hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
児童生徒の発達段階に対応した平和教育プログラムの開発と評価

3.小学生(1286名)、中学生(1049名)、高校生(587名)、大学生(78名)を対象に、「平和概念尺度」により平和概念の年齢発達を測定した。(1)平和概念は年齢発達につれて発達・分化していく。(2)中学2年生で第III段階まで発達するが、それ以後は緩やかな発達に留まる4.平和概念尺度により現行の「平和教育」プログラムの評価(1)原爆に関する知識の定着率が低い。(2)教わる相手は教師、情報源はテレビや資料館が多い。また、学校外での「平和教育」は皆無。(3)受け身的な知識学習が中心であり、主体的に考える教育内容は乏しい。5.発達段階に応じた小学校・中学校・高等学校の平和教育カリキュラムの構築(1)テキストの作成、(2)学習指導案の作成を完了した。I.研究計画;本年度の研究目的であった、I「平和教育プログラム」が小学生・中学生・高校生の平和に関する認知・平和社会構築への意欲・関心に及ぼす教育効果についての研究と、II「平和教育プログラム」実践者である小学校・中学校・高等学校教員を対象に使用した教材(広島平和ノート)及び平和教育プログラムの指導案への評価研究の2つの研究を完了した。平和イメージ尺度作成のための基礎的資料の収集及び研修プログラム作成の予備調査を計画していたが、発達段階に応じた平和教育プログラム、テキスト、指導案の作成まで達成した。また、平和教育の実施に向けて、教員への説明及び研修も実施した。1.平和教育プログラム新指導資料の作成:平成24年度、教員を対象に実施した「平和教育プログラム指導資料」でいくつかの課題が提起された。本年度はこうした評価結果に基づき平和教育プログラムのうち、補助資料の精選を行い、新たに平和ノートを作成し、その評価を行う。また、平成24年度の研究で明らかにされた授業の展開について改善を行い新しい指導案を作成する。これについても評価を行う。2.沖縄県及び長崎市の平和学習プログラムとの比較:平成23年、平成24年と広島市の児童生徒を対象に研究を行い、平和教育プログラムの評価を行ってきた。本年度は最終年度に当たっているため、平和学習の先進地である、長崎市、沖縄県の児童生徒を対象に平和概念に関する調査研究を行い、3つの平和教育プログラムを比較する。3.平和教育国際シンポジウムの開催:平成24年に台湾で行われた国際学会での発表について、フィリッピンの研究者より平和学習についてのシンポジウムの開催の申し入れがあったため、今秋、国際シンポジウムを開催する予定。4.報告集の作成:最終年度であるため、平成23年度ー25年度に行った研究の報告書を作成、公刊する予定。平成24年度は平成23年度に修了した研究計画に従い、次の2側面から平和教育プログラムの教育効果測定を行い、プログラムの精緻化を諮る。(1)プリーポスト研究計画に従い、児童・生徒の態度変容に及ぼす平和教育プログラムの効果測定を行う(2)教師を対象に授業分析と評価を行う1.平和教育プログラム新指導資料の作成:新資料を作成し、CDとして公刊する予定であるため、CD作成費を計上する。また、作成の補助者の人件費を計上する
軽症肢体不自由児に対する水泳運動の影響

〔研究目的・方法〕中等度または軽症肢体不自由者の主たる運動種目は水泳であるが、障害者にとっても容易に実施できるという理由のみで、水泳そのものが障害者にとってどのような影響を及ぼすかは十分には調べられていない。そこで、脳性麻痺、脊損、自閉症など937歳の障害者男女合計14名を対象に、浸水および種々の遊具を用いた水泳運動を約1時間負荷し、運動前、運動中および運動後約1時間にわたって採尿し、Na、K、カテコールアミン、VMAおよびMHPG尿中排泄量を調べた。さらに心拍数(HR)および心電図RR間隔からCVrrも算出した。尚、対照群として健常男児6名(平均10歳)、女児1名(10歳)に同様の実験を行った。〔結果〕陸上および水中での姿勢変換にともなうHR変化は、健常者では仰臥位、座位、立位の順で高くなり、水中では陸上でのそれに比較し6.910.2%低かった。しかし、障害者では障害の種類、程度によって姿勢変換にともなうHR反応は異なった。アナフィラキシーショック児では水中と陸上ではHR変化に差がなかった。痙直型四肢麻痺児では水中背浮き姿勢では水中立位姿勢時よりHRが上昇した。健常児および他の障害児では水中仰臥位姿勢(背浮き)が最もHRが低く、最もリラックスしていることがわかるが、痙型直型脳性麻痺および筋疾患ではむしろHRが上昇するか、低下しても程度は僅少であった。水泳中のHRは健常者では最高165200拍/分まで上昇したが、障害者では固体差が著しく、健常者程の上昇を示した者はみられなかった。尿量は両群共水泳中および直後著増した。60分後は健常者では前値に復したが、障害者ではさらに上昇した。障害者のカテコールアミン、VMAおよびMHPG尿中排泄量の固体差が著しかった。以上の結果は、障害の種類、程度によって生体負担程度が著しく異なることを示している。また、著しい利尿亢進がみられたことから脱水惹起の可能性もあり、水分補給の必要が示唆された。
UGT1A1遺伝子ヘテロ接合体を有する患者へのイリノテカンの至適投与量検討

イリノテカンは肺癌など多くの癌腫に適応を持つ抗がん剤で、ヒトの肝及び各組織において活性代謝物(SN-38)へ直接変換され、SN-38は肝代謝酵素(UGT1A1)により無毒なSN-38Gとなり、主に胆汁中に排泄される。しかし、UGT1A1はUGT1A1*6、UGT1A1*28等の遺伝子多型が存在し、ヘテロ接合体、ホモ接合体をもつ患者の順にSN-38Gの生成能力が低下し、SN-38の代謝が遅延し、骨髄抑制などの副作用発現リスクが高くなることが報告されている。しかし、具体的な減量率やヘテロ接合体を有する患者における減量の必要性は不明で、UGT1A1遺伝子多型を有する患者それぞれに合った至適投与量の設定が重要である。本研究では2010年4月2017年4月の間に徳島大学病院または徳島市民病院で肺がんに対しイリノテカンを投与した患者(PS1以下, 75歳未満)のうち、UGT1A1遺伝子型が判明している者を対象とした。イリノテカン投与量は標準投与量に対する実際の投与量の治療強度を評価する相対用量強度(RDI)に基づき評価した。治療成功期間(TTF)は治療変更、死亡またはRECISTに基づきPDとなるまでの期間と定義し、電子カルテよりレトロスペクティブに調査した。対象患者31名の年齢中央値は65歳(44-74歳)であり、その内訳は遺伝子多型を有さない群(WT)12名、ヘテロ接合体群14名、複合ヘテロ接合体群1名、ホモ接合体群4名であった。ヘテロ接合体群はWT群と比較して、TTFに有意な差は認めなかったが、骨髄抑制や下痢などの副作用によりRDIは有意に低かった(79.1%vs62.1%, P<0.05)。ホモ接合体および複合ヘテロ接合体群においてもTTFに有意な差はなかったが、RDIは有意に低かった(79.1%vs46.2%, P<0.01)。UGT1A1ヘテロ接合体を有する肺がん患者ではイリノテカンを開始する際に標準投与量の20%程度の減量を行う必要性が示唆された。この減量は治療効果を減弱させることなく、より安全な化学療法の実施につながる可能性がある。また、複合ヘテロ接合体やホモ接合体を有する患者において同様の結果を得るためには40%程度の減量が必要である可能性が判明した。
合成キラル金属ポルフィリンの反応機構と選択性の計算化学による研究

生体酵素である、Prostaglandin endoperoxide H synthases (PGHSs)のバイオミメティック触媒である、ポルフィリン錯体("ツインコロネット"型錯体)によって触媒されるジエンの位置選択的および立体選択的酸素化のメカニズムを理論化学計算で調べることを目標とし、さらにPGHSsの反応機構を理解することを試みた。手法としては、two-layer ONIOM (QM/MM)法及びAFIR法を用いた。特に、溶液中で最も熱力学的に安定な反応前駆体、中間活性種の生成過程、位置選択的水素の引き抜き反応、そして、ジエンの酸化過程について、詳細に調べた。選択的過程については、遷移状態構造の系統的かつ効率的な探索をAFIR法を応用し実行した。また、この錯体は300原子を超える系であり、応用する分子力場の依存性が高いことが考えられる。そのため、我々は、様々な種類の分子力場(AMOEBA09[分極可能],MMM3, MMFF, OPLS-AA, CHARMM22)を適用し、反応経路などに違いを詳細に検討した。その結果、反応経路の概略および位置選択性の決定過程が解明された。また、ノンヘム鉄(III)-スーパーオキソ系においては、中間体を含めた詳細な電子構造の解析とともに、2-ヒドロキシ2-アザマンタン、フェニルヒドラジンを基質とした、水素引き抜きの反応性について調べた。方法は、上述のtwo-layer ONIOM(QM/MM)法を使用した。その結果、反応機構の概略を解明した。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、反応経路自動探索(GRRM)戦略の人工力誘導反応(AFIR)法を用いて、中部大成田教授が開発した合成キラルポルフィリンの反応機構と選択性の解明することである。最終ターゲットとしているこの“ツインコロネット“型錯体は大きな柔軟なキラルリガンドを保持し非常に複雑なので、本年度は,モデル系として二つの比較的簡単な系を対象として、反応機構を明らかにした。1.阪大武田教授が開発した、Pd触媒による2-arylaziridinesのホウ素化反応機構、2.香港大チャン教授が開発したRh触媒による歪みのないケトンの炭素-炭素σ結合の酸化反応機構である。いずれも多成分AFIR法を用いて、可能な反応経路を探索し、選択性決定段階などの重要な中間体や遷移状態の構造やエネルギーを明らかにした。この結果に基づき2編の論文を執筆中である。さらに、成田系に対し予備計算を推進した。まず、この高原子価鉄ポルフィリン作体の電子状態の計算を行い、基底電子状態を明らかにした。さらに、この活性錯体とのエナンチオ選択的反応の際の基質(4Z,7Z)-undeca-4,7-dieneの接近方向が二つ有る事を明らかにし、それに関わる反応の遷移状態を決定中である。Prostaglandin endoperoxide H synthases (PGHSs)という金属酵素の模倣化合物として成田らにより発見された鉄錯体を用いたヒドロペルオキシ化反応の機構を検討した。まず、配位子から鉄ヒドロキソポルフィリンへの分子間電子移動が起こりラジカルが生成する。その後、1,4-ジエンからの位置、および立体選択的HCラジカル引き抜きが起こり、続いて酸素と反応するという反応機構が提案された。基本的なステップの解析が終了し、論文の投稿準備段階にある。簡単なモデル系については,既に二つの触媒反応の反応機構を明らかにしている。最終ターゲット系についても予備研究が進行中である。現在、計算には密度汎関数法と、UFF力場を組み合わせて用いている。将来的に金属酵素の反応への展開するために、タンパク質の記述に優れているとされる分極可能力場との組み合わせも検討する。最終ターゲット系について、さらに研究を推進し,反応機構の解明を目指す。
超高精度位置天文観測による位置天文重力レンズ天文学の開拓

本研究は位置天文的な観測手法によって重力レンズを観測し、これまでの観測と異なる新たな情報を得ることを目指すものである。研究の第3年次にあたる本年度は、位置天文学的な手法で重力レンズ研究を行うモデルケースとして昨年度観測したPKS1830-211など3つの重力レンズQSOについて、イメージング解析を進めている。現在のところ過去の結果と比べて位置の系統的な動きは検出されていないが、今後も大学連携VLBIネットワーク等で追観測を行い、位置変化の検出を目指す。一方、VERAで観測したメーザー源における位置天文重力マイクロレンズの探査も行っており、今年度は銀河系内の星形成領域W49Nについて、水メーザー源の解析を行っている。位置天文マイクロレンズによると思われる有意な位置変動はこれまでのところ観測されていない。関連して、太陽系天体による位置天文重力レンズ効果を正確に補正する遅延追尾ツールを引き続き開発しており、これによってVERAの位置天文計測精度の向上に成功している。具体的には銀河系外縁部の星形成領域S269の水メーザー観測において、5.3kpc相当の年周視差をSN20以上で検出することに成功し、年周視差計測の世界記録を樹立した。また、前記の星形成領域W49Nにおいても、年間6mas/yrの銀河系回転運動の計測に成功したほか、10kpc相当の年周視差の検出にも成功するなど、VERAを用いた位置天文計測において世界をリードする成果を得ている。第1次年次にあたる今年度は、位置天文重力レンズに必要な位置天文観測精度の実現性を確認するため、VERAの実観測データの精度評価を行った。具体的にはVERAで観測されたW49NとOH43.8-0.1というペアを約1年にわたって7回程度モニター観測し、その相対的な位置変化を計測した。その結果、2天体間の相対固有運動と思われる運動の検出に成功し、位置天文精度として0.1ミリ秒角程度の極めて高い位置計測精度が達成されていることが示された。この精度はすでに世界最高峰のレベルに達していると考えられる。また、W49N-OH43.8-0.1観測を位置天文重力レンズ現象の探査に利用可能かを検討し、その結果、銀河系内メーザーを対象天体とした位置天文重力レンズ研究の可能性があることが示唆された。通常位置天文レンズは銀河面背後のクエーサー対象とするが、このような(たまたま銀河面背後にある)クエーサーの数は限られている。一方、銀河面内にふんだんにあるメーザー源を重力レンズ探査の観測対象とできれば、探査対象天体は飛躍的に増加する。このため来年度以降もこの可能性について調査を続け、実際にW49N方向での位置天文レンズ現象の存在についても探査する予定である。また、位置天文重力レンズとは異なる副産物的な研究として、W49Nの観測期間中に発生したメーザーアウトバースト現象の検出に成功し、さらにバースト期間中のVLBI観測に基づいてバースト成分のW49N中における位置を初めて同定した。この結果は、2005年度の日本天文学会欧文報告として出版されている。第2年次にあたる本年度は、位置天文学的な手法で重力レンズ研究を行うモデルケースとして、PKS1830-211など3つの重力レンズQSOを、日本国内の大学連携VLBIネットワークを用いて観測した。この観測の目的は、これらの重力レンズ天体における複数像間の位置関係を精密に計測し、過去の結果と比較することでその位置変動を調べるものである。QSOから放出されるジェットでは、見かけ上光速度を超える運動が電波で観測されており、これらのQSOの電波ジェットでもこのような動きが期待できる。重力レンズを受けた電波ジェットが天球上を動く際に発生する像の位置変化が計測されれば、重力レンズモデルに新たな制限をつけることが可能になる。この観測は現在解析中であり、その詳しい結果は来年度以降に得られる予定である。一方、VERAで観測したメーザー源における位置天文重力マイクロレンズの探査も行っており、今年度は銀河系内の星形成領域OH43.8-0.1について、水メーザー源の内部固有運動の解析を行った。残念ながらマイクロレンズによると思われる有意な位置変動はこれまでのところ観測されていない。一方、OH43.8-0.1の水メーザースポットの運動については初めて詳細なマップを得ることができたので、これを2005年度の日本天文学会欧文報告に論文として出版している。

具体的には銀河系外縁部の星形成領域S269の水メーザー観測において、5.3kpc相当の年周視差をSN20以上で検出することに成功し、年周視差計測の世界記録を樹立した。また、前記の星形成領域W49Nにおいても、年間6mas/yrの銀河系回転運動の計測に成功したほか、10kpc相当の年周視差の検出にも成功するなど、VERAを用いた位置天文計測において世界をリードする成果を得ている。
強いランダム異方性をもつハイゼンベルクスピングラス

本研究は強いランダム異方性がある場合のハイゼンベルクSGのBinder比を調べたことが、きっかけとなっている(論文1)。従来、等方的なハイゼンベルグSGで異なったサイズのBinder比に交差がみられないことが、有限温度でのSG相の不在の証拠とされ、実験で観測されるSG相はランダム異方性のために生じるとされてきた。我々は、ランダム異方性のあるハイゼンベルグSGのBinder比は、転移温度近傍で交差ではなく、負のくぼみを示すことを見いだした。後に、この原因はランダム異方性がある場合でも、オーダーパラメーターとして等方的な場合と同じスピンオーバーラップのテンソル成分の2乗和を用いているせいであることがわかった。ランダム異方性がある場合により自然なスピンオーバーラップの対角成分の2乗和をオーダーパラメーターとして採用した場合には、それから定義されるBinder比は通常の相転移でみられる交差が観測されることがわかった(論文2)。問題は等方的な場合である。等方的な場合は、有限サイズの系では系全体のスピンの一様回転が生じてしまうために、対角成分の2乗和をオーダーパラメーターとしてもうまくいかない。そこで我々は、2つのレプリカ系の1つに、スピン系全体に一様回転を加えて、スピンオーバーラップの最大値を求め、それをオーダーパラメーターとした。カイラリティ自由度があるので、1つのレプリカ系のスピン系全体を反転した系に対しても同様のことを行い、大きい方と小さい方に分けてオーバーラップ分布関数を求め、それから種々のスピングラス物理量を求めた。その結果、大きい方のオーバーラップ分布関数は、低温で2ピーク構造が現れることがわかった。これは、川村らによってカイラリティ・オーバーラップ分布関数でみられた奇妙なふるまいとの関係を強く示唆するものであり、1ステップ・レプリカ対称性の破れを伴った相転移の可能性を示唆する(論文5)。同モデルの基底状態近傍の性質を調べるのも興味深い(論文3,4,6)。SG相の性質としては従来2つの描像が提案されてきた。(A)レプリカ対称性破れ描像:SG相ではエネルギーが基底エネルギーにほぼ等しい多くの状態が存在しそれらは無限に高いエネルギー障壁で隔てられている(パリジ状態)。(B)液滴描像:SG相の基底状態は唯一つであり、励起状態のエネルギーはその励起クラスターのサイズの増大と共に増加する。我々は、遺伝的アルゴリズムなどの方法により、基底状態とその近傍の準安定状態を調べ、パリジ状態が存在することを見いだした。更に、パリジ状態近傍の励起状態を調べ、これらの励起状態の性質が強磁性体のそれに非常に類似していることも得られた。これらはスピングラスの低温相の解明につながる重要な知見である。

今年度行った研究は、3次元ハイゼンベルグスピングラス(SG)の(1)基底状態と低励起状態の研究と(2)SG相転移点近傍でのオーダーパラメーター分布関数のふるまいの研究である。(1)に関しては、スピンクエンチ法とハイブリッド遺伝アルゴリズムにより基底状態と低励起状態を調べた。基底状態の他に有限の励起エネルギーΔEO(J)をもつ、基底状態とは大きく異なった準安定状態の存在を確認した。三次元では、基底状態とその準安定状態を隔てるエネルギー障壁は系のサイズとともに大きくなり、その準安定状態が純粋状態であることが示唆される。このことは、分子場モデルのレプリカ対称性の破れ(RSB)の描像との類似性を示唆するが、その純粋状態の近傍の励起エネルギーについてのさらに詳しい研究が現在進行している。(2)については、交換モンテカルロ法によりSG転移点近傍のオーダーパラメーター分布関数やSG帯磁率、Binder比などの物理量のふるまいを調べている。ハイゼンベルグスピングラスの場合には、そもそもスピン凍結をあらわすオーダーパラメーターをどのようにとるのが良いのかが自明ではない。そこでここでは従来使われてきたテンソルオーバーラップではなく、オーバーラップの対角成分の最大値をオーダーパラメーターとして採用した。その結果、オーダーパラメーター分布関数のふるまいは、カイラリティに対してだけでなくスピンに対しても、1ステップRSBを示唆する2ピーク構造が低温で現れることが観測された。このことは、ハイゼンベルグSGのBinder比に、なぜ相転移点での特徴的なふるまい(サイズの異なった系の交差)がみられないかを説明するものとなりうる重要な結果である。また、ランダム異方性を加えた場合との比較が、このモデルのSG相転移を解明する鍵となるとして、諸物理量の比較を行っている。前年度に引き続き、3次元ハイゼンベルクスピングラス(SG)の(1)基底状態と励起状態の研究と(2)SG相転移点近傍でのオーダーパラメーター分布関数の研究を行った。(1)に関しては、前年度絶対零度T=0での状態を数値的に調べ、パリジ状態の存在を示唆する結果を得た。すなわち、低温相は何らかのレプリカ対称性破れ(RSB)の相であることが示唆された。今年度はパリジ状態の近傍の励起状態の性質、有限温度でのパリジ状態間の遷移の様子を調べた。特に、パリジ状態に共役な磁化の緩和過程より、パリジ状態の緩和時間を見積もり、それがSG相転移温度以下ではサイズとともに発散的な振る舞いに変化することを確認した。(2)については、今年度はランダム異方性Dの導入による(等方的な場合との)定性的な変化の有無に焦点を当てた。川村らの先行研究では、「定性的な変化はない」という結論を出している。我々は、彼らより少し大きいランダム異方性(D=0.2J)でカイラリティ凍結q_cの分布関数P(q_c)を調べ、低温でのq_c0でのピークの(系のサイズによる)増加が、大きいサイズでは停止することを見いだした。これは、等方的な系での1ステップRSB的な相転移から、通常のフルRSB的な相転移への定性的な変化を示唆する結果である。
放線菌黄色色素生産における最終産物による自己生合成遺伝子群転写抑制の分子機構

放線菌Streptomycesgriseusの黄色色素(grixazone、以下GXと略す)生産において、最終生産物であるGXによってGX生合成遺伝子群の転写が抑制される機構があることが示唆されていた。GXをリガンドとする転写抑制因子(GriZ)とGX生合成の経路特異的転写活性化因子(GriR)の機能を抑制するco-repressor (GriU)の2つのタンパク質が、この転写抑制に関わると考えられたおり、その機能の詳細を明らかにすることが本研究の目的であった。昨年度、DNA-GriR-GriUの3者複合体の形成とその性質について、試験管内反応によって詳細に解析し、GriUが結合することでDNA-GriR間の結合が著しく安定化することを示したが、さらにin vitroでの解析を続け、GriUが存在しない時にはRNAポリメラーゼ(RNAP)-GriR-DNAの3者複合体が形成されるのに対して、GriU存在時ではRNAPがDNAに結合できないことを明らかにした。これにより、アンチアクチベーターとしてのGriUの機能を証明することができた。一方、GX(GX-A)を大量調製し、GriZとの結合を詳細に調べようとしたが、以前の結果と異なり、結合が確認できなかった。GriZのリガンドに関しては慎重に検討中である。また、種々の遺伝子破壊株におけるGX生合成遺伝子の転写様式を解析した結果、野生株の培養後期に見られるGX生合成遺伝子の転写抑制にはGriZ-GriU系は関与しないことが明らかになった。これらの結果より、GriUの生体内での機能が当初の想定と異なる可能性が高くなったため、新しい視点からの解析を開始した。研究代表者はこれまでに、放線菌Streptomyces griseusの黄色色素(grixazone、以下GXと略す)生産において、最終生産物であるGXによってGX生合成遺伝子群の転写が抑制される機構があることを見出してきた。この転写抑制には、GXをリガンドとする転写抑制因子(GriZ)とGX生合成の経路特異的転写活性化因子(GriR)の機能を抑制するco-repressor(GriU)の2つのタンパク質が関与する。本研究は、これらのタンパク質の詳細な機能解析により、『二次代謝最終産物による生合成遺伝子発現のフィードバック抑制』という重要な生命現象の分子機構を明らかにすることを目的とした。本年度は、まず、griU遺伝子破壊株およびgriU,griZの二重遺伝子破壊株を作製し、その表現型が予想通りのものであることを確認した。今後、これらの株を用いた転写解析を行っていく。また、DNA-GriR-GriUの3者複合体の形成とその性質について、試験管内反応によって詳細に解析し、GriUが結合することでDNA-GriR間の結合が著しく安定化することを示した。また、GriUによるGriRの転写活性化能の阻害を試験管内反応で検証するため、種々の条件検討を行った。一方、GriZの機能解析には、大量のGXが必要であるが、griU遺伝子破壊株においてgriRを過剰発現させることによってGXを大量に生産できると考え、この系を構築中である。次年度においては、GriZとGXの相互作用やDNA-GriR-GriUの3者複合体の形成について、超高感度等温滴定カロリメトリを用いた解析を行っていく計画である。
摂食・嚥下障害の包括的診断法とリハビリテーション法の確立‐口腔癌症例への応用‐

本研究は、口腔癌治療に伴う摂食嚥下障害に対する診断法、リハビリテーションの妥当性に関して検討することを目的とした。健常者と口腔癌患者の術前および術後の嚥下造影検査(以下、VF)画像における舌骨運動に着目し、従来行ってきた定性的評価と画像解析による定量的評価について比較検討した。口腔癌患者の舌骨運動は、術後の定性的評価において減弱したが、定量的評価においては不変あるいは増加した症例もあり、評価結果は必ずしも一致しなかったことから、VFを用いた定量的評価の併用は意義があると考えられた。口腔癌の術後機能は、手術だけでなく、術後合併症など様々な経過の影響もあり、さらなる検討が必要と考えられた。超高齢社会を迎えたわが国において「摂食・嚥下」は重大な関心事となっているが、いまだにエビデンスに基づいた臨床的研究の報告が不足している。口腔外科で治療する口腔癌治療後の摂食・嚥下障害に対する機能評価やリハビリテーションの有用性、妥当性に関する検討も不十分である。本研究は、人間が生涯にわたり安全に、かつ口から食べる楽しみを維持する観点から、摂食・嚥下障害を的確な診断、治療やリハビリテーション、日常の食事への反映は重要と考え、I.摂食・嚥下機能の複雑な調節のメカニズムの解明、II.包括的診断法の検討、III.摂食・嚥下障害に対する新たな戦略としてのリハビリテーション法、IV.摂食・嚥下障害の潜在的リスクの検索、V.口腔癌治療に伴う摂食・嚥下障害に対する診断法、リハビリテーションの妥当性について検討を行うものである。本研究では、摂食・嚥下障害を有しない健康成人における頸部筋群の筋活動計測やVF画像の解析により定量的評価を行い、従来のVF、VE所見から得られる定性的評価との比較検討を行なう。同様の比較検討を摂食・嚥下障害を有する患者群においても行う。また、すでに共同研究にてVF画像から食塊と器官を同時抽出し、嚥下時の食塊と関連器官の運動を解析している。この結果を踏まえ、異なる物性の検査食を用いたVF画像の運動解析を行ない、検査食の物性から食塊の動きを予測できれば、関連器官の運動や機能障害の予測も可能になることを目指す。機能障害の予測は、治療計画だけではなく、患者説明の際にひじょうに重要な点であり、治療法選択や治療後の生活に大きな影響を与える可能性が高いと考えている。殊に、臨床の現場では急速に患者の平均年齢が高齢化し、その対応は急務であるために、個々の施設で経験的なケアに留まっているのが現状である。その中で、口腔外科で治療する口腔癌治療後の摂食・嚥下障害に対する機能評価やリハビリテーションの有用性、妥当性に関する検討もさらに不十分である。本研究は、人間が障害にわたり安全に、かつ口から食べる楽しみを維持する観点から、摂食・嚥下障害を的確に診断した上で、治療やリハビリテーション、日常の食事に反映させることは重要と考え、I.摂食・嚥下機能の複雑な調節のメカニズムの解明、II.包括的診断法の検討、III.摂食・嚥下障害に対する新たな戦略としてのリハビリテーション法、IV.摂食・嚥下障害の潜在的リスクの検索、V.口腔癌治療に伴う摂食嚥下障害に対する診断法、リハビリテーションの妥当性について検討を行うものである。本研究では、摂食・嚥下障害を有しない健康成人における頸部筋群の筋活動計測や嚥下造影検査(以下、VF)画像の解析により定量的評価を行い、従来のVF、嚥下内視鏡検査(以下、VE)所見から得られる定性的評価との比較検討を行う。この結果を踏まえ、異なる物性の検査食を用いたVF画像の運動解析を行うことにより、検査食の物性に応じた食塊の動きを予測できれば、関連器官の運動や機能障害の予測が可能になることを目指す。機能障害の予測は、治療計画だけでなく、患者説明の際に非常にに重要であり、将来的には治療法選択や治療後の生活に大きな影響を与えると考える。超高齢社会を迎えたわが国において、摂食嚥下障害は重大な関心事となっているが、いまだにエビデンスに基づいた臨床研究の報告が不足している。特に、口腔外科で治療する口腔癌治療後の摂食嚥下障害に対する機能評価やリハビリテーションの有用性、妥当性に関する検討も不十分である。本研究では、人間が生涯にわたり安全に、かつ口から食べる楽しみを維持する観点から、摂食嚥下障害の的確な診断、治療、リハビリテーション、日常の食事への反映は重要と考え、I.摂食嚥下機能の複雑な調節のメカニズムの解明、II.包括的診断法の検討、III.摂食嚥下障害に対する新たな戦略としてのリハビリテーション法、IV.摂食嚥下障害の潜在的リスクの検索、V.口腔癌治療に伴う摂食嚥下障害に対する診断法、リハビリテーションの妥当性についての検討につながるものとして計画した。昨年度までに、同意の得られた健康成人と摂食嚥下障害を呈した口腔癌術後患者のVF、VEの定性的評価を分析した。

VEの有用性の報告が増えてきているが、口腔癌患者の場合は、咽頭期嚥下障害の原因が口腔内にあるため、口腔期から食道期まで一連の流れとして評価できるVFの方が有用性が高いと考えられた。本研究の対象患者の中には、VEでは誤嚥がなかったものの、VFで誤嚥を認めた例もあり、口腔期を含めた詳細な観察の必要性について、さらなる検討の必要がある。今年度は、さらに3次元運動解析ソフトを用いて定量的評価を加え、定性的評価との比較検討を行った。摂食嚥下障害を呈した口腔癌術後患者では、特に舌根の挙上、舌骨の動き、喉頭の挙上において術前と比べ運動不良が明らかで、定量的評価でも同様の結果が得られた。本結果は、機能障害を予測し、治療計画やリハビリテーション、患者説明を行う上で、重要な点であり、治療法選択や治療後の患者の生活に大いに影響を与える可能性が高いと考える。本研究は、口腔癌治療に伴う摂食嚥下障害に対する診断法、リハビリテーションの妥当性に関して検討することを目的とした。健常者と口腔癌患者の術前および術後の嚥下造影検査(以下、VF)画像における舌骨運動に着目し、従来行ってきた定性的評価と画像解析による定量的評価について比較検討した。口腔癌患者の舌骨運動は、術後の定性的評価において減弱したが、定量的評価においては不変あるいは増加した症例もあり、評価結果は必ずしも一致しなかったことから、VFを用いた定量的評価の併用は意義があると考えられた。口腔癌の術後機能は、手術だけでなく、術後合併症など様々な経過の影響もあり、さらなる検討が必要と考えられた。本研究で計画していたVFについては症例数を確保できたが、VE併用の症例は、検査に用いる内視鏡が口唇口蓋裂患者に使用されることが多く、検査時間が重複するなど診療に支障を来すおそれがあり、新たに内視鏡購入を計画していた。平成26年度に、より高性能でデータ管理が簡便な器材一式の発売を待ち、購入した結果、症例数が予定数より不足しており、その症例数の確保ならびに解析が遅れている。筋電計付刺激装置も、代用可能な既存の装置が複数あったが、いずれも器材故障などで予定どおり研究が進められていない。今年度の早期のうちに、これらの必要器材を残りの費用で購入し、データを集め、解析し、結果をまとめる必要がある。口腔外科健康成人ならびに摂食・嚥下障害を有する患者における1頸部筋群の筋活動計測、2VF画像の解析による定量的評価を行い、従来のVF、VE所見から得られる定性的評価との比較検討を引き続き行っていく。現在、新たな筋電計付刺激装置を購入手続き中であるため、入手次第、検査実施数をさらに増やすことは可能と考える。また、異なる物性の検査食を用いたVF画像の運動解析を行う計画については、検査食の物性の再現性について試験を継続中である。この結果が得られれば、検査食の物性と食塊の動きに関する解析を進める予定であり、本研究を計画に準じて遂行できると考える。VFに用いるX線透視装置は現有設備で、本研究に使用している。VEに用いる内視鏡は、主に口唇口蓋裂患者に用いており、検査実施時間が重複し、診療に支障をきたすことが懸念されたため新たに購入を計画していた。しかし次年度に(平成26年)より高性能でデータ管理が簡便な内視鏡一式が発売されることになったため、本年度は既存の機材を使用することにした結果、口唇口蓋裂の診療に配慮することになり、研究計画は予定どおりに進めることができなかった。筋電計付刺激装置については、当面は既存の装置で代用可能であることが判明し使用していたが、故障したため、当初の計画のとおり新規に購入することにした。
地震時における都市施設の破壊を考慮した道路網の信頼性評価とその強化・復旧戦略

2年間で得られた研究成果を要約すると以下のようである。1.1989年ロマプリエタ地震の調査から道路網の被災事例について検討した。その結果,地盤液状化による側方流動や沈下が道路網を構成する盛土や橋梁の被害に大きく影響を及ぼしていることが明らかとなった。2.地震時地盤液状化による側方流動や沈下に関する実験的研究を実施し、永久変位量を規定する要因を明らかにするとともに,実地盤における側方流動や沈下の簡単な予測法を提案した。3.意思決定のプロセスを支援する一つの方法であるVISMSを用いて,震災道路の復旧順位を求めた。このとき,1978年の伊豆大島近海地震における伊豆半島の道路網を対象にした。震災後の復旧段階において重要であると考えられる応急復旧について検討した結果,地震後の道路復旧計画策定時において本システムが有益な情報を与えくれることを明らかにした。4.地震時の緊急車両の整備は、人命の損傷に直接関連する重要な課題である。そこで,地震時の緊急車両網の通行可能性をVISMSと判別関数により構成されたシステムによる支援の下で、専門家の主観的判断によって評価する方法を提案した。また,本方法を簡単なネットワ-クに適用した結果,どの道路の通行可能性をどの程度改良することが最も効果的な整備計画に繋がるかを判定することができた。5.地震時における消防アクセス可能道路の通行信頼性の問題へ本評価モデルを適用し,消防力低下地域の予測を試みた。ここでは,個別道路の走行信頼度評価に,人間の直観を活用するソフト・システムズ・アプロ-チによる評価システムを導入したことが特徴として挙げられる。6.震後の橋梁災害は道路網の復旧時間に大きな影響を及ぼしている。そこで,土木技術者の立場から人工知能と知識工学の適用にエキスパ-トシステムソフト「大創玄」を用い,橋梁被害の復旧支援システムを構築した。本年度得られた研究実績を要約すると以下のようである。1.地震入力や道路網を構成する要素の抵抗強度の評価には、デ-タ数が僅少であるための不確定性が伴う。このような不確定性を考慮した道路網の被災予測法を開発することができた。2.道路網の被災予測を比較的短時間で精度よく得られる手法を、2点間の信頼性解析に対してはトポロジ-変換法を、全点間の信頼性解析に対しては部分グラフ集約化法を用いる手法を提案し、モデル道路網への適用性をシミュレ-ションにより検討することができた。3.地震後にどの道路から復旧を行なうかを判断するには、まず道路網における各道路がどれくらいの重要度をもっているのかを知るための指標を明らかにし、その指標から各道路の重要度の評価を行なわなければならない。この点に注目し、交通容量や人口分布が各道路の重要度に与える影響をモデル道路網を対象に検討した結果、道路網の交通容量が重要な指標であることがわかり、またその重要度を評価することができた。4.地震時の緊急車両の整備は、人命の損傷に直接関連する重要な課題であることから、VISMSと判別関数により構成されたシステムによる支援の下で、地震時の緊急車両路網のシステム信頼性を評価する方法を提案した。また本評価法を用い、どの道路の通行可能性をどの程度改良することが最も効果的な整備計画に繋がるかを判定することができた。5.1978年の伊豆大島近海地震における伊豆の道路網にVISMSを適用し、復旧順位の決定を行なった。その結果、道路網全体の被災状況と経済性、社会性を考慮した道路網の復旧順位を決定することができた。本年度得られた研究成果を要約すると以下のようである。

1.1989年ロマプリエタ地震の調査から道路網の被災事例について検討した。その結果,地盤液状化による側方流動や沈下が道路網を構成する盛土や橋梁の被害に大きく影響を及ぼしていることがわかった。そこで,地震時地盤液状化による側方流動や沈下に関する実験を実施するとともに,実地盤におけるこれらの予測法を提案した。2.意思決定のプロセスを支援する一つの方法であるVISMSによる震災道路の復旧順位システムを1978年の伊豆大島近海地震における伊豆半島の道路網に適用した。このとき,震災後の復旧段階において重要であると考えられる応急復旧について検討するとともに,土木構造物の震災復旧技術マニュアルに沿った道路の復旧順位に注目して復旧順位を決定した。その結果,地震後の道路復旧計画策定時において本システムが有益な情報を与えてくれることを明らかにした。3.地震時の緊急車両の整備は、人命の損傷に直接関連する重要な課題である。そこで,地震時の緊急車両網の通行可能性をVISMSと判別関数により構成されたシステムによる支援の下で、専門家の主観的判断によって評価する方法を提案した。また,どの道路の通行可能性をどの程度改良することが最も効果的な整備計画に繋がるかを判定することができた。4.地震時における消防アクセス可能道路の通行信頼性の問題への評価モデルを適用し,消防力低下地域の予測を試みた。ここでは,個別道路の走行信頼度評価に,人間の直観を活用するソフト・システムズ・アプロ-チによる評価システム導入をしたことに特徴がある。5.震後の橋梁災害は道路網の復旧時間に大きな影響を及ぼしている。そこで,土木技術者の立場から人工知能と知識工学の適用にエキスパ-トシステムソフト「大創玄」を用い,橋梁被害の復旧支援システムを構築した。
１１β―ＨＳＤ阻害剤による犬下垂体ＡＣＴＨ産生腺腫を標的とした治療に関する研究

今回の研究から、犬における11beta-HSD阻害剤の効果は用量依存的であることが明らかとなり、健常犬においては11beta-HSD阻害剤により下垂体からのACTH分泌を抑制できる可能性が示唆された。また、中長期的な投与においても明らかな副作用は認められなかったことから、今後はさらに頭数を増やして検討を重ねると共に、実際に下垂体ACTH産生腺腫に罹患した犬における効果を検討する必要があると考えている。本研究結果より、11beta-HSD阻害剤が犬下垂体ACTH産生腺腫の治療薬となりうる可能性が示唆されたため、今後も更に継続して研究を発展させたいと考えている。本研究は11β-hydroxysteroid dehydrogenase(11β-HSD)阻害剤による犬下垂体ACTH産生腺腫をターゲットとした治療に関する研究である。平成25年度は昨年度の結果をもとに、健常犬に対して中長期的に11β-HSD阻害剤を投与した場合の、内分泌学的変化および生理学的変化など、どのような影響が現れるかについて検討した。具体的な内容としては、次の14を検討した。1下垂体-副腎軸における内分泌学的変化について血中ホルモン濃度を経時的に測定。2生理学的変化の指標として、血液生化学マーカーを経時的に測定。3中長期的投与後の、下垂体および副腎における遺伝子発現量の変化に関する検討。4投与後の下垂体および副腎組織に関する免疫組織学的検討。昨年度の研究結果より、11β-HSD阻害剤が犬に与える影響には用量依存的な変化がみられることが明らかになっており、中長期的な投与においても、下垂体からのACTH分泌の抑制および副腎からのコルチゾール分泌の抑制が確認された(1)。また、投与期間中および投与後の血液生化学マーカーには変化はみられず、健常犬においては安全であることが確認された(2)。11β-HSD阻害剤が下垂体および副腎組織における影響を遺伝子発現量の面から検討した結果、ACTHおよびコルチゾールの産生分泌に関与する複数の遺伝子において顕著な変化が認められた(3)。免疫組織学的検討では、ホルモン分泌の低下を示唆する組織学的変化が認められた(4)。昨年度の研究結果も含め、これらの研究結果から、11β-HSD阻害剤は犬下垂体ACTH産生腺腫(Cushing's disease)の治療において用いられてる従来の薬剤とは異なり、本疾患の原因である下垂体ACTH産生腺腫に対して直接的な効果を持つ可能性が非常に高いことが示唆された。当該研究は11β-hydroxysteroid dehydrogenase (11β-HSD)阻害剤による犬下垂体ACTH産生腺腫を標的とした治療に関する研究である。本研究を遂行するにあたり、研究計画として3項目を掲げた。その1つである犬下垂体における11β-HSD isoformタンパク発現レベルの解明において必要となる犬組織に対する適切な11β-HSD抗体の選定は、他種動物のアミノ酸配列との相同性との比較等から適切な抗体の選定は終了し、犬での特異性についても確認済みである。11β-HSD isoformタンパク発現についての検討として、犬下垂体ACTH産生腺腫によるクッシング症候群に対する治療薬であるトリロスタンを連日投与したモデル犬を作製し、健常犬との11β-HSD isoformの発現の違いについて検討した。この研究内容に関しては現在、海外論文誌に投稿している。また、研究計画項目の1つである11β-HSD阻害剤が健常な犬の生体に与える影響の検討においては、用量を低・中・高用量と変化させ、短期間の投与の結果、どのような影響が発現するかについて検討した。内分泌学的検査の結果から、用量依存的に11β-HSD isoformに与える影響が変化することが示唆された。また、健常犬において下垂体からのACTH分泌が抑制される用量についても確認できた。本研究内容は、次年度の研究内容を加えて海外論文誌に投稿予定である。平成24年度の研究内容・実績としては概ね当初の計画通り進行しており、次年度は本年度の結果を踏まえてさらに遂行する予定である。研究内容としては、ACTH分泌の阻害が見込まれる用量を中長期的に投与した結果、犬生体にどのような影響がみられるかについて多面的な方向から検討する予定である。健常犬に対して11β-HSD阻害薬を投与した結果、用量依存的に11β-HSD isoformに対する影響が変化することが示唆された。その理由として、低・中・高用量を短期的に投与した際の副腎からのコルチゾールおよびコルチゾン濃度を測定した結果、用量の違いによりホルモン濃度にも変化が認められた。また、下垂体からのACTH分泌に関しても、用量の違いにより分泌量の変化が認められた。この短期的な結果から、下垂体のACTH

分泌を抑制する用量が概ね検討できた。そのため、本年度に実施予定である犬生体に対して中長期的に投与した結果、どのような影響がみられるかについて検討するためのバックグラウンドは整備されたと考えている。また、実際に犬副腎組織を用いた11β-HSD isoformに関するタンパク発現については、副腎皮質機能抑制モデル犬を作製し検討した。この結果から、犬副腎組織においては11β-HSD isoformの発現が他種動物と異なることが示唆されたため、今後の下垂体組織を用いた検討においても、この結果を考慮して行う予定である。今後はこれまでの実験結果を踏まえて、次の項目について研究を行う予定である。1健常犬に対して中長期的に11β-HSD阻害剤を投与した際の影響中長期的な投与期間を設定し、投与期間中も含めてどのような変化が発現するかを検討する。検討項目としては、視床下部-下垂体-副腎軸におけるホルモン濃度を中心に投与期間中継時的にモニターする。投与期間終了後は各臓器を採材し、11β-HSD isoformのmRNAおよびタンパク発現量の解析、および病理組織学的な検査を行う予定である。犬下垂体培養細胞に11β-HSD阻害剤を添加することで、どのような変化が発現するかを検討する。検討項目としては、生存細胞数の変化、アポトーシスの有無、11β-HSDやACTHの前駆物質であるPOMCの発現量、およびACTH分泌量の変化についての検討を予定している。健常犬に対する11β-HSD阻害剤の中長期的投与における影響を検討するために、実験動物、11β-HSD阻害剤、タンパク発現解析試薬、mRNA発現解析試薬、病理組織学的検査試薬等の購入に研究費を用いる予定である。また、犬下垂体培養細胞に対する影響を検討するために、細胞培養関連試薬等の購入を予定している。これらの試薬等は本年度から継続して使用可能なものもあるが、次年度も新たに購入が必要であるため、適切な研究計画を設定し購入する予定である。また、次年度は11β-HSD阻害剤を投与した犬生体の病理組織学的検査および培養細胞等の検討を予定している。これらの研究内容には画像解析も必要となるため、画像解析の使用に用いるコンピューターおよび画像解析ソフトの購入を検討している。本年度も本研究内容の一部を海外論文誌へ投稿するにあたり英文校閲の費用を研究費より支出した。次年度においても研究内容を海外論文誌に発表するために、英文校閲等の費用に使用する予定である。
自然免疫制御能の異なるペスチウイルスの共存に起因する感染特性の分子基盤研究

前年度に引き続き自然免疫制御能及び遺伝子型が異なる牛ウイルス性下痢ウイルス(BVDV)の完全長cDNA分子クローンの構築を進め、BVDV-2型のvKZ91NCPーウイルスの合成に成功した。当該ウイルスは強力な異種ウイルス干渉を示し、元ウイルスと同じ性状を維持した自然免疫誘導型であることを確認した。これにより、BVDV-1自然免疫誘導型(vNo.12/P8Lウイルス)および誘導型(vNo.12ー)並びにBVDV-2自然免疫誘導型(vKZ91NCPー)のそれぞれ合成ウイルスを揃えることを達成し、これらウイルスを組み合わせて感染させることによるウイルス間相互反応の解析が可能となった。自然免疫制御能及び遺伝子型が異なる合成ウイルスを培養細胞に同時感染させた後の、各ウイルスの複製を解析するための遺伝子型識別リアルタイムRT-PCR検出系を構築し、並びに自然免疫反応を解析するためのインターフェロン刺激関連遺伝子(Mx、ISG15及びPKR)のmRNAのリアルタイムPCR検出系を確立した。前年度に続き牛I型インターフェロン受容体サブユニット1(bFNAR1)ノックアウト(KO)細胞の作製を進めた。前年度で課題となった牛腎株化培養細胞へのgRNA/Cas9同時発現プラスミド導入効率を改善に取り組み、プラスミドと導入試薬の至適配合比を発見し、数%であった導入効率を最大12%まで向上した。さらに、フローサイト・セルソーティング系を用いてbIFNAR1-KO候補細胞を効率よく回収した。また、シングルセル・クローニングと変異検出を繰り返し、複数のbIFNAR1-KO候補細胞クローンを確保した。KZ91NCPーウイルスゲノム3'末端338塩基を連結し、完全長cDNA分子クローンプラスミドpKZーを完成させた。制限酵素で線状化したpKZーからの試験管内合成ウイルスRNAを用いた場合のウイルス合成効率が低かったため、pKZーを鋳型に長鎖PCR系で得たPCR産物から試験管内ウイルスRNA合成する方法を確立した。合成ウイルスRNA20μgを電気穿孔法で牛精巣(BT)細胞に導入し、合成ウイルスvKZ91NCPーの回収に成功した。vKZ91NCPー感染BT細胞は水胞性口炎ウイルス干渉(異種ウイルス干渉)を示し、自然免疫誘導型ウイルスであることを確認した。遺伝子型と生物型の異なる合成ウイルスの共感染後のウイルス複製を解析する遺伝子型識別リアルタイムRT-PCR検出系(絶対定量)を確立した。BVDV-1型検出にFAM標識の、BVDV-2型検出にHEX標識のTaqMANプローブを用いて、同一チューブで両ウイルスを同時定量できることを確認した。合成ウイルス回収に時間を要してウイルス相互反応の解析が未着手なため、やや遅れていると判断した。ただし、合成ウイルス各種が揃い、検出系も構築できたため、ウイルス相互反応の解析に着手できる状況にある。細胞導入試薬(TransFectin Lipid試薬,BIO-RAD)とgRNA/Cas9同時発現プラスミドの混合比を変えて試行し、前年度で数%であったプラスミド導入効率を1012%まで向上した。シングルセル・クローニングは難航したため、フローサイト・セルソーティングを導入し、bIFNAR1-KO候補細胞を効率よく確保できた。ソーティングされた候補細胞について変異検出を行いながらクローニングを実施しているが、変異導入が不安定なためにクローニング未達成と考え、やや遅れていると判断した。ただし、3系統のうち2系統の各々で複数のクローンを確保している。自然免疫制御能及び遺伝子型の異なる合成ウイルス(BVDV-1自然免疫抑制型とBVDV-2自然免疫誘導型)を牛腎細胞に共感染させ、遺伝子型識別リアルタイムRT-PCR検出系及び自然免疫関連遺伝子発現解析などを含む当初研究計画に沿ったウイルス間相互反応の解析を実施する。また、bIFNAR1-KO細胞の樹立を早期に達成し、自然免疫制御能及び遺伝子型の異なる合成ウイルスを共感染させ、遺伝子型識別リアルタイムRT-PCR検出系及び次世代シーケンサーによる網羅的解析により、自然免疫制御によらないウイルス間相互反応(内因性干渉)と変異型出現などの解析を展開する。自然免疫制御とペスチウイルス間相互反応を解析するため、ウイルス遺伝子型ごとに自然免疫制御能の異なるウイルスの単離を進め、特にBVDV-2型について重点的に実施した。KZ91NCP株から、限界希釈法で自然免疫制御型(END陽性型)ウイルスKZ91NCP+を、逆プラック法で自然免疫抑制型(END陰性型)ウイルスKZ91NCPーをそれぞれ単離した。KZ91NCPーの遺伝子解析の結果、ゲノム全長12,286塩基、推定アミノ酸数3,897個をコードする1個のオープンリーディングフレームを有することを確認した。KZ91NCP+の予測遺伝子配列と比べ、KZ91NCPーに非同義置換が7ヶ所見つかり、うち1つは自然免疫制御関連蛋白Npro領域に位置し、自然免疫制御とウイルス間相互反応の解析において重要な鍵になると期待された。次いで、KZ91NCPーの完全長cDNAクローンの構築を進め、ウイルスゲノムの97%相当のcDNAをリバースジェネティクス用プラスミドベクターに挿入した。完全長cDNAの分子クローニングを達成した暁には、遺伝的に均一な各ウイルス集団を実験に用いることができる。自然免疫によらない内因性干渉とウイルス間相互反応を解析するため、ゲノム編集ツールのCRISPR/Cas9システムを用いて、牛インターフェロンαβ受容体サブユニット1(IFNAR1)ノックアウト牛腎培養細胞の作製を進めた。IFNAR1

遺伝子配列をもとに、オフターゲットリスクが少ないと予測されたガイドRNA(gRNA)3種類を設計し、そのgRNAとCas9を同時に発現するプラスミドベクターを構築し、牛腎由来株化MDBK細胞内で導入し、各々発現させた。プラスミドが導入された培養細胞を確認できたことから、IFNAR1ノックアウト細胞のシングルセルクローニング及び性状確認を進めた。KZ91NCPーウイルスRNAからcDNAを合成し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いてウイルス遺伝子を5断片に分けて増幅した後、In-Fusion法によりpACYC177由来リバースジェネティクス用プラスミドベクターに順次連結しながら挿入し、分子クローンpKZ91NCPーの作製を進めた。完全長cDNAクローンの作製過程において、プラスミドベクターへのウイルス遺伝子断片の挿入・連結が進むにつれて、当該ベクターのIn-Fusion効率及び複製効率が低下し、さらに大腸菌体内での不安定性が高まったため、その構築に当初計画より時間を要しており、やや遅れていると判断した。ただし、完全長cDNAクローン完成までには3'末端338塩基の連結を残すのみであり、完成は近いと考える。IFNAR1ノックアウト細胞の作製においては、gRNAの設計、gRNAスクリーニング、並びにgRNAーCas9同時発現プラスミドベクターの構築などは順調に進んだ。しかし、当該プラスミドベクターをリポフェクション法で牛腎株化MDBK細胞への導入した際、様々なリポフェクション試薬の使用を試みても牛腎細胞への導入効率が数%と非常に低く、最も高いものでも10%に満たなかった。このため、IFNAR1ノックアウト候補細胞のシングルセルクローニングにおいて困難を極め、結果として時間を要していることから、当初計画よりやや遅れていると判断した。前年度に引き続き自然免疫制御能及び遺伝子型が異なる牛ウイルス性下痢ウイルス(BVDV)の完全長cDNA分子クローンの構築を進め、BVDV-2型のvKZ91NCPーウイルスの合成に成功した。当該ウイルスは強力な異種ウイルス干渉を示し、元ウイルスと同じ性状を維持した自然免疫誘導型であることを確認した。これにより、BVDV-1自然免疫誘導型(vNo.12/P8Lウイルス)および誘導型(vNo.12ー)並びにBVDV-2自然免疫誘導型(vKZ91NCPー)のそれぞれ合成ウイルスを揃えることを達成し、これらウイルスを組み合わせて感染させることによるウイルス間相互反応の解析が可能となった。自然免疫制御能及び遺伝子型が異なる合成ウイルスを培養細胞に同時感染させた後の、各ウイルスの複製を解析するための遺伝子型識別リアルタイムRT-PCR検出系を構築し、並びに自然免疫反応を解析するためのインターフェロン刺激関連遺伝子(Mx、ISG15及びPKR)のmRNAのリアルタイムPCR検出系を確立した。前年度に続き牛I型インターフェロン受容体サブユニット1(bFNAR1)ノックアウト(KO)細胞の作製を進めた。