hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ソフトウェアシステムの定量的な脆弱性評価法に関する研究

ソフトウェアの脆弱性を定量的に評価するために,まず,従来のソフトウェア信頼性の研究分野で用いられてきた考え方である,ソフトウェア内に残存するフォールトとそれに対する発見・修正過程の模式図であるIPOモデルを取り上げ,これを基本として,脆弱性と信頼性の捉え方の違いについて考察を行った.その結果,ソフトウェアの脆弱性を「ソフトウェア開発者とは異なる視点によって初めて発見可能となるソフトウェアフォールトが原因となって深刻な処理結果を招くソフトウェア故障が発生する性質や度合」と定義した.これにより,脆弱性を評価しようとするソフトウェアの運用段階において,深刻な処理結果を招くソフトウェア故障を生じ,それに対処する(当該フォールトを修正・除去する)ことによってそのソフトウェアの脆弱性が向上するという現象は,従来のソフトウェア信頼性の評価法を援用することで,定量的に評価可能であることが示された.具体的には,ソフトウェア信頼性評価モデルの一つである,遅延S字形ソフトウェア信頼度成長モデルを拡張し,ソフトウェアを運用・保守する防御者と,ソフトウェア内に潜在するセキュリティホールを探し出して攻撃する攻撃者側のそれぞれのソフトウェアフォールトの発見過程を,NHPP(非同次ポアソン過程)に基づいて構築した.また,長期に渡って運用・保守されている電子メール配信プログラムsendmailを取り上げ,この保守データを解析することにより,構築した脆弱性評価モデルを用いてsendmailの脆弱性評価を行ってみた.これにより,モデルから導出されたいくつかの定量的な脆弱性評価尺度の推定値を得ることが出来た.また,構築したモデルとデータとの適合性もコルモゴロフ・スミルノフ検定により調べ,このデータに対してはよく適合することが確認された.これらの研究成果は論文としてまとめ,現在日本信頼性学会誌に投稿中である.本研究における本年度の成果を以下に述べる.研究計画時点からの予想どおり,ソフトウェアシステムの脆弱性を定量化するに当たって,いくつかの問題点が洗い出されてきた.例えば,現在大きな問題となっているネットワーク化されたPC(パーソナルコンピュータ)の上に伝搬するウイルスプログラムが,個々のPCの防御の度合いを設定した上でどのように伝搬するかという問題を考える場合,格子状ネットワークを仮定し,シミュレーションによってなんらかの性質を調べることは可能であり,すでにいくつかの研究成果が発表されている.しかしながら,本質的な問題として,このようなシミュレーションを行う上での仮定が,現実の問題とどの程度類似あるいは乖離しているのかということに触れられていないということがあげられる.例えば,シミュレーションを行う上でネットワークの形状が格子状であるとすることは便利であるが,現実のWAN(wide area network)は決して格子状ネットワークではない.本年度はこのようにして,多くの文献を調査することで,複雑なシステムの合理的なモデル化・記述が事実上不可能であろうことを再確認した.したがって,来年度に研究を完成させることを目指す上で,以下の点に注力し,ソフトウェアシステムの脆弱性の定量的評価モデルを構築したいと考える.すなわち,脆弱性をとりまくplausibleな仮定を見極め,その枠組みでモデル化を行う.その一つの方法として,ポアソン型白色雑音を用いた確率微分方程式によってモデル化が可能と考えられる,システム外部からの攻撃の到着モデルを開発したい.今年度の成果として研究発表欄に記載した論文は,このモデル化の先鞭をなすものとして位置づけられる.ソフトウェアの脆弱性を定量的に評価するために,まず,従来のソフトウェア信頼性の研究分野で用いられてきた考え方である,ソフトウェア内に残存するフォールトとそれに対する発見・修正過程の模式図であるIPOモデルを取り上げ,これを基本として,脆弱性と信頼性の捉え方の違いについて考察を行った.その結果,ソフトウェアの脆弱性を「ソフトウェア開発者とは異なる視点によって初めて発見可能となるソフトウェアフォールトが原因となって深刻な処理結果を招くソフトウェア故障が発生する性質や度合」と定義した.これにより,脆弱性を評価しようとするソフトウェアの運用段階において,深刻な処理結果を招くソフトウェア故障を生じ,それに対処する(当該フォールトを修正・除去する)ことによってそのソフトウェアの脆弱性が向上するという現象は,従来のソフトウェア信頼性の評価法を援用することで,定量的に評価可能であることが示された.具体的には,ソフトウェア信頼性評価モデルの一つである,遅延S字形ソフトウェア信頼度成長モデルを拡張し,ソフトウェアを運用・保守する防御者と,ソフトウェア内に潜在するセキュリティホールを探し出して攻撃する攻撃者側のそれぞれのソフトウェアフォールトの発見過程を,NHPP(非同次ポアソン過程)に基づいて構築した.また,長期に渡って運用・保守されている電子メール配信プログラムsendmailを取り上げ,この保守データを解析することにより,構築した脆弱性評価モデルを用いてsendmailの脆弱性評価を行ってみた.これにより,モデルから導出されたいくつかの定量的な脆弱性評価尺度の推定値を得ることが出来た.また,構築したモデルとデータとの適合性もコルモゴロフ・スミルノフ検定により調べ,このデータに対してはよく適合することが確認された.これらの研究成果は論文としてまとめ,現在日本信頼性学会誌に投稿中である.
ウイルス感染超初期過程におけるウイルス－宿主共生機構の解析

本研究では、インフルエンザウイルス粒子の数を正確にカウントし、1細胞あたり何個のウイルス粒子が細胞に吸着するか厳密に制御した条件で感染実験をin vitorおよびex vivoで行う。その条件下で細胞応答を蛍光イメージングにより定量化し、1数個のウイルス粒子が細胞に吸着する、すなわち感染超初期過程で発動する細胞内シグナル伝達を検証する。
原発性アルドステロン症鑑別における新たなバイオマーカーの可能性

原発性アルドステロン症は高血圧症の原因の約10%とされ、治療法の異なるサブタイプの鑑別は重要である。本研究で我々はアルドステロン産生腺腫(APA)において他のサブタイプと比較して尿中に多く検出される物質を新たに見出し、新規バイオマーカーとしての可能性について検討した。物質の単離・構造決定までには至らなかったものの、高血圧患者検体の分析の結果、本態性高血圧や両側過形成を原因とする特発性アルドステロン症(IHA)に対して1.52倍の量が検出された。本研究の本年度の予定は(1)新規バイオマーカー物質の探索、(2)当該物質の単離、であったが研究協力者から提供された入院患者24時間蓄尿検体(17検体、合計31.6L)を用いて(1)(2)を同時に進めた。第1段階のターゲット物質の抽出では予備実験で用いた逆相担体の固相抽出をスケールアップすることに成功し、固相吸着物の溶出溶媒の極性を段階的に変えることによりターゲット物質の大まかな分離も行うことができた。この段階で得られたターゲット物質を含む抽出画分重量は12.4gであった。物質の探索・分離には当初予定していた酵素免疫測定(ELSIA)の反応性を指標として用いるのでは結果が判明するまでに時間が掛かるため、予備実験で得られていた質量分析データを応用して探索指標とした。第2段階の分離・精製ではオープンカラムを用いた逆相クロマトグラフィーを行い、さらに高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で分離を進めた。HPLC分離ではターゲット物質の検出をリアルタイムに行うことが不可欠であったが、通常の紫外線吸収検出では当該物質の物性(紫外線吸収波長)が不明なため、検出方法の改良を検討した。その結果多少の損失を伴うものの分離カラムからスプリッターで分岐した先を質量分析装置に接続して検出する方法が確実であると判断し、それを用いた。現在は分析用のカラムを用いたHPLC分離条件が定まったところであり、一部分離を進めたが分取カラムを用いてスケールアップする必要があるため、準備を行っている。本研究の予定では前年度の(1)新規バイオマーカー物質の探索、(2)当該物質の単離、に次いで本年度は(3)物質の構造決定であったが、前年度の物質の単離が予定通りに進まなかったため、同時並行的にターゲット物質の化学構造を予想して3種の物質を化学合成を目指した。ターゲット物質の可能性が一番強い物質について合成を進めたが、物質の性質が扱い難いものであったため、現在はNMRや質量分析といった各種分析装置を用いて当該物質の物性や構造の確認を行っている。また、他に可能性がある2種の物質についても化学合成を検討中であり、近々に進める予定である。予定よりも遅れている物質の単離については、分離装置(高速液体クロマトグラフィーシステム)の問題で本年度はほとんど進められなかったが、年度末に新たな装置の投入があり、次年度前半で急速に進むことが期待されている。以上の進展状況により以降の(4)物質の測定法の開発や(5)患者検体の測定、(6)定量結果の解析と評価およびこれまでのバイオマーカーとの比較・検討などは一気に進み、研究全体としての予定はクリアできるものと予想している。特に患者検体については研究協力者より既に提供されており、ターゲット物質が決定した後には早々に測定法を開発し、測定できる状態にある。本研究の当初の予定では3年間で(1)新規バイオマーカー物質の探索、(2)当該物質の単離、(3)物質の構造決定、(4)物質の測定法の開発、(5)当該物質について患者におけるデータ採取、(6)データの解析と評価、およびこれまでのバイオマーカーとの比較・検討であった。前年度までの研究の進度に遅れが生じており、特に(2)(3)では予想を超えた困難に遭遇したため同時並行でターゲット物質を予想して化学合成を行った。予想される3つの物質のうち可能性が一番高いものについて合成に成功して各種スペクトル分析により化学構造が確認されたが、当初から追跡していたターゲット物質とHPLC分析での挙動(カラム保持時間)、つまり“極性"が異なることが示され、予想は覆された。次に予想している物質については、合成が終了したところである。今後は化学構造を確認し、得られているターゲット物質の物性との比較を行う予定である。同時にかなりの遅れをとっているターゲット物質の単離については、できるだけ精製度を上げて予想物質の合成物との比較や存在確認に用いることができるようにすることが重要である。以降(4)(5)(6)の最終段階へ向けて物質の単離や物性の確認のための高速液体クロマトグラフ(HPLC)や、それに接続して質量分析を行うLC-MSを新たに導入しており、準備は着々と進んでいる。今後ターゲット物質が決定すれば最終目標への到達は近いものと考える。研究初年度からの遅れが響いていることや想定外の問題が発生して全体的に遅れを増幅していることが原因である。(1)初年度からの遅れ:ターゲット物質の取り扱いが難しく単離ができていない。(2)想定外の問題:所属機関の実験研究施設の改修・新築が発生し、それに伴う実験場所や研究機器類の移設で実験が出来ない期間があった。また、研究代表者の部局内での部署異動で実験機器類が使用できなくなった。最終目標である原発性アルドステロン症の鑑別に関わる新規バイオマーカーの探索について、前年度までにターゲット物質の単離が成されず遅れが生じていた。

それは試料中の含有量がかなり少ないことと、予想以上に分離が困難な夾雑物が多かったことが要因であった。本年度は分離・精製が進んだ状態の試料を用いて各種分析を行い、ターゲット物質の化学構造を推測し化学合成によって物質の同定を試みた。衝突誘起乖離反応を用いた質量分析によってターゲット物質はこれまでにアルドステロン産生腺腫のマーカーとして研究してきた18ーヒドロキシコルチゾール(18-OHF)に似たシグナルパターンを示すことが分かった。また、それらのイオンシグナルが全体で2つずつ大きく検出され、詳細な構造解析によって18-OHFのステロイドA環の一部が水素還元された物質が予想された。可能性のある2種の物質の合成を行い、ターゲット物質との比較を行った。結果として2種ともターゲット物質に対して質量分析のシグナルパターンはほぼ一致したものの、高速液体クロマトグラフィー分析の挙動が異なっており同定には至らなかった。これまでに得られた分析情報からターゲット物質の定量分析法を検討し、原発性アルドステロン症を含む高血圧患者の尿検体を測定したところ、アルドステロン産生腺腫の症例で他の症例(本態性抗血圧、両側副腎過形成)に対して高値傾向にあることが分かった。しかしながら集められた症例数が少なかったことや物質の化学構造が明らかになっていないため絶対量が決められないことなどから、今後更なる実験・研究が必要であると考える。原発性アルドステロン症は高血圧症の原因の約10%とされ、治療法の異なるサブタイプの鑑別は重要である。本研究で我々はアルドステロン産生腺腫(APA)において他のサブタイプと比較して尿中に多く検出される物質を新たに見出し、新規バイオマーカーとしての可能性について検討した。物質の単離・構造決定までには至らなかったものの、高血圧患者検体の分析の結果、本態性高血圧や両側過形成を原因とする特発性アルドステロン症(IHA)に対して1.52倍の量が検出された。前年度の進展状況から本年度は当初の予定を少々変更したが、以下の点において問題が発生し研究が遅れた。(1)年度初めに研究代表者の部局内での担当部署が変更になり、使用していた研究機器類が使用できなくなった。特に高速液体クロマトグラフィーは物質の単離に必要な装置であるため打撃が大きく、本年度は機器を用意することに奔走した。その他の分析装置類に関しては本学の共用機器類を使用したり、分析センターを活用して研究を進めたが、時間が掛かることは避けられなかった。(2)ターゲット物質の一つと想定したいた物質の性質が予想より取り扱いが難しいものであった。化学合成を行っているところであるが、分析の種類に依って示される物性が異なっているため、現在確認中である。初年度の遅れは取り戻せていないものの、それ以外の遅延原因はほぼ解消されている。そのため、当初の目標は研究期間の延長によって進展できるものと考える。特に新たな分析機器の導入に伴う初期調整は完了しており、ターゲット物質の決定がなされれば進展度はさらに高まるものと考えている。病態検査学研究が遅れている理由が本年度末に解消されつつあり、次年度は一気に研究が進むものと思われる。特に分離・分析装置に関しては新規に研究協力関係を結んだ研究室の好意により使用できるようになり、一層の進展が期待される。
極低振動数の動的弾性率測定による金属ガラスにおける原子運動のダイナミクスの研究

ガラス固体では,熱的ガラス転移温度に近い温度において構成原子・分子が熱揺動することによる粘弾性的挙動(α緩和と呼ばれる)が観測されるが,それよりも低い温度領域(あるいは高い周波数領域)において,それとはやや異なるメカニズムによる可逆的な力学緩和が観測されることがある.これはβ緩和とよばれ,金属ガラスにおいても最近Pd_<43>Cu_<27>Ni_<10>P_<20>合金において報告されている(Pelletierら,2002).本研究代表者がこれまで調べた結果によればZr-Al-Ni-Cuガラスにおいてはこの緩和現象は観測されず,一方pd_<42.5>Cu_<30>Ni_<7.5>p_<20>ガラスにおいては明瞭に現れる.本研究では後者におけるβ緩和をサブレソナンス強制振動法による動的剪断弾性率測定により詳細に調べた.β緩和は温度150°Cから240°Cの範囲では振動数10^<-3>Hzから10^0Hzに現れ,振動数スペクトルは幅は広いが対称であり,著しい非対称性を示すa緩和とは様相が異なる.今回は粘弾性モデルではなく擬弾性(anelasticity)モデルを用いて緩和時間の分布を考慮に入れて緩和スペクトルを解析した.緩和時間の逆数はアレニウス則に従い,その熱活性化パラメターは,振動数因子10^<12±1>s^<-1>,活性化エネルギー1.11±0.06 evであった.これらは結晶中の原子の拡散素過程における値と同程度であり,固体結晶における点欠陥の応力誘起再配向(短距離拡散)と同様なメカニズムが推測される.研究協力者である才田淳治(東北大学)・西山信行(RIMCOF)から試料の提供を受け,Zr-Al-Ni-CuおよびPd-Cu-Ni-Pバルク金属ガラス合金の動的剪断弾性率を,サブレゾナンス強制振動型力学スペクトロメターを用いて測定した.温度範囲は室温から熱的ガラス転移温度(それぞれ約400°C,300°C)まで,振動数範囲は10^<-3>Hzから10^<+1>Hzである.動的弾性率のin-phase成分とout-of-phase成分から固体としての通常の剪断弾性率と見かけの粘性率を求めた.粘性率の絶対値を低い振動数に外挿すると,多くのガラス物質と同様に熱的ガラス転移温度でおよそ10^<12>Pa sとなることを見いだした.Zr-Al-Ni-Cu合金において,一定温度で振動数の関数として動的剪断弾性率を測定し,高い振動数では固体的に,低い振動数では液体的に振る舞う動的ガラス転移を観測した.そのカイネティクスを解析し,活性化パラメタを評価した.活性化エネルギーの値は約6eV,振動数因子の値は10^<40> s^<-1>という異常に大きな値となった.これらの値は動的ガラス転移を律速している過程に複数個の原子が関わっていることを示唆している.Pd-Cu-Ni-P合金ではガラス転移温度よりもかなり低い温度領域で高分子ガラスにおいて見られるβ緩和が観測され,Zr-Al-Ni-Cu合金では観測されないことがわかった.平成19年度はPd-Cu-Ni-P合金におけるβ緩和を詳細に調べる計画である.ガラス固体では,熱的ガラス転移温度に近い温度において構成原子・分子が熱揺動することによる粘弾性的挙動(α緩和と呼ばれる)が観測されるが,それよりも低い温度領域(あるいは高い周波数領域)において,それとはやや異なるメカニズムによる可逆的な力学緩和が観測されることがある.これはβ緩和とよばれ,金属ガラスにおいても最近Pd_<43>Cu_<27>Ni_<10>P_<20>合金において報告されている(Pelletierら,2002).本研究代表者がこれまで調べた結果によればZr-Al-Ni-Cuガラスにおいてはこの緩和現象は観測されず,一方pd_<42.5>Cu_<30>Ni_<7.5>p_<20>ガラスにおいては明瞭に現れる.本研究では後者におけるβ緩和をサブレソナンス強制振動法による動的剪断弾性率測定により詳細に調べた.β緩和は温度150°Cから240°Cの範囲では振動数10^<-3>Hzから10^0Hzに現れ,振動数スペクトルは幅は広いが対称であり,著しい非対称性を示すa緩和とは様相が異なる.今回は粘弾性モデルではなく擬弾性(anelasticity)モデルを用いて緩和時間の分布を考慮に入れて緩和スペクトルを解析した.緩和時間の逆数はアレニウス則に従い,その熱活性化パラメターは,振動数因子10^<12±1>s^<-1>,活性化エネルギー1.11±0.06 evであった.これらは結晶中の原子の拡散素過程における値と同程度であり,固体結晶における点欠陥の応力誘起再配向(短距離拡散)と同様なメカニズムが推測される.
気泡の上昇・結晶の沈降に伴うマグマ対流

平成5年度は、マグマ溜まり内部の微粒子(気泡・結晶)の上昇・沈降によって引き起こされる流体運動について、非定常非線形数値解法の改良および大型計算機によるシミュレーションを行った。その結果、マグマ溜まりの運動のダイナミクスとマグマ混合について以下の示唆を得た。(1)マグマの粘性が極端に低い場合、もしくは気泡や結晶のサイズが大きい場合にはこれら微粒子はマグマ中を静かに素通りするだけマグマ溜まり全体におよぶ対流は励起されない。このような状況では、マグマは気泡の運度によって乱されにくく、混合のスケールの小さな比較的均質なマグマが維持・保存されることが期待される。これは、中央海嶺から低粘性のバサルトが連続的に生成・噴出される状況などにあてはまるかもしれない。(2)マグマの粘性が比較的高い、あるいは気泡・結晶のサイズが小さい場合には、気泡や結晶の水平分布のゆらぎによってマグマ溜まり全体におよぶ対流が励起される。このときマグマ溜まり内部で鉛直方向にマグマ混合が促進されることが期待される。(3)マグマの粘性がかなり高い場合、もしくは気泡・結晶のサイズがごく小さい場合、気泡・結晶はもはや個々に移動することができず集積し、塊状のプリュームを形成して移動する。このときプリューム自体は気泡・結晶のミクロ運動(ストークス運動)よりもはるかに高速で運ばれ得る。このときマグマ混合のスケールは大きくなり不均質なマグマが生成されることが予想される。この状況は、島弧火山では一般的に見られる、高粘性のデイサイト質マグマの底部からバサルト質マグマが供給され発砲・結晶化を起こしながらマグマ混合を起こす場合のメカニズムとなり得ると考えられる。特にこのメカニズムでは、個々の気泡・結晶がごく小さくてミクロな移動速度が小さい場合でも、巨視的には十分高速でマグマが輸送・混合され得る点で重要である。またこれら微粒子の上昇・沈降が引き起こす流体運動は、それまで熱的には静かだったマグマ溜まりを再び不安定化させ、噴火のトリガーになり得ることも示唆している。今後は、外部に巨視的な流れ場(例えば熱対流やマグマ噴出に伴う流れなど)があった場合に、気泡・結晶のミクロな運動とどのように相互作用しながら新しい流れ場がつくられていくかについて数値実験を行う予定である。
気液混相流の不安定流動に関する基礎的研究

ダム放流管での高速気液混相流での空気の輸送を生じさせる形態が、主として2つの形態に分類できる事が判って来た。一つは跳水現象によるものであり、もう一つは水と空気の界面で生ずる摩擦力によるものである。土木構造物での長い管路での流れでは、一つの管路中に幾つかの流れの形態が生じてきている。すなわち水の流速が速い場合に生ずる層状流、波状流、断面全体に気泡が流れる気泡流、流速が遅くなったときに生ずるプラグ流、スラグ流へと下流に行くに従って変わってくる。また空気の混入量はゲート開度の大きさによって(管路と水の流れる部分の比)ピーク値を取る状態が変化し、その比が0.25,0.6,0.8の付近にあり、これが管路の下流の流れの状態によって変化してくる事が判った。0.25,0.8は跳水によるものであり、0.6は層状流によるものである。また管の径が比較的小さく(d=6cm)管の長さが長い場合には層状の流れにはならなくなり跳水による混入のみが生じている。このような事を考えると通常考えられているFroudeの相似のみでなく、Reynoldsの相似も考えなければならない事が判り、この相矛盾する相似則では現象を説明できない事となる。従って現象を根本的に解明して相似性について考慮する必要があることが判った。次年度の研究課題である。またダム越流部の堤踵導流水路内での気液混相流では、新しい赤外線センサーを使用した空気濃度の測定を行った。この結果水の流速がある程度大きくなると水深方向の空気の濃度分布が似てきており、水深の60%付近で濃度が最大となる傾向を示してくる事が判明した。今後はより高速状態での混入状況の測定が必要である。下水管縦シャフトの流れでは管の長さが長くなると空気の量が増加してくる。しかし管の直径が大きくなってもその割に増加しないことが判明した。しかし充分なデーターを取得していないので今後測定ケースを増やして現象解明を目指す。理論解析モデルを作成したので現象との相関性を明らかにする。水に空気の混入した流れ、気液2相流の現象について3種類の実験を行った。すなわち、ダムの越流部の提し導流水路の中の流れ、ダム放流管の中の流れ、下水管の鉛直シヤフト内の流れについて、それぞれ3種類の大きさの模型を用意して実験を行った。その結果第1の現象では、模型の小さい場合で越流水深が小さく、流下高さが小さい場合には空気の混入がないことが判明し、流下高さが50cm以上でないと空気の混入が生じないことより相似性模型の最小寸法があることがわかった。空気の水路内での分布状況を水路内6点について鉛直断面について測定した。今後より流下高さの大きい水路での観測をし模型実験での相似性について解明する。後者の2つについては水の流速、流れの形態との関係で空気の連行量がどのように変化するかについて測定した。その結果ダム放流管では同じボイド率で各種の流れ、すなわち気泡流、プラグ流、スラグ流などが存在することがわかり、水の流速との関係で解析をしている。

下水管の縦シャフト内の流れでは側壁に沿って流れる水脈の厚さ、流速に空気の連行量が支配されていることが判明した。側壁に沿う流れの流速は落下に従って加速され、その早さは水脈の厚さが厚いほど大きくなり、空気の連行量も管路の長さが長いほど、流速が早いほど多くなる傾向があることが判明した。今後より大型の模型によって実験を行い現象の解明をする予定である。ダム放流管での高速気液混相流での空気の輸送を生じさせる形態が、主として2つの形態に分離できる事が判って来た。一つは跳水現象によるものであり、もう一つは水と空気の界面で生ずる摩擦力によるものである。土木構造での長い管路での流れでは、一つの管路中に幾つかの流れの形態が生じてきている。すなわち水の流速が速い場合に生ずる層状流、波状流、断面全体に気泡が流れる気泡流、流速が遅くなったときに生ずるプラグ流、スラグ流へと下流に行くに従って変わってくる。また空気の混入量はゲート開度の大きさによって(管径と水の流れる部分の比)ピーク値を取る状態が変化し、その比が0.25,0.6,0.8の付近にあり、これが管路の下流の流れの状態によって変化してくる事が判った。0.25,0.8は跳水によるものであり、0.6は層状流によるものである。また菅の径が比較的小さく(d=6cm)菅の長さが長い場合には層状の流れにはならなくなり跳水により混入のみが生じている。このような事を考えると通常考えられているFroudeの相似のみでなく、Reynoldsの相似も考えなければならない事が判り、この相矛盾する相似則では現象を説明できない事となる。従って現象を根本的に解明して相似性について考慮する必要があることが判った。次年度の研究課題である。またダム越流部の堤踵導流水路内での気液混相流では、新しい赤外線センサーを使用した空気濃度の測定を行った。この結果水の流速がある程度大きくなると水深方向の空気の濃度分布が似てきており、水深の60%付近で濃度が最大となる傾向を示してくる事が判明した。今後はより高速状態での混入状況の測定が必要である。下水管縦シャフトの流れでは管の長さが長くなると空気の量が増加してくる。しかし管の直径が大きくなってもその割に増加しないことが判明した。しかし充分なデーターを取得していないので今後測定ケースを増やして現象解明を目指す。理論解折モデルを作成したので現象との相関性を明らかにする。昨年に引き続きダム放流管での高速気液混相流での空気の輸送の実験を行った。その結果空気輸送を生じさせる形態が、跳水現象によるものと水と空気の界面で生ずる摩擦力によるものである事が確認できた。今年度は大きさの異なる模型を3種類作成し、長さも相似性を考慮して決めて実験を行った。その結果は昨年に確認した結果「一つの管路中に幾つかの流れの形態が生じ、水の流速が速い場合に生ずる層状流、波状流、断面全体に気泡が流れる気泡流、流速が遅くなったときに生ずるプラグ流、スラグ流へと下流に行くに従って変わってくる。また空気の混入量はゲート開度の大きさによって(管径とゲートの開きの比)ピーク値を取る状態が変化し、その比が0.25,0.6,0.8の付近にあり、これが管路の下流の流れの状態によって変化してくる事。および0.25,0.8は跳水により、0.6は層状流によるものである。」を確認した。また小さい管径のケース(d=6cm)では摩擦力の影響が強く出て他の管径の場合との相似性が無くなる傾向が判った。このような事から通常考えられているFroudeの相似のみでなく、Reynoldsの相似も考えなければならない事が判った。
トロンビンによる椎間板変性メカニズムにおける新規制御因子の解析

腰痛の原因の一つに椎間板変性が関与しており、このメカニズムを解明することは社会的に喫緊の課題である。我々は、血液凝固酵素であるトロンビンが炎症を惹起し、骨肉腫において腫瘍の転移を賦活化すること、骨折治癒過程では、骨芽細胞を遊走し治癒を促進することを示した。椎間板組織においては、先行研究でマウス椎間板にトロンビン受容体(PAR-1)の発現を確認した。本研究では、1)椎間板変性における炎症賦活メカニズムにおけるトロンビンの関与を解明し、2)PAR-1ノックアウトマウスによる椎間板変性抑制効果を明らかにし、その知見を用いて新規分子標的薬の開発研究を行い、臨床に還元し発展させることである。
パルス中性子分光法によるランタナイド・アクチナイド化合物の研究

本年度は、おもに高ネルギー研究所パルス中性子源KENSにある、チョッパー型分光器INCを用いて、以下の研究を行なった。1.近藤効果とRKKY相互作用の競合する系(CeSi_x,YbX)の結晶場励起の研究CeSi_xは、1.6<x<.85で強磁性、1.85<x<2で重い電子状態を示す系である。我々は、このうちx=1.7、1.8、1.9のSi濃度の化合物について、結晶場励起を測定した。その結果、結晶場励起の線巾がxの増加とともに急激に増加していることを見いだした。この現象は、xの増加に伴う近藤温度の増加と、その結果としての強磁性状態の不安定化を、直接的に反映しているものとして理解できる。YbX(X=N、P、As)は、低温(T<1K)で反強磁性を示す一方、やはり近藤効果も示す競合系である。INC分光器による測定の結果、XがN、P、Asと重い元素になるにつれて、結晶場が系統的に強くなっていることが見いだされた。これは、Ybの4f電子とX元素のp電子との混成効果の系統的な変化を反映しているものと考えられる。なお、YbNについては、結晶場励起とフォノンとの相互作用によるものと思われる、スペクトルの異常が見いだされた。2.以上のような実験のデータを解析するために、装置の分解能も考慮にいれた解析ソフトウエアを新たに開発した。3.サンプルチェンジャーの製作これによって、INC分光器の大きな真空槽の真空を破らずに、約20Kの低温にある試料の交換が容易に行なえるようになった。
レセプタ-結合活性に基ずく微量プロラクチン測定法の開発とその応用

プロラクチンは、標的器官の細胞膜に存在する受容体に結合してプロラクチン刺激を伝える。shiu等は、プロラクチンが受容体に結合する親和性とプロラクチンの持つ生物活性値との問に高い相関関係があることを示した。近年になりプロラクチンの多様性が明らかになり、生物活性値も非常に異なることが明らかになった。受容体は、これらプロラクチンと結合の親和性に差があることから、ラジオイムノアッセ-の持つ欠点を解決出来るのではと考えられた。本研究では、一般に広く用いられているミクロゾ-ムの代わりに、膜タンパク質を表面活性剤を用いて可溶化し、ニトロセルロ-ス膜に固定し、バラ付きの原因を少なくすると共に、操作の容易化をはがった。トリトンXー100によりミクロゾ-ムを日溶化し、コンカナバリンAアフィニティ-クロマトにより部分精製し、ニトロセルロ-ス膜に固定した。アッセ-方法の検定は、ウシ血清を用い、内因性のプロラクチンはラジオイムノアッセ-により同時に測定し、ラジオレセプタ-と比較検討した。本方法では、標準プロラクチン0.420ng/mlとで用量反応が認められ血清を16%まで加えても非特異的反応は認められなかった。又、ラジオイムノアッセ-とラジオレセプタ-アッセ-間で比較しても、ほぼ等しい値が得られ、相関係数も+0.99という高い値が得られた。ゲルロ過の結果においても、血中プロラクチンとのみ反応していることが明らかとなり、当初の目的を達成出来た。研究課題を遂行するため、以下の実験を行ない次の成果を得た。ウサギ乳腺に含まれるレセプタ-は、ミクロゾ-ムをトリトンで可溶化し,コシカナバリンAカラムを用いて部分精製した(約5倍)。可溶化レセプタ-をニトロセルロ-ス膜に結合させて再度不溶化した。ニトロセルロ-ス膜0.2cm^2を用いると、実験に必要なレセプタ-が結合していた。(1)不溶化レセプタ-の性質。解離係数は、2ng/mlであった。ヒツジ、ラット、ヒトプロラクチン、ヒト成長ホルモン,ヒド胎盤性ラクトゲンにのみ結合能を示し、他のホルモンには親和性を示さなかった。又、親和性の程度は、プロラクチン活性と比例していた。プロラクチンとの結合は、室温で一晩で平衝に達した。しかし、6時間の反応でも約80%の反応が進行していた。(2)レセプタ-アッセ系としての性能。ウシ血清を希釈してプロラクチンの用量反応曲線と比較すると完全に平行した。反応液中に約40%まで加えても非特異的反応は起こらなかった。実験内、実験聞の変動係数は、それぞれ5%,12%とアッセ-系として十分な精度を持っていた。又、添加回収試験においても約100%であった。(3)ラジオイムノアッセ-との比較。約70検体のウシ血清を用いて血清中プロラクチン濃度をラジオイムノアッセ-とラジオレセプタ-アッセ-で測定した。両者間の相関係数は、+0.95であった。回帰式は、RRA=0.62RIA+7.2であった。ラジオイムノアッセ-により求めた血中プロラクチンは、若干高い結果であった。血清と同様に、血漿を用いても行なった。ほぼ同一の結果が得られた。血清をゲルロ過した。ラジオイムノアッセ-でもラジオレセプタ-アッセ-でも同一のパタ-ンを示し、その分子量は約2万3千であった。標準プロラクチンと同じ分子量であった。他のフラクションでは反応は認められなかった。プロラクチンは、そのレセプタ-と特異的に結合する。この特異的結合を利用すれば、血中の生物活性を持つプロラクチンを定量出来る。

この目的のため、レセプタ-を多く含む乳腺ミクロゾ-ム分画が使用されている。しかし、操作の難かしさと、又、生物物質であることにより、高い再現性を得ることは困難であった。本研究ではこの問題を解決するために(1)ミクロゾ-ムを可溶化しアフィニティ-カラムで精製し、レセプタ-量を一定に調製しバラツキの原因を除く、(2)このレセプタ-をニトロセルロ-ス膜に吸着し分配に基ずくバラツキの原因を除く事を行ない以下の成果を得た。ニトロセルロ-ス膜に固定したレセプタ-は、レセプタ-としての本来の性質を保っていた。プロラクチンとの結合係数も高く、血中レベルのプロラクチンの測定が出来ることを示していた。それを実証するため、ウシ血清を用いてプロラクチンを測定し、従来から広く用いられているラジオイムノアッセ-と比較した。本方法ではアッセ-内及びアッセ-間の変動係数が共に約10%であり実用の範囲内であった。血清をゲルロ過すると分子量23,000のプロラクチンとのみ反応し、又、他の物質による非特異的な反応も認められなかった。ラジオレセプタ-アッセ-とラジオイムノアッセ-により求めた測定値においても、相関係数が+0.99とほとんど同一の結果が得られた。その絶体量においても同一の値が得られた。最も優れた性質として、45時間で測定が終了することからじん速な測定が行なえる。本研究年度内に実用化に向けての総ての問題を解決し、ニトロセルロ-ス膜固定レセプタ-を用いたラジオレセプタ-アッセ-法を確立した。
心理教育を応用した精神障害者向け地域生活セルフケア支援モジュールの開発と検証

厚生労働省は、平成21年9月「精神保健医療福祉の更なる改革に向けて」を取りまとめ、「地域を拠点とする共生社会の実現」を推進している。現在、精神障害者の地域生活支援には、医師、訪問看護師、作業療法士、臨床心理士、精神保健福祉士等の専門職が関わっているが、支援の中心は服薬管理と服薬指導に留まっている。しかし、地域で暮らす精神障害者の質の高い生活を支えるには、服薬の中断を食い止める心理社会的介入が重要である。そこで、本研究では、心理教育を応用した精神障害者の地域生活セルフケア支援モジュール(以下、支援モジュール)を開発して訪問看護実践に適用し、支援モジュールの有用性・実用性の検証を行ない改良することを目的に取り組みを開始している。研究初年度にあたる本年度は、心理教育を応用した精神障害者の地域生活セルフケア支援モジュールの開発を目指して、1心理教育に関する動画よりセッション運営に用いる技法の抽出、2訪問看護師の実践内容に関する文献レビュー、3精神科訪問看護師の看護実践の実際と地域生活支援の過不足の明確化に向けた取り組みを開始した。1については、心理教育に関する動画の情報収集を行なうと共に、セッションに用いられる技法の抽出を開始した。2については、国内外の文献収集とレビューを開始した。3については、所属施設内の研究倫理審査を受けるための準備と共に、対象地域に開設された訪問看護ステーションの情報収集を行なった。協力者数の確保が課題であるが、おおむね順調に進展している。今後も当初の計画通りに研究を遂行する。
マーモセットのIn vivo二光子励起カルシウムイメージング法の確立と応用

マーモセットは、現在多くの神経疾患モデルが作成中であり、これらの疾患解明にとって今後非常に有用な霊長類であると期待されている。しかしながら脳を解析する手法などは未確立である。そこで我々は、覚醒状態で神経細胞を可視化することが出来る実験技術の開発を行った。覚醒状態でマーモセットを拘束することが出来る固定装置の開発や、固定装置への実験個体の馴化トレーニング法の確立、生きたまま観察するための観察窓の作成方法の確立などにより、2光子顕微鏡にて覚醒状態での神経細胞レベルでの観察が可能になった。その結果、麻酔状態における神経活動は覚醒状態におけるものに比べて著しく弱く、覚醒下での観察の必要性が示された。現在までに、マウスを用いた2光子イメージングは既に行われている。しかしマーモセットの体はマウスに比して大きく、また力も強いため、その観察にはマーモセット専用の機器が必要である。また手術実施時に突然死するといった思わぬ脆弱性を示すことがあるなど、マーモセット専用の手術方法を確立する必要がある。そこで本年度、我々は以下14の実験技術を確立した。12光子イメージングは空間解像度μmオーダーでの観察であるため、小さな動きでさえ観察の致命的な妨げとなる。そのため実験対象を強固に固定する必要がある。そこでマーモセット専用の頭部固定器具を開発、作製した。次に、2脳内投与には、出来るだけ脳組織を傷つけないようにするために非常に細いガラス管(先端30μm)を作成し、プレッシャーインジェクターにより注入した。また、脳組織にダメージを与えることなくウイルス液が脳内に十分に広がる、最適な圧力条件を決定した。この条件により目的の部位にバイオセンサーが発現していることを確認できた。3長時間の顕微鏡観察による肉体的負担を軽減するため、個体にとって無理のない姿勢をとることができる観察台を作成した。また、長期間(数週間から数か月)におよぶ神経細胞の活動や形態変化を調べることができる観察窓の作成条件を確立した。上記13により麻酔下における2光子イメージングの基盤技術が整った。これらの技術により、マーモセットの神経細胞群の2次元および3次元画像を生きたまま取得することに成功した。一方、神経細胞は麻酔下では覚醒下に比し反応性が低下することが報告されている。従って、神経細胞の活動を調べるためには、覚醒下で2光子イメージングを行うことも必要である。そこで、4覚醒下で観察可能な拘束装置を開発中である。さらに拘束装置への馴化プロトコルを作成し実施することにより、マーモセットを比較的安定的に拘束することを試みている。平成26年度で、我々は新世界ザル・マーモセットの大脳皮質体性感覚野における神経細胞の、構造および活動を生きたまま観察するための手法を確立するために、以下の3点に主に取り組んだ。1本研究では、体性感覚野の神経活動を数mmオーダーで、包括的に観察することが出来るマクロ顕微鏡と、細胞レベルで観察することが出来る2光子顕微鏡の2種類の顕微鏡を使用する。そのため、それぞれの顕微鏡の対物レンズ下で、麻酔状態を維持したマーモセットを観察するためのマーモセット専用の観察台を開発した。22光子顕微鏡ではμm単位の観察を行うために、微細な個体の動きも大きな影響を受ける。そのためそれらの動きを減弱するための手術方法を確立した。3神経細胞の活動をモニターするためのカルシウムインジケーターを、神経細胞特異的に発現誘導するための手法を確立した。これらにより、麻酔状態における神経活動を観察することに成功した。しかしながら、神経細胞の活動は麻酔下と覚醒下とで大きく異なることが報告されている。そこで平成27年度では、さらに覚醒状態で観察するための手法の開発を行った。1覚醒状態の個体を、拘束するための固定装置の開発。この固定装置の特許を現在申請中である。2固定装置にてマーモセット個体が拘束された時に、動きを減弱させるための馴化トレーニングの開発。これらにより、覚醒状態の神経細胞の活動を観察することが可能になった。この手法を利用し、足(裏と甲)、太もも、尻尾に対して電気刺激を加えた時の、大脳皮質体性感覚野のどの領域が活性化するのかを、マクロ顕微鏡により、刺激部位の違いによる、刺激応答領域の違いを明確にし、さらに2光子顕微鏡によりその活動領域内の神経細胞の活動を覚醒状態で会観察することに成功した。現在、本研究結果の論文を投稿している。本年度は交付申請書に記載した「研究の目的」に対して、おおむね順調に進展することができた。本年度における、本研究の目的と計画は、マーモセットの神経細胞を、2光子顕微鏡により生きたまま可視化し、それら神経細胞の活動を観察することができる方法や技術を確立することであった。

この点において我々は、それら技術を開発することにより、脳内の神経細胞の3次元画像を取得し、神経活動を観察することに成功している。したがって、申請書に記載している本年度の計画とほぼ一致した進展状況であるため、計画の達成度は「おおむね順調に進展している」と考えている。本研究で作製した、マーモセットの固定装置は現在特許出願の手続きを行うところです。神経科学本年度の研究事業により、2光子イメージングに必要な基盤技術の確立や機器の開発に成功した。これらの技術を基に平成27年度からは神経細胞活動を観察することにより、霊長類の神経活動の基礎的な知見を蓄積する。その後、既に樹立されているパーキンソン病モデルマーモセットの神経活動を野生型と比較し、疾患発症メカニズムの解明をめざす。パーキンソン病モデルマーモセットは非トランスジェニックモデルであり、MPTP(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine)を皮下に投与することにより黒質線条体経路のドーパミン神経の脱落と、ヒトのパーキンソン病の主症状である震戦や無動などの表現型を示すことが知られている。そのため、パーキンソン病治療薬の薬効評価のモデルとして、現在、製薬企業などにも利用されている。一方、ヒトのパーキンソン病の治療では脳深部に刺激電極を埋め込み、装置周囲の神経細胞を刺激するDeep-brain-stimulation (DBS)法が知られているが、その治療効果は黒質線条体経路へ投射する大脳皮質神経への影響によることが最近明らかになった(Gradinaru et.al. 2009 Science)。そのため、パーキンソン病の発症メカニズムの解明に向けて、大脳皮質の神経細胞がどのような変化をしているのかを明らかにすることは非常に重要である。そこで我々はこのモデルマーモセットの大脳皮質神経細胞の動態を2光子イメーイング法を用いることにより調べ、パーキンソン病の発症メカニズムの解明を目指し、かつ治療薬や治療法の開発に役立てたいと考えている。
森林火災煙の移流と凍土層の融解が北方林の栄養塩循環やオゾン放出に及ぼす影響の解明

森林火災由来のエアロゾル沈着は北方林での栄養塩循環に重要とされている。地球温暖化に伴なう火災の増加は北方林の炭素収支や生育に影響していると仮説を建て,観測的データと既往モデルの改良により明らかにしようとした。Alaska大学内クロトウヒ保護林の観測タワーに多段式フィルター装置を設置し,火災煙の移流に伴う乾性沈着量を測定した。2014年度に集中観測し,2015年度は収集したフィルタの分析と火災煙の通過コースなどの解析を行った。微量栄養塩の沈着量は火災煙が観測サイトに達する流蹟線の場合に大きくなること,濃度が低いため2週間に一度しか沈着量を評価できず,定常的な評価は困難であることがわかった。植物の生長は窒素や微量栄養塩の可給性に大きく影響される。凍土上に分布する北方林植生では栄養塩循環が遅いため微量栄養塩供給が生育の制限因子となっている。一方,北方林では夏季の森林火災で放出される栄養塩を含む火災煙が森林に沈着することで生態系への窒素や微量栄養塩の供給として重要と考えられるが,定量的には未解明である。本研究は温暖化に伴う北方林の生育や炭素収支へ影響解明の基礎研究として,北方林植生における窒素および微量栄養塩の沈着と森林火災煙の移流との関係,ならびに凍土層融解に伴う窒素酸化物放出とオゾン放出の関係を解明する。アラスカ大学構内の永久凍土に生育しているクロトウヒ林に設置されたフラックス観測タワー(UAFサイト)を利用して,多段エアロゾル粒子捕集フィルターにより,窒素および微量栄養塩(ここでは,無機硫黄成分,アルカリ金属およびアルカリ土類金属)の沈着量を測定した他,オゾン分析計と窒素酸化物分析計を新規に設置し,ガス態の濃度を連続観測した。連続観測から森林火災煙の移流の有無を特定し,移流がある場合を過渡的な負荷状態として集中観測する計画であったが,2014年夏季は降雨の多い湿潤な気候であったため,UAFサイトへの火災煙の到達がなかった。このため清浄空気状態と負荷状態の比較測定はできなかったので,次年度も観測を試みる。森林火災煙の移流が北方林の栄養塩の沈着に及ぼす影響を,過去のデータから解析し,アラスカ内陸部の火災が栄養塩循環に影響していることを確かめた。現在論文投稿中である。オゾンの重要な前駆物質である窒素酸化物をリースした分析計で測定した。しかし,火災煙移流が無かったため,詳細は把握できなかった。永久凍土地帯の高緯度生態系では土壌圏からの栄養塩加給性に制約があるため,栄養塩の動態が生育を律速するとされている。一方,北方林では森林火災の発生件数と規模が地球温暖化に伴なって増加しており,これら森林火災由来のエアロゾルや微量栄養塩の生態系への沈着は,北方林での栄養塩循環に影響していると考えられた。そこで,火災煙の生態系への沈着が北方林の炭素収支や生育に影響しそれが温暖化の進展に伴って変化しているとの仮説をたてて,観測的データと既往モデルの改良により,これらを明らかにしようとした。森林火災に伴う微量栄養塩の沈着と火災煙の移流との関係を明らかにするために,Alaska大学キャンパス内クロトウヒ林のフラックス観測タワーに設置した多段式フィルター装置で火災煙に含まれるエアロゾルなどをサンプリングした。2014年度に集中してフィルタの収集を行ったが,火災煙が観測サイトに直接の到達することは少なかった。2015年度は常駐観測が困難となったので,フィルタ装置によるサンプリングはせず,これまでに収集したフィルタの分析と火災煙の通過コースなどの解析を行った。フィルタから求めた微量栄養塩の沈着速度は火災煙の移流が観測サイトに達する流跡線の場合に大きくなることがわかった。フィルタ分析から得られる絶対的な濃度が小さいため,2週間に一度の沈着速度しか出せないことがわかり,火災煙の到達毎に微量塩の沈着量を定量的に評価することは困難であることがわかった。定性的には妥当な結果が得られたが,当初挑戦課題とした火災煙に含まれる微量栄養塩の加給量を求めるまでにはいたらなかった。申請予算に比べて研究費配分が少なかったので,予定を変更してレンタルで窒素酸化物を測定する分析計を導入した。しかしながら,2014年度はアラスカが異常気象年で降水量が多く湿潤だったため,火災煙が観測サイトまで到達せず,初期目標としていたデータを取得できず,リースにより観測を行った。リース期間終了後の2014年10月に測器を返却したので,2015年度は測定の予定がない。挑戦的研究であるが故に,異常気象のためとはいえ,期待したデータを確保できなかったことは残念である。

しかし,Alaskaにおいて, CASTANETなど,火災煙の捕集やその分布に関するデータを集めることができたので,これらを用いて,2015年度のとりまとめに活用する予定である。微気象本研究は,2014,15年度の2カ年間の実施計画であるが,2015年度の予算が限られるので,現地観測は非常に困難である。一方,2014年度はアラスカが異常気象年で降水量が多く湿潤だったため,火災煙が観測サイトまで到達せず,初期目標としていたデータを取得できなかった。このため,得られているデータを元に,凍土層融解開始時のオゾン生成と前駆物質との関係についてまとめ,年度末に行われる国内学会(生態学会や日本農業気象学会)で成果を発表する。さらにフィルター捕集の分析を連携研究者の協力の元に進め,その結果を利用して,可能な範囲で森林火災煙の移流と窒素成分・微量栄養塩の沈着の関係をまとめ,年度末までに「森林火災煙移流が北方林の栄養塩沈着に及ぼす影響」として論文化し,学術誌に投稿,公表する。本研究は2014年度ot2015年度の2年間の実施計画である。しかしながら,2015年度予算は2014年度に比べて,非常に少額であり,海外での研究を継続することが困難と思われた。底で,購入予定の窒素酸化物分析計をレンタルの分析計で3か月間のみ測定し,節約した資金を2015年度に繰り越すこととした。2015年度もできるだけ,現地アラスカ大学に出張し,データ収集,試料収集に努める。
生体リズムによる多細胞体構築原理の理解

発生分化過程で細胞は生体分子を基本構成要素とし、自発的に組織化し秩序形成することで、全体の形を作り上げていく。細胞性粘菌の発生分化過程では、分化誘導初期に約6分からなる転写のオン・オフの生体リズムが生じていること、また、このリズムは多細胞体形成に必須であることがわかっている。本研究では、生体リズムを特徴とする多細胞体構築プロセスを理解する目的で、1)生体リズムを制御する因子の動態解析、2)タンパク質のリン酸化状態を可視化するプローブの開発、3)生体リズムの操作を行った。1)に関しては、転写因子に着目し細胞性粘菌のすべての転写因子のイメージング解析を行った。その結果、多細胞体構築の初期段階で約6分という短い周期で核局在化を示す新たな転写因子を同定した。この転写因子では、シグナル刺激後1, 2分でタンパク質の分子量の増加が起こるが、約5分後には元の分子量へ戻るという翻訳後修飾が観察された。2)に関しては、プロテインキナーゼ(PKB)の基質タンパクがリン酸化されると、蛍光タンパク質の立体構造が変化し、蛍光輝度が増減するプローブの開発を進めた。リンカーの長さや膜局在化を促進するなど複数のコンストラクトを試したが、シグナル刺激後の蛍光輝度の変化は数%しか観察できず、効率的なプローブの開発には至らなかった。3)に関しては、光センサータンパクを細胞内に組み込むことで、細胞内シグナル伝達経路の活性化を試みた。その結果、多細胞体構築過程で光刺激を用いることで、任意の領域に生体リズムを発生させることに成功した。以上の結果は、短周期の生体リズムにより多細胞体が構築する仕組みや原理の理解につながると期待される。これまで生細胞内で転写動態を長時間可視化する「遺伝子発現動態計測技術」を開発し、未分化状態では無秩序な振る舞いに見える遺伝子の転写動態が、発生分化が進行するに伴い細胞集団で同調的なリズムを生み出しながら多細胞体構築する様子をとらえることに成功した。そこで、多細胞体構築プロセスのダイナミックな振る舞いについて、その生体リズムを制御する因子の動態解析をDictyostelium細胞を用いて実施している。今年度は、まず多細胞体構築開始段階で転写制御因子のイメージング解析を行った。ここでは、ゲノム中に存在する162種類の転写制御因子の発現株を作製し、発生分化過程でのイメージング解析を行った。現在までに約半数を超えるその発現株について解析が終了している。その結果、周期的に局在変化を示す転写因子が発見されたほか、発生分化過程で局在変化を示す転写制御因子が同定された。引き続き、残りの発現株の解析を実施している。次に、リン酸化タンパク質の動態解析について、予定していた1リン酸化が恒常的なタンパク質、2リン酸化が増加するタンパク質、3リン酸化が減少するタンパク質をリン酸化抗体により同定することができた。また、このうちそれらのリン酸化を触媒するタンパク質キナーゼも明らかにすることができた。リン酸化タンパク質の解析について効率よく実験計画が進行したため、来年度に予定していたリン酸化タンパクの蛍光プローブ開発に着手している。現在までに、複数のコンストラクトを用いた検討を行っている。転写制御因子の解析では、予定されていたゲノム中に存在するすべての解析が完了していない。しかし、これまでに解析した中から周期的な局在変化を示す転写因子が見つかるなど、興味深い結果が得られている。また、リン酸化タンパク質の動態解析については、すでに次年度予定していた研究計画を実施中である。遺伝子の転写がオン・オフを繰り返す様子を長時間可視化するシステムを用い、未分化状態では無秩序な振る舞いに見える転写動態が、発生分化が進行するに伴い細胞集団で同調的なリズムを生み出しながら多細胞体構築する様子をとらえてきた。現在、この生体リズムを制御する因子を理解するため、周期的な局在変化を示す転写因子の同定を行うとともに、周期的な変化を生み出すシグナル伝達経路のタンパク質のリン酸化状態を可視化するプローブの開発を進めている。多細胞体構築過程での転写因子のイメージング解析の結果、作製した155の発現株の解析が終了し、その中から約6分という短い周期で核ー細胞質間を行き来する転写因子を発見した。この局在変化には、転写因子における約6分おきのリン酸化と脱リン酸化が関与しているのではないかという可能性を示唆する結果が得られている。さらに、周期的局在変化を示す別の転写因子や周期的なオン・オフを繰り返す遺伝子の転写との同時イメージングを行うことで、この生体リズムの特徴の解析を行っている。リン酸化タンパク質の可視化では、プロテインキナーゼB(PKB)の基質タンパクがリン酸化されると、蛍光タンパク質の立体構造が変化し、蛍光輝度が増減するプローブの開発を進めてきた。リンカーの長さや膜局在化を変えた複数のコンストラクトを用い、リン酸化刺激後の蛍光輝度の変化を解析したところ、現在のところわずか数%しか変化が見られず、効率化には至っていない。多細胞体構築過程での転写因子の解析によって、周期的局在変化や約6分おきのリン酸化と脱リン酸化という興味深い結果が得られた一方、リン酸化タンパクの蛍光プローブ開発では、期待された効率は得られていないため。