある。当然、早期の救済であればあるほど救済率は上がるが、早期の血行異常サインの把握は非常に困難で、救済決定の判定は曖昧で難しい反面、判定が遅れた場合、皮弁が壊死し救済が手遅れになる。本研究は組織移植における皮弁の初期虚血状態を正確に読み取る手段としてインドシアニングリーン(ICG)を用いた蛍光診断を行い、早期で確実な救済処置を行い皮弁生着率を向上させることを目的とした。
病腎移植に関する諸調査の実施とそれに基づく倫理問題の検討

夫婦間の生体腎ドナー8名に聞き取り調査行い、病腎移植への意見も聞いた。ドナーは皆、腎提供後、腎臓が1つになったことで不安があるという。ドナーの多くは、もし病腎移植が可能であったら提供せずにすんだと語った。アンケート調査では、人工透析患者2727名、生体腎移植では、ドナー142名、レシピエント152名から回答を得た。レシピエントの回答で、移植した当時、修復腎移植が可能であったなら、34%が「修復腎移植を選択した」という回答であった。透析患者では91%が移植登録をしておらず、「登録しても無理」「高齢」という理由だった。これらの調査結果をまとめ3年間で、国際学会で9回、英文誌5報で発表した。日本において臓器提供は非常に少ない為、腎移植希望者は平均待機年数14年で、待機中に死亡する患者も多い。また腎移植の80%以上は家族からの生体腎移植という異常な状況である。当初問題視された、腎ガン等で摘出された腎臓を修復して移植する病腎移植は臨床研究が進行中で、現在までに第三者間で12例、親族間で2例、合計14の症例が示されている。平成24年度の研究実績としては、23年度に行った国内外の医師らに対する病腎移植の是非や見解を聞いたインタビューや奄美大島で実施した夫婦間の生体腎ドナー8名に対する聞き取り調査の結果をまとめたものを、国際学会で3回発表し、さらに論文も2本発表した。また病腎移植に対して、人工透析患者、生体腎ドナー、生体腎レシピエントはどのように考えているかについて、多くの病院の協力の下、大規模のアンケート調査が実施できた。人工透析患者については、病腎移植の臨床研究を実施している宇和島徳洲会病院を含む徳洲会系列50病院から1495名のアンケートを回収した。アンケートの偏りをなくすため、実施病院系列以外の多数の病院にお願いし、1232名分が集まった。生体腎移植では、ドナーにおいて、宇和島徳洲会病院85名vs.それ以外の病院57名、レシピエントでは、宇和島徳洲会病院94名vs.それ以外の病院58名のアンケートが集まった。その後、これらの結果をコンピュータにデータ入力した。現在、透析患者数は約31万人で、その内の3万人が毎年死亡し、4万人が新たに患者となって導入されている。2014年3月末の腎移植希望登録者は約1万3千人で、死体腎や脳死からの提供が極端に少ない日本では平均待機年数14年となる。それ故、移植希望者は親族から腎提供に頼らざるをえない。この状況を打破する一方法として、腎ガン等で摘出された腎臓を修復して移植する修復腎移植があり、臨床研究では合計14症例に実施され、良好な結果を得ている。修復腎移植を、人工透析患者、生体腎ドナー、生体腎レシピエントはどのように考えるかについて、多くの病院の協力の下、大規模のアンケート調査を実施し、25年度はそれらの結果をまとめ、学会発表、論文発表を精力的に行った。生体腎移植レシピエントへのアンケート結果から、「もし移植した当時、修復腎移植が可能であったなら、生体腎移植、修復腎移植のどちらを選択したか」という設問に対し、152名中51名(33.6%)が「修復腎移植を選択した」という回答であった。特に移植後、健康状態が良好という人では、約半数がその選択を行った。これは、自分が健康になっても、腎臓を提供してくれた親族に対して健康体を傷つけさせたという加害者意識とドナーへの将来的な健康不安があると考えられる。ドナーは臓器を提供することにプレッシャーを感じたかという質問には、16%のドナーは夫婦間、子供や親から感じたということであった。透析患者では91%が移植登録をしておらず、「登録しても無理」「透析で十分」という意見であった。透析患者では高齢者の比率が高く、その人たちは特にそう考えていた。修復腎移植については、より若く、女性より男性の透析患者が医療として認める傾向が見られた。希望者には、しっかりしたICの下、第3の道として修復腎移植の選択肢を与えるべきという結論を得た。現在、日本では腎不全で透析治療を受けている患者数は30万人弱で、そのうち腎移植希望登録者は1万2500人である。死体腎や脳死からの提供は極端に少ないため平均待機年数14年となり、待機期間中に死亡する患者も多い。2007年における腎移植件数では年間1224例であるが、その内、親族間の生体腎移植は1037件(84.7%)で、それがほとんどを占めるという異常さである。

そこで、腎移植に関わっている医師達にまずインタビューを行った。生体間ドナーは血族または配偶者等に限られているが、養子縁組をした場合など、その確認が大変難しいということであった。Saltlakeでは、腎癌のスペシャリストDr. Bishoff、移植医Dr. Fujita, Dr. Van der Werfに腎移植についてインタビューを行った。彼らの所属するIntermountain Medical Centerでは、比較的簡単なinformed consentで、移植手術の同意を得ていた。病腎移植については、親族間の生体腎移植で最近、提供腎に小径癌が見つかったが、レシピエントの同意を得て、癌の箇所を修復し移植したという。腎移植患者組織がしっかりしている奄美大島では、夫婦間の生体腎ドナー8名に対し、聞き取り調査を行った。全員ドナー側から提供を申し出ており、生命倫理的な問題はなかった。但し生体腎移植を行ったにも係わらず、レシピエントに急性拒絶反応が起こり、結局、透析に戻ったケースでは、ドナー側の心的ケアも必要であったと感じた。病腎移植は本来廃棄されるはずの腎臓を修復して使用するため、ドナーやその家族に肉体的、心理的負担をほとんど与えない。生体腎移植した当時、病腎移植が医療として認められていたら、そちらを選択したというドナーも何人かいた。23年度に行った国内外での医師に対するインタビューや奄美大島で実施した夫婦間の生体腎ドナー8名に対する聞き取り調査結果を考察し、生命倫理関連の国際学会で発表4回、さらに論文も2本掲載されたので、この件に関しては100%達成した。アンケート調査は、人工透析患者については、徳洲会系列50病院から1495名、病腎移植実施関連病院以外の多数の病院から1232名分を回収した。また生体腎移植では、ドナーにおいて、宇和島徳洲会病院85名vs.それ以外の病院57名、レシピエントでは、宇和島徳洲会病院94名vs.それ以外の病院58名が集まった。このような大規模調査が実施できたので、この件に関しても100%達成といえる。しかしながら今年度に病腎移植裁判関係者へのインタビューは行えなかったので、トータルとして達成度95%といえる。1.宇和島徳洲会病院で2009年から臨床研究として病腎移植が行われているので、そこでの実態調査を行う。病腎移植臨床研究として10例が既に行われているが、10例目の患者さん(レシピエント)がまだ入院中だったので、インタビューした。さらに病腎移植に関わっている医師ー万波誠医師、万波廉介医師(宇和島徳洲会病院)、光畑直喜医師(呉共済病院)、宇和島徳洲会病院松原淳倫理委員会長にインタビューを行った。また病腎移植の立ち上げに関わった市立宇和島病院名誉院長・近藤俊文医師と会い、腎移植の歴史、病腎移植の可能性等について討論した。主に伺った項目は、生体腎移植において、腎提供する近親者の確認法/腎提供が親子間、兄弟・姉妹間、夫婦間における違い/提供者が年老いても1つの腎臓で大丈夫といえるか/ドナーの健康状態が悪くなった場合、誰が責任を持つべきか/ICで特に必要な事項/IRBで必要な審議は何かなどである。また病腎移植については、病腎移植の必要性・危険性/学会が反対する根拠/部分切除の基準は?(renal score?)/レシピエントへの適用範囲(若い患者にも可能か)等であった。2. USAでは藤田士朗医師を訪ね、アメリカにおける腎移植、病腎移植についてインタビューを行う。Salt
胎児期から乳児期の子どもを育てる両親のQOLとSOCに関する研究

育児不安や児童虐待を防止するために、胎児期から乳児期の子どもを育てる両親に焦点を当て、日本人に適したQOL(人生の質)調査票の開発を行うことと、胎児期から乳児期にかけて1年間の両親の子育て関するQOLおよびSOC(首尾一貫感覚)の変化を明らかにすることである。そして、問題となり得る夫婦の特徴を明確にし、夫婦が助け合い子どもを生み育てやすい環境を作っていけるような援助方法の一助とする。最終的に、問題を抱える両親の具体的な要因と改善策を専門職ととともに見出し、実践へつなげていくことを目標とする。
圧縮センシングとスパース表現の実時間処理技術の研究

国際会議での発表と雑誌での発表、そして、実験の実施などによる次の年度は計画より多くの経費使うことを予想したため。(理由)次の年度、雑誌と国際会議での発表、実験の実施は最初の計画より多いので、一定の経費を次年度に使用していただきます。(使用計画)各研究者用パーソナルコンピュータは現有のものを使用する予定であるが、実験とDeep Leaningの研究用のGPUコンピュータが必要であるので、追加する予定です。実験システムに関する改造修理費として、圧縮センシングとスパース表現の実時間処理技術についての評価テストなどの目的で、できるだけ現有のものを使用し節約する予定であるが、実験項目を変更するために改造と修理が必要である場合はそれための費用がかかる。学会と雑誌での学術発表のとき登録費や旅費、Paper Chargeなどで研究費も使う予定である。謝金・研究補助としては主に大学院生の研究補助の費用となる。研究の評価と実験、特に、音源分離に関する心理テストでは多数の被験者を集めるため大学院生の研究補助が重要である。会津大学において、院生の時給が1,000円となっているので、この基準と必要時間数で支払う。各研究者用パーソナルコンピュータは現有のものを使用する予定であるため、追加が必要な研究のためのサーバや実験用GPUコンピュータのみが必要である。また、謝金・研究補助としては主に大学院生の研究補助の費用となる。
内リンパ嚢における水吸収機構の解明

ラットの内リンパ嚢を回収し、AQP2の発現をmRNAレベルで測定するとともに、組織学的にも発現部位、発現強度を調べる実験を開始し、条件・環境設定の最適化を行っている。この基礎データをもとにして、in vitroでのAQP2 RNAi投与時のAQP2の発現抑制と関連遺伝子の発現の変化を観察する。Vasopressin type 2 receptor(V2-R)はAQP2との関連を指摘されている。V2-RはAQP2を制御しているとの報告もあるので、V2-RをノックダウンするとAQP2が減少することが予想される。Vasopressin、V2-R、AQP2の関連についてもそれぞれについて同様の手技をもちいて、測定する。また、AQPチャネルは10種以上存在し、それぞれの内リンパにおける機能はほとんど解明されていないため、それぞれのAQPチャネルをノックダウンできるような、実験系を準備する。以上の予備実験により、内リンパ嚢に発現し、内リンパ水腫に関与しているとおもわれるチャネルの測定できる実験系を確立する。次段階としては、in vivoでそれぞれのRNAiを投与して、内リンパ水腫の発生が起こるような条件を確立し、そのときの関連タンパクの発現を検証する。これらの実験を行うことで、比較的有病率が高く、根治的な治療法が未だ解明されていないメニエール病の本態である内リンパ水腫のイオンチャネルの観点からの発生機序を解き明かすきっかけになると期待している。Vasopressin type 2 receptor(V2-R)はAquaporin 2(AQP2)との関連を指摘されている。V2-RはAQP2を制御しているといわれており、メニエール病患者では血中Vasopressin濃度の上昇が認められているとの報告がある。今回我々は、発現mRNAを特異的に抑制することができるsmall interference RNA(siRNA)の技術を用いて、AQP2 mRNAを減少させることで、内リンパ水腫の治療に結びつく可能性があるのではないかと考え、以下の実験を行った。siRNA_AQP2をラットの蝸牛正円窓に留置し、48時間後に側頭骨を採取した。パラフィン包埋後に抗AQP2抗体を用いて蛍光顕微鏡下で観察すると、negative control_siRNAを留置したものと比較して、内リンパ嚢におけるAQP2の発現は減少していた。内リンパ嚢におけるAQP2 mRNAの発現の抑制程度については、Quantitative RT-PCR(qRT-PCR)により解析中である。qRT-PCRの実験においては、採取した内リンパ嚢への硬膜のcontaminationを完全に排除することが困難であった。Reissner's membraneの形態には差がなかった。以上より、内リンパ水腫モデルを作成した後に、siRNA_AQP2を留置し、内リンパ水腫に対する治療効果を確認することができれば、メニエール病におけるAQP2の重要性が確認でき、臨床における治療法の開発の足がかりになるものと期待できる。
細胞間ミトコンドリア輸送因子RhoT1の歯周組織修復に対する機能解析

本研究は、ミトコンドリア輸送因子であるmitochondrial Rho GTPase 1 (RhoT1)の歯周組織の修復に対する機能的役割を解明することを目的とした。RhoT1は、歯根膜間葉系細胞(MSCs)に発現が見られ、LPS刺激時や飢餓状態において、その発現が増加することが明らかにされた。また、LPS刺激などによりダメージを受けた歯根膜MSCsは、正常な歯根膜細胞からミトコンドリアを供給され、生存が維持された。これらの所見より、RhoT1は、歯根膜MSCsにおいて細胞ダメージを回復させるために重要であることが示唆された。本研究は、歯周病による歯の喪失を防ぐため、間葉系幹細胞(MSCs)の細胞間ミトコンドリア(Mt)輸送能に基づき、歯周病の治療法を開発することを最終目的としている。平成27年度は、MSCsにおける細胞間Mt輸送を調節する因子として考えられているRhoT1の機能的役割を検討した。本実験は、C57BL6マウスの歯周組織を対象とした。免疫組織化学的解析により、歯周組織におけるRhoT1の局在を検索した結果、歯根膜において、RhoT1陽性細胞が点在することが認められた。RhoT1はMSCsに発現することが知られていることから、歯根膜MSCsのマーカーであるCD146の抗体を用いて、Magnetic cell sortingによりCD146陽性細胞である歯根膜MSCsを単離した。このCD146陽性歯根膜MSCsは、RhoT1を発現していた。また、この歯根膜MSCsとRAW264.7細胞の共存培養を行い、MSCsの突起におけるRhoT1の局在を観察した。MSCsの突起は、RAW264.7細胞に向かって伸びており、その突起内にミトコンドリアの存在が認められた。歯根膜におけるMSCsの役割を検討するために、ミトコンドリアをMitoTrackerによりラベルしたMSCsをLPSで処理を行った歯根膜細胞と共存培養すると、歯根膜細胞内においてMitoTrackerでラベルされたミトコンドリアの存在が確認された。これらの所見は、歯根膜MSCsが、破骨細胞や歯根膜線維芽細胞に対して、Mtを供給している可能性が示された。以上より、マウス歯根膜において、MSCsは破骨細胞や歯根膜線維芽細胞を支持することが示唆された。歯根膜線維芽細胞に対するミトコンドリア輸送をタイムラプスにより観察する予定であったが、共焦点レーザー顕微鏡の故障により、実験が滞ってしまった。現在、染色色素を変えて対応しているが、装置の修理および条件検討により、若干、予定よりも遅れている。本研究は、歯周病による歯の喪失を防ぐため、間葉系幹細胞(MSCs)の細胞間ミトコンドリア輸送能に基づき、歯周病の治療法を開発することを最終目的としている。これまでの研究により、MSCsや破骨細胞にRhoT1が発現していることを明らかにした。これを踏まえ、平成28年度は、RhoT1の作用機序を明らかにするため、細胞接触が重要であることから、組織損傷時の細胞遊走を検討した。本実験では、マウス大腿骨に骨欠損を作製し、その治癒過程におけるMSCs遊走を観察した。細胞遊走に関わると考えられているLRP1を発現した細胞が、欠損3日目に出現し、徐々にLRP1陽性細胞数は増加した。欠損3日目の骨欠損部位から細胞を採取し、MACsによる細胞分離で、LRP1陽性細胞を単離した。単離LRP1陽性細胞は、MSCマーカーを発現していた。また、LRP1陽性細胞は、細胞遊走の際の細胞接着に関与するPaxillinに加え、RhoT1の高い発現を示した。また、マウス上顎第一大臼歯の抜去後の歯槽骨修復においても、同様な現象が生じることを確認している。これらのことより、組織損傷治癒において、MSCsの遊走とRhoT1発現は、相関関係がある可能性が示唆された。さらに、我々は、破骨細胞におけるRhoT1発現を確認しており、このLRP1との関連を検討した。破骨細胞前駆細胞である単球マクロファージは、LRP1およびRhoT1の発現は、認められなかった。しかしながら、分化誘導過程におけるRANKL刺激後、これらの発現の増加が認められた。以上の結果より、RhoT1は、MSCsと破骨細胞において、細胞遊走と細胞接着因子の発現と関連していることが示唆された。平成28年度に関しては、予定通りに実験を進めることができた。平成28年度までの研究によりMSCsや破骨細胞にRhoT1が発現すること、またRhoT1を発現するMSCsの細胞遊走能を調節すると考えられているLow density lopoprotein receptor-related protein 1 (LRP1)を発現することを明らかにした。これらの所見を踏まえ、平成29年度は、MSCsによる損傷を受けた細胞の認識とRhoT1の発現の相互関係を明らかにすることを目的とした。MSCs、マウス頭蓋骨由来骨芽細胞、そしてマウス歯根膜細胞にLipopolysaccharide (LPS)刺激を加えた結果、これらの細胞の細胞死率が増加した。また、LPS刺激または飢餓状態におくことで、これらの細胞におけるRhoT1発現量は増加した。

一方、LPS刺激後のMSCsに対して、非刺激MSCsを加えると、細胞間の細胞突起によるネットワークが活性化され、その細胞突起内にミトコンドリアが含まれていることが明らかになった。同時に、LPSによって刺激された細胞の生存率も改善された。これらの所見は、飢餓状態またはLPS刺激により、MSCsは細胞間ネットワークを活性化することで、細胞死から回避する機能を有することが示唆された。以上より、LPS刺激などに対してMSCsや歯根膜細胞のRhoT1発現が細胞損傷を改善するため、RhoT1を調節することで歯周病治療が可能になると推測される。本研究は、ミトコンドリア輸送因子であるmitochondrial Rho GTPase 1 (RhoT1)の歯周組織の修復に対する機能的役割を解明することを目的とした。RhoT1は、歯根膜間葉系細胞(MSCs)に発現が見られ、LPS刺激時や飢餓状態において、その発現が増加することが明らかにされた。また、LPS刺激などによりダメージを受けた歯根膜MSCsは、正常な歯根膜細胞からミトコンドリアを供給され、生存が維持された。これらの所見より、RhoT1は、歯根膜MSCsにおいて細胞ダメージを回復させるために重要であることが示唆された。平成28年度は、平成27年度から継続して、「歯周組織細胞の損傷におけるRhoT1のMt輸送調節機能」に加え、「MSCsが感知する損傷細胞からのシグナル」を解明するため、以下の実験を実施する。1. MSCsのMt輸送:歯根膜MSCsと歯根膜線維芽細胞または単球マクロファージを共存培養し、MSCsからのMt輸送をタイムラプスで観察する。2. RhoT1によるMt輸送機能調節:RhoT1発現を改変したMSCsまたは単球マクロファージを用いて、RhoT1の機能的な役割を評価する。さらに、細胞癒合因子DC-StampとOC-Stamp発現を測定し、RhoT-1と細胞癒合の関係を検討する。本実験により、破骨細胞におけるRhoT1の機能を解明する。3. MSCsが感知する損傷細胞からのシグナルの解明:(1) MSCsによる損傷細胞認識:培養皿を三分割(A, B, C)し、A: RhoT1改変MSCs, B: LPS処理線維芽細胞, C:LPS非処理線維芽細胞を播種し、MSCsの細胞移動、Mt輸送およびTNT形成をタイムラプスで観察する。本実験において、MSCsによる細胞認識の特異性を確認する。(2) MSCsが認識する液性因子の可能性:AにRhoT1改変MSCsを播種した後、LPS処理線維芽細胞および非処理線維芽細胞の培養上清をそれぞれ、B, Cのエリアに滴下する。MSCsの細胞移動、TNT形成、Mt輸送をタイムラプスにより継時的に観察する。(3) LPS刺激による分泌因子の検索:LPS処理細胞および非処理細胞を用いて、DNAマイクロアレイを行い、クラスター解析により損傷細胞がMSCsに伝達する因子を同定する。同定されたタンパクを歯根膜線維芽細胞に過剰発現させ、MSCsの細胞移動、TNT形成、Mt輸送をタイムラプスにより観察する。以上の実験により、細胞間Mt輸送システムの機序を解明する。
植物における細胞死制御機構の解明

本研究では、植物の環境ストレス適応や病原抵抗性と深い関わりを持つAtBI-1(Arabidopsis Bax Inhibitor-1)遺伝子の機能解析を中心に行い、本年度は以下の研究成果を得た。AtBI-1を過剰発現する植物細胞はサリチル酸、過酸化水素、イモチ病菌由来のエリシターなどが引き起こす細胞死を抑制するが、その際、活性酸素種の生成量には変化をもたらさないことが明らかとなった。すなわち、AtBI-1は過酸化水素が発生した後の過程で働くことにより細胞死を抑制すると考えられた。その過程で関与する因子として、前年度の解析からPmr1やSpf1などのカルシウムポンプの機能がAtBI-1の細胞死抑制活性に必要であることが明らかとなっている。本年度はこのカルシウムポンプの阻害剤であるCPAを用いることにより、AtBI-1の機能についてさらに詳細な解析をおこなった。AtBI-1を過剰発現させた細胞はCPAに対して耐性を示すことが明らかとなった。CPAを植物細胞に処理するとサイトゾルのカルシウム濃度が一過的に上昇し、細胞死が誘導される。AtBI-1を過剰発現させたシロイヌナズナやタバコのBY-2細胞は共にCPAによって引き起こされる細胞死が低いレベルに押さえられていた。また、エクオリンを用いたサイトゾルカルシウムの定量実験により、AtBI-1を過剰発現する細胞内ではカルシウムホメオスタシスが変化していることが示唆された。また、ストレス処理により細胞質に放出されたカルシウムはカルモジュリンと結合して、下流のさまざまな因子の調節を行うことが知られているが、本研究によりAtBI-1がカルモジュリン結合タンパク質であることが明らかになった。植物細胞の生死制御は、環境ストレス耐性や耐病性と密接に関係することから、重要な農業形質の一つとして認識されている。本研究では植物の細胞死抑制因子に注目し、本年度は以下の研究成果を得た。シロイヌナズナのBax inhibitor-1遺伝子は、酵母において動物のアポトーシス促進因子Baxが引き起こす細胞死を抑制する植物遺伝子として単離されたが、植物内でもBax誘導性細胞死を抑制する活性を有することが確認された。また、過酸化水素やサリチル酸等、植物におけるプログラム細胞死の制御因子が引き起こす細胞死に対しても抑制活性を有することが明らかとなった。また細胞死抑制の為には、Bax Inhibitor-1遺伝子のC末端領域の14アミノ酸が必須であった。この領域はcoiled-Coil構造をとると予測されることから、他のタンパク質と相互作用することが細胞死抑制活性に必要であると考え、酵母を用いたTwo hybrid法を用いて結合タンパク質の単離を行った。また、その際、Bax Inhibitor-1は小胞体膜上に存在する膜タンパク質で有ると予想されていることから、従来の手法ではなく、膜タンパク質用に開発されたsplit-ubiquitin法を導入し、スクリーニングを行った。その結果、これまでに数個の結合タンパク質候補を得ている。今後、これらについて詳細に解析を進めて行く予定である。また、細胞死を促進する新規植物因子としてcdfl(cell growth defect factor)を酵母を用いた機能的スクリーニング法により単離した。本遺伝子をシロイヌナズナで過剰発現すると成長途中で葉緑体が崩壊し、斑を生じるという表現型が現れた。またこの遺伝子の発現が植物の老化の際に上昇することが明らかとなり、細胞死進行との関わりが推測された。今後、ノックアウト植物を用いる等して、これらの因子について詳細な解析を行い、植物細胞死における役割について明らかにしていく予定である。本研究では植物の環境ストレス適応や、病原抵抗性と深い関わりを持つAtBI-1(Arabidopsis Bax Inhibitor-1)遺伝子の機能解析を中心に行い、本年度は以下の研究成果を得た。AtBI-1遺伝子は当初、動物のアポトーシス促進因子であるBaxが酵母に引き起こす細胞死を抑制する因子としてシロイヌナズナより単離されたが、本研究により植物細胞内でも活性酸素が誘導する細胞死を抑制することが明らかとなった。すなわち、本遺伝子を過剰発現するタバコBY-2細胞は過酸化水素やサリチル酸に耐性を示した。さらに、本遺伝子を発現するイネの培養細胞はイモチ病菌由来のエリシターが引き起こす過敏感細胞死も抑制することが明らかとなった。また、最近では本因子とオオムギのうどん粉病抵抗性遺伝子Mloとの機能的類似性が報告され、AtBI-1が種々のストレスに対して細胞の生存を可能とするsurvivingfactorとして機能していることが示唆された。また、本研究ではAtBI-1による細胞死抑制機構を明らかにするため、酵母の遺伝子破壊株を用いた解析をおこなった。すなわち、AtBI-1が細胞死を抑制できない遺伝子破壊株の探索を行い、AtBI-1による細胞死抑制能に関与する因子の単離を行った。その結果、細胞内カルシウムイオンの濃度調節に関与する遺伝子(Pmr1,Spf1)が欠損した酵母株ではAtBI-1が細胞死を抑制できないことが明らかとなった。また、AtBI-1を過剰発現するタバコの培養細胞を用いて、サイトゾルのカルシウム濃度の定量実験を行った結果、AtBI-1の発現により、小胞体へのカルシウムの取り込みに関与するカルシウムポンプの活性化が起きている可能性が示された。今後、これらのノックアウト植物を用いる等して、植物細胞内におけるAtBI-1による細胞死抑制の機構を明らかにしていく予定である。

AtBI-1を過剰発現する植物細胞はサリチル酸、過酸化水素、イモチ病菌由来のエリシターなどが引き起こす細胞死を抑制するが、その際、活性酸素種の生成量には変化をもたらさないことが明らかとなった。すなわち、AtBI-1は過酸化水素が発生した後の過程で働くことにより細胞死を抑制すると考えられた。その過程で関与する因子として、前年度の解析からPmr1やSpf1などのカルシウムポンプの機能がAtBI-1の細胞死抑制活性に必要であることが明らかとなっている。本年度はこのカルシウムポンプの阻害剤であるCPAを用いることにより、AtBI-1の機能についてさらに詳細な解析をおこなった。AtBI-1を過剰発現させた細胞はCPAに対して耐性を示すことが明らかとなった。CPAを植物細胞に処理するとサイトゾルのカルシウム濃度が一過的に上昇し、細胞死が誘導される。AtBI-1を過剰発現させたシロイヌナズナやタバコのBY-2細胞は共にCPAによって引き起こされる細胞死が低いレベルに押さえられていた。また、エクオリンを用いたサイトゾルカルシウムの定量実験により、AtBI-1を過剰発現する細胞内ではカルシウムホメオスタシスが変化していることが示唆された。また、ストレス処理により細胞質に放出されたカルシウムはカルモジュリンと結合して、下流のさまざまな因子の調節を行うことが知られているが、本研究によりAtBI-1がカルモジュリン結合タンパク質であることが明らかになった。
頭頸部癌におけるケモカインレセプターと癌幹細胞マーカー

最終的に上咽頭癌とCD44の発現に検討対象を絞り、上咽頭癌に対する放射線化学療法施行例でどのCD44variant isoformが1予後規定因子となるか2上咽頭癌の治療において重要なポイントとなる原発巣の放射線化学療法への抵抗性に関与する因子となるかを検討した。患者背景なども含めた多変量解析を行った結果、CD44v3の高発現が疾患特異的生存率の低下に有意に関与すること、CD44v6の高発現が原発巣の治療抵抗性に関与することを見出した。これらの結果を元に更に検討を加えると上咽頭癌治療において個別の治療強度設定が可能になったり、分子レベルをターゲットにした治療に発展する可能性があると考えている。平成24年度は平成23年度に実験を行った頭頸部癌症例のうち、特に症例毎に発現が異なり、腫瘍の転移能、治療抵抗性、予後との関連性があることが示唆された上咽頭癌に検討対象を絞り、更にCD44のvaraint isoform抗体も用いて、どのvariant isoformが治療成績と関与するかを検討した。前年度より症例数を増やし一次治療前の生検標本を検討することができた42症例を対象とした。CD44のstandard formに対する抗体、CD44v3抗体、v6抗体の発現と上咽頭癌症例の予後に有意差を見いだせた。CD44のstandard formに対する抗体では放射線化学療法の治療効果と差は見られなかったが、CD44v3抗体、v6抗体の発現と放射線化学療法の治療効果に有意差を認めた。又、CXCR3の発現と上咽頭癌の予後との関連についても症例数を増やし合わせて検討を行い有意差を認めた。上咽頭癌は解剖学的な理由から一般的には手術が適応とならず、治療は放射線化学療法が主体となる。現状では放射線化学療法の効果は腫瘍によって異なり十分とは言えず、また放射線化学療法後の後遺症は決して楽なものではない。どのマーカーが上咽頭癌の治療抵抗性、転移能を規定し、予後予測因子となるかを明らかにすれば個々に合わせてレジメンを変更した放射線化学療法を行ったり、追加治療の有無を検討したりすることができるようになる。効率的で副作用、後遺症をできる限り少なくした治療戦略が立てられるようになると考えている。また、新しい分子標的薬の開発につながる可能性もある。平成25年度はこれまで平成23年度24年度に行った試験的な検討結果や臨床的な有用性を考慮して頭頸部癌のうち上咽頭癌に検討対象を絞り、CD44variant isoformの発現と臨床データとの比較についての統計学的な検討を重ね、国際学会における発表、英文論文の作成を行った。検討の対象は一次治療前の生検標本を検討することができた上咽頭癌42例とした。これらの上咽頭癌症例に対してはすべて一次根治治療として放射線化学療法が行われていた。生検標本に抗CD44抗体を用いた免疫染色を行い、どのCD44variant isoformの発現が1予後規定因子となるか2上咽頭癌の治療において重要なポイントとなる原発巣の放射線化学療法への抵抗性に関与する因子となるかを検討した。疾患特異的生存率に関してLog-lank試験ではCD44v3とCD44v6の高発現群が低発現群に比べて有意に予後不良であった。患者背景などを加えた多変量解析を行うとCD44v3の高発現のみが疾患特異的生存率の低下に有意に関与するという結果であった。一方で、原発巣の放射線化学療法への抵抗性に関する多変量解析の結果はCD44v6の高発現のみが関与していた。上咽頭癌は放射線化学療法に対する感受性が比較的高い悪性腫瘍ではあるが、原発巣が残存した場合には解剖学的な部位もあり救済治療が困難である。また、上咽頭癌の放射線化学療法後の唾液腺障害による口腔乾燥などの合併症は患者の生活の質を大きく低下させるものである。上咽頭癌の予後予測因子、原発巣の放射線化学療法に対する治療抵抗性を治療前から推測できれば個々の腫瘍による治療強度の決定が可能となる可能性もあり、臨床的に有意義であると考えられる。また上咽頭癌におけるCD44 variant isoformの役割を検討することは分子レベルの治療に発展する可能性もある。平成23年度はこれまでに当院で診断、治療を行った頭頸部癌症例のうちまずはどの疾患を中心に研究を推進するかを検討した。その結果、まずは頸部郭清の必要性など各施設間で治療方針の意見が異なる上咽頭癌、早期舌癌(T1N0、T2N0)、頭頸部癌の中で最も予後不良である下咽頭癌を中心に検討を行うこととし、対象症例の臨床データの収集を行った。

次に各疾患毎にまずはランダムに症例を15例-20例抽出し、免疫染色(一次抗体としては、癌幹細胞マーカー:抗CD44 standard form抗体と抗NANOG抗体、ケモカインレセプターマーカー:抗CXCR3抗体と抗CXCR4抗体を用いた)を行った。その結果、特に上咽頭癌でCD44、CXCR3の発現が症例毎に異なり、腫瘍の転移能、治療抵抗性、予後と関連する可能性があることが指摘された。具体的には上咽頭癌18例中8例が予後不良群であったが、このうちCD44、CXCR3が各々6例(75%)ずつ高発現していた。本研究で、1どのマーカーが頭頸部癌の癌幹細胞、ケモカインレセプターのマーカーとして有用であるか、2癌幹細胞と放射線、化学療法の治療効果の関連、3腫瘍の転移能との関連を明らかにすれば、治療前に転移能が高いことや、治療抵抗性を示すことが予測される腫瘍に対しては現状のプロトコールを変更した治療を行ったり、追加治療を行っていくことで治療成績の向上を計ることができる。又、効率的で副作用の少ない機能温存を目指した新しい治療戦略を立てることも可能になり、さらに新しい分子標的薬剤の開発につながることが期待される。結果がでてから学会、論文発表を行える状態にするための検討、分析に時間がかかった。またCD44の抗体によっては全く陽性とならない場合もあり、実験条件によるものの可能性が否定できず、何度か条件を変えて実験を行い、確認を要した。補助事業期間の延長の承認をいただいた。(学振助一第437号、平成25年3月19日付)一次抗体によっては腫瘍細胞が全く陽性とならない抗体(抗NANOG抗体、抗CXCR4)もあり、熱処理など実験条件によるものの可能性も否定できなかったため、確認、検討を要したことが一因であると考えられる。上咽頭癌とCD44の他のvariant isoformとの関連についても検討を重ね、どのvariant isoformが上咽頭癌の予後や治療抵抗性と関連が強いかを見出し、統計学的にも検討を重ねて国際学会へ発表、国際雑誌に投稿していく予定である。今後更に症例数を増やし、臨床所見(転移の有無、治療への抵抗性など)との比較検討を行い、どのマーカーが頭頸部癌の診断、治療に有用であるかを統計学的な解析も含めて検討していく予定である。さらに平成23年度は行えなかった癌幹細胞のマーカーのBMI-1、ALDH-1、CD133、Gli-1に対する抗体を用いても研究を行い、CD44に関してもstandard formに対する抗体だけでなく、varinat isoformに対する抗体も用いて検討を行い、更に検討を進め、学会報告、成果が上げられれば論文発表を行っていく予定である。平成25年度の研究費の使用は研究結果の学会発表(国際学会での発表を予定)、国際雑誌への投稿の為の英文校正費、追加実験必要時の免疫染色の一次抗体、二次抗体の購入費などを中心に行う予定である。平成24年度の研究費の使用は免疫染色の一次抗体、二次抗体の購入費が中心となる予定である。
スピン偏極原子の自己組織化

スピン偏極原子を、基板との化学結合力・分子結合力が極度に小さく、純粋に少数のスピン偏極原子間相互作用だけで構造が決まるような舞台の上に置くことができれば、スピンに起源を持つ原子構造の発現、すなわちスピン自己組織化が期待できるのではないだろうか?本研究の目的は、そのようなスピン偏極原子の自己組織化の可能性を、思考実験から一歩進めて現実の実験系で調べることである。そのため、アルゴン(Ar)など希ガスの薄膜基板上に、スピン偏極させたセシウム(Cs)原子の2次元クラスター(スピンクラスター)を作り、自発的にできる原子構造やパターンの巨視的、微視的観察を試みた。1.希ガス基板の成長と構造解析: 2次元のクラスターを自由に成長させる基板として、アルゴンの薄膜基板を、超高真空中で極低温に冷却した水晶振動子膜厚センサの上に5層から30層の厚さで成長させ、結晶構造のRHEED観測を行なった。成長速度によって多結晶から単結晶ライクな膜まで結晶性を制御することが可能となった。2.Cs原子蒸着:第一歩として、非偏極熱原子CsビームをAr単結晶膜の上に照射し、極低温水晶振動子(QCM)およびRHEED像の観測を行なった。詳細は解析中である。詳細は解析中である。