hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ナノスケール高速液体クロマトグラフィー/質量分析計の法医学への応用

高速液体クロマトグラフィー/タンデム質量分析計(LC/MS/MS)は、生物学領域で広く用いられているのみならず、法医学でも薬毒物分析に重要な役割を果たす。本研究では、いわゆるナノスケールLC(nanoLC)/MS/MSによる薬毒物の超高感度分析法を開発し、最新のLC/MS/MS法との比較を行った。同時に新しい質量分析のイオン化法を開発し、法医学への応用が可能なものを検討した。本研究では、LC/MS及びLC/MS/MSで広く用いられているナノスプレーLCを用い、薬毒物分析の高感度化を図る。一方、ナノスプレーLC/MS/MSシステムはプロテオミクス分野で汎用されているが、多くは共通機器として使用されている。ナノスプレーLC/MS/MSによる分析が法医学領域で応用されれば、主に生化学等の領域で使用されているLC/MS/MSシステムを共有できることなり、高価な分析システムを教室で保有することなく、薬毒物の高感度分析が可能となる。同時に、新しいイオン化法のナノスプレーLCへの応用も同時に検討する。本研究の目標は、LC/MS及びLC/MS/MSシステムのスケールダウンである。スケールダウンによって達成できる利点の一つとしては、感度の向上や極微量の鑑定試料からの薬毒物検出が挙げられ、多くの大学の共同施設で利用されているナノMC/MS(/MS)システムを共有することができる。スケールダウンによって達成できる利点の一つとしては、感度の向上や極微量の鑑定試料からの薬毒物検出が挙げられ、多くの大学の共同施設で利用されているナノLC/MS(/MS)システムを共有することができる。本年度はまず、イオントラップ型LC/MS/MSシステムのナノスケールダウンを試みた。今回購入した多次元HPLCシステムのParadigm MS4は、もともとはイオントラップ型のLC/MS/MSによるプロテオーム解析のために開発されたものであり、高度に精製されたペプチド試料を使用することを前提としている。法医実務の試料を導入するためには、流路の目詰まりを防ぐ必要がある。現在行っている対策は、トラップカラムを流路に配置し、流路の太さをプロテオーム解析時よりも太くし、試料をフィルターで濾過することが挙げられる。予備実験では、これらの対策で法医試料の導入は可能であると考えられ、次年度以降はカラムスイッチングシステムの導入も考慮している。もう一つの研究計画として、我々のグループが行ってきたレーザースプレーイオン化のナノスケール化である。従来のレーザースプレーシステムにガイドレーザーを装着することにより、レーザーの焦点調節がより容易となり、レーザーイオン化のオンライン化が可能となった。現在、向精神薬の分析で、標準品を液体クロマトグラフィー上でイオン化したところ、通常のエレクトロスプレーと比較して数倍の感度上昇が得られ、更なる感度上昇のための条件の最適化を行っている。本研究は、プロテオーム分野で汎用されているナノスプレーLCを法医学分野に応用し、一般に共通機器として使用されているLC/MS/MSを法医学における試料の分析にも共有することを目的としている。同時に、ナノスプレーLCに接続するイオン化の効率化も同時に追求している。本年度は、セミミクロスケールである程度の効果が得られたレーザースプレーにつき、ナノスプレーにも装着可能であるかを検討した。これまでセミミクロスケールでレーザー照射系を作成した会社にナノスケールの照射系の設計を依頼した。最初の段階では、照射系は、困難であるものの構築可能であると考えられたものの、検討を重ねた結果、光路が著しく複雑になり、乱反射の防止も困難である等の理由で断念せざるを得なかった。一方、最近のLCシステムは高速化し、特に超高圧で作動するいわゆるUPLCが注目されている。高感度化を図る場合、LCシステムのスケールダウンの他に、LCの分離能を上げる選択肢があり、我々はUPLCシステムによる高感度化を平行して検討した。ブチロフェノン系薬物、マイナートランキライザー及び三環系抗うつ剤について、新しいMS/MSシステムと組み合わせて測定を行ったところ、感度限界は、最大でも1ng/ml以下で、多くの薬物が100pg/ml以下であった。また、ブチロフェノン系薬物では、11,000ng/mlの範囲で良好な直線性が観察され、5,50,200ng/mlの三種類の濃度において、CV値は約15%以下であった。回収率については、低濃度で回収率が減少する傾向が認められたため、今後は精製方法のミクロ化を検討する必要があると考えられた。また、ナノスプレーLCに接続するイオン化の効率化も同時に追求している。昨年度においては、ナノスプレーLCとレーザーイオン化システムの結合の代わりに、UPLCを用いたシステムによる高感度化を検討した。UPLCと新しい四重極のMS/MSを結合させた場合、ブチロフェノン系の向精神薬では、感度限界は100pg/ml以下のものも認められた。

一方、ナノスケールLCの場合、夾雑物の多いサンプルでは、流路の閉塞や、妨害ピークが大きく影響する可能性が存在するため、精製時の血漿サンプルは50 μl程度しか使用できない。そこで、50 μlの血漿にプチロフェノン系薬物を添加し、オアシスカラムで精製後100 μlの移動相に再構成し、1 μlをMS/MSに導入して測定した。その場合、オンカラムでは、感度は100 pg程度であった。このデータとUPLCを用いたデータと直接比較することは困難であるものの、感度は、現時点では十分の一程度と見積もられる。また、ナノスプレーLCは、最適化しても、一回の測定時間が50分程度であり、その点でも不利である。これらを総合すると、ナノスプレーLCの長所を発揮するためには、1)カラムを含めた精製法の最適化、2)毛髪、爪等、他のマトリックスを使用すること、3)MS/MSとして、従来ナノスプレーで用いたLCQではなく、UPLCと結合させているTQDと比較する必要があると考えられる。本年度は、昨年度に引き続いてUPLC/MS/MSと、nanoLC/MS/MSとの比較を行った。nanoLC/MS/MSでは、20種類のベンゾジアゼピン系薬物のうち、18種類が10ないし100pg on-columnの感度で、MSスペクトルないしMS/MSスペクトルの採取が可能であった。また、毛髪試料では、一試料あたり1ないし5ng含有している試料で薬物の同定が可能であった。しかしながら、流速等、諸パラメータの最適化が著しく困難であるため、これらの条件設定をさらに精緻化すれば、現在得られている感度の10倍程度の感度の向上が見込まれる。一方、UPLC/MS/MSは、5分以内で全薬物の溶出が完了し、これはnanoLC/MS/MSが約30分必要とすることと比較すると、スループットネスで優れている。しかし、UPLC/MS/MSは、短時間で薬物が溶出されるため、一つの薬物のピークあたりのデータポイントが少なく、スペクトルの質が劣ることが欠点である。特に、薬物の同定を行うためには、MS/MSモードでの測定が必要であるが、このモードでは、UPLC/MS/MSはnanoLC/MS/MSと比して感度が劣る。また、海産毒等の超高分子の同定にはUPLC/MS/MSは適していない。他方、nanoLC/MS/MSは操作性が煩雑で、メンテナンスにも注意が必要であり、一般のスクリーニング検査を行うには煩雑すぎると考えられる。加えて、nanoLC/MS/MSでは、ブチロフェノン系薬物やベンゾジアゼピン系薬物のそれぞれの薬物群について、異なる条件設定が必要であることが分かった。従って、結論としては、一般的なスクリーニング時にはUPLC/MS/MS、その後の同定や、毛髪等の超微量のサンプルからの薬物同定、超高分子の同定にはnanoLC/MS/MSが推奨される。
生骨組織中での骨細胞の機械的刺激応答能の検討

平成14年度の研究により共焦点レーザー顕微鏡を用いて骨組織中の生きた骨細胞を蛍光的に可視化できることを確認した。また、同様の方法を用いれば細胞内カルシウムインディケーターであるFluo3を骨組織中の骨細胞に取り込まし、細胞内カルシウムの動態を観察することが可能であると思われた。平成15年度は、まず、骨系細胞の力学的負荷による細胞内カルシウムの動態を検討するために、骨細胞、骨芽細胞、ライニング細胞を骨組織より取り出し培養し、流体剪断応力を負荷してこれらの細胞の細胞内カルシウムの変化を追跡した。これにより、骨系細胞の細胞カルシウムの濃度、オシレーションの頻度などの基礎的な細胞内カルシウムの動態を得た。その結果、骨細胞、骨芽細胞、ライニング細胞は、ともに流体剪断応力に応答することが明らかになったが、予想に反して骨細胞のカルシウム応答能は、他の細胞に比べて非常に低いことがわかった。細胞内カルシウムの変動は各群で有意差を生じなかった。これらの結果から、in vitroでの骨細胞は機械的応答能が低いことが予測された。また、生骨への機械的負荷は現在負荷装置を開発中であり、今後詳細な情報は得られるものと考えられている。得られた結果と今回のin vitroの結果を比較することにより、骨細胞のまわりの環境が細胞の機械的応答能に影響をあたえるかどうかを検討することができる。平成14年度の研究目標の一つである生骨組織の光学的3次元構築が行われた。まず、摘出したニワトリ胚頭蓋骨をニワトリ骨細胞特異抗体OB7.3をふくむ培地で1時間培養した。その後、蛍光標識した2次抗体を含む培地で30分間培養し、共焦点レーザー顕微鏡を用いて骨組織中の生きた骨細胞を蛍光的に可視化できることを確認した。OB7.3は骨細胞への特異性が非常に高く、細胞突起の細部に至るまで観察することができた。また、微分干渉顕微鏡により、骨芽細胞、骨小腔を同時に観察することができたため、骨芽細胞から骨細胞にいたるまでの細胞を生きた状態で観察することが可能であると考えられた。しかし、共焦点顕微鏡の感度の問題もあり、実験系については現在のところ検討中である。また、生骨組織中の細胞の細胞内カルシウムの動態を検討する前に、骨細胞、骨芽細胞、間質細胞を骨組織より取り出し培養し、流体剪断応力を負荷してこれらの細胞の細胞内カルシウムの変化を追跡している。これにより、骨系細胞の細胞カルシウムの濃度、オシレーションの頻度などの基礎的な細胞内カルシウムの動態を得るとともに、得られた結果と今後得られる生骨組織での結果を比較して、骨細胞の周囲骨基質の存在が骨中の細胞の機械的応答能に与える影響を検討する予定である。
パーキンソン病病態解析に基づくオートファジー調節化合物の開発

SENDA責任遺伝子WDR45について、表現型を満たす28例の変異を検討し7例に病因変異を認めた進行性黒質神経細胞死・呼吸不全を呈するPerry症候群責任遺伝子産物p150glued変異型により、オートファジー不全・アポトーシス誘導を確認するなど、オートファジー機能不全と神経変性との関連をより強固にした。家族性PD原因遺伝子CHCHD2(同遺伝子産物はミトコンドリアに局在)に変異を持つPARK22患者より疾患iPS細胞の樹立を終えた。黒質神経細胞選択的にオートファジー不全を呈するマウスの病理学的表現型解析を進め、黒質・縫線核・青斑核のTH陽性神経細胞内封入体が形成されることを確認した。当グループはA02:オートファジーの生理・病態において、パーキンソン病(PD)分子病態の解明とそれに基づくオートファジー・マイトファジー調節化合物の同定を目指し、下記の研究を進めた。2) PINK1/parkin介在性マイトファジー特異的化合物の探索・同定:ミトコンドリア膜電位低下時にparkin依存的なマイトファジーをモニタリングすべく、parkin-keimaプラスミドを作製し、Tet-onシステムにて発現調整したstable cell line作製を試みたが、長期使用に耐えうるラインを取得できなかった。そのため、まずGFP-LC3安定発現HeLaおよびPC12細胞を用いてオートファジー誘導薬を同定する戦略に変更し、化合物スクリーニングを進めている。3)オートリソソーム形成特異的に作用する化合物の薬効評価:連携研究者井本正哉が特定した化合物SO286はオートリソソーム産生促進作用を持つ。同機構解明のため、ビオチンタグしたSO286を作製し(構造活性相関に基づく)、結合タンパクを質量分析器を用いて2種同定した。1) PD黒質神経細胞死へのオートファジーの関与:研究分担者佐藤は黒質神経細胞特異的Atg7ノックアウトマウスを作製し、病態解析を進めた。同マウスはコントロールに比し寿命が短く、黒質神経細胞・青斑核にp62陽性・ユビキチン陽性の細胞質内封入体を認めた。同マウスの行動解析を平成27年度に進める予定である。2) PINK1/parkin介在性マイトファジー特異的化合物の探索・同定:当初はparkin-KeimaをTet-onシステムを用いて安定発現させたHeLa細胞を用いたスクリーニングを予定していたが、keimaリーク発現が高度で同蛋白蓄積の毒性を回避できないため、GFP-LC3安定発現HeLa細胞を用いてオートファジー促進薬を同定し、その中から2ndスクリーニングとしてマイトファジー促進作用を持つものを探索している。既に新たなオートファジー促進剤を26同定した。また、新たな家族性PD原因遺伝子CHCHD2を同定し(Lancet Neurol 2015)、同遺伝子産物によるマイトファジー調節機構について検討している。3)オートリソソーム形成特異的に作用する化合物の薬効評価:連携研究者井本正哉が特定した化合物SO286の結合タンパクを同定し、結合部位の特定並びに構造活性相関の検証を行った。現在論文投稿準備を進めている。また、SENDA原因遺伝子WDR45の遺伝子変異頻度を我が国の同様表現型症例群で評価し、女性のみにおいて25%の頻度でWDR45遺伝子変異を認めることを報告した(Neurobiol Aging 2015)平成27年度は下記の研究を実施し成果を得た。1)既存薬からオートファジー調節化合物を同定し、作用機序を解明する研究:本研究では現在も広く使用される抗結核薬エタンブトールがリソソーム中性化・リソソーム亜鉛貯留を介して、リソソーム機能不全が生じ、オートファジー不全状態が招来されることを証明し報告した。本成果はエタンブトールの深刻な副作用である視神経障害・肝機能障害の分子メカニズムに関与する可能性が示唆された。さらにエストロゲンレセプター拮抗薬として臨床応用されているクロミフェンが、akt/mTORC1経路の阻害を介してオートファジーを誘導するが、リソソーム酸性化阻害作用を併せ持つことを確認した。総和としてはオートファジー誘導作用を持つと判断され、血液脳関門を通過する特性から、創薬シーズへの可能性が残されていると判断している。2)パーキンソン病原因遺伝子産物VPS34についての研究:遺伝性パーキンソン病責任遺伝子産物VPS34の分子機能として構成するレトロマーの分解調節機構を解明し、報告した。3)パーキンソン病患者における内因性オートファジー調節物質の同定:パーキンソン病患者血漿にて特異的に上昇し、オートファジー調節効果を持つ小分子化合物群を3種類同定した。現在詳細な作用機序を解明している。当初予定していた研究項目の基礎データを順調に積み重ねており、2016年度には全ての項目において論文投稿が出来る見込みとなっているため。1)所属施設で同定・単離した家族性パーキンソン病PARK22について、PARK22-iPS細胞を樹立し、通常方法にて分化誘導を行い、ドパミン神経細胞を作成した。同ドパミン神経細胞は、神経細胞内にalpha-synucleinの凝集体(特に細胞体内に)を蓄積することを確認した。現在同細胞のオートファジーフラックスを検討している。

2)孤発性PD患者血清にて上昇していたalpha-1-antitrypsinについて、精製したAATを定位脳手術にて中脳黒質に注入したモデルマウスを作製したが、同蛋白は予想に反し凝集物を形成せず、パーキンソン病に準ずる表現型を示さなかった。そのためバイオマーカーとしてのAATの臨床的意義は確認できたが、病態への関与は解明できなかった。3) PINK1/parkin介在性および非介在性マイトファジー促進化合物の探索を完了し、既存薬ライブラリーから3種のマクロオートファジー促進・マイトファジー促進作用を、それぞれHeLa細胞、SH-SY5Y細胞、iPS細胞由来神経細胞にて確認した。同化合物の作用機序の中で1種はmTORC1阻害作用、残りの2種については現在プロテオーム解析を行い、さらなる分子薬理作用の同定を進める。4)オートファジーフラックス促進化合物SO286の分子薬理作用解明を進め、本化合物の結合蛋白を質量分析計を用いた解析で2つ明らかにし、結合部位を明らかにし、分子薬理作用を培養細胞にて明らかにした。現在、同化合物の結合部位の構造解析を進めている。研究分担者佐藤が施行している黒質神経細胞とオートファジーの関連についてのマウス実験研究は、成果を投稿中である。またオートファジー誘導化合物についてはその2種の特許申請を終え、マイトファジー誘導化合物については特許申請準備中である。それら化合物の薬効薬理作用研究は順調に進捗しており、動物実験につなげる。(1) PD黒質神経細胞死へのオートファジーの関与解明:a)PARK22、SENDA疾患iPS細胞の解析:患者由来iPS細胞分化誘導後に細胞外フラックスアナライザーXFe24によるミトコンドリア機能評価およびオートファジー活性を評価し、呼吸鎖機能低下を確認した。b)黒質神経細胞死におけるAATの役割について:精製AATを定位脳手術にて中脳黒質に注入したモデルマウスを独自に樹立したモノクローナル抗体を用いて評価したが、特に黒質神経細胞死は誘導されなかった。c) Atg7flox/floxTH-IRES Creマウス(tyrosine hydroxylase発現神経細胞特異的オートファジーノックアウトマウス)にて神経細胞内封入体を確認し、同封入体はレビー小体と同様にalpha-synucleinを構成成分としていた。(2) PINK1/parkin介在性マイトファジー特異的調節化合物の探索・同定:既存薬ライブラリースクリーニングを行い、メマンチン・クレマスチンが本分子作用を持つこと確認した。(3)オートリソソーム形成促進化合物SO286の疾患モデルでの薬効評価: SO286およびその誘導体(最もオートファジー誘導効果の高いもの)がオートファジーを誘導し、ハンチントン病モデルマウスの寿命を延長する作用を確認した。(4) PD特異的iPS細胞由来神経細胞でのヒット化合物の標的・薬効評価:(2)にて同定されたマイトファジー制御化合物、(3)にてSO286およびその誘導体の中から最も薬効が期待できるものについて、PARK2/6/9および孤発性PD患者由来iPS細胞由来神経細胞に添加し、薬効を評価し、メマンチン・クレマスチンがPARK2/6由来iPS細胞
酸化DNA損傷に伴う転写抑制と神経細胞死のメカニズム解明

本研究の目的は、「低アルブミン血症、眼球運動失調を伴う早期発症型脊髄小脳失調症(EAOH)」の原因遺伝子アプラタキシンに関する一本鎖DNA修復機能を明らかにし、本疾患のDNA損傷による神経細胞死のメカニズムを明らかにするのみならず、酸化ストレスに曝されうる高等動物の中枢神経系のゲノムおよび転写の安定性維持機構を明らかにしようとするところにあった。一本鎖DNA損傷修復過程におけるAPTXの生理機能に関して、45merのオリゴおよびそれに相補的な20mer,24merのオリゴを用いて、1ヌクレオチドギャップの2本鎖DNAを作成し、再構成実験を行った。組換えAPTXタンパク質が、in vitroでの再構成実験系において、3'phosphatase活性などの3'end processing作用を有することに加えて、3'exonuclease活性を有することを検証した。アプラタキシンに関する一本鎖DNA修復機能を明らかにしたことにより、本疾患のDNA損傷修復障害による神経細胞死のメカニズムが明らかにされつつあり、「低アルブミン血症、眼球運動失調を伴う早期発症型脊髄小脳失調症(EAOH)」の発病メカニズム解明と治療法開発にも大きく貢献できたと考えられる。病因不明の神経変性疾患が新たな視点から病態解明が可能となればその社会的意義は大きいと考えられる。さらに酸化ストレスからのDNA損傷の修復および防御の分子メカニズム、それに伴う転写活性の低下という観点から、孤発性の神経変性疾患の原因探求に新たな視点を与えることができた。DNA修復機構の障害を原因とする疾患は多岐に及ぶが、色素性乾皮症,コケイン症候群など中枢神経障害を呈するタイプでは一本鎖DNA修復障害に伴う転写障害(転写共役修復transcription coupled repairの障害)の存在が示唆されているが詳細は不明である。今回本研究は、APTXが転写共役修復に重要な役割を果たしている仮説のもとに、新規蛋白質APTXの中枢神経系におけるDNA修復機構に関連する生理機能の解明、一本鎖DNA修復障害に伴う転写障害による神経細胞死のメカニズムの解明を目的とした。APTXのN末端から段階的にの欠失する5種類のコンストラクト、およびXRCC1のC末から段階的に欠失させた5種類のコンストラクトを作成し、Yeast two hybrid systemを用いて相互作用部位の決定を試みた。Long formAPTXのN末端20アミノ酸とXRCC1のC末端に位置するBRCTドメインが相互作用することが判明した。組換えAPTXタンパク質を作成し、in vitroでのオリゴヌクレチドを用いた再構成実験系において、3'exonuclease活性を証明し得た。APTXの3'exonucleaseの中枢神経系の生理機能として、DNA polymerase beta・DNA ligase IIIと共役して塩基除去修復におけるproof readingを行うこと、あるいは、一本鎖DNA修復過程でunconventional DNA 3'-endを処理することが推定された。今後、APTX欠損と神経細胞死との関連の解明が重要と考えられる。

病因不明の神経変性疾患が新たな視点から病態解明が可能となればその社会的意義は大きいと考えられる。さらに酸化ストレスからのDNA損傷の修復および防御の分子メカニズム、それに伴う転写活性の低下という観点から、孤発性の神経変性疾患の原因探求に新たな視点を与えることができた。
3次元CTによる顎関節症に起因する下顎頭吸収と顎顔面形態, 機能の関連性の研究

下顎頭骨形態変化と顎顔面形態変化の関連を明らかにする目的で,1996年1月から1998年6月までの間に不正咬合の改善を主訴に新潟大学歯学部附属病院矯正科を受診した患者のうち,矯正治療前の臨床検査によって顎関節症状の現症あるいは既往歴が認められたため,鑑別診断の目的としてCT検査とMRl検査を施行した一般矯正患者,顎変形症患者の中から下顎頭骨形態変化を有するもの30名(平均年齢18.6±6.3歳)の被験者を選択した.なお,口唇裂口蓋裂などの先天異常患者は含まれていない.被験者は両側顎関節の病態によって,片側性下顎頭骨形態変化群(男3名,女11名,平均年齢16.8歳,以下片側群),両側性下顎頭骨形態変化群(男2名,女14名,平均年齢20.4歳,以下両側群)の2群に分類した.被検者に対して,顎顔面形態の解析のために側面および正面セファログラム,機能解析のために咬合力測定を行った.1.両側性下顎頭骨形態変化群(両側群)の下顎頭では変形と断裂が多く見られ,これらの変化は若年者のみならず大人にも見られた.片側性下顎頭骨形態変化群(片側群)では平坦化が最も多く見られ,断裂は19歳以下にのみ見られた.2.顎関節の非復位性円板転位は,両側群では90.6%,片側群では76.9%見られた.3.顎顔面形態は両側群では下顎骨後退の特徴を示し,片側群では全ての被検者で下顎頭骨形態変化側への下顎骨の偏位が見られた.4.咬合力は片側群では偏位側で咬合力が大きく,両側群の咬合力が小さい値を示した.これらの所見から,下顎頭骨形態変化は両側群と片側群の若年者のみならず両側群の大人でも進行性で不安定であることが示された.下顎頭骨形態変化は顎関節症状を伴う矯正患者において,下顎骨偏位と下顎頭後退の形態変化および咬合力の不均衡に関連してる可能性が示された.下顎頭骨形態変化と顎顔面形態変化の関連を明らかにする目的で,1996年1月から1998年6月までの間に不正咬合の改善を主訴に新潟大学歯学部附属病院矯正科を受診した患者のうち,矯正治療前の臨床検査によって顎関節症状の現症あるいは既往歴が認められたため,鑑別診断の目的としてCT検査とMRl検査を施行した一般矯正患者,顎変形症患者の中から下顎頭骨形態変化を有するもの30名(平均年齢18.6±6.3歳)の被験者を選択した.なお,口唇裂口蓋裂などの先天異常患者は含まれていない.被験者は両側顎関節の病態によって,片側性下顎頭骨形態変化群(男3名,女11名,平均年齢16.8歳,以下片側群),両側性下顎頭骨形態変化群(男2名,女14名,平均年齢20.4歳,以下両側群)の2群に分類した.被検者に対して,顎顔面形態の解析のために側面および正面セファログラム,機能解析のために咬合力測定を行った.1.両側性下顎頭骨形態変化群(両側群)の下顎頭では変形と断裂が多く見られ,これらの変化は若年者のみならず大人にも見られた.片側性下顎頭骨形態変化群(片側群)では平坦化が最も多く見られ,断裂は19歳以下にのみ見られた.2.顎関節の非復位性円板転位は,両側群では90.6%,片側群では76.9%見られた.3.顎顔面形態は両側群では下顎骨後退の特徴を示し,片側群では全ての被検者で下顎頭骨形態変化側への下顎骨の偏位が見られた.4.咬合力は片側群では偏位側で咬合力が大きく,両側群の咬合力が小さい値を示した.これらの所見から,下顎頭骨形態変化は両側群と片側群の若年者のみならず両側群の大人でも進行性で不安定であることが示された.下顎頭骨形態変化は顎関節症状を伴う矯正患者において,下顎骨偏位と下顎頭後退の形態変化および咬合力の不均衡に関連してる可能性が示された.若年期の顎関節症に伴う下顎頭吸収が,顎顔面形態に及ぼす影響について検討することを目的として本研究を行った.20名の顎関節症状を伴う偏位症例矯正患者に対してMRI撮影,3次元CT画像,側面および正面セファログラム,咬合力測定,筋電図測定を行った.1.MRIを用いた関節円板の解析では,偏位側で関節円板前方転位が有意に多く見られた.2.3次元CT画像では,偏位側の下顎頭の面積が小さく,関節突起長が短いことが示された.3.筋電図解析では,偏位側で筋活動が高いことが示された.4.咬合力解析では,偏位側で咬合力が大きいことが示された.以上の結果から,顎偏位症例では偏位側で関節円板転位が多く,下顎頭の発育が抑制されていることから,関節円板転位に伴う下顎頭への負荷が下顎頭の骨改造に関連している可能性が示された.また,偏位側で咬合力が大きく,筋活動が高いことから機能的要因の関与も考えられた.

今後は下顎頭運動,各歯における咬合力の3次元分布の模型解析を行い,顎運動,歯の配列が顎偏位症例における顎関節症患者における下顎頭吸収にどのような影響を与えているかを検討する.下顎頭骨形態変化と顎顔面形態変化の関連を明らかにする目的で,1996年1月から1998年6月までの間に不正咬合の改善を主訴に新潟大学歯学部附属病院矯正科を受診した患者のうち,矯正治療前の臨床検査によって顎関節症状の現症あるいは既往歴が認められたため,鑑別診断の目的としてCT検査とMRI検査を施行した-般矯正患者,顎変形症患者の中から下顎頭骨形態変化を有するもの30名(平均年齢18.6±6.3歳)の被験者を選択した.なお,口唇裂口蓋裂などの先天異常患者は含まれていない.被験者は両側顎関節の病態によって,片側性下顎頭骨形態変化群(男3名,女11名,平均年齢16.8歳,以下片側群),両側性下顎頭骨形態変化群(男2名,女14名,平均年齢20.4歳,以下両側群)の2群に分類した.被検者に対して,顎顔面形態の解析のために側面および正面セファログラム,機能解析のために咬合力測定を行った.1.両側性下顎頭骨形態変化群(両側群)の下顎頭では変形と断裂が多く見られ,これらの変化は若年者のみならず大人にも見られた.片側性下顎頭骨形態変化群(片側群)では平坦化が最も多く見られ,断裂は19歳以下にのみ見られた.2.顎関節の非復位性円板転位は,両側群では90.6%,片側群では76.9%見られた.3.顎顔面形態は両側群では下顎骨後退の特徴を示し,片側群では全ての被検者で下顎頭骨形態変化側への下顎骨の偏位が見られた.4.咬合力は片側群では偏位側で咬合力が大きく,両側群の咬合力が小さい値を示した.これらの所見から,下顎頭骨形態変化は両側群と片側群の若年者のみならず両側群の大人でも進行性で不安定であることが示された.下顎頭骨形態変化は顎関節症状を伴う矯正患者において,下顎骨偏位と下顎頭後退の形態変化および咬合力の不均衡に関連してる可能性が示された.
電弱相互作用によるK.D.B中間子の崩壊過程の理論的研究

(1)K,B中間子の稀崩壊における、新しい物理の効果。(論文2)この研究では、時間的領域での(SD)方程式の解を求める事が最終目標であるが、現在のところ、線形近似をし、更に解の解析性に対して仮定をする事で、SD方程式が一変数の積分方程式になることをしめした。現在、この積分方程式の解を調べている。(3)テクニカラー模型による輻射補正(論文1)この研究では、Custodial (Isospin) Symmetryを破ったテクニカラー模型に対する低エネルギー有効理論をつくり、それを用いて、電弱理論に対する輻射補正を計算した。その結果テクニフェルミオンの束縛状態であるIsospinと0のvector mesonsが混合する事によって、最近の実験と首尾一貫した輻射補正が得られる可能性を指摘した。最新の実験(rhoパラメーター)に依れば、この理論で予想されるvector mesonsの質量は、電弱理論のゲージ粒子(W及びZ)に近いスケールと思われる。我々の研究では、W及びZの質量よりも十分重いという近似をしたので、この点での計算の改良が必要で、現在進行している。
循環統合型生産システムの構築に関する国際比較研究

私たちは、現在危機に瀕するといわれる地球環境問題の解決のため、いかにして、動脈経済-従来から存在する活動で、人間の生産活動によって資源から製品が生み出され、社会に供給される活動-と静脈経済-人間による消費活動により廃棄物となったモノを新たな資源として動脈経済に還元する経済活動-を組み合わせ、循環型社会を構築するのかを明らかにしようと研究した。現在では、環境に対する理念を持った企業、その企業と協力しうる地域社会、環境技術、の存在が環境負荷を減らしうる要因だと結論している。われわれは、地球環境の人類史的課題に直面した現在、市場革命、情報革命に加えて環境革命を取り込んだ、体系化された新たな生産システムを「循環統合型生産システム」と規定し、どのようにすれば従来の際限なく生産活動を拡大しようとする生産制御システムから転換できるのか、そのためには具体的にどのようなシステムであるべきなのか、を明らかにすることを「研究目的」とした。そして、「研究実施計画」では、上述の目的のため、電力、鉄鋼、自動車、エレクトロニクスの生産システムに関する実態調査を、日本国内では自動車産業の集積する九州地域、再生可能エネルギー利用の積極的取り組みがみられる北海道地域を調査し、海外については主に中国・台湾の自動車産業・エレクトロニクス産業の重点的な調査等を、その成果を本科研費研究に携わる研究者の関係する学会等での公表を計画した。理論研究・政策研究もわれわれの研究母体である生産システム研究会で実施するものとした。平成22年度は、実際に、札幌駅南口エネルギーセンター、北九州エコタウン、日産自動車九州工場の見学とヒアリングを実施した。また台湾の企業見学とヒアリングを実施した。なお、台湾での調査結果は、すでにディスカッションペーパーとして公表済みであり、九州調査旅行については現在報告書を準備中である(なお、もちろん、公表に当たっては調査先への配慮を行っている)。上述の実態調査とこれまでに発表されている環境経営に関わる研究については、毎月1回研究会を開催して、常に5時間程度に及ぶ議論を行ってきた。以上の取り組みは、従来の先行研究をチェックしつつ、現実の企業現場を確認しており、今後生み出される新たな考えに結びつくものと確信している。「研究目的」として以下をあげた。すなわち、地球環境の人類史的課題に直面した現在、われわれは市場革命、情報革命に加えて環境革命を取り込んだ、体系化された新たな生産システムを「循環統合型生産システム」と規定し、どのようにして従来の際限なく生産活動を拡大しようとする生産制御システムから転換できるのか、そのためにはどのような条件・方法が必要であるのか、具体的にはどのようなシステムであるのか、を明らかにするとした。そして、「研究実施計画」では、上述の目的のため、日本国内、海外での実態調査を進め、理論研究、政策研究を行うために定期的な研究会の開催等をあげた。平成23年度、実際には、日本国内では東京電力福島第1原子力発電所事故後に、県として、原子力ゼロ、再生可能エネルギーの発展を掲げる福島県、その地域への電力供給を担当している東北電力に伺い、調査を行った。海外では、経済発展の著しい中国西部の中心地である成都、重慶の環境局、企業を、同時期に上海における環境保全を目的とした取組の調査を行い、同地の企業や大学諸機関を訪れた。そして、これまでの実態調査については、毎月1回研究会を開催して、常に5時間程度に及ぶ議論をたたかわせ、ディスカッションペーパーにまとめる作業を通じて、メンバー間での理念構築を行っている。また、研究会では、実態調査をめぐる議論だけではなく、これまでに発表されている環境経営に関わる研究を取り上げて検討している。なお、平成24年度の後半から、研究会では、これまでの調査結果を踏まえた出版活動のための具体的な議論を行いだしている。このため、従来の先行研究をチェックしつつ、現実の企業現場を確認しているので、成果が期待でるものと確信する。実際には、平成24年度の調査として,複数の研究者で,2年前に訪問した北九州エコタウンとの比較のために東京スーパーエコタウンを調査するために訪れ,その東京エコタウンの茨城県にある事業所にも足を運んでお話を伺い,われわれが考える「循環統合型生産システム」の実現性を検討した。なお,茨城調査の際,東京電力福島第1原子力発電所事故の影響を調査しようと福島県の企業も訪れた。これ以外にも,個別に調査,企業ヒアリングを実施した。

関西や金沢の自動車解体業者の訪問と調査,富山の黒部川ダムの排砂事業の調査,四日市の石油化学企業の調査などである。そして、今年度も,毎月1回研究会を開催して常に5時間程度に及ぶ議論をたたかわせ、11月には合宿を行ってこれまでの研究成果を振り返った。そして,今年度末には,昨年度実施した「成都・重慶・上海調査報告書」,3年間の研究成果を取りまとめた報告書を,大阪市立大学経営学会ディスカッションペーパーとしてまとめた。当初計画したように、日本国内、海外において調査を行うことができ、それぞれの調査結果を踏まえつつ、既存研究をも吟味しているからである。ただし、当初計画していたアンケートについては、これまでの調査の結果、その必要性の議論も必要のため実施できていない。検討が必要である。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究計画を大幅に変更する必要はないと考えている。ただし、上述したように、アンケート調査の是非をも検討する必要がある。また、最終年度となる平成24年度には、具体的な形を作り、実際の出版へと進めなければならず、これまでの研究活動レベルを維持しつつ、さらに一段高めるために、充実した研究会活動が望まれる。
海洋島における陸生貝類の種分化

小笠原諸島産カタマイマイ類について、生態調査およびマイクロサテライトDNA、ミトコンドリアDNAの分析を行い、本属の適応放散の状況、種分化の機構について明らかにした。母島において、ヌノメカタマイマイとコガネカタマイマイの出現頻度から生息場所の分化と活動時間の違いを検討した。その結果、両者は明らかに生活場所の分化、特に休息時の分化が顕著であることが明らかとなった。向島で生息分布の調査を行ったところ、母島の2種と同じように形態的に異なる2つのタイプがヌノメカタマイマイ個体群中に見出された。この2つのタイプは生息場所も異なっており、環境に対する選好性が異なると考えられる。マイクロサテライトDNAの変異から、この2つのタイプは同類交配していることがわかり、この島内で同所的種分化によって種分化が起きている可能性が示唆された。ミトコンドリアDNAの変異に基づき、カタマイマイ種群の系統推定を行った。その結果、従来、母島の種群は一回の父島からの移入の後、放散したと考えられていたが、父島から、ごく最近別の移住があったことが推定された。またカタマイマイには、遺伝子だけで区別できる隠蔽種が多く存在することが明らかになった。形態的な特徴と、ミトコンドリアDNA、マイクロサテライトDNAの変異の比較を行ったところ、特に母島諸島ではこれらがいずれも一致しないケースが認められた。これは、種間ないし地域集団間で、過去に雑種化が起こり、系統の異なる遺伝子群が集団中に流入したためと考えられる。以上のことから、カタマイマイ類の放散過程は同所的な分離と融合を繰り返す、網状の複雑な過程をたどったと考えられる。
移動型火災旋風の挙動に地表粗度とその配置が与える影響

移動型火災旋風は、火災による上昇流と接近風との相互作用によって生じるもので、本研究では、特に地表粗度が移動型火災旋風の発生形態および流況に与える影響を、主として室内実験で明らかにすることを目的とした。まず、可視化実験の容易な水路実験で、火災旋風に類似の現象を再現した。具体的には、水路の流れ(一般風に相応する)の中に水路の床面から噴流(火災による上昇流を模した)を放出した。噴流の放出口の形状は、火災旋風が起きやすいといわれる「コ」の字型とした(右側が上流)。そして、染料で可視化して観察するとともに、電磁流速計による点計測や画像処理による面計測により、火災旋風の発生形態と流況を把握した。その結果、以下のような3つの特徴が見られた。1.火災による上昇流が接近風に対して十分な強さになって初めて、火災旋風が発生する。接近風と火災域幅によるレイノルズ数が小さいと火災域後方に固定された渦が生じ(固定渦)、大きいと左右交互に渦が放出される(放出渦)。地表粗度が大きいと接近風の境界層が厚くなり、接近風を見かけ上弱くする効果がある。2.固定渦の場合には、火災域後方において上流へ向かう強い流れが見られ、これによる乱れの発生が顕著であった。また上昇流の両側に、接近風の流向に軸を有する回転流が対を成しており、流下とともに上方に移流しながら拡散している様子を定量的に捉えることができた。3.放出渦の場合、個々の渦の流下とともにその渦度が減衰していくと同時に、底面から上昇流が発生していることが定量的に確認された。これは火災域からの上昇流とは異なり、渦の流下とともに増加して一定値をとり、渦自体の減衰にともない消失するようであった。本研究では,移動型火災旋風の発生条件とその形態に地表粗度が及ぼす影響を明らかにするために,流れの可視化の容易な水中で,炎の代わりに上昇流を発生させて実験を行った.その結果,以下の知見が得られた.1.実験では,水路に水を流して接近流を与えるとともに,水路の底面1箇所から上昇流を噴出させた.噴出部の形状は,上流側を上にして逆U字型および一文字型の2通りとした.また噴出部より上流側には桟粗度を配置して,接近流の鉛直方向流速分布をコントロールした.2.噴出部が逆U字型の場合,上昇流を弱い場合には何ら旋風の発生が見られない(非発生)が,上昇流がある程度強くなると,上昇流域の左右後方に中規模の渦が発生・流下するようになる(移動渦).上昇流がさらに強くなると,今度は上昇流の裏側に巻き込まれるような渦運動(巻込渦)が見られるようになる.3.以上のような旋風の発生形態の相違には,接近流の接地境界層厚さも密接に関係していることがわかった.すなわち,境界層厚さが厚いほど,先述の非発生・移動渦・巻込渦の遷移点となる上昇流速が弱くなることが確認できた.4.以上2と3より移動型火災旋風の発生状況には,次の3者の影響が大きいと考えることが出来る.(1)昇流と接近流速の比(2)接近流速と上昇流域の幅を用いたレイノルズ数(3)接近流の境界層厚さと上昇流域の幅の比そして実際にこれら3軸によるグラフ上で系統的に分類できることを確認した.昨年度は,移動型火災旋風の発生形態が移動渦,巻込渦,その中間の3種類あり,それに地表粗度(境界層厚さ)が多大な影響を及ぼすことを明らかにした.今年度は特に巻込渦に注目し,流速場の基本的構造を調べた.その結果,以下の知見が得られた.

1.実験では,水路に水を流して接近流を与えるとともに,水路の底面の逆U字型(上流側を上にして)の噴出口から上昇流を噴出させた.また噴出部より上流側には桟粗度を配置して,接近流の鉛直方向流速分布をコントロールした.流速場の測定には電磁流速計を用いた.いくつかの水平断面,鉛直縦断面,鉛直横断面について流速変動の測定を行い,3次元的な平均流および乱流構造の把握に努めた.2.平均流速場については以下の3つの特徴が見られた.(1)鉛直縦断面では,噴出部のすぐ下流側の点から上流側および鉛直上方へと発散する流れがある.(2)鉛直横断面では,上昇流領域が接近流の作用で下流を向き,その両側に強い渦対が形成されている.(3)水平断面では噴出部直上で逆流域が形成されており,上方ほど下流に移動・拡散している.3.乱れエネルギーについては以下の3つの特徴が見られた.(1)噴出部の直上で乱れが大きいのは当然だが,そのすぐ下流の領域でも同程度の乱れが見られた.(2)上昇流領域の両側の渦対においても強い乱れが生じている.(3)上方で接近流が速くなっている領域で,上昇流との相互作用で乱れが強くなっている部分がある.移動型火災旋風の特徴をとらえるため、可視化実験の容易な水路実験で、火災旋風に類似の現象を再現した。具体的には、水路の流れ(一般風に相応する)の中に水路の床面から噴流(火災による上昇流を模した)を放出した。噴流の放出口の形状は、火災旋風が起きやすいといわれる「コ」の字型とした(右側が上流)。流れの様子は、染料で可視化して観察するとともに、その画像をコンピュータで処理して流速場を算出し、定量的な特徴も捉えるようにした。その結果、3つの特徴が見られた。1.水平面内の流れの特徴として、「コ」の字の放出口の下流端付近から、カルマン渦に似た渦が左右交互に放出されるのが見られた。その渦度は、渦の流下とともに減衰していく様子が定量的に確かめられた。2.その渦の流下にともない、底面から上昇流が発生していることが確認された。これは火災を模した上昇流ではなく、渦の流下とともに増加して一定値をとる傾向を見せた。ただし渦自体は減衰していくので、上昇流もやがて消失すると予測されるが、今回の実験ではそこまで確認できなかった。3.火災を模した上昇流の両側やや上方には、流下方向に軸を持つ定常的な回転流が確認された。その渦度は流下とともに減衰していたが、回転する領域は拡大していた。この回転流は、底面からの上昇流が一般流より下流方向に曲げられた際に発生したものと考えられる。「移動型火災旋風」は、火災による上昇流と一般風との相互作用によって生じるもので、火災旋風といわれる現象の中でも複雑かつその影響が広範囲に及ぶことから、その挙動の解明は非常に重要である。本研究では、特に地表粗度が移動型火災旋風の発生形態および強さ・大きさがどのように変化するか、室内実験および簡易シミュレーションで明らかにすることを目的としている。室内実験においては、水路の流れ(一般風に相応する)の中に水路の床面から噴流(火災による上昇流を模した)を放出した。火災旋風の発生形態は、密度差がない場合は2つのパラメータで決まる。一般風と上昇流の流速の比と、一般風の境界層厚さと上昇流領域の幅の比である。一般風が上昇流に比べて遅ければ、火災旋風のような流れは生じない。一般風の風速が大きくなると、上昇流領域の背後に固定された渦領域が見られるようになる。
形状記憶繊維による硬脆材料の靭性化に関する研究

本研究では圧縮強度に比ベて引張強度の低いコンクリート、セラミックス等の硬脆材料の強度と靭性を向上するため、形状回復によって母相中に残留圧縮応力場を形成できる形状記憶繊維との複合化を試みた。実施内容は次の通りである。(1)硬脆材料のモデル材としてエポキシ樹脂および石膏に、凹凸形状に記憶処理した形状記憶繊維(TiNi、およびノーソレックス)をそれぞれ埋込んだ後加熱によって繊維に回復を生じさせ、圧縮応力場を形成した材料を製作した。(2)これら試料を低ひずみ速度下で三点曲げ破壊し、亀裂進展の状況をビデオ撮影した。繊維との複合化によって、いずれの場合も破壊強度は上昇し、かつ、亀裂発生後も繊維によって亀裂進展が防止されるため、靭性が向上することが確認できた。(3)実体顕微鏡下で撮影された破面のステレオ画像を、三次元画像解析プログラムによって解析した結果、亀裂の三次元像を定量的に明かにでき、繊維の周辺での破面に特徴的なパターンが現れることがわかった。これについては今後、明かにする予定である。(4)破壊した試験片(破断はしていない)を加熱し、Late Breaking Ligamentとして機能している繊維の形状回復を行なった。その結果、亀裂開口量が微小であれば繊維の回復力により亀裂は閉鎖されることがわかった。開口量が増すと、亀裂面の荒れにより、完全な閉鎖は困難となった。(5)石膏とTiNi繊維との複合体について、動的三点曲げ破壊試験を実施し、破壊強度はあまり速度依存性を示さなかったが、繊維の持つ強度の速度依存性の効果により、靭性には速度効果が認められた。(6)繊維が動的に回復できる温度(本研究では70°C90°C)では破壊強度の上昇が認められ、靭性も向上した。以上の結果、形状記憶繊維による硬脆材料の靭性向上が可能であることが確認できた。
遺跡出土アスファルトの高精度原産地推定法の開発と先史流通システムの解明

本研究では、先史時代における天然資源の流通システムを探るうえで重要な遺跡出土アスファルトに対し、イオウ同位体比分析を用いて日本列島におけるアスファルト(原油)の高精度な原産地推定法を開発する。これにより、先史時代の天然資源利用戦略と流通の実態解明に寄与することを目的とする。分析方法は地球化学・考古学の学術融合的視点で、出土アスファルトと産地のバックデータ集積を試みる。
子宮体部漿液性腺癌の抗癌剤耐性克服にむけたメタボローム解析に基づく新治療戦略

ヒト子宮体部漿液性腺癌細胞株USPC-1とUSPC-1からパクリタキセル耐性を獲得した細胞株PTX1のメタボロームプロファイルを比較したところ、PTX1において、グルタチオン(GSH)、グルコース-6-リン酸、リボース-5-リン酸の濃度が高いことが明らかとなった。シスチントランスポーターの阻害作用を有するスルファサラジン(SSZ)投与により、PTX1のGSH濃度は低下し、パクリタキセルとの併用によりパクリタキセル感受性が増強した。さらに、SSZ投与により、PTX1の細胞増殖能は抑制され、死細胞が増加したが、この細胞死は非アポトーシス性細胞死であるフェロトーシスにより生じることを明らかにした。ヒト子宮体部漿液性腺癌細胞株であるUSPC-1とUSPC-1をパクリタキセル存在下で維持しパクリタキセル耐性を獲得した細胞株PTX1を用い、それぞれパクリタキセル15 nM存在下で24時間培養しメタボローム解析を行った。その結果、野生株とパクリタキセル耐性株におけるメタボロームプロファイルを作製した。グルタチオン代謝経路においては、USPC-1とPTX1の細胞内グルタチオン濃度を比較すると、PTX1でグルタチオン濃度が高い傾向にあった。また、USPC-1はパクリタキセル投与により細胞内のグルタチオン濃度が上昇傾向にあったが、PTX1ではパクリタキセル投与を行っても細胞内グルタチオン濃度に変化はなかった。この結果に加え、グルタチオンは化学療法による癌細胞の活性酸素上昇(酸化ストレス)から防御する機能を有すると考えられていることから、子宮体部漿液性腺癌において、パクリタキセル獲得耐性化機序が細胞内グルタチオン濃度上昇に起因する可能性について検証を行うこととした。グルタチオンはグルタミン酸、システイン、グリシンから構成されるたんぱく質であり、システインの取り込みを担うシスチン・トランスポーターに着目した。システイン・トランスポーターの阻害剤であるスルファサラジンを用いたところ、スルファサラジンとパクリタキセルをPTX1に同時投与したところ、パクリタキセル単独投与に比べて生細胞数の減少をもたらすことが明らかになった。この結果は、スルファサラジンによってPTX1の細胞内グルタチオン濃度を減少させることによりパクリタキセル耐性が減弱した可能性を示唆するものと考えた。スルファサラジンが子宮体部漿液性腺癌に有効であることを示すことができれば臨床上大きな意義があると考えられる。平成27年度の計画は、抗がん剤耐性株におけるメタボロームプロファイルを作製することであったが、パクリタキセル耐性株におけるメタボロームファイルを予定通り作成し計画を遂行できた。さらに、これまでの報告をもとに、グルタチオン代謝経路に着目し現在研究を進めており、おおむね順調に進展していると判断した。GSHはシスチントランスポーター(xCT)を介してシスチンが細胞内に取り込まれ産生されることから、xCTの阻害作用を有するスルファサラジン(SSZ)投与により、パクリタキセル(PTX)抵抗性を減弱させるかを検討した。最初に野生株、PTX1においてxCT, CD44が発現していることをWestern blotting法で確認した。PTX1にSSZを投与し、GSH濃度、ROS産生の変化をみたが、SSZ投与によってGSH濃度は低下し、ROSの産生が増加することを認めた。SSZ投与によるPTX1の細胞増殖能と死細胞数を検討したところ、SZZ投与によってPTX1の細胞増殖能は抑制され、死細胞が増加した。次に、SSZ投与によるPTX感受性の変化をMTS assay法で検討したところ、SSZの併用投与によりPTX感受性は増強された。次に、SSZによる細胞死の機序を検討した。野生株ではSSZ投与によりアポトーシスマーカーであるcleaved PARPの発現の経度増強を認めたが、PTX1では明らかな発現増強がなかった。また、野生株、PTX1ともに、PTX単剤と比較してSSZ+PTXでcleaved PARPの発現増強は認めなかった。このことから、細胞死の多くはアポトーシスとは別の機序によるものと考えられた。SSZは、非アポトーシス性細胞死であるフェロトーシスを誘導する薬剤としても注目されており、PTX1におけるフェロトーシス誘導の有無を検討した。SSZとフェロトーシス阻害薬Ferostatin-1を併用投与することでスルファサラジン単剤投与時に認めた細胞増殖能の抑制と死細胞の増加が解除された。パクリタキセル抵抗性機構の一つとして抗酸化機構があり、SSZはGSHの産生を抑制しフェロトーシスを誘導することで、パクリタキセル抵抗性を軽減することが今年度の研究で明らかになった。本研究は、抗癌剤耐性に関与する代謝経路を解明し、耐性に関わる因子をもとに新規治療標的を明らかにすることを目的とした研究であるが、網羅的メタボローム解析を基に抗酸化物質であるグルタチオンに着目し、スルファサラジンの投与によりパクリタキセル耐性が解除されるメカニズムを解明できた。さらに別の経路における酵素にも着目して解析をすすめており、概ね順調に進展していると判断した。前年度までの研究により、子宮体部漿液性癌細胞株(USPC1)から樹立したパクリタキセル耐性株(PTX)において、細胞内グルタチオン(GSH)濃度が増加していることを明らかにした。また、スルファサラジン(SAS)はシスチントランスポーター(xCT)を阻害することでGSHを減少させ複数の癌細胞で抗腫瘍効果が報告されていることから、USPC1とPTXの両細胞株におけるSASの抗腫瘍効果をMTS assay法で検討した。

どちらの細胞株においてもSASは細胞増殖抑制効果を示したが、PTX1においてより強い効果を示し、併用投与によりパクリタキセル感受性が亢進した。両細胞株において、SAS投与によるROS産生の変化をフローサイトメトリー法で、細胞死誘導をPI/hoechst法で検討したが、PTX1では低濃度のSAS投与によるROS産生上昇と細胞死誘導を認めた。次に、SASによる細胞死の機序を検討した。PTX1ではSASとフェロトーシス阻害薬及び鉄キレーターとの併用投与によりSASの細胞増殖抑制能と細胞死誘導能が抑制されたが、SASとアポトーシス阻害薬の併用投与では抑制されなかったこと、SAS投与によりcleaved PARPの発現が増強しなかったことから、PTX1におけるSAS投与による細胞死の多くは非アポトーシス性の細胞死、フェロトーシスであることが明らかとなった。次に、フェロトーシスを誘導する因子の検討を行った。RASエフェクターの下流分子の発現をWestern blotting法で検討したところ、Phospho-JNKの発現がPTX1において亢進していた。SASはパクリタキセル感受性株と比較して耐性株でより抗腫瘍効果が高く、耐性株ではROSの蓄積とRasエフェクターであるJNK活性による合成致死がフェロトーシス性の細胞死を誘導することを今年度の研究で見出した。ヒト子宮体部漿液性腺癌細胞株USPC-1とUSPC-1からパクリタキセル耐性を獲得した細胞株PTX1のメタボロームプロファイルを比較したところ、PTX1において、グルタチオン(GSH)、グルコース-6-リン酸、リボース-5-リン酸の濃度が高いことが明らかとなった。シスチントランスポーターの阻害作用を有するスルファサラジン(SSZ)投与により、PTX1のGSH濃度は低下し、パクリタキセルとの併用によりパクリタキセル感受性が増強した。さらに、SSZ投与により、PTX1の細胞増殖能は抑制され、死細胞が増加したが、この細胞死は非アポトーシス性細胞死であるフェロトーシスにより生じることを明らかにした。1、スルファサラジンによりみられたパクリタキセル耐性の減弱という現象がグルタチオン濃度減少によるものか検討する。PTX1細胞内のグルタチオン濃度を測定し、スルファサラジン投与によりグルタチオン濃度が減少することを確認する。また、シスチン・トランスポーターの安定性に関わるとされる細胞表面マーカーCD44の発現量をUSPC-1とPTX1において検討する。さらに、PTX1にスルファサラジンとパクリタキセルを同時投与することでパクリタキセル単独投与よりも細胞内活性酸素が上昇していることを確認する。2、スルファサラジンの抗腫瘍効果をin vivoで確認する。上記1の実験と並行してスルファサラジンの抗腫瘍効果を動物実験で検討する。ヌードマウスにPTX1を皮下および腹腔内に移植する。移植部位に関して、腫瘍が観察しやすく腫瘍径を測定することが可能である理由から皮下移植モデルを使用する。また、臨床的に子宮体部漿液性腺癌が容易に腹腔内播種を来すことを考慮し、腹腔移植モデルを用いる予定である。