hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
数十〜百MeVに於ける(p,n)反応による原子核のスピン・アイソスピン励起の研究

13年度に引き続き、東北大学サイクロトロン・ラジオアイソトープセンターのK=110MeVのサイクロトロンが順調に稼動し、本報告書に係る平成13年度計画の研究は所期の目的を大略達成することができた。1.陽子エネルギーE_p=50,69,70,80,90MeVにおいて、^6Li(p,n)^6Be反応の実験並びに解析を行い、アルファ核に2個の核子がついた質量数6の原子核に於ける粒子-空孔状態へのアイソスピン遷移の全貌を明らかにすることが出来た。特に励起エネルギー3MeVに新しい状態を発見しスピン・アイソスピン励起による2+状態と同定した。更に、15MeVにアイソスピン励起の双極子振動状態、また25MeVにスピン・アイソスピン励起の双極子振動状態を発見した。2.^<42>Ca(p,n)^<42>Sc反応の研究に関し、陽子エネルギーE_p=60MeVにおけるGT-遷移と、Fermi-型の1^+→0^+遷移を分離観測することに成功し、E_p=5090MeV領域のV_τ/V_<στ>比を明らかにすることが出来た。3.東北大学サイクロトロン・ラジオアイソトープセンターでは、陽子エネルギ-35MeVにおける(p,n)反応によって多くの業績をあげてきたが、E_p=5090MeV領域において、更に原子核のスピン・アイソスピン励起の研究を発展させるため、^<12>C(p,n)^<12>N反応の研究をE_p=70MeVにおいて行い、完壁に実験データを再現する解析手法など方法論を確立した。4.本研究課題の一つの柱である移行スピン・パリティーゼロマイナス遷移については、^<16>O(p,n)^<16>F並びに^<40>Ca(p,n)^<40>Sc反応の研究をE_p=50MeVにおいて行い、ゼロマイナス状態の同定が出来た。今後サイクロトロンの加速ビームの増強を待って、角度分布の測定を行う。東北大学サイクロトロン、ラジオアイソトープセンターのK=110MeVのサイクロトロンが順調に稼動し、本報告書に係る平成13年度計画の研究は所期の目的を大略達成することができた。1、標的を装着し入射陽子ビームによって(P,n)反応を生起する汎用の散乱槽は早期に完成し、既設のビームスウインガーと組み合わせて-3度から110度まで、切れ目なく反応生成中性子を44メートルの飛行距離を取って飛行時間分析法(TOF)によるエネルギー分析が可能となった。2、陽子エネルギーE_p=50.70,80,90MeVにおいて、^6Li(P,n)^6Be反応の実験を行い、システムの検証並びに、このエネルギー領域の中性子に対する液体シンチレーターの応答関数の測定を行って検出効率のエネルギー依存性と絶対値の導出を行うことができた。特に、^6Li(p,n)^6Be反応で起こる原子核における最も単純なガモフ、テラー型の1^+→0^+遷移(GT-遷移)で生成される中性子の角度分布を上記陽子エネルギーで測定し、核子核子(空孔)有効相互作用について重要な情報を得た。3、もう一つの目的である^<42>Ca(p,n)^<42>Sc反応の研究に関し、陽子エネルギーE_p=50,70,80,90MeVにおいて実験を行うことができた。

GT-遷移と、Fermi-型の1^+→0^+遷移を分離観測することに成功し、F-型遷移の相互作用の強さを代表する有効相互作用強度V_τとGT-型遷移の相互作用の強さを代表するV_<στ>との比V_τ/V_<στ>の入射陽子エネルギー依存性を実験的に明らかにした。13年度に引き続き、東北大学サイクロトロン・ラジオアイソトープセンターのK=110MeVのサイクロトロンが順調に稼動し、本報告書に係る平成13年度計画の研究は所期の目的を大略達成することができた。1.陽子エネルギーE_p=50,69,70,80,90MeVにおいて、^6Li(p,n)^6Be反応の実験並びに解析を行い、アルファ核に2個の核子がついた質量数6の原子核に於ける粒子-空孔状態へのアイソスピン遷移の全貌を明らかにすることが出来た。特に励起エネルギー3MeVに新しい状態を発見しスピン・アイソスピン励起による2+状態と同定した。更に、15MeVにアイソスピン励起の双極子振動状態、また25MeVにスピン・アイソスピン励起の双極子振動状態を発見した。2.^<42>Ca(p,n)^<42>Sc反応の研究に関し、陽子エネルギーE_p60MeVにおけるGT-遷移と、Fermi-型の1^+→0^+遷移を分離観測することに成功し、E_p=5090MeV領域のV_τ/V_<στ>比を明らかにすることが出来た。3.東北大学サイクロトロン・ラジオアイソトープセンターでは、陽子エネルギー35MeVにおける(p,n)反応によって多くの業績をあげてきたが、E_p=5090MeV領域において、更に原子核のスピン・アイソスビン励起の研究を発展させるため、^<12>C(p,n)^<12>N反応の研究をE_p=70Mevにおいて行い、完璧に実験データを再現する解析手法など方法論を確立した。4.本研究裸題の一つの柱である移行スピン・パリティーゼロマイナス遷移については、^<16>O(p,n)^<16>F並びに^<40>Ca(p,n)^<40>Sc反応の研究をE_p=50MeVにおいて行い、ゼロマイナス状態の同定が出来た。今後サイクロトロンの加速ビームの増強を待って、角度分布の測定を行う。
神経伝達機構に作用する高度活性物質の開発

神経細胞間で信号を搬送する物質を受容する器官の一つにグルタメートリセプターがあり、これは記憶や学習など重要な高次機能に関係していると考えられている。本課題に於いては、この受容体の機能について有機合成の側から解明研究を行った。1)アクロメリン酸B(Acro B)の効率的合成。先に発表した光射照による芳香族アルデヒドのエノル化によって生じたジェンに対するDiels-Alder反応を利用してAcro Bを効率よく合成する方法を検討し、通算21%の収率で得られる方法を開発した。即ち2-シアノピリジルエタノールトリフレートとビニルオキサゾリドンを縮合し、数段階を経て合成したピリジンアルデヒド1を光射照下に環化させ、立体選択的にピロリジン環を形成した。β-ケト酸部分をアルカリで切断したのち数段階を経て、Acro Bとした。2)L-2-(カルボキシシクロプロビル)グリシン(CCG)類の配座解析。今回、CCG類をグルタミン酸受容体の立体配座要請の解明のためのプローブとして考え、数種のCCG類の3'-位置換体を合成し、それらの活性の検討とともに分光学的手法により立体配座解析をおこなった。その結果、受容体の活性化におけるグルタミン酸の立体配座に関して重要な見知を得た。また、新しいアゴニストの開発もできた。3)本受容体に作用するカイノイドはC_4側鎖にπ電子を持つことが強い活性を示す一つの条件であることを見出しているが、このπ電子をもつ系はピロリジン環と直交したコンホメーションで働いていると考えられる。そこで逆に側鎖のπ電子系がピロリジン環と同一平面上にあるような化合物(14)を合成して活性を調べた。合成はトリメチレンメタンが分子内のαβ-不飽和エステルに付加することにより、3-アザビシクロ[3.3.0]オクタン骨格を作る方法で行った。二重結合の位置は金属触媒によって調整した。脱分極活性は全てについて著しく減り、やはり側鎖のπ電子平面がピロリジン環と直交するコンホメーションが強いと活性を示すために必要であることを示唆した。4)C_4に芳香環をもつカイノイドの新しい短段階合成法を開発した。4-ヒドロキシプロリンから4-フェニル-3-デヒドロプロリンを合成し、これにマロン酸モノメチルエステルのマンガン(III)酸化で生ずるラジカルを付加させ、酢酸基がC_4に生じたOH基とラクトンとなっている形のフェニルカイノイド中間体を立体選択的に合成し、これを水素添加してフェニルカイノイドとした。また、この方法によって、C_4にピリジンをもつカイノイドの合成にも成功した。5)3-デヒドログルタミン酸にトリメチレンメタルを付加させてグルタミン酸にexo-メチレンシクロペンタンを作りつけた化合物CPG-を合成し活性を調べた。4個の立体異性体中CPG-IVのみがカイニン酸同様の活性を示した。

4-ヒドロキシプロリンから4-フェニル-3-デヒドロプロリンを合成し、これにマロン酸モノメチルエステルのマンガン(III)酸化で生ずるラジカルを付加させ、酢酸基がC_4に生じたOH基とラクトンとなっている形のフェニルカイノイド中間体を立体選択的に合成し、これを水素添加してフェニルカイノイドとした。また、この方法によって、C_4にピリジンをもつカイノイドの合成にも成功した。5)3-デヒドログルタミン酸にトリメチレンメタルを付加させてグルタミン酸にexo-メチレンシクロペンタンを作りつけた化合物CPG-を合成し活性を調べた。4個の立体異性体中CPG-IVのみがカイニン酸同様の活性を示した。1.アクロメリン酸B(Acro B)の効率的合成。標題化合物はグルタメートリセプターに強く作用し、強い神経の興奮を惹き起す。そのため薬理学研究の重要な試薬になると予想される。しかし、現在までのところ、いくつかの合成法が発表されたとは云え、これを試薬として薬理学界に提供できる程の量を合成するのに適した方法は、発表されていない。そこでわれわれは、先に発表した光照射による芳香族アルデヒドのエノル化によって生じたジエンに対するDielsーAlder反応を利用してAcro Bを効率よく合成する方法を検討し、通算21%の収率で得られる方法を開発した。即ち2-シアノピリジルエタノールトリフレートとビニルオキサゾリドンを縮合し、数段階を経て合成したピリジンアルデヒド1を光照射下に環化させ、立体選択的にピロリジン環を形成した。β-ケト酸部分をアルカリで切断したのち数段階を経て、Acro Bとした。2.Lー2ー(カルボキシシクロプロピル)グリシン(CCG)類の配座解析。先にわれわれが開発したLー2-(カルボキシシクロプロピル)グリシン(CCG)類はグルタミン酸受容体の選択的かつ強力なアゴニストであり、神経科学研究の重要なツールとして用いられている。今回、CCG類をグルタミン酸受容体の立体配座要請の解明のためのプローブと考え、数種のCCG類の3'ー位置換体を合成しそれらの活性の検討とともにCCG類とあわせ分光学的手法により立体配座解析をおこなった。その結果、受容体の活性化におけるグルタミン酸の立体配座に関して重要な見知を得た。また、新しいアゴニストも開発できた。神経細胞間で信号を搬送する物質を受容する器官の一つに、グルタメートリセプターがあり、これは記憶や学習など重要な高次機能に関係していると考えられている。本課題に於いては、この受容体の機能について有機合成の側から解明研究を行った。1)本受容体に作用するカイノイドはC_4側鎖にπ電子を持つことが強い活性を示す一つの条件であることを見出しているが、このπ電子をもつ系はピロリジン環と直交したコンホメーションで働いていると考えられる。そこで逆に側鎖のπ電子系がピロリジン環と同一平面上にあるような化合物(14)を合成して活性を調べた。合成はトリメチレンメタンが分子内のαβ-不飽和エステルに付加することにより、3-アザビシクロ[3.3.0]オクタン骨格を作る方法で行った。二重結合の位置は金属触媒によって調整した。脱分極活性は全てについて著しく減り、やはり側鎖のπ電子平面がピロリジン環と直交するコンホメーションが強い活性を示すために必要であることを示唆した。2)C_4に芳香環をもつカイノイドの新しい短段階合成法を開発した。4-ヒドロキシプロリンから4-フェニル-3-デヒドロプロリンを合成し、これにマロン酸モノメチルエステルのマンガン(III)酸化で生ずるラジカルを付加させ、酢酸基がC_4に生じたOII基とラクトンとなっている形のフェニルカイノイドを立体選択的に合成した。
重金属毒性に対する転写因子Nrf1の防御的役割とその応答機構の解析

我々を取り巻く環境にはカドミウムやメチル水銀などの種々の有害金属が存在し、生体は常にそれらのストレスに曝されている。一方、生体はそれらの環境ストレスを感知し、応答・適応する生体防御システムを有することが近年示されている。本研究では生体防御遺伝子群の発現を制御している転写因子Nrf1に着目し、重金属に対する防御的役割およびその応答機構を解析した。その結果、ウシ大動脈血管内皮細胞において、Nrf1はカドミウムおよびメチル水銀に対して毒性防御に働いていることを明らかにした。更に、Nrf1はカドミウムによって活性化されて核に移行し、抗酸化剤応答配列(ARE)下流のNAD(P)H:キノン酸化還元酵素やペルオキシレドキシン1などの発現を誘導することを明らかにした。これらの結果は、転写因子Nrf1が重金属に対する毒性防御の細胞応答システムとして機能していることを示唆している。今年度は環境汚染重金属のモデルとして、カドミウムを使用した。カドミウムは動物実験や疫学的調査から、動脈硬化や高血圧などの血管病変誘発因子であることが知られている。そこで、血管内皮細胞におけるカドミウムの毒性に対するNrf1の防御的役割およびその分子機構の解析を行った。ウシ大動脈血管内皮細胞において、SDS-PAGE上にて約150kDaのNrf1の発現が観察された。このバンドはN結合糖鎖付加阻害剤であるツニカマイシンの処理により約110kDaにシフトしたことから、約150kDaのバンドが糖鎖結合型、約110kDaのバンドが脱糖鎖型であることが示唆された。そこで全長Nrf1を標的とするsiRNAを設計・導入して当該転写因子をノックダウンしたところ、カドミウムの細胞毒性は有意に増強された。同条件下において、抗酸化剤応答配列(ARE)の転写活性化は減弱し、下流の抗酸化酵素群の発現が減少していた。次に、カドミウムに対するNrf1の応答について検討したところ、カドミウムの曝露により脱糖鎖型Nrf1の発現が濃度依存的に増加し、核に蓄積した。更に、Nrf1はカドミウムの曝露によってNAD(P)H:キノン酸化還元酵素1やペルオキシレドキシン1のような抗酸化酵素群のプロモーター領域にリクルートされていた。以上より、Nrf1は血管内皮細胞において、重金属であるカドミウムの毒性に対する防御応答を担う転写因子である事が示唆された。カドミウムやメチル水銀は現在でも低レベルで環境中・食品中に存在し、長期曝露によりヒトの健康を障害する可能性が指摘されている。本研究では、これらの重金属に対する転写因子Nrf1の防御的役割とその応答機構を明らかにすることを目的としている。ウシ大動脈血管内皮細胞(BAEC)にsiRNAを導入してNrf1のノックダウンを行ったところ、カドミウムだけでなくメチル水銀の細胞毒性も増強することが明らかとなったことから、Nrf1はこれらの重金属の毒性防御に働く転写因子であることが示唆された。また、カドミウムはNrf1のmRNA量の変化を伴わず、脱糖鎖型Nrf1タンパク質の分解を抑制することでその発現量を増加させた。カドミウムの曝露により、転写因子Nrf2の活性化に伴うヘムオキシゲナーゼ-1(HO-1)、メタロチオネイン-I/II(MT-I/II)、NAD(P)H:キノン酸化還元酵素1(NQO1)およびペルオキシレドキシン1(Prx1)などのARE下流のタンパク質の発現誘導が観察されたが、Nrf1のノックダウンによりNQO1やPrx1の発現誘導レベルが低下した。我々はNrf2がカドミウムによって活性化され、AREを介してHO-1やMT-I/IIやの発現誘導に関わることを明らかにしていることから、BAECはカドミウムの細胞内侵入に対して異なるCNC転写因子群を活性化することで、本重金属の不活性化および酸化ストレス防御系を上昇させ適応しているのかもしれない。
猜疑心と妄想に関する認知神経科学的研究

1)共感・同情に関わる認知神経機構の解明不祥事を起こした他者への同情の程度がどの脳領域の活動の程度と関連しているか、および、その個人差を検証した。同情が高まるほど、他者理解に関連する脳領域(前頭葉内側、楔前部)の活動が高くなることが判明した。また、情け深い人ほど、主観的体験と関連した島皮質の活動が高いことが判明した。この研究成果は、国際誌(Nature Communications)において公表した。2)猜疑に関わる認知神経機構の解明信頼ゲームを用いて、裏切る他者への猜疑心の程度を脳活動から測定した。現在得られた結果を解析中である。猜疑心と妄想に関わる認知機能の脳活動を定量的に把握することを目的に、1)健常人における行動実験、2)健常人における機能的脳画像(fMRI)を用いた実験、3)脳損傷患者を対象とした実験を実施した。実験で用いる課題は、他者の表情に騙されないことが要求される信頼ゲームを用いた。表情に対する猜疑心に関わる脳機能と、相手の裏切りと信頼行動の学習による信念の形成を調べた。1)行動実験10名の健常者を対象にした。信頼性の高い顔の人物の裏切りに対する信念形成はベイズ確率により説明されうることが判明した。2)機能的脳画像(fMRI)を用いた実験健常者を対象に、機能的脳画像(fMRI)を用いて、信頼ゲームを実施し、信念形成に影響を及ぼす猜疑心の脳活動データを取得中である。現在までに8名のデータを取得した。猜疑心には情動に関与する脳領域(前頭葉腹内側面、島皮質、側頭葉)の活動が関わっているという予備的結果を得た。3)患者を対象にした実験過去の研究で、側頭葉内側部(扁桃体)を損傷すると他人に対して信頼性の判断ができなくなることが報告されている。そこで、側頭葉内側部にてんかんを持つ患者を対象に信頼ゲームを実施し、焦点切除術前後で行動結果を比較し、信念形成と猜疑心の関連を検討中である。上記を踏まえ、当該年度、機能的脳画像(fMRI)を用いて、他者への信念を調べるための研究を2つ行った。現在得られた成果を、投稿準備中である。
Caveolin-1の新規機能とHDL新生の調節

細胞膜にあるABCA1蛋白レベルは、遺伝子の転写発現による制御のほか、安定性や分解などの翻訳後制御を受け、HDL産生の制御に深く関わっていると考えられる。我々はcaveolin-1がABCA1の分解制御と安定化に関わることを見いだし、その分子機構を研究してHDL新生への関与について研究を進めた。ABCA1の細胞内への移行はcaveolin-1との相互作用が必要であり、SQとDQはABCA1とcaveolin-1の相互作用を阻害することにより、ABCA1の細胞内への移行とその分解を抑制し、タンパク質の発現が増加してHDLの産生を促進すると示唆された。今までに得られている実験成績は以下のようである。1)Caveolin-1欠損細胞ではABCA1蛋白質の分解及び細胞内への移行速度が低下しており、これらはcaveolin-1を強制発現で回復する。2)ABCA1とcaveolin-1の直接のinteractionが見られ、probucolの酸化物spiroquinone(SQ)とdiphenoquinone(DQ)を加えると、その相互作用が阻害される。3)野生型MEF細胞では、SQ,DQによりcaveolin-1蛋白質発現の増加がみられますが、caveolin-1欠損細胞ではこの増加はみられない。このように、ABCA1とcaveolin-1のinteractionはABCA1のendocytosisに必要であり、ABCA1の分解による活性制御と深く関わっていることが示唆された。4)これらの反応の形態学的検討を行い,蛍光色素による免疫組織染色により、生化学的に示された相互作用を蛍光画像として確認した。ABCA1はcaveolin-1と細胞膜で共存し、SQ,DQはこの共存を干渉することが観察された。5)さらにCaveolin-1の細胞内への移行とABCA1の関連を検証した。ABCA1欠損細胞を用いて、caveolin-1の細胞内取り込みを調べた。ABCA1欠損すると、caveolin-1蛋白質の細胞内の取り込みは野生型と比べ延滞することが分かった。ABCA1とcaveolin-1のinteractionはABCA1、caveolin-1のendocytosisに必要であり、Caveolin-1の細胞内への移行はABCA1と関連したことが示唆された。ABCA1蛋白の分解と安定化による活性制御の分子機構であるABCA1のendocytosis及び膜へのリサイクルにcaveolin-1がどのように関わっているかを明らかにし、Caveolin-1はHDL産生増加に関与しているかどうか、またその新生反応における役割をin vitroで詳しく検討し、その機序についてさらに解明するため研究を進めた。これまでにABCA1とcaveolin-1のinteractionはABCA1の細胞内への移行に必要であり、caveolin-1がABCA1のendocytosisと分解に深く関わっていることを証明した。さらに、caveolin-1の細胞内への移行におけるABCA1との関連について調べた。ABCA1欠損細胞において、caveolin-1の細胞内取り込みは、野生型と比べ延滞することがわかった。caveolin-1のendocytosisにはABCA1とのinteractionが必要であると示された。この反応の条件下のABCA1欠損細胞及び野生型細胞で、ABCA1とcavolin-1免疫染色を行い、生化学的に示された相互作用を蛍光画像として確認した。計画通りに実験を順調に進め、良い実験結果を得られた。現在revise実験を終えて、論文投稿中。私たちはcaveolin-1とABCA1の相互作用を検証し、それがABCA1タンパク質の分解制御と安定化に関わる分子制御機構を研究して、そのHDL新生への関与について研究進めた。caveolin-1野生型MEF及び欠損MEF細胞にSQとDQを添加し、ABCA1タンパク質の発現レベルを検討した。野生型MEF細胞では、SQ,DQによりABCA1蛋白質発現の増加がみられますが、欠損細胞では、この増加を消失する。そこでCaveolin-1欠損MEF細胞にcaveolin-1を強制発現させると、SQ、DQによるABCA1発現増加効果が回復した。また、SQ, DQのapoA1による細胞cholesterol排出の増加もcaveolin-1欠損によりキャンセルされ、caveolin-1発現により回復した。次に、ABCA1とCaveolin-1の直接相互作用について免疫沈降を行った。ABCA1とcaveolin-1の直接のinteractionが見られた。また、probucolの酸化物SQとDQの添加により、その相互作用が阻害された。これらの反応の条件下の培養細胞で、蛍光色素による免疫組織染色により、生化学的に示された相互作用を蛍光画像として確認した。ABCA1はcaveolin-1と細胞膜で共存し、SQ,DQはこの共存を干渉することが観察され免疫染色法によりABCA1とcaveolin-1の細胞内の共存を調べた結果も同じでした。このように、ABCA1の細胞内への移行はCaveolin-1との相互作用が必要であり、probucolの酸化物であるspiroquinoneとdiphenoquinoneはABCA1とCaveolin-1のinteractionを阻害することにより、ABCA1の細胞内への移行を抑制し、タンパク質の発現が増加し、HDLの産生を促進すると示唆された。

我々はcaveolin-1がABCA1の分解制御と安定化に関わることを見いだし、その分子機構を研究してHDL新生への関与について研究を進めた。ABCA1の細胞内への移行はcaveolin-1との相互作用が必要であり、SQとDQはABCA1とcaveolin-1の相互作用を阻害することにより、ABCA1の細胞内への移行とその分解を抑制し、タンパク質の発現が増加してHDLの産生を促進すると示唆された。計画通りに実験を順調に進め、良い実験結果を得られた。現在論文投稿中。Caveolin-1はHDL産生増加に関与しているかどうか、その新生反応における役割を、in vivo及びin vitroで詳しく検討し、ApoA-1により生じたHDL粒子を詳細に検討し、caveolin-1ありなしでHDLの質的変化に関連するかどうかを検証する。分子生物学ApoA-1による産生反応により生じたHDL粒子を詳細に検討し、caveolin-1の存在がHDLの質的変化に関連するかどうかを検証したい。上述した各々の実験条件における細胞培地からリポ蛋白質を超遠心により浮上濃縮し、コレステロールとコリン燐脂質についてHPLCによる粒子径分析を行う予定。研究の進行上の理由で、試薬等の購入が遅れ、消耗品の支出が予定より少額となった。平成28年度研究計画の実験用消耗品の予算と合わせて、前半に予定すること。平成27年度研究計画の実験用消耗品の予算と会わせて、前半に予定することとした。
創傷治癒培養モデルを用いた口蓋裂術後瘢痕形成の制御に関する研究

唇顎口蓋裂患者では、口蓋形成手術後に生じる瘢痕組織が、上顎骨の劣成長を引き起こすことが知られている。本研究は創傷治癒時の瘢痕収縮におけるTGF-βシグナリングとTRPチャネルの役割について明らかにすることを目的とした。皮膚創傷治癒モデルを作製し、経時的なゲルの収縮を計測した。さらに、TRPV14の阻害薬を用いて、皮膚創傷治癒モデルに対する作用を検討した。その結果、TRPV2阻害薬はゲルの収縮を有意に抑制し、筋線維芽細胞マーカーであるα-SMAの発現およびケラチノサイトからのTGF-β1の放出を有意に抑制した。このことから、創傷治癒時の瘢痕収縮にTRPV2の関与が示唆された。我々はこれまでに、粘膜骨膜剥離を伴うPush Back法による口蓋形成手術において、bFGFの局所投与により瘢痕形成の抑制と顎発育抑制の緩和をはかる新しい口蓋裂治療の確立を目指して、ラットを用いた動物実験により病理組織学的データを蓄積してきた。本研究では、創傷治癒過程における細胞と新生コラーゲンの動態を追跡する培養モデルを構築し、これを用いてbFGFやTGF-β3の投与、並びにTRPV4チャネルの発現が創傷治癒に与える影響を種々の条件下で検索する。また、得られた結果を動物実験で検討し、顎発育抑制を緩和する最適な薬剤投与の条件を明らかにすることを目的としている。そこで現在我々は、2日齢のラット皮膚から単離した線維芽細胞をコラーゲンゲル中に封入し、生体を擬似した三次元培養系を作成してin vitroの実験系を行っている。この三次元培養系に対して、bFGF、TGF-β3、並びにTRPV4拮抗薬を投与し、α-SMA発現を指標とした生化学的解析を行うとともに、筋線維芽細胞の収縮の解析としてコラーゲンゲルの収縮率を評価しているところである。筋線維芽細胞の分化マーカーであるα-SMA発現の減少、並びに筋線維芽細胞の収縮に対する薬剤の効果は認められており、当初の計画通りin vitroの実験系の確立が行えているため。口唇口蓋裂患者では、良好な鼻咽腔閉鎖機能の獲得のため、Push Back法による口蓋形成手術が広く行われている。しかし、本法では、粘膜骨膜剥離後の創傷治癒過程で形成される瘢痕組織が、上顎骨および上顎歯列歯槽部の発育障害や咬合不全をもたらすことが知られている。そこで、我々はこれまでに、粘膜骨膜剥離を伴うPush Back法による口蓋形成手術において、bFGFの局所投与により瘢痕形成の抑制と顎発育抑制の緩和をはかる新しい口蓋裂治療の確立を目指して、ラットを用いた動物実験により病理組織学的データを蓄積してきた。また、ラット皮膚三次元培養系を用いたin vitroの実験系によって、上皮が重層化する過程において恒常的に放出されたTGF-β1が線維芽細胞のα-SMA発現を増強することを見出し、上皮ー結合組織の細胞間の相互作用の重要性を明らかにしてきた。そこで本申請課題では、創傷治癒時の瘢痕収縮における細胞の動態を追跡するために、ラット皮膚三次元培養系を構築を用いて、TGF-βシグナリングと、近年、創傷治癒における線維芽細胞の分化誘導に関与すると報告されるTransient Receptor Potential(TRP)チャネルの関連性について検討を行っている。TGF-β受容体阻害薬や、TRPチャネル活性化薬および阻害薬を用いて三次元培養ゲルの収縮率を計測したところ、TGF-β受容体阻害薬であるLY364947、TRPV2阻害薬であるSKF96365ならびにTranilastによってゲルの収縮率が有意に減少することが明らかとなった。以上ことから、瘢痕収縮には、内在性に産生されたTGF-βとTRPV2チャネルが関与している可能性が示唆された。計画通り、ラット皮膚三次元培養系を用いたゲル収縮に対する各種阻害薬の効果が認められ、real time PCR法やELISAといった生化学的検索も順調に行えているため。口唇口蓋裂患者では、口蓋形成手術後の瘢痕収縮が上顎骨の成長発育に抑制的に働くことが知られている。本申請課題では、創傷治癒時の瘢痕収縮における細胞の動態を追跡するために、ラット真皮由来線維芽細胞をコラーゲンゲル中に包埋し、表皮より単離したケラチノサイトをゲル上に播種して三次元培養モデルを作成し、TGF-βシグナリングとTRPチャネルの関連性について検討してきた。本年度は、瘢痕収縮におけるTRPV2チャネルの上皮と線維芽細胞における役割を明らかにすることを目的とした。TRPV2阻害薬の処置により、ゲルの収縮が用量依存的に抑制されたことから、コラーゲンゲルの収縮にTRPV2の関与が示された。線維芽細胞におけるα-SMAのmRNA量はTRPV2阻害薬によって用量依存的に減少した。ケラチノサイトを播種していない条件下で、TGF-β1処置によるゲルの収縮がTRPV2阻害薬によって抑制されたことから、線維芽細胞に発現したTRPV2がTGF-β1によるゲルの収縮に寄与することが明らかになった。TRPV2阻害薬の処置でケラチノサイトから放出されるTGF-β1の放出量が減少した。三次元培養モデルにおいて、線維芽細胞ではTRPV2ならびにα-SMAのmRNAとタンパクが発現し、ケラチノサイトではTRPV2のみのmRNAとタンパクの発現が認められた。

TGF-β1で前処置した線維芽細胞において、TRPV活性化薬2-APBによって細胞内Ca2+濃度が増加し、その効果はTRPV2阻害薬で抑制された。TRPV2をノックダウンした線維芽細胞において、2-APBによる細胞内Ca2+濃度増加の抑制とα-SMAのmRNA量の減少が認められた。以上より、創傷治癒モデルの収縮に線維芽細胞およびケラチノサイトに発現するTRPV2チャネルが関与すること、また、TRPV2阻害薬が瘢痕収縮を抑制する可能性が示唆された。唇顎口蓋裂患者では、口蓋形成手術後に生じる瘢痕組織が、上顎骨の劣成長を引き起こすことが知られている。本研究は創傷治癒時の瘢痕収縮におけるTGF-βシグナリングとTRPチャネルの役割について明らかにすることを目的とした。皮膚創傷治癒モデルを作製し、経時的なゲルの収縮を計測した。さらに、TRPV14の阻害薬を用いて、皮膚創傷治癒モデルに対する作用を検討した。その結果、TRPV2阻害薬はゲルの収縮を有意に抑制し、筋線維芽細胞マーカーであるα-SMAの発現およびケラチノサイトからのTGF-β1の放出を有意に抑制した。このことから、創傷治癒時の瘢痕収縮にTRPV2の関与が示唆された。引き続き、三次元培養系を用いたin vitroの実験系にて、bFGF、TGF-β3、並びにTRPV4拮抗薬の投与が、筋線維芽細胞のアポトーシスや、瘢痕組織におけるコラーゲン線維の成熟に及ぼす効果を検討する。創傷治癒の炎症凝固期から増殖期を想定して、培養7日まで6時間間隔,12時間間隔,24時間間隔の投与(濃度は0, 1, 5, 10, 50,100 ng/ml)を行い、経時的に評価することでそれぞれの薬剤の投与条件の検索を行う。今後は、TRPチャネルの発現や活性をみるために、免疫組織染色等の形態学的検索やreal time PCR法やカルシウムイメージング法等を行い、創傷治癒におけるTGF-βシグナリングとTRPチャネルとの相互作用をより明確にしていく予定である。歯科矯正学27年度においては再現性のある実験系の確立にわずかに時間を有してしまい、当初計画していた生化学的解析に一部入ることができず、27年度に申請した研究費に一部未使用額が生じた。28年度において、27年度に開始できなかった生化学的解析を開始し、27年度未使用分の研究費を、計画通りに充てる予定である。
細胞骨格の細胞機能にはたす役割に関する細胞生物学的研究

細胞骨格は、フィラメント、マイクロチュブルの形で細胞質中に存在し、細胞の形態維持、形態変化、運動、分泌、分化等、いろいろな細胞機能に関与している。細胞骨格が、それぞれの細胞機能とどの様に関与しているかに重点を置き、細胞生物学的に解明することを目的に研究を行った。日本側の高知医科大学第二解剖学教室では、(1)ヒト好中球に、特殊顆粒やアズ-ル顆粒とは異なった、アルカリ性ホスファターゼ活性陽性の第3の新しい顆粒を発見している。この顆粒は、プロテインカイネースCの賦活剤であるPMAや、走化性ポリペプチドのfMLPの刺激により、好中球のマイクロチュブルオ-ガナイズセンターより、管状に再配列し、アルカリ性ホスファターゼ活性が、好中球の形質膜上へ出て行くのを観察している。この顆粒の再配列は、マイクロチュブルを抗チュブリン抗体により、免疫組織化学的に検出すると一致し、この顆粒の動きが、マイクロチュブルと関与していることが明らかになった。また好中球は炎症の際、細菌を貧食し、やっつけるが、その際活性酸素が産生される。この活性酸素を産生するNADPHオキシダーゼ活性の局在が、同様の実験により、このアルカリ性ホスファターゼ活性陽性顆粒と一致することが明らかになり、この顆粒の意義が明らかとなった。(2)筋収縮にはCaイオンが深く関与している。細胞内CaイオンはCa-ATPaseにより制禦されているが、この酵素活性の局在の検出は、従来の方法では生化学的に一致しない所がある。当教室では、セリウム塩を捕捉剤とし、p-NPPを基質として、生化学的理論と一致する新しい検出法を開発し、筋組織に応用し、その有効性を明らかにした。カナダ側のUBC解剖学教室では、抗ジストロフィン抗体を免疫組織化学的に、筋紡錘を染色し、筋紡錘内筋線維とそこに分布する神経と関連することを明らかにした。細胞骨格は、微細線維、微細小管の形をなして細胞質内に存在し、細胞の形態を保持するだけでなく、細胞の運動、形態変化、分泌、分化等、種々の細胞機能に関与している。従来、細胞骨格を構成する蛋白の生化学的分析、及びそれらの細胞内分布については、多くの研究がなされているが、細胞機能との関連についてはまだまだ推測の域を出ていない。細胞骨格がそれぞれの細胞機能にどのように関与しているかについて、細胞生物学的に解明していくことを目的として、研究を行った。日本側の高知医科大学第二解剖学教室では、(1)ウサギ膀胱移行上皮細胞内の細胞骨格の性状について、抗アクチン抗体、抗サイトケラチン抗体、ファロイヂン、及びHMMを用いて免疫組織化学的に解析した結果、移行上皮表層細胞の表面形質膜直下には、アクチンが存在し、膀胱の収縮伸展に伴う、形質膜よりの紡錘形空胞形成、形態変化に係わっていることが示唆された。一方表層細胞のみならず、中間細胞、基底細胞に豊富に存在する中間径の微細線維は抗サイトケラチン抗体に陽性であることが判明した。(2)マウス心室心筋線維中のレプトメア-について、アクチン、ビメンチン、デスミン等の各種の微細線維に対する抗体を用いて、免疫組織化学的に検索したが、いずれも陰性で、それ自体は全く収縮に関与しないことが示唆された。カナダ側のブリティッシュコロンビア大学解剖学教室では、(1)ラット精巣の曲精細管内で、精子細胞の変態の際に、セルトーリ細胞の細胞質にみられる微小管は、精子細胞の核を両側より挟み、丁度エレベータ-の様に、精子細胞を上下させ、その間に変態を行わしめる、重要な機能を持つことを明らかにしている。(2)マウス骨格筋では、抗ジストロフィン抗体により筋線維膜が陽性に染色されるが、筋紡錘内線維赤道部の知覚神経線維の付着部では陰性で、知覚神経線維が絡み付く様子が観察出来ることが判明した。

当教室では、セリウム塩を捕捉剤とし、p-NPPを基質として、生化学的理論と一致する新しい検出法を開発し、筋組織に応用し、その有効性を明らかにした。カナダ側のUBC解剖学教室では、抗ジストロフィン抗体を免疫組織化学的に、筋紡錘を染色し、筋紡錘内筋線維とそこに分布する神経と関連することを明らかにした。
受精卵と体細胞に共通する発生機作

被子植物の体細胞は分化状態にあるが分化全能性を保持しており、様々なストレスや生理状態の変化などによって脱分化し、さらには分裂・増殖・発生して個体へと再生することもできる。一方、受精による個体発生過程では、未分化な卵細胞が精細胞と融合することで全能性を示す受精卵へと変換し、発生が進行する。本研究では、体細胞と受精卵の発生機構を詳細に解析および比較することで、それらの発生機作における共通点を浮かび上がらせ、植物細胞の発生・増殖および分化全能性機構の基本的原理の一端を解き明かすことを目的とした。まず、イネ体細胞カルスの形態とそれらカルスから調製したプロトプラストの細胞活性の関係、および継代培養時のカルスの移植方法などの検討を進めた。その結果、継代培養1代目かつ移植後4日目のカルスからプロトプラストを調製すること、および、1 %セルラーゼ、0.1 %ペクトリアーゼY-23での6時間処理が最適であることが明らかになった。この際のプロトプラストの回収量及び単離時の生存率は、それぞれ、約400万プロトプラスト/gカルス及び52.9 %であった。この確立した実験条件で培養したプロトプラストの分裂・増殖過程の連続観察を行ったところ、プロトプラストの分裂・増殖パターンを7つに分類することができ、増殖性プロトプラストは、培養開始時には1細胞1核であり、培養3日目に2核に分裂し、その後細胞分裂、増殖を進行して最終的にカルスを形成するということが示された。また、培養したプロトプラストの約3.5 %(n=8/224)が増殖性プロトプラストであった。このことは、本研究で確立した方法により特定された増殖性プロトプラスト由来の細胞を単離・回収することで、それらのトランスクリプトームなどの単一細胞レベルの解析が可能であることを示しており、植物細胞の分化全能性機構の解明に大きく貢献するものと期待される。被子植物の体細胞は分化状態にあるが分化全能性を保持しており、物理的刺激・ストレス、環境条件の変化、生理状態の変化などによって脱分化し、さらには分裂・増殖・発生して個体へと再生する。一方、通常の受精による個体発生過程においては、未分化な卵細胞が精細胞と融合(受精)することで全能性を示す受精卵へと変換し、発生が進行する。本研究では、体細胞と受精卵の発生機構を詳細に解析および比較することで、それらの発生機作における共通点を明確にすることによって細胞の分化全能性の基幹機構が浮かび上がらせ、その知見をもとにして、植物細胞の発生・増殖および分化全能性機構の基本的原理の一端を解き明かすことを目的とする。今年度はまず、プロトプラス作出に用いるカルスの誘導法、継代可能回数、組織的特徴などを検討し、培養期間( 1ヶ月)、継代数(2回)、特徴(直径約2-6 mm、乳白色)の条件を決定した。次に、プロトプラスト作出の際の細胞壁分解酵素の組成および処理時間を至適化することで、培養に適していると想定されるプロトプラストを高い効率で調製することが可能となった。次に、プロトプラストの比較対象となる受精卵および卵細胞を用いて、数細胞10細胞という少数の細胞でのトランスクリプトーム解析を試みたところ、反復実験間で高い相関性が見られ、さらには受精誘導性の遺伝子群の同定に成功した。加えて、それら遺伝子群の効率的な機能解析手法として、シングルセルレベルでのPEG-Ca2+法による一過的遺伝子発現系の確立を進め、卵細胞および受精卵における外来プラスミドDNA由来の遺伝子発現に成功した。イネカルスの作出および継代培養について検討した。カルス誘導後の培養期間、継代培養の回数や方法などの条件を変え、それらカルスからそれぞれプロトプラストの単離を試みたところ、培養期間が約1ヶ月、継代培養が2回以内のカルスが望ましく、さらに、直径約2-6 mmでかつ乳白色を呈するカルスがプロトプラスト調製に適していることが示された。さらに、プロトプラスト単離の際の細胞壁分解酵素の組成や処理時間を検討したところ、セルラーゼ1%、ペクトリアーゼ0.1%の酵素液で6時間の処理が適正であり、回収量は0.1gのカルスから約60万個で、生存率は52.9 %であった。また、これらプロトプラストから「増殖性プロトプラスト」を分画することを目的に、スクロース不連続密度勾配遠心法を用いて細胞の比重による分画を試みたが、細胞の損傷が激しく、調製後のプロトプラストのさらなる分画については今後の検討が必要であった。トランスクリプトーム解析に関しては、卵細胞および受精卵10個からのcDNA増幅・ライブラリー作製および次世代シークエンス解析を3反復行い、信頼性があるデータが得られた。さらに、受精後に発現が誘導される、あるいは抑制される遺伝子群の同定にも成功した。PEG-Ca2+法による外来遺伝子の受精卵および卵細胞における一過的発現に関しては、PEG濃度、DNA濃度、処理時間などの至適化を行い、卵細胞および受精卵でそれぞれ約30%および70%の効率で一過的発現が可能であることが示された。さらには、2種類のプラスミドDNA(pGFP, pRFP)を同時に導入したところ、双方の蛍光が同一細胞中で観察された。これは、今後の本研究による解析で同定されると期待される全能性に関与する遺伝子と蛍光マーカータンパク質遺伝子の同時発現が可能であることを示している。

被子植物の体細胞は分化状態にあるが分化全能性を保持しており、物理的刺激・ストレス、環境条件の変化、生理状態の変化などによって脱分化し、さらには分裂・増殖・発生して個体へと再生する。一方、通常の受精による個体発生過程においては、未分化な卵細胞が精細胞と融合(受精)することで全能性を示す受精卵へと変換し、発生が進行する。本研究では、体細胞と受精卵の発生機構を詳細に解析および比較することで、それらの発生機作における共通点を明確にすることによって細胞の分化全能性の基幹機構が浮かび上がらせ、その知見をもとにして、植物細胞の発生・増殖および分化全能性機構の基本的原理の一端を解き明かすことを目的とした。昨年度に引き続き、プロトプラス作出に用いるカルスの誘導法、継代可能回数、組織的特徴などを検討し、培養期間(1ヶ月)、継代数(2回)、特徴(直径約2-6 mm、乳白色)の条件を決定した。次に、プロトプラスト作出の際の細胞壁分解酵素の組成および処理時間の至適化することで、約0.1%の効率でカルス由来のプロトプラスト集団から、分裂・増殖能を有する細胞を見出すことに成功した。これは、確率としては低いが、当該細胞を数個10個程度回収することができれば、昨年度確立した少数の細胞でのトランスクリプトーム解析系を適用することが可能である。植物細胞の発生・増殖および分化全能性機構に関与する遺伝子群の効率的な機能解析手法として、シングルセルレベルでのPEG-Ca2+法による一過的遺伝子発現系の確立を進め、卵細胞および受精卵における発現に成功した。さらには、当該系を用いて、植物細胞のゲノム編集を可能にした。解析用のカルスの作出及び継代培養について検討を続けた結果、カルスは培養期間が約1ヶ月、継代培養が2回以内のものが望ましく、さらに、直径約2-6 mmでかつ乳白色を呈するカルスがプロトプラスト調製に適していることが確認された。さらに、プロトプラスト単離の際の細胞壁分解酵素の組成や処理時間を再検討したところ、セルラーゼ1%、ペクトリアーゼ0.1%の酵素液で26時間の処理が適正であった。これらの条件を用いてプロトプラストを調整・培養すると、約0.1%の効率でカルス由来のプロトプラスト集団から分裂・増殖能を有する細胞が再現性よく生じることを見出し、また、プロトプラストの培養を開始してから分裂が数回起こる培養期間が約3日ということも明らかになった。細胞10個程度からのトランスクリプトーム解析が可能になったことから、プロトプラスト、卵細胞、受精卵などを直接的に用いた遺伝子機能解析法の確立を検討した。昨年度確立したPEG-Ca2+ transfection法によるイネ卵細胞への物質導入系を用いてイネ受精卵への遺伝子導入系の確立し、ターゲット遺伝子候補の機能解析を行うことを試みたところ、受粉後の花から単離したイネ受精卵ではプラスミドの導入およびその発現が確認できなかったが、in vitro受精系で作出した受精卵(融合・受精後約1時間)を用いることで、約7割のプラスミド導入効率が示された。さらに、GFPおよびDsRedをコードする2種のプラスミドDNAを共導入すると、導入が確認されたすべての細胞で両方の蛍光シグナルが同一細胞中に確認された。さらに、PEG-Ca2+ transfection法とCRISPR/Cas9によるゲノム編集技術を組み合わせることで、シングルセルレベルでのゲノム編集法の確立を試みた。その結果、CRISPR/Cas9ベクターおよびCas9タンパク質-gRNA複合体の直接導入により、処理した受精卵の約4-33%から、標的変異導入された植物体が得られた。
細胞老化を制御するエピジェネティック因子の機能解析

「細胞老化」はストレスを受けた細胞が増殖能を失う細胞応答の一種であり、生体内においては加齢やストレスにより各組織において観察される。老化した細胞は核内の遺伝子の発現、ならびに遺伝子の発現を制御するDNAメチル化やヒストン修飾などの「エピジェネティック調節機構」に変化が起こり、細胞の機能異常につながっている。これまでにどのような遺伝子が老化におけるエピジェネティック制御に関わっているかあまり分かっていない。そこで申請者は、遺伝子ノックダウンによるスクリーニングにより、細胞を細胞老化から守るために重要な因子の探索を行った。その結果、SETD8、NSD2といったエピジェネティック調節因子のノックダウンにより、ヒト線維芽細胞で細胞老化が促進されることが明らかになった。このことは、これらの遺伝子が正常な細胞機能に重要であり、細胞を細胞老化から守る働きをしていることを示している。申請者はさらにこれらの遺伝子のノックダウンがどのように細胞老化を促進するか解明を試みた。その結果、SETD8の発現低下により、細胞老化に重要な遺伝子であるp16/INK4A遺伝子およびp21/CDKN1A遺伝子領域上のヒストン修飾マーク(H4K20me1)の蓄積量が低下するとともにこれらの遺伝子の発現上昇が観察された。このことから、SETD8はH4K20me1を介してこれらの老化関連遺伝子の発現抑制に貢献していることが示唆された。さらにp16/p21の発現上昇は、網膜芽細胞腫タンパク質(RB)を介したミトコンドリア代謝の異常亢進に繋がることが明らかになった。NSD2のノックダウンにおいてもp21遺伝子の発現の上昇ならびにRB依存的な細胞老化の促進が観察された。これらの結果から、エピジェネティック制御の異常が、RBを介した細胞老化ならびにミトコンドリア代謝制御に繋がる分子メカニズムが明らかになった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。「細胞老化」はストレスを受けた細胞が増殖能を失う細胞応答の一種であり、がんに対する増殖抑制機能を果たす一方で、加齢などによる老化細胞の蓄積は組織の機能低下を引き起こす。老化した細胞は核内における遺伝子発現ならびに遺伝子発現を制御するDNAメチル化やヒストン修飾などのエピジェネティック調節機構が若い細胞と比べてゲノムワイドに変化していることが報告されているが、どのようなエピジェネティック因子が関わっているかあまり分かっていない。申請者は、siRNAライブラリーを用いたスクリーニングを行い、2017年に論文報告を行ったSETD8ヒストンメチル基転移酵素をはじめ、複数の細胞老化関連エピジェネティック修飾因子を見出した。現在主に解析中の因子は、siRNAを用いたノックダウンによりヒト線維芽細胞において細胞増殖の低下ならびに細胞老化マーカーである細胞老化関連ベータガラクトシダーゼ活性の増加を引き起こすことから、本因子の発現低下は細胞老化を促進することが示唆された。また、がん遺伝子誘導による細胞老化(oncogene-induced senescence,以下OIS)ならびに継代を繰り返すことで誘導される細胞老化(replicative senescence,以下RS)において本因子の発現量が低下していることが確認された。本因子の発現低下がどのように細胞老化の促進に関わるか明らかにするため、本因子をノックダウンした細胞の遺伝子発現変化をmRNA-Seqにより網羅的に解析した。その結果、ノックダウン後の初期の段階で細胞増殖やDNA損傷修復に関連する遺伝子発現が低下していた。またクロマチン免疫沈降により、本因子はこれらの遺伝子上に結合することが確認された。これらのことから、本因子は細胞増殖ならびにDNA損傷修復を促進することで細胞老化を防ぐ役割を果たしていることが予想される。本研究では、スクリーニングにより得られたエピジェネティック修飾因子がどのように細胞老化に関わるか、その分子メカニズムを明らかにすることを目的としている。網羅的な遺伝子発現解析ならびにクロマチン免疫沈降により、検証中の因子が細胞増殖やDNA損傷修復に関連する遺伝子の発現を維持する役割を果たしている可能性が示唆された。

NSD2のノックダウンにおいてもp21遺伝子の発現の上昇ならびにRB依存的な細胞老化の促進が観察された。これらの結果から、エピジェネティック制御の異常が、RBを介した細胞老化ならびにミトコンドリア代謝制御に繋がる分子メカニズムが明らかになった。これまでの解析から、スクリーニングによって得られたエピジェネティック修飾因子が細胞老化に関連する遺伝子の発現制御に関わることが分かってきたが、どのようにして特定の遺伝子のみの発現制御に関わるかまだ明らかになっていない。本因子がこれらの遺伝子上に特異的に結合するメカニズムの解明ならびにこれらの遺伝子の発現を制御するヒストン修飾の変化を明らかにする。また、本因子が細胞老化の過程で発現量が低下するメカニズムの解明を行う。現在、ゲノム上で本因子の遺伝子領域に集積する転写因子またはエピジェネティック修飾の候補が複数得られており、これらの制御因子がNSD2の発現ならびに細胞老化に果たす役割を明らかにする。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
含歯性嚢胞の成立機構に関する研究

病理組織学的に含歯性嚢胞,埋伏歯歯胚を用いて歯原性上皮の形態、増殖能apoptosisの傾向などについて検索し、含歯性嚢胞の形成過程をについて病理組織学的に検討を行った。形成された含歯性嚢胞においてH.E染色による形態観察では,apoptosisを示唆する断片化した細胞や凝集した細胞は認められなかった。またPCNA染色で陽性細胞を認めたが,嚢胞上皮全周にわたって陽性細胞が認められた症例は少なかった.また陽性細胞の上皮層内での分布状態は基底細胞層に認められるものが最も多く,一部の症例で棘細胞層にも認められた.MIB-1染色ではPCNA染色よりも陽性を示す細胞の数は少なかった.陽性細胞の分布状況はPCNA染色と同様に基底細胞層で多く認められ,上層に進むにしたがって陽性細胞の数は減少した.また、歯胚においてはPCNA,MIB-1ともに強い染色性と陽性細胞を多く認めた.一方,歯周嚢胞においてはPCNA,MIB-1ともに明らかな陽性細胞は認められなかったが,これは歯冠を含めて切片を作成したため脱灰液の影響の為と考えられた.TUNEL染色によるapoptosis細胞の検索では、完成された含歯性嚢胞で、少数の症例で陽性細胞が認められ、染色性の弱い陽性細胞が嚢胞上皮の基底細胞から傍基底細胞にかけて観察された.また歯胚においても陽性細胞を外エナメル上皮部で観察された.しかしながら歯周嚢胞においては上皮全層にわたって観察することはできなかった.今年度は材料の収集を中心として行いH.E染色細胞増殖核抗原であるPCNA染色,MIB-1染色,poptosisの検索にTUNE法,透過型電子顕微鏡による観察を行った.形成された含歯性嚢胞においてH.E染色による形態観察ではapoptosisを示唆する細胞は嚢胞上皮全層で認められなかった.またPCNA染色では全体に陽性細胞の数は少なく,染色性も弱いものであった.陽性細胞の上皮層内での分布状態は基底細胞層に認められるものが多く,一部に靭細胞層にも認められた.MIB-1染色ではPCNA染色よりも陽性を示す細胞の数は少なく,染色性も強いものではなかった.陽性細胞の分布状況はPCNA染色と同様に基底細胞層で多く認められ,上層に進むにしたがって陽性細胞の数は減少した.また,歯冠周囲の軟組織は歯胚が多く,歯周嚢胞も認められた.歯胚においてはPCNA,MIB-1ともに強い染色性と陽性細胞を認めた.一方,歯周嚢胞においてはPCNA,MIB-1ともに明らかな陽性細胞は認められなかった.TUNEL染色によるapoptosis細胞の検索では,完成された含歯性嚢胞で,明らかな陽性細胞は確認されず,染色性の弱い陽性細胞が嚢胞上皮の基底細胞から傍基底細胞にかけて少数観察された.また歯胚においては陽性細胞は全く確認することはできず,歯周嚢胞においても上皮全層にわたって観察することはできなかった.透過型電子顕微鏡による観察ではTUNEL陽性を示す症例においても特徴的な核クロマチンの濃縮,断片化は確認することはできなかった.いずれにしても今年度の結果は症例数が乏しく明らかな示唆は得ることができなかった.次年度はさらに症例数を増やし実験を進めていく予定である.病理組織学的に含歯性嚢胞,埋伏歯歯胚を用いて歯原性上皮の形態、増殖能apoptosisの傾向などについて検索し、含歯性嚢胞の形成過程をについて病理組織学的に検討を行った。またPCNA染色で陽性細胞を認めたが,嚢胞上皮全周にわたって陽性細胞が認められた症例は少なかった.また陽性細胞の上皮層内での分布状態は基底細胞層に認められるものが最も多く,一部の症例で棘細胞層にも認められた.MIB-1染色ではPCNA染色よりも陽性を示す細胞の数は少なかった.陽性細胞の分布状況はPCNA染色と同様に基底細胞層で多く認められ,上層に進むにしたがって陽性細胞の数は減少した.また、歯胚においてはPCNA,MIB-1ともに強い染色性と陽性細胞を多く認めた.一方,歯周嚢胞においてはPCNA,MIB-1ともに明らかな陽性細胞は認められなかったが,これは歯冠を含めて切片を作成したため脱灰液の影響の為と考えられた.TUNEL染色によるapoptosis細胞の検索では、完成された含歯性嚢胞で、少数の症例で陽性細胞が認められ、染色性の弱い陽性細胞が嚢胞上皮の基底細胞から傍基底細胞にかけて観察された.また歯胚においても陽性細胞を外エナメル上皮部で観察された.しかしながら歯周嚢胞においては上皮全層にわたって観察することはできなかった.