hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
分光電気化学的手法によるソフト界面におけるイオン液体構成イオンの挙動の解明

親水性イオン液体-水混合系の混合比について電気化学挙動変化を追跡した。イオン液体に水を加えていくと、アニオン由来の酸化ピークが出現した。水分量と酸化ピーク電気量の関係は、水分濃度10 %付近で変化の割合が変り、この濃度付近で液体の構造が変化したと考えられる。同様に、水分量10 %においてバルク中における溶液状態が変化によると思われる溶液抵抗の大幅な変化も見られた。また、チオール処理電極ではチオール鎖を押しのける必要があり、その分溶液抵抗の大幅な増大が見られた。バルク中の水分子の結合において、水の増加とともに水素結合が強くなり、水分子の結合が強くなると考えられる。内容と目的:イオン液体は、常温で液体であるイオン性の物質で、水・油とは違う「第三の溶媒」として近年注目を集めているが、その物性は未知な部分も多い。一方で、最近の研究から、イオン液体は固体表面上では10層前後のイオンの多層膜を形成すると考えられている。これは、一般の水溶液や有機溶媒と異なり、正負のイオンのみから構成されるイオン液体に特有の構造である。その詳細な構造については未だ議論が分かれるところである。イオンのみによって構成されるイオン液体は、通常の電解質水溶液のように電極界面において電気二重層が形成しないと考えらえる。最近の研究から、イオン液体は固体表面上では10層前後のイオンの多層膜を形成すると考えられているが、詳細は明らかではない。電極表面においてイオン液体分子が形成する構造は、イオン液体中での電気化学反応のみならず、イオン液体自身の安定性に深くかかわってくる。また、通常の固体表面とは異なるイオン液体/ソフトマター界面においての挙動はほとんど明らかになっていない。そこで本研究では、SEIRAS(表面増強赤外分光法)を用いて修飾した金電極表面におけるイオン液体分子の挙動を明らかにすることを目的とした。金電極上でのイオン液体のSEIRASスペクトル変化において、1200cm-1付近にアニオンの硫酸基由来ピークが観察された。こららのピークは、アノード掃引により増大、カソード掃引により減少する。電極表面の電位に変化に呼応して電極からの距離が変化している様子がわかる。また、1320cmー1のピークはこれと逆の挙動を示すことから、カチオン由来と考えられる。チオール処理電極においても全く同様のスペクトル変化が観察されたが、ピーク高さは無処理金電極と比べて小さくなっており、チオール分子によってイオン液体分子の電極表面への接近が阻害され、結果として得られる信号が弱くなったと考えられる。研究分担者が異動したことに伴い研究が一時遅滞したものの、おおむね順調である。電気化学と分光化学に分けて研究を進めており、それぞれの結果をリンクさせてまとめ上げ、さらに進展させていける可能性が見えている。電極上でのイオン液体の電気化学挙動を理解するために、イオン液体中、金電極を用いたCV測定を進めた。水分濃度の低いときにはイオン液体分子自身の吸着と考えられる酸化還元ピークのみが観測された。水分量の増加に伴い、水分子によると考えられる酸化還元ピークが出現し、水分量とともに増大していった。疎水性チオール分子で金電極を修飾した電極を用いた際も同様の傾向が見られた。これらの電極についてインピーダンス測定により溶液抵抗を見積もると、水分量の増加によって大きく減少することおよび、チオール修飾により大きく増大することが明らかとなった。これは、水分子の混入によりイオン液体同士のネットワークが切れ、溶液分子の流動性が大きく増大するためと考えられる。また、疎水性チオールで表面を修飾することにより、水分子および親水性のイオン液体は電極表面に接近できず溶液抵抗の大幅な増大として現れたと考えられる。最終的に、模擬細胞膜上における挙動を調査することを目的とし、今年度はチオール修飾により表面性質を変化させた電極と、イオン液体中水分量の変化に伴う挙動変化を中心に調査した。また、IRにより水分混入によるイオン液体バルク中での水分子の挙動を明らかにした。イオン液体に適した参照極の選定に手間取り、計画よりも遅れている。当初、白金疑似参照極を用いていたが電位が安定せず、定量的な評価までは至らず定性的な評価にとどまっていた。最近、安定した参照極の作成に成功したため問題は解決した。ソフトマター場でのイオン液体分子のふるまいを理解するために必須な情報である、金電極表面における親水性イオン液体分子の詳細な挙動を明らかにすることとした。イオン液体分子の電気化学挙動を観察しやすくなるように、イオン液体-水混合系を採用し、混合比についての電気化学挙動の変化を追跡した。またその後、もっとも単純な表面有機物層であるチオール分子で修飾した電極上での調査も行った。イオン液体に水を加えていくと、フェロセンの酸化ー還元電位に対して1.0V付近において酸化ピークが出現する。この酸化反応は、イオン液体のアニオンが電極表面に吸着する反応に対応すると考えられる。また、表面赤外分光分析の結果からもアニオンが同様の電位で電極に接近する様子が観察されており、この結果を裏付けた。さらに、水分量と酸化ピーク電気量の関係は、モル比1で変化の割合が変わり、この濃度付近で吸着機構が変化したものと考えられる。溶液抵抗の測定からも同様の混合比で変化の割合が変わることが分かった。赤外分光の結果からは水分子由来のピークの観測から、混合溶液のバルク中においても水分子同士の水素結合ネットワークが維持されていることがわかった。

このピークは、水分濃度が増加することで低波数シフトしており、水素結合が強くなっていると考えられる。水分量とピーク波数の関係でも、混合比1付近で変化の割合が変わり、この濃度で水分子同士の結合が変化したと考えられる。これらの結果から、今回用いた1-ethyl-3-methylimidazolium hydrosulfateと水分子とは強く相互作用し、モル比1において相転移に相当する変化を起こし、電気化学挙動にも強く影響することが明らかになった。これらの情報を用いることで、ソフトマター上においても同様の電気化学手法による挙動解析が可能になった。親水性イオン液体-水混合系の混合比について電気化学挙動変化を追跡した。イオン液体に水を加えていくと、アニオン由来の酸化ピークが出現した。水分量と酸化ピーク電気量の関係は、水分濃度10 %付近で変化の割合が変り、この濃度付近で液体の構造が変化したと考えられる。同様に、水分量10 %においてバルク中における溶液状態が変化によると思われる溶液抵抗の大幅な変化も見られた。また、チオール処理電極ではチオール鎖を押しのける必要があり、その分溶液抵抗の大幅な増大が見られた。バルク中の水分子の結合において、水の増加とともに水素結合が強くなり、水分子の結合が強くなると考えられる。電気化学、分光化学でそれぞれ得た結果をつなぎあわせて理解していくことが必要な段階であり、別々に行ってきた実験条件の整理など研究分担者と密に連携しながら進めていく予定である。現在までに数種類のチオール種を用いた実験に成功しており、さらに種類を増やして体系的にまとめ上げていく。やや遅れてはいるものの、これまでに計画していた通り、金電極上およびチオール処理電極上でのイオン液体挙動についての知見を得ることができた。今年度は、これらの成果を論文にまとめるとともに、脂質膜上での挙動の調査およSEIRASを用いた表面での挙動分析を行う予定である。界面化学研究分担者の異動に伴い、進展に若干の遅滞が生じたため。一部研究が遅れていることと、学会発表が道内において行われたために予定よりも支出額が少なかった。また、高額なイオン液体試薬の購入日時のずれにより予算使用が次年度にずれこんでいる。研究分担者が改めて装置を立ち上げるための準備と、研究打ち合わせ・共同研究に旅費が大きくかかるようになったため、これに充てる予定である。高額なイオン液体試薬の購入と学会発表旅費等で使用する予定である。
ASEAN進出日系企業における公平な組織マネジメントに関する国際比較研究

本研究の目的は、ASEAN進出日系企業における日本人労働者と現地国労働者の公平感の相違を明らかにすることによって、アメリカを中心に展開されてきた組織的公正理論の実践への応用性を高めることである。タイ、インドネシア、ベトナム等のASEAN諸国には、規模の大小を問わず数多くの日系企業が約30年前から活発に進出している。しかし、それらの日系企業が抱える人的資源管理上の多くの課題は、ASEAN進出当初からほとんど変わっていない。そこで、本研究では、ASEAN進出日系企業へのインタビューを中心とした定性的調査および大量サンプルによる定量的調査を実施することによって、日本とASEAN諸国における労働者の公平感の相違を明らかにし、「公正な組織マネジメントの実践」という人的資源管理への応用を明確に意識した、より説明力の高い理論的枠組みの構築を目指す。本研究は、2名の研究者が3年間の計画で行う予定であり、今期はその第1期目にあたる。今期は、文献研究およびインタビュー調査による定性的データの収集、分析枠組みの設定、パイロット調査の実施による調査票の修正を中心に行った。在ASEAN日系企業の実際の人的資源管理制度、とりわけ評価・報酬制度に関する一次データ収集の必要性から、当該日系企業を数社訪問し、調査対象先となる数社の経営者および各社の従業員にもインタビューを行った。本研究を進めるにあたっては、調査企業の協力が不可欠であるが、インタビュー調査については、研究代表者、研究分担者それぞれのネットワークを利用して、在タイ日系企業、在ベトナム日系企業の数社の協力を得ることができた。申請時の研究計画に従って、おおむね予定どおりに進んでいる。本研究は、本研究は、2名の研究者が3年間の計画で行う予定であるが、第1期は、文献研究およびインタビュー調査による定性的データの収集、分析枠組みの設定、パイロット調査の実施による調査票の修正を中心に行う計画となっている。研究資料の収集および関連文献研究については、計画通り実施された。また、こうした二次データの収集だけでなく、実際の人的資源管理制度、とりわけ評価・報酬制度に関する一次データ収集の必要性から、調査対象先の経営者および従業員へのインタビューを実施する必要があるが、これもおおむね予定どおり実施することができた。その後、二次データとして収集した文献や資料およびインタビューによって収集した一次データをもとに、本研究の目的に合致したパイロット調査を実施するための調査票を作成し、配付、回収した。今後は、日本語版調査票、英語版調査票、および現地語版調査票について、表現を中心に、修正を行いたい。以上のことから、交付申請書に記載した当該研究の目的の達成度については、おおむね順調に進展していると評価できる。今期は、分析モデルの修正も含めた本調査(定量的調査)への準備、調査の実施、分析および追跡調査を中心に行う予定である。まずはパイロット調査で判明した問題点を修正したうえで、本調査で使用する調査票を作成する。その後、候補企業のなかから調査対象企業を決定し、調査票を配布・回収する。在ASEAN日系企業あるいは現地企業における調査票の配布・回収については、調査対象企業より研究代表者もしくは研究分担者が赴いて実施することを求められており、その際には申請した海外旅費を利用する予定である。調査票回収後は、統計的処理が可能となるように加工し、データ入力を行う。データ入力の補助者については申請した謝金を利用する。その後、市販の統計パッケージソフトを購入し、統計分析を行う。また分析結果に基づく考察の際に、在ASEAN日系企業を中心に追跡調査を行う必要があり、その際には申請した旅費を利用する予定である。一方、日本企業の調査対象であるが、世界45か国に進出している日系大企業や今後海外進出を検討している中小企業など、いくつかの候補先を訪問し、本研究調査の実施を打診中しているところである。これらの日本企業のいずれも関西圏に本社をおいていないことから、申請した国内旅費を利用して、打ち合わせおよび調整のために各企業を訪問したい。以上のような計画で研究を進めることとしており、今年度中に分析を終え、次年度に報告できるところまで進める予定である。

本研究を進めるにあたっては、調査企業の協力が不可欠であるが、インタビュー調査については、研究代表者、研究分担者それぞれのネットワークを利用して、在タイ日系企業、在ベトナム日系企業の数社の協力を得ることができた。申請時の研究計画に従って、おおむね予定どおりに進んでいる。本研究は、本研究は、2名の研究者が3年間の計画で行う予定であるが、第1期は、文献研究およびインタビュー調査による定性的データの収集、分析枠組みの設定、パイロット調査の実施による調査票の修正を中心に行う計画となっている。研究資料の収集および関連文献研究については、計画通り実施された。また、こうした二次データの収集だけでなく、実際の人的資源管理制度、とりわけ評価・報酬制度に関する一次データ収集の必要性から、調査対象先の経営者および従業員へのインタビューを実施する必要があるが、これもおおむね予定どおり実施することができた。その後、二次データとして収集した文献や資料およびインタビューによって収集した一次データをもとに、本研究の目的に合致したパイロット調査を実施するための調査票を作成し、配付、回収した。今後は、日本語版調査票、英語版調査票、および現地語版調査票について、表現を中心に、修正を行いたい。以上のことから、交付申請書に記載した当該研究の目的の達成度については、おおむね順調に進展していると評価できる。今期は、分析モデルの修正も含めた本調査(定量的調査)への準備、調査の実施、分析および追跡調査を中心に行う予定である。まずはパイロット調査で判明した問題点を修正したうえで、本調査で使用する調査票を作成する。その後、候補企業のなかから調査対象企業を決定し、調査票を配布・回収する。在ASEAN日系企業あるいは現地企業における調査票の配布・回収については、調査対象企業より研究代表者もしくは研究分担者が赴いて実施することを求められており、その際には申請した海外旅費を利用する予定である。調査票回収後は、統計的処理が可能となるように加工し、データ入力を行う。データ入力の補助者については申請した謝金を利用する。その後、市販の統計パッケージソフトを購入し、統計分析を行う。また分析結果に基づく考察の際に、在ASEAN日系企業を中心に追跡調査を行う必要があり、その際には申請した旅費を利用する予定である。一方、日本企業の調査対象であるが、世界45か国に進出している日系大企業や今後海外進出を検討している中小企業など、いくつかの候補先を訪問し、本研究調査の実施を打診中しているところである。これらの日本企業のいずれも関西圏に本社をおいていないことから、申請した国内旅費を利用して、打ち合わせおよび調整のために各企業を訪問したい。以上のような計画で研究を進めることとしており、今年度中に分析を終え、次年度に報告できるところまで進める予定である。次年度使用額が発生した理由は、今年度購入予定であった物品が当初の予定より安価で購入できたためであり、ほぼ当初計画通りに執行したものと認識している。次年度使用額については、物品購入に充てる。
認知機能に焦点をあてたコーピングの柔軟性を獲得するための介入プログラムの開発

本年度は,昨年度に引き続き,介入研究の実施やデータ分析,追加のデータ収集を行った。昨年度は,コーピングの柔軟性におけるメタ認知や自己注目の役割について検討し,その結果を基にして,メタ認知を高めることにより,コーピングの柔軟性を獲得するための介入プログラムを作成し,その効果の検討を行うための研究を行ったが,データ集計やデータ分析については,昨年度に行うことができなかったため,今年度はそのデータ集計やデータ解析から行うこととなった。介入の結果,介入群はプリテスト(介入前)の注意の定位機能と,ポストテスト(介入後)の注意の定位機能は,ポストテストの適応的コーピング(コーピングの柔軟性)と有意な正の関連があり,ポストテストの適応的コーピングとフォローアップテスト(介入後3週間)の抑うつとの間に有意な負の関連があることが明らかになった。統制群においては,プリテストの注意の定位機能とポストテストの注意の定位機能との間に有意な正の相関があったものの,ポストテストのコーピングの柔軟性やフォローアップテストの抑うつとの間に有意な関連は生じない,という結果が明らかになった。これらのデータ,結果に加え,注意機能とコーピングの柔軟性,メタ認知との関連についてさらに検討するため,追加のデータを収集した。その結果,注意機能の中でも,特に実行注意はメタ認知と関連することが明らかになった。この結果から,コーピングの柔軟性と注意機能は,メタ認知機能を介して関連している可能性が示唆された。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は,コーピングの柔軟性と認知機能の関連を明らかにするために,調査研究を実施した。調査研究では,質問紙を用いて,コーピングの柔軟性とメタ認知および自己注目の関連について検討を行った。その結果,メタ認知を構成するいくつかの要素がコーピングの柔軟性に正の影響を及ぼし,抑うつを低減させることが明らかになったが,自己注目からコーピングの柔軟性への影響は認められなかった。これらの結果は,国内誌に掲載されたほか,学会にて報告された。当初の計画通り,コーピングの柔軟性と認知機能の役割について明らかにし,論文としてまとめることができた他,学会にて報告を行うことができたため。既にコーピングの柔軟性を高める介入研究の実施に取り掛かっており,今後はこれらのデータ分析等を行い,成果としてまとめ,報告を行う予定である。
プロテオミクスと組織化学を駆使したCADASILの原因物質の同定

CADASILの病態生理の手がかりを解明するためにプロテオミクス解析および組織化学解析を行った。脳動脈の中膜顆粒変性をレーアーマイクロダイセクションで採取して、LC-MS/ MSを用いて、その構成蛋白を解析した結果、病態生理に関係する蛋白質を検出した。また、Granular Osmiophilic Material(GOM)の化学的性質を組織化学的手法で解析した結果、GOMに酵素活性を見出した。両解析手法を組み合わせることでCADASILの病態生理に迫る結果が得られた。本研究において、CADASIL特異的病理所見Granular Osmiophilic Material (GOM)の組織化学染色法の開発に成功した。CADASIL特異的病理所見であるGOMはアミン酸化酵素活性を有すると仮説を立て、GOMの組織化学染色法を開発した。アミン酸化酵素は、アミンを基質として、過酸化水素を生成する酵素であるが、本染色では、セロトニンの類似物質で安定な塩酸トリプタミンを基質して、西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)により生成した過酸化水素を反応させ、DABを反応させて染色した。本方法では、細胞質とGOMの両者に染色性があり、非特異的な染色も見られたため、本染色時にアジ化ナトリウムを加えたところ、よりGOM選択的に染色性が見られるようになった。本染色は、脳血管および皮膚血管の両者にみられ、Notch3の蓄積の分布に一致していた。本染色行程でHRPを抜いて染色したところ、GOMの染色性は消失した。以上のことから、本染色性はHRPを必要とし、過酸化水素に関係した反応によるものと推測された。GOMのアミン酸化酵素活性として、モノアミン酸化酵素(MAO)およびsemicarbazide sensitive oxidase (SSAO)抗体を用いて、免疫染色したところ、脳血管にMAOの染色性はなく、SSAOの染色性を認めた。しかし、SSAOの染色性は皮膚の血管には見られなかった。以上より、SSAOは二次的に共存する蛋白と考えられた。1)プロテオミクス解析による網羅的解析CADASIL剖検脳組織の切片を作成して、レーザーマイクロダイセクションを行い、CADASILの病態に係る候補蛋白質の検索を行った。CADASIL Notch3 R133C変異62歳男性およびR449C変異62歳男性の脳組織切片を作成して、径200-500 μmの髄膜動脈を採取して、LC-MS/ MSで中膜顆粒状変性部位の共存蛋白を検索した。血管増殖に関係する蛋白質が病態に関連する蛋白質として検出された。本蛋白質は比較対照とした剖検脳組織では検出されず、CADASIL症例のみで検出されたため、CADASILの病態に関係する候補蛋白質と考えられた。本候補蛋白質の抗体を用いた病理解析では、脳血管の中膜の顆粒所変性部位への染色性は乏しく、肥厚した新生内膜に強く染色された。したがって、本候補蛋白質は血管変性課程の初期において、関与する蛋白質であると推測された。2)組織化学染色からのターゲット解析CADASIL特異的な病理所見であるGranular Osmiophilic Material (GOM)を組織化学染色で検出することを試み、GOMを光学顕微鏡で観察する方法を開発した。その組織化学染色法から得られたGOMの化学的性質に基づき、GOMの構成成分を探索した。候補物質の抗体により、免疫組織学的検討を行ったところ、CADASIL剖検脳組織の髄膜動脈の中膜顆粒状変性部位に候補物質の共存が確認された。従って、組織化学染色から得られた候補物質はCADASILの病態を反映している可能性があり、その候補物質とCADASILのNotch3蛋白の変異との関係について、今後検討する必要があると考えられた。神経内科CADASILに特異的病理所見であるGOMの組織化学染色法を開発・改良し、より選択的な染色法とすることに成功した。また、蛋白解析において、CADASILの病態を反映する蛋白質を同定つつあり、確認の段階に入っている。過去のプロテオミクス解析により同定されたTIMP3と同等もしくは、それ以上にCADASILの病態生理を反映していると考えられた。しかし、質量分析装置を用いたNotch3変異部位の修飾物質の同定に関しては、Notch3の選択的抽出方法が確立しておらず、質量分析装置を用いた解析には至っていない。以上より、進捗状況はやや遅れているものとした。Notch3細胞外ドメイン抗体を用いて、Notch3蛋白質を組織から抽出し、質量分析装置を用いて、Notch3の修飾部位の質量解析を行う。Notch3の変異部位の修飾物質とGOMの生化学的性質との関連性を検証する。変異型Notch3をKnock-inしたモデル動物を用いて、生体内でのGOM生化学的活性をリアルタイムで観察する実験系を確立する。

実験計画のうち、モデル動物を用いた生体内での実験系を確立させるために必要な費用の割合が多く、モデル動物を用いた生体内での実験系の確立は次年度に予定しており、次年度に使用する予算配分が多いため。CADASILのNotch変異蛋白をknock-inしたモデル動物を用いて、生体内でGOMの生化学的活性をリアルタイムに評価する実験系を確立する。
長鎖非コードRNAは如何に転写因子を制御するか：実生時ストレス応答機構をモデルに

非コードRNAであるNPC60は高塩濃度ストレス、高浸透圧や乾燥などに応答して顕著に発現レベルが上昇することがわかった。さらに、これらの環境ストレスを含む非生物ストレス応答で中心的な役割を担う植物ホルモンであるアブシジン酸に対して応答することがわかった。特に、NPC60は実生時のアブシジン酸に対する応答で機能していることを示唆することができた。実生時は種子中の栄養分に依存した従属栄養から、光合成による独立栄養に変化する成長段階である。この栄養システムの転換時に実生が環境ストレスにさらされるとアブシジン酸依存的に成長が抑制され、乾燥種子様のストレス耐性機構を利用してストレス耐性を獲得する。この実生時の乾燥ストレス耐性メカニズムにNPC60が関与していることを示すことができた。実生時の水ストレス耐性メカニズムは進化的に保存されているため、NPC60の種間保存性とその機能は今後の課題である。アブシジン酸は環境ストレスのみでなく生物ストレスにおいても重要な役割を担っていることがわかってきた。本研究では、まず経時的に組織レベルでの応答を検知して定量化できる実験系の構築を行った。これまで、非侵襲的な方法で蛍光シグナルを定量する方法は、動かない検体や細胞レベルに限られていた。本研究では、物理的に固定するストレスを軽減した形で解析できるシステムを見出した。これには、植物の輪郭を自家蛍光で認識することを利用し、これに目的とする蛍光シグナルを重ね合わせることで実現した。物理的な固定によるストレスに軽減した計測法と、定量化・経時解析を組み合わせることで、高感度に生物ストレス応答を検知することができる。さらに、輪郭を自動で認識することによってヒューマンエラーを削減することもできる。今後このシステムを利用してNPC60のノックアウトや過剰発現系統を利用して解析を進める予定である。本研究では、塩・乾燥等の環境ストレス応答において新規なストレス応答メカニズムを見出す事を目的とし、非コードRNAに着目した。非コードRNAには、大きく分けて低分子RNAと長鎖非コードRNAが存在する。長鎖非コードRNAには、タンパク質をコードするmRNAに対してアンチセンス型、センス型がある。さらに、タンパク質をコードする従来の遺伝子と重複しない長鎖非コードRNAが存在する。本課題では、環境ストレス誘導型長鎖非コードRNAに着目し、その発現パターンと下流候補遺伝子の発現パターンの解析を行った。機能解析においては、実生時におけるストレス依存性生長抑制機構をモデルとして用いた。この時期は、植物が従属栄養から独立栄養へと移行する時期であり、植物のライフサイクルの中で最も環境ストレスに弱い時期の一つである。実生がこの時期に環境ストレスに遭遇すると生長を抑制し、ストレス耐性を獲得する。この過程で長鎖非コードRNAが機能しているのかについても解析を行った。新しい環境での研究室の立ち上げと実験のセットアップに手間取った。今年度は、発芽試験をより細かなタイムスケールで追加・追試実験を行い、個体レベルでの表現型および遺伝子発現をより詳細に解析することができた。乾燥種子では、親水性タンパク質の高蓄積などのメカニズムによって、水分含量が9割程度低下した状況下でも胚珠が生存し、水分と光条件が適した状態では発芽できる状態を保っている。つまりこれは、高度な耐乾燥ストレス機構である。発芽直後の特異的なタイムウィンドウの範囲で植物が高塩・乾燥など、細胞が高浸透圧として感受する環境ストレスに遭遇すると、この種子形成時のストレス耐性機構を介して環境ストレスに応答し、ストレス耐性に必要な生理的プロセスが実行される。本研究における長鎖非コードRNAは種子形成時と発芽時プロセスにおいて重要な役割を担っており、その分子的なメカニズムの一部に迫ることができた。さらに、その過程で開発した生きた植物細胞におけるRNA分子の細胞内局在性について、この技術の汎用性を高めるためにベクターへ改良を含めるなど、一般的な技術にするための追加実験を行った。具体的には、外来DNAにより形質転換された細胞を抗生物質耐性ではなく、ビジュアルマーカーによる判別するベクターの改良、さらにそれをハイスループットで行えるメソッドへの移行である。この改良は、時間を要するが同じ代では形質のバラツキが少ない種子を介した継代に比べて、一過性発現系における解析では必須だと考えられた。さらに、一過的発現系では結果までに要する時間が短いこと、さらに外来遺伝子の発現レベルが種子による継代に比べて高いことから、ハイスループットに適していると考えられる。つまり、クローニングとその後の解析両方においてハイスループットが可能な技術改変を行うことができた。発芽時及び種子形成時における目的遺伝子が介するストレス応答における分子メカニズムにとおいて、当初予定していた実験を行い、その結果が得られた。さらに、細胞局在性解析におけるツールボックスの開発においても、材料と観察両方においてハイスループットが可能なツールを開発し、汎用性のあるものにした。干害・高塩濃度などの環境ストレス状況下においては、植物は外界ストレスを感知してストレス応答シグナル伝達経路を活性化し、下流のストレス応答・耐性遺伝子の発現が制御される。結果として植物は、形態変化・発生時期の変動などを伴う発生プログラムを柔軟に制御することによりストレス耐性を獲得して生存している。発芽は、乾燥種子から独立栄養個体へと変化する発生のプロセスである。これは同時に、種子における乾燥耐性から、栄養成長個体へと移行するプロセスである。このため、発芽時は、植物が最も環境ストレスに弱い発生段階の一つである。発芽期に環境ストレスに遭遇すると、実生は一旦発芽プログラムを停止する。

この状態で乾燥種子に備わっている乾燥耐性機構を再活性化し、高親水性タンパク質などの乾燥耐性因子を高発現し、乾燥ストレスに対して耐性を獲得する。一方で近年、主に哺乳類の研究から、長鎖非コードRNAがゲノムでの物理的な位置に非特異的に作用し、「グローバルに」遺伝子発現を制御していることが明らかになった。本研究では、高塩濃度ストレスに応答して発現誘導される長鎖非コードRNA、NPC60に着目した。このRNAが高浸透圧ストレスや、環境ストレス下で重要な役割を担う植物ホルモンであるアブシジン酸にも応答して発現が活性化することを見出した。細胞内局在性を解析する上で、細胞内で生きたままRNAの局在性を解析する手法は、細胞質におけるRNAに限定されていた。このため本研究では、核内に局在するRNAを生きた細胞内で可視化する技術を新たに開発した。この技術では、タバコの一過性発現系を利用することが可能であるため、ハイスループットな解析にも利用できる手法を開発した。この手法を用いて本RNAが核に局在することを示した。得られた結果を論文として発表した。哺乳類のゲノム解析によると、ゲノム中でタンパク質をコードしている部分はわずか1.5%にしか過ぎないのに関わらず、ゲノム上の70%が転写されている。この事実は転写産物の大部分が長鎖非コードRNAによって占められていることを示している。実際、動物細胞を用いた網羅的解析からは、大部分の長鎖非コードはトランスに作用して転写を制御していることが示されている。しかし、殆どの長鎖非コードに関しては個体レベルで明らかな表現型がないため、作用メカニズムに迫る研究が難しい状況にあるというのが現状である。本研究では、発芽時の環境ストレス応答に関してNPC60 RNAがどのように機能しているのか、環境ストレス応答において中心的な役割を担うアブシジン酸や、高塩濃度条件下などにおける詳細な表現型解析を行なっている。表現型解析には、シロイヌナズナの遺伝子破壊形質転換系統と恒常的過剰発現系統を用いた。この解析から、発芽時の環境ストレス応答メカニズムにおいて、個体レベルで表現型を示すことができた。環境ストレス応答で機能する転写因子に関しても、表現型と合致する発現パターンを示していた。しかし、直接的な相互作用は検知できなかった。組織特異的な発現パターンに関しては、本非コード長鎖RNAに関するプロモーター制御下で発現させたGUS酵素の活性を解析した。その結果、発芽直後に根で高発現していることがわかった。非コードRNAであるNPC60は高塩濃度ストレス、高浸透圧や乾燥などに応答して顕著に発現レベルが上昇することがわかった。さらに、これらの環境ストレスを含む非生物ストレス応答で中心的な役割を担う植物ホルモンであるアブシジン酸に対して応答することがわかった。
韻律制御可能な電気式人工喉頭の訓練プログラム開発研究

韻律制御可能な電気式人工喉頭(Pitch controllable electrolarynx ; PC-EL)の訓練プログラム開発とPC-ELによる発話(PC-EL音声)の評価を行った.訓練は,平板型4モーラ単語から始め,アクセント句,イントネーション句,文と進め,ピッチ操作に慣れた段階で,抑揚型アクセントの語を訓練した.2週間の訓練で,7名中5名が自発話で訓練目標を達成した.訓練後のPC-EL音声はピッチ固定型電気喉頭(PF-EL)の音声と比較して,より肉声に近いと評価された.韻律制御可能な電気式人工喉頭(Pitch controllable electrolarynx ; PC-EL)の訓練プログラム開発とPC-ELによる発話(PC-EL音声)の評価を行った.訓練は,平板型4モーラ単語から始め,アクセント句,イントネーション句,文と進め,ピッチ操作に慣れた段階で,抑揚型アクセントの語を訓練した.2週間の訓練で,7名中5名が自発話で訓練目標を達成した.訓練後のPC-EL音声はピッチ固定型電気喉頭(PF-EL)の音声と比較して,より肉声に近いと評価された.電気式人工喉頭(以下、電気喉頭)は、喉頭摘出者(以下喉摘者)に広く用いられているが多くの機種は音声の基本周波数が一定のため、初めて電気喉頭音声を聞く者に不自然な印象を与えることがある。本研究の目的は、親指一本でピッチを制御できる電気喉頭を用いて、喉摘者がその機能を十分に使いこなすための科学的根拠に基づいた訓練プログラムを開発することである。平成20年度は菊地を中心にピッチ調整操作の訓練を行うためのコンピュータシステムを開発した。提示された音声を聞き電気喉頭でピッチ変化を模倣する健常者を対象とした実験では、聴覚のみでは模倣が困難だった被験者もピッチパターンを視覚的に提示することで正しく模倣できた。今後は喉頭摘出者を対象として学習効果を調べる予定である。また、小池を中心に語音を用いた訓練プログラムの試案を作成し、喉摘者に実施した。(1)電気喉頭を頸部に圧抵せずにモデルの電気喉頭音声のピッチを模倣、(2)電気喉頭を頸部に圧抵しアクセント型をコントロールした単語対を復唱、音読、(3)対立するアクセントの語を含む短文の音読の順に行った。電気喉頭の基本周波数の変化幅は約20Hzにセットした。会話への般化が認められた例もあったことから、訓練の手順は有効と思われた。今後は、さらに被験者を増やす予定である。このプログラムが実用化されることにより、電気喉頭を使用する多くの喉摘者が望んでいる、より自然な発話が可能になると期待される。本研究の目的は、親指一本でピッチを制御できる電気式人工喉頭(以下PC-EL)の効果的な訓練プログラムを開発することである。全く新しいピッチ制御機能を備えたPC-ELの訓練プログラムは、より自然な発話を望む喉頭摘出者(以下、喉摘者)が大いに期待するものである。H21年度は訓練目標を会話におけるピッチ制御として訓練プログラムを作成した。H20年度に開発したピッチ調整操作の訓練を行うためのコンピュータシステムを用いて喉頭摘出者(以下、喉摘者)を対象に操作実験を実施したところ、高齢の喉摘者は若年健常者と異なり、学習が必ずしも容易でなかった。そこで発話訓練では、単語におけるピッチ制御の正確さに拘りすぎずに、文のレベルで全体的なピッチパタンを作ることをめざした。4モーラ平板型の単語、その語を用いたアクセント句、アクセント句の組み合わせの順に進め、早期に文の訓練を開始した。短文の訓練がある程度進んだ段階で平行して、複合名詞や平板型以外のアクセント型の単語を訓練した。2週間の集中訓練後に録音した発話サンプルを音響分析したところ、自発話(質問に答える形式の発話課題)において、7名中5名は文末で下降ピッチパタンを作ることができ、うち3名は強調するアクセント句で正確にピッチを制御していた。喉摘者の多くが短期間の集中訓練後に会話である程度のピッチ制御を行ったことから、早期に文課題を導入する方法は適切と思われた。聴取実験により、高親密度語の了解度がピッチ固定型ELよりもPC-ELを用いて発話した語の方が高く、また、発話の自然さ、聞きやすさは一対比較法により、ピッチ固定よりもPC-ELの方が好まれることが明らかになった。最終年度に向けさらに詳細な検討を加え、訓練プログラムを完成させる予定である。ピッチ制御可能な電気式人工喉頭(PC-EL)によるピッチ変化が妥当であるかどうかを客観的に見ることや、練習を効率的に行うために、パーソナルコンピュータを使ったピッチ制御可能な電気喉頭のための練習プログラム(ドリル)を作成した。また、PC-ELの実用性を推測する資料を得るために、PC-EL音声とピッチ固定型電気喉頭(PF-EL)の音声とを聴覚心理学的に比較した.発話者は昨年度までに開発した訓練プログラムに基づいて2週間練習した男性喉頭摘出者1名。電気喉頭はユアトーンII、及び、ピッチ操作ユニット(試作品)。音声資料は状況絵説明、模擬対話文音読1,2、感情表現文音読1,2の3課題5題。PF-ELとPC-ELで発話した音声を録音し、健常学生20名に提示した。

各課題において、肉声の発話への近さの程度、楽に聞ける程度(状況絵)、楽に会話できそうな程度(対話文)、感情表現の程度(感情文)をVASで評価させ、次に、形容詞10対について6段階評価を行わせ、統計的分析を行った。PC-EL音声のピッチレンジは144282centと狭く、東京方言のピッチ制御を実現できたアクセント句の割合は0.290.67だった。VAS1項目目「肉声の発話への近さ」については,対応のあるt検定で,対話文2を除く全ての発話課題においてPC-EL音声の評価がPF-ELよりも有意に高かった.形容詞10対を用いた6段階評の全ての発話課題を合計した平均の比較では,PC-ELの評価が有意に高かった.発話課題別では,10対全ての平均の比較において,対話文1,感情表現文1,2で有意差を認め、多くの発話課題で有意差および有意傾向を認めた。今回のPC-EL音声は東京方言の韻律を実現していないピッチ曲線を一部に含むもののPF-ELよりも有意に高い評価が得られ、訓練法やPC-ELの実用性を裏付ける一つの資料と考えられた。
子育て支援に向けた産後ケア施設の開設要件の研究～早期子育て支援の実現に向けて～

産後早期退院の条件を探るため、「3日目退院の条件」を設定し、複数条件の組合せ(退院後の支援、児の体重、血清ビリルビン値、育児技術到達度)について、順序型回答法を用いたコンジョイント分析を行った。助産師、産科医師、小児科医師は「退院後の支援」、新生児科医師は「育児技術到達度」が重要としていた。退院後の支援条件から、母子の健やかな成長を保証する医療的モデルと、母子一体の関係を支援する生活モデルの支援の重要性を示唆した。日本と同様に少子化が進行している韓国で行われている産後ケア施設事業の現状とその課題を明らかにし、本邦において、出産し退院した後も母子が心ゆくまで安心して滞在し、育児支援を受けることができる産後ケア施設導入に向けての示唆を得る目的で韓国のテジョンとソウルにある産後ケア施設(4施設)を視察し、インタビュー調査を行った。対象者は4施設の施設長および施設利用者の褥婦である。倫理的配慮として、研究参加は自由であること、中断可能であり、研究以外に使用しないことを伝えた。インタビュー結果:4施設共に2006年の「母子保健法、改正法律」を受けて入材と施設設備を整え届出を行った施設で、立地条件の良い雑居ビルの1フロア、もしくは2フロアで開設していた。施設で提供されているケアサービスは、褥婦の身体回復へのケアや家族計画、母乳哺育、育児に関する援助などであったが経営者の職種(助産師、看護師、医療職者以外)の違いによって差がみられた。また、産後ケア施設は業種としてサービス業に分類されているため運営やサービスの質を規定する法律がなく、施設内での産科医や小児科医の診療は医療法の違反となることや、特に新生児に感染が発症した場合の拡大の危険性等の課題を抱えていた。昨年世田谷に開設した本邦初の産後ケア施設もホテル業と見なされたことから、本邦における産後ケア施設導入については医療法に基づく施設とする課題や、褥婦や新生児に対するサービスの質の保証と安全性の担保についての検討の必要性が示唆された。わが国の産後入院期間は、概ね57日と諸外国と比較して長いのが特徴であり、多くの施設において入院日数は一律に決められ、母子に異常がない限り、決められた日に退院している。しかし、現在、母子の健康状態が良好であれば、希望による早期退院を許可するケースも増加している。その背景には、1985年には5884施設あった分娩施設が2005年には2938施設にまで減少し、お産難民が生じていること、また産科救急の受け入れ困難は社会的にも注目され、周産期の医療体制の整備が緊急課題の一つに挙がっていることなどが考えられる。今後、分娩できる場所を確保する環境整備において、入院期間の見直しや短縮が課題になってくることが予測され、早期退院後のケアをいかにしていくかが課題となる。そこで、今回は、医療者側の早期退院を許可する上での条件について、周産期医療に携わる医療者に早期退院の選好のコンジョイント分析を行った。コンジョイント分析では「退院後の支援」:助産師のよる訪問看護、外来受診、産後ケア施設入所、「児の体重」:減少、横ばい、増加、「黄疸の値」:Bil値15mg/dl未満、Bi値18mg/dl未満、「育児技術の到達度」:30%、50%、70%の4つの属性と水準とした。属性と水準の組み合わせから直行配列表により想定した「退院許可の条件」11種を調査に用いた。結果、3日目退院の条件で最も重要視するのは「退院後の支援」、ついで、「育児技術の到達度」「児の体重」「黄疸の値」であった。また、「退院後の支援」では「産後ケア施設入所」が最も好ましいとされていた。医療従事者の産後早期退院については、「退院後の支援」が十分に整っている施設への入所、つまり、専門家による産後支援体制があれば、産褥3日目の退院が可能であることが示唆された。このことから、産後ケア施設の本邦への導入の可能性を見出すことができた。産後入院期間は短縮化傾向にあり、筆者が行った調査でも経腟分娩は56日であり、約10%の施設は4日以内と設定していた。入院期間の短縮で、母親や家族に対する支援を提供する機会が少なくなることは否めない。そこで、産後4か月未満の乳児をもつ母親が望む産後支援形態についてインターネット調査を行い、産後支援の在り方を検討した。対象は生後4ヶ月未満の乳児を持つ母親であり、順序型の回答法を採用で用いた属性と水準は、退院後支援形態:産後ケア施設、訪問看護、産科外来、期間・頻度・時期:多い、少ない、費用:高め、低め、支援内容:産後の生活、母体の休養、新生児のケアである。4つの属性と水準の組み合わせは54通りあるが、直行配列表により9種を用いた。

各属性の相対重要度を知るためにコンジョイント分析をSPSS Statistics18.0を用い、属性毎の部分効用は最小二乗法により推定した。結果、516名(初産婦・経産婦共に258名)より回答があり、退院後支援を受けた人は494人(95.7%)で、ほとんどは実母と夫からで、期間は4週間以上が約半数であった。支援で最も重要とした属性は「退院後支援形態」であり、「主な支援内容」「期間・頻度・時期」「費用」の順であった。水準は、「退院後支援形態」では"産科外来受診"、次いで"訪問看護""産後ケア施設"。同様に「主な支援内容」では"生活・育児・授乳指導"、「期間・頻度・時期」では"少ない"、「費用」では"安い"であった。初経産婦別にみると、経産婦は「主な支援内容」では外来受診では望めない"母体の休養・養生"を好んでいた。母親達が望む退院後の支援の組合せは、『産科外来を2週間以内に1回受診し、費用は5,000円から10,000円、産後の生活・授乳・育児指導を受ける』であった。
機械的ストレスが歯周組織細胞におけるTGF-β発現に与える影響について

細胞調節因子として注目されるTGF-βは、歯根膜細胞において他の結合組織系の線維芽細胞に比べてその遺伝子発現量が高いこと、また、TGF-β1により歯根膜細胞の産生するtype I collagen,fibronectin,osteonectinなどの細胞外基質蛋白質の合成が促進されるとの報告があり、TGF-βの歯周組織リモデリングへの関与が示唆されている。今回我々は、6週齢ラットより得られた歯槽骨骨芽細胞と、14歳ヒト歯根膜組織より得られた歯根膜細胞にコンピューター制御のフレクサ-セルストレインユニットを用いて18%の周期的伸展力を加え、その培養上清中に産生されるTGF-β1の活性の測定を行なった。その結果伸展力を加えた場合、骨芽細胞および歯根膜細胞の両方において産生量の増大が認められた(p<0.05,p<0.001)。しかしその産生量の増大は、骨芽細胞では約1.2倍であったのに対し歯根膜細胞では約2倍の産生量が認められ、より反応性の高いことが示唆された。一方、我々は歯根膜細胞を継代培養していくと老化した細胞の性質を持つようになることを報告しており(Goseki et al.,Mech aging Dev,1996)、in vitroで老化させたヒト歯根膜細胞と2年齢のラットから得られた歯槽骨骨芽細胞に同様な伸展力を加え、TGF-β1の産生量の測定を行なった。その結果、aging細胞の方が伸展力を加えた群、加えていない群のどちらにおいてもyoung細胞より有意に高いTGF-β1産生量を示したが、aging細胞では伸展力を加えた群と加えていない群との間でTGF-β1の産生量に有意の差は認められず、伸展力に対する反応性の低いことが示唆された。今後、各週齢のラットより歯槽骨骨芽細胞と歯根膜細胞とを得、周期的伸展力に対する応答性の違いのみならず、agingによる応答性の差についても検討を加えていく予定である。
がん悪性化促進に関わる免疫応答の解明と治療応用

がん悪性化進展に関わるIL-17産生細胞としてVδ1 T細胞を同定した。Vδ1 T細胞はTNFRSFに属する分子の発現に特徴を示し、Vδ1 T細胞に選択的に発現する分子としてCD30を同定した。CD30のリガンドに対するモノクローナル抗体投与によって、腫瘍局所でのIL-17産生の抑制、さらにはがん悪性化進展の阻害が可能である事を示した。以上の結果から、Vδ1 T細胞の機能をターゲットとした炎症制御が、がん進展をターゲットとした新規治療となり得ると考えられる。【背景】がん病態においては慢性的な炎症を惹起することで免疫応答ががん悪性化に寄与している側面も持ち合わせる。本研究では新たに同定したがん悪性化に重要な炎症性免疫応答の起点となる細胞、ならびに炎症の維持・収束に関わる炎症性メディエーターの制御による新たながん治療への応用について検討した結果を報告する。【方法】QR32細胞は正常同系マウスであるB6マウスでは皮下移植の後に自然退縮するが炎症により悪性化転換する。これまでにKOマウスを用いた解析結果から、QR32の悪性化転換にIL-17を介した免疫応答が非常に重要である事を報告した。がん悪性化進展を促進するIL-17の産生細胞ならびに炎症性免疫応答の実態を明らかにするため、腫瘍局所で産生されるサイトカイン/ケモカインならびに炎症細胞浸潤におけるIL-17の役割、さらにIL-17の産生メカニズムについて検証した。【結果】IL-17産生細胞としてVd1 T細胞を同定した。Vd1 T細胞が産生するIL-17は炎症性サイトカインの産生増幅ならびに好中球浸潤を促進する事でがん炎症性微小環境の形成において重要な起点であり、そのIL-17産生にはTNFRSFに属する分子が重要であり、モノクローナル抗体治療により炎症によるがん悪性化進展が阻害出来ることを明らかとした。IL-17は腫瘍を含めた数多くの炎症病態の惹起において重要なサイトカインである事が報告されているが、がん病態における役割については明確でない。このようなIL-17に関する見解と同様にIL-17産生γδT細胞と細胞の腫瘍免疫応答における役割についても抗腫瘍エフェクターとしての側面と、腫瘍悪性化因子としての側面の2面性が指摘されている。これまでに腫瘍局所での炎症を惹起することによりin vivoにおいて自然退縮型がん細胞が致死性増殖能や転移能で表現される悪性化形質を獲得するがん悪性化進展モデルによって、炎症応答を惹起する起点となるIL-17産生免疫細胞としてVδ1 γδT細胞を同定した。さらにin vivoイメージングによるがん悪性化進展過程のリアルタイムモニタリング系を確立し、QR32の炎症性微小環境における腫瘍増殖過程における挙動と悪性形質との相関を解析する事によって、炎症性微小環境がQR32のがん悪性化形質獲得に与える影響について解析した。QR32のルシフェラーゼ安定発現細胞クローン(QR32 Luc2)を樹立した。QR32 Luc2をゼラチンスポンジとともにC57BL/6マウスに移植し、腫瘍形成過程におけるQR32 Luc2細胞の増殖変化をインビボイメージングシステム(IVIS)を用いて経時的かつ非侵襲的にモニタリングした。さらに造腫瘍性を示したマウス腫瘍からQR32 Luc2-GS細胞株を確立し、腫瘍移植後初期から増殖が見られた細胞株(Early progressor)と後期から増殖が見られた細胞株(Late progressor)に分類し、qPCR法およびサスペンジョンアレイ法(バイオプレックスのこと?)を用いて両者の悪性化関連分子の発現解析を行った。当初の計画した進捗を得られている。がん病態においては慢性的な炎症を惹起することで免疫応答ががん進展に寄与している側面も持ち合わせる。QR32細胞は正常同系マウスであるB6マウスでは皮下移植の後に自然退縮するが炎症により悪性化進展し造腫瘍性と転移能を獲得する。このQR32を用いたがん悪性化進展モデルにおいて、これまでにQR32の悪性化進展にIL-17を介した免疫応答が非常に重要である事、IL-17産生細胞としてγδT細胞が炎症の起点となりうる事を報告した。そこでQR32の悪性化進展に関わるγδT細胞の特徴について、mRNA発現解析ならびに細胞表面マーカー解析を行い、さらにIL-17産生に関わるメカニズムの解析をKOマウスを用いた解析、ならびに抗体によるブロッキング実験により行った。QR32の悪性化進展に関わるIL-17産生γδT細胞としてVδ1 T細胞を同定した。Vδ1 T細胞はこれまでに報告されている胸腺内でpre-programされる事でIL-17を産生するgdT細胞サブセットと同様の特徴を示した。Vδ1 T細胞はTNFRSFに属する分子の発現に特徴を示し、Vδ1 T細胞に選択的に発現するTNFRSF分子としてCD30を同定した。CD30のリガンドであるCD30L/CD153に対するモノクローナル抗体投与によって、腫瘍局所でのIL-17産生の抑制、さらにはがん悪性化進展の阻害が可能である事を示した。

Vδ1 T細胞はTNFRSFに属する分子の発現に特徴を示し、Vδ1 T細胞に選択的に発現する分子としてCD30を同定した。CD30のリガンドに対するモノクローナル抗体投与によって、腫瘍局所でのIL-17産生の抑制、さらにはがん悪性化進展の阻害が可能である事を示した。以上の結果から、Vδ1 T細胞の機能をターゲットとした炎症制御が、がん進展をターゲットとした新規治療となり得ると考えられる。当初予想していた内容とは若干異なるデータを得たが、H26年度内に計画していた研究成果はほぼ得る事ができた。Vδ1 γδT細胞に特徴的に発現する遺伝子群の解析から新規ターゲットを同定する。特にVδ1 γδT細胞に特徴的なシグナル経路、細胞表面分子、転写因子、並びにサイトカイン/ケモカインに着目して同定したターゲットのVδ1 γδT細胞機能における役割を解析する。免疫学、腫瘍生物学H26年度の成果から若干研究計画の軌道修正が必要であるが、興味深いデータが得られているので順調に研究を推進したい。本年度得られた研究結果により、当初の計画からの若干の変更が生じたため。H28年度の研究計画に組み込んで適切に使用する。H26年度繰越分使用予定の予算はH27年度研究計画に組み込んで使用する。
新規膜蛋白分子MAIR-I遺伝子群の免疫制御機構における役割

1.MAIR-Iノックアウトマウスの作出:MAIR-I改変ES細胞からキメラマウスを得、これを交配したがヘテロマウスが得られなかった。性腺に対するES細胞の寄与が少なかったためと考えられたので、再度ES細胞の遺伝子ターゲッティングを行い、新たなES細胞クローンを得ることとした。2.喘息モデルマウスに対する抗MAIR-Iモノクローナル抗体投与実験:マウス腹腔内に卵白アルブミン(OVA)を投与し感作させた後、経気道的にOVAを投与する喘息モデルにおいて、OVA暴露前に抗MAIR-Iモノクローナル抗体を腹腔内に投与したところ、コントロール抗体を投与した群と比較して、OVA暴露後の肺胞洗浄液中の好酸球数が有意に増加していた。MAIR-Iの抑制性シグナルを特異抗体によって阻害した可能性が考えられるが、分子メカニズムを含めさらなる検討が必要である。3.MAIR-Iのシグナル伝達機構:MAIR-I細胞内領域に存在する4つの抑制性モチーフITIM中のチロシン残基を、種々の組み合わせで置換した変異体をマスト細胞に遺伝子導入し解析した。結果、第258番目と270番目のチロシンを含むITIMが、実際の抑制性シグナル伝達に必要であった。また、マスト細胞の脱顆粒反応の抑制には、MAIR-Iと高親和性IgEレセプターを別々に刺激しても抑制はおこらず、両者の共架橋が必要であることを明らかにした。活性化レセプターとMAIR-Iが脂質ラフトの様なシグナル伝達に関わる細胞膜分画にともに存在してはじめて、抑制性シグナルが伝達されると考えられた。ゲノムDNAライブラリーよりMAIR-IのゲノムDNAクローンを単離し、その遺伝子構造を明らかにした。この結果をもとにターゲッティングベクターを構築し、マウスES細胞へ遺伝子導入を行なったが、合計2回の遺伝子導入にも関わらず目的の遺伝子導入体が得られなかった。このため構築を変更した新規のターゲッティングベクターを作成した。現在3度目の遺伝子導入の準備中である。現在、これらの置換変異体をラット好塩基性細胞白血病細胞株であるRBL-2H3に遺伝子導入し、抑制性シグナル伝達に関わる細胞内チロシン残基を同定するための解析を行なっている。(712字)MAIR分子群のうち抑制性レセプターのMAIR-Iについては、これまで2つのターゲッティングベクターで、ES細胞に合計3回の遺伝子導入を行ったが、いずれも組換え体が得られなかった。より組換え効率を高めれるために、Bacterial artificial chromosomeゲノムライブラリーより単離したMAIR-Iゲノムクローンを改変したターゲッティングベクターを構築し、遺伝子導入を行った。結果、組換え体を得ることができ、現在はノックアウトマウスを作出中である。活性型レセプターのMAIR-IIノックアウトマウスについては、組換え体のES細胞の単離を経て、ノックアウトマウスを得るべく現在交配中である。抑制性レセプターMAIR-Iの細胞内には、4つのITIM(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif)またはITIM様モチーフが存在する。これらに含まれるチロシン残基をフェニルアラニンに置換した種々の変裏体をラット好塩基性細胞白血病細胞株であるRBL-2H3に遺伝子導入したtransfectantを作製した。この細胞に発現する高親和性IgEレセプターを架橋すると脱顆粒反応が見られるが、この際、高親和性IgEレセプターと遺伝子導入したMAIR-Iを共架橋するとこの脱顆粒反応が抑制される。種々の変異体を導入したtransfectantでこの抑制反応を解析した結果、実際に抑制性シグナルを伝達するITIM(様モチーフ)をほぼ同定することができた。現在、確定のための生化学的解析を行っている。