hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
光コム・ビート変調光照射ＳＴＭによるヘテロダインＳＴＳと量子電磁波分光

光コム非線形光学の発達により、次世代精密分光が注目されております。この光コムを原子オーダーの空間分解能を持つ走査トンネル顕微鏡(STM)に導入し、マイクロ波THz域にある局所量子振動精密分光の基礎技術構築の取り組みを進めております。光コム光源に工夫を施し光コムが持つスペクトルを選択的に選別する機構を新たに構築しました。THzギャップと呼ばれる領域の広帯域光源はいまだ未発達な状況にあり、広い周波数領域に広がるスペクトルを有する光コムを活用した、STMによるTHz域精密分光技術の構築は広く学際領域からも望まれております。本課題によって構築された光は走査プローブ顕微鏡(SPM)がそなえる、原子レベルの空間分解能を有する新しい精密分光の構築に不可欠な、新しい分光光源となりえる為、次世代光源として今後の発展が特に有望視され期待されております。現在までの取り組み内容1 : 24年度課題を発展させ、超高速通信光コム変調光照射によるSTM量子電磁波の観測用光源を工夫し偏波変調を付加し、さらに光コムを任意に選別する機構をフィルターにより構築した。2 : STMによる局所非線形精密分光に本光コムを導入する導波路を改良し照射位置精度を向上させた。3 : STMが観測する信号は小さく検出効率向上のために、新たにチップ高周波整合回路に工夫を施した。4 :非線形試料に準備された本選別光コムを導き非線形光学応答のヘテロダイン計測を実施しています。5 :本光コムをSTMのMIM接合に精度よく導き局所非線形精密分光による、異方性の基礎データを取得する準備を整え、現在STMトンネル条件と関連するSTS基礎データの収集実験を進めております。
β-シクロヘキシル-α, β-ジフルオロスチレン構造の新規高性能液晶化合物の合成

平成79年度の3年間にわたり、β-シクロヘキシル-α,β-ジフルオロスチレンをコア構造とする新規の高性能液晶化合物の分子設計と合成について、実用化を視点に入れて検討してきた。1.基本骨格化合物の合成に関しては、シクロヘキシルリチウムの生成法およびテトラフルオロエチレンとの反応について検討し、4-アルキルシクロヘキサノールを原料とする有効な方法を確立した。2. β-シクロヘキシル-α,β-ジフルオロスチレン型液晶分子構造設計に関しては、シアノ体はジフルオロスチルベン型と同程度の誘電異方性を持つが、液晶相温度範囲は個々に大きく異なるため、分子設計が困難であることが明らかとなった。3. STN方式デバイス作成上必須の成分であるキラル添加剤の分子設計と合成については、官能基の種類・分子構造と、添加剤としての有効性との間に相関が少なく、予測が極めて困難である。安息香酸エステル型の化合物を系統的に合成して物性を測定した限りにおいて、らせんピッチと側鎖長は滑らかな曲線に乗る相関を示したが、粘度は側鎖の炭素数に依存した顕著な偶奇性を示しながらも、その偶奇性から大きく外れる異常点が存在することも明らかになった。4.大量スケールでの合成と精製方法に関しては、低温塩素化、およびアルキル金属化合物の関わる反応について、工業スケールでの検討が今後必要である。精製に関しても、今後の検討を要する段階がある。5.新規合成化合物の物性評価の結果から、十分実用化可能な有効分子を見い出すことができた。本研究を通して、液晶化合物の物性と構造に関する新しい多くの知見が得られたが、種々の官能基を有するものについて更に系統的な合成と物性評価を積み重ねる必要がある。その結果として構造物性相関が明らかとなり、有効分子設計が可能となろう。α,β-ジフルオロスチルベンやβ-(シクロヘキシル)-α,β-ジフルオロスチレンの置換誘導体が新規の構造の高性能低粘性液晶性化合物であることを見いだしたので、実用化を視点に入れて、分子設計と合成法について検討した。1,シクロヘキシルリチウムの効率のよい生成法およびテトラフルオロエチレンとの反応の検討。4-アルキルシクロヘキサノールを臭素化する反応は必ず位置異性体の副成を伴うこと、五塩化リンを低温で用いて塩素化を行えば、収率は十分とは言えないが、純粋な目的物を合成できることを明かにした。またクロロ体の立体化学に関係なく、テトラフルオロエチレンとシクロヘキシルリチウムの反応は95%程度の選択性でトランス体が得られた。2,β-シクロヘキシル置換スチレン合成の最適反応条件の検討および最適分子構造設計。シクロヘキシルトリフルオロエチレンとアリールリチウムの反応は従来のジフルオロスチルベン合成の反応条件が適用できることを明らかにした。また立体選択性は95%であり、再結晶により精製できる。末端にシアノ基を有するものはジフルオロスチルベン型化合物と同程度の誘電異方性を持つが、液晶相を呈する温度範囲は個々の化合物で大きく異なるため、分子設計を含めて、継続検討が必要である。3,大量スケールでの合成と精製方法の検討。五塩化リンを用いるシクロヘキサノールの塩素化反応は大量の発熱を伴う反応であり、収率も十分とは言えないので、スケールアップのためには何らかの別途合成法を開発する必要がある。他にも低温での反応を工業スケールで行うための検討が今後必要である。精製に関しては特別な問題はないと思われる。β-(シクロヘキシル)-α,β-ジフルオロスチレンの置換誘導体が新規の構造の高性能低粘性

液晶性化合物であることを見いだしたので、STN方式液晶デバイス作成上必須の成分であるキラル添加剤への応用を目的として、実用化を視点に入れた分子設計と合成法について検討した。その結果、(1)側鎖成分として光学活性のアルキル基の構造を変化させた一連の化合物を合成し、物性を測定したところ、フェニルエーテル型化合物は比較的粘性が大きく、また螺旋構造誘起能力は低かったが、安息香酸エステル構造のものは低粘性であり、螺旋構造誘起能力は大きく、添加剤として有効であることがわかった。また側鎖長やキラル中心の位置と添加剤としての有効性との間に一定の関係があることがわかり、最適分子構造を設計するための基礎的知見が得られた。(2)シクロヘキシルリチウムの生成法も含めてβ-シクロヘキシル置換スチレン合成条件を検討し、製造スケールでの合成と精製の方法について検討した結果、キラルなアルコールが容易に入手できるものであれば、比較的効率のよい合成が可能であることがわかった。(3)分子構造と安定性の関係を調べたところ、フェニルエーテル型化合物は非常に安定であるが、安息香酸エステル型化合物は吸収波長が可視光線に近く、また加水分解しやすい構造であるため耐候性にやや問題が残ることがわかり、より安定な構造でかつ優れた物性を発揮する分子を設計する必要性が明かになった。α,β-ジフルオロスチルベンやβ-(シクロヘキシル)-α,β-ジフルオロスチレンをコアとする高性能低粘性液晶表示材料の分子設計と合成法を確立することが研究目的である。第3年度としては、側鎖アルキル基の構造を変化させた一連の化合物を合成し、物性測定の結果から最適の分子構造を設計すること、分子構造と誘起される螺旋構造の関係から、優れた効果を有するキラル化合物を分子設計し、物性評価を行うこと、大量スケールでの合成と精製の方法について検討すること、等である。1.キラルなメチル基を含む1級アルキル基をパラ位に有する置換ブロモベンゼンを合成し、これから誘導したリチウム化合物からβ-(4-アルキルシクロヘキシル)-4-(キラルアルキル-α,β-ジフルオロスチレンを合成する反応について検討し、収率よく目的物を合成する条件を見出した。さらにその結果に基づいて種々の形状のアルキル側鎖を有する化合物を合成した。2.シリルエーテルとして保護したp-ブロモフェノールを用いて上と同様に反応を行い、パラ位にエーテル・エステル結合を介して光学活性アルキル基を有する化合物を合成する反応を確立し、一連のキラル化合物を合成することができた。3.上で合成された化合物の物性を測定し、置換基との関係を考察した結果、官能基の種類、キラル中心の位置、キラリ置換基の形状等と物性の間にある程度相関が認められたが、統一した数式で全てを表すことは困難であった。結果的には、実用化が可能な優れた物性を有する化合物を見出すことができた。4.大量スケール合成における問題点について検討し、低温・酸素遮断下で行う反応と、化合物精製法に関して実施上の問題があることがわかった。
レニン-アンジオテンシン系を介した腎性高血圧と腎機能障害との関連

本研究の目的は、腎機能障害の促進因子の一つとしてとして考えられている高血圧に関して、腎障害時のレニン-アンジオテンシン-アルドステロン系(以下RAA系)が血圧にどのような影響を及ぼし、腎機能障害の進行とどのように関連するのかを実験的腎性高血圧モデルならびに慢性腎不全症例において明らかにするものである。本研究の独創的な点は、無拘束・観血的に動物の腎機能障害に伴う高血圧発症と腎機能障害の促進因子とされるRAA系について連続的に把握することができる点である。本研究は慢性実験テレメトリー自動計測システムDATAQUEST)を用い正常な犬および猫の血圧の変動を長期間にわたり観察、従来不明であった犬、猫の正常血圧、血圧の日内変動、生活リズムと血圧の関係についてコントロールとなる基礎実験データの集積を行った。基礎実験に引き続き、実験的慢性腎不全モデル(犬、猫)を作成し、慢性腎不全が進行する過程における血圧変動とRAA系の関連について検討を行い、明らかに犬や猫においても腎機能障害により血圧が上昇し、腎性高血圧を発現することが確認された。さらに実験的慢性腎不全モデル(犬、猫)を作成し、慢性腎不全が進行する過程における血圧変動とRAA系の関連について検討を行った結果、腎機能障害時に発現する高血圧はRAA系の亢進と明らかに相関することが判明した。腎性高血圧の発現機序のひとつとしてRAAが関与していること想定されたことから、腎性高血圧を発現した実験的慢性腎不全モデルに対してACE阻害薬を投与し、血圧変動の変化について検討した結果、明らかにACE阻害薬の投与により血圧の低下が見られた。本研究の結果から、腎機能障害時における高血圧の発症にはRAA系が関与し、さらに高血圧そのものが腎糸球体の硬化を促進する可能性が示唆され、ACE阻害薬によりその悪循環を断ち切り、高血圧を是正することが腎糸球体硬化の進行を遅延させ、最終的には腎機能障害の進行を抑制できることが予想され、これまで内科的治療の限界とされている慢性の腎機能障害とRAA系を介した高血圧との関係について明らかにすることができた。平成10年度における本研究においては、犬および猫の実験的慢性腎不全モデルを用いて、腎機能の悪化と血圧変動について検討を行い、また血圧変動時におけるレニン-アンジオテンシン-アルドステロン系の関与についても検討を行った。腎動脈を段階的に遮断することによって慢性的な腎不全モデルを作成することが出来、慢性腎不全モデルの作成法を確立することが出来た。この慢性腎不全モデルを用いることによって、本年度の研究においては犬や猫においても腎機能が徐々に悪化するとともに明らかに血圧が上昇することが観察され、犬、猫においても腎機能悪化に伴う腎性高血圧が発現することが予想された。また腎機能の悪化に伴う血圧の変化に関してはテレメトリーシステムによりその詳細な変動を把握することが出来た。また慢性腎不全モデルの作成前後においてレニン活性、アンジオテンシンI・II、アルドステロン値を測定、検討した結果、腎機能悪化に伴い明らかにレニン-アンジオテンシン-アルドステロン系が亢進していることが観察され、さらにこの亢進と平行して血圧が上昇していること判明した。以上の結果から本年度においては慢性腎不全モデルの作成法、犬、猫における腎性高血圧の発現ならびにレニン-アンジオテンシン-アルドステロン系の関与について明らかにすることが出来た。

平成11年度における本研究においては、昨年度の研究成果、すなわち犬、猫においても実験的に慢性腎不全モデルを作成することによって、明らかに血圧が上昇し、腎性高血圧を発現し、この血圧の上昇がレニン-アンジオテンシン系に関与していることが示唆されたことから、本年度においてはこの慢性腎不全モデルを用い、アンジオテンシン変換酵素阻害薬を投与することによって、実験的に発現した高血圧がどのように変動するかを観察した。その結果、実験的に発現した腎性高血圧はアンジオテンシン変換酵素阻害薬の投与により、投与期間中明らかな血圧降下作用が認められ、犬、猫における腎性高血圧の発現機序の一つとしてレニン-アンジオテンシン系が関与していることが証明された。本研究の目的は、腎機能障害の促進因子の一つとしてとして考えられている高血圧に関して、腎障害時のレニン-アンジオテンシン-アルドステロン系(以下RAA系)が血圧にどのような影響を及ぼし、腎機能障害の進行とどのように関連するのかを実験的腎性高血圧モデルならびに慢性腎不全症例において明らかにするものである。本研究は慢性実験テレメトリー自動計測システムDATAQUEST)を用い正常な犬および猫の血圧の変動を長期間にわたり観察、従来不明であった犬、猫の正常血圧、血圧の日内変動、生活リズムと血圧の関係についてコントロールとなる基礎実験データの集積を行った。基礎実験に引き続き、実験的慢性腎不全モデル(犬、猫)を作成し、慢性腎不全が進行する過程における血圧変動とRAA系の関連について検討を行い、明らかに犬や猫においても腎機能障害により血圧が上昇し、腎性高血圧を発現することが確認された。さらに実験的慢性腎不全モデル(犬、猫)を作成し、慢性腎不全が進行する過程における血圧変動とRAA系の関連について検討を行った結果、腎機能障害時に発現する高血圧はRAA系の亢進と明らかに相関することが判明した。腎性高血圧の発現機序のひとつとしてRAA系が関与していること想定されたことから、腎性高血圧を発現した実験的慢性腎不全モデルに対してACE阻害薬を投与し、血圧変動の変化について検討した結果、明らかにACE阻害薬の投与により血圧の低下が見られた。本研究の結果から、腎機能障害時における高血圧の発症にはRAA系が関与し、さらに高血圧そのものが腎糸球体の硬化を促進する可能性が示唆され、ACE阻害薬によりその悪循環を断ち切り、高血圧を是正することが腎糸球体硬化の進行を遅延させ、最終的には腎機能障害の進行を抑制できることが予想され、これまで内科的治療の限界とされている慢性の腎機能障害とRAA系を介した高血圧との関係について明らかにすることができた。
がん細胞の浸潤・転移およびがん化におけるRho-mDia系の機能解析

低分子量G蛋白質Rhoの下流に位置する情報伝達系の細胞接着・運動への作用機構について解析を進めてきた。Rhoの標的蛋白質ROCKとは明らかに機能を異にするmDiaを中心にした研究により、新たな情報伝達経路であるRho-mDia-Srcキナーゼ系、新規mDia結合蛋白質DIPの発見に続き、本年度、mDiaが核内移行し、転写因子Pax6と結合してその転写抑制をすること、mDiaが神経細胞(小脳顆粒細胞の初代培養系およびNIE-115細胞株)の軸索伸展に関してはROCKと相反する効果を示すことを発表した。このことは、Rhoの下流における時・空間的制御機構の存在により、細胞運動が巧妙に制御されていることを示唆する。これに引きひき続き、DIPとSrcキナーゼの関係の検討をすすめ、DIPがvSrc依存的な細胞の形質転換能に影響すること、DIPがある刺激下でSrcキナーゼ依存的にリン酸化され、その際Rhoファミリー蛋白質の調節因子である二つの蛋白質がDIPと結合して活性化されることを見いだした。また、DIPのリン酸化部位および結合蛋白質との結合部位を同定し、DIPのdominant negative(DN)体および非リン酸化体のpoint mutantを作製した。Invasionassay, Time-lapseを用いた細胞の運動能を検討し、DIPおよびそのリン酸化それによって引き起こされる結合蛋白質の活性化が、細胞運動に重要で、DIPのDNおよびmutantでは細胞運動能が低下し、かつ細胞形態に変化が起きることを確認した(論文投稿中)。今回見いだした、Rho-mDia-Src-DIP-Rhoファミリー蛋白質の調節因子の経路は、Rhoファミリー蛋白質間の巧妙な調節機構を明らかにしたもので、この経路をもとに、がん細胞を用いてその浸潤・転移への影響を検討したい。
相互作用型授業における協調過程の多面的分析に基づく新たな教育手法の開発と評価

本研究では、物理学の相互作用型授業における学習者間の対話(議論)などの協調過程に注目し、学習に含まれる多様な活動や学習者の特性が、学習者の理解の深化をどのように促しうるかを、授業実践によって得られたデータの分析を通じて、実証的に解明することを目指す。また、獲得した知見をふまえ、相互作用型授業の新たな教育手法を提案し、授業実践に基づく評価・改善を実施することで、物理教育へ新たな進展をもたらす。
内向き整流特性カリウムチャネルの神経伝達調節と可塑性における役割

内向き整流カリウムチャネルスーパーファミリーの中枢神経系における分子機能解析を目的としてIRK1,IRK2,IRK3についてin situ hybridizationによって脳内の詳細な分布を調べそれぞれが特徴ある発現様式を持っていることを明らかとした。また、脳の内向き整流カリウムチャネルの調節機構を調べるため、脳mRNAをツメガエル卵母細胞に発現させてパッチクランプ法により解析した。脳の内向き整流カリウムチャネルはcAMP,cGMPによって抑制されることが明かとなった。この機構によってNOを含む各種のニューロトランスミッターが脳の内向き整流カリウムチャネル活性を抑制して、膜電位を上昇させ細胞の興奮性を上げることに働くと考えられ、新たな神経細胞興奮性の調節機構と考えられる。また、免疫組織化学的手法によりGIRK1はプレシナプスに存在することを明らかとした。このプレシナプスにおけるGIRK1の存在はこれまで全く考えられておらず、脳におけるG蛋白質制御カリウムチャネルの機能が単純なシナプス後抑制では無いことを示唆するものである。ATP依存性カリウムチャネルのK_<AB>-2の分布については既にグリア細胞にその発現がみられることを明らかとしていたが、網膜のグリア細胞であるMuller細胞にクラスター状に発現していること、Muller細胞では恐らくSAP97がこのチャネルの集積に関与していること、また、HEK細胞にSAP97を共発現させるとSAP97がK_<AB>-2に結合すること、SAP97がK_<AB>-2の膜上での発現を増加させることを明らかとした。ゲノム遺伝子のクローニングについても既にIRK3 geneを単離していたがさらにK_<AB>-2、GIRK1 geneを単離した。IRK3についてはIRK3を不活性化した遺伝子と相同組み替えをおこしたES細胞の作成に成功した。また、脳cDNAのスクリーニングによって新たな膜2回貫通型カリウムチャネルサブユニットGIRK2B,GIRK1B,uKATP,BIRをクローン化した。
脳損傷後の神経修復を阻害する脳繊維化の発症機序の解明と治療薬の開発

(1)AQP4ノックダウンによるアストロサイト遊走阻害効果の確認AQP4ノックダウン細胞と正常なアストロサイトを用いて、遊走能力を検討した。孔のあいた膜上に両アストロサイトを播種し、膜の反対側への遊走細胞数を検討した。アストロサイト遊走の誘発はラフィノースによる浸透圧差を作成することで行った。つまり、下の皿の培養液浸透圧を上の皿より高めることで、水の動きとともにアストロサイトが上の皿から下へ移動する。皿の下面に遊走してきた細胞を染色することにより測定する。実験系は確立することができた。正常アストロサイトでは、浸透圧格差により遊走が誘発されることを確認した。AQP4ノックダウンしたアストロサイトは安定して作成ができており、AQP4発現の低下も確認した。しかしながら、AQP4ノックダウンによるアストロサイトの遊走能力低下は、現在確定的な結果は得られておらず、実験を継続している。(2)in vitro脳傷害モデルにおけるAQP4ノックダウンによるアストロサイト遊走阻害効果の確認In vitro脳傷害モデルにおけるアストロサイトの遊走能を検討した。培養アストロサイトにプラスチックチップで傷をつけることによるin vitro脳傷害モデルを確立した。正常なアストロサイトでは、傷をつけた部位への遊走を確認することができた。さらに、AQP4ノックダウンしたアストロサイトによる同様の傷害モデルも完成することができた。AQP4ノックダウンによる遊走能力低下は現在検討中である。1、培養アストロサイトを用いたAQP4ノックダウン系の確立RNA interference (RNAi)技術を用いて細胞内のAQP4発現を抑制した細胞株を作成した。AQP4の発現の低下は、ウエスタンブロット法にて確認できている。AQP4に対するRNAiは、申請者の研究室の藤田義人講師によりすでに作成されており、同様の結果を得た。また、AQP4発現の測定系は、申請者の研究室で確立し、安定した計測ができており、大きな障害はなかった。なお、実験で使用するアストロサイトは、すでに確立した方法(Yamamoto N et al. : Mol Brain Res, 2001)によりラット脳から単離・培養でき、アストロサイトの培養は、申請者の研究室で日常的に行っており、技術面に大きな問題はなかった。2、AQP4ノックダウンによるアストロサイト遊走阻害効果の確認のための実験系の確立1で確立したAQP4ノックダウン細胞株と正常なアストロサイトを用いて、遊走実験系を確立した。孔のあいた膜上に両アストロサイトを播種し、ラフィノースによる浸透圧差を作成することで遊走を惹起させた。他の細胞株ではあるが、申請者の教室では同様の系を用いた遊走実験を行っており、技術的に大きな問題はなかった(Okada Y et al. : Int J Cancer, 1999.)。
歯髄由来幹細胞とヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の融合による新規脳出血治療の開発

自己動脈血投与によるラット脳内出血モデルを作成し、幹細胞とヒストン脱アセチル化酵素阻害剤との併用療法が脳組織および神経症状に与える影響を解明することが研究の目的である。当該年度は、脳出血モデルの不安定さに関して、尾動脈からの血液採取から脳内注入までのプロセスの迅速化を行うことで注入する血腫量や麻痺・姿勢異常などの神経徴候も安定させることが出来た。歯髄由来幹細胞の継代培養や表面マーカー解析などは問題なく、我々の研究グループは、脳虚血モデルに対して、歯髄由来幹細胞の経静脈内投与を行うことで、虚血性脳損傷に対する抗炎症作用、抗酸化ストレス作用および血液脳関門保護作用を認め,歯髄由来幹細胞の急性期における脳保護効果は確認することが出来た。更に、栄養因子を強発現させた歯髄由来幹細胞は、治療効果を増強させることを示した。同様に、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤との併用療法は有望であると示唆されるため、研究を進めていきたい。脳出血モデルの安定性がようやく確保された。歯髄由来幹細胞の継代やマーカー解析等は問題ない.採血から脳内投与までの一連の流れの迅速化を行うことで、安定した脳出血モデルを作成できるようになった。当初の目的を達すべく研究を進めていきたい。ただし、歯髄由来幹細胞に関わる諸費用が高額のため,より安価な薬剤での検討に変更することも考慮せざるを得ない可能性がある.臨床へのトランスレーションを目指した歯髄由来幹細胞移植による新規脳出血治療の研究基盤を確立することを目的とする.ラット尾動脈から採取した自己動脈血をラット線条体に注入することで脳内出血モデルを作成した.脳内血作成3日後に両側の大脳半球の湿重量を測定し,その後,乾燥させ,乾燥重量を測定することで,脳含水量の測定を行った.病側の大脳半球含水量は健側に比較して有意に増加していたが,出血による神経徴候(麻痺,姿勢異常)が軽微で有り,長期的な運動機能の観察には不適である可能性があることが判明した.最適なモデル作成のため,注入量を増やす,または注入部位をより内包に近い部位に注入するなど検討をしている.ラットの尾動脈から自己血を採取し,線条体に注入するモデルを作成しているが,当初はモデルが安定せず,治療効果の判定が出来る状態でなかった.現在,モデル作成の問題点を整理し,解決に向け取り組んでいる状況である.脳出血モデルの安定性が不良であった.具体的には,脳内に注入する自己血液が31 gage needle内で凝固が始まり,注入スピードが途中で低下してしまい予定の注入量を注入することが出来なくなってしまうことがしばしば認められた.脳出血モデル作成から3日後に,脳切片を作成したところ,血腫量や血腫の拡大などにばらつきが生じていた.そのため,麻痺や姿勢異常などの神経徴候が一定しなかったと考えられた.問題点が明らかになったため,今後はその対応を考え,検討を進める予定である.本モデルの安定性が十分でない場合は,治療効果の判定が困難になることが予想される.その場合は,我々の研究室で,すでに完成されたプロトコールを有する塞栓糸を用いる一過性中大脳動脈閉塞モデル(suture model)や2型糖尿病を有するラット(Goto-Kakizakiラット)を使用した出血性脳梗塞モデルを使用して,研究を進めていきたいと考える.一方,歯髄由来幹細胞は,継代培養や表面マーカー解析などは問題なく,一過性中大脳動脈閉塞モデルに対して,歯髄由来幹細胞の経静脈内投与を行うことで,虚血性脳損傷に対する抗炎症作用,抗酸化ストレス作用および血液脳関門保護作用を認め,歯髄由来幹細胞の急性期における脳保護効果は確認することが出来た.同様にヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の一過性中大脳動脈閉塞モデルに対する保護効果は確認できたため,この両者の併用療法は有望であると考えられた.脳出血モデルの安定性が不良であり,治療効果の判定に用いることが困難であった.歯髄由来幹細胞の継代やマーカー解析等は問題ない.自己動脈血投与によるラット脳内出血モデルを作成し、幹細胞とヒストン脱アセチル化酵素阻害剤との併用療法が脳組織および神経症状に与える影響を解明することが研究の目的である。

歯髄由来幹細胞の継代やマーカー解析等は問題ない.今後は,自家血ではなく,コラゲナーゼ(type IV)注入脳内出血モデルや我々の教室ですでに完成されたプロトコールを有する塞栓糸を用いる脳梗塞モデル(suture model)での検討も考慮する必要があると考える.脳出血モデルの安定性が悪かった原因として,尾動脈から採血を行い,脳内に投与する過程で,チューブ内,needle内で凝固が始まり,投与スピードが一定化することが出来ないことが主な原因と考えられた.今後は,微量のヘパリン添加や採血から脳内投与までの一連の流れの迅速化を行い,対処していきたいと考えている.また,それでも困難な場合は,脳梗塞モデル(一過性中大脳動脈モデル)を使用し,治療効果を検討することを考慮したいと考えている.歯髄由来幹細胞に関わる諸費用が高額のため,より安価な薬剤での検討に変更することも考慮せざるを得ない可能性がある.採血から脳内投与までの一連の流れの迅速化を行うことで、安定した脳出血モデルを作成できるようになった。当初の目的を達すべく研究を進めていきたい。ただし、歯髄由来幹細胞に関わる諸費用が高額のため,より安価な薬剤での検討に変更することも考慮せざるを得ない可能性がある.ステレオタキシックについては,他科から借りることが出来ることになった.また,モデル作成の問題があり,免疫組織科学的検討やFACS解析を用いた検討が出来ず,繰り越しが生じた.本年度は,研究の進捗の遅れもあり,使用額が少額となった.来年度は,PCRや免疫組織科学的検討等の予定があり,使用額が増えると思われる.昨年度は,研究の進捗の遅れもあり,使用額が少額となった.本年度は,PCRや免疫組織科学的検討等の予定があり,使用額が増えると思われる.モデル作成の安定化を進めると共に,予定していた免疫組織科学的検討やFACS解析を進めていきたい.
海馬台の入出力結合様式の形態学的解析

海馬体から皮質領域への記憶信号出力は、おもに海馬台から起こる。本研究では、ラットの海馬台から嗅内野、前海馬台、傍海馬台、および脳梁膨大後皮質への投射様式を、逆行性・順行性標識法により大脳半球伸展標本の海馬長軸横断切片を用いて形態学的に調べた。1)前海馬台、傍海馬台、脳梁膨大後皮質、内側嗅内野への投射細胞は、海馬台錐体細胞層のなかで深浅方向では中間部に、横断方向では遠位半に位置した。これに対し、外側嗅内野への投射細胞は、海馬台錐体細胞層の表層部と近位部に集中した。これは、海馬台の皮質下投射細胞のうち、乳頭体内側核投射細胞が前海馬台、傍海馬台、脳梁膨大後皮質、内側嗅内野へ投射し、中隔側坐核・視床下部投射細胞が外側嗅内野へ投射することを示唆する。また、視床腹側前核投射細胞は皮質性投射に関与しないと考えられる。2)海馬台の皮質性投射には、海馬の長軸と横断軸に沿う局所対応が見られた。長軸(中隔ム側頭葉)方向では、海馬台の側頭葉部分は前海馬台、傍海馬台の側頭葉部分へ、嗅内野の嗅脳溝より遠い部分(内側部)へ、脳梁膨大後皮質の尾側部分へ投射した。横断軸方向では、近位部(CA1に近い側)の細胞は、前海馬台、脳梁膨大後皮質の近位部へ投射し、遠位部は各皮質領野の遠位部に投射した。また嗅内野では、海馬台近位部の細胞は、内側・外側嗅内野の境界領域に投射し、遠位部の細胞はそれぞれの領野で境界から遠い部分に投射した。3)サルでの実験では、乳頭体内側核、視床腹側前核、中隔側坐核にトレーサーを注入し、海馬台における起始細胞の分布解析を行っている。中間的な所見として、ラットと類似して、視床投射細胞群はCA1から遠い領域に寄って白質に接すするように分布した。乳頭体内側核への投射細胞は、海馬台の横軸方向に広がり、視床腹側前核へ投射する細胞群よりも浅層に位置していた。中隔側坐核への投射細胞は、解析の途中である。本年度は、外側嗅内野と海馬台との相互結合様式を、WGA-HRPおよびPHA-L標識法を用いて、解剖学的に解析した。1)外側嗅内野から海馬台への投射は主にIII層細胞から起こり、II層細胞は歯状回・CA3に投射する。外側嗅内野V層、VI層の細胞は海馬台へは投射しない。反対に、海馬台の錐体細胞層からは、外側嗅内野の深層(V層、VI層)に投射し、浅層(II層、III層)にはほとんど投射しない。海馬台から外側嗅内野への投射細胞は、海馬台錐体細胞層の表層部に限局して分布し、白質に近い深部には観察されなかった。2)外側嗅内野と海馬台との相互結合には、海馬体長軸(中隔一側頭葉方向)と外側嗅内野の内外軸との間に、部位対応が見られた。海馬台の中隔側は外側嗅内野のうち嗅脳溝に近い部分と、海馬台の側頭葉側は外側嗅内野の嗅脳溝から遠い部分と結合していた。また、海馬台の横断軸(CA1ム前海馬台方向)と外側嗅内野の吻尾方向との間にも部位対応が見られた。海馬台の近位部(CA1に近い側)と外側嗅内野の尾側部とが相互に結合していた。さらに、外側嗅内野の吻側部は海馬台中位部から遠位半の部分と相互に結合していることが示唆された。これまで我々は、海馬台錐体細胞層には異なる皮質下構造へ投射する細胞群が層状に分布していることを明らかにしたが、外側嗅内野へ投射する海馬台細胞は、中隔側坐核投射細胞群の分布位置と重なり、乳頭体内側核や視床腹側前核に投射する細胞群の位置とは異なることがわかった。この外側嗅内野への投射細胞群が、同時に、他の皮質領域、間脳、中隔側坐核へも投射するかという点については、今後、蛍光色素二重標識法などを用いてさらに検討する必要がある。

また、視床腹側前核投射細胞は皮質性投射に関与しないと考えられる。2)海馬台の皮質性投射には、海馬の長軸と横断軸に沿う局所対応が見られた。長軸(中隔ム側頭葉)方向では、海馬台の側頭葉部分は前海馬台、傍海馬台の側頭葉部分へ、嗅内野の嗅脳溝より遠い部分(内側部)へ、脳梁膨大後皮質の尾側部分へ投射した。横断軸方向では、近位部(CA1に近い側)の細胞は、前海馬台、脳梁膨大後皮質の近位部へ投射し、遠位部は各皮質領野の遠位部に投射した。また嗅内野では、海馬台近位部の細胞は、内側・外側嗅内野の境界領域に投射し、遠位部の細胞はそれぞれの領野で境界から遠い部分に投射した。3)サルでの実験では、乳頭体内側核、視床腹側前核、中隔側坐核にトレーサーを注入し、海馬台における起始細胞の分布解析を行っている。中間的な所見として、ラットと類似して、視床投射細胞群はCA1から遠い領域に寄って白質に接すするように分布した。乳頭体内側核への投射細胞は、海馬台の横軸方向に広がり、視床腹側前核へ投射する細胞群よりも浅層に位置していた。中隔側坐核への投射細胞は、解析の途中である。
侵入害虫クリタマバチと天敵寄生蜂の導入が土着寄主・寄生蜂相に及ぼす影響の解析

クリタマバチの侵入から半世紀以上経過している日本と侵入直後であるイタリアにおける本種の分布や被害状況を比較することにより、侵入生物が土着生物相に与える長期的・短期的影響を同時に査定した。日本国内では導入天敵チュウゴクオナガコバチによってクリタマバチの生物的防除に成功したが、土着天敵に対する直接的な影響を初めて明らかにした。これらの成果を活かし、イタリアにおけるクリタマバチの生物的防除を成功に導いた。1クリタマバチ分布拡大と土着寄生蜂群の日欧比較(1)イタリア・トリノ大学との共同研究により、イタリアに侵入したクリタマバチの2007年現在の分布状況を明らかにするとともに、隣接するスロベニア・フランスへの分布拡大を確認した。日本産チュウゴクオナガコバチ老熟幼虫が内部で越冬している乾枯虫えいをイタリアへ直接送付し、イタリアでの成虫羽化状況を調査した。(2)茨城県内各地のクリタマバチ乾枯虫えいを採集し、チュウゴクオナガコバチの寄生率の年次変動に関するデータを蓄積した。また、秋期にクリタマバチの虫えい形成の状況(被害芽率)の定点調査を行い、つくば市におけるこれまでの調査結果との比較から、クリタマバチの密度が局部的に上昇傾向にあることを明らかにした。(3)イタリアの気候条件下でのチュウゴクオナガコバチ羽化消長とクリタマバチ虫えい形成状況を観察した結果、イタリアにおいても両者の間に同調性が保たれていることが判明し、チュウゴクオナガコバチの定着・増殖に関する問題点の一つが解決された。2クリタマバチ-寄生者複合体の成立過程の解析(1)つくば市周辺のチュウゴクオナガコバチおよび土着寄生蜂群の羽化消長を前年度以前より継続的に調査し、チュウゴクオナガコバチ放飼地点近傍では、依然としてチュウゴクオナガコバチが圧倒的な優占種となっていることを確認した。(2)チュウゴクオナガコバチ・近縁土着種クリマモリオナガコバチ早期・晩期羽化型を識別できるDNAマーカーを開発し、野外における個体数変動において、クリマモリオナガコバチ早期型からチュウゴクオナガコバチへの置き換わりを遺伝的に実証するとともに、晩期型からチュウゴクオナガコバチへの置き換わりが示された。(3)対馬の土着チュウゴクオナガコバチ集団の遺伝的特性の解明を目的として雌成虫の遺伝子解析を行った結果、チュウゴクオナガコバチ対馬集団は韓国集団と遺伝的に一致することが判明した。・チュウゴクオナガコバヂ、クリマモリオナガコバチ(早期・晩期羽化型)およびそれらの交雑個体を識別できるDNAマーカーを開発した。開発したDNAマーカーにより、クリマモリオナガコバチ晩期羽化型からチュウゴクオナガコバチへの置き換わりを遺伝的に実証した。また、この置き換わりの過程で両者の交雑個体(F_1)が最大22%検出され、両者間の遺伝的相互作用が初めて明らかになった。・昨年度のCOI領域の塩基配列変異の対馬・韓国・中国北東部集団間の比較から、韓国型のチュウゴクオナガコバチが対馬に侵入または分布拡大していることが判明している。この日本への分布拡大傾向を確認するため、周辺海域の離島(壱岐、五島、平戸、済州島)において乾固虫えいを採集し、塩基配列決定に向けて2月末から羽化個体を回収中である。・日本在来のコバチ類の中でクリタマバチと生活環の同調性が高いクリマモリオナガコバチは、その羽化時期の多型から、在来寄主タマバチは複数種いたと推定されている。虫えいの構造や出現時期から在来寄主の可能性があるハコネナラタマバチの両性世代成虫の形態を初めて明らかにし、単性世代成虫の形態と詳細に比較した。さらに本種は、その形態学的特徴に基づきCallirhytis属からAndricus属に移すべきと考えた。・茨城県下7地点、つくば市および周辺40ヵ所、ならびに果樹研究所内の各種・系統クリ樹のクリタマバチ虫えい密度、チュウゴクオナガコバチ(Ts)など天敵の寄生率と成虫羽化数の13年以上にわたる変動データを蓄積・解析し、導入天敵と在来天敵の作用機構の解明を進めた。中国、日本各地、ヨーロッパでのTsの生活史適応評価の基本知見として、耐寒性と休眠覚醒経過を解明した。Tsの交尾特性を調べ、在来種との交雑機構解明の基礎知見を得た。クリタマバチの生物的防除を目的として中国からチュウゴクオナガコバチを日本に導入し、防除に成功した。一方、本寄生蜂が土着のタマバチやその寄生蜂に悪影響を与えている可能性が懸念される。本寄生蜂に最も近縁なクリマモリオナガコバチの土着寄主タマバチが影響を受ける可能性が最も高い。土着寄主候補のタマバチCallirhytis hakonensisの分類学的検討を行い、本種をAndricus属に移し、単性世代を再記載、両性世代を記載した。

チュウゴクオナガコバチ幼虫の夏休眠の段階的な覚醒過程を解明し、生活史の全貌を明らかにした。つくば市と茨城県下7定点におけるクリタマバチと寄生蜂の個体数変動調査を継続実施するとともに、導入天敵放飼後27年間のクリタマバチと導入・土着寄生蜂の個体群動態の特徴を解明し、導入寄生蜂存在下での害虫管理方策を提案した。チュウゴクオナガコバチ集団の九州近海諸島における遺伝構造をCOIおよびITS2を用いて推定し、中国河北省および韓国集団と比較した。対馬・隠岐集団は韓国集団とハプロタイプが一致する一方で、済州島・五島・壱岐集団はむしろ中国集団と共通のタイプが多く、これらの地域での集団の成立過程を示唆した。産卵管は中国集団が短いことが判明し、チュウゴクグリのゴールの大きさまたはチュウゴクオナガコバチの寄生のタイミングが異なることを示唆した。日本各地でのチュウゴクオナガコバチとクリマモリオナガコバチ(早期・晩期羽化型)の交雑個体(F_1)ゲノタイプの出現頻度を調査した。早期羽化型とのF_1タイプは数%以下であったが、晩期羽化型とのF1タイプは数年間にわたり約20%出現したことから、晩期羽化型との交雑の方がより高頻度で起きていることが示唆された。また、これまで韓国でしか分布記録の無かったTorymus koreanusが長野県小布施町に生息していたことが明らかになった。
GB理論と言語習得:厳密下位範ちゅう化素性の習得をめぐって

本研究は、主に、子どもが動詞をどのように習得していくかを考察したものである。動詞を習得するということは、具体的には、動詞の意味がどのような述語関数の組み合わせとして表示されどのようなθ役割を担う項をとるか、即ち、項構造の習得という側面と、そのような動詞の項構造が統語構造にどのように投射またはLinkにされるか、即ち、厳密下位範ちゅう化素性の習得という側面から成っている。項構造の習得に関しては、Pinker(1989)の研究がいくつかの示唆深い知見を提示しているが、本研究での言語習得資料の分析からも子供の初期の段階においてみられる動詞の使用における誤りは、項構造の習得の誤りではなく、動詞の意味を正しく捉えていないことにおける誤りであることが実証された。このことは、UGの中にθ理論及びLinkingに関する基本的な原則があることを示すが、ここで問題となることは、Linkingに関わる原則がすべて普遍的なものであるのかどうか(個別言語に固有なLinking Ruleがあるのか)、さらに、普遍的であるとした場合にもパラメトリックは相違が言語においてみられた場合、それは言語の他のどのような事象と結びついているのかということである。この問題を考察するひとつの手がかりとして、動詞が非顕在項を許す場合をとりあげて研究してみた。非顕在項になる場合はいくつかの場合があり、(1)状況に結びついて予測可能な場に非顕在となる,(2)特定のθ役割に結びついて非顕在となる,(3)特定のθ役割に結びつきさらに特定の事象・事物に結びついて非顕在となることを明らかにした。習得過程においては、(1),(2),(3)という順序で項構造の習得が進むことがわかった。今後の残された問題として、日本語の言語発達資料についても本研究と同じ問題について考察し、Linking理論についてさらに考察を深めることである。
遅生まれ皮質神経細胞が脳梁への軸索を確立するための分子機構の解明

哺乳類大脳皮質神経細胞は脳室帯(VZ)に直接由来するものと、脳室下帯(SVZ)での二次的な分裂を経て産生されるものがある。前者はSVZ下部に集積して多極性細胞の形態をとり、約24時間停留した後に、脳の内側へと軸索を伸ばし、やがて脳梁の線維となる。SVZでさらに分裂する集団は前者のような集積は形成せず、SVZ内に広く分散する。本研究課題ではこれら2つの集団は異なる線維連絡を確立する可能性を考え、両者の産生バランスに関わる遺伝子の候補を得た。その内の1つは強制発現させるとSVZ分裂細胞の増加が観察され、その内在性タンパク質はSVZ分裂細胞そのものに発現することが示された。哺乳類大脳皮質神経細胞は脳室帯(VZ)あるいは脳室下帯(SVZ)で誕生し、脳表面側へと移動する。我々は、皮質形成後期過程において、VZで最終分裂を終えた皮質神経細胞は、多極性細胞の形態をとってSVZ下部に約24時間留まり、その後、双極性細胞へと変化して皮質板(CP)へと侵入することを観察した。多極性細胞が留まるSVZ下部を多極性細胞蓄積帯(MAZ)と呼ぶ。一方、VZ離脱後もさらに分裂する集団はMAZに特異的に留まることなく中間帯(IZ)に広く分布することを観察し報告した。前者の集団をSEP (slowly exiting population)、後者をREP (rapidly exiting population)と呼ぶ。SEPはMAZから移動を再開する時期に軸索を内側へと伸ばし、この場所に脳梁の線維を作る。このことから、SEPとREPはそれぞれ異なる線維連絡を持つ神経細胞へと分化する可能性が考えられた。本研究課題では、SEPとREPを区別してラベルし、その線維連絡を特に脳梁線維と連合線維との違いに注目して観察すること、さらにはSEPが脳梁線維を形成する分子機構を解明し、これがREPでも機能しているのかを明らかにすることを目的として研究を開始した。EGFPをCre依存的に発現するベクター、nestinプロモーター下でCreを発現するベクター、及び恒常的にRFPを発現するベクター(CAGプロモーター)を混合して子宮内電気穿孔法により胎生15日目マウス胎仔に導入して、2日後に観察するとSEPは赤の蛍光、REPは赤と緑の蛍光で標識されることが確認された。VZに直接由来する集団は多極性形態をとりながらSVZ下部に約24時間留まり、その後、双極性細胞へと変化して皮質板(CP)へと侵入することを観察した。一方、VZ離脱後もさらに分裂する集団はMAZに特異的に留まることなく中間帯(IZ)に広く分布する。前者の集団をSEP (slowly exiting popula tion)、後者をREP (rapidly exiting population)と呼ぶ。SEPはMAZから移動を再開する時期に軸索を内側へと伸ばし、中間帯下部に脳梁の線維束を作る。このことから、研究計画当初はSEPとREPはそれぞれ異なる線維連絡を持つ神経細胞へと分化する可能性を想定し、実験計画を立てた。初年度はSEPとREPをある程度区別してラベルする方法を開発し、その線維連絡を特に脳梁線維と連合線維との違いに注目して観察した。しかし系譜解析の困難さから、両者が異なった線維連絡を形成することを示唆する観察は得られなかった。そこで昨年度は(1)REPとSEPの標識方法を工夫し、発生が進行しても、その細胞系譜を追跡できる系を開発すること、(2)まずは脳梁線維と連合繊維(同側の領野間を結ぶ)の形成過程の違いを明らかにし、その後にSEPとREPの両者への貢献度が違うのかを検証することの2つの面から研究の推進を試みた。in utero electroporationにより様々な領野へのラベリングを行い、その軸索束の走行を観察したところ、ある条件下で前頭前野へ投射する神経細胞の集団をラベルできることを確認した。いずれも最終分裂を終了すると多数の突起を伸縮させて移動する多極性細胞となり、やがて脳表面側に太い先導突起、脳深部側に細いトレーリング突起を有する双極性の形態に変化して速い移動過程へと移行する。我々は皮質形成後期においては、VZに直接由来する神経細胞は、VZ内での最終分裂の後、約10時間VZ内に留まり、その後、VZの直上、SVZの下部に集積し、多極性細胞となって、さらに約24時間停留することを観察した。多極性細胞が集積するこの部位を多極性細胞集積帯(MAZ)と呼ぶ。一方、SVZでさらに分裂する集団は、早期にVZを離脱し、MAZに留まることなく、SVZ/中間帯(IZ)内に広く分散して分裂する。両者はVZを離脱するタイミングが異なることから、前者の集団をSEP (slowly exiting population)、後者をREP (rapidly exiting population)と呼ぶ。SEPはMAZから移動を再開する時期に軸索を内側へと伸ばし、IZ下部に脳梁の線維束を作る。

一方、SVZ内分裂細胞、すなわちREPに相当する細胞はヒトを含めた霊長類で著しく増加し、これらは大脳皮質の特に浅層の神経細胞を産生するとされている。これらの神経細胞は皮質の領野間を結ぶ連合繊維を形成し、複雑な情報処理を可能にしている。これらのことから、本研究課題では、SEPは脳梁の線維、REPは連合線維を形成する可能性を検討した。SEPとREPは細胞挙動によって同定される集団であり、両者を区別できる分子マーカーの存在は知られていなかった。本研究課題初期には未分化細胞で発現するNestinプロモーターにより、REPの同定を試みたが、このプロモーターはVZ内でも働くため、VZ由来のSEPにもラベルが入ってしまい、軸索が確立して成熟する時期まで細胞系譜を追跡することは困難であった。SEPとREPで発現が異なる分子を探索するため、SEPとREPの産生比が異なる皮質VZ内側部と外側部で遺伝子発現プロファイルを解析し、幾つかの候補分子を得ることに成功した。その内の1つはREPにおいて非常に特異的な発現が確認されたため、そのプロモーター領域を得るため、BACクローンから転写開始点付近の配列を単離した。この転写調節領域の支配下でGFPを発現するプラスミドを子宮内電気穿孔法により導入した結果、かなり正確にREPをラベルできることを確認した。子宮内電気穿孔法によるさらなる解析により、REPに特異的に発現するための転写調節領域は、遺伝子上流域のみならず下流域にも存在することが明らかとなった。しかし、電気穿孔法では導入される細胞当たりのコピー数が大きいため、Creリコンビナーゼによる系譜解析では特異性が担保されないことが問題となった。哺乳類大脳皮質神経細胞は脳室帯(VZ)に直接由来するものと、脳室下帯(SVZ)での二次的な分裂を経て産生されるものがある。我々はマウスの皮質形成後期においては、VZに直接由来する神経細胞は、VZ内での最終分裂の後、約10時間VZ内に留まり、その後、VZの直上、SVZの下部に集積し、多極性細胞となって、さらに約24時間停留することを観察した。一方、SVZでさらに分裂する集団は、早期VZを離脱し、SVZ/中間帯(IZ)内に広く分散して分裂する。両者はVZを離脱するタイミングが異なることから、前者の集団をSEP (slowly exiting population)、後者をREP (rapidly exiting population)と呼ぶ。SEPはSVZ下部から移動を再開する時期に軸索を内側へと伸ばし、脳梁の線維束を作る。一方、REPに相当する細胞はヒトを含めた霊長類で著しく増加し、これらは大脳皮質の特に浅層の神経細胞を産生することが他の研究グループにより示されている。本研究ではSEPとREPが異なる線維連絡を形成する可能性について検討を行った。SEPとREPの産生比を決定する分子のスクリーニングにより、重要な候補を得た。その分子の子宮内電気穿孔法による強制発現ではREP産生が増強した。また霊長類においてはこの分子の発現が強く、特にSVZにおける持続した発現が顕著であった。マウス、およびヒトゲノムから、この分子の転写調節領域を単離し、マウス胎仔脳内での転写活性を測定した結果、ヒトの配列はマウスよりもその活性が増強していることが確認された。これらの結果は、ヒトが進化過程で大きな脳を持つことに至った分子機構の一端を明らかにしたことに留まらず、小頭症等の発症機序を明らかにする上での重要な知見を提供する。
腐朽菌と細菌類間の木材腐朽時における微生物相互作用メカニズムの解析

本研究課題の目標は、腐朽菌と相互作用を呈する細菌類を明らかにし、両者の相互作用メカニズムの解析である。最終年度では、白色腐朽菌Pleurotus ostreatusの培地基材に堆積処理した竹材オガコを用いた場合で、相互作用を呈する細菌類の特定を試みた。本研究で用いた竹材は、堆積処理期間(0-24週間)にサンプリングしたものを用いた。得られた9つのサンプルから抽出したGenomic DNAを鋳型として、PCR-DGGE解析を行った。その結果、全てのレーンから複数のバンドが検出された。このことから、堆積処理期間中の竹材オガコ中には、複数の細菌類が存在していることが示唆された。また、堆積4週目において、ゲル中のバンドパターンの変化が観察され、この変化は8週目以降で安定していた。従って、堆積4週目以降で細菌類の菌叢が変化したことが予想された。ゲル中のバンドの塩基配列を決定し、相同性検索を行ったところ、放線菌であるStreptomyces属が多く検出された。このことから、堆積処理によってStreptomyces属が竹材オガコ中の主要な細菌類に変化したことが推察された。そこで、本菌の定量を行ったところ、P. ostreatusの成長率と本菌の存在量に相関がみられた。堆積4週目において、次に、堆積処理期間の竹材の細胞壁成分の分析を行ったところ、次に、堆積処理期間の竹材の細胞壁成分の分析を行ったところ、抽出成分の微減と堆積4週目で、還元糖量が顕著に減少していた。一方、細胞壁の主要成分には変化はみられなかった。以上の結果は、細菌類が腐朽菌の生育環境に何らかの影響を与えたことで、腐朽菌による木材分解が促進された可能性を示すもので、本研究によって、腐朽菌と細菌類による新たな腐朽機構に関する知見を得ることに成功した。最終年度では、竹材オガコ中の細菌類の菌叢解析を行い、主要な細菌類が放線菌Streptomyces属であることを明らかにした。本研究で得られた成果は、3件の学会年次大会にて発表した。また、学術雑誌に投稿するために論文を執筆中である。以上のことから当該研究の進捗状況について「2おおむね順調に進展している」と評価した。放線菌Streptomyces属によってP. ostreatusの成長が促進された要因として、細胞壁成分の構造の変化、または、Streptomyces属の生産する抗生物質による影響が推測される。今後の推進方策として、細胞壁成分の構造の解析と抗生物質の詳細な解析を行うことで、成長促進の要因を明らかにすることが可能になると考えられる。上記の解析を行うには、竹材に存在するStreptomyces属の単離を行い、細胞壁成分の分解活性や抗生物質の生産能を調査する必要がある。また、竹材オガコを基材としてP. ostreatusと共培養を行った場合で成長率を明らかにする必要があると考えられる。本年度は、腐朽菌と細菌類間の相互作用に関するメカニズムを明らかにするために、前者に同調的な後者を探索することを目的とした。細菌類が腐朽菌と相互作用を呈するには腐朽材内で同様の局在性を呈していると考えられる。そこで、腐朽材中での腐朽菌の局在性の解析を行った。街路樹のサクラから、生長錘を用いて得られたコアサンプルを約3cm毎に6分割した。各区画からGenomeDNAを抽出し、それを鋳型としてPCR-DGGEを行い、腐朽材中での腐朽菌の局在を解析した。その結果、全ての樹木からF.fraxineaが検出された。本菌はサクラの害菌として知られ、採取地周辺のサクラの腐朽の主要な原因菌であることが示唆された。また、本菌が検出された区画の近傍において、真菌類が検出されない区画が存在していた。このことから、腐朽菌は樹木中で高い局在性を呈していることが予想された。腐朽菌と相互作用を呈するような細菌類は、腐朽材中で共局在していると考えられるため、本結果は、本研究課題の推進にとって重要な知見となった。腐朽菌と細菌類の位置関係を解析するために、PNAプローブを用いたFISH法による腐朽材中の菌糸の可視化技術の構築を行った。白色腐朽菌のP.chrysosporium及び褐色腐朽菌のP.placentaを指標菌として用いて木片中の両菌の可視化を試みた。PVDF用ブロッキング剤で処理した場合で両菌の菌糸を可視化することに成功した。特に、P.chrysosporiumの解析において、多くの栄養物を保持しているとされる放射組織内で複数の菌糸に加え、多くのデンプンが観察された。以上のことから、腐朽菌は腐朽初期において本組織の様な栄養が豊富な領域を攻撃し、続いて貧栄養の領域を分解している可能性が示唆された。本結果は、初期の腐朽における腐朽菌の局在の解析に重要な知見となった。