hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超対称標準模型およびその拡張された模型の現象論の研究

超対称標準模型における超対称性の破れのパラメーターのフレーバー構造は超対称性の破れの起源や、超対称標準模型を越える理論の構造に強く依存するため、超対称性の破れを起源とするフレーバー対称性の破れの事象やCP対称性の破れの事象の探索により超高エネルギーの物理を探ることができる。特に、多くの研究者に興味をもたれている超対称大統一模型は、標準模型には存在しないフレーバー対称性の破れを予言し、それらは相互に関係がついているため、非自明な検証が可能である。ハドロンの異常電気双極子能率(EDM)は標準模型の予言が非常に小さいため小さく、標準模型を越える理論を探る有力な方法であると考えられている。その観測量自体はフレーバー対称性を破っていないのであるが、ループ効果を通してフレーバー対称性の破れに依存しうる。久野はハドロンのEDMによりスクォークの質量項におけるフレーバー対称性の破れの構造に対し強い制限を与えた。また、これを元に超対称大統一模型を制限し、そこから導かれる予言を検討した。超対称標準模型において、陽子の安定性からRパリティが要請されるが、これによりもっとも軽い超対称粒子は安定となり、その粒子は宇宙の暗黒物質の候補となりえる。WMAP衛星による宇宙論パラメータの精密測定により暗黒物質の存在が確固となった現在、次の間題は暗黒物質の正体は何であるかである。暗黒物質の探索には、原子核と暗黒物質との弾性散乱による直接探索と、宇宙における暗黒物質の対消滅現象起源の異常宇宙線探索がある。超対称標準模型において暗黒物質の性質は超対称性の破れに依存し、ある種の模型は暗黒物質が電弱電荷を持つことを予言する。久野はこの場合暗黒物質探索において量子効果が重要であることを示した。特にTEVスケールの質量を持つ暗黒物質の場合、共鳴効果により爆発的に対消滅現象が増大することがある。以前の解析ではTEV領域の質量を持つ暗黒物質の探索はその事象の数の少なさから困難と思われていたが、この解析によりその可能性が増えた。また原子核との弾性散乱の断面積に対しても有意な補正を生む場合があることも示した。超対称標準模型は、素粒子の標準模型を超える理論として多くの研究者に注目されている理論である。この模型の予言の1つに宇宙の暗黒物質が存在する。この理論では陽子の安定性から離散的対称性が要請されるが、その結果もっとも軽い超対称粒子は安定となり、その最も軽い超対称粒子(LSP)は宇宙の暗黒物質の候補である。LSPが何であるかは超対称性の破れのメカニズムに依存しいくつの候補が存在するが、その中で有力な候補はゲージボゾンやヒッグスボゾンの超対称粒子からなるニュートラリーノである。宇宙の暗黒物質がニュートラリーノであることを検証する方法として、地上で原子核との散乱課程を捕らえる直接探索と、宇宙におけるニュートラリーノ対消滅過程から生じる異常宇宙線を捕らえる間接探索が存在する。我々は、ニュートラリーノがSU(2)ゲージチャージを持つようなウイノやヒグシーノに近い状態である場合に着目し、その場合のニュートラリーノ対消滅から生じる異常宇宙線の研究を行った。
大量肝切除限界超越のための自家骨髄細胞移植による肝再生療法の研究と開発

免疫不全マウス(NOGマウス)に対して四塩化炭素(CCl4)の腹腔内投与を行い、肝障害モデルおよび慢性肝障害モデルの作成し,GFP陽性NOGマウスの骨髄細胞を尾静脈より移植すると、少量ながら肝臓内でのGFP陽性細胞を認め、肝細胞への分化が確認された。骨髄細胞移植群と非移植群では若干移植群での体重増加が多い傾向にあったが、肝機能などのパラメーターでは両者に差を認めなかった。NOGマウスにおける門脈塞栓モデルを作成し、結紮後4週時での結紮肝の萎縮ならびに非結紮肝の増大を確認することができた。当初実験系として正常免疫能を有するラットを用いて行う予定であったが、その都度のγ線照射、免疫抑制投与などの煩雑性が問題となり、これらの処置が不要である免疫不全マウスで同様の実験系を立ち上げることとした。初年度は、まず緑色蛍光タンパク質(GFP)を全身に発現する重度免疫不全マウスであるNOG-EGFPマウス(♂)の供給を受け、さらに通常のNQGマウス(♀)の提供を受けた。これら2種類のマウスの間で交配を繰り返し行い、GFPを全身組織に発現する重度免疫不全マウス(NOG-EGFPマウス)の樹立を行った。これらのマウスを樹立するまでに、かなりの時間を要してしまった。しかしながら、これにより、安定的にGFP陽性マウスを提供することに成功した。これにより、安定的にGFP陽性のマウス骨髄細胞を得ることが可能となった。このNOG-EGFPマウスの骨髄を採取し、骨髄細胞が蛍光顕微鏡下でGFPの発光を確認することに成功した。また、通常のNOGマウスにNOG-EGFPマウスの組織を移植した際に、GFP蛍光発光により、両者の組織が区別可能であることを確認した。NOG-EGFPマウスの骨髄細胞を採取し、通常のNOGマウスに移植し、末梢血でGFPが観察出来るかどうかを確認しようと試みたが、3.11の震災の影響で、研究の中止を余儀なくされ、現在も研究はストップしている。今後はこれらGFP陽性骨髄細胞を70%あるいは90%肝切除をおこなった通常のNOGマウスの門脈に注入することで、GFP陽性骨髄細胞由来の肝再生が起こっていることを証明する予定である。正常免疫のマウスにおいては70%肝切除は100%生存、90%肝切除は100%致死であることが報告されている。今回は、NOGマウスに対して70%90%の肝切除を行なう基礎的実験を行なった。手技的に安定していないことに加え、免疫不全のせいもあるためか、70%肝切除モデルにおいても1週間生存率は50%程度であったため、引き続き肝切除の手技修得に時間を費やした。緑色蛍光タンパク質(GFP)辱を全身に発現する重度免疫不全マウスであるNOG-EGFPマウスの骨髄細胞を採取し、70%肝切除マウスの肝切除と同時に脾静脈より投与を行なった。1週間後安楽死させ、肝臓を摘出し、肝組織中のGFP陽性細胞の存在を観察した。また、実際の大量肝切除時には、術前に摘出予定肝の肝内の門脈枝を塞栓し、萎縮させ、手術の際の残存肝の肥大を起こさせるという手技(門脈塞栓術)を行なうことが一般的である。今回はマウスの70%の領域の門脈枝を結紮し、ヒトにおける術前門脈塞栓術モデルを作製した。このマウスに門脈塞栓と同時にGFP陽性の骨髄細胞を投与し、非塞栓領域の肝脾大に骨髄細胞が関与しているかどうかについても検討を行なうこととした。こちらの研究については、現時点では門脈塞栓モデルの確立に留まっており、実際のGFP陽性骨髄細胞の投与は行なっておらず、来年度以降の検証を行なう予定である。免疫不全マウス(NOGマウス)に対して四塩化炭素(CCl4)の腹腔内投与を行い、肝障害モデルおよび慢性肝障害も出るの作成を行った。具体的には、0.5, 1.0, 1.5ml/kgのCCl4単回投与を行い、マウス急性肝障害モデルを作成した。いずれのマウスも早期に肝障害を認めるものの、1ヶ月後には回復し、CCl4投与量と肝障害の程度は相関しないことが判った。また、死亡マウスは認めなかったため、1.5ml/kgを急性肝障害モデルの投与量として設定した。急性肝障害モデルマウスの尾静脈よりGFP陽性NOGマウスの骨髄細胞を移植すると、少量ながら肝臓内でのGFP陽性細胞を認め、肝細胞への分化が確認された。次いで、NOGマウスにおける門脈塞栓モデルの作成を行った。

実際にはマウスの門脈を塞栓することは困難であり、マウスの左葉・中葉への門脈枝を胆管、動脈より分離し、結紮することで門脈結紮モデルの作成を試みた。最終的にこのモデルマウスの作成に成功し、結紮後4週時での結紮肝の萎縮ならびに非結紮肝の増大を確認することができた。このモデルに対して骨髄細胞の移植を行う予定であったが、時間的制約があり、未施行である。多種多様な幹細胞の集まりの骨髄中の間葉系幹細胞は胚葉を超えて内胚葉や外胚葉への分化が報告されているが、骨髄細胞内にはmuse細胞(Multilineage-differentiating Stress Enduring Cell)と呼ばれる多能性幹細胞が存在していることが、東北大学細胞組織学分野出澤らによって報告されており、骨髄細胞の肝細胞への分化のメカニズムについてはmuse細胞が肝細胞・肝組織に分化した可能性について今後の研究課題とした。昨年度末の震災の以後、研究室の破損、実験器具の破損などにより、研究を立ち上げるまでに時間を要した。さらに、マウスの手術手技の修得、技術の安定化に予定外の時間を要している。24年度が最終年度であるため、記入しない。マウス肝切除を行い、GFP陽性骨髄細胞の投与により、肝再生が促進されるかどうかを確認する。また、門脈塞栓モデルを作製し、同様にGFP陽性骨髄細胞を投与し、非塞栓葉の増大に骨髄細胞が関与しているかどうかを確認する予定である。
様々な筋の運動単位発射様式の解明

本研究の目的は、様々な筋における運動単位の発射様式を解明することにより、筋間における力調節の神経制御メカニズムの異同性を脊髄レベルで明らかにすることであった。具体的には、大きな筋の代表として大腿の伸筋を、そして小さな筋の代表として小指外転筋をそれぞれ被験筋としてそれぞれの運動単位発射様式を比較するものであった。その結果、当該研究期間においては上記の目的を完全に達成することはできなかったものの、大腿伸筋の代表として内側広筋を対象におこなった実験において、いくつかの重要な知見か得られた。まず、試作した四極ワイヤー電極を用いることによって、針電極では得ることができなかった安定した筋内電気信号を得ることができるようになった。力目標値を50%MVCに設定した台形力発揮においては、動員閾値の低い運動単位は、動員閾値の高い運動単位よりも常に高頻度で発射していた。この現象は、Erim & DE Luca(1996)が報告しているOnion skin phen omenonと一致することが判明した。また、同筋においておこなわれたランプ力発揮課題では、50%MVCを超えるカレベルにおいても新たな運動単位が動員されることなどが分かった。さらに、出来る限りすばやい力発揮課題においては、通常では考えられないような高頻度での運動単位の発射が認められた。以上のことから、内側広筋のようにinternal shorteningの大きな筋においても、四極ワイヤー電極を用いることによって安定した筋内電気信号を得ることが出来るようになった。今後は、本研究期間内で達成出来なかった小さな筋における運動単位発射様式の解明をおこない、筋間における力調節機構の異同性について明らかにしていきたい。本研究の目的は、ヒトが随意的に力を発揮する際の運動単位発射様式を様々な筋において解析することによって、力調節の神経制御メカニズムの筋間異同性を明らかにすることである。この目的を達成するため、大きな近位の筋の代表として内側広筋を、一方、遠位の小さな筋の代表として小指外転筋を被験筋とすることとした。平成14年度においては、内側広筋を対象として実験をおこなった。被験者は述べ10名であった。被験を実験用椅子に座らせ、右膝を90度に固定し、等尺性条件下における膝伸展力発揮をおこなうよう指示した。随意最大収縮測定後、被験者の約1m前方に設置したモニターに、力発揮目標ラインを提示し、力追跡課を課した。力発揮目標は、1)記録開始1秒後から2秒かけて50%MVCまで力を漸増する相(力漸増相、25%MVC/秒)、2)5秒間の力保持相、および3)2秒かけて0%MVCまで力を漸減する相(力漸減相、-25%MVC/秒)の3つの相からなる台形状とした。各被験者にこの課題を5試行おこなわせた。この試行を遂行中に、右内側広筋に刺入した四極ワイヤー電極から筋内電気活動を双極電位として3チャンネル同時記録し、力信号とともにコンピュータに取り込んだ。記録された複雑な筋内電気信号をPrecision decompositionを用いて運動単位活動電位波形を同定し、各運動単位について動員閾値、発射頻度および脱動員閾値を測定した。その結果、12個の運動単位を同定することができた。同定された12個の運動単位発射列から、高閾値の運動単位は、低閾値の運動単位よりも平均発射頻度が低いという傾向が観察された。また、動員閾値と脱動員閾値との間には、強い正の相関関係が認められた。以上の結果は、内側広筋においても、"Common drive"(De Luca & Erim 1994)が存在することを示唆している。

2年目においては、内側広筋に加えて小指外転筋における運動単位発射様式の解析をすすめる予定である。本研究の目的は、様々な筋における運動単位の発射様式を明らかにすることにより、筋間における力調節の神経制御メカニズムの異同性を脊髄レベルで明らかにすることである。この目的を達成するため、De Lucaが中心となって開発したprecision Decomposition法を用いて、運動単位の動員閾値および発火頻度を解析することとした。しかしながら、precision decomposition法は、運動単位を正確に同定できるアルゴリズムではあるものの、解析に要する時間と手間は、他の解析プログラムと比べると多大なものとなる。そこで平成15年度においては、平成14年度から継続して、下肢の大きな筋の代表として「内側広筋」を対象に実験を継続した。その概要は以下のとおりである。被験者健常男性5名であった。被験者の右内側広筋にガイド針を用いて四極ワイヤー電極を刺入し、筋内電気活動の記録・解析をおこなった。力発揮の課題として、リラックスした状態から2.5秒かけて50%MVCまで力漸増(20%MVC/s)、続いて50%MVCの力を3秒間保持、その後、2.5秒かけて0%MVCまで力漸減(-20%MVC/s)させる力曲線を被験者の前にモニター表示した。被験者は、力目標に合わせて力発揮をおこなった。その際記録された力信号と筋内電気活動を同時記録し、運動単位の動員閾値、脱動員閾値、および平均発射頻度を解析した。その結果、動員閾値と脱動員閾値との間には強い正の相関関係(r=0.940)が認められた。さらに、平均発射頻度と動員閾値および脱動員閾値との間には強い負の相関関係(r=-0.891、r=0.800)が認められた。得られた成果は、国際バイオメカニクス学会および国際脳研究機構神経科学学会において発表された。本研究の目的は、様々な筋における運動単位の発射様式を明らかにすることにより、筋間における力調節の神経制御メカニズムの異同性を脊髄レベルで明らかにすることであった。この目的を達成するため、平成15度までは、De Lucaが中心となって開発したprecision Decomposition法を用いて、運動単位の動員閾値および発火頻度を解析することとした。しかしながら、precision decomposition法のデータ獲得・解析システムの借用期限が過ぎたため、平成16年度は、他のデータ獲得・解析システム(Spike 2)を用いて、「内側広筋」を対象に実験を継続した。その概要は以下のとおりであった。昨年度と同様に、被験者の右内側広筋にガイド針を用いて四極ワイヤー電極を刺入し、筋内電気活動の記録・解析をおこなった。力発揮の課題も昨年度と同様に、リラックスした状態から2.5秒かけて50%MVCまで力漸増(20%MVC/s)、続いて50%MVCの力を3秒間保持、その後、2.5秒かけて0%MVCまで力漸減(-20%MVC/s)させる力曲線を被験者の前にモニター表示した。その結果、昨年度と同様、動員閾値と脱動員閾値との間には強い正の相関関係が認められた。
負イオンクラスターの衝突脱離電子分光法の開発と固体表面相互作用解明への応用

炭素、シリコンの負イオンクラスターをMoS_2単結晶表面に衝突させて、2次電子放出、散乱イオン、基板電流を入射エネルギーの関数として測定した。低い衝突エネルギーで電子放出効率がピークをもつという新しい現象について詳細な検討を加えた結果、この機構はクラスターのポテンシャル曲面に強く支配されていることがわかった。つまり負イオンと中性のポテンシャル面の交差が低いエネルギーでおきるものは低い衝突エネルギーで電子が脱離するが、一方交差が高いエネルギーで起こる場合には大きな衝突エネルギーが必要であり、その場合電子脱離がターゲット表面のより近傍(又は内側)で起こるため、電子は真空中に放出されず基板に流れると考えると実験事実がうまく説明できる(実際基板電流は電子放出と相補的な関係にあることを確認した)。今後の課題としては、より高いエネルギー分解能で実験を行なうことが重要である。またシリコン単結晶をターゲットとした実験を行うために超高真空槽を作成し、本課題で購入したRHEEDを用いてシリコン表面の評価を行なった。一方、電子放出のピークがクラスターの構造に非常に敏感であることを利用して、衝突実験からクラスターの構造に関する知見を得ることを試みた。本研究では炭素クラスターをレーザー蒸発法およびフラーレンのレーザー脱着という二種類の方法で発生させ衝突実験を行なった。その結果、電子放出効率はクラスターの発生法によって全く異なっていることがわかった。このことから、レーザー蒸発のように原子からクラスター成長していく場合とフラーレンから分解していく場合で、別の構造のクラスターができている。つまり低温でのクラスター成長ではフラーレンはできない、という重要な結論が得られた。1.炭素負イオンクラスタ-と固体との衝突による電子脱離実験(衝突エネルギ-約640eV)。タ-ゲットは二流化モリブデン単結晶を使用した。(1)阻止電場型電子エネルギ-分析器を用いて2次電子エネルギ-分布を求めた。さらにスペクトルの入射エネルギ-依存性を検討し、低い入射エネルギ-において負イオンクラスタ-の自体の性質が放出電子により強く反映することを明らかにした。(2)ファラデ-カップによる電流測定から2次電子放出効率を求めた。2.2次電子放出効率の衝突エネルギ-依存性測定。負イオンクラスタ-のエネルギ-数+eV領域で2次電子放出効率が鋭いピ-クを持つことがわかった。炭素クラスタ-には直線構造のもの、環状構造のもの、球殻状のフラ-レン類と3種のものが知られているが、電子放出効率の低エネルギ-ピ-クは環状の炭素クラスタ-で著しく大きく、直線構造のクラスタ-ではほとんど観測されない。一方フラ-レンでは比較的小さいピ-クが出現するが、その位置は高エネルギ-側に大きくシフトしている。3.超高真空下(10^<10ー11>Torr台)で清浄表面をタ-ゲットとして用いた実験を行うための真空槽を作成しクラスタ-ビ-ム発生、サイズ分離を行った。4.2次電子測定に加えて基板電流と散乱イオンを定量的に測定すれば負イオンの衝突における荷電の行方を完全に把握することが出来る。散乱イオンは斜入射リフレクトロン型減速系を利用した実験で検出することができた。また基板電流の測定をイオンの入射エルルギ-を走査した行った。炭素負イオンクラスターをMoS_2単結晶表面に衝突させて、2次電子設出、散乱イオン、基板電流を入射エネルギーの関数として測定した。低い衝突エネルギーで電子放出効率にピークが出現するという新しい現象について詳細に検討を加えた結果、この機構はクラスターのポテンシャル曲面に強く支配されていることがわかった。

つまり負イオンと中性のポテンシャル面の交差が低いエネルギーでおきるものは低い衝突エネルギーで電子が脱離するが、一方交差が高いエネルギーで起こる場合には大きな衝突エネルギーが必要であり、その場合電子脱離がターゲット表面のより近傍(又は内側)で起こるため、電子は真空中に放出されず基板に流れると考えると実験事実がうまく説明できる(実際基板電流は電子放出と相補的な関係にあることも確認した。)今後の課題としてはより高いエネルギー分解能で実験を行なうことが重要である。またシリコン単結晶による実験を行なうために、超高真空槽を作成し、本課題で購入したRHEEDを用いてシリコンの表面の評価を行なった。一方、電子放出のピークがクラスターの構造に非常に敏感であることを利用して、衝突実験からクラスターの構造に関する知見を得ることを試みた。本研究では炭素クラスターをレーザー蒸発法およびフラーレンのレーザー脱着という二種類の方法で発生させて衝突実験を行なった。その結果、電子放出効率はクラスターの発生法によって全く異なっていることがわかった。このことから、レーザー蒸発のように原子からクラスター成長していく場合とフラーレンから分解していく場合で、別の構造のクラスターができている、つまり低温でのクラスター成長ではフラーレンはできない、という重要な結論が得られた。
拡張不全心への再生医療学的治療戦略

左室心筋圧負荷モデルとして、大動脈結紮モデル(TAC)を作成して、ADRC移植を行ったが、有意な改善は得られなかった。そこで、脂肪由来間葉系幹細胞(ADRC)と骨髄単核球細胞(BM-MNC)移植ではどのような違いがあるかについて実験を行った。ADRCは、BM-MNSと同様な血管遊走能、抗アポトーシス作用を示し、より強い抗炎症作用を示した。下肢虚血モデルに移植したところADRC移植筋組織では、M2マクロファージの遊走が多く見られ、抗炎症性サイトカインであるIL-10等が多く分泌されており、これらがADRCの抗炎症効果作用を惹起するメカニズムと考えられた。心不全急性増悪のため入院となる患者の約40%が左室収縮能が保たれた拡張機能障害であることが、近年の登録研究より明らかとなった。現在、収縮能が保たれた拡張不全心患者における標準的治療は確立しておらず、新たな治療法の開発が望まれる。我々はこれまで体性幹・前駆細胞移植を用いた再生医療の開発研究に従事してきた。これら細胞移植による治療効果は、移植細胞から放出される様々なサイトカインによるパラクライン効果である。特に、皮下脂肪組織由来間葉系前駆細胞(ADRCs: adipose-derived regeneration cells)移植は、実験動物モデルにおける血管新生やリンパ管新生の増強のみならず、骨髄から末梢血中へ抗炎症作用のあるM2マクロファージ動員を惹起することが、我々の検討から明らかとなった。つまり、拡張不全型心不全患者へのADRCsを用いた細胞治療は、抗炎症作用を介した心筋繊維化の抑制により心筋スティフィネスが低下することが期待される新たな治療戦略といえる。マウスADRCsを培養すると、骨髄単核球細胞と異なり、血管内皮細胞ではなく平滑筋細胞へと分化した。ADRCs培養液中には、VEGFやSDF-1といった血管新生増強サイトカインのみならず、M2マクロファージへの極性転換を起こすプロスタグランジンE2(PGE2)が多く含まれることが確認された。ADRCsから放出されたサイトカインは、血管内皮細胞の遊走能の亢進や虚血状態におかれた細胞アポトーシスの抑制のみならず、虚血骨格筋における炎症細胞の浸潤抑制効果がある事が明らかになった。また、厚生労働大臣より臨床試験実施承認が得られているADRCs移植による血管新生療法を行った2例の膠原病患者に、比較的良好な結果が得られていることも、ADRCs移植特有の抗炎症作用と考えられる。近年、急性心不全患者の約40%程度は、左室機能が保たれた拡張機能障害によるものであることが明らかになった。昨年、名古屋大学医学部附属病院へ緊急入院した心不全患者においても35%程度の患者では収縮能が保たれた拡張不全型心不全患者であった。現在、拡張障害を伴う心不全患者への標準的治療法は確立しておらず、脂肪組織由来間葉系前駆細胞(ADRCs: adipose-derived regeneration cells)移植による再生医療学的アプローチを検討する。我々は、実験動物モデルにより、ADRCs移植は血管新生増強因子の放出のみならず、骨髄より内皮前駆細胞の動員を増強し、血管新生やリンパ管新生を増強することを確認した。また、ADRCs移植は末梢血中へ抗炎症作用のあるM2マクロファージ動員を増強することも確認された。マウスADRCsは、マトリゲル上でHUVECの管腔形成および虚血骨格筋における血管ネットワークに取り込まれた。培養マクロファージは、ADRCsから放出されたPGE2を介しM2への極性が亢進し、抗炎症性サイトカインであるIL-10の放出を増強すること、さらにマウス下肢虚血モデルにおいても、ADRCs移植により、虚血骨格筋でM2への極性亢進やIL-10の増強が確認され、PGE2受容体であるEP2/4を拮抗することで抗炎症性サイトカインの減少が見られた。我々が臨床導入した「ADRCs移植による重症虚血肢に対する血管新生療法」は、ヒト幹細胞を用いた臨床研究として厚生労働大臣から実施承認が得られており、ADRCs単離の際に使用する「セリューション遠心分離器」を開発したサイトリセラピューティクス社(米国)とは定期的に国際情報交換を行なっている。最近の登録研究より、心不全急性増悪のため入院加療を必要とする患者の約40%は、左室収縮能が保たれた拡張機能障害であることが明らかになった。拡張不全を伴う心不全に対し、これまで様々な薬剤による臨床試験が行われてきたが、未だ標準的治療は確立しておらず、新たな治療戦略の開発が望まれる。我々はこれまで体性幹・前駆細胞移植による再生医療研究に従事してきた。細胞移植による組織再生機序は、未分化細胞の標的組織への分化のみならず、細胞から放出されるサイトカインによるパラクライン効果が主体である。特に、我々が報告した皮下脂肪組織由来間葉系前駆細胞(ADRCs: adipose-derived regenerative cells)移植は、実験動物モデルにおける血管新生やリンパ管新生の増強効果のみならず、骨髄から末梢血へ抗炎症作用のあるM2マクロファージ動員を惹起することが明らかとなった。つまり、拡張不全型心不全患者に対するADRCsを用いた細胞移植療法は、抗炎症作用を介した心筋繊維化の抑制により心筋スティフィネスが低下することが期待される新たな再生医療学的アプローチといえる。

培養したマウスADRCsは、血管内皮細胞ではなく平滑筋細胞へ分化し、血管ネットワークに取り込まれた。ADRCsは、VEGF、SDF-1といった血管新生増強因子のみならず、M2マクロファージへの極性転換を起こすプロスタグランジンE2(PGE2)も放出していた。これらサイトカインは、血管内皮細胞の遊走能の亢進や虚血状態の細胞アポトーシスの抑制のみならず、虚血骨格筋における炎症細胞浸潤の抑制効果があることが確認された。ウサギ片側下肢虚血モデルを用いた検討では、骨髄単核球細胞移植と同等の治療効果であった。脂肪細胞由来間葉系前駆細胞(ADRC)を移植することで、虚血誘発性血管再生の過程を促進することが報告されているが、その詳細なメカニズムは解明されていない。骨髄由来単核球細胞移植(BM-MNC)も同様に、この過程を促進することが報告されているが、両者の有効性について比較した報告は無い。そこで、本研究では、ADRCの血管新生メカニズムを解明するとともに、その効果をBM-MNC移植による血管新生効果と比較した。まずin-vitro実験で、ADRCおよびBM-MNCのcondition mediumは、HUVEC細胞のmigrationを亢進させ、また、アポトーシスを抑制する作用があることを確認した。下肢虚血モデルにそれぞれの細胞を移植したところ、コントロールに比べ両者とも血管新生効果があることが観察されたが、ADRC群にてその効果が顕著であった。ADRCの血管新生促進作用のメカニズムを明らかにするため、炎症性サイトカインに注目した。ADRC治療群は、抗炎症作用を持つIL-10の発現が亢進しており、また、TNF-aやIL-6などの炎症性サイトカインの低下が観察された。このようなサイトカインはマクロファージより分泌されるため、その分画を調べたところ、ADRC治療群において有意にM2マクロファージ分画が増加していた。また、IL-10の中和抗体を用いるとADRCの移植効果はキャンセルされた。また、ADRC治療群では、VEGFやHGFなどの血管新生因子も上昇していることが確認された。以上より、ADRCによる血管新生促進作用は、血管新生促進因子を増加させるとともに、抗炎症作用を持つM2マクロファージの増加を促すことで、過剰な炎症を低減し、虚血により誘発される細胞障害を抑制しているものと考えられた。現在、我々の施設では、下肢虚血患者に、BM-MNC移植とADRC移植をそれぞれ行っているが、本研究により、ADRC移植がより効果的である可能性が示されたため、今後は、ADRC移植にシフトして行くものと思われる。左室心筋圧負荷モデルとして、大動脈結紮モデル(TAC)を作成して、ADRC移植を行ったが、有意な改善は得られなかった。そこで、脂肪由来間葉系幹細胞(ADRC)と骨髄単核球細胞(BM-MNC)移植ではどのような違いがあるかについて実験を行った。ADRCは、BM-MNSと同様な血管遊走能、抗アポトーシス作用を示し、より強い抗炎症作用を示した。下肢虚血モデルに移植したところADRC移植筋組織では、M2マクロファージの遊走が多く見られ、抗炎症性サイトカインであるIL-10等が多く分泌されており、これらがADRCの抗炎症効果作用を惹起するメカニズムと考えられた。本研究は、左心室の能動的弛緩の低下と心室内腔スティ
細胞の力学応答極性に寄与する局所翻訳制御機構の立証

まず,顕微鏡ステージ上で観察視野に留めながら細胞に伸展刺激を負荷する装置を作製した.シリコーンゴム製のストレッチチャンバを,両側に設置したステッピングモータを用いて引張ることで,チャンバ内の細胞を観察視野内に留めながら,繰り返し伸展することが可能となった.実際に同一細胞における接着基質伸展前後の細胞核蛍光画像を取得し,細胞核内に生じるひずみ分布を得ることに成功した.また,局所力学特性を評価するため細胞内部に微小ビーズを導入するインジェクションシステムの構築を行った.ピペットプラーを用いて作製した先端外径約1マイクロメートルのガラスキャピラリーを顕微鏡ステージ上で細胞に刺入し,細胞核内部に微小蛍光ビーズを導入した.導入したビーズの熱振動挙動を解析し,細胞内部局所の動的弾性特性をする方法を確立した.細胞内RNAを蛍光標識することで,繰り返し伸展刺激を負荷した細胞内におけるRNAの局在性および合成量変化の評価を試みた.蛍光標識されたRNAはほぼ細胞核内で観察され,細胞質内での局在は観察されなかった.細胞核内部で観察されたRNAの蛍光輝度分布に核内位置との顕著な相関は見られなかった.繰り返し伸展刺激を負荷した細胞で経時的変化を調べた結果,刺激負荷1時間で,細胞核内のRNA蛍光の減少傾向,24時間の地には回復傾向がそれぞれ見られ,RNA合成そのものに伸展刺激負荷の影響が示唆された.核膜タンパク質の一つであるネスプリンー1を発現抑制した細胞においても,伸展刺激負荷時に同様なRNA合成の変化傾向が観察され,細胞骨格であるアクチンフィラメントを介した力学刺激伝達の影響は確認されなかった.顕微鏡ステージ上伸展装置の開発ならびに微小ビーズの細胞内導入方法の確立に予定より時間を要しており,当初予定していたタンパク質合成の局所性評価,ライブイメージングまで至らなかった.細胞の力学環境タンパク質翻訳に与える影響をより確実に評価するため,翻訳に直接関わるリボーソムや翻訳抑制因子の細胞内分布の免疫蛍光観察を実施し,それら分布と局所力学特性や変形挙動,さらに細胞骨格・焦点接着斑分布との関係をまず調べる.その後,ライブイメージングを行い,経時的相関関係から翻訳機構と力学的環境との関係解明をすすめる.まず,顕微鏡ステージ上で観察視野に留めながら細胞に伸展刺激を負荷する装置を作製した.シリコーンゴム製のストレッチチャンバを,両側に設置したステッピングモータを用いて引張ることで,チャンバ内の細胞を観察視野内に留めながら,繰り返し伸展することが可能となった.実際に同一細胞における接着基質伸展前後の細胞核蛍光画像を取得し,細胞核内に生じるひずみ分布を得ることに成功した.また,局所力学特性を評価するため細胞内部に微小ビーズを導入するインジェクションシステムの構築を行った.ピペットプラーを用いて作製した先端外径約1マイクロメートルのガラスキャピラリーを顕微鏡ステージ上で細胞に刺入し,細胞核内部に微小蛍光ビーズを導入した.導入したビーズの熱振動挙動を解析し,細胞内部局所の動的弾性特性をする方法を確立した.細胞内RNAを蛍光標識することで,繰り返し伸展刺激を負荷した細胞内におけるRNAの局在性および合成量変化の評価を試みた.蛍光標識されたRNAはほぼ細胞核内で観察され,細胞質内での局在は観察されなかった.細胞核内部で観察されたRNAの蛍光輝度分布に核内位置との顕著な相関は見られなかった.繰り返し伸展刺激を負荷した細胞で経時的変化を調べた結果,刺激負荷1時間で,細胞核内のRNA蛍光の減少傾向,24時間の地には回復傾向がそれぞれ見られ,RNA合成そのものに伸展刺激負荷の影響が示唆された.核膜タンパク質の一つであるネスプリンー1を発現抑制した細胞においても,伸展刺激負荷時に同様なRNA合成の変化傾向が観察され,細胞骨格であるアクチンフィラメントを介した力学刺激伝達の影響は確認されなかった.顕微鏡ステージ上伸展装置の開発ならびに微小ビーズの細胞内導入方法の確立に予定より時間を要しており,当初予定していたタンパク質合成の局所性評価,ライブイメージングまで至らなかった.細胞の力学環境タンパク質翻訳に与える影響をより確実に評価するため,翻訳に直接関わるリボーソムや翻訳抑制因子の細胞内分布の免疫蛍光観察を実施し,それら分布と局所力学特性や変形挙動,さらに細胞骨格・焦点接着斑分布との関係をまず調べる.その後,ライブイメージングを行い,経時的相関関係から翻訳機構と力学的環境との関係解明をすすめる.(理由)研究実施に必要な物品購入を行うことができない期間に判明した残額であり,次年度に繰り越すこととした.(使用計画)次年度研究計画および研究費使用に影響することのない金額であると判断する.
ファーマコプロテオミクスを用いた抗うつ薬のグリアにおける新規標的分子の同定

モノアミン神経をターゲットとした抗うつ薬の開発は限界に来ている。グリア、特に抗うつ効果に関連の深い神経栄養因子(GDNFやFGF-2など)を多く貯蔵するアストロサイトにおける抗うつ薬の分子薬理メカニズムを明らかにした。抗うつ薬はアストロサイトにおいて、モノアミンとは関係なく、GDNFやFGF-2の発現を増加させた。その経路はMMPーチロシンキナーゼーERKーCREBのシグナルカスケードを介し、ファーマコプロテオミクスを用いて5つの標的候補蛋白を同定した。このようなグリアを標的とした抗うつ薬特異的な分子およびカスケードがさらに今後特定できれば、視点の異なった抗うつ薬開発に貢献できると考えられる。グリア細胞のひとつであるアストロサイトにおける抗うつ薬の神経栄養因子・成長因子群誘導作用を明らかにした。うつ病との関連が深い神経由来神経栄養因子(BDNF)、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、繊維芽細胞成長因子(FGF)、血管内皮成長因子(VEGF)の4因子は、神経細胞ではなく、アストロサイトにおいて、抗うつ薬がいずれも発現を誘導した。その抗うつ薬の誘導作用は、モノアミンを介さない、モノアミン非依存性のメカニズムであることを明らかにした。さらに、標的分子として、マトリックスメタロプロテアーゼおよびG蛋白が候補として重要であることを見出した。アストロサイトをターゲットとし、現在抗うつ効果との強い関連が着目されている神経栄養因子・成長因子群(BDNF, GDNF,FGFなど)を誘導するような作用部位が特定できれば、モノアミン仮説を補うような新しい抗うつ薬の創薬への新たなアプローチが可能となる」と仮説をたてて検討した。ヒト正常アストロサイト、ラットおよびマウス正常アストロサイト、ラットC6グリオーマ細胞株において神経栄養因子の発現増加作用を指標としたin vitroでのassay系を確立し、そのassay系を用いて新規標的分子を直接的にアプローチするために必要な抗うつ薬リガンド(ビオチン化抗うつ薬)の合成に成功し、そのリガンドを用いてアフィニティクロマトグラフィに応用し、プロテオミクス解析を行い、5つの候補蛋白を同定した(未発表データ)。一方、アストロサイト培養細胞における神経栄養因子誘導性の抗うつ薬の作用メカニズムを薬理・生化学的手法を用いて検討し、その薬理作用はモノアミンを介さず、アストログリアおよび抗うつ薬に特異的であり、繊維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)-ERK-CREBシグナリングおよびその上流の分子機構(マトリックスメタロプロテアーゼ[MMP]活性化によるFGF-2の放出機構)を介していることを明らかにした。抗うつ薬のグリア(アストロサイト)における作用点を明らかにする目的で、機能的アプローチ(1)および直接的アプローチ(2)の双方向から検討した。(1)抗うつ薬によるグリアへの作用をグリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)産生を指標に分子薬理学的検討を行った。抗うつ薬→マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)活性化→線維芽細胞成長因子(FGF)2切り出し→FGF受容体の活性化→MEK/ERK/CREB系を介したGDNFmRNA増加→GDNF蛋白の遊離の一連のプロセスを明らかにした。(2)アフィニティクロマトグラフィの手法を用いて検討を行った。数種類の抗うつ薬ビーズの作成に成功し、これをリガンドとしてグリア細胞溶解液と反応させて、抗うつ薬と直接結合する蛋白質を免疫沈降、電気泳動および銀染色を用いてバンドとして表出することに成功した。これらの結果から、抗うつ薬はグリアにおいて、細胞膜近傍のMMPの活性化に関連する部位に直接作用することが想定される。また、直接的アプローチの手法の基礎的段階はクリアできたため、今後は条件の最適化やアミノ酸解析を行うことにより候補蛋白の探索へ進むことができる。アストロサイトのモデル細胞であるC6細胞だけでなく、初代培養アストロサイトにおいて、多種類のうつ病関連栄養因子・成長因子の発現作用を見出すことができた。さらに標的分子としてマトリックスメタロプロテアーゼおよびG蛋白が候補として重要であることを見出した。機能的アプローチは順調に解析が進んだが、直接的アプローチによる基礎的検討および条件の最適化に時間を要した。今後は、アストロサイトにおける抗うつ薬のモノアミン非依存性メカニズムを検討する。マトリックスメタロプロテアーゼおよびG蛋白を標的分子の候補として、薬理学的検討および直接効果の有無を試験管内で明らかにしていく予定である機能的アプローチに関しては直接的アプローチよりも軌道に乗っているため、機能的アプローチを推進する。特に抗うつ薬によるMMP活性化に焦点をあてて解析を行う。例えば活性化されるMMPのサブタイプやMMP活性化因子(G蛋白など)の関与も検討する分子薬理学的手法に関する消耗品に使用する予定である。分子薬理学的手法に関する消耗品に使用する。
全方向スパイン計測解析法の開発と前頭前野神経細胞スパインの解析

スパイン(シナプス後部)は神経ネットワークにおいて中心的な役割を担っている。研究代表者らが開発したプログラムは膨大な数のスパインの解析を可能とした。困難だった3次元的な解析について、蛍光の褪色を大幅に改善し、3次元的な解析を行うための決め手となる方法を見出した。以上を多くの研究者に役立つ手段とするプログラムの整備を行った。また前頭前野を含むオキシトシン定量法を確立し、前頭前野スパインの機能解析の基盤を構築した。本年度ではスパイン可視化のより良い手段を前年度に引き続き探求した。スパイン(シナプス後部)は脳の神経細胞ネットワークにおいて中心的な役割を担っている。前年度に使用を想定していた量子ドットが予想に反して十分な発光が得られなかった等の問題があったが、検討を重ね発光の特性が共焦点顕微鏡の観察・測定に適しているものを見出した。現在これを用いて神経細胞の可視化を検討してきており、今後克服すべき課題も見出されたが近い将来解決可能と思われ、3次元可視化のための新規な方法として論文を準備中である。また、計画に記載した前頭前野の神経細胞スパインとオキシトシンに関する研究の実行過程において、驚くべきことに実はオキシトシンの脳実質内濃度はよくわかっていないことが判明した。内在性および外部から投与したオキシトシンの濃度が定量できなければ、オキシトシンの効果を見定めることは難しい。しかし現在用いられている方法は非常に不十分なものであった。よって、まずオキシトシンの定量法の開発に努めた。具体的には放射性標識されたオキシトシンを用いることにより、定量作業中に失われる分を考慮したオキシトシンの正確な濃度を決定する方法の確立に成功した。現在の研究以外への波及効果(ヒト試料にも適用可能)も大きいと考えられ、現在、論文を投稿準備中である。さらに、前頭前野神経スパインの機能解析を試みた。スパインが変化した結果、シナプス機能が変化することが前頭前野の機能発現上非常に重要と考えられる。そのため、多電極でシナプス活動による局所電場電位を測るための測定系を構築した。現在までに予備的な結果を得つつある。年度末での研究代表者の転任により再構築が必要であるが、今後オキシトシンによるシナプス機能の変化の測定を重ねさらに発展することが見込まれる。この棘構造は約1世紀前に発見されて以来、記憶を担う可塑性の主役と目され、統合失調症などの精神疾患でも変化していることが明らかになってきており、世界中で研究が重ねられている。しかし、その莫大な数ゆえに、計数・解析作業は熟練した研究者の手作業にほぼ頼っており、多数の神経細胞に及ぶ研究は阻まれてきた。この難局面を打開すべく、研究代表者らによって開発されたスパイン自動解析プログラムSpisoはスパインの計測解析を手作業からコンピュータの自動作業に変えることに実用的なレベルで世界で初めて成功した。以上の成果を多くの脳科学の研究者に役立つ新たな計測解析手段として提供することを目的として、プログラムのさらなる整備を行い、成果を国際的な欧文誌であるCerebral Cortex誌に研究代表者を筆頭著者とする論文として投稿し、査読を経て掲載に至らせた(Mukai, H. et al.,"Automated analysis ofspinesfrom confocal laser microscopyimages: application to the discrimination of androgen and estrogeneffects on spinogenesis"Cerebral Cortex, 21(12), 2704-2711, 2011)。この論文は発行号においてEditor's Choice(編集者推薦論文)に選ばれ、また掲載後海外からの問い合わせも相次ぐなど高い関心を集めている。また方法の深化を目指すべく、神経細胞の可視化手段にとって重要である量子ドット・有機金属色素等の検討を行った。さらにこれまで主に解析の対象であった海馬に加え、前頭前野の神経細胞の可視化にも取り組んだ。本研究では、多くの脳科学の研究者に役立つ新たな計測解析手段としてスパイン解析プログラムを提示することを一つの目的としている。そのため、様々な整備を行って、成果を国際的欧文誌であるCerebral Cortex誌に研究代表者を筆頭著者とする論文として投稿し、査読を経て掲載に至らせたこと(Mukai, H. et al., Cerebral Cortex, 21(12), 2704-2711, 2011)は大きな具体的成果である。この結果は世界の最先端を行くものであり、実際この論文は発行号において一号につき一論文のみ選ばれるEditor's Choiceとなった。また掲載後海外からの問い合わせも相次ぐなど高い関心を集め、十分な波及的効果を挙げつつあると考えられる。成果の一部を発表すると同時に、一方の目的である方法のさらなる深化を目指して、神経細胞の可視化手段にとって重要である量子ドット・有機金属色素等の検討を行いつつある。

これまでに有望な蛍光分子をいくつか見出し、さらに最適なものを選び出す努力を続行中である。最終的には非常に有力な物質が見出されると期待できる。またこれまで主に解析の対象であった海馬に加え、申請において計画した前頭前野の神経細胞の可視化にも取り組んでいる。具体的には帯状回皮質のII・III層細胞の樹状突起の機能を保存した形で切り出す方法の開発を電気生理などの多側面からの手段による検討を加え行っている。現在までに薬理学的に皮質のネットワーク振動を起こすことができるような状態の脳標本の調製に成功した。以上のように、本研究では成果を確実に発表に結び付けつつ、最終年度に向けて研究の遂行に努めており、現時点での目的の達成度は良好と判断される。研究の最終年度である24年度では、方法のさらなる深化を目指して、神経細胞の可視化手段にとって重要である量子ドット・有機金属色素等を検討し最適なものを選び出す努力を続行する。これまでに有望な蛍光分子をいくつか見出したが、さらに決定的なものを見出すべく従来生物学研究に使われてきた色素の範囲を超えることを考えている。本研究のような計測を主とする実験研究では、測定機器と量子ドット・有機金属色素など色素・薬品類は一体となって改善され初めて測定性能の上がった結果に結びつくものであり、測定機器自体も一新し、研究費も以上に相当額を支出して展開を図る。前年度に取り組んできた前頭前野の神経細胞の可視化の検討をさらに進める。具体的には情動や社会的行動制御にかかわる前頭前野の一部である帯状回皮質を選び、そのII・III層細胞の樹状突起の機能を保存した形で切り出す方法の開発を、電気生理的測定などの多面的な手段による検討を加え行った。現在までに薬理学的に皮質のネットワーク振動を起こすことができるような状態の脳標本の調製に成功しているので、この標本を中心に、前頭前野の神経細胞の形態やオキシトシンの効果の全貌解明を目指す。以上の実験研究の努力に加え、現時点までの成果の普及を促進する。上述の論文という結果は日本発にして世界の最先端を行くものであり、先述のように十分な波及的効果を挙げつつあるが、さらに論文にとどまらず、国際学会(北米神経科学学会)に研究代表者本人が出席して海外研究者と積極的に議論し普及を図り、研究者の顔が見える日本の科学の成果という評価を確立することに努める。以上のように成果を確実に普及するとともに、最終年度の研究を推進しさらなる成果を得る。上述のように24年度では、23年度で準備を重ねた計画を実行するために研究費を支出する。24年度に使用する予定の研究費がある理由としては、特殊事情として、研究代表者は研究初年度(23年度)の半ば(8月)で研究機関を異動したことがあげられる。そのため前所属機関では事務上の要請から支出が行えず、利用可能な周辺機器類もある程度変動した。さらに東日本大震災の影響による予算措置で研究費の分割交付という事情もあり、測定機器等に支出可能な額の見極めも不明な時期を経験せざるを得なかった。
異種気管移植の実験的検討、特に冷凍保存による抗原性低下の可能性について

1.ブタからイヌへの凍結保存異種気管移植ブタ気管を採取し-80°Cで14週間凍結保存した後、摘脾した雑種成犬に同所性に異種移植し移植片の生着状況観察した。ブタ気管は移植後2週目には拒絶反応による線維性肉芽性組織の増殖によって高度の狭窄、閉塞Obliteratyive airway disease(OAD)をきたすことが判った。FK506、DSG、methylpredonisoloneで防止することは出来なかった。また凍結の有無、期間によるOADの程度に差はなかった。しかしstentを移植気管内に留置することによって内腔を保持し、長期生存が可能であった。2.移植気管におけるのCD4,CD8,IgMの発現モルモットからラットへの凍結保存気管の腹腔内異種移植モデルを用いて、移植片の浸潤細胞のCD4,CD8,IgMの発現をmAbを用いて免疫染色し、同系、同種移植片と比較検討した。CD4(+)細胞は同系では全くみられず、同種で60%、異種で100%にみられた。CD8(+)細胞は同系で75%、同種で100%、異種で100%にみられた。IgM(+)細胞は同系では全くみられず、同種で40%、異種で100%にみられ、凍結保存の有無、期間による差はなかった。OADは異種移植で最も高度であり、細胞性免疫のみならず液性免疫の両者が関与していることが判った。3.気管異種移植における免疫寛容ハムスターからF344ラットへの気管・腹腔内移植モデルを作成し、hypoxanthine phosphoribosyl-transferase geneをprimerとしてPCR法を用いてレシピエント末梢血白血球におけるmicrochimerismの発現を観察した。ハムスターに特異的な128bpのbandは生存期間中確認されず、microchimerismは発現しないことが判った。CsA,FK506,DSG,PredinisoloneでOADの発生を防止することはできなかった。【実験方法】体重3040kgのブタより気管を採取し-80°Cで13週間冷凍保存した。体重1420kgの雑種成犬に摘脾を行い1週後に、縦隔気管を5軟骨輪切除して、解凍したブタ気管5軟骨輪を同所性に移植し有茎大網で被覆した。免疫抑制剤の種類によってイヌを次の4群に分けた。【結果】生存期間:移植後712日目に6頭が衰弱、肺炎で死亡した。14頭が857日生存したが、気管の高度狭窄のため犠牲死させた。57日生存したイヌはTチューブをグラフト内にステントとして留置した。術後4週目には気管粘膜の再生は良好であったが、Tチューブを除去すると狭窄をきたすため犠牲死させた。気管支ファイバー所見:術後グラフトの粘膜は白色調で高度の阻血性変化を示し、1週目には次第に壊死性となり、2週目以後は高度の瘢痕性狭窄を示した。各群も同じ経過を示し差はみられなかった。Microangiographyの所見:術後1週目には移植気管の外膜側に微小血管の新生がみられるが粘膜下への血流の再生は2週目でもみられなかった。各群間に差はみられなかった。【小括】ブタ気管は移植後2週目には高度の狭窄をきたす。

拒絶反応による微小循環障害によるものと思われ、FK506、DSGの単独もしくは併用、methylpredonisoloneとの併用で防止することは出来ない。しかし、気管内ステントを用いることによって、長期生存が期待できる。【実験方法】ラット凍結気管の腹腔内移植モデルを作成し、同系、同種、異種移植における移植片の生着状況、拒絶反応の発現をHE染色、m-AbCD4,CD8による免疫組織染色を行って組織学的に検討した。凍結保存は-80°C、2週間および4週間とし、1週目、2週目に犠牲死させた。動物を1群(n=12):同系移植(F344→F344ラット)、2群(n=16):同種移植(BN→F344ラット)、3群(n=16):異種移植(モルモット→F344ラット)の3群に分けた。CD4,CD8は全視野で染色陽性細胞数10個以上を陽性と判定した。【結果】組織所見:1群では内腔の狭窄・閉塞は全くみられず、1、2週目ともに全てのラットで中等度の細胞浸潤、扁平上皮円柱上皮の再生が認められた。2群では1、2週目ともに50%のラットで上皮の再生が認められず、高度の炎症細胞浸潤を伴い、内腔の狭窄がみられた。50%に扁平上皮の再生、中等度の炎症細胞浸潤がみられたが狭窄はなかった。2週目も同様の所見を示し、3群では内腔は繊維・瘢痕化し閉塞しており、1、2週目ともに上皮の再生は全く認められなかった。各群とも、即時移植片、2、4週間保存片に差はみられなかった。【結論】モルモットからラットへの気管異種移植において、移植気管は2週目に気管内膜の肥厚により完全閉塞し、粘膜上皮の再生は全く認められずgraft failureとなった。CD4陽性細胞が著明な増加を来していたことから、細胞性免疫機構による拒絶反応が原因と考えられる。冷凍保存期間による差はみられず、4週間以内の冷凍保存は免疫能に著名な影響を及ぼさないことが示唆された。1.凍結保存気管の異種移植片浸潤細胞のCD4,CD8,IgM発現について検討した。方法:ラット気管およびモルモット気管を-80°Cに凍結保存し2週もしくは4週目にラット腹腔内に同系、同種、および異種移植移植し、術後2週目に犠牲死させ、移植片の浸潤細胞を抗CD4,CD8,およびIgM抗体を用いて免疫染色した。結果:CD4(+)細胞は同系では全くみられず、同種で60%、異種で100%にみられた。CD8(+)細胞は同系で75%、同種で100%、異種で100%にみられた。IgM(+)細胞は同系では全くみられず、同種で40%、異種で100%にみられ凍結保存期間による差はみられなかった。結論:拒絶反応による線維性肉芽組織による気管の閉塞は異種移植で最も高度であり、液性免疫のみならず細胞性免疫が関与していることが判った。2.気管異種移植における免疫寛容の成立の有無について検討した。方法:ハムスターからF344ラットへの気管・腹腔内移植モデルを作成し、3、5、7、14日めにレシピエントの末梢血を採血し、hypoxanthine phosphoribosyl-transferase geneをprimerとしてPCR法を用いて白血球のmicrochimerismの発現を観察した。免疫抑制剤CsA,FK506,Predonisdoloneを単独および併用投与した。結果:各群とも14日目に気管内腔は完全に閉塞し、ハムスターに特異的なl28bpのbandは生存期間中確認されなかった。