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思考力・表現力を育てるスクイーク活用授業-企画書作成と作品ふりかえりを重視して-

児童の思考力・表現力の育成をねらいに、平成18年度から、総合的な学習の時間に「Squeak-etoys」(以下スクイーク)を活用した授業実践に取り組んできた。実践から学んだことを順序だてて考えたり、自分の考えを明確に伝えたりする力が弱いことが、新たな課題となってきた。そこで、論理的に順序だてて書いたり話したりする力を育てるために、企画書作成と作品の作品づくりのふりかえりを重視した実践をおこない、その有効性を考察した。本研究は、児童の思考力・表現力の育成をねらいに、図工科の時間において、スクイークを活用し、【企画書作成】【表現活動】【発表・公開】の3ステップを基本とした授業実践に取り組んだ。今年度は【企画書作成】の改善として、絵と動きを表現した文章を紙面にまとめることに加え、言語活動を取り入れたこと、また、作品完成後に作品づくりのふりかえり活動を導入して実践を進めた。研究の結果、児童が作成した作品には、複数のプログラムを組み合わせて複雑な動きを表現したものが多く見られた。『企画書』作成時に、何をどのように動かしたいのかを指導者と話し合い、完成作品を強くイメージ持たせたことが、より豊かな発想で作品づくりに取り組むことにつながったと考えられる。子どもたちは、毎時間の学習のふりかえりをすることで、次時の活動の目標や課題を自ら設定して活動を進めていた。同時に、自分の作品をどのように完成に近づけるのかを、失敗しても何度も繰り返して作品作りをしていた。スクイークを活用した授業では、ふりかえり活動を取り入れることは試行錯誤する姿勢を育成できると考えられる。『企画書』作成、作品作り、作品づくりのふりかえりのそれぞれの活動を、効果的に進めるためには、図工科だけにとどまらず、国語科などの他の教科と連携して活動を進める等の、さらなる授業改善をおこなうことが課題として挙げられた。
慢性腎不全における高リン血症を抑制する新規リン代謝調節ホルモンの機能解析

長期透析における合併症対策は、患者のQOLを左右する重要な問題である。透析時の高リン血症への対策を図るため、腸管および腎臓におけるリン(再)吸収抑制因子の検索が行われ、低リン血症を引き起こす未同定の液性因子phosphatoninが注目された。最近、ポジショナルクローニングより常染色体優性遺伝性低リン血性くる病(ADHR)の原因遺伝子としてFGF23が同定され、同様に低リン血症を呈する腫瘍性骨軟化症の責任腫瘍からも過剰分泌されていることが証明された。そこで、本研究ではHemangiopericytoma患者の摘出腫瘍からFGF23 cDNAをクローニングし、pCIneo発現ベクターに組み込んだ。FGF23をCHO-K1細胞にトランスフェクションし、その培養上清を濃縮しウェスタンブロット法にてその分泌を確認した。さらにこの培養上清をブタ腎臓近位尿細管細胞株LLC-PK1細胞に添加し、24時間培養後total RNAを抽出しRT-PCR解析にてNPT2の発現を検討した。その結果、FGF23によってNPT2の発現は抑制され、先に我々が同定したSTC2とほぼ同程度の抑制効果を示した。また、ADHR患者の変異部位である176番目に変異を導入したFGF23変異体をmutagenesisによって作製し、CHO-K1細胞にトランスフェクションした。この培養上清をLLC-PK1細胞に添加し、同様にNPT2の発現を検討した。その結果、FGF23変異体はSTC2およびFGF23と比較して有意にNPT2の発現を抑制した。最近、FGF23の176-180番目に存在するRXXRモチーフがプロテアーゼ消化をうけることが示唆され、NPT2の発現低下すなわち低リンの誘導には、プロテアーゼによる修飾を受けないFdF23変異体が効果的である可能性が示唆された。今後この変異体をGSTとの融合蛋白として発現させ、5/6腎摘ラットへ投与し、腎不全時の高リン血症予防効果について検討する予定である。我々は透析時の高リン血症への対策を図るため、腸管および腎臓におけるリン(再)吸収抑制因子の検索を行ない、腎近位尿細管におけるリン再吸収を抑制する新規の因子Stanniocalcin-2(STC2)を同定した。そこで、本研究では組換えSTC2を作製しその機能解析を行った。まずGSTをタグとして有するベクターにSTC2 908bpを組み込み、大腸菌に発現させた。GST-STC2融合タンパク質を発現させた大腸菌の抽出液を、セファロース樹脂と混合しグルタチオンを介して結合させた後、さらに過剰のグルタチオンを添加し、競合反応させて融合タンパク質を溶出させた。さらにPreScission Proteaseを用いてGSTとSTC2を切断し、SDS-PAGEを行い33.6kDaのSTC2タンパク質を得た。この精製STC2をフクロネズミ由來腎近位尿細管細胞株(OK細胞)に添加し、リン輸送活性を測定した。その結果Na依存性リン輸送活性は変化せず、ヒトII型リン輸送担体遺伝子5'転写調節領域を用いたプロモーター活性にも影響を与えなかった。最近STC2が細胞外に分泌される際にCasein KinaseIIによってリン酸化される蛋白質であることが報告され、Mammalian細胞発現系による修飾が必要であることが推定された。そこで次に各種細胞株を用いてSTC2の分泌機序について検討したところ、STC2はCHO-K1細胞では発現量に応じ、糖付加修飾を受けた糖蛋白質として構成的分泌が行われ、一方OK細胞では、細胞内にSTC2蛋白質が存在しているにもかかわらず細胞外への分泌は確認されなかった。現在、STC2の分泌調節機構について検討するとともにSTC2トランスジェニックマウスを用いた機能解析を進めている。

最近、FGF23の176-180番目に存在するRXXRモチーフがプロテアーゼ消化をうけることが示唆され、NPT2の発現低下すなわち低リンの誘導には、プロテアーゼによる修飾を受けないFdF23変異体が効果的である可能性が示唆された。今後この変異体をGSTとの融合蛋白として発現させ、5/6腎摘ラットへ投与し、腎不全時の高リン血症予防効果について検討する予定である。
局在化ビラジカル種のスピン多重度制御

ビラジカル種の最安定スピン多重度(1重項vs3重項)に関する研究は、物理有機化学的興味のみならず、機能性有機材料(磁性・電子伝導性)開発の観点からも重要である。歴史的には、カルベンあるいは非局在化ビラジカル(非ケクレ分子、キノジメタン分子)を中心にした研究が行われ、それらの最安定スピン多重度、それに及ぼす隣接置換基効果、及び化学的反応挙動が明らかにされてきた。一方、局在化ビラジカル種に目を向けてみると、理論化学(量子化学計算)的にはある程度研究が行われているが、実験的にはまだまだ未知な部分が多い。すなわち、局在化ビラジカル種は分子内での反応性が非常に高く、化学的及び分光学的な捕捉が困難であった事が考えられる。そこで本研究では、速度論的に安定化を受けたシクロペンタン環上の1,3位にスピンを有するビラジカル種を研究対象として選び、(1)最安定スピン多重度に及ぼす2位上置換基の探査とその効果の解明、(2)スピン多重度に依存した化学的反応挙動の精査、を主な研究目的とした。まず、理論化学計算(B3LYP/6-31G*)によりその最安定スピン多重度に及ぼす置換基(X, Y)効果を見積もった。その結果、一般的な置換基である酸素官能基が、その最安定スピン多重度に大きな効果を及ぼすことを見出した。すなわち、通常(X, Y置換基が水素あるいは炭素官能基の場合)3重項状態が最安定スピン多重度として存在するビラジカルは、2位上への酸素官能基の導入により1重項がその最安定スピン状態になることが理論的に予測された。次にその理論的予測を実験化学的に証明するために、局在化ビラジカルをジアゾ化合物より発生させ、その最安定スピン多重度とその反応性を調査した。その結果、ビラジカルは、確かに1重項状態をその最安定スピン状態として有していることが証明できた。さらに一重項の電子的性質を知る目的で寿命に及ぼす置換基効果を行った。分子内に二つのスピンを有するビラジカル種の最安定スピン多重度(1重項vs3重項)に関する研究は、物理有機化学的興味のみならず、機能性有機材料(磁性・電子伝導性)開発の観点からも重要である。そこで本研究では、速度論的に安定化を受けたシクロベンタン環上の1,3位にスピンを有するビラジカル種を研究対象として選び、(1)最安定スピン多重度に及ぼす2位上置換基の探査とその効果の解明、(2)スピン多重度に依存した化学的反応挙動の精査、を主な研究目的とした。まず、理論化学計算(B3LYP/6-31G^*)によりその最安定スピン多重度に及ぼす置換基(X,Y)効果を見積もった。すなわち、通常(X,Y置換基が水素あるいは炭素官能基の場合)3重項状態が最安定スピン多重度として存在するビラジカルは、2位上への酸素官能基(の導入により1重項がその最安定スピン状態になることが理論的に予測された。すなわち、通常(X, Y置換基が水素あるいは炭素官能基の場合)

3重項状態が最安定スピン多重度として存在するビラジカルは、2位上への酸素官能基の導入により1重項がその最安定スピン状態になることが理論的に予測された。次にその理論的予測を実験化学的に証明するために、局在化ビラジカルをジアゾ化合物より発生させ、その最安定スピン多重度とその反応性を調査した。その結果、ビラジカルは、確かに1重項状態をその最安定スピン状態として有していることが証明できた。さらに一重項の電子的性質を知る目的で寿命に及ぼす置換基効果を行った。
TA-EUSOおよびBalloon-EUSOの望遠鏡の試作・準備

本研究課題は平成26年度が最終年度のため、記入しない。本研究では、TA-EUSO実験およびEUSO-Balloon実験の検出器の準備研究を行う。EUSO光学系と光検出器回路、Telescope Array検出器を用いて、EUSO検出器の較正を行う。本研究の結果を反映させて、実際の宇宙線空気シャワーを観測するEUSO-Balloon実験を遂行する。TA-EUSOで用いる望遠鏡は、JEM-EUSO宇宙望遠鏡の地上試作モデルである。JEM-EUSOは、口径約2.5mで約60度の視野を持つ超広視野望遠鏡で、高度約400kmの軌道上の国際宇宙ステーションから、10^<20>eVを超える極限エネルギー宇宙線を観測するもので、荷電粒子による新しい天文学を創始し、永年の謎である極限エネルギー宇宙線の起源を解き明かすものである。2017年打ち上げ予定のJEM-EUSO実験を、より確実に遂行するために、プロトタイプ望遠鏡を製作し、TA-EUSOとして米国のTelescope Array実験サイトで空気シャワー観測を行う。今年度は、TA-EUSO実験の準備として以下のことを行った。(実験サイトの背景光の推定を含む、)観測時間の推定。検出器の較正方法の確立。データの可視化ソフトの開発。また、実験サイトへのTA-EUSO機器の設置とテストのために、現地(米国のTelescope Array実験サイト)で作業を行った。平成24年12月3日7日に東大宇宙線研究所、理研で行われた定例の第12回JEM-EUSO国際会議に出席し、これらの経過を報告、議論した。TA-EUSO検出器の設置に必要なソフトウェアの開発や研究は、装置の設置スケジュールの前に成功裏に終了した。米国ユタ州での装置設置も成功した。来年度は、TA-EUSO実験に於いて、実際にデータ収集を行い、データ解析を行う。そのために、観測サイトである米国ユタ州にも赴く。TA-EUSO実験で得られた知見は、EUSO_Balloon実験にも有益となる。EUSO_BalloonやJEM-EUSOの国際会合、また、宇宙線国際会議に参加し、これらの結果を報告し議論する。
ループスアンチコアグラント対応抗原の多様性と接着分子を介する血栓形成機序の解明

近年,反復性血栓症の既往のある抗リン脂質抗体症候群(antiphospholipid syndrome ; APS)症例では血中接着分子(vascular cell adhesion molecule-1;VCAM-1)濃度が高いことが報告され,本症候群の血栓症の発症と細胞相互間作用の変化との関連が注目されている.しかし,接着分子の発現を高める抗体のサブタイプは不明であり,接着分子の発現による血栓症の発症機構も不明である.本研究では,抗リン脂質抗体の主要抗体である4種類の抗プロトロンビン抗体(anti-PT)を培養ヒト臍帯静脈血管内皮細胞(HUVEC)に添加後培養し,anti-PTの相違によるVCAM-1,intercellular adhesion molecule (ICAM)-1,E-selectinの発現量・発現部位の差違を比較することにより,血管内皮において接着分子の発現を高める抗リン脂質抗体のサブタイプを特定した.その結果,陰性荷電リン脂質,カルシウムイオン存在下でヒトプロトロンビンとのみ結合するanti-PT#1は血管内皮に作用して各種接着分子の発現を亢進させ,これにより血管内皮-白血球の接着をきたし血栓形成を惹起する可能性が示唆された.他のanti-PT,特にヒトのみならずウシプロトロンビンとも結合しうるanti-PT #3,#4は血管内皮上の接着因子発現を誘導せず,このことはこれらのanti-PTが血栓症をほとんど発症しないという臨床所見と合致するものと考えられた.以上の結果より,抗リン脂質抗体陽性者における臨床症状の多様性は個々の症例が有する抗体の多様性により血管内皮細胞の接着分子の発現におよぼす影響が異なることにより,血管内皮のみならず単球・血小板の向血栓性を惹起する効果に相違があることに起因する可能性が示唆された.本研究成果から,個々の症例が有する抗リン脂質抗体のサブタイプを同定することにより本抗体陽性症例の血栓症発症の予後が推測可能であり,一次予防が必要な症例を検出可能であると結論される.近年,反復性血栓症の既往のある抗リン脂質抗体症候群(antiphospholipid syndrome ; APS)症例では血中接着分子(vascular cell adhesion molecule-1;VCAM-1)濃度が高いことが報告され,本症候群の血栓症の発症と細胞相互間作用の変化との関連が注目されている.しかし,接着分子の発現を高める抗体のサブタイプは不明であり,接着分子の発現による血栓症の発症機構も不明である.本研究では,抗リン脂質抗体の主要抗体である4種類の抗プロトロンビン抗体(anti-PT)を培養ヒト臍帯静脈血管内皮細胞(HUVEC)に添加後培養し,anti-PTの相違によるVCAM-1,intercellular adhesion molecule (ICAM)-1,E-selectinの発現量・発現部位の差違を比較することにより,血管内皮において接着分子の発現を高める抗リン脂質抗体のサブタイプを特定した.その結果,陰性荷電リン脂質,カルシウムイオン存在下でヒトプロトロンビンとのみ結合するanti-PT#1は血管内皮に作用して各種接着分子の発現を亢進させ,これにより血管内皮-白血球の接着をきたし血栓形成を惹起する可能性が示唆された.他のanti-PT,特にヒトのみならずウシプロトロンビンとも結合しうるanti-PT #3,#4は血管内皮上の接着因子発現を誘導せず,このことはこれらのanti-PTが血栓症をほとんど発症しないという臨床所見と合致するものと考えられた.以上の結果より,抗リン脂質抗体陽性者における臨床症状の多様性は個々の症例が有する抗体の多様性により血管内皮細胞の接着分子の発現におよぼす影響が異なることにより,血管内皮のみならず単球・血小板の向血栓性を惹起する効果に相違があることに起因する可能性が示唆された.本研究成果から,個々の症例が有する抗リン脂質抗体のサブタイプを同定することにより本抗体陽性症例の血栓症発症の予後が推測可能であり,一次予防が必要な症例を検出可能であると結論される.抗リン脂質抗体症候群(APS)の血栓形成機序として抗リン脂質抗体(aPL)による血管内皮細胞・単球における接着分子発現の亢進が関与しているとする報告がある。一方で、aPL陽性例でも血栓症発症を認めない症例など臨床症状に相違が見られることからaPL、特に抗プロトロンビン抗体(anti-PT)を抗原(prothrombin)との結合様式の相違により4種類のサブタイプに分類し、本年度(2002年度)は血管内皮細胞において接着分子の発現を高める抗リン脂質抗体のサブタイプの同定を試みた。以上の結果よりanti-PT#1は血管内皮に作用して各種接着分子の発現を亢進させ、これにより血管内皮-白血球の接着をきたし血栓形成を惹起する可能性が示唆された。他のanti-PT、特にanti-PT#3,#4は血管内皮上の接着因子発現を誘導せず、このことは,これらのanti-PTが血栓症をほとんど発症しないという臨床所見と合致するものと考えられた。以上の結果より,抗リン脂質抗体症候群における血栓形成・不育症の発症には接着分子の果たす役割が重要であるものと考えられた.
歯内埋込み型無線ICタグによるステルス認証

ISO/IEC15693におけるRFIDの通信周波数は短波帯(13.56MHz)であり,この帯域の電波については生体軟組織を通過することは既に確認されている。本研究以前に、本研究実施者の研究により、歯の内部に無線ICタグが格納された際,比較的電子密度の高い硬組織を電波が通過できる可能性について、中波帯の小型RFIDタグを用い,これをヒト抜去歯内部に格納した際の影響は、5パーセント未満の通信距離の減少にとどまり、少なくともRFIDをヒトの歯の内部に格納しても,外部にあるリーダーとの通信にはさほど影響を与えないことがわかった.そこでまず本研究では、SUICAやエディなどのセキュリティ機能を持つRFIDが使用される周波数帯である13.56MHzにおけるRFIDの口腔内設置を念頭に、ISO/IEC15693(近傍型)RFIDを用いて,直径3mm,長さ8mmの小型無線ICタグを作成,埋め込み前の状態で3cmの通信距離を確保した.これをビーグル犬における歯内療法を実施した犬歯歯髄腔内部に設置したところ,約0.5W出力を有するハンディリーダ・ライター(FPRH100:マイティーカード株式会社)を用いて,口腔周囲組織を介して顔面側方部から口腔外にあるリーダーと通信可能であることが実証された。そしてその際の通信距離は2.5cmと推定された.さらに、この試作したRFIDが口腔内に設置された状態で、携帯電話に内蔵したリーダー通信を実施するため、リーダーの小型化を実施したところ、幅1cm、長さ3cm厚さ2mmのアンテナから、口腔内にあるRFIDへの通信が可能となった。携帯電話と口腔内に設置したRFIDの通信はステルス性が高く、セキュアな本人確認に威力を発揮すると見られるが、充分な通信距離を確保し,かつ情報漏洩を防止する観点から,通信距離を10cm程度にコントロールするのが適切と思われる.ISO/IEC15693におけるRFIDの通信周波数は短波帯(13.56MHz)であり,この帯域の電波については生体軟組織を通過することは既に確認されている。携帯電話と口腔内に設置したRFIDの通信はステルス性が高く、セキュアな本人確認に威力を発揮すると見られるが、充分な通信距離を確保し,かつ情報漏洩を防止する観点から,通信距離を10cm程度にコントロールするのが適切と思われる.本研究は、う蝕等の病変および補綴学的要求等による歯科臨床的要件により、歯の歯髄が除去された状態、すなわち失活歯の内部に生ずる歯髄腔および根管内に、非接触通信型ICチップ(以下RFID)等、無線通信機能を有する微小な電子媒体を収容した上、RFID電子媒体に本人を証明するユニークな電子情報を格納して、確度の高い本人確認手段とする手法を開発するものである。この方法により、電子媒体のような生体親和性に乏しい異物であっても、長期間にわたり生体内に安全に格納、留置することが可能となる。またその際、歯内に格納されたRFIDとの通信を、携帯電話に格納したリーダ・ライターを用いて行うことで、装置の存在および運用を秘匿(ステルス化)することが可能となり、個人のプライバシー保護およびセキュリティの確立に利用することができる。生体内に設置した無線ICタグ通信媒体と通信し制御を実施するために用いる電波として、硬組織および軟組織を同時に透過しうる短波領域を用いるのが適当と思われる。そこでこの帯域をカバーするRFIDチップ(ISO/IEC15693chip 13.56MHz : SRF55V10S, Infineon Technologies)をもとに縦3mm、横8mm、厚さ2mmの無線ICタグを顕微鏡下にて製作した。この無線ICタグとマルチタグロングレンジリーダ・ライター(TD-1、マイティカード)を用いて通信を実施したところ、最大通信距離は約40mmであった。この通信距離は歯内に設置されたことを想定した際に、装着者本人の携帯電話内にあるリーダ・ライターとの通信には充分な距離である上、第3者による外部からの歯内にあるRFIDに対する不正アクセスを抑止するにも有効であると見られる。

この技術は近年普及しつつあるクレジットカード機能などの決済機能を持つ携帯電話による電子決済の際の本人確認手段として利用することが可能である。本研究は,歯内埋込型無線ICタグを利用したセキュアな個人認証を目的として,これを実現する具体的手法を確立することである.一昨年度は口腔内に無線ICタグを実装する方法として,ICタグを小型化して歯内に格納する方法を確立した.今報告年度では無線ICタグを口腔周囲に格納するより実践的な手段を具体化し,さらにその安全性の確立を念頭に開発を行ってきた.その結果,これまではICタグの格納手段を歯に求めていたけれども,ICタグのさらなる小型化には電子チップのさらなるダウンサイジングなど,現在は開発途上にある技術の確立を待つ必要があるため,現状ではC3以上の齲蝕による歯内療法を実施した歯や,ブリッジのポンティック内などに適用が限られる.さらに,無線ICタグを歯に実装するには,無線ICタグには咬合力などに耐えうる高い物理的耐久性も要求される.そこで,無線ICタグを口腔内に設置できる症例範囲を,これまでの歯に限定していた方法から,軟組織を含む口腔周囲組織内を実装対象とするため,無線ICタグを歯周組織再生治療用のGTRメンブレン等に組み込んで歯周組織内に設置する方法を合わせて確立することとした.これは個人認証機能と併せ,将来的には生体センサーも無線ICタグに取り入れることで,生体内部情報のモニタリングによる健康維持システムへの発展をも目指すものである.この方法は従来からある歯周外科手術の過程で無線ICタグを無理なく生体組織内に導入できるので,既にある歯内埋込型無線ICタグと同様,歯周病治療の一環として患者に適用することが出来る点で医学的倫理条件をクリアしている.しかも歯槽骨に貼付することで,生体内に固定され安定して留置できるので,安全性についても問題がない.これは従来生体組織に埋設できるガラスカプセル型生体埋込タグには無い全く新しい発想のものであり,技術的に大きく進歩したものである.ISO/IEC15693におけるRFIDの通信周波数は短波帯(13.56MHz)であり、この帯域の電波については生体軟組織を通過することは既に確認されている。本研究以前に、本研究実施者の研究により、歯の内部に無線ICタグが格納された際、比較的電子密度の高い硬組織を電波が通過できる可能性について、中波帯の小型RFIDクグを用い、これをヒト抜去歯内部に格納した際の影響は、5パーセント未満の通信距離の減少にとどまり、少なくともRFIDをヒトの歯の内部に格納しても、外部にあるリーダーとの通信にはさほど影響を与えないことがわかった.そこでまず本研究では、SUICAやエディなどのセキュリティ機能を持つRFIDが使用される周波数帯である13.56MHzにおけるRFIDの口腔内設置を念頭に、ISO/IEC15693(近傍型)RFIDを用いて、直径3mm,長さ8mmの小型無線ICタグを作成、埋め込み前の状態で3cmの通信距離を確保した.これをビーグル犬における歯内療法を実施した犬歯歯髄腔内部に設置したところ、約0.5W出力を有するハンディリーグ・ライター(FPRH100:マイティーカード株式会社)を用いて,口腔周囲組織を介して顔面側方部から口腔外にあるリーダーと通信可能であることが実証された。そしてその際の通信距離は2.5cmと推定された.
非対称融合のためのマイクロプロトプラスト生成誘導法の開発

1、物理的方法による異常減数分裂誘導非対称細胞融合の一方の細胞として、なるべく少ない染色体数をもつ細胞を生成する目的で、前減数分裂期のS期G2期と推定される花粉母細胞を含むエンレイソウ蕾(植物体)に対し、それぞれ30°C・3日間の処理を行った。高温処理後、植物体を15°Cで保存したところ、対合異常、キアズマ形成異常、紡錘体の機能不全などにより、様々な中期像がみられ、結果として正常の四分子に代わり異常減数分裂生成物となった。S期後期の処理群は、減数分裂のかわりに体細胞分裂をした結果、80%以上の細胞が25分子を形成した。一方、G2期処理群では、異常減数分裂の結果610分子以上を形成するものがG2前期の処理群で約50%、G2中期の処理群で約70%出現した。したがって、G2中期に対する高温処理が最も激しい多極分裂を誘導し、より少数の染色体を含むマイクロ細胞を生成することが明らかになった。2、培養による異常減数分裂誘導減数第一分裂複糸期から中期のテッポウユリ花粉母細胞を5期に分割して培養を行い、培養による異常減数分裂の頻度を調査した。複糸期前期では、花粉母細胞の生存率は1020%未満、後期で約30%であったが、染色体の分配が不均等な38分子を形成する細胞の割合が高く、58極に分裂する細胞が30%以上出現した。移動期以降に培養された場合、花粉母細胞の生存率は上昇するが、異常の割合は減少し4、5、6細胞を形成した。さらに第一分裂中期に培養された細胞では、ほとんどが四分子を形成した。したがって、生存率が比較的高く、高頻度に多細胞を形成する複糸期後期の花粉母細胞の培養は、マイクロ細胞生成に有効であると判断された。3、酵素処理によるマイクロ細胞のプロトプラスト分離高温処理・培養によって生成された多分子からは、1530分の酵素処理によって、大小さまざまな大きさのプロトプラストが分離可能であった。このようにして得られた、いわゆるマイクロプロトプラストは、非対称細胞融合の一方の材料として、体細胞への染色体導入と同じ価値を持つと考えられる。
ずり応力により調節される血小板凝集と血栓形成過程の生体内リアルタイム解析

生理的血流状況(ずり応力下)での血栓形成の制御機構を明らかにする為に、血小板の粘着・凝集とPS発現に着目して生体内で血栓形成過程をリアルタイムに解析した。高ずり応力下においては、接着蛋白であるvon Willebrand Factor(vWF)は高次構造が変化し血小板と内皮下のコラーゲンの粘着を仲介するとされる。我々はvWF切断酵素(ADAMTS13)遺伝子欠損マウスと緑色蛍光蛋白発現遺伝子変異マウスのhybridoma(GFP-ADAMTS13^<-/->)を作成し、血管内皮細胞のWeibel Parade小体(W-P body)より分泌されるUltra large multimer vWFの血栓形成に及ぼす影響を検討した。(1)ADAMTS13-/-GFPではGFPに比較して、FeCl2による血管内皮傷害時のvWFが有意に長く、これに粘着した血小板数も多かった。(2)レーザー照射による血管内皮傷害部位における初期血小板血栓の形成に際し、ADAMTS13-/-GFPではGFPに比較してその大きさが有意に大きかった。(3)レーザー照射による血管内皮傷害部位における血小板血栓の中央にvWFの集積が認められたが、その量はADAMTS13-/-GFPとGFPで有意差を認めなかった。これらの事実より、ADAMTS13により切断されないultra largemultimer vWFは、内皮傷害部位における血小板の粘着と、初期血小板血栓の形成を促進していると考えられた。その後の血栓安定化にはvWFの集積が不可欠であり、これにはvWFの長さを影響しないと考えられた。ADAMTS13活性が低下することにより発症する血栓性血小板減少性紫斑病の病態を理解する上で重要であり、播種性の微小血栓は形成しやすくなるものの、血栓症の原因となる巨大血栓の形成にはいたらないという臨床症状を説明するものである。本研究では生理的血流状況(ずり応力下)での血栓形成の制御機構を明らかにする為に、血小板の粘着・凝集とPS発現に着目して生体内で血栓形成過程をリアルタイムに解析している。高ずり応力下において'は、接着蛋白であるvon Willebrand Factor(vWF)は高次構造が変化し血小板と内皮下のコラーゲンの粘着を仲介するとされる。野生型GFPマウスと比較して、GFP-ADAMTS13^<-/->では血管内皮細胞より数珠状につながる粘着血小板を多く認めた。形状よりvWF multimerに粘着したGFP-血小板と考えられる。vWF分泌刺激として知られるDDAVP投与より血小板粘着vWFは増加した。多くは短時間(10-20分)で消失したが、脱水あるいはストレス負荷を加えることにより微小血管の閉塞像も認められた。ADAMTS13の活性低下等により播種性に血小板血栓が形成され血栓性血小板減少性紫斑病を惹起するとされる。これまでコラーゲンに粘着したvWFのADAMrs13による分解のみが注目されていたが、血管内皮から分泌されたultra largemultimerもADAMTS13依存性に分解される事が明らかとなった。

これよりvWFの急激な分泌増加は血小板凝集及び血栓形成の引き金になると考えられた。今後は分泌直後のultra large multimerに粘着した血小板が、どのような機序で消失するか、また逆にどのような刺激が加わると血栓形成の基盤となるべく活性化されるかをずり応力の異なる動静脈で検討し、血栓形成機構におけるその役割を解析する。von Willebrand因子(vWF)切断酵素(ADAMTS13)遺伝子欠損マウスとGFP発現遺伝子変異マウス(GFP)のhybrid mouse(ADAMTS13-/-GFP)を用いて,ultra large multimer vWFの血小板血栓,ならびにPS発現に及ぼす影響を検討した。(1)ADAMTS13-/-GFPではGFPに比較して,FeC12による血管内皮傷害時のvWFが有意に長く,これに粘着した血小板数も多かった。(2)レーザー照射による血管内皮傷害部位における初期血小板血栓の形成に際し,ADAMTS13-/-GFPではGFPに比較してその大きさが有意に大きかった。(3)レーザー照射による血管内皮傷害部位における血小板血栓の中央にvWFの集積が認められたが,その量はADAMTS13-/-GFPとGFPで有意差を認めなかった。これらの事実より,ADAMTS13により切断されないultra large multimer vWFは,内皮傷害部位における血小板の粘着と,初期血小板血栓の形成を促進していると考えられた。その後の血栓安定化にはvWFの集積が不可欠であり,これにはvWFの長さを影響しないと考えられた。ADAMTS13活性が低下することにより発症する血栓性血小板減少性紫斑病の病態を理解する上で重要であり,播種性の微小血栓は形成しやすくなるものの,血栓症の原因となる巨大血栓の形成にはいたらないという臨床症状を説明するものである。
離散型要素を用いたFEMによる鉄筋コンクリート構造の非線形解析プログラムの開発

1.ひび割れ進展プログラムの作成部材中に逐次進展するひび割れを、解析上で計算される部材の主引張応力がコンクリ-トの引張強度に達する点に1ステップあたりひび割れ要素を一要素ずつ挿入し、この過程を繰り返すことにより表現している。ひび割れ要素は主引張応力方向に対して直角に挿入し、部材中の応力状態により発生する斜めひび割れおよび分岐ひび割れを、アイソパラメトリック四辺形および三角形要素を用いて再メッシュ分割が可能となった。2.ひび割れ界面で伝達される垂直・せん断力を表現する離散型ひび割れ要素の開発ひび割れ界面での応力伝達には、ひび割れ面垂直方向の変位(δ_n)により発主する垂直応力(σ_n)、およびひび割れ面平行方向の変位(δ_t)により発生するせん断伝達応力(τ_t)が挙げられる。本研究で提案する要素構成則では、垂直応力-変位関係(σ_n-δ_n)には既往研究からの引張軟化特性を用いて表現した。また、τ_tはδ_nおよびδ_tに依存するため、ひび割れ幅-かみ合わせ関係(δ_η-τ_<max>)を仮定し、任意のδ_nで伝達される最大せん断力(τ_<max>)を決定し、そのτ_<max>を最大点とするせん断応力-変位関係(τ_t-δ_t)を仮定して表現した。ひび割れ閉口時は、ひび割れ要素の剛性はコンクリ-トと同様の剛性を有するものとしている。3.鉄筋とコンクリート間で伝達される付着・ダウエル力を表現する離散型付着要素の開発鉄筋とコンクリート界面での応力伝達には、鉄筋軸方向に作用する付着応力、および鉄筋の変形時に発生するダウエル応力が挙げられる。付着特性には、コンクリー卜強度(低・高強度)、コンクリートの応力状態(引張・圧縮)をパラメータとした付着試験を行い、この結果を逆解析することにより付着応力-すべり関係を明らかにした。ダウエル特性には、2次元解析では部材奥行き方向の応力分布が考慮できないため、かぶり厚さをパラメータとしたダウエル力-変位関係を仮定し、従来の研究結果を逆解析することにより、その特性を明らかにした。4.離散型のひび割れおよび付着要素を用いたせん断補強鉄筋を有さないRC梁の解析上述した1、2および3で行った研究成果を用いて、せん断補強鉄筋を有さないRC梁の解析を行った。ひび割れ増分法および離散型要素を用いることにより、各荷重レベルでの構成材料の応力分布の把握が可能となった。また、離散型要素の負担せん断力の算定を行い、各破壊モ-ドにおける分担せん断力の相違を明らかにし、本解析手法の妥当性および問題点の検討を行った。1.再分割プログラムの開発部材中に逐次進展するひび割れを、解析で計算される部材の主引張応力が引張強度に達する点に1ステップあたりひび割れ要素を一本ずつ挿入し、この計算を繰り返すことにより表現した(以後ひび割れ増分法)。

ひび割れ要素は主引張応力方向に対して直角に挿入し、部材中の複雑な応力状態により発生する斜めひび割れおよび分岐ひび割れを、四辺形要素および三角形要素を用いて再メッシュ分割が可能となった。2.せん断破壊時に発生するひび割れ面に平行な方向の伝達応力関係の表現ひび割れには、ひび割れ面垂直方向の相対変位により発生する垂直応力(model)、ひび割れ面水平方向の相対変位により発生するせん断伝達応力(mode2)、および両方向に変位した場合の応力伝達関係(mode3)を考慮しなくてはならない。また、せん断破壊時には部材上縁での圧縮を受けるひび割れがせん断すべりを起こし破壊にいたる。これらの複雑な伝達応力関係を、圧縮状態に対してはコンクリートの破壊基準、引張状態ではひび割れ面での引張軟化特性およびせん断剛性低下特性を考慮した構成則を用いて表現した。3.鉄筋とコンクリート間に作用する付着・支圧特性を考慮した付着要素の開発鉄筋とコンクリート間の応力伝達機構には、鉄筋軸方向に作用する付着応力、および鉄筋のだぼ変形時に発生する支圧応力が挙げられる。付着特性に関しては、コンクリート強度(低・高強度)、試験方法の違いによるコンクリートの応力状態(引張・圧縮)、コンクリートの種類(普通・軽量)をパラメータとした付着試験を行い、この結果を逆解析することにより付着応力-すベリ関係を明らかにした。支圧特性に関しては、2次元解析では部材奥行き方向の応力分布が考慮できないため、従来の研究結果を逆解析することにより、部材厚さを考慮したパラメータを新たに取り入れ、その支圧応力-相対変位関係を明らかにした。4.ひび割れ要素・付着要素を用いたせん断ひび割れの進展に関する研究上述した1、2および3で行った研究成果を用いて、RCはりのせん断ひび割れの進展に関する研究を行った。ひび割れ増分法および離散型要素を用いることにより、曲げ・せん断ひび割れの進展時にはひび割れを跨ぐ部分での鉄筋軸力・曲げモーメント、および付着・支圧応力の局所的な増大を表現することが可能となった。また、最大荷重時には、圧縮部のひび割れ面でのせん断抵抗、およびひび割れを跨ぐ部分での鉄筋のダウエル作用によるせん断耐荷機構をモデル化することが可能となった。1.ひび割れ進展プログラムの作成部材中に逐次進展するひび割れを、解析上で計算される部材の主引張応力がコンクリートの引張強度に達する点に1ステップあたりひび割れ要素を一要素ずつ挿入し、この過程を繰り返すことにより表現している。ひび割れ要素は主引張応力方向に対して直角に挿入し、部材中の応力状態により発生する斜めひぴ割れおよび分岐ひび割れを、アイソパラメトリック四辺形および三角形要素を用いて再メッシュ分割が可能となった。2.ひび割れ界面で伝達される垂直・せん断力を表現する離散型ひぴ割れ要素の開発ひび割れ界面での応力伝達には、ひび割れ面垂直方向の変位(δ_n)により発生する垂直応力(σ_n)、およびひび割れ面平行方向の変位(δ_t)により発生するせん断伝達応力(τ_t)が挙げられる。本研究で提案する要素構成則では、垂直応力-変位関係(σ_n-δ_n)には既往研究からの引張軟化特性を用いて表現した。また、τ_tはδ_nおよびδ_tに依存するため、ひび割れ幅-かみ合わせ関係(δ_n-τ_<max>)を仮定し、任意のδ_nで伝達される最大せん断力(τ_<max>)を決定し、そのτ_
尿毒素物質による異化亢進機序の解明と治療への応用

慢性腎臓病(CKD)患者では、病期の進行に伴い「やせ」や骨格筋萎縮など異化亢進を認め、心血管病発症・死亡リスクが上昇する。この背景には、インスリン作用減弱の関与があり、原因として腎不全で蓄積する「尿毒素」が想定される。尿毒素には多数の物質が知られ、おもに腸内細菌叢で産生される。尿毒素はさまざまな機序でインスリン作用の減弱やCKDにおける異化亢進に関与していることが明らかになったため、効率的な除去法の開発が望まれる。本研究の目的は、既知の尿毒素物質が脂肪および骨格筋(前駆)細胞に及ぼす影響を、増殖、アポトーシス、分化・成熟、インスリン感受性について検討することであった。マウス脂肪前駆細胞3T3-L1を培養し、尿毒素としてフェニル酢酸(PAA)・インドキシル硫酸(IS)・pクレゾール(PC)・pクレゾール硫酸(PCS)などを添加し、細胞のviabilityを確認した。次に、細胞増殖能を細胞数・Brd-U incorporationで、アポトーシスをトリパンブルー染色・DNA fragmentationによって評価した。細胞の成熟については、Oil Red染色による脂肪蓄積を評価し、分化や細胞形質を示す遺伝子について定量的real time RT-PCR法で、PPARγmRNAレベルの発現を検討した。また、インスリン感受性に対する各尿毒素物質の影響を検討するため、glucoseの取り込みについてRI(3H-Labeled 2-DOG)を用いたトレーサー実験を行った。われわれは、PCが100μM以上の濃度で3T3-L1細胞の増殖、分化を抑制し、成熟脂肪細胞数が減少すること、一方でアポトーシスが増加すること、その結果、インスリン存在下、非存在下において細胞内へのグルコース取り込みが低下することを見出した。一方で、PCSによる細胞増殖、分化、アポトーシスへの影響は認められなかった。しかし、PCSはインスリン感受性を抑制するという結果が得られた。このことは、すなわち、進行したCKDにおけるインスリン抵抗性には少なくとも一部尿毒素が関与していること、そしてPCとPCSでは、脂肪細胞、脂肪前駆細胞に与える影響やその機序が異なることが示された。まず、マウス脂肪前駆細胞3T3-L1を培養し、confluentになった時点で成長因子を含まないtest mediumに交換する。尿毒素としてフェニル酢酸(PAA)・インドキシル硫酸(IS)・pクレゾール(PC)・pクレゾール硫酸(PCS)などを添加し、細胞のviabilityを確認した。次に、細胞増殖能を細胞数・Brd-U incorporationで、アポトーシスをトリパンブルー染色・Hoechst染色・Caspase3発現によって評価した。細胞の分化・成熟については、Oil Red染色による脂肪蓄積を評価し、分化や細胞形質を示す遺伝子について定量的real time RT-PCR法、で、PPARγなどのmRNAレベルの発現を検討した。一方で、PCSやPAAではこのような著明な反応は認められなかった。このことは、すなわち、進行したCKDにおけるインスリン抵抗性には少なくとも一部尿毒素のPCが関与していること、そしてこの作用はPCに特異的である可能性を示唆している。この機序としてインスリン作用減弱の関与が知られており、私どもは「尿毒素」がインスリン作用の障害を惹起するという仮説を立てた。マウス脂肪前駆細胞3T3-L1を培養し、尿毒素としてフェニル酢酸(PAA)・インドキシル硫酸(IS)・pクレゾール(PC)・pクレゾール硫酸(PCS)を添加し、細胞のviabilityを確認した後、細胞の増殖能、アポトーシス、分化・成熟について検討した。インスリン感受性に対する各尿毒素物質の影響を検討するため、glucoseの取り込みを評価した。その結果、PCは100μM以上の濃度で増殖分化の抑制により成熟脂肪細胞数が減少し、アポトーシスが増加すること、その結果、インスリン存在下、非存在下において細胞内へのグルコース取り込みが低下することを見出した(Tanaka S, Yano S, et al. Artificial Organs 2014)。一方で、PCSではこのような有意な細胞障害性を認めなかったが、細胞内へのグルコース取り込みにおいてインスリン作用の減弱を惹起していた(論文準備中)。

現在この機序について、さらに検討を進めており、炎症性サイトカインとして知られる腫瘍壊死因子(TNF)αの分泌促進の関与を示唆する結果が得られている。尿毒素には多数の物質が知られ、おもに腸内細菌叢で産生され肝臓で代謝を受ける。PCよりも代謝を受けたPCSの有害性が低いことは合理的と思われる。以上から、尿毒素はさまざまな機序でインスリン作用の減弱やCKDにおける異化亢進に関与している可能性が示された。透析・腎臓、内分泌代謝当初の研究目的であった脂肪および骨格筋に対する尿毒素の効果について、脂肪前駆細胞を用いた検討では一定レベルの結果が得られており、ほぼ順調に進んでいると考えている。しかしながら、予定していた大学院生のアクシデントのため、骨格筋細胞については、解析が十分に進められていない。また、終末糖化産物(AGEs)についても検討する予定であったが、同様の理由により結果を得るには至っていない。現在、遅れを取り戻すべく実験を進めているところである。当初の研究目的であった脂肪および骨格筋に対する尿毒素の効果について、脂肪前駆細胞を用いた検討では一定レベルの結果が得られており、ほぼ順調に進んでいると考えている。しかしながら、骨格筋細胞については、未だ十分な結果が得られていないため、解析を速めてゆきたい。また、終末糖化産物(AGEs)についても検討する予定であったが、今までのところ、有意な結果を得るには至っていない。現在のところ、脂肪前駆細胞に対するPCの影響について、検討を進めている。培養マウス脂肪前駆細胞および骨格筋前駆細胞において、各尿毒素物質が細胞にどのように取り込まれるのか、その機序として関与する分子、シグナル経路、転写因子を定量的real time RT-PCR法、Western blot法などを用いて解明する。尿毒素による細胞障害性を回復する候補分子あるいは候補薬剤を同定するため、各尿毒素物質の細胞内への取り込みや動態について、阻害薬やsiRNAなどの分子手法を用いて明らかにする。また、PCSによりインスリン感受性の低下が認められたため、その障害機序についても検討する。尿毒素による細胞障害性を回復する候補分子あるいは候補薬剤を同定するため、各尿毒素物質の細胞内への取り込みや動態について、選択的阻害薬やsiRNAなどの分子手法を用いて明らかにする。また、尿毒素物質によりインスリン感受性の低下が認められた場合は、その障害機序についても検討する。平成25年度の予定に対して実験進行の遅れが生じており、必要な物品の購入についても予定額に達しなかった。当初予定していた大学院生のアクシデントのためであり、平成25年度に購入できなかった分は平成26年に購入し、実験を進行する予定である。当初の予定の物品費に前年度分を加える。
Ｐａｒｋｉｎの新規基質ＩＰＡＳの解析によるパーキンソン病発症メカニズムの解明

本研究において、IPASがPINK1-Parkin経路によって制御を受けていることが判明した。CCCP依存的にIPASはPINK1によりリン酸化され、それによってIPASとParkinの結合が引き起こされ、ユビキチン化されたIPASが分解されることがわかった。さらにパーキンソン患者組織の解析により、IPASの発現量がこれらの患者の中脳黒質で増加していた。またIPASノックアウトマウスにおいてMPTPによる中脳黒質神経細胞死が緩和された。これらの結果からPINK1とParkinの変異によって制御の破綻が起きた際にIPASが蓄積して神経細胞死を誘発しパーキンソン病発症に関与していることが示された。本研究の目的は、PINK1-Parkin経路の新規基質として見出したタンパク質IPASの解析を行うことによりパーキンソン病発症メカニズムの解明に繋げることと、これらの神経変性疾患に関わるオートファジーの新規分子シグナル機構の解明を行うことである。本年度においては、まずミトコンドリアのIPASがCCCPによって活性化されたPINK1-Parkin経路によってどのように制御されるかを解析した。IPASとParkinの結合を免疫沈降実験で解析したところ、両者の結合がミトコンドリア脱分極剤であるCCCP依存的に起こることを見出した。さらにPINK1の基質にもIPASがなる可能性を考え、PINK1とIPASの結合も解析したところ同様にCCCP依存的に結合することがわかった。さらにPINK1によるIPASのリン酸化を、Phos-tagとPINK1 siRNAを用いて解析したところ、IPASが複数のセリンかスレオニンでPINK1依存的にリン酸化されることを見出した。IPASノックアウトマウスの作製は理化学研究所との共同研究によって完了した。ノックアウトマウスはメンデルの法則に準拠して生まれ成長しており胎生致死は起きなかった。MPTP投与を上記のマウスに行い、通常マウスとIPASノックアウトマウスでの影響の差を中脳黒質ドーパミン作動性神経細胞のマーカーであるチロシン水酸化酵素の免疫染色で解析した結果、IPASノックアウトマウスではMPTPによる神経細胞の減少が抑えられることがわかった。これらの結果からIPASがPINK1-Parkin経路によってリン酸化とユビキチン化を受けること、さらにMPTPによる神経細胞死においてIPASが関与することを見出した。本年度においては、前年度に見出されたミトコンドリアのIPASがPINK1-Parkin経路によって制御される機構に関して、さらに詳しい解析を行った。その結果、IPASはスレオニンの12番目を含むいくつかのアミノ酸がCCCP依存的にPINK1によってリン酸化されることを見出した。さらに既知の基質との周辺配列の相同性が高い12番目のスレオニンをアラニンに置換したT12A変異体を作製したところ、IPASとParkinとの結合が起きなくなることを見出した。このことからIPASはPINK1-Parkinによって高度に制御されて分解されていることがわかった。またIPASはParkinのユビキチンリガーゼ活性に重要なリング配列の疾患型変異体とは結合が弱まることがわかった。さらにパーキンソン患者組織の解析により、IPASの発現量がこの患者特異的に中脳黒質で増加されていることが示された。これらの結果からIPASがPINK1-Parkin経路によってリン酸化とユビキチン化を受け分解されること、さらにParkinの変異などによってその制御の破綻が起きた際にIPASが蓄積して神経細胞死を誘発しパーキンソン病発症に関与している可能性があることが示された。IPASのPINK1によりリン酸化される必須のスレオニンが見出されると共に、さらにParkinによるIPASの分解にこのリン酸化が必須であることが解明され、制御メカニズムの解明が大きく進展したと考えられる。さらに実験計画の主軸を占めるパーキンソン患者組織の解析が行われ、IPASの発現量増加が見出されたことは、進歩が順調に進んでいると考えられる。前年度までの研究において、ミトコンドリアのIPASは、スレオニンの12番目を含むいくつかの部位がCCCP依存的にPINK1によってリン酸化されることを見出した。さらにIPAS T12A変異体を作製したところ、IPASとParkinとの結合が起きなくなることを見出した。このことからIPASはPINK1-Parkinによって制御されていることがわかった。またパーキンソン症状を引き起こすMPTPによってIPASは発現誘導されるが、IPASノックアウトマウスにおいてMPTPによる中脳黒質神経細胞死が緩和された。これらの結果からIPASがPINK1-Parkin経路によってリン酸化とユビキチン化を受け分解されること、さらにParkinの変異などによってその制御の破綻が起きた際にIPASが蓄積して神経細胞死を誘発しパーキンソン病発症に関与していることが示された。

本年度はさらにIPASがMAPK/p38経路の下流においてもリン酸化され制御されることを見出し、このリン酸化がIPASのよるアポトーシス誘導機能を促進することを明らかにした。また、神経保護作用を持つタンパク質NXFとの関連を解析した結果、両者が相互作用してIPASによる神経細胞死を抑制することを見出した。これらの結果をまとめて現在論文投稿中である。またオートファジーの新規分子シグナル機構を解析した結果、Ulk1の脱リン酸化酵素を見出すことに成功し論文として報告した。本研究において、IPASがPINK1-Parkin経路によって制御を受けていることが判明した。CCCP依存的にIPASはPINK1によりリン酸化され、それによってIPASとParkinの結合が引き起こされ、ユビキチン化されたIPASが分解されることがわかった。さらにパーキンソン患者組織の解析により、IPASの発現量がこれらの患者の中脳黒質で増加していた。またIPASノックアウトマウスにおいてMPTPによる中脳黒質神経細胞死が緩和された。これらの結果からPINK1とParkinの変異によって制御の破綻が起きた際にIPASが蓄積して神経細胞死を誘発しパーキンソン病発症に関与していることが示された。IPASとPINK1-Parkin経路の制御機構がリン酸化依存的であることが解明され、大きく進展したとともに、最大の目的であるMPTPにおける中脳黒質の神経細胞死にIPASが関与していることが見出されたため。本年度の解析で見出されたIPASのスレオニン12番目の抗リン酸化抗体を作製し、細胞での内在性IPASのリン酸化を解析する。また、IPASノックアウトマウスからマウス胎児繊維芽細胞を樹立し、IPASによる細胞死のさらなる検証を行う。加齢により黒質でレビー小体が誘発されることがあることから、前年度から準備したマウスを用いて加齢によるIPASの発現量の差がないか解析する。また、分解されないで残ったリン酸化IPASの蓄積が見られるか抗リン酸化抗体で解析する。さらに抗体を用いて、MPTP投与マウスにおけるIPASの発現誘導、局在をより詳しく解析する。ミトコンドリアマーカーMitoGreenもしくはTom20抗体を用いることで、内在性IPAS/リン酸化IPASがミトコンドリアに局在することを明らかにする。IPASが発現していても小脳プルキンエ細胞においては細胞が死なないことからミトコンドリア局在の制御等があることが期待される。ヒトパーキンソン病の患者を含めたより多くの症例(組織サンプル)を用いてIPASの挙動を解析する。内在性IPAS/リン酸化IPASの蓄積の有無、αシヌクレイン抗体を用いたレビー小体での共局在、ミトコンドリアや核の異常(アポトーシス)等を検討する。PINK1/Parkinの下流ではミトコンドリアオートファジー(マイトファジー)が起こり、ミトコンドリアが除去されることがわかっている。