hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
上皮・間質間の作用からみたホルモン療法抵抗性前立腺癌の増殖機構に関する研究

さらに、連続切片を抗第VIII因子関連抗原抗体で染色すると、PD-ECGF高発現群における切片中の血管数は、そうでない群に比べて有意に多かった。この二群間の生存率は、高発現群の方が転帰不良の傾向を示した。この成長因子もPCの進行との関連が考えられる。1)前立腺上皮内癌(PIN)について検討を行った。全対象は276例(前立腺肥大症193例、前立腺上皮内癌31例、前立腺癌StageB 52例)、延べ336回の前立腺生検標本である。初回生検でPINが発見された場合(全体の9.2%)には半年以内に再生検することを基本方針とし、PIN31例のうち、22例が計37回生検を受けた。再生検によって、low grade PINでは44%、high grade PINでは33%の症例で癌が発見された。この発見率は、これまで報告されてきた欧米諸国での割合とほぼ同じである。われわれの研究から、潜在癌だけでなくPINでも発生率には人種差が少ないことが明らかになった。さらに興味深いことに、血清前立腺特異抗原(PSA)測定値の比較では、PINとStageB癌症例の間に統計学的な有意差(p<0.001)が認められた。PSA Densityについても同様に有意差(p<0.001)が存在した。2)ホルモン療法に抵抗性になったと考えられる前立腺癌症例の前立腺特異抗原(PSA)蛋白質の癌性変化について調べた。非癌細胞由来のPSAが存在しない試料として、癌患者末梢血と転移部位の前立腺癌組織を採用した。比較対照には、前立腺肥大症(BPH)組織を用いた。それぞれの試料からRNAを抽出し、PCR法によってPSAのcDNA全長を増幅させた。個々の症例について、このPCR産物の遺伝子配列を決定し、文献上の報告を含めてBPHからのそれと対比した。その結果、症例ごとに数カ所のバリエーションは認められるものの、明らかな癌性変化と呼べる変異はなかった。したがって、少なくともmRNAレベルでは、癌特異的なPSAは存在しないと考えられた。
予蒸発予混合燃焼機構に及ぼす噴霧特性の影響に関する研究

本研究は,予蒸発予混合燃焼器の噴霧特性,蒸発特性,燃焼特性,燃焼ガス特性などを調べてそれらの間の関係を明らかにし,低NO_xx燃焼法としての希薄予蒸発予混合燃焼器の設計指針を得ることを目的としている。まず初めに,試作燃焼器を用いて噴霧の蒸発実験を行った。それによれば,常温場では噴射弁から離れるにしたがい,液滴質量流束分布は一様分布に近づき,中心軸上の質量流束のピークは急激に減少し,噴射弁下流495mm(蒸発管出口)では,中心部の質量流束は管壁近くの流束の倍程度まで減少する。一方,気流速度30m/s,気流温度550Kでの水の蒸発実験によれば,噴射弁下流175mmの位置では,中心軸上の液滴の質量流束は蒸気に比べてかなり大きいが,下流に行くにつれ急速に蒸発が進み,430mm付近で両者は逆転する。蒸気の水成分全体(液滴と蒸気を含む)に対する割合の半径方向分布は,中心と蒸発管内壁の間にピークを持ち,中心部および内壁近傍で低くなる。つぎに,燃焼実験を行った.それによれば,当量比の減少に対して,φ=0.6付近で保炎位置が保炎板およびステップの両者から保炎板のみに変化し,火炎は全体的に長くなる。希薄側保炎限界当量比は,蒸発管が長くなるほど,燃焼用気流温度が高くなるほど,気流速度が大きくなるほど小さくなる。燃焼ガス中のNO_x濃度は,当量比の増大とともに指数関数的に増大し,そのEmission Index値は断熱火炎温度に対して実験式で与えられた。本燃焼器では当量比0.540.68の条件で燃焼を行えば,EI(NO_x)値を1g(NO_x)/kg(Fuel)以下かつEI(CO)値を10g(CO)/kg(Fuel)以下に抑えることが可能である。さらに,噴霧の流動や蒸発に関する数値シミュレーションを行った。その結果,気流速度30m/s,気流温度550Kの条件では,噴射弁下流500mmの位置で中心部の気流温度は周辺部より約35K低く,中心部のザウタ-平均粒径は周辺部より約30μm小さいことが分かった。本年度は,気流温度650K,気流速度40m/sまで条件設定が可能な高温風洞内で,比較的容易に微細噴霧が得られる半内部混合式の同軸気流噴射弁によって水を噴霧し,高温気流内での水噴霧の蒸発性を調べた。さらに,数値シミュレーションにより高温気流内での噴霧粒子の挙動ならびに蒸発率の変化を計算した。まず,静止大気中で水を噴霧し気流噴射弁の噴霧特性を測定した。粒子径の測定結果によれば,微粒化用空気流量を増大すると粒子径は減少し,水流量を増大すると粒子径は増大して,典型的な気流噴射弁の噴霧特性の傾向を示すことが明らかとなった。蒸発実験範囲内での噴霧粒子のザウタ-平均粒径は4070μmであった。次に,高温風洞内で水を噴霧し,噴霧粒子の蒸発率を測定した。蒸発率の測定にはスピルオーバ法を用いた。

風洞断面内での,噴霧粒子と水蒸気を合わせた質量の流束分布は,上流では中心部で高く風洞壁に近づくにつれ減少する分布を示すが,下流に行くにつれて分布が平均化することが分かった。水の供給流量が増大するほど,気流速度が増大するほど,また微粒化用空気流量が少なくなるほど,噴霧粒子および水蒸気の半径方向への拡散が相対的に減少することが分かった。蒸発率については,実験範囲内でほぼ全ての条件で70%以上となって,噴霧の観察結果に比べてかなり大きな値を示しており,スピルオーバ法による蒸発率の測定は今後改良の余地があると思われた。さらに,高温風洞内での噴霧粒子挙動の数値シミュレーションを行った。計算結果によれば,下流に行くほど,気流温度が高くなるほど蒸発率が高くなることが分かった。また,気流速度が大きくなるほど,微粒化用空気流量が多くなるほど,蒸発率はやや減少することが分かった。一方,断面内での気流温度分布の計算結果は実験結果と異なっており,今後検討の余地があることが明らかとなった。本研究は,予蒸発予混合燃焼器の噴霧特性,蒸発特性,燃焼特性,燃焼ガス特性などを調べてそれらの間の関係を明らかにし,低NOx燃焼法としての希薄予蒸発予混合燃焼器の設計指針を得ることを目的としている。まず初めに、試作燃焼器を用いて噴霧の蒸発実験を行った。それによれば、常温場では噴射弁から離れるにしたがい,液滴質量流束分布は一様分布に近づき,中心軸上の質量流束のピークは急激に減少し,噴射弁下流495mm(蒸発管出口)では,中心部の質量流束は管壁近くの流束の倍程度まで減少する。一方,気流速度30m/s,気流温度550Kでの水の蒸発実験によれば、噴射弁下流175mmの位置では,中心軸上の液滴の質量流束は蒸気に比べてかなり大きいが,下流に行くにつれ急速に蒸発が進み、430mm付近で両者は逆転する。蒸気の水成分全体(液滴と蒸気を含む)に対する割合の半径方向分布は,中心と蒸発管内壁の間にピークを持ち,中心部および内壁近傍で低くなる。つぎに,燃焼実験を行った。それによれば,当量比の減少に対して,φ=0.6付近で保炎位置が保炎板およびステップの両者から保炎板のみも変化し,火炎は全体的に長くなる。希薄側保炎限界当量比は,蒸発管が長くなるほど,燃焼用気流温度が高くなるほど,気流速度が大きくなるほど小さくなる。燃焼ガス中のNOx濃度は、当量比の増大とともに指数関数的に増大し,そのEmission Index値は断熱火炎温度に対して実験式で与えられた。本燃焼器では当量比0.540.68の条件で燃焼を行えば,EI(NOx)値を1g(NOx)/kg(Fuel)以下かつEI(CO)値を10gco/kgFuel以下に抑えることが可能である。さらに,噴霧に流動や蒸発に関する数値シミュレーションを行った。その結果,気流速度30m/s,気流温度550Kの条件では,噴射弁下流500mmの位置で中心部の気流温度は周辺部より約35K低く,中心部のサブター平均粒径は周辺部より約30μm小さいことが分かった。
アイヌ民族の冬期生活資料に関する比較研究

アイヌ民族の冬,雪,寒さに関する文化に視点を置き,各地の博物館等に残存する雪上歩行具,除雪具,衣服等の有形民族資料を通し,アイヌ民族がどの様な文化的特色を継承してきたか,日本文化,北方諸民族の文化と比較しながら調査を進めた。その結果以下の事が明確となった。1.アイヌ民族が使用する雪上歩行具(カンジキ)には単輪型,複輪型の2タイプがあり,前者は岩手県北部に分布するものと同一であり,後者は北海道に分布するものと同一であった。両者とも樺太,シベリヤ,アラスカに分布するラケット状カンジキとは明確に異なるものであった。また,樺太,シベリヤ地方に分布する橇,スキ-がアイヌ民族にみられなかった。従って,アイヌ民族の雪上歩行員,運搬具は,日本文化の影響を強く受けたものであると考えられる。2.アイヌ民族に若干の除雪具があった事を確認したが,伝統的に継承し,普及していたものとは考えられず,日本にみられる除雪具(コスキ)の影響がなかった思われる。この点に関しては,樺太,シベリヤ地方の諸民族が除雪具を有しない事と同様であった。3.アイヌ民族の衣服,特に冬期間着用する衣服は,北方諸民族が毛皮中心であるのに対し,毛皮製衣服を着用する事例が少なく,夏,冬とも日本文化の影響を受けた単衣形式の布,樹皮製衣服であり,防寒性を考慮した衣服ではないものと考えられる。しかし,この点に関しては近世を中心とする毛皮交易を背景に考えなければならないであろう。これらの結果は、残存する有形民族資料,文献等から江戸時代後期には成立していたものと考えられ,当時の社会背景からみても日本文化の影響を強く受けていたものと思われる。しかし,日本文化と必ずしも同一ではなく,また,北方諸民族の冬期生活資料とも極めて異なる点にアイヌ民族の特異的文化が成立していたものと推察される。この調査・研究は、アイヌ民族の冬期生活資料,特に住居,毛皮製衣服,カンジキ,スキ-,除雪具に重点をおき,アイヌ民族が冬あるいは寒さに対してどのような考えをもち,それらが歴史的,文化的にどのような変遷を経たか。樺太,千島など北方諸民族,さらに日本の資料と比較し解明しようとするものである。今年後の調査は,ロシア語論文の翻訳,及び上記資料の所在調査を国立民族学博物館,北方民族博物館(網走),名寄市郷土資料館にて実施した。この結果,毛皮製衣服,スキ-,除雪具が残存していないことが明らかになった。毛皮製衣服が残存しないことは,アイヌ民族が冬期間に毛皮製衣服を一般的に着用しなかったことを意味するものであり,その背景には手皮が松前藩の重要な交易品のひとつであったことが大きく影響した結果と思われる。しかし,これらの交易が盛んであった近世以前はどうであったかは不明であり,今後の課題である。樺太,シベリアの北方諸民族に認められるスキ-は,冬期間の歩行具として一般的であるのに対し,アイヌ民族では認められず,冬期間における生業形態の相異によるものと思われる。除雪具に関しては,スキ-の事例と逆に,東北・北陸地方多様に伝承されたにもかかわらず,北海道アイヌ,樺太等では使用しなかったようである。このことは雪質の相異が大きく影響するものと考えられ,今後,カンジキの形態的相異,あるいは住居の相異と変遷を加味しながら解明しなければならない。次年度の調査は,博物館等における上記資料の所在調査,文献調査を進めるとともに,近世における毛皮の交易に関する背景,冬期間における生業形態の比較,近世における毛皮の交易に関する背景,冬期間における生業形態の比較,雪質の相異と生活様式の関係について解明し,アイヌ民族の冬,寒さに対する考え方,あるいは文化の一端を明確にしようとするものである。

これらの結果は、残存する有形民族資料,文献等から江戸時代後期には成立していたものと考えられ,当時の社会背景からみても日本文化の影響を強く受けていたものと思われる。しかし,日本文化と必ずしも同一ではなく,また,北方諸民族の冬期生活資料とも極めて異なる点にアイヌ民族の特異的文化が成立していたものと推察される。
「植民地朝鮮」の映像と歴史の記憶-ポスト植民地時代の国際的アーカイブの構築-

本研究は、日本植民地下にあった朝鮮半島の歴史の記憶を埋もれていた映像資料の中から再検討することである。しかし、それらの映像は、各時代の権力者・支配者の立場から収集され、保管され、再構築されてきた。ここでは、関連先行研究を整理し、それを乗り越えるべく問題意識を明確に持ち理論的展開を進めると同時に、これまでほとんど学術利用されないままに世界各地に埋もれている植民地朝鮮に関する映像資料を収集することを試みる。アーカイブと研究のネットワークを形成しながら、これまで検証されることのなかった植民地における被抑圧者たちの歴史と記憶について考察することを目指すものである。今年度は、オーストラリアでのフィールドワークや、日本国内の各地における調査を実施した。オーストラリアの戦争記念館、国立フィルム・音響アーカイブなどにおいては、日本や韓国では見ることができない、植民地解放直後や朝鮮戦争中にオーストラリア軍が朝鮮半島で撮影した映像などが所蔵されており、歴史を再検討する上で非常に重要な記録としての映像資料が多数発見された。これらの資料は研究利用が可能となっているので、規定の手続きの上、複写し収集した。さらに、関連資料について詳しい研究者などへのインタビュー調査も行なうことができた。オーストラリア国立大学においては、テッサ・モリス-スズキ教授の協力により、関連研究者たちとの連携や協力が可能となり、アジア・環太平洋規模での研究ネットワークを形成することができ、研究にダイナミズムを与えてくれた。平成25年6月には日本マス・コミュニケーション学会において、口頭発表を行い、また平成25年7月にはオーストラリア日本学会などで発表を行い、国際的な学術ネットワークが構築されつつある状況である。(抄録なし)(抄録なし)本研究の目的は、日本植民地下にあった朝鮮半島の歴史の記憶を、埋もれていた映像資料の中から再検討することである。これらの映像資料は、当事者の手を離れ、各時代の権力者、支配者などに収集され、保管され、その記憶は再構築されてきた。また、植民地解放後も東西冷戦となった朝鮮半島の映像の保管や利用は、冷戦によるイデオロギー対立などが大きく影響しており、冷戦が終焉した90年代から2000年代にかけてやっと情報公開や機密解除などが進んでいる状況である。本研究では、これまで闇に埋もれてきた植民地朝鮮に関連する映像資料のアーカイブ状況の実態を調査し、リスト化、収集などを行なうと同時に、アーカイブと研究のネットワークを形成することを試みる。この作業によって、これまで検証されることのなかった植民地の被抑圧者たちの歴史と記憶がどのように人びとに伝えられてきたのか、あるいは消え去ってきたのかという、システムの構造自体の問題にも焦点を当てる。そのためにまず、国内外の先行研究をまとめ、日本国内においては、東京国立美術館フィルムセンター、記録映画保存センター、NHKアーカイブス、放送ライブラリー、川崎市市民ミュージアムなどに所蔵されている関連資料を実態調査し、リスト化し、可能な限り閲覧あるいは収集を行なった。さらに、韓国においては、韓国映像資料院などに所蔵されている資料なども調査を行ない、また米国においては、ワシントンD.C.の国立公文書館、議会図書館、マサチューセッツ州ハーバード大学のフィルムセンターなどで関連映像資料の調査を行い、所定の手続きを行なった上で複写・収集作業を行なうことができた。各機関においては、アーキビストや関連研究者にもヒアリングやインタビュー調査を行なうことができた。また、日本マス・コミュニケーション学会の査読論文掲載や日本社会学会での口頭発表を通じて、このテーマに関連する重要な意見や助言を得ることができた。当初の計画の重要な柱であった日本・韓国の国内の映像資料収集は各方面の研究協力などがあり、実際にアーカイブへ訪問しまたインタビュー等も行なうことが出来、順調に進行している。また、米国の国立公文書館や議会図書館などへのフィールドワークでも、関連研究者などの協力があり情報収集なども順調に進み、予想以上の収穫があった。(抄録なし)今後も引き続き映像資料収集とインタビュー調査を中心とした国内外のフィールドワークを進める。

国内外のアーカイブにおいては、対象としている映像資料がかなり昔のものであるためか、当初予想していたよりもデジタルアーカイブ化やデータベース化が進んでいなかった。そのため、紙媒体の参照カードで検索したり、フィルムを映写機にかけて閲覧するような場合が多いために、閲覧や収集自体に時間と資金が予想よりも多くかかった。ここでは、当初の研究の目的を果たすべく、アーカイブのシステムについて事前に綿密に調査し、時間面、費用面での対策を練った上で、閲覧や収集を推進していく予定である。(抄録なし)
造血幹細胞特異的遺伝子の網羅的解析:自己複製・分化関連分子の同定

我々が新規造血幹細胞特異的表面マーカーとして同定したendothelial cell-specific adhesion molecule-1 (ESAM-1)について、「造血幹細胞上のESAM-1の生理的意義」を明らかにすることを目的として研究を行った。マウスを5-FU処理した後の回復期にある造血幹細胞がESAM-1を高発現することを見出し、細胞周期とESAM-1発現との関連性を明らかにした。一方、ESAM-1欠損マウスに対して5-FU処理を行った場合、赤血球の回復が遅延することが原因で、一部のマウスが死亡した。造血回復期のBFU-E, CFU-Eコロニー形成細胞が著明に低値であり、造血幹細胞から赤芽球への早期分化段階にESAM-1が必要であると考えられた。また、ヒトにおけるESAM-1の発現を検討した結果、造血幹細胞の他にもESAM-1高発現細胞集団が臍帯血中に存在した。これら細胞は造血細胞への分化を示さなかったものの、血管内皮細胞への分化能を有することが明らかになった。細胞治療の新しい材料として期待できる結果であると思われる。造血幹細胞を中心とした階層的な造血システムは、リンパ血液細胞を供給するだけでなく必要に応じて環境変化に対応できる。造血幹細胞特異的表面マーカーとして新たにendothelial cell-specific adhesion molecule-1(ESAM-1)を同定した。今年度、ESAM-1の生体内制御機構について検討した。正常マウスを5-FUにて処理し、血球回復時の造血幹細胞(Lin-, SCA-1+, c-kit+)分画のESAM-1発現を解析した。血液細胞の枯渇に反応して造血幹細胞が増殖する時期に一致して非常に高いESAM-1発現が認められ、細胞増殖が終了するに従いESAM-1の発現も元の発現レベルまで減少した。実際、非常に高いESAM-1発現が認められる大部分の細胞が細胞周期に入っていることを確認した。次に、阻害剤をマウスに投与した結果、5-FU処理後のESAM-1発現増強には、TOPOIIやNF-kBを介するシグナルが関与していると考えられた。また、TGF-β阻害剤によってもESAM-1発現増強が抑制された。以上、造血幹細胞上のESAM-1の発現は、細胞周期と関係を持つことが明らかとなった。ESAM-1発現細胞の骨髄内での局在を組織学的に解析したところ、ESAM-1発現細胞は血管周囲に存在していた。このことは、細胞周期にある造血幹/前駆細胞がVascular nicheに存在することよく合致すると考えられた。5-FU処理後の血球回復期にある骨髄細胞のESAM-1発現をFlow cytometerにて解析した。回復期にある造血幹細胞は非常に高いESAM-1発現が認められた。ESAM-1を高発現する細胞はすべて細胞周期に入っていることも確認した。また、ESAM-1欠損マウスに5-FU処理を行うと、赤血球系細胞の回復が著明に障害されていることを見出した。このように、ESAM-1は細胞周期にある造血幹細胞上に発現され、特に赤芽球造血に深く関わることが明らかになってきた。以上の結果に基づき、ESAM-1を欠損する造血幹細胞の質的異常に関する分子メカニズムについて解析を行うことにした。野生型およびESAM-1欠損マウスの造血幹細胞の遺伝子発現を網羅的に比較するためにDNA arrayを予定しており、既に、両細胞分画からRNAを回収している。(1) ESAM-1欠損マウスに対して5-FU処理を行った場合、赤血球の回復が遅延することが原因で、一部のマウスが死亡することが明らかになった。5-FU処理の骨髄では、造血回復期のBFU-E, CFU-Eコロニー形成細胞が著明に低値であり、造血幹細胞から赤芽球への早期分化段階で障害が認められた。ESAM-1は造血幹細胞や血管内皮細胞で発現が認められる膜蛋白である。ErythropoietinなどはむしろESAM-1欠損マウスで増加していたことから、赤血球回復遅延の原因として血液細胞(ESAM-1欠損)に問題があると考えられた。

更なる解析を進めるため、野生型およびESAM-1欠損マウスの造血幹細胞の遺伝子発現を網羅的に比較するためのDNA arrayの材料として、両細胞分画からRNAを回収した。(2)ヒトにおけるESAM-1の発現を検討した結果、臍帯血中にESAM-1を高発現する細胞集団が存在した。これら細胞は造血細胞への分化を示さなかったものの、血管内皮細胞への分化能を有することが明らかになった。細胞治療の新しい材料として期待できる結果であると思われる。造血幹細胞におけるESAM-1の役割を明らかにすることができた。この研究成果については、現在、論文投稿中である。また、本事実に基づき、遺伝子発現を網羅的に解析する細胞の組み合わせ(野生型とESAM-1欠損マウス由来造血幹細胞)を決定できた。24年度が最終年度であるため、記入しない。野生型とESAM-1欠損マウス由来造血幹細胞の間でのDNA arrayに取り組んでおり、実験材料も整ってきた段階である。造血幹細胞から赤芽球系細胞への初期分化に関わる分子を同定したい。
象牙質再生のためのin vitro覆髄モデルの構築

覆髄の効果を判定するため、ラット大臼歯に対して人工露髄面を形成し、高周波ラジオ波メスによって止血を行い、修復象牙質形成を調べた。通常の止血法による止血と高周波ラジオ波メスによる止血を比較検討したところ、良質な修復象牙質形成が観察され、歯髄の炎症性反応は少なかった。また、規格化された露髄径が修復象牙質形成にどのような影響があるかを検討した。30号のKファイルによって拡大された露髄径では良質な修復象牙質が形成されたが、50号以上の拡大ではトンネル状欠損を有する修復象牙質の形成が観察された。これらの結果から、止血状態や露髄径の大きさは、良質な象牙質再生および歯髄の炎症に影響を与えることが示唆された。北海道医療大学病院で採取されたヒト歯牙から歯髄を採取し、不死化を誘導し、かつ分化能を維持する遺伝子をヒト歯髄細胞に導入することで寿命を延長させ、その歯髄細胞の機能を明らかにすることである。本年度はまず、ラット歯髄から細菌性コラゲナーゼ消化法によってラット歯髄細胞を採取したのち、有効かつ生体にとって安全な方法での石灰化の条件を検討するため、食品添加物としても使用されている大豆イソフラボンを添加して石灰化を調べた。実験の結果、大豆イソフラボン投与によってアルカリフォスファターゼの活性が観察された。さらにラット歯髄細胞からtotal RNAを回収してRT-PCR法によって石灰化関連遺伝子群(オステオカルシン、オステオポンチン、I型コラーゲン)の遺伝子発現も確認したところ大豆イソフラボン投与によって遺伝子発現の上昇が観察された。また、大豆イソフラボンをラット直接覆髄法実験モデルに使用し、覆髄実験を行ったところ、4週間で水酸化カルシウムによる直接覆髄法と比較して良好な新生象牙質の形成を伴う覆髄効果が発揮される傾向が観察された。また、以前に樹立したhTERT (humanTelomerase reverse transcriptase), hE6E7 (Human papillomavirus E6 E7 genes)を用いて不死化を行ったイヌ歯髄細胞の実験結果から、これらの遺伝子をレトロウイルスベクターに組み込み効率的にヒト歯髄細胞の不死化に着手した。本年度の研究予定であったヒト歯髄細胞の不死化に関しては、提供を受けた第3大臼歯の歯髄が極めて小さく、初代歯髄細胞の培養が困難であった。しかしながらヒト歯髄細胞を採取し、不死化実験を継続して行う予定である。そこで、本年は初代ラット歯髄細胞を中心に研究を進めることとした。in vitroでの覆髄法の効果を判定するため、初めにラット大臼歯に高周波ラジオ波メスによって止血を行い、修復象牙質形成を調べた。ラット臼歯部に人工的な露髄面を形成し、通常の止血法による止血と各種強度による高周波ラジオ波メスによる止血を比較検討した。各実験群ともに水酸化カルシウム製剤によって覆髄を行い、2週間および4週間後にサンプルを摘出した。通法に従ってHE染色を行い形態学的に、修復象牙質の形成および歯髄の炎症性反応を観察した。高周波ラジオ波メスによる止血効果は、次亜塩素酸と過酸化水素水による止血に比べ、短時間で止血効果を示し、かつ良質な修復象牙質形成が観察された。また、歯髄の炎症性反応は、通法に比較して炎症反応が少なかった。これは統計学的にも優位な差が認められた。本研究結果から、高周波ラジオ波メスによる歯髄組織の止血効果は、良質な修復象牙質形成を誘導することがわかった。今後はin vitroでの高周波ラジオ波メスによる止血を行った際の歯髄組織の変化のデーターを基に、安全性および確実性を確認し、早期に臨床応用可能かどうかを検討したい。当初の予定であったヒト歯髄細胞の不死化実験は継続しているが、完全な不死化細胞は、未だ得られていないのが現状である。昨年度に行っていたin vitroでの覆髄法の効果を判定するため、ラット大臼歯に対して人工露髄面を形成し、高周波ラジオ波メスによって止血を行い、修復象牙質形成を継続的に調べた。通常の止血法による止血と各種強度による高周波ラジオ波メスによる止血を比較検討したところ、統計学的に短時間で止血効果を示し、かつ良質な修復象牙質形成が観察された。これらの結果は現在論文発表準備中である。また、新規直接覆髄剤の評価のためには、統一した実験モデルの作製が重要である。そこで露髄径の大きさを規格化し、露髄径が修復象牙質形成にどのような影響があるかを検討した。

ウィスター系雄性ラットの上顎第一臼歯に人工露髄面を形成し、各種大きさのKファイルを用いて露髄部の拡大を行った。#30によって拡大された露髄径では、術後14日目にて良質な修復象牙質が形成された。歯髄は軽度の炎症性細胞の浸潤が観察されたが、空胞変性は観察されなかった。一方、#50群および#80群、#100群では、トンネル状欠損を有する修復象牙質の形成が観察され、歯髄は炎症性細胞の浸潤を伴った空胞変性が観察された。これらの結果から、露髄径の大きさは、良質な象牙質再生および歯髄の炎症に影響を与えることが示唆された。さらにラット歯髄細胞およびマウス歯髄細胞株(MDPC23)を用いて、in vitroにおける覆髄の効果判定のための実験を行う予定である。
ビスオキサゾリンリガンドの特性を利用した新規連続反応の開発

先に我々は、ビスオキサゾリン(box)配位子が、2価パラジウムのπ-求電子性を増大させることを見出している。今回、このbox配位子の特性を活用することで、環化-カルボニル化-環化-カップリング反応(CCC-coupling反応)の開発および5-メトキシ-3(2H)-フラノン類の効率的合成法の開発に成功した。前者は、インドール環、ベンゾチオフェン環、ベンゾフラン環およびキノリン環等の医薬品化学的に重要な様々な複素環を2つ持つ対称ケトンを、また後者は、C-17位にスピロフラノン構造を有する新規ステロイド類を、共に比較的単純なアルキン類から一挙に合成できる有用な反応である。目的1: Box-Pd(II)による環化-カルボニル化-環化-カップリング反応(CCC coupling反応)の開発(1)反応の基質として、種々の置換基を有するプロパルギルジケトン類、プロパルギルヒドラジン類およびプロパルギルウレア類を合成した。(2)それぞれの反応について、パラジウム触媒の種類やリガンドの種類について検討した。その結果、比較的良好な結果を与えたパラジウム触媒および配位子を用いて溶媒の検討を行い、反応条件の最適化を行った。(3)内部アルキンを含む基質一般性を検討し、2つのフラン環、ピラゾール環および2-アミノ-2-オキサゾリン環を有するケトン類の合成法として確立することができた。目的2:プロパルギルカルバメートの環化-カルボニル化-脱炭酸-環化反応の開発確立した反応条件を用いて、A環およびD環にスピロフラノン構造を有する新規ステロイド類を合成した。また、ステロイドC17位に関するジアステレオマーを別途合成し、2種のジアステレオマーの反応を比較することで、フラノンへの環化がSN1機構で進行していることを、さらに13COの取り込み実験などから反応機構を明らかにした。生成物の立体化学は、持田智行神戸大学教授(研究協力者)との共同研究で、X-線結晶構造解析により決定できた。目的1: Box-Pd(II)による環化-カルボニル化-環化-カップリング反応(CCC coupling反応)の開発(1)反応の基質として、種々の置換基を有するプロパルギルアセテート類、プロパルギルアミド類、プロパルギルフェノール類およびプロパルギルアニリン類を合成した。(2)それぞれの反応について、(i)パラジウム触媒の種類(ii)リガンドの検討を行う。パラジウム触媒としては、(CH3CN)2PdCl2,酢酸パラジウム,ビストリフェニルホスフィンジクロロパラジウム,パラジウムトリフルオロアセテート等について検討した。またリガンドとしては、ホスフィン系,ビピリジン,スパルテイン, boxのような窒素原子で配位するもの、Pybox,ピンサー型のboxおよびビスイミダゾリンのような3座配位子を検討した。(3)内部アルキンを含む基質一般性を検討し、2つのフラノン環、オキサゾール環、ベンゾフラン環およびキノリン環を有するケトン類の合成法として確立することができた。目的2:プロパルギルカルバメートの環化-カルボニル化-脱炭酸-環化反応の開発各種ケトン類へのアセチリドの導入でプロパルギルアルコールを調製した後、カルバモイル化を行い、種々の置換基を有するプロパルギルカルバメートを合成した。[目的1]と同様の手法で反応条件の最適化を行った後、内部アルキンを含む基質一般性を検討し、5-メトキシ-3(2H)-フラノン類の合成法として確立することができた。以上、24年度の研究実施計画に記載した事項は、全て達成された。BoxがPd(II)の配位子となることで“Pd(II)のπ-bindingなルイス酸性を強くする"という、独自に見出したboxリガンドの特性に基づき、新規連続反応の開発を行うと共に合成した新規化合物の生物活性評価を行った。目的1 Box-Pd(II)触媒によるヘテロ原子のアルキンへの環化反応を利用して、単純な化合物から2つの複素環を持つケトン類を一挙に合成できるCCC coupling反応を開発した。平成24年度および25年度は、フラノン環、オキサゾール環、ベンゾフラン環、キノリン環、フラン環、ピラゾール環、2-アミノ-2-オキサゾリン環、平成26年度はこれらに加え、医薬品化学的に重要な複素環であるインドール環やベンゾチオフェン環を構築する反応にも適用できることを明らかにし、本反応の一般性を確立した。

目的2 Box-Pd(II)触媒を利用した環化-カルボニル化-脱炭酸-環化反応によって、単純なプロパルギルカルバメートから5-メトキシ-3(2H)-フラノン類を合成できる新規連続反応を開発した。平成24年度および25年度は、反応条件の最適化や反応機構の解明を目的とした13COを用いたコントロール実験、さらに本反応を利用したC-17位にスピロフラノン構造を有する新規ステロイド類の合成を行った。また生成物の立体化学は、研究協力者(持田智行教授)との共同研究としてX-線結晶構造解析により決定した。平成26年度は、本反応の初めての不斉触媒化に成功すると共に基質一般性の検討を行った。合成した化合物のアンドロゲンおよびエストロゲン作用について評価した結果(連携研究者、井上義雄名誉教授との共同研究)一部のジアリールケトン類において、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用する新規化合物を見出すことができた。受容体調節作用を有する化合物を見出すべく、現在も活性評価を継続して行っている。有機金属化学Boxリガンドの特性とは、boxがPd(II)の配位子となることで“Pd(II)のσ-bindingなルイス酸性を弱めると同時に、π-bindingなルイス酸性を強くする"というもので、最近申請者が見出し提唱している。CO雰囲気下、box-Pd(II)触媒を用いプロパルギル化合物を処理すると、このboxリガンドの効果によって、従来報告されている反応経路が抑制され、新しい連続反応((1)環化-カルボニル化-環化-カップリング反応または(2)環化-カルボニル化-脱炭酸-環化反応)が一挙に進行し、医薬品や天然物の構造として重要な、新規ジヘテロアリールケトン類およびスピロフラノン類が一工程で合成できることを明らかにすることを目的として研究を遂行してきた。その結果、25年度の研究実施計画に記載した事項は、全て達成されその一部は2報の論文として公表されている。(Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 7845-7849. Org. Biomol Chem. 2013, 11, 4943-4948.)Boxリガンドの特性とは、boxがPd(II)の配位子となることで“Pd(II)のσ-bindingなルイス酸性を弱めると同時に、π-bindingなルイス酸性を強くする"というもので、最近申請者が見出し提唱している。その結果、24年度の研究実施計画に記載した事項は、全て達成されその一部は4報の論文として公表されている。
統合失調症・感情障害者の社会脳機能の解析

(1)声に対する聴覚誘発反応a)正常者の声に対する感覚フィルタリング機構について本研究にて、声に対しても非言語音と同様に、連発刺激によるP50m, N100mの振幅の抑制が認められ、社会生活のうえで重要な情報であるヒトの声に対しても感覚フィルタリング機構が存在することが示唆された。b)統合失調症者の声に対する感覚フィルタリング機構について統合失調症者17名、正常対照者17名の聴覚誘発反応を比較した。両側半球ともに、2発目の声に対するN100m、P50mの抑制度は統合失調症者で有意に小さいという結果が得られた。統合失調症者は声に対する聴覚抑制機構の障害があることが判明した。c)感情障害者の声に対する感覚フィルタリング機構について当該研究では感情障害者についても研究を行っている。双極性障害者16名の聴覚誘発反応を記録した。両側半球ともに、2発目の声に対するN100m、P50mの抑制度は双極性障害者で小さい傾向があるが、その障害は統合失調症者より軽度のようである。更に精神病症状を呈した双極性障害者は統合失調症と同様に感覚フィルタリング障害が認められるようである。(2)顔認知時の後頭葉における脳血流変化-LAIRSを用いた研究-後頭葉における脳血流の変化をNIRSで捉えることは困難であり、脳波による研究を行うことと方針を変更した。統合失調症者14名、正常対照者28名を対象として顔、家に対する視覚誘発反応を記録した。正常者では後側頭部の誘発反応(N170)は顔>家というパターンを示したが、統合失調症者ではそのパターンが失われていた。これは統合失調症者には比較的早期から顔認知に障害があることを示す結果であり、先行研究と一致した所見であった。(1)声に対する聴覚誘発反応a)正常者の声に対する感覚フィルタリング機構についてヒトの声は社会生活において重要な聴覚情報であると考えられる。我々はヒトの声を連発刺激として用い、刺激後約50ms、100ms付近の聴覚誘発磁場(P50m,N100m)を記録し、声に対する健常者の感覚フィルタリング機構について検索した。健常者17人(男性9名、女性8名、平均27.9±4.8歳)に対して声刺激を呈示した。刺激として声刺激(母音「ア」、持続200ms、音圧60 dB SPL)を用い、2連発刺激を1セットとし、左右両側各120セット呈示し、左右両側聴覚野での聴覚刺激に対する誘発磁場反応を37チャンネルSQUID装置にて記録した。両側半球ともに、1発目に比べ2発目の声に対するN100m、P50mの振幅は有意に抑制されるという結果が得られた。また、N100mのほうがP50mに比べ有意に強く抑制されていた。本研究にて、声に対しても非言語音と同様に、連発刺激によるP50mの振幅の抑制が認められた。社会生活のうえで重要な情報であるヒトの声に対しても感覚フィルタリング機構が存在することが示唆された。本研究を平成17年12月1日、第35回日本臨床神経生理学術大会にて発表した。b)統合失調症者の声に対する感覚フィルタリング機構についてa)の項で述べた条件で、統合失調症者16名(男性13名、女性3名、平均38.9±11.9歳)の聴覚誘発反応を記録し、更に年齢をマッチさせるため正常対照者4名を被験者として追加した。

現在慎重に解析中であるが、両側半球ともに、2発目の声に対するN100m、P50mの抑制度は統合失調症者では小さい(声に対する聴覚抑制機構の障害がある)傾向が認められるようである。(2)顔認知時の後頭葉における脳血流変化-NIRSを用いた研究-NIRS(近赤外線を用いた酸素モニタ)を用いて4名の健常者に顔、車の写真を呈示し、後頭葉における脳血流の変化を測定した。顔刺激は社会生活において重要なため、車に比べ顔を見たときに有意に脳血流が増加するという仮説を立てて研究を行った。しかしながら、その変化を捉えることは困難であった。1)脳血流の変化は僅かで現有のNIRSでは感度が不足し検出困難、2)後頭部は毛髪が多いため技術的に測定が困難、などの理由が考えられた。このため、先行研究で、比較的顔認知に特異的な脳反応を捉えることのできる脳波(誘発電位)にて測定を行うよう研究デザインを変更した。本研究では、現有の脳波計を用いるが、顔認知反応を密に記録できるよう特注キャップ(含電極)を購入した。平成18年度に本研究を(1)の研究と並行して進める。(1)声に対する聴覚誘発反応a)正常者の声に対する感覚フィルタリング機構について本研究にて、声に対しても非言語音と同様に、連発刺激によるP50m, N100mの振幅の抑制が認められ、社会生活のうえで重要な情報であるヒトの声に対しても感覚フィルタリング機構が存在することが示唆された。平成17年度に第35回日本臨床神経生理学術大会にて発表し、本年度Psychiatry Research誌に原著論文として投稿した。査読者からrevisionのコメントをもらい、書き直して再投稿した。b)統合失調症者の声に対する感覚フィルタリング機構について統合失調症者17名、正常対照者17名の聴覚誘発反応を比較した。両側半球ともに、2発目の声に対するN100m、P50mの抑制度は統合失調症者で有意に小さいという結果が得られた。統合失調症者は声に対する聴覚抑制機構の障害があることが判明した。現在論文を作成中である。c)感情障害者の声に対する感覚フィルタリング機構について当該研究では感情障害者についても研究を行っている。双極性障害者16名の聴覚誘発反応を記録した。両側半球ともに、2発目の声に対するN100m、P50mの抑制度は双極性障害者で小さい傾向があるが、その障害は統合失調症者より軽度のようである。現在解析を進めている。(2)顔認知時の後頭葉における脳血流変化-NIRSを用いた研究-平成17年度に報告したように、後頭葉における脳血流の変化をNIRSで捉えることは困難であり、脳波による研究を行うことと方針を変更した。統合失調症者14名、正常対照者28名を対象として顔、家に対する視覚誘発反応を記録した。正常者では後側頭部の誘発反応(N170)は顔>家というパターンを示したが、統合失調症者ではそのパターンが失われていた。これは統合失調症者には比較的早期から顔認知に障害があることを示す結果であり、先行研究と一致した所見であった。
含フッ素キラル小分子の触媒的不斉合成

トリフルオロメチル基は医農薬品の機能向上のために汎用される置換基である。今回我々はβ-フルオロメチルアクリル酸エステルの不斉Diels-Alder反応により,不斉炭素上にフルオロメチル基を持つシクロヘキセン類を高エナンチオ選択的に合成することに成功した。さらに,4,4,4-トリフルオロクロトンアルデヒドへの不斉マイケル付加反応にも成功した。得られたトリフルオロメチル化合物は医薬品候補分子の有用な中間体となる。含フッ素有機小分子は医農薬品の合成中間体として需要が大きい。中でもトリフルオロメチル基に代表されるフルオロメチル基は生物活性物質の機能向上のために汎用される置換基である。しかしながら不斉炭素上への立体選択的な同置換基の導入は困難であり、効果的な手法の開発が求められている。以前に我々は,ルイス酸活性化型キラルオキサザボロリジン触媒を用いたαーフルオロエノンの不斉Diels-Alder反応を報告した。今回,同触媒を利用したβーフルオロメチルアクリル酸エステルの不斉Diels-Alder反応により,不斉炭素上にフルオロメチル基を持つシクロヘキセン類を高エナンチオ選択的に合成することに成功した。本反応は99%eeという極めて高い立体選択性で進行する。また、βージフルオロメチルアクリル酸エステル、およびβーモノフルオロアクリル酸エステルをジエノフィルとすることで不斉炭素上にジフルオロメチル化合物、モノフルオロメチルを導入することも可能であった。いずれの反応も99%eeの立体選択性で進行する。さらに得られた付加体を,シキミ酸エステル誘導体等の医薬原料となり得る含フッ素化合物へ変換することに成功した。次に4,4,4-トリフルオロメチルクロトンアルデヒドを合成し、これを反応基質とした不斉マイケル付加反応を行うことで、不斉炭素上にトリフルオロメチル基を持つβ二置換アルデヒドを最高99%eeで合成した。本反応ではプロリン誘導体を有機分子触媒として利用することで高いエナンチオ選択性の発現に成功した。求核剤としては芳香族化合物、オキシム、アルキルチオール等を用いることができる。さらに得られた付加体を利用してMAO-A阻害剤であるベフロキサトンを合成することに成功した。薬物の一部にフッ素原子を導入することで体内動態や生理活性を向上させる例が多く報告されている。特にトリフルオロメチル基に代表されるフルオロメチル基(-CF3,-CHF2,-CH2F)は,薬物の基本構造を大きく変化させること無く脂溶性・代謝安定性を向上させることが可能であることから薬物設計において有用な置換基である。一方で、フルオロメチル化合物の合成法は十分に確立されているとは言えず、特に不斉炭素上への同置換基の導入は至難であることから有効な手法の開発が急務とされている。このような背景から,不斉点にフルオロメチル基を有する有機小分子の不斉合成法の開発を企画した。我々はフルオロメチル化合物のビルディングブロックとしてβーフルオロメチルアクリル酸エステルに着目し、本化合物をジエノフィルとした不斉Diels-Alder反応を行った。Diels-Alder反応によって得られるシクロヘキセン骨格は様々な医薬品の基本骨格となる。具体的にはまず、キラルオキサザボロリジン触媒存在下でβートリフルオロメチルアクリル酸エステルとジエン類との反応を行い、目的とする含フッ素シクロヘキセン誘導体を99% eeで得た。また同様にβージフルオロメチルアクリル酸エステル、およびβーモノフルオロメチルアクリル酸エステルを用いた反応においても目的の付加体を99% eeで得ることに成功した。さらに得られた付加体をシキミ酸誘導体、二環性エノン等の生物活性物質の中間体となる化合物へ誘導化することに成功した。何れの化合物も従来の手法では製造が極めて困難な化合物である。不斉Diels-Alder反応を利用して不斉炭素上にトリフルオロメチル基を有するシクロヘキセン化合物を99% eeというほぼ完全な光学純度で合成することに成功した。この純度は医農薬品の合成原料として十分である。また同様に、ジフルオロメチル基、モノフルオロメチル基を持つ化合物の合成にも成功した。何れも従来の手法では極めて合成困難であった化合物である。さらに、得られた化合物の薬物原料への誘導化にも成功した。具体的には、トリフルオロメチル基を持つシキミ酸エステル、およびジフルオロメチル基を持つ二環性エノンの合成を行った。前者はインフルエンザ治療薬等、後者は生物活性天然アルカロイドの含フッ素アナログの原料となる。現在までの研究の達成度は良好と言える。上述のように、1)フルオロメチル基を不斉炭素上に持つキラルシクロヘキセン類のエナンチオ選択的合成法を開発したこと、2)得られたシクロヘキセン類の薬物原料への誘導化に数例成功したこと、がその理由である。βーフルオロメチルアクリル酸エステルに変わる新たな含フッ素ビルディングブロックとして,βーフルオロメチルアクロレインの利用を検討する。

このようなα,βー不飽和アルデヒド類は,一般的にアクリル酸エステル類に比べて反応性が高い。そこで本アルデヒドを利用して前年度に開発したDiesl-Alder反応の基質適用範囲の拡大と触媒料の低減をはかる。またα,βー不飽和アルデヒドは有機分子触媒を利用した不斉分子変換反応により様々な光学活性化合物へ誘導化することができる。そこで本アルデヒドを原料として有機分子触媒を用いた不斉マイケル付加型反応を行い、不斉炭素上にフルオロメチル基を持つキラル小分子を合成する。さらに得られた付加体を生物活性物質の合成へと応用する予定である。有機合成化学研究の性格上,研究推進には多種多量の有機反応剤,有機溶媒,反応用ガラス器具を必要とする。さらに光学活性触媒開発を行うことから高価な光学活性試薬の購入が必須となる。このため,金額の大部分を消耗品費としてこれらの購入に当てる。具体的な使用計画は以下の通り。有機合成反応用試薬(500千円)、有機合成反応用溶媒(600千円)、合成反応用ガラス器具(200千円)、HPLC用光学活性カラム(200千円)、学会参加用旅費(100千円)、論文投稿費用(100千円)
企業の外部要因および内部要因と新規公開企業の資本構成についての研究

昨年度は,新規公開企業のデータを用いて,企業がおかれる製品市場での競争度,成長性,リスクの程度といった製品市場属性が企業の資金調達手段に与える影響を,確認した。学会やワークショップなどでのコメントを参考にして,本年度は以下の点の改善を行った。第1に,資本制約の程度のコントロールを行った。具体的には,資産規模,創業後年数,現金同等物保有比率により,サンプルを分割した上で,各サンプルに対して同じ推定を行った。結果として,資本制約下にあると考えられるサブサンプル(規模が小さい,企業年齢が低い,現金同等物保有比率が低い)において,産業属性に関する変数の説明力が高いことが確認された。第2に,株式発行による調達規模をコントロールした。結果として,株式発行を多く行う企業であるほど負債利用が多いことが確認された。上述の改善により,昨年度確認された,産業属性が資本構成に影響を与えるとの結果は,より頑強なものであることが確認された。Phillips(2011)において指摘されているように,元来の資本構成,ひいては,コーポレート・ファイナンス研究においては,他企業の影響に関しては,ほとんど注月を浴びてこなかった。特に他企業の行動の総和であると考えられる産業属性に関しては,フォーカスされて来なかった。本研究の結果から,企業行動は,産業属性,つまり他企業の行動に大きく影響されていることが確認された。そのため,今後コーポレート・ファイナンス研究において,産業組織論的観点から,ある企業の行動が滝行に与える影響を考慮する重要性が示唆される。本年度は,企業がおかれる製品市場での競争度,成長性,リスクの程度といった環境が,企業の資金調達手段に与える影響を,新規公開市場のデータを元にして明らかにした。新規公開前後では情報の非対称性の程度が変化すると考えられ,そのことが資金調達手段に影響すると考えられる。本研究から得られた結論は以下の通りである。第1に新規公開前の企業の負債比率は上場企業と比較して高いこと,また上場直後に低下することが確認された。これらはBrav(2008)やLemmonet al.(2008)など諸外国での傾向と類似したものである。さらに,産業の競争度,リスク,成長性,規制の程度といった要因が,新規公開後の企業の負債利用に値して影響を与えていることが分かった。このことより,また,これら産業の要因は競争的産業に属する企業において強く確認された。さらに,製品市場内における企業のポジションと,新規公開後の負債利用との関係を確認した。結果,製品市場内におけるポジションが特異である企業は,新規公開後に多くの負債による資金調達を行う傾向にあることが明らかになった。ポジションの定義としては,ROAまたはK/L比率の産業中央値からのかい離を用いた。新規公開後の負債額の変化に関しては,いくつかの研究が行われているものの(Pagano et al. 1998 ; Kim and Weisbach, 2008),統一した結果が得られていない。本研究の結果から,それら先行研究における分析結果の違いは,説明力の高い製品市場に関連する変数が欠落していること(omitted variables)が原因であると考えられる。近年の資本構成研究においては,特に海外においては製品市場環境が与える影響に関して議論がなされているしかし,日本においては,製品市場と資本構成の関係を確認した研究はほとんど行われていないのが現状である。このことから,本研究が果たした役割は大きいと考えられる。
プルキンエ細胞の分割されたトランスラトームのデジタル表現プロファイリング

私たちはプルキンエ細胞内に存在するRNAを研究した。当該細胞は脳内の小脳と呼ばれる部位に見られる神経細胞で、その役割の1つは体の動きを制御することである。そのため、また、プルキンエ細胞は大型の細胞で発見しやすいことから、脳の可塑性を解明するための数々の研究の対象となってきた。プルキンエ細胞のシナプス内にリボソームが存在することが報告されたことを受け、当プロジェクトでは、これらのリボソームに関連するRNAの特徴付けと定量化を目指した。これらのリボソームがシナプス可塑性を制御するタンパク質の生成あるいは翻訳自体に関連している可能性があるためである。私たちは理化学研究所脳科学総合研究センターLauney研究ユニットとの共同研究により、リボソーム・キャプチャーと呼ばれる方法を用いてプルキンエ細胞内のリボソームを選択的に標識化し、これらのリボソームと結合したRNAを収集した。そして、収集したRNAを理化学研究所ライフサイエンス技術基盤研究センターが開発したCAGEscan法を用いて解析し、RNAの転写開始点を同定、その量を計測し、構造の特性を明らかにした。この方法により私たちはプルキンエ細胞のための新たなRNAマーカーを発見し、当該リボソームと同時精製されたことから翻訳の制御にかかわっている可能性のあるノンコーディングRNAを同定。この研究結果は『Genome Research』誌に発表した(Kratz et al. , 2014)。26年度が最終年度であるため、記入しない。
廃油からのクリーンディーゼル燃料生産用の環境調和型バイオプロセスの開発

工業的にリパーゼを用いたメタノリシス反応によりバイオディーゼル生産を行うためには、無溶媒系で反応を行なう必要がある。そこで、まず各種リパーゼについて、無溶媒系におけるメタノリシス反応を行い、糸状菌Rhizopusoryzaeリパーゼ(ROL)をはじめとするいくつかのリパーゼが優れた反応特性を示すことを明らかにした。より安価にバイオディーゼル燃料を生産するために、リパーゼを微生物菌体内および菌体表面に大量発現させて、菌体を直接酵素剤(微生物菌体触媒)として利用することを試みた。ここでは、まず、リパーゼを蓄積生産している糸状菌R oryzaeの菌体そのものを微生物菌体触媒として利用することを試み、繰り返し安定に利用できることを明らかにした。また、ROLを大量に発現させるため、凝集性を持ちBSPへの固定化が可能な酵母S.cerevisiaeに強力なプロモーターとともに導入し、菌体内高発現型の安定な形質転換体を創製することを試みた。得られた細胞は、熱風乾燥処理することで、活性が飛躍的に増大することが明らかとなった。さらに高活性な菌体触媒を得るために、細胞の内部に高機能化したROLを生産するのみでなく、細胞表層工学の手法を用いて細胞表面にも固定化される形でROLを生産することを試みた。酵母細胞表層のレクチン様タンパク質であるFlo1のN末端領域を利用して、そのC末側にROLを融合発現することで、高活性にROLを表層発現できることが明らかとなった。また、リパーゼの反応特性を向上させるために、ROL細胞表層発現系を用いて、エラー導入PCR法によるランダム変異の導入とスクリーニングをいったところ、優れた反応特性を持つリパーゼを効率よく探索できることが明らかとなった。資源循環および環境保全の観点から、廃油(トリグリセリド)をメタノールと反応させて、硫黄等を含まないクリーンな燃料であるメチルエステル(バイオディーゼル燃料)に変換する(メタノリシス反応)プロセスを構築することが強く望まれている。我々は、Rizopus oryzaeリパーゼ(ROL)が、適当量の水分存在下においては、無溶媒系において効率的に植物油とメタノールから量論的にメチルエステル合成を触媒することを見出した。しかしながら、バイオディーゼル燃料生産を実用化するためには、生産コストを下げることが必須である。そこで、より安価にバイオディーゼル燃料を生産するために、リパーゼを微生物菌体内および菌体表面に大量発現させて、菌体を直接酵素剤(微生物菌体触媒)として利用する手法を確立し、環境適合型のバイオディーゼル燃料生産プロセスを確立することを目指した。本年度は、微生物において発現させて無溶媒系でのメタノリシス反応を行うのに適したリパーゼであるROLの反応機構を解明すると共に、分子進化工学的な手法により、ROLのメタノール耐性および活性のさらなる向上を図った。有機溶媒中でのリパーゼの安定性、反応性及び反応速度の解析は数多く研究が行われているが、無溶媒系での反応特性解析は、ほとんどなされていない。そこでまずROLを用いて、無溶媒系でのメタノリシス反応メカニズムの検討を行い、反応の律速段階を明確にした。反応液中の水分濃度、メタノール濃度が反応速度に与える影響を調べ、ROLによるメタノリシス反応の基本モデルを確立した。リパーゼは、メタノールにより不可逆的に失活するので、高機能触媒として利用するためにはメタノール耐性の向上が必要不可欠である。そこで、エラー導入PCR法による変異導入、進化分子工学的手法を用いた選択により、リパーゼの機能改変を行い、安定性、メタノリシス活性の向上をはかった。本年度は以下の3点について検討し、バイオディーゼル生産プロセスの完成を目指した。