hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
次世代エネルギー対応型家庭用プレート式デシカント外気処理システムの開発

本研究では,衛生・健康かつ空調エネルギー負荷の小さい快適な室内空間の形成を目的として,次世代エネルギー対応型家庭用プレート式デシカント外気処理システムを開発する。今年度では1住宅の電力需要・温水需要および家庭用燃料電池の電力出力・温水出力を調査・基礎データベースを構築した。2家庭用プレート式デシカント外気処理システムの簡易モデル作成した。
スタフィロキナーゼの血栓溶解活性発現機作の分子生物学的解析

心筋梗塞や、脳血栓の治療薬として、種々の血栓溶解剤が模索されている。黄色ブドウ球菌の産生するスタフイロキナーゼ(SAK)はその一つである。SAKそれ自身はプラスミノゲン(PG)活性化(PA)活性を持たない。また、PGが活性化されたプラスミン(PG)もPA活性を持たない。しかし、両者が結合するとPA活性を持つようになる。しかもこのPAは血栓特異性を有する。この活性化機構の分子機作の解析が本研究の目的であった。当該年度にかなり解析は進行し、その一部を投稿した(BBA in press),更に現在Major Journalに数編を投稿準備中である。以下順にその概略を述べる。1.PMとSAK-PM複合体の基質特異性の違いを以下の方法で解析した。(a)PMに特異的な合成基質(HD-Val-Leu-Lys-pNA)を用いて化学反応論的に両者が極端に異なることを証明した(この基質に対するKmがPMに対し、SAK-PMは約10倍大きくなる)。(b)Glu-PGのN末端ペプチドの限定分解は、PMにより速やかに進行するがSAK-PMによっては認められないことを、分解産物のN末端アミノ酸の同定と、SDS電気泳動にて証明した。2.PGとSAK,PMとSAKの結合反応の分子機作を解析した。方法は、イプシロンアミノカプロン酸、アプロチニン、DEP,PAPMSF,などを利用し、PGのエラスターゼや、V8による分解産物、mutant recombinant SAK,放射性ヨードで標識したそれぞれの蛋白質を用いて施行した。結果、これまでの報告とは異なり、この反応が2段階反応であることや、両者の結合に関与する部位がかなりのレベルまで明らかになった。現在、更に他の方法で結果を確認するとともに解析を進め、幾つかのJouranalにまとめて報告する予定である。
固体金属から電子を引き抜く硫酸還元菌が引き起こす金属腐食のメカニズム解明

固体金属から電子を引き抜く微生物が引き起こす金属腐食(EMIC)が、配管など金属設備の深刻な腐食被害に大きく関与していることが示唆されている。しかし、EMICのメカニズムは未解明な部分が多く、対策立案のための情報が不足している。そこで、本研究では腐食速度・形態の異なるEMICを引き起こす硫酸還元菌3種を対象として、それらの腐食過程を電気化学、材料科学、分子生物学分野の解析手法を活用した統合的なアプローチにより比較解析を行う。それにより、EMICの速度・形態を決定づけている因子を明確にし、EMICのメカニズムに関する知見を得る。
先進内視鏡手術における執刀医のニーズに応えた「内視鏡知覚センシング技術」の開発

一層の低侵襲化と高度化が求められている内視鏡医療の発展に向けて,本研究では内視鏡下の手術において執刀医が求める様々な知覚情報を治療器具上に集積したセンサで取得・表示する「内視鏡知覚センシング技術」を開発し,医師が患者体内の状況や触診で得る情報を内視鏡下で取得しながら安全に手術を行なう「触診内視鏡手術」の実現に向けた異分野融合型研究を推進している。平成30年度は,軟性内視鏡へ実装したセンサデバイスの実用化を目指した開発研究を進めると共に,取得可能な圧力値の下限や体内環境における耐環境性の評価を中心に研究を行った。その結果,実応用で必要とされる性能を実現できたとともに,胃酸等が存在する過酷な環境下においても安定的な動作が可能なセンサデバイスを実現することができた。一方,腹腔鏡手術に向けたセンサデバイスについても,本年度は大幅な進展が得られた。腹腔鏡手術器具ではセンサを実装可能な空間が非常に限られてくることから,パッケージを含めてMEMS技術を最大に活用することが求められる。また,3次元プリンター技術の急速な発展により,MEMS技術と組み合わせた高精度のセンサデバイスを試作することができた。この第1版の試作チップは高密度なセンサデバイスの集合として形成されており,その検出感度や入力レンジについて,ほぼ設計と同じ性能を発揮することが確認された。腹腔鏡による「実証実験」の前段階となる「評価実験」においては,十分安定的かつ高感度の動作が確認されている。実証実験は次年度に実施される予定であるが,高い性能と安定性が期待されると共に,執刀医の意見を取り入れて実用化を目指した研究へと展開してゆく。本課題において4年間で開発するセンシング技術は,軟性内視鏡に実装するデバイスと,腹腔鏡手術用器具に実装するデバイスの2種類である。それぞれの応用においてセンシングに必要な仕様を決定し,執刀医からの適切なフィードバックを得られるように密な連携関係を構築して研究を進める計画である。開始2年めとなる平成30年度において,軟性内視鏡,腹腔鏡ともにそれぞれ新しいセンサデバイスが完成し,評価が開始された。その結果は十分実用に用いられる可能性を示すものであり,第一次の試作としては十分な成果であるといえる。本年度は特に,まだ試作チップが実現できていなかった腹腔鏡用センサの実現を重点的に実施し,良好な性能と安定性を示すデバイスが実現されている。また,昨年度までに実現された軟性内視鏡用センサについては既に複数回の試作でデバイスが実現しており,安定化と堅牢性の向上について十分な進展が得られている。よって,執刀医のフィードバックを得ながら実用的センシング技術を構築する本計画は,現時点においておおむね順調に進展しているといえる。今後は,軟性内視鏡用センサについて,実証実験に向けた改良型センサの製作と実装手段の洗練化を進める。センサを軟性内視鏡先端に実装できる様に,精密かつ使い捨てが可能となる単純な構成で実現してゆく。開発評価のループを繰り返すことで,システム全体の大幅な性能と安定性向上を目指してゆく。一方,腹腔鏡用センサについては,今年度に基本的評価を実施したセンサデバイスを腹腔鏡鉗子の先端に実装する。様々な表面状態を有するサンプルで安定的に検知が可能なことを実証してゆく。そこで十分な性能を確認した後に,執刀医が用いるシステムへの組込を計画している。執刀時に必要とされる情報とそれを補助するためのデータを選出し,効果的に提示するソフトウェアも開発してゆく計画である。以上より,全体としてセンシング技術の開発と執刀医側の評価を繰り返すことで,実用に耐える高度な内視鏡知覚センシング技術の実現を目指してゆく。

それぞれの応用においてセンシングに必要な仕様を決定し,執刀医からの適切なフィードバックを得られるように密な連携関係を構築して研究を進める計画である。開始2年めとなる平成30年度において,軟性内視鏡,腹腔鏡ともにそれぞれ新しいセンサデバイスが完成し,評価が開始された。その結果は十分実用に用いられる可能性を示すものであり,第一次の試作としては十分な成果であるといえる。本年度は特に,まだ試作チップが実現できていなかった腹腔鏡用センサの実現を重点的に実施し,良好な性能と安定性を示すデバイスが実現されている。また,昨年度までに実現された軟性内視鏡用センサについては既に複数回の試作でデバイスが実現しており,安定化と堅牢性の向上について十分な進展が得られている。よって,執刀医のフィードバックを得ながら実用的センシング技術を構築する本計画は,現時点においておおむね順調に進展しているといえる。今後は,軟性内視鏡用センサについて,実証実験に向けた改良型センサの製作と実装手段の洗練化を進める。センサを軟性内視鏡先端に実装できる様に,精密かつ使い捨てが可能となる単純な構成で実現してゆく。開発評価のループを繰り返すことで,システム全体の大幅な性能と安定性向上を目指してゆく。一方,腹腔鏡用センサについては,今年度に基本的評価を実施したセンサデバイスを腹腔鏡鉗子の先端に実装する。様々な表面状態を有するサンプルで安定的に検知が可能なことを実証してゆく。そこで十分な性能を確認した後に,執刀医が用いるシステムへの組込を計画している。執刀時に必要とされる情報とそれを補助するためのデータを選出し,効果的に提示するソフトウェアも開発してゆく計画である。以上より,全体としてセンシング技術の開発と執刀医側の評価を繰り返すことで,実用に耐える高度な内視鏡知覚センシング技術の実現を目指してゆく。
放射光とレーザーを用いたキラル分子の光電子放出と光解離の立体選択性の探索と制御

(1)レーザー実験:カイラル分子のフェムト秒レーザーによる解離性光イオン化実験を行うための実験装置(電子の計測は飛行時間型エネルギー分析器、イオンは三次元運動量イメージング法による運動量分析器)を製作した。1KHzフェムト秒レーザーを光源とし、パルスモーターをもちいて波長板を回転し右回り・左回り円偏光をデータ収集と同期して切り替えて、荷電粒子を三次元運動量イメージング法により計測する自動計測システムを構築した。メチルオキシラン分子線に400nmフェムト秒レーザーパルスを集光し、円偏光の高速切り替えを行い、多光子イオン化解離生成したイオンを計測した。全イオン収量の円偏光切り替えによる増減(円2色性)は実験誤差内(1%)であった。また光進行方向に対する角分布における前向き・後向きの非等方性も実験誤差内(5%)であった。(2)放射光実験:SPring-8の直線偏光軟X線ビームライン27SUにおいてメチルオキシラン分子の内殻光電子スペクトル、ノーマルオージェ電子スペクトル、共鳴オージェ電子スペクトルを記録し、理論的は解析を施した(J.Electr.Spectrosc.Relat.Phenom.に投稿中)。さらに、共鳴オージェ電子・イオン同時計測により、共鳴オージェ電子放出後の分子解離に関する情報を得た(投稿準備中)。(3)SPring-8の27SUにおいて、アルゴンダイマーの原子間クーロン電子緩和実験、緩和振動励起したN2O分子の軟X線角度分解イオン収量分光、N2分子の高分解能高エネルギー光電子分光に参加し、論文作成にも積極的に参加した。(1)キラル分子の典型的な例である気相メチルオキシラン分子を標的として、シンクロトロン放射光施設SPring-8で得られる高輝度高分解単色軟X線を励起光源として用いて、炭素・酸素原子のK殻からの内殻光電子放出、KVVオージェ電子放出、内殻電子を共鳴励起した後におきる共鳴オージェ電子放出を観測し、第一原理計算に基いてオージェ遷移終状態(イオン化状態)の帰属を行った。さらに、内殻光電子、オージェ電子、共鳴オージェ電子と解離生成したイオンとの同時計測を行い、おのおののオージェ終状態からの分子解離に関する知見を得た。これらの知見は、シンクロトロン放射光を用いた分子解離円二色性実験を遂行するにあたり不可欠なものである。これらの成果については、現在投稿準備中である。(2)レーザーパルス(1kHz)を真空中で分子線に照射し、解離生成イオンの質量分析と電子分光とを行うことのできる装置を作成した。アルコール分子やメチルオキシラン分子の分子線に400nm,100fsのレーサーパルスを集光し、解離生成するさまざまなイオンの強度や電子スペクトル強度のレーザーパワー依存性を測定した。レーザーパワー密度が10^<12>W/cm^2のオーダーでは多光子イオン化が支配的であるが、レーザーパワー密度が増えるに従い、電場イオン化に移行する様子を観測することができた。現在、これらのデータの理論的な解析を進めている。(3)400nm,100fsのパルス(1kHz)の右回り・左回り円偏光を一定時間で自動的に切り替えて解離イオンを計数し、分子解離の円二色性を測定するための装置の改良を行った。
生態学的現象学の技術哲学的展開-生態学的に優れた人工環境の構築に向けて

わたしたちの生活はつねに多様な人工環境によって支えられている。この「人工環境・内・存在」のあり方を生態学的現象学、技術哲学、生態学的心理学、さらには、認知科学や建築学などの知見を利用して解明すること、これが第一に取り組んだことである。第二に、この知見に基づいて、バリアフリーデザイン、ユニバーサルデザイン、そして、人間中心設計などの設計観の意義を明らかにし、具体的な人工物の製作過程への応用可能性を検討した。本年度は、計画通り、7月、12月、3月に研究会を実施し、それぞれの会で4つのグループの間で研究テーマの共通理解を深めながら、今後の研究計画を具体的につめるための発表が行われた。第1回には、代表者をはじめ、第1グループから生態学的現象学の観点と技術哲学を結びつける視点の可能性に関する発表と、第4グループの三嶋博之氏から15thICPAの国際会議での発表に基づく報告がなされた。第2回には、第3グループの研究として乳児のつかまり立ちの発達を例にして、運動能力と環境の関係を解明する発表(山崎寛恵)とデザインを中心とした建築論と照明論の発表(関博紀、吉澤望)が行われた。第3回には、第2グループから音知覚に関する生態学的アプローチの可能性に関する発表(丸山慎)とスキーのジャンプを例にした運動エキスパートの知覚と運動の関係に関する発表(工藤和俊)が行われた。こうした固有の研究会のほかに、E・ホーレンシュタインによる講演会「地図の哲学と哲学の地図」、A・シュタインボックの講演会「信頼」、また、ワークショップ「技術哲学と日本哲学」(総合文化研究科のCOE、UTCPと共催)、T・インゴールドによる人類学的観点からの生態学と技術哲学の議論に関する研究会、などを行った。こうした多様な研究会を通して、ひとつの重要な観点として、人工環境(住居環境、照明環境、スポーツの道具に関するルール)の製作や変更の過程とその中で形成される運動の形の形成(乳児の運動能力からスポーツのエキスパートまでさまざまな形)、知覚の形の形成(音知覚のあり方、住居環境の陰影の意味)の間のダイナミックな関係へと光を当てる観点が取り出された。この観点をさらに深め、それを技術哲学の観点と統合させることが課題として浮き彫りとなった。本年度は、哲学的・理論的観点と経験科学的観点を結合させることによって、生態学的現象学の内実を具体化することを主な目標として研究会を行った。7月の研究会では、生態学的観点からの経験概念とその技術哲学的意義の分析(染谷昌義)、および、空間把握に関しての影の役割の分析(柴田崇)の発表が行われた。12月の研究会では、埼玉大学の加地大介教授を招いて、環境の構成要素として重要な『穴』の存在論的意義についての発表を頂き、それをもとにしての乳児の食器の使い方に見られる行動発達の分析の発表がなされた(青木洋子)。3月12日には総合的シンポジウム「身体運動、ユニバーサルデザイン、アフォーダンス」を予定していたが、地震の影響で延期となった。そのほか、1月19日にはフランスの心理学者Blandine Bril氏の講演会A functional perspective on tooluse : the case of stone knappingを開催した。ここでは石器の製作の分析に生態学的観点がどこまで有意義かが議論された。また、3月7日、9日、11日にはイギリスの哲学者Andy Clark氏を招いて、連続講演会・研究会を開催した。ここでは、「拡張された心」という生態学的観点と類似の観点を提起している著名な哲学者Clark氏の見解をめぐって、有意義な議論が展開された。以上のような成果をもとにして、来年度からは、生態学的現象学の観点をユニバーサルデザインのような実践的な技術観とっき合わせる作業へと進むことを予定している。本年度には、先の2年間でおもになされてきた理論的面からの研究を踏まえて、実践面への応用可能性の検討を中心に据えた研究がおこなわれた。7月の研究会では、研究協力者の川内美彦氏(東洋大学)によるユニバーサルデザインの現状とその問題点に関する発表、ならびに安藤昌也氏(千葉工業大学)による人間中心主義設計の意義と射程に関する発表がなされた。12月11日には、関連して行われている科研のプロジェクト「生態学的なコミュニケーションと社会的アフォーダンスに関する実証哲学的研究」との共同シンポジウムを開催した。このシンポジウムでは、ユニバーサルデザインとアフォーダンスをめぐる議論を、実際の椅子等の製作や看護の現場で活躍されている方々の発表を踏まえて行った。また、12月26日には、田坂さつき氏(立正大学)、水谷光氏(湘南工科大学)、生田目明彦氏(「朋」施設長)らにより障害者施設を場にして行われている障害者のための物作りと大学教育との連携のあり方が報告された。また、直江清隆氏(東北大学)による設計の哲学に関する発表では、設計と技術と社会との関係をめぐって原理的な検討がなされた。

これらの試みによって、生態学的観点を踏まえながら人工物を設計・製作する場合に考慮しなければならない課題、とりわけ設計者・製作者中心の従来の見方へのさまざまな問題点が指摘された。しかし同時に、使用者の視点を重視しながら人工物の特性を生かす方法に関連する困難も指摘された。年度末最後の3月18日には、生態学的現象学の観点を特に音と聴覚の世界に焦点をあわせて検討する機会を持った。伊藤精英氏(はこだて未来大学)による聴覚世界の豊かさに関する発表と池上高志氏(東京大学)による音を使った新たな作品の可能性に関する発表がなされた。これらを通して音に固有な空間性の特質や、それらの存在論的な身分への原理的な議論がなされた。本年度は、本研究の最終年度であり、これまでの研究成果を総合し、それを具体的な仕方で公刊する準備を行うことを中心に据えて研究活動を行った。本研究の最初の2年間には、おもに理論的面で生態学的観点と技術哲学の統合を試み、3年目には、人間中心主義デザインやユニバーサルデザインなど具体的な設計のあり方を取り上げて検討してきた。そうした過程で、2011年3月11日に起きた東日本大震災と福島の原子力発電所の事故という事態をどのように扱うか、あるいは、そもそも扱えるのか、という点も議論となった。そうした議論を通して、人間環境を構築する技術は同時に(自然)環境からの影響を大きく受けるあり方をしていることに光が当てられ、自然環境と人工環境を簡単には分けられないことを確認することになった。そして、技術と環境の関係を密接不可分な関係とみなす生態学的観点の重要性があらためて確認された。こうした研究の成果をもとに、分担者を含め、その他の協力者それぞれの研究を論文にまとめ、出版の形態をとることが目指された。具体的には、2012年の9月から10月にかけて、5回の集中研究会を行い、総計、33本の論文を対象とする検討会を行った。こうした検討会を経て、3巻のシリーズとして2013年の6月から出版することが決まった。シリーズの題名は「知の生態学的転回」であり、それぞれの巻は身体、技術、倫理をテーマとする。なお、この出版は、本年度から始まった基盤研究(A)「知のエコロジカルターン」との共同作業によって可能となったものである。本研究は4年計画のもので、最初の2年はおもに、生態学的現象学と技術哲学の連関を原理的・理論的な面から検討することに重点を置いて研究が計画され、実際、昨年までの2年間でこの課題に対して、さまざまな具体的な研究を踏まえた取り組みがなされた。そして、2011年度には、それまでの成果を踏まえて、ユニバーサルデザインを含む様々な実践的取り組みの現状と問題点を探ることが行われる計画であった。実際、上に記したようにこの課題に取り組むことが多様になされ、その点で、おおむね順調に研究が進展しているといえる。24年度が最終年度であるため、記入しない。2012年度は本研究最後の年であり、これまでの多様な研究をまとめることが課題となる。すでにそのために夏に集中的な研究会を連続して行い、成果を著作にまとめる試みがなされる準備が進んでいる。
脳の活動電位の軸索伝導は制御を受けている-軸索分枝による新しい神経情報処理機構-

実験はモルモット海馬の500μm厚のスライス標本を作成して行った。有髄神経標本としてCA1領域の放線層を走る線維群を、無髄神経標本としてCA3の苔状神経線維群を用いた。それぞれの軸索の線維群に刺激電極を置き、軸索を伝導する活動電位を含む複合反応電位を記録し、その波形のうちから軸索成分を薬理学的な方法で分離した。この電位に対する(1)GABA(1.0mM)、(2)グルタミン酸(0.5mM)、(3)セロトニン(0.5mM)、(4)ドーパミンD1受容体作動薬(SKF38393,10μM)の効果を検討した。その結果以下のことが明らかになった。(1)軸索成分をCa^<2+>-freeあるいはCa^<2+>0.5mMの灌流液で伝達を遮断することにより分離した場合では、GABAでCA1およびCA3領域の軸索成分の振幅が510%程度減少した。他の薬物の投与による効果はなかった。(2)CNQX(10μM)およびAP5(50μM)でグルタメートの伝達を遮断した場合では、GABAでCA1領域の反応が抑制され、さらにCA3領域では、セロトニンあるいはドーパミンでも約5%減少した。しかし、スライスによっては有意の効果の見られないものもあった。以上の結果から、軸索に伝達物質が作用し活動電位の伝導が制御される可能性が十分あると結論した。その効果はGABAで最も顕著であり、セロトニンあるいはドーパミンでは細胞外Ca^<2+>が重要であること、および有髄と無髄の神経で差のある可能性が明らかになった。神経終末にはこれらの伝達物質の受容体があることが知られており、この部に作用した時に電位の減少がおこる可能性もあるが、グルタメートによる振幅の減少が少ないこと、薬物により差異がのあることは神経末端での可能性が少ないことを示唆している。以上の結果をより信頼のあるものにするために、さらに実験を進める必要があると考える。
ＤＮＡ損傷修復マーカーを用いた膠芽腫における抗癌剤作用機序と悪性化の解明

研究代表者はDNA傷害の際γH2AXが陽性になることを利用し実験を行ってきた.当該研究ではグリオーマ細胞株により抗癌剤への反応性が異なりアポトーシス誘導よりも細胞増殖停止や細胞老化への移行が顕著にみられることがわかった.またγH2AXを用いてDNA損傷応答をグリオーマ臨床検体で調べた結果,悪性度が増すに従いγH2AX検出細胞割合が低下した.よってグリオーマ悪性化にDNA損傷応答障害が関わる可能性が示唆された.グリオーマでは多形性の顕著な核ではDNA傷害が顕著でかつ増殖マーカー陽性細胞が多くみられ,核多形性にはDNA傷害が関わること,核の多形性は直接的な悪性度の指標ではないことがわかった.当該研究のユニークな点は,最も重大なDNA傷害であるDNA二本鎖断裂の際に,コアヒストンを構成する要素の一つであるヒストンH2AXの特異部位がリン酸化されることによって生じるγH2AXの特異抗体を用いてDNA二本鎖断裂を検出し,さまざまな細胞現象を比較検討することである.この方法を用いればprimaryなDNA二本鎖断裂のほかにアポトーシスも検出できる.また病理組織切片に応用することによって細胞のDNA傷害の程度やDNA損傷にたいする細胞応答を検出することが出来る.24年度は主に後者の研究,すなわちグリア系腫瘍におけるγH2AXの陽性細胞を調べた.グリア系腫瘍の多くは低悪性度のものから高悪性度のものへと経時的に変化していく.臨床の場では再発を繰り返す内により高度の悪性性格を獲得することがしられている.近年の癌研究は遺伝子変異に主眼を置いたものが主体であるが,当該研究ではDNA損傷およびその応答の側面から調べる点が特異である.今までに,グリア系腫瘍では,高悪性度のものよりも低悪性度のものの方がγH2AX陽性細胞の比率が高い.細胞増殖の盛んな高悪性度腫瘍の方が陽性率が高いと推測されるがその反対の結果である.このことからグリア系腫瘍に関してはDNA損傷応答異常が悪性化に関与している可能性もある.このような知見は過去に発表されておらず,現在は細胞増殖能とDNA傷害との関係を解析中である.さらに現在までの結果から,核異型の高度な細胞は一般にDNA傷害が高度であり,もはや腫瘍増大に繋がるような増殖能を失った細胞であることが分かった.よって今までの核異型に関する認識を変える必要がある.申請者らは,DNAが最も重篤な傷害である二本鎖断裂を生じた際,コアヒストン蛋白の一部の特定部位がリン酸化されてγH2AXができることを利用し,この特異抗体を用いてDNA二本鎖断裂を検出し,DNA傷害及びDNA傷害に対する細胞応答をみることで,悪性化や抗癌剤の作用機序を調べることを目的とする.こういった方法による検討は他の研究者では殆ど行われていない.本年度はアストロサイト系腫瘍を用い研究を行った.アストロサイト系腫瘍は悪性度によりgrade IからIVまで分けられる.これらのうち,grade II, III, IVのastrocytomaを対象に個々の症例においてγH2AXの陽性率を調べた.その結果,grade IIとgrade IIIに有意差をもってgrade IIIのほうがγH2AXの陽性率の低下がみられた.grade IIIとIVでは有意差はないがgrade IVの方が陽性率が低下する傾向がみられた.従来,大腸癌,肺癌,子宮癌では癌の進行とともにγH2AXの陽性率が上がることが報告されているがastrocytomaでは逆の結果となった.このことからastrocytomaにおいてはDNA傷害に対する修復機能の低下が悪性化に繋がっている可能性が示唆される.またastrocytomaではgradeの上昇とともに核の多形性が高度になるが,大型の多形核はMIB-1が陽性であってもγH2AXも強陽性であるものが多くみられ,このようなγH2AX強陽性細胞はもはや増殖能はないと考えられるため,MIB-1陽性細胞の評価には注意が必要であることを喚起できた点も実績である.研究代表者はDNA傷害の際γH2AXが陽性になることを利用し実験を行ってきた.当該研究ではグリオーマ細胞株により抗癌剤への反応性が異なりアポトーシス誘導よりも細胞増殖停止や細胞老化への移行が顕著にみられることがわかった.またγH2AXを用いてDNA損傷応答をグリオーマ臨床検体で調べた結果,悪性度が増すに従いγH2AX検出細胞割合が低下した.よってグリオーマ悪性化にDNA損傷応答障害が関わる可能性が示唆された.グリオーマでは多形性の顕著な核ではDNA傷害が顕著でかつ増殖マーカー陽性細胞が多くみられ,核多形性にはDNA傷害が関わること,核の多形性は直接的な悪性度の指標ではないことがわかった.脳腫瘍における抗癌剤の選択は数々の治験結果に基づいて行われていると言っても過言では無く,腫瘍ごとにいかなる機序で抗腫瘍効果を発現しているのかは不明の点が多い.申請者は抗癌剤による殺細胞効果に大きな役割を負っている抗癌剤によるDNA損傷とアポトーシスの誘導について,有用なDNA損傷マーカーであるγH2AXの特異抗体を用いて検討している.これにより,薬剤投与による一時的なDNA傷害とともに薬剤による二次的アポトーシスも同時に検出でき,しかもフローサイトメトリーを用いることで細胞周期のいかなる時期でかかる細胞傷害が生じているかが分かるため抗癌剤作用機序の解析に極めて有効な方法である.

現在までにグリオーマ培養細胞株においテモゾロミドを主体にDNA損傷とその後のアポトーシスについて調べた,その結果,現在グリオーマ治療に多く用いられているにもかかわらずテモゾロミドは細胞ごとに異なる効果を示した.一部の細胞はアポトーシスではなくsenescenceに陥ることが分かった.またこれらの効果はp53変異の有無とは無関係であった.また癌化や悪性化については癌遺伝子や癌抑制遺伝子発現からの研究が主流である.前述の申請者らのDNA傷害の検出は通常の病理組織切片にも応用できる.すなわちγH2AXを免疫組織化学的に検出することで個々の腫瘍細胞におけるDNA傷害の程度が検出できる.この方法により,様々なグリオーマの病理組織切片においてDNA傷害を検出したところ,グリオーマにおいては低悪性度のものよりも高悪性度のものの方がγH2AX陽性率が低かった.通常は細胞増生が活発なものほど細胞自身が産生する活性酸素の影響を受けDNA傷害が高度になると予測されるがその反対の結果が得られた.このことはDNA傷害に対する正常の細胞応答が機能していないことが悪性化に繋がっている可能性を示唆しており,今後の研究課題である.当該研究が採択された年年度から,申請者は現在の所属に移動となった.現在の所属は新設された講座であり,研究スペースや研究器材ともに不足している.また職員や大学院生の出入りも未だ少なく,マンパワーも不足している.しかしながら,科研費のお陰で培養関係の器材や試薬等を揃えることが出来た.当該研究を申請した後,申請者は現在の所属に移動となった.現在の所属は新設された講座であり,研究スペース,研究機材ともに不足している.また職員や大学院生等の出入りが未だ少なく,マンパワーも不足している.以上の理由により,当初の予定よりもやや遅れているが,現在の環境でも可能な手段を用いて研究を進めている.脳腫瘍の内,主にグリア系腫瘍において,低悪性度のものの方が高悪性度のものよりもγH2AX陽性細胞比率が高いことが判明しつつある.この理由を調べることで,グリア系腫瘍がより悪性化するメカニズムに迫ることが出来ると考えている.具体的にはDNA傷害の程度と増殖能とを比較する.またγH2AXの関わるDNA損傷応答に関連する因子の発現について調べる.さらにDNA傷害と増殖関連因子の発現を同一細胞で調べることによって,現在細胞増殖能の評価に用いられている種々の蛋白の意義について解析する.前述の通り,抗癌剤の作用機序については同じ種類の腫瘍においても個々の細胞株によって反応性に違いが見られる.この際が何によるものか検討を進めたい.また,悪性化するとγH2AX陽性率が下がることについて,低悪性度のものではDNA傷害に対する細胞応答が正常であるため細胞自身の盛んな代謝によって活性酸素が生じてDNA傷害が起きるために腫瘍細胞の多くがγH2AX陽性になり,高悪性度のものではDNA傷害が生じても修復機構のいずれかに障害があるためγH2AXが陽性にならないと考えられる.とすると,DNA傷害への応答の欠如が悪性化に繋がっている可能性があり,この点から悪性化の機序を解析することを進めたい.特にグリオーマで最も悪性度の高いグリオブラストーマは,低悪性度のものから二次的に生じるものと,de novoで生じるものの二種類があり,それぞれ,p53変異やIDH-
電顕的 in situ ハイブリダイゼーションによるウイルス核酸同定法の確立

最近分子生物学の進歩により遺伝子のレベルで新しいウイルスが解明され、その構成蛋白質やそのウイルスの性状が推察されるようになったが、構造が確認できていないウイルスがある。ウイルス粒子の形態構造を知ることは、そのウイルス粒子の基本的な性状、分類的位置関係、さらにその感染様式などの予測に重要である。そこで、形態未知のウイルスを明らかにする手段として電顕的in situハイブリダイゼーション(EM-ISH)によるウイルス核酸同定法を確立することを目的とし、次の項目について行った。1. EM-ISHを確立するため、Epstein-Barrウイルス感染細胞中のEBV-DNAの存在をEBV BamHI-Wをプローブとして用い、低温樹脂包埋切片上でのEM-ISHの条件および検出法を確立し、感染細胞内ウイルス前駆体の存在を明らかにした。2.低温樹脂包埋切片のコントラスト増強のため、ルテニウムレッドとOsO_4混合液で免疫反応後に染色すると、コントラストの良いウイルス粒子像が得られた。3. HIV粒子中のウイルス遺伝子の存在をこのEM-ISH ISH法で認めた。4.アデノウイルス感染細胞内のウイルス粒子の結晶様配列は、の基本的条件および検出法を確立するのに、有用な試料であることがわかった。5. PCR装置を用いて、ビオチン高標識プローブを作製すると、アデノウイルス粒子配列で1コピーまたは数コピーの遺伝子に1標識できるEM-ISHが確立できた。また、HIVでも検出率が向上した。6.遺伝子配列が既知のボルナ病ウイルスの形態および形態形成を免疫電顕で明らかにした。さらに、EM-ISHで、遺伝子的にも明らかにしようとしている。最近PCRの進歩により遺伝子のレベルで新しいウイルスが解明され、その構成蛋白質やそのウイルスの性状が推察されるようになった。しかし、ウイルス遺伝子構造のみが知られているが,そのウイルス構造が確認できていないウイルスがある。ウイルス粒子の形態構造を知ることは、そのウイルス粒子の基本的な性状ばかりか、分類的位置関係、さらにその感染様式などの予測に重要である。そこで、これらのウイルスの形態を明らかにする手段として電顕的in situハイブリダイゼーションによるウイルス核酸同定法の確立することを目的とし、初年度の9年度は次の3項目について行った。1.電顕的in situハイブリダイゼーションを確立するため、Epstein-Barrウイルス感染細胞中のEBV-DNAの存在をEBV BamHI-Wをプローブとして用い、低温樹脂包理切片上でのin situハイブリダイゼーションの条件および電顕的検出法を確立し、感染細胞内ウイルス前駆体の存在を明らかにした。2.低温樹脂包理切片は免疫電顕法には優れているが、コントラストの良い像が得られないため、ウイルス粒子などの微細な構造の観察には十分ではなかった。そこでコントラスト増強のため、ルテニウムレッドとOsO_4混合液で免疫反応後に染色すると、高コントラストの像を得ることができ、免疫反応したウイルス粒子内部の構造を明らかにすることができた。3.1コピーまたは数コピーの遺伝子でも検出できる電顕的in situハイブリダイゼーションを確立するため、HIV感染U1細胞(2コピー/細胞)を用いて、PCR法で増幅を行い、in situハイブリダイゼーションの最適条件を検討した。そこで、形態未知のウイルスを明らかにする手段として電顕的in situハイブリダイゼーションによるウイルス核酸同定法を確立することを目的とした。2年度(最終年度)の10年度は新たに次の項目について行った。1.アデノウイルス感染細胞内のウイルス粒子の結晶様

配列は、低温樹脂包埋切片上でのin situハイブリダイゼーションの基本的条件および検出法を確立するのに、有用な試料であることがわかった。2. PCR装置を用いて、プローブをhigh priming法で作製することにより、アデノウイルス感染細胞で1コピーまたは数コピーの遺伝子でも検出できる電顕的in situハイブリダイゼーションが確立できた。また、HIVでも検出率が向上した。3.免疫反応用の低温樹脂包埋切片に、ルテニウムレッドとOsO_4混合液でコントラスト増強のため方法は、核酸変性の高温処理過程を含むにもかかわらず、in situハイブリダイゼーションでも利用できることがわかった。4.遺伝子配列が既知で、形態が確立していないボルナ病ウイルスの形態および形態形成を免疫電顕で明らかにした。さらに、今回確立されたin situハイブリダイゼーションで、このウイルスに最適なプローブを開発し、遺伝子的にも明らかにしようとしている。
次世代メタボローム解析技術開発と応用

本年度は,定量分析系の開発において,引き続きGC/MSにおける定量ライブラリの構築に取り組み解析対象親水性代謝物の拡充を図るとともに,当該分析系を用いた実サンプルの分析を実施し,分析系の検証を行った.誘導体化条件等の最適化を実施し高精度で定量データの取得が可能なGC/MS分析系の構築に成功した(論文投稿準備中).また,SFC/MSにおける定量リピドーム解析システムの開発にも引き続き取り組む,解析対象脂質の拡充を図るとともに,当該分析系を用いた実サンプルの分析を実施し,分析系の検証および応用研究を実施した.さらに,GC/MSで分析が困難な高親水性代謝物の分析系として,親水性相互作用/陰イオン交換クロマトグラフィータンデム質量分析(HILIC/AEX/MS/MS)による新しい親水性代謝物分析法の開発に取り組み,HILC/AEXデュアルモードの新規分析系の開発に成功した(特許出願.論文投稿準備中).その他に,個別分析系の開発として,脂質,有機酸,糖類,核酸類等を対象とした質量分析系を検出器に用いない分析系の開発に取り組んだ(論文投稿済).また,定量解析用安定同位体ラベル化標準品およびMSプローブの開発においては,安定同位体ラベル化標準品の微生物におけるin vivo合成、および、無細胞系でのin vitro合成に取り組んだ.「安定同位体ラベル化内部標準群(SILIS)」の生産・調製技術の構築に取り組み,大腸菌の培養条件を最適化することで安価かつ主要な親水性代謝物の13Cラベル化率95%以上を担保したSILIS調製に成功した(論文投稿準備中).また,定量メタボロームデータ解析手法の開発についても,実データを用いて解析アルゴリズム,ソフトウエアの開発に取り組み,ベースとなる解析システムの構築に成功した.定量分析系の開発において,これまで分析が困難であった高親水性代謝物について,新規カラムを開発するとともに,新たな分離系として親水性相互作用/陰イオン交換クロマトグラフィーを提唱し,タンデム質量分析を接続したHILIC/AEX/MS/MS分析系の構築に成功した(特許出願.論文投稿準備中).その他に,個別分析系の開発として,質量分析系を検出器に用いない脂質,有機酸,糖類分析系を開発し,特に,脂質分析系については,これまで困難であった個々の脂質クラスの定量データが取得可能な分析系の構築に成功した(論文投稿済).上記のとおり,当初の計画より定量分析系の開発は進展している状況である.また,定量解析用安定同位体ラベル化標準品調製技術の開発については,大腸菌を用いて安価かつ主要な親水性代謝物の13Cラベル化率95%以上を担保した「安定同位体ラベル化内部標準群(SILIS)」の生産・調製に成功した(論文投稿準備中).また,安定同位体製造企業と,無細胞系でのin vitro合成システムの開発や,18Oラベル体を用いた代謝物定量分析手法の開発にも取り組んでおり,研究開発は当初予定していたより進展している状況である.定量分析系の開発においては,引き続きHILIC/AEX/MS/MS分析系における対象親水性代謝物の拡充を図るともに,当該分析系を用いた実サンプルの測定を行い,必要に応じて分析系の改良,開発を実施する.また,GC/MSにおけるCCLD定量ライブラリの構築,SFC/MS分析系における定量リピドーム解析システムの開発にも同様に解析対象代謝物の拡充,実サンプルの測定を実施し,必要に応じて分析系の改良,開発についてもとり組む.さらに,生体サンプルを用いて構築した手法のバリデーションを行い,必要に応じて改良・最適化を実施する.定量解析用安定同位体ラベル化標準品の調製においては,引き続き,安定同位体ラベル化標準品の微生物におけるin vivo合成,および,無細胞系でのin vitro合成に取り組む.高標識化率SILIS生産のための技術開発を進め,各種モデル生物を用いたin vivoでのSILIS合成では使用宿主を拡張するとともに,大腸菌を中心として合成代謝経路導入と代謝工学的宿主改変を適用することで野生型大腸菌に本来含まれない代謝物や,その他の宿主も含めて細胞内存在量の少ない代謝物を多く含有するSILIS生産基盤の構築に取り組む.微量成分の高感度化・絶対定量に向けたMSプローブの開発においては,酸化脂質や特定官能基を有する化合物を対象としたプローブの開発等について取り組む.定量メタボロームデータ解析手法の開発についても,実データを用いて解析システムの構築を進めるとともに,課題を解決するための技術開発に取り組む.以上の次世代定量メタボローム分析法の開発を進めるとともに,現状の分析法を用いて,共同研究者と連携しながら各種代謝アダプテーション研究を精力的に実施する.本年度は,定量分析系の開発において,引き続きGC/MSにおける定量ライブラリの構築に取り組み解析対象親水性代謝物の拡充を図るとともに,当該分析系を用いた実サンプルの分析を実施し,分析系の検証を行った.誘導体化条件等の最適化を実施し高精度で定量データの取得が可能なGC/MS分析系の構築に成功した(論文投稿準備中).また,SFC/MSにおける定量リピドーム解析システムの開発にも引き続き取り組む,解析対象脂質の拡充を図るとともに,当該分析系を用いた実サンプルの分析を実施し,分析系の検証および応用研究を実施した.

さらに,GC/MSで分析が困難な高親水性代謝物の分析系として,親水性相互作用/陰イオン交換クロマトグラフィータンデム質量分析(HILIC/AEX/MS/MS)による新しい親水性代謝物分析法の開発に取り組み,HILC/AEXデュアルモードの新規分析系の開発に成功した(特許出願.論文投稿準備中).その他に,個別分析系の開発として,脂質,有機酸,糖類,核酸類等を対象とした質量分析系を検出器に用いない分析系の開発に取り組んだ(論文投稿済).また,定量解析用安定同位体ラベル化標準品およびMSプローブの開発においては,安定同位体ラベル化標準品の微生物におけるin vivo合成、および、無細胞系でのin vitro合成に取り組んだ.「安定同位体ラベル化内部標準群(SILIS)」の生産・調製技術の構築に取り組み,大腸菌の培養条件を最適化することで安価かつ主要な親水性代謝物の13Cラベル化率95%以上を担保したSILIS調製に成功した(論文投稿準備中).また,定量メタボロームデータ解析手法の開発についても,実データを用いて解析アルゴリズム,ソフトウエアの開発に取り組み,ベースとなる解析システムの構築に成功した.定量分析系の開発において,これまで分析が困難であった高親水性代謝物について,新規カラムを開発するとともに,新たな分離系として親水性相互作用/陰イオン交換クロマトグラフィーを提唱し,タンデム質量分析を接続したHILIC/AEX/MS/MS分析系の構築に成功した(特許出願.論文投稿準備中).その他に,個別分析系の開発として,質量分析系を検出器に用いない脂質,有機酸,糖類分析系を開発し,特に,脂質分析系については,これまで困難であった個々の脂質クラスの定量データが取得可能な分析系の構築に成功した(論文投稿済).上記のとおり,当初の計画より定量分析系の開発は進展している状況である.また,定量解析用安定同位体ラベル化標準品調製技術の開発については,大腸菌を用いて安価かつ主要な親水性代謝物の13Cラベル化率95%以上を担保した「安定同位体ラベル化内部標準群(SILIS)」の生産・調製に成功した(論文投稿準備中).また,安定同位体製造企業と,無細胞系でのin vitro合成システムの開発や,18Oラベル体を用いた代謝物定量分析手法の開発にも取り組んでおり,研究開発は当初予定していたより進展している状況である.本年度は,個別定量分析系の開発において,親水性代謝物解析用ガスクロマトグラフィー質量分析系(GC/MS)およびリピドーム解析用超臨界流体クロマトグラフィー質量分析系(SFC/MS)における定量データ取得のための技術開発に取り組んだ.GC/MS分析系においては,検出感度比が一定となるように調整するターゲットチューニングを用いて構築するCalibration Curve Locking Database (CCLD)に基づいて代謝物濃度を導出する半定量法の開発に取り組み,メタボロミクス用の新規CCLDを構築した(論文投稿準備中).SFC/MS分析系においては,順相系のカラムを用いたSFCに三連四重極型質量分析計(QqQMS)を接続したワイドターゲット定量リピドーム分析法の開発に取り組み,脂質クラスごとに内部標準物質を用いて脂質クラス内の個々の脂質分子のマトリクス効果を一斉に標準化し定量分析するNP-SFC/QqQMS分析系の構築に成功した(Takeda, H.et. al., J. Lipid Res. 2018).その他にアミノ酸,有機酸等を対象とした個別分析系の開発についても取り組み,高濃度塩を含む培地成分の解析に適用可能なハイスループットのアミノ酸分析系の構築に成功した(論文投稿準備中).また,定量解析用安定同位体ラベル化標準品およびMSプローブの開発においては,安定同位体ラベル化標準品のin vivo合成,in vitro合成にむけた種々の条件検討を行った.
小脳コネクトーム形成機構

小脳神経回路を構成する顆粒細胞・プルキンエ細胞・投射神経・下オリーブ核ニューロン特異的に転写活性化因子Gal4を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュ系統を単離し、ゼブラフィッシュ小脳神経回路の解剖学的・発生学的解析を行った。また、顆粒細胞の軸索走行に異常を示す変異体の責任遺伝子をcollagen4a6と同定し、IV型コラーゲンが基底膜の構造を保つことで軸索走行を制御していることを見出した。失調性遊泳異常を示すメダカ変異体roの原因遺伝子としてcontactin1bを同定した。小脳神経回路特異的Tg系統からFACSで小脳神経回路ニューロンを単離し、トランスクリプトーム解析を行った。小脳は円滑な運動の制御のみならず、認識・感情・学習などの高度な神経活動にも関与している。本研究ではゼブラフィッシュとメダカを用いて、小脳神経回路形成過程およびそれを制御する分子メカニズムを解明することを目的として実験を行い下記の結果を得た。1.ゼブラフィッシュを用いた神経回路ライブイメージングシステムの確立:三種類の蛍光タンパク質遺伝子を含むレポーター遺伝子を有するトランスジェニックフィッシュ(Tg)の作製を行った。加えて、個々の小脳神経回路ニューロン特異的に転写活性化因子Gal4FFを発現するTg、およびGal4FF依存性にDNA組換え酵素CreERT2発現Tgの作製を行った。2.ゼブラフィッシュとメダカと用いた小脳神経回路形成の分子機構の解明:(1)IV型コラーゲンを介した穎粒細胞軸索形成機構の解明:基底膜を構成するIV型コラーゲンの遺伝子collagen4a6に変異体は、顆粒細胞の軸索走行異常を示す。基底膜成分Fibronectin1およびその受容体lntegrin5aの変異体においても同様に顆粒細胞軸索走行異常を示す。電顕解析から、これら変異体では中枢神経を囲む基底膜構造に異常が認められることを見いだした。また。IV型コラーゲンはSlitと相互作用することで軸索ガイダンスを制御しているとの報告があるが、顆粒細胞の軸索形成にはSlitが関与しないことを見いだした。(2)Contactin1による小脳神経回路形成機構:失調様行動異常を示すメダカ変異体roの原因遺伝子としてcontactin1bを同定しているが、その神経回路形成における役割を解析するため、TALEN法を用いてゼブラフィッシュcontactin1a/1b変異体の作製を行った。(3)遺伝子プロファイリング解析:1のTgを用いて、種々の小脳神経回路ニューロンからRNAの回収を行った。小脳は円滑な運動学習のみならず、認識・感情・学習などの高度な神経活動にも関与している。本研究ではゼブラフィッシュとメダカを用いて、小脳神経回路形成過程を制御する分子メカニズムを解明することを目的として実験を行い、下記の結果を得た。1.ゼブラフィッシュを用いた神経回路ライブイメージング:顆粒細胞・プルキンエ細胞・投射神経・登上線維ニューロン特異的に改良型転写活性化因子Gal4(GFF)を発現するトランスジェニックフィッシュ(Tgを)単離した。Gal4依存性のレポーターTgと交配し、個々のニューロンの樹状突起および軸索投射先の詳細な解析を行った。また、Gal4依存性に神経回路を多蛍光で識別できるTg系統を作製した。2.ゼブラフィッシュとメダカと用いた小脳神経回路形成の分子機構の解明:(1)IV型コラーゲンを介した顆粒細胞軸索形成機構の解明:基底膜を構成するIV型コラーゲンの遺伝子collagen4a6およびcollagen4a5の変異体は、顆粒細胞の軸索走行異常を示す。また基底膜形成に関与するFibronectin1およびその受容体Integrin5aの変異体においても、同様に顆粒細胞軸索走行異常を示す。これらのことから、基底膜の形成が顆粒細胞軸索形成に重要な役割を果たしていることを見出した。また、レーザー照射軸索破壊実験から、顆粒細胞のパイニア軸索と基底膜の会合が重要である可能性が示唆された。(2)Contactin1による小脳神経回路形成機構:失調様行動異常を示すメダカ変異体roの原因遺伝子としてcontactin1bを同定した。TALEN法を用いてゼブラフィッシュcontactin1a/1b変異体の作製を行い、contactin1b変異体が運動失調を示すことを明らかとした。(3)遺伝子プロファイリング解析:1のTgを用いて、種々の小脳神経回路ニューロンからRNAを回収し、RNA sequencingを行った。小脳は円滑な運動の制御のみならず、認識・感情・学習などの高度の神経活動にも関与している。本研究では、ゼブラフィッシュとメダカを用いて、小脳神経回路形成過程の解析を行った。1.ゼブラフィッシュを用いた神経回路形成のライブイメージング:顆粒細胞・プルキンエ細胞・投射神経・下オリーブ核ニューロン特異的に転写活性化因子Gal4を発現するトランスジェニック(Tg)系統を単離した。Gal4依存性のレポーターTg系統と交配し観察することで、下オリーブ核から反対側のプルキンエ細胞への投射、顆粒細胞からプルキンエ細胞・投射神経・下オリーブ核への直接・間接的接続を確認した。また、小脳体の顆粒細胞の軸索はお互いに反発し合うことで平行線維を形成すること、顆粒細胞軸索形成と細胞体の移動は連動していることを見出した。2.小脳神経回路形成の分子機構の解明:(1)IV型コラーゲンを介した顆粒細胞軸索形成

機構:基底膜を構成するIV型コラーゲンの遺伝子collagen4a6および4a5の変異体では、顆粒細胞軸索走行に異常を示す。走行異常は基底膜の構造異常と関連しており、IV型コラーゲンは基底膜の構造を保つことで、顆粒細胞軸索の走行を制御していることを見出した。(2)Contactin1による小脳神経回路形成機構:失調様遊泳異常を示すメダカ変異体roの原因遺伝子としてcontactin1bを同定した。TALEN法を用いてゼブラフィッシュContactin1a/1b変異体を作製し、Contactin1の機能が脊椎動物で保存されていることを見出した。(3)遺伝子プロファイリング解析:小脳神経回路特異的Tg系統から、蛍光タンパク質の発現を指標に個々の種類のニューロンをFACSで単離し、RNA sequencingを行った。比較解析から、プルキンエ細胞に特異的遺伝子を多数単離し、in situ hybridizationにより発現確認を行った。これらの内、神経回路形成に関与する候補遺伝子に関して、変異体の作製を行った。1.ゼブラフィッシュを用いた神経回路形成のライブイメージング小脳神経回路を構成する顆粒細胞・プルキンエ細胞・投射神経(eurydendroid細胞)・下オリーブ核ニューロン特異的に転写活性化因子Gal4を発現するトランスジェニック(Tg)系統を単離した。これらTg系統とGal4依存性レポーターTg系統を交配し観察することで、下オリーブ核ニューロンから対側プルキンエ細胞への投射(登上線維)、顆粒細胞からのプルキンエ細胞・投射神経への投射を確認した。また、顆粒細胞の軸索は平行線維を形成するが、初期に軸索はランダムに伸長し、軸索どうしの反発作用によって平行線維が形成されることを見出した。また、顆粒細胞の軸索形成と腹側への細胞体の移動は連動していることを明らかにした。2.小脳神経回路形成の分子機構の解明(1)IV型コラーゲンを介した顆粒細胞軸索形成機構:IV型コラーゲンcol4a6およびcol4a5の変異体では、顆粒細胞の軸索走行に異常を示す。これら変異体では、中枢神経組織を覆う基底膜の構造に異常を有しており、異常な基底膜に沿って顆粒細胞の軸索が異常に走行することを見出した。このことから、基底膜が軸索を標的ニューロンに導く重要な役割を果たしていると考えられた。(2)Contactin1による神経回路形成機構;失調様遊泳異常を示すメダカ変異体roの原因遺伝子としてcontactin1bを同定した。ゼブラフィッシュcontactin1a/1bの変異体を作製し、Contactin1の機能が真骨魚類で保存されていることを見出した。(3)遺伝子プロファイリング解析:顆粒細胞、プルキンエ細胞特異的に蛍光タンパク質を発現するTg系統から、これら細胞をFACSを用いて単離、RNA-seqを行い、顆粒細胞、プルキンエ細胞特異的遺伝子を多数単離した。これらの内、神経回路形成に関与する候補遺伝子に関して、変異体作製を開始した。
アセチルコリン受容体を介した概日時計の非光同調機構の解明

ヒトを含むほとんどの生物には約24時間周期の概日時計が備わっている。概日時計は、睡眠や体温などの様々な生理機能に日内変動を与える重要な役割を持つ。哺乳類における概日時計の中心振動体は、視交叉上核(Suprachiasmatic nucleus, SCN)であり、約24時間の概日リズムを形成しているだけでなく、地球の自転に伴う外界の24時間とのずれを日々補正することで、正確な24時間リズムを発振している。哺乳類における同調因子は光同調と非光同調に分類され、光同調についてはその神経伝達物質や作動箇所は明らかにされている一方、非光同調については食事や運動、社会的ストレスなどがあるが、これまでSCNでの作用機構を含め、その神経分子機構はほとんど解明されていない。今回私は、従来より非光同調因子として注目される古典的神経伝達物質であるアセチルコリンに着目して、SCNにおけるその作用を検索した。まず、SCNの器官培養系を用いて、コリン作動薬であるカルバコールが時計遺伝子の発現位相を変位させることを解明し、今年度に開催された第9回アジア睡眠学会で報告した。さらに、SCNに発現するニコチン性およびムスカリン性受容体サブタイプを特定し、そのうちSCNに多く発現するニコチン受容体Chrns1とChrns2が、それぞれ特徴ある発現リズムを持つことを明らかにした。これら受容体が生体における概日リズム発振にどのような効果を持つか調べるため、Chrns1およびChrns2のSCN特異的ノックアウトマウスを作成した。その結果、SCNに発現するニコチン受容体Chrns1およびChrns2は、概日リズムの発振機構ならびに、概日リズムの光同調機構には必須ではないことが判明した。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。