hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
固液二相性ハイドロゲルの潤滑機構の解明およびその高機能化に関する研究

本研究では、PVA(ポリビニルアルコール)ハイドロゲルの潤滑機構解明のため、予荷重付与によるPVAハイドロゲルの水分流出が摩擦・摩耗挙動に与える影響を調査した。PVA凍結解凍,キャストドライゲルおよび関節軟骨は予荷重時間の増加とともに摩擦・摩耗が増大したが、PVAハイブリッドゲルは摩擦・摩耗の増大は僅少であり、耐摩耗性に優れたせん断抵抗の低い表面構造を有していることが明らかになった。また、PVAハイブリッドゲルのさらなる耐摩耗性向上を目指し、単層ゲル内でPVA凍結解凍,キャストドライゲルの構造を複合化したバイブリッドゲルを開発し、高接触面圧下でも低摩擦・低摩耗を実現した。本研究では,PVA(poly(vinyl alcohol)ハイドロゲルの二相性潤滑特性の解明のため,予荷重付与によるPVAハイドロゲルおよび関節軟骨内部の水分流出が摩擦・摩耗挙動に与える影響を調査した.その結果,PVA凍結解凍ゲル,PVAキャストドライゲル,関節軟骨は予荷重時間の増加とともに摩擦が増大し,摩耗も顕著に発生した.しかし,PVAハイブリッドゲルは予荷重付与による摩擦の増大は僅少であり,摩耗も軽微であった.そのため,PVAハイブリッドゲルは,1)内部の透水率が小さく,荷重による内部流体の流出が起こりにくい,2)予荷重が増加した状況においても低摩擦・低摩耗を維持可能な特異的表面構造を有する,ということが推察された.そこで,透水性試験を行い,PVAハイドロゲルおよび関節軟骨の透水率を実測したところ,PVAハイブリッドゲルの透水率はPVA凍結解凍ゲルよりは2桁程度低いものの,PVAキャストドライゲルよりは高く,関節軟骨と同程度であった.このことから,PVAハイブリッドゲルが予荷重時間が増加した場合にも低摩擦を維持可能なのは,透水率が低いことで内部流体が流出しにくく,二相性潤滑機構が維持されやすいのではなく,せん断抵抗が低くかつ耐摩耗性に優れる特異的表面構造を有することに起因するものと考えられた.PVAハイブリッドゲル表面を意図的に摩耗させた場合,ゲル状表面構造がクレーター上の構造が露出することがわかった.これは表面に親水性高分子による水和層を有する関節軟骨と類似しており,PVAハイブリッドゲル表面には親水性PVA分子鎖による水和層が形成され,関節軟骨と同様の水和潤滑機構が機能していることが示唆された.予定している実験はおおむね順調に進行している.PVAハイブリッドゲルが,予荷重が付与され二相性潤滑,水和潤滑機構の発現に不利である状況においても低摩擦かつ低摩耗を維持しており,従来のPVA凍結解凍ゲル,PVAキャストドライゲルよりも人工軟骨候補材料としての有用性が示された.また,PVAハイブリッドゲルの低摩擦・低摩耗性が二相性潤滑機構のみでなく,表面ゲル水和層によるものが大きい可能性が摩擦試験および透水率の実測により示されたことは大きな進展であり,さらなる低摩擦・低摩耗化を目指した材質改善の指針策定に有用な知見となる.しかし,原子間力顕微鏡を用いた特異的表面構造の同定については,原子間力顕微鏡のプローブとPVAハイブリッドゲル表面の相互作用力が大きく走査が困難なため,代替手法を検討中である.PVAハイブリッドゲル表面に特徴的な表面ゲル水和層が存在することを示唆する研究結果は得られているため,原子間力顕微鏡ではなく分光分析等の表面分析手法を用いたアプローチによりその詳細構造の同定を検討しており,研究目標は当初の計画に沿い一貫している.本研究では,PVA(poly(vinyl alcohol)ハイドロゲルの潤滑特性の解明のため,昨年度実施した予荷重付与によるPVAハイドロゲル内部の水分流出が摩擦・摩耗挙動に与える影響に関して追加調査を行った.その結果,PVA凍結解凍ゲル,PVAキャストドライゲルは予荷重付与により摩擦が上昇し,摩擦開始後早期に表面損傷が発生していた.しかし,PVAハイブリッドゲルは予荷重付与による摩擦の増大は僅少であり,摩擦開始直後の表面損傷も確認されなかった.そのため,PVAハイブリッドゲルは予荷重付与によるゲル内部の水分流出には影響を受けず,耐摩耗性に優れたせん断抵抗の低い表面構造を有していることが明らかになった.しかし,PVAハイブリッドゲルにおいても,接触面圧が増大するとこの特異的表面構造の摩耗が進行することが明らかになった.そのため,PVAハイブリッドゲルの耐摩耗性向上を目指し,従来のPVA凍結解凍ゲル,キャストドライゲルの二層積層型ハイブリッドゲルではなく,単層ゲル内で両ゲルの構造を複合化した新規ハイブリッドゲルを開発した.この単層複合型PVAバイブリッドゲルは,30%圧縮応力は二層積層型PVAハイブリッドゲルよりも高く,接触面圧が1MPaを超える領域においても二層積層型PVAハイブリッドゲルよりも低摩擦・低摩耗であった.PVAハイブリッドゲルの単層複合化は,高荷重,高接触面圧条件下においても優れた摩擦・摩耗特性を実現可能であるため,PVAハイドロゲルの人工軟骨としての応用に対して有用であると考えられる.本研究では、PVA(ポリビニルアルコール)ハイドロゲルの潤滑機構解明のため、予荷重付与によるPVAハイドロゲルの水分流出が摩擦・摩耗挙動に与える影響を調査した。

今後は,PVAハイブリッドゲルの潤滑性に寄与していると考えられる表面構造を形態観察のみでなくラマン分光もしくは赤外分光法等の化学分析も合わせて追及する予定である.また,圧縮力学試験によって応力緩和挙動やゲル内部の流体による荷重支持能についても調査を行う.そして,初年度に得られた摩擦・摩耗試験や透水率に関する知見と合わせ,摩擦・摩耗特性,荷重支持特性に優れたPVAハイブリッドゲルの開発指針を提案し,改良型PVAハイブリッドゲルの試作を行う.なお,現在のPVAハイブリッドゲルは凍結解凍法およびキャストドライ法によって製作されているが,これは水素結合を用いた物理架橋ゲルである.しかし,今後のゲルの改質にあたっては,従来の物理架橋によるゲル化に限定せず,必要に応じて化学架橋によるゲル化や追加架橋を検討し,低摩擦・低摩耗,荷重支持能に優れたゲルの作製を目指す.改良型PVAハイブリッドゲルの評価については,単純化した摩擦試験条件下にて基礎的摩擦・摩耗特性を理解した後,生体模擬環境下ので評価を行い,材質改善の有用性を調査する.バイオトライボロジー
先天性胆道拡張症の胆管組織における神経構造ならびに神経伝達物質の研究

先天性胆道拡張症(以下CBD)における胆管拡張の原因を検索する事を目的に、CBD8例と胆嚢に異常のみられない7例の小児計15例の胆嚢を用いて神経組織を検索した。胆嚢壁の血管網はCBD群において有意に減少し、血管表面に神経叢が描出された割合もCBD群において有意に低下していた。神経節細胞数に有意差は認められなかった。CBDでは血管床の減少に伴う胆嚢壁内の血流低下によって、胆管や胆嚢の収縮不全と拡張を来たすと共に、血管周囲神経叢が減少して壁内動脈の収縮を抑制し、血流減少を代償していると考えられた。先天性胆道拡張症(CBD)群8名,対照群7名(遊走胆嚢,後腹膜神経芽腫,Wilms腫瘍,I型糖原病,familial amyloid polyneuropathy)の計15名(男:女=3:12,平均年齢8.0±標準偏差10.7歳,range生後3か月-41歳)から胆嚢を摘出した。胆嚢のwhole-mount標本を作成し,胆嚢壁内神経を抗protein gene product9.5抗体,抗neurofilament抗体を用いて免疫染色により描出した。両群において神経線維の方向には規則性は認められず,分枝した枝が他の神経線維と立体交差する箇所が幾つか観察された。胆嚢壁の血管分布はCBD群5.5±1.9/cm^2,対照群27.6±14.4/cm^2で,CBD群において有意に減少していた。胆嚢壁内の血管表面に血管周囲神経叢が描出された割合はCBD群37.7±18.1%,対照群80.2±17.4%で,CBD群において有意な低下が認められた。頚部,体部,底部の各部位において,神経節細胞の数は頚部15.4±9.4,体部11.2±7.7,底部11.6±8.2で,各部位間に有意差は認められなかった。神経節細胞数についてはCBD群,対照群で各々38.5±24.0,42.3±20.6であり有意差は認められなかった。CBDにおいては血管分布の減少に伴う壁内の血流低下によって,胆管や胆嚢の収縮不全と拡張をきたす機序が考えられ,これに対して血管周囲神経叢を減少させて壁内動脈の収縮を抑制し,血流不足を代償する機構が作用していることが推察された。胆嚢のwhole-mount preparationを作成し,胆嚢壁内神経を抗proteingene product 9.5抗体,抗neurofilament抗体を用いて免疫染色により描出した。胆嚢壁のvascularityはCBD群5.5±1.9/cm^2,対照群27.6±14.4/cm^2で,CBD群において有意に減少していた。胆嚢壁内の血管表面にperivascular plexusesが描出された割合(PR)はCBD群37.7±18.1%,対照群80.2±17.4%で,CBD群において有意な低下が認められた。CBDにおいては,総胆管下部の狭小部から胆汁を圧出するために,胆嚢,胆管が収縮亢進状態にあり,内圧上昇のために胆管が拡張すると推察され,更に胆壁の血流減少を代償するためにperivcasuclar plexusesが減少しているとも考えられる。先天性胆道拡張症(以下CBD)における胆管拡張の原因を検索する事を目的に、CBDの胆嚢における神経組織の形態を検索した。CBD群8例、胆嚢に異常のみられない7例を対照群とした15例(男:女3:12、平均年齢8.0歳)から摘出した胆嚢を、ただちにザンボニ駅で保存した後、whole-mount標本を作製し、胆嚢壁内神経組織を、抗protein gene product 9.5抗体、、抗neurofilament抗体を用いた免疫染色により検討を行った。

両群において神経繊維の方向には規則性は認められず、分枝した神経が他の神経線維と交差していた。胆嚢壁の血管網はCBD群5.5±1.9/cm^2、対照群27.6±14.4/cm^2で、CBD群において有意に減少していた。胆嚢壁内の血管表面に神経叢が描出された割合は、CBD群37.7±18.1%、対照群80.2±17.4%で、CBD群において有為な低下が認められた。胆嚢の頸部、体部、底部の各部位における神経節細胞の数は、各部位間で有意差は無かった。神経節細胞数は、CBD群、対照群は各々38.5±24.0, 42.3±20.6であり有意差は認められなかった。CBDにおいては、総胆管下部の狭小部から胆汁を圧出するために、胆嚢、胆管が収縮亢進状態にあり、胆道内圧が上昇するために胆管が拡張するものと推察され、更に胆壁の血流減少を代償するために血管周囲神経叢が減少していると考えられた。
小胞体コレステロールによる脂肪滴形成とリポタンパク質分泌の制御

本研究ではヒト培養肝細胞を用いて、ACAT阻害剤により細胞内のコレステロール量を増加した時の脂肪滴形成とアポリポ蛋白質B(ApoB)の分泌について調べた。その結果脂肪滴の形成とApoBの分泌は抑制されることがわかった。細胞内のApoBの局在を蛍光顕微鏡で調べたところ、小胞体に蓄積することが示唆された。ApoBの分泌には脂肪滴特異的タンパク質ADRPとRab18が深く関与していることも明らかになった。肝臓において、コレステロールは中性脂質とともに超低比重リポタンパク質(VLDL)として合成、分泌され体中の細胞に運ばれる。一方、肝細胞は脂肪滴の形成も常時行い、肝臓内にコレステロールや中性脂質を蓄積している。よって、VLDLの分泌、また脂肪滴の形成は肝臓の重要な機能であり、これらが異常になった場合は、肝臓さらには生体全体に著しく影響を及ぼす。これまでの研究により、ACAT阻害剤とコレステロール・サイクロデキストリンの複合体を用いて、ヒト肝臓由来培養細胞Huh7の小胞体のコレステロールを増加すると、VLDL,の分泌が阻害され、VLDLを構成するリポタンパク質ApoBが細胞内へ蓄積すること、そして脂肪滴の主なタンパク質であるADRPの分解が促進され、脂肪滴の数が減少することがわかった。蛍光顕微鏡を用いて、ApoBの局在を調べたところ、小胞体マーカーPDIと共存することがわかった。われわれの結果は、小胞体にコレステロールが豊富なドメインが存在し、そこにApoBが蓄積され、その結果VLDLの分泌を阻害していることを示唆している。しかし小胞体のコレステロール量を生化学的に定量することは難しい。そこで、われわれはコレステロールが豊富なドメインを観察するために、新たな脂質プローブの開発を行った。新たに発見されたタンパク質は、コレステロールとスフィンゴミエリンの複合体を認識することが人工膜を用いた実験で示唆された。今後、細胞を用いてこのタンパク質の性状解析を行う予定である。本研究の目的は肝臓における超低比重リポタンパク質(VLDL)の分泌と脂肪滴の形成におけるコレステロールの役割を解析することである。VLDLと脂肪滴は共に小胞体で形成され、リン脂質の一重膜の中にトリグリセリドやコレステロールエステルを含んだ脂質集合体である。これまでの研究により、培養ヒト肝細胞Huh7にアシルCoA-コレステロールアシルトランスフェラーゼ(ACAT)阻害剤を処理すると、VLDLの分泌が抑制されること、脂肪滴数の減少および肥大化が引き起こされることが分かった。解析の結果ACAT阻害剤は小胞体のコレステロールの量を増加させ、コレステロールエステルの量を減少するため、正常細胞と比べて小胞体内のコレステロールとコレステロールエステルの比が著しく変化することが分かった。また阻害剤を処理した細胞ではVLDLを構成するリポタンパク質ApoBが細胞内に蓄積しているのが観察された。脂肪滴の主なタンパク質であるADRPを解析するとADRPの分解が促進されることも分かった。ADRPを高発現した場合では、阻害剤を処理してもApoBの細胞内への蓄積は観察されなかったため、脂肪滴の形成がApoBの蓄積およびVLDLの分泌をコントロールしていることが示唆された。今年度は脂肪滴形成メカニズム解明を目的にし、脂肪滴特異的な低分子量Gタンパク質Rab18の解析を行ったところ、ADRPの分解よりも非常に早い段階でRab18の脂肪滴からの解離が起きていることがわかった。このことはコレステロール蓄積の最初のターゲットはRab18であることを示唆している。
Tet2機能低下によるエピゲノム制御異常を介したリンパ腫発症メカニズムの解明

TET2遺伝子は,メチルシトシンをヒドロキシメチルシトシンに変換する酵素をコードしており,エピゲノム制御に重要な役割を果たしている.TET2遺伝子変異は骨髄球系造血器腫瘍および一部のT細胞性リンパ腫で高頻度に認められることが知られている.我々の解析したTet2 knockdownマウスは濾胞性ヘルパーT細胞の特徴を有したT細胞性リンパ腫を発症した.そのメカニズムにはエピゲノム制御異常を介したBcl6の発現亢進が関与しており,ヒトにおける一部のT細胞性リンパ腫の発症において,同様の機序が存在する可能性が示唆された.1.Tet2gt/gtマウスに生じたリンパ腫細胞におけるエピゲノム解析:TET2は最終的にDNAの脱メチル化を導く機能を有していることから,TET2の機能不全が引き起こすエピゲノム異常とT細胞性リンパ腫の発症との関連を明らかにするため(h)MeDIP sequenceを行った.ゲノムワイドでの解析では,メチルシトシンの有意な増加および転写開始点付近でのヒドロキシメチルシトシンの有意な低下を認め,個別の遺伝子解析では濾胞性ヘルパーT(Tfh)細胞の主要転写因子であるBcl6のintron1に高メチル化部位を認めた.バイサルファイトシークエンス法でも検証を行った.この部位のメチル化はB細胞性リンパ腫においてBCL6の転写を促進することが知られており,Bcl6の転写が促進されることによりTfh様細胞の増加をきたしている可能性が考えられた.2.網羅的解析から得られた結果に関する検証:Bcl6 intron1のメチル化と発現制御の関連を調べるために,EL4マウスT細胞性リンパ腫細胞株を用いて脱メチル化剤であるデシタビンを添加し,脱メチル化された際の遺伝子発現の変化を検証した.EL4のBcl6 intron1はほぼ完全にメチル化された状態にあり,デシタビンを加えることにより脱メチル化を引き起こせることをバイサルファイトシークエンス法にて確認した.脱メチル化に伴い,Bcl6のmRNA発現量が低下することをreal time PCR法にて確認した.3.Tet2gt/gtマウスに生じたリンパ腫細胞におけるadditional hitの解析:次世代シークエンサーを用いて正常対照とリンパ腫細胞のゲノムを得ることができた1個体において網羅的変異解析を行った.さらに個体数を増やして現在解析中である.正常対照とリンパ腫細胞のゲノムを得ることができた1個体において次世代シークエンサーを用いて網羅的変異解析を行った.13個の候補遺伝子が抽出され,Sanger法によるvalidationを行った結果,Cadm2,Angel2,Skint10,Taar5,Bcl6の5遺伝子の変異を特定した.腫瘍のゲノムのみ得る事が出来た別の4個体を用いて,上記5遺伝子の変異を確認したが,recurrent mutationは認められなかった.また,ヒトではTET2と共存して見られる変異として,骨髄系腫瘍ではFlt3,Npm1, T細胞性リンパ腫ではDnmt3a,Rhoa,IDH2の変異が知られている.これらの遺伝子変異が存在するかどうか,前述の5個体においてそれぞれの遺伝子についてdeep sequencingを行った.結果,上述の遺伝子変異は認められなかった.以上から,Tet2gt/gtマウスに生じたT細胞性リンパ腫は既に知られている特定の遺伝子変異の関与の可能性は低く,腫瘍発症までの中央値が67週齢と長期間を要したことから,複数の遺伝子変異が蓄積することにより発症している可能性が高いものと推測した.以上の研究成果をふまえて,“造血器腫瘍におけるTET2のゲートキーパーとしての役割"という総説を臨床血液に発表した.TET2遺伝子は,メチルシトシンをヒドロキシメチルシトシンに変換する酵素をコードしており,エピゲノム制御に重要な役割を果たしている.TET2遺伝子変異は骨髄球系造血器腫瘍および一部のT細胞性リンパ腫で高頻度に認められることが知られている.我々の解析したTet2 knockdownマウスは濾胞性ヘルパーT細胞の特徴を有したT細胞性リンパ腫を発症した.そのメカニズムにはエピゲノム制御異常を介したBcl6の発現亢進が関与しており,ヒトにおける一部のT細胞性リンパ腫の発症において,同様の機序が存在する可能性が示唆された.Tet2gt/gtマウスの解析を通して,これまでの研究成果を英文誌に投稿し,掲載されたため.血液学Tet2gt/gtマウスはT細胞性リンパ腫の発症までに中央値67週齢と長期間を要することから,エピゲノム異常のみならず,何らかの付加的なゲノム異常が発症に関与している可能性が考えられる.次世代シーケンサーを用いた網羅的ゲノム解析を進めることにより,additional hitの解析を進めている.
曳航型水中ロボットを用いた浅海域における海底3D地図作成の高速広域化

曳航型水中ロボットを用いた浅海域における海底3D地図作成の高速・広域化の手法を確立することを目的とする.既に曳航型でない操縦型・自律型水中ロボット(ROV, AUV)を用いた海底3D地図作成の事例はある.しかし,従来の水中ロボットでは,広範囲のデータ取得には時間がかかり,一度の調査範囲は狭くなる.小型船による曳航型ロボットは,一般的な水中ロボットより速く,データ量も短時間で多く取得できる.一方,高速運動する曳航型水中ロボットの実現には深度維持・姿勢維持などの各種制御技術の実装やカメラの取付位置の最適化等が重要な技術課題となる.これらの課題に取り組み,海底3D地形情報を短時間に入手する手法を開発し,海洋立国日本の沿岸利用に大きく貢献するものである.今年度は以下の研究実施計画を行なった.・曳航型水中ロボットの曳航速度一定化での横波影響の低減検証これまでの海実験では,横波の影響により,曳航型水中ロボットのロール角が90度ほど姿勢変化することがあった.安定した曳航には,曳航型水中ロボットのロール角の姿勢変化を押さえる必要がある.そこで,曳航型水中ロボットの下部に垂直尾翼を追加するとともに,重心を下げる改善を施した.その効果により,今年度の海実験では,これまでの横波影響の低減が図られ,ロール角の姿勢変化が押さえられた.曳航速度は最大1.52 [m/s],最大深度約6 [m]で海実験を行なうことができた.・カメラ・光源の最適は位置の検討単眼カメラ一つでも3D地図作成は可能であるが,一回の曳航で作成できる3D地図の精度や広域化を考えるとマルチカメラシステムに優位性があると考え,マルチカメラシステムを採用している.曳航型水中ロボットの先端にマルチカメラシステムを搭載し,単眼カメラ一つより,マルチカメラシステムの方が,広域の3D地図作成が可能となることを海実験により確認した.初年度の研究実施計画は100%達成している.本年度(2020年3月31日)の研究実施計画・曳航型水中ロボットの各種制御則の検討(研究代表者武村)前年度までに開発した曳航型水中ロボットの姿勢維持制御・深度維持制御・高度維持制御が可能となるように各種センサの実装を行なう.これらのセンサデータを元にして,どのような制御が可能となるか,の検討を行なっていく.・海底3D地図作成の処理手順の検討海底3D地図の手順の簡略化について,精度・作業効率・広域化の観点から検討を行なっていく.曳航型水中ロボットを用いた浅海域における海底3D地図作成の高速・広域化の手法を確立することを目的とする.既に曳航型でない操縦型・自律型水中ロボット(ROV, AUV)を用いた海底3D地図作成の事例はある.しかし,従来の水中ロボットでは,広範囲のデータ取得には時間がかかり,一度の調査範囲は狭くなる.小型船による曳航型ロボットは,一般的な水中ロボットより速く,データ量も短時間で多く取得できる.一方,高速運動する曳航型水中ロボットの実現には深度維持・姿勢維持などの各種制御技術の実装やカメラの取付位置の最適化等が重要な技術課題となる.これらの課題に取り組み,海底3D地形情報を短時間に入手する手法を開発し,海洋立国日本の沿岸利用に大きく貢献するものである.今年度は以下の研究実施計画を行なった.・曳航型水中ロボットの曳航速度一定化での横波影響の低減検証これまでの海実験では,横波の影響により,曳航型水中ロボットのロール角が90度ほど姿勢変化することがあった.安定した曳航には,曳航型水中ロボットのロール角の姿勢変化を押さえる必要がある.そこで,曳航型水中ロボットの下部に垂直尾翼を追加するとともに,重心を下げる改善を施した.その効果により,今年度の海実験では,これまでの横波影響の低減が図られ,ロール角の姿勢変化が押さえられた.曳航速度は最大1.52 [m/s],最大深度約6 [m]で海実験を行なうことができた.・カメラ・光源の最適は位置の検討単眼カメラ一つでも3D地図作成は可能であるが,一回の曳航で作成できる3D地図の精度や広域化を考えるとマルチカメラシステムに優位性があると考え,マルチカメラシステムを採用している.曳航型水中ロボットの先端にマルチカメラシステムを搭載し,単眼カメラ一つより,マルチカメラシステムの方が,広域の3D地図作成が可能となることを海実験により確認した.初年度の研究実施計画は100%達成している.本年度(2020年3月31日)の研究実施計画・曳航型水中ロボットの各種制御則の検討(研究代表者武村)前年度までに開発した曳航型水中ロボットの姿勢維持制御・深度維持制御・高度維持制御が可能となるように各種センサの実装を行なう.これらのセンサデータを元にして,どのような制御が可能となるか,の検討を行なっていく.・海底3D地図作成の処理手順の検討海底3D地図の手順の簡略化について,精度・作業効率・広域化の観点から検討を行なっていく.当該年度で使用する物品はすでに購入できていた.そのため,次年度以降の予算に使用することにした.
東アジアにおける隅一柱式建物の比較研究：日中韓三国木造建築技術の源流と特質

本年度の研究では主に二つの進展ができた。まずは敦煌壁画に確認された数十点の古代隅一柱式建物の画像資料の性格を解明した。初唐期の仏殿図と吐蕃ー曹氏時代の仏殿図は仏の居る正殿を表すものとして、日本の諸例金堂遺跡と同じ性格をもつものの画像と認められ、史料価値が高い。一方、初唐期の楼閣図は楼閣を表すものと認められるが、絵画要素として一つの壁画に複数に描かれ、何の特定な建物を表現しているかが不明である。それに対して、吐蕃ー曹氏時代の楼閣図は描かれた建物は楼閣にみえるが、描法としては仏殿図を上下に重ねて描かれたわけのことが分かった。次に、東アジア範囲で古代隅一柱式建物の地域性はある程度で解明できた。敦煌、長安の周辺地域、および日本の近畿地区に関係資料があり、長安の周辺地域に年代の一番早い関係例が確認された。よって現段階の資料で長安周辺地域がその起源地と考えられる。精確な伝播ルートがまだ分からないが、長安からシルクロードをそって敦煌に、そして仏教東伝ルートをそって日本に伝来したと推測される。このように、前年度の研究に重ね、当初予想した範囲より狭いが、隅一柱式建物の東アジアにおける全体像を作ることができた。隅一柱式建物は独自な技術特徴を有するものとして、吹き放しの四面庇つきの単層仏殿に限定すべきである。このような仏殿は7ー10世紀の敦煌壁画に、7ー8世紀ごろ日本近畿地方に姿を現す。そして6ー8世紀の長安地方の壁画に、前述の仏殿と様式の類似する住宅と宮殿建築が描かれている。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本年度の研究では、まず文献資料調査を行い、日中韓三国における隅一柱式建物の基本情報をまとめて分析した。その結果、隅一柱式建物の関係資料は、古代では遺跡と画像資料が中心となることに対して、中世以降では現存例が多少あることが分かった。このように、資料が古代と中世以降の二段に分けられることに従い、研究内容も12世紀を境とし、古代と中世以降の二部分に分けて行う計画を立てた。そして本年度では主にその古代部分の研究を実施した。古代隅一柱式建物に関する研究は日本の古代隅一柱式金堂遺跡と中国の7-11世紀の敦煌壁画に確認された隅一柱式建物画像資料をめぐって展開した。研究結論として、まずは現存例によると、隅一柱式建物は外周柱列の構造上の特徴により、裳階型と庇型に分けられることが分かった。そして古代の関係資料によると、庇型のものだけが古代隅一柱式建物として特徴的であることが明らかになった。その上で、古代隅一柱式建物は裳階型のものを排除すべき、一番正確な定義は四面庇の柱配置が「隅一柱式」である建物に限るものであるという結論に辿り着いた。本年度実施した建築・資料調査は国内のが1回ある:2017年12月、奈良薬師寺建築調査。海外のが2回ある:2017年8月、蘇州-無錫の隅一柱式建物調査。2018年3月、敦煌莫高窟壁画調査。以上の建築・資料調査と文献資料研究の内容を踏まえ、本年度の研究成果を国際会議と博士論文にまとめて提出した:2017年東アジア建築史国際会議(中国・天津)、口頭発表。東京大学平成29年度博士学位論文、『日中古代隅一柱式建物の研究』。本研究は隅一柱式建物の類型化に関する初めての研究を目指し、隅一柱式建物を特別な架構類型として捉えた上で行う研究である。当初予想したのは隅一柱式建物は古代から中世まで、日中韓三国に渡り少なからず存在することである。しかし、資料調査と現存例分析により、裳階型の隅一柱配置の建物を特別な架構類型の「隅一柱式建物」から外すことになった。それに従い、研究対象の数が大部減った。本論が定義した庇型隅一柱式建物は、まず地域について、韓国の古代実例が残っていないことにも理由があるが、韓国には資料がないことが分かった。次に日本と中国の関係資料は多少確認できたが、主に古代のものであり、中世のものが1例ずつしかない。このように、研究範囲は日中韓三国から日本と中国の両国のみに縮小し、時代区分は古代の研究を中心に構成し、中世の部分が予想より内容が少ない。このため、古代の部分を行うと半分以上の内容を進んでくるから、結果的に研究が当初の計画以上に進展していることとなっている。本年度具体的に進展できた内容は、まず日中両国における隅一柱式建物に関する資料の全体像が把握でき、そのデータベースを作ることができたことにある。そしてその上で、古代隅一柱式建物の平面規模、建築類型、建築様式などの面に関する研究を行ったことである。

一方、初唐期の楼閣図は楼閣を表すものと認められるが、絵画要素として一つの壁画に複数に描かれ、何の特定な建物を表現しているかが不明である。それに対して、吐蕃ー曹氏時代の楼閣図は描かれた建物は楼閣にみえるが、描法としては仏殿図を上下に重ねて描かれたわけのことが分かった。次に、東アジア範囲で古代隅一柱式建物の地域性はある程度で解明できた。敦煌、長安の周辺地域、および日本の近畿地区に関係資料があり、長安の周辺地域に年代の一番早い関係例が確認された。よって現段階の資料で長安周辺地域がその起源地と考えられる。精確な伝播ルートがまだ分からないが、長安からシルクロードをそって敦煌に、そして仏教東伝ルートをそって日本に伝来したと推測される。このように、前年度の研究に重ね、当初予想した範囲より狭いが、隅一柱式建物の東アジアにおける全体像を作ることができた。隅一柱式建物は独自な技術特徴を有するものとして、吹き放しの四面庇つきの単層仏殿に限定すべきである。このような仏殿は7ー10世紀の敦煌壁画に、7ー8世紀ごろ日本近畿地方に姿を現す。そして6ー8世紀の長安地方の壁画に、前述の仏殿と様式の類似する住宅と宮殿建築が描かれている。当初予想した研究方向は、現存例が充実した上で、隅一柱式建物の架構、特に構造の面について深く研究し、その特質を解明することである。しかし、実際確認した結果、庇型隅一柱式建物に絞り込むと、現存例が希にあり、それに対して、敦煌壁画を始め画像資料が多くあることになった。画像資料には一部とても精度が高いものがあり、構造ないし架構の確認がある程度できるが、予想ほどまでできない。しかし、画像資料には寺院建築配置、建築空間、一部の空間の使う様子などの情報が充実する。このように、実際確認できた資料の特徴により、今後の研究方向を調整した。これからの研究は日本古代金堂遺跡(非隅一柱式建物も含め)と敦煌壁画における隅一柱式建物を表した浄土図に基づき、古代隅一柱式建物の空間特徴、寺院建築配置上の特色、宗派、宗教儀式との関連性などの面をめぐって展開する計画である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
新規ヘム酵素アルドキシム・デヒドラターゼの機能、多様性および生理学的意義の検討

本研究は、有機化学、酵素化学工学、蛋白質工学、微生物学等のさまざまな分野の知識・手法を総合的に駆使し、1)アルドキシム・デヒドラターゼの反応メカニズムの解明、2)アルドキシム・デヒドラターゼの多様性、3)アルドキシム-ニトリル経路の生理学的意義の解明、の3点を達成することである。当概目的を達成するために以下の検討を行った。(1)アルドキシム・デヒドラターゼの大量供給法確立Bacillus由来のアルドキシム・デヒドラターゼの遺伝子組換え大腸菌における高発現条件を確立し、本酵素を短時間・高収率かつ安定に迅速精製する条件を見出した。(2)アルドキシム・デヒドラターゼの分子分光学的解析高度に精製した本酵素を、EPR(電子スピン共鳴)、共鳴ラマン、電子吸収スペクトル等の分光学的手法により解析することで、本酵素に共通なヘムの配位状況、ヘム鉄の酸化度やスピン状態を決定し、これにより酵素反応時に関与する触媒残基の推定を行った。(3)アルドキシム・デヒドラターゼの遺伝子スクリーニング既知のアルドキシム・デヒドラターゼの保存領域をもとにしたオリゴヌクレオチドプライマーを用い、ハイブリダイゼーション法およびPCRにて、各種保存菌株中より本酵素遺伝子の増幅、遺伝子クローニングを行った。(4)アルドキシム・デヒドラターゼの多様性の検討得られた酵素遺伝子を発現させ、精製し、酵素学的諸性質を解明した。その性質と酵素蛋白の一次構造をもとに本酵素の多様性を検討した。(5)「アルドキシム-ニトリル経路」中のニトリル分解酵素遺伝子スクリーニング「アルドキシム-ニトリル経路」を有する菌株において、各種ニトリル分解酵素群の存在を、酵素・遺伝子的に検討した。(6)「アルドキシム-ニトリル経路」の多様性と生理学的意義の検討得られた酵素蛋白の一次構造をもとに本酵素の多様性を検討し、アルドキシム・デヒドラターゼの多様性と照らし合わせて、同経路の進化を考察した本研究は、有機化学、酵素化学工学、蛋白質工学、微生物学等のさまざまな分野の知識・手法を総合的に駆使し、1)アルドキシム・デヒドラターゼの反応メカニズムの解明、2)アルドキシム・デヒドラターゼの多様性、3)アルドキシム-ニトリル経路の生理学的意義の解明、の3点を達成することである。(6)「アルドキシム-ニトリル経路」の多様性と生理学的意義の検討得られた酵素蛋白の一次構造をもとに本酵素の多様性を検討し、アルドキシム・デヒドラターゼの多様性と照らし合わせて、同経路の進化を考察した1.アルドキシム・デヒドラターゼの分布既知のアルドキシム・デヒドラターゼの保存領域を特定し、これをもとにしてオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。ハイブリダイゼーション法および各種保存菌中のゲノムDNAまたは固体培地上で生育させた菌体そのものからのPCRにて本酵素遺伝子の増幅を試みた。増幅断片等をベクターにクローニング後、常法によりその塩基配列を決定し、コードする蛋白質の一次構造を明らかにし、本酵素遺伝子の分布を遺伝子レベルで探索した。その結果、本酵素活性を有する菌株のうち、鉄型ニトリルビドラターゼをともに有する菌群において高感度で本酵素遺伝子の存在が確認された。2.アルドキシム・デヒドラターゼの反応機構の解明本酵素の反応機構を分子分光学的手法により推定した。この部分は研究協力者の岡崎統合バイオサイエンスセンター青野教授と共同で行った。Bacillus由来のアルドキシム・デヒドラターゼのN-末端部分にHis-tagを付加させて大腸菌で発現させ、コバルトを担体とするアフィニティーカラムを用いることで、本酵素を短時間・高収率かつ安定に迅速精製する条件を見出した。高度に精製した本酵素を、EPR(電子スピン共鳴)、共鳴ラマン、電子吸収スペクトル等の分光学的手法により解析した。

これらのスペクトルデータを既存のヘム酵素のデータと比較検討することで、ヘムの配位状況、ヘム鉄の酸化度やスピン状態を決定し、これにより酵素反応時に関与する触媒残基の推定を行った。1)アルドキシム・デヒドラターゼの反応機構の解明各種微生物由来のアルドキシム・デヒドラターゼを、EPR(電子スピン共鳴)、共鳴ラマン、電子吸収スペクトル等の分光学的手法により解析した。これらのスペクトルデータを平成17年度の研究により明らかにされた、Bacillus由来のアルドキシム・デヒドラターゼのそれと比較することで、本酵素に共通なヘムの配位状況、ヘム鉄の酸化度やスピン状態を決定し、これにより酵素反応時に関与する触媒残基の推定を行った。2)「アルドキシム-ニトリル経路」の分布以前の研究で選出された、「アルドキシム-ニトリル経路」を有する菌株において、同経路に存在すると想定される、ニトリラーゼ、ニトリルヒドラターゼ/アミダーゼといったニトリル分解酵素群の存在を、酵素・遺伝子的に検討した。オリゴヌクレオチドプライマーの設計の際、ニトリルヒドラターゼに関しては相同性が高いといわれているα-サブユニット間における相同領域を用い、ニトリラーゼに関しては既存のニトリラーゼとのみならず、近年報告された環境DNAからのランダムスクリーニングにより得られた多様性に富むニトリラーゼ遺伝子情報を参考にした。これらのプライマーを用い、サザンハイブリダイゼーションまたはPCRにより各遺伝子の存在を証明した。得られた目的断片をクローニング後、常法により塩基配列を決定し、さらにハイブリダイゼーション法やインバースPCR法にて同経路遺伝子クラスターをクローニングした。各酵素遺伝子を大腸菌中で大量発現させ、精製して諸性質の検討を行い、既知の情報と比較検討した。
大腸菌におけるsRNAを介したシグマE依存性プログラム死経路の解明

大腸菌集団の多くの細胞は、増殖定常期初期にVBNC(生きているがコロニー形成ができない)細胞となり、その大部分はシグマE発現増加によって溶菌する。本研究ではその引き金(シグナル)およびプログラム死経路(PCDカスケード)を解明することを目的とした。解析の結果、活性酸素種の蓄積がシグナルとして働き、PCDカスケードはシグマE発現増加⇒sRNA(micA,rybB)発現増加⇒Omp(ompA,ompC,ompW)発現低下とすすみ、最終的に膜構造が弱くなり膜破壊に至ると推測された。微生物におけるプログラム細胞死は、枯草菌の胞子形成母細胞の死などで一部知られるが、その生理的意義を含めて詳細な分子機構はほとんど明らかでない。本申請課題では、「シグマE(RNAポリメラーゼのサブユニット)依存性プログラム細胞死(PCD)」のカスケード解明を目的とする。本細胞死は、申請者らが見出した現象であるが、長らくその分子機構は不明であった。最近、small RNA(sRNA)のmicAやrybBが関与し、それらが0mpの発現を抑制し、溶菌に至ることが判明したことから、本研究では、そのカスケードの開始と最終段階に焦点を当てた。すなわち、「カスケードを誘導するシグナル」と「Ompの発現抑制から溶菌まで」を解析する。この機構の解明は、発酵細菌の細胞死や溶菌の抑制あるいは病原菌の繁殖抑制などの技術として発酵産業や衛生等に活かされると期待される。初年度の研究によって、「カスケードを誘導するシグナル」の検討を行ったところストレスの中で内在性の活性酸素種がシグナル分子であることが示唆された。定常期初期、活性酸素種が一過的に蓄積し、それに伴ってコロニー形成不能細胞が増加することが明らかとなった。さらに、その直後から溶菌が観察されたことから、シグマE依存性PCDがスタートすることが示された。溶菌の評価に申請の高速液体クロマトを用いた。一方、「Ompの発現抑制から溶菌まで」の解析の結果、Mg2+が溶菌を抑制し、EDTA処理によってその抑制が解除され迅速に溶菌へ導かれたことから、Mg2+は細胞の外側から外膜の破壊をくい止めていると推測された。これまでの結果と合わせて考えると、カスケードはシグマE発現増加〓sRNA(mica rybB)発現増加〓0mp(ompA, ompC, ompW)発現低下とすすみ、最終的に膜構造が弱くなり膜破壊がおこるものと推測される。微生物におけるプログラム細胞死は、枯草菌の胞子形成母細胞の死などで知られるが、その生理的意義を含めて詳細な分子機構はほとんど明らかでない。最近、small RNA (sRNA)のmicAやrybBが関与し、それらがOmpの発現を抑制し、溶菌に至ることが判明したことから、本研究では、そのカスケードの開始と最終段階に焦点を当てた。昨年度に引き続いて、「カスケードを誘導するシグナル」の検討をすすめた。昨年度の解析からストレスシグナルとして内在性の活性酸素種がシグナル分子である可能性が示唆されたことから、活性酸素種レベルに影響する関連遺伝子の変異株やクローン体を用いて検討したところ内在性の活性酸素種がシグナル分子であることが再確認された。従って、定常期初期の活性酸素種の一過的に蓄積が、コロニー形成不能細胞を形成し、シグマE依存性PCDがスタートすると考えられる。一方、「Ompの発現抑制から溶菌まで」の解析をさらにすすめたところ、Omp(opA,ompC,ompW)の発現調節にsRNAに加えてあらたにペリプラズムのタンパク質フォールディングに関わるPpiDが関与していることが示唆された。特に、コロニー形成不能細胞において、PpiDの発現が減少し、これが0mp発現低下を加速させ、外膜の不安定化そして溶菌に繋がると推測される。本申請課題では、「シグマE (RNAポリメラーゼのサブユニット)依存性プログラム細胞死(PCD)」のカスケード解明を目的とする。

最近、small RNA (sRNA)のmicAやrybBが関与し、それらがOmpの発現を抑制し、溶菌に至ることが判明したことから、本研究では、そのカスケードの開始と最終段階に焦点を当てた。すなわち、「カスケードを誘導するシグナル」と「Ompの発現抑制から溶菌まで」を解析する。この機構の解明は、発酵細菌の細胞死や溶菌の抑制あるいは病原菌の繁殖抑制などの技術として発酵産業や衛生等に活かされると期待される。これまでの解析からストレスシグナルとして内在性の活性酸素種がシグナル分子であることが示唆された。本年度は、「カスケードを誘導するシグナル」の出現時期について増殖曲線に沿って詳細に検討した。その結果、定常期初期に活性酸素種が一過的に蓄積し、続いてコロニー形成不能細胞が出現し、最終的に溶菌が起ることが示された。溶菌が進む時期が死滅期と一致することから、これまで不明であった定常機から死滅期の進行の1つがシグマE依存性PCDによって進められることが示唆された。sRNAの変異株を作製しその変異の影響を検討したところ、シグマE依存性PCDが抑制され、長期定常期での生存率が大きく低下した。これらの結果から、死滅期から長期定常期への移行において、シグマE依存性PCDが重要な役割を演じていることが示唆された。
歌舞伎の物語生成―多重物語構造・型・芸能情報システムに基づく調査と構成―

研究計画においては,初年度において物語生成の観点から歌舞伎の多重構造要素を摘出,全般的に調査を行うこととしていたが,本年度において15の多重的要素及び2の他のカテゴリー要素を摘出し,それら全般に関する調査・研究を行った(これらの要素は,以下の通りーさらに,本年度においては,特に上記5,6,16,17の要素を対象に,それらを物語生成の技法や方法の観点から捉え,個々のシミュレーション及び全体を結合したシミュレーションを試みた.以上から,当初の予定通りに進展している部分をベースに,特に後半のシステム化について,当初の計画以上に進展していると言える.1.歌舞伎の17の要素についての全般的調査を行ったが,今後はこれをより深化させ,また物語生成としての統合的な方向に近付ける.具体的には,各要素の文献研究を進め,さらに実地フィールドワークとして役者の演技や劇場の観察と記録などをより組織的に行う.2.昨年度においては,人,ストーリー,綯い交ぜ,尽しの要素について,物語生成の観点から検討を行い,最終的にそれぞれのシミュレーションと統合的なシミュレーションをCommon Lisp言語を用いて行ったが,今後はこれをより汎用的な物語生成システムである「統合物語生成システム」の枠組みに組み込む.さらに,より多くの要素をシミュレーション対象とする.3.歌舞伎の研究書の調査ではなく,歌舞伎の作品そのものの調査を行う.一つは,実際の劇場での上演のフィールドワークであるが,もう一つは,本としてまとめられている歌舞伎の脚本(台帳)の読書及び調査であり,大正から昭和にかけて発刊された春陽堂発行の歌舞伎脚本全集も調査対象とする.4.筆者の研究体系において,歌舞伎は「芸能情報システム」と呼ばれるシステム構想の基幹を成す対象であるが,歌舞伎研究の進展と連動して,この芸能情報システムのデザインをより具体化させる作業に着手する.研究計画書にも述べたように,芸能情報システムは上記統合物語生成をその中に含むより統合的なシステムであるので,この4の作業は上記1の作業との連動において進められる.研究計画においては,初年度において物語生成の観点から歌舞伎の多重構造要素を摘出,全般的に調査を行うこととしていたが,本年度において15の多重的要素及び2の他のカテゴリー要素を摘出し,それら全般に関する調査・研究を行った(これらの要素は,以下の通りーさらに,本年度においては,特に上記5,6,16,17の要素を対象に,それらを物語生成の技法や方法の観点から捉え,個々のシミュレーション及び全体を結合したシミュレーションを試みた.以上から,当初の予定通りに進展している部分をベースに,特に後半のシステム化について,当初の計画以上に進展していると言える.1.歌舞伎の17の要素についての全般的調査を行ったが,今後はこれをより深化させ,また物語生成としての統合的な方向に近付ける.具体的には,各要素の文献研究を進め,さらに実地フィールドワークとして役者の演技や劇場の観察と記録などをより組織的に行う.2.昨年度においては,人,ストーリー,綯い交ぜ,尽しの要素について,物語生成の観点から検討を行い,最終的にそれぞれのシミュレーションと統合的なシミュレーションをCommon Lisp言語を用いて行ったが,今後はこれをより汎用的な物語生成システムである「統合物語生成システム」の枠組みに組み込む.さらに,より多くの要素をシミュレーション対象とする.3.歌舞伎の研究書の調査ではなく,歌舞伎の作品そのものの調査を行う.一つは,実際の劇場での上演のフィールドワークであるが,もう一つは,本としてまとめられている歌舞伎の脚本(台帳)の読書及び調査であり,大正から昭和にかけて発刊された春陽堂発行の歌舞伎脚本全集も調査対象とする.4.筆者の研究体系において,歌舞伎は「芸能情報システム」と呼ばれるシステム構想の基幹を成す対象であるが,歌舞伎研究の進展と連動して,この芸能情報システムのデザインをより具体化させる作業に着手する.研究計画書にも述べたように,芸能情報システムは上記統合物語生成をその中に含むより統合的なシステムであるので,この4の作業は上記1の作業との連動において進められる.初年度においては,歌舞伎研究項目の一般的な文献・資料調査やメジャーな劇場のフィールドワークが主体であり,またシステム開発等に使用するPC等機材は既存のものを利用したため,総体として当初の予算計画を下回る結果となったが,今後は,継続的に文献・資料の拡大(映像や音声資料にも拡張),劇場等フィールドワークの拡大(地方の地芝居や人形浄瑠璃,能など関連ジャンルへの拡張を含む),鑑賞や開発に関わるPC等機材,さらに資料調査や研究に関わる学生等アルバイト要員への謝金など,初年度を上回る範囲と規模の予算が必要となる.,
結核菌によるIL-1関連レセプターからのシグナル伝達機構の調節

我々は結核菌生菌がヒト線維芽細胞株に対して細胞傷害活性をもち、本活性は死菌では全く見られないことを明らかにした(J.Interferon Cytokine Res.,2001,Antimicrob.Agents Chemother.,2002)。本研究では、インターロイキン1関連レセプターからの結核菌生菌によるシグナル伝達の調節機構を明らかとするために、IL-1レセプターファミリーであるtoll like receptors(TLRs)の発現調節機構について検討した。抗酸菌のリポ蛋白はTLR2の強いリガンドであり、マクロファージのアポトーシスを誘導することが報告されている。一方、大腸菌などのグラム陰性菌に含まれるリポ多糖(LPS)はTLR4を介して、そのシグナルが伝達されることが報告されている。本研究では、TLR2とTLR4の発現調節機構をLPSやTGFβにより正・負に制御されていることを明らかとした(Immunology,2003,J.Leukocyte Biol.,2004)。また、生菌特異的な細胞傷害活性についてTLRsからのシグナル伝達とサイトカイン産生について検討した。ヒト肺由来培養細胞株MRC-5はTLRsのうちTLR1TLR10までを発現していた。TLRsからの共通のシグナルを伝達するNF-κBについてレポーター遺伝子アッセイを行った結果、細胞傷害活性とNF-κBの活性化が比例していた。NF-κBを遺伝子制御領域に含む炎症性サイトカインのレポーター遺伝子アッセイを行った結果、同様に転写活性が生菌特異的に上昇していた。これらの炎症性サイトカインのmRNAの発現をRNase protection assayにより行った結果、生菌特異的に前述のサイトカン遺伝子の発現を確認できた。興味あることに、これらのサイトカインの誘導時期が細胞傷害活性の発現誘導時期と一致していることからTLRからのシグナルが共通に関与していることが示唆された。本研究の実践的な成果として、臨床株の抗結核薬ピラジナミドの薬剤感受性試験に応用可能であることが示された(Antimicrob.Agents Chemother.,2005)。本研究の背景として、結核菌生菌がヒト線維芽細胞株に対して細胞傷害活性をもつこと、この現象は死菌では全く見られないことを研究代表者らは明らかにしている(J. Interferon Cytokine Res. 21(3), 187-196 (2001))。本研究では、この結核菌の細胞傷害活性の機構を明らかとするために、IL-1レセプターファミリーであるtoll like receptors(TLRs)からのシグナル伝達の関与について検討した。MRC-5細胞はTLRsのうちTLR1TLR10の発現をRT-PCR法によって調べたところ、全てのTLRsを発現していた。これらのサイトカインやTLRsからのシグナル伝達に共通に関わっているNFκBについてレポーター遺伝子解析を行った結果、細胞傷害活性とNFκBの活性化が比例していた。抗酸菌のリポ蛋白はTLR2の強いリガンドであり、マクロファージのアポトーシスを誘導することが近年報告された。共同研究で、結核菌と同じ抗酸菌であるM. lepreの33kDのリポ蛋白を同定した(Infect. Immun. 70(8) : 4106-4111 (2002))。このリポ蛋白は細胞壁の中に存在し、一部放出されているが、死菌では飽埋されてしまい、免疫原性が失われてしまう。

本現象も同様な菌体細胞壁中に存在するリポ蛋白によって引き起こされる可能性がある。本現象は生菌で認められ、死菌で全く認められないことから、新規抗結核薬のスクリーニング法に応用した(Anti microb. Agents Chemother. 46(8) : 2533-2539 (2002))。結核症の第1選択薬として使用されている5種の薬剤(INH, SM, RFP, EB, PZA)のうち、4種の薬剤(INH, SM, RFP, EB)については、液体培地を用いた従来法と比較して同程度の感度で抗菌活性を測定が可能であった。時間的には従来法では2週間かかるところ、本法では3日で結果を得ることが可能である。また、試験管内で抗菌活性を測定することが非常に難しいピラシナミド(PZA)(宿主細胞内に取り込まれ、食胞とリソソームが融合して酸性条件下で活性を示す)については128倍の高感度で測定することが可能であった。本法はPZAのような宿主細胞内で活性を持つタイプの抗菌薬のスクリーニングにも適している。研究の背景として、我々は結核菌生菌がヒト線維芽細胞株に対して細胞傷害活性をもち、本活性は死菌では全く見られないことを明らかにしている(J.Interferon Cytokine Res.,2001,Antimicrob.Agents Chemother.,2002)。本研究では、インターロイキン1関連レセプターからの結核菌生菌によるシグナル伝達の調節機構を明らかとするために、IL-1レセプターファミリーであるtoll like receptors(TLRs)の発現調節機構について検討した。抗酸菌のリポ蛋白はTLR2の強いリガンドであり、マクロファージのアポトーシスを誘導することが報告されている。一方、大腸菌などのグラム陰性菌に含まれるリポ多糖(LPS)はTLR4を介して、そのシグナルが伝達されることが報告されている。本研究では、TLR2とTLR4の発現調節機構をLPSやTGFβにより正・負に制御されていることを明らかとした(Immunology,2003,J.Leukocyte Biol., in press)。また、生菌特異的な細胞傷害活性についてTLRsからのシグナル伝達とサイトカイン産生について検討した。ヒト肺由来培養細胞株MRC-5はTLRsのうちTLR1TLR10までを発現していた。TLRsからの共通のシグナルを伝達するNF-κBについてレポーター遺伝子アッセイを行った結果、細胞傷害活性とNF-κBの活性化が比例していた。NF-κBを遺伝子制御領域に含む炎症性サイトカインのレポーター遺伝子アッセイを行った結果、同様に転写活性が生菌特異的に上昇していた。これらの炎症性サイトカインのmRNAの発現をRNase protection assayにより行った結果、生菌特異的に前述のサイトカン遺伝子の発現を確認できた。現在、培養上清中のサイトカイン量の測定を行っている。また、平行してヒト遺伝子アレイ(約15,000)チップを用いて生菌特異的に発現が上昇してくる遺伝子の解析を進めている。
I型インターフェロンによる全身性エリテマトーデスの病態形成機構の解明

全身性エリテマトーデス(SLE)は高親和性の自己抗体産生とその免疫複合体形成による、全身の臓器障害を特徴とする予後不良の自己免疫疾患である。SLEにおいては依然としてステロイド及び免疫抑制薬による治療がその中心であり、治療予後に大きな改善が得られているとは言い難く、ループス腎炎(LN)などの根本的治療法は未だ開発されていない。近年、SLEの発症及び病態形成にはI型インターフェロン(IFN)が深く関与していることが示唆されている。本研究は、SLEの疾患活動性マーカー並びに治療ターゲットとしての新規IFN経路関連分子を同定することで、次世代のLN治療戦略基盤を構築する。