hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
NODマウスのクラスII分子,特にアイソタイプ混合AαEβ分子の特異性と機能解析

1.NODマウスの脾細胞にアイソタイプ混合Aα^dEβ^<nod>分子が発現しているか否かを2次元電気泳動法により解析した。モノクロ-ナル抗体(10.2.16,MKD6,K24ー199,13/4など)を用いてAβ^<nod>,Aα^d,Eβ^<nod>,Eα^dのスポットを同定した。通常の状態の脾臓細胞を用いた実験では、抗Aα^d抗体により、Eβ^<nod>の分子は沈降されず、アイソタイプ混合クラスII分子の存在は証明できなかった。現在、さまざまなサイトカインの刺激によりアイソタイプ混合クラスII分子の発現が誘導できるか否かを解析中である。2.NODマウス由来のベ-タ細胞株特異的T細胞クロ-ン、外来抗原特異的T細胞クロ-ン、アロ抗原反応性T細胞クロ-ンを多数作成し、その拘束特異性を種々のモノクロ-ナル抗体を用いて調べた。ほとんどのクロ-ンは、Aβ^<nod>Aα^d分子に拘束されており、Aα^dEβ^<nod>に拘束されるクロ-ンは検出出来なかった。しかし、いくつかのクロ-ンはNODマウスのIーA^<nod>ホモ接合体に拘束特異性を有しており、(BALB/cxNOD)F1マウスの脾細胞には反応性(拘束性)を示さなかった。このことは、NODマウスのホモ個体に特異的に発現しているクラスIIの特異性が存在することを示唆するものである。この特異性がどのような分子構造を有するものかを解析中である。3.NODマウスの脾臓細胞をBALB/cマウスに免疫して細胞融合し、モノクロ-ナル抗体を作成した。NODマウスのAβ^<nod>に対する抗体以外に、NODマウスの脾細胞、胸腺細胞に100%反応する抗体が得られた。この抗体を用いた免疫沈降を行なうと、240,205,190Kdのバンドが検出され、Ly5分子と非常によく似たものであることが推測され、現在その同定を進めている。また、このmAbが認識する分子の遺伝子が、NODマウスの膵炎発症と連鎖しているか否かを解析中である。
腸管腫瘍形成におけるＰＬＥＫＨＧ１の役割

本研究は大腸がんの発生・進展におけるPLEKHG1の役割の解明を目指した。Plekhg1-/-; Apc+/Δ716複合変異マウスでは、Apc+/Δ716マウスと比較して直径3 mm以上の大腸ポリープ数が有意に多かった。in situ hybridization法により、腸管ではPLEKHG1の発現は主に腸上皮細胞に認められた。一方、大腸がん細胞に上皮間葉転換(EMT)を誘導するとPLEKH1の発現が著しく増加し、大腸がん細胞株にPLEKHG1を強制発現させるとマトリックス浸潤能が亢進した。PLEKHG1は大腸がんの発生初期過程では抑制的に働くが、浸潤・転移は促進する可能性が示唆された。Plekhg1の腸管腫瘍形成における役割を明らかにするため、Plekhg1のホモ接合変異とApcのヘテロ接合変異を併せ持つ、Plekhg1^<-/1>Apc^<+/Δ716>マウスを作出した。マウスがmoribundとなった時点で安楽死させ採材したところ、コントロールのApc^<+/Δ716>マウスと比較して、複合変異マウスでは大腸のポリープの数が多く、サイズも大きい傾向を示した。現在、マウスの数を増やしてPlekhg1の欠損が腸管腫瘍形成に与える影響に統計的意義があるかどうか検証中である。PLEKHG1のN末部分(アミノ酸1110)を大腸菌で発現させ精製したタンパク断片をモルモットに免疫し、得られた抗血清からPLEKHG1に対する抗体を、抗原タンパクカラムを用いてアフィニティ精製した。得られた抗体を用いてウェスタンブロットを行い、HEK293細胞で高発現させたヒトおよびマウスPLEKHG1を認識することを確認したが、内在性のPLEKHG1を検出することはできなかった。PLEKHG1と14-3-3ζとがPLEKHG1のSer 611のリン酸化依存的に結合することを既に見出していた。このSer 611はその周辺配列からAktによりリン酸化される可能性が考えられたため、Aktによってリン酸化された基質を認識するリン酸化Akt基質抗体を用いてIP/WB解析を行った。免疫沈降したPLE阻G1はこのリン酸化Akt基質抗体によって認識されること、そのシグナルは、活性型Aktを発現させることで顕著に増強したがキナーゼ活性を失ったAktでは増強されず、またSer 611をアラニン残基に置換することにより顕著に減弱した。これらの結果から、PLEKHG1はAktによってSer 611にリン酸化を受け、14-3-3と結合することが示唆された。1. PLEKHG1の腸管腫瘍形成における役割Plekhg1のホモ接合変異とApcのヘテロ接合変異を併せ持つPlekhg1-/- Apc+/Δ716マウスでは、Apc+/Δ716マウスと比較して、大腸に発症する直径3 mm以上の大きなポリープの数が有意に多かった。腸管においてPlekhg1を発現する細胞種を同定するため、in situ hybridizationを行ったところ、正常腸管組織では主として腸上皮細胞に発現が認められ、Apc+/Δ716マウスのポリープでは正常部位に比較して発現レベルが高く、やはり主に腫瘍上皮細胞に強く発現していた。我々は最近、ヒト大腸がん細胞株HT29とDLD-1にEGF/basic EGFを用いて上皮間葉転換(EMT)を誘導できること、EMT誘導に伴ってCDX2の発現が顕著に低下することを見出し報告した。大腸がん細胞におけるCDX2とPLEKHG1の発現の相関について検討するため、EMT誘導前後でのPLEKH1の発現を定量的RT-PCRによって調べたところ、予想に反してその発現はEMTに伴って顕著に増加した。前年度までに、ヒト大腸がん細胞株DLD-1およびマウス大腸がん細胞株colon26にPLEKHG1を誘導的に発現させるとマトリックスへの浸潤能が顕著に亢進する結果を得ていたことと考え合わせると、PLEKHG1が、大腸がんの浸潤・転移をむしろ正に制御する可能性が示唆された。3.PLEKHG1結合タンパク前年度までに、PLEKHG1と14-3-3とがPLEKHG1のSer 611のリン酸化依存的に結合することを示し、この部位を標的としたリン酸化抗体を作製していた。本年度は、この抗体を用いて、血清刺激によってPLEKHG1のSer611のリン酸化が亢進することを見出した。1. PLEKHG1の腸管腫瘍形成における役割Plekhg1のホモ接合変異とApcのヘテロ接合変異を併せ持つPlekhg1-/- Apc+/Δ716

マウスでは、コントロールのApc+/Δ716マウス(家族性大腸腺腫症のマウスモデル)と比較して、大腸に発症するポリープの数が多くそのサイズも大きいことが分かっていたが、本年度の解析によりPlekhg1-/- Apc+/Δ716マウスの大腸遠位部ではdysplasticな変化が認められ、Apc+/Δ716マウスと比べて多くの微小腺腫が発生していることが分かった。ヒト大腸がん細胞株DLD-1、およびマウス大腸がん細胞株colon26にTet-On発現誘導システムによってPLEKHG1を誘導的に発現させる系を作製し、マトリックス浸潤アッセイを行ったところ、いずれの大腸がん細胞においてもdoxycyclineによるPLEKHG1の発現誘導が浸潤能を顕著に増強させることが分かった。3.PLEKHG1結合タンパク前年度までに、PLEKHG1と14-3-3とがPLEKHG1のSer 611のリン酸化依存的に結合すること、PLEKHG1はこのリン酸化Akt基質抗体によって認識されることを明らかにしていた。本年度は、この部位を標的としたリン酸化抗体を作製した。HEK293細胞に強制発現させたPLEKHG1はこの抗体によって認識されたが、Ser611をアラニンに置換した変異型PLEKHG1は認識されなかったことから、Ser611がリン酸化されたPLEKHG1に対する抗体が作製できたことが示唆された。研究代表者は平成22年12月.に現所属に着任した。平成23年7月にようやく遺伝子改変マウスを前任地の京都大学から移送できたこと、新しい研究室の立ち上げに伴って実験ができる体制を整えるのに想定よりも時間を要したことなどから、当初の計画からはやや遅れている。25年度が最終年度であるため、記入しない。マウスの飼育環境も整い、Plekhg1とApcの複合変異マウスの解析が進展し、Plekhg1の欠損によってApc変異マウスの大腸における腫瘍形成が促進することがさらに強く示唆されたPLEKHG1のSer611特異的なリン酸化抗体の作製に成功した。また、PLEKHG1を誘導的に発現する大腸がん細胞株を用いた実験から、PLEKHG1が大腸がんの浸潤能を正に制御する可能性が新たに示唆された。研究体制はほぼ整ったので遅れを取り戻したい。良性の腺腫性ポリープを発症するApo変異マウスに加えて、浸潤性の腸がんを発症するcis-Apc/Smad複合変異マウスとPlekhg1変異マウスとの交配を行い、大腸がんの浸潤、転移におけるPLEKHG1の役割を評価する。また、PLEKHG1がAktによりリン酸化に依存して14-3-3に結合することが強く示唆されたので、PI3-kinase/Akt経路によりPLEKHG1がどのような制御を受けているかについて集中的に研究する。内在性のPLEKHG1を認識する抗体については、最近新たに入手可能となった市販の抗体の使用、異なる抗原部位を用いての免疫などを含めてさらに検討する。遺伝子改変マウスを用いた解析をさらに推進し、Apc変異マウスの大腸腫瘍形成におけるPlekhg1の役割を解明する。
硼素中性子捕捉療法のためのガス放射化を利用したビームプロファイルモニターシステム

硼素中性子捕捉療法のためのガス放射化を利用したビームプロファイルモニターシステムの構築し、その特性および有効性の確認を行った。本システムでは、照射時間3090分の典型的なBNCT臨床時において、最大1分毎に線量測定・評価が可能であることが確認された。他の測定・評価手法と比較したところ、本システムによる線量評価の不確かさは±5%程度であることが確認された。安全性および安定性を確認しながら、実際のBNCT臨床時に使用する予定である。まず、運転再開後の京都大学研究炉(KUR)重水中性子照射設備の照射特性評価を行い、本研究に必要な基礎データの取得を行った。次に、アルゴンを用いて、放射化の量すなわち線量計で得られる電流値とガスの流量および流速ならびに放射化ケース直径の関係について、KUR重水中性子照射設備においてサーベイ実験を行った。また、ケースを置く位置を変えることで中性子ビーム強度を調整し、検出限界等の確認も行った。例えば、直径10cmのケースの場合、KUR1MW運転時の混合中性子照射モードで2ml/minの流量で5pA程度の電流値が得られた。一方、熱外中性子照射モードでは、2ml/minの流量で1pA程度の電流値であった。また、ビーム強度の検出限界は熱中性子に対して1×10^5cm^<-2>s^<-1>程度、熱外中性子に対して1×10^6cm^<-2>s^<-1>程度であることが確認された。続いて、電離箱を通過した放射化ガスの、HPGe半導体検出器による誘導γ線スペクトル測定を行った。ネオン、アルゴン、クリプトン、キセノンそれぞれのガスに応じた放射性核種の生成がγ線ピークのエネルギーおよび半減期から確認された。特に、キセノンについては、中性子のエネルギーに応じて多数の核種の生成が確認され、流量を調整することによる中性子エネルギースペクトル評価が期待できることが分かった。これら平成22年度の研究成果から、「ビームプロファイルモニターシステム」の可能性が確認された。典型的なBNCT臨床時の照射時間3090分を想定した、最大1分毎に計測できるシステムの構築の可能性が見いだされた。システムの評価精度を臨床時の照射野(コリメータ)端部において確認したところ、士10%程度の不確定さがあることが確認された。平成22年度に引き続き、運転再開後の京都大学研究炉(KUR)重水中性子照射設備の照射特性評価を行い、本研究に必要な基礎データの取得を行った。設備の照射特性評価と並行して、プロファイルモニターの作製を行った。ガス放射化ケースの形状および寸法については、前年度の結果を参考に決定した。ケースの中心軸を基準に同心円状のセグメントを配置し、外直径34、64、95、110mmの4つのセグメントを有するガス放射化ケースを作製した。KUR重水中性子照射設備において、作製したプロファイルモニターの特性評価実験を行った。アルゴンとネオンの2種類のガスについて評価を行った。各セグメントでのガス流量については、昨年度の結果を踏まえて、0.55ml/minの間で調整した。作製したプロファイルモニターで得られたプロファイルを、金等の放射化法や光ファイバー検出器による測定結果と比較したところ、相対的には良い一致を示すことが確認された。続いて、同じ形状よび寸法のケースを三層に多層化して、ビームの方向性の確認実験を行った。本プロファイルモニターによるコリメータ出口でのJ/φの評価値は0.60.7であり、従来の公称値0.67を誤差の範囲内に含む結果が得られた。最後に、同設備において患者を模擬したファントム実験を行い、プロファイルモニターの出力とファントム内中性子束分布との関係の確認を行った。これら平成23年度の研究成果から、作製された「ビームプロファイルモニターシステム」の特性および有効性が確認された。実際のBNCT照射時を想定すると、本プロファイルモニターによる各セグメントの出力は、事前シミュレーション結果の補正に有用であり、その不確かさは±10%程度に収まる見込みである。硼素中性子捕捉療法(BNCT)のためのガス放射化を利用したビームプロファイルモニターシステムの試作機を完成させた。これまでの結果を踏まえて、各セグメントで得られる情報を事前シミュレーション結果にフィードバックするソフトウェアの作製を行った。また、試作機を用いて、京都大学研究炉(KUR)重水中性子照射設備や若狭湾エネルギー研究センターの中性子照射場等でフリーインエアーおよびファントム実験を行い、さまざまな中性子照射場における本プロファイルモニターの有効性を検証した。ガス放射化ケースの形状および寸法については、これまでの結果を参考に選定した。ケースの中心軸を基準に同心円状のセグメントを配置し、各セグメントの外直径は34、64、95、110mmとした。各セグメント中のガスの厚さは1cmとし、4層に多層化した。上述の複数の中性子照射場において、プロフアイルモニター試作機の特性評価実験を行った。

アルゴンとネオンの2種類のガスについて評価を行った。各セグメントでのガス流量については、これまでの結果を踏まえて、0.55ml/minの間で調整した。15°程度の分解能で、ビームの方向性評価が可能であることが確認された。ファントムに対する治療計画シミュレーションにおいて、プロファイルモニターのセグメントに対応した線源を作成し、各セグメント線源ごとに計算を行った。作製したソフトウェアを用いて、プロファイルモニターにより評価された各セグメントの中性子強度をシミュレーション結果にフィードバックし、全セグメント線源の寄与を重ね合わせたファントム内線量分布を計算した。この結果と金等の放射化法による測定結果と比較したところ、不確かさ±5%程度で補正が可能であることが確認された。このように、平成24年度の研究成果から、「ビームプロファイルモニターシステム」の特性および有効性が確認された。プロファイルモニターのセグメントの数および寸法はまだ最適値として確定されておらず、今後、若干の変更の可能性はあるが、システム全体の完成度はおおむね計画通りである。本モニターシステムの特性および有効性についても計画時に設定した目標をほぼ達成している。24年度が最終年度であるため、記入しない。本年度の結果を踏まえて、各セグメントで得られる情報を事前シミュレーション結果にフィードバックするソフトウェアの作成を行う。フリーエアー実験およびファントム実験を行い、完成したシステムの特性評価を本年度に継続して行う。今後は、ケースを多層化したシステムに重点を置いて、ビームの方向性評価の検証を行う。可能であれば、加速器ベースの中性子照射場においても、本システムの特性実験を行う。
乾式系でのアクチニドの化学分離に関する実験的研究

本研究では、原子力利用が可能な非湿式化学分離候補技術の中でもっとも実用に近いと期待される塩化物溶融塩と液体金属を用いた高温化学分離法での、アクチニドやランタニドの系統的な熱力学データの評価を実験的に行った。併せて、低温で溶融し水の含有量が少ない溶融塩である、水和物溶融体を無機溶媒として用いた溶媒抽出における、アクチニドとランタニドの挙動を実験的に調べた。(1)塩化物溶融塩と液体金属を用いた高温化学分離に関する研究LiCl-KClの共晶塩と液体金属(ビスマスと亜鉛)の2相系における、アクチニドやランタニドの分配挙動を、放射化学的な手法を用いて調べた。アクチニドやランタニドの分配挙動を実測し、これらの元素が液体金属と合金形成する際の熱力学的な諸量との関係について考察し、これらのf-元素が液体金属と合金を生成する際の安定化の自由エネルギー変化についてランタニドおよびアクチニド系列に渡る系統性を詳細に調査した。ランタニドについては、起電力測定実験によって、f-元素が液体金属と合金を生成する際の安定化の自由エネルギー変化を実測した。その結果、液体金属中および溶融塩中での3価f-元素の、溶媒との相互作用による安定化の効果が、どのような系統性を持つかを明らかにすることが出来た。(2)硝酸カルシウム水和物溶融体からのf-元素の溶媒抽出挙動の研究水の含有量が大変低い低融点の溶融塩(水和物溶融体)を無機溶媒として用いた抽出系として、TBP-Ca(N0_3)_2・4H_20系に着目し、この抽出系における希土類の抽出特性を実験的に研究した。この結果、硝酸カルシウム水和物溶融体(Ca(NO_3)_2・xH_2O)中においては、3価f-元素イオンヘの水和が不完全に行われており、水含有量の低下に伴う水和効果の減少が、これら元素のTBP抽出に大きな効果を与えることが分かった。また、このような水分量の低い水和硝酸カルシウム中においては、ランタニド元素のイオンの大きさに依存して異なる水和効果が働いてることを明らかにした。高温化学分離法によるアクチニドやランタニドの最も効率的な分離体系(溶媒金属や塩の組成、使用条件)の絞り込みを行うことを目的に、溶融塩-液体金属2相系でのアクチニドやランタニドの還元抽出実験を行った。溶融塩相としてアルカリ塩化物、液体金属相として亜鉛及びビスマスを選び、放射性トレーサを用いてアクチニドやランタニドの分配比を測定し、抽出反応に係わる熱力学データを算出した。得られた熱力学データを解析して、両元素の溶媒金属との相互作用(金属間結合)の系統性を解析した。その結果、ランタニドとアクチニドの溶媒金属との相互作用の特性の違いや、両者の分離効率などについて明らかになった。還元抽出実験を補強するために、電気化学的な手法で、ランタニドとアクチニドが溶媒金属と相互溶解するための自由エネルギー変化を測定し、これを用いて還元抽出実験により得た熱力学データを補正し、ランタニドとアクチニドの金属間相互作用の系統性を解析した。

更に、乾式系での分離をやや湿式系に近づけたいわば半乾式の抽出体系として、低融点の水和溶融塩(4水和硝酸カルシウム塩)と有機系の抽出材(TBP)との間での、アクチニドやランタニドの分配挙動を実験的に調べた。放射性トレーサを用いてアクチニドやランタニドの分配比を測定し、アクチニドやランタニドの抽出平衡定数を求めた。抽出平衡定数の系統性を解析することによって、無機相中で水がアクチニドやランタニドに与えている影響を定性的に評価した。高温化学分離法によるアクチニドやランタニドの分離挙動を評価するために必要な熱力学諸量の測定と、f-元素系列におけるこれらの系統性についての評価を行った。ランタニド金属が液体金属に溶解して液体合金を生成する際の自由エネルギー変化を直接測定するために、溶融塩-液体金属2相系での起電力測定を行った。溶融塩相としてリチウムとカリウムの塩化物の共晶塩を用いて、ビスマス-ランタン、ビスマス-ネオジム、亜鉛-テルビウムの組み合わせについて起電力を測定した。この結果、それぞれの組み合わせでの自由エネルギー変化を、3つの温度において測定できた。更に、ランタニドの液体合金の標準生成自由エネルギー変化に関する報告値と、半経験的な理論式を用いて、そのランタニド系列における系統性を評価した。また、昨年度に実施した還元抽出実験で得られたランタニドの分配比のデータと種々の熱力学諸量を用いて、実測されていない溶融塩中でのランタニド塩化物の過剰自由エネルギーを推定した。更に、乾式系をやや湿式系に近づけたいわば半乾式の抽出体系として、低融点の水和溶融塩(水和硝酸カルシウム塩)と有機系の抽出材(TBP)との間での、ランタニドの分配挙動を実験的に調べた。昨年度に実施した4水和硝酸カルシウム塩を用いて得た分配挙動のた結果と比較するために、水和硝酸カルシウム塩中の水含有量を変化させて抽出を行い、ランタニドの分配比への水の影響について調べた。この結果、4休和相当よりも極端に水が不足した硝酸カルシウム塩中では、ランタニドへの水の影響の傾向が特異性を示すことが分かった。本研究では、原子力利用が可能な非湿式化学分離候補技術の中でもっとも実用に近いと期待される塩化物溶融塩と液体金属を用いた高温化学分離法での、アクチニドやランタニドの系統的な熱力学データの評価を実験的に行った。併せて、低温で溶融し水の含有量が少ない溶融塩である、水和物溶融体を無機溶媒として用いた溶媒抽出における、アクチニドとランタニドの挙動を実験的に調べた。(1)塩化物溶融塩と液体金属を用いた高温化学分離に関する研究LiC1-KC1の共晶塩と液体金属(ビスマスと亜鉛)の2相系における、アクチニドやランタニドの分配挙動を、放射化学的な手法を用いて調べた。アクチニドやランタニドの分配挙動を実測し、これらの元素が液体金属と合金形成する際の熱力学的な諸量との関係について考察し、これらのf-元素が液体金属と合金を生成する際の安定化の自由エネルギー変化についてランタニドおよびアクチニド系列に渡る系統性を詳細に調査した。ランタニドについては、起電力測定実験によって、f-元素が液体金属と合金を生成する際の安定化の自由エネルギー変化を実測した。その結果、液体金属中および溶融塩中での3価f-元素の、溶媒との相互作用による安定化の効果が、どのような系統性を持つかを明らかにすることが出来た。(2)硝酸カルシウム水和物溶融体からのf-元素の溶媒抽出挙動の研究水の含有量が大変低い低融点の溶融塩(水和物溶融体)を無機溶媒として用いた抽出系として、TBP_-Ca(NO_3)_2・4H_2O系に着目し、この抽出系における希土類の抽出特性を実験的に研究した。
「行政的な訴え」の類型と「日本型」処理手続-近世日本を対象として-

近世日本においては、「民事的な訴え」「刑事的な訴え」のほかに、「行政的な訴え」とも呼べる訴えの類型があった。それは行政庁に対する各種の嘆願・請願であり、歴史学で一般に「訴願」と呼ばれているものであった。近世日本においては、庶民によるこの種の訴えが奉行所に対して頻繁に行われた。それだけ「行政的な訴え」は人々の生活に密接な関わりを有していたのである。従来、未解明であった近世日本における「行政的な訴え」の類型と法的手続の特徴を明らかにすることが、本研究の目的であった。本研究では、「行政的な訴え」の最も主要な類型として二つの類型を抽出し、そのうち、第三者の不当な活動に対し、行政庁に何らかの措置を求める告発型「訴え」に焦点をあてて、その処理手続を明らかにした。差し当たり解明し得た手続を順を追って記すと、次のようになる。(1)訴状提出、(2)訴状糺、(3)奉行の冒頭尋問、(4)審理、(5)証拠の提出、(7)被非難者の召喚、(7)答弁書の提出、(8)答弁書に対する意見書の上申、(9)内済(示談、?)、(10)裁定、(11)裁定請証文の提出。これらの手続から、「行政的な訴え」の特徴として、一面では、当事者主義的な出入筋の手続に類似している側面があると同時に、他面では、糺問主義的な吟味筋の手続に類似している側面があったこと、そして「行政的な訴え」の処理にはこの両側面が求められていたことが明らかになった。「行政的な訴え」の「目本型」処理手続ということができよう。「行政的訴え」の処理手続が「民事的訴え」と「刑事的訴え」の処理手続の中間的形態であったこと、近世の「訴訟」手続とは、これら総体から成り立っていたことを明らかにすることが出来た。初年度は基礎資料の収集とその整理に力点を置いた。(1)最も中心的な基礎資料の一つともいうべき『大坂編年史』全27巻を購入し、その中から、「行政的な訴え」についての具体的史料の抽出作業を開始した。史料が膨大であるのでこの作業はかなり時間がかかりそうに思われる。なお、大坂における「行政的な訴え」についての処理手続を明らかにするため、「大坂編年史」以外の近畿の各種県史、市史類からも史料を収集した。(2)このほか、国立国会図書館所蔵古文書のなかから、「願下分綴込」、「安永撰要類集」、「類集撰要」、「撰述格例」、「諸色調類集」などの訴願、訴訟関係文書を複写したが、これについてはまだ目を通せていない。(3)住民からの各種の「行政的な訴え」については、『東京市史稿』にも多数収録されている。幸い、本史料集は立命館大学図書館に所蔵されているが、150巻近い膨大な量ゆえ、本年は点検作業に取り組むことが出来なかった。(4)また、近世においては、藩内の住民から各種の訴願がなされたときに、その処理につき、事前に幕府に伺って指示を求める傾向が強かった。その伺・指令集が『問答集』という形で多数残されており、その中で刊行されたものを対象にして、どのような訴願の処理につきどのような大名から伺いがなされたのかの類型分けを学生アルバイトの方に頼んだ。(5)江戸の「行政的な訴え」について、各種県史、市史を探索することは全くできなかった。

今年度は、史料収集を中心とした基礎的作業に取り組みを開始し一定の前進をすることができた。次年度も引き続きこの作業を継続して行く必要があろう。昨年は研究の初年度に当たり、基礎資料の収集と整理に力点を置いた。今年は(1)昨年集めた基礎資料を読みこなし、その中から「行政的な訴え」についての処理手続の類型を可能な限り抽出するとともに、その処理手続の解明に向けて予備的作業に取り組んだ。具体的には、『大阪編年史』全27巻から一定数の「行政的な訴え」についての具体的史料を抽出し、その手続を明らかにする作業を進めつつある。また(2)昨年度は取り組むことのできなかった江戸の「行政的な訴え」について各種県史、市史を探索することが一定程度でき、関連史料もある程度集めることができた。(3)昨年集めた古文書類(複写史料)については解読に手間取り、目下解読作業を継続中である。解読作業はしばらく続きそうである。(4)『東京市史稿』全150巻についても、住民からの「行政的な訴え」についての史料を目下点検・収集作業を進めているところである。(5)訴願、「行政的な訴え」の手続的特徴を対比して明らかにするために、今年は通常の「民事的な訴え」に関する古文書史料(江戸東京博物館所蔵)をいくつか収集した。収集した古文書を解読する作業は次年度も引き続き継続して行く必要がある。本研究では、公権力に何らかの救済・措置を求める訴えを広く「訴訟」ととらえ、その中に「民事的な訴え」(出入筋の「訴訟」)「刑事的な訴え」(吟味筋の「訴訟」)、「行政的な訴え」(願筋の「訴訟」、「訴願」)の三類型を考え、この三つの中で、従来その法的・手続的研究がほとんどなされて来なかった「行政的な訴え」(願筋の「訴訟」)について、差し当たり主要な類型を抽出し、その法的手続を明らかにするとともに、出入筋の「訴訟」や吟味筋の「訴訟」との異動を明らかにするという手法をとってきた。本年度は、研究の最終年度であるので、これまで収集し得た史料・文献類を再度点検して、先ず始めに、(一)「行政的な訴え」(願筋の「訴訟」、「訴願」)の類型として、最も主要なものとして二つの類型を抽出した。一つは、第三者の不当な活動に対し、行政庁に何らかの措置を求めるもの(告発「訴訟」)、もう一つは、行政の措置・処分に不服を訴え、善処を求めるもの(不服申立「訴訟」)である。次に、(二)これらについて、その法的手続きを明らかにすることに努めた。差し当たり解明し得た手続きを順を追って記すと、次のようになる。(1)訴状提出、(2)訴状糺、(3)奉公の冒頭尋問、(4)審理、(5)証拠の提出、(6)被非難者の召喚、(7)答弁書の提出、(8)答弁書に対する意見書の上申、(9)内済(示談、あつかい)、(10)裁定、(11)裁定請証文の提出。そして、(三)これらの手続から、「行政的な訴え」(願筋の「訴訟」、「訴願」)の特徴として、一面では、当事者主義的な出入筋の手続きに類似している側面があると同時に、他面では、糺問主義的な吟味筋の手続に類似している側面があったこと、そして「行政手続的な訴え」(願筋の「訴訟」、「訴願」)の処理にはこの両側面が求められていたことを明らかにした。
日本語数量詞構文に関する談話文法論的研究

本研究では、従来統語論的な機能だけが注目され、意味差を検討される機会の少なかった連体数量詞構文と遊離数量詞構文の意味的な違いが何か、また、それは何に起因するものか、などについてさまざまなデータを集めることにより、分析を行うものである。平成12年度から13年度にわたる研究の結果、以下に述べるようなことが明らかになった。(1)統語論的な機能差は、日本語の修飾構造の基本的特質を反映し、その一部を増幅する形で説明することが可能なこと。日本語の統語構造において、連体修飾要素を副詞的な連用修飾要素に転換することが容易で両者の対応関係については、すでにいくぶんかの研究があるが、名詞を限定する成分である連体修飾要素が用いられた場合は、すでに確立された概念の存在を前提にしているのが普通であり、これは以下の既定的単位と大きく重なるものである。(2)連体数量詞構文は、それが既定的な単位と認知されていることを反映していること。既定的単位とは、ある個別物の集合体(1以上の集合的存在)について、それが離散的に存在しているのではなく、ある種のまとまりを持って存在していると認知されている。このことは、談話においては語用論的な条件となりうる。(3)遊離数量詞は既定的な単位とは認定されていないことを反映していること。遊離数量詞構文では、集合的な単位という認識はないが、これはただちに離散的な単位と認識していることを意味しない。集合的な単位という認識は、それが義務的に生じる場合、義務的な要請の結果として生じたのではないが結果的に生じている場合、生じないことが義務的に求められる場合が想定されることなどが分かった。(4)理論的に有標なのは連体数量詞構文であり、遊離数量詞構文のほうが無標であるが、これは、データによっても裏付けられる。文法や論理的関係からは、連体数量詞構文が無標であり、遊離数量詞構文が派生形態のように思われるが、実態は逆であり、収集したデータからもそのことを支持する結果が出た。本研究は、日本語における数量詞構文の使い分け(遊離数量詞構文と連体数量詞構文の機能区分)が話者の認知を反映し、語用論的な要因に左右されるという仮説を検証するものである。本年度は、当初の実施計画に沿って、理論的基盤の整備に重点をおいて研究を進めた。その内容は大きく4つに分けることができる。1つは、認知上の要因として、「既定的単位」「未定的単位」という概念を設定することの有効性の検証である。これには、統語論的な背景と認知言語学的に探るべき方向性が考えられるため、関連する資料や情報を収集し、整理しつつ、理論の精緻化を進めているところである。2つめは、数に関する言語表示を、言語研究全般においてどう位置づけるか、また、その基盤をどう整備するかという問題の解決である。日本語における数表示は、文法範疇としては存在しないとされてきたが、語用論的な観点から見ると、「一貫性」を確保する意味で日本語にも「数」のカテゴリーを考えるべきこと、また、そこにはいくつかの意味特徴が階層的に関わっていることが、徐々に見えてきた。この仮説の論証については、次年度に論文の形で成果にできる見込みが立っている。3つめは、語用論研究の枠組みの中での位置づけと、その扱いの確定である。その中で、数量詞構文の問題を語用論の領域から扱う場合に、意図や認識や解釈といったシステム的なレベルで扱うべきケースと、指示詞・談話標識・省略などの個別トピックの領域で扱うべきケースの2つが想定されると、現時点では考えている。この方向性に沿って、数量詞と数量詞構文を含む「数」の領域を2つのレベルで捉えなおし、理論的な精緻化を行おうと考えている。以上の理論面の作業と平行して、関連する例文のデータベース化を進めており、おおよそ計画の3分の1程度が集められている。

集合的な単位という認識は、それが義務的に生じる場合、義務的な要請の結果として生じたのではないが結果的に生じている場合、生じないことが義務的に求められる場合が想定されることなどが分かった。(4)理論的に有標なのは連体数量詞構文であり、遊離数量詞構文のほうが無標であるが、これは、データによっても裏付けられる。文法や論理的関係からは、連体数量詞構文が無標であり、遊離数量詞構文が派生形態のように思われるが、実態は逆であり、収集したデータからもそのことを支持する結果が出た。
乳癌早期診断支援のためのパルス中性子屈折型画像診断法の開発

通常の病理診断では、乳癌は良性か悪性かの最も重要な判断が難しく早期発見を困難としている。そこで、中性子短時間計測による中性子イメージング屈折コントラスト画像化法の開発を行った。本システムが短時間計測可能か調べるため、金属材料を用いて実験を行った。銅単結晶にレーザー照射し、金属表面の変化をリアルタイムで測定を行った。レーザーの繰り返し照射による材料への負荷累積回数と負荷の強度をパラメータとして、X線反射強度曲線のプロファイルを測定結果、試料へのレーザー照射回数の増加と共に、X線反射強度曲線の半値幅が大きくなった。試料中に生じる数μm領域の秒毎の変化を捉えることが可能であることを示した。乳癌は、乳腺の組織像が非常に多様であるため癌の中でも通常の病理診断(細胞診)では良性か悪性かの最も重要な判断が難しく早期発見を困難としている。近年、乳腺に沈着しているカルシウムをX線によりイメージングする早期診断法が開発されているが、カルシウム沈着の乏しい早期乳癌は検出できないという問題がある。そこで、カルシウムが少ない場合でも細胞組織の画像化を可能とする中性子の複数エネルギーの短時間計測による中性子イメージング屈折コントラスト画像化法の開発を行う。平成24年度は、J-PARCでのパルス中性子実証実験に向けて、パルス中性子及び屈折アナライザーの同期システムの開発、試料マウントシステムの設計を行った。まず、パルス中性子及び屈折アナライザー同期システムの開発について説明する。パルス中性子は、定常中性子と異なり、中性子のエネルギーにより飛行時間が変わる。そこで、パルス中性子の飛行時間つまり、中性子エネルギーと屈折アナライザーの反射角を同期させて、屈折アナライザーに中性子が入射する角度を制御するシステムを開発した。パルス中性子の特徴を生かした複数のエネルギー領域での検出が可能となる。さらに、画像取得に必要なエネルギー領域の中性子到達時間で検出器にゲートをかけることにより、検出した信号へのノイズを減少させる効果も得られる。次に、試料マウントシステムの構築について説明する。中性子照射中には照射室に入室することはできない。照射直後においても、実験装置等の放射化によるガンマ線の放出で被ばくのおそれがあるため、照射室に入室することはできない。そこで、遠隔操作で被写体を移動させることができるシステムを設計した。システムは主にXZステージから構成されており、0.01mmの精度で制御可能である。研究代表者が25年度、育児に専念したため、研究を実施できなかった。このような理由から補助事業期間を1年間延長し、計画全体を1年遅れで遂行する。来年度に、本年度計画していた実験用備品を調達して、実証実験を実施する。乳癌は、女性が癌にかかる割合で最も多く、日本人では24人に1人、欧米では8人に1人の割合で乳癌にかかると言われ、深刻な社会問題となっている。最近、早期発見を目指したマンモグラフィ検診が普及しているが、カルシウム沈着の無い症例は判断が難しく、良性か悪性かの確定診断は病理診断に頼るところが大きい。しかし、乳腺組織像自体が多様であることから、病理診断においても判断が難しいケースが多くある。近年、X線屈折コントラストによる乳癌早期診断法[1]が開発されているが、カルシウム沈着の無い乳癌の画像化は難しいのが現状である。そこで、J-PARC(Japan Proton Accelerator Research Comlex)パルス中性子による複数エネルギーを短時間で計測する屈折コントラスト画像化法の開発を行う。中性子位相情報の画像形成利用は幾つかの方式で研究されている。ドイツにある研究用原子炉で位相コントラスト中性子イメージングの研究がなされている。各方式の中で、申請者が提案する中性子完全結晶シリコンアナライザーを用いる方式は最も高感度となることが推察され、唯一、癌等の軟部組織内の構造が描出する技術として期待できる。そこで、申請者は複数中性子エネルギーを得られるJ-PARCパルス中性子に注目し、J-PARCパルス中性子屈折イメージング法の開発を行うことにより、カルシウム沈着が無い乳癌の画像化を目標とし、それを可能とする中性子光学技術の開発を行っている。本年度は中性子屈折イメージングシステムと解析アルゴリズムの開発を行った。

近年、乳腺に沈着しているカルシウムをX線によりイメージングする早期診断法が開発されているが、カルシウム沈着の乏しい早期乳癌は検出できないという問題がある。そこで、カルシウムが少ない場合でも細胞組織の画像化を可能とする中性子の複数エネルギーの短時間計測による中性子イメージング屈折コントラスト画像化法の開発を行った。本システムが短時間計測可能か調べるため、金属材料を用いて実験を行った。試料として、銅単結晶を選定して,約10mm角の大きさに切り出して使用した。銅単結晶にレーザー照射し、金属表面の変化をリアルタイムで測定を行った。レーザーの繰り返し照射による材料への負荷累積回数と負荷の強度をパラメータとして、それらの条件に対するロッキングカーブのプロファイルを測定した。その結果、試料へのレーザー照射の回数の増加と共に、ロッキングカーブの半値幅が広がった。これは試料がレーザー照射により結晶構造が変化したことを意味している。これらのことから、試料の数μm領域の秒オーダーの変化をリアルアイムに捉えることが可能であることが分かった。今後は、本システムの実用化を目指したさらなる実験を行っていきたい。原子力学本研究では、カルシウム沈着の無い乳癌摘出標本の非破壊での画像化を目標とし、それを可能とする中性子光学技術の開発をする。平成23、24年度には次に挙げる5項目、中性子屈折イメージングシステムの開発、中性子屈折画像解析アルゴリズムの構築、JRR-3を用いた基礎研究、パルス中性子及び屈折アナライザーの同期システムの開発、試料マウントシステムの構築を実施する計画だった。そのうち、平成23年度は、中性子屈折イメージングシステムの開発、中性子屈折画像解析アルゴリズムの構築を行った。特に、中性子屈折アナライザーの設計及び、中性子屈折イメージングシステムで得られた中性子屈折画像を解析するためのアルゴリズムを構築した。平成24年度においては、パルス中性子及び屈折アナライザーの同期システムの開発、試料マウントシステムの構築を行った。JRR-3を用いた基礎研究も行う予定だったが、東日本大震災の影響でJRR-3での実験を行うことができなかった。また、平成24年5月に妊娠が判明したため、平成24年度後半は研究を中断した。これらの研究進捗状況より、平成24年度までの研究計画は70%の達成度であると自己評価した。本研究ではカルシウム沈着の無い乳癌摘出標本の非破壊での画像化を目標とし、それを可能とする中性子光学技術の開発をする。平成23、24年度には次に挙げる5項目、中性子屈折イメージングシステムの開発、中性子屈折画像解析アルゴリズムリズムの構築、JRR-3を用いた基礎研究、パルス中性子及び屈折アナライザーの同期システムの開発、試料マウントシステムの構築を実施する計画だった。そのうち、平成23年度は、中性子屈折イメージングシステムの開発、中性子屈折画像解析あるアルゴリズムリズムの構築を行った。
不均質断層の破壊伝播理論に基づく地動加速度の強度予測

大きな地震が励起する短周期の地震波は、地震動災害に直接関係する強震動の強さを支配している。この波動の性質を調べるために、不均質な断層破壊過程の理論を発展させ、震源の不均質領域のサイズ分布や破壊強度分布のゆらぎと短周期震源スペクトル構造の関係を明らかにした。さらに、断層破壊様式や破壊伝播の影響が、どのように短周期地震波や強震加速度,また、被害地震の震度分布に反映されているのか、日本と中国の大きな被害地震を網羅し、現象論的に研究した。以上の研究結果は、下記の四編の論説にまとめられた。2.ランダム波動のフラクタルスペクトル構造:この研究では、断層パッチのサイズ分布がどの様に短周期震源スペクトル構造を決めているのかを明らかにした。4.断層パッチのサイズ分布と不均質断層の震源スペクトル構造:この研究では、不均質断層破壊の複雑な破壊過程を、破壊する断層パッチの統計的な性質を考えることで、理論的に表現した。そして、短周期地震波の励起を不均質断層破壊の立場から統一的に議論した。
局所進行食道癌の集学的治療に関する研究-手術療法は必要か-

研究計画【対象】臓器転移のない(M0)他臓器浸潤(T4)胸部食道扁平上皮癌、年齢75歳以下、PS:0-2【選択枝】手術:照射化療+手術(術前:超多分割照射36Gy+CDDP/5Fu少量連日投与、術後:超多分割照射24Gy+CDDP/5Fu少量連日投与、食道切除またはバイパス)、非手術:照射化療単独(手術例と同じ超多分割照射CDDP+5Fu少量連日投与を2コース施行)【方法】食道手術の有無はインフォームド・コンセントに基づき患者が選択する。研究結果【症例数】54例/1994-2002年。手術29例、非手術24例、治療中1例。【奏効率】1コース(36Gy照射):有効(PR)31例58%(全てPR)、無効(NC/PD)22例42%【手術】治癒切除:18例62%,姑息切除:7例24%,バイパス:4例14%手術vs非手術:NS,有効例における手術vs非手術:NS,無効例における手術vs非手術:p=0.029、有効例vs無効例:p=0.011結論他臓器浸潤(T4)食道癌の予後を規定する因子は放射線化学療法の有効性であり、手術(食道切除またはパイパス術)の有無ではなかった。照射化療の有効例(CR/PR)では手術の必要がなく、無効例(NC/PD)では手術の必要がある。研究計画【対象】臓器転移のない他臓器浸潤(T4)食道扁平上皮癌、年齢75歳以下、PS:0-2【選択枝】1群:照射化療+食道切除(術前:超多分割照射36Gy+CDDP/5Fu少量連日投与、術後:超多分割照射24Gy+CDDP/5Fu少量連日投与)、2群:照射化療単独(1群と同じ超多分割照射CDDP+5Fu少量連日投与を施行、非切除)【方法】食道切除の有無はインフォームド・コンセントに基づき患者が選択する。研究結果【症例数】34例/1994-2000年。1群15例、2群14例、治療中3例、完遂不能2例。【奏功率】1群:73%(PR73%)、2群:64%(CR34%、PR29%)、全体の奏功率:70%【切除例(1群)】治癒切除:73%(PR60%,NC13%)、姑息切除:27%(PR13%,NC13%)【非切除例(2群)】手術拒否:64%(CR36%,PR29%)、手術不能:36%(NC21%,PD14%)【1・3・5年生存率】1群:80%・50%・50%(治癒切除例:82%・53%・53%、姑息切除例:75%・-)(PR:73%・44%・44%、NC:100%・-)。2群:33%・22%・-(手術拒否:50%・33%・-、手術不能:0%)(CR:80%・53%・-、PR:0%、NC/PD:0%)。結論照射化療による著効CR例では、食道切除の必要はない。有効PR例や不変NCまたは進行PD例では、食道切除が必要である。研究計画【対象】臓器転移のない他臓器浸潤(T4)食道扁平上皮癌、年齢75歳以下、PS:0-2【選択枝】

1群:照射化療+食道切除(術前:超多分割照射36Gy+CDDP/5Fu少量連日投与、術後:超多分割照射24Gy+CDDP/5Fu少量連日投与)、2群:照射化療単独(1群と同じ超多分割照射CDDP+5Fu少量連日投与を2コース施行、非切除)【方法】食道切除の有無はインフォームド・コンセントに基づき患者が選択する。研究結果【症例数】40例/1994-2000年。1群22例、2群18例、治療中1例。【奏効率】1群:68%(PR68%)、2群:61%(CR39%、PR22%)、全体の奏効率:65%【切除例(1群)】治癒切除率:77%(PR59%,NC18%)、姑息切除率:22%(PR9%,NC14%)【非切除例(2群)】手術拒否:66%(CR39%,PR22%,NC6%)、手術不能:33%(NC17%,PD17%)【1・3・5年生存率】1群:86%・36%・24%(1コース後の効果判定PR:79%・43%・29%、NC:100%・-)。2群:50%・21%・21%(1コース後の効果判定PR:76%・32%・32%,NC/PD:0%)。結論照射化療1コース後の効果判定で著効または有効例(CR/PR)では、食道切除の必要性が認められない。不変または進行例(NC/PD)では、長期生存は得られないが食道切除の必要性を認める。研究計画【対象】臓器転移のない他臓器浸潤(T4)食道扁平上皮癌、年齢75歳以下、PS:0-2【選択枝】1群:照射化療+手術(術前:超多分割照射36Gy+cDDP/5Fu少量連日投与、術後:超多分割照射24Gy+cDDP/5Fu少量連日投与、食道切除またはバイパス)、2群:照射化療単独(1群と同じ超多分割照射CDDP+5Fu少量連日投与を2コース施行、非手術)【方法】食道手術の有無はインフォームド・コンセントに基づき患者が選択する。研究結果【症例数】47例/1994-2001年。1群27例、2群19例、治療中1例。【奏効率】1群:63%(PR63%)、2群:63%(CR37%、PR26%)、全体の奏効率:63%【手術例(1群)】治癒切除:63%,姑息切除:22%,バイパス:14%【非手術例(2群)】手術拒否:68%、手術不能:26%,救済手術(再発再燃時):5%結論他臓器浸潤(T4)食道癌に対する照射化療後の効果判定で、有効例(CR/PR)は食道手術の必要がない。無効例(NC/PD)は長期生存が得られないが、食道手術の必要があるかもしれない。研究計画【対象】臓器転移のない他臓器浸潤(T4)食道扁平上皮癌、年齢75歳以下、PS : O-2【選択枝】1群:照射化療+手術(術前:超多分割照射36Gy+CDDP/5Fu少量連日投与、術後:超多分割照射24Gy+CDDP/5Fu少量連日投与、食道切除またはバイパス)、2群:照射化療単独(1群と同じ超多分割照射CDDP+5Fu少量連日投与を2コース施行、非手術)【方法】食道手術の有無はインフォームド・コンセントに基づき患者が選択する。研究結果【症例数】54例/1994-2002年。1群29例、2群24例、治療中1例。【奏効率】1群:62%(PR 62%)、2群:54%(60Gy後、CR 29%、PR 21%)、全体の奏効率:58%【手術例(1群)】治癒切除:62%,姑息切除:24%,バイパス:14%【非手術例(2群)】手術拒否:63%、手術不能:37%照射化療1コースのみ:21%、2コース:79%【1・3・5年生存率】1群(手術例):72%・27%・20%(CR/PR症例:78%・36%・27%、NC/PD症例:77%・0%・0%)。2群(非手術例):52%・24%・24%(CR/PR症例:75%・33%・33%、NC/PD症例:24%・0%・0%)。CR/PR症例:77%・34%・28%、NC/PD症例:44%・0%・0%。手術vs非手術:NS,有効例における手術vs非手術:NS,無効例における手術vs非手術:p=0.029、有効例vs無効例:p=0.011結論他臓器浸潤(T4)食道癌の予後を規定する因子は放射線化学療法の有効性であり、手術(食道切除またはパイパス術)の有無ではなかった。導入照射化
間葉系幹細胞の分化スイッチ制御に関わる遺伝子の解析

間葉系幹細胞(MSCs)は、間葉系への細胞に分化する能力を有し、様々な組織で未分化状態を維持している組織幹細胞である。MSCsは、in vitroで培養された細胞を用いて定義されているため、その性質について実験ごとの相違が生じている。本実験では、ヒトおよびマウスMSCsを予期的に分離し、MSCsについての未分化維持について、クローナルな解析を行った。その結果、未分化なMSCsにはTeneurin-4(Ten-4)遺伝子が発現しており、分化後に発現が低下していることが分かった。本実験の結果により、MSCsの未分解時においてTen-4遺伝子が一部役割を担っている可能性が示唆された。本研究は、申請者が開発した間葉系幹細胞を分離する技術を応用し、均一な間葉系幹細胞を用いて、間葉系幹細胞の分化に影響を与える遺伝子の機能解析を行う。特に、間葉系組織に発現しているTeneurin-4遺伝子に着目し、間葉系幹細胞の分化におけるTeneurin-4の役割を解析することを目的としている。Teneurin-4の分化制御は、間葉系組織だけにとどまらず、骨格筋や神経など多岐にわたるため、組織間で共有される「分化スイッチ機構」を体系的に解明することは、学術的ばかりでなく、安全な先進医療を確立する上でも大きな意義を持つ。本年度は、間葉系幹細胞の分化制御にTeneurin-4が関与しているかどうかという基礎的なデータを得るため、フローサイトメーターで分離したヒト間葉系幹細胞を用いて、分化前後でTeneurin-4遺伝子の発現変化を確認した。骨髄より間葉系幹細胞を分離・培養し、骨・軟骨・脂肪に分化させた後にRNAを採取した。分化前と後で、どのような遺伝子変化が起こっているかを解析したところ、分化後にTeneurin-4の発現が著しく低下することがわかった。また、分化能力が高い未分化間葉系幹細胞と分化能力が低い老化間葉系幹細胞の遺伝子発現においても解析を行ったところ、未分化間葉系幹細胞においてTeneurin-4の発現が高いことが確認された。マウス骨髄由来の間葉系幹細胞については、現在Teneurin-4ノックアウトマウスやヘテロマウスを用いた解析を行っているところである。間葉系幹細胞は、その多分化能から再生医療の細胞治療ソースとして注目されているが、その多分化能がどのような制御機構を持っているかについて基礎的な研究はほとんど進んでいない。本研究は、骨髄ならびに様々な組織に含まれる間葉系幹細胞を分離培養し、細胞自体の特性、基準となる指標を明確に示すこと目的とする。特に、間葉系幹細胞を分離する技術を利用し、純化した間葉系幹細胞を用いて、分化能力を担う遺伝子の探索・機能解析を行う。前年度までの研究結果により、分化によって大きく発現が変動するTeneurin-4に着目した。本年度は、Teneurin-4ノックアウトマウスを用いて、間葉系組織の解析を行った。成体マウス骨髄をコラゲナーゼ処理を行うことで、骨髄由来細胞を採取した。得られた細胞に対し、表面抗原に対する抗体にて染色し、フローサイトメーターを用いて間葉系幹細胞を分離した。間葉系幹細胞(PDGFRa+Sca-1+細胞)の割合を調べたところ、野生型に比べてノックアウトマウスではやや低下していることが分かった。分離した間葉系幹細胞を血清を含んだ培養皿上で培養すると、野生型・欠損型について、どちらも増殖能力にさほど大きな差は無い事が分かった。現在、長期培養した際の細胞老化、および骨・軟骨・脂肪への分化能力についての解析を行っているところである。また、長期培養や分化の際に、Teneurin-4遺伝子がどのような挙動を示すかを今後解析していきたいと考えている。本年度は、ヒト間葉系幹細胞における増殖能力とTen-4遺伝子の相関についての解析を行った。これまでの成果により、フローサイトメーターを用いてヒト骨髄細胞より表面抗原マーカーを指標にした分離技術を確立している。分離した間葉系幹細胞は、単一細胞で培養しても増殖し、約10継代以上まで増殖することを確認した。また、これらの間葉系幹細胞クローンは、骨・軟骨・脂肪などの間葉系細胞への分化能を持つことが分かった。ヒト間葉系幹細胞の増殖能力が高いクローン(REC)と増殖能力が低いクローン(SEC)を比較した所、増殖能力の高さに応じてTen-4遺伝子の発現が高くなることが分かった。そこで、ヒト間葉系細胞の分化誘導後におけるTen-4遺伝子の発現についての解析を行うために、骨・軟骨・脂肪に分化させた細胞からRNAを採取し、分化前後でのTen-4遺伝子発現の比較を試みた。その結果、分化後においてTen-4遺伝子の発現は著しく低下することが確認された。現在、培養方法も変えた条件(Sphere培養・無血清培養・低酸素培養)も同様に遺伝子変化を調べている。本年度の研究実績により、マウス間葉系幹細胞に加えヒト間葉系幹細胞においても、幹細胞能力とTen-4の発現に相関関係があるのではないかと考えられた。

その結果、未分化なMSCsにはTeneurin-4(Ten-4)遺伝子が発現しており、分化後に発現が低下していることが分かった。本実験の結果により、MSCsの未分解時においてTen-4遺伝子が一部役割を担っている可能性が示唆された。予定していた実験計画通りにおおむね進展している。本年度は、Teneurin-4のノックアウトマウスの骨髄から間葉系幹細胞を純化・培養することが可能であった。間葉系幹細胞におけるTeneurin-4の能力を調べるための重要な知見が得られている。今後も計画通りにすすめていく予定である。再生医学Teneurin-4のノックアウトマウスの骨髄から得られた間葉系幹細胞を、骨・軟骨・脂肪に分化させ、野生型と比較して分化能力の違いを解析する。間葉系幹細胞に対する遺伝子導入効率が未だ低いので、今後の実験をスムーズに進めるために引き続き改善を行っていく予定である。分化前後でのTeneurin-4遺伝子発現の結果は、本研究において非常に重要なデータであり、得られている結果も予想していた結果に限りなく近いことから、今後も計画通りに進めていく予定である。筋線維芽細胞のセルラインにおいて、Teneurin-4のノックダウンによって分化が促進し、過剰発現により分化が抑制されることが分かっている。この系を用いて、間葉系幹細胞におけるTeneurin-4の遺伝子制御を行い、分化能に与える影響を調べる予定である。間葉系幹細胞への遺伝子導入技術において、導入効率がやや低いという課題があるため、現在改善を行っている。参加予定であった学会が、2014年4月に開催であったことと、出版論文の別刷の納期が年度をまたいだため、次年度使用額が生じた。次年度使用額は、2014年4月に開催される学会参加費と、出版論文の別刷印刷料として使用される。その為、翌年度分として請求した助成金への影響は無い。