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人工光合成反応による太陽光を用いた高酸化状態オキシ水酸化物の合成

本課題は、人工光合成反応により太陽光をエネルギー源として製造した次亜塩素酸等を用いて、有用な酸化剤であるオキシ水酸化ニッケルを生成し、太陽光エネルギーを化学エネルギーに変換して比較的安定な形で蓄積するための、基礎技術開発を行うものである。太陽光エネルギーの有効利用方法について、様々なアプローチで盛んに研究が進められているが、得られた化学エネルギーを安定に貯蔵することが大きな課題となっている。本年度の研究では、光電気化学的な人工光合成による次亜塩素酸および次亜臭素酸の生成効率を向上させるため、光電気化学セルの改良に取り組んだ。カソードとしてガス拡散層を有するPt/C電極を使用し、これまでの2室型から1室型に変更したところ、ノーバイアス(外部印加電圧なし)条件における次亜塩素酸や次亜臭素酸の生成量が大幅に増加することを見出した。また、同様の光電気化学セルを用い、電解液として海水(人工海水)を用いてたところ、光アノードに太陽光を照射するだけで次亜塩素酸や次亜臭素酸が生成することが分かった。これらの知見をもとに、1室型の光電気化学セルを用いて、電解液にNi2+を添加して光アノードに太陽光を照射し、Ni2+をNiOOHへ酸化することを試みた。カソードに電解析出されたNi種は電解液中の塩化物イオンの有無によって変化し、光アノードで塩化物イオンから生成した次亜塩素酸により、Ni2+がNi3+に酸化され、カソードにNiOOHとして析出したと考えられる。このようにして作成したNiOOH電極は、水や尿素の電解酸化に活性を示し、Ni(OH)2よりも高い性能を示すアノードとして機能することを見出した。しかし、NiOOHの定量的な分析には至らなかった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本課題は、人工光合成反応により太陽光をエネルギー源として製造した次亜塩素酸を用いて、有用な酸化剤であるオキシ水酸化ニッケルを生成し、太陽光エネルギーを化学エネルギーに変換して比較的安定な形で蓄積するための、基礎技術開発を行うものである。本年度(約6ヶ月間)の研究では、太陽光エネルギーを化学エネルギーに変換する部分(すなわち、人工光合成反応)の効率向上を重点目標として研究に取り組んだ。具体的には、電解液量5 mLのアクリル製1室セルを新規設計・製作し、カソード電極の検討により生成する次亜塩素酸濃度の増大、及び反応に必要の外部バイアスの低減に取り組んだ。その結果、これまでに比べて、次亜塩素酸の生成に必要な外部バイアスを大幅に小さくすることに成功した。また、海水(人工海水)から、ノーバイアスで(太陽光のエネルギーのみで)有用化学品を製造できることを見出した。その際、海水中の主要アニオンである塩化物イオン(Clー)の酸化生成物である次亜塩素酸だけでなく、微量に含まれる臭化物イオン(Brー)の酸化生成物である次亜臭素酸も同時に生成した。次亜臭素酸も、殺菌・消毒剤として幅広い用途で使用されている重要な化成品である。一方、大型放射光施設でのX線吸収端微細構造(XAFS)スペクトルの測定により、オキシ水酸化ニッケルの定性的な解析を試みたが、次亜塩素酸による処理前後のスペクトル変化が確認されなかった。次年度は、電気化学的な手法により定性的・定量的にオキシ水酸化ニッケルを分析し、太陽光と海水からのエネルギー変換反応によりオキシ水酸化ニッケルが生成することを明確に示すと共に、その利用性についても検討したいと考えている。本年度(約6ヶ月間)は、人工光合成反応の効率向上に重点的に取り組んだ。太陽光エネルギーを化学エネルギーに変換する反応の中核を担うものが「光電極」である。光電極自体の高性能化は、多くの研究者が抱える大きな課題であることは明らかであるが、高性能化のためのストラテジーを明確にするためにも、多くの時間を費やすことが必要となってしまう。そこで本研究課題においては、反応系全体の改良を行うことによって、効率の向上を試みた。新しく設計・製作したアクリル製の1室反応セルでは、「イオン交換膜を使用しないこと」及び「2極間が物理的に近いために液抵抗を減らせること」により、これまでと比べて、太陽光エネルギーの変換効率の向上に成功した。また、同様の理由により、反応の進行に必要な外部バイアスが大きく低減され、外部バイアスなし(太陽光エネルギーのみ)で反応が進行すること見出した。この点に関しては、対極の材料を、バルクの白金ではなく、白金ナノ粒子を炭素材料上に分散させたガス拡散電極へ変更したことも、大きく寄与したと考えている。さらに、様々な成分を含む人工海水を電解液として使用する検討も行った結果、外部バイアスなし(太陽光エネルギーのみ)で反応が進行し、電解液である人工海水中に有用化学品である次亜塩素酸が生じることを見出した。また、海水中には塩化物イオン(Clー)だけでなく臭化物イオン(Brー)も含まれているが、Brーの酸化生成物である次亜臭素酸の生成も同時に確認した。30分程度の太陽光照射により生成した次亜塩素酸と次亜臭素酸の合計濃度は、飲料水の消毒剤として用いるのに十分なものであった。その一方、オキシ水酸化ニッケルの定性的な分析は、予定通りに進行しなかった。水酸化ニッケルの最表面だけが酸化されていると考えられるため、平均情報をもたらすXAFSでは酸化前後の差を明確にできなかったと考えられる。

本課題は、人工光合成反応により太陽光をエネルギー源として製造した次亜塩素酸等を用いて、有用な酸化剤であるオキシ水酸化ニッケルを生成し、太陽光エネルギーを化学エネルギーに変換して比較的安定な形で蓄積するための、基礎技術開発を行うものである。太陽光エネルギーの有効利用方法について、様々なアプローチで盛んに研究が進められているが、得られた化学エネルギーを安定に貯蔵することが大きな課題となっている。本年度の研究では、光電気化学的な人工光合成による次亜塩素酸および次亜臭素酸の生成効率を向上させるため、光電気化学セルの改良に取り組んだ。カソードとしてガス拡散層を有するPt/C電極を使用し、これまでの2室型から1室型に変更したところ、ノーバイアス(外部印加電圧なし)条件における次亜塩素酸や次亜臭素酸の生成量が大幅に増加することを見出した。また、同様の光電気化学セルを用い、電解液として海水(人工海水)を用いてたところ、光アノードに太陽光を照射するだけで次亜塩素酸や次亜臭素酸が生成することが分かった。これらの知見をもとに、1室型の光電気化学セルを用いて、電解液にNi2+を添加して光アノードに太陽光を照射し、Ni2+をNiOOHへ酸化することを試みた。カソードに電解析出されたNi種は電解液中の塩化物イオンの有無によって変化し、光アノードで塩化物イオンから生成した次亜塩素酸により、Ni2+がNi3+に酸化され、カソードにNiOOHとして析出したと考えられる。このようにして作成したNiOOH電極は、水や尿素の電解酸化に活性を示し、Ni(OH)2よりも高い性能を示すアノードとして機能することを見出した。しかし、NiOOHの定量的な分析には至らなかった。オキシ水酸化ニッケルの定性的・定量的な分析について、XAFSやRamanスペクトルの測定といった分光学的な検討を継続すると同時に、電気化学的な分析も検討する。オキシ水酸化ニッケル(酸化体)は、水酸化ニッケル(還元体)との間で、電気的に充電・放電を繰り返す材料であることが広く知られており、酸化電流・還元電流を分析することにより、水酸化ニッケルの最表面だけに生成した酸化体についての情報も得ることができる。これまでの報告例を参考にして、化学エネルギー蓄積材料としてのオキシ水酸化ニッケルを評価できる手法を確立する。その上で、今年度の研究において確立した海水からの有用化学品生成反応(人工光合成反応)と組み合わせ、次亜塩素酸・次亜臭素酸を含む海水を連続的に注入することによるオキシ水酸化ニッケルの生成実験に取り組む。これにより、太陽光エネルギーの有効利用方法の一つとして、オキシ水酸化ニッケルへのエネルギー変換反応を示すことができると考えている。また、状況に応じて、オキシ水酸化ニッケルの応用的な利用方法についても検討することを予定している。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
南宋・張炎『詞源』楽律論の研究

中国・南宋の文人張炎の『詞源』巻上は、当時隆盛した文人歌曲である「詞」に関する楽理書である。その内容の難解さに加え、漢文で書かれた音楽理論という特殊性の故、従来その本文と図表の意味する所は充分に解読されていなかった。本研究では『詞源』各伝本の校勘、歴代の楽書及び他の分野の書籍との比較検討を通じて、『詞源』巻上各条目の音楽理論を解読し、その詳細な訳注を作成し、付録として中国古典音階一覧表を作成した。南宋・張炎の『詞源』巻上は、当時隆盛した文人歌曲「詞」の楽理面(詞楽)の専著である。13世紀における音楽理論書たる本巻は、中国学のみならず音楽史においても貴重な資料であることは言うまでもないが、残念ながら我が国では未だ本格的な研究がなされているとは言い難い。本研究の目的は、中国古典文献の研究方法を基本とし、さらに音楽学の知見を踏まえつつ、『詞源』巻上の楽律論を解読することである。本年度はまず基礎作業として、今日に伝わる『詞源』各伝本を比較して文字及び音符・図表の校勘を行った。これにより写本の系統、誤写の来歴、後の編集者による訂正などの過程が明らかになった。また些か複雑な伝本の系統を「解題」として分かりやすく整理した。さらにこれを踏まえつつ、『詞源』巻上第一条「五音相生」および第二条「陽律陰呂合声図」に対する訳注を作成した。「五音相生」では、五音音階を構成する各音程と陰陽五行思想との関連を、典故となる古典文献と照らし合わせつつ明らかにしている。「陽律陰呂合声図」では、本文の図表の意味するところを天文学的な知識と照らし合わせつつ明らかにし、また図表と本文とが合わせ示すところの音楽学的・五行思想的な意味合いを明らかにしている。また中国側の研究者の解釈も検証し、その疑問点を明らかにした。これらの成果については、解題と訳注を紀要等の雑誌に発表した。さらに音符や図表の校勘表は別途冊子を作成して、今後の研究の便に供するために公開・配布している。詞楽で用いられる音階は、絶対音高たる十二律呂と、相対的音程を示す音階たる五声七声、という二つの柱からなっており、『詞源』巻上はその思想的意義、律学的算出方法、相生順や音程順による音階相互の関連などを図を交えつつ説明している。本研究ではその難解な音階論の述べるところを儒教思想・律学的計算・図の解釈・音符の解釈など、異なる角度から明らかにし、詳細な訳注を作成した。さらにその研究結果に基づき、中国の学者による『詞源』の音階論に関する論衡を再検証し、従来定説とされてきた解釈に対して疑問を呈し、そこから、その条目一つにのみ目を置かず、『詞源』全体の論の流れに着目しつつ、そこに自然に位置づけられるべき新たな解釈を提示した。また天下の孤本たる『詞源』の元代写本二種について調査し、他の諸本との文字異同を比較し、異同表を作成し、それを通じてこれら古写本の系統・価値などを考察した。これら成果は、「張炎『詞源』巻上訳注稿(二)付異同表」と題する冊子としてまとめ、関連する研究者、全国の中国文学関係の学科を有する大学、音楽大学等に送付した。張炎『詞源』巻上は、中国南宋に於ける重要な楽律論の専著であるが、我が国ではその全編にわたる注釈や翻訳は未だ例を見ない。本研究は難解を極める『詞源』楽律論の各章について、その述べるところを解読し、詳細な訳注を作成することを目的とする。まず『詞源』歴代の各種伝本を収集し、文字の校勘、図表の比較を行い、基本となる底本を確定した。従来詳細が知られていなかった中国国家図書館所蔵明鈔本・南京図書館所蔵清鈔本について調査し、その内容を明らかに出来たことは一つの成果である。続いてこれに基づき、思想的・理念的音階論から、演奏や歌唱に関連する実用的な宮調論に至る各章について、出典の確認、本文の解読、図表の解釈を行い、従来充分に解読できていなかった記述について、その述べるところを基本的に解読することに成功した。

さらにそのデータを整理し、論文として発表し、また詳細な訳注を作成した。特に「律呂四犯」の「羽犯角・角帰本宮」の宮調命名規則を解明したこと等、いくつか新たな発見をなし得たことと自負している。同時に、これらの研究成果の閲覧を少しでも容易にするために、中国古典音階に於いて理論上成立する全ての調(宮調)を、同主調配列・平行調配列・調式別配列・三分損益順など、様々な方式で分類・配置した一覧表を作成し、訳注に別冊として付録することとした。最終年度には、『詞源』巻上の内「五音相生」「陽律陰呂合声図「律呂隔八相生図」「十二律呂」「律呂四犯」「結声正訛」の各章の訳注、及び『詞源』巻上諸本異同表、解題、抄本紹介、国家図書館(北京)所蔵『詞源』明鈔本・南京図書館所蔵『詞源』清鈔本解題を編集して報告書冊子(全211頁)を作成し、これに別冊付録「音階一覧表」を付して、音楽関係の大学図書館や研究機関に配布した。現在までに中国古典音階学の思想的・理念的基礎であるところの陰陽五行・天文暦法、及び律学的・數理的基礎であるところの三分損益生成という、最も難解な部分の訳注は完成した。当初の計画ではこれに加えてより音楽の実際面に係わる宮調・転調に係の条目も一部は訳注を作成する予定であったが、これは調査・検証のみ終わった段階である。残りの条目は互いに関連するものなので、最終年度で訳注としてまとめる予定である。24年度が最終年度であるため、記入しない。現在までの研究成果をふまえつつ、『詞源』楽律論の中心たる宮調論・転調論・音符(工尺譜)運用法に係わる残りの条目の訳注を完成させる。特に、思想や理念を離れて、より実際の音楽の創作や演奏に関連の深いこれら条目は、決して別個に独立してあるものではなく、互いに関連しつつ、内容的にも連続しつつ発展するように配置されている。訳注作成においても、それを十分考慮しつつ、各条目相互の関連がより立体的に明らかになるような訳注となるよう配慮する。また訳注作成を通じて明らかになった個別事項も別個に論文として発表する予定である。
ウイルス肝炎および肝臓癌におけるNKT細胞の役割の解明と治療応用

ナチュラルキラーT(NKT)細胞は、NK細胞マーカーとT細胞受容体(TCR)を併せもつリンパ球で、CD1分子に提示される糖脂質を認識し、自然免疫と獲得免疫を結ぶ重要な細胞でsり、多くの免疫調節作用を発揮する。しかし、ウイルス肝炎や肝癌におけるNKT細胞の役割は殆ど解明されていない。我々は先ずC型慢性肝炎(C-CH)患者の末梢血単核球(PBMC)を糖脂質であるαgalactosylceramide(αGalCer)とIL-2存在下に培養し、CH患者のNKT細胞の頻度はそのsubsetにより分布が異なるものの、糖脂質に対する反応は良好であり、インターフェロン(IFN)治療によりNKT細胞のIFN-γ産生が増加し、Th1優位になることを認めた。肝癌のNKT細胞機能も、そのsubsetにより低下を示した。肝内NKT細胞は、PBMCのそれに比べ高頻度に分布、活性化を認め肝臓での一定の役割が示唆された。C-CHでは樹状細胞機能の低下が示されているが、その対策については未解決の状況にある。上記糖脂質は、Vα24+NKT細胞を活性化し、樹状細胞の成熟を促進することが知られている。そこで、健常人の末梢血CD14+単球をGMCSF, IL-4存在下に、また同時にCD3+細胞をαGalCerとIL-2存在下にそれぞれ5日間培養後、両細胞を併せ、GMCSF, αGalCer, IL-2を添加、更に2日間培養した。その結果、従来の標準的培養法に比べ、本法では樹状細胞機能とその表現型をより強力に誘導することが分かり、治療への応用が期待された。次ぎにB型肝炎でのNKT細胞の役割をB型肝炎ウイルス(HBV)特異的細胞障害性T細胞(CTL)誘導の観点から、Balb/cマウス、同じストレインのVα14+NKT knockoutマウスおよびHBVトランスジェニック(Tg)マウスにより検討した。HBV特異的CTLは、HBs抗原免疫に加え、NKT細胞が活性化すると強力に増殖した。さらにHBs抗原に対し免疫学的寛容状態にあるHBVTgマウスにおいてもHBs抗原+αGalCerの免疫によりCTLの誘導が可能であった。CTLレベルでのtolerance breakが可能という意味で重要であり、B型肝炎の治療や発症機序の解明にも寄与するものと考えられた。ナチュラルキラーT(NKT)細胞は、NK細胞マーカーとT細胞受容体(TCR)を併せもつリンパ球で、CD1分子に提示される糖脂質を認識し、自然免疫と獲得免疫を結ぶ重要な細胞である。TCR刺激により機能的に相反するIFNγ,IL4などのサイトカイン産生や細胞障害活性を通し、多くの免疫調節作用を発揮する。しかし、C型慢性肝炎(CH)や肝癌(HCC)におけるNKT細胞の役割は殆ど解明されておらず、治療による動態を含め発現頻度とサイトカイン産生を検討した。

対象は健常人8例、CHとHCCの各10例で、CHはIFN治療前と治療2週目、HCCは治療前とRFAなどの治療後2週目の末梢血単核球(PBMC)を糖脂質であるαgalactosylseramide(αGalCer)とIL-2存在下に10日間培養し、NKT細胞の頻度と細胞内IFNγ、IL4産生をナローサイトメトリーにて測定した。CH7例では肝内リンパ球も検討した。PBMC中のCD3+Vα24+NKT細胞は、健常人では培養前1.0±1.2%が、αGalCer刺激により約10倍に増加した。CHも1.1±0.8%から約15倍増えた。IFN治療2週では培養前で平均3.4%に増加した。HCCは治療前後とも3%前後で健常人より高い傾向を示し、αGalCer刺激にも有意な反応を示した。TCR Vα24+Vβ11+NKT細胞は各群でCD3+Vα24+細胞と同様な傾向を認めた。CD3+CD56+NKT細胞は健常人の6.2±4.3%に対し、CHでは治療前後とも2%台と低値であったが、αGalCerには良好な反応を示した。HCCはαGalCerへの反応が低かった。Vα24+T細胞のIFNγ産生は各群で差はないが、IFN治療後に上昇を示した。IL4産生は健常人に比べ肝疾患群で低かった。CH患者の肝内NKT細胞は、PBMCのそれに比べ高頻度に分布し、肝内での一定の役割が示唆された。NKT細胞の主な構成細胞は、ヒトではVα24+T細胞であるが、抗原受容体やCD1d分子拘束性などが異なる細胞が含まれる。本研究でも、その多様な構成を反映する所見が示され、NKT細胞の頻度や機能の意義の解釈には慎重を要すると考えられた。ナチュラルキラーT(NKT)細胞は、NK細胞マーカーとT細胞受容体(TCR)を併せもつリンパ球で、CD1分子に提示される糖脂質を認識し、自然免疫と獲得免疫を結ぶ重要な細胞である。しかし、C型肝炎ウイルス(HCV)感染や肝癌(HCC)におけるNIT細胞の役割は殆ど解明されていない。我々は昨年度の研究において、C型慢性肝炎(CH)患者末梢血単核球(PBMC)を糖脂質であるαgalactosylse-ramide(αGalCer)とIL-2存在下に培養し、CB患者のNKT細胞の頻度はそのsubsetにより分布が異なるものの、糖脂質に対する反応は良好であり、インターフェロン(IFN)治療によりNKT細胞のIFNγ産生が増加することを示した。また、肝内NKT細胞は、PBMCのそれに比べ有意に高頻度に分布し、肝内での一定の役割が示唆された。C型CHでは、樹状細胞機能の低下が認められているが、その対策については未解決の状況にある。本年度は先ず健常人PBMCからビーズ法にて採取したCD56+NKT細胞をgranulocyte-macrophagecolo-ny-stimulating factor(GMCSF)と7日間培養することにより、HLA DR+,CD80+,CD86+で樹状細胞様の形態と健常人T細胞とのリンパ球混合培養にて、T細胞の幼若化反応を補助できる細胞が誘導できることが認められた。また、上記糖脂質は、Vα14+NKT細胞を活性化し、樹状細胞の成熟を促進することが知られている。そこで、健常人PBMCよりビーズ法にて得たCD14+細胞(単球)をGMCSF,IL-4存在下に、また同時にCD3+細胞をαGalCer、IL-2存在下にそれぞれ5日間培養後、両細胞を併せ、GMCSF,αGalCerとIL-2を添加、更に2日間培養し、樹状細胞に関連するCD
造血システムの加齢に伴うエピゲノム変化と造血器腫瘍発症の分子基盤

加齢に伴う造血幹細胞(HSC)の変化について、PRC2の活性が低下することに伴い、H3K27me3修飾が減少することが示唆されたため、PRC2のメチル化修飾活性を持つEzh2の活性を負に制御する21番目のセリンのリン酸化(S21リン酸化)について検証を行なった結果、老齢HSCではS21リン酸化が顕著に増加していることが示された。一方で、Ezh2のタンパク量に変化は見られなかった。また、S21のリン酸化酵素Aktの活性化型であるリン酸化Aktの量が、老齢HSCで顕著に増加していた。これらの変化は、より分化した造血前駆細胞では見られなかった。また、老齢HSCを若齢マウスに移植し、その変化について検証を行なったところ、移植後の老齢HSCにおいて、S21リン酸化は減少し、リン酸化Aktの量の減少も見られた。この結果から、AktによるEzh2のリン酸化はニッチ依存的に可逆的に変化する事が示された。次に、若齢および老齢のHSC、造血前駆細胞を用いたATAC-seqにより、網羅的なオープンクロマチン領域の変化について解析を行った。その結果、加齢に伴いHSC特異的に開く領域に、Nrf2結合配列が濃縮される事が明らかになった。そこで、Nrf2のタンパク量を免疫染色により調べたところ、老齢HSCにおいて有意に増加している事が示された事から、何らかのシグナルによりNrf2が安定化し、Nrf2/Keap1経路が活性化している事が示された。今後、Ezh2 S21A、S21D変異体によるHSCの影響や、Keap1 KOによる恒常的Nrf2活性化状態におけるHSCの変化について検証を行う。加齢に伴う造血幹細胞の変化について、これまでに得られている結果を裏付け、更にその分子機構に関わる興味深い知見が蓄積し、一部計画と異なるところがあるが、発展させていく中で当初の疑問を明らかにし、更に新たな知見が得られる事が予想される。当初の計画を推進するとともに、ATAC-seqによりこれまでに報告のない様々な変化についての情報が得られたことから、これらの結果も合わせて解析していく事で、加齢に伴う造血幹細胞の変化についての包括的な理解が得られるよう研究を進めていく。
腸管上皮M細胞のプリオン蛋白取り込みに関わる分子構成と発現調節機構の解明

腸管上皮M細胞のプリオン蛋白に親和性がある膜蛋白を同定する目的で、M細胞に分化したウシ腸管上皮細胞にプリオン蛋白結合磁気ビーズを添加し、磁気ビーズを取り込んだ細胞内小胞を回収した。2次元電気泳動後、解糖系酵素アルドラーゼAをLC-MS/MS解析により同定した。アルドラーゼAは、異常プリオン蛋白の取り込みに関わる回腸パイエル板M細胞および鼻腔咽頭上皮の管腔側に局在し、プリオン蛋白に親和性があることを発見した。本研究課題は、経口摂取プリオン蛋白の腸管M細胞を介した侵入機構の解明を目的とする。申請者は、世界に先駆けてウシおよびマウスの腸管上皮細胞株の樹立に成功し、これらの腸管上皮細胞株とリンパ球との共培養を行うことにより、蛍光ビーズを取り込んで腸管上皮細胞の下部ヘトランスサイトーシスを行うM細胞分化誘導系を既に確立している。開発したM細胞分化誘導系と磁気ビーズ蛋白捕捉法を用いて、腸管上皮M細胞のプリオン蛋白取り込みに関わる膜輸送蛋白複合体トランスポートゾームライブラリーを構築し、本研究終了時までにはM細胞のプリオン蛋白取り込みに関わる蛋白の同定と発現調節機構の解明を試みるものである。本年度は、当研究室で確立したM細胞分化誘導系と磁気ビーズ結合蛋白質補足法を用いてM細胞のPrP取り込みに関わる膜蛋白の同定を試みた。【方法】ウシPrP(25-242)にHis-tagを付加した発現ベクターを大腸菌に導入して大量培養を行い、発現誘導後に可溶性蛋白をNiカラムに吸着させ、refoldingを行った後に精製した。また、精製したウシPrPとIgAが磁気ビーズ1個当たりそれぞれ3.14amoleあるいは1.56amole結合した磁気ビーズを作製した。ウシ腸管上皮細胞株をM細胞に分化誘導させ、ウシPrPおよびIgA結合磁気ビーズを添加して9時間後に細胞内にある磁気ビーズを含む小胞を磁気スタンドにより回収した。回収した蛋白質は、2次元電気泳動後に、スポット解析を行った。【結果】回収した小胞では、ウシPrPおよびIgAだけにしか見られない数個のスポットを確認した。また、小胞のビーズ非吸着蛋白中にウシPrPおよびIgAに結合する膜蛋白が存在することを確認した。以上より、ウシPrPあるいはIgAに特異的に結合する膜蛋白が存在し、これらが取り込みに関わることが示唆された。世界に先駆けて樹立に成功したウシおよびマウスの腸管上皮細胞株のM細胞分化誘導系と磁気ビーズ蛋白捕捉法を用いて、腸管上皮M細胞のプリオン蛋白取り込みに関わる膜輸送蛋白複合体トランスポートゾームライブラリーを構築し、M細胞のプリオン蛋白取り込みに関わる蛋白の同定と発現調節機構の解明を試みるものである。本年度は、M細胞に分化誘導したウシ腸管上皮細胞がプリオン蛋白結合磁気ビーズを取り込んだ細胞内小胞を回収し、2次元スポット解析およびLC-MS/MS解析を行った。【方法】組み換え型ウシPrPを精製し、1個当たり3.14amole結合した磁気ビーズを作製した。ウシ腸管上皮細胞株をM細胞に分化誘導させ、磁気ビーズあるいはウシPrP結合磁気ビーズを添加して9時間の培養を行い、細胞内に磁気ビーズ取り込ませた。磁気ビーズを含有する細胞内小胞は、磁気スタンドを用いて回収し、2次元電気泳動を行い、特異的に発現しているスポットを切り出してLC-MS/MS解析による蛋白同定を行い、組織における発現を解析した。【結果】M細胞に分化したBIE細胞より回収した蛋白で、磁気ビーズのみの対象区と比較してウシPrP結合磁気ビーズ添加区において強く発現している5個の蛋白スポットを確認した。分子量40kDaのスポットに着目し、LC-MS/MS解析によりaldolase Aであることが判明した。aldolase Aはウシ空腸上皮には発現が確認されなかったが、回腸バイエル板濾胞随伴上皮(FAE)で発現していた。回腸のaldolase A陽性細胞は、ウシ腸管M細胞マーカーのサイトケラチン18と共染色されたことにより、M細胞であることが判明した。aldolase Aは糖質を分解する機能を有し、脳神経組織や小腸に発現していることが報告されている。また、類似したAldolase Cがプリオン蛋白に親和性があることが報告されでいることから、aldolase Aは腸管上皮M細胞のプリオン蛋白取り込みに関わる膜蛋白である可能性が考えられた。世界に先駆けて樹立に成功したウシおよびマウスの腸管上皮細胞株のM細胞分化誘導系と磁気ビーズ蛋白捕捉法を用いて、腸管上皮M細胞のプリオン蛋白取り込みに関わる膜輸送蛋白複合体

トランスポートゾームライブラリーを構築し、M細胞のプリオン蛋白取り込みに関わる蛋白の同定と発現調節機構の解明を試みるものである。我々は、M細胞に分化誘導したウシ腸管上皮細胞がプリオン蛋白結合磁気ビーズを取り込んだ細胞内小胞を回収し、解糖系酵素aldolase Aの同定したに成功した。本年度は、aldolase Aの細胞における存在様式およびプリオン蛋白との親和性を明らかにすることを試みた。【方法】組み換え型ウシPrPを精製した。ウシ腸管上皮細胞株をM細胞に分化誘導させ、抗aldolase A抗体を用いた免疫染色を行った。aldolase Aとプリオン蛋白との親和性は、アルドラーゼA発現が確認されている樹立したウシ神経前駆細胞株より抽出した蛋白をSDS-PAGE後にメンブランへ転写し、プリオン蛋白を処理してその結合性を判定するFar Western Blot解析を行った。【結果】BIE細胞はaldolase Aを発現し、M細胞に分誘導することによりその発現が増加した。また、aldolaseAはBIE細胞の頂端側に染色された。Aldolase Aはプリオン蛋白と結合し、その結合はメンブラン転写後に抗aldolaseA抗体で処理することにより特異的に阻害されることが、Far Western Blot解析より明らかとなった。以上より、ウシ腸管M細胞に特異的に発現するaldolaseAは、プリオン蛋白に特異的な親和性を有することが判明し、経口摂取した異状プリオン蛋白の腸管における侵入機構に関わっている可能性が示された。
吸放熱スイッチング機能を有する宇宙自律熱制御ループシステムの研究

本研究の目的は,惑星探査機や月面着陸機などの次世代宇宙ミッションで想定される複雑な熱環境変動に対して,電力を用いることなくパッシブに対応できる「自律熱制御ループシステム」を提案し,「高温時の排熱」と「低温時の保温」を同時に成立させる新しい熱制御技術を確立することである。一年次は主要部となるマルチエバポレータ型ループヒートパイプならびに展開吸放熱パドルの要素研究を中心に行った。マルチエバポレータ型ループヒートパイプに関してはNASA/GSFCと共同研究を実施し,チタンウィック・アンモニア冷媒およびニッケルウィック・水冷媒からなるマルチエバポレータ型ループヒートパイプの設計ならびに流動特性評価を行った。エバポレータ形状より必要な作動流体封入量と配管容積を明らかにし,予想される毛細管力限界と飽和温度の関係から最適と判断されるリザーバ形状と配管形状を決定し製作を行った。また,毛細管力限界とその重力方向依存性について実験的に明らかにするとともに解析的な整合性評価を行った。さらに,マルチエバポレータの起動特性に関して,これまで明らかになっていなかった蒸発部内部の気液二相状態の分布の違いに伴う特性変化を実験的に明らかにした。並行して,日本においてもループヒートパイプ評価システムを新たに構築し,100W級ループヒートパイプの起動特性と重力依存性ならびにリザーバの加熱冷却による伝熱流動制御(熱コンダクタンス制御)について実験的に検証した。また,放熱部として,単結晶形状記憶合金,グラファイトシート,ポリイミドフォーム断熱材から構成され,自律的に宇宙空間への排熱量調整を行う可逆展開吸放熱パドルの要素を試作し,恒温槽ならびに宇宙環境を模擬した真空チェンバを用いて吸熱・放熱・保温特性評価を行い,優れた自己排熱調整機能を実証した。
住民との協調に基づく安全な住環境づくりのための街灯整備指標の開発

夜間の道路照度は住宅地の安全性を左右する重要な要因である。5箇所の住宅地において、住民が参加して10m間隔で夜間の道路照度を実測するとともに、各点における明るさ・暗さの主観評価を行った。そのデータを用いてヒストグラム分析を行い、街灯照度指標を検討した。次に、2箇所の住宅地の自治会においてケーススタディを行い、地区内の道路に対する住民の利用度や不安感に関するアンケートの回答結果と、地区内の全道路における10m間隔の道路照度の実測データから、早急に街灯を改善すべき地点を抽出する方法を検討した。1.夜間道路照度は地区の安全性を左右する重要な要因であり、その照度を担う街灯の改善に対する住民のニーズは高い。そこで、本研究は、各地区の街灯仕様データ、夜間道路照度実測データ、住民アンケートデータを総合的に分析することにより、住民主導の安全な住環境づくりに役立つ住民が使いやすい街灯照度指標を開発することを目的とする。2.街灯整備指標を検討するための第一歩として、これまでのケーススタディで得られたデータを解析した。まず、各地区における街灯仕様データを整理した。次に、街灯仕様データを用いた街灯整備指標を検討した。そのうち「道路延長距離1m当たりのワット数」は、道路延長、街灯ワット数総計とも算出が容易であり、街灯整備指標として適切と考えられた。次に、夜間における道路の照度実測データの整理を行った。水平面照度を10m間隔で実測したデータから夜間道路平均照度を算出した。一方、住民アンケートによる地区全体の道路の明るさに対する意識データを整理した。3.上記の「道路延長距離1m当たりのワット数」と「夜間道路平均照度」「地区全体の道路の明るさに対する意識データ」について相関分析を行ったところ、きわめて高い相関が見られた。この結果から、「道路延長距離1m当たりのワット数」は、夜間道路平均照度と住民の明るさ感を推定できる街灯整備指標としてきわめて有効であることを見出した。4.街灯整備を行うためには、住民が自ら夜間の道路の照度を実測してデータを収集することはきわめて有効である。そこで、そうした活動を可能とする「手引き」を試作した。2.現在、夜間照度は日本防犯設備協会が定めている推奨照度を用いており、防犯灯メーカーや自治体において照度基準として使用されている。しかし、筆者らによるこれまでの研究成果によると、実際に推奨照度を満たしている地区はきわめて少ない。そこで、過去に住民が参加して道路の夜間照度実測と明るさ・暗さの主観評価を行った5地区のデータを分析した。その結果、明るさ・暗さに関する住民の主観評価が中立となる状態では歩行者の安全性に問題がないと考え、ヒストグラム分析により「どちらでもない(中立)」「明るい」と評価した地点の54%に当る2.51xを日本防犯設備協会が定めるクラスAの51xに代わる推奨照度とし、かつ、住民の主観評価が中立となる地点の50%に当る1.51xを日本防犯設備協会が定めるクラスBの31xに代わる推奨照度とすることを提案した。4.マレーシア・クアラルンプールの住宅地において街灯照度を実測したデータの分析において上記の知見を適用し照度の適否判定を試みた。5.研究の推進に当り、住民へのアンケート実施においては回答者の人権やプライバシー保護に十分留意した。そこで、本研究は各地区の街灯仕様データ、夜間道路照度実測データ、住民アンケートデータを分析することにより住民主導の安全な住環境づくりに役立つ住民が使いやすい街灯照度指標を開発することを目的とする。2.前々年度と前年度の研究成果を検証するため、第2次ケーススタディを実施することとした。対象となる自治会の選定に当っては、埼玉県・東京都の自治会長にケーススタディ実施の案内を送付し、参加の要望があった自治会長のうち、K自治会(埼玉県川越市)とM自治会(埼玉県川口市)を対象地区として選定した。3. K自治会地区、M自治会地区において第3次ケーススタディとして、(1)全住民への活動の周知、(2)地区の全世帯対象とするアンケートの実施、(3)自治会住民との共同による夜間道路照度の実測、(4)実測参加住民による明るさ感の主観評価、(5)街灯整備レベルの判定、(6)今後の街灯整備に関する住民との話合い、を実施した。

4.地区の全世帯対象のアンケートで得られた「よく利用する道路」「不安に思う道路」の回答結果と、地区内の全道路における10m間隔の各地点の道路照度の実測データ及び住民による主観評価を加味し、夜間の明るさに問題のあり早急に街灯を新設または改善すべき地点を抽出する方法を検討した。5.地区内の全地点にランク付けを行った。現状維持で良い地点をAランク、改善の余地ありの地点をBランク、改善した方が良い地点をCランク、即座に改善すべき地点をDランクとした。両地区とも住民にこれらの研究成果を報告し、今後地方自治体との連携のもと街灯の改善を進めることを住民が決定した。6.最後に3年にわたる研究のまとめを行った。研究の推進に当り、住民へのアンケート実施においては回答者の人権やプライバシー保護に十分留意した。
神経原性角化異常症の病態解明と疾患概念の確立

メルケル細胞はヒト皮膚神経系を構成する重要な細胞のひとつである。この細胞は表皮基底に存在し、機械的刺激の受容にかかわる細胞であると多年にわたり信じられてきた。しかしながら、近年毛包膨大部に不整形のメルケル細胞が多数存在することが分かってきた。そこでメルケル細胞の神経原性角化異常へのかかわりを検討するため、ヒトの正常ならびに病的皮膚でメルケル細胞ならびに神経を、抗サイトケラチン20モノクローナル抗体ならびに抗PGP9.5ポリクローナル抗体を用い、免疫組織化学と電子顕微鏡を使って研究した。まず神経終末がメルケル細胞に付着するか否かを、免疫組織化学を用いヒトの種々の部位で検索した。結果として、表皮ではメルケル細胞のことごとくは卵円形で、三日月状の膨らんだ神経終末が付着している。一方毛包膨大部では、メルケル細胞は細胞質突起を突出して樹状細胞の形を呈する。一方神経終末の付着は殆ど認められない。これらのデータに基づき、メルケル細胞の多形態性の存在が本研究で明らかにされた。表皮に存在するメルケル細胞の約95%は卵円形を呈するが、毛包膨大部のメルケル細胞の多くは樹状である。とくに顔面では約30%が、また頭部では約20%が樹状である。メルケル細胞に付着する神経については、表皮では半月状の経終末が付着するが、毛包膨大部では神経終末の付着はほとんど認められない。これらのデータに基づけば、膨大部の樹状メルケル細胞の機能は、表皮の卵円形メルケル細胞のそれとは異なることが示唆される。また毛包近傍や表皮下には球形の真皮メルケル細胞がしばしば認められた。メルケル細胞が樹状メルケル細胞(未熟あるいは未分化な)から発達し表皮に供給される可能性、そして真皮メルケル細胞はその途上にある細胞である可能性が推測された。さらに樹状メルケル細胞は感覚受容とは異なる機能を司ると示唆される。メルケル細胞は角化を促進するある種の内分泌物質を放出している可能性を考えるに至った。基底細胞癌、毛包芽腫(trichoblastoma),毛包上皮腫,外毛根鞘嚢腫,外毛根鞘腫などの、毛包に関連した腫瘍組織で、メルケル細胞と神経とを検討した。毛包芽腫の腫瘍塊周縁部には多数の樹状メルケル細胞が認められたが、基底細胞癌ではメルケル細胞は観察されなかった。メルケル細胞の存在は、毛包角化を来たす腫瘍の確実性のある指標となることが考えられる。今後の研究が期待される。平成13年度は、毛包間上皮性良性腫瘍、毛包系腫瘍、脂腺母斑、毛芽腫などを中心に、メルケル細胞ならびに神経線維のこれら腫瘍へのかかわりを検討した。ルチンにはヘマトキシリン・エオジン染色、メラニン染色などを行った。

メルケル細胞の検出・同定にはサイトケラチン20モノクローナル抗体を、神経線維の観察にはPGP9.5モノクローナル抗体をそれぞれ用いて免疫組織化学的に検討した。サイトケラチン20によるメルケル細胞の観察には、発色に際しニッケルを用いた方法が優れていた。検索の結果は、脂腺母斑では、正常表皮に比して25倍のメルケル細胞が存在することがわかった。現在は増生しているメルケル細胞を電子顕微鏡で観察する方向に研究を進めている。いずれにせよ毛包あるいは脂腺への分化を示す腫瘍(母斑)において、メルケル細胞の増生が見られたこと、その一方で外毛根鞘性の腫瘍や嚢腫ではメルケル細胞細胞の増生が認められなかったこと、などは本研究を進める上で大きな収穫であった。次年度さらに鋭意本研究を進めて行きたい。平成14年度は、皮膚の角化性腫瘍における1)メルケル細胞の存在と2)メルケル細胞に随伴する神経線維につき検討した。試料は皮膚生検し得た各種角化性皮膚疾患につき、ルチン染色であるH&E染色とともに、メルケル細胞をサイトケラチン20、神経線維をPGP9.5,ランゲルハンス細胞をS100プロテインによる免疫染色で検討した。その結果、正常部皮膚では、表皮では球形のメルケル細胞が表皮突起先端に孤立散在性に認められ、神経線維の付着も認められた。一方、毛包ではメルケル細胞は膨大部に集簇し樹状細胞として認められる。神経線維の付着は不明瞭である。腫瘍群では毛包系腫瘍に樹状突起を伸ばしたメルケル細胞が集簇して認められるが、メルケル細胞への神経の付着ははっきりしない。ランゲルハンス細胞とメルケル細胞、神経線維との関係については、相関性がはっきりしなかった。これらの結果を踏まえて考察すると、1)表皮のメルケル細胞(サイトケラチン20陽性細胞)と毛包のそれとは、機能面で異なる可能性が推測される。たとえば前者は知覚受容細胞として、後者は神経分泌細胞として機能するなどの可能性である。2)神経原性の角化異常症は、神経線維それ自体の分泌刺激によるのか、メルケル細胞由来の神経内分泌物質を介して生じ、増殖するのかなどの問題点が生じてきた。当該年度は、主として1)表皮、毛包におけるメルケル細胞と神経のinteraction,ならびに2)メルケル細胞のpolymorphismとその意義、3)皮膚疾患におけるメルケル細胞の3点につき研究を進めた。まず表皮、毛包におけるメルケル細胞と神経の関連性については、ヒトの皮膚で免疫組織化学、共焦点レーザー顕微鏡を用い研究した。その結果、表皮基底に存在するメルケル細胞には、ほぼすべてに神経線維の付着が認められた。一方、毛包のメルケル細胞については、神経の付着はほとんど認められなかった。一見付着しているような所見も観察されたが、共焦点レーザー顕微鏡で試料の角度を傾斜して観察すると神経線維のメルケル細胞への付着は見られなかった。次に、メルケル細胞の形態のpolymorphismにつき検討を行った。ヒト皮膚を用い免疫組織化学的手法で観察した。メルケル細胞はCK20で、神経はPGP9.5で検出した。その結果、メルケル細胞は表皮では基底に存在し、球形または類円形を呈することが多いが、小数ながら細長い細胞質を1側に突出したtadpole型あるいは両側に突出したbipolar型も認められた。毛包では、メルケル細胞は毛包のbulge areaに集簇して観察された。毛包では、約30%のメルケル細胞はtadpole型またはbipolar型を呈し多形性の存在が確認された。
哺乳類体細胞分裂期における核膜再構築機構の解析

分裂期Hela細胞の抽出液をいくつかの画分に分画し、それらを抗原として抗核膜抗体を調製したところ、核膜孔を認識するモノクローナル抗体(MY95)が得られた。核膜孔には核膜孔複合体(NPC)と呼ばれる分子量約125MDa、100種類以上の蛋白質からなる巨大な複合体が存在し、これが核膜孔における物質輸送を制御している。細胞分裂期には核膜の崩壊とともにNPCも崩壊し分裂間期に向かう過程で再構築される。NPCの崩壊と再構築が正しく行われなければ細胞は致死となるので、この崩壊、再構築には精巧な制御機構が存在すると考えられる。哺乳類体細胞分裂期における核膜再構築機構の解析をNPCの崩壊と再構築の解析という観点から行った。NPCは100種類以上の蛋白質からなる複合体だがMY95は主としてそのうちの三種類の蛋白質を認識した。次にこの抗体を用いて分裂期における核膜孔複合体の存在様式を明らかにするため分裂期細胞抽出液をゲル濾過法で分画して解析した。その結果、これらの蛋白質を含む分子量400kDa以上のサブコンプレックスが少なくとも三種類存在することが明らかとなった。各サブコンプレックス構成蛋白質のうち、いくつかをイオン交換カラム、ゲル濾過カラム、電気泳動法で完全精製し、アミノ酸配列の決定を行っている。今回得られた結果により細胞分裂期におけるNPCの存在様式を把握でき、これは今後NPCの崩壊、再構築機構を解析する上での基礎データとして重要なものである。
尿を検体とする内臓リーシュマニア症の免疫診断法の開発とバングラデシュにおける野外応用

(1)内臓リーシュマニア症免疫診断法の開発血液の代わりに尿を検体とする「尿」免疫診断法を開発している。これまでに特異的IgG抗体を検出するELISA法、直接凝集法(DAT)を完成させ、バングラデシュで野外調査に応用した。また、尿中の抗原を検出するELISA法も開発した。サンプル採取が容易なため人々の協力が得られやすく疫学調査に非常に有用であることが示された。平成17年度はさらに2種類の新しい診断法を開発した。*新しい組み換えタンパクを用いた尿ELISA法rKRP42蛋白を作成しELISA法に応用した。この診断法は特異的IgGを検出するもので、感度は94.3%で従来法とほぼ等しいが、特異性が高く99.6%に達する。現在は、主としてこのELISA法を用いて野外調査が行われている。*抗体結合プレートを用いた凝集法非常に有望な尿診断法で、感度・特異性が高く、肉眼で陽性、陰性を判定できる。検査設備のない流行地での応用が可能である。現在、バングラデシュのラジシャヒ大学医学部で試用されており良好な結果を得ている。(2)患者の早期発見にむけた尿診断法の利用ラジシャヒのノバイボッタラ村では、H.17年3月に尿抗体陽性者が29名いたが、7月の再訪問時にはそのうちの14人(48.3%)が発症していた。一方、3月の尿抗体陰性者178人では2名(1.1%)のみが発症した。内臓リーシュマニア症の早期発見に結びつく所見と考えている。また、尿抗体陽性であったにもかかわらず発症しなかった人々の免疫学的背景を探ることは重要である。平成18年3月にノバイボッタラ村、Modhu Math村をおとずれ尿サンプル863検体を採取した。内臓リーシュマニア症は死亡率が高く重篤な疾患であるがインドやバングラデシュなどの田舎に分布が限られていること、良い治療法が無いことなどにより長く無視されてきた感がある。我々は、流行地で応用できる簡便な免疫診断法の開発を目標に研究を続けており、特に尿を検体とするする診断法に力を注いでいる。2003年12月にバングラデシュ、ラジシャヒにおいて血液及び尿検体、約900サンプルを採取した。これらを用い、我々が開発した尿を用いるELISA、尿による直接凝集法(機器を要しないので途上国における応用が可能)、さらに今回新しく開発したレコンビナント蛋白rK39-like proteinを用いたELISAなども検討した。これらの診断法は(すでに市販されている製品も含めて)実験室レベルでは良好な結果が得られるものの、野外応用では必ずしも満足できない結果が得られた。流行地では、陰性/陽性の境界域にあるサンプルが多いためと考えられる。今後さらに改良する必要がある。我々は既に、尿中抗体と強く反応するリーシュマニア虫体成分calreticulinを同定した。この大量発現のために様々な実験を重ねているが満足な結果は得られていない。最近calreticulin分子を切断し、幾つかのタンパク質を得ることが出来たので、それらの抗原性を検討中である。プロマスチゴート抗原に対して作製された抗体を用いて尿中の抗原を検出するantigen capture ELISAが開発された。感度89.0%、特異性95.1%が得られている。野外応用の準備が進行中である(2005年3月にラジシャヒ訪問の予定)。
ヒスタミン値の過眠症での感受性、特異性の確認と、反復性過眠症の原因検索

髄液ヒスタミン値が過眠症状に依存性に低値であることが明らかになった。コントロ-ルに比べて、HLA-DR2陽性で脱力発作のあるオレキシンが低値のナルコレプシ-だけではなく、オレキシン値は正常である特発性過眠症、DR2陰性や脱力発作のないナルコレプシ-でもヒスタミン値は有意に低値であった。しかしながら、リタリン等の中枢神経刺激薬を内服している症例では、対照群との有意差は認められなかった。ナルコレプシ-ではリタリンの内服の有無にて、オレキシン値に変化はないが、ヒスタミン値に関しては、高値になる傾向がみられた。ヒスタミン値は、睡眠時無呼吸症では対照群と同等な値であった。(1)過眠症状に対する髄液ヒスタミン値の状態感受性、状態特異性を確認すること。(2)Kleine-Levin症候群で視床下部ペプチドの測定。(1)ヒスタミン神経系はオレキシン神経系の下位にあり、睡眠の実行系と考えられている。過眠症で髄液中のヒスタミン値を測定したところ、ナルコレプシーと特発性過眠症は、同様に対照群に比べて共に低値であった。ナルコレプシーではリタリンの内服の有無にて、オレキシン値に変化はないが、ヒスタミン値に関しては、高値になる傾向がみられた。(2)Kleine-Levin症候群(反復性過眠症)は思春期に好発し、数日間から2週間程度傾眠状態が続き、病相間歇期には全く平常に戻る疾患である。脳血管関門が欠如しているので感染等の影響を受けやすい視床下部の内側底部の弓状核のαMSHが障害されると活動量は低下し、摂食は亢進することになり、Kleine-Levin症候群の表現型に一致している。故に同疾患における視床下部ペプチドの測定を行った。結果としは髄液オレキシンは正常値であり、メラノコルチン系(αMSH、AgRP等がライガンド)については、αMSHは測定出来ず、AgRPも対照群と同様の値であった。一方で神経性食指不振症ではAgRPは高値であった。次年度は視床下部の別の神経ペプチド(MCH,NMU,NMS等)を測定する計画である。ヒスタミン値は、睡眠時無呼吸症では対照群と同等な値であった(Kanbayashi,Sleep2009)。(2) Kleine-Levin症候群(反復性過眠症)は思春期に好発し、数日間から2週間程度傾眠状態が続き、病相間歇期には全く平常に戻る疾患である。今後は視床下部の別の神経ペプチド(MCH,NMU,NMS等)を測定する計画である。
TYLCVのゲノム複製における宿主RPA-ウイルス間相互作用の機能解明

トマトのタンパク質SlRPA1(replication protein A、70kDサブユニット)とトマト黄化葉巻病の原因ウイルスTYLCVとの相互作用に必要なSlRPA1のアミノ酸残基を明らかにした。相互作用能を喪失した変異型SlRPA1をトマトで発現させると、TYLCVの増殖抑制が観察された。通常SlRPA1は細胞内の小器官に局在するが、TYLCVのタンパク質の一つであるrepが共存すると、C3が局在する核へと局在性が変化することが分かった。これらの結果から、SlRPA1はTYLCVの感染時に核に移行してC3と相互作用し、共同してTYLCVの複製プロセスに関与する可能性が示唆された。SlRPA1とTYLCVのC3タンパク質との相互作用に必要とされるSlRPA1のN末端110アミノ酸の範囲にerror-prone PCRにより変異を導入し、SlRPA1のmutant libraryを作製した。酵母Two-Hybrid系に基づいた相互作用検出系を利用して作製したmutant libraryを供試して、C3タンパク質との相互作用能を欠失した変異型SlRPA1タンパク質を検索した。その結果、1アミノ酸置換で相互作用を欠失する変異3種、2アミノ酸置換で相互作用を欠失する変異9種、3アミノ酸置換で相互作用を欠失する変異6種が確認された。SlRPA1の野生型および前述で作出した変異型SlRPA1、およびN末端、C末端からの部分欠損SlRPA1を過剰発現するコンストラクト、SlRPA1のORFを標的とするRNAiコンストラクト、SlRPA1およびC3と蛍光タンパク質との融合タンパク質を過剰発現するコンストラクトを構築した。これらのバイナリープラスミドをアグロバクテリウムに導入し、組換えアグロバクテリウムをトマト培養細胞237-7に感染させ、カナマイシンを含む選択培地上で選抜・継代することにより組換え培養細胞系統を得た。(1)SlRPA1遺伝子について改変を行った遺伝子組換えトマト培養細胞系統のTYLCV増殖評価平成25年度に作出したstableな遺伝子組換えトマト培養細胞系統(SlRPA1の過剰発現コンストラクト導入、SlRPA1のRNAiコンストラクト導入、相互作用能欠失変異SlRPA1の過剰発現コンストラクト導入)を供試して、SlRPA1の発現量の増減や、ウイルスタンパク質C3との相互作用の有無がウイルス増殖に与える影響を評価した。TYLCVの接種は感染性クローン(TYLCV-Mld系統、焼津株)を保持したアグロバクテリウムを培養細胞と共存培養・感染させることにより接種した。接種後、経時的にウイルスDNA量をリアルタイムPCRにより定量しウイルス増殖量を評価した。いずれの遺伝子組換え培養細胞系統においても、接種後ウイルスの増殖が観察されたが、導入コンストラクトがウイルス増殖に与える再現性のある影響を認めることはできなかった。(2)SlRPA1遺伝子について改変を行った遺伝子組換えトマトの作出SlRPA1の発現量の増減およびC3タンパク質との相互作用の有無が植物体内におけるウイルス増殖に与える影響を評価するために、SlRPA1遺伝子について改変を行った遺伝子組換えトマトを作出した。野生型および相互作用欠失変異型のSlRPA1の過剰発現コンストラクトおよびSlRPA1を標的としたRNAiコンストラクトを、アグロバクテリウムを用いたリーフディスク法により罹病性トマト「秋玉」に導入した。野生型SlRPA1の過剰発現コンストラクト、RNAiコンストラクトについて、遺伝子組換え再生シュートを得た。相互作用欠失変異型のSlRPA1の過剰発現コンストラクトについては、現在形質転換体の作出途中である。TYLCVのC3タンパク質と相互作用するトマトの宿主タンパク質として単離されたSlRPA1(replication protein A、70kDサブユニット)について、デリーション解析により、N末端の110アミノ酸がC3タンパク質との相互作用に必要な領域であることを明らかにし、さらに変異ライブラリーの検索により、相互作用能を欠失させる3つのアミノ酸変異を同定した。SlRPA1とC3タンパク質の相互作用がTYLCV感染応答に与える影響を明らかにするために、SlRPA1の野生型および各種変異型タンパク質(SlRPA1のN末110アミノ酸残基のみ、R47L、G61E、M62K)過剰発現コンストラクト、SlRPA1を標的としたRNAiコンストラクトを構築、トマト培養細胞に導入し、遺伝子組換え培養細胞系統を作出した。作出した細胞系統に対して、TYLCVを感染性クローン接種により導入し、TYLCVの増殖に与える導入遺伝子の影響を調査したが、有意な影響を観察することはできなかった。さらにSlRPA1遺伝子についての改変コンストラクト群がトマト植物体レベルで与える影響を調査するために、これらのコンストラクトを罹病性トマトに導入した各種遺伝子組換えトマトを作出した。27年度には、SlRPA1について改変した各種遺伝子組換えトマトにTYLCVを接種し、ウイルス増殖量および病徴発現程度を評価した。その結果、野生型の過剰発現コンストラクト、RNAiコンストラクトを導入した組換えトマトでは、罹病性トマトと同様にウイルスが増殖し、病徴も現れ、感染応答反応に大きな変化は観察されなかった。一方、変異型のSlRPA1タンパク質を導入した組換えトマトでは、R47L変異SlRPA1を導入した組換えトマトにおいて、ウイルス増殖の抑制が観察された。R47L変異はC3タンパク質との相互作用を消失させる変異であり、C3タンパク質と相互作用できない変異型のSlRPA1が共存することにより、TYLCVの増殖が抑制される可能性が示唆された。