hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞内カルシウムの新規調節因子環状ADPリボースの脳における代謝と機能

cADPRの代謝に関する基礎研究として、弱いながらもcADPRの合成活性を示すヒト細胞表面抗原CD38にZn^<2+>を添加すると、その合成活性約4倍に増加することを見出した。本年度の結果を踏まえてさらに基礎研究を進めるとともに、cADPRが神経伝達物質である可能性の検討やヒトの精神神経疾患患者(アルツハイマー病、精神分裂病)とcADPRとの関連を調べる予定である。私たちは先に、レチノイン酸によるHL-60細胞の好中球への分化過程にNADアーゼが誘導され、この酵素活性がリンパ球表面抗原のCD38分子によることを明らかにした。CD38はアメフラシの卵精巣より単離されたADPリボース環化酵素と構造上類似し、さらにその生成物である環状ADPリボース(cADPR)は、IP_3と同様にある細胞内プールからCa^<2+>を放出させる作用、あるいはその調節因子として機能することが期待されている。本研究では、細胞内Ca^<2+>濃度を調節しうるcADPRの脳機能における役割を明らかにすることを目的とし、ラットを用いて脳内cADPRの局在や代謝に関する基礎検討を中心に行った。私たちが確立したcADPRのラジオイムノアッセイ(RIA)法を用いて、cADPRラット脳内の分布を調べたところ、大脳皮質、海馬、線条体、中脳、小脳、橋、延髄、脊髄の各部にcADPRが一様に存在している(150-200pmol/g tissue)ことが判った。この脳組織のcADPR量は肝臓などの様々な抹消組織(20-50pmol/g tissue)に較べて3-5倍多く、cADPRの脳組織での重要性がうかがえた。またラット大脳皮質を細胞膜、細胞質、シナプトゾーム分画等に分画すると、大脳皮質cADPRの約40%がシナプトゾーム分画に回収された。これらのことより、cADPRが神経伝達物質である可能性も考えられた。またヒト死後脳のcADPR量は齧歯類の脳内含量より2-3倍高い傾向が見られた。またcADPRの代謝に関する基礎研究として、弱いながらもcADPRの合成活性を示すヒト細胞表面抗原CD38にZn2+を添加すると、その合成活性約4倍に増加することを見出した。さらに、ヒト死後脳のcADPR量を精神神経疾患患者(精神分裂病、アルツハイマー病、血管性健忘症、パーキンソン病)に関して調べたが、現在のところこれらの疾患では対照と較べて優位な差異は測定されなかった。
感染初期における細胞の抗ウイルス応答の選択

これまでにRNAウイルス刺激の模倣刺激である二本鎖RNA刺激後24時間のマウス胎児期線維芽細胞(MEF)において、I型IFN産生細胞とアポトーシス細胞が異なる細胞集団であることを示してきた。さらに、これまでに1細胞から増殖させたクローン集団においてもI型IFN産生集団とアポトーシス集団という異なる2つの集団に分かれることを示してきた。このことからたとえ遺伝的に均一な細胞集団においてもI型IFN産生集団とアポトーシス集団という2つの集団に分かれることが示唆された。しかし、たとえ均一なクローン集団においても、一部の細胞でどちらかの応答を選びやすいといったバイアスがかかっていた可能性が考えられる。そこで、二本鎖RNA刺激後にI型IFNを産生した細胞をFACSで単離し、二度目の二本鎖RNA刺激を行った。すると二度目の二本鎖RNA刺激に対しても一度目の刺激と同様の割合でI型IFN産生細胞とアポトーシス細胞が現れた、さらに一度目にI型IFNの産生もアポトーシスも誘導しなかった細胞集団を単離して、二度目の二本鎖RNA刺激を行っても一度目と同様の割合でI型IFN産生集団とアポトーシス集団に分かれた。これらの結果から、どちらの応答を誘導するかはあらかじめ決まっているわけではなく、確率論的なプロセスが関与する可能性が考えられる。さらに実際のウイルス感染においてもI型IFN産生集団とアポトーシス集団に分かれるのかを調べた。MEFに対して水泡性口内炎ウイルスを感染させたところ、この場合もI型IFN産生集団とアポトーシス集団に分かれた。この結果から実際のウイルス感染においても2つの集団に分かれることが示された。今回用いたtiterでは、ウイルスのtiterが高いほどI型IFN産生集団の割合が高かった。この結果からウイルスのtiterが抗ウイルス応答の選択に影響を与える可能性が示唆された、28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。これまでウイルス摸倣刺激後24時間後の細胞でI型IFNを産生する細胞とアポトーシスを誘導する細胞が異なることが観察されていた。しかし、アポトーシスのみを選択したと思われる細胞が観察前に一過的にI型IFNを産生してレポーターであるYFPを発現していた可能性が考えられる。そこで、I型IFN産生性細胞とアポトーシス誘導細胞をタイムラプス観察したところ、この場合もI型IFNを産生した細胞群とアポトーシスした細胞群が異なることが観察された。では、ウイルス感染模倣刺激に対して「I型IFNを産生する細胞」と「アポトーシスする細胞」は、それぞれいかなるメカニズムでその応答を選択しているのだろうか。ひとつの可能性は、用いた細胞がそもそもヘテロな集団であり、その中で役割分担しているというモデルである。もうひとつの可能性は、例え全く同じ種類の細胞であっても、応答性の異なる細胞群が存在するというモデルである。後者のモデルを検証するために、MEFをクローン化して用いた。するとクローン細胞においても、I型IFN産生細胞とアポトーシス誘導細胞が分かれるという結果が得られた。このことから同種の細胞の中でも2つの細胞群に分かれるという後者のモデルが存在する可能性が示唆された。では、この違いを産み出すメカニズムは細胞間相互作用に基づくのか、それとも細胞自律的に決まっているのだろうか。まず、前者の可能性を検証するため、I型IFNの産生とアポトーシスの誘導のうち、一方の応答を阻害したときにもう一方の応答を誘導する細胞の割合が変化するかを調べた。すると、一方の応答を阻害するともう一方の応答を誘導する細胞の割合が減少することが示された。これらの結果から、I型IFN産生細胞とアポトーシス誘導細胞がお互いに影響しあいながらそれぞれの応答を誘導する細胞の割合を決定していることが示唆された。この可能性について検証するためにI型IFN産生性細胞とアポトーシス誘導細胞をタイムラプス観察したところ、この場合もI型IFNを産生した細胞群とアポトーシスした細胞群が異なることが観察された。平成27年度は、この実験以外にも本当に細胞がI型IFNの産生とアポトーシスの誘導を使い分けているのかさらに検証していた。その結果、同種の細胞においても、細胞がI型IFNの産生とアポトーシスの誘導を使い分けていることがさらに示唆された。平成27年度は計画通りにこの抗ウイルス応答を使い分けるメカニズムについても検証を行ってきた。抗ウイルう応答を使い分けるメカニズムとして、細胞間相互作用によって細胞が応答を決定する可能性と、細胞自律的に応答が決まっている可能性が考えられた。平成27年度は細胞間相互作用と細胞自律的な要因の両方の観点から、いくつかの分子に注目して、使い分けのメカニズムを検証してきた。まだ完全にメカニズムを解明できた訳ではないが、使い分けのメカニズムに迫る実験を行ってきた。年次計画では平成27年度中に抗ウイルス応答のメカニズムを解明することを目指していたが、メカニズムについてもある程度検証できたため、おおむね順調に進展していると評価した。

これまでにRNAウイルス刺激の模倣刺激である二本鎖RNA刺激後24時間のマウス胎児期線維芽細胞(MEF)において、I型IFN産生細胞とアポトーシス細胞が異なる細胞集団であることを示してきた。さらに、これまでに1細胞から増殖させたクローン集団においてもI型IFN産生集団とアポトーシス集団という異なる2つの集団に分かれることを示してきた。このことからたとえ遺伝的に均一な細胞集団においてもI型IFN産生集団とアポトーシス集団という2つの集団に分かれることが示唆された。しかし、たとえ均一なクローン集団においても、一部の細胞でどちらかの応答を選びやすいといったバイアスがかかっていた可能性が考えられる。そこで、二本鎖RNA刺激後にI型IFNを産生した細胞をFACSで単離し、二度目の二本鎖RNA刺激を行った。すると二度目の二本鎖RNA刺激に対しても一度目の刺激と同様の割合でI型IFN産生細胞とアポトーシス細胞が現れた、さらに一度目にI型IFNの産生もアポトーシスも誘導しなかった細胞集団を単離して、二度目の二本鎖RNA刺激を行っても一度目と同様の割合でI型IFN産生集団とアポトーシス集団に分かれた。これらの結果から、どちらの応答を誘導するかはあらかじめ決まっているわけではなく、確率論的なプロセスが関与する可能性が考えられる。さらに実際のウイルス感染においてもI型IFN産生集団とアポトーシス集団に分かれるのかを調べた。MEFに対して水泡性口内炎ウイルスを感染させたところ、この場合もI型IFN産生集団とアポトーシス集団に分かれた。この結果から実際のウイルス感染においても2つの集団に分かれることが示された。今回用いたtiterでは、ウイルスのtiterが高いほどI型IFN産生集団の割合が高かった。この結果からウイルスのtiterが抗ウイルス応答の選択に影響を与える可能性が示唆された、本研究において骨髄由来マクロファージやマウス胎児期繊維芽細胞において抗ウイルス応答の使い分けが存在する可能性が示唆された。そこで、これらの細胞以外の細胞でも抗ウイルス応答の使い分けが存在するかを確認するために、脳や心臓、上皮といった様々な組織の様々な細胞にウイルス模倣感染を行い、それぞれの抗ウイルス応答を示す細胞の分布を観察する。また、細胞種ごとの分布の違いを比較し、細胞種と選択する抗ウイルス応答の違いから、抗ウイルス応答の使い分けの意義をさらに検証する。さらに、抗ウイルス応答を使い分けるメカニズムを解明する。少なくともMEFについては、クローン化した集団においてIFNを誘導する細胞とアポトーシスする細胞が分かれるという結果を得ている。従って、同種の細胞集団であっても応答の違いを生み出すメカニズムが存在する可能性が考えられる。クローン化したMEFにウイルス感染しても、ある一定の割合で「IFN産生細胞」と「アポトーシス細胞」が観察された。では、抗ウイルス応答の違いを生み出すメカニズムは細胞間相互作用に基づくのか、それとも細胞自律的に決まっているのかについて検討する。平成27年度の研究によって、2つの抗ウイルス応答のうち一方の応答を阻害した場合にもう一方の抗ウイルス応答を選択する細胞の割合が減少することが示唆された。この結果からそれぞれの抗ウイルス応答を誘導する細胞の割合が細胞間相互作用によって影響を受けることが示唆された。
有限要素法を用いた骨盤骨転移の骨強度予測スコアリングシステムの開発

骨転移の治療の目的は病的骨折や麻痺を予防・治療してADLを改善することである。転移性骨腫瘍により骨盤の骨折を生じるリスクが高い切迫骨折の患者に対しては、免荷を指示することが多く、部位的な性質もあり四肢と比較すると骨折を生じる患者は少ない。このように骨折事例が少ないことが、骨折のリスク因子を明確にすることを困難にしている。さらに、単純レントゲン像では検査の感度が低いこと、形状が複雑なこと、手術が容易に行える場所ではないこと、などが理由で、これまで骨盤転移による骨折リスクや手術適応の指標が存在していなかった。そこで、これらの問題点を解決する方法として、我々は有限要素法を用いることとした。有限要素法とは、骨のCT画像を元に、骨密度を持った3mm大の四面体要素(骨の表面は3mm大の三角形平板)から成る3次元の骨シミュレーションモデルを作成し、このモデルに対して仮想的に力を加えることで、立体構造の強度や骨折部位を予測する方法であり、共同研究者である別所cadaverを用いた実験によってその精確性を証明している。平成30年度は、転移性骨盤腫瘍をもつ患者のCTデータをDICOMデータとして有限要素法解析ソフトに取り込み、健常側をもとに正常骨盤モデルを作成した。仙腸関節を拘束し恥骨結合は水平方向のみに拘束した条件で、股関節の臼蓋に体軸方向に荷重をかけて、荷重のかかり方を検証している。また、条件によってどの様な変化が生じるのかを解析し、最適な荷重モデルを検討している。予想としては股関節臼蓋と仙腸関節をつなぐ範囲に荷重がかかるものと想定しているが、現在は、予想通りの荷重のかかり方と考えられた。有限要素法の解析用ソフトのライセンス契約の問題で、使用できるタイミングが遅れてしまい、コンピュータの購入、設置に時間を要した。患者データの取得は順調に進んでいる。本年度は、荷重拘束条件を詳細に詰めた上で、荷重のかかり方の詳細な解析を進める。その後、正常骨盤に腫瘍を模した欠損を作成し、どの部位に欠損があると骨折を生じやすくなるのかを検証する。さらに、実際の骨盤骨転移患者のCTデータを用いて、腫瘍の位置・大きさだけでなく、性状による強度の違いも検証する。転移性骨腫瘍は溶骨像や造骨像、これらの混合像を呈することがあるが、溶骨像は骨強度が弱く造骨像が強いと考えて良いのかを確認する。また、がん種による骨強度の違いに関しても検討する。これらのデータをもとに、位置や大きさ、腫瘍の種類や性状によるリスク因子の候補を挙げる。コンピューター及びソフトの購入費が予定よりも低額であったことで、物品購入費が抑えられたため。来年度は関連した論文投稿(英文校正や投稿料)および学会発表での使用額が増額する見込み。
高融点金属間化合物における拡散の研究

(1)金属間化合物の拡散で最も多くの研究がなされてきたのはB2型であり、その拡散機構としてSix-Jump Vacancy CycleモデルやTripleDefectモデルが提案されてきた。一方、L1_2型金属間化合物に関しては、これまで構成原子の両元素の拡散係数が測定された系はなかった。我々は^<63>Niおよび^<68>Geの放射性同位元素が共にトレーサーとして利用できることに注目し、L1_2型金属間化合物Ni_3GeにおけるNiとGeの拡散係数を測定した。その結果、Niの拡散係数D_<Ni>はD_<Ge>よりも30倍も大きいことが見い出された。このように、major elementがminor elementよりも速く拡散する傾向は、最近、D0_3型のFe_3Siなどでも見い出されている。(2)もし、1元素のトレーサー自己拡散係数D_Aと熱力学的因子φが既知であり、さらに相互拡散係数D_<AB>を測定すれば、Darkenの式を用いて、もう一方のトレーサー自己拡散係数D_Bの大きさを見積もることができる。我々はこのようなアプローチで、L1_0型金属間化合物TiAl単相、D0_<19>型金属間化合物Ti_3Al単相、B2型金属間化合物CoTi単相における相互拡散の測定を行った。本研究では、TiAl単相中での相互拡散係数の温度依存性を測定した。KnollらのTiの自己拡散の結果に近い値であり、平野らによる多相相互拡散係数とは大きく異なる。多相相互拡散は非平衡過程であり、また、界面効果が大きいなどの理由からintrinsicな拡散係数とは見なせないだろう。(3)D0_<19>型金属間化合物Ti_3Al単相での27at%Al合金と34at%Al合金との拡散対による測定結果に関して、24at%Al合金と34at%Al合金との拡散対の場合は、濃度分布が誤差関数に従わない。このことは相互拡散に顕著な濃度依存性のあることを示している。(4)B2型金属間化合物CoTi単相における相互拡散の測定結果は、van Looらによる多相相互拡散係数とは大きく異なっている。以上のことから、従来の多相相互拡散実験から決定された相互拡散係数は、intrinsicな拡散係数ではないと考えられる。
台風の巨大化に対応できる沿岸災害予測法の開発

研究の実績として、下記の1.5.に掲げる成果が得られ世界の学科に発表および予定である。1.先に開発した改良型換算波エネルギー法を1950年以降最も勢力の強い台風9918号による被害規模の予測に適用し、沿岸被害の予測法として有意義であることをInternational Journalにて発表した。2.先に開発した改良型マグニチュード法を用いて台風9918号による被害の程度を予測し、1.と同様予測法の有効性について水情報学に関するニュヨークで開催された国際会議にて発表した。3.先に開発した改良型マグニチュード法を用いて、台風9918号の経路の変化およびその位置において台風来襲地点の被害の予測を行い、その予測が避難警報においての有意性について論じ、有効性を明らかにした。4.地球の温暖化により台風の規模が巨大化することが一般的に議論されている。この研究においても、温暖化を前提として「台風の巨大化に対応できる災害予測法の開発」を研究テーマとして進めて来た。しかしながら、巨大化に対応できる予測法の開発とともに温暖化に伴って台風が巨大化しているのかを明らかにすることと共に、予測法の開発を進める必要がある。そこで、地球気候変動に基づいて台風の中心気圧を用いた沿岸域の脆弱性についての研究成果をAGU Fall Meetingにおいて発表した。5.さらに、ボストンで開催予定されているASCEの国際会議において、地球温暖化による台風気象変化に伴う沿岸への影響についての成果について発表予定である。なお、新しい予測法を開発中である。研究実績として、下記の1.4.に掲げる成果が得られ世界の学会に発表した。1.先に開発した改良型中心気圧法を用いて1950年以降最も勢力の強い台風9918号による被害の予測に適用し、沿岸被害の予測法として有意義であることを実証した。2.先に開発した改良型換算波エネルギー法を用いて、1.と同様に台風9918号に適用し、この予測法が有意義であることを明らかにした。3.先に開発した改良型最大風速法による避難警報システムが、沿岸住民にとっての有効性について明らかにした。4.1951年から2010年までの気象データを用いて、地球温暖化が台風の規模に影響が出ているかについて論じ、その成果の一部について発表した。また現在、本研究の課題である「台風の巨大化による災害への影響」の核心を進めるために、1900年以降最も発達した1945年の枕崎台風による被害についての予測結果を発表した。さらに、25年度の研究成果として5.6.に掲げる成果を世界の学会で発表することが決定されている。5.改良型マグニチュード法による予測を用いて、台風9918号に適用し、この予測法が有意義であることを明らかにすることになっている。6.改良型マグニチュード法が避難警報システムにおいて、有効であることを明らかにすることになっている。以上により、これらの開発された予測法は、台風の襲来に対する事前対策において沿岸住民にとって極めて必要な情報源であり、沿岸に住む地域住民の安全確保のための避難対策と経済的損失を最小限にするための情報として、さらに沿岸の堤防、海岸・港湾構造物、沿岸施設などの設計における情報として必要不可欠である。気象庁の長期の台風に係わるデータが、戦争や気象観測技術などの影響により未整備であるので、補完のための作業に時間を要している。その他は概ね達成されつつある。気象庁の台風データの不備を補完するためのデータの掘り起こし、天気図の解析研究を実施する。これらによって、研究課題である予測法の開発とその精度を高める。したがって、開発そのものは達成されると思われる。もし課題があるとすれば、データの掘り起こしに多大の時間を要すること、予測精度が落ちることである。翌年度の使用予定額が大きくなることが予測されるため、使用額を節約したことによる。気象庁のデータが未整備のため、資料整理に係わる学生への謝金に使用する計画である。
齲蝕象牙質の細管侵入細菌におけるスクロース代謝の動的解析

プラークならびに象牙細管中に生息する細菌における糖代謝経路の動的変化を解析することは,象牙質齲蝕の発症と進行機序を解明する上で重要な課題である。申請者らは,Streptococcus mutansを懸濁した培養液中でウシ象牙質板を連続培養し,培養途中で条件(スクロース濃度・温度およびpH)を変化させた際,象牙質板に付着したS.mutans)各種糖代謝関連酵素の遺伝子(glycosyltransferaseB/C/DおよびdextranaseAの遺伝子であるgtfB/C/D geneおよびdexA gene)の発現量がどう変化するのかを,semiquantitative RT-PCRにより検索した結果,以下の所見を得た。すなわち,1.象牙質板に付着したS.mutans(以下,付着細菌)のgtf遺伝子群(gtfB/C/Dgene)およびdexA geneの発現量は,浮遊したS.mutans(control:以下,浮遊細菌)のそれよりも多い傾向がみられ,特にgtf C geneの発現量が最大であった。2.培地の温度を37°Cから42°Cへ上昇させた場合,各gtfおよびdexA geneの最大発現量に達する時間は付着細菌の方が早かった。3.作製した齲蝕象牙質モデルにおける象牙細管径の増大率の解析から,GTFCの重要性が明らかとなった。以上のことから,S.mutansは付着状態において培地の条件変化(環境変化)に対してより早く対応し,特にGTF Cは付着状態でのグルカン合成および象牙質齲蝕の進行において,重要な役割を果たしていることが示唆された。また酸性環境下では菌体外グルカンの分解を促進することでエネルギー源として再利用し,菌体の生理活性の維持を図っていることが推察された。申請者らは,Streptococcus mutansを懸濁した培養液中で象牙質板を連続培養し,培養途中で条件(温度およびpH)を変化させた際,象牙質板に付着したS.mutansの各種糖代謝関連酵素の遺伝子(glycosyltransferaseB/C/DおよびdextranaseAの遺伝子であるgtf B/C/D geneおよびdexA gene)の発現量がどう変化するのかを,semiquantitative RT-PCRにより検索した結果,以下の所見を得た。すなわち,1.象牙質板に付着したS.mutans(以下,付着細菌)のgtf遺伝子群(gtf B/C/D gene)およびdexA geneの発現量は,浮遊したS.mutans(control:以下,浮遊細菌)のそれよりも多い傾向がみられ,特にgtf C geneの発現量が最大であった。3.培地のpHを7.5から5.5へ低下させた場合,浮遊細菌のgtf gene発現量は上昇し10分後には最大となったが,付着細菌においては逆に低下傾向を示した。またdexA geneは付着細菌において時間と共に増加傾向を示した。以上のことから,S.mutansは付着状態において培地の条件変化(環境変化)に対してより早く対応し,特にGTF Cは付着状態でのグルカン合成において,重要な役割を果たしていることが示唆された。

プラークならびに象牙細管中に生息する細菌の糖代謝経路の動的変化を解析することは,象牙質齲蝕の発症と進行機序を解明する上で重要な課題である。申請者らは,S.mutansのグルカン合成に関与するGTFB/C/Dをコードする遺伝子(gtfB, gtfC, gtfD)を欠失させた遺伝子改変株を用いてウシ人工齲蝕象牙質を作製し,培地のスクロース濃度を変化させて連続的に培養した場合の,グルカン合成に関わる酵素の遺伝子発現あるいは付着グルカンの合成量を解析すると共に,細管への細菌侵入に伴う形態学的変化について検索した結果,以下の所見を得た。すなわち,1.親株であるS.mutans MTならびに欠失株であるS2株(gtfB(-))およびDE1株(gtfD(-))において,スクロースの濃度に関わらず,gtfCの発現量が最大であり,GTFCのグルカン合成過程における重要性が示唆された。2.gtfB遺伝子はスクロースの有無に依存して発現しているのに対し,gtfC, gtfDはスクロースの影響を受けず,高栄養状態でのグルカン合成にgtfBが重要な働きをしていることが示唆された。3.スクロース濃度の低い状態では,付着非水溶性グルカンが増加したが,gtfC欠失株のみ,その増加を認めず,gtfC遺伝子がスクロース非依存的に発現することが示唆された。4.S.mutans MT, S2株およびDE1株で培養した象牙質試片においては,培地へのスクロース添加により,細管径の増大率が有意に増加したが,R4株(gtfC(-))では有意に増加しなかった。これは,R4株が他の菌株よりも脱灰能力が低下していることを示し,象牙質齲蝕における細管の拡張,すなわち脱灰に関わるグルカンの合成にgtfC遺伝子が重要な役割を担っていることが示唆された。
生体膜と電場との相互作用に関する総合的研究

細胞を電場によって操作する技術(電気穿孔法、誘電泳動法、電場融合法等)は、細胞生物学の各分野においてきわめて重要な技術になりつつある。本研究は、この技術のそこに横たわる「生体膜と電場との相互作用」を、基礎と応用の両面から総合的に解明することを第一の目的とした。更に、これまでに未開拓であった種々の細胞現象に対する電場効果を調べることを第二の目的とした。主な研究成果を箇条書にする。(1)パルスレ-ザ-顕微鏡という新しい機器を開発し、これを用いて、細胞電気穿孔過程をマイクロ秒の時間分解能、マイクロメ-トルの空間分解能で解析した。その結果、穿孔は、誘起膜電位が閾値を越えると1マイクロ秒以内に起きることが分かった。脂質膜でも同様の現象が観察され、特に直径数マイクロメ-トルの大きな孔の形成も見られたことは特筆するに値する。(2)新しい型の電気融合法用及び電気穿孔法用電源を開発した。(3)電気的細胞融合の機構、電気穿孔により生じた孔の修復機構を検討した。その結果にたって、いくつかに細胞系において、細胞融合あるいは遺伝子移入のための至適条件を確立し、標準実験法を作製した。(4)細胞のみならず生体膜小胞をも電気的に融合させ得ることを見出し、生体膜小胞を巨大化させる条件を調べ、他の巨大化法と比較検討した。(5)生体膜の構造形成に関する静電場の効果を調べるために、脂質膜に対して塩基性ペプチド(メリチン)を導入し、膜の表面電荷密度を変化させた。その結果、メリチンの膜破壊活性は表面電荷密度に大きく依存することが示された。超音波測定により、膜破壊の際に膜のゆらぎが以上に増大することが示された。以上の結果は、細胞膜・脂質膜における構造形成機構に対して重要な知見を加えると共に、細胞操作技術の基盤を与えるものである。桐野:新型パルス発生装置を製作し、生体膜ベシクルを融合させ巨大化ベシクル調整した。これにより、これ迄不可能であった種々の電気生理学的手法をベシクル膜に対して適用することができるようになった。稲葉:哺乳類細胞への遺伝子導入の諸条件を検討し、簡便で効率の良い標準的な方法を確立した。この方法により、生理活性のあるコスミドDNAの導入も可能であった。葛西:電気穿孔法によって形成された孔の修復に対する各種イオンの効果を調べた。Ca^<2+>はリンパ球に対して有効であることを示唆する結果が得られた。岡田:新型の高電圧・低インピーダンスの矩形波パルス発生装置を開始し、これを用いて、骨髄腫細胞への大型遺伝子の移入を行った。高収率移入に成功し、新しいタンパク質を産成するpermanent cell lineが得られた。木下:パルスレーザー蛍光顕微鏡のサブマイクロ秒撮像能を生かして、外部電場による細胞膜電位誘起及びその結果としての細胞電気穿孔現象を調べた。電気穿孔は誘起膜電位が約1Vという國値に達すると1μs以内に起きること、孔の修復も1ms以内の速い現象であること、などが分った。中西:蛍光顕微鏡像の画像処理装置を試作し、T細胞の細胞内Ca^<2+>の動態を単一細胞レベルで追究した。電場によるT細胞間相互作用の制御を行ない、上記装置との組合せについて検討した。美宅:質膜ーメリチン系でpHと塩濃度を変えていったところ、特定の条件下、メリチンが特異的な構造をしている時々に膜破壊活性が高いことを見出した。

吉岡:GH_3細胞を用い、高K^+刺激時の細胞内Ca^<2+>濃度を測定し、同時にCa^<2+>電流を測定した。その結果、細胞内Ca^<2+>濃度上昇には、L型チャネルが寄与していることが分った。班会議:8月末に、班員に加えて相当数のゲストを関連分野から招き、3日間にわたって合宿形成の班会議を開催して、十分な意見交換を行った。昨年度に続いて、細胞を電場によって操作する技術(電気穿孔法、誘電泳動法、電気融合法等)について、直接観察による検討をすすめると共に、これまで未開拓であった種々の細胞現象に対する電場効果を調べる手法を開発し、いくつかの興味深い知見を得た。主な研究成果を箇条書にする。(1)パルスレ-ザ-顕微鏡という新しい機器を開発し、これを用いて、細胞電気穿孔過程をマイクロ秒の時間分解能、マイクロメ-トルの空間分解能で解析した。その結果、穿孔は、誘起膜電位が閾値を越えると1マイクロ秒以内に起きることが分かった。脂質膜でも同様の現象が観察され、特に直径数マイクロメ-トルの大きな孔の形成も見られたことは特筆するに値する。(2)電気的細胞融合の機構を検討し、内因性チオ-ルプロテア-ゼが関与していることを見出した。(3)電気穿孔法による遺伝子移入の至適条件を検討し、効率のよい標準実験法を確立した。(4)電気穿孔により細胞膜に生じた孔の修復機構を検討し、これが二価金属イオンにより加速されることを見出した。(5)起電性イオンポンプであるH^+-ATPase及びCa^<2+>-ATPaseの能動輸送機構の電気生理学的解析を行うため、プロテオリポソ-ムからリン脂質平面膜に組み込む方法を開発し、起電性の直接的証明、外部電場の影響、速度論的解析を行った。(6)リポソ-ム中において、チュ-ブリンを重合させることにより、突起を持つリポソ-ムを形成できた。同様のリポソ-ムに高周波電場を印加することによりリポソ-ムの変形を起こすことができた。(7)直径100nm程度の膜小胞の融合過程を、電流、容量、画像の同時計測により実時間で測定するシステムを開発した。また、ヘルパ-T細胞が抗原提示細胞により活性化される際の細胞内カルシウム動態と膜電位変化を同時計測する手法を開発した。こうして、広範な細胞現象に対する電場効果を追究する方途が開かれた。
ナノ結晶の空間的な外場制御によるマルチ機能ガラス材料の創製

最終年度である平成21年度の目標を、「ガラス等をベースとするマルチ機能材料の創製と革新機能性の評価」として実施し、次に示す成果を得ることが出来た。(1)特異な配向構造と発光特性を有する酸化亜鉛を含有するナノ結晶化ガラスの開発:多様な電子・光機能性を示す酸化亜鉛(ZnO)について、ガラス中にナノ結晶として析出させることで、ガラス-結晶の界面準位や非平衡酸素欠陥などの可変的な導入が期待される。これは、例えばナローギャップ化による発光特性の拡幅など、さらなる高機能性化の実現につながる。この目的の元に、ある種のガラス系を前駆体とし、結晶化処理条件を最適化することによってZnOが単相で析出し、かつ50%以上の体積分率を有する従来にはない半導体含有結晶化ガラスを得ることに成功した。この結晶化ガラスは、熱処理条件や局所的なレーザー加熱、さらには外部印加電場による結晶化処理に依存して高い結晶配向性を示し、また単結晶等に比べて長波長領域にブロードな発光特性を示す。これらは局所的な外場制御により発現した特異な形態や光物性であることが示唆され、新規なガラスベースのマルチ機能材料につながる基盤的な成果が得られたといえる。(2)酸化亜鉛薄膜の極性制御による1D/2D分極反転構造の形成と第二高調波発生:従来例に比して波長領域が格段に広い非線形光学素子への応用を目指して、分極反転構造を有するZnO薄膜を用いて、非線形光学特性の評価を実施した。1次元および2次元分極反転構造に特有の入射光角度成分に対して位相整合により振幅増幅された高調波発生を確認した。特に2次元分極反転構造は、これまで報告されている誘電体結晶の場合と比較して、およそ一桁以上の微細化が可能となり、より高機能・多機能な素子展開が期待される。平成19年度の目標を「レーザー局所結晶化及び外場制御に好適なナノ結晶化ガラスの探索と基本実験」として実施した。レーザー局所結晶化法として、紫外レーザーを用いてガラスの光学吸収端近傍を励起する方法を採用し、ナノ結晶化を呈するガラスの候補材料として、酸化チタンおよびテルル結晶を析出する系を選択し、以下の成果を得た。1,世界初の発見となる酸化チタンを選択的に単相として析出するナノ結晶化ガラスに対して、加熱補助による外場制御に加えて、紫外パルスレーザー照射を実施し、基板表面に直径数十から数百nmのナノ結晶粒子を高密度で生成・形成することに成功した。これは、通常の均一熱処理ではこれまでには発現しない結晶相・形態であり、パルス加熱と光子効果によって時間制御されたガラスの結晶化挙動に起因すると考えられる。ガラスと結晶という異相からなる新しい表面ナノ構造の手法として、光触媒能の増大や表面プラズモン効果の発現など、多様な展開が期待される。2,上記と同様のレーザー局所結晶化法により、テルライト系ガラスから直径数十nmのテルル結晶が析出することを見出した。アーバック則による光学吸収端の解析やパルス加熱の熱伝導解析によって、この場合のテルル・ナノ結晶析出は、主に熱的な要因に起因することを明らかにした。さらに位相マスクを用いた光干渉法によって、テルル・ナノ結晶の配列構造形成に成功し、ナノ光回路への適用を目指して、時間領域差分法による光波シミュレーションから、光伝搬損失を低減するナノ粒子連結構造の最適化を行った。平成20年度の目標を「外場による結晶化挙動の制御とファイバ型デバイスの創製」として実施し以下の成果を得た。1.光吸収剤(遷移金属元素:約1モル%)を含む特殊なクラッド構造を有する光ファイバに対して、レーザー光を用いた空間選択的な手法により、ファイバの一部のみを結晶化させることに成功した。これは、結晶固有の電気光学効果に起因する外部電圧による屈折率変化をガラス・ファイバ内に生じさせ、光ファイバのコアを伝搬する光波の位相や強度などの可変制御が可能であることを示しており、ガラスの腑形性と結晶のアクティブな光波制御性を併せ持つ、マルチ機能光ファイバ型素子開発につながる世界初の成果である。この結果は、著名な欧州光通信会議(ECOC)におけるポストデッドライン論文の一つとして採択され、国際的にも高く評価された。今後、伝搬損失の低減や動作電圧の改善など、実用化に向けてさらなる開発が期待される。2.局所的な光結晶化の手法について、簡便性や量産性の観点から高価なレーザーに代わる光源として赤外ランプを選択し、その光結晶化の可能性を確認した。レーザーを用いた光結晶化においては、主に光→熱変換により局所結晶化が生じていると考えられる。従って、本技術の広い普及や利便性を考慮すると、光源として必ずしもレーザーが最適とは限らない。今回、市販されている安価な赤外ランプを用いて、光吸収剤を含有するガラスを照射したところ、ガラス表面近傍における結晶化を確認することが出来た。ガラス試料は透明性を保持したまま結晶化を生じさせることが可能であり、レーザー光源の場合に比べて極めて簡便な局所光結晶化が実現できることを示した。

これは、例えばナローギャップ化による発光特性の拡幅など、さらなる高機能性化の実現につながる。この目的の元に、ある種のガラス系を前駆体とし、結晶化処理条件を最適化することによってZnOが単相で析出し、かつ50%以上の体積分率を有する従来にはない半導体含有結晶化ガラスを得ることに成功した。この結晶化ガラスは、熱処理条件や局所的なレーザー加熱、さらには外部印加電場による結晶化処理に依存して高い結晶配向性を示し、また単結晶等に比べて長波長領域にブロードな発光特性を示す。これらは局所的な外場制御により発現した特異な形態や光物性であることが示唆され、新規なガラスベースのマルチ機能材料につながる基盤的な成果が得られたといえる。(2)酸化亜鉛薄膜の極性制御による1D/2D分極反転構造の形成と第二高調波発生:従来例に比して波長領域が格段に広い非線形光学素子への応用を目指して、分極反転構造を有するZnO薄膜を用いて、非線形光学特性の評価を実施した。1次元および2次元分極反転構造に特有の入射光角度成分に対して位相整合により振幅増幅された高調波発生を確認した。特に2次元分極反転構造は、これまで報告されている誘電体結晶の場合と比較して、およそ一桁以上の微細化が可能となり、より高機能・多機能な素子展開が期待される。
CMV抵抗性遺伝子産物RCY1と宿主タンパク質からなる分子複合体の構造と機能解析

キュウリモザイクウイルス黄斑系統[CMV(Y)]に対する抵抗性を制御している抵抗性遺伝子RCY1は、CC(Coiled-coil)-NB(Nucleotide binding)-LRR (Leucine-rich repeat)ドメインを有するタンパク質をコードしている。同タンパク質の機能と、相互作用する宿主タンパク質について解析を行ったところ、(1)CMV(Y)罹病性C24変異体の解析から、RCY1タンパク質内のCC、NBS、LRRの各ドメインが、その機能に必須である、(2)RCY1タンパク質を細胞内で発現させると自発的細胞死が誘導されるが、分割した各ドメインを共発現させた場合、ドメイン間の相互作用や自発的細胞死が誘導されない、(3)RCY1によるCMV(Y)抵抗性は、RCY1タンパク質の蓄積量によって特異的に制御されており、その蓄積量により抵抗性の強度が決定される、(4)RCY1タンパク質と相互作用する宿主タンパク質として、43kDaタンパク質と'GHKL'ATPaseモチーフを有するNTPaseが同定された。これらの結果は、抵抗性タンパク質RCY1の機能解明に新規な知見を提供するものと考えられる。抵抗性遺伝子RCY1(CC-NBS-LRRドメインをコードする)を持つシロイヌナズナC24は,キュウリモザイクウイルス黄斑系統[CMV(Y)]に対して抵抗性を誘導する.RCY1タンパク質とCMV(Y)抵抗性について解析を行ない,以下の結果を得た.RCY1タンパク質側からのアプローチ:(1)CMV(Y)罹病性C24変異体8ラインのRCY1の塩基配列解析の結果,4ラインはLRRドメイン,1ラインはCCドメイン,3ラインはNBSドメインに変異が生じており,各ドメインがRCY1の機能に必須であることが明らかになった.(2)RCY1を形質転換した罹病性シロイヌナズナは,すべてCMV(Y)抵抗性を示したが,その程度は形質転換ラインで異なっていた.また,(3)細胞内におけるRCY1タンパク質の動態を把握するため,HAタグを付加したRCY1をコードするベクター(HA-RCY1)を構築し,HA-RCY1の一過的発現系およびHA-RCY1を安定的に発現する形質転換体(Col::pRCY1-HA)を作出した.両実験系とも,HA-RCY1タンパク質が高感度に検出されたことから,RCY1分子複合体の機能解明に着手する準備が整った.次に,(4)Co1::pRCY1-HAラインを用いて,CMV(Y)抵抗性とRCY1タンパク質の蓄積量の関係を解析したところ,抵抗性の強度とHA-RCY1の蓄積量に正の相関が認められた.以上より,CMV(Y)抵抗性は,健全状態のRCY1量により制御されていると考えられた.RCY1タンパク質と相互作用する宿主タンパク質側からのアプローチ:ALSVベクターを用いて,RCY1のノックダウンを行った.RCY1のサイレンシングによるノックダウンとともに抵抗性の消失が確認できた.今後,同ベクターはRCY1タンパク質複合体解析のツールとして利用できることが明らかになった.NB-LRRドメインを有するタンパク質をコードする抵抗性遺伝子Rcr1を持つシロイヌナズナは,キューウリモザイクウイルス黄斑系統[CMV(Y)]に対して抵抗性を誘導する. RCY1のmRNA量が高い植物は, CMV(Y)に対して細胞死の誘導を伴わない高度抵抗性を示し,抵抗性シグナル伝達系が常に活性化されている.本年度の研究では, HAタグを付加したRCY1-HAタンパク質を発現する形質転換体Co1 : : pRCY1-HAを複数ライン作出し, CMV(Y)抵抗性とRCY1タンパク質の蓄積量の関係について解析した.RCYI-HAタンパク質を高レベルに蓄積しているCo1 : : pRCY1-HAラインにCMV(Y)を接種すると,ウイルス増殖が完全に抑制されるほどの高度抵抗性を示したのに対して, RCYI-HAタンパク質が低レベルで発現しているCo1 : : pRCY1-HAラインでは, CMV(Y)に対する抵抗性が不完全になった.また、RCY1-HAタンパク質の発現レベルが両ラインの中間レベルのラインでは、CMV(Y)強さも中レベルとなり,抵抗性の強度とRCY1の蓄積量に正の相関が認められた.

さらに, RCY1-HAタンパク質を高レベルに蓄積するラインにおける他の病原体(P. syringae pv tomato DC3000や病原性CMV-B2系統など)に対する抵抗性を調べたが,いずれも野生型と同様の罹病性を示した.したがって, RCY1により制御されるCMV(Y)抵抗性は,植物の健全状態でのRCY1タンパク質の蓄積量によって特異的に制御されており,その蓄積量により抵抗性の強度が決定されると考えられた.抗HA抗体結合アガロースビーズを用いた免疫共沈実験により、RCY1-HAタンパグ質と複合体を形成する宿主タンパク質の候補を同定することができた.キュウリモザイクウイルス黄斑系統[CMV(Y)]に対する抵抗性を制御している抵抗性遺伝子RCY1は,NB(Nucleotide binding)-LRR(Leucine-rich repeat)ドメインを有するタンパク質をコードしている.本年度の研究では,HAタグを付加したRCY1タンパク質(RCY1-HA)を発現する形質転換体Col::pRCY1-HAを用いて,抗HA抗体結合アガロースビーズによる免疫共沈実験から,RCY1-HAタンパク質と複合体を形成する宿主タンパク質の候補を同定することができた.しかし,同タンパク質をコードする遺伝子の単離および,同遺伝子破壊植物を用いたRCY1タンパク質の機能確認までには至らなかった.一方,EMS処理による変異体のスクリーニングから単離された遺伝子CRT1は,'GHKL'ATPaseチーフを有するATPaseをコードしており,CRT1タンパク質はRCY1タンパク質と直接結合することが明らかになった.さらに,CRT1タンパク質とRCY1-HAタンパク質を植物細胞で一過的に発現させる実験により,CRT1タンパク質はRCY1タンパク質の安定性の制御を介して,CMV(Y)抵抗性に寄与している可能性が考えられた.また,CRT1タンパク質は,他のNB-LRR型抵抗性タンパク質とも相互作用することから,病害抵抗性タンパク質の機能発現において基本的な役割を果たしているものと推察された.
植物の発生、成長および分化におけるポリアミンの役割の解明

シロイヌナズナには5つのポリアミン酸化酵素遺伝子(Polyamine oxidase, PAO)の存在が知られ、AtPA01AtPA05と呼称されている。これまでの研究により、AtPA01AtPA04までの特徴づけがなされていた。本研究では、AtPA05の特徴づけと植物における生理的役割を明らかにすることを目的とした。組換えAtPA05酵素は酸性側(pH 6.5)ではサーモスペルミンを、よりアルカリ性側(pH 7.5)ではスペルミンを共にスペルミジンに変換する逆変換型の活性であること、従って、シロイヌナズナの5種のPAO酵素は全て逆変換型であること、を明らかにした。今年度、T-DNAの挿入によりAtPA05の機能を欠失した2つのシロイヌナズナ系統(Atpao5-1、Atpao5-2)を用いて、AtPAO5の機能に迫ることを試みた。野生株と比べ、Atpao5-1、Atpao5-2ではプトレシン、スペルミジンそしてスペルミン含量はほぼ同程度であったが、サーモスペルミン含量が約2倍となっていた。さらに、低濃度のサーモスペルミン含有培地に播種するとAtpao5-1、Atpao5-2の地上部の生育が阻害されることを見出した。根部の伸長には野生型との間に差異が見られなかった。この現象は、サーモスペルミン特異的であり、20倍量のスペルミン、200倍量のスペルミジンやプトレシン含有培地でも野生型との生育の差異は見られなかった。Atpao5-2に野生型由来のAtPA05遺伝子を導入した形質転換植物では、上記のサーモスペルミンによる生育阻害が回復することも確認した。Atpao5-1とAtpao5-2は、野生型に比べ栄養成長期から生殖成長期への移行が著しく遅れることも明らかにした。これらの知見は、サーモスペルミン代謝の重要性を強く支持する結果と言える。本研究課題は平成26年度が最終年度のため、記入しない。シロイヌナズナ植物には、5種のポリアミン酸化酵素遺伝子(AtPA01AtPA05と呼称)が存在する。これら5つの遺伝子がそれぞれ機能を失った植物体を確立してきた。それぞれの単一遺伝子欠損植物体を詳細に観察し、Atpao5欠損植物体が生育後期に茎の身長が著しく遅れることを見出した。野生株とAtpao5変異体のポリアミン組成を調べると、サーモスペルミンの含量のみが野生株の2倍となっていることを見出した。また、本遺伝子欠損個体種子を低濃度のサーモスペルミン含有培地に播種すると、地上部の生育が著しく阻害されることも見出した。根部の生育には、野生株との差を見ることができなかった。これらの現象は、Atpao5変異体に野生株由来のAtPAO5ゲノムDNAを導入すると相補されることも確認した。サーモスペルミン合成酵素遺伝子を欠損しているシロイヌナズナは茎伸長が著しく阻害されることが、他グループによって明らかにされている。この点を考慮すると、シロイヌナズナにおいてサーモスペルミン代謝は、厳密に制御される必要があり、合成そして分解のいずれが阻害されても茎の伸長阻害が起こることを明らかにしつつある。AtPAO5タンパク質の植物細胞内での局在部位、さらには大腸菌の系から精製した組換えAtPAO5につき、酵素化学的特徴づけも行い、シロイヌナズナの全てのポリアミン酸化酵素が逆変換反応型の反応様式をもつこと、試験管内では、サーモスペルミンだけでなく、スペルミンをスペルミジンに変換する活性をもつことも明らかとした。上記の内容をまとめた原著論文の改定稿を準備しているところである。

Atpao5-1とAtpao5-2は、野生型に比べ栄養成長期から生殖成長期への移行が著しく遅れることも明らかにした。これらの知見は、サーモスペルミン代謝の重要性を強く支持する結果と言える。本研究課題は平成26年度が最終年度のため、記入しない。シロイヌナズナのポリアミン酸化酵素5がサーモスペルミン特異的な酸化酵素であること、この遺伝子破壊株が生育後期に形態異常を示すこと、を明らかにした。しかし、学術論文の受理に至っていないことから上記の「区分」とした。学術論文の受理に向け、必要なデータを作成する。また、ドイツ国ゲーテ大学グループとの共同研究により、ポリアミン酸化酵素5が機能しないシロイヌナズナが示す形態異常の分子基盤を明らかにすることを、次年度の目標とする。
海底地震計の波形データを用いた巨大地震断層面の間隙流体圧推定

地震学では、地震波から地球内部の構造の情報を引き出すために、レシーバ関数解析よばれる手法がよく用いられるが、高周波帯域では計算(デコンボリューション)が安定しない。また、海底地震計で記録される地震波形データには、海面多重反射波が含まれているため、レシーバ関数解析の前提となる条件を満たさない。本年度は、前年度に引き続き、この問題を解決するための手法開発にあたった。新手法は、現代的な統計学の手法(リバーシブルジャンプマルコフ連鎖モンテカルロ)を利用しており、コンピューターの計算能力を駆使するものである。新手法によって、従来のレシーバ関数解析手法よりも正しく、高周波帯域かつ海底の地震波形記録でレシーバ関数を計算できるようになった。新手法についての論文が国際誌に採択されたほか、プログラムコードをWEB上に公開している。なお、ここまでの研究成果はブリティッシュ・コロンビア大学(カナダ)との共同研究となっている。新手法を用いて、沈み込み帯の巨大地震断層面近傍の地震波速度構造を明らかにするために、紀伊半島沖に設置されているDONET海底ケーブル地震計での解析に着手した。その結果、得られたレシーバ関数波形上で、巨大地震断層面に由来すると考えられる変換波を確認することができた。現在は、レシーバ関数波形に対してインバージョン解析を行うことで、地震波速度構造の推定を試みている。暫定的ではあるのものの、巨大地震断層面近傍に厚さ1 km程度の低速度層が存在することが分かってきた。また、日向灘に設置された海底地震計のデータに対しても同様の解析を始めている。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。沈み込み帯巨大地震断層面の摩擦特性は,断層面に沿った間隙流体圧に大きく左右されることが知られている.沈み込み帯に設置された海底地震計で記録される地震波形データには,巨大地震断層面に由来する変換波・反射波が含まれており,巨大地震断層面の間隙流体圧を知るための手がかりとなり得る.本研究では,海底地震計の波形データから,地震波速度不連続面に由来する反射波・変換波を抽出するための新手法を開発した.新手法は,マルコフ連鎖モンテカルロ法と呼ばれる手法を利用しており,従来の従来地震学で広く使われている手法(レシーバ関数解析)のように,観測点直下の地下構造に入射する地震波の形をあらかじめ仮定する必要がない.加えて,従来の手法と比べて,1.海面多重反射波が卓越する海底地震計でも正しい計算が可能,2.高周波帯域まで安定して計算が可能であり,空間解像度の向上が見込める,3.PP反射波が抽出可能であり,新たにP波速度構造を拘束できる見込みがある,4.誤差の推定が可能,といった長所を持つ.現在までに,理論波形によるシミュレーションを行い,新手法の有用性を確かめた.また,海底地震計の実観測データに適用した場合でも,もっともらしい結果が得られることを簡単に確認している.今後は,追加の検証を行い,手法を完成させる予定である.その後,完成された手法を各地の沈み込み帯に設置された海底地震計のデータに適用し,巨大地震断層面の間隙流体圧推定に役立てる.海底地震計のデータから巨大地震断層面由来の反射波・変換波を抽出するための新たな手法の開発に成功したものの,当初の計画より遅れており,平成29年度内の成果発表には至らなかったため.地震学では、地震波から地球内部の構造の情報を引き出すために、レシーバ関数解析よばれる手法がよく用いられるが、高周波帯域では計算(デコンボリューション)が安定しない。1.新手法の完成前年度までに,マルコフ連鎖モンテカルロ法に基づくブラインド・デコンボリューション法を考案した.理論波形でのシミュレーションにより,同手法の有用性が確認できている.次のステップとして,海底地震計の実データに適用した場合でも手法が正しく機能するかどうかを確認し,必要があれば手法の改良を試みる.結果がまとまり次第,国際誌に投稿,国内学会での発表を行う.

2.巨大地震断層面間隙流体圧の推定各地の沈み込み帯(西南日本・東北日本・ヒクランギ沈み込み帯・カスカディア沈み込み帯)のデータに新手法を適用し,巨大地震断層面に由来する反射・変換波を同定する.その後,波形インバージョン解析を行い,巨大地震断層面近傍の地震波速度構造を推定する.得られた結果と地質・岩石学の知識に基づき,巨大地震断層面の間隙流体圧の推定を試みる.研究成果を国際学会および国際誌にて発表する.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
異常タンパク伝播阻止に立脚した神経変性疾患の進行予防治療開発

本年度は(i)細胞内輸送とαシヌクレイン(aS)代謝および(ii) aS細胞間伝播に関する2課題に注力した。第一の課題では、エンドソーム分子DNAJC13遺伝子変異による家族性パーキンソン病(PD)の分子病態を検証した。同研究にて、ヒトN855S変異型DNAJC13発現ショウジョウバエにヒトaS遺伝子を共発現することで、複眼変性が顕著に増強されると共にハエ脳内にproteinase K耐性不溶性aS蓄積を生じること、またclimbing assayによる運動機能が低下することを確認した。培養細胞系を用いた検討では、変異型DNAJC13発現によりエンドソーム内にaSの異常蓄積を認めること、初期-後期エンドソーム/リサイクルエンドソームの輸送が障害さることを明らかにした。さらに、変異型DNAJC13陽性エンドソーム上では、アクチン骨格形成が阻害されるとともに、エンドソームへのRabタンパクリクルートメント異常が起こっていることを明らかにした(※現在投稿中)。もう一つの課題として、aS細胞間伝播のメカニズム解析を進めた。この過程で細胞外aSは細胞膜上のドパミントランスポーター(DAT)パーティションを変調させるとともに、エンドサイトーシスによる同分子の内在化・不活性化を誘導し、ドパミン神経機能に影響を与えていることを確認した。また、一部の細胞外aSはDATエンドサイトーシスに伴って細胞内へ取り込まれていることが確認された。(投稿準備中)。また、安定した線維化aS脳内接種を可能とする超音波印加装置を用いた改良型マウスモデルを作出し、先行実験で線維化aS細胞内取込阻害効果が確認されたセルトラリンの治療効果検証を進めている。28年度が最終年度であるため、記入しない。遺伝性・孤発性神経変性疾患において、病変部位における異常凝集タンパク沈着は病理学的指標であるばかりでなく、神経細胞死につながる重要なステップと考えられている。プリオン仮説は、PD患者脳におけるLewy病理のtopographic progressionとも論理的整合性を有する。一方、プリオン病と神経変性疾患の間には症状進行スピードや病理学的進展パターンの点で大きな隔たりがある。実際、分子・細胞レベルでみても変性疾患関連タンパクとプリオンの挙動には相違点が多く、個々の凝集性タンパクの生化学的特性、タンパクの高次構造、あるいは細胞のストレス状況によっても伝播機構が異なる可能性が指摘されている。故に、それぞれの凝集性タンパク毎に分泌・吸収・分解機構を精緻に解明することが今後の治療応用を考える上で不可避である。申請者らは異常タンパク伝播の背景にある膜輸送・小胞輸送系に早くから着目し、PD患者脳内に蓄積する凝集化αシヌクレイン(αS)の吸収・分泌・分解に関与する小胞輸送経路を詳細に渡り明らかとしてきた。これらの研究をさらに発展させるべく、本研究では各種神経変性疾患における異常凝集タンパク伝播現象の背景にある分子機構の詳細を明らかとする。具体的には(i)神経細胞におけるTau、TDP-43の吸収・分泌・分解メカニズム解明、(ii)家族性PD・ALS病態下における異常タンパク伝播への影響、(iii)細胞外核酸特にエキソソーム中microRNAを介した伝播現象の可能性の3命題にターゲットを絞り、動物モデルおよび髄液中microRNA (miRNA)などの患者由来生体試料を用いた多角的な病態メカニズム解析を進めると同時に、伝播阻害効果をもつリード化合物を探索する。本年度は以下の2つの研究に注力した。第一の課題として、ミスフォールド蛋白の品質管理におけるエンドソーム-リソソーム制御因子ESCRT分子の機能的役割を検証した。同研究にて、マウスにおける前脳特異的ESCRT-0/Hrs欠損が、αS、TDP-43をはじめとするユビキチン陽性蛋白蓄積を伴う海馬神経細胞の変性脱落を生じることを確認した。さらにPC12細胞を用い、Hrsサイレンシングがオートファジー分解を停滞させ、JNKおよびネクロトーシス促進分子RIPK1の活性化を介しERストレス誘導性細胞死を惹起することを確認した(Sci Rep, provisionally accepted)。もう一つの課題として、αS細胞間伝播のメカニズム解析を進めた。この中でDATのエンドサイトーシスがαSの細胞内取り込み促進することを発見した。またダイナミンGTPase阻害作用を有するセルトラリン存在下でαS fibrilの取込みが顕著に抑制されることを見出した。これらの知見をさらに発展させるべく、現在αS脳内接種マウスを用いセルトラリンの治療効果検証実験を進めている。さらに、変異型DNAJC13陽性エンドソーム上では、アクチン骨格形成が阻害されるとともに、エンドソームへのRabタンパク