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東アジアにおける西洋古典の受容―比較史的研究への試み

', Almut-barbara Renger and, Xin Fan (eds.), Receptions of Greek and Roman Antiquity in East Asia, pp. 73-87, Nov. 2018.西洋古典は西洋に起源を持つので、当然日本はある時期まで西洋古典学を欧米から受容する一方であった。この受容は16世紀にイエズス会士たちが日本に布教に訪れたことがきっかけである。彼らは学校を開き、そこでラテン語を教え、ラテン語の文法書や辞書を印刷し、イソップ物語など西洋古典文学も翻訳した。その後も受容は続いていくが、今日、日本から欧米に向けて発信する機会も増えている。日本人が研究成果を英語で発信したり、日本において世界的な研究会が開かれることもある(例えば2010年の東京における国際プラトン学会)。こうした一方的な受容から発信へとスタンスが変わった大きなきっかけは、日本西洋古典学会が1950年に設立されたことにあるだろう。本稿では、日本において西洋古典が受容(reception)されていた時代、すなわち16世紀から日本西洋古典学会誕生までの歴史を概観したものを発表した。また以下の論文も発表した。泰田伊知朗、「フランシスコ・ザビエルが携わったアジアにおける語学教育」、『観光学研究』、18、pp. 117-125、2019年3月。フランシスコ・ザビエルはヨーロッパを出てからインド、東南アジア、日本などで布教活動を行なった。本稿ではアジアにおいてザビエルが推進したラテン語教育について概観した。2018年度後半において2本の論文を発表することができた。また前野良沢によるラテン語原典の日本語への翻訳に関する論文(Translation of Latin Texts of the Edo Period, by the Japanese Scholar Maeno Ryo;taku)も投稿中である。2019年度は5月に慶應大学にて「ワークショップ日本における西洋古典受容」、11月に台湾大学にてInternational Symposium on European Languages in East Asiaという研究会に参加予定である。2つの会でも日本、アジアにおける西洋古典受容について論じる予定にしている。
乳生産量,採食量および栄養価による添加物利用サイレージの評価

平成13年度は、申請書に記載した研究実施計画通り、平成11年度と平成12年度め研究から得られた成果に、すてに基磐研究(C)(2)で交付された課題(平成9年度と平成10年度)「高品質サイレージ調製のための添加物利用とその作用機序」からの研究成果を合わせてまとめた。サイレージの発酵品質を良質にするためには、酪酸発酵を阻止しなければならない。発酵品質の安定には材料草の草種、生育ステージ、刈り取り回次、予乾の程度などの要因が複合的に関与している。これらの要因が材料草の可溶性糖類(WSC)含量に影響を及ぼし、、発酵晶質を決定付けていた。サイレージの発酵品質向上は、保存の安定性を図るのみではなく、ヒツジの採食量や栄養価にまで大きく影響した。牧草サイレージではギ酸、乳酸菌製剤および酵素剤を添加し、発酵品質が向上すれば栄養価(TDNとDE含量)および養分(TDNとDE)摂取量が増加した。トウモロコシサイレージでは、添加物を利用しても発酵品質に差異が認められなかったが、乾物採食量とTDNおよびDE含量は添加物利用によって高くなり、養分(TDNとDE)摂取量が向上した。乳牛の泌乳試験では、乳酸菌製剤の添加により、乳生産量と日増体量、あるいは乳成分が高まる場合があった。これらのことから、良質の発酵品質を得ることは、養分摂取量の向上に繋がることから、自給粗飼料の利用率を高めることができ、濃厚飼料の節約に貢献できる。そのためのキーポイントは、材料草の条件、特にWSC含量を考慮した適正な添加物使用にある。しかし、添加物の使用は発酵品質や養分摂取量に好結果をもたらしても、サイロ開封後の好気的変敗抑制効果が現れない場合が多かった。平成11年度の実験は、申請書に記載した研究実施計画通り、東京農業大学と帯広畜産大学で実施した。1.東京農業大学では水分74%に予乾したチモシーとアカクローバの混播1番草を供試し、無添加、ギ酸添加、乳酸菌製剤添加および乳酸菌製剤+酸素剤添加サイレージを調製した。給与試験にはヒツジ4頭を供試し、4×4のラテン方格法で消化試験と採食試験を実施した。その結果、サイレージの発酵品質は、無添加区が3添加区よりもVスコアーが低く劣質であった。添加区のうち、ギ酸添加区のVスコアーが最も高かった。サイレージの化学成分では、ギ酸添加区の可溶性糖類と可溶無窒素物(NFE)含量が他の処理区よりも有意(p<0.01)に高かった。乾物、粗蛋白質、エネルギーの消化率は処理区間に有意差がみられなかったが、NFE消化率は無添加区が最も低く、ギ酸添加区が最も高く、処理区間に有意差(p<0.01)がみられた。TDNとDE含量は、無添加区が3添加区よりも低かった。サイレージの乾物摂取量、体重およびメタボリックボディサイズに対する乾物摂取量の割合ともに、乳酸菌製剤添加区が他の処理区よりも高く、乳酸菌製剤+酸素剤添加区が低い傾向があった。TDNとDE摂取量は、乳酸菌製剤添加区とギ酸添加区が無添加区および乳酸菌製剤+酸素剤添加区よりも高い傾向があった。2.帯広畜産大学では水分77%に予乾したチモシー、オーチャドグラス、ラジノクローバおよびアカクローバ混播1番草を供試し、無添加と乳酸菌製剤添加サイレージを調製した。24頭のホルスタイン種泌乳牛を3試験期に割り当て、反転法で泌乳試験を実施した。なお、サイレージは濃厚飼料と混合し、TMRとして給与した。

その結果、サイレージの発酵品質は無添加区と乳酸菌製剤添加区ともに良質であった。乾物摂取量は両処理区間に差がみられなかった。乳生産量と日増体重はともに乳酸菌製剤添加区が高い傾向がみられたが、有意差(p<0.05)は認められなかった。乳成分には両処理区間に差がみられなかった。平成12年度の実験は、申請書に記載した研究実施計画通り、東京農業大学と帯広畜産大学で実施した。1.東京農業大学では、水分82.9%の無予乾の混播1番草(チモシーとアカクローバ)を供試し、無添加、ギ酸添加、乳酸菌製剤添加および乳酸菌製剤+酵素剤添加サイレージを調製した。給与試験にはヒツジ4頭を供試し、消化試験と採食試験を実施した。その結果、サイレージの発酵品質は、無添加区と乳酸菌製剤添加区が劣質となり、ギ酸添加区と乳酸菌製剤+酵素剤添加区は良質となった。劣質サイレージのNFE含量は良質サイレージよりも低く、繊維区分は高かった。ギ酸添加区の有機物、粗蛋白質およびNFEの消化率は、無添加区よりも有意に高かった(P<0.05)。DCP、TDNおよびDE含量はギ酸添加区が最も高く、無添加区が最も低かった。乾物摂取量は、ギ酸添加区が多く、無添加が少ない傾向が見られた。DCP、TDNおよびDE摂取量は、いずれもギ酸添加区が多く、無添加区が少ない傾向が見られた。前年度の軽予乾サイレージと比較すると、軽予乾サイレージの養分摂取量は無予乾サイレージのすべての処理区よりも上回った。2.帯広畜産大学では、水分70%程度に予乾した牧草2番草(オーチャードグラス主体)を供試し、無添加と乳酸菌製剤添加サイレージを調製した。12頭のホルスタインを2群に分け、反転法で泌乳試験を実施した。サイレージの発酵品質は、両処理区に大きな違いが見られなかった。乾物摂取量は両処理区間に差が見られなかった。乳生産量と4%FCM量は処理区間差が見られず、乳成分のうち無脂固形分と乳糖含量は添加区が有意に高かった(P<0.01)。平成13年度は、申請書に記載した研究実施計画通り、平成11年度と平成12年度の研究から得られた成果に、すでに基盤研究(C)(2)で交付された課題(平成9年度と平成10年度)「高品質サイレージ調製のための添加物利用とその作用機序」からの研究成果を合わせてまとめた。サイレージの発酵品質を良質にするためには、酪酸発酵を阻止しなければならない。発酵品質の安定には材料草の草種、生育ステージ、刈り取り回次、予乾の程度などの要因が複合的に関与している。これらの要因が材料草の可溶性糖類(WSC)含量に影響を及ぼし、発酵品質を決定付けていた。サイレージの発酵品質向上は、保存の安定性を図るのみではなく、ヒツジの採食量や栄養価にまで大きく影響した。牧草サイレージではギ酸、乳酸菌製剤および酵素剤を添加し、発酵品質が向上すれば栄養価(TDNとDE含量)および養分(TDNとDE)摂取量が増加した。トウモロコシサイレージでは、添加物を利用しても発酵品質に差異が認められなかったが、乾物採食量とTDNおよびDE含量は添加物利用によって高くなり、養分(TDNとDE)摂取量が向上した。乳牛の泌乳試験では、乳酸菌製剤の添加により、乳生産量と日増体量、あるいは乳成分が高まる場合があった。これらのことから、良質の発酵品質を得ることは、養分摂取量の向上に繋がることから、自給粗飼料の利用率を高めることができ、濃厚飼料の節約に貢献できる。そのためのキーポイントは、材料草の条件、特にWSC含量を考慮した適正な添加物使用にある。
細胞コンテナとモデル動物によるヒト iPS 細胞由来脂肪細胞の細胞治療の研究

ヒトiPS/ES細胞由来脂肪細胞の詳細な脂肪細胞機能評価とヌードマウスへの細胞移植による生着及び維持に関する検討を行った。本研究においてヒトiPS・ES細胞由来脂肪細胞が脂肪分解などの脂肪細胞機能を備え、移植後少なくとも4週間は生着することが明らかとなった。この分化誘導及び細胞移植系は疾患iPS細胞のin vitro, in vivoにおける病態解析に有用であり、さらに将来的な細胞治療への応用が期待される。これまでに我々はin vitroでヒトiPS細胞から脂肪細胞への分化誘導を示した(FEBS Lett. 2009)。今回、ヒトiPS細胞由来脂肪細胞の詳細な脂肪細胞機能評価と細胞移植による生着及び維持に関する検討を行った。ヒトiPS・ES細胞を胚様体形成を介してin vitroにて脂肪細胞への分化誘導を行った。ヒトiPS・ES細胞由来細胞は脂肪蓄積及び脂肪細胞関連遺伝子の発現を認め、フォルスコリン誘導性の脂肪分解反応、インスリン応答性等の脂肪細胞機能を持つことが示された。続いて分化誘導後、2×107個の細胞をヌードマウス背部皮下へ移植した。対照として未分化iPS細胞の移植も行った。組織学的解析により移植後14週において脂肪細胞様細胞の生着が認められた。さらにヒトvimentin抗体にてヒト細胞由来であることを示し、Oil Red O染色で脂肪滴の染色が認められた。脂肪細胞面積の定量的解析では2週で頂値を示し、移植後の脂肪細胞様細胞の増殖活性はほぼ認めらなかった。移植後14週の移植細胞においてPPARγ2, Leptinなどの脂肪細胞関連遺子の発現も認められた。ヒトiPS・ES細胞由来細胞の細胞移植後の生着効率に関しては細胞株間で差が認められた。一方、未分化iPS細胞の移植においては移植後14週においてneural tube様の強い増殖活性を持つ神経外胚葉細胞が認められた。移植細胞における未分化細胞の残存は奇形種形成を引き起こす可能性が示唆される。本研究においてヒトiPS・ES細胞由来脂肪細胞が脂肪細胞機能を備え、移植後少なくとも4週間は生着することが明らかとなった。
粗粒火山灰土層における水分・熱移動特性に関する研究

未風化軽石から構成される火山放出物未熟土(粗粒火山灰土)を基盤とする農地は、保水性に寄与する間隙量(マイクロポア)が少なく潅漑や降水によってもたらされた大部分の水分が下層に速やかに移動してしまう。つまり排水性や良好であるが保水性が著しく不良な土壌物理特性を示す土壌である。それゆえこのような農地は、生産性の低い農地となっている。そこで本研究では、バ-ク資材を用いた土層改良によって生じる土壌中の間隙特性の変化および水分・熱移動特性の解析を行い、水・熱移動の制御の面から改良効果について検討した。バ-ク資材とは、林産廃棄物であるバ-クと畜産廃棄物である糞尿を、好気的条件下で完全に発酵させたもので、排水性、保水性に優れた土壌改良資材である。このバ-ク資材を20t/10a、粗粒火山灰土に混層することにより、容水量は0.5cm^3/cm^3から0.6cm^3/cm^3へ増加し、易有効水分(4.9kPa98kPaの吸引圧)を保持する間隙量は、0.08cm^3/cm^3から0.16cm^3/cm^3へ増大する。この間隙組成の変化や容水量の増加にともない、土層内の水変動が小さくなり、常時、易有効水分領域内で安定的な変動を示している。また対照区では降雨によって供給された水分(19.5mm)の30%(12mm)が保持され、24時間後(圃場容水量)では15%(3mm)であったのに対して、混層区ではそれぞれ60%(12mm)、25%(5mm)とより多くの水分を表層内に保持することが認められた。バ-ク資材を混層することにより圃場容水量が増大し初期の乾燥速度は相対的に大きいが、含水量が大きい時点で減率乾燥に移行することより、耐乾性の増大が確認された。また対照区とバ-ク資材混層区の土層の地温変動は、バ-ク資材の混層により熱容量が増大した結果、常に12°C高い温度で変動していた。したがってバ-ク資材の混層による間隙構造の変化により容水量・易有効水分量が増大し、保水性の改良とともに耐乾性も改善でき、温度環境的にも有効であることが明らかになった。
モガムリズマブの免疫関連有害事象；制御性T細胞除去がヒト免疫機構に及ぼす影響解明

モガムリズマブによる制御性T細胞除去により、ケラチノサイト、メラノサイトに反応する自己抗体が産生され、皮膚関連有害事象に直接的に関与していることを明らかにした。ヒトB細胞は、B細胞受容体遺伝子再構成(VDJ recombination)後、自己抗原応答性B細胞はアポトーシス(負の選択)に陥る(central tolerance,中枢性自己寛容)と考えられている。今回の研究成果は、ヒトにおいて、この中枢性自己寛容をすり抜けた自己抗原応答性B細胞が、FOXP3陽性CCR4陽性制御性T細胞(Treg)によって、制御されている(peripheral tolerance,末梢性自己寛容)ことを直接的に示すものである。また、モガムリズマブ投与後、免疫関連有害事象を認めないケースにおいても、ケラチノサイト、メラノサイトに反応する自己抗体を検出した。自己抗体が、pathogenicか否かについて、如何なる因子が規定しているのか不明であり、今後の重要な検討課題である。モガムリズマブに対する感受性を規定する因子として、CCR4分子C末端gain-of-function変異を同定した。本変異を有するATL患者においては、高い頻度で、同種造血細胞移植を実施することなく長期生存を獲得しており、ATLに対するゲノムオーダーメイド治療を考える上で、基盤データになり得るものである。一方、モガムリズマブ抵抗例において、CCR4に遺伝子変異を同定しており、今後、変異体導入株を作成し、確認実験を計画する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。・モガムリズマブ投与後、皮膚障害出現時、血清中に出現する自己抗体を用いて、標的抗原を探索し、いくつかの候補タンパクを同定した。・モガムリズマブ投与後皮膚障害局所において、免疫病理学的検討を実施。皮膚細胞に反応するIgM抗体、IgM抗体に沈着する補体C1qの存在を確認した。この所見は、皮膚細胞に対する自己抗体が、補体古典経路を介して皮膚障害を引き起こしていることを示す。・モガムリズマブ皮膚障害時において、末梢血単核球のT細胞受容体のレパトア解析を行った。結果T細胞受容体のレパトアdiversityが広がっていることが明らかになった。研究は当初の予定に従い、進行している。1.モガムリズマブ投与後、皮膚障害出現時、血清中に出現する自己抗体が、ヒトケラチノサイト、ヒトメラノサイトに対し、CDC活性を有することを確認した。2.複数の患者において、モガムリズマブ皮膚障害時の末梢血単核球を用い、IgMのレパトア解析を行った。結果皮膚障害に一致してskewするIgMの存在を認めた。3. IgM variableregionの塩基配列を元に、自己抗体の標的抗原を探索中である。4.モガムリズマブ皮膚障害時の末梢血単核球を用いたTCRのレパトア解析について、症例数を増やし、詳細に解析中である。当初の予定に従い、進行している。計画に基づき、研究を継続する。
新規疾患変異・染色体異常同定ツールを用いたミトコンドリア心筋症の診断率向上

網羅的遺伝子解析を用いたミトコンドリア心筋症の診断率向上を目的として、申請者が新規開発した常染色体劣性疾患変異の同定ツール(Hamming Distance Ratio: HDR法)および同ツールを応用した染色体構造異常同定ツール(HDR-del法)を用いて計29症例のミトコンドリア心筋症例における核DNA・ミトコンドリアDNA上の疾患変異・染色体構造異常の同定および変異の病原性に対する各種証明実験に成功しさらにミトコンドリアDNA変異症例においては心筋における高変異率(ヘテロプラスミー率)を証明した。またこれまでに原因遺伝子を同定したミトコンドリア病137症例の中で、心筋症合併例は21%と高率であることおよび心筋症非合併例と比較して予後不良であること(10年推定全生存率:18% vs. 67%, p< 0.001)を明らかにし成果の論文発表(Imai-Okazaki A et al, Int J Cardiol 2019)及び国内外での学術集会での発表を行った。また常染色体優性疾患変異の絞り込みに関しては従来は大家系を用いた連鎖解析が唯一の遺伝統計学的アプローチであったが、疾患変異周囲のヘテロ接合度の上昇という現象に着目することにより常染色体優性疾患変異に対する新規遺伝統計手法であるheterozygosity mapping法を開発して実家系での検証に成功し、同アルゴリズムを搭載したソフトウェアを公開し論文発表を行った(Imai-Okazaki A et al, Hum Mutat 2019).さらに新規のミトコンドリア心筋症例に対する網羅的遺伝子解析を完了させ、候補変異に対して発現解析を含めた各種検証実験による病原性の証明を進めている。当年度に予定していた解析予定のサンプルの網羅的遺伝子解析および変異の病原性の証明実験は順調に完了し、心筋およびその他の臓器を用いたミトコンドリアDNAのヘテロプラスミー率の測定方法も確立できた。またミトコンドリア心筋症の原因変異同定に際して課題となっていた常染色体優性疾患変異の絞り込みに対する新規遺伝統計手法の開発および実家系を用いた検証にも成功した。さらに新規のミトコンドリア心筋症例に対する網羅的遺伝子解析も完了しているために、次年度は同症例に対する候補変異に対する病原性の証明実験および今後追加になる新規症例に対する候補変異の同定および証明実験を効率よく進めることができる。初年度に解析済みの新規のミトコンドリア心筋症例に対する網羅的遺伝子解析結果を用いた候補変異に対する病原性の証明実験を行うとともに、今後追加になる新たなミトコンドリア心筋症例に対する網羅的遺伝子解析及び心筋を用いたミトコンドリアDNAのヘテロプラスミー率の測定および心筋でのヘテロプラスミー率と心筋症の重症度との相関を検討する。またミトコンドリアDNA変異症例において心筋以外の組織(血液等)を用いた早期診断の可能性についても検討を行う。開発済みのHDR法・HDR-del法および初年度に開発した常染色体優性疾患変異に対する絞り込み手法を活用した網羅的なミトコンドリア心筋症の遺伝子解析により、同疾患の診断率向上を目指す。さらに遺伝学的に診断のついたミトコンドリア心筋症例において遺伝子変異と予後との相関に対して検討を行う。

初年度に解析済みの新規のミトコンドリア心筋症例に対する網羅的遺伝子解析結果を用いた候補変異に対する病原性の証明実験を行うとともに、今後追加になる新たなミトコンドリア心筋症例に対する網羅的遺伝子解析及び心筋を用いたミトコンドリアDNAのヘテロプラスミー率の測定および心筋でのヘテロプラスミー率と心筋症の重症度との相関を検討する。またミトコンドリアDNA変異症例において心筋以外の組織(血液等)を用いた早期診断の可能性についても検討を行う。開発済みのHDR法・HDR-del法および初年度に開発した常染色体優性疾患変異に対する絞り込み手法を活用した網羅的なミトコンドリア心筋症の遺伝子解析により、同疾患の診断率向上を目指す。さらに遺伝学的に診断のついたミトコンドリア心筋症例において遺伝子変異と予後との相関に対して検討を行う。2018年度に解析予定のサンプルの一部の発注が臨床上のサンプル入手スケジュールの都合で2018年度終盤の発注となり、支払いが2019年度と繰越になったこと及び2018年度に研究成果を発表予定であった海外学会参加に必要な予算が研究遂行上2019年度の学会参加予定へと変更になったこと
免疫能選抜マウスの免疫機構の解明と抗病性の検討　～抗病性育種に向けて～

本研究では、マウス末梢血免疫能を指標とした免疫能選抜マウス(末梢血貪食能高、抗体産生能高、両形質高、対照の4系統)の免疫機構と、疾病抵抗性を検討することを目的としている。昨年度までに明らかにした末梢血貪食能選抜における血中好中球数増加のメカニズム追求し、また、感染実験から疾病抵抗性に関する検討を行った。血清成分の系統間の違いが示唆されていたことから、血清成分の違いが遊走能に与える影響について詳細を詰めた。トランスウェルの下層に個体ごとの血清、もしくは全系統の血清をプールしたものを添加し好中球遊走能試験を行った。結果、どちらの血清を用いた場合においても骨髄好中球の遊走数に変化は認められなかったものの、系統ごとの遊走好中球数は血中好中球数と同様であったため、血中成分の違いによる影響は小さく、むしろ受容体の発現量が遊走数に強く関与すると考えられた。そこで、好中球遊走に関与する受容体であるCXCR2やCXCR4の発現量を骨髄と末梢血において検討した。結果として、末梢血貪食能高マウスでは骨髄好中球CXCR2高発現による遊走能増加が血中好中球数を増加させ、血中好中球数が最も少ない対照系統では末梢血好中球のCXCR4の高発現が血中好中球を組織にホーミングさせることで減少している可能性が考えられた。一方、免疫能選抜マウスの抗病性の検討のため、肺炎レンサ球菌を用いた感染実験を行った。その結果、系統間の体重減少率に差の傾向が認められ、感染5日目において末梢血貪食能高、抗体産生能高選抜マウスの体重減少率が対照系統に比べ低いことが明らかとなった。本研究結果は、指標とする免疫能により抗病性が高まる可能性を示しているが、好中球数の増加やCXCR2発現量の増加と、感染時における体重減少抑制との関連性や、昨年度明らかにした抗体産生能高選抜マウスの脾臓細胞増殖活性との関連を明らかにする必要がある。【研究の目的】免疫能選抜による抗病性育種実現化へ向けた基礎研究として,25世代に渡るマウス末梢血免疫能を指標とした免疫能選抜マウス(末梢血貪食能高,抗体産生能高,両形質高,対照の4系統)の免疫機構の変化を明らかにし,さらに,疾病抵抗性を検討することを目的とした.【研究成果】本年度は系統別の免疫能の比較を行った.末梢血貪食能による選抜が好中球数を増加させること,また血中貪食能と血中好中球数の相関が高いことから血中貪食能の選抜が血中好中球数を増加させると考えられた.一方,脾臓,骨髄等においては好中球数に差が認められなかったことから,好中球遊走に係わる因子の探索を行った.系統別にプールした血漿のサイトカインアレイ解析を行った結果,系統間で2-3倍の違いが認められるケモカインが見出された.しかし,トランスウェルを用いた遊走能試験から,好中球表面上の受容体発現量の差が重要であることが示唆され,ケモカイン受容体に系統間差が認められた.その他に,血中,脾臓を用いた解析から貪食能の選抜によりCD4/CD8比は減少すること等が明らかとなった.また,脾臓細胞を用いたインビトロ試験において,ConA,PHA, LPSで刺激したところ抗体産生能高選抜マウスにおいて増殖活性が高くなっていることが認められた.以上の結果は,25世代以上選抜している本系統マウスの定常時免疫能に違いが有ること,そして免疫刺激時において異なる反応性を示すことを意味しており,疾病抵抗性試験においても異なる反応性が期待される.本研究では、マウス末梢血免疫能を指標とした免疫能選抜マウス(末梢血貪食能高、抗体産生能高、両形質高、対照の4系統)の免疫機構と、疾病抵抗性を検討することを目的としている。その結果、系統間の体重減少率に差の傾向が認められ、感染5日目において末梢血貪食

能高、抗体産生能高選抜マウスの体重減少率が対照系統に比べ低いことが明らかとなった。本研究結果は、指標とする免疫能により抗病性が高まる可能性を示しているが、好中球数の増加やCXCR2発現量の増加と、感染時における体重減少抑制との関連性や、昨年度明らかにした抗体産生能高選抜マウスの脾臓細胞増殖活性との関連を明らかにする必要がある。間接選抜による抗病性育種システム開発へ向けたステップを着実に進められている.本年度の目標であった系統ごとの免疫能,免疫反応の違いを明らかにしたことで,来年度の「末梢血免疫能選抜マウスの抗病性の検討と免疫機構との関連性」のための基礎情報を得ることができた.当初の計画通り,末梢血免疫能を選抜した系統マウスの免疫機構についての基礎的知見を更に深める.特に,好中球数増加原因の詳細を明らかにすること,そして抗体量増加の原因を追究し,選抜免疫形質と特に関連性の高い形質を明らかにすることで原因を明らかにしていく.さらに,これらの選抜マウスに対する疾病抵抗性試験の検討を行っていく.
マルチメディア双方向ワイアレス通信を支える撮像素子搭載の動画像符号化LSIの研究

(1)アルゴリズムの開発これまでに開発した「中断法動きベクトル検出アルゴリズム」の特性を解析したところ、所望の動きベクトルの約50%が従来の探索範囲の1/2以下で検出できることがわかった.この特性を利用して、狭い探索範囲で第1回目の動きベクトル検出を実行し、動きベクトルが検出された場合、探索を終了し、検出されない場合、第2回目、第3回目・・・第n回目の探索を実行する「マルチステップ中断法MEアルゴリズム」を開発した.この結果、検出速度を従来方法の50倍以上高速化することができた.(2)LSIの性能上述した「マルチステップ中断法MEアルゴリズム」にサブサンプリング法、低ビットアルゴリズム、等を併用することにより、処理速度をさらに(4倍以上)に高速化することができた.この結果、プロセッサの中心である動きベクトル検出回路の消費電力を100uW(1/100,000)以下に削減できることがわかった.(3)LSIの設計・試作・評価「マルチステップ中断法MEアルゴリズム」をハード化するための各種回路(動きベクトル検出回路・差分絶対値和回路、メモリLSI、等)を0.18-um CMOS技術を用いて設計した.2004年度初期にVDECによりLSI試作が完了するので、2004年度中にLSI評価を行う予定である.(1)アルゴリズムの開発これまでに開発した「中断法動きベクトル検出アルゴリズム」の特性を解析したところ、所望の動きベクトルの約50%が従来の探索範囲の1/2以下で検出できることがわかった.この特性を利用して、狭い探索範囲で第1回目の動きベクトル検出を実行し、動きベクトルが検出された場合、探索を終了し、検出されない場合、第2回目、第3回目・・・第n回目の探索を実行する「マルチステップ中断法MEアルゴリズム」を開発した.この結果、検出速度を従来方法の50倍以上高速化することができた.(2)LSIの性能上述した「マルチステップ中断法MEアルゴリズム」にサブサンプリング法、低ビットアルゴリズム、等を併用することにより、処理速度をさらに(4倍以上)に高速化することができた.この結果、プロセッサの中心である動きベクトル検出回路の消費電力を100uW(1/100,000)以下に削減できることがわかった.(3)LSIの設計・試作・評価「マルチステップ中断法MEアルゴリズム」をハード化するための各種回路(動きベクトル検出回路・差分絶対値和回路、メモリLSI、等)を0.18-um CMOS技術を用いて設計した.2004年度初期にVDECによりLSI試作が完了するので、2004年度中にLSI評価を行う予定である.(1)動画像高圧縮技術、高速信号処理技術、固体撮像素子の構成・性能・製造方法、LSIの低消費電力化・高性能化技術、等を調査し、長所・短所を洗いだした.(2)これまでに開発した「中断法動きベクトル検出アルゴリズム」の特性を解析したところ、所望の動きベクトルの約50%が従来の探索範囲の1/2以下で検出できることがわかった.この特性を利用して、狭い探索範囲で第1回目の動きベクトル検出を実行し、動きベクトルが検出された場合、探索を終了し、検出されない場合、第2回目の探索を実行する「2ステップ中断法MEアルゴリズム」を開発した.この結果、検出速度を従来方法の10倍以上高速化することができた.(3)上述した「2ステップ中断法MEアルゴリズム」にサブサンプリング法、低ビットアルゴリズム、等を併用することにより、プロセッサの消費電力をトータルで約1/50,000以下に低減できるみとうしが得られた.(4)設計・試作・評価:「2ステップ中断法MEアルゴリズム」をハード化するための各種回路(動きベクトル検出回路、差分絶対値和回路、メモリ、等)を0.5-μm CMOS技術を用いて設計・試作・評価した.(1)アルゴリズムの開発これまでに開発した「中断法動きベクトル検出アルゴリズム」の特性を解析したところ、所望の動きベクトルの約50%が従来の探索範囲の1/2以下で検出できることがわかった.この特性を利用して、狭い探索範囲で第1回目の動きベクトル検出を実行し、動きベクトルが検出された場合、探索を終了し、検出されない場合、第2回目、第3回目...第n回目の探索を実行する「マルチステップ中断法MEアルゴリズム」を開発した.この結果、検出速度を従来方法の50倍以上高速化することができた.(2)LSIの性能上述した「マルチステップ中断法MEアルゴリズム」にサブサンプリング法、低ビットアルゴリズム、等を併用することにより、処理速度をさらに(4倍以上)に高速化することができた.この結果、プロセッサの中心である動きベクトル検出回路の消費電力を100uW(1/100,000)以下に削減できることがわかった.(3)LSIの設計・試作・評価「マルチステップ中断法MEアルゴリズム」をハード化するための各種回路(動きベクトル検出回路、差分絶対値和回路、メモリLSI、等)を0.18-um CMOS技術を用いて設計した.2004年度初期にVDECによりLSI試作が完了するので、2004年度中にLSI評価を行う予定である.
微分方程式の解析的並びに力学的研究

この研究では微分方程式の解の性質の解析的及び力学的な考察を行った。代表者南部は、退化する非線形放物型方程式の解の正則性と漸近挙動の研究を行い、特に吸収項と退化する非線形拡散項の関係による解の性質を研究し有限時間で解が消滅する場合の漸近挙動を調べ、これらの結果を含む形で一般の場合の結果をまとめて発表準備中である。分担者小野は、小野が長年に渉り独自に開発したMorrey-Sobolev型のImbedding定理を用いて、線形一様楕円型境界値問題の解の導関数に対する精密な評価を与えた。分担者中尾は、単調増加でない非線形項をもつ退化型非線形放物型方程式の大域解の存在と解の漸近挙動に関する結果を発表し、更にある種の非線形波動方程式の周期解の存在とその解の詳しい減衰評価やエネルギー減衰評価に関する結果を発表した。分担者加藤は、Navier-Stokes方程式の弱解のSingularityの集合をハウスドルフ測度で測ることによって、解の正則性の判定条件を得た。分担者押川、浜地は本研究に力学系理論の立場から協力すると共に、今期は【I_2】型factorの無限テンソル積としてつくられるフォンノイマン環でその随伴流が純点スペクトル流れになるものを構成し、更に固有値リストの比が発散しない場合の型の決定を行った。分担者鎌田、石川は位相幾何学の立場から本研究に参加すると共に、鎌田は弱概複素多様体上の【S^1】-半自由作用の固定点多様体を研究し特性数の条件による多様体の次元の関係式を導き、それを発表した。分担者風間、佐藤、山口は多様体研究の立場から本研究に協力したが、今期は風間は弱擬凸な多様体の族での∂問題の判定条件を導きそれを発表し、更に∂コホモロジー群と幾何学的問題との関係を調べた。
ＲＮＡを基盤としたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９Ｓｙｓｔｅｍのエンジニアリング

昨年度に引き続き、細胞種特異的に発現するmicroRNA(miRNA)によるCRISPR-Cas9systemの制御法の確立を目指した。昨年度までに開発したシステムは、標的miRNAの活性が高い時にCas9活性が低くなるOFFシステムであった。そのため、標的とするmiRNAを探すのが煩わしいという問題があった。そこで、標的miRNAの活性が高い時にCas9活性が高くなるONシステムも開発した。しかしながら、このONシステムは標的miRNAの活性が低い状態でもCas9活性がみられた。そこで上記問題を解決するために新しいONシステムの開発を行った。具体的には、Cas9の機能を阻害するタンパク質(抗CRISPRタンパク質)の発現を標的miRNAで制御することで、Cas9を翻訳後レベルで制御した。本システムを評価した結果、標的miRNAの活性に応じて、「1遺伝子のノックアウト」、「2ゲノムに組み込んだレポーター遺伝子の活性化」が可能であることが明らかとなった。本システムは、標的細胞の標的miRNAの活性が高い時にゲノムを編集することができるので標的とするmiRNAを選別しやすいという利点がある。また、Cas9を翻訳後レベルで制御(Cas9の標的DNA配列への結合を阻害)するので、遺伝子の活性化以外にも、遺伝子抑制化・塩基編集・エピゲノム編集などを標的細胞特異的に行うことが可能であると考えられる。基礎研究においては、細胞特異的に特定遺伝子の機能を解析するツールやmiRNAの活性状態を記録するツールなどに利用できると考えられる。遺伝子治療においては、非標的細胞のゲノムを編集してしまうと思わぬ副作用が生じる危険性があるので、本システムはその危険を回避するのに役立つと考えられる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。当初はガイド鎖を介したCRISPR/Cas9systemの制御を試みたが、競争が激しい分野であることも考慮して当該研究室で開発されたmiRNA switch(miRNAによりタンパク質の発現が抑制される人工mRNA)を利用した制御法も検討した。miRNA switchを利用した方法によりCas9活性をmiRNAにより制御できる可能性が示唆されたため、miRNA switchを利用するCRISPR/Cas9systemの構築を優先的に進めた。EGFP遺伝子を安定発現しているHeLa細胞とiPS細胞を用いてCas9活性を評価した。結果は、それぞれの細胞で特異的に発現している内在性のmiRNA(HeLa細胞はmiR-21、iPS細胞はmiR-302a)によりCas9活性を制御(ここでは活性の低下を誘導)することに成功した。また、miR-302aを標的とすることで、iPSとHeLaの共培養の条件においてHeLa細胞特異的にEGFPをノックアウトすることに成功した。Cell-classifier circuitを利用し、Cas9活性の制御を逆転(miRNAによりCas9活性の上昇を誘導)することにも成功した。HeLaとiPSの共培養条件下での結果は、ヘテロな細胞集団より標的細胞のみを選択的にゲノム編集できることを示唆し、ゲノム編集を用いた遺伝子治療に有益になると考えられる。また、Cas9活性をmiRNA存在時に上昇させるのに成功したことは、所望の細胞でのゲノム編集を簡便化することが期待される。当初の予定とは異なるが、miRNA switchを用いることでCRISPR/Cas9 system(Cas9活性)を内在性のmiRNAにより制御することに成功した。この事実は、上記項目で述べた研究目的1をほぼ達成したことを示している。そこで現在は、当初の予定であるガイド鎖を介したCRISPR/Cas9systemの制御を試みている。具体的には、ガイド鎖の塩基配列を変更できると示唆されている領域を基準とした簡易的スクリーニングを行っている。プレリミナリーな結果ではあるが、Cas9活性は落ちるものの活性を保つことが可能である領域を確認した。今後、この変異に対して寛容なガイド鎖が実際にmiRNAに応答することができるかの検証が必要である。懸念事項として、ガイド鎖を改変し外在性のシグナル(タンパク質やアンチセンスオリゴ)によりCRISPRa(CRISPR/Cas9systemを用い遺伝子を活性化する手法)の制御に成功した報告がなされたことがある。エピゲノム制御法を確立するために、まず、dCas9(Cas9のヌクレアーゼ活性を欠損させた変異体)による転写制御系が当該研究室でも可能かを検証した。dCas9にVP64 (転写活性化因子)を融合させたコンストラクトでの検証実験では、標的とした遺伝子の転写活性化は見られなかった。原因として、1.評価系に問題があった、2. VP64では活性化能が低いため遺伝子の活性化が見えなかった、可能性が考えられる。そのため現段階は再検証を実施している段階である。当該年度において、他の研究グループによりエピジェネティックな制御に成功したとの報告が複数なされた。そのためこちらの研究も早急に進めていく必要性があると考えている。以上のことを考慮し、進捗状況としては「やや遅れている」と判断した。上記1については、当該研究室で開発されたmiRNA switch(miRNAによりタンパク質の発現が抑制される人工mRNA)を利用することによりほぼ達成された。よって、1についてを論文としてまとめ発表した。(そのため、当該年度の研究の成果は、昨年度の研究実績の概要と同じである。)本成果は、細胞種により活性の違うmiRNAを応用することで、細胞種に応じたゲノム編集の制御を可能とするため、将来的には医療応用にも役立つことが期待される。

またmiRNAの状態に応じたゲノム編集ができるため、細胞状態の記録や機能改変など、基礎研究にも有益であると考えられる。上記2については、まずは、遺伝子制御系の実験系の確立を行なった。具体的には、TRE(Tetracycline response element)を標的とし下流の遺伝子発現を制御する系の構築を試みた。TREの下流をhmAG1遺伝子としたベクターを構築し、HeLa細胞のゲノムに組み込んだ細胞株を作製した。dCas9(Cas9のヌクレアーゼ活性を欠損させた変異体)にVPR(転写活性化因子)を融合させたコントラストを用い、ガイド鎖の標的をTREにすることでhmAG1の発現が見られた。つまり、遺伝子制御系を評価するための実験系は一応確立できた。今後は、この実験系を利用し、遺伝子制御系の評価をするとともに、可能であれば(時間が許せば)、エピゲノム制御の系に移行していきたい。miRNA switchを用いることでCRISPR-Cas9 system(Cas9活性)を内在性のmiRNAにより制御することに成功した。そこで、本成果を論文として発表した。今回作製したシステムは、活性の高いmiRNAによりCas9の活性が下がる(ゲノム編集が起きなくなる)ものであった(OFF型)。そこで、人工遺伝子回路を利用することで、活性の高いmiRNAでゲノム編集が起きるシステムも開発した(ON型)。しかし、Cas9活性のリーク等の問題がみられたので現在は、これの改善を行なっている。前回より引き続き、EGFP遺伝子を安定発現しているHeLa細胞を用いてゲノム編集効率を評価している。エピゲノム制御法を確立するために、まず、CRISPRa(dCas9に転写因子を融合させ標的遺伝子の発現を活性化させるシステム)が当該研究室でも可能かを検証した。そのためにTREの下流にhmAG1遺伝子を組み込んだベクターを作製した。このベクターによりCRISPRaが機能することを確認した後、これをゲノム上に組み込んだ細胞株を作製した。dCas9-VPRとTREを標的としたガイド鎖のプラスミドをこの細胞に導入したところhmAG1発現がみられたことよりCRISPRaは機能していると判断した。現段階は実験系の最適化(導入遺伝子量や解析日数の検討など)を実施している段階である。論文として成果を発表できたこと遺伝子制御系が構築できたことを考慮し、現在までの進捗状況としては「おおむね順調に進展している」とした。昨年度に引き続き、細胞種特異的に発現するmicroRNA(miRNA)によるCRISPR-Cas9systemの制御法の確立を目指した。昨年度までに開発したシステムは、標的miRNAの活性が高い時にCas9活性が低くなるOFFシステムであった。
逆方向光受容体Opn5L1の生理機能の同定

光受容タンパク質ピノプシンは、Opn5L1と同様に脊椎動物が持つ非視覚性の光受容タンパク質の一種である。これは鳥類を含む爬虫綱の動物において特に松果体に特異的に発現することが知られている。ピノプシンの遺伝子は、哺乳類や硬骨魚類のゲノムから失われており、基本的には一部の脊椎動物の松果体における光受容を担うものと考えられてきた。動物の非視覚性光受容の機能解析プロジェクトの1つとして今年度、ピノプシンの解析を行った。種々の条鰭綱魚類(ガー、チョウザメ、ポリプテルス)や軟骨魚類(トラザメ)、無尾両生類(カエル)の網膜を分子組織学的に解析し、これらの動物においてはピノプシンが松果体のみならず、網膜の視細胞にも発現し、特に一部の桿体視細胞の外節に発現していることを示した。過去の報告においてピノプシンは視物質と同様にトランスデューシン(視細胞で特異的に働くGタンパク質)を活性化することが示されているため、ピノプシンは桿体視細胞外節において視物質と同様に機能するものと考えられた。そこでピノプシンの分子特性(熱活性化頻度・熱安定性)を解析したところ、その性質は明るいところで働く錐体視物質と比較して、暗いところで働くロドプシンに近いことを示した。さらに分子系統解析を行うと、分子進化の過程でピノプシンはロドプシンに先んじて現れていることがほぼ確実であることがわかり、ピノプシンは脊椎動物における初期型の薄明視視物質である可能性が示された。特定の光受容タンパク質を発現する細胞の機能を解析するため、トレーサーとして機能する遺伝子(小麦胚芽凝集素・ニトロ還元酵素など)をノックインした、もしくはトランスジェニックしたメダカの作出を試みている。既報に従い、Cas9 mRNA(もしくはタンパク質)、ガイドRNA、ノックインドナー(プラスミドもしくは一本鎖オリゴヌクレオチド)のメダカ胚への顕微注入によるゲノム編集を行っているが、現在のところ成功していない。一方、同様にCrispr/Cas9を用いたノックアウトメダカの作出は進行しており、非視覚光受容タンパク質の遺伝子(Opn5L1、Opn5m、Opn3)をノックアウトしたメダカ系統を作出し、確立した。これらの遺伝子が神経系のどの領域で発現しているかについてもmRNAレベルでの解析が終了し、今後解析を進める予定である。いくつかの光受容タンパク質の遺伝子をノックアウトしたメダカ系統を作出し、確立したため、これらのノックアウトメダカを用いた遺伝子の機能解析を行う。各遺伝子の発現領域、及び大まかな分子特性(吸収波長や活性化するGタンパク質のサブタイプなど)は既に解析済みであるため、それらのデータに基づき、研究を進行させる。また、実験条件を見直しながら、ノックイン・トランスジェニックメダカの作成についても行う。動物の最も重要な光受容機能である視覚の初期過程を担うのはオプシンと呼ばれるタンパク質である。動物においてオプシンは脳や副腎など、網膜以外の組織にも発現しており、非視覚性の光受容を担うと考えられるが、その詳細な機能は不明な点が多い。本研究では、オプシンの中でも特異な性質を示すOpn5L1の機能を明らかにすることを目的としている。材料としてはメダカを用い、まずOpn5L1を発現する神経細胞、さらにその細胞とシナプス結合を作っている細胞を特定するため、遺伝子組み換えメダカを作ることを試みた。メダカのゲノム上からOpn5L1の発現を制御すると考えられる領域を単離することに成功した。この領域の配列と、神経細胞を標識する遺伝子を連結し、メダカゲノムへと組み込むことでOpn5L1が発現する細胞で標識遺伝子が発現するメダカを作製することを試みた。受精直後のメダカ卵に構築した遺伝子を顕微注入し、数日後にゲノムDNAを抽出して遺伝子型解析を行った結果、標識遺伝子がゲノムに挿入されていることを確認した。しかし、顕微注入したメダカ胚の多く(80%以上)は発生途中で死んでしまい、正常に孵化しなかった。最終的に孵化した一部のメダカを生育し、ヒレからゲノムDNAを調製して遺伝子型解析を行なった結果、標識遺伝子がゲノムに挿入されたメダカが得られていないことがわかった。現在、目的の遺伝子組み換えメダカを得るために、ゲノムへの挿入方法や標識遺伝子を変えた実験を計画中である。特異な光反応を示す光受容タンパク質Opn5L1の機能の探索のため、Opn5L1を発現する神経細胞及び、その細胞とシナプス結合を作っている細胞を特定するための遺伝子組み換えメダカを作ることを目標とした。メダカはL1a、L1b、L1cの3種類のOpn5L1をそのゲノム上に持っている。それらの発現を制御すると考えられる、メダカゲノム上の5`側上流領域をそれぞれ8000, 5000, 5000塩基ずつ単離することに成功した。この配列を用い、経シナプス性トレーサーWGAと蛍光タンパク質GFPを自己開裂性のペプチド配列であるP2Aで連結したものを発現させるべく、遺伝子構築を行った。また同時に実験の陽性対照とすべく、メダカβアクチン上流配列3700塩基を同様にWGA-P2A-P2Aへ連結したものも作製した。トランスポゾンAc/Dsを用いてメダカゲノムへ上記のコンストラクトを導入するため、まずAcトランスポゼースのタンパク質を発現し、精製することを試みた。しかし、精製タンパク質を得るのに十分な量を大腸菌で発現することはできなかった。

次にAcトランスポゼースをメダカ胚中で発現させるため、上記のメダカβアクチン上流配列にAcトランスポゼースとGFPを連結したプラスミドを構築した。これを1細胞期のメダカ胚に顕微注入すると、注入から1、2日後にGFPに由来する蛍光を確認することができた。また顕微注入した卵からゲノムDNAを調製し、遺伝子型解析を行った結果、WGAの配列がゲノムに挿入されていることを確認した。しかし、顕微注入したメダカ胚の多く(80%以上)は発生に異常が見られ死亡するなど、正常に孵化しなかった。一部の孵化したメダカを生育し、ヒレからゲノムDNAを調製して遺伝子型解析を行なった。しかし、現在まで目的の配列がゲノムに挿入されたメダカは得られていない。光受容タンパク質ピノプシンは、Opn5L1と同様に脊椎動物が持つ非視覚性の光受容タンパク質の一種である。これは鳥類を含む爬虫綱の動物において特に松果体に特異的に発現することが知られている。ピノプシンの遺伝子は、哺乳類や硬骨魚類のゲノムから失われており、基本的には一部の脊椎動物の松果体における光受容を担うものと考えられてきた。動物の非視覚性光受容の機能解析プロジェクトの1つとして今年度、ピノプシンの解析を行った。種々の条鰭綱魚類(ガー、チョウザメ、ポリプテルス)や軟骨魚類(トラザメ)、無尾両生類(カエル)の網膜を分子組織学的に解析し、これらの動物においてはピノプシンが松果体のみならず、網膜の視細胞にも発現し、特に一部の桿体視細胞の外節に発現していることを示した。過去の報告においてピノプシンは視物質と同様にトランスデューシン(視細胞で特異的に働くGタンパク質)を活性化することが示されているため、ピノプシンは桿体視細胞外節において視物質と同様に機能するものと考えられた。そこでピノプシンの分子特性(熱活性化頻度・熱安定性)を解析したところ、その性質は明るいところで働く錐体視物質と比較して、暗いところで働くロドプシンに近いことを示した。さらに分子系統解析を行うと、分子進化の過程でピノプシンはロドプシンに先んじて現れていることがほぼ確実であることがわかり、ピノプシンは脊椎動物における初期型の薄明視視物質である可能性が示された。特定の光受容タンパク質を発現する細胞の機能を解析するため、トレーサーとして機能する遺伝子(小麦胚芽凝集素・ニトロ還元酵素など)をノックインした、もしくはトランスジェニックしたメダカの作出を試みている。既報に従い、Cas9 mRNA(もしくはタンパク質)、ガイドRNA、ノックインドナー(プラスミドもしくは一本鎖オリゴヌクレオチド)のメダカ胚への顕微注入によるゲノム編集を行っているが、現在のところ成功していない。一方、同様にCrispr/Cas9を用いたノックアウトメダカの作出は進行しており、非視覚光受容タンパク質の遺伝子(Opn5L1、Opn5m、Opn3)をノックアウトしたメダカ系統を作出し、確立した。これらの遺伝子が神経系のどの領域で発現しているかについてもmRNAレベルでの解析が終了し、今後解析を進める予定である。同時に進行中の他の研究課題において、メダカの標的ゲノム領域に特異的に目的の配列を挿入(ノックインできる)できることがわかってきた。よって、本研究課題においても、トランスポゾンを用いてゲノム中にランダムを配列する方法ではなく、ノックインによって目的の遺伝子改変メダカを作製することを試みる。
マウス人工染色体を用いた新規モデル動物作製システムの開発

従来のトランスジェニック技術によるヒト化モデル動物作製は予期しない遺伝子発現、系統維持の問題から多大な労力が費やされてきた。これらの課題を解決するために、本研究ではマウス個体において安定なマウス人工染色体(MAC)ベクターを用い、簡便なヒト化モデル動物作製を目指した。ヒト化マウス作製例として、MAC上にヒトPXR遺伝子およびマウスとラット両方の内在Pxr遺伝子に対応するshRNAの導入を行い、ヒト化モデル作製のためのノックイン・ノックダウン用MAC(KID-MAC)ベクターの構築に成功した。KID-MACベクターシステムはヒト化モデル動物作製のための有用なツールとなることが期待される。従来技術によるモデル動物作製は、予期しない遺伝子発現制御、系統維持の問題から多大な労力が費やされてきた。これら課題を解決するために、本研究では簡便化を可能とする新規モデル動物作製システム開発を目的として、マウス個体において極めて安定なマウス天然染色体由来マウス人工染色体(MAC)ベクターを用い、ヒトゲノムの導入および対応遺伝子の翻訳除去を同時に行い、簡便なヒト型モデルマウス作製を目指す。本年は以下のステップで研究を進めた。1.複数遺伝子搭載可能MACベクターの構築(MI-MACベクターと呼ぶ): MACベクターへの各種遺伝子搭載はCHO細胞内において行った。MACベクター上のloxPサイトに複数遺伝子搭載用プラットフォームを導入した。2. MI-MACの動作確認:上記MI-MACベクター上の複数遺伝子搭載部位が正確に機能するかを確認するために、遺伝子の搭載されていない空ベクターを各種サイトへ導入することで、各サイトが機能することを確認した。また、DNAの確認はPCR法により行い、MAC上へのみの遺伝子搭載の確認はFISH解析により行った。3.マウス・ラットPxrを共通してノックダウンするshRNAの選別:培養細胞を用いた遺伝子導入実験により、マウスおよびラットPxrを共通にノックダウンするshRNAを5つ選別した。ヒト繊維肉腫(HT1080)細胞株にshRNAの標的であるマウスおよびラットPxr遺伝子発現ベクターを候補のshRNA発現ベクターとリポフェクションにより共導入し、ノックダウンの効率をリアルタイムPCRで検証した結果、2つの候補shRNAを選別した。一方、ヒトPXR発現ベクターと候補shRNA発現ベクターの共導入も実施し、ヒトPXR遺伝子発現に影響がないことも確認した。従来技術によるモデル動物作製は、宿主ゲノム改変の困難性、染色体を侵襲することに起因する予期しない遺伝子発現制御、系統維持の問題から多大な労力が費やされてきた。1.ヒトPXR遺伝子の搭載:MAC上のMIサイトにヒトPXR遺伝子を導入するためにヒトPXRを含むBACの改変を行った。次にMI-MACを保持するCHO細胞内に上記ヒトPXR改変BACをインテグレースとともにリポフェクション法にて共導入し、薬剤選択を行った。PCR法およびFISH法によりヒトPXR遺伝子がMI-MAC上に搭載できていることを確認した。2. shRNA発現ユニットのMI-MACへの搭載のための改変:昨年度までに選別したマウスおよびラットのPxrの発現を抑制し、ヒトPXRの発現に影響を及ぼさないshRNA候補の2種類(A, B)について、Aを2コピー、Bを2コピー、A・Bそれぞれ1コピーずつ、の3種類組み合わせでMI-MACベクター上に搭載するためのベクターを構築した。従来技術によるモデル動物作製は予期しない遺伝子発現制御、系統維持の問題から多大な労力が費やされてきた。これらの課題を解決するために、本研究では簡便化を可能とする新規モデル動物作製システムの開発を目的として、マウス個体において極めて安定なマウス天然染色体由来マウス人工染色体(MAC)ベクターを用い、ヒトゲノムの導入および対応遺伝子の翻訳除去を同時に行い、簡便なヒト型モデルマウス作製を目指す。昨年度までに構築したPXR-MI-MAC(ヒトPXR遺伝子が搭載されたMI-MACベクター)を保持するCHO細胞に、昨年度構築したshRNA候補(マウスおよびラットのPxrの発現を抑制し、ヒトPXRの発現に影響を及ぼさないshRNA)をリポフェクション法にて導入した。薬剤耐性コロニー100クローン程度をピックアップし、PCR法にて組換えサイトの両端の配列を増幅することにより、目的プラスミドベクターの挿入を確認した。候補クローンが2クローン獲得された。今後はマウスES細胞、ラットES細胞に導入することで、個体を作製する予定である。計画にかかげたステップを実行し、目的のPXR導入

MI-MACの構築に成功し、sHRNA改変ベクターも構築できたことから、順調に進展したといえる。染色体工学今後はPXR搭載MI-MACベクター上にshRNAを搭載し、マウスおよびラットES細胞に導入する予定である。計画にかかげたステップを実行し、目的のMAC導入細胞とshRNAを獲得できたことから、順調に進展したといえる。