hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
網羅的RNAiによるドラッグリプロファイリングに向けたアプローチ

化合物を基礎として生命科学の研究を進める上で、化合物の細胞内標的の同定は、非常に重要だがとても困難な課題である。本研究では、プール型shRNAライブラリーを用いたスクリーニングによる遺伝学的解析を効率化して、化合物の標的同定と関連パスウエイの同定に用いた。この方法で海洋天然物オーリライドBの解析を行った結果、ナトリウムポンプの触媒サブユニットATP1A1蛋白質が細胞のオーリライドBに対する感受性を決める因子であることがわかった。ATP1A1蛋白質の阻害剤ウアバインをオーリライドBと共に細胞に作用させると、単独の場合よりも低濃度でオーリライドBが細胞増殖抑制を引き起こした。化合物の標的や、作用機序に関連するシグナル経路を同定する方法として、動物培養細胞でのshRNAライブラリーを用いた網羅的RNAiによって遺伝学的に調べることは非常に有効である。今年度は、標的既知あるいは標的未知で、細胞増殖に影響を与える計5つの化合物についてshRNAライブライリースクリーニングを行った。スクリーニングにはHeLa S3細胞を用いた。まず細胞にレンチウイルスshRNAライブラリーを導入して、ノックダウン細胞のプールを作成した。この細胞プールを複数に分け、一つのサブプールはコントロールとして化合物未処理のままで培養を続けた。他のサブプールにはそれぞれ化合物を添加し、一週間から10日間の培養を行った。各細胞群のDNAからshRNA遺伝子領域を増幅し、配列解析によって各shRNAを持つ細胞の頻度を決定した。コントロール細胞群での頻度との比較により、化合物感受性に差をもたらすshRNAを同定した。これに基づき、ノックダウンすると化合物感受性を上昇させる遺伝子のリストと、ノックダウンすると感受性を低下させる遺伝子のリストを作成した。スクリーニングを行った化合物のうち、標的既知化合物のひとつでは、作用機序に関わるパスウエイ上の遺伝子群が、ノックダウンすると化合物感受性を上昇させる遺伝子リスト中に濃縮された。また、別の標的既知化合物では、標的からは予想されなかったパスウエイの遺伝子群が、ノックダウンすると化合物感受性を上昇させる遺伝子リスト中に濃縮されていた。目標としていた化合物のスクリーニングが進行しているため。細胞増殖を抑制する化合物が、どのようなメカニズムで作用しているのかを明らかにすることは、創薬研究に大いに役立つのみならず、生体高分子の細胞内機能を知る上でも重要である。動物培養細胞での網羅的shRNAライブラリースクリーニングは、化合物の直接の分子標的だけでなく、細胞の化合物への感受性に関わる遺伝子群を同定することができる。今年度は、昨年度に行ったshRNAライブラリースクリーニングで得られた候補遺伝子の解析を進めた。また、新たに標的既知化合物の感受性に関わる遺伝子同定を目指したshRNAライブラリースクリーニング、がん細胞株の増殖に必須な遺伝子の同定を目指したshRNAライブラリースクリーニングを行った。スクリーニングの際はshRNA同定のために、PCRアンプリコンの次世代シークエンスを行うが、サンプル毎に異なるインデックス配列をPCRプライマーに付加することによって複数サンプルの同時シークエンスが可能となった。この方法を用いて、海洋天然物オーリライドBなどの化合物の感受性に関わる遺伝子同定を目指したスクリーニングを行なった。その結果、Na+/K+ ATPaseの触媒サブユニットの遺伝子をノックダウンすると、オーリライドBへの感受性が顕著に高まることがわかった。さらにNa+/K+ ATPase阻害剤であるウアバインとオーリライドBを併用することによりアポトーシスが亢進したことから、Na+/K+ ATPaseの触媒サブユニットが、細胞のオーリライドBへの感受性を決定する因子であることが明らかになった。今後は、今回得られた化合物標的候補遺伝子の二次スクリーニングを個々の遺伝子に対するsiRNAを用いて行う。さらに、新たに標的既知化合物を用いてスクリーニングを行い、このスクリーニング法をドラッグリプロファイリングに用いることを目指す。分子生物学旅費が少なくて済んだため。学会参加発表費用に使用する。
カムランドでの高感度2重ベータ崩壊探索のための液体シンチレーターの特性研究

極低放射能環境を有し、世界最大(1000トン)の液体シンチレーターを有する高感度ニュートリノ検出器カムランドを利用して、キセノン同位体核(136Xe)の2重ベータ崩壊探索実験を遂行するため、これに必要な液体シンチレーターの開発を行い種々の基礎的データを獲得した。すなわち、液体シンチレーターに対するキセノンの溶解度、キセノン溶解時での発光量、光透過率、収納容器であるバルーン膜のキセノン透過率、経年特性などを測定した。今年度はキセノンガスの液体シンチレーターへの溶解度測定と発光量の測定を行った。2重ベータ崩壊探索実験の感度は第1に崩壊元素をどれだけ多く用いるかで決定まるので、溶解度は実験遂行上最も基本的な物理量である。有機液体への溶解度は質量比で約2%であることが知られているが、液体の分子構造(芳香族と直鎖状飽和炭化水素)では異なることと、カムランド実験で用いる液体シンチレーターへの溶解度の測定例はほとんどない。溶解度測定:キセノンガスを資料の液体に飽和させ重量を直接測定する方法を用いた。10万分の1の高精度で測定できる電子天秤が使用できたためで、ガスクロは用いなかった。カムランド液体シンチレーターの構成成分であるプソイドクメンとノルマルドデカンについてキセノンをバブリングで飽和させた。その結果、重量比で、前者は2.0%後者は2.7%増加した。後者は前者に比べ30パーセント以上多く溶けることがわかった。また両者の1:1の混合液に対する溶解度は2.4パーセントで丁度中間であった。この結果は検出器の大きさと液体シンチレーターの成分を決める基礎データである。発光量測定:発光剤であるPPO(ジフェニルオキサゾール)をプソイドクメンに少量(3g/リットル)溶かした液体シンチレーターにキセノンガスを飽和させコバルト60のガンマ線を照射し、コンプトン後方散乱の電子の光信号を2台の光電子増倍管を用いて同時測定した。結果、キセノンガスを溶解させる前にくらべて発光量が2割ほど増加した。これはキセノン原子の発光への寄与を示唆する興味ある結果である。検出エネルギーのスペクトルと合わせさらに測定を行なう。その他:キセノンガスを窒素ガスでパージする試験を今年度行ったが、ガス流量計の安定性と精度が十分でないことがわかり、次年度に行う。光減衰長と発光量の経年変化は計測装置が競合したため次年度に行う。カムランドでの2重ベータ崩壊探索では検出器の1000トン液体シンチレーター(以下「液シン」)の中心に薄い透明なバルーンを設置し、これにキセノンを最大限に溶かした液シンを収納する。キセノン溶解により液の重量が大幅に増加しバルーンの許容限度を超えるため新たな液シンを開発した。カムランド液シンの成分であるドデカンとプソイドクメンでは条件が満たされないことがわかったのでデカン+プソイドクメンを用いて混合比の最適化(81.8%/18.2%)を行なった。さらに発光剤のPPOを調整し、キセノンを溶解させ発光量、光透過率を測定した。キセノン溶解度は重量比で2.6%、発光量は目標である現在のカムランド液シンとほぼ同程度が得られた。なおキセノン溶解により発光量は減少することが確認された。これは前年度の結果と異なるが、液シンのバイアルと光電子増倍管(PMT)の光接触が原因と判明した。光透過率は分光光度計を使いPMTに必要な波長領域(400nm近辺)で測定誤差の範囲で変化はみられなかった。続いてキセノンのバルーン膜に対する透過率を測定した。カムランドバルーン膜(厚さ135μm)、ナイロン(25μm)、エバール(13μm)などの薄膜で仕切った容器に液シンを満たし一方の液シンにキセノンを溶かし、長時間放置してキセノンの拡散をガスクロマトグラフ(TCD検出器)で調べた。カムランドの膜は60日の保持でキセノンの透過は検出されなかった。他の膜についても検出されなかったが温度を上げて現在も継続中である。なおキセノン溶解による光透過率の経年変化については誤差の範囲で変化は見られなかったが、短波長側でさらに注意深く調べる必要があることがわかった。以上の研究により、目的とする液シンが最終的に決定された。経年変化についてはさらにテストを続ける必要がある。
南北朝・室町時代初期における軍記の研究-西源院本・神田本『太平記』を中心に-

本研究の目的は、西源院本・神田本『太平記』を中心に南北朝時代から室町時代にかけての軍記の成立、本文異同の問題などについて考察することにある。本年度の目標は、公的機関でもマイクロフィルムを披見できない『太平記』や『難太平記』をはじめとする関係作品の基礎調査と、古態本『太平記』の本文の問題について考察することにあった。その成果は以下の三点に大略まとめられる。(1)『太平記』伝本の調査古態本の前田尊経閣蔵相承院本『太平記』を調査し紙焼き写真をとった。この伝本調査も踏まえ、古態本『太平記』の研究、本文の校合・調査を進めている。また、古態本ではないが、永青文庫蔵の絵入り『太平記』を一部調査した。この伝本の調査は今後も続けていく予定である。(2)『難太平記』ほか他作品の調査『太平記』の成立過程について具体的に語っている、室町時代初期の唯一の資料である『難太平記』の調査を行った。その過程で、新出伝本を発見した。この伝本についての報告は、次年度にする予定である。本年度は、香川県の多和文庫や長崎県の島原松平文庫にも調査に行き、軍記や中世の作品の原本を調査し、写真に撮った。中には、軍記の享受の問題を考える上で興味深い資料もあり、この資料についても報告する予定である。(3)阪本龍門文庫蔵豪精本『太平記』の調査興味深い伝本であるといわれながら、その内容が知られていない豪精本『太平記』の調査を行った。この調査は今年で6年目になるが、今後も継続していく予定である。本年度の目標は、公的機関でもマイクロフィルムさえ披見できない古態本『太平記』伝本の基礎調査と、古態本『太平記』の表現の問題について考察することにあった。本年度の研究活動をまとめると、以下の三点に大略まとめることができると考える。1、古態本『太平記』の調査静嘉堂文庫蔵松井本『太平記』の書誌調査を行い、紙焼き写真をとった。また、前田尊経閣蔵織田本『太平記』の紙焼き写真をとった。これらをもとに、本文の校合・調査を進めているところである。2、『難太平記』の調査・考察(1)『太平記』の成立過程について具体的に語っている、室町時代初期の唯一の資料である『難太平記』の伝本調査を行った。具体的には、宮内庁書陵部・京都府立総合資料館・久留米市立中央図書館等の伝本を調査した。特に、久留米市立中央図書館蔵の写本は、存在は知られていながらその特徴は報告されていない。その報告は次年度にする予定である。なお、同図書館所蔵の軍記物語の書誌調査も行ったので、この報告についても整理出来次第行いたいと考えている。(2)また、『難太平記』の記事と対応させながら、古態本を中心とした『太平記』の本文形成問題についても考察を加えた。これらの調査を踏まえた成果を、三本の論文にまとめ発表した。3、龍門文庫蔵豪精本『太平記』の調査『太平記』伝本中、いまだ詳細な調査されていない丁類に分類されている伝本のうち、興味深い伝本であるといわれながら、その内容が知られていない豪精本『太平記』の調査を行った。本年も七月と三月の年二回の閲覧日に調査したが、この調査は今後も続けていく予定である。
ヒトParkinson病に対する自家星状交感神経節神経移植への影響因子に関する研究

ヒトParkinson氏病に対する自家頚部交感神経節脳内移植の移植効果への影響因子について検討した。平成7年には臨床的因子、平成8年には星状交感神経節の生物学的因子の検討を行った。その結果については、詳細に平成7,8年の科学研究成果報告書で報告している。臨床的因子としては、手術時の年齢、罹病記間、重症度(H/Y stage,UPRS)をt-およびchi-square testによる統計学的検討を加え行った。いずれの因子も統計学的には有意差を認めなかったが、重症度、罹病記間が臨床的因子の中で臨床効果へ影響する重要な因子であることが示唆された。星状交感神経節の生物学的因子の検討として、その移植に用いた星状交感神経節の病理組織像、培養組織の検討をした。病理組織学的には中枢神経系同様の変性所見が観察され、その変性所見としてのLewy小体の有無が、臨床移植効果への重要な影響因子であることが示唆された。培養組織学的にも、神経伸長度,Schwann cellの増生に各症例間で差を認め、神経伸長にinterleukin-1βが重要な一つの生物学的因子であることが示唆された。平成9年度には、平成7,8年度の結果について統計学的検討を含む詳細な検討を行なった。神経伸長度については、2週後の神経突起伸長度より3群-1).神経突起伸長が良好(≧500μm)、2).神経突起伸長が中等度(<500μm)、3).神経突起伸長が不良-早期にSchwann cellの増生を認める。に分類し得、interleukin-1β細胞上清濃度は、神経伸長度1)群-12.93±1.47 2)群-8.72±4.52 3)群-2.3±0.57pg/ml(平均±標準偏差)を示した。神経伸長度と培養上清interleukin-1βとの間に統計学的有意差がないものの相関傾向を示した。interleukin-1β産生が、Schwann cell由来が神経細胞由来かを今後、さらに検討を要する。以上、ヒトParkinson氏病に対する自家頚部交感神経節脳内移植の移植効果への影響因子について、臨床的因子およびドナー組織の生物学的因子について明らかにした。ドナー組織の変性の程度を術前に判定できない点が問題点として残された。術後、平均3年followした20例を対象とした。L-Dopa剤を中止した時のH/Y stageはIVが最も多く11例でV-5例、III-4例。罹病記間は平均9年。術後移植効果として、L-Dopa剤を中止しえたもの-著効、同剤を半減しえたもの-有効の有効群とし、そのほかを無効と判定した。経時的に術後移植効果を見ると、術後1、2年では70-80%に、3年では50%に有効でありました。この有効/無効群において、臨床効果へ影響する因子を検討した。臨床的因子としては、手術時の年齢、罹病記間、重症度(H/Y stage,UPRS)をt-およびchi-squarentestによる統計学的検討を加え行った。その結果、年齢は、有効群-53歳、無効群-55歳を平均とし有意差を認めなかった。罹病記間においては有効群-90ケ月、無効群-120ケ月を平均とし、有効群において罹病記間が短い傾向を示すが有意差を認めなかった。(H/Y stageでは、GradeIII、IVに有効群を多く認め、UPRSは、有効群-57、無効群-80を平均とし、有効群において重症度が低い傾向を示したが有意差を認めなかった。いずれの因子も統計学的には有意差を認めなかったが、重症度が臨床的因子の中で最も臨床効果へ影響すると考えられた。生物学的因子の検討として、培養組織での検討では神経突起のoutgrowthは約3週間観察され、2週で平均600mmを示したが症例によりバラツキを認めた。また、培養上清中のcatecholaminesでは生着にともない1週にかけてepinephrine優位に増加を示しその後は一定を示した。培養早期にschwann cellの増生を示したものは神経突起のoutgrowthは少ない傾向を示した。培養組織学的にも、neurite growth,schwann cellの増生に各症例間で差を認めた。

培養組織学的にも、神経伸長度,Schwann cellの増生に各症例間で差を認め、神経伸長にinterleukin-1βが重要な一つの生物学的因子であることが示唆された。平成9年度には、平成7,8年度の結果について統計学的検討を含む詳細な検討を行なった。神経伸長度については、2週後の神経突起伸長度より3群-1).神経突起伸長が良好(≧500μm)、2).神経突起伸長が中等度(<500μm)、3).神経突起伸長が不良-早期にSchwann cellの増生を認める。に分類し得、interleukin-1β細胞上清濃度は、神経伸長度1)群-12.93±1.47 2)群-8.72±4.52 3)群-2.3±0.57pg/ml(平均±標準偏差)を示した。神経伸長度と培養上清interleukin-1βとの間に統計学的有意差がないものの相関傾向を示した。interleukin-1β産生が、Schwann cell由来が神経細胞由来かを今後、さらに検討を要する。以上、ヒトParkinson氏病に対する自家頚部交感神経節脳内移植の移植効果への影響因子について、臨床的因子およびドナー組織の生物学的因子について明らかにした。ドナー組織の変性の程度を術前に判定できない点が問題点として残された。術後、平均3年followした20例を対象とし、その移植として用いた星状交感神経節の一部を病理学的検索を行い臨床効果への影響を検討した。術後移植効果として、L-Dopa剤を中止しえたもの-著効、同剤を半減しえたもの-有効とし、そのほかを無効と判定した。移植効果は著効-4例、有効-6例、無効-10例であった。星状交感神経節の病理学的所見として、その神経節細胞数は、著効・有効群-115±24mm2、無効群-94±25で、Lewy小体は、著効・有効群10例中4例、無効群10例中9例に認めた。免疫組織学的に、chromogranin.tyrosine hydroxylase免疫陽性度の低下を著効・有効群10例中3例、無効群7例中5例に認めた。同様に、synaptophysin免疫陽性度の低下を著効・有効群10例中3例、無効群7例中4例に認めた。移植片である星状交感神経節に高頻度に、中枢神経系同様変性所見が観察され、その変性所見としてのLewy小体の有無は、臨床移植効果への重要な影響因子と考えられた。さらに、生物学的因子の検討として、培養組織での上清中のinterleukin-1βと神経伸長との関係について検討した。培養2週での神経伸長度と上清中のinterleukin-1βとの間には相関傾向を認め、星状交感神経節の神経伸長にinterleukin-1βは重要な生物学的因子と考えられた。
小学校図画工作科における知性教育の理論的及び実践研究

本研究の目的は、知性的美術教育の理論的な妥当性と、その具体的方法論の実践的な有効性を明示することにある。その直接の根拠は、平成10年度版学習指導要領における改訂に求められた。そこで高学年に「伝え合いたいこと」の主題表現が新訂増補されたが、それは解説書に述べられているように、自己の精神的倫理的なあり方を前提とした表現といえよう。このように「伝え合いたいこと」という文言は主題発想の範囲規定と見なされるが、それは人生や生活世界において人が、直面しなければならない具体的な表現課題の一つであり、図画工作科における知性教育的内容の典型としての意味を担ってくる。現在の美術教育界は易きに流れる時代の趨勢を全面的に受け入れ、児童・生徒のポスト・モダン的なあり方を肯定する姿勢で、実にソフトな教育が行われている。とりわけ図画工作科における「造形遊び」の領域では、生(生きること)や世界との関係が括弧に入れられ、材料と場所から発想しつまるところ物質の形式が、精神的倫理的なあり方との脈絡を疎外した形で単独に構想されるにすぎない。そうした風潮の中、本研究は学習指導要領に新たに示された知性主義的な芽を確実に発芽させ、その種のハードな内容を今後のあるべき姿として明示した。ひいては人間の普遍的なあり方に対する明快な見解を打ち出した。これまで増補領域に関してその題材化はおろか、その実践研究はほとんで行われてこなかった。そのような中にあって、「伝え合いたいこと」の主題表現をめぐる本研究の成果が、改訂作業に影響を与えることを念願している。1.新内容「伝え合いたいこと」が、教育現場でどのように捉えられているか、具体的な対応としてどのような授業がなされているかを、小学校教員に対するアンケート調査を行い、各地の教育センターに保管されている「伝え合いたいこと」をめぐる指導案を探査した。その結果、ほとんど行われず、実施されたものも導入の趣旨に照らして分析したが、その適合性はほとんどなかった。2.こうした実態調査を前提にして、図画工作科における知性教育が教科目的を達成しうる、という命題を基本的な仮説として設定した。ここで目的とは、「造形表現力」の設定と「情操」の涵養である。そうした立場から知性的図画工作科教育の方法論的考察を学術的に行った。その内容は第一に題材例を具体的に考案・設定し、それに基づく授業形態及び指導課程を構想すること、第二に本題材に関してその指導レベルにおける特徴的な方法論を仮説として構築すること、第三にそれらを構成する概念を吟味し、論理関係を追究することである。かくて題材「私たちのつながりコラージュ技法を用いて」(小学5年生)が設定された。3.ついで方法論的仮説の有効性を実践を通して検証した。授業形態の特徴については、作品の読み取りの仕方などを中心とした鑑賞活動を、初回授業の冒頭と最終授業に設定する。指導課程の工夫については三段階に分け、第一次は導入としての作品鑑賞とそれを前提としたラフ・スケッチ制作を内容とする。第二次は、本絵制作を内容とする。第三次は、鑑賞活動を内容とする。今回構想した授業形態及び指導課程をめぐる方法論的仮説は有効性を発揮した。新内容に特徴的と見なされる指導法上の方法論的仮説として、「ワークシート」のフォーマットと導入時期を工夫した。それは発想の手助けや作業計画の認識として活用させるべく、「導入」終了の段階で彼らに課されたが、発想やその後の制作における構想、作業計画に対して有効性を発揮した。「伝え合いたい」ことは人生や生活世界において、人が直面しなければならない具体的な表現課題の一つであり、認識の主体としての自分に気付く小学校高学年児童にとって、教育の適時性を備えていることが判明した。

学習指導要領図画工作編は、材料や場所から発想する造形活動を一方の柱に立て、意味や概念が住まう脳内イメージではなく、材料や場所など外部の存在を基にして想像する外在的なイメージを基軸とすることで、観念や感情を一切前提としない反知性的な枠組みを鮮明にした。しかもその性格を裏付けるように、ことさらに造形活動の「楽しさ」が強調されている。そうした中にあって、増補内容「伝え合いたいこと」は人間と現実に対する知見の存在を条件としているので、これまで教育現場を指導してきた美術教育の考え方と比べてみても、それは意外にも知性教育の立場にある。とにかく解説書に「伝え合いたいこと」はその根拠は示されないものの、自分を見つめ人を分かろうとする大切な表現の内容である、と述べられている。それは精神的倫理的なあり方をめぐる主題表現と見なしてよかろう。そうした思想的な事柄を、造形的に捉えさせようとする行為は当教科において画期的な出来事なのであり、図画工作科が鑑賞行為以外で人文主義的教科としてのあり方を、ようやく自覚した事態とも考えられる。本研究はそれを前提として、図画工作科における知性教育が教科目的を達成しうる、という命題を基本的な仮説として設定した。ここで目的とは要領が提示している、「造形表現力」の育成と「情操」の涵養である。それが方法論的に、果たして正しいのかどうかを考察し、はたまた実践的に有効かどうかを確かめた。すなわち知性的美術教育の活路を新たに拓くべく、題材考案・設定をはじめとして、具体的な指導法や指導過程などとの関連を理論的に考察し、そこで構築された実践的方法論の妥当性を見きわめた。第二に、それに基づいた題材実践を行うことで、その理論の教育現場における現実性や実効性が検証された。
環境に応答して働く転写因子のＤＮＡ結合様式の変化

SoxRはセンサー部位に[2Fe-2S]を持つ酸化ストレスに応答する転写因子である。活性な酸化状態ではプロモーター領域のDNAがひずんだ構造を持ち、転写活性を持つが、それに対して還元型については不明である。本研究では、蛍光プローブとしてアデニンを2-Aminopurine(2Ap)に置き換えたプロモーターDNAに組み込み、SoxRの酸化還元による構造変化を検討した。プロモーター配列の中心部に2Apを導入したDNAにおいて、還元剤を加えると蛍光強度は減少した。[2Fe-2S]の酸化還元されることにより、SoxRの構造が変化し、それに伴って結合したDNAの構造が変化していることが示された。これまでスパーオキサイドが直接SoxRのシグナルとして働き転写活性を持つのか、あるいは外からの薬物によるものか不明であった。一方同様な鉄イオウクラスターを持つSoxRが種々のバクテリアにも存在するが、大腸菌と異なり酸化ストレス防御系に働かないことを申請者のグループは報告している。本研究ではスパーオキサイドがSoxRの応答するシグナルになりうるのか明らかにするために, E.coliと緑膿菌SoxRのスーパオキサイドに対する反応性にについてパルスラジオリシスを用いて検討した.その結果,スーパーオキサイドが還元型SoxRとの反応を観察することができた。またその反応速度定値から細胞内においてもスーパーオキサイドが直接SoxRの応答するシグナルとなっていることが明らかにした。それに対して緑膿菌SoxRについても同様の反応が見られたが、その速度はE. coliの10分の1以下と大きな差が見られた。この反応性の違いは,E. coliとP. aeruginosaにおけるSoxRの生理的役割の違いを大きく反映しているとが分かった。SoxRのNOによる活性化機構は、NOが直接鉄イオウクラスターと反応してジトロシル錯体(DNIC)を生成して転写活性を持つことが報告されている。DNICは合成モデル無機化合物を用いた研究でその生成機構が検討されているがその動力学については不明である。そこで申請者は亜硝酸イオン存在下でパルスラジオリシス法を用いることにより、NOとSoxRとの反応を調べた。その結果、鉄イオウクラスターにほぼ拡散律速に近い速度でNOが配位する過程を観測することに成功し、最終生成物としてDNICが生成されていることをESRにより確認した。このような反応は同じ鉄イオウ蛋白質であるフェレドキシンでは観測されず、NOの鉄結合にともなうSの酸化が重要であることが分かった。バクテリア内に存在し、薬物や重金属、酸素などの種々のストレスに対して応答し、転写活性を持つMerRファミリーという転写因子群が存在する。このファミリーの大きな特徴は、ストレスがかかるとタンパクの構造が変化し、それに伴って結合したプロモーターDNAが歪んだ構造をとることである。大腸菌内にはMerRファミリーに属し、酸化ストレスに応答して転写活性を持つSoxRという転写因子が存在する。SoxRはそのセンサー部位に[2Fe-2S]クラスターを持ち、この可逆的な一電子酸化還元によって転写制御されている。SoxR-DNA複合体の酸化型の構造は、プロモーターDNAが、他のMerRファミリーと同様に歪んだ構造をとっている。それに対して還元型SoxRは結合したDNAの構造変化については不明である。本研究では、DNA鎖中に蛍光プローブとしてアデニンを2-Aminopurine (2AP)、シトシン(C)をPyrrolo-Cとそれぞれ置き換え、SoxRの酸化還元による蛍光強度の違いを観察した。プロモーター配列の中心部(A1、A1')に2APを導入したDNAにおいて、還元剤であるチオナイトを加えると蛍光強度は大きく減少し、362 nmから370 nmへピークシフトが見られた。さらに、[2Fe-2S]クラスター結合ドメインを持たずプロモーターDNAへの結合能は変わらないSoxRの変異体を用いて同様の実験を行ったところ、ジチオナイトを入れる前後で蛍光スペクトルには変化が見。以上の結果より、SoxRの鉄イオウクラスターの酸化還元によって、プロモーターDNAの特に中心部で大きな構造変化が起こり、SoxRの転写活性の制御においてこの中心部における構造変化が重要であるということが示唆された。水銀イオンを解毒化する時に働く転写因子として発見されたMerRと同様の機能・構造を持つタンパク質が、薬物、重金属イオン、酸素ラジカルに応答する転写因子として働いていることが明らかになった。これら転写因子は共通する機構、すなわち、特異的な"coactivator"がタンパク質に結合すると、局部的にプロモータ領域DNAの相補的塩基対が解離することが知られている。酸化ストレスに応答する転写因子SoxRは、MerR familyに属し、転写制御部位に鉄イオウクラスター[2Fe-2S]を持ち、その酸化還元によって転写制御されている。

鉄イオウクラスターの酸化還元により、どのような機構で分子全体へ連動して、DNAへの結合や転写の活性化や抑制を実現しているかを明らかにすることを目的として、芳香族アミノ酸(Trp、Tyr)に由来する紫外共鳴ラマンスぺクトル(UVRR)を測定した。SoxRを還元するとTrp91およびTrp98のUVRRは大きく変化し、鉄イオウクラスターに隣接するTrp91はより親水性に、Trp98はより疎水性の環境に変化した。それに対してDNA結合ドメインに存在するTyr31, 49, 56は鉄イオウクラスターの還元により変化しなかった。一方プロモーターであるDNAが結合するとTrpによるスペクトル変化が見られず、DNA結合にともなうTyrの水素結合の切断による変化が見られた。一方SoxRが活性を持つ機構については不明であった。本研究では、スーパーオキサイドが直接SoxRのシグナルになりうるのかパルスラジオリシス法により検討した。パルスラジオリシス法を用いると、水和電子により還元され還元型となる。また、酸素存在下では水和電子は酸素と反応してスーパーオキサイドが生成し、還元型とスーパーオキサイド反応を調べることができた。本研究の大きな目標であった転写因子に結合したDNAの構造変化を追跡する研究については蛍光プローブ法により大きな進展が得られ、特にその構造変化が中央部分のみに局在化していることが分かった。一方一酸化窒素による活性化機構についてはパルスラジオリシス法により、その反応中間体をとらえることに成功した。従来不可能とされていた還元型SoxRとスーパーオキサイドとの反応を観測することができ、スーパーオキサイドが直接の活性化のシグナルになっていることを証明した。また紫外共鳴ラマンスペクトルによる方法でSoxRの酸化還元あるいはDNA結合による構造変化を明らかにした。E. coliとP. aeruginosa SoxRのスーパオキサイドに対する反応性の違いを明らかにすることを目的として、鉄イオウクラスター周辺のアミノ酸残基に注目し、異なるアミノ酸をそれぞれに対応するアミノ酸に置換した変異体を作製する。パルスラジオリシス法でスーパオキサイドとの反応速度を観察する。SoxRのみC2とC3の間のアミノ酸の数が1つとなっており、この違いが鉄イオウクラスターの反応性と関係していると考えることができる。そこで、SoxRのC2とC3の間のアミノ酸数を増やした変異体を作製し、NOとの反応効率の変化を検討する。本研究では、転写不活性な還元型SoxRに結合しているDNAの結合様式を明らかにするために、以下の研究を行う。1)DNAの相補鎖の解離の追跡法として、グアニン(G)-シトシン(C)ペアの解離により蛍光強度が増加するプローブであるPyrrolo-C (C*)を用いる。またAminopurine (A*)も同様にチミン(T)と水素結合すると消光される。本研究では、DNA-SoxR複合体のX線構造解析により、相補的塩基対が解離していることが判明している塩基にC*あるいはA*を導入し、その蛍光スペクトルを測定する。
シンセティック・バイオロジーによる人工RNP複合体及びシステム進化系の構築

近年、生体分子や遺伝子ネットワークを「人工的に創り出す」作業を通して生命システムを理解しようとする「シンセティック・バイオロジー」が注目を集めている。本研究では、生体内で多くの機能を担うRNA-蛋白質(RNP)複合体をシンセティック・バイオロジーの一つの素材と捉え、(1)機能性人工RNP創製のための基盤技術を開発し、(2)RNPを利用した人工遺伝子回路を構築することを目指した。さらにこの複合体を工学的に応用し、(3)RNA-蛋白質相互作用に基づいた新しい遺伝子発現制御システム(RNPスイッチ)を構築することを研究目的に定めた。本年度は、人工RNPをデザインする基盤技術の開発、及びそのRNPを利用した人工翻訳制御システムを試験管内、及びヒト細胞内で構築することに成功した。具体的には、以下の研究成果を達成した。(a)機能性人工RNP創製のための基盤技術として、天然に存在するRNA-蛋白質相互作用に関連したモチーフを取得した。HIVのRNA結合蛋白質RevとバクテリオファージλN、及びそれらと特異的に相互作用するRNAモチーフを基盤にして、人工RNPをデザインし、その構造と配向性のデザインをゲル電気泳動及びFRETにより確認し、目的の人工RNP構造をデザインする技術を確立した。(b)RNP相互作用を基盤とした人工遺伝子回路を作成するため、ヒト細胞内で機能する人工リボスイッチを作製した。モデルシステムとして、GFPの発現を様々なパターンで制御できるRNPスイッチを創出した。(c)さらに、このシステムをヒト細胞に導入することで、ガン細胞のアポトーシス誘導回路をON/OFFに制御するRNPスイッチを創出することに成功した。近年、生体分子や遺伝子ネットワークを「再構築」することで、生命システムの理解を目指し、新しいバイオテクノロジーの誘発を目指すSynthetic Biologyが注目を集めている。我々のグループでは、RNAやタンパク質を分子デザインのためのモジュラー・ユニットとして利用することでSynthetic Biologyの新たなツールを開発し、生命システムの理解・制御に応用することを目指している。本年度は、(1)新規人工タンパク質創製技術を利用した、癌細胞アポトーシスネットワークの制御、(2)分子デザインと試験管内進化の融合技術(Design and Selection)を利用した、機能性RNA/RNPの研究を進めた。(1)天然タンパク質のペプチドモチーフを人工タンパク質上に再構成する「モチーフ・プログラミング」技術(Saito et al.,Nucleic Acids Res,2007)を用いて、細胞死抑制型Bcl-xL、および促進型Noxa由来4つのBH1-4モチーフを基盤とした人工タンパク質ライブラリーを作製した。単一のライブラリーから抽出した28個の人工タンパク質の中には、アポトーシスの誘導/抑制といった、逆の機能をもつクローンが含まれていた。このことは、タンパク質相互作用により形成されるアポトーシスネットワークの進化に、ペプチドモチーフが重要な役割を果たしたことを示唆している。(2)これまでに本研究代表者らのグループでは、Design and Selection技術により、二つのRNAを連結する人工RNA酵素(リボザイム)を創製した。このRNA酵素は、RNAの構造や基質認識部位を規定するモジュラー・ユニットと、触媒ユニットから構成される。本年度は、RNAエンジニアリングにより、様々な基質特異性をもったtrans型RNAリガーゼの取得に成功した。
妊娠期のストレス曝露が誘発する子の情動障害に対する抑肝散の治療メカニズムの解明

胎生期ストレス刺激により惹起される子の精神症状の緩和には早期の対応が必要となるが、小児の薬物療法では特に安全性の担保が必須である。抑肝散は子供の夜泣きなどに使用されてきた実績があり、また、種々の精神疾患治療薬と比較し、長期投与による副作用リスクが少ない。このような背景から、胎生期ストレス刺激が誘発する精神障害に対する安全かつ有効的な薬物療法として抑肝散の使用が期待されるが、その基礎医学的エビデンスの構築はなされていない。本研究は、マウスを用いた基礎実験を通じて、胎生期ストレス刺激が誘発する精神障害に対し、幼少期における安全性の高い薬物治療を提唱することを目的としている。
震災時の地域住民の避難圏域と建物被害からみた医療・福祉施設の配置計画に関する研究

本研究は、今回の阪神・淡路大震災における住民の避難行動などを明らかにして、災害時における医療活動の効率的な運営を模索するとともに、医療・福祉施設の被災状況を文献などから明らかにして、適正な施設配置計画を提案することを目的としている。本研究で明らかになったことは以下の通りである。1.灘区の各避難所への避難者の圏域を避難者名簿をもとにして分析した結果、80%避難圏は1Km程度とほぼ平常時の徒歩圏に当たることがわかった。したがって避難所や医療活動拠点は、今まで言われてきた広域拠点で対応するだけでは不十分で、もっと狭い地域ごとに対応できる体制づくりが必要である。2.医療施設では、大きな被害を受けなかった施設においても、水道などのライフラインの被害により活動が大幅に制約されたことがわかった。したがって今後は、施設自体の耐震性の向上とともに、速やかに外部からの援助を被災地へ投入すること、被災地内部の患者を被災地外に転送するシステムづくりが要求される。3.特に医療活動においては、平常時から全国的にネットワークを組んでいた組織ほど、被災地外からの支援が素早く行われ、地震後の立ち上がりが容易であったことから、医療施設同士のネットワークの強化が求められることがわかった。4.福祉施設においては建設年度が比較的新しいものが多く、その耐震性のために被害の程度が軽かった施設が多く、高齢者の救援活動に大きな力となったことがわかった。今回の地震においては、障害者や高齢者などの弱者対策の貧しさが指摘されているが、こうした施設を緊急時に役立てる方策が将来とも必要である。以上の結果より、医療・福祉施設の配置計画の提案としては、フェイルセーフの考え方を取り入れて集中配置よりも分散配置にし、それらをネットワークとして活用するシステム作りが将来の地震対策としても必要である。
血管内皮・平滑筋細胞においてレラキシンが関与する情報伝達経路の解明

レラキシンはU46619(トロンボキサン誘導体)によって引き起こされるブタ冠動脈平滑筋の収縮を増強するが、その機序は不明な点が多く、レラキシンが関与する情報伝達経路を解明するためには、血管平滑筋の収縮を制御する新規の情報伝達因子を同定することが重要である。そこで、ブタ冠動脈平滑筋収縮を引き起こす因子として研究代表者が最近発見したスフィンゴシルホスホリルコリン(SPC)を用い、血管平滑筋の情報伝達系を調べる実験を行った。SPCは、β-エスシンによって細胞膜に小孔をあけたスキンド標本において、細胞質Ca^<2+>一定の条件下で収縮を引き起こした。これによって、SPCは、血管平滑筋収縮装置のCa^<2+>感受性を増加させることが、直接証明された。SPCによる細胞質Ca^<2+>一定下での収縮は、Rho-kinaseの阻害剤であるY27632によって抑制された.Rho-Kinaseは、Ca^<2+>-カルモジュリン-ミオシン軽鎖キナーゼを介さずに、ミオシン軽鎖を直接リン酸化することによって、平滑筋の収縮を引き起こす新規の細胞内情報伝達因子として、最近同定された物質である。Rho-kinaseは、in vitroにおいて、低分子量G蛋白Rhoによって活性化されることがわかっている。SPCによる細胞質Ca^<2+>一定下での収縮は、G蛋白阻害剤であるGDPβSによっても抑制された。したがって、SPCによるCa^<2+>感受性増加作用には、RhoとRho-kinaseを介する経路が関与している可能性が高い。しかし、受容体と三量体G蛋白を介する経路や、Rho-kinaseを直接SPCが活性化する経路の可能性も考えられ、さらなる研究が必要である。トロンボキサンの誘導体であるU46619によって引き起こされるブタ冠動脈平滑筋の収縮を、レラキシンが増強することが明らかとなった。レラキシンの効果は、ホルモン状態によって変化する可能性が大きいと考えられる。したがって、週齢およびエストロゲンがレラキシンの効果に影響するかどうかを、ラット大動脈を用いて検討したが、レラキシンを投与しても、フェニレフリンによって引き起こされるラット大動脈の収縮は変化しなかった。一方、レラキシンが関与する細胞内情報伝達系は、不明な点が多いため、血管平滑筋の収縮を制御する新規の細胞内情報伝達因子を同定する実験を平行して行った。その結果、細胞膜の生理的構成成分であるスフィンゴ脂質の一つであるスフィンゴシルホスホリルコン(SPC)が、ブタ冠動脈平滑筋の収縮を引き起こすことが明らかとなった。さらに、SPCは、ブタ冠動脈平滑筋の細胞質Ca^<2+>濃度を増加させるが、細胞質Ca^<2+>濃度増加から予想される以上に強い収縮Ca^<2+>非依存性の収縮)を引き起こすことが示された。細胞質Ca^<2+>濃度の測定は、蛍光指示薬fura-2を用いて行った。細胞内へfura-2を負荷し、340nmおよび380nmの励起光を当て、510nmにおいて蛍光を測定し、その蛍光比を細胞質Ca^<2+>濃度の指標とした。今後は、レラキシンによる収縮とスフィンゴ脂質によるCa^<2+>非依存性の収縮との関係を明らかにしていくと共に、レラキシンが血管内皮細胞に与える影響を調べていく必要がある。
ICAとGAを併用したノイズ除去アルゴリズムの開発

音声信号からのノイズ除去手法としては様々な手法が提案されているが,本研究では近年信号処理の分野で注目されているICA用いてノイズ除去を行う手法の開発を行った.これは,ノイズが本来の信号成分とは統計学的に独立であることに基づくものである.従来のICAは主としてニューラルネットワークを用いて実装されており,この場合,ノイズ除去性能は向上させるためには,ニューラルネットワークの閾値関数を入力となる信号の確率密度分布に応じて適切に決定する必要があった.本研究では,この点に関して信号の独立性を相互情報量を数値積分によって求めることによって直接的に評価し,入力信号の確率密度分布に依存しないノイズ除去手法の開発を目的としている.この目的に対して,計画第2年度では,初年度に行った基礎的なシミュレーションによる検討に基づき,主として処理速度について改善を行った.処理速度を改善するにあたって,リアルタイムに入力されるデータを遅延なく処理するために,専用の積和演算回路を開発することとした.このため,近年,大規模な回路を容易に構築することが可能なことで注目されているFPGAの利用を検討した.結果として,FPGAを用いて乗算器を並列に構成することにより,10MHzの動作周波数で550MHzの計算機と同等の処理速度を達成することが確認された.以上の検討により,初年度で問題であった計算コストについてもある程度改善することができた.音声信号からのノイズ除去手法としては様々な手法が提案されているが,本研究では近年信号処理の分野で注目されているICA用いてノイズ除去を行う手法の開発を行った.これは,ノイズが本来の信号成分とは統計学的に独立であることに基づくものである.従来のICAは主としてニューラルネットワークを用いて実装されており,この場合,ノイズ除去性能は向上させるためには,ニューラルネットワークの閾値関数を入力となる信号の確率密度分布に応じて適切に決定する必要があった.本研究では,この点に関して信号の独立性を相互情報量を数値積分によって求めることによって直接的に評価し,入力信号の確率密度分布に依存しないノイズ除去手法の開発を目的としている.この目的に対して,計画初年度では,従来のニューラルネットワークを初めとする微分情報に基づいた逐次最適化アルゴリズムを基本として,相互情報量を数値積分によって評価するための枠組みとGAによる実装について基礎的な検討とシミュレーションを行った.結果として,従来ニューラルネットワークで実装されていた手法と比較して,同程度の信号分離を行うことが可能であることが示された.また,様々な確率分布をもつ入力信号に対しても安定した分離性能を得ることができた.しかし,相互情報量の数値積分とGAによる最適化には膨大な計算コストが必要であるため,実用化に際しては大きな問題になると考えられる.次年度ではこの点についてさらに検討を進める予定である.音声信号からのノイズ除去手法としては様々な手法が提案されているが,本研究では近年信号処理の分野で注目されているICA用いてノイズ除去を行う手法の開発を行った.これは,ノイズが本来の信号成分とは統計学的に独立であることに基づくものである.従来のICAは主としてニューラルネットワークを用いて実装されており,この場合,ノイズ除去性能は向上させるためには,ニューラルネットワークの閾値関数を入力となる信号の確率密度分布に応じて適切に決定する必要があった.本研究では,この点に関して信号の独立性を相互情報量を数値積分によって求めることによって直接的に評価し,入力信号の確率密度分布に依存しないノイズ除去手法の開発を目的としている.この目的に対して,計画第2年度では,初年度に行った基礎的なシミュレーションによる検討に基づき,主として処理速度について改善を行った.処理速度を改善するにあたって,リアルタイムに入力されるデータを遅延なく処理するために,専用の積和演算回路を開発することとした.このため,近年,大規模な回路を容易に構築することが可能なことで注目されているFPGAの利用を検討した.結果として,FPGAを用いて乗算器を並列に構成することにより,10MHzの動作周波数で550MHzの計算機と同等の処理速度を達成することが確認された.以上の検討により,初年度で問題であった計算コストについてもある程度改善することができた.
R+D変態の共存・競合系のクラスター変分計算

クラスター変分法(Cluster Variation Method;CVM)は、モンテカルロ法や分子動力学法と並んで、原子配列の詳細を考慮し得る平衡状態の計算手法として多くの成功をおさめてきた。しかし、これまでの取り扱いは、いわゆるReplacive transformation(以下R変態)、即ち原子の拡散による位置交換が生起する変態現象(拡散変態)に特化されてきた。規則-不規則変態に代表されるR変態は相変態論の一大領域を形成するが、もう一つの大領域を形成するマルテンサイト変態に代表されるDisplacive transformation(以下D変態)へのCVMの応用はなされていない。本研究では、連続変位クラスター変分法を原子の集団変位の問題に拡張することによりR+D共存・競合系の相変態の理論計算を遂行した。特に、正方格子に関する相安定性の問題に取り組み、c軸の変位効果に関して、これまでよりも多くの準格子点を導入し、計算の精緻化を図った。また、エネルギー項の導入に当たっては、電子状態の計算から原子間有効相互作用エネルギーを導出する必要があるが、超多元系に対するクラスター展開を実行した。さらに、ZrO_2における酸素イオンの変位が誘起するマルテンサイト変態に本手法を拡張し、この変態が2次変態であることを確かめた。加えて、フォノンモードの考察を行う為に、連続変位クラスター変分法から得られる原子変位をフーリエ変換することにより、k-空間での散漫散乱強度を算出した。これらの計算は、常に平衡状態図の計算とカップルして行い、相安定性とR+D相変態に対する統合的な知見を得た。マルテンサイト変態に代表される変位型相変態は、規則不規則変態に代表される拡散型相変態と同じように極めて重要な相変態モードである。しかし、これまでのクラスター変分法の応用は、拡散型変態に集中しており、変位型変態の取り扱いはなされていない。本研究の目的は、変位型相変態にクラスター変分法を応用することである。初年度の本年度は、クラスター変分法を変位型相変態に適用すべく、連続変位クラスター変分法(CDCVW)に基づく定式化を行った。特に、モデル系の相平衡状態図を算出し、規則-不規則変態温度が原子の局所変位の効果によってどの程度まで減少するかの知見を得た。これに加えて、quasi-harmonic近似を用いて、格子の高温軟化の計算を試み、異なったサイズの原子が混合した場合、Bravais格子の対称性を保ったまま格子が軟化することによる自由エネルギーの減少量と、原子の局所変位による自由エネルギーの減少量を比較した。後者の効果が極めて大きいことを確認し、連続変位クラスター変分法による計算が有効であることを確認した。次に、マルテンサイト相の自由エネルギーを単純な現象論的手法で書き表し、これを用いたフェーズフィールド法の計算を行った。この計算では、マルテンサイト相の空間分布や温度変化による変態の進行状況の可視化が可能になった。又、正方歪を有するL10規則相の相安定性・相平衡の理論計算を行うために、c軸方向への原子変位を連続変位クラスター変分法の範疇で定式化を行った。
情報変換分子の静的及び動的微細構造

視物質に特異的に反応するモノクローン抗体を用い(徳永,谷村)オブシンの生合成が11-シスレチノイドによって小胞体や多胞体で開始されることが結論された(谷村)。またレチノイドが異なれば合成されるオプシンもまた異なることが推論された(塚原)。甲殻類視細胞で熱的に最も不安定な11-シスレチナールが多不飽和脂肪酸とエステルを作って安定に存在し視物質代謝の補給源であることが発見された{鈴木(龍)}。生体膜中にある機能蛋白が、抽出されても機能保持が可能な界面活性剤の開発を行った。親水部がしょ糖で、疎水部が適当な長さの脂肪酸がエステル結合したものが可溶可能、溶液の安定性ともに優れていることが明らかにされた(鬼頭)。この研究から、受容膜は流動性に富むことが予測されるが、ある種の甲殻類視細胞では受容分子の自由回転は非常に制限されていることが推定された(塚原)。この原因は膜タンパク質の側方移動を強く制限しうる細胞骨格(大西)とは異なる機構にあると考えられる。さらに、機能分子の挙動に関する理論的な検討も進んでいる{鈴木(英)、物井}。視物質の再生過程におけるスペクトル再生とG蛋白質活性化能の消滅に関与する部位間は低温でデカップルされる(猪飼)。バクテリアの光情報変換レチノイド蛋白質のナノ秒分光により新しい中間体が発見された(小林)。一方バクテリオロドプシンがプロトンを膜内から外へ輸送するさいのプロトン化シッフ塩基やそれと相互作用を行う蛋白質側の部位の機能が明らかにされた(前田)。全く違った機構で分子内にプロトンの流れを生ずるチトクロム酸化酵素が酸素を水に還元する際の分子変化の様子が明らかにされ、マイクロ秒単位でプロトンの速い動きを観察する事に成功した(折井)。同じ系で、鉄に結合したヒスチジンが電子移動とプロトンポンプをカップリングしている可能性が示唆された(北川)。
耐塩性シロイヌナズナが有する塩馴化能の遺伝学的解析

シロイヌナズナには世界中に1000種以上のaccession(自然変異系統)が存在し、これらのaccession間には耐塩性に大きなバリエーションが確認されている。先行研究から耐塩性accessionは、塩に馴化することで強力な浸透圧ストレス耐性(塩馴化後浸透圧耐性)を示すこと、さらにこの塩馴化後浸透圧耐性には1遺伝子座(ACQuired OSmotolerance locus: ACQOS locus)が寄与していることが示された。ACQOS locusを特定するため、当該領域のみを耐性種Bu-5由来の塩基配列に置換したCol-0バックグラウンドのNILを作出した。NILを用いた高精度遺伝学的解析の結果、当該領域を67 kbまで絞り込むことに成功した。この67kb内にはBu-5とCol-0の間に塩基配列が大きく異なる領域が存在すること、両者においてもその領域にはNB-LRR (NLR)がコードされていることが明らかとなった。これらの遺伝子を用いた相補試験の結果、Col-0の有するNLRが塩馴化後浸透圧耐性を抑制する原因遺伝子ACQOSであることが示された。NLRは、病害抵抗性を誘導する植物免疫センサーとしての役割が知られている。そこでACQOSの免疫応答への関与を調べるため、浸透圧ストレス下における免疫応答の活性化を調べた。その結果、Col-0は浸透圧ストレス下でサリチル酸の高蓄積と免疫応答遺伝子の発現誘導を示したことから、ACQOSは浸透圧ストレスにより免疫応答を活性化することが示唆された。次に免疫応答に働く因子の欠損変異株(Col-0バックグラウンド)における塩馴化後浸透圧耐性を評価した結果、免疫応答の主要制御因子欠損株であるeds1, pad4は塩馴化後浸透圧耐性を示した。一方、サリチル酸枯渇株sid2, eds5、およびNahG過剰発現株は、塩馴化後浸透圧耐性を示さなかった。これらの結果から、ACQOSによる塩馴化後浸透圧耐性の抑制はEDS1/PAD4を介したサリチル酸非依存的なシグナル伝達経路に依ることが示唆された。27年度が最終年度であるため、記入しない。我々のグループでは、世界中から集められたシロイヌナズナのaccessions間における耐塩性のナチュラルバリエーションを分子遺伝学的に解明することを目的に、350種のaccessionsについて耐塩性評価を行った。その結果、著しい耐塩性を示すaccessionsをいくつか発見し、これらの耐塩性accessionsは塩に馴化する能力(塩馴化能)を有し、強力な浸透圧ストレス耐性を獲得できることを明らかにした。本研究はこの塩馴化能を分子レベルで解明することを目的に遺伝学的解析を進めている。これまでの研究から、塩馴化能の有無を司る遺伝子領域は第5染色体上の約67 kbpまで絞り込まれていた。シロイヌナズナについては約1000 accessionsについて塩基配列の情報が公開されているが、ゲノムシーケンサーによる塩基配列情報は、実験系統Col-0の塩基配列を基準として貼り付け作業を行うため、10 bpを超える「挿入」や「欠損」が他のaccessionsに存在する場合、それらを検出することが出来ないため、accession間に存在する全多型を検出することは不可能であった。そこで本年度は塩馴化型accession Bu-5のゲノムに由来するBACライブラリー(昨年度作出済み)のシークエンス解析を行い、前述の67kbpについて塩基配列を決定した。その結果、Col-0とBu-5とで塩基配列が大きく異なり、コードされる遺伝子の数も異なる(Col-0は4個、Bu-5は1個)領域が存在することが明らかとなった。Col-0の有する4遺伝子のうち、3つの遺伝子について欠損体を獲得し、塩馴化能を確認した。その結果、1遺伝子の欠損体が塩馴化能を示した。さらに、この遺伝子を導入したBu-5では塩馴化能が損なわれたことから、この遺伝子が塩馴化能を抑制する遺伝子であることが明らかとなった。