hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
人工リボヌクレアーゼの合成と,ガン・エイズ治療への応用

本基盤研究により、ターゲットRNAを位置選択的に加水分解する人工リボヌクレアーゼの構築に成功した。具体的には、(1)tRNAの2本鎖部分にインターカレートするアントラキノンにリンカーを介してグリシンおよびイミノ二酢酸を導入した分子を用いて生理条件下でtRNAが位置選択的に加水分解されることが明らかになった。この切断は、末端のカルボキシラートとアンモニウムイオンが必須であり、これらの酸塩基協同触媒作用によって進行していることが示された。(2)種々のアミン類によるRNA加水分解反応に対する動力学的な検討を行ない、ジアミンによるRNA加水分解の反応機構を明らかにした。生理条件下におけるジアミン類によるRNAの加水分解は、ジアミン中のニュートラルなアミノ基がRNAの2'-位のプロトンを引抜くと当時に、もう一方のプロトン化したアミノ基が酸触媒として協同的に作用することにより進行していることが示された。(3)側鎖にベンジルエステルやエチルエステルをもつホスホロアミダイトモノマーの合成に成功した。また、このアミダイトを用いてDNAオリゴマーの中央にオリゴアミンを配した人工リボヌクレアーゼの構築し、RNA切断を行なったところ、標的とした位置でより選択的にターゲットRNAが加水分解されることが明らかとなった。以上のように、ターゲットRNAを位置選択的に切断することが可能となった。これらの結果を発展させ、人工リボザイムを細胞へ導入することにより、遺伝子発現の制御やガン・エイズ等の治療が可能となると考えられる。従来RNAの特定の塩基配列を認識してこれを選択的に切断する天然酵素は全く知られていなかったが、RNA酵素(リボザイム)がターゲットRNAを選択的に切断することが発見され大いなる注目を集めてきた。しかし、RNA酵素には、切断できる塩基配列にある一定の制限があること、RNAであるので生体内の酵素により分解され易いこと、ならびに特定の化学構造が必須であることなどの欠点がある。すでに、我々は、エチレンジアミンやジエチレントリアミンのようなオリゴアミンを触媒として用いると、温和な条件でRNAが容易に切断できることを見いだしている。さらに、ターゲットのRNAの特異的な位置に結合する塩基配列認識部位(合成オリゴマーDNA)にオリゴアミンを結合することにより、ターゲットRNAを選択的に切断する人工リボヌクレアーゼを構築することにも成功している。本研究では、触媒活性部位と塩基配列認識部位を結ぶリンカーをはじめとして種々の部分の分子構造を系統的に変化させ、人工リボヌクレアーゼの最適化を行うことを目的とした。触媒活性部位の最適化のため、種々のオリゴアミンを用いてオリゴマーRNAの切断実験を行ったところ、特にトリス(2-アミノエチル)アミンやエチレンジアミンが高活性であった。さらに、種々のオリゴアミンをカルボニルジイミダゾールで活性化したオリゴマーDNAの5′端にウレタン結合を介して導入した人工リボヌクレアーゼを用い、オリゴアミンの分子構造と切断活性の相関を明らかにした。RNAを塩基配列特異的に切断する人工リボヌクレアーゼが開発されれば,その意義は極めて大きい。我々は,すでに,エチレンジアミンやジエチレントリアミンのようなオリゴアミン類を触媒として用いると,温和な条件でRNAが容易に加水分解されること報告している。本研究では,種々のアミン類によるRNA加水分解反応に対する動力学的な検討を行ない,ジアミンによるRNA加水分解の反応機構を明らかにした。生理条件下におけるジアミン類によるRANの加水分解は,ジアミン中のニュートラルなアミノ基がRNAの2'-位のプロトンを引抜くと同時に,もう一方のプロトン化したアミノ基が酸触媒として効率的に働くことにより進行すると推定される。また,オリゴアミンをターゲットRNAの特異的な位置に結合する塩基配列認識部位(合成DNAオリゴマー)の5'-末端に結合することで,ターゲットRNAを塩基配列特異的に加水分解する人工リボヌクリアーゼを構築することにも成功した。さらに,側鎖にベンジルエステルやエチルエステルをもつホスホロアミダイトモノマーの合成に成功した。

このアミダイトを用いて,塩基配列認識部位の中央にオリゴアミンを配した人工リボヌクレアーゼの構築を行なった。本人工リボヌクリアーゼを用いてRNAの加水分解を行なったところ,塩基配列認識部位とオリゴアミンを結合するリンカー部分の揺らぎを最小限に押えられ,標的とした位置でより効率的にターゲットRNAが加水分解されることが明らかとなった。
硬組織形成細胞の遺伝子発現調節に関する分子生物学的研究

完成したエナメル質は生体内で最も高度に石灰化した組織で、有機質は殆ど含まれていないが、形成初期のエナメル質には約30%ものタンパク質(主としてアメロジェニン)が含まれており、これが石灰化の進行にともなってエナメル質から消失していく。このエナメルタンパク質は分化したエナメル芽細胞によりエナメル質形成過程の一時期にだけ合成され、細胞外に分泌され、その石灰化に重要な役割を演じていると考えられているが、その分子レベルでのメカニズムについては明かではない。本研究ではエナメル芽細胞の分化およびエナメル質形成の機構を明らかにする目的で、アメロジェニン遺伝子についての分子生物学的研究を行った。また骨形成と骨吸収の分子生物学的研究をおこなう手始めとして、矯正学的歯の移動にともなう骨改造をモデルとして用い、骨改造機構における骨有機基質タンパク質についてin situ hybridization法を用いて検討した。その結果以下の成果が得られた。(1)ヒト・アメロジェニン・プロモーターのクローニングを行った。(2)性染色体上のアメロジェニン遺伝子の同定法の開発。アメロジェニンの遺伝子は、ヒトにおいてはXおよびY染色体上に存在することが明らかになっているが、微量の染色体DNAを用いて、簡便にこれらの遺伝子を検出する方法を開発し、性の鑑別に用いることができることを明らかにした。(3)Y染色体上のアメロジェニン遺伝子が発現していることを証明した。(4)マウス・アメロジェニンの染色体DNAをクローニングした。(5)歯の移動にともなう骨改造における骨タンパク質の発現パターンの解析。完成したエナメル質歯生体内で最も高度に石灰化した組織で、有機質は殆ど含まれていないが、形成初期のエナメル質には約30%ものタンパク質(アメロゲニンを主成分とする)が含まれており、これが石灰化の進行にともなってエナメル質から消失していく。このエナメル質は分化したエナメル芽細胞によりエナメル質形成過程の一時期にだけ合成され、細胞外に分泌され、その石灰化に重要な役割を演じていると考えられている。エナメル芽細胞や象牙芽細胞の分化は歯胚の発生過程で未分化な上皮と間葉系細胞の相互作用により誘導されていると考えられているが、その分子レベルでのメカニズムについては明かではない。本研究ではエナメル芽細胞、象牙芽細胞、骨芽細胞の分化の機構を明らかにする目的で、アメロゲニン、エナメリン、phosphophoryn、オステオネクチン、オステオカルシン、オステオポンチン、コラゲナーゼなどのcDNAや抗体を作製し、それらをプローブとしてこれら硬組織形成細胞細胞の分化誘導機構の解明を行うことを目的としている。当該年度までに以下の成果が得られている。1)PCR法を用いてヒト・アメロゲニンプロモーター領域を増幅し、クローニングした。2)アメロゲニン遺伝子はXおよびY染色体上にあるが、Y染色体上の遺伝子が活性のある遺伝子で、mRNAおよびアメロゲニン・タンパク質を合成していることを、PT-PCR法を用いて証明した。(1994IADRにて発表)3)マウス・アメロゲニンの染色体DNAをクローニングした。4)エナメリンを精製し、そのN末端側20個のアミノ酸配列を決め、そのアミノ酸配列に相当するペプチドを化学合成し、さらにそれに対するポリクローナル抗体を得た。本研究ではエナメル芽細胞の分化および形成の機構を明らかにする目的で、アメロジェニン遺伝子についての分子生物学的研究を行った。

また骨形成と骨吸収の分子生物学的研究をおこなう手始めとして、矯正学的歯の移動にともなう骨改造をモデルとして用い、骨改造機構における骨有機基質タンパク質についてin situ hybridization法を用いて検討した。その結果以下の成果が得られた。(1)性染色体上のアメロジェニン遺伝子の同定法の開発アメロジェニンの遺伝子は、ヒトにおいてはXおよびY染色体上に存在することが明らかになっているが、微量の染色体DNAを用いて、簡便にこれらの遺伝子を検出する方法を開発し、性の鑑別に用いることができることを明らかにした。(2)Y染色体上のアメロジェニン遺伝子発現の証明。アメロジェニン遺伝子がヒトやウシではXおよびY染色体上に存在することが明らかになっているが、Y染色体上の遺伝子が発現していることを、ウシの同一個体の永久歯歯胚を用いて、エナメル質から抽出したアメロジェニン・タンパク質の二次元電気泳動像、およびその特徴的なスポットのアミノ酸配列の比較、同じ歯胚から抽出したmRNAのin vitro translation産物の二次元電気泳動像などから証明した。(3)歯の矯正学的移動にともなう骨改造における骨タンパク質の発現パターンの特徴。ラットの矯正学的歯の移動を実験的に起こさせ、骨改造に伴うコラーゲンや骨シアロタンパク質のmRNAの発現について検索し、それらの特徴的な発現パターンを明らかにした。
尾張藩鷹場制度の研究

さきに提出した研究計画調書にもとづき、東京都内、三重県中・北部、名古屋市内において、史料と文献の蒐集を行い、解読・分析作業をすすめた。これらの作業を通じて本年度中に明らかにした点は、以下の通りである。1.尾張藩の鷹場制度のうち、現在最も研究が進んでいる江戸周辺地域の鷹場については、東京都区内および多摩地域において、史料・文献調査およびフィールド・ワークを行った。この結果、(1)尾張藩が、同藩の江戸周辺鷹場を、「御鷹場村々之儀者御料所又者他之御領分御知行ニ付、御国表御取扱与者御模様も相違仕候儀ニ付」(徳川林政史研究所所蔵「手続書」)と、自領がなく他領ばかりであるため、国元の鷹場とは扱いが異なると認識していたこと、(2)この認識にもとづき地域の有力者を鷹場預り役に任命することで鷹場支配を行っていたこと、(3)鷹場預り役は、近世前期の中世的系譜を引く有力農民から、近世後期には新たに台頭してきた豪農層へと幅を広げ、両者の間に緊張関係が生じていたこと、などの諸点が明らかになった。2.三重県北部の北勢地域の尾張藩鷹場制度の実態を明らかにするために、三重県各地において史料調査とフィールド・ワークを行い、亀山藩領内に同藩鷹場が存在したことが明らかになった。3.名古屋城下の鷹場制度については、「鸚鵡篭中記」をはじめ『愛知県史』『名古屋市史』などの解読をすすめ、鷹場のおよその範囲を確定するに至った。以上、13の作業を通して、尾張藩が3か所の鷹場それぞれに藩独自の支配権を行使していたことが明らかとなったが、職制の細部などについては、なお今後の課題となった。今年度の研究成果は、今後学会誌・研究報告書などを通して、順次発表していく予定である。
もやもや病のエピゲノム血液バイオマーカー探索ー血漿microRNAの包括的検証ー

RNF213遺伝子は、もやもや病の遺伝的素因を規定する感受性遺伝子の一つであるが、発病に至る病態は未だ解明の途上である。我々はmicroRNAが制御するエピゲノム環境が、発症素因を修飾して、もやもや病の発病機序に関与するとの仮説を立てた。先行研究で同定したもやもや病特異的血漿microRNAが、もやもや病の血液診断マーカーとなりうるか?、レジストリ・生体試料・ゲノムバンクを利用して包括的に検証する。ハイリスク患者のスクリーニングと先制医療開発のシーズとなることが期待できる。
心因性顎関節症患者の特徴

顎関節症は多因子性の疾患であり,咬合に起因する顎関節症患者でも,心理的要因が深く関わっていることが日常の臨床から容易に推測される.しかしこれまでの報告では,顎関節症患者の臨床症状と精神的ストレスとの関係は明らかにされていない.そこで本研究では,歯科治療時における精神的ストレスが,患者に及ぼす影響の特徴を検索し,精神的ストレスと患者の臨床症状との関係を明らかにすることを目的とした.被験者は,当科に来院した患者18名(男性9名,女性9名,年齢2062歳,平均34.6歳)で,歯冠修復の形成が必要な症例を用いた.実験は,高感度発汗測定装置を用いて,以下の治療等を行い,精神性発汗を経時的に記録・測定し,精神的ストレスの変化およびその程度を分析した.治療内容は,歯冠修復のために形成,印象および暫間被覆冠の装着とし,症例によっては浸麻および修復物除去を行った.また,治療中における体位の変化および術者との会話など,治療中の環境の変化についても検討した.その結果,以下のこしが明らかになった.1.被験者により,応答性,応答する処置内容が異なっていた.2.被験者の体位変化および会話に対応して高頻度(80100%)に応答が認められた.3.被験者は,応答頻度の低い群と高い群に分けられることが示唆された.4.姿勢変化および会話では,いずれの群でも同様に高頻度で応答した.一方,歯科治療については,応答性の低い群では,いずれの処置においても応答しなかった.以上の結果より,当教室で開発した発汗測定装置が患者の精神反応の測定に有用であることが明らかになった.また,患者には精神反応を惹起し易い者とそうでない者が存在し,さらに歯科治療の内容によってもその応答性が異なることが明らかになった.今後,顎関節症患者についても実験し,精神的ストレスと顎関節症との関係を明らかにしていく所存である.顎関節症は多因子性の疾患であり,咬合に起因する顎関節症患者でも,心理的要因が深く関わっていることが日常の臨床から容易に推測される.しかしこれまでの報告では,顎関節症患者の臨床症状と精神的ストレスとの関係は明らかにされていない.そこで本研究では,歯科治療時における精神的ストレスが,患者に及ぼす影響の特徴を検索し,精神的ストレスと患者の臨床症状との関係を明らかにすることを目的とした.被験者は,当科に来院した患者18名(男性9名,女性9名,年齢2062歳,平均34.6歳)で,歯冠修復の形成が必要な症例を用いた.実験は,高感度発汗測定装置を用いて,以下の治療等を行い,精神性発汗を経時的に記録・測定し,精神的ストレスの変化およびその程度を分析した.治療内容は,歯冠修復のために形成,印象および暫間被覆冠の装着とし,症例によっては浸麻および修復物除去を行った.また,治療中における体位の変化および術者との会話など,治療中の環境の変化についても検討した.その結果,以下のこしが明らかになった.1.被験者により,応答性,応答する処置内容が異なっていた.2.被験者の体位変化および会話に対応して高頻度(80100%)に応答が認められた.3.被験者は,応答頻度の低い群と高い群に分けられることが示唆された.4.姿勢変化および会話では,いずれの群でも同様に高頻度で応答した.一方,歯科治療については,応答性の低い群では,いずれの処置においても応答しなかった.以上の結果より,当教室で開発した発汗測定装置が患者の精神反応の測定に有用であることが明らかになった.また,患者には精神反応を惹起し易い者とそうでない者が存在し,さらに歯科治療の内容によってもその応答性が異なることが明らかになった.今後,顎関節症患者についても実験し,精神的ストレスと顎関節症との関係を明らかにしていく所存である.
重金属-ペプチド錯体を用いた一酸化窒素の水溶液ESRによる検出

重金属イオンに対して、ジチオカルバメートと同様の配置環境を作ると予想される、チオール基を有するアミノ酸であるシステインの鉄(III)錯体を水溶液中で形成させ、この系中でNOドナーであるS-nitroso-N-acetylpenicillamine(SNAP)からNOを発生させてESRを測定したところ、特定のFe^<3+>vsシステイン比の系で、安定な、超微細分裂を示す信号が得られ、鉄(III)-チオレート錯体によっても、水溶液中でNO捕捉が行われることを確認した[第33回ESR討論会,1994年9月,東北大工,にて発表]。従って、ジチオカルバメートに代え、チオール基を有するペプチドは配位子とした系で、研究を続行した。2.研究計画3に沿って、様々なシークエンスのシステインペプチドを合成し、その鉄(III)錯体によるNO捕捉を試みた。その結果、テトラペプチドノナペプチドのほとんどが、被捕捉NOによるESRスペクトルを与えた。また、これらのスペクトルから、ペプチド鎖長やペプチドシークエンス中のシステイン残基数、あるいは配置に依存して、超微細分裂の様子や超微細結合定数が異なることがわかり、またこれらのESRパラメータは単分子チオール基の鉄(III)錯体の結果とも、まったく異なることが分かった。すなわち、ペプチド鎖の形成がチオール基の鉄(III)イオンとの錯形成およびそれら錯体の電子状態に、さらにはNO捕捉の結果生成する鉄(III)-チオレート-NO錯体の電子状態にも大きな影響を与える事が、明らかになった。[第69回日本化学会春期年会にて発表]。現在、ペプチド鎖のタイプと鉄(III)錯体の電子状態との関連を系統的に検討中である。
μ粒子稀崩壊探索実験

本研究は、μ粒子の稀崩壊現象の探索を通じて、世界に先駆け、大統一理論の検証を行う事を目的としている。稀崩壊現象を探索する本研究においては、1秒間に1,000万個という大量のμ粒子の崩壊現象を観測する。μ粒子は、ただちに、陽電子、γ線、及びニュートリノに崩壊するが、陽電子をドリフトチェンバーを用いて観測する。ドリフトチェンバー内に陽電子の飛跡が残され、この飛跡を再構成(トラッキング)することにより、陽電子の運動量と放出角を算出する。この再構成を正確に行う事が、研究遂行上、極めて重要である。前述のように、大量のμ粒子の崩壊がするため、ドリフトチェンバー内には大量の荷電粒子の飛跡が残り、これらがデータとして記録される。この中から、目的とするシグナルと雑音を分別し、運動量を算出する事は容易ではない。高計数率に加え、ドリフトチェンバー内での多重散乱も考慮する必要があるためである。helix fittingはそのアルゴリズムが単純である為、高速な計算が可能であるからである。ドリフトチェンバーに記録された大量の荷電粒子の飛跡を、helix fittingを用いて再構成する研究、及び算出される運動量や放出角についての精度についての研究を進めた。液体キセノンγ線検出器の内部に配置される構造物の最終設計を行った。本研究において、液体キセノンγ線検出器はγ線を高精度で測定する中核的な検出器である。液体キセノンより発せられる真空紫外光の観測によりγ線を計測する仕組みだが、キセノンに水、酸素などの不純物が含まれると、キセノンの吸収長が短くなり、γ線の計測が困難となる。即ち、キセノンが汚染されないよう工夫された検出器の設計が極めて重要であり、私はこの設計に携わった。具体例としては、真空紫外光を観測する光電子増倍管の背面の設計である。設計条件として、キセノンを汚染しない物質である事、光電子増倍管の動作を悪化させない物質で充填率を最大にあげる事、ガンマ線に対する放射長が長い事、等が挙げられる。これら条件を満たす物質として、アセタール樹脂とクオーツガラスを選定した。更に、これら材料と光電子増倍管を用い、液体キセノンの吸収長が悪化しない事確かめる為の実験を行った。実験には、8リットルの液体キセノン、真空システム、データ取得システムを用いた。真空システムやデータ取得システムには、本実験用の改良が加えられた。結果、液体キセノンの吸収長が大幅に悪化しないことが確認された。更に、モンテカルロシミュレーションにより、解析技術の開発と、検出器の感度限界についての詳細な計算を行った。本研究においては、波形解析技術の開発や、γ線検出器内に配置された光電子増倍管からの信号を組み合わせて解析を行う、光量分布解析の開発が行われている。これらの解析技術により、優れたγ線の時間分解能とパイルアップ現象の同定が可能となる期待されている。私は、光量分布による解析の開発に着手し、波形解析と併せて検出器の感度限界を詳細に計算し、2年間に渡るデータ取得により、本研究が到達目標とする大統一理論の検証が達成可能である事を具体的に示した。18年度は、実験にて取得するデータの種類と統計を、より正確に決定するためのシミュレーションの開発と、実験の更なる分解能向上を睨んだ新しい光検出器の開発実験の準備を行った。本研究課題では、1秒間に10^7個のμ粒子の崩壊を測定するため、複数個のμ粒子の崩壊現象が一度にデータとして記録される。これを正確にトリガーも含めてシミュレートするソフトの開発は、実験にて取得するデータの種類や統計を決定する上で必要不可欠である為、18年度の初旬より、この開発に着手した。トリガーシミュレーションとしては、実験にて予定されているトリガーをほぼ全て網羅するよう、全9種類開発した。具体的には、μ→eγ崩壊の探索用トリガー、陽電子スペクトロメーターの較正用に用いられる、μ粒子通常崩壊の測定トリガー、γ線検出器と陽電子スペクトロメーターの時間較正に用いられる、μ粒子輻射崩壊の測定トリガー、γ線検出器内に配置されている光電子増倍管の較正に用いられる、アルファ線源の測定トリガー等である。これと平行して18年度中旬より、陽電子スペクトロメーター用トラッキングソフトの開発に着手した。トラッキングでは、ドリフトチェンバーにて記録される複数個の陽電子の軌跡から各粒子の運動量を1%の精度で再構成する事を目指すが、18年度は、Hough変換やConformal mapping技術を用いて、複数個の陽電子の軌跡を識別するパターン識別機能を開発した。18年度中旬より、実験の更なる分解能向上を目指した新しい光検出器であるマルチアノード光電子増倍管の開発実験の準備を行った。この光電子増倍管は、液体キセノンγ線検出器内で使用し、γ線の位置分解能の向上が見込まれる。液体キセノン中でその性能を評価する事が重要であり、性能評価実験のための実験機材の設計、製作を行った。

ドリフトチェンバー内に陽電子の飛跡が残され、この飛跡を再構成(トラッキング)することにより、陽電子の運動量と放出角を算出する。この再構成を正確に行う事が、研究遂行上、極めて重要である。前述のように、大量のμ粒子の崩壊がするため、ドリフトチェンバー内には大量の荷電粒子の飛跡が残り、これらがデータとして記録される。この中から、目的とするシグナルと雑音を分別し、運動量を算出する事は容易ではない。高計数率に加え、ドリフトチェンバー内での多重散乱も考慮する必要があるためである。helix fittingはそのアルゴリズムが単純である為、高速な計算が可能であるからである。ドリフトチェンバーに記録された大量の荷電粒子の飛跡を、helix fittingを用いて再構成する研究、及び算出される運動量や放出角についての精度についての研究を進めた。
骨組織における副甲状腺ホルモン関連ペプチドの生物学的作用

我々は、副甲状腺ホルモン関連ペプチド(PTHRP)およびそのレセプターに対する一連の分子細胞生物学的検索を行い、平成8年度中に関連論文で国際雑誌に約10編を報告するとともに、国際および国内学会において活発に活動している。従来我々は腫瘍関連タンパクとして発見されたPTHRPが、正常組織の発生に重要な役割を果たすタンパクであることを明らかにし、特に軟骨や骨組織の形態形成および細胞の分化増殖におよぼす作用を分子細胞生物学的に検索してきた。前年度の主だった研究を挙げると、遺伝子組み替えにより、PTHRPの相同遺伝子を一部削除したHeterozygousミュータントマウスを検索し、個体成長に伴いその異常が蓄積し著明になること、さらにPTHRPやレセプターの局在や遺伝子発現を明らかにしている(Amizuka et al.Deve.Biol.)。またPTHRP欠損Homozygousマウスでは軟骨の発達が著しく阻害されるばかりでなく、軟骨細胞のアポトーシス(細胞死)が促進され、軟骨から骨への置換部位で軟骨内骨化が抑制されていることを報告している(Amizuka et al.,Endocrinology)。PTHRPに対するレセプターであるPTH/PTHRPレセプターでについても検索しており、軟骨細胞と骨芽細胞および腎臓の細胞を用いて、PTH/PTHRPレセプターの遺伝子発現における上流と下流のプロモーターの機能についてin situ hybridizationを用いて解明している(Amizuka et al.,Endocrinology)。また、PTHRPは本来、腫瘍にて発見されたことから、腫瘍細胞におけるPTHRPが細胞増殖にも関与するとともに、細胞内プロセッシングにも関与していることを明らかにしている(Bin et al,Int.J.Cancer,Sidler et al.,J.Clin.Endcorinol.Metab.)。
聴覚・視覚の複数レベル実時間情報統合の研究

ヒューマノイドと人間との柔軟なコミュニケーションのために,混合音を聞き分け理解する機能を設計することを目的としている.平成15年度は,前年度開発をした方向情報や話者情報などの複数のレベルで視覚と聴覚を統合したアクティブ方向通過型フィルタ(ADPF)の高性能化,及び,ADPFを使用した音源分離システムと音声認識システムのインタフェース化を行い,簡単な3話者同時発話認識を,複数のロボット上に実現した.また,日本ロボット学会に「ロボット聴覚」研究専門委員会を設立した.(1)アクティブ方向通過型フィルタ(ADPF)の散乱理論による高性能化:画像と音から得られる話者の方向情報を基に,特定の方向からの音を分離するADPFでは,2本のマイクロフォンで得られる入力音から求めた両耳間位相差と両耳間強度差を用いて方向情報を得ていた.聴覚エピポーラ幾何に加えて散乱理論により頭部音響伝達関数の近似精度を向上させた結果,30度以上の周辺領域で音源定位と音源分離性能を大幅に向上させることができた.さらに,2種類のヒューマノイドロボット,SIG2とReplieに実装し,本手法の一般性を確認した.(2)3話者同時発話認識(聖徳太子ロボットの予備実験):昨年5月に放映された「鉄腕アトムを作る」(NHK)では方向と話者に依存した音響モデルを使用し3話者同時発話認識を行っていた.ADFPで得られる分離音は,周波数成分での特徴量が欠け,時間成分でのデータも喪失しているので,単一の音響モデルで済ませるために,ミッシングフィーチャ理論に基づいた音声認識システムを開発し,演繹ミッシングマスクにより,分離音の認識精度が大幅に向上することを確認した.(3)音一般の認識と対話システムへの展開:音声を用いた柔軟な対話システム構築のために,音声認識誤りに確信度を導入し,不要な問い合わせを解消する方法を開発した.また,非音声認識のために,楽器音認識と擬音語認識にも取り組み,単音について認識技法を確立した.ヒューマノイドと人間との柔軟なコミュニケーションのために,混合音を聞き分け理解する機能を設計することを目的としている.平成15年度は,前年度開発をした方向情報や話者情報などの複数のレベルで視覚と聴覚を統合したアクティブ方向通過型フィルタ(ADPF)の高性能化,及び,ADPFを使用した音源分離システムと音声認識システムのインタフェース化を行い,簡単な3話者同時発話認識を,複数のロボット上に実現した.また,日本ロボット学会に「ロボット聴覚」研究専門委員会を設立した.(1)アクティブ方向通過型フィルタ(ADPF)の散乱理論による高性能化:画像と音から得られる話者の方向情報を基に,特定の方向からの音を分離するADPFでは,2本のマイクロフォンで得られる入力音から求めた両耳間位相差と両耳間強度差を用いて方向情報を得ていた.聴覚エピポーラ幾何に加えて散乱理論により頭部音響伝達関数の近似精度を向上させた結果,30度以上の周辺領域で音源定位と音源分離性能を大幅に向上させることができた.さらに,2種類のヒューマノイドロボット,SIG2とReplieに実装し,本手法の一般性を確認した.(2)3話者同時発話認識(聖徳太子ロボットの予備実験):昨年5月に放映された「鉄腕アトムを作る」(NHK)では方向と話者に依存した音響モデルを使用し3話者同時発話認識を行っていた.ADFPで得られる分離音は,周波数成分での特徴量が欠け,時間成分でのデータも喪失しているので,単一の音響モデルで済ませるために,ミッシングフィーチャ理論に基づいた音声認識システムを開発し,演繹ミッシングマスクにより,分離音の認識精度が大幅に向上することを確認した.(3)音一般の認識と対話システムへの展開:音声を用いた柔軟な対話システム構築のために,音声認識誤りに確信度を導入し,不要な問い合わせを解消する方法を開発した.また,非音声認識のために,楽器音認識と擬音語認識にも取り組み,単音について認識技法を確立した.
ナスの６種類の細胞質雄性不稔系統の発現様式及び特性の解明

本研究室では、Solanum virginianumの細胞質をもつナス細胞質置換系統(A系統)において、葉緑体DNAの組換え型が出現し、機能的雄性不稔性を示すことを明らかにしている。本研究では、2009年にS. virginianumとナスとの間に新たに育成したB系統のBC1に戻し交雑を繰り返し育成したBC3において、花粉稔性および種子稔性、細胞質DNAの調査を行い、A系統と比較した。その結果、B系統は開葯すること、花粉稔性がA系統より低いことおよび葉緑体DNAがS. virginianum型であるという結果が得られた。これらの違いは、葉緑体DNAの違いに起因していると考えられる。応募者はこれまで、戻し交雑核置換法によるナスの細胞質置換を行ってきた結果、Solanum anguivi、S. kurzii、S. violaceum、S.virginianum、S. aethiopicumおよびS. grandifoliumの各細胞質をもつ細胞質置換系統の育成に成功し、これらがすべてCMSを示すことを明らかにした.本研究では、これらの示す雄性不稔性の詳細について明らかにする。昨年度までの研究から、S. kurzii、S. violaceum、S. virginianumの細胞質をもつナス細胞質置換系統は、葯内に花粉を形成するものの、開花時に全く葯を開かない葯裂開不全型の雄性不稔性を示すこと及びS. anguivi、S. aethiopicumおよびS. grandifoliumの細胞質をもつナス細胞質置換系統は、葯内において花粉が全くできないという花粉形成不全型の雄性不稔性を示すことが明らかにした。本研究室では、ナス属野生種の細胞質を用いたナスの雄性不稔系統の育成に関する研究を行っており、これまでに戻し交雑で育成したSolanum virginianumの細胞質をもつナス細胞質置換系統(A系統)において、葉緑体DNAの組換え型が出現し、これが開花しても開葯しないタイプの機能的雄性不稔性を示すことを明らかにしている。本年度では、2009年にS. virginianumとナス`千両二号'のF1にナス`Uttara'を交配して新たに育成したB系統のBC1に戻し交雑を繰り返し育成したBC3において、花粉稔性および種子稔性、細胞質DNAの調査を行い、葉緑体DNAの組換え型であるA系統と比較した。その結果、B系統では、葯の先端が裂開し花粉の放出性が認められたのに対し、A系統では葯の先端が裂開しておらず花粉の放出性が認められなかった。さらに、花粉稔性がB系統がA系統より低いことが確認された。また、ミトコンドリアDNAの2領域(nad7/3-4およびV7)において制限酵素AluIおよびScrFIを用いて処理した結果、A系統およびB系統ともにS. virginianum型の制限パターンであった。また、葉緑体DNAの3領域(matK AF-MR,rpoC1-C2およびrbcL-ORF106)において制限酵素24種を用いた結果、B系統はS. virginianum型であった。これらの結果から、今回作出したB系統は細胞質DNAが母性遺伝したものであることが確認された。A系統においては、葉緑体DNAにおいてmatK AF-MR,rpoC1-C2およびrbcL-ORF106の領域で父性遺伝している箇所が確認され、rbcL-ORF106領域では組換えも確認された。以上のことから、これらA系統とB系統の性質の違いは、組換えによって生じた葉緑体DNAの違いに起因していると考えられる。応募者はこれまで、戻し交雑核置換法によるナスの細胞質置換を行ってきた結果、Solanum anguivi、S. kurzii、S. violaceum、S. virginianum、S. aethiopicumおよびS. grandifoliumの各細胞質をもつ細胞質置換系統の育成に成功し、これらがすべてCMSを示すことを明らかにした.本研究では、これらの示す雄性不稔性の詳細について明らかにする。まず、S. kurzii、S. violaceum、S. virginianumの細胞質をもつナス細胞質置換系統は、葯内に花粉を形成するものの、開花時に全く葯を開かない葯裂開不全型の雄性不稔性を示すことが明らかとなった。また、これらの雄性不稔性は約5ヶ月という比較的長い栽培期間で安定した雄性不稔性を示した。葯内の花粉の稔性は、どれも50%程度あった。しかし、花粉の人工培地上での発芽率はどれも10%未満であった。したがって、3系統とも雄性不稔性として実用レベルにあることが示唆された。

つぎに、S. anguivi、S. aethiopicumおよびS. grandifoliumの細胞質をもつナス細胞質置換系統は、葯内において花粉が全くできないという花粉形成不全型の雄性不稔性を示すことが明らかとなった。したがって、こちらの3系統も雄性不稔性として実用レベルにあることが示唆された。Solanum anguivi、S. kurzii、S. violaceum、S. virginianum、S. aethiopicumおよびS. grandifoliumの各細胞質をもつナス細胞質置換系統が、葯裂開不全型および花粉形成不全型のいずれかの雄性不稔性を示すことを明らかにした。さらに、花粉の稔性を詳細の明らかしていることが大きく評価できる点である。今後は、花粉稔性に加えて種子稔性について詳しく調べる予定である。これによって、各CMSの発現の程度・様相を明らかにする。さらに、季節変化に対するCMSの発現の変化の有無についても明らかにする。また、オルガネラの両性遺伝現象の解析も明らかにする予定である。各CMS系統を育成する際の各世代の実生について、細胞質DNA(葉緑体及びミトコンドリアDNA)を詳細に分析することでオルガネラの両性遺伝現象の様相を解明し、交雑による細胞質改変への応用の可能性を探る。一方、CMS系統識別法の開発も行う。CMS系統が実用化された際の権利保護のために、葉緑体及びミトコンドリアのDNAマーカーによる各CMS系統を同定できる識別法の開発を行う。さらに、葯培養による雄性不稔系統の純系化を行う。さらに、CMS系統識別法の開発も行う。これまでに引き続いて、平成23年度に本研究費で導入したNano drop 2000を活用してDNAを定量し、効率よくDNAを分析する。特に、オルガネラの両性遺伝現象の解析を明らかにする予定である。実際には、葉緑体及びミトコンドリアDNAを詳細に分析する。また、栽培して諸特性を調査するために圃場の整備およびガラス温室の整備を行う。特に、アセトカーミンなどの試薬で花粉稔性を調査する。平成23年度に本研究費で導入したNano drop 2000を活用してDNAを定量し、効率よくDNAを分析する。さらに、栽培して諸特性を調査するために圃場の整備およびガラス温室の整備を行う。
Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ細胞制御を基盤とした癌ワクチン療法の新展開

我々は血管内皮細胞増殖因子受容体2(VEGFR2)が腫瘍新生血管に高発現していることに注目し、VEGFR2由来エピトープペプチドによる腫瘍新生血管を標的とした癌ペプチドワクチン療法の第I相臨床試験を行い、安全性と高率なVEGFR2特異的CTLの誘導を報告した(Cancer Sci. 101:433-9 2010)。一方、抗腫瘍効果の妨げとなる制御性T細胞(Treg)にVEGFR2が高発現しており、Treg制御の標的となる可能性が報告された(Eur.J.Immunol. 40:197-203 2010)。本研究はVEGFR2特異的CTLによるTregの制御について検証し、TregのVEGFR2を介したシグナルの機能解析を行い、VEGFR2特異的CTLが腫瘍新生血管のみならず、Tregも制御し、強力な抗腫瘍効果を発揮できることを証明する。本年度は前年度に引き続き、VEGFR2特異的CTLの制御性T細胞(Treg)に対する細胞傷害活性の検討を進めた。健常人PBMCからVEGFR2特異的CTLの誘導が可能であることを確認したのち、VEGFR2+FOXP3+CD4+Tregに対する細胞傷害活性についての検討を開始した。まず,標的となるVEGFR2+FOXP3+CD4+T細胞の誘導を試みた。autoMACSでselectionしたCD4+T細胞をIL-2,anti-CD3抗体, anti-CD28抗体,TGF-βを添加し,培養した後、FACSでVEGFR2+FOXP3+CD4+Tregのsortingを行った。十分量の標的細胞を安定して確保した後、Chromium-release assay用いた細胞傷害活性について検討中である。考察として、Tregの免疫抑制機能はTreg上のMHC Class Iの発現と相関することが報告されており、FOXP3の発現が強いほど、MHC Class Iも高発現しており、CD8+T細胞とTregのinteractionによりTregでのIL-10の産生が増強するすなわちTregの免疫抑制機能が増強することが示唆されている。FOXP3の発現強度に、Tregに発現したMHC Class I上のVEGFR2ペプチドをVEGFR2特異的CTLが認識できるかどうかも依存している可能性がある。したがって、今後はTregに対するVEGFR2特異的CTLによる細胞傷害活性もFOXP3の発現強度別に解析することが肝要で、その際のIL-10等免疫抑制性サイトカインの発現の差についても検討する必要がある。VEGFR2特異的CTLのTregに対する細胞傷害活性が証明できれば,次にVEGFのTregの機能に関する検討に移る。すなわち,VEGFR2を介したTregへのシグナルが,抗腫瘍免疫に抑制的に作用することを証明する。具体的にはagonist抗体をTreg上のVEGFR2に結合させることで,Treg細胞内のTGF-β,IL-10といった免疫抑制性のcytokineの発現が増強するかについて細胞内cytokine染色を行いFACSで解析する。Treg関連活性化マーカー(CTLA-4),Treg誘導に関与する転写因子解析(STAT3,SMAD2/3)についてもmonoclonal抗体で染色し,FACSで解析する。TregのapoptosisについてもAnnexin V抗体を用いてFlow cytometryで解析する。Tregマスター遺伝子FOXP3の発現は定量的にreal time PCRで検討する。Treg-mediated suppression assayでTregのCD4+CD25negT細胞に対するapoptosis誘導能のみならず,cell to cell suppressionの誘導についても評価する。いずれの系もVEGFR2agonist投与の有無で比較検討する。当初予定していた研究計画と大きな変更なく進めることが可能と考えている。すなわち,VEGFR2特異的CTLのTregに対する細胞傷害活性が証明できれば,次にVEGFのTregの機能に関する検討に移る。研究物品としては各種抗体、TGF-β,IL-10といったcytokineのほか、FACSやPCRのrunning costを要する。また、研究成果の発表のため、学会参加費や旅費に使用する予定である。本研究では正確な細胞数の測定を迅速に行うことが,ELISOT,Cr release assay,Flow cytometryといった実験で非常に重要な要素を占める。従来の目視によるcell count法では再現性や正確性といった点で限界がある。よって今回Countess(invitrogen社)に研究費を使用する予定である。

これは正確に,生死細胞数と細胞径の平均を測定できる機器で,必要サンプル量も少量で,希釈数計算と転送可能なデータ作成機能,PCを接続も不要といった特徴がある。迅速,簡便かつ正確に細胞数を測定できるため,本実験には必須であると考える。その他,各種抗体や各種サイトカイン,細胞培養液,FACSやautoMACSの維持に必要な消耗品,ELISPOT kitに研究費を使用する。また,研究成果を国内国際学会で発表するための経費も研究費から使用する予定である。
組織マイクロアレイFISH法による放射線誘発甲状腺がんの国際分子疾学的解析

広島・長崎の原爆後障害疾患として、白血病などとともに甲状腺がんのリスクが増加し、さらに1986年のチェルノブイリ原子力発電所の事故以降、小児甲状腺がんが激増した。しかし放射線誘発甲状腺がんの分子機構の詳細は未だ明らかにされていない。チェルノブイリの小児甲状腺がんではret遺伝子の再配列が高頻度にみられるが、組織型との関連性、あるいは予後との関連など、不明な点が多い。そこで我々は、近年用いられるようになった組織マイクロアレイFISH法を用いて甲状腺がんの遺伝子再配列について分子疫学的解析を行っている。現時点で長崎原爆被爆者、セミパラチンスク核実験場周辺地区住民のサンプルの収集を終え、それぞれについてret遺伝子の再配列についてFISH法でのスクリーニングを行っている。現在までのところ、原爆被爆者についてはret遺伝子再配列の頻度が比較的低いことが示唆されており、この点で被ばく形態によるret遺伝子の変異メカニズムの差異が見られる可能性があり、興味深いところである。さらに、最近になって、甲状腺乳頭がんにおけるbraf遺伝子の再配列が報告されたことから、放射線誘発がんにおける本遺伝子の再配列の関与を調査中である。今後は、FISH法に加えて、近年用いられるようになってきているCGH法を利用して、さらに甲状腺がんの染色体レベルにおける地域差、民族差、そして環境因子の影響について調査を継続していく予定である。チェルノブイリの小児甲状腺がんではret遺伝子の再配列が高頻度にみられるが,組織型との関連性、あるいは予後との関連など、不明な点が多い。現在放射線誘発甲状腺がんに特異的な再配列の候補(ret/PTC3)は想定されているものの、現場の混乱や研究各施設の実験手技の違いから、一定の結論を出すのが困難な状況である。そこで本申請では、放射線誘発甲状腺がんの組織マイクロアレイFISH(蛍光in situハイブリダイゼーション)法による遺伝子解析を、世界の被爆者の甲状腺がんサンプルを用いた民族分子疫学的アプローチとして行い、具体的には、長崎(日本)、チェルノブイリ(ベラルーシ共和国、ウクライナ、ロシア連邦)、セミパラチンクス(カザフスタン共和国、ロシア連邦)で、甲状腺がん病理組織ブロックのサンプリングを行い、ret遺伝子再配列を調査することとした。初年度はまず、長崎原爆被爆者における甲状腺がんサンプル約50例を用いてまずブロックよりRNAを抽出してRT-PCRを行ってret/PTC1及び3の再配列の有無をスクリーニングする一方、同一の症例を用いてFISH法により再配列を確認した。その結果、RT-PCRでは約50例中1例のみにret/PTC1の再配列が認められ、この症例ではFISH法でも再配列を示す染色体相当部位の接近が認められた。このことは、従来考えられてきた日本人甲状腺がんにおけるret/PTC再配列が低頻度であるということを、FISHレベルでも示したものである。次年度は、同様の調査をチェルノブイリ、さらにはセミパラチンスクの症例にも拡大し、民族分子疫学的見地から、FISH法を用いた甲状腺がん再配列の頻度を調査していき、放射線誘発甲状腺がんにおけるret/PTC再配列の意義について検証していく。
活動制限を受ける思春期入院患児の睡眠に関する研究－睡眠ケアモデルの試案－

入院して活動制限を受けている思春期児における夜間睡眠のパターンと関連要因、看護援助の調査から、以下のことが明らかになった。思春期児の主観的睡眠評価と夜間覚醒は、身体症状、環境要因、ストレス認知、不安との関連が示唆された。入院中の睡眠に関するセルフケア行動は入院前のセルフケア行動と関連していた。看護師の睡眠援助には、入院による睡眠障害が生じないように日常的に続けている支援と、睡眠障害をもつ思春期児への問題解決的な支援が見出された。本研究は治療のために入院して活動制限を受けている思春期児の夜間睡眠パターンと関連要因を明らかにし、睡眠ケアモデルの試案を作成することを目的としている。活動制限を受けている思春期児の睡眠測定の方法の確定のために次の事を実施した。(1)客観的に睡眠状態の測定法は、申請者らが入院中の小・中学生に実施したActigraphによる方法(2006)を評価し、手続きを確定した。(2)主観的睡眠の自己評価および睡眠記録については自己報告とすることとし、申請者らが作成した睡眠記録と主観的睡眠評価(2005)を評価し、活動制限によって生じる身体症状について追加した。(3)文献検討から、不安との関連が示唆されたので、調査内容に不安評価を加えることとした。(4)環境測定の方法については、音、光センサーを健康な成人を対象に使用し、使用についての検討と準備を行った。思春期入院児の生活および睡眠に関するセルフケア行動については、(1)申請者らがThe Childrens Self-Care Performance Qiestionnaire (Moore, 1993)の日本語版として検討した36項目からなるセルフケア行動質問紙の検討した。(2)健康児及び病児を対象とした文献検討及びケア経験者との討議から、活動制限のある思春期入院児へのインタビュー方法と分析方法について検討し、確定した。思春期児入院児への睡眠支援については、文献検討を行い、活動制限にある入院児の夜間睡眠においては、活動制限の期間、程度、内容が影響し、睡眠リズム、夜間覚醒、身体苦痛などの問題があった。支援の結果とその評価については事例検討であった。本研究は治療のために活動制限を受けている思春期入院患児の夜間睡眠パターンと関連要因を明らかにすること、およびケア提供者が行っているケア方法を明らかにし、睡眠ケアモデルの試案を作成することを目的としている。夜間睡眠-覚醒状態のデータ収集は、平成21年度に検討し確定したActigraphを用いて思春期児2例を対象に測定した。併せて質問紙による主観的睡眠評価と音センサーによるケア環境の測定を行い、睡眠-覚醒状態と環境との関連について分析し検討した。思春期入院児の睡眠および睡眠にかかわるセルフケアについては、21年度に確定した方法をもとに、睡眠についての考え、睡眠における主観的評価、セルフケア、他者からのサポートなどについて、5名(女児3名、男児2名)にインタビューを実施し、入院生活にける睡眠の意味およびセルフケアの抽出を行った。尚、事例を追加して比較検討を行っている。思春期入院児が実践しているセルフケア行動と効果についての認識についてのデータ収集のために、前述のインタビューから抽出されたセルフケア行動、およびThe Children's Self-Care Performance Qiestionnaire (Moore, 1993)の日本語版を検討し質問紙を作成した。思春期児入院児へのケア提供者からの睡眠支援については、思春期入院児の経験をもつ看護師5名に、日常的に実践している支援及び有効であった看護支援場面について語ってもらい、介入方法の抽出を行った。併せて文献検討から得られた日本における4症例の看護実践を検討して、介入に関する追加資料とするために検討した。本研究の目的は、治療のために活動制限を受けている思春期入院患児の夜間睡眠パターンの特徴および関連要因を明らかにすること、ケア提供者が行っているケア方法を明らかにし、入院中の思春期児の睡眠ケアモデルの試案を作成することである。1.平成21年度・22年度に実施した先行研究をもとに、自己記入式の質問用紙を作成した。内容は、入院中の睡眠の主観的評価、睡眠パターン、睡眠に関するセルフケア行動、睡眠を阻害している身体および環境要因、ストレス内容である。睡眠のパターンとセルフケア行動については入院前の行動も含めた。対象は、牽引・ギブス固定などにより一日の大半をベッド上で生活している、持続点滴注射など何らかの行動制限を受けている、清潔管理目的で個室生活している入院中の思春期児患児を対象とした。2.質問紙調査の実施し分析を行った。2施設に入院中の思春期患児を対象に調査を行い、得られたデータをもとに分析を行った。入院中の身体要因、環境要因、ストレスは、患児の睡眠の主観的評価、睡眠パターンとの間に関連が認められた。3.Actigraphを用いての夜間睡眠-覚醒については、21年度・22年度に得たデータについては、主-観的評価、環境要因との関連の分析を行った。

4.看護師が実施している看護介入については、22年度に得られたデータの分析および国内外の文献を検討し、看護師が行っている援助内容について要因を抽出した。5.ケアモデルの試案の作成のために、上記の24の結果をもとに要因関の関連を検討した。
細胞を要さない再生血管用医材の開発とその臨床応用

細胞の播種をすることなく生分解性素材のみにて再生血管を作成するための素材の探究と最適化を行った。分解速度、物理強度、形状の異なる素材を組み合わせ2年にわたる長期埋稙実験を行い、良好な開存性と機能、組織像を有する再生血管の作成に成功した。それは、生力学的にも正常血管とほぼ同等な弾性率を有する血管であった。本研究により素材のみでも良好な再生血管がin vivoにて作成できることが証明された。細胞を用いず生分解性素材のみで再生血管の作成を可能とする素材の条件の探究と開発を行った。分解速度、物理強度、形状の異なる素材を組み合わせを最適化することで、細胞を用いなくても格段の開存性を得ることが可能となった。生分解性素材を実験動物の下大静脈へ移植し、その妥当性の評価と過去の実験データとの優位・相違点を検討した。その結果、ある条件下の素材において、開存性(100%)、合併症の有無(血管の閉塞、血栓症、腹水の出現なし)、組織学的検討(細胞がなくても従来と変わらない組織像。また6ヶ月の時点で石灰化は認められず)、造影検査(有意な狭窄はなし)、生力学的試験(6ヶ月において、正常と比して約9割の弾性力を有する)という結果を得た。また、再生血管の新たな評価システムとして圧カテーテル(Millar)と血管内超音波カテーテルによる再生血管の血管内弾性率評価法を確立し、導管型再生血管の経時的な変化、則ち生力学的再生度につき動物を犠牲死させることなくデータを収集し、その検査方法の有用性を検討した。血管壁の微弱な壁運動と微弱な静脈圧変化の解析により血管の弾性率が計測できるが、その解析によると再生血管の生力学的再生度は6ヶ月で約90%であることが示された。本研究により再生血管の生力学的再生度を計測することによりおよその組織学的再生度を推測可能になったばかりか、実験動物の犠牲を減らすことが可能となり、また生体内における再生血管の経時的変化を客観的に示すことが可能となった。今後、約2年間の観察期間を設け、その間に血管の評価を行いつつ、再生血管の長期間での有効性をその開存性と組織学的優位性により示す予定である。径8mmの生分解性素材を実験動物の下大静脈に移植した。埋植後、1ヶ月以降は抗凝固剤を一切使わず、2年を経過した時点でのカテーテル検査、圧較差測定し、さらに摘出した組織の検討を行った(n=7)。その結果、開存性(100%)、合併症(血栓症、腹水)の出現はなく、右心房一下大静脈間の有意な圧較差はなく(meanで0.5mmHg)、組織学的検討では従来と変わらない組織像であった。また組織学的に石灰化は認められず、生力学的試験では正常と比して約9割の弾性力を有する(1年、1.5年と経時的に見ても有意な変化なし)という結果を得た。再生血管の新たな評価システムとして開発した圧カテーテル(Millar)と血管内超音波カテーテルによる再生血管内弾性率評価法が再生血管の経時的な変化を反映し、動物を犠牲死させることなく2年以上の長期期間経過観察した。本研究により再生血管の組織学的再生度を推測可能になったばかりか、実験動物の犠牲を減らすことが可能となり、また生体内における再生血管の経時的変化を客観的に示すことが可能となった。次年度はさらに長期の観察期間を設け、より遠隔期の再生血管の評価を行う予定である。また今回得られた組織のさらなる詳細な検討(生化学的検討を含む)を行い、組織の再生度(正常組織との比較)を検証する予定である。分解速度、物理強度、形状の異なる素材の組み合わせの最適化が本研究で可能となり、長期遠隔期における開存性を得ることができた。径8mmの生分解性素材を実験動物の下大静脈に移植し、現時点で最長3年までの経過観察を行い、良好な開存性を得ている。2年時でのカテーテル検査では圧較差なし、摘出した組織像は正常血管のそれと遜色のない物であった(n=9)。開存性(100%)、合併症(血栓症、腹水)の出現はなく、導管部での有意な圧較差(mean0.5mmHg)を認めなかった。また組織学的に石灰化は認められず、生力学的試験では正常と比して約9割の弾性力を有する(1ケ月1.5年と経時的に見ても有意な変化なし)という結果を得た。

再生血管の新たな評価システムとして開発した圧カテーテル(Millar)と血管内超音波カテーテルによる再生血管内弾性率評価法が再生血管の経時的な変化を反映し、動物を犠牲死させることなく経時的長期期間経過観察を可能とした。本研究により再生血管の組織学的再生度を推測可能になったばかりか、実験動物の犠牲を減らすことが可能となり、また生体内における再生血管の経時的変化を客観的に示すことが可能となった。これからの問題点としては、これを臨床応用するにあたり、より径の大きい、長いグラフトでの開存性と組織形成のメカニズムを解明していくことであり、これからも研究を継続していく予定である。
密度汎関数法とKKR-Green関数法を基礎とする第一原理計算による合金相図予測

密度汎関数法を基礎とするKKR-Green関数法の材料設計用計算プログラムの基礎的部分の開発とその計算プログラムの計算精度の点検と応用を行った。具体的には,1密度汎関数法の局所密度近似,LSDA)を超えた一般化密度勾配を取り入れた計算(Generalized Gradient Approximation)は遷移金属を含む完全結晶の平衡格子定数と弾性定数の実験値をそれぞれ,1%,10%以内の誤差で再現する.LSDAは格子定数を34%過小評価,体積弾性率を50%ほど過大評価する.2金属中の原子空孔形成エネルギーの実験結果を再現した。実験は高温での結果であるので,絶対0度での格子定数が0.050.01α.u.のびている効果を取り入れる必要がある。取り入れない場合は,少し実験結果を過小評価する。温度による格子定数の膨張を取り入れると,LSDAは実験値をかなり過大評価するが,GGAは実験の誤差内で,実験値を再現する.3金属中の不純物対相互作用エネルギーの大きさと符号で,母体元素と不純物元素からなる2元合金相図の定性的予測に成功した。4上記の不純物対相互作用エネルギーで内部エネルギーを記述し,配置エントロピーをクラスター変分法で求める自由エネルギー計算で,Pd中のRh不純物溶解度限の温度依存性を定量的に再現した.密度汎関数法を基礎とするKKR-Green関数法の材料設計用計算プログラムの基礎的部分の開発とその計算プログラムの計算精度の点検と応用を行った。4上記の不純物対相互作用エネルギーで内部エネルギーを記述し,配置エントロピーをクラスター変分法で求める自由エネルギー計算で,Pd中のRh不純物溶解度限の温度依存性を定量的に再現した.