hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
in-situ XAFS測定を利用した高活性光触媒の構造解析

21世紀の化学は、環境を強く意識した発展が不可欠であり、物質変換においては、高選択的で超効率な触媒系の開発が望まれている。その達成には、クリーンで無尽蔵な光エネルギー(太陽光)を利用した選択的物質変換反応を可能とする光触媒の開発が重要な課題と言えるが極めてチャレンジングである。本申請課題では、選択的分子変換反応を可視光照射下で促進する表面固定化光応答性金属錯体の新規開発を行う。また放射光XAFSなどの分光学的手法を駆使して、優れた触媒機能とナノレペルの構造との相関を明らかにする。特に、様々な反応ステージでのin-situXAFS測定によって、反応ガスの吸着・配位により生成する反応中間体の微細構造をも高精度で決定する。種々の分光学的手法を駆使した触媒活性種近傍の微細構造に関する知見と触媒機能の関連性を解明することで、更なる高性能光触媒の設計指針にフィードバックする。平成23年度は、主に研究対象とする光触媒の調製を行い内包した光応答性金属錯体の電子状態、配位環境、光励起過程を、細孔環境により精密制御した。本年度は、調製した光触媒を用いて、可視光照射下での水からの水素生反応、酸素を用いた選択的酸化反応など各種選択的分子変換反応を検討した。また放射光XAFSなどの分光学的手法を駆使して、優れた触媒機能とナノレベルの構造との相関を明らかにした。特に、様々な反応ステージでのin-situ XAFS測定によって、反応ガスの吸着・配位により生成する反応中間体の微細構造をも高精度で決定することができた。例えば、単核Pt (II)(tPy)錯体を利用した光触媒的水素生成反応においては反応中にコロイド粒子は生成せず、Pt((II)錯体そのものが活性種であることがわかった。これは、XAFSにより本反応の活性種を同定した初めての例である。(抄録なし)21世紀の化学は、環境を強く意識した発展が不可欠であり、物質変換においては、高選択的で超効率な触媒系の開発が望まれている。また放射光XAFSなどの分光学的手法を駆使して、優れた触媒機能とナノレベルの構造との相関を明らかにする。特に、様々な反応ステージでのin-situ XAFS測定によって、反応ガスの吸着・配位により生成する反応中間体の微細構造をも高精度で決定する。平成23年度は、主に研究対象とする光触媒の調製を行った。具体的には各種ゼオライト、メソポーラスシリカの細孔内に様々な光応答性金属錯体(Pt,Ir,Ru etc.)の導入を行った。金属錯体の導入法としては、ship-in-a bottle法あるいは、有機リンカーへの固定化法を用いた。ゼオライトの細孔は、分子の配向と配列が制御された異方性を有するミクロ空間環境場であり、しかもイオン交換能を有することから、交換カチオン種を選択することで、細孔内の静電場や空間体積などの分子環境場を任意に制御できる。一方、メソポーラスシリカでは、合成段階の構造規制剤の種類や、Si/Al比を変えることで、細孔サイズや表面の酸・塩基性をコントロールすることが可能である。本申請課題では、内包した光応答性金属錯体の電子状態、配位環境、光励起過程を、細孔環境により精密制御する。

例えば、単核Pt(II)(tpy)錯体を利用した光触媒的水素生成反応においては反応中にコロイド粒子は生成せず、Pt(II)錯体そのものが活性種であることがわかった。これは、XAFSにより本反応の活性種を同定した初めての例である。21世紀の化学は、環境を強く意識した発展が不可欠であり、物質変換においては、高選択的で超効率な触媒系の開発が望まれている。その達成には、クリーンで無尽蔵な光エネルギー(太陽光)を利用した選択的物質変換反応を可能とする光触媒の開発が重要な課題と言えるが極めてチャレンジングである。本申請課題では、選択的分子変換反応を可視光照射下で促進する表面固定化光応答性金属錯体の新規開発を行う。また放射光XAFSなどの分光学的手法を駆使して、優れた触媒機能とナノレペルの構造との相関を明らかにする。特に、様々な反応ステージでのin-situXAFS測定によって、反応ガスの吸着・配位により生成する反応中間体の微細構造をも高精度で決定する。種々の分光学的手法を駆使した触媒活性種近傍の微細構造に関する知見と触媒機能の関連性を解明することで、更なる高性能光触媒の設計指針にフィードバックする。平成23年度は、主に研究対象とする光触媒の調製を行い内包した光応答性金属錯体の電子状態、配位環境、光励起過程を、細孔環境により精密制御した。本年度は、調製した光触媒を用いて、可視光照射下での水からの水素生反応、酸素を用いた選択的酸化反応など各種選択的分子変換反応を検討した。また放射光XAFSなどの分光学的手法を駆使して、優れた触媒機能とナノレベルの構造との相関を明らかにした。特に、様々な反応ステージでのin-situ XAFS測定によって、反応ガスの吸着・配位により生成する反応中間体の微細構造をも高精度で決定することができた。例えば、単核Pt (II)(tPy)錯体を利用した光触媒的水素生成反応においては反応中にコロイド粒子は生成せず、Pt((II)錯体そのものが活性種であることがわかった。本年度は、来年度以降に詳細なキャラクタリゼーションをする予定である光触媒試料の調製を主に行った。各種ゼオライト、メソポーラスシリカの細孔内に様々な光応答性金属錯体(Pt,Ir,Ru etc.)の導入を行い、窒素吸脱着、XRD等により規則性細孔構造を維持したまま錯体を導入することに成功した。Pt錯体を利用した光触媒的水素生成反応においてin-situ XAFSにより反応中での活性種の構造変化詳細に検討し、光触媒活性との相関を明確にすることに成功した。23年度に調製した光触媒を用いて、可視光照射下での水からの水素生反応、酸素を用いた選択的酸化反応など各種選択的分子変換反応を検討する。また放射光XAFSなどの分光学的手法を駆使して、優れた触媒機能とナノレベルの構造との相関を明らかにする。特に、様々な反応ステージでのin-situ XAFS測定によって、反応ガスの吸着・配位により生成する反応中間体の微細構造をも高精度で決定する。24年度得られた成果をフィードバックし更なる高活性触媒設計の指針とする。(抄録なし)
ターゲット分子に対し特異的認識能を有するキラル充填剤調製法の確立

これまでの多糖誘導体を用いたHPLC用キラル充填剤の開発は、広範囲のキラル化合物に対して高い光学分割能を有することを目的に行われてきたが、ある特定の光学異性体に対して高い不斉識別能を有するキラル充填剤を合目的的に調製する手段の開発が今後重要となる。昨年度までの研究では、セルローストリス(4-メチルベンゾエート)(1)を固定相、菊酸エチルエステル(2)をターゲット分子に設定し、キラル充填剤を調製する際、1のコーティング溶液の中にメチルベンゾエートやアセトフェノンを添加することで2に対して高い光学分割能を有するキラル充填剤の調製が可能であること、また添加剤を入れて調製した充填剤は、カラムに充填後も、熱処理やインプリント分子導入によりカラム内で光学分割能を変化させることが可能であることを見いだしている。本年度は、インプリント分子を加えずに調製した1の充填剤のカラム中での分子インプリントについてより詳細な検討を行い、添加剤をあらかじめ加えなくても、メチルベンゾエートやアセトフェノンのヘキサン溶液をカラムに導入後、カラムに熱を加えることにより、カラム中でその能力を変化させることが可能であることを見いだした。さらに、1を用いた2の膜分離への応用として、アセトフェノンをインプリント分子として加えた1のクロロホルム溶液をレーヨンリボンにキャストし、溶媒を減圧で留去・乾燥させ、これを用いて2の不斉吸着実験及び連続光学分割実験を行った。その結果、HPLC用キラル充填剤と同様、2の(1R)-trans体を特異的に吸着させることに成功し、本手法により殺虫剤として有用な異性体の濃縮が可能であることを見いだした。セルロースやアミロースなどの多糖のフェニルカルバメートやベンゾエート誘導体は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)用のキラル固定相として医薬品を含む広範囲のラセミ体に対して高い光学分割能を有しているが、分けたい化合物に適したカラムや溶離液を選択することは容易ではなく、またおよそ2割の化合物は分割する手段が見つからないのが現状であり、分けられない2割のキラル化合物をいかにして分割可能にするかが、この分野の大きな課題となっている。そこで、本研究では、分けたいものを分ける、ターゲット分子に対して特異的認識能を有するHPLC用キラル充填剤の調製法確立について検討を行った。これまでの研究では、セルローストリス(4-メチルベンゾエート)(1)を固定相に用いてキラル充填剤を調製する際、1のコーティング溶液の中にメチルベンゾエートやアセトフェノンを添加することで菊酸エチルエステル(2)に対して高い光学分割能を有するキラル充填剤の調製が可能であることを見いだしている。本年度は、インプリントした充填剤をカラムに充填後、カラムごと加熱して分割能を失わせたのち、後からアセトフェノンなどのインプリント分子を流し込むことでもインプリントが可能である(2に対する光学分割能を持たせることができる)ことを見いだした。この結果は、一本のキラルカラムがあれば、カラム充填後に分けたい化合物に対して分割能を様々に変化させることができる可能性の存在を示しており、大変興味深いものである。また、この光学分割能の変化について円二色性(CD)スペクトルを測定し、インプリントや加熱、また再インプリントによる1の膜のCD変化を観測することに成功し、1の光学分割能の変化を単なる現象からだけではなく、分光学的手法を用いた構造変化から議論することを可能にすることができた。
自然免疫系によるウイルス感染認識の実際とその回避

自然免疫は、病原微生物感染初期の生体防御の要であり、微生物固有の因子を認識して発動する。本研究では、一本鎖マイナス鎖RNAウイルス(SeV)のプロトタイプであるセンダイウイルスをモデルに、実際のウイルス感染で「何が」「どこで」「どうやって」自然免疫に認識されるのかを明らかにすることを目的とし、以下の成果を得た。1. SeV蛋白質の一つであるC蛋白質の自然免疫応答因子であるSTAT1との細胞質内及び核内での抑制的相互作用の解明、2. C蛋白質によるウイルスRNA合成制御機能の解明、3.自然免疫誘導性RNA分子の同定とその産生機序及びこれらの分子の宿主側認識機構の解明など。自然免疫は、感染初期に発動する極めて重要な生体防御機構であり、微生物固有の因子を認識し発動する。この認識には、RNAウイルス感染ではウイルス由来のRNA分子がリガンドとして機能すると考えられているが、実際のウイルス感染ではそれが具体的にどのようなウイルス由来RNA分子なのか、ということはほとんど明らかにされていない。本研究では、強い自然免疫抑制能を持つセンダイウイルス(SeV; Z株)を基本とし、IFN-β誘導性の高いC蛋白質変異組換えウイルスやSeVカンテル株との比較から、自然免疫系に認識されるウイルスRNA分子の実態を解明することを目的として研究を行っており、その過程に於いて、これまでに主に以下の成果を得た。1. SeVの増殖に必須ではなく「アクセサリー蛋白質」と呼ばれるC蛋白質が、特にウイルスゲノムRNAの極性制御において決定的な役割を果たしており、(-)鎖RNAウイルスが「(+)鎖」ではなく「(-)鎖」RNAゲノムをもったウイルスとなるための仕組みを明らかにした(入江ら, Journal of Virology 2014)。2.また、上記の様な様々なSeVの比較から、SeV感染では、IFN-β誘導性の少なくとも3種類のウイルス由来RNA分子が産生されること、これらの産生が非自然免疫誘導性のSeVでは抑制されていること、宿主によるこれらの認識機構が異なっていることなどを見出した(入江ら,論文投稿中)。3.さらに、上記のIFN-β誘導性のウイルス由来RNAのうちcopyback型DIゲノムは、カンテル株SeV感染で顕著に産生されるが、その産生にN蛋白質上の変異が重要な役割を果たしていることを明らかにした(入江ら,論文準備中)。4. C蛋白質の1分子種であるY蛋白質が、核移行性を持ち、これがIFN応答抑制に関係していることを明らかにした(入江ら, PLoS ONE 2013)。この認識には、RNAウイルス感染ではウイルス由来のRNA分子がリガンドとして機能すると考えられているが、実際のウイルス感染ではそれが具体的にはどのようなウイルスRNA分子であるのか、ということは殆ど明らかにされていない。本研究では、実際のRNAウイルス感染において「何が」「どこで」「どうやって」認識されるのかを明らかにすることを目的とし、強い自然免疫抑制能を持つセンダイウイルス(SeV; Z株)と、逆にIFN-β誘導性の高いC蛋白質変異組換えSeVやカンテル株SeVを用いた比較を行い、以下のような成果を得た。1. IFN-β誘導性SeV感染では、ウイルスN蛋白質が結合したヌクレオカプシド構造を持つコピーバック型欠損干渉(cbDI)RNAゲノムやウイルスゲノム5'末端領域に相同な裸のRNA分子などの、通常のSeV感染では見られないRNA分子が産生され、それぞれ別々の細胞質内構造物中に蓄積されることを明らかにした。(論文投稿中)。2.カンテル株SeV感染で見られるcbDIゲノム産生の原因が、ウイルスのヌクレオカプシド構築の主要因子であるN蛋白質上の変異によることを明らかにした(論文投稿中)。3. SeVはC蛋白質やV蛋白質の機能により、IFN産生誘導系及び応答系を阻害して自然免疫を回避することが知られている。これらのうちV蛋白質は、宿主のRNAセンサー分子であるMDA5と抑制的に相互作用することが報告されているが、我々は、その他のRNAセンサーであるRIG-Iや下流の転写因子IRF3とも抑制的に相互作用することを報告している(入江ら, Journal of Virology 2012)。V蛋白質とこれら複数の宿主因子との相互作用の意義をウイルスの病原性発現の観点から探るため、各因子との相互作用に必要なV蛋白質上のアミノ酸部位を同定した。RNAウイルス感染では、ウイルス由来RNA分子がリガンドとして機能すると考えられているが、実際のウイルス感染で、その実態はほとんど明らかにされていない。本研究では、実際のRNAウイルス感染で、「何が」「どこで」「どうやって」自然免疫系に認識されるのかを明らかにすることを目的とし、以下の成果を得た。インターフェロン(IFN)-β誘導性の高いセンダイウイルス(SeV)株(カンテル株)のクローニングにより、IFN-β誘導性の高いクローンとほとんどIFNを誘導しないクローンの2種類を得た。この両者の差は、ウイルスゲノムと同様のヌクレオカプシド構造をもつコピーバック型欠損干渉(cbDI)ゲノムの有無が原因になっていることを発見し、またウイルスRNA合成の鋳型となるヌクレオカプシドを構成する主要因子であるN蛋白質中のアミノ酸変異がその産生の原因となっていることを見出した(論文投稿中)。

また、SeV C蛋白質欠損ウイルスでは、IFN-β誘導性が著しく上昇するが、その原因がウイルスゲノム5'末端領域に相同でヌクレオカプシド構造を取らない裸のRNA分子の産生が原因となっていることを明らかにした(入江ら, Front Microbiol 2015)。これらのIFN-β誘導性RNA分子は、通常のウイルス感染ではほとんど産生されておらず、通常のウイルス感染は自然免疫系から感知されにくい状態にあると考えられる。また、これらのRNA分子を選択的に認識、蓄積する宿主側機構の存在の可能性を示した(入江ら, Front Microbiol 2015)。上記の他、V蛋白質やC蛋白質による新規自然免疫回避機構や、そのメカニズムを明らかにすることができた(小田ら, J Virol 2015;準備中論文)。自然免疫は、病原微生物感染初期の生体防御の要であり、微生物固有の因子を認識して発動する。本研究では、一本鎖マイナス鎖RNAウイルス(SeV)のプロトタイプであるセンダイウイルスをモデルに、実際のウイルス感染で「何が」「どこで」「どうやって」自然免疫に認識されるのかを明らかにすることを目的とし、以下の成果を得た。1. SeV蛋白質の一つであるC蛋白質の自然免疫応答因子であるSTAT1との細胞質内及び核内での抑制的相互作用の解明、2. C蛋白質によるウイルスRNA合成制御機能の解明、3.自然免疫誘導性RNA分子の同定とその産生機序及びこれらの分子の宿主側認識機構の解明など。当初のIFN-β誘導性ウイルスRNA分子の解明のみならず、その産生の原因がウイルスRNA合成の異常によるものであること、その原因となるアミノ酸変異を同定することに成功した(入江ら,論文投稿中)。また、本研究から派生し、様々な自然免疫関連宿主因子とウイルスV蛋白質の相互作用について、その相互作用に重要なアミノ酸部位の同定に成功した。これを元に、各相互作用を欠損した組換えウイルスの作成を進めており、これらのウイルスを用いてマウスなどの個体での病原性、IFN誘導性等を調べることにより、宿主自然免疫とウイルスによるその回避の攻防について、実際のウイルス感染系での意義を明らかにすることが可能となる。ウイルス学これまでの成果を元に、以下の点を中心に明らかにしていきたい。1. SeV V蛋白質と様々な自然免疫関連因子との相互作用の、実際のウイルス感染における意義。3. cbDIゲノム産生ウイルスの、ワクチン開発への応用の可能性の検討。本研究課題で初年度の目的としていた、IFN誘導性の高いウイルスRNA分子種の同定については、いくつかの性質の異なるRNA分子種の存在を明らかにすることが出来たが、この研究から派生して、(-)鎖RNAウイルスが「(+)鎖」ではなく「(-)鎖」ゲノムを持ったウイルスとなるための重要なメカニズムを明らかにすることに成功した(入江ら, Journal of Virology 2014)。
麻酔ガス汚染空気の活性炭ベルトによる新浄化法の研究

手術室空気の麻酔ガス汚染防止の方法は、麻酔器には全て麻酔ガス排除装置をつけることと、部屋の換気を全新鮮空気方式にすることが重要で、どちらか一方では不十分である。ところが、全新鮮空気方式は、設備と維持費に大きな費用がかかり、小規模な病院では、この方式は採用出来なくて、再循環方式を取らざるをえない。そこで、本研究では、この再循環方式の空気ダクト中に挿入し、再循環空気中の汚染麻酔薬や消毒薬のガスや蒸気を連続的に除去し、浄化する装置を開発することを試みた。この装置は、活性炭のエンドレスベルトを逆M字型に、空気ダクト内に通し、回転し、汚染物質を吸着してダクト外へ出て来たベルトに熱風を当てて吸着物をはずし、次に冷風を当てて吸着能を回復させてからベルトがダクト内に再び入るようにしたものである。即ち、活性炭のエンドレスベルトにより、ダクト内の空気の汚染物質をダクト外へ汲み出すポンプのような働きをさせる訳である。我々の目的の為には、多くの活性炭の中から、クラクティブFT-300-20が最良と判断し、これを用いた。この装置は改良に改良を重ねて試作品が完成した。空気ダクト内の風量を0.82m^3/min.として、笑気とハロセン又は笑気とセボフルレンの模擬汚染空気をこの装置内に流すと、ベルト速度が150cm/min.の時、浄化効率が最も良かった。将来、笑気に対する浄化効率を更に高める為にクラクティブFT-300-10-10を重ねたエンドレスベルトに改良し、実用装置に一層近づけたい。更に、今回は測定器が故障して出来なかった消毒薬に対しても検討を加えて行きたい。現在、手術室空気の麻酔ガス汚染を防止する方法は、第一に全ての麻酔器に麻酔ガス排除装置を付け、第二に部屋の換気に100%非再循環方式を採用することである。この両者が揃ってこそ汚染度は1/10以下にしうる。一方のみでは、不完全で、特に後者が重要であることは、一般にあまり知られていない。この非再循環方式の空調は、大型の装置と莫大なランニング・コストがかかり、エネルギ-の浪費とも言えるもので、普通、大病院のみで採用されているに過ぎない。また大病院でもバイオクリ-ン・ル-ムでは今でも再循環方式を取らざるをえない。中小以下の病院では、再循環方式が殆どで、汚染防止は不完全のまゝと言ってもよい。本研究は、再循環式空調を手術室に採用した場合に、再循環空気を活性炭ベルトにより淨化し、小さな病院でも汚染対策が完全になるようにしたいと考えている。再循環式の方が、装置や維持費も経済的であるばかりかフィルタ-の通過回数が多く、塵埃や浮遊細菌も少なく、むしろ手術室の空調としては、ガス汚染のことを除けば、理想に近い。本研究では、先ずこの活性炭ベルトに用いるのに最も適した活性炭の探求と低濃度の麻酔ガスや蒸気が活性炭に対して果して吸着されるかどうかの研究が必要になった。即ち活性炭はガス濃度が低い程吸着性が低下するからである。既に予備実験で各種活性炭(GG,GA,GGーF,クラシ-ト,クラクティブ)の笑気、ハロセン、エンフルランに対する等温吸着曲線を検討すると、後二者は私どもが対象としている様な低濃度でも吸着性があること、吸着性が小とされる笑気には特異な吸着曲線のあることを発見した。更に破過曲線も検討し、私どもの目的には活性炭線維クラクティブが最良でこれをベルトに使用することを決定した。一方この活性炭のエンドレスベルトを再循環空気のダクト内に通し,低速モ-タ-で動かし、汚染空気を淨化する装置を工夫・設計し、着々と製作中。

前年度、既に予備実験で、各種活性炭に対する検討を施行し、笑気、ハロセン、エンフルランに対する等温吸着曲線及び破過曲線を求めて、一連の研究結果から、我々の目的には、形状から言っても、活性炭線繊クラクティブが最良であることを決定した。そこで新製品のクラクティブFT-300-20を購入し、本装置のエンドレス・ベルトに組み込むことにした。本年度は、この活性炭ベルトによる浄化装置の試作品が完成し、平均3ppm弱のハロセンと平均50ppm弱の笑気、又は平均30ppm弱のセボフルレンと平均150ppm弱の笑気の模擬手術室汚染空気を作り、それぞれこの装置にフレキシブルダクトをつなぎ、その中に小型換気装置を用いて0.82m^3/minの風量で導入し、この装置の性能を調べた。最初、活性炭ベルトのスピードは180cm/minであった。更に、この装置の性能を向上させる為、活性炭ベルトに対する冷風の温度を室温より下げる様にしたり、活性炭ベルトを通すダクト開口部の気密性を高めたり、汚染空気が活性炭ベルトに添って流れるように誘導板を新設したりして、改良に改良を重ねた。又、活性炭ベルトのスピードも15180cm/minと7段階に変化させて研究を追加すると、この模擬汚染空気の風量では150cm/minが最良で、ベルトのスピードには至適スピードがあることが判明した。本研究で、この新浄化装置が実用装置として大体の目途はついたが、笑気に対する浄化がFT-300-10を用いた予備実験の時より効率が悪く、本年度にクラクティブFT-300-10を購入し、更に、これをエンドレス・ベルトに二重に重ねた構造に改良し、今後も研究を続けて行きたい。予定していた消毒薬汚染空気の実験は、残念ながら測定器が故障して出来なかったが、これも将来行う所存である。
確定前立腺がん診断を可能にするマルチプレックス診断法の開発

現在前立腺がん(PC)の診断には組織特異性の高いPSA値がマーカーとして用いられている。しかしPSA値4-10 ng/mlはグレーゾーンと言われ良性疾患(BPD)の患者が7割も含まれ診断が困難である。このため患者への負担が大きい生検に依存せざるをえず医療費増加の要因にもなっている。申請者はがんに伴う血清中の糖蛋白質の糖鎖構造変化に着目し、レクチンの特異性を利用して悪性/良性腫瘍を明瞭に識別できる方法を近年発見した。そこで本研究では多項目同時測定が可能なマルチプレックスビーズ結合抗体ーレクチン検出法を開発し、迅速かつ高精度な実用レベルの診断システムの確立を目的とした。患者血清の定量プロテオミクス解析からPC特異的に増加するキャリア糖蛋白質として同定したclusterin、apo-A4について、O型糖鎖認識レクチンACA、MPA、Jacalin結合ビーズを用い前立腺がん由来培養細胞および培養上清からアフィニティー精製しウエスタンブロットを行った。その結果clusterin、apo-A4ともにO型糖鎖の存在およびがんによる糖鎖変化を培養細胞でも確認した。患者血清中のO-glycosyl化されたclusterinやapo-A4は前立腺組織に由来し疾患の状態を反映している可能性が強く示唆された。さらにビオチン化レクチンを用いた蛍光ビーズ結合抗体ーレクチン検出法を検討した。apo-A4については非特異的なバックグラウンドが高く測定法の確立は困難であった。一方clusterinではレクチン結合量からO-glycosyl化の定量を行う検出法を確立し、MPAのclusterin結合量はPC-BPD間で有意差が示された。特にPSA値10ng/ml以下のグレーゾーン患者のROC分析ではPSA値より優れた結果が得られclusterinのMPA結合量を指標としたPC識別可能な測定法という目的を達成した。現在、前立腺がんの診断には組織特異性の高いマーカーとしてPSA値が用いられている。しかしグレーゾーンといわれる検出範囲(4-10 ng/ml)にはがんではない良性疾患の患者が7割も含まれ、結局、生検に依存せざるをえないため患者の身体的・精神的負担や医療費の増加の要因になっている。そこで生検不要の前立腺がん診断の実現にむけて、本研究では多項目同時測定が可能なマルチプレックスビーズ結合抗体ーレクチン検出法を開発し、迅速かつ高精度な実用レベルの診断システムの確立を目的とした。まず、患者および健常者血清を用い網羅的にレクチンとの結合性を測定できるレクチンアレイ分析を行って悪性腫瘍患者血清に結合特異性の高いレクチンの選定を行った。この結果、AOL, ACA, MPA, Jacalin, AALレクチンの結合に有意差が見出された。次に血清中から前立腺がんに特異的に増加するキャリア糖蛋白質を同定するため、これらのレクチンを結合したビーズを用いて患者および健常者血清からアフィニティー精製した糖タンパク質の、質量分析によるiTRAQラベル定量プロテオミクス解析を行った。これにより悪性腫瘍で増加する糖鎖構造を持った数種類のキャリア糖タンパク質候補を見出すことができた。これらの候補糖タンパク質はこれまで前立腺がんとの関連の報告が少ないものも含まれ、糖鎖に着目したからこそ見出すことができた興味深い結果が得られた。さらに多項目同時測定が可能なマルチプレックスビーズ結合抗体ーレクチン検出法の開発をめざし、最適な抗体の選定などの条件検討を行っていく。本研究では多項目同時測定が可能なマルチプレックスビーズ結合抗体ーレクチン検出法の確立を目指し、初年度においては悪性腫瘍を健常者と識別できるレクチンを選定し、さらに特異的糖鎖構造変化を提示するキャリアとなる糖タンパク質を同定することを計画していた。これまでの研究から、患者および健常者血清を用いた網羅的レクチンアレイ分析の結果、悪性腫瘍の識別に有用なレクチンを選定することができた。また、この結果をもとに作成したレクチンビーズを用いて、患者および健常者血清中から悪性腫瘍で増加する糖鎖構造を提示したキャリア糖タンパク質の同定に至った。以上の経過を踏まえ、当初の研究計画はおおむね順調に進展しているといえる。しかしグレーゾーンといわれる検出範囲(4-10 ng/ml)には良性疾患の患者が7割も含まれ、結局、生検に依存せざるをえないため患者の身体的・精神的負担や医療費の増加の要因になっている。昨年度の研究において悪性腫瘍患者血清に結合特異性の高いレクチンとして, ACA, MPA, Jacalinを選択した。次に前立腺がんに特異的に増加するキャリア糖蛋白質を同定するため、患者血清からレクチン結合ビーズを用いたアフィニティー精製および質量分析によるiTRAQラベル定量プロテオミクス解析を行い、キャリア糖タンパク質候補としてclusterinおよびapolipoprotein-A IVを同定した。

この結果を確認するため血清のウエスタンブロッティングを行ったところ、ターゲットタンパク質の量に健常者、良性患者、悪性腫瘍患者間の差異は認められなかった。一方レクチン結合ビーズを用いたアフィニティー精製後のサンプルをウエスタンブロッティングした場合は健常者に比べ疾患患者で増加する傾向が検出されiTRAQ分析の結果と一致した。これらの成果をもとに多項目同時測定が可能なマルチプレックスビーズ結合抗体ーレクチン検出法の開発をめざし、ACA, MPA, Jacalinレクチンとclusterinおよびapolipoprotein-A IVなどをターゲットとして最適な測定条件の検討を行っている。本研究では多項目同時測定が可能なマルチプレックスビーズ結合抗体ーレクチン検出法の確立を目指し、初年度において悪性腫瘍と健常者を識別できるレクチンを選定し、さらに特異的糖鎖構造変化を提示するキャリアとなる糖タンパク質を同定した。質量分析で得られた結果を確認する目的でウエスタンブロッティングを行い一致した結果が得られた。現在ターゲットとなるレクチン-糖タンパク質の組み合わせをもとに多項目同時測定マルチプレックスビーズ結合抗体ーレクチン検出法の条件検討を進めており当初の研究計画はおおむね順調に進展しているといえる。現在、前立腺がん(PC)の診断には組織特異性の高いマーカーとしてPSA値が用いられている。しかしグレーゾーンといわれる範囲(4-10 ng/ml)には良性疾患(BPD)の患者が7割も含まれ生検に依存せざるをえないため患者への負担や医療費増加の要因になっている。申請者はがんに伴う血清中の糖蛋白質の糖鎖構造変化に着目し、レクチンの特異性を利用して悪性/良性腫瘍を明瞭に識別できる方法を近年発見した。そこで生検不要の前立腺がん診断の実現にむけて、本研究では多項目同時測定が可能なマルチプレックスビーズ結合抗体ーレクチン検出法を開発し、迅速かつ高精度な実用レベルの診断システムの確立を目的とした。レクチンアレイ解析からPC患者血清に特異性の高いO型糖鎖認識レクチンACA, MPA, Jacalinを選択し、また患者血清の定量プロテオミクス解析からPC特異的に増加するキャリア糖蛋白質clusterin、apo-A4を同定した。まずがんとの関連が報告されているclusterinについて、前立腺がん細胞の培養細胞および培養上清を用いレクチンビーズによるアフィニティー精製および抗clusterin抗体によるウエスタンブロットを行った。その結果、がん患者血清と同様、clusterinにO型糖鎖の存在が確認され、がんによる糖鎖変化が培養細胞でも確認できた。患者血清中のO-glycosyl化されたclusterinは前立腺組織に由来し疾患の状態を反映している可能性が強く示唆された(投稿準備中)。さらにclusterin抗体とビオチン化レクチンによる蛍光ビーズ結合抗体ーレクチン検出法を確立し、レクチン結合量からO-glycosyl化の定量を行った。MPAの結合量はPC-BPD間で有意差が示され、PSA値とのROC分析の比較からclusterinのMPA結合量を指標としたPC識別の可能性が示唆された。
転位線上のキンク運動の原子レベル動的観察

高分解能電子顕微鏡(HREM)を使った転位芯の原子像観察法として、電子ビームをすべり面に直角に入射させる新しい方法を用いて転位線上のキンクを直接観察し、その運動や発生を調べることにより、電子励起によって転位のすべり運動が著しく増速される現象-REDG効果の機構究明を行なった。結果は以下の通り。(1)格子像シミュレーション:部分転位に挟まれた積層欠陥に対応する3倍超周期構造は、膜厚が30Å以下でないと十分なコントラストで得られないこと、30°部分転位の再構成を示す2倍周期コントラストは非常に弱いこと、が分かった。(2)HREM観察:490°Cで圧縮変形したn-GaAs結晶から(111)すべり面で切り出した板状試料から作成した試料を、300kVでHREM観察した。(3)画像解析:画像処理により積層欠陥だけを抽出した像を検討した結果、一般的特徴として、(1)30°,90°部分転位のあいだで転位線形状にあまり差がないこと、(2)両転位成分を問わずキンク濃度が非常に高い(0.1/b)こと、(3)時間とともに部分転位の形状は変化すること、を見いだした。(4)実験結果の検討:(1)の事実は、全転位の運動は30°部分転位で律速されると考えられる事実と矛盾する。(2)の事実からは、キンクが高温変形時に形成されたものとすると、キンクの形成エネルギーは0.15eV以下と極端に小さいことになってしまう。異常に高密度のキンクの存在は、転位線が長距離にわたってパイエルスポテンシャルの谷方向に沿っている事実とも合わない。(3)の事実と照らし合わせ、最も妥当な解釈として、電顕観察に用いる電子線によってキンク対生成が電子励起され、過剰なキンクが非平衡に導入されているとの結論に到った。また、本手法を使用してREDG効果の素過程をその場観察できる可能性が実証された。結果は以下の通り。
Hγ吸収線プロフィールを用いた楕円銀河の年齢測定

この研究の目的は楕円銀河の分光学的年齢を測定し、現代天文学でもっとも謎とされる楕円銀河の形成の時期を突き止めることにある。本課題で承認された三年間の研究期間において、すばる望遠鏡(国立天文台)、ウィリアム・ハーシェル望遠鏡(スペイン・英国)、NTT望遠鏡(ESO)といった国内外の観測装置を駆使して近傍のフィールド(13個)と銀河団(乙女座銀河団14個)にある楕円銀河のHγプロフィールを測定し年齢と化学組成を求めた。このHγプロフィールを用いる方法は研究代表者が中心となって開発したものであり、それまでは困難とされてきた銀河スペクトルに於ける年齢と化学組成の縮退を解いて、各々を精度良く求める方法として国際的にも非常に高く評価されており、この研究はそれを多数の楕円銀河について初めて適用した画期的なものである。本研究では銀河の年齢・化学組成が銀河の力学的質量や光度とともにどのように変化しているか、銀河環境にどのように依存しているか、更に、銀河の中での星の年齢や化学組成がどのように分布しているかについて詳細に調べた。その結果、1)巨大な楕円銀河の年齢は銀河団では一様に古く、100億年以上である。それに対して、フィールドでは60-100億年以上と年齢に大きな幅を持つ。このことはフィールド銀河の中には星生成をごく最近まで行っていたものがあることを意味する。2)矮小楕円銀河は環境に無関係に30-100億年以上という大きな散らばりを示す。これは矮小楕円銀河の星生成史が従来考えられていたよりも複雑であることを意味する。3)楕円銀河のマグネシウム/鉄の比と質量の間には強い正の相関があり、質量が大きなものほど星生成の期間が短いことを意味する。4)我々に最も近い楕円銀河M32では周辺から中心部に向かって星の平均年齢が30億年程度減少し、マグネシウム・鉄比の値も銀河系ハローの値から太陽値まで減少しており、これは星生成が中心部では最後まで起こっていたことを示す。これらのことから、楕円銀河の形成は銀河によって個性がある(特に矮小楕円銀河)ものの、大局的には、大質量の楕円銀河ほど、また、銀河密度が高いほど星生成を早く終えると言える。本年度は本研究の初年度である。すばる望遠鏡やVLTなどの超大型地上望遠鏡で楕円銀河の高品位の分光データを収得し、水素バルマー系列のHγ吸収線の強度から楕円銀河の年齢を決定するのが本研究の主目的である。幸いにもすばる望遠鏡のS02A期と欧州南天文台のNTTの2002年春期にそれぞれ二晩と三晩が採択されたので、H14年の4月と5月におとめ座銀河団の楕円銀河と南天のフィールド楕円銀河の高品位のデータが得られる予定である。本年度はスペイン領パルマ諸島にあるウイリアム・ハーシェル望遠鏡で収得した中品位のデータを用いて、おとめ座銀河団中にある6個の楕円銀河の年齢を測定した。これらの銀河は色-等級関係に上にのる普通の楕円銀河である。この結果では、いずれの楕円銀河も80億年よりは古く、銀河の年齢と光度の間には顕著な相関は見られない。一方、副次的に測定できる金属量の方は、銀河の光度や、色、速度分散などと良い相関を示す。これによって、楕円銀河の色-等級関係の起源が金属量にあると結論できよう。

しかしながら、この結果は暫定的なものであり、すばる望遠鏡による高品位の分光データによる再解析が必要である。また、銀河環境と年齢との関係を調べる必要があろう。楕円銀河の年齢を正確に求めることは本研究によって初めて可能になったが、その信頼性を確かめるには他の方法で年齢の測定が可能である天体についてHγ法で年齢を測定し、比較検討することが必要である。この目的のために、金属量がもっとも高い球状星団47Tucの年齢を求めた。その結果は200億年を超えるものとなった。これはこれまでに色-等級図の転向点の光度から求められてきた90-130億年という年齢に比べてあまりにも大きな値である。この矛盾を解消するには、通常の星の進化路に重力による元素の拡散の効果や、アルファ元素の相対組成比を鉄に比べて増加させる(実際の球状星団ではそうなっている)などの処置が必要であることが分かった。異なる方法による年齢評価の食い違いが、47Tucの独自の問題であるのか、Hγ法の問題であるのかは今後さらに、金属量の違う星団や、もっと多数の星団について検証すべき考察の対象であることが明らかになった。本年度は昨年度に構築した銀河のスペクトル進化・種族合成モデルを更に発展させ、銀河の化学進化と星の生成史とをカップリングしたモデルを開発した。これによって、単一の星の種族よりなる銀河のみならず、星生成が連続的に行われた(より現実的な)銀河についても、非常に波長分解能の高いスペクトル進化を予測するモデルを構築できたと言えよう。特筆すべきことは、念願のすばる望遠鏡(口径8.2m)の公募観測に二夜採択(H14年4月)されたことである。また、欧州南天文台(ESO)のNTT望遠鏡・(口径3.6m)でも三夜採択(H14年5月)され、それぞれ7個と5個の楕円銀河の分光撮影に成功し、非常にSN比の高いHγ(σ)吸収線のプロフィールを得ることができた。これを本研究で構築した銀河スペクトルのモデルを用いて解析すると、年齢と金属量とを導出することができる。このモデルは年齢と金属量の縮退を初めて解いたモデルであり、楕円銀河の年齢を正確に求めたのは本研究が世界で初めてである。楕円銀河のサンプリングは色一等級関係に沿って明るいもとから暗いものまでを抽出し、銀河団にあるものとフィールドにあるものとを比較のために選んだ。これに昨年度までにWHT望遠鏡。(口径4.2m)で分光した楕円銀河のサンプルを加え、楕円銀河はその明るさ(質量)によって年齢が異なることを見出した。即ち、質量の大きな楕円銀河については年齢が古い(約100億年以上)のに対して、矮小楕円銀河では年齢に大きな分散(50億年-100億年以上)があることを発見した。この矮小楕円銀河の年齢の結果は、これまで有本等によって楕円銀河の形成理論として提唱されていた銀河風理論でも、また近年宇宙の大規模構造をよく説明する。とされる階層的合体理論でも単純には説明できるものではなく、今後はこの結果を説明するような理論・シナリオを構築することが本研究の主要な目的となる。この研究の目的は楕円銀河の分光学的年齢を測定し、現代天文学で最も謎とされる楕円銀河の形成の時期を突き止めることにある。
異物代謝酵素CYP2D3発現の個体差を引き起こす新規調節機構の解明

これまでの研究で、ラットの系統間及び個体間でCYP2D3に遺伝的多型が存在することを明らかにしてきた。さらにCYP2D3と同じCYP2Dサブファミリーの一員である、CYP2D2もラットでは同様に非常に多くの医薬品の代謝を行う重要なシトクロムP450であることが報告されている。ラット系統によってCYP2D2は発現量に違いがあることが知られているが、その発現調節機構に関する詳細な報告はいまだされていない。そこで、今年度もCYP2D2の発現調節機構および低発現系統におけるその低発現機序について明らかにするため、以下の解析を行った。昨年度の研究で、CYP2D2mRNA低発現系統であるDAラットのCYP2D2遺伝子の5'上流において見出した一塩基置換によって、核蛋白質とDNAとの結合親和性が低下する事により、CYP2D2mRNA発現量が低下する事を明らかにした。そこで本年度は、CYP2D2遺伝子の転写に関与し、遺伝子変異により転写調節領域との結合が低下する転写因子の同定を試みた。まず、in silico解析により、転写調節領域に結合する転写因子を予測し、ゲルシフトアッセイを用いて解析したが、予測された転写因子はいずれも結合には関与していなかった。そこで、DNAプローブと磁気ビーズを利用したプルダウンアッセイから、転写調節領域に特異的に結合する核蛋白質を精製した。さらに、質量分析装置を用いて、この核蛋白質の同定を試みた。その結果、転写装置の足場蛋白として働く多機能な核蛋白質である、ヘテロ核内リボ核蛋白質K(hnRNP K)が、転写調節領域に結合する事を明らかにした。よって、これまでの研究成果から、DAラットにおけるCYP2D2mRNAの低発現は、CYP2D2遺伝子の転写調節領域内の一塩基置換により、hnRNP K蛋白質のDNA結合が低下する事が原因である事を初めて明らかにした。そこで、今年度はCYP2D2の発現調節機構および低発現系統におけるその低発現機序について明らかにするため、以下の解析を行った。まず、CYP2D2遺伝子の5'上流領域におけるラット系統間での違いの有無を確認するため、5'上流域4Kbをクローニングしてシークエンス解析を行った。その結果、CYP2D2mRNA低発現系統であるDark Agouti(DA)ラットの雌雄において、一塩基置換を確認した。一方、高発現系統であるSprague-Dawleyラットでは変異は認められなかった。そこで、この変異が発現調節に与える影響および発現調節領域を検討するために、次にプロモーター解析を行った。5'上流域から欠失変異体を作製してルシフェラーゼアッセイを行ったところ、転写調節領域と予想される領域を同定した。加えて、DAラットで検出された変異がこの転写調節領域に含まれていることから、DAラットと同じ変異を導入した欠失変異体を作製して野生型との転写活性の比較を行った。その結果、変異を含む欠失変異体では野生型に比べ転写活性が約2030%に低下しており、DAラットは他の系統に比べCYP2D2mRNA発現量が約30%であると言う従来の報告と一致するものであった。以上のことから、DAラットにおけるCYP2D2mRNAの低発現は転写調節領域内の一塩基置換による可能性が考えられる。そこで、昨年度に引き続き今年度もCYP2D2の発現調節機構および低発現系統におけるその低発現機序について明らかにするため、以下の解析を行った。昨年度の研究で、CYP2D2mRNA発現量が低い系統であるDAラットにおいてのみCYP2D2遺伝子の5'上流域に一塩基置換があることを見出した。さらにルシフェラーゼアッセイを用いて、この一塩基置換は転写調節領域内に含まれていること及び転写活性を著しく低下させることを明らかとしてきた。そこで本年度は、この一塩基置換が核蛋白質とDNAの結合に与える影響を調べるため、ゲルシフトアッセイを行った。その結果、一塩基置換を含む変異型のプローブは核蛋白質との結合親和性が低下することが明らかとなった。一方、ラット系統間での核蛋白質の違いは結合親和性に影響を与えなかった。つまり、DAラットにおいて見出した一塩基置換によって核蛋白質内の転写調節因子とDNAとの結合親和性が低下する事により、CYP2D2mRNA発現量が低下している事が明らかとなった。今後は、MALDI TOF MSを用いてCYP2D2の転写に関与する転写調節因子の同定を試みる予定である。

これまでの研究で、ラットの系統間及び個体間でCYP2D3に遺伝的多型が存在することを明らかにしてきた。さらにCYP2D3と同じCYP2Dサブファミリーの一員である、CYP2D2もラットでは同様に非常に多くの医薬品の代謝を行う重要なシトクロムP450であることが報告されている。ラット系統によってCYP2D2は発現量に違いがあることが知られているが、その発現調節機構に関する詳細な報告はいまだされていない。そこで、今年度もCYP2D2の発現調節機構および低発現系統におけるその低発現機序について明らかにするため、以下の解析を行った。昨年度の研究で、CYP2D2mRNA低発現系統であるDAラットのCYP2D2遺伝子の5'上流において見出した一塩基置換によって、核蛋白質とDNAとの結合親和性が低下する事により、CYP2D2mRNA発現量が低下する事を明らかにした。そこで本年度は、CYP2D2遺伝子の転写に関与し、遺伝子変異により転写調節領域との結合が低下する転写因子の同定を試みた。まず、in silico解析により、転写調節領域に結合する転写因子を予測し、ゲルシフトアッセイを用いて解析したが、予測された転写因子はいずれも結合には関与していなかった。そこで、DNAプローブと磁気ビーズを利用したプルダウンアッセイから、転写調節領域に特異的に結合する核蛋白質を精製した。さらに、質量分析装置を用いて、この核蛋白質の同定を試みた。その結果、転写装置の足場蛋白として働く多機能な核蛋白質である、ヘテロ核内リボ核蛋白質K(hnRNP K)が、転写調節領域に結合する事を明らかにした。よって、これまでの研究成果から、DAラットにおけるCYP2D2mRNAの低発現は、CYP2D2遺伝子の転写調節領域内の一塩基置換により、hnRNP K蛋白質のDNA結合が低下する事が原因である事を初めて明らかにした。
考古学・鳥類学・歴史学から解明する江戸時代のツルの多様な利用：食用、飼育、流通

本研究では考古学、歴史学、鳥類学の方法を統合的に用いて、ツルの種による利用の違いとツルの利用に際する身分的制約の有無を考慮しながら、江戸時代におけるツルの利用の実態を食用、飼育、流通の視点から明らかにする。1誰が、どのような目的でツルを食べたか、どのような種がどのように調理されたかを調べ、江戸時代の食文化における食肉としてのツルの位置づけを明らかにする。2誰がどのようにツルを入手し、どのような目的、どのような方法でツルを飼育したか、江戸時代のツルの飼育の実態を明らかにする。3流通商品としてのツルの産出地と消費地を解明し、権威による贈答利用が強調されてきたツルの流通の事実を明らかにする。
高透過速度を有するゼオライトナノクリスタル触媒膜の開発と反応分離プロセスへの適用

ゼオライトはその結晶内に低級炭化水素の最小分子径とほぼ等しい径の細孔を有するため、高い分子篩能に由来する得意な触媒活性と分離能を示す。しかし、細孔内の拡散速度が極めて遅いため、その性能を最大限に生かしていない。研究実施者はゼオライトの結晶をナノサイズに調製することでこれらゼオライト使用時に問題となる点を克服できるとの着想に至った。そのため、平成16年度は、1)単分散ゼオライトナノクリスタルの開発について研究を実施し、珪素、アルミナ源とテンプレート分子が溶解した水溶液と、界面活性剤(O-15)および有機溶媒(シクロヘキサン)を浪合してミクロサイズのエマルションを形成し、その後水熱処理することで、シリカライトとZSM-5について60-200nmの範囲で単分散のゼオライトのナノクリスタルを合成することに成功した。そこで、平成17年度は平成16年度に開発したゼオライトナノクリスタルを利用して、次の研究を展開し、所望の成果を得た。2)水の選択的高速分離膜の開発:上記1)で合成したシリカライトのナノクリスタルを、アルミナフィルターの表面に吸引濾過固定化し、さらに水熱処理によって固着・薄膜化することで、膜厚が数百nmから数ミクロンの範囲でゼオライト薄膜を合成した。この膜を用いて浸透気化法により高濃度アセトン水溶液(アセトン/水=90/10)から水の選択透過に成功した。透過速度は、緻密な膜に比べて100倍の高速に達した。3)メタノールからのオレフィン選択合成用触媒膜の開発:ZSM-5のナノクリスタルを用いて2)と同様の方法により触媒膜を作成した。本触媒膜により、緻密な膜に比べて200倍以上の処理速度でメタノールからオレフィンを60%以上の選択率で合成することに成功した。ゼオライトは、高表面積、固体酸性と分子篩能を有するために、吸着剤や触媒として工業的に広く使われている。触媒として用いる場合、ゼオライト結晶内における原料分子の反応速度に比べて、その拡散速度は遅い。結晶内ミクロ孔における原料分子の拡散の影響を低減するには、結晶サイズがナノメータスケールのゼオライトナノクリスタルを用いることが有効であると考えられる。そこで本研究では、界面活性剤/有機溶媒/水から成るマイクロエマルションを反応場に利用し、酸点を持つ均一なMFI型ゼオライトナノクリスタルの調製を検討した。シリカとアルミナの原料金属アルコキシドとテンプレートを含む水溶液を界面活性剤/有機溶媒溶液に投入し、マイクロエマルション相を形成する溶液を調製した。この溶液をオートクレーブに投入し、100°C160°Cの水熱条件下でゼオライトナノクリスタルの合成を行った。原料金属アルコキシド濃度、テンプレート濃度を変化させることにより、結晶サイズが150nm500nmの範囲で制御された単分散なゼオライトナノクリスタルが得られた。X線回折法とラマン分光法により、得られたゼオライトナノクリスタルの結晶性を評価したところ、粒子表面まで結晶性に優れていることが明らかとなった。更に、加えるアルミニウム量によって酸量の制御が可能であった。界面活性剤/有機溶媒中で合成する本法では、100°C24hでゼオライトナノクリスタルが得られたことから、通常の水溶液系での合成法と比べ、核発生と結晶化が進行しやすいことが考えられた。次年度は、結晶サイズの異なるZSM-5ゼオライトナノクリスタルを用いて触媒膜型反応器を作製し、メタノールからのオレフィン合成反応(MTO反応)実験を行う予定である。
免疫記憶に関わる昆虫宿主因子の探索・同定と機能解析

昆虫の免疫機構には、一度侵入・感染した病原体に対する免疫記憶はないとされる。しかし我々は最近、昆虫にも記憶を伴った免疫機構があることを示唆する知見を得た。本研究ではカイコを用い、免疫記憶に関わる昆虫側の因子の解析を行った。候補因子としてダウン症細胞接着性因子(Dscam)に着目し、in silicoクローニングし、第4エキソンが15種類、第6エキソンが23種類あることを見いだした。さらに、カイコで発現するこれらエキソンの発現パターンが接種する細菌の種類によって異なる傾向にあることが示された。また、大腸菌接種によるカイコ幼虫のメラニン化の度合いは、大腸菌の一次接種で低下することを明らかにした。昆虫の免疫機構は脊椎動物とは異なり、迅速で非特異的に行われる自然免疫機構のみを有し、一度侵入・感染した病原体に対する免疫記憶はないとされる。しかし申請者は最近昆虫にも記憶を伴った免疫機構があることを示唆する知見を見いだした。そこで本研究では、昆虫の記憶を伴った免疫機構を明らかにするために、カイコを実験材料とし、免疫記憶に関わる昆虫側の因子の探索同定を行うことを目的とする。今年度は選択的スプライシングによって1万種類以上もの翻訳産物を潜在的に形成することが知られ、かつ異物を認識するレセプターとしての機能があることが知られているダウン症細胞接着性分子(Dscam)に着目し、免疫記憶のキー因子として作用するかを解析した。まず、カイコゲノム情報を利用して、Dscam遺伝子をin silicoクローニングし、本遺伝子のエキソンが37個存在すること、そのうち第4エキソンが15種類、第6エキソンが23種類、第12エキソンが19種類、第31エキソンが2種類あることを見いだした。次に4齢幼虫カイコに大腸菌あるいは黄色ブドウ球菌を接種し、24時間後に血球を回収して、Dscam遺伝子の第4エキソンの発現パターンを解析した。その結果、無処理カイコの発現パターンは大腸菌や黄色ブドウ球菌を接種したカイコの発現パターンとは異なる傾向があること、大腸菌接種カイコと黄色ブドウ球菌カイコ間でも発現パターンが異なる傾向にあることが示された。また、3齢幼虫に大腸菌を接種(一次接種)した後、5齢4日目カイコに再度大腸菌を接種して体液を回収し、体液中のメラニン化の度合いを一次接種をしない対照区と比較した結果、一次接種した実験区は対照区よりメラニン化の度合いが低いことが示された。おおむね計画通りに進捗している。昆虫は、迅速で非特異的に行われる自然免疫機構のみを有し、一度侵入・感染した病原体に対する免疫記憶はないとされる。しかし昆虫にも記憶を伴った免疫機構があることを示唆する知見を見いだしている。そこで本研究ではこの免疫機構を明らかにするため、免疫記憶に関わる昆虫側の因子の探索同定をカイコを用いて行うことを目的とした。今年度は選択的スプライシングによって1万種類以上もの翻訳産物を潜在的に形成し、かつ異物認識レセプターとしての機能があることが知られているダウン症細胞接着性分子(Dscam)に着目し、免疫記憶因子として作用するかをさらに解析した。まず、Dscam遺伝子の第6エキソンに着目し、このエキソンのクローニングを進めたところ、少なくとも27種類あることを見いだした。4齢幼虫カイコに大腸菌あるいは黄色ブドウ球菌を接種し、24時間後に血球を回収して、Dscam遺伝子の第6エキソンの発現パターンを解析した結果、無処理カイコの発現パターンは大腸菌や黄色ブドウ球菌を接種したカイコの発現パターンとは異なる傾向があること、大腸菌接種カイコと黄色ブドウ球菌接種カイコ間でも発現パターンが異なる傾向にあることが示された。しかしながら、大腸菌あるいは黄色ブドウ球菌接種カイコいずれにおいても特定のエキソンバリアントのみが特異的に発現しているわけではないことも示唆された。また、第6エキソンを含まないバリアントも見いだされ、これは、細菌処理をしたカイコでより多く発現している傾向にあることが分かった。第4エキソンにも着目し、発現パターンをさらに正確に調べるため、定量RT-PCR解析を行ったところ、エキソンバリアントごとによって発現量が大きく異なることが示されたが、細菌処理カイコ、ペプチドグリカン処理カイコ、無処理カイコ、生理食塩水処理カイコ間で発現量が大きく異なるエキソンバリアントは見出されなかった。一次接種をしたカイコに大腸菌を再接種した場合、一次接種をしない場合と比べて有意にメラニン化の度合いが低下したことから、この度合いの違いが、体液中の顆粒細胞やプラズマ細胞等の数の違いによるものかを明らかにする。

また、大腸菌や黄色ブドウ球菌の接種した場合のアイソフォームの発現パターンを第4エキソン以外のエキソンに着目し、特異的なアイソフォームが転写されるかを確認する。さらに、特異的なアイソフォームの発現が確認できれば、in vivoトランスフェクション法を用いて特定のアイソフォームをカイコ幼虫に発現させた時に、大腸菌接種後の細胞性免疫能が増大するかを体内の細菌数を測定することにより検証する。また、免疫記憶を導き出す微生物側の構成成分を解析する。応用昆虫学研究用試薬やガラス・プラスチック器具等を効率的に使用した結果、研究費に余剰が生じた。余剰が生じた研究費は次年度の研究費と合わせて、人件費や遺伝子発現解析実験などに必要な試薬類、器具類の購入にあてる。