hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
コエ語族比較言語学の新展開

以下に要約する本研究の6点のうち、(1)コイサン諸語コエ語族の2つの未記述言語を現地調査する。(2)音韻構造・文法構造の重要な側面と語彙を高い精度で記述する。(3)定説とされていたコイサン諸語コエ語族の系統分類を批判的に検証する。(4)グイ・ガナ語群とナロ語群と東カラハリ=コエ語派の構成言語を再考する。(5)十分な実証的根拠を提示しながら改定案を提案する。(6)カバ語とツェラ語の社会言語学的動態を現地調査し記述する。今年度は、とくに、(3)(4)(5)を進めるのに、最適の機会をもうけることができた。すなわち、5月中旬に海外における研究協力者のベルリン大学のトムグルデマン教授、ボツワナ大学のアンディチェバネ教授とブザニハバナモツェ講師が日本に滞在したので、その期間中に、中川裕と連携研究者の大野仁美とともに京都大学を訪れ、グルデマンによるコエ語族の言語史に関する新仮説をテーマとするセミナーを開き、京都大学のコエ研究者とともに討議を行った。とくに、上記の(3)(4)(5)についての意見交換を詳しくすることができた。主として8月に、連携研究者の大野仁美がドイツのライプチヒおよびケルンに赴き、コエ語の親族名称からみた歴史の解釈にかんする討議をマックスプランク研究所で行い、さらに、アフリカ言語学国際会議に参加した。この学会には中川も参加し、グイ語およびコイサン全体の音韻論的タイプというべき語根の音素配列論的な特色の再解釈に関する発表をした。これは、語根の歴史を新しい視点から考えるための基礎になる。12月1月に、大野仁美は、ボツワナ共和国カラハリ地区で現地調査を行い、コエ諸語の文法要素の歴史的な比較を行うための資料収集を実施した。2月以降、中川と大野はこれまでの調査結果の分析成果を総合し、もたらされた知見から、グルデマンのカラハリ・コエ言語交替仮説の検討に着手した。2010年度は、最終年度であるためこれまでに蓄積してきたコエ諸語のデータの分析結果を総合した。そして、本研究が計画段階から目指してきた、コエ語族カラハリ・コエ語派の系統分類の問題にたいする一つの解答を、新しい一次資料の提供とともに、提起する準備が整った。従来の定説では、ハバ語がグイ・ガナ語群に系統分類されているが、今年度に行った現地調査でハバ語の基礎語彙データの大幅な追加がなされた。その一次資料に基づき、ハバ語とナロ語とグイ語、ガナ語との比較が明らかにした音対応から、子音、母音、声調のいずれにも、ハバ語にはナロ語とおなじ歴史的音変化の起きたことが再建され、また、グイ・ガナ語群に起きた(そしていまも進行中の)子音の歴史的変化(非クリック歯茎閉鎖音の口蓋化)が、ハバ語には観察されないということが明らかになった。これは、従来の定説による系統分類が誤りで、正しくは、ハバ語はグイ・ガナ語群ではなく、ナロ語と同一の語群をなすと見なすべきだということを示す。さらに、追加的に収集することのできた、カラハリ・コエ語派内での系統的な位置が不明であったツィラ語の基礎語彙の分析から、この言語がガナ語のひとつの方言(しかも音韻史的にはもっとも保守的な一面をもつ変種)であるという事実が明らかになった。以上の、ハバ語およびツィラ語の系統的な位置づけに関する改訂と発見は、コエ語族比較言語学におけるカラハリ・コエの全体像を現時点でもっとも実証的で正確な理解する知見である。この成果の一部は、2011年7月に開催される国際コイサン言語学シンポジウムと国際歴史言語学会で研究発表する予定である。
出芽酵母脱ユビキチン化酵素の網羅的機能解析

本研究では出芽酵母に存在する20種類の脱ユビキチン化酵素の性状を網羅的に解析することで、脱ユビキチン化酵素のユビキチン鎖特異性の解明を行った。まず、コムギ無細胞タンパク質合成系により合成した脱ユビキチン化酵素を用いて、K48リンク鎖、K63リンク鎖、ユビキチン前駆体に特異的な脱ユビキチン化酵素を同定した。プロテアソームの脱ユビキチン化酵素Rpn11とUbp6にはK48鎖、K63鎖の特異性はみられず、ユビキチン鎖特異性はユビキチン化タンパク質がプロテアソームに運搬される以前に生じる可能性が示唆された。また、Ubp6はプロテアソーム前駆体に結合する有害なユビキチン化タンパク質を除去することでプロテアソームの分子集合を正に制御するという新しい知見を得た。さらに、定量プロテオミクスの新技術Parallelreaction monitoring法を用いて全てのユビキチン鎖を100アトモルから高感度に測定する手法を開発し、脱ユビキチン化酵素変異株の細胞内のユビキチン鎖を定量し新知見を得た。ユビキチン化はプロテアソームによる分解やタンパク質輸送のシグナルとして機能するタンパク質の翻訳後修飾である。ユビキチン化はリン酸化のような可逆的反応であり、細胞内ではユビキチン化反応と脱ユビキチン化反応が拮抗している。後者の反応を実行しているのが一連の脱ユビキチン化酵素群である。脱ユビキチン化酵素はヒトでは約70種類、出芽酵母では20種類存在するが、一部の分子を除いて生理機能や使い分けなど多くの問題が未解決である。本研究では出芽酵母全脱ユビキチン化酵素の生化学的性質と生理機能を網羅的に解析することで、脱ユビキチン化酵素の機能重複性と特異性を明らかにすることを目的としている。平成22年度は、脱ユビキチン化酵素の活性中心に変異を導入した基質トラップ型変異体を網羅的に作製し、20種の酵母変異株を得た。そのうち10種類について定量的質量分析法により細胞内で結合する標的タンパク質と認識するユビキチン鎖の構造を解析した。その結果、複数の脱ユビキチン化酵素について特異的に相互作用するタンパク質が同定され本方法が有効であることが明らかとなった。また、脱ユビキチン化酵素の切断するユビキチン鎖の構造特異性を明らかにするため、コムギセルフリー系を用いて全20種類の脱ユビキチン化酵素のタンパク質合成に成功した。今後もこれらの解析を進展させる。一方、脱ユビキチン化酵素の一つUbp6がプロテアソームの分子集合の初期の段階から結合していることを見出し、Ubp6はプロテアソーム前駆体に結合する有害なユビキチン化タンパク質を除去することでプロテアソームの分子集合を正に制御するというモデルを提案し報告した。本年度は、ユビキチン前駆体のプロセシングに関与する脱ユビキチン化酵素を明らかにするため、コムギセルフリー系により合成した脱ユビキチン化酵素20種を用い直鎖のユビキチン鎖の切断活性を解析した。その結果、ユビキチン前駆体に特異性め高い4種類の脱ユビキチン化酵素が同定された。これらはいずれも非必須遺伝子であったため、現在4重遺伝子破壊株を作製し解析を行っている。一方、平成22年度に見出したプロテアソームの分子集合に関与する脱ユビキチン化酵素Ubp6の解析を深化させた。

試験管内においてUbp6の脱ユビキチン化酵素活性がプロテアソームの形成中間体により確かに上昇すること、プロテアソーム中間体にユビキチン化タンパク質を運搬する分子がRad23であることを見出した。これまで、脱ユビキチン化酵素Ubp2、Ubp12、Ubp14、Ubp15がユビキチン前駆体Ubi4のプロセシング酵素であること、Ubp6がプロテアソームの分子集合を制御していることを見出している。平成24年度は以下の解析を実施した。1.脱ユビキチン化酵素多重破壊株の作製試験管内の実験により見出されたユビキチン前駆体プロセシング酵素の候補UBP2、UBP12、UBP14、UBP15について各遺伝子破壊株を掛け合わせることにより、ubp2D ubp12Dubp14Dubp15D四重破壊株を作製した。しかし、四重破壊株は、ubi4Dの表現系(高温ストレスやアミノ酸アナログ感受性)を示さず、ユビキチン抗体によるウェスタンブロット解析や、細胞抽出液を用いたユビキチン前駆体のプロセシングも野生株のものと差異は認められなかった。さらなる多重破壊株作製のためCre-loxP法により、残りの全ての組み合わせで6重破壊株まで作製したが、ubi4D様の表現系を示す株は未だ得られていない。2.脱ユビキチン化酵素のユビキチン鎖切断特異性の解析細胞内には8種類の異なる構造のポリユビキチン鎖が存在する。これらのユビキチン鎖を識別する方法として定量質量分析計が広く用いられているが、複雑な試料からK6鎖やK29鎖などの微量ユビキチン鎖を検出することは困難である。そこで、最新型の高分解能質量分析計を用いたParallel Reaction Monitoring法を用いることで複雑試料中からユビキチン鎖を絶対定量する方法を確立し、複雑試料中から全ての種類のユビキチン鎖を少なくとも100 amolから定量可能であることを明らかにした(Tsuchiya et al, BBRC, in press)。本手法を用いることで、細胞内における脱ユビキチン化酵素のユビキチン鎖切断特異性を直接解析できると期待される。質量分析機の長期にわたる不調のため、プロテオミクス解析の進展が遅れているものの、ユビキチン前駆体プロセシングを実行する脱ユビキチン化酵素の同定、プロテアソームの分子集合に関与する脱ユビキチン化酵素の同定など研究は順調に進展している。24年度が最終年度であるため、記入しない。全ての脱ユビキチン化酵素を合成できるという利点を生かし、脱ユビキチン化酵素のユビキチン鎖構造特異性を明らかにする。
強相関電子系における量子相転移の排他的分数統計、数値的手法等現代的視点からの研究

[1]モット転移、量子相転移を示す系の数値的手法による研究。モット転移が本質的に電荷の自由度がフリーズされることであることを考え、スピンレスフェルミオン系におけるモット転移を考えた。最近接相互作用のみの系では相互作用を変化させていった場合ハーフフィルド占有率1/2の場合に限りある相互作用の値で励起にエネルギーギャップが生じモット絶縁体となることはよく知られている。そこで相互作用が冪で減衰するモデル等、長距離相互作用の場合を考察した。強結合領域での振る舞いは過去にハバ-ド等の研究があるが本研究では厳密対角化の手法を用い転移点近傍の振る舞いを含めて詳しく研究を行った。対応する連続体の模型は最近研究が進んでいるように朝永ラッティンジャー液体となり金属的であることもふまえると長距離相互作用を持つ系においては一般のp/qの分数占有率の系においても相互作用がある臨界値を越えると励起にエネルギーギャップが生じモット転移が生ずることがわかった。(論文投稿中)[2]拡張された排他的統計等による量子ホール効果の研究。Haldaneにより、初めて考察された、一般化された排他的統計に従う分数統計粒子系を用いて分数量子ホール効果における準粒子の熱力学に関する研究を行い興味深い結果を得た。(論文準備中)[3]量子ホール効果におけるトポロジカルな効果量子ホール効果におけるトポロジカルな効果についてバルク状態とエッジ状態との関係に特に注目し、今までの研究成果を総合報告の形にまとめた。(出版予定)[1]モット転移、量子相転移を示す系の数値的手法による研究。(出版予定)
生体高分子に対する分子インターフェイスを用いた蛋白質の集積・機能化

分子認識性のインターフェイス分子としてイミノニ酢酸とフェニルホウ酸が有効であることを実証し、これらを組込んだ非天然アミノ酸の合成に成功した。非天然アミノ酸型イミノニ酢酸は、ペプチド固相合成と酵素半合成を併用することによってリボヌクレアーゼのペプチド骨格に組み入れることができた。得られた半合成リボヌクレアーゼは遷移金属イオンの結合によって活性がスイッチされ、これまで再構成法で示してきた知見がより一般の酵素にまで拡張される可能性を示唆した。またフェニルホウ酸アミノ酸を修飾したヘム補因子は、これまでうまくいかなったヘモグロビンとの再構成が可能となった。ヘモグロビンのアロステリックな酸素結合活性を人工的に組込んだインターフェイス分子によってコントロールする方法論が開けてくるかもしれない。さらに詳細な構造と活性相関についての研究を展開中である。
子宮内免疫反応制御による牛性選別精液人工授精方法の確立とその制御機構の解明

近年、乳牛後継牛が大幅に減少しており、効率的に雌子牛を生産できる牛性選別精液の活用が推進されている。しかし、封入精子数が少ないことなどから経産牛の受胎率が低いことが課題となっている。注入された精子は子宮内で異物と認識され、子宮内の白血球により貪食される。本研究では、申請者らが初めて豚および牛で明らかにしたカフェインによる子宮内免疫反応の制御技術に加えて、Sirtuin (SIRT)1を活性化し、ミトコンドリアの酸化ストレスを低減するレスベラトロールの添加により、精子運動性の長期化を図るこのことによって通常精液と同等の受胎率が得られる人工授精(AI)方法を確立する。
免疫介在性脳炎・脳症患者の血清中に存在する抗血管内皮抗体に関する研究

ヒト大脳微小血管内皮細胞を抗原とする免疫沈降と質量分析により、視神経脊髄炎患者の血清中に存在する抗血管内皮抗体の認識抗原として、補体成分であるC1qを同定した。また血清抗C1q抗体価は、血液脳関門の透過性の指標となる、髄液/血清アルブミン比と正の相関を示し、抗C1q抗体が血液脳関門の破綻に関与する可能性が示唆された。一方、NMDAR脳炎11名と健常者15名において抗C1q抗体価を比較検討したところ、NMDAR脳炎の血清中で有意に抗体価の上昇を認めた。NMDAR脳炎や視神経脊髄炎では、血清中の抗C1q抗体価の上昇が、血液脳関門の破綻による病的自己抗体の中枢移行に関与している可能性が示唆された。27年度、ヒト大脳微小血管内皮培養細胞に対し、抗NMDAR脳炎患者10名の血清を用い、免疫染色を行った。その結果、1名を除く9名の抗NMDAR脳炎患者の血清で、健常者の血清にはみられない、ヒト大脳微小血管内皮細胞に対する染色性を認めた。具体的には、核に染色性を認めた症例が7例、細胞質に認めた症例が4例、核小体に認めた症例が2例であった。ヒト大脳微小血管内皮細胞膜表面に明らかな染色性を認めた症例はなかった。多くの抗NMDAR脳炎患者の血清中に、ヒト大脳微小血管内皮細胞に反応する自己抗体(抗血管内皮抗体)が存在する可能性が示唆された。次にこれら患者の血清を用いて、同じ培養細胞を抗原とする免疫沈降を行い、その沈降物をSDS-PAGEで解析したところ、一部の患者で、健常者およびその他疾患患者には認めない約75kDaと240kDa超に位置する2本のバンドを確認した。現在これらのバンドを切り抜き、質量分析を施行中である。近年、免疫介在性脳炎・脳症に関しては、抗NMDAR抗体を含め、神経シナプスに発現する神経細胞膜表面抗原に対する抗神経抗体が、相次いで報告されている。さらにこれら抗神経抗体は、神経細胞に直接的な影響を及ぼす可能性が示唆されており、その中枢移行において、血液脳関門の破綻は不可欠である。現在同定中の抗血管内皮抗体が、抗NMDAR脳炎における、血液脳関門の破綻に関連する特異的な抗血管内皮抗体である可能性もあり、引き続き解析を進める予定である。27年度の研究において、抗血管内皮抗体の検出ならびに認識抗原蛋白の同定に関わるシステムを確立し、抗神経抗体が関連する自己免疫性脳炎の中で最も頻度が多いとされる、抗NMDAR脳炎患者の解析が終了したことから、進行状況は概ね順調と考えられる。本年度、ヒト大脳微小血管内皮培養細胞(HBMEC)を用いた免疫染色により、中枢神経ループス患者20例の血清中に存在する抗血管内皮抗体の検出を試みた。その結果、11名の患者血清でHBMECに対する染色性を認めた。この11名の患者血清を用いて、同じHBMECを抗原とする免疫沈降を行い、質量分析により認識抗原蛋白の同定を行った。その結果、Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase component of pyruvate dehydrogenase complex, mitochondrial (DLAT)とProteasome activator complex subunit 3 (PSME3)を同定した。DLATは、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体(PDC)の中心的な触媒作用をもつ分子であり、PDC-E2とも呼ばれている。PDC-E2は、原発性胆汁性肝硬変で高率に陽性となる抗ミトコンドリアM2抗体の標的抗原として知られている。一方、PSME3はプロテアソーム活性化因子であるが、現時点においてこれらの抗原のHBMECにおける役割は明らかにされていない。また、同じ手法を用い視神経脊髄炎(NMO)の患者より補体成分のC1qに対する自己抗体を検出した。その後、ELISA法を用い、15名のNMO患者、25名の自己免疫性脳炎患者、13名の多発性硬化症患者、15名の健常者の血清中の抗C1q抗体価を測定した。結果、NMO患者における急性期の抗C1q抗体価は、その他神経疾患患者および健常者と比較し有意に高値であった。また、その抗体価は、血液脳関門(BBB)の透過性の指標である髄液/血清アルブミン比と正の相関関係を示したことから、NMOの急性期にみられるBBBの破綻と抗C1q抗体が、関連している可能性が示唆された。昨年度確立した、抗血管内皮抗体の検出ならびに認識抗原蛋白の同定に関わるシステムを用い、中枢神経ループスおよび視神経脊髄炎患者より抗血管内皮抗体を検出し、その認識抗原蛋白を同定することができたため、進行状況は概ね順調と考えられる。昨年度までの成果として、ヒト大脳微小血管内皮細胞を抗原とする免疫沈降と質量分析により、視神経脊髄炎(NMOSD)患者の血清中に存在する抗血管内皮抗体の認識抗原として、補体成分であるC1qを同定した。

本年度、25名の自己免疫性脳炎患者においてELISA法により血清抗C1q抗体価を測定し、15名の健常者と比較検討した。結果、両群間の抗体価に有意差は認めなかった。しかし、NMDAR脳炎11名で健常者と比較検討したところ、NMDAR脳炎患者の血清中で有意に抗C1q抗体価の上昇を認めた(P = 0.01)。次に、抗C1q抗体が血管内皮細胞に及ぼす影響を検討するため、ヒト大脳微小血管内皮細胞を用いて細胞接着因子であるClaudin 5の発現量の変化を検討した。細胞にC1qを加えることにより、Claudin 5の発現量の増加がみられた。一方、血清抗C1q抗体価が高値のNMOSD患者の血清を単独もしくはC1q添加後に加えることにより、ともにClaudin 5の発現量の低下がみられた。C1qは、大脳微小血管内皮細胞において、wnt/beta-catenin signalを介し、claudin-5の発現に関与しているという報告(Naito et al. Cell 2012; 149: 1298-1313)があり、NMOSDおよびNMDAR脳炎患者の急性期血清中で上昇する抗C1q抗体が、C1qと結合し、wnt/beta-catenin signalの阻害を介し、Claudin 5の発現量の低下と、その後の血液脳関門の破綻に関与し、抗AQP4抗体や抗NMDAR抗体といった病的抗体の中枢神経内への移行をもたらす可能性が示唆された。ヒト大脳微小血管内皮細胞を抗原とする免疫沈降と質量分析により、視神経脊髄炎患者の血清中に存在する抗血管内皮抗体の認識抗原として、補体成分であるC1qを同定した。また血清抗C1q抗体価は、血液脳関門の透過性の指標となる、髄液/血清アルブミン比と正の相関を示し、抗C1q抗体が血液脳関門の破綻に関与する可能性が示唆された。一方、NMDAR脳炎11名と健常者15名において抗C1q抗体価を比較検討したところ、NMDAR脳炎の血清中で有意に抗体価の上昇を認めた。NMDAR脳炎や視神経脊髄炎では、血清中の抗C1q抗体価の上昇が、血液脳関門の破綻による病的自己抗体の中枢移行に関与している可能性が示唆された。今後、抗VGKC複合体抗体などのその他の神経細胞膜表面抗原に対する抗神経抗体を有する脳炎患者、CNSループスなどの膠原病や全身性自己免疫疾患に合併する脳症患者および免疫介在性脳炎に関連する既知の自己抗体を有さない脳炎・脳症患者の血清を用い、本年度と同様、ヒト大脳微小血管内皮培養細胞を抗原とする免疫染色、免疫沈降およびSDS-PAGEによる抗血管内皮抗体の検出と、質量分析を用いた抗血管内皮抗体の認識抗原蛋白の同定を行う予定である。本年度同定した、抗血管内皮抗体の標的抗原蛋白の大脳微小血管内皮細胞における役割の解明と、抗血管内皮抗体の産生機序ならびに大脳微小血管内皮細胞と血液脳関門に及ぼす影響につき検討する予定である。特にC1qに関しては、大脳微小血管内皮細胞においてwnt/beta-catenin signalingを介し、claudinの発現に関与しているという報告があり(Naito et al. Cell 2012; 149: 1298-1313)、抗C1q抗体がこれらのシグナルならびにclaudinの発現に影響を及ぼすか検討する予定である。免疫性神経疾患質量分析に用いる費用として当初500,000を計上していたが、解析に回す前の免疫沈降の行程において、特異的なバンドが予想してよりも得られなかったため、質量分析費用が、当初の予定よりも少なくなりました。
扁平上皮がんの発生、進展におけるTHG-1の役割

THG-1 / TSC22D4の扁平上皮がんの進展における役割を分子、細胞、個体レベルで明らかにするため、以下の研究を行った。1.新規同定したTHG-1の結合タンパク質(4種類)の解析を進め、THG-1がどのようにがんを進展させるのか分子メカニズムを検討した。特にTHG-1は、その結合タンパク質との結合を介して、がんの微小環境、幹細胞性、さらにはストレス抵抗性を制御する可能性が考えられた。2.THG-1の生理的役割の解析:THG-1ノックアウトマウスの解析を進めて、重層扁平上皮構築への役割について検討し、1で同定したTHG-1の結合タンパク質との関連性について検討を進めた。その結果、結合タンパク質の一つによって制御される標的遺伝子がTHG-1ノックアウトマウスにおいても変化することが明らかになり、生体マウスにおいても機能していることが示された。現在一部の結合タンパク質について組織染色ができないため、抗体の作成を検討している。3.THG-1の発現・リン酸化・変異・結合タンパクを標的にした分子腫瘍マーカーの開発:THG-1のリン酸化を認識する抗体を用いて、THG-1のリン酸化を指標に複数の扁平上皮がん組織の免疫染色を進めた。今後THG-1のリン酸化と1で同定した標的遺伝子発現との関連性を進め、新規診断法開発の可能性についての検討を進めている。4.THG-1結合ペプチドの同定と分子診断・分子標的薬への応用:THG-1に結合するペプチド候補物質の絞り込みを行い、THG-1とその結合タンパク質との結合を定量的に評価する検出系を用いて、同ペプチドが上記タンパク質間相互作用の一部を容量依存的に抑制することが明らかになった。Tsc-22ファミリータンパク質のひとつであるT H G - 1の扁平上皮がんの進展における役割を分子、細胞、個体レベルで明らかにするため、以下の研究を行った。1.T H G - 1の機能解析:扁平上皮がん培養細胞株を用い、THG-1の過剰発現及びノックダウンを行い、細胞の増殖、分化、がん化におけるTHG-1の役割を明らかにした。さらに新規THG-1の結合タンパク質(4種類)を質量分析により同定し、その役割の解析を進め、THG-1がどのようにがんを進展させるのか分子メカニズムを検討した。2.T H G - 1の生理的役割の解析:THG-1ノックアウトマウスの解析を進めて、重層扁平上皮構築への役割について検討し、1で同定したTHG-1の結合タンパク質との関連性について検討した。3.T H G - 1の発現・リン酸化・変異・結合タンパクを標的にした分子腫瘍マーカーの開発:THG-1のリン酸化を認識する抗体を用いて、THG-1のリン酸化を指標に扁平上皮がん組織の免疫染色を行い、新規診断法開発の可能性について検討した。4.T H G -1結合ペプチドの同定と分子診断・分子標的薬への応用:THG-1に結合するペプチドをスクリーニングし、候補物質を得た。さらに同ペプチドの作用を評価するため、THG-1とその結合タンパク質との結合を定量的に評価する検出系の確立に成功した。THGー1結合タンパクを同定し、その生理学的な意義について検討を進めることができたため。1.T H G - 1の機能解析:扁平上皮がん培養細胞株を用い、THG-1の過剰発現及びノックダウンを行い、細胞の増殖、分化、老化、がん化におけるTHG-1の役割を明らかにした。さらに新規同定したTHG-1の結合タンパク質(4種類)についてその役割の解析を進め、3種類の結合タンパクについて、その結合部位、及びその下流で働く制御因機構について明らかにした。2.T H G - 1の生理的役割の解析:THG-1ノックアウトマウスの解析を進めて、重層扁平上皮構築への役割について検討し、1で同定したTHG-1の結合タンパク質との関連性について検討を進めた。3.T H G - 1の発現・リン酸化・変異・結合タンパクを標的にした分子腫瘍マーカーの開発:THG-1のリン酸化を認識する抗体を用いて、THG-1のリン酸化を指標に扁平上皮がん組織の免疫染色を行い、新規診断法開発の可能性についての検討を進めた。4.THG-1に結合する環状ペプチドの評価を進め、細胞染色、タンパク質プルダウンに利用可能であることを明らかにした。さらに特定の結合タンパクとの結合を阻害することが明らかになった。THGー1結合タンパクを同定し、その生理学的な意義について明らかにすることができたため。

その結果、結合タンパク質の一つによって制御される標的遺伝子がTHG-1ノックアウトマウスにおいても変化することが明らかになり、生体マウスにおいても機能していることが示された。現在一部の結合タンパク質について組織染色ができないため、抗体の作成を検討している。3.THG-1の発現・リン酸化・変異・結合タンパクを標的にした分子腫瘍マーカーの開発:THG-1のリン酸化を認識する抗体を用いて、THG-1のリン酸化を指標に複数の扁平上皮がん組織の免疫染色を進めた。今後THG-1のリン酸化と1で同定した標的遺伝子発現との関連性を進め、新規診断法開発の可能性についての検討を進めている。4.THG-1結合ペプチドの同定と分子診断・分子標的薬への応用:THG-1に結合するペプチド候補物質の絞り込みを行い、THG-1とその結合タンパク質との結合を定量的に評価する検出系を用いて、同ペプチドが上記タンパク質間相互作用の一部を容量依存的に抑制することが明らかになった。扁平上皮がんは、未だ早期診断マーカー、分子標的治療法が確立されていない予後不良のがんである。本研究においてTHG-1の分子機能、及び臨床的な意義を明らかにし、扁平上皮がんの新規診断、及び分子標的治療への応用を進めて行く。また本年度に確立したタンパク結合の評価系を用いて、THGー1との結合を阻害する低分子についても検討を進める。また本年度までに得られたTHGー1との結合を阻害する環状ペプチドについて検討を進める。
関節スティフネスと筋・腱の受動的力学特性に関する研究

高齢者の転倒は,骨折・寝たきりにつながる可能性のある重大な問題と考えられている.高齢者転倒の一要因として,足関節柔軟性の低下が考えられている.関節の柔軟性と傷害の関連性に関して,Ekstrand and Gillquist(1983)は,柔軟性の低下は傷害の素因である事を示した.こうしたことから,転倒や傷害の予防のために,関節柔軟性向上を目的としてストレッチがしばしば行われる.本研究では,ストレッチを異なる膝関節角度,足関節角度で行った結果,ストレッチ前後における腓腹筋スティフネスの減少率に関して,関節角度の影響が認められた.すなわち,二関節筋である腓腹筋筋長が大きく引き伸ばされる関節角度の組み合わせ(膝関節をより伸展し,足関節をより背屈する)においては,腓腹筋スティフネスはより減少する傾向が認められた.一方,足関節背屈の程度が大きすぎると,腓腹筋に大きなつっぱり感を感じ,ストレッチ遂行が難しい場合もあった.腓腹筋を除いた足関節回り組織(ヒラメ筋,靭帯,関節包,皮膚)のスティフネスは足関節背屈角度に依存する為,この腓腹筋を除いた足関節回り組織のスティフネスを高める為には,腓腹筋伸長の程度を小さくするため,膝関節を屈曲するのがよいと考えられる.実際,膝関節を屈曲することにより,腓腹筋に痛みを感じること無く足関節背屈が可能となり,結果として得られるストレッチの効果(スティフネスの減少)は大きくなる結果が得られた.よって,腓腹筋の柔軟性を向上させる必要が有る場合には,膝関節を伸展し足関節を背屈するストレッチを行い,ヒラメ筋や足関節周りの皮膚や靭帯,関節包の柔軟性を向上させる必要がある場合には,膝関節を十分屈曲する事で腓腹筋へのストレッチ強度を減少させ,より足関節を背屈させるストレッチを行うことが有用であることが示唆された.ストレッチトレーニングによって筋・腱の弾性特性がどのように変化し,また,関節柔軟性改善に貢献するかを,平均年齢57歳(5564歳)の健常な男女6名(男性3名,女性3名)を対象として調べた.3週間のストレッチトレーニング(膝関節完全伸展位,足部背屈1530度)を行った結果,トレーニング前後における腓腹筋スティフネスの減少率に関して,トレーニング足と非トレーニング足の間に有意な差が認められた.このことから,ストレッチトレーニングにより,腓腹筋の柔軟性が高まった事が明らかにされた.従来の研究では,関節レベルでの柔軟性のみを評価していたため,ストレッチトレーニングによる関節レベルでの柔軟性の向上が,筋や腱の柔軟性向上によるものか,それとも他の組織(靭帯,関節包,皮膚)の柔軟性向上によるものかは明らかにされてこなかった.本研究結果は,ヒト生体を対象として初めて,ストレッチトレーニングにより筋の柔軟性が向上する事を定量的に示した.一方,腓腹筋を除いた足関節回り組織(ヒラメ筋,靭帯,関節包,皮膚)のスティフネスには有意な減少が認められなかった.これは,腓腹筋以外に柔軟性向上が生じなかった事を示唆する.被験者の内省報告によると,ストレッチ中,つっぱり感を感じるのは腓腹筋筋腹の部分で,足部やヒラメ筋(遠位部)付近には大きなつっぱり感を感じていなかった.こうした部位による感覚の差異が,各部位に対するストレッチの強度を反映しているものだとすれば,本研究におけるストレッチトレーニングは,腓腹筋に対しては強度が高く,ヒラメ筋や足関節周りの皮膚や靭帯,関節包に対しては強度が低かったかも知れない.それにより,腓腹筋のみ柔軟性が向上し,他の組織に有意な柔軟性向上が認められなかったという結果が得られた可能性が考えられる.高齢者の転倒は,骨折・寝たきりにつながる可能性のある重大な問題と考えられている.高齢者転倒の一要因として,足関節柔軟性の低下が考えられている.関節の柔軟性と傷害の関連性に関して,Ekstrand and Gillquist(1983)は,柔軟性の低下は傷害の素因である事を示した.こうしたことから,転倒や傷害の予防のために,関節柔軟性向上を目的としてストレッチがしばしば行われる.本研究では,ストレッチを異なる膝関節角度,足関節角度で行った結果,ストレッチ前後における腓腹筋スティフネスの減少率に関して,関節角度の影響が認められた.すなわち,二関節筋である腓腹筋筋長が大きく引き伸ばされる関節角度の組み合わせ(膝関節をより伸展し,足関節をより背屈する)においては,腓腹筋スティフネスはより減少する傾向が認められた.一方,足関節背屈の程度が大きすぎると,腓腹筋に大きなつっぱり感を感じ,ストレッチ遂行が難しい場合もあった.腓腹筋を除いた足関節回り組織(ヒラメ筋,靭帯,関節包,皮膚)のスティフネスは足関節背屈角度に依存する為,この腓腹筋を除いた足関節回り組織のスティフネスを高める為には,腓腹筋伸長の程度を小さくするため,膝関節を屈曲するのがよいと考えられる.実際,膝関節を屈曲することにより,腓腹筋に痛みを感じること無く足関節背屈が可能となり,結果として得られるストレッチの効果(スティフネスの減少)は大きくなる結果が得られた.よって,腓腹筋の柔軟性を向上させる必要が有る場合には,膝関節を伸展し足関節を背屈するストレッチを行い,ヒラメ筋や足関節周りの皮膚や靭帯,関節包の柔軟性を向上させる必要がある場合には,膝関節を十分屈曲する事で腓腹筋へのストレッチ強度を減少させ,より足関節を背屈させるストレッチを行うことが有用であることが示唆された.
セグメント特異的同位体ラベルP450を用いた電子伝達相互作用部位の解明

チトクロムP450は炭化水素の特定部位を水酸化する酵素で,その温和な反応条件と反応位置の特異性から酵素化学的だけではなく,実用的,工業的にもその応用が注目されている.この酵素の水酸化反応においての解明するべき点の一つは,分子状酸素の活性化に必要な電子の供給機構であり,この電子伝達機構が解明され,その人工的制御が可能になればこの酵素の応用範囲が大きく広がることが期待される.本研究課題ではこのチトクロムP450における電子伝達機構の解明とその制御を目指して,NMRとペプチド鎖の同位体置換を組み合わせることで,代表的なチトクロムP450であるd-カンファーを基質とする緑膿菌のチトクロムP450(P450cam)と,その電子供与体であるプチダレドキシン(Pd)の電子伝達相互部位の決定,およびその電子伝達過程の制御機構について検討を行った.本研究で得られた主な結果は以下のとおりである.1.P450camのNMRスペクトルを詳細に検討し,基質であるd-カンファーやヘム近傍に位置するスレオニン252に由来するNMRシグナルの帰属に成功した.2.今回帰属したNMRシグナルを用いて電子供与体であるPdの結合によるP450camのヘム近傍の構造変化を検討し,Pd結合によりヘム面が傾き,ヘム鉄とd-カンファーとの距離が短くなることを見出した.このことは,ヘム鉄上で生成する活性酸素を効率的にd-カンファーに転移させる上で有利であると考えられた.3.電子伝達相互作用部位と想定される領域を含むP450camのアミノ酸配列が無細胞系でも合成できることを示し,セグメント特異的同位体ラベルがP450camでも可能であると考えられた.しかし,実際のセグメント特異的同位体ラベルP450camの作製のためには,この配列の収率は低く,更なる反応条件の検討が必要であった.チトクロムP450は炭化水素の特定部位を水酸化する酵素で,その温和な反応条件と反応位置の特異性から酵素化学的だけではなく,実用的,工業的にもその応用が注目されている.この酵素の水酸化反応においての解明するべき点の一つは,分子状酸素の活性化に必要な電子の供給機構であり,この電子伝達機構が解明され,その人工的制御が可能になればこの酵素の応用範囲が大きく広がることが期待される.本研究課題ではこのチトクロムP450における電子伝達機構の解明とその制御を目指して,NMRとペプチド鎖の同位体置換を組み合わせることで,代表的なチトクロムP450であるd-カンファーを基質とする緑膿菌のチトクロムP450(P450cam)と,その電子供与体であるプチダレドキシン(Pd)の電子伝達相互部位の決定,およびその電子伝達過程の制御機構について検討を行った.本研究で得られた主な結果は以下のとおりである.1.P450camのNMRスペクトルを詳細に検討し,基質であるd-カンファーやヘム近傍に位置するスレオニン252に由来するNMRシグナルの帰属に成功した.2.今回帰属したNMRシグナルを用いて電子供与体であるPdの結合によるP450camのヘム近傍の構造変化を検討し,Pd結合によりヘム面が傾き,ヘム鉄とd-カンファーとの距離が短くなることを見出した.このことは,ヘム鉄上で生成する活性酸素を効率的にd-カンファーに転移させる上で有利であると考えられた.3.電子伝達相互作用部位と想定される領域を含むP450camのアミノ酸配列が無細胞系でも合成できることを示し,セグメント特異的同位体ラベルがP450camでも可能であると考えられた.しかし,実際のセグメント特異的同位体ラベルP450camの作製のためには,この配列の収率は低く,更なる反応条件の検討が必要であった.
低酸素シグナルによるリンパ球機能制御機構の解明

生体内外の環境の酸素濃度には大きなグラジエントが存在する。リンパ球などの免疫担当細胞は、生体内を広く移動し、極端な酸素環境の変動に曝されうる代表的組織といえる。さらに、免疫担当細胞が機能する場である炎症組織・腫瘍組織などにおいては、組織内酸素分圧が著しく低下しており、リンパ球などの細胞にとって、環境酸素濃度のダイナミックな変化に適応することは、細胞・組織の機能を維持するうえできわめて重要であるといえるが、そのメカニズムについてはほとんど明らかにされていない。低酸素によって活性化される転写因子Hypoxia-inducible factor-1α(HIF-1α)は、細胞の低酸素環境への適応に重要な多くの遺伝子の発現を転写レベルで制御している。本研究は、低酸素がリンパ球の機能・形質にあたえる影響とその分子機構を明らかにすると共に、リンパ球機能制御、免疫応答制御におけるHIF-1αおよび低酸素シグナルの役割を明確にし、低酸素シグナル伝達システムを標的とする新たな免疫制御法開発の基盤を確立することを目的とするものである。平成16年度研究実施計画に沿って以下の様に研究が展開された。低酸素がリンパ球機能に与える影響の解明。健常人の末梢血より分離した単核細胞をPHAで幼若化したのちIL-2存在下で培養し、固相化抗CD3抗体で刺激し、活性化細胞死(AICD)を誘導する系を構築した。低酸素下ではAICDは有意に抑制され、T細胞の生存率は上昇した。かかる条件下のT細胞においては解糖系の亢進により、エネルギー産生が維持されていた。リンパ球におけるHIF-1α発現の解析。上記のごとくAICDが抑制される培養条件下、すなわち低酸素環境下で、かつCD3刺激が共存する場合のみHIF-1αの発現が誘導された。かかるHIF-1α発現は翻訳のレベルで制御されていた。リンパ球におけるHIF-1α発現の意義の究明。リンパ球においてHIF-1αはアドレノメジュリン遺伝子を誘導しAICDの制御に関与することが示唆された。一方、解糖系酵素、糖輸送蛋白遺伝子を誘導しエネルギー代謝の維持に重要な働きを果たしていることが示された。本研究は、低酸素がリンパ球の機能・形質にあたえる影響とその分子機構を取らかにすると共に、リンパ球機能制御、免疫応答制御におけるHIF-1αおよび低酸素シグナルの役割を明確にし、低酸素シグナル伝達システムを標的とする新たな免疫制御法開発の基盤を確立することを目的とするものである。平成15年度研究実施計画に沿って以下の様に研究が展開された。健常人の末梢血より比重遠心法で分離した単核細胞をPHAで幼若化したのちIL-2存在下で培養し、固相化抗CD3抗体で刺激し、活性化細胞死(AICD)を誘導する系を構築した。低酸素がかかる細胞死に与える影響を解析した。上記のごとくAICDが抑制される培養条件下でのリンパ球におけるHIF-1αの発現を解析した。低酸素環境下で、かつCD3刺激が共存する場合のみHIF-1αの発現が誘導された。

健常人の末梢血より分離した単核細胞をPHAで幼若化したのちIL-2存在下で培養し、固相化抗CD3抗体で刺激し、活性化細胞死(AICD)を誘導する系を構築した。低酸素下ではAICDは有意に抑制され、T細胞の生存率は上昇した。かかる条件下のT細胞においては解糖系の亢進により、エネルギー産生が維持されていた。リンパ球におけるHIF-1α発現の解析。上記のごとくAICDが抑制される培養条件下、すなわち低酸素環境下で、かつCD3刺激が共存する場合のみHIF-1αの発現が誘導された。かかるHIF-1α発現は翻訳のレベルで制御されていた。リンパ球におけるHIF-1α発現の意義の究明。リンパ球においてHIF-1αはアドレノメジュリン遺伝子を誘導しAICDの制御に関与することが示唆された。一方、解糖系酵素、糖輸送蛋白遺伝子を誘導しエネルギー代謝の維持に重要な働きを果たしていることが示された。
三次構造からタンパク質の構造変化を予測するための理論の確立

アゴニストの結合によって引き起こされるグルタミン酸受容体タンパク質での振動励起エネルギーが,再配分して行く過程が存在することは既にわかっている.そこで,リガンド結合部位のArg485側鎖から,振動エネルギーの移動経路を主成分分析法によって明らかにすることを試みた.この解析法を用いることにより,受容体が最も大きくゆらぐ方向を明らかにすることが示され始めた.受容体のある特定の振動モード(GluR2ではArg485側鎖の変角振動)にエネルギーを与えると,受容体はそのエネルギーを機能部位に移動させて構造変化を起こすことがわかった.それ以外の場所にエネルギーを与えても,散逸するだけで生物学的な意義はないようであった.次に,グルタミン酸受容体のリガンド結合部位であるArg485を振動励起させた場合と振動励起させない場合のシミュレーション結果を比較した.振動エネルギーによるリガンド結合領域の構造変化が現在明らかになりつつある.さらには,Arg485の振動励起エネルギーの移動による膜貫通領域の構造変化の考察を試みた.リガンド結合領域は,膜貫通領域と3本のリンカーペプチドで連結されている.GluR2リガンド結合領域の結晶構造は,リンカーペプチドのアミノ酸残基を含んでいる.そこでシミュレーション中のリンカーペプチドの動きに着目し,リンカーペプチドの動きが膜貫通領域をどれくらい変位させる力を生むのかを,膜貫通領域をシリンダーでモデル化した.特に,Kチャネルの膜内構造との比較を重視し,これとの相同点・相違点について現在考察しているところである.アゴニストの結合によって引き起こされるグルタミン酸受容体タンパク質での振動励起エネルギーが,再配分して行く過程が存在することは既にわかっている.そこで,リガンド結合部位のArg485側鎖から,振動エネルギーの移動経路を主成分分析法によって明らかにすることを試みた.この解析法を用いることにより,受容体が最も大きくゆらぐ方向を明らかにすることが示され始めた.受容体のある特定の振動モード(GluR2ではArg485側鎖の変角振動)にエネルギーを与えると,受容体はそのエネルギーを機能部位に移動させて構造変化を起こすことがわかった.それ以外の場所にエネルギーを与えても,散逸するだけで生物学的な意義はないようであった.次に,グルタミン酸受容体のリガンド結合部位であるArg485を振動励起させた場合と振動励起させない場合のシミュレーション結果を比較した.振動エネルギーによるリガンド結合領域の構造変化が現在明らかになりつつある.さらには,Arg485の振動励起エネルギーの移動による膜貫通領域の構造変化の考察を試みた.リガンド結合領域は,膜貫通領域と3本のリンカーペプチドで連結されている.GluR2リガンド結合領域の結晶構造は,リンカーペプチドのアミノ酸残基を含んでいる.そこでシミュレーション中のリンカーペプチドの動きに着目し,リンカーペプチドの動きが膜貫通領域をどれくらい変位させる力を生むのかを,膜貫通領域をシリンダーでモデル化した.特に,Kチャネルの膜内構造との比較を重視し,これとの相同点・相違点について現在考察しているところである.
変動流体力場における多層石礫フィルター工法の水理・環境機能評価と設計技術の確立

石礫で構築される構造物は空隙を有する多孔質体であるため,間隙を流水が通過することによる曝気効果も期待できるのみならず景観面においても優れた構造物と言える.本研究では,多孔質水理構造物として捨石堰や河床保護工を取り上げ,水理・環境機能を実験的かつ理論的に検討した.研究成果の概要は以下のようである.1.多層石礫フィルターは河床保護工のみならず護岸の裏込め土砂流出防止策として効果があることが明らかにされているが,実際の適用に関しては,最上層の石礫が破壊されない,すなわち掃流されないという設計条件を課すため石礫径を相当大きくする必要がある.本研究では,最上層の石礫を小さくしても掃流抵抗を大きく取れる工法として石礫を連結することを提案し,連結石礫の流体力評価を行うとともに破壊防止効果を示した.2.水制は水の流れを制御し河岸を保護するのみならず,澪筋を安定させる効果があるが,一方で水制周辺部の局所洗掘が水工学上の課題となっている.本研究では,自然石を用いた水制の水理機能を検討した.その結果,捨石で構築される透過型の水制は,不透過型の水制よりも,水制周辺部における急変流の強度を低下させ,水制周辺の局所洗掘を減少させる効果を有することを明らかにした.3.透過型の水理構造物周辺流れを精度よく再現できる数値モデルを構築することを目的として捨石堰を対象として実用的な数値シミュレーションモデルを構築した.4.捨石堰の環境水理機能の一つとして,水質浄化機能を検討した結果,捨石堰そのものの浄化機能を確認した.また,捨石堰にRDF炭化物をサンドイッチ状に挟むことにより水質浄化機能の向上が見込まれることを確認した.石礫で構築される構造物は空隙を有する多孔質体であるため,間隙を流水が通過することによる曝気効果も期待できるのみならず景観面においても優れた構造物と言える.本研究では,多孔質水理構造物として捨石堰や河床保護工を取り上げ,水理・環境機能を実験的かつ理論的に検討した.研究成果の概要は以下のようである.1.多層石礫フィルターは河床保護工のみならず護岸の裏込め土砂流出防止策として効果があることが明らかにされているが,実際の適用に関しては,最上層の石礫が破壊されない,すなわち掃流されないという設計条件を課すため石礫径を相当大きくする必要がある.本研究では,最上層の石礫を小さくしても掃流抵抗を大きく取れる工法として石礫を連結することを提案し,連結石礫の流体力評価を行うとともに破壊防止効果を示した.2.水制は水の流れを制御し河岸を保護するのみならず,澪筋を安定させる効果があるが,一方で水制周辺部の局所洗掘が水工学上の課題となっている.本研究では,自然石を用いた水制の水理機能を検討した.その結果,捨石で構築される透過型の水制は,不透過型の水制よりも,水制周辺部における急変流の強度を低下させ,水制周辺の局所洗掘を減少させる効果を有することを明らかにした.3.透過型の水理構造物周辺流れを精度よく再現できる数値モデルを構築することを目的として捨石堰を対象として実用的な数値シミュレーションモデルを構築した.4.捨石堰の環境水理機能の一つとして,水質浄化機能を検討した結果,捨石堰そのものの浄化機能を確認した.また,捨石堰にRDF炭化物をサンドイッチ状に挟むことにより水質浄化機能の向上が見込まれることを確認した.堰下流部に設置される護床工として多層石礫フィルターを設置して,各種水理条件下における安定条件を実験的に検討した.その結果,多層石礫上の流れ場が常流の場合と射流の場合について安定条件を示すことができた.つぎに,石礫を用いた構造物として,捨石堰を対象として,環境水理機能評価を行った.従来のコンクリートや鋼製の不透過性の堰は,河川が持つ本来の自浄作用を低下させ,水質の悪化を招いたり,魚類の遡上降下を妨げたり,周辺の水生生物の生態系に負の影響を及ぼしたりすることが問題となっている.一方,透過性を有する捨石堰は,堰体内を流水が通過可能であるため,曝気機能により水質の悪化を防いだり,また,石礫の抵抗により堰上の流速が低減するため,魚類が遡上し易くなるなど,不透過堰が有する環境面における諸問題を改善する効果を発揮することが期待されている.本年度は捨石堰を用いた堰による水質浄化機能を実験的に検討した.その結果,捨石堰は多孔性を有するため,曝気効果が期待されることが示された.また,RDF炭化物を併用した場合の水質改善効果について検討した結果,更なる浄化効果が発揮されることが明らかにされた.さらに,捨石を用いた水制周辺の流れ場について透過型構造物の方が不透過型構造物よりも水制先端部における局所流を低減させる効果があり,洗掘防止工かも期待できることを実験的に明らかにした.このような捨石を用いた水制周辺の流れ場を予測する2層流モデルを提案し,実験結果との比較により提案したモデルの有効性を明らかにした.

さらに,水制周辺の流れ場を3次元的に解析するモデルを提案し,実験結果との比較によりモデルの妥当性を検証した.石礫で構築される構造物は空隙を有する多孔質体であるため,間隙を流水が通過することによる曝気効果も期待できるのみならず景観面においても優れた構造物と言える.本研究では,多孔質水理構造物として捨石堰や河床保護工を取り上げ,水理・環境機能を実験的かつ理論的に検討した.研究成果の概要は以下のようである.1.多層石礫フィルターは河床保護工のみならず護岸の裏込め土砂流出防止策として効果があることが明らかにされているが,実際の適用に関しては,最上層の石礫が破壊されない,すなわち掃流されないという設計条件を課すため石礫径を相当大きくする必要がある.本研究では,最上層の石礫を小さくしても掃流抵抗を大きく取れる工法として石礫を連結することを提案し,連結石礫の流体力評価を行うとともに破壊防止効果を示した.2.水制は水の流れを制御し河岸を保護するのみならず,澪筋を安定させる効果があるが,一方で水制周辺部の局所洗掘が水工学上の課題となっている.本研究では,自然石を用いた水制の水理機能を検討した.その結果,捨石で構築される透過型の水制は,不透過型の水制よりも,水制周辺部における急変流の強度を低下させ,水制周辺の局所洗掘を減少させる効果を有することを明らかにした.3.透過型の水理構造物周辺流れを精度よく再現できる数値モデルを構築することを目的として捨石堰を対象として実用的な数値シミュレーションモデルを構築した.4.捨石堰の環境水理機能の一つとして,水質浄化機能を検討した結果,捨石堰そのものの浄化機能を確認した.また,捨石堰にRDF炭化物をサンドイッチ状に挟むことにより水質浄化機能の向上が見込まれることを確認した.
高精密電着超砥粒ホイールの研削性能に関する研究

本研究は,切れ味がよいが形状精度が悪いという欠点を持つ,電着超砥粒ホイールの問題を解決するために,新しく考案した,高精密電着超砥粒ホイールの製作法を確立し,その後,その砥石の研削性能を明らかにすることであった.新しい砥石製作法とは,超精密エアスピンドル上で超精密切削された金型を用いて,砥粒層を遠心鋳造したのち,電気メッキすることによって,高精密な電着超砥粒ホイールを製作する方法であった.この方法により製作された砥石は,金型の形状が砥石表面に正しく転写され,砥粒切れ刃高さのばらつきがせいぜい数μm以内となり,高精密砥石を得ることが出来た.つぎに,上述のように製作された,高精密電着超砥粒ホイールの研削機構および研削性能を明らかにするために,実際の研削を行った.厚さ12mm程度の薄板状焼き入れ鋼の平面プランジ研削を行い,高応答研削動力計を用いて,瞬間研削力を測定し,その変化を測定することにより,有効砥粒切れ刃の分布を調べた.また,各種研削条件を替えて実験を行い,砥石損耗と砥粒突きだし量との関係などを検討した.その結果,有効切れ刃の分布はかなり均一であり,比較的重研削条件下でも良好な仕上げ面を得ることができた.また,砥粒突きだし量が砥粒径の1/41/3のときに,砥石損耗がもっとも少ないことがわかった.本研究は,切れ味がよいが形状精度が悪いという欠点を持つ,電着超砥粒ホイールの問題を解決するために,新しく考案した,高精密電着超砥粒ホイールの製作法を確立し,その後,その砥石の研削性能を明らかにすることであった.新しい砥石製作法とは,超精密エアスピンドル上で超精密切削された金型を用いて,砥粒層を遠心鋳造したのち,電気メッキすることによって,高精密な電着超砥粒ホイールを製作する方法であった.この方法により製作された砥石は,金型の形状が砥石表面に正しく転写され,砥粒切れ刃高さのばらつきがせいぜい数μm以内となり,高精密砥石を得ることが出来た.つぎに,上述のように製作された,高精密電着超砥粒ホイールの研削機構および研削性能を明らかにするために,実際の研削を行った.厚さ12mm程度の薄板状焼き入れ鋼の平面プランジ研削を行い,高応答研削動力計を用いて,瞬間研削力を測定し,その変化を測定することにより,有効砥粒切れ刃の分布を調べた.また,各種研削条件を替えて実験を行い,砥石損耗と砥粒突きだし量との関係などを検討した.その結果,有効切れ刃の分布はかなり均一であり,比較的重研削条件下でも良好な仕上げ面を得ることができた.また,砥粒突きだし量が砥粒径の1/41/3のときに,砥石損耗がもっとも少ないことがわかった.
マウス接触性過敏反応におけるエストロゲンによるエフェクターリンパ球の機能増強

研究成果の概要:女性ホルモンが接触アレルギーを増悪化する機構を解明するため、アレルギー反応で生じるリンパ球の増殖を検討した。マウスに女性ホルモンである17β-estradiolを3.2μg投与し、感作物質を塗布して7日後、血液中のリンパ球を解析した。またリンパ球を培養して培養液中に17β-estradio1を添加した。その結果、17β-estradiolはリンパ球の一種であるメモリーリンパ球を増加させることが明らかになった。女性ホルモンが接触アレルギーを増悪化する機構を解明するため、動物を感作した後に生じるリンパ球の増殖を検討した。3週齢の雌性BALB/cマウスから卵巣を摘出し、17β-estradiol (E2)を3.2μg投与および3%4-ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one (OXA)溶液を50μL塗布して7日間飼育後、腹部大静脈から血液を100μL採取し、溶血および洗浄後、各種蛍光標識抗体を添加して室温暗所で30分間静置してPBSを用いて洗浄し、氷中に保存してフローサイトメトリーで解析した。メモリーCD8^+細胞の指標となるCD8^+CD45RA^-CCR7^+の表面抗原タンパク質を有する細胞を計数した結果、E2投与群における存在比が非投与群における存在比よりも大きかった。またエフェクターメモリーCD8^+細胞の指標となるCD8^+CD45RA^-CCR7^-の表面抗原タンパク質を有する細胞を計数した結果、E2投与群における存在比が非投与群における存在比よりも大きかった。E2がメモリーCD8^+細胞の存在比を増加させる機構を検討するため、E2投与およびOXA塗布の直前に1%DMSOを含む1mg/mLインドメタシン-オリーブオイル溶液を5mg/kgとなるように皮下注射して同様に解析した結果、E2はメモリーCD8^+細胞を増加させ、インドメタシンはそれを抑制しなかった。以上のことから、ナイーブCD8^+細胞からメモリーCD8^+細胞への分化およびセントラルメモリーCD8^+細胞からエフェクターメモリーCD8^+細胞への分化をE2が促進する可能性が示唆された。またその作用機構はインドメタシンで抑制されなかったことから、プロスタグランジン類を介さない可能性が示唆された。女性ホルモンが接触アレルギーを増悪化する機構を解明するため、アレルギー反応で生じるリンパ球の増殖を検討した。3週齢の雌性BALB/cマウスから卵巣を摘出し、17β-estradiol(E2)を3.2μg投与および3%4-ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one(OXA)溶液を50μL塗布して7日間飼育後、脾臓を摘出し、リンパ球を採取して、培養を行った。4日間の培養後、細胞を回収し、各種蛍光標識抗体を添加して室温暗所で30分間静置してPBSを用いて洗浄し、氷中に保存してフローサイトメトリー法で測定した。エフェクターメモリーCD8+細胞の指標となるCD8+CD45RA-CCR7-の表面抗原タンパク質を有する細胞を計数した結果、E2投与マウスから採取した脾臓リンパ球は対照マウスから採取した脾臓リンパ球に比べて増殖が促進され、エフェクターメモリーリンパ球の存在比が上昇していた。無投与マウスの脾臓リンパ球の培養液中にE2を添加しても、エフェクターメモリーリンパ球の存在比が上昇する結果が得られた。以上の結果から、ナイーブCD8+細胞からメモリーCD8+細胞への分化およびセントラルメモリーCD8+細胞からエフェクターメモリーCD8+細胞への分化をE2が促進する可能性が示唆された。すなわち、17β-estradiolはリンパ球の一種であるメモリーリンパ球を増加させることを通じて接触アレルギーを増悪化していることが明らかになった。