hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腸管細胞での異物応答に関わるトランスポーターの分子機構と食品因子による調節

本研究では、小腸上皮細胞層における生体異物の透過性制御機構を、異物排出と異物処理に関与するトランスポーターの視点から検討することとした。トランスポーターとしては、異物排出に関わるトランスポーターであるP-glycoprotein(P-gp)と各種細胞毒性に対して防御的に働くと言われているタウリンの輸送に関わるタウリントランスポーター(Tau-TP)に着目し、その腸管上皮細胞における機能の解析、調節機構、調節因子(食品因子等)を培養細胞レベルで検討した。まず、P-gpやTau-TPの活性発現を見るのに最も適した細胞としてヒト腸管上皮細胞株Caco-2の培養系を構築し、それらの輸送活性を測定する手法について確立した。次いで、実際にP-gpやTau-TPの活性が生体異物や食品成分によって受ける影響について検討した。異物に対するP-gpの応答性を検討したところ、内分泌攪乱作用が指摘されているトリブチルスズ(TBT)によってP-gpの発現が上昇すること、それには転写レベルでの発現亢進が関わっていることを明らかにした。TAUTの活性は、浸透圧ストレスやサイトカイン刺激によって顕著に上昇するが、ダイオキシン、TBTなどの化学物質による有意な変化は認められなかった。一方、P-gpを長期的あるいは短期的に活性化または阻害する食品成分を動植物食品素材の抽出物中に検索した結果、短期的効果については、ニガウリなど数種の野菜抽出液中にP-gpの活性を抑制する活性を見出した。精製したその活性成分を同定し、現在その作用機構や構造相関について検討している。また、各種ストレスに応答して細胞内へのタウリン取り込みを活性化するTau-TPは、ゴマ抽出物によって活性が抑制されたが、その阻害因子はリゾレシチンであった。この作用機構についても明らかにした。1.ヒト腸管上皮細胞Caco-2中の異物応答に関わると考えられるトランスポーターとしてタウリントランスポーター(TAUT)とP-糖タンパク質(P-gp)に注目し、両トランスポーターの細胞における発現状態を、まずRT-PCRによる遺伝子発現の面から調べた。Caco-2細胞にはTAUTが発現していることはすでに確認しているが、P-gpをコードしているMDR-1およびグルタチオン抱合体排出ポンプをコードしているMRP-1,2を始めとするMRPファミリーのトランスポーター(MRP-1-6)もCaco-2に発現していることがRT-PCRによって確認された。一方、MDR-2の発現は認められなかった。2.Caco-2におけるP-gpの活性を測定する手法について検討した。トリチウム標識したビンブラスチンあるいは蛍光色素であるローダミンを細胞に取り込ませて、その排出を測定したところ、時間依存的なローダミンの排出が観察され、その排出はP-gpの基質として知られているベラパミル等によって顕著に阻害された。この結果、Caco-2細胞にはP-gpが活性を持って発現していること、およびその活性を感度良く測定できることが確認された。3.食品因子によるP-gpの活性調節について検討するための予備実験として、いくつかの既知のフラボノイド類を細胞に加えて、細胞に取り込ませたローダミンの排出活性を測定した。その結果、アピゲニン、ヘスペレティンなどがP-gpの活性を上昇させ、ローダミンの細胞内濃度を低下させる作用を持っていることが示唆された。本年度は、ヒト腸管上皮細胞Caco-2におけるP-糖タンパク質(P-gp)の活性測定系の確立と、それを用いたP-gpの異物排出活性に影響を及ぼす食品成分の探索に着手した。まず、これまで用いてきたローダミン以外にP-gpの基質として知られているダウノマイシン(トリチウム標識体)を用いてP-gpの活性測定を行ない、より感度が良く定量性の高い測定法として使用できること確認した。

そこで、これを用いて様々な食品抽出物を検索した結果、ニガウリをはじめ数種の試料にP-gpの活性を抑制する活性があることを見出した。透過性膜上に培養したCaco-2細胞層を用いてダウノマイシンの細胞層における挙動を観察したところ、上記の試料は、粘膜側から基底膜側へのダウノマイシンの透過を顕著に促進し、逆向きの透過(体内からの排出)を抑制することが認められた。ニガウリ中の活性成分は主として水抽出性であり、現在これをSep-pakカラムで分画中であるが、主要な活性成分は耐熱性の低分子であることが見出されている。一方、内分泌かく乱物質として知られているトリブチルスズ(TBT)存在下でCaco-2細胞を培養したところ、P-gp(MDR-1)の活性上昇が観察され、またそのmRNAレベルでの増加も見出された。すなわち、TBTのような物質の食品中への混入がP-gp活性発現に影響を及ぼすことが示唆された。腸管における異物対応に関わるトランスポーターとして注目しているもう一つのトランスポーターであるタウリントランスポター(TAUT)については、本年度はサイトカインによる制御の研究を進め、Tumor necrosis factor (TNF)-αが腸管上皮でのTAUT活性を上昇させる事を見出した。本年度は両トランスポーターの協調的な制御についても併せて検討していく予定である。本研究では、小腸上皮細胞層における生体異物の透過性制御機構を、異物排出と異物処理に関与するトランスポーターの視点から検討することとし、これらトランスポーターの機能と活性調節について細胞レベルで検討した。トランスポーターとしては、異物排出に関わるトランスポーターであるP-glycoprotein (P-gp)と各種細胞毒性に対して防御的に働くと考えられるタウリンの輸送に関わるタウリントランスポーター(Tau-TP)に着目し、その腸管上皮細胞における機能の解析、調節機構、調節因子(食品因子等)を培養細胞レベルで検討した。まず、P-gpやTau-TPの活性発現を見るのに最も適した細胞としてヒト腸管上皮細胞株Caco-2の培養系を構築し、それらの輸送活性を測定する手法について確立した。次いで、実際にP-gpやTau-TPの活性が生体異物や食品成分によってどのような影響を受けるかについて検討を開始した。異物に対するP-gpの応答性を検討したところ、内分泌攪乱作用が指摘されているトリブチルスズの処理によってP-gpの発現が上昇することが見出され、それには転写レベルでの発現亢進が関わっていることを明らかにした。TAUTの活性は、浸透圧ストレスによって顕著に上昇するが、ダイオキシン、TBTなどの化学物質による有意な変化は認められなかった。一方、P-gpの活性に影響を与える食品成分を検索するために、動植物食品素材の抽出物をCaco-2細胞に加え、P-gpの活性を長期的あるいは短期的に活性化または阻害する成分を広く検索した。その結果、短期的効果については、ニガウリなど数種の野菜抽出液中にP-gpの活性を抑制する活性を見出し、精製に成功したその活性成分の一つについては現在構造解析をした。
会計基準選択のモチベーションと会計情報の質との関係にみるグローバル基準設定の研究

本年度は、当該研究と関連するテーマについて、University of Valenciaでのワークショップにての研究報告、ワーキングペーパーの作成、国際ジャーナルへの投稿、海外研究協力者と次の段階へ向けてのディスカッションを行うなど非常に実り多い年となった。本研究テーマでは、3年間で(1)日本企業の会計基準選択のロジックをその経済的環境および企業属性を加味しながら、独自データベースの利用により具体的かつ包括的に明らかにすること、(2)(1)の結果を受けて、会計情報の品質という視点からJ-GAAP・米国SEC基準・IFRSの優位性について、財務諸表作成者及び利用者の立場を比較検討しながら理論的・実証的に考察すること、(3)最終的にグローバルな会計基準の制度設計のあり方を議論することが目標であるが、本年度の活動により(2)を完了する段階にまで来ていることから、研究スケジュールについて大分巻き戻しを図ることができた。具体的には海外研究協力者2名とのやり取りにより、追加的な関連文献レビュー、大規模なサンプル収集およびデータの追加・更新の完了、ワークシートの更新、およびサブテーマ(2)を見据えたリサーチモデルの構築およびトライアル検証を行う段階に来ている。またこれらの作業を元にドラフト執筆および論文へのブラッシュアップを現在行っているところである。今後は国際学会・ワークショップでの発表・議論を経ることで研究論文としての精度を上げていくことを予定している。研究協力者の当該研究テーマへコミットすることができる時間が増加した。今後は、IFRS研究に関心の高い欧州での国際学会にて研究報告のアクセプトを受けることができたため、その学会での研究報告を目指して、論文の完成度を上げていく。最終的には、今投稿審査中の一本を含め、国際ジャーナルでの研究論文公表を目指す予定である。本年度は、共同にて遂行している当該研究と関連するテーマについて、40th European Accounting Association, University of Valencia, Spain (査読有, May 10-12, 2017)にて発表する機会を得ることができ、当該研究テーマにとっても援用できる有益なディスカッションおよびコメントを得ることができた。また、その後Valencia大学にて直接的に当該研究テーマの海外研究協力者2名とディスカッションおよび共同作業を行うという貴重な機会を創出することができた。本研究テーマでは、平成31年度までの3年間で、(1)日本企業の会計基準選択のロジックをその経済的環境および企業属性を加味しながら、独自データベースの利用により具体的かつ包括的に明らかにすること、(2)(1)の結果を受けて、会計情報の品質という視点からJ-GAAP・米国SEC基準・IFRSの優位性について、財務諸表作成者及び利用者の立場を比較検討しながら理論的・実証的に考察すること、(3)最終的にグローバルな会計基準の制度設計のあり方を議論することが目標であるが、上記の活動により(1)の問題意識のブラッシュアップおよび具体化を行うことができた。また海外研究協力者2名とのその後のやり取りにより、2017年12月までにIFRS任意適用済/適用予定と発表した企業とコントロール・サンプル企業について、データの追加・更新を行い、作業シートの更新、およびサブテーマ(2)を見据えたリサーチモデルの検討を行った。これらの作業とこれまでの先行研究等のレビューの蓄積から当該テーマの論文の下書きとなるドラフトの作成まで漕ぎ着けることができた。予定では、実際に設定した検証モデルをもとに計算していき、検証結果について研究協力者と議論を重ねていき、29年度終盤(3月頃)には共同研究者とサブテーマ(1)の研究成果について、学会報告ができる段階に仕上げていく予定であった。しかしながら、問題意識を若干変更したこと、またそれに伴い検証モデルの変更の必要性が出てきたため、若干予定より遅れている状況である。今後は研究協力者とのコミュニケーションを取る頻度を上げていくこと、また当該研究テーマに割く時間を増やすことによって、検証モデルの確定、検証、論文の執筆につなげて行くことを考えている。

問題意識を若干変更したこと、またそれに伴い検証モデルの変更の必要性が出てきたため。30年度はこの点をクリアし、まとまった成果とし、31年度にはフルペーパ^の形にしていく予定である。年度前半の研究進捗状況が遅れていたため、予定していた国際学会出張をよりも国内での研究打ち合わせを優先したため。昨年度後半から研究進捗度のピッチが上がったため、今年度は、論文完成に向けて、論文ダウンロード件数、学会報告に伴う出張等の諸費用が増加する見込みである。
がん細胞で異常化した酵素を検出する細胞内イメージングシステムの開発

本研究では、がん関連酵素の一種であるプロテインキナーゼ(PK)を利用したがん診断、治療システムの開発に向けて、PK活性検出とPK応答的な治療法の研究を行った。PKは、細胞の生存や増殖、細胞死を決める重要な分子であり、がん細胞におけるPKの異常活性化が、悪性がんの浸潤や転移、薬剤耐性にも関わっている。そこで本研究では、がんの根本的な診断、治療法の開発を目指し、PKに応答する分子システムを開発した。本年度は、PK活性の検出感度の向上と、プローブや薬剤の血中投与を可能にする安定化技術の開発を行った。まず、PKに応答する活性検出の分子設計指針を見直した。従来の指針では、PKの基質ペプチドを機能部位に直接結合していた。分子設計によりPK応答性を改善するために、ペプチドと機能部位を結合するリンカーの長さに着目した。今回、活性検出と治療システムに応用可能なペプチド担持型ポリマーとDNAの複合体を用いて、リンカー長によるPK応答性への影響を評価した。合成した種々の長さのリンカーを持つペプチド担持型ポリマーにより、リンカー長の影響がDNAとの複合体の形成には見られなかったが、リンカー長が長いほど複合体の崩壊が抑制され、PK応答性が10倍改善された。リンカー長によりPK応答性がさらに向上できることが明らかになり、生細胞中でのPK活性の検出が期待される。次に、安定化技術として血清アルブミンにより複合体を安定化した。血清アルブミンは、複合体の凝集を抑制し、長期保存や凍結乾燥が可能になった。また血清アルブミンにより、複合体の血中安定性が向上しており、複合体の全身投与が可能になった。今回用いた安定化技術は、PK応答性にも適用できるものであり、自殺遺伝子を用いたがん選択的な治療が可能となる。これらの知見は、PK応答システムの実用化に向けて極めて有益であり、今後の開発の一助となると考えられる。28年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、がん関連酵素であるプロテインキナーゼ(PK)を利用したがん診断、治療基盤の創製に向けて、PK活性検出系の基盤技術の確立とPKを利用した治療システムの実用化に向けた研究を実施した。細胞内には数百種類ものPKが存在するが、それらの役割は、増殖や生存、細胞死の制御である。PKの異常化は、がんの悪性度と深い関連性が報告されている。したがってPK活性の検出は、がん創薬や治療において重要な指標となる。そこで、本研究では、生細胞中でのPK活性検出を可能にする新規ペプチド型プローブの開発を行った。プローブの開発において、数百種類も存在するPKに対応するために、汎用的かつ簡便なシステムの確立を目指した。プローブの合成には、ペプチド合成の一般的な方法であり、自動化も可能であるFmoc固相合成法を用いることで、簡便かつ迅速な合成が可能となった。PK活性を検出する上で、ペプチドの立体構造の変化を利用するため、PKに応答していないときは構造変化をしないように、剛直なアミノ酸であるプロリンをつなげたプローブをデザインした。本プローブを用いることで、1.5倍程度の蛍光強度の変化が測定できた。今回の結果から、PKの活性検出が可能であること、またプローブの分子設計に対して汎用的な知見を得ることができた。具体的には、生きた細胞中でも感度よくPKを検出するために、プローブを長くすること、親水性が高いアミノ酸を組み込むことがよいことが明らかとなった。また本年度は、PKを利用した治療システムの実用化に向け、がん細胞選択的に薬効を制御する薬剤の開発を行った。血中で凝集してしまい全身投与ができなかった従来の薬剤において、その血中安定性を改善した。これらの研究結果から、がん関連酵素を利用して、がんを診断・分析し、有効な治療法でがんを治療することが期待される。本年度は、1ペプチド型プローブの合成と、2精製酵素を用いたペプチド型プローブの評価、という計画を立てて、実験を行った。1に関して、プローブの合成方法の確立ができ、予定通り進めることができた。具体的には、ペプチド合成の一般的な方法であるFmoc固相合成法を用いて、プローブの分子設計の最適化を試みた。まず様々ながんで異常化しており、その基質ペプチドの配列が短い、Srcをターゲットとすることで、合成時間を短縮した。次にプロリンを修飾することで、構造に剛直性を持たせ、リン酸化前に2つの蛍光基が近づかない構造を設計した。さらに、Fmoc固相合成でも分解せず、かつ活性検出において重要な高い光安定性をもつ蛍光基(アクリジンとベンゾ[a]アクリジン)をプローブに組み込むことで、簡便に合成することに成功した。2に関しては、1の実験結果から、新しい知見が得られた。1で合成したプローブを用いることで、1.5倍程度の蛍光強度の変化が測定できた。しかし、この実験条件は、メタノール溶液中であった。これプローブの水溶性が悪く、細胞の条件に近い水系バッファーでは測定できなかったためである。そこで、この結果から、プローブに親水性のアミノ酸を修飾することで、プローブの水溶性を改善すればよいという分子設計に対する知見を得ることができた。1、2から、PK活性の検出に向けた、プローブの分子設計に対する知見を十分に得ることができており、進捗状況はおおむね順調に進展しているといえる。

本研究では、がん関連酵素の一種であるプロテインキナーゼ(PK)を利用したがん診断、治療システムの開発に向けて、PK活性検出とPK応答的な治療法の研究を行った。PKは、細胞の生存や増殖、細胞死を決める重要な分子であり、がん細胞におけるPKの異常活性化が、悪性がんの浸潤や転移、薬剤耐性にも関わっている。そこで本研究では、がんの根本的な診断、治療法の開発を目指し、PKに応答する分子システムを開発した。本年度は、PK活性の検出感度の向上と、プローブや薬剤の血中投与を可能にする安定化技術の開発を行った。まず、PKに応答する活性検出の分子設計指針を見直した。従来の指針では、PKの基質ペプチドを機能部位に直接結合していた。分子設計によりPK応答性を改善するために、ペプチドと機能部位を結合するリンカーの長さに着目した。今回、活性検出と治療システムに応用可能なペプチド担持型ポリマーとDNAの複合体を用いて、リンカー長によるPK応答性への影響を評価した。合成した種々の長さのリンカーを持つペプチド担持型ポリマーにより、リンカー長の影響がDNAとの複合体の形成には見られなかったが、リンカー長が長いほど複合体の崩壊が抑制され、PK応答性が10倍改善された。リンカー長によりPK応答性がさらに向上できることが明らかになり、生細胞中でのPK活性の検出が期待される。次に、安定化技術として血清アルブミンにより複合体を安定化した。血清アルブミンは、複合体の凝集を抑制し、長期保存や凍結乾燥が可能になった。また血清アルブミンにより、複合体の血中安定性が向上しており、複合体の全身投与が可能になった。今回用いた安定化技術は、PK応答性にも適用できるものであり、自殺遺伝子を用いたがん選択的な治療が可能となる。これらの知見は、PK応答システムの実用化に向けて極めて有益であり、今後の開発の一助となると考えられる。今後の研究では、より高感度な活性検出を可能にするプローブの開発を目指す。今年度の研究成果から、1.5倍程度の蛍光強度の変化が測定できたが、より実用的なPKの活性検出を行うために、100倍程度の蛍光強度の変化を目指す。そのために、今回得られた知見をもとに、プローブのアミノ酸配列の最適化を図っていく。また、PK活性検出を実用化していくうえで、その治療方法が実用化できていないという従来のがん治療の問題点がある。そこで、PKに応答することで、治療効果を発揮するがん治療方法の確立に向けた研究にも精力的に取り組んでいく。がん診断と治療を両立することができれば、従来の治療では克服できなかったがんに対して、有効な治療法として展開できることが期待できる。具体的には、所属する研究室において、PKに応答して、がんの治療遺伝子の発現をコントロールするポリマーを開発している。また本年度において、薬剤として全身に投与できるように、ポリマーの血中安定性を改善することに成功している。そこで、今後は、がん細胞選択的な治療と高い血中安定性を併せ持つ薬剤の開発も行う。PKを利用したがん細胞の診断と、がん細胞選択的な治療システムの実用化を目指した研究を行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。
タンパク質分子の動きを観るために結晶中に創り出した隙間を利用する新発想結晶解析

結晶コンタクト効果フリーな空間(CCFS)を結晶格子中につくり,結晶コンタクトによる柔構造の変形・固定問題の解決を行う.2つの技術要素は,タグタンパク質との融合タンパク質の作製と2つのタンパク質を一本の長いヘリックスを用いて硬く接続することである.ミトコンドリアタンパク質Tom20によるプレ配列認識は「複数の部分的認識状態の動的平衡」で達成される(Biophys Rev, 2018)ことを検証するために,プレ配列中のコンセンサス配列にアミノ酸置換や4-ヨードフェニルアラニンを導入などを行い,MBP-Tom20-プレ配列の融合タンパク質の結晶化を行った.シーディングにより回折測定に適した大きさの結晶を得た.CCFSの他の利用法として結晶コンタクトによる柔構造の変形を除くことができる.酵母ミトコンドリアTim21タンパク質を選択し,MBPとの融合タンパク質の結晶構造決定を行った.その結果,CCFS中のループの構造は通常の結晶構造とNMR溶液構造のどちらとも異なっていた.そこで,NMR構造を再決定し,MD計算による溶液構造の推定を行った結果,CCFS中のループの構造は真の溶液構造の代表構造と見なして良いと結論した.溶液中の動きを評価するためにX線小角散乱(SAXS)を使った方法を検討した.2つの重原子間の距離分布関数を決定する.軽原子の影響を除くために,重原子が1個あるいは0個のSAXSも測定し,4つのSAXSデータの加減算を行う.フレキシブルなポリエチレングリコール骨格でつながった2つのヨウ素原子を含む化合物を合成・測定して,PEG骨格がランダムなコンホメーションをとると仮定したときの距離分布関数に一致する結果を得ることに成功した.その他,ランチオニンペプチドの2つの溶液状態の構造決定と動的交換をNMRを用いて詳細に調べた(Commun Biol, 2018).平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。“隙間"をタンパク質結晶格子中につくり,結晶コンタクトによる「柔動構造の変形・固定問題」を解決し,タンパク質の一部あるいはリガンドが動いている状態の「振幅の大きさ=空間スケール」を実験的に決定する手法の開発を進めている.実現のための技術要素は,1タグタンパク質との融合タンパク質の作製,2タグタンパク質と対象タンパク質を一本の長いヘリックスを用いて硬く接続,であり,さらに親和力の弱いリガンドの場合は,3占有率を保障するために共有結合を用いて,リガンドを対象タンパク質にテザリングする.隙間に位置したタンパク質の一部あるいはリガンドの動きを視覚化するために,該当部分に対応するモデルをオミットして作成した差フーリエ電子密度マップを用いる.適用する対象として,ミトコンドリアプレ配列受容体であるTom20タンパク質に結合した状態のプレ配列ペプチドの大きな運動性を定量的に解析する.タグタンパク質としてマルトース結合タンパク質(MBP)を用いる.過去に電子密度マップのノイズ低減にローパスフィルターを用いることが有効であることを示した.今年度は構造精密化計算のオーバーフィッティングを防止するためのFreeR手法を改良する必要があることがわかった.通常のFreeR計算では計算の検証に使うために,あらかじめ少数の構造因子を除外して構造計算に使わない.使用するデータの数が減るために電子密度の質は必然的に低下するが,動きが小さい原子ではその影響は無視できる.しかし,運動性の大きな原子では影響が無視できないことを見いだした.解決策として5%のFreeRセットを使うと20通りのFreeRセットを作ることができるので,20個の独立した構造計算を行うことができる.その結果作製できる20個の電子密度マップの平均を計算することで,FreeR計算の影響を取り除けることが分かった.ミトコンドリアプレ配列受容体であるTom20タンパク質に結合した状態のプレ配列ペプチドの大きな運動性を定量的に解析するために,マルトース結合タンパク質(MBP)との融合タンパク質をデザインした.隙間に位置したプレ配列ペプチドの運動の空間分布を視覚化するために,プレ配列のモデルを置かずに作成した差フーリエ電子密度マップを用いる.本年度はバルクソルベント補正の影響を検討した.バルクソルベントとはタンパク質結晶において,タンパク質分子間の空間を埋めているディスオーダーした水分子やイオンを指し,低分解能側のX線回折の強度を減少させる.このバルクソルベントによる減衰効果を補正する計算手法がバルクソルベント補正であり,通常のX線解析計算でも考慮されているが,本法では差電子密度マップの作成の際にローパスフィルターを使って低分解能側の回折データだけを抜き出して使うために,その影響を詳細に評価することが重要である.3つのX線解析計算用プログラム, REFMAC5, PHENIX, CNSを比較したところ,ほぼ同等の品質の電子密度が得られた.さらに詳しくみると,PHENIXの場合に一番体積の大きい電子密度が得られており,最新のバルクソルベント補正アルゴリズムを用いていることが理由であると推察された.本法の適用を広げた.オリゴ糖転移酵素はN型糖鎖付加配列のアスパラギン残基にオリゴ糖鎖を転移する活性を持つ.この時,酵素は糖鎖付加配列中の3番目のセリン・スレオニン残基の側鎖を認識するポケットを用いて,糖鎖付加配列を認識することがわかっている.このポケットを構成するアミノ酸残基を含む20残基程度のセグメントが大きな運動性を持っていることがわかっているので,MBPとの融合タンパク質をつくって結晶解析を行った.その結果,このセグメントの大きな振幅の運動を可視化することができた.

結果的に原書論文(Protein Science, 2015)としてアクセプトされたが,採択に至るまでに,複数のレビューワーからのコメントに答えるための実験や原稿改訂に長時間を要した.上述のバルクソルベント補正の問題はその際に提起されたものである.今回の論文は,従来のタンパク質のX線結晶学のコンセプトには無いまったく新しい発想に基づいているため,レビューワーからのコメントも相当厳しいものがあったが,それらをクリアしたことで,多くのX線結晶科学者の疑問に答える水準になったと考えている.結晶コンタクト効果フリーな“隙間"を結晶格子中につくり,「結晶コンタクトによる柔動構造の変形・固定問題」の解決を目指している.ミトコンドリアプレ配列受容体Tom20タンパク質とマルトース結合タンパク質(MBP)の融合タンパク質を作製し,MBPとTom20の間にできる空間を利用して,Tom20に結合した状態のプレ配列ペプチドの動きを電子密度として可視化する.Tom20によるプレ配列の認識は,特異性が広くpromiscuous認識の典型である.Promiscuous認識の分子構造基盤は結合状態における大きな運動性に起因すると考えている.現在得られている電子密度マップではプレ配列ペプチドの大きな振幅の動きの重なり部分に対応しており,運動全体の空間分布を見積もるには電子密度マップのシグナル・ノイズ比を改善する必要がある.そこで,複数の結晶のマップを積算して電子密度マップの改善を行う.結晶化条件の改良により安定して結晶を得ることができるようになったが,興味深いことに構造多形が見られた.すなわち,MBPとTom20の間を繋ぐ長いαヘリックスリンカーの曲がり具合が複数存在し,その結果,結晶コンタクトフリー空間の大きさが変わって,その中のプレ配列の電子密度にも違いが見られた.結晶コンタクトフリー空間の利用法として,結晶コンタクトによるタンパク質構造の変形を除くことができる.結晶構造と溶液NMR構造の両方が決定されていて,一部の構造が異なる例として酵母のTim21タンパク質を選択した.MBPとの融合タンパク質を作成し,結晶化と構造決定を行った.その結果,結晶コンタクトフリー空間に置いた当該セグメントは結晶構造ともNMR構造とも異なったコンホメーションをとっていた.研究実績でも述べたとおり,複数のMBP-Tom20/プレ配列ペプチドの結晶を得てX線解析を行ったが,MBPとTom20の間にあるαヘリカルリンカーの曲がり具合に多形性が見られた.構造多形の原因は凍結操作にあると推定される.凍結操作によるこうした結晶全体のコヒーレントな変形はアミノ酸側鎖レベルでは知られているが,主鎖レベルでは珍しい.原因として大きな容積の結晶コンタクトフリー空間を結晶内に作ったことが考えられる.今後,結晶コンタクトフリー空間の利用の一般化を目指す上で,この凍結変形と構造多形の原因を探求し,制御の方法を見つけることが重要な課題である.結晶コンタクト効果フリーな隙間を結晶格子中につくり,結晶コンタクトによる柔動構造の変形・固定問題の解決を目指している.Tom20タンパク質とマルトース結合タンパク質(MBP)の融合タンパク質を作製し,MBPとTom20の間にできる空間を利用して,Tom20に結合した状態のプレ
温度・電気・薬物の各ニューロモデュレーションによるてんかん発作抑制効果の比較研究

本研究では、温度・電気・薬物による各ニューロモデュレーションのてんかん発作抑制効果について比較した。電気・温度・薬物による脳への刺激を1つのデバイスで達成するためのデバイスを新たに作製し、麻酔下のラットに対して右体性感覚野を開頭し、本デバイスを設置した。デバイス中央部に設けられた穴より皮質下にペニシリンGを投与することでてんかん様異常脳波を誘発し、その後各ニューロモデュレーションによるてんかん発作抑制効果を比較した。その結果、電気刺激の効果はばらつきが大きい一方で、冷却と薬物による発作抑制効果は相補的な関係にあった。ニューロモデュレーションの組み合わせによる治療技術は有効な可能性がある。*本研究は、温度・電気・薬物による各ニューロモデュレーションのてんかん発作抑制効果を比較することで、最適なニューロモデュレーションの組み合わせについて探索する事が目的である。初年度においては、温度・電気・薬物の3種類のそれぞれ異なるニューロモデュレーションデバイスを用いて実験を実施するべく、各デバイスの試作を進めた。冷却デバイスと電気刺激デバイスについては、先に開発を進めていたため、試作を進めることが出来たが、薬物投与デバイスについては、レーザー加工膜についての試作がすすまず、やむなく汎用の薬物微小注入カニューレで代用する方針に変更した。*試作後、これらニューロモデュレーションデバイスの基本性能の評価を実施した。麻酔下のラットに対して開頭により脳表を露出し、開頭野状に書くニューロモデュレーションデバイスを設置することで接触性の確認や実際に温度・電気・薬物が有効に脳表を刺激できるかについても確認を実施した。温度については、脳表温度の低下と脳波の抑制、電気については運動野刺激、薬物については脳波抑制についてそれぞれ確認し安定的効果があることを確認した。*しかしながら、慢性てんかん焦点モデルに対するニューロモデュレーション効果についての検討には至らなかった。一方で、複合的ニューロモデュレーションデバイスの試作についてはデザインがほぼ完成していたため、初年度に前倒しで試作を進めることができた。デバイスの試作から、実験の実施まで、申請予定時の8割は達成できた。また、複合的ニューロモデュレーションデバイスに関しても初年度に試作を実施できた。本研究は、温度・電気・薬物による各ニューロモデュレーションのてんかん発作抑制効果を比較することで、最適なニューロモデュレーションの組合せや相乗効果について探索することが目的である。H28年度は、試作した一体型のニューロモデュレーションデバイスを用いた実験を実施した。各モデュレーターの動作を確認するために麻酔下のラットに対してデバイスのインプラントを実施した。回復期間を経た後に、未処置脳に対する効果について検討を実施した。電気刺激、温度制御、薬物投与による正常脳波に対する興奮・抑制効果を確認することで、インプラント化状態においても正常モデュレーターが動作することを確認した。その後、コバルト粉末の脳表設置することで形成される慢性焦点モデルに対するてんかん様異常脳波抑制効果の評価を実施した。しかしながら、コバルト誘発性の異常脳波がいずれのモデュレーターにおいても安定制御下に置けない状況に陥ってしまった。したがって、コバルト設置量を調整することで本実験において最適サイズの焦点形成方法について検討を進めた。コバルトの設置量を減らし焦点形成サイズを小さくすることで、概ね制御可能な慢性てんかん焦点を形成することができた。なお、各モデュレーターによる発作抑制効果については解析を実施中であるが、それぞれの発作抑制に対する特性が異なるために、解析方法について検討が必要となった。また、引き続き例数の追加によるデータの蓄積が必要である。ラットを用いた実験によりデータを取得することができたが、それぞれのモデュレーション効果の比較方法について検討を要しており、解析が遅れている。H29年度は、電気刺激は刺激方法が温度や薬物と大きく異なるため、脳冷却デバイスと薬物の微小注入に関して比較検討を進めた。内部に冷却水還流用の水路を有する6ミリ角のステンレス製局所脳冷却デバイスの中央に薬物投与用のカニューレを通すことのできる貫通孔を有するデバイスを用いた。局所脳冷却との比較に使用した薬物は擬似的局所脳冷却効果を引き起こす温度感受性受容体チャネルの作動薬であり、ペニシリンG誘発型のてんかん様異常脳波に対して冷却と同様の異常脳波の抑制効果を確認できた。その効果は濃度依存的に効果を示したが、持続期間は10分以内であった。薬物による作用は冷却と比較して迅速で強力であったが、効果持続時間が短いため、効果発現まで時間が掛かるが持続時間が長い局所脳冷却と併用することによって、電気刺激と同等のオンデマンド制御も可能であると考えられる。温度・電気・薬物によるニューロモデュレーションのうち温度と薬物による異常脳波の抑制効果のメカニズムは関連があることがわかってきた。難治性てんかん治療のための局所脳冷却技術について、今後はデバイス開発と創薬の両面から研究開発を進ていく。これは、医療機器と医薬品の相互作用により強力な効果を発揮するあたらしい分類の治療技術の確立につながる可能性がある。

その結果、電気刺激の効果はばらつきが大きい一方で、冷却と薬物による発作抑制効果は相補的な関係にあった。ニューロモデュレーションの組み合わせによる治療技術は有効な可能性がある。デバイス試作はほぼ完了したため、H28年度は動物実験に集中することで、各種ニューロモデュレーションの効果の比較を進める。H28年度の実験を引き続き実施し、効果の違いについての詳細な検討進める。脳情報工学デバイスの試作費用が比較的少額で済んだため。動物実験実施中に液漏れや断線等に寄るデバイスの故障が起きる可能性があるため、デバイスを複数個試作し、ストックとして準備しておくために用いる。計測装置関係のパーツの調達にも充てる。
マウスにおける遺伝子置換を用いたMycファミリー遺伝子の個別的制御機能の解析

N-myc、L-myc、c-mycをメンバーとするMycファミリー遺伝子は、細胞分化、細胞増殖に重要な機能を果たしていると考えられる原がん遺伝子であり、長いあいだ研究の対象とされてきたが、未だにその真の機能は明かでない。また、これら3つのMycファミリー遺伝子の個々の作用の特異性についても全く解析が行われていなかった。本研究は、大阪大学のグループとトロントのMount Sinai Hospital研究所のグループによって作製されたN-myc欠損マウスを基礎にして、共同研究によってMycファミリー遺伝子個別的制御機能を解明することを目指した。L-mycとN-mycはともに胎児期特異的な遺伝子である。発現組識が一部重複し、しかもL-myc欠損マウスが全く正常であることからこれらのあいだの機能的重複が示唆されていた。しかし、N-myc、L-myc2重突然変異体にはN-myc単独の突然変異体と全く差が見出されず、積極的な機能重複は否定された。N-mycの転写制御因子としての制御標的は明らかでなかった。そこで、正常胚とN-myc欠損胚の間で発現に大きな違いがある遺伝子のmRNA群をサブトラクション法で濃縮し、そのなから、N-mycの制御下にある遺伝子の候補を単離した。得られたものの多くは、N-mycによって発現を抑制されるものであった。その一つNdr1について解析した。N-myc遺伝子座にc-mycのcDNAを導入したES細胞をを用いてキメラマウスの作製を試みたが、出生を見なかった。N-mycが発現されるべき組識でc-mycが高発現されると、重大な障害が生じている可能性がある。これらの研究によって、個々のMycファミリー遺伝子の特性を明かにするための基礎が与えられた。N-myc,L-myc,c-mycをメンバーとするMycファミリー遺伝子は、細胞分化、細胞増殖に重要な機能を果していると考えられる原がん遺伝子であり、長いあいだ研究の対象とされてきたが、未だその真の機能は明らかではなかった。そこで、特に我々が最近単離に成功したN-mycによって制御される遺伝子Ndr1を指標として、N-myc遺伝子によるその遺伝子の制御を解析すること、またそれに対する作用の特異性を明かにすること、また、N-mycとL-mycの2重突然変異体マウスがどのような表現型を示すかなど個体レベルでの解析を行なった。(1)N-myc欠損胚で発現が上昇する遺伝子として単離されたNdr1遺伝子を解析したところ、プロモーター上流側に、Myc:Max結合配列が多数存在し、またこのプロモーターはN-myc:Maxによって抑制されることを示した。(2)N-mycとL-mycは発現が重複し、一方、L-myc欠損マウスが全く異常を示さないことから機能的重複が示唆された。そこでN-myc、L-myc2重突然変異体を作製したところ、N-myc単独の突然変異体と全く差がなく、個体レベルでは機能的重複は否定された。しかし、Ndr-1は、L-myc突然変異体においてもまた発現が上昇するようであり、個々の遺伝子レベルでは、作用は重複している可能性がある。(3)N-myc遺伝子座にc-mycのcDNAを導入したES細胞を作製は、ターゲッティングベクターの作製に手数を要したが(2段階の標的遺伝子組換えとCre-LoxP系による不要な塩基胚列の除去による)完了し、ES細胞でのスクリーニングを行なっている。(4)N-mycの欠損をC57B1/6系統に導入すると、これまでに観察されていた異常に加えて、眼の形成異常が観察されるようになった。L-mycはこの表現型に関与しない。L-myc遺伝子はN-myc遺伝子と同様に胚の時期に発現される遺伝子であることなどから、両者が機能的に重複しているのではないかと考えられてきた。N-myc、L-

myc2重突然変異体マウスを作製し、N-myc単独の突然変異体と比較したが、全く差が見出されなかった。また、N-myc+/-;L-myc-/-の成体マウスはN-myc+/-;L-myc+/+のマウスと等しく健常であった。従って、N-mycとL-mycの間の積極的な機能重複は否定された。N-myc発現組織の分化過程で、N-mycの発現上昇、N-mycの発現低下、Ndr1の発現が順に起こる。Ndr1プロモータがN-mycによって抑制されるためである。トランスフェクションを用いた解析では、Ndr1のN-mycによる転写抑制には、N-mycとMaxの共存が必要であった。In vitroの結合反応を解析すると、N-mycは単独でモノマーとして非典型的な配列に結合し、そのN-myc/DNA複合体に更にMaxが結合することが明かになった。この状態でin vivoでの転写抑制が成立すると考えられる。既知のc-mycの制御標的遺伝子がc-myc : Maxによって転写を活性化されることと対照的である。これは、Mycファミリー蛋白質による転写制御の全く新しい機構を示している。N-myc遺伝子座にc-mycのcDNAを導入したES細胞を用いてきメラマウスの作製を試みたが、出生を見なかった。同時に作製した、N-myc遺伝子をN-myc座に戻したES細胞を用いた場合には正常なキメラマウスが生まれたことから、N-mycが発現されるべき組織でc-mycが高発現されると、重大な障害が生じている可能性がある。
固体および液体燃料表面上でのマイクロフレームの燃え広がり

本研究では、管内を燃え拡がる火炎がマイクロフレーム、つまり拡散支配の火炎となる条件を明らかにすることが目的であった。昨年度まではマイクロフレームとなる実験条件を調べ、その火炎の大きさはレイノルズ数によって決まることを見出した。噴流拡散火炎の場合は浮力による影響が大きいため、レイノルズ数の条件に加えてフルード数が1より大きいという条件がある。この結果をふまえて、管内燃え拡がりの浮力の影響および燃焼機構を明らかにするために、今年度はより広範な条件で実験を行い以下の知見を得た。1.管内燃え拡がりで酸化剤流速を大きくしたときに特異的に起きる安定燃焼への遷移条件がダムケラー数によって決まることを明らかにした。この結果はこれまで特異的であると考えられてきた管内燃え拡がりが(曲率の影響を入れ込んだ)平板上の燃え拡がりの拡張として考えられることを示唆している。2.管内燃え拡がりでは、火炎は自身の熱によって酸化剤流路に凹みを形成しその凹みに入り込むことで、吹き飛び限界以下でも保炎することができることを明らかにした。このような限界ダムケラー数以下の燃え拡がりは既存の燃焼学では観察されていなかった現象であり、その保炎機構は燃焼学的に興味深いだけでなく、火災予防や消火などについての基礎的知見を与え得るものである。3.管内燃え拡がりは文字通り燃焼内部を燃え拡がる現象であるため、流れ場の半径方向は燃料壁面によって制限される。したがって浮力による自然対流の影響は、通常の燃え拡がりや噴流拡散火炎に比べてかなり小さくなる。火炎の長さに与えるフルード数の影響は小さくなるため、径の小さい管内を燃え拡がる火炎は本質的に拡散支配の火炎となることを示した。近年、噴流拡散火炎ではレイノルズ数が100以下かつフルード数が1よりも大きい条件では、マイクロフレームと呼ばれる浮力の影響の小さい球状の火炎が得られることが知られており、微小重力火炎に代わるものとして期待されている。一般に燃え広がりでは燃焼領域外縁部に酸化剤となる空気が存在するため火炎長さは理論上無限となる。そのため、マイクロフレームが燃え広がる現象についての研究は報告されていなかった。しかし、管内燃え広がりでは燃料壁面によって空気が流入しないため火炎長さは有限となり、火炎長さを考えることができる。本研究では管内を燃え広がる火炎の長さを定義することで、マイクロフレームの燃え広がりを観察することを目的とする。マイクロフレームの動的観察より、その消炎限界や安定性についての燃焼学的な知見が得られることが期待される。今年度はレイノルズ数やフルード数など拡散火炎の燃焼現象を支配する無次元数が火炎長さにおよぼす影響を実験的に調べた。その結果、管内を燃え広がる火炎の長さはレイノルズ数に対して一次関数的に比例することが明らかとなった。また、燃焼場のフルード数条件を変えて行った実験から、浮力支配となる領域では燃え広がりの火炎長さは噴流拡散火炎の場合と同様フルード数の累乗で見積もることができ、浮力支配となる限界フルード数はレイノルズ数に依存することがわかった。本研究ではフルード数が1よりも小さい条件であってもマイクロフレームが観察されたことから、噴流拡散火炎と燃え広がりではマイクロフレームとなる条件が異なる可能性があることがわかった。
高熱負荷状態におけるセラミックス炉材料の損傷に関する基礎的研究

本研究では、定常高密度熱源としてプラズマジェットを使用し、高熱負荷状態における各種セラミックスの様々な損傷について基礎的研究を行ない、それらの試料の損傷状態をもとにして熱負荷との関連を明らかにするとともに、セラミックスの核融合炉材料としての適性の評価を試み以下の結果を得た。アルミナ(【Al_2】【O_3】),ボロンナイトライド(BN),窒化ケイ素(【Si_3】【O_4】)黒鉛(C)の各セラミックス材料に対して、プラズマジェットによる熱負荷の状態をトーチとの距離l、試験時間tにより変化させた。このプラズマからの熱負荷については、水冷銅ダミーを用いた熱量測定実験により、l=10mmにおいて2.4×【10^3】W/【cm^2】のエネルギー密度が得られている。【Al_2】【O_3】,【BN_2】,【Si_3】【O_4】の損傷については、距離に対する損耗量の傾向が指数的であり、熱負荷と距離の関係と同様の傾向であった。Cの場合は他のセラミックス材料と異なる傾向を示したが、高熱負荷での損耗量は他の材料と比較して小さい値が得られた。各セラミックスの損耗量の大きさは、l=20mm,t=10secの場合、【Al_2】【O_3】<BN<C<【Si_3】【O_4】となったが、【Al_2】【O_3】については溶融、クラックの特徴が見られた。次に熱負荷試験で得られた各種セラミックス試料の表面損傷状態を光学顕微鏡、SEMによって観察し、X線回折により表面組成を明らかにした。その結果、【Al_2】【O_3】については、熱負荷後の表面は溶融再結晶により粒界が明確になり結晶粒が粗大化し、αアルミナのみが同定された。また、BN及び【Si_3】【O_4】についても分解蒸発による表面層の変質が観察された。特に【Si_3】【O_4】は、Siの粒状組織が形成されていた。しかし、Cについては表面に多数のボイドが形成され激しい蒸発現象を裏付けていた。なお熱負荷を与えると、全てのセラミックス材料の表面層において、ビッカース硬度の低下が生じていた。
本人の音声記録による代用音声の開発と音声獲得

<はじめに>代用音声の開発は、当初興味を示したR社の協力が昨今の不景気で得られないため、発声源の開発より先に発声源を取り付ける位置について検討した。<目的>どの部に発声源を置けば口腔内に音を導けるか、骨の厚み・空洞・口腔への伝導に着目して検討した。<方法>骨導補聴器の振動体を発声源の代用に用いた。これを合成樹脂の頭蓋骨モデル(頭蓋のみ空洞)、人体頭蓋骨モデル、及び被験者を対象に各頭頂部、側頭部、前額部(前頭洞前壁)、頬部(上顎洞前壁)にあて、各部位5回調べた。骨導補聴器のマイクより同じ大きさの音を入れ、その振動体を接触させ最も共鳴した(音の大きい)部を調べた。さらに、被験者では5人に口の形で音が変化するかも調べた。<結果>大きい順は、合成樹脂:側頭部>頭頂部>前額部>頬部。人体頭蓋:側頭部>頭頂部>前額部=頬部。被験者:頬部>前額部>側頭部>頭頂部。口の形により音が変化:頬部のみ。<考察>最も共鳴したのは壁が薄く、空洞のある部であった。模型は両方とも頭蓋に大きな空洞があり、頭頂部と側頭部で最も共鳴した。頭頂部が劣るのは骨が厚いためと考えられた。人体頭蓋と被験者は、前額部(前頭洞)と頬部(上顎洞)に空洞をもつため大きく共鳴する。実際の人(被験者)では頭蓋は空洞でないため、前額部・頬部が優り、より空洞の大きい頬部が最も共鳴する。頬部は口腔に近いこと、共鳴腔の上顎洞は中鼻道を介して口腔とつながっていること等もその原因と考える。これは口を開けると頬部だけ音が大きくなること、さらに口の形に合わせて小さな母音が聞こえる事などからも説明できる。頬部(上顎洞前壁)は、音響学的にダクト(共鳴音を排出する穴)をもつバスレフ型スピーカーボックスに近い形をしている。解剖学的にも口腔内から簡単にアプローチでき、厚い軟部組織で覆われるため、代用音声の装着部位に適していると考える。代用音声を作る際、術前の本人の音声をどのように記録しておくかについて検討した。1)コンピューターでの記録形式について音声ファイルの形式を調べ、どの方法で残すのが良いか検討。圧縮を行わないものとして(WAV,AIFF)非可逆圧縮を行うものとして(MP3,AAC)の三つを比較。後の編集を考え、圧縮しないものを選択した。データは大きくなるが(約10MB程/分)、1音声は23秒あれば十分記録でき、1MB程度で収まるため問題ない。その中でも、MacにはAIFF形式(Mac標準)が最適であるが、Os XよりWAV (Window標準)形式も使用可能なため、ソフトやユーザーの多さを考えWAV形式を音声記録の標準とすることが良いとの結論となった。2)個人の声の再生には、いくつの音声を保存が必要かについて基本的に日本語は、子音の後半は母音となる。子音は、摩擦音や破裂音と母音の組み合わせである。しかし母音そのものは他を組み合わせても作成出来ないため、少なくとも5つの母音が必要であった。3)いくつの子音が必要かについて摩擦音と母音の“あ"でサの音が再生できた。この際、摩擦音は他人のものでも代用できることが示唆された。サ行についてはほぼ再生可能と考えられる。4) Mac OS Xに対応するサンプリングマシーンが現在製造されておらず、本年度は同様の機能を持つ後継機のシンセサイザーの機能を用いて解析を始めざるを得ない状態であった。そのためコンピューターへの音声取り込みに手間取っており、その他の子音の解析は21年度の課題としている。代用音声作成のため、音声記録の実際と言葉の作成について検討した。1)Mac OsXに対応するサンプリングマシーンとソフトやコンバーターが本年度すべて揃い、マッチングの問題が解決した。また昨年度、音声記録の標準に決めたWaveファイル(.wav)を実際に使用して、WindowsとMacの両方で記録が可能な事が確認でき、これを使用して新しい子音の作成も可能であった。2)記録した音声(母音)から子音を作る課程で、他人の摩擦音と記録した母音との組み合わせで、昨年度「サ」が再生できた。今回新しく「ス」、「セ」、「ソ」が、破裂音との組み合わせでは「カ行」が再生できた。3)単音から言葉を作る際、本器が特徴とするバリフレーズ形式(.vpw)に変換すると、音の3要素であるピッチ(高さ)、タイム(長さ)、フォルマント(音質)をそれぞれ独立して変えられる。例えばレコードのターンテーブルをゆっくり回すと歌手の声を長くできるが、声は低くなり、音質も変わってしまう。しかしこの形式では、一つの音声を記録すると、音質を変えないままいろいろな高さの声が作れ、音質を変えないまま声の長さも変えられる。さらにこれがリアルタイムに行える。4)Waveファイルで二つの声を記録し、バリフレーズ形式に変換すると、二つの声のサンプルから音の3要素を変えて言葉を作れる。実際に「ア」と「メ」から「雨」「飴」「アーメ」「アメー」などが作成出来た。つまり喉頭摘出手術前に本人の声を最小限に記録することで、手術後声を失っても、本人に近い声での新しい言葉が再生可能と考えられた。

5)言葉を再生する際、音声が似ている事以外に話し方の癖の影響も大きい事が解った。今後は音の三要素だけでなく、ミキシングソフトでさらに細かい変化を加え(言葉尻を上げる、音をゆらすなど)、より本人に近い話し方の再現を検討する。<はじめに>代用音声の開発は、当初興味を示したR社の協力が昨今の不景気で得られないため、発声源の開発より先に発声源を取り付ける位置について検討した。<目的>どの部に発声源を置けば口腔内に音を導けるか、骨の厚み・空洞・口腔への伝導に着目して検討した。<方法>骨導補聴器の振動体を発声源の代用に用いた。これを合成樹脂の頭蓋骨モデル(頭蓋のみ空洞)、人体頭蓋骨モデル、及び被験者を対象に各頭頂部、側頭部、前額部(前頭洞前壁)、頬部(上顎洞前壁)にあて、各部位5回調べた。骨導補聴器のマイクより同じ大きさの音を入れ、その振動体を接触させ最も共鳴した(音の大きい)部を調べた。さらに、被験者では5人に口の形で音が変化するかも調べた。<結果>大きい順は、合成樹脂:側頭部>頭頂部>前額部>頬部。人体頭蓋:側頭部>頭頂部>前額部=頬部。被験者:頬部>前額部>側頭部>頭頂部。口の形により音が変化:頬部のみ。<考察>最も共鳴したのは壁が薄く、空洞のある部であった。模型は両方とも頭蓋に大きな空洞があり、頭頂部と側頭部で最も共鳴した。頭頂部が劣るのは骨が厚いためと考えられた。人体頭蓋と被験者は、前額部(前頭洞)と頬部(上顎洞)に空洞をもつため大きく共鳴する。実際の人(被験者)では頭蓋は空洞でないため、前額部・頬部が優り、より空洞の大きい頬部が最も共鳴する。頬部は口腔に近いこと、共鳴腔の上顎洞は中鼻道を介して口腔とつながっていること等もその原因と考える。これは口を開けると頬部だけ音が大きくなること、さらに口の形に合わせて小さな母音が聞こえる事などからも説明できる。頬部(上顎洞前壁)は、音響学的にダクト(共鳴音を排出する穴)をもつバスレフ型スピーカーボックスに近い形をしている。解剖学的にも口腔内から簡単にアプローチでき、厚い軟部組織で覆われるため、代用音声の装着部位に適していると考える。