hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
楽譜情報に基づく記号論的音楽情報検索のための基盤技術開発

音楽情報検索のためのクラスタ抽出手法の開発を目的として,形式概念に基づくクラスタ抽出手法の拡張,および,グラフの高速クリーク探索手法の拡張を様々な角度から試みた.主な成果として,チャンスパターン(概念)の抽出,長大内包パターンの高速抽出,クラスタ構造の変化検出,真極大k-plexの高速抽出,真極大k-plexの繰返し探索による最大k-plexの高速抽出が可能なアルゴリズムを得た.今年度の主な成果は次の通りである.楽曲データベースの整備:1,000,000の楽曲から成るMillion SongDatasetのデータ整形・加工処理を行い,本研究で開発したシステムで利用できる形式に整備した.具体的には,オリジナルデータとして公開されているクロマベクトル(実数ベクトル)列から,強成分のみを抽出したバイナリベクトル列へ変換することで離散化を行った.これをコード進行の代替物と捉えることで,楽曲の(ある種の)構造が明らかとなる.音楽に特化したSNSにより提供された楽曲タグ情報も一部取り込んだことから,複合的視点からの楽曲間類似性も扱える様になった.楽曲タグ情報に基づくクラスタ抽出の予備実験:Million SongDatasetの一部(10,000曲)にデータに対して付与された楽曲タグ情報のみを用いたクラスタ抽出実験を予備的に行った結果,タグ情報は高品質クラスタの抽出において極めて有効な制約として機能することが観察され,今後の研究における有用な知見を得ることができた.クラスタ探索過程にこうした制約を組み込むことで,計算処理の高速化も実現できるものと考えている.クラスタ構造の変化検出手法の開発:様々な視点からのクラスタ構造の変化を検出するための基盤アルゴリズムの設計を行った.対象間の関係がグラフ構造で表現された場合,そこでのクラスタとは,密な部分グラフを構成する頂点集合を意味する.ここでは,所与のふたつのグラフにおける構造変化検出を,一方では擬似的な独立集合,他方では擬似的なクリークを形成する頂点集合の抽出処理と捉え,制約付き極大k-plex探索問題としてこれを定式化し,その高速アルゴリズムを与えた.これにより,例えば,ジャンルAの楽曲ではよく用いられるが,その他のジャンルではほとんど用いられないコード進行パターンの抽出が可能となる.本課題では,クラスタ抽出の枠組みを基礎とする記号論的音楽情報検索のための基盤技術開発を試みる.今年度はクリークの緩和モデルk-plexを抽出対象とするふたつのアルゴリズム開発を行なった.真極大k-plexの高速抽出:従来のk-plex抽出法は,緩和の度合いを制御するパラメータkが大きくなると,解を得ることが事実上不可能となる.その主要因は,緩和モデルとして不適当な膨大なk-plexの存在にある.ここでは真k-plexの概念を新たに導入し,抽出対象をサイズ下限制約を満たす真k-plexに限定することで,連結性と50%の密度を保証する妥当なk-plexのみを高速に抽出する.探索過程では,頂点間の上限距離に基づく分枝の抑制,および,真k-plex性に基づく枝刈りが可能であり,結果として既存手法では解を得ることができなかったkに対しても高速に動作する.真極大k-plexの繰返し探索による最大k-plexの高速抽出:真極大k-plex抽出法をもとに,最大k-plex抽出問題においても,より大きなkに対応できる手法を開発した.具体的には,緩和パラメータkを段階的に強化しながら真極大k-plex探索を繰返すことで,最大k-plexを高速に抽出するアルゴリズムを与えた.繰返しの各段階においては,既に得られている暫定最大k-plexのサイズを用いた探索の分枝限定が可能であるが,初期の段階で大きなサイズのk-plexが見つかる傾向にあることから,繰返しが進むにつれて分枝限定効果はより強力となる.ベンチマークグラフによる実験では,既存の最速アルゴリズムと比較して100倍から1000倍の高速化を観察した.音楽情報検索のためのクラスタ抽出手法の開発を目的として,形式概念に基づくクラスタ抽出手法の拡張,および,グラフの高速クリーク探索手法の拡張を様々な角度から試みた.主な成果として,チャンスパターン(概念)の抽出,長大内包パターンの高速抽出,クラスタ構造の変化検出,真極大k-plexの高速抽出,真極大k-plexの繰返し探索による最大k-plexの高速抽出が可能なアルゴリズムを得た.本研究課題では,申請者がこれまで携わってきたデータマイニングにおける重要なタスクのひとつであるクラスタ抽出,特に,形式概念に基づくクラスタ抽出の枠組みを基礎とする多視点音楽情報検索のための基盤技術開発を試みる.特にここでは,楽曲の音を信号処理ベースで扱うのではなく,楽譜情報に代表される離散的データとして捉え,純粋な記号論的アプローチにより検索結果を得る枠組みの実現を目指している.今年度の主な成果は次の通りである.チャンスパターン(概念)の抽出アルゴリズム設計:意味的に離れた概念間にまたがるレアな概念をチャンスパターンと呼び,その高速抽出アルゴリズムの設計を行った.特にここでは,文書から重要な(レアな)キーワードを抽出する枠組みであるKeyGraph(R)におけるアイデアをもとに,"頻出パターンと共起するレアパターンは重要である"との考えを反映した制約を満たすパターンのみを高速に抽出する基本アルゴリズムを与えた.これにより,異なる視点にまたがるチャンスパターンの抽出が原理的に可能となり,多視点検索へ向けての重要な足掛かりになるものと期待している.長大内包パターンの高速抽出アルゴリズム設計:伝統的な頻出パターンマイニングシステムでは抽出が困難な,長大パターン(概念内包)の抽出アルゴリズムの設計を行った.

具体的には,固定長の頻出パターン群の情報を保持するパターングラフをもとに,アイテム間の共起グラフを動的に更新しながら,長さが上位Nである長大パターンを高速に列挙するアルゴリズムを設計・実装し,ベンチマークデータに対してその有効性を確認した.これにより,様々な属性(特徴)を同時に有するパターンの抽出が可能となり,多視点検索における重要な基盤になるものと期待している.楽曲データベースの整備がほぼ整い,最終年度における本格実験の目処が立った.また,高品質のクラスタ抽出におけるタグ情報の有用性が確認できたことから,タグ情報を制約としてクラスタ抽出過程に取り込むことで,これまでに提案したアルゴリズムを,品質および効率の面で更に改良できる可能性があることがわかった.さらに,新たな基盤アルゴリズムの設計・実装も行い,その大まかな挙動を把握することで,多視点情報検索においても有用であろうとの見通しも得られた.これらにより,次年度の具体的課題も明らかととなり,当該研究研究は大きく停滞することなく着々と進んでいると考えている.多視点情報検索に向けてのふたつの基盤アルゴリズムの設計・実装を行い,予備実験を通してそれらの大まかな挙動を把握し,改良点等の洗い出しができた.次年度における具体的な考察課題が明確となり,以降の本格実験に向けての準備が着々と進んでいると考える.これより,当該研究は概ね予定通りに進行していると判断する.最終年度の最重点課題は,大規模音楽データにおける,これまでに提案したアルゴリズムの有用性評価である.一部のデータを用いた予備実験では部分的に行っているが,データが大規模になった場合の品質・計算効率を評価する必要がある.品質については,被験者による経験的な評価が主になるだろう.また,計算効率については特にユーザとのインタラクティブなやり取りに耐えうるかを重点的に観察・評価したいと考えている.それらの結果を踏まえ,必要に応じて問題設定やアルゴリズムの改良・修正を試み,提案アルゴリズムの利点・欠点を整理し研究をまとめる.当該研究の総括を通して,以降の研究展開につながる有用な知見が得られることを期待する.次年度は主に,今年度に設計した基盤アルゴリズムの改良を行う.具体的には,チャンスパターン抽出については,現状のユークリッド距離に基づく単純な概念間距離を洗練化することで,抽出ターゲットとなるパターンをより意味的に明確なものとすることを試みる.また,長大パターン抽出においては,パターングラフ生成の際に行う固定長頻出パターン群抽出の高速化が最重要課題であると考えている.現状は固定長3 - 4程度が実質の上限となっているが,これをさらに増大させることができれば,アルゴリズム効率がさらに格段に向上することが見込まれる.これらと並行して,音楽情報検索の分野で2011年2月に公開されたMillion Song Datasetを用いた本格実験に備えたデータ整備を進める.最終年度は,より規模の大きなデータに対して実験を行うため,主記憶を拡充した50万円程度の計算サーバの導入を検討する.
個別化治療を見据えた唾液腺癌の分子病理学的解析：大規模多施設共同研究

代表的な唾液腺腫瘍のひとつである腺様嚢胞癌に関して、EGFR経路の遺伝子異常を検索したところ、これらの異常がこれまで考えられていたよりもより高頻度に認められ、また患者の不良予後と関連することを明らかにした(Oncotarget、2018年)。唾液腺腫瘍hは比較的稀であり、研究を進める上で多数症例の収集が重要である。本研究のために構築した多施設共同研究グループから約200例の症例を蒐集し、病理中央診断を行った(2018年9月)。これらの多数症例を用いて、現在さらに解析を続けている。もう一つの代表的な唾液腺腫瘍である粘表皮癌に関して、CRTC1/3-MAML2融合遺伝子の意義を検討したところ、低い臨床病期症例に関して、融合遺伝子陽性症例では術後放射線治療を行わなくとも良好な予後を示すことを明らかにした(Head and Nec、2018年)。同様なことが、高い臨床病期症例においても当てはまるか検討するため、構築した多施設共同研究グループから約100例の症例を蒐集した。今後、病理中央診断を行い、分子病理解析を行い、データを出す予定である。また唾液腺腫瘍に関する日本語総説を依頼され執筆(病理と臨床)するとともに、シンポジウムでの発表を依頼され、講演を行った(日本臨床細胞学会およびTaiwan Joint Cancer Conference)。唾液腺腫瘍の代表的な腫瘍である腺様嚢胞癌に関して、研究論文を発表した(2018年)。また多施設共同研究施設から約200例の症例を蒐集した。もう一つの代表的な腫瘍である粘表皮癌に関しても、研究論文を発表した(2018年)。唾液腺腫瘍の代表的な腫瘍である腺様嚢胞癌および粘表皮癌に関して、多施設共同研究施設を通じてそれぞれ200例の症例を蒐集が可能であった。これらの症例を用いて、分子病理学的な解析をさらに進める予定である。
マラリア原虫スポロゾイトの肝臓細胞への感染機構

マラリア原虫のオオシスト及び唾液腺から調整したスポロゾイトのEST解析を行い、熱帯熱マラリアゲノムにホモローグのあるもので、構造的に接着性ドメインを持つとか細胞侵入に関わる既知分子との相同性を持つ分子とか検索分類整理し、14個のcDNAクローンを選定し、解析した。すでに機能が同定できているSPECT(sporozoiteprotein essential for cell traverse)について報告する。SPECTの抗体を作製し、Western Blotを行ってSPECTを検出したところ、中腸オオシスト内のスポロゾイトでの発現はなく、唾液腺に入った後のスポロゾイトではじめて発現することが判った。同じ抗体を用いて、免疫電顕を行って細胞内での分布を検討した結果、SPECTはミクロネームという分泌オルガネラに局在することが判明した。SPEC遺伝子をノックアウトした原虫を作製し、その表現形について様々な角度から検討した。KO原虫はマウス体内でのメロゾイトの発育に関しては全く影響しなかった。またハマダラカの吸血によって蚊の体内に入ってからの発育等についても野生株原虫と同等であった。KO原虫を感染した蚊の唾液腺からスポロゾイトを回収し、ネズミへの注射によって感染させたところ、感染効率が野生株原虫に比べて、約10分の1に落ちていた。このKO原虫スポロゾイトを用いin vitro系で培養肝細胞(HepG2)に感染させたところ、感染性に差はなかった。また、HeLa細胞への侵入・通過を調べたがこれも野生株と同等であった。以上のことから、SPECTは唾液腺に入ったスポロゾイトで特異的に発現し、肝臓への感染に重大な機能を持つ分子であることが判った。
アダプタータンパク質が担う，乳がん細胞における転写因子STATの活性化基盤の解明

Brk (Breast tumor kinase)は細胞内に存在する非受容体型チロシンキナーゼであるが,多くの乳がん細胞や卵巣がん細胞に発現が見られる。ヒト乳がん培養細胞において、STAP-2とBrkの存在によりSTAT3およびSTAT5が活性化され,細胞増殖が誘導される。そこで,この分子メカニズムを明らかにするため,それぞれのタンパク質を高純度調製し,生化学的・構造生物学的な手法により評価した.Brkによる自身のリン酸化部位特定やSTAP-2, Brk間の相互作用解析,溶液構造解析をおこない,調節メカニズムに対する考察をおこなった。多くの腫瘍組織やがん細胞株において,増殖の原因となる因子は複数考えられるが,JAK-STATシグナル伝達経路に属するSTAT3およびSTAT5の顕著な活性化が認められている.細胞生物学実験の結果を踏まえ,乳がん細胞株におけるSTAT3/5分子の活性化はアダプター分子STAP2とキナーゼBrkの協調作用による寄与が大きいと考えられるため,本申請研究では原子レベルでの活性化メカニズムの解明を行う.転写因子STATファミリーの存在が発見され,Janus kinase (JAK)-signal transducerand activator of transcription (STAT)シグナル伝達経路の概要が明らかにされたのは約30年前である.JAK-STATシグナル伝達系はレセプターに会合するJanus kinaseと,その主要な基質である転写因子STATにより構成される.STATはJAKによりリン酸化・活性化され,SH2ドメインを使用してホモ二量体を形成すると核に移行し,標的遺伝子の転写を活性化する.JAK-STAT系は発生,細胞運動,増殖・分化,がん化や免疫系に深く関わっており,自己免疫疾患など免疫系を調節するターゲット分子としても近年注目されている.活性状態のBrk, STAP2,およびSTATを調製することに成功していたが,さらに精製度を上げるためのコンストラクト改善を行い,Hisタグ融合タンパク質を大腸菌・昆虫細胞を用いて調製した.BrkによりSTAP2がリン酸化されることやBrkとSTAP2の結合を検出するBiacoreのアッセイ系も構築している.また,それぞれ単独,複合体の結晶化を試みており,小角散乱実験の結果と合わせ,パラメータを最適化中である.JAK-STATシグナル伝達経路に属するSTAT3およびSTAT5の顕著な活性化と,細胞異常増殖との相関が認められている.細胞生物学実験の結果を踏まえ,乳がん細胞株におけるSTAT3/5分子の活性化はアダプター分子STAP2とキナーゼBrkの協調作用による寄与が大きいと考え,STAP2が担う具体的な分子メカニズムを明らかにする.JAK-STATシグナル伝達系はレセプターに会合するJanus kinaseと,その主要な基質である転写因子STATにより構成される.活性状態のBrk, STAP2,およびSTAT3を調製することには前年度までに成功していた.今回はさらにSTAT1やSTAT2に対するBrkのリン酸化活性測定をおこない,Brkの基質選択性に関することや,選択性に対するSTAP2の関与を調べた.また,これまでBrkおよびSTAP-2のX線小角散乱(SAXS)はバッチ法によりおこなっており,単量体と二量体が存在するため完全に単分散のサンプル測定をおこなうことができず,ギニエ解析やP(r)関数からは慣性半径の値が大きく出てしまっていた.そこで,ゲル濾過クロマトグラフィ(SEC)装置を多角度散乱解析(MALS)やSAXSに直接接続し,単分散で測定可能な条件を検討した結果,慣性半径は26オングストローム程度であることがわかり,分子量から見積もった球状蛋白質の大きさに対応した.すなわち,閉構造の単分散ピークの測定に成功した.さらなる精度を上げ,またSTAP-2との複合体測定条件パラメータを最適化している.用量依存的にSTAP-2がBrkを活性化することが示せた.この活性化において,Brk自身のリン酸化は直接は関与していないことや,基質特異性にSTAP-2は関与しないことなどが新たに判明した.加えて,小角散乱解析の最適測定条件を決定することができたため,最終目的である,「複合体構造解析によりSTAT2とBrkが結合することがSTATリン酸化能の亢進に大きく関与することを説明する」に向けて着実に性状解析が進んだように思う.結晶の作製には至っていないが,複合体を安定化する変異体の作製などに向けて,目処がついてきたため概ね順調に進んできたと言って良い.調製した野生型Brkを用い,自己リン酸化反応を検出した。ATPおよびMg(II)イオンの存在下でのみBrkがチロシンリン酸化されることを確認した。また,基質としてSTATを与えると,STATのリン酸化が検出できた。変異体においては,自身のリン酸化能が上昇するものおよび,低下するものが見られた。基質として使用したSTATに対してするリン酸化能にも相関が見られた。STAP-2の非存在下および存在下において,Brkの自己リン酸化およびSTAT1のリン酸化を検出したところ,STAP-2が存在することでリン酸化が亢進する。BrkとSTAP-2間の相互作用解析を行ったところ,非常に強い相互作用をもつことがわかった。この値はpY-Brkとu-STAP2のKD値との一致が見られ, Brkのリン酸化は非リン酸化STAP-2との結合に影響しないことがわかった。非リン酸化Brkおよびリン酸化Brkに関し,Photon FactoryのBL10Cを用いてSEC-MALSおよびSEC-SAXS測定をおこない, ab initioモデル構築した。予想に反し,野生型Brkはリン酸化型・非リン酸化型ともに慣性半径26オングストローム;

程度のコンパクトな構造をとっており,構築されたモデルもよく似ていた。Brk (Breast tumor kinase)は細胞内に存在する非受容体型チロシンキナーゼであるが,多くの乳がん細胞や卵巣がん細胞に発現が見られる。ヒト乳がん培養細胞において、STAP-2とBrkの存在によりSTAT3およびSTAT5が活性化され,細胞増殖が誘導される。そこで,この分子メカニズムを明らかにするため,それぞれのタンパク質を高純度調製し,生化学的・構造生物学的な手法により評価した.Brkによる自身のリン酸化部位特定やSTAP-2, Brk間の相互作用解析,溶液構造解析をおこない,調節メカニズムに対する考察をおこなった。研究期間内での最終目的は,複合体結晶構造解析によりSTAT2とBrkが結合することがSTATリン酸化能の亢進に大きく関与することを説明することにある.これまで,それぞれの蛋白質を昆虫細胞や大腸菌を使用して調製してきた.精製度や修飾に相違があることが認められ,これが活性にどのように影響するか,また,溶液中での構造変化をするために小角散乱実験を適用している.蛋白質の性質としては,ある程度安定であるものの,長期間の保存はできず,大量に調製することもまだまだ必要である.しかし,結晶化をトライすることに耐えうる標品は得られており,スクリーニングや予備回折実験等を始めている.コンストラクトを工夫することで,様々な生化学実験・生物物理学実験も可能になってきており,多くの予備データが蓄積されてきたことは,概ね順調に進んできたと言って良い.STAP-2によるBrk活性化の分子メカニズムの実体は,これまでのデータを検討すると何らかの方法でBrkオープンフォームが持続される.これまでの相互作用研究から,両者の結合は解離速度定数が大きな成分が見られる.STAP-2はBrkの基質になることにより,生成物リン酸化チロシンがBrkのSH2ドメインと結合することも寄与しているのかもしれない.STAP-2の中でリン酸化を受けるチロシンは,22, 250, 310, 322が発見されており,実際にどのリン酸化がBrkオープンフォームの維持に関わるか,変異実験により究明している段階である.
腎細胞癌における低酸素応答と腫瘍の進展の機序

腎癌細胞株ではHIF-1αの発現が欠失していることが判明した。このことは他の癌では観察されることが稀な腎癌を特徴づける所見と考えられた。機序としては、プロモーター領域のメチル化による機序は否定的であり、明確な機序は不明である。たとえHIF-1αを欠損してもHIF-2αによりVEGFの発現を維持しようとする腎癌におけるVEGFの重要性が明確になった。9種類の腎癌細胞株を使用し、VHL遺伝子変異をダイレクトシークエンス法で検索した。4種でVHL遺伝子変異あるいはメチル化によると考えられる発現の消失が見られた。HIF-1αとHIF-2αの発現はRT-PCRおよびウエスタンブロット法で検索したところ、これら4種の株では野生型のHIF-1αの発現が消失していた。さらに野生型のVHLをもつ株でも1例においてHIF-1αの発現が消失していた。HIF-1αの発現の消失がプロモーター領域のメチル化に起因するものと考え、bisulfate処理したDNAのシークエンスにより評価したが、メチル化のパターンに大きな差を認めなかった。これら野生型のHIF-1αを有さない5種の株ではsiRNAによるHIF-2αの発現のノックダウンによりVEGFの産生が低下した。HIF-1αとHIF-2αの両者を発現する4種の株ではHIF-1αの発現のノックダウンによりVEGFの産生が低下した。HIF-1αを分子標的とすることによりVEGFの産生を低下させることができるものと考えられる。しかし、腎細胞癌では高率にHIF-1αの発現が欠失しているため、その場合はHIF-2αが分子標的になりうると考えられた。Hypoxia induciblefactor(HIF)は低酸素状態で活性化される転写因子であり、vascular endothelial growthfactor(VEGF)の産生を誘導する。腎細胞癌における特徴的な血管増生の主要なメカニズムを担うものと考えられる。腎癌細胞株におけるHIF-αのサブタイプの発現とVHL遺伝子の変異との関連およびVEGFの発現との相関について検索した。腎癌細胞株である786-O, A-498, SW-839, 769-Pの4種でVHL遺伝子変異あるいはメチル化によると考えられる発現の消失が見られた。RT-PCR法によりmRNAの発現を検討したところ、HIF-2αの発現はすべての株で検出されたが、HIF-1αのmRNAは769-PとKU20-01ですべての領域で欠損し、786-Oはtruncated formが検出された。蛋白レベルでの発現をウエスタンブロット法で検索したところ、上記3つの細胞株に加えてA-498とSW-839も蛋白発現が認められなかった。ノザンブロット法でさらに検索したところ、この2種ではmRNAを検出できず、mRNAの発現レベルが低いため蛋白レベルで発現を認められなかったものと考えられた。786-Oはノザンブロット法でもtruncated formが検出された。全体として、mRNAの発現レベルと蛋白の発現レベルは相関した。HIF-2αの発現も同様にノザンブロットおよびウエスタンブロット法で検索したところ、769-P以外のすべての株での発現を認めた。A-498とSW-839におけるHIF-1α蛋白の低発現、769-PにおけるHIF-2α蛋白の低発現はmRNAの低発現に起因するものと考えられた。HIF-1αの発現が消失していた株ではHIF-2αにより高いVEGFの発現を維持していたが、HIF-2αの発現も低い769-PではVEGFの発現は低いままであった。
KLF5ヘテロノックアウトマウスを用いた腸管障害モデルの病理学的分子生物学的解析

KLF5ヘテロノックアウト(KO)マウスにおいて1)上腸間膜動脈結紮による虚血再潅流障害による腸炎モデル3)水浸拘束マウスにおける胃潰瘍形成モデルを対照マウスと比較検討した。これまでのところいずれのモデルにおいてもヘテロノックアウト(KO)マウスにおいて特に障害が弱いという傾向は見られていない。KLF5 KOマウスにおいては、DSS腸炎で逆に腸管傷害の所見が強く出てしまう傾向が観察された。これは元々の腸管の構造の異常(上皮細胞、間質細胞とも細胞数が少なく、絨毛の構造が脆弱)のためなのか、急性炎症については、KOの方で逆に強く出てしまった。腹腔マクロファージを採取して、LPS投与したときのマクロファージの応答を見たところ、TNFaの産生などはむしろKOで高く出てしまうなどの反応の異常が見られ、またマクロファージの遊走能にも異常がみられた。上腸間膜動脈結紮による虚血再潅流障害による腸炎モデルと水浸拘束マウスにおける胃潰瘍形成モデルにおいては当初KLF5 KOマウスにおいて障害が病理所見上軽い傾向が見られたがその後の実験では大きな差はみられないようであった。一概に現在の所、KLF5KOマウスで炎症が強いのか、弱いのか言えなくなっている状況で、急性炎症か慢性炎症か、モデルによって反応はずいぶん異なるようである。また肝臓のデータとしては、高脂肪食負荷をしたときに、KOマウスでは脂肪肝になりにくい事が判明してきており、KLF5の阻害剤にApoE KOマウスやOb/Obマウスの脂肪肝を改善する効果が観察され現在検討中である。我々はIKLFノックアウトのヘテロマウスを用いて小腸上皮の病理学的解析を共同研究にて行ってきたが、腸管上皮の形態形成のみならず支持組織の形成もワイルドマウスと比べ障害があることが判明してきた。BTEB2/IKLF(KLF5)はラットやウサギにおけるバルーン障害モデルにおいて、新生内膜の平滑筋細胞に再発現し、平滑筋細胞の形質転換やプラークの破綻、血栓形成に関与する転写因子として機能することが推察されているが、東京大学循環器内科永井教授の下に作成されたKLF5ノックアウトマウスはホモでは胎児期致死性を示し、ヘテロ(KLF^<+/->)においては外部組織に対して起きる血管のリモデリングが低下し、動脈壁の肥厚、血管新生、繊維組織の増大、細胞増殖のすべてが抑制されていた。現在我々はこのマウスモデルを用いて、小腸上皮の細胞増殖、分化がKLF5を介してどのように行われているか、BTEB2/LKF5ノックアウトヘテロマウスの腸管障害モデルを作成し、ワイルドマウスの障害モデルと比較し病理学的、分子生物学的解析を行っている。これまで1)DSS腸炎モデルの作成、2)水浸拘束マウスを用いた胃潰瘍惹起モデルの作成を行い、それらの解析を行ってきた、これまでの所、上記2モデルにおいては、病理所見上ワイルドのマウスと比べ傷害の程度が軽い傾向が見られている。現在その分子生物学的解析を行っている。また近年、腸管の腫瘍性増殖あるいは悪性腫瘍への転化へのKLFファミリーの関与も示唆されでいるが、この腫瘍性増殖の解析を行なう上でもヘテロ(KLF^<+/->)マウスの知見は重要と考えられ、今後このマウスを用いた実験系を検討している。
糖化終末化合物生成を抑制し糖尿病合併症予防に有効な新規プレニルフラボノイドの創製

糖化終末化合物(AGEs)生成阻害活性成分の探索研究を行い、既知プレニルフラボノイド30種、新規プレニルフラボノイド20種を単離構造決定した。その中でも既知のEpimedokoreanin B,及びES-1, ES-2, ES-4と仮称する新規プレニルフラボノイドに強い生成阻害活性が認められた。生成阻害活性の強い化合物の構造活性相関を検討した結果、プレニルフラボノイドにおいては、配糖体よりもアグリコンでAGEs生成阻害活性が強く、またフラボノイド骨格のB環部分にカテコール基を有し、8, 5'位にプレニル基を有することがAGEs精製阻害活性作用の発現に必須であると示唆された。本研究の目的は、糖化終末化合物(Advanced glycation end products: AGEs)の生成を抑制することにより、糖尿病合併症や動脈硬化症、アルツハイマー病の予防・改善に有効なプレニルフラボノイド誘導体を創製することである。申請者は、共同研究者と開発したELISA法を用いてAGEs生成阻害活性試験を行い、フラボノイドLuteolinに2本のプレニル基が結合したEpimedokoreanin Bをイカリソウ(Epimedium spp.)より見出した。一方、種々プレニル基の導入で元の化合物の生物活性が向上する事例も報告されている。そこで、AGEs生成阻害活性に関する詳細な構造活性相関の検討を行うために、代表的AGEs構造体であるNε-(carboxymethyl)lysine (CML)とコラーゲン特異的AGEs構造体であるNω-(carboxymethyl)arginine (CMA)の生成を阻害する化合物をイカリソウより単離し、構造活性相関の検討を行った。得られた単一化合物についてCMLおよびCMA生成阻害活性試験を行ったところ、配糖体よりもアグリコンの活性が強いと判明した。また、フラボノイド骨格のB環部分にカテコール基を有し、8、5'位にプレニル基を有することが生成阻害活性の発現に必須であると判明した。以上の知見より、これまでのスクリーニング試験と同様に、今回得られた化合物のなかでEpimedokoreanin Bが、CML, CMA生成阻害活性が強く、収量も多いことから、イカリソウのAGEs生成阻害活性の本体であると推定された。イカリソウより単離したプレニルフラボノイドのうち、サンプル量が確保できた35個について、抗モノクローナルCML, CMA抗体を用いたELISA法により、CML, CMA生成阻害活性を測定した。その結果、阻害活性の強い化合物は、配糖体よりもアグリコンであった。また、アグリコンの中でもC環3位に酸素官能基を有するフラボノール骨格より、3位に酸素官能基が無いフラバン骨格で活性が強いことが判明した。即ち、EK-B (8), epimedonin E (21), G (22), H (24)の4種のプレニルフラボノイドに顕著なCML, CMA生成阻害活性が観察された。生成阻害活性の強い4種の化合物は、共通してカテコール基とプレニル基を有しているため、それらの官能基の重要性を検討した。先ず、EK-Bのフェノール性水酸基をジアゾメタンでメチル化した。その結果、メチル化誘導体はEK-Bより活性が低下したが、特にフラボノイド骨格A環5位の水酸基がメチル化された化合物は活性が顕著に低下した。このことから、A環5位の水酸基とC環4位のカルボニル基との水素結合がCML, CMA生成阻害活性に重要であることが示唆された。また、カテコール基を持つ単純な3つの化合物(gallic acid, pyrogallol, chlorogenic acid)とEK-BについてCML, CMA生成阻害活性を比較した。その結果、3つの化合物ともにEK-Bより弱い阻害活性を示すのみであった。次に、プレニル基の重要性を検討するために、プロポリス由来のartepillin C, drupanin, baccharinを用いてCML, CMA生成阻害活性を検討した。しかしながら、どの化合物にもCML, CMA生成阻害活性は確認できなかった。EK-Bと関連のある天然有機化合物とCML, CMA生成阻害活性の比較を行うことが出来た。その結果、ファーマコホアの絞り込みに関して有効なデータを得ることが出来た。これまでに行った抗CML、抗CMA抗体を用いる競合的ELISA法による生薬エキスのスクリーニングの結果、イカリソウに含まれるプレニルフラボノイド類に顕著な生成阻害活性が認められた。さらに検討を進めたところ、ハーブティーとして飲用されているローズレッドエキスにCML, CMA生成阻害活性が観測されたことから、阻害活性を有する化合物の単離を目的に抽出分離を行った。その結果、1)ローズレッドのAGEs (CMA, CML)生成阻害活性画分より、RR-14と仮称する4種の化合物を単離した。生成阻害活性の強い化合物の構造活性相関を検討した結果、プレニルフラボノイドにおいては、配糖体よりもアグリコンでAGEs生成阻害活性が強く、またフラボノイド骨格のB環部分にカテコール基を有し、8, 5'位にプレニル基を有することがAGEs

精製阻害活性作用の発現に必須であると示唆された。イカリソウの抽出分離を行い、得られた44種類の単一化合物について、CML, CMA生成阻害活性の評価を行った。その結果、阻害活性の強い化合物の化学的特徴を観測することが出来た。Luteolinをリード化合物として、各種プレニルフラボノイド誘導体を効率的に合成:市販されているLuteolinを原料として、Luteolinの芳香環の水素原子8位と5'位にイソプレン単位の異なる官能基(ジメチルアリル基、ゲラニル基、ファルネシル基)を付加させ、プレニル基のバラエティーを組み合わせたプレニル化フラボノイドの合成法を検討する。先ず、プレニル基の導入には、Qinggang Meiらのicariinの全合成を参考に、para-Claisen Cope rearrangement法を用いて行う(Beilstein J. Org. Chem. 2015, 11, 1220-1225)。AGEs生成抑制活性の評価:得られた化合物のAGEs生成抑制活性試験は、モノクローナル抗CML抗体、抗CMA抗体を用いたELISA法で行う。ポジティブコントロールとして、LuteolinとEpimedokoreanin Bを用いる。そして、プレニル化の影響について詳細な構造活性相関の検討を行い、更なる誘導体の合成に活用する。天然薬物学1.Luteolinをリード化合物として、各種プレニルフラボノイド誘導体を効率的に合成:キクカより容易に得られるLuteolinを原料として、Luteolinの芳香環の水素原子3、6,8位と2'、5'、6'位のうちの1カ所もしくは複数箇所にイソプレン単位の異なる官能基(ジメチルアリル基、ゲラニル基、ファルネシル基)を付加させ、プレニル基のバラエティーを組み合わせたプレニル化フラボノイドライブラリーの調製を行う。プレニル基の導入には、アルカリ存在下、プレニル臭化物を加えて行う(Basabe P., et al., Euro. J. Med. Chem., 45, 4258-4269 (2010))。2.AGEs生成抑制活性の評価:得られた化合物のAGEs生成抑制活性試験は、モノクローナル抗CML抗体、抗Pentosidine抗体、抗CMA抗体を用いたELISA法で行う。先ず、DMSOに溶解した化合物(100 μM)をリボース(30 mM)とゼラチン(2 mg/mL)の混合溶液に添加し、37°Cで7日間インキュベートする。次に、抗CML抗体、抗CMA抗体、抗Pentosidine抗体を一次抗体として、ELISA法で生成阻害活性を評価する。直接経費は、ほぼ申請通りの金額を支出した。年度末の消耗品の購入において、残額が出てしまった。直接経費は、ほぼ予定通りの金額を支出した。年度末の最後に消耗品の支出で残額を0円に調整することが上手くいかずに、197円分が次年度に繰り越しとなってしまった。繰り越した分は物品費にあてる。繰り越した分は、物品費にあて、サンプル瓶の蓋などに使用する予定である。
洪水氾濫解析における局所流のサブモデル化

大規模な洪水氾濫解析に用いる空間差分が数100数1,000mの格子系では表現できないサブグリッドの地形や構造物周辺の局所流について、氾濫初期およびピーク時の流れに対応する2つのサブモデルを作成した。前者は単純な形状の破堤口や氾濫時に堰のように作用する堤防・道路などの線構造物の破堤や越流を含む問題であり、時間的に強度の変わるソース・シンクのペアとみなす従来の方法を用いた。一方、後者の適用できる段階になると線構造物を挟んで流れが連続し線構造物にあたる差分格子点の代表水深を一時的に小さくとることで粗度の空間変化を与えるのと等価な取扱いが可能である。このように洪水初期から中期にかけて時間的にモデル接続することにより、初期の目的を達成したが、両者の中間段階で想定される急激な地形変化を追跡していないので改良を要する、さらに、非氾濫の河床変動問題について高濃度シルト分を含む流れ解析を考えた。とくに、粒径が数10μmと細かい場合、陽解法に固有の数値振動に伴って摩擦速度が変動するため、平滑な地形変動の計算は困難である。そこで、半陰解法を導入して洗掘・堆積傾向を安定に評価するとともに、濁度による僅かな密度差を打消すように作用し、時間スケールの大きな洪水氾濫では重要と考えられる水温とその成層効果を考慮しうる3次元モデルを作成し、長期の洪水氾濫も計算するようにした。応用として、バングラデシュ国の大規模な氾濫現象の解析を進めており、今後、大流域モデルあるいは地方毎のモデルとして発展させるとともに、サブモデル相互の接続性を高めることが課題といえる。
人口歯根と骨誘導蛋白を用いた顎骨再建に関する実験的研究

平成7年度は担体としてアテロコラーゲンを選択し、骨誘導蛋白との複合体を作製した。これをマウス大腿部筋肉内に移植し、以下の結果を得た。尚、対照としてアテロコラーゲン単体、骨誘導蛋白単体を移植した。(1)アテロコラーゲンは骨誘導蛋白の担体として組織吸収性には優れているが、賦形性は乏しかった。(2)骨誘導能および骨形成の経時的変化は、複合体移植と骨誘導蛋白単体移植を比較してX線学的、組織学的に大きな違いはみられなかった。(3)アテロコラーゲン単体の移植では骨は形成されなかった。人口歯根の植立を前提として、骨誘導蛋白の移植によるSinus Liftの実験を行った。すなわち家兎の鼻腔より鼻腔粘膜を剥離し、粘膜と骨の間に骨誘導蛋白を移植した。骨誘導蛋白は成牛の骨皮質より抽出し、ゼラチンカプセルに封入して移植した。また粘膜を剥離しゼラチンカプセルのみを移植したものを対照群とした。術後1ヵ月で屠殺し、以下の結果を得た。(1)移植群では鼻腔粘膜と上顎骨の間に骨が形成されていた。(2)これを組織学的に観察し、既存の骨とは別に骨が新生していることが確認された。(3)対照群では新生骨の形成はみられなかった。従ってアテロコラーゲンは骨誘導蛋白の担体として、賦形性の必要の無い部位への応用は有用であることが明かとなった。また、従来ではSinus Liftに自家骨等を移植していたが、今回の研究で自家骨のかわりに骨誘導蛋白が使用可能であることが示唆された。
第三世代重力波望遠鏡の迅速な光学的性能回復による観測不能時間の改善

第三世代重力波望遠鏡計画では、現第二世代重力波望遠鏡の100Hz前後の最重要観測帯域を制限している熱雑音の低減のため、鏡を低温化させることが既定路線となっている。しかし、低温鏡は、主な残留ガスである水分子の表面吸着を招き、鏡の超低損失光特性を損なう。本研究では、真空かつ低温下で装置に装着した状態の鏡に対し、外部からパルスレーザーや真空紫外光を照射し、低温による表面吸着分子の光刺激脱離、及び、鏡に発生した静電気等で引き寄せられた表面を汚染する有機物質などの分解により、鏡の反射性能の低下を、昇温過程を経ずに回復させ、観測不能期間を可能な限り低減させる技術の開発を行う。KAGRA重力波測定器で用いられるレーザー反射鏡は極低温で運用されるが、表面への水分子の吸着によって反射率が下がって使えなくなるという問題がある。これはKAGRAだけでなく次世代の重力波望遠鏡でも共通の課題である。これを外部からのパルスレーザーの照射によって脱離させる手法の研究である。KAGRAのレーザー反射鏡の問題によって2か月もの不感時間が生じることは大きな問題である。いつ発生するか分からない重力波を観測するために、観測不能時間を極力短くすることは非常に重要である.これはKAGRAだけの問題ではなく、重力波の発生方向を測定するための国際的な観測網に対しての責任でもあり、この研究計画の成功に期待したい。
苦味レセプターTAS2R及び肝臓解毒酵素GSTの遺伝子多型と食品の苦味感受性

苦味受容体TAS2Rsは、口腔内だけでなく消化器系や甲状腺、気道など、様々な組織で発現し、栄養素や刺激物などのシグナル受容を介した生理機能に関与るすることが示唆されている。本研究では、機能的な変異が知られているTAS2R38とTAS2R46について、癌患者群と対照群との間での遺伝子型頻度を比較し、各受容体の癌リスクとの関連性を推定した。その結果、PTCのリガンドであるTAS2R38において、PTC非感受性型ホモでは対照群よりも癌患者群において遺伝子頻度が有意に高かったため、この遺伝子型は消化器癌の高リスクタイプと分類された。一方、PTC感受性型ホモでは低リスク型と分類された。ブロッコリー等のアブラナ科植物の摂取量が少ない集団で、各種の発がん率が高いというヒト疫学データが多数報告されている。このことから、アブラナ科植物の苦味感受性の個人差、すなわち苦味受容体(TAS2Rs)の個人差が摂取食物の選択に影響していることが推察された。さらに、アブラナ科植物成分を代謝(解毒)する肝臓内酵素であるGSTs(グルタチオンS-トランスフェラーゼ)も、酵素活性に個人差があり、遺伝子多型が認められる酵素である。よって、この研究ではその二つのタンパク質群の発現の個人差を明らかにすることによって、食品の好き嫌いの個人差と代謝の個人差を明らかにして発癌の個人差との関係を明らかにしていこうとした。先ず、味覚受容体は25種類もある中で最もよく研究されているTAS2R38を中心に検討した結果、PTC (phenylthiocarbamide)やPROP (6-n-propylthiouracil)のレセプター候補として知られるTAS2R38は、3か所のSNPの組み合わせによって、non-taster (AVI/AVI)、medium-taster (AVI/PAV)、super-taster (PAV/PAV)に分けられる。AVI/AVI群はPTC, PROPに対する苦味感受性が低く、AVI/PAV群は中程度の、PAV/PAV群は高い苦味感受性を有することが知られている。しかし、カゼイン酸水解物や他の苦味物質に関しては、AVI/AVI群が最も苦味感受性が高い結果となった。また、グレープフルーツ中の苦味成分に関しても、リモニンが唯一TAS2R38に受容されるという報告がある(Meyerhof et al., 2012)が、グレープフルーツに対する苦味感受性の個人差がTAS2R38の遺伝子型の違いで説明できないことが初めて示された。平成27年度の研究実施計画にあった1)アブラナ科植物の調理法の違いによるisothiocyanate類の濃度変化と苦味の変化、植物中のmyrosinase活性変化、および摂取後の尿中排泄変化の計測(ヒト被験者)は、他のTAS2Rs(1, 4, 7, 10, 14, 19, 46)の遺伝子多型解析に時間を費やした結果、次年度に回すこととなった。計画2)の健常人および癌患者のisothiocyanate類の苦味感受性の個人差の解析は、アンケート調査及びDNAサンプリングを終え、遺伝子多型解析を行った。とくに後者については現在まとめており、投稿して2回目の査読の段階にあるが、遺伝子データのため内容の公開を保留したい。計画3)のisothiocyanate類の苦味レセプターの同定と遺伝子多型の分類に関しては、TAS2R38の他にTAS2R1, 4, 7, 10, 14, 19, 46等で解析を進めており、これは近々公開できるものと考えている。よって、今回の公表は研究計画成果の一部のみとなった。苦味受容体(TAS2Rs)は食物に含まれる有害な物質を検出しそれらの偶発的な摂取を防ぎ、健康を維持するうえで重要な機能を担っている。TAS2Rsは口腔内だけではなく、消化器系や甲状腺、呼吸器、など様々な組織で発現し、栄養素や刺激物などのシグナル受容を介した生理機能に関与することが示唆されている。TAS2R遺伝子の変異は食行動や栄養摂取量などの嗜好性の違いや、生活習慣病などの疾患に対する罹患率を変動させることが知られているが、発癌におけるTAS2Rの関与については十分に理解されていない。そこで本研究では、機能的な変異が知られているTAS2R38と46について癌患者群と対照群との間で遺伝子型頻度を比較し、各苦味受容体の癌リスクを推定した。【方法】消化器系癌(胆道癌、肝細胞癌、膵臓癌、大腸癌及び胃癌)と診断された癌患者群79人と対照群186人の口腔粘膜からDNAを抽出・精製し、変異部位を含む領域を増幅した後、シークエンスにより配列を決定して遺伝子型を解析した。【結果】TAS2R46は対照群の中で約6%のヌルアレルホモであり、癌患者群においてもこの頻度は同程度であった。従って、このヌル変異は癌の大きなリスクとはならないことが推定された。一方phenylthiocarbamide(PTC)のリガンドであるTAS2R38において、PTC非感受性型ホモは、対照群よりも癌患者において遺伝子頻度が有意に高かった。対照的にPTC感受性型ホモにおいては、対照群よりも癌患者において頻度が低く、PTC感受性型は癌リスクを低下させる遺伝子型であることが示唆された。よって、TAS2R38は発癌物質の検出に関与している事が推察された。

なお、解毒酵素GST(Glutathione-S-transferase)の解析はすでに行っており、間もなく公表する予定である。苦味受容体TAS2Rsは、口腔内だけでなく消化器系や甲状腺、気道など、様々な組織で発現し、栄養素や刺激物などのシグナル受容を介した生理機能に関与るすることが示唆されている。本研究では、機能的な変異が知られているTAS2R38とTAS2R46について、癌患者群と対照群との間での遺伝子型頻度を比較し、各受容体の癌リスクとの関連性を推定した。その結果、PTCのリガンドであるTAS2R38において、PTC非感受性型ホモでは対照群よりも癌患者群において遺伝子頻度が有意に高かったため、この遺伝子型は消化器癌の高リスクタイプと分類された。一方、PTC感受性型ホモでは低リスク型と分類された。平成28年度は、計画1)ヒトisothiocyanate類の肝臓代謝酵素(GSTM1およびGSTT1)の一塩基多型(SNP)と尿中代謝物解析を予定通り行う。初期予定では癌患者の解析を入れていたが、予算縮小の影響があることと、遺伝子型との対応が明確になれば目的が達成されるため、健常人のみで行う事に変更したい。計画2)TAS2R38の遺伝子多型とGSTs(GSTM1およびGSTT1)の遺伝子多型との関連性の解析は一定の成果を得ている(論文査読中)。すなわち、消化器系の癌患者では、TAS2R38とGSTsの遺伝子多型の組み合わせパターンで、健常人とは異なるパターンが認められたので、これをさらに追求していくこととなった。計画3)のisothiocyanate類のKeap1-Nrf2系を介した発癌抑制における個人差の解析は、実験動物(ラット)での検討も視野に入れていたが、これについては他の研究者の成果でも証明されてきたので、これを参考にして考察していきたい。食品科学、栄養生理学東北大学病院における癌患者のサンプリングに時間を要したことで、若干の後ずれが生じたため。前年度に残ったDNA解析代等の消耗品費として326,344円、および旅費として75,000円を使用する予定である。
T細胞の分化と細胞死のシグナル伝達におけるレドックス調節機序の解明

1.受容体型チロシンキナーゼRETの分子モデルにおいて、がん遺伝子産物RET-PTC-1のキナーゼドメインのC末端側に保存されたシステインをアラニン(疎水性)、グリシン(親水性)、セリン(親水性、OH基保有)、リジン(塩基性、e-アミノ基保有)のそれぞれに置換したミュータント遺伝子(cDNA)を導入した細胞を作製し、RETの活性を解析した。その結果、この位置のシステインが酵素活性の発現に重要であることが確認された。このシステインの分布をデータベースで解析したところ、一つの例外を除いてすべてのヒトチロシンキナーゼ分子のMXXCWモチーフ配列の中に極めて高度に保存されていることが判明した。一方、RETチロシンキナーゼ分子内のリン酸化を受けるチロシン部位を質量分析法によって網羅的に解析した。この結果、主要リン酸化部位であると推定されていたY905を含めて少なくとも5個所のチロシンリン酸化部位がキナーゼドメインの中に同定された。RET分子の立体構造モデルにおいてこれらのリン酸化部位となるチロシン群とキナーゼドメインのaヘリックスHのC末端側にあるMXXCWモチーフ中のシステインのキナーゼ活性化における異なる役割を推定した。2.T細胞表面の受容体が砒素などで酸化的化学修飾を受けて生ずるシグナル伝達は、細胞膜ラフトの機能に依存して産生される活性酸素の働きを必要とすることを示した。また、脂質由来のカルボニル化合物であるHNEを細胞に作用させた時、HNEにより活性化するカスパーゼによりSrcキナーゼの活性が負に制御され、このため、チロシンリン酸化が低下して活性化するホスファターゼPP2Aの作用でAktキナーゼの活性が低下してアポトーシスシグナル経路が正にフィードバック制御されるというラフト依存性の新経路の存在を示した。3.先に樹立したMKK6-/-マウスを解析し、胸腺リンパ球のネガテイブセレクションとそれ以後の終末分化において、MKK6と関連するレドックスシグナルが関与することを確認した。(1)酸化的化学修飾によるチロシンキナーゼ活性化の機序の解析:ヒトリンパ性白血病細胞から分離された受容体型チロシンキナーゼRETの分子モデルにおいて、がん遺伝子産物RET-PTC-1のキナーゼドメインのC末端側に保存された特定のシステイン(Cys376)をアラニン(疎水性)、グリシン(親水性)、セリン(親水性、OH基保有)、リジン(塩基性、e-アミノ基保有)のそれぞれに置換したミュータント分子の遺伝子(cDNA)を導入した細胞を作製した。これらの細胞から分離したRETの活性をin vitro kinase assayで解析した結果、いずれのミュータントRET分子のキナーゼ活性も対照の親RET分子のそれに比べて極めて低値であり、この位置のシステインが酵素活性の発現に重要であることが確認された。そこで、RET蛋白のアミノ酸配列から北里大の梅山博士が開発した蛋白モデリングソフトによって3次構造を推定し、その中で、このシステインの反応基の役割を推測した。(2)T細胞表面への酸化ストレスにより起動するシグナル伝達の機序の解析:T細胞表面の受容体が砒素などで酸化的化学修飾を受けると、細胞の生と死を誘導する正反対の2種類のシグナルが起動すること、そのいずれも、細胞膜ラフトの機能に依存して産生が促進される活性酸素の働きを必要とすることを明らかにした。(3)T細胞の分化と細胞死のレドックス調節の機序におけるp38MAPK

上流のMKK6の役割の解析:樹立したMKK6-/-マウスを解析し、胸腺リンパ球のネガティブセレクションとそれ以後の終末分化において、MKK6と関連するレドックスシグナルが関与することを明らかにした。1.酸化的化学修飾によるチロシンキナーゼ活性化の機序の解析:昨年度の研究により明らかにされた酸化ストレスの標的となってチロシンキナーゼ活性の起動に基本的に重要な働きをするチロシンキナーゼ分子内の特定のシステインの分布をデータベースで解析した結果、一つの例外を除いてすべてのヒトチロシンキナーゼ分子のMXXCWモチーフ配列の中に極めて高度に保存されていることが判明した。一方、RETチロシンキナーゼ分子内のリン酸化を受けるチロシン部位を質量分析法によって網羅的に解析した。この結果、従来、間接的な証拠により主要リン酸化部位であると推定されていたがリン酸化部位であることを確定するとともに、少なくとも5個所の比較的保存されたチロシンリン酸化部位がキナーゼドメインの中にあり、それぞれキナーゼの活性化に異なる様式で関与することを明らかにした。RET分子の立体構造モデルにおいてこれらのリン酸化部位となるチロシン群とキナーゼドメインのaヘリックスHのC末端側にあるMXXCWモチーフ中のシステインのキナーゼ活性化における異なる役割を推定した。2.T細胞表面への酸化ストレスにより起動するシグナル伝達の機序の解析:脂質由来のカルボニル化合物であるHNEを細胞に作用させた時、HNEにより活性化するカスパーゼによりSrcキナーゼの活性が負に制御され、このため、チロシンリン酸化が低下して活性化するホスファターゼPP2Aの作用でAktキナーゼの活性が低下してアポトーシスシグナル経路が正にフィードバック制御されるというラフト依存性の新経路の存在を示した。3.T細胞の分化と細胞死のレドックス調節の機序におけるMKK6の役割の解析:先に樹立したMKK6-/-マウスのさらなる解析により、胸腺リンパ球のネガテイブセレクションとそれ以後の終末分化において、MKK6と関連するレドックスシグナルが関与することを確認した。
イオン衝撃法を用いた新規な高活性酸素電極の開発

水電解による水素・酸素の製造と水素・酸素から燃料電池による電力の発生は、将来のエネルギーシステムにおけるキーテクノロジーである。本研究では、大きな過電圧を持ち大幅な効率低下の原因となっている酸素電極反応(酸素発生、酸素還元)に対して高活性な電極材料の開発を目的とし、イオン衝撃法により電極表面に反応活性点(原子レベルのギャップ)を形成するという新しい考え方で研究を行った。市販のネサガラスやチタン板を基板とし、この上にRuO_2、Ru_<1/2>Ti_<1/2>O_2、Ru_<2/3>Ti_<1/3>O_2などの微粒子薄膜をゾル・ゲル法で作製し、これにイオン注入法(イオン工学研究所)によりRu+、Zn^+、Co^+などの陽イオンを打ち込み、1M NaOH中で電気化学的特性(酸素発生特性)を測定した。この結果、イオン打ち込みにより酸素発生過電圧が40-100mVも低下すること、これまで酸素発生に対して最も活性とされているRuO_2電極の過電圧も40mVほど低下すること、これらの低下は打ち込むイオンの種類によらず、電極表面の化学組成の変化では説明できないことなどを明らかにした。さらに、SEM、XPS、TEM等の観察を行い、イオン打ち込みにより電極表面の化学組成は変化しないこと、イオン打ち込みにより電極表面付近に原子レベルのダメージ層が形成されることなどを明らかにした。これらの結果から、金属酸化物電極に高エネルギーイオンを打ち込むと電極表面付近に原子状間隙等の欠陥(反応の活性点)が発生して酸素発生過電圧が低下することが明らかになり、また、この方法が高活性な酸素電極開発に有効な方法となることが明らかになった。この結果はJ. Phys. Chem. Bに投稿し、現在審査中である。