hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
代謝ネットワークに基づいたシステムバイオロジーによる遺伝病発症規定因子の探索

細胞内小器官の1つであるペルオキシソームは脂質代謝を中心に生体に重要な機能を有しており、特に飢餓時や過食など非常時にその機能が発揮されることから、生活関連病との関連も示唆されている。平成19-20年度の2年間における本研究では、このペルオキシソームにおける機能が脂質代謝ネットワークの中で、他の代謝経路にどのような影響を与え、脂質代謝パスウェイのどこに位置づけられているかを、システムバイオロジーを用いて萌芽的な研究を行った。具体的には遺伝的にペルオキシソーム代謝機能が広範に障害されているペルオキシソーム形成異常症のうち、温度感受性にその異常が可逆的に正常化する表現型、遺伝子変異を有する複数のヒト患者細胞を用いることにより、同じ細胞において温度変化だけでペルオキシソーム代謝機能が全般的にON/OFFになるそれぞれの状態からRNAを抽出してマイクロアレイ解析により遺伝子発現の変動を網羅的に検討した。2年間の萌芽研究により患者ならびに対照細胞での温度変化による遺伝子発現変動の網羅的情報を収集し、有意に発現の変動を認めた遺伝子群を同定している。今後、データマイニングを含めて解析を続け、脂質代謝ネットワークにおけるペルオキシソーム機能の位置づけ、さらには生活習慣病患者集団におけるペルオキシソーム代謝に関連する遺伝的要因を同定する研究へ展開して行く。本研究では以上の成果に加えて、ペルオキシソーム代謝異常症でもっとも頻度の高い副腎白質ジストロフィーに関して、同一家系、同一遺伝子変異でも臨床型が全く異なる患者細胞のペアを用いて、マイクロアレイ解析等の手法により遺伝子発現の差異を網羅的に解析して、臨床病型の規定因子同定に向けたデータの集積を行っている。ペルオキシソーム脂肪酸代謝系に異常を来す副腎白質ジストロフィーはその病因であるABCD1遺伝子は解明されたものの病態は未だ不明で、同一家系内の同一遺伝子変異でも全く異なる臨床型を呈する。本症はX連鎖劣性遺伝の難治性神経疾患で、唯一の治療法は発症早期の造血幹細胞移植であり、発症前を含めた早期診断とともに、発症規定因子の探索は不可欠である。今年度は副腎白質ジストロフィーの患者のうち同一家系、同一遺伝子変異で臨床型の異なる複数のペア細胞よりRNAを抽出して、発現量の異なる遺伝子群を以下の方法で探索したので報告する。1)ABCD1およびペルオキシソーム代謝系に関わる特定の代謝系の遺伝子発現の差異を探索する:ペルオキシソームABCタンパクに属するABCD14、これらペルオキシソーム膜タンパクの輸送に関わる一連のPEX遺伝子、および脂肪酸β酸化系代謝に関わる遺伝子群の発現を定量PCRにて比較検討した。2)マイクロアレイ解析を用いて網羅的に遺伝子発現の差異を探索する:DNAチップを用いて両者間の発現量に有意差のある遺伝子群を網羅的に解析する。以上の結果についてはデータマイニングを含めて現在、その解釈を検討中である。さらに、今回のマイクロアレイ解析を応用して、遺伝子のコピー数の解析に有用なCGHアレイを行うことにより、本症におけるABCD1遺伝子の欠失例において、その欠失範囲の探索と家系内における女性例の欠失部位のコピー数を解析することにより、従来の遺伝子解析では診断未確定の症例に対して、保因者診断を実施している。
漢字熟語の音読メカニズムに関する認知心理学的・計算機科学的・神経心理学的検討

1.研究の目的文字単語の音読には「文字・意味・音韻」に対応する心的表象が関与し、文字表象の活性が音韻表象に直接伝えられる音韻処理と、文字表象の活性が意味表象の活性を介し音韻表象に伝えられる意味処理が想定されている。日本語では表音文字である仮名では音韻処理が、表意文字である漢字では意味処理が働くと考えられてきた。これに対し、本研究の目的は、漢字の音読にも意味処理のみならず音韻処理も働くと仮定し、認知心理学、計算機科学、神経心理学の手法により検証する。2.研究成果漢字熟語の音読に意味処理のみが働くなら心像性(意味のイメージのしやすさ)の高い高心像語(例.医院、奉行)は心像性の低い低心像語(例.宇宙、寿命)に比べ音読が容易なはずである。一方、音韻的処理が関与するなら、個々の漢字の読みが一貫している高一貫語(例.医院、宇宙)は、個々の漢字に対し稀な読みを当てはめなければならない低一貫語(例.奉行、寿命)に比べ音読が容易なはずである。実験の結果、健常成人の音読潜時は、高一貫語が低一貫語より短く、高一貫語では心像性による差異はないが低一貫語では高心像語が低心像語より短かいことが明らかとなり、従来の説とは異なり、漢字熟語の音読では基本的に音韻的処理が働くが、音韻的処理が困難な低一貫語でのみ意味的処理の役割が重要となることがわかった。意味処理には前述のように「文字→意味→音韻」のフィードフォワード(FF)型の活性化過程のみならず「文字→音韻⇔意味」のフィードバック(FB)型の活性化過程も想定できる。FB型処理の存在を検討するため、文字形態は非語であるが音韻形態は単語となる同音擬似語(例.電給、爆談)と文字形態、音韻形態とも非語となる非同音非語(例.電談、爆給)の音読潜時を比較した。これらの文字列にはFF型処理の処理は作用しないと考えられるが、同音擬似語の音読潜時は非同音非語より短かく、FB処理の存在が示唆された。意味記憶に選択的な障害を示す意味痴呆における漢字熟語の音読成績を検討したところ、高一貫語の音読は良好であるが、低一貫語の音読に強い障害を示し「奉行、寿命」を「ほうこう、すめい」と読むなどの誤りが頻発した。一方、非語(例.医宙、宇院)の音読は良好であり、意味痴呆では音韻的処理のみに基づいた音読が残存していることが示された。また計算機シミュレーションでは、音韻処理、および(擬似的な)意味処理を実装したニューラル・ワークが健常成人の音読潜時における一貫性の影響を再現すること、意味処理を破壊すると意味痴呆の音読傾向が再現されることが示された。これらの結果は漢字語における音韻処理の存在を肯定している。

一方、非語(例.医宙、宇院)の音読は良好であり、意味痴呆では音韻的処理のみに基づいた音読が残存していることが示された。また計算機シミュレーションでは、音韻処理、および(擬似的な)意味処理を実装したニューラル・ワークが健常成人の音読潜時における一貫性の影響を再現すること、意味処理を破壊すると意味痴呆の音読傾向が再現されることが示された。これらの結果は漢字語における音韻処理の存在を肯定している。1.研究の目的近年の認知心理学では、音読の背景には、心的な文字符号、意味符号、音韻符号の計算過程があると考えられている。一般的には、形態素文字である漢字では、文字符号から、意味符号を計算し、その後、音韻符号を計算する過程「文字→意味→音韻」が重要であり、表音文字である仮名では、文字符号から音韻符号を直接計算する過程「文字→音韻」が重要であるといわれる。これに対し本研究では、漢字にも「文字→音韻」があると仮定し検討している。本年は健常成人を対象とし、認知心理学的実験を行った。2.実験結果1)漢字熟語の音読における親密度・一貫性・心像性効果の検討漢字熟語の音読に「文字→意味→音韻」のみが関与するなら、音読において、心像性(意味のイメージのしやすさ)の高い「運送、書留」などは心像性の低い「告訴、成就」に比べ音読が容易だが、個々の漢字の読みが一貫している「運送、告訴」などと、個々の漢字の読みが稀な読みである「書留、成就」などの差はないはずである。しかし、実験の結果、普段、よく用いる高親密度語ではいずれの音読速度が速すぎていずれの影響もなかったが、低親密度語では、心像性、一貫性の影響がともに認められた。これから、漢字熟語の音読に「文字→意味→音韻」、「文字→音韻」の双方が関与することが示唆された。2)漢字非語の音読における疑似同音非語効果の検討漢字熟語の音読に「文字→意味→音韻」のみが関与するなら、「電談」などの無意味文字列は読めないはずである。しかし実験の結果、人間は無意味文字列を読むことができ、「文字→音韻」が関与していることがわかった。さらに「電球」の一文字に当て字をした、文字形態は無意味だが音韻形態が有意味となる「電給」などの疑似同音非語は、「電談」など文字形態も音韻形態も無意味となる非同音非語はより読みやすかった。この結果から、文字符号から音韻符号を計算し、そこから計算される意味符号から音韻符号を再帰的に計算する過程「文字→音韻→意味→音韻」の存在が示唆された。1.研究の目的文字単語の音読には「文字・意味・音韻」に対応する心的表象が関与し、文字表象の活性が直接音韻表象に伝えられる音韻的処理と、文字表象の活性が意味表象の活性を介し音韻表象に伝えられる意味的処理が想定されている。日本語では表音文字である仮名では音韻的処理が、表意文字である漢字では意味的処理が働くと考えられてきた。これに対し我々は、漢字の音読にも意味的処理のみならず音韻的処理も働くと仮定し、認知心理学、計算機科学、神経心理学の手法により検証している。2.昨年度の研究成果漢字熟語の音読に意味的処理のみが働くなら心像性(意味のイメージのしやすさ)の高い高心像語(例.医院、奉行)は心像性の低い低心像語(例.宇宙、寿命)に比べ音読が容易なはずである。一方、音韻的処理が関与するなら、個々の漢字の読みが一貫している高一貫語(例.医院、宇宙)は、個々の漢字に対し稀な読みを当てはめなければならない低一貫語(例.奉行、寿命)に比べ音読が容易なはずである。これらの熟語について健常成人の音読潜時を測定したところ、高一貫語の音読潜時は低一貫語より短く、高一貫語では心像性による差異はないが低一貫語では高心像語の音読潜時が低心像語より短かった。この結果から、従来の説とは異なり、漢字熟語の音読では基本的に音韻的処理が働くが、音韻的処理が困難な低一貫語では意味的処理の役割が重要となることが示された。3.今年度の研究成果
境界研究から見る「北極」‐デンマークの北極圏戦略と媒介項としてのグリーンランド

最終年度は、論文・エッセイの寄稿や国内・国外学会での研究報告等のアウトプットに精力を注いだ。その結果、共編著1冊(2015年8月刊行予定)、共著2冊(うち1冊は2016年3月刊行予定)、学術論文3本(うち1本投稿中)、研究報告を国内外合わせて10度(受理4本含む)行った。国立民族学博物館・企画展協力や全国紙への寄稿をはじめ、アウトリーチ活動も積極的に行った。年度中には、本研究の土台として位置付けられる拙著『自己決定権をめぐる政治学』(明石書店、2013年)に対して、地域研究コンソーシアム登竜賞、日本島嶼学会研究奨励賞を受賞した。研究成果を発表する際に特に意識したのは、北極海沿岸諸国の権力関係と国内政治をどのように架橋するかという点であった。内外の人文社会科学系研究には、「国家主導の環北極海地域協力等のガバナンス形成をめぐる動き」や「国家・地域間合意・規範と地域の政治関係」に焦点をあてるものが多く、国家戦略との係わりの中で極域に居住し生活を営む人たちが、どのような考えに基づき行動しているかという視点が抜け落ちていた。言い換えれば、普遍的な科学を志向し、当該地域の権力関係を明らかにしようとする研究と、ステークホルダーとしての生活者(主に先住民族)の伝統的知見に耳を傾けようとする研究を架橋するような視点が欠落していた。そこで、最終年度は、代表者によるこれまでの成果をふまえ、自治をめぐる新たな分析概念としての「対外的自治」と「対内的自治」を援用しながら、生活者としての北極圏先住民族と北極のガバナンス形成の変遷を通史的に描くことで、自治研究と境界・ガバナンス研究を架橋させることに力を注いだ。その成果の一つは、デンマークの北極圏戦略を「地理的中立」という分析概念によって説明する論文として、年鑑(Arctic Yearbook2015)に掲載される予定である。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の意義は、デンマークの北極戦略を通じて先行研究が十分に扱い切れていない北極の境界問題における「権力の空間分析」を行っている点にある。本年度は、北極研究の世界的拠点であるノルウェー・トロムソでの在外研究を通して得た知見に基づき、先行研究に抜け落ちていた二つの空間的視座:「沿岸5ヵ国」と「NORCs8ヵ国」を提示することで次年度以降の研究の基盤作りを行った。沿岸5ヵ国とは国連海洋法条約の規定に基づき北極海域との地理的近接性を有する主体を指し、NORCs8ヵ国とは北緯45度以北に位置する主体を指している。これまでの北極は、当海域の厚い海氷の存在によって実際の境界確定や資源採掘を行うには十分な環境を有していなかったため、北緯45度以北というより広範な地理的空間としてのNORCsが議論の中心となってきた。当海域に係わる共通課題を議論する場としてNORCsを中心とする北極評議会が重視されてきたのはその証左である。しかし、近年の気候変動に伴う海氷の溶解によって北極は、資源・航路開発を行うに十分な環境を有する海域へと変質し、北極海域との地理的近接性というより局地的な視座が、実際の外交の場で意味を持ち得るようになった。なかでも、デンマークはこの二つの視座に最も意識的であらなければならない主体であった。デンマークは、自身が北極海域と地理的に近接していない点でNORCsとしての権利のみ有する主体であり、北極圏域の資源・航路開発に伴う権益を享受し得る法的主体であるが、北極海域と地理的に近接する自治領グリーンランドを介することで、北極海域での海洋権益を享受する法的主体でもあり、根拠を異にする二つの地理的近接性を有する唯一の主体となっている。本研究は、このようなデンマークの地理的・法的立場を主な分析対象としつつ、沿岸国、NORCsの二つの視座から当海域の境界問題を捉え直す試みである。本研究の目的は、デンマークの北極圏戦略を通して、先行研究が十分に扱い切れていない北極海域における「権力の空間分析」を行うところにある。デンマークに着目するのは、デンマークが北極海域と地理的に近接していない点で、北極圏域を構成する主体、つまり北緯45度以北に位置する主体としての権益のみを享受するが、北極海域と地理的に近接する自治領グリーンランドを介することで、北極海域を構成する主体、つまり北極海と地理的に近接する主体としての海洋権益をも享受する唯一の存在だからである。社会科学分野における北極研究には、「国家主導の環北極海地域協力等のガバナンス形成をめぐる動き」を分析し、それを「国家・地域間合意・規範が地域の政治関係に影響を与え得る」ものとして捉えるリベラリストの系譜と国益の錯綜する場として北極海域を捉えるリアリストの系譜の二つが存在する。そこでは、北極圏との地理的近接性を有する北緯45度以北の8ヵ国=A8(アメリカ、カナダ、デンマーク/グリーンランド、ノルウェー、ロシア、フィンランド、アイスランド、スウェーデン)が分析主体として位置付けられてきた。しかし、近年の気候変動に伴う海氷の融解によって北極は、資源・航路開発を行うに十分な環境を有する海域へと変質し、UNCLOS第76、77条に基づく北極海域との地理的近接性を有する5ヵ国=A5(アメリカ、カナダ、デンマーク/グリーンランド、ノルウェー、ロシア)という、より局地的な視座が実際の外交の場で意味を持ち得るようになった。

当該年度は、北極海域の地理的・法的状況を明らかにした上で、北極海域と地理的に近接していないA8であるにもかかわらず、法的に近接していることによってA5としての特権を享受する唯一の国家としてのデンマークに焦点をあて、そこで行使される政治的影響力について考察し、北極の境界未確定問題の実相を明らかにする作業を進めた。最終年度は、論文・エッセイの寄稿や国内・国外学会での研究報告等のアウトプットに精力を注いだ。その結果、共編著1冊(2015年8月刊行予定)、共著2冊(うち1冊は2016年3月刊行予定)、学術論文3本(うち1本投稿中)、研究報告を国内外合わせて10度(受理4本含む)行った。国立民族学博物館・企画展協力や全国紙への寄稿をはじめ、アウトリーチ活動も積極的に行った。年度中には、本研究の土台として位置付けられる拙著『自己決定権をめぐる政治学』(明石書店、2013年)に対して、地域研究コンソーシアム登竜賞、日本島嶼学会研究奨励賞を受賞した。研究成果を発表する際に特に意識したのは、北極海沿岸諸国の権力関係と国内政治をどのように架橋するかという点であった。内外の人文社会科学系研究には、「国家主導の環北極海地域協力等のガバナンス形成をめぐる動き」や「国家・地域間合意・規範と地域の政治関係」に焦点をあてるものが多く、国家戦略との係わりの中で極域に居住し生活を営む人たちが、どのような考えに基づき行動しているかという視点が抜け落ちていた。言い換えれば、普遍的な科学を志向し、当該地域の権力関係を明らかにしようとする研究と、ステークホルダーとしての生活者(主に先住民族)の伝統的知見に耳を傾けようとする研究を架橋するような視点が欠落していた。そこで、最終年度は、代表者によるこれまでの成果をふまえ、自治をめぐる新たな分析概念としての「対外的自治」と「対内的自治」を援用しながら、生活者としての北極圏先住民族と北極のガバナンス形成の変遷を通史的に描くことで、自治研究と境界・ガバナンス研究を架橋させることに力を注いだ。その成果の一つは、デンマークの北極圏戦略を「地理的中立」という分析概念によって説明する論文として、年鑑(Arctic Yearbook2015)に掲載される予定である。26年度が最終年度であるため、記入しない。今年度の目的は、社会科学分野における北極研究(先行研究)の収集・整理にあったが、今年度はそれを上回る成果があった。一つは、国内外の機関において資料収集(北海道大学付属図書館、ノルウェー・トロムソ大学及び極地研究所図書館)・インタビュー調査(ノルウェー海洋研究所、北極評議会事務局)を行うことができ、さらにそれを様々な場所(インド、韓国、日本)で報告することができたこと。もう一つは、今日の北極海域の動向を説明し得る空間的視座としての「沿岸5ヵ国」と「NORCs8ヵ国」の二つを提示できたこと。この二つの視座を北極の境界問題に当てはめつつ、当問題の実相を実証的に明らかにしていく作業は次年度に向けた課題である。北極海域における境界未画定問題をデンマークの北極圏戦略を基点に分析する試みは、論文、学会発表を通して、またアウトリーチ活動の中でコンスタントにアウトプットできた点で、おおむね順調に進展した。現在は、先行研究との対比の中から新たな知見を生み出す過程にあるが、その中間報告をできた点で順調に進展したと考えている。
生体分子機能電極を用いた生体系金属錯体の電子移動反応制御と精密化学反応への展開

本研究では新規精密化学反応構築の基礎として、金属タンパク質の電極上での速い電子移動とその応用を目的とした研究を進めた。その成果の大略は下記の通りである。1.タンパク質の速い電子移動が可能な機能電極の開発:非ヘム系酸性タンパク質で光合成系における重要な電子伝達タンパク質であるフェレドキシンについて、In_2O_3やカ-ボン電極を用いて、適当なポリカチオンの共存下、明瞭なレドックス波が得られることを見出した。特にIn_2O_3電極上、微量のポリ-Lーリジン存在下で不均一電子移動速度定数5X10^<-3>cm/s程度の極めて速い直接電子移動が達成された。この電極は、起源の異なるフェレドキシンや部位特異的な人工変異分子についても適用できる。種々のフェレドキシンの電気化学測定から、光合成系非光合成系フェレドキシンの特性を明らかにするとともに、進化論的に保存された39番目及び46番目のセリン残基が必ずしもフェレドキシンの機能に必須のアミノ酸ではないことも示された。また、馬心筋由来のヘム蛋白質であるミオグロビンの速い電子移動が可能な電極を得た。この電子移動が未変性ミオグロビンによるものであることを分光電気化学的手法で明らかにした。2.フェレドキシンの電極反応を介した生物電気化学反応系の構築:フェレドキシンの電極反応を制御することで、種々の酵素反応系を共役させて精密合成化学反応への展開を可能とした。即ち、フェレドキシンーNADP^+ーリダクタ-ゼを用いてNADP^+からNADPHを生成させ、さらにNADPHを補酵素とする反応と組合わせて還元的カルボン酸サイクルの一部をモデル化した。例えば、リンゴ酸酵素存在下、ピルビン酸にCO_2を固定してリンゴ酸が生成する。また、同様に、NADPHを補酵素としてアンモニアを固定してアミノ酸合成も可能である。
セルロース・ヘミセルロース加水分解菌の電位制御による発酵ビートトップ飼料創製

農産系バイオマスであるビートトップの有効活用を目的として混合生菌剤を用いる酪農等の養牛用飼料の創生を検討した。BIO-PKC発酵ビートトップの栄養成分、安全性と保存性を確認した。飼料価値について、めん羊を用いた消化・窒素出納試験と泌乳牛を用いた飼養試験により乳生産に対する有効性を確認した。特に、体細胞数を抑え、乳房炎予防効果が推察された。混合生菌剤(BIO-PKC)の酸化還元調節によるセルロース・ヘミセルロース加水分解菌の活性化を目的として開発した酸化還元電位制御発酵バイオリアクターの印加処理によって、BIO-PKC発酵によるビートトップセルロース・ヘミセルロースの糖化促進が認められた。1.発酵ビートトップTMR乳牛泌乳試験構成粗飼料の乾物50%相当量の発酵ビートトップを混合して、乳牛用TMRを調製した。対照区のTMR構成粗飼料はイネ科乾草のみとした。泌乳牛10頭を用い、試験区及び対照区各5頭宛、泌乳試験を45日間実施し、乳量及び乳質を評価した。また発酵ビートトップ及び発酵ビートトップTMRの安全性及び保存性については残留農薬検査、シュウ酸、硝酸態窒素、大腸菌検査及びマイコトキシンを検査した。発酵ビートトップTMRは対照区TMRより嗜好性が良好で、飼料摂取量は有意に(p<0.01)高い推移を示した。乳生産量は発酵ビートトップTMRの方が対照区TMRより有意に(p<0.01)高い値を示した。体細胞数はビートトップTMRは対照区TMRより有意に(p<0.01)低い値を示した。2.電位制御バイオリアクターによるビートトップ加水分解試験2-1.電位制御バイオリアクターによる乳酸、低級脂肪酸(VFA)発酵試験...-0.1, -0.3及び-0.5VvsAg/AgClの印加電圧における乳酸及びVFA生成量を測定した結果、最も高いー0.3 Vで17,000mg/Lを示し,プロピオン酸で生成も高かったが、-0.5 Vでは乳酸発酵及びプロピオン酸発酵は阻害された。2-2.電位制御バイオリアクターによるグルコース酸化試験...見掛けの電流密度として10mA/cm2を達成することができ、電位制御バイオリアクターに用いた炭素繊維フェルトの活性化法が微生物電極として有効なものであることを確認した。2-3.セルラーゼを用いるビートトップ加水分解試験...-0.3VvsAg/AgClについて乳酸発酵処理試験を行った結果、セルロース・ヘミセルロースの加水分解とそれに続く、乳酸、VFA発酵の適正電極電位はー0.3VvsAg/AgCl近辺であることが明らかになった。1.供試ビートトップはビートトップチョッパーを設備するビートハーベスターで収穫した。収穫したビートトップはフレコンバックを用い、原物重量2%の混合生菌剤と混合し、水分調製剤としてビートトップに対して原物比で2:1の割合でビートパルプと混合して、全体の水分割合を60%に調製し、細断型ロールベーラーでロールベールに成型した。糖化発酵のために、2ヶ月間、20°Cで貯蔵した。混合生菌剤のセルロース・ヘミセルロース加水分解能電位制御処理のために、導電性カーボンフェルト電位制御バイオリアクターを製作し、炭素フェルトへの菌担持による電位制御が混合生菌剤のセルロース・ヘミセルロース加水分解菌の活性化に及ぼす影響を検討する。2.ビートトップに対する混合生菌剤のセルロース・ヘミセルロース分解及び糖化に対する混合生菌剤の電位制御効果について生成還元糖量より明らかにした。とくに、混合生菌剤の構成菌であるバチルス属の加水分解菌が、電位制御により賦活化することが明らかになった。菌叢解析については目下検討中である。3.発酵ビートトップの保存性の検証飼料の栄養価値、保存性等を解析するとともに、シュウ酸、硝酸態窒素、大腸菌群、マイコトキシン及び残留農薬について安全性を確認した。1.発酵ビートトップTMR乳牛泌乳試験構成粗飼料の乾物50%相当量の発酵ビートトップを混合して、乳牛用TMRを調整した。泌乳牛10頭を用い、試験区及び対照区各5頭あて、泌乳試験を45日間実施し、乳量及び乳質を評価した。また発酵ビートトップ及び発酵ビートトップTMRは対照区TMRより嗜好性が良好で、飼料摂取量は有意に(p<0.01)高い推移を示した。2.電位制御バイオリアクターによるビートトップ加水分解試験2-1.電位制御バイオリアクターによる乳酸、低級脂肪酸(VFA)発酵試験...-0.1,-0.3及び-0.5VvsAg/AgC1の印加電圧における乳酸及びVFA生成量を測定した結果、最も高い-0.3Vで17,000mg/Lを示し、プロピオン酸で生成も高かったが、-0.5Vでは乳酸発酵及びプロピオン酸発酵は阻害された。2-3.セルラーゼを用いるビートトップ加水分解試験...-0.3VvsAg/

AgC1について乳酸発酵処理試験を行った結果、セルロース・ヘミセルロースの加水分解とそれに続く、乳酸、VFAの発酵の適正電極電位は-0.3VvsAg/AgC1近辺であることが明らかになった。酪農生産コスト低減と飼料自給率向上のために、電位制御リアクターを開発し、北海道特有のセルロース系未利用バイオマス資源であるビートトップのセルロース・ヘミセルロースの分解促進について、混合生菌剤の賦活による加水分解促進効果を検討した。適正印加電圧下で、電位制御リアクター内の発酵還元雰囲気は嫌気条件に制御可能であることが証明され、電位制御リアクター内部に装着した導電性カーボンフェルトに担持された混合生菌剤の加水分解能は促進効果が認められ、電位制御リアクターは想定通りの能力を発揮した。次に、混合生菌剤発酵TMRの泌乳牛給与試験結果から、混合生菌剤発酵ビートトップは栄養価に優れた実用的TMRであり、乳質検査の結果から、体細胞数を減少する効果が認められ、乳房炎等の機能性を有する、酪農飼料として優れた飼料であることが証明された。最終年度は科研費基盤研究費(B)平成20年度22年度「反芻動物における温室効果ガス抑制効果を有する天然素材インベントリー」で作成したホームページ(http://tech.obihiro.ac.jp/takahashikaken/index.html)にリンクを張った本献課題の「セルロース・ヘミセルロース加水分解菌の電位制御による発酵ビートトップの飼料創製」(http://tech.obihiro.ac.jp/takahashikaken/beettop/)のホームページを作成し、成果を公表した。農産系バイオマスであるビートトップの有効活用を目的として混合生菌剤を用いる酪農等の養牛用飼料の創生を検討した。BIO-PKC発酵ビートトップの栄養成分、安全性と保存性を確認した。飼料価値について、めん羊を用いた消化・窒素出納試験と泌乳牛を用いた飼養試験により乳生産に対する有効性を確認した。特に、体細胞数を抑え、乳房炎予防効果が推察された。混合生菌剤(BIO-PKC)の酸化還元調節によるセルロース・ヘミセルロース加水分解菌の活性化を目的として開発した酸化還元電位制御発酵バイオリアクターの印加処理によって、BIO-PKC発酵によるビートトップセルロース・ヘミセルロースの糖化促進が認められた。平成24年度に試作した電位制御バイオリアクターの性能試験について乳酸・VFA発酵、グルコース酸化試験及びセルラーゼによるビートトップ繊維成分加水分解試験を実施し、電位制御バイオリアクターの適正印加電圧を検討した。その結果、-0.3VvsAg/Agc1で最も高いセルロース加水分解と乳酸・VFA発酵を示し、平成24年度の試験結果を裏付ける結果が得られた。これらの結果から、導電性炭素フェルトに担持された供試生菌剤の加水分解酵素活性は-3Vに印加電圧を調整することにより、増幅することが確認された。すなわち、本モデルを原理とする電位制御バイオリアクターは嫌気性繊維加水分解菌を適正な嫌気性に電気制御することが可能であり、未利用の農産物セルロースバイオマスに応用することが可能であることが証明された。しかし、電位制御によって活性化されるセルロース・ヘミセルロース加水分解菌の同定にはPCR菌叢解析が必要であるが、想定外の分析機器補修費等のための予算が制約され、本科研費では断念せざるを得なくなった。
シリカフュームの品質評価法に関する研究

シリカフュームの品質を評価するにあたり、当該年度で実施した内容およびそれらに関する研究成果の概要を述べる。(1)シリカフュームの分散性状についてシリカフュームは、平均粒径0.1μm以下の球形の超微粒子であるため、集塵後何も処理を施さない状態では、ファンデルワールス力などにより平均粒径が数百μm程度の凝集体として存在している。このようなシリカフュームの凝集性状と、外力(超音波)による分散性状を、レーザー回折式粒度分布測定装置を用いて比較したが、分散処理を施さない状態の粒度分布、ならびに超音波を施した後の粒度分布は、いずれも銘柄によって大きく異なることがわかった。また、同一銘柄のシリカフュームであっても分散処理の程度により、その粒度分布が大きく異なることがわかった。(2)シリカフュームの性質に影響を及ぼすその他の要因についてわが国においては、シリカフュームの大半は輸入に頼らざるをえないのが現状である。これにともない、長期間かつ長距離にわたる運搬ならびに保管が生じ、これらがシリカフュームの品質に及ぼす影響を明らかにする必要があり、これについての検討を行った。その結果、著しい乾湿履歴を受けたシリカフュームはセメント硬化体の基礎特性に好ましくない影響を与えること、1年以上の長期間保管されたシリカフュームは、セメント硬化体の強度増加に余り寄与しなくなること、などが明らかとなった。(3)コンクリート用混和材としてのシリカフュームの適用方法について以上(1)および(2)の検討結果より、シリカフュームをより有効に使用するための要件としては、(1)低水結合材比領域で使用すること、(2)シリカフュームを分散させるため練混ぜ等に配慮を要すること、および(3)集塵後できる限り早く使用すること、が挙げられる。平成4年度においては、(1)シリカフュームの品質評価法、(2)シリカフュームの物理化学的質性、および(3)ペーストを用いたシリカフュームの品質評価についての検討を行った。以下に各々の概要を記す。(1)品質評価法についての検討土木学会「高炉スラグ微粉末を用いたコンクリートの設計施工指針(案)」に準じた配合のモルタルに、各種のシリカフュームを混和(置換率:10%)し、フロー値、圧縮強度についての比較を行った。その結果、シリカフュームを含んだモルタルは無混和のものに比べてフロー値は1020%程度低下し、圧縮強度は材令28日で15%程度の増加となった。また、高性能減水剤を加えた場合、銘柄により減水効果の違いが確認できた。(2)シリカフュームの物理化学的性質についての検討物理的性質については、窒素吸着法を用いた測定では再現性のある結果が得られたが、レーザー回折法を用いた場合、超音波等による前処理方法の違いで測定値が大きく変化する結果を得た。このことより、一次粒子の比表面積は窒素吸着法を用いることが好ましいこと、水中における分散状態はレーザー回折法で検討が可能であることが明らかとなった。また、シリカフュームの化学成分は、いくつかの相関性のあるものどうしでグルーピングが可能であり、わが国で市販されているシリカフュームには、ASTMなどの海外のシリカフュームに関する規格を満たさない銘柄があることが判明した。(3)ペーストによるシリカフュームの品質評価シリカフュームを用いたペーストは、これを用いないものに比べて平均細孔径が小さくなり、総細孔量も減少することが確認できた。また、練混ぜ時点でのシリカフュームの初期形態がこれらの指標に大きく影響を及ぼすことが確認できた。

ただし、ペーストの細孔径および細孔量に及ぼすシリカフュームの品質については、現時点では判断が困難であり、次年度以降においてさらに検討を行う必要があると考えられる。シリカフュームの品質を評価するにあたり、当該年度で実施した内容およびそれらに関する研究成果の概要を述べる。(1)シリカフュームの分散性状についてシリカフュームは、平均粒径が0.1μm以下の球形の超微粒子であるため、集塵後何も処理を施さない状態では、ファンデルワールス力などにより平均粒径が数百μm程度の凝集体として存在している。このようなシリカフュームの凝集性状と、外力(超音波)による分散性状を、レーザー回折式粒度分布測定装置を用いて比較したが、分散処理を施さない状態の粒度分布、ならびに超音波を施した後の粒度分布は、いずれも銘柄によって大きく異なることがわかった。また、同一銘柄のシリカフュームであっても分散処理の程度により、その粒度分布が大きく異なることがわかった。(2)シリカフュームの性質に影響を及ぼすその他の要因についてわが国においては、シリカフュームの大半は輸入に頼らざるを得ないのが現状である。これにともない、長期間かつ長距離にわたる運搬ならびに保管が生じ、これらがシリカフュームの品質に及ぼす影響を明らかにする必要があり、これについての検討を行った。その結果、著しく乾湿履歴を受けたシリカフュームはセメント硬化体の基礎特性に好ましくない影響を与えること、1年以上の長期間保管されたシリカフュームは、セメント硬化体の強度増加に余り寄与しなくなること、などが明らかとなった。(3)コンクリート用混和材としてのシリカフュームの適用方法について以上(1)および(2)の検討結果より、シリカフュームをより有効に使用するための要件としては、(1)低水結合材比領域で使用すること、(2)シリカフュームを分散させるため練混ぜ等に配慮を要すること、および(3)集塵後できる限り早く使用すること、が挙げられる。
ピロリ菌CagAによる細胞内シグナル撹乱を抑制する分子標的阻害剤の探索

X線結晶構造解析ならびに生化学的解析を通じ、ピロリ菌病原因子CagAが引き起こすヒトがんタンパク質SHP2の異常活性化の構造基盤を原子レベルで解明した。タンパク質構造情報に基づきCagA-SHP2相互作用を特異的に遮断する低分子化合物の探索を行った。化合物ライブラリーを用いたスクリーニングの結果、数十の阻害剤候補化合物を取得した。本成果は、CagA-SHP2結合を分子標的とすることによりピロリ菌感染を背景とした胃発がんの予防あるいは早期胃がんの治療のための新たな創薬展開の基盤となることが期待される。ヘリコバクター・ピロリが有するがんタンパク質CagAによるチロシンホスファターゼSHP2の異常活性亢進を特異的に阻害する低分子化合物探索のため、CagA-SHP2相互作用を試験管内でハイスループットに検出する実験系を構築した。直接的なCagA-SHP2結合実験として、Amplified luminescence proximity homogeneous assay (Alpha)を採用した検出系を構築した。またCagA-SHP2複合体形成の結果誘導されるSHP2活性亢進を検出するため、低分子基質pNPPを用いた比色定量による酵素活性の検出系を構築した。CagA-SHP2相互作用はCagAのチロシンリン酸化に依存することから、本アッセイ系でもCagAのチロシンリン酸化特異的に相互作用シグナルを検出できることを確認した。ハイスループットスクリーニングではZ'値が0.5を越えることが良好なアッセイ系である指標となるが、両アッセイともに384ウェルマイクロプレート上でZ'値>0.8となる安定な実験系を構築した。これらのアッセイ系においてそれぞれ化合物ライブラリーを用いた阻害剤スクリーニングを行い、現在までに複数の候補化合物を得ている。さらに偽陽性除去等を目的とした2次スクリーニングのため別法の試験管内結合実験系の構築を目指し、組換えタンパク質を用いたGSTプルダウン法によるCagA-SHP2相互作用の検出系を構築した。H28年度は、当初の計画に加えてAlpha法を用いた実験系を構築し、結合アッセイならびに酵素学的アッセイの2つの異なるハイスループットスクリーニング系を構築することができており、より信頼性の高いアッセイ環境が整っている。また化合物ライブラリーを用いた阻害剤探索を行った結果現在までに数十の候補化合物を得ており、おおむね順調に研究は進展していると考えている。ヘリコバクター・ピロリ病原因子CagAによるヒトがんタンパク質SHP2の異常活性化機構を明らかにするため、CagA-SHP2相互作用部位のX線結晶構造を解明した。構造情報に基づいて各種点変異体を導入した物理化学的、生化学的、ならびに細胞生物学的解析から、CagAがSHP2を活性化するために重要な分子構造を明らかにした。CagAは胃がんの多発する東アジア諸国で単離される東アジア型CagAと、世界中のその他の地域で単離される欧米型CagAに大別される。本研究から東アジア型CagAは欧米型CagAに比較しSHP2に対して約100倍高い親和性を有し、この結合に依存して細胞運動能・浸潤能が上昇することが示され、CagAの発がん活性の強弱を規定する構造基盤が明らかになった。上記の研究成果をまとめ国際科学誌Cell Reportsに発表した。解明したCagA-SHP2相互作用の構造情報に基づきCagAによるSHP2の活性化を特異的に遮断する低分子化合物の探索を実施した。複数の化合物ライブラリーを用い、CagAによって活性化されたSHP2の酵素活性を阻害する化合物をスクリーニングした。1次ヒット化合物の中からSHP2の触媒ドメイン単体に強く作用したものを除外し、SHP2が活性化するための構造変化を阻害する可能性のある化合物を数十種類得た。これらのシード化合物は絶対値としての阻害活性は顕著でないことことから、今後、化合物とSHP2との共結晶化等を通じた複合体構造解析により化合物の結合部位と結合構造を順次決定し、構造最適化を通して阻害剤開発を進める。H29年度はまず現在有している候補化合物について再現性ならびに濃度依存性の確認を行う。さらに実験系に依存した偽陽性を除去するため複数のアッセイ系を通して真のヒット化合物を探索していく。具体的にはGSTプルダウン法を用いた結合阻害実験、表面プラズモン共鳴法を用いた化合物-標的タンパク質間の親和性試験を行う。これらの試験を通して選抜した化合物については培養細胞レベルにおけるCagAの生物活性を阻害できるか否かを検討していく。本研究の性質上、化合物選抜の結果ヒット化合物が全く得られない場合も想定されることから、より大規模あるいは焦点の絞られた化合物ライブラリーを用いたスクリーニングの試行を検討し、随時異なるライブラリーの利用を考慮しながら研究を進める。生化学、分子腫瘍学
分子間振動モード選択的なプロトントンネリングの研究

超音速ジェット冷却されたトロポロン分子(TRN)に希ガス原子(Ar,Kr,Xe)、直線分子(N_2,CO,CO_2)、または環状分子(C_3H_8,C_6H_6,CH_<12>)が1個結合したファンデルワールス(vdW)錯体のS_1←S_0蛍光励起(LIF)スペクトル、及びホールバーニング(HB)スペクトルの観測によって、S_1状態のゼロ点準位および分子間振動準位のトンネリング分裂値を決定した。これらの値を基に分子間振動がプロトントンネリングにどのような影響を与えるかについて調査した。CO_2以外の原子、または分子はTRNの分子面上に結合するが、CO_2はTRNの水酸基と疑似的水素結合することが明かにされた。希ガス原子以外の溶媒分子の結合は、TRNに比べてトンネリング分裂値を減少させる。トンネリング分裂値の減少は、面外に溶媒分子が結合する場合は、トンネリングの距離とポテンシャル障壁の増加による。減少の度合は、分子内振動と分子間振動とのカップリングの強度に依存する。擬似的分子間水素結合が形成される場合には、溶媒分子とOH基との直接的な相互作用によって、TRNの対称二極小型ポテンシャルが非対称化するために、プロトントンネリングが著しく阻害される。
下顎調音運動に対する咬筋筋紡錘由来の求心性情報の役割

1)目的咀嚼、嚥下、発音時における顎運動はそれぞれの合目的制御機構に基づいて遂行される多様性に富む統合された機能である。これまで我々は、咬筋筋紡錘由来の求心性情報が、閉口時よりも主として閉口時に運動制御機構に取り入れられていることを報告し、このフィードバック機構は開口所要時間が約5秒の遅い開口運動から数100msecの急速開口運動に至る、広範囲の顎運動制御系で機能していることを明らかにした。一方、発音時の顎運動に関して既に幾つかの研究グループにより報告され、中でもs発音時の下顎位は、調音運動学的に比較的安定していることから下顎前歯排列位置や咬合高径の一つの目安として今日利用されている。しかしこの様にs-positionは臨床的に大変重視されているにもかかわらず、この調音がいかなる機序でコントロールされているか明らかにされておらず、特にフィードバック制御を含めた調音運機構的な裏付けは必ずしも十分とは言い難い。そこで今回の研究は、s発音時の顎運動時に対する、咬筋筋紡錘由来の求心性情報の役割を解析することを目的としている。2)結果s音、即ち、サシスセソを含む連続音節を発生させた際の下顎位の限定には不明瞭ながらもある画一的な傾向がみとめられた。しかし、統計学的解析によると個々のデータ間の相関は認め難かった。従って本研究については今後も継続的に対処していく必要があると考えた。
Simulation of laser-driven many-electron atoms and molecules

化学反応を理解するためには、分子内の電子の動きを明らかにする量子力学的なシミュレーションが欠かせない。本研究の目的は、時間に依存するシュレーディンガー方程式を解くための方法の開発である。本研究では、二つの新しい方法論を提案した。(1)Factorized CI法と(2)時間依存ジェミナル法である。(1)のFactorized CI法は、配置間相互作用係数の行列を行列積で近似する方法で、(2)の時間依存ジェミナル法は、波動関数を反対称化された2電子波動関数の積で表わす方法である。これら二つの方法論をレーザー電場内の多電子系のシミュレーションに応用した。計算化学
サブナノ格子物質におけるプロチウム新機能

本特定領域研究の目的は、21世紀へ向けての環境重視という強い社会的要求の背景の中で、プロチウムが持つナノプロセス機能やエネルギー貯蔵媒体としての固溶機能というポジティブな機能を総合的に理解すると共に、それぞれの材料の特性を飛躍的に向上させることである。本領域研究の4年間の活動とその研究成果には、期待をはるかに超えた結果が得られている。これまでに得られている主な特記すべき研究成果として、まずプロチウムのプロセス機能を利用した機能材料の特性向上が挙げられる。チタン系材料に対してプロチウムの吸放出と加工熱処理を施すことにより、結晶粒はサブミクロンまで微細化され、超塑性特性を約9300%の伸びを示すまでに向上させている。本領域研究の第二の具体的達成目標である通産省のWE-NET計画の100°C以下3mass%のプロチウム含有材料開発であるが、V含有量の少ないTi-Cr-V合金において、WE-NETの目標におよばないものの、プロチウム容量を向上させ、高価なVフリーのTi-Cr-Mo合金においても、同様の特性を得ている。また、メカニカルグラインデイングしたグラファイトやMgとグラファイトのコンポジットでも7.3%の吸蔵量が観察されている。高密度プロチウム合金中のプロチウム占有状態、プロチウム誘起格子欠陥・脆化などの基礎的課題についても、新しい知見が引き続き報告されている。プロチウムの新機能として、プロチウムを固溶したZr-Cuアモルファス合金において、Siを添加することにより、室温近傍でも、高防振特性を得ている。また、プロチウムの溶解・析出を利用し、種々のポーラス金属の作製にも成功している。従って、本領域研究の当初の達成目標は十分に達成されたと判断される。また、研究終了ヒヤリングにおいても、評価結果は「A」(期待通り研究が進展した)と高く評価された。本領域研究は、プロチウムが侵入できる全ての機能材料を対象とし、プロチウムという元素がサブナノ格子物質に対して、どのように有用な機能を発現するのかについて、プロチウム機能の多面性を明らかにし、それぞれの材料特性の向上を図ることを目的として、平成10年度から開始された。スタートアップ研究発表会が7月30日、31日に開催し、本年度は計画班(19課題)および公募班(27課題)が参加した。また、平成10年10月には中国の杭州においてMH(Metal-Hydrogen System)に関する国際シンポジウムが開催され、本領域の研究者18名が研究発表を行った。本特定領域研究は新しくプロチウムの有する有用な機能という観点からの取組みであり、世界的な関心も高かった。また11月13日には「ニッケル・水素電池の新しい展開」と題する第1回研究会を開催し、本領域メンバー以外の大学、民間企業の第一線の研究者を招き、表題に関する新しい解析法や、応用面での現況について活発な議論がなされた。さらに12月17日、18日に第2回研究会「新しいプロチウム解析法とカーボン材料の現況」を開催し、国内にとどまらず、海外の大学の研究者を招聘し、途上段階の解析法や、本研究分野では従来にない新材料であるカーボン材料についての発表があり、多数の参加者を得て、活発な意見交換がなされた。この様に本領域研究総括班は他の5つの計画班と同様、国内の本研究分野を活発に、統一的に推進させる母体として注目されている。本年度の締めくくりとして、研究成果発表会を平成11年1月21日、22日に開催し、初年度の一年間の研究成果として、新しいプロチウム解析法やプロチウムの新機能等の研究において、新しい着想による新しい結果が随所に見られた。

本年度に引き続いて次年度以降も、プロチウムの有用な機能の解明・探索という観点から新しい研究成果が期待される。本領域研究は、プロチウムが侵入できる全ての機能材料を対象とし、プロチウムという元素がサブナノ格子物質に対して、どのように有用な機能を発現するのかについて、プロチウム機能の多面性を明らかにし、それぞれの材料特性の向上を図ることを目的として、平成10年度から開始された。本年度はスタートアップ研究発表会を7月に開催し、計画班(19課題)および公募班(26課題)が参加した。また、8月には、計画班、公募班研究グループの若手研究者のための研究会を3日間開催し、実際に実験を遂行している大学院生を中心とした研究者による最近の研究成果について発表、ポスターによる討論を行い、プロチウムの有する種々機能について理解を深めた。領域研究を強力に推進するためにも再度若手研究者のための研究会を開催し、将来のプロチウム研究者の養成に努める予定である。9月には第1回「プロチウム新機能」と題する国際シンポジウムが開催された。外国からの招待講演者は6名と少なかったものの、参加者は106名に及び、現在最も関心の高いテーマについて、活発な議論がなされた。また個々の計画研究や公募研究の連携を促し、共同研究としての成果をもたらしている。特にA02班「占有機構」、A03班「非平衡物質」、A04班「新規材料」は互いに密接に関係しており、研究班が連携を密にして研究を遂行している。この傾向は各研究グループの研究が深まる中で、今後更に、活発化すると予想される。本年度の締めくくりとして、研究成果発表会を平成12年1月に開催し、平成10年度から2年目としての研究成果として、新しいプロチウム解析法やプロチウムの新機能等の研究において、初年度に得られた新しい着想による新しい結果や問題点の整理・解決が着実に推し量られている。次年度は本領域3年目となるが、さらなる結果の向上および新しい成果が期待される。本領域研究は、プロチウムという元素がサブナノ格子物質に対して、どのように有用な機能を発現するのかについて、プロチウム機能の多面性を明らかにし、それぞれの材料特性の向上を図ることを目的として、平成10年度から開始された。本年度はスタートアップ研究発表会を7月に開催し、計画班(19課題)および公募班(27課題)が参加した。また、8月には、計画班、公募班研究グループの実際に実験を遂行している大学院生を中心とした研究者による、第2回若手研究者のための研究会を3日間開催し、最近の研究成果について発表、ポスターによる討論を行い、プロチウムの有する種々の機能について理解を深めた。これまでに得られている主な特筆すべき研究成果として、まずプロチウムのプロセス機能を利用した材料の特性向上が挙げられる。チタン系材料に対してプロチウムの吸放出と加工熱処理を施すことにより、結晶粒はサブミクロンサイズまで微細化され、超塑性特性を約9300%へと向上させている。
宿主特異性決定過程における宿主-病原体の遺伝子発現に関する研究

エンドウ褐紋病菌の胞子発芽液中に含まれるエリシタ-とサプレッサ-が、エンドウ防御反応遺伝子、特にエンドウのファイトアレキシンの生合成系の律速酵素として非常に重要な役割を果たすフェニ-ルアラニンアンモニア・リア-ゼ(PAL)とカルコン合成酵素(CHS)をコ-ドする遺伝子に焦点をおいて、これらの遺伝子発現にどのような影響を及ぼすかを調べた。エリシタ-で処理したエンドウ胚軸では、処理後1時間以内にPAL-,CHS-mRNAの蓄積の急激な増加がみられ、3-4時間で一旦下がり始めるが、再び増加しその後しばらくしてもとのレベルにまで下がる。これに対し、エリシタ-とサプレッサ-で同時処理すると、上胚軸におけるPAL-,CHS-mRNAは、処理後4時間後になってはじめて顕著な増加が認められ、その後はエリシタ-単独処理の場合と同様のパタ-ンを示す。即ち、サプレッサ-をエリシタ-によるPAL-,CHS-遺伝子の活性化を約3時間遅らせる作用を有する。このことは病原菌由来のサプレッサ-が、植物防御反応遺伝子の活性化を一時的に抑える役目を果たしていること示す。ジャガイモ疫病菌の親和性・非親和性レ-スをジャガイモ葉に接種後、接種部位でのPAL-mRNA蓄積量をinsitu hybridizationによって調べたところ、親和性レ-ス接種葉におけるPAL-mRNA蓄積量の顕著な増加は、非親和性レ-ス接種葉のそれに比較して、約3時間遅れるというin vivoでの実験結果(Cuypers et al.1988.Mol.Plant-Mic.Intr.1:157-160)とほぼ一致することは、サプレッサ-がレ-ス・品種の特異性や種レベルにおける宿主特異性を決定する1つの重要な因子であることを支持している。更に、エリシタ-で処理したエンドウ胚軸からポリ(A^+)RNAを調製し、cDNAライブラリ-を作成した。インゲンPAL-cDNAをプロ-プとしてcDNAライブラリ-からPAL-cDNAのスクリ-ニングを行ったところ、6個の陽性プラ-クを得た。全長に近いと考えられる2.5kbのcDNAの部分的塩基配列を決定したところ、3'-側にはインゲン、パセリのPAL-cDNAと非常に高い共通塩基配列が見られたが、5'-側は比較的分散していた。また、ゲノミックDNAライブラリ-を作成し、上記エンドウPAL-cDNAをプロ-ブとして5×10^6個のプラ-クをスクリ-ニングしたところ、5個の陽性プラ-クが得られた。現在、これらのクロ-ンをサザンブロット・ハイブリダイゼ-ションと各種制限酵素マッピングにより解析している。1.エリシター,サプレッサーのPAL酵素活性とピサチン蓄積に及ぼす影響エリシター処理による裏面剥離エンドウ葉のPAL遺伝子転写活性を,インゲンPALcDNAをプローブとするノーザンブロットハイブリダイゼーションにより検索したが,本系ではi)

裏面剥離処理に人手と時間がかかり過ぎ,PALnRNAの経時変化を正確に把握するには誤差が大きいこと,更にii)温室育成のエンドウ葉では,光誘導によるPAL転写活性が高く,エリシターの誘導によるPAL遺伝子転写レベルを経時的に比較するには,バックグランドが高すぎること,の問種点が明らかになった.従って,暗黒下で育成した播種後6日目のエンドウ上胚軸を供試植物体とし,エリシターのPAL酵素活性,ピサチン蓄積量に及ぼす効果を調べたところ,PAL酵素活性はエリシター処理後9時間に顕著な増加が,また1824時間にはピサチンの蓄積が認められた.エリシターのサプレッサーの同時処理では,エリシターの誘導は確認されず,サプレッサーがエリシターの効果を打消すことが明らかとなった.2.エリシター,サプレッサーのPALmRNA転写活性に及ぼす影響上記の結果から,エリシター処理後1ー5時間の各時間ごとにエンドウ上胚軸かりRNAを抽出し,ホルムアルデヒドRNAアガロースゲルでRNAを分画後,インゲンPALcDNAをプローブとしたノーザンブロットハイブリダイゼーションを実施したところ,1ー3時間で著しいPALmRNA転写活性が確認された.現在,サプレッサーのPALmRNA転写活性に及ぼす影響を検討している.3.エンドウcDNAライブラリーの作成非生物的エリシター,アクチノマイシンDで処理したエンドウ鞘からポリ(A^+)RNA画分を精製し,所定の方法によりλgt11を用いたcDNAライブラリーを作成したところ,1μgあたり2×10^6個の組換え体プラークを得た.現在PAL,CHS,HRGPのcDNAを同定している.エンドウcDNAライブラリーからPAL遺伝子を同定するためλgtllアームを用いたin vitro packagingによりエンゲンPALーcDNA(ソーク研究所、ラム教授より供与)をプローブとしてプラークハイブリダイゼーション法を行なったところポジティブなハイブリダイゼーションのシグナルを得たが、受容菌のE、coli、Y1088に含まれるpMCペクターがPALとDNA塩基配列において相同性を持つことが判明した。そこで現在λgt10ベクターを用いたcDNライブラリーの作成とそのスクリーニングを急いでいる。2.エンドエPALアイソザイムの純化。エンドウPALアイソザイムの精製を次のように行なった。まず硫安塩析の沈澱物を透析し、DEAEイオン交換クロマトグラフィーで分画したところ3つの活性ピークが得られた。現在、最も活性の高い画分をHPLCで精製し、更にTOYOPEARLーAFーTresylアフィニティークロマトグラフイーで純化し、SDSアクリルアミドゲル分析を行なったところ、約8万ダルトンの単一ピークを得た。現在ペプチドシークエンサーによるアミノ酸残基配列の決定と、DEAEイオン交換で得られた他の二つの活性画分を更に精製している。3.ゲノム上PAL遺伝子の構造エンドウのゲノミックDNAを所定の方法で切断分画し、EMBL3アームを用いて7×10^6個のライブラリーを作成し、インゲンPALーcDNA、およびHRGPをプローブとしてプラークハイブリダイゼーションを行なったところ少なくとも25コのPAL、40コのHRGPと考えられるプラークを分離した。現在更に遺伝子同定を進めている。1エンドウPAL-cDNAのクロ-ニングとDNA塩基