hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
スンクス口蓋扁桃陰窩上皮の発現する接着分子に関する基礎的研究

今年度、本研究課題に交付された補助金で実施された研究により、スンクス口蓋扁桃の陰窩上皮とリンパ球の接着機構に関して以下に示す新知見が明らかにされた。1.スンクス口蓋扁桃をPPDなどの蛋白抗原で反復刺激すると陰窩上皮内に浸潤するリンパ系細胞が増加し、上皮側にもM細胞様の細胞が出現するなどの組織構築の変化がみられ、その背景には上皮とリンパ系の細胞接着を担う接着分子の発現パターンの変化があるものと思われた。2.正常スンクス口蓋扁桃の新鮮凍結切片を用いたWoodruff assayで扁桃を覆う粘膜上皮とリンパ球との接着を調べたところ、陰窩上皮の領域においてのみリンパ球の特異的接着が観察され、その他通常の重層偏平上皮では接着はみられなかった。3.上皮が発現し得る接着分子に対する抗体を用い免疫組織学的染色を行ったところ、陰窩上皮の上皮細胞はラットICAM-1に対する抗体で膜に陽性反応を認め、その発現の程度は抗原刺激された個体で増加する傾向を示した。4.Woodruff assayに抗ICAM-1あるいは抗LFA-1抗体を添加することで接着反応は部分的に阻害されたことから陰窩上皮ーリンパ球間の細胞接着の一部はICAM-1/LFA-1反応系に依存していることが示唆された。5.以上の結果から、口腔内抗原により扁桃が刺激されると陰窩上皮において接着分子の発現パターンに変化が生じ、そのことが抗原に対応するリンパ系細胞の上皮内への遊走を支持し、抗原の捕捉や抗原提示などの免疫応答を促進するものと考えられた。
放射線関連甲状腺癌におけるWnt系活性化へのPin1の関測の検討

我々はセミパラチンスク核実験周囲地域やチェルノブイリ事故汚染地域の放射線関連甲状腺癌に、散発性甲状腺癌に比べてWnt/β-catenin系の発現が亢進していることを報告している。前年度の検討では放射線関連甲状腺腫瘍のcyclin D1過剰発現とβ-catenin胞体内発現とPin1発現の相関が示唆された。さらにβ-catenin exon 3やAPC変異のない乳頭癌細胞株TPC-1にcyclin D1、β-cateninとPin1の発現があり、甲状腺癌化過程でのPin1によるcyclin D1とβ-catenin発現調節機構の関与が示唆された。本年度は以下の点を明らかにした。2甲状腺癌細胞におけるPin1の放射線応答機構:Pin1は放射線誘発DNA障害時、p53に結合することでその活性化とアポトーシスを促進する。TPC-1(野生型p53)とARO(変異型p53)はX線10Gy照射後2時間で、ともにcyclin D1蛋白発現レベルは減少し、アポトーシスはTPC-1に高度であった。この時免疫沈降法で、Pin1はTPC-1で活性化p53蛋白とcyclin D1との複合体を形成し、AROでは変異型p53とは複合体を形成せずcyclin D1と結合する。以上の結果より、Pin1は甲状腺癌でcyclin D1の正の調節因子として細胞増殖に関与すること、放射線照射時にp53やcyclin D1と複合体を形成してアポトーシスを含む細胞応答に関与することが示唆された。チェルノブイリ事故汚染地域からの濾胞腺腫(FA)と乳頭癌(PTC)各14例を用い、cyclin D1、β-catenin、Pin1の発現レベルを免疫染色とRT-PCRにより評価し、それらの相関を統計学的に検定した。cyclin D1核内過剰発現はFAの14.3%、PTCの100%に認め、FAの57.1%に胞体内発現を認めた。転写レベルでcyclin D1過剰発現はFAの45.5%、PTCの54.5%であった。Pin1の過剰発現はFAの28.5%、PTCの100%で、PTCのPin1発現はRT-PCRで確認した。β-catenin胞体内発現はFAの85.7%、PTCの100%に認めたが、FAでは全例弱陽性であった。FAとPTCを合わせた甲状腺腫瘍で、核内cyclin D1とPin1、核内cyclin D1と胞体内β-catenin、Pin1と胞体内β-cateninの発現レベルに正の相関を認めた(p<0.001)。cyclin D1 mRNA過剰発現とPin1、胞体内β-cateninの発現レベルに有意な相関を認めた(各々p=0.017,0.045)。PTCのβ-catenin exon 3の変異は認めなかった。これらの結果は放射線関連甲状腺腫瘍でのcyclin D1過剰発現とβ-catenin胞体内発現へのPin1の関与を示唆している。放射線関連FAの胞体内cyclin D1は転写レベルでの過剰発現を伴っていて、これら甲状腺腫瘍のcyclin D1転写活性の亢進は早期のイベントで、cyclin D1の核内蓄積が悪性転化に重要であるのかも知れない。未分化癌細胞株AROとPTC細胞株TPC-1にはβ-catenin exon 3に変異はなく、AROにAPC遺伝子変異を認めた。Western解析では、Pin1発現はTPC-1のみに高度で、cyclin D1とβ-cateninの発現はARO、TPC-1ともに同等に認めた。甲状腺癌化過程での、Pin1によるcyclin D1とβ-catenin発現調節機構の関与が示唆された。

我々はセミパラチンスク核実験周囲地域やチェルノブイリ事故汚染地域の放射線関連甲状腺癌に、散発性甲状腺癌に比べてWnt/β-catenin系の発現が亢進していることを報告している。前年度の検討では放射線関連甲状腺腫瘍のcyclin D1過剰発現とβ-catenin胞体内発現とPin1発現の相関が示唆された。さらにβ-catenin exon 3やAPC変異のない乳頭癌細胞株TPC-1にcyclin D1、β-cateninとPin1の発現があり、甲状腺癌化過程でのPin1によるcyclin D1とβ-catenin発現調節機構の関与が示唆された。本年度は以下の点を明らかにした。2甲状腺癌細胞におけるPin1の放射線応答機構:Pin1は放射線誘発DNA障害時、p53に結合することでその活性化とアポトーシスを促進する。TPC-1(野生型p53)とARO(変異型p53)はX線10Gy照射後2時間で、ともにcyclin D1蛋白発現レベルは減少し、アポトーシスはTPC-1に高度であった。この時免疫沈降法で、Pin1はTPC-1で活性化p53蛋白とcyclin D1との複合体を形成し、AROでは変異型p53とは複合体を形成せずcyclin D1と結合する。以上の結果より、Pin1は甲状腺癌でcyclin Dlの正の調節因子として細胞増殖に関与すること、放射線照射時にp53やcyclin D1と複合体を形成してアポトーシスを含む細胞応答に関与することが示唆された。
遺伝子変異情報に基づいた大腸癌に対する新規治療戦略の開発

(1)大腸癌幹細胞様細胞株の樹立大腸癌培養株の樹立に関しては、癌幹細胞性を持つ細胞が維持されるという培養液と条件(Ohata, Cancer Res. 2012)を利用した。通常の大腸癌手術症例だけでなく、同時性多発肝転移を伴うStage IV症例で、原発巣を切除する症例(図2)や、術前生検検体にてKRAS野生型と判明している右側結腸癌症例は積極的に検体収集している(BRAF変異型症例が多いため)。特に、同時性多発肝転移を伴うStage IV症例では、原発巣切除後に全身化学療法を行うため、その治療効果判定(RECIST)が得られ、樹立した大腸癌細胞株の薬剤感受性データ等との相関性が検証しやすい。現在までに約440症例での樹立を試みている。(2)大腸癌幹細胞様細胞株のプロテオゲノムプロファイリングと薬効評価・プロテオミクス:樹立した大腸癌幹細胞様癌細胞株(特にBRAF変異株)を用いて、プロテオーム解析を開始した。分子標的薬の主要標的となっているチロシンリン酸化に特化したチロシンリン酸化プロテオーム解析も同時に行っている。・薬効評価:樹立した大腸癌幹細胞様癌細胞株を用いて、標的が明確となっている92種類の抗腫瘍薬剤からなるオリジナルライブラリー(EGFR阻害剤、VRGF阻害剤、FGFR阻害剤、mTOR阻害剤、PI3K阻害剤、MEK阻害剤、Wnt系阻害剤など)に対する薬剤感受性を検討している。当初の実験計画に沿って、おおむね順調に進んでいると考えている。今後は、樹立した細胞株の中で特に、KRAS変異株およびBRAF変異株を用いた薬効評価(単剤および多剤併用)を優先的に行う。さらに、ゲノミクス・プロテオミクスデータと薬剤感受性・抵抗性データを統合し、キナーゼ・基質データベース等を活用したインフォマティクス解析によって、薬剤感受性を規定する因子(キナーゼ)群やシグナル経路を推定する。さらに、候補となったキナーゼやシグナル経路の阻害剤を用いて、それらのキナーゼやシグナル経路が本当に薬効に関与しているかどうか検証する。本年度は実験試薬および細胞培養液のストックがあったために、予定よりも購入量を減らすことができ、助成金に余剰が生じた。本年度の余剰金は、翌年度分として請求した助成金と合わせて、実験試薬および細胞培養液の購入に充当することによって、癌細胞の樹立を継続し、遺伝子変異解析も実験計画に従って進めていく予定である。
ヒト母乳由来の新しい神経分化制御因子の探索

ヒトを含む哺乳類は、生後、母体が分泌する乳を摂取することにより発達・成長する。乳摂取により、神経系と相互作用する分子が消化管内に生成することは合目的である。本研究では、特に、ヒト母乳タンパク質に着目した。ヒトラクトフェリンを、消化管を想定した酵素条件で分解した際に生成するペプチドを分析するとともに、神経系との相互作用を行動学的に検討した。その結果、ヒトラクトフェリン由来ペプチドを経口投与した際に抗不安作用を示すことを見出した。神経系における新しい母子間相互作用と考えられ、今後、ヒト母乳由来の神経調節因子として生理的意義の解明が期待される。神経系における母子間の物質的な相互作用が存在する。これまで我々は、主要な牛乳タンパク質alphaS1カゼインに由来するペプチドTyr-Leu(YL)およびTyr-Leu-Gly(YLG)が強力な情動調節作用を示すことを見出した。ヒト母乳タンパク質からも同様の神経調節因子が生成すると予想されるが、母乳中にはalphaS1カゼインは含まれない。そこで本研究では、ヒト母乳由来の新しい神経調節因子を探索し、その生理的意義の解明を目指す。ヒト母乳の主要なタンパク質ラクトフェリンを各種消化管酵素により消化しLC-MSを用いて神経調節ペプチド候補を分析した。その結果、消化管を想定した酵素条件、すなわち、ペプシン消化、次にパンクレアチン消化した際に、N末端側にYL配列を有する複数のペプチド断片が生成することを見出した。これらのペプチド断片を化学合成し、現在、各種行動試験により神経系に対する生理作用を評価中。したがって、乳摂取により、神経系と相互作用する分子が消化管内に生成することは合目的である。最近我々は、主要な牛乳タンパク質&#61537;S1カゼインを消化管酵素で分解した際に効率的に生成するトリペプチドTyr-Leu-Gly (YLG)が、強力な情動調節作用を示すことを見出した。ヒト母乳タンパク質からも類似の神経調節因子が生成すると予想されるが、母乳中には&#61537;S1カゼインは含まれない。そこで本研究では、ヒト母乳の主要なタンパク質であるラクトフェリンを消化管酵素で処理した際に生成するペプチド断片に着目し、マウス高架式十字迷路試験により、その情動調節作用を検討した。ヒトラクトフェリンを、消化管を想定した酵素条件で分解した際に生成する複数のペプチドを、化学合成し、それらをマウスに腹腔内投与したところ、抗不安作用を示すことがわかった。さらに、上記のYLGをN末端に有する6残基ペプチドが経口投与(1 mg/kg)で抗不安作用を示すことを見出した。食品生理機能学ヒト母乳の主要なタンパク質ラクトフェリンを各種消化管酵素により消化したところ、神経調節ペプチド候補を複数見出した。得られた母乳由来の神経調節ペプチド候補について、行動学的試験を実施し、それらの情動調節作用を検討する。本年度、主に情動調節ペプチド候補の探索を行い、次年度、同定したペプチドについて大量合成し、機能性を検討することにした。新たに同定した情動調節ペプチド候補の機能性をマウス行動試験などで評価する。このため、物品費2,316,235円、旅費200,000円、人件費・謝金160,000円、その他200,000円の支出を予定している。
平安時代の「諸司所々別当制」についての研究-中央政府行政機構の中世的変容の一側面-

平安時代の中央国家機構に関する研究が進展しつつあるが、そこで強調されてきたのは、蔵人所による新設内廷諸官司(「所」)の統合と自己完結化、律令制的官司統属方式(太政官一省一寮・司・職)の解体と太政官系列の諸官司の自立化、特定氏族による官司請負=「家業」化などについてであり、これらの現象が、律令国家の中世国家への変容の指標として積極的に意義づけられてきた。しかし、個別官司はいかに自立性を高めようとも、宮廷で行なわれる政務・行事・儀式の執行に参加する一部局であるところにその存立根拠がある。したがって宮廷中枢は、これら蔵人所系列と太政官系列の独立諸官司を、政務・行事・儀式に有機的に結合する新たな統属方式をつくりあげていたと想定されなければならない。そこで注目されるのが、公卿・殿上人・弁官局官人・蔵人を、「所宛」(ところあて)によって太政官系列諸官司と蔵人所系列諸所の「別当」に任命する「諸司所々別当」制である。本研究によって、律令制的官司統属方式である省一寮一司にかわって一〇世紀に登場した新たな官司統属方式である「諸司所々別当制」の実態と特質にせまることができた。「研究成果報告書」では、研究成果の概要を紹介するにとどめ、より詳細な研究成果は、いずれ論文として公表するつもりである。また「諸司所々別当」制の展開と密接に開連する院政期の「記録所」についての基礎的研究を、論文「天永の記録所について」(『史学研究』199号1993年2月)として公表した。この論文も「研究成果報告書」のなかに含めて提出する。平安時代の中央国家機構に関する研究が進展しつつあるが、そこで強調されていきたのは、蔵人所による新設内延諸官司(「所」)の統合と自己完結化、律令制的官司統属方式(太政官ー省ー寮・司・職)の解体と太政官系列の諸官司の自立化、特定氏族による官司請負=「家業」化などについてであり、これらの現象が、律令国家の中世国家への変容の指標として積極的に意義づけられてきた。しかし、個別官司はいかに自立性を高めようとも、宮延で行なわれる政務・行事・儀式の執行に参加する一部局であるところにその存立根拠がある。したがって宮延中枢は、これら蔵人所系列と太政官系列の独立諸官司を、政務・行事・儀式に有機的に結合する新たな統属方式をつくりあげていたと想定されなければならない。本研究の目的は「諸司所々別当」制の諸官司統合機能の実態と特質にせまることであるが、本年度は、主として研究史の整理、関係史料の調査・整理を行った。次年度は、今年度に引き続き、関係史料の調査・整理を行うとともに、研究のまとめを行い、できれば論文として公表したい。

したがって宮廷中枢は、これら蔵人所系列と太政官系列の独立諸官司を、政務・行事・儀式に有機的に結合する新たな統属方式をつくりあげていたと想定されなければならない。そこで注目されるのが、公卿・殿上人・弁官局官人・蔵人を、「所宛」(ところあて)によって太政官系列諸官司と蔵人所系列諸所の「別当」に任命する「諸司所々別当」制である。本研究によって、律令制的官司統属方式である省一寮一司にかわって一〇世紀に登場した新たな官司統属方式である「諸司所々別当制」の実態と特質にせまることができた。「研究成果報告書」では、研究成果の概要を紹介するにとどめ、より詳細な研究成果は、いずれ論文として公表するつもりである。また、「諸司所々別当」制の展開と密接に関連する院政期の「記録所」についての基礎的研究を、論文「天永の記録所について」(『史学研究』199号1993年2月)として公表した。この論文も「研究成果報告書」のなかに含めて提出する。
二分決定グラフ論理にもとづく単電子集積デバイスの研究

前年度に提案した単電子形二分決定グラフをカスケード接続して論理システムを設計し、その動作をシミュレーション確認した。全体システムの構成要素をあげると、(1)二分決定グラフデバイスを組み合わせたグラフ回路、(2)グラフ頂点からメッセンジャ電子を送り込む電子注入回路、(3)終点に到達するメッセンジャを検出して0-1の出力信号を出す出力インターフェイス、である。一例として4ビット加算器では、各桁の和と桁上げを5つのグラフ回路で並列計算する。各グラフ回路にメッセンジャ電子を複数個おいてパイプライン演算を行う。すべての入力組み合わせについて正確に動作することをシミュレーション確認した。加算器以外に数種のサブシステム(補数生成器や一致検出回路など)を設計して動作をシミュレーション確認した。次世代集積システム用LSIの開拓を目的として、単電子輸送を利用した二部決定グラフ論理デバイスの提案を行った。同時に、デバイス特性のシミュレーションを行って、期待する論理動作を確認した。提案したデバイスは、単電子ポンプ構造を利用した二分岐スイッチの構造を持つ。4つのトンネル接合からなり、1つの流入ブランチと2つの流出ブランチ(1ブランチと0ブランチ)および入力電圧端子を有する。流入ブランチから単電子を入れる。入力電子が正(論理信号1)のときには、1ブランチから電子が流出する。流入電圧Xが負(論理信号0)なら0ブランチから電子が流出する。その結果として、単電子の輸送経路を入力電圧で切り換えて二分岐スイッチ動作を行わせることができる。この単位デバイスを組み合わせて、任意の組み合わせ論理を構成できる。構成した論理回路は転送クロックで駆動する。期待する論理動作かが得られることをシミュレーションで確認した。すなわち、各種の基本論理(否定,論理和,論理積,排他的論理和)の回路を設計して、その論理動作をシミュレーション確認した。また、いくつかの組み合わせ論理回路を設計して、その動作もシミュレーションで確かめた。以上により、単電子二部決定グラフデバイスの実現可能性を示すことができた。前年度に提案した単電子形二分決定グラフをカスケード接続して論理システムを設計し、その動作をシミュレーション確認した、全体システムの構成要素をあげると、(1)二分決定グラフデバイスを組み合わせたグラフ回路、(2)グラフ頂点からメッセンジャ電子を送り込む電子注入回路、(3)終点に到達するメッセンジャを検出して0-1の出力信号を出す出力インターフェイス、である。
急性呼吸窮迫症候群の新しいバイオマーカー血中硫化水素イオンと重症化との関連性

ARDSは予後不良の肺疾患である。インフルエンザモデルを用いて解析した結果、酸化ストレスに応じて8-ニトロcGMPが産生され、酸化ストレス応答因子を誘導し防御能を発揮することがわかった。最近、蛋白異化の過程で内因性に産生される硫化水素イオン(HS-)が8-ニトロcGMPを消去する現象を見いだした。本研究では、HS-および関連化合物の生体濃度を質量分析法にて解析した。その結果、培養細胞および感染マウスの血漿や臓器においては、HS-ではなくCysSSHやGSSHといったポリスルフィド体が産生され、これらは8-ニトロcGMPを消去し、ARDSの病態や酸化ストレス応答に関連している可能性が示唆された。急性呼吸窮迫症候群(acute respiratory distress syndrome, ARDS)は極めて死亡率の高い呼吸器症候群である。我々は、インフルエンザウイルス(A/H2N2/Kumamoto/67)感染マウスモデルを用いてARDS病態の解析を行ってきた。その結果、活性酸素(ROS)や一酸化窒素(NO)の過剰な産生(酸化ストレス)に依存して、NOの2次シグナル分子cyclic GMP(cGMP)のニトロ化体である8-ニトロcGMPが、主にウイルス増殖の場である気道上皮細胞において産生されることを免疫組織染色法を用いて明らかにした。さらに8-ニトロcGMPは、細胞内蛋白質のチオール基にcGMPを付加するユニークな翻訳後修飾(S-グアニル化)を介して、ヘムオキシゲナーゼ1などの酸化ストレス応答因子の誘導に関わるシグナル分子として機能し、生体防御機能を発揮することも明らかにした。従って、8-ニトロcGMPの低下をもたらす病態環境は、酸化ストレス応答の抑制を介しARDSの重症化に寄与する可能性が示唆されるが、最近我々は、8-ニトロcGMPの代謝経路を解析する過程で、硫化水素イオン(HS-)およびその関連化合物が8-ニトロcGMPを消去する現象を見いだした。硫化水素はシステイン(Cys)分解の過程でcystationine β-synthase(CBS)やcystationine γ-lyase(CSE)により内因性に産生され、また消化管内では嫌気性菌によって多量に産生されることが知られている。重篤な病態下においては、蛋白異化亢進に伴なうCys分解、腎排泄の障害、細菌による産生などが相まって血中濃度が増加する可能性が考えられる。本研究においては、HS-およびその関連化合物の生体内濃度を独自に開発した安定同位体希釈法・質量分析法を用いて測定し、ARDS重症化の新しいバイオマーカーとしての有用性と新たな治療戦略の開発に向けた基盤的研究を推進する。我々は、インフルエンザウイルス感染マウスARDSモデルを用いた解析の結果、活性酸素(ROS)や一酸化窒素(NO)の過剰な産生がARDS病態を悪化させることを明らかにした。一方、ROS・NOに依存して、NOの2次シグナル分子であるcyclic GMPのニトロ化体である新しい環状ヌクレオチド8-ニトロcGMPが生じ、細胞内蛋白質のチオール基にcGMPを付加する翻訳後修飾(S-グアニル化)を介して、酸化ストレス応答のシグナル分子として生体防御的に作用することも明らかにした。8-ニトロcGMPの低下をもたらす病態環境は、ARDSの重症化に寄与する可能性が示唆されるが、最近、硫化水素イオン(HS-)が8-ニトロcGMPを消去することを発見した。硫化水素はシステイン(Cys)分解の過程でcystationineβ-synthaseやcystationineγ-lyaseにより内因性に産生され、また、消化管内では嫌気性菌によって多量に産生される。重篤な病態下における硫化水素の生物活性は不明な点が多いが、蛋白異化亢進に伴なうCys分解、腎排泄の障害、病原菌自体による産生などが相まって血中濃度が増加する可能性が示唆される。硫化水素による8-ニトロcGMPの消去は、酸化ストレス応答の抑制を介しARDS病態の重症化につながると考えられる。本研究においては、3-ニトロチロシンや脂質過酸化物といった既存の酸化ストレスマーカーを網羅的に解析するとともに、血漿中の硫化水素イオン濃度を独自に開発した安定同位体希釈質量分析法を用いて測定し、ARDS重症化の新しいバイオマーカーとしての有用性と病態解明、新たな治療戦略の開発に向けた基盤的研究を推進する。急性呼吸窮迫症候群(ARDS)は極めて死亡率の高い呼吸器症候群である。我々は、インフルエンザウイルス感染ARDSモデルを用いて解析を行ってきた。

その結果、酸化ストレスに依存して8-ニトロcGMPが気道上皮にて産生されること、さらに8-ニトロcGMPは、蛋白質のチオール基にcGMPを付加する翻訳後修飾を介して酸化ストレス応答因子を誘導し、生体防御機能を発揮することを明らかにした。従って、8-ニトロcGMPの低下をもたらす病態環境はARDSの重症化に寄与する可能性があるが、最近、硫化水素イオン(HS-)およびその関連化合物が8-ニトロcGMPを消去する現象を見いだした。硫化水素はシステイン(Cys)分解の過程で内因性に産生され、また消化管内では嫌気性菌によって多量に産生されることが知られている。病態下においては、蛋白異化亢進や細菌による産生などが相まって血中濃度が増加する可能性が考えられる。本研究では、HS-および関連化合物の生体内濃度を独自に開発した安定同位体希釈法・質量分析法を用いて測定し、ARDS重症化の新しいバイオマーカーとしての有用性について検討した。まず、細胞・組織破砕液や血漿といった生体試料にチオール反応試薬であるMBBを加え、上清中に含まれるMBBとHS-、Cys、GSH、およびそのポリスルフィド体のアダクトをLC-MS/MSにて測定した。それぞれの安定同位体を外部標準とし定量性を確保した。その結果、種々の培養細胞およびマウスの血漿や臓器においては、HS-ではなくCysSSHやGSSHといったポリスルフィド体が産生され、これらは8-ニトロcGMPを消去し8-SH-cGMPを生じることがわかった。インフルエンザウイルス感染マウスの解析では、肺組織破砕液中でCysやGSHが減少するとともにCysSSHが増加することがわかった。以上より、インフルエンザ肺炎の肺局所でポリスルフィド体が産生され、ARDSの病態や酸化ストレス応答に関連している可能性が示唆された。呼吸器内科学まず、HS-およびその関連化合物を高感度・特異的に定量分析する安定同位体希釈法・質量分析法を開発した。具体的には、細胞・組織破砕液や血漿といった生体試料にチオール反応試薬であるmonobromobimane(MBB)を加え、遠心分離上清中に含まれるMBBとHS-のアダクトであるBis-S-bimane、CysやGSH(還元型グルタチオン)、およびそのポリスルフィド体であるシステインパースルフィド(CysSSH)やグルタチオンパースルフィド(GSSH)等のMBBアダクト(CysS-bimane、GS-bimane、CysSS-bimane、GSS-bimane)を液体クロマトグラフィー質量分析器(LC-MS/MS)にて測定した。それぞれの安定同位体(Bis-[34S]-bimaneなど)を外部標準として添加・同時測定し定量性を確保した。その結果、生体内においては、CBS・CSEの酵素活性に依存して、食事中に含まれるメチオニンから作られるシスチン(CysSSCys)を基質として、HS-ではなくCysSSHが産生されること、さらにCysSSHは、細胞質内に多量に存在するGSHと反応しGSSHへと変換されることがわかった。実際、種々の培養細胞の細胞質内および健常マウスの血漿や主要臓器中には非常に高い濃度(GSHの5%程度に相当する10-100μMのGSSHレベル)のポリスルフィド体が存在することなどが明らかとなった。さらにin vitroの解析にて、GSSHは8-ニトロ
日本古代・中世の敷地選定

風水における景観上での四神の表現方法に関する比較研究である。最古記録では、四神に対応する地形的な特徴は不明瞭なままである。後に、二つの共存する風習が、風水の中で、発達してきたようである。一つでは、自然地形の存在が強調され、四神は山などの地形として表現された。もう一つでは、それぞれの四神について、異なる自然的・人為的な地形的特徴の存在が必要とされていた。本研究では、後者の風習に注目した。文書資料の調査に基づいて、四神相応の思想の起源と発展をさかのぼり、異なる記録に関する基礎分析を行った。そして、「四神相応が宮都の位置の決定過程において利用されていた」という一般的な認識に対し、異議を唱えた。本研究では、11世紀の『作庭記』に書いてある「四神相応」の概念に付与された解釈の起源について調査をおこなっている。『作庭記』に敷地条件として、東に川、西に大道、南に澤、北に山が明記される。しかし、もし「四神相応」の地勢でない場合、四方に特定の植物を配すれば「四神相応」になるとしている。研究方法としては、「四神相応」の解釈が書いてある文献を探して、その内容を比較する。23年度に、主に中国語の文献史料を調べた。まず、文淵閣四庫全書電子版を使用して、「玄武」や「四獣」というケーワードで『作庭記』・『〓〓;内伝』・『地理新書』とほぼ同一の「四神相応」の解釈を中国文献中に権認しようとしていた。それから、宮崎順子氏の「宋代の風水思想:『地理新書』を中心に」(關西大學中國文學會紀要24、2003年)からきっかけを得て、敦煌写本の研究も始めた。「S5645」と「P2615a」という敦煌写本には、「四神相応」の概念みたいな解釈が記されている。しかし、集まった史料の中に必要条件、樹木、数字に違いがある。この違いがある理由についての研究も始めた。最後に、「四神相応」にはいろんなモデルがあったことも確認した。集まった史料はほとんどすべて個人の邸宅に関する「四神相応」モデルだが、実は、『地理新書』という中国文献にはもう一つのモデルが見つかった。軍壘地形についての一節には、個人の邸宅のように、北は丘、西は道、南は汚地ですが、東は河ではなくて、林である。これから、ほかのモデルも出てくるかも知れない。25年度に、集まった史料(『作庭記』・『ほき内伝』・『地理新書・敦煌写本など)の徹底的な比較検証を続けた。それから、必要条件、樹木等の違いがある理由と最適地選択に必要な条件に関する文脈についての研究も続けた。「四神相応」の新解釈がどの時代まで遡るかも考察した。最後に、関連分野の研究者との意見交換するために研究会とシンポジウムを開催した。1月13日15日に、Hillary Pedersen (ヒラリー・ピーダセン)博士を招待して、奈良・平安時代の信仰・儀式についての研究会を開催した。1月27日29日に、風水に関するシンポジウム「Fengshui in Asiaand Beyond: Origins and Diasporas」及び現地見学会を開催した。24年度に、主に集まった史料(『作庭記』・『ほき内伝』・『地理新書』・敦煌写本など)の中の必要条件、樹木、数字の違いを調べた。多くある樹木の中で、特定の種類のみが好まれる理由と数字の根拠についての研究もした。また、「四神相応」にはいろんなモデルがあったことも確認した。

分析の結果、私が「作庭記法」と呼ぶ中に、二つの慣行が見分けられることが理解できる。古い慣行に分類される文献は、西に広い道を要求するという点に共通の特色がある。さらに、古い慣行はグループAに属する文献のみが該当する。これらの文献は、それぞれの方角に一種類ずつの樹木を指定するという共通項を有しており、特定の本数の樹木を植えることによる、地形的特徴条件の代替を認めている。加えて、樹木の種類に関しては統一が見られない。新しい慣行は、西側に長い道を条件とし、グループBに属する文献のみを含んでいる。これらの文献は、調和的な環境を作り出すため、それぞれの主要な方角(東西南北)に二種類の樹木を配置しており、それらの本数は明記していない。新しい史料を見つけられて、比較検証においても着実に進歩している。一つの論文は出版されて、もう一つは準備中(掲載確定)である。加えて、本研究のおかげでフンボルト大学ベルリンでの国際学会に招待されている。25年度が最終年度であるため、記入しない。二つの論文は出版されて、もう一つは準備中である。加えて、本研究のおかげでフンボルト大学ベルリンと明治大学での国際学会に招待されている。『作庭記』・『〓〓内伝』・『地理新書』・敦煌写本等の徹底的な比較塗証を続ける。それから、必要条件等の違いがある理由についての研究も続ける。最後に、「四神相応」の新解釈がどの時代まで遡るかを考察することになる。集まった史料の徹底的な比較検証を続ける。それから、必要条件、樹木等の違いがある理由と最適地選択に必要な条件に関する文脈についての研究も続ける。関連分野の研究者との意見交換するために研究会を開催する。
アメリカの移民政策をめぐる市民社会と政治との協働

2018年度は、前年度にハリケーンのため中断した現地調査を、移民をめぐる政治の展開に対応した形で組み換え、二度の現地調査を実施した。その一つが、トランプ政権下で連邦政府の移民政策が従来の包括的な統合をめざす流れと逆行する中で、州政府が移民の権利を保護する方向で政策を進めているという対立構造に関する調査である。事例としてカリフォルニアの動きを取り上げ、2018年5月にサクラメントにおいてカリフォルニア州議会議員および州政府と連携する市民社会団体の聴き取り調査を行った。カリフォルニアにおける移民問題の中心はラテン系であるが、アジア系などマイノリティ間の活動の提携関係の実態が浮かび上がり、調査の過程においてもも聴き取り対象範囲の拡大についての助言を受けた。もう一つは、2018年秋の選挙で連邦下院において民主党が多数派を取り戻し、新たな動きが生じたワシントンにおいて2019年3月に行った現地調査である。連邦政府への移民法改正に向けた働きかけを行う州議会連合体や立法化を支持する市民社会団体に対する聴き取り調査を行った。同時に、従来は移民問題とは関係してこなかった福祉団体が、移民問題とマイノリティ問題が重なりあう実情に向き合う中で活動範囲を移民の権利保護へと拡大する様子についても聴き取り調査を行った。前半の調査結果から浮かび上がった政府と市民社会の建設的な連携の方向性については紀要論文としてまとめた。後半の調査結果は、次年度の調査対象をさらに絞り込んでいくための資料として活用していく。2017年度に中止したマイアミ現地調査を組み換えて、州政府と連邦政府の状況がリアルタイムで展開しているカリフォルニアとワシントンでの現地調査を行うことで、前年度の遅れを取り戻した。基本的には計画に基づいて調査・研究を進めていく。ただし、2018年度の調査結果を活用するため、調査対象を拡大するのではなく、カリフォルニア州に絞って現地調査を継続する。2017年度は、アメリカの移民制度をめぐる最近の文献資料を入手し、対立点や課題をめぐる研究の動向を確認すると同時に、本課題において新たに取り組む地方政府や市民社会と移民政策の接合面を取り扱った研究を整理した。最初の現地調査の対象として、連邦政府による移民法改正の動向を調べるためにワシントンDCを選んだ。また、地方政府の対応事例として、ラテン系の中でもキューバ系を中心としたコミュニティを抱え、2016年大統領選挙でも移民問題が関心を集めたマイアミ市に絞った。議会のデータベースを利用しながら新たな移民法案をめぐる議論を整理し、中心的な立場にある議員への聴き取り調査に臨む計画であった。しかし、トランプ政権が若年層の非合法移民(DREAMER)への政策転換を発表する一方、議会での新たな法案成立の手続きが党派対立により進まなかった。そこで聴き取り調査の対象を市民社会に絞り、全国的な組織を持つ移民支援団体への聴き取り調査を実施した。聴き取り調査から、移民コミュニティが政権交代により受けた影響が浮き彫りになった。続けてマイアミにおいて研究者と移民コミュニティに対する聴き取り調査を予定していたが、日程がハリケーン襲来と重なり、州外避難命令が出されたため訪問を断念し帰国した。年度の後半は、議会による移民法改正が進まない中で、オバマ政権において非合法移民の救済のために用いられた行政措置が持つ政治的な意味を整理し、トランプ政権が発した行政命令と比較しながら論文としてまとめた。また、移民法改正が進まない大きな政治的環境としてのポピュリズムの興隆についての考察を、本の一章としてまとめた。現地調査の訪問予定であった2都市のうちの1都市が、移動中にハリケーン襲来で避難命令が出たため訪問できなくなったため、現地調査を中断して帰国することとなった。現地調査の中断により実施できなかった情報収集は、文献の購入と国内で開催された関連研究会に参加して意見交換する形で補足した。実施できなかった現地調査は、次年度以降に訪問を調整する予定である。

基本的には当初の予定通り調査研究を進めていき、次年度は移民に対して厳しい態度をとる州の現地調査に取り組む。ただし、非合法移民をめぐる姿勢の違いから、トランプ政権との間で法的対立が生じている州の現状を把握するため、中間選挙のタイミングで追加的に現地調査を行う。具体的にはカリフォルニア州を選び、州政府関係者および市民団体への聴き取り調査を行う。基本的には計画に基づいて調査・研究を進めていく。ただし、2018年度の調査結果を活用するため、調査対象を拡大するのではなく、カリフォルニア州に絞って現地調査を継続する。現地調査の訪問予定であった2都市のうちの1都市が、移動中にハリケーン襲来で避難命令が出たため訪問できなくなった。そのため現地調査を中断して帰国し、その期間の滞在費が未使用分として残った。現地調査で実施できなかった情報収集は、文献の購入と国内で開催された関連研究会に参加して意見交換する形で補足した。補足的な資料購入および国内出張の経費と、現地調査の中断により未使用となった経費との差額は次年度に繰り越し、次年度以降に訪問を調整する予定である。2017年度にハリケーンのため現地調査を中断し帰国したために生じた繰り越し分が2018年度予算に追加されている。2018年度はほぼ計画通りに研究活動が進展したことで、この繰り越し分が2019年度へと再度繰り越される結果となった。2018年度の2度の現地調査を通して調査対象をさらに具体化することができたため、2019年度は1)物品費で関連文献を入手し、2)旅費に繰り越し分を充当することで現地調査を拡充し、3)2018年と同じくアルバイトに調査結果の整理を依頼しながら、成果の発表へと繋いでいく予定である。
内皮分化における血管局所ホルモンの意義に関する発生学的検討と血管再生治療の試み

増殖性血管病変は、内皮細胞の機能破綻とそれに基づく血管平滑筋細胞の脱分化による遊走・増殖等によりもたらされる。従って、内皮細胞の機能分化の分子レベルでの解明は、内皮機能異常のメカニズムの理解に直結し、更に血管機能再生治療への応用につながる。本研究では、我々がこれまで一貫して研究してきたナトリウム利尿ペプチド系を中心に血管局所ホルモンに焦点を当て、その内皮再生分化における病態生理的意義に関し、特に発生学的手法を駆使して検討した。1.血管内皮増殖因子(Vascular Endothelial Growth Factor;VEGF)のヒト動脈硬化病変における発現とその機序の検討:これまで我々はVEGFが血管局所ホルモンであるCNP、エンドセリン分泌制御作用を有することを明らかにした。今回、免疫組織化学的検討により、ヒト冠動脈硬化病変において、病期の進展に伴い活性化した内皮細胞、及びプラーク内新生血管の内皮細胞においてVEGF発現が強く誘導されることを明らかにした。また、脱分化した血管平滑筋細胞やプラークに集簇するマクロファージにおいてVEGFの強い発現を認めた。更に、VEGFの受容体であるFlk-1、flt-1の発現もマクロファージを中心に検出され、動脈硬化症の発症及び進展におけるVEGFの病態生理的意義が示唆された。また培養ヒト冠動脈由来内皮細胞において酸化LDLによりVEGF発現が有意に亢進することを明らかにした。2.フローサイトメーターによるマウスES細胞からの内皮細胞前駆細胞のソーティングと内皮細胞分化における血管局所ホルモンの意義の検討:今回、Flk-1陽性マウスES細胞をフローサイトメーターによりセルソーティングし、VEGFを添加することにより内皮細胞に分化誘導し、更に三次元コラーゲンゲル内培養を行うことで管腔構造を構成することにも成功した。一方、ES細胞浮遊培養し、embryoid body(EB;胚様体)へ分化させ、その分化過程でVEGFファミリー、及びそのレセプター群(内皮細胞特異的レセプターチロシンキナーゼ)の発現を明らかにするとともに、CNP及びその受容体が血管発生初期からその発現の認められることを報告した。また、ラット胎児及び新生児期の肺組織において、CNPが肺血管系及び肺胞上皮発生分化過程でその発現が認められることも報告した。3.血管局所ホルモンのジーン・トランスファー及びトランスジェニックマウスによる血管再生における意義の検討:CNPcDNAを組み込んだ非増殖性アデノウィルス(Ad.CNP)を構築し、ウサギバルーン傷害モデルにAd.CNPを感染させた。その結果、大腿動脈新生内膜病変が40%抑制され、更に、血管平滑筋細胞の高分化マーカーであるSM-2発現の誘導を認めた。また、増殖性病変の抑制に伴い、内皮再生の有意の促進が認められた。また、CNP等ナトリウム利尿ペプチド及び一酸化窒素NOの共通の細胞内シグナルであるcGMPカスケードの主要なシグナル伝達物質であるヒトcGKタイプ1αをクローニングした。更に、サイトメガロウィルスエンハンサー、βアクチンプロモーターに連結したcGKをトランスジーンに用い、cGK.トランスジェニックマウス(Tg)を開発した。cGK.Tgでは、脳、心臓、血管、骨格筋にcGKの強い発現を認めた。新しい血管障害モデルとして、光化学励起法を用いcGK.Tgにおける増殖性血管病変の形成について検討し、その結果、cGKが血管保護的に作用する結果を得た。

また、ラット胎児及び新生児期の肺組織において、CNPが肺血管系及び肺胞上皮発生分化過程でその発現が認められることも報告した。3.血管局所ホルモンのジーン・トランスファー及びトランスジェニックマウスによる血管再生における意義の検討:CNPcDNAを組み込んだ非増殖性アデノウィルス(Ad.CNP)を構築し、ウサギバルーン傷害モデルにAd.CNPを感染させた。その結果、大腿動脈新生内膜病変が40%抑制され、更に、血管平滑筋細胞の高分化マーカーであるSM-2発現の誘導を認めた。また、増殖性病変の抑制に伴い、内皮再生の有意の促進が認められた。また、CNP等ナトリウム利尿ペプチド及び一酸化窒素NOの共通の細胞内シグナルであるcGMPカスケードの主要なシグナル伝達物質であるヒトcGKタイプ1αをクローニングした。更に、サイトメガロウィルスエンハンサー、βアクチンプロモーターに連結したcGKをトランスジーンに用い、cGK.トランスジェニックマウス(Tg)を開発した。cGK.Tgでは、脳、心臓、血管、骨格筋にcGKの強い発現を認めた。新しい血管障害モデルとして、光化学励起法を用いcGK.Tgにおける増殖性血管病変の形成について検討し、その結果、cGKが血管保護的に作用する結果を得た。増殖性血管病変は、内皮細胞の機能破綻とそれに基づく血管平滑筋細胞の脱分化による遊走・増殖等によりもたらされる。従って、内皮細胞の機能分化の分子レベルでの解明は、内皮機能異常のメカニズムの理解に直結し、更に血管機能再生治療への応用につながる。そこで本研究では、我々がこれまで一貫して研究してきたナトリウム利尿ペプチド系を中心に血管局所ホルモンに焦点を当て、その内皮再生分化における病態生理的意義に関し、特に発生学的手法を駆使して検討することを目的とする。本年度は以下の研究結果を得た。(1)ヒト冠動脈硬化病変における血管内皮細胞増殖因子(VEGF)及びその受容体(flk-1,flt-1)の発現の検討:ヒト冠動脈硬化病変において、内皮細胞でのVEGF発現が亢進していること、及び脱分化した血管平滑筋細胞及び病変部に集積するマクロファージにおいて、VEGF,flk-1,flt-1発現が認められることを明らかにした。(2)フローサイトメーターによるマウスES細胞からの内皮細胞前駆細胞のソーティングと内皮細胞分化における血管局所ホルモンの意義の検討:マウスES細胞より、VEGF受容体flk-1陽性細胞をFACSアナライザーによりソーティングし、この細胞にVEGFを添加することによりVEカドヘリン陽性の内皮細胞の誘導に成功した。更にこの細胞を用い、コラーゲンゲル三次元培養にて管腔構造の構成に成功した。(3) cGMP依存性プロテインキナーゼ(cGK)トランスジェニックマウスの開発と内皮損傷、血栓形成及び管平滑筋増殖モデルでの検討:サイトメガロウイルスエンハンサー、βアクチンプロモーターにヒトcGKIαcDNAを連結したトランスジーンを用いたcGK過剰発現トランスジェニックマウス(cGK.Tg)を開発した。cGK
アルブミンの肺内動態制御による新規薬物デリバリー法の構築

本研究は、アルブミンの肺内動態並びに薬物エスコート能の解明とそれらの制御を通して、アルブミンを薬物の輸送担体として肺局所及び全身性疾患の治療に応用するという、新規の薬物デリバリー法を構築することを目的として行っている。本年度は、まず、アルブミンの構造改変体(ダイマー、マンノース化体、PEG化体、凝集体)を調製し、これらをCy5で標識した後、ラット初代培養肺胞細胞単層膜透過性を観察し、アルブミン単独のデータと比較した。その結果、いずれの構造改変体もアルブミンより低い膜透過性を示すことが明らかとなった。本実験と並行して、ラット由来肺胞マクロファージ(NR8383)を用いた取り込み実験を行ったところ、マンノース化体および凝集体ではアルブミンおよび他の構造改変体に比べマクロファージへの取り込みが高いことが示唆された。このように、昨年度明らかにしたアルブミンの電荷の調整に加え、アルブミンの多量体化あるいは表面修飾によって、肺胞膜透過性、肺胞腔内滞留性さらにはマクロファージへの標的化等、薬物の肺内動態を制御できる可能性が示唆された。次に、ミカファンギンを用いてアルブミンあるいはダイマー共存下での膜透過性を検討したところ、ダイマー共存下での透過性がアルブミン共存下の場合よりも低いことが明らかになり、呼吸器真菌症などの肺局所の疾患への適応の可能性が示された。さらに、リファブチンを用いてマンノース化体共存下での肺胞マクロファージへの取り込みを検討したところ、有意ではないもののアルブミン共存下以上の取り込みが示され、肺結核などの疾患への利用が期待された。以上のように、薬物の肺内動態制御を目的としたデリバリーキャリアとしてアルブミンの利用に向けて有用な基礎知見を得ることができた。アルブミンの構造改変体と薬物の複数の組み合わせでの細胞透過実験ならびに取り込み実験に時間を要したため、阻害剤等を用いた透過・取り込み機構等の詳細に関する検討ができなかった。本年度の予備検討により、肺胞透過性、肺胞腔内滞留性、マクロファージ標的性を目的とするアルブミン構造改変体の選択の見通しが立ったため、動物を用いたその実証と透過・取り組み機構の詳細に関する検討を、構造改変体と薬物の組み合わせを絞り込んで効率的に行う予定である。本年度は、まず、アルブミンの構造改変体(カチオン化体、アニオン化体)を調製した。カチオン化体はエチレンジアミンにより、また、アニオン化体は無水コハク酸によりアルブミンを化学修飾し調製した。これらをCy5で標識した後、ラット初代培養肺胞細胞単層膜透過性を観察し、アルブミン単独のデータと比較した。その結果、カチオン化体はアルブミン以上の膜透過性を示し、エチレンジアミンによる修飾率が高いものほど透過性が良い傾向を示した。一方、アニオン化体はアルブミンと同程度かそれ以下の透過性を示した。このように、アルブミンの電荷の調製によって透過性を制御できる可能性が示唆された。次に、アルブミンに高い結合性を示す薬物のスクリーニングを行い、その中で高い結合性を示したインスリンデテミルを用い、その結合性を構造改変体でも確認した。その結果、今回用いた構造改変体へのインスリンデテミルの結合はアルブミンに比べ弱いことが確認された。さらに、インスリンデテミル単独とアルブミンあるいは構造改変体共存下での膜透過性を検討したところ、アルブミンあるいは構造改変体共存下での透過性が高いことが明らかになり、中でもカチオン化体での透過性が高かった。このように、薬物の肺胞透過におけるデリバリーキャリアとしてアルブミンが有効であり、さらに構造改変によりデリバリー効率を制御できる可能性が示唆された。アルブミンの構造改変体の調製に時間を要したため、多くの種類の構造改変体(ドメイン欠損体、ダイマー、マンノース化体、PEG化体等)を用いた検討ができなかった。

さらに、リファブチンを用いてマンノース化体共存下での肺胞マクロファージへの取り込みを検討したところ、有意ではないもののアルブミン共存下以上の取り込みが示され、肺結核などの疾患への利用が期待された。以上のように、薬物の肺内動態制御を目的としたデリバリーキャリアとしてアルブミンの利用に向けて有用な基礎知見を得ることができた。アルブミンの構造改変体と薬物の複数の組み合わせでの細胞透過実験ならびに取り込み実験に時間を要したため、阻害剤等を用いた透過・取り込み機構等の詳細に関する検討ができなかった。本年度の予備検討により、これら構造改変体(ドメイン欠損体、ダイマー、マンノース化体、PEG化体等)の作成法などについて見通しが立ったため、これらを用いた検討を行い、肺内動態制御に関する知見を蓄積する予定である。本年度の予備検討により、肺胞透過性、肺胞腔内滞留性、マクロファージ標的性を目的とするアルブミン構造改変体の選択の見通しが立ったため、動物を用いたその実証と透過・取り組み機構の詳細に関する検討を、構造改変体と薬物の組み合わせを絞り込んで効率的に行う予定である。当初試薬(タンパク定量用)を購入予定であったが、実験の進捗上使用する必要がなくなったため購入しなかった。次年度、構造改変体上のアミノ基の化学修飾率定量試薬(トリニトロベンゼンスルホン酸;TNBS)の購入に使用する予定である。アルブミンの蛍光標識を共同研究者が合成したCy5で行ったため、当初予定していたインドシアニングリーン標識のための試薬を購入する必要がなくなった。未使用額については、次年度実施予定の動物実験においてラットの購入に使用する計画である。
外洋性渦鞭毛藻類の系統分類学的研究

単細胞PCR法を用いて外洋性渦鞭毛藻類の形態記録を伴うDNA配列蓄積と分子系統解析を行った。ディノフィシス目6属32種,Ceratium属29種の観察・単細胞PCR処理を行った。系統解析結果から,ディノフィシス目の属分類の見直しを行い,さらに,藍藻類を細胞外共生体として持つものについては,ホストと共生藍藻は共に同じ2つの系統群に分かれたことからそれぞれ異なる共生藍藻を独立に獲得したことと,共生藍藻とホストとの種特異性を明らかにした。Ceratium属については,現在設立されている4つの亜属を初めて支持した。平成19年度9月から3月において、東シナ海海域(長崎県五島列島周辺海域)の合計30サンプルを検鏡した。その中から、主にCeratium属について29種68細胞、藍藻を細胞外共生体として持つものについて12種23細胞を観察・単細胞PCR処理を行った。日本における定期的な外洋性渦鞭毛藻類の出現調査・観察記録はなく、今回の結果は東シナ海日本周辺域における外洋性渦鞭毛藻類相とその多様性を示す、また、各種の季節的消長をも示すものとして重要であると言える。現在までに、Ornithocercus属について得られたDNA配列に基づく分子系統解析を行った。貧栄養な外洋では、藍藻類とプランクトン性真核生物の共生関係が見られる。そのうちの一つとして、ディノフィシス目に属するOrnithocercus属が知られている。これまで、Ornithocercus属の共生藍藻についてのDNA配列解析・TEM観察は行われており、その多様性や一つのホストに複数の藍藻が共生していることが示されているが、ホスト細胞についての研究はない。これまで解析をおこなったところまでで、Ornithocercus属3種(O.magnificus・5細胞、O.steinii・2細胞、O.thurnii・2細胞)について、光学顕微鏡観察を行った後に、ホストの18SrDNAとITS領域、共生藍藻の16SrDNAの配列を決定した。まず、ホストの18SrDNA配列の解析結果から、Ornithocercus属は単系統群となり、ディノフィシス目のタイプであるDinophysis属と姉妹群関係となった。これにより、Ornithocercus属のディノフィシス目への所属の妥当性が初めて示された。また、18SrDNA配列ではほとんど変異が無く種の識別は行えなかったが、ITS領域を用いた系統解析の結果、3種はそれぞれ単系統群となった。また、O.magnificusでは、2つのクレードに分かれ、それぞれに形態的差異が認められた。共生藍藻の分子系統解析の結果、今回得られたサンプルでは一つのホスト細胞のものからは単一の配列が得られ、その系統樹の樹形はホストの樹形と一致しており、ホストと共生藍藻との種特異性が示された。平成20年度4月から3月において,東シナ海海域(長崎県五島列島周辺海域)の合計48サンプル,広島大学練習船豊潮丸平成20年度第2次調査航海(広島県呉港沖縄県那覇港往復,平成20年5月1929日)において,合計29サンプルを検鏡した。その中から,主にCeratium属について29種133細胞,ディノフィシス目渦鞭毛藻類について6属32種65細胞を観察・単細胞PCR処理を行った。日本における定期的な外洋性渦鞭毛藻類の出現調査・観察記録はなく,今回の結果は東シナ海日本周辺域における外洋性渦鞭毛藻類相とその多様性を示す,また,2年連続で同じ時期,同じ地点において採水をしているため各種の季節的消長をも示し得るものとして重要であると言える。これまで,ディノフィシス目渦鞭毛藻類6属32種(Dinophysis5種,Ornithocercus3種,Histioneis2種,Parahistioneis1種,Amphisolenia1種,Triposolenia1種)のSSU rDNA配列とLSU rDNA部分配列の決定に成功した。系統解析の結果,ディノフィシス目の単系続性が示され,5つのクレード;(1:Amphisolenia,Triposolenia,(2:D. rotundata, D. rudgei,(3:D. schuetti, D. fortii, D. infundibulus,4:Ornithocercus spp.,5:Histioneis spp., Parahistioneis)))に分かれた。クレード2はPhalacromaの特徴を有しており,Phalacromaの独立性が示された。藍藻類を細胞外共生体として持つグループは,クレード4と5に分かれた。また,それらの持つ藍藻のSSU rDNA配列の決定にも成功し解析したところ,ホストのクレードと対応して2つに分かれ,それぞれ異なる藍藻類を細胞外共生体として獲得したことが明らかとなった。

さらに,ホストと共生体は種特異的な関係であることも明らかとなった。本研究での分岐順はこれまでの研究において形を基に考えられてきた進化の道筋とは大きく異なり,ディノフィシス目渦鞭毛藻類の形態進化は複雑であり,形態の変異は突発的であり,我々の想像を超えるものであった。Ceratium属についての系統解析の結果は,現在設立されている4つの亜属(Ceratium属,Amphiceratium亜属,Archaeceratium亜属,Tripoceratium亜属)を初めて指示した。
卵巣癌発癌機構の解明と微量核酸解析による癌早期発見を目指した新規検査法の開発

本研究は卵管上皮または卵巣由来からの微量細胞のTP53遺伝子変異を子宮頸部の液状細胞診検体中より次世代シークエンサーまたはデジタルPCRにて検出し、卵巣癌発症高リスク症例については癌早期発見を、卵巣癌既発症例には卵巣癌再発予測を早期に可能とする簡便な検査ツールを確立することである。卵巣癌は卵巣が腹腔内に存在することや検診対象臓器ではないことから早期発見が難しく婦人科腫瘍の中で最も予後が悪い。しかし、癌が卵巣内に限局したI期で対処された症例の5年生存率は90%以上であることから、早期発見の重要性は言うまでもない。そこで本研究は卵巣癌早期発見を目的とした有用な新規検査法の確立を目指して実施する。