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自動車産業におけるグローバル・サプライヤーシステムの変化と国際競争力に関する研究

日本自動車産業の海外での部品調達システムは、リーマンショックを契機に現地での直接調達に転換、海外部品工場の成長テンポは自動車メーカーを遥かに上回った。自動車・同1次部品メーカーの巨大な結合は、QCDの水準の高さを条件とした、新たな「日系系列」を『形成しつつある。他方、2007年のピーク以降、国内の部品出荷額は停滞し、中小部品業者の経営は厳しい。日本部品産業の国際競争力基盤はQCDの水準の高さにあり、海外ではそれが日系系列形成と成長の条件になっているが、国内ではQCD維持の負担が経営困難の原因となっている。成長が困難な国内市場においては、従来の調達政策の根本的な転換が必要である。本研究は、平成23年11月に追加認定されたものであり、今年度の事業については23年12月から24年3月までの4か月間に急遽体制を構築することを余儀なくされた。今年度の実施した事業は概略以下のとおりであり、プロジェクトの準備が中心で、成果はごく限られている。11月末にメンバーを再構築したのち、12月26-27日に合宿研究会を開催し、今年度の取り組みを以下の3点に絞り込んだ。第一に、日本国内の自動車を中心とする製造業2次・3次サプライヤーの事態調査(アンケート及びヒアリング)については平成24年度の実施を目標とし、その準備として平成24年1月7日および3月27日に東京大学MMRCにおいて研究会を開催し、アンケート調査票についての意見交換を実施した。この調査票検討は24年6-7月まではかかると思われるが、並行して各地域別の調査対象企業の選定、具体的な調査実施方法について、資料・情報収集を開始した。第二に、国際比較研究のための海外企業調査については、ドイツ4名、フランス2名、イタリア・スペイン1名、アメリカ2名、韓国3名、中国3名、インド9名の延べ24名を派遣し、それぞれ当該地域における自動車産業・サプライヤー産業の実態調査を実施した。調査結果は現在取りまとめているところであるが、先進各国企業の中国・インド等新興国における活動の特徴点が既に報告されており、特に深層現調化(ネット現調化)という用語に象徴される資材・部品の現地調達と、これを支える第三国間ネットワークの形成が特に重要な分析対象となることが推察され、今後の研究方針の一つの柱が明確となった。第三は、平成24年3月7日に実施した国際会議である。会議は国際的なネットワーク形成という点ではスタートアップ会議的な性格を持っており、会議に先立ってドイツのIMO研究所、スイスのETH研究所、フランスのGerpisaなどとの連携を図られた。また当日の会議は、ミュンヘン大学の他、ホンダ・デンソーなどの企業からの参加を得て活発な討論が展開され、その報告資料集が作成された。2013年度は2次・3次サプライヤー調査結果の集計分析を行い、回答企業に対するレポートを発送すると同時に,研究会などで集計結果に関する分析を行った。その特徴点は全般的に受注減・単価引き下げの中、殆どの企業は経営内容を悪化させているが、約4分の1の企業が受注増・売り上げ増・利益率5%以上と回答しており、しかもそれはどの規模階層、業種にも共通した特徴である。これは本調査に独特な結果であり、今後、日本製造業の構造変化を考える場合の重要な論点を提示することになった。13年度はこのアンケート調査に関連する2次・3次サプライヤー調査の他、年度末になって1次サプライヤー調査を実施した。また海外調査についてはタイ、ベトナムなどの他、中国・インド・ブラジルなどを視野においた調査を行った。特にインドネシアに続いて実施したタイ調査では部品サプライヤーの深層現地化は、単なる部品調達だけではなく、現地人エンジニアにサプライヤーの生産技術指導をさせるなどの日本型サプライヤー指導の現地化まで進んでいるケースを発見出来た。またこれらの新興国では賃金上昇が開始され、これに伴って自動化・省力化の推進が現実の課題になっている実情も把握した。その上で現地サプライヤーの評価を見ると、30ー40年の経験を経ても現地サプライヤーが育たない現実があり、日系2次・3次の進出が課題になっていることが明確になりつつある。これらの内容について、中小企業を含めた業界及び中小企業基盤整備機構、地方自治体、さらに研究者をも含めた国際会議を開催し、現状と直面する課題、海外生産の可能性に関する報告を実施した。また年間を通じて2ヶ月に1回のプロジェクト会議及び全国大学の研究者に呼びかけた自動車サプライヤー研究会を開催し、多面的な研究の継続を図った。2012年度はグローバルサプライヤーシステム変化の動向を把握する上での前提となる、日本国内2次・3次下請企業に対するアンケート調査を実施し、その集計分析報告書を取りまとめた。アンケート調査票の発送先7000社に対して回収企業数は950社弱、回収率12%程度で、まずまずの結果であった。この結果は2013年度におけるより詳細な分析および個別インタビュー調査、地域別調査、および自動車部品メーカー調査によって補完され、最終的に総合的な分析に進むことになる。海外調査については、中国(黒瀬、林、兼村)、ドイツ・フランスなどの欧州地域(田村、小林)、北米(北原、遠山)のほか、近年急激に注目されつつあるインドネシア(清、田村、中川、西岡、伊藤、遠山)、ブラジルなどにも関心を広げてきた。これらの中で、欧州地域については、欧州企業のインド・中国進出実態調査を進めるため、チューリッヒのETH研究所、マインツのIMO研究所などとの連携を強めており、既にETH研究とは共同研究について意見交換を開始した。

またイギリス自動車工業会との調査票の交換など、研究の基盤を広げることができた。共同研究会については、東大ものづくり経営研究センター、早稲田日本自動車部品産業研究所とともに自動車サプライヤーシステム研究会を組織し、2ヶ月に1回程度の研究会を実施、海外をも含む多くの研究者を迎えて研究会を開催した。この成果は2013年度における国際会議開催の準備作業にもなった。プロジェクト参加者の研究業績は別紙のとおりであるが、この中で「深層現調化」と呼ばれる新しい傾向を捕捉し、日本中小企業学会全国大会での基調報告を行い、論集にも掲載された。この「深層現調化」は、今後のグローバルサプライヤーネットワーク形成を分析する際のキイワードであり、本プロジェクトの3年目以降の研究を進める上での基礎的な視点を提供するものとなった。平成26年度のプロジェクト研究の成果は、主として3つの内容に区分される。第一は平成25年度に実施した自動車関連1次サプライヤーアンケート調査の追加発送を行い、その結果の集計・分析を行った。本調査は最終的に100件を超える回答を確保し、集計分析結果は「早稲田大学自動車部品産業研究所紀要」に掲載し、平成25年度に取りまとめた「2次・3次サプライヤーアンケート調査結果分析」と併せて、自動車・同部品産業の産業構造を俯瞰して全体像を明らかにするものとなり、平成27年度における研究成果の取りまとめの骨格を抗しくすることとなった。第二に海外渡航調査については、これまでのインド、インドネシア、タイ、ベトナムに続いて平成26年度は台湾調査を実施し、さらに3月には、近年自動車部品産業の進出ラッシュに沸くメキシコでの工場訪問・インタビュー調査を実施した。その結果、グローバル化の進展が各国における過剰の連鎖を表裏一体であることを解明、最終年度の成果とりまとめの方向性に重要な示唆を与えるものとなった。第三に研究会については、自動車サプライヤー研究会のほか、プロジェクト研究会を7月、9月、12月、3月に実施、研究成果の取りまとめは、1日本国内の地域別分析、2生産・開発の現地化と中小企業の海外進出、3グローバル化の進展と21世紀のモノづくり、の3つの方向で行うことを確認。このうち平成27年度には少なくとも1冊以上の単行書の出版を具体化することがメンバーの了解事項となった。以上のほか、プロジェクトメンバーによる単行本3冊の出版をはじめ、雑誌論文、研究報告、学会発表などが精力的に行われ、全体として最終年度である平成27年度事業での成果の取りまとめに十分な準備が行われた。2015年度末の段階で研究代表者の健康上の理由で成果物を単行本として取りまとめる作業が遅れたことにより、予算の一部を2016年度に繰り越した。その成果の一つは、2016年4月1日付けで、「日本自動車産業グローバル化の新段階と自動車部品・関連中小企業」(社会評論社)として刊行された。
自己の腹膜を利用した腹膜メッシュによる消化管再建の基礎的研究

本研究の目的は,自己腹膜を化学処理して作成した腹膜メッシュの汚染環境における耐久性を立証し,腹膜メッシュ被覆下での組織治癒過程を検証することである。【上部消化管穿孔モデルにおける腹膜メッシュの耐久性】実験動物で汚染度の低い上部消化管穿孔モデルを作製し,腹膜メッシュ群(試験群),腹腔内脂肪群(対照群)を比較検討する。全身麻酔を施行したウサギの腹部を正中切開し,腹膜を一部切除する。胃に直径5mmの穿孔部を人為的に作製し上部消化管穿孔モデルとする。A.腹膜メッシュ群(試験群)1切除した腹膜を0.62%グルタルアルデヒドで10分間固定する。2固定した腹膜を生理食塩水で十分洗浄し,腹膜メッシュの表面から固定液を完全に除去する。3穿孔部を中心として20×20mmの腹膜メッシュを胃壁に縫合固定し被覆する。4麻酔より覚醒させて飼育し,縫合不全の有無を評価するとともに術後30日の生存を確認する。B.腹腔内脂肪群(対照群)1試験群と同条件にするため腹膜の一部切除は同様に行い,切除した腹膜は破棄する。2穿孔部を中心に直径20mmの範囲にわたって腹腔内脂肪を胃壁に縫合固定し被覆する。3麻酔より覚醒させて飼育し,縫合不全の有無を評価するとともに術後30日の生存を確認する。【下部消化管穿孔モデルにおける腹膜メッシュの耐久性】汚染度の低い上部消化管穿孔モデルで良好なデータが得られたのちに,より汚染度の高い下部消化管穿孔モデルでの実験へと移行する。盲腸に直径5mmの穿孔部を人為的に作製し下部消化管穿孔モデルとする。腹膜メッシュ群(試験群),腹腔内脂肪群(対照群)を作製し,上部消化管穿孔モデルと同様の手順で比較検討する。一昨年度、腹膜採取およびその固定処理の手技が安定するまでに時間を要して進捗が遅れた。その影響で、上部消化管穿孔モデルでの実験が予定症例数に満たない状況である。上部消化管穿孔モデルについては症例数を増やして検討するのみでありスピードを上げて取り組んでいきたい。下部消化管穿孔モデルについては基本手技が同じであるため、上部消化管穿孔モデルの実験が終われば遅滞なく移行したいと考えている。腹膜採取およびその固定処理の手技が安定するまでに時間を要したため進捗が遅れている。

2穿孔部を中心に直径20mmの範囲にわたって腹腔内脂肪を胃壁に縫合固定し被覆する。3麻酔より覚醒させて飼育し,縫合不全の有無を評価するとともに術後30日の生存を確認する。【下部消化管穿孔モデルにおける腹膜メッシュの耐久性】汚染度の低い上部消化管穿孔モデルで良好なデータが得られたのちに,より汚染度の高い下部消化管穿孔モデルでの実験へと移行する。盲腸に直径5mmの穿孔部を人為的に作製し下部消化管穿孔モデルとする。腹膜メッシュ群(試験群),腹腔内脂肪群(対照群)を作製し,上部消化管穿孔モデルと同様の手順で比較検討する。一昨年度、腹膜採取およびその固定処理の手技が安定するまでに時間を要して進捗が遅れた。その影響で、上部消化管穿孔モデルでの実験が予定症例数に満たない状況である。腹膜採取およびその固定処理については本研究の基礎部分であり、確実に遂行すべきと考えている。また、この部分が確立されてしまえばその後の研究については順調に進めることができる。上部消化管穿孔モデルについては症例数を増やして検討するのみでありスピードを上げて取り組んでいきたい。下部消化管穿孔モデルについては基本手技が同じであるため、上部消化管穿孔モデルの実験が終われば遅滞なく移行したいと考えている。実験回数が少なかったため残額が生じた。次年度は不足分の実験を施行予定であり次年度使用額を充てる予定である。実験件数が少なかったため、これに伴う必要経費がかからなかった。
筑豊炭鉱業における労働市場と労働組織

予想以上の方に自身のポスターまで足を運んで頂き、自身の研究について説明をすることができた。自身の研究の背景にある考え方についての代替案や、研究のラフな部分についての指摘を頂いた。また、ポスター発表であるため、ポスターを眺めている方にその場で英語によって説明し、質疑応答するという作業は、口頭発表や今後さまざまな場面で活きる経験となった。当初の研究計画にあるように、特別研究員DC2の期間において、国内のみならず複数の国際学会において発表することが実現できた。2.『社会経済史学』、第81巻3号への論文掲載。昨年度より取り組んでいた、労働者の勤怠管理簿(「「勤怠表」」)をデータベース化し、雇用契約書(「「志願書」」)データベースと照合し、間接管理の実態や、労働者の入職経路と配属組織を明らかにした研究が『社会経済史学』に2015年11月刊行号に掲載された。匿名査読者の先生に度々ご指摘を頂き、自身が発表したいものと、またその発表のために必要な情報も合わせ、ひとつの論文にすることが可能となった。3.博士学位取得4.まとめ:研究計画に記したように、炭鉱における労働組織の漸次的な変遷について、技術条件と情報構造と労働組織の相互作用によって説明を与え、更にそれを一次史料を用いた帰納的分析をして検証し、変遷過程を明らかにすることが大きく進んだと感じている。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度の研究成果として、査読を経た口頭発表である4つの学会報告がある。意義等について研究内容別に述べる。1、「勤怠表」を用いた研究の発表「麻生家文書」(九州大学附属図書館付設記録資料館所蔵)から、1900年代に操業した麻生藤棚第二坑の雇用契約書にあたる「志願書」と、鉱夫の出勤を記録した「勤怠表」という一次史料の分析をこれまで行ってきた。本年度は1905年7月時点の「勤怠表」に含まれる情報をすべてデータベース化し、これを使用した研究を社会経済史学会(平成26年5月)にて発表した。「勤怠表」の情報を既にデータベース化した「志願書」の情報に照合すると、双方で確認できる鉱夫がいた。彼らについては雇用契約時点と労働管理に関する情報の両方が得られる。つまり、個々の鉱夫について入職経路、勤怠状況、所属組織の構造までひとつながりで分析することが可能となった。これは、「研究の目的」である、筑豊炭鉱業の労働組織変化を捉える為の過渡的な労働組織の分析に該当し、組織の漸次的変化の一端を明らかにするもののひとつとなったと感じている。2、「志願書」を用いた研究の発表ISNIE(平成26年6月)という制度派経済学の中でも最高峰とも言われる学会や、経済学全般における米国最大の学会であるASSA(平成27年1月)に自身の論文が扱っている話題が興味深いと感じられ、採択されたことは大変意義があり、また、米国の地域学会の中でも最も活発に活動している学会であるMEA(平成27年3月)にて発表し、そこでの討論者に素晴らしいアドバイスを頂き、3つの国際学会を通して、自身の研究を国際的に評価される雑誌に刊行されるための準備を進展することができたと感じ、また「研究実施計画」に記載した、1900年代の日本の炭鉱業にあてはめた、推薦採用(referral hiring)の効果についての考察もこの学会により深まった。筑豊炭鉱業における労働組織の漸次的な変遷、その漸次的な変遷過程に存在した過渡的な雇用組織の実態把握について、「勤怠表」と「志願書」を併せた詳細な分析を行い、「研究の目的」は達成に向かい順調に進展していると感じている。しかし、現時点では数量的な分析に依拠するところが少なくないため、当時の炭鉱企業の日誌などから、現時点での分析結果を補強するものが必要であると感じている。

一方、「志願書」により採用状況を分析した研究においては、3つの国際学会で発表、それぞれでご指摘を頂き、経済学的な視点での考察が深まったと感じている。以上の理由で、「研究の目的」は、おおむね順調に進展していると考える。27年度が最終年度であるため、記入しない。平成27年度においては、「勤怠表」を主に用いた研究について、The International Society for New Institutional Economics (ISNIE) 19th Annual Conferenceのポスターセッションにて発表する予定であり、労働市場から労働組織内部までをひとつながりのものとして観察した研究が、経済学的な視点によって更に深められる。平成26年度には4つの学会報告やその準備により、時間的制約が大きく、行くことができなかった九州大学附属図書館附設記録資料館への資料調査へ行き、定量的な分析を補強する定性的な証拠を持たせた論文にしていく。
物理映像の制作・提供による教育工学実践ネットワーク利用手法の開発

大学の教育学研究者と中学・高校の教育実践者をコンピュータネットワークを利用して結び両者が協同して研究と教育双方に成果を生み出す機構を教育工学の立場から調べることを目的とした。高校生に現在の科学研究の成果と方法の事例として物理に関する映像を提供し、高校における学習に意味づけする機会を提供するための開発研究を行った。物理内容の面では、平成7年より楢原良正筑波大学名誉教授他の低温物理学ビデオ制作に視聴覚メディア制作の立場で参加し、2巻のビデオ作品「低温てなんだ」(63分)および「低温てなんだ超流動」(43分)を完成させた。インターネットによる本ビデオ作品の配信実験のため、映像配信用にRealVideoサーバおよびWebサーバーを筑波大学内に設置した。更に、研究協力者により「インターネットを用いたビデオ評価システム」開発が行われ、システム開発面でもユニークな成果が得られた。上記映像配信用サーバーおよびWebサーバーに低温物理学ビデオを載せた。これとビデオテープにより、小学校、中学校、高等学校の教員および児童・生徒約90名に本作品の視聴を依頼して質問紙調査を実施し、幅広い学年段階にわたり教師・児童・生徒の回答が得られ、教育上の有効性と適用範囲が検討できた。本研究でもう1つの目標とした、外国人留学生による教育工学研究の支援では「遠隔教育環境における相互作用と心理的距離の実験「インターネットを用いたオーセンティックな学習活動」「Web-Based自主性学習環境の研究」等の研究、更に現職研究生による「体育・スポーツにおけるマルチメディア技術の利用」に関する研究として、成果を上げた。大学の教育学研究者と中学・高校の教育実践者をコンピュータネットワークを利用して結び両者が協同して研究と教育双方に成果を生み出す機構を教育工学の立場から調べることを目的とする。教育学研究には実践の場が必要であり、一方、教育実践者は担当の教育を豊かにする教材と人的・物的ネットワークを求めていると想像される。両者の必要性がネットワーク技術の介在によって如何に満たされうるか研究する。内容として、現在の高校生に現在の科学研究の成果と方法の事例として物理に関する映像を提供し、高校における学習に意味づけする機会を提供することを試みる。今年度は、デジタル映像配信用にRealVideoサーバーを選びソフトを導入して既設のサーバーで稼働させる準備をし、WWWのための実験的サーバーを筑波大学内に設置した。またCD-RWなどパッケージメディアも制作するシステムを構成した。また、筑波大学付属学校の情報教育準備の一員として、大学と付属学校間のコンピュータネットワークの整備に参加してきた。内容面では、平成7年より楢原良正筑波大学名誉教授他の低温物理学ビデオ制作に制作の立場で参加したが、この成果として「低温てなんだ」「低温てなんだ超流動」が殆ど完成した。制作した低温物理学映像を用い、WWWページ及びパッケージメディアを用いて物理教材を制作し、これらを高校生に視聴してもらう機構をコンピュータネットワークを利用してつくり、その視聴経験が進路選択にもたらす影響を調べる予定である。今年度はシステム面で、デジジル映像配信用にRealVideoサーバーを既設サーバー機上で稼働させ、WWWのための実験的サーバーを筑波大学内に設置した。またサーバープラットフォームの機能向上のため開発用システムを設置し、また制作用機器を強化した。内容面では、平成7年より楢原良正筑波大学名誉教授他の低温物理学ビデオ制作に制作の立場で参加したが、この成果として「低温てなんだ」(63分)「低温てなんだ超流動」(43分)が完成し一部の専門分野研究者に公開した。大学初年段階学生に視聴を求め物理映像の学習における影響に示唆を得た。

制作した低温物理学映像を用い、WWWページを用いて物理教材を制作し、これらを高校生に視聴してもらう機構をコンピュータネットワークを利用して構成しつつある。また、筑波大学加速器センターで長島泰夫教授他が行う加速器質量分析による塩素同位体比率測定実験の映像を一部取材した。大学の教育学研究者と教育実践者をコンピュータネットワークを利用して結び両者が協同して研究と教育双方に成果を生み出す機構を教育工学の立場から調べることを目的とする。教育学研究には実践の場が必要であり、一方、教育実践者は担当の教育を豊かにする教材と人的・物的ネットワークを求めていると想像される。両者の必要性がネットワーク技術の介在によって如何に満たされうるか研究する。内容として、学校教員及び在学児童・生徒に現在の科学研究の成果と方法の事例として物理に関する映像を提供し、授業に教材を提供すると共に、学習に意味づけする機会を提供する試みを行った。今年度は、昨年度設置したデジジル映像配信用RealVideoサーバー及びWWWサーバーに、昨年度制作の低温物理学ビデオを載せ、これとビデオテープにより、小学校、中学校、高等学校の教員及び児童・生徒約80名に本教材の視聴を依頼して質問紙回答を得た。これを分析して成果報告書に掲載予定である。また研究協力者により「インターネットを用いたビデオ評価システムの開発」研究が行われた。コンピュータによるデジタルビデオを視聴しつつ逐次に評価値を入力しビデオの評価を行うことができる。これも成果報告書に掲載する。本研究でもう1つの目標とした、外国人留学生による教育工学研究の支援では「遠隔教育環境における相互作用と心理的距離の実験」「インターネットを用いたオーセンティックな学習活動」「Web-Based自主性学習環境の研究」研究、現職研究生による「-体育・スポーツにおけるマルチメディア技術の利用」に関する研究として、それぞれ成果を上げた。
アッセンブリーシャペロンが関わるプロテアソームの動的成熟過程の活写

昨年度までに、CPの構成サブユニットであるα7とα6が7:1で含まれるヘテロオクタマーが形成されるヘテロ8量体の形成過程に関して、高速AFM解析によって2重リング構造を形成しているα7の14量体に対して単量体のα6が相互作用することで、2重リング構造が開裂し、α7の1重リング構造の中心にα6が結合しするプロセスを示してきた(Kozai et. al.Sci. Rep. 2017, 7: Article No. 15373. )。本年度はこうした開裂が他のサブユニット中で起きるかどうかを調べたところ、α6サブユニット以外では、唯一α4サブユニットに認められることをゲル濾過クロマトグラフィーと超分子質量分析にて明らかにした。一方で、α7の14量体のX線結晶構造をもとに、α7のN末端側のセグメントの欠失変異体やアミノ酸変異体を作成することで、α7の14量体形成を阻害したα7モノマー改変体を作成することに成功した。さらには、モノマー改変体α7に対して、各αサブユニットを加えたところ、α4とα6のみが特異的にα7変異体と多量体形成をすることを見出した。このようにして掲載された多量体をAFM解析や電子顕微鏡像で解析したところ、こうした2つのサブユニットからなる複合体はヘテロ14量体のダブルリング構造を形成していることを見出した(Sekiguchi et.al.Int. J. Mol. Sci. 2019, 20: Article No. 2308.)。このように、本研究では、超分子質量分析、高速AFM、および電子顕微鏡を利用することで、プロテアソームの中間体構造のキャラクタライズを通じて、自己組織化機構について新たな知見を得ることができている。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成29年度当初は2つのサブユニットのみで構成される古細菌由来のプロテアソームを対象として研究を進めた。その結果、古細菌のプロテアソームとアッセンブリーシャペロンのホモログが結合した状態を高速AFM解析と溶液散乱を用いて捉えることに成功した。こうした研究を通じて、真核生物のプロテアソームのアッセンブリー中間体を解析するための基盤技術を整えることができた。真核生物のプロテアソームに関しては、大腸菌発現系を用いて、7種類のαサブユニットおよびアッセンブリーシャペロンをリコンビナントタンパク質として調製することに成功した。これらタンパク質を超分子質量分析に供したところ、14量体構造を示すα7以外のαサブユニットは単量体と2量体の平衡状態で存在することを明らかにした。リコンビナントタンパク質として調製した各αサブユニットとアッセンブリーシャペロン(PAC1-2およびPAC3-4)を試験管内で混ぜ合わせた結果、PAC1-2がα1およびα2と結合した複合体、PAC3-4がα5と結合した複合体がアッセンブリー中間体として存在することを見出した。また、混合試料をゲル濾過カラムで分離した高分子量の分画に、α7とα6が7:1で含まれるヘテロオクタマーが形成されていることも見出した。このヘテロ8量体の形成過程に関しては、高速AFM解析によってα7ホモ14量体とα6による形成過程の可視化を試みた。その結果、2重リング構造を形成しているα7の14量体に対して単量体のα6が相互作用することで、2重リング構造が開裂し、α7の1重リング構造の中心にα6が結合するという中間体形成プロセスを明らかにすることに成功した。大腸菌発現系を用いて、7種類のαサブユニットおよびアッセンブリーシャペロンをリコンビナントタンパク質と調製することが可能となったため、プロテアソームのアッセンブリー中間体を取れることに成功している。一部のアッセンブリー中間体に関しては、高速AFM解析によってその形成過程を捉えることに成功した。こうした結果は、2017年の11月に論文公表している[Kozai et al. Scientific Reportsvolume 7, Article number: 15373 (2017)]。以上の成果を総合的に判断して順調に研究は進展しているものと判断している。

このようにして掲載された多量体をAFM解析や電子顕微鏡像で解析したところ、こうした2つのサブユニットからなる複合体はヘテロ14量体のダブルリング構造を形成していることを見出した(Sekiguchi et.al.Int. J. Mol. Sci. 2019, 20: Article No. 2308.)。このように、本研究では、超分子質量分析、高速AFM、および電子顕微鏡を利用することで、プロテアソームの中間体構造のキャラクタライズを通じて、自己組織化機構について新たな知見を得ることができている。前年度に引き続き、同定したアッセンブリー中間体は、超分子質量分析により複合体中の構成サブユニットの化学量論を明らかにする。古細菌由来のプロテアソーム複合体を対象として行った溶液散乱や高速AFMなど解析から蓄積することのできた各計測手法の基盤技術を真核生物のプロテアソーム中間体のキャラクタライズへ応用する。前年度までに明らかになっているアッセンブリー中間体に関しては、構成コンポーネントを組換えタンパク質として大量発現し、試験管内再構築をすることにより、その3次元構造情報を得ることを試みる。また本研究で見出される形成中間体は、動的であり構造的に不均一である可能性が高いため、高速AFMで複合体を測定する。さらにはこうした複合体に関して、構成するサブユニットを順次加えて行くことで、高速AFMによって複合体の形成過程を活写することを試みる。一方で、安定性の高い中間体においては、量子ビーム散乱も利用して、構造のキャラクタライズを行うことも計画している。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
ジーンターゲティング法を用いたアルデヒト脱水素酵素(aldh)2次損マウスの作成

1 ALDH2ノックアウトマウスの作成F2マウスから戻し交配を行った結果N7まで進み、戻し交配はほぼ完了した。今後はマウスの諸実験に用いると共に、Aldh2 homo mutantマウスを凍結受精卵として保存する。2 in vitro系でのALDH2の解析(F2およびF3マウス肝粗画分での検討)(1)ミトコンドリア分画のアセトアルデヒドに対する酵素活性は、Aldh2 homo wildマウス由来の場合と比較してheterozygoteでは約1/2に低下、homo mutantでは完全消失していた。(2)抗ALDH2抗体を作成し、粗画分をwestern blot法で解析した。抗体はALDH2+/+、+/-mice由来ミトコンドリア分画を認識し、そのタンパクはリコンビナントmALDH2と等しいサイズを示した。(1),(2)の結果から、mALDH2欠失を目的としたAldh2 targetingの成功は、タンパクレベルでも証明された。(3)各種基質に対する酵素活性を測定、比較した。ミトコンドリア分画の活性レベルはALDH2の基質となる複数のアルデヒド体に対してAldh2 gene dosage effectが認められたが、細胞質分画の活性にはAldh1,3の選択的気質に対してgenotypeの影響は認められなかった。よってALDH2欠失時もAldh1,3の代償は発生していないと推測された。3メトキシエタノール(ME)の連続経口投与(5日間)による精巣毒性F3マウスでは300mg/kgBW/day以上で精巣重量の有意な低下を示し、組織像としては精母細胞に障害が観察された。2-(3)でhomo mutantマウス由来肝粗分画のみMEの代謝産物に対して酵素活性を持たなかったことから、現在ALDH2欠損が上記精巣障害に及ぼす影響を検討中である。1 ALDH2ノックアウトマウスの作成:以下の手順で行った。(1) aldh2遺伝子を欠損させるターゲティングベクターを構築した。(2)上記ベクターの導入後、相同組み換えによってaldh2遺伝子がノックアウトされたE細胞を選別して得た。(3)初期胚にこのES細胞を注入し、キメラマウスを作成した。(4)キメラマウスをC57B6と交配してFlマウスを得た(germline transmissionの確認)。(5) FlヘテロザイゴートからF2マウスを、また戻し交配も進行中である(現在N4)。ホモ欠損マウスは生存可能で、F2のgenotypeの比率はメンデルの法則に一致したことから、この酵素欠損はマウスの発生過程での致死を誘導しないことが確認された。2in vitro系でのALDH2蛋白の解析:野生型マウス肝からのミトコンドリア粗画分で以下の検討を行った。(1) 129及びC57B6マウスの2種のstrain間での肝ALDH2発現レベルの違いを調べた。未処理時、エタノール投与時、共に発現レベルにはstrainの差が見られず、またエタノ単回投与後も、明らかな発現誘導は観察されなかった。この2種はアルコー嗜好性に違いがあると報告されているが、この結果から、ALDH2発現レベルの違いが原因ではないと考えられた。(2)生体有害物でALDH2の基質となり得るものを調べた。その結果、既知のALDH2の基質に加えて、メトキシアセトアルデヒドも強い基質特異性を示した。この化合物は代謝産物が精巣毒性を持つと報告されている2-メトキシエタノールの中間代謝物であり、aldh2欠損が及ぼす生体影響が注目される。今後、back crossが終了したノックアウトマウスを用いて、in vivoでの検討を行う予定である。
熱電相関物性の非平衡量子シミュレーション

徹底した省エネ・リサイクルを実現するためには、これまで回収が困難とされてきた150°C以下の低温排熱の有効利用が鍵であり、この分野において計算物質科学の果たすべき役割は大きい。本研究では、次の2つの項目:項目1:原子レベルでの熱電変換シミュレーション手法の開発項目2:電流と熱流の非平衡複合相関現象の解明・予測を推進した。今年度のそれぞれの項目に対する研究実績の概要を以下に記す。項目1では、昨年度に引き続き「非平衡グリーン関数法+密度汎関数法(NEGF法)」と「波束ダイナミクス法(WPD法)」に基づく熱電変換シミュレーション手法の開発を行った。特に、量子伝導領域から古典伝導領域までの全領域での熱電変換シミュレーションを実行できるようにWPD法を改良した。この方法をカーボンナノチューブに応用した結果、半導体カーボンナノチューブでは(チューブの直径にも依るが)サブ100nmでコヒーレント量子輸送から拡散的(古典的)輸送へとクロスオーバすることが明らかとなった。項目2では、遷移金属ダイカルコゲナイド物質(TMDC)の電流と熱流の非平衡複合相関現象の研究を実施した。その結果、TMDCに円偏光した光を照射すると、磁場を印加することなくネルンスト効果が生じることを発見した。また、2014年に発見されたばかりのフォスフォレン(黒リン単原子層)を伸張することで、フォスフォレンの熱電パワーファクターが変調可能であることを発見した。26年度が最終年度であるため、記入しない。廃熱から有用な電気エネルギーを高効率に回収する革新的熱電材料の創製は、エネルギー枯渇や地球温暖化などの環境問題を克服する上で重要であり、この分野においても計算物質科学が果たすべき役割は大きい。本研究では熱電変換シミュレーション技法として「非平衡グリーン関数法+密度汎関数法(NEGF+DFT法)に基づくシミュレーション手法」と「波束ダイナミクス法(WPD)に基づくシミュレーション手法」の開発を進めている。本年度は、次の2つの研究項目に取り組んだ。項目1:原子レベルでの熱電変換シミュレーション手法の開発項目2:電流と熱流の非平衡複合相関現象の解明・予測項目1としては、NEGF+DFT法に基づくシミュレーション手法を開発し、さらに、WPD法による熱電変換シミュレーション手法の開発を行った。特に、WPD法の開発ではコヒーレント伝導領域に焦点を絞り、非平衡グリーン関数法と比較・検討を行った。項目2としては、項目1で開発したNEGF+DFT法に基づくシミュレータを用いて、ナノカーボン材料の熱電物性を調査し、国内の実験グループと共同で新規熱電デバイスの開発に成功した。当初の予定通りにナノ材料の熱電物性シミュレーション研究が進んでいるだけでなく、国内の実験グループとの連携により、シミュレーション結果に基づいて、高純度な半導体カーボンナノチューブ薄膜による熱電素子の開発に世界で始めて成功した。この点は、当初の計画をはるかに上回る進展であった。当初の研究計画書どおり、項目1と項目2に関して次のように研究を推進する。項目1に関しては、量子伝導領域から古典伝導領域までの全領域での熱電変換シミュレーションを実行できるようにWPD法を改良する。また、熱伝導シミュレーションと電気伝導シミュレーションの融合を図り、原子レベルでの熱電変換シミュレーション技術を確立させる。項目2としては、未踏領域である量子-古典クロスオーバー領域での熱電相関現象を解明し、新規な熱電材料の創製を目指す。
核酸毒作用動態に基づくDNA-PKcs/scid遺伝子のDNA修復再構成機構解析

マウスのscid遺伝子は、DNA依存性の蛋白キナーゼ(DNA-PK)の酵素活性に必須の蛋白サブユニットであるDNA-PKcsであることが強く示唆されている。本研究では、DNA障害作用を有する各種の化合物のSCIDマウス自体(in vivo)、またはSCIDマウス由来の培養細胞株(in vitro)に対する、毒性、細胞毒性、アポトーシス誘導作用などの作用動態を解析し、DNA障害修復機構における本遺伝子産物の役割を考察することを目的とした。昨年度に引き続き、本年度は、分子薬理学的に作用メカニズムの異なる各種のDNA障害化合物のSCIDマウスおよびその対照野生型マウスの個体における毒性のキャラクタリゼーションを行った。その結果、SCIDマウスは、トポイソメラーゼ(トポ)のうち、日本鎖DNAを一時的に切断・再結合を行うトポIIを阻害する薬剤に特異的に高感受性を示した。いっぽう、日本鎖DNAの一本のみを切断・再結合するトポIの阻害剤では、対照マウスとの間の感受性差は、認められなかった。また、本マウスは、DNAインカレーターに高感受性を示すいっぽう、DNAアルキレーターやクロスリンカーなどでは対照マウスと同程度の感受性を示し、DNA障害のメカニズム別に特徴的なパターンを示した。また、本マウスと同様の重症免疫不全を呈するがその発症メカニズムが異なるRAG2ノックアウトマウスを用いた同様の検討を行い、この研究によって見いだされた現象はSCIDマウス特異的なものであることを確認した。重症免疫不全(SCID)マウスの遺伝子scidの本体は、DNA依存性の蛋白キナーゼ(DNA-PK)の酵素活性に必須の蛋白サブユニットであるDNA-PKcsであることが強く示唆されている。本研究では、各種のDNA障害作用を有する化合物のSCIDマウス自体(in vivo)、または本研究で新たに樹立するSCIDマウス由来の培養細胞株(in vitro)に対する、毒性、細胞毒性、アポトーシス誘導作用などの作用動態を解析することによって、DNA障害修復機構における本遺伝子産物の役割を考察することを目的とした。本年度は、分子薬理学的に作用メカニズムの異なる各種のDNA障害化合物のSCIDマウスおよびその対照野生型マウスの個体における毒性のキャラクタリゼーションを行った。その結果、SCIDマウスは、トポイソメラーゼ(トポ)のうち、二本鎖DNAを一時的に切断・再結合を行うトポIIを阻害する薬剤で高感受性を示した。いっぽう、二本鎖DNAの一本のみを切断・再結合するトポIの阻害剤では、対照マウスとの間の感受性差は、認められなかった。今後は、TgH(RAG2)マウスなどでの解析を加えるとともに、細胞レベルでの解析を進める。
サイトカインによるラット視床下部・下垂体・副腎系の調節機構に関する研究

本研究では、細菌感染症などの際に免疫担当細胞から産生される種々のサイトカインによる視床下部・下垂体・副腎系の調節機構をラットを用いて検討することを目的とした。当該研究の研究期間のうちに本研究代表者が得た新地見は次の通りである。(1)Interleukin(IL)-1βは視床下部・下垂体・副腎系の賦活化作用を有する最も重要なサイトカインであることが知られており、このIL-1βによるACTH分泌は主に視床下部corticotropin releasing hormone(CRH)の分泌亢進を介しているとされている。しかしながら、CRH neuronal systemにおけるIL-1βの作用部位については明らかではなかったことから、本研究代表者はこのことをラット脳のpush-pull perfusion(PPP)法を用いて検討した。その結果、IL-1βはCRH neuron細胞体の存在する室傍核とCRH neuron軸策末端の存在する正中隆起の両者に作用することを見い出した。また、IL-1βによるACTH分泌はCRHのみならずarginine vasopressin(AVP)によっても仲介されていることを示唆する成績を得た。(2)IL-1βによるACTH分泌には脳内prostaglandin(PG)E_2の分泌亢進が関与しているとされているが、このことの詳細をPPP法により検討した。PPP法を用いて、IL-1β静注後のPGE_2の分泌動態を脳内の種々の部位において検討したところ、PGE_2は室傍核においてのみ有意な増加を示し、それは同部位でのCRHの分泌亢進と同期していた。このことは、室傍核におけるPGE_2の分泌増加がIL-1βによるCRH-ACTH分泌亢進のtriggerである可能性を示唆する。本研究の目的はヒトでの感染症での発熱時などに認められる視床下部・下垂体・副腎系の賦活化機構を動物実験により明らかにすることにある。平成4年度にはラット脳のpush-pull perfusion(PPP)法を用いてinterleukin(IL)-1βのcorticotropin-releasing hormon(CRH)neuronal systemへの作用部位について検討したが、平成5年度にはIL-1βによるCRH-ACTH分泌への脳内のprostaglandin(PG)の関与について検討した。脳内のPG、特にPGE_2がIL-1βの作用を仲介しているという成績がいくつかの研究グループにより報告されているが、IL-1β投与によるラット視床下部でのCRH、arginine vasopressin(AVP)、およびPGE_2などの変動をin vivoの実験系で観察した報告はない。このことから、平成5年度にはPPP法を用いてIL-1β静注後のCRH、AVP、およびPGE_2の変動をparaventricular nucleus(PVN)(CRH及びAVP neuronの細胞体が存在)、median eminence(ME)(CRH及びAVP neuronのaxon terminalが存在)、およびpreoptic area(POA)で観察した。その結果、PGE_2はPVNでのみ有意に増加し、それは同部位でのCRHおよびAVPの分泌亢進と同期していた。このことは、IL-1β静注投与後のCRHおよびAVP neuronの賦活化にはPVNあるいはその近傍でのPGE_2分泌の亢進が深く関与していることを示唆する。IL-1βの静注投与によるラット視床下部でのCRH、AVP、及びPGE_2分泌の変動を同時に検討したのは本研究が世界初であると考えられる。本研究の目的はヒトにおける感染症での発熱時などに認められる視床下部・下垂体・副腎系の賦活化

機構を動物実験により明らかにすることにある。本研究の最終年度である平成6年度には、当初の予定通り次の2項目について検討した。(1)interleukin(IL)-1βによるACTH分泌には脳内のcorticotropin releasing hormone(CRH)とarginine vasopressin(AVP)の分泌亢進が関与していることが知られている。ACTH分泌を刺激するとされている神経ペプチドには、このCRHとAVP以外にoxytocin(OT)、angiotensin II(AII)、およびcholecystokinin(CCK)-8などがあるが、IL-1βによるACTH分泌にこれらのペプチドが関与しているのか否かについては不明である。従って、このことを検討する目的から、OT、AII、CCK-8に対する抗体をラット第3脳室内に投与し、これらのペプチドの免疫学的中和がIL-1βによるACTH分泌に及ぼす影響を調べた。その結果、IL-1βによるACTH分泌は抗AII抗体の投与により有意に抑制されたが、抗OT抗体および抗CCK-8抗体によっては有意な影響を受けなかった。このとこから、IL-1βによるACTH分泌はCRHとAVPに加えてAIIによっても仲介されているが、同反応へのOTとCCK-8の関与はないものと考えられた。(2)IL-6およびtumor necrosis factor(TNF)-αなどのサイトカインも、IL-1と同様にCRH分泌を促進し、ひいてはACTH分泌を促進することが知られている。しかし、これらの反応へのAVPの関与については不明である。このことを検討する目的から、抗AVP抗体をラット第3脳室内に投与し脳内AVPの免疫学的中和がIL-6とTNF-αによるACTH分泌に及ぼす影響を調べた。その結果、IL-6によるACTH分泌は抗AVP抗体により有意に抑制されたが、TNF-αによるACTH分泌は有意な影響を受けなかった。このことから、AVPはIL-6によるACTH分泌を仲介してはいるが、TNF-αによるACTH分泌への関与はないものと考えられた。これらの成績は現在までに報告がない。
視覚障害児・者のコンピュータ利用における理解しやすい漢字詳細読みに関する研究

視覚障害者に音声で漢字を説明する表現「詳細読み」について、その理解しやすさに与える要因の検討、検討結果に基づいた詳細読みの策定、及びその評価を行った。1.既存詳細読みの書き起こしと分析5種類のスクリーンリーダ製品のJIS第1水準(2965字)の詳細読みを書き起こし、その要素と構成を分析したところ、漢字の難易度が上がるにつれて説明単語の親密度は下がり、かつ構成も多様になることがわかった。2.児童の単語親密度調査学習基本語彙から小学5年配当教育漢字を含んだ単語を抽出し、これを音声刺激として小学5年生に聞かせて親密度を評定させた。その結果、単語の初出学年により親'密度の平均値が有意に変化することがわかった。3.成人を対象とした漢字書き取り調査スクリーンリーダ製品の詳細読みを成人に聞かせて漢字を書き取らせたところ、その平均正答率は児童より30%高かった。これより、児童の正答率が低かったのは、成人より児童の語彙が小さいためであることがわかった。4.教育漢字の詳細読みの策定とその評価児童の語彙範疇と単語親密度を考慮して教育漢字1006字の詳細読みを新たに策定した。この新しい詳細読みを使って、児童を対象とした漢字書き取り調査を行ったところ、既存の詳細読みによる調査結果より平均正答率は有意に高くなった。5.JIS第1水準漢字の詳細読みの策定とその評価利用者の語彙と単語親密度を考慮して、JIS第1水準漢字の詳細読みを作成した。このうち常用漢字の詳細読みを評価するため、大学生を対象とした漢字書き取り調査を行ったところ、同じ漢字のスクリーンリーダ製品の詳細読み(の一部)より高い正答率を得た。6.新しい漢字判別方法の試作仮名漢字変換の結果を単語単位で意味や用例で説明する手法として「辞書説明読み」を提案した。試作プログラムを開発して視覚障害者に試用してもらったところ、概ね肯定的な意見を得た。1.児童向け詳細読みに関する研究『語彙指導の方法[語彙表編]』(甲斐睦朗編)の中の学習基本語彙(4113語)を電子化し,4年6年の教育漢字を含んだ語彙(単語)をここから抽出した。次に,5年の教育漢字を含んだ単語を初出5年以下と6年以上とに分け,初出学年を条件とした「言葉の親密度調査」を5年生を対象として実施した。2.成人の晴眼者を対象とした漢字想起調査スクリーンリーダの詳細読み表現を聞いて元の漢字をどの程度想起できるかを,大学レベルの教育を受けている/受けた成人47人を対象に調べた。児童を対象に同様な調査を行っており,その結果と比較することで,成人と児童との間で,詳細読みの問題がどのように変化するかを考察する。3.論文の投稿児童を対象とした漢字想起実験の結果(既存)を詳細に分析し,電子情報通信学会論文誌に投稿した。4.詳細読みの書き起こしと分類XP Reader, PC-Talker XP, VDM100-PC-Talkerの3種類のスクリーンリーダについて,JIS第1水準・第2水準の詳細読みを書き起こした(第1水準:2965字,第2水準:3388字)。さらに,(第1水準:2965字-教育漢字=1959字)の要素を分類した(教育漢字1006字については既に分類済み)。5.漢字説明実験の結果の再分析電話を介して漢字を音声で説明させる実験(平成14年度に実施済み)の結果を再分析し,電子情報通信学会福祉情報工学研究会で発表した。

6.他国における漢字の入力・確認方法の調査他国における漢字の入力・確認方法と漢字の指導方法について,日本と同じく漢字文化圏である台湾の状況を現地で調査したところ,日本の「詳細読み」に相当する「無字天書入力法」という漢字確認手段が使われていることがわかった。7.研究協議会の開催研究分担者らが集まって研究方針を検討する研究協議会を2回行った。視覚障害者に音声で漢字を説明する表現「詳細読み」について,その理解しやすさに与える要因の検討と,検討結果に基づいてより理解しやすい詳細読みを策定することを研究目的としている。平成17年度の実施内容は以下の通りである。1.児童の単語親密度実験学習基本語彙の中から小学5年配当教育漢字を含んだ単語を抽出し,これを初出学年5年以下と6年以上に分け,初出学年を条件とした単語親密度調査を小学5年生を対象として実施した。その結果,単語の初出学年により親密度が有意に変化することを確認した。2.成人を対象とした漢字想起実験スクリーンリーダの詳細読み(漢字説明表現)を成人116人に聞かせて漢字を書き取らせた。成人の平均正答率は児童より30%高かった。両者で正答率が大きく異なる説明表現を比較することで,児童の正答率が低かったのは成人より児童の語彙が小さいためであることを明らかにした。3.新しい詳細読みの作成とその評価児童の語彙範ちゅうと単語親密度を考慮した詳細読み作成の基準をまとめ,この基準に基づいて教育漢字1,006字の詳細読みを新たに作成した。この新しい詳細読みを使って,児童を対象とした漢字想起実験を行ったところ,既存の詳細読みによる実験結果より平均正答率が有意に高くなった。従って,既存の詳細読みより理解しやすい新たな詳細読みを作成できたといえる。4.既存・新詳細読みの分析XP Reader, PC-Talker XP, VDM100-PC-Talker, JAWS 4.5の4種類のスクリーンリーダの詳細読みについて,JIS第1水準の漢字の表現を分析した。分析作業は,使用単語の親密度の算出と,詳細読みの構成(熟語による説明か,字形による説明か,など)の分類である。平成18年度には、以下の研究実績を残した。1 JIS第1水準漢字2965字の詳細読みの策定と評価教育漢字同様に利用者の語彙と単語親密度を考慮して、教育漢字以外の常用漢字、及び常用漢字以外のJIS第1水準漢字の詳細読みを作成した。このうち、常用漢字の詳細読みを評価するため、大学生を対象とした漢字書取調査を行った。その結果、同じ漢字のスクリーンリーダ製品の詳細読み(の一部)より高い正答率を得た。統計的検定によれば、正答率の平均値の差は有意であった。2詳細読み以外の新しい漢字判別方法の試作詳細読みが漢字を1文字ずつ説明するのに対して、仮名漢字変換の結果を単語単位で意味や用例を使って説明する手法として「辞書説明読み」を提案した。この手法の実際の利用場面における有効性を確認するため、スクリーンリーダと併用できるプログラムを試作し、数名の視覚障害者に配布して試用してもらったところ,概ね肯定的な意見を得ることができた。3同音異義語のかな漢字変換練習用音声コンテンツの試作日本語には多くの同音異義語が存在している。
リボザイム、カタリチックDNAを用いたSOD変異によるALSの遺伝子治療

RNAを配列特異的に切断する方法として最近short interference RNA(siRNA)が開発されたため、SOD1 mRNAに対するsiRNAを作製してリボザイム、カタリチックDNAとその効果について比較検討した。野生型およびG93A SO1mRNAの2次構造の解析から数カ所に19mer RNAとTTの3'overhangからなるsiRNAをデザィインした。HEK293TおよびN2a培養細胞にsiRNAとSOD1発現ベクターと共発現させて、有効なsiRNA配列をスクリーニングした。SOD1mRNAの2次構造上もっとも大きな1本鎖のループ構造をとる部分にin vitroでは90%以上の切断活性のあるribozymeとDNA enzymeを作成した。siRNAは培養細胞の内因性SOD1タンパクを配列特異的に認識して、有効にタンパクの発現を抑制し、その抑制効率はリボザイム、カタリチックDNAよりはるかに高かった。点変異を認識するために5'側から9-13塩基に変異をデザインするとその区別が可能になることを発見し、培養細胞上で野生型mRNAにはほとんど影響せずに、変異mRNAを特異的に発現抑制するsiRNAのデザインに成功した。さらに作製したsiRNA配列をアデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスベクターに組み込んで培養細胞内で有効に内因性SOD1タンパクの発現を抑制することに成功した。SiRNAによる核酸試薬を用いた変異SOD1によるALSの遺伝子治療はその第1段階を完了したというよう。mRNAを配列特異的に切断する方法として最近short interference RNA(siRNA)が開発されたため、SOD1 mRNAに対するsiRNAを作製してリボザイム、カタリチックDNAとその効果について比較検討した。野生型およびG93A SOD1 mRNAの2次構造の解析から数カ所に19mer RNAとTTの3'overhangからなるsiRNAをデザインした。さらにALSに関連する点変異であるSOD1の遺伝子変異について、siRNAはその1塩基の違いを認識して、野生型mRNAにはほとんど影響せずに、変異mRNAを特異的に発現抑制した。加えて、有効なsiRNA配列をtRNA promotor, U6 promotor,独自のtandem型^<2)>,stem型^<3)>の各種デザインした発現型DNAベクターで構築し、その有効性を比較検討したその結果、U6promotor下のstem型の発現型siRNAvectorが最も有効であった。G93Aの点変異を認識して変異SOD1遺伝子の発現を特異的に抑制するsiRNAのデザインに成功した。点変異の位置を5'末端から10-13塩基目にデザインすると最も有効に点変異を羅織できた。同一のSOD1 mRNAの基質部位に対してsiRNA, ribozymeやDNA enzymeをデザインした。ribozymeやDNA enzymeはin vitro転写によるin vitroでの切断実験で切断効率は90%以上の有効なものを作製し得た。これらを用いて培養細胞系でその効率効率を同部位にデザインしたsiRNAと比較検討すると特に内因性のSOD1の発現抑制においてsiRNAはribozymeやDNA enzymeよりはるかに有効であった。さらに有効なsiRNA配列をDNAベクターに組み込んで発現型siRNADNAベクターを構築した。プロモー夕ーはtRNAよりU6の方が優れており、siRNA配列はtandem型よりstem型の方が優れていた。このU6プロモーター下stem型siRNA配列をアデノウイルスベクターとアデノ随伴ウイルスベクターに組み込みその効果も培養細胞系では確認した。今回作製したSOD1遺伝子変異に特異的なsiRNAは、家族性筋萎縮性側索硬化症(ALS)の遮伝子治療への第1ステップになり得たと考えられる。