hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
近世後期江戸語から明治期東京語における第三者用法の体系的研究

平成30年度は、平成29年度で遅れが見られた、用例収集とデータ整理を進めるとともに、近世後期江戸語の使用についての考察を進め、明治期東京語への変化の様相や丁寧語とのつながりを明らかにすることを目指し、研究を進めた。具体的には、1近世後期江戸語における〈行く・来る〉の謙譲語についての考察結果を発表し、論文化すること、2明治期東京語の用例収集とデータ整理を行なうこと、31の考察結果を踏まえ、明治期東京語における〈行く・来る〉の謙譲語の使用について考察を行なうことである。1の近世後期江戸語における〈行く・来る〉の謙譲語についての考察結果は、早稲田大学日本語学会前期研究発表会(7月)にて発表することができた。「うかがう」「あがる」「さんず」「まいる」「めえる」の五語を中心に取り上げ、各語の使用実態や各語の似た点と相違する点について記述し、「うかがう」や「あがる」が新しい謙譲語として用いられ始めた要因について指摘した。発表の際、様々な意見や指摘を受けることで、自身の考察方法や分類基準を再考するきっかけを得ることができた。この再考に時間を費やしてしまったが、必要な再考であったと思う。さらに、口頭発表の内容を「近世後期江戸語における〈行く・来る〉の謙譲語ー「うかがう」「あがる」「さんず」「まいる」ー」(『早稲田日本語研究』28)にまとめた。2の明治期東京語の用例収集とデータ整理については、ほぼ完了した。ただし、用例の精査や写本の確認等、すべての作業が完了したとはいえないため、さらに進めていく必要がある。3の明治期東京語における〈行く・来る〉の謙譲語の使用についての考察は、内輪の口頭発表を行ない(2回)、様々な指摘を受けることができた。この指摘を踏まえて考察を深めることができた。用例収集やデータ整理等、おおむね順調に進んでいる。ただし、データの整理を平成30年度中に終えることを目標としていたが、完了しなかった。また、明治期東京語における〈行く・来る〉の謙譲語の使用については、考察の観点や分類方法等、考えなくてはならない課題が残っている。データの整理については、誤りのない研究を進めるにあたり不可欠な作業であるため、データの整理を進める時間を今まで以上に確保できるようつとめていく。考察については、用例に向き合いながら様々な観点から見ていきたい。近世後期江戸語については、謙譲語についての論文化を進める。明治期東京語資料については、引き続き、本文データ化と用例収集、データベース化を進める。研究を進めてわかったことだが、まずは、近世後期江戸語から明治期東京語における謙譲語の使用と変遷についての考察を進めたい。第三者に対して用いられる場合だけでなく、聞き手に対して用いられる場合も合わせた、広い視野を持ってまとめていく。これにより、本研究の目的の一つである丁寧語との関わりという点にまでつなげることができると考えている。考察の順番を変えることで、スピードアップをはかりたい。本研究課題は、第三者に対して使用される謙譲語と通常語の使用全体を見渡していくことを目的としていた。その第一歩として、〈行く・来る〉の謙譲語の使用についての考察を中心に進めてきた。研究を進めるうちに、多くの課題が見つかった。今後は、〈行く・来る〉の敬語の体系という意味領域の枠組みを設けた考察に変更し、残っている通常語の使用(文末)の考察を行なっていく。
リアルタイムハイブリッド実験による極低温環境下の免震橋梁の地震応答の解明

巨大地震が北海道の冬期に発生した場合の,免震橋梁の地震応答を解明するため,-30°Cで載荷実験のできる実験設備を用いて数値解析と載荷実験を組み合わせたハイブリッド実験を行う.橋梁の免震構造としては免震ゴム支承を対象とする.これまでに申請者らが実施した低温環境下での実験から,ゴム支承の剛性といった力学的特性は温度に依存することが分かった.さらに,ゴム支承は地震の揺れが続いていくと特性が変化することが知られているが,低温環境下ではその変化が大きかった.-30°Cのような極低温環境下では,このように免震橋梁の地震応答が常温環境下とは異なる可能性が大きく,その解明が必要と考える.巨大地震が北海道の冬期に発生した場合の,免震橋梁の地震応答を解明するため,-30°Cで載荷実験のできる実験設備を用いて数値解析と載荷実験を組み合わせたハイブリッド実験を行う.橋梁の免震構造としては免震ゴム支承を対象とする.これまでに申請者らが実施した低温環境下での実験から,ゴム支承の剛性といった力学的特性は温度に依存することが分かった.さらに,ゴム支承は地震の揺れが続いていくと特性が変化することが知られているが,低温環境下ではその変化が大きかった.-30°Cのような極低温環境下では,このように免震橋梁の地震応答が常温環境下とは異なる可能性が大きく,その解明が必要と考える.
父親の高齢化に伴う母子間コミュニケーション障害の神経分子基盤の解明

これまでの疫学研究より、父親の高齢化は、様々な精神疾患や発達障害の発症リスクを増大させることが知られている。申請者らはこれまでに、高齢の父親マウス由来の仔マウスにおいて母子間の言語コミュニケーション障害を示すことを見出しており、本研究ではその病態基盤の解明を目的とする。昨年度はまず、言語コミュニケーション障害の詳細なシラブル解析を実施し、高齢の父親由来の仔マウスは、若齢の父親マウス由来の仔マウスと比較して、"Down"や"Flat"等の単純なシラブル頻度が増加する一方で、"One jump"や"More jump"等の複雑なシラブル頻度が減少することを見出した。このことより、父親マウスの高齢化は仔マウスの言語コミュニケーションの減少を引き起こすのみならず、言語パターンを変化させることが示唆された。また、高齢の父親マウスの精子におけるDNA低メチル化が仔マウスの言語コミュニケーション障害の原因であることを検証するために、若齢の父親マウスに対してDNAメチル転移酵素阻害剤を反復投与して精巣におけるDNA低メチル化を誘導し、若齢の雌マウスと交配して得られた仔マウスの言語コミュニケーションについて検討した。その結果、高齢の父親由来の仔マウスと同様に言語コミュニケーションの減少が確認された。さらに、その詳細なシラブル解析を実施し、"Down"や"Flat"等の単純なシラブル頻度が増加することと"One jump"や"More jump"、"One jump + Harmonics"等の複雑なシラブル頻度が減少することを見出した。以上より、父親マウスの高齢化によるDNA低メチル化は仔マウスの言語コミュニケーションの低下および言語パターン異常の原因であることが示唆された。申請者らはこれまでに、若齢あるいは高齢の父親マウス由来の仔マウスにおいて、母子間の言語コミュニケーション障害を示すことを見出しており、本研究では、その病態基盤の解明を目的とする。これまでに、母子間の言語コミュニケーションにおける不安の関与が指摘されていることから、若齢および高齢の父親マウス由来の仔マウス脳を用いて、不安に関係する脳領域における神経活動を免疫組織学的に評価した。その結果、高齢の父親マウス由来の仔マウス脳において、不安に関わる脳領域における神経活動の低下を見出した。このことより、高齢の父親マウス由来の仔マウスにおける言語コミュニケーション障害は不安に対する応答性の低下に起因する可能性が示唆された。また、若齢および高齢の父親マウス由来の精子における包括的メチローム解析を実施し、16個の高メチル化領域と96個の低メチル化領域を同定した。こられのうち5つの低メチル化領域が、既報の自閉症関連遺伝子座の近傍に存在することを確認した。さらに、これらの遺伝子の中から、高齢の父親マウス由来の仔マウスにおいて有意に発現低下する遺伝子を同定した。しかしながら今回解析した遺伝子の中には、不安関連脳領域において発現変化するものは含まれていなかった。また、メチル化領域のモチーフ解析を実施し、メチル化領域の約20%においてREST/NRSF結合サイトが共通して存在することを見出した。REST/NRSFは神経分化を抑制する分子であることから、高齢の父親マウス由来の仔マウスは、神経発生の過程における神経分化が遅延することによる不安の形成異常が言語コミュニケーション異常の病態基盤である可能性が示唆された。本年度の研究計画では、父親マウスの高齢化による言語コミュニケーション障害に関わる神経基盤と父親マウスの精子を用いた網羅的メチローム解析から言語コミュニケーション障害に関わる候補遺伝子をリストアップすることを目指しており、いずれの研究計画とも当初の予定通り実施されている。加えて、後者の網羅的メチローム解析から、父親の高齢化による精子のDNAメチル化領域に共通したREST/NRSF結合サイトを同定した。このことは、加齢という現象がただ単なるエラーの蓄積ではなく、生物学的意義のある現象であることを示唆するものであり、また、この共通した分子基盤を利用することにより、父親の高齢化による次世代における表現系獲得のメカニズム解明の研究に大きな発展性をもたらすことが期待できる。昨年度は、高齢の父親マウス由来精子のDNA低メチル化領域のモチーフ解析を実施し、REST/NRSF結合モチーフが濃縮されることを明らかにしたが、今年度はさらに、ChIP-Atlasを用いたin silico解析において、高齢の父親マウス由来精子のDNA低メチル化領域の多くにREST/NRSFが実際に結合することを確認した(37/96 DNA低メチル化領域)。REST/NRSFは神経分化を抑制する分子であることから、高齢の父親マウス由来の仔マウスにおいて、REST/NRSFの機能異常による神経発生あるいは発達への影響が想定されたため、若齢あるいは高齢の父親マウス由来の仔マウス脳における大脳皮質形成について免疫染色法を用いて検討した。興味深いことに、高齢の父親マウス由来の仔マウス脳では、大脳皮質の厚みが減少しており、特に、第VI層ニューロンの神経細胞数、細胞密度の低下が認められた。一方で、第II-IV層および第V層のニューロンについては有意な変化は認められなかった。

現在、その分子基盤について検討するために、現在、第VI層ニューロンが誕生する胎生期11.5日齢の終脳における網羅的遺伝子発現解析を実施している。今年度は、高齢の父親由来の精子の高・低メチル化領域の近傍の遺伝子発現について検討する予定であったが、精子のメチル化情報のモチーフ解析およびChIP-Atlasによるin silico解析の結果より、神経分化抑制に関わるREST/NRSFが濃縮されていることが分かったため、父親の高齢化はランダムに影響するのではなく、何らかの生物学的意義により影響する可能性が想定された。そのため、仔マウス脳の組織学的解析を実施し、父親の高齢化の影響が比較的神経発生の初期に限定的であることを明らかにした。現在、その分子基盤について解明を進めている。このような研究の発展性については当初の想定以上のものであったため、これらの解析に多くの時間を要した。一方で、今年度よりエピゲノム操作に関わる発現ベクターの構築を進める予定であったが、現在までにコンストラクションは進められていない。また、申請書ではTALENを用いたシステム構築を計画したが、Crispr-dCas9システムによる構築を進める予定である。これまでの疫学研究より、父親の高齢化は、様々な精神疾患や発達障害の発症リスクを増大させることが知られている。申請者らはこれまでに、若齢あるいは高齢の父親マウス由来の仔マウスにおいて、母子間の言語コミュニケーション障害を示すことを見出しており、本研究では、その病態基盤の解明を目的とする。昨年度は、若齢および高齢の父親マウス由来の胎生期11.5日齢および14.5日齢の終脳における網羅的遺伝子発現解析を実施した。その結果、胎生期11.5日齢および14.5日齢のいずれの時期においても、遺伝子発現が半減あるいは2倍以上変動し、かつ統計的に有意な変化を示すものは同定されなかった。そこで本研究では、Gene Set Enrichment Analysis (GSEA解析)を用いて、遺伝子発現プロファイルにおいて類似の機能およびモチーフをもつ遺伝子群の同定を試みた。その結果、高齢の父親マウス由来の14.5日齢の終脳において遺伝子発現が低下する遺伝子群に胎生前期の遺伝子群(EARLY500)が濃縮しており、一方で、遺伝子発現が増加する遺伝子群に胎生後期の遺伝子群(LATE500)が濃縮することが確認された。さらに、モチーフ解析から、高齢の父親マウス由来の14.5日齢の終脳において遺伝子発現が増加する遺伝子群の制御因子として、神経分化抑制因子であるREST/NRSFを同定した。これらより、高齢の父親マウス由来の終脳において、神経発生が前段的に引き起こされており、REST/NRSFの関与が示唆された。これまでに若齢および高齢の精子のDNAメチローム解析の結果より、DNA低メチル化領域においてREST/NRSF結合モチーフを同定した。そこで本年度は神経発生に関わる免疫組織学解析に加えて、胎生期11.5日齢および14.5日齢の終脳において網羅的遺伝子発現解析を実施した。
重症感染症に伴うＡＲＤＳにおけるＰＧＤ２／ＣＲＴＨ２を介する病態メカニズムの解明

エンドトキシンショックに続発する急性肺損傷におけるPGD2/CRTH2の役割の解明が目的だが、前段階として、CRTH2特異的阻害薬がLPS誘導性エンドトキシンショックにおける保護的役割のメカニズムを引き続き検討した。まず、腹膜炎誘導敗血症マウスモデルと同様に、LPS誘導性エンドトキシンショックモデルにおいても腹腔内のProstaglandin D2濃度は経時的に上昇していくことを確認した。CRTH2特異的阻害薬をLPS投与13時間前から12時間おきに投与したところ、LPS投与12時間後の時点でProstaglandin D2濃度が低下傾向だった。これは炎症が抑えられた結果を見ている可能性があると考えた。次に腹腔内洗浄液中の細胞分画を評価したところ、CRTH2特異的阻害薬において腹腔内好中球遊走を抑制することが分かった。好中球遊走に関わるケモカインとして、CXCL1, CXCL2が挙げられる。腹腔内好中球数増加の原因として、これらケモカインの腹腔内洗浄液中濃度が変化するか、ELISAで評価した。LPS投与後の腹腔内洗浄液中のCXCL1, CXCL2濃度はCRTH2特異的阻害薬投与群と対照群で差を認めなかった。ただしCRTH2特異的阻害薬投与群ではLPS投与後の末梢血中のCXCR2発現好中球の割合が対照群よりもより減少する傾向だった。このことはCRTH2特異的阻害薬投与群において腹腔内への好中球浸潤が抑制されたことの一因になりうると考えられる。さらに、前年の検討でIFN-γがCRTH2阻害薬投与群での生存率改善に関連している可能性が示唆されたため、IFN-γ産生源を確認するために細胞内染色を行った。LPS投与6時間後の脾細胞を単離し細胞内染色を試みたが、T cellやNK cellのIFNγ発現量に群間差を認めなかった。リンパ球系以外の細胞集団が関与していることが考えられた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。我々はすでにCRTH2特異的阻害薬の投与により、LPS誘導性エンドトキシンショックにおけるマウスの生存率が改善する結果を得ている。その機序を解明するために各種実験を行い、検討した。まず、LPS投与の2, 6, 12時間後に腹腔内洗浄液を採取し、ELISAでサイトカイン濃度の測定をおこなったところ、CRTH2特異的阻害薬投与群において、CXCL10, IFN-γ, TNF-αの濃度が低下していた。CRTH2特異的阻害薬投与による炎症性サイトカインの変化がLPS誘導性エンドトキシンショックでの生存率改善に寄与していることが示唆された。その中でも、特にIFN-γーCXCL10が重要な役割を果たしている可能性があると考えられた。細胞割合に差はなかったが、細胞の機能に差がある可能性がある。そのために、細胞機能を解析する目的で、腹腔内洗浄液からNK cellをMACSにて単離し、RT-PCRにて遺伝子の発現を評価した。その結果、CRTH2特異的阻害薬投与群では、対照群と比較し、LPS投与後のIFN-γのmRNA上昇が抑制されていた。同様の検討をCD4+ T cellでも行い、CRTH2特異的阻害薬の投与によりIFN-γのmRNA発現が変化するかを検討する予定としている。LPS誘導性エンドトキシンショックモデルにおいて、CRTH2特異的阻害薬が対象となる細胞集団が明らかになりつつあるが、肺障害における機序解明には至らなかった。また、in vitroの系が確立できていない点も進捗が遅れている理由である。

さらに、前年の検討でIFN-γがCRTH2阻害薬投与群での生存率改善に関連している可能性が示唆されたため、IFN-γ産生源を確認するために細胞内染色を行った。LPS投与6時間後の脾細胞を単離し細胞内染色を試みたが、T cellやNK cellのIFNγ発現量に群間差を認めなかった。リンパ球系以外の細胞集団が関与していることが考えられた。まずは、細胞内染色にて、IFN-γの産生源を検討することを考えている。気管支肺胞洗浄液中でも上記と同様の検討を行い、肺内でも同様の現象が生じているか、検討する。同様の検討をCRTH2ノックアウトマウスでも行う予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
微小乳頭成分を有する肺腺癌の高い脈管侵襲・転移能に寄与する因子の解明

629症例の肺腺癌から101例(16.1%)のMPC腺癌が確認された。臨床病理学的検討では、non-MPC群に比べ、MPC群の脈管侵襲、リンパ節転移、術後病理病期、全生存期間と無再発生存期間が有意に悪く、MPC腺癌は独立した一つの高悪性度の臨床病理学的疾患単位であった。二次元電気泳動によるプロテオーム解析と免疫組織染色による半定量的検討では、non-MPC群よりMPC群におけるvimentinの発現が有意に高かった。また、MPC群のみにおいても、多変量解析でvimentinの高発現が予後不良因子であった。Vimentin高発現は、MPCのより低分化な性格ないし脱分化を反映している可能性がある。肺癌は癌死原因の第一位であり、そのうち肺腺癌の増加が顕著であり、本邦では腺癌が肺癌全体の約50%、女性肺癌の約70%を占める。肺腺癌のうち、線維・血管の芯を持たない腫瘍の微小乳頭成分(micropapillary component, MPC)を有するものは高度のリンパ管侵襲・転移を起こすため予後が有意に悪い。しかし、依然、MPCの高い浸潤・転移能を規定する因子は全く不明である。平成24年度の研究結果と併せて、MPCが腫瘍全体の1%以上を占める症例を、計101例を確定診断した。臨床病理学的検討では、MPCを有しない(non-MPC)群に比べ、MPC群のリンパ管侵襲、静脈侵襲、リンパ節転移と術後up-staging及び術後病理病期の頻度・程度が有意に高く、non-MPC群よりMPC群の全生存期間と無再発生存期間は何れも有意に短かった。MPC肺腺癌は独立した一つの高悪性度の臨床病理学的疾患単位であることを再確認した。平成24年度の二次元電気泳動によるプロテオーム解析で、MPC腺癌におけるvimentinの量的発現はnon-MPC腺癌の2.2倍であった。平成25年度の基礎的研究では、免疫組織化学染色による半定量的検討を行ったところ、non-MPC群よりMPC群におけるvimentinのin vivo発現が有意に高いことを明らかにした。また、MPC群においてvimentin発現は腫瘍の脈管侵襲とリンパ節転移に有意に相関し、多変量解析にてvimentinの高発現が予後不良因子であった。MPCにおけるvimentinの高発現は、MPCのより低分化な性質ないし脱分化を反映している可能性がある。平成25年度では、MPC患者の胸水から一つ細胞株の樹立に成功した。現在、その細胞株の生物学的特性を詳細に検討中である。肺腺癌は増加が顕著であり、本邦では肺癌全体の約50%、女性肺癌の約70%を占める。肺腺癌のうち、線維・血管の芯を持たない腫瘍の微小乳頭成分(micropapillary component, MPC)を有するものは高度のリンパ管侵襲・転移を起こすため予後が有意に悪く、MPCを含有する腺癌は独立した一つの臨床病理学的疾患単位であると報告されているが、依然、MPCの高い浸潤・転移能を規定する因子は全く不明である。平成24年度では、retrospective臨床病理学的研究で、外科切除された約1,100症例の肺癌のHE染色標本をレビューし、MPCを含有する肺腺癌を86症例抽出した。MPCの有無、その割合と腫瘍脈管侵襲及びリンパ節転移と患者予後との関連などを分析した。通常型の腺癌に比べ、MPC(+)腺癌は脈管侵襲とリンパ節転移の頻度が有意に高く、全生存期間が有意に短かった。MPCを有する肺腺癌は高悪性度のものであることを再確認した。組織学的にMPCが確認された腺癌とMPCを有しない通常型腺癌の凍結生組織を用い、二次元電気泳動法にてそれぞれのタンパク質発現を比較検討した。MPC(-)腺癌に比べ、MPC(+)腺癌で2.2倍以上の量で発現したタンパク質の一つはvimentinであることが同定された。現在、MPC(+)腺癌とMPC(-)腺癌に於けるvimentinのin vivo発現を比較検討中である。肺癌において腺癌は増加が顕著であり、肺癌全体の約半分以上を占める。肺腺癌のうち、線維・血管の芯を持たない腫瘍の微小乳頭成分(micropapillary component, MPC)を有するものは高頻度にリンパ管侵襲・転移を起こすため悪性度が高い。しかし、MPCのタンパク質発現・遺伝子異常のプロファイルは、依然解明されておらず、MPCの高悪性度に寄与する分子的基盤は未だに不明である。

平成2425年度の研究では、629症例の肺腺癌から101例(16.1%)のMPC腺癌が確認された。臨床病理学的検討では、non-MPC群に比べ、MPC群の脈管侵襲、リンパ節転移、術後病理病期、全生存期間と無再発生存期間が有意に悪く、MPC腺癌は独立した一つの高悪性度の臨床病理学的疾患単位であった。二次元電気泳動によるプロテオーム解析と免疫組織染色による半定量的検討では、non-MPC群よりMPC群におけるvimentinの発現が有意に高かった。また、MPC群のみにおいても、多変量解析でvimentinの高発現が予後不良因子であった。Vimentin高発現は、MPCのより低分化な性格ないし脱分化を反映している可能性がある。平成26年度では、ホルマリン固定・パラフィン包埋した同一腫瘍からMPCとnon-MPCをそれぞれmicrodissectionし、cDNAマイクロアレイ解析によるMPCにおいて発現が変動した遺伝子の同定を行った。MPCとnon-MPCに間に発現比率2倍以上に変動した遺伝子が千個以上検出され、両者の遺伝子発現プロファイルの違いが示唆された。しかし、microdissectionした組織から抽出した微量RNAの前増幅が不可欠であるため、これから展開するMPCの高悪性度に寄与する因子の選別には慎重な分析が必要である。人体病理学研究実績の概要の如く。しかし、cDNAマイクロアレイによるMPC群とnon-MPC群の網羅的遺伝子発現の比較解析は、予定より遅れている。研究実績の概要の如く。しかし、ランダム免疫法抗体作製によるMPC特異タンパク質の同定は、予定より遅れている。1.腫瘍成分のmicrodissectionに基づいたcDNAマイクロアレイにて、MPC腺癌とnon-MPC腺癌における遺伝子発現の差異を解析する。2.平成25年度に樹立したMPC細胞株の生物学的特性を詳細に解析し、本細胞株を用いて、ランダム免疫法によるMPC特異的単クローン抗体の作成やその認識するタンパク質の同定に努める。3.術前生検材料でMPCが含まれることが判明された症例の手術材料を用いる細胞培養を行い、新たなMPC細胞株の樹立を試みる。4.得られた研究結果の分析・まとめ、論文作成。1. MPC(+)肺癌の症例蓄積の継続。2.腺癌に於けるvimentinのin vivo発現と、それと腫瘍分化度、増殖能と脈管侵襲などとの関連を検討する。3.ランダム免疫法抗体作製によるMPC特異タンパク質の同定を行う。4. MPC腺癌細胞株の樹立。術前生検材料でMPCが含まれることが判明された症例の手術材料を用いる細胞培養を行い、MPC細胞の株化を試みる。5. cDNAマイクロアレイを用い、MPC(+)腺癌とMPC(-)腺癌の網羅的遺伝子発現を解析。cDNAマイクロアレイによるMPC群とnon-MPC群の網羅的遺伝子発現の比較解析は、予定より遅れている。Microdissection消耗品・試薬。cDNAマイクロアレイ解析。単クローン抗体作製試薬・動物飼育。細胞培養用試薬・免疫染色試薬・消耗品。プロテオーム解析試薬・器具類。論文校正・投稿・掲載。タンクローン抗体作製試薬。Microdissection消耗品・DNA sequencing試薬・消耗品。
分秘ベクタ-保有大腸菌による異種遺伝子産物の菌体外分秘生産の培養工学的研究

1.分秘ベクタ-保有大腸菌の流加培養(分担研究者:山根恒夫)分秘ベクタ-保有大腸菌による好アルカリ性菌由来のペニシリナ-ゼの分秘生産に及ぼす培地組成および培養条件の影響を調べた。グルコ-スと無機塩とからなる合成培地では、ほとんど分秘されないが、LB培地ではよく分秘され、さらにLB培地に種々の炭素源を加えた場合、グリセロ-ルが好成績を与えた。次に、初発培地としてLB培地を用い、かつ培養初期にグリセロ-ルを流加し、溶菌を極力抑え、菌体濃度を20g/L程度まで高め、後半でLBとグリセロ-ルの3成分を種々の流量で供給するという2段階の自動流加法について詳細に調べた。自動流加の方策は、濁度センサ-で菌体濃度を連続的に測定し、これと培養液量とから総菌量を算出し、比グリセロ-ル供給速度qsf[g・(gDC)^<ー1>・h^<ー1>]を種々変える方式である。実験結果から、培養後半のグリセロ-ルの流加は、菌体外酵素活性を高めるのに有効であること、また流加量を多くすると菌体濃度は高くなるが酵素活性は高くならないこと、分秘率は85ー90%であること、などがわかった。培養後半のグリセロ-ルの流加の最適値はqsf=0.10であることがわかった。この条件での成績は、LB培地を用いた回分培養の成績と比較して、菌体外の最大酵素活性は約20倍まで上がり、生産性[Unit・L^<ー1>・h^<ー1>]は約5倍となった。2.分秘ベクタ-の改良(分担者:堀越弘毅)菌体外分秘ベクタ-の分秘発現の強化を目指して、ペニシリナ-ゼプロモ-タ-とtacプロモ-タ-を持つ分秘ベクタ-pEAP85を構築した。このベクタ-に好アルカリ性バチルス菌由来のサイクロデキストリン合成酵素(GTase)遺伝子を導入して、その分秘発現におよぼす影響を調べた。その結果、pEAP85ーCGTを持つ大腸菌においてCGTaseは高発現し、しかも大部分の活性は菌体外に分秘されることがわかった。1.分泌生産に及ぼす炭素源流加の影響(分担者山根恒夫)分泌ベクタ-保有大腸菌による好アルカリ性菌由来のペニシリナ-ゼの分泌生産に及ぼす培地組成および培養条件を調べた。グルコ-スと無機塩とからなる合成培地では、ほとんど分泌されないが、LB培地ではよく分泌され、さらにLB培地に種々の炭素源を加えた場合、グリセロ-ルが好成績を与えた。そして、しんとう培養による回分実験より、グリセロ-ル濃度が高いと分泌しにくくなり、それだけ菌体濃度が高くなるが、一方、グリセロ-ル濃度が低すぎると分泌しやすくなるが溶菌も起こることが分かった。そこで、5lの培養槽を用い、濁度センサ-で菌体濃度を連続的に測定し、これと培養液量とから菌体総量を算出し、比グリセロ-ル供給速度qsf〔g・(gDC)^<ー1

>・h^<ー1>〕を種々変える方式の自動流加法を実施した。培養は、まずLB培地の3倍濃度でqsf=0.22によって約20g/lまで菌体濃度を高めて、しかる後、qsf=0.050.20まで種々変えて分泌生産への影響を調べたところ、qsf=0.12の時、菌体外の酵素活性は培養開始後27時間後に700V/mlとなり、これは通常の回分培養の約7倍であった。この2段階培養法の後半期では、菌体濃度は20〔g/l〕から25〔g/l〕へと微増に抑えられた。また、培養前半期ではグリセロ-ルはほぼ0.2%に維持され、後半期では検出できないほど低い値(30ppm以下)であった。分泌率(総生産量のうち菌体外へと分泌された量の割合)は85ー90%であった。2.分泌ベクタ-の改良(分担者堀越弘毅)菌体外分泌ベクタ-に於ける異種遺伝子の発現強化を目指してペニシリナ-ゼ遺伝子のプロモ-タ-部位にtacプロモ-タ-の導入を行ない、更に人成長ホルモン遺伝子をこのベクタ-に導入してその分泌発現におよぼす影響を調べた。また、成熟型kilペプチドを化学合成した。(1)分秘ベクタ-保有大腸菌の流加培養(分担研究者:山根恒夫)昨年に引き続き、プラスミドpEAP82ー1に好アルカリ性Bacillus spのペリシリナ-ゼ遺伝子を組み込んだ場合について研究した。とくに、初発培地としてトリプトンと酵母エキスを用い、培養初期にグリセロ-ルを流加し、溶菌を極力抑え、菌体濃度を20g/l程度まで高め、後半でトリプトンと酵母エキスとグリセロ-ルの3成分を種々の流量で供給するという2段階の自動流加法について詳細に調べた。その結果、2段階流加培養の培養後半でのグリセロ-ルの流加は、菌体外の酵素活性を高める上で有効であること、また流加量を多くすると、菌体濃度は高くなるが、酵母活性は高くならないこと、分秘率は実験を行ったグリセロ-ル流加の範囲ではあまり差がないことがわかった。菌体当りの菌体外酵素活性から考えると、2段階流加培養の培養後半でグリセロ-ルの流加の最適な比基質供給速度、qsf[(gーsubstrate)・(gーdry cell weight)^<-1>・h^<-1>]は0.10であると考えられる。この条件での成績は、LB培地を用いた回分培養の成績と比較して、菌体外の最大酵素活性は約20倍まで上がり、生産性[Unit・L^<-1>・h^<-1>]は約5倍となった。(2)分秘ベクタ-の改造(分担者:堀越弘毅)菌体外分秘ベクタ-の分秘発現の強化を目指してペニシリナ-ゼプロモ-タ-とtacプロモ-タ-を持った分秘ベクタ-pEAP85を構築した。更に好アルカリ性バチルス38ー2由来のサイクロデキストリン合成酵素(CGTase)遺伝子をこの分秘ベクタ-pEAP85や大腸菌ー枯草菌のシャトルベクタ-に導入してその分秘発現におよぼす影響を調べた。その結果、pEAP85ーCGTを持つ大腸菌においてCGTaseは高発現し、しかも大部分の活性が菌体外に分秘されることがわかった。
呼吸器感染症の予防を目的とした粘膜ワクチンの開発

ブレビス菌-ベクター系により作製した無毒の組換えコレラ毒素Bサブユニット(rCTB)を粘膜アジュバントとして、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、B型肝炎ワクチンなどとともにマウスに経鼻接種すると、それぞれのワクチンに特異的な血清IgGおよび各粘膜部位でのIgA抗体が誘導され、得られた血清IgG抗体価は感染防御に十分な高い値を示す。これを基にして、本研究では以下の実験が行われた。(1)インフルエンザA型赤血球凝集素(HA)ワクチン[A/ニューカレドニア(NC)/20/99株由来]1μg+インフルエンザB型HAワクチン[B/ヨハネスバーグ(JB)/5/99株由来]1μg±rCTB10μgのマウスへの経鼻投与実験(0,14,21,28日目に計4回接種、35日目に解剖)A型HAワクチン、B型HAワクチンともに抗原特異的血清抗体価(IgG, IgA)、肺と鼻腔のIgA抗体価および血清の赤血球凝集阻止(HI)抗体価が有意に上昇した。(2)インフルエンザA型HAワクチン1μg±rCTB10μgによる経鼻免疫マウスへの感染実験遺伝学的にA/NC/20/99株に近いA/Aichi/88/02株をBALB/cマウスに経鼻投与、肺をすりつぶしてその遠心上清を次のマウスに経鼻投与、この操作を5代繰り返してマウス馴化ウイルスを得た。これをMDCK細胞により増やした。このウイルスの100%致死量をHA±rCTB経鼻免疫マウス(0.14,21,28日目に計4回接種)に最終免疫後14日目に経鼻感染させて、生死を14日間観察した。その結果、HA±rCTB免疫マウスは全て生き残ったのに対して、HA単独免疫マウスは感染後4日目までに半数近くが死亡、非免疫マウスは感染後6日目までに全てが死亡し、経鼻免疫におけるrCTBの重要性が示された。(1)肺炎球菌莢膜多糖体(PS)-rCTB化学結合ワクチン(PS-rCTB)のマウスへの経鼻投与PSとrCTBを化学的に結合させた後、ゲル濾過により精製した。PS-rCTB0.5または5μgをrCTB10μg存在下と非存在下で(1)と同様に経鼻免疫して、35日目に血清と肺洗浄液を採取、ELISA抗体価を測定した。PS特異的血清IgG、IgA、IgM抗体価はPS量とrCTBの有無に関係なく上昇し、肺洗浄液中の粘膜IgA抗体価はrCTB存在下でのみ有意に上昇した。PS-rCTB結合ワクチンの可能性が示唆された。

PS-rCTB結合ワクチンの可能性が示唆された。現在、大部分のワクチンは皮下または筋肉内注射により接種されているが、それを経鼻または経口接種に切り換えることが可能か否かについて、ブレビス菌-ベクター系を使って作製した無毒の組換えコレラ毒素Bサブユニット(rCTB)を粘膜アジュバントとして、一連の研究を行ってきた。その結果、rCTBは同時に経鼻投与した破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、B型肝炎ワクチンなどに対してアジュバント活性を示し、それぞれのワクチンに特異的な血清IgG及び各粘膜部位でのIgA抗体を誘導した。また、得られた血清IgG抗体価は感染防御に十分な高い値を示した。今回は、近年問題になっている高齢者や乳幼児のインフルエンザや肺炎球菌感染症の予防を目的として、インフルエンザA型及びB型赤血球凝集素(HA)ワクチンとrCTB、肺炎球菌莢膜多糖体ワクチン(PW)とrCTBをそれぞれマウスに経鼻投与し、抗原特異的血清抗体価(IgG, IgA)と各粘膜部位におけるIgA抗体価を調べた。(1)インフルエンザHAワクチンとrCTBの混合物の経鼻投与A型とB型、両者のHAに対する血清IgG及びIgA抗体は、ともにrCTBの有無に関わらず誘導され、rCTB存在下で高くなる傾向にあった。また、赤血球凝集阻止(HI)価もrCTB同時投与により有意に高くなると共に、個体差による変動が少なくなった。A型HAに特異的な粘膜IgA抗体価は鼻腔、肺、小腸、膣の各洗浄液と糞便で、B型HAに対しては鼻腔、肺、大腸、膣の各洗浄液で、それぞれrCTB存在下で高くなる傾向にあった。以上の結果から、rCTB同時投与により、血清HI抗体価が上昇して中和活性が高まること、鼻腔や肺の粘膜IgA抗体価が上昇して粘膜部位での感染防御ができる可能性が高いことが示された。従って、インフルエンザワクチンの経鼻接種においても、感染防御能を確実に賦与するためには、粘膜アジュバントが必要であると考えられた。(2)肺炎球菌莢多糖体ワクチン(PW)とrCTBの混合物の経鼻投与rCTBの有無に関わらず、血清中の抗PWIgM抗体価は初回免疫で最高値に達し、2回目以後の免疫でブースター効果は認められなかった。血清IgGおよびIgA抗体価はかなり低く、粘膜IgA抗体は全く検出されなかった。抗原が多糖体の場合、単にrCTBと混合して投与するだけではIgGやIgA抗体の誘導は難しく、両者を化学的に結合する必要があると考えられた。ブレビス菌-ベクター系を使って作製した無毒の組換えコレラ毒素Bサブユニット(rCTB)を粘膜アジュバントとして、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、B型肝炎ワクチンなどと共にマウスに経鼻接種すると、それぞれのワクチンに特異的な血清IgG及び各粘膜部位でのIgA抗体が誘導され、得られた血清IgG抗体価は感染防御に十分な高い値を示す。平成14年度の研究で、rCTBはインフルエンザA型およびB型赤血球凝集素(HA)ワクチンに対しても、マウスへの経鼻投与で抗原特異的血清抗体価(IgG, IgA)と肺や鼻腔のIgA抗体価を有意に上昇させ、血清の赤血球凝集阻止(HI)抗体価も有意に高くなることが示された。平成15年度はインフルエンザHAワクチンについては免疫マウスを使って感染実験を、肺炎球菌多糖体ワクチンについてはrCTBと化学的に結合してマウスへの経鼻投与実験を試みた。(1)インフルエンザHAワクチン1μg[A/ニューカレドニア(NC)/20/99由来]±rCTB10μg(HA±rCTB)による経鼻免疫マウスへの感染実験遺伝学的にA/NC/20/99株に近いA/Aichi/88/02株をBALB/cマウスに経鼻投与、肺をすりつぶしてその遠心上清を次のマウスに経鼻投与、この操作を5代繰り返してマウス馴化ウイルスを得た。これをMDCK細胞により増やした(馴5-A/Aichi MDCK1ウイルス)。
希土類錯体の配位構造とf電子の挙動のEPRによる研究

希土類元素の最大の特徴はf電子を持つことであり、このf電子が化学結合にどの様に寄与するかという問題が、希土類錯体の化学における主要なテーマであると言ってよい。本研究では、このf電子を直接的・積極的に観測できる磁気共鳴的な分光手段である電子常磁性共鳴法(EPR)を用い、希土類錯体の中心金属イオン回りの配位構造とf電子の挙動との関連について解明することを目標とした。特に、平面型の配位子を持つGd(III)錯体をもちい、ここで上下の軸方向に種々の配位子が付けることで、f電子に対する配位子場の効果を、平面方向と軸方向に分けて検討した。Gd(III)錯体を配位性の溶媒に溶かした場合や、種々のアニオン(CN^-,SCN^-,Br^-,I^-,NO^-_3)を大過剰添加したアセトニトリル溶液の場合の、凍結溶液のEPRのスペクトル線形に差異が見られた。これらのスペクトル線形の差異は、平面型配位子を持つGd(III)錯体の軸方向から溶媒分子配位し、この配位子場により4f電子のエネルギーレベルが影響を受けた事を意味している。希土類イオンはイオン半径がおおきいために、分子面の上下に合計2個以上の軸配位子が付く可能性もある。いずれにしても、軸配位子が付くことにより、4f軌道に影響を与えたものと考えられる。
原始紅藻のゲノム解析に基づく真核生物の成立と進化に関する研究

極限環境(45-55°C, pH 0-1.5)に棲息する原始紅藻シアニジウム類の1種、Cyanidioschyzon merolae(シゾン)のゲノムについて、塩基配列を100%完全解読した。真核生物としては世界で最初の例である。また、これまでに決定されていたミトコンドリアゲノム(Ohta et al, NAR 1998)、葉緑体ゲノム(Ohta et al. DNA Res. 2003)と併せて、1真核生物の3ゲノムを完全解読したことになる。ゲノムサイズは16,520,305塩基対で、染色体は20本であった(Matsuzaki et al. Nature 2004)。総遺伝子数は5,331個であり、これは従属栄養性の酵母、寄生性のマラリア原虫とほぼ同数で、タンパク質をコードする4,771個の遺伝子のうち1,620個の遺伝子は高等植物のものと共通であった。シゾンはこれまでに解析されている真核生物の中では最小セットの遺伝子を持ち、特にリボソームを構成するリボソーマルRNA遺伝子が3セットしか存在していなかった。更に、イントロンを持つ遺伝子が僅か26遺伝子しかなく、転写・翻訳の過程もあまり修飾を受けない単純な仕組みであることが明らかとなった。代謝系に関しても各パスウェイにアノテーションされる遺伝子(648個)が明らかされ、ゲノム解読の完了した真核生物の中では最少である。またシゾンのゲノム解析過程で50万クローンの完全長cDNAを得、その3万8千クローンについてEST解析したところ、約90%の遺伝子が発現していた。即ち真核生物として最も完全なEST情報が得られたことになる。これらの完全なゲノム情報を基に、多角的な手法で分子系統解析をおこなったところ、シゾンが植物、ひいては真核生物の基となる系統的立場にあることが明らかとなった(Nozaki et al. JME 2003)。特に、真核生物を特徴づけるミトコンドリアや葉緑体の起源、遺伝、分裂増殖に関する機構に関してもゲノム情報より新たな知見を得ることが出来、当初の目標以上の成果が挙げられたと考えている(Nishida et al. PNAS 2003, Miyagishima et al. Plant Cell 2003)。以上のゲノム情報は真核細胞の基本原理の解明に向けたポストゲノム研究への道を大きく拓いた。今後はこのゲノム情報を基盤に、シゾンを真核生物の細胞システムととらえ、トランスクリプトーム、プロテオーム、メタボロームそしてフェノーム解析といった「オミクス解析」へと展開する計画である。Cyanidioschyzon merolae(以下シゾンとする)は、細胞の直径が僅か2ミクロン、約14メガ塩基対のゲノムを有し、高温(45°C)、高硫黄、強酸性(pH1.5)の温泉に生息する単細胞の紅藻で、最古の真核植物と考えられる。

本研究の官的は、シゾンの細胞核のゲノム解析を行い、それを基盤にして真核植物の誕生、進化及び環境適応の機構の解明をすることである。研究目的の達成のために、まず全てに優先させて、シゾンの細胞核のゲノム解析を行った。この解析はゲノム解析とEST解析に分けて行った。ゲノム解析は国立遺伝学研究所の小原研究室の助力でショットガン法で行い、30万リードを読み終えた。これを基本に整列し約800のコンティグを得た。このコンティグを総計すると16.4Mbpであった。これは当初パルスフィールド電気泳動法で得た値より、2Mbpほど多かった。これを各染色体にアサイメントを行った。ノルスフィールドで得た染色体数は17本であったが、ゲノム解析の結果から20本と推定された。各染色体にアサインされたコンティグは平均90%を越えた。現在これをBAC, PCRなどによってブリッジングしている。既に3番染色体は2コンティグとなった。またEST解析は東大医科研の菅野研究室の協力により、完全長のcDNAの50万クローンを得た。この3万5千クローンを遺伝研で読んだ。その結果、約5500の遺伝子が発現していることが明らかとなった。遺伝子の総数や種類に関しては、BLASTをかけたり、EST解析のデータを参考にしたり、更に遺伝子解析予測ソフトなどを用いて解析し、約6000遺伝子があることが分かった。更に詳しいカタログ化を進めている。現在、こうしたデータと既に得られている葉緑伝ゲノムどミトコンドリアゲノムの全塩基配列データを比較し、それぞれの班員がオルガネラの増殖、転写機構の進化などについて解析を進めている。本研究プロジェクトは平成13年度から始まった。シゾンのミトコンドリアと葉緑体のゲノムの全塩基配列は既に決定されていた為、これに加えて細胞核ゲノムの全塩基配列が決定されれば、ミトコンドリアや葉緑体などオルガネラの分裂・増殖機構、オルガネラの起源と進化に関係した真核生物や真核植物の起源、更に極限環境への適応機構など、真核生物としての基本的な機構が解明できると考えられた。しかしながら核ゲノムの全塩基配列を解読するにあたり、シゾンには物理的・遺伝的マップがほとんどなかったことから、WGSG法で解読を進めることにした。WGSG法でのシークエンシングと、データのアセンブル作業は、当初ゲノムサイズが14Mbpと予想されたことから、30万リード(ゲノム8×に相当)を読み、そこから928コンティグが構築した。その結果、ゲノムの総延長は約16.4Mbpで、パルスフィールド電気泳動(PFGE)法の結果より、2.4Mbp多かった。各コンティグについての染色体のアサインメントは、主にPFGEで分けられた染色体へのサザンにより行った。その結果、PFGEのバンドには一部重複があることが判明し、染色体数は20本で従来の予想より3本多かった。コンティグの整列化、ギャップ埋めはインサートサイズ100kbpと50kbpのBACライブラリのエンドシーケンスを参照し、主にPCRによって進め、ほぼ埋まりつつある。また完全長cDNAの解析の結果、約5500の遺伝子について発現が確認された。アノテーションはBLAST, KEGG, COG, ESTなどの情報に基づいて行い、約6000の遺伝子を推定した。
パフォーマンス向上および障害予防の観点からみた腱組織の可塑性に関する研究

ヒト生体の腱組織における加齢現象やトレーニングによる変化のメカニズムを「力学的因子」と「代謝的因子」との関わりから明らかにすることを目的とした。腱組織の伸展性は加齢とともに低下し、それは筋よりも早期に生じることが明らかになった。さらに、トレーニング様式により腱の力学的および代謝的因子に及ぼす影響が異なり、特に等尺性トレーニングでは腱血液量の増加を伴うことなく、腱ステイッフネスを著しく増加させた。本研究では、ウエイトトレーニング(WT)とPTが、筋腱の力学的特性、神経筋活動特性および跳躍能に及ぼす影響を比較検討し、PTにおける跳躍能増加の機序を探ることを目的とした。10名の成人男性が、足底屈トレーニングを12週間実施した。各被検者の左右脚について、WT(80%1RM)とPT(40%1RM)にランダムに振り分け、WTは10回×5セット、PTはホッピングおよびドロップジャンプを各々10回×5セットとした。その前後で、最大筋力、筋体積(MR法より)、アキレス腱ステイッフネス(超音波法より)、3種の跳躍高(SJ、CMJ、DJ)を測定した。最大筋力と筋体積の増加率については、WTとPTでほぼ同程度であった。アキレス腱ステイッフネスは、WTで有意な増加を示したがPTでは変化がみられなかった。3種の跳躍高は、WTではSJのみ有意な増加がみられたが、PTでは3種ともに有意な増加が認められた。跳躍中の底屈相における筋活動水準(筋電図積分値)は、WTではSJのみ有意な増加がみられたが、PTではすべての跳躍で有意な増加が認められた。以上の結果より、ウエイトトレーニングによる反動を伴う跳躍(CMJ、DJ)で有意な跳躍高の増加がみられなかった原因としては、ポジティブな効果(筋力および活動水準の増加)とネガティブな効果(腱ステイッフネスの増加により反動効果減少)の両者が相殺しあって、その結果としてCMJとDJの跳躍高に変化がみられなかったことが推察された。一方、プライオメトリックトレーニングによる跳躍能の増加は、腱ステイッフネスを増加させないで筋機能を改善する事に起因している可能性が示唆された。(研究1)3ケ月間の筋力トレーニングおよびデイトレーニングにおける腱組織の力学的および代謝的特性の変化被検者10名を対象にして3ケ月間の筋力トレーニング(膝伸展運動)および3ケ月間のデイトレーニングを実施した。3ケ月のトレーニング後に、最大筋力、筋の活動水準、筋体積、腱ステイッフネスはいずれも有意な増加を示した。しかし、3ケ月のデイトレーニング後では、筋体積、腱ステイッフネスはトレーニング前まで戻っていたが、最大筋力および筋の活動水準はトレーニング前まで戻っておらず効果が残存していた。以上の結果、トレーニングおよびデイトレーニングに伴い筋および腱の形態および特性が必ずしも一様に変化しないことが明らかになった(発表論文準備中)。(研究2)女性の月経周期に伴う筋および腱の力学的特性の変化女性の月経周期(月経期、排卵期、黄体期)に伴う筋機能(最大筋力、活動水準、Twitch特性など)および腱特性を調査した。その結果、いずれのパラメータともに有意な変動がみられなかった(論文投稿中)。(研究3)ヒト腱の血液量、酸素飽和度および酸素消費量の測定法の確立レーザー組織血液酸素モニタを用い、等尺性収縮中の腱の血液量および酸素飽和度を測定した。発揮張力が高くなるにつれて収縮中の血液量の低下の程度が大きい傾向が認められた。さらに、筋収縮を繰り返した後では、腱の血液量および酸素飽和度ともに安静時よりも有意に高い値が維持され、腱の修復に関連していることが示唆された(Kuboら2008 Acta Physiol)。さらに、近位部を300mmHgで加圧中の酸素飽和度の低下率から腱の酸素消費量を算出すると、筋のおよそ半分であり、運動後の増加率も小さく、かつ終了10分後には安静時に回復していた(論文投稿中)。(研究1)等尺性トレーニングと等張性トレーニングが腱のステイッフネスおよび血液量に及ぼす影響被検者10名を対象にして、3ヶ月間の等尺性および等張性膝伸展トレーニングを実施した。最大筋力および筋体積の増加率には、両トレーニング様式による差は認められなかった。腱ステイッフネスは、等尺性トレーニングで有意に増加したのに対し、等張性トレーニングでは変化がみられなかった。逆に、腱血液量は等尺性トレーニングで変化がみられなかったのに対し、等張性トレーニングではトレーニング後に有意に増加した。以上の結果より、トレーニングに伴う腱血液量の増加が十分になされないと、腱内において過剰なコラーゲン生成が生じ、その結果として腱ステイッフネスが著しく増加することが示唆された(Kubo, et.al. 2009 J Appl Physiol)。(研究2)温熱刺激と鍼刺激が腱の血液循環に及ぼす影響ホットパックによる10分間の温熱刺激とアキレス腱部に対する10分間の鍼刺激、およびその後30分間の回復過程におけるアキレス腱の血液量および酸素飽和度の変化を測定した。

両刺激ともに刺激中は腱の血液量が有意に増加したが、回復過程においては温熱刺激は腱血液量が減少するのに対し鍼刺激では増加する傾向を示した。また、両刺激ともに回復過程における腱の酸素飽和度は安静時よりも有意に高かった。以上の結果より、両刺激によって腱内の血液量や酸素濃度が高まることが明らかになり、これらの現象が腱障害の治療に貢献している可能性が示唆された(論文投稿中)。
ニッコウガイ上科の生態多様性の進化に関する研究

本年度では前年度に引き続きニッコウガイ上科の生態多様性の進化に関する研究のため1.分子系統解析による系統関係の解明、2.安定同位体比解析よる食性解明3.化石種の形態解析による白亜紀における同グループの生態推定の3つの側面から随時研究を進め、ある程度の結果が得られた。分子系統解析では28SrRNA, 18SrRNA, 16SrRNAの3領域を網羅的に解析できた。これによってほぼ分子系統樹は完成し、今後はそれらをまとめ投稿論文、および学位論文として発表予定である。これらの結果これまでわかっていたニッコウガイ上科の5グループはより強く支持されたがグループ間の系統関係には不明な点が残った。これらは次世代シーケンサーを使った大量解析などの新手法を使わなければ系統関係を解き明かすのは難しいと考えられる。安定同位体比解析ではさらに解析する地点数を増やし5種のニッコウガイ上科の食性を同定できた。一部では近縁種間にもかかわらず食性が異なっている例が発見され、食性の変化が進化において頻繁に起こっていることが示された。さらにこれまで堆積物食者が確認されていなかったグループ(シオサザナミガイ科)でも堆積物食者がいることが確認された。一方でシオサザナミガイ科の堆積物食者は他のグループより堆積物食の依存度が低く、懸濁物食者と堆積物食者の中間型であることが分かった。このことからニッコウガイ上科の堆積物食性は段階的に進化してきたことが示唆された。化石種の形態解析ではパリ自然史博物館とロンドン自然史博物館において追加の標本を解析し、ニッコウガイ上科がアルビアンを境に堆積物食性に有利な形態を獲得していたことが示唆された。研究のデータ自体はとり終えたが解析や整理がまだ終わっていない部分があり、また学位取得もまだ出来ていないため。研究のデータをまとめ学位論文および投稿論文を発表したい。分子系統解析では新たに10種のサンプルを入手し、合計で80種程度を含んだ分子系統樹を完成させられるとかんがえられる。追加で入手したサンプルについては順次解析を進めており、またこれまで入手していた種についても今まで解析した28SrRNAおよび16SrRNA領域の他に18SrRNAおよびH3の領域について追加で解析を行った。H3では30種程度の解析を終了したが、系統関係を推定するのには適していない領域であることがわかり、今後の解析でこの領域を使用しないことを決定した。また18SrRNA領域では全体80種の中の70%にあたる56種の解析を終了している。安定同位体比解析では(1)福岡県津屋崎沖(2)沖縄県瀬底島周辺(3)佐賀県伊万里市波瀬、(4)沖縄県石垣市名蔵の4地点において、計20種のニッコウガイ上科(これまで分子系統解析で使用した種と同じものを含む)を採集し、その食性を特定することができた。化石種の生息姿勢の推定ではこれまで50種の生息姿勢と殻の形態の関係性を定量的に示しており、十分なデータを得ることができた。さらに化石種についてスミソニアン博物館やフィラデルフィア科学アカデミーに所蔵されている白亜紀ニッコウガイ上科の標本の検討を行った。これらにより、形態測定に必要な写真やレプリカを入手しており、今後計測をすすめる予定である。研究は概ね予定通り終了したが、現在まだ分子系統解析を完全に終えておらず、化石種の形態解析も終わっていないためやや遅れているの評価を下した。

研究のデータ自体はとり終えたが解析や整理がまだ終わっていない部分があり、また学位取得もまだ出来ていないため。データ整理・解析、実験、フィールドワークをバランスよくこなして研究を進めていきたい。研究のデータをまとめ学位論文および投稿論文を発表したい。