hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生命系の大局的構造とその階層的複雑化に対する理論構築

ヒトゲノム解読も一応終了して網羅的研究もトランスクリプトームやプロテオームへと広がりつつあるなかで、網羅的生命情報から「生命をシステムとして理解する」方向が、最近の重要な目標の1つになりつつある。申請者はこれまで複雑系の視点から生命系の解明に携わってきたが、近年、発生制御遺伝子など生命の系構築に関連するゲノム情報が急速に蓄積される状況を踏まえ、生命のシステム的構造についての枠組み理論の構築には、これら「系構築」関連遺伝子グループの網羅的ゲノム情報を詳細に検討し、「システムとしての生命」が進化的にも発生的にもどのように形成されるかを解明することが最も有効なアプローチであると考えた。そして、2つの課題を究明した。(1)遺伝子ネットワーク系の進化理論の構築とHox系およびMHC系への適用遺伝子ネットワークの<ネットワーク構造>の進化についてその進化的複雑化を解明する方法論を構築する。とくに発生を制御する多重遺伝子族であるHox遺伝子族について、その遺伝子重複による進化的複雑化の過程を明らかにした。(2)タンパク質間相互作用ネットワークによる生命分子ネットワークの構築原理の解明Yeastのtwo-hybridsystemによるデータを基礎にして、生命分子ネットワークの構築原理を解明した。本研究では多細胞生物に特有な発生関連遺伝子の階層的構造の形成過程を進化的に解明するもので、当該領域の目標達成に他の班員の実験的研究成果と総合して、システム理論の立場から貢献した。
造血系疾患の治療を目指した歯髄、骨髄の神経堤及び中胚葉由来間葉の造血支持能の研究

中胚葉或いは神経堤由来細胞を蛍光標識し、かつジフテリアトキシン受容体(DTR)を発現し、DT投与により中胚葉或は神経堤由来細胞を欠損させることの出来るマウスを用いて、神経堤或は中胚葉に由来する細胞を欠損させると胸腺及び骨髄の造血に異常が見られる事を明らかにした。神経堤由来細胞は間葉のみならず、自律神経や副腎髄質にも寄与し、神経堤欠損マウスでは、血中のアドレナリンやノルアドレナリンが減少し、これが造血異常の原因である可能性が示唆された。新生仔マウス歯髄間葉が骨髄間葉同様にB細胞や破骨細胞の分化支持能を持つ事を見いだしたが、胎仔歯髄には胎仔骨髄同様の造血器官形成能や造血支持能は確認できなかった。神経堤或は中胚葉由来細胞特異的にCre-recombinaseを発現し、Creの存在下で蛍光遺伝子とジフテリアトキシン(DT)受容体を発現するマウスを作製し、DT投与により、骨髄、胸腺の造血異常を認めた。造血異常の原因と歯髄の造血支持能を調べる目的で以下の研究を行い、結果を得た。[1]造血異常が骨髄或は胸腺の間葉欠損によるか、全身性の影響かを明らかにする為に,胸腺に焦点をおき、胸腺を単離し、血液細胞のみ区別出来るマウスの腎皮膜下に移植し、移植後にDTを投与した。DT投与により蛍光標識された間葉細胞は殆ど消えたが、DT投与群にT細胞の分化異常は認めなかった。[2]放射線照射マウスから胸腺を単離し、血液細胞を区別できるマウスの腎皮膜下に移植し、DT投与後の間葉が欠損した状態での血液細胞の移植胸腺内移入とT細胞分化について検討したが、大きな差は認められなかった。[3]造血異常が骨髄間葉の欠損によるかを調べる目的で、骨髄細胞培養にDTを添加し、造血支持能を調べたが、非添加群との間に大きな差は認めなかった。[4]DT投与により胸腺細胞が減少する原因の1つに神経堤由来細胞欠損によるアポトーシスの亢進を認めた。[5]DT投与による間葉細胞死が炎症性サイトカイン等の血中への放出を誘導し、造血異常を誘導する可能性を考慮し,DT投与マウスの血漿を正常マウスの静脈内に接種し同様の現象が誘導できるかを検討したが、同様の病態は誘導できなかった。[6]胎仔骨髄、胸腺を免疫不全マウスに移植し、片方の間葉を欠損させた上で,造血機能を確認する系を確立した。また、胎仔胸腺のみならず胎仔骨髄のDT添加による器官培養系を確立した。[7]胎仔骨髄中には骨髄形成能・造血支持能を持つ細胞集団が存在することが知られるが、同様の細胞表面マーカーを持つ集団が胎仔歯髄にも存在することを見いだし、現在造血支持能を検討している。神経堤細胞或は中胚葉細胞に特異的にCre-recombinaseを発現するマウスとCreの存在下で蛍光遺伝子YFPとジフテリアトキシン(DT)受容体を発現する3種類のマウスを用いて、主に以下の実験を行った。[1]中胚葉或いは神経堤由来細胞を特異的に標識及び欠損させることのできるマウスを用いて胸腺、骨髄等の造血器官形成における2種類の間葉細胞の役割を解析したところ、片方の間葉が欠損する事で、特にリンパ球の造血に異常が出る事がわかった。さらに凍結切片を作製し骨髄や胸腺の組織学的変化を調べている。[2]神経堤細胞は、自律神経、特にアドレナリン等の産生細胞でもあり、これらの生体でみられた現象が、全身的な影響か、局所における間葉の欠損の直接的な影響かを調べる方法として、器官培養法を用いた。まずは、マウスの胎仔胸腺、胎仔大腿骨を単離し、器官培養を行ない、培養液中にDTを加え、片方の間葉を欠損させ、マウスの間葉が一種類になった場合のT細胞、B細胞分化へ影響をフローサイトメトリーにて検討した。[3]さらに成体骨髄や胸腺での両間葉細胞の役割を調べるために、放射線照射し、血液細胞を死滅させ、間葉細胞が残る条件で放射線照射した胸腺と骨髄を、免疫不全或はホストとドナーの血液を区別できるマウスの腎皮膜下等に移植し、さらにDT投与し、間葉を欠損させて、造血への間葉の影響を調べた。[4]さらに、試験管内での両間葉細胞の造血への役割の解明として、これらのマウスから骨髄細胞を取り出し、播種し、DTを加えて培養し、片方の間葉を欠質させた状態でのB細胞或はマクロファージ系への分化誘導の影響を解析した。

今回、特に中胚葉系細胞は、間葉のみならず血液細胞にも寄与しているので、放射線照射にて、造血細胞を入れ替え、間葉細胞のみの欠損による造血支持能への影響を検討している。神経堤及び中胚葉由来間葉細胞の欠損モデルで認められた血液細胞、特にリンパ球の異常の原因を明らかにする為に、神経堤細胞が間葉細胞のみならず、末梢神経や副腎髄質に寄与することからカテコラミンに焦点を置き、測定を行なった。間葉細胞の欠損マウスでは、ノルアドレナリン、アドレナリンの濃度が激減していたが、ドーパミンの濃度は増加していた。従って、ドーパミン産生神経以外の神経に原因があると考えられた。続いて、アドレナリン及びノルアドレナリンのどちらが、リンパ球異常の原因であるかを検討する目的で、副腎除去手術を行ない、リンパ球への影響を調べた。副腎除去によりアドレナリンの血中濃度は激減したが、リンパ球の異常は認められなかった。さらに、カテコラミンの血液系細胞への影響を考える為に、神経毒である6-OHDAを投与したモデルマウスを作製した。6-OHDA投与マウスでは、間葉細胞の欠損に類似した症状を認めた。これらのマウスの血中カテコラミンを測定したところ、ドーパミン、ノルアドレナリン、アドレナリンの全てが減少していた。上記の二つの実験からノルアドレナリンの減少がリンパ球の異常に関わる可能性が考えられた。ノルアドレナリンが、神経接合部で分泌され、神経機能に重要である事、交感神経が造血幹細胞の骨髄内での維持や移動に深く関わるという報告があるので、骨髄中のtyrosine hydoroxyrase陽性の交感神経の存在を確認し、さらに交感神経から分泌されるノルアドレナリンの受容体が間葉系細胞に発現しているかを検討した。最後に、胎仔期の歯間葉の造血支持能を検討する為に、胎仔骨髄細胞を指標に、骨髄及び歯間葉の非血液分画を単離し、ヌードマウスに移植し、造血支持能を検討した。少なくともB細胞に関して、胎仔期の骨髄間葉と異なり、胎仔歯間葉にはB細胞の分化誘導能が殆ど認められなかった。幹細胞発生学結果を基に、[1]腎皮膜下への成体胸腺移植と解析[2]間葉細胞の試験管内造血への影響の検討[3]歯髄間葉細胞と骨髄間葉細胞の遺伝子発現の検討[4]胎仔骨髄と歯髄間葉細胞の単離と移植[5]胎仔胸腺及び骨髄の器官培養法及び移植系の検討を行なった。神経堤由来細胞からなる歯髄間葉が、造血関連因子SCF,IL7,SDF1の発現が高く、これら神経堤由来間葉が骨髄・胸腺にも存在することから、神経堤由来間葉が造血細胞の分化や移動に深く関わると想定したが、現在の結果から必ずしも説明はできない。[1][2]から神経堤由来細胞欠損による造血異常が、骨髄や胸腺自体の間葉欠損というよりは、それ以外の原因である可能性が示唆される。DT投与し間葉細胞を欠失させたマウスの血漿移入にて、病態が再現できない事から、炎症性サイトカイン等の上昇により、造血異常が誘導されたとは考えにくく,神経堤由来細胞の全身性異常としてカテコラミンの異常による可能性を考えて実験を進めている。[3]歯髄と骨髄間葉のマイクロアレイ[4]造血幹細胞と間葉細胞を同時に放射線照射マウスに移植し,造血の再構築は,一時中断した。一方,腎皮膜下移植系にてCD45-CD31-CD105+Thy1.2-の胎仔骨髄細胞が骨髄形成能を持つ事がわかり、歯髄細胞にも同様の細胞集団が存在するので、単離・移植による骨髄器官の形成能については検討中である。我々は、これまで歯、胸腺、骨髄の間葉細胞が主に神経堤と中胚葉に由来することを明らかにし、特に歯の間葉系幹細胞が神経堤に由来することを明らかにした。
スピンドル運動を制御する遺伝子機能と産物の研究

分裂酵母S.pombeの温度感受性変異nuc2-663は制限温度下核分裂におけるスピンドル運動を特異的に阻止する.その結果,短いスピルドンは形成されるものの,伸長することができずに停止する.この時染色体は凝縮し,中期プレート様構造を形成し,短スピンドルはこれに垂直に位置する.すなわち, nuc変異は核分裂中期より後期への遷移をブロックするようである.野生株および許容温度下Dのnuc変異株では,スピンドルは約5倍に伸長する.nuc2^+遺伝子をクローン化した.塩基配列の決定さらにRNaseプロテクション実験からイントロンの存在の決定により,予想されるアミノ酸配列が求められた. 665個のアミノ酸より成立し,分子量76000で,内部に反復単位を持つ.大腸菌においてnuc2タンパクを大量に生産し,純化後,抗原として用いウサギより抗血清を得た.この抗血清を用い,分裂酵母エキストラクト中に分子量67000のポリペプチドp67を検出した.このp6D7は,分裂酵母におけるnuc2^+遺伝子を多コピーにすると増産されたことから, nuc2D^+遺伝子によってコードされることが明らかである.細胞分画およびウエスタンブロッティングにより, p67は核分画に存在することを見い出した.核分画中の不溶性部分に主として存在する.この不溶性画分は, 2MNaCl, 25mMLISに不溶なのでいわゆる核骨格もしくは核マトリックス部分と類似する. nuc2タンパクは可溶性のp76前駆体を経て不溶性になるようである. p67は,動原体タンパクのような核骨格様タンパク,もしくはスピンドル装置内で核マトリックス類似の挙動をするのかもしれない.もし動原体タンパク質であるなら,これがスピンドル運動を調節することになり大変興味深い.分裂酵母S.pombeの温度感受性変異nuc2-663は制限温度下核分裂におけるスピンドル運動を特異的に阻止する.その結果,短いスピルドンは形成されるものの,伸長することができずに停止する.この時染色体は凝縮し,中期プレート様構造を形成し,短スピンドルはこれに垂直に位置する.すなわち, nuc変異は核分裂中期より後期への遷移をブロックするようである.野生株および許容温度下Dのnuc変異株では,スピンドルは約5倍に伸長する.nuc2^+遺伝子をクローン化した.塩基配列の決定さらにRNaseプロテクション実験からイントロンの存在の決定により,予想されるアミノ酸配列が求められた. 665個のアミノ酸より成立し,分子量76000で,内部に反復単位を持つ.大腸菌においてnuc2タンパクを大量に生産し,純化後,抗原として用いウサギより抗血清を得た.この抗血清を用い,分裂酵母エキストラクト中に分子量67000のポリペプチドp67を検出した.このp6D7は,分裂酵母におけるnuc2^+遺伝子を多コピーにすると増産されたことから, nuc2D^+遺伝子によってコードされることが明らかである.細胞分画およびウエスタンブロッティングにより, p67は核分画に存在することを見い出した.核分画中の不溶性部分に主として存在する.この不溶性画分は, 2MNaCl, 25mMLISに不溶なのでいわゆる核骨格もしくは核マトリックス部分と類似する. nuc2タンパクは可溶性のp76前駆体を経て不溶性になるようである. p67は,動原体タンパクのような核骨格様タンパク,もしくはスピンドル装置内で核マトリックス類似の挙動をするのかもしれない.もし動原体タンパク質であるなら,これがスピンドル運動を調節することになり大変興味深い.本研究は染色体分離運動に関わる分裂装置のスピンドル伸長を制御する遺伝子機能と産物を明らかにすることを目的としている。分裂酵母S.pombeの細胞周期突然変異nuc2は温度感受性(ts)であり、制限温度下に細胞を置くと、高度に同調して有系分裂期に停止する。この時、均一長で短かいスピンドルが形成されるが、伸長はおこらない。nuc2遺伝子産物が有系分裂後期におけるスピンドル伸長に直接関与する可能性が高い。本遺伝子機能と産物を明らかにするうえで、以下に述べる実績を得た。1.nuc2遺伝子をクローン化した。全塩基配列を決定し予想されるタンパク質のアミノ酸配列を得た。2.nuc2遺伝子DNAを1acZプロモーター領域と結合し、nuc2タンパク質を大腸菌において大量に生産した。さらにこのタンパク質を純化した。3.純化されたnuc2タンパク質を抗原としウサギにおいて抗血清を二種類調製した。4.この抗血清は分裂酵母細胞抽出液中において、分子量67Kのタンパク質をウエスターン法において検出した。DNA塩基配列から予想される分子量と一致する。5.分子量67Kタンパク質(p67)は、nuc2遺伝子をマルチコピープラスシドおよび高発現プロモーターADHと結合して細胞内に導入すると、数十倍増産された。これよりnuc2の産物がP67であることが結論できた。6.p67の細胞内局在を、細胞分画、オルガネラ分画とウエスターン法の併用により調べた。その結果、p67は核に局在し、不溶性であり、ごく少量(細胞あたり1000コピー程度)存在することが明らかとなった。
音声インターフェースを持つ学習支援ロボットの開発に関する研究

1.研究の流れ:(1)装置仕様の検討:学習環境や身体情報として有効な計測項目と可能性について検討(2)基本動作の検討:装置の基本仕様に小学生の興味関心を加味してロボットの動作を検討(3)装置の製作と性能評価:仕様に基づいて回路の設計及び試作、プログラム開発を実施2.結果:(1)計測部:身体情報として体温、脈拍、運動量(万歩計)、気分(本人判定)を測定項目とした。学習環境の測定項目として室温、照度、就寝・起床時間、騒音を検討した。(2)音声応答処理部:対話処理を実現するために対話の範囲と応答に必要な語彙について検討し、(1)生活リズムに関するもの(対話型)(2)存在確認に関するもの(呼びかけ型)(3)健康状態に関するもの(対話型)(4)就寝・起床に関するもの(対話型)(5)周辺環境に関するもの(呼びかけ型)(6)その他(対話型)の6群に分類した。これらは児童からの呼びかけに応答する対話型とシステム側から呼びかける呼びかけ型からなり、それぞれの群に約50語からなる音声辞書を持たせた。音声応答処理はNEC製1チップMPU V850Eを採用し、ソフトウエアで音声認識及び音声合成を実現した。(3)表示動作部:児童に親近感を与えたり、感情の動きを明示的に伝える為の仕様を検討した。(1)否定と強い否定:頭部左右2段階の回転動作(2)肯定と強い肯定:頭部上下2段階の動作(3)驚き、興奮:左右耳部収縮動作(4)叱責、穏やか、冴え:瞳部LEDの点灯及び色の変化(赤、白、青)(4)統合制御部:各部の連携を行う総合制御部にはHITACHIのMPU、SH3を採用した。3.考察:本年度は音声応答処理部に重点を置いて開発を行った。プロトタイプを使った音声認識の評価では、不特話者に対して認識率の低下は認められなかった。また、実用的に扱うことのできる語彙数は約50語程度と言える。これらの結果から音声認識は現方式で対応可能と考える。一方、音声合成はメモリ容量等の制約から音素単位の合成を採用したため抑揚が無く不自然さが残った。このため児童との対話には向かないと判断した。実用化ではADPCM方式などの検討が適当と考える。1.平成13年度に実施した音声インターフェースを持つ学習支援ロボットの開発に関する研究の流れ開発は声認識・音声合成回路、学習環境計測部及び身体情報計測部、音総合制御部の順で分割して行い、プログラムも各部位に合わせて開発を進めた。(1)音声認識・音声合成回路の設計及び試作音声合成・音声分析に関する資料収集を行い、半導体メーカー数社の該当LSIについて資料上での選択の上、NEC製の音声認識LSIを使ったプロトタイプを製作の上評価を行った。(2)学習環境及び身体情報の計測部の設計及び試作小学生を対象に実施した「児童生徒の学習環境が身体に及ぼす影響」や「生活のリズムと健康の関係」についての調査結果等を基に学習環境や身体情報として計測すべき項目について検討した。これを基に学習環境や身体情報を収集するためのセンサーの選定、回路構成の検討を行った。(3)総合制御部統合制御部は処理内容などについてまとめた上で主要部のMPUと回路構成について検討した。2.本年度実施した研究により得られた知見(1)製作した音声合成・音声分析回路プロトタイプの評価では認識語の数が50単語程度であるが、処理の内容を限定することにより予定している性能は得られる見通しを持った。(2)学習環境の測定項目の一つとして生活のリズムについて周囲の明暗、時計、騒音等で判断する事にした。この他気温、湿度、照度を測定し、学習環境の補助情報とする。身体情報収集回路はペット型ロボット本体とは別に万歩計型の独立した装置とし、被測定者は常時携帯する仕様とした。身体情報として脈拍、体温、歩数を測定する。(3)統合制御部は推論機構や高度な応答処理を実現する必要性を考慮して検討した結果、HITACHI社RISC型MPU SH-4が妥当であるとの結論を得た。(1)否定と強い否定:頭部左右2段階の回転動作

(2)肯定と強い肯定:頭部上下2段階の動作(3)驚き、興奮:左右耳部収縮動作(4)叱責、穏やか、冴え:瞳部LEDの点灯及び色の変化(赤、白、青)(4)統合制御部:各部の連携を行う総合制御部にはHITACHIのMPU、SH3を採用した。3.考察:本年度は音声応答処理部に重点を置いて開発を行った。プロトタイプを使った音声認識の評価では、不特話者に対して認識率の低下は認められなかった。また、実用的に扱うことのできる語彙数は約50語程度と言える。これらの結果から音声認識は現方式で対応可能と考える。一方、音声合成はメモリ容量等の制約から音素単位の合成を採用したため抑揚が無く不自然さが残った。このため児童との対話には向かないと判断した。実用化ではADPCM方式などの検討が適当と考える。
細胞シミュレーションによる心筋細胞発生過程の理解

本研究は、包括的心筋細胞モデル(Kyoto model)に基づき、齧歯類の発生過程上典型的な4段階(胎生初期、胎生後期、新生仔期、成体)における心室筋細胞のモデル化を行い、構築したモデルを用いたシミュレーション(試行実験)を行っている。昨年度は最新の文献に基づいたKyoto modelの更新により、従来モデルによる胎生初期段階の自発的な活動電位の形成や、胎生後期段階以降の活動電位持続時間の一連の変化の定性的な再現に加え、1)胎生初期心室筋細胞の基本周期長および2)胎生後期・新生仔期心室筋細胞の細胞内イオン濃度等の定量的な値を従来のモデルよりも精密に再現することが可能となった。本年度は、更新したモデルに基づき、新生仔期段階におけるNa^+-Ca^<2+>交換機転の過剰活性の意義に関する理論的な考察を行った。Na^+-Ca^<2+>交換機転は、細胞内外のNa^+イオンの濃度勾配エネルギーにより3個のNa^+イオンと1個のCa^<2+>イオンが交換し、Ca^<2+>イオンを細胞外へ汲み出す起電性のトランスポータである。筋小胞体が未発達の細胞では、Na^+-Ca^<2+>交換機転に起因する電流(I_<NCX>)の活性が高いことが報告されている。本研究では、新生仔期モルモット心室筋細胞モデルを利用し、筋小胞体を発達をシミュレーション上で進行させ、筋小胞体の発達とI_<NCX>の活性の関係を理論的に考察した。その結果、Na^+-Ca^<2+>交換機転の過剰活性は未発達の筋小胞体へのCa^<2+>の取り込み不足を補い、心室筋細胞の弛緩を促し、より少ないATP量で収縮一弛緩を行う効果があることが分かった。心臓の心室を構成する心室筋荊朋包は,胎生初期においては自律拍動を行う.しかし,発生中期に自律拍動が停止した後,特殊心筋から構成される刺激伝導系から伝わる電気により興奮する受動的な細胞へ変化する.心臓は生命維持に不可欠の機能を担うため,発生のいかなる中間段階においてもその機能を喪失するわけにはいかないと考えられるが,心筋細胞がつねに機能を維持しつつ著しく表現型の異なる細胞に分化することは驚嘆に値する.本研究では,単一心筋細胞の活動電位の発生過程による変化の概要は細胞膜を流れるイオンチャネル・交換体の量的変化で説明できるという作業仮説を立て,発生過程上典型的な4段階(胎生初期,胎生後期,新生仔期,成体)の心室筋細胞のモデル化を行った.心筋細胞の電気生理学的モデルであるKyoto Modelにイオンチャネル・交換体の量的変化を実装し,活動電位のシミュレーションを行った結果,共通の数理モデルから派生して,胎生初期,胎生後期,新生仔期,成体の活動電位を良く再現するモデルを構築できることが分かった.この結果は,発生過程における心筋細胞の電気的特性の変化の概要が,既知のイオン電流・交換体の量的変化によって説明できることを強く示唆するものである.本研究は,心筋細胞発生過程の理解にシステム生物学的アプローチを用い,単一心筋細胞レベルにおけるイオンチャネル・交換体の発生過程による変化に関する分子生物学・電気生理学的知見を数理モデルに統合した最初の試みであり,構築されたモデルを用いたシミュレーションを行うことにより,これまで精密に検討されてきた各論的事象を客観的に総合し,現象の背後に潜む因果関係を明らかにできると期待される.本研究では、現存する細胞モデルの中では高精度に現象を再現できる心筋細胞の電気生理学的モデルに基づき、心筋細胞が常にその機能を維持しつつ著しく異なる細胞に分化する過程のモデル化と観察事象の記述に留まらない考察を行う為のシミュレーション(試行実験)を行っている。昨年度は、齧歯類の発生過程上典型的な4段階(胎生初期、胎生後期、新生仔期、成体)における心室筋細胞の活動電位が細胞膜を流れるイオン電流・交換体の量的変化のみで良く再現できることを示した。本年度は、構築されたモデルを用いたシミュレーションの応用として、発生・分化の途中段階で採用された細胞のデザインを俯瞰し、モデリング・シミュレーションにより新たな解釈を加えることのできる問を模索、心筋細胞発生過程における諸現象を司る背後のメカニズムを理論的・定量的に説明した。まず、一つ目の問として、新生仔期段階におけるNa^+/Ca^<2+>交換機転の過剰活性の意義を考察し、Na^+/Ca^<2+>交換機転の増加が筋小胞体によるCa^<2+>の取り込みの不足により延長したCa^<2+>トランジェントの持続時間を短縮させ、新生仔心室筋細胞モデルが一拍動あたりに消費するATPの削減に至ることが分かった。二つ目の問では、不規則に活動する細胞と受動的な細胞が混在する心筋組織の安定性の考察を行った。電気的に繋げた二つの細胞から構成されるモデルを用いて、内向き整流K^+電流(I_<K1>)の抑制及び過分極活性化陽イオン電流(I_<ha>)の導入により誘発した自発興奮の同調性の検証を行った。その結果、I_<K1>の抑制により誘発した自発興奮は、コンダクタンスが異なる2つの細胞間でも同調されたが、I_<ha>の導入により誘発した自発興奮は、自発的な興奮が消失することが分かった。

本研究は、心筋細胞の電気生理学的モデルに基づき、齧歯類の発生過程上典型的な4段階(胎生初期、胎生後期、新生仔期、成体)における心室筋細胞のモデル化を試みた。心室筋細胞の活動電位の発生過程による変化の概要を細胞膜を流れるイオン電流・交換体の量的変化のみで再現することに成功し、構築したモデルを用いたシミュレーション(試行実験)を行っている。昨年度は、1)新生仔期におけるNa(+)-Ca(2+)交換機転の過剰活性の意義と2)不規則に活動する細胞と受動的な細胞が混在する心筋組織の安定性を問い、1)Na(+)-Ca(2+)交換機転は未発達の筋小胞体のCa(2+)の取り込み不足を補い、一拍動で消費するATPの削減を促すこと、2)過分極活性化陽イオン電流の導入により誘発される不規則な自発興奮は、コンダクタンスが異なる2つの細胞間では自発的な興奮が消失することが示唆され、観察事象の記述に留まらない考察ができる事例として提案することができた。しかし、いずれの事例においても細胞内イオン濃度が生理学的に妥当な範囲から逸脱するなど、構築したモデルを用いたシミュレーションの精度に関する課題が残った。本年度は、最新の文献に基づいた包括的心筋細胞モデル(Kyoto model)の更新を行い、上述した課題の解決を試みた。従来のモデルによる胎生初期段階の自発的な活動電位の消失(胎生後期)から、活動電位持続時間の短縮(新生仔期)、再延長(成体)の一連の変化の定性的な再現に加え、モデルの更新により、1)胎生初期心室筋細胞の基本周期長および2)胎生後期・新生仔期心室筋細胞の細胞内イオン濃度等の定量的な値をより精密に再現することができた。本研究は、包括的心筋細胞モデル(Kyoto model)に基づき、齧歯類の発生過程上典型的な4段階(胎生初期、胎生後期、新生仔期、成体)における心室筋細胞のモデル化を行い、構築したモデルを用いたシミュレーション(試行実験)を行っている。昨年度は最新の文献に基づいたKyoto modelの更新により、従来モデルによる胎生初期段階の自発的な活動電位の形成や、胎生後期段階以降の活動電位持続時間の一連の変化の定性的な再現に加え、1)胎生初期心室筋細胞の基本周期長および2)胎生後期・新生仔期心室筋細胞の細胞内イオン濃度等の定量的な値を従来のモデルよりも精密に再現することが可能となった。本年度は、更新したモデルに基づき、新生仔期段階におけるNa^+-Ca^<2+>交換機転の過剰活性の意義に関する理論的な考察を行った。Na^+-Ca^<2+>交換機転は、細胞内外のNa^+イオンの濃度勾配エネルギーにより3個のNa^+イオンと1個のCa^<2+>イオンが交換し、Ca^<2+>イオンを細胞外へ汲み出す起電性のトランスポータである。筋小胞体が未発達の細胞では、Na^+-Ca^<2+>交換機転に起因する電流(I_<NCX>)の活性が高いことが報告されている。本研究では、新生仔期モルモット心室筋細胞モデルを利用し、筋小胞体を発達をシミュレーション上で進行させ、筋小胞体の発達とI_<NCX>の活性の関係を理論的に考察した。その結果、Na^+-Ca^<2+>交換機転の過剰活性は未発達の筋小胞体へのCa^<2+>の取り込み不足を補い、心室筋細胞の弛緩を促し、より少ないATP量で収縮一弛緩を行う効果があることが分かった。
プラズモニック光捕集アンテナ界面による反応増強

本研究では、金属ナノ粒子の局在プラズモン共鳴を利用することで、局在振動電場を生じるプラズモニックアンテナ界面を作り、それらを人工光合成系に適用することを目的としている。プラズモニックアンテナ界面は、金属ナノ粒子を光アンテナとみなし、粒子近傍に存在する色素や半導体の励起効率を向上させる系と、金属ナノ粒子と酸化チタンなどの半導体界面で起こるプラズモン誘起電荷分離(PICS)を利用する系の2つに大きく分類できる。前者については、新しい光アンテナとして、金-銀合金ナノ粒子のPICSに伴う銀の溶出(脱合金化)を利用して、近赤外域にプラズモン共鳴を示すポーラスナノ粒子を作製することに成功した。金-銀合金の脱合金化およびそれに伴うポーラス化は、これまで化学的あるいは電気化学的手法で行われてきたが、本研究では光電気化学的な脱合金化にはじめて成功した。さらに、粒子がポーラス化した段階で自動的に銀の溶出が停止することが明らかとなり、従来法では難しかった、粒径25ナノメートル以下のポーラスナノ粒子の作製が可能となった。このようなプラズモニックポーラスナノ粒子は、近赤外領域の光アンテナとして利用できるだけではなく、半導体光触媒の助触媒などとしての応用も期待できる。後者については、平成27年度に引き続き、PICSにおける酸化電位の支配因子について検討を行った。PICSに伴って金ナノ粒子の表面が水酸化することが明らかとなり、その照射波長および電解液のpH依存性から、酸化チタンのフラットバンド電位から金ナノ粒子が吸収した光子のエネルギー分だけ正側の電位が酸化電位に相当することがわかった。PICSを人工光合成系における水分解反応などに適用する上で、酸化電位に関する情報は極めて重要であり、本研究によってPICSに基づく光触媒の設計指針が得られたといえる。28年度が最終年度であるため、記入しない。平成27年度は、金ナノ粒子と酸化チタンを組み合わせた系におけるプラズモン誘起電荷分離について、金の錯化溶解反応と、表面不動態化反応を利用した酸化力の評価を行った。その結果、プラズモン誘起電荷分離の酸化力が、酸化チタンのフラットバンド電位と照射光のエネルギーに依存することを見出した。これにより、プラズモン誘起電荷分離における酸化力が、電解液のpHや照射光の波長によって制御でき、本系が色素や半導体を用いた増感系とは異なる特徴を示すことがわかった。また、新たな光捕集系を構築する目的で、金のハーフシェルアレイ構造を作製し、そのプラズモン誘起電荷分離特性を評価した。ハーフシェルアレイが光吸収層と対極の役割を兼ねていることから、構造を最適化することによって、プラズモン誘起電荷分離における酸化電位を直接測定することが可能になると考えられる。さらに、銀ナノキューブのプラズモン誘起電荷分離に伴う溶解挙動を追跡することで、プラズモン誘起電荷分離が局在電場の強い部分で優先的に起こることを確認できた。その他にも、金-銀合金ナノ粒子のプラズモン誘起電荷分離を利用した脱合金化によって、ナノポーラス構造を有するナノ粒子を作製することに成功した。この光誘起脱合金化過程は、プラズモン誘起電荷分離の酸化力評価や、ナノポーラス粒子の大きい反応表面積を利用した光触媒反応に利用できると考えられる。プラズモン増強の系についても、銀ナノキューブによる全固体型量子ドット太陽電池の光電変換効率の向上に成功しており、異方的な形状の金属ナノ粒子が光アンテナとして有用であることを示した。半導体量子ドットや、それを増感剤としてワイドギャップ半導体を組み合わせた水素発生系のプラズモン増強については計画よりもやや遅れているが、銀ナノキューブなどの異方的な形状のナノ粒子が、プラズモン増強に適していることを太陽電池の光電流増強から明らかにしており、今後の研究についての明確な指針が得られている。一方で、プラズモン誘起電荷分離を利用した系については、本年度に酸化力や反応機構に関する多くの知見が得られており、順調に進展している。また、計画外ではあるが、金-銀合金ナノ粒子のプラズモン誘起電荷分離を利用したナノポーラス構造体の作製やその応用などの新たな研究展開も可能となった。以上の点から、総合的に見て、本研究はおおむね順調に進展していると言える。

このようなプラズモニックポーラスナノ粒子は、近赤外領域の光アンテナとして利用できるだけではなく、半導体光触媒の助触媒などとしての応用も期待できる。後者については、平成27年度に引き続き、PICSにおける酸化電位の支配因子について検討を行った。PICSに伴って金ナノ粒子の表面が水酸化することが明らかとなり、その照射波長および電解液のpH依存性から、酸化チタンのフラットバンド電位から金ナノ粒子が吸収した光子のエネルギー分だけ正側の電位が酸化電位に相当することがわかった。PICSを人工光合成系における水分解反応などに適用する上で、酸化電位に関する情報は極めて重要であり、本研究によってPICSに基づく光触媒の設計指針が得られたといえる。平成27年度に明らかになった、プラズモン誘起電荷分離の酸化力に関する知見から、水からの水素発生あるいは酸素発生に最適な条件を設定し、実際に実験を行う。また、金-銀合金ナノ粒子の光誘起脱合金化ついて、pHおよび照射波長依存性を調べ、本年度に得られた酸化力に関する知見を補強する。さらに、脱合金化により得られたナノポーラスナノ粒子を水からの水素発生あるいは酸素発生をはじめとした光触媒反応に応用する。それ以外にも、金属酸化物の析出を利用した、反応サイトの可視化にも着手する。半導体量子ドットや、それを増感剤としてワイドギャップ半導体を組み合わせた水素発生系については、実際に硫化カドミウム(CdS)、硫化銅インジウム(CIS)、銅亜鉛スズ硫化物(CZTS)などからの水素発生系に対して、プラズモン効果による反応増強を試みる。これらの実験は、領域内の共同研究により遂行する。28年度が最終年度であるため、記入しない。
随意性嚥下における口腔感覚の役割

本研究では健常被験者において随意性嚥下を行わせた場合、口腔咽頭・喉頭部への刺激が随意性嚥下にどのような影響を及ぼすのかを調べた。刺激溶液(蒸留水および食塩水)を咽頭部に限局して与えた実験から、受容器別に嚥下促進効果を調べることができた。嚥下間隔時間には個人差があり、繰り返しの嚥下遂行能力の低い被験者(嚥下間隔時間の長い被験者)ほど、末梢感覚刺激による嚥下促進効果が大きかった。このことから、繰り返しの嚥下遂行能力の低い人において、口腔内感覚入力が随意性嚥下を補償する役割のあることが示された。本研究では、咽頭口腔内感覚が随意性の嚥下にどの様な影響を与えるのかをテーマにしている。嚥下の効果を調べるのに連続した嚥下と嚥下の間隔時間を測定した。刺激には水あるいは0.3M食塩水を用いた。注入速度は非常に遅い速度の0.2ml/minから1.0,2.0そして比較的高速の5.0ml/minを用いた。最初に、注入速度を非常に遅くし、水を咽頭・喉頭部に限局して与えた実験では、水刺激で有効に嚥下が誘発される部位が咽頭・喉頭部に限局していることがわかった。これは水に特異的に応答する水感受性受容器が咽頭・喉頭部へ限局して存在するということに依存している。一方、舌後部にはNa味覚受容器が在るため、舌後部のNaC1溶液刺激が嚥下の促通に有効になり、水刺激は嚥下に有効で無くなった。以上の結果は、舌後部と咽頭・喉頭部では異なる刺激が嚥下の促通効果に関わっていることを示している。次に、注入速度を速くすると、さらに嚥下の促通効果は増した。これは注入量が増したことにより深部の機械受容器が興奮したためと考えられる。今回、刺激部位や刺激液の種類・流量を変えて、随意性嚥下を行わせ、嚥下促通効果への影響を調べた結果、嚥下の促通効果を水受容器、Na味覚受容器、深部機械受容器という受容器ごとの効果に分けて評価することができた。嚥下障害者や高齢者に行われている口腔ケアやリハビリの意義を明らかにするあたり、咽頭口腔内感覚を機能別に評価することは、その口腔ケアやリハビリの効果のメカニズムを知るのに非常に有用でありかっ重要である。高齢者の誤嚥性肺炎が深刻な問題になっている。本研究では誤嚥防止に寄与する口腔感覚の意義を追求するために、まず健常被験者において随意性嚥下を行わせた場合、口腔咽頭・喉頭部への刺激が随意性嚥下にどのような影響を及ぼすのかを調べた。刺激溶液(蒸留水および食塩水)を咽頭部に限局して少量与えた実験から、咽頭部への水刺激を行うと繰り返しの嚥下の嚥下間隔時間は短縮し、嚥下を促進させることが分かった。一方、高濃度食塩水刺激では、繰り返し嚥下の嚥下間隔時間は延長し、水刺激による促進効果の抑制が明らかになった。注入量を増した実験では、刺激液の容量が増えたことによって嚥下が促進されることが明らかとなり(深部機械受容器の興奮効果)、咽頭・喉頭部を表面麻酔した実験では、水刺激の効果を抑制する極わずかの食塩水刺激をしたときよりも嚥下間隔時間は延長し、粘膜表面の触感覚の効果が明らかになった。口腔咽頭部末梢刺激による嚥下促進効果を、受容器別に分けて表した実験は本研究が初めてのものである。本実験で行わせた随意性嚥下間隔時間には被験者間で個人差が認められ、繰り返しの嚥下遂行能力の低い被験者(嚥下間隔時間の長い被験者)ほど、末梢感覚刺激による嚥下促進効果が大きかった。
細胞内におけるリポ蛋白質代謝過程に基づいたアミロイドーシス病態機序の解明

本研究は、高密度リポ蛋白質(HDL)を材料としたAApoAIIアミロイドーシスモデルにおいて、画期的なレーザーダイセクション装置を用いて細胞外および細胞内両方におけるアミロイド形成機序の分子メカニズムを解析することで、アミロイドーシス発症の分子基盤を明らかにすることを目的とする。具体的には、1培養細胞系におけるAApoAIIアミロイド沈着物形成モデルの確立、2細胞内アミロイド凝集体における生体分子群の網羅的解析、3アミロイド形成メカニズムの解明とモデルマウスを用いた評価、の3点を実施する。アミロイドーシスは疾患特異的な蛋白質が線維化し、アミロイド沈着として臓器に蓄積することで機能不全を来す疾患である。線維構造の獲得に伴うアミロイド形成過程には、前駆蛋白質の細胞内における様々な代謝過程が関与することが示唆されているが、細胞内のアミロイド凝集体の精製が困難であることから共存分子の体系的解析は為されておらず、その詳細は未だ未解明である。本研究は、培養細胞系におけるアミロイド沈着の解析系に確立および画期的なレーザーダイセクション装置を駆使することで、アミロイド形成過程に関与する細胞内分子機構の解明を目的としている。平成30年度は、血清高密度リポ蛋白質(HDL)のアポ蛋白質であるアポリポ蛋白質A-II(ApoA-II)に由来するアミロイドーシス(AApoAIIアミロイドーシス)をモデルとして、AApoAIIアミロイドーシスモデルマウスから精製したHDL(含ApoA-II分画)またはAApoAII線維を材料に、1培養細胞系におけるAApoAII沈着形成モデルの確立、2生体内アミロイドとの比較解析、3アミロイド形成時の細胞状態の検討、の3点を目指した。マクロファージ系細胞へのAApoAIIの添加は、細胞外におけるチオフラビンT(アミロイド線維に特異的に結合する蛍光色素)陽性の沈着物形成を誘導することを明らかにした。この形成物は、生存細胞数には影響を与えないこと、アポリポ蛋白質A-I, Eなどの生体内でアミロイドと共沈着する蛋白質が含まれること、生細胞の存在下では時間経過に伴って減少することを明らかにした。また、HDLの添加はマクロファージの泡沫化を誘導し、上記の沈着減少を抑制することを明らかにした。以上の結果から、本研究成果はプリオンと類似した伝播現象に基づいたアミロイドの形成過程、または沈着後のアミロイドの分解過程の解析において有用なモデルである可能性が示唆された。平成30年度は、1AApoAIIアミロイドーシスモデルマウス由来のアミロイド線維または前駆蛋白質(HDL)を材料としてマウスマクロファージ系細胞においてアミロイド沈着形成モデルを確立する、2共沈着蛋白質の同定や凝集体構造を電子顕微鏡により観察を行うことで生体内のAApoAIIとの比較解析を行う。以上の研究の実施を予定していた。培養細胞系におけるAApoAIIアミロイド沈着の形成は、当初の計画通りマウスマクロファージ系細胞を用いて生体由来のAApoAIIアミロイド線維の添加により成功した。形成されたアミロイド沈着は、生体内アミロイドと同様のアミロイド関連蛋白質の含有やアミロイド特異的な蛍光色素への反応性を示し、in vitroのアミロイド解析システムとして確立できた。一方、HDLの添加試験により、マクロファージ細胞には細胞外の異常凝集体の分解する分子機構が存在し、それは細胞内の脂質含有量の増加によって抑制されることが示唆されたが、研究計画に記載していたHDLの添加によるde novoのアミロイド沈着形成は達成できなかった。これについては今後、アミロイド線維核の投与やより長期的な試験を検討する。また予期していなかった事であるが、培養細胞系で形成されたAApoAII沈着が生細胞の存在下において短期間で消失することを発見した。いくつかの全身性アミロイドーシスでは血中の前駆蛋白質量を減少させることにより、既に沈着したアミロイドが消失することから、生体内のアミロイドは沈着と融解のバランスが重要だと考えられているが、このモデルはアミロイド沈着の分解メカニズムの解析に利用できる可能性が示唆された。これらのモデルを用いることで次年度以降の研究計画がスムーズに遂行可能である。今後の研究計画は、確立した培養細胞系モデルを用いて以下の実験を実施する。1改良型レーザーマイクロダイセクション装置により回収した形成過程のAApoAII沈着についてプロテオーム解析を行うことで、相互作用する生体分子を網羅的に同定し、アミロイド沈着の形成過程に関与する細胞内の分子機構を明らかにする。また、蛍光ラベルにより細胞内に取り込まれた代謝過程のHDLを観察し、同様の装置で回収し質量分析や生化学的解析を行うことで、断片化されたApoA-IIの検出やHDLが時間経過に伴ったアミロイドの減少を抑制するメカニズムを明らかにする。特に、各種受容体やプロテオグリカンの発現・機能の抑制によるエンドサイトーシスの阻害や、プロテアーゼ阻害剤などによるライソゾーム機能の阻害が、アミロイド沈着形成に及ぼす効果を検討する。これらの効果について、AApoAIIアミロイドーシスモデルマウスを用いて種々の濃度の阻害剤を継続的に投与し、アミロイド沈着程度を病理組織学的に比較検討する。2生細胞の存在下でアミロイド沈着が時間経過と共に消失したメカニズムを解明するために、HDLの添加によるマクロファージ細胞の泡沫化がこれを抑制したことに着目し、RNA-seq法による網羅的な遺伝子発現解析を行うことで、泡沫化マクロファージにおいて変動した細胞内分子機構を明らかにする。また、LDL, VLDLなどの他のリポ蛋白質分画ならびにApoaA-IIノックアウトマウス

由来のHDLの添加による作用を生化学的・分子生物学的に解析することで、細胞内の脂質含有量とアミロイド消失の関係を明らかにする。以上の結果から、既に沈着したアミロイドを分解機構の活性化により、アミロイドーシスの新たな治療戦略の開発を目指す。本研究は、高密度リポ蛋白質(HDL)を材料としたAApoAIIアミロイドーシスモデルにおいて、画期的なレーザーダイセクション装置を用いて細胞外および細胞内両方におけるアミロイド形成機序の分子メカニズムを解析することで、アミロイドーシス発症の分子基盤を明らかにすることを目的とする。具体的には、1培養細胞系におけるAApoAIIアミロイド沈着物形成モデルの確立、2細胞内アミロイド凝集体における生体分子群の網羅的解析、3アミロイド形成メカニズムの解明とモデルマウスを用いた評価、の3点を実施する。アミロイドーシスは疾患特異的な蛋白質が線維化し、アミロイド沈着として臓器に蓄積することで機能不全を来す疾患である。線維構造の獲得に伴うアミロイド形成過程には、前駆蛋白質の細胞内における様々な代謝過程が関与することが示唆されているが、細胞内のアミロイド凝集体の精製が困難であることから共存分子の体系的解析は為されておらず、その詳細は未だ未解明である。本研究は、培養細胞系におけるアミロイド沈着の解析系に確立および画期的なレーザーダイセクション装置を駆使することで、アミロイド形成過程に関与する細胞内分子機構の解明を目的としている。平成30年度は、血清高密度リポ蛋白質(HDL)のアポ蛋白質であるアポリポ蛋白質A-II(ApoA-II)に由来するアミロイドーシス(AApoAIIアミロイドーシス)をモデルとして、AApoAIIアミロイドーシスモデルマウスから精製したHDL(含ApoA-II分画)またはAApoAII線維を材料に、1培養細胞系におけるAApoAII沈着形成モデルの確立、2生体内アミロイドとの比較解析、3アミロイド形成時の細胞状態の検討、の3点を目指した。マクロファージ系細胞へのAApoAIIの添加は、細胞外におけるチオフラビンT(アミロイド線維に特異的に結合する蛍光色素)陽性の沈着物形成を誘導することを明らかにした。この形成物は、生存細胞数には影響を与えないこと、アポリポ蛋白質A-I, Eなどの生体内でアミロイドと共沈着する蛋白質が含まれること、生細胞の存在下では時間経過に伴って減少することを明らかにした。また、HDLの添加はマクロファージの泡沫化を誘導し、上記の沈着減少を抑制することを明らかにした。以上の結果から、本研究成果はプリオンと類似した伝播現象に基づいたアミロイドの形成過程、または沈着後のアミロイドの分解過程の解析において有用なモデルである可能性が示唆された。平成30年度は、1AApoAIIアミロイドーシスモデルマウス由来のアミロイド線維または前駆蛋白質(HDL)を材料としてマウスマクロファージ系細胞においてアミロイド沈着形成モデルを確立する、2共沈着蛋白質の同定や凝集体構造を電子顕微鏡により観察を行うことで生体内のAApoAIIとの比較解析を行う。以上の研究の実施を予定していた。
歯周病と血管内皮機能障害の相互作用におけるRhoキナーゼの役割と阻害剤の効果

In vitroで歯周病原細菌およびその構成成分であるLPSで培養ヒト血管内皮細胞を刺激した。定量的PCRおよびEnzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)またはウェスタン法によりタンパク質発現量を解析した結果、Porphyromonas gingivalis LPSはRhoキナーゼ関連遺伝子の発現に影響する可能性が示唆された。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)において歯周病原細菌の病原因子のひとつであるPgのLPSがiNOSを誘導し、産生されたNOが内皮細胞層の連続性を低下させることが報告されている。また、臨床研究では、心血管障害の患者において歯周病がNOの生理活性の低下による血管内皮機能障害のリスクファクターであることが報告されている。本研究では、血管内皮機能制御の中でこれまでに歯周病との関連が明らかでないRhoキナーゼをメディエーターとした歯周病と血管内皮機能障害の相互作用に焦点をしぼり以下について実施した。具体的には歯周病原細菌由来のLPSおよび菌体の暴露が、血管内皮細胞でRhoキナーゼ活性の変化、Rhoキナーゼアイソフォーム間の活性の差異、下流の遺伝子発現、たとえば、トロンビンによって誘導されるICAM-1やNO産生に重要なeNOSおよびiNOS発現について検討した。これらの内皮細胞をF-actinを免疫染色し、細胞間ギャップ形成や膜ラッフル形成状態を観察したところ、P. gingivalis LPS刺激で形成促進される傾向が観察された。現在、LPS刺激の有無によりHUVECおよびHAECのeNOSおよびiNOSのリン酸化が関与しているのか、またeNOSおよびiNOSの発現を阻害した場合の分子動態や形態変化について解析中である。心血管疾患やその発症のリスクとなるメタボリックシンドロームと口腔の関係についてさまざまな知見が得られており、歯周局所における細菌感染および炎症が全身疾患の発症、進行に関わることが示唆されている。心血管疾患の初期段階には血管内皮機能障害が関与するが、近年、Rhoキナーゼ経路の血管内皮機能障害での役割が注目されている。これまでに、(1)歯周病原細菌がRhoキナーゼ経路を介して血管内皮機能障害を惹起するか、(2)Rhoキナーゼ阻害薬の効果に変化をもたらすかについてin vitroモデルを用いて検討した。歯周病原細菌由来のLPSおよび菌体の暴露が、血管内皮細胞でRhoキナーゼ活性の変化、Rhoキナーゼアイソフォーム間の活性の差異、下流の遺伝子発現、たとえば、トロンビンによって誘導されるICAM-1やNO産生に重要なeNOSおよびiNOS発現について検討した。これらの内皮細胞をF-actinを免疫染色し、細胞間ギャップ形成や膜ラッフル形成状態を観察したところ、P.gingivalis LPS刺激で形成促進される傾向が観察された。また、菌体およびLPS刺激の有無によりHUVECおよびHAECのeNOSおよびiNOSのリン酸化に違いがあり、それらの分子の関与が示唆されたため、eNOSおよびiNOSの発現をRhoキナーゼインヒビターおよびRNAiにより抑制した場合の分子動態や形態変化に差がみられた。メタボリック状態の血管内皮細胞におけるPgLPSの影響について評価した。高グルコース、酸化LDL、あるいはレジスチン存在下での血管内皮細胞に対してPgLPSはROCKの発現およびNOSの発現に対して影響が認められなかった。ROCKインヒビターの影響をについては、ROCK遺伝子の抑制状態ではPgLPSの刺激があってもeNOSおよびiNOSの発現には大きな変化がみられなかった歯周病関連細菌およびそのLPSは血管内皮細胞に対してRhoキナーゼに関連する遺伝子の発現を誘導する可能性が示唆されたものの、歯周病関連細菌およびLPS単独での作用は非常に弱く、再現性が予想よりも高くなかった。本年度計画のRhoキナーゼによる阻害実験およびRNAiによるノックダウン実験の実施が終了したので順調に推移していると思われる。24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの結果を踏まえて、グルコース存在下および酸化LDL存在下といった非生理的状態の血管内皮細胞におけるRhoキナーゼ経路および阻害剤の効果についての歯周病原細菌の影響とRhoキナーゼ阻害剤の歯周病原細菌の内皮侵入性に対する影響について検討する予定である。
学士課程教育のアウトカム評価とジェネリックスキルの育成に関する国際比較研究

ジェネリックスキルの育成については、教育目標を明確にし、そのために体系的に構造化された教育内容の整備をし、教室内では参画型・双方向型のアクティブラーニング、教室外では体験型学習を取り入れた、学習重視の教育方法を組織的に導入していくことが効果的である。学生自身、教員、友人の三者のジェネリックスキルについての評価の結果を比較すると、友人評価以上に教員評価の方が学生の自己評価との一致度は高く、専門知識、情報収集・活用、批判的思考、論理的思考、分析的思考等については評価が一致し、主にゼミ、演習等の教育活動の中で確認されている。本研究では、大学卒業者が卒業時点において社会で共通して求められる能力・態度・価値観等々の習得を目指す概念であり、高等教育の成果指標として有効性が論じられているジェネリックスキルの育成に注目し、その修得についてメカニズムと具体的な育成方法を明らかにすべく、文献調査、海外訪問調査を中心に初年度の研究を進めた。初年度の研究成果として、第一に、ジェネリックスキルの含意するものについて、労働市場での評価尺度としての有効性について検討をした結果、企業のコンピテンシー評価は、必ずしも一般性を有するものとは限らず、当該企業で高評価の社員の特性を分析した事例が一般的であり、一般的に構造化して把握し、育成していくという性格は持ちにくいことが明らかになってきた。第二に、ジェネリックスキルの育成について効果的であると考えられている教育内容・方法の実践事例の収集・分析については、アメリカ及びオーストラリアの大学訪問調査を行い、教育内容だけでなく教育方法や評価方法と連動した教育プログラムを組織的に開発している事例について情報収集を行うことができた。各国のアクレディテーションや教育制度との関係を整理し、これらの事例の一般化が可能か今後検証していく予定である。本研究では、大学卒業者が卒業時点において社会で共通して求められる能力・態度・価値観等々の習得を目指す概念であり、高等教育の成果指標として有効性が論じられているジェネリックスキルの育成に注目し、その修得についてメカニズムと具体的な育成方法を明らかにすることをねらいとしている。この目的の下、2年目は、海外訪問調査、国内大学訪問調査、国内の大学を対象とした質問紙調査を中心に研究を進めた。その研究成果として、第1に、海外訪問調査については、アメリカの大学訪問調査を行い、教育内容だけでなく教育方法や評価方法と連動した教育プログラムを組織的に開発している事例について情報収集を行うことができた。第2に、国内大学訪問調査については、10大学程の大学を対象として、ジェネリックスキル育成に係る効果的な教育内容・方法の具体的な取り組みに関する情報収集を行うことができた。第3に、質問紙調査については、予備調査として、学生本人、友人、教員の三者が当該学生をどのように評価しているのかに関して予備調査を実施し、ジェネリックスキルの測定方法の可能性を探ることができた。この目的の下、3年目は、国内の大学を対象とした質問紙調査、海外の研究者を招聘しての国際ワークショップの実施、海外訪問調査を中心に研究を進めた。その研究成果として、第1に、質問紙調査については、国内の複数大学を対象として、学生本人、教員の二者が当該学生本人をどのように評価しているのかに関する調査を実施し、場面に応じたジェネリックスキルの測定方法の可能性を探ることができた。第2に、国際ワークショップについては、アメリカでジェネリックスキルおよび教育プログラムの開発・評価に携わっている研究者を招聘して、学士家庭教育のアウトカム評価とジェネリックスキルの育成の先駆的方法に関するワークショップを開催し、貴重な示唆を得ることができた。第3に、海外訪問調査については、アメリカの大学訪問調査を行い、教育内容だけでなく教育方法や評価方法と連動した教育プログラムを組織的に開発している事例について情報収集を行うことができた。
核酸自己組織化膜を利用したハイスループット可能なバイオセンサーの開発

ヒト遺伝子のドラフトシーケンシングが終了し、これを生かしたゲノム解析、プロテオーム解析が始められている。しかしながら、それら解析は非常に手間がかかるとともに、解析システムの感度も高くない。私は、有機合成化学的に分子設計した分子を解析システム上に導入することによって、省資源化、高感度化を図ることができると考えた。特にDNAはアドレス機能を有するタグとして働き、また近年では導電性も議論されていることから有用なツールであると考えられる。そこで、DNAを合成化学的に改良し、基板上でこれら解析を行うことができるシステムの作成を目指した。これからのゲノム機能、プロテオーム機能の解析は、フェムトモルからアットモルスケールの極微量でかつハイスループットな多機能解析が可能であることが要求される。これら条件の達成を目指して、金基板上で形成することができる核酸自己組織化膜を有効に利用することにより、鋭敏な感度を有する基質特異的な系の構築を目指した。まず第一に、導電性を助ける酸化還元性ユニットを連結した人工核酸塩基を開発し。DNAに導入した。私は、そのための種々の酸化還元性ユニットを開発することができた。第二に、電極として用いる金基板上に配列の異なるDNAそれぞれを担持させることができた。DNA末端は電極上に自己組織化膜を形成させやすいように硫黄原子で修飾しておくことが重要であった。また、メルカプトヘキサノールで電極上をマスキングすることによりさらによい結果が得られるようになった。第三に、上記の技術を用いて、電気応答性DNA自己組織化膜を電極上に作成することができた。微分パルスボルタンメトリーによって、二本鎖状態と一本鎖状態の電気応答を比較したところ、顕著な違いが観測された。私は、以上のように、核酸自己組織化膜を利用したハイスループット可能なバイオセンサーの開発の研究において、種々の酸化還元性ユニットを連結した人工核酸塩基を開発し、高機能性修飾電極を作成することができた。いずれの成果も高い実用性が期待され、本科学研究費は、大変有効に役立てることができたと考えている。DNAに導入した。