hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ゲノムワイドsiRNAライブラリーを用いた新規解糖系制御遺伝子探索と疾患への応用

解糖系は癌や炎症性疾患などで重要な役割を果たすエネルギー産生機構であるが、その制御機構は未だ不明な点が多い。そこで本研究では、ゲノムワイドsiRNAライブラリーを用いて解糖系制御に関わる遺伝子を探索し、新規に解糖系制御に関わる遺伝子を19個同定した。これらの遺伝子の中には、その遺伝子発現を抑制することで癌細胞の増殖を抑えるものや、マクロファージの機能を抑制するものが見られた。これらの新規遺伝子は、解糖系制御を介して癌、炎症性疾患などの疾患の新たな治療標的になるかもしれない。解糖系は癌、免疫疾患、糖尿病など多くの疾患で重要な役割を果たすエネルギー産生機構であるが、その制御機構は未だ不明な点が多い。そこで本研究ではゲノムワイドsiRNAライブラリーを用いて新規解糖系制御遺伝子のスクリーニングを行った。H22年度に実施したスクリーニング、および検証実験の結果、酸素依存性の細胞性増殖に関わる遺伝子13個、解糖系阻害剤2DG存在下での細胞増殖に関わる遺伝子7個を同定した。この中で酸素依存性細胞増殖に関わる遺伝子1個は酸素依存性増殖に関して既知のものであったが、残りの19遺伝子については新規の遺伝子であった。またこれら19遺伝子間のパスウェイ解析、gene ontology解析を行った結果、RNA代謝に関わる遺伝子が6個見出された他は、特定の機能やパスウェイに偏ることはなく、さまざまな細胞機能と解糖系が関わることが示唆された。この19遺伝子の中から、機能の全くわかっていないある遺伝子に着目して解析を行った結果、この遺伝子は解糖系とミトコンドリアでの酸化的リン酸化のバランスに重要な役割を果たすPDK1のユビキチンリガーゼとして機能することが明らかとなった。この遺伝子をRNAiで発現低下させることにより癌細胞は通常酸素下で解糖系を用いた代謝をより行うようになった。またこの遺伝子を発現低下させた癌細胞は軟寒天培地でのコロニー形成能が低下し、ヌードマウス皮下での造腫瘍能が著しく低下することが明らかとなった。この研究結果をまとめた論文を現在投稿準備中である。H23年度では、H22年度に同定した19の新規解糖系制御遺伝子についてがん細胞とマクロファージにおける役割について解析を行った。その結果、分子Aはがん細胞において足場非依存状態でのエネルギー代謝に重要な役割を果たしていることが明らかとなり、分子Aをノックダウンすることでin vivoでのがん細胞の増殖を制御することが明らかとなった(論文投稿中)。また分子Bは、エネルギー飢餓環境でのがん細胞の増殖・生存を制御していることが明らかとなり、この分子を抑制することで造腫瘍能が著しく低下することが明らかとなった(投稿準備中)。一方マクロファージにおいては、分子Cが解糖系を介したエネルギー産生と運動能、サイトカイン産生能などの細胞機能に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。本研究では全研究期間を通じて、ゲノムワイドsiRNAライブラリーを用いることで新たな解糖系制御分子の網羅的同定に成功し、新たな解糖系制御のメカニズムが明らかとなった。またこれら新規解糖系制御分子ががん細胞やマクロファージで重要な役割を果たしていることが明らかとなった。今後これらの知見を基にさらなる研究を展開することによって、解糖系制御機構を利用した疾患治療への応用が期待される。
根圏生態系の総合的評価手法の確立

平成11年,12年の研究の結果,以下のような成果を得た.1)高知県下の農耕地土壌を用いて微量要素であるホウ素の分析を行った.可給態ホウ素の抽出法についての検討を行うと同時に,土壌中での形態について分別定量を行った.高知県下の農耕地土壌は,可吸態のホウ素含量が少なく欠乏気味の濃度範囲にあった.2)メチルブロマイドの使用禁止に伴う代替土壌消毒法として,蒸気消毒法の検討を行った.メチルブロマイド消毒と蒸気消毒は土壌中の微生物の多様性を比較的損なわない消毒法であったが,クロロピクリンを用いた場合には非常に強い殺菌効果があった.蒸気消毒法はある程度メチルブロマイドの代替法として機能するが,マンガンの溶出を抑えるための対策が必要であることがわかった.3)菌根菌資材を用いて植物根圏でリン酸などの養分吸収が促進されることを確認した.その際に,根圏でリン酸フォスファターゼ活性が高まっており,土壌中のリン酸を分別定量結果から,鉄結合態のリン酸が可溶化されることによって,鉄,リン酸の有効態画分が増加することが明らかとなった.4)造成された日本シバ草地において,周縁の森林土壌との比較を目的に,土壌の物理・化学的性質と微生物の動態をモニタリングした.造成シバ草地では,造成後経年数が増加するにつれて,に従って,低栄養要求性の細菌類が増加することがわかった.その原因は,シバの根圏より10cm下に,牛の踏み固めによる硬盤層が生成し,さらにその直上に粒状構造が発達することで根圏の物理環境(保水性・排水性)が改善されることにより,微生物にとって良好な生活環境ができることから,低栄養でも生育可能な微生物の働きが一層重要になることがわかった.5)中間種鉱物粘土の合成を行い,重金属の吸・脱着反応を検討した.重金属の選択性は,吸着サイトの性質の違いによって大きく左右されることが明らかとなった.平成11年,12年の研究の結果,以下のような成果を得た.1)高知県下の農耕地土壌を用いて微量要素であるホウ素の分析を行った.可給態ホウ素の抽出法についての検討を行うと同時に,土壌中での形態について分別定量を行った.高知県下の農耕地土壌は,可吸態のホウ素含量が少なく欠乏気味の濃度範囲にあった.2)メチルブロマイドの使用禁止に伴う代替土壌消毒法として,蒸気消毒法の検討を行った.メチルブロマイド消毒と蒸気消毒は土壌中の微生物の多様性を比較的損なわない消毒法であったが,クロロピクリンを用いた場合には非常に強い殺菌効果があった.蒸気消毒法はある程度メチルブロマイドの代替法として機能するが,マンガンの溶出を抑えるための対策が必要であることがわかった.3)菌根菌資材を用いて植物根圏でリン酸などの養分吸収が促進されることを確認した.その際に,根圏でリン酸フォスファターゼ活性が高まっており,土壌中のリン酸を分別定量結果から,鉄結合態のリン酸が可溶化されることによって,鉄,リン酸の有効態画分が増加することが明らかとなった.4)造成された日本シバ草地において,周縁の森林土壌との比較を目的に,土壌の物理・化学的性質と微生物の動態をモニタリングした.造成シバ草地では,造成後経年数が増加するにつれて,に従って,低栄養要求性の細菌類が増加することがわかった.その原因は,シバの根圏より10cm下に,牛の踏み固めによる硬盤層が生成し,さらにその直上に粒状構造が発達することで根圏の物理環境(保水性・排水性)が改善されることにより,微生物にとって良好な生活環境ができることから,低栄養でも生育可能な微生物の働きが一層重要になることがわかった.5)中間種鉱物粘土の合成を行い,重金属の吸・脱着反応を検討した.重金属の選択性は,吸着サイトの性質の違いによって大きく左右されることが明らかとなった.平成11年度は以下の項目についての調査・研究を行った.(1)根圏土壌に植物や微生物によって供給される低分子有機酸の量と組成(2)菌根菌やその他の細菌,放線菌の季節変動(3)土壌環境(気温,地温,降水量,土壌水分,土壌硬度)のモニタリング(4)土壌中の有機体セレンの分別定量まず,調査対象圃場である,高知県南国市白木谷斉藤牧場周辺の天然生林,造成地,草地において,地形・土壌・植生の調査を行った.同時にサンプリングを行い,土壌の理化学性の分析(pH,電気電導度,陽イオン交換容量,交換性塩基(Ca,Mg,Na,K)含量,全炭素・全窒素含量,可給態リン酸含量,酸化物含量、荷電ゼロ点,粘土鉱物組成)を行った.また,現地において上記の項目をモニタリングすると同時に,根圏土壌中の低分子有機酸組成の分析(乳酸,リンゴ酸,シュウ酸,クエン酸,コハク酸,マロン酸,マレイン酸、フマル酸)の量と組成の季節変動の解析を行った.土壌生態系のモニタリングとしては,細菌・放線菌の季節変動(希釈平板法),グラム陽性・陰性菌の種の同定(バイオログ法)を行った.

微生物生菌数と低分子有機酸の量は密接に関係しており,主に,温度と土壌の水分条件によって変動することがわかった.検出・同定された細菌のほとんどがBacillus属のものであったが,土地利用形態によってその組成,季節変動性が異なることがわかった.新しいシバ草地では養水分の土壌断面内での移動が少なく,草地生態系が安定化するにつれて,土壌断面内ででの物質循環が活発になることや,化学的,生物学的にはしだいに天然生林の様相に近づいていくことなどがわかった.平成12年度は以下の項目についての調査・研究を行った.1)高知県下の農耕地土壌を用いて微量要素であるホウ素の分析を行った.可給態ホウ素の抽出法についての検討を行うと同時に,土壌中での形態について分別定量を行った.高知県下の農耕地土壌は,可吸態のホウ素含量が少なく欠乏気味の濃度範囲にあった.2)メチルブロマイドの使用禁止に伴う代替土壌消毒法として,蒸気消毒法の検討を行った.メチルブロマイド消毒と蒸気消毒は土壌中の微生物の多様性を比較的損なわない消毒法であったが,クロロピクリンを用いた場合には非常に強い殺菌効果があった.蒸気消毒法はある程度メチルブロマイドの代替法として機能するが,マンガンの溶出を抑えるための対策が必要であることがわかった.3)菌根菌資材を用いて植物根圏でリン酸などの養分吸収が促進されることを確認した.その際に,根圏でリン酸フォスファターゼ活性が高まっており,土壌中のリン酸を分別定量結果から,鉄結合態のリン酸が可溶化されることによって,鉄,リン酸の有効態画分が増加することが明らかとなった.4)造成された日本シバ草地において,周縁の森林土壌との比較を目的に,土壌の物理・化学的性質と微生物の動態をモニタリングした.造成シバ草地では,造成後経年数が増加するにつれて,に従って,低栄養要求性の細菌類が増加することがわかった.その原因は,シバの根圏より10cm下に,牛の踏み固めによる硬盤層が生成し,さらにその直上に粒状構造が発達することで根圏の物理環境(保水性・排水性)が改善されることにより,微生物にとって良好な生活環境ができることから,低栄養でも生育可能な微生物の働きが一層重要になることがわかった.5)中間種鉱物粘土の合成を行い,重金属の吸・脱着反応を検討した.重金属の選択性は,吸着サイトの性質の違いによって大きく左右されることが明らかとなった.
均等粒径砂地盤上の浅い基礎の変形強度特性に及ぼす進行性破壊の影響

粒径の異なる粒状体を用い浅い基礎の載荷試験(帯基礎、幅3cm)と一面せん断試験を行い、せん断層の発達過程をX線写真によって観察した。載荷試験では、粒径にかかわらず極限支持力発見時に変形の卓越したせん断層が受働域の地表面付近まで既に発達していたが、極限支持力発見時に生じた体積膨張を伴ったせん断層の長さは粒径の小さな試料ほど長かった。同一相対密度の粒径が異なる試料では、粒径が大きな試料ほど極限支持力発見時の沈下量が大きく、平均粒径が0.637mmの試料は平均粒径が0.177mmの試料の約1.7倍の沈下量を必要とした。また、粒径の細かい試料ほど多くのせん断層が発生し、せん断層の長さ方向に沿ったせん断層の両側での相対変位の変化勾配が急であり、より進行的な破壊形態を示していた。測定されたせん断層の幅は平均粒径の520倍程度の値であった。一面せん断試験では、粒径が細かく有効鉛直圧が高いほど複数のせん断層が発生する傾向が見られ、より進行的な破壊形態を示した。最終変形段階でのせん断層の幅の各試料ごとの平均粒径D_<50>の1020倍程度であり、重力場の載荷試験から得られる値とほぼ同程度の値を示した。実験をおこなった0.54.0kgf/cm^2の範囲では粒子破砕もほとんど生じず、有効鉛直圧によるせん断層幅の明確な変化は見られなかった。せん断層幅と破壊時のtanphi_f、破壊前の体積一定時時のtanphi_<cv>、およびtanphi_f-tanphi_<cv>との関係を整理すると、有効鉛直圧0.5kgf/cm^2のケースではせん断層幅が大きくなるほどこれらのtanphiが大きくなる傾向が見られたが、1kgf/cm^2以上ではほぼ一定であり、せん断層幅による影響は見られなかった。このように低拘束圧域でせん断層の幅が破壊強度に影響を及ぼすことがわかった。
後腎の動静脈および下大静脈の発生に果たす副腎原基の役割

我々は脊椎動物の初期胚に適用可能な樹脂鋳型法を開発し、東北サンショウウオやラットを材料として前、中、後腎動静脈と腎臓器内血管の発生過程の解析を進めて来た。その結果、後腎動脈の起源は中基(中腎ではなく)が重要な意義を持つことを明らかにした。本研究では原始爬虫類であるアカウミガメの初期胚に上記樹脂鋳型法を適用して、中腎から後腎への移行に伴う臓器内の微細血管の形態変化を三次元的に解析する。この過程で、ラットで明らかとなった後腎血管系の発生に果たす副腎原基の役割を系統発生学的に解明する。本研究の遂行にあたり500個以上のアカウミガメの卵を必要とした。アカウミガメが保護野生生物種であることからその採取には採補地である屋久島町の許可を必要とし、年間の許可総数は一腹(約100-120個)とした。以上の理由から、研究に必要とする標本の発生段階を4期に分け、4年間で一連の発生標本を揃えることとした。鹿児島県屋久島田舎浜にて保護団体の指導の下に平成13年度と14年度に産卵観察と予備調査を行い、採卵法、輸送法、飼育法を検討した。15年度は99個の卵を得て標本を作製したが、約5割強の卵が輸送中に死卵となって研究に使えなかった。この不足分を補うため16、17、18年度は年間2腹(総数200個)の採補許可を得た。実際の採卵数は16年度233個、17年度281、18年度209個であった。17年度には、17年度の予定標本について段階毎に血管内色素注入標本と樹脂鋳型注入標本作製するとともに、16年度までの不足分の血管内色素注入標本と樹脂鋳型注入標本作製した。17年度までに作成した全標本について精査した結果、若干数の不足を認めたため、18年度は予定標本数を確保するとともに上記不足分を補うため必要な標本の作成とその観察を継続して行ない、本研究の遂行に必要なウミガメ卵を得て、標本の作成を完了した。既に研究計画書で述べた様に本研究の遂行に当たり、総数で400?500個のアカウミガメの卵を必要とする。アカウミガメは保護野生生物種であり、その採取には採補地の県知事の許可を必要とし、また、1年間の許可数は約100個(1腹)と限られている。以上の理由から、研究に必要とする標本の発生段階を4期に分け、4年間で一連の発生標本を揃える事とした。15年度は鹿児島県知事の許可を受けて、屋久島いなか浜にて保護団体の指導の下に、99個のウミガメ卵を得た。直ちに(産卵後24時間以後は移動不可)に空輸して岩手医科大学内に設置した恒温器内で飼育を開始した。血管内色素注入標本と樹脂鋳型標本作製のため、心臓鼓動開始期から連日約10個の卵を使用して10日に渡って標本作製を試みた(総数99個)。結果:段階ごとに血管内色素注入標本と樹脂鋳型標本(総数47個)を得、所定の処置後標本として保存し、光学解剖顕微鏡と走査型電子顕微鏡による観察を行った。しかし、恒温器で飼育した総数99個の卵の約5割強が循環開始以前に発生を停止し死卵となっていたため研究に使えず、予定の標本数に達しなかった。

これまでのデータによれば24時間以内の移動後の生存率は7?8割とされており、屋久島から岩手の遠距離輸送が何らかの影響を与えたと考えられる。これは本研究遂行に当たって大きな問題である。必要な標本の総数を得るためには16年度以降、飼育卵の生存率を7?8割まで上げる必要があり、採取、輸送、飼育方法に改良を加え飼育卵の生存率を上げねばならない。本研究の遂行にあたり約500個のアカウミガメの卵を必要とするが、アカウミガメが保護野生生物種であることからその採取には採補地の県知事の許可を必要とし、年間の許可総数は一腹(約100個)に限られている。以上の理由から、研究に必要とする標本の発生段階を4期に分け、4年間で一連の発生標本を揃えることとした。鹿児島県屋久島田舎浜にて保護団体の指導の下に15年度は99個の卵を得て標本を作製したが、約5割強の卵が輸送中に死卵となって研究に使えなかった。16年度はこの不足分を補うため特別の採補許可を取り2腹(総数227個)の卵を得た。結果:15年度の不足分と16年度の予定標本について段階毎に血管内色素注入標本と樹脂鋳型注入標本作製を試みた。16年度予定数を得て必要な観察を行ったが、15年度の不足分を完全に補うには至らなかった。17年度は予定標本数を確保し15年度不足分を補うため、再度の特別採補許可を得るとともに、採取、輸送、飼育方法に改良を加え卵の生存率を上げる事を予定している。以上、本研究を完遂するに必要な標本の作成とその観察を継続して行った。16年度と17年度はこの不足分を補うため特別の採補許可を取り、各年度とも2腹(総数200個)の卵を得た。結果:16年度には、15年度の不足分と16年度の予定標本数を確保するため、段階毎に血管内色素注入標本と樹脂鋳型注入標本作製を試みた。その結果、16年度分については予定数を得る事が出来たが、15年度の不足分を完全に補うには至らなかった。17年度は17年度予定標本数を確保し15年度不足分を補うため、再度の特別採補許可を得るとともに、採取、輸送、飼育方法に改良を加え卵の生存率を上げた。その結果、15,16,17年度までに予定していた発生段階の血管内色素注入標本と樹脂鋳型注入標本をほぼ得ることが出来た。我々は脊椎動物の初期胚に適用可能な樹脂鋳型法を開発し、東北サンショウウオやラットを材料として後腎動静脈と腎臓器内血管の発生過程の解析を進めて来た。その結果、後腎動脈の起源は中腎の遣残動脈ではないこと、後腎動脈と下大静脈そして後腎臓器内の初期血管路の形態形成に、副腎原基(中腎ではなく)が重要な意義を持つことを明らかにした。本研究では原始爬虫類であるアカウミガメの初期胚に上記樹脂鋳型法を適用して、中腎から後腎への移行に伴う臓器内の微細血管の形態変化を三次元的に解析する。この過程で、ラットで明らかとなった後腎血管系の発生に果たす副腎原基の役割を系統発生学的に解明する。
転写因子c-Mafの胎児造血,造血器腫瘍発生における機能解析

c-Mafノックアウトマウス(KOマウス)の解析を通じて、正常造血の仕組みや、血液細胞の癌化における大Maf転写因子群の機能を動物モデルにより明らかにし、多発性骨髄腫を含む造血器腫瘍の原因の究明および治療法への応用を目指す。胎児造血におけるc-Mafの役割c-Maf KOマウスは胎生致死となる。胎児肝臓ではc-Mafはマクロファージのみに発現しており、マクロファージが胎生致死の原因であると考えられる。c-Maf KOマウスの赤芽球小島をディッシュ上で観察したところ、マクロファージに接着する赤芽球が野生型と比べて少ないことがわかった。さらに赤芽球小島より赤芽球のみ取り除き、別の赤芽球を用いて再構成させる実験を行なった。その結果、c-Maf KOマウス由来マクロファージに接着する赤芽球は野生型、c-Maf KOいずれの赤芽球を用いてもその数が少なかった。また、胎児肝臓マクロファージを分離し、マイクロアレイ解析を行なったところ、赤芽球小島の形成に関与するVcamlのmRNA発現が低下していた。この結果はc-MafがVcamlの発現を制御している可能性を示唆するものであり、c-Mafの新たな標的遺伝子の同定を意味する。造血器腫瘍発生におけるc-Mafの役割造血系転写因子の異常は造血器腫瘍を引き起こすことが知られている。多発性骨髄腫におけるc-Mafの過剰発現の報告がある。レトロウイルスベクターを用いて造血細胞にc-Mafを導入し、その表現型を解析することで造血器腫瘍発生と大Maf転写因子群との関わりを解明する。c-Maf遺伝子を導入した造血細胞を、致死量放射線照射したマウスに移植し血液系を再構築した。移植後、約6ヶ月を経て血液系の再構築を確認できたが、造血器悪性腫瘍のモデルとなるような表現型は認められなかった。胎児造血におc-Mafの役割c-Maf KOマウスは胎生致死となる。c-Maf KOマウスの赤芽球小島を培養ディッシュ上で観察したところ、1つのマクロファージに接着する赤芽球が野生型と比べて少ないことがわかった。その結果、c-Maf KOマウス由来マクロファージに接着する赤芽球は野生型、c-Mafノックアウトいずれの赤芽球を用いてもその数が少なかった。移植後、約6ヶ月を経て血液系の再構築を確認できたが、これまでのところ造血器悪性腫瘍のモデルとなるような表現型は認められていない。今後も引き続き、経過観察を行っていく。

レトロウイルスベクターを用いて造血細胞にc-Mafを導入し、その表現型を解析することで造血器腫瘍発生と大Maf転写因子群との関わりを解明する。c-Maf遺伝子を導入した造血細胞を、致死量放射線照射したマウスに移植し血液系を再構築した。移植後、約6ヶ月を経て血液系の再構築を確認できたが、造血器悪性腫瘍のモデルとなるような表現型は認められなかった。
薄膜ライブラリを用いたコンビナトリアル評価法の研究

本研究では,サーモグラフィを利用し,条件の異なる微小な薄膜サンプルを集積した薄膜ライブラリ上での高効率熱特性評価法の実現を目的としている,具体的な熱特性として,薄膜アモルファス合金の結晶化特性,薄膜形状記憶合金のマルテンサイト変態温度の評価を目指してきた.平成21年度には,薄膜アモルファス合金の結晶化開始温度の高効率評価に成功した.そこで本年度は,薄膜アモルファス合金の時間温度変態曲線の高効率な解明法と,薄膜形状記憶合金のマルテンサイト変態温度評価法の基礎検討について重点的に研究を行った.時間温度変態曲線の高効率な解明法では,温度傾斜真空加熱炉を製作し,他種類の温度条件での保持試験を一括で行う手法を提案した,この加熱炉により,薄膜アモルファス合金サンプルを加熱・保持し,温度の異なる各部での結晶化までに要した時間を測定する.結晶化は,サーモグラフィにより検知する.Pd-Cu-SiおよびNi-Nb-Zr薄膜アモルファス合金で実際に測定を行ったところ,各合金の時間温度変態曲線を1回の加熱・保持試験で得ることに成功した.また,得られた結果から,アーレニウスプロットによる活性化エネルギの算出にも成功した.提案する手法では,従来の示差走査熱量計による測定と比較し,72%の測定時間の削減を達成した.次に,薄膜形状記憶合金については,大面積のTi-Pd-Ni薄膜形状記憶合金のマルテンサイト変態温度および逆変態温度を,サーモグラフィで検知することに成功した.サーモグラフィによる,非接触測定に成功したことで,今後,組成傾斜を有する薄膜ライブラリを利用した,薄膜形状記憶合金の変態温度のコンビナトリアル評価を実現することが期待できる。本研究課題では,上述の成果について,本年度中に投稿論文5編,国際会議での発表2回,国内会議での発表1回を行った.本研究では,サーモグラフィを利用した薄膜ライブラリ上での高効率熱特性評価法を研究することを目的としている.具体的な熱特性としては,薄膜アモルファス合金の結晶化開始温度と時間温度変態曲線,薄膜形状記憶合金のマルテンサイト変態温度の測定の実現を目指す.この中から,平成21年度は,薄膜アモルファス合金の結晶化開始温度測定について重点的に研究を行った.従来,DSC法による単一サンプルでの測定が一般的であったが,本研究では,サーモグラフィを利用し,結晶化を放射率変化として捉えることで,薄膜ライブラリ上での一括測定を行った.実際にPd-Cu-Si系薄膜アモルファス合金ライブラリで測定を行い,組成の異なる246のPdCuSi薄膜アモルファス合金の結晶化開始温度を,約2週間で測定することに成功した.従来法では,100日以上かかることが予想され,飛躍的な高効率化を実現したと言える.さらに,この中から3組成について,DSC試験の結果と比較を行ったところ,最大8Kの差異での測定を実現しており,本測定法の妥当性についても示すことができた.これらの成果について,21年度中に論文2本(内1本は査読返答済),国際会議1回,国内会議2回で発表を行った.また,並行して次年度以降の重点課題である,時間温度変態曲線,マルテンサイト変態温度測定のための準備も進めた.これらの測定には,それぞれ温度傾斜保持加熱機構と,加熱・冷却速度制御可能加熱冷却機構が必要となるため,これらの装置の製作を行った.温度傾斜保持加熱機構は,50mm程度の範囲内で200K以上の温度傾斜保持に成功した.加熱冷却機構は,ペルチェ素子を利用し,250400K程度の温度範囲で10K/minの制御に成功した.本研究では,サーモグラフィを利用し,条件の異なる微小な薄膜サンプルを集積した薄膜ライブラリ上での高効率熱特性評価法の実現を目的としている,具体的な熱特性として,薄膜アモルファス合金の結晶化特性,薄膜形状記憶合金のマルテンサイト変態温度の評価を目指してきた.平成21年度には,薄膜アモルファス合金の結晶化開始温度の高効率評価に成功した.そこで本年度は,薄膜アモルファス合金の時間温度変態曲線の高効率な解明法と,薄膜形状記憶合金のマルテンサイト変態温度評価法の基礎検討について重点的に研究を行った.時間温度変態曲線の高効率な解明法では,温度傾斜真空加熱炉を製作し,他種類の温度条件での保持試験を一括で行う手法を提案した,この加熱炉により,薄膜アモルファス合金サンプルを加熱・保持し,温度の異なる各部での結晶化までに要した時間を測定する.結晶化は,サーモグラフィにより検知する.Pd-Cu-SiおよびNi-Nb-Zr薄膜アモルファス合金で実際に測定を行ったところ,各合金の時間温度変態曲線を1回の加熱・保持試験で得ることに成功した.また,得られた結果から,アーレニウスプロットによる活性化エネルギの算出にも成功した.提案する手法では,従来の示差走査熱量計による測定と比較し,72%の測定時間の削減を達成した.次に,薄膜形状記憶合金については,大面積のTi-Pd-Ni薄膜形状記憶合金のマルテンサイト変態温度および逆変態温度を,サーモグラフィで検知することに成功した.サーモグラフィによる,非接触測定に成功したことで,今後,組成傾斜を有する薄膜ライブラリを利用した,薄膜形状記憶合金の変態温度のコンビナトリアル評価を実現することが期待できる。本研究課題では,上述の成果について,本年度中に投稿論文5編,国際会議での発表2回,国内会議での発表1回を行った.
ホモキラリティーの起源を探る分子化学

L体とD体は鏡像関係にあるので、反転運動によって相互に変換することができる。しかしながらアラニンなどではその反転運動のバリアーは高く簡単には変換しないため、別の分子として存在できる。一方、'軸性キラル'として知られる分子では変換のバリアーは低くなる場合がある。例としてイソプロパノール(CH3)2CHOHが研究されている。その分子のgauche formではD体とL体の交じり合いの結果、アンモニアのような反転分裂が観測されている。そのような準位からL体の性質をよく保有している状態へ赤外線を照射することにより遷移を起こさせ、それを固定すれば、最終的にはL体の濃縮につながる。今年度、赤外線励起用光源としての利用、及び高感度分光用光源として速続発振型赤外OPOレーザーを整備した。OPOレーザーは波長1ミクロンのシードレーザー光をファイバーアンプで最大20Wまで増幅し、LiNbO3の結晶に照射した。タイ型共振器を調整し、波長3ミクロンのアイドラー光、波長1.6ミクロンのシグナル光を得た。ポンプパワー5Wでアイドラー光の出力600mWがえられた。ポンプパワーを増大すればより大きな出力が得られるので、通常の振動回転遷移の励起には十分である。またこのOPOレーザーは分子の振動回転スペクトルの実時間測定にも応用できることを確認した。その場合は、PZTによりシードレーザー光の波長を変化させ、シグナル光を固定しておけば、アイドラー光の波長が変化する。すなわち周波数にして約100GHzを200VのPZTの電圧変化で掃引できた。この掃引を速くおこなえばオシロスコープ上で吸収スペクトル線とエタロンの干渉波形を同時に観測、記録することができた。新しい分光システムの感度を見積もっているところであるが、フーリエ変換型分光器にくらべて一桁以上の感度上昇が期待できている。これまでの研究により、分子ビームでの低温分子の測定、赤外励起によるL体、D体の分離へ適用できるようになった。本研究では、軸性キラル分子イソプロピルアルコール分子の内部回転運動によって混合している状態を利用して、赤外線照射、低温体への付着を行い、D体とL体の分離を試みることにより、ホモキラリティーの起源との関連を探ることを目的とする。本年度、研究の第一ステップとしてイソプロピルアルコールの振動回転準位を詳しく調べる実験を行った。これまで、低分解能のスペクトルは測定されているが高分解能スペクトルは報告されていない。高分解能フーリエ分光器を用いて測定を行ったが非常に複雑なスペクトルが観測された。連続分子線で試みたが、弱くて観測できなかった。パルスノズルでの実験が必要であると結論し、PZTを用いた高速繰り返しノズルを製作した。それを用いた実験が進行中である。初年度、イソプロピルアルコールの振動回転準位を詳しく調べるために、通常の多重反射セルにサンプルを導入し、高分解能スペクトルの測定を試みた。しかしながら、観測したスペクトルは多くの低振動状態からのスペクトルが多数重なり、個々の線を分離して測定できなかった。そこでPZTを用いた高速繰り返しパルスバルブを製作した。スペクトルの観測は時間分解フーリエ分光器で、高速サンプリングに適しているので、できるだけ速い繰り返しのPZTノズルを目指した。現在、繰り返し200Hzが実現している。フーリエ変換型分光器では広い波数範囲を同時に測定できるメリットはあるが、感度はレーザー分光系に比べると低くなるので、赤外OPOレーザーの整備を平行して行った。高感度が要求される場合はレーザーを用いることが可能になった。

そのような準位からL体の性質をよく保有している状態へ赤外線を照射することにより遷移を起こさせ、それを固定すれば、最終的にはL体の濃縮につながる。今年度、赤外線励起用光源としての利用、及び高感度分光用光源として速続発振型赤外OPOレーザーを整備した。OPOレーザーは波長1ミクロンのシードレーザー光をファイバーアンプで最大20Wまで増幅し、LiNbO3の結晶に照射した。タイ型共振器を調整し、波長3ミクロンのアイドラー光、波長1.6ミクロンのシグナル光を得た。ポンプパワー5Wでアイドラー光の出力600mWがえられた。ポンプパワーを増大すればより大きな出力が得られるので、通常の振動回転遷移の励起には十分である。またこのOPOレーザーは分子の振動回転スペクトルの実時間測定にも応用できることを確認した。その場合は、PZTによりシードレーザー光の波長を変化させ、シグナル光を固定しておけば、アイドラー光の波長が変化する。すなわち周波数にして約100GHzを200VのPZTの電圧変化で掃引できた。この掃引を速くおこなえばオシロスコープ上で吸収スペクトル線とエタロンの干渉波形を同時に観測、記録することができた。新しい分光システムの感度を見積もっているところであるが、フーリエ変換型分光器にくらべて一桁以上の感度上昇が期待できている。これまでの研究により、分子ビームでの低温分子の測定、赤外励起によるL体、D体の分離へ適用できるようになった。
顕微授精による牛精子の受精能の解析

筆者らは、ウシ精子一個を卵細胞質内に強制的に注入して授精させ、受精卵の作出と子ウシの生産が可能なことを実証した。しかし精巣内には精子以外に精子形成過程の精祖細胞、精母細胞、精娘細胞、精子細胞などの精細胞が多数存在する。特に精子細胞は、減数分裂を終了し、精子と同様に半数体である。そこで精子の代わりに精子細胞を卵細胞質内に注入して、受精卵を作出して子ウシを生産する可能性が十分考えられる。さらには精子細胞になる前の精祖細胞、精母細胞、精娘細胞を体外培養して減数分裂を完了させて精子細胞や精子まで発生させることができたら、これらの細胞を用いて顕微授精が可能になると考えられる。これらの可能性を追求することは受精生理学や発生学上きわめて意義あるものである。そこで本研究では下記の点について研究を進めた。1.ウシの精巣や精巣上体の各部(頭部・中片部・尾部)から未熟精子を採取してウシ卵子内に顕微注入し、受精卵の作出を試みた。2.ウシ精巣から採取した精子と精子細胞をウシ卵子内に顕微注入して受精卵の作出の可能性の有無を調べた。3.ウシ精巣から精娘細胞を集めて体外で精子細胞まで培養して顕微注入に用い、受精卵の作出を試みた。ウシの精巣や精巣上体中の未熟精子をウシ卵子内に顕微注入すると正常な受精卵が得られることがわかった。また精子細胞の顕微授精でも正常な受精卵が得られ、その受精卵の品質(細胞数/胚盤胞)は、生体から回収した受精卵と同等であることがわかった。以上の成果は、顕微授精の新たな可能性を示し、今後希少動物の増殖、優秀な雄ウシ精子の有効利用あるいはヒトの不妊治療に役立つものと思われる。
スチールベルト駆動機構のダイナミックスと位置制御

本研究では,スチールベルト駆動機構の特長を生かした高速・高精度位置決めを実現することを目的に,下記のことを行った.なお,購入したデータ解析,制御系設計装置は,データ処理,制御系の設計などに利用した.(1)スチールベルト駆動機構の計測・制御系本研究で対象としている機構は,可動範囲が200mm以上ある.この範囲でサブミクロン以下の測定精度を得るために,レーザ測長機を取り付けた.またデータ処理能力を向上させるため,演算処理装置を高性能なものに交換した.(2)機構のダイナミックスステップ高さを変えた位置決め実験を行った結果,機構の動特性が変位領域の大きさによって変化することが分かった.そこで次に,ナノメートルオーダからミリメートルオーダの範囲の動特性のモデル化を検討した.その結果,領域を10μm1mmとその前後用の3種類のダイナミックスモデルで,機構の動特性を表現できることが分かった.但し10μm1mmの領域は,その前後の境界領域としての色彩が濃く,他の領域に比べ,実際の機構の特性を精密にモデル化するのは困難であった.(3)位置制御機構のダイナミックスモデルを利用して,各変位領域での位置制御実験を行った.コントローラは,各変位領域毎に設計した.その結果,いずれの領域においても位置決め精度を0.1μmまで実現できた.精度限界は,現在設置環境の問題のため,センサの性能を十分発揮できないことにある.今後は,この点を改善し,さらなる高精度化を図る必要があると考えている.本研究では,スチールベルト駆動機構の特長を生かした高速・高精度位置決めを実現することを目的に,下記のことを行った.なお,購入したデータ解析,制御系設計装置は,データ処理,制御系の設計などに利用した.(1)スチールベルト駆動機構の計測・制御系本研究で対象としている機構は,可動範囲が200mm以上ある.この範囲でサブミクロン以下の測定精度を得るために,レーザ測長機を取り付けた.またデータ処理能力を向上させるため,演算処理装置を高性能なものに交換した.(2)機構のダイナミックスステップ高さを変えた位置決め実験を行った結果,機構の動特性が変位領域の大きさによって変化することが分かった.そこで次に,ナノメートルオーダからミリメートルオーダの範囲の動特性のモデル化を検討した.その結果,領域を10μm1mmとその前後用の3種類のダイナミックスモデルで,機構の動特性を表現できることが分かった.但し10μm1mmの領域は,その前後の境界領域としての色彩が濃く,他の領域に比べ,実際の機構の特性を精密にモデル化するのは困難であった.(3)位置制御機構のダイナミックスモデルを利用して,各変位領域での位置制御実験を行った.コントローラは,各変位領域毎に設計した.その結果,いずれの領域においても位置決め精度を0.1μmまで実現できた.精度限界は,現在設置環境の問題のため,センサの性能を十分発揮できないことにある.今後は,この点を改善し,さらなる高精度化を図る必要があると考えている.
神経活動評価のための顕微鏡オートフォーカスと蛍光画像解析

本研究の目的は、生物が持つ「神経系の活動状態」とそのアウトプットとしての「行動」を高い時間・空間分解能で計測する装置を開発することである。生物の行動を理解するためには、それを作り出している神経系の複雑な情報処理過程を解明することが必要不可欠である。しかし、近年の行動遺伝学の進展にもかかわらず多段階の情報処理過程はいまだにほとんど明らかにされていない。その最も大きな原因は、観察倍率と視野サイズがトレードオフの関係にあり、運動する生物を高い空間分解能で長時間観察することができないことにある。そこで本研究では、「顕微鏡画像のフィードバックにより顕微鏡ステージを制御して生物の行動を追跡する」という、本質的な解決策により、高い時間分解能を保ったまま神経活動を長時間記録・解析可能なシステムを開発する。とくに、モデル生物として盛んに研究されている線虫(C. elegans)やゼブラフィッシュ(Danio rerio)の神経部位を明視野像と蛍光像を用いてリアルタイム追跡し、同時に神経細胞の蛍光像を定量計測できる顕微鏡の実現を目指す。本年度は、線虫の変形やZ軸方向のズレにロバストな画像処理アルゴリズムとその高速化手法の開発、高精度な三次元追跡システムの実現、神経細胞レベルで光刺激可能な光学プロジェクタシステムの実現、1600fps超高速カメラを用いたゼブラフィッシュトラッキングシステムの実現などを実施した。これらの成果は、埼玉大学中井教授、大阪大学木村准教授、名古屋大学森教授、東京大学飯野教授などの研究室に導入され、今年度はシステムハードウェア・ソフトウェアの改良を行いつつ、いくつかの重要な共同研究成果を発表するに至った。24年度が最終年度であるため、記入しない。そのもっとも大きな原因は、観察倍率と視野サイズがトレードオフの関係にあり、運動する生物を高い空間分解能で長時間観察することができないことにある。そこで本研究では、顕微鏡画像のフィードバックにより顕微鏡ステージを制御して生物の運動を追跡するという本質的な解決策により、高い空間分解能を保ったまま神経活動を長時間記録・解析可能なシステムを開発する。とくに、モデル生物として盛んに研究されている線虫(C.elegans)やゼブラフィッシュ(Danio rerio)の神経部位を明視野像と蛍光像を用いてリアルタイム追跡し、同時に神経細胞の蛍光像を記録できる顕微鏡の実現を目指す。本年度は、線虫の変形やZ軸方向のずれにロバストな画像処理アルゴリズムおよびその高速化手法、神経細胞の蛍光像をフィードバックしたオートフォーカス手法、高精度な三次元追跡が可能なビジュアルサーボステージを開発した。実際、埼玉大学中井教授、大阪大学木村准教授、名古屋大学森教授、東京大学飯野教授などの研究室にXYZステージを導入し、フィードバック制御アルゴリズムを提供した。これらの共同研究の成果は学会発表の予定である。線虫のトラッキングはロバストに実現できている。オートフォーカスは明視野カメラで評価する範囲では高い精度で実現できている。次のステップとしては蛍光画像での評価が必要である。さらに、蛍光カメラのフィードバックを実現し、ロバスト性を高めたい。ゼブラフィッシュのトラッキングは着手したばかり。変形やZ軸方向の位置ずれにロバストな画像処理アルゴリズムを開発し、神経細胞の蛍光像を利用したオートフォーカスを実現する。線虫の体のくねりや光軸方向の位置ずれが生じた際にも対象神経細胞を追跡することのできる画像処理アルゴリズムを開発する。画像取得、画像処理、ステージ移動コマンド出力が制御ループとなり全体の処理速度を決定するので、高速化のために並列画像処理手法を開発する。
骨細胞のマルチスケール力学解析に基づく力学刺激感知機構の解明

本研究では、骨リモデリング過程における骨細胞の力学刺激感知機構を明らかにするため、微視的な高分子構造から巨視的な骨基質の材料特性までを考慮したマルチスケール力学解析を行った。まず、骨細管内に存在する細胞周囲マトリックスを考慮した流体ー構造連成解析を通じ、間質液流れによる骨細胞突起の変形を調べた。また、層板構造を有する骨組織を多層多孔質弾性体としてモデル化し、骨小腔ー骨細管系内の骨細胞に負荷される流れ刺激を定量的に評価した。さらに、骨小腔ー骨細管構造の異なる骨梁に対してリモデリングシミュレーションを行い、微細な流路構造の相違が骨梁の適応的な形態変化を及ぼす影響を明らかにした。本研究では,骨リモデリング過程における骨細胞の力学刺激感知機構を明らかにするため,微視的な高分子構造から巨視的な骨基質の材料特性までを考慮したマルチスケールな力学解析を通じ,骨細管内の間質液流れにより骨細胞に付与される力学刺激の定量的評価を目指している.本年度は,繰返し荷重下における骨梁内部の間質液流体圧を理論的に解析するとともに,流体圧勾配により骨細管内に生じる間質液の流れ場と,それにともなう骨細胞突起の変形挙動についてシミュレーションによる検討を行った.以下に,本年度中の主な研究実施内容と,得られた成果をまとめる.1.層板構造を有する骨梁内部における間質液流体圧の多孔質弾性解析海綿骨の微視構造要素である骨梁は,発達した層板構造を有する多孔質体であり,生体内において歩行運動や姿勢維持等に起因する繰返し荷重を受けている.そこで,単体骨梁を各層で透水係数が異なる二次元多層多孔質弾性体としてモデル化し,繰返し荷重下における間質液の流体圧分布を理論的に解析した.その結果,荷重周波数が一定であれば,骨梁内部に比べ骨梁表面の透水係数値が小さい場合の方が,より顕著な流体圧勾配が発生することが示された.2.骨細管のイメージベースモデルを用いた骨細胞突起変形シミュレーション超高圧電子顕微鏡観察に基づき,骨細胞突起を含む骨細管のイメージベースモデルを作成した.骨細管内の細胞周囲マトリックスを考慮し,格子ボルツマン法と骨細胞膜の粗視化粒子モデルとを組み合わせた流体構造連成解析を行うことにより,骨細管内における間質液の流れと,それにともなう骨細胞突起の変形挙動を解析した.その結果,骨細管壁の微視的な凹凸により発生した不均質な流れ場により,骨細胞突起に複雑なひずみ分布が確認された.また,細胞周囲マトリックスが密に分布するほど,間質液の流れ,および,細胞突起の変形は,抑制されることが示された.本研究では,微視的な高分子構造から巨視的な骨基質の材料特性までを考慮したマルチスケール力学解析を通じ,リモデリングによる骨の機能的適応過程における骨細胞の力学刺激感知機構を明らかにすることを目指している.本年度は,昨年度に実施した多孔質弾性解析を拡張し,層板構造を有する円柱状の骨梁および骨単位内部の間質液流れを評価するとともに,骨細管中において流れを受けるプロテオグリカンの挙動を分子動力学法により解析した.以下に,本年度中の主な研究実施内容と得られた成果をまとめる.1.骨梁・骨単位内部における間質液流れの多孔質弾性解析海綿骨ならびに皮質骨の微視構造要素である骨梁・骨単位を,それぞれ不均質な材料特性を有する中実円柱・中空円柱形状の多孔質弾性体としてモデル化し,繰返し荷重下における内部の間質液流れを理論的,数値的に解析した.その結果,間質液の流路である骨小腔ー骨細管形態の不均質な空間分布は,骨細胞への流れ刺激に大きな影響を及ぼし得る重要な因子であることが示された.2.間質液流れを受けるプロテオグリカンの分子動力学解析骨細胞による流れ刺激感知過程において,骨細管中に存在するプロテオグリカンの果たす役割を明らかにするため,間質液流れにともなうプロテオグリカンコアタンパク質の構造変化を分子動力学法により解析した.その結果,間質液の流速とコアタンパク質に蓄積される内部エネルギーとの関連を定量的に評価することができた.本研究では,微視的な高分子構造から巨視的な骨基質の材料特性までを考慮したマルチスケール力学解析を通じ,リモデリングによる骨の機能的適応過程における骨細胞の力学刺激感知機構を明らかにすることを目指している.昨年度の研究により,骨細胞への流れ刺激を定量的に評価する上で,間質液の流路である骨小腔ー骨細管形態の不均質な空間分布の重要性が明らかとなった.そこで本年度は,骨組織内部における骨小腔ー骨細管系の構造的特徴が,骨細胞に対する流れ刺激,およびリモデリングによる骨組織の形態変化に及ぼす影響をシミュレーションにより検討した.以下に,本年度中の主な研究実施内容と得られた成果をまとめる.1.骨細胞に対する流れ刺激の定量評価骨梁を多孔質弾性体とみなし,扁平骨様の太い骨細管を持つ単体骨梁モデル(Model F)と,長管骨様の細い骨細管を持つ単体骨梁モデル(Model L)を作成した.骨小腔ー骨細管系の構造が異なるこれら2種類の骨梁モデルに対し,繰返し荷重が負荷された際に,内部の骨細胞に作用する流れ刺激を定量的に評価した.その結果,Model Fの方がModel Lよりも骨細胞への流れ刺激が大きいことが示された.2.骨小腔ー骨細管形態を考慮した骨梁リモデリングシミュレーション骨小腔ー骨細管系の構造が異なる上記2種類の単体骨梁モデルに対して同一の荷重を負荷し,リモデリングシミュレーションを通じてそれらの形態変化を解析した.

その結果,いずれのモデルにおいても荷重方向に配向した骨梁が形成されたが,リモデリング後における骨梁の体積を比較すると,Model Fの方がModel Lより約2倍の太さを有することが示された.以上の結果から,骨組織内部における骨小腔ー骨細管形態の相違は,骨細胞が感知する力学刺激量の調整に関連していることが示唆された.骨細胞に作用する流れ刺激を定量的に評価するとともに,マルチスケール力学解析を通じ,骨組織の微視的な構造がリモデリングによる巨視的な骨形態変化に及ぼす影響を明らかにできたことから,本研究はおおむね順調に進展しているものと考えられる本研究では,微視的な高分子構造から巨視的な骨基質の材料特性までを考慮したマルチスケール力学解析を通じ,リモデリングによる骨の機能的適応過程における骨細胞の力学刺激感知機構を明らかにすることを目的として,以下の成果を得た.1.間質液流れによる骨細胞突起の変形評価:格子ボルツマン法と骨細胞膜の粗視化粒子モデルとを組み合わせた流体構造連成シミュレーションにより,骨細管内における間質液の流れと,それにともなう骨細胞突起の変形挙動を解析した.これにより,細胞周囲マトリックスの密度が,骨細胞のひずみ分布に及ぼす影響を明らかにした.2.骨梁・骨単位内部における間質液流れの定量評価:海綿骨・皮質骨の微視構造要素であり,発達した層板構造を有する骨梁・骨単位を,それぞれ不均質な材料特性を有する多孔質弾性体とみなし,繰返し荷重下における内部の間質液流れを解析した.これにより,間質液の流路である骨小腔ー骨細管形態の不均質な空間分布が,骨細胞への流れ刺激に及ぼす影響を明らかにした.3.間質液流れが骨梁形態変化に及ぼす影響の評価:骨小腔ー骨細管構造の異なる骨梁モデルに対してリモデリングシミュレーションを行い,力学荷重に対する骨梁の適応的な形態変化を解析した.これにより,骨組織内部における骨小腔ー骨細管形態の相違は,骨細胞が感知する流れ刺激量の調整に寄与しており,骨量を制御している可能性が示唆された.最終年度においては,上述の研究成果をより精緻なものにするため,追加の解析を実施して学術論文としてまとめるとともに,国際会議にて研究発表を行った.本研究では、骨リモデリング過程における骨細胞の力学刺激感知機構を明らかにするため、微視的な高分子構造から巨視的な骨基質の材料特性までを考慮したマルチスケール力学解析を行った。まず、骨細管内に存在する細胞周囲マトリックスを考慮した流体ー構造連成解析を通じ、間質液流れによる骨細胞突起の変形を調べた。また、層板構造を有する骨組織を多層多孔質弾性体としてモデル化し、骨小腔ー骨細管系内の骨細胞に負荷される流れ刺激を定量的に評価した。さらに、骨小腔ー骨細管構造の異なる骨梁に対してリモデリングシミュレーションを行い、微細な流路構造の相違が骨梁の適応的な形態変化を及ぼす影響を明らかにした。層板構造にともなう材料特性の不均質性が骨組織内部の間質液流れ場に及ぼす影響を明らかにするとともに,流れを受けるプロテオグリカンの力学的挙動を分子レベルで評価できたことから,本研究はおおむね順調に進展しているものと考えられる.これまでの研究成果をまとめ,国際会議にて研究発表を行うとともに,学術論文を作成し,国際学術誌に投稿する予定である.
モルモット嗅上皮分裂細胞の動態(嗅細胞の分化成熟と細胞死の関連について)

(目的)嗅細胞の再生母細胞は基底細胞の一層上にある分裂細胞とされており、嗅上皮内には分裂細胞が多数集積しているいわゆるactive zoneとほとんど分裂期の細胞のみられないquiescent zoneが存在する。これは多くの嗅細胞が細胞死を迎えているzoneと嗅細胞が成熟期に入っているzoneがあるためと考えられる。ところで恒常的に嗅細胞数を維持するにはこれらのzoneは常に変動すると考えられる。今回zoneの動向をBromodeoxy-uridine(BrdU)の反復投与により、免疫組織化学染色的手技を用いて経時的に観察した。(材料および方法)実験には体重約850gの生後約4カ月の成熟モルモットを用いた。分裂期の細胞の標識のため、BrdU80mg/kgを初回と断頭1時間前の2回、腹腔内に反復投与した。BrdU初回投与後それぞれ5,14,28日後に鼻中隔後上部より嗅上皮を採取した。嗅上皮はパラフィン包埋し、5μm切片を作製、SABC法によりBrdUに対する免疫組織化学的染色を行った。基底細胞直上のactive zoneと嗅上皮中間層にBrdU陽性細胞が存在する領域を比較し重複率を求め、zoneの変動を検討した。(結果および考察)BrdU初回投与5日後の嗅覚上皮ではzoneの重複率は平均48.6%であったが、BrdU初回投与14,28日後の嗅上皮ではぞれぞれ29.3%,22.9%となった。以上の結果からactive zoneは嗅細胞の恒常性のために徐々に変動していることが考えられた。(今後の方針)現在28日までしか検討していないが、BrdU投与後35日まで増やし検討中である。また各日数でのn=2から3であるため、n=5まで増やし、検討中である。今回zoneの動向をBromodeoxyuridine (BrdU)の反復投与により、免疫組織化学染色的手技を用いて経時的に観察した。(材料および方法)実験には体重約850gの生後約4ヵ月の成熟モルモットを用いた。分裂期の細胞の標識のため、BrdU 80mg/kgを初回と断頭1時間前の2回、腹腔内に反復投与した。
雄が雌の体表へと寄生する、チョウチンアンコウ亜目魚類の繁殖生態に関する組織学的研究

硬骨魚類は地球上のほぼ全水域へと適応放散を遂げた、脊椎動物中最も繁栄した分類群である。なかでも中深層性のチョウチンアンコウ亜目魚類は非常に興味深い分類群である。11科、約160種中4科において、雄が雌の体表へと寄生する。しかし、寄生を伴うこの特異な繁殖生態に関する詳細な研究は未だ行われていない。本研究では、脊椎動物中他に例を見ないチョウチンアンコウ亜目魚類の寄生機構の解明を目的とした。研究実績は以下の通りである。1:組織学的研究。凍結置換法によりミツクリエナガチョウチンアンコウの精子を凍結・固定し、TEMにて微細構造の観察を行なった。精子は大きな球状の核を有する特徴的な構造をしており、今後精子間競争など、興味深い研究材料となることが期待される。海洋研究船白鳳丸KH00-2次航海において採集された、体表に8個体の雄を寄生させていたミツクリエナガチョウチンアンコウの雌個体を材料に、雄と雌の結合部の組織学的観察を行うための作業を行い、現在精査中である。2:寄生機構。雄が雌の体表へと寄生する様式には少なくとも二通りあることが判明した。この研究結果は、平成15年度日本水産学会大会(平成15年4月2日、東京水産大学)にて発表した。3:雌から雄への栄養供給機構。北海道大学水産学部魚類コレクション所蔵標本、KH01-3次航海採集標本より、雌と寄生雄の組織片を切除し、窒素と炭素安定同位対比を測定した。雌雄の安定同位体値の比較から、雌から雄へと確実に栄養分が供給されていることが判明した。本補助金により実施された研究より、雌の体表へ雄が寄生するチョウチンアンコウ亜目魚類の寄生機構、繁殖生態について新知見が多数得られた。しかしまだ研究の出発点に到達したばかりである。今後寄生機構の解明のために、採集努力量を増し、新規採集個体を用いて寄生部位の詳細な組織学的観察、トレーサー等の注入による雌から雄への栄養分の移動過程の追跡、寄生時の免疫系抑制機構の働きなどの研究を展開する予定である。硬骨魚類は、地球上のほぼ全ての水域へと適応放散を遂げた、脊椎動物中最も繁栄した分類群である。現在約24,000種の魚類が確認されている。なかでも中深層性魚類のチョウチンアンコウ亜目はひときわ眼を引くユニークな分類群である。現在11科、約160種が知られ、そのうち4科において、雄が雌の体表へと寄生する事が知られている。この雄が雌の体表へと寄生するチョウチンアンコウ亜目魚類の特異な繁殖生態は、古くから知られていた。しかし、雄が寄生した雌の採集報告はあるが、この寄生による繁殖生態に関する詳細な研究は未だ行われていない。本研究では、この脊椎動物中他に例を見ないチョウチンアンコウ亜目魚類の寄生機構の解明を、組織学的手法を用いて行うことを目的とした。研究の第一段階として、既存の標本の精査を実施した。アメリカ合衆国のワシントン大学水産学部魚類コレクションへと赴き、チョウチンアンコウ亜目研究の第一人者であるTheodore W.Pietsch教授と情報交換を行った。その結果、雄が雌の体表へと寄生する様式には少なくとも二通りあることが判明した。第二段階として、海洋研究船白鳳丸KH00-2次航海において採集された、体表に8個体の雄を寄生させていたミツクリエナガチョウチンアンコウの雌個体を材料に、雄と雌の結合部の組織学的観察を行うための作業を行い、現在精査中である。第三段階として、分子生物学的手法を用いて雌雄間並びに寄生雄同士の同胞鑑定を実施すべく、分子生物学的手法の確立作業を行っている。練習台として、タツノオトシゴ類の系統類関係をミトコンドリア16S r RNAの塩基配列情報より求め、その結果を学術雑誌DNA多型へと投稿し、印刷となった(小林敬典、正岡哲治、塚田修、古田正美、猿渡敏郎2002)。1:組織学的研究。2:寄生機構。

この研究結果は、平成15年度日本水産学会大会(平成15年4月2日、東京水産大学)にて発表した。3:雌から雄への栄養供給機構。北海道大学水産学部魚類コレクション所蔵標本、KH01-3次航海採集標本より、雌と寄生雄の組織片を切除し、窒素と炭素安定同位対比を測定した。雌雄の安定同位体値の比較から、雌から雄へと確実に栄養分が供給されていることが判明した。本補助金により実施された研究より、雌の体表へ雄が寄生するチョウチンアンコウ亜目魚類の寄生機構、繁殖生態について新知見が多数得られた。しかしまだ研究の出発点に到達したばかりである。今後寄生機構の解明のために、採集努力量を増し、新規採集個体を用いて寄生部位の詳細な組織学的観察、トレーサー等の注入による雌から雄への栄養分の移動過程の追跡、寄生時の免疫系抑制機構の働きなどの研究を展開する予定である。