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親水性陰イオンの脱水和を促進する官能基を有するイオン交換樹脂の開発研究

1.クロロメチル化ポリスチレン樹脂を出発原料として,ジメチルアミノ型,メチル(2-ヒドロキシエチル)アミノ型およびビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ型の3種類の弱塩基性陰イオン交換樹脂(WBA),トリメチル(2-ヒドロキシエチル)アンモニウム型およびジメチルビス(2-ヒドロキシエチル)アンモニウム型の2種類の強塩基性陰イオン交換樹脂(SBA)を合成した.2.WBAに2-ヒドロキシエチル基を導入しても,各種陰イオンの吸着選択性は,テトラメチルアンモニウム型のSBAと実質的に同じであるが,水和数はかなり減少した.陰イオン上の塩基性サイトとアミノ基上のプロトンとの間の電荷の中和を伴う水素結合の形成は,陰イオンの脱水和を促進するが選択性には寄与しないことが判った.3.SBAに2-ヒドロキシエチル基を一つ導入すると,リン酸およびフッ化物イオンに対する選択性が向上した.二つ目を導入すると,フッ化物イオンの選択性は向上したが,リン酸イオンの選択性はほとんど変わらなかった.静電的な相互作用とは異なる部位での水素結合形成は,親水性陰イオンの脱水和を促進するとともに,吸着選択性も向上させることが明らかとなった.二つの陰イオンに対する挙動の違いは水素結合性アームの長さに対するイオンの大きさの違いによると結論された.4.強酸性の陽イオン交換樹脂に鉄(III)イオンが吸着する際にある種の陰イオンが共存すると,ドナン膜排除の原理に逆らって樹脂相へ侵入することを明らかにした.また,生成する共吸着種の組成にかなりの多様性があることを明らかにした.5.キレートゲルにジルコニウム(IV)を担持して得られる高分子錯体への陰イオン(フッ化物,リン酸,ヒ酸,亜セレン酸)の吸着を,クロマトグラフィーおよびバッチ吸着実験により解明した.フッ化物イオンに対する親和性は特に高く,強酸性領域では逐次に2モルまで,弱酸性領域では水酸化物イオンと共に吸着しうることを明らかにした.1.クロロメチル化ポリスチレン樹脂を出発原料として,ジメチルアミノ型,メチル(2-ヒドロキシエチル)アミノ型およびビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ型の3種類の弱塩基性陰イオン交換樹脂(WBA),トリメチル(2-ヒドロキシエチル)アンモニウム型およびジメチルビス(2-ヒドロキシエチル)アンモニウム型の2種類の強塩基性陰イオン交換樹脂(SBA)を合成した.2.WBAに2-ヒドロキシエチル基を導入しても,各種陰イオンの吸着選択性は,テトラメチルアンモニウム型のSBAと実質的に同じであるが,水和数はかなり減少した.陰イオン上の塩基性サイトとアミノ基上のプロトンとの間の電荷の中和を伴う水素結合の形成は,陰イオンの脱水和を促進するが選択性には寄与しないことが判った.3.SBAに2-ヒドロキシエチル基を一つ導入すると,リン酸およびフッ化物イオンに対する選択性が向上した.二つ目を導入すると,フッ化物イオンの選択性は向上したが,リン酸イオンの選択性はほとんど変わらなかった.静電的な相互作用とは異なる部位での水素結合形成は,親水性陰イオンの脱水和を促進するとともに,吸着選択性も向上させることが明らかとなった.二つの陰イオンに対する挙動の違いは水素結合性アームの長さに対するイオンの大きさの違いによると結論された.4.強酸性の陽イオン交換樹脂に鉄(III)イオンが吸着する際にある種の陰イオンが共存すると,ドナン膜排除の原理に逆らって樹脂相へ侵入することを明らかにした.また,生成する共吸着種の組成にかなりの多様性があることを明らかにした.5.キレートゲルにジルコニウム(IV)を担持して得られる高分子錯体への陰イオン(フッ化物,リン酸,ヒ酸,亜セレン酸)の吸着を,クロマトグラフィーおよびバッチ吸着実験により解明した.フッ化物イオンに対する親和性は特に高く,強酸性領域では逐次に2モルまで,弱酸性領域では水酸化物イオンと共に吸着しうることを明らかにした.1.一連の陰イオンを陰イオン交換樹脂(I型)上に捕捉して水和数を測定したところ,脱水和のエネルギーが大きいものほど多くの水を伴っていることを見出した.しかしながら,脱水和のエネルギーが400kJ/molを越えると水和数は3-4に収束した.一方,メチル基の一つがヒドロキシエチル基に置き換わった陰イオン交換樹脂(H型)上での水和数は,上述の樹脂と比較して僅かに少なかったが,リン酸二水素イオンだけは著しく脱水していた.リン酸二水素イオンとヒドロキシエチル基との間の水素結合のために,脱水和が促進されることが明らかとなった.これらの選択係数は脱水和エネルギーと良い相関性を示したが,400kJ/molを越えると一定値に漸近した.II型のリン酸二水素イオンはこの相関性から期待されるよりも大きい選択係数を示し,上述の水素結合およびそれによる脱水和の促進が吸着選択性を向上させることを見出した.弱塩基性の陰イオン交換樹脂(WBA型)についても測定を行ったところ,同様にリン酸二水素イオンは著しく脱水しており,これに対応して吸着選択性も向上した.以上の知見を基にして,ヒドロキシエチル基を二つ導入した新規の弱イオン交換樹脂を合成し,その性能を評価した結果,上記のいずれよりも優れたリン酸選択性が観測された.2.これらの研究を補完する意味で,一連の陽イオンを強および弱酸性陽イオン交換樹脂に捕捉して,水和数を測定したところ,強酸性型ではいくつかの例外を除いてアクアイオンとして吸着するのに対して,弱酸性型ではかなりの脱水和が起こることを明らかにした.

3.また,Feイオンの吸着に当たってある種の陰イオンが共吸着することを実験的に明らかにすると共に,Feイオンを架橋する能力を有する陰イオンが特に吸着されやすく,水和を含めて樹脂中でかなり配位不飽和になっていることを見出した.上記の知見に対して,現在3編の論文が投稿中あるいは執筆中である.1.クロロメチル化ポリスチレン樹脂を出発原料として,ジメチルアミノ型,メチル(2-ヒドロキシエチル)アミノ型およびビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ型の3種類の弱塩基性陰イオン交換樹脂(WBA),トリメチル(2-ヒドロキシエチル)アンモニウム型およびジメチルビス(2-ヒドロキシエチル)アンモニウム型の2種類の強塩基性陰イオン交換樹脂(SBA)を合成した.2.WBAに2-ヒドロキシエチル基を導入しても,各種陰イオンの吸着選択性は,テトラメチルアンモニウム型のSBAと実質的に同じであるが,水和数はかなり減少した.陰イオン上の塩基性サイトとアミノ基上のプロトンとの間の電荷の中和を伴う水素結合の形成は,陰イオンの脱水和を促進するが選択性には寄与しないことが判った.3.SBAに2-ヒドロキシエチル基を一つ導入すると,リン酸およびフッ化物イオンに対する選択性が向上した.二つ目を導入すると,フッ化物イオンの選択性は向上したが,リン酸イオンの選択性はほとんど変わらなかった.静電的な相互作用とは異なる部位での水素結合形成は,親水性陰イオンの脱水和を促進するとともに,吸着選択性も向上させることが明らかとなった.二つの陰イオンに対する挙動の違いは水素結合性アームの長さに対するイオンの大きさの違いによると結論された.4.強酸性の陽イオン交換樹脂に鉄(III)イオンが吸着する際にある種の陰イオンが共存すると,ドナン膜排除の原理に逆らって樹脂相へ侵入することを明らかにした.また,生成する共吸着種の組成にかなりの多様性があることを明らかにした.5.キレートゲルにジルコニウム(IV)を担持して得られる高分子錯体への陰イオン(フッ化物,リン酸,ヒ酸,亜セレン酸)の吸着を,クロマトグラフィーおよびバッチ吸着実験により解明した.フッ化物イオンに対する親和性は特に高く,強酸性領域では逐次に2モルまで,弱酸性領域では水酸化物イオンと伴に吸着しうることを明らかにした.
新概念に基づく超高能率ナノメータ超平滑研削盤の試作

近年の機器の高品位化・低価格化に伴い,部品の高精度化・高平滑化や高能率化が求められている.このため,現在,高平滑部品の最終工程では,ラッピングやポリシング等の遊離砥粒による定圧力研摩加工法が用いられているが,加工能率が非常に悪いという課題がある.この観点から,研摩加工に替える目的で,固定砥粒法である研削加工において,研究代表者は,現在用いられているプランジ・トラバースでは,実現が難しい超平滑加工を可能とする新概念に基づく方法を考案・開発した.そして,横型角テーブル型研削盤により,平滑度・加工能率についての有用性が確認された.しかし,横軸研削方式では,格段の加工能率を得ることが難しかった.本研究では,この点を踏まえ,その高能率化を図るために,超平滑研削加工法の加工能率を解析した結果に基づいて小径砥石を超高速回転させる方式の立型研削盤を設計試作し,その有用性を検討した.製作した立型研削盤は,汎用立型研削盤を改造したものと,新しく設計試作した4コラム型の高剛性立型研削盤の2台である.それらの検討とともに,多数の砥粒切れ刃が不規則に分布し,手動的評価が難しい砥石作業面上の切れ刃の自動画像処理による自動評価システムを構築した.また,横型角テーブル型研削盤を用いて,超平滑研削加工特性の検討を行った.その結果の概要は,以下の通りである.(1)新しく試作した,改造型および4コラム高剛性型の2種類の立型研削盤ともに,ファインセラミックや超鋼合金・焼き入れ処理ダイス工具鋼等の難削材金属を3次元測定で,50nm(Rz)程度以下,2次元測定で20nm(Rz)以下の仕上面に研削加工することが可能である.その加工能率は,横型研削盤の数倍以上である.(2)ファインセラミックの超平滑研削加工には,研削油剤の種類や希釈倍率などの研削液供給方法が大きな影響を及ぼす.(3)通常の研削加工法で考えられている砥石切込み10μmの100倍程度の砥石切込み1mmで,炭化けい素ファインセラミックの超平滑研削加工が行い得ることが見出された.(4)構築した全砥石作業面自動評価システムは,形直し・日直し,研削加工,砥石寿命に至る全研削作業過程で,定量的に切れ刃の挙動を追跡することが可能で,有用な砥石作業面評価システムであることが確認された.近年の機器の高品位化・低価格化に伴い,部品の高精度化・高平滑化や高能率化が求められている.このため,現在,高平滑部品の最終工程では,ラッピングやポリシング等の遊離砥粒による定圧力研摩加工法が用いられているが,加工能率が非常に悪いという課題がある.この観点から,研摩加工に替える目的で,固定砥粒法である研削加工において,研究代表者は,現在用いられているプランジ・トラバースでは,実現が難しい超平滑加工を可能とする新概念に基づく方法を考案・開発した.そして,横型角テーブル型研削盤により,平滑度・加工能率についての有用性が確認された.しかし,横軸研削方式では,格段の加工能率を得ることが難しかった.本研究では,この点を踏まえ,その高能率化を図るために,超平滑研削加工法の加工能率を解析した結果に基づいて小径砥石を超高速回転させる方式の立型研削盤を設計試作し,その有用性を検討した.製作した立型研削盤は,汎用立型研削盤を改造したものと,新しく設計試作した4コラム型の高剛性立型研削盤の2台である.それらの検討とともに,多数の砥粒切れ刃が不規則に分布し,手動的評価が難しい砥石作業面上の切れ刃の自動画像処理による自動評価システムを構築した.また,横型角テーブル型研削盤を用いて,超平滑研削加工特性の検討を行った.その結果の概要は,以下の通りである.(1)新しく試作した,改造型および4コラム高剛性型の2種類の立型研削盤ともに,ファインセラミックや超鋼合金・焼き入れ処理ダイス工具鋼等の難削材金属を3次元測定で,50nm(Rz)程度以下,2次元測定で20nm(Rz)以下の仕上面に研削加工することが可能である.その加工能率は,横型研削盤の数倍以上である.(2)ファインセラミックの超平滑研削加工には,研削油剤の種類や希釈倍率などの研削液供給方法が大きな影響を及ぼす.(3)通常の研削加工法で考えられている砥石切込み10μmの100倍程度の砥石切込み1mmで,炭化けい素ファインセラミックの超平滑研削加工が行い得ることが見出された.(4)構築した全砥石作業面自動評価システムは,形直し・日直し,研削加工,砥石寿命に至る全研削作業過程で,定量的に切れ刃の挙動を追跡することが可能で,有用な砥石作業面評価システムであることが確認された.1)新概念に基づく超平滑研削盤の試作近年,研究代表者によって開発された,新概念による超平滑研削加工原理に基づき,超平滑立型平面研削盤を,試作速度や予算的問題等を考え,大学で試作した.新概念超平滑研削加工原理は,次のようなものである.

(1)従来のトラバース研削法とは逆に,まず砥石あるいは工作物を研削方向とは直角方向に,砥石1回転当たりの工作物直角送り量f_<Gn>が,研削方向と直角方向の切れ刃逃げ面摩耗幅w_n(摩耗面が連なるとみなされる場合には,それを複合したもの)以下となるような送り速度で,砥石-工作物接触幅を加工する.(2)次いで,幾何学的に計算される砥石-工作物の干渉高さ(研削方向平行仕上面粗さH_pに相当)が,要求する高平滑仕上面粗さH_<max>以下になるように,微小な研削方向平行に間欠送り量f_pだけ,工作物あるいは砥石を間欠的に移動する.そして,次の砥石-工作物接触幅を仕上げる.開発された超平滑研削法は,このようなことを繰り返して,工作物全面を加工し,研磨加工に替え得る,あるいは,研磨加工に近い超平滑研削仕上を行おうとするものである.試作研削盤の基本構造は,次のようなものである.砥石主軸が箱形研削盤コラムから懸垂形に吊り下げられ,Z軸方向に移動する構造である.砥石主軸には,砥石回転数N_wを大きくしても,高砥石周速度にはならず,研削方向直角送り速度(砥石1回転当たりの研削方向直角送り量×砥石回転数)を大きくできるように,超高速砥石スピンドルを使用している.研削盤テーブルとしては,本年度は,X-Yテーブルを用いた.砥石軸およびX-Yテーブルの移動制御にはサーボモータを用い,パーソナルコンピュータで独立で駆動でき,1μm以下の精度で移動が可能である.2)超平滑研削可能性の概括的検討上記で製作した立型平面超平滑研削盤を用いて,炭化けい素の超平滑研削面加工の可能性を,概括的に検討した.その結果,砥石軸回転数約20,000rpmの馴らし運転の状況であるが,40nm(P-V値)以下の超平滑面を得ることが出来た.次年度で詳細な検討が行い得ることがわかった.1)平成15年度試作の新概念超平滑立軸研削盤の機械特性の検討と改善(1)試作した超平滑立軸平面研削盤の砥石切込み精度とX-Yテーブルの運動精度の検討を行った結果,1μm程度であった.ソフトウエアを改善するとともに,支持機構を高剛性化し,100nm程度の運動精度を確立した.また,3次元曲面加工技術を構築した.(2)高速スピンドルの回転についての検討を行い,150,000rpmまでの高速駆動を順次検討し,問題がないことを確認した.2)汎用立軸研削盤の改良(1)上記試作立軸研削盤に加えて,より高能率に研究を遂行するために,汎用立軸研削盤を改良し,実験に加えることができた.(2)この研削盤では,回転テーブルを使用できる.ただし,回転速度や砥石切込み等は手動で行う.3)試作超平滑立軸研削盤と改良汎用立軸研削盤を用いた研削特性の検討(1)ダイス工具鋼,超鋼合金,セラミック等の各種材料で,50nm(P-V値)以下の超平滑面を得ることができた.なお,炭化けい素セラミックでは,50mm角の大きさで,この結果を得ている.(2)ただし,砥石作業面の状態や研削液供給方法(研削液の種類も含む)が適切なことが必要で,安定的に超平滑面を得るための条件選択を確立するまでには至らなかった.今後も引き続き検討する予定である.4)横軸平面研削盤による超平滑研削特性の検討と砥石作業面評価システムの改善(1)横軸平面研削盤を用いた超平滑研削特性の検討を行い,炭化けい素セラミックで砥石切込み1mm以上の加工ができることを見出した.(2)また,従来製作済みの自動砥石作業面画像処理システムに加えて,砥石半径方向の砥石作業面変化挙動追跡システムを構築した.適切な砥石作業面の作成の研究に役立っている.
日韓新石器時代における鱗茎利用の時空間的変遷の解明

1)現生鱗茎標本の採取・観察春と秋の2回に渡って現生鱗茎標本の収集を行った。実体顕微鏡下で収集した鱗茎の外部形態(横断面)の観察・計測と写真撮影を行った。土器の圧痕として見られる鱗茎と比較するため、春に現生鱗茎の子球を採取し、小型の鱗茎圧痕との比較を行った。2)遺跡出土鱗茎の収集・観察・同定茨城県上境旭台遺跡から出土した縄文時代後期の土器付着炭化鱗茎の同定を行い、複数の土器破片でツルボと同定した。成果は、論文で発表した。さらに新たな遺跡で、出土炭化鱗茎を見出し、同定に取り組み、論文化の準備を行った。また、複数遺跡の土器から鱗茎圧痕が見出されることが明らかになった。レプリカで種レベルの同定を行うには外部形態と細胞レベルの検討が必要なため、現生の鱗茎外形形態や表皮細胞の観察に着手し、生の状態での観察や炭化させた鱗茎の計測、記録を行った。3)現生鱗茎を用いた実験・民俗調査現生のツルボ鱗茎を用いてアク抜き方法の検討を行うため、試作した土器で灰を使ったアク抜き実験を行った。またアク抜き過程で茹でこぼしを行うのに、かごの中に入れて処理すると効率が良く、なおかつ蓋つきの土器で行った方がより熱効率が良いことが想定された。平成30年度は、関東地方の遺跡から新たな土器付着炭化鱗茎資料が得られ、状態が良いため、これまでの既報の遺跡出土報告例を検討するのではなく、新たに見出された関東地方の炭化鱗茎を重点的に行った。また、炭化鱗茎だけでなく、土器圧痕としても鱗茎をしばしば見出したため、現生鱗茎との比較を行って、比較可能な識別点を見出すことに専念した。北関東地方における土器付着炭化鱗茎にツルボがあることを明らかにできたため、他地域での鱗茎を探索していく。また既存の炭化鱗茎の再検討を進める。土器圧痕として出土する鱗茎が複数あることが新たに判明したため、これらの圧痕鱗茎の再検討を行い、種を明らかにする。また土器作りの場に鱗茎そのものではなく子球が残されている意味を解析し、学会、論文等に発表する。1)現生鱗茎標本の採取・観察先行研究により収集した鱗茎のリスト(10種)を基盤として、東北大学植物園の協力の下、春と秋の2回に渡って現生鱗茎標本の収集した。実体顕微鏡下で収集した鱗茎の外部形態(横断面)の観察・計測と写真撮影を行い、生の鱗片から包埋切片を作製して、組織を観察し、前科研で開発した同定基準を補強、高精度化した。2)遺跡出土鱗茎の収集・観察・同定宮崎県王子山遺跡から出土した縄文時代草創期の炭化鱗茎の種類の同定を行い、ツルボと同定した。本科研以前も検討したが、その際には同定の基準は定まっていなかった。鱗茎は、13400年前の年代が与えられており、日本列島最古の鱗茎がツルボであることを明らかにした。また鹿児島県芝原遺跡から出土した縄文時代後期の土器付着炭化鱗茎の同定を行い、ツルボと同定した。これらの成果は、日本植生史学会で発表した。富山県小竹貝塚から出土した土器付着炭化鱗茎の同定を行い、ツルボであることを明らかにした。現在論文を投稿中である。茨城県上境旭台貝塚から土器付着炭化鱗茎が複数個体出土していることを確認し、次年度分析を進めるべく土器の選定を行った。さらに、東京都多摩ニュータウン遺跡群の縄文時代中期の土器圧痕に鱗茎が含まれていることをレプリカ法によって明らかにし、論文で公表した。ただし、圧痕のレプリカでは細胞レベルの検討ができず、鱗茎の科以上の同定はできなかった。弥生時代初期の鱗茎利用を検討するため、神奈川県中屋敷遺跡出土土坑覆土の水洗作業を行い、炭化植物遺体の検討を行った。3)現生鱗茎を用いた実験・民俗調査今年度は実験はできなかったが、韓国におけるツルボ利用の民俗調査を行い、いくつかの文献から利用や食用化にあたり重要な示唆を得ることができた。平成29年度は関東・中部地方を中心とした出土炭化鱗茎を調査予定であったが、関東地方での新たな炭化鱗茎出土遺跡が得られたことや、過去の調査の炭化鱗茎を再同定したため、調査を予定していた遺跡の検討が全てできなかった。また、炭化鱗茎だけでなく、土器圧痕としても鱗茎を見出したため、研究対象が当初よりも広がった。

レプリカで種レベルの同定を行うには外部形態と細胞レベルの検討が必要なため、現生の鱗茎外形形態や表皮細胞の観察に着手し、生の状態での観察や炭化させた鱗茎の計測、記録を行った。3)現生鱗茎を用いた実験・民俗調査現生のツルボ鱗茎を用いてアク抜き方法の検討を行うため、試作した土器で灰を使ったアク抜き実験を行った。またアク抜き過程で茹でこぼしを行うのに、かごの中に入れて処理すると効率が良く、なおかつ蓋つきの土器で行った方がより熱効率が良いことが想定された。平成30年度は、関東地方の遺跡から新たな土器付着炭化鱗茎資料が得られ、状態が良いため、これまでの既報の遺跡出土報告例を検討するのではなく、新たに見出された関東地方の炭化鱗茎を重点的に行った。また、炭化鱗茎だけでなく、土器圧痕としても鱗茎をしばしば見出したため、現生鱗茎との比較を行って、比較可能な識別点を見出すことに専念した。平成30年度に平成29年度調査予定であった遺跡出土鱗茎の調査も合わせて調査を行っていく。また、新たに土器圧痕として鱗茎がしばしば残存することが明らかになったため、土器に鱗茎を埋め込むなどの実験を重ね、圧痕での鱗茎の同定方法も模索する。北関東地方における土器付着炭化鱗茎にツルボがあることを明らかにできたため、他地域での鱗茎を探索していく。また既存の炭化鱗茎の再検討を進める。土器圧痕として出土する鱗茎が複数あることが新たに判明したため、これらの圧痕鱗茎の再検討を行い、種を明らかにする。また土器作りの場に鱗茎そのものではなく子球が残されている意味を解析し、学会、論文等に発表する。3月分の研究補助業務の支払い金額が残金より大きくなり、次年度分の直接経費と合わせて支出することにしたため。予算自体は年度内に使用したが、会計を年度超えて処理することにしたため。
鉄および鉄基合金の固液界面エネルギー測定

液相および2つの固相を取り扱う多相合金系のフェーズフィールド方程式を導出した。ここでは、各相のそれぞれにフェーズフィールドを定義し、thin interface limit条件における各フェーズフィールドパラメータを求めた。このモデルを用いて鉄-炭素合金の包晶凝固過程の解析を試み、初晶δファライト界面に沿うように包晶オーステナイト相が成長すること、その成長は各相の界面エネルギーにより変化することを確認した。また、各種金属の界面エネルギーおよび界面成長カイネティクスの値およびその異方性を文献調査し、これらの値を用いた2次元フェーズフィールド解析により鉄の界面安定性パラメータを求め、0.102の値を得た。さらに、鉄のデンドライト成長速度と過冷度の関係を2次元フェーズフィールド解析結果から推定し、実験値と比較した結果、実験との良い一定を得た。また、等方的界面特性を仮定したによりデンドライト成長理論(LKTモデル)との関連を検討し、安定性パラメータとして1/4π^2を用いた場合には、両者はほぼ同じ成長速度を与えることを見出した。この結果は、LKTモデルは先端形状を正しく記述していないものの、等方界面を想定した場合の平均的デンドライト成長速度予測には有効であるとの結論を得た。なお、鉄基合金の2次元一方向急冷凝固試料の作成実験を試みたものの、試料充填時の鋳型破損、試料中の残存酸素により試料表面が酸化され、これが鋳型材料のサファイヤと反応すること、急冷時の鋳型破損等の要因により、急冷試料の作成実験には成功しなかった。このため、本研究終了後も引き続き、装置改良と実験条件の最適化を検討する予定である。液相および複数の固相を取り扱うことのできる多相合金系のフェーズフィールドモデルを導出した。ここでは、液相、固相1、固相2にそれぞれφ1、φ2、φ3のフェーズフィールドを定義し、その和が常に1になる条件を課し、その条件のもとで各フェーズフィールドに対する方程式を導出した。また、このようなフェーズフィールドを用いた場合についてthin interface limit条件におけるフェーズフィールドパラメータを求めた。導出したフェーズフィールドモデルの解析精度を検証するために、結晶方位の異なる2つの結晶が液相と平衡する場合の界面形状を解析した。その結果、フェーズフィールドモデルによる解と解析解の誤差は十分に小さいことが明らかになった。また、本モデルを用いて鉄-炭素合金の包晶凝固過程の解析を試みた。初晶であるδファライトデンドライトの界面に沿うように包晶であるオーステナイト相が成長すること、その成長はフェライト/液相、オーステナイト/液相の界面エネルギーの相対値により変化することが確認できた。また、鉄基合金の2次元一方向凝固試料を作成するための実験装置を試作し、これを用いた予備実験を行った。装置は、タングステンヒーターによる加熱部と試料保持・移動部からなり、高真空雰囲気下での実験を可能とするものである。予備実験の結果、装置自身は所定の機能を発揮するものの、鉄基合金試料を保持する鋳型の破損などの問題も生じ、今後の改良が必要であることが分かった。
健常人において見られた自己抗体に対応する細胞周期特異的自己抗原の同定と解析

[目的]健常小児で蛍光抗体法による抗核抗体高値例が見出された。既知の抗原抗体系とは異なるため、検討を加えた。[結果]健常小児の血清多数例についてHEp-2細胞を用いた間接蛍光抗体法により抗核抗体の有無をスクリーニングし、予想以上にその陽性率が高いことおよび基準値を引き上げる必要性があることを見出した。この中には、かなりの高力価陽性者(640倍以上)が含まれていたが、それらにおいて既知の疾患標識抗体は陰性であった。これらの小児検体についてその対応抗原を同定するためimmunoblottingを施行したところ、50kDに陽性バンドを示すもの、あるいは75kDに陽性バンドを示すもの等があり、それらのheterogenousな性質が判明したためこれを報告した(アジア臨床病理学会、1998)。また各種疾患患者において出現する既知の疾患標識抗体の対応抗原についてHEp-2細胞抽出液を抗原として用いたimmunoblotting法により検討した。U1-RNPにおいては65kDおよび27kDの位置にバンドが確認され、以下、Smでは27kD、SS-Aでは36kD、SS-Bでは50kD、Scl-70では70kDの位置にバンドが確認され、報告予定である(国際電気泳動学会、1999)。小児において特徴的に多く見出されたのはSLEに特異的とされる抗PCNA抗体に類似のパターン(PCNA-like)を示すものであり、これについて検討を進めた。このパターンは細胞周期依存性に発現される抗原に対する抗体と考えられた。この抗体は種々の疾患患者に見られ、疾患特異性は低いことが判明した。これらについてimmunoblottingを施行したところ、多くの例で80kDと60kDの位置にバンドが見られ、かなりhomogenousな性質が見出された。これらについて、初期の予定ではhuman cDNA libraryを用いて抗原同定まで施行する予定であったが、現在、進行中であり、引き続き検討を進め、当初の目標まで到達する予定である。1.今年度の成果研究の出発点である健常小児の抗PCNA抗体類似のパターンを示した検体が、研究の中途にて量の不足を生じてきたため、さらに抗核抗体検出用のHEp2細胞を用いた間接蛍光抗体法にて、スクリーニングを重ねて、さちにいくつかの小児患者由来の検体を見いだした。この検討過程において、さらに、なんら症状もないのにspeckled型で非常な高力価を示す検体や、granular型で同様に高力価を示すものなど、種々の興味深いパターンを示す検体が見いだされた。これらはいずれも既存の特異抗原検出系ELISA等ではいずれも陰性を示すものであった。2.今後の研究計画抗PCNA抗体類似のパターンを示す検体をさらにスクリーニングするとともに、見いだされた検体についてRTE、HEp2細胞抽出液を用いたSDS-PAGE後、Western blotを行い、対応抗原の分子量を解析し、以前の我々のデータとともに集積して解析する予定である。さらに抗原をDNase、RNase、protease等を作用させて抗体と反応させ、その性状を明らかにすることも行い、以前のデータとともに解析する。抗原がかなり、類似しているなら、この抗原を同定すべくMOLT-4のλgtllcDNAライブラリ、あるいは他のライブラリについて上記血清および125I-1abeled proteinAをもちいてスクリーニングを行う予定。スクリーニングされたcDNAを市販plasmid(pkk233)内にsubcloningし、E.coliにて増幅させ、dideoxy法にて塩基配列を決定する。既知のデータベースとの比較検討を行うと同時に、これをライブラリのre-screening用として用い、抗原同定を進める。

これらについて、初期の予定ではhuman cDNA libraryを用いて抗原同定まで施行する予定であったが、現在、進行中であり、引き続き検討を進め、当初の目標まで到達する予定である。
大腸浸潤癌マウスモデルの作製

腸粘膜の上皮細胞で特異的に遺伝子発現を調節できる遺伝子配列を利用して、大腸上皮細胞で大腸癌関連遺伝子であるApcの欠損をもったマウスを作製したところ、ヒトの大腸癌に非常によく似た大腸浸潤癌が自然発生した。このマウスは、大腸癌の発生、浸潤の機序に関する研究や、大腸癌の発生を誘発、抑制する物質の検出や抗癌剤の効果などを検証するために非常に有用な動物疾患モデルとなる可能性が示唆された。本年度は2006年7月末までの勤務先で作製したCDX2P-CreマウスならびにApc floxマウスの凍結受精卵を作製し、広島大学に輸送した。学内の遺伝子組み換え生物の使用許可を受けた後、受精卵から成人マウスへ戻した。現在、広島大学で凍結受精卵を再度作製しバックアップをとるとともに、新しい飼育環境での研究体制を確立しつつある。交配したマウスから生まれて来た子マウスの尾から染色体DNAを抽出しPCR法によって遺伝子型を調べ、CDX2P-CreとApc-loxPの両方の相同遺伝子をもつマウスを実験マウス、Apc-loxPのみまたはCDX2P-Creのみをもつマウスをコントロールマウスの確認ができる環境が整った。このような実験準備の成果をふまえ、最終年度となる来年度には、これらマウスモデルに高脂肪の食餌を与えて現在の飼育環境による影響を経時的に観察する。具体的には、生後2、4、6、8ケ月で大腸を回収し、ポリープの有無や局在、サイズなどを記録する。また得られたポリープからマイクロダイセクション法を用いてDNAの回収を行い、遺伝子異常についてPCRを使ったダイレクト・シークエンスやマイクロサテライトの不安定性などを解析、またポリープから初代培養を試みてマウスのポリープ細胞から培養細胞株の樹立を試みる。研究期間の2年目である本年度は、私共が作製した大腸上皮細胞特異的ノックアウトマウスの標準モデルの確立と、それを改良した新規モデルの作製に取り組んだ。(1)標準モデルについては、学内の遺伝子組み換え生物の使用許可を受けた後、凍結受精卵から成人マウスへ戻して継代可能であることを確認後、凍結受精卵を再度作製しバックアップした。マウスの尾から染色体DMを抽出しPCR法によって遺伝子型を調べ、CDX2P-CreとApc-loxPの両方の相同遺伝子をもつ実験マウスと対象マウスを比較したところ、実験マウスでの腫瘍発生の程度や期間などが確認でき、このモデルの再現性を確認した。また、これら標準マウスモデルに高脂肪の食餌を与えて通常の飼料と比較したところ通常の飼料では腫瘍の発生率が低く、高脂肪食での研究、評価が必要であることがわかった。今後、この標準モデルをスタンダードとして、薬剤や食餌などが大腸癌発生に与える影響の検討を開始することが可能となった。(2)私共が確立したもう一つの大腸進行癌モデルは大腸上皮細胞特異的、遺伝子発現誘導型モデルについても、プロトタイプができた。Cre遺伝子の第1コドンと第2コドンの間に19-22個のグアニン塩基の繰り返し構造を挿入して遺伝子の発現をマイクロサテライト不安定性に依存して遺伝子発現の制御がマウスの大腸上皮細胞でも可能であることが本研究でわかった。さらに挿入するグアニン塩基の数やトランスジーンのコピー数を調節して、新しいトランスジェニックマウスが作製されてきており、遺伝子改変を行うためのトランスジーンの調整が終了した。今回の大腸進行癌マウスモデルの確立により、これを応用した遠隔転移をもつ新規モデルを作製することが可能となった。
生体糊を使用した接着固定および安全な抜去が可能な心外膜ペーシングリードの開発

1.〈目的〉本研究では、柔軟性に富むカーボン線を生体接着剤を用いて心筋に接着固定して使用し、安定なペーシングかつ安全な抜去が可能な心外膜ペーシングリードを開発する事を目的とした。2.〈心外膜ペーシングリードの作成〉カーボン繊維として、X線下での心電図導出用リ-ド(Xトランスロード:日本光電製)のリ-ド部分のみを使用し、これを2本平行に配置し、肉厚約0.2mmの医用シリコンゴムで被覆した。被覆したカーボン線の一端のカーボン繊維を露出させ、電極部分とした。リ-ドの他端は、針状に加工して、胸壁を貫通できる様にした。3.〈動物実験〉ネンブタール麻酔下の3頭の雑種成犬の第4肋間を開胸し、心膜を開き、作成したペーシングリードの電極部分を右心房に、フィブリン糊(ベリプラストP)を用いて接着固定した。ペーシングリード埋め込み直後から7日間、ペーシング閾値、電極間インピーダンスを測定し、ペーシング状態を評価した。また、リ-ド埋め込みから7日後に体外からリ-ドを抜去し、その際に要する張力を測定すると共に直ちに開胸して出血等の以上の有無を観察した。ペーシング閾値は、多少の変動が観られたが、0.74.8ボルトの良好な値を示した。電極間インピーダンスは、320690オームの良好な値を示した。心電図から観察したペーシング状態も、良好であった。リ-ド抜去に必要な張力は、単純にフィブリン糊で接着した場合に80100グラム重であり、心外膜にリ-ドの一部を固定した場合に820グラム重であった。開胸下に、リ-ド抜去直後の出血等の以上の無いことを確認した。以上の結果から、本研究で開発した心外膜ペーシングリードは、容易な接着と確実なペーシングそして、安全な抜去ができる可能性の高い事が判った。
人生80年代の体力に関する基礎的研究--中高年からの食餌制限と長期中等度運動負荷--

本研究は、現在から未来へかけて高齢化社会の人口構造を考え、中高年者の活動度をいかに増進、維持していくかをライフサイクルの短かいラットを用いて行った。生後5週目より中等度運動負荷(25m/min、10分を1日1回6回/週)により12週間鍛練し、以降食餌制限と週2度の運動負荷を続行させる(T群)と、これに体重を合わせた食餌制限無負荷(RC)群及び飽食対照群(SC)に分けた。また、更に中年期に当る12ヶ月齢時より食餌及運動負荷(2025m/minを1日10分;6回/週で12週間、以降週2回の負荷)群(MAT)並びに中年以降食餌制限のみを行った(MRC)5群について、12、15及び18ヶ月齢時の運動能力、基礎代謝(BM)、体温、体脂肪量を測定した。体脂肪量は直接測定できないため水を用いた体積測定から体密度を求め、Brozek(1963)の式により体脂肪量(%)を出した。12ヶ月齢時におけるBM(O_2消費量で示す)はT群で最も高く(218.5ml/分・m^2;P<0.002)、つづいて若年時より食餌制限をしてきている(RC)群(192ml/分・m^2)で、SC群は175ml/分・m^2であった。12ヶ月(中年)からの食餌制限と運動負荷で、負荷直後の15ヶ月齢時には、トレーニングにより有意なBMの増加を示した(P<0.01)。しかし、運動能力では、T群に及ばなかった。食餌制限のみではBMの増加傾向がみられたが、有意な差違は認められなかった。S・C群およびT群は減少傾向にあった。BM測定時の体温の変化も有意な差はないが、加齢により低下の傾向にあった。12ヶ月齢時における体脂肪量はT群が最も低く24.78±8.7%であり、RC群はT群とほぼ同一体重であるのにもかかわらず36.48±6.7%と体脂肪量が多く、代謝量の有意な相違の1ツに活性組織量の差が考えられた。中年過ぎにかけられた食餌量制限(25%減)と運動負荷とにより体脂肪量が41.67±5.3%から36.54±1.0%に減少したが有意差はなく、食餌制限のみの場合にも同じく減少の傾向にあった。従って、中年以降の食制及運動負荷群の代謝の亢進には、活性組織酵素活性増大が考えられた。
イメージサイトメトリーを用いたコピー数多型解析のための細胞調整法の開発

最近になってがん発症感受性の信頼できるマーカーとしてCNV (コピー数多型)が注目されるようになっている。実際、ある種のCNVが個人におけるがん発症感受性に影響しているとの証左が蓄積されてきた。異なったCNVが異なった種類のがん発症に関連しており、がん発症感受性に関係するCNVが次々に報告されるようになっている。しかしながら、簡単かつ安価なCNV解析法はない。この研究では、この問題に応えるべく、新しい間期細胞遺伝学的手法の開発を行った。ホルムアミドの長時間処理とペプシン処理がこれを可能とした。この方法は各人のがん感受性の推定に利用できる。ゲノムにおけるコピー数多型(copy number variation: CNV)の少なくとも一部は疾患発症感受性と密接に関連していることが明らかになり、コピー数多型の解析は研究としてのみならず、臨床医学としても注目されるようになっている。ゲノムの一部である遺伝子等のコピー数の定量的解析には種々の方法が開発されているが、細胞レベルでの解析は未だ可能ではなく、精度、操作性ともに問題を抱えている。細胞レベルでの解析が可能となれば、疾患特異CNVを日常診療に利用できるばかりではなく、その情報を疾病予防にも大いに役立てることができる。細胞レベルでの解析を可能にするためには、細胞調整法の開発が極めて重要であると考え、本プロジェクトではこの課題にフォーカスして研究を行っている。本プロジェクトの基本は、コピー数のカウントにはfluorescence in situ hybiridization (FISH)を利用し、そのシグナル数をカウントすることにある。FISHのシグナルは必ずしも顕微鏡観察に対応できる大きさであるとはかぎらない。そこで、シグナルを大きくすることから開始した。1.先ずは低張液処理により細胞核を膨潤させた。核の膨潤に伴い、FISHシグナルも大きくなり、顕微鏡観察がある程度は可能となった。しかしながら、サイズの小さなCNVはこれだけでは、認識し難い。さらなる処理が必要である。2.タンパク質分解酵素処理は、シグナルの増大とともに蛍光強度を増幅させるが、処理の程度が極めて重要である。過剰の処理は、シグナル強度は大きく増すが、形状が崩れ、数としてのカウントを難しくする。現在は、この条件決めを行っている。シグナルの増大と蛍光強度の増幅は、その後に続くイメージサイトメトリーによるCNVの自動算定を安価で簡単にする。本研究の当初の目的である細胞核におけるfluorescence in situ hybridization (FISH)の蛍光シグナルを大きくかつ明るくするという課題は完全とはいえないまでも、大きくかつ蛍光強度も増幅できている。安定性という点では現時点では十分ではないが、調整段階というところまでは来ている。そういった観点から、「おおむね順調に進展している。」と評価した。がんは遺伝子疾患であるという考えは広く定着しているが、個人の遺伝情報が散発性がんの発生に必須である環境因子(発がん因子)を修飾している。最近になってがん発症感受性の信頼できるマーカーとしてCNV (コピー数多型)が大きく注目されるようになっている。実際、ある種のCNVが個人におけるがん発症感受性に影響しているとの証左が急速に蓄積されている。異なったCNVが異なった種類のがん発症に関連していおり、幾つかのCNVの組み合わせは個人のがん発症感受性の判定推測における精度を上げる。すなわち、特定のCNVの解析がその個人の特定のがんの発生リスクを判定することにつながり、さらにはCNV解析は個人における各がんの発症リスクの数値化も可能にする。実際、現在ではがん発症感受性に関係するCNVが次々に報告されるようになっている。しかしながら、簡単かつ安価なCNV解析法はないことが、臨床応用の大きな問題点となっている。当該研究開発では、この問題に応えるべく、新しい間期細胞遺伝学的手法の開発を行った。FISHシグナルが大きくて明るくなればCNVは簡単かつ安価となる。この方法は各人のがん感受性の推定を可能にし、がん対策さらには健康管理に利用できる。本研究の目標であるfluorescence in situ hybridization (FISH)の蛍光シグナルを大きくかつ明るくは既に一部では達成できているが、安定的で再現性のあるプロトコルを作成し、多くの研究者に使ってもらえることを目指す。イメージサイトメトリーを組み合わせることにより、極めて安価で信頼性のある臨床検査方法となる。医療のみではなく、健康産業にも貢献できいると期待している。病理学初年度は予定した高額試薬を予定量使用せずに第1期の目標をほぼ達成することができた。研究のスピードも当初の予定どおりであった。計画以上に進捗しても予算不足にならないように予算を立てた。そこまでは、研究が加速せず(当初の予定は達成したが)、結果的には次年度に予算を繰り越すこととなった。予定の目標を最終段階まで達成せねばならない次年度に向けてまとめた経費が使えるという利点が生じた点は研究の推進にむしろ大きなメリットとなる。
アンモニア酸化細菌による新規ハイブリッド亜酸化窒素生成のメカニズム解明

好気性アンモニア酸化細菌によるヒドロキシルアミンおよび亜硝酸塩のNを一つずつ由来とするハイブリッド亜酸化窒素(N2O)生成のメカニズムを15Nトレーサー法により推測した。好気的なハイブリッドN2O生成はアンモニアからのヒドロキシルアミン供給に依存することが明らかになった。基質の組み合わせに応答するN2O生成速度とそれに占めるハイブリッドN2O生成の割合は菌株によって異なった。好気性アンモニア酸化細菌は、強力な温室効果ガス亜酸化窒素(N2O)を生成し、その経路としてアンモニア酸化と硝化菌脱窒の2つが知られている。申請者は独自の実験方法を開発し、アンモニア酸化の中間産物ヒドロキシルアミン(NH2OH)および亜硝酸イオン(NO2-)のNを一つずつ由来とするハイブリッドN2Oの生成経路の存在を示した。本研究では、純粋培養アンモニア酸化細菌を用いて、(1)申請者の開発した方法を駆使してハイブリッドN2O生成経路の寄与率を求め、(2)ゲノム情報を利用して関与酵素の候補を特定することによって、ハイブリッドN2O生成の代謝経路を完全に記述する。さらに(3)廃水処理系における各N2O生成経路の寄与率の迅速診断プロトコルを確立する。平成26年度は、主に標準株Nitrosomonas europaea ATCC 25978株を用いて、各種酵素阻害剤や一酸化窒素除去剤を加えた培養によりハイブリッドN2O生成経路における中間産物の推定実験を行い、現在も継続中である。さらに、全ゲノム解読済みでもっともよく研究されているNitrosomonas europaea ATCC 19718株およびその機能遺伝子欠損株を用いてN2O生成速度を比較し、各生成経路の寄与率を試算した。本研究では、純粋培養アンモニア酸化細菌を用いて、(1)申請者の開発した方法を駆使してハイブリッドN2O生成経路の寄与率を求め、(2)ゲノム情報を利用して関与酵素の候補を特定することによって、ハイブリッドN2O生成の代謝経路を記述する。さらに(3)廃水処理系における各N2O生成経路の寄与率を診断する。平成27年度は、まず異動した所属機関において、新たにガスクロマトグラフ質量分析計(GC/MS)を設置し、そのチューンアップを行った。全ゲノム解読済みでもっともよく研究されているNitrosomonas europaea ATCC 19718株およびその機能遺伝子欠損株を用いてN2O生成速度を比較し、各生成経路の寄与率を試算した。また、N2O生成の中間産物として知られる一酸化窒素(NO)の除去剤を加えた培養によりハイブリッドN2O生成経路における中間産物の推定実験を行った。その結果、N2O生成に関与する既知の機能遺伝子変異株においてもハイブリッドN2Oの生成が検出され、またNO除去剤の存在下でハイブリッドN2Oの生成が検出された。よって、既知の酵素反応のみでは説明できない経路によるハイブリッドN2Oの生成が示唆された。異動した所属機関におけるガスクロマトグラフ質量分析計の機種選定、設置およびチューンアップに予定より時間がかかったため。しかし、Nitrosomonas europaea ATCC 19718株を用いた解析については順調に進展している。申請者は安定同位体トレーサーを用いて、アンモニア酸化の中間産物ヒドロキシルアミン(NH2OH)および亜硝酸イオン(NO2-)のNを一つずつ由来とするハイブリッドN2Oの生成経路の存在を示した。平成28年度は、全ゲノム解読済みでもっともよく研究されているNitrosomonas europaea ATCC 19718株およびその機能遺伝子変異株、その他Nitrosomonas属細菌を用いてN2O生成速度を比較し、各生成経路の寄与率を算出した。各種阻害剤を添加した培養実験により、ハイブリッドN2Oはアンモニアとアンモニアモノオキシゲナーゼ(AMO)を介さずに、NH2OHおよびNO2-から生成されることが明らかになった。また、N2O生成においてどの経路が優占するのかは菌株によって大きく異なり、異なる添加基質および酸素濃度に対するN2O生成における応答も菌株によって異なることが示唆された。さらに、N2O生成に関与する既知の機能遺伝子変異株の使用とN2O生成の中間産物として知られる一酸化窒素(NO)の除去剤を組み合わせた培養により、NO除去剤の存在下で機能遺伝子変異株がハイブリッドN2Oを生成することが検出された。よって、既知の酵素反応を介さないハイブリッドN2Oの生成が示唆された。前培養条件の検討によりN2O生成活性の安定したNitrosomonas属細菌の菌体を回収することが可能となったため、安定同位体トレーサーを用いた培養実験を繰り返し行うことができた。関連する酵素の推定等については、研究協力者らと情報交換を進めている。好気性アンモニア酸化細菌は、強力な温室効果ガス亜酸化窒素(N2O)を生成し、その経路としてアンモニア酸化と硝化菌脱窒の2つが知られてきた。

申請者は安定同位体トレーサーを用いて、好気性アンモニア酸化細菌の純粋培養株がアンモニア酸化の中間産物ヒドロキシルアミン(NH2OH)および亜硝酸イオン(NO2-)のNを一つずつ由来とするハイブリッドN2Oを生成することを示した。平成29年度は、廃水処理系の活性汚泥から分離され申請者らが維持するNitrosomonas sp. AL212株と全ゲノム解読済みで最もよく研究されているNitrosomonas europaea ATCC 19718株の好気条件におけるN2O生成速度および生成特性を安定同位体トレーサー法により比較した。2菌株は、好気性アンモニア酸化細菌の16S rRNA遺伝子による系統樹において異なるクラスターに位置し(それぞれcluster 6A、cluster 7)、AL212株はATCC 19718株に比べて高濃度のアンモニウムイオン(NH4+)に対して感受性がある。その結果、AL212株の方がATCC 19718株よりN2O生成速度が高く、また添加基質としてNH4+およびNO2-、もしくはNH2OHおよびNO2-の2つの組み合わせにおいて、NH4+およびNO2-を加えたときに2菌株の優占するN2O生成経路が異なることが示された。この成果を最も関連する第5回国際硝化会議(ICoN5)にて発表した。好気性アンモニア酸化細菌によるヒドロキシルアミンおよび亜硝酸塩のNを一つずつ由来とするハイブリッド亜酸化窒素(N2O)生成のメカニズムを15Nトレーサー法により推測した。好気的なハイブリッドN2O生成はアンモニアからのヒドロキシルアミン供給に依存することが明らかになった。基質の組み合わせに応答するN2O生成速度とそれに占めるハイブリッドN2O生成の割合は菌株によって異なった。ハイブリッドN2O生成経路の寄与率の算出について、試算段階であるが進展している。18Oトレーサーを組み込んだ分別定量については課題が残っているが、平成27年度の研究実施計画に含めていたNitrosomonas europaeaの野生株と変異株を用いたN2O生成の比較を平成26年度に開始した。Nitrosomonas europaea ATCC 19718株およびその機能遺伝子変異株によるN2O生成実験データが蓄積してきたため、全ゲノム情報を活用して、ハイブリッドN2O生成に関与する酵素の候補を挙げる。さらに、純粋培養株による成果を基に、廃水処理系のようなアンモニア酸化細菌が集積されたモデル実験系を用い、各N2O生成の各寄与率を算出する。複数のNitrosomonas属細菌純粋培養株およびNO発生剤等を用いた追加実験を行い、また窒素変換に関するゲノム情報を参照してさらにハイブリッドN2O生成経路を絞り込む。研究協力者らと情報交換を進め、Nitrosomonas属細菌純粋培養株におけるハイブリッドN2O生成の証明について論文発表する。29年度が最終年度であるため、記入しない。微生物生態学所属機関を異動したため、本研究課題実施に必要なガスクロマトグラフィー質量分析計(GC/MS)を設置し、チューンアップする。
誘導型RNAi法の開発とこれを用いた網膜リボンシナプス情報伝達の分子機構の解明

Amphiphysin I(amph I)は、神経細胞の軸索終末部でシナプス小胞膜のエンドサートーシス過程に関与するタンパク質の一つである。これまでにヒト網膜cDNAライブラリーのクローニングと特異抗体を用いた生化学・免疫組織化学的な解析を行い、網膜特異的に発現するamph Iバリアント(amph Ir)の存在を見いだした。Amph Irには複数のオルタナティブスプライスフォームがあり、これらはリボンシナプス特異的に発現するタイプと網膜色素上皮に強発現するタイプに大別できる。リボンシナプスは網膜における視覚情報の伝達に重要な構造であり、色素上皮は神経網膜の健常性の維持に不可欠な組織であるが、そこで働く分子群や分子機構については不明な点が多い。Amph Irの生理機能の解明は、網膜での視機能発現・維持の仕組みを理解する上で重要な研究課題と考えられる。本研究ではamph Ir遺伝子特異的なRNAi現象を誘起するsiRNA発現ベクターの作製を行い、これまでに以下の成果を得た。2)PCRを利用したヘアピンタイプのsiRNA発現DNAカセットの合成法を確立した。3)合成siRNA発現DNAカセットと培養細胞を用いた、迅速かつ簡便なsiRNA標的配列のスクリーニング法を確立し、高いRNAi効果を示すsiRNAを得た。4)siRNA発現カセットとマーカー遺伝子発現配列を併せ持つ、siRNA発現ベクターをプラスミドベースで作製した。5)培養細胞を用いた解析から、作製したsiRNA発現ベクターが機能することが確認された。内因性に発現するamph Irに対するRNAi効果については、検討中である。Amphiphysin Iはニューロンの軸索終末部でシナプス小胞膜のエンドサイトーシスに関与するタンパク質である.我々はヒト網膜cDNAライブラリーのクローニングや特異抗体を用いた生化学・免疫組織化学的解析から,網膜特異的に発現するamphiphysin Iバリアント(amphiphysin Ir)を見いだした.Amphiphysin Irには複数のオルタナティブスプライスフォームが存在するが,網膜リボンシナプス特異的に発現するタイプと,網膜色素上皮に特に強く発現するタイプに大別することができる.リボンシナプスは網膜の視覚情報の伝達過程に,一方の色素上皮は神経網膜の健常性の維持に不可欠であることから,amphiphysin Irが網膜視機能の発現・維持に何らかの重要な役割を担っている可能性が考えられる.初代培養法が確立され,また培養細胞も樹立されている色素上皮細胞を用いてRNAi法の開発を進めるとともに,色素上皮タイプのamphiphysin Irの機能解析を行い,以下の結果を得た.1)AmphiphysinIr遺伝子の発現抑制に有効と考えられるsiRNA標的配列の予想と培養細胞(HEK293)を用いた,最適なsiRNA標的配列のスクリーニング法の確立.2)siRNA発現カセット配列をもつプラスミドベクターの作製と精製.3)ラット網膜色素上皮を用いた初代培養の立ち上げと,ウエスタンブロットによる初代培養系でのamphiphysin Ir(色素上皮タイプ)発現の確認.Amphiphysin I(amph I)は、神経細胞の軸索終末部でシナプス小胞膜のエンドサートーシス過程に関与するタンパク質の一つである。