hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
気孔の青色光情報伝達の遺伝学的・生化学的解析

1.昨年度に引き続き、赤外線サーモグラフィを用いて青色光による気孔開口に異常のあるシロイヌナズナ変異体の探索を行い、これまでに1次スクリーニングとして約10万個体のEMS処理株と10万個体のT-DNA挿入株の測定が終了し、目標としていた20万個体の測定が完了した。葉面温度変化に異常が見られた個体に関しては、2次スクリーニングとして次世代の植物における再現性の確認、3次スクリーニングとして表皮および生葉における気孔開度測定、4次スクリーニングとして細胞膜H+-ATPaseの活性化の測定を行い、変異体の絞り込みを行った。2. blue light signaling1(blus1)は昨年度、上記スクリーニングにより単離された変異体であり、フォトトロピンとH+-ATPase間の情報伝達を完全に欠いている。本年度はマッピングにより原因遺伝子の同定を進めたところ、BLUS1は孔辺細胞特異的に発現する新奇のプロテインキナーゼをコードしていることが分かった。次にBLUS1がフォトトロピンからの情報を下流へと伝達する分子機構について研究を進め、BLUS1のC末端のSer残基が青色光に依存して特異的にリン酸化されることを見出した。そこで同定されたSerをAlaに置換したBLUS1をblus1変異体に導入し、リン酸化の役割について調べた。その結果、野生型BLUS1を導入した形質転換体では気孔開口は回復するが、変異型BLUS1では回復せず、BLUS1の青色光によるリン酸化は気孔開口に必須のメカニズムであることが示唆された。24年度が最終年度であるため、記入しない。赤外線サーモグラフィによる葉面温度変化を指標とし、青色光による気孔開口に異常のあるシロイヌナズナ変異体の探索を行った。植物体にあらかじめ強い赤色光を照射し光合成による気孔開口を十分に行わせた後、微弱な青色光を照射すると、野生株では青色光に応答して気孔が開口し葉面温度が低下するが、phot1 phot2二重変異体ではこの変化は全く見られない。現在、本システムを用いて1次スクリーニングを行っており、これまでに約60,000個体のEMS処理株と80,000個体のT-DNA挿入株の測定が終了している。葉面温度変化に異常が見られた個体に関しては、2次スクリーニングとして次世代の植物における再現性の確認、3次スクリーニングとして表皮および生葉における気孔開度測定、4次スクリーニングとして細胞膜H^+-ATPaseの活性化状態の測定を行い、変異体の絞り込みを継続している。これらの中から、特にblue light signaling1(blus1)と名付けた変異体について興味深い結果を得ている。blus1は青色光による気孔開口、H^+放出反応、細胞膜H^+-ATPaseのリン酸化が全く見られないが、H^+-ATPaseの活性化剤であるfusicoccinに応答した反応は正常に見られた。また、blus1ではフォトトロピンや細胞膜H^+-ATPaseそのものは正常に発現し機能していることを確認しており、blus1の原因遺伝子は青色光情報伝達に必須の因子をコードしている可能性が示唆された。赤外線サーモグラフィによる青色光特異的な気孔開口に異常を示すシロイヌナズナ変異体めスクリーニング手法を開発した。本手法を用いてシロイヌナズナのT-DNAおよびEMSラインを対象にスクリーニングを行ったところ、blus1と名付けた興味深い変異体を入手することに成功した。本変異体の発見は光に対する植物の環境感覚の分子機構の解明に大きな進展をもたらすものと考える。今後はEMS処理株を100,000個体、T-DNA挿入株を100,000個体、phot1-EMS、phot2-EMS処理株それぞれ30,000個体を目標として、1次スクリーニングを継続する。

得られた変異体について詳細な解析を行い、フォトトロピンと細胞膜H^+-ATPase間の情報伝達に異常のある変異体を絞り込む。先行的に解析を行っているblus1変異体について、原因遺伝子を同定し、当該因子が青色光の情報を伝達する分子機構について、さらなる詳細な機能解析を行う。
動電過給法の高効率化によるキャピラリー電気泳動分析の高感度化と水質分析への応用

キャピラリーゾーン電気泳動法の高感度化を目的として、動電過給前濃縮法を最適化し、希土類金属イオン等をpptレベルで検出する事が可能となった(例えばエルビウム(III)の場合、0. 04 nM(6. 7 ng/ L))。これはICP-MSにも比肩できる感度である。これは試料体積を900. L、キャピラリー末端と電極の距離を約40mmと通常より長くする事などによって、試料を効率的に注入する事ができたためである。濃縮率は8万倍であった。動電加給前濃縮により高感度化を行うためには、試料バイアルにおける試料導入時の電場を拡大し、効率よく試料を導入する必要がある。単に電極とキャピラリー末端を離しただけでもある程度の効果が認められるが、電気は最短距離を流れるため、導入量はすぐに頭打ちしてしまう。そこで、H21年度はEKS前濃縮に用いる電極の構造および試料バイアルの構造と導入量の関係を、シミュレーションおよび実験により検討した。用いたソフトウエアはCFD-ACE+(CFD-RC, USA)と呼ばれるシミュレーションソフトウエアで、電気泳動と液体の流れなど物質移送に関する複数の物理要素を3次元空間において時系列で解くものである。(1)電極一体型リザーバーの設計製作:上記のシミュレーション結果に基づき、1020mL程度の容量の金属製(Al, Cu)リザーバー(外壁が電極)を作成し、実験的に試料導入効率を評価した。その結果、Cu製のバイアルは十分実用になることが明らかになった。ただし、極微量の金属イオンの漏れ出しがあるので、ppbレベル以下の分離には使用しにくい。また、容量を大きくするため直径方向を増加させるよりは、むしろ縦長の構造とする方が試料の効率よい導入が可能であることが明らかになった。(2)キャピラリー電気泳動装置の改造:作製したリザーバーを装着可能とするため、試料バイアル電極の接触面に安全に電極を接触させるよう注意し、CE装置に小規模な改造を施し、評価実験を行った。(3)現時点での結論:各種の試料導入部を検討した結果、現在では体積約1mL長さ50mm程度の非伝導性バイアル(PP製)に試料900μL程度を入れて使用する方法が、最も簡便であり、サブppbレベルの分析が可能であることを明らかにした。ただ、高感度であるが故に大気からの汚染対策が望まれ、次年度以降の課題としたい。動電加給前濃(EKS)により高感度化を行うためには、試料バイアルにおける試料導入時の電場を拡大し、効率よく試料を導入する必要がある。このため、シミュレーション(CFD-ACE+, CFD-RC, USA)による検討を重ねながら、電極一体型リザーバーの作製や、それに伴うキャピラリー電気泳動装置の改造などを行ってきた。今年度はさらに種々の形状を検討したが、試料液を細長いバイアル(直径約6mm、長さ約50mm、容積約1mL)に充填し,可能な限り広範囲に電場を印加できるよう、短縮した電極をセットし、EKSに適した電解液を使用することにより,十分な濃縮性能を得ることができた。得られたLODは希土類元素で0.04nM(イットリウムで3.6ppt、エルビウムで6.7ppt)濃縮率は約8万倍を達成した。さらに大容量の試料容器(25mL)を用いて、17mLの試料に対して試験を行ったところ,リング電極を用い同時に試料溶液を緩やかに攪拌することにより,LODは6pM(エルビウムで1ppt)濃縮率は約50万倍を達成した。これらはいずれもUV吸収法を用いたCE分析法として世界最高レベルである。一方本年度は、EKSによるとなぜこのような高度の濃縮が可能であるか,シミュレーションにより詳細に検討した。その結果,低濃度の試料のEKSにおいては、等速電気泳動的前濃縮に必要な、ターミナルゾーン(他のゾーンより電位勾配が高いゾーン)が、自動的に生成し、このゾーンの存在が高度の濃縮に極めて重要な役割を果たしていることを見出した。これらの詳細はすでに論文として公表済みである。現在,アニオンについても高感度化を進めている。アニオン分析についてはカチオン以上に大気からの電解液や水の汚染の影響が顕著であり、解決すべき難題である。動電加給前濃(EKS)による前濃縮を用いるキャピラリーゾーン電気泳動法(EKS-CZE)により、申請者らは、希土類元素で0.04nM(エルビウムで6.7ppt)という極めて低い検出限界濃度(LOD)を達成した。高感度化の基本的戦略は、(1)等速電気泳動濃縮が起こる泳動バッファーを使用すること、(2)電気泳動比較的大量の試料を使用すること、(3)その試料全体に電場を印加することの3点で、結果、希薄試料中痕跡濃度成分の導入効率を向上させ、検出可能とする。

これまで使用した装置(大塚電子、CAPI-3300)は、キャピラリーと電極が分離したタイプであり、電極をリング状に改造する事が容易であり、かつ試料体積も最大17mLまで使用する事ができた。しかしながら、CAPI-3300は我が国でしか使用されていない装置であり、本分析法を普及させるには、海外で広く使用されている装置の使用が不可欠である。そこで本年度は、Agilent製HP-3D電気泳動装置を使用して、EKS-CZEを試みると共に、本装置の問題点などについて詳細に検討した。HP-3Dではキャピラリーと電極が一体であるため(同軸構造)、オリジナルの構造を生かしてEKSを行うためには、電極を短くする必要があった。この改良により、試料体積を最大230μLまで増加できたが、同軸構造のままでは試料に印可される電場範囲が十分でなかったのでリング電極に改めた結果、高感度分析が可能となった。また、本年度はDNAの分析に応用し感度を評価した。結果、オリジナル構造では72bpについてLODが125pptであったものが、リング電極により約10pptを達成した。また、EKSのシミュレーションおよび実験により、高感度分析においては、特に電解液のcarry overの問題が深刻であることを明らかにし、試料導入前の電極等の洗浄プロセスが重要であることを明らかにした。
プラナリア成体における形態形成遺伝子の異所的発現

プラナリア成体の幹細胞(新生細胞)に外来遺伝子をを導入するために、ベクターの開発および、新生細胞の分子的特徴づけを行なった。ベクターの構成要素であるプロモーター、選択遺伝子の開発を終えた。プロモーターとして、プラナリアEFlおよびEF2遺伝子の5'プロモーター領域の遺伝子配列をuniversalPCR法により決定した。選択遺伝子として、プラナリアNa^+/K^+-ATPase遺伝子をin vitro mutagenesisで改変し、ウアバイン耐性Na^+/K^+-ATPase遺伝子を作成した,プラナリア成体への遺伝子導入をパーティクルガン、電気穿孔法により試みた。プラナリア用のベクターがまだ完成していないので、CMVプロモーターにGFPをつないだベクターを用いたが、有意なシグナルをえることができなかった。一方で、遺伝子導入の標的となる新生細胞の分子的な特徴づけが進んだ。新生細胞は細胞増殖と全能性で特徴づけられる。増殖に関して、DNA複製複合体の構成分子であるPCNA遺伝子をプラナリアでクローニングし、また、PCNAタンパク質特異抗体を作成した。PCNAが間充織に散在する新生細胞に特異的に発現していることを確認した。全能性に関しては、新生細胞のクロマトイド小体が卵の生殖顆粒に類似していることに注目し、生殖顆粒の構成要素の一つであるvasa遺伝子をプラナリアで探索した。結果、vasa-like gene A(vlgA)のクローニングに成功した。vlgAの発現をin situ hybridizationにより調べたところ、間充織スペースの新生細胞で発現することがわかった。再生過程において、vlgAは再生芽そして再生咽頭で発現し、これは新生細胞から一段分化の進んだ再生細胞においてもVlgAが残存しているか、または、なんらかの機能をはたしているものと考えられたプラナリア成体の幹細胞(新生細胞)に外来遺伝子をを導入するために、ベクターの開発および、新生細胞の分子的特徴づけを行なった。再生過程において、vlgAは再生芽そして再生咽頭で発現し、これは新生細胞から一段分化の進んだ再生細胞においてもVlgAが残存しているか、または、なんらかの機能をはたしているものと考えられた
RA滑膜細胞における活性酸素種産生と細胞死に対するミトコンドリアMnSODの効果

慢性リウマチ性関節炎や変形性関節症などの関節炎の発症には、活性酸素(ROS)や一酸化窒素(NO)発生が重要なイベントであることが知られている。ROSは細胞にアポトーシスなどの障害を与えるだけでなく、炎症の活動性や伝達因子として影響することが明らかとなっている。本研究により、ミトコンドリアに局在する抗酸化酵素(マンガンスーパーオキサイドディスムターゼ)は、ミトコンドリア由来ROSを消去する作用があり、細胞障害や炎症作用を抑制することが示唆された。RAやOAの関節疾患におけるミトコンドリア由来活性酸素産生やアポトーシス発現に対するMnSOD効果との関連性については未だ知られていない。本研究では、MnSOD発現を抑制したRA細胞モデルを作製し、酸化ストレスによるミトコンドリア活性酸素産生の増加やアポトーシス誘導に対するMnSOD効果について解明する。得られたミトコンドリア障害に対するMnSODの効果と炎症の活動性との関わりについて評価を行うことを目的とした。まず、初年度はMnSODの発現を抑制した種々の細胞モデルを作製することを試みた。RA滑膜線維芽細胞を用い、MnSOD発現の異なる細胞モデルの確立を行った。MnSODの発現抑制については、MnSOD siRNAのコンストラクト(Ambion社)を用いて、Lipofectamine 2000(Invitrogen社)により細胞内に遺伝子の導入を行った。MnSOD遺伝子レベルでの発現量は、現有のABI PRISM 7000装置を用い、TaqMan probeによる定量RT-PCRで検討した。また、蛋白レベルでのMnSOD活性については、Nondenaturedgel assay法で定量的に評価を行った。RA滑膜線維芽細胞におけるMnSOD活性および発現量の程度を、それぞれ親株細胞と比較した。結果:(1)siRNAによるMnSOD mRNAの発現については、トランスフェクト3日後で最も抑制された。親株細胞やcontrol siRNAを行った細胞に比較して、MnSOD mRNAは20%程度にいたるまで発現抑制がみられた。(2)Nondenatured gel assayによるMnSOD活性については、トランスフェクション5日後で最も抑制され、親株細胞やcontrol siRNAを行った細胞に比べて、約60%にまで発現抑制が認められた。初年度に作製したMnSOD発現を抑制したRA滑膜線維芽細胞モデルを用い,酸化ストレスによるミトコンドリア活性酸素産生の増大や過酸化脂質産生,アポトーシス誘導に対するMnSODの効果について解明することを目的とした。さらに,ミトコンドリア障害に対するMnSODの効果と炎症活動性との関わりについて評価を行った。材料と方法:RAの滑膜細胞を用い,サイトカイン刺激,無刺激下で培養した。細胞内のROSはHPF蛍光試薬,NOはDAF蛍光試薬により共焦点レーザー顕微鏡で観察を行った。過酸化脂質はHNE抗体法,アポトーシスはHoechst染色法にて検出した。細胞にミトコンドリア内superoxideを消去するMnSOD遺伝子のsiRNAを導入し,MnSOD量の変化とROS, NO産生,過酸化脂質,アポトーシスとの関連性を検討した。また,サイトカイン刺激および無刺激下で培養した上清を回収し,上清中に含まれるIL-6量をELISA法で測定した。結果:1)RA滑膜細胞にMnSOD遺伝子のsiRNAを導入した群では,Control siRMを行った群に比較してサイトカイン刺激によりROS量が有意に増加した。また,細胞から発生するROSはミトコンドリア由来であることが示唆された。2)MnSODsiRNAにより,過酸化脂質産生やアポトーシスはサイトカイン刺激で有意に増加がみられたが,NO産生に対して影響は認められなかった。4)サイトカイン刺激により培養上清中のIL-6量は上昇し,ミトコンドリア由来活性酸素量の増大が炎症の活動性と関連することが示唆された。結論:細胞にMnSODsiRNAの導入で,NO量は一定であるにもかかわらずミトコンドリアROS量が増大し,パーオキシナイトライト,過酸化脂質およびアポトーシスを増大させることにより,NO量とは別にミトコンドリアROS量の変化の重要性が示唆された。
喫煙による早期血管障害におけるmicroRNAの関与と機序

我々は早期血管障害を生じていた喫煙者群と早期血管障害が生じていなかった非喫煙者群の両群で、次世代シーケンサーによるmicroarrayを用いたmicroRNA(miR)発現プロファイル解析を実施した。その結果、15のmiRで両群間に発現の差異を認めた。しかしながら、両群間で発現差異を認めたmiRが喫煙による早期血管障害に関与するのか、早期血管障害発生機序とどのように関わるか、は、明らかではない。本研究では、喫煙者における早期血管障害に関わるmiRを明らかにし、NO産生能の低下、炎症をはじめとする血管制御因子に関わるmiRを検討し喫煙による早期血管障害におけるmiRの役割とその機序を解明することを目的とする。
ひずみ硬化型高靭性セメント複合材料の構造利用に関する国際共同企画研究

1.引張ひずみ硬化型高靭性セメント複合材料の評価と利用に関する調査引張ひずみ硬化型DFRCCは,引張応力を受けると,微細ひび割れが分散して生じ,大きな引張ひずみに耐えることができ,破壊の過程におけるエネルギー吸収量が極めて大きいという性能を有している.これらの性能を生かして,引張ひずみ硬化型DFRCCは,防食材,止水材,鋼材被覆材,エネルギー吸収材,緩衝材等への利用が期待される.こうした性能を生かした利用をはかるためには,構造利用を念頭においた評価項目,評価基準(閾値),評価試験方法の体系を整備し,材料構成則や設計施工指針等を調える必要がある.さらに,製造のしやすさ(品質管理)やフレッシュな状態での施工のしやすさに加え,耐久性,耐疲労性,耐熱性等の硬化後の性能についても,十分把握し必要に応じて改良する必要がある.2.国際ワークショップの開催平成14年10月21日22日に高山グリーンホテル(岐阜県高山市)において,JCI国際ワークショップ「高靭性セメント複合材料の適用と評価(DFRCC-2002)」を開催した.海外からDr. V.C. Li (USA),Dr. A.E. Naaman (USA), Dr. H.W. Reinhardt (Germany),F.H. Wittmann (Switzerland)を含め22名,国内から61名の参加があり,基調講演3件,委員会報告2件,一般講演23件が行われ,論文集(B5版298ページ)が出版された.展示やワークショップ後の見学(岐阜大学実験室,クラレ岡山工場)も行われた.国際的な研究者・技術者のネットワークの構築,力学特性・耐久性・品質管理に関する基礎データの収集,利用拡大と設計法の確立,試験方法の確立について,協力していくことを確認した.コンクリート工学2月号で詳細を報告した.1.引張ひずみ硬化型高靭性セメント複合材料の評価と利用に関する調査引張ひずみ硬化型DFRCCは,引張応力を受けると,微細ひび割れが分散して生じ,大きな引張ひずみに耐えることができ,破壊の過程におけるエネルギー吸収量が極めて大きいという性能を有している.これらの性能を生かして,引張ひずみ硬化型DFRCCは,防食材,止水材,鋼材被覆材,エネルギー吸収材,緩衝材等への利用が期待される.こうした性能を生かした利用をはかるためには,構造利用を念頭においた評価項目,評価基準(閾値),評価試験方法の体系を整備し,材料構成則や設計施工指針等を調える必要がある.さらに,製造のしやすさ(品質管理)やフレッシュな状態での施工のしやすさに加え,耐久性,耐疲労性,耐熱性等の硬化後の性能についても,十分把握し必要に応じて改良する必要がある.2.国際ワークショップの開催平成14年10月21日22日に高山グリーンホテル(岐阜県高山市)において,JCI国際ワークショップ「高靭性セメント複合材料の適用と評価(DFRCC-2002)」を開催した.海外からDr. V.C. Li (USA),Dr. A.E. Naaman (USA), Dr. H.W. Reinhardt (Germany),F.H. Wittmann (Switzerland)を含め22名,国内から61名の参加があり,基調講演3件,委員会報告2件,一般講演23件が行われ,論文集(B5版298ページ)が出版された.展示やワークショップ後の見学(岐阜大学実験室,クラレ岡山工場)も行われた.国際的な研究者・技術者のネットワークの構築,力学特性・耐久性・品質管理に関する基礎データの収集,利用拡大と設計法の確立,試験方法の確立について,協力していくことを確認した.コンクリート工学2月号で詳細を報告した.
わが国を中心とした先天性胆汁酸代謝異常症の包括的スクリーニング構築

先天性胆汁酸代謝異常症(IEBAM)は小児における原因不明の胆汁うっ滞症を来たす疾患の一つである。我が国における本疾患の全体像はいまだ不明であり、症状が進行すると死に至る可能性がある一方で、適切な治療を行えば生存を見込める可能性がある。liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS)を用いた胆汁酸分析により、8つのIEBAMを早期診断することが可能である。これまでの凍結尿検体郵送法の代わりに濾紙尿郵送法を用いることにより、簡便でかつ低コストでスクリーニングを行うことができる。IEBAMのスクリーニングを行い、我が国および海外におけるIEBAMの実態調査や治療の提言、鑑別される胆汁うっ滞性疾患の生化学的評価を中心に研究を行ってきた。今回の研究期間において、依頼を受けた件数は33例であり、うちIEBAMは7例であった。全症例に関して、臨床経過、肝機能の推移、定期的な胆汁酸分析を行っており、治療に関する提言を依頼先へ行っている。さらに本スクリーニング法を用いて3βースルホオキシ-7β-N-アセチルグルコサミニル-5-コレン酸を検出することで、Niemann-PickC型の一部を診断することが可能となった。IEBAMやNiemannーPickC型は非常に稀な疾患であり、確定診断には遺伝子解析といった特殊な検査が必要であるため、診断までに長い時間や高いコストがかかるケースがある。本スクリーニングシステムを用いることで簡便にかつ、低コストで診断を行うことが可能となった。以上について国際学会や研究会で発表し、本疾患の理解の普及に努めた。また、本研究によるスクリーニングシステム及び診断し得たIEBAM症例に関して、研究論文を作成中である。
Tollレセプター複合体による細菌リポ多糖(LPS)認識機構の解明

感染防御機構において、病原体の認識が重要であることはいうまでもない。抗原特異的な認識は抗体やT細胞レセプターを持つリンパ球が担うと考えられていた。しかしながら病原体成分に特異的な認識分子としてToll-like receptorが発見され、自然免疫における病原体排除ばかりでなく、獲得免疫応答の誘導にも重要であることが明らかになってきた。病原体成分の中で最も強く免疫機構を活性化するものがエンドトキシン(LPS, Lipopolysaccharide)である。エンドトキシンショックをはじめとして多くの疾患に関わることが報告されており、多くの研究者がその認識機構を研究し、認識分子を検索してきた。LPSの認識機構も長い間なぞであったが、TLRとして最初にクローニングされたTLR4がその認識分子であることが明らかにされた。我々はTLR4の細胞外ドメインに会合する分子MD-2をクローニングした。本研究期間においてはMD-2分子がTLR4によるエンドトキシン認識に重要かどうかについて、MD-2欠損マウスを作成することで検討した。その結果、MD-2欠損マウスはTLR4欠損マウスと同様にLPSにまったく応答しないことが明らかとなり、長い間検索されてきたエンドトキシン認識分子はTLR4-MD-2であることが結論された。またTLR4-MD-2に構造的に類似したRadioprotective105(RP105)-MD-1についてもそれぞれの遺伝子欠損マウスを作成した。これらのマウスはB細胞においてのみ、LPS応答が低下していた。したがってB細胞のLPS応答にはTLR4-MD-2ばかりでなく、RP105-MD-1も関わることが明らかになった。グラム陰性菌の膜成分であるリポ多糖(LPS)は病原体由来糖脂質の中でもっとも強力に免疫機構を活性化する。LPSを免疫機構が認識するメカニズムについて我々は解析を進めている。これまで、LPSはToll-like Receptor 4(TLR4)と我々が発見したTLR4会合分子MD-2による複合体TLR4/MD-2によって認識されることを我々は報告している。本年はTLR4/MD-2のプロトタイプであり、我々が発見したRP105/MD-1複合体のLPS認識における役割をノックアウトマウスを作成し、解析することで検討した。RP105ノックアウトマウスにおけるB細胞の産生、分化には異常は認められなかった。B細胞レセプターやCD40を介するシグナルによる活性化にも異常は認められなかったが、LPS刺激による増殖反応と抗体産生反応において低応答性を示した。低応答性のメカニズムを、細胞株を用いて検討したところ、TLR4/MD-2とRP105/MD-1が機能的に協力していることが明らかになった。この結果はLPS認識が複数のTLRおよびその類似分子によって制御されている可能性を初めて示したものである。TLR2によるグラム陽性菌の認識においても、TLR2/TLR1、TLR2/TLR6という複合体を形成することの重要性が報告がされている。今後はさらにTLR4/MD-2とRP105/MD-1が物理的に会合しているのかどうかという点と、これらの複合体がLPSをどのようにして認識しているのか、LPS認識機構を分子レベルで明らかにしてゆく予定である。これまで、LPSはToll-like Receptor 4(TLR4)とTLR4会合分子MD-2による複合体TLR4/MD-2によって認識されることを我々は報告している。本年はMDタンパクの機能解析を進め、以下の成果を得た。1.TLR4/MD-2に類似している分子にRP105/MD-1がある。

昨年度のRP105ノックアウトマウスに続いてMD-1ノックアウトマウスを作成し、その解析を行った。RP105欠損B細胞はLPS低応答性を示すが、MD-1欠損B細胞も同様なLPS低応答性を示した。MD-1欠損B細胞の細胞表面でのRP105、MD-1の発現を調べてみると、MD-1ばかりでなく、RP105の発現も検出できなかった。すなわち、MD-1がRP105の細胞表面への発現に必須の分子である事が明らかになった。2.MD-2の機能解析としてlipid A誘導体を用いた実験を行った。Lipid IVaはLipid Aの誘導体であり、マウスにはアゴニストとして、ヒトにはアンタゴニストとして作用する。この種特異的な薬理作用がTLR4によって規定されるのか、MD-2によって規定されるのか検討するためにマウスTLR4/ヒトMD-2のキメラ複合体を発現する細胞株を確立し、LipidIVaに対する応答性を検討したところ、ヒトと同様にLipidIVaは拮抗剤として作用した。この結果はTLR4によるLPS認識の微妙な特異性がMD-2によって影響されることを示しており、TLR4のエンドトキシン認識にMD-2が直接関わっていることを示唆している。自然免疫機構において、病原体認識のメカニズムは明らかではない。Toll-like receptors (TLRs)が病原体を認識してシグナルを伝達するが、その認識機構は分子レベルでの理解には至っていない。本研究ではグラム陰性菌の膜糖脂質であるエンドトキシン(LPS, Lipopolysaccharide)の認識に焦点を絞り、その認識機構の分子レベルでの解明を目的とする。LPSの認識にTLR4が必須であることはTLR4ミュータントマウスのLPS低応答性から明らかである。しかしながらTLR4は単独ではLPSを認識できない。我々はTLR4の細胞外ドメインに会合する分子MD-2を発見し、この分子がLPS認識に重要な役割を果たしていることを細胞株で示してきた。本年度は、個体レベルでのLPS応答におけるMD-2の役割を明らかにするために、MD-2ノックアウトマウスを作成し、そのLPS応答性を検討した。その結果、MD-2を欠損したB細胞、マクロファージ、樹状細胞などの免疫担当細胞はLPSにまったく反応せず、LPS投与による血中のサイトカイン産生はまったく認められなかった。MD-2欠損マウスはグラム陰性菌であるネズミチフス菌の感染に高い感受性を示し、またエンドトキシンショックには逆に抵抗性であった。これらの表現系はTLR4ミュータントマウスに類似しており、個体レベルにおいてもTLR4-MD-2複合体がLPSを認識していることが明らかになった。さらに我々はTLR4に対するMD-2の役割についても検討した。MD-2の欠損した線維芽細胞ではTLR4はゴルジ体に停滞しており、MD-2と会合してはじめて細胞表面に出られることを明らかにした。つまりMD-2がTLR4の細胞内での分布を制御していることを明らかにした。今後はMD-2のLPS認識における役割を明らかにする必要がある。
変形性脊椎症の発症と進展メカニズムに関する研究-加齢に伴う頸肩痛・腰痛の予防と治療をめざして-

変形性脊椎症の発症と進展メカニズムを、主にアテトーゼ型脳性麻痺患者の頸椎を参考に研究調査し、以下の結果を得た。1)アテトーゼ型脳性麻痺患者の頸椎レ線調査により、本患者群の頸椎症性変化は一般健常人より約30年早いことが判明し、下位頸椎の骨棘形成と上位椎間のすべり不安定性という一般高齢者の本症と共通した特徴をもち、本患者群頸椎が変形性脊椎症の早期出現モデルと見做しうることが立証された。2)本患者群の頸椎運動を解析し、円滑さを欠く、速度、加速度の急激な変化を伴う椎間運動が観察された。これをモデルで近似することで、上位頸椎にこはせん断力、下位頸椎には曲げモーメントが生じていると推測され、運動学的側面から1)のレ線所見との関連が示唆された。3)これまでにない手術中に脊椎の剛性を計測する方法を開発し、椎間板変性と剛性値との関係、手術操作に伴う不安定性変化などの結果を得た。4)繰り返す荷重が脊椎症を引き起こすことを家兎を用いてin vivoで立証した(脊椎症モデルの作成)。また、そうした繰り返し荷重が脊椎単位の力学特性をどのように変化させているのかをねじり負荷についてin vitroで計測した。以上より疲労現象として脊椎症を見做しうる可能性を示した。5)臨床的側面からアテトーゼ型脳性麻痺患者頸椎症の手術成績をまとめ、より優れた確実なものとするための治療計画を提唱した。6)痙性両麻痺患者も対象としてとりあげ、その腰痛出現の原因をレ線により解析し分離症の発生頻度が高いことを明らかにし、その発症要因を考察した。各年代にわたる150人のアテト-ゼ型脳性麻痺患者を登録した。今後長期にわたり頸椎症変化を観察し得る。第一段階の調査では、アテト-ゼ型脳性麻痺患者の頸椎症変化は一般健常人より約30年進行が早いことが判明した。上位頸椎は辷り不安定性が著明で下位頸椎は頸椎症変化が若年より重症化する。頸椎における力学的負荷の蓄積の普遍的結果を示す。これらの患者における頸椎運動解析によりその運動様式が著しく異なることが判明した。矢状面運動において頸椎運動の速度・加速度が著しく大きい、あるいは、時間的いびつさを有する。加速度としては、健常人の2.7倍が記録された。頭頸部運動は頭部を『重り』、頸部(頸椎)を『はり』とする片持ちばりの運動と近似でき、その大きな加速度により上位頸椎には著しいせん断力、下位頸椎には曲げモ-メントが生じていると考えられ、これらが前述の辷り不安定(上位頸椎)並びに骨棘形成(下位頸椎)を促進する力学的因子と推察される。さらに運動解析の継続により『力』についての推論、並びに回旋も含めて同一個体内の運動様式上の特徴が将来どのような頸椎変化を生じるか、引き続き観察することを通して、どのような力学的負荷が頸椎破綻の基因であるかを追求する。さらに術中不安定測定により脊椎構成因子が力学的負荷に対して、各々、どのような維持機構を有するかについて判明しつつある。さらに以上のような、いかなる力学的負荷が構造破綻を生じるかという点と同様にそのくり返し(すなわち疲労現像)がいかに脊椎の構築破綻をきたすかという問題を家兎の脊椎にくり返し負荷を加えることにより、頸椎症の作成が可能であることを明らかにした。現在、どの方向、どの程度の力のくり返しがどのような脊椎の拳動と構築破綻を生じるかについて実験継続中である。今日まで各年代にわたる約200人のアチト-ゼ型脳性麻痺患者を登録した。現在、彼等の頸椎・腰椎における変形性脊椎症の進展状況についての調査を継続している。

上位頸椎では辷り、下位頸椎では矢状面回旋不安定性を多く示し、運動解析より示された健常人と比較して上位頸椎での大きなせん断力、下位頸椎での大きな曲げモ-メントが変形性脊椎症発症において力学的観点からみて重要な要素と考えられる。術中不安定性測定により、椎間板変性と脊椎運動単位の剛性として捕えた脊柱不安定性の間に明確な相関のあることが示され、さらに脊柱構成因子の脊柱安定性にはたす役割についてデ-タを蓄積中である。これよりいかなる脊柱の構造破綻がどのような変性を生じていくのかをさらに明らかにする予定である。さらに現在、動物の新鮮屍体、あるいは生体における脊椎の運動単位に対して生体工学的見地より、破壊テスト並びに繰り返し負荷テストを行っている。力学的負荷としてはアテト-ゼ型脳性麻痺の運動解析より曲げ、回旋、圧縮一引張り等であり、ヒト脊椎における負荷の中でもアテト-ゼで特徴づけられる負荷と加えその力学的特性を調査している。破壊テストにより各種負荷に対する力学的特性を探り、それを基準として繰り返し負荷テストを行い、その力学的特性の変化とその構造破綻がどの構成要素よりいかに進展するか、また各種負荷に対する破綻様式の相違について調査中である。これらのデ-タの部は工学関係の学会より発表を予定している。1)各年代にわたる84人の痙直型脳性麻痺患者を登録した。この患者群では加齡とともに腰椎前湾が増大し、高頻度に腰椎分離症が発症することを明かにした。腸腰筋の痙性により股関節の屈曲拘縮が生じ、腰椎前湾の増大することで脊椎後方要素への力学的負荷が繰り返され、腰椎が構造破綻を生じると考えられた。2)家兎の脊椎に繰り返し運動を負荷することにより、椎間板変性や椎体辺縁部の骨棘形成のみならず、椎間関節の変形性関節症などの脊椎症変化を短期間のうちに作成することが可能であることを示した。今日まで変形性脊椎症は加齡により生じると考えられてきたが、この実験は変性性脊椎症が力学的負荷の蓄積による脊椎の構造破綻としてとらえることが可能なことを示した。3)個々の負荷形態(引張り一圧縮、曲げ、せん断、ねじり)に対する椎間板の力学的挙動を知るために、家兎脊椎用把持具を作成し、脊椎機能単位に繰り返し負荷を加えた。ねじり負荷の場合は、発生するトルクがある繰り返し数で急激に低下し破壊に至ることが示された。組織学的には、椎間板線維輪の層板構造の破壊が見られた。さらに、ねじり負荷の角度振幅の大きさと、破壊を生じる繰り返し回数の間には、一定の関係があることが示された。また、椎間板高位の違いも影響し、これは脊椎機能単位の断面係数の影響であることが示された。こうしたデータの蓄積により、脊椎運動単位における損傷の累積特性が明らかになりつつある。現在、他の負荷形態における脊椎の挙動についての実験継続中である。1)繰り返す運動負荷の脊椎への影響を明かにするために、前年度に引き続き家兎腰椎椎体-椎間板-椎体単位に繰り返しねじり負荷を加えてその挙動を調査した。繰り返し回数の増加とともに一定の角度振幅によって観察されるトルクが漸減し、ある回数で急激に低下し破綻することが明かとなった。この破綻繰り返し回数とねじり負荷角度振幅の間に一定の対数式で示される関係が存在、これは1回の負荷での破綻と異なる力学挙動であることが示された。またトルクの漸減課程での荷重変位曲線の観察から単位としての不安定性増加が示された。破綻後の組織学的調査では、破綻部位は椎体成長軟骨帯であったが、椎間板内に線維輪層板状構造の乱れ、亀裂が存在し、脊椎機能単位における累積損傷(疲労特性)の一端が明かとなった。
バクテリオファージが引き起こす腸内細菌叢破綻メカニズムに関する研究

炎症性腸疾患(IBD)の発症機序の1つとして、腸管内でのバクテリオファージによる腸内細菌の溶菌、それに続く菌体内からの抗原の露出により、炎症が惹起さることが想定される。IBDを含むdysbiosisが生じる腸管疾患を理解する上で、ファージと細菌叢との関係性を明確にする必要が有る。本研究は、ファージが引き起こす腸内細菌叢破綻メカニズムに関する研究である。健常者およびIBD患者の腸内の全バクテリオファージ解析(phageome解析)と細菌種の株レベルでのゲノム比較・多様性解析を行い、ファージにより溶菌される細菌叢中の主要クローンとそのファージを特定し、ファージによる腸内細菌叢破綻メカニズムを解明することを目的としている。本年度では、潰瘍性大腸炎(UC)患者のメタゲノム解析から行った。抗菌薬多剤併用療法開始前の活動期では、Bacteroides, Parabacteroides, Rickenella, Clostridium属細菌の比率が増加していたが、治療終了3ヶ月後の寛解期では、Bifidobacterium及びLactobacillus属細菌の比率が顕著に増加していた。一方、抗菌薬多剤併用療法で有効性を示さなかった患者では、治療前後でBacteroides及びParabacteroides属細菌の大きな変動は認めらなかった。ファージ配列に関しては、昨年度作成したphageome解析の為のファージゲノムDNA配列のデータベースに対して検索を実施したものの、ファージ配列の多様性が多く認められ、得られた配列がどの細菌種に対するものかの判定が困難であった。更に、UC患者の病変粘膜細胞内から分離されたFusobacterium属細菌の完全長ゲノム配列も決定した。ゲノム系統解析の結果、F. varium以外の同一な種も、本疾患の病変部より多数分離されていたことが明らかとなった。Whole shotgun metagenome解析に関しては概ね順調に進んでいるが、ファージ配列の多様性が多く、得られたファージ配列がどの細菌種に感染するファージかを推測するのことに苦戦している。また、ファージ粒子の回収量を多くし、ファージ感染実験を実施する必要性がある。細菌叢中の細菌に対するファージ感染実験を行い、UC患者由来のファージがどの菌種に作用するかを確認する。さらに、特定された菌種のうち、細菌叢で主要な比率を占める細菌種の分離をし、分離菌株および分離ファージの特異性の確認を試みる。本年度は、糞便中のファージ粒子の回収方法の検討とファージゲノム解析を行い、腸管内ファージ配列のカタログ化(phageome解析)を行なった。また、公開済みファージゲノム配列及び細菌ゲノム配列よりprophage領域を推定及び抽出し、phageome解析の為のファージゲノムDNA配列のデータベース作成も行った。糞便中のファージを効率よく回収する手法を確立し、メタゲノム配列からde novo assembleすることで、糞便中に存在する主要なファージゲノム配列を取得した。配列のカタログ化は実施することができ、新規ファージゲノム配列が多数存在することが明らかとなった。更に、潰瘍性大腸炎(UC)患者の病変粘膜細胞内から分離されたFusobacterium variumの完全長ゲノム配列も決定し、本菌の特徴をゲノムレベルで解析し、本菌の有するprophage領域も推定した。糞便中のファージを効率よく回収する手法は確立でき、メタゲノム配列からファージ配列をde novo assembleすることで、糞便中に存在する主要なファージゲノム配列を取得し、配列のカタログ化は実施することができた。それら配列を作成したデータベースを用いて検索したところ、新規ファージゲノムが多数存在し、どの細菌種に感染するファージであるかまでは、本年度では特定できていない。

一方、抗菌薬多剤併用療法で有効性を示さなかった患者では、治療前後でBacteroides及びParabacteroides属細菌の大きな変動は認めらなかった。ファージ配列に関しては、昨年度作成したphageome解析の為のファージゲノムDNA配列のデータベースに対して検索を実施したものの、ファージ配列の多様性が多く認められ、得られた配列がどの細菌種に対するものかの判定が困難であった。更に、UC患者の病変粘膜細胞内から分離されたFusobacterium属細菌の完全長ゲノム配列も決定した。ゲノム系統解析の結果、F. varium以外の同一な種も、本疾患の病変部より多数分離されていたことが明らかとなった。Whole shotgun metagenome解析に関しては概ね順調に進んでいるが、ファージ配列の多様性が多く、得られたファージ配列がどの細菌種に感染するファージかを推測するのことに苦戦している。また、ファージ粒子の回収量を多くし、ファージ感染実験を実施する必要性がある。ファージ粒子及びファージゲノム配列は得られているので、次年度にて、UC患者のどの種類のファージが健常者のどの菌種に作用するかを実験的に確認し、さらに、得られたファージの感染能力についてもphageome解析を用いて調査していく。細菌叢中の細菌に対するファージ感染実験を行い、UC患者由来のファージがどの菌種に作用するかを確認する。さらに、特定された菌種のうち、細菌叢で主要な比率を占める細菌種の分離をし、分離菌株および分離ファージの特異性の確認を試みる。理由:年度末納品等にかかる支払いが平成30年4月1日以降となったため、当該支出分については次年度の実支出額に計上予定である。平成29年度分については、一部次年度使用額が生じてるが、本研究にて、ファージ粒子を効率よく回収できたことで、当初予定していた次世代シークエンサーの解読回数よりも少ない条件で解析を行なうことができた為である。使用計画:次年度に計画しているファージ感染実験条件下でのphageome解析にかかる費用として使用する予定である。年度末納品等にかかる支払いが平成31年4月1日以降となったため。当該支出分については次年度の実支出額に計上予定であるが、平成30年度分についてはほぼ使用済みである。
音像定位に関連する皮質活動の脳磁図による記録

左右両耳聴による音源の定位に関連する大脳皮質の活動を,脳磁図によって記録し,検討した。左右の耳に到達する時間差(interaural time difference,ITD)をつけた左右相関ノイズの仮想現実音(音像)による刺激を作製し,音圧を較正した左右のチューブイヤホンから刺激音を提示した。音像刺激としては,従来の音像刺激とは異なり,相関ノイズを,1秒前後の持続時間の無相関ノイズ(音像を結ばない)に挟んで提示し,停止した音像が突然現われるように聞こえ,音像の動きによる反応が混入せず,音像の位置にのみ対する反応が得られるようにした。コントロールとして,2ないし5周波数の純音バースト刺激を用い,推定電流双極子(estimated current dipole,ECD)の位置がトノトピーを示すことから,大脳皮質1次聴覚野の反応の指標とした。健聴被験者に対し,特定の位置に音が来る回数を数えさせ,セッション毎に数える音像の位置を変え,注意による影響をバランスさせた。無相関ノイズから相関ノイズへの移行から,潜時約140msで脳波上ならびに側頭上から記録した脳磁図にピークが見られ,記録脳と反対側の音像に対してより〓〓な反応が見られた。誘発反応を起こしている神経細胞の重心であると考えられるECDの平均位置は,純音バーストと比べると,右で数mm前方,左で後方であった。すなわち,純音バーストの反応の中心を第1次聴覚野と仮定すると,相関ノイズの音像定位に関わる大脳皮質部分の中心は,第1次聴覚領ではない可能性がある。各被験者で,異なる場所の音像のECDの位置は異なるので,音の外空間が何らかの形で大脳皮質上にマップされている可能性がある。今後は,移動する相関ノイズの刺激をも使用し,音像の移動加わることによる反応の違いを検討し,さらに,音による方向感覚の障害を持つ患者のデータとも比較検討していく。
ウイルスDNAを標的としたEBV疾患モデルマウスでの新規治療法の開発

Epstein-Barrウイルス(EBV)は様々な腫瘍性疾患に関与する。全てのEBV関連疾患で発現しているウイルスタンパク質EBNA1はウイルスゲノムを保持し、潜伏感染に必須である。本研究の目的はEBNA1を標的とした人工ヌクレアーゼを利用し、感染細胞からウイルスゲノムを排除する新規治療法の開発である。今回、CRISPR/Cas9システムを用いて、HeLa細胞内で効果的にEBNA1配列を切断することができた。しかしながら、EBV感染細胞では十分な効果を得ることはできなかった。さらに治療効果を評価するためのEBV疾患モデルマウスが作製出来た。EBV感染細胞での効果が上がり次第、試す予定である。EBVには特効薬はなく移植後リンパ増殖性疾患(PTLD)の抑制は今後の再生医療技術の成否の鍵を握る為、早急に抗ウイルス薬や新規治療法の開発が望まれる。申請者は既に肝臓などにリンパ腫を誘発するEBV疾患モデルマウスの作製に成功しており、EBVの腫瘍の原因の一つがEBNA1である可能性を見出した。本研究はDNAヌクレアーゼを利用したEBVゲノムを改編する新規治療法の開発を目指し、マウス内でEBV関連疾患の治療を試みる。平成25年度は、1、改良レンチウイルスベクターの作製、2、DNAヌクレアーゼ含有レンチウイルスの作製、3、in vitroでEBV感染細胞株のEBNA1の発現抑制の確認を実施計画としていた。しかしながら、急速に人工ヌクレアーゼの研究分野が進歩発展し、申請時にはZinc finger nuclease(ZFN)やTranscription Activator-Like Effectors nuclease(TALEN)といった2ヶ所での認識による配列特異的DNA切断ツールしかなかったが、現在1か所での認識による切断可能なCas9ヌクレアーゼとguide RNAによるCRISPR/Cas9システムや、Compact TALENが利用出来る。本年度はレンチウイルスベクターに含有させる切断ツールの有効性について検討を行った。1、Compact TALEN、2、CRISPR/Cas9システム、それぞれ2か所でEBNA1特異的人工ヌクレアーゼを作製した。そのうち、CRISPR/Cas9システムの一つがEBV感染細胞株のEBNA1遺伝子を効果的に切断した。今後はCRISPR/Cas9システムをレンチウイルスベクターに導入し、マウス内でのEBV関連の腫瘍抑制効果を検証する予定である。Epstein-Barrウイルス(EBV)は成人の大半が保有しており、通常は免疫により抑制され、生涯にわたって潜伏感染している。しかし、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、移植後リンパ増殖性疾患など様々な腫瘍性疾患にも関与する。これらの全ての疾患で発現しているウイルスタンパク質がEBNA1である。EBNA1はウイルスゲノムを宿主エピゾーム状に結合させ、潜伏感染を成立させる。EBVには特効薬はなく、抗ウイルス薬や新規治療法の開発が望まれる。本研究はEBNA1を標的としたDNAヌクレアーゼを利用し、感染細胞からウイルスゲノムを排除する新規治療法の開発を目指す。平成26年度は、EBNA1に特異的な配列を標的としたガイドRNAとCas9を発現するベクターとそれぞれの標的部位の切断により蛍光タンパク質が発現するベクターを構築した。これらをHeLa細胞にtransfectionし、48時間後の蛍光を観察した。非特異的なガイドRNAの発現による蛍光は確認されなかったが、標的配列では蛍光を確認できた。次に、EBV感染細胞に、CRISPR/Cas9システムを導入した。transfectionされた細胞だけを回収し、切断効率をsurveyor nuclease assayにより確認した。しかしながら、切断効率はあまりよくなかった。今回の研究期間では、EBV疾患モデルマウスでの検証はできなかったが、数種類のEBV疾患モデルマウスを作製することが出来た。疾患によって、脾臓、肝臓、腎臓に腫瘍が見られた。現在、切断効率のよいCRISPR/Cas9システムを作製中であり、系が完成すれば、すぐに試す予定である。実験動物学当初の研究計画とはかなり異なったが、これまでの計画で1、改良レンチウイルスベクターの作製および2、DNAヌクレアーゼ含有レンチウイルスの作製にはHIV-1 Vprによる人工ヌクレアーゼのウイルス粒子への取り込みを計画していた。しかしながらVprに融合するタンパク質の分子量が大きくなればウイルス粒子形成に影響が出てくる。またこれまでの2分子で1か所を切断するダブルモジュール型のヌクレアーゼでは1分子で切断効果のあるCas9やCompact TALENに比べて、取り込み量が2分子必要なため半減する。今回EBNA1の切断効果の得られたCas9は分子量が大きくVprによる取り込みにはむかない。現在Cas9とguide RNA配列を発現出来るレンチ

ウイルスベクターが利用可能であり、今後は今回得られた配列をレンチウイルスベクターに導入し、EBV感染細胞のEBNA1の発現抑制効果を免疫不全(NOG)マウスでの病態変化により確認出来ると考えている。3、in vitroでEBV感染細胞株のEBNA1の発現抑制の確認だが、EBNA1にはGly、Alaに富む領域がある。当初、EBV感染細胞には全てEBNA1が発現しているので、人工ヌクレアーゼの切断効果をEBNA1全長のPCRで確認しようとしたが、Gly、Alaに富む領域を含むと非特異的なバンドが走って、切断効果を正しく確認できなかった。いくつかの細胞株を試した結果、Rajiで全長のEBNA1をPCRで走らせることが出来た。RajiのEBNA1は野生型のEBNA1より分子量が小さく、おそらくGly、Alaに富む領域が欠損していると考えられる。これらの結果より、Rajiに導入したCRISPR/Cas9はEBNA1を効果的に切断できたことが確認できた。来年度につながる成果であると考えられる。本研究課題は今年度、1、in vivo EBVリンパ腫モデルマウスでのEBNA1発現抑制による肝臓の腫瘍抑制効果の検証、2、in vivo EBV感染ヒト化マウスでのEBNA1発現抑制によるリンパ増殖疾患抑制の検証を行う予定であったが、CRISPR/Cas9システムのDNA切断効率は遺伝子発現量が低いと切断効果が弱いため、CRISPR/Cas9システム含有レンチウイルスをin vivoでEBV感染細胞にだけ感染させることが難しく、in vitroで感染させたEBV感染細胞株をNOGマウスに移植する方法で行う。昨年度の研究計画の変更に伴い、今後は以下のように計画する。1、CRISPR/Cas9システムをレンチウイルスベクターに導入、(1)EBNA1配列特異的切断効果のあるguide RNAとあまりない配列をコントロールとしてCas9発現レンチウイルスベクターに組み込む。3、in vivo EBVリンパ腫モデルマウスでのEBNA1発現抑制による腫瘍抑制効果の検証を行う。(1)EBV感染細胞株にCRISPR/Cas9含有レンチウイルスを感染させ、NOGマウスに移植する。(2)衰弱により解剖したマウスから各臓器のウイルスDNA量の測定およびホルマリン固定により免疫染色に使用する。特に腫瘍の程度がひどい臓器からRNAを抽出し、RT-PCRによる遺伝子発現解析を行う。(3)再現実験を行い、生存曲線や臓器のコピー数などのデータ解析を統計的に行い、腫瘍抑制効果を検証する。
鉤虫感染に対する新規記憶Th2細胞による防御免疫の解明

我々は今年度の研究において、寄生虫(Nippostrongylus brasiliensis, Nb)に対する防御免疫機構および、記憶Th2細胞サブセットの分子レベルでの機能解析を行った。具体的には、記憶Th2細胞サブセットの解析として網羅的に発現分子の確認をし、細胞表面マーカーおよびTh2サイトカインの発現によりサブセットに分け、得られたサブセットを養子移入することで感染防御応答に関与する記憶Th2細胞サブセットの同定を行なった。その結果、寄生虫感染によって誘導される記憶Th2細胞のうち、感染防御応答に関与するサブセットと、関与しないサブセットを同定した。これらのサブセットはRNAシークエンス解析により、それぞれ固有の細胞集団であることが確認された。さらに、好塩基球、好酸球、ILC2の欠損マウスに記憶Th2細胞サブセットを養子移入する実験を行い、記憶Th2細胞依存性の感染防御応答は、好塩基球およびILC2非依存性で、好酸球依存性であることを見出した。さらに、寄生虫感染によって誘導される記憶Th2細胞のうち、感染防御応答に関与するサブセットと、関与しないサブセットをRNAシークエンス解析により発現分子を比較することで、抗寄生虫記憶Th2細胞特異的に発現する遺伝子を見つけ、それらの分子を欠損させる実験から、寄生虫(Nb)感染防御に必須な分子を同定し、現在論文のrevise原稿を投稿中である。