hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脂肪組織由来幹細胞による移植前血管床構築に基づく次世代細胞治療方法の確立

研究の過程でADSCによる新生血管床構築に時間を要することが判明したため、皮下における血管新生効果が明らかとなっているbFGFを用いて、移植予定箇所への新生血管の程度と移植成績についての検討を行うこととしたため。重症糖尿病に対する根治療法である膵島移植は、局所麻酔下で移植を実施可能な低侵襲な移植療法である。しかし現行の門脈から肝臓内に移植する方法では、膵島が移植直後に新鮮血に触れることで惹起される原子免疫反応によって移植後24時間以内に5-60%の膵島が破壊される。さらに出血や門脈塞栓等の合併症が一定の確率で起こることから、これらの問題を回避可能な新たな移植部位として皮下への膵島移植の実現が望まれている。皮下は移植が容易で低侵襲でであり、万が一移植後に不具合が生じた場合にも摘出が容易であることから理想的な移植部位であるが、その乏血管性のため膵島生着が不良であるという問題がある。そこで我々は移植予定箇所の皮下に脂肪由来前駆細胞(ADSC)を導入し、血管床を構築後に膵島を移植する二段階移植法を確立することを目的に研究を行った。平成28年度は、マウス腹腔内脂肪からADSCを調製し、ADSCをハイドロゲルデバイスに封入後、STZ誘発糖尿病B6マウスの皮下に10-12日間留置後、B6マウスの皮下に膵島を移植し、血糖と体重の推移を観察した。対照として、血管誘導効果が確認されているbFG徐放Fデバイスとデバイス導入しないコントロールを置いて糖尿病の治癒を比較した。その結果、ADSC導入群はコントロールより治癒効率は良好であったが、bFG群よりは治癒効率は低かった。ADSCはbFGFと比べて出血や浸出液貯留のリスクが低いという利点があるため、臨床応用を視野に入れた場合には非常に有用なツールであると考えられるため、今後はADSC調製方法のさらなる至適化や、移植前血管床構築に要する日数、ADSCの皮下への導入方法の再検証を行い、ADSCによる移植前血管床構築方法の確立を目指していきたいと考えている皮下細胞移植は低侵襲で安全な移植が可能であるという利点があるが、乏血管性という課題を克服する必要がある。この課題の解決には、移植予定箇所の予め有効な血管床を構築することが必要である。本研究では、脂肪組織由来幹細胞(Adipose-Derived Stem Cells: ADSC)を移植予定箇所の皮下に導入で移植前血管床構築し、膵島の生着効率を向上させることを目的に研究を行った。その結果、比較検証のため実施したbFGF導入では移植成績の向上を確認したが、ADCSによる皮下新生血管構築は肉眼レベルでは確認できたが移植効率の向上までには至らなかった。皮下における移植前血管構築によって膵島の生着が促進し、糖尿病ラットの治癒と移植膵島の生着を確認することが出来た。ADSCによる移植前血管床構築後に膵島を移植する実験と、移植膵島への血管申請の定量は次年度に実施するが、実験に必要な基礎的条件の検証は実施済みである。ADSCによる移植前血管床構築によって皮下膵島移植が向上することをマウスの同種同系移植によって明らかにし、さらに多光子顕微鏡を用いて移植膵島への血管新生を同じ動物を用いて経時的に定量する。これらの実験に必要な手技についての経験を申請者は豊富に有しており、また必要な計測機器等もすべて揃っている。細胞移植ADSCによる移植前血管床構築が膵島移植成績に及ぼす影響について検証するとともに、移植膵島周囲への新生血管の数が移植予定箇所に血管床を予め構築することで増加するかどうかについて多光子顕微鏡を用いて検証する。研究計画において2013年度は(1)ADSCによる皮下血管床構築、(2)皮下膵島移植における移植膵島量の検証を計画した。
酸化LDL受容体(CD36)阻害による新しい動脈硬化治療法の開発

CD36は血小板、単球、マクロファージ、脂肪細胞等の細胞膜に存在する膜2回貫通型の糖蛋白で、コラーゲンやトロンボスポンジンの受容体であることが報告されている。私共はCD36欠損症を発見し、遺伝子変異を同定すると共に、CD36欠損症患者のマクロファージでは酸化LDLの結合が約50%低下しており、CD36がマクロファージにおける酸化LDLの受容体として粥状動脈硬化の発症過程で重要であることを明らかにした。また、ヒト大動脈の粥状硬化巣でCD36が強く発現することを見出した。本研究ではかかるCD36に関する細胞及び分子生物学的研究を基盤に、抗CD36抗体を作成し、その腹腔内投与による動脈硬化発症への影響を観察し、さらに発生工学的手法によりCD36ノックアウトマウスの作製を試みた。CD36抗体はペプチド抗体を2種類作成した。さらに、マウスCD36cDNAをプローブとしてマウスC129genomic libraryをスクリーニングしてゲノムDNAを取り、pGKNEOのNeo耐性遺伝子の上流及び下流にエクソンを分断するようにゲノム遺伝子断片を挿入し、ターゲッテイングコンストラクトを完成させた。これをエレクトロポレーションによりES細胞に導入し、Neomycinでスクリーニングして耐性を獲得した細胞を選択し、サザンブロット法により目標部位に相同染色体組換えを確認したES細胞を得た。このES細胞をマウスにマイクロインジェクションしてキメラマウス作製を行い、現在これらの交配によりCD36欠損マウスを樹立中である。今後CD36抗体の投与効果を確認すると共に、CD36欠損マウスの脂質代謝プロフィール、腹腔マクロファージの機能解析、動脈硬化病変などについて検討の予定である。また、SRAノックアウトマウスとの交配によりダブルノックアウトマウスを作成し、動脈硬化惹起性であるアポEノックアウトマウスやLDL受容体ノックアウトマウスとの交配により、CD36欠損が動脈硬化発症に及ぼす影響について検討する。一方、CD36欠損症例の臨床的特徴について、26例の患者の解析を行ったところ、当初の予想に反してCD36欠損症例では高トリグリセリド血症、高レムナント血症を中心とした高脂血症を合併し、インスリン抵抗性が存在すること、また血圧の上昇も認められた。従って、CD36欠損はインスリン抵抗性やマルチプルリスクファクター症候群の新しい遺伝的基盤であることが明らかになった(Lancet2001に報告)。CD36は88kDの糖蛋白で血小板、単球、マクロファージ、脂肪細胞の細胞膜に存在し、コラーゲンやトロンボスポンジンの受容体であることが報告されていた。私共はCD36欠損症を発見し、遺伝子変位を同定するとともに、CD36欠損症患者のマクロファージを用いた実験により、患者由来マクロファージでは酸化LDLの結合が約50%低下していたことから、CD36がマクロファージにおける酸化LDLの受容体として粥状動脈硬化の発症課程で重要であること明らかにした。また、ヒト大動脈の粥状硬化巣でCD36が強く発現し、とくに泡沫化の強いマクロファージでの顕著な発現が認められ、スカベンジャー受容体Class A(SRA)の分布とは異なることを見出した。

本研究ではかかるCD36に関する細胞及び分子生物学的研究を基盤に、まずマクロファージにCD36を過剰発現するマウスの作製を試みた。SRAプロモーターとヒトCD36cDNAを含むfragmentをマウス受精卵にmicroinjectionし、CD36過剰発現F1マウスを作成した。32匹をスクリーニングした結果、2匹でCD36発現を得ることができ、交配を試みたが、不妊のため、F2マウスを得ることができなかった。不妊の原因は不明であるが、CD36過剰発現との関連も示唆される。そこで、動脈硬化巣の単球由来マクロファージにおけるCD36の発現を抗CD36モノクローナル抗体の反復注射によるin vivoでのCD36抑制を介して、酸化LDLのマクロファージ内への取り込みを抑制し、泡沫細胞形成を抑制することによる粥状動脈硬化症の新しい治療法を開発することを試みた。この目的のため、マウスCD36に対するモノクローナル抗体の作製を試みており、現在までに数種類が得られている。今後、マウスマクロファージの培養系に上記のCD36抗体を添加し、酸化LDLの結合、取り込み、マクロファージの泡沫化抑制の有無を検討し、さらにLDL受容体欠損マウスに抗マウスCD36抗体を反復注射し、酸化LDLのin vivoでの結合抑制及びマクロファージの泡沫化抑制、動脈硬化巣の変化について検討する予定である。CD36は血小板、単球、マクロファージ、脂肪細胞等の細胞膜に存在する膜2回貫通型の糖蛋白で、コラーゲンやトロンボスポンジンの受容体であることが報告されている。私共はCD36欠損症を発見し、遺伝子変異を同定すると共に、CD36欠損症患者のマクロファージでは酸化LDLの結合が約50%低下していたことから、CD36がマクロファージにおける酸化LDLの受容体として粥状動脈硬化の発症過程で重要であること明らかにした。また、ヒト大動脈の粥状硬化巣でCD36が強く発現することを見出した。本研究ではかかるCD36に関する細胞及び分子生物学的研究を基盤に、抗CD36抗体を作成し、その腹腔内投与による動脈硬化発症への影響を観察し、さらに発生工学的手法によりCD36ノックアウトマウスの作製を試みた。CD36抗体はペプチド抗体を2種類作成した。さらに、マウスCD36cDNAをプローブとしてマウスC129genomic libraryをスクリーニングし、ゲノムDNAを取り、ターゲッテイングベクターpGKNEOのNeo耐性遺伝子の上流及び下流にエクソンを分断するように5-10kbのゲノム遺伝子断片を挿入し、ターゲッテイングコンストラクトを完成させた。このターゲッテイングコンストラクトをエレクトロポレーションによりES細胞に導入し、Neomycinによりスクリーニングして耐性を獲得した細胞を選択した。我々はサザンブロット法により目標部位に相同染色体組換えを起こしたことを確認したES細胞を得ている。さらに、このES細胞をマウスにマイクロインジェクションしてキメラマウスの作製を行い、現在これらの交配によりCD36欠損マウスを樹立中である。
画像データ処理とシミュレーションによる氷衛星の火山地形発達史の解析

天王星の氷衛星、ミランダとアリエルには、幅15-80km深さ1-4kmの地溝の中に連続した線状の地塁の続いている地形が、確認されている。この二重溝地形は、地溝の中央部から線状に噴出した氷が、左右に広がって形成されたと考えられている。この地形から氷衛星進化の重要な要素である噴出氷の粘性率を推定することができる。これまでの研究では、粘性率一定の流体の流れでしかも鉛直方向の構造は考えずに、地形の広がりをもとめている。結果として、地形の縦横比から推定される粘性率は測定されているH_2OとNH_3系の氷の粘性率よりも10^5以上高くなっている。本研究の目的は、画像処理とシミュレーションを通じて、この地形を解析して、噴出氷の粘性率を考察することにある。本年度、グラフィックデータ処理機を購入して、画像処理のシステムを立ちあげた。画像データはNASAで供給されているCDROMを別に購入して、解析を開始した。12月に、アリゾナ大学月惑星研究所を訪問して、画像解析の手法を議論した。画像処理のソフトウエアの一部は、アリゾナ大学から最新版を直接移植した。また、グラフィックデータ処理機をワークステーションや大型計算機の端末として、利用できる環境を設定した。シミュレーションでは、面対称あるいは軸対称モデルで地形変化を記述する陽解法の差分コードでの計算を行い、体積一定の場合、初期条件にかかわらず解析解に収束することを確認した。粘性率の時間変化の効果により、地形の広がりが抑えられることを確かめた。そのため、初期粘性率としては、これまで考えられたよりも1-2桁小さい値をとりうることを示した。
癌幹細胞を標的とした新規癌特異的免疫治療法の開発

消化器癌における癌幹細胞のマーカーを明らかにするとともに、その生物学的特徴を明らかにすることを第一目標として研究を行った。細胞周期を指標とした方法により癌幹細胞成分を抽出した。また、網羅的遺伝子発現解析により、癌幹細胞に特徴的な遺伝子候補を同定した。それらの遺伝子が癌幹細胞に対する新規免疫治療の実施に有用な分子である可能性が示唆された。〈消化器癌株化癌細胞からの癌幹細胞の抽出〉消化器癌における癌幹細胞のマーカーを明らかにするとともに、その生物学的特徴を明らかにすることを第一目標として研究を行った。われわれは、ヒト肝細胞癌株化細胞を用いて、初めて癌幹細胞の存在を明らかにした(Haraguchi,Tanaka, et. al.,stem cells,2006)。最終目標である癌幹細胞を標的とした特異的免疫治療を実施するために、マウス肝細胞癌細胞株MH129を用いて癌幹細胞の同定を進めた。ヒト肝癌細胞HuH7の癌幹細胞同定と同じ手法のSP成分をソーティングし、培養実験を行ったが、MH129では癌幹細胞成分は得られなかった。そこで、新規同定方法として、癌幹細胞が長期生存できるという性質を考慮し、細胞周期が停止しているGO期に着目した。FACSを用いてGO期細胞をソーティングした後に、in vitroで増殖能、コロニー形成能、また同系のマウス皮下に投与することによる腫瘍造成能を解析した。その結果、非GO期細胞と比較してGO細胞が増殖能、コロニー形成能に優れ、また同系マウスのin vivoにおける腫瘍造成能にも優れていることが初めて明らかにされた。また、無血清培地において肝細胞、胆管細胞へ分化させる因子を混合培養することで、それぞれの成分への分化を実施している。また、薬剤耐性に関して、ABCトランスポーター遺伝子に依存するアンソラサイクリン系抗癌剤のみならず、多種の抗癌剤を用いて耐性実験を行っている。又向時に、4万4千遺伝子搭載オリゴマイクロアレイを用いて遺伝子発現解析を行った。これらの結果を基に、GO細胞群より更なる候補マーカーの組み合わせにより、より癌幹細胞の本質に迫る。また、この絞り込みによって得られた細胞を用いて、最終目標である癌幹細胞特異的免疫を誘導することによる抗腫瘍効果の解析を実施する予定である消化器癌における癌幹細胞のマーカーを明らかにするとともに、その生物学的特徴を明らかにすることを第一目標として研究を行った。われわれは、ヒト肝細胞癌株化細胞を用いて、初めて癌幹細胞の存在を明らかにした(Haraguchi,Tanaka et al.,Stem cells,2006)。FACSを用いてGO期細胞をソーティングした後に、in vitroで増殖能、コロニー形成能を解析した。その結果、in vitroでは非GO期細胞と比較してGO細胞が増殖能、コロニー形成能に優れ、かつ肝臓細胞のマーカーであるアルブミンのみならず胆管細胞マーカーのKRT19を発現することが示された。すなわち、多分化能を有することを示した。また、未分化な細胞であることを示す表面マーカーの一つであるKRT14の発現をGO細胞でのみ認めた。またin vivoにおける腫瘍造成能にも優れていることが初めて明らかにされた。又同時に、4万4千遺伝子搭載オリゴマイクロアレイを用いて遺伝子発現解析を行った。本解析の結果、GO細胞群特異的な候補遺伝子群の同定がなされた。
近代日本における皇室制度と政治統合

平成25年度は、資料の公開状況を踏まえ、宮内公文書館での調査に重点を置き、「特定歴史公文書等」の利用請求をさらに進めた。その中でも、とりわけ帝室制度調査局・帝室制度審議会関係の資料を精査した。帝室制度調査局については・作成・配布された議案の整理を行い、法令案の作成過程をより精緻に再現し、その中から各御用掛の認識の差異をあぶり出す作業を行なった。その結果、これまでの研究でも既にその役割が着目されてきた有賀長雄の位置づけを、岡野敬次郎や奥田義人など他の御用掛と比較しつつ論じる視角を持つことができた。帝室制度審議会については、議案の収集と共に、議事録の精読を進めた。特に栄典の一つである叙位、そして位階令に関しては、第62回内務省研究会にて報告を行なった。位階令の制定をめぐっては、内閣と宮内省を代表する形で参加していた各委員・御用掛たちが、帝室制度審議会という場で、「奉宣」の解釈、勅令・皇室令といった法令形式などの論点を、内閣と宮内省の関係や憲法と典範の関係を視野に入れた形で討議していた。位階は勲章や爵位とは異なり、その主管などがやや曖昧な栄典であり、審議の過程で、内閣と宮内省は「栄誉大権」をめぐる解釈の競演を繰り広げることとなった。伊東巳代治を総裁とする帝室制度審議会は、内閣と宮内省との間の調整を充分に行ない得なかったと評価することも可能であるが、あくまで審議会という空間での葛藤に留めることで、各機関同士の正面対立を防止する安全弁としての機能を一面では果たしたと位置づけることができよう。こうした帝室制度調査局・帝室制度審議会の活動からは、明治立憲制の根底に存在する天皇の定置化をめぐる争点が、「立憲制」の定着と連関しつつ、「宮中・府中関係」を主軸として、論議されていたことが読み取れる。帝室制度調査局、帝室制度審議会の作成した法令についての分析は、全体としては当初の研究計画以上の進展を見せたが、当初の計画で予定していた皇室財政と国家財政の関係については、いまだ充分な理解を得られていないため。平成25年度は、本研究課題の最終年度であった。本年度に充分な分析ができなかった、皇室財政と国家財政の関係をめぐる帝室制度調査局・帝室制度審議会の取り組みについては、比較の観点を意識しつつ、調査を続けたい。本研究は、「天皇親裁」を理念とした明治国家の政治過程において、各政治主体が天皇・皇室を如何に立憲制の文脈に定着させようとしたのか、を考察するものである。平成23年度は、明治後期において皇室制度に関する諸法令の整備に関与した帝室制度調査局(伊藤博文総裁、伊東巳代治副総裁)の活動とその影響を明らかにするために、当初の研究計画に則りつつ、国立国会図書館憲政資料室、国立公文書館、宮内公文書館などの諸機関に所蔵されている未刊行資料の調査を実施した。また、公刊私文書の読解、新聞・雑誌の関連記事の渉猟を行った。これらの作業を踏まえて、以下の知見を得ることができた。憲法と皇室典範の法的関係を視野に入れた上で、帝室制度調査局は、截然とした区分が必ずしも成立しない宮中・府中の関係性の再確認を促した。帝室制度調査局の作成した代表的な法令である公式令の制定過程から、皇室令と勅令の規定の修正のように、各政治主体の多様な宮中・府中関係に対する認識が確認できる。そして、こうした葛藤は、大正期において、天皇の即位礼と大嘗祭という大礼の事務を担当する大礼使の官制をめぐる論争として再燃した。この大礼使官制問題では、皇室の事務と国家の事務の関係は如何にあるべきか、換言すれば、「天皇」と「国家」の関係性、そして「宮中」という言葉の解釈が論議されていた。特に「宮中」という言葉の解釈の多元化は、単に「府中」と対比される非政治的領域を意味するのではなく、内閣や議会などを超越した「挙国一致」を実現する政治領域として「宮中jが解釈される素地を生んだと考えられる。なお、以上の研究成果の一部については、2011年11月6日、史学会大会(日本史部会近現代)において、「明治後期皇室制度改革と大正初期の「宮中」-公式令制定と大礼使官制問題-」と題した報告を行った。平成24年度は、大正期の天皇・皇室制度関係の諸法令の調査・整備事業に関して、伊東巳代治を総裁とする帝室制度審議会の活動と影響を主眼に置きつつ、考察を加えた。そこで、(1)帝室制度審議会関係の資料、(2)当該期の宮内省首脳部・宮内官僚の旧蔵文書、(3)皇室制度関係の法整備に関与した人物の著作など、の渉猟を中心的な課題とし、国立国会図書館憲政資料室、国立公文書館、宮内公文書館、東京大学大学院法学政治学研究科附属近代日本法政史料センター原資料部などの諸機関での調査を前年度と同様に実施した。私文書では国立国会図書館憲政資料室所蔵「牧野伸顕関係文書」、「関屋貞三郎関係文書」、「倉富勇三郎関係文書」の読解に重きを置いた。特に、戦前期に宮内大臣・内大臣を務めた牧野伸顕の発信書簡には、それぞれの時局における状況判断や感想が散見され、既に刊行されている『牧野伸顕日記』の記述と対応させることで牧野への理解を深化させた。

さらに、宮内公文書館所蔵の資料の調査によって、帝室制度審議会関係だけではなく、これまで未発見であった帝室制度調査局関係の書類を発見した。帝室制度調査局・帝室制度審議会の活動の詳細は、本研究にとって不可欠な前提であり、これによって、前年度までの研究以上に、帝室制度調査局内部の議論や法令の作成過程を理解することができた。他方、そのために、学術雑誌に投稿準備を進めていた研究論文の修正を余儀なくされ、帝室制度審議会についても、皇室裁判令などといった、帝室制度調査局において原案の作成がなされた法令の制定過程を明らかにしたに留まった。しかしながら、明治立憲制における天皇の位置づけ、君主の果たした政治的な統合機能などについて得られた研究成果の一端は、書評という形ではあるが公表することができた。平成25年度は、資料の公開状況を踏まえ、宮内公文書館での調査に重点を置き、「特定歴史公文書等」の利用請求をさらに進めた。その中でも、とりわけ帝室制度調査局・帝室制度審議会関係の資料を精査した。帝室制度調査局については・作成・配布された議案の整理を行い、法令案の作成過程をより精緻に再現し、その中から各御用掛の認識の差異をあぶり出す作業を行なった。その結果、これまでの研究でも既にその役割が着目されてきた有賀長雄の位置づけを、岡野敬次郎や奥田義人など他の御用掛と比較しつつ論じる視角を持つことができた。帝室制度審議会については、議案の収集と共に、議事録の精読を進めた。特に栄典の一つである叙位、そして位階令に関しては、第62回内務省研究会にて報告を行なった。位階令の制定をめぐっては、内閣と宮内省を代表する形で参加していた各委員・御用掛たちが、帝室制度審議会という場で、「奉宣」の解釈、勅令・皇室令といった法令形式などの論点を、内閣と宮内省の関係や憲法と典範の関係を視野に入れた形で討議していた。位階は勲章や爵位とは異なり、その主管などがやや曖昧な栄典であり、審議の過程で、内閣と宮内省は「栄誉大権」をめぐる解釈の競演を繰り広げることとなった。伊東巳代治を総裁とする帝室制度審議会は、内閣と宮内省との間の調整を充分に行ない得なかったと評価することも可能であるが、あくまで審議会という空間での葛藤に留めることで、各機関同士の正面対立を防止する安全弁としての機能を一面では果たしたと位置づけることができよう。こうした帝室制度調査局・帝室制度審議会の活動からは、明治立憲制の根底に存在する天皇の定置化をめぐる争点が、「立憲制」の定着と連関しつつ、「宮中・府中関係」を主軸として、論議されていたことが読み取れる。平成23年度から公開が始まった宮内公文書館の所蔵資料によって、これまで知られていなかった宮内省・宮中の慣習や会議の議事を確認できたものの、その資料群としての性格の理解は十分ではなく、その意義づけができていない。それに伴い、宮内官僚や宮中側の持っていた天皇・皇室への認識の解明があまり進展していないため。宮内公文書館の所蔵資料の調査を進める中で、帝室制度審議会関係だけではなぐ、帝室制度調査局関係の書類も多く発見することができた。これによって、本研究にとっての資料上の障害が軽減し、当初の研究計画以上に詳細な分析が可能となった。しかし資料の全体像や現存に至るまでの経緯などを本年度は解明するには至らず、さらに資料の発見によって、投稿予定だった学術論文の一部修正を要したため。帝室制度調査局、帝室制度審議会の作成した法令についての分析は、全体としては当初の研究計画以上の進展を見せたが、当初の計画で予定していた皇室財政と国家財政の関係については、いまだ充分な理解を得られていないため。次年度以降も、各機関・個人蔵の資料調査を継続する。
メタボリック症候群と非アルコール性脂肪肝炎の発症機構

Phosphatidylethanolamine N-methyltransferase (Pemt)の発現が肥満マウス肝臓で上昇することを見出した。Pemtノックアウトマウスに高脂肪高蔗糖食を負荷したところ肥満と脂肪組織の増大が著明に改善し、インスリン抵抗性が改善され血糖が低下するが、脂肪肝炎を来たし肝硬変や腺腫を発症することが判明した。Pemt活性の低下は非アルコール性脂肪肝炎の発症に深く関与していることを明らかにした【目的】2型糖尿病動物モデルマウスのインスリン標的臓器の発現プロファイル解析によって肥満において発現が亢進する遺伝子を検索しPhosphatidylethanolamineNmethyltransferase(Pemt)を同定した。PEMTは肝細胞の小胞体に局在するphosphatidylcholine (PC)生合成酵素であり、Pemt経路はPC合成のマイナー経路として知られている。本研究ではPemtのメタボリックシンンドロームにおける意義について検討した。【方法】Pemtノックアウトマウスを作製して高脂肪高蔗糖(HF)食で飼育して検討した。【結果】5週̃25週までHF食で飼育すると、Pemt+/-, Pemt-/-の体重増加はPemt+/+と比較してそれぞれ17%,̃22%抑制された。内臓脂肪重量もPemt-/-ではPemt+/-とPemt+/+と比較して有意に減少し、また脂肪細胞サイズの縮小も認められた。糖負荷試験およびインスリン負荷試験を行うと、Pemt+/+マウスに比べて、Pemt+/-マウスでは糖代謝の改善が認められ、さらにPemt-/-マウスでは、より強いインスリン抵抗性の改善と血糖の低下が認められた。ところがPemt-/-では著しい肝脾腫を呈し、肝組織では大脂肪滴や細胞浸潤・アポトーシス細胞や強い線維化を伴う脂肪肝炎・肝硬変を呈し、ALTが上昇していた。高脂肪食飼育Pemt-/-マウス肝臓ではDNAメチルが亢進していた。一部のマウスでは腫瘤形成を認め、60週齢まで観察すると100%のPemt-/-の肝臓に多発性の腫瘤が出現し、90週齢では発癌も認めた。【結論】Pemt阻害は肥満における体重や脂肪増加の抑制に対しては有効であるが、内臓脂肪および肝組織の脂質分布異常をきたし、腫瘤形成を伴う著しい脂肪肝炎を呈することが明らかとなった。Pemt活性の低下は非アルコール性脂肪肝炎の発症に深く関与していることを明らかにした2型糖尿病動物モデルマウスのインスリン標的臓器の発現プロファイル解析によって肥満において発現が亢進する遺伝子を検索し、phosphatidylethanolamine N-methyltransferase (PEMT)を同定した。PEMTは肝臓におけるphosphatidylcholine (PC)生合成酵素であり、PEMT経路はPC合成のマイナー経路として知られている。本研究ではPEMTのメタボリックシンンドロームにおける意義について検討した。Pemtノックアウトマウスを作製し、その表現型について検討した。5週25週まで高脂肪高蔗糖(HF)食で飼育すると、pemt+/-, pemt-/-の体重増加はpemt+/+と比較して夫々17%, 22%抑制された。内臓脂肪重量もpemt-/-ではpemt+/-とpemt+/+と比較して有意に減少し、また脂肪細胞サイズの縮小も認められた。糖負荷試験およびインスリン負荷試験を行うと、pemt+/+マウスに比べて、pemt+/-マウスでは糖代謝の改善が認められ、さらにpemt-/-マウスでは、より強いインスリン抵抗性の改善と血糖の低下が認められた。HF飼育pemt-/-マウスでは体重当たりの摂餌量が多い一方で、酸素消費量も増加していた。ところがpemt-/-では著しい肝脾腫を呈し、肝組織では巨大脂肪滴や炎症細胞浸潤・アポトーシスを伴う脂肪肝炎を呈し、AST・ALTが上昇していた。すなわちPEMT阻害は肥満における体重や脂肪増加の抑制に対しては有効であるが、脂肪肝炎を惹起することが判明した。Pemtノックアウトマウスを作出し、高脂肪食下で飼育すると脂肪肝炎を発症することが判明し、研究はおおむね順調に進展している。今後はPemtノックアウトマウスの脂肪肝炎が60週齢以降に発癌の有無などどのような病態を呈するか検討する。またPemtの相互作用分子を同定することにより、このマウスの表現型の分子メカニズムを明らかにする。ノックアウトマウスの飼育費用やその解析などの消耗品にあてる。
噴火による脱ガスは揮発性元素の同位体組成変動をひきおこすか

本研究では,火山活動など蒸発現象により,同位体組成の変動がひきおこされるかを検討した.2年間の研究期間に以下のことを明らかにした.1,ICP質量分析計による,スズ,銅,亜鉛の同位体測定法を確立した.それぞれの元素の試料からの精製法を検討した.銅と亜鉛に関しては^<65>Cu/^<63>Cu,^<66>Zn/^<64>Zn比が0.2‰の精度で測定可能である.スズについては^<116>Sn/^<120>Snについて同位体測定は0.2パーミル程度で可能であるが,試料精製の際の同位体分別が1‰程度起こることが分かった.スズの精製法の改良が今後の課題である.2,中国の殷の時代の青銅器数試料を分析し,スズの同位体組成が試料により有意の差を持つことを明らかにした.これは青銅器の繰り返し溶融による,同位体組成の変動により生じた可能性がある.蒸発実験の結果,同位体変動を起こすことを確認した.同位体組成変化の大きさは今後の考察が必要である.この成果については2001年地球化学会年会と2002年のGoldschmidt Meetingで口頭発表した.3,火山活動により放出される銅,亜鉛の同位体組成が有意に変動することを明らかにした.三宅島の2000年噴火とラバウル火山の火山灰から純水により溶脱した成分を試料として用いた.ただし,銅や亜鉛の濃度と同位体組成の間にはこれまでのところ相関は見出せなかった.また噴火活動の推移と同位体組成の変動についても明瞭な相関は見出せなかった.この成果については2002年地球化学会年会で口頭発表した.ラバウルの試料については,今後測定試料を増やし分析を続ける.試料の主成分及び微量元素分析も行っている.本研究は,自然界の試料で蒸発による同位体変動が,観測されるかを検討している.本年はまず,スズ,亜鉛,銅の同位体分析法の検討を行った.ICP質量分析計を用いることにより,116Sn/120Snの同位体比が0.2〓程度,65Cu/63Cu同位体比が0.2〓程度,66zn/64Zp同位体比が0.2〓程度で測定可能なことを確認した.元素精製などの化学操作の際に,スズでは1〓程度の同位体分別が起こることを確認した.銅,亜鉛では化学操作の間の同位体分別は小さい.スズについては,まず考古学資料について同位体変動が見られるか検討した.その結果,中国産の青銅器で実験誤差よりも有意に大きい3〓程度の変動が存在することを確認した.青銅器のリサイクル使用に伴う,繰り返し蒸発の影響の可能性がある.蒸発実験を行い,同位体変動を再現することに成功した.これらの成果は2001年地球化学会年会で口頭発表した.今後,過去の精錬技術を検討した,蒸発実験を予定している三宅島の2001年火山灰試料を純水で洗い,付着した成分を分析したが,スズは回収できなかった.これはスズが蒸発の際に酸化されて,水に不溶の4価のスズになったためと考えられる.銅,亜鉛については三宅島火山灰試料から付着成分を回収することに成功した.同位体分析を開始したがこれまでのところ有意の同位体変動は観測されていない.今後,付着成分の化学組成と組みあわせた議論を行う.本研究では,火山活動など蒸発現象により,同位体組成の変動がひきおこされるかを検討した.2年間の研究期間に以下のことを明らかにした.1,ICP質量分析計による,スズ,銅,亜鉛の同位体測定法を確立した.それぞれの元素の試料からの精製法を検討した.銅と亜鉛に関しては^<65>Cu/^<63>Cu,^<66>Zn/^<64>Zn比が0.2‰の精度で測定可能である.スズについては^<116>Sn/^<120>Snについて同位体測定は0.2パーミル程度で可能であるが,試料精製の際の同位体分別が1‰程度起こることが分かった.スズの精製法の改良が今後の課題である.2,中国の殷の時代の青銅器数試料を分析し,スズの同位体組成が試料により有意の差を持つことを明らかにした.これは青銅器の繰り返し溶融による,同位体組成の変動により生じた可能性がある.蒸発実験の結果,同位体変動を起こすことを確認した.同位体組成変化の大きさは今後の考察が必要である.この成果については2001年地球化学会年会と2002年のGoldschmidt Meetingで口頭発表した.3,火山活動により放出される銅,亜鉛の同位体組成が有意に変動することを明らかにした.三宅島の2000年噴火とラバウル火山の火山灰から純水により溶脱した成分を試料として用いた.ただし,銅や亜鉛の濃度と同位体組成の間にはこれまでのところ相関は見出せなかった.また噴火活動の推移と同位体組成の変動についても明瞭な相関は見出せなかった.この成果については2002年地球化学会年会で口頭発表した.ラバウルの試料については,今後測定試料を増やし分析を続ける.試料の主成分及び微量元素分析も行っている.
in vitro シナプス形成で自己組織化された大脳皮質神経回路の構造と機能

本年度はヒトノ記憶メカニズムにおいて組織レベルで重要な役割を担っているとされる海馬の構造機能に付いて総合的な考察を加え、「トレ-シング回路・海馬連合強化モデル」を提唱し、国際誌に発表した。海馬がヒトノ陳述記憶に重要であるという考えは、両側性に海馬とその周辺を切除されたてんかん患者、H.M.が前向性健忘症を示したという症例によって強く示唆されている。本モデルは1989年に発表したヒト記憶トレ-シング回路説を発展させたものでヒト海馬の強化(consolidation)機能の実体が呈示出来るばかりでなく、2つ以上の記憶ニュ-ロンを結び付ける連合機能も海馬にあるという新しい考え方である。最近明らかになってきた海馬内外のニュ-ロン回路構造と機能のデ-タをふまえ、海馬の強化・連合機能モデルを考えついた。先ず、海馬と大脳皮質には海馬傍回を介した両方向性の投射があるという報告は、大脳皮質にある記憶ニュ-ロン回路とつながった閉回路の存在を可能にする。この閉回路は大脳皮質の記憶ニュ-ロン回路のトレ-シングをより延長し、長期記憶へのシナプス変化をより促進し、記憶の強化メカニズムの実体となる。しかも、海馬での主なニュ-ロン回路である入力→CA3→CA1→出力というニュ-ロン回路のうち、1つのCA3ニュ-ロンからCA1ニュ-ロンへの投射は、数百μmの厚さで輪切りにした切片中では殆ど起こっておらず、長軸方向のほぼ全長に渡った他のCA1ニュ-ロン群の樹状突起に対して行われていることが本重点研究の石塚班員らによって報告された。この重要な発見は海馬のある部位のCA3から遠く離れた部位のCA1ニュ-ロンへの投射径路により、全く異なった感覚入力による異なった大脳皮質部分に同時に出来た2つの記憶回路同士が簡単に連合出来ることを示している。しかもこの歯状回→CA3→CA1シナプスがLTPを起こすのである。さらに、膜電位感受性色素を用いた海馬長軸方向への興奮の広がりの観察も、この様な長軸方向を結ぶ回路が機能的にも存在し重要な働きをしていることを支持している。一方、大脳皮質内でも、繰り返し同時に呈示された2つの情報の間には直接または言語系などさまざまなより高次の情報を介して間接的に、連合が形成されるに違いない。海馬を中心とする入出力系は、視床下部との連絡など非常に多様である。今後、大脳皮質ー海馬の機能的空間的特異性がどのくらいあるかなどを始め、海馬を中心とするニュ-ロン回路の詳しい構造と機能が判明すれば、海馬の持つであろうまだ未知の高次情報処理機能が明らかになると期待できる。
アンジオテンシンII 1型受容体阻害薬のインバースアゴニスト活性について

アンジオテンシンII(AngII)1型(AT1)受容体は心肥大などの様々な心血管障害の病態形成において重要な役割を果たしている。私たちはAT1受容体が、アゴニストであるAngII非依存性に、メカニカルストレスである伸展刺激によって活性化され、その活性化がインバースアゴニスト活性を有するAT1受容体阻害薬(ARB)により抑制されることを報告した。本研究では、伸展刺激によるAT1受容体活性化に重要な領域を探索し、さらに水溶性でビフェニルテトラゾールリング構造を基本骨格とするARB4種類について、インバースアゴニスト活性を薬剤間で比較し、ARBの化学構造とインバースアゴニスト活性との因果関係を検討した。AT1受容体と伸展刺激による活性化を受けないエンドセリン1タイプA受容体とのキメラ変異体を用いた検討により、AngIIによるAT1受容体の活性化にはLys199からSer252までの領域が必須であることが明らかとなったが、伸展刺激によるAT1受容体活性化に重要な領域については同定することができなかった。また、受容体の自律活性に対する抑制効果と伸展刺激による受容体に対する抑制効果のどちらを指標とした場合にも、ロサルタンは軽度のインバースアゴニスト活性しか示さなかったのに対して、バルサルタン、カンデサルタン、オルメサルタンは中等度以上のインバースアゴニスト活性を示した。バルサルタン、カンデサルタン、オルメサルタンがイミダゾールリングの側鎖として有しているカルボキシル基をロサルタンは有していないことから、ARBのインバースアゴニスト活性にはイミダゾールリングのカルボキシル基が重要な役割を果たしている可能性が考えられた。AT1受容体の構造機能解析と、ARBの化学構造とインバースアゴニスト活性との関連について検討を進めることで、よりインバースアゴニスト活性が高く臓器保護作用の強い駅Bの開発が可能となるであろう。メカニカルストレスにより、AngIIタイプ1(AT1)受容体はリガンドであるアンジオテンシンII(AngII)を介さず直接的に活性化される。また、メカニカルストレスは生体レベルでもAngII非依存性にAT1受容体を活性化することで心肥大を誘導する。伸展刺激によって活性化されたAT1受容体は、G蛋白質やJanus kinase 2との共役を介して細胞内シグナルを活性化し、signal-regulated kinases(ERKs)の活性化やなどの心肥大反応反応を誘導するが、伸展刺激によるAT1受容体活性化に必須な領域はまだ同定されていない。AT1受容体と同じくG蛋白質共役型受容体に属するエンドセリン1タイプA(ET-A)受容体も心肥大形成に重要な役割を果たしているが、ET-A受容体は伸展刺激による活性化を受けない。そこで、AT1受容体とET-A受容体のキメラ変異体を作成し、伸展刺激を与えた際のERKs活性化を検討することで、伸展刺激によるAT1受容体活性化に重要な領域の同定を試みた。膜貫通ドメイン(TM)6のSer252までがAT1受容体で、それ以降の領域がET-A受容体であるキメラ変異体では、AngII刺激によるERKs活性化が保たれていたが、TM5のThr198までがAT1受容体で、それ以降の領域がET-A受容体であるキメラ変異体では、AngII刺激によるERKs活性化が消失していた。したがって、AngIIによるERKsの活性化にはLys199からSer252までの領域が必須であることが明らかとなった。一方で、伸展刺激では一定の結果を得ることが困難であり、キメラ変異体ではジスルフィド結合による受容体の構造維持機構が破綻してしまうために、機械的刺激に対して一定の構造変化を生じないという可能性が考えられた。

わが国では5種類のアンジオテンシンII(AngII)Iタイプ1(AT1)受容体プロッカー(ARB)が市販され、降圧薬として広く使われている。これらARBは多様な薬理学的特性を示すが、臓器保護作用を規定する因子としてインバースアゴニスト活性が近年注目されている。ARBのインバースアゴニスト活性の違いを明らかにするために、ロサルタン、バルサルタン、カンデサルタン、オルメサルタンについて、活性型変異体の自律的活性に対する抑制効果と伸展刺激による受容体活性化に対する抑制効果を比較検討した。受容体の自律活性に対するARBの抑制効果は、AT1受容体の111番目のアスパラギン残基をグリシンに置換した変異体(AT1-N111G)は受容体の自律的活性が亢進することが知られており、内因性のAT1受容体の発現が検出されないCOS7細胞にAT1-N111G変異体を強制発現させて、c-fos遺伝子の転写活性をルシフェラーゼアッセイにより評価した。また、伸展刺激による受容体の活性化に対するARBの抑制効果は、内因性のAngIIが存在しないHEK293細胞にAT1受容体を強制発現させて、伸展刺激によるERKsリン酸化を評価した。その結果、ロサルタンは軽度のインバースアゴニスト活性しか示さなかったのに対して、バルサルタン、カンデサルタン、オルメサルタンは中等度以上のインバースアゴニスト活性を示した。ARBはビフェニルテトラゾールリングを共通の基本構造としているが、イミダゾールリングの側鎖構造が異なっている。特に、バルサルタン、カンデサルタン、オルメサルタンが側鎖として有しているカルボキシル基をロサルタンは有していないことから、ARBのインバースアゴニスト活性にはイミダゾールリングのカルボキシル基が重要な役割を果たしている可能性が考えられた。
非相溶高分子ブレンドのトポロジー転移と電気粘性効果

せん断流下において非相溶高分子ブレンドの3次元構造観察とせん断応力測定を同時に行なうことができる装置を開発した。これを用いて、無せん断流下で電場を印加したときのドロプレットの合体およびカラム構造形成過程を初めて観測した。さらに、せん断流下でステップ電場を印加した場合のネットワーク構造形成過程を明瞭に観察することができた。過渡過程における3次元構造から求めた界面テンソルを基に構造と応力の間に成立する関係を明らかにした。ソフトマターはその柔軟性のために外場(電場、磁場、流動場)により容易に大変形が起こり、その結果として粘弾性等に劇的な物性変化が生じるため、応用上も重要である。例えば、互いに相溶しない2種類の流体を混合すると単一の流体には無い新たなレオロジー的性質が現れることが古くから知られている。本研究では、流動および電場下においてソフトマター(主に非相溶高分子ブレンドと液晶)の3次元動的構造観察とレオロジー測定が同時にできるシステムを構築し、非平衡系における構造とレオロジーの関係、さらに転移機構を明らかにする。互いに相溶しない2種類の流体を混合すると単一の流体には無い新たなレオロジー的性質が現れることが古くから知られており、その制御は工業的に重要である。我々は共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いてある種の非相溶高分子ブレンドにおいては流動に加えて電場を印加するとこれらの相乗効果により界面構造の単なる変形に止まらず、そのトポロジーまでもが変化し、平均粘度が劇的に増大する現象(電気粘性効果)を見出している。例えば、せん断流下でドロプレットが分散した構造は電場を印加するとネットワーク構造へ変化する。この結果は、非相溶高分子ブレンドにおいてトポロジー変化を引き起こす外場として電場が極めて効果的で、レオロジー特性を制御するのに有用であることを示している。本研究では、流動および電場下において非相溶高分子ブレンドの3次元動的構造観察とレオロジー測定が同時にできるシステムを構築し、非平衡系における構造とレオロジーの関係、さらに転移機構を明らかにする。共焦点レーザー顕微鏡とレオメーターにより、せん断流および電場下において非相溶高分子ブレンドの構造変化を観察できるようになった。液晶性高分子とオイルのブレンドにせん断流と電場を印加したところ、応力の増大が観測され、それに伴って構造変化が観察された。せん断流と電場により形成された構造は全体的にはネットワークであるが、微細構造を持ち、高さ方向へと進むとネットワークの結合が変化することがわかった。さらに、せん断速度および電場を大きくすると網目が小さくなり、それに伴って応力も徐々に増大することが明らかになった。本研究では流動および電場下において非相溶高分子ブレンドの3次元動的構造観察とレオロジー測定が同時にできるシステムを構築し、非平衡系における構造とレオロジーの関係、さらに転移機構を明らかにする。昨年度に続き、共焦点レーザー顕微鏡とレオメーターにより、せん断流および電場下において非相溶高分子ブレンドの構造変化を調べた。本年度は非相溶高分子ブレンドにせん断流下でステップ電場を印加したときのせん断応力測定および構造観察を行なった。次元解析により電場が時間に依存する場合のスケーリング関係を導出し実験結果と比較したところ、良く一致していた。無電場下でせん断速度をステップ的に変化させたときのスケーリング関係は実験的に検証されていたが、電場については本研究により初めて導出され、実証された。低分子液晶の電気粘性効果の研究も行なった。一定電場下でオシレーション測定を行なうと複素粘土に特徴的な緩和が現われ、一定周波数において電場強度を上げると、複素粘度の実部が増大するとともに、虚部がピークをとることがNarumiらによって見出されていた。本研究では液晶の構成方程式であるエリクセンーレスリーの方程式を解くことによって、複素粘度の表式を導出するとともに、粘性係数が知られている液晶を用いてこの表式が正しいことを実証した。本年度は、せん断流下で分散したドロプレットの交流電場に対する応答を調べた。その結果、応力が印加電場の周波数の2倍の周波数を持って振動し、周波数依存性にドロプレットの変形に由来する特徴的な緩和が見られた。その緩和時間はドロプレットサイズに比例し、せん断速度に反比例することが分かった。MM(Maffettone-Minale)モデルを用いてこの結果を解析したところ、ドロプレットの変形モードに対する固有値が複素数になることが判明した。

実際、応答関数には実部が負になるところがあり、単純な緩和でなく、減衰振動であることが明らかとなった。この結果は、MMモデルによれば、ポテンシャルを持たない速度勾配テンソルの反対称部分に起因するものであり、非平衡定常系の顕著な特徴の一つであると考えられる。低分子液晶の電気粘性効果の研究も行なった。本年度は一定せん断下で交流電場に対する応力応答を調べた。交流電場の周波数に対して特長的な緩和が見出された。液晶の構成方程式であるエリクセンーレスリーの方程式を解くことによって、応力の電場応答の表式を導出し、実験結果と比較したところ、両者はほぼ一致した。互いに相溶しない2種類の流体を混合すると単一の流体には無い新たなレオロジー的性質が現れることが古くから知られており、その制御は工業的に重要である。本研究では流動および電場下において非相溶高分子ブレンドの3次元動的構造観察とレオロジー測定が同時にできるシステムを構築し、非平衡系における構造とレオロジーの関係、さらに転移機構を明らかにする。今年度は、本研究で作成したせん断流下において構造観察ができるシステムを用いてステップ電場を印加したときの構造変化とレオロジーの関係を詳細に調べた。電場を印加するとドロプレットが伸び、カラムとなり、さらにカラムが複雑に絡み合ってネットワークが形成されることがわかった。このような構造変化に対応してせん断応力が増大するが、3次元画像解析から界面テンソルを計算し、応力増大が界面張力およびマックスウェルの応力に起因することが明らかとなった。また、定常せん断流下でのドロプレットの合体頻度を求める新たな方法を考案した。ドロプレットを蛍光色素で染色した後、半数のドロプレットに強い光を照射し、褪色させる。この後、せん断を印加するとドロプレットが合体・分裂を繰り返し、褪色していない色素が拡散する。このときの画像を解析することにより定常せん断流下におけるドロプレットの合体頻度を初めて求めることに成功した。その結果、理論的に予想されていた、合体頻度とせん断速度およびドロプレットの体積分率の比例関係を実験的に確かめた。平成21年度までの研究により、ステップ電場を印加したときの構造変化とレオロジーの関係が界面テンソルにより関係づけられることが分かってきた。今年度は、さらに詳細な定量的測定および理論的考察を行なった。せん断流下で非相溶高分子ブレンドにステップ電場を印加すると、ドロプレットが分散した状態からドロプレットが伸びてカラムになった状態を経て、最終的にはネットワーク構造が形成される。この過程における構造を特徴づける界面テンソルを得られた3次元画像より求めた。非相溶高分子ブレンドでは2相の間に界面が存在するが、その界面上の単位法線ベクトルからつくられる2階のテンソルが界面テンソルである。
ヤマネの日内休眠場所における温湿度とその利用率に関する研究

ヤマネが生息する森林は概して湿度が保たれており、日当たりのよい南斜面では生息数が少ないと示唆されているが(中島2006)、これまでヤマネの日内休眠場所についての温湿度等の気象について調査した報告はない。そこで本研究ではヤマネが利用した巣箱とそうでない巣箱設置場所の温湿度をヤマネの活動期を通して調査するとともに、ヤマネが特に利用する巣箱設置箇所において、巣箱出入り頻度等の夜間活動状況の観察についてセンサーカメラを設置し録画画像の目視観察を行う事を目的とした。小型温湿度データロガーで411月の期間に巣箱架設箇所の温湿度計測を行う計画であったが、資材購入時期の関係で春夏にかけての計測が出来ていないため引き続き温湿度を計測してデータを集積し、1年間の温湿度の解析を行う。ヤマネの巣箱出入り頻度等の夜間活動状況の観察については、購入したセンサーカメラの感度の問題により小型のヤマネの行動を撮影できなかった。これについては機種選定が十分でなかったことが原因と考えられ、今後の調査計画に活かしたい。しかしヤマネの天敵であるテンが設置してある巣箱に加害している様子が撮影された。巣箱を開けられたり齧破される等の直接被害はなかったが、現在の巣箱設置高(1.5m)ではヤマネの巣箱利用時に天敵に狙われる可能性があることが改めて確認された。現在ヤマネの巣箱調査は目視可能な高さに巣箱をかけているのが現状であるが、そのためにヤマネを天敵に狙われる危険性を高めているとするなら大きな問題であるとともに、早急に調査方法の改善が必要である。
Ｘ線結晶構造解析とコヒーレントＸ線回折イメージングによるPBCV1の相関構造解析

巨大ウイルスであるPBCV1を用い、X線結晶構造解析とコヒーレントX線回折イメージングを用いた相関構造解析を目指した研究に取り組んだ。PBCV1の結晶を得ることができなかったが、他のウイルス結晶をモデルとして用いた周辺技術開発により、脆弱な結晶から効率よく高分解能データを取得することに成功した。X線自由電子レーザーを用いたコヒーレントX線回折イメージングでは多数の回折像を取得し、2次元の像回復に成功し、3次元再構築を目指したデータ選別に取り組んでいる。分子量が10億にも及ぶPBCV1のX線結晶構造解析とコヒーレントX線イメージングのための試料の大量調製はこれまでの研究により確立されており、必要な量は十分量調製できている。X線結晶構造解析のための結晶化を妨げる要因であると考えているPBCV1表面のファイバー状構造体の除去を目指した実験を実施しているが成果は得られていない。PBCV1の結晶構造解析を目指した周辺技術開発を平行して実施した。巨大な分子の結晶はその回折が弱い可能性があるため、既に結晶の得られている他のウイルスをモデルとして周辺技術の開発と整備を行った。モデル結晶を用い、より高分解能のX線回折データを効率よく取得するための放射光施設でのデータ収集法の改良とビームライン整備を行った。さらに、放射光を利用した回折実験では放射線損傷を避けるための結晶の凍結が一般的であるが、ウイルスの様な巨大分子の結晶は周辺環境の変化に脆弱である可能性が考えられるため、結晶の環境変化を極力避けることのできる結晶凍結の手法である高圧凍結法の改良と整備を行った。コヒーレントX線イメージングでは既に取得済みであった回折イメージの選別を実施し、PBCV1の単粒子由来であると考えられる回折パターンを複数得ることができた。ここで得られた回折イメージの位相回復を行い、低分解能ではあるが妥当な2次元イメージを得ることに成功した。また、より高分解能の回折データ取得を目指した回折実験を他のウイルスをモデルとして実施した。X線結晶構造解析とコヒーレントX線イメージングのためのPBCV-1試料の調製は恒常的に実施できており順調である。X線結晶構造解析のための結晶化は、結晶化を妨げる要因であると考えているPBCV1の表面に存在するファイバー状構造体の除去が当初の予定通りには進んでいない。結晶化に適したサンプル調製が予定通り進んでいないため、結晶化スクリーニングを実施できていない。また、コヒーレントX線イメージングのためのデータ選別と2次元の位相決定までは予定通り進んでおり、概ね順調である。以上の理由により、総合的にはやや遅れていると判断した。分子量が10億にも及ぶPBCV-1のX線結晶構造解析とコヒーレントX線イメージングを目指した試料の大量調製系はこれまでの研究により確立されており、実験に必要な量の試料は十分に調製可能となっている。X線結晶構造解析のための結晶化を妨げる要因であると考えているPBCV-1表面のファイバー状構造体の同定を目的とした各種アッセイを実施したが、現在も同定するには至っていない。また、結晶化条件の探索は継続して実施しているが結晶様の凝集体を得るのみである。結晶化時のPBCV-1の沈降が結晶化を妨げる原因であると考え、クリノスタットを用い重力加速度をキャンセルした状態での結晶化を試みたが結晶性を改善するには至らなかった。巨大分子の結晶は結晶格子が大きくなることが予想されるため、その回折強度は弱くなると考えている。そこで、既にこれまでの研究で結晶が得られている他のウイルス様粒子をモデルとして、X線結晶構造解析の周辺技術開発と整備を行った。モデル結晶を用い、より高分解能のX線回折データを効率よく取得するための放射光施設でのデータ収集法の改良とビームライン整備を前年度に引き続き実施した。放射光を利用した回折実験では放射線損傷を低減させるため、結晶を凍結することが一般的であるが、ウイルスの様な巨大分子の結晶はこれまでの経験から周辺環境の変化に脆弱であると考えている。そこで、結晶の環境変化を極力避けることのできる結晶凍結法である高圧凍結法の改良と整備を実施した。コヒーレントX線イメージングのために既に取得済みであった回折イメージから2次元イメージングに前年度までに成功したが、より高分解能かつ精度の高いデータを取得するために、新たに回折実験を実施した。これまでよりも精度の高いデータ収集に成功しており、新規データからの2次元イメージングにも成功しており、更なる回折データの選別に取り組んでいる。X線結晶構造解析とコヒーレントX線イメージングを目指した試料の大量調製は恒常的に実施できており順調である。また、コヒーレントX線イメージングのための新たな回折実験を実施し、そのデータ解析を進めているため比較的順調である。しかし、X線結晶構造解析を目指した結晶化では、結晶化条件、結晶化方法、サンプル調製方法と検討を実施したが、結晶取得には至っておらず、予定通り進んでいない。以上の理由より、総合的にはやや遅れていると判断した。X線結晶構造解析のための結晶化を妨げる要因であると考えているPBCV-