hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
急性呼吸不全に対する腹臥位管理の換気力学と換気パターンに及ぼす影響の分析

近年、急性呼吸不全に対する新しい呼吸管理法として腹臥位管理法が開発された。我々は腹臥位にはPaO2と肺病変を改善する効果のあることを既に報告した。本研究は急性呼吸不全を対象に腹臥位のPaO2改善効果に換気力学的な分析を加えること、併用する呼吸理学療法の効果を検討することを目的に実施した。腹臥位への体位変換によってPaO2は約30%増加し、同時に自発呼吸仕事量(WOBp)は約17%有意に軽減した。この成績は、過去に報告が無く新知見である。さらに、気道抵抗(Raw)と動肺コンプイアンス(Cdyn)は、それぞれ約17%、約25%有意に改善した。肺酸素化能改善の機序が、腹臥位にすると背側肺障害領域が上側になるため、障害肺が増加した自己重量の圧迫から解放されて、局所換気が改善、換気血流比(Vr/Qr)が増加するためと考えると、同時に生じたWOBp改善など換気力学的変化は、すべて無理なく説明できる。さらに、呼吸理学療法の基本手技である呼吸介助法は、急性呼吸不全に伴う浅い頻呼吸を抑制し、一回換気量増加と呼吸数減少をもたらした。この効果は努力呼吸を併用すると増強された。従って、用手呼吸介助は強制的呼出に続いて強い吸気(胸腔内陰圧)を作るため、pulmonary interdependenceによる虚脱肺胞や末梢気道を再拡張を促進すると考えられ、腹臥位管理との併用は吸気時の胸腔内陰圧をより増強するので有利であると結論できた。腹臥位の効果は非侵襲的呼吸管理に有用である。さらに、今回の成績によって、自発呼吸仕事量を軽減し吸気時の胸腔内陰圧を増強する治療、例えば陰圧人工呼吸補助法、ヘリウム併用の呼吸管理法を併用することが、呼吸管理法の新しい方向として示唆できた。現在、本研究の申請が承認されて約4ヶ月が経過した。新たに組み上げた測定系の安定性、測定精度、稼働状態の点検に大部分の時間を費やしている。さらに、研究代表者の救急部への配置換え(平成7年12月1日付け)、つづいて研究分担者の配置換えが起こり、集中治療部から救急部ICUで研究を再開する事となった。このため本格的な研究活動は平成8年度に入れば研究分担者が再び揃うため、積極的に推進する事ができる。【研究実績】この間、従来、測定報告の全くない用手的呼吸介助の換気力学に及ぼす影響についてpreliminary studyを行ったので、その結果を報告する。【対象と方法】腹臥位呼吸管理に併用する肺理学療法の中心である用手的呼吸介助を、その専門家であるリハビリテーション理学療法士が急性呼吸不全患者で行い、その効果を換気力学的に測定した。急性呼吸不全で呼吸管理施行中の12例を対象とした。仰臥位、気管内チューブ挿管、圧支持換気モードにて人工呼吸中である。【結果】(1)肺不全のため呼吸数が15/min以上の患者では減少し、一回換気量が増加した。そのため分時換気量は正常値に近づいた。一方、呼吸数が少ない患者では、一回換気量と分時換気量が正常方向に改善した。(2)呼吸回数の多い患者では、最大吸気及び呼気流速が正常に向かって減少した。呼吸数の少ない患者では、最大吸気流速は増加し、最大呼気流速は低下し、それぞれ正常範囲い近づいた。【考察】これらの成績は、用手的呼吸介助が肺不全の異常な換気運動を正常範囲に近づける方向で作用すると推定できた。これは新知見であるため第23回日本集中治療医学会総会(1996. 1,横浜)において報告し、多くの注目を受けた。

さらに、今回の成績によって、自発呼吸仕事量を軽減し吸気時の胸腔内陰圧を増強する治療、例えば陰圧人工呼吸補助法、ヘリウム併用の呼吸管理法を併用することが、呼吸管理法の新しい方向として示唆できた。【目的】急性呼吸不全における体位依存性肺酸素化能改善効果と用手的呼吸介助(MRS)の促進効果を換気力学的側面から分析することである。【方法】人工呼吸補助下の自発呼吸で、腹臥位(あるいは前傾側臥位)に伴う換気力学的変化、換気パターンの変化を測定した。同時にMRS併用による影響を分析した。【結果】現在のところ腹臥位による換気力学的変化は、個体差が大きく有意な変化を認めていない。MRSにより一回呼出量が増加し努力性呼気に匹敵するが、呼吸仕事量はやや少ないが有意でない。MRSによる一回呼出量の増加は下部胸郭に加えられた時に著しい。【考察】急性呼吸不全の換気改善にMRSは有効である。換気力学的評価が定まらなかったのは、人工呼吸補助の程度や肺障害の程度が影響した結果と考えられる。また、MRSの効果も、施行者のテクニックによって著しく異なる。さらに測定を重ね、分析を進める。
会員制(クラブシステム)による農産物の生産販売に関する基礎的研究

ピンクレディーシステムはりんごの新品種に関し育成者権と商標権を盾にクラブ制を用いて育成者の権益を保護しながら、販売価格の維持をはかることを目的にオーストラリアから始まった。わが国ではクラブ制システムに近い制度を導入しているのは、弘前中央青果の専用利用権の行使であるが、これは生産段階に限ったクラブ制と言える。今後、品種経営の時代の到来が予測される中で日本の対応が問われている。今日、各分野において知的財産権の保護が重要な課題になっている中で、農業分野は遅れていると言わざるを得ない。その理由として、従来の農産物の生産販売システムでは、知財に関する権利意識が希薄だったため参入自由が一般的とされ、有望な品種でも生産拡大による供給増加に伴い、価格の低下や農家の経営難を生じさせていた。それに対し、今日、日本を含む先進諸国において知的財産権(育成者権と商標権)を生かした会員制(Club System)、つまり品種栽培許諾とともに商標使用ライセンス契約を通じて農産物の生産販売を行おうとする新しい取組が活発化しつつある。この研究は内外における会員制の事例研究を通じて会員制の特徴を明らかにすると同時に、今後のわが国における農業振興にいかに寄与できるか、その応用可能性について調査研究することを目的としている。今年度は、育成者権や商標権、ライセンシング・ビジネスに関する先行研究を中心に知財関連文献のサーベイを行い、現状と課題を整理した。Websiteから情報を収集し、整理する。国内現地調査として、国内で会員制に取り組んでいる地域を訪問調査した。具体的には、弘果(青森県弘前市)の専用利用権制度、岩手県花き開発センター(岩手県安代町)の「安代りんどう」の会員制調査、日本ピンクレディー協会とシナノゴールドの海外栽培許諾(長野県)調査を行った。また、10月に長野で開催された国際ピンクレディー連盟の総会に出席し、ピンクレディー・システムにかかわる世界中の関係者と知見を交流した。さらに、2月にオーストリア、ニュウジーランドの現地調査を行い、次年度の研究継続が可能となった。従来の農産物の生産販売システムでは、知財に関する権利意識が希薄だったため参入自由が一般的とされ、有望な品種でも生産拡大による供給増加に伴い、価格の低下や農家の経営難を生じさせていると言える。それに対し、この研究は内外における会員制の事例研究を通じて会員制の特徴を明らかにすると同時に、今後のわが国における農業振興にいかに寄与できるか、その応用可能性について調査研究することを目的としている。今日、日本を含む先進諸国において知的財産権(育成者権と商標権)を生かした会員制(ClubSystem、クラブシステム)を取る新しい取組が活発化しつつある。そこで今年度は、品種栽培許諾とともに商標使用ライセンス契約を通じて農産物の生産販売を行っている海外の主要なりんご生産地の調査を行った。2011年3月オーストリア/ニュージーランド(調査者:黄・カーペンター)2011年9月中国く遼寧省・新彊ウイグル自治区〉(調査者:黄・カーペンター)2011年11月米国くワシントン州〉(調査者:荒川・カーペンター)また、わが国の農産物輸出において「クラブ制」をとる「安代りんどう」(岩手県安代市)の農家会員調査を行った。これはりんごの事例ではないが、わが国においては数少ない「クラブ制」を導入している取り組みであり、りんごのクラブ制を考える上で参考になった。さらに2011年10月に弘前大学において国際りんごシンポジウムを開催し、オーストラリア、アメリカ、中国から研究者を招待し、りんごのクラブ制に関する報告を行ってもらい、クラブ制の長所と短所を明らかにした。このシンポは地域の農業関係者に公開し、200名弱の参加者があり、クラブ制を理解する上で役立つ取り組みと評価された。農産物の知財に関する権利意識はようやく関係者の関心事となってきた。事例のピンクレディーシステムはりんごの新品種に関し育成者権と商標権を盾にクラブ制を用いて育成者の権益を保護しながら、販売価格の維持をはかることを目的にオーストラリアから始まった。しかし、我が国ではこれに関する本格的な研究は見られなかった。本研究では、このことに関する世界的な動向を調べると同時に我が国での取り組みの現状を調査し、考察を行った。最終年度の本年度は、手つかずであったヨーロッパ、南米などを調査した。具体的には、12012年9月イタリア/フランス(カーペンター・黄・荒川)、22013年1月中国/広州・上海(調査者:カーペンター・黄)、32013年3月チリ(調査者:カーペンター)を調査することができた。国内では、クラブ制にまでは至っていないが専用利用権を導入する岩手県八幡平市の安代りんどうの輸出の事例とりんご地帯の弘前中央青果株式会社の取り組みを明らかにした。専用利用権を持つ弘果は,契約農家だけに栽培を与えるが,結実りんごの販売市場を強制し,権益を確保している。言わば品種育成者権は活用しているが,商標権まで視野に入れた活用をしていない。それ故,弘果の専用利用権はピンクレディーのクラブ制と比較すると生産段階に限ったクラブ制と言える。

とはいえ、現在、専用利用権を有する「大紅栄」の販売が中国・台湾市場で順調に展開しており、知財を活用した事例としては注目される。農産物の知財マネジメント(品種経営)は世界で始まったばかりであり,今後さまざまな取り組みが予想される。品種経営の時代の到来が予測される中で日本の対応が問われている.これらについて日本農業経済学会(2013年3月、東京農業大学)で一部を報告した。海外調査及び国内調査も順調に実施することができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。海外調査では、ニュージーランド、,オーストラリア、中国、米国の実態を調査することができた。今年度は可能であればヨーロッパ調査を実施したい。
フラーレン誘導体の非局在電子・水素結合系の構築

C_<60>はそのLUMOが比較的低いため、通常求電子剤として機能し、求核剤にはならない。しかし、C_<60>を2電子還元してC_<60>^<2->とすると、ハロゲン化アルキルの様な求電子剤と反応してアルキル付加体が得られる。こうして得られたアルキル付加体に、再度この手法を適用することで、更に高次なフラーレン誘導体化を図ることができると考えられる。一方、フラーレン類の3重項励起状態は、基底状態のフラーレンに比べてその求電子性が著しく増大する。本研究では、フラーレン類のアニオン種や光励起状態の高い反応性を利用した熱および光付加反応について検討を行った。C_<60>^<2->とハロゲン化アルキル(RX)との反応は電子移動を経て進行し、ここで生成したRC_<60>^-と立体障害の小さい種々のハロゲン化アルキルとの反応は、S_N2機構により進行し、C_<60>のジアルキル付加体が得られた。また、C_<70>についても同様にジアルキル付加体が得られた。C_<60>のジベンジル付加体を電気化学的に還元してジアニオンとするとC_<60>^<2->よりも更に高い電子供与能を有し、臭化ベンジルとの反応でテトラベンジル付加体が生成することを見出した。得られた生成物から、2種類のテトラベンジル付加体を単離し、その構造をX線結晶構造解析により明らかにした。C_<60>、C_<60>ジベンジル付加体、テトラベンジル付加体のラジカルアニオンを各々ESRにより観測すると、ESRシグナルの線幅(ΔH_<msl>)は、この順に小さくなることがわかった。一方、4-アルキルNADH類縁体のt-BuBNAHとC_<70>との反応は、脱酸素ベンゾニトリル中暗所で全く進行しないが、可視光を照射するとt-ブチル付加体アニオン(t-BuC_<70>^-)が選択的に生成することを見いだした。
農協経営機構の情報論的研究

農産物輸入自由化、金融自由化等の進展に伴う農協危機克服策として、農協の大規模合併の促進が図られているのであるが、大規模化に伴い、経営効率の低下をきたし、組合員の農協離れを招いている農協も少なくはないのが実態である。農協経営は、大規模化するに伴って経営管理機構が複雑になり組合員の意向が農協のトップに反映しづらくなると同時に、農協トップの意思が現場の職員に浸透しづらくなる等の理由から、大規模化の経済的メリットを上回りデメリットが発生するためである。そこで本研究では、二カ年にわたり、多数の近代経営学・管理会計に関する文献の探索を行うとともに、全国農協中央会、各県農協中央会等をはじめ、関係諸機関、著名農協において、資料収集とヒアリングを行った。(1)合併大型農協を類型区分すると同時に、それらの経営管理機構の実態をその機構図の変遷からパタ-ン化し、類型区分を行ない、機構の望ましい在り方を示した。(2)農協における現地サ-ベイの結果、トップマネジメント機構の在り方が極めて重要であることに注目し、大型農協にふさわしいトップ機構として組織代表としての組合員ポストの先進性と安定性を同時に実現する方策や作目部会代表、婦人部代表等の理事を確保する方策等についての検討を行った。総務庁による農協の行政監察においても指摘されている営農指導体制強化に関しても、情報論的視点から経営管理の刷新を通して若干の改善方向を見出した。また、合併の促進と合併後の運営効率化の双方の視点から“連邦制"の試みを提唱した。農産物輸入自由化、金融自由化等の進展に伴う農協危機克服策として農協の大規模合併の促進が図られているのであるが、大規模化に伴い、経営効率の低下をきたし、組合員の農協離れを招いている農協も少なくはないのが実態である。これは、大規模化の経済的メリットを上回るデメリットが発生するためである。大規模化のデメリットの最大のものは、農協経営管理機構が複雑になり、組合員の意向が農協のトップに反映しづらくなると同時に、農協トップの意思が現場の職員に浸透しづらくなる等の理由から生ずる経営効率の低下である。そこで本研究では、三ヶ日町農協、神戸西農協等の農協の現地実証調査を踏まえ、情報論的視点から、経営管理機構のあるべき姿について試論を構築した。(1)合併大型農協を類型区分すると同時に、それらの経営管理機構の実態を、その機構図の変遷からパターン化し、類型区分を行った。(2)農協における現地サーベイの結果、トップマネジメント機構の在り方が極めて重要であることに注目し、大型農協にふさわしいトップ機構として組織代表としての組合長ポストの先進性と安定性を同時に実現する方策や作目部会代表、婦人部代表等の理事を確保する方策等についての検討を行った。総務庁による農協の行政監察においても指摘されているところの営農指導体制強化に関しても、情報論的視点から経営管理の刷新を通して若干の改善方向を見出した。次年度においては、本年度の調査研究結果をふまえて、現在各県で進展を見つつある第3次オンを活用して、大規模農協の経営刷新の方策を明らかにする。昨年に引き続き、静岡県下の農協はもちろん、岡山阿新農協・長野県伊南農協等において行った現地実証調査をふまえ、情報論的視点から、経営管理機構のあるべき姿について試論を構築した。(1)合併大型農協を類型区分すると同時に、それらの経営管理機構の実態をその機構図の変遷からパタ-ン化し、類型区分を行った。

すなわち営農指導部門を独立の専門部署として位置づけるとともに、その内部において専門分化を図り、営農指導機能の飛躍的な質的向上方策を図るとともに、多面において、兼業化、主婦兼業化、高齢専業化農家への指導体制の在り方を刷新することにより、コストダウンを図りながら普及指導の面的(質的・量的)拡大を図る方向を見出した。
新規ワクモ防除用ワクチンの開発：組換えマレック病ウイルス生ワクチンの応用

ワクモ(鳥類の外部寄生虫)による吸血被害は、世界中の養鶏場で深刻な問題となっている。殺虫剤に変わる新たなワクモ防除法として、ワクチンによる防除法開発に取り組んでいる。本研究では、使用しやすいワクチンの作製を目指し、ウイルスベクターの応用を検討した。ウイルスはほぼ全ての鶏に接種されるマレック病弱毒生ワクチンを用いて、ワクチン抗原遺伝子が挿入された組換えウイルスを作製した。組換えウイルス感染細胞では、抗原タンパク質の発現が認められており、新たなワクモ防除用ワクチンとして期待される。本研究では、世界中の養鶏場で深刻な問題となっているワクモの新規防除用ワクチンの開発を目指す。抗ワクモワクチンについては、いくつかの抗原がこれまでに同定されている。本研究では、マレック病弱毒生ワクチンにワクモ抗原遺伝子を組み込んだワクチンを作製し、マレック病の発症予防に加え、ワクモ防除も同時に可能となるワクチン開発を行う。マレック病ワクチンは、養鶏場においてほぼ全ての鶏に接種されているため、抗ワクモワクチンの実用化を目指す上で、ワクチン接種にかかる負担軽減にも貢献する基礎研究となる。今年度はワクモ抗原発現プラスミドを作製し、その発現カセットをEn Passant Mutagenesis法によりマレック病ウイルス(MDV)ゲノムに挿入した。本研究では、MDV強毒株であるRB1Bを用いた。MDVの病原性に必須であるmeq遺伝子と、目的遺伝子を置換させることで、ワクモ抗原遺伝子発現カセットの挿入に加え、MDVの病原性も欠失させたMDVゲノムの作製を目的とした。得られたクローンのうち、目的の領域にワクモ抗原遺伝子発現カセットが挿入されているかどうか、RFLP、PCR及び塩基配列解析により確認した。その結果、meq遺伝子欠損、ワクモ抗原遺伝子発現カセット挿入RB1B感染性クローンが複数得られた。続いて、得られた感染性クローンプラスミドをリン酸カルシウム法により培養細胞に導入し、ウイルスの再生を試みた。しかし細胞変性効果は認められず、ウイルスは再構成されなかった。理由としては、発現カセットを挿入したことにより、ワクモ抗原遺伝子の発現量が多く、細胞またはウイルスの増殖に影響を及ぼしていることが考えられた。そのため、挿入するワクモ抗原遺伝子の機能を損なわせる変異を挿入し、新たな感染性クローンを作製し直す必要がある。本研究計画では、平成28年度に目的のワクモ抗原遺伝子を挿入したマレック病弱毒生ワクチンを作製する予定であった。計画通りに感染性クローンプラスミドの作製までは完了したが、得られたプラスミドからウイルスを再生させることができず、研究計画の変更が必要となった。ウイルスの再生が認められなかった原因としては、発現した抗原タンパク質が、細胞またはウイルスの増殖に影響を与えている可能性がある。当初はワクモ抗原遺伝子の発現量を高めるため、作製した発現プラスミドの発現カセットをウイルスゲノムに挿入する計画であったが、ワクモ抗原タンパク質の機能を損なわせる点変異を導入した感染性クローンプラスミドを作製するか、あるいは発現カセットではなく、ワクモ抗原遺伝子のみとmeq遺伝子を置換させ、タンパク質発現量を低下させた感染性クローンを作製することで対応する必要がある。世界中の養鶏場で深刻な問題となっているワクモの新規防除用ワクチンの開発を目指した。本研究では、マレック病弱毒生ワクチンにワクモ抗原遺伝子を組み込み、マレック病の発症予防に加え、ワクモ防除も可能となるワクチン開発を試みた。マレック病ワクチンはほぼ全ての鶏に接種されており、抗ワクモワクチンの実用化を目指すうえで、本研究はワクチン接種にかかる負担軽減に貢献する基礎研究となることが期待される。ワクモ抗原発現プラスミドを作製し、その発現カセットをマレック病ウイルス(MDV)強毒株であるRB1B株のゲノムに挿入した。MDVの病原性に必須であるmeq遺伝子と、目的遺伝子を置換させることで、ワクモ抗原の発現に加え、MDVの病原性を欠失した組換えウイルスの作製を行った。ワクモ抗原遺伝子は、これまでに本研究室で同定したワクチン抗原候補を複数用いた。得られた感染性クローンについて、RFLP、PCR及び塩基配列解析により、目的領域へのワクモ抗原遺伝子発現カセットの挿入を確認した後、得られた感染性クローンプラスミドをリン酸カルシウム法により培養細胞に導入し、ウイルスの再構成を試みた。しかしウイルスの再構成が認められなかったため、コーディングリージョンのみを挿入した感染性クローン、あるいは抗原タンパク質の機能を損なわせる変異を挿入した感染性クローンを新たに作製した。その結果、コーディングリージョンのみを挿入した感染性クローンプラスミドよりウイルスが再構成された。再構成された組換えウイルスは、親株として用いたRB1B株由来感染性クローンプラスミドより再構成した組換えウイルスと比較しても、in vitroにおける増殖性に差異は認められなかった。また組換えウイルス感染細胞においては、ワクチン抗原タンパク質の発現が確認された。このように、抗ワクモワクチン抗原を発現する弱毒組換えMDVの作製に成功した。

ウイルスの再生が認められなかった原因は、発現した抗原タンパク質が持つ機能によるもの、あるいは抗原タンパク質の過剰な発現が細胞またはウイルスの増殖に影響を与えている可能性がある。そのため平成29年度は、まずワクモ抗原遺伝子の機能を損なわせる点変異を導入した感染性クローンプラスミド、さらにワクモ抗原遺伝子のみとmeq遺伝子とを置換させた感染性クローンプラスミドを作製し、ウイルスを再生させる。ウイルスを再生させた後は、ワクモの防除効果とマレック病の予防効果を観察するため感染実験を行う。マレック病の予防効果については、再生させた組換えウイルスで免疫した鶏にMDV強毒株を接種し、生存率や腫瘍形成率を観察することで検討する。ワクモの防除効果は、感染実験に用いた免疫鶏より血液を採取し、人工吸血装置を用いてワクモに吸血させ、その後2週間に渡り生死判定を行い、抗ワクモ効果を検討する。また、本感染実験に供する鶏は、経時的に血液を採取し、ELISAにより抗体価の推移を確認する。獣医伝染病学今年度作製した組換えウイルスゲノムからウイルスの再構成は確認されなかったため、新たに数種類の組換えウイルスを試作する必要がある。そのため、新たな組換えウイルス作製用の試薬代およびウイルス再構成後の実験に必要な経費として、細胞培養用試薬および実験動物経費の一部を次年度の使用とした。当初の実験計画より作製する組換えウイルスの種類を増やす必要があるため、次年度使用額のうち、約25万円については細胞培養試薬および消耗品に使用し、約15万円については実験動物経費に使用する。
光合成による光エネルギー変換：光駆動電子移動の分子制御機構の解明

フーリエ変換赤外分光法(FTIR)などの分光学的手法と量子化学計算を用いて、植物およびシアノバクテリアにおいて水分解・酸素発生反応を担う光化学系II蛋白質の電子移動反応の制御機構を調べた。その結果、キノン電子受容体、非ヘム鉄、チロシンYZ、YDなどの各電子伝達成分の電子・プロトン移動反応は周辺蛋白質との直接的な相互作用および蛋白質内のプロトン移動経路、さらに電子伝達成分間の長距離相互作用によって制御されることが明らかとなった。光化学系IIにおける電子伝達コファクターの酸化還元電位制御(Em)のメカニズムの解明を目指し、第一キノン電子受容体QAおよび第二キノン電子受容体QBの電位制御機構の研究を行った。QA,QBは、いずれもプラストキノンー9(PQ-9)より成り、それらはヒスチジンと非ヘム鉄を介して相互作用している。QAはQBよりも80 mV程低いEmを持つことにより、QAからQBへのスムースな電子移動が実現される。本研究では、光誘起フーリエ変換赤外(FTIR)差スペクトル法による分光解析および密度汎関数法(DFT)を用いた量子化学計算によって、QA及びQBが異なるEmを持つしくみを明らかにした。まず、PQ-9のモデル化合物としてPQ-1を用い、水分子を水素結合供与体とする様々な水素結合複合体モデルについてDFT計算を行い、水素結合数とEmの相関を調べた。その結果、カルボニル基への水素結合数とEmには線形関係があり、1水素結合あたり100-200 mVのEm上昇があることが示された。この関係はアミノ酸モデルを水素結合供与体として用いた複合体の計算においても成立していた。一方、これらのモデルの基準振動解析により、水素結合構造の対称性および水素結合数と中性PQのCO伸縮振動の振動数との間に一定の相関があることが示された。また、セミキノンアニオンの最も強いCO振動バンドの振動数は水素結合構造の影響をあまり受けないが、水素結合するアミノ酸の振動とのカップリングにより特徴的なサイドバンドが現れることが示された。これらの結果を実測のQAおよびQBの光誘起FTIR差スペクトルに適応することにより、QAは対称的な2つの水素結合を持つのに対し、QBは非対称的な3つの水素結合を持つことが明らかとなった。この水素結合数の違いがQAおよびQBのEm値の違いの主原因であることが示された。1.チロシンYZの水素結合構造とプロトン放出機構:光化学系IIの水分解マンガンクラスターへの直接的電子供与体として働くチロシンYZについて、フーリエ変換赤外分光法(FTIR)と量子化学計算を用いてその水素結合構造を調べた。その結果、YZの光酸化によって近傍の水分子が移動し、水素結合ネットワークの再構築が起こることが明らかとなった。この結果から、水分解反応におけるYZを経由する新規なプロトン移動機構を提唱した。2.マンガンクラスターと非ヘム鉄中心との長距離相互作用:FTIR電気化学計測法を用い、マンガンクラスターの除去が電子受容体として働く非ヘム鉄ーキノン中心の構造および酸化還元電位に与える影響を調べた。その結果、非ヘム鉄の近傍に存在するアミノ酸残基への構造変化と+18 mVの酸化還元電位の変動が認められた。この結果によって、光化学系IIにおける酸化側と還元側の間の長距離相互作用による電子移動制御機構の存在が明確に示された。3.クロロフィルdを持つシアノバクテリアにおける電子受容体の構造:近赤外光を吸収するクロロフィルdを持つシアノバクテリアAcaryochloris marinaにおけるフェオフィチンおよび第一キノン電子受容体の分子相互作用をFTIR法を用いて調べた。その結果、これらの電子受容体はクロロフィルaを持つ通常のシアノバクテリアとは異なる水素結合相互作用を持つことが示された。A. marinaは、この相互作用変化によって酸化還元電位を上昇させ、通常よりも小さなエネルギーで光合成を行うことを可能にしていると考えられる。1.光化学系IIにおける末端キノン電子受容体QBの酸化還元電位を、光誘起フーリエ変換赤外(FTIR)法と電気化学計測を組み合わせることによって初めて測定した。さらに、水分解Mnクラスターを除去した際のQBの酸化還元電位も測定し、未処理試料の値と比較した。これらの結果から、Mn4CaO5クラスターとキノン電子受容体間の長距離相互作用による光化学系IIの光保護機構の分子メカニズムが明らかとなった。2.光化学系IIにおいて対称的に位置するチロシンYZとチロシンYDは、いずれもクロロフィルP680への電子供与体として働くが、YZの電子移動反応はYDのそれに比べて著しく速く、YZのみが水分解系への直接的な電子受容体として機能する。そこで、これらのチロシンの反応性の違いの原因を解明するため、FTIR法を用いて、YZおよびYDの光酸化の際のプロトン放出反応を調べた。その結果、YZは隣接するHis側鎖にプロトンを渡すのに対し、YDはプロトンを蛋白質外へ放出することが明らかとなった。このプロトン移動距離の顕著な違いがYZ、YDの反応速度の大きな違いを生じ、水分解反応の高い量子効率を実現させていることが示された。3. FTIR法を用いて、水分解Mnクラスターの近傍に存在する水分子ネットワークのOH伸縮振動バンドを観測した。さらに、QM/MM法による量子化学計算によって基準振動解析を行い、それらのバンドを帰属した。

その結果、FTIRスペクトルに現れる2800 cm-1付近の幅の広いバンドは、強い水素結合を持つ水分子および複数の水分子に非局在化したOH伸縮振動に由来することが明らかとなった。これらの水分子の振動が、水分解反応におけるプロトン放出および基質水分子の取り込みに重要な役割を果たすことが示された。フーリエ変換赤外分光法(FTIR)などの分光学的手法と量子化学計算を用いて、植物およびシアノバクテリアにおいて水分解・酸素発生反応を担う光化学系II蛋白質の電子移動反応の制御機構を調べた。その結果、キノン電子受容体、非ヘム鉄、チロシンYZ、YDなどの各電子伝達成分の電子・プロトン移動反応は周辺蛋白質との直接的な相互作用および蛋白質内のプロトン移動経路、さらに電子伝達成分間の長距離相互作用によって制御されることが明らかとなった。これまでの研究によって、光化学系IIにおけるYZやキノン、フェオフィチンなどの酸化還元コファクターについて、それらが関与する電子移動および水分解反応の制御機構が着実に明らかとなってきている。27年度が最終年度であるため、記入しない。光合成の生物物理学これまでの研究をさらに推進するため、まず、これまで実測例がない第二キノン電子受容体QBの酸化還元電位をFTIR電気化学計測によって測定する。さらに、QAとQB間の電子移動平衡のpH依存性を測定し、光化学系IIにおける電子受容体側の制御機構を明らかにする。また、水の酸化を可能にするクロロフィル二量体P680の高い酸化還元電位の原因を明らかにするため、P680近傍のアミノ酸残基を改変した部位特異的変異体を作成し、FTIR法によってそのカチオン状態の電子状態を解析する。当初予定していたキノン電子受容体の酸化還元電子制御のしくみについて、フーリエ変換赤外測定と量子化学計算による重要な結果を得た。常に消耗品費を必要とする研究であるため、年度初めにも継続的に研究を遂行できるようにするため。キノン電子受容体QAおよびQBの酸化還元電位制御の機構解明をさらに推し進めるため、それらの中間に位置し、QAからQBへの電子移動経路を形成する非ヘム鉄中心について、その酸化還元電位の制御機構を明らかにする。そのため、光誘起フーリエ変換赤外(FTIR)差スペクトル法と分光電気化学計測を組み合わせた手法を用い、水分解マンガンクラスターとの長距離相互作用による電位制御機構について調べる。また、光化学系IIの電子供与体側に位置し、マンガンクラスターの直接的な電子受容体として働くチロシンYZについて、その水素結合構造、および電子・プロトン移動反応を光誘起FTIR法と量子化学計算を用いて実験、理論の両面から詳細に調べ、YZとマンガンクラスター間のプロトン共役電子移動反応の分子機構を明らかにする。物品費は基本的に消耗品として用いる。また、不定期に起こる装置の修理に対応するため、その他の項目として100万円を計上している。旅費(60万円)は、数回の国内学会参加(本人、学生を含めて)のための交通費、宿泊費等に当てる。2014年3月でのWindowsXPのサポート終了に伴い、4月の年度初めにコンピュータおよびソフトの購入が必要であったため。
脳幹セロトニンニューロンによる脊髄運動メゾスコピック神経回路の制御様式の解明

哺乳類の運動の発現には、脳幹に局在するセロトニンニューロンによる脊髄への下行性の制御が重要な役割を担っていると考えられている。本研究では脊髄運動回路内の基本的な結合がすでに形成されている新生児期から運動機能が成熟して離乳する時期の動物において、セロトニンニューロンが脊髄前角の運動ニューロンからの出力を調節している局所回路、特に歩行運動神経回路をどのように制御しているのかを明らかにすることを目的とした。野生型マウスおよびウサギ様跳躍歩行を示すキメリン欠損マウスから作製した脊髄摘出標本において、NMDAとセロトニンを灌流することで誘発される歩行運動様リズム活動において、セロトニンの濃度を変化させることによって左右の協調のタイミングもしくはリズムの周波数が変化することを見いだした。さらに計算論的手法を用いて誘発されたリズムの際の運動ニューロンへの興奮性および抑制性シナプスの入力様式を推定した。この結果は第44回北米神経科学会において学会発表を行なった。また、脳幹のセロトニンニューロンの活動を光によって制御し、脊髄の局所回路をどのように調節しているのかを調べるために、トリプトファンヒドロキシラーゼのプロモーターによってチャネルロドプシン変異体を発現するマウスを導入した。このマウスの新生児の脳幹-脊髄摘出標本を用いて頸髄あるいは腰髄の運動ニューロンからパッチクランプ記録を行い、延髄網様体の腹側に位置するセロトニン細胞体およびその下行性線維の光刺激によって5-HTニューロンを興奮させたときの効果の解析を進めている。26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、光感受性色素タンパク質チャネルロドプシン(ChR2)変異体(ChR2(ET/TC))をセロトニン(5-HT)ニューロン特異的に発現する遺伝子改変マウスの繁殖コロニーを確立した。このマウスの新生児の脊髄摘出標本を作製し、腰髄の運動ニューロンからホールセルパッチクランプ記録を行なった。特に、脊髄腹側索において脳幹からの下行路である脊髄腹側を走行するChR2陽性の軸索に対して光刺激を行い、運動ニューロンの膜電位応答を記録するための条件検討を行なった。また5-HTによる脊髄歩行CPG活性化には下部胸髄から上部腰髄(第11胸髄-第2腰髄)にかけての部分が重要であるので、これらの部位を含む数髄節の脊髄ブロック標本を作製し、セロトニン受容体およびNMDA型グルタミン酸受容体を薬理学的に活性化することによって、脊髄全体の摘出標本でみられるのと同様の頻度と振幅を持った歩行運動様の活動が腰髄運動ニューロン群にされることを見いだした。この際、ホールセルパッチクランプ記録を用いて、単一ニューロンで興奮性シナプス電流および抑制性シナプス電流を詳細に観察することができた。遺伝子改変マウスの繁殖コロニーの確立にやや時間がかかったが、神経回路解析のための実験技術、特に適切な光刺激方法および記録手法の確立を進めている。今年度も引き続き、5-HTニューロン特異的にChR2を発現する遺伝子改変マウスマウス新生児の脳幹・脊髄摘出標本およびスライス標本を用いて、5-HTニューロンによる脊髄の細胞レベルでの制御様式を明らかにしたのち、脊髄神経回路レベルおよび個体レベルに対する制御様式を明らかにする予定である。
金属製生体材料からの生体・細胞内での微量溶出金属元素の分布・状態評価

4種類の歯科用合金を動物皮下に埋入し、埋入部周囲組織中への合金成分元素の移行を微量元素の検出に好適な放射光XRFを用いて分析し、周囲組織中での合金元素分布を可視化した。耐食性の低い非貴金属添加銀合金では、埋入部周囲にAg, Snなどの局在が認められ、より耐食性の高い金銀パラジウム合金やコバルトークロム合金でも周囲に微量の合金成分元素の局在が確認された。対象元素の化学状態を識別可能なXAFS測定を併用することにより、組織中の合金元素の殆どが溶出した水和イオン状態か、硫化物(Ag)、酸化物(Cr)として析出したものであることが判明した。陽極酸化表面を持つチタンインプラントは生体親和性や骨結合性に極めて優れ、歯科用インプラントの主流となっている。これまでの研究で金属チタン加工面を持つインプラントからは生体内で微量のチタンが溶出する可能性が示唆されている。本研究では陽極酸化型インプラント周囲に付着した骨に含まれる微量チタンを蛍光XAFS法により分析し、骨内での溶出インプラントの化学状態を分析した。XFAS測定は対象元素のX線吸収スペクトルから、その化学状態を知る方法で、中でも蛍光XAFS法は微量元素の状態を知る優れた手段である。試料は撤去されたフィクスチャー周囲に付着した骨で、XFAS測定は高エネルギー加速器研究機構放射光化学研究施設BL-9Aにて行った。フィクスチャー周囲に付着した骨から微量のチタンが検出され、その中にはルチル型二酸化チタンが含まれていた。フィクスチャー表面にはアモルファスかアナターゼ二酸化チタンであり、異なる結晶携帯の二酸化チタンが検出されたのは、フィクスチャーから微量溶出したチタン骨内への移行が起こる可能性が示唆された。しかしながら、ルチル型二酸化チタンは極めて安定な化学種であるため、溶出による生体への為害性は少ないと考えられた。さらに歯科用金属(金銀パラジウム合金、銀合金、ニッケルクロム合金、コバルトニッケル合金)をマウスに埋入して、半年後に周囲組織とともに摘出し、生体内における溶出状況を分析中である。歯科用合金は耐食性が十分に考慮された組成であるが、なお金属アレルギーなどの微量の溶出金属元素が生体に影響を及ぼす可能性が懸念されている。本研究では歯科用合金の生体内での安定性、生体適合性を評価するため、歯科用合金4種(金銀パラジウム合金、銀合金、ニッケルクロム合金、コバルトニッケル合金)を直径1mm、長さ10mmの円柱状として表面を鏡面研磨した。この試料を動物皮下に埋入し、6ヶ月埋入後にその周囲組織を摘出し、慎重に埋入金属試料を抜去した後に一部を真空乾燥し、残部を通法に従ってパラフィン薄切標本とした。パラフィン薄切標本は放射光蛍光X線分析(SR-XRF)により、組織中に移行した合金成分の分布分析に供した。また乾燥標本を用いてXAFS(X線吸収微細構造)解析を行った。SR-XRFで一部の合金(コバルトークロム合金)で金属埋入部周囲にCrの局在が確認された。コバルトの検出量は微量であったが、これは試料の固定・脱水・包埋の過程で流出したものと推測された。乾燥標本を用いたXAFS測定ではCo, Crとも検出され、Coはイオン状態であり埋入金属から溶出したものと推測された。Crは酸化物(Cr2O3)として検出されたが、こちらも溶出したCrが組織中で酸化物として析出したと推測された。以上より、一部の歯科用合金において組織内での溶出が確認され、その分布と組織中の状態がSR-XRFおよびXAFS法により分析が可能であった。チタンの陽極酸化は表面の物理・化学的性状を改質する手法として、広く用いられており、特に初期の骨結合を促進する上で効果的であることが知られている。演者らの過去の研究において、歯科用チタンインプラント周囲組織において微量金属元素の状態・構造解析を蛍光XAFS法を用いて行い、金属チタン及び二酸化チタンが僅かに検出されること、二酸化チタンの由来として、チタンの溶出・再析出の可能性を示し、機械加工面を持つチタンインプラント表面から極微量のチタンが周囲軟組織中に溶出し、二酸化チタンとして再析出することが判明している。本年度は陽極酸化表面を持つチタンインプラントの表面性状について検討した。実験は陽極酸化表面を持つフィクスチャー(Nobel Biocare, Groovy)と、脱落した同fixtureに付着していた骨中のチタンの状態分析をXAFS (X-ray absorption fine structure)法により行った。XAFS測定は高エネルギー加速器研究機構放射光科学研究施設にて転換電子収量法および蛍光法により行った。陽極酸化した表面のTiK吸収端のXANES

スペクトルは転換電子収量法で測定するとアモルファスTiO2様を示し、蛍光法で測定するとアナターゼ型TiO2様を示した。転換電子収量法の測定深さは高々2300nmであり、蛍光法のそれは数μmに及ぶことから、同表面の極表層は非晶質で内部が結晶化していると推測された。12%金銀パラジウム合金、銀合金、ニッケルクロム合金、ニッケルコバルト合金をマウスに長期間埋入して、周囲軟組織を含めて摘出し、蛍光XAFS法で分析しているところであるが、分析機器が限られた設備であるため、ここでしばらく停滞しているが、平成25年度では分析が進む予定である。陽極酸化表面を持つチタンインプラントの表面性状について検討し、陽極酸化した表面のTi K吸収端のXANESスペクトルは転換電子収量法で測定するとアモルファスTiO2様を示し、蛍光法で測定するとアナターゼ型TiO2様を示した。転換電子収量法の測定深さは高々2300nmであり、蛍光法のそれは数μmに及ぶことから、同表面の極表層は非晶質で内部が結晶化していることを明らかにできたため。12%金銀パラジウム合金、銀合金、ニッケルクロム合金、ニッケルコバルト合金をマウスに1年間埋入して、周囲軟組織を含めて摘出し、蛍光XAFS法で分析を進める予定である。In vivoでの溶出金属元素の細胞内分布測定とマイクロXAFSマッピング測定培養細胞を溶出金属元素に暴露し、細胞内での金属元素の局在をマイクロ蛍光X線マッピングを用いて測定し、特に細胞内小器官などへの蓄積や細胞毒性との関係を調査する。またマイクロ蛍光X線分析と蛍光XAFS測定の同時測定を試み、場所による金属元素の状態差を可視化する、XAFSマッピング測定も試み、細胞内での金属元素の反応過程の解明を試みる。生体内での金属製生体材料の表面分析と溶出特性との関係の評価各種金属製生体材料を動物に長期間埋入し、材料表面の微量の腐食生成物を蛍光XAFSや全反射XA FS法により分析し、生体内での腐食挙動を解析して、求めた溶出挙動との関係を評価する。具体的には板状金属材料を1年以上の長期、動物の皮下に埋入して表面に薄く生成した腐食生成物の状態や構造解析を行って、腐食挙動を考察する該当無し当該研究に於いては、金属材料の作製と動物実験関連費用、放射光実験用の試料作製などの消耗品に大部分の予算を充てる計画である。また旅費は北海道大学から放射光施設(つくば播磨)までの旅費などに充てる計画である。平成23年度は論文投稿できなかったため、未使用額が生じたが、これは次年度に使用する予定である。
GISと水利解析によるコレラ流行とインフラストラクチャ整備との関連性の検討

【背景と目的】ザンビア国ルサカ市は毎年11月から翌年5月までの雨期において患者数6,000名を超す大規模なコレラ流行が報告されてきた。これまでの調査では、ルサカ市内のスラム地域におけるコレラ流行と衛生施設の不備や井戸水の摂取との関連性が示唆された。本研究は、ルサカ市全域のコレラ流行に関し、降雨ならびに都市排水システムとの関連をGISを用い解明することを目的として実施された。【研究経過】ザンビア国ルサカ市の2005年-2006年のコレラ流行シーズンに報告された患者6,045名のうち、GPS(Global Positioning System、全地球測位システム)を用い居住場所を測位した2,590名の患者を研究対象とした。コレラ流行の伝播特徴は、Space-time permutation法を用い、患者分布の時空間集積を解析した。一方、コレラ流行と排水システムめ関連は、調査対象地域メッシュ地図(500メートル)を作成し、各区画内の水利解析による表面流水ならびに排水溝の長さとコレラ患者数を積算し、回帰分析を用い解析した。患者分布地図より、95%以上の患者がルサカ市西部に偏在し、時空間解析による検定では、それら地域内に有意なコレラ患者の集積が認められた(P<0.01)。コレラ流行と排水システムとの関連性の解析を試みた結果、排水システムの完備度が高い程、コレラ患者数が少なくなる有意な負の関連性が示唆された(P<0.01)。途上国におけるコレラ制御には、先行研究によって示唆された安全な給水やトイレなどの衛生施設とあわせ排水システムのインフラ整備が重要な要因であると考えちれる。本研究により、行政のインフラストラクチャ整備の重要性が示唆され、長期的なコレラ制御対策に関する科学的根拠が示された。【研究発表】本研究成果は、American Journal of Public Health誌に掲載が決定し、また、第67回日本公衆衛生学会総会において発表され、優秀ポスター賞を受賞した。
歯の吸収およびその修復に関する細胞生物学的研究-ヒト乳歯を観察モデルとして-

歯根が完全に吸収された脱落前のヒト乳歯では、歯髄面からの内部吸収が観察される。この吸収現象は、明確な経時的組織変化を示すことから、吸収過程を4段階に大別することができた。破歯細胞およびその前駆細胞の同定に酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP)活性染色を用い、各吸収段階の歯髄内のTRAP陽性細胞の動態について観察した。その結果、破歯細胞は、単核の前駆細胞として歯髄内に出現し、象牙質表面に細胞突起で接着後、多核化し、Ruffled boaderとClear-zoneを持った破歯細胞に分化し、象牙質を吸収することが明らかになった。また、吸収機能が低下すると、Ruffled boaderが次第に減少、消化し、最終的には吸収表面から破歯細胞が離れ、吸収が終了することも明らかになった。各吸収段階の切片をTRAP活性染色と各種サイトカイン抗体を用いた免疫組織化学染色で共染すると、歯髄内に破歯細胞の前駆細胞が出現する以前に、多数のサイトカイン陽性細胞が歯髄内に観察された。さらに、種々の分化状態を示す破歯細胞に隣接してサイトカイン陽性細胞が多数認められた。この結果は、ヒト乳歯の内部吸収では、各種のサイトカインは破歯細胞の誘導、分化だけではなく、破歯細胞の吸収機能に直接的あるいは間接的に関与している可能性が示唆された。今後、破歯細胞とサイトカイン陽性細胞の相互の関連性について、さらに詳しく検討する予定である。この結果は、ヒト乳歯の内部吸収では、各種サイトカインは破歯細胞の誘導、分化だけでなく、破歯細胞の吸収機能に直接的あるいは間接的に関与している可能性が示唆された。ヒト乳歯の脱落後期に認められる歯髄内部からの吸収現象を観察モデルとし、歯の吸収機序、およびその修復機構について破歯細胞を中心に炎症性細胞、歯髄細胞あるいは歯根膜の細胞の相互の関連性について微細構造学的、組織化学的、また免疫組織化学的手法を用いて検討を加えた。歯髄内部からの吸収過程を4段階に大別し、まず破歯細胞の分化過程を観察した。その結果、破歯細胞は単核の前駆細胞として歯髄内に出現し、その細胞は象牙前質に接着後多核化し吸収が進行することが明らかになった。また、吸収が停止する頃になると多核の破歯細胞は吸収面から次第に離れ、吸収窩表面にセメント芽細胞が出現し修復が開始され、吸収から修復へのCoupling factorの存在が示唆された。

ヒトの乳歯における歯髄内部からの吸収開始からその修復の一連の過程で、歯髄内には多数のモノサイト、マクロファージ、リンパ球などの炎症性細胞が常時観察され、これらの細胞はIL-1、IL-6、TNF-α、βなどを産生していることが免疫組織化学的に明らかになった。さらに、吸収停止前には、TGF-β、TNF-γなどのサイトカインを産生している細胞が破歯細胞に隣接して観察された。以上の結果より、ヒト乳歯の歯髄内部からの吸収は、炎症性のサイトカイン類が直接、あるいは間接的に関与する可能性が示唆された。さらに、歯の吸収からその修復過程においても、これらのサイトカイン類が破歯細胞の吸収活性の抑制や、セメント芽細胞などの形成系の細胞の活性化を通して重要な役割を果たしているものと考えられた。
HOX11によるリンパ球腫瘍化の分子機構の解析

HOX11は染色体転座t(10;14)(q24;q11)を有するT細胞急性白血病の染色体切断部位よりクローニングされたホメオボックス遺伝子である(Science,1991)。このHOX11によるリンパ球腫瘍化の機序を調べるために、HOX11cDNAをIgプロモーター/エンハンサーの支配下に組み込んだ発現ベクターを用いトランスジェニックマウスを作製した。このマウスのB細胞をLPSで刺激すると細胞増殖反応が増強しておりG0/G1からS期への移行が亢進していた。さらにこのマウスにおいて能腫瘍の発生が観察され、その病理組織的検討を行っている。また、HOX11遺伝子のプロモーター部分の遺伝子解析をおこなった。この結果、ヒトのHOX11による解析結果とは異なるキャップサイトの存在を明らかにした(準備中)。ヒトの解析では染色体転座した腫瘍細胞由来のmRNAを用いた解析結果であり、正常のヒトでは今回の解析により発見されたキャップサイトを使用していることが予想されている。また、キャップサイトの上流800ベースにはその発現を負に調節するサイレンサー部があることも明らかにした。HOX11関連遺伝子をクローニングしてその発現解析をおこなった。この遺伝子は胎生期の交感神経節や知覚神経節などや生後の副腎髄質などの神経堤由来の組織にその発現が認められたことから、神経堤細胞の分化増殖に重要な機能をもつことが示唆された(投稿中)。
Wntシグナルを制御するリン酸化酵素の探索とその機能解析

Wntによって活性化される複数のシグナル伝達経路は、主として細胞の分化・増殖を制御するβ.カテニン経路と細胞運動・極性を制御するβ.カテニン非依存性経路に大別される。両経路で機能する細胞内因子Dvlにはリン酸化される可能性の高いセリン、スレオニン、チロシンが多く存在し、実際に幾つかの細胞株においてWntで刺激をすると内在性のDvlのリン酸化が観察される。しかし、現在までに両経路におけるDvlのリン酸化制御やリン酸化の意義に関する知見は乏しい。そこで、ヒトの710種類のリン酸化酵素を網羅したsiRNA libraryを用いてHeLaS3細胞におけるWnt5aシグナル依存性Dvlのリン酸化に関与するリン酸化酵素のスクリーニングを試みた。Wntによって活性化される複数のシグナル伝達経路は、主として細胞の分化・増殖を制御するβ-カテニン経路と細胞運動・極性を制御するβ-カテニン非依存性経路に大別される。両経路で機能する細胞内因子Dvlにはリン酸化される可能性の高いセリン、スレオニン、チロシンが多く存在し、実際に幾つかの細胞株はWntで刺激をすると内在性のDvlのリン酸化が観察される。しかし、現在までに、Dvlのリン酸化制御や関与するリン酸化酵素に対する知見は乏しく、また両経路においてWnt刺激依存性にリン酸化されたDvlがどのように機能し、下流のシグナル伝達を制御しているのかは不明である。当研究室の知見から、HeLaS3細胞は内在性にWnt5aを多く発現しており、内在性Dvlが恒常的にリン酸化されている。siRNAを用いてWnt5aやその受容体であるFz2、Ror1/2をノックダウンすると、そのリン酸化が減弱する。つまり、HeLaS3細胞におけるDvlのリン酸化は、内在性Wnt5aが関与するシグナル経路の活性化に因る。そこで、本年度は、ヒトの710種類のリン酸化酵素を網羅した2130種類(一つのリン酸化酵素につき3種類のsiRNAで構成されている)のsiRNAより構成されるlibraryを用いてHeLaS3細胞におけるDvlのリン酸化に関与するリン酸化酵素のスクリーニングを行った。方法としては、各リン酸化酵素ごとの3種類のsiRNAを同時にHeLaS3細胞に導入し、内在性Dvlのリン酸化を減弱させる(Dvlのbandのシフトダウンを引き起す)一次候補を選別した。さらに、一次候補の3種類のsiRNAを個別にHeLaS3細胞に導入し、少なくとも2種以上が依然としてDvlのリン酸化を減弱させる候補を二次スクリーニングした。その結果、32個のリン酸化酵素が同定された。これらの候補の中には、これまでにDvlのリン酸化に関与すると報告されているCKIδやRor2も含まれているため、スクリーニングは機能していたと考えられる。今後、Wnt5aシグナルに関与する候補をさらに様々な実験系を通して選別し、リン酸化酵素の同定を試みる予定である。HeLaS3細胞はWnt5aを高発現しており、siRNAを用いてWnt5aやその受容体であるFz2、Ror1/2をノックダウンすると、そのリン酸化が減弱する。つまり、HeLaS3細胞におけるDvlのリン酸化は、内在性Wnt5aが関与するシグナル経路の活性化による。そこで、ヒトの710種類のリン酸化酵素を網羅したsiRNAlibraryを用いてHeLaS3細胞におけるWnt5aシグナル依存性Dvlのリン酸化に関与するリン酸化酵素の一次スクリーニングを行い、32種のリン酸化酵素を同定した。これらの候補め中には、これまでにDvlのリン酸化に関与すると報告されているCKIδやRor2も含まれているため、スクリーニングは機能していたと考えられた。次に、siRNAを導入後Wnt5aで刺激しても依然としてDvlのリン酸化が減弱したままの候補を選別しようと試みた。しかし、Wnt5aシグナル下流で機能する決定的なリン酸化酵素の同定には至らなかった。受容体Fz2のノックダウンでは、Wnt5a刺激を行ってもDvlのリン酸化は減弱したままであることから、Fz2下流で複数のリン酸化酵素が作用しDvlのリン酸化を引き起しているものと考えられた。