hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Xバンド・ドップラー海洋レーダによる荒天時広域海象観測に関する研究

Xバンドレーダによる沿岸海洋観測は広域の対象海域内の海象現象をほぼ瞬時に計測できるなど,従来の海洋観測機器にはない大きな特徴を有している.しかしながら海面における電磁波散乱機構や,散乱電磁波がどのような形でさまざまな海象現象の情報を有しているかは不明である.そこで本研究では昨年度,室内実験による海面での電磁波散乱特性を解明し,Xバンドレーダの現地海洋観測への可能性も検討した.本年度は,昨年の成果を踏まえ,このXパンドレーダが定点海洋観測機器として荒天時にも有用な観測データを取得できるかを検討した.本研究ではXバンドレーダを京都大学防災研究所大潟波浪観測所に設置し,冬期日本海の観測を1時間毎に約3ヵ月間行った.その結果,このレーダ設置点を中心とした半径5kmの領域で海洋表層流流速分布と波浪方向スペクトルが計測できた.さらに,冬期季節風や発達した低気圧通過に伴う荒天時,高波浪時においても観測可能であった.次にXバンドレーダによって得られた海洋観測データを解析し,大潟海岸における冬期の海洋表層流・波浪特性について検討した.その結果,海洋表層流や海洋波浪は通常季節風の風向と同じ方向で海岸に入射しているが,低気圧通過などに伴い風向が変化した場合には風向の変化にやや遅れて流向や波向も風向の方向に変化する傾向が見られた.また表層流は通常汀線に近付くにつれてその向きを沿岸北東方向に変化させている事も見出された.以上より,本年度の研究ではXバンドレーダによる海洋観測を行い,このレーダが荒天時にも安定して波浪観測できることを示し,さらに,このレーダでは,従来の観測機器では計測困難であった海洋表層流や波浪方向スペクトルの空間分布を継続して観測可能であることも明らかにした.そしてこれらの検討からXバンドレーダは新たな海洋観測機器として活用可能であると結論づけることができた.Xバンドレーダによる沿岸海洋観測は広域の対象海域内の海象現象をほぼ瞬時に計測できるなど,従来の海洋観測機器にはない大きな特徴を有している.しかしながら海面における電磁波の散乱機構や,散乱電磁波がどのような形でさまざまな海象現象の情報を有しているか不明である.そこで本研究では室内実験および現地観測を通して,これらXバンドレーダの有する問題の解決を試み,このレーダによる海洋観測への可能性を検討する.まず,室内実験では風洞付波動水槽内に風波を発生させ,室内用マイクロ波レーダによりこの風波の電磁波散乱特性を検討した.その結果,水面での散乱強度が水位変動に対応していることがわかった.これは特に風波の波峰近傍では水面が乱れており,このため波峰部では電磁波散乱特性が向上するためである事がわかった.また海面での散乱波のドップラー周波数は,幾何学的に電磁波の散乱対象となる表面張力波の位相速度ではなく,主波の位相速度に対応していた.これは主波の波峰部で見られる乱れに主に電磁波が散乱され,この散乱波のドップラーシフトが検出されたためであった.次にXバンド船舶レーダを中心とした,レーダ海象観測システムを構築し,現地にて海洋沿岸観測を行った.この観測では,シークラッターの写ったレーダ画像を複数連続的に取得し,これを解析して海象諸現象の検出を行った.その結果,波浪方向スペクトルや海浜流流速分布の,より高精度の推定方法を導出し,これにより方向スペクトルや流速分布を得ることができた.また砕波帯や雨域なども検出でき,この時間的変動も得ることが出来た.これら室内実験および現地観測を通した検討により,Xバンドレーダによる海象観測の可能性を示し,観測に必要な各種手法を開発した.また一方でその問題点も明らかでき,これを次年度への研究課題とする.Xバンドレーダによる沿岸海洋観測は広域の対象海域内の海象現象をほぼ瞬時に計測できるなど,従来の海洋観測機器にはない大きな特徴を有している.しかしながら海面における電磁波散乱機構や,散乱電磁波がどのような形でさまざまな海象現象の情報を有しているかは不明である.そこで本研究では昨年度,室内実験による海面での電磁波散乱特性を解明し,Xバンドレーダの現地海洋観測への可能性も検討した.本年度は,昨年の成果を踏まえ,このXパンドレーダが定点海洋観測機器として荒天時にも有用な観測データを取得できるかを検討した.本研究ではXバンドレーダを京都大学防災研究所大潟波浪観測所に設置し,冬期日本海の観測を1時間毎に約3ヵ月間行った.その結果,このレーダ設置点を中心とした半径5kmの領域で海洋表層流流速分布と波浪方向スペクトルが計測できた.さらに,冬期季節風や発達した低気圧通過に伴う荒天時,高波浪時においても観測可能であった.次にXバンドレーダによって得られた海洋観測データを解析し,大潟海岸における冬期の海洋表層流・波浪特性について検討した.その結果,海洋表層流や海洋波浪は通常季節風の風向と同じ方向で海岸に入射しているが,低気圧通過などに伴い風向が変化した場合には風向の変化にやや遅れて流向や波向も風向の方向に変化する傾向が見られた.また表層流は通常汀線に近付くにつれてその向きを沿岸北東方向に変化させている事も見出された.以上より,本年度の研究ではXバンドレーダによる海洋観測を行い,このレーダが荒天時にも安定して波浪観測できることを示し,さらに,このレーダでは,従来の観測機器では計測困難であった海洋表層流や波浪方向スペクトルの空間分布を継続して観測可能であることも明らかにした.
表面プラズモン吸収励起光触媒反応の機構解明と高効率化

金を担持させた酸化チタン(Au-TiO2)による反応の作用スペクトルはAu-TiO2の拡散反射スペクトルにほぼ一致した.これに矛盾しない反応機構として(1)電子注入機構:SPR励起した金粒子から酸化チタンに注入された電子が酸素を還元/電子欠損金粒子が有機物を酸化,(2)熱触媒機構:SPR吸収した金の脱励起過程で発生する熱により,金の触媒作用が発現,あるいは(3)ホットスポットによる多光子吸収:SPR吸収した金粒子の増強電場により,酸化チタンが2光子吸収して生じる励起電子-正孔による酸化還元反応,があげられる.伝導帯位置が高いシリカに金を担持させても反応がほとんど進行しないことから(1)が支持されるともに(2)の可能性が低いことが示唆された[2]、(1)の機構で注入された電子を光音響分光法により観測することを試みたが,金粒子による光散乱が大きいためか,現在のところ確認には成功していない.一方,比較的大きな金粒子を担持させたマイクロメートルサイズの酸化チタン粉末に,十数ナノメートルのサイズの酸化チタンをさらに担持させたときに,それぞれの酸化チタンに金を担持させたものを大きく上回る光触媒活性(2-プロパノールの酸化)が見られ,粒径が異なる酸化チタンの共存による相乗効果が観測された.これの結果にもとづき,3段階のプロセスによる金-酸化チタン-金構造粒子の調製を試み,その光触媒活性を検討した.また,金-銀合金粒子担持酸化チタンを調製し,その光触媒活性を確認した.これまでに,金を担持させた酸化チタン(Au-TiO_2)による反応の作用スペクトルがAu-TiO_2の拡散反射スペクトルとほぼ一致することを確認している.これに矛盾しない反応機構として,(1)電子注入機構:SPR励起した金粒子から酸化チタンに注入された電子が酸素を還元/電子欠損金粒子が有機物を酸化,(2)熱触媒機構:SPR吸収した金の脱励起過程で発生する熱により,金の触媒作用が発現,あるいは,(3)ホットスポットによる多光子吸収:SPR吸収した金粒子の増強電場により,酸化チタンが2光子吸収して生じる励起電子-正孔による酸化還元反応,が挙げられる.伝導帯位置が高いシリカに金を担持させても反応がほとんど進行しないことから(1)が支持されるともに(2)の可能性が低いことが示唆された.ただし,シリカでは酸化チタンのような光析出法が利用できないため,金の分散状態が異なるため活性が低かったという可能性も否定できない.(1)の機構で注入された電子を光音響分光法により観測することを試みたが,金粒子による光散乱が大きいためか,現在のところ確認には成功していない.一方,比較的大きな金粒子を担持させたマイクロメートルサイズの酸化チタン粉末に,十数ナノメートルのサイズの小粒径の酸化チタンをさらに担持させたときに,それぞれの酸化チタンに金を担持させたものを大きく上回る光触媒活性(2-プロパノールの酸化)が見られ,粒径が異なる酸化チタンの共存による相乗効果が観測された.これが(3)の機構によるものかどうかを検討中である.金を担持させた酸化チタン(Au-TiO2)による反応の作用スペクトルはAu-TiO2の拡散反射スペクトルにほぼ一致した.これに矛盾しない反応機構として(1)電子注入機構:SPR励起した金粒子から酸化チタンに注入された電子が酸素を還元/電子欠損金粒子が有機物を酸化,(2)熱触媒機構:SPR吸収した金の脱励起過程で発生する熱により,金の触媒作用が発現,あるいは(3)ホットスポットによる多光子吸収:SPR吸収した金粒子の増強電場により,酸化チタンが2光子吸収して生じる励起電子-正孔による酸化還元反応,があげられる.伝導帯位置が高いシリカに金を担持させても反応がほとんど進行しないことから(1)が支持されるともに(2)の可能性が低いことが示唆された[2]、(1)の機構で注入された電子を光音響分光法により観測することを試みたが,金粒子による光散乱が大きいためか,現在のところ確認には成功していない.一方,比較的大きな金粒子を担持させたマイクロメートルサイズの酸化チタン粉末に,十数ナノメートルのサイズの酸化チタンをさらに担持させたときに,それぞれの酸化チタンに金を担持させたものを大きく上回る光触媒活性(2-プロパノールの酸化)が見られ,粒径が異なる酸化チタンの共存による相乗効果が観測された.これの結果にもとづき,3段階のプロセスによる金-酸化チタン-金構造粒子の調製を試み,その光触媒活性を検討した.また,金-銀合金粒子担持酸化チタンを調製し,その光触媒活性を確認した.
粒界設計・制御による構造用セラミックスの耐摩耗性の向上

本研究は、優れた耐磨耗性を有する構造用セラミックス開発のための基礎的知見を得ることを目的として、硬度特性に優れ、耐磨耗性材料として期待されているSiCの粒界微細組織と耐磨耗性、破壊強度との相関を明らかにするとともに、最適粒界微細組織に関する知見を得ることを目的として行われたものである。住友大阪セメント製の超高純度SiC粉末を出発粉末とし、焼結助剤としてBを0.5mass%添加し、さらに微量添加元素として周期律表においてSiと同一周期で価数の異なるMg、Al、Pのいずれかを0.11mass%添加してホットプレス法(2373k、40MPa、5min)により作製した焼結体を試料として用い、微量元素添加によるSiCの摩耗特性に及ぼす微量添加元素の影響を検討した。ホットプレスSiCの粒界微細組織は添加元素の種類に依存しており、粒径はP添加材、Al添加材、Mg添加材の順に大きくなること、Al添加材やMg添加材では粒界に微量添加元素の偏析が確認され、偏析量は粒界のタイプに依存しており、高エネルギーのランダム粒界に優先的に偏析することが明らかとなった。SiCの摩耗特性に及ぼす添加元素の影響は摩耗環境に著しく依存し、湿度60%の環境では微量添加元素の種類に依らずSiCの摩擦係数が約0.2であるのに対し、湿度30%の比較的ドライな環境下におけるSiCの摩擦係数は微量添加元素の有無あるいは種類に依存しており、無添加材の約0.8に対してMg添加材では約0.4と低下することが明らかとなった。摩耗試験後の表面観察およびSEM/EDX分析の結果、Mg添加材では摩耗痕近辺に紙縒り状のSiO_2が観察され、Mg添加材ではドライ環境下でSiO_2が形成され、形成したSiO_2が潤滑材として働くものと考えられる。耐摩耗性材料として期待されている構造用セラミックス炭化珪素(SiC)の耐摩耗性向上を目的とした、SiCの粒界微細組織の最適設計に関する知見を得るために、本年度は焼結助剤としてBとCを用いたβ-SiCに、周期律上において同一周期で価数の異なるMg、Al、Pのいずれかを0.11mass%添加したホットプレス材を作製し、湿度が異なる環境下でのSiCの磨耗特性を調べた。ホットプレスSiCの粒界微細組織は、添加元素の種類に依存して変化し、粒径はP、Al、Mgの順に大きくなった。SiCの磨耗界面における破壊や劣化(水環境における酸化や水和反応)は、粒界に偏析する添加元素の種類(粒界化学組成)に依存して変化した。すなわち、Alを添加したSiCは高い摩擦係数を示すのに対して、P添加材は低い摩擦係数を示すことが明らかとなった。この結果は、Alを添加したSiCは磨耗中に生じるSiCと水との間のトライボケミカル反応が抑制され境界潤滑状態が続くのに対して、P添加材は水とのトライボケミカル反応が促進され、表面粗さがナノスケールオーダーまで減少し、境界潤滑から流体潤滑への遷移が生じたためであると考えられる。これらの知見は、脆性のために加工熱処理による組織制御ができない構造用セラミックスにおいて、化学的手法による粒界微細組織(粒界密度・粒界性格分布、粒界連結性、粒界化学組成)の制御、および耐磨耗性向上が可能であることを示している。
遺伝子空間的転写モデルに基づいたＣＹＰ３Ａ４代謝活性の個人差解明とその臨床展開

CYP3A4遺伝子発現の個人差の要因解明ならびにCYP3A4遺伝子発現予測バイオマーカーの確立を試みた。Chromosome Conformation Capture(3C)アッセイにより周辺領域の高次構造の検討したところ、CYP3A4エンハンサー領域と同遺伝子の転写開始点が近傍に位置していることが示された。ヒト末梢血の遠心分離とそれに引き続く肝特異的膜タンパクを利用した免疫沈降を行い、ヒト肝特異的なmiR-122を発現する細胞の分離に成功し、同細胞から分離したDNAのDNAメチル化状態の解析も可能であったことからバイオマーカーの分離解析手法を確立することができたと思われる。CYP3A4遺伝子のDNAメチル化領域の転写への影響とCYP3A4遺伝子発現メカニズムを空間転写モデルに基づき明らかにすることを目的とした。1.HepG2細胞を5-aza-dCまたはTrichostatin A (TSA)処理した。CYP3A4および転写に関与する複数の転写因子の発現量をreal-time PCR法により測定した結果、脱メチル化により、転写因子の発現上昇を伴わずにCYP3A遺伝子の発現増加を見た。2.CYP3A4発現量との間に強い相関を認めたCpGアイランド(CpGI)とその前後のCpG領域を含むベクター(VC)を作成し転写活性への影響を評価した。各VCにはCYP3A4転写開始点近傍約2kbpの領域を含めた。その結果、CYP3A4発現量と相関を認めたCpGIを含むVCにおいてのみTSA存在下で転写活性の上昇を見た(約34倍)。3.5Mbp離れたCpGIとCYP3A4遺伝子の空間的距離を明らかにするため、CYP3A4mRNA発現量が既知のヒト肝臓検体で3C解析を行った。その結果、CpGIとCYP3A4遺伝子、その2kbp上流域において近接効果を認め、発現量の高い肝臓検体では、低い検体と比べ有意に高い結合頻度を示した。以上の結果より、脱メチル化によるCYP3A4発現上昇は、CYP3A4遺伝子自体の脱メチル化に起因すること。レポーターアッセイの結果より、ヒト肝臓においてCYP3A4発現量と相関を認めたCpGIの重要性が示唆された。同領域は3C解析により立体的にCYP3A4遺伝子に近傍し、相互作用を行っていることが示唆された。発現量の高い検体程、CpGIがCYP3A4遺伝子に立体的に近づいていると考えられた。CYP3A4遺伝子発現制御にはエピジェネティック制御機構に基づく空間配置の変化が重要と考えられる。コヒーシンモデルによりDifferentially methylated region (DMR)とCYP3A4の2 kb上流が空間立体的に近接することによりエピジェネティックな相互作用がCYP3A4遺伝子発現に与える影響ならびに発現個人差との関連を解析した。5-aza-2-deoxycytidineによる脱メチル化処理の結果、濃度依存的なCYP3A4遺伝子発現上昇を認める一方で、PXRなどのCYP3A4転写促進因子の変動は見られなかった。chromosome conformation capture assayによりDMRとCYP3A4遺伝子が近接していることが明らかとなった。また、近接効果はCYP3A4遺伝子発現が高い検体においてより強く認めた。高次構造に特徴を認めたこれら領域について介在する転写因子の同定を試みた。その結果、DMR近傍にコヒーシンモデルの主要な因子であるRad21の結合を認めた。このことから、DMRにおけるDNAメチル化の変動により高次構造の変化によりDMRとCYP3A4遺伝子が相互作用を行うことで、CYP3A4遺伝子発現が制御されていると考えられる。また、上記メカニズム解析と平行してその臨床展開のためCYP3A4遺伝子発現予測バイオマーカーの確立を行った。ヒト末梢血中に含まれる剥離した肝由来細胞を単離しDNAメチル化が同定できれば、CYP3A4遺伝子発現の指標とできるのではないかと考えた。ヒト末梢血の遠心分離とそれに引き続く肝特異的膜タンパクを利用した免疫沈降を行った。その結果、ヒト肝特異的に発現することが知られているmiR-122を発現する細胞の分離に成功し、同細胞から分離したDNAのDNAメチル化状態の解析も可能であった。以上より、CYP3A4遺伝子機能予測臨床試験を行う上で前提となるバイオマーカーの分離、解析手法を確立することができたと思われる。これまでの検討から、CYP3A4遺伝子から5.2 Mbp離れた領域A(differentially methylation region)と5'上流域の領域Bの立体的近接をchromosomeconformation capture法により同定した。領域AにおけるDNAメチル化状態がCYP3A4

発現や立体的近接に関連していたことから、5-aza-2-deoxycytidineによる脱メチル化の影響を評価したところ、CYP3A4遺伝子の濃度依存的な発現上昇と同時に領域Bの濃度依存的アセチル化亢進を認めた。一方で多くのCYP3A4転写促進因子の発現は変動していなかった。また、ヒト肝において領域Aのメチル化と領域Bのアセチル化には強い負の相関を認めている。このことから、領域Aにおける脱メチル化が領域A-B間の立体的近接を引き起こし、それに伴いリクルートされた未同定のエンハンサーによりヒストンアセチル化が亢進したのではないかと考えられる。エンハンサー機能を担う因子を同定するため、領域Aの塩基配列から複数の転写因子を候補とし、候補転写因子のsiRNAによるノックダウンによりCYP3A4発現の大きな低下を認めた転写因子を同定した。領域AがCYP3A4発現を制御するメカニズムの解明と平行して、その臨床展開の可能性について検討を行った。ヒト血液中には各臓器由来のエクソソームが分泌することが知られている。我々はこれに着目し、ヒト肝特異的膜蛋白を利用したヒト肝由来エクソソームの分取ならびに同エクソソームからのゲノムDNA抽出、メチル化解析を行った。その結果、ヒト血液からの肝由来エクソソーム分取、メチル化状態の同定を可能とするプロトコールを確立することが出来た。当初その重要性が予測された3カ所の領域の機能を特定することができ、次のステップへの移行が図られた事、精度等には検討点を残すものの、3C解析が可能であることが示唆された点など、年度内にすべき検討項目に結果が得られたため。25年度が最終年度であるため、記入しない。研究計画では平成24年度に以下の項目について検討する計画であった。・相互作用検証(平成2324)・転写因子解析(平成2324)・メチル化・アセチル化と活性相関(平成2425)【研究実績の概要】において記述したとおり、「相互作用検証」と「メチル化・アセチル化と活性相関」については解析結果を得ることが出来た。特に「メチル化・アセチル化と活性相関」については計画を前倒して終了することができた。一方転写因子解析は候補因子の絞込みは行うことが出来たが当該因子の直接的な作用の検証には至っていない。以上より全体の研究進捗状況としてはおおむね順調であると思われる。(1)現在開発済みの3C解析においては、PCRによる増幅領域が大きいため、目的以外の領域もPCR産物に含まれている。そのため、mRNA発現量との間にブロードな相関が得られることから、より目的領域特異的なプライマー設計を通して、評価領域に焦点を当てたより精度の高い3C解析の開発が望まれる。(2)その後、ヒト肝検体数を増やし、目的領域同士の空間距離とCYP3A4mRNA発現量とのより精度の高い相関評価を行い、得られた結果の検証を行う予定である。
細胞スケール閉鎖空間内における反応拡散波の物理

バクテリアの細胞分裂開始面を決定するMinタンパク質の反応拡散波(Min波)の人工細胞内再構成系を用い、反応拡散波の細胞サイズ空間におけるふるまいを解明することを目的としている。H28年度までに、Min波の人工細胞内での創発に必要な条件を見出したが、そのメカニズムは不明であった。そこでH29年度は、生化学的手法とMin波の人工細胞のサイズ相関を組み合わせ、このメカニズムに迫った。Min波の発生条件を探索したところ、Min波の要素であるMinEの自発的な膜吸着が小さな空間サイズでは促進されることを見出した。空間サイズとMinEの自発的吸着の相関を解析したところ、MinE濃度依存的に空間依存性が変化することが見出された。そこでMinEの膜吸着能が異なる変異体を用意し同様の解析を行ったところ、その空間サイズ依存性は変異体の性質に伴い大きく変化することが示された。この結果は、MinEとの結合依存性が異なるよう脂質膜成分を変化させることに観察された。このことから、空間サイズが支配する細胞質:膜面での存在比の変化が細胞サイズ空間における反応拡散波の発生に重要であることが示された。また、人工細胞内でのMin波は、バルク系と異なり、一定の濃度下でのみ発生することが明らかになった。それゆえ、転写翻訳装置の添加によりMin波の成分を合成させたところ、Min波の発生と消失が遷移する現象が観察された。さらにMin波が示す性質の空間サイズ依存性を解析したところ、空間サイズがMin波の形状や速さをスケーリングし、波が単一の条件では空間サイズによらずMin波の占有率や回転周期が一定となる現象を見出した。この現象は数値シミュレーションにより、空間サイズに由来することが示唆された。29年度が最終年度であるため、記入しない。バクテリアの細胞分裂面の起点はMinタンパク質の反応拡散波により決定される。この波はバルク系では再現可能であるが、細胞サイズ閉鎖空間では再現できないことが知られていた。しかし申請者らはごく最近、特定の高分子を一定量添加することで、閉鎖系においてもこの波を再現できる条件を見出した。このことは細胞がバルク系とは異なる反応拡散系により制御されていることを意味するが、その物理は未解明である。そこで、人工細胞内でのMin波再現系をモデルとして用い、生命に適用可能な閉鎖系における反応拡散系と構造形成の物理を導くことを目的とした。本年度は、細胞サイズ空間に内包した条件において反応拡散波を発生させるための条件を解明すべく研究を展開した。そのために1イオン環境や分子濃度が波の発生に与える影響の解析、2波発生の初期状態の解析を行った。1のイオン環境に関しては、細胞空間に細胞空間が反応拡散により生じる波に対してイオン環境に対する頑健性を与えるという新規な現象の存在を示唆した。2の波発生の初期状態においては1つの波のみが生じるサイズの液滴においては興味深い現象が観察された。まず膜上と細胞質部分の間をMinタンパク質が一様振動し、その後に極間を往復するstanding waveが発生、最後にtravelingwaveと変化することが明らかになった。このような波の種類の遷移は因子の混合後20分程度で完結した。この現象は、1時間後の観察においては90%程度の油中水滴においてtravelingwaveが観察された理由を説明した。当初想定していた内容は全て達成できた。その過程において、非常に興味深い物理現象を見出すに至った。引き続き空間のサイズがMin波の性質に与える影響について解析する。また、理論研究と照らし合わせ、反応拡散波が細胞サイズ閉鎖空間において見せる特徴を明らかにする。
高分解能放射光造影CTによる肺３次元ミクロ病態の解明

本研究は,放射光CTの検出器の高性能化,肺3次元ミクロ解剖学を創生して新しい画像診断・治療の発展を目的とした.このために(1)放射光CT検出器の高性能化の研究開発,(2)ナノ粒子造影剤を用いた伸展固定肺標本作製法の開発,(3)3次元ミクロ画像データベースの構築,(4)3次元ミクロ形態解析の技術基盤の構築を推進した.放射光CTの高性能化,ナノ粒子造影剤による標本作製法,3次元ミクロ形態解析法を研究開発し,肺3次元ミクロ病態解明の技術基盤として期待できる成果を得た.慢性閉塞性肺疾患,間質性肺炎,肺がんなどの疾患の3次元ミクロ病態の解明は未知の分野である.肺末梢構造の観察は病理学において視野範囲(FOV)の制限された組織スライス画像を用いて実施されているが,この30-40年間で格段の進歩がないと言われている.ここでは,放射光CTの検出器を高性能化(目標値:空間分解能3μm,FOV50mm)し,ヒト肺標本の血管系(細血管・毛細血管(内径10μm))にナノ粒子造影剤(ハイドロキシアパタイトナノ粒子等)を注入して正常標本や疾患の進展度別標本をイメージングし,これらの3次元ミクロ形態画像(2-3TB/標本)から肺の基本単位である肺2次小葉(大きさ10-30mm)を中心にして正常形態や病態の発生・進展過程をコンピュータ解析をする.研究計画は1.放射光CT検出器の高性能化の研究開発(最終目標は受光面サイズ横36mm×縦24mmで画素サイズ3μmのX線検出器を開発し,オフセットCTスキャンにより視野を拡大し横視野50mmの画像を撮影する)2.ナノ粒子造影剤を用いた伸展固定肺標本作製法の開発,3.大容量3次元ミクロ画像データベースの構築,4. 3次元ミクロ形態の画像解析の技術基盤の構築,5.3次元ミクロ形態の解明からなる.本年度は,データベース構築に向け協力医療機関の倫理審査委員会の承認を得て研究計画通り推進し,検放射光CT出器の高分解能化,血管造影のためのナノ粒子造影剤のを用いた標本作製実験,非実質構造(肺血管,気管支・肺血管周囲組織,小葉間隔壁,肺胸膜)構造の3次元ミクロ形態解析法の確立に期待できる成果を得た.慢性閉塞性肺疾患,間質性肺炎,肺がんなどの疾患の3次元ミクロ病態の解明は未知の分野である.肺末梢構造の観察は病理学において視野範囲(FOV)の制限された組織スライス画像を用いて実施されているが,この30-40年間で格段の進歩がないと言われている.ここでは,放射光CTの検出器を高性能化(目標値:空間分解能3μm,FOV50mm)し,ヒト肺標本の血管系(細血管・毛細血管(内径10μm))にナノ粒子造影剤を注入して正常標本や疾患の進展度別標本をイメージングし,これらの3次元ミクロ形態画像(2-3TB/標本)から肺の基本単位である肺2次小葉(大きさ10-30mm)を中心にして正常形態や病態の発生・進展過程をコンピュータ解析をする.研究計画は1.放射光CT検出器の高性能化の研究開発(最終目標は受光面サイズ横36mm×縦24mmで画素サイズ3μmのX線検出器を開発し,オフセットCTスキャンにより視野を拡大し横視野50mmの画像を撮影する)2.ナノ粒子造影剤を用いた伸展固定肺標本作製法の開発,3.大容量3次元ミクロ画像データベースの構築,4.3次元ミクロ形態の画像解析の技術基盤の構築,5.3次元ミクロ形態の解明からなる.本年度は,データベース構築に向け協力医療機関の倫理審査委員会の承認を得て研究計画通り推進させた.放射光CT検出器に薄型蛍光板と拡大光学系を導入して高分解能化に成功した.血管造影のためのナノ粒子造影剤を用いた標本作製実験,非実質構造(肺血管,気管支・肺血管周囲組織,小葉間隔壁,肺胸膜)構造の3次元ミクロ形態解析法の開発を進めた.慢性閉塞性肺疾患,間質性肺炎,肺がんなどの疾患の3次元ミクロ病態の解明は未知の分野である.肺末梢構造の観察は病理学において視野範囲(FOV)の制限された組織スライス画像を用いて実施されているが,この30-40年間で格段の進歩がないと言われている.ここでは,放射光CTの検出器を高性能化(目標値:空間分解能3μm,FOV50mm)し,ヒト肺標本の血管系(細血管・毛細血管(内径10μm))にナノ粒子造影剤(ハイドロキシアパタイトナノ粒子等)を注入して正常標本や疾患の進展度別標本をイメージングし,これらの3次元ミクロ形態画像(2-3TB/標本)から肺の基本単位である肺2次小葉(大きさ10-30mm)を中心にして正常形態や病態の発生・進展過程をコンピュータ解析をする.研究計画は1.放射光CT検出器の高性能化の研究開発(最終目標は受光面サイズ横36mm×縦24mmで画素サイズ3μmのX線検出器を開発し,オフセットCTスキャンにより視野を拡大し横視野50mmの画像を撮影する)

2.ナノ粒子造影剤を用いた伸展固定肺標本作製法の開発,3.大容量3次元ミクロ画像データベースの構築,4.3次元ミクロ形態の画像解析の技術基盤の構築,5.3次元ミクロ形態の解明からなる.データベース構築は協力医療機関の倫理審査委員会の承認を得て推進させた.本年度は,放射光CT検出器に薄型蛍光板と拡大光学系を導入した高分解能化の開発を進め,血管造影のためのナノ粒子造影剤を用いた標本作製実験,非実質構造(肺血管,気管支・肺血管周囲組織,小葉間隔壁,肺胸膜)構造の3次元ミクロ形態解析法の開発を行った.本年度の主要な成果は次の通り.・大容量3次元ミクロ画像データベース構築に向け,協力医療機関の倫理審査委員会の承認を得て標本作製法の開発を継続して推進させた.・現在までに開発中の撮影系は,高効率な散乱抑制をもたらす材質を採用した薄型蛍光板(厚さ6μ)と36M画素X線検出器(35.9 mm ×24.0mm [7360×4912素子],画素サイズ:4.88 μm)からなる.この撮影系を用い,ヒト正常肺標本の3次元再構成画像(視野40 mm×40 mm×15 mm・13,371×13,371×4,912画素(3.3 TB)・画素サイズ3 μm)の計測を実現した.・毛細血管撮影のためのナノ粒子造影剤として金ナノ粒子,バリウムナノ粒子造影剤(電子顕微鏡計測径:数百ナノm)を用いて費用対造影効果に優れる試薬評価実験を行い,均一なナノ粒子径を有する臨床用造影剤を用いた標本作製法の開発を進めた.・ガス交換をつかさどる肺実質構造(肺胞,肺胞道,肺胞嚢,肺胞隔壁などの組織と空気から構成)と非実質構造(肺血管,気管支・肺血管周囲組織,小葉間隔壁,肺胸膜)の空間配置,肺細血管に繋がる肺細血管(細静脈,細動脈:径100μm未満)の空間位置に注目した血管走行追跡法を開発し,肺ミクロ3次元形態を明らかにした.本研究「高分解能放射光造影CTによる肺3次元ミクロ病態の解明」に関する平成27年度の研究成果は、招待講演1件、解説論文1件、国際学会発表4件、国内学会発表5件、受賞1件である.放射光CT検出器の高性能化は空間分解能4.2μmを実現し,この撮影系による高精度肺ミクロ構造のイメージングに期待が持たれる結果を得ており,申請時の計画通り概ね順調に進展している.慢性閉塞性肺疾患,間質性肺炎,肺がんなどの疾患の3次元ミクロ病態の解明は未知の分野である.肺末梢構造の観察は病理学において視野範囲(FOV)の制限された組織スライス画像を用いて実施されているが,この30-40年間で格段の進歩がないと言われている.本研究は,放射光CTの検出器を高性能化し,ヒト肺標本の血管系にナノ粒子造影剤を注入して正常標本や疾患の進展度別標本をイメージングし,これらの3次元ミクロ形態画像から肺の基本単位である肺2次小葉を中心にして正常形態や病態の発生・進展過程を解析する技術基盤の確立を目指すものである.このため1.放射光CT検出器の高性能化の研究開発,2.ナノ粒子造影剤を用いた伸展固定肺標本作製法の開発3.3次元ミクロ画像データベースの構築,4.3次元ミクロ形態解析の技術基盤の構築に取り組み,データベース構築は協力医療機関の倫理審査委員会の承認を得て推進させた.本年度は,放射光CT検出器に薄型蛍光板と拡大光学系を導入した高分解能化の開発を進め,血管造影のためのナノ粒子造影剤を用いた標本作製実験,非実質構造(肺血管,気管支・肺血管周囲組織,小葉間隔壁,肺胸膜)構造の3次元ミクロ形態解析法の開発を行い,肺3次元ミクロ病態解明の技術基盤として期待できる成果を得た.本研究は,放射光CTの検出器の高性能化,肺3次元ミクロ解剖学を創生して新しい画像診断・治療の発展を目的とした.このために(1)放射光CT検出器の高性能化の研究開発,(2)ナノ粒子造影剤を用いた伸展固定肺標本作製法の開発,(3)3次元ミクロ画像データベースの構築,(4)3次元ミクロ形態解析の技術基盤の構築を推進した.放射光CTの高性能化,ナノ粒子造影剤による標本作製法,3次元ミクロ形態解析法を研究開発し,肺3次元ミクロ病態解明の技術基盤として期待できる成果を得た.本年度の主要な成果は次の通り.・大容量
遺伝子導入細胞障害性T細胞による悪性グリオーマへの養子免疫療法の開発

本研究の目的は、悪性グリオーマに対する新規治療法として、グリオーマ特異抗原であるIL13Rα2を標的とした遺伝子導入細胞障害性T細胞(CTL)による養子免疫療法を開発することにある。本年度は以下のことを行った。1.本治療法の適応範囲を知る上で、用いる抗原であるIL13Rα2がグリオーマにどのくらいの頻度で発現しているかを確認することが重要である。そこで、患者から得られたグリオーマ組織の切片に対してIL13Rα2に対するモノクローナル抗体を用いて免疫染色を行い、その発現を解析した。グリオーマを悪性度により分類し、その発現頻度を検討すると、最も悪性度の高いGrade4のグリオーマでは、半数以上でIL13Rα2の発現が見られ、また同一患者で悪性転化した症例を検討すると、悪性化とともにその発現が強くなり、悪性化とも関連することが示唆された。2.本治療の治療材料であるCTLを樹立する際に、T cell receptor(TCR)の遺伝子導入技術が要になる。そこで、すでに当研究室で保有している他の抗原(変異型EGFR)に対するTCR遺伝子を用いて、T cellへの遺伝子導入法を検討した。レトロウィルスベクターを用いることにより、T cellに対してTCR遺伝子を導入したのち、日的とするTCRがその細胞表面上に発現していることを、フローサイトメトリー等の方法によって確認した。また遺伝子導入されたCTLは腫瘍細胞と反応してIFNγを放出し、TCRが有効に機能していることが示唆された。上記の結果から、IL13Rα2は対象抗原としてふさわしく、TCR導入も可能であると考えられ、今後はIL13Rα2に対するTCRを作成して、それをT cellに遺伝子導入してIL13Rα2特異的CTLを樹立することが次のステップである。
体内時計中枢である視交叉上核における光入力制御に係わるゲート機構の解明

哺乳類の視交叉上核における光入力制御に係わるゲート機構を検討した。その結果、ラット視交叉上核において光照射にて遺伝子誘導が生じる腹外側部のゲートの位相が背内側部によって規定されていることが明らかとなった。さらに、ラット網膜の神経節細胞層において昼間に光入力情報を抑制するゲート機構が存在することが示唆された。また、マウス視交叉上核においてもシェル領域により、光照射にて遺伝子誘導が生じるコア領域のゲートの位相が規定されていることが明らかとなった。さらに、マウス網膜においても昼間に光入力情報を抑制するゲート機構が存在することが明らかとなった。哺乳類の体内時計を環境の明暗周期に同期させるものは光であり、体内時計中枢である視交叉上核の概日リズムをシフトさせる最大の入力である。夜間の光照射では体内時計が発振する概日リズムの位相変位が生じ、視交叉上核の腹外側部でcfos,Per1遺伝子発現の誘導を伴う。一方、昼間の光照射ではほとんど位相は変化せずcfos, Per1遺伝子も誘導されない。すなわち視交叉上核への光入力が抑制されており、ゲート機構が働いている。このゲート機構の機序の解明のため、まずゲートの位相を規定している領域を検討した。ラットにおいて急激な明暗サイクルの変化により視交叉上核の腹外側部と背内側部を脱同期させた後、光による視交叉上核におけるcfos、Per1遺伝子発現の誘導を経時的に観察した。その結果、明暗サイクルを10時間後退させた時には、背内側部におけるPer1遺伝子発現サイクルの位相は1日約2時間の位相変位を示した。また、光による腹外側部でのcfos遺伝子発現誘導も同様な位相変位を示した。また、明暗サイクルを6時間前進させた時には、背内側部において明暗サイクルシフト後3日間はほとんど位相変位が認められなかったが、その後、明暗サイクルを後退させた時よりもゆっくりとした位相変位が認められた。光による腹外側部でのcfos遺伝子発現誘導も同様な位相変位を示した。次に、恒暗条件下で2時間おきに30分間の光照射後、ラット網膜を採取して、cfosタンパクと遺伝子発現を観察した。その結果、1日を通して観察したすべての時間でラット網膜の神経節細胞層において光照射によるcfosタンパクと遺伝子発現細胞が認められた。ラット網膜においては、ゲート機構が働いていないことが示唆された。このことから光照射にて遺伝子誘導が生じる腹外側部のゲートが背内側部によって支配されていることが明らかとなった。体内時計が発振する概日リズムの位相変位は夜間の光照射では生じるが、昼間の光照射ではほとんど位相は変化しない。以前、我々は急激な明暗サイクルのシフトによりラット視交叉上核において背内側部と腹外側部間の内的脱同期が起こることを明らかにした。この系を用い、ラットにおいてこのゲートの位相は視交叉上核の背内側部により規定されていることを報告した。今回、マウスにおいても同様に視交叉上核のシェル領域(ラットの背内側領域に相当する領域)によりゲートの位相が規定されているかを検討した。マウスにおいては、コア領域(ラットの腹外側領域に相当する領域)とシェル領域間での明確な脱同期が報告されていない。そこで、我々は、明暗サイクルをシフトさせた時にマウス視交叉上核においてもコア領域とシェル領域の脱同期が生じるかを検討した。マウス(C57BL/6J)で明暗サイクルを10時間後退させて視交叉上核の吻側から尾側にわたりPer1遺伝子発現を経時的に観察した。その結果、明暗サイクルシフト後3日目ではPer1遺伝子発現のピーク位相がコア領域では約10時間シフトして、すでに新しい明暗サイクルに同期していたが、シェル領域では約6時間のみシフトして、まだ新しい明暗サイクルに同期していなかった。これらのことからマウスにおいても急激な明暗サイクルのシフト後、コア領域とシェル領域間での脱同期が生じることが明らかとなった。次にマウスにおいてゲートの位相を規定している領域を検討し、マウスにおいても同様に視交叉上核のシェル領域によりゲートの位相が規定されていることが明らかとなった。ゲート機構が網膜あるいは視交叉上核に局在するかを明らかにする実験計画についておおむね順調に進展している。哺乳類の体内時計中枢である視交叉上核の概日リズムをシフトさせる最大の入力は光である。夜間の光照射では体内時計が発振する概日リズムの位相変位が生じるが、昼間の光照射ではほとんど位相は変化しない。以前、我々は急激な明暗サイクルのシフトによりラットおよびマウス視交叉上核において背内側部と腹外側部間(ラット)およびシェル領域とコア領域間(マウス)の内的脱同期が起こることを明らかにした。また、この系を用いて、ラットおよびマウスにおいて、このゲートの位相は視交叉上核の背内側部およびシェル領域により規定されていることを報告した。今回、マウス視交叉上核に投射していることが知られている網膜の網膜神経節細胞においてゲート機構が存在するかを検討した。まず、マウス視交叉上核におけるグルタミン酸受容体(AMPA受容体)の活性化を検討した結果、視交叉上核においてAMPA受容体の活性化は暗期に高く明期に低下していた。

これはマウス網膜の網膜神経節細胞から視交叉上核におけるグルタミン酸の分泌あるいはAMPA受容体の感受性に概日リズムがあることが示唆された。次に、恒暗条件下で2時間おきに30分間の光照射後、マウス網膜を採取して、c-Fosタンパク発現を観察した。その結果、網膜神経節細胞において明期に低く暗期に高い明瞭なリズムが観察された。これらの結果からはマウス網膜においても昼間に光入力情報を抑制するゲート機構が存在することが明らかとなった。哺乳類の視交叉上核における光入力制御に係わるゲート機構を検討した。その結果、ラット視交叉上核において光照射にて遺伝子誘導が生じる腹外側部のゲートの位相が背内側部によって規定されていることが明らかとなった。さらに、ラット網膜の神経節細胞層において昼間に光入力情報を抑制するゲート機構が存在することが示唆された。また、マウス視交叉上核においてもシェル領域により、光照射にて遺伝子誘導が生じるコア領域のゲートの位相が規定されていることが明らかとなった。さらに、マウス網膜においても昼間に光入力情報を抑制するゲート機構が存在することが明らかとなった。網膜にゲート機構が局在するかを明らかにする実験計画についておおむね順調に進んでいる。網膜や視交叉上核のスライス培養で、各受容体などの作動薬や拮抗薬を用いて微弱発光測定装置、冷却CCDカメラ観察装置を行うと共に、組織切片を用いて各受容体などのリン酸化の同定などの検討を増やしていく。医歯薬学微弱発光測定装置の使用数を増やし視交叉上核の全体や腹外側部と背内側部の分離スライス培養実験の頻度を増やしていく予定である。試薬の購入などに少し余裕が生じたので次年度使用額が生じた。電子冷却デジタルCCDカメラを購入するため、前倒し支払い請求により予算の上乗せを行いましたが、当初の予定より低価格での電子冷却デジタルCCDカメラの購入することが出来ました。そのため次年度使用額が生じることとなりました。遺伝子やタンパク発現の検索のための分子生物学的研究に使用する試薬や実験動物および飼料代や培養実験用品の購入費用に使用する。当初の計画通りに進める。視交叉上核のスライス培養を電子冷却デジタルCCDカメラを用いて観察を行う。光入力制御の領域が網膜か視交叉上核かという問題の解決に取り組む。また、視交叉上核における光情報を制御する分子の特定に取り組む。
認知症に対する画像診断の有用性に関するシステマティックレビュー

一方、除外する研究としては、ADのみ、あるいはAD vs normalのみを検討しているもの、また、Parkinson-related dementiaやParkinsonism with dementia、ADの特別な家系や遺伝子タイプ、FTDの特別な家系や遺伝子タイプなど特殊な認知症をきたす疾患のみ、あるいはこれらと正常対象群との鑑別診断を検討しているものは除外とした。スクリーニングの結果、MCI関連は363本、FTLD関連は129本、DLB関連は126本、VD関連は89本、fMRIのMCIへの使用関連は640本を仮採用とした。各テーマにおいて論文から診断精度に関するデーターを抽出し、メタ分析を実施する。まずDLB関して解析を行った。DLBの鑑別診断に関して、採用基準を満たす研究が41件あり、単一検査の検査特性としては、画像バイオマーカーではMIBGシンチ(遅延相),髄液バイオマーカーでは総タウタンパクの診断精度が最も高く報告されていた。これらの検査は間接比較では感度・特異度の信頼区間が他の検査と重複があり,他と比較して有意に優れている検査の同定はできなかった。現在論文作成中である。FTLDの鑑別診断に関して、髄液バイオマーカー、画像バイオマーカーを検討対象とした。採用基準を満たす研究は髄液検査22件、MRI24件、脳血流SPECT13件PET14件(926例)であった。報告された臨床コンテクスト、患者特性、診断精度は不均一であった。さらに、MCIの診断能に関して、機能的MRIを評価した研究に関してシステマティックレビューを実施した。177件の研究が報告されていたが、多くは診断検査としての妥当性を評価したもので、日常臨床に適応できる診断精度に関するデータを報告している研究は17件のみであり、外部検証を含めエビデンスは不十分であると評価した。認知症のバイオマーカーの診断精度に関して、どのタイプの認知症の、どういったバイオマーカーを対象にするか検討し、現在、ADNI研究などの国際的な大規模研究でも主要なテーマとしてあげられるmild cognitive impairment (MCI)からAlzheimer disease (AD)への転換をテーマの柱とし、さらに、MCIもしくはADさらには正常との鑑別診断能の検討を二つ目のテーマとした。文献検索を行う上で、3番目のテーマとして、dementia with lewy body (DLB)さらにはfrontotemporal lobar dementia (FTLD), vascular dementia (VD)の鑑別診断能に関しても、同時にスクリーニングをすることとした。特別な遺伝子家系、遺伝子変異は除外し、一般的な疾患群のみを対象とした。対象疾患は上記のとうりであるが、対象とするバイオマーカーは、SPECT, PET, MRI等の画像機器、髄液検査(Aβとtau)、遺伝子マーカーとしてはAPOE、さらに脳波を検討すべきバイオマーカーに設定した。それ以外にもさまざまな遺伝子やタンパク、臨床心理検査などの報告があるが、今回は含めないこととした。2000.1.1-2012.12.31までにPubMedに報告された英語論文のなかで独自に設定したキーワードを用いて検索したところ、総数総数23403本の論文が一次候補として選択された。この抄録を読み独自に設定したクライテリアを満たすものを採用と判断したところ、MCI関連は363本、FTLD関連は129本、DLB関連は126本、VD関連は89本、fMRIのMCIへの使用関連は640本を二次候補とした。この中で、まず、DLBに関して、メタ分析を実施した。126本の中から、さらに診断精度が計算できるか否か、臨床で一般に使用される検査か否かなどを判断基準にし、最終的に、総計36本の論文を採用した。一つの論文で複数のバイオマーカーに関する結果を報告しているものがあり、全体として50の研究からの検査結果を解析対象とした。DLB患者1024例、非DLB患者(主にAD)2241例が検討されており、鑑別診断目的の検査精度についてメタ分析を実施した。臨床状況は主にDLBとADの鑑別目的となるが、画像バイオマーカーではSPECT-MIBGが要約感度91%、要約特異度100%もっとも高い診断精度であった。CSFに関してはt-tauが、要約感度90%、要約特異度92%と高い診断能であった。文献データベースはmedlineのみとし、直近の10年(2000.1.1-2011.12.31)の抄録をすべて検討し、各テーマに相当する論文の抽出作業を開始した。総計18848本の論文がリストアップされ、本研究の目的に適合する論文の一次スクリーニングを終了した。抄録からfull textscreeningが必要とされる論文が現段階で1500程度(まだ、正式に決められていない論文がある)あり、現在、本論文を収集する作業を行いつつ、2次スクリーニングを行っている。DLBの鑑別診断能の研究に関しては、すでに結果が得られており、研究発表や論文作成を進めている。他の4つのテーマに関しては、順次、メタ分析を行う予定であるが、MCIへのfMRIの適応に関しては、診断精度に至る情報はなく、現在までに報告された、検査状況やその質に関して、どの様なエビデンスが得られているのかに関して、報告をする予定である。最終スクリーニングを経過し、10例以上の臨床例を検討し、かつ、前述に記載したバイオマーカーで評価してある論文を、以下の5つのカテゴリーに分配し、各カテゴリーに関して、2×2テーブルを作成し、診断能を評価する。

もし可能であれば、メタ分析に進む予定である。(1)DLBか否か?(2)MCIの予後予想(MCIが後にADにコンバートするか否か?)(3)MCIか否か?(4)FTLDか否か?(5)VD(検査目的は鑑別・予後予想など考えられるが未定)。とくに、先行させるものは、1,4のテーマを先行させる予定である。各カテゴリーごとの解析を始めるのは、6月ごろと予想され、最初の診断能の評価が検討できるのは8ー9月ごろと考えている。本研究は、論文の収集やデータの取込みにマンパワーが必要であり、現在、一名の研究補助員に支援を頂いている。引き続き、この研究補助員への人件費が大きな使用目的である。その他、研究成果の論文作成や、その過程における英文校正やその他、学会発表などの旅費に使用したいと考えている。本年度は学会発表や、他施設の研究分担者(藤田保健衛生大学七栗サナトリウム、長寿医療研究センター)との間で、進捗確認や、打ち合わせ等を頻繁に実施し、研究を進捗させる。繰越の研究費は、こうした旅費や、学会参加、可能なら、論文掲載料として使用する。この研究で必要な論文収集や検索をおこなう事務的な協力者が必要不可欠であり、こうした人件費にも充当する。
異なる間葉系細胞による腱・靭帯マトリクス再構築機序の解明とその分子標的制御

3)TGF-βの投与は除負荷を受けた膝蓋腱の力学的特性劣化を抑制し、抗TGF-β抗体の投与はそれを促進した。TGF-βの投与はin situ凍結処理前十字靭帯および移植腱の力学的特性劣化を抑制したが、EGFおよびPDGF-BBの投与は無効であった。TGF-β1の投与は膝蓋腱中央欠損部に再生する線維性結合組織の生体力学的特性を有意に向上させた。VEGFの投与はin situ凍結処理前十字靱帯の血管新生を促進したが、力学的特性には無効であった。4)Ex vivoにおいてTGF-β1を投与した培養自家滑膜由来細胞の投与はin situ凍結処理前十字靭帯および前十字靱帯再建術後の移植腱、膝蓋腱欠損部における再生組織の力学的特性を向上させた。(2)家兎右膝蓋腱にin situ凍結解凍処理を行ない、6週後に右膝蓋腱から外来性線維芽細胞(EF)を、左膝蓋腱から内在性線維芽細胞(IF)を単離培養した。第1継代細胞の細胞増殖能についてはMTS法を用いて、Intergrinを始めとする細胞表面の各種のReceptorの発現についてはモノクロナール抗体とFACScan flow cytometerを用いて定量的に解析した。次に単離培養された各種の線維芽細胞をcollagen gelの中に播種し、この中に無細胞腱マトリクスを埋植して培養した。培養された腱マトリクスに対し共焦点レーザー顕微鏡を用いた組織学的評価、および万能試験機を用いた力学的評価を行なった。その結果、(1)増殖能:両細胞ともに細胞数は経時的に有意に増加した。7日目のEFおよびIFの平均細胞数は0日目の8.9倍および21.8倍であり,EFの増殖能はIFのそれより有意に低かった。(2)浸潤能:EFの浸潤能はIFのそれより有意に低かった.(3)腱マトリクスへの浸潤細胞数は、IFでは経時的に有意の増加を示したが(p<0.05)、EFは有意の変化を示さなかった。EF細胞数はそれぞれの時期においてIF細胞数より有意に低値であった(p<0.05)。(4)腱マトリクスのtangent modulusはいずれの細胞浸潤後にも経時的に有意に減少した(p<0.05)。(1)種々のサイトカインの投与が、種々の環境にある線維芽細胞のマトリックス合成および分解に与える効果(1)Ex vivoにおいてTGF-β1を与えて培養した自家骨膜由来細胞をin situ凍結解凍処理前十字靭帯(関節内に存在する無細胞マトリックスモデル)に投与し、In vivoで6週間経過すると、これらの細胞は無治療群に比べて有意に再構築マトリックス(線維性結合組織)の引っ張り強度およびTangent modulesを増強させた。(2)Ex vivoにおいて外来性線維芽細胞に対するマクロファージ遊走阻止因子(MIF)の投与は、細胞内のコラゲナーゼ転写を亢進させた.(3)In vivoにおいて家兎膝蓋腱中央欠損部に再生する線維芽細胞に対するTGF-β1の投与は、3および6週においてこれらの細胞が合成するマトリックス(線維性結合組織)の引っ張り強度およびTangent modulusを有意に増強させた。一方PDGF-BBの投与は、それらに有意の効果を与えなかった。(2)除負荷された線維芽細胞に対する種々のサイトカインの効果(1)除負荷を受けた膝蓋腱の線維芽細胞にはTGF-β、IL1-/3、TNF-αの発現亢進が認められ、膝蓋腱マトリックスの力学的特性は有意に低下していた。(2)抗TGF-β抗体の投与は除負荷による膝蓋腱マトリックスの力学的特性劣化を有意に増強した。しかしTGF-β1の投与はそれに有意の影響を与えなかった。(1)TGF-β1は凍結解凍処理ACLの力学的特性劣化を有意に抑制し、損傷を受けた膝前十字靭帯の力学的特性を有意に増強する。(2)EGFおよびPDGFは凍結解凍処理前十字靭帯の力学的特性劣化に有意の影響を与えない。(3)VEGFは凍結解凍処理前十字靭帯および移植腱の血管新生を有意に促進するが、力学的特性には有意の影響を与えない。1.家兎36羽を用い、A群では左膝滑膜から採取した細胞を4週間培養して、1.5x10^6個の滑膜由来細胞を含むfibrin sheetを作成し、培養液にTGF-β1(10ng/ml)を投与して48時間後に、in situ凍結処理した右膝ACLに投与した。B群ではTGF-β1の非投与以外はI群と同処置を行なった。C群はfibrin sheetのみを投与した。12週で屠殺した。

本研究は上述の処理をした細胞投与が凍結処理ACLへの細胞浸潤を促進し、また力学的特性の劣化を抑制することを明らかにした。2.成熟羊32頭を用い、半腱様筋腱を移植腱として右ACLを再建後、4群に分けた。A群では何も投与しなかった。B群では、移植腱にfibrinのみを投与した。C群では左膝関節の滑膜から採取した滑膜細胞を2週間培養した滑膜由来細胞(3x10^6)を投与した。D群では、C群の処置後、48時間前にTGF-beta1(10ng/ml)を投与した細胞を投与した。各群とも術後12週で屠殺した。本研究は上述の処理をした細胞投与が再建ACLへの細胞浸潤を促進し、また力学的特性の劣化を抑制することを明らかにした。3.家兎30羽の左膝より滑膜組織を採取し,線維芽細胞を単離培養した.採取14日後に右膝蓋腱実質中央部に全層欠損を作成し,3群に分けた.A群は前述の培養細胞(1×10^6)を浮遊させたDMEM0.3mlを,B群は移植2日前にrh-TGF-BETA1を投与した同細胞浮遊液0.3mlを,C群DMEM0.3mlのみを欠損部に投与した.6週後に屠殺した.本研究は自家滑膜由来線維芽細胞をscaffoldsの存在しない膝蓋腱欠損部に移植すると再生組織の力学的劣化を促進させることを明らかし,さらに細胞移植前のTGF-BETA1投与は前述の再生組織の力学的劣化を抑止することを示した.