hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
がんの浸潤転移とRhoファミリーの活性制御機構

低分子量G蛋白質Rhoファミリー(Rho, Rac, Cdc42)はアクチン細胞骨格系を制御し、生理的環境下では極性を有する上皮細胞層の形成に重要である。一方、非生理的環境下では、培養細胞へのRho変異遺伝子のtransfection、Rac1 GEFであるTiam1、ROCKの阻害薬Y-27632などの研究成果から、がん細胞の浸潤転移能への関与が示唆されている。転移能と相関してRhoC、Rho GDI2遺伝子発現の変動が報告されているが、その意義や分子機構はまだ明らかではない。私どもはRhoファミリーとその活性調節蛋白質であるRho GDI (GDP dissociation in-hibitor)およびSmg GDS (GDP dissociation stimulator)欠損マウスを用いて、p53欠損マウスとの交配およびTPA/DMBA投与による個体発がん研究を展開中である。また、Rho GDI α/β二重欠損マウスの表現型を解析した結果、顕著な体外受精率の低下と精子形成異常、成熟T細胞およびB細胞の減少、未分化顆粒球系細胞の増加が観察された。二重欠損マウスの胸腺、脾臓ではRhoA, Rac1蛋白質量が減少し、逆にGTP結合型Rhoの割合とErk活性は増加傾向を示した。従って、Rhoファミリーは精子形成と血球系細胞の分化過程で重要な役割を果たしており、GDI活性が限界まで低下した二重欠損マウスでは、残存するRhoファミリー分子の活性を亢進させることで適応いることが明らかになった。一方、Smg GDS欠損マウスで観察された心筋、胸腺細胞のアポトーシス亢進はp53欠損による影響を受けないことが明らかになり、p53非依存性アポトーシスである可能性が示唆された。
ストレス蛋白質の腎疾患モデルおよび遺伝子導入による腎障害抑制に関する研究

熱ショック蛋白質(heat shock protein,HSPs)は,細胞防御・機能維持に必須であり,多くのHSPsは非ストレス下でも細胞内に発現し,分子シャペロンとしての機能を有する.我々は主要なHSPsを哺乳動物から精製し、特異抗体の作製に成功してきた.以前,gentamicin(GM)腎症で,近位尿細管の障害されたライソゾームにHSP73が蓄積することを報告した.平成9年度はこのモデルで非分子シャペロンであるarginosuccinate syntetase(ASS)との局在変化を比較検討した.また,poly-D glutamic acid(PDGA)によるライソゾーム蓄積症モデルでHSP73,HSP90,ASSの局在変化と量的変動を比較検討した.さらに培養細胞にHSP72遺伝子を導入し、各種有害な環境や毒物に対する抵抗性を検討し以下の結果を得た.1. GMをラットに投与し,HSP73とASSの局在変化を免疫電顕で観察し,HSP73が近位尿細管の障害されたライソゾームに特異的に蓄積することを確認した.2. PDGA腎症でも,GM腎症と同様にHSP73,HSP90は障害されたライソゾームに特異的に蓄積することを見い出した.したがって,HSPsは傷害されたライソゾーム内で能動的な役割を担っていると考えられる.3. HSP72の遺伝子をベクター(pBK-CMV)に導入し,リボソーム法によりブタ腎尿細管上皮細胞株(LLC-PK1)にトランスフェクションした.HSP72の過剰発現を抗HSP72抗体を用いた生化学的方法(immunoblot法)で確認し,HSP72過剰発現細胞株を作製した.この細胞株は過酸化水素およびシスプラチンによる障害に対して,コントロールより約2から3倍の抵抗性を示した.したがって,HSP72は尿細管細胞においても細胞防御・機能維持に必須と考えられる.熱ショック蛋白質(heat shock protein,HSPs)は,細胞防御・機能維持に必須であり,多くのHSPsは非ストレス下でも細胞内に発現し,分子シャペロンとして機能することが明らかとなってきた.我々は主要なHSPsを哺乳動物から精製し,特異抗体の作製に成功してきた.以前,gentamicin(GM)腎症で,近位尿細管の障害されたライゾームにHSP73が蓄積することを報告した.平成9年度はこのモデルで非分子シャペロンであるargininosuccinate synthetase(ASS)との局在変化を比較検討した.また,poly-D-glutamic acid(PDGA)によるライソゾーム蓄積症モデルでHSP73,HSP90およびASSの局在変化と量的変動を比較検討した.さらに培養細胞にHSP72遺伝子を導入しHSP72を過剰発現させ,各種有害な環境や毒物に対する抵抗性を検討した.1.GMをラットに投与し,HSP73とASSの局在変化を免疫電顕で観察し,HSP73が近位尿細管の障害されたライソゾームに特異的に蓄積することを確認した.2.PDGA腎症でも,GM腎症と同様にASSと比較してHSP73,HSP90が障害されたライソゾームに特異的に蓄積することを見い出した.したがって,HSPsは傷害されたライソゾーム内で能動的な役割を担っていると考えられる.3.HSP72の遺伝子をベクター(pBK-CMV)に導入し,リボソーム法によりブタ腎臓尿細管上皮細胞(LLC-PK1)にトランスフェクションした.HSP72の過剰発現を抗HSP72抗体を用いた生化学的方法(immunoblot法)で確認した.この細胞株は過酸化水素による障害に対して,コントロールより約2から3倍の抵抗性を示した.したがって,HSP72は尿細管細胞においても細胞防御・機能維持に必須と考えられる.熱ショック蛋白質(heat shock protein,HSPs)は,細胞防御・機能維持に必須であり,多くのHSPsは非ストレス下でも細胞内に発現し,分子シャペロンとしての機能を有する.我々は主要なHSPsを哺乳動物から精製し、特異抗体の作製に成功してきた.以前,gentamicin(GM)腎症で,近位尿細管の障害されたライソゾームにHSP73が蓄積することを報告した.平成9年度はこのモデルで非分子シャペロンであるarginosuccinate syntetase(ASS)との局在変化を比較検討した.また,poly-D glutamic acid(PDGA)によるライソゾーム蓄積症モデルでHSP73,HSP90,ASSの局在変化と量的変動を比較検討した.さらに培養細胞にHSP72遺伝子を導入し、各種有害な環境や毒物に対する抵抗性を検討し以下の結果を得た.1. GMをラットに投与し,HSP73とASSの局在変化を免疫電顕で観察し,HSP73が近位尿細管の障害されたライソゾームに特異的に蓄積することを確認した.2. PDGA腎症でも,GM腎症と同様にHSP73,HSP90は障害されたライソゾームに特異的に蓄積することを見い出した.

したがって,HSPsは傷害されたライソゾーム内で能動的な役割を担っていると考えられる.3. HSP72の遺伝子をベクター(pBK-CMV)に導入し,リボソーム法によりブタ腎尿細管上皮細胞株(LLC-PK1)にトランスフェクションした.HSP72の過剰発現を抗HSP72抗体を用いた生化学的方法(immunoblot法)で確認し,HSP72過剰発現細胞株を作製した.この細胞株は過酸化水素およびシスプラチンによる障害に対して,コントロールより約2から3倍の抵抗性を示した.したがって,HSP72は尿細管細胞においても細胞防御・機能維持に必須と考えられる.
Categorial Grammar の学習アルゴリズムに関する研究

本研究の目標は、範疇文法を用いた自然言語のための学習モデルの定式化であり,定式化に際しては、学習成功のクライテリアである「極限における同定」に注目して研究を行った。また、将来的に定式化したモデルを、自然言語処理に応用するため、範疇文法の拡張であり、かつ範囲疇文法よりも柔軟な文法形式である主辞駆動句構造文法の実用化に向けた研究も行った。本研究で定式化された言語学習モデルは、この主辞駆動句構造文法を介して自然言語処理の改良、発展に貢献するであろう。より具体的に研究した内容について述べると、まず、一点めとしては、範疇文法での範疇(カテゴリー)をコーパスから学習する研究を行った。この研究では、新聞1年分のテキストコーパスから、動詞、副詞などの品詞、およびサ変名詞、時間、主体、組織、道具、場所、量/強度などを指し示す名詞などの語クラスを生成することができた。また、生成に際して使用した学習アルゴリズムは、ある語分類のクラスにたいして「極限における同定」が可能であることを証明した。さらにこのような語クラスを埋め込んだ文法の学習アルゴリズムを考えることができ、語クラスの極限における同定の可能性から、語クラスが埋め込まれた文法の学習アルゴリズムの極限における同定も同様に証明することができる。また、コーパスから生成された語クラスの精度の検証は、2通りの方法でおこなわれた。まず、被験者を用いた適合率/再現率の評価を行い、良好な結果をえた。同時に先に言及した主辞駆動句構造文法による構文解析器に統計的曖味性解消機構を融合したシステムを開発し、このシステムに語クラスを導入して、人手で生成した語分類とほぼ同等の精度向上が見られることを確認した。本研究の目標は、範疇文法を用いて多項式時間言語学習アルゴリズムを定式化し、実験をおこなってその検証を行なうことである。本年度は、以前に作成済みの学習アルゴリズムをさらに改良し、テキストコーパス(新聞)を用いて、語のより良好な統語的/意味分類が得られるようになった。より具体的には、アニーリング手法の導入による統計的クラスタリング手法の改良と、分類を行なう際のキーとなる単語の選択で、多数決原理を導入したことである。この単語分類の結果は、最終的な目標である範疇文法に型として組み込まれることになる。クロスバリデーションを行なった結果、これらによって、収束の度合が10%程度向上していることを確認した。また、従来得ていた極限における同定の証明を発展させ、新しいアルゴリズムに関しても証明をおこなった。さらに複数の被験者に単語分類を行なってもらい、それと我々のアルゴリズムの出力の比較を行なった。概して、従来提案されてきた語の統計的クラスタリング手法で、同じ数のクラスを作成した場合よりも再現率、適合率ともに若干高い値となっている。従来のクラスタリング手法では取り扱うことができなかった曖昧性の取り扱いができるようになったことで、再現率が向上したものと考えられる。実際に出力結果を見たところ、場所と組織の両方に属する単語が多いなど、直観に合う結果が得られている。また、分類を行なう基準となる単語についても、直感的に妥当なものが得羅得ている。
脊髄虚血モデルにおける灰白質及び白質傷害の長期的評価

脊髄虚血モデルを用い、軽度低体温や各種薬剤の脊髄虚血後の灰白質傷害と白質傷害への影響について検討した。脊髄虚血後の灰白質傷害と白質傷害はその発症様式や時間的経過が異なることが明らかになり、各種の治療的手段の効果についても異なることが明らかになった。また、灰白質傷害と白質傷害の回復過程の変化を明らかにすることで、機能回復のための治療戦略の可能性を示唆した。ウサギ脊髄虚血モデルを用いて脊髄虚血後の灰白質と白質の傷害についての長期的検討を行った。ウサギはNew Zealand White Rabbitを用い、後腹膜アプローチにて下行大動脈を腎動脈分岐部直下で遮断した。麻酔はイソフルランによるマスク麻酔とし、体温を38°Cに維持し、大動脈を16分間遮断した。再還流3時間、1日、2日、4日、7日、14日目の後肢運動機能を評価し、1,4、14日目の組織学的評価を行った。灰白質傷害は前角の正常神経細胞数で評価し、白質傷害は前及び前側索の空砲化率を算出した。また、免疫染色によりamyloid precursor protein (APP)の沈着の程度を評価した。結果、後肢運動機能は時間と共に低下し、14日目に最悪となった。正常神経細胞数は4日目で最低となった。白質傷害の指標である空砲化率は再還流24時間では低値であったが、4日、14日目には有意に上昇していた。また、4日、14日目ではAPPの沈着が著明であった。これらのことより、ウサギ脊髄虚血後の障害は再還流14日に渡り変化しており、その変化の形態は運動機能、灰白質、白質で異なることが示唆された。脊髄虚血後の神経評価においては、灰白質と白質の長期的評価が必要であると考えられた。ラット脊髄虚血モデルを用い、虚血後の白質傷害について検討した。脊髄虚血は2Frのフォガテフィカテーテルを大腿動脈から下行大動脈まで挿入し、また、中枢側血圧は40mmHgに調節した。運動機能評価についてはBBBスコアを用い、組織学的検討はHE染色及び免疫染色を行った。白質傷害については空砲化率を算出した。また、免疫染色を用い、amyloid precursor protein (APP)の沈着により白質の機能的障害を評価した。結果、虚血24時間後に白質における空砲化は著明で、同部位にAPPの沈着が認められた。白質傷害の程度は、運動障害や灰白質傷害の程度と関連性が認められた。ウサギ脊髄虚血モデルにおいても、虚血後の白質傷害について検討した。虚血モデルは腎動脈下大動脈の遮断により行った。結果、虚血24時間後は白質傷害は軽度であったが、虚血4日後より白質傷害の程度は顕著となった。一方、灰白質傷害は虚血24時間後でも著明であったことから、ウサギ脊髄虚血モデルにおいては白質傷害と灰白質傷害では、その発生に時間的相違があることが示唆された。ラット脊髄虚血モデルを用い、脊髄虚血後の灰白質傷害と白質傷害の関係について検討した。脊髄虚血は2Frのフォガティカテーテルを大腿動脈から左鎖骨下動脈分岐直下まで挿入し、同時に脱血により頚動脈圧を40mmHgになるように調節した。中枢側の血圧調節により大動脈遮断時の側副血流を一定にすることができると考えられている。運動機能評価についてはBBBスコアを用いて評価した。灰白質傷害は前角部の正常神経細胞数を計測した。白質傷害は空砲化率を計測した。SDラット(n=95)を常温群、軽度低体温(35°C)、軽度低体温(33°C)の3群に分け、傷害の長期的変化を観察した。観察は虚血後2日、28日におこなった。灰白質傷害は軽度低体温群で有意に少なく、33°C群ではこの効果は虚血後28日まで持続した。白質傷害も同様に、軽度低体温群に保護効果を示したが、時間経過とともに改善傾向が認められた。下肢運動機能は軽度低体温群で有意に良好であったが、時間経過とともに改善した。以上より、軽度低体温には長期的な保護効果が認められるが、傷害の程度は経時的に回復することから、脊髄虚血後の機能的回復の機序とその修復の重要性が示唆された。ラット脊髄虚血モデルを用い、軽度低体温や各種薬剤の脊髄虚血後の灰白質傷害と白質傷害への影響について検討した。

白質傷害は空砲化率を計測した。SDラット(n=95)を常温群、軽度低体温(35°C)、軽度低体温(33°C)の3群に分け、傷害の長期的変化(28日)の観察をおこなった。灰白質傷害は軽度低体温群で有意に少なく、33°C群ではこの効果は虚血後28日まで持続した。白質傷害も同様に、軽度低体温群に保護効果を示したが、時間経過とともに改善傾向が認められた。下肢運動機能は軽度低体温群で有意に良好であったが、時間経過とともに改善した。次に脳虚血などで神経保護効果が報告されているミノサイクリンの脊髄虚血後の神経細胞障害への影響について検討した。虚血3日目の運動機能はミノサイクリン投与群で有意に良好であり、灰白質傷害の程度も軽い傾向が認められた。現在、長期的予後について検討中である。
APC/Cユビキチンリガーゼの活性を阻害するEmi1の過剰発現と癌化との関連

細胞周期チェックポイントの異常や細胞分裂の異常は、癌化の引き金になると考えられており、なかでも細胞分裂制御のキー分子として機能しているタンパク質の多くが、APC/Cユビキチンリガーゼ複合体により、タンパク量が調節されていることが知られている。Emi1は、APC/Cの活性を阻害する因子で、S期からM期初期にかけて発現が誘導され、APC/Cの活性を抑制している。本研究では、APC/Cの活性を抑制するEmi1が癌細胞株や頭頸部癌症例で、高頻度に強い発現を示すことを見出した。さらに、Emi1の分解異常により、恒常的にEmi1を発現する癌細胞株を見つけ、その細胞がERK-RSK経路によりEmi1のSer310およびThr315がリン酸化され、そのリン酸化がユビキチン分解を阻害することを見出した。Emi1の恒常的な発現は、細胞周期を通じてAPC/Cの活性を抑制し、その基質タンパクの過剰発現を引き起こしていた。以上の結果から、Emi1の分解異常による過剰発現が、恒常的なAPC/C活性の抑制をひきおこし、細胞周期制御異常や癌化に関連することが明らかとなった。癌において、細胞周期チェックポイントの異常や細胞分裂の異常は、分化や細胞増殖の異常の引き金になると考えられており、なかでも細胞分裂制御のキー分子として機能しているタンパク質の多くが、APC/C複合体により、ユビキチン分解されることが知られている。これらタンパクは、癌細胞でしばしば過剰発現していることから、APC/Cによる分解制御異常が、その過剰発現に関与するのではないかと考えた。さらに、我々の予備実験では、APC/Cの活性を抑制するEmi1が癌細胞株で強い発現を示していることから、Emi1の過剰発現により、APC/Cの活性を抑制し、基質タンパクの過剰発現を引き起こすことによって、異常な増殖や分裂異常を介して、癌化に関与するのではないかと考えた。実際に、Emi1は、頭頸部癌症例で、高頻度に過剰発現しており、癌細胞株においても、高い発現を示していた。通常、Emi1は、細胞分裂期初期において、APC/Cが活性化する際に、ユビキチン分解されるが、癌細胞株においても、高い発現を示すにもかかわらず、細胞分裂期での発現は、みられない細胞がほとんどであった。しかし、一つの細胞は、細胞周期を通じて、Emi1が発現しており、その細胞では、APC/Cの基質タンパクの過剰発現がみられた。さらに、Emi1の恒常的な発現が、ERK-RSK経路によるリン酸化がユビキチン分解を阻害することも見出した。現在、そのリン酸化部位の詳細と、リン酸化異常が及ぼすEmi1の恒常的な発現が、APC/Cの基質タンパクの過剰発現をひきおこすかやその癌化への影響について検討中である。我々は、APC/Cの活性を抑制するEmi1が癌細胞株や頭頸部癌症例で、高頻度に強い発現を示すことを見出した。また、Emi1の分解異常により、恒常的にEmi1を発現する癌細胞株を見つけ、その細胞がERK-RSK経路によるリン酸化により、Emi1のユビキチン分解が阻害されていることを見出した。今年度は、Emi1がERK-RSKにより、Ser310およびThr315がリン酸化されることを明らかにした。RSk2によるEmi1のリン酸化が、G2期でのタンパクの安定性に関わることをRSk2siRNAにより明らかにした。また、Ser310およびThr315をアラニンに変異させたリン酸化欠失変異体を作製し、そのタンパクの安定性を検討した結果、Emi1のSer310およびThr315のリン酸化は、G2期での安定性に関わることが証明された。現在、Emi1におけるSer310およびThr315の恒常的なリン酸化が及ぼす癌化への影響とAPC/Cの基質タンパクの過剰発現をひきおこすかどうかを検討中である。

これまでの研究で、我々はAPC/Cの活性を抑制するEmilが癌細胞株や頭頸部癌症例で、高頻度に強い発現を示すことを見出し、その過剰発現にEmilの分解異常が関与することを明らかにした。さらに、ERK-RSK経路によるEmilのSer310およびThr315のリン酸化が、ユビキチン分解を阻害することを見いだした。とくに、RSK2がEmilのSer310およびThr315のリン酸化し、RSk2のknockdownがG2期でのEmilのタンパクの安定性に関わることを明らかにした。今年度は、EmilのSer310およびThr315のリン酸化抗体を作製し、リン酸化のタイミングとEmilの安定性に関して検討したところ、G2期からM期の初期にリン酸化され、Emilのタンパク安定性とよく相関することを確認した。さらに、Ser310およびThr315をアスパラギン酸に変異させたリン酸化模倣型変異体では、野生型に比べてp53のknockoutした細胞で、増殖を促進させるとともに、軟寒天培地で多くのコロニーを形成したことから、Emilのタンパク安定化による過剰発現が発癌に関わることが明らかとなった。また、DNA損傷過程の初期で、Emilが安定化し、APC/Cの活性が抑制されることを見いだし、その際にSer310およびThr315がリン酸化されることも明らかにした。現在、本研究成果を論文としてまとめている最中である。
DNAコーディング法による知的火災判断システム

本研究では,様々な環境下において設置されている火災報知システムの信頼性の向上を目的として,遺伝的アルゴリズムを用いた火災判断ルールの自動獲得手法を提案してきた.煙濃度時系列データに対し,煙濃度データを波形としてとらえ,着炎火災・薫燻火災・煙草・水蒸気(湯気)・調理の各カテゴリに対する特徴をIFTHEN形式で抽出することにより,その特徴を用いて火災判断を行った.本年度には,時系列データに対する特徴を,木構造形態で自動的に抽出するシステムとして,Routing Tree(RT)を提案した.RTは,最大4つの枝を持つ木構造をしており,各枝はそれぞれ2つのFOR条件部と2つのIF条件部からなっている.ルート(根)ノードは,それぞれのFOR条件部,IF条件部に対して接続する/しない,及び判断するクラスタを持つものとする.ここでFOR条件部,IF条件部とは,時系列データの連続した情報や離散的な情報などを,その時系列データの特徴として表現する部分であり,C言語(プログラミング言語)におけるFOR文,IF文で構成されている.各条件部は,複数の選択経路とその経路を決定する分岐点が連なった形で構成され,学習により経路を獲得する事でそれぞれの表現型(抽出された特徴及びクラスタリングされるクラスタ)が得られる.本提案手法を,煙濃度時系列データからの特徴抽出に適用することにより,有効な火災自動判断システムの構築を行った.また,本研究で用いている遺伝的アルゴリズムをはじめとした進化的計算手法では,繰り返し計算により探索を行うため,所望の解を獲得するために時間を要する.そこで本研究では,進化的計算手法における染色体の実評価回数を大幅に減らし,残りの染色体の評価値を推論により求めることで全体としての評価回数を短縮する評価値推論手法を提案した.この提案手法により,評価値推論手法の精度を向上させ,評価の負荷を軽減しながらも,効率のよい探索が行えることを示した.現在、様々な環境下において火災報知システムが設置されている。火災報知システムは、人命や財産を守り、安全な社会生活を保証するために欠かせないシステムである。しかし現状では、火災ではないのに警報が鳴る非火災報が頻繁に起こり、システムの信頼性が低下しているために、実際の火災時に適切な行動が遅れるといった問題が指摘されている。また、管理者がシステムを停止することにより、火災の発見が遅れ、ビルの大火災を招いた事実もいくつか報告されている。センサの改良により非火災報件数は減少しつつあるものの、現在においても依然として非火災報件数の低減は大きな課題となっている。そこで本研究として,遺伝的アルゴリズムを用いた火災判断ルールの自動獲得手法を提案した.煙濃度時系列データに対し,煙濃度データを波形としてとらえ,着炎火災・薫燻火災・煙草・水蒸気(湯気)・調理の各カテゴリに対する特徴をIFTHEN形式で抽出することにより,その特徴を用いて火災判断を行った.また,予備実験として,煙濃度時系列データを用い,人間による火災判断実験を行った.火災データとして,着炎・燻焼,非火災データとして煙草・水蒸気・調理の計5カテゴリに対する時系列データを学習用・テスト用とに分け,5人の被験者に各学習用データを1つずつ見てもらい,各カテゴリに対する特徴を抽出してもらった.それぞれが得た各カテゴリの特徴を基に,テスト用データをランダムに見せ,それがどのカテゴリのものかを認識してもらい,人間による火災判断の認識率を測定した.その結果,本手法により,人間が抽出した特徴(火災判断ルール)に近いルールが自動生成されることを示すとともに,人間でも予想が困難な特徴も同時に発見されることを示した.また本手法により得られた特徴を用いて火災自動判断を行い,現行で用いられているシステムに対し高い火災判断正答率が得られることを示した.本研究では,様々な環境下において設置されている火災報知システムの信頼性の向上を目的として,遺伝的アルゴリズムを用いた火災判断ルールの自動獲得手法を提案してきた.煙濃度時系列データに対し,煙濃度データを波形としてとらえ,着炎火災・薫燻火災・煙草・水蒸気(湯気)・調理の各カテゴリに対する特徴をIFTHEN形式で抽出することにより,その特徴を用いて火災判断を行った.本年度には,時系列データに対する特徴を,木構造形態で自動的に抽出するシステムとして,Routing Tree(RT)を提案した.RTは,最大4つの枝を持つ木構造をしており,各枝はそれぞれ2つのFOR条件部と2つのIF条件部からなっている.ルート(根)ノードは,それぞれのFOR条件部,IF条件部に対して接続する/しない,及び判断するクラスタを持つものとする.ここでFOR条件部,IF条件部とは,時系列データの連続した情報や離散的な情報などを,その時系列データの特徴として表現する部分であり,C言語(プログラミング言語)におけるFOR文,IF文で構成されている.各条件部は,複数の選択経路とその経路を決定する分岐点が連なった形で構成され,学習により経路を獲得する事でそれぞれの表現型(抽出された特徴及びクラスタリングされるクラスタ)が得られる.本提案手法を,煙濃度時系列データからの特徴抽出に適用することにより,有効な火災自動判断システムの構築を行った.また,本研究で用いている遺伝的アルゴリズムをはじめとした進化的計算手法では,繰り返し計算により探索を行うため,所望の解を獲得するために時間を要する.そこで本研究では,進化的計算手法における染色体の実評価回数を大幅に減らし,残りの染色体の評価値を推論により求めることで全体としての評価回数を短縮する評価値推論手法を提案した.この提案手法により,評価値推論手法の精度を向上させ,評価の負荷を軽減しながらも,効率のよい探索が行えることを示した.
高齢者の居住環境バリアフリー化と体力維持予測に関する研究

1.在宅高齢者の生活・居住環境に対する不満度を、面接アンケートに調査した。調査対象地区は、兵庫県にある山間部集落と市街地の在宅高齢者とした。居住環境に対する不満は、地域に関係なく冬季の室内の寒さに対する不満が顕著であった。2.山間部集落および市街地集合住宅に居住する高齢者住宅の居間の温湿度を夏季と冬季に、それぞれ1ヶ月間程度測定した。冬季において独居世帯および夫婦世帯の気温が、同居世帯よりも顕著に低かった。3.高齢者と大学生、男女の間で嗜好する手摺の太さ及び材質に差がみられるかどうかについて検討した結果、高齢者・大学生とも35mmの手摺を一番高く評価し、25mmの手摺を低く評価した。高齢者においては、木材、プラスチック、金属の評価の間に有意な差はみられなかったが、大学生においては木材が最も高く評価された。4.70歳以上の高齢女性を対象として、またぎ動作時の認知とQOL、ADL、体力との関係について検討した。ステップワイズ法を用いて多重ロジスティック回帰分析を行った結果、握力が有意な変数として選択された。本研究において、バーをまたぐ際の自己認識と実際の動作能力との間の不一致とも有意な関連がみられた。その一方で、下肢の運動機能と認識の不一致との間には有意な関連がみられなかった。握力を良好な状態に保つことの重要性が確認された。5.インターネット入力装置の使いやすさと年齢の高低、健康状態の良悪、携帯電話・インターネットの必要性の有無との関連について検討した結果、高年齢者群(オッズ比=3.86,95%信頼区間0.83-18.98)、健康状態の悪い群(オッズ比=5.00,95%信頼区間1.05-25.41)、今後の携帯電話・インターネットの必要性を認めない群(オッズ比=7・22,95%信頼区間1.34-43.88)が選んだ最も使いやすい入力装置は、タッチスクリーン入力方式であった。6.在宅高齢者(要介護者を含む)とその家族(介護者)を対象にアンケート調査及び簡単な体力測定を行い、住宅の各種性能に対する不満の所在、バリアフリー化(住宅改修)の効果、QOL(モラール)・ADLと居住環境との関係、介護者に対する介護負担の軽減効果等について検討を行った。バリアフリー化によって、住宅内の段差等に対する不満は軽減されていた。しかし、一方で住宅内の温熱環境に対する不満が比較的多く、住宅に対する総合的不満につながっている傾向が示された。6.山村集落の自立高齢者に対する転倒予防教室において、体力測定とアンケート(転倒リスクアセスメント等)調査を行った。自宅住宅内での転倒経験は少ないものの、「つまづき」への恐怖心が生活動作に対する自信を失わせている傾向が示された。

自宅住宅内での転倒経験は少ないものの、「つまづき」への恐怖心が生活動作に対する自信を失わせている傾向が示された。1.高齢者の住宅の温熱環境の基礎調査として、兵庫県飾磨郡Y町の山間部Y地区に居住する高齢者住宅の居間の温湿度を夏季(2001年8月)と冬季(2001年12月、20002年1月)に、それぞれ1ヶ月間程度測定した。高齢者独居世帯、高齢者夫婦世帯および子世帯同居の違いによる室内温湿度状況および暖冷房状況等の違いについて検討した結果、冬季において独居世帯と夫婦世帯の温湿度はほぼ同等の状況で、同居世帯は独居・夫婦世帯よりも高い室内温度であった。2.高齢者の生活・居住環境全般に対する意識としての不満度を、面接アンケートに調査した。調査対象は、Y町山間部Y地区、Y町公営住宅C地区および姫路市内S地区の在宅高齢者とした。Y地区では生活環境としての交通の利便性に不満度が高かった。一方、市街地のS地区では交通事故に対する不安、運動不足に対する不安が相対的に顕著であった。居住環境に対する不満は、地域に関係なく冬季の室内の寒さに対する不満が顕著であった。3.兵庫県飾磨郡Y町に在住する65歳以上の独居高齢女性30名を対象として、生活体力と健康状態について調査を行った結果、以下の知見が得られた。1.日常生活において困難と感じる動作として訴え率の高かった項目は、男女とも「長時間立っているのが苦痛」、「膝が悪いので正座が困難」、「高い所に手が届きにくい」、「かがむのが苦痛」、「手や腕に力が入りにくい」であった。2.年齢の高さと筋力の弱さの両方と関連がみられた、日常生活において困難と感じる動作、居住環境で不便に感じる場所・事柄は「長時間立っているのがつらい」、「手や腕に力が入りにくい」、「高いところに手が届きにくい」であった。また、高齢女性を対象としてインターネット入力機器に関する調査を行ったところ、タッチスクリーンによる入力方式が無理のないインターネット入力方法であることがわかった。1.高齢者住宅の温熱環境の基礎調査として、兵庫県H市の市街地に立地する高齢者福祉公営集合集宅(いわゆるシルバーハウジング,5階建て)23世帯を対象に、夏季(2002年8月)に室内温湿度を測定した。このデータから冷房使用世帯と非使用世帯との温湿度の状況、冷房使用パターン等について解析を行った。冷房世帯と非冷房世帯との室内温度に顕著な違いが認められた。2.上記H市のシルバーハウジングに居住する高齢者25名に対し、生活・居住環境全般に対する意識としての不満度を、面接アンケートに調査した。昨年度調査した山間地域と比較した結果、生活環境としての人間関係において不満度が高い傾向を示した。居住環境では、夏の暑さに対する不満度が高い傾向を示した。3.兵庫県Y町の在宅高齢女性40名(78.5±4.5歳、範囲70-89歳)を対象として、パソコン入力装置の使いやすさついて調査を行った結果、タッチスクリーン入力方式と年齢の高さ(P<0.05)、健康状態の悪さ(P<0.05)、今後の携帯電話・インターネットの必要性の低さ(P<0.01)との間でそれぞれ有意な関連が認められた。その一方で、ひらがな50音キーボード入力方式と今後の携帯電話・インターネットの必要性の高さ(P<0.05)の間で有意な関連が認められた。4.兵庫県H市に在住する65歳以上の高齢女性58名を対象として、アフォーダンスの知覚((1)7m前方にあるバーの高さを上下させ高齢者自身が跨げる高さを判断する
高信頼広域移動体ネットワーク構成手段の研究

ノート型のコンピュータやPDAなどの移動コンピュータを構成要素とするモバイルコンピューティング環境への要求が高まっている。ロボットや無人探査機など、移動コンピュータが状態情報をもちミッションクリティカルなアプリケーションを実行するためにのフォールトトレランス技術を確立するために、本研究では、チェックポイントリカバリ技法の研究をおこなった。その解として、移動コンピュータと固定コンピュータがその特性に応じてそれぞれ異なる手法を用い、全体として矛盾のないチェックポイントを設定する複合チェックポイントを提案していた。今年度は、実用にむけて、現在普及が進みつつある無線LANプロトコル(IEEE802.11)を通信に用いるモバイルコンピューティング環境に適応可能なプロトコルの設計を行った。従来、移動コンピュータの通信モデルとして、すべてのメッセージがアクセスポイントによって中継されるものを想定していた。ところが、無線LANプロトコルでは、同一無線セルに含まれるコンピュータ同士は直接通信する。このため、これまでは保証されていた追加メッセージなしに通信ログをアクセスポイントで取得できるという性質を保つことができなくなる。本論文で提案する手法は、無線LANプロトコルのブロードキャスト性を利用して同様の性質を保証している。また、メッセージそのものとその受信順序情報を独立に管理する方法によって、モデルの変更によって生じる順序の逆転の問題を解決している。広域ネットワークでのコンピュータの移動の対して、通信の保証を行うプロトコルとして、現在のインターネットではMobileIPというプロトコルが用いられている。本研究では、蒸気のチェックポイント技法をMobileIPに基づいて拡張し、リカバリ時のオーバヘッドを削減する方法も提案している。評価実験の結果、リカバリ時オーバヘッドを削減する方法も提案している。評価実験の結果、リカバリ時のネットワーク負荷を軽減することが明らかになった。これまでにローカルエリアネットワーク(LAN)を対象として研究、開発されていた高信頼ネットワーク構築技術に対して、広域ネットワークにおいてこれらを実現するための基礎的研究を行なった。ここでは、移動端末の特性(ネットワーク上の位置の時間変化、ディスクや電源の不十分性)を考慮した新しいチェックポイント手法を提案し、その実現プロトコルの構成を行なった。現在の広域ネットワークは、性能の異なる様々なコンピュータが、速度、帯域の異なるネットワークに接続されており、またネットワークに固定的に接続された端末と移動端末とが混在する複雑なネットワークである。特に、移動端末については、ディスク等の資源を十分に持たない端末、資源をある程度持っている端末、ネットワークとの接続が安定している端末、不安定な無線通信によりネットワークに接続されている端末などがあり、我々がこれまでに提案している手法を一律に適用することはできない。そこで、移動端末をその性質から分類し、それらが混在するときにより小さなオーバヘッドで再実行を可能とするチェックポイント・リスタート手法について検討を行なった。
新規な高次トポロジカル分子の合成法の開発

本年度の主な研究実績は以下の3点である。(1)ジエンおよびジエノフィルユニットを二つの環に含むカテナンの合成水素結合サイトとして第二級アミド結合をもち、ジエン構造を有するマクロサイクルの存在下でジエノフィルとしてフマル酸誘導体を含むジアミンと、適度な長さを有するジ酸クロリドの環化反応を行うことでジエン構造とジエノフィル構造をそれぞれの環に含む[2]カテナンを合成した。ジ酸クロリドの構造には他の官能基の導入も可能であり、また本カテナンの合成法は非常に穏やかな反応条件下で進行するため、様々な官能基を有するカテナンを自在に合成する手法を確立した。ジエン構造およびジエノフィル構造を二つの環コンポーネントに含む[2]カテナンを溶融重合させることでカテナンユニットを全て環状構造で連結したポリカテナン状ポリマーを合成した。カテナンモノマーに組み込んだジエンとフマル酸誘導体のDiels-Alder反応は速やかに進行し、カテナンユニットを含むポリマーが簡便に得られることを確認した。この結果より、本研究の「協奏的環化反応による高次インターロックト化合物の合成」手法が、ポリカテナン合成に向けた方法論として適切であることを実証した。(3)ジエン構造をもつインターロックト化合物の応用として、フラーレンをDiels-Alder反応によって環に導入したロタキサンを合成した。さらに、軸分子に亜鉛ポルフィリンを導入することによって環にフラーレン、軸にポルフィリンを導入したロタキサンを合成した。これらのロタキサン上においてポルフィリンからフラーレンへ空間を介した光誘起電子移動が観測され、インターロックト化合物が優れた電子移動システムを構築できることを示した。
APRILおよびBAFFの機能解析と自己免疫疾患発症への関与の検討

TNFファミリーに所属する分子であるAPRILおよびBAFFはII型膜蛋白で、この2分子は高い相同性を有している。これら2分子はBCMA,TACIという2つのレセプターを共有し、これらを介してB細胞の分化や増殖に関与していると考えられている。我々はAPRILおよびBAFFの機能解析と自己免疫疾患発症への関与を検討することを研究目的とした。まずAPRILのG67R、N96Sという2つの遺伝子多型を同定し、SLE148名、健常人146名を対象にアレル頻度を比較したところ67Gのアレル頻度がSLEで有意に上昇していた(p=0.0302)。つぎに可溶型APRIL、BAFFをELISAにより測定する系を確立し、可溶型APRILの血中濃度がSLE患者では健常人に比較し、有意に上昇していることを初めて明らかにした。BAFFに関しては特異的レセプターBR3の遺伝子解析を行い、BAFF結合領域であるCystein-rich domain内に新しい遺伝子多型Pro21Arg(P21R)を同定した。膜型BAFFを介した内向きシグナルの解析を行うため、遺伝子工学的にFurin転換酵素認識部位を変異させることにより、Furin転換酵素で切断されない膜型BAFFを作成した。本研究によりSLEにおける新たな疾患感受性遺伝子としてAPRIL遺伝子が同定された。SLE患者において血清APRILおよびBAFFが上昇していることを明らかにし、B細胞刺激を介してSLEの病態形成に関与している可能性が示唆された。BR3における新たな遺伝子多型の同定や膜型BAFFの作成により自己免疫疾患におけるBAFFの役割の解析が可能になった。APRILおよびBAFFが今後自己免疫疾患の特異的治療を行う際のターゲットになる可能性が示された。TNFファミリーに所属する分子であるAPRILおよびBAFFはII型膜蛋白で、この二分子は高い相同性を有している。これら2分子はBCMA, TACIという2つのレセプターを共有、またBAFFは固有のレセプターとしてBR3を有し、これらを介してB細胞の分化や増殖に関与していると考えられている。さらにSLEのモデルマウスであるNZBWF1に可溶型蛋白TACI-Igを投与することで病態が著明に改善することが報告された。以上より本研究ではAPRILおよびBAFFが自己免疫疾患の発症に関与しているかどうかを検討することを研究目的とした。まずAPRILの遺伝子構造を決定し、G67R、N96Sという2つの遺伝子多型を同定した。SLE148名、健常人146名を対象にアレル頻度を比較したところ67Gのアレル頻度がSLEで有意に上昇していた(p=0.0302)。つぎに可溶型APRIL、BAFFをELISAにより測定する系を確立し、可溶型APRILの血中濃度がSLE患者(84.1±106.1ng/ml, mean±S.D.)では健常人(16.0±25.6ng/ml)に比較し、有意(p=0.0004)に上昇していることを初めて明らかにした。またBILAG indexを用いた解析では血清APRIL濃度はSLE患者の関節症状と関連していた(P=0.0151)。APRILおよびBAFFが今後SLEの特異的治療を行う際のターゲットになる可能性が示された。TNFファミリーに所属する分子であるAPRIL

およびBAFFはII型膜蛋白で、この2分子は高い相同性を有している。これら2分子はBCMA,TACIという2つのレセプターを共有し、これらを介してB細胞の分化や増殖に関与していると考えられている。我々はAPRILおよびBAFFの機能解析と自己免疫疾患発症への関与を検討することを研究目的とした。まずAPRILのG67R、N96Sという2つの遺伝子多型を同定し、SLE148名、健常人146名を対象にアレル頻度を比較したところ67Gのアレル頻度がSLEで有意に上昇していた(p=0.0302)。つぎに可溶型APRIL、BAFFをELISAにより測定する系を確立し、可溶型APRILの血中濃度がSLE患者では健常人に比較し、有意に上昇していることを初めて明らかにした。BAFFに関しては特異的レセプターBR3の遺伝子解析を行い、BAFF結合領域であるCystein-rich domain内に新しい遺伝子多型Pro21Arg(P21R)を同定した。膜型BAFFを介した内向きシグナルの解析を行うため、遺伝子工学的にFurin転換酵素認識部位を変異させることにより、Furin転換酵素で切断されない膜型BAFFを作成した。本研究によりSLEにおける新たな疾患感受性遺伝子としてAPRIL遺伝子が同定された。SLE患者において血清APRILおよびBAFFが上昇していることを明らかにし、B細胞刺激を介してSLEの病態形成に関与している可能性が示唆された。BR3における新たな遺伝子多型の同定や膜型BAFFの作成により自己免疫疾患におけるBAFFの役割の解析が可能になった。APRILおよびBAFFが今後自己免疫疾患の特異的治療を行う際のターゲットになる可能性が示された。
ラミニンの細胞接着部位によるがん細胞の浸潤を促進するメカニズムの解明

基底膜の主要糖蛋白質ラミニンの活性ペプチドの中でがん細胞の浸潤転移を最も強く促進するC-16(KAFDIYVRLKF)とA-13(RQVFVAYIIIKA)の2種類のレセプターの同定とこれらによるがん細胞の浸潤促進のメカニズムの解明を目的に研究を行った。A-13あるいはC-16を固定化したペプチドアフィニティーカラムクロマトグラフィ-やインテグリン抗体を用いた細胞接着の阻害実験により、A-13の細胞接着にはインテグリンαvβ3が関与していること、C-16にはβ1インテグリンとインテグリン以外のレセプターの2種類が関与していることが示唆される結果が得られた。C-16の細胞接着がヘパリンによって阻害されたことからC-16の第2のレセプターとしてシンデカンなどのプロテオグリカンが想定された。種々のシンデカン抗体を用いた実験から、C-16にはシンデカン-2が強く結合することがわかった。C-16の細胞接着にはインテグリンとシンデカンの両方が関与していることがわかり、これらのレセプターを介したがん細胞の浸潤転移に関するメカニズムの解明が今後の課題である。また、C-16のアミノ酸を一つずつアラニンに置換した10種類のペプチドをプレートにコートする方法とビーズに結合する方法で細胞接着活性を測定した。6位のThrと7位のTyrがプレートアッセイにおいて、9位のArgと11位のLysがビーズアッセイにおいて細胞接着活性に重要な働きをしていることがわかった。また、シンデカン-2の接着には6位のThrと7位のTyrと9位のArgが重要な働きをしていることがわかった。さらに、C-16の配列をスクランブルしたペプチドにC-16による細胞接着や浸潤を阻害するアンタゴニスト活性が示され、がんの浸潤転移を促進するペプチドの誘導体でアンタゴニストがデザインできる可能性が示唆された。
エンドセリン変換酵素の作用機構解析と阻害剤開発-血管合併症新規治療薬開発に向けて

成熟エンドセリン(ET-1)は中間体のbig ET-1が「エンドセリン変換酵素-1」(ECE-1)によりプロセスされて生成する。big ET-1には殆ど生物活性がないため、big ET-1からET-1への変換はET作用発現のkey stepと考えられる。本研究ではECE-1の構造・活性相関を解析、ECE-1の阻害剤開発に必須の基礎的知見を得ることを目的として以下の成績を得た。2. ECE-1の細胞内局在とbig ET-1の細胞内変換部位の同定:ECE-1の阻害剤のデザイン上、阻害剤が細胞内に入る必要性等、big ET-1の細胞内変換部位の同定は重要である。この点に関しては従来、一定の見解が得られていなかったが、本研究で、生細胞で観察可能なGreen Fluorescence Protein(GFP)とECE-1のキメラ蛋白の発現系を構築、生きた細胞でその局在と活性を観察することにより、big ET-1の変換部位が細胞内であることを突き止めた。3.ヒトECE-1 cDNAのmutagenesis法による構造・活性相関の検索:ECE-1/NEP/Kellfamilyに共通のC末触媒部位の変異で活性が消失する。さらに、C末細胞外ドメインに糖鎖を付加するAsn残基の存在が、ECE活性に必須であること、膜結合ドメインが正常の細胞内糖鎖付加プロセスに必須であることをを見い出した。エンドセリン(ET-1)は成熟個体では、血管内皮障害をきたす種々の病態の原因ないし増悪因子であることが示されている。成熟ET-1は中間体のbig ET-1が「エンドセリン変換酵素-1」(ECE-1)によりプロセスされて生成する。big ET-1には殆ど生物活性が認められないため、big ET-1からET-1への変換は生体中でのET作用発現のkey stepと考えられる。本研究では「エンドセリン変換酵素」の構造・活性相関を解析、分子設計コンピュータープログラムによるECE-1の阻害剤開発に必須の基礎的知見を得る。(1)big ET変換活性を阻害するbig ET誘導体の検索種々の構造変換を行ったbigET-1誘導体を合成し、ブタ大動脈より精製したET変換酵素(ECE)に対する阻害活性を検討した結果、有意の阻害活性(k1≒10μM)を示す2種類の誘導体を得た。さらにクローニングしたヒトECE-1βを発現ベクターに組み込みCHO-K1細胞にトランスフェクトし、その膜画分に誘導されたECE活性が上記の2種のbigET誘導体で阻害されることを確認した。(2)ヒトECE-1 cDNAのmutagenesis法による基質認識ドメインの検索成熟エンドセリン(ET-1)は中間体のbigET-1が「エンドセリン変換酵素-1」(ECE-1)によりプロセスされて生成する。bigET-1には殆ど生物活性がないため、bigET-1からET-1への変換はET作用発現のkey stepと考えられる。本研究ではECE-1の構造・活性相関を解析、分子設計コンピュータープログラムによるECE-1の阻害剤開発に必須の基礎的知見を得ることを目的として以下の成績を得た。1.bigET変換活性を阻害するbigET誘導体の検索:種々の構造変換を行ったbigET-1誘導体を合成し、ECE-1に対する阻害活性を検討した結果、[F^<21>]bigET-1(18-34)と[A^<31>]bigET-1(18-34)の2種の誘導体が有意の阻害活性を示した。興味あることに、[F^<21>]bigET-1(18-34)(Ki=20.6μM)は競合阻害、[A^<31>]bigET-1(18-34)(Ki=35.6μM)は非競合阻害を示し、ECE-1がbigET-1のP1部位とC末部位を異なった様式で認識する可能性が示唆された。

2.ECE-1の細胞内局在とbigET-1の細胞内変換部位の同定:ECE-1の阻害剤のデザイン上、阻害剤が細胞内に入る必要性等、bigET-1の細胞内変換部位の同定は重要である。この点に関しては従来、一定の見解が得られていなかったが、本研究で、生細胞で観察可能なGreen Fluorescence Protein(GFP)とECE-1のキメラ蛋白の発現系を構築、生きた細胞でその局在と活性を観察することにより、bigET-1の変換部位が細胞内であることを突き止めた。3.ヒトECE-1 cDNAのmutagenesis法による構造・活性相関の検索:ECE-1/NEP/Kellfamilyに共通のC末触媒部位の変異で活性が消失するとは当然であり、既に報告されているが、さらにECE-1独自の活性に重要な構造を同定した。この点に関しては最も重要な知見であり、さらに解析中である。
超高分解能非共焦点型スライシング顕微鏡の開発

本研究の目的は、高屈折率ガラスなどの使用によって大きな開口数の対物レンズを作り、光学顕微鏡の分解能をこれまでのものより上げて、光学的スライシングを非共焦点方式によって実現することを試験するものである。開口数の大きいレンズの製作については、オリンパス光学工業(光学機器設計部・阿部氏)の全面的協力を得て開口数1.65のものを設計し、実際にガラスの研磨とレンズの組立に成功した。数値上の規格は以下のようになった。名称:アポHR(オリンパス)、開口数:NA=1.65、倍率:100倍、適応波長域:700350nm、最適中心波長:450nm、油浸乾燥の別:油浸レンズ、油浸用オイル:カ-ギル社高屈折率オイル(n=1.78)、カバーガラス:光学研磨済み高屈折率タイプ(特製品)。これまでの開口数の最高値はNA=1.4であったのでこれを上回るレンズができた。これによる観察テストを、ビデオ顕微鏡方式を用いて、線維細胞、分泌細胞、血液細胞、腸管上皮細胞などにておこなった。画像撮影にはCCDカメラを用い、映像信号の増幅には高速画像処理装置を用いた。赤血球では膜下の細胞骨格の不均等配列による模様が見えた。血小板では細胞内顆粒と刺突起が、小腸上皮ではマイクロビライが、これまでのどのレンズによるよりも鮮明に捉えられた。実効的分解能は0.1μmに達し、本試作品は十分商品化可能と判断された。問題点としては、カバーガラスが標準品でないこと、油浸用オイルが数分のうちに着色し光透過性がやや低下すること、などがある。試作レンズの性能チェック用にもう一つ同じ規格のレンズを作ったので、これをコンデンサーレンズとしてさらに性能を改良中である。すべてのシステムが完成した段階で、ニューロンのシナプスの開口放出をリアルタイム観察する予定である。本研究では、レンズの色収差や球面収差の補正を犠牲にするというアイデアのもとに、光学顕微鏡の分解能をこれまでのものより上げることと、光学的スライシングを非共焦点方式によって達成することとを試験する。このために今年度は、(1)開口数の大きいレンズの製作、(2)2波長同時照明法による微分干渉像と蛍光像の多重観察について計画を進めた。最も根幹となる開口数の大きいレンズの製作については、オリンパス光学工業の全面的協力を得て7月から打ち合わせを繰り返した。この結果、視野中心のみをCCDカメラで撮るということから球面収差を犠牲にすることが決まり、現在可能な最高開口数の1.4を大きく越える理論開口値1.7を目標とすることとした。この段階で、カバーガラスや油浸用オイルも高屈折率のものにしなければならないことがわかり、それらの材料を探索した。その結果、ガラスは住田ガラスで、油浸用オイルは米国カーギル社の高屈折オイル(n=1.7)でよいことがわかった。このような細かい条件設定が終わり9月より設計に入った。この設計が完成したのが1月で、現在実際にレンズの研磨をしている段階となっている。これらの仕事のための費用は、設計費、謝金等で申請していたが、本学用度掛りの判断で完成したレンズを消耗品として購入することになった。この最も難しい段階を一応製作にまでこぎつけることができたので目標の半分は達成されたと考えている。今後予想される困難は、油浸用オイルが揮発性砒素化合物を含むため、レンズの組み立て(実際と同様に観察しながら職人がレンズ調節をする工程)をフード内で行わなければならないこと。顕微鏡観察にも換気における注意が必要なことなどが挙げられる。

(2)の件については2枚のダイクロイックミラーを組み合わせることにより比較的容易に実現した。好中球とクロマフィン細胞について、分泌顆粒の開口放出がキナクリン蛍光法と微分干渉法とで同時観察でき、fura-2蛍光法と微分干渉法との同時観察もできた(94年度生理学会発表予定)。光学顕微鏡の解像度は対物レンズの開口数によって決まり、現在の最高レンズでもはや限界に達したといわれてきた。しかし、高い屈折率を持つガラスの出現や、設計方針の転換によって、これを改善する道があることが分かりこの試験研究を開始した。今年度は最も大きな目標としていた、高い開口数を持つ微分干渉用対物レンズの作製をおこなった。昨年度の設計に基づきレンズの研磨、組立、調整を行い最終試作品ができあがった。数値上の規格は以下のようになった。高分解能微分干渉観察用対物レンズ名称アポHR(オリンパス)開口数NA=1.65倍率100倍適応波長域700400nm最適中心波長450nm油浸レンズ油浸用オイルカ-ギル社高屈折率オイル(n=1.78)カバーガラス高屈折率タイプ光学研磨製品(特製品)これまでの最高値であるNA=1.4を上回るレンズが完成した。これによる実際の観察テストを、ビデオ顕微鏡方式を用いて、培養ニューロン、活性化血漿板、小腸上皮細胞にておこなった。ニューロンではフィロポディア像が、血漿板では細胞内顆粒と刺突起が、小腸上皮ではマイクロビライが、これまでのどのレンズによるよりも鮮明に捉えられた。推定分解能は0.1μmに達した。残された問題点は、カバーガラスの入手が制限されていること、油浸用オイルが数分のうちに光によって着色し、光透過性がやや低下してくること、コンデンサー側の開口数も対物レンズにあわせてあげる必要があること、などである。試作レンズの性能チェック用にもう一つ同じ規格のレンズを作ってあるので、これをコンデンサーレンズとして現在改良中である。すべてのシステムが完成した段階で、ニューロンのシナプスの開口放出をリアルタイム観察する試験をおこなう予定である。本試作品は十分商品化可能と判断された。