hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多値高階グラフマッチングによる高速かつ省メモリな多元画像のマッチング

当初の計画を変更し,以下のEnd-to-endの処理体系を構築することを目的とした.課題1.深層学習による2画像間の剛体運動推定:現在論文誌へ投稿する準備を進めている.推定する運動をHomography(平面射影行列)に限定し,既存研究(HomographyNet)の欠点克服を試みた.具体的には,特徴量抽出と回帰推定の性能向上である.課題期間終盤に既存研究を上回る結果が得られた.課題2.深層学習による2画像間の領域マッチング:体外発表に至らなかった.近年注目されている画像・動画のスタイル変換の考え方を導入することで,物体・カメラの位置/姿勢に対して頑健な領域マッチングの実現性を検討した.課題3.画像の幾何学的特徴量・局所特徴量の応用研究:初年度の成果を利用し,画像の幾何学的特徴量や局所特徴量を利用した応用研究を行い,2件の体外発表を行った.画像の幾何学的特徴量とGraph Matchingを利用することで透明マーカの検出・追跡に関する研究を行った.申請課題である多元画像のマッチングへの適用を行っていく.画像の局所特徴量を利用することで,画像のインペインティング(欠損補填)を行った.本年度の目標は以下の2つに設定した.(1)申請課題の核となる高階グラフマッチング問題の多値MRFでの定式化,(2)小規模かつ限定的な運動(剛体運動)をする物体を対象とした単元画像のマッチングを実現するためのエネルギー設計.上記の目標に対して,下記の項目を実施した.(1)多値高階グラフカットによる領域分割の理論を基に,二値MRFで定式化されている高階グラフマッチングの問題を多値MRFで再定義,(2)問題の単純化を図り,トイプロブレムとして小規模な点群データのマッチングを行う.対象を剛体運動に限定する事で,アイディアを着想するに至った大局的な剛体運動の一貫性を考慮したモデルフィッティングを基にエネルギーを設計.最新の研究成果との精度比較検証実験を行った.実験結果から,小規模(点群サイズが10-30程度)では数分程度で処理が完了することを確認した.ただ,高階グラフカットの最適化に利用するアルゴリズム次第で最適解が得られないことが判明したため,劣モジュラ関数の要件を満たすエネルギーの再設計が必要であることが判明した.また,近年コンピュータビジョンやパターン認識の分野で非常に活発に利用されているDeep Learningをグラフマッチングに取り込む方法についての検討を同時進行で行っている.最小化するエネルギーの設計及び最適化アルゴリズムによって最適解が得られないことがある状況を再現・確認する作業に大量の時間を消費してしまったため.多値高階グラフカットによる領域分割の理論を拡張した結果,劣モジュラ関数の要件を満たさないエネルギーを設計した.一般的に用いられる多値MRFにおける非劣モジュラ関数の最小化アルゴリズムは元の問題を二値MRFにおける最適化問題に変換し近似解を求める.上記のアルゴリズムを使用した結果,ノイズが一切含まれない理想的な環境下ですら最適解が得られない事が実験結果から判明した.本年度の目標は以下の2つに設定した.(1)劣モジュラ関数の要件を満たすエネルギーの再設計,(2)近年コンピュータビジョンやパターン認識の分野で非常に活発に利用されているDeep Learningをグラフマッチングに取り込む方法についての検討.上記の目標に対して,下記の項目を実施した.(1)劣モジュラ関数による剛体運動のエネルギーの定義,(2)Deep Learningによる点群認識.実施項目(1)では,劣モジュラ関数の要件を満たすように剛体運動のエネルギーを定義することが困難であること,定義したエネルギーが高階MRF最適化との相性が悪いため最適解を得るために膨大な計算時間が必要となることが判明した.実施項目(2)では,距離画像から得られた点群の画像認識を第一課題として着手し,距離画像から得られた点群の座標及び法線ベクトルを入力とし,深層畳み込みニューラルネットワークにより撮影された物体の種類を識別する手法を構築し,国内研究会1件,国際会議1件の発表を行った.当初計画していた高階グラフマッチング問題を多値MRF最適化で解く方法を中止し,Deep Learningによる画像のマッチング問題を解く方法の検討を進めていく.劣モジュラ関数の要件を満たすためのエネルギーの再設計,及び高階MRF最適化による実験・検討に大半の時間を労した.当初の計画を遂行するため作業時間の大半を浪費したが,全ての要件を満たすエネルギー・最適化の組み合わせを導出することができなかったため,代替案として検討していた深層学習による点群のマッチングを主計画に切り替えた.当該年度の目標として,深層学習による3次元点群の識別問題を解くことと定め,国内研究会1件,国際会議1件の対外発表を行った.代替案に切り替えた点を考慮すると,進捗状況としておおむね順調に進展していると言える.当初の計画を変更し,以下のEnd-to-endの処理体系を構築することを目的とした.課題1.深層学習による2画像間の剛体運動推定:現在論文誌へ投稿する準備を進めている.推定する運動をHomography(平面射影行列)に限定し,既存研究(HomographyNet)の欠点克服を試みた.具体的には,特徴量抽出と回帰推定の性能向上である.課題期間終盤に既存研究を上回る結果が得られた.課題2.深層学習による2画像間の領域マッチング:体外発表に至らなかった.近年注目されている画像・動画のスタイル変換の考え方を導入することで,物体・カメラの位置/姿勢に対して頑健な領域マッチングの実現性を検討した.課題3.画像の幾何学的特徴量・局所特徴量の

応用研究:初年度の成果を利用し,画像の幾何学的特徴量や局所特徴量を利用した応用研究を行い,2件の体外発表を行った.画像の幾何学的特徴量とGraph Matchingを利用することで透明マーカの検出・追跡に関する研究を行った.申請課題である多元画像のマッチングへの適用を行っていく.画像の局所特徴量を利用することで,画像のインペインティング(欠損補填)を行った.当初の予定では,大規模かつ制約の少ない運動(非剛体運動)をする物体を対象とした単元画像のマッチングを実現するために,エネルギー設計及びクリーク選択によるグラフサイズ削減アルゴリズムの確立を予定していた.初年度に判明した提案アルゴリズムの問題点を鑑み,以下の4案を進める(優先度順に掲載).1.現在使用しているエネルギー・アルゴリズムをそのまま拡張.大規模かつ制約の少ない運動を対象とするようアルゴリズムを拡張.1.現在使用しているエネルギーをそのまま使用し,最適化アルゴリズムから得られた局所解を洗練する後処理を加える.3.エネルギーを再設計し,劣モジュラ関数の要件を満たすエネルギーの最小化問題を解く.当初の計画を変更し,深層学習による画像のマッチングを目的とする.処理対象を点群から画像に変更することで,End-to-endの処理体系を構築する.(優先度順に掲載).1.深層学習による2画像間の剛体運動推定2.深層学習による2画像間の領域マッチング購入物品の値下げに対応できなかったため当初計画していた研究計画通りに研究が進まず代替案を主計画としたため,(1)実験データ取得に必要な装置を購入しなかった,(2)成果発表にかかる金額が減ったため.ほぼ誤差として無視できる金額なので,当初の計画通りに執行する予定
企業と農山村地域の協働障壁解明とその解消による農業・環境ブランド価値の高度化

本研究を通じて,農山村地域の資産を保有し,適切に利用することで地域経済の活性化に寄与しうる地域外部企業との協働の障壁は,事前の情報の非対称性と「協働」的活動を実施しうる地元のマンパワーの不足にあることが指摘された。それを克服しさえすれば,良好な自然資源を活用した農業・環境ブランドを形成し,税収,出生率,雇用など,多くの面で好循環が生まれる可能性が指摘できた。そのためには,地域経営を間接的に担う関係人口の増加と定着を進めるか,そしてそのための原資をいかに確保するかという,次なる課題を浮き彫りにすることができた。企業や地域住民が協働で環境保全に取り組む素地を確立するためには,まず農山漁村地域の生活基盤の安全性と社会の持続性,経済の持続性が認知されなければならない。本年度の研究では,かねてから自然災害リスクが懸念されている南海・東南海トラフ沿岸地域の企業や住民を対象としたアンケートを実施し,活動基盤としての都市志向と農村志向,経済が集積する都市部ではなく農山漁村地域へと回帰するメリットなどを確認した。その結果,本研究が目的とする環境活動へ参加することの障壁の前提となる地方への回帰傾向の現状と限界等の多くの知見が得られた。これらの結果は適宜公表予定である。また,定性的な調査として,首都圏企業のCSR担当職員への聞き取りを行い,実際のメリット意識やコスト感覚に関する現状を詳細に把握した。予定していた研究内容の前提となる基本的な内容から調査に入ったが,その部分を含めて多くの情報をアンケート調査によって得ることが出来た。今後はより詳細かつ確実性の高い企業の動向を見定めていくための調査方法や実施手順について,担当部局社員らとの情報交換,農山漁村地域でのニーズ収集などを掘り下げていく。2年目は初年度の成果を積極的に学会等で公表して,最終年度に向けた研究の展開を図る。初年度に引き続き,企業あるいはそれに準ずる組織が地域資源の所有と保全(利用)を行うことの正負の効果を定量的に評価するため,事例調査を進めた。地方創生の文脈では,否定する地方農山村部に企業が進出することのメリットを期待する声と,地域に根付いた主体でないことによる拒否感があり,本年度は特に定量化しにくい後者に着目して調査を進めた。結果の一例を示すと,水源地域には貴重な森林資源があり,その周辺は観光価値が高いエリアが存在するが,決定的にコミュニティの後継者が不足していることへの外国企業の参入事案がある。この点に関しては,県担当部局はあくまで手続き的公正性を堅持すること以外にはその正負の効果に関して主体的に論じないという見地であったが,住民がらは当初の予想通り賛否の県が見られた。この点をさらに掘り下げて分析するため,森林地域の希少資源の利用と保全に向けた,自主的な施策を創出することや,県・基礎自治体・林業組合らが階層的に連携を強めるために仕組み作りに対して,個人として貢献可能な量を経済的な指標から計測した。その結果,企業の参入の有無でかなりの地域差がみられ,企業の地域参加を顕在的な発展のポテンシャルとできるか安定の阻害要因と扱うかの差を生じさせる可能性を検知した。本研究の成果は既に一部は学術論文として公表が決定しており,残りの成果も準備ができ次第公表予定である。それ以外の成果としても,希少生物資源の保全に関する都市住民や企業経営体の参加と利用価値の発掘,国内企業の環境保全活動への参加の経緯や特徴を相対化するため,海外の企業の取り組みに関する調査も並行して実施した。研究計画内容に対して着実な調査が出来たほか,企業と地域の協働による希少生物資源の利用価値化とその可能性,環境資源から派生して地域の伝統文化に関する外部主体の参加による維持保全など,広範な範囲の分析対象に対してアプローチすることが出来た。成果は逐次学術的な成果として公表予定である。最終年度では,「地方創生の文脈では,否定する地方農山村部に企業が進出することのメリットを期待する声と,地域に根付いた主体でないことによる拒否感がある」という前年度までの知見を踏まえ,さらに事例分析を進め,地域住民個別の属性などから認識形成に至る要因分析を行った。その点は,地域環境の担い手を地域外部から確保出来るか否かに直結し,その結果として地域環境の高付加価値化,ブランド化に資するものである。とりわけ最終年度では,前年度に続く日本の水源地域の森林資源に対する企業等のニーズや,都市近郊から中山間地域までが対象となる太陽光発電に対する企業投資に焦点を当てて,大規模社会調査を実施した。企業等が水源地域周辺の森林を買収し,固定資産税や多くの税収が増加した例が散見される今日,そのような状況を肯定的に捉えるか否定的に捉えるか,公論形成が急がれている。本研究では全国調査から,地域住民の心理を網羅的に捉えた結果,森林買収という事案が近隣で発生しているか否かは住民心理に影響しない,つまり多くの住民が未だ印象などによって認識が形成されていることが明らかとなった。好影響,悪影響等を明確に周知し,より多くの住民が現状を客観的に把握した上での公論形成が急がれる。また,近年急増する太陽光発電施設への投資についても,地域住民が建設初期の段階で嫌悪感を抱く状況が統計的に確認された。初期の段階での説明不足が最終的に円滑な事業推進を阻害する根源であることがほぼ明らかとなったため,個別地域の自主的な問題解決に全てを任せるのではなく,環境アセスメントの内容を拡充し,積極的に太陽光発電の合理的な普及のあり方を議論すべきである。

そうすることにより,エネルギー支給地域という「ブランド」を獲得することも可能となろう。本研究を通じて,農山村地域の資産を保有し,適切に利用することで地域経済の活性化に寄与しうる地域外部企業との協働の障壁は,事前の情報の非対称性と「協働」的活動を実施しうる地元のマンパワーの不足にあることが指摘された。それを克服しさえすれば,良好な自然資源を活用した農業・環境ブランドを形成し,税収,出生率,雇用など,多くの面で好循環が生まれる可能性が指摘できた。そのためには,地域経営を間接的に担う関係人口の増加と定着を進めるか,そしてそのための原資をいかに確保するかという,次なる課題を浮き彫りにすることができた。より大規模かつ高精度の調査を実施するには,本科研費のみでは予算的に不足しているため,適宜他の競争的資金の獲得に向けて成果をつみあげ,実社会への還元する意義が高い成果の獲得に向けて研究を進めていく。現状では特に研究進展の面で大きな問題は無いが,企業への調査のネットワークの拡充については,必要に応じて研究協力者を追加して確実に進めていきたい。最終年度は,継続して現場からデータを収集することに加えて,現在までに集めたデータを統計的に分析し,企業が環境資源の保全主体となりうるか,そしてその活動自体が地域のブランド価値として評価されるかと例証する。具体的な調査対象としては,国内の希少生物資源,森林環境資源,文化資源に対する地元と企業の協働的管理,海外の農企業による地域ブランド化の開発プロセスである。これらの対象から得られた調査結果を分析し,3カ年にわたる研究の総括を行う。29年度が最終年度であるため、記入しない。地域計画学29年度が最終年度であるため、記入しない。
戦後日本における「若者」を社会問題化する言説のエスノメソドロジー研究

本研究の目的は、戦後日本における「若者」を社会問題化してきた新聞・雑誌・映像等の言説を対象に、それらがいかなる常識的・専門的知識を基盤にして、「社会問題」としての理解可能性を獲得してきたのかを明らかにすることである。近年の日本における「若者」の語られ方をめぐる重要な論点として、1科学的なエビデンス主義の浸透にともなう、通俗的な若者問題化言説への批判の強まり、2少子高齢化にともなう、「若者」を人口規模のみで社会問題化する視点の説得力の低下、が挙げられる。これらの問題状況から、今後の日本社会において「若者」をどのような観点から社会的に重要な問題として捉え、対処していくのかを検討することが喫緊の課題となっている。本研究は、こうした課題に対応するための基礎研究として、戦後日本における若者問題化言説の歴史的変遷を記述することを通して、社会における「若者」カテゴリーの意味を解明し、今後の「若者」への社会的対応を検討するための基礎となる知見を提出することを目指している。以上の問題関心から、2018年度は1活字メディア(新聞・雑誌・書籍など)、2映像メディア(テレビ番組)における、若者問題化言説を中心に調査および分析を行った。分析の際は、問題化言説の信憑性を解体するのではなく、そのような信憑性が構成される方法の解明を主眼とした。そうすることによって、若者問題化言説の信憑性の基盤を形成している、暗黙の常識的知識を解明することを目指した。さらに、日本の若者および若者言説の固有性を把握していくために、イギリス・ドイツへ渡航し、現地の若者研究者との研究会・交流会へ参加した。海外の若者のメディア利用、文化状況、労働環境など多様な視点からの研究動向を知ることで、今後の日本の若者言説研究の指針を得ることができた。1に関しては、「若者」と「メディア」を関連付けた言説、および「若者」と「マーケティング」を関連付けた言説の分析を行った。いずれも、若者問題化言説の主要なパターンの1つであり、これまでは批判的な観点から、「技術決定論」「消費のお客様論」といった分析がなされてきたが、本研究では問題化言説それ自体の志向性に即して、これらの問題化言説が「若者」カテゴリーを用いることを通していかなる社会的実践を行ってきたのかを明らかにした。これらの分析は、2019年度に学術誌に投稿予定である。2に関しては、ある民放の歴史あるテレビドキュメンタリー番組における若者問題化言説の特徴について分析を行った。今回は特に学校における「いじめ自殺」問題を対象に、それらがテレビ番組においてどのように社会問題化されてきたのかに注目した。分析の結果、同番組では単に「自殺」の原因を「いじめ」に帰属させるのではない、様々な番組実践を行っていたことが明らかになった。この分析は、2019年度に共著の学術書として刊行予定である。2019年度はまず、上記1の、「若者」と「メディア」を関連付けた言説、および「若者」と「マーケティング」を関連付けた言説の分析を完了し、早急に学術論文として発表する。それらに加えて、一昨年度までに執筆した論文の改稿を進め、様々な社会的実践における「若者」カテゴリーの意味についての1つの見通しを与えることを目的とした、博士論文の完成を目指す。

いずれも、若者問題化言説の主要なパターンの1つであり、これまでは批判的な観点から、「技術決定論」「消費のお客様論」といった分析がなされてきたが、本研究では問題化言説それ自体の志向性に即して、これらの問題化言説が「若者」カテゴリーを用いることを通していかなる社会的実践を行ってきたのかを明らかにした。これらの分析は、2019年度に学術誌に投稿予定である。2に関しては、ある民放の歴史あるテレビドキュメンタリー番組における若者問題化言説の特徴について分析を行った。今回は特に学校における「いじめ自殺」問題を対象に、それらがテレビ番組においてどのように社会問題化されてきたのかに注目した。分析の結果、同番組では単に「自殺」の原因を「いじめ」に帰属させるのではない、様々な番組実践を行っていたことが明らかになった。この分析は、2019年度に共著の学術書として刊行予定である。2019年度はまず、上記1の、「若者」と「メディア」を関連付けた言説、および「若者」と「マーケティング」を関連付けた言説の分析を完了し、早急に学術論文として発表する。それらに加えて、一昨年度までに執筆した論文の改稿を進め、様々な社会的実践における「若者」カテゴリーの意味についての1つの見通しを与えることを目的とした、博士論文の完成を目指す。海外の若者研究者による研究発表会、研究会、交流会への参加のために、イギリスとドイツに出張。当初の予定より多くの研究者との交流が実現し、海外の研究の動向について知る貴重な機会となったが、結果として旅費が超過した。次年度に関しては、調査費用、資料費等で調整し、計画通りの使用に収める予定である。
S複合遺伝子座の構造と葯発現遺伝子のS特異性の解析

R.sativusの10種類のSP11と9種類のSRKの塩基配列を決定した。R.sativusのS-21はB.rapaのS-9とSP11が極めて類似し、SRKも推定アミノ酸配列で91%の相同性を示した。これらSハプロタイプは属分化前は同一のSハプロタイプであることが示唆された。SP11タンパク質において、B.oleraceaとB.rapa同一認識特異性をもつSハプロタイプ間で異なるアミノ酸が少ないRegion IIIとRegion Vは認識特異性に重要と考え、その領域を類似SP11間で組み換えた変異SP11遺伝子を導入した形質転換体を作成し、認識特異性の変化を検定中である。Brassica napusの内、最も多くの品種が有するBnS-1とBnS-13についてSP11とSRKのゲノムクローンを単離し、全長の塩基配列を決定したところ、BnS-1はB.rapaのS-47と極めて類似しており、SRKは正常に機能していることを見出した。また、BnS-13もB.oleraceaのS-15に酷似し、このSRKも正常に機能していることを明らかにした。種分化前は同一のSハプロタイプであったと推定されるB.rapaのS-47とB.oleraceaのS-12のS遺伝子座の塩基配列を決定し、B.oleraceaのS-12のS遺伝子座の方がB.rapaのS-47よりも大きいことを見出し、劣性グループのクラスIIハプロタイプであるB.oleraceaのS-15とB.rapaのS-60の比較においてもB.oleraceaの方がS遺伝子座が大きいことを明らかにした。B.oleraceaのS遺伝子座が大きい原因としてレトロトランスポゾンの挿入が大きく関わっていることが分かった。S遺伝子座に存在するレトロトランスポゾン様配列は、B.rapaよりもB.oleraceaのゲノム中により多いコピー数で検出された。B.oleraceaとB.rapaのSRKのS領域の塩基配列を新たに18種類のSハプロタイプについて決定し、SLGの塩基配列も含め解析を行った。B.oleraceaとB.rapaの2種間で塩基配列および推定アミノ酸配列が極めて類似するペアーを7種類見出した。これらは、種分化前は同一のSハプロタイプであったと考えられた。一方、パルスフィールド電気泳動によるS遺伝子座の解析で、SRKとSLGの間、あるいはそれらの近傍に存在する遺伝子間の距離は、B.oleraceaの方がB.rapaより長いことが推定でき、種分化後にS遺伝子座にDNA断片の挿入が起こったことが示唆された。SRKやSLGの同義置換の率から、B.oleraceaとB.rapaの分化は約100万年前に起こったと推定された。B.oleraceaのS^<24>はSLGが欠失するSハプロタイプであるが、これとSRK遺伝子が類似するB.rapaのSハプロタイプでも、SLG遺伝子が検出できないことがわかった。花粉リガンド遺伝子と考えられるSP11の相同遺伝子がB.oleraceaにも存在するかどうかをゲノミックサザンブロット分析で調べたところ、13種類のSハプロタイプでバンドが検出された。また、柱頭mRNAからRT-PCRでDNAの増幅を試みたところ、8種類のSハプロタイプで増幅が見られた。増幅したDNAの塩基配列を調べたところ、SP11様の蛋白質をコードしていることが分かった。イエローサルソンで自家和合性をもたらすm遺伝子は、柱頭のアクアポリンの遺伝子MODの突然変異とされたが、自家不和合性の'おそめ'がイエローサルソンと同じアクアポリン遺伝子を持つことを明らかにした。'おそめ'のこの遺伝子の発現はイエローサルソン同様に低いことから、柱頭のアクアポリンの遺伝子がM遺伝子の本体ではないことを明らかにした。B.oleraceaとの18種類のSハプロタイプの花粉側認識分子の遺伝子SP11の塩基配列を決定しB.rapaと比較した。SP11はきわめて多様性に富み、SRKの比較から種分化前に同じであったと考えられるSハプロタイプのペアー間では、SP11の塩基配列の相同性も高いことを見いだした。種分化前同じであったと考えられるBoS-7とBrS-46の認識特異性を種間雑種を作出して検定したところ、これらは相互に不和合であり、種分化前の認識特異性が現在も保持されていることが分かった。B.rapaのクラスII SRKのS領域の塩基配列を決定し、既報のクラスII SRKと比較したところ、互いの相同性はクラスI内の比較より高いことから、クラスIIの成立はクラスIの成立より新しいことを示唆した。B.nigraのSLG遺伝子を解析しB.oleraceaやB.rapaと比較したところ、B.oleraceaのSLGとB.rapaのSLGとの間のように類似するものはなかったものの、系統樹において独自のグループを形成しなかったことから、これらの種が分化する前にSLG遺伝子の多様化が起こっていたことが分かった。自家和合性の複二倍体種であるBrassica napusやB.juncea,B.carinataのSLG遺伝子も解析し、これらは、B.oleraceaやB.rapaと極めて類似するSLG遺伝子を保有することを明らかにした。B.rapaのS-46のSRKとSP11を含む78kbのDNA断片をクローニングし、物理地図を作成し、遺伝子の位置と向きを明らかにした。

B.rapaのS-46と同一のSハプロタイプであったと推定されるB.oleraceaのS-7のSRK,SP11,SLGを含むファージのクローンを単離し、S遺伝子座の構造の比較を行った。イエローサルソンで自家和合性をもたらすm遺伝子はアクアポリン遺伝子と密に連鎖していることが明らかなため、'おそめ'のゲノムクローンの塩基配列情報を元に、クロモゾームウォーキングを行うため、バイナリーベクターで巨大DNAのライブラリーを作成した。クラスIとクラスIIでは、不和合性の強度に差があることが知られているが、クラスIの中でも強度に差があることを明らかにした。Sハプロタイプ同定技術としてPCR-RFLP法に代わる新たな方法を開発した。この技術の完成には種内に存在する全Sハプロタイプを収集する必要があるため、B.oleracea, B.rapa及びRaphanus sativusのSテスターラインの整理と新規作成に着手したが、その過程でB.rapaのS^9と極めて類似するR.sativusのSP11遺伝子を見出した。B.oleraceaのSP11遺伝子を導入したB.rapaの形質転換体を作成し、交配実験を行うことによって、B.oleraceaとB.rapaの間でSRK, SP11遺伝子が極めて類似するSハプロタイプが同じ認識特異性を持つことが証明できた。種分化前はB. rapaのS^<46>と同一のSハプロタイプであったと推定されるB. oleraceaのS^7のSRK, SP11,SLGを含むファージのクローンを単離し、SRKとSP11を含むコンティグを作成した。SRKとSP11の距離は、B. oleraceaのS^7がB.rapaのS^<46>より約16kb長く、その領域にレトロトランスポゾン様配列が見出された。劣性グループのクラスIIハプロタイプであるB.rapaのS^<60>のSLGとSRKを含む約55kbのクローンを得、そこに座乗する遺伝子を調査したところ、2種類の新たな遺伝子を見出した。イエローサルソンで自家和合性をもたらすmod遺伝子を明らかにするため、バイナリーベクターでコマツナ品種おそめの巨大DNAのライブラリーを作成し、MOD遺伝子に密に連鎖したアクアポリン遺伝子(MLM)を含むクローンを得た。染色体歩行を行い、MLM遺伝子の近傍の約250kbをカバーするコンティグを作成した。昨年開発したSP11のドットブロット分析によるSハプロタイプ同定法の利用を図るため、Brassica oleracea, Brassica rapaで塩基配列未決定のSP11遺伝子を新たに11種類決定した。その中に、この2種間でSP11が極めて類似するSハプロタイプを新たに5種類見出し、2種間でSP11が類似するSハプロタイプは合計10種類となった。SRK, SP11遺伝子が2種間で極めて類似するSハプロタイプの対が同じ認識特異性を有するかどうかを調べるため、種間雑種を用いた方法、形質転換体作成による方法、及び合成SP11タンパク質を用いた認識特異性の検定を行い、5対が同じ認識特異性を持つことを示した。このことから、これらの対は、5種の分化前は同一のSハプロタイプであり、その認識特異性が現在まで変わらず維持されてきたと考えられた。種分化前は同一のSハプロタイプであったと推定されるB.rapaとB.oleraceaのS
植物ホウ酸トランスポーターの構造解析

植物ホウ酸トランスポーターBORの結晶構造を明らかにするために、BORタンパク質の可溶化・精製・結晶化の条件検討を行った。酵母に発現させたシロイヌナズナのBOR4タンパク質と界面活性剤ドデシルマルトシド(DDM)の組み合わせが結晶化に適した単分散性の良い組み合わせであることを明らかにし、BOR4タンパク質精製系を確立した。また、アニオン交換体の輸送阻害剤であるDIDSおよび輸送基質であるホウ酸の添加により、BOR4タンパク質の熱安定性を大幅に向上できることが明らかにした。今年度は、前年度に得られたBOR4タンパク質の熱安定性が向上する条件を用いて結晶化スクリーニングを行った。具体的には、アニオン交換輸送体の阻害剤であるDIDSを添加した条件、BOR4輸送基質であるホウ酸を添加した条件について、結晶化スクリーニングを行った。しかしながら、現在までに結晶を得ることは出来ていない。BOR4以外の結晶化しやすいBORタンパク質の候補を探るために、コムギのTaBOR1.1, TaBOR1.2, TaBOR1.3, TmBOR4.5について可溶化に用いる界面活性剤のスクリーニングを行ったが、BOR4と界面活性剤ドデシルマルトシドの組み合わせほど単分散性の良い組み合わせを得ることは出来なかった。また、BOR1の植物体での機能を欠損させる変異であるbor1-1, bor1-2変異をBOR1とBOR4に導入しタンパク質を合成し、結晶化の候補として使用できるかどうかを検討した。残念ながら、これらbor1-1, bor1-2変異によりBORタンパク質の細胞膜局在性が失われることが判明した。この結果は結晶化解析の立場からはネガティブであるが、新しい知見でもあるため論文として公表する予定である。研究期間全体を通じて、酵母を用いたBOR4の発現系の安定化、BOR4精製の効率化を図ることができた。また、BOR4の熱安定性の向上させる条件として、アニオン交換輸送体の阻害剤であるDIDSの添加、輸送基質であるホウ酸の添加が有効であることを見いだした。残念ながら、いまだに結晶を得ることが出来ていないが、異なるタンパク質発現系を用いたり、結晶化に用いるタンパク質濃度の最適化を行うことで、結晶化の成功を目指し、本研究課題で得られた情報を活かして行きたいと考えている。これまでにシロイヌナズナのホウ酸トランスポーターの一つであるBOR4と界面活性剤ドデシルマルトシド(DDM)の複合体BOR4-DDMの単分散性が高いことを見いだしており、本年度はBOR4-DDMの結晶化を中心に研究を進めた。BOR4の発現は出芽酵母を用いて行ったが、これまでの培養法では発現量が安定せず、精製タンパク質の収量および純度が一定しなかったため、培養条件と精製法の再検討を行った。フラスコあたりの培養液量を減らし、培養時間を調節することで比較的安定した発現量を得られるようになった。His-tag融合BOR4タンパク質のコバルトレジンによる精製において、洗浄条件を緩やかにし、Superdex200カラムを用いたゲル濾過精製ステップを加えることで収量の改善に成功した。具体的には、約0.4 mg BOR4/ 12L培養液から約0.7 mg BOR4/ 18L培養液に改善した。CPMアッセイ法によるBOR4-DDMの熱安定性を向上させる条件の探索を行った。アニオン交換体の輸送阻害剤であるDIDSで処理することによりBOR4-DDMの熱安定性が大幅に向上すること明らかになった。また、輸送基質であるホウ酸によっても、BOR4-DDMの熱安定性が向上した。ホウ素の添加濃度を0.110 mMと変化させた場合、熱変性パターンが異なり、ホウ素濃度によりBOR4のコンフォメーションが異なる可能性が示唆された。シロイヌナズナBOR4以外の結晶化候補BORを探索するために、コムギBORであるTaBOR1.1、TaBOR1.2、TaBOR1.3、TmBOR4.5(未発表)の発現系を構築した。このうち、TmBOR4.5発現量が高く細胞膜への局在性が強く、新たな結晶化候補となる可能性が示された。今年度の研究実施計画として、1. CPMアッセイによるBOR4-DDMの熱安定性が向上する条件の検索、2.新たな結晶化候補BORの探索、3.結晶化スクリーニングとX線解析の3つを設定していた。1の課題に関しては、DIDSおよびホウ酸の添加がBOR4-DDMの熱安定性を向上させることを見いだすことに成功し、さらに、ホウ素の添加量を変えることにより様々なコンフォメーションをもつBOR4の結晶が得られる可能性が示され、一定の成果が得られたと考えている。しかしながら、2の課題に関しては、コムギBORの一つであるTmBOR4.5新たな結晶化候補BORとして挙げることができたが、FSEC法による界面活性剤のスクリーニングが完了しなかった。

また、3に関しては、大きな課題であった精製タンパク質の収量の改善を図ることができ、結晶化スクリーニングを行うために必要なタンパク量が得られるようになったが、いまだに結晶を得る条件が見いだすことができておらず、X線回析実験を行う段階に到達できていない。DIDSおよびホウ酸の添加により熱安定性が向上したBOR4-DDMを用いて結晶化スクリーニングを進める。いまだ結晶が得られていないため、これまでに使用しているMolecular Dimensions社のMemGold kit以外の条件や、新たな方法として、近年膜タンパク質の結晶化で効果をあげているLipidic cubic phase法によるスクリーニングも行う。コムギBORについて、FSEC法による界面活性剤のスクリーニングを行い、CPMアッセイ法によりDIDSとホウ酸がシロイヌナズナBOR4同様に熱安定性向上効果を示すかどうかを確認し、結晶化スクリーニングを進める。また、シロイヌナズナBOR4の立体構造を認識するモノクローナル抗体の作製も試みる。結晶が得られ次第、X線回析実験を行い、より分解能の高い回析結果が得られる良質な結晶を絞り込む。放射光を用いたタンパク質X線結晶構造解析を行い、BORの構造を決定し、ホウ素輸送機構のモデルを構築する。消耗品費として、BORタンパク質精製を行うために、酵母培養試薬に約15万円、界面活性剤に約20万円を使用する。結晶化スクリーニング用の試薬に約25万円、プラスチック器具に約10万円を使用する。国内旅費として、他施設での実験に約10万円、学会発表約10万円使用する。外国旅費として、他施設での実験に約40万円使用する。その他、論文投稿、英文校閲に約20万円使用する。以上、計約150万円を使用する。
PTEN結合分子解析によるPTEN制御機構と疾患の解明

(1)PICT1の機能解析:T細胞特異的なPICT1欠損マウスでみられる著しいT細胞形成障害はp53依存性であることを見いだしており、22年度ではPICT1欠損したES細胞を用いてPICT1のp53依存性について検討を行った。PICT1欠損したES細胞は5日以上生育できず、p53依存性に細胞周期の停止と細胞死の亢進をみること、p53の上昇はMDM2の機能障害よることなどを見いだした。また、PICT1の抑制は種々のがん細胞株の増殖抑制に働くこと、PICT1のヘテロ欠損したマウスでは皮膚2段階発がんの抑制がみられること、ヒト大腸癌患者ではPICT1の発現低下ががんの予後に相関することも見いだしている。(2)PBP1の機能解析:PBP1はin vitroおいてAktの活性を抑制する因子であり、その作用機序はPTENと結合してそのホスファターゼ活性を上昇させること、転写因子としても働き、PI3Kp110βなどの転写を抑制することなどを見出している。そこでin vivoにおける作用を明らかにするために、PBP1欠損マウスを作製したものの、このマウスは全く発現型を呈さなかった。次に我々はPBP1と構造が類似するPBP2が存在し、この分子もPBP1と同様の作用を有することを見出したことから、平成22年度にはPBP2欠損マウスを作製するために、ターゲティングベクターの作製、変異ES細胞の作製を終え、現在キメラマウスまでをうることができた。PTEN結合分子PICT1の機能解析:LckCre TgマウスとPICT1floxマウスを交配し、T細胞特異的PICT1欠損マウスを作製した。PICT1はPTENを安定化するものの、MDM2やp53とも直接結合し、PICT1欠損によってDNA障害がないにも関わらずp53が著しく上昇することを見出した。またこのマウスはDN3-DM以降の段階でT細胞分化が著しく障害され総胸腺細胞数は、野生型マウスの約100倍に減少していた。さらにPICT1/p53のダブル欠損マウスでは、PICT1欠損による胸腺細胞の減少がほとんど回復することから、PICT1欠損による効果がp53に大きく依存性であることを見出した。PTEN結合分子PBP1の機能解析:酵母ツーハイブリッド法を用いてPTENと結合する新規分子PBP1を見出した。PBP1はPTEN依存性にAktの活性化を抑制し、またその作用機序の1つとしてPBP1はPTENのもつ脂質ホスファターゼ活性を有意に亢進させること、またPBP1は構造上、転写因子としても働くことが予想され、実際PBP1の発現によりPI3Kp110βやPDGFRの転写が著明に抑制されることから、PBP1はこれら分子の転写抑制因子として働くことによりAktを抑制する可能性もあることを現在までに見出している。また、PBP1欠損マウスは胎生致死であることが予想されたためにPBP1floxマウスを作製したが、完全なPBP1欠損マウスとしても生存可能であることまでを見出した。PTEN新規結合分子の機能解析:酵母ツーハイブリッド法を用いてこれまでに約40種類のPTEN結合分子を単離し(これらのうちの1つがPBP1である)、全長が非常に長い1分子を除く、これら40種類すべての全長cDNAをクローニングし、そのうち5種類がPTENと哺乳類細胞内で結合することを見出した。(1)各種組織特異的なPICT1欠損マウスの解析:T細胞特異的なPICT1欠損マウスでは著しいT細胞形成障害を見いだしており、p53やp19欠損マウスやOT-IITgマウスとの交配により、このT細胞形成障害はp53依存性でp19非依存性であること、T細胞受容体の構築が原因でないことを見いだした。その他に、骨髄幹細胞特異的なPICT1欠損マウスでは汎血球減少症を認め、ケラチノサイト特異的なPICT1欠損マウスでは皮膚に重層障害を認めることをこれまでに見いだしている。(2)PTEN結合分子PBP1の機能解析:PBP1の生体における機能を明らかにするため、PBP1遺伝子欠損マウスの解析を行った。当初はいくつかの変化が見られる傾向にあったが、遺伝子背景を均一にしたところ、未だ明らかな表現型は見いだせていない。具体的には線維芽細胞・肝細胞・脾細胞における有意なAktの活性化はみられず、腫瘍形成や、血糖変化やインスリン反応性なども変化をみず、また各種組織標本においても有意な差は認められなかった。現在は、PBP1と構造が近いPBP2の存在を見いだしており、この分子もPTENと結合できることを見いだしている。(3)PTEN新規結合分子機能解析:酵母ツーハイブリッド法を用いて単離し、実際に哺乳類細胞内で結合することを見いだした分子10種類のなかでAktの活性化を変化させうるか、また結合する分子の機能を変化させうるかなど結合による相互作用の検討を行ったが、明らかな変化や作用は未だ見いだせていない。

PICT1欠損したES細胞は5日以上生育できず、p53依存性に細胞周期の停止と細胞死の亢進をみること、p53の上昇はMDM2の機能障害よることなどを見いだした。また、PICT1の抑制は種々のがん細胞株の増殖抑制に働くこと、PICT1のヘテロ欠損したマウスでは皮膚2段階発がんの抑制がみられること、ヒト大腸癌患者ではPICT1の発現低下ががんの予後に相関することも見いだしている。(2)PBP1の機能解析:PBP1はin vitroおいてAktの活性を抑制する因子であり、その作用機序はPTENと結合してそのホスファターゼ活性を上昇させること、転写因子としても働き、PI3Kp110βなどの転写を抑制することなどを見出している。そこでin vivoにおける作用を明らかにするために、PBP1欠損マウスを作製したものの、このマウスは全く発現型を呈さなかった。次に我々はPBP1と構造が類似するPBP2が存在し、この分子もPBP1と同様の作用を有することを見出したことから、平成22年度にはPBP2欠損マウスを作製するために、ターゲティングベクターの作製、変異ES細胞の作製を終え、現在キメラマウスまでをうることができた。
RNA polymerase IIに対する自己抗体の分子免疫学的性状に関する研究

本年度は強皮症に特異的な抗RNA polymerase II(RNAPII)抗体の分子免疫学的性状を遺伝子工学的手法で追究した。【方法】(1)免疫沈降法でRNAP IIサブユニットと反応した抗RNAP II抗体陽性強皮症15例を対象、全身性エリテマトーデス(SLE)、多発性筋炎(PM)、健常人の400例を対照とした。(2)cDNA^<CTD>をpGEX-2Tに組み換え、融合蛋白とし発現、同抗体との反応性を免疫ブロット法で調べた。(3)Adenovirus major late promoterによるRNAP IIに特異的なin vitro transcriptionの反応系に対象症例からの血清IgGを添加し、その抑制活性を調べた。(4)免疫沈降反応に18アミノ酸からなるCTD合成ペプチド{NH_2-(YSPTSPS)_2-YSPT-amide}を添加し、同抗体陽性症例間の反応様式を検討した。【結果】(1)免疫ブロット法で精製220kDaサブユニットを認識した11例全例がCTD融合蛋白と反応した。一方、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎患者、健常人からの対照血清は同蛋白と反応しなかった。(2)抗RNAP II抗体陽性例血清IgGは、RNAP II特異的転写活性を抑制したが、対照血清IgGはしなかった。(3)11例中8例(5例で完全、3例で部分的)に免疫沈降反応の抑制が認められた。【結語】RNAP II-220kDaサブユニットCTDを構成する反復配列が抗RNAP II抗体の主要抗原エピトープで、強皮症における自己免疫現象の標的として重要なことが示唆された。
腹腔鏡手術の痛み：モデルラットによる術中術後痛のメカニズム解明と有効鎮痛法の検討

これまで腹腔鏡手術について、痛みのメカニズムに迫る研究はない。本研究により腹腔鏡手術による痛みのメカニズムが明らかになれば安全かつ有効な鎮痛法が明らかとなり、今後もますます増加する腹腔鏡手術を受ける患者に対し有用な治療法を提供できるようになると考えられる。我々が開発した腹腔鏡手術モデルを用いて、行動生理学的評価に加え電気生理学的・免疫学的評価を行う。上記手法によって気腹刺激による痛みの受容および腹腔鏡手術後痛のメカニズムを解明し、腹腔鏡手術中および術後における最適な鎮痛法の開発を目指す。
光と金属を用いる直截的分子変換手法の開発

有機合成化学には医薬品や高機能材料に至るまで、社会が必要とする様々な有機化合物を合成する効率的な手法を提供することが求められる。この目標に向け、入手容易な化合物を直截変換する新しい反応の開発は重要な研究課題である。本研究では入手容易な原料を直截変換する反応の開発を目指して、光と金属の特性に着目した検討を行っている。当該年度の代表的な成果は以下の通りである。1.ベンゾイル基を光配向基とする位置選択的な炭素ー水素結合アシル化反応炭素ー水素結合を炭素ー炭素結合へと直接変換する反応は炭素骨格の効率的な構築法を提供する。有機化合物に多数存在する炭素ー水素結合の特定の位置だけを選択的に変換することは難しく、この制御が課題である。本研究ではベンゾイル基が光の作用によって近接した炭素ー水素結合を位置選択的に切断することを利用して、入手の容易な芳香族ケトンにアシル基を位置選択的に導入する反応を開発した。2.アルケンの移動を用いるアルデヒドのジアステレオ選択的アリル化連続する不斉中心を立体選択的に構築することは現代の有機合成化学における重要な課題である。置換アリルホウ素化合物はアルデヒドとジアステレオ選択的に反応してホモアリルアルコールを与えることが知られている。合成的に魅力的であるが、置換アリルホウ素化合物の合成は容易でない。置換アリルホウ素化合物の新しい発生法が望まれている。今年度は、アルキンから出発して、遷移金属触媒を用いたジホウ素化、アルケン部位の移動を経てホウ素部位を2つ持つアリルホウ素化合物を発生させて、アルデヒドに付加する手法を開発した。これにより、γーホウ素置換ホモアリルアルコールを入手の容易な原料からジアステレオ選択的に合成できるようになった。(1)非極性σ結合の活性化を起点とする直截的分子変換入手容易な原料を活用する有機合成に向けて、炭素ー炭素結合、炭素ー水素結合の切断を契機とする反応を多数開発した。例えば、飽和炭化水素の炭素ー水素結合を切断して二酸化炭素に付加する反応を開発した。この成果は現在論文投稿の準備中であり、さらに他のカルボニル化合物との反応にも展開している。また、当初の想定にはなかったが、検討の途中で得られた知見に着想を得て、ビス(1,5-シクロオクタジエン)ニッケルを合成する簡便な手法を開発した。光のエネルギーを活用して、入手の容易なケトンから合成した1,2-ジオールの炭素ー炭素結合の切断が起点となる反応である。この知見は触媒反応にも応用できると期待され、現在これを利用した新しい合成反応に着手している。このほか、リグニンモデル分子の炭素ー炭素結合開裂反応、オレフィンの炭素ー炭素結合開裂を起点とするピリジンのアルキル化反応、先に述べたベンゾイル基を光配向基とする位置選択的な炭素ー水素結合アシル化反応なども開発した。(2)アルキンを起点とする直截的ワンポット多官能基化法入手の容易なアルキンを原料とした連続不斉中心の構築法を発展させた。具体的には末端アルキンからγーホウ素置換ホモアリルアルコールをジアステレオ選択的に合成する手法を開発した。ホウ素置換基は多様な変換反応が知られており、有用なビルディングブロックである。現在は、この成果を展開してδーホウ素置換ホモアリルアルコールのジアステレオ選択的合成法に取り組んでいる。またアルキンより入手容易なアルケンを起点とする新しい炭素ー炭素結合形成反応も新たに見出し、その展開検討を進行中である。以上のように入手容易な原料を活用する有機合成に資する多数の反応を開発できており、今後の展開も期待できることから、「(2)おおむね順調に進展している」とした。基本的にはこれまでの方針を維持・発展する形で、光と金属触媒がもつ特性に立脚した(1)非極性σ結合の活性化を起点とする直截的分子変換と(2)アルキンを起点とする直截的ワンポット多官能基化法の開発検討を行う。具体的にはジオールの炭素ー炭素σ結合の電子を還元剤とする有機合成手法の開拓や、末端アルキンを出発物質とするδーホウ素置換ホモアリルアルコールの立体選択的合成を行う。すでにこれらの反応に関して予備的検討を行い、ある程度進行することを見出している。今後は1溶媒や触媒の配位子などの反応条件検討、2反応機構の解明を目的とした量論反応や量子化学計算、3有用物質や新規物質の合成検討を行う。また、以上のような合理的戦略に基づいて着実に研究を遂行するとともに、この過程を通して斬新な反応の発見を目指したい。合成実験では、予想していた生成物のみならず、想定外の生成物が得られることがままある。これらの新規性・有用性についても随時検証する。また、副生成物の生成機構も慎重に吟味する。このような、想定の外にあった事象も検証することで、新しい合成化学の可能性を模索したい。有機合成化学には医薬品や高機能材料に至るまで、社会が必要とする様々な有機化合物を合成する効率的な手法を提供することが求められている。本研究では入手容易な原料をより直截的に変換する革新的な手法を開発することを目的として、光と金属の特性に着目した検討を行っている。1.単純アルケンのアリル位カルボキシル化反応単純アルケンは石油化学のプロセスで大量に生産されており、安価な炭素原料として注目されている。

一方、二酸化炭素はエネルギー生産の副産物として多量に産出され続けている。地球温暖化の原因物質と考えられており、その削減が社会的に強く求められているにもかかわらず有効な利用法はほとんどない。新しい利用法の開発が喫緊の課題となっている所以である。本研究では紫外光・ケトン触媒・銅触媒を用いた単純なアルケンと二酸化炭素の付加反応を開発した。この反応ではアリル位の炭素ー水素結合が選択的に切断されて二酸化炭素の中心炭素に付加して、不飽和カルボン酸が生成した。2.末端アルキンを出発物質とするホウ素アザエノラートの発生末端アルキンは様々な誘導体が市販されている上、合成法が確立されているために入手容易である。一方、ホウ素エノラートは立体選択的アルドール反応に有効であり、ポリケチド等の天然物合成における重要な中間体である。本研究では、末端アルキンから出発してトリアゾールを経由してホウ素アザエノラートを立体選択的に合成できることを見出した。すなわち、末端アルキンとアジドのHuisgen反応によって合成されるトリアゾールに、ロジウム触媒の存在下で9-BBNを作用させると、ホウ素エノラートがE体選択的に生成した。続いて反応系にアルデヒドを加えることにより交差アルドール反応が進行して、アンチーβーヒドロキシイミンが立体選択的に生成した。当初の計画のとおりに、光と金属の特性を活かして、入手容易な単純アルケンと二酸化炭素を直接反応させる手法を開発した。この成果はChemistry-- A European Journalに掲載され、Hot Paper(編集者が当該分野で重要と認める論文)に選出された。また、末端アルキンを出発物質とするホウ素アザエノラートの発生法を開発し、入手容易な末端アルキン、アジド、9-BBN、アルデヒドからアンチーβーヒドロキシイミンをワンポットで、立体選択的に合成する手法へと展開した。この成果はAngewandte Chemieに掲載され、高い評価を受けている。これらに加えて、入手容易な原料を直截変換する手法を多数開発し、査読付き国際学術雑誌に論文として報告している。これらを踏まえて「2おおむね順調に進展している」とした。有機合成化学には医薬品や高機能材料に至るまで、社会が必要とする様々な有機化合物を合成する効率的な手法を提供することが求められている。本研究では入手容易な原料をより直截的に変換する革新的な手法を開発することを目的として光と金属の特性に着目した検討を行っている。当該年度の代表的な成果は以下の通りである。1.アルキルベンゼンと臭化アリールのクロスカップリング反応アルキルベンゼンは石油化学プロセスで大量に生産されており、安価かつ大量に入手できる。これらは主に溶媒として利用されているほか、芳香族求電子置換反応によって様々な芳香族化合物の原料として利用されている。本研究では紫外光とニッケル触媒を用いることで、アルキルベンゼンのベンジル位炭素ー水素結合を切断して、臭化アリールと直截カップリングする反応を開発した。従来はベンジル位炭素ー水素結合のハロゲン化、もしくはメタル化を経由して同様の変換が行われていたが、本反応は一段階で炭素ー炭素結合を形成でき、より直截的で原子効率に優れている。
嗅覚レセプタの活性化機構の解明

本年度は、嗅覚レセプタ(OR)の機能発現の実現に向けていくつかの試みを行った。β2-アドレナリンレセプター(β2-AR)およびドーパミンレセプター(DR)においてはGα15とHEK293に共発現させてCaイメージングによりリガンドに対する応答を得ることに成功している。そこで、ORの機能発現においてボトルネックとなっている細胞膜への移行を改善するため、β2-ARおよびDRとORとのキメラレセプターを作成した。まず、β2-ARのTM3からTM6をORのものに置換したキメラレセプターを作成した(ORの匂い分子結合サイトは膜貫通ドメインのTM3からTM6の領域であると考えられている)。また、DRではカルボキシル末端に特徴的なアミノ酸配列が存在し、その配列を認識してレセプタの膜への輸送を調節しているタンパク質がある事が示されていることから、ORのC末端領域をDRのC末端領域へと置換したキメラレセプタを作成した。そして、これら2種類のキメラレセプタをGα15と共にHEK293細胞へ遺伝子導入し、Caイメージングにより匂い分子への応答を調べたが応答の検出には至らなかった。次に、最近報告されたORの機能発現の改善に成功した論文の方法も検討した。1つはオートファジーの阻害剤3-MAを用いる方法で、3-MAがORの分解を抑え、細胞膜へのORの発現量が増大することが報告されている。もう1つは、ある特定のORをβ2-ARと共発現させると、そのORの細胞膜への発現が劇的に増加することを報告している。これら2つの論文に基づいて実験を行ったがORの応答は得られなかった。現在は嗅覚レセプタの膜輸送に関与する分子シャペロンとして最近発見されたRTPファミリーの発現ベクターを作成し、我々のクローニングしたORの機能解析に有効であるのか検証するための実験を進めている。14年度では、ロドプシンのタグ配列をN末端に付加した嗅覚レセプタを発現するプラスミドおよび、嗅覚レセプタに共役させるGタンパク質としてG_<α15>を発現するプラスミドを構築したが、所有するHEK293細胞にトランスフェクションした限りでは、匂い応答が生じる細胞は見いだせさせなかった。15年度は、ロドプシンの配列と同様に嗅覚レセプタの細胞膜への発現を促進すると報告されているIHS(Influenza Haemagglutinin Signal Sequence)をロドプシンのタグ配列の代わりに嗅覚レセプタのN末端に付加した発現ベクターの構築を行った。また、嗅覚レセプタとG_<α15>の共役を改善する可能性が期待されるマウスのG_<α11>遺伝子をクローニングし、C末端のアミノ酸残基5つがマウスG_<olf>のアミノ酸残基になるように変異を導入した遺伝子G_<α11-olf>を作成した。そして、これらの新しい発現プラスミドが嗅覚レセプタの機能解析が十分に出来る程度に細胞内カルシウムイオンの増加を誘導できるかどうか検討するための実験を行った。まず、用いる培養細胞がGPCRの機能発現系として利用可能であることを、β2-アドレナリンレセプタを用いたポジティブコントロール実験で確認した。この結果、リガンドであるイソプロテノールに対して、一過性の細胞内カルシウムイオン濃度の増加が認められ、アドレナリンレセプタ、G_<α15>、G_<α11-olf>はCHO細胞、神経由来細胞、嗅上皮由来細胞で機能的に発現することが確認された。しかし、嗅覚受容体では、そのリガンドである匂い分子に対する応答は見られなかった。現在、これらの細胞の内で嗅覚レセプタの機能発現に最適な条件を実験的に検討している。

現在は嗅覚レセプタの膜輸送に関与する分子シャペロンとして最近発見されたRTPファミリーの発現ベクターを作成し、我々のクローニングしたORの機能解析に有効であるのか検証するための実験を進めている。