hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
特別支援教育専攻学生を対象とした障害理解のための教材開発と教材情報の集積

しかし、困難の体験に関しては、肢体不自由教育における車イス体験、関節可動域制限体験等に限定されおり、病弱教育領域の困難体験による「障害理解」については、体系的な教材の準備は行われていないことが明らかとなった。「1.困難の擬似的体験を可能にする教材開発」に関しては、当初改良モデルの製作段階までの到達を計画していたが、血友病および糖尿病の自己注射、糖尿病の血糖自己測定のための穿刺にかかわるモデルは、試作モデルを改良し「改良モデル」の製作にまで進展している。また、23年度に主として対象とした喘息発作の教材は素材・作製手続き、指導評価のためにアンケート等の活用といった指導体制の大枠が完成している。一方、「2.教材活用に関する情報集積とライブラリーの構成」に関しては、教材の材料・作製過程・活用場面等の画像・動画から構成するライブラリーシステムのプロトタイプを完成させ、一部の教材を集積した。しかし、第2次調査として全国の教育大学・学部のシラバス情報の集積を行ったが、2次調査としての全国の「心理・生理・病理」および近接領域科目に関わる指導を担当する教員を対象とする調査が不十分である。したがって、研究全体の進行状況については、当初計画と照らし合わせるとバラつきがあり、全体としてはおおむね順調に進展していると判断するに至った。「1.困難の擬似的体験を可能にする教材開発」に関しては、当初試作モデルの製作段階までの到達を計画していたが、喘息の陥没呼吸モデルについては試作モデルをさらに改良し「改良モデル」の製作にまで進展している。一方、「2.教材活用に関する情報集積とライブラリーの構成」に関しては、第1次調査として研究者間の情報交流・集積を行い、2次調査に用いる調査項目の作成まで行った。これは当初の予定通りであるが、全国の「心理・生理・病理」および近接領域科目に関わる指導を担当する教員を対象とする調査が十分集計されるに至っていない。「1.困難の擬似的体験を可能にする教材開発」に関しては、対象とする疾患・障害の範囲を拡大し、血友病性関節症などの関節障害とその状態での動作時の「痛み」「違和感」など対象としてモデルを作製する予定である。学生へのアンケート調査を行い、教材を自ら作製することによる「困難」の理解促進について検討を深める。一方、「2.教材活用に関する情報集積とライブラリーの構成」に関しては、全国の「心理・生理・病理」および近接領域科目に関わる指導を担当する教員を対象とする調査の分析を早い時期に実施する予定である。またライブラリー構成のための教材の材料・作製手順、活用方法等にかかわる情報収集と画像・動画等の作製を実施する。「1.困難の擬似的体験を可能にする教材開発」に関しては、対象とする疾患・障害の範囲を拡大し、「インシュリン依存型糖尿病」「血液凝固異常症(血友病)」の自己注射、血糖自己検査等を対象としてモデルを作製する予定である。
超臨界処理による環境浄化型酸化チタン複合炭化物の創製

研究実施者らは、近年、超臨界イソプロパノール中でチタンアルコキシドを処理すると、光触媒活性を有する酸化チタン(Tio_2)に効率よく変換されることを見出した。この変換反応を木質系炭化物の表面に適用することで、有害物質の吸着能を有する炭化物に光触媒活性を付与した新規な環境浄化型TiO_2複合炭化物が創製し得ることを明らかにした。この事実に基づき、本研究では、ゾルーゲル反応によるチタンアルコキシドの酸化チタンへの変換を、超臨界イソプロパノール中、炭化物表面にて行わせ、光触媒活性の高いアナターゼ型TiO_2複合の炭化物を得ることを試みた。その結果、複合体の炭化物部からは有害物質の高い吸着能を、複合したTiO_2からは、光触媒活性による吸着物の効果的分解、無害化を誘引する新規な高機能性木質系炭化物を開発することができた。これは炭化物本来の吸着能とは異なり、吸着→分解→無害化の不可逆反応により、有害物質がCO_2とH_2Oにまで分解されることが期待でき、その際、CO_2は吸着サイトから放出されるため、再度吸着サイトが有害物質の吸着に利用され、半永久的に環境浄化効果の持続が期待しうるものである。具体的には、シックハウス症侯群として知られる疾病を引き起こすホルムアルデヒドについて検討し、本研究で開発したTiO_2複合炭素物がこれらを効果的に分解し、CO_2とH_2Oに無害化することを明らかにした。さらに、アセトアルデヒドにおいては、中間体としてホルムアルデヒド及びメタノールに変換され、最終的にCO_2とH_2Oに分解されることを明らかにした。
多重スパッタ法による高温超伝導膜成長の低温プロセス化と接合素子形成

本研究においては、スパッタ法により複合酸化物膜を合成するとき、結晶化温度の低い低級酸化物を多重積層化するプロセスを開発し、結果として低温合成を可能にすることを目指している。本年度の研究成果は大きく3つに分れており、各々の実績について以下に概要を述べる。YーBaーCuーO系薄膜に関しては、Y_2Cu_2O_5とBaCuO_2酸化物膜のスパッタ形成にあたりタ-ゲットとして合金と焼結体の2つのタイプを用いた結果を詳細に比較検討した。結論として、合金タ-ゲットを用い、基板温度約600°Cのもとで、成膜可能であることを明らかにした。特に、YーCuーO膜においては、紫外線照射下でのN_2O反応性スパッタが低温化に有効であることを確かめた。BiーSrーCaーCuーO系薄膜に関しては、対向タ-ゲットスパッタ法により、基板温度700°Cのもとで、110K相単相膜の形成が可能であることを示した。しかし、膜の超伝導特性に関しては、膜の結晶性についての種々の物理分析の結果、大幅な改善が必要であることを明確にした。CuーO系多層膜形成に関しては、dc反応性スパッタ法により、350450°Cの低温基板温度のもとで、単結晶CuO膜をうることができることを実験的に明らかにした。さらに、CuO/NiO多重積層膜の形成を試み、CuOの半導体特性を制御・変化する上でNiO層の存在が有効であることを確かめた。また、NiO膜の結晶相の強い影響を受け、CuOエピタキシャル膜は、正方晶へ相変化することを確認することができた。
脳虚血においてＧＬＰ－１がアポトーシスを抑制し神経再生を促進する分子機構の解明

本実験計画ではGLP-1 agonistであるexendrin-4をラットに腹腔内投与することで、一過性前脳虚血により誘発されるアポトーシスに差がみられるか否かを検討することを第一目標としている。本年度はexendrin-4非投与群・投与群のそれぞれにおいて、ラットの一過性前脳虚血モデルを作成した。これらラットモデルは両側総頚動脈遮断に加えて脱血により平均血圧を30mmHgまで低下させることで、前脳虚血をラット脳に負荷し、遅発性神経細胞死を誘発する。これらラットの虚血モデルは虚血12時間後、1日後、3日後、5日後のタイムポイントでそれぞれを断頭した。その後、断頭した脳から、固定後に脳切片を作成した。本実験計画においては、動物モデルの安定した作成こそが、良質な実験結果を導くために重要な意義をもっている。そのため、本年度中に安定したモデル作成と一定数の脳切片を確保できたことは、今後の円滑な実験進行のために重要である。また、経時的な変化を追跡することが各種抗原の発現および神経新生の分化の過程をとらえることに重要である。年度後半においては、この作成したモデルから、脳切片を作成し、順次、免疫染色を開始している。その画像解析および統計学的解析も同時に並行して行っている。すでに多くの脳切片が確保できていることから、今後は各種抗体を用いて、解析を進め、当初の目標であるアポトーシスおよび神経分化にかかわる因子の解明に尽力したい。Glucagon-like peptide 1 (GLP-1)は小腸のL細胞から分泌されるペプチドホルモンであるが、最近膵臓β細胞のアポトーシス抑制および再生(増殖)にも関与することが明らかとなっている。また、このGLP-1は神経細胞でも合成され、GLP-1受容体も中枢神経系の神経細胞に広く発現していることが判明し、中枢神経系においてもアポトーシス抑制および再生促進作用を有する可能性が示唆されている。本研究では脳虚血後のアポトーシスを基盤とする神経細胞障害におけるGLP-1の役割と脳虚血後神経再生における促進効果について全脳虚血モデル(海馬CA1におけるアポトーシス)、局所脳虚血モデル(ペナンブラ)、局所脳虚血再潅流モデル(再潅流障害)を用いて検討する。GLP-1受容体アゴニスト(exendrin-4)投与群、非投与群でアポトーシスの中核となる各種Bcl2ファミリータンパクのリン酸化、その上流の細胞内情報伝達経路であるPI3K/Akt系およびMAPK-JNK系におけるタンパクの活性化に及ぼす効果についての検討を予定している。さらに新生細胞発生の促進効果についてBrdU染色および各種細胞マーカーの多重染色を用いて検討する予定である。現在、種々の投与方法(経口投与、腹腔内注射、静脈内注射)や投与量でexendrin-4をラットへ投与し、虚血性神経傷害に対する保護効果を示す至適条件を検討中である。Glucagon-like peptide 1(GLP-1)は血糖降下作用に加えて膵臓β細胞のアポトーシス抑制作用および細胞再生(増殖)作用を有する糖尿病治療薬であるが、種々のアポトーシス誘発刺激に対して細胞保護的に機能することが報告されている。我々はラット一過性前脳虚血モデルを使用し、脳虚血におけるアポトーシスを基盤とする神経細胞傷害および神経新生に対するGLP-1アゴニストであるexendrin-4の効果について検討した。昨年度までに作成したラット一過性前脳虚血モデルの脳切片を使用し研究を行った結果、exendrin-4を虚血7日前から腹腔内投与すると、海馬CA1領域のアポトーシス細胞数は減少する傾向にあることが示された。しかし、アポトーシスの中核となるBcl2ファミリータンパクのリン酸化やその上流の細胞内情報伝達経路であるPI3K/Akt系およびMAPK-JNK系におけるタンパクの活性化、チトクロムC、Smac/Diablo, HrtA2/Omiの定量的評価では有意差が得られず、その抑制機序の解明には至らなかった。また、免疫染色の結果、exendrin-4の投与はKi67陽性細胞数を増加させ、神経新生への関与が示唆された一方で、NestinやDCX, NeuN, GFAP, NG2などの細胞分化マーカーでは有意差が得られず、その神経分化への効果を明らかにすることはできなかった。脳神経外科本年においては、安定したモデル作成とそのアポトーシス量の解析を第一目標としており、当初の計画通りの前脳虚血モデル作成と脳切片が得られた。現在exendrin-4による虚血性神経傷害に対する保護効果の至適条件が確定される予定であるので、以後、各種細胞内情報伝達経路の関与について検討していく予定であるが、本年度にこの実験をスタートできていない点が予定から遅れているところである。作成したラット脳切片に対し、免疫染色を行い、細胞死量の定量的評価または各種細胞発現マーカーを追跡し、神経新生と分化について画像解析を進める予定である。予定がやや遅れているが、本年度の成果をもとに次年度の研究を継続していく。進行状況を確認しつつ、状況により実験に充てる時間を調節していく。本年度においては、主に動物実験モデル作成に費用を使用したが、各種免疫染色と蛋白発現解析までは進展が得られなかった。各種免疫染色と蛋白発現解析のための試薬・抗体購入のために使用する予定である。今回進行が遅れているため、平成24年度のラットや抗体等の購入額が予定を下回った。
小児悪性軟部肉腫の原因融合遺伝子を標的とした配列特異的治療薬の開発

H29年度まではEwing肉腫のEWS-FLI1遺伝子を標的とし、エピジェネティクな変化により細胞増殖抑制効果を示すPIP化合物の薬理効果について検討を行い、ヒストンアセチル化を誘導する候補化合物を取得してきた。使用しているEwing肉腫由来SK-ES-1細胞がもつ融合遺伝子のbreakpointが不明であったため、H30年度ではSK-ES-1細胞のゲノムDNAを用いたシークエンスによりbreakpointの同定を行った。その結果、EWS遺伝子のintron 8およびFLI1遺伝子のintron 4がbreakpointであることが分かったことから、PIP-seco-CBI化合物およびPIP-CTB化合物の標的配列がSK-ES-1細胞のEWS-FLI1融合遺伝子に含まれることを確認した。一方、滑膜肉腫については原因遺伝子であるSS18-SSX融合遺伝子のDNA配列上において特異性の高い標的配列9 bpを認識するPIP-seco-CBIを設計・合成し、滑膜肉腫由来細胞を用いたin vitroの評価系において、その薬理効果について検討した。その結果、HS-SY-II細胞におけるIC50値が1.4 nMであり、強い細胞傷害活性を示すことが分かった。この化合物によるSS18-SSX融合遺伝子発現への影響を検討したところ、Western blot法により融合遺伝子発現の抑制が認められたことから、この化合物はSS18-SSX融合遺伝子を標的とする候補化合物であることが示された。本研究課題により、特に治療成績の向上が求められている軟部肉腫であるEwing肉腫や滑膜肉腫の原因となっている融合遺伝子を標的とするPIP化合物の候補化合物を取得した。モデル動物における投与実験に必要な化合物の大量合成が進行中であり、担がんマウスにおける抗腫瘍効果の評価は今後の重要な検討課題である。本研究では、PIP-seco-CBI化合物を治療成績の向上が求められている軟部肉腫、特にEwing肉腫や滑膜肉腫に応用し、その原因となる融合遺伝子を標的とした新規治療薬の開発につなげることを大きな目的としている。そこで、本年度はまずEwing肉腫の原因遺伝子であるEWS-FLI1遺伝子のDNA配列上において特異性の高い標的配列9bpを認識する化合物を設計・合成し、その薬理効果について、Ewing肉腫由来細胞株を用いたin vitroの評価系において検討した。その結果、融合遺伝子上に結合配列を持たない陰性コントロール化合物におけるIC50値が6 nMであったのに対して、結合配列をもつ化合物のIC50値が0.2 nM前後であった。また、この化合物処理により融合遺伝子の発現が抑制され、アポトーシスのマーカーの上昇が確認されたことから、この化合物は融合遺伝子の発現を抑制し細胞死を誘導していることが示唆された。これらの結果から、融合遺伝子配列を認識するPIP-seco-CBI化合物を応用することにより、軟部肉腫の新規治療薬開発の可能性が示された。一方、PIP-SAHAライブラリーを用いた実験においては、融合遺伝子陽性細胞におけるIC50値がPIP-seco-CBI化合物に比べ高い結果となった。肉腫細胞においてPIP-SAHAによるヒストンのアセチル化が強く起こらないことから、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるSAHA以外のエピジェネティクス制御化合物を検討することとし、ヒストンアセチル化酵素活性化剤であるCTBによる修飾化合物の合成を行い、今後その薬理効果について検討する。融合遺伝子のパートナー遺伝子のうち、Ewing肉腫のEWS-FLI1遺伝子を標的としたPIP-seco-CBI化合物については、薬理効果の解析が順調に進んでいる。一方、SS18-SSX1を原因融合遺伝子とする滑膜肉腫については、滑膜肉腫由来細胞を培養し、細胞増殖に対するSS18-SSX1融合遺伝子への依存度をノックダウンにより検討しているところである。この遺伝子を標的とする化合物についてはすでに設計を終えている。また、PIP-SAHAの候補化合物のEwing肉腫由来細胞における検討を行った。さらに他のエピジェネティクス制御化合物を用いることにより、より抗腫瘍効果の高い化合物を取得できると考えている。本研究では、軟部肉腫、特に治療成績の向上が求められているEwing肉腫や滑膜肉腫に対して、特異性の高い標的配列9bpを認識するPIP-seco-CBI化合物を設計・合成し、原因遺伝子異常である融合遺伝子EWS-FLI1遺伝子やSS18-SSX遺伝子の発現を抑制する薬理効果をもつ化合物を取得することを目的としている。前年度のPIP-SAHAライブラリーを用いた実験において、融合遺伝子陽性細胞におけるIC50値がPIP-seco-CBI化合物に比べ高い結果となったことから、今年度はヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるSAHA以外のエピジェネティクス制御化合物を検討することとし、ヒストンアセチル化酵素活性化剤であるCTBによる修飾化合物の薬理効果について検討を行った。その結果、PIP-SAHAによる増殖抑制効果はSAHAに比べ弱く、H3K27アセチル化のレベルも低いことが示された。一方、PIP-CTBはCTBよりも低い濃度で増殖抑制効果を示し、今後をPIP-CTB化合物による抗腫瘍効果の評価を行う。また、PIP-CTBが標的とした遺伝子が細胞増殖および増殖関連シグナルの制御に関わる遺伝子であることが予想されることから、これらPIP-CTB標的遺伝子を明らかにすることが今後の重要な検討課題となる。

Ewing肉腫のEWS-FLI1遺伝子を標的としたPIP化合物のうち、今年度はヒストンアセチル化を誘導する修飾を行った化合物について解析を行い、研究計画を順調に進めてきた。まずEwing肉腫由来細胞におけるヒストンH3K27アセチル化の誘導についてヒストン脱アセチル化酵素阻害剤SAHAとヒストンアセチル化酵素活性化剤CTBを用いて検討したところ、いずれの細胞においてもSAHA処理によりH3K27acが誘導されたのに対して、CTB処理においてもSAHAに比べ弱いながらアセチル化が誘導されることを確認した。また、細胞増殖に対する影響を0.03 10 μMの異なる濃度で検討したところ、SAHAでは0.3 μM以上で増殖抑制効果が確認されるのに対して、CTBは10 μMと高い濃度が必要であった。さらに、PIPにSAHAを修飾した化合物PIP-SAHAを用いて同様に検討を行ったところ、SAHAに比べ増殖抑制効果が減弱する結果となった。このときのH3K27アセチル化の誘導も弱く、PIPによるDNAへの配列特異的結合によりヒストン脱アセチル化酵素の阻害が限定的となり、アセチル化ヒストンのレベルが上がらなかったのではないかと考えられた。一方、PIPにCTBを修飾した化合物PIP-CTBの増殖抑制効果を調べたところ、CTBよりも低い濃度で増殖抑制効果が得られた。このときH3K27acは弱いながら誘導され、シグナル分子の活性化を解析したところリン酸化ERKが抑制されていたことから、PIP-CTBによるエピジェネティックな変化により細胞増殖シグナルに関わる遺伝子制御が変化したものと考えられた。この増殖シグナルの制御に関わる分子がEwing肉腫の重要な標的分子となると予想されることから、今後PIP-CTBが標的とした遺伝子について明らかにすることが今後の重要な検討課題となる。H29年度まではEwing肉腫のEWS-FLI1遺伝子を標的とし、エピジェネティクな変化により細胞増殖抑制効果を示すPIP化合物の薬理効果について検討を行い、ヒストンアセチル化を誘導する候補化合物を取得してきた。使用しているEwing肉腫由来SK-ES-1細胞がもつ融合遺伝子のbreakpointが不明であったため、H30年度ではSK-ES-1細胞のゲノムDNAを用いたシークエンスによりbreakpointの同定を行った。その結果、EWS遺伝子のintron 8およびFLI1遺伝子のintron 4がbreakpointであることが分かったことから、PIP-seco-CBI化合物およびPIP-CTB化合物の標的配列がSK-ES-1細胞のEWS-FLI1融合遺伝子に含まれることを確認した。一方、滑膜肉腫については原因遺伝子であるSS18-SSX融合遺伝子のDNA配列上において特異性の高い標的配列9 bpを認識するPIP-seco-CBIを設計・合成し、滑膜肉腫由来細胞を用いたin vitroの評価系において、その薬理効果について検討した。その結果、HS-SY-II細胞におけるIC50値が1.4 nMであり、強い細胞傷害活性を示すことが分かった。
可逆なイミン結合形成反応に基づくインターロック化合物の構築とその動的構造制御

昨年度は軸・環部がイミン結合により連結されたイミン架橋型ロタキサンの軸上にマクロサイクルと水素結合を形成するトリエチレングリコール(TEG)部位を導入した分子シャトルを構築した。その分子シャトルにおいてマクロサイクルはイミン結合形成時、軸分子中央に固定化されているが、酸性加水分解条件下にすることで加水分解が完全に進行し、マクロサイクルはTEG部位へと移動した。さらに、高温条件下へとすることでマクロサイクルはイミン結合ステーションへと完全に偏り、酸性加水分解条件下では温度変化だけでマクロサイクルの位置を完全に制御できることを明らかにした。また、軸・環部をイミン結合により集合化させるロタキサン構築法は、イミン結合の動的共有結合性に基づく可逆性および効率的な集合特性、共有結合型テンプレートとしての安定性により様々な骨格に対し広い適応範囲を有すると予想される。一方、加水分解においては加水分解の運動性、すなわちエントロピー的要因がその平衡に寄与すると予想される。そこで本年度はどのような構造的要因がスレッディング効率、加水分解効率に影響を与えるかを調査する事を目的とし、軸分子上における2つのホルミル基の距離や環のサイズ、軸・環部の柔軟性が異なる誘導体を合成し、それらを用いたスレッディング特性、加水分解特性の調査を行った。すでに合成されているヒドリンダセン型軸分子に加えてシクロヘキサン型、ヘキサヒドロピレン型軸分子を新たに合成し、マクロサイクルはヘキサジイン型、ヘキサメチレン型に加えて、メタキシリレン型、アニシル修飾型、フェニルエチキサン修飾型の3種のマクロサイクルを合成し、それらを用いて調査を行ったところ、スレッディング段階においては軸および環の剛直性が重要な要因であること、およびマクロサイクルのアニリン部の置換基効果もスレッディング効率に影響しうることが示唆された。また、加水分解段階においては環の柔軟性が必要であることも分かった。加えて、軸分子の分子サイズを大きくすることでイミン体における立体障害が増加し、加水分解平衡状態における[2]ロタキサンの組成比が大きくなることが明らかにされた。軸状分子と環状分子をイミン結合を用いて集合化させたイミン架橋型ロタキサンでは、イミン結合の形成/解離・動的平衡条件下において高温時は結合形成側(イミン架橋型ロタキサン)へ、低温時には解離側(「2」ロタキサン)へ平衡が偏るような運動性の逆温度依存性を持ち、系全体のエンタルピー、エントロピー制御がシャトリングなどの運動性制御に重要な鍵となる。しかしながらこの系では-40度においても「2」ロタキサン種は22%程度と平衡を完全に偏らせることは出来ていなかった。そこで本年度ではこの運動性の逆温度依存性を利用したエントロピー駆動型分子シャトルの構築を計画した。イミン架橋型ロタキサンの軸上にマクロサイクルと非共有結合性相互作用的な親和性を有する付加的なステーションを配した新規ロタキサン分子においては高温時にはイミン結合側のステーションへ、低温時には非共有結合相互作用ステーションヘマクロサイクルが移動すると予想され、温度制御型ロタキサンスイッチとして機能すると考えた。実際、非共有結合性相互作用ステーションとしてマクロサイクルと水素結合を形成するトリエチレンダリコール(TEG)部位を軸分子上に導入した分子シャトルを構築したところ、マクロサイクルはイミン結合形成時、軸分子中央に固定化されているが、酸性加水分解条件下に付したところ室温においても加水分解が完全に進行し、マクロサイクルはTEG部位へと移動した。さらに予想したとおり、高温条件下へとすることでマクロサイクルはイミン結合ステーションへと完全に偏り、酸性加水分解条件下では温度変化だけでマクロサイクルの位置の完全な制御が可能な分子シャトルの構築に成功した。

加えて、軸分子の分子サイズを大きくすることでイミン体における立体障害が増加し、加水分解平衡状態における[2]ロタキサンの組成比が大きくなることが明らかにされた。
診断群分類包括評価データを用いた従来手術と新たな低侵襲手術の費用対効果の比較

近年新たな低侵襲手術が登場し、適応や費用対効果が問題になっている。日本のビッグデータによる解析が必要と考え、DPCデータに着目した。データ抽出のプロトコールを作成すれば、全国データでの解析が可能であると考え、大動脈弁狭窄症(AS)に対する従来手術(AVR)と新たな低侵襲手術、経カテーテル的大動脈弁留置術(TAVI)を抽出するプロトコールを作成した。AVRは95.0%、TAVIは100%検出できた。当院のDPCデータでは在院死亡に差はなく在院日数はTAVIが有意に短かった。また全入院費はTAVIが有意に高く、薬剤はAVRが材料はTAVIが有意に高かった。全国DPCデータでの解析につなげたい。本年度は日本における低侵襲手術の現症の把握とDPCデータ収集、解析のシステム形成を中心に行った。佐賀大学での「従来の大動脈弁置換術:AVR」と「経カテーテル的大動脈弁置換術」の比較のみの解析しか行えなかった。今後は「人工血管による大動脈再建術」と「大動脈ステント治療」の比較も行う予定であるが、当初予期していなかった保険診療改訂が2016年4月に行われ、過去のデータとの比較が難しい状況になる可能性がある。また、「植込型人工心臓:LVAD」と「両心室ペーシング:CRT」の比較に関しては、当院での症例数が少ないためモデル作成には一考を要する。佐賀大学病院、佐賀県医療センター好生館での2施設のDPCデータを用いた解析に関しては、26年度にDPCデータの相互利用の取決めを結んではいるものの、今年中に着手できなかった。そのため、やや遅れていると評価した。心臓血管外科の領域において、低侵襲であるステントグラフト治療や経カテーテル大動脈留置(TAVI)が広まりつつあるが、医学的な有用性だけでなく、費用対効果の検討も避けられない状況にある。特にTAVIに関しては、従来の弁置換術での人工弁の5倍以上の保険償還額がTAVIの材料費として認められており、それに見合う費用対効果が得られているかの研究は少ない。本邦独自の診断群分類包括評価データ(DPC)を用いることでその解析を行うことを目的とした。昨年度末に日本循環器学会にて、大動脈狭窄症に対する単独弁置換術(AVR)とTAVIのDPCデータを用いた初期データを集積し公表した。症例数は少ないがTAVI20例、AVR42例との比較では、在院日数はTAVI平均19.1日、AVR平均28.9日とTAVIが有意に短かったが、医療費はTAVI平均623万7947円、AVR平均479万5188円とTAVIの方が医療費が高いことが分かりました。そのほとんどが医療器具に対するいわゆるMedical Suppliesであり、Gross ProfitはTAVIの方が安いという結果であった。TAVIの方が在院日数を短縮できたが、現在の保険診療では高いMedical Suppliesにより医療費の軽減にはつながっておらず、かつGross profitも少ないという結果だった。現在、TAVIとAVRの症例を増加させるとともに、より精度の高いプロトコールを作成中である。また、別の疾患である腹部大動脈瘤に対する開腹手術とステントグラフト治療にも同様の研究を行っており、さらに他病院との多施設合同研究へつなげたいと考えている。。本研究を遂行することで、複数の治療手段を有する疾患、特に低侵襲手術を有する疾患に対してそれぞれの治療法の費用対効果の判定を行うことができ、臨床の現場に有用な指針を提供できるという意義があると考えている。DPCデータを用い以下の手順で解析を行う計画としております。1.佐賀大学における従来手術と低侵襲手術の治療成績、例えば腹部大動脈瘤に対する開腹手術とステントグラフト治療や大動脈弁狭窄症に対する開胸弁置換術とTAVIを比較検討し、DPCデータからのデータ抽出が可能か、また費用対効果の分析をするためのプロトコールを作成する。2.前述したプロトコールが当院だけでなく他院のデータでも応用可能か、佐賀県立病院好生館に協力してもらいDPCデータから2施設の症例群で費用対効果の検討を行う。3.佐賀県のすべてのDPCデータを用いて、多施設のDPCデータを用いて費用対効果解析が可能であることを明らかにする。研究分担者であり当研究の発案者で当科代表の森田茂樹教授が昨年急遽退職されるという予期していなかった事態が起こり一時期、研究の中段を余儀なくされました。また、電子カルテを操作できデータ作成を行える人員の確保が困難で、TAVIの症例数が予想より増えなかったこともあり、1のプロトコールの精度を上げるのに時間を要している現状です。現在プロトール作成の最終段階であり、多施設のDPCデータ使用の承諾を得、多施設も含めたDPCデータの共有、解析を行っていきたいと考えております。「人工心肺を用いる大動脈弁置換術(SAVR) vs.経カテーテル的大動脈弁置換術(TAVI)」における費用対効果検証プロトコールを作成し実際にそのDPCデータを用いてどのようなことが判明するかを検討した。<データ抽出プロトコール作成>当科の手術リストから単独SAVR症例(79例)、TAVI症例(67例)を抽出し、それぞれのDPCデータを解析し、どのような条件設定が最も優れた検出率を示すかを検討した。

結果として、SAVRは手術名K5551(弁置換術1弁のもの)に入院の契機となった傷病名が(AS(I350)あるいはASR(I352))を加えて検索することで95%という高い検出率に到達可能であった。一方、TAVIは手術名1から5の中にK555-2(経皮的大動脈弁置換術)を含むもので検索すると100%の患者を過不足なく検出できた。<DPCデータにてどのようなことが比較できるか?>上記対象中で完全なDPCデータを入手可能であった単独大動脈弁置換術SAVR77例(S群)とTAVI65例(T群)を比較した。在院死亡:S群: 2.6%(2/77),T群0%(P=0.19)、ICU滞在期間:S群平均2.2日、T群1.9日(P=0.43)、病院滞在期間: S群30.8日、T群21.9日(P=0.001)、30日以内の再入院:S群: 6.5%(5/77),T群9.2%(6/65)(P=0.54)、出来高合計:S群496.5万円、T群633.8万円(P<.0001)、薬剤出来高:S群59.1万円、T群22.7万円(P=0.005)、材料出来高:S群166.1万円、T群465.3万円(P<.0001)であった。これらの結果から、TAVI群のほうが、低侵襲であるがゆえに在院日数は短く、薬剤、検査費用は低額であるが、材料出来高が高額であるため総医療費は高額であるという結論を得た。近年新たな低侵襲手術が登場し、適応や費用対効果が問題になっている。日本のビッグデータによる解析が必要と考え、DPCデータに着目した。データ抽出のプロトコールを作成すれば、全国データでの解析が可能であると考え、大動脈弁狭窄症(AS)に対する従来手術(AVR)と新たな低侵襲手術、経カテーテル的大動脈弁留置術(TAVI)を抽出するプロトコールを作成した。AVRは95.0%、TAVIは100%検出できた。当院のDPCデータでは在院死亡に差はなく在院日数はTAVIが有意に短かった。また全入院費はTAVIが有意に高く、薬剤はAVRが材料はTAVIが有意に高かった。全国DPCデータでの解析につなげたい。今後は、「従来の大動脈弁置換術:AVR」と「経カテーテル的大動脈弁置換術」の比較と「人工血管による大動脈再建術」と「大動脈ステント治療」の比較に焦点をあて、当院での蓄積症例の解析を行う。また同様の手法を用い、佐賀県での2施設のDPCデータを用いた解析、しいては佐賀県内の多施設のDPCデータを共有しての解析まで拡大してその有用性を検討する。最終年にはDPCデータの共有を拡大することによりNational Databaseに近づけることが可能と考えているため、佐賀大学でアクセス可能なCISAやセンチネルプロジェクトからのデータに対して、費用対効果の解析プログラムが適応可能かどうかを検討する予定である。現在、佐賀大学における従来手術と低侵襲手術の治療成績、1.腹部大動脈瘤に対する開腹手術とステントグラフト治療、2.大動脈弁狭窄症に対する開胸弁置換術とTAVIの比較検討が終わり、DPCデータからプロトール作成の最終段階です。プロトコールそのものの精度を上げるために、複数回の検証を行います。このプロトールが作成できれば、多施設も含めたDPCデータの共有、解析が可能となりますので、2施設おより県内施設の協力を得て複数施設で検討する予定です。
腎薬物トランスポーターの寄与率に基づいた薬物間相互作用の定量的予測法の開発

医薬品の体内動態特性は標的分子への暴露を通じて、薬効・有害作用発現に影響を与える重要な要因である。トランスポーターは薬物の組織分布ならびに排泄経路の支配要因となることが明らかにされている。トランスポーターにより効率的な輸送が行われている一方で、薬物間相互作用が生じる要因ともなっており、トランスポーターの機能変動が全身レベルでどの程度の変動を生じるのかを推定することが医薬品開発過程で求められている。医薬品の体内動態特性を論理的に説明するため、また、トランスポーターを介した薬物相互作用を理解する上で、トランスポーターの薬物動態学上の重要性を解明することは、重要な課題である。本研究では、cimetidineとの相互作用データに基づき、ヒト薬物動態、特に腎臓内動態におけるMATEの重要性を明らかにした。生体内リアルタイム共焦点顕微鏡を用い、マウス腎臓におけるPYRの阻害効果を検討したところ、PYR投与群において近位尿細管上皮細胞内でのASPの蛍光強度が増強されており、PYRとの相互作用がMate1の局在する部位で生じていることを明らかにした。マウスin vivoでMATE選択的阻害剤であるPYRとcimetidineの阻害効果を比較したところ、両阻害剤によりカチオン性薬物の腎/血漿中濃度比の上昇がみられた。Cimetidineによる阻害効果はPYR投与時と同程度であり、PYRとcimetidine併用により相乗効果も認められなかったことから、両阻害剤は同じターゲット、Mate1を阻害していることを明らかとした。本研究の成果により、FDAの薬物間相互作用ドラフトガイダンスにMATEも追加される予定であり、本研究で得られた知見は、薬物動態におけるMATEの重要性を示すとともにより安全性の高い医薬品の開発に貢献するものと期待される。本研究では、カチオン性医薬品の尿細管分泌メカニズムに焦点を当て、ヒトにおけるMATE蛋白の重要性をさらに定量的に実証すること、多種のカチオン性薬物について検討することで、MATE蛋白の重要性を一般化するとともに排出側輸送機構に働くトランスポーターの多様性を解明することを目的とする。マウスにpyrimethamine(PYR)をプレ投与し相互作用試験を行った結果、MATE蛋白により排泄される薬物群を明らかにした。Cimetidineの包括的な阻害実験を行った結果、臨床投与量ではOCT2を阻害するほど高濃度にはならず、MATE阻害の可能性が示唆された。マウスを用いてMATE基質とcimetidineの相互作用試験を行ったところ、MATE基質の腎臓内蓄積がみられ、取り込み側ではなく排泄側の阻害であるこが明らかとなった。従来からカチオン輸送系の評価に用いられているN-methylnicotinamide(NMN)について、臨床投与量のPYRはBBMVへのH^+勾配依存的な輸送を完全に阻害するが、腎スライスへの取り込みには影響を与えないことを明らかとした。PYRを投与した臨床検体を用いてNMNの腎クリアランスを測定したところ、PYR投与群では尿細管分泌がほぼ完全に消失し、MATEのプローブ基質としてmetforminよりも優れていることを実証した。医薬品の排泄過程に働くトランスポーター分子を明らかにすることで、薬物間相互作用や遺伝的要因によるトランスポーターの機能変動により生じる体内動態の個人間変動、さらに薬剤応答性の個人間変動を明らかにすることができると考えられる。本研究により、医薬品および内因性化合物の尿細管分泌過程におけるMATE蛋白の重要性を示すとともに、取り込み側だけでなく排泄側トランスポーターの寄与率に基づいた定量的な薬物間相互作用予測法を開発することを目指す。Mate1によって尿細管分泌を受けるカチオン性医薬品を同定したことおよびcimetidineによる薬物間相互作用がMATEに起因するものもあるということを実証し、MATE蛋白の重要性を一般化し、また、NMNが内因性のプローブ基質となることを臨床サンプルを用いて実証することができた。種々のカチオン性医薬品についてBBMVを用いた輸送実験を行い、H^+交換輸送系に占めるMATE蛋白の寄与率を評価する。

PYRによる阻害効果が認められない場合には、他の腎に発現するトランスポーター(P-gp、BCRP、MRP4、OCTN1)の強制発現系やノックアウトマウス、阻害剤を用いた試験を行い、医薬品排泄過程に働くトランスポーター分子を明らかにする。OCT2、MATE蛋白の絶対定量法を確立し、それぞれのタンパク強制発現系やヒト腎臓における発現量および輸送活性と尿細管分泌固有クリアランスを比較することによって、トランスポータータンパクの絶対量に基づいたより正確なscaling factorが算出し、in vitroからin vivoへのより精度の高い予測法を確立する。
レーザ加工用ベッセルビームのサイドローブ抑制

収束角度の異なるベッセルビームを重ね合わせることにより,ベッセルビームのサイドローブを抑制することができる。開口とレンズの組み合わせで2重ベッセルビームを発生させ,通常主ビームの16%あるサイドローブ強度が4%まで抑制できることを確認した。さらに2重ベッセルビームを効率よく安定的に発生させるための回折光学素子を設計・制作し,サイドローブが主ビームの5%6%抑制できる結果を得た。近年、レーザ加工は広い分野で利用されている。通常,レーザ加工はレーザ光をレンズで集光し,その集光点に加工対象物を設置する。ビーム径は場所により変化し,集光点以外では光エネルギー密度が低いので加工を行うことができない。ところが1987年に発見されたベッセルビームは光軸上どこでもビーム形状が一定という特徴をもったビームである。レーザの微細加工への応用,特に高アスペクト比の穴あけ加工への応用を考えるとき、ビームが伝播しても径が一定のビーム(ベッセルビーム)が必有効になることは容易に推測できる。また,高アスペクト比の穴加工でなくとも、微細な加工を行うとき焦点合わせが必要な従来のビームに対し、ベッセルビームは焦点合わせが不要となる利点がある。ところがベッセルビームは主ビームのまわりに複数の無視できない大きさを持ったサイドローブが存在するので、そのままでは応用範囲が限定される。本研究では複数のベッセルビーム重畳によるサイドローブ抑制可能性を理論的・実験的に検証するものである。本年度はバルク素子(レンズと輪帯開口マスク)を用いて2重ベッセルビームを発生させ,サイドローブが実際に抑制されることを実験により確認した。最初にバルク素子としてアキシコンプリズムを用いるか,レンズと輪帯開口マスクを用いるかを製作精度,アラインメント・調整の容易性などを比較検討し、レンズとマスクを用いる方式とした。既に昨年度バルク素子(レンズと輪帯開口マスク)を用いて2重ベッセルビームを発生させ,サイドローブが実際に抑制されることを実験により確認したので,その結果に基づき,サイドローブ抑制範囲を拡大するための位相板を設計・制作した。これと同時に2重ベッセルビームを発生させるための回折素子を考案した。既に昨年度バルク素子(レンズと輪帯開口マスク)を用いて2重ベッセルビームを発生させ,サイドローブが実際に抑制されることを実験により確認している,本年度はベッセルビームを発生させるための回折素子を設計・制作しその有効性を確認した。23年度中に2重ベッセルビームを発生させるための回折光学系の設計を完了する予定であったが、解説素子設計に時間を要し,まだ設計段階にある。24年度が最終年度であるため、記入しない。24年度では前半で2重ベッセルビーム発生させるための回折素子の設計を完了し,後半で素子を制作し,その有効性を確認する予定である。
主要組織適合性抗原からみた顎関節症の免疫遺伝学的要因の研究

顎関節症の発症における遺伝的素因は,顎関節内障患者の家族歴からこの可能性が推測されているのみ(TaUentsら,1996)で,全く推測の域を出ていない.本申請は,当講座で行った双生児研究に引き統き,顎関節症に関連する遺伝的素因をヒトMHCすなわちHLAのタイプから免疫遺伝学的に解明しようとするものである。現在まで、1)変形性顎関節症群16名:重度の顎関節の変形を伴うもの、2)顎関節リウマチ群5名:慢性関節リウマチが顎関節にも波及したものの2群に分けて継続して末梢血採取を行っている。サシブル数が少ないこともあり、はっきりした傾向は明言できないが、顎関節リウマチ群は、従来遺伝的なリスクが高いと報告された遺伝形質を持っていたが、変形性顎関節症の場合にはその傾向は曖昧であった。顎関節症の発症における遺伝子的素因は,顎関節内障患者の家族歴からこの可能性が推測されているのみ(Tallentsら,1996)で,全く推測の域を出ていない.また,広義の顎関節症すなわち顎顔面慢性疼痛疾患のひとつである片頭痛においても,遺伝性のあるサブグループが同定されているこのような経緯から,申請者ら(1996)も,顎関節疾患や顎顔面慢性疼痛疾患において遺伝的素因が関与しているかどうかを明らかにするため,双生児法により疫学的解析を行った.その結果,一卵性の方が二卵性双生児よりも顎関節症状発現一致度が高く,特に顎関節の疼痛について遺伝的素因の関与が強く示唆された.一方,慢性関節リウマチの発症に遺伝的要因が大きく関与していることはよく知られており(Silmanら,1993),主要組織適合性抗原(MHC)がその大きな役割を演じていることが明らかとなっている.本申請は,前述の双生児研究に引き続き,顎関節症に関連する遺伝的素因をヒトMHCすなわちHLAのタイプから免疫遺伝子学的に解明しようした.その結果、1)変形性顎関節症群12名:重度の顎関節の変形を伴うもの、2)顎関節リウマチ群2名:慢性関節リウマチが顎関節にも波及したものの2群に分けて継続して末梢血採取を行っている。現在のところ、サンプル数が少ないこともあり、はっきりした傾向は明言できないが、顎関節リウマチ群は、従来遺伝的なリスクが高いと報告された遺伝形質を持っていたが、変形性顎関節症の場合にはその傾向は曖昧であった。
アクチンアセンブリー動態の細胞間不均一性からせまる遊走モードの多様性と制御原理

本研究では、高い再現性・操作性と豊富な知見を兼ね備えた細胞性粘菌と好中球細胞を対象に、微小流路を利用したハイスループットイメージング解析によってアクチンとその制御因子について包括的な観察を行う。機械学習や数理モデリング解析結果を生細胞観察実験と比較し、フィードバックさせることから、細胞遊走動態における多様な細胞行動の決定要因や支配法則の解明に挑む。
イメージングによるゴルジ体内タンパク質輸送機構の解明

細胞周期ごとに形成・消失をくりかえすダイナミックな細胞小器官である小胞体やゴルジ体の形成・維持機構を解明するため、イメージングを中心とした手法により解析を行った。その結果、試験管内で小胞体の網目状構造を安定に再構成・定量することに成功し、タイムラプス観察も行うことができた。また、小胞体形成に関わる可溶性因子を生化学的手法により分画・同定した。この因子は単独でも網目形成を促進する機能をもつことが分かった。細胞内小器官である小胞体(ER)とゴルジ体は細胞内の物質輸送において互いに密接に関連しながら重要な役割を果たしている。細胞内に網目状に広がる小胞体表面のリボソームで合成されたタンパク質は小胞体のサブドメインであるERexit siteからCOPII小胞とよばれる輸送小胞にのってゴルジ体へと送り出され、ゴルジ体のシスからトランス槽へと通り抜ける間に段階的に修飾・選別されてそれぞれの目的地へと運ばれていく。小胞体で作りだされ、ゴルジ体内を輸送されて分泌されたタンパク質は細胞や固体の恒常性の維持に極めて重要である。小胞体やゴルジ体は細胞周期ごとに消失・形成をくりかえすダイナミックな細胞小器官であり、その形成・維持にはさまざまな因子がはたらいていると考えられるがその機構に関しては明らかになっていないことが多い。本研究では小胞体・ゴルジ体のダイナミクスおよび分泌タンパク質の動態を、イメージングを中心とした手法により解析することを目的としている。当初はゴルジ体内のタンパク質輸送に重点を置いて研究を行う予定であったが、研究の過程において、タンパク質輸送の出発点である小胞体のダイナミクスに重要な新規の因子を複数発見するに至った。また、この過程で試験管内で小胞体を再構成する実験系の条件検討を行い、網目状の構造を再現性よく作ることができるようになった。さらに、イメージングの条件を工夫することにより、試験管内で小胞体の網目状構造が再構成される様子をリアルタイムで観察することに成功した。細胞内に網目状に広がる小胞体表面のリボソームで合成されたタンパク質はCOPII小胞とよばれる輸送小胞にのってゴルジ体へと送り出され、ゴルジ体のシスからトランス槽へと通り抜ける間に段階的に修飾・選別されてそれぞれの目的地へと運ばれていく。小胞体・ゴルジ体を通って分泌されたタンパク質は細胞や個体の恒常性の維持に極めて重要である。小胞体・ゴルジ体は細胞周期に応じて形成と分解をくりかえすダイナミックな細胞小器官であり、その形成・維持にはさまざまな因子がはたらいていると考えられる。しかし、その分子メカニズムに関しては明らかになっていない点が多い。本研究では小胞体・ゴルジ体のダイナミクスについてイメージングを用いた解析を行った。試験管内で小胞体を再構成する実験系の条件検討を行い、蛍光ラベルしたアフリカツメガエル卵のマイクロソームと哺乳類から調整したサイトゾルを用いて小胞体の網目状の構造を安定して再構成することに成功した。再構成の過程は共焦点顕微鏡を用いてタイムラプス観察することができた。また、サイトゾルを生学的手法を用いて分画し、小胞体の網目状構造の形成に関わる因子を複数発見した。同定した因子のリコンビナントタンパク質を大腸菌で発現・精製し、試験管内再構成系に加えたところ、単独でも網目状の構造形成を促進するものがあった。サイトゾルに含まれる可溶性タンパク質で、小胞体形成を促進する機能を持つものが同定されたのは本研究が初めてのことである。
Tリンパ球の抗原認識と活性化の一分子イメージング解析

本研究では、Tリンパ球が抗原提示細胞上のペプチド・MHC複合体の認識、活性化する分子機構の一分子レベルでの解析を目指している。そのため3つのシステム改良を導入した:抗原提示細胞の代わりに、GPI型MHC、ICAM1を用いた人工脂質二重膜のplanar membraneシステム、TCR-Tg由来の正常T細胞に蛍光標識シグナル分子を導入したT細胞を用いる、及び一分子解析が可能な解像力の全反射レーザー顕微鏡(TIRF)での観察、である。既に昨年度、抗原刺激に伴いTCRマイクロクラスターが形成され活性化シグナルを誘導することを見いだした。一分子レベルでの解析から、ミクロクラスターには50-300のTCRが集積し活性化初期にはT細胞の接着面全体に形成され中心に移動し、免疫シナプス(cSMAC)が形成される後期には、接着面の辺縁領域のみで形成されることが判明した。これから、T細胞の長期にわたる活性化維持において、辺縁部で形成されたミクロクラスターがT細胞活性化維持のシグナルを形成する場として機能している。ミクロクラスターに集結して活性化シグナルを伝達する下流の一連の分子を同様に解析した結果、Lck, LAT, SLP-76, PLCγ,Vav, PI3 kinase,が抗原刺激に伴い、早期にミクロクラスターを形成することが判明した。一方、より下流の分子としての、MEK, Erk, Ras, Carmal, Bc110など、Ras活性化やNF-κB活性化に直接関与する活化経路の分子群は、TCRミクロクラスターに集積しないことが判明した。更に、T細胞活性化に必須のco-stimulationシグナルについての解析から、主要な受容体CD28もミクロクラスターに集積するとともに、CD28がリガンドCD80の存在下で、NF-κB活性化に重要なPKCθをミクロクラスターにリクルートすることが示唆された。これまでPKCθはcSMACに集積する代表的分子として知られていたが、その誘導機構は不明であり、今回初めてco-stimulationに伴って制御されることが示唆され、成果を収めた。T細胞が抗原により活性化される際のシグナル分子の動態を一分レベルで解析することを目指し、全反射レーザー顕微鏡での高感度解析を行った。標的分子を蛍光標識した正常T細胞をMHC, ICAM-1を含む脂質二重膜に落とし動態を観測するシステムを樹立した。T細胞レセプター、キナーゼ、アダプター分子としてCD3ζ,ZAP-70,SLP-76のGFP融合蛋白をTCR-Tgマウス由来のT細胞に導入し抗原特異的な活性化を解析した。これにより免疫シナプスの形成制御とシグナル伝達のプラットフォームと考えられている脂質ラフトの時空間的な動態のイメージング解析に成功した。T細胞がpMHCを認識するとTCRミクロクラスター(MC)が形成され、MCにはキナーゼやアダプターも共存する。活性化の指標としてのリン酸化や細胞内カルシウム反応はMCでのみ誘導され時間経過と共にTCR・CD3は細胞中心に集まって免疫シナプス中心を作るのに対し、キナーゼ・アダプター分子は乖離して、免疫シナプス形成後も細胞辺縁部で形成され続けるMCのみで活性化シグナルが誘導される。即ち、TCR MCは、活性化のユニットであり、免疫シナプス形成以前に活性化され、新たなMCによって活性化が維持されることを明らかにした。活性化に重要なシグナル伝達分子を含む脂質ラフトの細胞活性化における機能解明の為LAT-GFPを発現するTgマウスを作製しマスト細胞を用いて解析した。

LAT-GFPは細胞膜上を大変早く動きクラスターとして挙動し単一のラフトの動態と考えられた。一分子解析から、ラフト局在シグナルを欠如したLAT(CA)-GFPは膜上の動きがなく、ラフトは局在しているシグナル分子の細胞膜上での動きを制御していると考えられた。細胞活性化によるラフトの凝集は観察されず、シグナルソームでの凝集は蛋白相互作用によると考えられる。本研究では、Tリンパ球が抗原提示細胞上のペプチド・MHC複合体の認識、活性化する分子機構の一分子レベルでの解析を目指している。そのため3つのシステム改良を導入した:抗原提示細胞の代わりに、GPI型MHC、ICAM1を用いた人工脂質二重膜のplanar membraneシステム、TCR-Tg由来の正常T細胞に蛍光標識シグナル分子を導入したT細胞を用いる、及び一分子解析が可能な解像力の全反射レーザー顕微鏡(TIRF)での観察、である。既に昨年度、抗原刺激に伴いTCRマイクロクラスターが形成され活性化シグナルを誘導することを見いだした。一分子レベルでの解析から、ミクロクラスターには50-300のTCRが集積し活性化初期にはT細胞の接着面全体に形成され中心に移動し、免疫シナプス(cSMAC)が形成される後期には、接着面の辺縁領域のみで形成されることが判明した。これから、T細胞の長期にわたる活性化維持において、辺縁部で形成されたミクロクラスターがT細胞活性化維持のシグナルを形成する場として機能している。ミクロクラスターに集結して活性化シグナルを伝達する下流の一連の分子を同様に解析した結果、Lck, LAT, SLP-76,PLCγ,Vav, PI3 kinase,が抗原刺激に伴い、早期にミクロクラスターを形成することが判明した。一方、より下流の分子としての、MEK, Erk, Ras, Carma1,Bcl10など、Ras活性化やNF-κB活性化に直接関与する活性化経路の分子群は、TCRミクロクラスターに集積しないことが判明した。更に、T細胞活性化に必須のco-stimulationシグナルについての解析から、主要な受容体CD28もミクロクラスターに集積するとともに、CD28がリガンドCD80の存在下で、NF-κB活性化に重要なPKCOをミクロクラスターにリクルートすることが示唆された。これまでPKCOはcSMACに集積する代表的分子として知られていたが、その誘導機構は不明であり、今回初めてco-stimulationに伴って制御されることが示唆され、成果を収めた。
π共役導電性高分子配位子を用いる高分子錯体の調製と新規触媒機能制御

有機金属化学の手法を用いて多様なπ共役導電性高分子配位子を合成した。また、その金属錯体を合成した。さらに、得られた高分子錯体の機能を解析した。π共役導電性高分子配位子を構成する配位子としては、ピリジン、2,2'-ビピリジル、1,10-フェナントロリン、5,6-ジアルコキシ-1,10-フェナントロリン、ビイミダ・ゾール、ジピリド[3:2-c:2',3'-e]-ピリダジン、ジピリド[3,2-b:2',3'-d]フラン、ビチアゾール、ベンズイミダゾール、8-キノリノール、Salen型配位子等の単位を選び、これらの高分子配位子を合成した。合成に当っては、ゼロ価ニッケル錯体を用いる炭素-炭素結合形成反応、パラジウム錯体を用いるSuzuki coupling, Sonogashira coupling, Stille coupling等を用いた。得られた高分子配位子は、GPC、光散乱法等による解析の結果、約10000の分子量を持つ場合が多いことが分かった。また重合の結果、主鎖に沿うπ共役系が拡がり、紫外可視吸収スペクトルにおけるピークが長波長側にシフトすることが分かった。このようにして、得られたπ共役導電性高分子配位については、銅、ニッケル、ルテニウム、亜鉛等の金属の化合物と反応させることにより、高分子錯体を形成させた。高分子錯体の形成に伴い、紫外可視吸収スペクトルにおいて、d-d吸収帯が現われる等の変化が見られた。これらのπ共役導電性高分子配位子及びその金属錯体は(1)電気化学的に活性であり、電気化学的触媒機能が期待される、(2)発光機能を有する、(3)導電性を有する等の機能を有する。触媒機能については、水の光分解、レドックス触媒反応に有効なものがあることが分かっている。有機金属錯体化学的な手法を重縮合に適用し、遷移金属と配位・相互作用可能な複素環骨格から主鎖が構成される各種新規π共役導電性高分子配位子を調製した。パラジウム錯体触媒を用いるクロスカップリング反応では遷移金属に対して配位可能なイミン窒素を有するベンゾイミダゾールとチオフェンの交互共重合体が得られた。また、ニッケル錯体を用いる脱ハロゲン化重縮合では金属イオンと相互作用可能なO, S原子を有するエチレンジオキシチオフェンから成る可溶性π共役高分子が中性状態で合成・単離された。さらに、同様な重縮合法により、主鎖中に直接フェロセン等の有機金属化合物を導入したπ共役導電性高分子の調製を行った。上記の結果から得られたπ共役分子について紫外-可視吸収、蛍光等の光学的特性及び電気化学的酸化還元特性や電気伝導度等の電気的特性を測定し、新しいπ共役導電性高分子としての基本物性を明らかにした。また、側鎖導入等によって可溶化したいくつかのπ共役高分子のキャストフィルムについてX線回折測定を行い、高分子鎖間の相互作用による高次構造の解析を行った。さらに、新しい重縮合法としてジクロロベンゾキノンイミンと芳香族ジグリニャール化合物の炭素-窒素結合生成反応及び重縮合反応について検討を行い、各種酸化型ポリアニリン構造から構成されるπ共役高分子が得られることを明らかにした。