hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ランの組織培養と工場生産化

培養苗生産企業についても視察を行い、施設の整備状況、使用機材の一覧、雇用人員数等を調査し、生産コストの算定を行うと共に、専門技術員の教育体制あるいは営業手法を含めた実務的な事情についても情報の提供を受け、中国における植物組織培養苗生産の可能性について討論を行った。その結果、中国における植物種苗の現地生産の可能性が高いことが明らかとなり、広西農学院との植物組織培養種苗生産における合弁企業の設立に関して合意が成立した。また、これに関しては本科学研究費に基づく研究の終了後についても継続して当時者間が協議を行い、平成6年度中には調印が行われることとなった。本研究の課題である「ランの組織培養と工場生産化に関する研究」における成果としては、岐阜大学及び広西農学院の共通植物対象として高級ランの一種であるバンダを選定した。これは鉢花として流通できるばかりでなく切り花用花卉としても流通できる植物で、世界的な研究レベルにおいても研究が遅れている植物である。共同研究を実施した結果、広西農学院ではこれの無菌播種技術の開発を取り組み、岐阜大学では生長点培養技術及び不定胚形成技術の開発について実施した。広西農学院における研究成果としては、3種類の培地の検討を行い、その中ではMS培地が適しており、これにBAP0.3mg/lとNAA0.05mg/lを添加することで生育が促進し、さらにカザミノ酸あるいは未熟バナナ果汁を添加することによって良好な生育がえられることが明らかとなった。これらの成果は広西農学院研究報告に取りまとめられ、出版された。岐阜大学における研究成果としては、親植物から生長点培養の採取部位としては頂芽の生長点が最も適しており、腋芽の生長点の生育は頂芽生長点のそれに比べて著しく生長が遅いことが明らかとなった。また、5種類の基本培地の検定を行った結果、RC培地が最も適しており、これにBAPを0.1μM添加することで生育が著しく促進され、良好なプロトコームが形成された。このプロトコームを継代培養した結果,不定胚,不定芽プロトコームの集合体であることが明らかとなった。これらの組織をそれぞれ分離して培養した結果,不定胚集塊,不定芽集塊,プロトコーム様集塊に分けられた。広西省における自生植物を調査した結果,数種のイワタバコ科植物を見つけることができ,日本で栽培されているセントポ-リアの育種に活用できる可能性が明らかとなった。また,ラン科のデンドロビウム属の野生ランを採取し,広西農学院で栽培し,今後デンドロビウムの耐病性育種に活用する計画である。広西農学院を訪問し、広西農学院における植物組織培養施設の視察を行った。広西農学院ではこれまで「バナナ」の優良系統の選抜育種を行い、選抜された系統を茎頂培養を用いて年間300万本を生産し、広西省内の周辺農家に配布する事業を展開していた。年間300万本の組織培養苗を生産できる企業は、日本でも1社しかなく、極めて高い生産技術を修得していたが、ランに関しては試験段階にとどまっていた。現地でのランの自生種の調査を行ったが、南寧市周ではシンビジュウム属の種がほとんどであった。しかし、中国国内で出版されている植物分類学に関する書籍を調査したところ、広西省にはデンドロビウム属をはじめとして、バンダ属等も豊富に自生していることが明らかとなり、次年度での調査地域を広げた植物分布調査を実施する必要性が明らかとなった。研究実施検討会を開催した結果、広西農学院では自生植物を茎頂培養することによりin vitroで大量増殖し、フラスコ苗あるいは順化した苗として生産することにした。
海洋の生物多様性保全に関する国際法ー制度の複合的・重層的連関と調整の実証研究

本研究では、海洋の生物多様性の保全を統合的に可能とする海洋秩序のあり方について探求した。研究の対象が、多様な資源(生物資源・鉱物資源・遺伝子資源など)に及び、またそれらの存在する地域(領海・公海・深海底など)が異なるので、多くの関係する条約などの国際的合意を分析し、その有効性について検討した。また、そうした国際的合意を実施する方策(海洋保護区など)について検討するとともに、北東アジア地域における地域的実施にむけての韓国との共同研究をおこなった。2015年度は、「海洋の生物多様性保全に関する国際法」に関する先行する研究をふまえて、海洋生物多様性保全の問題が国連海洋法条約(UNCLOS)や生物多様性条約などに関する国家・条約実行としていかに統合的に実施・実現されているかを実証的に研究した。具体的には、2015年8月と2016年3月に計2回の研究会合を開催し、各人が次のようなテーマで研究の進捗を報告し、問題状況を確認し検討した。第1回研究会では、2つの報告がなされた。「船舶からの温室効果ガスの排出規制ー国際海事機関(IMO)と地球温暖化の防止ー」富岡仁(名古屋経済大学)は、生物多様性保全に重要な関係のある地球温暖化の防止問題の新しい展開の現状と問題点について、また、「パパハナウモクケア海洋国立記念碑ーUNCLOS121条の解釈と実際ー」加々美康彦(中部大学)は、海洋生物多様性保全の主要な方策の一つである海洋保護区の先行的事例とその条約上の問題点について検討する。第2回研究会では、3つの報告がなされた「紛争解決フォーラムの多重化と欧州裁判所」高村ゆかり(名古屋大学)は、環境保全に関する国際的実施という現代的に重要な課題を理論的・実証的に検討するものであり「海洋ガバナンス形成過程におけるNGOの役割」都留康子(上智大学)は、生物多様性保全に関係する現在の海洋秩序のありようについて国際政治学の観点から検討する。「韓国のMPAの近況」「ISAの近年の動向」河錬洙(北海道教育大学)は、韓国における海洋保護区をめぐる状況について、また、国際海底機構の海底資源保全をめぐる活動状況を分析するものである。以上の報告とも、課題とする研究を進展させるために重要かつ不可欠の研究である。なお、研究会においては、これまでの研究成果を2019年度末をめどに出版する予定で企画しており、各人がそれにむけての執筆計画を作成する作業を行った。2015年度においては、海洋法が海洋の生物多様性保全の観点から変容を迫られ、かつ普遍的・地域的条約や機関において蓄積されている多様な実行について確認したうえで、さらにそれらの背景にあり形成されつつある制度間の相互連携と調整の動態とその国際法的問題についての検討を進展させ、2018年度末をめどにその成果を刊行することに向けて、着実にその研究成果を積み上げることができた。平成28年度は、昨年度における、海洋の生物多様性保全の要請から現行の海洋法が変容を迫られている三つの分野(海洋保護区、海洋生物資源管理、陸域起因海洋汚染)における状況に関する実証的研究をふまえて、国際社会における諸制度間の相互連関と調整の動態を解明し、関連する法的問題の検討を行ったが、特に、関連する主要な諸条約(UNCLOS,CBD)の間、それら条約と他の国際機関、地域的制度との間の相互連関と調整の動態を明らかにすることにより、本研究課題の観点からの肯定的・否定的な国際的実行の評価を行った。そのうえで、普遍と地域の制度間の相互連関と調整による新しい海洋法秩序の形成に伴う国際法の諸問題を実証的に解明する作業を行った。以上の観点から、具体的には、平成28年9月と平成29年3月に研究会合を、また、平成28年12月には、韓国海洋研究院(KIOST)を訪問し、本研究の目標である、東アジアにおける地域的制度のあり方の探求に向けた意見交換および韓国海洋保護区の視察を行った。第一回研究会では、上記研究課題の進展の観点から、各自(富岡、高村、加々美、都留、河)の研究の現状の報告を行い、意見交換を行った。とくに、平成30年度に計画されている研究成果の公刊の観点から、相互の研究成果の調整を意識して行った。第二回研究会では、特に検討が必要とされる二つの課題すなわち「韓国の海洋保護区」(河錬沫)および「ポスト南シナ海仲裁の離島管理政策」(加々美康彦)の報告を受けて、上記研究課題の遂行の観点からの検討を行った。さらに、KIOSTへは、富岡、都留、河が訪問し、実効的な海洋の生物多様性保全を可能とする北東アジア地域の法制度のあり方についての意見交換を行った。各自の研究成果は、論文および学会等の報告において随時社会に発信した。平成28年度においては、前年度における、海洋法が生物多様性保全の観点から変容を迫られ、新しい条約や国際機関の実行として形成されつつある多様な実行について確認したうえで、それらの背景にある条約、国際機関、地域的制度との間に存在する問題の相互連関と調整の実態を明らかにし、さらに、それらの新海洋法秩序の形成に伴う国際法の諸問題の解明に向けての着実な成果を積み上げることができた。さらに、本研究の課題とする北東アジア地域における地域的制度のあり方についても、韓国海洋研究院との意見交換により重要な進展を見ることができた。共通の課題を追求している韓国海洋研究院とは、この7月に日本において第二回の共同研究会を開催する計画である。

また、公刊を予定している研究成果については、各自の残された研究課題の追求と平行して、統一した章別編成に基づき各自においてまとめる作業を進展させている。本研究は、海洋の生物多様性の保全を統合的に可能とする海洋秩序のあり方について探求することを目的とした。そのための主要な分野である、海洋保護区、海洋生物資源管理そして陸域起因海洋汚染防止の観点から、それぞれの条約・国家実行を分析し、制度間の相互連関と調整の動態を解明し、北東アジア地域における地域的制度のあり方について提言することを目指した。研究の最終年度に当たる本年度は、以上の観点から、平成28年7月に「海洋の生物多様性の保全をめぐる共同研究会」を韓国海洋海洋科学技術院海洋政策研究所とともに名古屋において開催した。また、平成30年3月には、研究成果の刊行に関する研究会を開催した。上記日韓共同研究会においては、藤前干潟の視察を行いあわせて環境省自然保護官・遠藤誠氏から藤前干潟における生物多様性保全の現状と課題について講義をうけた。共同研究会においては、日本側から「日本の海洋保護区の現状と課題」(加々美)および「Nagoya Protocol and relevantissues to beaddressedin the negotiation on BBNJ」(高村)が、韓国側からは「韓国における深海底資源開発の現状と深海底法の制定動向(Yang Hee Chel)および「韓国における海洋空間計画法の制定と主な内容」(Lee Moon Suk)の報告がなされ、日韓における現状と課題を前提に、活発な討議が行われ、東アジア地域における地域的制度の構築に向けた有益な意見交換がなされた。第2回の研究会においては、これまでの研究の成果の出版のための各自の成果報告がなされた。各自の研究成果は論文及び学会等の報告において随時社会に発信した。また、研究成果についての刊行はまもなく実現する見込みである。本研究では、海洋の生物多様性の保全を統合的に可能とする海洋秩序のあり方について探求した。研究の対象が、多様な資源(生物資源・鉱物資源・遺伝子資源など)に及び、またそれらの存在する地域(領海・公海・深海底など)が異なるので、多くの関係する条約などの国際的合意を分析し、その有効性について検討した。また、そうした国際的合意を実施する方策(海洋保護区など)について検討するとともに、北東アジア地域における地域的実施にむけての韓国との共同研究をおこなった。2014年度に研究代表者が逝去したことにより中断した本研究課題について、2015年度に新規の研究課題として採択されたことにより、これまでの研究の成果を十分にふまえ研究を発展的に遂行するための基盤ができた。実質的に継続する本研究について、その成果を刊行することがきわめて重要でありまた社会的に意義あることと考えるので、前研究代表者の分担していた役割について各研究者が分担し直して計画の完成を目指したいと考えている。最終年度を迎える平成29年度においては、これまでの生物多様性保全のための国際法の構築にむけての研究成果を統合し、刊行することがきわめて重要でありかつ社会的に意義あることと考える。したがって、その観点からの各自のこれまでの研究成果の統合・調整の作業を一層進展させたい。
二枚貝の配偶子成熟における性ステロイド、セロトニン、Ca2+の作用機構

セロトニンによって誘導される精子運動の開始には、電位依存型のKチャンネルやCaチャンネルを介した精子からの細胞外K流出と細胞内Ca流入が大きく関与することが明らかになった。同時に、プロトンチャンネルを介した細胞内Hプロトン排出によるpHの上昇もともなうことが明らかになった。さらに、セロトニンによって引き金を引かれた精子運動は、Caチャンネルを介した細胞内Ca流入の増加と続く減少と増加を繰り返し、Ca/カルモデュリン依存性の精子鞭毛の規則的なビートによって活性化されることが示唆された。二枚貝類の精子運動活性化のメカニズムの概要を整理すると、産卵刺激を受けた個体で中枢神経からセロトニンが精巣内に放出され、精子鞭毛上に存在するセロトニン受容体によって精子にセロトニンシグナルが伝達される。T、L-タイプのCaチャンネルを介した細胞内へのCaの流入が起こり細胞内Ca濃度が上昇し、精子運動が活性化される。外部環境への精子放出と同時に、K濃度の低い外部環境へのKチャンネルを介したK放出とプロトンチャンネルを介したHプロトン放出によるpH上昇が起こり、Na/Ca交換チャンネルによる細胞内Ca濃度の調節によって鞭毛のビートに不可欠なCaの波状的に繰り返す増減形成によって、二枚貝の精子運動が維持されることが示唆された。二枚貝の精子運動の引き金物質であるセロトニンによる精子運動活性化のメカニズムが不明であったが、今回の研究によって精子を取り巻くイオン、pHを中心にそれらの関連を明らかにすることができた。(抄録なし)1)海産二枚貝の精子運動能活性化の評価のための実験条件の検討精子運動能を解析するシステムを用い、通常の人工海水中でセロトニンやアンモニアで活性化されたアサリ精子運動能が数時間以上維持されることが明らかになり、実験条件を決定した。2)海産二枚貝の精子運動能活性化と抑制調節セロトニンやアンモニアによるアサリ精子の活性化は外部カルシウム依存性であり、カルシウム存在下でも見られる組み換えOMAFによる強い精子運動抑制作用は、カルシウムチャンネルを介した抑制機構の存在によることを示唆した。しかし、Tタイプカルシウムチャンネルブロッカー(ミベフラジル)による強い精子運動活性化に対する抑制作用が見られたが、細胞内カルシウムは組み換えOMAFと同じ挙動は認められず、OMAFが抑制的に働くカルシウムチャンネルの特定には至らなかった。3)精子運動活性化に対する性ステロイドの影響テストステロンやエストラジオールによるホタテガイ精巣組織の処理によって、セロトニンによる精子運動活性化を強く促進した。このことは性ステロイドによる精子の成熟もしくは活性化を示唆している。まだ未着手のホタテガイのアンドロゲン受容体(AR)のPCRクローニングを開始し、いくつかの候補断片を得ることができた。今後、配列確認と伸長反応による一次構造解析を進めたい。1)海産二枚貝類の精子活性化に関わる化学的環境精巣内と精漿内のpHは酸性状態にあることを確認し、酸性条件下では精子は休止状態にあり、種によってセロトニンやアンモニアによって活性化されるものとされないものがあった。しかし共通してセロトニンによる活性化は外部カルシウムに依存していることは明らかであった。さらに、細胞外のNa+の存在が不可欠であることも明らかになった。2)海産二枚貝類の精子活性化におけるOMAFの役割卵成熟休止因子0MAF(Oocyte Maturation Arresting Factor)はセロトニンによる精子活性化および精子運動を抑制した。セロトニンによる精子頭部のCa2+オシレーションの誘導は、EGTA存在下と同様に組換えOMAF存在下で強く抑制されていた。このことは、OMAFがセロトニンに依存した外部からのCa2+流入を阻害することで精子活性化および精子運動を抑制したことを示唆しており、精子のカルシウムイオンチャンネルを介した反応であると考えられた。3)精子成熟の指標となる遺伝子の同定マガキESTデータベースから哺乳類・ウニ類・原索動物の先体に局在するピアルロニダーゼとアクロシンに相同の配列を検索した。候補断片の相同性検索から、マガキのビアルロニダーゼとアクロシンと推定された。IUCE法による伸長によって完全長の獲得を目指す。

精子運動を安定して観察できる条件が得られた。ただし、人工海水中で完全に停止状態におく詳細な条件を今後詰める。精子運動活性化におけるカルシウムイオンチャンネルを介した外部カルシウムの取り込みの必要性が明らかにできた。加えて、ステロイドホルモンによる精子活性化に対する促進調節の存在を示すことができた。精巣内精子が二枚貝類でも酸性状態下で不活性化しており、その活性化にセロトニンがカルシウムやナトリウムと協同して関わり、さらに、精巣内での抑制調節にはOMAFによる外部カルシウムイオンの流入阻害が働いていることを明らかにした。また、精巣内での精子成熟にかかわる先体に局在する分子の同定に着手した。精子運動活性化と同時に、新たに、先体反応の活性化もセロトニンによって認められ、それらに関わる内分泌調節を新たに明らかにする。さらに、先体反応に関わる分子の同定とそれらとの関わりへも展開する計画でいる。さらに、精子運動活性化の促進と抑制調節の相互関連を組み換えタンパクを併用しながら解析し、二枚貝類の精子運動活性化に対する生殖内分泌による調節メカニズムを明らかにする。セロトニンに依存した精子活性化の細胞内シグナルカスケードを明らかにするために、セロトニン受容体が局在する原形質膜を除去した精子の調整とそれを使ったカルシウムやcAMPによる軸糸タンパク質の振動解析を行う予定である。また、候補断片が得られたピアルロニダーゼとアクロシンの完全長を得ることで、これらの先体局在性とこれらの発現と精子成熟との関係を明らかにする予定である。(抄録なし)
タイ伝承写本にみられる「マハーブッダグナ(偉大なる仏徳)」の研究

本研究の成果は、タイで作製された、クメール文字、パーリ語で書かれている折本紙写本(一部貝葉写本を含む)の影印データをタイ、欧州、米国から入手して研究代表者田辺和子が、今まで知られていない「マハーブッダグナ(偉大なる仏徳)」と題されたパーリ文経文のローマ字転写を行い、研究分担者茨田通俊が和訳を行った。これは世界ではじめて明らかになったものである。さらにミャンマーの仏徳文献の要約を研究協力者原田正美が行い、清水洋平は写本の造形説明を行い、仏徳の注釈書の一部を舟橋智哉が解読したことである。既にデジタル画像として収集済みの、バンコク郊外の水牛寺と呼ばれるWat Huakrabu所蔵のMahabuddhagunavannana(偉大なる仏徳の称賛)の書かれている絵付き折本紙写本(水牛寺本)を取り上げ、クメール文字パーリ語の写本のローマ字転写作業を終えた。この写本は特殊な太字なので解読困難であるので貝葉写本資料のbuddhaguna解読作業を行って校合しながら解読を進めた。7月から9月にかけて来日していたフランス極東学院(EFEO)の前特別研究員J.Filliozat女史の指導を得て、ローマ字転写を行った。また貝葉写本調査の許可を得ていたトンブリー地区のWat Arunからの貝葉写本の資料のbuddhagunaをも入手して解読作業の助けとすることができた。次にペッブリ県の寺院Wat Lad所蔵のアユタヤ時代後期作のクメール文字パーリ語で書かれた絵付折本紙写本のローマ字転写作業をも行ったが、この写本はある部分から切り取られていて完本でないことが判明した。年度末にフィリオザ女史からEFEO所蔵の同時代の写真を手に入れることができたのでそれを使用しながら校合テクストを作成する試みを行ってきた。研究の総括は研究代表者田辺が主となって行い、紙写本の解読と対応貝葉写本の校合は研究分担者茨田が行った。これらローマ字転写作業、並びに校訂テクスト作成作業については、クメール文字パーリ語読解専門家の舟橋智哉博士と東南アジア撰述の仏教説話文献のデータベース化を行う清水洋平博士に研究協力者として従事してもらった。吉元信行大谷大名誉教授からもアドヴァイスを頂いた。タイ、バンコク郊外の寺院Wat Hua krabau、ペッブリ県の寺院Wat Ladそしてフランス、パリの極東学院(EFEO)に所蔵されているアユタヤー後期(18世紀)折本紙写本計5本のクメール文字パーリ語で書かれている「マハーブッダグナ(偉大なる仏徳)」のローマ字転写を全て完成しおえた。またタイ、トンブリー地区の寺院Wat Hong Ratanaramから収集した貝葉写本1本に「マハーブッダグナ(偉大なる仏徳)」の完本を発見したのでこれについてもローマ字転写を行った。これのみでは校訂作業が不充分と思ったので、アメリカ、ニューヨークパブリックライブラリー所蔵のアユタヤー後期しかも18世紀前半とみなされる折本紙写本2本の影印を現地に出かけて撮影してきた。そしてこの2本もローマ字転写を終えた。また茨田通俊氏を中心にWat Hua krabau所蔵の写本の「マハーブッダグナ(偉大なる仏徳)」の和訳を終えている。解読が困難である上、これまでに南方上座仏教関係書に「マハーブッダグナ(偉大なる仏徳)」の出版が見られないので和訳するにあたって困難をきわめた。校訂本と和訳が完成すれば17,18世紀における南方上座仏教の仏陀観がはっきりとみえてくると思う。本研究は、クメール文字、パーリ語で書かれた折本紙写本(一部貝葉写本を含む)の資料を用いてタイに流布した仏徳(ブッダグナ)の研究を行うものである。これまでに資料収集と調査を行っていた、バンコク地区のワットマハータートウ、その対岸のトンブリー地区所在のワットラジャシタラー、、ワットアルンそしてペトブリー地区の各寺院から撮影を許されて得ていた所蔵貝葉写本の影印データの整理を行い、その中の仏徳(ブッダグナ)に関係する資料を確認した。またこれまでに影印データを得ていたバンコク郊外のワットフアクラブ、ペトブリー地区のワットラット所蔵絵付折本紙写本の中の「偉大なる仏徳(マハーブッダグナ)」と題された経文を読み始めた。仏徳(ブッダグナ)については貝葉と紙両者の写本に書かれていることがわかったが、紙写本はクメール文字・パーリ語で書かれているが、貝葉写本には、その多くが現在では解読不可能なクメール文字・タイ語で書かれていることがわかり、貝葉写本についてはパーリ語のもののみを利用することにした。

そこでタイ所蔵の折本紙写本だけでは不充分であるのでフランス極東学院所蔵3本、ニューヨークパブリックライブラリー所蔵2本、ダブリンのチェスタービーティライブラリー2本の影印データを入手して研究代表者田辺和子が、これらを参照してワットフアクラブ寺院所蔵折本紙写本の「偉大なる仏徳(マハーブッダグナ)」と題されたパーリ文経文のローマ字転写を行い、研究分担者茨田通俊が和訳を行った。ミャンマーにもこれに近い仏徳文献があることがわかったので、研究協力者原田正美がミャンマー本の要約を行った。清水洋平はタイ写本の造形の説明をおこなった。タイの仏徳の注釈書も発見されたので舟橋智哉がその一部を解読した。写本研究家のフランス極東学院元研究員フィリオザ女史から提供された多くの文献、写本資料を加えて成果報告書を作成した。これまでに入手している全ての「マハーブッダグナ(偉大なる仏徳)」についての写本のローマ字転写を終え、さらに1本の和訳を終了しているのでこれをもとにして校訂、和訳をすすめることは容易であると思う。アイルランドのダブリンのチェスタベッティライブラリー所蔵のアユタヤー期作製折本紙写本の影印を入手できればさらに学問に貢献できると思われる。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究分担者茨田通俊氏、研究協力者清水洋平氏、舟橋智哉氏の協力を得て毎月一回の研究例会を開催して校訂作業の検討を行い、さらに和訳の検討を行っていく。また研究協力者の原田正美氏から情報を得て、ミャンマーでは「仏徳」の讃歎をどのように行っているかを調査してもらう。
改良型キトサンナノ繊維管による胸腔内自律神経機能再生に関する実験的臨床的研究

ナノテクノロジーを応用して作成したキトサンナノ繊維チューブ(C-tube)による胸腔内自律神経再生効果について検討した。ビーグル犬を使用し、交感神経および横隔神経を切断し、神経の断端をそれぞれC-tubeの両端に縫合した。いずれの犬も合併症なく生存した。術後1年でC-tube内で神経が連結しており、神経障害症状が回復する犬もいた。C-tubeは交感神経および横隔神経の形態的再生を促し、神経機能の一部を再生させることを確認した。【目的】ナノテクノロジーを応用して作成したキトサンナノ繊維チューブ(C-tube)の交感神経および横隔神経再生効果について検討した。【対象と方法】ビーグル犬6頭を使用(交感神経3頭、横隔神経3頭)。右開胸で交感神経および横隔神経を確認のうえ約1cm切除し、神経の断端をそれぞれC-tubeの両端に縫合。<評価法>交感神経:手術前後、犠牲死の際にホルネル症候群を観察。横隔神経:術直後と術後1年に、横隔膜の運動性を透視および胸部Xpで評価。6頭とも犠牲死の際,C-tubeと交感神経または横隔神経を一塊に摘出し神経再生や感染を病理学的に評価。【結果】6頭ともに犠牲死まで肺炎や創感染はなく生存。開胸時6頭ともC-tube周囲に肉芽造生を認めるも、膿瘍形成はなし。交感神経:犬3頭中2頭で、犠牲死の際ホルネル症候群が改善。術後3か月後に摘出したC-tube内に索状物が増生し、術後1年ではC-tube内で神経が連結していた。病理学的には索状物の多くは肉芽組織からなっていたが、その内部には交感神経断端から連続して増生した神経細胞が確認された。横隔神経:右横隔膜は、術直後には3頭とも挙上し運動性はなかったが、1年後には3頭中2頭で呼吸に合わせ頭尾側に運動するようになった。横隔膜の運動性が戻った犬ではC-tube内で横隔神経が索状物で連結されており、策状物は再生した神経細胞であった。【結語】C-tubeは自律神経である交感神経および横隔神経の再生において安全に効果をもたらす可能性がある。神経線維の再生だけでなく機能の再生も期待される。<評価法>交感神経:手術前後、犠牲死(術後3、7、12か月)の際にホルネル症候群を観察。左右上肢の温度差も測定。横隔神経:術直後と術後1年に、横隔膜の運動性を透視(動画)および胸部レントゲン写真で評価。6頭とも犠牲死の際、C-tubeと交感神経または横隔神経を一塊に摘出し神経再生や感染を病理学的に評価。術後3か月では右上肢の温度は左上肢より1°C以上高かったが、12か月後には温度の左右差はなくなった。病理学的評価:術後3か月後に摘出したC-tube内に索状物が増生し、術後1年ではC-tube内で神経が連結していた。【方法】ビーグル犬を使用。

右開胸で交感神経および横隔神経を確認のうえ、神経を約1cm切除し、神経の断端をそれぞれC-tubeの両端に縫合。【実験1】交感神経モデル3頭、横隔神経モデル3頭、計6頭を対象。いずれも犠牲死まで肺炎や創感染はなく生存し、C-tube周囲に肉芽造生を認めるも、膿瘍形成はなかった。交感神経:3頭中2頭で、犠牲死の際ホルネル症候群が改善。術後3か月では右上肢の温度は左上肢より1°C以上高かったが、1年後には温度の左右差はなくなった。病理学的に術後3か月でC-tube内に索状物が増生し、術後1年でC-tube内で神経が連結していた。横隔神経:右横隔膜は、術直後には3頭とも挙上し運動性はなかったが、1年後には3頭中2頭で呼吸に合わせ頭尾側に運動するようになった。横隔膜の運動性が戻った犬ではC-tube内で横隔神経が再生していた。【実験2】横隔神経モデルで、A群:一重層C-tube(n=4)、B群:二重層C-tube(n=4)、C群:C-tubeを用いず神経切断のみ(n=1)の3群に分け、横隔神経再生効果を術後1年で評価した。現在までにA群3頭とC群の評価を行った。C群では術後1年で、横隔膜は挙上し運動性はなく、神経は離断されたままであり、神経伝導検査装置による横隔神経の電気刺激で横隔膜は動かなかった。A群では、術後1年後には3頭ともに呼吸に合わせ横隔神経が頭尾側に、ある程度運動するようになった。C-tube内の再生組織が太いほど、弱い横隔神経電気刺激で横隔膜が動き、この神経電位図を作成した。【結語】C-tubeは自律神経である交感神経および横隔神経の形態的再生を促し、横隔神経で神経機能の一部を再生させることを確認した。
4倍性魚種コイのc-myc遺伝子2タイプの進化

コイc-myc遺伝子の細胞レベルでの機能を明らかにするためには抗体を用いた実験が必須であるが、相同性の高い2つのc-Mycを区別できる抗体を作製することは困難である。そこで、それそれのc-myc遺伝子にFLAGエピトープタグを付加してコイ上皮腫由来の培養細胞株EPCにトランスフェクションし、400-μg/mlG418を含むMEMで培養したところ、c-mycを恒常的に発現する株を得ることかできた。この株を用いることにより、Anti-FLAG抗体を使った免疫沈降やChIPアッセイなどを可能にしただけでなく、細胞増殖や老化など長期にわたる解析も可能となった。進化速度が速く新しい機能を持っているであろうと推測されるc-Myc1蛋白質の解析をおこなうため、大腸菌による組換え蛋白質の合成を試みた。c-mycのcDNAをpETベクターに挿入し、大腸菌Rosetta(DE3)株を形質転換し、GST融合蛋白質を発現させることに成功した。この蛋白質を用いることにより、c-Myc1の新規結合蛋白質のスクリーニングか可能となった。コイc-myc遺伝子の個体レベルでの解析は、これまでRT-PCRでの発現解析のみであった。本研究では、どの組織のどの細胞でc-myc遺伝子が発現しているかを詳細に明らかにするために、10%中性ホルマリンで灌流固定したコイの各臓器の組織切片を作製しin situハイブリダイゼーションをおこなった。2種類のc-mycに共通な領域をプローブとして用いたところ、脳のダリア細胞と大型神経細胞、鯛の上皮細胞で強い発現が観察され、肝膵臓の膵細胞でも弱い発現が認められた。今回、2種類のc-mycを特異的に見分けられるように設計したオリコヌクレオチドプローブでは感度が低く、シグナルを検出することはできなかったが、個体レベルでの機能を推定する上では重要な知見を得ることかできた。コイのc-myc遺伝子2タイプの間にどのような機能の分化が起きているのかを明らかにするために、コイ由来培養細胞株を用いてc-Myc蛋白質の生化学的機能の違いについて解析をおこなった。まず、血清刺激後のc-mycの発現量をRT-PCRで定量したところ、KF細胞ではc-myc2の発現が誘導されたのに対し、KG細胞では逆にc-myc1の発現が誘導された。そこで、遺伝子発現制御に影響を与えると考えられる転写開始段階での機能の違いを明らかにするために、c-mycの5'上流領域の欠失変異体を作製し、ルシフェラーゼアッセイを行うたところ、c-myc1とc-myc2は異なる転写制御機構を持つことが分かった。また、ゲルシフトアッセイの結果では、両c-Mycはその標的配列であるE-boxに対して親和性に違いは見られなかったものの、レポータージーンアッセイでは、保存的なc-Myc2はc-Myc1に比べて高い転写活性をもつ傾向が見られた。それぞれのc-Mycと特異的に相互作用する蛋白質を網羅的にスクリーニングするために、E. coliツーハイブリッドシステムをおこなったところ、cDNAライブラリーからc-Myc1とc-Myc2に対してそれぞれ異なる11個の候補蛋白質が得られ、相互作用する蛋白質においても2つのc-Mycの間に違いが認められた。以上の結果から、c-myc1とc-myc2の機能はオーバ-ラップしてはいるものの、この2つは明らかに区別することができ、倍数性進化の仮説を支持する知見を得ることができた。
近視性黄斑症に関連する遺伝子の解明

研究者らは前年度に近視性黄斑症に関連する遺伝子として、CCDC102Bを報告している。(Nat Commun. 2018 May 3;9(1):1782.)さらに今年度は国際研究グループであるCREAM(Consortium for Refractive Error and Myopia)とメタ解析を行った。既報の50以上の近視関連遺伝子について検討を行い、近視関連遺伝子としてもよく知られているKCNMA1とGJD2が、近視発症のみならず近視性黄斑症の発症にも寄与していることを特定した。この結果はアジア人のみならず、白人でも再現性を確認した。以上の結果について、現在英文雑誌に投稿中である。上記と並行して、眼底を定量的に評価することにより、眼疾患関連遺伝子の特定を試みた。眼には網膜と強膜の間に脈絡膜という血流豊富な組織が存在する。脈絡膜は眼の循環をつかさどっており、主要な失明原因である加齢黄斑変性や中心性漿液性脈絡網膜症の発症において、非常に重要であることが分かってきている。特に中心性漿液性脈絡網膜症は脈絡膜の肥厚を特徴とし、近年失明原因として注目されてきている。今回研究者らは世界で初めて脈絡膜厚に関連する遺伝子として、CFHとVIPR2の2つの遺伝子を特定した。さらにその2つの遺伝子における、脈絡膜を肥厚させる遺伝子変異が、中心性漿液性脈絡網膜症の発症に寄与していることを明らかにした。この関連性は日本人のみならず、韓国人においても再現性が確認された。これらの結果については、本年度に英文誌に掲載された。(Proc Natl Acad Sci U S A. 2018Jun 12;115(24):6261-6266)近視性黄斑症関連遺伝子として新規遺伝子を特定し、さらに当初の目的通りに、眼底の定量的な評価により、中心性漿液性脈絡網膜症感受性遺伝子も特定できた。次年度は下記に記すさらに新たな手法を用いて、他の眼他因子疾患の関連遺伝子解明を試みる。これまで定量的な指標を用いて、正常人をもちいてGWASを行い眼表現系に関連する遺伝子を特定し、さらにその候補遺伝子と疾患との関連を検討する試みは数多くなされてきた。この試みは、疾患のサンプル数が数多く集めることが困難なため有用であり、今年度研究者らも脈絡膜に関連する遺伝子を特定した。しかしながら正常人のGWASでは候補遺伝子が多数になるため、検定の多重性を考慮すると、次の疾患との関連を検討する段階において、偽陰性が多くなってしまうことが問題点である。そこで本年度は、数多くの候補遺伝子から、さらに重要な遺伝子を絞り込むための手法として、IBM Watsonを用いることとする。Watsonは問題を認識して、その解答として正しいもの、正しそうなものを推測し、提示すると言う役割を担う目的で開発された第三世代の「コグニティブ・コンピューティング・システム」である。ありとあらゆる自然科学系の出版物を読むことにより、それらの間に未知の関係性を発見することができる。活用例として、ベイラー医科大学のがん研究者はp53の活性化を導くキナーゼを予測するため、p53に関する7万もの科学論文をWatsonを用いて分析し、既知のp53キナーゼの近隣に位置するキナーゼを、新たな研究対象となり得るp53に作用するキナーゼとして特定した。別の事例として、筋萎縮性側索硬化症に関係するRNA結合タンパク質の同定にもwatsonを用いたという報告がされている。次年度は、上記のWatsonを我々のGWASデータと組み合わせることにより、さらなる眼多因子疾患関連遺伝子の特定を試みる。(Proc Natl Acad Sci U S A. 2018

Jun 12;115(24):6261-6266)近視性黄斑症関連遺伝子として新規遺伝子を特定し、さらに当初の目的通りに、眼底の定量的な評価により、中心性漿液性脈絡網膜症感受性遺伝子も特定できた。次年度は下記に記すさらに新たな手法を用いて、他の眼他因子疾患の関連遺伝子解明を試みる。これまで定量的な指標を用いて、正常人をもちいてGWASを行い眼表現系に関連する遺伝子を特定し、さらにその候補遺伝子と疾患との関連を検討する試みは数多くなされてきた。この試みは、疾患のサンプル数が数多く集めることが困難なため有用であり、今年度研究者らも脈絡膜に関連する遺伝子を特定した。しかしながら正常人のGWASでは候補遺伝子が多数になるため、検定の多重性を考慮すると、次の疾患との関連を検討する段階において、偽陰性が多くなってしまうことが問題点である。そこで本年度は、数多くの候補遺伝子から、さらに重要な遺伝子を絞り込むための手法として、IBM Watsonを用いることとする。Watsonは問題を認識して、その解答として正しいもの、正しそうなものを推測し、提示すると言う役割を担う目的で開発された第三世代の「コグニティブ・コンピューティング・システム」である。ありとあらゆる自然科学系の出版物を読むことにより、それらの間に未知の関係性を発見することができる。活用例として、ベイラー医科大学のがん研究者はp53の活性化を導くキナーゼを予測するため、p53に関する7万もの科学論文をWatsonを用いて分析し、既知のp53キナーゼの近隣に位置するキナーゼを、新たな研究対象となり得るp53に作用するキナーゼとして特定した。別の事例として、筋萎縮性側索硬化症に関係するRNA結合タンパク質の同定にもwatsonを用いたという報告がされている。次年度は、上記のWatsonを我々のGWASデータと組み合わせることにより、さらなる眼多因子疾患関連遺伝子の特定を試みる。
水素貯蔵を目的とした準結晶粉末のメカニカルアロイングによる創製と水素貯蔵特性

準結晶は,一般に,水素に関して化学親和性の低い成分元素で構成されているので,水素吸蔵特性に関する研究は今まで行われてこなかった.しかし,最近,液体急冷法により作製されたTi基の準結晶合金が水素化物を形成することなく61.5at%程度の水素を吸蔵することが報告され,準結晶の水素吸蔵合金としての可能性が示唆されている.本研究では,メカニカルアロイングによる準結晶の生成が報告されていないTi-Zr-Ni系の混合粉末に注目し,その混合粉末のメカニカルアロイングによる合金化,さらに,その後の真空熱処理を行ってメカニカルアロイングによる準結晶粉末の作製の可能性を調べた.そして,得られたメカニカルアロイング粉末に高圧ガス容器を用いて水素を導入し,メカニカルアロイング粉末の水素吸放出特性を評価し,高密度プロチウム新規材料としての準結晶粉末の可能性を探索することを目的とした.実験の結果,Ti_<45>Zr_<38>Ni_<17>混合粉末のメカニカルアロイングはアモルファス相を生成するが,その後,773K以上で十分な真空熱処理を行うことにより正二十面体準結晶相(i相)が形成されることが分かった.また,メカニカルアロイング後のアモルファス粉末とその後の熱処理を行って得られた準結晶粉末の水素吸蔵量(温度573K,初期水素ガス圧3.8MPa)は水素吸蔵合金としては良好で,どちらも構造には依存せず,約60at%([H]/[M]≒1.5)を示した.水素吸蔵後,準結晶粉末は安定に存在するが,アモルファス粉末は(Ti,Zr)H_2水素化物へ相変化した.このことに起因して水素の放出はアモルファス粉末より準結晶粉末で比較的容易に生じることが明らかとなった.以上のことから,Ti-Zr-Ni系準結晶粉末は,高密度プロチウム新規材料として可能性があることが示唆された.準結晶は,一般に,水素に関して化学親和性の低い成分元素で構成されているので,水素吸蔵特性に関する研究は今まで行われてこなかった.しかし,最近,液体急冷法により作製されたTi基の準結晶合金が水素化物を形成することなく61.5at%程度の水素を吸蔵することが報告され,準結晶の水素吸蔵合金としての可能性が示唆されている.本研究では,メカニカルアロイングによる準結晶の生成が報告されていないTi-Zr-Ni系の混合粉末に注目し,その混合粉末のメカニカルアロイングによる合金化,さらに,その後の真空熱処理を行ってメカニカルアロイングによる準結晶粉末の作製の可能性を調べた.そして,得られたメカニカルアロイング粉末に高圧ガス容器を用いて水素を導入し,メカニカルアロイング粉末の水素吸放出特性を評価し,高密度プロチウム新規材料としての準結晶粉末の可能性を探索することを目的とした.実験の結果,Ti_<45>Zr_<38>Ni_<17>混合粉末のメカニカルアロイングはアモルファス相を生成するが,その後,773K以上で十分な真空熱処理を行うことにより正二十面体準結晶相(i相)が形成されることが分かった.また,メカニカルアロイング後のアモルファス粉末とその後の熱処理を行って得られた準結晶粉末の水素吸蔵量(温度573K,初期水素ガス圧3.8MPa)は水素吸蔵合金としては良好で,どちらも構造には依存せず,約60at%([H]/[M]≒1.5)を示した.水素吸蔵後,準結晶粉末は安定に存在するが,アモルファス粉末は(Ti,Zr)H_2水素化物へ相変化した.このことに起因して水素の放出はアモルファス粉末より準結晶粉末で比較的容易に生じることが明らかとなった.以上のことから,Ti-Zr-Ni系準結晶粉末は,高密度プロチウム新規材料として可能性があることが示唆された.
担癌患者血清および癌組織の各種サイトカイン微量測定と免疫学的機能の検討

担癌患者末梢血を術前術後に採取し、IL-1,IL-6,INF-α,GM-CSF値を測定し、各サイトカインが高値であることを見出した。また、術後1日目は3時間毎に、その後2,3,5,7日目に、退院後は来院時に採血し、各サイトカインの変動を検討したところ、TNF-αは術前から高値を示し、術後15時間目と2日目にピークをもって産生され、IL-1αは術後18時間と3日目に、IL-1βは術後21時間目と5日目に、IL-6は術後24時間目と7日目にそれぞれ2相性にピークを示すことも見出した。また、再発がAFP,CEA等の腫瘍マーカーや画像診断で捕らえられる以前にTNF-αが上昇する傾向が見られ、TNF-αの腫瘍マーカーとしての有用性が示唆された。さらにこれらサイトカインの変動が手術侵襲によるものかまたは癌そのものによるかを検討するため、胆石症患者において同様の検討を行なったところ、各サイトカインのピークは担癌患者と同じ傾向が得られたが、産生量は低く、7日目にはほぼ正常値になった。一方手術時に得た癌組織において各サイトカインを抽出、測定を試みたところ、この上清中に多量のサイトカイン、特に癌部にはTNF-α,GM-CSFが、非癌部にはIL-2,IL-6が多く検出された。さらに手術時に肝癌組織を採取、これを培養し、cell line化も行なっている。この細胞株はすべて上清中にTNF-α,IL-6, GM-CSFがかなり高濃度で検出された。これらはその特異抗体により、細胞数、生存率共に抑制され、さらにこれらサイトカイン間での相互作用も観察された。また、レセプターの存在も確認出来、肝癌のオートクリン、パラクリン増殖にこれらサイトカインが関係することが推測された。次に、末梢血単核球の各サイトカイン反応性を検討した。その結果患者群は健常者群に対して各サイトカイン反応性が低下していること、健常者群に見られるようなサイトカインの濃度依な性の^3H-TaR摂取率抑制が認められないことなどが判明した。(1)担癌患者末梢血を術前術後に採取し、ILー1,ILー6,TNFーα,GMーCSF値を測定したところ、各サイトカインが高値である事が判明した。そこで術後1日目は3時間毎に、2日目以降7日目までは1日おきに、退院後は来院時に採血し各サイトカインの変動を検討した。その結果、TNFーαは術前からコントロ-ル群より高値を示し、さらに術後15時間と2日目にピ-クをもって産生される事が判明した。またILー1αは術後18時間と3日目にILー1βは21時間と5日目に、ILー6は24時間と7日目にピ-クを示した。GMーCSFは術後徐々に上昇する傾向が認められた。また再発がAFP、CEA等の腫瘍マ-カ-や画像診断でとらえられる前にTNFーαが上昇する傾向がみられ、TNFーαの腫瘍マ-カ-としての有用性が示唆された。(2)胆石症患者においても同様の検討を行なったところ、各サイトカインのピ-クは担癌患者と同様の結果が得られたが、産生量は低かった。

(3)手術時に癌組織を採取、これを培養し、cell line化を試みた。組織は肝細胞癌、転移性肝癌を用いた。組織を採取後、RPMIー1640ー10%FCS培地にて細胞を浮遊し、これを37°C、5%CO_2下で培養した。約1カ月後より増殖の認められたものを継代し現在まで7株の細胞が得られた。この細胞株の上清中の各サイトカインを測定したところ、TNFーα,ILー6,GMーCSFがかなりの高濃度で検出された。これらはその特異抗体添加培養により、細胞数、生存率ともに抑制された。また、10%FCSの影響を除くため無血清培地(エスクロン、SPー02)で培養し、各サイトカインおよび特異抗体を添加後、上清中の各サイトカインを測定したところ、各サイトカイン間での相互作用が観察された。現在癌細胞のサイトカインによるauto crine増殖が注目されているが、我々の樹立した細胞株は、この事を研究するうえで最良のモデルであると思われた。(1)昨年は担癌患者血清中における各サイトカインを測定、これらが高値を示し、特にTNFーαは再発時に上昇、予後因子として重要である事等を見出した。このことから癌局所ではより多くのサイトカインが産生され癌細胞の増殖に深く関与していることが予測された。そこで今年は、切除時の肝癌組織および非癌部組織中の各サイトカインを測定し、発癌機構の解明に努めた。各組織は5mlの生食中で細切後ホモゲナイズし、その後超音波破壊しその上清を試料とした。癌部ではTUFーα、GMーCSFが有意に高く、ILー2、ILー6は非癌部が有意に高かった。ILー1α、βはこれらと比較して低値傾向を認めた。以上、癌組織中でTNFーα、GMーCSFが高値を示すことから、これらサイトカインが癌細胞のautocrine増殖と密接に関与している事が示唆された。(2)さらに肝癌患者の術前術後、TAE前後等で各サイトカイン反応性を検討した。その結果、患者群は健常者群に対して各サイトカイン反応性が低下していること、健常者群にみられるようなサイトカインの濃度依存性の^3HーTaR摂取率抑制が認められないことなどが判明した。この結果は患者での血清サイトカイン値の上昇が末梢単核球のreceptor異常によって生じ、これが局所での癌増殖を促していることを推測させた。(3)化学療法、サイトカイン療法の併用を前提として以下の検討をしたところ、末梢単核球に抗癌剤(CDDP、5ーFu)を添加して培養したものが、非添加時よりもサイトカイン反応性が上昇する事がわかった。これは化学療法とサイトカイン療法の併用の有効性を示唆していると思われた。(1).担癌患者血清中のIL-1、IL-2、IL-6、TNF-α、GM-CSFが高値を示すのは癌局所によるものと推測し、肝切除時に癌部、非癌部を採取し、さらに、検討したところ、癌部にはTNF-α、GM-CSFが、非癌部にはIL-2、IL-6が高値を示した。この事より癌局所でのサイトカイン動態の一部が解明された。(2).手術時に採取した癌組織より樹立した細胞株を用いて、サイトカインとオートクリン増殖の関係を検討した。培養上清中にIL-6、TNF-α、GM-CSFがかなり高濃度に検出され、サイトカイン添加により細胞増殖を、特異抗体により細胞数、生存率共に抑制された事は昨年度に検討したが今年度はさらにレセプターアッセーを行なった。IL-1、TNF-α、GM-CSFのレセプターが確認され、Lowとhigh affinityの2種類のものが認められた。以上より、肝癌細胞のオートクリン増殖にこれらサイトカイン特にTNF-αGM-CSFが関与している事が推測された。
膵β細胞特異的TNFα過剰発現マウスを用いた1型糖尿病発症メカニズムの解明

膵β細胞特異的TNFα過剰発現マウスは著明なinsulitisを呈しているが、インスリン分泌は比較的良好に保たれており、過栄養負荷に対しても糖代謝は良好であった。インスリン産生細胞が形態的、機能的障害に陥ったとしても、そこからparacrineしたTNFαにより、グルカゴンやソマトスタチンの機能的障害が同時に存在するため、相対的にインスリン作用が優位となり、糖尿病抵抗性になると考えられた。膵β細胞特異的TNFα過剰発現マウスは肥満抵抗性、脂肪肝抵抗性を示したことから、自己免疫性1型糖尿病の発症メカニズムの解明に向けたモデルと言うより、むしろ過栄養性脂肪肝抑制モデルとしての価値が注目された。膵β細胞特異的TNFα過剰発現マウス(TNFαTgマウス)の基礎データの検討を行った。大分大学アニマルセンターで同時期に出生した9ー13週齢の雄のTNFαTgマウスと野生型のC57BL6Jマウスとを比較したところ、TNFαTgマウスでは体重が有意に低く、血糖値も有意に低下していた。摂食量には差は認めなかったが、飲水量がTNFαTgマウスで有意に低かった。事実、摂食亢進ペプチドであるNPY、AgRP、MCH、ならびに摂食抑制ペプチドであるCRH、POMC、CARTには、この2群のマウス間で、視床下部での発現差は認めず、一方で、AVPはTNFαTgマウスで1.6倍ほど有意に上昇していた。飲水量の違いはAVPの発現量の違いによることが示された。C57BL6Jに比べ、TNFαTgマウスでは随時血糖値、絶食時血糖値、5時間再摂食時の血糖値は有意に低く、IPGTTでの血糖曲線も有意に低下していた。IPITTではC57BL6Jには有意な低血糖を誘発できない0.5U/kgのインスリン投与でも、有意な血糖抑制が観察され、TNFαTgマウスではインスリン感受性が良好であることが確認された。インスリン値はTNFαTgマウスで有意に高く、グルカゴン値は有意に低下していることが判明した。病理所見では、著明なラ氏島炎にもかかわらず、インスリン陽性細胞は残存しており、一方でグルカゴン陽性細胞やソマトスタチン陽性細胞が明らかに減少していた。TNFαTgマウスの耐糖能が良好なのは、インスリン分泌が保たれている割には、グルカゴンが抑制されていることが一因である可能性が示唆された。膵β細胞特異的TNFα過剰発現マウス(TNFαTgマウス)の糖代謝についてさらに詳細な検討を行った。同時期に出生した11ー13週齢の雄のTNFαTgマウスと野生型のC57BL6Jマウスで、しかも体重、随時血糖値がほぼ同一な8匹を使用して比較した。TNFαTgマウスではインスリン陽性細胞は形態的には障害されていたが、インスリンは有意に高値であった。一方で、グルカゴン陽性細胞やソマトスタチン陽性細胞は明らかに減少していたが、グルカゴンは低下していなかった。両マウスを24時間絶食にしたところ、血糖値は同程度に抑制され、インスリンはそれぞれ有意に低下、一方でグルカゴンには変化を認めなかった。以上の結果は、TNFαTgマウスではインスリン分泌制御機構、またグルカゴン分泌も保っていることを示している。一方で、野生型マウスには有意な低血糖を誘発できない0.5U/kgのインスリン投与でも、明らかに血糖が抑制されたことから、グルカゴン機能は障害されている可能性が考えられる。次に約1年間の飼育を行ったところ、野生型マウスは、体重は生後16週で30kgを超え、生後50週には40kgを超えるが、TNFαTgマウスは生後1年経っても体重は30kgにも満たなかった。また野生型マウスの血糖は生後16週で200mg/dlを超えたが、TNFαTgマウスは生後1年経っても血糖が200mg/dlを超えることはなかった。つまり野生型のC57BL6Jマウスは肥満糖尿病になりやすい性質があるが、TNFαTgマウスは加齢による肥満、糖尿病に抵抗性を示すことがわかった。さらに11ー12週齢雄の両マウスに8週間の高脂肪食、高ショ糖食負荷を行ったところ、C57BL6Jは有意に体重が増加したのに対し、TNFαTgマウスでは全く変化が認められなかった。またTNFαTgマウスでは高脂肪食、高ショ糖食負荷による脂肪肝(病理学的steatosis)の程度も明らかに抑制されていた。このことはTNFαTgマウスが高脂肪食、高ショ糖食負荷に対しても抵抗性であることを示している。膵β細胞特異的TNFα過剰発現マウス(TNFαTgマウス)の糖代謝に対し、より詳細な検討を行った。高脂肪食負荷、高ショ糖負荷に明らかに抵抗性を示すことが確認できた。また長期生育下でも肥満、糖尿病抵抗性を示していることがわかった。これまでの検討では、TNFαTgマウスのインスリン分泌ならびに感受性上昇は、機能的グルカゴンの低下が寄与している可能性があると考えられた。膵β細胞特異的TNFα過剰発現マウス(TNFαTgマウス)は明らかなinsulitisを呈するにも関わらず、糖尿病発症に抵抗性を示すことから、自己免疫性1型糖尿病の発症メカニズムを解析する目的で本実験を始めた。

ところがこれまでの3年間の研究で明らかになったことは、極めて意外なことであった。TNFαTgマウスはIPGTTでもIPITTでも血糖曲線は低く、インスリン感受性は良好であった。TNFαTgマウスではインスリン陽性細胞は形態的には障害されていたが、インスリンは有意に高値。一方で、グルカゴン陽性細胞やソマトスタチン陽性細胞は明らかに減少していたが、サンドイッチ法で確認した血中グルカゴン値は低下していなかった。野生型のC57BL6Jマウスは肥満糖尿病になりやすい性質があるが、TNFαTgマウスは生後1年経っても血糖が200mg/dlを超えることはなく、体重も有意に低く、TNFαTgマウスは加齢による肥満、糖尿病に対して抵抗性を示した。また高脂肪食、高ショ糖食負荷に対しても体重増加、血糖上昇を認めなかった。しかも、このような過栄養負荷に対して肝臓の脂肪蓄積をみとめるものの、脂肪肝の程度はC57BL6Jマウスより明らかに弱く、驚くべきことに肝臓重量は普通食摂取マウスより有意に低下していた。つまりTNFαTgマウスは肥満抵抗性、糖尿病抵抗性、脂肪肝抵抗性マウスであることを示している。また摂食調節に関わる中枢性神経ペプチドには変化はなかったが、AVPのみ有意に上昇しており、飲水量の違いのみならず、本マウスの表現型を説明する鍵となる可能性が示された。膵β細胞特異的TNFα過剰発現マウスは著明なinsulitisを呈しているが、インスリン分泌は比較的良好に保たれており、過栄養負荷に対しても糖代謝は良好であった。インスリン産生細胞が形態的、機能的障害に陥ったとしても、そこからparacrineしたTNFαにより、グルカゴンやソマトスタチンの機能的障害が同時に存在するため、相対的にインスリン作用が優位となり、糖尿病抵抗性になると考えられた。膵β細胞特異的TNFα過剰発現マウスは肥満抵抗性、脂肪肝抵抗性を示したことから、自己免疫性1型糖尿病の発症メカニズムの解明に向けたモデルと言うより、むしろ過栄養性脂肪肝抑制モデルとしての価値が注目された。本年度は膵β細胞特異的TNFα過剰発現マウス(TNFαTgマウス)の基礎データの収集が主なテーマであったが、マウスの生活環についてはかなり詳細に検討できた。糖代謝が良好であった原因として、血清学的、免疫組織学的データの収集は順調と考える。また摂食量と飲水量の変化を、摂食ならびに飲水に関わる中枢の遺伝子発現と比較検討できた。基本的には研究計画に則って研究を進める。一方で、ラットインスリンプロモーターを使用したトランスジェニックマウスであるため、TNFαの異所性、特に中枢性発現がないことを再度確かめているところである(免疫染色では視床下部を中心とした脳全体に、異所性発現はないようだが、さらにin situで確認予定)。糖代謝が良好であった原因として、機能的グルカゴンの低下が示唆されているが、再度IPGTT、IPITTでグルカゴン分泌を調べる必要があると思われた。内分泌代謝基本的には研究計画に則って研究を進める。食事負荷モデルでの検討、長期生育下での検討を行う。肥満症、糖尿病の病態における、このモデルの解析意義を念頭において、研究を継続する。腸内細菌との関連にも興味があるので、余裕があれば解析を行う。1、前年度未使用額が比較的大きく、本年度予算に余裕があった。2、中枢性摂食調節因子の遺伝子発現に関わる物品などについて、教室から他大学へ国内留学した大学院生が実施してくれたため、残額が生じた。