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科学的意識研究の方法論的基礎の哲学的検討：プロセス論的アプローチの確立に向けて

本研究では「意識内容の神経相関」を越えて「意識の動的側面」や「意識の構造的側面」をどうやって神経科学の枠組みで研究できるのかという神経現象学的課題に取り組んだ。その結果、そうした研究を推進するためには、実験参加者から彼らの意識経験について豊かで信頼のできる報告を得るための技術が必要だということがわかった。そうした報告を得るための方法論について次のような研究を行った。(1)被験者が意識経験をよりうまく記述できるような短期的なトレーニングを開発しテストした。(2)被験者のよりよい経験記述を引き出すためのインタビュー方法を開発しテストし、それを用いて両眼視野闘争についての実験研究を実施した。今年度は次の二点についての研究を行った。すなわち、(1)意識の動的・構造的側面についての現象学的・哲学的分析、(2)意識の動的・構造的性質を適切に記述するために必要な現象学的反省-報告能力のトレーニング法の開発、である。後者のトレーニング法の開発は、意識の動的・構造的性質を神経科学の枠組みで研究していくうえで、不可欠だと考えられる。(1)の成果については次である。現在、科学的意識研究の分野で最も大きな注目を集めている理論の一つである「意識の統合情報理論(Integrated Information Theory of Consciousness)」の詳細な読解と批判的検討をおこない、それを通じて、意識の動的・構造的側面の現象学的分析を進展させた。研究代表者の新川は、2017年3月に北陸先端科学技術大学院大学で開催されたセミナーにおいて、本研究の中間的な成果を発表した。今後は、2017年6月開催の国際会議The Science of Consciousness 2017で成果発表したのちに、国際誌に論文を投稿する作業を進める。(2)の成果については次である。錯視図形を用いた自由記述と、Explicitation Interview Methodを応用したガイダンスを組み合わせて、意識経験の反省-記述に必要な能力を養成するためのトレーニング法を開発した。そして、その心理実験によってそのトレーニング法の効果を検証した。その結果、トレーニングの効果は一定程度検証されたが、トレーニング法の細部についてはさらなる改定が必要だということが明らかになった。このトレーニング法については、2017年6月に北京で開催されるAssociation for the Scientific Study of Consciousness(ASSC)の大会で発表予定である。意識の動的・構造的側面の哲学的・現象学的分析と、そうした側面を神経科学的に研究するための方法論の構築が、どちらも順調に進んでいる。本研究の主要な目的は、意識経験の動的・構造的側面を神経科学的に研究するための枠組みを構築することである。そのためには、意識についての専門的な知識をもっていない一般の人から彼らの意識経験について豊かで信頼のできる報告を引き出すことが必要となる。研究の初年度には、被験者の経験報告能力を高めるための短期的なトレーニングの方法論を開発し、その実証的テストを行った。本年度には、実験者が実験参加者の意識経験についてインタビューを行うことにより、彼らから豊かで正確な経験報告を引き出すためのインタビュー方法論(Micro-Phenomenology)について検討し、こちらが短期的なトレーニング法よりも実用的であると分かった。実際にそうしたインタビュー方法論をもちいて意識経験の動的・構造的側面を神経科学的に研究できれば、そうした意識の側面を研究するための神経科学的な枠組みが構築できたことになる。そこで私たちは、そのインタビューを用いて、両眼視野闘争時の意識経験がもつ動的・構造的特徴を特定しようと試みた。両眼視野闘争を扱った理由は、両眼視野闘争が現代の科学的研究においてよく用いられており、また、その経験が日常的な経験(変化するものの動画をみるような経験)とは構造的に異なっていると考えられるからである。そのために行った実験は次である。(A)両眼視野闘争経験に似せた動画を作成し、被験者に両眼視野闘争の経験とその動画による経験を識別する課題を行ってもらう。(B)それらの経験の違いについてインタビュー形式で報告してもらう。(C)そこで得られた記述をもとに、(通常の経験と対比したうえでの)両眼視野闘争経験に特徴的な動的・構造的性質のリストをつくる。なお、現在はこのリストの作成が終わったところである。今後は、このリストをもとに、両眼視野闘争経験の構造的性質の神経基盤を探る研究を行っていく予定である。TSCやASSCでの発表とそこから得られるfeedbackをもとに研究を進展させ、意識の動的・構造的側面について現象学的・哲学的に分析した論文と、現象学的反省のトレーニング法についての論文を執筆し、海外のトップジャーナルに投稿していく。また、そのトレーニング法を実施に用いながら、神経現象学的な研究に着手していきたい。

心の哲学、意識の哲学、知覚の哲学、神経現象学今年度に予定していた国際会議(ASSC 20・ブエノスアイレス)への参加をとりやめ、次年度に開催される会議に参加することを決定した(TSC・サンディエゴ)。それに伴い、関連する予算を次年度に回す必要が出たため。次年度の6月にサンディエゴ(アメリカ)で開催される意識研究の国際会議(TSC)への参加のために使用する。
C型肝炎ウイルスの増殖に必要な肝細胞内の因子の特定と増殖阻害剤の開発

平成14年度には、C型急性肝炎患者血清を用いて、HCVの全領域の遺伝子をRT-PCRにより増幅し、direct sequence法で全塩基配列の決定を行い、クローニング、変異導入を行った。H15年度には、それぞれのクローンを連結してdirect sequenceと一致するHCVクローンを作製し、PBR322にHCV全長、T7プロモーター、HDVリボザイムが挿入されたコンストラクト(HCV infectious clone)を得た。さらに、T7 RNA polymerase発現ベクターをキュアード細胞にstable transufectionし、HCV infections cloneをstable transfectionしてHCV持続発現細胞株の作製を試みている。また、HCV infectious cloneをRNAに転写し、その転写産物を、in vivoで投与を行いHCV複製について血清のRT-PCR、肝組織の免疫染色などにより感染性の検討を行っている。C型肝炎ウイルス(HCV)感染症は、容易に慢性化し、肝硬変、肝細胞癌に進展する重要な疾患である。インターフェロンにより一部の患者は治癒するようになったが、大部分、ことに日本に多いgenotype 1b感染患者は、血中のウイルス量が多く、インターフェロン治療に抵抗性である。現在我が国には約150万人存在するHCV陽性患者にとって、肝硬変への移行、肝細胞癌の胚胎は、生死を左右する重要な問題である。本研究では、HCVのpolymerase、helicase、proteaseなどの主なHCVの機能蛋白を発現させ、それらと会合する肝細胞因子を同定し、その結合を阻害する物質を発見して新たなC型肝炎治療薬を開発することを目的とする。平成13年度には、HCVのpolymerase、helicase、protease領域の遺伝子をpolymerase chain reactionにより増幅し、大腸菌を用いてクローニングした。Taq DNA polymeraseによる変異の導入を防ぐため、また、HCV genomeが大腸菌内で容易に遺伝子変異などの修飾を受けるため、sequenceを確認し、典型的な配列を要するHCV cloneを得るため、site directed mutagenesisを用いて誤って導入されたと考えられる塩基置換の修正を現在行っている。平成14年には蛋白発現ベクターにクローニングされたDNA断片を入れ替え、各蛋白を発現し、発現した蛋白をアフィニティーカラムなどを使用して高度に精製し、各蛋白の機能を測定する系を構築する。平成14年度には、C型肝炎患者血清を用いて、HCVの全領域の遺伝子をRT-PCRにより増幅し、ほぼ全塩基配列の決定を行った。また、各領域の遺伝子を、大腸菌を用いてクローニングし、それぞれ約10クローンずつ塩基配列を決定し、ダイレクトシークエンスの配列に近いものを検索した。また、より近い配列のクローンを用いて、変異導入を行い、ダイレクトシークエンスとほぼ等しいHCVクローンの作成を開始した。それぞれのクローンを連結してPBR322にHCV全長、プロモーター、HDVリボザイムが挿入されたコンストラクトを作成し、in vivo、in vitroでトランスフェクションを行い、HCV複製系を確立し、RNA interferenceなどによるHCV増殖制御の検討や、新たな増殖制御領域の特定、増殖阻害剤の探索を行っていく予定である。さらに、T7RNA polymerase発現ベクターをキュアード細胞にstable transufectionし、HCV infectious cloneをstable transfectionしてHCV持続発現細胞株の作製を試みた。HCVcore蛋白を定量的に測定したところ、細胞内では多量にHCV core蛋白が発現されていたが、細胞上清への放出は微量であった。また、HCV infectious cloneをRNAに転写し、その転写産物を、ヒト肝細胞キメラマウスを使用し、in vivoで投与を行いHCV複製について血清のRT-PCR、肝組織の免疫染色などにより感染性の検討を行った。これまでに、明らかな感染は認められていないが、ヒト患者血清から得られたHCVの投与実験ではキャリア状態を作製することが出来た。また、平成14年度には、E2、NS5A蛋白を恒常的に発現する細胞株を作るために、IFN抵抗性のC型肝炎患者のE2、NS5Aをインフルエンザウイルスベクターに組み込んで、293T細胞、MDCK細胞に感染させて蛋白発現を試みたがE2およびNS5A共に蛋白発現が低かった。

そこで、平成15年度には、上記のHCV infectious cloneの各領域(core、E1、E2、NS2、NS3、NS4A、NS5A、NS5B)を真核細胞発現ベクター(pKS336)に組み込んだ。それらをHuh7細胞にtransfectionし、各領域の蛋白発現細胞を作製し、蛍光抗体およぴ免疫沈降により各領域の蛋白発現を確認した。E2領域を除いては各蛋白の発現を確認することが出来た。さらに、各領域がpKS336に組み込まれたプラスミドとIFN-βpromoter-Luciferaseプラスミドをco-transfectionし、PolyI : Cで刺激し、IFN-βの産生に対する影響について検討を行った。これまでに、数領域でIFN-βの作用を阻害している結果が得られた。
癌間質制御の新しいアブローチ ‐膵間質細胞のセネセンスと間様系幹細胞誘導の関わり‐

膵癌組織ではセネセンスに陥っている細胞は少数であり、間葉系幹細胞との相互作用によってセネセンスが抑制されている可能性がある。本研究では、膵癌の前駆病変とも考えられるIPMNではセネセンスマーカーの高発現を認めるも癌では認められないことから、癌へと進展するにつれセネセンスマーカーの発現が低下することが示唆された。新しい癌間質相互作用の制御として、既存の薬剤であるゾメタとピルフェニドンがGemcitabinとの併用で膵癌の進展を抑制することが明らかとなった。膵癌は間質細胞の増生が特徴的であり、近年間質細胞が膵癌の悪性度を高めているという報告がある。これまで腫瘍細胞自体に関する研究が主に進められてきたが、新たな治療戦略開発を目的として、本研究では間質細胞におけるセネセンスという非可逆的分裂停止現象に着目した。膵癌間質細胞ではセネセンスに陥る細胞は極めて稀であり、その結果desmoplasiaという過剰間質増生が誘導され、抗癌剤が腫瘍に到達しにくいことで抗癌剤耐性を生じている可能性がある。そこで膵癌間質細胞におけるセネセンス制御を解明する事により、新しい膵癌治療戦略を立案した。膵星細胞のセネセンス誘導と、組織内の間葉系幹細胞同定を目標とした新規特異的表面抗原の検索を行い膵癌患者より得られた手術切除標本を用いて、ヒト膵星細胞株を30株以上作成した。作成された細胞株は、膵星細胞の特徴とされるMyofibroblast様の形態を呈し、α-SMAが陽性であることを確認した。また、これら膵星細胞において間葉系幹細胞のマーカーとされる表面抗原の解析を行い、膵星細胞内にsubpopulationが存在すること、更に放射線照射後にセネセンス関連Βガラクトシダーゼを発現している事を確認した。最終年度では特発性肺線維症に用いられるピルフェニドン、骨転移治療薬であるゾメタの2剤が濃度依存性に膵星細胞の浸潤や増殖を抑制し、その過程においてPDGF,HGF,Fibronectin,Collagen type1,Periostin,MMP2,MMP9の膵星細胞からの分泌を抑制することを解明した。更にin vivoで膵癌の抗癌剤であるジェムシタビンと先の2剤を併用すると著明な腫瘍縮小効果があることを見出した。このことにより、ピルフェニドン、ゾメタは膵星細胞の腫瘍増大を抑制していることが考えられ、膵星細胞をセネセンスへ誘導する可能性があることが示唆された。膵臓癌は間質細胞の増生が特徴的であり、近年間質細胞が膵臓癌の悪性度を高めているという報告がある。これまで腫瘍細胞自体に関する研究が主に進められてきたが、新たな治療戦略開発を目的して間質細胞に着目した、本研究ではセネセンスという非可逆的分裂停止現象に着目している。膵癌間質細胞ではセネセンスに陥った細胞は極めて稀であり結果としてdesmoplasiaという過剰間質増生が誘導され、結果として抗癌剤が腫瘍に到達しにくい原因となり抗癌剤耐性を生じている可能性がある。本研究は膵癌間質細胞におけるセネセンス制御を解明する事により新しい膵癌治療戦略を目的とした研究を立案した。1膵星細胞のセネセンス誘導と新規特異的表面抗原の同定膵癌患者より得られる手術切除標本を用いて、ヒト膵星細胞株を20株以上作成した。さらに星細胞が放射線治療によりセネセンス関連Βガラクトシダーゼを発現している事を確認した。また、特発性肺線維症に用いられるピルフェニドン、骨転移治療薬であるゾメタの2剤が濃度依存性に膵星細胞の増殖を抑制することを確認した。また、癌間質相互作用に関与するTGF-β1、FGFなどの増殖因子やdesmoplasiaの構成器質であるコラーゲンIやフィブロネクチンの発現を抑制し、desmoplasia抑制作用を持つことが示唆された。膵星細胞の作成に成功しており、これを基にin vitro研究が容易となり順調に計画を遂行していると言える、また、申請書の計画通りピリフェニドン、ゾメタなどの薬剤による星細胞への影響も確認しており、順調に計画が遂行されていると考えられる。(1)間葉系星細胞純化セネセンス誘導星細胞特異的表面抗原の同定を手術組織標本、樹立した星細胞で行い、これを基にセルソーターによるセネセンス誘導星細胞の純化を進めていく(2)セネセンス誘導間質細胞-間葉系幹細胞相互作用とdesmoplasia、EMT、治療抵抗性の関連の解明(3)間葉系幹細胞を標的とした治療法および癌細胞ニッチ相互作用を標的とした治療法の開発1.セネセンス誘導間質細胞ー間葉系幹細胞相互作用とdesmoplasia

・EMT・治療抵抗性の関連の解明膵癌においてdesmoplasiaは特筆すべき病理組織学的特徴であり、膵癌の浸潤・転移・予後に強く影響する。また、EMTに基づく転移や浸潤は固形癌に特異で、特に膵癌では予後を決定する。具体的にはセネセンス誘導星細胞や上記のセネセンス・間葉系幹細胞表面マーカーで初代培養星細胞あるいは切除組織から純化した間質細胞を用いて、in vitro、in vivoで間質増生や基質・増殖因子合成能、抗癌剤や放射線への感受性の評価を行い、さらに固形癌特有である浸潤・転移能やEMTへ間葉系幹細胞が与える影響を検討し、またこれらの能力に関連する分子発現を検討する。直接共培養状態やマウス共移植モデルで形成した腫瘍・転移腫瘍から癌細胞や間葉系幹細胞を分取し、遺伝子・蛋白発現の解析も行う。-多方面からの検討-更に、近年、右図のように新規免疫不全マウスに手術的に切除された膵腫瘍組織を移植し、癌細胞とその周囲の間質細胞が共存したモデルの作成に成功している。このモデルを用いても癌細胞だけでなく癌細胞を支持している周囲のニッチ細胞までを含めて再現・解析していく。2.間葉系幹細胞を標的とした治療法及び癌細胞ニッチ相互作用を標的とした治療法の開発マイクロアレイによる網羅的な解析から間葉系幹細胞に特異的に発現する分子を同定し、レトロウイルスに組み込むshRNAを作成する。このshRNAの導入により治療実験をin vitro、in vivoにおいて行う。さらに、癌細胞ニッチ相互作用に関わる分子を標的とした治療実験を共培養、共移植を用いて行う。
βアレスチン一酸化窒素修飾のケモカインシグナル調節機構と動脈硬化との関連について

動脈硬化をはじめ慢性炎症を基盤とする疾患において特異的に活性化されたり調節を受けるシグナルの解明は新規治療法、診断法の開発につながる可能性がある。βアレスチンはG蛋白共役型受容体(GPCR)調節因子として働き、炎症状態において翻訳後修飾を受ける。動脈硬化において単球(マクロファージ)は病態形成に関与する重要なプレーヤーであり、ケモカイン受容体(GPCR)は病態形成において重要であるが、そのシグナル調節機構についてはまだ未解明な部分が多い。本研究ではβアレスチンの一酸化窒素修飾を介したケモカインシグナル調節機構の解明と動脈硬化病態との関連について検討する。
咬合支持を実験的に失わせた下顎の変位について(6自由度顎運動測定装置による測定)

目的近年,短縮歯列を基盤とする補綴処置が論議され,ヨーロッパ諸国ではその考えが実行されているようである.しかし,現代社会環境の複雑性が時として短縮歯列に対して顎機能障害を引き起こしていることは否定できない.そこで,顎機能に異常がなく,臼歯部の歯冠修復処置を必要としている被験者において,後方より順次咬合の支持域を失わせ,両側顆頭の咬合時の変位量ならびに変位方向を測定し,咬合が確立している状態と比較し,咬合支持域の変化が下顎顆頭にどめように影響するかを測定する.このことにより短縮歯列に対する考え方を含め,咬合支持域の安定性を検討する.結果補綴物を除去した時の両側顆頭の変位量は,除去前と比較して,除去していくに従い増加する傾向を示した.一方,顆頭の変位方向は咬合支持の有無に拘わらず上方から前上方となった.最大噛みしめ時の咬合力については,咬合支持が完全に確立している場合に対し,咬合支持を喪失させるとともに咬合力は徐々に減少して行く傾向を示した.今回の実験結果から,後方臼歯部の咬合支持域減少症例において,過剰な咬合力が加わった場合,顆頭が変位しやすいタイプとあまり変位しないタイプとが存在することが認められた.変位しないタイプでは大臼歯部が喪失しても,顎関節部に大きな負荷が加わるとは考えにくい.これに対し,変位しやすいタイプは,咬合支持域が第二大臼歯まで存在する場合と比較し,顎関節部に与える負荷は大きくなると考えられる.しかし,生体のもつ適応能力,あるいは防御機構の働きにより,全ての症例で顎関節部の退行性変化が生じるとは考えにくいが,何らかの機能的,感覚的変化が生じる可能性も大きいことが示唆された.目的近年,短縮歯列を基盤とする補綴処置が論議され,ヨーロッパ諸国ではその考えが実行されているようである.しかし,現代社会環境の複雑性が時として短縮歯列に対して顎機能障害を引き起こしていることは否定できない.そこで,顎機能に異常がなく,臼歯部の歯冠修復処置を必要としている被験者において,後方より順次咬合の支持域を失わせ,両側顆頭の咬合時の変位量ならびに変位方向を測定し,咬合が確立している状態と比較し,咬合支持域の変化が下顎顆頭にどのように影響するかを測定する.このことにより短縮歯列に対する考え方を含め,咬合支持域の安定性を検討する.結果補綴物を除去した時の両側顆頭の変位量は,除去前と比較して,除去していくに従い増加する傾向を示した.一方,顆頭の変位方向は咬合支持の有無に拘わらず上方から前上方となった.最大噛みしめ時の咬合力については,咬合支持が完全に確立している場合に対し,咬合支持を喪失させるとともに咬合力は徐々に減少して行く傾向を示した.今回の実験結果から,後方臼歯部の咬合支持域減少症例において,過剰な咬合力が加わった場合,顆頭が変位しやすいタイプとあまり変位しないタイプとが存在することが認められた.変位しないタイプでは大臼歯部が喪失しても,顎関節部に大きな負荷が加わるとは考えにくい.これに対し,変位しやすいタイプは,咬合支持域が第二大臼歯まで存在する場合と比較し,顎関節部に与える負荷は大きくなると考えられる.しかし,生体のもつ適応能力,あるいは防御機構の働きにより,全ての症例で顎関節部の退行性変化が生じるとは考えにくいが,何らかの機能的,感覚的変化が生じる可能性も大きいことが示唆された.目的近年,短縮歯列を基盤とする補綴処置が論議され,ヨーロッパ諸国ではその考えが実行されているようである.しかし,現代社会環境の複雑性が時として短縮歯列に対して顎機能障害を引き起こしていることは否定できない.そこで,顎機能に異常がなく,臼歯部の歯冠修復処置を必要としている被験者において,後方より順次咬合の支持域を失わせ,両側顆頭の咬合時の変位量ならびに変位方向を測定し,咬合が確立している状態と比較し,咬合支持域の変化が下顎顆頭にどめように影響するかを測定する.このことにより短縮歯列に対する考え方を含め,咬合支持域の安定性を検討する.結果補綴物を除去した時の両側顆頭の変位量は,除去前と比較して,除去していくに従い増加する傾向を示した.一方,顆頭の変位方向は咬合支持の有無に拘わらず上方から前上方となった.最大噛みしめ時の咬合力については,咬合支持が完全に確立している場合に対し,咬合支持を喪失させるとともに咬合力は徐々に減少して行く傾向を示した.今回の実験結果から,後方臼歯部の咬合支持域減少症例において,過剰な咬合力が加わった場合,顆頭が変位しやすいタイプとあまり変位しないタイプとが存在することが認められた.変位しないタイプでは大臼歯部が喪失しても,顎関節部に大きな負荷が加わるとは考えにくい.これに対し,変位しやすいタイプは,咬合支持域が第二大臼歯まで存在する場合と比較し,顎関節部に与える負荷は大きくなると考えられる.しかし,生体のもつ適応能力,あるいは防御機構の働きにより,全ての症例で顎関節部の退行性変化が生じるとは考えにくいが,何らかの機能的,感覚的変化が生じる可能性も大きいことが示唆された.
人工膜中での配座制御を基盤とした大員環構築法の開発

大員環骨格を鎖状分子の分子内環化により構築することは、基質の配座の自由度が大きく反応点同士が近づいた配座を取りにくいため、効率よく行うことが難しい。本研究では、人工膜中に基質となる鎖状分子を取り込ませれば、膜の低い流動性と密な環境の為に反応点同士が近づいた配座となり、分子内環化が促進されると考えた。即ち、長鎖アルキル基の両末端にケイ皮酸エステル部位を持ち、中央部にコハク酸部位を有する両親媒性化合物を、膜構成分子と共に水溶液中で分散させ反応基質を取り込んだ人工膜を調製し、続く光照射により分子内環化を行う計画を立てた。まず、膜中での光反応の挙動を調べるべく、基質を取り込んだ人工膜を調製し室温下光照射を行ったところ、人工膜中では、溶液中ではほとんど進行しない光二量化反応が容易に進行することが明らかとなった。生成物は多くの位置及び立体異性体の混合物であったが、主にδ、β、α体がほぼ同程度生成していた。ここでα体が多く生成したことから、分子間反応がかなりの割合で生成したと考えられた。これは、基質が十分に分散しない状態で膜中に取り込まれたことを示唆している。そこで高温で反応を行えば分離が解消され、分子間反応が制御されるものと考え、膜の相転移温度より高い90°Cで光照射を行った。その結果、α体の生成が見事に抑えられ、δ体が選択性良く得られることがわかった。さらに、生じた二量体が分子間、分子内のいずれの反応によるものかを直接的に調べるため、ケイ皮酸エステルと同等の反応性を示す4-メトキシケイ皮酸エステルを有する基質との交差実験を行ったところ、高温では顕著に分子内反応の割合が増加することがわかった。また、基質の極性基をリン酸基に変えると、さらに分子内反応が進行し易くなることを見出した。これらの結果は、本研究の目的である膜中での鎖状分子の配座制御が実現可能であることを示しており、大変意義深い。天然にはgymnodimine,prorocentrolideのような大環状炭素骨格を含む化合物が知られており、その骨格は生体内では分子内Diels-Alder反応により構築されると推定されている。これらの骨格構築を合成化学的に鎖状分子の分子内反応により一挙に行うことを考えた場合、一般には分子の配座の自由度が大きく反応点同士が近づいた配座を取ることが難しいため、効率よく目的物を得ることは容易ではない。本研究では、長鎖アルキルアンモニウム塩や長鎖アルキルリン酸エステルなどから調製した人工膜中に、長鎖アルキル基の両末端に反応点を持ち、かつ分子内の適当な位置に親水性基を有する鎮状分子を取り込ませれば、膜の持つ低い流動性と密な環境のために配座が制御されて反応点同士が近づき、分子内反応が促進されるのではないかと考えた。本年度は、上記コンセプトが実現可能かどうかを検証するためケイ皮酸誘導体の分子内光二量化反応をモデルとして選び研究を行った。実際には長鎖アルキル基の両末端にケイ皮酸エステル部位を持ち、中心部にコハク酸ハーフエステルを有する基質を合成し、まず基質単独の希薄溶液中での光反応の挙動を調べた。その結果、MeOH,hexane,CHCl_3,H_2Oなどの溶媒中では、環化体はほとんど生成せず、希薄溶液中では分子内環化は実現できないことが確認できた。そこで、実際に基質を膜に取り込んだ状態で反応を試みることとし、基質とジヘキサデシルホスフェイトとを水中で混合分散させて膜を調製した後、光照射を行った。その結果予想通り分子内環化体が約50%の収率で得られることを見いだした。この結果は、人工膜による鎖状分子の配座制御が実現できることを示すものであり大変興味深い。来年度は、様々な基質を用いて本手法の適用範囲について調べるとともに、温度や膜構成分子等の効果について詳細な検討を行う。

さらに、生じた二量体が分子間、分子内のいずれの反応によるものかを直接的に調べるため、ケイ皮酸エステルと同等の反応性を示す4-メトキシケイ皮酸エステルを有する基質との交差実験を行ったところ、高温では顕著に分子内反応の割合が増加することがわかった。また、基質の極性基をリン酸基に変えると、さらに分子内反応が進行し易くなることを見出した。これらの結果は、本研究の目的である膜中での鎖状分子の配座制御が実現可能であることを示しており、大変意義深い。
環状DNA単分子の高密度凝縮化技術による生体個体内未踏空間送達システムの創製

本研究では、科学的に通常不可能な、生体内の水系の環境におけるDNAの陰イオンと一価の陽イオンとの結合体である「モノイオンコンプレックス(MIC)」の学理を構築し、MICでしか実現し得ない微小空間への環状DNAの高密度な閉じ込めにより、環状DNAの飛躍的な拡散性に基づく生体個体内未踏空間への環状DNAの送達システムを創製する。生体個体内の任意の全細胞での無侵襲的な、環状DNAの発現に基づくタンパク質医薬治療、RNA干渉、ゲノム編集の実現により、難治性疾患治療に対するDDS基盤技術の確立を目指す。本年度は、MICを形成する一価の陽イオンを有する生体適合性高分子の構造最適化の過程で合成したAPe-Im-E-PEG、すなわち、アミドペンチルイミダゾリウムとポリエチレングリコール(PEG)のスペーサーに生分解性のエステル結合を有するモノカチオン性PEGを用いた環状DNAの送達システムのためのMIC構造を最適化した。APe-Im-E-PEGの経時的な加水分解過程を、ゲルろ過クロマトグラフィーにより評価し、生理pHでの約2週間の持続的な加水分解の促進が確認された。加水分解後のAPe-Im-E-PEGは、赤血球溶血実験により、生理pHと比較して、エンドソーム内pHでの細胞膜破壊活性を示した。さらに、これらモノカチオン性PEGとpDNAとのMICについて、透過型電子顕微鏡による詳細な観察の結果、混合電荷比16および32おいて、球状ではなく、凝縮が弱い傾向の形状を示した。得られたAPe-Im-E-PEGとpDNAとのMICをマウスの脛骨筋へ投与し、複数回の実験結果を統計的に処理すると、電荷比16の条件で、投与1週間から2週間にかけて遺伝子発現量が向上した。この時、蛍光組織切片観察からも、拡散的な発現が示唆された。以上の結果は、難治性疾患治療に対するDDS基盤技術の確立に寄与する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、生体内の水系の環境におけるDNAの陰イオンと一価の陽イオンとの結合体である「モノイオンコンプレックス(MIC)」の学理を構築する。そして、MICでしか実現し得ない微小空間への環状DNAの高密度な閉じ込めにより、環状DNAの飛躍的な拡散性に基づく生体個体内未踏空間への環状DNAの送達システムを創製する。さらに、生体個体内の任意の全細胞での無侵襲的な、環状DNAの発現に基づくタンパク質医薬治療、RNA干渉、ゲノム編集の実現により、難治性疾患治療に対するDDS基盤技術の確立を目指す。本年度は、「(I)環状DNAと生体適合性高分子とのMIC形成の学理構築」では、MICを形成する一価の陽イオンを有する生体適合性高分子の構造最適化の過程で、アミドペンチルイミダゾリウムとポリエチレングリコール(PEG)のスペーサーに生分解性のエステル結合を有するAPe-Im-E-PEGを合成した。得られたAPe-Im-E-PEGは、高い拡散性により標的細胞へ到達後、PEG鎖の結合点の加水分解によりPEG鎖が切断されるのみならず、切断されたMIC側にpH応答性官能基が残る設計となってる。すなわち、今までの生体個体内の拡散性のみに特化していたMICを、標的細胞内で効率的に細胞質内移行を促す分子設計に最適化した。また、MICと超泳動現象の相関解析の過程では、透過型電子顕微鏡(TEM)による観察を行い、特殊な形状を確認した。さらに、「(II)MIC形成でのみ実現し得る環状DNA単分子の高密度な凝縮による生体個体内拡散性の向上」では、上述で合成したAPe-Im-E-PEGとpDNAとのMICをマウスの脛骨筋に投与すると、予備的検討ではあるが、電荷比1の条件で、投与1週間後から2週間後にかけて、遺伝子発現量が向上するという、生体個体内の拡散性のみならず、持続的遺伝子発現の観点からも興味深い結果を得た。本年度の計画では、「(I)環状DNAと生体適合性高分子とのモノイオンコンプレックス(MIC)形成の学理構築」および「(II)MIC形成でのみ実現し得る環状DNA単分子の高密度な凝縮による生体個体内拡散性の向上」を掲げた。(I)では、PEG切断後にpH応答性を発揮するAPe-Im-E-PEG(アミドペンチルイミダゾリウムとポリエチレングリコール(PEG)のスペーサーにエステル結合を有する高分子)を合成することにより、今までの生体個体内の拡散性のみに特化していたMICを、標的細胞内で効率的に細胞質内移行を促す分子設計に最適化されたためである。また、TEMによる超泳動を示すMICの直接観察に成功したことも理由として挙げられる。(II)では、(I)で得られたAPe-Im-E-PEGとpDNAとのMICは、生体個体内で、長期間、経時的に遺伝子発現を向上させるという生体個体内の拡散性の向上以上の機能が示唆されたためである。

本年度は、MICを形成する一価の陽イオンを有する生体適合性高分子の構造最適化の過程で合成したAPe-Im-E-PEG、すなわち、アミドペンチルイミダゾリウムとポリエチレングリコール(PEG)のスペーサーに生分解性のエステル結合を有するモノカチオン性PEGを用いた環状DNAの送達システムを構築した。APe-Im-E-PEGの経時的な加水分解過程を、ゲルろ過クロマトグラフィーにより評価し、従来型のエステル結合を有さないAPe-Im-PEGと比較して、加水分解の促進が確認された。さらに、これらモノカチオン性PEGとpDNAとのMICについて、透過型電子顕微鏡による観察に加えて、1DNA/RNA分析用マイクロチップ電気泳動、および、2ナノトレッキングによる解析を行った。その結果、1においても超泳動現象が確認され、2においては、電荷比8のMICに対して、電荷比1のMICでは、ほぼ凝集していないことが確認され、低電荷比での動物実験結果の良好性が支持された。そして、APe-Im-E-PEGとpDNAとのMICをマウスの脛骨筋へ投与し、複数回の実験結果を統計的に処理すると、電荷比1の条件で、投与1週間から2週間にかけて遺伝子発現量が向上するという、難治性疾患治療に有望な環状DNA送達に成功した。モノイオンコンプレックス(MIC)の形状観察として、透過型電子顕微鏡(TEM)に加えて、新しい分析法(マイクロチップ電気泳動やナノトレッキング)を取り入れ、MIC形成の学理と動物実験における生体個体内での拡散性の向上との相関を明らかにした点が挙げられる。さらに、アミドペンチルイミダゾリウムとポリエチレングリコール(PEG)のスペーサーに生分解性のエステル結合を有するモノカチオン性PEG(APe-Im-E-PEG)の分子設計の合理性を明らかにした点が挙げられる。すなわち、スペーサー内でのエステル結合の向きを逆(加水分解後のMICにpH応答性が無い)にしたコントロールのモノカチオン性PEGでは、遺伝子発現の向上が認められなかったため、生体内を拡散後に細胞内に取り込まれたMICには、pH応答性が必要であり、細胞質内移行性の重要性も明らかにしたことである。そして、得られたMICは、マウス脛骨筋投与後、1週間から2週間にかけて遺伝子発現を向上させることに成功したため、タンパク質発現量の積分値は大きいと考えられる。従って、APe-Im-E-PEGとpDNAとのMICは、治療用タンパク質やshRNA発現に有望であり、難治性疾患治療の実現に寄与すると考えられるため。本研究では、科学的に通常不可能な、生体内の水系の環境におけるDNAの陰イオンと一価の陽イオンとの結合体である「モノイオンコンプレックス(MIC)」の学理を構築し、MICでしか実現し得ない微小空間への環状DNAの高密度な閉じ込めにより、環状DNAの飛躍的な拡散性に基づく生体個体内未踏空間への環状DNAの送達システムを創製する。生体個体内の任意の全細胞での無侵襲的な、環状DNAの発現に基づくタンパク質医薬治療、RNA干渉、ゲノム編集の実現により、難治性疾患治療に対するDDS基盤技術の確立を目指す。本年度は、MICを形成する一価の陽イオンを有する生体適合性高分子の構造最適化の過程で合成したAPe-Im-E-PEG、すなわち、アミドペンチルイミダゾリウムとポリエチレングリコール(PEG)のスペーサーに生分解性のエステル結合を有するモノカチオン性PEGを用いた環状DNAの送達システムのためのMIC構造を最適化した。
水頭症に於ける脳循環代謝障害の特異性の検討

我々は、ラット実験水頭症モデルを用いて脳循環代謝障害の特異性について検討した。(方法)5週齢の雄Wisterラット(100-120g)を用いて、Yamaki et alの方法に準じてカオリン水頭症モデルを作製し、急性期(水頭症作製後1-2週以内)および慢性期(4-6週)に多重標識オートラジオグラフィの手法を用いて以下の検討をおこなった。1:脳血流量及びブドウ糖代謝の同時測定(18FDGと14C-IAP)2:嫌気的代謝および好気的代謝の検討(H-3 deoxyglucoseとC-14 glucose)(結果)水頭症急性期と慢性期との間には、脳質拡大の程度、体重、ともに有意差は認められれなかった。脳血流量については急性期には水頭症群は対照群と比較して全脳で低下していた。特に大脳皮質、脳室周囲白質でその傾向が著しかった。この傾向は慢性期水頭症ラットでテント上で更に顕著となっていた。一方ブドウ糖代謝は水頭症急性期には各部位において逆に増加傾向を示していた。deoxyglucoseの取り込みがglucoseの取り込みより高い、即ち嫌気的糖代謝の存在を示唆する領域は急性期では大脳皮質、視床、視床下部、海馬、脳梁などに認められる傾向があり、慢性期では両者の格差は減少し、大脳皮質領域と視床においてのみdeoxyglucose imageの方が高かった。以上の実験結果より、水頭症急性期において、脳内の環境変化とともに脳細胞内での酸化的リン酸化の障害はすでに始まっており、好気的代謝障害によるenergy chargeの低下が早期からの組織障害を招いている可能性が示唆された。われわれはカオリン水頭症の脳循環と代謝の関連を多重標識オートラジオグラフィの手法を用いて検討した。5週齢の雄Wisterラットを用いて、カオリン生理食塩水懸濁液0.2mlを大槽内に投与した。対照群として生理食塩水のみの大槽内投与を行った。脳血流量及びブドウ糖代謝の測定は、急性期(水頭症作製後1-2週以内)および慢性期(4-6週)におこなった。18F-fluoro-deoxyglucoseを静脈内投与44分後、4-Iodo-(N-methyl-14C)-antipyrineを静脈内投与し45秒後に断頭した。水頭症モデルにおける脳血流量及びブドウ糖代謝率は%changeを用いて正常対照群における値と比較検討した。(結果)急性期には脳血流量は対照群と比較して全脳で低下していた。特に大脳皮質、尾状核、脳梁、septal nucleus等の脳室周囲白質でその傾向が著しかった。一方ブドウ糖代謝に関しては水頭症急性期には各部位において逆に増加傾向を示していた。慢性期には、前脳でわずかに低下傾向が認められたもののそれ以外の部位では正常対照群と比較して明らかに増加していた。(考察)さて本検討の結果から、水頭症急性期に於ては、組織障害或は間質の浮腫により正常な好気的代謝が行えず、嫌気的解糖によってエネルギー代謝を営んでいる事が示唆された。われわれはカオリン水頭症のブドウ糖代謝における嫌気的解糖を多重標識オートラジオグラフィの手法を用いて検討した。H-3deoxyglucose静脈内投与後39分に6-C-14glucoseを投与し6分後に断頭した。

脳を凍結した後に20μmの切片を作製しBioimaging analyzerを用いて、脳局所glucose代謝率と脳局所deoxyglucose代謝率を求め比較検討した。その性質から前者は好気的代謝を反映し、後者は嫌気的及び好気的代謝の和を表している。両者の差を計算することによって脳局所における嫌気的代謝量が求められる。(結果)急性期には大脳皮質領域を中心に10%程度の嫌気的ブドウ糖代謝の存在が確認された。この傾向は慢性期水頭症でも観察されたが程度は軽度であった。しかし正常コントロール群では嫌気的代謝の存在は確認できなかった。(結論)本検討の結果から、水頭症急性期に於ては、組織障害或は間質の浮腫により酸化的燐酸化の障害が始まっており正常な好気的代謝が行えず、嫌気的解糖によってエネルギー代謝を営んでいる事が示唆された。
単一原子観測/制御下の量子多体ダイナミクス解明に向けた非摂動手法構築

身の回りの物質は電子と原子が互いに相互作用して形作られている。このような量子多体系のダイナミクスを、単一原子分解能で微視的に観測/制御する事が近年実現した。ミクロな運動の詳細は観測/制御できないという仮定のもとに成立してきた従来の物性/統計物理学の枠組みは、このような状況では破綻し、異なる一般原理に基づいた基礎理論が必要となる。一方で、単一原子制御は固体物理では実現し得なかった新しいクラスの量子物質の研究を可能にする。本研究では、単一原子観測/制御下の非平衡な量子多体問題を解明するための基礎理論を構築し、物性/統計物理学の新たなフロンティアを拓くことを目指し研究を行う。
超高真空中でのエキシマレ-ザ励起AlーSi界面形成過程のXPS分析による研究

本年度はAl堆積のソ-スガスであるトリメチルアルミニウム[TMA:Al(CH_3)_3]により、SiO_x/Si表面上へ膜の堆積を行い、この時の反応過程をXPS(X線光電子分光法)で分析した。まず、基板温度400°Cにおいて、SiO_x/Si表面上へTMAにより膜の成長を行なった。この膜をXPS分析した結果、成長初期に多量の炭素の混入(Al:C=1:2程度)が見られた。そして、成長するに従いこの混入量は低減していくが、最終的にはほぼAl:C=4:3程度の組成比の膜となった。同様に、基板温度350600°Cの範囲で変化して膜の成長を行ったところ、どの基板温度においても上記とほとんど似た結果となった。これより、TMAによりAl膜を成長する場合には、多量の炭素混入がみられるため、これを防ぐための検討が必要である。また、この成長膜をRHEED(反射型高速電子線回折)観察したところリングパタ-ンとなり、この膜が多結晶であることが明かとなった。さらに、このパタ-ンにより膜の構造を同定してみたところAl_4C_3の多結晶膜であることがわかった。この結果はXPS分析による結果と一致している。次に、炭素混入量の軽減を計り、TMAと水素を同時に導入し、膜の成長を行なったところTMAのみで成長した場合に比べ、膜の成長初期における炭素混入量の低減(Al:C=2:3)が見られた。しかしながら、成長する膜はAl_4C_3膜であった。現在、TMA以外のソ-スガスを用いて、膜の成長を行なったいる。来年度中にこれらの結果をまとめ、エキシマレ-ザの効果も含めてさらに反応過程の考察を行なう予定である。
チョーサー作『カンタベリー物語』Hg,El写本及び刊本の言語の計量的比較

本研究の目的は、コンピュータを利用し、『カンタベリー物語』について、2つの代表的な写本と2つの代表的な刊本を取り上げ、4つのテクストを対応させたコンコーダンスを作成し、Chaucerの言語研究及びtextual criticismに貢献することである。写本は代表的な2写本、Hengwrt(以下、Hg)写本とEllesmere(以下、El)写本を、そして刊本は、Hgに依拠したN.Blake(1980)とElに依拠したBenson(1987)を取り上げた。平成17年度においては、The Miller's TaleとThe Reeve's Taleに関して、Hg, El写本及び刊本Blake(1980),Benson(1987)に基づいて、包括的な校合コンコーダンスを完成させた。平成16年度に作成したものに、句読点の違いを含めたことで、テクスト生成及び編集過程を一層客観的・網羅的に示すことが可能になった。Linne Mooney(2004)がHg, El写本の写字生、Adam Pynkhurstを同定したこともあって、両写本の特性の記述は今大きな議論を呼んでいる。この学会動向に対しても有益な情報を提供できると考えている。本研究の目的は、コンピュータを利用し、チョーサー作『カンタベリー物語』(The Canterbury Tales)について、2つの代表的な写本と2つの代表的な刊本を取り上げ、4つのテクストを対応させたコンコーダンスを作成し、Chaucerの言語研究及びtextual criticismに貢献することである。写本は当該作品84写本のうち、最も重要であると考えられる2つの写本、Hengwrt(以下、Hg)写本とEllesmere(以下、El)写本を取り上げた。また現代の代表的な2つの刊本として、Hgに依拠した刊本、N.Blake, ed.(1980) The Canterbury Tales, Edward ArnoldとElに依拠したL.D.Benson, ed.(1987) The Riverside Chaucer, OUPを取り上げた。写本間の校合は、Stubbs (2000)のCD-ROM及びHanna III (1989)とRuggiers (1979)のファクシミリを利用した。本研究の目的は、コンピュータを利用し、『カンタベリー物語』について、2つの代表的な写本と2つの代表的な刊本を取り上げ、4つのテクストを対応させるコンコーダンスを作成し、Chaucerの言語研究及びtextual criticismに貢献することである。写本は代表的な2写本、Hengwrt(以下、Hg)写本とEllesmere(以下、El)写本を、そして刊本は、Hgに依拠したBlake(1980)とElに依拠したBenson(1987)を取り上げた。平成17年度においては、The Miller's TaleとThe Reeve's Taleに関して、Hg,El写本及び刊本Blake(1980),Benson(1987)に基づいて、包括的な比較コンコーダンスを完成させた。句読点の違いも含めたことで、テクストの生成・編集過程を一層客観的・網羅的に示すことが可能になった。Linne Mooney(2004)がHg,El写本の写字生、Adam Pynkhurstの可能性を指摘したこともあって、両写本は今大きく注目されている。
バイオメカニクスから紐解く雌雄交尾器の共多様化機構

雌雄交尾器の共多様化が如何にして生じたかに答えるため,1雌雄交尾器の物理的相互作用がどう達成されるのか,2雌雄交尾器の形の違いがその相互作用に影響をもたらすか,という疑問にバイオメカニカルな立場から取り組んだ.1雌雄交尾器の種間変異の記載と定量化,2物理的相互作用の断片的視覚化と物性の理解から雌雄交尾器の機能や動きがもたらされるメカニズムを機械的に説明,3実験的に2の仮説の検証のステップで進めた.雌雄交尾器が物理的に相互作用する過程のうち,本年度は昆虫の極端に長い交尾器を介した射精プロセスを対象に,実体・光学・電子・レーザー顕微鏡,X線μCTを駆使し,以下のことを明らかにした.1.極端に長い交尾器のサイズ(直径)が,交尾器の長さ・体サイズ・系統関係と関係なく種間で雌雄共に著しく変異する(雄交尾器:2μmから数10μm).2.上の計測値を基に1精液がオス交尾器の管を表面張力で満たすのに要する時間,2精液をオス交尾器の管から押し出すのに必要な力を計算した.その結果,どの種でも表面張力だけで2cm程度の長さのオス交尾器の管を容易に濡らせること,一方で精液の雌への受け渡しプロセスはオス交尾器の直径によってメカニズムが異なることが,理論的に示された.直径が2μmの種では,精液を押し出すには昆虫では不可能なほど大きな力が必要であるが,直径が数10μmの種では,精液はオス側の押し出す力でメスへ受け渡し可能である.3.オス交尾器の直径が比較的大きな種ではオスの交尾器に発達した筋肉が認められポンプとして機能することが示唆されるのに対し,直径の小さな種では類似の構造は認められなかった.後者については,オス側とメス側を満たす液体の濃度勾配などから能動的に精液がオスからメスへ流れる可能性が考えられる.次年度,実験的にその可能性を確かめるため,実験を検討中である.翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。雌雄交尾器に見られる著しい共多様化を促した背景の解明を目指し,雌雄交尾器の物理的相互作用のメカニクスに取り組んでいる.本年度は,ペニス挿入に焦点をあて,雌雄交尾器の定量が容易な体長に匹敵するほど長い生殖器をもつカメノコハムシ類からCassida rubiginosaとCassida vibexをメインの材料として,以下の成果を得た.交尾時に接触する雌雄の構造を精査したところ,メスの構造はスパイラルを描き,かつスパイラルの逆転が確認された.オスに比べ種間変異が乏しいと考えられていたが,種間でスパイラルの曲率・数やスパイラルの逆転の数が著しく変異し,種内変異も著しいことが判明した.オスは種内変異は乏しいが,種間では顕著な違いがみられた一方で共通した基本構造として,ペニスを取り巻きペニスの縦軸方法に走る筋肉を確認した.構造理解から,縦筋肉の収縮がペニスの押し出し(メスへの挿入)をもたらしている可能性が考えられた.そこで,交尾中のペアと交尾中ではないオスを瞬間固定して,ペニスの状態を視覚化ならびに計測した.その結果,交尾中の個体ではペニスを取り巻く縦筋肉が通常時より短くなっており,その短縮分は挿入長に相当した.これらは,複雑な形状をとるメスへのペニスの挿入がペニスを取り巻く縦筋肉の収縮のみで引き起こされることを支持する.さらに,物質組成の推定ならびに,新たに構築した実験系を用いた交尾器の硬さ測定も行った.その結果,ペニスの先端にある物質の局在が示唆され,かつペニスには硬さに勾配(基部が硬く,先端が柔らかい)があることを発見した.数学者の協力を得て,以上の成果を基に数学的に雌雄の構造を記述し,ペニスを基部から押すというシンプルなシミュレーションを行った.メスの変異を特徴づけるスパイラルの曲率とスパイラルの逆転の存在,ペニスの硬さといった要素がペニスの挿入に影響することが判明した.局所的には,進行の遅れや予定外の進展があるが,全体的には概ね順調に進行している.遅れた部分の要因として,分野を超えて多くの研究者からの協力や彼らとの議論を通して進めているため,研究者間の足並みが揃わない時があったことがあげられる.しかし,初年度に予定した挿入プロセスに関しては,既に出版済み・投稿中・数日中にも投稿の段階であり最終的には遅れは取り戻した.想定外の発展には,予定になかった工学者との議論から派生的なプロジェクトもスタートした.加えて2年目の予定であった射精プロセスに関しても既にデータがある程度揃い,執筆を進めている.これも一部揃っていないデータは協力者の協力が不可欠な部分であり,共同研究者にいかに協力いただくかが今後の課題と言える.雌雄交尾器の共多様化が如何にして生じたかに答えるため,1雌雄交尾器の物理的相互作用がどう達成されるのか,2雌雄交尾器の形の違いがその相互作用に影響をもたらすか,という疑問にバイオメカニカルな立場から取り組んだ.1雌雄交尾器の種間変異の記載と定量化,2物理的相互作用の断片的視覚化と物性の理解から雌雄交尾器の機能や動きがもたらされるメカニズムを機械的に説明,3実験的に2の仮説の検証のステップで進めた.

雌雄交尾器が物理的に相互作用する過程のうち,本年度は昆虫の極端に長い交尾器を介した射精プロセスを対象に,実体・光学・電子・レーザー顕微鏡,X線μCTを駆使し,以下のことを明らかにした.1.極端に長い交尾器のサイズ(直径)が,交尾器の長さ・体サイズ・系統関係と関係なく種間で雌雄共に著しく変異する(雄交尾器:2μmから数10μm).2.上の計測値を基に1精液がオス交尾器の管を表面張力で満たすのに要する時間,2精液をオス交尾器の管から押し出すのに必要な力を計算した.その結果,どの種でも表面張力だけで2cm程度の長さのオス交尾器の管を容易に濡らせること,一方で精液の雌への受け渡しプロセスはオス交尾器の直径によってメカニズムが異なることが,理論的に示された.直径が2μmの種では,精液を押し出すには昆虫では不可能なほど大きな力が必要であるが,直径が数10μmの種では,精液はオス側の押し出す力でメスへ受け渡し可能である.3.オス交尾器の直径が比較的大きな種ではオスの交尾器に発達した筋肉が認められポンプとして機能することが示唆されるのに対し,直径の小さな種では類似の構造は認められなかった.後者については,オス側とメス側を満たす液体の濃度勾配などから能動的に精液がオスからメスへ流れる可能性が考えられる.次年度,実験的にその可能性を確かめるため,実験を検討中である.次年度は,射精プロセスに焦点をあて,実験的にそのメカニズムを検証する.今年度の成果を基に,当初の予定以外にも神経生理学的な実験を行う必要があると考えている.既に神経生理学者との議論は進めているが,彼らの協力なくして実験の成功は極めて難しい.今年度の経験から,いかに協力者の信頼を得て彼らが協力を惜しまないような研究者になれるかが成功の鍵を握ると考える.次年度は,協力者との議論の場をさらに増やし,不測の事態にも速やかに対応できる体制を整備する予定である.次年度も新たな技術を身に着けながらの実験になり,さらに今年度の成果発表として国際学会も複数予定をしており,体調管理と先を見据えたスケジュールについて,現在検討中である.翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
脂肪組織由来幹細胞を用いた胎児細胞移植療法の検討

胎児期より進行性の中枢神経症状を呈するダウン症などに対しての細胞治療はほとんど報告がない。本研究では胎児細胞移植療法のセルリソースとして脂肪組織由来幹細胞(ADSC)の中枢神経系への有効性を明らかにする事を目的とした。CAG-EGFP Tgマウス鼠蹊部よりGFP陽性ADSCを採取し、子宮内にて胎生14.5日マウス胎仔の脳室内へ投与したところ、脳室周囲の脳実質内にGFP陽性細胞を認め、長い細胞突起を有する神経細胞様の形態を呈し、神経への分化能を有した。ADSCは胎児の中枢神経系の再生や機能補完に細胞治療の有用なリソースと考える。マウス脂肪組織由来幹細胞はSca-1, CD106, CD105, CD29, CD44を発現し、骨髄幹細胞と同等の発現パターンを示した。さらに、間葉系幹細胞のマーカーであるSca-1およびPDGFRalfaαを共発現した細胞は57.3%存在した。初代培養脂肪由来幹細胞にレチノイン酸存在下で1日、さらにPDGF, bFGF, forskolin, GGF2存在下で5日間培養すると形態学的に軸索様の細長い細胞突起と豊富な細胞体を有する神経細胞様細胞へ分化した。さらに、NSEやGFAPのmRNAの発現上昇を認めた。また、免疫組織学的にはS100B, GFAP, TUBB3に陽性を示し、脂肪由来幹細胞から神経細胞への分化誘導が確認された。またマウス脂肪由来間細胞より3次元培養を行いスフィア形成能を確認し、此のスフィアにおいて最外層にNeuN及びTUBB3陽性のニューロンを認めた。また内層にはGFAP及びS100B陽性のアストロサイトとともにNestin及びSOX2陽性の神経前駆細胞を認めた。胎児移植においてEGFPマウスより採取した脂肪組織由来幹細胞を胎生14.5日マウス胎仔の脳室内へ投与したところ、胎生19.5日に脳室周囲に投与細胞が脳実質内にGFP陽性細胞を認め、長い細胞突起を有する神経細胞様の形態を呈していた。免疫化学的に脳内におけるGFP陽性細胞を検討したところアストロサイトのマーカーであるGFAP陽性細胞及びニューロンのマーカーであるTUBB3陽性細胞を認めた。以上の結果から、これらのことから脂肪組織由来幹細胞は神経への分化能を有すること、胎仔脳内で生着、分化が可能である事が示唆された。脂肪組織由来幹細胞は胎児の中枢神経系の再生や機能補完において細胞治療における有用なリソースになると考える。28年度が最終年度であるため、記入しない。周産期医学28年度が最終年度であるため、記入しない。