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糖尿病性腎症治療戦略における活性酸素制御-新規分子ターゲットの応用-

現在の腎臓領域における問題の一つは慢性腎不全患者の増加である。年々透析患者数は増加しており、我が国において2000年末には現在約206,134人が透析を受けている。慢性腎不全患者増加の最大の要因は糖尿病性腎症の増加であり、1998年より糖尿病性腎症が透析導入の原疾患の第一位となった。2000年の1年間に慢性透析に導入された31,925人のうち糖尿病性腎症による導入は11,685人で、全体の36.6%を占めている。しかも糖尿病性腎症を原疾患として透析導入となった場合、心・脳血管障害等のマクロアンギオパチーや感染症のため、5年生存率は約50%と予後は不良である。この爆発的な糖尿病性腎症による腎不全の抑制のためには、厳密な血糖コントロールが最も重要であるが、合併症の成立機序を明らかにし、それを作用点とした新しい治療方法の開発も重要である。我々は平成11-13年度基盤研究(B)において、ICRマウスにストレプトゾトシンを投与し糖尿病を誘発することによりヒト糖尿病性腎症のびまん性病変類似の病変がもたらされることを見出した。このモデルを用いることにより、糸球体過剰濾過期のもたらされる遺伝子発現の変化を、遺伝子サブトラクション法や、高密度DNAアレイ法を用いることにより広くスクリーニングを行なった(Wada J et al. Kidney Int 59(4), 1363-1373, 2001)。そのなかにはまったく未知の遺伝子が含まれており、我々はこれらの遺伝子の構造を決定すると共にその機能を報告した(Wada J et al. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 144-149, 1998; Yang Q etal. Proc Natl Acad Sci U S A 97(18):9896-9901, 2000)。我々の同定した遺伝子のひとつは、translocase of inner mitochondrial membrane 44(Tim44)である。Tim44はミトコンドリア蛋白を細胞質よりミトコンドリア内へimportするmachinery proteinであり、多くのミトコンドリア蛋白がTim44に依存している。Tim44が上昇するとミトコンドリア蛋白、特にミトコンドリアマトリックス蛋白がimportされるためミトコンドリア機能は亢進すると考えられ、ミトコンドリアの機能亢進とそれにつづく活性酸素の産生がミトコンドリアの機能を逆に障害し、腎症の進展に関与していると推測される。Tim44、uncoupling protein-1(UCP-1)、mitochondrial manganesesuperoxide dismutase(Mn-SOD)の発現ベクター(pcDNA3.1)を作製した。またそれらを腎尿細管に発現させるために、HVJ-Eベクターを用い基礎的導入実験を行い、発現ベクターの導入が可能となった。Tim44の導入によって活性酸素の低下と糖尿病性腎症の改善を認めた。

Tim44、uncoupling protein-1(UCP-1)、mitochondrial manganesesuperoxide dismutase(Mn-SOD)の発現ベクター(pcDNA3.1)を作製した。またそれらを腎尿細管に発現させるために、HVJ-Eベクターを用い基礎的導入実験を行い、発現ベクターの導入が可能となった。Tim44の導入によって活性酸素の低下と糖尿病性腎症の改善を認めた。現在の腎臓領域における問題の一つは慢性腎不全患者の増加である。年々透析患者数は増加しており、我が国において2000年末には現在約206,134人が透析を受けている。慢性腎不全患者増加の最大の要因は糖尿病性腎症の増加であり、1998年より糖尿病性腎症が透析導入の原疾患の第一位となった。2000年の1年間に慢性透析に導入された31,925人のうち糖尿病性腎症による導入は11,685人で、全体の36.6%を占めている。しかも糖尿病性腎症を原疾患として透析導入となった場合、心・脳血管障害等のマクロアンギオパチーや感染症のため、5年生存率は約50%と予後は不良である。この爆発的な糖尿病性腎症による腎不全の抑制のためには、厳密な血糖コントロールが最も重要であるが、合併症の成立機序を明らかにし、それを作用点とした新しい治療方法の開発も重要である。我々は平成11-13年度基盤研究(B)において、ICRマウスにストレプトゾトシンを投与し糖尿病を誘発することによりヒト糖尿病性腎症のびまん性病変類似の病変がもたらされることを見出した。このモデルを用いることにより、糸球体過剰濾過期のもたらされる遺伝子発現の変化を、遺伝子サブトラクション法や、高密度DNAアレイ法を用いることにより広くスクリーニングを行なった(Wada J et al. Kidney Int 59(4),1363-1373,2001)。そのなかにはまったく未知の遺伝子が含まれており、我々はこれらの遺伝子の構造を決定すると共にその機能を報告した(Wada J et al. Proc Natl Acad Sci USA 95,144-149,1998 ; Yang Q etal. Proc Natl Acad Sci USA 97(18) : 9896-9901,2000)。我々の同定した遺伝子のひとつは、translocase of inner mitochondrial membrane 44(Tim44)である。Tim44はミトコンドリア蛋白を細胞質よりミトコンドリア内へimportするmachinery proteinであり、多くのミトコンドリア蛋白がTim44に依存している。Tim44が上昇するとミトコンドリア蛋白、特にミトコンドリアマトリックス蛋白がimportされるためミトコンドリア機能は亢進すると考えられ、トコンドリアの機能亢進とそれにつづく活性酸素の産生がミトコンドリアの機能を逆に障害し、腎症の進展に関与していると推測される。本年度はTim44,uncoupling protcin-1(UCP-1)、mitochondrial manganesesuperoxide dismutase(Mn-SOD)の発現ベクター(pcDNA3.1)とアンチセンスベクターを作製した。
国分寺を中心とした8世紀の瓦生産・流通に関する基礎的研究

今年度に行った研究実績の概要を列記する。(1)国分寺の瓦に強い影響を与えた平城宮・京出土の瓦の検討をおこなった。特に、平城宮大極殿院・東院、国分総寺である東大寺、国分総尼寺である法華寺の瓦について詳細に検討した。平城宮大極殿院・東院については軒瓦だけでなく道具瓦や丸・平瓦も含めた総合的な研究を行った。東大寺については、これまで未公表であった東大寺転害門の資料を使って新たな知見を得た。法華寺については、阿弥陀浄土院庭園との関わりの中でその所用瓦磚について研究した。その成果の一部はすでに今年度に公表しており、更に投稿済みの論文が数本あり、平成16年度に掲載される予定である。(2)平城京から他地域へ瓦笵が移動した例として知られている、唐招提寺金堂創建軒瓦と丹波国分寺の同笵瓦を研究した。この同笵瓦は平城京の西大寺、西隆寺、法華寺や、山城高麗寺からも出土しているが、これらをすべて実見し、笵傷進行や製作技法の詳細な検討を行った。その結果、従来、平城京にいた工人が丹波へ移動したとされてきたが、工人は移動していないと結論づけた。この成果については研究会で口頭発表を行い、論文としても投稿する予定である。(3)紀伊や淡路国分寺に影響を与えた興福寺の瓦を検討した。その過程で、古代の瓦生産・供給体制との比較研究のため、鎌倉時代の興福寺出土瓦についても検討し、いくつかの新たな知見を得た。その成果は既に論文として投稿済みで、平成16年度に掲載される予定である。
小脳核出力軸索投射の機能構築と小脳核出力信号の形成機構の解明

小脳は、従来から知られている種々の運動調節に加えて、認知機能や自律神経機能の調節など多彩な機能に関与することが示唆されている。これら多種類の機能出力は、小脳の主な出力核である内側核(室頂核)、前・後中位核(栓状核・球状核)、外側核(歯状核)のわずか4種類の部分からなる小脳核によって果たされている。したがって、小脳が多彩な機能を果たすためには、それぞれの小脳核のなかに、細かい機能区分、あるいは機能的に異なる複数種類のニューロンが含まれているなどの構築の存在が必要と考えられる。そのため、本研究においては、小脳核内のそれらの機能構築を明らかにすることが目的である。本年度は、まず、小脳内側核を形成するニューロンの同定を行った。急性単離した約70個のマウス内側核の単一ニューロンに含まれる神経伝達物質関連遺伝子やイオンチャネル遺伝子などをqPCRで定量し、それらの発現量のデータを元にクラスター分析を行った。すると、内側核の興奮性および抑制性のニューロンのそれぞれについて、興奮特性が異なると想定される複数種類のニューロングループが存在することが明らかとなった。また、本年度は、機能区分の観点から小脳核構築を調べる目的で、Aldoc-GFPノックインマウスを新潟大学の崎村教授らとの共同研究により作製した。Aldocは小脳の機能区分である縦帯区画を染め分けることのできるマーカーであるが、このマウスはその縦帯区画の可視化を意図したものである。このマウス小脳を蛍光実体顕微鏡で観察すると、in vivoにおいてもAldoc陽性および陰性の縞模様が見えることが確認された。このマウスにおいて、マウス小脳におけるAldoc発現パタンを詳細にマッピングしたアトラスを作成した。このマウスを用いることで小脳の虫部、傍虫部、および半球部という従来の区分よりも細かい区分を考慮した生理学実験が可能になると考えられた。(抄録なし)小脳が、前後左右の部位(小脳区分)ごとにさまざまな種類の運動調節などを分担していることは、古くから臨床的に知られている。これまでの解剖学的な研究においても、半側あたり20個以上の小脳区分に応じた神経線維連絡のパタンや分子発現のパタンの違いが示されてきている。しかし、その構築の解剖学的な詳細および生理学的な動作原理は未だ多くが不明である。そのなかでも特に、小脳出力の唯一の源である小脳核に関しては、その動作機構のみならず、その軸索投射の基本構築すら未解決である。本研究では、小脳の行う多彩な機能の本質的動作機構を、小脳核の入出力を中心にして、解剖学・生理学の立場から理解することが目的である。本年度は主に、小脳区分の解剖学的な本質をより明らかにするため、その形成過程の解析を行った。小脳皮質と小脳核の特定の区分は、胎児期から発達を通してPLCβ4、EphA4、Pcdh10などの分子発現パタンで区別されるため、これに着目した。まず、マウス胎児期の小脳皮質プルキンエ細胞層の構築を、胎児期プルキンエ細胞のマーカー分子と確認されたFoxP2を用いて明らかにした。マウス胎児期のプルキンエ細胞層は、複数のプルキンエ細胞塊が立体的に重なり合った構築をしていた。連続切片を切って、PLCβ4、EphA4、Pcdh10などの分子とFoxP2とに対する蛍光二重免疫染色を行い、小脳区分を立体的に解析した。この結果、胎生17.5日のマウスにみられるプルキンエ細胞塊の区分と、成獣で見られる小脳区分との間にはほぼ1対1の関係があることが明らかとなった。このようにして、成獣での細かい区分のひとつひとつが胎児期からすでに分子発現パタンによって規定される重要な区分であることがわかった。この結果は現在国際誌へ投稿中である。また、本年度の研究の過程で、マウスの成長に伴ってFoxP2の発現パタンが均一パタンから横縞様パタンへ変化することが明らかとなったので、国際誌に発表した。小脳には機能的な区分が多数存在し、それによって様々な種類の運動調節を含む多彩な機能に関与できる。しかし、小脳機能を小脳の外へ出力する唯一の源である小脳核に関しては、その電気生理学的な動作機構のみならず、その軸索投射の基本構築すらほとんど知られていない。本研究では、小脳の本質的動作機構を、小脳核の入出力を中心にして、解剖学・生理学の立場から理解することを目的とする。本年度はまず、昨年度に引き続き、小脳区分の形成過程を、小脳皮質における分子発現により区分を同定することにより胎仔期(E17.5)から成獣期まで追跡した。その結果、胎仔期の区分は特異的分子発現を持ち立体的に配置する50余りのプルキンエ細胞集団となっていること、そして、それらの集団が、スライドや分裂といったダイナミックな再構成を経て、胎児期の区分とほぼ一対一で対応付けられる成獣での区分となることが判明した(国際誌に発表)。また、この研究で見られた、ひとつの集団がふたつに分裂するという現象は、小脳の体部位局在が小脳の前と後ろとでミラーイメージになっているという従来からの知見をよく説明すると考えられた。そこで、所属研究室で蓄積していた登上線維単一軸索の投射パタンを再分析したところ、投射先への枝分かれが大きく前後に分かれているものは、上記のプルキンエ細胞集団の前後への分裂と関連付けられる傾向が確認された。

すなわち、小脳の体部位局在形成の基盤に、小脳区分の発達過程が関わっていることが示唆された。これらの結果を国際誌に総説として発表した。また、これらを踏まえて、単一の小脳核ニューロンにおいて、その興奮特性を決めるイオンチャネルの発現量を分子生物学的に定量し、ニューロンを分類し、そのタイプに応じた小脳核内での局在と小脳区分との対応を調べる研究を開始した。小脳は、従来から知られている種々の運動調節に加えて、認知機能や自律神経機能の調節など多彩な機能に関与することが示唆されている。これら多種類の機能出力は、小脳の主な出力核である内側核(室頂核)、前・後中位核(栓状核・球状核)、外側核(歯状核)のわずか4種類の部分からなる小脳核によって果たされている。したがって、小脳が多彩な機能を果たすためには、それぞれの小脳核のなかに、細かい機能区分、あるいは機能的に異なる複数種類のニューロンが含まれているなどの構築の存在が必要と考えられる。そのため、本研究においては、小脳核内のそれらの機能構築を明らかにすることが目的である。本年度は、まず、小脳内側核を形成するニューロンの同定を行った。急性単離した約70個のマウス内側核の単一ニューロンに含まれる神経伝達物質関連遺伝子やイオンチャネル遺伝子などをqPCRで定量し、それらの発現量のデータを元にクラスター分析を行った。すると、内側核の興奮性および抑制性のニューロンのそれぞれについて、興奮特性が異なると想定される複数種類のニューロングループが存在することが明らかとなった。また、本年度は、機能区分の観点から小脳核構築を調べる目的で、Aldoc-GFPノックインマウスを新潟大学の崎村教授らとの共同研究により作製した。Aldocは小脳の機能区分である縦帯区画を染め分けることのできるマーカーであるが、このマウスはその縦帯区画の可視化を意図したものである。このマウス小脳を蛍光実体顕微鏡で観察すると、in vivoにおいてもAldoc陽性および陰性の縞模様が見えることが確認された。このマウスにおいて、マウス小脳におけるAldoc発現パタンを詳細にマッピングしたアトラスを作成した。このマウスを用いることで小脳の虫部、傍虫部、および半球部という従来の区分よりも細かい区分を考慮した生理学実験が可能になると考えられた。本研究の主要部分となる小脳核の軸索投射に関する解剖学的解析に関しては、その問題を解決するためには、小脳区分の発生学的区分の解明が必須であることが研究の過程において判明した。そこで、小脳の区分ごとの解剖学的および生理学的違いを解析するうえで重要な、本質的な小脳区分について、小脳の発生を通じて胎生17.5日から生後6日まで追跡する研究に集中した。その結果、成獣の細かな小脳区分が、胎児期の小脳でも、配置のパタンは未発達であるが、区分としては完成しているという、これまで未知の結果を出すことができた。昨年度から引き続いて、個体の発生を通して小脳区分がどのように出来上がるのかを明らかにし、小脳区分ごとの解剖学的・生理学的な違いをより本質的な観点から検討することができるようになった。さらに、小脳核ニューロンに関しては、イオンチャネル発現量を単一ニューロンごとに調べると、興奮性ニューロンの中にも2つ以上の異なるタイプのニューロンが存在することが明らかになった。小脳核の軸索投射に関する解剖学的解析に関しては、その問題を解決するためには、小脳区分の発生学的区分の解明が必須であることが研究の過程において判明した。
超高圧走査プローブ顕微鏡による液晶分子の界面相転移の観測と分子操作

本研究は、混合化に伴う分子と基板との間の相互作用の空間的不均一性を利用した分子操作や、高圧印加に伴う分子間相互作用の変化を利用した分子操作など、新しい手法による分子操作の実現を目指した基礎研究を目的としている。本年度には、グラファイト(HOPG)基板上のシアノビフェニール系(nCB:n=612)液晶の単分子膜の配列構造の観測を行い、異なったnに対する単一相の配列梼造をより高い分解能で観測するとともに、これまで未観測であったn=6について、初めてそのSTM像を高分解能で観測することに成功した。加えて、これらの混合液晶にどのような混合物特有の配列構造が観測されるかを研究した結果、HOPG上では、ダブルロウとシングルロウ(例えば8CBと9CBの混合)、あるいはダブルロウ同士(例えば8CBと10CBの混合)のいずれの組み合わせにおいても、混合物特有の配列構造が観測されたが、シングルロウ同士では観測されなかった。今回、これらを詳細に検討し、その出現性をより系統的に整理した。また、その基板依存性を知るために、二硫化モリブデン基板上での混合液晶の配列構造の観測も行った。その結果、二硫化モリブデン基板上でも、混合物特有の配列構造が観測されたが、この場合には、二硫化モリブデン基板上での単一相の配列が、各々シングルロウとダブルロウの配列となる液晶の組み合わせでのみ特有の配列構造が観測され、ダブルロウ同士やシングルロウ同士の組み合わせでは観測されないことが分かった。このように混合物配列構造には基板依存性が見られるが、両基板に現れる構造それ自体にはよい類似性が観測された。そこで、その系統的な比較・検討を行った結果、基板とアルキル鎖の間に多少のミスマッチが存在しても混合物特有の配列が許されることが分かった。
信濃における民俗と文学に関わる研究

わが国の民俗学は民間伝承を研究資料として、民俗性や民族分化を庶民の生活感情を通して研究するものである。民間伝承が民族性格の個的因由を解明する唯一のものであり、文学が社会生活の論理を発掘することを目ざすものとすれば、一国文学の研究は民俗学の目的とする所から出発しなければならない。いままでの研究において、ひとつひとつの民俗の持つ本来の意義、その姿の究明はなされてき。しかし、ひとつひとつの民俗の本質的な究明だけでなく、個々の民俗はいづれもその土地、その風土の中で生まれ育ち推移してきたわけであるから、個々の民俗とその風土との関わりから追求することが必要である。そこで、本研究では、今もなお、民習の古典的形態が残る伝統の民俗を取り上げ、信濃における民俗と風土、そして文学との関わりを調査検討した。旧家のしきたり、方言、食分化等は地域の分化を伝え、地域の豊かな人間関係を担うものである。そして、それぞれの地域に伝承する民俗はその土地に生きる人々の生活の知恵の結晶であり、その地の風土を背景に受け継がれてきている。柳田國男の『信州随筆』、貝原益軒の『岐蘇路記』は信濃の民俗、風土を伝えながら名高い随筆紀行文として成立している。また島崎藤村の『夜明け前』は、家長制度、民具、冠婚葬祭の慣習、食の文化までもこと細かに記され、それが作品をより重厚なものにしている。古来から、信濃に残る民俗生活的文化を文芸作品に書き記すことは、その土地の歴史、風土を伝え、作品の舞台風土、作中人物の生活描写をより明確にし、地域文化の生活化にもつながっていく。それは、ともすれば忘れ去られようとしている伝統的民族文化、民俗的生活の伝統の崩壊への警鐘文明批評的発現をも包含している。
医療的ケア児支援を可能にする現職訪問看護師育成プログラムの開発

地域で生活している医療的ケア児は急増しているが、支援可能な訪問看護師は少なく、必要な知識・技術を学ぶ機会が少ない。このため医療的ケア児の支援可能な訪問看護師の育成は重要である。特に離島の多い本県は、知識・技術を学ぶには物理的に不利な状況にある。訪問看護師に特化したプログラムは確立されておらず専門的な知識・技術が習得し難い。本研究では既存の訪問看護師の能力を生かし、訪問看護師に特化した医療的ケア児支援プログラムを開発する。医療的ケア児の支援可能な訪問看護師の増加に貢献する。
紫外線損傷DNAを特異的に認識する抗体分子の機能の改変

以下に,今年度得られた新たな知見等の成果を示す.(1) Dewar型異性体を特異的に認識するDEM-1抗体の可変領域部遺伝子のクローニングを行い,その塩基配列およびアミノ酸配列を決定した.重鎮(H鎖)中にシステイン残基の存在が確認された.(2) Dewar型異性体特異的1本鎖抗体(DEM1scFv抗体)遺伝子の構築(VH-linker-VL型およびVL-linker-VH型)および大腸菌システムによる大量調製を行った.天然型では活性を有するscFv抗体蛋白質を得ることはできなかったが,システインをセリンに置換した変異scFv抗体では活性を有していた.(3)バイオセンサー(BIAcore)を用いて,Dewar型異性体を含む合成オリゴヌクレオチドとの相互作用を速度論的に解析したところ,特異的な結合が観察され,結合速度定数kass,解離速度定数kdissならびに解離定数Kdが得られた.DEM1scFv(C47S)抗体の抗原アナログd4merに対するKd値は,2.5±0.2x10^<-7>(VH-linker-VL型),2.2±0.3x10^<-7>(VL-linker-VH型),抗原アナログd6merに対するKd値は,2,4±0.2x10^<-7>(VH-linker-VL型),2.7±0.5x10^<-7>(VL-linker-VH型)となった.DEM-1 Fabの抗原アナログd4merに対するKd値は,1.1±0.1x10^<-7>,抗原アナログd6merに対するKd値は,1.0±0.1x10^<-7>となった.以上のことから,scFv抗体はFab抗体同様の抗原結合特性を有していることが分かった.以下に,今年度得られた新たな知見等の成果を示す.(1) Dewar型異性体を特異的に認識するDEM-1抗体の可変領域部遺伝子のクローニングを行い,その塩基配列およびアミノ酸配列を決定した.重鎮(H鎖)中にシステイン残基の存在が確認された.(2) Dewar型異性体特異的1本鎖抗体(DEM1scFv抗体)遺伝子の構築(VH-linker-VL型およびVL-linker-VH型)および大腸菌システムによる大量調製を行った.天然型では活性を有するscFv抗体蛋白質を得ることはできなかったが,システインをセリンに置換した変異scFv抗体では活性を有していた.(3)バイオセンサー(BIAcore)を用いて,Dewar型異性体を含む合成オリゴヌクレオチドとの相互作用を速度論的に解析したところ,特異的な結合が観察され,結合速度定数kass,解離速度定数kdissならびに解離定数Kdが得られた.DEM1scFv(C47S)抗体の抗原アナログd4merに対するKd値は,2.5±0.2x10^<-7>(VH-linker-VL型),2.2±0.3x10^<-7>(VL-linker-VH型),抗原アナログd6merに対するKd値は,2,4±0.2x10^<-7>(VH-linker-VL型),2.7±0.5x10^<-7>(VL-linker-VH型)となった.DEM-1 Fabの抗原アナログd4merに対するKd値は,1.1±0.1x10^<-7>,抗原アナログd6merに対するKd値は,1.0±0.1x10^<-7>となった.以上のことから,scFv抗体はFab抗体同様の抗原結合特性を有していることが分かった.
新規機能性巨大ポルフィリン分子の創製

ポルフィリンは天然に広く存在する芳香族化合物であり、近年はその特異的な物性により、様々な機能性材料としても研究が広く行われている。当研究者は、植物の光合成に欠かせない光捕集アンテナに注目した。光捕集アンテナはポルフィリン誘導体であるバクテリオクロロフィルが環状に配置されている。そこでこの環状構造を模倣して当研究者は人工的な光捕集アンテナを合成することにした。当研究者はこれまでに環状ポルフィリン多量体の合成に成功している。ポルフィリン同士を直接結びつける銀塩酸化反応を利用してポリフィリンを多量化していき、最終的に高希釈条件化で分子内環化させることによって合成に成功した。この環状ポルフィリン多量体に様々な修飾反応を試した。まずはイリジウム触媒による直接ホウ素化を試した。しかし、種々の条件を試したものの、反応は全く進行せず原料回収に終わった。そこで次にニトロ基を導入した環状ポルフィリン多量体の合成を行なった。反応は進行したが、最終の環化反応のところで反応が進行しなくなり目的の分子を得ることは出来なかった。当研究者はコロールの置換反応についても検討した。側鎖にペンタフルオロフェニル基を持つコロールに対して、種々の求核剤を反応させた。するとペンタフルオロフェニル基のパラ位で求核置換反応が進行して、様々なコロール誘導体の合成に成功した。この反応を応用して、研究者は有機溶媒中でゲル化する新規機能性コロールの合成を行なった。長鎖アルキル基を導入することによって、見事にゲル化するすばらしい新規材料の開発に成功した。ゲル化の様子は吸収スペクトルによってモニターすることが出来て、ゲル中でH型の会合構造をとっていることを明らかにした。巨大環状ポルフィリン多量体の合成と光特性の計測ポルフィリンを基本骨格とした大環状分子の合成はせいぜいポルフィリンを6分子含む分子までしか合成されてこなかった。そこで申請者は、銀塩酸化反応を用いた巨大環状分子の合成を行い、実際にポルフィリンを最大32個含む環状ポルフィリン多量体の合成に成功した。子の分子は、共有結合、非共有結合に関わらずポルフィリンを基本骨格とした単分散の分子としては世界最大の分子であり、非常に大きなインパクトを与えた。この成果はChemistry A European Journal誌に掲載されている。この合成した種々の環状ポルフィリン多量体を様々な分光学的手法を駆使して明らかにした。つまりアンサンブル測定では、時間分解分光法を用いることで分子内で高速の励起エネルギー移動がおこっていることを明らかにし、またポルフィリンの数を系統的に変化させてその物性の変化を追った。この研究はこれまでに行われておらず、非常にユニークで重要な研究である。一方、近年の検出器の性能、分解能の向上により1分子に対する分光学的測定が出来るようになった。つまりこれまでは溶液などのもと非常に多くの分子が存在している系のバルクの状態での光物性を追いかけてきたが、現在では1分子に対して分光測定をすることが出来、1分子の時間の変化による物性の変化を追うことが出来るようになってきているのである。この最先端の単分子計測を用いることでさまざまな大きさの環状ポルフィリン分子の1分子の光物性を押さえることに成功した。これまでの実験からアンサンブルの系では平均化されてわからなかった単分子の性質が明らかになってきたが。今回の環状ポルフィリン多量体の単分子計測も例外ではなかった。つまりポルフィリンの蛍光の量子収率がアンサンブルと単分子では異なったのである。この実験の成果はJournal of the American Chemical Society誌に掲載された。本年度の研究は当初の計画通り、環状ポルフィリン分子へのホウ素化反応を行なった。しかし、予定していたイリジウム触媒を用いたホウ素化反応は進行しないことが分かった。これは分子が大きすぎるために触媒サイクルに乗らなかったのではないかと考えられる。次に前年度に引き続きカルボキシル基を導入した環状ポルフィリン分子の合成に取り組んだ。カップリング反応がうまくいかずなかなか収率をあげることが出来ず最終的な合成にいたらなかった。今年度も反応条件を検討しつつ、実験を進めていきたい。研究の途中で、ポルフィリンと同電子体であるコロールと呼ばれる分子に注目した。このコロールは3日の金属イオンを取り組むという非常に興味深い分子である。ポルフィリンにカルボキシル基を導入すると、ゲル化するという報告例から、コロールでもゲル化反応を行なうことにした。ペンタフルオロフェニル基を持っているので芳香族求核置換反応が利用できることに注目して、適当なゲル化駆動部位を導入する反応を種々試した。その結果アミド基を持ち、またトリアクコキシ基を持つので、ゲル化反応が効率よく進行することが分かった。当初の計画に加え、新たな領域の研究も進めていきたい。

ポルフィリン同士を直接結びつける銀塩酸化反応を利用してポリフィリンを多量化していき、最終的に高希釈条件化で分子内環化させることによって合成に成功した。この環状ポルフィリン多量体に様々な修飾反応を試した。まずはイリジウム触媒による直接ホウ素化を試した。しかし、種々の条件を試したものの、反応は全く進行せず原料回収に終わった。そこで次にニトロ基を導入した環状ポルフィリン多量体の合成を行なった。反応は進行したが、最終の環化反応のところで反応が進行しなくなり目的の分子を得ることは出来なかった。当研究者はコロールの置換反応についても検討した。側鎖にペンタフルオロフェニル基を持つコロールに対して、種々の求核剤を反応させた。するとペンタフルオロフェニル基のパラ位で求核置換反応が進行して、様々なコロール誘導体の合成に成功した。この反応を応用して、研究者は有機溶媒中でゲル化する新規機能性コロールの合成を行なった。長鎖アルキル基を導入することによって、見事にゲル化するすばらしい新規材料の開発に成功した。ゲル化の様子は吸収スペクトルによってモニターすることが出来て、ゲル中でH型の会合構造をとっていることを明らかにした。
Driver変異不明の肺癌を層別化する試み

ドライバー変異(EGFR, KRAS, ALK)のない肺の腺癌は、喫煙などの外来性発癌因子との関連がより濃厚であると推定される。本研究では、mRNAおよびmiRNA発現を網羅的に検索した。外来発がん因子として、喫煙とアスベスト曝露とに着目した。喫煙量、肺内アスベスト量とmiRNAの発現と相関を検討し、アスベスト曝露に特有のmiRNAを抽出できた。miRNA発現とRNA発現の統合的解析を試みたが、miRNAとmRNAとでクラスターが一致せず、再実験を行っている。免疫チェックポイント阻害薬関連のバイオマーカーPD-L1発現は腺癌では予後不良因子であったが、小細胞癌では予後良好因子であった。1.解析対象例の選定:対象はいずれも手術材料で、EGFR, KRAS, ALK変異のない腺癌30例、小細胞癌25例、および扁平上皮癌のうちEGFR・KRAS・DDR2の変異, ALK融合遺伝子、FGFR1増幅のないもの35例であった。これらの症例90例について、組織型、病理病期、予後情報、喫煙歴、アスベスト曝露歴、腫瘍歴、家族歴を、対象症例ファイルとしてまとめた。組織アレイの作製は、腺癌、小細胞癌が終了した。2.ゲノム不安定性の解析:腺癌30例のアレル量データを詳細に再解析し、ゲノム全体のアレル量の変化の程度により染色体不安定性の程度により分類した結果、軽度12例、中等度13例、高度5例となった。染色体不安定性が高度になるほど、有意に喫煙量が増加した。小細胞癌については、非喫煙者3症例の全エクソンシークエンスを計画中である。3.メチル化異常:ゲノムワイドメチル化解析については、腺癌30例、扁平上皮癌35例の中から、症例を絞って実施する方向で準備中である。小細胞癌25例については、予後と相関して層別化することができた。すなわち、メチル化の多い群(high CIMP群)は有意に予後不良であった。内在性レトロエレメントについては、LINE-1のプロモータ部位のメチル化を検索し他の因子と比較している。4.非コードRNAの検索:腺癌については、アレイを用いて、長鎖非コードRNA(とmRNA)発現解析を行い、データを取得した。現在、非コードRNAの発現パターンと、臨床病理情報、ゲノム不安定データ、その他の因子との相関を総合的に検討中である。5.PD-L1、PD-1の発現と肺癌の予後:肺癌においても、免疫チェックポイント阻害薬の効果が注目されている。本年は、腺癌300例を対象に、腫瘍細胞におけるPD-L1の発現と諸因子との関係を検討した。その結果、PD-L1高発現群では、喫煙者が多く、EGFR変異陰性例が多かった。またPD-L1発現は、喫煙者、EGFR変異陰性群でのみ、予後因子であった。ほぼ予定通りに進捗している。採択以降、免疫チェックポイント阻害薬が注目されるようになり、その発現と諸因子(予後を含む)との関係も検討することとした。1.解析対象例の選定:ドライバー変異のない肺癌90例を抽出した。これらの症例の、組織型、病理病期、予後情報、喫煙歴、アスベスト曝露歴、腫瘍歴、家族歴などを対象症例ファイルとしてまとめた。更に、扁平上皮癌のうち、FGFR1増幅のない扁平上皮癌40例を抽出して、tissue arrayを作製した。2.ゲノム不安定性の解析:腺癌33例のアレル量データを詳細に再解析し、ゲノム全体のアレル量の変化の程度により、染色体不安定性の程度を、軽度、中等度、高度の3段階に分け、喫煙量との相関を検討した。その結果、LOH頻度と喫煙量とが相関することが判明した。小細胞癌については、予後と相関する4種のmiRNAを抽出した。3.メチル化異常:20例の小細胞癌について、ゲノムワイドメチル化解析のデータの取得が完了したので、部位の解析、パスウェイ解析を行った。その結果、末梢型小細胞癌では、TTF-1パスウェイが活性化していた。4.非コードRNAの検索:腺癌については、非コードRNAの発現パターンと、臨床病理情報、ゲノム不安定データ、その他の因子との相関を継続して検討中である。5.PD-L1の発現と予後:肺腺癌において、PD-L1の発現を検索し、予後との相関を検討した。その結果、一般にPD-L1高発現の症例は予後不良であった。この傾向は、喫煙者でのみ有意であり、非喫煙者では、予後の差は無かった。採択以降、免疫チェックポイント阻害薬が注目されるようになったので、ゲノム不安定性・メチル化の費用をPD-L1解析に向けている。昨年度までに、ドライバー変異のない肺癌90例について、組織型、病期、予後、喫煙・アスベストに対する曝露歴、腫瘍歴、家族歴などをまとめ、腫瘍の組織アレイを作製した。また、miRNA発現を網羅的に検索した。mRNA発現は、新鮮凍結材料を用いたアレイ解析と、FFPE材料を用いたnCounterでの解析を比較した。外来発がん因子では、喫煙・アスベスト曝露とmiRNAの発現と相関を検討し、アスベスト曝露に特有のmiRNAを抽出した。本年度は、症例をまとめたデータベースを作製し、組織マイクロアレイを用いて、アレルデータ、miRNA発現、mRNA発現検索のデータの統合的解析を試みたが、miRNAとmRNAとでクラスターが一致せず、再度検索中である。

本研究計画採択後に、急速に注目されてきた、免疫チェックポイント阻害薬関連のバイオマーカーについて、PD-L1、B7-H3に注目し、本研究への付加項目として検索した。PD-L1発現は、ドライバー変異のない肺癌(多くは喫煙者の肺癌)に多いことが判明している。検索の結果、PD-L1発現は腺癌では予後不良因子であったが、小細胞癌では予後良好因子であった。B7-H3では、発現と予後との相関は、喫煙状況で異なっていた。すなわち、肺腺癌でのその発現は、重喫煙者では予後良好因子であったが、軽度・非喫煙者では予後との相関は無かった。また、B7-H3高発現は、EGFR変異無しの肺腺癌と相関していた。ドライバー変異(EGFR, KRAS, ALK)のない肺の腺癌は、喫煙などの外来性発癌因子との関連がより濃厚であると推定される。本研究では、mRNAおよびmiRNA発現を網羅的に検索した。外来発がん因子として、喫煙とアスベスト曝露とに着目した。喫煙量、肺内アスベスト量とmiRNAの発現と相関を検討し、アスベスト曝露に特有のmiRNAを抽出できた。miRNA発現とRNA発現の統合的解析を試みたが、miRNAとmRNAとでクラスターが一致せず、再実験を行っている。免疫チェックポイント阻害薬関連のバイオマーカーPD-L1発現は腺癌では予後不良因子であったが、小細胞癌では予後良好因子であった。ほぼ当初の予定通り推進する予定であるが、免疫チェックポイント阻害薬のバイオマーカーになると推定されるPD-L1の発現が、driver変異のない癌で高いことが判明したので、その方向の研究を目的に加え、ゲノム不安定性の解析・メチル化解析のうち、費用のかかるものについては、実施を再検討している。ほぼ当初の予定通り推進する予定であるが、免疫チェックポイント阻害薬のバイオマーカーになると推定されるPD-L1の発現が、ドライバー変異のない癌で高いことが判明したので、その方向の研究を目的に加え、ゲノム不安定性の解析・メチル化解析のうち、費用のかかるものについては、実施を再検討している。29年度が最終年度であるため、記入しない。腫瘍病理学29年度が最終年度であるため、記入しない。
新しい発想による超伝導マグネット作製技術に関する研究

超伝導マグネットは、多大な電力を消費することなく、非常に強い磁場を発生することが出来ることから、エネルギー、医療、輸送など応用分野は非常に広い。本研究は、現在行われている冶金学的な線材製造技術に頼らず、「新しい視点から、超伝導マグネットを製造する技術」の開発を目標とし、我々が考案した直径Dの薄膜円筒基板上に超伝導体をヘリカルな線状に形成することにより、一層分のソレノイドコイルを得る方法(πD法)を採用した。この方法では、必要な超伝導体形成技術は、πD、すなわち、数m以下の長さに対するもので十分となる。本研究では歪に対して超伝導特性が安定で、大型超伝導機器への利用が有望視されているNb_3Al超伝導体を対象とした。今回、直径50μmのNbワイヤーを金属基板上に配置し、その上からAlパウダーをプラズマ溶射にて吹き付け、サンプル前躯体を作製した。その後、Nbワイヤー直上を電子ビームで照射してNb_3Alサンプルを作製した。前躯体は、基板材質とプラズマ溶射の溶射電流値をパラメータにした。また、電子ビーム照射は、電子ビームの出力と送り速度をパラメータにした。サンプルの評価および解析は、(1)X線回折、(2)SQUIDによる磁化の温度依存性、(3)SEMによる断面観察とEDSによる断面の元素分析、(4)電気抵抗の温度依存性測定、(5)磁場下での臨界電流密度測定、を実施した。基板材質の違いでは、SUSの基板を用いた場合では、Nb_3Alを確認することはできなかった。Nb基板では、電子ビーム照射の投入熱量が1300W以上において、X線およびSQUIDにてNb_3Alを確認することができた。しかしながら、SEMによる断面観察結果からこれらの投入熱量では、Nbワイヤーが完全に溶融しており、Nb_3Alの生成部位を特定するには至らなかった。本研究では、当初目標としていた直線状のNb_3Alを作製するには、Nbワイヤーの径が小さかったため十分な成果を得ることが出来なかったが、Nb_3Al超伝導特性の確認および磁場依存性の臨界電流の評価など多くの知見を得ることが出来た。この方法では、マグネットを製造するために必要な超伝導体形成技術は、πD、すなわち、数m以下の長さに対するもので十分となる。今回、歪に対して超伝導特性が安定で、大型超伝導機器への利用が有望視されているNb_3Al超伝導物質を対象とした。我々の過去の研究研究から、NbとAlの混合パウダーを吹き付けた後で電子ビーム照射を行っただけでは連続なNb_3Alを生成することは困難であるという実績を得ている。今回、マイクロプラズマという新しいプラズマ発生方法を採用し、NbとAlのシーズワイヤーから基板上に、NbおよびAlのデポジットを行って前躯体を作製し、その後電子ビーム照射にてNb_3Alを作製するという計画のもとで実験を行った。第一に、マイクロプラズマ実験用回転・直動装置を開発し、基板が回転および並進できる実験装置を製作した。次にこの装置を使用して、まずはNbのデポジットを行った。ここでは、Nbの融点の2470度という高温をマイクロプラズマで安定に生成させることが困難であることが分かった。これは、マイクロプラズマの生成自体が一定のパラメータを採用しても再現性が悪いことも起因している。そこで、マイクロプラズマとは異なるプラズ溶射を利用したAl薄膜とNbワイヤーを用い多Nb_3Al前駆体を作製する方法を並行して行うことにした。

基板材質の違いでは、SUSの基板を用いた場合では、Nb_3Alを確認することはできなかった。Nb基板では、電子ビーム照射の投入熱量が1300W以上において、X線およびSQUIDにてNb_3Alを確認することができた。しかしながら、SEMによる断面観察結果からこれらの投入熱量では、Nbワイヤーが完全に溶融しており、Nb_3Alの生成部位を特定するには至らなかった。本研究では、当初目標としていた直線状のNb_3Alを作製するには、Nbワイヤーの径が小さかったため十分な成果を得ることが出来なかったが、Nb_3Al超伝導特性の確認および磁場依存性の臨界電流の評価など多くの知見を得ることが出来た。
植物病原菌の生育を抑制するマイコウイルスの機能解析及び生物防除資材としての開発

本研究ではイネいもち病菌を弱毒化するマイコウイルス(Magnaporthe oryzae chrysovirus 1,MoCV1)の生化学的解析を行い、MoCV1のウイルスゲノムは少なくとも4つの分節ゲノムを有し、直径約33nmの粒子に各dsRNAセグメントが1成分ずつパッケージングされることを明らかにした。スフェロプラスト化を経ないMoCV1の細胞外感染実験を試みたところ、ウイルス散布された菌体中からはMoCV1由来のdsRNAゲノムが存在することを確認でき、菌糸体への直接感染を示唆する結果を得た。植物病原菌の防除は化学農薬への依存が高く、環境負荷低減型農業への変換が食の安全面からも期待されている。本研究は、重要作物であるイネに重大な被害をもたらすイネいもち病菌と、生活環境に広く存在し、かつ植物病原菌としても重要であるアルタナリア菌の生育を抑制しうるマイコウイルスに着目して、これらを新しい植物病原菌防除法のツールとして開発することを目的とする。イネいもち病菌マイコウイルスは4成分の2本鎖RNAゲノムを有するものが多いが、中には2種のウイルスが混合感染して8成分のウイルスゲノムが存在する菌株もある。これらマイコウイルスのうち、3.6kbp, 3.2kbp, 2.9kbp, 2.8kbpのサイズの2本鎖RNAは分節パターンからクリソウイルス科に分類されることが示唆され、MoCV (Magnaporthe oryzae Chrysovirus)と称した。一方、2.0kbp, 1.8kbp, 1.5kbpの2本鎖RNAゲノムに関してはシークエンス解析の結果、アマさび病菌内在性2本鎖RNAと相同性があることが判明し、MoEV (Magnaporthe oryzae Endogenous Virus)と称した。アルタナリア・アルタナータ菌マイコウイルス(AaV-1)に関しては、ウイルス粒子を精製後、N末解析と内部アミノ酸配列解析を試みたところ、ウイルス粒子タンパク質はdsRNA3にコードされることが明らかとなった。AaV-1をマイコウイルスフリーのアルタナリア・アルタナータに導入させる感染実験を行う際には、ウイルス感染の有無を簡便に確認するELISAシステムが必要であり、そのために抗原としてウイルス粒子約1mgを調整して抗体作製を行った。ELISAによる検出システムは出来たが、精度の高い実験実施のために、アフィニティー精製による抗体の再精製を行っている。本研究は、重要作物であるイネに重大な被害をたらすイネいもち病菌と、生活環境に広く存在し、かつ植物病原菌としても重要であるアルタナリア菌の生育を抑制するマイコウイルスに着目して、これらを新しい植物病原菌防除法のツールとして開発することを目的とする。イネいもち病菌マイコウイルスは4成分の2本鎖RNAゲノムを有するものが多い。これらマイコウイルスのうち、3.6kbp,3.2kbp,2.9kbp,2.8kbpのサイズの2本鎖RNAは分節パターンからクリソウイルス科に分類されることが示唆され、MoCV1 (M__-agnaporthe o__-ryzae C__-hrysov__-irus)と称した。MoCV1ウイルス粒子の精製を行い、抗ウイルス粒子抗体を作製し、抗体を用いたウイルス粒子の検出システムの構築に着手した。特にMoCV1は長期間の培養を続けると液体培養上清中にウイルス粒子が存在するようになるが、作製した抗体を利用したELISA法によるマイコウイルスの検出系の構築により、この現象が生じるメカニズムについて明らかにしていく。アルタナリア・アルタナータ菌に関しては、鳥取大学植物病理学研究室から新たに分譲を受けた16株のうち、6株から新規なマイコウイルス由来の2本鎖RNAの検出に成功した。これらのうち、1株については単胞子分離法による治癒処理により完全ウイルスフリー株の取得に成功した。また他のウイルス混合感染株1株については一部ウイルス脱落株の作出にも成功した。完全ウイルスフリー株やウイルス一部脱落株は、オリジナル感染株と比較すると明らかに生育状況が異なり、これら新規なマイコウイルスも宿主であるアルタナリア・アルタナータ菌の生育に影響を与えることが明らかとなった。本年度研究では、研究代表者らが独自に発見したイネいもち病菌を弱毒化するマイコウイルス(Magnaporthe oryzae chrysovirus 1,MoCV1)の遺伝子構造やウイルス粒子構造を明らかにした。MoCV1のウイルスゲノムは、dsRNA1(3,554nt)、dsRNA2(3,250nt)、dsRNA3(3,074nt)、dsRNA4(3,043nt)の少なくとも4つの分節ゲノムで構成されており、ウイルス粒子の形態は直径35nmの球形で浮遊密度は1.36-1.39g/cm^3であり、粒子には各dsRNAセグメントが1成分つつパッケージングされることを明らかにした。

REMI法による形質転換技術を利用したマイコウイルス感染実験においては、薬剤耐性遺伝子を有するDNAプラスミドの形質転換技術は確立したが、ウイルス感染技術の確立は継続検討中である。現在、各ウイルス遺伝子由来のcDNAクローンをイネいもち病菌に形質転換する実験も進めており、弱毒化の要因となるMoCV1遺伝子を特定化する実験を進行中である。尚、研究者らはMoCV1がマイコウイルスとしては新しい特徴である細胞外での存在が可能であることを見出していたが、ウイルスフリー株のイネいもち病菌に、液体培養中に菌体中から浮遊してきたMoCV1を接種すると、ウイルス散布により委縮した菌体中からは、MoCV1由来のdsRNAゲノムが存在することを確認し、マイコウイルスはスフェロプラスト化を経ずに、菌糸体に直接的に感染できることを示唆する結果を得た。今後はウイルス感染株とウイルスフリー化株との間で、アレイ解析などを行うことで遺伝子発現プロファイルを比較して、ウイルスが原因となる弱毒化現象などの解析を行っていく。
効率的ヒト遺伝子機能解析のためのヒト培養細胞を用いたRNA干渉法の確立

RNAiは、二本鎖RNA(dsRNA)を細胞に導入し塩基配列特異的に遺伝子機能を破壊する方法で、ポストゲノム・シーケンス時代の網羅的遺伝子機能破壊法として注目されている。哺乳類においては、dsRNAによるapoptosisを避けるために21bpからなるsiRNAが長いdsRNAの変わりに用いられてきた。我々は、はじめに、哺乳類におけるsiRNA依存的RNAiに、eIF2C1-4及びDicerが必要であり、これらのタンパク質がeIF2CのPIWIドメインを介して相互作用する事を明らかにした。次いでヒトやマウスの遺伝子機能解明をゲノムワイドで実施する上で問題となるsiRNA法の問題点、即ちランダムに設計したsiRNAのおよそ80%は役にたたないという問題にチャレンジし、それを実際的に克服する方法を見出した。内容の詳細は、発表論文に譲るが、有効なsiRNAは、4つの条件を同時にみたしており、これらは、少なくとも部分的にsiRNAのRISCへの取り込みとsiRNAの変性の過程に依拠していると推定された。コンピュータをも知多解析から、ヒトやマウスのほとんど全ての遺伝子に有効なsiRNAが設計できることが分かり、ここで開発した手法で求めたsiRNAの配列を用いて、ヒトマウスのほとんどの遺伝子の機能かは異がかのうであることが分かった。良く効くsiRNA配列は、細胞内で、配列の類似している別の遺伝子由来のmRNAを破壊するかもしれない。この効果をoff target効果という。off target効果を最小にするコンピュータプログラムをコンピュータ科学の専門家(東京大学大学院新領域研究科・森下真一教授)との共同研究でつくり、最適siRNAを、投入した任意の配列に対してコンピュータで素早く応答するweb site (siDirect)を構築した。ヒトゲノム計画の結果、ヒトゲノムDNAのおおよその塩基配列が決められ、ヒト遺伝子機能の解析に関心が移りつつある。しかし問題はそれをどのようにして行うかである。RNAiとは、dsRNAを細胞に導入し、塩基配列特異的に遺伝子機能を破壊する技法で、線虫、ショウジョウバエや植物で広く使われるようになってきている。我々は、このRNAiが哺乳類遺伝子の機能解析に使えないかと検討してきたが、その結果、ある種の培養細胞では、使用可能であることを世界に先駆けて明らかにした。ヒトの培養細胞も含め多くの哺乳類細胞で、長いdsRNAを用いたRNAi効果をホタルのルシフェラーゼ遺伝子を標的として調べてみると、哺乳類培養細胞は、大きく分けて3つのグループに分けられることが分かった。第一は、チャイニーズハムスター細胞CHOに代表されるグループで、dsRNAを用いたRNAiが実行可能なもの、第2は、dsRNAの導入によりapoptosisを引き起こすグループ。第3は、dsRNAの導入によりapoptosisは引き起こさないが、対照として導入した遺伝子の転写を著しく阻害するグループである。第3のグループの場合には、ある特殊な処理をすることで、長いdsRNAを用いたRNAi効果を、対照となる遺伝子の発現を抑制することなしに引き起こせるらしいことを最近見出した(土井等、論文準備中)。また、一般に、長いdsRNAの代わりに、dsRNAをコードするDNAをトランスフェクションする事で、ある程度のRNAiを誘発できることも見出された(程等、論文準備中)。長いdsRNAの代わりに21bpのsiRNAを用いて、哺乳類細胞で広くRNAi現象を惹起することが可能であることが分かってきた。しかし実際には、塩基配列等の問題点が有ることも指摘されており必ずしも全ての場合にうまくいく訳ではないことも分かりつつある。系統的な研究で、siRNAによるRNAi最適化に関するヒントをつかみつつある(程等、論文準備中)RNA interference、(RNAi)は、長い2本鎖RNAに依存した遺伝子の転写後抑制機構(Posttranscriptional gene silencing,PTGS)である。

下等真核生物においては、細胞質に入った長い2本鎖RNAは、RNase III様の酵素活性を持つ、Dicerと呼ばれるタンパクによって21-23塩基対のshort interfering RNA(siRNA)に切断され、標的mRNAを切断するガイドとして働くと考えられている。一方、哺乳類では、長い2本鎖RNAに依存したPTGSが誘導できるのは、恐らくインターフェロン応答のために、特定の細胞種に限られているが、インターフェロン応答を誘発しない合成siRNAを用いると、様々な細胞種において、効率よく遺伝子阻害効果を示す。下等真核生物における生化学的、遺伝学的解析により、DicerおよびPIWIファミリーに属する遺伝子群は長い2本鎖RNAに依存したPTGSに必須であることが示されている。しかし、siRNAに依存したPTGSの分子メカニズムはよくわかっていなかった。我々は、DicerおよびPIWIファミリーに属する翻訳開始因子である、eIF2C1-4が、いずれもsiRNAによるRNAiに関わること、そしておそらくそれらは相乗的に相互作用にする事を示した。さらに、免疫沈降実験の結果から、ヒトおよびマウスにおいて、DicerとeIF2C1、またはDicerとeIF2C2が複合体を形成すること、また、この複合体形成には、eIF2CのPIWIドメインが必須であることを示した。RNA干渉(RNAi)は、二本鎖RNA (dsRNA)を細胞に導入し塩基配列特異的に遺伝子機能を破壊する方法で、ポストゲノム・シークエンス時代の網羅的遺伝子機能解析法として注目されている。哺乳類においては、dsRNAによるapoptosisを避けるために21bpからなるsiRNAが長いdsRNAの代わりに用いられてきた。siRNA法の問題点は、およそ80%の配列が役にたたない点である。この点の克服は、特にヒトやマウスのゲノムワイドでの遺伝子機能破壊実験にとっては、非常に重要である。我々は、siRNA依存的RNAiの分子機構を解明する過程で、良く効くsiRNA配列を決定することに成功した。詳細は発表論文に譲るが、有効なsiRNAは、4つの条件を同時に満たしており、これらは、少なくとも部分的にsiRNAのRISCへの取り込みとsiRNA変性の過程に依拠していると推定された。コンピュータを用いた解析から、ヒトやマウスの個々の全ゲノム遺伝子に有効なsiRNAの配列を特定することが可能であることが分かり、ここで開発した手法で求めたsiRNA配列を用いて、ヒトマウスのほとんどの遺伝子の機能破壊が可能であることが分かった。良く効くsiRNAは、細胞内で、配列の類似している別の遺伝子由来のmRNAを破壊するかもしれない。この効果をoff target効果という。