hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
硫黄細菌由来光活性化アデニル酸シクラーゼの構造機能連関の解明

本研究は、光活性化アデニル酸シクラーゼ(PAC)の活性化メカニズムを明らかにすることを目的として企画されたものである。本研究において、シアノバクテリアOscillatoria acuminataから新たに見出された光活性化アデニル酸シクラーゼ(OaPAC)が大腸菌において良好な可溶性タンパク質として精製可能であることが示された。これを用いて分光学的、酵素学的特性を明らかにするとともに、共同研究によりX線結晶構造の解明にも成功した。本研究は、光で直接活性化されてcAMPを産生する特異な光センサータンパク質、光活性化アデニル酸シクラーゼ(PAC)の活性化メカニズムを明らかにすることを目的として企画されたものである。本年度は硫黄細菌Beggiatoa由来の光活性化アデニル酸シクラーゼ(BsPAC)を材料として多数の変異体を作成し、アデニル酸シクラーゼ欠損大腸菌の機能相補を指標として機能上重要なアミノ酸残基を特定するとともに、活性を保持した試料の大量発現・精製法を確立することを目標とした。1. BsPACへの変異導入BsPACの発現ベクター(pColdBsPAC4)に対して部位特異的変異導入を行い、これまでに機能上重要と判断されたQ49, K94, L113等のアミノ酸残基に加えて、G138が光活性化に欠かせない事が明らかとなった。これによりBsPACの分子内信号伝達に関する情報の集積が進んだ。2.大腸菌におけるBsPACの大量発現・精製好冷温細菌由来のシャペロニンを発現する宿主大腸菌(ArcticExpress,)をpColdBsPAC4で形質転換することにより、比較的良好なフラビン結合性を示す試料が得られることを確認し、さらにその発現条件あるいは封入体からの再生条件を検討したが、十分な精製度の試料を得ることができなかった。一方、本研究の応募後に公開された細菌のゲノム情報中にBsPACの類似遺伝子(OaPAC, TpPACと仮称)を見出し、それらの大腸菌での発現を試みたところ、純度の高い試料を得ることに成功し、さらにそれらが光活性化アデニル酸シクラーゼとして機能することも確認できた。本年度は、前年度新たに見出されたバクテリア由来の光活性化アデニル酸シクラーゼ(OaPAC)に注目し、これの光応答特性ならびに酵素活性をin vivoとin vitroの両面から明らかにするとともに、X線結晶構造解析に供するための試料調製条件を確立することを目標とした。1アデニル酸シクラーゼ欠損大腸菌の機能相補によるOaPACの機能解析昨年度までの研究で明らかとなったBsPACの機能上重要なアミノ酸残基に注目し、OaPACでこれらに対応するアミノ酸残基に対する置換体をコードするベクターを作成した。これらをアデニル酸シクラーゼ欠損大腸菌株に形質転換し、MacConkey平板培地でのコロニーの着色によりアデニル酸シクラーゼ活性の評価を行った。その結果、BsPACと同様、BLUFドメインのC末端側およびシクラーゼドメインとのリンカー領域に複数の重要なアミノ酸残基を見出すことができた。2大腸菌におけるOaPACの大量発現・精製好冷温細菌由来のシャペロニンを発現する宿主大腸菌(ArcticExpress)を用いて低温で長時間培養することにより、活性を保持した可溶性タンパク質としてOaPACを回収できることを前年度に確認しており、この発現条件を吟味して良好な試料を得る条件を確立した。ここで得られた試料を用い、BLUFドメインの光応答を紫外可視分光により検討し、光サイクルの特徴を明らかにした。また、アデニル酸シクラーゼ活性の金属イオン要求性および基質濃度依存性を明らかにした。さらに、構造生物学の専門家との共同研究を開始し、結晶化からX線結晶構造解析へと進むことができた。本年度は、前年度までに試料の大量調製に成功し、生化学的、分光学的特性が明らかとなったシアノバクテリア由来の光活性化アデニル酸シクラーゼ(OaPAC)について外部研究者の協力を得てX線結晶構造解析に供するとともに、ゲノムデータベース上に新たに見出した類似配列の機能解析を進めた。1 OaPACのX線結晶構造解析と変異導入外部研究者との共同研究によりOaPACのX線結晶構造解析に成功した。得られた構造情報に基づいて部位特異的変異導入を行い、アデニル酸シクラーゼ欠損大腸菌の機能相補ならびにin vitro酵素活性測定により変異体の機能解析を進めた。その結果、光受容から酵素活性化にいたる分子内シグナリング経路の概要が明らかとなった。2新規光活性化アデニル酸シクラーゼの機能解析上記によりOaPACに関しては当初目的を達成したので、オプトジェネティック・ツールボックスの拡充を目指して他の生物由来の光活性化アデニル酸シクラーゼの探索を行った。シアノバクテリアPseudanabaena biceps PCC 7429および放線菌Ilumatobacter coccineus YM16-304のゲノム上に新たに光活性化アデニル酸シクラーゼ様の配列を見出し、それぞれPbPAC, IcPACと名付けて機能解析を試みた。

その結果、PbPACはアデニル酸シクラーゼ欠損大腸菌に対して光依存的に機能相補することが示されたが、IcPACは活性がみとめられず、偽遺伝子である可能性が示唆された。本研究は、光活性化アデニル酸シクラーゼ(PAC)の活性化メカニズムを明らかにすることを目的として企画されたものである。本研究において、シアノバクテリアOscillatoria acuminataから新たに見出された光活性化アデニル酸シクラーゼ(OaPAC)が大腸菌において良好な可溶性タンパク質として精製可能であることが示された。これを用いて分光学的、酵素学的特性を明らかにするとともに、共同研究によりX線結晶構造の解明にも成功した。本研究は当初計画では硫黄細菌由来の光活性化アデニル酸シクラーゼ(BsPAC)を用いてその光活性化メカニズム解明を目指していたが、新たに見出したバクテリア由来の類似タンパク質(OaPAC)に軸足をシフトすることにより、大幅に進展した。OaPACは大腸菌での発現が容易であり、活性を保持した試料の大量調製が可能となったことがその要因である。光生物学本年度の研究において、バクテリア由来の新規光活性化アデニル酸シクラーゼ(OaPAC)の光化学的特性ならびに酵素学的特性の概要が明らかとなった。BsPACに類似した遺伝子をこれまでに公開されたバクテリアゲノム配列中で検索すると、OaPAC以外にも幾つか存在することがわかっており、今後はこれらについても光依存的酵素活性の評価を進めていく。また、OaPAC変異体についても活性評価を詳細に行い、オプトジェネティック・ツールとして優れた特性を持つ光活性化アデニル酸シクラーゼの探索を進める。さらに、積極的なドメイン交換等の手法により新規な光活性化酵素の創出も試みる。本研究は硫黄細菌由来の光活性化アデニル酸シクラーゼ(BsPAC)を用いてその光活性化メカニズム解明を目指したものであり、アデニル酸シクラーゼ欠損大腸菌の機能相補を指標とした解析ではそれなりの結果を得ることができた。一方、X線結晶構造解析を視野に入れた大量発現系の確立に関しては困難を極めていたが、他のバクテリアゲノム中に類似配列を見出し、それらを用いることで極めて良好な試料を得ることができた。これは画期的なことであり、今後結晶化へ向けて大きな展望が開けた。購入を予定していた試薬の国内在庫がなく、年度内納品が無理であることが判明したためキャンセルした。本年度の研究において、バクテリアゲノム中に新たなPAC類似遺伝子(OaPAC, TpPAC)の存在がわかり、それらが光活性化アデニル酸シクラーゼとして機能することが確認できた。しかもそれらは大腸菌での大量発現・精製が容易で、X線結晶構造解析に供する試料の調製も十分に可能と考えられる。そこで今後は特にOaPACを材料として、その光化学的、酵素学的特性を明らかにするとともに、結晶化条件の検討を進めることになる。また、BsPACで集積された変異体の機能に関する知見もOaPACで再検討を進める。次年度分の消耗品費に合算し、同試薬の購入に充てる。
NASH発症における自然免疫防御反応とKupffer細胞の機能分化の解析

NASH発症病態においてKupffer細胞の機能異常は重要である。本研究において、NASH肝組織ではKupffer細胞サブセットであるCD11b+Kupffer細胞が増加し、CD68+Kupffer細胞が減少していた。また、1Gy放射線照射にてCD11b+Kupffer細胞数を減少させると、肝脂肪化に変化はないが肝臓の炎症と線維化は著明に改善した。一方、クロドロネート投与にてCD68+Kupffer細胞を減少させると肝障害は増悪した。以上より、CD68+Kupffer細胞および骨髄由来CD11b+Kupffer細胞の肝臓内集積はNASH発症病態に極めて重要な役割を果たしている。これまで我々は、非アルコール性脂肪肝炎(NASH)発症においてKupffer細胞の機能異常が、その病態進展において需要な役割を果たしていることこれまで明らかにしている。昨年からの我々の検討では、NASHモデル動物においては、Kupffer細胞サブセットであるCD11b+Kupffer細胞が増加しCD68+Kupffer細胞が減少することが明らかになった。さらに、サイトカイン分泌を主に担うCD11b+Kupffer細胞が増加し、貪食能を主に担うCD68+Kupffer細胞が減少することが明らかとなった。NASH肝においてはKupffer細胞が増加するが、そのサブセットの変化がサイトカインの過剰分泌とともに貪食能の低下という自然免疫の異状状態を来たしていることが明らかとなった。また、肝臓はNASHに至る前の脂肪肝の段階から細胞サブセットの変化と機能異常がCD11b+Kupffer細胞が認められることも明らかとなった。さらに、CD68+Kupffer細胞は肝臓レジデントな細胞であると推定されるのに対し、CD11b+Kupffer細胞は主に脾臓や骨髄などの肝臓外から流入する細胞が中心であることが明らかとなった(PLoS One. 2014 Mar 25;9(3):e92515.)。以上のように、研究助成により順調に研究成果が上がっているものと考えられる。これまで我々はNASH(非アルコール性脂肪肝炎)発症病態においてKupffer細胞の機能異常が重要な役割を果たしている事を明らかにしてきたが、さらに「肝臓の自然免疫防御としてのKupffer細胞のサブセットの変化による異常状態と細胞老化」に焦点を当て、NASHの病因解明にアプローチすることを本研究の目的して研究を進めてきた。NASHモデル動物においては、Kupffer細胞サブセットであるCD11b+Kupffer細胞が増加しCD68+Kupffer細胞が減少するが、サイトカイン分泌を主に担うCD11b+Kupffer細胞が増加し、貪食能を主に担うCD68+Kupffer細胞が減少することが明らかとなった。また、CD68+Kupffer細胞は肝臓レジデントな細胞であると推定されるのに対し、CD11b+Kupffer細胞は主に脾臓や骨髄などの肝臓外から流入する細胞が中心であることが明らかとなった。さらに、肝切除など急激な肝再生の際にはCD11b+Kupffer細胞は骨髄からの供給が主体となっていることも明らかとなった。(PLoS One. 2015 ;10(9):e0136774.)。また、未発表データーながら、NASH肝においても急激な肝障害の際にはCD11b+Kupffer細胞の主な供給は脾臓から骨髄にシフトすることが確かめられた(未発表データ)。昨年から本年度にかけて順調に数多くの研究データーが出ており、その実験結果に関する論文発表と学会での報告が行われている。NASH肝においてはKupffer細胞が増加するが、そのサブセットの変化がサイトカインの過剰分泌とともに貪食能の低下という自然免疫の異状状態を来たしていることが明らかとなった(PLoS One. 2014 Mar 25;9(3):e92515.)。昨年から本年度にかけて多くの研究データーが出ており、その実験結果に関する論文発表と学会での報告が行われている。

今後は、NASH発症における肝星細胞およびKupffer細胞の細胞老化の果たす役割について検討を進めていく予定としている。NASHでは肝細胞やKupffer細胞などがアポトーシスを起こしているが、死滅せずに生き残った老化細胞も多く存在していると推定されている。我々の検討でもNASHのKupffer細胞からはIL-6やIL-1、CXCL9などが過剰に分泌されることから、細胞老化を来した肝星細胞およびKupffer細胞が多く認められると考えられる(未発表データ)。マクロファージも疾患に応じて細胞老化を来す状態があることが最近報告されており、同様のことがNASHのKupffer細胞においても認められることが想定される。一般に、CD11b+Kupffer細胞が主に炎症性サイトカインを分泌するとされているが、細胞老化を来すことで炎症性サイトカインを過剰に分泌するKupffer細胞の由来がCD11b+Kupffer細胞なのかCD68+Kupffer細胞なのかなどは明らかになっていない。さらに、NASHのKupffer細胞のうち、アポトーシスおよび細胞老化を来す細胞の割合を評価し、炎症性サイトカインの過剰分泌との関連を明らかにする。以上、細胞老化の評価はこれまでの報告の通り、IL-6やIL-1、CXCL9などSASP因子の発現とp21やp16蛋白の発現により評価を行うこととする。さらにNASHにおいてなぜ死滅せずに生き残った老化細胞が多く存在するのか、また、細胞老化を来す原因について、他の慢性肝疾患モデル動物と比較検討し、NASH特有の現象なのかどうかについても検討を行うこととする。さらに、老化細胞の持続的な存在を防ぐ手段についてもNASHマウスモデルを用いた実験から検討を行うこととする。また、NASH患者から採取した肝組織においてもIL-6やIL-1、CXCL9などSASP因子の発現とp21やp16蛋白の発現について評価を行い、臨床データと比較検討してその原因について明らかにする方向で準備を進めて行く予定である。NASH発症におけるKupffer細胞機能異常やLPSへの過剰反応の重要性が明らかになっており、LPSの起源として腸管内および口腔内からの細菌の重要性が指摘されている。口腔内特に歯周病菌P.gingivalisの関与はNASH発症に重要であることをこれまでに我々は報告してきたが、この自然免疫系への刺激に対し、Kupffer細胞サブセットがどのように変化するのか?また、増加したCD11b+Kupffer細胞ではTLR4, 9およびCD14の発現の亢進が認められるのか?NASHの肝細胞でのみP.gingivalisが検出することと貪食能を有するCD68+Kupffer細胞の減少とはどのような関連があるのか?さらに、腸内細菌との関わりにおいても腸内細菌叢の変化によるKupffer細胞サブセットの変化がどのようになるのか?などについてはまだ明らかではない。このため、当初の予定通り、本研究期間内でこれを明らかにすることを本年度の研究の方策とする。購入予定であった消耗品を購入しなかったため購入予定であった消耗品を購入しなかったため。28年度に購入・使用予定である。
レーザ微生物DNA組替法において誘起される流動の制御に関する研究

本研究ではレーザトラッピングという手法を含め,レーザを用いた微粒子やDNAなどのマニピュレーションに焦点を置き、微粒子に対し光放射圧を作用させマニピュレーションする手法と液体内の流動を利用して,微粒子やDNAなどの運動を誘起させる手法を用い、以下の成果を得た.1)幾何光学理論に基づいて算出した微粒子のトラッピング力は,照射されるレーザ光の出力に比例し,レーザ光の入射角と屈折角により決定される無次元数トラッピング効率に依存する.レーザ光の入射角は対物レンズの開口数に依存し,屈折角は微粒子と媒質の屈折率に依存するので、シリカ微粒子,ガラス微粒子,ポリスチレン微粒子に対し,レーザトラッピングを行った際に得られるトラッピング効率結果を得た.2)レーザトラッピング用の光源にQスイッチを用いたパルス化レーザ光では、従来の連続発振レーザ光を用いた場合のトラッピング力を上回ることができた.また大気中微粒子のレーザマニピュレーションが可能となった.マニピュレーションに必要なレーザ出力は,パルスレーザ光のピーク出力に関係性があり,平均照射出力に依存しないことがわかった.3)微粒子レーザマニピュレーションの操作性向上のために,ガルバノスキャナを採用した.PCとDAボードを用いてガルバノスキャナを制御するための信号を出力し,微粒子に照射する光軸を高速走査することで,一本のレーザ光によって複数の微粒子を操作し,複数微粒子の輸送が可能となった.また,複数微粒子の輸送の原理を応用して,時間変容するマイクロ文字の作製が可能となった.4)液滴内微粒子にレーザ光を照射することで,液滴内に生じる微小な対流を利用し,微粒子の回転を行った.回転数は照射レーザ出力に依存せず,回転径に依存することがわかった.微粒子の回転に利用する対流は,マランゴニ対流であるが,対流の強さや大きさを評価することができなかったので,今後、数値解析,解析解が必要である.本研究ではレーザトラッピングという手法を含め,レーザを用いた微粒子やDNAなどのマニピュレーションに焦点を置き、微粒子に対し光放射圧を作用させマニピュレーションする手法と液体内の流動を利用して,微粒子やDNAなどの運動を誘起させる手法を用い、以下の成果を得た.1)幾何光学理論に基づいて算出した微粒子のトラッピング力は,照射されるレーザ光の出力に比例し,レーザ光の入射角と屈折角により決定される無次元数トラッピング効率に依存する.レーザ光の入射角は対物レンズの開口数に依存し,屈折角は微粒子と媒質の屈折率に依存するので、シリカ微粒子,ガラス微粒子,ポリスチレン微粒子に対し,レーザトラッピングを行った際に得られるトラッピング効率結果を得た.2)レーザトラッピング用の光源にQスイッチを用いたパルス化レーザ光では、従来の連続発振レーザ光を用いた場合のトラッピング力を上回ることができた.また大気中微粒子のレーザマニピュレーションが可能となった.マニピュレーションに必要なレーザ出力は,パルスレーザ光のピーク出力に関係性があり,平均照射出力に依存しないことがわかった.3)微粒子レーザマニピュレーションの操作性向上のために,ガルバノスキャナを採用した.PCとDAボードを用いてガルバノスキャナを制御するための信号を出力し,微粒子に照射する光軸を高速走査することで,一本のレーザ光によって複数の微粒子を操作し,複数微粒子の輸送が可能となった.また,複数微粒子の輸送の原理を応用して,時間変容するマイクロ文字の作製が可能となった.4)液滴内微粒子にレーザ光を照射することで,液滴内に生じる微小な対流を利用し,微粒子の回転を行った.回転数は照射レーザ出力に依存せず,回転径に依存することがわかった.微粒子の回転に利用する対流は,マランゴニ対流であるが,対流の強さや大きさを評価することができなかったので,今後、数値解析,解析解が必要である.レーザマニピュレーション技術をDNA組替えなどの微生物遺伝子操作へ応用する際に生じる流動現象を明らかにすることが本研究の第一の目的である。微生物が混合された液体が入っている微小セルにはレーザ照射よってどのような外乱としての流動が生じているのかを明らかにし、その流動を制御することが本研究の第二目的である。本年度においては、レーザスキャニング用ガルバノミラーを含む光学系の設計を行った。マニピュレーション用レーザ光源は現有設備の連続発振最大出力16WのYAGレーザを使用する。レーザビーム照射による微小セル内の温度変化計測を行い、レーザ照射時間が液体加熱与える影響実験を行った。短時間レーザ照射を行うため、Qスイッチを平成16年度に購入した。Qスイッチを装着したCW発信型のYAGレーザから、レーザパルスの発信が可能であることをレーザパワー測定により確認した。ガルバノスキャナーによりレーザ発信線1本に対して、複数本のレーザが見かけ上発射されている手法を考案し、その実射を確認できた。レーザ光照射により誘起される液滴に流動を発生させた。流動発生の原因はレーザ照射による液滴を積層されているガラス面が加熱されたことによる液滴内部の自然対流である思われる。また液滴内に混入した固体微粒子の回転運動計測を行った。He-Neレーザ光を液滴に照射し、液滴内微粒子回転によるレーザ光の散乱光変動を計測した。

レーザパワーが340mWならば85Hzの液滴内微粒子回転が発生していることを明らかにした。本研究ではレーザトラッピングという手法を含め,レーザを用いた微粒子やDNAなどのマニピュレーションに焦点を置き、微粒子に対し光放射圧を作用させマニピュレーションする手法と液体内の流動を利用して,微粒子やDNAなどの運動を誘起させる手法を用い、以下の成果を得た.1)幾何光学理論に基づいて算出した微粒子のトラッピング力は,照射されるレーザ光の出力に比例し,レーザ光の入射角と屈折角により決定される無次元数トラッピング効率に依存する.レーザ光の入射角は対物レンズの開口数に依存し,屈折角は微粒子と媒質の屈折率に依存するので、シリカ微粒子,ガラス微粒子,ポリスチレン微粒子に対し,レーザトラッピングを行った際に得られるトラッピング効率結果を得た.2)レーザトラッピング用の光源にQスイッチを用いたパルス化レーザ光では、従来の連続発振レーザ光を用いた場合のトラッピング力を上回ることができた.また大気中微粒子のレーザマニピュレーションが可能となった.マニピュレーションに必要なレーザ出力は,パルスレーザ光のピーク出力に関係性があり,平均照射出力に依存しないことがわかった.3)微粒子レーザマニピュレーションの操作性向上のために,ガルバノスキャナを採用した.PCとDAボードを用いてガルバノスキャナを制御するための信号を出力し,微粒子に照射する光軸を高速走査することで,一本のレーザ光によって複数の微粒子を操作し,複数微粒子の輸送が可能となった.また,複数微粒子の輸送の原理を応用して,時間変容するマイクロ文字の作製が可能となった.4)液滴内微粒子にレーザ光を照射することで,液滴内に生じる微小な対流を利用し,微粒子の回転を行った.回転数は照射レーザ出力に依存せず,回転径に依存することがわかった.微粒子の回転に利用する対流は,マランゴニ対流であるが,対流の強さや大きさを評価することができなかったので,今後、数値解析,解析解が必要である.
口腔癌における癌抑制遺伝子候補ING4の機能解析と新規遺伝子治療開発

特別研究員Esra Gunduzは今回、ING癌抑制遺伝子ファミリーの新規メンバーであるING4の研究継続成果は以下の通りです:a.頭頸部癌または口腔癌由来細胞株であるHSC2,HSC4,SCCKNが用いられた。まずp53およびING4のmutation statusおよび発現レベルの解析を行った。その後p53およびING4単独または併用でTransfectionし、細胞増殖およびApoptosis Assayを行った(MTT、Casp3アッセイなど)。その結果、ING4単独でも十分な細胞増殖抑制が得られた。p53がMutantである細胞でも増殖抑制が見られたが,これはp53mutantではない細胞より増殖抑制は低かった。p53とING4の併用Transfectionしたところ,細胞増殖とApoptotic活性がもっとも高かった。この結果ING4がp53依存的,または非依存的機能を持っていることを示唆した。今回ING4のFull Length発現ベクターが使用されたが、現在核移行シグナルを有するあるいは有しないバリアントについても実験継続中である。b.最近私たちのグループはINGファミリーメンバーであるING3について研究し、頭頸部癌でING3が単独で予後因子として用いられることを発表した。現在私もING4について同様に患者の臨床病理所見と以前行ったmRNA発現レベルを比較し統計解析を行っている。まだ最終段階ではないがING4が減少した患者では,減少していない患者に比較して予後、生存率が悪いことを示している。c.頭頸部癌または正常組織でING4抗体を用いて免疫染色を行った。その結果正常組織も癌組織もING4蛋白を発現した。しかし癌組織の染色は弱かった。興味深いことに,正常組織ではING4は核に陽性を示すが、腫瘍組織では細胞質が陽性を示す細胞も多くみられた。これはING4のバリアントが関係している以外に,癌化の段階でING4が細胞質に移動している可能性も示唆した。現在患者の臨床病理所見と染色パターンなど解析している。さらに,ING4は最近新生血管形成も抑制しているという報告があるので新生血管形成と関係あるリンパ節転移などの解析と比較もしているところです。最終的にこの研究で得られた結果から,実験動物でも予後または分子治療の可能性を検討するため実験計画を立てている。特別研究員Esra Gunduzは広汎なヒト腫瘍で有力な癌抑制遺伝子として機能すると思われるINGファミリー遣伝子の作用機序について多数の研究成果を発表して来た。今回、ING癌抑制遺伝子ファミリーの新規メンバーであるING4め機能を解明するために研究を始めた。まず口腔癌と正常の組織ペアーでING4の欠失を特異的に検出できるマーカーを設定し、39例でヘテロ接合性の消失(LOH)を検討したところ、高頻度のLOH(60%以上)を見つけた。さらに腫瘍でのING4のmRNA発現をrealtimeRT-PCRで調べたところ、正常に比較してING4発現は腫瘍で著明に減少した。非常に面白い結果として、ING4のさらに3つの新規splicingバリアントを同定した。このバリアントの発現は正常組織でも腫瘍組織でも発現しているため重要な役割を持つと考えられた。このバリアントは核移行シグナルを有するものと有しないものがあるので癌化の段階で重要な意味があると考えられた。ING4の機能解析を行うためにING4のORFにタッグを付けて、PCDNA3にクローニングし、発現ベクターを作製した。ING4の発現ベクターまたはコントロールの空ベクターを293、SCCKN、HSC2またはHSC3細胞株にトランスフェクションし、細胞増殖を検討した。トランスフェクションの効率を先にGFP発現ベクターで確認したところ、293またはHSC3の細胞株では導入は良かった。Trypan Blue Dyeアッセイとmicroplate readerによりMTTアッセイを行った。preliminaryの結果では空ベクターに比較してING4の過剰発現は有意的に細胞増殖を抑制した。さらに、上述の細胞株を抗癌剤の5-FU、Cysplatin、Etoposideを10mM、40mMまたは100mM濃度で処理し、ING4、及びapoptotic(Bax)またはproapoptotic(Bel-2)のmRNA発現を検討している。さらにp53の発現ベクターの併用トランズプ1クジョシにより、p53依存的または非依存的シグナル経路も現在検討中である。

現在私もING4について同様に患者の臨床病理所見と以前行ったmRNA発現レベルを比較し統計解析を行っている。まだ最終段階ではないがING4が減少した患者では,減少していない患者に比較して予後、生存率が悪いことを示している。c.頭頸部癌または正常組織でING4抗体を用いて免疫染色を行った。その結果正常組織も癌組織もING4蛋白を発現した。しかし癌組織の染色は弱かった。興味深いことに,正常組織ではING4は核に陽性を示すが、腫瘍組織では細胞質が陽性を示す細胞も多くみられた。これはING4のバリアントが関係している以外に,癌化の段階でING4が細胞質に移動している可能性も示唆した。現在患者の臨床病理所見と染色パターンなど解析している。さらに,ING4は最近新生血管形成も抑制しているという報告があるので新生血管形成と関係あるリンパ節転移などの解析と比較もしているところです。最終的にこの研究で得られた結果から,実験動物でも予後または分子治療の可能性を検討するため実験計画を立てている。
発展途上国における新興感染症に対する早期警戒システムの構築のための基礎研究

近年の新興感染症では短期間に世界中に国境を越えて広がるということが特徴としてあげられ、効果的な対応するためには、従来のサーベイランスを強化するとともに新たなシステムを開発する必要がある。本研究を通して、サーベイランスデータの解析ではその地域の人口学的な特徴を勘案する必要があること、難民の発生地域など脆弱な保健システムにおいてもサーベイランスによる探知が対策に必須であること、その中で実験室的な確定診断が重要であるが、核酸増幅や抗体検出などの新たな系の確立が重要であると考えられた。近年のグローバリゼーションや交通網の発達は、感染症対策に関する研究でも大きな転換点となっており感染症アウトブレイクの初期の兆候をすばやく検出する早期警戒システム(Early warning system)およびそれを受けた迅速な初期対応が感染拡大とならないために不可欠であると考えられる。平成19年度はフィリピン共和国を研究地域として、途上国において安全で効果的な検体輸送の可能性について検討するとともに、途上国における感染症サーベイランスシステムの現状を整理した。検体輸送の可能性については特に市販されている検体の乾燥保存キットのうちRNA抽出データのある核酸保存濾紙(FTA paper, Whatman)を利用したインフルエンザウイルス検出の感度試験を行った。キットの操作手順書に従い1×10^5pfu/mlというウイルス濃度を滴下したのちにRealTime PCRを施行したが検出効率が悪いことが判明した。今後は、punchingしたディスクの枚数を増やすことなどを含めて検討する予定である。世界保健機関によれば2005年のフィリピンにおける罹患率上位10位のうち肺炎(人口10万あたり828人)、気管支炎(人口10万あたり739人)およびインフルエンザ(同487人)が含まれており、急性呼吸器感染症のdisease impactが大きいと考えられる。一方でその病因を明らかにしてゆくことは早期警戒システムの構築に重要であると考えられ、とくにRNAウイルスの同定に向けた検体の輸送系を確立することは意義があると考えられる。近年のグローバリゼーションは、感染症にも大きな影響を与えており重症急性呼吸器感染症(SARS)を例にとっても短期間で世界規模へ伝播が広がることが示された。すなわち感染症アウトブレイクの初期の兆候をすばやく検出する早期警戒システム(Early warning system)およびそれを受けた迅速な初期対応が感染拡大を防ぐために不可欠であり、世界保健機関では世界保健規則を改定して重大な健康事象の早期探知・報告を国家責任としているがほとんどの途上国の現行のサーベイランスは早期警戒システムとして機能していないことが初期対応の大きな障害となっている。本研究では途上国における既存のサーベイランスシステムの強化につながる研究をすすめるとともに、特に重症急性呼吸器症候群のような未知の感染症が出現した際にも異常シグナルを感知し早期対応がとれる感度の高いシステムを新たに構築することを目的として研究を進めている。1)自然災害あるいは紛争による健康システムの破壊は感染症の流行を引き起こす重要な要因であると考えられる。2004年に紛争による難民キャンプの設置が行われたコートジボアールでの麻疹および風疹の集団発生について難民における麻疹の流行に関する文献的検討を踏まえてまとめたところ、積極的症例探査の意義、集団予防接種などの速やかな対策連携、症例を踏まえた対象年齢の設定が重要であることが明らかとなった。2)モンゴルにおけるインフルエンザ関連超過死亡の評価を継続して実施したが乳幼児死亡率の低下および高齢者割合の増加が特徴的な人口構造では疾病負荷が超過死亡によってはきちんと反映されない可能性が示唆された。3)フィリピンにおける麻疹の分子疫学的解析を行ったところ、ワクチンキャンペーン全後に別の遺伝子型(D3とG3/D9)が出現していることが明らかとなった。対策により有病率が低下するワクチン予防疾患におけるサーベイランスの重要性が示された。すなわち感染症アウトブレイクの初期の兆候をすばやく検出する早期警戒システム(Early warning system)およびそれを受けた迅速な初期対応が感染拡大を防ぐために不可欠であるが、ほとんどの途上国でのサーベイランスでは早期警戒システムとして機能していないことが初期対応の大きな障害となっている。自然災害あるいは紛争による健康システムの破壊は感染症の流行を引き起こす重要な要因であると考えられる。とくに難民での麻疹のアウトブレイクを中心に文献研究を行ったところ、サーベイランスの構築と集団予防接種などの対策の連携が重要であることが明らかとなった。またフィリピンでは、2008年にレストンエボラウイルスの感染がブタで確認されたが、このウイルスのN蛋白を抗原として用いたIgG-ELISAの系を確立することで、農場における感染の浸淫度について検討を行うことが出来た。さらに同国でおこなわれている急性弛緩性麻痺サーベイランスにて探知されたポリオ以外のエンテロウイルスのうち3例はEV71であることを明らかとした。

これらはいずれも従来のサーベイランスでは同定あるいは検出できなかったものに対して新しい検出方法によって同定しており、疫学像の把握とともにこの検出系の途上国における実現性についても検討を進める必要があると考えられた。以上から途上国における早期警戒システムとしての感染症サーベイランスが対策に果たす役割が自然災害や紛争による難民においても確認された。またそのシステム構築の際には、適切に病原体を検出するような検査系の確立が重要であると考えられた。
クラカタウ諸島におけるハチ・アリ類の移住過程にかんする研究

3年間の研究により,現在のカリバチ相,ハナバチ相,アリ相,シロアリ相をかなり正確に把握することができた。今回4島から7科46種のカリバチが得られたが,これは1982年における62種の74.2%にすぎない。1982年ですでに平衡種数に達していたグループがあったが,今回は全てのグループで前回を下回った。ハナバチでは1982年に24種,今回23種とほとんど変化がなかった。これに対して,アリとシロアリでは1982年にくらべ顕著な増加がみられた。アリの場合,約100年間ほぼ同じ率で種数の増加が続いている(82年77種,今回95種)。シロアリでは,1996年の調査が不十分であった(9種)ため,それ以後の増加が急勾配となったが(今回は19種),100年間通してみると種数曲線はほぼ同じ傾きで推移している。カリバチやハナバチにはオープンな環境を生息地としている種が多いため,森林の発達によって生息地の面積が減少し,種数が頭打ちになったり減少したと思われる。一方,アリやシロアリには元来森林性の種が多く森林の発達にともない種数が増えることが予想されたが,予想通り依然として増え続けている。アリにおいては撹乱地性の種が姿を消し,森林性の種が新たに発見されたケース(植生遷移にともなう回転)が多く見られた。このように,分類群の性格により平衡種数に達する期間が異なることが実例で示された。クラカタウ諸島へのこれらの昆虫の移住様式については,シロアリで木材などのドリフトによるものが強く推定された。また,アリにおいても女王に翅がないハシリハリアリの1種の定住が確認されたことから,ドリフトによる移住があったことがわかった。材に営巣するジガバチモドキ類でも同様のことが示唆された。しかし,ハチやアリでは飛翔して移住してくる種が多数を占めるものと思われる。2005年8月8-24日にインドネシアにおいて野外調査を実施した(クラカタウ諸島および周辺地域における調査は実質11日間)。インドネシア側からはボゴール動物博物館のDrs Rosichon Ubaidillah,ボゴールハーバリアムのDr.Tukirin Partomihardjo,シア・クアラ大学のMr.Syaukaniが参加した。最初の4日間は,クラカタウへの生物移住にとって飛び石の役割をはたしているセベシ,セブク両島を,残りの7日間でクラカタウの4島を調査した。ファウナの調査は,アリでは主にコロニー採集,有剣ハチ類(ハナバチ・カリバチ)では海岸や森林内のギャップでの見つけ採り,寄生バチではスウィーピング,シロアリではトランセクト法によって実施した。これまでに,アリ,有剣ハチ類,シロアリについては,クラカタウで得られたほぼ全ての標本のソーティングが完了した。アリは全体で38属74種が採集され,1982年の32属68種をわずかに上回った。平衡種数が達成されたかどうかの判断には継続調査が必要である。植生の変化にともなう種の入替りが確認された。放浪種をふくむ広域分布種は15種採集されたが,イエヒメアリ,ツヤオオズアリ,アカカミアリといった重要放浪種は見いだされなかった。ハナバチは12属22種,カリバチは21属34種で,1982年にくらべて種数はむしろ減少した。

これは,植生遷移の進行によって,オープンサイトの面積が減少し,ハチ類の生息場所が減少したためと考えられる。しかし,調査時期が乾期であったため,雨期における追加調査が必要である。アリ,ハチをつうじて,コロニー増殖を巣分かれのみで行う種は確認されなかった。シロアリはトランセクト調査を重視しマニュアル採集をほとんど行わなかったため,若干の採りこぼしがあると思われる。4島合わせて5属14種が採集され,その内6種がクラカタウ初記録であった。現在,島間のファウナの類似度,セベシ・セブクのファウナとの比較など詳細な分析を進めている。2005年には乾期である8月に調査を実施したため,今年度は雨期である12月下旬から1月にかけて調査を実施した。また,今回はクラカタウヘの供給源として重要なジャワ島西部(チャリタ)での調査も行った。実質的な調査日数は,チャリタで2日間,クラカタウの4島で各島1-2日間であった。またシロアリに関しては,クラカタウとの比較のため,長期にわたって安定した生態系を維持してきたスマトラ沖のメンタワイ諸島において,2007年2月13日一3月2日に調査を実施した。ハナバチ・カリバチ類は見つけ採りとスウィーピングで採集し,チャリタでは2科5属12種31個体のハナバチ,26種108個体のカリバチ,クラカタウでは3科8属12種103個体のハナバチ,31種165個体のカリバチがえられた。雨が多く,開花植物が少なかったため,採集された種数は予想したよりは少なかったが,ハナバチで1種クラカタウ初記録種が採集された。島レベルでは6種を新たに記録した。アリ類はコロニー・ベースでの採集に努め,営巣場所の特定を行った。また花外蜜に誘引されるアリ相を解明するため,おもに海岸に生育するパイオニア樹種を対象にサンプリングを試みた。チャリタではサンプル管で25本,クラカタウ4島で215本分のアリが採集された。チャリタではおよそ30種,クラカタウではおよそ50種が採集された。シロアリはクラカタウ諸島で合計160コロニーが採集された。前回の調査と比べると属レベルでは追加はなかったが,種レベルでは2-3種の追加があった。メンタワイ諸島では,クラカタウ諸島とは属や種の構成において大きな違いが見いだされた。原著論文は,来年度にスマトラ島南部の調査を終えてから,全データを比較した上で執筆の予定。2007年9月8-23日に、クラカタウ諸島のハチ・アリ相の供給源の一つと考えられるスマトラ南部ランプン州の沿岸およびレグンディ島を地元のランプン大学と協力して調査した。また、クラカタウ諸島の森林性種の供給源として重要と考えられるランプン州西部のバリサン山脈南端に位置するスンブルジャヤの一次林・二次林・植林地を調査した。その結果、カリバチの中では社会性種の種数がスマトラ南部に多く、これらのうちごく一部しかクラカタウに到達していないこと、ハナバチではスマトラ寄りの3島(セベシ、セブク、レグンディ)では種相の著しい不調和が見られるものの、これら3島がスマトラからクラカタウへの侵入経路として重要であることが示唆された。レグンディ島は全島が人為によって激しく攪乱されているためアリの種数は少なく、放浪種の供給源として注目する必要がある。スンブルジャヤの森林では、クラカタウでは見つかっていない多数の森林性アリ類が採集された。これらの種がいずれクラカタウに到着するかどうかが興味ある。これ以外にシロアリについてもサンプリングを行った。同一時期に特定の分類群についてクラカタウと周辺域全体をこれだけ徹底して調査した例はこれまでにない。
分岐鎖アミノ酸のゲノムワイド関連解析とメンデル無作為化による膵がんの分子疫学研究

申請者らは日本人において血中分岐鎖アミノ酸濃度と膵がんの関連を報告したが、今回遺伝情報を用いて因果関係を明らかにすることを計画した。本研究ではゲノムワイド関連解析にて血中分岐鎖アミノ酸濃度を規定する遺伝要因を明らかする。さらにその遺伝情報を用いて未知の交絡要因を調整するメンデル無作為化解析研究を行い、メカニズム解明に寄与し、さらには膵がんのマーカーや治療標的としての分岐鎖アミノ酸の関与を明らかにする可能性がある。
新規インテグリン結合タンパク質の解析

接着分子インテグリンは、主に細胞基質間接着を司るタンパク質の一つで、細胞運動、増殖、分化に深く関与していることが知られている。しかし、いかなる分子機構で、膜上のインテグリンが数量調節を受けているかは、ほとんど解明されていない。本研究によって、その数量調節機構を解明し、インテグリンの機能解明の一助となることを目的とする。これまで、インテグリンは細胞膜上でユビキチン化された後、エンドサイトーシスされるとの仮定の下、各種実験を行ってきた。その結果、インテグリンα5β1がユビキチン化される際に、インテグリンとユビキチン化酵素の結合を仲介するアダプター分子の候補として、ARRDC1を見出した。本研究では、特に、ARRDC1を介したインテグリンα5β1のユビキチン化制御機構の解明を焦点に研究を進めている。Nedd4L、ARRDC1をノックダウンした細胞を用いて、wound-healing assayを行うと、細胞運動能が減少していることが明らかとなった。細胞が適切に遊走するためには、細胞基質間接着を司るインテグリンが、細胞外基質と結合したり離れたりして、時間的空間的に細胞膜上のインテグリンが数量調節される必要があると考えられている。よって、この運動能の減少は、両分子のノックダウンがインテグリンα5β1のエンドサイトーシス量を減少させ、上記数量調節機構が破綻したことが原因と考えられる。接着分子インテグリンは、細胞基質間接着を司るタンパク質の一つで、細胞運動、増殖、分化に深く関与していることが知られている。本研究によって、インテグリンのユビキチン化の制御機構、およびその役割を明らかにすることを目的としている。これまで、インテグリンは細胞膜上でユビキチン化され、その結果エンドサイトーシスされるとの仮定の下、各種実験を行ってきた。インテグリンα5β1は、ユビキチン化酵素Nedd4Lによってユビキチン化されること、またARRDC1はインテグリンα5β1に結合することを見出している。そこで、Nedd4LとARRDC1が結合するかどうかを免疫沈降法により調べた。構造的な特徴として、ARRDC1は、PYモチーフと呼ばれる配列を有している。この配列は、WWドメインを有するタンパク質と結合することが知られており、Nedd4LはWWドメインを有する。まず、Myc-Nedd4LとARRDC1-EGFPをHeLa細胞に一過性に共発現させた後、GFP抗体を用いて、免疫沈降を行った。沈降画分をウェスタンブロッティング解析し、本画分にMyc-Nedd4Lが含まれるか否かを、Myc抗体により検出した。その結果、Myc-Nedd4LはARRDC1-EGFPと結合することが明らかとなった。現在までに、インテグリンα5β1がARRDC1と結合すること、またインテグリンα5β1のユビキチン化酵素Nedd4LがARRDC1と結合することを明らかにした。これらのことから、インテグリンα5β1がNedd4Lによりユビキチン化される際に、ARRDC1が両分子の結合を仲介するアダプター分子として機能していることが示唆された。この結果は、本研究の根幹をなすものであり、研究はおおむね順調に進展していると考えられる。RNAi法により培養細胞で発現しているARRDC1をノックダウンし、各種実験を行う予定である。これまでの実験結果から、ARRDC1は、インテグリンα5β1とNedd4Lのアダプター分子として機能していると考えている。

よって、ARRDC1をノックダウンすると、Nedd4Lがインテグリンα5β1と間接的に結合できなくなり、インテグリンα5β1のユビキチン化量が減少すると推測される。また、インテグリンα5β1は、細胞内で分解されるときに、ユビキチン化されるとの報告がある。よって、細胞膜上と細胞内のインテグリンを区別するために、細胞表面のインテグリンを抗体ラベルした後、ウェスタンブロッティングを行い、ユビキチン抗体で検出する。インテグリンα5β1はユビキチン化されることで、エンドサイトーシスされることをこれまでに明らかにしている。よって、上述の解析の結果、ARRDC1のノックダウンによりインテグリンα5β1のユビキチン化量が減少していることが明らかとなれば、インテグリンのエンドサイトーシス量も減少することが予想される。そこで、ARRDC1をノックダウンした細胞において、インテグリンα5β1のエンドサイトーシス量が減少するかどうかを調べる。細胞表面のインテグリンα5β1をラベルした後、一定時間細胞内に取り込ませ、エンドサイトーシス量を定量する。インテグリンの定量は、ウェスタンブロッティング法を用いる。研究費の効率的な使用に努めたため、少額の次年度使用額8209円が生じた。次年度以降請求する研究費と合わせて、物品費の購入代金として、使用する予定である。
がんの放射線治療によるヒト正常組織の線維化抑制の研究

がんの放射線治療の晩発性障害として、照射部位やその周辺組織に線維化が進行して、QOL低下につながり、また、がんの発生頻度も高くなるため、その線維化を抑制する意義は大きい。特に肺や腎臓は他の組織より低い線量で線維化が発生することが知られているため、マウスに放射線を照射し、同時に線維化を抑制すると考えられる薬剤の投与を行ったところアスコルビン酸およびAHCC (Active Hexose Correlated Compound活性化植物性多糖類関連化合物)により肺や腎組織の線維化の抑制が認められた。がん放射線治療の晩発性障害として、照射部位やその周辺の組織に線維化が進行して、QOLの低下やがん化、寿命の短縮等が知られており、その線維化の制御は極めて意義の高いものとなる。そこで、ヒト組織のがんと非がん部組織をSCIDマウスに移植し放射線を照射することにより、移植片組織の形態学的、分子生物学的変化を観察して、線維化、かん化の機序を解明するとともに、現在臨床で利用できる抗線維化剤を投与することにより、がん放射線治療の際の正常組織の障害(線維化)を抑制し、最終的にがんの発生を抑制することを目的とする。実験(1)手術で切除された肺組織のがん組織と非がん組織の部分をSCIDマウスの皮下に移植した。生着が確認されたので、移植組織片(他の部位は遮蔽)に放射線照射を行った。実験(2)線維化の抑制が期待きれる化学物質の数を絞り込むために、マウスを用いて実験した。1:放射線に感受性の高いB6マウスに肺、肝、腎にのみに(他の部位は遮蔽)、分割または一括照射を行い、その前あるいは後に線維化抑制が期待される化学物質を投与した。2: B6マウスに全身一括照射を行い、その前後に化学物質を投与して、経時的に胸腺、脾臓、肺、肝、腎血液の白血球の変化を観察した。実験(2)-1においては、化学物質によって体重の差や毛の変化(白髪や脱毛)の差が見られている。また、実験(2)-2においても、化学物質によって体重の差や白血球(特にリンパ球)の数に差が見られている。今後、照射組織にたいして、組織学的、分子生物学的解析を行って、線維化抑制物質をさらに絞り込み、それらの至適投与条件を求めていく予定である。がん放射線治療の晩発性障害として、照射部位やその周辺の組織に線維化が進行して、QOLの低下やがん化等が知られており、その線維化の制御は極めて意義の高いものとなる。そこで、マウスに放射線を照射するとともに、現在臨床で利用できる線維化を抑制すると考えられる薬剤を投与することにより、がん放射線治療の際の正常組織の障害(線維化)を抑制する化学物質を同定し、最終的にはがんの発生を抑制することを目的とする。実験(1)部分照射:放射線に感受性の高いB6マウスに肺、肝、腎、(およびその照射野に存在する組織)にのみに(他の部位は遮蔽)分割照射(2Gyx10, 2Gyx20)、あるいは一括照射(10Gy 15Gy 20Gy)。実験(2}全身照射:B6マウスに5Gyまでの全身一括照射。実験(3)ブレオマイシン投与:肺の障害を比較するため、B6マウスにBLM投与。実験(1)-(3)の放射線あるいはBLM投与前後に線維化抑制が期待される化学物質を投与、すべてにおいて経時的に体重測定や毛の観察を行い、一定期間の後、micro CT、採血、採尿等を施行し、各組織採取。結果実験(1)では総被曝線量が多くなるに従い、毛の脱穎粒(白髪)化、肺の硬化、腎や肝臓の萎縮、死等が見られたが、それらはアスコルビン酸やAHCC(植物性多糖体)等で軽減されている。実験(2)では肺、腎、肝臓に差は見られなかったが、体重減少、胸腺・脾臓の重量およびリンパ球数減少が見られたが、数種の薬剤により軽減している。実験(3)では各臓器の見かけ上の変化は少ないが、肺の線維化(コラーゲン量)は大きく、これも数種の薬剤により線維化抑制が見られている。今後、照射組織にたいして、主に組織学的、分子生物学的解析を行って、線維化抑制物質を絞り込み、それらの至適投与条件を求めていく予定である。放射線治療の晩発性障害として、照射部位付近の組織に線維化が進行することが知られており、その制御が重要となる。そこで、マウスの肺、腎臓組織に放射線を照射するとともに線維化を抑制すると考えられる薬剤を投与してその効果を観察した。生後約5週のC57BL/6JマウスにX線(線量率0.88Gy/分)照射を行った。肺、腎のみに部分照射(分割部分照射(2Gyx1020回)、あるいは一括部分照射(1020Gy))あるいは4Gyの全身一括照射を施行。

さらに線維化を抑制すると考えられる薬剤を投与して、生食投与群、非照射群と比較した。放射線照射群は6-8ヶ月後に肺と腎組織のmicro CT、HEおよびマッソン・トリクローム(MT)染色やSircol assayおよび血液、尿のCystatin-C assayを行い、肺や腎の線維化や腎機能の評価を行った。<肺、腎組織の変化>15Gy以上照射群では、肺、腎組織の破壊が著明に見られた。また、7ヶ月以上経過した組織にはMT染色により、線維化が認められた。肺、腎組織のSircol値および血液、尿のCystatin-C値は10Gy照射以上で高値を示した。<薬剤による線維化抑制効果>肺組織:2Gyx20回照射群、20Gyx1回照射群(雄のみ)においてアスコルビン酸およびAHCC(活性化植物性多糖類関連化合物)投与群でSircol値の低下が見られた。腎組織:2Gyx20回照射群(雄のみ)、2Gyx10回照射群(雄のみ)、15Gyx1回照射群(雌のみ)、10Gyx1回照射群(雌のみ)においてアスコルビン酸およびAHCC投与群でSircol値の低下が見られた。2Gyx20回照射群(雄のみ)、10Gyx1回照射群(雌のみ)においてアスコルビン酸およびAHCC投与群でCystatin-C値の低下が見られた。放射線による各組織の線維化は長期間を要するが、推定期間で予想通り線維化が認められており、またその繊維化を抑制する薬剤もいくつか出現しているため。実験のウェイトは当初予定していたSCIDマウスによる実験からB6マウスによる実験にシフトしている。これはまず、繊維化を抑制する物質を同定することが先決と考えたため。.24年度が最終年度であるため、記入しない。今後、照射組織にたいして、主に組織学的、分子生物学的解析を行って、線維化抑制物質を絞り込み、それらの至適投与条件を求めていく予定である。さらに、実験のn数を追加して有意差を確実にしていく予定。24年度が最終年度であるため、記入しない。