hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エフェクターとの結合の選択的阻害によるras癌遺伝子産物機能の抑制手段の開発

1.約50種類の1アミノ酸置換変異体H-Ras蛋白質についてRaf-1,B-Raf,Ral-GDS,Byr2,酵母アデニル酸シクラーゼとの結合と活性化を測定し、各エフェクターを識別する変異体Rasを得た。しかし、この変異体を用いて各エフェクターの細胞内での役割を識別解析する方法には限界を見い出した。蛍光偏光度測定法により、種々の1アミノ酸置換変異を持つRasエフェクター領域ペプチド(アミノ番号17-44)が各種エフェクターを識別して結合し、そのRasとの結合を競合阻害することを示した。その特異性はRas蛋白質そのものを用いた場合と同じであった。各種エフェクターの選択的抑制の可能性が示された。Ras蛋白質とRaf-1蛋白質Cysteine-rich領域(CRR)との間の新しい相互作用機構を発見した。この結合はRasのアクチベータ領域の変異で失われ、Rasの翻訳後修飾依存性である事がわかった。また、この結合がRasによるRaf-1活性化に必須であることも証明した。これに基づき、がん抑制遺伝子産物Rap1Aの作用機構を解明した。Rap1AはCRRに対して非常に強い親和力を持ち、Ras存在下で三者複合体を形成してRasのCCRへの結合を阻害する事により、RasによるRaf活性化を抑制する。出芽酵母アデニル酸シクラーゼのRas蛋白質による活性化においてRasの翻訳後脂質修飾(特にファルネシル化)が必須である分子機構を明らかにした。Rasのファルネシル化は、アデニル酸シクラーゼとの結合親和力には影響が無いが、Rasによるシクラーゼ活性化に必要である。この翻訳後修飾の活性化促進効果には、アデニル酸シクラーゼがシクラーゼ結合蛋白質CAPと結合していることが必要であった。この結果は、CAPがRasに付加されたファルネシル基の受容体であり、翻訳後修飾の影響を仲介している可能性を示した。1.ヒトRaf-1蛋白質上に従来知られていたRas結合領域とは別に、もう一つの結合領域CRR(Cys-rich region)を発見した。種々のRas変異体を用いて検討した所、CCRとの結合はRasのいわゆるエフェクター結合領域の近傍のアクチベータ領域の変異で失われ、Rasの翻訳後修飾が必須である事がわかった。また、この結合はRasによるRaf-1の活性化に必須であることも証明した。この結果により、Rasのアクチベータ領域の変異体、および翻訳後修飾を受けていないRas蛋白質がRaf-1と結合はするが活性化できない理由がほぼ解決された。現在、大部分の研究者は、翻訳後修飾を受けたRasの役割はそれと結合したエファクターを細胞膜へ連れていく事であり、エファクターの活性化に直接的には関与しないと考えているが、我々が新しく発見したRasアクチベータ領域とRaf-1CRRの翻訳後修飾依存性の結合は、この既製概念を修正するばかりでなく、新しいタイプの抗癌剤の標的となる可能性が示唆された。更に、RasのエファクターであるヒトB-Rafおよび出芽酵母アデニル酸ツクラーゼについて膜成分非存在の試験管内系を用いての活性化能力の測定を行った結果、Rasの翻訳後修飾は両エファクターとの結合親和性に影響は無いが、エフェクターの活性化には翻訳後修飾(特にファルネシル化)が必須であることを証明した。この結果は、Raf-1だけでなく他のエフェクターにもCCRのような第二のRas結合領域が存在する事を示唆した。2.約50種類の1アミノ酸置換変異体H-Ras蛋白質についてエフェクターRef-1,Ral-GDS,Byr2,酵母アデニル酸シクラーゼとの結合と活性化を測定し、Byr2のみに結合して活性化するD38N、シクラーゼのみを活性化するY32Fなどの各種エフェクターを識別する変異体Rasを得た。

Rasのファルネシル化は、アデニル酸シクラーゼとの結合親和力には影響が無いが、Rasによるシクラーゼ活性化に必要である。この翻訳後修飾の活性化促進効果には、アデニル酸シクラーゼがシクラーゼ結合蛋白質CAPと結合していることが必要であった。この結果は、CAPがRasに付加されたファルネシル基の受容体であり、翻訳後修飾の影響を仲介している可能性を示した。1,各種エフェクターを識別して確認するRas変異体の検索を続行し、Raf-1とB-Rafを識別するものを得た。しかし、これらの変異体を用いて各種エフェクターの役割を識別解析する方法には限界を見い出した。2,蛍光偏光速度法により、種々の1アミノ酸置換変異を持つRasエフェクター領域ペプチド(アミノ番号17-44)が各種エフェクターを識別して結合し、そのRasとの結合を競合阻害することを示した。その特異性はRas蛋白質そのものを用いた場合と同じであった。各種エフェクターの選択的抑制の可能性が示された。3,昨年度の本研究で発見したRas蛋白質とRaf-1蛋白質Cysteine-rich領域(CRR)との間の新しい相互作用機構に基づき、がん抑制遺伝子物産RaplA(Krev-1)の作用機構を解明した。RaplAはRaf-1CRRに対して翻訳後脂質修飾依存性に非常に強い親和性を持ち、Ras存在下でRas-RaplA-Raf-1の三者複合体を形成することにより、RasのRaf-1CRRへの結合を阻害し、RasによるRaf活性化を抑制する。RasとRaplAの相拮抗する活性が、両者のアミノ酸番号31番の1残基の相互置換(グルタミン酸とリジンの置換)によって決定されることを示した。4,出芽酵母アデニル酸シクラーゼのRas蛋白質による活性化においてRasの翻訳後脂質修飾(特にファイルネシル化)が必須である分子機構を明らかにした。この翻訳後修飾の活性化促進効果には、アデニル酸シクラーゼはシクラーゼ総合蛋白質CAPと結合していることが必要であった。
戦後西ドイツにおける労使共同決定システム形成の研究

本研究の課題は、占領下西ドイツにおける労使共同決定システムの形成過程を明らかにし、ドイツ企業の労務管理のあり方を規定する労使関係の特質を解明することにあった。一般にドイツにおける労使関係の大きな特徴の一つに、産業別に組織された労働組合と、事業所、経営内の経営評議会との並存を指摘することができる。現在では、二つの組織は役割を分担しているものの、敗戦直後に結成された経営評議会が労働組合の再建を支援するとともに、古参の組合員たちによる両組織の再建も進められていた。敗戦直後、労働組合では経営評議会を基盤とする統一組合の結成が意図されていたが、経営評議会に対する不信と政治的対立、さらに占領政策から、経営評議会の経営評議会組織からの組織的な分離とともに、自由労組とキリスト教労組を基盤とする統一組合の結成が進められた。このような経営評議会は、ナチス支配に対する反省から、職場の非ナチ化、さらに最高意思決定機関への参加を求めていた。イギリス連合軍と企業側は、経営者支配の正当性の維持や労使関係の「安定」を課題に、比較的穏健な労働組合の意向を受け入れ、労働組合を企業の意思決定に参加させることで、労使関係の「安定化」を図ろうとしたものと考えることができる。そうだとすれば労使共同決定システムの課題は、労働組合運動の転換を背景に、経営者支配の正当性を維持しながら、職場労使関係の「安定化」をはかることにあったとみることができるであろう。本研究の課題は、ドイツ企業の労使共同決定体制の形成を考察することで、共同決定制形成の労使関係における意義を明らかにすることにあった。ドイツにおける労使関係の特徴は、企業、ないし経営での経営評議会の設置と、企業の最高意志決定機関への労働者代表の派遣が法律によって規定されていることにある。けれども、このような労働者の参加制度は、すでにワイマール時代に法制化されていたのである。したがって第二次大戦後の労使共同決定体制は、ワイマール時代に生まれた経営参加制度の復活、ないし展開と理解されてきた。だが、そのさい、戦後、ドイツ経済の新たな構築の過程で共同決定制が導入され、そのさい労使ともに労使関係の新たなあり方を模索していたことを看過できない。この研究では、共同決定制の形成を戦後直後の労働運動との関連から考察することを分析の視角としているが、そのさいとくに重要になるのが、経営評議会である。従来、戦後直後に結成された経営評議会が、労働組合再建の基盤となるとともに、共同決定要求を行うなど広範な活動を展開していたと理解されてきた。だが近年、ドイツでもこのような理解が十分に実証されていないと指摘されてきた。とはいえ、経営評議会の活動については十分な資料が残されていないため、この研究では占領地域の研究の検討と、文書館の資料による考察を行った。一般に労働組合は経営評議会を基盤に下から形成されたとされるが、古参の労働組合メンバーが中心になり労働組合がいわば上から形成されることもあったが、敗戦直後には経営評議会と労働組合は密接な関係にあった。また、敗戦直後、経営評議会はきわめてラディカルな活動を行っていたとされるが、文書館の資料をみるかぎり、協議機関として一般的な活動をしていたことが明らかになった。今後、こうした成果を基盤に、共同決定制の生成の意義を考察することにしたい。本研究の課題は、1947年のルール鉄鋼業への企業共同決定制の導入を、第二次大戦直後に展開した労働運動、政党の再建活動、さらに占領軍の労働政策にまでたちいり、企業共同決定制形成の労使関係における意義を問うことにあった。企業共同決定制の形成については、近年、その導入の背景となった敗戦直後の労働運動や、占領軍の労働政策などが注目されるようになった。本研究では、こうした研究に依拠しながらも、かかる研究の論点になった問題を実証的に再検討することで研究課題に応えることにした。労使共同決定制の形成は、労働組合の再建と密接に関わっており、そのさい労働組合と経営評議会との関係が一つの論点となった。

まずブレーメンの事例を中心に労働組合と経営評議会とは必ずしも敵対的な関係と把握できないことをみた。とはいえ、ブレーメンで労働運動の統一を規定した反ファシズム委員会の解散したシュトットガルトでは、労働運動の統一という要求にもかかわらず運動路線の異なる経営評議会の共存が見られた。こうした路線対立のなかで、左翼勢力の分裂を背景に統一組合なる路線が対立の争点となったことをルール地方の事例を中心に検討した。また争点となった統一組合路線の転換について、イギリス軍の政策をも考慮しながらケルンの事例を中心に検討を行った。これまで敗戦直後の経営評議会の活動をラディカルなものと把握されることが多かったが、ルール鉄鋼業に残された経営評議会の議事録や工場長の記録などから経営評議会活動の内容を明らかにした。経営評議会の活動は、指摘されるほどにラディカルなものではなく、争点となった「統一組合」路線は、占領軍の介入のもとで産業別組合路線の採用で解決し、労使関係の枠組みが形成されることになった。今後、経営協定をめぐる労使の対立と、それを背景とする企業共同決定制の導入を明らかにすることで本研究の課題に応えることにしたい。本研究の課題は、戦後ドイツにおける労務管理の展開を規定してきた労使共同決定システムの性格を、とりわけ敗戦直後から進められた労働運動との関連から明らかにすることにあった。すでに周知のように敗戦直後には、連合軍により労働組合の活動が禁止されていたために、労働運動の担い手となったのは、経営評議会であった。これまで経営評議会の組織化は、職場労働者により自生的に進められたと把握されてきたが、労働組合の活動家によっても設立されてきたのである。このような労働運動で特徴的なことは、ヴァイマール時代に政治的傾向の違いから労働運動が分裂してきたという反省から、統一的な労働組合の結成が求められてきたことである。かかる労働運動のなかで社会民主党や共産党の勢力などの協力も進められていた。とはいえ連合軍の介入などとともに、職場では社会民主党勢力と共産党のメンバーとの対立が深まり、ヴァイマール時代には相互に敵対していたキリスト教労働組合を統合した統一組合が設立されたのである。統一組合の設立とともに労働組合と経営評議会との分断も明確になるが、そのさい問題になったのは、経営評議会の共同決定権であった。実際、ルール鉄鋼業では経営評議会が監査役会にとどまらず、取締役会の労使同数構成を求めていたのである。当時、社会民主党だけでなく、キリスト教労働組合でも労使共同決定を求めており、経営側と非公式な接触を行っていたといわれている。社会民主党系の組合幹部たちも、労働組合運動の統合策として労使共同決定を要求していたのであり、1947年に導入された企業共同決定制は、まさにこのような労働組合運動の転換を背景に、経営評議会の共同決定要求に応えつつ、労働者を労働組合運動に統合することにその課題があったと考えられるのである。
遺伝子の異常メチル化による悪性黒色腫の早期鑑別診断

病理組織診断において、悪性黒色腫と鑑別が困難である色素性母斑、Spitz母斑、異型母斑(dysplastic nevus)、および悪性黒色腫の表皮内癌(melanoma in situ)の患者検体15例よりレーザーマイクロダイセクションを用いてDNA、RNAの抽出を行い、マスアレイを用いたZAR1遺伝子のDNAメチル化解析を行った。しかし、レーザーマイクロダイセクションによるDNAの抽出が困難であり、抽出できた場合でもマスアレイによる解析が困難であり、メチル化解析を行うことができなかった。日本大学医学部付属板橋病院皮膚科で皮膚腫瘍切除術を施行され、病理組織診断において悪性黒色腫と鑑別が困難である色素性母斑、Spitz母斑、異型母斑(dysplastic nevus)、および悪性黒色腫の表皮内癌(melanoma in situ)等と診断された患者よりDNA、RNAの抽出を行っている。表皮内腫瘍など病変が小さい場合はレーザーマイクロダイセクションを用いて腫瘍を切り出し、DNA, RNAを抽出後にマスアレイを用いたZAR1遺伝子のメチル化の解析、リアルタイムPCRを用いたmRNAの発現解析を行っている。また、各疾患において、ZAR1遺伝子のDNAメチル化変化と、人種、性別、年齢、紫外線暴露、予後等に臨床相関があるか解析を行っている。臨床診断、および病理組織診断において悪性黒色腫と鑑別が困難である皮膚腫瘍(Spitz母斑、異型母斑、悪性黒色腫の表皮内癌)について、我々が悪性黒色腫のDNAメチル化解析において同定したZygote Aresst 1(ZAR1)遺伝子(J Dermatol Sci 59:98-106,2010)のメチル化解析を試みた。日本大学医学部付属板橋病院皮膚科を受診した患者の中で、病理組織学的に悪性黒色腫と鑑別が困難であったSpitz母斑5例、異型母斑(dysplastic nevus)5例、および悪性黒色腫の表皮内癌(melanoma in situ)4例の患者検体を採取した。患者検体は全例病変部が小さいため、レーザーマイクロダイセクションにより腫瘍の切り出しを行った。しかし、DNAを採取するのが困難であり、また、DNAを少量得られた場合は、その後にマスアレイを使用し、定量的にメチル化解析を試みたが、結果を得ることができなかった。また、RNAを採取し、リアルタイムRT-PCRを用いてZAR1遺伝子の発現解析を行う予定であったが、DNAと同様、RNAの採取が困難であり、解析を行うことができなかった。日本大学医学部付属板橋病院皮膚科で皮膚腫瘍切除術を施行され、病理組織診断において悪性黒色腫と鑑別が困難である色素性母斑、Spitz母斑、異型母斑(dysplastic nevus)、および悪性黒色腫の表皮内癌(melanoma in situ)等の患者よりDNA, RNAの抽出を行った。検体の大きなものは直接抽出し、表皮内腫瘍などの病変が小さい疾患に対しては、レーザーマイクロダイセクションを用いて抽出を行った。DNA、RNAが抽出された検体に対しては、それぞれマスアレイを用いたZAR1遺伝子のDNAメチル化解析、リアルタイムPCRを用いたZAR1遺伝子の発現解析を行った。症例が当初の予定より少なく、表皮内腫瘍に対しては、レーザーマイクロダイセクションによりDNA、RNAの抽出を行っているが、病変が小さいためDNA、RNAを抽出することができない場合が多く、マスアレイを用いたDNAメチル化解析、およびリアルタイムPCRを用いた遺伝子の発現解析に至らない症例があり、達成度は遅れている。表皮内腫瘍に対しては、レーザーマイクロダイセクションによりDNA、RNAの抽出を行っているが、病変が小さいためDNA、RNAを抽出することができない場合が多く、マスアレイを用いたDNAメチル化解析、およびリアルタイムPCRを用いた遺伝子の発現解析に至らない症例があり、達成度はやや遅れている。レーザーマイクロダイセクション用のプレパラート作成時のミクロトームによる切片の厚さの変更や、レーザーマイクロダイセクションの設定の変更などにより、良質で高濃度のDNA、RNAを抽出する。また、マスアレイを用いたZAR1遺伝子のDNAメチル化解析、およびリアルタイムPCRを用いた遺伝子の発現解析の精度を上げていくため、PCR用のプライマーの設計の変更等を検討する。レーザーマイクロダイセクション用のプレパラート作成時のミクロトームによる切片の厚さの変更や、レーザーマイクロダイセクションの設定の変更などにより、良質で高濃度のDNA、RNAを抽出し、マスアレイを用いてZAR1遺伝子のDNAメチル化解析およびリアルタイムPCRを用いた遺伝子の発現解析の精度を上げていく。引き続きレーザーマイクロダイセクションによるDNAの抽出を行い、マスアレイを用いてZAR1遺伝子のDNAメチル化解析を行っていく。また、リアルタイムPCRを用いてZAR1遺伝子の発現解析を行い、良性組織と悪性組織の鑑別が可能か解析を行う。また、各疾患において、ZAR1遺伝子のDNAメチル化変化と、人種、性別、年齢、紫外線曝露、予後等に相関があるか検討を行っていく。レーザーマイクロダイセクションによるDNAの抽出を行い、マスアレイを用いてZAR1遺伝子のDNAメチル化解析を引き続き行う。また、リアルタイムPCRを用いてZAR1遺伝子の発現解析を行い、良性組織と悪性組織の鑑別可能か解析を行う。
細胞特異的分離・認識機能を有する高分子材料

特定の細胞集団に対して特異的親和性を有する材料は,生命科学分野における新素材の中でも特にその発展に大きな期待が寄せられており,その開発のための方法を確立することは材料科学における最重要な課題の一つである.このような材料の分子設計にあたっては,細胞の挙動と材料物性との関係を定量的に解析し,最適な分離・認識機構の発現をもたらしすように,材料の分子設計と表面構造の制御を行なうことが必要である.本研究においては,イオン性相互作用に基づいて細胞と特異的相互作用を示すことが期待されるアミノ基を有する種々の高分子材料を設計し,リンパ球の2大亜集団であるB細胞とT細胞との簡便かつ迅速な分離法として吸着クロマトグラフィに着目して検討を進めた結果,ポリアミングラフト共重合体(HAx)が, B細胞に対する高い選択吸着能を有することを見いだし,この共重合体をビーズ状吸着体とする分離システムの開発に成功した.すなわち, HA13カラムを用いて,ラット腸間膜リンパ節リンパ球の分離を行なうと,カラム中にはB細胞が選択的に吸着し,流出フラクションとして,純度95%以上のT細胞をほぼ回収率100%で得られることが明らかとなった.また, B細胞は脱着フラクションとして得られ,その純度は90%以上,回収率は85%であり,充分実用上の分離が達成されているものと判定された.分離には, (1)ポリアミン鎖のプロトン化度, (2)プロトン化度変化にともなうポリアミン鎖の溶存状態の変化, (3)吸着体表面に形成されるミクロドメイン構造の状態という3つのファクターが重要であり,この3つのファクターを制御することにより,膜表面のイオン的性質の異なる細胞間の効率的な吸着分離システムの開発が可能であることが期待される.さらに,一定のせん断応力下で経時的に細胞の接着強さを測定できる新しい方法論の確立にも成功した.特定の細胞集団に対して特異的親和性を有する材料は,生命科学分野における新素材の中でも特にその発展に大きな期待が寄せられており,その開発のための方法を確立することは材料科学における最重要な課題の一つである.このような材料の分子設計にあたっては,細胞の挙動と材料物性との関係を定量的に解析し,最適な分離・認識機構の発現をもたらしすように,材料の分子設計と表面構造の制御を行なうことが必要である.本研究においては,イオン性相互作用に基づいて細胞と特異的相互作用を示すことが期待されるアミノ基を有する種々の高分子材料を設計し,リンパ球の2大亜集団であるB細胞とT細胞との簡便かつ迅速な分離法として吸着クロマトグラフィに着目して検討を進めた結果,ポリアミングラフト共重合体(HAx)が, B細胞に対する高い選択吸着能を有することを見いだし,この共重合体をビーズ状吸着体とする分離システムの開発に成功した.すなわち, HA13カラムを用いて,ラット腸間膜リンパ節リンパ球の分離を行なうと,カラム中にはB細胞が選択的に吸着し,流出フラクションとして,純度95%以上のT細胞をほぼ回収率100%で得られることが明らかとなった.また, B細胞は脱着フラクションとして得られ,その純度は90%以上,回収率は85%であり,充分実用上の分離が達成されているものと判定された.分離には, (1)ポリアミン鎖のプロトン化度, (2)プロトン化度変化にともなうポリアミン鎖の溶存状態の変化, (3)吸着体表面に形成されるミクロドメイン構造の状態という3つのファクターが重要であり,この3つのファクターを制御することにより,膜表面のイオン的性質の異なる細胞間の効率的な吸着分離システムの開発が可能であることが期待される.さらに,一定のせん断応力下で経時的に細胞の接着強さを測定できる新しい方法論の確立にも成功した.
円錐型基板接続部を持つ単分子ワイヤーの開発

単一分子を用いた機能性材料作成を目標として、円錐型分子を効果的に合成する新しいConvergent法の開発を行った。その結果、非常に効率的かつ広範な分子の合成に応用可能なConvergent法を新しく完成した。開発した合成方法はFrechetらによって開発されたConvergent法と鈴木カップリング反応、ヨウ素化反応、薗頭カップリング反応を繰り返し用いる新規のConvergent法により構成されている。この方法では最初にFrechetらのConvergent法により種々の世代のポリベンジルエーテル型デンドロンを側鎖として合成する。次に側鎖の末端にホウ酸基を導入する。このポリベンジルエーテル型側鎖を鈴木カップリング反応により、共役鎖に導入する。さらに、ヨウ素化、薗頭カップリング反応を行うことにより共役鎖を延長する。この3つの反応を繰り返し用いることで円錐型分子を高収率で合成することに成功した。このとき導入する側鎖の世代は順次大きなものを使用した。合成したデンドロンの精製には、当初の予想どおりGPCが非常に有効であることがわかった。特に、サイズの大きなデゾドリマーの分離に有効であった。さらに円錐型分子末端へのチオール基導入に関しても検討を行った。その中で共役系末端アセチレンをTBDMS (tert-butyldimethylsilyl)基でポリベンジルエーテル型デンドロン末端をTBDPS (tert-butyldiphenylsilyl)基で保護することによりチオールの導入が可能であることを明らかにした。小さなHOMO-LUMO差を持つ共役分子の合成とその性質の評価1、小さなHOMO-LUMOギャップをもつ両性クォーターチオフェン誘導体の合成と性質小さなHOMO-LUMOギャップを持つ分子を得るために、(CPDT)骨格をもつクォーターチオフェン誘導体を合成した。紫外-可視吸収スペクトルとサイクリックボルタモグラム(CV)を測定した結果、合成した分子が中性のポリチオフェンのバンドギャップ(2.1 eV)よりも小さなHOMO-LUMO差(1.03-1.97 eV)を持つこと、特徴的な多段階の酸化還元挙動を示すことを明らかにした。また、CPDT骨格を二量化すると、HOMOのエネルギーは大きく不安定化するが、LUMOのエネルギーにはほとんど影響を与えないことを示した。2、クォーターチオフェン誘導体のジカチオンの合成と構造定電流電解法によりクォーターチオフェン誘導体のジカチオン塩(FeCl_4塩)の作成、単離に成功した。また、ジカチオン塩の単結晶を作成しX線構造解析を行った。その結果より、ジカチオン状態ではCPDT骨格がキノイド型の構造をとっていることを明らかにした。これはオリゴチオフェンおよびその誘導体のジカチオンの単離、結晶構造構造を行ったはじめての例である。3、オルトキノイド骨格を有するビチオフェン誘導体の合成と性質ジケトン基で3、3'位を架橋したビチオフェン誘導体のα位に種々のヘテロ環を導入し、分子HOMO-LUMO差を制御した。紫外可視吸収スペクトル、CVの測定により、分子のHOMO-LUMO差、フロンティア軌道のエネルギー準位に対するヘテロ環導入の効果をしらべた。その結果、ヘテロ環の導入により分子のHOMO-LUMO差が小さくなること、ヘテロ環の効果は分子のHOMOの軌道を変化させるがLUMOの軌道には現れないことを明らかにした。
膝半月板無血行野の縦断裂に対するraspingとTGF-β1導入滑膜・軟骨細胞移植

半月板無血行野の断裂に対する半月板ラスピングの有効性とその機序を明らかにするために成熟日本白色家兎を用いて両膝関節を展開して、両内側半月板前節の無血行野(周辺から1/2の部位)に5mmの全層におよぶ縦断裂を作製した。その後、片側半月板はダイヤモンドバーを用いて滑膜周辺部から断裂部まで半月板の大腿骨側表面を約0.5mmラスビングし、術後1日,1,2,4,8,16週で半月板を採取し、interleukin 1-α(IL-1α)、transforming growth factor β1(TGF-β1)、platalet-derived growthfactor(PDGF)等のサイトカインとproliferationcell nuclear antigen(PCNA)を用いて免疫組織染色を行った。その結果、ラスピングした半月板大腿骨側表面および断裂部でのこれらの発現が断裂部修復に関与することが判明した。また、成熟日本白色家兎の膝関節から滑膜組織を採取し、組織片培養によって得られた滑膜細胞にエレクロポレーションを行い、transforming growthfactor β1(TGFβ1)遺伝子を導入し培養上清中のTGFβ1をELISA法で定量するとともに、TGFβ1遺伝子導入滑膜細胞をコラーゲンゲルに包埋して、その組織学的観察、およびII型コラーゲン、アグリカン、condromodulinのmRNAの発現を検索した。その結果、TGFβ1遺伝子導入滑膜細胞ではその上清中のTGFβ1の発現が増加し、アグリカンおよびcondromodulinのmRNAの発現を認めた。これによって、TGFβ1遺伝子滑膜細胞がコラーゲンゲルに包埋培養すると軟骨様組織が形成されることが判明し、半月板修復をさらに促進できる可能性が示された。1.軟骨細胞培養家兎膝関節から軟骨組織を採取し,酵素処理にて軟骨細胞を単離した.これをコラーゲンゲルに包埋し,培養を行ない,移植媒介(コラーゲンゲル)下での培養法,および培養条件を確立した.2.培養軟骨細胞に対するTGF-blの効果の検討1.の条件下にて培養液中にTGF-β1(1ng/ml)を添加し,軟骨細胞に対する細胞増殖能およびコンドロイチン硫酸産生量を調べた.その結果,対照群に比べ約2倍の細胞増殖能,約1.7倍のコンドロイチン硫酸産生量であることがわかった.3.培養軟骨細胞に対するTGF-β1とbFGF,IGF,ヒアルロン酸の影響の比較1.の条件下にて培養液中にbFGF(1ng/ml),IGF-1(10ng/ml),ヒアルロン酸(0.1mg/ml)を添加し,軟骨細胞に対する細胞増殖能およびコンドロイチン硫酸産生量を調べ,TGF-blのそれらと比較した.その結果,細胞増殖能およびコンドロイチン硫酸産生量はともにTGF-blが他に比べ優れていることがわかった.また,これらの相互作用について検討中である.4.半月板無血行野に対するraspingの効果家兎膝関節半月板無血行野に作製した縦断裂にraspingを行い,修復及び修復過程にて出現するTGF-β1などのサイトカインの発現につき経時的に観察し,raspingの有用性を証明した.pSVTGF-blにマーカーとなるgreenfluorescent proteinの遺伝子pEGFPを組み込んだものを,1.で調節した軟骨細胞にelectroporationを用いて遺伝子導入し,その導入効率および条件について検討中である.6. Probeの作製滑膜細胞へのTGF-β1の導入実験に先立ち、培養細胞を用いて導入方法としてのelectroporationの条件設定や効率を検索した。これによって、electroporation実験に再現性があることがあることと実用に向けての可能性があることが明らかになった。

次に家兎膝関節から分離した滑膜細胞にelectroporationでlacZgeneを導入し、導入後にlacZを発現させることに成功した。しかし、、導入条件によって細胞の生存率や遺伝子の発現率が大きく変化することが分かり、厳密な設定条件が必要であることが判明した。そこで現在、至適条件を求めるために追加実験を行い、刺激電圧、刺激時間、細胞濃度、細胞浮遊液成分等を検索しているところである。この決定には多くの労力と時間が必要であるが、この決定こそが本研究が実用化できるための鍵であり、慎重に行っている。また、半月細胞でも同様に導入至適条件を求める実験を行っており、これが成功すれば、すでに確立した半月板縦断裂モデルを用いて、TGFβ導入細胞移植実験を行う予定である。前年度の研究を進め、家兎膝関節から分離した滑膜細胞にelectroporationでlacZgeneを導入し、導入後にlacZを発現させることに成功した。ついでTGFβ遺伝子をQinらの方法に準じて、滑膜細胞に導入を行った。導入の際の至適条件を求めるため刺激電圧、刺激時間、細胞濃度、細胞浮遊液成分等を検索した。この至適条件の決定には導入条件によって細胞の生存率や遺伝子の発現率が大きく変化することが分かった。従って、導入効率を上げるためには厳密な設定条件が必要であり、この決定には多くの労力と時間がなお必要であると考えられた。しかし、この決定こそが本研究が実用化できるための鍵であり、慎重に行っている。また、半月細胞でも同様に導入至適条件を求める実験を行っているが、その至適条件の決定にはなお時間と労力が必要である。一方、半月板断裂モデルはすでに確立でき、コントロールとしての半月ラスピング後の半月および滑膜のTGF-β、IL-1,IGF, Lamininに対する免疫組織学的検索を行った。これによると、IL-1,TGF-β、lamininなどのサイトカインがラスピング早期に出現することが判明した。また、生体力学的検索においてラスピング群がより力学的強度を有していることが判った。この半月板断裂モデルを用いてTGFβを導入した半月軟骨細胞移植実験を行い、その免疫学的検索とともに、生体力学的評価も行う予定である。半月板無血行野の断裂に対する半月版ラスピングの有効性とその機序を明らかにするために成熟日本白色家兎を用いて両膝関節を展開して、両内側半月板前節の無血行野(周辺から1/2の部位)に5mmの全層におよぶ縦断裂を作製した。その後、片側半月板はダイヤモンドバーを用いて滑膜周辺部から断裂部まで半月板の大腿骨側表面を約0.5mmラスピングし、術後1日,1,2,4,8,16週で半月板を採取し、interleukin 1-α(IL-1α)、transforming growth factor β1(TGF-β1)、platelet-derived growthfactor(PDGF)等のサイトカインとproliferatingcell nuclear antigen(PCNA)を用いて免疫組織染色を行った。
上皮成長因子(ESF)が癌細胞の悪性化形質獲得および遺伝的不安定性に与える影響

2.EGFがER-1細胞のgelatinase産生に及ぼす影響zymographyにて検索したところ、1カ月間EGF処理ER-1細胞において、64、68KDのゼラチナーゼの亢進していた。(日口外誌.41:682-689.1995.)3.ER-1細胞及び1カ月間EGF処理ER-1細胞におけるEGF結合能の検索^<125>1-EGFを用い、binding assayを行いスッキャチャード解析により両細胞のレセプターの発現状態を検索したところ高親和性受容体、低親和性受容体ともに、ER-1細胞とEGF1カ月間処理ER-1細胞においてEGF受容体数および結合能に変化は認められなかった。ER-1細胞および1カ月間EGF処理ER-1細におけるEGFreceptorのmRNAレベルの検索EGFreceptorのmRNAレベルをRT-PCR法にて検索した結果、両細胞において同等に発現していた。5.EGF長期間処理が遺伝的不安定性に与える影響EGFの長期間処理が遺伝的不安定性に与える影響を6-チオグアニン、ウアバインの選択培地にて、薬剤耐性株の出現を検索した。親株c-SST-2は、両薬剤に対し感受性をしめすが、1カ月間EGF処理c-SST-2においては、両薬剤に対して耐性を示すコロニーの出現が認められた。(日口外誌.42:226-234.1995.)2.EGFがER-1細胞のgelatinase産生に及ぼす影響zymographyにて検索したところ、1カ月間EGF処理ER-1細胞において、64、68KDのゼラチナーゼの亢進していた。(日口外誌.42:226-234.1995.)
砂浜海岸の地形変動に応答した底生生物の行動様式の解明

地球上のほぼすべての環境において,地表面上(海底面上)だけでなく,堆積物の中にも多くの生物が生息している.地表面上に生息する生物と同様に,こうした埋在性底生生物も多様な行動生態(行動パターン)を有していることが予想される.埋在性底生生物も生態系の主要な構成要素であるため,それらの生態を理解することは生態系全体を考える上で非常に重要である.しかしながら,埋在性底生生物が堆積物中でどのように行動しているかについては,現在のところほぼ未解明である.なぜなら,彼らは常に地表面下に埋もれて活動するために,その行動を野外で直接観察することが不可能なためである.本研究では,地形変化が活発に起こる砂浜海岸に生息する底生生物(多毛類Euzonus)を材料とし,底生生物の行動生態および地形変化作用との関連性を世界で初めて定量的に明らかにした.本研究の最大の特徴は,堆積物中での底生生物の活動を記録したものである"生痕(這い後・巣穴など)"に着目したことである.生痕を解析することにより,堆積物中に埋もれて生息する生物の「見えない」行動を如実に明らかにすることが可能となる.さらには,応募者は,砂浜海岸の地形変化の観測をも合わせて行い,地形変化作用の規模によって底生生物の行動パターンや生息域が変化することを明らかにした.このように,砂浜海岸における物理環境と生物行動との関連性を理解し,砂浜海岸の生態系を保全するうえで貴重な情報を提供した.沿岸域は地圏・水圏・大気圏の交わる場所で,地球表層環境において最も変化に富む領域である.刻々と変化する気象・海象の影響を受けて,沿岸域では堆積や浸食といった地形変化が頻繁に生じている.そのため,沿岸域に生息している底生生物は,それらに適応した生態を有していると考えられる.しかしながら,自然条件下では,地表面下の生物の生態を直接的に観察することは極めて難しい.そのため,埋在性の底生生物が地形変動に対してどのように応答しているかは,ほとんど未解明であった.そこで,本研究では,生物が堆積物に残した痕跡,すなわち生痕に着目した.生痕を解析することで,地表面下に隠された生痕形成者の行動様式を読み取ることができる.本研究では,最も激しい地形変化が起こる海浜環境に生息する埋在性多毛類Euzonusの生態を,その生痕の解析を通じて明らかにし,埋在性底生生物の生態-地形変動作用の関係について検討した.調査の結果,海浜地形動態に呼応してEuzonusの生息幅が変化していることが明らかとなった.すなわち,海浜勾配に対して,Euzonusおよびその生痕の分布幅は負の相関を持つ:海浜斜面が急になると,Euzonusおよびその生痕の分布幅は縮小する傾向が見られた.逆に,海浜斜面が緩やかになると,より幅広いEuzonusおよび生痕の分布が見られた,このことから,海浜形状の変化が,Euzonusの分布幅-すなわち海浜堆積物中の間隙生態系の分布幅を増減させていることが示唆された.また,地層中の海浜堆積物の観察から,地質時代のEuzonus(生痕化石Macaronichnus segregatis)もまた,海浜地形に応答してその行動様式および分布幅を変化させていたことがわかった.地球上のほぼすべての環境において,地表面上(海底面上)だけでなく,堆積物の中にも多くの生物が生息している.地表面上に生息する生物と同様に,こうした埋在性底生生物も多様な行動生態(行動パターン)を有していることが予想される.埋在性底生生物も生態系の主要な構成要素であるため,それらの生態を理解することは生態系全体を考える上で非常に重要である.しかしながら,埋在性底生生物が堆積物中でどのように行動しているかについては,現在のところほぼ未解明である.なぜなら,彼らは常に地表面下に埋もれて活動するために,その行動を野外で直接観察することが不可能なためである.本研究では,地形変化が活発に起こる砂浜海岸に生息する底生生物(多毛類Euzonus)を材料とし,底生生物の行動生態および地形変化作用との関連性を世界で初めて定量的に明らかにした.本研究の最大の特徴は,堆積物中での底生生物の活動を記録したものである"生痕(這い後・巣穴など)"に着目したことである.生痕を解析することにより,堆積物中に埋もれて生息する生物の「見えない」行動を如実に明らかにすることが可能となる.さらには,応募者は,砂浜海岸の地形変化の観測をも合わせて行い,地形変化作用の規模によって底生生物の行動パターンや生息域が変化することを明らかにした.このように,砂浜海岸における物理環境と生物行動との関連性を理解し,砂浜海岸の生態系を保全するうえで貴重な情報を提供した.
病原性ウイルスの進化機構の解明と進化方向の予測

本研究の目的は、「病原性ウイルス遺伝子を用いて、その進化機構を解明し、未来進化の実証可能な予測を行なう」ことであった。本年度では、特にエイズウイルスとA型インフルエンザウイルスに注目して、これらのウイルス遺伝子の塩基配列デ-タを用いて、塩基置換パタ-ンの推定とそれに基づく進化方向の予測を行なった。エイズウイルスにおいては、ヒトエイズウイルスの系統樹作成と祖先ウイルスゲノムの塩基配列の推定を同時に行ない、AとG間の塩基置換が全塩基置換数の約50%を占めることを明らかにした。この生物学的要因としては、様々な可能性が指摘できるが、基本的にはエイズウイルスの複製酵素である逆転写酵素が有する複製エラ-の特性によるものと考えられる。この突然変異の特徴とも言える特質は、エイズウイルスの進化機構の解明や進化方向の予測を行なう上で、極めて重要な資料と言える。また、エイズウイルスの系統樹から、日本で感染した患者のウイルスが、どの地方のエイズウイルスと最も近縁であるかを解打し、日本のエイズ患者におけるウイルスの地理的起源を明らかにする手法、「エイズウイルスの「統統樹診断」とも言うべき方法を開発した。この新手法は、エイズウイルスの分子疫学において、非常に有用な方法となるのであろう。また、インフルエンザウイルスの塩基配列デ-タに関しても、同様な方法を用いて、動物インフルエンザウイルスとヒトインフルエンザウイルスの系統関係を明らかにした。また、インフルエンザウイルスの塩基置換パタ-ンを解析し、エイズウイルスのそれとは、かなり異なる可能性を示摘した。これらの研究成果は、インフルエンザウイルスの造化機構と進化方向の予測を行なう上で、非常に重要であると考えられる。DNAデ-タバンク(DDBJ、Gen Bank,EMBL)・タンパク質デ-タバンク(PIR)より、エイズウイルス、B型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、成人T細胞白血病ウイルスの塩基配列デ-タを多数収集した。これらの収集されたデ-タを分子進化学的解析に用いることが可能なように、ワ-クステ-ション上で整理して、フラットファイルとしてのデ-タベ-スを構築した。エイズウイルスに注目して、各遺伝子ごとに塩基配列デ-タから、分子系統樹を作成した。その結果,アフリカミドリザルから単離されたウイルスSIVagmのみが、分子系統樹の進化的位置において、遺伝子ごとに変化することを発見した。このことから.ヒトエイズウイルスの起源はSIVagm様エイズウイルスにある可能性が示唆されるとともに、ヒトエイズウイルスに至る進化的経路において、複数回の遺伝子組換えが祖先エイズウイルスに起こったものと考えられる。また、ヒトエイズウイルスの外膜タンパクの遺伝子であるenvにおいて、塩基置換パタ-ンを分子系統樹から推定した。その結果、env遺伝子においては.塩基Aと塩基Gとの間の塩基置換が極端に高く発生していることが判った。同様の解析を、env以外の遺伝子であるgagについても行なったところ、同じような結果を得た。このことは.エイズウイルスゲノムにおいて、AとGの塩基置換が一般に高頻度で発生していることを意味する。以上の本年度の研究成果から、エイズウイルスにおける未来進化を考える場合、これからもAとGの塩基変化が多数発生することが理論的に予測できたものと考える。また、遺伝子組換えも時として起こり.その際.宿主の特異性を乗りこえて.新種のエイズウイルスとして進化する可能性も強く示唆された。
ゼニゴケ性染色体の構造解析

前年度から単離したY染色体由来PACクローンpMM4G7には、BamHl2.4kbの反復配列が存在する。この反復配列はサザンハイブルダイゼーションおよびPCRの結果より、Y染色体に特異的であることが明らかになった。すなわちBamHl2.4kb断片と相同な配列を持つPACクローンはY染色体由来であると考えられる。そこで、この反復配列をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーションを行い、PACクローン429個を得た。これらのうち、雄ゲノムDNAにのみハイブリダイズするPACクローンは70個であった。クローン整列化に必要な分子マーカーを得るため、Y特異的PACクローンからpMM4G7とそれを含むpMM29D7を除いた68個のDNA混合物のショットガンシークエンスを行い、その塩基配列情報からマーカーとして利用できるプライマーセットを53組設計した。これらのプライマーセットを利用し、pMM4G7を起点に総全長1.6Mbpにわたる5つのコンティングを作製した。これらのコンティングに属する雄特異的PACクローンの一部については塩基配列を決定し、遺伝子コード領域を発見した。この中には、転写因子やリングフィンガーモチーフをもつタンパク質がコードされていた。Y染色体DNA中に見いだされた新奇な遺伝子の機能を解析するため、ゼニゴケの形質転換系を開発した。無性芽播種後約2週間のゼニゴケ葉状体に、パーティクルガンを用いてCaMV35Sプロモ-タで発現するハイグロマイシン耐性遺伝子を導入した。約2ヶ月でハイグロマイシン耐性株が得られ、その過程で植物ホルモンの調製による脱分化・再分化操作の必要がないことから、遺伝子操作による機能解析に極めて有用であると言える。ゼニゴケ雌および雄ゲノムPACライブラリーを完成した。50kb以上のDNA断片をもつクローンが、雄株では32,800個、雌株では31,700個得られた。オルガネラゲノムの含有率が約30%と見積もられているので、雌雄それぞれ約22,000個の核ゲノムDNA断片をもつクローンが含まれていることになる。ゼニゴケのゲノムサイズは核型分析の結果280Mbと推定されているので、性染色体を含めてゲノムの99.9%をカバーするには、平均90kb以上の核ゲノム挿入断片を持つPACクローン約20,000個が必要である。従って、今回得られたそのようなPACクローンの数は雌雄共に十分である。上記のライブラリーより高密度フィルターを作成し、雌および雄ゲノムDNAをプローブとしたディファレンシャルスクリーニングによって雄特異的DNAを含むPACクローンpMM4G7を単離した。pMM4G7をプローブとして雌および雄ゲノムDNAに対するハイブリダイゼーションを行うと、雄ゲノムDNAのみにシグナルが観察された。また、pMM4G7を用いて雄の染色体サンプルに対してFISHを行い、Y染色体にシグナルを得た。従って、pMM4G7はY染色体に由来することが確認された。ゼニゴケ生殖器官で発現している遺伝子群に関する知見を得るため、EST(expressed equencetag)解析を行った。雌生殖器官由来715種類、雄生殖器官由来44種類のESTsを比較すると、雌雄に共通する配列102種類、雌のみで見られた613種類、雄のみで見られた344種類に分類できた。糖結合性タンパク質lectin遺伝子に相同性のあるESTは、出現頻度から転写産物が未熟雌性生殖器官で蓄積していると考えられる。逆に、ショウジョウバエの性決定因子transformer-2に相同性のあるESTは、雄のみで見られた。
αCaMKII mRNAのシナプスにおける翻訳調節機構の解明

我々はαCaMKII mRNAが自らを樹状突起に輸送するために必要とするシス領域を3'UTR上に同定し、この約30塩基から成る領域に結合する蛋白質を検索する目的で、RNAをプローブとするアフィニティーカラムの作製をおこなった。すでに放射性同位体でラベリングしたシス領域の配列をプローブとした結合アッセイを行ない、この領域に特異的に結合する蛋白質が約52kDaの分子量を持つことを明らかにしている。次のステップとしてシス配列の5'末端をビオチンで標識したオリゴヌクレオチドを化学的に合成し、これをストレプトアビディンの担体に固着化したアフィニティーカラムを作製した。これをラット脳より抽出した細胞質画分を反応させた後、非特異的に吸着した蛋白質を洗浄し、RNA分解酵素でプローブに結合した蛋白質を溶出した。この分画を濃縮しSDS-PAGEにより分離したが、バックグラウンドが高く蛋白質として単離することは不可能であった。そこでシス領域を含む配列の3'末端にポリ(A)のリンカーを付加したプローブをRNAポリメラーゼで合成し、このプローブをポリ(U)リンカーを表面に有する担体に吸着させたアフィニティーカラムを作製した。これにラット脳の細胞質画分を反応させ、非特異結合を洗い出したのち、塩濃度を上昇させることにより溶出される蛋白質を回収した。これをSDS-PAGEにより分離し銀染色でゲルを染色したところ、放射性プローブで得られた結果と同様の分子量の蛋白質を単離することができた。現在この蛋白質を蛋白質分解酵素で処理し、アミノ酸配列の解析を行なっている。
転写共役因子Smad4による運動器制御機構の解明

Smad4は、TGF-βファミリーの細胞内シグナル伝達に必須の転写共役因子である。我々は、タモキシフェン誘導型Smad4 cKOマウスを樹立し、出生後の骨格成長におけるTGF-βファミリーの役割について検討した。出生後にSmad4を欠失させたマウスは、骨形成が亢進し骨量が増加した。また、Smad4 cKOマウスでは、骨端成長板における肥大軟骨細胞層が拡張していた。初代軟骨細胞をTGF-β1を添加して培養すると、軟骨細胞分化が抑制された。これらの結果から、TGF-βファミリーのSmad4依存的な細胞内シグナル伝達系が出生後の軟骨細胞や骨芽細胞の分化や機能を制御している可能性が示された。骨形成を強力に促進するBMP、骨格筋線維の肥大化を抑制するMyostatinや、軟骨形成に重要なTGF-βは、TGF-βファミリーに分類される成長因子群である。TGF-βファミリーの因子は、多彩な生物活性を示す一方で、その活性には転写共役因子であるSmad4を共通に必要とする。本研究では、Cre-LoxPシステムを用いて、薬剤誘導性にin vivoでSmad4を任意の時期に欠失できるマウスを樹立し骨・軟骨組織や筋組織等の運動器の表現型を組織学的・分子生物学的に解析することを目的とする。平成27年度は、タモキシフェン誘導性Smad4欠失マウスを樹立することに成功し、予備的な解析結果を得ることができた。Floxed Smad4マウスとタモキシフェン-Creマウスを交配し、タモキシフェン誘導性Smad4欠失マウスを樹立することに成功した。さらに、タモキシフェン誘導性に蛍光タンパク質GFPを発現するレポーターマウスを用いて、骨・軟骨組織での遺伝子組み換え効率に対するタモキシフェン投与量の最適化を行った。予備的な実験結果から、出生後のマウスにおいて、Smad4を欠失すると特に軟骨組織に変化が認められることが示唆された。現在、骨形態計測及びマイクロCTを使った三次元解析によって詳細な表現型を解析中である。さらに、タモキシフェン誘導性Smad4欠失マウスの肋軟骨から軟骨細胞を分取しin vitroでSmad4を欠失することのできる軟骨細胞の樹立に成功した。骨形成を促進するBMPや、軟骨形成に重要なTGF-βは、TGF-βファミリーに分類される成長因子である。TGF-βファミリーは30種類以上の因子からなり、それぞれ骨組織、軟骨組織や骨格筋組織に作用し運動器の形成や維持に重要な役割を果たす。また、その多彩な生物活性は、転写共役因子のSmad4を必須とする事が知られている。本研究では、TGF-βファミリーの運動器における役割を明らかにすることを目的に、出生後の任意の時期にSmad4を欠失できるタモキシフェン誘導性Smad4 cKOマウスを樹立し解析を行った。本年度は、前年度の予備的な実験結果に基づき、in vivo及びin vitroの詳細な解析を行った。出生後にタモキシフェンを投与したSmad4 cKOマウスは、短期間で骨組織に変化が認められた。マイクロCTで三次元の骨解析を行った結果、Smad4 cKOマウスは、脛骨及び大腿骨の一次海綿骨の骨量が増加している事が判明した。また、非脱灰凍結切片を作製し組織学的に検討すると、Smad4 cKOマウスは、成長板軟骨における軟骨細胞分化が亢進し、成長板が肥厚している事が判明した。さらに、Smad4 cKOマウスの肋軟骨から調整した軟骨細胞をin vitroで活性型タモキシフェン処理し、細胞凝集塊として培養した。すると、Smad4が欠失した軟骨細胞は、軟骨細胞分化マーカーの発現が亢進する事がわかった。以上の結果から、出生後のマウスでは、Smad4依存的なTGF-βファミリーの細胞内情報伝達系によって、内軟骨性骨化が抑制されていることが示唆された。平成27年度の実験から、TGF-βファミリーの細胞内シグナルを伝達するSmad4が出生後のマウスの運動器においても重要な役割を果たすことが明らかとなった。平成28年度は、in vivoにおける骨・軟骨組織の詳細な表現型解析を引き続き行い、並行してSmad4の下流で運動器を制御している分子を検討するために、マイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析を行う予定である。さらに、網羅的解析から運動器の制御に重要と予想される遺伝子について、培養細胞で過剰発現及びノックダウンを行い作用メカニズムを検討する。以上の一連の実験により、TGF-βファミリーによるSmad4を介した運動器制御の生理的役割を解明する。病態生理学細胞培養で使用するディスポーザブル器具の使用量が予定より少なかったため。平成28年度の一般消耗品の購入に充てる。
解離性大動脈瘤手術への形状記憶合金製リング付グラフトの応用に関する研究

末梢動脈から挿入可能なリング付きグラフトの開発を目的として形状記憶合金を用いて様々なタイプのグラフトを試作した。すなわちNITINOL WIREをリング状にした人工血管の両端に装着したもの、または板材を環状にし両端に装着したもの、あるいはNITINOL WIREをコイル状にしたものなどを試作したが、いずれもカテ-テル法に準じた方法で挿入する際の変形の困難なこと、あるいは形状回復限界を越えること、また特にコイル状のものでは留置できてもコイルの間からの血液の漏れは相当量に達し、偽腔への血液流入防止が不可能に近いと思われることなどの問題点が明らかになり、いずれのものも望ましくないことが判明した。そこで現在推し勧めているのは板財を螺旋状に巻き、円筒状にする方法である(下図参照)この方法によれば形状回復能の限界を超えずに十分な細さに変形させることが可能と考えられる。ちなみに直径10mmのものは冷生食中で直径3mm、直径20mmのものは直径5mmまで縮小可能であり加温により永久歪を生ずることなく形状回復している。また外側及び内側に隙間をカバ-するように人工布を装着することは容易であり、血液の漏れも少ないと思われ、新しいタイプの人工血管とも言える。形状回復の方法としては通電法と電磁誘導法の2法を考えている。現在は通電法が進んでおり、模擬回路内では37°Cの潅流生食水中で直径20mm、長さ40mmのもの(臨床応用に極めて近い大きさのもの)を3秒以内に形状回復させることが可能である。これからの問題点としては通電の端子と形状記憶合金との接点の処理などが残っている。またこれと並行してグラフトの効果判定(特に偽腔への血流防止,血栓化)のための実験モデルとして解離性大動脈瘤犬の作製も行っており、解離性大動脈瘤の作製に成功している。当初のものからはデザインを変更し、線状の形状記憶合金を人口血管の内側に裏張りする形(コイル状にして)の形状記憶合金製リング付きグラフトの開発を行ってきたが、この間の実験により以下の問題点が明らかになった。1.形状回復時に人口血管を巻きこむことがある。2.臨床応用を考えた場合の線径1mm、コイル径2mmのものは氷冷水中で冷やすことにより十分に直線に近いところまで変形させ、その後、復温することにより元の形状に回復させることが可能であった。しかしながら、動物実験の場合には、このような大きなサイズの物は使用できないので、線径1.0、0.9、0.8mmのものでコイル径12、10、8mmのものを作製し氷冷水中で冷やし直線状に変形させようとしたが、曲率半径が小さく、元の変形度が大きいため、どうしても曲がりが残り、直線状にすることは困難であった。リングとしての強度の点などからはできるだけ太い線径が好ましいので記憶合金の温度処理時間を検討し金属弾性を殺し、また、極低温にするとより容易に変形できるので液体窒素で冷却するなど試みたが、やはり波状の形態が残り直線状にすることは困難であった。従って現在、線径、コイル径、処理温度、時間などの再検討を行なっているところである。また、これとは別に板状の形状記憶合金を用いて、同様に人工血管の裏張りをする形のものを考案し、現在検討中である。当初、実験2年目には動物実験を行う予定であったがリング付きグラフトの作製が予想外に困難を極めたため模擬回路内での実験にとどまっている。

これまでNITINOL WIREをリング状にし人工血管の両端に装着したもの、または板材を環状にし両端に装着したもの、あるいはNITINOL WIREをコイル状にしたものなどを試作したが、いずれもカテ-テル法に準じた方法で挿入する際の変形の困難なこと、あるいは形状回復限界を越えること、また特にコイル状のものでは留置できてもコイルの間からの血液の漏れは相当量に達し、偽腔への血液流入防止が不可能に近いと思われることなどの問題点が明らかになり、いずれのものの望ましくないことが判明した。そこで次に考案したのが板材を螺旋状に巻き、円筒状にする方法である。(下図参照)この方法によれば形状回復能の限界を越えずに十分な細さに変形させることが可能と考えられる。また外側及び内側に隙間をカバ-するように人工布を装着することは容易であり、血液の漏れも少ないと思われ新しいタイプの人工血管とも言える。形状回復の方法としては通電法と電磁誘導法の2法を考えている。現在は通電法が進んでおり、模擬回路内では37°Cの灌流生食水中で直径20mm、長さ40mmのもの(臨床応用に極めて近い大きさのもの)を3秒以内に形状回復させることが可能である。これからの問題点としては通電の端子と形状記憶合金との接点の処理などが残っている。またこれと平行してグラフトの効果判定(特に偽腔への血流防止、血栓化)のための実験モデルとして解離性大動脈瘤犬の作製も行っており、解離性大動脈瘤の作製に成功している。