hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
胃癌前癌病変であるテロメア短縮病変における遺伝子異常

胃癌においてテロメアが短縮することは広く知られている。非癌部胃粘膜におけるテロメアの変化と分布を検討すると、テロメアが短縮を示す局在性領域が認められ、テロメア短縮病変と名付けた。病理組織学的にはテロメア短縮病変はdysplastic metaplasiaの像を呈しており、腸上皮化生上皮におけるhigh risk lesionである可能性が考えられた。このテロメア短縮病変における特異的遺伝子変化を検討すると、CR-1 pseudogeneの一つであるTDGF-2の遺伝子欠失が高頻度に認められた。TDGF-2遺伝子産物はCR-1とNodalの相互作用を阻害しnegative regulatorとして作用した。TDGF-2欠失はCR-1-Nodal活性化をもたらしstem cell hyperplasiaを惹起すると考えられた。また、CYP2D6遺伝子の変異型がテロメア短縮病変に発現している可能性が認められ、発癌物質の代謝に変化が生じていることが考えられた。テロメア短縮病変は組織学的にはほとんどがdysplastic intestinal metaplasiaの像を示すことから、まず、腸上皮化生において変化を示す遺伝子を検討した。腸上皮化生で過剰発現する遺伝子としてcripto (CR-1, TDGF-1)を報告者はすでに報告しているが、この遺伝子のcDNAを用いてサザン法で遺伝子変化を検討すると2.2-2.4kbpのfragmentの欠失が癌周囲腸上皮化生粘膜と胃癌組織に認められる。一方、ホルマリン固定胃切除標本を全割し、ISHによりテロメア量を全粘膜について検討し検出されたテロメア短縮病変部からDNAを抽出しマイクロサテライト領域の変化を検討すると、2qに欠失が認められ、CR-1のpseudogeneであるTDGF-2の遺伝子座に近接する。そこで、TDGF-2に対するprimerを作成し同一症例のテロメア短縮病変、腸上皮化生粘膜、及び、癌部組織でTDGF-2遺伝子の変化を検討すると、テロメア短縮病変と癌部組織でTDGF-2遺伝子欠失が認められた。TDGF-2はfunctional pseudogeneとされRT-PCRでもTDGF-2特異的配列の発現が認められる。また、TDGF-1 (CR-1)はnodal (activin)と結合しES細胞のstemness維持に働くことが報告されている。報告者はTDGF-2のES細胞における意義について検討中である。腸上皮化生で過剰発現する遺伝子としてcripto(CR-1,TDGF-1)を報告者はすでに報告しているが、この遺伝子のcDNAを用いてサザン法で遺伝子変化を検討すると2.2-2.4kbpのfragmentの欠失が癌周囲腸上皮化生粘膜と胃癌組織に認められる。この欠損フラグメントをシーケンシングすると、昨年度研究実績で報告したTDGF-1が高い相同性を示したが、これとは別にCYP2D6との相同性を有するフラグメントも認められた。CYP2D6は、肺癌ではタバコ特異的ニトロサミンの活性化に関与するが大腸癌では低活性化型SNPを有する患者で、大腸粘膜内ATPase活性が高いとの報告がある。CYP2D6の非担癌胃粘膜における発現は全例で見られ、男性より女性で高く認められた。そこで、short telomere lesionが同定されたホルマリン固定胃切除全割標本でCYP2D6の発現を検討すると、short telomere lesionを含む腸上皮化生粘膜で発現はほぼ保たれていた。しかし、CR-1との相同性を示したフラグメントを用いてISHを行うと発現の低下が認められ、特に、short telomere lesionでは発現は非常に低かった。以上のことから、酵素活性の異なる変異型CVP2D6がshort telomere lesionに発現している可能性が考えられ、現在、詳細を検討している。本年度は、昨年度見出したテロメア短縮病変特異的な新規遺伝子異常であるCR-1 pseudogeneであるTDGF-2の遺伝子欠損について、その機能を中心に検討を行った。TDGF-2遺伝子欠損部位はCR-1や同じくintronless pseudogeneであるTDGF-3のcodingregionの全長を含む領域を欠損しており、CR-1やTDGF-3の機能との比較は困難と考えられた。また、TDGF-2近傍の遺伝子の検索を行ったが、遺伝子欠損範囲は小範囲であり、他に遺伝子は含まれてはいなかった。欠損部位のcodingregionのアミノ酸配列を検討すると、CR-1とTDGF

-2では、同じ領域に10数個のアミノ酸変異がありタンパク結合ドメインを含んでいる。このため、TDGF-2はCR-1と異なる機能を有する、あるいは、CR-1と競合阻害作用を有する可能性が考えられた。このためタンパク結合ドメインを含む約100アミノ酸領域をCR-1、TDGF-2について作成し、Noda1との結合性を検討した。すると、TDGF-2はNodalとの結合性を欠いており、CR-1とNodalとの結合性を部分的に阻害することが明らかになった。このことから、TDGF-2の欠損はCR-1-Nodal結合を促進し、stemnessの亢進を招くことが示唆された。これは、腸上皮化生、とくに、dycplastic metaplasiaにおいてstem cell hyperplasiaが生じているという観察によく一致する。TDGF-2遺伝子欠損は腸上皮化生由来胃発がんの重要な早期遺伝子変化と見なされた。
Piecemeal necrosisには特定のT細胞レパトアが関与するか -PCRによるVβ gene解析

我々は,自己免疫マウスにおいて肝臓のdouble negative T cellの増加することが共通の現象であることを見いだし報告したきた。ヒト肝臓においてもdouble negative Tcellが存在していわゆるautoimmune hepatitis以外のウイルス性肝炎においても自己免疫現象が関与している可能性があるものと推測してきた。ウイルス性肝炎ではspotty necrosisの部分にはウイルスが証明されるのに,門脈域周囲のpiecemeal necrosisの部位ではウイルスなど明らかな病原体は確認されていない。しかし,そこでは多数のTリンパ球が出現し肝細胞を破壊し肝炎の予後を決定している。前述の動物の結果と合わせpiecemeal necrosis部位には肝細胞に対する異常はT細胞の禁止クローンが重要な役割を果たしている可能性が示唆された。そこで,ウイルス性肝炎の病巣において特定のTリンパ球が出現しているか否かを検討するために,肝臓の生検材料を用いてリンパ球のモノクローナリティを検討した。当初,生検材料からmRNAを抽出しVβ遺伝子の検索をする予定であったが,検体が小さく十分な量の検体が得られず,免疫組織化学的に検討した。αβTCRスクーリングパネルの各種モノクローナル抗体を用いて特定のリンパ球が関与しているかどうかを検討した。本抗体はFACS用の抗体でなかなか十分な結果を得ることはできなかったが,肝細胞障害部に出現しているリンパ球はかなりheterogenousなものであることが推定された。これらのリンパ球の大部分はαβ型を示し,γδ型は少数であった。免疫組織化学法による検索となってしまったが肝炎において関与しているリンパ球には今回は必ずしも明瞭な特異なグループを確認できなかった。今後も検討を継続してゆくつもりである。我々のこれまでの研究の結果、肝臓類洞に添ってγδ-Tリンパ球などの各種リンパ球が内皮細胞に密着し存在し肝臓における免疫監視機構を担っているものと考えられる。これまでにもCD8陽性リンパ球などの重要性が指摘されてきたが、我々は自己免疫マウスにおいて肝臓のdouble negative cellが増加していることが共通の現象であることを見いだし、ウイルス性肝炎においてもDN-T cellが存在し、自己免疫が関与しているものと推測した。piecemeal necrosis部位では多くの場合明らかな病原体が証明されず、多数のリンパ球が認められることより肝細胞に対する異常なT細胞禁止クローンが重要な病態となっているものと考えられる。残念ながら現在までに、自己免疫マウスのVβ8の様な特定のレセプター遺伝子の異常は確認されていない。piecemeal necrosisが本当に自己免疫に関与しているものならばdouble negative Tcellを中心とした禁止クローンの異常リンパ球の出現が予測される。これら特定のTリンパ球レパトアの存在の有無を検討を試みた。そこでウイルス性肝炎を示す臨床症例のリンパ球のVβ遺伝子の利用状況を新鮮な肝臓生検材料を用いてノーザンブロッティング法で検討する予定であったが、mRNAを抽出するに十分な余分の肝生検を実施することが中々できずやむを得ず免疫組織化学法とin situ hybridization法を中心に検索することに方針に変更せざるを得なかった。piecemeal necrosisの期待される適当な可燃症例を採取の血直ちにPLP固定液にて固定し、凍結切片とし免疫組織化学法を用いてT細胞レセプターを検索すべく材料を集めている。免疫染色の抗体としてはαβTCRスクリーニングパネルの各種モノクローナル抗体群を用いて検討し始めている。しかし、本抗体はFACS用の抗体であり中々免疫染色により十分な染色結果が得られず、免疫染色条件設定に苦労している。自己免疫マウスにおいて、肝臓のdouble negative CD4^-8^-T-cellの増加することが共通の現象であることを見いだし報告してきた。ヒト肝臓においてもdouble negative Tcellが存在し、ウィルス性肝炎においても自己免疫現象が関与していると推測してきた。

ウィルス性肝炎では、spotty necrosisの部分にはウィルスが証明されるのに、グリソン鞘周囲のpiecemeal necrosisの部位ではウィルスは確認されていない。しかし、ここでは多数のTリンパ球が出現し肝細胞を破壊している。前述の動物の結果と合わせpiecemeal necrosis部位には肝細胞に対する異常なT細胞の禁止クローンが重要な役割を果している可能性が示唆された。そこで、ウィルス性肝炎の病巣において特定のTリンパ球が出現しているか否かを検討するために、肝臓の生検材料を用いてVβ遺伝子のモノクロナリティを検討を試みた。生検材料の小さな材料からは十分なmRNAが採取されず、αβTCRスクリーニングパネルの各種モノクローナル抗体群を用いて特定のリンパ球が関与しているかどうか調べた。本抗体はFACS用の抗体であり中々十分な染色性が得られなかった。材料の固定条件を未固定、あるいはPLP固定、電子レンジ固定、各種濃度のパラホルム固定を行ない検討したがいずれも信頼性のある十分な結果は得ることができなかった。免疫染色が必ずしもうまくいってはいないがかなりheterogenousなリンパ球よりなっているようではあった。piecemeal necrosis部に関与しているリンパ球はTリンパ球で、大部分はαβ型を示し、γδ型Tリンパ球は少数であった。肝炎の初期病巣と考えられるspotty necrosis部では比較的γδリンパ球が多いのに比べ対象的にαβ主体であった。炎症が進行して見られるpicemeal necrosis部ではこれらのTリンパ球からサイトカインを分泌しBリンパ球の分化増殖を誘導しこれらも関与しているものと考えられた。
各種グリコサミノグリカンの角膜疾患との関わりについての免疫組織化学的検討

マウス角膜および強膜のD-周期コラーゲン線維の表面トポグラフィーを原子間力顕微鏡を用いて観察し比較したところ、強膜に比べて角膜のコラーゲン線維では表面の凹凸が小さいことがわかった。ルテニウム・レッド染色によりプロテオグリカン(PG)ないしグリコサミノグリカン(GAG)の分布を調べたところ、マウスでは強膜に比べて角膜のコラーゲン表面に多く分布していることがわかり、このPGs/GAGsによって角膜のコラーゲン線維の表面の溝は埋められていることがわかった。また、ヒト角膜において、これらGAGと関わるPGとコラーゲン細線維の相互関係を調べる目的で、病理解剖でえられたヒト角膜をコンドロイチナーゼABCまたはケラタナーゼで消化処理し、その前後でのコラーゲン細線維の表面構造の比較を三次元的解析により行なった。コンドロイチナーゼABC処理では角膜のコラーゲンの表面構造に変化はなかったが、ケラタナーゼ処理ではコラーゲンの周期構造の溝が深くなり、角膜においてケラタン硫酸がコラーゲンの周期の溝を埋める形で存在し、これにより線維の等間隔性が保たれ、角膜の透明性に寄与していることがわかった。さらにヒト角膜実質の創傷治癒過程におけるケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸の動態を調べる目的で、全層角膜移植術後、移植片の内皮障害などにより再移植を行なった4例4眼よりえられた角膜組織を用い免疫組織化学的検討を行なったところ、ケラタン硫酸は全例において角膜組織全体、ことに上皮下に局在していた。コンドロイチン硫酸Cは全例において検出されず、コンドロイチン硫酸A構造は角膜の創傷治癒の早期の段階で発現がみられ、2年以上経過すると観察されなくなる。即ち、コンドロイチン硫酸A構造が角膜実質の創傷後の再構築に深く関わっていることが示唆された。ヒト角膜実質の創傷治癒過程におけるケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸の動態を調べる目的で、全層角膜移植術後、移植片の内皮障害などにより初回手術後7ヵ月、1年3ヵ月、2年10ヵ月、30年で再移植を行なった4例4眼よりえられた角膜組織を用い、抗ケラタン硫酸抗体、抗コンドロイチン硫酸C抗体、抗コンドロイチン硫酸A/C抗体を一次抗体とした免疫組織化学的検討を行なった。ケラタン硫酸は全例において角膜組織全体に分布していたが、ことに上皮下に局在がはっきりしていた。コンドロイチン硫酸A/Cは7ヵ月および1年3ヵ月後の再移植例での上皮下と患者角膜との接合部に局在していたが、2年10ヵ月および30年を経た移植片からは発現が認められなかった。一方、コンドロイチン硫酸Cは全例において検出されず、発現が認められたのはコンドロイチン硫酸A構造であり、この構造が角膜の創傷治癒の段階で深く関わっていることが示唆された。次に、ヒト角膜において、これらグリコサミノグリカンと関わるプロテオグリカン(PG)とコラーゲン細線維の相互関係を調べる目的で、病理解剖でえられたヒト角膜をコンドロイチナーゼABCまたはケラタナーゼで消化処理し、その前後でのコラーゲン細線維の表面構造の比較を三次元的解析により行なった。

マウス角膜および強膜のD-周期コラーゲン線維の表面トポグラフィーを原子間力顕微鏡を用いて観察し比較したところ、強膜に比べて角膜のコラーゲン線維では表面の凹凸が小さいことがわかった。ルテニウム・レッド染色によりプロテオグリカン(PG)ないしグリコサミノグリカン(GAG)の分布を調べたころ、マウスでは強膜に比べて角膜のコラーゲン表面に多く分布していることがわかり、これらPGあるいはGAGによって角膜のコラーゲン線維の表面の溝は埋められていることがわかった。本研究期間でさらに我々は角膜実質においてPGとともにVI型コラーゲンと共存してその透明性維持に関わっているタンパクβig-h3に着目し、その遺伝子βig-h3の変異に由来する格子状角膜変性症患者の臨床経過と所見を記録し、このVI型コラーゲンと共存するタンパクの異常によってもたらされる病態調べた。患者、家族へのインフォームドコンセントの上で遺伝子診断を行ったところ、本疾患の原因として通常言われているβig-h3遺伝子のコドン124の変異に加え、新たに518および527の変異に由来する格子状角膜変性症の家系が愛知県にあり、それぞれが異なった臨床病型を示すことがわかった。今後、格子状角膜変性症患者に加えて近年原因遺伝子が発見され、コンドロイチン硫酸の異常によって発症することが明らかになってきた斑状角膜変性症患者の臨床所見の記録からβig-h3とPGの角膜実質における役割と疾患への関わりについて明らかにしてゆきたい
走査型近視野顕微分光法による空間的閉じ込め励起子の研究

本研究では、ガラス中に分散した半導体微結晶中や、層状半導体中の2次元界面などを被測定物として、その評価と分光測定を行う走査型近視野顕微鏡の開発をおこなった。今年度に得られた成果は以下のとおりである。1.走査型近視野顕微鏡の心臓部である。プローブヘッド駆動部(ピエゾステージ)の製作を行い、その性能の評価をおこなった。その結果、x,y方向はおよそ12μm、z方向にはおよそ7μm、の範囲を独立に移動させることができ、その走査精度がおよそ4nm程度のピエゾステージを作ることが出来た。2.光学ステージやプリズム、レーザーなどの光学部品の整備を行い、上述のピエゾステージと市販のファイバープローブを組み合わせて、近視野顕微鏡を構成した。3.ステージのコントロールや、データ取り込みをおこなうソフトウェアーを開発し、近視野顕微鏡としての基本動作を確認した。4.近視野顕微鏡の性能の評価のため、光学プリズムの表面の2次元像を測定した。その結果、プリズムの仕様に対応した200nm程度の表面の凹凸が観測出来た。このことは、本装置のz方向の分解能が200nm以下であることを示している。5.空間的に閉じ込められた励起子系の例として、ガラスマトリックス中に分散した半導体微結晶の試料を作成し、高エネルギー研究所のフォトンファクトリーのSORを用いたX線散乱により半導体微結晶のサイズを決定した。今後、x,y方向の分解能の評価を行い、走査型近視野顕微鏡としての性能を押さえること、制御ソフトウェアー等を整備して、測定時間を短縮すること、また実際に走査型近視野顕微鏡を用いた分光を行っていくことを予定している。
大学における知的相互作用が学術研究および科学技術の革新に与える効果の定量分析

本研究は大学教員が実施する研究指導の効果を指導学生の研究成果の成長への貢献として定量化した.そのために学生の研究成果を指導教員の「質」と関連づけるセミパラメトリック付加価値モデルを導入し,研究指導の「質」の下限を推定した.本研究の特色は教員の研究指導効果を識別するために,定年退職・異動・死亡などを原因とする教員の離職に着目したことにある.研究指導環境の世代間の相違を擬似的な対照実験とみなすことで,教員離職による研究指導の「質」の変化が学生の研究成果の成長に与える影響を識別した.実証分析では,東京大学物理学研究者を対象に,その指導教員の研究指導効果を計測した.本研究では、大学における知的相互作用と知識のスピルオーバーの実態を理論的かつ実証的に解明することを目的とする。特に、研究者間の連鎖的な知的相互作用が生み出す知識のスピルオーバーが学術研究と科学技術の推進に与える定量的な効果を計測する。同時に、指導教員から指導学生に伝播する知識フローを数値化することで若手研究者養成に発揮される大学教員の教育的貢献を可視化して評価する。具体的に以下の2つのテーマに則して分析を進める。1研究者間の知識のスピルオーバーの計量分析:本研究では、研究拠点大学における相乗効果によって増幅された知識が、研究者間に拡散する速度と範囲を測定し、学術研究と科学技術の成果の質と量の向上に与える影響を定量化する。2教員から学生へ伝播する知識のスピルオーバーの計量分析:大学における知的相互作用は指導教員から指導学生への世代を超えた知識の伝播という形でも発現する。本研究では若手究者人材育成における大学教員の貢献度を博士号取得研究者の学術研究・科学技術の成果に対する生産性の上昇への寄与分として推定し、大学院教育における高度技術人材育成の有効性を可視化して評価する。本研究では、大学における知的相互作用と知識のスピルオーバーの実態を理論的かつ実証的に解明することを目的とする。特に、研究者間の連鎖的な知的相互作用が生み出す知識のスピルオーバーが学術研究と科学研究の推進にあたえる効果を計測する。同時に指導教員から指導学生に伝播する知識フローを数値化することで若手研究者養成に発揮される大学教員の教育的貢献を可視化して評価する。具体的に以下の2つのテーマに即して分析をすすめる。1研究者間の知識のスピルオーバーの計量分析:本研究では研究拠点大学における相乗効果によって増幅された知識が、研究者間に拡散する速度と範囲を計測し、学術研究と科学研究の成果の質と量の向上にあたえる影響を定量化する。2教員から学生へ伝播する式のスピルオーバーの計量分析:大学における知的相互作用は指導教員から指導学生への世代を超えた知識の伝播という形でも発現する。本研究では若手研究者人材育成における大学教員の貢献度を博士号取得研究者の学術研究・科学技術の成果に対する生産性の上昇の寄与分として推定し、大学院教育における先端的研究人材育成の有効性を定量的に評価する。本年度は1のテーマについて村田安寧教授(日本大学)と本研究課題の研究分担者である田村龍一特任助手(一橋大学)と共同研究を進め、近距離での知識のスピルオーバーの計測の精度を高めた局所的線形密度推定法を全米特許データに適用し、より適切な知識の局所化の程度の指標を計算した。この推定結果に基づき、現在ワーキングペーパーを執筆中である。2のテーマについては前年度作成したデータベースに基づき、大学教員の指導大学院生の研究成果の向上にあたえる付加価値を定量化した。これらの成果に基づき、北海道大学経済学研究科の菊地雄太助教との共同研究として、ワーキングペーパーを執筆し、日本経済学会秋季大会における特別招待講演で成果の一部を報告した。執筆したワーキングペーパーは国際的学術雑誌に近日中に投稿予定である。日本の大学の国際競争力強化にむけて、一部の研究大学に優れた研究者を集結させ、そこを組織的かつ戦略的な研究・教育のための「拠点」とするという取り組みが行われている。こうした「知の拠点」における研究者間の知的相互作用は、学術研究の発展と科学技術の革新にどのような影響を与えているのだろうか?本研究では、大学における知的相互作用と知識のスピルオーバーの実態を理論的かつ実証的に解明することを目的とする。同時に、指導教員から指導学生に伝播する知識フローを数値化することで研究者養成に発揮される大学教員の教育的貢献を可視化して評価する。本研究では、大学における知的相互作用と知識のスピルオーバーの実態を理論的かつ実証的に解明する。特に、研究者間の連鎖的な知的相互作用が生み出す知識のスピルオーバーを学術研究と科学研究の推進にあたえる定量的な効果を計測する。具体的に1研究者間の知識のスピルオーバーの計量分析:本研究では研究拠点大学における相乗効果によって増幅された知識が、研究者間に拡散する速度と範囲を計測し、学術研究と科学研究の成果の質と量の向上にあたえる影響を定量化する。また、2教員から学生へ伝播する式のスピルオーバーの計量分析:大学における知的相互作用は指導教員から指導学生への世代を超えた知識の伝播という形でも発現する。

本研究では若手研究者人材育成における大学教員の貢献度を博士号取得研究者の学術研究・科学技術の成果に対する生産性の上昇の寄与分として推定し、大学院教育における高度技術人材育成の有効性を定量的に評価する。本年度は1のテーマについて日本大学・村田安寧教授と本研究課題の研究分担者である田村龍一・一橋大学特任講師と共同研究を進め、近距離での知識のスピルオーバーの計測の精度を高めた局所的線形密度推定法を全米特許データに適用し、より適切な知識の局所化の程度の指標を計算した。この推定結果に基づき、ワーキングペーパーを完成し、国際学会誌に投稿した。さらに投稿後得られた学会誌の編集者および査読者のコメントを受けて、論文の改訂を行った。この論文は新たなバージョンのワーキングペーパーとして慶応義塾経済研究所ワーキングペーパーシリーズとして公表予定である。本研究の目的は学術研究と科学技術における知識の集積拠点である大学における知的相互作用の実態を理論的かつ実証的に解明するというものである。これまで1研究者間の知識のスピルオーバーの計量分析と2教員から学生への知識のスピルオーバーの計量分析という二つのテーマに則して分析を実施してきた。研究内容1に関して言えば、昨年度までに、米国特許データを利用した研究者間の知識のスピルオーバーの計測を完了しており、その結果に基づき、近距離バイアスを低下させる新たな計量経済学的手法(局所線形密度法)の開発と提案を終えている。本年度はその研究成果のとりまとめを行いTesting forlocalization: Anew approachという題目の英文ワーキングペーパーを執筆し、国際学会誌への投稿を行った。研究内容2については、大学教員が実施する研究指導の効果を指導大学院学生の研究成果の成長への貢献として定量化した。そのために学生の研究成果を指導教員の「質」と関連づけるセミパラメトリック付加価値モデルを導入し、研究指導の「質」の下限を推定した。昨年度までに実施した研究により大学教員の研究指導は指導学生の研究業績の成長に無視できない影響を及ぼしているという研究結果を得ている。本年度はその成果を元にEvaluating Professor Value-added: Evidence from Professor and Student Matching in Physicsという題目の英文ワーキングペーパーを執筆し、その研究内容を欧州の大学セミナーと学会、および北米の学会で報告し研究成果を広く流布することにつとめた。さらに、報告時に得られた研究者との議論および、反応を下敷きに、分析内容をさらに深め、現段階では、査読付き国際学会誌へ投稿する準備をすすめている。本研究は大学教員が実施する研究指導の効果を指導学生の研究成果の成長への貢献として定量化した.
腎尿細管上皮細胞株LLC-PK_1における細胞外ATPによる細胞増殖と細胞死の調節

本研究課題は、腎尿細管上皮細胞株LLC-PK_1の増殖と死に対する細胞外ATPの調節の機構、特にその受容体との関わりを中心に明らかにしようと行った。最初に増殖に及ぼす影響を検討したところ、対数増殖期の細胞では細胞外のATPは、増殖を強く促進することが明らかになった。そこで、ATPに特異的に結合するプリン(P_2)受容体各サブタイプに選択的な誘導体の増殖促進能を比較したところ、P_<2z>受容体アゴニスト3'-O-(benzoyl)-benzoylATPが最も強い作用を示した。次に、各種蛋白リン酸化酵素阻害薬の影響を調べると、Ca^<2+>/カルモデュリンキナーゼII阻害薬KN-62に最も強い阻害作用を見出した。これらのことは、対数増殖期の細胞において細胞外のATPがP_<2z>受容体-Ca^<2+>/カルモデュリンキナーゼII活性化を介して細胞増殖を促進させることを示唆している。一方、単層上皮を形成し増殖を停止した細胞においては、細胞外ATPによる顕著な増殖促進作用は認められなかった。これは、コラーゲン処理した膜上に培養した細胞を用い頂膜側あるいは基底膜側から作用させた場合でも同様であった。そこで、本培養条件下血清飢餓によって引き起こされる細胞死に及ぼす細胞ATPの影響について乳酸脱水素酵素活性の細胞からの漏出を指標に検討した。その結果、頂膜側からのATP添加は血清飢餓によって引き起こされる細胞死にほとんど影響しなかったが、基底膜側から添加は細胞死を促進させた。このことは、増殖を停止した細胞において、基底膜上にプリン受容体が存在し、細胞死と関連していることを示唆している。本研究計画により、腎尿細管において細胞外のATPが細胞増殖ならびに細胞死の制御因子として機能することを示すことができ、細胞間情報伝達に関与する細胞外ATPの作用機序および生理的役割の一端を明らかにすることができた。
アルドステロン産生腺腫を基盤にした新規アルドステロン合成機構の解明

今日まで,約半数のアルドステロン産生腺腫の原因やアルドステロン合成機序は全く解明されていない.本研究では,未解明のアルドステロン産生腺腫のアルドステロン合成機序を解明し,本疾患の新規治療薬・診断薬の創薬,またアルドステロン合成阻害による降圧薬の創薬につなげることを目的とする.アルドステロン産生腺腫における新規アルドステロン合成機序を解明するため,アルドステロン合成機構が解明されていない(いわゆる,既知の遺伝子変異をもたない)腺腫を対象に網羅的遺伝子発現解析を行った.その対照としてアルドステロンを産生しない非機能性副腎皮質腺腫および遺伝子異常をもつアルドステロン産生腺腫(KCNJ5およびATP1A1)に対しても同様の遺伝子発現解析を実施した.過去の報告から,アルドステロン合成において細胞内カルシウムを増加させることや,細胞内カルシウム伝達機構が重要であることが報告されている.遺伝子変異をもたないアルドステロン産生腺腫において,細胞内カルシウムに関連した遺伝子発現を統計解析ソフトを用いて検索したところ,細胞内カルシウム調節に関わる複数の遺伝子が同定された.また,他の過去の報告から,アルドステロン産生腺腫に異所性G蛋白共役受容体(GPCR)発現がアルドステロン合成に関与することが報告されていることから,GPCRを標的にアルドステロン産生腺腫で発現する遺伝子検索も行い,複数の候補GPCRを同定することができた.続いて,高発現していた遺伝子のmRNAや蛋白発現量を確認するため,real time PCRや免疫染色で確認したところ,それらの発現がアルドステロン合成の律速酵素であるCYP11B2発現と強い相関があることやCYP11B2発現部位に染色されることを同定し,アルドステロン合成に深く関わっていると考えている.アルドステロン産生腺腫におけるアルドステロン自律合成の機序は不明であったが,近年,約半数の腺腫においてアルドステロン合成に関わる遺伝子変異を認めることがわかった.しかし,遺伝子変異を認めないアルドステロン産生腺腫におけるアルドステロン合成機構は全く解明されていない.本研究では,アルドステロン産生腺腫における未解明のアルドステロン合成機序を解明し,本疾患の新規治療薬・新断薬の創薬,またアルドステロン合成阻害による降圧薬の創薬につなげることを目的とする.アルドステロン合成機序が解明されていない(いわゆる,既知の遺伝子変異をもたない)腺腫を対象に網羅的遺伝子発現解析を行った.異所性G蛋白共役受容体(GPCR)発現がアルドステロン合成に関与することが報告されていることから,GPCRを標的にアルドステロン産生腺腫で発現する遺伝子検索を行ったところ,アルドステロン合成に関与する可能性のある複数のGPCRを同定した.アルドステロンを合成する副腎皮質癌細胞株(HAC15)に対し,GPCR刺激薬を投与すると,アルドステロン合成酵素(CYP11B2)の発現は亢進し,アルドステロン合成が促進されることがわかった.さらに,レンチウイルスを用いて作製したGPCRの過剰発現モデルにおいても,CYP11B2の発現は亢進し,アルドステロン合成が促進されることがわかった.さらに,同因子の発現を抑制することにより,アルドステロン合成は減弱することを同定した.続いて,GPCRを標的にした刺激薬を使用し,ヒトにおけるアルドステロン合成促進作用の検討を開始した.遺伝子変異をもたないアルドステロン産生腺腫をもつ症例の一部において,本刺激薬によりアルドステロン合成が促進されることが分かった.また,既知の遺伝子変異をもつ症例においては,アルドステロン合成の促進は軽度であることも分かった.本研究における,昨年度の研究計画では,1In vitroにおいて,GPCRの調節薬によるアルドステロン合成に与える影響を検討すること,2In vitroにおいて,GPCR発現を調節した上で,アンギオテンシンIIによるアルドステロン合成に与える影響を検討すること,3In vitroにおいて,GPCRの遺伝子発現調節がアルドステロン合成に与える影響を検討することを予定した.1の「GPCRの調節薬によるアルドステロン合成に与える影響」ついては,上述のように,HAC15においてGPCR刺激薬を投与することで,アルドステロン合成が促進されることが分かった.さらに,アルドステロン合成を調節するステロイド合成酵素を検索したところ,アルドステロン合成の律速酵素であるCYP11B2が著明に上昇することもわかった.対象としたGPCRの拮抗薬や阻害薬が市販されていないことから,GPCRを負に調節する薬剤を使用しての研究の実施はできなかった.2に示す「アンギオテンシンIIとの関連を示す研究」は,遺伝子発現調節を行った細胞株での実施が好ましく,3の研究(HAC15におけるGPCR遺伝子発現調節)を終えているため,次年度に実施することとした.3の「GPCR遺伝子発現調節を行ったHAC15におけるアルドステロン合成」に対し,レンチウイルスにより遺伝子発現調節に成功した.GPCRを過剰発現したHAC15においては,アルドステロン合成が促進され,GPCRを抑制したHAC15においてはアルドステロン合成が低下した.各々,それらの調節はCYP11B2を介していることがわかった.さらに,当初は予定をしていなかったが,ヒトにおける解析を行った.アルドステロン産生腺腫を有する症例に,GPCR刺激薬を投与したところ,アルドステロン合成が促進された.一部の結果は当初予定した計画を上回って進行している.

原発性アルドステロン症はアルドステロン産生腺腫(APA)と特発性アルドステロン症(IHA)に大別される.APAにおいてカリウムチャネル(KCNJ5)やイオンポンプ(ATP1A1やATP2B3)などに遺伝子変異が同定され,それらがアルドステロン合成に関わっていることを我々は報告してきた.APA症例を対象に,腫瘍摘出前にGnRH刺激試験を実施したところ,GnRH刺激によるアルドステロン上昇率とGNRHR発現量に強い正の相関がみられた(r=0.726, P<0.001).また,GNRHRが発現するAPA-WTにおいてのみ,GnRH刺激によるアルドステロン上昇が顕著であった.HAC15(副腎皮質癌細胞株)にレンチウイルスを用いてKCNJ5 T158Aを導入し,in vitroにおいてKCNJ5の遺伝子異常がGNRHRに与える影響を検討したところ,GNRHR発現量はコントロールに比較し0.64倍と有意に低下していた(P<0.05).APAにおいて,GNRHRがアルドステロン合成に関与することが示唆された.特に,APA-WTにおいて,GNRHRを介したアルドステロン合成を認め,APA-WTにおけるアルドステロン合成の分子機序を解明する一助になると考える.本研究における,平成26年度の研究計画では,1アルドステロン産生腺腫や非機能性副腎皮質腺腫から腫瘍組織の抽出,2摘出した組織を用いてマイクロアレイ解析(網羅的遺伝子発現解析)を実施,3マイクロアレイ解析結果からアルドステロン合成に関わる新規因子の同定,を予定していた.1に示した,「アルドステロン産生腺腫や非機能性副腎皮質腺腫から腫瘍組織の抽出」に関しては,研究実績の概要に示したように,アルドステロン産生腺腫からアルドステロン合成酵素(CYP11B2)が発現する箇所を標的にmRNA抽出を行った.また,非機能性副腎皮質腺腫において,CYP11B2の発現がないことを確認した上で,mRNA抽出を行った.2に示す「摘出した組織を用いてマイクロアレイ解析を実施」についても,研究実績概要に示した通り,アルドステロン産生腺腫と非機能性副腎皮質腺腫の検体を用いて,マイクロアレイ解析による網羅的遺伝子発現解析を実施した.3に示す「マイクロアレイ解析結果からアルドステロン合成に関わる新規因子の同定」であるが,過去の報告や我々が独自に有しているマイクロアレイ解析の結果と比較解析することにより,アルドステロン合成に強く関わっている可能性のある複数の候補遺伝子を抽出することができている.さらに,その発現解析をreal time PCRや免疫染色などで確認している.つまり,当初予定した計画通りに研究が進展していると考える.1In vitroおよびIn vivo (ラット)における研究HAC15においてGPCRを調節した上で,アンギオテンシンIIによるアルドステロン合成に与える影響を検討する.この結果から,アルドステロン産生腺腫のみならず,正常の副腎皮質球状帯から合成されるアルドステロンの調節も解析することができる.低ナトリウム食で飼育したラット(アンギオテンシンII依存性の高アルドステロン血症を示す)において,GPCR発現を調節し血中アルドステロン値や血圧の変化を測定する.
人類学的特徴を加味した新しい復顔法に関する予察的研究

本研究は、現代日本人の解剖体やCT画像のデータをもとにして、顔面における皮膚の厚みを計測し、最新のコンピュータグラフィックス技術を用いて、古人骨の三次元的な復顔を行う方法を検討するものである。本年度は、最終年度に当たるので、これまで得られたCT画像、古人骨の三次元データ、解剖体の皮膚の厚みおよび鼻根部の形態の基礎的データについて整理した。また、現代人を標準的な縄文系のグループと標準的な渡来系弥生人系のグループに分け、それぞれの顔面画像を撮影し、眼、眉毛、耳、鼻、口唇などの顔面部品を作製した。実物の古人骨から得られたUVWファイノレの三次元データにっいては、ウェブなどで公開するには充分の解搬を撒ていた。昨年度からの検討課題であった正確なポリゴンデータ収集については、撮影方法等にも工夫をこらしたところ、やや改善したものの、歪みのない三次元ファイルを作製することは困難であった。したがって、読み込んだ頭蓋骨の三次元データに皮膚の厚みデータを付加することはできず、復顔の立体造型には至らなかった。しかしながら、今回の研究を通じて、鼻根部の詳細な形態が得られたこと、三次元データをOBJファイルに変換することによって現代人の顔面部品のJPG画像がコンピュータ上で貼り付けできることが分かったことは、三次元ソフトの進歩によるところが大きい。このことは、将来、より正確な復顔像を作製する上で、大きな進歩であったと考えられ、バーチャル復顔像の作製に関する現時点での問題点を抽出することができた。将来、ソフト面の開発が進めば、本研究を基礎として、容易に三次元復顔ができる可能性を示唆したものと言える。マルチスライスCT撮影装置を利用して撮影されたCT画像をもとに、人類学的な骨形態計測点の解析を行った。実際の頭蓋骨は三次元的な構造を持っているため、計測点の把握は容易であるが、実際のCT画像では、これまで用いられてきている人類学的な計測点の設定は極めて困難であった。そのほかの要因として、小さな頭蓋縫合はCT画像として極めてとらえにくいことがあげられた。このため、これまで人類学で用いられてきた計測点をそのまま利用することは実質的には困難で、新たな計測点の設定も難しいことが分かった。そこで、実際の頭蓋骨をデジタルカメラで撮影し、三次元画像を作製してそこから復顔を行う方法を検討することにした。資料としては、岡山県から出土したほぼ完形の弥生時代の頭蓋骨を用い、様々な方向から撮影したデジタル映像をもとに、コンピュータ上で三次元画像合成ソフトを用いてどれぐらい精度の良いバーチャル三次元頭蓋骨が完成するのかを検討した。その結果、頭蓋底などの形状は実物を正しく反映されないという点や眼窩や鼻腔などの奥行きのある構造物は正しく奥行きが反映されないという問題点はあったものの、頭蓋全体や復顔に必要な顔面頭蓋の形状については、合成時のパラメーターを調整することによって、ほぼ満足すべきバーチャル立体画像を得ることができることが明らかになった。この結果は、CTを用いなくても、頭蓋骨をデジタルカメラで撮影することによってコンピュータ復顔ができることを示唆するものであり、今後のコンピュータによる古人骨の復顔の基礎を築くことができた。現代日本人の解剖体やCT画像のデータをもとにして、顔面における皮膚の厚みを計測し、最新のコンピュータグラフィックス技術を用いて三次元的な復顔を行う方法を検討するものである。CT画像を撮影し、これまで人類学で用いられてきた指標をもとに、皮膚の厚みを算出することを試みたが、一部の指標点においてはCT上認識できたが、かなり量の点について特定することは難しかった。頭蓋の三次元的グラフィックスにおいては、微小な縫合を認識することは量不可能であり、CT画像からの復顔は困難であった。また、解剖体10体について、鼻根部を中心に、これまで報告されていなかった皮膚の厚みのデータを得た。岡山県から出土した弥生人骨を回転台に載せ、1020度回転させながら撮影して、コンピュータソフト「iModeller」を用いて三次元像を得た。これは、3DモデルだけでなくUVWファイルはコンピュータ画面上でマウスでもって回転させることができ、頭蓋の三次元的形状を視覚的に理解するには有効な手段であった。「iModeller」で得られた情報にはポリゴンデータが含まれており、OBJファイルに変換することが可能で、コンピュータグラフィックスの「modo301」に読み込ませることができた。しかし、詳細に見ると、うまくデータが生成されていない箇所が多々あることが分かり、「iModeller」上でポリゴン数を変更したりして、ポリゴンの均一化を図ったが、頭蓋のゆがみは解消できなかった。これは、「iModeller」の限界であるかもしれないが、撮影上のぶれに起因するかもしれず、引き続き検討課題とした。頭蓋に写真イメージの貼り付けは可能であったが、皮膚の厚みを貼り付けるには、ベースとなる頭蓋の三次元像にゆがみが認められたため、復顔の立体造型には至らなかった。

実物の古人骨から得られたUVWファイノレの三次元データにっいては、ウェブなどで公開するには充分の解搬を撒ていた。昨年度からの検討課題であった正確なポリゴンデータ収集については、撮影方法等にも工夫をこらしたところ、やや改善したものの、歪みのない三次元ファイルを作製することは困難であった。したがって、読み込んだ頭蓋骨の三次元データに皮膚の厚みデータを付加することはできず、復顔の立体造型には至らなかった。しかしながら、今回の研究を通じて、鼻根部の詳細な形態が得られたこと、三次元データをOBJファイルに変換することによって現代人の顔面部品のJPG画像がコンピュータ上で貼り付けできることが分かったことは、三次元ソフトの進歩によるところが大きい。このことは、将来、より正確な復顔像を作製する上で、大きな進歩であったと考えられ、バーチャル復顔像の作製に関する現時点での問題点を抽出することができた。将来、ソフト面の開発が進めば、本研究を基礎として、容易に三次元復顔ができる可能性を示唆したものと言える。
ＩＦＸ投与患者における薬剤抵抗性の発現と血中ＭＴＸ濃度の関係

本申請課題では、メトトレキサート(MTX)の血中濃度の個人差が抗インフリキシマブ(IFX)抗体発現の個人差に影響している可能性を考え、IFXによる治療を受けている関節リウマチ患者における抗IFX抗体発現に対するMTXの効果を評価することを目的として、“IFX投与患者における薬剤抵抗性の発現と血中MTX濃度の関係"について検討した。まずIFXについては、IFXおよびヒト血液中のタンパク質をタンパク分解酵素により断片化し、得られたサンプルをLC-MSで分析し、主成分解析(PCA解析)を行うことでIFX特有のイオンピークを複数種類抽出した。これらのピークのうち、比較的強いピーク強度を有し、なおかつIFXを含むサンプルに特異的に存在するピークをPrecursorionとして選択し、LC-MS/MSを用いた測定によりProductionを同定した。これらのPrecursorionとProductionを組み合わせて測定することにより、高感度かつ特異的なIFXの濃度測定の確立を行った。一方MTXについても、LC-MS/MSを用いた高感度測定の確立を行った。本研究で確立した測定法を用いて、ブランク血清にIFXを添加したサンプルを測定した結果、絶対検量線法ではあるがこれまで報告されているIFXの血中濃度範囲におけるリニアな検量線を得ることが出来た。一方MTXにおいても、蛍光偏光免役測定法を用いた既存の測定法に比べ、より高感度かつリニアな検量線を得ることが出来た。現在は、患者血清の前処理および濃縮のための固相抽出法による精製を用いることで、さらなる高感度測定に向けた検討を行っている。条件が確立され次第、患者検体の測定を行っていく。
微小面歪み検出のための面状走査型触覚センシングシステムの開発

本研究では,雑巾がけのように,対象曲面を隈なく走査することで,微小面歪みを検出する,面状の走査型触覚センシングシステムを開発する.具体的には,1)フレキシブルかつソフトであり,「幅のある」面状走査型触覚センサの開発,2)対象曲面上の微小面歪みの場所を特定するための触覚情報処理技術「触覚SLAM」の開発,3)柔らかい触覚センサで微小面歪みを検出するためのセンシング理論の確立,の3つの課題に取り組む.長年の未解決問題であった微小面歪み検出の解を提供することで,カメラやマイクに匹敵する標準的な触覚センサを確立し,触覚学の発展に寄与する.本研究では,雑巾がけのように,対象曲面を隈なく走査することで,微小面歪みを検出する,面状の走査型触覚センシングシステムを開発する.具体的には,1)フレキシブルかつソフトであり,「幅のある」面状走査型触覚センサの開発,2)対象曲面上の微小面歪みの場所を特定するための触覚情報処理技術「触覚SLAM」の開発,3)柔らかい触覚センサで微小面歪みを検出するためのセンシング理論の確立,の3つの課題に取り組む.長年の未解決問題であった微小面歪み検出の解を提供することで,カメラやマイクに匹敵する標準的な触覚センサを確立し,触覚学の発展に寄与する.
結合組織タンパク質調製物の経口摂取による食事由来ペプチドの血中移行とその生理機能

本研究において、我々はエラスチン加水分解物摂取後の血液より食事由来ペプチドでとしてPro-Glyを検出した。健康な被験者にエラスチン加水分解物を摂取(10g/60kg体重)して頂いた。摂取前後に採血を行い、その血液から血漿を調製した。固相抽出とサイズ排除クロマトグラフィー分画(SEC)によって血漿中のペプチドを分離した。SEC画分中のペプチドをフェニルイソチオシアネート(PITC)で誘導化後、逆相クロマトグラフィー(RP-HPLC)によって分離した。摂取後、血中に特異的に検出された食事由来ペプチドはPro-Glyであった。摂取から30分後に血漿中の濃度が最大値(18μM)に到達した。摂取から4時間後には最大値の約20%まで減少した。1μg/mL以上のPro-Glyはヒト真皮正常線維芽細胞(NHDF)からのエラスチン合成を増加させた。研究実施期間最終年度の平成24年度では、昨年度ヒト血液中から検出された食事由来エラスチンペプチド、Pro-Glyのより詳細な血中濃度変化と生理活性について調べた。またサメ軟骨加水分解物摂取後のヒト血中食事由来ペプチドの検出も試みた。【方法】1被験者には試験開始12時間前の飲食を禁止して頂き、20代と50代それぞれ3名ずつの被験者にエラスチン加水分解物(25g/体重60kg)を摂取して頂いた。摂取から0.5, 1, 2, 4, 7時間後に採血し、血清を調製した。イオン交換樹脂によって血清からアミノ酸とペプチドを分離し、AccQ(6-aminoquinolyl-N-hydrosysuccinimidyl carbamate reagent)誘導化後LC-MSによってPro-Gly濃度の経時的変化を調べた。ヒト正常繊維芽細胞を培養し、培地中にPro-Glyを添加後、エラスチン合成をELISA法によって測定した。2エラスチン同様の方法で、サメ軟骨加水分解物摂取後の被験者から採血を行った。血清からアミノ酸・ペプチドを分離し、ゲル濾過カラム、疎水性カラムを使用してAccQ誘導化した食事由来ペプチドを分離した。【結果】1エラスチン加水分解物摂取後、いずれの被験者も摂取から30分後に血中Pro-Glyが最大濃度(約25μM)に達し、4時間後まで検出されたが、7時間後には摂取前と同程度であった。また50代に比べて、20代の被験者において血中濃度が高い傾向にみられた。1μg/mL以上のPro-Gly添加によって線維芽細胞からのエラスチン合成が上昇した。2AccQ誘導化を導入したHPLC血中ペプチド分離の結果、サメ軟骨加水分解物摂取後の血液からは摂取前には検出されないピークが複数検出されたが、ペプチド配列の同定には至らなかった。このことから、検出ペプチドに糖が結合している可能性が考えられた。全研究期間内での目標としては、結合組織タンパク質の摂取後に、血中へ吸収される食事由来の低分子ペプチドを検出し、そのペプチドの細胞に対する生理活性を調べることである。平成23年度においては、結合組織タンパク質であるエラスチン加水分解物摂取後、血中の食事由来ペプチドの検出を目標として研究を進めた。【方法】被験者に加水分解物を被験者に摂取して頂き、0、30、60分後に末梢静脈の血液を採取した。血漿を調製後、エタノールによるタンパク質除去、イオン交換樹脂によるペプチドとアミノ酸の吸着回収を行った。回収されたペプチドはゲル濾過HPLCによって分子量別に分画、回収された。分取した低分子ペプチド画分には、PITCによる誘導化処理を行い逆相HPLCによる分離を行った。各摂取時間後のクロマトグラムを比べ、摂取後に出現・増加するピークを回収し配列の同定を行った。PITC誘導化ペプチド(PTC-ペプチド)はエドマン分解の生成物であるため、誘導化物を直接的に、エドマン分解法を基にしたアミノ酸配列解析装置による分析が可能である。【結果】エラスチン加水分解物摂取後、血中でPro-Gly濃度が増加していることが分かった。これは、エラスチンタンパク質にはPro-Glyの豊富な繰り返し配列が存在し、この低分子ペプチドが血中へ吸収されたことが考えられる。エラスチンペプチド摂取後(10g/60kg体重)のPro-Hypの血漿中濃度は、30と60分でそれぞれ23.1と21.0μMであった。

これまでにコラーゲン加水分解物摂取後のヒト血中で、Proが修飾を受けたHypを含む特殊な食事由来ペプチドがμMレベルで検出されている。今回、修飾を受けていない高濃度の食事由来ペプチドを血中から検出する事に初めて成功した。次年度から、Pro-Glyの細胞に対する生理活性について調べる。申請書に提出した平成23年度の計画通り、結合組織タンパク質加水分解物であるエラスチンペプチド摂取後のヒト血液から、食事由来ペプチドの検出を試みた。その結果、ヒト血液から食事由来エラスチンペプチドとして、Pro-Glyを検出することに成功した。実験手法としては、これまでコラーゲン摂取後の血液から食事由来ペプチドの検出に成功しており、その方法を基に行った。エタノールによるタンパク質除去・イオン交換樹脂によるペプチドとアミノ酸の吸着回収・ペプチドのゲル濾過HPLC分画・PITCプレカラム誘導化逆相HPLCによる分離を通して、食事由来ペプチドを分離した。各摂取時間後のクロマトグラムを比べ、摂取後に出現・増加するピークを回収し配列の同定を行った計画通り、上記実験方法からPro-Glyを同定した。次年度はこのペプチドの機能性について検討を進める。平成23年度は、エラスチン摂取後のヒト血液から、食事由来ペプチドの検出に成功した。今後は、結合組織タンパク質である、軟骨のプロテオグリカン加水分解物摂取後の血液からの食事由来ペプチド検出を試みる。また、食事由来エラスチンペプチドPr-Glyと、食事由来プロテオグリカンペプチドの細胞に対する生理活性について調べる。ヒト血液中に存在する、食事由来プロテオグリカンペプチドは短鎖ペプチドであることが予想され、さらに微量成分であることが考えられる。そこで、これまで行ったきたプレカラム誘導化法と、新たな誘導化試薬を導入した方法を用いて、検出を試みる。新たな誘導化試薬としてAccQを用いる。この誘導化試薬は、これまで使用していたPITC誘導化試薬とは異なり、誘導化物質をMS分析によって検出と同定する事が可能である。そのため、これまでの手法よりも高感度な検出が可能である。細胞に対する影響は、マウス皮膚より調製する初代線維芽細胞を用いて行う。この細胞は、皮膚からの遊走によって調製した細胞であり、継代細胞ではなく、またコラゲナーゼ処理などを行わないため、それらに比べて生体内に近い条件であると考えられる。これら細胞を使い、検出された食事由来ペプチド添加が、細胞増殖、コラーゲンゲル収縮能、さらにAGE生成等にどのような影響を及ぼすかについて調べる。次年度より所属研究機関が変更するため、これまでの研究を継続するため、設備や機器の購入が増えると考えている。そのため若干研究費の使用計画に変更が生じることが予想される。機器としては、ペプチド検出用のHPLC関連機器や細胞培養関連の機器である。
オンサイト分析のためのポンプ統合型携帯マイクロチップLCの開発

本研究では,液体クロマトグラフィーの分離媒体および電気浸透流ポンプの機能をあわせ持つ新規材料を開発し,携帯可能なポンプ統合型オンサイト分析デバイスの開発を目指したものである。送液能と分離能をもつ媒体を作製するため,高分子・無機材料合成による多孔質体材料を基盤にしたアプローチと,半導体加工技術によって作製した微細構造体を基盤にしたアプローチの両方面から新規分離媒体の開発を行った。多孔質体材料合成を基盤にしたアプローチでは,イオン交換モノリスとして知られる化学種のうち,電気浸透流(EOF)ポンプ材料として報告のあるモノマーを用いてカチオン性および疎水性物質に対する分離能を有し,速いEOFを発生するポリマーモノリスの作製に成功した。また,シリカモノリス表面をスルホ基で修飾することによって,速いEOFを発生するシリカモノリスキャピラリーを作製した。シリカモノリス表面の修飾に関する研究はこれまでも多く報告されており,幅広い分離分析への応用が期待できる。半導体加工技術によって作製した微細構造体を基盤にしたアプローチでは,微小流路内に円柱型構造や六角柱構造を作製したマイクロ流体デバイスをLCカラムとして用いることで,疎水性の違いにもとづいて保持時間が変化することを明らかにした。円柱や六角柱を有する微小流路がカラム圧を低減させること,構造体作製に用いた材料が安定なEOFを発生させることはすでに報告されており,構造を制御することで高送液能,低カラム圧な小型LCデバイスが期待できる。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。