hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肥満および糖尿病モデルマウスを用いた血栓傾向の病態機序の解明と治療法の基礎的検討

また、ob/obマウスの脂肪組織におけるPAI-1 mRNAの発現は、脂肪細胞だけではなく、血管平滑筋細胞や血管内皮細胞においても著明に増強しており、週齢を重ねるにしたがってより顕著となった。外因系凝固の起始因子であるTFの発現も、ob/obマウスでは亢進していた。脂肪組織におけるTF mRNA発現は、12週齢のob/obマウスで対照マウスの37倍、12ヶ月齢では20倍以上に亢進していた。このTF mRNA発現増加も脂肪細胞自体によることがわかったが、脂肪組織内の血管を構成する細胞(血管外膜細胞)においてもTF mRNA発現の増強が認められた。ob/obマウスにおけるTF mRNAの発現増加は脂肪組織以外の主要臓器でも顕著であり、臓器特異的な実質細胞において認められた。12週齢のob/obマウスでは、脳(神経細胞)、肺(気管支上皮細胞)、心臓(心筋細胞)、腎臓(尿細管上皮細胞)、肝臓(Kupffer細胞)などにおいても対照マウスの24倍のTF mRNA発現を認めている。PAI-1に加え、肥満個体におけるこのようなTFの発現増加が、全身的な凝固亢進状態を増幅しているであろうと推測された。また、脂肪組織におけるPAI-1およびTFの発現を強力に誘導すると考えられるTGF-βの発現もob/obマウスおよびdb/dbマウスの脂肪組織で週齢依存的に増加しており、それは脂肪細胞自体におけるTGF-β産生亢進によることが明らかとなった。これらの事実より、糖尿病、インスリン抵抗性、血栓傾向、動脈硬化など肥満に関連した病態の進展にとってTGF-βのメディエーターとしての役割は非常に重要であろうと考えられた。肥満・糖尿病とストレスは血栓症発症の危険因子として認識されているが、その分子生物学的メカニズムは解明されていない。本研究では肥満・糖尿病のモデルとして遺伝的肥満マウス(ob/obマウス)を用い、心因性ストレスを負荷したときの線溶阻害因子PAI-1の発現と組織内微小血栓形成について解析を行い、肥満・糖尿病におけるストレス起因性血栓症の分子メカニズムを検討した。具体的には8週齢オスの肥満マウスおよび対照マウスを50ml用チューブ内に一定時間閉じ込めて拘束ストレスを負荷した後、血漿中の総PAI-1抗原量をELISA法にて、また組織RNA中のPAI-1 mRNA発現量を定量的RT-PCR法にて測定した。またin situ hybridization法にて組織内PAI-1 mRNA発現の局在について検討した。さらに病理組織学的な検索により、ストレス負荷後の腎糸球体におけるフィブリン沈着について検討した。その結果、肥満マウスではストレス負荷2時間後に早くも著明な血中PAI-1抗原量の上昇と組織内PAI-1 mRNAの発現増加を認めた。特に、脂肪組織や心臓、腎臓におけるPAI-1 mRNA発現は、対照マウスに比べて顕著に増加していた。この傾向は20時間という長時間ストレスでも同様であった。in situ hybridization法による解析で、このPAI-1 mRNA発現は腎糸球体の内皮やメサンギウム細胞、心筋内微小血管内皮細胞、脂肪細胞等に一致して認められた。またストレス負荷後の肥満マウスでは腎糸球体微小血管内にフィブリン沈着を認めたが、対照マウスでは認めなかった。
エナメル上皮腫の骨浸潤メカニズムにおける上皮-間葉クロストーク

エナメル上皮腫細胞(AM-3)と線維芽細胞(HFF-2)の相互作用を解析することにより、AM-3が分泌するIL-αに刺激されたHFF-2のIL-6,IL-8の発現を促進すること、両者を共培養するとAM-3の遊走能を高めることが分かった.このことはエナメル上皮腫細胞はIL-1α分泌を介して間質線維芽細胞と相互的に働き、腫瘍の浸潤発育に有利な微小環境を構築することを示唆した.2層コラーゲンゲル半球培養において、AM-3単独培養に比べ線維芽細胞の存在下ではAM-3は浸潤突起を積極的に形成し集団として浸潤することが伺えた.また、その浸潤突起の先端では、線維芽細胞が浸潤を誘導する様子が認められた.本研究はエナメル上皮腫と腫瘍間質の線維芽細胞との相互作用を明らかとすることを目的としている。平成26年度は、我々が樹立したエナメル上皮腫不死化細胞株であるAM-3とヒト線維芽細胞株HFF-2、およびエナメル上皮腫病変部より採取し培養した線維芽細胞を用いて実験を行った。実験内容は、細胞の培養上清を用いた細胞刺激試験、細胞間の相互作用による遺伝子・蛋白発現の変化、破骨細胞分化や細胞遊走能・増殖能の変化について評価を行った。その結果、以下の知見が得られた。1AM-3細胞はHFF-2細胞に比べ、Interleukin(IL)-1α、IL-1β、IL-8、TNF-αといったサイトカインの遺伝子を高発現しており、中でもIL-1αの発現が著明であった。また、病変部嚢胞腔の内容液はIL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-αを高濃度に含んでいた。さらに、AM-3培養上清も同様に測定した結果、IL-1αが高濃度に含まれていた。2AM-3の培養上清で刺激した線維芽細胞では、IL-6、IL-8の遺伝子発現が著明に亢進した。さらに、AM-3細胞の培養上清刺激の際に、抗IL-1α抗体またはIL-1Ra(レセプターアンタゴニスト)を加えたところ、この反応は中和することが可能であった。さらに、タンパク分泌について評価したところ遺伝子発現の変化と同様の傾向であった。3AM-3細胞の培養上清で刺激された線維芽細胞の培養上清は、AM-3細胞の細胞遊走能を有意に亢進した。また、その反応は抗IL-6抗体、抗IL-8抗体により中和することが可能であった。また、IL-6、IL-8で刺激したAM-3細胞の細胞遊走能および細胞増殖能は有意に亢進した。以上の結果は、エナメル上皮腫細胞はIL-1α分泌を介して間質線維芽細胞と相互的に働き、腫瘍の浸潤発育に有利な微小環境を形成する可能性を示すと考えられた。本研究では、申請者等が過去に樹立した不死化エナメル上皮腫細胞株を用いて、エナメル上皮腫の腫瘍上皮細胞と間質細胞との相互作用(クロストーク)が本腫瘍細胞の骨吸収破壊メカニズムに及ぼす影響を明らかにすることを目指した。平成26年度は、エナメル上皮腫細胞がIL-1α分泌を介して間質線維芽細胞と相互的に働き、腫瘍の浸潤発育に有利な微小環境を構築する可能性を明らかとした。本年度は、腫瘍細胞と間質細胞との相互作用がエナメル上皮腫の浸潤能に及ぼす影響について解明するための研究を行った。マトリゲル上培養法やDouble-Layeredコラーゲンゲル半球培養法(DL-CGH法, Cell Commun Adhes, 2007,真庭ら)による三次元培養実験において、緑色蛍光蛋白質(GFP)を遺伝子導入したエナメル上皮腫細胞株AM-1およびAM-3と赤色蛍光蛋白質(DsRED)を遺伝子導入した線維芽細胞株HFF-2を共培養することで、腫瘍細胞と間質細胞の相互作用が腫瘍細胞の集団的な動態にどのような影響を与えるのかについて評価することを可能とした。その結果、マトリゲル上共培養法では、DsRED発現線維芽細胞が腫瘍細胞間の接触を支持するとともに、腫瘍細胞の遊走を誘導している像が得られた。また、DL-CGH法では、腫瘍細胞と線維芽細胞がお互いに集団的に引き合う特異な細胞遊走形態を示していた。これらの知見は、エナメル上皮腫の浸潤形態の変化には間質線維芽細胞が関与している可能性を示している。また、DL-CGH法においてMMP(マトリクスメタロプロテイナーゼ)-9阻害剤を添加すると、腫瘍細胞の集団的な浸潤が著明に抑制されることが分かり、MMP-9はエナメル上皮腫の浸潤に深く関わる因子であることが確認された。さらに、エナメル上皮腫細胞株に抗IL-1α抗体を加えると、腫瘍細胞のMMP-9の発現が有意に抑制されることが分かった。いままで、腫瘍上皮細胞単独では、腫瘍増殖の三次元構築を明らかにできなかったが、本年度はマトリゲル上培養法やDouble-Layeredコラーゲンゲル半球培養法(DL-CGH法, Cell Commun Adhes, 2007,真庭ら)による三次元培養実験において、緑色蛍光蛋白質(GFP)を遺伝子導入したエナメル上皮腫細胞株AM-1およびAM-3と赤色蛍光蛋白質(DsRED)を遺伝子導入した線維芽細胞株HFF-2を共培養することで、腫瘍細胞と間質細胞の相互作用が腫瘍細胞の集団的な動態に与える影響について評価することが可能であった。

この結果を、第80回日本口腔科学会総会に発表する予定であり、また、現在論文として国際誌に投稿する計画を進めている。さらに、本年度はエナメル上皮腫の悪性化に関する論文1編、学会シンポジウムで本腫瘍の治療に関する発表を行った。本研究では、研究代表者等が過去に樹立した不死化エナメル上皮腫細胞株を用いて、エナメル上皮腫の腫瘍上皮細胞と間質細胞との相互作用(クロストーク)が本腫瘍細胞の骨吸収破壊メカニズムに及ぼす影響を明らかにすることを目指す。H26年度は、エナメル上皮腫細胞がIL-1α分泌を介して間質線維芽細胞と相互的に働き、腫瘍の浸潤発育に有利な微小環境を構築する可能性を明らかとしたH27年度は、腫瘍細胞と間質細胞との相互作用がエナメル上皮腫の浸潤能に及ぼす影響について解明するための研究を行った。マトリゲル上培養法やDouble-Layeredコラーゲンゲル半球培養法による三次元培養実験において、緑色蛍光蛋白質(GFP)を遺伝子導入したエナメル上皮腫細胞株AM-1およびAM-3と赤色蛍光蛋白質(DsRED)を遺伝子導入した線維芽細胞株HFF-2を共培養して、エナメル上皮腫細胞の三次元的な挙動を観察した。その結果、マトリゲル上共培養法では、DsRED発現線維芽細胞が腫瘍細胞間の接触を支持するとともに、腫瘍細胞の遊走を誘導している像が得られた。H28年度は,エナメル上皮腫細胞集団の周囲を線維芽細胞を含んだコラーゲンゲルでコーティングしながら、腫瘍細胞の挙動を観察した.その結果,AM-3単独では細胞間接着を保ったまま平滑な浸潤辺縁を維持し浸潤したのに対し、線維芽細胞存在下では複数の腫瘍細胞が細胞間接着を維持したまま浸潤突起を形成し、積極的に周囲に浸潤する様子が伺えた。また、その浸潤突起の先端には線維芽細胞が存在し、浸潤を誘導する様子が認められた。エナメル上皮腫には複数の病理組織型が存在し、それぞれ異なる浸潤増殖様相を示している。今回の結果より、エナメル上皮腫の浸潤動態には元来の腫瘍細胞の特性のみでなく、腫瘍細胞周囲の線維芽細胞の存在も重要であることが示された。H28年度は、H27年度に構築したDL-CGH法による実験系に工夫を加えた上で実験を行った。まず、腫瘍細胞単独でのエナメル上皮腫細胞の集団的な細胞浸潤を評価した。その結果、異なる腫瘍型由来のエナメル上皮腫細胞株であるAM-1とAM-3では異なる細胞浸潤形態を示すことが分かった。さらに、エナメル上皮腫細胞集団の周囲を線維芽細胞を含んだコラーゲンゲルでコーティングすると、腫瘍細胞集団の浸潤動態は著明に変化した。特に濾胞型由来であるAM-3においてその変化は著明であり、AM-3単独では細胞間接着を保ったまま平滑な浸潤辺縁を維持し浸潤したのに対し、線維芽細胞存在下では複数の腫瘍細胞が細胞間接着を維持したまま浸潤突起を形成し、積極的に周囲に浸潤する様子が伺えた。今回の結果より、エナメル上皮腫の浸潤動態には、元来の腫瘍細胞の特性のみでなく、腫瘍細胞周囲の線維芽細胞の存在も重要であることが示された。本研究は、申請者等が過去に樹立した不死化エナメル上皮腫細胞株AM-1およびAM-3を用いて、エナメル上皮腫の腫瘍上皮細胞と間質線維芽細胞との相互作用(クロストーク)が本腫瘍細胞の細胞活性ならびに骨吸収破壊メカニズムに及ぼす影響を明らかにすることを目的とした.
中国壮族における文字文化の継承についての人類学的研究

本研究は中華人民共和国の壮族の新しい書き言葉である現代壮文の普及が全く進まない要因を、国家の言語政策のみに帰するのではなく、フィールドワークと聞き書きによって壮族の人々が文字に対してどのような観念を抱いていたかを明らかにすることを通じて、考察しようとしたものである。考察の概略は以下の通りである。壮族の農村社会では、行政文書や系譜(家譜)を記述する漢字と、壮族のうたを記述する方塊字(漢字系民族文字)を併用してきたが、その使用範囲は明確に区別されてきた。場面を問わずに使用することができ、かつその表記体系としてアルファベット表記文字を採用した現代壮文を、壮族の人々は受け入れることができなかった。中国に居住するタイ系の民族である壮族の人口は1500万人であり、壮語は危機言語ではないが、中華人民共和国成立後に制定されたアルファベット表記の民族文字である「現代壮文」の制定と普及に際して、関係機関が壮族の人々の文字に対する観念と慣習を理解しないまま事業を進めたために、「現代壮文」の普及が進まない一方で、壮族の伝統文字である漢字系文字「方塊字」を私的な文字としたために、その学習者が減少した。壮族は自らの書き言葉を失おうとしているようにみえる。本研究は、フィールドワークによって、壮族の人々の文字に関する観念と慣習を明らかにしたうえで、新旧の文字を対比させることによって、壮族に必要とされる民族文字とはどのようなものであるかを考えることを目的としている。2014年度は、中華人民共和国広西壮族自治区内の2地点(「現代壮文」の標準音に指定された武鳴県、20世紀末まで広西の経済的な中心地であった柳州市)で、「方塊字」の基本的性質(担い手と通用範囲)および「方塊字」と漢字が用途を異にしながら併用されてきた実態を、聞き書きによって明らかにすると共に、伝承されてきた「方塊字」表記の歌本、漢字表記の家譜等を収集した。また、「現代壮文」の普及の過程や、当該者の新旧の文字に対する考えを、その背景を含めて理解するために、聞き書きによって、4人のライフヒストリーを作成した。この他に、「現代壮文」や「方塊字」に関する文献資料、広西壮族自治区における漢字文化に関する文献資料を収集した。中国に居住するタイ系の民族である壮族の人口は1500万人であり、壮語は危機言語ではないが、中華人民共和国成立後に制定されたアルファベット表記の民族文字である「現代壮文」の制定と普及に際して、関係機関が壮族の人々の文字に対する観念と慣習を理解しないまま事業を進めたために、現代壮文の普及が進まない一方で、壮族の伝統文字である漢字系文字の「方塊字」の使用者が激減した。現在、壮族は自らの書き言葉を失うか否かの瀬戸際にいる。本研究はフィールドワークによって壮族の人々の文字に関する観念と慣習を明らかにした上で、新旧の文字を対比させることによって、壮族に必要な民族文字はどのようなものであるのかを考えるものである。2015年度は、中華人民共和国広西壮族自治区武鳴県、平果県において、方塊字の基本的性格(担い手と通用範囲)および方塊字と漢字が用途を異にしながら併用されてきた実態を聞き書きによって明らかにするとともに、関連文書(方塊字による恋文、漢字による家譜)を収集した。また同自治区南寧市、百色市では、大学で現代壮文を教員および大学で現代壮文を専攻した卒業生と現代壮文の使用の実態および現代壮文の抱える問題について議論を重ねた。この他に現代壮文、方塊字に関する文献資料および壮族の作家が漢語で記した文学作品を収集するとともに、方塊字のIME(インプットメソッドエディタ)に関する情報を収集した。2015年度のフィールドワークについてはほぼ計画通りに実施できたが、フィールドワークで得られた資料(方塊字を用いて記述された歌本・恋文)を電子データ化する作業がほとんど進んでいない。作業が進んでいない理由は、広西大学の開発していた方塊字のIME(インプットメソッドエディタ)の公開が遅れたためである。年度途中でβ版が公開されたため、試験的なテキスト入力を行って、使い勝手を検証している状況である。2016年度は、現代壮文の主要な高等教育機関であった広西民族大学の関係者から、広西民族大学における壮語の教育制度の変遷および民族文学(壮族文学)の教育研究の変遷について聞き書きを行った。また高校教育の現場における壮語教育の現状について、武鳴県の高校において聞き書きを行った。

さらに壮族の2名の作家(母語は壮語で創作に用いる言語は漢語である者、母語は壮語で創作に用いる言語は現代壮文である者)に、創作において漢語を用いること、現代壮文を用いることについてインタビューを行った。その上で、広西壮族自治区の文学雑誌の編集者と上海の文学雑誌の編集者に、少数民族の作家の作品において彼が用いる文字が作品世界にどのような影響を与えているかをインタビューを行った。また2014年度2015年度に収集した資料(歌本、恋文)をの電子データ化を進めた。壮族のうた文化と文字に関してアジア民族文化学会で口頭発表し、それをもとに論文を作成し、学会誌に掲載した。さらに現代壮文と方塊字の両者に通じた希有な壮族のうたい手であるジャン・ホンのライフヒストリーを作成し、出版作業の途中(印刷中)である。本研究は中華人民共和国の壮族の新しい書き言葉である現代壮文の普及が全く進まない要因を、国家の言語政策のみに帰するのではなく、フィールドワークと聞き書きによって壮族の人々が文字に対してどのような観念を抱いていたかを明らかにすることを通じて、考察しようとしたものである。考察の概略は以下の通りである。壮族の農村社会では、行政文書や系譜(家譜)を記述する漢字と、壮族のうたを記述する方塊字(漢字系民族文字)を併用してきたが、その使用範囲は明確に区別されてきた。場面を問わずに使用することができ、かつその表記体系としてアルファベット表記文字を採用した現代壮文を、壮族の人々は受け入れることができなかった。2014年度のフィールドワークについては、ほぼ計画通りに実施できたが、フィールドワークで得られた資料である「方塊字」を用いて記述された「歌本」を電子データ化する作業が、実施できなかった。実施できなかった理由は、現在中国で「方塊字」を電子データ化するためのIMEの開発が進んでいるが、その完成が2014年度末までに為されなかったために、このIMEを用いて「歌本」を電子データ化することができなかったことによる。2016年度は2015年度に調査を行った武鳴県、平果県において継続調査を実施し、前年までに収集した方塊字資料の読解に取り組む。また南寧市において、漢語で文学作品を書く壮族の作家を対象に母語と言語表現についてインタビューを行う。方塊字IMEを用いて、フィールドワークで得られた資料(方塊字を用いて記述された歌本・恋文)を電子データ化する。これまで蓄積してきた資料から、一人の歌い手のライフヒストリーを作成し、その中で、漢字、方塊字、現代壮文がどのように使われてきたか示しながら、壮族の人々の文字に関する観念と慣習を明らかにする。文化人類学2015年度は、2014年にフィールドワークを実施した地点において、より詳細な調査を行い、「方塊字」の通用範囲が次のいずれ(親族や歌の師弟関係といった特定のグループ、うたの旋律を共通する地域=婚姻圏、近代化以前の行政区画)に重なるのかを明らかにするとともに、現代壮文の制定・普及にあたった当事者(壮語研究者、学校関係者)から、その制定と普及の過程と現況について、聞き書きを行う。また「歌本」の制作過程を映像に記録することによって、「方塊字」の記述法についての映像資料を作成する。なお、研究成果のひとつとして予定している「歌本」の電子テキスト作成およびそのデータベース化には、IMEによる「方塊字」入力が好ましいが、2015年度の中盤までに「方塊字」IMEが完成頒布されない場合は、外字作成による入力法によって電子テキスト化を図る。2016年度は、2015年度の調査を踏まえて、広西壮族自治区内の複数の地点で比較調査を行い、「方塊字」の系統についての資料を作成する。
NADPH酸化酵素による脂肪分化機構と生活習慣病への応用

本研究において、間葉系幹細胞から脂肪細胞への分化過程に活性酸素が関与しているのか検討した。間葉系幹細胞の分化に伴い細胞内に活性酸素が産生され、抗酸化剤処理により分化が抑制されたことから、脂肪分化に活性酸素が関与することが示唆された。次に、阻害剤及びRNA干渉法による検討により、活性酸素の産生酵素としてNADPH酸化酵素Nox4を同定した。さらに、肥満モデル動物である高脂肪食負荷マウスに抗酸化剤を慢性投与したところ、脂肪の蓄積が抑制された。以上の結果から、活性酸素が脂肪分化と肥満に重要であることが示唆された。申請者は、生活習慣病治療薬の新規標的分子を探索する目的で、ラット大腿骨由来の間葉系幹細胞を用いて脂肪分化を抑制する化合物のスクリーニングを行った。その結果、抗酸化剤であるN-アセチル-L-システインが脂肪分化を抑制することを新たに見い出した。そこで、本年度は活性酸素と脂肪分化の関連についてin vitroの検討を行った。まず、分化誘導によって活性酸素が産生されるのかDCFを用いて検討したところ、分化誘導に伴い一過性にDCFの蛍光強度の増加が認められたことから、分化により活性酸素が産生されることが明らかになった。次に、分化に関与する活性酸素産生酵素について検討した。NADPH酸化酵素の選択的阻害剤であるアポサイニンは、分化誘導による活性酸素の産生および脂肪滴の蓄積を抑制したが、キサンチンオキシダーゼ阻害剤やNO合成酵素阻害剤は分化に髭響を与えなかった。さらに、NADPH酸化酵素の触媒サブユニットNoxファミリーのサブタイプについて検討を行った。RT-PCR法により、間葉系幹細胞にNox4が高発現していたことから、Nox4に対するshort-hairpin RNA(shRNA)を作製して間葉系幹細胞の脂肪分化に対する影響を検討した。その結果、Nox4に対するshRNAの導入により分化誘導による脂肪滴の蓄積は抑制されたが、コントロールのshRNAでは抑制されなかった。従って、分化に関与する活性酸素産生酵素としてNox4が示唆された。以上の結果から、NADPH酸化酵素の触媒サブユニットNox4によって産生される活性酸素が間葉系幹細胞の脂肪分化に関与することが示唆された。申請者は、昨年度にNADPH酸化酵素の触媒サブユニットNox4によって産生される活性酸素が間葉系幹細胞の脂肪分化に関与することを明らかにした。本年度は、Nox4の下流シグナルおよび病態モデル動物におけるNADPH酸化酵素の解析を行った。まず、下流のシグナルとしてCREBの関与を検討した。間葉系幹細胞にCREB欠失変異体を導入することにより、脂肪分化に伴う活性酸素の産生および油滴の蓄積が抑制された。また、脂肪分化誘導によるCRE転写活性化は、抗酸化剤N-アセチル-L-システインあるいはNADPH酸化酵素の選択的阻害剤であるアポサイニンによって抑制された。従って、NADPH酸化酵素を介する脂肪分化機構にCREBが関与する可能性が示唆された。次に、生活習慣病の病態モデル動物として高脂肪食負荷マウスを作成し、脂肪形成などに対する抗酸化剤NADPH酸化酵素阻害剤の影響について検討した。その結果、N-アセチル-L-システインあるいはアポサイニン慢性投与により、高脂肪食負荷による体重の増加および脂肪の蓄積が抑制された。一方、高脂肪食の摂取量には影響が認められなかった。従って、高脂肪食負荷による脂肪形成にNADPH酸化酵素が関与することが示唆された。以上の結果から、in vitroおよびin vivoにおいてNADPH酸化酵素によって産生される活性酸素によって脂肪形成が誘導されることが示唆された。以上の結果から、NADPH酸化酵素の触媒サブユニットNox4は生活習慣病治療薬の新たな標的分子と考えられる。
栄養性木本作物における産地判別のための品種内識別DNAマーカーの開発

四季成り性のカンキツであるシキキツ(Citrus mandurensis Lour.)の実生に対し,根に当たらないように炭素イオンビーム照射を実施し,品種内識別や産地判別用のDNAマーカーの開発を行った.50Gyまでの照射区では無照射区とほぼ同様の成育を示したが,50Gy照射区では,斑入りや葉形異常となるものや,成長が非常に遅く,極小化・矮小化体等を示す照射体が複数観察された.これらの実生の中から1個体DNA多型が検出された.この個体は接ぎ木繁殖後も安定的にDNA多型パターンを維持していた.本研究では,地域資源を守り、活用を支える品種内識別や産地判別用のDNAマーク開発を行うために、以下の実験を行った。材料には、多胚性を示すシキキツ(Citrus madurensis Lour.)の実生を供試し、放射線医学総合研究所・HIMACの炭素イオンビーム(LET 20keV/μm)で、発芽10日前後の実生に0-100Gy(吸収線量)の強度で照射した。その結果、30Gyまでの照射区の実生では、葉の一部に斑入りまたは葉形異常が見られたものの、無処理区と同様の生育を示した。しかし、50Gy以上の照射区では実生の生長停止が認められた。その後、75と100Gy照射区では枯死または生長が停止した状態であったのに対し、50Gy照射区では生長停止後、しばらくしてから、第1節間深部から新たに萌芽が見られた。育成を継続したところ、無処理区の実生と同様に旺盛な生長を示すものと、極小化・矮小化するものが観察された。実験1の「種子や茎頂等への粒子線(重イオンビーム)照射条件の検討を行い、DNAマーキング技術の確立」(担当:理化学研究所)では、平成27年度の目標である「カンキツの種子と頂芽に重イオンビーム照射を行い、DNAマーク最適条件(強度・線量、サンプルの状態・生育ステージ等)を検討する」に対し、シキキツ実生の茎頂への50Gy照射によりDNA多型が検出され、DNAマーク付与系統の作出に成功した。実験2の「開発されたDNAマーク付与系統の形態・形質の評価」(担当:静岡大学)では、平成27年度の目標である「照射・DNA多型検出のためのサンプル育成・調整」に対して、発芽10日前後の実生に調整することで、50Gy照射の実生でDNAマーク付与系統が作出され、生育に変化を観察することができた。本研究では、地域資源を守り、活用を支える品種内識別や産地判別用のDNAマーク開発を行うために、以下の実験を行った。まず、これまで重イオンビーム照射シキキツとユズの実生について既報の改良RAPD法(Shirao et al., Mol Breed. 31: 729-735, 2013)でDNA多型解析した結果、シキキツ1系統では、原品種にないバンドが多数検出され、ユズ1系統では原品種に対し、バンド消失ないしはシグナル強度が小さくなるタイプのパターンを示した。カンキツの中には1つの種子から2つ以上の芽を出すものがあり「多胚性」と呼ばれる。これは胚のうを取巻く珠心細胞から胚(珠心胚)を生じる無性的生殖に起因し、カンキツ特有の現象である。この珠心胚の発生により、受精があった場合、1つは受精胚となり残りは珠心胚由来の母系クローンとなる。別枝由来の葉を供試しても全て同一であり、これらは受精胚由来系統の可能性が高いと考えられた。また、多型パターンから、前者は他品種の花粉が掛かった他殖、後者は同品種の花粉が掛かった自殖と推察され、新たな育種素材系統の育成に成功した。さらに、`太田ポンカン'、ニンポウキンカン、`こん太'等のカンキツ優良品種にもHIMACの炭素イオンビームで50Gy照射処理を行った結果、これまでに獲得されたDNAマーク付与体が示した生育特性、すなわち生育の遅い実生が高頻度で確認された。実験1の「重イオンビーム照射条件の検討を行い、DNAマーキング技術の確立」(担当:理化学研究所)では、平成27年度に明らかになった照射条件(発芽10日後に50Gyで照射)で、シキキツおよびユズに加え、`太田ポンカン'、ニンポウキンカン、`こん太'等のカンキツ優良品種にも処理を行った。DNAマーク付与個体以外に、シキキツからは受精胚由来の実生が、ユズからは自殖由来の実生が確認され、新たな育種素材系統の育成に成功した。実験2の「開発されたDNAマーク付与系統の形態・形質の評価」(担当:静岡大学)では、これまで育成されたDNAマーク系統および育種素材系統について接ぎ木を行った。また、カンキツ優良品種においても本処理条件でこれまでシキキツ実生で見られた生育異常が確認された。強度・照射野・照射深度の制御可能であるイオンビームは、植物育種において変異誘発に利用され、多々の新品種が育成されている。我々は照射後に変異のなかった植物体からDNA多型を検出し、花卉を中心とした品種内レベルの識別マーカー開発(DNAマーキング)も進めてきた。この技術を用いて人為的な突然変異育種が進んでいない栄養繁殖性木本植物において粒子線の特徴を生かした変異誘発の確立を目指している。今年度は、カンキツ

実生へのイオンビーム照射の反応や接ぎ木繁殖後の形態的特徴やDNAマークの安定性について報告する。遺伝的均一性をもたらす珠心胚形成能を有する四季成りのシキキツの実生を供試した。放射線医学総合研究所のHIMACで炭素イオンビーム(0100Gy)を照射した。その結果、50Gyまでの照射区では無照射とほぼ同様の成育を示し(A群)、50Gy照射区では照射後成長を一旦停止し、第1節間深部から新たに萌芽を開始したものが観察された(B群)。初期生育の形態的特徴として、A群では斑入り・葉形異常となる実生がいくつか見られた。それに対し、B群ではこれらに加え極小化・矮小化体等を示す照射体が複数観察された。これらの実生についてDNA変異解析を改良RAPD法で行った結果、3系統でDNA多型が検出された。うち2系統は有性胚由来であったが、残り1系統は、幼植物体の段階で照射を受けた地上部と受けなかった根の間で多型が得られていた。さらに、新たに生じた枝からも同じDNA多型パターンが検出され、接ぎ木繁殖後もDNA多型パターンを維持していた。なお、この系統は接ぎ木後も対照区と比べ生育がやや劣り、葉が小さくなる特徴を有している。以上より、これらの成果は品種・系統識別のためのDNAマーク作出のみならず、カンキツあるいは木本の植物育種において枝変わりの効率的な変異誘発法として新たな展開に繋がる知見と考える。四季成り性のカンキツであるシキキツ(Citrus mandurensis Lour.)の実生に対し,根に当たらないように炭素イオンビーム照射を実施し,品種内識別や産地判別用のDNAマーカーの開発を行った.50Gyまでの照射区では無照射区とほぼ同様の成育を示したが,50Gy照射区では,斑入りや葉形異常となるものや,成長が非常に遅く,極小化・矮小化体等を示す照射体が複数観察された.これらの実生の中から1個体DNA多型が検出された.この個体は接ぎ木繁殖後も安定的にDNA多型パターンを維持していた.実験1の「種子や茎頂等への粒子線照射条件の検討を行い、DNAマーキング技術の確立」(担当:理化学研究所)では、平成28年度も引き続き、照射条件の設定(高精度化した照射実験系の確立と再現性の確認)と照射個体の多型検出を進める。特に、50Gy付近の照射強度で、照射部位や実生の生育ステージについて検討する。多型が検出された場合は、随時、静大農場にDNAマーク付与体を送る。実験2の「開発されたDNAマーク付与系統の形態・形質の評価」(担当:静岡大学)では、平成28年度も引き続き、実験材料の調整・提供を行う。また、平成27年度の成果で得られたDNAマーク付与体の育成を行い、それらの形態・形質を調査するとともに、「DNAマーク」が維持されるかどうかを確認していく。実験1の「重イオンビーム照射条件の検討を行い、DNAマーキング技術の確立」では、平成29年度も引き続き、これまでの実験で明らかとなった効率的な粒子線照射条件(50Gy)で、カンキツ優良品種の実生に処理を行い、DNAマーク付与体を育成していく。また、接ぎ木したDNAマーク付与体のDNAマークが維持しているかどうかを確認する。実験2の「開発されたDNAマーク付与系統の形態・形質の評価」では、これまで理化学研究所で育成されたDNAマーク付与体の形態・形質調査を行い、非照射体と比較を行う。また、平成28年度で育成された新育種素材系統についても同様の調査を行う。そして、変異がない場合はDNAマーク付与体として、変異が認められた場合は育種素材としての利用を図る。最後に、3年間で得られたデータの取りまとめを行う。果樹園芸学
炭素-炭素結合生成のための分子の柔軟性を利用したゼオライト固定化錯体触媒の創生

容易に調製できる再利用可能な固体触媒を用いた高難度な炭素-炭素結合生成反応を実現するために,ゼオライトを担体とする新たな金属錯体固定化触媒を開発する.すなわち,ゼオライトの細孔内部で形成した金属錯体を活性点とし,物質濃縮を生かした触媒反応をおこなう.さらにクロロベンゼン誘導体を基質とした鈴木-宮浦カップリング反応,およびアリルアルコールを基質とした辻・トロスト反応に高い活性・再利用性を示す,ゼオライトの外表面に固定化した金属錯体触媒を創生する.容易に調製できる再利用可能な固体触媒を用いた高難度な炭素-炭素結合生成反応を実現するために,ゼオライトを担体とする新たな金属錯体固定化触媒を開発する.すなわち,ゼオライトの細孔内部で形成した金属錯体を活性点とし,物質濃縮を生かした触媒反応をおこなう.さらにクロロベンゼン誘導体を基質とした鈴木-宮浦カップリング反応,およびアリルアルコールを基質とした辻・トロスト反応に高い活性・再利用性を示す,ゼオライトの外表面に固定化した金属錯体触媒を創生する.
生活科学分野における安全・安心に関する総合的研究

本研究では、生活科学的視点に立った総合的な「防災・安全・安心」の確立に向けた新しい提案を行うことを目的とした。具体的には、研究組織の基盤である大阪市立大学大学院生活科学研究科の食品栄養科学・居住環境学・人間福祉学の3分野が共同して、「健康・環境・福祉」の立場からそれぞれの研究成果をつなぎ・発展させる形で日常生活における安心感測定尺度の作成を行った。本研究では、これまでの各種自然災害や事故への対策の枠組みの不備を補う、生活科学的視点に立った総合的な「防災・安全・安心」の確立に向けた新しい提案を行うことを目的とした。すなわち、いわゆるハードか工学的手法に某つく防災対策ではなく、ソフトな対策による災害時の減災対策および日常の安全・安心め確立を目指すこととした。ここにおける特徴は、研究組織の基盤である大阪市立大学大学院生活科学研究科の食品栄養科学・居住環境学・人間福祉学の3分野が共同して、「健康・環境・福祉」の立場からそれぞれの研究成果をつなぎ・発展させる形で「生活安全科学」の創出を図り、日常がら非日常へとつながる安全性評価手法の提案を行うところにある。本年度は初年度にあたることから、本研究組織の基盤となる、健康・環境・福祉の各分野における個別研究を開始ずると同時に、2回の全体会議および6回の合同研究会を連続して行い各研究の相互理解を図った。個別研究では、健康分野として「QOLプロモーター育成事業を介した食の安全住民ネットワーク構築」、「高齢者にとって安心な食事サービスシステムの構築」を、環境分野では、「屋外空間における認知症高齢者の事故実態把握とその予防」、「情報通信技術(ITC)の有効利用による防災と安全・安心な住まいの構築」、「大阪市を対象とした地域防災システムの構築」を行った。福祉分野では、「幼老統合ケアの観点を活かした、地域における新しい「子どもの防犯モデル」の構築」、「地域福祉における住民の主体的参加とネットワーク形成」、「「日常生活安心感」尺度の開発及びその規定要因に関する検討」を行った。すなわち、いわゆるハードな工学的手法に基づく防災対策ではなく、ソフトな対策による災害時の減災対策および日常の安全・安心の確立を目指すこととした。ここにおける特徴は、研究組織の基盤である大阪市立大学大学院生活科学研究科の食品栄養科学・居住環境学・人間福祉学の3分野が共同して、「健康・環境・福祉」の立場からそれぞれの研究成果をつなぎ・発展させる形で「生活安全科学」の創出を図り、日常から非日常へとつながる安全性評価手法の提案を行うところにある。開始から2年目に当たる本年度も継続して健康、環境、福祉の各分野における個別研究を進めると同時に、合同研究会を6回にわたって行い、進捗状況の確認と相互理解を図った。個別研究では、健康分野として「食の安全ネットワーク構築」において健康被害状況を携帯電話で確認できるサイトを立ち上げた。また、「食事サービスシステムの構築」では、会食場におけるニーズ調査により高齢者の食嗜好を明らかにした。環境分野では、「認知症高齢者に安全なまちづくり」において、高齢者施設の床の衝撃力吸収性についてJIS測定基準に基づく測定を実施し、構造別の衝撃吸収性の差異を明らかにすると同時に、二重床工法の骨折危険度緩和への効果を確認した。また「大阪市の地域特性に応じた自主防災活動プランづくり」では、昨年度開発したマニュアルの改善を行った。さらに福祉分野では、「地域における子どもの防犯モデルの構築」において、健康遊具の多い公園のデータと、利用状況や利用者の意識の相違等について比較検討を行った。また、「安心・安全マップの作成」では地域福祉論が内包してきた問題を考察し、地域の安全・安心に関する役割分担を明らかにした。本年度は引き続き健康、環境、福祉の各分野における個別研究を進めた。個別研究では、健康分野として「食の安全」に関して従来から実施している食中毒細菌に関する食品衛生学的研究を継続し、ヒトや家畜および食品における下痢原性大腸菌の分布を明らかにすることでリスクコントロールに必要な情報を得ることができた。また、「食事サービス」では高齢者の適正な栄養管理と会食、運動とレクレーションによる食と運動講座の実施を通じてADL(日常生活動作)についての検討を進めることができた。

環境分野では、「認知症高齢者」では竣工後3年以上経過した全国の特別養護老人ホーム2,000施設を無作為抽出し、アンケート調査を実施し、359施設から有効回答を得た。その結果、ショートステイは特養より1.5倍、転倒転落による骨折のリスクの高い実態が把握された。また、「情報通信技術」ではタブレット型端末を用いて、見守りシステムを構築し、高齢者および若年者に対して実証実験を行った。さらに福祉分野では、「安全マップ」については、対照的な2種の公園の調査を行った。また、「日常生活安心尺度」については、日常生活における安心感を測定する指標の作成を試みた。本研究では、これまでの各種自然災害や事故への対策の枠組みの不備を補う、生活科学的視点に立った総合的な「防災・安全・安心」の確立に向けた新しい提案を行うことを目的とした。最終年度の本年度は、健康・環境・福祉の各分野における個別研究の継続と成果の統合を行った。健康分野では、「食の安全」について下痢原性大腸菌の生態調査を行い、現在報告されている6サブタイプのうち3サブタイプ(腸管出血性大腸菌、腸管毒素原性大腸菌、腸管凝集接着性大腸菌)に下痢原性があること、腸管侵入性大腸菌は現在の大阪からはほとんど消滅していることを明らかにした。また、「食事サービス」に関しては介護予防における地域の人材養成を目指し、食生活・運動の改善、学習内容の他者への伝達を目標としたリーダー養成講座(講話、会食など)により、受講者は日常生活動作能力・社会的役割の向上、献立改善の確認を行うことができた。環境分野では、「認知症高齢者」に関して無作為抽出した全国のグループホーム4000件に過去3年間の骨折についてのアンケートを実施し、950施設から有効回答(利用者のべ約35000人)を得た。その結果、利用者100人あたり年間、転倒59.2件、転落10.2件、転倒骨折4.5件、転落骨折0.6件、合計骨折4.9件という発生実態が把握された。「情報通信技術」では、大阪府泉北ニュータウンで高齢者への見守り活動に関する調査を行い、見守り(声かけ)は在住高齢者の数%が対象となることなどが明らかになった。本研究において、日常生活における安心感を測定する指標の作成を試み、4因子構造の内在的安心要素指標および3因子構造の外在的安心要素指標を見出した。個別研究を健康・環境・福祉の3分野で行うため、2年目までは合同研究会を実施して相互理解を図り、3年目の平成23年度は個別研究をさらに発展させた。その結果、個別の研究において当初計画した研究内容の多くを達成している。24年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は最終年度にあたることと、本研究を進めるに当たり「健康・環境・福祉」の3分野で4年計画の3年目(昨年度)までの期間に、相互の理解を図りながら個別に進めてきた研究が一定の成果を上げていることから、今年度は各研究の学会発表や成果の全体取りまとめを中心に行う。なお、全体の取りまとめを具体的に進めるために、今年度は研究担当者による合同研究会を行う。さらに、今年度の最後には、4年間の研究成果をまとめた報告書の作成を行う。
DNAメチル化異常の網羅的解析による癌易罹患性の評価

DNAメチル化異常は癌のみならず、癌発症の背景となる慢性胃炎や潰瘍性大腸炎等の非癌部組織にも認められる。本研究では我々が独自に開発したDNAメチル化マイクロアレイを用いて、DNAメチル化異常をゲノム全域に渡り網羅的に捕捉し、担癌、非担癌潰瘍性大腸炎の非癌部組織にみられる変化を癌部組織と比較検討することにより、潰瘍性大腸炎の発癌に関わる遺伝子群(メチル化異常138カ所、脱メチル化異常221カ所)を同定した。<研究の目的>癌の発生、進展には遺伝子配列の変化を伴う遺伝子異常とともにDNAメチル化のような遺伝子配列の変化を伴わない遺伝子修飾の異常が重要な役割を演じている。特に遺伝子修飾の異常は癌のみならず、癌発症の背景となる慢性胃炎や潰瘍性大腸炎等の非癌組織にも認められる。そこで癌化に先行して引き起こされている遺伝子修飾の変化を正常組織において捉える事ができれば、癌の易罹患性を予見する有用な手段になりうると考えられる。本研究では我々が独自に開発したDNAメチル化マイクロアレイを用いてDNAメチル化異常をゲノム全域に渡り網羅的に捕捉、評価し、癌の易罹患性因子を同定する事を目的とした。<対象>胃癌、慢性胃炎、正常胃粘膜、大腸癌、潰瘍性大腸炎、正常大腸粘膜、血液。<方法>DNAメチル化マイクロアレイを用いて癌部、非癌部、慢性炎症組織のメチル化異常を網羅的に検出し、正常組織と比較する事により癌化の背景に関わるメチル化異常を同定する。<結果>平成19年度は潰瘍性大腸炎関連疾患を対象に比較検討を行った。担癌潰瘍性大腸炎では非担癌潰瘍性大腸炎に比べ癌部組織のみならず非癌部組織にもメチル化、脱メチル化異常が高い頻度で認められた。現在症例数を増やし解析を進めている【目的】DNAメチル化異常は癌のみならず、癌発症の背景となる非癌部炎症組織等にも認められる。我々は、潰瘍性大腸炎で長年炎症に暴露された組織のメチル化異常に着目し、そこに蓄積された癌化に関わる異常を網羅的に捉えることにより、潰瘍性大腸炎の癌易罹患性を評価した。【方法】担癌潰瘍性大腸炎;背景粘膜組織(CN群)6例、癌組織(CT群)6例と非担癌潰瘍性大腸炎粘膜組織(1群)16例を対象とした。9,654箇所のNotI領域の異常メチル化を検出できる「DNA array MS-AFLP」を用い、正常大腸粘膜を比較対照(cut-off値2倍)としてメチル化、脱メチル化異常を評価した。またMulti Experimental Viewer (MeV)を用いメチル化プロファイルの比較、クラスタリング解析を行った。【成績】メチル化異常/脱メチル化異常(平均±SD)は1群2.0%±1.0/1.3%±0.50, CN群2.4%±0.76/2.4%±1.1, CT群4.1%±1.7/3.5%±2.0であり、I群、CN群、CT群と段階的な変化を認めた。MeVを用い染色体ごとのメチル化プロファイルを比較すると、CN群ではCT群と高度に類似し、I群は炎症の程度や原疾患の罹患年数に応じてCT群に類似する傾向が認められた。すなわちCN群、CT群に共通する癌化に関連する異常メチル化・脱メチル化異常がI群で徐々に蓄積され、I群での高頻度な異常メチル化は発癌の高い危険性になると考えられた。クラスタリング解析では、CN群、CT群に共通するメチル化異常は66カ所、脱メチル化異常は273カ所に認められ、これらの遺伝子または領域が潰瘍性大腸炎の癌化に関わっている可能性が示唆された。【結論】潰瘍性大腸炎における炎症粘膜のメチル化異常を網羅的に検索することで、発癌の危険性を予測し得ると考えられた。
シア・ストレス応答性cDNAの包括的単離と動脈硬化における役割の解明

マイクロビーズ上に培養したヒト臍帯静脈血管内皮細胞(HUVEC)にshear stressを負荷して作製した差分化cDNAライブラリーより、低分子量G蛋白質のコンセンサス配列を持ち、Rho familyと非常に高いホモロジーを有するクローン、Recs28を単離した。精製したRecs28の蛋白質にGTPγSは結合するがATPは結合しなかった。また、GTPγSの結合は共存する過剰のGTP、GDPで抑制されるが、ATPでは抑制されず、Recs28はGTP、GDPと特異的に結合することが示された。Rho familyは種々の細胞で細胞骨格系並びに細胞間接着を制御していることが知られているので、Recs28をHUVEC内に過剰発現させて、この2点について検討した。Recs28またはRecs28の活性型変異体を発現させたHUVECでは、phorbolesterによるstress fiber形成刺激下においても、著しいstress fiberの形成抑制が認められた。一方、Recs28の不活性型変異体にはこの抑制作用は無かった。monolayerに培養したHUVECにphorbol esterの刺激を加えると、大きな細胞間隙を形成し、形質膜上の同部位でVE-cadherinの消失が見られるが、Recs28を発現させたHUVECのmonolayerでは、光学顕微鏡レベルで見られる細胞間隙は認められず、VE-cadherinも細胞接着面に途切れること無く線状に染色された。また、HUVECを二重ウェルの膜上に培養し、細胞間隙の指標であるデキストランの透過量を測定したところ、controlのHUVECではphorbol ester刺激により著しく透過性が上昇するのに対し、Recs28を発現させたHUVECでは透過性の上昇は全く見られず、バリア機能は維持されたままであった。
小胞体膜の秩序化と出芽(カルシウムシグナリングによる膜小胞形成の制御)

本研究成果は以下の6項目にまとめられる。カルシウム信号系について、受容体刺激から放出に至る過程を様々なレベルで解析した。1)ほ乳類小胞体(ER)管腔内カルシウムによる小胞形成の制御:ER標本に膜容量測定法を適用し、カルシウム濃度依存性に小胞体膜容量が増減することを見い出した。小胞体カルシウム濃度減少により、小胞形成は促されると考えられる。2)膵腺腺房細胞カルシウム放出機構における小胞体イオンチャネルの役割:小胞体イオンチャネルのリストを作成し、とりわけ、maxiカリウムチャネルとClチャネルのカルシウム放出機構への影響を調べた。両者が存在しないと、カルシウムを小胞体内に維持することができない。3)小胞体maxi-Kチャネルの小胞体間カルシウム分配:Maxi-Kチャネルの特異的ブロッカーであるイベリオトキシンを細胞内に負荷し、かつカルシウム情報系を活性化することで、小胞体間カルシウム輸送にmaxi-Kチャネルが関与することの示唆を得た。4)肝細胞小胞体に存在する大きな陰イオン性チャネル:肝細胞小胞体に250-300pSほどの陰イオン性チャネルを同定し、その膜電位依存性活性化・不活性化機序を調べた。脱および過分極両方向性に、60mV程度以上の電位にて顕著な不活性化が観察された。5)膵腺腺房細胞ACh受容体での膜電位依存性過程:ムスカリン性カルシウム信号において、受容体レベルでの膜電位依存性をGタンパクとの関連において調べた。低親和性受容体のとき、すなわち、Gタンパクとの連関低下にともない、受容体とAChの結合は電位依存性を強めることが解った。6)CD38ノックアウトマウス膵腺腺房細胞でのカルシウム信号:CD38はサイクリックADPリボースの生成酵素である。無サイクリックADPの状態でACh受容体刺激を行った。サイクリックADPはカルシウム振動応答の一部を担うことが示唆された。標準的パッチクランプ法のオルガネラ膜(小胞体膜)への適用に当たり、細胞核包を調整取得する操作からはじめた。単一膵腺腺房細胞は消化酵素(コラゲナーゼとトリプシン)を段階的に用いることで得られた。単一膵腺腺房細胞からNuclear envelope(NE)を得て、Endoplasmic Reticulum(ER)指向性蛍光色素(DiOC6(3))、および核酸指向性蛍光色素(Ethidium bromide)により染色し、共焦点レーザー顕微像を得た。また、パッチクランプ法Whole-ER recording(通常のWhole-cell recordingと同様の操作)を用いて親水性蛍光色素、ルシファーイエロ-、をERに注入すると、バルーン状に膨れ上がったER管腔が確認できた。このように形態的にもまたパッチクランプ法手技のうえからも、NEはER膜による閉鎖管腔を構成していることをみた。以上をふまえ、200pS・Maxi-Kチャネル、Cl-チャネル等、数種のイオンチャネルがER膜上に存在することを確認した。NE標本に膜容量測定法を適用し、ER管腔内Ca濃度により膜容量が変化することを見いだした。ER膜の出芽およびその崩壊と解釈される。このことは、出芽が細胞内カルシウム信号系と密接に連動していることを示唆した。いっぽう、200pS・Maxi-Kチャネルの阻害剤であるイベリオトキシンおよびパキシリンを細胞内に注入し、そのときの細胞応答を電気的にモニターした。Maxi-Kチャネルの抑制は特異なカルシウム応答を示した。

つまり、G-蛋白活性化による細胞刺激に伴い、こうした阻害剤はカルシウム反応の膜電位依存性を促進させた。Maxi-Kチャネルは細胞内カルシウム貯蔵部位でのカルシウム分布制御に与ると考えられた。粗面小胞体が大部をしめる膵腺腺房細胞において、小胞体膜(核包膜)に存在するイオンチャンネルのリストがおおむね完成した。1)チャネルコンダクタンス200pSのいわゆるmaxi-Kチャネル、2)10pS以下のCFTRと思われるClチャネル、3)500pSのbingClチャネル、4)60pSのKチャネル等が存在する。いっぽう、滑面小胞体が大部をしめる肝細胞小胞体膜では、上記リスト中、3)および希ではあるが1)の存在が認められる。涙腺腺房細胞および唾液腺腺房細胞の小胞体膜では、上記1)の存在が顕著である。こうした多くの分泌上皮細胞小胞体膜に共通して存在するmaxi-Kチャンネルの役割を推定するため、このチャネルの特異的阻害剤であるイベリオトキシンあるいはパキシリンを膵腺腺房細胞自体に注入し、ついで細胞内からのカルシウム遊離反応を誘発させたところ、反応は高位の膜電位で有意に増大した。細胞内での事象が細胞膜電位に依存することは新知見であり、従来想像さえされていなかった。maxi-Kチャネルによる細胞内カルシウム分布制御機構を推定し、カルシウムの再分布に必要な駆動力のシミュレーションを行った。上の実験途上、細胞内カルシウム遊離反応経路での膜電位依存性ステップの詳細を知る必要が生じ、ムスカリン性アセチルコリン受容体の膜電位依存性を調べた。その結果、GDP結合G蛋白と受容体が共約している時(高親和性受容体)にのみ、受容体とリガンド結合の電位依存性が明瞭となることが分かった。カルシウム伝達機構途上、こうして二つの電位依存悴ステップが推定できた。maxi-Kチャネルの関与する小胞体レベルとG-蛋白の関与する受容体レベルであった。小胞体からの小胞出芽仮説については、形態からのアプローチを考慮して顕微鏡システムを整備した。膵腺腺房細胞核小胞体膜の膜容量は、小胞体膜管腔Ca2_+濃度が上昇すると増大する。出芽はつまり、Ca2_+シグナルと関連があるとの結論に達した。いっぽう、小胞体膜(核包膜)には次のイオンチャンネルが存在する:1)チャネルコンダクタンス200-250pSのいわゆるmaxi-Kチャネル、2)10pS以下のClチャネル、3)500pSのbigClチャネル、4)60pSのKチャネル等が存在する。1)、2)は常に存在し、いっぽう、3)、4)は希である。膵腺腺房細胞におけるチャンネル1)、2)のCa2_+シグナルヘの関与をみるため、細胞からのK+およびClイオンの除去をパッチクランプ法を用いて行った。Na-glutamate溶液にて細胞内を潅流すると自発的なCa2_+反応が現れた。つまり、1)、2)のチャネルは小胞体へのCa2_+取り込みに関与していることが示唆された。現在、fura-2顕微測光法により、より直接的な知見を集めている。また、maxi-Kチャンネルを単独に阻害した場合(特異的阻害剤であるイベリオトキシンあるいはパキシリンを膵腺腺房細胞自体に注入)、正の膜電位と負の膜電位におけるCa2_+
呼吸器外科における胸腔鏡下機械的気管、気管支吻合・肺凍結術式の開発

1.気管吻合が自動吻合で可能であるかその条件を検討するため、まずstaplerで気管吻合が可能で有るか検討した。雑種成犬20頭を用い、5気管軟骨輪切除の後、手縫い吻合群4-Opolyglactin(10頭)とstapler群(10頭)に分けて検討した。6ヶ月後、吻合部の状態について検討した結果、手縫い吻合群も、stapler吻合群も吻合部には不良肉芽等の形成はなく、staplerで吻合可能であることが証明された。2.転移性肺癌に対する手術適応として、1)原発巣が充分抑制されている。2)肺以外に転移巣を有さない、等が条件で、この場合、胸腔鏡は低侵襲であり、再切除も比較的容易に可能である。このような条件の基に胸腔鏡下部分切除法と通常開胸法の予後を検討した結果、胸腔鏡下部分切除と通常開胸による部分切除で予後に有意差がないことが判明した。3.転移性肺癌の治療を目的として、肺用マイクロウェーブプローベを作成し、その作用について検討した。1800Jで焼却径1.16±0.19cm、3600Jで焼却径1.57cmが得られ、Azan染色でも焼却範囲が確認され、有用であった。また、家兎移植可能VX2細胞を家兎の片肺に移植針で肺内に移植したところ、20例中5例に肺転移モデルが作成された。肺移植モデルによる各種実験が可能となった。4.末梢の診断未確定病変に対して従来行われていた葉切除前の楔状切除に変わり、胸腔鏡下に針生検し、術中迅速にて確診する方法を開発した。悪性腫瘍18例、良性腫瘍15例に適応した。通常使用する生検針は16Gx115mm(エースカット針)であり、腫瘤性病変より肉眼的にも良悪が診断できる生検材料を得ることが出来た。悪性腫瘍18例中15例(83.3%)が葉切除、楔状切除前に組織診断がなされた。良性腫瘍については5例中5例(100%)の正診率であった。本診断法の特異性は100%であり、感度は83.3%であり、楔状切除に必要な自動吻合器が不要になり有用と思われた。1.気管吻合が手縫いではなく、自動吻合が可能であるかその条件を検討するため、まずstaplerで気管吻合が可能で有るか、実験した。雑種成犬20頭を用い、頸部に襟状切開をくわえ、5軟骨輪切除の後、手縫い吻合群4-0polyglactin(10頭)とstapler群(10頭)に分けて検討した。また、その吻合状態を確認するため、気管支鏡にて毎週観察した。その結果、手縫い吻合群も、stapler吻合群も吻合部に狭窄はみられなかった。