hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マイクロ波静磁波による磁気光学効果を用いた超高速薄膜機能素子の研究

静磁波による磁気光学効果を用いた光モード変換素子用ガーネット結晶薄膜をRFスパッタリング法により作成する際,ファラデ効果を大きく,光伝搬損失,マイクロ波静磁波の伝搬損失を小さくする必要がある.基板温度を500°Cとして作成したアモルファス薄膜を1000°C,約6時間熱処理することによって再結晶化させると薄膜のマイクロ波静磁波の伝搬損失が小さくなることがしられた.膜厚を13μm変化させたとき,伝搬損失は膜厚が厚くなるに従い小さくなった.伝搬するマイクロ波の周波数は,印加される外部磁界の大きさで決まり,例えば, 900Oeで周波数4.5GHzであある.マイクロ波周波数を変えて静磁波の伝搬損失の周波数依存性について測定した結果,周波数が高くなるにつれて,その損失は大きくなり, 2.3GHzで約1.6dB/cm, 6.4GHzで12.8dB/cmとなった.ガーネット結晶薄膜にマイクロ波静磁波を効率よく励振させるために,マイクロ波用電極を2つの方法により作製した.金メッキしたアルミナ基板をフォトリソグラフィー法によって作製したマイクロストリップ線路と,構造と作製方法が比較的簡単である.細い金線を銀ペーストで接着した線路を用いて静磁波の励振を行なった.作製が簡単な金線を用いた線路でもマイクロストリップ線路に比べて挿入損失に関して遜色はなかった.つぎに, TE-TMモード変換の実験的確認を行なった.波長1.15μmのHe-Neレーザ光をプリズムを介してTEモードで伝搬させ,別のプリズムから取り出した光をGeフォトディテクタで検出した.マイクロ波スイープジェネレータから出力5mWを増巾器により,約500mWに増巾し,静磁波を励振させた.外部磁界520Oe,マイクロ波周波数2.25GHzにおいて0.98%のTE-TMモード変換効率を確認できた.微量のBiをドープすることによってファラデ効果を大きくすることができた.静磁波による磁気光学効果を用いた光モード変換素子用ガーネット結晶薄膜をRFスパッタリング法により作成する際,ファラデ効果を大きく,光伝搬損失,マイクロ波静磁波の伝搬損失を小さくする必要がある.基板温度を500°Cとして作成したアモルファス薄膜を1000°C,約6時間熱処理することによって再結晶化させると薄膜のマイクロ波静磁波の伝搬損失が小さくなることがしられた.膜厚を13μm変化させたとき,伝搬損失は膜厚が厚くなるに従い小さくなった.伝搬するマイクロ波の周波数は,印加される外部磁界の大きさで決まり,例えば, 900Oeで周波数4.5GHzであある.マイクロ波周波数を変えて静磁波の伝搬損失の周波数依存性について測定した結果,周波数が高くなるにつれて,その損失は大きくなり, 2.3GHzで約1.6dB/cm, 6.4GHzで12.8dB/cmとなった.ガーネット結晶薄膜にマイクロ波静磁波を効率よく励振させるために,マイクロ波用電極を2つの方法により作製した.金メッキしたアルミナ基板をフォトリソグラフィー法によって作製したマイクロストリップ線路と,構造と作製方法が比較的簡単である.細い金線を銀ペーストで接着した線路を用いて静磁波の励振を行なった.作製が簡単な金線を用いた線路でもマイクロストリップ線路に比べて挿入損失に関して遜色はなかった.つぎに, TE-TMモード変換の実験的確認を行なった.波長1.15μmのHe-Neレーザ光をプリズムを介してTEモードで伝搬させ,別のプリズムから取り出した光をGeフォトディテクタで検出した.マイクロ波スイープジェネレータから出力5mWを増巾器により,約500mWに増巾し,静磁波を励振させた.外部磁界520Oe,マイクロ波周波数2.25GHzにおいて0.98%のTE-TMモード変換効率を確認できた.微量のBiをドープすることによってファラデ効果を大きくすることができた.光モード変換素子用ガーネット結晶薄膜をRFスパッタリング法で作成する際、光伝搬損失,マイクロ波静磁波の伝搬損失を小さくすることが要求される。基板温度500°C前後で作成されたアモルファス薄膜を1000°C、約6時間熱処理することによって再結晶化させると、その薄膜のマイクロ波静磁波の伝搬損失が小さくなることがわかった。次にマイクロ波静磁波の伝搬損失のガーネット結晶薄膜膜厚依存性について調べた。膜厚を13μm変化させたとき、その伝搬損失は膜厚が厚くなるに従い小さくなった。伝搬するマイクロ波の周波数は印加される外部磁界の大きさで決まり、例えば、約900Oeで周波数4.5【GH_z】である。マイクロ波周波数を変えて静磁波の伝搬損失の周波数依存性について測定した結果、周波数が高くなるにつれて、その損失は大きくなり、2.3【GH_z】で約1.6dB/cm,6.4【GH_2】で12.8dB/cmとなった。ガーネット結晶薄膜にマイクロ波静磁波を効率よく励振させるために、マイクロ波用電極を2つの方法で作製した。金メッキしたアルミナ基板をフォトリソグラフィー法によって作製したマイクロストリップ線路と、構造と作製方法が比較的簡単である、細い金線を銀ペーストで接着した線路を用いて静磁波の励振を行なった。作製が簡単な金線を用いた線路でもマイクロストリップ線路に比べて挿入損失に関して遜色はなかった。次にTE-TMモード変換の実験的確認を行なった。

波長1.15μmのHe-Neレーザ光をプリズムを介してTEモードで伝搬させ、別のプリズムから取り出した光をGeフォトディラクタで検出した。マイクロ波スイープジェネレータからの出力5mWのパワを増幅器により、約500mWに増幅し、静磁波を励振させた。その結果、外部磁界520Oe、マイクロ波周波数2.25【GH_z】において0.98%のTE-TMモード変換効率を確認できた。
植物開花ホルモンによる花成促進・抑制の構造学的基盤

開花ホルモン・フロリゲンは植物で花が咲く時期を決定している蛋白質性のホルモンであり、2007年になって初めて同定された。これまで我々はフロリゲンの新規細胞内受容体を発見し、花成の分子機構を明らかにしてきた。最近、この受容体は花成期だけでなく栄養成長期においても中心的な役割を担っていることが判明し、従来の開花制御機構の概念を新たに組み直す必要が出てきている。そこで本研究では生化学と構造生物学の手法を駆使し、この新規受容体を含む2種類のフロリゲン複合体(花成期の活性化複合体と成長期の抑制複合体)、及び関連した転写複合体の解析を行い、開花の促進・抑制の分子制御機構の全貌を解明する事を目的としている。さらに、人工的に改良したフロリゲンと開花制御機構の情報を用いた植物改変・育種技術への応用も目指している。本研究においては研究項目を大きく2つ(項目1「フロリゲンと花成リプレッサーによる花成制御の分子機構の全貌解明」、項目2「分子機能に基づくフロリゲンの改変と植物導入技術開発、植物改良への応用」)に分けて研究を進め、フロリゲンの開花制御機構に関する新たな知見と応用技術を得ることを目的とする。初年度は(項目1)フロリゲンと花成リプレッサーによる花成制御の分子機構の解明を進めた。栄養成長期に開花の抑制をになう花成リプレッサーに注目し、その制御機構を調べるために構造解析を行い、花成リプレッサーと受容体からなる複合体(抑制複合体)の分子構造を高分解能で決定する事に成功した。既に構造が得られていたフロリゲン-受容体からなる「活性化複合体」と新たに得られた「抑制複合体」との立体構造比較から、受容体上でフロリゲンと花成リプレッサーが競合し置き換わる開花促進抑制の切り替えモデルを構築した。また、フロリゲン上に存在し開花機能に関与するポケット構造に結合する生理活性分子を発見し、詳細な解析を行った。ほぼ当初計画していた通りに研究が進展している今後も当初の計画通り、着実に研究を進める。(項目1)構造情報より得られた開花の促進抑制切り替えモデルを証明するため、受容体への競合メカニズムをNMR法と生化学的なプルダウン実験を使った定量的な結合アッセイで解明する。また新たに発見した生理活性分子の影響も調べる。(項目2)これまでにフロリゲンの受容体結合部位にアミノ酸変異を入れ、花成機能を調整した改良フロリゲンの開発に成功している。ただ植物によっては花成が早すぎると成長不足で種子形成不全が起こるため、作成した変異イネの表現型と茎頂組織、種子の稔性と遺伝子発現プロファイルを解析し早花の影響を明らかにする。植物への導入技術は、まずはシロイヌナズナで検証を行う。また導入補助因子(界面活性剤等)探索や花成リプレッサーの同時導入等による開花制御能の向上を行う。

ただ植物によっては花成が早すぎると成長不足で種子形成不全が起こるため、作成した変異イネの表現型と茎頂組織、種子の稔性と遺伝子発現プロファイルを解析し早花の影響を明らかにする。植物への導入技術は、まずはシロイヌナズナで検証を行う。また導入補助因子(界面活性剤等)探索や花成リプレッサーの同時導入等による開花制御能の向上を行う。(理由)花成抑制の分子機構解析の研究計画が順調に進み、次年度以降のフロリゲン機能改変実験をより効率的に進めるために繰越しを行った。計画には変更はない。(使用計画)次年度計画の新たな機能改変実験の準備のために使用する。
抗体微細構造が微生物における発現・分泌に与える影響の系統的解析と汎用生産系の開発

73個および83個のアミノ酸からなるリンカーペプチドにより連結された単鎖Fab遺伝子を作製し、Bacillus brevisにおいて発現させた。これらの遺伝子の発現効率はほぼ等しく(200mg/l)、前年度に作製した63個のアミノ酸からなるリンカーペプチドにより連結された単鎖Fab遺伝子の発現効率の約2倍であった。この結果より、単鎖FabをB.brevisにおいて効率よく発現させるために必要なリンカーペプチドの長さは7080アミノ酸であると考えられる。B.brevisに見いだされたコピー数が低いクリプティクプラスミドであるpWT481を用いて新しい高効率抗体発現ベクターを構築するため、その構造と機能の解析を前年度に引き続き行った。見いだされたORFを欠失させて解析した結果、ORF3は宿主菌の増殖定常期における生存率を高める機能を持つことが明らかとなった。ORF3はこの機能を付与することにより、宿主菌において安定に維持されていると考えられる。またORF2の欠失はプラスミド安定性および宿主増殖能、生存能に影響を与えないことも明らかとなった。現在、ORF2欠失プラスミドを用いて作製した発現・分泌ベクターによるFabの生産を試みつつある。様々な欠失を導入したCH1ドメインの前半部cDNAをBacillus licheniformisのα-アミラーゼ(BLA)遺伝子の上流に融合させ、B.brevisで発現させた。培養液中に分泌された遺伝子産物の定量を抗BLA抗体を用いたウェスタンブロット法により行った結果、CH1ドメインN-末端の4つの残基の中にB.brevisにおける発現あるいは分泌を阻害するアミノ酸残基が含まれていることが示唆された。これまでの各種宿主ベクター系による抗体生産例は用いられた宿主、ベクター、シグナルペプチド等が様々であり、それらの生産効率の差が何に起因するのか判定できない。そこで大腸菌において高効率に生産されたヒト腫瘍抗原に対するヒト化マウスIgG1Fab′断片の遺伝子をBacillus brevis発現分泌ベクターに導入して、既にB.brevisにおいて発現に成功している抗ヒトウロキナーゼIgG1Fab′との生産効率の比較を行った。現在までに構築した抗ヒト腫瘍抗原IgG1Fab′発現分泌ベクターにおいては転写開始領域のみがB.brevis由来のものであり、翻訳開始領域及びシグナルペプチドは大腸菌由来のものである。それにも関らず、抗ヒト腫瘍抗原IgG1Fab′は抗ヒトウロキナーゼIgG1Fab′より数倍高い生産効率を示した。現在、翻訳開始領域及びシグナルペプチドをB.brevis由来のものと置換することにより一層高い生産効率が得られるか否か、また二つのFab′のアミノ酸配列のどのような違いが生産効率の差の原因となっているかを解析しつつある。さらに二つのFab′の立体構造にどのような差があるかを調べるため、抗ヒトウロキナーゼIgG1Fab′の立体構造予測を行った。一方ではB.brevisにおける遺伝子操作の能率を高めるため、B.brevisの形質転換法の改良を行い、以前の方法と比べて約20倍高い形質転換効率を得ることに成功した。また、B.brevisにおけるヒト遺伝子発現について、その産物のアミノ酸配列との相関性に関する情報を蓄積するため、ヒトインターロイキン2、成長ホルモン及びエリスロポイエチンのB.brevisによる生産を行った。B.brevis由来の転写開始領域と大腸菌由来の翻訳開始領域及びシグナルペプチドからなる抗ヒト白血球抗原IgG1Fab発現分泌ベクターによるFabの生産量は抗ヒトウロキナーゼIgGIFabより数倍高い生産効率を示した。前者のH鎖遺伝子の翻訳開始領域及びシグナルペプチドをB.brevis由来のものと置換したところ、Fabの生産量は約4分の1に減少した。この結果は大腸菌由来のシグナルペプチドの方がB.brevis由来のものよりH鎖の発現に適していることを示唆している。

S-S結合形成を促進するB.brevisの細胞外酵素であるBdbを共発現させてFabの生産量に対する影響を調べたが、促進効果は観察されなかった。抗ヒトウロキナーゼIgG1FabのL鎖遺伝子の下流にBacillus licheniformisのα-アミラーゼの遺伝子を融合させて、その発現について解析した。このアミラーゼはB,brevis系において大量に生産されることがら、転写、翻訳、分泌過程において障害となるアミノ酸配列を含まず、分泌後のタンパク質としての安定性も非常に高いと考えられる。融合遺伝子の産物は培地中に分泌されたが、L鎖部分が分解され、α-アミラーゼ部分が培地中に蓄積した。その量はα-アミラーゼ遺伝子を単独で発現させた場合とほぼ同量であった。この結果は抗ヒトウロキナーゼIgG1FabのL鎖はBbrevisにおける転写、翻訳、分泌過程を阻害するアミノ酸配列を含まないが、分泌後に分解されやすいことを示している。現在H鎖のアミノ酸配列について同様な解析を行いつつある。前年度に作製してB.brevisにおける発現に成功した63個のアミノ酸からなるリンカーペプチドにより連結された単鎖Fabについて立体構造予測を行った。先ず、FabのL鎖C末端にリンカーペプチドを接続し、徐々に2面角を変えながらH鎖N末端に連結した。連結後、リンカーペプチド部分で局所的エネルギーの極小化計算を行い、次にFabを含めた分子全体でエネルギーの極小化計算を行った。この結果、リンカーペプチド挿入前と挿入後でFabの構造はほとんど変化しないことが確かめられた。B.brevisに見いだされるクリプティクプラスミドをベクターとした場合に培養中の組み換えプラスミドの安定性が高く、高い生産効率が得られることがわかっている。またいくつかのタンパク質について、過剰に発現させるよりも低いレベルで持続的に発現させる方が最終的に得られる産物の量が多くなることが示されている。そこでコピー数が低いB.brevisクリプティクプラスミドであるpWT481の構造と機能を解析し、新しい高効率抗体発現ベクターの構築を試みることとした。先ずpWT481の全塩基配列を決定した。pWT481は2471ヌクレオチドからなり、その塩基配列中に3個のORF(ORF1ORF3)が見出された。ORF1がコードするタンパク質のアミノ酸配列はStaphylococcus aureusのプラスミドpT181のRep高い相同性を示した。複製中間体である一本鎖DNAが検出されたことから、pWT481はpT181グループに属し、ローリングサークル型の複製を行うプラスミドであると考えられる。ORF2とORF3のそれぞれを欠失させたところ、いずれの欠失プラスミドもB.brevisにおいて安定に保持された。これらの欠失プラスミドを用いて抗体断片の発現・分泌ベクターを構築中である。
性能照査設計法における鋼橋床版の疲労照査方法に関する研究

床版は直接荷重を受けるため,性能照査設計法における要求性能のうち疲労強度が最も重要になる。本研究においては疲労強度の照査方法を検討した。本来床版構造物が受ける荷重は繰返し荷重であると同時に走行荷重でもある。そこで本研究では,疲労強度に関連する研究と同時に輪荷重走行試験機での疲労強度を実験的に調べた。一般に疲労強度は静的強度および繰返し回数に大きく関係し,これらに関する検討が必要となり,次のような要領で実験を行った。まず,静的押抜きせん断強度を的確に評価するための評価式を作成し,さらに評価式に対するばらつきの検討を行った。さらに,山口大学・工学部の輪荷重走行試験機による実験結果から繰返し回数に対する評価を行った。供試体は実床版をモデル化したものの他に,実床版と同等のものも実験を行った。その結果,本来のコンクリート設計強度であれば十分耐えうることが判明した。また,適切にモデル化を行えば,疲労照査が十分可能であることも判明した。これらの結果を踏まえ,日本鋼構造協会で鋼構造物性能照査設計法の中で床版に関する性能照査設計法を取りまとめた。また,土木学会鋼構造委員会の床版に関する研究科委員会では性能照査設計法部会を作り,浜田純夫が主査となって作成した。これらの性能照査設計法において疲労照査における荷重は従来の調査から求められ,また繰返し回数も調査から判明することがわかった。また,照査方法についても一部記述できた。限界状態設計法においては、材料、部材、構造解析等にそれぞれの安全係数が適用されている。面部材の設計押抜きせん断強度に対しては材料係数と部材係数を用いて安全性の確認をしている。この材料係数と部材係数はともに1.3が用いられている。本来、これらの係数は何らかの論理に基づくべきもので、「一般に1.3」の「一般」あるいは「一般でない場合」がどのような場合かは規定されていない。本研究においては部材係数の根拠を求めるため、コンクリート標準示方書の設計押抜きせん断耐力式に対し、従来の実験と対比し、部材係数の算出を試みた。なお、部材係数は実験値のばらつきが関係しており、設計算定式が異なれば必然的に部材係数は異なる。つまり、実験値に対して極めて良い算定式であれば安全係数はそれだけ低い値をとることができる。示方書のように極力簡単な式で示すように求められた式ではばらつき(変動係数)は大きくなり、それだけ大きい部材係数が必要となる。コンクリート標準示方書の設計押抜きせん断強度式に限らず、ACI式、角田らの提案式、松井らの提案式、および著者らの松井の提案する式の修正式に対しそれぞれの部材係数を求めた。すなわち、各算定式により得られた計算値に対する実験値の比を確率変数とし、この値が各確率密度分布関数に従うと仮定して求めた破壊確率より部材安全係数を算出し、その妥当性について論じた。その結果、現在の示方書にて用いられている床版の押抜きせん断強度算定式の部材安全係数1.3は、計算値に対する実験値の値が正規分布関数に従うと仮定した場合、破壊確率において1%以上となった。また、Weibull分布関数に従うと仮定した場合は1%以下となった。すなわち現行の値は妥当であると考えられる。また、角田らの提案式や松井らの提案式を用いる場合は、示方書の式よりも精度がよいため部材安全係数を現在より小さく設定できる。

RC構造物の設計を限界状態設計法に基づいて行う場合,種々の安全係数が用いられる.コンクリート標準示方書では,面部材の押抜きせん断強度の部材係数を1.3としているが,この値の論理的な根拠は明らかではない.本研究では部材係数の根拠を探るべく,RC床版に関する算定式12式,PC床版に関する算定式2式を研究対象とし,山口大学で行った21体を含む計297体のRC床版データと,計45体のPC床版データを各算定式に照合し,確率統計的に部材係数を求めた.すなわち,計算値に対する実験値の比を確率変数とし,正規分布関数,Weibull分布関数,指数分布関数に適合させた.RC床版に関する算定式では各算定式の精度,安全性を明らかにした.また,データの絞り込みにより累積破壊確率の小さい部分での適合性が良くなることが分かった.Weibull分布関数では,3つの係数を求めるときに分割和法を用いたが,3個の代表点をどのように与えるかを議論した.その結果,破壊確率の小さい部分での適合性について,全データを対象とした場合でも重みをつけた分割方法であれば適合性が良いことが分かった.指数分布関数に適用する場合は,その特徴から,実験値を基準に算定値を評価した.その結果,指数分布関数は正規分布関数と同様で,対象データ数を絞った場合が危険側での適合性が向上した.以上から部材係数を算出した結果,正規分布関数では破壊確率5%で約1.24となった.また海外示方書式における破壊確率5%では,1.14から1.46の範囲に,その他各研究者による算定式では,1.31から1.79の範囲になった.RC床版は脆性破壊を示すため破壊確率は1%程度で論ずる必要があるが,示方書式において破壊確率1%で約1.50という値が得られた.実際は,示方書ではコンクリート設計強度を規格値に示し,1.3の材料係数を用いている.算定式中ではその平方根を用いるため,この材料強度に関する安全係数は約1.14となる.この材料係数と部材係数1.3を含めれば式全体での安全係数は1.48となり,現示方書での部材係数1.3は破壊確率1%に相当することが明らかになった.床版は直接荷重を受けるため,性能照査設計法における要求性能のうち疲労強度が最も重要になる。本研究においては疲労強度の照査方法を検討した。本来床版構造物が受ける荷重は繰返し荷重であると同時に走行荷重でもある。そこで本研究では,疲労強度に関連する研究と同時に輪荷重走行試験機での疲労強度を実験的に調べた。一般に疲労強度は静的強度および繰返し回数に大きく関係し,これらに関する検討が必要となり,次のような要領で実験を行った。まず,静的押抜きせん断強度を的確に評価するための評価式を作成し,さらに評価式に対するばらつきの検討を行った。さらに,山口大学・工学部の輪荷重走行試験機による実験結果から繰返し回数に対する評価を行った。供試体は実床版をモデル化したものの他に,実床版と同等のものも実験を行った。その結果,本来のコンクリート設計強度であれば十分耐えうることが判明した。また,適切にモデル化を行えば,疲労照査が十分可能であることも判明した。これらの結果を踏まえ,日本鋼構造協会で鋼構造物性能照査設計法の中で床版に関する性能照査設計法を取りまとめた。また,土木学会鋼構造委員会の床版に関する研究科委員会では性能照査設計法部会を作り,浜田純夫が主査となって作成した。これらの性能照査設計法において疲労照査における荷重は従来の調査から求められ,また繰返し回数も調査から判明することがわかった。また,照査方法についても一部記述できた。
アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを使用した白血病に対する遺伝子治療の基礎的研究

アデノ随伴ウイルス(AAV)の遺伝子治療への応用に有利な特性を認識し、基礎的な研究から、レトロウイルスベクターで当時行なわれていた臨床応用までの幅広い研究をAAVにおいて計画した。内容としてはマーカー遺伝子を利用したAAVの各種細胞への導入に対する検討、ベクター産生システムの開発、治療標的遺伝子も用いた研究である。(研究結果)A)マーカー遺伝子を利用した各種細胞への遺伝子導入の検討1)血液幹細胞への遺伝子導入の検討血液幹細胞への導入はMOI1で1%以上の導入効率が確認された。また各種サイトカインによる導入効率の変化はなかった。2)白血病細胞への遺伝子導入の検討ネオ耐性遺伝子の各種白血病細胞株への導入効率はMOl (multiplicity of infection)が1で1%以下であり、レトロウイルスのそれと同じであった。導入効率はMOlとリニアーな関係にあり、慢性骨髄性白血病由来株で高く、Tリンパ球白血病由来株で低かった。3)肝細胞への遺伝子導入の検討各種間細胞株での導入効率は極めて高いことが確認された。4)グリオーマ細胞への遺伝子導入の検討当脳外科との共同研究で各種脳腫瘍細胞株への遺伝子導入効率を検討し、その後Tk遺伝子によるヒトグリオーマ細胞の遺伝子治療モデルをマウスで完成させた。5)Tリンパ球への遺伝子導入の検討Tリンパ球に対してのAAVベクターでの導入効率は低い。B)リコンビナントAAVの性質の基礎的研究1)インテグレーション部位サザン法やFISHにより、ネオ耐性遺伝子がホストDNAに組み込まれていることが確認されたが、そのインテグテーション部位はランダムであった。2) AAV遺伝子に働く細胞内蛋白AAVのP5プロモータ領域にNF-IL6の結合モチーフがあることに注目し、プロモーター活性やウイルス産生におけるMF-IL6の影響を検討した。C)AAVベクターの導入効率改善の研究(組み替え抗CD34抗体のついたAAVキャプシドの作成)AAVの血液幹細胞への導入効率を高めるためにSCFおよびCD34に対する単鎖免疫グロブリンをAAVの殻につけることを研究している。(まとめ)Neo耐性遺伝子を用いてた各種細胞へのAAVの導入効率、挿入部位などの基礎的研究をほぼ終了した。とくにFISIIを使った系での、ランダムインレグレーションを証明できた(A、B)。パッケージセルラインの確立を含むAAVの産生システムは我々の独創性を生かし、持続的に研究を継続的に続けていく予定である(C)。平成7年度の研究計画・方法に基づいて以下の研究を行なった。マーカー遺伝子としてNeomycin耐性遺伝子を組み込んだAAVベクターであるpHS2/Ag^*/Neoと新たにpAAV/nNeoを作成し、これらをヘルパーウイルスと一緒にアデノ5型に既感染したHeLa細胞に感染させウイルス上清を得た。

ウイルス上清のtiterは既存の方法で測定するとともにMOIを求め、MOI=0.1の条件にて各種ヒト白血病細胞株に感染させ、G418を選択マーカーにして、コロニー法および限界希釈法により遺伝子の導入効率を調べた。(2)MOIと遺伝子導入効率との間にはあきらかに正の相関関係を認めた。(3)コロニー法で得られたクローン毎にサザン法、PCR法により導入された遺伝子が染色体遺伝子のなかに存在すること、またFISH法によりrAAVでは染色体のさまざまな場所に遺伝子が挿入されていることを見い出した。これらの研究成果に関して欧文の論文を準備中である。アデノ随伴ウイルス(AAV)の遺伝子治療への応用に有利な特性を認識し、基礎的な研究から、レトロウイルスベクターで当時行なわれていた臨床応用までの幅広い研究をAAVにおいて計画した。内容としてはマーカー遺伝子を利用したAAVの各種細胞への導入に対する検討、ベクター産生システムの開発、治療標的遺伝子も用いた研究である。(研究結果)A)マーカー遺伝子を利用した各種細胞への遺伝子導入の検討1)血液幹細胞への遺伝子導入の検討血液幹細胞への導入はMOl1で1%以上の導入効率が確認された。また各種サイトカインによる導入効率の変化はなかった。2)白血病細胞への遺伝子導入の検討ネオ耐性遺伝子の各種白血病細胞株への導入効率はMOl(multiplicity of infection)が1で1%以下であり、レトロウイルスのそれと同じであった。導入効率はMOlとリニアーな関係にあり、慢性骨髄性白血病由来株で高く、Tリンパ球性白血病由来株で低かった。3)肝細胞への遺伝子導入の検討各種間細胞株での導入効率は極めて高いことが確認された。4)グリオーマ細胞への遺伝子導入の検討当脳外科との共同研究で各種脳腫瘍細胞株への遺伝子導入効率を検討し、その後Tk遺伝子によるヒトグリオーマ細胞の遺伝子治療モデルをマウスで完成させた。5)Tリンパ球への遺伝子導入の検討Tリンパ球に対してのAAVベクターでの導入効率は低い。B)リコンビナントAAVの性質の基礎的研究1)インテグレーション部位サザン法やFISHにより、ネオ耐性遺伝子がホストDNAに組み込まれていることが確認されたが、そのインテグテーション部位はランダムであった。2)AAV遺伝子に働く細胞内蛋白AAVのP5プロモータ領域にNF-IL6の結合モチーフがあることに注目し、プロモーター活性やウイルス産生におけるNF-IL6の影響を検討した。C)AAVベクターの導入効率改善の研究(組み替え抗CD34抗体のついたAAVキャプシドの作成)AAVの血液幹細胞への導入効率を高めるためにSCFおよびCD34に対する単鎖免疫グロブリンをAAVの殻につけることを研究している。(まとめ)Neo耐性遺伝子を用いてた各種細胞へのAAVの導入効率、挿入部位などの基礎的研究をほぼ終了した。
光学的p38活性制御により明らかになる細胞増殖抑制シグナルの時間情報コーディング

抗癌剤や炎症性サイトカインなどの刺激の種類に依存して、刺激を受けた細胞内シグナルは非常に動的な時間・空間的変動を示すことが明らかになっている。本研究では、p38の動的な挙動が癌細胞の増殖および増殖抑制の細胞内シグナルにどのように寄与するかを明らかにすることを目的とする。そのために、生細胞内のp38の酵素活性を任意の細胞内部位およびタイミングで人為的に誘導する新規の光操作実験系を構築し、これを用いて、細胞機能におけるp38動態の生理的意義を解明する。
日本の食料調達をめぐる国際価値連鎖の変動に関する体系的研究

本研究は,1980年代後半からの日本企業による「開発輸入」を通じて海外に形成された日本企業主導の農産物の国際価値連鎖の変動について,その全体像を把握するとともに,変動に対する体系的な説明を試みるものである.3年目までの研究期間で,1980年代後半当初の日本企業主導の食料調達様式が解消されて現地企業との相対取引が主体となっていること,その背後には,進出先企業の能力向上,進出先および第3国市場における市場拡大,日本企業の購買力低下といった要因が強く働いていること,それらの動態は品目間で違いがあり上記の諸要因が変動の経路を規定していることなど,研究の主要な成果が得られていた.ただし,1こうした食料調達様式の変動を品目横断的,定量的に示すことができていない点,2個別事例において連鎖の変化を堅牢に実証するための現地調査が不足している点,3成果の取りまとめとその公表が遅れている点に,課題が残されていた.最終年度である4年目は,2については,特定の品目における個別企業の海外進出の変動を裏付ける聞き取り調査や文献資料の収集を継続した.3については,ドイツで行われた国際経済地理学会において成果の一部を学会報告するとともに,論文執筆を進めた.他方で,1については,既存の統計や資料だけではこれを捕捉できず,独自の調査票に基づいた大規模なサーベイを実施するか,多数の人員を動員しての定型的な聞き取り調査を行う必要があると考えられた.予算と時間の制約から,本研究ではこうした確度の高い分析は断念せざるを得ず,今後の課題として取り組む必要がある.初年度である平成27年度は,財務省貿易統計を利用して,各品目の輸入量,輸入額,輸入国等の経年変化を把握するとともに,FAOSTAT,農林水産省作物統計等により当該品目の海外および国内での生産量,消費量等の変化を把握し,研究の基礎資料となる品目ごとの変動についてのデータベースを作成した.また,名鑑や業界団体の所有するリストに基づきながら,商品連鎖に関わる日本側の企業群とその経年変化の把握を試みた.同時に,既に研究者自身による調査実績があったカボチャおよび牛肉部門に関して,国内外で卸売業者や生産者への聞き取り調査を実施し,1990年代からの国際価値連鎖の変容という視点から,輸入量の変動とそれに伴う日本の輸入業者群,海外の輸出業者群や生産者群の変動を整理しなおした.これらの予察的作業を通じて,日本の食料調達をめぐる連鎖とその変化を網羅的に把握するための基礎となる情報が得られたほか,連鎖を変動させる重要な要因として,川下の国内スーパーマーケットの巨大化,中国をはじめとしたアジア諸国における食料需要の量的・質的変化,川上である産地側の資本・技術の蓄積といった要因が示唆された.2年目となる平成28年度は,収集したデータベースの解析を進めるとともに,カボチャや牛肉以外の品目についても連鎖の変動を把握し,国際価値連鎖の変動のパターンに関する類型化を進めていきたい.また,国際価値連鎖アプローチに関する文献講読を進め,分析枠組みの精緻化を図っていきたい.初年度は,おおむね計画通りに研究を遂行できたものの,他の業務との兼ね合いがあり,当初計画していた海外での国際価値連鎖アプローチに関する学術ワークショップに参加できなかった.また,市販の年鑑やリストから商品連鎖に関わる日本の輸入企業を網羅的に把握するのは,精度の面でやや難しかった.これらを補う作業が,次年度以降必要であると考えている.2年目である平成28年度は,1昨年度に引き続き,財務省貿易統計,農水省作物統計,FAOSTAT等を利用して,各品目の輸入量,輸入額,輸入国,国内生産量,海外生産量等の経年変化を把握した.加えて,名鑑や業界団体の所有するリストに基づいて,各品目の輸入に関わる日本側の企業群を把握した.これらを通じて日本の各品目におけるデータベースを完結させた.さらにそのうえで,個別品目における国際価値連鎖の変動パターンに関する類型化を行った.2また,国際価値連鎖をめぐる文献講読を進め,日本の食料調達の変化を説明するうえでの方法論を精緻化し,価値連鎖の動態を説明する枠組みについて具体的に検討した.加えて,3既に研究者自身による研究実績があったカボチャおよび牛肉(wagyu),コメ,水産物の各部門について,国内外の卸売業者および生産者に対する調査結果を改めて整理した.両品目における価値連鎖の変化を分析するとともに,カボチャおよび牛肉に関しては関連する論文を執筆した.最終年度である平成29年度は,昨年度まで十分に実施できていなかった,国内外における,生産者,卸売業者,輸出業者,金融業者等への聞き取り調査を進め,連鎖の変動の背後にあったメカニズムを理解する.そのうえで,国際価値連鎖アプローチに基づいた具体的な分析枠組みに即して日本の食料調達様式の変化を体系的に説明したい.これらの成果をもとに,国内外の権威ある査読付き学会誌への論文投稿を行うことを予定している.調査結果の一部を論文にすることができ,また,研究枠組みに関わる文献講読によって方法論上の整理を進められたが,現地調査に行く十分な時間を確保できなかったため,連鎖の変動メカニズムをめぐる将来な分析が進んでいない面がある.3年目となる平成29年度は,1農産物輸出・輸入に関する国内地域の事業者(生産者,卸売業者,輸入業者等)へのインタビュー調査を行うとともに,2引き続き連鎖の変動をめぐる文献・資料の収集を行うことにより,日本の食料調達の変化のパターンを類型化し精緻化した.これらの結果,以下の動態が整理された.まず,日本の食料調達様式は,1全体としては,日本企業が開発輸入を目的として海外進出した1980年代後半当初の垂直的な食料調達様式は大きく崩れており,水平的・相対的な取引関係へと移行しつつある.

2その背後には,日本企業の購買力低下,進出先企業の能力向上,進出先および第3国市場における市場拡大といった要因が強く働いている.ただし,3こうした連鎖の動態には品目間で違いがあり,日本企業と進出先企業との期初の資本・技術力の違いや,第3国への当該品目の市場の広がり,当該品目の生産・流通に要する技術・資本の高低といった諸条件が,動態の経路を強く規定している.4以上の諸条件を踏まえることにより,今後の日本の海外食料調達様式の変化についても,その展開をある程度見通すことができる.以上の成果は,日本の食料調達様式の変化をめぐる重要な知見であると考えられるが,これを堅牢に実証するための現地調査と成果公表が十分には実施できていない.このため,研究期間を延長して平成30年度にも現地調査および資料分析を続け,また,国内外で研究成果報告を行いたい.平成29年度は食料調達様式の変動をめぐる動態を整理でき,充実した成果が得られた.ただし,それを堅牢に実証するためには追加的に現地調査が必要であり,研究期間を延長した.本研究は,1980年代後半からの日本企業による「開発輸入」を通じて海外に形成された日本企業主導の農産物の国際価値連鎖の変動について,その全体像を把握するとともに,変動に対する体系的な説明を試みるものである.3年目までの研究期間で,1980年代後半当初の日本企業主導の食料調達様式が解消されて現地企業との相対取引が主体となっていること,その背後には,進出先企業の能力向上,進出先および第3国市場における市場拡大,日本企業の購買力低下といった要因が強く働いていること,それらの動態は品目間で違いがあり上記の諸要因が変動の経路を規定していることなど,研究の主要な成果が得られていた.ただし,1こうした食料調達様式の変動を品目
核内受容体ＥＲＲγを介したビスフェノールＡのシグナル毒性の分子機構解明

ビスフェノールA(BPA)はポリカーボネートや高分子接着剤の原料として用いられる低分子化合物である一方で、ごく微量で胎児・乳幼児に悪影響を及ぼす内分泌撹乱物質として懸念されている。このBPA作用メカニズムとしてBPAが非常に強く結合する核内受容体ERRγを介した内分泌撹乱作用が考えられている。本研究の目的は、核内受容体ERRγを介したBPAのシグナル毒性の分子メカニズムを解明し、BPAの低用量効果の分子機構を明らかにすることである。BPAによるDNAメチル化、脱メチル化の可能性を検証するため、実験系の構築に取り組んだ。前年度の報告書で「Hela細胞に内在するDNAがBPAによってメチル化または脱メチル化されるか」の検証について報告したが、今回はこの結果を再現するかを再検証した。実験の結果、以前の報告同様BPAを暴露したものは暴露していないものと比較して、DNA全体のメチル化総量が減少していた。どのような機構でメチル化が減少しているかは明らかにできなかったが、BPAが遺伝子のメチル化量に影響することが明らかになった。ビスフェノールA標的核内受容体の予測法を開発するため、結合試験の結果とドッキング計算の結果の相関性を検証し、検量線を作成した。この検量線から最も強く結合すると予測された甲状腺ホルモン受容体(TR)についてレポーター遺伝子アッセイによる活性測定を行ったが、BPAの活性は見られなかった。しかし、常に高い活性を示す自発活性化型核内受容体とTRを共発現させたとき、エストロゲン関連受容体(ERR)を含むいくつかの受容体によってTRの活性が増強されることを明らかにした。この実験系でBPAの活性を測定するとTR単独の時には見られなかった活性がわずかに見られたことからBPAがTRにも結合する可能性が示唆され、BPA標的核内受容体の探索法の完成に一歩近づくことができた。28年度が最終年度であるため、記入しない。ビスフェノールA(BPA)はポリカーボネート樹脂や接着剤の原料として用いられる低分子化合物である。一方、ごく微量で胎児や乳幼児に悪影響を及ぼす内分泌撹乱物質であり、その原因の一つとしてBPAが非常に強く結合する核内受容体ERRγを介した内分泌撹乱作用が考えられている。本研究の目的は、ERRγを介したBPAのシグナル毒性の分子メカニズムを解明し、その低用量効果の実体を明らかにすることである。ショウジョウバエにBPAを食餌させると多動性になり、明期、暗期共に活動量が増加する明期暗期多動性ハエ、明期だけに増加する明期多動性ハエが存在する。本年度はこれらBPA食餌ハエについて、時計遺伝子periodの3' RACEによるmRNA塩基配列解析を行った。その結果、3' UTRにいくつかの点変異、さらには核酸塩基挿入を発見した。3' UTRにはmiRNAが結合し、その発現を調節する領域である。このため、今回発見された変異や挿入がmRNAの発現調節に影響する可能性があり、特異的なmiRNAの存否の検討が必要なことが判明した。また、ERRγ以外の受容体を介した低用量効果の可能性もあるため、BPA標的核内受容体の計算化学予測法の開発に取り組んだ。そして、計算化学の結果と結合試験の結果の間に有意な相関を見出し、これに基づいてBPA結合性の指標作成に成就した。さらに、この指標からBPA標的の核内受容体候補がいくつか見出された。BPAによるメチル化問題では実験系構築に鋭意に取り組んでいる。例えば、必要なプラスミド作製では天然の塩基配列を参考にしながらデザイン・調製を実施している。しかしながら、現在まで有効な実験系の作出までに至っていない。BPAはDNAをメチル化、脱メチル化する可能性があり、これがシグナル毒性の分子機構解明につながる可能性がある。本年度は、BPAによる遺伝子のメチル化、脱メチル化を検証する実験系の構築に取り組んだ。DNAのメチル化は遺伝子上のCpGアイランドと呼ばれるCとGが多く存在する領域で起こる。したがって、人工的なCpGアイランドを挿入したプラスミドと実際のCpGアイランドをクローニングし、その遺伝子を挿入したプラスミドの作製を試みた。作製予定の8つのプラスミドのうち3つは作製が完了している。今後は、残りのプラスミドを作製すると共に作製したプラスミドを細胞に導入し、BPAのメチル化への影響を調べる。また、ヒト子宮頸がん由来のHela細胞を用いた実験系の構築のため、Hela細胞に内在するDNAがBPAによってメチル化または脱メチル化されるかを検証した。その結果、BPAを暴露した細胞のDNAは暴露されていないものより、メチル化の総量が減少しており、シトシンが脱メチル化されていることがわかった。今後は、特定の遺伝子の配列に対してBisulfite試験を行い、どの遺伝子がBPAによってメチル化または脱メチル化を受けているのかを調べる。

BPA標的核内受容体の探索についても取り組んでおり、甲状腺ホルモン受容体に結合する可能性が予想された。現在、結合試験系構築に取り組むと同時に活性試験も行っている。2年目の計画である細胞を用いたBPAによるDNAメチル化の検証実験系の構築については、今までに行われていない実験であるため実験系のデザインを行った。実験に必要なプラスミドの作製や細胞を用いたメチル化実験の検証などを行うことで検証実験系の構築に向け確実に進展している。また、3年目に計画していた「ビスフェノールA標的核内受容体の予測法の開発」にも取り組み、甲状腺ホルモン受容体にBPAが結合する可能性が予想された。さらに甲状腺ホルモン受容体の活性試験を行ったところ、特定の核内受容体と共存させることで活性が増強される増強効果を発見した。このことから、おおむね順調に進展していると言える。ビスフェノールA(BPA)はポリカーボネートや高分子接着剤の原料として用いられる低分子化合物である一方で、ごく微量で胎児・乳幼児に悪影響を及ぼす内分泌撹乱物質として懸念されている。このBPA作用メカニズムとしてBPAが非常に強く結合する核内受容体ERRγを介した内分泌撹乱作用が考えられている。本研究の目的は、核内受容体ERRγを介したBPAのシグナル毒性の分子メカニズムを解明し、BPAの低用量効果の分子機構を明らかにすることである。BPAによるDNAメチル化、脱メチル化の可能性を検証するため、実験系の構築に取り組んだ。前年度の報告書で「Hela細胞に内在するDNAがBPAによってメチル化または脱メチル化されるか」の検証について報告したが、今回はこの結果を再現するかを再検証した。実験の結果、以前の報告同様BPAを暴露したものは暴露していないものと比較して、DNA全体のメチル化総量が減少していた。どのような機構でメチル化が減少しているかは明らかにできなかったが、BPAが遺伝子のメチル化量に影響することが明らかになった。ビスフェノールA標的核内受容体の予測法を開発するため、結合試験の結果とドッキング計算の結果の相関性を検証し、検量線を作成した。この検量線から最も強く結合すると予測された甲状腺ホルモン受容体(TR)についてレポーター遺伝子アッセイによる活性測定を行ったが、BPAの活性は見られなかった。しかし、常に高い活性を示す自発活性化型核内受容体とTRを共発現させたとき、エストロゲン関連受容体(ERR)を含むいくつかの受容体によってTRの活性が増強されることを明らかにした。この実験系でBPAの活性を測定するとTR単独の時には見られなかった活性がわずかに見られたことからBPAがTRにも結合する可能性が示唆され、BPA標的核内受容体の探索法の完成に一歩近づくことができた。1年目の計画はビスフェノールA食餌のショウジョウバエ、マウスの時計遺伝子period mRNAにおける突然変異の同定であり、ショウジョウバエについては3'UTRにおいて点変異および核酸塩基挿入を発見した。また、3年目に計画していた「ビスフェノールA標的核内受容体の予測法の開発」にも取り組み、BPA結合性の指標作成に成就した。さらには2年目に計画していた「ビスフェノールAによるメチル化を検証する実験系の構築」にも取り組んでいる。
日本版デュアルシステムの導入過程・試行実態に関する伴走的調査

本企画調査では、(1)日本版デュアルシステムはどのような政策状況や教育訓練ニーズに対応しようとしているか、(2)個々の機関等の取組のねらいは何か、(3)「デュアル」教育訓練の形態・中身、(4)教育訓練機関と受け入れ企業との連絡・連携体制、受け入れ企業の開拓方法、(5)教育訓練修了時の能力証明の方法、(6)雇用(契約)への転換可能性とその実績、(7)生徒・訓練生の能力・職業観の特徴などに関して、高等学校、専門学校、職業能力開発の各機関と企業等との連携事業の実態を、全国的に調査した。詳細は報告書に掲載されるが、(1)主に文部科学省、厚生労働省によって推進された試行実験に相当の広がりが見られること、(2)制度外の取組として展開されているにもかかわらず、これに参加した生徒・訓練生のモチベーションが高いこと、とくに彼らが現実的な職業観を形成する傾向にあること、(3)しかしながら、やはり制度外の試行であることから、指導員・生徒・企業担当者等にとって相当の負担(ボランティア活動的)になっていること、(4)この事業の政策的継続性に対する一定の不安定さにより、拡大・発展が必ずしも展望できていないこと、等が明らかになった。学問的には、一般的なインターンシップに近いものとして本事業を捉えるのか、あるいは職業教育訓練の方法として捉えるのか、が問われていると言える。
災害警報の効果に関する実験的研究

NHKが制作した東海地震オーディション番組第3版をNHKの許可を得て編集・改変し、実験用番組を5種類作成した(うち1つはコントロール刺激用のオリジナルの番組)。これらを用いて7月に静岡市、10月に東京において主婦を対象として実験をおこなった。静岡では等質な被験者群を6群つくり、2群にコントロール番組,2群に「自衛隊等の救援準備完了」に言及した番組,2群に「避難後の警察による治安維持」に言及する番組を視聴させた。東京では等質な8群の被験者群をつくり、2群にコントロール番組,2群に無関係な番組,2群に「パニックの発生」に言及した番組,2群に「パニックが発生しないこと」に言及した番組を視聴させた。各群とも視聴の前後に質問紙に記入させ、感情の変化,番組の理解,地震発生の可能性や切迫度の認知,混乱の予想,被害予測,自分の行動の予想などの諸項目について測定した。(実験手続は、すでに昭和58年度,59年度に実施した実験の場合と同一である。「文部省科学研究費自然災害特別研究研究成果No.A-59-5」,1984,pp.87-120参照。)データは各測定項目ごとに実験群をコントロール群と比較する、という形式で大検定や【X^2】検定などを用いて番組による差を検出するために分析をおこなっており、その結果は近々に論文にまとめて報告する予定である。なお、東海地震の警戒宣言報道に関してはテレビ以外にもラジオを用いた研究も同様に重要であるので、今後機会を求めてこの種の実験的研究を実施していきたいと考えている。
プラスチドの光合成関連遺伝子mRNAの新たな翻訳制御機構(RNAプロセシングの影響と翻訳産物によるフィードバック制御機構)

1.(1)昨年度開発に成功したタバコ葉緑体in vitroエディティング系をさらに改良し、タバコndhB mRNAもin vitroでエディットされることを示し、この系が汎用性を持つことを示した。(3)さらに、上記のpsbL mRNAのシス配列と相互作用するトランス因子を同定した。(4)さらに、葉緑体mRNAの翻訳に関与する5種の葉緑体RNA結合タンパクのRNAエディティングに関与することを調べた。2.(1)タバコ葉緑体と非光合成タバコ培養BY-2細胞の色素体のそれぞれのリボソームタンパク質とそのmRNAの蓄積量を比較し、またその翻訳開始効率をin vitro翻訳系にて比較検討した。(2)リボソームタンパク質S2とS19をコードしているrps2およびrps19のmRNAの翻訳シス配列を、葉緑体in vitro翻訳系と新たに開発したBY-2色素体in vitro翻訳系を併用して解析した。
脱ユビキチン化酵素による細胞機能の制御メカニズム

1)脱ユビキチン化酵素USP18が内在性のユビキチン化された変性タンパク質を凝集させアグリソームの形成を誘導したことから、USP18が変性タンパク質の毒性から細胞を守る因子であることが示唆された。2)核小体でリボソーム生合成を制御する脱ユビキチン化酵素USP36の核小体局在化配列に結合する低分子化合物を同定し、それらがUSP36の核小体への局在化と脱ユビキチン化機能を阻害することを培養細胞レベルで見出した。3)脱ユビキチン化酵素USP37が自身のもつユビキチン結合配列UIMを介して基質となるユビキチン鎖に結合し、基質を酵素活性中心近傍につなぎ止めることにより、USP37の酵素活性の上昇に寄与することを見出した。USP36は核小体に局在する脱ユビキチン化酵素である。核小体は細胞分裂期にいったん消失し、分裂終了後に再形成される。そこで、緑色蛍光タンパク質GFPを融合したUSP36をHeLa細胞に発現させ、ライブセルイメージングにより細胞分裂期におけるUSP36の動態を観察した。その結果、USP36は細胞分裂終了後の核小体再形成の非常に早い段階に核小体の形成される部位に局在化することが明らかとなった。このことは、USP36のノックダウンにより核小体が消失する、という以前に見出していた結果と合わせ、USP36が核小体の形成に重要な役割を担っていることを示唆するものである。すなわち、USP36が核小体の主要機能であるリボソーム生合成のみならず、核小体構造の形成・維持にも働いていることが示唆された。また、ジンク・フィンガー・ドメインをもつ脱ユビキチン化酵素に着目し、そのような脱ユビキチン化酵素の1つであるUSP13の解析を行った。USP13にFlagエピトープ・タグをつけてHeLa細胞に発現させ、免疫蛍光染色を行ったところ、USP13は核において核小体を除く核質に局在した。また抗ユビキチン抗体で共染色した結果、USP13の酵素活性欠失体(優性不能型変異体)の過剰発現により、USP13の基質と予想されるユビキチン化タンパク質が核質に蓄積することがわかった。今後、プロテオーム解析によりこれらのユビキチン化タンパク質を網羅的に同定することにより、核質におけるUSP13の機能解析を進めていく予定である。アグリソームは、微小管形成中心付近の細胞質に形成する変性タンパク質の凝集体である。本研究では、ヒト培養細胞において脱ユビキチン化酵素ubiquitin-specific protease(USP)ファミリーのメンバーUSP18を過剰発現させると、微小管形成中心付近に抗ユビキチン抗体によって強く染色される異常構造体の形成が誘導されることを見出した。免疫電子顕微鏡法で観察すると、この構造体はアグリソームの特徴である直径100nmの電子密度(すなわち分子密度)の高い粒子状構造の凝集体であることが明らかとなった。USP18の酵素活性欠失体によっても同様のアグリソームが誘導されたことから、この現象はUSP18の脱ユビキチン化酵素に非依存的なものであると考えられた。熱ショックやプロテアソーム阻害などの細胞内の変性タンパク質レベルを上昇させる処理により、USP18誘導アグリソームの数やサイズが上昇した。またUSP18誘導アグリソームには、細胞質の変性タンパク質のモデルとして用いられるタンパク質(CL1デグロンなど)、小胞体関連分解をうける変性タンパク質のモデルとして用いられるタンパク質(ウイルスタンパク質VSVGの変異体など)、さらにユビキチン化された変性タンパク質のプロテアソーム分解を促進するタンパク質BAG6の蓄積・局在が観察された。以上の結果から、USP18は細胞内におけるアグリソームの形成、変性タンパク質の除去に関与することが示唆された。1)脱ユビキチン化酵素USP18をヒト細胞に過剰させると、アグリソームと呼ばれるタンパク質凝集体が微小管形成中心に形成誘導される。本研究では、USP18によるアグリソームの形成に関し、そこに内在性のユビキチン化タンパク質や凝集性タンパク質のモデルタンパク質が含まれること、細胞内の変性タンパク質の量を増加させる処理によりUSP18誘導性アグリソームの数が増加すること、このアグリソームの形成誘導にUSP18のN末端領域とC末端領域が重要な役割を果たすことを見出した。2)脱ユビキチン化酵素USP36は核小体に局在し、リボソームの生合成を正に制御するタンパク質である。

本研究課題では、USP36をN末端、中央、C末端の3つの領域、およびC末端領域に存在する塩基性アミノ酸に富んだ20アミノ酸程度の核小体局在化シグナル配列に結合する低分子化合物のスクリーニングを行い、合わせて35種類のUSP36結合化合物を同定した。その中で、核小体局在化シグナル配列に結合する化合物をヒト細胞の培養液に添加した結果、その中の1つの化合物によりUSP36の核小体局在が失われ、USP36が核質に漏出することを見出した。3)脱ユビキチン化酵素USP37は3つのユビキチン結合配列UIMをもつ。USP37の機能における各UIMの役割を調べた結果、C末端側の2つのタンデムUIMがUSP37のユビキチン結合に必須の役割を果たすことを見出した。さらに、この2つのUIMがUSP37の基質となるユビキチン鎖に結合して基質を酵素活性中心の近傍に安定的にポジショニングすることにより、USP37の高い酵素活性の発現に重要な役割を果たしていることを見出した。脱ユビキチン化酵素USP18が細胞内の変性タンパク質の除去に関与することを新たに見出し。この研究成果に関する論文を投稿準備中である。したがって、研究は順調に進展していると判断している。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題では、上記のUSP18に加え、核質において機能するUSP13やUSP37、核小体で機能するUSP36などの脱ユビキチン化酵素の解析も行っている。今後、これらの脱ユビキチン化酵素の機能解析を推進する。