hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血管壁由来生理活性物質を応用した動脈硬化巣の可視化に関する研究

また培養血管平滑筋細胞にTNF-αを添加すると活性酸素種の産生の増加することを蛍光プローブを用いた顕微鏡観察で確認した。動脈硬化発症における血管壁由来生理活性物質の役割を調べるために、糖尿病での血管内皮機能障害の発生に対する内因性サイトカインの影響をサイトカイン産生抑制薬であるSemapimod (Sem)を用いて検討した。糖尿病モデルとして12週齢、雄のZuckerラットを用いた。それらをlean (LZ), obese (OZ), Sem (5mg/kg/day)を投与するobese (OZ/Sem)ラットに分けた。Semの4週間の投与後に摘出胸部大動脈でのアセチルコリン(ACh)およびアドレノメデュリン(AM)に対する内皮依存性血管拡張反応を検討した。また摘出胸部大動脈にAM (10^<-7>M)を15分間投与した後のリン酸化Akt (p-Akt)およびcGMP産生をWestern Blot法およびELISA法で検討した。収縮期血圧、空腹時血糖、中性脂肪、コレステロールはOZ群でLZ群よりも有意に上昇していたが、Sem投与はそれらの値に影響を与えなかった。血清CRP濃度はOZ群でLZ群よりも有意に上昇し、Sem投与で上昇は抑制された。血清および臓器中のTNF-α,IL-1β,およびIL-6含有はOZ群でLZ群よりも有意に高値を示し、Sem投与でそれらの増加は抑制された。AChおよびAMによる内皮依存性血管拡張反応はOZ群でLZ群に比べて低下しており、Sem投与で改善した。LZ群にTNF-αを腹腔内投与しておくとAChによる血管拡張反応は減弱した。AM刺激による胸部大動脈でのAktのリン酸化およびcGMP産生はLZ群に比べてOZ群で低下していたが、Sem投与で回復した。糖尿病では内因性サイトカインが血管内皮機能障害の発症に重要な役割を果たしており、内因性サイトカインの産生を抑制すると血管内皮機能は改善する。
ランダムδ磁場を持つシュレディンガー作用素の解析

アンダーソン型、ポアソン型のランダムδ磁場を持つシュレディンガー作用素のスペクトル集合の存在範囲、およびランダウ準位の多重度に対する評価を与えた。アンダーソン型などのランダムδ磁場についてのリフシッツテイルを示した。ポアンカレ平面上のシュレディンガー作用素について、δ磁場が有限個ある場合のランダウ準位間の固有値数の評価、およびδ磁場が格子上に存在する場合のランダウ準位の多重度に対する評価を与えた。本年度の研究成果は以下の通りである。(1)野村祐司氏との共同研究によるユークリッド平面上のランダムなδ磁場を持つシュレディンガー作用素に関する研究。特にリフシッツ・テイルの証明、ランダウ準位が無限多重度の固有値となるための定数磁場の満たすべき十分条件、ランダウ・ギャップの状態密度の評価を与えた。これらは未解決問題である「ランダム磁場によるアンダーソン局在」の理論において、基礎をなすべきものである。(2)岩塚明氏・島田伸一氏との共同研究による、三次元空間のトーラス内に台を持つ磁場を持つシュレディンガー作用素の、トーラスの太さがOに収束する極限におけるノルム解核収束に関する研究。これは、外村彰氏らによるアハラノフ・ボーム効果に関する実験の数学的解析を意図している。(3)ポアンカレ平面上のδ磁場を持つシュレディンガー作用素のスペクトルに関する研究。特に、δ磁場が有限個存在するとき、あるいはδ磁場の分布が群SL(2, Z)の離散部分群の作用により不変な離散集合であるときに、そのランダウ準位の多重度、ランダウ・ギャップ中の固有値数について調べ、ユークリッド平面の場合と類似の結果が成り立つことを証明した。これは、現在磯崎洋氏らにより進められている双曲空間上のシュレディンガー作用素の研究に寄与するものである。上記の成果について下記雑誌論文で発表し、さらに研究集会「Spectral and Scattering Theory for Quantum Magnetic Systems」(2008年7月Luminy, France)、「夏の作用素論シンポジウム」(同9月佐賀市)、日本数学会秋季総合分科会(同9月東工大)、「ランダム作用素のスペクトルと関連する話題」(同11月京大)などにおいて学術講演を行った。本年度は京都工芸繊維大学の若手教員海外研究派遣事業参加のため、チェコ共和国のDoppler Instituteに滞在しての研究活動を行った。Czech Technical UniversityのPavel St'ovicekとの共同研究を行い、(1)双曲上半平面におけるPauli作用素のzero-modeの重複度、(2)ユークリッド平面上のAharonov-Bohm型磁場を持つSchrodinger作用素の解核のSchulman公式による表示に対する数学的定式化についての研究を行った。また愛媛大学の野村祐司との共同研究により、(3)双曲上半平面における定数磁場とAharonov-Bohm型磁場を併せ持つSchrodinger作用素のランダウ準位の重複度の研究を行った。さらに、(4)一般のリーマン多様体上でのAharonov-Bohm型磁場を持つSchrodinger作用素の自己共役拡張に関する研究を行った。上記のうち、(1)、(3)は密接に関わり合う問題であり、超対称性の破れなどとも関連する重要な課題であるが、単に数理物理学的な興味のみならず、その解析には数論、特に保形関数の理論も用いられる点で興味深い問題と言える。この研究により、Geyler-St'ovicekが2006年に得たzero-modeの多重度が無限大になるための十分条件を精密化し、必要十分条件を求めることが出来た。(2)についてはKocabova-St'ovicekによる結果に基づいているが、Schulmanの公式における普遍被覆空間の代替として、近年砂田らにより研究されている極大Abel被覆を用いることによりSchulmanの公式の変形を示し、それによってAharonov-Bohm型磁場を持つSchrodinger作用素の解核の表示を得ることに成功した。これにより、難問として知られる複数のAharonov-Bohm型磁場を持つSchrodinger作用素のレゾナンスの問題の解決への一助となることが期待されている。(4)については、Dabrowski-St'ovicek, Exner-St'ovicek-Vytras, Lisovyyらによって個々に得られていた作用素の自己共役拡張に関する結果を統括し、より統一的な視点を与えたとして、意義深い結果と言える。(1)一般のRiemann多様体上でのAharonov-Bohm型磁場を持つSchrodinger作用素の自己共役拡張に関する研究を行った。(2)愛媛大学の野村祐司氏との共同研究で,双曲上半平面における定数磁場と周期的Aharonov-Bohm型磁場を併せ持つSchrodinger作用素のLandau準位の重複度について,前年度までに得られていた結果の精密化を行った。(3)2次元Euclid平面上の無限個の点相互作用を持つSchrodinger作用素の自己共役拡張に関する研究を行った。(4)東北学院大学の神永正博氏との共同研究で,1次元Euclid直線上の周期的な点相互作用に対するSchrodinger方程式の解作用素に関するStrichartz型時間減衰評価に関する研究を行った。

(1),(3)は多様体上での量子力学を扱う上での基礎となる研究である。(1)が一般のRiemann多様体上の結果であるのに対し,(3)はEuclid平面に限定してより精密な結果を与えることを目的とする。(1)については「Acta Mathematica」誌に結果が掲載された。(3)については現在引き続きPavel Exner氏との共同研究を行っている。(2)は研究代表者がこれまでにEuclid平面上のSchrodinger作用素について得た同様の結果に対し,双曲多様体の負曲率が及ぼす影響を調べるのが目的である。特に周期格子の対称群が尖点を持つ時,前年度までの結果を大幅に一般化し,より広範な格子を取り扱うことに成功した。結果は2011年2月の研究集会「Spectral and Scattering Theory and Related Topics」で発表した。(4)は線形方程式の性質としても興味深いが,非線形Schrodinger方程式への応用の観点からも意義深い。現在までに神永氏と共にBloch理論を用いた解析的な計算,および数値実験を行った。
心不全発症進展に対するインスリンシグナルの関与についての基盤研究

複数の臨床研究により、心不全と全身のインスリン抵抗性との関連性が示唆されていたが、分子機序は明らかではなかった。我々は、持続的な圧負荷により心筋組織内のインスリンシグナルが過剰に活性化し、心肥大が進行する事て心不全が発症、増悪することを明らかにした。その機序として心不全時に全身のインスリン抵抗性(高インスリン血症)が惹起されることが重要であったが、詳細な分子機序は明らかではなかった。更に研究を進めた結果、持続的な圧負荷により交感神経緊張を介して過剰な脂肪融解が生じ、脂肪組織内でp53依存的な炎症が生じることで全身のインスリン抵抗性が獲得されることが明らになった。圧負荷モデルでは心不全慢性期に全身のインスリン抵抗性が生じ、血中インスリン濃度は高値を示した。内臓脂肪では脂肪融解が進行することで、過剰な活性酸素の産生とDNA障害が生じ脂肪組織内ではp53の蓄積を認めた。p53シグナルの亢進により、NFkB経路を介した脂防炎症が生じ、全身のインスリン低抗性が惹起された。脂肪組織特異的にp53を抑制すると心不全慢性期の脂肪融解は抑制されなかったが、脂肪組織の炎症と全身のインスリン抵抗性は軽快し、心機能の改善を認めた。脂肪組織の交感神経を抑制した後に圧負荷モデルを作成すると脂肪組織の炎症と全身のインスリン抵抗性の改善が認められることより、心不全慢性期において交換神経緊張に伴う過剰な脂肪融解が脂肪組織内における炎症の惹起に不可欠であると考えられた。本研究によって、心不全慢性期では交感神経活性の緊張に伴う過剰な脂肪融解により脂肪組織内でp53依存的な炎症が惹起され、全身のインスリン抵抗性を介して心機能が増悪する悪循環が存在することが明らかとなった。心不全時に生じる脂肪炎症が心不全の新たな治療標的となる可能性が示唆される。
DNA二重鎖切断修復機構とリンパ腫発症機序の関係の解明

松山睦司博士がBuffaloラットを20代に及び兄妹交配し樹立したBuf/Mnaは性差なく100%胸腺種を発症する。同博士はこの胸腺腫瘍が組織型ではヒト胸腺腫と類似した上皮細胞間に著しいリンパ球の増生を伴うリンパ球優性型であり、ほぼ全例にmyopathyを伴うこと、移植実験の結果、腫瘍性性格は胸腺上皮にのみ存在すること、胸腺腫発生は単一優性遺伝子により統御されていることを明らかにしてきた。Buf/Mnaの胸腺上皮細胞からライブラリーを樹立した。これよりヌード遺伝子をクローニングし全塩基配列を決定した。これと蛋白質レベルで相互作用する分子をtwo hybrid法を用いてクローニングした。複数の遺伝子が単離され、機能解析に、さらに時間が必要である。遺伝子の報告は機能解析の結果とともに行う予定。
ジオパークにおけるマグマ生成実験を活用した地学教育手法の開発

火山・火山岩が分布するジオパークの教育活動にマグマ生成実験教材(七輪2個を上下に組み合わせた加熱実験装置)を導入することで,学習者がマグマの熱を実感し,火山活動と地域地質発達史の関係を学ぶことのできる新たな地学教育手法の開発に取り組んでいる.本年度は,溶岩流と立木の接触によって生じる溶岩樹型形成の再現実験に取り組んだ.前年度研究において作成した模擬火山(砂山)斜面に複数本の小枝・爪楊枝・木材等を立て,溶岩流と接触させた.いずれも根元が消失し,特に小枝・木材を立てた部分において溶岩樹型同様の跡が形成されることがわかった.さらに,砂山斜面の先端部分に小型の水槽を設置することにより,溶岩流の水冷破砕を観察可能にした.上記の開発実験の内容を取り入れた授業・講演を,福井市宝永小学校理科授業(6年生対象),恐竜渓谷ふくい勝山ジオパーク,洞爺湖有珠山ジオパークの教育イベント(小・中学生親子対象),日本火山学会の公開講座(小学生親子対象,秋田大学)において実施した.福井市宝永小学校理科授業,各ジオパークイベント,日本火山学会公開講座では,火山活動による地域の地質発達史を含めた内容を考案し,以下の火山岩,火山地形およびジオサイトを題材とした実験・講演を行った.福井市宝永小学校:坂井市三国海岸の水冷破砕溶岩(中新世);恐竜渓谷ふくい勝山ジオパーク:勝山市の法恩寺山火山溶岩(約70万年前)および溶岩地形(県内最大のスキー場として活用);洞爺湖有珠山ジオパーク:豊浦町海岸の水冷破砕溶岩(中期中新世);日本火山学会公開講座:寒風山(約2万年前)の溶岩地形.参加者からは概ね良い反応が得られた.当初予定通り,七輪マグマ実験装置を用いた溶岩樹型形成の再現実験を開発した.さらに,溶岩の水冷破砕を再現することができた.これら新たに開発した実験内容について,福井県内およびユネスコ世界ジオパークである洞爺湖有珠山ジオパークのイベントにて実践し,参加者から概ね良い反応を得ることができた.また,次年度以降に計画していた研究成果の国際学会発表を本年度に行うことができた.一方,前年度からの課題である卓上型電気炉を用いた室内実験に遅れが生じている.これについては次年度実施予定である.以上を統合し,現時点では「おおむね順調に進展している」と評価する.本年度までに開発した実験内容を踏まえ,今後は過去に世界で発生した火山災害や溶岩流対策事例のミニチュア再現実験に取り組む.その際,複数枚の溶岩を連続して流す必要が生じる可能性を考え,複数台の装置を同時或いは僅かな時間差で作動可能になるよう実験装置の改良を行う.また,融剤の種類および混合比率を変化させて実験を行い,生成するマグマの粘性の制御を試みる.この実験に際し,卓上型電気炉を準備する.上記の実験内容を含めた授業等を,主にユネスコ世界ジオパークの地域の小・中学校等において実施する.本研究では,火山・火山岩が分布するジオパークの教育活動にマグマ生成実験教材(七輪2個を上下に組み合わせた加熱実験装置)を導入することで,学習者がマグマの熱を実感し,火山活動と地域地質発達史の関係を学ぶことのできる新たな地学教育手法の開発に取り組んでいる.初年度である本年は,複数枚の溶岩流の重なりによって生じる溶岩の流路変更の再現実験に取り組んだ.従来は,ステンレス製板等で斜面を作り,そこへ生成した溶岩を流していたが,学習者がより火山をイメージしやすくなるように,土で模擬火山(30×100 cm程度)を作成し,山頂の凹み部分(模擬火口)から斜面に向かって溶岩を流すようにした.砂山斜面に作った溝に沿って溶岩が流れるため,溶岩が低地を流れるということを観察しやすくなった.さらに,複数回溶岩を流すことで,溶岩流の流路変更を再現することができた.上記開発内容を取り入れたマグマ生成実験を,福井大学教育学部附属義務教育学校理科授業(中学1年生対象),恐竜渓谷ふくい勝山ジオパーク,島原半島ジオパークの教育イベント(小・中学生親子対象),日本火山学会の公開講座(小学生親子対象,熊本大学)において実施した.附属義務教育学校理科授業,各ジオパークイベント,日本火山学会公開講座では,火山活動による地域の地質発達史を含めた内容を考案し,以下の火山岩,火山地形およびジオサイトを題材とした実験・講演を行った.附属義務教育学校:坂井市三国海岸の中新世溶岩;恐竜渓谷ふくい勝山ジオパーク:勝山市の法恩寺山火山溶岩(約70万年前)および溶岩地形(県内最大のスキー場として活用);島原半島ジオパーク:島原半島形成初期に流出した早崎玄武岩溶岩(約430万年前);日本火山学会公開講座:阿蘇火山西部の高遊原溶岩(約9万年前)および溶岩地形(空港滑走路として活用).参加者からは概ね良い反応が得られた.当初は福井県内のみでマグマ生成実験を用いた教育活動を行う予定であったが,島原半島ジオパークや熊本県など,次年度以降の県外活火山分布地域における実践計画を部分的に先取りして実施することができた.その一方で,当初予定していた卓上型電気炉を用いた室内実験およびサーモグラフィカメラを導入した授業の開発に遅れが生じている.これらについては次年度実施予定である.以上を統合し,現時点では「おおむね順調に進展している」と評価する.火山・火山岩が分布するジオパークの教育活動にマグマ生成実験教材(七輪2個を上下に組み合わせた加熱実験装置)を導入することで,学習者がマグマの熱を実感し,火山活動と地域地質発達史の関係を学ぶことのできる新たな地学教育手法の開発に取り組んでいる.

本年度は,溶岩流と立木の接触によって生じる溶岩樹型形成の再現実験に取り組んだ.前年度研究において作成した模擬火山(砂山)斜面に複数本の小枝・爪楊枝・木材等を立て,溶岩流と接触させた.いずれも根元が消失し,特に小枝・木材を立てた部分において溶岩樹型同様の跡が形成されることがわかった.さらに,砂山斜面の先端部分に小型の水槽を設置することにより,溶岩流の水冷破砕を観察可能にした.上記の開発実験の内容を取り入れた授業・講演を,福井市宝永小学校理科授業(6年生対象),恐竜渓谷ふくい勝山ジオパーク,洞爺湖有珠山ジオパークの教育イベント(小・中学生親子対象),日本火山学会の公開講座(小学生親子対象,秋田大学)において実施した.福井市宝永小学校理科授業,各ジオパークイベント,日本火山学会公開講座では,火山活動による地域の地質発達史を含めた内容を考案し,以下の火山岩,火山地形およびジオサイトを題材とした実験・講演を行った.福井市宝永小学校:坂井市三国海岸の水冷破砕溶岩(中新世);恐竜渓谷ふくい勝山ジオパーク:勝山市の法恩寺山火山溶岩(約70万年前)および溶岩地形(県内最大のスキー場として活用);洞爺湖有珠山ジオパーク:豊浦町海岸の水冷破砕溶岩(中期中新世);日本火山学会公開講座:寒風山(約2万年前)の溶岩地形.参加者からは概ね良い反応が得られた.当初予定通り,七輪マグマ実験装置を用いた溶岩樹型形成の再現実験を開発した.さらに,溶岩の水冷破砕を再現することができた.これら新たに開発した実験内容について,福井県内およびユネスコ世界ジオパークである洞爺湖有珠山ジオパークのイベントにて実践し,参加者から概ね良い反応を得ることができた.また,次年度以降に計画していた研究成果の国際学会発表を本年度に行うことができた.一方,前年度からの課題である卓上型電気炉を用いた室内実験に遅れが生じている.これについては次年度実施予定である.以上を統合し,現時点では「おおむね順調に進展している」と評価する.福井県内における授業実践を引き続き行い,福井県嶺北におけるマグマ生成実験を用いた地域地質史再現の授業内容の確立を目指す.授業実践に際し,卓上型電気炉およびサーモグラフィカメラを準備する.また,福井県外のジオパークの地質情報を収集し,マグマ生成実験を用いて各ジオパークの地質発達史を再現する授業を考案する.さらに,次年度は新たに溶岩流と立木の接触によって生じる溶岩樹型形成の再現実験に取り組む.本年度までに開発した実験内容を踏まえ,今後は過去に世界で発生した火山災害や溶岩流対策事例のミニチュア再現実験に取り組む.
難治性癌に対する重粒子線治療の転移抑制作用の解明

重粒子線照射により免疫監視細胞であるTLR(Toll like receptor)を有するマクロファージ、樹状細胞、マスト細胞が癌細胞を認識されやすなり、それらの細胞から分泌されるサイトカインであるTNFαあるいはIL-12の産生を増加させることでNK細胞が活性化され、さらにNK細胞から分泌されるIFN-γの産生を増加し、さまざまな細胞性免疫機構が活性化され転移巣に対する抗腫瘍作用がおこることが示された。C3Hマウスにマウス扁平上皮癌細胞であるSCCVIIを下腿に移植し直径8mmに達した時点で、重粒子線を照射し、さらに1週間後に尾静脈よりSCCVIIを2.5×10^5個注入し、その9日後に肺転移の個数を測定した。重粒子線照射により、尾静脈より注入した肺転移が抑制された。この肺転移抑制作用は下腿部腫瘍に対する線量が高くなるほどおよび下腿部腫瘍の大きさが小さいほど転移が大きく抑制された。しかし、最も肺転移抑制作用に影響したのは重粒子線のLinea Energy Transfer(LET)であった。非照射群で平均56(±15)個の転移数、重粒子線照射(+)群ではLET14KeV/μm(30Gy)で6.5(±31)個、LET77KeV/μm(30Gy)では1.3(±1.5)個であった(γ線30Gy照射群では18(±8.7であった)。すなわちLETが高くなると下腿部腫瘍の抗腫瘍効果以上に相乗的に肺転移抑制効果が認められた。これらのことから重粒子線は特有な肺転移抑制作用を有することが示された。また、この肺転移抑制効果はヌードマウスにおいても同様に認められた。これよりT細胞を介さない免疫系の効果が示唆された。さらに、重粒子線照射したマウス血清をin vitroにてSCCVIIの培養液中に添加すると腫瘍細胞増殖を抑制する作用が認められた。これより血清中に抗腫瘍作用を有する物質の存在が示唆された。本研究は、難治性癌に対する重粒子線治療よる転移抑制作用機序を明らかにし新しい治療法の開発の基礎作りを行うことが目的である。C3Hマウス扁平上皮癌SCCVIIにおいては、重粒子線照射により肺転移能が抑制される。培養したSCCVII細胞に直接in vitroで重粒子線照射した場合、転移能の指標となる遊走能および浸潤能は4Gyでそれぞれ10%および15%の抑制作用しか認められなかった。しかし、マウス下腿に移植したSCCVII細胞に重粒子線照射し48時間後に摘出した細胞では遊走能および浸潤能はそれぞれ30%,40%と著明に抑制が認められた。また、これらの抑制作用は重粒子線のLETが高くなるほど大きい傾向が認められた。以上の結果から、重粒子線により宿主の腫瘍免疫の活性化が促進されることで転移抑制作用が誘導されることが示唆された。そこで、腫瘍を移植し重粒子線照射したマウスの血液を採取しIL-2,4,6,12、INF-γ、TNF-αなどのサイトカインの濃度をELISAにて測定するとIL-2,12,INF-γの上昇が認められた。これらのことから細胞性免疫の活性化が示唆された。さらにヌードマウスを用い同様に転移抑制の実験を行ったが、C3Hと同様に転移抑制効果が認められた。これらのことから、重粒子線による転移抑制作用にはT細胞系ではなくNK細胞やNKT細胞系の活性化を介し転移抑制作用を示すことが示唆された。本年度は重粒子線による宿主腫瘍免疫反応としてNK細胞・NKT細胞等の役割を明らかにする。高転移能を有するマウス扁平上皮癌NR-S1においても同様に転移抑制作用が認められた。一方重粒子線照射した移植腫瘍と異なる腫瘍を尾静脈から静注した場合は、転移抑制作用が極めて小さかった。これらのことから重粒子線照射により腫瘍特異的な免疫が賦活化されていることが示唆された。細胞障害性試験を用いたCTL/NK細胞の標的細胞に対する作用の解析では、重粒子線照射後に脾細胞を用いたCTL/NK細胞の細胞障害能が上昇していた。以上の結果から、重粒子線により細胞免疫が活性化していることが示された。その要因としては重粒子線が樹状細胞等の抗原提示細胞に標的癌細胞を認識しやすい状態に変化させていることが示唆された。そこで、骨髄細胞から調節した樹状細胞を用いて、重粒子線照射後1x10^6個を3回マウス腫瘍内に投与すると二次移植の生着抑制効果の増強が認められ、重粒子線照射にて樹状細胞が癌細胞を高率よく認識していることが示された。

現在臨床で施行されている自己がん細胞感作樹状細胞ワクチン療法は、採取した癌細胞の溶解液を取り込ませ認識させる必要があるが、認識させるのに必要な癌細胞を採取するのは困難である。その代わりに重粒子線照射により生体内で癌細胞の認識を効率良く施行できる可能性が期待された。
アクチン関連蛋白質カルポニン等を分子標的とした癌の腹膜播種の検討

Calponin h1(CN)は通常平滑筋に強く発現するactin結合蛋白質で、細胞の増殖、運動、接着性を調節することが知られている。カルポニン欠失(CN^<-/->)マウスの血管と腹壁は野生型(CN^<+/+>)マウスに比べ脆弱であり、(CN^<-/->)マウスの腹膜にB16F10 melanomaをi.p接種したところ腹膜播種が顕著であることを報告した。13年度研究の目的は腹膜中皮細胞のCN低下による癌細胞浸潤の増強をin vitro実験において示すこと、またCN^<-/->マウスの中皮細胞にCN遺伝子を導入し、癌細胞が浸潤できるか否か調べ、腹膜播種の遺伝子治療の可能性を検討することであった。得られた成果1)CN発現がヒト悪性腫瘍部の血管で減少していること、CN^<-/->マウスの血管および腹膜が脆弱であること、CN^<-/->マウスにおいてB16-F10(F10)による血行性転移および腹膜播種が亢進していることを報告した(Cancer Res,2001)。2)CN^<+/+>及びCN^<-/->マウスの腸間膜から中皮細胞を培養しそこへF10を重層してその浸潤能を観察した。その結果、CN^<+/+>に比べCN^<-/->中皮細胞への癌細胞浸潤が亢進していた。またCN^<+/+>中皮細胞においてF10の浸潤に先立ってCN蛋白質の発現低下が抗CN抗体による免疫染色で観察された。以上から、CNは中皮細胞間の接着性を正に制御し、癌の浸潤を抑制することが示唆された。3)CN遺伝子を導入したadenovirus vector(CN-GFP Ad)を構築し、CN^<-/->マウス培養中皮細胞に感染させた。そこへF10を重層したところ、重層培養後6hr経過してもF10の中皮細胞層への浸潤が認められなかった。4)CN-GFP Adをi.p接種したところ、CN^<-/->マウスの腸管膜表面の中皮細胞への導入を確認し、腸管の癒着等副作用はみられないことが分った。
海洋窒素循環の新規窒素導入を担う窒素固定生物の分子生理生態学的手法による定量解析

日本周辺海域の窒素固定生物の分布や生理生態を明らかにするため、東北区水産研究所による親潮・混合域低次生態系モニタリング航海(2012年7月)、鹿児島大学による平成24年度第7次航海(2012年6月)および中央区水産研究所による黒潮域低次生産調査航海(2012年8月)により、親潮域、混合域、黒潮域の水温、栄養塩濃度などの物理化学データを取得するとともに、研究試料のサンプリングを行った。窒素固定生物の分布は、窒素固定酵素遺伝子(nifH)の検出と蛍光顕微鏡観察により調べた。黒潮上流(沖縄沖)と下流(御前崎沖)でのnifHの検出頻度を比較したところ、黒潮沖では大型窒素固定ラン藻TrichodesmiumやRichelia、単細胞窒素固定ラン藻など多種の窒素固定ラン藻が検出されたが、御前崎沖では単細胞窒素固定ラン藻の検出頻度が大幅に減少するなど、生物相の変化が見られた。蛍光顕微鏡観察ではTrichodesmiumは沖縄沖よりも御前崎沖で45倍多く検出されたが、Richeliaは約50%、単細胞窒素固定ラン藻は約10%まで減少した。この要因として、海洋環境の変化や被食、競争生物の出現・増加などが考えられた。一方、混合域や親潮では2011年度には窒素固定ラン藻の遺伝子が検出されたが、2012年度のサンプルからは検出されず、両年通じて検出されたのは窒素固定バクテリアに限られた。このことから、窒素固定バクテリアは親潮・混合域に生息しているが、窒素固定ラン藻は暖水塊などにより黒潮から一時的に移入する可能性が示唆された。また、窒素固定生物が現場で実際に窒素固定を行っているかどうかを検証するため、窒素固定酵素に対する抗体を用いた免疫学的手法やセルソーター付フローサイトメトリーによってソーティングした微量の対象生物の安定同位体比解析(^<15>N/^<14>N)を行う手法の検討を行った。日本周辺海域の窒素固定生物の遺伝子解析と蛍光顕微鏡観察により、海域による生物相の違いなど窒素固定生物の分布を明らかにした。また、現場で窒素固定生物が実際に窒素固定を行っているかを細胞レベルで解析するため、免疫学的手法や対象生物のソーティングならびに微量サンプルでの安定同位体比解析手法の導入を検討し、測定が可能な段階に到達した。混合域や親潮の窒素源濃度は黒潮の10100倍と高濃度で窒素固定が必須ではない環境であり、窒素固定バクテリアが実際に窒素固定を行っているかは今後検証の必要がある。現場で窒素固定酵素の合成を検出する免疫学的手法や対象生物をセルソーター付フローサイトメーターによってソーティングし、微量サンプルでの安定同位体比解析(^<15>N/^<14>N)を行う手法の検討を行った。これらの手法はいまだ確立途中であるが、安定同位体比解析法ではわずか数千数万細胞で測定が可能ということが明らかになり、実用化が期待される。日本近海の主要海流である親潮と黒潮における窒素固定生物量を明らかにし、窒素循環への寄与を推測するため、東北区水産研究所が実施した親潮・混合域低次生態系モニタリング(2010年7月13日7月26日)、中央区水産研究所が実施した黒潮域低次生産調査(2010年8月24日9月3日、10月26日11月5日)の調査航海に乗船し、水温、塩分、クロロフィル量や栄養塩濃度などの物理科学データを取得するとともに、研究試料のサンプリングをおこなった。窒素固定生物の分布は、窒素固定酵素遺伝子を特異的プライマーでPCR増幅することで検出した。窒素固定酵素遺伝子と思われるPCR増幅産物は、親潮・混合域および黒潮域のすべての海水サンプルから検出され、窒素固定生物が存在する可能性が示唆された。また、実験室に持ち帰った海水では、親潮から3サンプル、混合域から2サンプル、黒潮域から85サンプルの微細藻類が検出された。未だ完全な単離には至っていないが、黒潮域のサンプルのうち30株は単細胞性で、窒素欠乏培地でも生育したため、窒素固定をおこなう能力を持つことが期待される。これまでに日本周辺海域で分離培養された窒素固定生物は、糸状体性の窒素固定生物Trichodesmium属に限られ、単細胞性では報告が無い。本研究で単細胞性の窒素固定生物の分離が成功すれば、日本周辺海域の窒素固定循環における窒素固定生物の寄与を推測する上で重要な知見となる。日本周辺海域の窒素固定生物の生理生態を明らかにし、窒素循環への寄与を評価するため、今年度は、これまで不明であった日本周辺海域の窒素固定生物の分布について、構成種組成とラン藻についてはさらに蛍光顕微鏡での細胞数計数により現存量を明らかにした。黒潮域では、水温、塩分、クロロフィル量や栄養塩濃度などの海洋環境データを取得するとともに、分離培養用、DNA解析用、細胞観察用などの研究試料のサンプリングを行った。また、西海区水産研究所の協力により、東シナ海からも分離培養用、DNA解析用、細胞観察用などの研究試料を取得した。これらのサンプルと昨年度採集した親潮域のサンプルをあわせ、夏季の日本周辺海域の窒素固定生物の分布を窒素固定酵素遺伝子のPCRおよびシーケンス解析、蛍光顕微鏡観察により調べた。その結果、窒素固定バクテリアではα、β、γ、およびClusterIIIの4グループのプロテオバクテリアの窒素固定酵素遺伝子が親潮、黒潮、東シナ海のすべての海域の海水サンプルから検出されたことから、これらすべての海域に分布していると考えられた。

窒素固定ラン藻では、ヘテロシスト形成ラン藻と単細胞ラン藻の窒素固定酵素遺伝子が黒潮と東シナ海で多く検出された。ラン藻特有の自家蛍光を利用した蛍光顕微鏡観察でもヘテロシスト形成ラン藻と単細胞ラン藻は、東シナ海と黒潮で多く観察され、遺伝子解析の結果と一致した。しかし、ヘテロシストを形成しないTrichodesmium属は、蛍光顕微鏡観察では東シナ海と黒潮域でのみ観察され、親潮域では観察されなかった。同属の窒素固定酵素遺伝子が親潮海域においても検出されたことから、Trichodesmium属の一部は親潮域まで北上している可能性が示唆された。日本周辺海域の窒素固定生物の分布や生理生態を明らかにするため、東北区水産研究所による親潮・混合域低次生態系モニタリング航海(2012年7月)、鹿児島大学による平成24年度第7次航海(2012年6月)および中央区水産研究所による黒潮域低次生産調査航海(2012年8月)により、親潮域、混合域、黒潮域の水温、栄養塩濃度などの物理化学データを取得するとともに、研究試料のサンプリングを行った。窒素固定生物の分布は、窒素固定酵素遺伝子(nifH)の検出と蛍光顕微鏡観察により調べた。黒潮上流(沖縄沖)と下流(御前崎沖)でのnifHの検出頻度を比較したところ、黒潮沖では大型窒素固定ラン藻TrichodesmiumやRichelia、単細胞窒素固定ラン藻など多種の窒素固定ラン藻が検出されたが、御前崎沖では単細胞窒素固定ラン藻の検出頻度が大幅に減少するなど、生物相の変化が見られた。蛍光顕微鏡観察ではTrichodesmiumは沖縄沖よりも御前崎沖で45倍多く検出されたが、Richeliaは約50%、単細胞窒素固定ラン藻は約10%まで減少した。この要因として、海洋環境の変化や被食、競争生物の出現・増加などが考えられた。一方、混合域や親潮では2011年度には窒素固定ラン藻の遺伝子が検出されたが、2012年度のサンプルからは検出されず、両年通じて検出されたのは窒素固定バクテリアに限られた。このことから、窒素固定バクテリアは親潮・混合域に生息しているが、窒素固定ラン藻は暖水塊などにより黒潮から一時的に移入する可能性が示唆された。また、窒素固定生物が現場で実際に窒素固定を行っているかどうかを検証するため、窒素固定酵素に対する抗体を用いた免疫学的手法やセルソーター付フローサイトメトリーによってソーティングした微量の対象生物の安定同位体比解析(^<15>N/^<14>N)を行う手法の検討を行った。昨年の東日本大震災による長期停電のため、分離途中であった窒素固定生物の培養試料および遺伝子・タンパク質解析用のサンプルが損失したため培養株の生理実験及び窒素固定酵素タンパク質の発現解析については、再度サンプルを集める必要が生じた。しかし、調査航海への参加や海水サンプルの依頼採水などにより集めたサンプルの解析を進め、遺伝子解析は計画通り達成、培養株の分離およびタンパク質解析も順次進めている。日本周辺海域の窒素固定生物の遺伝子解析と蛍光顕微鏡観察により、海域による生物相の違いなど窒素固定生物の分布を明らかにした。また、現場で窒素固定生物が実際に窒素固定を行っているかを細胞レベルで解析するため、免疫学的手法や対象生物のソーティングならびに微量サンプルでの安定同位体比解析手法の導入を検討し、測定が可能な段階に到達した。
嫌気性微生物におけるプラズマローゲン生合成経路の解明

プラズマローゲン生産菌を簡便に探索すべく、プラズマローゲンをメタノール処理した際に生じるジメチルアセタール(DMA)を指標としたプラズマローゲン検出系の確立を行なった。菌体からの脂質抽出、および、メタノール処理の各ステップについて条件検討を行ない、菌体脂質中のプラズマローゲンを効率的にDMA化できる条件を明らかにした。さらに、GC-MS分析条件を最適化し、DMAを高感度で検出できる分析系を確立した。確立した分析系を用いて研究室保存菌(真菌類、担子菌、嫌気性細菌、乳酸菌)および自然界からの新規単離細菌の合計1055株を対象にスクリーニングを行ない、236株からDMAを検出した。特に高いDMA値を示した60株についてLC-MS分析に供した結果、Clostridium属、Megasphaera属、Bifidobacterium属をはじめとする嫌気性細菌25株において、エタノールアミン型プラズマローゲンが生産されていることを明らかにした。これらの株をLTQ Orbitrapに供し、生産されるエタノールアミン型プラズマローゲンの分子種について詳細な分析を行なった結果、sn-1位、sn-2位ともに、主に炭素数1620の飽和脂肪酸または一価不飽和脂肪酸から構成されていることを明らかにした。以上、スクリーニングによってプラズマローゲン生産菌を見い出し、生産されるプラズマローゲンの分子種について明らかにした。平成29年度は、1.プラズマローゲンを簡便かつ効率的に検出できるスクリーニング系の確立、2.確立したスクリーニング系を用いてのプラズマローゲン生産菌の探索、3.探索によって見い出されたプラズマローゲン生産菌における生産プラズマローゲンの分子種の解析、に取り組む予定であった。このうち、1.、2.については、ジメチルアセタールを指標とするプラズマローゲン簡易検出系を確立したこと、確立した分析系を用いて実際にプラズマローゲン生産菌を多数見い出したことから、当初想定した目標を完全に達成したと言える。3.についても、見い出されたプラズマローゲン生産菌の属レベルでの同定を行なうとともに、生産されるプラズマローゲンの分子種を分析し、細菌におけるプラズマローゲンの組成分布をある程度明らかにしている。プラズマローゲンの定量については未だ手法を確立しておらず、次年度以降の課題となっているものの、おおむね順調に研究が進展していると評価できる。当初の想定では、次年度以降は、プラズマローゲン生産菌におけるプラズマローゲン生産条件の精査、プラズマローゲン生産性変異株の取得と解析プラズマローゲン生合成に関与する酵素遺伝子の探索および機能解析などに取り組み、得られた知見をもとに、プラズマローゲン生合成に関連する酵素(遺伝子)の特定を試みる予定であった。現在までにおおむね予定通り進捗しているため、今後の推進方策についても変更点は無く、上記計画に沿って遂行してゆく予定である。ただし、現在出産を控えている為、平成30年度中は研究を中断する予定である。平成31年度より研究を再開予定であり、年次計画としては、当初予定よりもおよそ1年遅れでの研究遂行を予定している。

現在までにおおむね予定通り進捗しているため、今後の推進方策についても変更点は無く、上記計画に沿って遂行してゆく予定である。ただし、現在出産を控えている為、平成30年度中は研究を中断する予定である。平成31年度より研究を再開予定であり、年次計画としては、当初予定よりもおよそ1年遅れでの研究遂行を予定している。
金属元素特異的微視画像解析法によるGdキレート造影剤の脳内局所蓄積機序の解明

本研究では、臨床において造影MRI検査に広く利用されてきた直鎖キレート型ガドリニウム(Gd)造影剤(LGBCA)の複数回投与後に生じるGdの脳内残存および組織沈着について、実験動物モデルを対象に金属元素特異的微視画像解析を行った。実験動物モデルの作出には健常なラットを使用し、先行研究を考慮して設定した造影剤投与プロトコルにしたがってGd-DTPA-BMAの頻回投与を行った。Gdの脳内残存および組織沈着は、経時的に実験小動物用コンパクトMRI装置(1.5T)による脳撮像を行い、小脳歯状核の経時的な信号増強を全ての対象動物で確認した。経時的MRI撮像における対象動物の頭部固定を精度よく再現性するため、撮像用ヘッドポジショナーを考案し、本研究での経時的MRIに導入した。対象動物の脳組織は、電子線マイクロアナライザー(EPMA)による金属元素特異的微視画像解析を実現し、対象ラット脳におけるGdの局所脳組織沈着を実証した。小脳歯状核においてGdの沈着部位は、Caの局在に一致し、Pの分布とも隣接した。本研究の実施により、LGBCAの複数回投与に生じるGdの脳内残存および組織沈着について、沈着Gdの状態に迫る重要な情報が明らかとなった。本研究では、造影MRI検査に生じる“Gdの脳局所蓄積"に着目し、1腎機能の低下を認めるCyラットを用いた脳内Gd蓄積モデル動物の作出、2実験小動物用コンパクトMRIによるマクロスコピックな脳画像解析、3電子線マイクロアナリシス(EPMA)による特定金属元素微視解析を組み合わせた動物実験系の樹立、を目的に段階的に研究遂行を試みた。まず、Cyラットによる脳内Gd蓄積モデルの作出については、Gdキレート造影剤(GBCA)の投与量の検討と最適化に時間を要し、当該年度中に実現に至っていない。先行研究では健常ラットにヒトの一回通常投与量の25倍以上のGBCAを投与して当該モデルの作出を実現しており、腎機能の低下を呈するCyラットに対する投与量の低減が影響したと考える。さらに、先行研究では腎機能の良否に関わらず、GBCAの複数回被投与患者に脳内蓄積が認められたことも踏まえ、適当な投与量を継続して検討中である。MRIでの脳内Gdの検出と可視化に関しては、基礎検討としてGdイオンのBBB透過性をMRI画像にて検討した結果、健常なBBBを有するラットの片側内頚動脈にGd3+を投与した直後、同側中大脳動脈支配域に高信号領域を認め、GdイオンがラットのBBBを通過して脳内に移行する可能性が示された。一方、GBCAについては投与直後に明らかな後輪号領域を認めなかった。これらの結果から、Gd脳内蓄積の機序として、キレートから遊離したGdイオンがBBBを透過して脳内に移行する可能性が考えられる。しかし、近年、GBCAの脳内移行に関して脳脊髄液からの脳内移行が報告されていることから、引き続き詳細な検討が必要と考える。EPMAについては、MRIで検出可能な濃度のGdイオンやGBCAがEPMAでも十分計測できるかについて基礎検討を行った。本結果から、EPMAの感度は組織内Gdを計測しうると判断した。前述したCyラットの実験条件設定に関わる遅延に加え、関連動物生産施設の重要施設工事に伴う動物供給の停止等が重なり、当初の計画通りの進行が困難であった。さらに、計画申請時に想定が困難であった本務以外の公的業務(厚生労働省)の委嘱に伴うエフォートの変更が影響したと考えられる。本研究の目的は、1臨床で利用されてきた直鎖型キレートGd造影剤を生体ラットを対象に多数回静脈投与し、ヒトで報告されているGdの脳内残存蓄積を再現すること、2作出したGd脳内蓄積モデルの脳組織について電子線マイクロアナライザー(EPMA)を用いた金属元素特異的微視画像解析を実施し、Gdの検出とその局在を明らかにすること、である。昨年度、当初の計画に従い腎機能低下ラット(Cyラット)を対象にGd脳内蓄積モデルの作出について検討を重ねたが、その結果および動物供給体制の想定外の事情により、本年度は健常なWistar STラットを対象としたGd脳内蓄積モデルの作出に研究方法を改めた。ラットを対象としたGd脳内蓄積モデルの作出に関わる先行研究を参照に投与量、投与回数を決定し、2匹の健常ラットを対象に直鎖型キレートGd造影剤であるGD-DTPA-BMAを5週間にわたり20回投与した。その間、経時的に同ラット脳のMRIを施行し、経時的な信号強度変化を検討した。経時的に撮像したMRIデータにおいて、いずれのラットにおいても小脳歯状核および淡蒼球において、Gdの残存蓄積を示唆する信号増強を認めた。一方、本年度は電子線マイクロアナライザー(EPMA)による脳試料解析を実施するため、適切な灌流固定法と凍結薄切試料作製法を併用した脳組織カーボン貼付法を考案し、作製した試料をEPMAによる解析を試みた。得られたEPMAの計測データから、小脳歯状核および淡蒼球においてGdの微視的マッピングに成功し、その波長解析から確実にGdが脳組織中に存在することを明らかにした。他の先行研究においては、エネルギー分散型X線解析により組織中のGdが同定されているが、特性X線波長を指標としたより精度の高い解析が可能なEPMAにおいてGdの同定を実現した。対象動物について、腎機能低下ラット(Cyラット)から健常なWistar STラットに変更した。

実験動物施設の管理上の理由からCyラットの供給が困難となったことが主たる理由である。しかし、健常なWistar STラットを対象にGd脳内蓄積モデルの作出に成功したことから、Cyラットから実験対象の変更が本年度の進捗に大きな影響を及ぼすことはなかった。本研究では、臨床において造影MRI検査に広く利用されてきた直鎖キレート型ガドリニウム(Gd)造影剤(LGBCA)の複数回投与後に生じるGdの脳内残存および組織沈着について、実験動物モデルを対象に金属元素特異的微視画像解析を行った。実験動物モデルの作出には健常なラットを使用し、先行研究を考慮して設定した造影剤投与プロトコルにしたがってGd-DTPA-BMAの頻回投与を行った。Gdの脳内残存および組織沈着は、経時的に実験小動物用コンパクトMRI装置(1.5T)による脳撮像を行い、小脳歯状核の経時的な信号増強を全ての対象動物で確認した。経時的MRI撮像における対象動物の頭部固定を精度よく再現性するため、撮像用ヘッドポジショナーを考案し、本研究での経時的MRIに導入した。対象動物の脳組織は、電子線マイクロアナライザー(EPMA)による金属元素特異的微視画像解析を実現し、対象ラット脳におけるGdの局所脳組織沈着を実証した。小脳歯状核においてGdの沈着部位は、Caの局在に一致し、Pの分布とも隣接した。本研究の実施により、LGBCAの複数回投与に生じるGdの脳内残存および組織沈着について、沈着Gdの状態に迫る重要な情報が明らかとなった。Cyラットの供給が再開されるまでの間は、健常ラットを対象としてGd脳内蓄積モデルの作出を試み、研究の遅延を取り戻すように尽力する。MRIおよびEPMAを用いたマルチモーダルな解析法についても、引き続きブラッシュアップを行い、作出されたモデル動物の解析を確実に遂行して当初の計画において目標とした研究成果の創出を目指す。4匹の健常なWistar STラットを対象に、EPMA解析モデルと同じ投与プロトコルを用いて直鎖型キレートGd造影剤の多数回投与を実施し、MRIによる経時的信号変化について統計解析を加える。対象とする4匹のラット脳を摘出し、適切な組織固定処理等を実施した上で病理組織学的解析を実施する。これまでに得られたEPMAの計測結果を、経時的MRI解析および病理組織学的解析の結果と比較検討するとともに、Gdの淡蒼球および小脳歯状核における局在や化学的状態について考察する。最終年度として、これらの成果をまとめ、公表の準備を進める。次年度使用額が生じた理由については、当初計画において当該年度に作出予定であったCyラットによるGd脳内蓄積モデルが計画通りに作出されず、特にそれらモデル動物のEPMA計測費用として想定した費用、さらにそれに伴う成果の公表を想定した旅費等の支出が行われなかったことに起因する。当該研究支出計画(交付決定額)においては、直接経費区分"その他"を80万円とし、主にEPMA計測に関わる費用として想定をしていたが、実際の研究遂行においては同計測を実施する際に要する費用よりも、その試料作製およびモデル作出に関連する実験備品・消耗品等に要する支出が想定以上に増加し、それらについて経費区分を"その他"から"物品費"に変更した。一方、極めて特殊な当該研究におけるEPMA計測の課題解決には、費用支出を伴わない多くの前準備的計測・計測条件設定のための試行計測が必要となったことから、当該年度については同計測に関わる支出は発生せず、支出を必要とする計測(本計測)は次年度に実施されることとなった。
地史を考慮した割れ目分類に関する研究

地殻表層での岩盤の変形挙動、強度および水の流れは、岩盤内に多数存在する大小さまざまな割れ目、特に開口した割れ目の分布・挙動に大きく支配されている。岩盤内あるいは岩盤中に構造物を建設する場合にはこれらの割れ目の影響を適切に評価する必要がある。岩盤はほとんどの場合いくつかの応力覆歴を受けており、全体としてみるとランダムに分布しているように見える割れ目を有している。このまま割れ目群の影響を考慮しようとすると統計的な扱いしかできないが、地史を考慮することで一つの応力場を反映した割れ目系を分類抽出することが可能であると考えられる。さらに、岩盤の挙動を知るうえでもう一つ欲しい情報は割れ目間隔に関係するものである。割れ目間隔についてはcolumnar jointsやboudin structureなど、引張応力下で形成された割れ目について詳しく調べられており、それによれば岩石の物性と変形速度がわかれば理論的に割れ目間隔を決定することができる。そこで、本年度の研究では、タ-ビダイトから成る堆積岩分布地域と柱状節理を有する火山岩分布地域を調査地域として、割れ目に関する基礎データを蓄積するとともに、割れ目形成にかかわる性質について考察した。概要を示すと以下の通りである。1.タ-ビダイト中の泥岩に発達するEn echelon tension gashにおいて、最長のベインはほぼその中央に位置し、一連のベインから成る割れ目ゾーンの長さと幅の間には線形的な関係が存在する。2.タ-ビダイト中の砂岩に発達するジョイントは必ずしも層理に垂直ではなく、同時代に形成した地層においてほぼ一致した走向傾斜を有し、このジョイントが一つの応力場を反映して形成されたことを意味する。そのほか多くの知見が得られたが、今後これらの性状を力学的に解明していく必要がある。
脳虚血再灌流時における脳血管破錠のメカニズムの解明

平成11年度から13年度にわたって、ラット中大脳動脈閉塞モデルを用い脳虚血再灌流時における、大脳白質病変と転写因子cyclic AMP response element bindingProtein (CREB)のリン酸化(活性化)の関係を、オリゴデンドロサイトの特異的マーカーを用い、TUNEL染色やBcl-2蛋白発現と共に、免疫組織学的に調べた。すなわち、白質が皮質よりも大きな容積をしめるヒト脳では大脳白質が脳梗塞において主な病変部位であることが大変多く、今後の血栓溶解療法や血流再開療法の施行に伴い、白質保護が益々重要な課題になってきているからである。CREBは種々の神経栄養因子の作用発現やBcl-2蛋白などの抗アポトーシス因子発現に関与し、神経細胞の発生、分化や再生、シナプス可塑性の維持など細胞保護的に機能することが注目されている。また、CREBはthioredoxin発現を調節することで酸化ストレス抑制にも重要な役割を果たしていることが明らかとなっている。実験の結果、代表的な大脳白質部位である脳梁の虚血周辺部では、再灌流24-48時間の時点で、オリゴデンドロサイト細胞核におけるCREBリン酸化の亢進の持続とともに、同細胞の細胞質でBcl-2発現は明らかに増大しかつTUNEL染色は陰性であり、Cresyl violet染色上、細胞の形態は正常に保たれていた。また、髄鞘染色上、髄鞘の密度や構造は正常に保たれていた。また、同部位のCREBリン酸化の明らかなオリゴデンドロサイトはニトロチロシン染色陰性であり、一酸化窒素やペロキシナイトライトを介した酸化ストレスを免れていた。一方、虚血中心部の脳梁では再潅流24-48時間の時点で、リン酸化CREBは全く検出されず、かつBcl-2も陰性化し、TUNEL染色は強陽性、ニトロチロシン染色陽性であり、オリゴデンドロサイトの傷害は明らかであった。また、髄鞘は明らかに非薄化していた。以上より、脳虚血再灌流時において、CREBリン酸化の持続が大脳白質のオリゴデンドロサイトや髄鞘に保護的に作用していることが明らかとなった。また、電位依存性Na^+/Ca^<2+>チャンネル阻害薬(NS-7)によって、本虚血モデルにおけるこれら細胞内情報伝達系障害が抑制され、梗塞巣が縮小化することが明らかとなり、今後の新しい治療への展望が開けてきた。本年度は、脳虚血再潅流時、組織保護的に作用する内因性組織反応の実態を明らかにする目的で、種々の神経栄養因子の作用発現やBCL-2蛋白などの抗アポトーシス因子発現に関与する転写因子cyclic AMP response element binding protein(CREB)のリン酸化(活性化)を免疫組織学的検討を中心に調べた。その結果、CREBリン酸化は再潅流早期に虚血中心部および虚血周辺部の神経細胞で明らかに亢進していた。しかし、虚血中心部ではその後、急速にCREBリン酸化は減退し、それに少し遅れて組織学的に細胞傷害が明らかとなり、壊死に陥った。

一方、虚血周辺部では、CREBリン酸化の亢進は持続し、組織学的にも神経細胞は正常に保たれていた。これらのことより、脳虚血再潅流時、CREBリン酸化の持続が神経細胞の運命を決定する重要な鍵を握っていることが示された。今後、CREBリン酸化の下流のシグナルを解明する必要がある。一方、組織保護的に作用するサイトカインの一つであるinterleukin-6は、CREBリン酸化より若干遅れて、虚血中心部、周辺部でその発現が明らかとなり、神経細胞のみならず、ミクログリアにもその存在が確認された。Interleukin-6の発現調節はCREBリン酸化以外にもいくつかの因子の関与が示唆されており、今後の検討が必要である。本年度は、ラット中大脳動脈閉塞モデルを用い脳虚血再潅流時における、転写因子cyclic AMP response element binding protein(CREB)のリン酸化(活性化)を、TUNEL染色やBcl-2蛋白、BDNF蛋白発現と共に、免疫組織学的に調べた。CREBは種々の神経栄養因子の作用発現やBcl-2蛋白などの抗アポトーシス因子発現に関与し、神経細胞の発生、分化や再生、シナプス可塑性の維持など細胞保護的に機能することが注目されている。実験の結果、虚血周辺部では、再潅流24-48時間の時点で、神経細胞核におけるCREBリン酸化の亢進の持続とともに、同細胞の細胞質でBcl-2やBDNF発現は増大しかつTUNEL染色は陰性であり、Cresyl violet染色上、細胞の形態は正常に保たれていた。一方、虚血中心部では再潅流24-48時間の時点で、リン酸化CREBは全く検出されず、かつBcl-2も陰性化し、TUNEL染色は強陽性であり、細胞傷害は明らかであった。脳虚血再潅流時において、CREBリン酸化の持続が、下流のシグナルとしてBcl-2やBDNF産生を賦活化し、細胞保護的に作用している可能性が高いことが明らかとなった。また、CREBリン酸化のシグナル伝達の上流として、虚血再潅流の早期には脱分極に伴う細胞内へのCa^<2+>流入が大きく関与していること、後期にはサイクリックAMP依存性蛋白リン酸化酵素やMAPキナーゼ系の関与がより重要であることが示唆された。なお、これらの所見は大脳皮質に限らず線条体や海馬でも同様に認められた。本年度は、ラット中大脳動脈閉塞モデルを用い脳虚血再潅流時における、大脳白質病変と転写因子cyclic AMPresponse element binding protein(CREB)のリン酸化(活性化)の関係を、オリゴデンドロサイトの特異的マーカーを用い、TUNEL染色やBcl-2蛋白発現と共に、免疫組織学的に調べた。すなわち、白質が皮質よりも大きな容積をしめるヒト脳では大脳白質が脳梗塞において主な病変部位であることが大変多く、今後の血栓溶解療法や血流再開療法の施行に伴い、白質保護が益々重要な課題になってきているからである。また、CREBはthioredoxin発現を調節することで酸化ストレス抑制にも重要な役割を果たしていることが明らかとなっている。