hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
日本人網膜色素変性患者における原因遺伝子 EYS の寄与と遺伝子変異-病態の関連解析

RP原因遺伝子のスクリーニングは、既に欧米等の施設によって行われているが、我が国のRP患者における変異解析は少数のadRPとarRP患者で行われているのみであった。この状況を打開するために、申請者は研究協力者と共同でarRP、adRP,レーバー先天盲(Leber's Congenital Amaurosis, LCA)患者の収集を開始した。本年度は収集できた100人のarRP、19人のadRP、28人のLCA患者に対してPCRダイレクトシーケンス法を用いてEYSの変異解析を行い、18人のarRP患者から7種(c.4957_4958insA, c.8868C>A, c.2522_2523insA, Deletion exon 32, c.6557G>A, c.7793G>A, c.8351T>G)の疾患原因変異を同定した。18人中9人は片側アレルの原因変異のみ同定できた。また上記18人の患者以外の8人から6種のミスセンス変異も同定した(c.77G>A, c.2923T>C, c.5404C>T, c.5884A>G, c.8875C>A, c.9272T>C)。今回同定した13種の変異のうちc.6557G>A以外の12種は新規変異であった。18人中12人にc.4957_4958insA、18人中4人にc.8868C>Aの変異を同定した。19人の日本人adRP患者と28人のLCA患者からは上記2種の変異は見つからなかった。これら2種の変異は日本人arRP患者において突出して頻度の高い遺伝子変異である可能性が高い。この結果は2012年にPLoS ONEに掲載された。本年度は、100名の日本人arRP患者を収集し、EYSの変異解析を実行することができた。我が国にこれだけ大規模にRP症例を収集して行う原因遺伝子の変異探索は初めてであり、達成度はおおむね順調に進展していると言える。次年度の研究計画は以下(5)(7)を計画した。(5)変異探索、(6)遺伝子変異と表現型の検討、(7)データベースの構築。申請者は既にEYSの遺伝子解析により18人から疾患原因変異を同定しているが、変異が片側アリルにしか同定されなかった症例が18人中9人存在した(Hosono et al., 2012)。これは、変異が見つからなかった方のアリルに大きな欠失や重複が存在する場合と、未同定のエキソン中に変異が存在する場合など様々な原因が考えられる。そのため片側アレルのみ変異を同定できた9人の患者に対しもう一方の片側アレルの欠失・重複の有無をMLPA(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)解析を行い検証する。また新規エキソンの存在する可能性については本年度の研究計画(2)で挙げたEYSのゲノム構造解析を行う。新規エキソンが同定できた場合は、上記9人に対しそのエキソンについて再度PCRダイレクトシーケンス法で変異解析を行う。(5)については本年度に挙げた研究計画の(1)を引き続き継続し、更に100人のarRP患者を収集し、合計200人を用いて変異探索を行う予定である。新たに収集する100人のarRP患者に対しては以下のスクリーニング方法を実施する。a.1次スクリーニング; c.4957_4958insAとc.8868C>AをPCRダイレクトシーケンス法で変異解析を行う。b.2次スクリーニング;EYS全44エキソンをPCRダイレクトシーケンス法で変異解析を行う。
高密度プラズマ物性の総合的研究

3年間の組識研究により次の諸問題が解明された。詳細は「研究成果報告書」(添付)中で報告する。1・クーロン系多体相関関数の構造2.相関関数計算にあたっての積分方程式の方法の確立3.局所場補正関数を用いた強結合効果の表現4.種々の高密度プラズマ系の状態方程式と相特性。5.多種イオンプラズマの相互溶融度理論とその太陽内部への応用6.凝縮系のガラス転移理論と計算機シミュレーション7.輸送過程に対するクーロン強結合効果、電子系の量子効果、電子・イオン間散乱に関わる非ボルン的効果8.プラズマ中微視的電場ゆらぎと不純物準位9.高密度プラズマからの制動輻射10.電離平衡と金属誘電体転移11.界面プラズマの理論とシミュレーション12.低次元電子プラズマ中の相関効果13.低次元凝縮系における非線型励起14.高密度星進化へのプラズマ物性の応用3年間の組識研究により次の諸問題が解明された。5.多種イオンプラズマの相互溶融度理論とその太陽内部への応用6.凝縮系のガラス転移理論と計算機シミュレーション7.輸送過程に対するクーロン強結合効果、電子系の量子効果、電子・イオン間散乱に関わる非ボルン的効果8.プラズマ中微視的電場ゆらぎと不純物準位9.高密度プラズマからの制動輻射10.電離平衡と金属誘電体転移11.界面プラズマの理論とシミュレーション12.低次元電子プラズマ中の相関効果13.低次元凝縮系における非線型励起14.高密度星進化へのプラズマ物性の応用
免疫系、神経系におけるカルシニューリン情報伝達系の解析

serine/threnine脱リン酸化酵素であるカルシリューリンはT細胞活性化に重要な酵素であることが判明している。我々は本研究の中で、この酵素の標的である転写因子NFATについてその詳しい分子内制御機構について解析し、リン酸化部位を含めた機能解析に加え、NFATの特異的なキナーゼ(NFATキナーゼ)としてCKIおよびPKCを同定した。免疫細胞に特異的な転写因子として知られていたNFATであるが、他の臓器にもそのサブタイプが発現していることが判明し、心筋細胞ではカルシニューリン/NFATを介する情報伝達系が心筋肥大に関与すること、および神経細胞やグリア細胞にも発現し、その役割が改めて注目されるようになった。一方、カルシニューリンは活性依存的にアポトーシスを起こすことを依然報告したが、実はBcl-2 familymemberの1つであるBadの脱リン酸化を介してアポトーシスを誘導することが判明した。我々はこの経路が神経疾患で実際に働いているかどうかを調べるために、ラットの前脳虚血モデルを用いて検討した。虚血一週間後には海馬のCA1領域が特異的に障害されるが、このときCA1領域のみにBadの脱リン酸化およびミトコンドリアからのチトクロームc流出が認められ、CsAとFK506の前処置により完全に脱リン酸化が阻止された。さらに動物用のMRIを用いて詳しい解析を行った結果、CsAは完全に虚血性神経細胞死を抑えるにも関わらず、FK506は40-50%の抑制しかなく単なるカルシニューリンの抑制だけでは説明できないことが判明した。その後、詳細な解析により、細胞死に大きな役割を演じているミトコンドリアに発現するシクロフイリンDがCsAにより抑制され細胞死が効果的に阻止されているらしいことがわかってきた。また、カルシニューリンはBadのみならずBcl-2自体も脱リン酸化することが判明し、リン酸化部位特異的な抗体作成により、Bcl-2リン酸化は乳癌やB細胞リンパ腫において認められた。現在Bcl-2キナーゼを同定しており、カルシニューリンとの相互作用を含めた詳しい解析を今後とも行う予定である。以上、カルシニューリンの多様な作用を2年間の本研究において解析し、多くの新たな知見を得られたと確信する。(1) Bcl-2キナーゼの同定とカルシニューリンとの相互作用の解析(芝崎、大森、近藤)本年度の研究成果としてカルシニューリンによるBcl-2の機能的脱リン酸化部位の決定を行った。Dexamethazonc耐性を指標にしたBcl-2変異体の解析にて、N-末端にあるBH4領域およびそれに続くLoop領域のdeletion mutantはBcl-2の抗アポトーシス効果を消失させた。さらに詳しい解析によりS24およびS70が非常に重要な部位であることが判明した。さらにリン酸化に関与するキナーゼの同定を行うため、bovine thymus,brainから約60kdaのBcl-2キナーゼを精製した。現在、遺伝子を同定しており、今後リン酸化、脱リン酸化に伴うBcI-2/Baxの制御機構や細胞死の情報伝達系を詳しく解析する予定である。(2)神経細胞死、特に虚血に伴う遅発性神経細胞死におけるカルシニューリン情報伝達系の解析(大森、吉澤)

これまでの報告によりカルシニューリン依存性の細胞死がBax familyの一つであるBadの脱リン酸化を介して起こることが判明した。さらに別の報告では虚血性神経細胞死にカルシニューリンの特異的阻害剤であcyclosporineA(CsA)やFK506が著明な効果を示すことが判明し、この神経細胞死にカルシニューリン情報伝達系の関与が強く示唆されるため、ラットを用いた詳しい解析を現在行っている。加えてカルシニューリンのdominant negative.変異体をラットに遺伝子導入し、現在founderが生まれた。今後、各組織におけるこの変異体の影響を解析するとともに、このラットを用いて虚血を起こし、カルシニューリンがどの程度遅発性細胞死に関与しているかを詳しく解折していく予定である。3)カルシニューリン/NF-AT細胞内情報伝達系系の解析(芝崎、大森、近藤)T細胞に特異的に発現していると思われていたNF-ATはそのサブタイプの検討により、心臓、脳などの非リンパ球組織にも発現していることが判明した。昨年の報告ではカルシニューリン/NF-Tの活性化により心筋肥大の原因になることや、さらに我々の独自の解析により、NF-AT4、即ち未熟T細胞にのみ発現しているサブタイプが脳内特にGlial cellsに発現していることを初めて見いだした。来年度はこれらの実験結果に踏まえ、上記の遺伝子導入ラットおよびマウスを用いた詳細な解析を行う予定である。serine/threonine脱リン酸化酵素であるカルシニューリンはT細胞活性化に重要な酵素であることが判明している。我々は本研究の中で、この酵素の標的である転写因子NFATについてその詳しい分子内制御機構について解析し、リン酸化部位を含めた機能解析に加え、NFATの特異的なキナーゼ(NFATキナーゼ)としてCKIおよびPKCを同定した。免疫細胞に特異的な転写因子として知られていたNFATであるが、他の臓器にもそのサブタイプが発現していることが判明し、心筋細胞ではカルシニューリン/NFATを介する情報伝達系が心筋肥大に関与すること、および神経細胞やグリア細胞にも発現し、その役割が改めて注目されるようになった。一方、カルシニューリンは活性依存的にアポトーシスを起こすことを以前報告したが、実はBcl-2 family memberの1つであるBadの脱リン酸化を介してアポトーシスを誘導することが判明した。我々はこの経路が神経疾患で実際に働いているかどうかを調べるために、ラットの前脳虚血モデルを用いて検討した。虚血一週間後には海馬のCA1領域が特異的に障害されるが、このときCA1領域のみにBadの脱リン酸化およびミトコンドリアからのチトクロームc流出が認められ、CsAとFK506の前処置により完全に脱リン酸化が阻止された。さらに動物用のMRIを用いて詳しい解析を行った結果、CsAは完全に虚血性神経細胞死を抑えるにも関わらず、FK506は40-50%の抑制しかなく単なるカルシニューリンの抑制だけでは説明できないことが判明した。その後、詳細な解析により、細胞死に大きな役割を演じているミトコンドリアに発現するシクロフィリンDがCsAにより抑制され細胞死が効果的に阻止されているらしいことがわかってきた。
不完全な半透膜としての泥質岩挙動と長期地圏環境安定性評価に対する重要性の定量化

高レベル放射性廃棄物地層処分場の長期安定性を確認し、また、その性能を評価するためには、難透水性岩盤内の地下水挙動及び物質移行過程を明らかにすることが不可欠である。特に、泥質岩の不完全な半透膜としての性質は、地下深部の地下水挙動に大きな影響を及ぼす可能性があることが指摘されている。すなわち、泥質岩層をはさんで塩水・淡水が在している場合、泥質岩が不完全な半透膜として機能し、淡水が泥質岩中を低濃度側から高濃度側に移行することにより、泥質岩の両側において圧力差を発生させることが想定される。最近の研究では、この現象によって最大20MPaにも達する圧力差をもたらす場合があることが報告されている。したがって、沿岸域における深地下水環境の長期安定性を評価するためには、従来のように重力ポテンシャル場の評価だけでなく、上記のような半透膜としての特性を明らかにすることが重要である。本研究は、わが国の泥質岩を対象として半透膜としての特性を評価するための実験装置を開発し、実際に計測することによってその重要性を定量的に示すことを目的としている。本年度は、昨年度までに開発した実験装置によって、本装置を特徴づける塩濃度の連続計測用センサーのキャリブレーション実験を行い、濃度校正用の基礎データを収集した。また、供試体として半透膜としての機能が明らかなRO膜を用いて、半透膜が介在する場合の供試体内の塩水・淡水の挙動を実測した。特に、泥質岩類は、1980年代から不完全な半透膜としての機能を果たすことが指摘されていながら、その重要性はあまり理解されておらず、塩水・淡水が接するような状況下における地下水挙動・物質移行過程の評価が不十分なまま議論が進められている可能性が高い。すなわち、泥質岩層をはさんで塩水・淡水が存在している場合、泥質岩の不完全な半透膜としての機能の結果、淡水が泥質岩中を低濃度側から高塩濃度側に移行することにより、泥質岩の両側において圧力差を発生させることが想定される。最近の研究によると、泥質岩の種類によっては、この効果によって発生する圧力差は20MPaにも達することが指摘されている。したがって、沿岸域における地下水環境の長期安定性を評価するためには、難透水性岩の透水特性、ポテンシャル場の評価に加えて、難透水性岩(特に泥質岩)の半透膜としての特性を明らかにすることが重要である。そこで、本研究では、国内の代表的な泥質岩(珪質泥岩、粘土質泥岩、シルト岩、凝灰質泥岩)を対象とした半透膜としての特性評価を行うための実験装置を開発し、計測を行うことにより、その重要性を定量的に示すことを目的とする研究を実施することとした。本年度は、そのために必要な実験装置の開発に注力することし、計測試料端面において水圧および塩濃度を計測することを可能とするセンサー開発および圧力セルの試作を行った。その上で、実験を実施するに当たって必要な周辺機器の整備を行い、実験の準備を完了した。
pH4から自然に中性化した屈斜路湖の将来予測:富栄養化か再酸性化か

夏期の成層期から冬季結氷期にかけて、採水とCTD観測を繰り返した。前年に観測された通り温水が湖底から供給され、かつ、すみやかに混合していること、冬季には湖底水温は最大密度よりも軽い約2°Cまで冷却されており、冬季でも混合が継続し異常な温度プロファイルが作られ続けることが確認された。屈斜路湖に流入する10本以上の河川と流出河川(釧路川)について、4回の流量観測と試料採取を行った。また、地元のボランティア団体の協力を仰ぎ、釧路川については毎月の採水、観測を継続した。2003年9月から屈斜路湖最深部に設置した水温、電導度、クロロフィル・濁度計を2004年8月に回収した。秋季・春季混合が湖底まで起きた後、水温が最大密度で安定せず連続的に変化すること、解氷後クロロフィル量が大幅に増加することなどが示された。酸のバランスを考える上で最も重要な、酸濃度・成分濃度の高い湯川流入口に水温・電導度計を再び保留した。冬場を含めたイオン収支の情報を与える。これまで採取した試料について、アルカリ度、溶存成分などの測定を行った。その結果、イオン濃度の減少とアルカリ度の上昇については、高精度の測定を行うことで年変化が検出できた。アルカリ度は依然として減少傾向にはなっておらず、現在のところ再酸性化のおそれはないことが示された。一方、春先のクロロフィル量増加などの傾向があり、公共用水域の栄養塩観測などと合わせて、今後の富栄養化には警戒が必要であることが示唆された。夏期の成層期に湖心部を中心とし,複数地点でのCTD観測を行い,水温と成分のプロファイルを得た.最深部(水深120m)での水温は,地点ごとにわずかな差がありながら約5°Cを示していた.前回の調査と水温が異なっており,温水が湖底から供給され,かつ,すみやかに混合していることとその程度が年々異なっていることを示す.成分を伴う明瞭な湧水が最深部付近にないことが示された.屈斜路湖に流入する10本以上の河川と流出河川(釧路川)について,5回の流量観測と試料採取を行った.また,地元のボランティア団体の協力を仰ぎ,釧路川については毎月の採水,観測を開始した.その他,湖岸の数ヶ所にある温泉の採水も実施した.完全結氷した逆列成層湖での観測を氷上から行った.その結果,湖底水温は最大密度よりも軽い約2°Cまで冷却されており,冬季でも混合が継続し異常な温度プロファイルが作られることが分かった.屈斜路湖の和琴半島付近に約2ヶ月間クロロフィル・濁度計を係留し,連続観測の可能性と,フィルタサンプルのHPLC蛍光実測によるキャリブレーションを行った.また,9月からは,最深部において水温,電導度,クロロフィル・濁度計を各層に設置した係留し,特異な水温プロファイルの形成と冬季成層-循環に伴う構造変化,解氷による生物生産の増大などを観測する.屈斜路湖は氷結するため,回収は2004年の初夏を予定している.これまで採取した試料については,アルカリ度,溶存成分などの測定を行った.その結果,過去15年間では明らかなイオン濃度の減少とアルカリ度の上昇があり,高精度の測定を行えば年変化も検出できるレベルの変化が継続していることが示された.夏期の成層期から冬季結氷期にかけて、採水とCTD観測を繰り返した。

屈斜路湖に流入する10本以上の河川と流出河川(釧路川)について、4回の流量観測と試料採取を行った。また、ボランティア団体の協力を仰ぎ、釧路川については毎月の採水、観測を継続した。2003年9月から屈斜路湖最深部に設置した水温、電導度、クロロフィル・濁度計を2004年8月に回収した。秋季・春季混合が湖底まで起きた後、水温が最大密度で安定せず連続的に変化すること、解氷後のクロロフィル量が大幅に増加することなどが示された。酸のバランスを考える上で最も重要な、酸濃度・成分濃度の高い湯川流入口に水温・電導度計を再び係留した。冬場を含めたイオン収支の情報を与える。これまで採取した試料について、アルカリ度、溶存成分などの測定を行った。その結果、イオン濃度の減少とアルカリ度の上昇については、高精度の測定を行うことで年変化が検出できた。アルカリ度は依然として減少傾向にはなっておらず、現在のところ再酸性化のおそれはないことが示された。一方、春先のクロロフィル量増加などの傾向があり、公共用水域の栄養塩観測などと合わせて、今後の富栄養化には警戒が必要であることが示唆された。
腎癌細胞株における同種細胞間接着機能と細胞周期制御との関連の分析

正常腎組織、腎癌標本25例、腎癌細胞株7種について各種カドヘリン(CD)及びカテニンの発現状況と機能/細胞形態との関連について検討した。腎細胞株は接着機能と関連すると考えられる生育形態により緊密増殖型(2種)と粗増殖型(5種)に分けて検討した。E-CDは緊密増殖型1種で強く発現されており、粗増殖型では発現が現弱していた。またCD-6は粗増殖型の2種で現弱欠損しており、接着機能との関連が示唆された。N-CDについては粗増殖型1種のみで強発現であり強い機能はないと考えられた。各カテニン(α,β;γは未施行)のmRNAはいずれの細胞株でも検出された。β-カテニンについては蛋白発現量の増強が粗増殖型に3種みとめられた。β-カテニンの変異の有無についてPCR-SSCPにて検討したが、それらに明らかな変異は認められず、また腎癌標本25例にも同様の検討では変異はなかった。従って腎癌においては大腸癌などとは異なってβ-カテニン遺伝子の変異は稀と考えれた。またβ-カテニン蛋白の増加は転写レベル以降と考えられ、GSK-3燐酸化との関連などの可能性も考えられた。また陰性対照として用いたカドヘリン機能のない白血病株にβ-カテニン蛋白の軽度発現が認められたことはβ-カテニンの接着以外の機能を示唆すると考えられた。腎癌細胞株7種,膀胱癌細胞株3種,乳癌細胞株1種および白血病細胞株1種についてβカテニンのWestern Blottingを施行した結果,腎癌細胞株KRC/Yにおいて蛋白量の増大が,腎癌細胞株ACTHでは減少が認められた以外は欠損やサイズの異常は認められなかった.また既にE-カドヘリンなどの発現がないことがわかっており,カドヘリンを介した細胞間接着機構のないと考えられる白血病細胞株(Namalwa)にもβ-カテニンが発現していることが判明した。β-カテニンのNH_3側のGSK-3によるリン酸化作用部位(アミノ酸37-45)を含む領域にプライマーを設定してRT-PCRを施行した結果,同部に明らかな欠失は認められなかったが,腎癌細胞株2種(Caki-1,Caki-2)および膀胱癌細胞株1種(RT-4)にてcDNAサイズの増大が疑われた.今後はβ-カテニンGSK-3作用部位のDNAサイズに異常の疑われた腎癌細胞株についてSSCPまたはsequencingを予定している.β-カテニン蛋白量の発現増大が認められたKRC/Yはβ-カテニンのGSK-3作用部位のcDNAに異常が認められなかったことから,β-カテニンの安定化を阻害するもう一つの作用機序と考えられるAPCに関して,β-カテニンのAPC結合部位およびAPC遺伝子・蛋白の異常についてもRT-PCR,Western Blottingなどにて検討する予定である.正常腎組織、腎癌標本25例、腎癌細胞株7種について各種カドヘリン(CD)及びカテニンの発現状況と機能/細胞形態との関連について検討した。

また陰性対照として用いたカドヘリン機能のない白血病株にβ-カテニン蛋白の軽度発現が認められたことはβ-カテニンの接着以外の機能を示唆すると考えられた。
ヒストン修飾酵素の欠損による転写疾患とゲノム機能調節

転写活性領域にはヒストンH3K36メチル化が種を越えて集積している。そのヒストン修飾を担う酵素の一つであるWhsc1は転写因子とともにDNA損傷応答因子と複合体を形成する。しかし通常のDNA損傷応答因子と異なってDNA切断部位への集積は認められない。そこで転写とDNA切断修復が共役して細胞分化が進むB細胞でWhsc1の機能解析を行ったところ、Whsc1欠損によりV(D)J組み換え異常によってB細胞分化が抑制されることが明らかになった。この結果は、転写活性領域に誘導されるDNA損傷修復にH3K36メチル化酵素Whsc1が機能する新規のクロマチン制御制御機構の存在を示す。ヒストンH3の36番目のリジン残基のジ・トリメチル化(H3K36me2/3)は、酵母からヒトまで種を越えてゲノムの転写活性化状態と明確な正の相関関係を示し、進行中の転写領域をマークして分布する。が、その分子機能は未だに不明である。Setドメインを含むNSDファミリータンパク質の一つ、Wolf-Hirschhorn syndrome candidate 1(Whsc1,別名MMSET,NSD2)の欠損マウスは4p-症候群(Wolf Hirschhorn syndrome,WHS)と同様に、正中線に沿った様々な形態異常を引き起こし、出生直後に死亡する。これまでの特異的なヒストンH3抗体を用いた、in vitroヒストンメチル化酵素活性解析に加えて、本年度、H3K36meヒストンを用いた再構成ヌクレオソームを基質に用いて、Whsc1がH3K36me特異的なヒストンメチル化酵素である事を明らかにした。また、Whsc1の転写制御機能を解き明かすために、Whsc1欠損ES細胞の分化異常を胚様体形成過程で検討した。その結果、Whsc1欠損ES細胞では、胚様体の大きさが、遺伝子欠損マウスと同様に小さくなる事が判明した。マイクロアレーを用いた遺伝子発現解析の結果、Whsc1遺伝子を欠損すると、Oct3/4やNanogなど未分化ES細胞で高発現している遺伝子群の細胞分化による抑制が、ことごとく抑えられる事が判明した。また一方で、Whsc1の複合体解析の結果、Whsc1は特定の転写因子以外に、DNA損傷修復に関わるH2AXやヒストンアセチル化酵素Tip60に結合している事が確認された。以上の結果から、今後、転写制御・細胞増殖とゲノムの機能維持の接点がWhsc1の機能解析から解明される事が期待される。ゲノムの進行中の転写領域をマークするピストンH3,36番目のリシン残基のメチル化酵素Whsc1は転写調節因子、核構造体に加えてDNA損傷因子と複合体を形成する事から、転写とDNA損傷応答をリンクさせた新規のゲノム機能維持機構につながる可能性が高い。本研究ではヒストンH3K36化酵素が転写反応過程におけるDNAストレス応答に働き、個体発生・分化過程で過度の細胞死を防いでいるとの独自の転写-DNA損傷応答モデルの検証を目指す。Whsc1が主要な原因遺伝子である4p-症候群の顕著な異常は成長阻害である。Whsc1欠損マウスの成長阻害を組織別に比較したところ、ほとんどの組織が体重差を反映しているのに対して、胸腺と脾臓が極端に小さいことを見出した。実際に、胸腺細胞および脾臓細胞数が野性型に比べて著しく減少しており、アネキシンVの抗体を用いたFACS解析から、Whsc1欠損リンパ細胞でアポトーシスを起こした細胞が多い事を、胎仔でも出生後でも確認した。胸腺細胞ではT細胞の減少に加えて、細胞分化異常が示唆された。そこでさらに、欠損マウスは出生後致死である事から造血細胞分化を欠損マウスのE14.5胎仔、肝臓の細胞を成体に骨髄移植して解析を行った。その結果、造血幹細胞数には大きな数の変動は見られないが、各種造血細胞への分化の早い段階で細胞数が減少し、特にB細胞・T細胞が激減することがFACS解析により確認された。リンパ球はDNAストレスに鋭敏な細胞であり、今後、細胞分化に伴ってDNA再編成があるIgH,TCR遺伝子座に着目したクロマチン解析を行うために、胎仔肝臓から造血幹細胞をFACSソートしてストローマ細胞上で培養するin vitroB細胞分化系を立ち上げつつある。H3K36me酵素Whsc1の機能を転写とDNA修復の分子共役の視点で明らかにするために、Whsc1欠損による造血幹細胞からのB細胞分化誘導で抗体IgM産生抑制に着目して解析を進め,以下の結果を得た。(2)同様に、Whsc1がV(D)J遺伝子組み換えに伴ったDNA損傷応答に関与する可能性を検討した。分化誘導後、遺伝子欠損による細胞増殖抑制が認められ、アポトーシスの増進が確認された。そしてIgHそしてコメットアッセイでゲノムDNAのダメージがWhsc1欠損によって集積している現場を捉える事ができた。(3)V(D)J遺伝子組み換えを起こす非相同組み換え(NHEJ)反応へのWhsc1の関与を検討するために、人工的に制限酵素I-SceI認識配列をGFP遺伝子と共にゲノムに組み込んだH1299細胞株にI-SceIを発現させて損傷修復活性を解析した。siRNAを用いてWhsc1をノックダウンするとNHEJ活性が顕著に抑制される結果が得られた。一方、相同組み換え効率を同様の方法で解析するHeLa細胞でWhsc1をノックダウンしても修復効率に影響は見られなかった。従ってWhsc1はNHEJ反応過程に機能すること示唆される。

以上の結果から、転写因子と複合体を形成するWhsc1はV(D)J組み換えを含めた転写活性領域の2本鎖切断の非相同組み換え修復反応に直接関与するモデルをここに提唱する。ヒストンH3,36番目のリシン残基のメチル化(H3K36me)は、種を越えてゲノム全体で進行中の転写活性領域に分布を示すが、転写との直接の繋がりが未だに判然としない。哺乳類でヒストンH3K36me活性が確認された5種類の酵素の中でWHSC1は成長遅延、精神遅滞を示す4p-症候群の原因遺伝子である。私達はH3K36me酵素Whsc1がDNA損傷応答因子と複合体を形成し、その欠損マウスが転写とDNA損傷修復が共役して分化が進行するB細胞分化過程で異常を示すことを見出し、Whsc1が転写とDNA修復の分子共役に関与するのではないかとの仮説をもとに研究を進めた。造血幹細胞からストローマ細胞との共培養でex vivoでB細胞に分化させ、分化段階を追って、V(D)J組み換え、免疫グロブリン遺伝子座の転写、そしてDNAの損傷を詳細に解析した。その結果、免疫グロブリン軽鎖(Igh)遺伝子座の転写は活性化されているが、組み換えが上手く行かないことが分化異常の原因であることが示唆された。そこで、Whsc1欠損マウスにV(D)J組み換えが完了した遺伝子をB細胞で発現するトランスジェニックマウスを交配して、骨髄移植でB細胞分化を見たところ、Whsc1欠損による分化異常が野性型とほぼ同程度に回復した。この結果はWhsc1がV(D)J組み換えに機能していること示しており、ヒストンH3K36メチル化酵素が転写とDNA損傷応答の分子カップリングに関与する私達のモデルを支持する。転写活性領域にはヒストンH3K36メチル化が種を越えて集積している。そのヒストン修飾を担う酵素の一つであるWhsc1は転写因子とともにDNA損傷応答因子と複合体を形成する。しかし通常のDNA損傷応答因子と異なってDNA切断部位への集積は認められない。そこで転写とDNA切断修復が共役して細胞分化が進むB細胞でWhsc1の機能解析を行ったところ、Whsc1欠損によりV(D)J組み換え異常によってB細胞分化が抑制されることが明らかになった。この結果は、転写活性領域に誘導されるDNA損傷修復にH3K36メチル化酵素Whsc1が機能する新規のクロマチン制御制御機構の存在を示す。ヒストンH3,36番目のリシン残基のメチル化(H3K36me)は、種を越えてゲノム全体で進行中の転写活性領域に分布を示すが、転写との直接の繋がりが未だに判然としないヒストン修飾である。H3K36me特異的な酵素Wolf-Hirschhorn syndrome candidate 1 (Whsc1)の欠損マウスは、成長遅延や骨形成異常を示す他に、脱毛など早老の傾向を示す。そのタンパクはユークロマチンに局在して、特定の転写因子やクロマチン修飾因子の他にTip60や53BP1などのDNA損傷応答因子と複合体を形成する。そこでDNA損傷応答の異常が細胞分化に大きく影響するリンパ球系でWhsc1の機能解析を進めた。
骨に働きかけ再生を促す吸収性骨修復材料の創製

骨に働きかけ再生を促す吸収性骨修復材料の創製を目指した。まず、ケイ酸を含有するリン酸三カルシウム(TCP)を合成した。その焼結体を擬似体液に浸漬したところ、ケイ酸を添加しないTCPに比べ、表面での水酸アパタイト(HA)形成が促進する傾向が見られた。ケイ酸を含有するTCPの成形体を水熱処理したところ、柱状粒子からなるCa欠損組成のHAを得ることにも成功した。一方、Ca欠損組成の大きいHAほど、酸性緩衝液中で溶解しやすいことも明らかにした。基礎となる材料について合成プロセスの確立と特性評価を行えた。病気や事故による骨欠損の回復は、術後の患者の生活の質(QOL)の向上に欠くことのできないものである。本研究では、自家骨や細胞移植を伴わなくても早急な骨再生が期待できる骨修復材料の開発を目指し、骨に働きかけ再生を促す吸収性骨修復材料を創製することを目的とした。湿式法を利用し、固溶限界以下で種々の量のケイ酸を含有するリン酸三カルシウムの合成に成功した。ケイ酸を含有するリン酸三カルシウムからなる焼結体をヒトの体液とほぼ等しい無機イオン濃度を有する擬似体液に浸漬したところ、ケイ酸を添加しないリン酸三カルシウムに比べ、表面での水酸アパタイト形成が促進する傾向が見られた。これは、ケイ酸添加によりリン酸三カルシウムの骨結合性が向上する可能性を示す。また、ケイ酸を添加したリン酸三カルシウム粉末の成形体を水熱処理したところ、柱状粒子からなるカルシウム欠損組成の水酸アパタイトを得ることにも成功した。一方、水熱合成した水酸アパタイトにおいては、カルシウム欠損組成の大きい水酸アパタイトほど、酸性緩衝液中で溶解しやすいことも明らかにした。これは、生体内において水酸アパタイトが破骨細胞によって吸収される際に、カルシウム欠損組成の大きいものほど吸収されやすい可能性を示す。ケイ酸を添加したリン酸三カルシウム粉末を水熱処理して得られるカルシウム欠損組成の水酸アパタイトは、吸収性の骨修復材料として期待できる。これらの知見は、骨に働きかけ再生を促す吸収性骨修復材料の創製をするにあたり、基礎的な材料合成プロセスの確立と得られた材料の特性評価を行えた点で、非常に有用であった。今年度は、湿式法を利用した独自のプロセスにより、固溶限界以下で種々のケイ酸含有量を有するケイ酸含有α型リン酸三カルシウムの合成に成功した。これまでには、ケイ酸は骨形成を促進することが報告されていたが、ケイ酸の存在状態をきちんと制御したケイ酸含有リン酸三カルシウムを合成できていなかった。ケイ酸含有リン酸三カルシウム焼結体のペレット上で、骨芽細胞用細胞を培養したところ、ケイ酸を添加しないリン酸三カルシウムに比べ、細胞増殖の抑制効果は認められなかった。ケイ素含有リン酸三カルシウムのペレットをヒトの体液とほぼ等しい無機イオン濃度を有する擬似体液に浸漬したところ、ケイ酸を添加しないリン酸三カルシウムに比べ、表面での水酸アパタイト形成が促進される傾向が見られた。さらに、ケイ酸含有リン酸三カルシウム粉末の成形体を水熱処理したところ、柱状粒子からなるカルシウム欠損組成の水酸アパタイトも得ることにも成功した。これらの知見は、骨に働きかけ再生を促す吸収性骨修復材料の創製をするにあたり、基礎的な材料合成プロセスの確立と得られた材料の特性評価を行えた点で、非常に有用であったと考える。今年度、材料合成プロセスの確立およびそのin vitroでの評価を行えた。このまま研究を進めていきたいと考える。現段階で、材料合成、およびそのin vitroでの評価も行えている。ただし、より高機能な人工骨を目指すために、材料設計についてもさらに検討を続けるとともに、評価も進めたいと考える。次年度使用額は、今年度は東日本震災の影響で研究の開始が遅れたことと、今年度の研究を効率的に推進したことに伴い発生した未使用額であり、平成24年度請求額とあわせ、次年度に計画している研究の遂行に使用する予定である。
光エネルギ-の化学的変換のための新規可逆反応系の開発

本年度は本研究課題の初年度であり、熱異性化の過程で化学励起を起こす高歪化合物の分子設計の基礎についての研究を行なった。反応系の設計にあたって、(a)反応が熱的に禁制であること、(b)反応熱が大きくこと、遷移状態から生成物の励起一重項項秘態への遷移がエネルギ-的に可能なことの2つをまず考慮した。1つの候補として、すでに見出している1,2,3ートリーtーブチルアントラキノン(1__ー)と1__ーの光照射で得られる1,2,3ートリーtーブチルー1,4ーデュワ-アントラキノン(2__ー)の原子価異性体対を検討した。この系は上記2の条件を満たしていると思われるのみならず1__ーの最低励起一重項がππ性であることも化学励起に都合がよい。しかし、この系では化学励起の検出が困難なため、1,2,3ートリーtーブチルー5,8ーデュワ-アントラキノン(3__ー)を合成し、1__ーへの異性化に伴う化学励起を検討した。比較のため1,4ーデュワーアントラキノン(4)についても検討を行なった。3__ー、4__ーともに定量的に1__ーおよびアントラキノンを与えた。それぞれの熱異性化反応の活性化エネルギ-は18および27キロカロリ-/モルで、反応熱はそれぞれー62およびー65キロカロリ-/モルと測定された。これは、3__ー→1__ーおよび4__ー→アントラキノンの反応ともに、生成物から見た遷移状態のエネルギ-が80キロカロリ-以上もあることを意味しており、それぞれの生成物の励起一重項を与えるに十分である。熱異性化において、4__ー→アントラキノンでは化学励起は検出されなかった。一方、3__ー→1__ーにおいては、反応に1,2,3ートリーtーブチルー1,4ーデュワ,アントラキノンの生成が認められ、化学励起が化学滴定された。この2例の違いは、生成物の返励起一重項の性質(ππかnπか)の違いに帰属でき、当初の分子設計上の考えが妥当であることを裏づけており、今後のより高効率な分子の設計へ展開したい。
脳形成に必須の分泌蛋白質リーリンの、翻訳後修飾とその分子メカニズム

リーリンは脳の層構造が形成される過程に必須の分泌蛋白質であり,ヒトでもリーリン遺伝子の欠損により重度の精神遅滞を伴う滑脳症を引き起こす。成体脳においてもリーリンは発現しており,統合失調症や自閉症の発症と高い相関が有る。従って,細胞外に分泌されたリーリンが「いつ,どのように」機能するか解析することはこれらの疾患の発症機序を解明するうえできわめて重要である。本研究では「リーリンC末端配列が何らかの修飾を受けている」との仮説に基づき,以下の研究をおこなった。リーリンが細胞外でどの程度まで拡散できるか知る目的で,脳内リーリンの膜親和性を生化学的に解析した。その結果,マウス胎仔の脳内リーリンは1.高い膜親和性を有し,2.脂溶性の高いものが存在することが明らかとなり,3.リーリン蛋白質への脂質結合により脂溶性を獲得することが示唆された。また,培養細胞にリーリンを発現させたところ,脂溶性の高いものが一部存在した。各種脂質修飾の阻害薬の適用によりリーリンの脂溶性が変動するか検討したところ,脂肪酸アシル化やイソプレニル化,GPI等の脂質修飾阻害薬では影響をうけなかった。従って,新たな形式の脂質修飾によりこれらの脂溶性獲得に至るものと考えられた。更に,脳内リーリンの細胞外における結合分子を知る目的で,野生型リーリン及びC末端領域欠失型リーリンを培養神経細胞に適用し,分布を調べたところ,C末端領域を持つ野生型リーリンはC末端領域欠失型リーリンに比べ,神経細胞膜に強く結合することが明らかとなった。この2種のリーリンは受容体への結合力に差はなく,膜表面への結合力はリーリンシグナルの活性化能と相関した。以上により,リーリンC末端配列が未知の共同受容体に結合することが示唆された。C末端配列における脂質修飾はリーリンの細胞外分布を制御し,シグナル伝達活性化を制御する可能性が示唆された。リーリンは巨大分泌蛋白質であり、大脳皮質の層構造が形成される過程に必須の分子である。リーリン遺伝子の欠損により、ヒトにおいて重度の精神遅滞を伴う滑脳症を呈する。成体脳においてもリーリンは発現しており、統合失調症や自閉症の発症と高い相関が有ることが知られている。本研究ではいくつかの予備的知見から、『脳内のリーリンは、C末端領域においてなんらかの修飾を受けている』との仮説に基づき、以下の研究をおこなった。マウス大脳皮質あるいは小脳より脳内リーリンを精製したところ、脳内在性リーリンは細胞膜と高い親和性をもつことが明らかとなった。この膜親和性は、(1)特定の膜蛋白質との結合を介するものではなく、(2)リーリン自身の脂質結合性によるものであることも示唆され、(3)大脳および小脳層構造形成のおこなわれる時期に脳内に存在していた。培養細胞にリーリンを発現させたところ、細胞画分のリーリンには脳内在性リーリンと同様に脂溶性の高いものが存在した。現在、どのような脂質がリーリンと結合しているかについて解析中である。一方、リーリンC末端配列は種を超えて保存されており、リーリンの機能に重要な役割を果たすことが示唆される。C末端配列が修飾を受けている可能性を想定し、八番目のリピート内C末端側に対するペプチド抗体(抗R8-pep抗体)を作成し、リーリン変異体に対する反応性を検討した。その結果、抗原蛋白質及びC末端が存在しない変異体を認識できる抗R8-pep抗体が、C末端配列を持つ野生型リーリンを認識できないとする事実を新たに見いだした。抗R8-pep抗体のエピトープを決定し抗体反応性の低下の原因を解析したところ、リーリンC末端配列は翻訳後修飾に依存しない特異な立体構造を形成していることが明らかとなった。

以上により,リーリンC末端配列が未知の共同受容体に結合することが示唆された。C末端配列における脂質修飾はリーリンの細胞外分布を制御し,シグナル伝達活性化を制御する可能性が示唆された。
ラン藻類の遷移に及ぼすキレート物質の影響に関する研究

霞ヶ浦において大発生していたMicrocystisが著しく減少し、代わりにOscillatoriaやPhormidium等が異常発生している。この藻類種の遷移を明らかにするため、霞ヶ浦から分離した4種の藻類を用いて藻類培養試験を行い、種の遷移に及ぼす化学的影響因子について検討を加えた。今年度は、前年度と同様にMicrocystis aeruginosa K-5株を用いて霞ヶ浦における藻類増殖制限因子を調べた。25°C、2000lx、白色蛍光灯連続照射条件下で静置培養を行い、藻類の増殖量を測定した。Microcystisの増殖制限物質は、EDTAまたはEDTA・リン・窒素であったが、EDTAのみの添加では増殖量は以前ほど認められず、利用可能なリン、窒素が減少しているのではないかと考えられた。さらに、合成キレート剤のEDTA (Na2EDTA 2H_2O)およびNTA (Nitrilotriacetic acid)ならびに霞ヶ浦の底泥より分離した天然のキレート物質のフミン酸およびフルボ酸による、Microcystisの重金属毒性の抑制効果について明らかにするために、重金属を含む合成培地にキレート物質を添加し、Microcystisの増殖に及ぼす影響を調べた。Cd, Ni, WおよびZnは、低濃度でM.aeruginosa K-5の増殖を阻害したが、EDTA, NTA,フミン酸およびフルボ酸は重金属毒性の抑制効果を示した。フミン酸及びフルボ酸の同時添加は、K-5株の増殖の誘導期が短くなる効果を示した。キレート物質の重金属毒性の抑制効果はMicrocystisの種により異なっていた。霞ヶ浦の湖心において、Microcystisの増殖制限物質は、1999年4,7,8月が、キレート物質であり、他の月はキレート物質の他にリンと窒素が同時にキレート物質になっていた。これまでは、夏期の湖水は、リンと窒素が制限物質でありキレート物質は制限にならず、その他の月は、リンとキレート物質が制限物質となっていた。最近は、年間を通して常にキレート物質が制限物質に含まれ、かつ窒素を制限物質とする月が多く認められた。以上より、Microcystisにとって、最近の霞ヶ浦の湖水は、増殖困難な環境となっていることが推定された。Phormidium属の制限物質に対する挙動はMicrocystis属のものに類似していた。Anabaena属はMicrocystis属に似していたが、窒素固定能を有するため窒素が制限になることはなかった。Oscillatoriaは他の種と異なり窒素が制限物質でキレート物質は制限とならなかった。ラン藻によりかなり性質が異なっていた。また、藻類の培養試験の結果、湖水の錯化容量とキレート物質量とは相関関係が認められ、錯化容量からMicrocystisの現存量の予測の可能性が示唆された。この藻類種の遷移を明らかにするため、霞ヶ浦から分離した4種の藻類を用いて藻類培養試験を行い、種の遷移に及ぼす化学的環境因子について検討を加えた。今年度は、Microcystis、Anabaena、OscillatoriaならびにPhormidiumの4種の藻類を用いて霞ヶ浦における藻類増殖制限物質を調べた。25°C、2,000lx、白色蛍光灯連続照射条件下で静置培養を行い、藻類の増殖量を測定した。藻類培養試験結果から、Oscillatoriaの場合、窒素の単独添加あるいは窒素とリンの同時添加で増殖が促進され、リンまたは窒素が増殖制限物質であり、EDTAを必要としなかった。Anabaenaの増殖制限物質はEDTAであり、Phormidiumは、リン・窒素、鉄、またはリン・窒素、EDTAであった。これらの結果は、これまでと同様の傾向を示した。

Microcystisの増殖制限物質は、EDTAまたはEDTA・リン・窒素であったが、EDTAのみの添加では増殖量は以前ほど認められず、利用可能なリン、窒素が減少しているのではないかと考えられた。リン、窒素、鉄、EDTAを上記と同様の濃度添加した湖水ならびにM-12合成培地を用いて、アミノ酸の4種の藻類の増殖に及ぼす影響を調べた。リジン、ヒスチジンを0.5mg10mg/lの範囲で添加した。湖水を用いた場合には、リジン、ヒスチジンの4種の藻類に対する増殖阻害は、Anabaenaで最も高く、リジン、ヒスチジンが1mg/lで強い阻害が認められた。MicrocystisとPhormidiumは510mg/lで阻害が認められたが、Oscillatoriaは10mg/lでも阻害が認められず微量有機物に最も影響を受けない性質を有するものと考えられた。M-12培地の場合では、両アミノ酸の阻害は、Microcystisでは1mg/lで阻害が認められ、湖水を用いたときより強い阻害が認められた。霞ヶ浦において大発生していたMicrocystisが著しく減少し、代わりにOscillatoriaやPhormidium等が異常発生している。この藻類種の遷移を明らかにするため、霞ヶ浦から分離した4種の藻類を用いて藻類培養試験を行い、種の遷移に及ぼす化学的影響因子について検討を加えた。今年度は、前年度と同様にMicrocystis aeruginosa K-5株を用いて霞ヶ浦における藻類増殖制限因子を調べた。25°C、20001x、白色蛍光灯連続照射条件下で静置培養を行い、藻類の増殖量を測定した。さらに、合成キレート剤のEDTA(Na_2EDTA 2H_2O)およびNTA(Nitrilotriacetic acid)ならびに霞ヶ浦の底泥より分離した天然のキレート物質のフミン酸およびフルボ酸による、Microcystisの重金属毒性の抑制効果について明らかにするために、重金属を含む合成培地にキレート物質を添加し、Microcystisの増殖に及ぼす影響を調べた。Cd, Ni, WおよびZnは、低濃度でM.aeruginosa K-5の増殖を阻害したが、EDTA, NTA,フミン酸およびフルボ酸は重金属毒性の抑制効果を示した。フミン酸及びフルボ酸の同時添加は、K-5株の増殖の誘導期が短くなる効果を示した。キレート物質の重金属毒性の抑制効果はMicrocystisの種により異なっていた。
高次クロマチンにおける相同組換え反応の解析

相同組換えは、DNA二重鎖切断損傷の主要な修復経路であり、さらには減数分裂期における遺伝的多様性の創出に機能する。相同組換えは、高次に折り畳まれたクロマチン構造上で行われるが、クロマチン構造と相同組換えの関係の詳細は明らかになっていない。本研究では、減数分裂期に発現するリンカーヒストンバリアントが、体細胞型のH1バリアントと比較して、緩んだクロマチンを形成し、相同組換えの進行に機能することを明らかにした。さらに、構造生物学的および生化学的解析により、DNA二重鎖切断損傷応答に機能するヒストンのモノユビキチン化修飾によるクロマチン構造変換機構を解明した。本研究の目的は、高次クロマチンでの相同組換えを介したDNA二重鎖切断損傷修復の分子機構を明らかにすることである。相同組換えは、その中心的酵素RAD51およびRAD54依存的に損傷を受けた領域と相同な配列が無傷のDNA鎖から検索され、その配列をもとにDNA二重鎖切断損傷が修復される。真核生物の細胞核内に収納されているゲノムDNAはクロマチン構造を形成し、細胞核内に収納されているが、クロマチン上での相同組換えの反応機構は分かっていない。本年度は、クロマチン高次構造制御に重要なリンカーヒストンH1に着目し、生化学的および細胞生物学的な解析を行った。ヒトのH1には11種類のバリアントが存在するが、H1バリアントが形成する多様な高次クロマチン構造と相同組換えの関係は分かっていない。そこで、様々なH1バリアントを含むクロマチンを試験管内で再構成し、それらを基質としてRAD51およびRAD54依存的な相同組換え反応を解析した。その結果、H1バリアントを含むクロマチンは相同組換え反応に阻害的に働くが、興味深いことに、精母細胞で高発現しているH1Tが他のH1バリアントと比較して、相同組換え反応の阻害効果が著しく低いことが明らかになった。精母細胞は、減数分裂を経て精子となるが、その減数分裂の進行には相同組換えによるキアズマの形成が必須である。精母細胞特異的に発現するH1Tは、相同組換えのための「場」としてのクロマチン構造形成に機能することが予想された。加えて、相同組換えの進行に必須である120番目のリジンがユビキチン化されたヒストンH2B(H2BK120ub)を化学的に合成し、H2BK120ubを含むヌクレオソームを試験管内で再構成した。さらに再構成したH2BK120ubヌクレオソームの結晶化を行い、良質な単結晶を得ることに成功し、3.3オングストロームでX線回折データを得た。本研究の目的は、高次に折り畳まれたクロマチン上での相同組換えを介したDNA二重鎖切断損傷修復の分子機構を明らかにすることである。真核生物の細胞核内に収納されているゲノムDNAはクロマチン構造を形成し、細胞核内に収納されている。クロマチンは、多様な高次構造を形成することで、相同組換え反応を制御することが知られているが、その詳細は明らかになっていない。そこで、クロマチン高次構造形成に機能するリンカーヒストンH1に着目した。ヒトのリンカーヒストンH1には11種類のバリアントが存在するが、それらが形成する多様なクロマチン構造と相同組換えの関係は分かっていない。そこで、試験管内で再構成したH1バリアントを含むクロマチンを基質とした、RAD51およびRAD54依存的な相同組換え反応を解析を行った。その結果、精巣特異的に発現するH1バリアント(H1T)の相同組換え反応抑制効果が、他のH1バリアントと比較して、著しく低いことが明らかになった。さらに、H1Tの形成するクロマチン高次構造形成をポリヌクレオソームレベルで分析超遠心法により解析し、H1Tの形成するクロマチンが体細胞型のH1バリアントと比較して緩んだ構造であることを明らかにした。H1Tが最も発現している精母細胞は、減数分裂を経て精子となる。その減数分裂の進行には相同組換えによるキアズマの形成が必須であることから、精母細胞に発現するH1Tは、相同組換えのための「場」としてのクロマチン構造形成に機能することが示された。さらに、ヒストンのモノユビキチン化によるクロマチン高次構造制御機構を、構造生物学的手法により明らかにすることを試みた。転写活性化領域に局在することが知られているH2BK120ubおよびH4K31ubを含むヌクレオソームのX線結晶構造解析を行い、3.3オングストロームでその立体構造を明らかにすることに成功した。

本年度の研究により、リンカーヒストンバリアントおよびユビキチン化ヒストンを含む多様なクロマチンを試験管内で再構成する技術を確立した。さらに、その技術を用いて、RAD51およびRAD54依存的な相同組換え試験系の確立に成功した。これら確立した技術は他のコアヒストンバリアントやヒストン修飾体の解析に直接応用出来る。また、これらの技術により、精巣特異的リンカーヒストンバリアントH1Tの相同組換え抑制効果が、他のH1バリアントと比較して弱いことを明らかにした。加えて、ユビキチン化ヒストンを含むヌクレオソームの結晶化に成功し、3.3オングストロームでX線回折データを得ることに成功している。これらのことから、本年度の研究が当初の計画以上に進展していると考えた。27年度が最終年度であるため、記入しない。生化学本年度の研究により、ヒストンH1バリアントの中で、H1Tによる相同組換え反応の抑制効果が著しく弱いことが明らかになった。このことは、精母細胞特異的に発現するH1Tが相同組換えのための「場」としてのクロマチン高次構造形成に機能することを示唆する。今後は、H1Tを含むクロマチンの高次構造を分析超遠心法やヌクレアーゼを用いた試験により解析し、クロマチン高次構造と相同組換えの関係の詳細を明らかにする。並行して、H2BK120ubヌクレオソームの構造解析を行い、ヒストンのユビキチン化によるクロマチン高次構造制御機構を原子レベルで解明する。加えて、H2BK120ubを含むポリヌクレオソームを試験管内で再構成し、RAD51およびRAD54依存的な相同組換え反応への影響を解析する。これらの結果から、ユビキチン化ヒストンによる相同組換えの制御機構を明らかにする。
地域レジャー複合体の経済効果(4) 〜「ゆとり空間」へのエコロジカル・マーケティング・アプローチ〜

大規模ドーム型競技場の施設展開が、地域に及ぼす経済社会的効果が分析された。1.産業連関分析から:福岡ドームの建設費480億円から地域経済に波及する効果は570億円と試算され、初期投資の約1.12倍である。東京ドーム(約350億→約530億円:約1.51倍)と比較すると波及効果は小さい。これは地域経済圏の規模差・波及係数差によるもの。全天候型(イベント)空間・スポーツ種目拡大という特性から消費経済の広がりが見られている。2.環境経済学から:福岡ドームの施設技術運営面での環境面での配慮は、水不足都市対策を支援する雨水利用、広域中水処理、海水利用ヒートポンプによる広域冷暖房、先進的防災、光公害や錆発生を防止するチタン屋根、そして衝撃吸収力が改善された人工芝、AI制御の効率的空調等が積極的に導入されている。多くの行政・金融支援が示された東京ドームの技術が参考にされているが、福岡ドームでは地域社会との関係が浅く、支援が行われていない。地域活性化を企図した公共的空間への地域的支援と、それらからの新たな経済社会への誘因化が検討課題となる。3.本研究は産業連関に環境因子を取り込んだモデル作りと、さらに周辺施設との連携による経済効果創出モデルが目的であるが、このモデル化には、そこに介在する人的資本の蓄積、人材育成への投資という、質的な中間因子を考慮する必要性があり、その部分の位置づけが今後の課題となる。それはスポーツ・レジャー複合体としての関連産業とのネットワーク化、戦略的提携化の過程であろう。