hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
精神病症状を伴う気分障害の視床下部ー下垂体系脆弱性と前頭葉ネットワークの障害

40代50代の被験者3群(精神病症状を伴う双極性障害;PBD9例、精神病症状を伴わない双極性障害;NPBD9例、健常者22例)を対象として拡散テンソル画像とTBSSを用いてFA, MD, AD, RDを比較解析した。PBDではNPBDに比して前頭前野・頭頂葉・後頭葉の交連線維、および左側の頭頂葉・後頭葉と側頭葉・前頭前野の連合線維において、軸索障害を伴わない髄鞘の障害などの白質障害が重度であることが示唆された。これらの白質障害は前頭葉ネットワーク機能の低下に伴う情動・行動障害、視床下部ー下垂体系の調節障害、認知機能低下に関連し、双極性障害における精神病症状の発現につながると考えられた。健常者においても加齢による脳白質変化の報告が集積されてきており、本研究デザインは精神病性の特徴を伴う重症の気分障害群、軽度または中等度気分障害群、および健常群の3群の脳白質の拡散パラメータ(FA, MD, RD, AD)に関する横断的比較であることから、加齢による変化が交互作用あるいは交絡因子として病的所見に偽陽性の効果をもたらす可能性があると考えた。双極性障害患者では年齢に比して脳白質高信号が多くみられる報告も集積されており、健常者の加齢変化の個人差との差異も課題であることから、加齢の影響を少なくするために、本研究の被験者の年齢層は患者群・健常群ともになるべく50代までになるように考えている。本年度は対照群の主体となる40代50代の健常群32例の脳白質に関して、加齢による変化を解析した。その結果、加齢に脆弱な脳白質神経束と頑健な神経束の差があり、従来の報告との一致も矛盾もみられた(投稿準備中)。その過程で一般線形モデルによるTract-Based Spatial Statistics(TBSS)およびTBSSを用いた白質skeletonにおけるMNI152atlasに基づくROI法による拡散パラメータの評価方法を比較した。それらの方法間で所見の矛盾のある領域に関して被験者のnative spaceにおいてDTIstudioを用いたFibertractographyを行い、3つの異なる方法で白質神経束の拡散パラメータを評価することで、より頑健なデータが得られると考えた。その方法が適切であることを、国内の代表的な神経画像研究者が開催する「包括脳チュートリアル」に参加して確認できた。健常群の解析を行うことで発達・加齢に伴う脳白質変化という視点と研究の方法論を獲得し、気分障害における脳白質の病的変化について発達・加齢の要因に関する考察が深まった。拡散テンソルデータの解析方法に関して、TBSS(Tract-Based Spatial Statistics )では標準化に伴う情報変容・喪失などの課題があり、本研究では被験者個々の脳における解析であるため感度の高いfibertractographyや3D-ROI法も併用する。今年度はDTI studioによるfiber tractographyを用いたFA (Fractional anisotropy),Trace, RD(radial diffusivity), AD(axial diffusivity)値の測定信頼性について、健常者6名を対象に、帯状束、鉤状束、脳梁、脳弓、弓状束、下縦束、下前頭後頭束、内包前脚、前交連、上小脳脚、淡蒼球ー視床線維について検討した。神経束の分枝の量や走行様式なども含めて被験者間の形態学的個体差が課題であり、「解剖学的知見に基づいて」解析対象領域を取捨選択する過程で評価バイアスが生じると思われ、とくに前部帯状束は脳回レベルで個体差が大きい部位であり、再現性の低さが目立った。One-ROI approachで神経束全体をreconstructionするのではなく、multiple-ROIによって解析対象領域を神経束の一部に限局し、解剖学的に厳密な定義をおこなうことが測定信頼性を高めると考え、前部帯状束では、背側・腹側・膝下領域に分けて解析することが機能的考察をおこなう上でも適切と考えられた。弓状束の直接路の存在は左右差や個体差があったが間接路の前部・後部は被験者間の差が比較的少なかった。他の神経束でも同様の解析方法を工夫したが、神経束の量や走行様式はTBSSでは得られない情報であり、その意義については今後も検討課題とする。淡蒼球ー視床線維はreconstructionされる線維数が少ないため3D-ROI法も併用する方法を検討した。健常者においても白質の微細構造の加齢変化があることから、加齢の影響を除くために患者群を40代50代に限局するように努めたが十分なサンプル数には至らず、研究期間を一年延長した。患者群のサンプル数の十分でない状況での予備解析は後のデータ解釈にバイアスを与えると考えて行っていない。患者群と健常群の比較解析の際に脳白質の加齢変化と病的変化の区別を考察する上での要因を探るために、健常者を対象として、脳白質容積の解析を試みた。SPM8,VBM8を用いて白質容積の加齢変化を40代50代の健常者を対象として解析したところ、加齢変化を示す脳白質領域は検出されなかった。

従来の研究では脳白質の加齢変化に関しては容積減少を示す前に拡散テンソル画像のFA, MD, RD, ADなどのパラメータが先行して加齢変化をより鋭敏に反映するという報告が多くあり、中年期において脳白質容積変化がみられた場合は加齢変化よりも病的変化を示唆するものと考えて良いのかもしれない。本研究の解析対象は拡散テンソル画像であり、容積変化は当初の解析対象には含めていないが、両者の解析を併用することで、脳白質の加齢変化と病的変化の区別に関する考察に役立つものと考えられた。また、健常者の拡散テンソル画像において加齢変化は広範な白質領域で性差がみられた。本研究対象の気分障害のなかでも有病率の性差の観点からは女性に多い単極性うつ病と性差が少ないとされる双極性障害(II型では女性に多いという報告もある)とは異なることから、患者群と健常群の比較において加齢変化を考慮する場合に性差にも注意すべきであると考えられた。目的:精神病症状を伴う双極性障害(PBD)と精神病症状を伴わない双極性障害(NPBD)の脳白質障害に関して、視床下部ー下垂体系の脆弱性と前頭葉ネットワークの障害の観点から調べる。方法:年齢、性別、利き手、教育年数を一致させた40代50台の被験者3群(PBD9例,NPBD9例,健常者22例)を対象として拡散テンソル脳画像を3Tにて撮像した。TBSS(FEWによる多重比較補正)を用いて年齢・性別を共変量とするANCOVAにより3群のFA値, MD値, RD値, AD値を比較した。結果:PBDがNPBDに比して有意にFA低下(大鉗子の一部;両側頭頂葉後頭葉白質)、MD上昇(左側脳梁膝部・脳梁体部・大鉗子・上縦束・下縦束・帯状束後部・前視床放線・下前頭後頭束・放線冠・皮質脊髄路、両側小鉗子前頭葉眼窩部白質)、RD上昇(両側脳梁膝部・脳梁体部・大鉗子・小鉗子前頭葉眼窩部白質・鈎状束・上縦束・下前頭後頭束・帯状束後部、左側脳梁体部・下縦束・上小脳脚)。PBDが健常者に比して有意にFA低下(両側脳梁体部・大鉗子・上縦束・下縦束、右側帯状束体部)、MD上昇(両側脳梁膝部・脳梁体部・小鉗子前頭葉眼窩部白質・上縦束・前視床放線・帯状束後部、右側脳梁体部・帯状束体部)、RD上昇(両側脳梁膝部・体部・大鉗子・小鉗子前頭葉眼窩部白質・鈎状束・放線冠・下前頭後頭束・上縦束・帯状束後部、左側前視床放線・下縦束、右側帯状束体部)。FA値, MD値, RD値, AD値いずれにおいてもNPBDと健常者で有意差を示した領域はなかった。3群間でAD値の有意差を示した領域はなかった。考察:PBDでは前頭前野・頭頂葉・後頭葉の交連線維、および左側の頭頂葉・後頭葉と側頭葉・前頭前野の連合線維、視床と前頭前野の連合線維、小脳・皮質脊髄路などの投射線維において、軸索障害を伴わない髄鞘の障害が示唆された。40代50代の被験者3群(精神病症状を伴う双極性障害;PBD9例、精神病症状を伴わない双極性障害;NPBD9例、健常者22例)を対象として拡散テンソル画像とTBSSを用いてFA, MD, AD, RDを比較解析した。PBDではNPBDに比して前頭前野・頭頂葉・後頭葉の交連線維、および左側の頭頂葉・後頭葉と側頭葉・前頭前野の連合線維において、軸索障害を伴わない髄鞘の障害などの白質障害が重度であることが示唆された。これらの白質障害は前頭葉ネットワーク機能の低下に伴う情動・行動障害、視床下部ー下垂体系の調節障害、認知機能低下に関連し、双極性障害における精神病症状の発現につながると考えられた。前頭葉ネットワークに関与する脳白質構造について、H26年度には患者群2群と健常群の3群で解析をおこない、論文発表、学会発表をおこなう予定であったが、研究計画を一年間延長した。
敗血症におけるnucleophosminの動態と制御法の検討

障害細胞から放出され臓器障害や予後を悪化させるDAMPsのうち,我々はNPMに着目し,血液中の動態と予後との関係を既存のDAMPsであるHMGB1とヒストンと比較検討した。ラット敗血症モデルでは血中HMGB1は4時間,ヒストンは8時間後から増加し12時間後をピークに漸減したが,血中にはNPMは増加しなかった。HMGB1とヒストンとの間に高い相関がみられた。敗血症性ショック患者の血中NPMは,非ショック患者に比べ有意に増加し,SOFA scoreとの相関は最も高かった。新定義Sepsis-3では臓器障害が重視されることから,NPMは敗血症の診断,治療における重要なパラメータとなりえる。平成27年度に予定した1)HMGB1、ヒストン蛋白,Nucleophomin(NPM)測定用の敗血症症例の臨床検体の採取(血漿,胸水,他):今後,測定することによって,敗血症の重症度,予後との関連を検討する2)盲腸結紮穿刺によるラットの敗血症モデルにおいて,HMGB1、ヒストン蛋白,NPMの発現をwestern blotting組織法で行なうため,準備中である。新しい職場での研究となったため,前施設との共同研究方式とさせていただいております。連携を図りつつ,臨床検体の収集,鋭意,実験の準備を行っております。2)敗血症の重症度とHMGB1,ヒストン蛋白,NPMの測定値の検討を行った4)敗血症の臨床検体,ラットの敗血症モデルによる血液浄化法によるこれらの因子の検討2)敗血症の重症度とHMGB1,ヒストン蛋白,NPMの測定値の検討を行った本研究の目的は,ラットの敗血症モデルにおいて,血液中のNPMやHMGB1,ヒストン蛋白が経時的にどのような経過をとるのか,また敗血症症例の保存凍結検体において,血中NPMやHMGB1,ヒストン蛋白濃度と患者のどのパラメータと関連が強いのかを検討した。<実験1>対象と方法:盲腸結紮針穿刺によるラットの敗血症モデルを用い,血中のNPMやHMGB1,ヒストン蛋白濃度を24時間測定,観察した。結果:血液中のHMGB1は4時間後から,ヒストンは8時間後から増加し,16時間をピークに漸減した。HMGB1とヒストンは高い相関がみられ(R2=0.8),NPMとヒストンとの間にも弱い相関がみられた(r2=0.4)。<実験2>対象と方法:敗血症患者の保存血漿を用いて,NPM, HMGB1,ヒストン蛋白濃度を測定し,バイタルサイン,SOFAなどの重症度,PCT, CRPなどの検査との相関を検討した。結果:NPMは敗血症性ショックでは有意な増加し,SOFA scoreとも有意な相関が得られた。結語:新定義Sepsis-3では「敗血症は臓器障害を伴う感染症」と定義される。PNMは他のアラミンに比べ,臓器障害とよく相関することから,敗血症の診断,治療における重要なパラメータとなりえる。平成27年度に予定した1)採取したHMGB1、ヒストン蛋白,Nucleophomin(NPM)測定用の敗血症症例の臨床検体(血漿,胸水,他)測定:測定することによって,敗血症の重症度,予後との関連を検討する.2)盲腸結紮穿刺によるラットの敗血症モデルを作成し,HMGB1、ヒストン蛋白,NPMの発現をwestern blotting組織法で行なう平成28年度に予定している1)敗血症の臨床検体を用いた血液浄化法(PMXーDHP、セプザイリス)によるHMGB1、ヒストン蛋白,NPMの吸着実験による検討.2)ラット敗血症モデルによるHMGB1、ヒストン蛋白,NPMの中和抗体,血液浄化カラムによる吸着実験による検討3)敗血症の臨床検体による血液浄化法によるこれらの因子に関しては,検体量から行うのは厳しい4)ラットの敗血症モデルによる血液浄化法によるこれらの因子の検討は,カラムの作成を検討中である臨床での仕事に悩殺され,研究時間が取れなかったため。使用を予定していた旅費,その他の費用に関して,未使用であったため。27年度予定していた1)保存検体によるHMGB1、ヒストン蛋白,NPMの測定.2)敗血症ラットによるHMGB1、ヒストン蛋白,NPMの発現をWestern Blotで発現を検討する28年度に予定の1)臨床検体を用いた血液浄化(PMXDHP,セプザイリス)によるHMGB1、ヒストン蛋白,NPMの吸着実験.2)敗血症ラットを用いたHMGB
固相に吸着した多環芳香族炭化水素の微生物による輸送・分解特性の評価

前年度までにオイル汚染土壌より分離した多環芳香族炭化水素(PAH)分解菌PhD1-3y株、PhD1-3w株、B3株およびD4株に関して、16S rRNA遺伝子配列(13681434bp)の解析を行った。データベースでの相同性検索の結果、PhD1-3y株、PhD1-3w株およびD4株はα-プロテオバクテリアに属することがわかった。PhD1-3y株とD4株はXanthobacter属細菌と98100%の相同性が、PhD1-3w株はStarkeya属細菌と99%の相同性が示されたことから、各々Xanthobacter spp.、Starkeya sp.と同定した。一方、B3株はγ-プロテオバクテリアに属し、未分離クローン1つ(油田の微生物群集由来)と99%以上の相同性が認められたが、既知の細菌の中では最も相同性の高かったXanthomonas属細菌でも97%以下の相同性しか認められなかった。このことから、B3株は新属の細菌である可能性があり、新規性の高いPAH分解菌であると考えられた。他の3菌株はナフタレンとフェナントレンを分解するがピレンを分解しない。一方、B3株はナフタレン、フェナントレン、ピレンの分解能を併せもつ。前年度までの検討で明らかにされた高親和性のPAH取り込み機構を有する分解菌Mycobacterium sp. RJGII-135株とともに、B3株は土壌等の固相中で残留し易い高分子PAHの分解除去に有効であると考えられる。本研究は、多環芳香族炭化水素(PAH)分解菌によるPAHの多様な細胞内輸送・分解特性を解析することを目的としている。分解菌には、Mycobacterium sp.RJGII-135株を用い、まず固相より遊離(脱着)した水相PAHを対象として細胞内への輸送機構の解明を検討した。菌体懸濁液に、[^<14>C]フェナントレンを水溶解度の1mg/L以下になるように添加した後、一定時間毎にガラス繊維フィルター(ワットマンGF/F)で吸引ろ過し、菌体によるフェナントレンの取り込み量を液体シンチレーションカウンターで測定した。その結果、酢酸ナトリウムを炭素源として培養した菌体では取り込みは瞬時に定常に達し、平衡時の取り込み量はフェナントレン添加濃度に比例していた。従って、酢酸培養菌体では水相-菌体間の分配により取り込まれるものと推察した。一方、フェナントレンを炭素源として培養した場合、インキュベーション時間の経過とともに取り込み量は直線的に増加した。この取り込み速度は、種々のフェナントレン濃度においてミカエリス-メンテン式に従うことが示され、見かけの親和定数(K_m)及び最大速度(V_<max>)は26±8nM(±SD)、4.2±0.3nmol/mg of cell/minと算出された。菌体中の^<14>Cを溶媒抽出し薄層クロマトグラフィーで分析したところ、ほぼ全量が代謝物として存在しており、フェナントレンは検出されなかった。この結果は、フェナントレンの取り込みにおいて代謝過程は律速になっていないことを示しており、観察された飽和型の取り込みが担体輸送によるものであることが強く示唆された。さらに、この取り込みはエネルギー代謝阻害剤であるKCNやCCCP(カルボニルシアニドm-クロロフェニルヒドラゾン)により阻害された。以上の結果より、Mycobacterium sp.RJGII-135株は、フェナントレンの添加により誘導されるエネルギー依存性の担体輸送システムによりフェナントレンを取り込むことが明らかになった。多環芳香族炭化水素(PAH)分解菌であるMycobacterium sp.RJGII-135株、未同定のPhD1-3y株、PhD1-3w株、B3株及びD4株について、PAHの輸送・分解の基礎知見を得るため、PAH分解試験、細胞表面疎水性並びにバイオサーファクタント生産性を検討した。懸濁体PAH(ナフタレン、フェナントレンまたはピレン)の分解性をHPLCで評価した結果、RJGII-135株は中間代謝物をほとんど蓄積せずにフェナントレンとピレンを分解したが、ナフタレンを分解しなかった。前年度の^<14>C-フェナントレンの取り込み試験により、本菌は水相フェナントレンをエネルギー依存的に膜輸送することが示唆されていたが、さらに本研究で他のPAHと^<14>C-フェナントレンの競合試験を行った結果、この輸送過程は3環以上のPAHに選択的でありナフタレンの認識は極めて低いことが明らかになった。分解試験の結果と併せ、RJGII-135株は水相に極低濃度で遊離した3環以上のPAHを取り込み分解すると推察された。B3株は3種のPAHを分解し、残りの3株はピレンを分解しなかったことから、RJGII-135株とは異なる取り込み・分解の機構を持つと考えられた。これら4株の培養液上清の表面張力を測定した結果、バイオサーファクタントの産生は認められなかった。細胞表面疎水性をBATH法により評価したところ、D4株で高い疎水性度(55%)が示されまた培養液中の浮遊菌体もほとんど観察されなかったことから、本菌は懸濁体PAHに付着することで高濃度のPAHを取り込む機構が示唆された。

今後は4株についても^<14>C-フェナントレン取り込み試験を行うとともに、固相吸着したPAHの輸送・分解特性を検討する。前年度までにオイル汚染土壌より分離した多環芳香族炭化水素(PAH)分解菌PhD1-3y株、PhD1-3w株、B3株およびD4株に関して、16S rRNA遺伝子配列(13681434bp)の解析を行った。データベースでの相同性検索の結果、PhD1-3y株、PhD1-3w株およびD4株はα-プロテオバクテリアに属することがわかった。PhD1-3y株とD4株はXanthobacter属細菌と98100%の相同性が、PhD1-3w株はStarkeya属細菌と99%の相同性が示されたことから、各々Xanthobacter spp.、Starkeya sp.と同定した。一方、B3株はγ-プロテオバクテリアに属し、未分離クローン1つ(油田の微生物群集由来)と99%以上の相同性が認められたが、既知の細菌の中では最も相同性の高かったXanthomonas属細菌でも97%以下の相同性しか認められなかった。このことから、B3株は新属の細菌である可能性があり、新規性の高いPAH分解菌であると考えられた。他の3菌株はナフタレンとフェナントレンを分解するがピレンを分解しない。一方、B3株はナフタレン、フェナントレン、ピレンの分解能を併せもつ。前年度までの検討で明らかにされた高親和性のPAH取り込み機構を有する分解菌Mycobacterium sp. RJGII-135株とともに、B3株は土壌等の固相中で残留し易い高分子PAHの分解除去に有効であると考えられる。
糖鎖遺伝子発現による大腸癌マーカー開発と糖鎖を制御するマイクロRNAの同定と解析

癌の発癌・進展の過程で糖鎖プロファイルは大きな変化を来す。糖鎖遺伝子発現異常が癌細胞の糖鎖構造異常、さらに生物学的特性を規定しることから、糖鎖遺伝子はバイオマーカー候補として魅力的である。大腸癌マイクロアレイデータを糖鎖遺伝子を用いてクラスタリングすることで、予後不良な新規サブタイプを同定し、かつ複数のデータセットでこれを検証した。TCGAデータ解析等により、このサブタイプが病理学的特徴、および特定のゲノム異常と関連することを発見した。候補となる糖鎖遺伝子の免疫染色および癌細胞株における機能解析により、糖鎖遺伝子バイオマーカーが大腸癌のサブタイプ同定、個別化医療につながる研究を継続している。大腸癌など固形癌において糖鎖は臨床的・生物学的に極めて重要であるが、糖鎖自体はDNAに直接コードされず多数の糖転移酵素群により合成され細胞表面で複雑な分枝構造をとるため解析は容易でなく、研究途上であり無限の可能性を持つ分野である。本研究の目的は複数の独立した大腸癌の網羅的遺伝子発現データセットから、臨床的意義のある糖鎖遺伝子群を同定しその発現に基づく予後予測マーカーの確立と臨床応用に向けた多段階の検証を行うこと、それら糖鎖遺伝子を調節するマイクロRNAを同定しその生物学的機能を解析すること、さらに遺伝子レベルからタンパク・酵素・糖鎖レベルへ、多層的に細胞機能研究と臨床関連研究を展開することである。平成25年度は、主に生物科学情報的アプローチ(複数の独立大腸癌データセット)(1)複数のマイクロアレイデータセットを用いた新規糖鎖遺伝子予後signatureの作成と検証(2)糖鎖遺伝子発現signatureを当研究室の独立コホートで再検証(3)糖鎖遺伝子を制御しうるmiRNAの同定;ターゲット検索と関連解析(4)その他の関連解析;層別化解析(KRAS変異、MSI)、クラスター解析、パスウェイ解析を実施する予定である。大腸癌における糖鎖の生物学的、臨床的意義に迫るため、複数のアプローチをとりつつ、糖鎖関連遺伝子(糖転移酵素)とそれらを制御するマイクロRNAの同定、さらにバイオマーカーとしての確立を目指している。例えば2つの独立したマイクロアレイデータセットで、ある特定のセラミドグルコシルトランスフェラーゼが予後不良と相関していた。この遺伝子の癌促進的意義が示唆されるが、さらにマイクロRNA-200cの標的部位を持つと推測される。miR-200cは大腸癌でエピジェネティックな機序で低下しており、EMT(上皮間葉移行)および転移を制御する。それゆえ大腸癌ではmiR-200c低下に伴うセラミドグルコシルトランスフェラーゼが高発現することで転移を惹起し、予後不良に関わるという仮説を検討している。さらに糖鎖遺伝子を制御しうるmiRNAの同定、ターゲット検索、層別化解析、クラスター解析、パスウェイ解析に加え、機能的アプローチ(大腸癌細胞株)や組織学的解析(FFPEサンプルを用いた免疫染色など)を進めていく。大腸癌など固形癌において糖鎖は臨床的・生物学的に極めて重要であり、CA19-9をはじめとしてモノクローナル抗体により認識される糖鎖構造の一部が実臨床で腫瘍マーカーとして利用されている。しかし糖鎖自体はDNAに直接コードされず多数の糖転移酵素群により合成され細胞表面で複雑な分枝構造をとるため解析は容易でなく、研究途上であり無限の可能性を持つ分野である。複数の網羅的データを集積し約190の糖鎖関連酵素遺伝子をプロファイリングすることで、15の糖鎖関連酵素遺伝子を抽出した。それらの遺伝子によるクラスタリングにより大腸癌をサブタイピングできること、またそれらの新規サブタイプが既知のゲノム異常に関連することを解明した。また特定のフコシル基転移酵素やN-acetylgalactosaminyltransferase発現レベルがこれらのサブタイプを特徴づけていると考えており、大腸癌組織におけるタンパクレベルでの発現、細胞株を用いた機能解析を進めている。マイクロアレイなどによる遺伝子発現やマイクロRNA発現データ、さらに公開されているTCGAデータなどの大規模データのバイオインフォマティクスによる関連解析、さらにその意味付けと機能解析に多大な時間を要するため。大腸癌生命情報的アプローチとしてさらに複数のマイクロアレイデータセットを用いた新規糖鎖遺伝子の探索を行い、糖鎖遺伝子発現と相関するマイクロRNAの同定を行う。

ターゲット検索などによりマイクロRNAの標的遺伝子予測を行う。クラスター解析、パスウェイ解析など。並行して機能的アプローチとして大腸癌細胞株を用いた候補miRNAのin vitroでの確認実験、過剰発現・阻害実験、機能解析などを行う。さらに臨床に近いアプローチとして大腸癌パラフィン切片を用いた免疫染色(糖鎖酵素、糖鎖)を行う。大腸癌におけるがん関連の糖転移酵素群と大腸癌で発現が亢進しているマイクロRNAを関連付ける作業に時間を要するため。データ解析および実験系の確立に時間を要し、標的をしぼりきれなかったことで十分な機能解析、臨床データ解析に移れなかったため。大腸癌において、転移や浸潤に関係する糖転移酵素を絞り込み、その遺伝子の発現を制御することが予想されるマイクロRNAをコンピュータ解析などで予測し、発現に連動性があるか見出していく。さらに解析を進め、機能解析を行うとともに、大腸癌切除標本を用いた解析を行う。解析に時間を要し、細胞を用いた検証実験までは行えなかったため。大腸癌の切除標本からRNAやマイクロRNAを抽出し、網羅的に癌で発現変化する糖転移酵素とマイクロRNAを見出していく。
衛星搭載機器および衛星本体が持つ残留磁気量の高速計測システムの研究開発

衛星本体や衛星の搭載部品が持つ磁気の帯磁は、地球磁場との相互作用によって衛星の姿勢を変化させる他、搭載機器への磁気的影響により機器の動作を阻害する場合もある。従って、搭載部品の帯磁量を打ち上げ前に計測し、飛翔体として適合するかどうかの試験を実施し、大きい場合は消磁などの対策をとる。本研究は、部品の帯磁量を高精度で計測できるポータブル式磁気モーメント計測装置の開発と精密測定を行なって、実際の衛星部品の磁化低減に寄与した。衛星本体や衛星の搭載部品が持つ磁気の帯磁は、地球磁揚との相互作用力によって衛星姿勢を変化させたり搭載機器に電磁気的影響を与える。そのため搭載部品の帯磁量を打ち上げ前に計測し、飛翔体として適合するかどうかの電磁環境適合性(EMC)試験を実施し、大きな帯磁量を持つ部品は消磁するなどの対策をとっている。本研究では、部品の帯磁量を分解能0.001[Am2]で短時間で計測できる磁気モーメント計測装置を開発、製作して磁気シールドルームなどでの精密測定を行なってきたが、さらに測定精度は落ちるが簡便で実用的なポータブル式磁気モーメント計測装置を開発し、小型衛星搭載部品や単体の磁気モーメント測定を行なった。JAXAの小型観測衛星「れいめい」の搭載機器の残留磁気モーメントを調べた後,実験データの解析検証を行い,消磁対策を施した。この結果,対策前0.30Am^2あった衛星全体の残留磁気モーメントを設計要求値である0.1Am^2以下に低減できた。さらに近年活発な大学小型衛星の帯磁量を計測する要望が大きくなっており、東京工業大学が開発している衛星の機器や衛星全体の磁気モーメント計測を行い、目標とする残留磁気量が0.010.02Am^2以下に低減できたことを確認した。また、東海大学がソラン株式会社と共同で打上げ予定の「かぶやき」衛星の搭載機器の残留磁気モーメントを計測するため、ポータブル磁気モーメント計測装置を用いたフライト品の帯磁量を計測している。ロケットや衛星搭載の機器や部品が持つ帯磁量を測定する目的で、携帯用の回転式帯磁量計測装置を開発して製作した。これを用いて、JAXAの科学衛星や大学小型衛星に搭載する機器や部品の帯磁量を計測し、大きな磁化を持つ部品に対しては、消磁対策を施し、飛翔中の磁化の影響を最小限にする方策を採った。特に、小型衛星にとっては衛星の磁化は姿勢に変動を与えるなど、科学技術観測に多大な影響を及ぼす。小型衛星の多くには、姿勢安定や制御の為の磁気トルカが用いられていて、飛翔中の磁化や透磁率の高い部品に大きな影響を及ぼす。そのために飛翔前や飛翔中の磁気モーメント計測は重要なEMC対策であるが、これまで磁気モーメントの精密計測は軽視されてきた。この研究目的は、近年増えてきた大学衛星などの小型衛星にも対応できる部品の磁気モーメントを短時間で簡便に計測するスピナー式磁気モーメント計測装置で種々の部品や機器を計測した。計測は磁気モーメントを0.01Am^2オーダーで計測可能であるので、双極子と仮定した場合の磁気モーメントが0.1Am^2以上の機器を要対策品とみなした。小型衛星4機の部品約25点について磁気モーメント計測を行なった。バッテリー、コネクター、磁気トルカ(通電なし状態)、構体、アンテナ、カメラ、GPSセンサなどを計測し、大きな帯磁量を持つ部品の再検討や消磁対策を施して、打上げた。さらに我々が開発制作した、昨年度から利用している高精度磁気モーメント測定装置は、2台の3軸フラックスゲート磁力計と2軸(1軸も可能)回転台で構成され、磁気シールド室内で0.001Am^2の精度で計測が可能である。また、1回の計測・解析が約5分程度と短時間で実施できるため、短期間で多くのパターンの磁気モーメントを測定することができる。本装置を用いた精密計測も一部で用いた。
網膜視細胞の発生機構の解析

申請者は網膜の発生の中で、網膜未分化前駆細胞から網膜視細胞への運命決定機構の解明を目指している。申請者らは、本研究で転写因子Otx2がCrxと共同して視細胞の後期分化に必要であることを見出し報告した(Koike et al.,2007)。さらに網膜視細胞の運命決定機構の解明を目指して、交付申請書に記載した4つの研究項目を行い、研究成果を得ている。1)視細胞の運命決定に必須であるOtx2遺伝子の発現制御因子の同定。我々はOtx2のプロモーター解析を、トランスジェニックマウスを用いて行い、Otx2遺伝子上流に存在する500bpの領域を視細胞エンハンサーとして同定することに成功し,上流制御因子の候補を3つ同定した(論文準備中)。現在さらに解析を継続している。(2)新たな網膜視細胞特異的リプレッサーMR-Sの解析と錐体の運命決定機構の解明。Mr-sが視細胞特異的転写因子PNRと会合し、錐体桿体のサブタイプの分化に関わることをmr-s/PNRダブルノックアウトマウスの解析から明らかにした(論文準備中)。(3)胎生期の視細胞(錐体)に発現する転写因子raxのコンディショナルノックアウトによる解析。申請者はrax-floxマウスの作成に成功し、CrxプロモーターCreERT2トランスジェニックマウスを掛け合わせ、タモキシフェンの投与により、raxの視細胞特異的ノックアウトマウスを作成し、現在網膜表現型を解析中である。(4)Crx-GFPトランスジェニックマウス作成による錐体の発生の解析。申請者はCrx-GFPトランスジェニックを作成し、実際にGFPの発現がCrxの発現を再現することを確認している。FACSソートにより、GFP陽性細胞を精製し、遺伝子発現を検定したところ、Crx陽性Pax6陰性で、予想されたように視細胞前駆細胞を単離することができた。これを用いて錐体の発生に関わる遺伝子の単離を目指して解析中である。我々は視細胞の運命決定に必須の役割を持つOtx2の解析を行っている。Otx2とCrxはともに分化しつつある視細胞に発現しており共通のDNAターゲット配列に結合しうるが、機能的オーバーラップはないのかという点を検定するために、我々はOtx2+/-;Crx-/-ダブルミュータントを作成してOtx2とCrxの機能的重複についての機能解析を行った。ダブルミュータントではロドプシンの発現をはじめとして、視細胞遺伝子群の発現のさらなる低下や視細胞の発生の遅延が認められた(論文投稿中)。Otx2遺伝子は生後、Crxとは異なり双極細胞に高く発現する。Otx2の双極細胞の発生における機能を検定するために、双極細胞でCreリコンビネースを発現するL7-Creトランスジェニックマウスのラインを用いて、双極細胞特異的Otx2変異マウスを作成し解析したところ、双極細胞の分化マーカーであるPKCの発現が認められなかった。つまり、Otx2は双極細胞の最終分化に必要であることが明らかとなった(論文投稿中)。また、我々は網膜前駆細胞でCreリコンビネースを発現するDkk3-Creトランスジェニックマウスのラインを作成した。このラインを用いてOtx2遺伝子を網膜前駆細胞でノックアウトしたコンディショナル変異マウスを作成し、その表現系を解析したところ、Otx2は視細胞の運命決定以外に、水平ニューロンの最終分化にも関わっていることを見出した(論文投稿中)。

Otx2の発現制御機構の解析はトランスジェニックマウスを用いた解析で500bpの領域に特定し、現在最終確認と結合因子の単離を試みている。新たな視細胞特異的リプレッサーmr-sに関しては、ノックアウトマウスの作成に成功し現在解析を行っている。錐体に発現する転写因子raxのコンディショナルノックアウトマウスも作成に成功したところで、今後解析を行っていく。申請者は網膜の発生の中で、網膜未分化前駆細胞から網膜視細胞への運命決定機構の解明を目指している。申請者らは、本研究で転写因子Otx2がCrxと共同して視細胞の後期分化に必要であることを見出し報告した(Koike, et. al.,2007)。さらに網膜視細胞の運命決定機構の解明を目指して、交付申請書に記載した4つの研究項目を行い、研究成果を得ている。(1)視細胞の運命決定に必須であるOtx2遺伝子の発現制御因子の同定。我々はOtx2のプロモーター解析を、トランスジェニックマウスを用いて行い、Otx2遺伝子上流に存在する500bpの領域を視細胞エンハンサーとして同定することに成功し,上流制御因子の侯補を3つ同定した(論文準備中)。現在さらに解析を継続している。(2)新たな網膜視細胞特異的リプレッサー-MR-Sの解析と錐体の運命決定機構の解明。Mr-sが視細胞特異的転写因子PNRと会合し、錐体桿体のサブタイプの分化に関わることをmr-s/PNRダブルノックアウトマウスの解析から明らかにした(論文準備中)。(3)胎生期の視細胞(錐体)に発現する転写因子raxのコンディショナルノックアウトによる解析rax-floxマウスの作成に成功し、CrxプロモーターCreERT2トランスジェニックマウスを掛け合わせ、タモキシフェンの投与により、raxの視細胞特異的ノックアウトマウスを作成し、現在網膜表現型を解析中である。(4)Crx-GFPトランスジェニックマウス作成による錐体の発生の解析。申請者はCrx-GFPトランスジェニックを作成し、実際にGFPの発現がCrxの発現を再現することを確認している。FACSソートにより、GFP陽性細胞を精製し、遺伝子発現を検定したところ、Crx陽性Pax6陰性で、予想されたように視細胞前駆細胞を単離することができた。これを用いて錐体の発生に関わる遺伝子の単離を目指して解析中である。
農商工連携におけるナレッジマネジメントを活用した共創的関係構築の条件に関する研究

本研究の目的は農商工連携におけるナレッジマネジメントを活用した共創的関係構築の条件を解明することにあった。これまで、食品・外食企業と農業分野の連携は、継続性の乏しい不安定で未完成な連携からいかなる条件によって連携組織のすべてがwin-winの状態になる共創的・価値創造的な関係へと進化していったのか、その解明が十分なされているとはいい難い。本研究ではまず、はじめに、農業、食品・外食企業、消費者各々に内在する潜在的ニーズと現実とのミスマッチの実体と連携組織内での問題の解明方向を明らかにし、次に連携が未完成なものから共創的関係に進化する要因をナレッジマネジメント活用の視点から明らかにした。本年度は農業分野、食品・外食企業分野、消費者各々に内在するミスマッチの実態および連携組織内での問題の解明をおこなった。はずはじめに、農業分野においては農業経営の方向性と原料供給の方向性に関するミスマッチが想定される。この場合、農業分野全体の上記ミスマッチの実態把握については農協、企業的農業法人等への大量アンケート調査を実施し、定量的分析をおこなった。さらにすでに加工・外食企業と連携を組織している農協、企業的農業法人等に対して上記アンケートで明らかになった問題について定性的分析により解明の方向を明らかにした。次に、食品・外食企業において想定されるミスマッチの実態については企業の経営方針と国産原料使用の方向とのミスマッチの実態が想定される。また、生産コストと適正販売価格のミスマッチの実態についても検討をおこなう必要がある。この場合も上記ミスマッチの実態把握について食品・外食企業への大量アンケート調査をもとに定量的分析を用いて検討を進めた。さらに、消費者に想定されるミスマッチには潜在ニーズと支払可能額のミスマッチ等が想定される。これらの実態についても消費者への大量アンケート調査による定量分析をもとにその実態把握をおこなった。また、解明方向の検討にあたっては、国産原料を使った食料加工品を多く取り扱う生協、消費者グループ、量販店等への定性的分析をもとにその解明を試みる。上記3分野のアンケート調査に基づく定量的分析はデータの収集整理・分析においてSPSS統計パッケージ等を用いて分析をおこなった。また、原料供給を担う農業分野や、加工・外食分野等ついては、上記アンケート結果の中から比較的優良と思われる事例を取り上げ定性的調査を実施し、連携組織内での各分野の抱える問題の解明をおこなった。平成23年度は前年の分析結果を整理、統合するとともに、全国の食品・外食企業、食農連携事例の中から、未完成な連携、シンプルな構造の連携、共創的関係性を構築している連携に整理し、その違いを明らかにした。さらに未完成な連携からシンプルな連携に進化したグループ、シンプルな連携から共創的関係性が構築されたグループを各々ピックアップし、定性分析を実施した。その際の分析のKeyとなるアプローチが産業クラスターにおける競争優位の源泉(企業戦略、要素条件、需要条件、関連産業・支援産業)によって形成される地域発展条件と各企業間の連携によって生まれる技術革新の源泉となるナレッジ(知識)の共有・活用の方法の2段階の視点である。農商工間の連携には、すでに地域クラスターが形成され、競争優位の環境下で、共創的連携を構築している段階と、それらの地域発展条件の濃淡とは別に、個々の企業が商品開発、技術革新のために暗黙知、形式知を共有・活用して共創的連携を深める段階に分け、その実態を把握する必要があるものと思われる。調査では全国各地の農商工連携優良事例の調査が実施でき、有意義なデータが得られた。これらの調査結果の中から、福岡(グラノ24k)、鹿児島(フェスティバロ社)、徳島(石井養豚センター)、和歌山(古座川ゆずの里)、神奈川(小田急ビルサービス)の事例を上記競争優位の条件ならびにナレッジマネジメントの視点から整理することができた。これらの研究成果は平成24年5月、農林統計出版より『農商工間の共創的連携とナレッジマネジメント』というタイトルで単著を出版予定である。平成24年度は、前年度にまとめた研究成果『農商工間の共創的連携とナレッジマネジメント』をもとに、これまでの分析により明らかになった点、不明な部分を整理し、補足調査を実施するとともに、最終的にナレッジマネジメントを活用した農商工連携の共創的関係構築の条件を明らかにするとともにその理論化を試みた。前年度に実施した優良事例への定性調査は、その分析視点が過去の進化プロセスに遡りその実態を解明する作業であり多くの困難をともなった。企業の核心的部分にも関わる事例調査でもあり、また、関連する連携組織すべてへの調査は、多くの事例に対して再調査および補足調査が必要であった。平成24年度はそれらの補足調査に多くの時間を割くとともに、最終的にそれら事例の包括的整理を実施し理論化を進めた。それらの成果を踏まえ、特に水田農業における農商工連携に大きな課題があることがあきらかになった。

それらは今後の課題として引き続き科研による研究を継続の予定である。調査対象地域の協力も得られ、スムーズに調査を遂行することができたため。24年度が最終年度であるため、記入しない。ここまで得られた研究成果を整理し、補足調査を今年度は実施する予定。
接合上皮発現タンパク質の発現制御による歯周病予防戦略

Ca9-22細胞をTNF-αで刺激すると、アメロチン(AMTN)mRNAおよびタンパク質量は刺激6時間以降に増加した。-211、-353および-501AMTN LUCコンストラクトをCa9-22細胞に導入し、TNF-αで12時間刺激すると、LUC活性の上昇が認められ、-353AMTN LUCのC/EBP1、C/EBP2、YY1配列に変異を挿入すると、LUC活性の上昇が部分的に抑制され、C/EBP1とC/EBP2の両方に変異を導入するとさらに活性の上昇が抑制された。TNF-αおよびIL-1βによる-353AMTN LUC活性の上昇は、PKA阻害剤、チロシンリン酸化阻害剤、MEK1/2およびPI3阻害剤存在下で抑制された。以上の結果から、上皮細胞でのヒトFDC-SPとAMTN遺伝子発現は、TNF-α刺激後に、上記のシグナル伝達経路を介して調整されると考えられた。歯根膜および接合上皮で発現するFDC-SPの遺伝子発現に対するTNF-α炎症性サイトカインの影響を解析した結果、Ca9-22ヒト歯肉上皮細胞でFDC-SP mRNA量およびタンパク質量の増加を認め、FDC-SPルシフェラーゼ(LUC)コンストラクト(-116-948塩基対上流)を作成し、Ca9-22細胞に導入してTNF-αで刺激した結果、ルシフェラーゼ活性が上昇し、同プロモーターの-345塩基対上流までに存在するYY1、C/EBP2およびC/EBP3配列にミューテイションを導入したミューテイションコンストラクトを使用したLUCアッセイの結果、TNF-α刺激後の転写活性の上昇が抑制されたことから、FDC-SP遺伝子プロモーター中のTNF-α応答配列がほぼ明らかになったこと。さらに、接合上皮で発現するヒトアメロチン(AMTN)に対するTNF-αの影響を解析した結果、Ca9-22ヒト歯肉上皮細胞でAMTN mRNA量およびタンパク質量の増加を認め、同プロモーターの-353塩基対上流までのC/EBP1、C/EBP2、YY1配列に変異を挿入すると、LUC活性の上昇が抑制されたため、AMTN遺伝子プロモーター中のTNF-α応答配列がほぼ明らかになったこと、さらにシグナル伝達経路が判明したため。TNF-α刺激で、FDC-SPおよびAMTNの遺伝子およびタンパク質発現が増加することが明らかになった。ルシフェラーゼアッセイおよびミューテイションルシフェラーゼアッセイの結果から、遺伝子プロモーターのどの部分がTNF-α刺激に応答しているかがほぼ明らかになり、各種リン酸化阻害剤を使用したルシフェラーゼアッセイの結果、細胞内情報伝達系が明らかになった。今後、転写因子応答配列のオリゴヌクレオチドを合成し、ゲルシフトアッセイを行う。また、抗体を用いたクロマチン免疫沈降法を行う予定である。アメロチン(AMTN)は、近年新たに発見された分泌エナメルタンパク質の1つであり、そのタンパク質発現は成熟期エナメル芽細胞の基底膜および接合上皮の内側基底板に限局していることから、接合上皮と歯質との接着に関与する可能性が示唆されている。接合上皮は軟組織と硬組織の接合部に位置し、ヘミデスモゾーム結合により歯面に付着する特殊な上皮組織であり、歯周組織の健康を維持する役割を担っており、歯周炎の発症および治療において重要な領域であると考えられる。本研究では、歯周組織におけるAMTNの転写調節機構を解明するため、ヒト歯肉上皮細胞をTNF-αで刺激し、AMTNの転写への影響について解析を行った。ヒト歯肉上皮様細胞株Ca9-22およびSa3と、ヒト唾液腺由来腺癌細胞株HSYを用いてリアルタイムPCRおよびウェスタンブロットを行い、AMTN mRNAおよびタンパク質量の変化を解析した。Ca9-22細胞を濃度の異なるTNF-αで12時間刺激すると、AMTN mRNA量は1 ng/mlから50 ng/mlの濃度で有意に増加し、10 ng/mlで最大となった。Ca9-22細胞およびSa3細胞を10 ng/ml TNF-αで刺激すると、AMTN mRNA量は6時間後に増加し、12および24時間後にさらに増加した。HSY細胞を10 ng/ml TNF-αで刺激すると、AMTN mRNA量は12時間後に増加し、24時間後に最大となった。Ca9-22細胞をTNF-α(10 ng/ml)で刺激すると、AMTNタンパク質量は6時間後に増加し、12および24時間後に最大となった。上皮細胞のマーカーであるCytokeratin19(CK19)のタンパク質量は、TNF-α刺激12時間後に増加し24時間後に最大となった。

以上の結果から、上皮細胞でのヒトFDC-SPとAMTN遺伝子発現は、TNF-α刺激後に、上記のシグナル伝達経路を介して調整されると考えられた。歯根膜および接合上皮で発現するFDC-SPの遺伝子発現に対するTNF-α炎症性サイトカインの影響を解析した結果、Ca9-22ヒト歯肉上皮細胞でFDC-SP mRNA量およびタンパク質量の増加を認め、FDC-SPルシフェラーゼ(LUC)コンストラクト(-116-948塩基対上流)を作成し、Ca9-22細胞に導入してTNF-αで刺激した結果、ルシフェラーゼ活性が上昇し、同プロモーターの-345塩基対上流までに存在するYY1、C/EBP2およびC/EBP3配列にミューテイションを導入したミューテイションコンストラクトを使用したLUCアッセイの結果、TNF-α刺激後の転写活性の上昇が抑制されたことから、FDC-SP遺伝子プロモーター中のTNF-α応答配列がほぼ明らかになったこと。さらに、接合上皮で発現するヒトアメロチン(AMTN)に対するTNF-αの影響を解析した結果、Ca9-22ヒト歯肉上皮細胞でAMTN mRNA量およびタンパク質量の増加を認め、同プロモーターの-353塩基対上流までのC/EBP1、C/EBP2、YY1配列に変異を挿入すると、LUC活性の上昇が抑制されたため、AMTN遺伝子プロモーター中のTNF-α応答配列がほぼ明らかになったこと、さらにシグナル伝達経路が判明したため。ルシフェラーゼアッセイの結果から、ー353からー100塩基対上流までのヒトAMTN遺伝子プロモーター配列中にTNF-αに応答する配列が存在すると考えられることから、同領域の転写因子結合配列のオリゴヌクレオチドを合成し、核内タンパク質との結合をゲルシフトアッセイで解析する。Ca9-22細胞をTNF-α(10 ng/ml)で刺激し、核内タンパク質を抽出し、C/EBP1、C/EBP2およびYY1配列への核内タンパク質の結合を解析する。また、結合の特異性をコンペティションゲルシフトで、結合する転写因子の同定を抗体を用いたスーパーシフトアッセイで解析する。さらに、転写因子結合配列と転写因子との結合をクロマチン免疫沈降法(ChIPアッセイ)で解析する。TNF-α刺激で、FDC-SPおよびAMTNの遺伝子およびタンパク質発現が増加することが明らかになった。ルシフェラーゼアッセイおよびミューテイションルシフェラーゼアッセイの結果から、遺伝子プロモーターのどの部分がTNF-α刺激に応答しているかがほぼ明らかになり、各種リン酸化阻害剤を使用したルシフェラーゼアッセイの結果、細胞内情報伝達系が明らかになった。今後、転写因子応答配列のオリゴヌクレオチドを合成し、ゲルシフトアッセイを行う。また、抗体を用いたクロマチン免疫沈降法を行う予定である。
炎症性疾患におけるIL-17ファミリー遺伝子とIL-17産生性T細胞の役割の解析

最近、IL-17を産生するCD4+T細胞は、IFN一γを産生するTh1細胞でもIL-4を産生するTh2細胞でもない新たなT細胞サブセット(Th17)であることが分かり、このTh17細胞が自己免疫疾患や感染防御に重要な役割を果たしていることが明らかになってきた。さらに、IL-17ファミリーの中で最もIL-17と相同性の高いIL-17FもTh17細胞から産生され、炎症性疾患の発症に重要な役割を果たしていると考えられているが、生体内におけるIL-17Fの役割はほとんど分かっていない。本研究は、免疫応答におけるIL-17とIL-17Fの役割を明らかにすることを目的として、新たにIL-17F欠損、IL-17/IL-17F欠損マウスを作製し、T細胞依存性免疫応答や細菌感染の生体防御におけるIL-17AとIL-17Fの役割について解析した。遺伝子欠損マウスの解析から、IL-17FではなくIL-17が実験的自己免疫性脳脊髄炎や遅延型過敏症、接触型過敏症、1L-1レセプターアンタゴニスト欠損マウスに自然発症する自己免疫性関節炎といった炎症性疾患の発症に重要な因子であることを明らかにした。一方、マウス病原性大腸菌であるCitrobacter rodentium感染モデルにおいては、IL-17とIL-17Fのどちらもがβデフェンシンなどの抗菌ペプチドを介して生体防御に重要な役割を果たしていることを明らかにした。さらに、IL-17/IL-17F欠損マウスではIL-17欠損マウスやIL-17F欠損マウスに比べ、SPF環境下において日和見感染菌であるStaphylococcus aureusに易感受性になっていることが分かった。本研究により、免疫応答においてIL-17とIL-17Fは機能的特異性や重複性を有しており、炎症性疾患や感染防御に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。最近、IL-17を産生するCD4+T細胞は、IFN-γを産生するTh1細胞でもIL-4を産生するTh2細胞でもない新たなT細胞サブセット(Th17)であることが分かり、このTh17細胞が自己免疫疾患や感染防御に重要な役割を果たしていることが明らかになってきた。本研究は、免疫応答におけるIL-17とIF-17Fの機能的特異性や重複性を明らかにすることを目的として、新たにIF-17F欠損、IL-17/IF-17F欠損マウスを作製し、T細胞依存性免疫応答や細菌感染の生体防御におけるIF-17AとIL-17Fの役割について解析した。遺伝子欠損マウスの解析から、IL-17FではなくIL-17が実験的自己免疫性脳脊髄炎や遅延型過敏症、接触型過敏症、IL-1レセプターアンタゴニスト欠損マウスに自然発症する自己免疫性関節炎といった炎症性疾患の発症に重要であることを明らかにした。一方、マウス病原性大腸菌であるCitrobacter rodentium感染や日和見感染菌であるStaphylococcus aureusの局所感染においては、IL-17とIL-17Fのどちらもが生体防御に重要であることを明らかにした。今後、IL-17とIL-17Fの機能的特異性や重複性の分子メカニズムについて解析していく予定である。
腫瘍随伴性マクロファージをターゲットとした悪性黒色腫新規免疫療法の開発

本研究では、はじめに各種免疫賦活薬の悪性黒色腫腫瘍内の腫瘍随伴性マクロファージ(Tumor-associated macrophages: TAMs)に対する影響を検討する。また、これら薬剤の腫瘍の免疫環境への影響をDNA microarrayで検証した。その結果、Imiquimodやインターフェロンなど複数の免疫調整因子がTAMsを介して免疫チェックポイント阻害薬の抗腫瘍効果を増強することがマウスB16F10黒色腫モデルで明らかとなった。また、これらTAMsの産生するケモカインの中で、CCL22が腫瘍内抑制型免疫環境の形成に重要であることを明らかにした。他にもケモカインで、エフェクター細胞の腫瘍内への遊走に関与するCXCL9, CXCL10, CXCL11、Th17の腫瘍内への遊走に関与するCCL20, CXCL5など各種ケモカインが腫瘍の増殖に密接に関与していることが明らかになりつつある。更に、マウスでTAMsの活性化が免疫チェックポイント阻害薬である抗PD1抗体の治療効果の予測因子になりうることを解明した。それゆえ、ヒトにおけるTAMsの活性化マーカーであるsCD163に注目し、悪性黒色腫患者におけるTAMsの活性化状況を抗PD1抗体で治療した悪性黒色腫患者の治療前後で検討した。その結果、最終的にヒトTAMsの活性化指標であるsCD163により、3ヶ月目における抗PD1抗体による根治切除不能悪性黒色腫の治療効果を治療開始6週目で85%の感度、87%の特異度で予測できることを明らかにした。この結果は、英国研究雑誌Frontiers in Oncologyに掲載された他、プレスリリースでは日経新聞、読売新聞をはじめ6社に掲載された。また、本案件を特願出願を行った(特願2018-215880:免疫チェックポイント阻害薬の治療効果予測方法)。本研究により、はじめにマウスB16F10モデルで、腫瘍内免疫環境は腫瘍内で抑制型マクロファージである腫瘍随伴性マクロファージ(TAMs)を、IFNbやイミキモドなど臨床で抗腫瘍薬として使われている薬剤により成熟過程で抗腫瘍型マクロファージに分化することを明らかにした。さらにそのマクロファージを単離して、ケモカイン産性能を検証したところ、ケモカインが制御性T細胞関連ケモカインからエフェクター細胞関連のケモカインに変化することが明らかになった。その結果、腫瘍内浸潤細胞中の制御性T細胞の比率が減弱することがわかった。これらの結果を人に応用するため、ヒト単球由来M2マクロファージを用いて各種薬剤の検証を行ったところ、IFNbはマウスの場合と同様にマクロファージから産生されるケモカインを抗腫瘍型に変化させることが分かった。以上、2015年にOncoimmunology (IF 7.644)に掲載した論文に追加データを加え、ニボルマブ、IFNb併用療法の臨床応用を行うため、医師主導臨床研究により安全性試験を行った。結果、ニボルマブとの併用の安全性はIFNb 300万単位で担保された。この結果はOncotarget (2017, in press:IF=5.008)に成果として掲載した。その他、臨床で悪性リンパ腫の治療薬として用いられている薬剤としてIFNaとIFNgのヒト単球由来M2マクロファージに対する影響を同様に行い、変化するケモカインが実際の治療患者の腫瘍内で変化すること、そのケモカインが誘導する細胞のフェノタイプが抑制型免疫担当細胞から抗腫瘍型免疫担当細胞に変化することを明らかにした。この結果は、2016年にExperimental Dermatology(IF=2.675)とJournal of Dermatological Science(IF=3.739)に掲載された。本研究では平成28年度内に、医師主導臨床研究を終え、かつ成果を国際誌(Oncotarget: IF=5.008)に採用となった。臨床応用のための安全性試験は当初の目的では平成29年の9月までかかる予定で、この成果を論文掲載するのは平成29年度内が目標であったため、予定より早く目標を達成できたと考えられる。また、この論文内での発表している免疫チェックポイント阻害薬のバイオマーカーに関しての新知見も発表しており、かつこのバイオマーカーを国内特許の申請も終了している。さらに腫瘍随伴マクロファージという悪性黒色腫のみでなく、多彩な癌腫にあるこの細胞に対する各種薬剤の影響を網羅的に調べることにより、腫瘍随伴マクロファージをターゲットとした免疫療法は悪性黒色腫のみでなく、多彩な癌腫への応用も可能であることを明らかにした。実際、後述するように平成28年度の国際誌への掲載件数は主著で10件あり、予測された業績をはるかに上回ると考えられる。以上から、平成28年度の進捗状況は当初の計画以上に進展している。本研究は腫瘍随伴マクロファージをターゲットとした新規悪性黒色腫治療法の開発を目的として、マウスと人の細胞を用いて研究を行った。本年度は、前年度施行した、ニボルマブ、IFNb併用療法の臨床応用を目的とした医師主導臨床研究より得た、pilot studyの結果を基として、ニボルマブによるimmune-related adverse events (irAE)の発症予測システムを、腫瘍随伴性マクロファージ関連物質であるsCD163と関連ケモカインを用いて施行した。この研究では根治切除不能