hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肺胞上皮増殖因子遺伝子導入による肺保護戦略ー臨床応用へのアプローチー

MSCにKGFを遺伝子導入し、炎症部位に遊走したMSCがKGFを過剰発現させることでKGFの傷害軽減効果を増強できないか、検討した。MSCにKGF発現アデノウイルスベクターを導入し、KGF遺伝子の発現を確認した。MSCをマウスに投与して、マウスの体内でKGFが発現したのを確認した。肺傷害の動物モデルとして、盲腸結紮後腸管穿刺後肺傷害、上腸管膜動脈阻血再還流後肺傷害のモデルを作製した。急性肺傷害へのkeratinocytegrowthfactor(KGF, FGF-7)投与は上皮細胞の損傷を軽減し、修復を促進する。多くの動物モデルに対して有効性が示され、臨床研究もはじめられている。傷害発生の初期の投与の有効性に比較して、投与のタイミングがおそくなると効果が認められない点が問題である。また近年、炎症部位へ遊走し、炎症組織を修復するmesenchymal stem cell(MSC)投与の有効性も多くの論文で示されている。KGFの遺伝子をMSCに導入し、MSCをKGFのベクターとして投与する方法について、有効性を示す報告が散見されており、我々の研究でも、KGFを疾患モデルに投与する手段としてMSCを用いるよう試みることとした。以前の研究で使用した、マウスKGF発現アデノウイルスベクターを、マウスMSCの培養細胞に感染し、ウエスタンブロット法でKGF発現を確認した。KGF遺伝子導入したMSCをマウスの生体内へ投与する実験を行うにあたり、生体内へのMSC分布を明らかにするように、GFPをラベルする目的で、KGF-GFP発現アデノウイルスベクターを作製中である。コントロールとしてKGF発現単位を持たない、GFPのみ発現するアデノウイルスベクターも作製する。MSCにアデノウイルスベクターを感染させ、KGF-GFPまたはGFPのみの遺伝子導入したMSCを作製する。マウス尾静脈よりMSCを静脈注射し、KGFの傷害軽減修復効果について検討を加える。急性肺傷害へのKeratinocyte growthfactor(KGF, FGF-7)投与は上皮細胞の損傷を軽減し、修復を促進する作用がある、以前から多くの肺傷害動物モデルへの投与でその有効性が示され、近年は、臨床研究も開始されている。またmesenchymal stem cell(MSC)投与による肺傷害修復効果についても大きく取り上げられている。本研究ではMSCから生理的に分泌されて、肺傷害修復の一端を担っているKGFをウイルスベクターを使用して、MSCにKGF遺伝子導入し、MSCからKGFを過剰に分泌する状態をつくり、その効果を確認することが目的である。今年度ウイルスベクターの発現確認マーカーとして、KGFとGFPが1分子ずつ発現するアデノウイルスベクターを作製した。生体内に投与した際に、外から投与したMSCの分布を明らかにすることができる。アデノウイルスベクターのcloning siteの内、E1領域にKGF(CAG promoter)、E4領域にGFP(EF promoter)遺伝子をいれた。コントロールベクターとして、KGF発現単位をもたない、GFPのみを発現するものを用いる。MSCにアデノウイルスベクターを感染させ、KGF-GFPまたはGFP遺伝子を導入したMSCを作製する。今後マウス尾静脈からMSCを投与し、KGFの傷害軽減効果について検討を加える予定である。KGF遺伝子導入にあたり、KGF発現アデノウイルスベクターを作製した。またこの遺伝子を効率よく、傷害を受けた肺胞上皮に運ぶ目的で、中胚葉幹細胞(Mesenchymal Stem Cell:MSC)にウイルスベクターを感染させた。MSCは炎症部位に遊走する性質を利用するためである。KGF発現アデノウイルスベクターにはGFPタンパク質をタグとして付け、GFPをマーカーとしてMSCでの発現を確認できた。肺傷害の動物モデルとしては、Cecal ligationand puncture:CLP敗血症モデルを作製し、間接型ARDSを想定した。MSCにKGF-GFPアデノウイルスベクターを感染させたグループ(KGF群)、MSCにGFPアデノウイルスを感染させたグループ(コントロール群)において、CLP術後7日目までの生存率、全身の炎症、肺傷害の程度の比較(病理組織学的、生理学的、免疫組織学的検討)を行った。2群間で炎症の程度、肺傷害の程度に差ができず、今回の実験系では、KGFによる治療的な効果について主命することはできなかった。アデノウイルスベクター作製に時間を要し、感染させたMSCを動物に投与することができなかった。急性肺傷害KGF-GFP発現アデノウイルスベクターは1か月程度で完成の見込みである。MSCへウイルスベクター投与する予備実験で、KGF発現が確認できているので、26年度は動物モデルへ投与する実験を行いたい。昨年度動物実験までを予定していたが、ウイルスベクター作製に時間を要したため、その過程に進めなかったためウイルスベクターを作製済みなので、動物に投与、生化学実験、病理学的実験等を進める。
大強度加速器施設の気体中に生成される放射性核種の存在状態と挙動の解明

大強度の粒子加速器施設では、ビームで照射される標的等に多量に生成される放射性核種を適切に取り扱うことが施設の安全な運用上不可欠である。本研究では、大強度陽子加速器施設J-PARCのハドロン実験施設において、金標的内で生成された放射性核種が標的容器を経由して循環するヘリウム気体に移行する過程、気体中での核種の挙動を明らかにすることを目指して検討を行っている。また、J-PARCの物質・生命科学実験施設(MLF)の液体水銀標的内に生成されるH-3の挙動についても詳細な解析を進めている。ハドロン実験施設での検討から、ビーム運転中に循環ガス中から検出されるガンマ線放出核種は、標的やビーム窓に生成される多様な核種のうちで気体状化学種を生成しやすい元素のC,N,O,F,Ne,S,Ar,Hg等の核種が選択的に気相に移行して検出されていることを明らかにした。平成30年度は、気体中の各放射性核種の濃度を決定し、各核種の固体から気相への移行割合を定量的に評価した結果、C-10, N-16, O-14, O-19, O-20, Ne-23, Ar-41については、固体から気相へ移行する割合が同程度の値を示すことが分かった。一方、F-20, S-37, Hg-191m, Hg-192, Hg-193m, Hg-195, Hg-195mについては、上記核種に比べて1/201/4程度の値を示し、気相に移行する割合が小さいことが分かった。これらの特徴は、核種の存在化学形態を反映したものと考えられる。MLFでの検討においては、水銀標的容器を交換する作業時におけるH-3の気相への放出挙動に着目し、水銀容器を構成するステンレス材料へのH-3の吸蔵と気相への放出の過程をモデル化し、詳細に検討した。その結果、容器交換時に観測される気相中のH-3濃度の時間変化について、定量的に説明することが可能となった。平成30年度までの検討では、J-PARCのハドロン実験施設における標的容器循環ヘリウム気体中で観測される放射性核種とMLFの水銀標的中に生成されるH-3を主要な検討対象として研究活動を行った。ハドロン実験施設では、様々なビーム運転条件で観測されたヘリウム気体のガンマ線スペクトルと経時変化を詳細に解析し、ビーム強度、標的温度などと注目する核種の気相濃度の関係について検討し、その特徴を明らかにした。また、固体から気相への核種移行割合は、C, N, O, Ne, Ar等の元素の核種では同程度の値を示すのに対し、F, S, Hg元素の核種はやや小さな値を示すことを明らかにした。これらの気相移行割合の特徴は、気体中および固体表面における核種の存在化学形態を反映した結果と推定され、本研究ではじめて明らかになった重要な知見であると考えている。また、MLFの水銀標的内で生成されたH-3のステンレス材料内への吸蔵と固体内拡散、気相への放出などの過程についても、本研究によりはじめて定量的な解釈を試みた。これらの研究成果は、放射性核種の化学挙動に関連する研究会等での報告に加え、水素同位体科学の専門研究者を訪問しての意見交換、核反応シミュレーション計算の専門研究会における報告などを行い、多くの有益な助言を得た。また、海外の大型加速器施設の安全関係者が集まる情報交流会に参加し、加速器施設での安全管理に関わる情報交換にも取り組んだ。以上の成果は研究計画に概ね沿ったものであり、本研究は、おおむね順調に進展していると自己評価している。今後の検討においても、多くの基礎情報を取得可能な系として、J-PARCハドロン実験施設の標的容器循環ヘリウム気体中の放射性核種、MLFの水銀標的に生成されるH-3を主要な対象として検討を行う。ビーム運転中および標的容器の交換作業中に取得されたガンマ線スペクトルや経時変化データを詳細に解析し、注目する放射性核種の挙動についてより詳細・定量的に考察する。また、ハドロン実験施設のガス循環経路に設置されているHEPAフィルター、活性炭フィルターのガンマ線スペクトル測定から、粒子状として気相中に存在してHEPAフィルターに補足される核種、活性炭に吸着補足される核種などの存在とその割合等について議論が可能となると考えている。また、ビーム運転条件における標的やビーム窓の温度において、固体表面および気体中の放射性核種の存在形態について、化学平衡計算プログラムを利用して予測し、化学種の沸点・融点・蒸気圧等も考慮して、固ー気間移行過程、気相での微粒子生成過程などについても考察する。これらの実験、および計算的手法による解析結果について多方面から考察し、放射性核種の気相および固体表面における存在状態、挙動を詳細に理解することを目指す。さらに、得られた知見を踏まえて、加速器トンネル内の空気や排気など加速器施設の放射線安全管理において重要な、他の気相系における放射性核種の挙動予測についても検討する。以上の検討で得られた知見を踏まえ、大強度加速器施設において起こり得る放射性物質漏えい等の異常事態を想定し、その発生と拡大の防止措置についても検討する。これらの取り組みについては、国内外の大型加速器施設とも情報交換、議論を進める。

大強度の粒子加速器施設/ビーム利用実験施設においては、ビームで照射される標的や窓材等に多量の放射性核種が生成され、これらの生成放射性核種を適切に取り扱うことが、施設の安全な運用上不可欠である。本研究では特に、固体内で核反応により生成された放射性核種が気相に移行する過程、気相での存在状態と挙動を明らかにすることを目指すものである。申請者らは、世界最高強度の陽子加速器施設J-PARCのハドロン実験施設において、陽子線で照射される金標的の容器を経由して循環するヘリウム気体中の放射能監視システムの運用グループと協力して、放射線計測の立場からヘリウム気体のガンマ線スペクトルと時間変化の詳細な解析に取り組んでいる。同施設の循環ヘリウム気体のガンマ線スペクトルでは、ビーム運転中に多数のピークが検出された。511 keVの消滅放射線、C-10, O-19, O-20, F-20, Ne-23, Ne-24, Ar-41等のガンマ線は、ビーム強度に対して単調に強度が増大する傾向を示した。この特徴は、ビーム窓や標的に生成される核種のうちで、気体状化学種を生成しやすい核種が選択的に気相に移行したものと考えられ、固体中に生成されたこれら核種の一定割合が気相に移行することを示している。一方、Hg-191m, Hg-192, Hg-193, Hg-195等のHg核種はビーム強度が一定レベルを超えた条件で検出され、これ以上のビーム強度で急激に計数率が増大する特徴が見られた。Hg核種はAuの核反応により生成され、初期的にはHg核種として金固体から気相に移行するものと考えられるが、ビーム強度と共に金の表面温度が上昇してHgの蒸気圧も上昇し、Hg化学種が気相に放出されやすくなるためであると考えれば説明可能である。定量的な解析と考察をさらに進め、気相における放射性核種の挙動の特徴をより詳細に明らかにする。平成29年度の検討は、J-PARCハドロン実験施設の標的循環ヘリウム中で観測される放射性核種を主要な検討対象として行った。様々なビーム運転条件で観測されるヘリウム気体のガンマ線スペクトルと経時変化を解析し、ビーム強度、標的温度などと注目するガンマ線ピーク強度の関係を調査した。また、循環気体試料から放出されるガンマ線を計測する特殊な本Ge検出器システムの検出効率(エネルギー依存性)を決定し、ピーク計数率から各核種の気体中放射能濃度を決定する方法を確立した。一方、粒子輸送モンテカルロシミュレーション/誘導放射能計算コードを利用して、陽子照射により金標的とチタン合金製ビーム窓に生成される放射性核種量を求めた。以上の実測・計算結果を踏まえ、固体中の核種生成量と、気体中の核種検出濃度を定量的に比較し考察した。検討の結果、金標的に生成された様々な放射性核種のうち、C, N, O, F, Ne, Ar, Hg等の気体状化学種を形成しやすいと考えられる核種のみが選択的に気相に移行すること、C, N, O, Ne, Ar核種では、固体に生成された核種のほぼ同一の割合が気相に移行すること、Hg核種の気相移行割合は金標的表面の温度を反映したHg蒸気圧に関係している可能性を示唆する傾向などを明らかにした。また、J-PARC MLF施設で核破砕中性子源として運用している水銀標的系での主要な核破砕生成核種H-3の挙動に関して、水素同位体科学の専門研究者と情報交換し、ステンレスに吸着されたH-3の気相への脱着挙動に関して、多くの重要な知見を得た。さらに、海外の大型加速器施設の安全部門の研究者・技術者の情報交流会に参加し、加速器施設での放射性核種の挙動理解や施設の安全管理に関わる情報交換を行った。以上の成果は研究計画に概ね沿ったものであり、本研究は、おおむね順調に進展しているものと考えている。
快適度と省エネルギーを両立する低コストアドオン型BEMSの実現技術

本研究では,オフィスや公共空間の照明や空調の省エネルギー化を,高価なビルエネルギー管理システム(BEMS)に頼ることなく,モバイル機器で低コストに実現する技術の創出に挑戦している.温湿度と行動センシングにより個人の快適度の常時把握を実現する.これにより,快適度・行動・環境・電力データを間欠的かつ低コストでクラウドサーバに集約するシステムを設計している.また,網羅的なシミュレーションデータを併用することで,それらの低コストセンシングデータから,快適性を損なわない空調制御を予測する手法についても実施している.原子力発電所の長期停止や火力発電用燃料費の高騰,景気上昇による需要増などにより,電力需給の更なるひっ迫が予想される.特にオフィスビルや商業施設におけるエネルギー消費の約70%を占める照明や空調の省エネ化は喫緊の課題である.しかし,東京都がオフィスビル等に対して実施したアンケートにおいて「節電のために投資する場合もその投資額を抑制し,比較的短期に回収できることが必要」といった回答がみられるように,厳しい経済状況で省エネルギーにかけるインフラ投資額にも費用対効果が求められていることもうかがえる.これに対し,本研究では,オフィスの照明や空調の省エネルギー化を,高価なビルエネルギー管理システム(BEMS)に頼ることなく,モバイル機器で低コストに実現する技術の創出に挑戦している.温度センサーとスマートフォンを連携させることで個人の快適度と温湿度の常時センシングを実現する.これにより,快適度・行動・環境・電力データを間欠的かつ低コストでクラウドサーバに集約するシステムを開発しつつある.また,網羅的なシミュレーションデータを併用することで,それらの低コストセンシングデータから,快適性を損なわない空調制御を予測する手法についても実施している.これは,様々な空調設定温度や風量,人の存在における温度変化シミュレーションをCFDソフトウェアを用いてあらかじめ実施し,その結果をデータセットとして蓄積しておき,実際の温度観測からその後の温度変化をそのデータを用いて予測する手法である.これを用いることで,最適な空調設定を管理者に示唆するシステムの実現を目指している.なお,センシングシステムについては商業施設と連携して温度センサーと人検知システムを仮設置し,実証実験を開始する体制を整えている.予定していたパーソナルセンシング技術および屋内の位置行動センシング技術については,研究代表者のこれまでの知見と保有技術に基づき,学術的に十分な成果創出ができたと考える.特に屋内の位置行動センシング技術については取り組みが全国紙で報道されており,社会還元の観点からも目標以上の成果を達成できていると自負する.また,人の存在をとらえるスマートポールも予定通りにプロトタイプ制作し,実在する商業ビル内の1000平米以上の空間に設置することで,データ取得と実証実験の準備体制を整えた.また今年度は予定していなかったビル空調制御との関係解析にも取り組み,新指標の検討を含めて環境工学の専門家との議論を重ねながら,空調制御における人の存在とセンシングデータの活用技術に関し一定の実現目途を得ている.原子力発電所の長期停止や火力発電用燃料費の高騰,景気上昇による需要増などにより,電力需給の更なるひっ迫が予想される.特にオフィスビルや商業施設におけるエネルギー消費の約70%を占める照明や空調の省エネ化は喫緊の課題である.しかし,東京都がオフィスビル等に対して実施したアンケートにおいて「節電のために投資する場合もその投資額を抑制し,比較的短期に回収できることが必要」といった回答がみられるように,厳しい経済環境で省エネルギーにかけるインフラ投資額にも費用対効果が求められていることもうかがえる.これに対し,本研究では,オフィスの照明や空調の省エネルギー化を,高価なビルエネルギー管理システム(BEMS)に頼ることなく,モバイル機器で低コストに実現する技術の創出に挑戦している.温湿度と行動センシングにより個人の快適度の常時把握を実現する.これにより,快適度・行動・環境・電力データを間欠的かつ低コストでクラウドサーバに集約するシステムを開発している.また,網羅的なシミュレーションデータを併用することで,それらの低コストセンシングデータから,快適性を損なわない空調制御を予測する手法についても実施している.様々な空調設定温度や風量,人の存在における温度変化シミュレーションをCFDソフトウェアを用いてあらかじめ実施し,その結果をデータセットとして蓄積し,実際の温度観測からその後の温度変化をそのデータを用いて予測する.これらを用いることで,最適な空調設定を管理者に示唆するシステムの実現を目指している.商業施設と連携して複数の温度センサーと人検知システムを設置し,実証実験を実施している.本研究では,オフィスや公共空間の照明や空調の省エネルギー化を,高価なビルエネルギー管理システム(BEMS)に頼ることなく,モバイル機器で低コストに実現する技術の創出に挑戦している.温湿度と行動センシングにより個人の快適度の常時把握を実現する.これにより,快適度・行動・環境・電力データを間欠的かつ低コストでクラウドサーバに集約するシステムを設計している.また,網羅的なシミュレーションデータを併用することで,それらの低コストセンシングデータから,快適性を損なわない空調制御を予測する手法についても実施している.方法論はおおよそ確立に至りつつあり,今年度中の論文発表を目指す.また,もともとはキャンパス内での実証実験を予定していたが,実際の商業施設での実証実験の目途がつけられたことから,そういった注目度の高い施設においてより実践的な成果創出に挑戦する予定である.以上より平成28年度も順調に研究開発を遂行できると考える.モバイルコンピューティング
超臨界流体中における分子の回転異性化のダイナミックスと溶媒和

平成2年度の同名課題の研究において製作した超臨界流体赤外測定装置を用いて、4-ヒドロキシ-4-メチル-2-ベンタノン(4H4M2P)、4-ヒドロキシ-2-ブタノン(4H2B)、及び、1、2-ジブロモエタン(1、2-ジブロモエタン(1、2-DBE)の赤外スペクトルをキセノン流体中で測定した。温度は298Kとし、キセノンの圧力を0barから140barまで変化させた。セル内部に試料だけを入れた状態では、試料の蒸気圧が低いために吸収は観測されないが、キセノンを導入すると、圧力30bar(4H4M2P)あるいは50bar(4H2B、1、2-DBE)付近から吸収が現われ、圧力と共に強くなる。これから4H4M2Pの場合、30bar→120barの圧力上昇で溶解度が約10倍増加することが分かった。4H2Bと1、2-DBEの溶解度増加も同様である。4H4M2Pと4H2Bでは30-50barの低圧域で2量体に帰属されるブロ-ドな吸収帯が観測された。これは、50bar以上の圧力では消失する。4H4M2Pと4H2Bの分子内水素結合OHバンドν_<1b>及び1、2-DBEのCH_2縦揺れバンドν_wの振動数の圧力に対するシフトをKirkwood-Bauer-Magatのモデルと比較したところ、66bar付近でモデルから予測される直線関係からのずれが著しい。これは、298Kにおいてキセノンの圧力に対する密度変化率が最大となる66barの付近で溶質分子近傍のキセノンの密度がバルク密度より高いことを示すもので、溶媒和構造あるいはクラスタ-の形成によるものと考えられる。4H4M2Pの回転異性化平衝に対する圧力効果を調ベたところ、異性体間の部分分子容差が圧力によって大きく変化することが分かった。これを、溶媒和エネルギ-の理論モデルで解析した結果、振動数シフトの場合と同様にキセノン圧66bar付近でモデルの直線関係からのずれが見られた。4H4M2Pのν_<1b>のバンド幅の解析からは,第一溶媒和圏内のキセノン数が60bar付近で飽和数の半分に達し、70bar付近でおおよそ飽和するとの描像が得られた。
ツールホルダのオンマシンたわみ修正と耐びびり性向上による高精度・高能率金型加工

金型切削加工の高精度・高能率化に資するため、金型切削加工用ツールホルダの耐びびり性向上と、主軸とツールホルダからなる主軸系の質量アンバランスによる主軸高速回転時のツールホルダのたわみを工作機械上で修正できるシステムについて検討した。ツールホルダの耐びびり性はツールホルダの剛性と減衰比の積で評価した。得られた結果を要約すれば以下のようである。1.長尺ツールホルダの耐びびり性を向上させるためにホルダ先端部に振動吸収用ダンパを内蔵させたツールホルダモデルを製作してその性能を実験的に調べた。ツールホルダの先端部にダンパを内蔵させることによって静的曲げ剛性をほとんど減少させないで減衰比を912倍向上させることができたため、振動吸収用バンパを内蔵しないツールホルダと比較して、そのツールホルダの耐びびり性は大幅に向上した。2.鋳鉄製テーパシャンク部と特殊鋼SCM415製ホルダ部を拡散接合したツールホルダを製作し、その耐びびり性と切削性能を調べた。ツールホルダ全体が特殊鋼SCM415性のモデルと比較して、静的曲げ剛性は約5%低くなったが、耐びびり性は基準モデルの約1.4倍弱向上し、切削性能は同等であった。3.主軸およびツールホルダに作用する遠心力が大きくなる主軸高速回転時のツーホルダの曲げ剛性を向上させるため、鋼と比較して低密度・高ヤング率のアルミナセラミックス製の主軸と合金鋼製のツールホルダからなる主軸系を提案した。数値シミュレーションの結果、提案した主軸系は高い曲げ剛性を有し、かつ主軸回転数の影響をほとんど受けなかった。4.低速回転時のツールホルダたわみ量の測定結果から主軸高速回転時のツールホルダのたわみを工作機械上で自動的に修正できるシステムを提案した。本年度は,高速マシニングセンタによる深彫りエンドミル加工の高精度・高能率化を目的としてツールホルダの回転たわみ修正およびツールホルダの耐びびり性向上に関して,以下に示す研究を行った.ツールホルダの軸方向の回転たわみを,位置決め可能なXVZステージに固定した静電容量式変位センサを用いて測定した結果,軸方向の回転たわみのモードは一次モードが支配的であることが明らかとなった.この結果に基づいて,ツールホルダの突き出し長さLと直径Dの比が長いツールホルダの回転たわみ修正法として,ツールホルダ先端に回転たわみ修正用の調整おもりを付加する方法を考案した.この方法によるツールホルダのたわみ低減効果を確認する実験を行った結果,その修正方法の有効性が明らかにされた.つぎに,ツールホルダの耐びびり性の向上について,ツールホルダの工具側にMnCu鋼を設置する方法を考案し,耐びびり性(剛性×減衰性)の観点から,有限要素法を用いた数値シミュレーションを行った結果,MnCu鋼部分の軸方向長さを最適値があることがわかった.次年度,この解析結果に基づいて求めた最適長さを有する耐びびり性の高いツールホルダを試作し,切削実験結果から耐びびり性を明らかにする.

さらに,実用性がある耐びびり性の高いツールホルダを開発するため,次年度はツールホルダとマシニングセンタ主軸の接触界面における摩擦係数とその接触面圧がツールホルダの振動モードに及ぼす影響について調べる.その基礎として,本年度は,ツールホルダとマシニングセンタ主軸の接触面界面を簡略化したモデルを製作するとともに,接触界面における摩擦抵抗や接触面圧がこのモデルの振動モードに及ぼす影響を有限要素法で解析する方法を確立した.高速マシニングセンタによる高硬度金型材料の深彫りエンドミル加工では、工具突き出し量が大きいためにツールホルダの曲げ剛性が小さくなり、その結果、切削力やツールホルダのアンバランスによるツールホルダのたわみが増大すると同時にびびり振動が発生しやすくなって加工精度と生産性が低下する。また高速マシニングセンタの場合、主軸を支持しているベアリングのdn値の関係上、主軸直径を小さくせざるを得ず、曲げ剛性の高い主軸の設計が困難となる。そのため、高速マシニングセンタの主軸は剛性ローターと見なすことはできず、弾性ローターとして取り扱う必要がある。高速マシニングセンタによる高硬度金型材料の高精度・高能率深彫りエンドミル加工を実現するため、ツールホルダの回転たわみ修正およびツールホルダの耐びびり性向上に関して以下の研究成果を得た。高速マシニングセンタの場合、主軸系を弾性ローターと見なさなければならない主軸回転数では、ツールホルダのアンバランスが原因で発生するツールホルダの回転たわみの修正は、工具を把持したツールホルダを主軸に装着した状態で行わなければならない。その手順は、まずツールホルダの軸方向の静的な振れを計測する。つぎに、シミュレーションあるいは実測により、使用する主軸回転数が主軸系のいかなる振動モードのところに位置しているかを知る。つづいて、得られた振動モードからツールホルダの回転たわみを修正するのに一番適したアンバランス修正量を最初に計測した振れから計算し、軸方向にアンバランスを修正していく。工具側に制振材料を接合した深彫りエンドミル加工用ツールホルダを試作し、その耐びびり性を剛性試験と加振試験から確認できたが、接合部の強度不足で切削実験でその耐びびり性を確認できなかった。ツールホルダと主軸の接触界面における摩擦抵抗および接触面圧が主軸系の固有振動数に及ぼす影響は小さいことが予測された。高速マシニングによる高硬度金型材料の高精度・高能率深彫りエンドミル加工を実現するため、ツールホルダの回転たわみ修正およびツールホルダの耐びびり性向上に関して以下の研究成果を得た。BT40のテーパシャンクを有するツールホルダを用いて回転中のツールホルダのたわみ測定とたわみ修正を行うとともに、回転中のツールホルダのアンバランス測定を行った。ツールホルダ先端のたわみ量とアンバランス量に及ぼすたわみ量低減のために設置する付加おもりの位置およびその大きさの影響を明らかにした。その結果、質量アンバランスの近傍でたわみ修正を行うことによって、主軸にツールホルダを装着したときに発生する残留振れ量まで小さくできることを明らかにした。さらに、振動解析ソフトウェアを用いてツールホルダ軸方向の回転たわみ状態をシミュレーションした結果に基づいてツールホルダのたわみ量の測定結果から修正量を計算するソフトウェアを試作した。実用性がある耐びびり性の高いツールホルダを開発するため、ツールホルダのテーパシャンク部とホルダ部をそれぞれ特殊鋳鉄とクロムモリブデン鋼(SCM415)で製作し、テーパシャンク部とホルダ部を拡散溶接およびボルト締結によって接合した異種金属接合構造のツールホルダを試作した。これらのツールホルダの剛性試験とインパルスハンマによる加振実験の結果から、異種金属接合構造のツールホルダは従来のクロムモリブデン鋼のツールホルダの1.3倍以上の耐びびり性を有することを明らかにした。また、これらのツールホルダを用いた切削実験の結果からその耐びびり性について検証した。主軸とツールホルダからなる主軸系の高速回転における剛性は、遠心力によって主軸テーパ部が拡張するため、低速回転時よりも小さくなる。このことは主軸系の耐びびり性低下につながる。
ATL治療薬をめざしたHTLV-1プロテアーゼ阻害剤のデザイン

我々は,基質遷移状態に着目してそのミミックをデザインするという新しく論理的な方法を用いて,アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤のデザインを行なってきており,高血圧治療薬としてレニン阻害剤,抗エイズ薬としてHIVプロテアーゼ阻害剤などのデザインを行ない,強力な阻害剤の合成に成功した.この有用な方法を,HTLV-1プロテアーゼ阻害剤のデザインに応用し,基質遷移状態誘導体と酵素の相互作用の解析から阻害剤を分子設計し,それに基づいて,ペプチドmimicを合成しメカニズムの明確な抗ATL薬の開発をめざした.また,本研究に必要なHTLV-1プロテアーゼおよび化学的に安定な誘導体を,効率的固相法を用いて化学合成した.1.HTLV-1プロテアーゼ及び誘導体は我々が開発した希釈メタンスルホン酸をα-アミノ保護基切断に使用する効率的固相合成法で合成した.また,HTLV-1プロテアーゼ中のは2つのシステインをイソステリックなアミノ酸に変換した誘導体を合成した.3.阻害剤.遷移状態誘導体の概念に基づいてHTLV-1プロテアーゼに特徴的な基質の切断部位Leu-ProおよびLeu-Val(P1-P1′)のアミド結合をイソステリックな還元型[CH_2-NH],ヒドロキシエチレン型[CHOH-CH_2],ジヒドロキシエチレン型[CHOH-CHOH]に変換し,各基質遷移状態誘導体を合成した.4.阻害活性の測定.合成したHTLV-1プロテアーゼ及び合成基質を用いて酵素活性測定系を確立し,この系を用いて合成阻害剤の阻害活性の測定を行なった.我々は,基質遷移状態に着目してそのミミックをデザインするという新しく論理的な方法を用いて,アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤のデザインを行なってきており,高血圧治療薬としてレニン阻害剤,抗エイズ薬としてHIVプロテアーゼ阻害剤などのデザインを行ない,強力な阻害剤の合成に成功した.この有用な方法を,HTLV-1プロテアーゼ阻害剤のデザインに応用し,基質遷移状態誘導体と酵素の相互作用の解析から阻害剤を分子設計し,それに基づいて,ペプチドmimicを合成しメカニズムの明確な抗ATL薬の開発をめざした.また,本研究に必要なHTLV-1プロテアーゼおよび化学的に安定な誘導体を,効率的固相法を用いて化学合成した.1.HTLV-1プロテアーゼ及び誘導体は我々が開発した希釈メタンスルホン酸をα-アミノ保護基切断に使用する効率的固相合成法で合成した.また,HTLV-1プロテアーゼ中のは2つのシステインをイソステリックなアミノ酸に変換した誘導体を合成した.3.阻害剤.遷移状態誘導体の概念に基づいてHTLV-1プロテアーゼに特徴的な基質の切断部位Leu-ProおよびLeu-Val(P1-P1′)のアミド結合をイソステリックな還元型[CH_2-NH],ヒドロキシエチレン型[CHOH-CH_2],ジヒドロキシエチレン型[CHOH-CHOH]に変換し,各基質遷移状態誘導体を合成した.4.阻害活性の測定.合成したHTLV-1プロテアーゼ及び合成基質を用いて酵素活性測定系を確立し,この系を用いて合成阻害剤の阻害活性の測定を行なった.
形式概念分析によるユーザーの直観に適したウェブ検索結果の視覚化システムの開発

本プロジェクトでは、ウェブ検索結果をはじめとする、ゲノム、画像群、医療データ等の大規模な情報を、人間の直観にわかりやすい形式の一つとしての概念構造として視覚化する方法として、形式概念分析に基づく手法を提案した。特に、ウェブ検索結果およびゲノムの視覚化においては、関連識者による評価を通して、提案手法の有効性を確認している。本プロジェクトの遂行により、雑誌論文7編、国際会議および国内学会での発表多数、特許出願1件、という業績を挙げている。今年度,形式概念分析に基づいた直感的なインタフェースとして,2つの大きな応用事例を開発し,さらにその拡張として,学習支援への応用も行った.それぞれを以下に示す.1.まず応用事例の1つめとして,Web上の画像検索を対象としたシステムの開発を行った.具体的なシステムの流れとしては,ユーザーの任意の検索クエリに対して,Google画像検索を用いて検索結果の画像および周辺テキストページ群を取得する.取得後のテキストページを,形態素解析API等を利用することでキーワードに分割する.さらに,それらのキーワードの重要度,頻度を計量した上で画像および対応するキーワード群の関係表を作成し,情報表に対して形式概念分析を適用し,検索結果の画像群を概念構造の観点から抽象化し,ユーザーに対して咀嚼しやすいシステムを開発している.さらに,前年度に開発した力学系モデルに基づく束構造視覚化を用いて,画像検索結果の視覚化もより咀嚼しやすいものに対応させている.2.応用事例の2つめとして,動画閲覧サイトYoutubeを対象とした,動画推薦システムを形式概念分析を利用して開発した.従来の動画推薦では,推薦理由が明示されない点を,形式概念分析の概念の連結情報を利用し,推薦理由を明示するシステムを構築した.今年度は,新たにLinkedデータにも拡張を行い,その枠組みにおいて直感的な検索を適用する枠組みを構成した.具体的には,あるサイトで公開しているオンライン辞書データおよび図版データを利用し,これらのLinkedデータに対してリンク解析を行い,それぞれの関連度を求める.この関連度に基づき,関連の強いキーワードは近くに,弱いキーワードは遠くに配置するような視覚化を行っている.さらにこれらの結果を,オンライン辞書作成に関わる専門家に評価してもらい,高い評価を得ることができている.今年度、本研究の最終年度として、これまでに得られた知見を最大限に活用し、3つの応用領域における試験的展開を行った。1.まず応用事例の1つめとして、テキストデータ、特にインターネット上に公開されている電子テキストを対象に形式概念分析を適用し、その視覚化を行った。この応用の枠組みでは、国会議事録をはじめニュースサイトなどへの適用を行い、国会議事録の視覚化においては、東日本大震災前後において重点的に議論されていた項目等が、適切な情報粒度で抽出することができることを確認した。2.応用事例の2つめとして、農業分野における育種支援のツールとして、形式概念分析を利用したゲノム配列の視覚化を行った。これに関しては、実際にシステムの実装を行い、この結果を育種の専門家に評価してもらい高い評価を得るとともに、その成果は国際雑誌論文に採録されている。3.応用事例の3つめとして、医療診断における診断支援ツールとして、形式概念分析とニューラルネットワークを組み合わせたシステムを開発し、それを実際の医療データに適用した。この研究成果については、国際会議等において報告している。以上、本研究では、これまでの3年間の研究を通して、形式概念分析を利用した(1)検索結果の視覚化、(2)動画検索結果の視覚化および推薦理由の明示、(3)画像検索結果の視覚化、(4)電子テキスト(特に議事録)の視覚化、(5)育種支援のためのゲノム配列の視覚化、(6)医療診断支援のための視覚化、という6つの多様な分野への応用を行い、それぞれの分野において高い評価を得るとともに、具体的な業績として多くの雑誌論文および国際会議において採録されており、本研究はこれらの観点から十分な成果が得られていると言える。形式概念分析に基づいた検索エンジンの視覚化技術のプロトタイプをPython開発を行った.具体的なシステムのプロセスとしては,ユーザーの任意の検索クエリに対して,Yahoo APIを用いて検索結果のテキストページ群を取得する.取得後のテキストページを,eutiful Soupおよび形態素解析APIを利用することでキーワードに分割する.さらに,それらのキーワードの重要度,頻度を計量した上でWebページおよび対応するキーワード群の関係表を作成する.ここで各キーワードの重要度の計量には,篠崎らの提案している手法「リンク構造と語の共起を利用したWebページからのキーワード抽出手法とページ要約による検索支援」(第3回楽天研究開発シンポジウム)を採用する.構成した情報表に対して形式概念分析を適用し,検索結果のwebページ群を概念構造の観点から抽象化し,ユーザーに対して咀嚼しやすいシステムを開発している.

従来の形式概念分析では,得られた概念構造が複雑になりすぎて具体的に出力された結果が何を示しているのかよくわからない,といった現象を引き起こしていたが,本研究で提案する束構造視覚化では,力学系モデルを採用し,また束構造をできるだけ保持した形で視覚化することで,この問題を解決している.本研究の成果として,国内特許出願(情報検索支援装置,特願2012-2539)が1件,また国際会議1件,国内学会(査読つき)1件が得られている.本研究の拡張として,静止画・動画のみならず,具体的な産学連携に発展している点から,当初の計画以上に進展していると言える.国内研究会・国際会議のほか,特許の出願も完了している点今年度までは,テキストおよび画像情報までを視覚化したが,今後は,マイクロブログ,オンライン辞書,その他,様々なソーシャルサービルまで展開.農業データまで.平成23年度において得られた研究成果を,テキスト以外のにマルチメディアに拡張する.具体的には,画像,映像をはじめとする膨大なデータベースから,さらにマイクロブログ,ソーシャルサービス,音楽のレコメンデーション等,はばひろい応用を目指す.次年度は,繰越発生分も含めて,平成24年度において得られた成果を,国際会議,雑誌論文等へ積極的に投稿する予定である.その際の旅費,論文掲載料をメインに支出する予定である.すでに平成24年度に得られた成果が雑誌論文として投稿がなされており,これが採択された場合に支出を予定している.平成23年度から繰越額が発生しているが,これらについては,招聘を予定していた研究者が急病のため来日できず、そのための費用を繰り越すこととなったためである.次年度は,繰越発生分も含めて,平成23年度において得られた成果を,国際会議,雑誌論文等へ積極的に投稿する予定である.その際の旅費,論文掲載料をメインに支出する予定である.すでに平成23年度に得られた成果が雑誌論文として掲載が決まっており,それらに充当する予定である.
巨大骨欠損に対する骨充填材の開発

目的)骨欠損に対する充填剤として、キチン・キトサンを原材料にして網目状構造を有するカルボキシメチルキチン-ハイドロキシアパタイト複合体(CMキチンHA)並びにCMキチンHAをDDSとして使用することを考慮しbFGF含浸CMキチンHAを作製し、骨充填材として有効であるかどうかについて検討した。成果)今回の検討では、熱による架橋の程度が不十分であったと思われたにもかかわらず、家兎の脛骨への埋植試験では、比較的早期より生体内において材料の吸収が起きており、骨形成を阻害しないものと考えられた。しかしながら、家兎橈骨骨欠損モデルに用いた実験では、複合体の生体吸収速度が速すぎたためとそれによるbFGFの流出が早期に生じてしまったため、円形細胞浸潤を伴う無菌性の強い炎症が生じ、結果として逆に骨形成を遅延させているものも見られた。通常キチン・キトサンは、その溶解性の高さゆえに生体内に使用することはこれまで困難なこととされてきた。そこで、熱架橋技術を利用し物理的な力を作用させて可溶性であるが比較的難溶性の充填材を開発し、骨充填材としての有効性について検討した。骨欠損が比較的小さい場合には、複合体の吸収速度に見合って、周囲より骨形成が観察されたが、長管骨の大きい骨欠損に対しては、骨吸収が早すぎるために十分な骨形成は得られなかった。したがって、今後生体内での吸収速度の制御法を改善することにより、これらの課題を克服できれば、安全でしかも長期間生体内に残存しない組織置換材として有用なものになるものと考えられる。骨形成因子(rhBMP-2)の担体としてのヒアルロン酸ナトリウム(以下HA)の有用性についてラットにて検討した。まず、ラットの皮下に異なる分子量のHAを浸透させたTi fiber mesh implant(以下Ti implant)を移植し、HAが局所に存在する期間と濃度の変化、周囲組織への移行と分布状態を蛍光色素でラベリングしたHAを用いて検討した。分子量90万と200万のHAはともに移植後3日間で外へほとんど放出されたが、周囲の肉芽組織内には2週後も強い蛍光強度が認められたことから、放出された後も血中ならびに周囲軟部組織へ移行するHAの量は少なく、局所に残留しているものと考えられた。次に、高分子HAを浸透したTi implantとBMP徐放性Ti implantをラットの頭蓋骨表面、骨膜下に置いて、骨誘導能を確認した。移植後3週、6週でX線写真を撮影後、骨と一塊をして試料を採取し、光顕と透過型電顕で観察した。さらに、走査型電顕による観察とEDX法による骨化の分析も行った。rhBMP-2を添加したHAを浸透させると、Ti meshのfiber間にも骨新生が生じていたが、Ti implantのみを頭蓋骨骨膜下に移植した群ではTi mesh内には骨形成は見られなかった。この結果はrhBMP-2を含んだHAがTi fiber間で骨形成時に有効に作用することを示しており、rhBMP-2の担体としてHAは有効であることが示唆された。骨欠損に対する骨充填剤として各種人工材料を作製し、b-FGFを添加剤として用いて骨欠損の充填剤としての良否を検討した。用いた骨充填材料としては1.ハイドロキシアパタイト(気孔率30%、気孔径平均100ミクロン、以下HA)、2.ハイドロキシアパタイト-TCP複合体(以下HA-TCP)、3.ハイドロキシアパタイト-キチン複合体(以下CMキチン)4.金属タンタリウム(気孔率50%、気孔径平均100ミクロン、以下Ta)である。これらの材料で直径3mm前後の円柱を作製し、日本白色家兎体重2.5kgの脛骨に埋入した。この際コントロールとして脛骨に直径3mmの骨開孔部をもうけ骨欠損部の充填経過につき他の材料と埋入後3週、4週にて比較した。

さらに、同様の材料にそれぞれ100μg/mlの濃度のb-FGF水溶液を真空ポンプを用いて材料内に脱泡吸引させた試料を同様に家兎脛骨内に埋入した。骨形成の程度については、HA-TCP>HA>Ta>CMキチンの順であり、これはb-FGFの存在の有無に関わらなかった。また、いずれの試料においても埋入後4週ではある程度の骨形成が試料内にまで進入しているのが観察されたが、3週ではHA-TCP以外ではこれは見られなかった。次いで、b-FGFを添加させた試料について観察したが、骨の試料内への進入の程度はb-FGFを添加しない場合と差は見られなかった。しかしながら、b-FGFを添加した試料では試料の外側で旺盛な軟骨性仮骨が観察された。このことより、家兎においては皮質骨内での骨形成はb-FGFの添加の有無にはそれほど影響されないが、臨床的には試料の外側での旺盛な軟骨性仮骨は十分に骨充填に有効であると考えられた。また、今回の実験では、ハイドロキシアパタイト-TCP複合体-b-FGF添加試料が骨欠損に対し、最も有効であると考えられた。まず、日本白色家兎の脛骨に直径3mmの骨孔を開け、これにCMキチン-ハイドロキシアパタイト複合形成体(直3mm、長さ0.5cm)、同様の大きさの金属タンタル、骨形成誘導体のコントロールとしてハイドロキシアパタイトをそれぞれ埋入した。術後6週の時点にて、脛骨を取り出し硬組織切片標本を作製し光学顕微鏡にて観察した。次に、巨大骨欠損充填材の開発目的で、日本白色家兎の両側前肢橈骨に長さ2cmの骨膜および骨欠損モデルを作製した。これに無作為に分けた高密度化CMキチン-ハイドロキシアパタイト複合形成体(直径5mm、長さ2cm)あるいはFGF(100μg/ml)浸潤高密度化CMキチン-ハイドロキシアパタイト複合形成体(直径5mm.長さ2cm)にて充填した。骨欠損充填家兎は、術後2週、4週、8週にて屠殺し、骨形成の程度につき光学顕微鏡にて観蔡した。(結果)家兎脛骨に埋入した充填材では、骨形成は金属タンタル、ハイドロキシアパタイトではほぼ同等の骨侵入が見られたのに対し、CMキチンでは生体内での反応が早すぎたためと思われる炎症性肉芽組織が多く見られた。このため、CMキチンを高密度化した材料を再度作製して骨欠損部位に充填した。巨大骨欠損に充填した高密度化CMキチン-ハイドロキシアパタイト複合形成体は、脛骨の時と同様に炎症性肉芽組織が多く見られ、骨癒合は形成されなかったが、FGF浸潤高密度化CMキチン-ハイドロキシアパタイト複合形成体充填群では4例中1例に骨癒合が得られた。従って、FGF浸潤高密度化CMキチン-ハイドロキシアバタイト複合形成体を骨次損に充填材として使用することは、周囲の環境などを整えることで骨癒合に有効に作用する可能性があると考えられる。
RNAiを用いたショウジョウバエ変異体ライブラリーの構築

我々の開発したDNA型RNAiの、ハエ個体での使用上での有効性、問題点を洗い出すために、変異体表現型の分かっている遺伝子について検討を始めた。RNAiコンストラクトを作製中の遺伝子は55種類、ベクターコンストラクトは122である。既に38遺伝子/88コンストラクトを作成してハエに導入し、そのうち68コンストラクトについては形質転換系統を合計586系統樹立した。これらのうち、5遺伝子を用いた実験がら、IR-cDNA断片を強制発現すると、表現型においてもまたmRNA量においても、loss-of-function変異をGal4driver依存的に誘導できること、IRは、head to headにアレンジした方がより効果的であること、及びORFの方がUTRよりも効果が高いこと、が判明した。ORF断片の長さ500bp程度では、ほとんど何等の問題も生じなかった。染色体上の位置やコピー数がRNAi効果に影響を及ぼすかもしれない。この問題点は、transgeneに一般に関わる問題ではあるが、ゲノム網羅的な高効率RNAi遺伝子機能破壊系統作成を考えるときは、特に重要な検討事項となる。弱い表現型を示すemc遺伝子IRとdppGal4を同じ染色体上に組み合わせた系統を作成し、これを染色体欠失系統に交配した。74の第3染色体欠失を調べると、およそ1割で表現型の増強/抑圧が観察され、多数のエンハンサー・サプレッサーの存在の可能性が示唆された。他の遺伝子についても同様の解析をおこない、共通する染色体領域を特定することによりこれらの遺伝子を特定したい。このようなRNAiのmodifier screenの試みをさらに拡げ、他種生物のRNAi関連遺伝子のハエでのcounterpartの機能解析の解析も進め、ハエでのRNAiの作用機構を解明したい。核から細胞質へのdsRNAの移行を促進するためにIRの間にイントロンを導入したSCベクターを作成した。現在それをハエに戻している。
ミスマッチ修復依存のアポトーシスを誘導するクロマチン動態の解析

損傷塩基の一つであるO6-メチルグアニン(O6-mG)は、DNA複製の際にシトシン以外にチミンと誤対合し、突然変異を誘発する。ヒトはこの損傷に対してMutSα複合体、MutLα複合体に依存したミスマッチ修復機構によってアポトーシスを誘導することが知られている。この機構は発ガンに対して抑制的に働くが、詳細な分子機構は不明な点が多い。本年度は最終年であるため、論文投稿を目的として補完する実験を行なった。その結果、MNU処理した細胞の突然変異頻度はSMARCAD1欠損株が野生株と比べて有意に上昇することが確認された。この突然変異頻度の上昇は、MNUによって生じたO6-mGに対してミスマッチ修復が機能しないため突然変異頻度が上昇したと考えられる。そのためSMARCAD1がミスマッチ修復に寄与していることを改めて確認することができた。今後、変異型SMARCAD1を用いて示唆したSMARCAD1のクロマチンリモデリング活性とミスマッチ修復の関係を、O6-mG損傷部位周辺のクロマチン状態の解析する必要があり、今後の課題となった。具体的にはMutSα複合体、MutLα複合体のサブユニットといったミスマッチ修復関連タンパク質を免疫沈降することでO6-mG損傷部位特異的に存在するヒストンを共沈させ、その量、並びにヒストンの修飾を解析することでクロマチンの状態を明らかにすることができる。最後に本年度は最終年度であるため、今までの成果を論文としてまとめ、投稿した。損傷塩基の一つであるO6-メチルグアニン(mG)は、DNA複製の際にシトシン以外にチミンと誤対合し、突然変異を誘発する。本年度は、野生株とSMARCAD1ノックアウト細胞株を比較することでO6-mG損傷によるアポトーシス誘導にSMARCAD1が関与するか検証を行った。アルキル化剤メチルニトロソウレア(MNU)によって人為的にO6-mG損傷を起こした野生株は、薬剤処理から48時間以降にアポトーシス特異的な現象であるサブG1(DNAの断片化)、Caspase-9/PARP1の切断(タンパク質の断片化)の増加が観察される。これに対してSMARCAD1ノックアウト細胞株は薬剤処理から48時間経過してもサブG1、Caspase-9/PARP1の切断に対して野生株のような顕著な増加がみられず、アポトーシスに対して抑制的な結果となった。これは、SMARCAD1がO6-mG損傷によって引き起こされるアポトーシスに対して促進的に機能することを示唆する。さらにSMARCAD1がミスマッチ修復経路のどこに機能するか調べるため、免疫沈降法を用いてMutSα複合体のサブユニットMSH2と相互作用するタンパク質を解析した。SMARCAD1はMSH2との相互作用が以前から示唆されており、SMARCAD1の有無の影響が大きいと考えた。その結果、O6-mG損傷時の野生株においてみられるMutSα複合体とMutLα複合体の結合がSMARCAD1ノックアウト細胞株において有意に減少した。この結果は、SMARCAD1によるアポトーシス誘導の促進がミスマッチ修復の分子機構特異的に起きたことを示している。本年度の研究により「SMARCAD1がO6-mG損傷によるアポトーシスを誘導する」という仮説の立証に必要であったSMARCAD1ノックアウト細胞を用いたアポトーシス特異的な現象の解析が進んだ。さらにO6-mG損傷特異的にみられるMutSα複合体とMutLα複合体間の相互作用にSMARCAD1が影響していることを新たに見出せたため。本年度は、ATP依存型クロマチンリモデラーであるSMARCAD1のATPase活性が前年度明らかにしたアポトーシス誘導の促進に関与するか検証を行った。SMARCAD1ノックアウト細胞に野生型SMARCAD1、並びにATPase活性変異型SMARCAD1がそれぞれ野生株のSMARCAD1と同程度に発現させた復帰株を作成した。そしてこれら株に対してアルキル化剤メチルニトロソウレア(MNU)処理を行い、サブG1(DNAの断片化)、Caspase-9/PARP1の切断(タンパク質の断片化)を比較した。野生型SMARCAD1発現株は野生株と同等の応答を示し、復帰を確認した。これに対しATPase活性変異型SMARCAD1発現株は変化がなく、SMARCAD1ノックアウト株と同じ表現系であるサブG1量、Caspase-9/PARP1の切断量の抑制を示した。さらに免疫沈降法を用いたMutSα複合体とMutLα複合体によるミスマッチ複合体の形成量の変化も野生型SMARCAD1発現株は野生株と同等まで復帰したのに対して、ATPase活性変異型SMARCAD1発現株はSMARCAD1ノックアウト細胞と同様に減少を示した。

以上よりSMARCAD1のクロマチンリモデラーとしての機能がミスマッチ修復依存的なアポトーシス誘導の損傷認識に寄与していることが明らかとなった。本年度の研究によりATP依存型クロマチンリモデラーであるSMARCAD1のATPase活性がO6-mG損傷によるアポトーシス誘導の促進に関与していることを明らかにすることができたから。損傷塩基の一つであるO6-メチルグアニン(O6-mG)は、DNA複製の際にシトシン以外にチミンと誤対合し、突然変異を誘発する。ヒトはこの損傷に対してMutSα複合体、MutLα複合体に依存したミスマッチ修復機構によってアポトーシスを誘導することが知られている。この機構は発ガンに対して抑制的に働くが、詳細な分子機構は不明な点が多い。本年度は最終年であるため、論文投稿を目的として補完する実験を行なった。その結果、MNU処理した細胞の突然変異頻度はSMARCAD1欠損株が野生株と比べて有意に上昇することが確認された。この突然変異頻度の上昇は、MNUによって生じたO6-mGに対してミスマッチ修復が機能しないため突然変異頻度が上昇したと考えられる。そのためSMARCAD1がミスマッチ修復に寄与していることを改めて確認することができた。今後、変異型SMARCAD1を用いて示唆したSMARCAD1のクロマチンリモデリング活性とミスマッチ修復の関係を、O6-mG損傷部位周辺のクロマチン状態の解析する必要があり、今後の課題となった。具体的にはMutSα複合体、MutLα複合体のサブユニットといったミスマッチ修復関連タンパク質を免疫沈降することでO6-mG損傷部位特異的に存在するヒストンを共沈させ、その量、並びにヒストンの修飾を解析することでクロマチンの状態を明らかにすることができる。最後に本年度は最終年度であるため、今までの成果を論文としてまとめ、投稿した。今後は、SMARCAD1ノックアウト細胞に野生型SMARCAD1、並びに変異型SMARCAD1が野生株のSMARCAD1と同程度に発現させた復帰株を作成する。野生型SMARCAD1復帰株はO6-mG損傷に対して野生株と同様の応答を示すことが期待される。また変異型SMARCAD1は自身のクロマチンリモデリング活性とミスマッチ修復依存的なアポトーシス誘導の相関を明らかすることに寄与すると予想される。さらにクロマチン構造の指標であるヒストンの修飾を観察することでミスマッチ修復機構におけるクロマチン構造の重要性を示したいと考えている。SMARCAD1がミスマッチ修復機構やこの機構依存的なアポトーシス誘導に関与するなら、SMARCAD1との相互作用因子がO6-mG損傷部位特異的にリクルートされる可能性が高い。このリクルートされた因子群には未知のアポトーシス誘導制御因子が含まれている可能性もあり、これを同定するためにO6-mG損傷部位に集まるタンパク質を質量分析を用いて特定する。次年度の前半に条件検討を行い、後半には質量分析を行いたいと考えている。今後は、O6-mG損傷部位周辺のヒストンの量、及び修飾を解析する予定である。現在のSMARCAD1抗体やMSH2抗体を用いた免疫沈降法では共沈の効率が悪く、十分なヒストンを共沈できない。