hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
心筋細胞特異的発現遺伝子群の統合的調節機構および慢性的疾患発生機序の解明

本研究計画では各発生段階からの均一な心筋細胞集団からDNAメチル化エピゲノムデータから、細胞種特異的なDNAメチル化エピゲノムの成り立ちについての理解を深めた。結果として、細胞特異的発現遺伝子の一部に、gene body領域での顕著なDNAメチル化変動を経る遺伝子があることを見出した。これら成熟細胞におけるgenebody領域の低メチル化状態は転写マシナリーおよびp300の蓄積を伴い、さらに成熟過程における細胞種および発生段階特異的な一過性なDNA脱メチル化中間産物の蓄積と関連している。gene body領域でのDNA脱メチル化プロセスが細胞特異的遺伝子発現に関与している可能性を示した。本研究計画では人為的疾患モデルマウスの心筋細胞のDNAメチル化エピゲノム解析を行い、病的状態の心筋細胞のエピゲノム変化を調べる。H24年度は、病的状態の心筋細胞を、マウスの大動脈縮窄(TAC)による心肥大および心不全の起こったマウス心臓および同じ週齢のマウス心臓から採取した。ランゲンドルフ潅流法を用いて心筋細胞を単離し、DNAを抽出した。DNAよりDNAメチル化感受性・非感受性制限酵素断端を利用した大量タグシークエンスを行い、ゲノムワイドなDNAメチル化パターンを作成した(HELP法)。TAC処理を行わなかった同時期の心筋細胞エピゲノムとの比較により、病態発生に従ってDNAメチル化が変化する領域を抽出した。心不全に陥った心臓では胎児型遺伝子の遺伝子発現が起こる"幼若化"が観察されることから、若手研究(B)「心筋細胞分化の段階的DNAメチル化プロファイリングと幹細胞分化能評価ツールの開発」で得られた発生段階別の心筋細胞エピゲノムとの比較により、病的状態エピゲノムの異常には、幼若化に関与するものとそうでないものの両方が含まれることが明らかになった。このうち、gene body領域(プロモーター以外のエクソン-イントロンを含む遺伝子コード領域)における変化では、DNAメチル化の変化に伴ってDNA結合タンパクの蓄積量が変化する可能性があるため、クロマチン免疫沈降法によるDNA結合タンパクの分布の検討についての計画を進めている。心筋細胞のエピゲノム変化の生物学的意味の検討には、遺伝子の転写活動をsplicing調節も含め詳細に解析する予定であり、mRNA-seqおよびsmallRNA-seqの検討を行なっている。また、脱メチル化分子機構関連遺伝子の遺伝子操作を用いて心筋細胞における脱メチル化分子機構の解明を目指す。本研究計画は、DNAメチル化エピゲノム解析によって、心筋細胞の発生と成熟について理解することを目的としている。そのため、これまでに大量DNAメチル化解析法であるHELP法によって作成した心筋細胞の発生化的における均一な細胞集団からのDNAメチル化エピゲノムデータを基に、さらにES細胞と肝臓のDNAメチル化エピゲノムデータを加えることにより、細胞特異的なDNAメチル化パターンをゲノムワイドに把握した。更にこれを詳しく調べるために、各細胞種の遺伝子発現パターンによって遺伝子群を分類したところ、プロモーター領域よりも、gene body領域(プロモーターを除く遺伝子のエクソンおよびイントロン領域)で興味深いDNAメチル化パターンが観察された。限られた高発現遺伝子の一部に、極めて低メチル化状態のgenebody領域を持つ遺伝子が含まれており、成体の成熟細胞では特に細胞種特異的発現遺伝子がこれに多く含まれていた。細胞種特異的発現遺伝子の低メチル化はES細胞には観察されず、分化・成熟細胞の特徴と考えられた。このgene body領域はENCODEの網羅的エピゲノムデータと比較すると、Pol2およびp300の蓄積する遺伝子と一致しており、Pol2およびp300の蓄積が成熟細胞におけるgenebody領域のDNA低メチル化と密接な関係をもつことが示唆された。更にこれらの領域についてDNA脱メチル化中間産物についても解析したところ興味深いDNAメチル化ターンオーバーが観察された。心不全においては、慢性的な酸化ストレスが病態発生の一つの要因とされていることから、酸化ストレスがDNAメチル化ターンオーバーを介して特定の遺伝子群の発現増強に関わっている可能性があり、本研究によってその標的候補遺伝子を示すことができたといえる。本計画は、ほぼ計画通りに進行している。最も懸案であった疾患モデル動物の作製も順調に行うことができ、DNAメチル化エピゲノムの取得に至ることが出来た。25年度の転写産物の解析のための準備も順調に進行中である。25年度が最終年度であるため、記入しない。25年度は、24年度の解析で得られたDNAメチル化の変化を、転写および他のエピゲノム情報とのリンクを仮定し、検討を進めていく。次世代シークエンサー技術による詳細な転写.,解析の他、データベースにおけるエピゲノム情報との比較を行なっていく。本計画で得られたDNAメチル化エピゲノム情報は他では見られない貴重なデータであるため、これを公共データベースからのデータと照らしあわせてさらに解読していくことにより、具体的な標的を絞っていくことができると期待している。
構造系と制御系の統合最適設計による情報機器の追従制御機構の性能向上

振動制御系と位置決め制御機構の高性能化を達成するために、構造系と制御系の統合設計法の提案および開発を行った。本方法は、遺伝的アルゴリズムと感度解析法を用いた非線形計画法に基づいており、制御性を考慮した構造最適化および構造系と制御系の統合最適化の両方を実行可能である。構造系と振動制御系の統合最適化では、制御系としてH^∞制御系を採用し、遺伝的アルゴリズムを用いて構造物形状と制御則、さらにセンサーおよびアクチュエーターの配置最適化を行うことにより、高性能な周波数整形を可能にした。構造系とサーボ系の統合最適化では、周波数領域と時間領域の性能に対応するために2種類のサーボ系を導入した。すなわち、1入出力系に対して用いられる動的補償器と、多入力系に対して設計されるLQI制御系である。サーボ性を考慮した構造最適化では、制御対象の固有振動数と固有モードをサーボに適した周波数応答が実現されるように最適化する方法を開発した。構造系と動的補償器の統合最適化では、着目する全てのモードの安定性を維持しながら、サーボ性能を左右する主要な極の配置を最適化し、閉ループ系に要求される周波数特性を達成することを可能にした。構造系とLQI制御系の統合最適化では、閉ループ系の安定性を維持しながら、目標入力に対する時間領域での高速追従性能を実現した。本研究で提案・開発した方法を簡易構造の位置決めデバイスの統合設計に適用し、その有効性と実用性を検証している。
遺伝子発現制御システムの機能解析に基づいた新規予防医学的バイオマーカー開発

本研究は、遺伝子発現制御システムであるマイクロRNA(miRNA)の体内動態および機能を解析し、加齢に伴う疾患の共通発症基盤である血管内皮機能障害の早期予知を可能とする新規予防医学的バイオマーカーを開発することを目的として行った。1として、地域住民コホート対象者から血液・尿中エクソソームを回収し、内包miRNAを定量解析し、血管内皮機能を反映する指標との関連を評価することを目的とした。また、2として、ヒト正常細胞を用いてゲノム編集により血管内皮機能に関連する遺伝子多型のモデル細胞株シリーズを構築し、miRNAとの相互作用について作用機序を詳細に解明し、個別化予防法確立へ応用できる予防医学的バイオマーカーになり得るか検証することを目的とした。目的1については、エクソソームの回収方法について検討し、血管内皮機能に影響を及ぼすマイクロRNAの発現と、動脈硬化指標との関連性について検討した。目的2については、まず地域住民コホートで得られた血液を用いて、血管内皮機能に影響を及ぼす遺伝子型を抽出した。ヒト正常細胞にゲノム編集によりこれらの遺伝子型を導入し、影響を評価することを試みた。本研究は、地域住民コホートにおいて、加齢に関する疾患の共通発症基盤である血管内皮機能障害の初期過程の早期予知を可能とする鋭敏な予防医学的バイオマーカーの提示を目指している。平成28年度においては、全対象者について、PON1、PPARG、eNOS、PLA2G7等、血管内皮機能に関連する遺伝子の多型解析を終えた。また、一部の対象者について、血中および尿中エクソソームを回収し、内包miRNAを抽出した。エクソソームの回収方法、miRNA抽出及び定量解析方法について検討した。住民対象者において、非侵襲性動脈硬化指標は測定し終え、遺伝子型解析も終えている。しかしながら、血清中および尿中における血管内皮機能関連マーカーの測定については、測定方法の予備実験を終えただけであり、さらに血中および尿中エクソソームの回収方法についても検討を終えた段階で、実際の対象者の検体についての測定を行えていないため、やや遅れていると考える。本研究は、地域住民コホートにおいて、心疾患や脳血管疾患、認知症などの加齢に関する疾患の共通発症基盤である動脈硬化に着目し、その原因となる血管内皮機能障害の初期段階での早期予知を可能とする鋭敏な予防医学的バイオマーカーの提示を目指している。また、血中および尿中のエクソソーム回収について検討した。特に、血液の保存状態の影響について、沈殿法やカラム法など数種類の方法について検討した。遺伝子型の解析については順調に進んている。また、血中尿中の血管内皮機能障害、酸化ストレスマーカー測定についても、前年度で予備実験を行った結果を考慮した上で、本格的な解析に取り組んでいる。エクソソーム回収については、血液の保存状態の影響がより出にくい回収方法について検討中であり、また、内包miRNA抽出および発現量解析についても数種類の方法について検討中であり、やや遅れていると考える。ゲノム編集による各遺伝子型モデル細胞構築については、当該年度に着手する予定であったが、まだ着手できていないため、遅れていると考える。当該年度で確立した方法を用いて、全対象者について血管内皮機能障害指標を解析し、抽出した対象者について、miRNAの解析を進め、血管内皮機能関連遺伝子型との相互作用機序解明について研究を進める。さらに、平成29年度では、ゲノム編集ツールであるCRISPR/Cas9システムを用い、ヒト正常組織由来細胞に一塩基置換を導入し、血管内皮機能関連遺伝子多型モデル細胞株シリーズの構築を目指す。血中尿中血管内皮機能障害及び酸化ストレスマーカー測定を終え、エクソソーム回収及び内包miRNA抽出および発現量解析についての方法論を確立し、測定した上で、解析する。ゲノム編集については、申請時に予定していたヒト正常血管由来細胞HUVECおよびHAECなどについて、CRISPR/Cas9法を用いて、これまでに解析を終え、血管内皮機能との関連が明らかとなっているPON1や血管内皮型一酸化窒素合成酵素(eNOS)などについて、一塩基置換を導入し、影響を評価する。本研究で使用する予定の試薬について、本研究助成決定前に購入していた試薬を用いて予備実験を行ったため、当該年度では試薬を購入しなかったため。血中尿中バイオマーカー測定、エクソソーム回収、内包miRNA解析に使用する試薬について、数種類について検討していたため、実際の測定が行えず、当該年度に使用するため。

また、ゲノム編集については着手するのが当該年度にずれ込んだためである。申請時の計画どおり、血管内皮機能障害指標、血中および尿中エクソソーム内包miRNA解析用試薬購入に充てる。また、ゲノム編集ツールであるCRISPR/Cas9システム、細胞購入を予定通り行う。
アセトアミノフェン中毒の病態形成における樹状細胞の役割解析と法医診断学への応用

解熱鎮痛剤として汎用されているアセトアミノフェン(APAP)は,肝臓特異的に障害を起こすことが知られており,容易に入手できることから自殺や偶発的な事故など,法医実務においてしばしば中毒事例と遭遇する.本研究では,炎症の制御あるいは増幅に関わる樹状細胞の中でも,特に細胞障害性T細胞を誘導する活性が強いXCR1陽性樹状細胞(XCR1+DC)に注目し,マウスを用いた実験によりAPAP肝障害におけるXCR1+DCの態様,マクロファージ(クッパー細胞)の動態,APAP代謝動態,炎症性サイトカインの発現動態との関連性を解析することを目的として実験を行った.マウスはXCR1遺伝子欠損およびXCL1遺伝子欠損マウスと,コントロールとして野生型(C57BL/6)マウスを使用し,APAPを600 mg/kg投与後,経時的(10,24時間)に各マウスから採取した血液を血清分離し,血清中逸脱酵素(ALT, AST)の測定を行い,肝障害の程度を生化学的に解析した.その結果,野生型マウスと比較してXCR1遺伝子欠損マウスでALT,AST上昇の増加が見られた.さらに投与後10時間及び24時間に採取した肝臓組織から作成したパラフィン包埋切片をHE染色し,形態学的変化を観察したところ,野生型マウスと比較してXCR1遺伝子欠損マウスで,肝障害の増悪が見られたことから,APAP肝障害におけるXCL1-XCR1シグナルの関与が示唆された.野生型マウスにAPAPを投与後,経時的(10,24時間)に採取した肝組織により,total RNAを抽出し,逆転写によりcDNAを合成,real time RT-PCRを行い,各時間におけるXCL1およびXCR1のmRNAを定量した結果,XCL1は24時間まで増加していた.当初の計画通り進展しているため今後は,免疫染色やウエスタンブロットを行い,また蛍光二重染色によるXCL1発現細胞の確認も行うことで,さらに詳しいAPAP肝障害におけるXCR1陽性樹状細胞の動態及び分子メカニズムの解明を目指すとともに,APAP投与後の各遺伝子欠損マウスにおける炎症性サイトカインの遺伝子発現検討を行う.さらに実際の法医解剖においてAPAPやその他薬物中毒と判断された事例において,血液や各臓器を採取し,各XCR1の動態をたんぱく質及び遺伝子レベルで検索を行う.それらの検索結果は,動物実験モデルを用いた結果と比較検討し,XCR1発現動態がAPAP中毒診断に応用可能か否かについて検討する.解熱鎮痛剤として汎用されているアセトアミノフェン(APAP)は,肝臓特異的に障害を起こすことが知られており,容易に入手できることから自殺や偶発的な事故など,法医実務においてしばしば中毒事例と遭遇する.本研究では,炎症の制御あるいは増幅に関わる樹状細胞の中でも,特に細胞障害性T細胞を誘導する活性が強いXCR1陽性樹状細胞(XCR1+DC)に注目し,マウスを用いた実験によりAPAP肝障害におけるXCR1+DCの態様,マクロファージ(クッパー細胞)の動態,APAP代謝動態,炎症性サイトカインの発現動態との関連性を解析することを目的として実験を行った.マウスはXCR1遺伝子欠損およびXCL1遺伝子欠損マウスと,コントロールとして野生型(C57BL/6)マウスを使用し,APAPを600 mg/kg投与後,経時的(10,24時間)に各マウスから採取した血液を血清分離し,血清中逸脱酵素(ALT, AST)の測定を行い,肝障害の程度を生化学的に解析した.その結果,野生型マウスと比較してXCR1遺伝子欠損マウスでALT,AST上昇の増加が見られた.さらに投与後10時間及び24時間に採取した肝臓組織から作成したパラフィン包埋切片をHE染色し,形態学的変化を観察したところ,野生型マウスと比較してXCR1遺伝子欠損マウスで,肝障害の増悪が見られたことから,APAP肝障害におけるXCL1-XCR1シグナルの関与が示唆された.野生型マウスにAPAPを投与後,経時的(10,24時間)に採取した肝組織により,total RNAを抽出し,逆転写によりcDNAを合成,real time RT-PCRを行い,各時間におけるXCL1およびXCR1のmRNAを定量した結果,XCL1は24時間まで増加していた.当初の計画通り進展しているため今後は,免疫染色やウエスタンブロットを行い,また蛍光二重染色によるXCL1発現細胞の確認も行うことで,さらに詳しいAPAP肝障害におけるXCR1陽性樹状細胞の動態及び分子メカニズムの解明を目指すとともに,APAP投与後の各遺伝子欠損マウスにおける炎症性サイトカインの遺伝子発現検討を行う.さらに実際の法医解剖においてAPAPやその他薬物中毒と判断された事例において,血液や各臓器を採取し,各XCR1の動態をたんぱく質及び遺伝子レベルで検索を行う.それらの検索結果は,動物実験モデルを用いた結果と比較検討し,XCR1発現動態がAPAP中毒診断に応用可能か否かについて検討する.
性成熟後の養育環境はラットの視空間的能力の性差を形成する

地図を読む、幾何学の問題を解くなどの視空間的能力において、男性は女性と比べて優位性を示すことが報告されており、このような性差はヒトのみならずサルやラットなどの他の哺乳類でも確認されている。従来、視空間的能力の性差は、脳の性分化により引き起こされると考えられていた。しかし我々は、ラットを用いた一連の研究から、この視空間的能力の性差が生後の環境の影響でつくられることを明らかにした(Endo et al.,1994;Takase et al.,2005a;Takase et al.,2005b)。とは言え、生後のどの時期の環境が視空間的能力の性差をつくるのか未だ不明であった。そこで我々は、雌雄ラットが性成熟する6週齢以降の時期に注目した。この時期はヒトでは思春期以降にあたる(Ojeda and Urbanski,1994)。本研究では視空間的能力という高次脳機能の性差が、思春期以降の環境によってつくられることを明らかにし、思春期以降の環境がどのように視空間的能力の性差をつくるのか、海馬体に注目し、その神経基盤の解明を試みた。現在まで、1)雌雄ラット海馬体内アセチルコリン分泌量は発達に伴い増加すること、2)6週齢以降は雄性ラットの分泌量が雌性ラットに比べて顕著に増加すること、3)その性差は6週齢以降の給餌環境の操作により解消されることを明らかにし、その結果を論文にまとめた(Takase et al.,Phsiol Behav:2007)。また途中、運動機能の性差を偶然発見し、その神経基盤を解明するに至った(Takase et al.,Brain Res:2007)。さらに、視空間的能力に関わる内側前頭前野においてもアセチルコリン分泌に顕著な性差を認め、現在その結果を論文にまとめ投稿中である(Takase et al.,Neuroscience:2007)地図を読む、幾何学の問題を解くなどの視空間的能力において、男性は女性と比べて優位性を示すことが報告されており、このような性差はヒトのみならずサルやラットなどの他の哺乳類でも確認されている。しかし我々は、ラットを用いた一連の研究から、この視空間的能力の性差が生後の環境の影響でつくられることを明らかにした(Endo et al.,1994;Takase et al., 2005a ; Takase et al., 2005b)。この時期はヒトでは思春期以降にあたる(Oj-eda and Urbanski, 1994)。現在まで、1)雌雄ラット海馬体内アセチルコリン分泌量は発達に伴い増加すること、2)6週齢以降は雄性ラットの分泌量が雌性ラットに比べて顕著に増加すること、3)その性差は6週齢以降の給餌環境の操作により解消されることを明らかにし、その結果を論文にまとめ現在受理に向けて作業を進めている(Takase et al., Phsiol Behav : accept with revise)。また途中、運動機能の性差を偶然発見し、その神経基盤を解明するに至った(Takase et al., Brain Res : 2007)。

また途中、運動機能の性差を偶然発見し、その神経基盤を解明するに至った(Takase et al.,Brain Res:2007)。さらに、視空間的能力に関わる内側前頭前野においてもアセチルコリン分泌に顕著な性差を認め、現在その結果を論文にまとめ投稿中である(Takase et al.,Neuroscience:2007)
バイオロジカルモーションの幾何学と脳内鋳型:刻印づけ手順による研究

バイオロジカルモーション(生物的運動BM)とは、主要な関節を光点で置き換えた単純な動画から、人間が活き活きとした人の姿を近くすることができる、という現象である。Johanssonによる発見以来、人間はBMから対象の性別、年齢、個人を特定するのみならず、その人の感情を読み取ることができることが判明した。この問題に対して生物学的に納得のいく答えはまだ提出されていない。本研究では、孵化直後のニワトリのヒナが、BMに対する選好性を示すという先行研究(Vallortigara et al. 2005)の結果の再現性を検討することから研究を開始した。実際、孵化直後に全くの視覚経験も与えないヒナは、我々の研究ではBM選好性を示すことがなかった。そこで、刻印付け(インプリンティング)手順を用いて光点動画の記銘を試みたところ、BM選好性が強く発現することが判明した。特にオスに置いては、刻印付け手順に手曝された刺激がBM性を持っている必要はなかった。ニワトリの形状を模した二次元射影像(ニワトリの形状を含むがBM性はない)、あるいは周期的であるが互いの二次元配置が固定された動画像、更には、互いに関連することなくランダムに動く光点であっても良い。いずれの初期経験を負荷した場合でも、その直後のテストに置いて、ヒナはBM性を持つ画像に対して選好性を示した。即ち、この選好性は刻印付けによって教示的に獲得されたものでない。BM選好性は生得的であるが、発現のためには光点動画への暴露が必要であったのである。この結果はAnimal Cognition誌に投稿し、acceptable after revisionのコメントを得た。現在改訂稿の投稿を済ませ、エディターの決定を待っている。更に、刻印付けが甲状腺モルモンの作用亢進を経て、その後の色記銘を長期にわたり強化することを示唆する結果を得た。バイオロジカルモーション(生物的運動、BM)は、ヒトや動物の動く姿を極度に単純化した動画から、生き生きとした生き物の姿が知覚される現象である。主要な関節の位置を光点(ドット)に置き換えて、その3次元的運動の2次元射影像を見るだけで、ヒトは対象の性別・情動・意図などを読み取ることができると報告されている。Johanssonによる発見以来、ヒト新生児においてもBMの知覚(BMへの選好性)が認められることから、この知覚が生得的であることが示唆された。更に、本研究の連携研究者(G.Vallortigara)によって、孵化直後の鶏雛(ヒヨコ)においても同様のBM選好性が見出されることから、BMの知覚は種の垣根を超えて普遍的な視覚系の動特性であることが示唆されるにいたった。本年度は、刻印付け手順(インプリンティング、刷り込み)を施すことによって、BM選好性がどのように修飾されるか、特に強いBM選好性を誘導するため実験的手順を行動実験を通して体系的に検索した。その結果、先行研究といささか異なり、(1)ナイーブな個体(孵化直後に一切の視覚経験を持たないヒヨコ)は明確なBM選好性を示さないが、(2)刻印付けを施した個体は強いBM選好性を示し、かつ、(3)刻印付けに用いる視覚的刺激がBM性を備えている必要はない、事が示された。このことは、BM選好性が生得的であるという、先行研究の結論に修正を求めるものとなった。生得的であるが、しかし初期の視覚経験が必須であり、非特異的な経験によってBMへの選択的な行動が許容的に誘導されるものと解釈することができる。今後は、BM選好性をもたらす脳内部位を明らかにすると共に、更なる行動研究を通して動画像全体から成る空間における生物的構造を実験的に構成することを試みる。

現在改訂稿の投稿を済ませ、エディターの決定を待っている。更に、刻印付けが甲状腺モルモンの作用亢進を経て、その後の色記銘を長期にわたり強化することを示唆する結果を得た。
神経因性疼痛における新規KチャネルとATPの役割に関する研究

神経因性疼痛の発生原因を調べる目的で、ラット脊髄後根神経節ニューロンを用いて、熱刺激で活性化される新規K+チャネル(Kheat)に対するアデノシン三リン酸(ATP)の役割を、パッチクランプ法を用いて検証した。Ba2+あるいはtetraethylammoniumでKheat電流を単離したのち、ATPによるKheatの制御機構を調べたが、Kheatの制御は確認出来なかった。同様に、TRPV1受容体の制御も確認できなかった。今回の研究では正常ラットを用いて実験を行ったため、ATPによる制御機構を確認出来なかった可能性があるため、末梢神経傷害モデルラットを用いて同様の実験を引き続き行う予定である。目的:「末梢神経傷害が交感神経節後細胞の発芽を誘起し,その軸索が脊髄後根神経節神経細胞(DRG神経細胞)に到達している」という報告がある.我々は,交感神経から放出されるノルアドレナリン(NA)が新規Kチャネル(Kheatチャネル)を抑制することを報告しており,またNAはDRG神経細胞からATPを放出させることが示されている.本研究では,「ATPがP2Y受容体を介してKheatチャネルやTRPV1受容体に作用し,神経因性疼痛の発生要因になっている」と仮説を立て,その可能性について検討する.本年度は,「ATPが,P2Y受容体を介してKheatチャネルを抑制し,DRG神経細胞の興奮性を亢進させる」ということについて検証する.方法:パッチクランプ法を使用してDRG神経細胞から膜電流記録を行い: 1.TRPV1受容体阻害薬を用いてTRPV1受容体電流(ITRPV1)を抑制した状態において,熱刺激によってIKheatのみを記録できる条件を決定する.2.ATPの作用によってP2Y受容体を介してIKheatが抑制されることを確認する,3.各種阻害薬を用いて,2.の抑制作用がどのATP受容体サブタイプを介したものか,どの蛋白キナーゼを介したものか,を調べる。目的:「末梢神経傷害が交感神経節後細胞の発芽を誘起し,その軸索が脊髄後根神経節神経細胞(DRG神経細胞)に到達している」という報告がある.我々は,交感神経から放出されるノルアドレナリン(NA)が新規Kチャネル(Kheatチャネル)を抑制することを報告しており,またNAはDRG神経細胞からATPを放出させることが示されている.本研究では,「ATPがP2Y受容体を介してKheatチャネルやTRPV1受容体に作用し,神経因性疼痛の発生要因になっている」と仮説を立て,その可能性について検討する.本年度は,「ATPによるKheatチャネルおよびTRPV1受容体の制御機構」について検証する.方法:パッチクランプ法を使用してDRG神経細胞から膜電流記録を行い: 1.熱刺激によって誘起されたKheatチャネル電流(IKheat)を測定し,ATPがP2Y受容体を介してIKheatを制御することを確認し,その機序を検証する,2.ATPがP2Y受容体を介してTRPV1受容体機能を制御することを確認し,その機序がTRPV1受容体の熱による活性化閾値を低下させることに起因しているか検証する.結果:上記方法で得られた結果は次の通り:1.熱刺激により誘起されたIKheatを測定できたが,現在までのところATPによるIKheatの制御は確認できていない.DRG神経細胞にはATPによって活性化されるP2X受容体も存在しているため,P2Y受容体のみを介した測定条件を検索している.2.については未実施.目的:「末梢神経傷害が交感神経節後細胞の発芽を誘起し,その軸索が脊髄後根神経節神経細胞(DRG神経細胞)に到達している」という報告がある.我々は,交感神経から放出されるノルアドレナリン(NA)が新規Kチャネル(Kheatチャネル)を抑制することを報告しており,またNAはDRG神経細胞からATPを放出させることが示されている.本研究では,「ATPがP2Y受容体を介してKheatチャネルやTRPV1受容体に作用し,神経因性疼痛の発生要因になっている」と仮説を立て,その可能性について検討する.本年度は,単一のDRG神経細胞における「TRPV1受容体に対するATPの作用」について,パッチクランプ法を用いて電気生理学的に検証する.方法:パッチクランプ法を使用してDRG神経細胞から膜電流記録を行い, 1.熱刺激によって誘起されたKheatチャネル電流(IKheat)を測定できる細胞を確認する.さらに,測定条件を変えて,同一細胞において,TRPV1受容体の活性化による電流(ITRPV1)を測定し,これがATPによって制御されるか否かについて検討する.2.ATPによってITRPV1が制御された場合,その機序が温度依存性の変化によるものか,を検討する.結果:1.熱刺激によりDRG神経細胞においてIKheatが誘起された.引き続き同一細胞においてITRPV1の測定を試みたが,ITRPV1を記録できる細胞は非常に少なく,またITRPV1は大きさが小さかったため,ATPによるITRPV1の制御までは確認できなかった.2.上記1.に記載したようにITRPV1を記録することが困難であったため,ATPによるITRPV1の温度依存性制御は検証できなかった.神経因性疼痛の発生原因を調べる目的で、ラット脊髄後根神経節ニューロンを用いて、熱刺激で活性化される新規K+チャネル(Kheat)に対するアデノシン三リン酸(ATP)の役割を、パッチクランプ法を用いて検証した。

今回の研究では正常ラットを用いて実験を行ったため、ATPによる制御機構を確認出来なかった可能性があるため、末梢神経傷害モデルラットを用いて同様の実験を引き続き行う予定である。ATPがP2Y受容体を介してIKheatを制御することを検証しているが、その現象が確認できていない。その可能性として、1)実験条件が適切ではない、2)仮説が間違っている、などが考えられる。神経生理学研究計画が遅れている原因として、実験条件が整っていないことが考えられるため、その阻害要因となっているP2X受容体を活性化しない条件を検討して研究を進める。熱刺激によって活性化されるKheatチャネル電流(IKheat)に対するATPの作用を調べるためには,熱刺激によって同時に活性化されるTRPV1受容体電流(ITRPV1)を阻害薬で抑制した条件下に実験を行う必要がある.現在,IKheatのみを記録できる条件を検索している最中で,ATPの作用を検討する段階に至っていない.実験仮説に沿って研究を行ったが、予測通りの研究結果を得ることができず、物品等の購入が滞ってしまったため未使用額が生じた。研究計画が当初の予定よりも遅れているため,先ず,平成25年度に実施予定であった研究目的を遂行し,その上で平成26年度に実施予定の研究内容を行う.実験条件を見直し、遅れた研究分の必要物品等の購入費用に充てる。本研究を遂行するためには,顕微鏡を使用することが不可欠である.現在使用中の顕微鏡は,ステージが勝手に動くなどの不具合があり,またかなり古いため,部品交換等の修理も困難である.そのため,当初,顕微鏡を購入することを計画していたが,平成25年度の助成金では購入額に届かず,次年度使用額が生じた。次年度使用額と平成26年度の助成金と合算し,現有顕微鏡に代わる顕微鏡を新規購入することを計画している.
Web情報の収集とメタデータ付与の自動化による学習情報の流通促進

現在までに、複数の市販の専門用語辞書を搭載した、シラバスの専門分野への分類作業を支援するシステムを開発した。Webシラバスのテキスト情報から語彙の出現情報を取得し、複数追加可能な専門用語辞書とマッチングさせることで、出現した語彙とその専門分野をユーザへフィードバックする仕組みである[1]。また、LOMの自動生成を目的とした、Webシラバスから「授業科目名」・「授業目的」などの項目情報を抽出するアルゴリズムを開発し、実験を行った。その結果、61大学の授業シラバス12066件から「授業科目名」を抽出して精度を目視により確認した所、93.82%の精度が得られた。また、「授業目的・内容」については87.74%の精度が確認できた(次年度発表予定)。さらに、項目情報の抽出の成否を目視で確認する作業についても人手によるコストがかかるため、自動化するシステムを現在開発中である。抽出が失敗した事例について、文字列の長さや品詞・語彙の出現頻度などの特徴を踏まえた上でフィルタリングを行うことで抽出に失敗した事例については削除することが可能となると考えられる(次年度開発予定)。尚、学会発表等の学術的成果を以下に記す。■国内発表1件辻靖彦,清水康敬"専門用語の出現頻度に基づく学習オブジェクトの分類作業支援システムの開発",日本教育工学会第22回全国大会2a-B106-1,pp.653-654現在までに、34大学135学科7515科目の工学系のシラバスのテキスト情報から学科、科目、概要、講義計画別に重み付けをした上で名詞情報を抽出し、出現頻度を基に語彙辞書を作成して分類実験を試みた。その結果、大学教員の専門家の手による精査を加えた語彙辞書を用いた場合に関しては、高い精度で分類が可能であることが分かった[1],[2]。また、分類機能・専門用語語彙表示機能を有する、分類作業の支援システムの設計を行った(今年度中に開発予定)。さらに、シラバス文書の構成に着目し、LOM項目を自動生成するシステムについて、現在開発中である。■国際学会1件■国内発表2件[2]辻靖彦,吉井亜沙,清水康敬,"名詞の出現頻度を基にした学習シラバスの自動分類",日本教育工学会第21回全国大会1a-502-3,2005-09[3]清水康敬,辻靖彦,小河原正久,高野雄二,"LOM検索システムによる学習ゲートウェイNIME-gladの開発と運用",教育システム情報学会30周年記念全国大会TD-3,2005-08現在までに、複数の市販の専門用語辞書を搭載した、シラバスの専門分野への分類作業を支援するシステムを開発した。■国内発表1件辻靖彦,清水康敬"専門用語の出現頻度に基づく学習オブジェクトの分類作業支援システムの開発",日本教育工学会第22回全国大会2a-B106-1,pp.653-654
DNAタギングによる植物遺伝子の効率的なクローニング及びマッピング法の開発

アグロバクテリウムによる植物の形質転換において、偶発的にT-DNAが活性ある遺伝子内に挿入されると、その遺伝子は機能を失い、その突然変異は、形質転換当代の自殖後代で劣性形質として検出される。このような突然変異体からは、挿入されたT-DNAを手掛りに、その標的となった遺伝子を単離することができる。T-DNAタギングにより、遺伝子をクローニングするためには、かなり多くの形質転換個体をスクリーニングする必要があり、それぞれの植物種に応じて、効果的な形質転換システムを使用することが重要である。この研究では、トマトとシロイヌナズナを研究材料に選び、それぞれに有効な形質転換システムを作った。野生種L.peruvianumのゲノムの一部を含むトマトを使い、アセトシリンゴンをアグロバクテリウム接種時に培地に加えると、形質転換率が上昇することを明らかにした。シロイヌナズナでは、エコタイプWassilewskijaの根の切片が形質転換に適していることを確かめた。さらに、茎の先端に形態異常の花を生じる変異体を形質転換体の中から見出した。遺伝分析とサザン分析の結果、この変異はターミナルフラワーとして知られている遺伝子の座位に、T-DNAが挿入されて生じたものであることが強く示唆された。挿入されたT-DNAに隣接する領域が、クローニングされ、またその領域のDNA断片をプローブとして、野生型の植物から、ゲノムDNAライブラリーを作り、そのなかから相同配列をもつDNAクローンが選択された。これらの研究のほか、植物遺伝子のプロモーターをスクリーニングするためのベクターを構築し、それが実際に役立つと思われる結果を得た。また、シロイヌナズナにおいて、蛍光in situハイブリダイゼイション(FISH)を用いて染色体マッピングを行い、180bpファミリーの反復配列および10kbサイズのシングルコピーDNAの染色体位置を決定した。DNAタギングによる遺伝子クロ-ニング及びマッピング手法を確立するため以下の実験を行なった。1.シロイヌナズナとトマトで形質転換法を基準化するために、後にDNAタギングに都合がよいと考えられるTiプラスミドベクタ-pGA482(カナマイシン耐性遺伝子、pBR322ori及びλcos領域をTーDNA上に有する)を含むアグロバクテリウムをそれらの植物の組織に接種することによって、形質転換を試みた。シロイヌナズナでは、エコタイプとしてColmbia及びWassileskija(WS)の根、葉または胚軸切片を用い、接種後カナマイシンを含む選択培地で培養した。その結果、いずれもカナマイシン耐性カルスを生じたが、その発生率はWSの胚軸で最も高かった。またこれらのカルスから個体が再生され、種子が得られた。トマトは葉切片を用いてpGA482による形質転換を試み、このベクタ-による形質転換率が高い系統を見出した。2.DNAタギングをエレクトロポレ-ションによる形質転換系を使って行なう系を開発するため、若干のマ-カ-遺伝子(GUS,カナマイシン耐性等)を含む数種のプラスミドを構築した。また、エレクトロポレ-ション実験のため、トマト及びシロイヌナズナのプロトプラスト調整法、培養法を検討し、トマトではエレクトロポレ-ション処理後のプロトプラストの分係を確認した。3.染色体上の特定のDNA配列をin situハイブリダイゼイションで検出する方法を確立するため、プロ-ブとしてシロイヌナズナから大きさ180bpのDNA反復配列をクロ-ニングし、ハイブリダイゼイションの条件を検討した。その結果、このプロ-ブは染色体のセントロメア領域またはその近傍と特異的にハイブリダイズすることを明らかにした。

この手法に基き、形質転換体の染色体における外来挿入配列の検出条件の若干の検討を行なった。この手法は現在改良中である。DNAタギングによる遺伝子クローニング及びダギングされたDNAのin situハイブリダイゼイションによる染色体へのマッピングの手法を確立するために昨年度に引続き以下の実験を行なった。1.シロイヌナズナでは、形質転換が高頻度で生じるエコタイプWassileskija(WS)を用い、主として根切片とアグロバクテリウムとの共存培養によって、形質転換実験を行なった。TiプラアスミドベクターとしてはpGA482(カナマイシン耐性遺伝子nptIIをT-DNA上に有する)を使用した。これによって約700個以上のカナマイシン耐性個体を再生させ、種子を得た。これらの種子を播いて生じた植物の中には葉色が黄緑色を示すもの、茎葉の形態が異常なものなど若干の変異体が見出された。これらの変異がT-DNAの特定の遺伝子への挿入によって生じたものか否かについて検討中である。2.トマトは葉切片とアグロバクテリウムとの共存培養による形質転換法の改良を行ない、アセトシリンゴン、グリシンベタインなどの共存培養地への添加がカナマイシン耐性カルスの発生率を高めことを見出した。3.DNAタギングによってプロモーターを探索するためのバイナリーベクターの構築を行なった。またサイズの大きなDNAを染色体に挿入するためのベクターも構築した。4.植物染色体に挿入されたT-DNAを検出さするために、プラスミドベクターpGA482の全DNAをビオチンでラべルし、形質転換トマトの根から作成した染色体標本にハイブリダイズさせた。これをFITC-アビジンで検出、さらに坑アビジンで増幅させたところ、染色体上にシグナルが認められた。しかし、バックグラウンドノイズが高いなどの欠点があった。シロイヌナズナでは、染色体が極めて小さいため、まだ検出できていない。10kbサイズのシングルコピーでは、染色体上にマップできることが示された。植物の遺伝子のクローニング及びマッピングの手法の確立をめざし、以下の実験を行った。1.シロイヌナズナの芽切片にバイナリベクターpGA482を含むアグロバクテリウムを接種し、多数の形質転換個体を得た。そのうち130個体の自殖後代をスクリーニングし、花序形質が異常な変異体を検出した。本変異体は、花軸の頂端の分裂組織が早期に花芽に変化し、茎頂の花は雌しべ、雄しべ、花べんが無秩序な異常花であったが、受精能力は正常であった。本変異体は、遺伝分析とサザン分析から、ある遺伝子にT-DNAが挿入されたものと判断された。そこで、T-DNAの隣接領域を回収し、その一部をプローブとして、正常なシロイヌナズナのゲノムDNAライブラリーから、相同領域をもつ10kb以上の断片を選択した。これにより、茎頂の分裂組織で働く遺伝子のT-DNAタギングに成功したと考えている。2.バイナリーベクターpBI101のT-DNAを改変し、カナマイシン耐性遺伝子のほかに、T-DNA右端近傍にプロモーターを欠失したβ-グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子をもつベクターを構築した。
絵本の読みあい活動における読み手と聞き手の関係性の促進に関する実証的研究

本研究では、絵本読みあい中の脳活動から身振りやオノマトペが絵本の聞き手に及ぼす影響を検討した。健常成人では身振りをつけて「ぴょーん」と読むとミラー・ニューロンや言語理解に関わる前頭前野が活動したが、「うぎゃー」では減衰し、オノマトペの種類で様相が異なった。健常児では、「ぴょーん」で顕著な活動はなかったが、定期的に読みあいをする健常児や障害児では言語野近傍が活動し、絵本と言語発達の関連が示唆された。絵本の読みあい場面において読み手の大人たちは,身振り・声の抑揚などを通してさまざまなシグナルを送り,聴き手の子どもたちを絵本の世界に引き込もうとする。本研究では,絵本の読みあいにおける「読み手」のジェスチャーが,「聴き手」に与える影響の神経基盤に注目した。他者の動作を観察すると,前頭前野の腹外側領域が活動することが明らかにされ,このような働きはミラー・ニューロン・システムと呼ばれている。乾(2013)も,ミラー・ニューロン・システムの働きをLike-meシステムと呼び,他者の動作を“自分のことのように"(Like-me)に脳内で再現し,他者の動作の意図をとらえる基盤になる部位であると指摘した。絵本の読みあい場面においても,子どもたちが読み手のジェスチャーを受けて,一緒になって体を動かしながら絵本を楽しむ際に,ミラー・ニューロン・システムを神経基盤として,読み手の送るシグナル,あるいはその意図を受け取っているのではないかと考えた。絵本を聴いているときの前頭前野活動を検討するため、本年度は健常成人(25名)を対象として実験者がジェスチャーをつけて読み聞かせる条件(ジェスチャー条件)と、ジェスチャーをつけずに読み聞かせる条件(ジェスチャー無し条件)を設けた。使用する絵本はオノマトペ絵本2冊を用いた。結果としては,身振りが伴う絵本の読みあいは,他者の身振りからその意図を子どもが捉える多くの機会を与えていることが示された。絵本の読みあい活動が,子どもの他者の意図理解に与える実証研究は少なく,本研究の成果は,絵本の読みあい活動における子どもの発達やその援助に重要な知見となる。また,本研究では,社会脳の発達という視点で捉えると,オノマトペ絵本2冊に,興味深い異なる結果が得られたため,今度,この点についてさらに検討する必要があることも明らかとなった。27年度は,基盤となる成人の研究をほぼ予定通り行うことができた。また,4ヶ月から8歳までの乳幼児及び児童9名も脳血流計測を行った。当初,使用したオノマトペ絵本2冊で,同様に前頭前野が活性することを期待していたが,絵本によって異なる脳活動が得られた。この結果は,読みあい活動における社会脳の発達に新たな知見を加えることを期待させるものであった。本研究では、「うぎゃーっ」と「ぴょーん」というオノマトペ絵本の読み合い場面における聞き手の脳血流変化をNIRSで計測した。絵本「ぴょーん」のジェスチャー条件では、動物が飛び上がる描写にジェスチャーを加えて読み聞かせたところ、左右腹外側前頭前野とその近傍が活性化していた。絵本「うぎゃーっ」のジェスチャー条件では、読み手が驚きのジェスチャーを見ると、その直後に左右の眼窩前頭皮質と背外側前頭前野にかけての部位で有意に活動が減衰していた。当初同種と考えていたオノマトペ絵本であったが,動作を描いたオノマトペ絵本と,うぎゃーという驚きを描いたオノマトペ絵本では,脳の働きが異なることが示唆された。この知見は,計画当初の予測とは異なるものであったが,読み合い活動における共感的な関係性の促進に重要な知見と考えられた。本研究は,絵本の読み手が自然に行なう読み合いの間のジェスチャーに着目している。自身に向けられた読み手のジェスチャーを聴き手の子どもがシグナルと捉えて読み手に反応を返すようになるやりとりが成立する神経基盤には,聴き手のミラー・ニューロン・システム(MNS)が関与するであろうと仮定した。また,実験課題には,感性言語であるオノマトペを用いた絵本を用意した。情動には発達的な変化が認められるのかなどについて脳血流の変化の視点で捉えようと試みてきた。27年度は,動物や虫が「ぴょーん」と飛びあがるしぐさを繰り返す絵本と、「うぎゃー」と驚きのしぐさを繰り返す絵本の2冊の絵本を用いた読み聞かせを行い、成人25名を対象にしたジェスチャー有り無し条件での基礎データを収集した。成人データでは動作を表現している「ぴょーん」と「うぎゃ」では,前頭前野の活性と抑制の様相が異なることが明らかとなったが,数名の乳幼児のデータではそのような変化は認められなかった。28年度は,成人で得られたデータを基礎として,同様の課題について27年度に引き続き主に定型発達の子どもを中心としたNIRS計測を行ってきた。その際,併せてKーABC「手の動作」,KIDSの発達調査,S-M社会生活能力検査なども実施した。定型発達の子ども68名および障害のある子ども7名の計測データを得た。現在,計測データの解析,および,KーABC「手の動作」,KIDSの発達調査,S-M社会生活能力検査などの結果整理および,前頭計測部位との連関を検討する作業を進めている状況である。概要にも記したが,絵本の読みあい活動におけるジェスチャーが聞き手に及ぼす影響について、前頭前野の活動の様相から検討してきた。

初年度には、動物や虫が「ぴょーん」と飛びあがるしぐさを繰り返す絵本と、「うぎゃー」と驚きのしぐさを繰り返す絵本の2冊の絵本を用いた読み聞かせを行い、これらの絵本の読み聞かせ聞いているときの健常成人25名の脳活動を計測した。その結果、健常成人では、「ぴょーん」のしぐさを付与した条件で聞いているときには、右前頭前野外側領域において有意に脳血流が増大していたが、しぐさを加えずに読んだときには有意な脳活動は認められなかった。一方、「うぎゃー」と驚きのしぐさを付与した条件で聞いているときのみ、前頭極付近で脳血流の有意な減少が認められ、類似した絵本でも情動の有無によって脳活動の様相が異なることが明らかになった。2年目には、学齢前後のこどもたちにおける絵本の読みあいの影響を調べるため、同じ条件の読みあいを定型発達の子ども68名と障害のある子ども7名を対象に実施した。さらに、社会性や動作の記憶の影響も調べるため、研究に参加した学齢期の児童にはK-ABCの「動作の記憶」を実施するとともに、各児の担任教員にSM社会能力検査への記入を求めた。その結果、うぎゃーの読みあい中のこどもの脳活動には、年齢や「動作の記憶」との間に相関がみられなかったものの、SM社会能力検査との相関が認められた。これらのことから、情動を含む絵本を聞いているときには、社会性の発達水準と関連しており、社会性が高いほど前頭葉が活発に活動することが明らかになった。読み手と聞き手のコミュニケーションを促進する読み手の身振りに注目し,聞き手のMNS(ミラーニューロン)の働きと社会性との関連を調べることを目的とし,NIRSによる脳活動の計測を実施した。本研究ではまつおかたつひで「ぴよーん」,「うわーっ」(ポプラ社)を参考に実験刺激を作成した。実験刺激のオノマトペは,「ぴよーん」,「うぎゃーっ」とし各6場面を作成した。実験条件は,「ぴよーん」,「うぎゃーっ」に,ジェスチャつきの読み各3場面ずつの条件を分析した。312歳までの定型発達児においては、『ぴょーん』と『うぎゃー』のいずれの絵本でも、読み合い中の聞き手の前頭前野で有意Oxy-Hbの増大は認められなかった。一方、健常成人においては、『ぴょーん』の絵本読み合い中に右前頭前野外側で有意にOxy-Hbが増大していた。さらに、社会性と前頭前野の活動の関連を調べるため、学齢期の児童の中からS-M社会生活能力検査のSQ指数が高い対象者(>115)を選んで脳活動を検討したところ、高SQ群においても右前頭前野の外側領域の有意な血流増大が認められた。定型発達児の中でも社会生活能力が高い児では成人と似た前頭前野活動の様相を示すことが明らかになった。健常成人や高SQ群で読み合い中のOxy-Hb増大が認められた右外側前頭前野は、合目的的な運動や高次な運動動作の制御に関与し、それを観察するときにも活動することから、MNSに関連する領域であると考えられる。本研究においても、実験参加者は、実験者が行う『ぴょーん』の身振りを観察していた。そのため、健常成人と高SQ群における右前頭前野の活動も、MNSに関連する脳活動であると考えられる。高SQ群は日常場面でのイベントが内在化され、読み手の意図理解もしやすく、絵本の場面と日常とのマッチングなども生じやすいため,他群児童よりも活動が惹起されたのではないかと推察された。本研究では、絵本読みあい中の脳活動から身振りやオノマトペが絵本の聞き手に及ぼす影響を検討した。
超流動ヘリウム中におけるSF_6の赤外分光

本研究の目的は超流動ヘリウム中におけるSF_6分子の観測であった。今回は実験手法として新しい方法を開発し、今回、それらの技術を応用し、超流動ヘリウム中におけるSF_6分子の赤外吸収スペクトルを観測したので報告する。実験は液体He用のメタルデュワ-中で行った。液体Heは減圧する事により超流動状態にした。He中に0.10.01%に希釈したサンプル超流動He中に導入した。本研究の最も大きな課題は分子をいかにして孤立状態で注入するかである。分子は低温のため、すぐに微粒子になるからである。サンプル導入には断熱真空チューブを用いて用いた。また、迅速に孤立分子を注入するために、ジェネラルバブルを用いて分子を注入した。これにより、SF_6(ν3)のスペクトルを観測する事に成功した。このスペクトルの線幅は分解能より狭い。これらのスペクトルはサンプル導入を止めると消滅することにより、窓に付着したものからの信号ではない事を確認した。気相中におけるSF_6(ν3)の値は947.975cm^<-1>であり、今回得られた947.7cm^<-1>の値はほとんどシフトが見られなかった。回転構造を含めた詳細な構造について情報を得るために、現在ダイオードレーザーでの測定を試みている。また、非常に冷たく密度の濃いヘリウム雰囲気中でのCO-He錯体の振動回転スペクトルを観測した。
神経幹細胞の細胞周期制御機構の解明

神経幹細胞は、多分化能を持つとともに、活発に増殖する。神経幹細胞においてbHLH型転写因子Hes1の発現が23時間周期で振動すること、Hes1依存的にプロニューラル因子Mash1/Ascl1の発現も振動することがわかった。また、Mash1/Ascl1は発現が振動すると神経幹細胞の増殖能を活性化するが、定常発現になると神経幹細胞の分裂を止めてニューロン分化を誘導した。Hes1の発現が持続するとアストロサイトへの分化を誘導した。したがって、Mash1/Ascl1やHes1の発現が振動するか持続するかで、神経幹細胞の細胞周期の進行が活性化されるかどうかが制御されることが明らかになった。神経幹細胞は、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトを生み出す多分化能を持つ。bHLH型転写因子Ascl1はニューロン分化決定因子として働くが、細胞周期の制御に関わる遺伝子群の発現を活性化して神経幹細胞の増殖を促進する。しかし、Ascl1がこの相反する機能をどのように制御しているのかはよくわかっていない。本研究では、ルシフェラーゼとbHLH型転写因子の融合蛋白質を発現する遺伝子改変マウスを作製し、bHLH型転写因子の発現動態を解析した。その結果、神経幹細胞においてHes1依存性にAscl1蛋白質は23時間周期で発現が増減(発現振動)していることが明らかになった。一方、ニューロン分化の際にはAscl1は持続発現していた。したがって、Ascl1は発現振動すると神経幹細胞の増殖を活性化し、持続発現するとニューロン分化を誘導すると考えられた。そこで、光応答性の転写因子であるhGAVPOを用いて、青色光照射依存的にAscl1の発現動態を人工的にコントロールできる実験系を開発した。3時間ごとに青色光を照射することでAscl1の発現振動を、30分ごとに青色光を照射することでAscl1の持続発現を神経幹細胞に誘導できた。神経幹細胞に青色光照射を行い、3時間周期のAscl1の発現振動を誘導したところ、神経幹細胞の増殖(自己複製)が促進された。一方、Ascl1の持続発現を誘導したところ、ニューロン分化が誘導された。すなわち、Ascl1は発現動態の違いで相反する作用を示すことが明らかになり、青色光の照射パターンを変えるだけで、神経幹細胞の増殖やニューロン分化を自在にコントロールすることが可能になった。神経幹細胞は胎生期には盛んに増殖して多様な細胞を産生するが、成体脳では時折分裂するのみで、多くは休止状態である。さらに加齢とともに、神経幹細胞は複製老化になり分裂能を失う。このような分裂能の変化を引き起こす分子機構は、よくわかっていない。我々は、神経幹細胞の維持に必須な役割を担う転写抑制因子Hes1が細胞分裂能と密接に関わることを見出してきた。Hes1の発現がネガティブフィードバックを介して振動しているときは細胞分裂は活性化されているが、発現が定常になると休止状態になり、さらにHes1の発現が無くなると分裂能が消失した。Hes1の異なる発現動態の制御機構を明らかにするために、まずHes1 mRNAの3'非翻訳領域を標的とすることが知られているmicroRNAであるmiR-9の発現を解析した。その結果、Hes1やHes5の発現が振動している領域では、miR-9は高レベルに発現するのに対して、Hes1が定常発現する境界領域ではmiR-9は発現していなかった。さらに、Hes1の発現が振動している細胞においてmiR-9をノックダウンしたところ、Hes1の発現振動が阻害されて定常発現になった。また、miR-9の強制発現によって、Hes1 mRNAは不安定になり、Hes1蛋白の発現量も減少した。その結果、神経幹細胞は減少し、ニューロンへの分化が亢進した。これらの結果から、miR-9はHes1 mRNAを不安定化させることによってHes1の発現振動を引き起こすこと、miR-9が無くなるとHes1は定常発現することが明らかになった。また、miR-9はHes1の発現振動を引き起こすことによって神経幹細胞の維持に重要な役割を担うが、その発現が高くなりすぎると神経幹細胞は維持されなくなることも示された。したがって、miR-9の適度な発現量が、神経幹細胞の維持に重要であることがわかった。神経幹細胞は、胎生期には盛んに増殖して活性化状態にあるが、成体脳では細胞周期静止状態でほとんど増殖しない。この活性化状態と静止状態を制御する分子機構は不明である。この制御機構を明らかにするために、神経幹細胞特異的に働くFucciマウス、すなわちNestin promoter/enhancer下にG0/G1期に発現するmKO2-hCdt1 (pNes-mKO2-hCdt1)、およびS/G2