hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
システムデザインのためのリスク発見テクノロジー

大規模複雑システムに潜むリスク要因を発見するための方法論を確立し、社会に受容される安全なシステムを創成するために必要な共通基盤技術を創出することを目的に、「モデルからのリスク発見」、「生命規範からのリスク発見」、「経験からのリスク発見」、「シナリオ共創によるリスク発見」の4つのアプローチについて、リスク発見の要素技術となる手法を提案・確立して基本的なリスク発見ツールを開発した。1.ネットワーク分析によるリスク発見:ネットワークシステムに潜む機能の喪失と波及のリスクを検出する手法を開発するため,ネットワーク可視化,分析フレームワーク,そのためのアルゴリズムの開発を行った。本年度は,ネットワーク時系列データから抽出されるクラスタの特性を分析し,そのような時間依存のネットワーク分析を行う際の時間間隔の決定法について検討した。2.シミュレーションによるリスク発見:H19年度は,人工減少に伴う都市システムのリスク発見の基盤手段として,公共交通システムの拡充が及ぼす影響を交通混雑状況と財務的観点からシミュレーションする手法を知的マルチエージェントモデルとリアルオプションに基づき構築し,岡山市のLRT駅前延伸問題を例として具体的な評価を行い,その有効性を確認した。3.生命規範からのリスク発見:大規模複雑問題への高いスケーラビリティをもつ生命発生的進化モデルを開発した。人工胚発生モデルに基づき,複雑なパターンを効率的に生成できるアルゴリズムを開発し,次に,これを一般的な複雑構造物の生成に適するよう改良した。これにより,大規模複雑システムの構造評価,リスク評価を可能とした。4.経験からのリスク発見:リスク発見のための重要な情報源である事故,故障報告から教訓を最大限に抽出し,水平展開につなげる技術を開発する。まず公開されている事故,故障報告データベース,失敗データベースを基に,事故,故障オントロジーを構築し,これに基づき事故,故障の事象因果,関係要因を形式的に記述する手法を開発する。つぎに,事故,故障報告において自然言語で自由記述された事象の発生状況,発生原因といった内容を,事故,故障オントロジーに基いて自動分析するシステムを開発する。(5)シナリオ共創によるリスク発見:実務チームをメンバーとするWeb上の議論環境において,参加者や話題の関係を可視化するとチーム活性化の背景因子が把握できることを実験的に検証した。また,文章に記入者自らがアノテーションを施すインタフェースを開発し,感覚的な気づきを表出化する効果を得た。これらの根底には潜在因子を掘り起こすメタ認知の効果があるため,Web上のホワイトボードに様々な概念を並べて共通性を考える思考空間を試作し,潜在リスク要因に気づくメタ認知プロセスについて観察的にモデル化を進めている。1.ネットワーク分析によるリスク発見:電子掲示板やSNSにおけるオンラインコミュニケーションのログデータから、ネットワークの時系列を構築し、クラスタリングによってコミュニティ構造を抽出し、前後のマッチングによってコミュニティ構造の時系列を構築し、得られたコミュニティ集団の生成・消滅・分裂・融合を可視化する枠組みをデザイン・実装した。2.シミュレーションによるリスク発見:知的マルチエージェントモデルに、視野を考慮した視覚認知モデルを組み込んだ。本モデルを用いて交通シミュレーションを行ったところ、エラー率のような人工的パラメータを導入することなく、交通事故を起こすことが可能となった。また、視野狭窄によって事故の発生率が上昇する状況を再現できた。シミュレーションによるリスク発見のプロトタイプを構築することができた。3.生命規範からのリスク発見:人工胚発生モデルによる構造物の進化的発生機構を研究した。トラス型構造による建造物を対象として、構造要素の種別が多いときには総和型のセルオートマトンルールを用いた。構造物に外力を作用させながら、進化的に強度の高い構造を発生する様子を確認した。また、ルールベースの進化アルゴリズムが高いスケーラビリティをもつことを示した。4.経験からのリスク発見:医療現場におけるインシデント事例、およびその発生原因を調査することで、その特徴を整理した。それらの情報を元に、事故原因の分析に用いるオントロジーの設計を行った。また、レポートの自動分析を実施するためのシステムに関して、テキストマイニングの先行研究などをベースに構築を行った。5.シナリオ共創によるリスク発見:電子掲示板やSNSにおけるオンラインコミュニケーションのログデータから、ネットワークの時系列を構築し、クラスタリングによってコミュニティ構造を抽出し、前後のマッチングによってコミュニティ構造の時系列を構築し、得られたコミュニティ集団の生成・消滅・分裂・融合を可視化する枠組みをデザイン・実装した。1.ネットワーク分析によるリスク発見:論文のデータベースやウェブにおける閲覧履歴といった行動情報の履歴から、人と人の社会的インタラクションが作るネットワークを構築し、その時間変化を捉えるための研究を行った。コミュニティ構造の通時的分析と可視化によって、ソーシャルネットワークにおけるコミュニティ構造の遷移ダイアグラムを構築し、それによって行動情報の背後にある個人の属性、あるいはネットワークを構成するエンティティの属性を明らかにするための新しい方法論を示した。2.シミュレーションによるリスク発見:視野および視点移動を考慮した視覚認知モデルを知的マルチエージェントシミュレータに組み込み、本シミュレータを用いて交通流シミュレーションを行った。その上で認知モデルに含まれる生理学的パラメータに関する感度解析を実施した。感度解析を通じ、安全を保つために視話すべき車両を見落とすという認知エラーの発生状況、ひいては交通事故というリスクの発生状況に対してパラメータの差異がどのように関与しているか示すことができた。

3.生命規範からのリスク発見:人工胚発生アルゴリズムに基づく構造発生モデルを作成し、これを利用した構造形成の特徴を明らかにした。ルール集合としてセルオートマトンと同様の制約伝播型アルゴリズムを用いた。また、人工胚発生ルール集合のモジュール性に着目し、対象とする問題サイズの増加に対応できるようスケーラビリティを上げる方法として、問題サイズを徐々に増加しながら解を進化させていく段階的進化法を提案し、この有効性を示した。4.経験からのリスク発見:医療インシデントの発生要因、および因果関係を整理したオントロジーを元に、インシデントレポートとして入力されたデータを自動処理し、背後要因や因果関係、および再発防止対策の推論・提示を行う分析システムを開発した。分析システムによる結果を用い、インシデントをその発生要因や因果関係から体系的にとらえ、再発防止対策の考案を行いやすくするために、インシデントの発生パターンについて検討した。5.シナリオ共創によるリスク発見:かねてから企業でのチャンス発見およびその基礎能力強化効果が実験的に認められていたイノベーショングーム、アナロジーゲームを統合したプロセスを構築し、さらに「都合」の表現形式を提案して盛り込むことによって、実現性の高いシナリオを創造する効果を検証した。検証実験では製造業、サービス業におけるビジネスリスクの発見から、医療、原子力への応用展開まで扱った。また、部分的にWeb上で稼働するシステムとし、会話情報環境を実現した。
実験病理学的難治性根尖性歯周炎モデルの開発とその化学的制御法の検討

本研究課題は、未解明である難治性根尖性歯周炎の病態と根尖孔外バイオフィルムの関係を開発するモデル上で検索し、さらにその難治性疾患の化学的制御法の有用性を検討することを目的とした。開発したモデル上で、根尖孔外バイオフィルムの存在が根尖病巣の増大に関与することをin vivoで初めて解明した。化学的制御法の開発は、単一細菌種根尖孔外バイオフィルムモデルの開発が困難で方向転換し、根管治療モデルの開発にほぼ成功した為、将来その成果を発表する予定である。一方、バイオフィルムに伴う高病原化細菌の検索では、Eikenella corrodensが、普遍的に高病原化しLuxSが深く関与していることを発表した。研究代表者らは、根尖性歯周炎の難治化には根尖孔外バイオフィルムが密接に関与することを報告したが、本研究では未解明であるその病態とバイオフィルムの進展状況の関係を開発する病態モデル上で解明し、さらに得られるモデル上で、その難治性疾患の化学的制御法の有用性を検討することを目的とした。本年度は、まず病態モデルの作製を行った。本研究は、大阪大学大学院歯学研究科動物実験委員会の承認を得て実施した(承認番号:動歯22-003-1)。まず、難治性根尖性歯周炎モデルの作成に着手した。雄性ウイスター系ラットの、下顎第1臼歯を露髄し4週間後に根尖孔外を破壊してガッタパーチャポイントを根尖孔外まで挿入し2週間放置することで、根尖孔外にバイオフィルムを形成した。その成果の詳細は第137回日本歯科保存学会秋季学術大会において発表した。次に、計70匹のラットを用いて、本モデルにおいて形成される根尖孔外バイオフィルムの経時的な定量の他、根尖孔外バイオフィルムの存在下における根尖性病巣の進展をマイクロCTにて露髄20週後まで解析した。この結果、根尖孔外のバイオフィルム細菌の形成量は露髄6週後から経時的に増加傾向を示し、根尖孔外バイオフィルムの存在が根尖病巣の増大に関与することをin vivoで初めて示した。この結果は平成25年の第9回世界歯内療法会議において発表する予定である。25年度以降は本モデルを用いた化学的制御法の開発研究に移行する予定であり、本研究は化学療法による難治性根尖性歯周炎の制御の礎となると推察される。一方、辺縁性および根尖性歯周炎に関与するバイオフィルムの構成細菌の1種であるEikenella corrodensの臨床分離株を用いて高病原化が普遍的な現象であるかを検討した。その結果、以前は23834株にプラスミド由来のリコンビナーゼを導入すると高病原化すると報告していましたが、臨床分離株のうち数株でも同様の現象が見られたこと、すべての株で23834株と同じ変化だったことから、高病原化がEikenellaで普遍的に発生ことを示した。研究代表者らは、昨年平成24年度に、ラットを用いて難治性根尖性歯周炎モデルの作製に成功した。25年度はそれらの研究成果を第9回世界歯内療法会議でポスター発表するとともに、国際的に著名なアメリカ細菌学会の機関誌の一つであもあるApplied Environmental Microbiology(IF:3.768)に投稿しアクセプトされた。現在雑誌は印刷中で、間もなく掲載される予定である。一方、研究は研究実施計画に従って実施され、難治性根尖性歯周炎モデルを基にして、これも世界で初となる根管治療モデルの開発に挑戦している。難題であった4根管の根管充填法を根管充填材電気加熱注入器と電熱式根管プラガによる方法から25号の0.6テーパーによる規格根管充填材のシングルポイント法に変更することにより、本モデルもほぼ確立のところまでこぎつけた。今後は、確立したモデル上で、抑制法の開発研究に移行する予定であり、本研究は新規の手技・手法による難治性根尖性歯周炎の制御・予防の礎となるものと推察される。他方で、辺縁性および根尖性歯周炎の発症と進行と関与するデンタルバイオフィルム構成細菌種の1種であるEikenella corrodensのバイオフィルムの成熟とデタッチメントにLuxSが影響を及ぼすことおよびオートインデューサー2不活性化酵素を産生することを見出し、Journal of Bioscience and BioengineeringおよびBioscience Biotechnology, and Biochemistryの国際雑誌に掲載された。現在このような高病原化のメカニズムについてさらに詳細な検討を加えるべく研究を行っている。研究代表者らは、初年度である平成24年度にラットの下顎第1臼歯にGPを過剰根管充填することによって、難治性根尖性歯周炎モデルの開発に成功した。

そして、25年度にはそれらの研究成果を第9回世界歯内療法会議でポスター発表するとともに、アメリカ細菌学会の機関誌のひとつであるApplied Environmental Microbiology (IF= 3.768)に公表した。26年度は、研究実施計画に従って、開発したモデルを基に根尖孔外に過剰挿入したガッタパ-チャの影響のないモデルの開発を行い、GPの過剰挿入が、根尖病巣の体積に影響しないことを組織形態学的に、X線的に証明し、その成果を第12回日本顕微鏡歯科学会の学術大会で発表した。一方で、歯周病関連細菌Eikenellacorrodensの定常期の培養上清からオートインデューサー(AI-2)を不活化するタンパク質を見つけ精製した。精製したタンパク質のN末アミノ酸配列より、このタンパク質は外膜ポーリンであることを示唆した。外膜ポーリンの欠損株を作成したところ、この株では定常期におけるAI-2の不活化は見られなかった。また、精製したポーリンは用量依存的にAI-2を不活化した。また、野生株では定常期においてメンブランベシクル中のポーリンが増加した。これらのことから、E. corrodenは定常期においてメンブランベシクルによって放出されたポーリンによってAI-2を不活化することが示唆した。これらの成果は、本年度の農芸化学会および日本生物工学会で発表し、現在世界的に著名な雑誌への投稿準備を行っているところである。26年度が最終年度であるため、記入しない。歯科保存学26年度が最終年度であるため、記入しない。研究代表者は、疾病により3カ月程度休暇をとったが、研究協力者(大学院生)のサポートもあり、研究は概ね順調に遂行された。本年度は昨年度確立した難治性根尖性歯周炎モデルを基に、予定した根管治療モデルの開発に成功したので、概ね順調に進展している。本年度は、予定した難治性根尖性歯周炎モデルを作製することに成功したので、来年度は予定通りそれを基に化学的制御法の開発研究に移行する予定である。来年度は、これまでに開発したモデルを基に、予定通り難治性根尖性歯周炎の抑制法の開発研究に移行する予定である。実験病理学的モデルの開発までは至って順調に研究は遂行されており、今後の実施にあたって現状では問題は見当たらない。残金は287円であり、来年度の早期に来年度の計画に則って研究計画を遂行する際に使用する予定である。
イオンチャネル透過路の立体構造:チャネルと非荷電分子の相互作用による解析

ポア裏打ち構造と考えられているH5領域のイオン選択性特異配列(Gly-Tyr-Gly)に続く残基は、電位依存性KチャネルではAspと負電荷を持つが、内向き整流性KチャネルではPheに続いてArgという正電荷が存在する。この正電荷の役割を明らかにするために内向き整流性KチャネルIRK1の148残基を部位特異的変異導入によってHisに置換した(R148H)。mRNAを注入したツメガエル卵母細胞を2本刺し電位固定法によって電流記録を行うと野生型では数10μAの電流が得られたが、R148Hでは大量のmRNA注入によってもチャネル電流が得られなかった。R148Hとの共発現によって野生型チャネルにくらべ電流量の抑制が見られた。共発現した卵母細胞では単一チャネル記録によって野生型より小さな数種のコンダクタンスを持つチャネルが観察できた。R148Hは単独ではチャネル活性がないが、野生型とヘテロオリゴマーを形成することが証明された。野生型に対してMg^<2+>は電位非依存性のブロックを示したが、変異によってより低濃度でブロックが見られ、しかも電位依存性となった。この効果は変異型の野生型に対する注入比、細胞外pHによって影響を受けた。オープンチャネルブロッカーであるBa^<2+>やCs^+はブロック速度が変異によって促進した。以上の実験結果よりArg^<148>はK結合部位の外側、ポア入口付近でバリアを形成し、Mg^<2+>やCa^<2+>による内向き電流のブロックを防いでいることが明らかになった。キテネィクスの解析からArg^<148>のポア内での位置情報が得られた。Ba^<2+>やCs^+のブロック速度に対する影響はHis^<148>の細胞外からのプロトン化とそれによって起こる荷電状態の変化がその原因と考えられる。単一チャネルの結果は透過Kイオンとチャネルとの非静電的相互作用が示唆された。
Th1誘道DNA断片(CpG)点鼻による鼻アレルギーの新しい治療法の開発

申請者はすでに日本住血吸虫卵抗原を用いてマウスを経鼻感作し、経鼻感作アレルギー性鼻炎モデルを作成することに成功していた。まず、CpG点鼻を一次免疫(感作)する時に併用してアレルギー性鼻炎の発症そのものを抑えられるかどうか調べるため、皮下投与群、点鼻投与群、非投与群とにわけ、一次免疫時にCpG 50μgを投与した。点鼻投与群ではCpG非投与群と比べ、抗原特異的IgE産生が抑制され、鼻粘膜リンパ球のIL-5産生が抑制された。また鼻粘膜組織の好酸球浸潤も抑制されていた。一方、感作相にCpGを皮下投与した群については抗原特異的IgE産生、鼻粘膜内好酸球浸潤数、鼻粘膜リンパ球のIL-5産生は、CpG非投与群と比べ、いずれも有意な抑制を認めなかった。以上から、CpG点鼻が鼻アレルギーの感作そのものを抑制できることが明らかとなり、第21会耳鼻咽喉科免疫アレルギー学会で報告した。詳細は耳鼻咽喉科免疫アレルギー誌に掲載予定である。さらに、CpG点鼻が感作成立後のアレルギー性鼻炎にも有効かどうか調べるため、二次免疫時にCpGを投与して、同様の検討を行った。その結果、二次免疫時に投与しても、点鼻投与群ではCpG非投与群と比べ、抗原特異的IgE産生、鼻粘膜内好酸球浸潤数、鼻粘膜リンパ球のIL-5産生が抑制された。以上より、発症後のアレルギー性鼻炎に対してもCpG点鼻が有効であることが明らかとなり、第51回日耳鼻中部地方連合会で報告した。
10?13世紀東アジア史の歴史文献研究-元代における『遼史』『金史』『宋史』編纂を中心として

10世紀から13世紀にかけての東アジア史とは、遼(契丹)の成立と唐朝の崩壊よりモンゴル帝国(元)が女真(金)・南宋政権を滅ぼすまでの時期、すなわち、おおよそ前半期には遼と北宋とが、そして後半期には金と南宋とが並立した時期を指す。この時代の歴史を知るための基本史料は、元代に中国歴代王朝の伝統にのっとって編纂された正史『遼史』『金史』『宋史』である。本研究では1013世紀の東アジア史を明らかにするべく、その基本史料であるこの三つの正史に関わる研究を行った。まず、元代における三史編纂過程に関する研究である。元代における正史の編纂は正統問題によって遅延したというのが通説であるが、実際には政権の歴史編纂の方針は遼・金・宋の三つの正史を公平に立てるという編纂で一貫していた。本研究では一二三四年に脩端という人物によって書かれた「辯遼宋金正統」という文献を取りあげて訳注・研究を行った論文を発表し、その事実をあとづけた。次に、金代の歴史『金史』の内容に関する研究に着手した。現在のところ、巻一「世紀」という金国建国以前の歴史を記した部分に関する政治史的分析を進めつつある。元代の正史編纂に関する研究を進めるにあたっては、背景となる元代の出版や文化政策の知識が必要となる。その一例として、元代に出版された禅籍『勅修百丈清規』という書物について、政治史・文化史の側面からの研究を同時進行した。この研究は、日本・中国・韓国の国境を超えた出版文化史の解明を目指して組織され、研究代表者もその一員として参加した領域横断的共同研究班「日中韓版本研究会」における研究の一環として行われた。研究代表者はこの研究組織参加メンバーを中心に進められた平成十四年度京都大学附属図書館展示会「学びの世界-中国文化と日本-」の企画・展示にたずさわり、京都大学附属図書館に所蔵される貴重な漢籍の紹介を行った。1013世紀の東アジアの歴史を理解するためにその根本史料となるのが、14世紀元代中国において編纂された『遼史』『金史』『宋史』の三史である。13年度には、三史の編纂事業に関する研究に着手し、元代中国で書かれた関連文献を広く収集し、史料データ入力作業を行った。その中で、モンゴル帝国が金を滅ぼした直後の一二三四年に脩端なる人物が記したとされる「辯遼宋金正統」という文章の言説を特に取り上げ、現代日本語による訳注を作成し、その内容および文章が作られた周辺状況を詳細に検討した。その結果、モンゴル政権による歴史編纂事業の推進過程においてこの言説が極めて重要な影響を及ぼしたということが明らかになった。この言説の内容についてはまだ詰めきれていない部分がいくつかあり、今後さらに研究を進めたうえで近く論文を発表する予定である。次に、元代中国江南で編纂された『勅修百丈清規』という禅宗寺院で用いられる規則集についての研究を行った。その結果、この清規の編纂はモンゴル皇帝及び政権要人と深い関係を結んだ禅僧によって政権の全面支援を得て行われたものであり、そして日本にもいち早く伝えられ、日本禅宗の制度の形成過程において大きな役割を果たしたことが分かった。また編纂が行われた時期は『遼史』『金史』『宋史』三史が編纂された時期と近く、その研究により三史編纂が行われた元代中国の政治・文化状況をより深く理解することができるようになった。この研究についても、近く論文を発表する予定である。このほか、遼・宋・金時代の重要文献の精読も同時に並行して行った。これは現在のところ研究の基礎段階にとどまる。さらにこの時代の東アジアの歴史を考えるうえで看過し得ない場所である河西回廊に関わる文献の収集・解読をすすめ、そのうち元代カラホト文書の訳注を発表した。

この研究は、日本・中国・韓国の国境を超えた出版文化史の解明を目指して組織され、研究代表者もその一員として参加した領域横断的共同研究班「日中韓版本研究会」における研究の一環として行われた。研究代表者はこの研究組織参加メンバーを中心に進められた平成十四年度京都大学附属図書館展示会「学びの世界-中国文化と日本-」の企画・展示にたずさわり、京都大学附属図書館に所蔵される貴重な漢籍の紹介を行った。
ミニチュアヒト肝臓を用いた肝癌の浸潤・転移機序解明による革新的肝癌治療の開発

ラット・マウス摘出肝右葉に緩衝液であるTriton Xを門脈から還流する事で、精緻な脈管構造を維持した脱細胞鋳型肝臓の安定した作成が可能となった。また、ミニチュアヒト肝臓のex vivo長期還流培養を可能にするために、新しく人工肺装置を回路に組み込み、最大2日間のex vivo還流培養を可能とした。この循環回路にキーエンスを組み込み、GFPやRFPをコードしたplasmidを導入してマーキングしたヒト肝癌細胞株(Hep 3B)を可視できるシステムを構築した。倫理委員会の承認のもと、患者からインフォームド・コンセントを得て、ウイルス肝炎や肝硬変合併のない肝切除症例の切除標本非癌部より、コラーゲナーゼ還流法を用いて生存率80%と高いviabilityを維持したヒト初代培養肝細胞を得るプロトコールを確立した。マウス右葉脱細胞鋳型にヒト初代培養肝細胞を懸濁したコラーゲンゾルを注入して再細胞化し、培地循環培養(3時間)をして、ミニチュアヒト肝臓を創成した。このミニチュアヒト肝臓は3.5 pg/cell/dayのアルブミン産生能を有していた。優れた肝構築を得るための播種ルートを検討した所、肝動脈より初代培養肝細胞を注入する方法により、類洞に類似した肝構築を得る事を見出した。細胞量の確保のために、ヒト初代培養肝細胞の不死化を試みている。初代培養肝細胞にレンチウイルスを用いてSV40 T antigen、E6/E7&hTERTなどの遺伝子を導入して不死化させる事に成功した。In vitroでは増殖しないヒト初代培養肝細胞に増殖能を供与する事ができたが、G6Pやα1ATなどの肝特異遺伝子の発現が初代培養肝細胞に比して1/10に低下しており、肝特異機能を喪失して可能性が高いと考えられた。一方で、ヒト臍帯血由来のiPS細胞より分化誘導した肝細胞を得る事に成功した.現在、その詳細な機能解析をすすめている。平成28年度の実験到達目標は「ミニチュアヒト肝臓の創成」である。まず、ラット脱細胞鋳型肝臓の安定した作成が可能となった。また、ミニチュアヒト肝臓のex vivo還流培養を可能にするために、人工肺などを組み込んだ還流回路を新しく組み立て、最大2日間のex vivo還流培養が可能となった。細胞源としてヒトiPS細胞由来分化肝細胞を考えていたが、現段階では安定した大量供給が不可能なため、ヒト初代培養肝細胞を細胞源にする事に変更した。その採取に関しては、熊本大学医学部附属病院の倫理委員会より新しく承認を受けた。癌細胞の浸潤課程を評価するために、ヒト肝癌細胞株(Hep3Bなど)にGFPやRFPをコードしたplasmidをエレクトロポレーション法にて遺伝子導入してマーキングする事に成功した。循環回路に組み込んだキーエンスで回路中に流れるGFPやRFP導入細胞が可視可能である事を確認した。平成28年4月に研究代表者が九州がんセンターから熊本大学へ異動したため、研究環境の整備に時間を要した。熊本大学動物実験施設では、ラット実験の実績がなく、動物実験計画書の提出からのスタートであった。また4月の熊本地震により、実験環境が壊滅的に破壊され、本格的な実験再開は6月からとなった。ヒト初代培養肝細胞採取に関しても倫理委員会の承認からのスタートとなった。しかし、共同研究者(井嶋教授、白木川助教)の協力のお陰もあり、ラット脱細胞鋳型肝臓作成の手技も熊本大学側でマスターし、ex vivo循環に用いる還流回路も完成した。平成29年2月に熊本大学でのラット実験が承認され、ラット脱細胞鋳型肝臓の安定した供給が可能となった。また、細胞源であるヒト初代培養肝細胞採取に関しても、平成29年3月に倫理委員会の承認を受けた。臨床検体を用いたヒト初代培養肝細胞採取に関しては豊富な経験を有しており、該当症例があれば、細胞源の確保も可能となった。以上、今後の研究推進が加速できる段階となっている。平成29年度の実験到達目標は「ミニチュアヒト肝臓を用いた肝細胞癌の循環・転移機序の解明」である。ラット摘出肝に緩衝液であるトリトンXを門脈から還流する事で、精緻な脈管構造を維持した脱細胞鋳型肝臓の安定した作成が可能となった。また、ミニチュアヒト肝臓のex vivo長期還流培養を可能にするために、新しく人工肺装置を回路に組み込み、最大2日間のex vivo還流培養が可能となった。この循環回路にキーエンスを組み込み、GFPやRFPをコードしたplasmidをエレクトロポレーション法で導入してマーキングしたヒト肝癌細胞株(Hep 3B)を可視できるシステムを構築した。当院倫理委員会の承認のもと、患者からインフォームド・コンセントを得て、肝門部胆管癌、転移性肝癌、肝内胆管癌などウイルス肝炎や肝硬変合併のない肝切除症例の切除標本非癌部より、コラーゲナーゼ還流法を用いてヒト初代培養肝細胞を得るプロトコールの確立を目指して実験を重ねている。これまで、10例近く症例を重ねているが、細胞収率・生存率などがまだ安定しないのが状況である。細胞量の確保のために、採取したヒト初代培養肝細胞の不死化を試みている。

In vitroでは増殖しないヒト初代培養肝細胞に増殖能を供与する事ができたが、G6Pやα1ATなどの肝特異遺伝子の発現が初代培養肝細胞に比して1/10に低下しており、肝特異機能を喪失して可能性が高いと考えられた。平成28年度の進捗の遅れを完全に取り戻す事ができなかった。平成28年の4月に研究代表者が九州がんセンターから熊本大学へ異動した。熊本大学ではラット実験の実績がなく、動物実験計画書の提出からのスタートであった。また4月の熊本地震により、実験環境が壊滅的に破壊され、本格的な実験再開は8月からとなった。ヒト初代培養肝細胞採取に関しても倫理委員会の承認からのスタートとなった。平成29年2月に熊本大学でのラット実験が承認され、ラット脱細胞鋳型肝臓の安定した供給が可能となった。また、細胞源であるヒト初代培養肝細胞採取に関しても、平成29年3月に倫理委員会の承認を受けた。これまでに、ヒト初代培養肝細胞採取に関しては豊富な経験を有してはいるが、安定した採取を実現するプロトコールの確立に難渋している。また、本実験系を実現するためには、最低7日のex vivo培養が必要と考えられるが、まだ長期還流培養を可能にする安定した酸素供給系を構築できずにいる。ミニチュアヒト肝臓を構築するための肝細胞量確保のために、ヒト初代培養肝細胞の不死化に成功したが、同時に肝特異機能が著しく喪失している事が判明し、ミニチュアヒト肝臓の細胞源として適格かどうか不安が残る。ラット・マウス摘出肝右葉に緩衝液であるTriton Xを門脈から還流する事で、精緻な脈管構造を維持した脱細胞鋳型肝臓の安定した作成が可能となった。また、ミニチュアヒト肝臓のex vivo長期還流培養を可能にするために、新しく人工肺装置を回路に組み込み、最大2日間のex vivo還流培養を可能とした。この循環回路にキーエンスを組み込み、GFPやRFPをコードしたplasmidを導入してマーキングしたヒト肝癌細胞株(Hep 3B)を可視できるシステムを構築した。倫理委員会の承認のもと、患者からインフォームド・コンセントを得て、ウイルス肝炎や肝硬変合併のない肝切除症例の切除標本非癌部より、コラーゲナーゼ還流法を用いて生存率80%と高いviabilityを維持したヒト初代培養肝細胞を得るプロトコールを確立した。マウス右葉脱細胞鋳型にヒト初代培養肝細胞を懸濁したコラーゲンゾルを注入して再細胞化し、培地循環培養(3時間)をして、ミニチュアヒト肝臓を創成した。このミニチュアヒト肝臓は3.5 pg/cell/dayのアルブミン産生能を有していた。優れた肝構築を得るための播種ルートを検討した所、肝動脈より初代培養肝細胞を注入する方法により、類洞に類似した肝構築を得る事を見出した。細胞量の確保のために、ヒト初代培養肝細胞の不死化を試みている。初代培養肝細胞にレンチウイルスを用いてSV40 T antigen、E6/E7&hTERTなどの遺伝子を導入して不死化させる事に成功した。一方で、ヒト臍帯血由来のiPS細胞より分化誘導した肝細胞を得る事に成功した.現在、その詳細な機能解析をすすめている。
病原性機構の異なる2種の近縁な植物ウイルスにおける遺伝子間相互作用の研究

植物RNAウイルスであるブロムモザイクウイルス(BMV)とササゲクロロティックモトルウイルス(CCMV)は、同じブロモウイルス属に分類される極めて近縁なウイルスであるにもかかわらず細胞間移行における外被タンパク質(CP)要求性という点で、細胞間移行機構が大きく異なることが示唆されてきた。まず、BMVとCCMVにコードされたどの遺伝子が細胞間移行において、CP要求性と非要求性を生じさせるのかを調べた。RNA3にコードされた3a移行タンパク質(MP)遺伝子を両ウイルス間で相互に置換したキメラウイスルBMV(C3a)とCCMV(B3a)は接種植物に病斑を形成した。CP遺伝子を欠損させたBMV(C3a,△cp)は病斑を形成し、CCMV(B3a,△cp)は形成しなかった。CP遺伝子をマーカー遺伝子であるGFP遺伝子で置換したウイルスを作製し、接種葉におけるウイルスの拡がりを蛍光顕微鏡観察した結果、病斑形成とGFPの蛍光の拡がり(ウイルスの細胞間移行)との間には正の相関があった。以上の結果、CP要求性に関与するウイルス遺伝子は、3a-MP遺伝子であることが明らかになった。つぎに、各ウイルスMPの機能解析を行った。これまで、BMVのMPには拡酸結合活性があることが示されていたが、さらにCCMVのMPにも同様に一本鎖の核酸に対して配列非特異的な結合活性があることを明らかにした。一方、BMVとCCMVのMP遺伝子の3'末端にGFP遺伝子を融合させ、プロトプラストに導入し発現させた結果、プロトプラスト表面に管状構造が観察された。以上の結果、BMVとCCMVはそれぞれ細胞間移行におけるCPの要求性は異なるものの、いずれもRNA-MP複合体で原形質連絡中をまたは粒子で管状構造を移行する2つの可能性が示唆された。一方、GST pull-downアッセイによりBMVのMPとCPはin vitroで結合することが示された。今後、CCMVのMPについても同様の実験を行い、各ウイルスのMPのCP要求性と、両タンパク質間の結合活性の有無の相関関係を研究する。植物RNAウイルスであるブロムモザイクウイルス(BMV)とササゲクロロティックモトルウイルス(CCMV)は、同じブロモウイルス属に分類される極めて近縁なウイルスであるにもかかわらず細胞間移行における外被タンパク質要求性という点で、細胞間移行のメカニズムが大きく異なることが示唆されてきた。本年度の研究では、3分節RNAゲノムを持つBMV(B1+B2+B3)とCCMV(C1+C2+C3)にコードされた遺伝子の中で、どの遺伝子が細胞間移行において、BMVにおける外被タンパク質要求性とCCMVにおける非要求性を生じさせるのかを調べた。まず、複製酵素遺伝子を含むゲノムRNA成分(RNAとRNA2)をBMVとCCMVの間で相互に置換した組み換えウイルスC1+C2+B3と1+B2+C3はそれぞれ植物(キノア)の接種葉に病斑を形成した。それぞれのウイルスのRNA3から外被タンパク質遺伝子を欠損させた組み換えウイルスC1+C2+B3(Δcp)は病斑を形成せず、B1+B2+C3(Δcp)は病斑を形成した。つぎにRNA3にコードされた3a移行タンパク質遺伝子をBMVとCCMVの間で相互に置換したキメラウイルスB1+B2+B3(C3a)とC1+C2+C3(B3a)は病斑を形成した。外被タンパク質遺伝子を欠損させたキメラウイルス

B1+B2+B3(C3a,ΔCP)は病斑を形成し、C1+C2+C3(B3a,Δcp)は形成しなかった。ウイルスの細胞間移行能力を細胞レベルで直接観察するため、外被タンパク質遺伝子を発光クラゲ由来のマーカー遺伝子であるGFP遺伝子で置換したウイルスを作製し、蛍光顕微鏡で接種葉におけるウイルスの拡がりを観察した結果、病斑形成とGFPの蛍光の拡がり(ウイルスの細胞間移行)との間には正の相関があった。以上の結果、外被タンパク質要求性に関与するウイルス遺伝子は、複製酵素遺伝子ではなく、3a移行タンパク質遺伝子であることが明らかになった。植物RNAウイルスであるブロムモザイクウイルス(BMV)とササゲクロロティックモトルウイルス(CCMV)は、極めて近縁なウイルスであるにもかかわらず細胞間移行に外被タンパク質(CP)を必要とするか否かという点で、細胞間移行のメカニズムが大きく異なることが示唆されてきた。初年度の研究において、BMVとCCMVの細胞間移行においてCP要求性の違いを生じるウイルス遺伝子は移行タンパク質(MP)遺伝子であることが強く示唆された。本年度は、各ウイルスMPの機能解析およびMPとCPの間の相互作用の解析を試みた。これまで、BMVのMPには核酸結合活性があることが示されていたが、今年度はさらにCCMVのMPにも同様に核酸とくに一本鎖の核酸に対して配列非特異的な結合活性があることを明らかにした。この結果、BMV,CCMVともにRNA-MP複合体として細胞間を移行する可能性が示唆された。一方、BMVとCCMVのMP遺伝子の3'末端にGFP遺伝子を融合させ、プロトプラストに導入し発現させ、蛍光顕微鏡観察した結果、プロトプラスト表面に管状構造が観察された。この結果、両ウイルスとも原形質連絡中の管状構造中を粒子の形態で移行する可能性が示唆された。以上の結果、BMVとCCMVはそれぞれ細胞間移行におけるCPの要求性は異なるものの、いずれもRNA-MP複合体および粒子で移行する2つの可能性が示唆された。一方、BMVのMP遺伝子をグルタチオンS-トランスフェラーゼとの融合タンパク質として大腸菌で発現させ、純化し、BMV粒子から純化調整したCPとの結合をグルタチオンカラムを用いたpull-downアッセイにより調査した結果、BMVのMPとCPはin vitroで結合することが示された。今後、CCMVのMPについても同様の実験を行い、各ウイルスのMPのCP要求性と、両タンパク質間の結合活性の有無の相関関係を研究する際に今回確立したin vitro結合アッセイ系の利用が期待できる。
クラス特異的抗DNA抗体の由来とその産生機構の分子生物学的解析

全身性エリテマトーデス(SLE)には血中に高力価の抗DNA抗体が認められるが、中でもIgGクラスの抗体がSLE病態発症と密接に相関している。SLEのモデルマウスであるNZB/W F1マウスにおいても、加令とともにSLEの発症に相関して抗DNA抗体のIgMからIgGへのクラス転換がみられる。我々は先に、このNZB/W F1マウスに出現するIgM抗DNA抗体はCD5B細胞に由来するのに対して、IgG抗DNA抗体はCD5抗原を持たないB細胞に由来することを発見した。この事実は、IgMとIgG抗DNA抗体が異なるlineageのB細胞から産生されていることを示唆するものであるが、一方、IgG抗体産生B細胞がクラス転換とともにCD5分子を消失する可能性も考えられる。最近、抗体遺伝子可変(V)領域の解析から、IgG抗DNA抗体の大部分はV領域に多数のmutationを持つ抗体であり、しかもこれらはクローン性に選択され、増殖していることが示されている。一方、CD5B細胞由来のIgM抗DNA抗体は、polyclonalであり、その多くにはmutationは認められてないという報告がなされている。今回我々は、SLEに出現するクラス特異的抗DNA抗体の由来を明らかにするためにNZB/W F1マウスを用いてモノクローナル抗DNA抗体の抗体遺伝子V領域の解析を行なった。その結果、(1)CD5B細胞は通常のB細胞と異なり、加令とともに高度にclonalになること、(2)IgM抗DNA抗体産生B細胞もIgG抗DNA抗体産生B細胞と同様にclonalに増殖していること、(3)病的IgG抗体の抗体遺伝子V領域には多数のsomatic mutationが認められるが、このmutationはすでにIgM抗体の時期から起こり始めること、が明かとなった。以上の結果から、病的IgG抗DNA抗体はCD5分子を失ったCD5B細胞由来であり、clonalに選択され増殖した抗DNA抗体産生B細胞の抗体遺伝子V領域にmutationが集積することによって生じてくることが強く示唆された。代表的自己免疫疾患の一つである全身性エリテマト-デス(SLE)においては、血中に高度の抗DNA抗体産生が認められる。抗DNA抗体の中でも、IgMクラスと異なりIgGクラスの抗体の出現はSLE病態の増悪ときわめてよく相関することから、SLEの病因として重要である。そのため、このIgG抗DNA抗体産生B細胞の起源を明らかにすることは、病因の解明のみならず、SLEの治療面からも、きわめて重要であると考えられる。SLEのモデルマウスであるNZB×NZWF1マウスを用いて、IgM及びIgGクラスの抗DNA抗体産生B細胞の表面形質を調べてみると、前者はCD5^+ sIgM^+であるのに対し、後者はCD5^- sIgM^-であることが明らかとなった。この事実からIgM及びIgG抗DNA抗体産生B細胞の異同が重要な問題である。今回、この点を解析する目的で、6ケ月令の1個体NZB×NZWF1マウスから多数の抗DNA抗体産生へハイブリド-マ株を樹立し、その免疫グロブリン遺伝子の塩基配列を解析した。その結果、IgM抗DNA抗体産生B細胞がIgG抗体産生B細胞に変化する事実が明らかとなり、IgM及びIgG抗DNA抗体産生B細胞は細胞表面形質が異なるにも関わらず同一のB細胞亜群、つまりCD5B細胞に属している可能性が示された。

外来抗原に対する免疫応答は、CD5B細胞以外の通常のB細胞が担っていることから、CD5B細胞の機能を阻止することによって生体の防御能を障害することなく自己抗体の産生をおさえることが可能となると考えられる。代表的自己免疫疾患の1つである全身性エリテマトーデス(SLE)においては、血中に高力価のIgG抗DNA抗体の産生が認められる。IgMクラスの抗DNA抗体は正常個体にも少量は認められるが、IgGクラスの抗体は正常個体には認められず、明らかに病的抗体である。従来より、我々はSLEのモデルマウスであるNZB X NZW F1マウスを用いて、抗DNA抗体のIgMからIgGへのクラス転換が、SLE病態発症ときわめてよく相関することを明らかにしている。今回は、抗DNA抗体がどのような過程を経て、クラス転換し、病的抗体へと変化していくのかを抗体遺伝子可変(V)領域を解析することにより、明らかにすることを目的とした。今回の研究結果から、我々は以下の点を明らかにした。(1)IgM抗DNA抗体はIgG抗DNA抗体と同様にすでにクローン性に選択されて増殖していること。(2)IgM抗DNA抗体を産生しているB細胞クローンが明らかに病的IgG抗DNA抗体産生B細胞に移行し得ること。(3)IgG抗DNA抗体の抗体遺伝子V領域には多数のsomatic mutationが認められるが、このmutationはすでに抗体がIgMクラスの時期から起こり始めていること。(4)このmutationにより抗体のDNAに対する結合能が増加すること。従来より、IgG抗DNA抗体にはそのV領域に多数のmutationが認められ、これらは抗原によりクローン性に選択され増殖しているが、IgM抗DNA抗体にはmutationが認められず、抗原による選択やクローン性増殖は抗体のIgMからIgGへのクラス転換後に生じる現象であると考えられていた。しかし、今回の我々の成績から、病的IgG抗DNA抗体はすでに抗原による選択されクローン性に増殖するIgM抗DNA抗体にそのV領域にmutationを生じることにより更に抗体のクラス転換を経て出現してくることが明かとなった。
G蛋白質と連関した神経伝達物質受容体の精製法の開発

神経伝達物質やホルモン受容体の構造と機能の解明は、生理機能の理解に必要なだけでなく、副作用のない薬物を開発するためにも重要である。最近では、受容体を精製することなくcDNAを単離し、アミノ酸配列を決定する方法が使えるようになった。しかし、受容体分子の立体構造、翻訳後の修飾、他成分との相互作用等の研究には受容体の精製が不可欠である。本研究はG蛋白質共役受容体の一般的精製法の開発を目標とした。(1)モデル系のムスカリン性アセチルコリン受容体を多量に可溶化、精製する系の開発、(2)ムスカリン受容体・G蛋白質複合体を安定に保つ条件の検討、(3)G蛋白質または抗G蛋白質抗体をリガントとするゲルの調製、(4)ゲルでの受容体の精製、の順序で検討した。従来の低分子リガントを用いた精製法の改良には限界があった。バキュロウイルス発現系をもちいて比較的大量にムスカリン受容体を発現させ、精製する系を導入した。また、新しいG蛋白質をクロ-ニングし、この系での発現を検討している。ムスカリン受容体とG蛋白質の相互作用は、従来の方法に加え、受容体のリン酸化を見る方法によっても検証された。ムスカリン受容体・G蛋白質複合体を可溶化する条件を検討し、低濃度ラウリルスクロ-スで比較的安定であることを見出した。G蛋白質α及びβγサブタイプに対する抗体またはG蛋白質βγサブタイプを結合させたゲルを作成した。αサブタイプの精製が可能な抗αゲルあるいはβγゲルなどを調製できたが、ムスカリン受容体あるいはムスカリン受容体・G蛋白質複合体の特異的な吸着・脱吸着の条件は見出されておらず、検討継続中である。(1)ブタ大脳よりムスカリン受容体を可溶化するdigitoninに代る界面活性剤として、脂肪酸庶糖エステルを検討した。C8、C10、C12、C16脂肪酸の庶糖エステルを種々濃度単独、あるいはsodium cholate又はdigitoninとの混合溶媒として用いた。約20%のムスカリン受容体が可溶化されたが、digitonin可溶化標品よりリガント結合活性が不安定であった。調べたなかでは、0.5%Myristoyl Sucroseと0.1%sodium cholateという組合せが最良の結果を与え、この溶媒で可溶化した標品をABT(Aminobenztropine)agaroseアフィニテイ-クロマトグラフィ-で精製することが可能であった。しかし現在までの結果では収率がdigitoninに及ばない。他のオリゴ糖エステルについても検討中である。(2)HPLC用ゲル(Tresyl Toyopearl,Asahipak GS620など)を用いてアフィニティ-クロマトグラフィ-系の効率の改善を試みたが、十分量ABTの結合したゲルが得られなかった。現状ではSepharoseにEpoxyを介して結合させる方法以上の系は見出せなかった。(3)ブタ大脳及び心房より精製したムスカリン受容体と精製したG蛋白質(Go、GiまたはGn)をリン脂質中に再構成させる系で、グアニンヌクレオチド依存性アゴニスト結合、アゴニスト依存性グアニンヌクレオチド結合、アゴニスト依存性リン酸化などを調べたが、いずれの結果もアゴニスト・受容体・G蛋白質複合体の生成という仮説を支持した。この複合体を安定な形で可溶化する方法の検討をこれから開始する。(4)G蛋白質αサブユニットとβγサブユニットに対するポリクロ-ナル抗体の調製を試みた。αサブタイプC末端のペプチドを用いた時良い抗体が得られだが、βγサブタイプに対する良い抗体はまだ得られていない。(5)受容体・G蛋白質

複合体の可溶化および精製の条件を検討するためかなり多量の受容体が必要になるので、ムスカリン受容体を多量に発現させる系の検討を開始した。(1)ムスカリン受容体を比較的多量に調製する為、ムスカリン受容体のcDNAをバキュロウイルスに組込み昆虫培養細胞(Sf9)で発現させる系を導入した。11の培養液あたり、m2とm3サブタイプで約10nmol、ml、m4で数nmolの受容体が得られるようになった。(2)バキュロウイルス・昆虫細胞系で発現させたm2サブタイプは、大脳あるいは心房標品と同等以上の効率で可溶化・精製され、リン脂質中の再構成系でG蛋白質と相互作用した。(3)リン脂質中で受容体とG蛋白質の複合体を生成させる最適な条件を検討した結果、ムスカリン受容体・G蛋白質複合体には2種類あることが推測された。Mgが存在するときの複合体はアゴニストにより高親和性で、アゴニスト存在時にGDPに低親和性を示した。(4)ムスカリン受容体とG蛋白質をリン脂質に再構成させた系から受容体・G蛋白質複合体を可溶化する条件を、種々の界面性剤を用いて検討した。その結果、庶糖脂肪酸エステルを含む低イオン強度溶液による可溶化標品でグアニンヌクレオチド依存性高親和性結合が観察された。複合体可溶化の収率を上げ、可溶化複合体を安定に保つ条件を検討している。(5)アゴニスト・受容体・G蛋白質複合体の存在を証明するため、受容体のレクチン(Wheat Germ Hemaggulutinin)への結合条件の検討を開始した。(6)G蛋白質βγサブユニットを比較的多量調製し、単クロ-ン抗体調製の試みを継続している。(7)G蛋白質βγサブユニットをアガロ-スゲルに架橋した標品の調製を試みている。そこにG蛋白質αサブユニット及び受容体を結合させる実験を行なう予定である。(1)庶糖エステル(Sucrose monolaurate,SM-1200)を用いて、ブタ心房膜標品またはヒトm2サブタイプを発現させた昆虫細胞からムスカリン受容体をリガント結合活性を維持して約50%可溶化できることが分った。(2)SM-1200での可溶化標品から、同一溶媒中でのアフィニティ-クロマトグラフィ-操作で、ムスカリン受容体を約1000倍精製できた。精製した受容体はG蛋白質と相互作用する活性を維持していた。(3)心房膜標品にG蛋白質を取込ませ、そこからムスカリン受容体・G蛋白質複合体を可溶化することを試みた。複合体の指標としてグアニンヌクレオチド感受性高親和性アゴニスト結合を用いた。調べた13種の界面活性剤の中では、SM-1200を用いたとき最も高いGTP感受性高親和性アゴニスト結合が可溶化上清に見い出された。(4)SM-1200で可溶化したムスカリン受容体と可溶化・精製したG蛋白質をSM-1200溶液中で混ぜ合わせると、GTP感受性高親和性アゴニスト結合が観察された。この結果は溶液中で受容体とG蛋白質の複合体が生成可能であることを示唆する。(5)G蛋白質βγサブユニットを結合させたアガロ-スゲルを作成した。このゲルには、Gi、Go及びGqのαサブユニットが結合した。しかし、このゲルにSM-1200で可容化した受容体を結合させる試みは成功していない。(6)G蛋白質αβγ3量体を結合させたゲルに、SM-1200で可溶化した受容体を結合させる試みを行なった。GTP感受性の結合が観察されたが、その収量は1%以下であった。
電子分光によるランタノイド錯体の価電子状態

(1)電子分光装置の整備改良老朽化の著しい油回転ポンプ、油拡散ポンプ、トラップ、真空バルブ等を新規に導入し、排気系の整備をおこなった。また、従来のイオン化室に代えて、高温まで加熱が可能で、しかも少量の試料で測定できるイオン化室を設計製作した。次年度予定している固体試料の測定に必要な試料冷却装置を試作した。(2)Ln(C_5H_5)_3の測定と解析上述の装置を用いて、解析の基礎となるM(C_2H_5)_2についてMAESとUPSの測定をおこなった。また、Ln(C_5H_5)_3(Ln=La,Ce,Pr,Nd,Sm,Er)では加熱温度、昇華速度等について最適条件を決定し、UPSの測定をおこなった。その結果、以下のことが明らかになった。(a)Co(C_5H_5)_2等遷移金属錯体と比較すると、Ln(C_5H_5)_3ではCpπ_2軌道のイオン化エネルギーが約1eV小さくなっていることがわかった。これは、Ln(C_5H_5)_3ではイオン結合性が高く、Cp環からの電子が出やすくなったことを示す。
MSX2拘束性ベクターによる膵癌遺伝子治療の検討

本研究により、EMTに際してMSX2と共に誘導されるカルシウム結合蛋白S100Pが同定され、その誘導はMSX2と同様Smad4依存性であった。MSX2、S100Pの誘導にはいずれも新規の蛋白合成が必要であり、Smad4の下流の標的遺伝子がこの過程に重要であると推測された。ホメオボックス遺伝子であるMSX2が膵癌において癌幹細胞の性質のひとつである抗癌剤耐性を誘導し、その過程にはトランスポーター遺伝子であるABCG2の誘導が関わっていることが明らかにされた。プロモーター解析によりMSX2はABCG2の発現を直接制御していることが判明した。これらの分子機構は膵癌の新規治療標的となりうるものであると考えられる。平成20年3月現在、膵癌細胞株Panc-1、BXPC3においてMSX2に対するsiRNAを用いたノックダウン実験及びMSX2発現ベクターを用いた過剰発現実験により、癌幹細胞に富む細胞分画で高発現が報告されているトランスポーター遺伝子、ABCG2の発現がmRNAレベルでMSX2により正に制御されていることが明らかとなった。この現象がこれらの膵癌細胞株において生物学的な悪性度にどのように影響しているかにつき、Cell sorting法を用いてABCG2高発現細胞を膵癌細胞株より分離し、解析を行うべく検討中である。MSX2によるABCG2の転写制御に関してはレポーターアッセイやChIP assayにて検討する予定である。また、以前に我々が報告したBMP4によるMSX2の誘導に際して、膵癌細胞株及び膵癌臨床検体において高発現が報告されているカルシウム結合蛋白質、S100Pが同時に強く誘導されていることが明らかとなり、BMP4によるEMTに際して重要であることが判明している。我々はMSX2もBMP4によるEMTの誘導に必須であることを報告してきたが、本分子とMSX2との機能上の協調に関しては未だ報告が見られておらず、検討する価値があるものと考えられる。その他、新規MSX2標的遺伝子の同定を引き続き進めている。以上の結果のうち、S100Pの誘導と機能に関しての報告を平成20年4月、AACR annual meeting 2008にて発表予定である。2009年3月現在、MSX2過剰発現細胞株におけるトランスポーター遺伝子ABCG2の発現が蛋白レベルで上昇していること、また対照的にMSX2ノックダウン細胞株でABCG2の発現が低下していることをFACSにて確認している。MSX2過剰発現細胞株ではゲムシタビン処理に対して抵抗性であることがMTTアッセイによって確認された。この結果は癌幹細胞が抗癌剤に対して抵抗性を示すことと一致する結果とがえられ、MSX2が癌幹細胞としての性質を規定する因子となりうることが示唆されている。ABCG2のプロモーター解析により、転写開始点より400-600bp上流に存在するMSX2 binding elementがABCG2の発現制御に重要であることが判明した。現在、この領域を標的とした新規治療法の開発を検討中である。以上の結果については2009年5月、日本消化器病学会総会にて報告予定である。また、MSX2とともに膵癌細胞においてBMP4により誘導されるカルシウム結合蛋白質S100PはBMP4によるEMTに寄与するが、その誘導過程にはMSX2と同様にSmad4依存性の経路が必須であることが明らかとなった。興味深いことに、MSX2およびS100Pの誘導はいずれもBMPシグナルによるde novoの蛋白合成が必要であることが判明した。この結果はSmad4依存性の経路により誘導される未知の因子がEMTに重要であることを示唆しており、今後の治療標的となることが期待される。以上のBMP4によるS100P誘導機構の詳細については以下の通り論文発表を行った(Cancer Sci. 2009 Jan ; 100(1) : 103-10.)。