hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ミジンコを用いた水圏環境毒性物質の効率的評価のための標準手法の確立

ミジンコ(Daphnia magna)を用いて環境毒性物質の遺伝的影響や細胞機能に対する影響を、高感度で効率的に評価するための標準手法を開発することを目的とした。1.雌ミジンコを変異原物質で処理して、F1およびF2の個体で観察される突然変異を調べるための基礎的検討を行った。変異原としてはアルキル化剤のエチルニトロソウレアを用いて、数千匹のミジンコを処理した。処理条件としては高用量単回(60分)、高用量3回(4日毎に60分)、および低用量連続(24時間)処理を試みた。触角や複眼に形態異常のある個体が得られたが、その頻度は低く、また遺伝性の変異ではなかった。他の変異原を用いて、出現頻度が高く観察が容易で効率的な評価ができる変異形質の検索を続けている。2.分化の異常による形態変化を調べるためエチレンチオウレアを用いて実験を行なった。卵を育房から取り出してin vitroで培養した。胚の発生過程でエチレンチオウレアを作用させることによって高率に殻の形に奇形が誘発されることを見いだした。3.環境影響評価に用いるためのミジンコの標準飼育法として水質の影響を調べた。飼育水としては脱塩素処理した水道水よりもElendt M7培地が適切であると結論した。4.単為生殖による増殖を続けているミジンコの飼育密度を上げて、雄の個体を産ませて有性生殖サイクルに移行させた。有性生殖の結果形成される耐久卵を分離して、高い孵化率を得る保存条件を検討したが、安定した結果が得られず今後の検討課題として残った。5.研究過程で得られた、卵のin vitro発生系の基礎技術の確立は、発生毒性の評価手法としてのミジンコの有用性を高めることになると期待された。
放射線被曝による障害歯根の再生治療法の開発に向けた基盤研究

放射線が歯根形成障害を引き起こすメカニズムを解明するため、これまでに歯根形成が開始する生後5日齢マウスにエックス線を頭部照射し(10Gy、20Gy)、生後6、7、9、11、13、15日齢を観察対象として、マイクロCT解析、HE染色、免疫染色(抗サイトケラチン抗体、抗ネスチン抗体)、BrdU取り込み実験をおこなった。その結果にて、10Gy、20Gy照射の歯根の長さは、OGyと比べて有意に短くなり、生後11日齢でヘルトヴィッヒ上皮鞘(HERS)細胞の動態の異常、根尖部の象牙質形態の異常(HERSを取り囲むように象牙質を形成)が起きることを確認した。本研究は、この頭部照射が歯根形成に与える影響が放射線の歯への直接的な影響によるものなのか、あるいは照射野に含まれる内分泌器のダメージによる間接的な影響によるものなのかを明らかにするため、採血による血中のホルモン濃度(GH, PTH, TSH, Calcitonin, T4など)の測定を行った。また、さらにホルモン投与による補充実験を行い、歯根の伸長がみられるかの観察を行った。それにより、頭部照射(10,20Gy)を行ったマウスの血中ホルモン濃度は線量依存的に低下していた。一方でホルモン投与を行った実験では歯根伸長の回復はみられなかった。現在、追加実験によるこれらの確認を行っており、今後、照射後の根尖周囲の細胞でのホルモンレセプターの観察を行うことを検討している。これらにより、内分泌器のダメージによる二次的影響についての新たな知見を得ようと考えている。本研究の一部は第54回歯科基礎医学会学術大会・総会(2012年9月14、15、16日、奥羽大学、郡山)にて報告を行った。
神経因性疼痛発症トリガー因子としての"Nav1.9燃え上がり現象"の基礎的解析

小型DRGニューロンに特異的に発現しているNaV1.9電流のピーク値が経時的に数倍以上に増大し、その後に減少する現象(キンドリング)の調節メカニズムの詳細は不明である。そこで本研究では、キンドリングに対する細胞内環境変化の影響について検討した。キンドリングは、細胞内ATP(3mM)存在下においてほぼ完全に抑制されることが見出された。一方、GTP(500μM)およびPMA(100nM)存在下ではキンドリングの抑制は認められなかった。この事より、細胞内ATPが枯渇するような神経障害時にはNaV1.9電流が増大し、神経細胞の興奮性に対して促進的に作用することが示唆された。野生型(WT)マウスと,痛みとの関連が指摘されているサブタイプであるNaV1.8を欠失したNav1.8ノックアウト(KO)マウスから後根神経節(DRG)細胞を単離し,IB4による生体染色を行い,IB4陽性細胞と陰性細胞を同定した.ホールセルパッチクランプ法を用いて,各タイプの細胞に発現する各種Naチャネルの電気生理学的性質を解析し,活動電位の発生に果たすNaチャネルサブタイプの機能分担について検討した.その結果,WTマウスのIB4陽性細胞,陰性細胞共に,静止膜電位付近ではNaV1.8によるTTX-R/slow Na電流が活動電位の主体となっていることが示された.しかし,膜電位が過分極側になると,IB4陰性細胞でのみ,TTX感受性サブタイプによるTTX-S/fast Na電流が活動電位の一部を形成していた.このような違いが,それぞれの細胞群が異なる痛みの伝搬に関与していることと関連している可能性が考えられた.一方,NaV1.8KOマウスのDRG細胞においては,IB4陽性細胞,陰性細胞共に,NaV1.8の欠失により,静止膜電位付近で主体となるNa電流がTTX-S/fast Na電流にスイッチし,代償的に働いている可能性が示唆された.さらに,IB4陽性細胞ではNaV1.9によるTTX-R/persistent Na電流のアップレギュレーションが見られ,このサブタイプもNaV1.8を代償している可能性が考えられた.これらの結果より,IB4陽性細胞および陰性細胞は痛覚伝搬において異なった役割を担っていると考えられた。侵害情報を伝搬する小型DRGニューロンに特異的に発現しているNa_v1.9は他のNaチャネルよりも深い活性化閾値を示し、持続型Na電流を発生させる。このため、Na_v1.9電流は活動電位の閾値下での興奮性の制御を担っていると考えられている。これまでに私たちの研究室では、voltage-clamp法による電流記録中にNa_v1.9電流のピーク値が経時的に数倍以上に増大し、その後に減少する現象(キンドリング)を見出した。しかし、この現象の調節メカニズムの詳細は不明である。そこで今回、私たちはキンドリングに対する細胞内環境変化の影響について検討した。対照群において発生するキンドリングは、細胞内ATP(3mM)存在下においてほぼ完全に抑制されることが見出された。一方、GTP(0.5mM)およびprotein kinase C (PKC)活性化薬PMA(100nM)存在下ではキンドリングの抑制は認められなかった。さらにsteady-state inactivation(h-カーブ)に対する効果も検討した。PMA存在下では保持電位-80mVではピーク電流値が次第に減少するが、-120mVでは維持されており、h-カーブの過分極側へ移行が確認された。しかしATPおよびGTP存在下では有意な変化は認められなかった。以上の事より、細胞内ATPが枯渇するような神経障害時にはNa_v1.9電流が増大し、神経細胞の興奮性に対して促進的に作用することが示唆された。一方、PKCの活性化によりNa_v1.9の開口確率が減少し、神経細胞の興奮性に対して抑制的に作用することが示唆された。Na_v1.9電流は細胞内環境の変動に強く影響を受け、病的な痛覚の伝達は、このような調節機構のバランスの破綻により、なされている可能性が考えられる。

対照群において発生するキンドリングは、細胞内ATP(3mM)存在下においてほぼ完全に抑制されることが見出された。一方、GTP(0.5mM)およびprotein kinase C (PKC)活性化薬PMA(100nM)存在下ではキンドリングの抑制は認められなかった。さらにsteady-state inactivation(h-カーブ)に対する効果も検討した。PMA存在下では保持電位-80mVではピーク電流値が次第に減少するが、-120mVでは維持されており、h-カーブの過分極側へ移行が確認された。しかしATPおよびGTP存在下では有意な変化は認められなかった。以上の事より、細胞内ATPが枯渇するような神経障害時にはNa_v1.9電流が増大し、神経細胞の興奮性に対して促進的に作用することが示唆された。一方、PKCの活性化によりNa_v1.9の開口確率が減少し、神経細胞の興奮性に対して抑制的に作用することが示唆された。Na_v1.9電流は細胞内環境の変動に強く影響を受け、病的な痛覚の伝達は、このような調節機構のバランスの破綻により、なされている可能性が考えられる。
コミットメント問題としての被害者通報問題 いじめ被害者を中心として

いじめの被害者がその被害を通報する際に生じる不安を減少させるためには、通報が割に合うという期待を被害者に持たせることが重要である。しがし、通報が割に合うと期待させるためには、どのような制度の整備が必要なのだろうか。現状把握のため、いじめに身近に接する機会のあった者へのインタビュー調査ならびに質問紙調査を行ったところ、当時、いじめの被害者としていじめを経験した者の多くは、担任やその他の公的な機関に直接通報しておらず、通報した者も、その通報が割に合ったとは考えていないと解釈できる結果が示された。これと対照的に、教員は通報のあったいじめに関しては積極的に関与し、改善に繋がったと考えていると解釈できる結果が示された。この被害者と教員間での認識上の乖離は、教員の介入の過程が通報者には伝わりにくく、通報者の不満足は教員には伝わりにくいことを意味している。また、文献による検討から、通報が割に合うと期待させる形で制度を整備するためには、中立的な裁定の場が用意されていること、また、裁定にあたって、被害者にとって効果があると思える罰が用意されていること、そして、裁定にあたってのルールが明示化されていることが指摘された。この点に関して、再度インタビューによる検討を行った結果、いじめの場合では、理想的に裁定制度を導入した場合、いじめ加害者の冤罪という過誤が明確な形で生じてくることを考慮に入れておくこと、また、今日日常的に些細なケースまでがいじめという言葉で括られているため、全ケースを裁定で吟味するのは難しいこと、むしろ、深刻な被害者を見過ごす過誤はあれ、通報から一定期間様子を見て、なお続いている深刻なケースに優先的に介入する、ある種の前払いが現状に即していることが指摘された。これらのことは、制度の導入に先立ち、どちらの過誤を容認するかという意味で改めて社会的合意が必要になることを意味している。研究の目的は、いじめの被害者がその被害を通報する際に生じる不安、すなわち"通報不安"を減少させる制度的・構造的要因について詳細に実証的手法を用いて検討することであった。具体的には、学校でのいじめ問題解決の具体的目標として被害者から教師への通報の増加を挙げ、通報の増加を達成する上で必要となる、通報不安の減少という問題について検討することであった。研究開始年度である18年度においては、主に二つのアプローチからの検討が行われた。第一のアプローチは文献的検討であった。具体的には、これまでに経済学や社会学、人類学、社会心理学の分野で扱われてきたコミットメント問題についての理論研究の文献、ならびに、国際紛争や誘拐事件でのコミットメント形成を扱った文献の収集・検討を行った。第二のアプローチは、いじめに近い立場の人々から得られたインタビューデータの分析であった。以上のアプローチから得られた知見は一つにまとめることができる。つまり、現状では、当事者である生徒たちが納得するような、加害者にとって効果的な処罰が現状では設けられていないと生徒たちも教員たちも考えているということである。被害者が通報するかどうかに関わる要因として、加害者の処罰といった、通報が結果的に報われることが重要である。しかし、現状では、いじめに関わった生徒たちに与えるルールと罰則は不明確でかつ未整備であり、多くの場合、生徒や教師たちはそのルールや罰則についてよく知らないのである。また、現在、検討中の罰則についても多くの生徒や教員たちは、その罰則を仮に実施したとしても効果がないと考えていることが明らかになった。
発生・分化における細胞核内３次元ゲノム構造の役割

トランスポゾン再挿入部位の網羅的同定に関して、前年度までの解析で用いた次世代シークエンサー(GAIIx)のread長が短い欠点を補うため、より長いread長の得られるGS FLXによる解析を実施し、両者のデータを比較することで解析精度の向上を計った。解析の結果、マウスES細胞の発生関連遺伝子座を起点として転移させたトランスポゾンの再挿入分布は、特定のエピジェネティックマークと相関を示すことが判明した。コントロール実験としては、プラスミドから染色体へのトランスポゾン転移分布を測定する実験を実施した。なお、ES細胞からのin vitro分化過程でトランスポゾンを転移させた実験では、今回の条件下では再挿入分布に顕著な変化が見られず、さらなる検討を要する。また、2倍体ゲノムにおける再挿入部位のアレル識別が問題となったため、半数体ゲノムでの動態を調べる目的で英国のLeebらが開発した半数体マウスES細胞を用いた実験を行った。半数体ES細胞に関しては、Cell Stem Cell誌に概説を発表した。さらに、トランスポゾン転移によって生じるDNA二重鎖切断と修復過程が3次元ゲノム構造を反映している可能性があることから、ゲノム安定化遺伝子であるBlmを一時的に抑制できるES細胞を用いて、酵素的にDNA二重鎖切断を導入した際のゲノム修復・再構成の様相を高密度SNPタイピング及びarray-CGH法によって包括的に解析した。その結果、ゲノム再構成断端ではマイクロホモロジーが関与すること、再構成断端の一方がゲノムのinverted repeat領域に集積しやすい傾向があることが示された。この現象と核内3次元ゲノム構造との関連については、さらにゲノムワイドな解析が必要と考えられた。ここまでの成果については、Genome Research誌に論文発表を行った。25年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度は、まず哺乳類細胞の分化過程における核内3次元ゲノム構造の変化の有無を検討する目的で、マウスES細胞培養系で均一な細胞集団から別の均一な細胞集団へのin vitro分化系の確立を試みた。その結果、ES細胞から栄養外胚葉(Trophectoderm, TE)細胞へのin vitro分化系が使用細胞数や転移酵素の導入効率の面で本実験の目的に適していることが分かった。そこでマウスES細胞の特徴的な2つのゲノム領域に着目し、この系を用いて分化に伴うトランスポゾン転移分布の比較実験を開始した。一方、トランスポゾンの転移分布を解析する過程で、マウスゲノムのリピート配列の分布等によってはこれまでに使用した次世代シークエンサー(GAIIx)の短いリードでは解析精度に限界が生じる可能性が検討された。そこで平成24年度はGAIIxに加えて、リード数では劣るものの長いリード長が得られる次世代シークエンサー(GS FLX)を用いた検証実験を行い、現在データ解析中である。さらにトランスポゾンの転移・再構成プロセスと染色体構造の関係を分析する過程で、DNA二重鎖切断と修復過程における核内染色体DNAの振る舞いを把握する必要性が求められた。そこでマウスES細胞の系でゲノム修復に関わるBlm遺伝子を一時的に抑制できるシステムを利用し、酵素的にDNA二重鎖切断を導入した際のゲノム再構成の様相を高密度SNPタイピング・array-Comparative Genome Hybridization (array-CGH)により包括的に解析した。その結果、ゲノム再構成断端で1-6塩基程度のマイクロホモロジーが関与すること、再構成断端がinvertedリピート領域に集積しやすい傾向があることが分かった。この結果は論文にまとめ現在投稿中(リバイス中)である。平成24年度中に、それまでに用いた次世代シークエンス・プラットフォームGAIIx (Illumina社)から産出される短リードのデータではトランスポゾン再挿入分布の解析精度に限界が生じる場合があることが判明した。

そこで解析プロセスを一部変更し、より長いリード長が得られるGS FLXシークエンサー(Roche社)やPacBioシークエンサーによる解析・検証を追加することになり、このための新たな試料作製プロトコールとデータ評価の確立に時間を要した。また、マウスES細胞からのin vitro分化実験系として当初検討していた皮膚角化細胞への培養系においては、トランスポゾン転移酵素の導入効率が予想よりも低く、様々な条件検討によっても改善が困難であった。そこで新たにES細胞からTE(栄養外胚葉)細胞へのin vitro分化系を整備し、これに対するトランスポゾン転移誘導実験の条件検討を行った。以上2つの理由から、これらの実験の結果に基づいて選択されるゲノム領域の改変実験が遅れる状況となっている。平成24年度に確立したマウスES細胞からTE細胞へのin vitro分化培養系へのトランスポゾン転移誘導実験を中心に、細胞分化の過程における核内3次元ゲノム構造解析を進めて行く。またトランスポゾン転移挿入分布のシークエンス解析の手法として、GAIIxシークエンサーから得られる短リードデータとGS FLXあるいはPacBIoシークエンサーから得られる長リードを組み合わせることにより、双方の特長を生かした新しいデータ解析システムを整備し、従来のデータと合わせて高精度のデータ解析を実現する。25年度が最終年度であるため、記入しない。
X線吸収微細構造の測定・解析方法の調査研究

EXAFS(広域X線構造微細構造)やXANES(X線吸収端構造)の応用が近年急速に拡大されているが、それにしたがって、EXAFSやXANESの測定方法の標準化、EXAFSデ-タの解析方法の確立、EXAFSやXANESに関する理論の検討、さらには、EXAFやXANESに関するデ-タベ-スの作成等の必要性が高まり、数年前から世界各国の関連分野の研究者の協力のもとに「XAFS国際ワ-クショップ」が開かれて、その報告がまとめられた。また、1992年にわが国で第7回XAFS国際会議を開催することになっており、そこでも上記の問題が会議の重要な課題になる。このような状況を踏まえて本研究課題では、国際ワ-クショップの報告を研究分担者に配布するとともに、各分担者が国際ワ-クショップの報告に取り上げられている個々の課題を分担して検討し、また、EXAFSならびにXANESの解析のためのプログラムに整備を推進した。それらの結果を持ち寄った国内ワ-クショップを1回開催し、分担して検討してきた内容の報告を求めるとともに、国際ワ-クショップの勧告に関する総合討論を行なった。また、現在、EXAFS解析プログラムがいくつか国内で作成されていろいろな研究グル-プによって利用されているが、それらのプログラムの妥当性と各研究グル-プが採用している解析手順の妥当性の相互比較を行なうために、国際ワ-クショップで作成された標準デ-タ等を各分担者に配布して、各分担者にその解析を求めた。以上のような活動の他に、第7回XAFS国際会議の企画・立案のための会議を数回開催し、同国際会議の開催に向けての準備活動を推進した。
腸管粘膜系免疫細胞に対する漢方方剤の作用解析

漢方方剤の免疫調節作用を考えるとき、投与された漢方方剤成分が腸管免疫系に作用することで効果を発揮している可能性が考えられる。本研究では、漢方方剤に使用される生薬エキスの腸管免疫系細胞に及ぼす影響を検討することで、漢方方剤の作用機序の解明を試みるため、樹状細胞に対する作用を検討した。また、併せて病態モデルに対する有効性の評価も実施した。本研究は、複数の免疫細胞が相互にクロストークしている腸管免疫が関連する疾患においては、単一成分を用いている西洋薬よりも、多成分で構成されている生薬エキスや漢方方剤のほうが、分子標的や細胞に対して幅広いスペクトルで奏功することが考えられる。漢方医学の概念には、「気・血・水」という3つの要素が存在し、それぞれのバランスによって健康状態が維持されている。その中で、「気」の一部は胃腸管からの栄養素の吸収であり、「気」に作用する漢方方剤を「気剤」の中には、胃腸管に作用するものも少なくない。胃腸管への作用というと、蠕動運動を回復させ、消化吸収を助けるといったような作用以外にも、腸管免疫に作用していることも十分に考えられる。また、多くの薬剤の作用は、腸管からの吸収過程を考慮に入れなければならないが、腸管が作用の場であることから、吸収課程を考慮する必要がないため、直接細胞に添加した結果と、in vivoの結果が十分に相関するものと考えられる。しかしながら、複数の細胞と多成分の作用を解析することは、非常に煩雑になるため、まず本研究では、単一細胞に対する生薬・漢方方剤の影響について検討し、その作用をデータベース化することを第一目標とした。また、ユニークな活性を示すエキスについては、その活性本体の同定を試みることも視野に入れている。最終的には共培養系を用いた複数細胞を用いた検討を実施することを目的として遂行している。単一細胞に対する作用をデータベース化することで、漢方方剤による腸管免疫への作用を予測することも可能となるばかりか、その生薬から活性成分を単離同定することで、標的の定まった治療も可能となると考えられる。その中で、「気」の一部は胃腸管からの栄養素の吸収であり、「気」に作用する漢方方剤を「気剤」といいその中には、胃腸管に作用するものも少なくない。平成27年度は、樹状細胞に対する生薬エキスのスクリーニング及びin vivoでのT細胞の分化プロファイルを検討する予定であった。しかしながら、後述の理由により遂行はできなかった。平成27年度において、研究代表者は樹状細胞を用いた生薬エキスのスクリーニングおよび、in vivoにおけるT細胞分化能試験の実験系の構築を行う予定であった。しかしながら、私事であるが、エフォートとして研究機関異動を視野に入れた活動が発生し、それに多大な時間がとられたため、ほぼ実施はできなかった。

単一細胞に対する作用をデータベース化することで、漢方方剤による腸管免疫への作用を予測することも可能となるばかりか、その生薬から活性成分を単離同定することで、標的の定まった治療も可能となると考えられる。平成28年度は、研究代表者の異動に伴い、大学業務(教育)と研究へのエフォートの大幅な変更が発生したため、十分な成果は得られなかった。平成28年度は、研究代表者の異動に伴い、大学業務(教育)と研究へのエフォートの大幅な変更を迫られることとなった。さらには、研究環境に関しても、十分な設備を確保するのに時間を要する結果となった。また、研究に用いる生薬エキスに関しては前所属研究室のものであり、新たに調製する必要に迫られた。そのため平成28年度は、本学に貯蔵されている標本室内の生薬及び別途購入した生薬を用いてエキス調製に時間の大部分をとられる結果となったことも遅延の原因である。本研究は、複数の免疫細胞が相互にクロストークしている腸管免疫が関連する疾患においては、単一成分を用いている西洋薬よりも、多成分で構成されている生薬エキスや漢方方剤のほうが、分子標的や細胞に対して幅広いスペクトルで奏功することが考えられる。漢方医学の概念には、「気・血・水」という3つの要素が存在し、それぞれのバランスによって健康状態が維持されている。その中で、「気」の一部は胃腸管からの栄養素の吸収であり、「気」に作用する漢方方剤を「気剤」といいその中には、胃腸管に作用するものも少なくない。また、多くの薬剤の作用は、腸管からの吸収過程を考慮に入れなければならないが、腸管が作用の場であることから、吸収課程を考慮する必要がないため、直接細胞に添加した結果と、in vivoの結果が十分に相関するものと考えられる。しかしながら、複数の細胞と多成分の作用を解析することは、非常に煩雑になるため、まず本研究では、単一細胞に対する生薬・漢方方剤の影響について検討し、その作用をデータベース化することを第一目標とした。また、ユニークな活性を示すエキスについては、その活性本体の同定を試みることも視野に入れている。最終的には共培養系を用いた複数細胞を用いた検討を実施することを目的として遂行している。平成29年度は、大学内で使用できる研究設備で、動物からの初代培養実施を模索したが、共同設備での利用は不可能であったため、生薬エキスライブラリーの更なる充実を図るにとどまった。漢方方剤の免疫調節作用を考えるとき、投与された漢方方剤成分が腸管免疫系に作用することで効果を発揮している可能性が考えられる。本研究では、漢方方剤に使用される生薬エキスの腸管免疫系細胞に及ぼす影響を検討することで、漢方方剤の作用機序の解明を試みるため、樹状細胞に対する作用を検討した。また、併せて病態モデルに対する有効性の評価も実施した。研究代表者は平成26年度において、まず樹状細胞に対する作用の検討を試みた。
LPSのマウスB細胞内結合分子の解析

LPSによる刺激は生体細胞表面上のCD14を介して細胞内にシグナル伝達されるが,一方で,スカベンジャーレセプターを介してLPS分子のままで,あるいはLPSがCD14と結合した状態で生体細胞内へ取り込まれる可能性も示唆されている.しかし,細胞内でのLPS分子の挙動については明らかとはなっていない.本研究では,LPSの細胞内結合分子を明らかにすることを目的に,LPS反応性のマウスB細胞由来株化細胞(CH12.LX細胞)を用いてLPSが特異的に結合する生体細胞内分子を分画し,得られた試料より分子生物学的手法を用いて細胞内の特異的なLPS結合部位について検討した.まず,CH12.LX細胞をCHAPSを用いて溶解後,カラム分画により,Escherichia coli由来のLPSに特異的結合を示す細胞内タンパクを精製した.LPSとの結合能はenzyme-linked biotin-avidin assayにより行った.調製したタンパクのN末端シーケンスを行い,部分アミノ酸配列を決定した.その結果,ラットのリボゾームタンパクL5と高い相同性を示すことが推定された.そこで,L5タンパクの推定塩基配列から設計したプライマーを用いて,マウスcDNAライブラリーよりPCR法によりマウスリボソームタンパク(L5m)のcDNAクローニングを行った.cDNAのシークエンスの結果,マウスのL5mの塩基配列はラットのそれと高い相同性を示した.得られたcDNAを大腸菌の高発現ベクターであるpTrc99を用いて発現させたところ,SDS-PAGE上で約36kDaのリコンビナントタンパクのバンドが認められた.このリコンビナントタンパクにおいてもLPSとの特異的な結合が認められた.以上の結果より,LPSが特異的に結合するマウス細胞内分子の一つはリボソームタンパクL5mであることが明らかとなった.LPSによる刺激は生体細胞表面上のCD14を介して細胞内にシグナル伝達されるが,一方で,スカベンジャーレセプターを介してLPS分子のままで,あるいはLPSがCD14と結合した状態で生体細胞内へ取り込まれる可能性も示唆されている.しかし,細胞内でのLPS分子の挙動については明らかとはなっていない.本研究では,LPSの細胞内結合分子を明らかにすることを目的に,LPS反応性のマウスB細胞由来株化細胞(CH12.LX細胞)を用いてLPSが特異的に結合する生体細胞内分子を分画し,得られた試料より分子生物学的手法を用いて細胞内の特異的なLPS結合部位について検討した.まず,CH12.LX細胞をCHAPSを用いて溶解後,カラム分画により,Escherichia coli由来のLPSに特異的結合を示す細胞内タンパクを精製した.LPSとの結合能はenzyme-linked biotin-avidin assayにより行った.調製したタンパクのN末端シーケンスを行い,部分アミノ酸配列を決定した.その結果,ラットのリボゾームタンパクL5と高い相同性を示すことが推定された.そこで,L5タンパクの推定塩基配列から設計したプライマーを用いて,マウスcDNAライブラリーよりPCR法によりマウスリボソームタンパク(L5m)のcDNAクローニングを行った.cDNAのシークエンスの結果,マウスのL5mの塩基配列はラットのそれと高い相同性を示した.得られたcDNAを大腸菌の高発現ベクターであるpTrc99を用いて発現させたところ,SDS-PAGE上で約36kDaのリコンビナントタンパクのバンドが認められた.このリコンビナントタンパクにおいてもLPSとの特異的な結合が認められた.以上の結果より,LPSが特異的に結合するマウス細胞内分子の一つはリボソームタンパクL5mであることが明らかとなった.
メタボリックシンドロームにおける反応性低分子による蛋白質翻訳後修飾の解析

メタボリックシンドローム(MS)は代謝複合病であり、病因にインスリン抵抗性が関わる。本研究はMSの代表的モデルZucker Ratの血管につき解析を行った。MS血管では1)誘導型一酸化窒素合成酵素依存性の血管収縮能の低下2)チオール抗酸化能低下、アルギニン代謝変化、メチオニン代謝変化(特にメチル化供与体の低下)3)メチル化蛋白質の低下を認めた。また、インスリンシグナルに活性酸素種、窒素種,ガス分子が関与する事が培養内皮細胞にて示された。本研究は21世紀人病医療の最重要課題である、メタボリックシンドロームの最終標的である心血管病変の病因解明、新規治療法開発を最終目標とする。そのため、メタボリックシンドロームの際に代謝経路から放出されるフリーラジカルやガス分子等の反応性低分子に着目して、これらによる蛋白質翻訳後修飾生成機序と、その標的蛋白質を検索して、心血管病進展の病因と新たな治療分子標的の固定を行う。今年度は、メタボリックシンドロームの代表的モデルであるZucker Ratの血管病と蛋白質翻訳後修飾について検討を進め、以下のデータを蓄積した。1)Zucker Ratでは、血清中ホモシステインレベルが軽度上昇しており、チオール代謝の異常及びメチル化の異常が示唆された。2)生理学的検査より、血管内iNOSの発現により収縮力が低下していることが示唆された。3)プロテオミクス解析によりいくつかの血管内蛋白質メチル化の低下が検出された。4)iNOSの阻害により蛋白質メチル化が回復した事から、iNOSからのNOが蛋白質メチル化低下に働く事が想定された。5)in vitroの検討ではインスリンシグナルに関連するPten/PP2Aがチオール酸化修飾を受けることが判明した。本年度は特に蛋白質翻訳後修飾を効率的に検出する系の確立に時間を費やした。本研究は21世紀成人病医療の最重要課題である、メタボリックシンドロームの最終標的である心血管病変の病因解明、新規治療法開発を最終目標とする。そのため、メタボリックシンドロームの際に代謝経路から放出されるフリーラジカルやガス分子等の反応性低分子に着目して、これらによる蛋白質翻訳後修飾生成機序と、その標的蛋白質を検索して、心血管病進展の病因と新たな治療分子標的の同定を行う。そのために、メタボリックシンドロームの代表的モデルであるZucker Ratの血管内蛋白質翻訳後修飾と代謝変化、遺伝子発現について更に検討を進め、以下のデータを蓄積した。1)Zucker Ratでは、血清中ホモシステインレベルが軽度上昇と共にSAMの低下など低メチル化を引き起こす代謝変化を見出した。現在これを拡大し、葉酸代謝、アルジニン代謝についても検討している。2)プロテオミクス解析によりいくっかの血管内蛋白質メチル化の低下が検出された。遺伝子解析では、むしろNOXの関与が示唆され、更なる検討が必要である。また、インスリンシグナルに関わるHSP70,HSP90についても翻訳後修飾が示唆された。来年度は更にメチル化修飾・チオール修飾蛋白質翻訳後修飾がインスリンシグナルに及ぼす影響を明らかにしたい。最終年度は、メタボリックシンドロームの代表的モデルであるZucker Ratの血管病と蛋白質翻訳後修飾に加え、血管メタボローム解析術、血管遺伝子解析も行い、以下のデータを蓄積した。これに加え、アルギニン代謝の異常と遺伝子会解析にてアルギナーゼ発現低下を認めた。3)プロテオミクス解析によりHSP60/70/90等血管内蛋白質メチル化の低下が検出された。また、iNOSの阻害により蛋白質メチル化が回復した。5)in vitroの検討ではインスリンシグナルに関連するPten/PP2Aがチオール酸化修飾を受ける事、一酸化炭素がインスリンシグナル増強とメチル化の増加に働く事が判明した。これらの所見により、メタボリックシンドロームにおける血管内代謝変化と蛋白質翻訳後修飾が血管病態やインスリン抵抗性に関与する事が示唆された。
腫瘍内血管増殖因子受容体のブロックによる温熱効果の増強

腫瘍細胞は増殖能が大きいので、血管新生が追い付かず、低栄養、低酸素状態にある。そのために腫瘍は栄養、酸素等を確保する為に血管増殖因子(VEGF)を放出して栄養血管を新生する。この時、腫瘍に対して温熱治療を加えると腫瘍部血管は選択的に血管損傷が発生し、更に血管が必要となる。しかし、正常組織では神経支配によって血管拡張が発生し血流は増加し温熱障害を受け難い。本研究は腫瘍組織が栄養血管の新生をするためにVEGFを放出した周囲の血管のVEGF受容体(VEGF-R)が受け取り、血管新生を開始する時、VEGF-Rをブロックする事で腫瘍組織は血管が新生されると感じて細胞分裂を開始するが、実際には血管は腫瘍部には新生されず、分裂停止や分裂異常によって抗腫瘍効果が出現する事を調べた。人臍帯血管(Informed consentあり)およびSCC-VII腫瘍担癌C3Hマウスから血管内皮細胞を採取し、培養後、温熱刺激によって放出されるVEGFとVEGF-Rの抽出を試みた。人臍帯とマウス腫瘍血管からのVEGF抽出は困難であったが、VEGFを含む分画を抽出した。また、VEGF-Rは抽出同定は出来ませんでした。マウス大腿部皮下の5mmの腫瘍から2cm離れた皮下に12μg/0.05mlのVEGF分画を投与した。処理後に腫瘍が2倍に成長する日数は無処理群は3.3日、温熱単独処理群は5.8日、温熱+VEGF併用群は7.7日となり、VEGF分画投与による新生血管の出現に関連して、温熱効果の増強が僅かに観測された。VEGF分画投与による新生血管の出現は脳梗塞、外因性壊死等の虚血疾患の治療に有効である事を示唆している。本研究は腫瘍血管増殖因子の確認と血管増殖因子受容体のブロックによる温熱効果の増強を確認することである。悪性腫瘍は増殖能が大きく細胞分裂に必要な栄養や酸素等が不足すると細胞分裂を停止した細胞(GO期)が増加する。そこで温熱を加えると腫瘍血管が損傷を受け血流低下に伴う低pH、低血流、低酸素状態が更に進み腫瘍は生存するために血管増殖因子を放出して腫瘍内に血管を引き込もうとする。この時腫瘍血管増殖因子受容体を投与すると、腫瘍は血管が新生されたと感じて細胞分裂を開始(GO期細胞も細胞分裂周期に移動)する。しかし、実際には血管新生はされておらず、低栄養低酸素のため分裂途中で分裂不能になり死亡する。以上の内容を確認するために以下の実験を開始している。現在、人臍帯(インフォームド・コンセントは行われている)より剥離した血管内皮細胞の培養条件を検索中である。血管内皮細胞による血管増殖因子の抽出と分離した血管増殖因子の血管増殖能を調べる目的で兎の眼球角膜への注入後の血管新生速度測定を開始した状態で、現時点では実験中であり結果は得られていない。今年中に行う実験は(1)血管増殖因子を同定する。(2)血管増殖因子受容体を同定する。(3)血管増殖因子受容体を担癌マウスに投与して腫瘍縮小効果を測定する。(4)温熱効果の増強を確認する。以上の実験を行い血管増殖因子受容体投与による抗腫瘍効果を確認する予定である。腫瘍細胞は増殖能が大きいので、血管新生が追い付かないために低栄養、低酸素状態にある。そのために腫瘍は栄養、酸素等を確保するために血管増殖因子(VEGF)を放出して栄養血管を新生する。この時、腫瘍に対して温熱治療を加えると腫瘍部血管は選択的に血管損傷が発生し、更に血管が必要になる。正常組織では血管拡張によって血流が増加し、温熱損傷を受け難い。

本研究は腫瘍組織が栄養血管の新生のため放出したVEGFを周囲の血管のVEGF受容体(VEGF-R)が受け取り、血管新生を開始する時、VEGF-Rをブロックする事で抗腫瘍効果の出現があるかを調べた。人臍帯動脈および静脈(Informed consentあり)及びSCC-VII腫瘍担癌C3Hマウスから血管内皮細胞を採取し、温熱等の刺激によって放出されるVEGFとVEGF-Rの抽出を試みた。人VEGF(38kDa)とマウスVEGF(46kDa)の抽出は可能であったが両者のVEGF-Rの抽出は困難であった。VEGFによる腫瘍効果をSCC-VII腫瘍担癌C3Hマウスで調べた。大腿部皮下に腫瘍細胞を移植後5mm径に腫瘍が成長した時点で無処理群、温熱単独処理(43°C、20分加熱)群、温熱処理後腫瘍から2cm離れた皮下に2μg/0.05mlのVEGF(46kDa)を投与した(温熱+VEGF投与)群について腫瘍成長速度を測定した。処理後に腫瘍が2倍に成長する日数は無処理群は3.25日、温熱単独処理群は5.82日、温熱+VEGF投与群は7.70日になり、VEGF投与による温熱効果の増強が確認された。またVEGF投与によって血管新生が確認された事は脳梗塞、外因性壊死等の治療にも有効である事を示唆している。尚、本研究の詳細は報告書に記載します。
米国新聞・雑誌における沖縄（人）の表象に関する基礎的研究（1995-2018）

平成30(2018)年度は、琉球大学附属図書館で可能な限り2016年2018年の新聞記事のテキスト収集を継続し、質的分析を試みている。質的分析に関しては、より客観的な分析を試みるため、研究代表者と分担者が互いの資料を分析し、各々の分析を検証する体制を継続している。研究代表者と分担者はともに、2019年4月にワシントンDCで行われるPopular Culture Association/American Culture Associationで口頭発表が認められたため、共同で発表予定の"Representations of 'Okinawa' in US Newspapers (2016)"を執筆した。これまでほとんど取り上げられることのなかった「地位協定」や「思いやり予算」の問題に関して、端的であるが記事の中で言及されるようになったことと、その要因として、在沖米軍人による重大な犯罪や事故の多発や米国の大統領選挙戦などを挙げ、在沖米軍基地関連記事のフレーミングの変化を指摘した。沖縄に住む人々や、政治的・社会的リーダーの声、沖縄関連問題の研究者の声を積極的に取り上げていた点は、個々のジャーナリストの人権意識や沖縄の歴史や文化への理解度が影響していると分析した。しかし、沖縄の置かれている状況を正確に発信するためには、いまだ端的な言及に留まっている問題に関してさらに踏み込んだ報道が必要であり、その実現のための提言もまとめている段階である。同論文を口頭発表後、学会誌に投稿する予定である。また、2020年2月のシンポジウム開催に向け、参加予定の研究者やジャーナリストと意見交換を行っている。研究代表者の家族の介護が必要となったため、学会発表や論文投稿、シンポジウム開催等の計画が大幅に遅延している。2018年度後半は、2019年4月に米国で行われるPopular Culture Association/American Culture Association学会発表に向けての発表原稿の執筆を研究分担者と分担し、2019年4月に発表予定。2020年2月にシンポジウム開催を計画しており、招へいする研究者やジャーナリストとシンポジウムの方向性や発表内容について意見交換を行った。2019年4月に米国で行われるPopular Culture Association/American Culture Associationで研究分担者と共に発表予定。可能であれば、再度米国大学の付属図書館で新聞・雑誌資料・原紙、論文の収集を行い、記事の量的分析・質的分析・データベース化を進め、論文投稿につなげる。2020年2月に「米国新聞・雑誌における沖縄(人)の表象(仮)」に関するシンポジウムを開催する予定。招へいする研究者やジャーナリストと発表内容についての議論を重ね、準備を進める予定である。平成28年4月8月は沖縄県内、特に琉球大学図書館での新聞・雑誌資料収集にあたった。また、沖縄県立公文書館のフライマス・コレクションにおける1994年から2000年の沖縄関連の米国新聞・雑誌記事の原紙の複写を行った。県内で収集できる資料が限られているため、その後、平成28年9月16日から28日まで、研究分担者1名とともに、米国ワシントンD.C.にあるジョージ・ワシントン大学付属図書館内グローバル・リソーシーズセンター、メリーランド大学付属図書館ならびに米国公文書館においてデータベース等を利用し、沖縄関連の米国主要新聞・雑誌記事や関連資料の調査・収集を行った。これまで収集した資料の分析結果を"Representations of 'Okinawa' in Major U.S. Newspapers: A Focus on U.S. Military- related Issues in Okinawa (2012-2014)"として平成29年3月発行琉球大学法文学部人間科学科紀要『人間科学』第36号に掲載した。20122014年のThe Washington PostとTheNew York Timesの在沖米軍基地関連記事や社説において、沖縄に住む人々の声や沖縄の置かれてきた状況や歴史的背景に言及する報道が以前に比べ顕著になってきた事実を指摘した。しかし、米軍基地関連事件・事故や日米地位協定、思いやり予算、環境問題に関する報道は依然少なく、これらの問題に関して米国主要新聞読者に沖縄の実情を理解してもらうには、沖縄に関するさらなる歴史的、社会的背景事情や環境問題の詳述が求められるという結論に達した。米国の図書館では新聞・雑誌の原紙やPDFの資料収集も予定していたが、必要な資料が膨大なことと、米国の大学図書館でのデータベースの切り替えの時期であったことから、異なる機関や大学付属図書館のデータベースによる資料収集を余儀なくされたこともあり、想定外の時間を要した。結果、米国におけるさらなるリサーチが必要な状況である。また、米国への出張中に予定していたジャーナリストへのインタビューが急な仕事の都合により実現できなかった。沖縄の米軍基地問題を取り巻く状況が緊迫化してきていることから慎重にインタビューを進めなければならない状況になってきている。研究代表者は、初年度に米国ワシントンDCにあるジョージ・ワシントン大学で収集した米国主要新聞の沖縄関連記事を分析し、琉球大学法文学部人間科学科紀要『人間科学』第38号(2018年3月)に研究論文"Representations of U.S. Military-related Matters in Major U.S. Newspaper (2015)"を投稿、掲載された。米国主要新聞2紙(ワシントン・ポストとニューヨーク・タイムズ)による2015年の在沖米軍基地関連報道における主要なニュース・フレームは、普天間基地移設に伴う辺野古沖埋め立てをめぐる沖縄県と国との対立、沖縄の住民や新基地建設に抗議する人々の声、沖縄における反新基地建設運動に対する日本政府の強行的対応などであった。2012年2014年の報道にも見られた傾向が継続している要因を分析すると同時に、記事に反映された沖縄の現状を説明した。

昨今、国内外の沖縄関連報道において、必ずしも事実ではない報道、また説明不足から誤解が生じる報道が見られることに鑑み、誤報を訂正し米国と沖縄の情報格差を埋めることが喫緊の課題であると指摘した。情報格差を埋めるためには、事件の報道のみでなく、その歴史的、文化的、社会的背景事情や沖縄の現状の詳説も取り入れた報道が必須であり、情報源を米軍や米国政府等にのみ依存しないことが肝要であると指摘した。琉球大学付属図書館や沖縄県立公文書館での資料収集を継続し、データベース化を試みている。質的分析に関しては、より客観的な分析を試みるため、研究代表者と分担者が互いの資料を分析し、各々の分析を評価する体制を構築する段階にある。研究代表者の所属学部の改組があり、2016年からは改組のためのワーキング・グループ、委員会などの委員を務め、新学部説明のための高校訪問や改組のための書類作成に多くの時間を費やさなければならなかった。学内の事務的な仕事が大幅に増えたことに加え、改組で新設科目が増え、その講義の準備に腐心したため、研究活動が遅れている。研究代表者は2017年度入学生の指導教員も務めることになり、登録調整等の指導期間に米国での学会発表(4月初旬の開催のため)が重なったうえ、改組初年度という事情もあり発表を見送らざるを得なかった。実習科目も担当しているため、学生への対応等で時間が割かれたことも要因の一つである。また、研究分担者別の科研費プロジェクトが最終年度であったため、その研究を優先し、その分本科研費研究が予定通り進まなかった事情がある。平成30(2018)年度は、琉球大学附属図書館で可能な限り2016年2018年の新聞記事のテキスト収集を継続し、質的分析を試みている。質的分析に関しては、より客観的な分析を試みるため、研究代表者と分担者が互いの資料を分析し、各々の分析を検証する体制を継続している。研究代表者と分担者はともに、2019年4月にワシントンDCで行われるPopular Culture Association/American Culture Associationで口頭発表が認められたため、共同で発表予定の"Representations of 'Okinawa' in US Newspapers (2016)"を執筆した。これまでほとんど取り上げられることのなかった「地位協定」や「思いやり予算」の問題に関して、端的であるが記事の中で言及されるようになったことと、その要因として、在沖米軍人による重大な犯罪や事故の多発や米国の大統領選挙戦などを挙げ、在沖米軍基地関連記事のフレーミングの変化を指摘した。
トランスジェニックマウスを用いた神経原性腫瘍とヒルシュスプリング病の病因論的研究

筑波大学の深水、杉山等がレニン産生腫瘍を得ることを目的に、ヒトレニンプロモーターとhuman adenovirus type12のE1A・E1B融合遺伝子をヘテロに持つトランスジェニックマウスを作成したところ、予想に反して、マウスに高頻度にprimitive neuro-ectodermal tumor(PENT)が特異的に発生し、しかもこの発癌はマウスゲノムに組み込まれたアデノウィルス遺伝子による安定した遺伝性を有していた。また、腸管が拡張し、ヒルシュスプルング病に酷似した病態で死亡するマウスも見られた。我々はmatingにより155匹のトランスジェニックマウスを得、PENTの発生頻度、発生時期、発生部位、組織型、免疫組織学的特性、さらに腸管拡張の病態の解明について詳細な研究を行った。調べた155匹中、剖検数は153で、そのうち132匹、実にトランスジェニックマウスの85%に特異的にPENTが発生した。PENT発生時期は生後20-39週齢が最も多く、79匹、51%にのぼった。発生部位は多彩で、生後19週齢以前の早期には腹部・骨盤・四肢・体幹発生が80%を占めたのに対し、20週齢以降は頭脛部発生が激増して20週以降発生例の70%に達し、半数以上の55%が脳・頭骨内PENTという高頻度であった。組織学的には脳・頭骨内及び一部の骨盤位発生PENTはいずれもロゼットを形成し、電子顕微鏡所見ではmedullo-ependymalrosetteで上皮性の特徴を有していた。それ以外の部位のPENTは全てundifferentiated typeで、glycogenやneuropilの発達が証明されたが、神経分泌顆粒はほとんど認められなかった。腫瘍抗原はPGP9.5,neurofilamentの発現が両組織型で見られたが、他の神経腫瘍抗原の発現はほとんどなかった。腸管拡張マウスは8匹(5%)であったが、腸管壁内神経節細胞の欠如やアセチルコリンエスラーゼ陽性神経繊維の増生はなく、ヒルシュスプルング病ではないことを証明した。主要な腸管神経伝達物質の異常は認められなかった。ヒトレニンプロモーターとアデノウイルスE1A・E1Bの融合遺伝子を誘導したオスのC57BL6Jマウス1匹とwild typeのメスとの交配で、F_110匹中41匹(37%)の遺伝子導入マウスを得た。現在F_3まで飼育中であるが、遺伝子導入率はF_2が55/141(39%)、F_3が57/148(39%)と一定であった。これまで得られた計154匹の遺伝子導入マウスのうち、すでにオス10匹、メス22匹の32匹(21%)に神経原性腫瘍(PNTT)の発生が認められた。また、ヒルシュスプルング病様腸管拡張症が8匹、水腎・水尿管症が3匹に確認された。腸管拡張は生後間もなく認められたものではなく、狭小部腸管には壁内神経節細胞は認められ、ヒルシュスプルング病とは異なった病態であった。

腫瘍は生後3週齢より出現し始め、発生部位は頭部、四肢、縦隔、腹腔内、後腹膜、骨盤と多彩であるが、交換神経幹、副腎からの明らかな発生はなく、むしろ皮下などの軟部組織から原発したと考えられるものが多かった。組織学的にはどの腫瘍もほぼ同一の組織型で、光顕像・電顕像とも、強く神経原性を示唆し、免疫組織型的検索では、PGP9.5、Leu7のみ陽性で、NSE、NF、S-100、tyrosine hydroxylase(TH)、glialfibrillary acidicprotein(GFAP)、MIC2、vimentin、desmin、myoglobinは陰性であり、非常に未熟な神経原性腫瘍(PNET)と診断された。腫瘍をヌードマウス皮下に移植したところ順調に増殖し、ほぼ2ケ月毎に継代を繰り返して現在に至っている。今後、ヌードマウス移植腫瘍を用い、導入遺伝子で活性化されると神経原性腫瘍の発生との関係を調べる予定である。筑波大学の深水、杉山等がレニン産生腫瘍を得ることを目的に、ヒトレニンプロモーターとhuman adenovirus type12のE1A・E1B融合遺伝子をヘテロに持つトランスジェニックマウスを作成したところ、予想に反して、マウスに高頻度にprimitive neuroectodermal tumor(PNET)が特異的に発生し、しかもこの発癌はマウスゲノムに組み込まれたアデノウィルス遺伝子による安定した遺伝性を有していた。また、腸管が拡張し、ヒルシュスプルング病に酷似した病態で死亡するマウスも見られた。我々はmatingにより155匹のトランスジェニックマウスを得、PNETの発生頻度、発生時期、発生部位、組織型、免疫組織学的特性、さらに腸管拡張の病態の解明について詳細な研究を行った。調べた155匹中、剖検数153で、そのうち132匹、実にトランスジェニックマウスの85%に特異的にPNETが発生した。PNET発生時期は生後20-39週齢が最も多く、79匹,51%にのぼった。発生部位は多彩で、生後19週齢以前の早期には腹部・骨盤・四肢・体幹発生が80%を占めたのに対し、20週齢以降は頭頸部発生が激増して20週以降発生例の70%に達し、半数以上の55%が脳・頭骨内PNETという高頻度であった。組織学的には脳・頭骨内及び一部の骨盤位発生PNETはいずれもロゼットを形成し、電子顕微鏡所見ではmedullo-ependymalrosetteで上皮性の特徴を有していた。それ以外の部位のPNETは全てundifferentiated typeで、glycogenやneuropilの発達が証明されたが、神経分泌顆粒はほとんど認められなかった。腫瘍抗原はPGP9.5,neurofilamentの発現が両組織型で見られたが、他の神経腫瘍抗原の発現はほとんどなかった。腸管拡張マウスは8匹(5%)であったが、腸管壁内神経節細胞の欠如やアセチルコリンエステラーゼ陽性神経線維の増生はなく、ヒルシュスプルング病ではないことを証明した。主要な腸管神経伝達物質の異常は認められなかった。