hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経因性疼痛の細胞レベルでの発生機序の解明

神経因性疼痛モデル動物では、脊髄背根神経節(Dorsal Root Ganglion ; DRG)内の神経成長因子(NGF)濃度が増加することや、NGF存在下で培養したラットDRGニューロンでは自発性活動電位が生じることから、NGFが神経因性疼痛の発症に関わっていると考えられている。しかし、DRGニューロンは均質な細胞集団ではなく、NGFにより興奮性が亢進したニューロンがどのような特徴を持つか、またNGFを添加することで細胞内Ca^<2+>濃度([Ca^<2+>]_i)はどのように変化するか不明である。NGF存在下で培養したDRGニューロンの特徴を[Ca^<2+>]_iを指標に検討した。NGF群のニューロンでは対照群と比較して、無刺激条件下の[Ca^<2+>]_i変動の振動に増大が認められた。この[Ca^<2+>]_i変動は細胞外Na^+濃度を減少させることや、TTX、Lidocaineの適用により減少した。このことから[Ca^<2+>]、変動の振動増大は電位依存性Na^+チャネルの活性化、すなわち活動電位の発生に起因していることが示唆された。DRGには侵害刺激を受容するCニューロンが存在している。このCニューロンには侵害刺激を受容するTRPV1が発現している。TRPV1はCapsaicinにより活性化されることが知られているので、Capsaicinを用いてNGFにより[Ca^<2+>]_i変動の振動の増大が引き起こされたニューロンの特性を調べた。その結果、NGFにより興奮性の亢進したDRGの中にはCapsaicinに応答して[Ca^<2+>]_i上昇を示す細胞が多数存在することが分かった。以上の成績からNGFはCニューロンに作用し自発性活動電位を引き起こし[Ca^<2+>]_iを上昇させていることが明らかになった。このNGFによる侵害受容Cニューロンの異常興奮性誘発が神経因性疼痛の発症機序の一因であると考えられる。神経成長因子(NGF)が神経原性疼痛の発症に関与していることが示唆されている。しかし、NGFが直接,背根神経節(DRG)ニューロンに作用し継続的な自発性の活動電位が発生した、という報告はなされておらず、DRGにおけるNGF発現量増加とDRGニューロンの自発的な発火との関連は不明瞭である。本研究では、NGF存在下で継続的に培養した成熟ラットDRGニューロンの興奮性の変化についてパッチクランプ法を用いて検討した。NGF存在下で培養したDRGニューロンの中には自発性のスパイク反応が見られるニューロンがあり、TTXとLidocaineが全か無かの法則に従った抑制様式を示したことから、細胞全体の自発性の活動電位を記録していると考えた。これらのニューロンのうち75%で、ホールセル電位固定記録下で自発性に発生する内向き電流(I_<sp>)が記録された。このI_<sp>に対してもTTX、Lidocaineが全か無かの法則に従った抑制様式を示したこと、K^+チャネル抑制薬によりI_<sp>の持続時間が延長したことから、I_<sp>が電位固定が不十分な局所で発生する活動電位によるものであることが示唆された。I_<sp>はアウトサイドアウトパッチ記録下でも観察された。アウトサイドアウトパッチ記録下のI_<sp>のkineticsや薬理学的な性質はホールセル記録下のI_<sp>の性質に一致した。すなわち、ホールセル記録時には電位固定できていた電極先端周囲の細胞膜が、アウトサイドアウト記録への移行時に電位固定し難い形状に変形し、活動電位を発生するようになったものと考えられる。以上の結果から、NGF存在下でDRGニューロンを培養することによって細胞膜の興奮性が増大し、細胞膜の局所で自発的に活動電位が発生するようになっていることが示唆された。神経成長因子(NGF)が神経因性疼痛の発症に関与していること、神経因性疼痛モデル動物の背根神経節(DRG)ニューロンは自発的に活動電位を生じていることが示唆されている。しかし、NGFが直接的にDRGニューロンに作用し細胞の興奮性を変化させるという報告はなされていない。本研究では、成熟ラットより単離したDRGニューロンをNGF存在下で継続的に培養し、細胞膜興奮性の変化を検討した。(投稿論文の追加実験を中心に行ったため、年度当初に計画していた研究には大きな進展はなかった。)NGF存在下で培養したDRGニューロンの中にはセルアタッチ記録で自発性スパイク電流が見られるものがあった。この電流に対してTTXとLidocaineが全か無かの法則に従った抑制作用を持つことから、このスパイク電流が細胞全体の自発性の活動電位を反映していると考えた。このうち75%の細胞で、ホールセル電位固定記録下で自発性に発生する内向き電流(Isp)が記録された。Ispに対してもTTX、Lidocaineが全か無かの法則に従った抑制作用を持つこと、K+チャネル抑制薬がIspの持続時間を延長させる作用を持つことから、Ispが局所的な活動電位を反映しているものであることが示唆された。Ispのkineticsは20ms以内に個々の電流が終了する非常に速いものであった。Ispはアウトサイドアウト記録下でも観察された。アウトサイドアウト記録下のIspのkineticsや薬理学的な性質はホールセル記録下のIspの性質に一致した。

つまり、自発性活動電位を生じるような興奮性の高い部位が細胞体に存在しており、アウトサイドアウトパッチに引きちぎられ得ることが示された。以上の結果から、NGF存在下でDRGニューロンを培養することによって細胞膜の興奮性が増大し、細胞体の局所で自発的に活動電位が発生するようになっていることが示唆された。神経因性疼痛モデル動物では、脊髄背根神経節(Dorsal Root Ganglion ; DRG)内の神経成長因子(NGF)濃度が増加することや、NGF存在下で培養したラットDRGニューロンでは自発性活動電位が生じることから、NGFが神経因性疼痛の発症に関わっていると考えられている。しかし、DRGニューロンは均質な細胞集団ではなく、NGFにより興奮性が亢進したニューロンがどのような特徴を持つか、またNGFを添加することで細胞内Ca^<2+>濃度([Ca^<2+>]_i)はどのように変化するか不明である。NGF存在下で培養したDRGニューロンの特徴を[Ca^<2+>]_iを指標に検討した。NGF群のニューロンでは対照群と比較して、無刺激条件下の[Ca^<2+>]_i変動の振動に増大が認められた。この[Ca^<2+>]_i変動は細胞外Na^+濃度を減少させることや、TTX、Lidocaineの適用により減少した。このことから[Ca^<2+>]、変動の振動増大は電位依存性Na^+チャネルの活性化、すなわち活動電位の発生に起因していることが示唆された。DRGには侵害刺激を受容するCニューロンが存在している。このCニューロンには侵害刺激を受容するTRPV1が発現している。TRPV1はCapsaicinにより活性化されることが知られているので、Capsaicinを用いてNGFにより[Ca^<2+>]_i変動の振動の増大が引き起こされたニューロンの特性を調べた。その結果、NGFにより興奮性の亢進したDRGの中にはCapsaicinに応答して[Ca^<2+>]_i上昇を示す細胞が多数存在することが分かった。以上の成績からNGFはCニューロンに作用し自発性活動電位を引き起こし[Ca^<2+>]_iを上昇させていることが明らかになった。このNGFによる侵害受容Cニューロンの異常興奮性誘発が神経因性疼痛の発症機序の一因であると考えられる。
HBVのヒトmtDNAへの組み込み解析と創薬への応用

核酸アナログ製剤を始めとしたB型肝炎治療の進化だけでは肝発がん阻止が実現できないことから、現在ではHBVウイルスゲノムのヒトゲノム内組込み解析および発がんメカニズム研究が求められている。近年、次世代シーケンサー(NGS: Next Generation Sequencing)の登場によりヒトゲノム網羅的肝発がん解析が進むものの、通常のNGS解析で得られた結果は非組込み部位のゲノム配列がほとんどで、効率的な組込み部位解析が事実上困難であり十分な網羅的解析は実現できていない。我々は独創的な発想から生まれた組込み部位特異的次世代シークエンス解析法の開発(G-NAVI法)に成功し、GenomeResearch 2015ほかへ報告してきた。この手法でHBV感染肝がん細胞株では組込み部位の多くが非翻訳領域であったが、興味深いことにミトコンドリアDNA内COX3遺伝子の翻訳領域(exon)へHBV全長が組み込まれていることを発見した。HBVゲノム組込みによりミトコンドリアの呼吸活性低下がHBVゲノム組込みCOX3複合タンパクの分泌を起こし、その近隣の前がん細胞や正常細胞が互いに影響を及ぼすことで悪性化し、がん化が促進されると考えられた。本研究では、COX3-HBV複合タンパクの発がんへの関与や発がんに関連のあるHBx遺伝子の関与を検討することで肝発がんメカニズムの一端を解明し、既存薬剤であるCOX3選択的阻害剤(アセトアミノフェン)の新たな肝発がん抑制効果として創薬への応用につなげる。次世代シーケンサーにてミトコンドリア領域内COXIII近傍にヒトB型肝炎ウイルス(以下HBV)の組込みが同定された肝がん細胞株HepG2.2.15について、ダイレクトシークエンス法でも同様にCOXIII近傍にHBVが組み込まれていることを証明した。次に肝がん細胞株からミトコンドリアを抽出し、COXIIIおよびシトクロムcをウェスタンブロット(WB)にて同定した。HBV陰性肝がん細胞株であるHepG2と比較してHepG2.2.15ではCOXIIIで顕著な上昇が見られ、シトクロムcは低下していた。更にWBで炎症・癌の増殖に関与するシクロオキシゲナーゼ(COX2)についてHepG2と比較すると上昇していることが明らかになったことから、活性酵素種が関連する発癌機序の可能性が考えられた。今後は、DNA損傷の酸化ストレスマーカーである8-OHdGをELISA法により定量測定することで活性酵素種の関連を明らかにする。またCOX2の上昇からアセトアミノフェンにおける炎症反応の抑制効果が推測されるため、検証する予定である。初年度の実験結果よりHBVの組込みによるCOXIIIの複合蛋白がシトクロムcの機能低下を及ぼし、活性酵素種の増加に伴う発癌機序が考えられた。今後はHepG2.2.15を用いて、直接的な作用機序を解明するとともに、創薬研究としてアセトアミノフェンにおける炎症反応の抑制効果についても検討を行う。

初年度の実験結果よりHBVの組込みによるCOXIIIの複合蛋白がシトクロムcの機能低下を及ぼし、活性酵素種の増加に伴う発癌機序が考えられた。今後はHepG2.2.15を用いて、直接的な作用機序を解明するとともに、創薬研究としてアセトアミノフェンにおける炎症反応の抑制効果についても検討を行う。予定の一部を来年度に繰り越したため。昨年度に予定していた創薬研究を今年度に行う。特にアセトアミノフェンにおける炎症反応の抑制効果の検証を行う予定である。
電子顕微鏡内その場可視分光法による極微半導体結晶の光学特性の研究

結晶学・電子論の両面からナノ構造の光学特性を研究するため透過電子顕微鏡法と分光学的手法を組合わせた複合的研究法「透過電子顕微鏡内その場可視分光法」を開発してきた。科学研究援助金の補助により測定装置に偏光測定機構を装備した。これにより光学異方性が定量的に測定できるようになった。この研究手法をCuPt型規則構造を持つGaInPの反位相境界に適用した。本測定法により、はじめて反位相境界からの微弱偏光発光を検出した。すなわちバンド間遷移による発光に加えて、より低いエネルギー側に複数の偏光発光線を検出した。詳細な解析より、発光は反位相境界面と平行に偏光していることが分かった。反位相境界内でホールの量子閉じこめが生じて2つの新しいホール準位が形成され、その準位を介して発光が生じるという量子井戸モデルを提案した。この測定法を、我々のグループで独自に形成されたシリコンナノワイヤーにも適用した。その結果、可視領域での偏光発光が観測された。発光の起源は今のところ不明であるが、発光にはナノワイヤー中での量子閉じこめ効果が影響していると考えている。可視分光・透過電子顕微鏡複合法により、ナノ構造とそれに付随する電子状態の変化を原子レベルで理解ができた。今後はこの装置を、空間的に組成や構造の異なる様々な不均一試料に適用していきたい。GaPとInPの単層超格子(CuPt型自然超格子)を形成したGaInP中には、副格子上の原子配列が逆転する領域(反位相境界)が多く含まれる。高い空間分解能(約250nm)の透過電子顕微鏡-カソードルミネセンス(TEM-CL)測定法により、反位相境界では超格子領域と異なる発光特性を示すのが分かった。CL発光強度と反位相境界密度の関係およびCL発光スペクトルの偏光特性を定量的に調べた結果、反位相境界に量子井戸構造が自己形成されると結論された。この研究手法により、極微半導体結晶構造とそれに付随する光学特性を原子のレベルで理解できた。試料は(001)面から[11^^-0]方向に傾斜したGaAS基盤上に650°Cで成長させた、[11^^-1]方向に超格子構造をもつGaInPである。この試料は価電子帯と伝導帯間の電子遷移により1.9eV付近(バンドギャップE_gに相当)に強い発光を示す。この発光と共に、境界密度の高い領域で非常に反値幅の狭い(10数meV)4つの新しい発光ピークが観測された。ピークエネルギーはそれぞれE_gより8meV、18meV、24meV、32meVだけ低かった。これらの発光ピークの強度と反位相境界の密度との関係より、E_g-8meVとE_g-24meVの発光は(1^^-11)面上の、E_g-18meVとE_g-32meVの発光は(1^^-10)面上の反位相境界から生じると結論された。発光ピークの偏光特性を詳しく解析すると、反位相境界中の余剰なIn原子層を含む領域がGaInP/InP/GaInP量子井戸構造を形成し、井戸中の軽いまたは重い正孔準位から電子準位への電子遷移によって発光が生じると考えればよく実験結果を説明すると分かった。

この測定法を、我々のグループで独自に形成されたシリコンナノワイヤーにも適用した。その結果、可視領域での偏光発光が観測された。発光の起源は今のところ不明であるが、発光にはナノワイヤー中での量子閉じこめ効果が影響していると考えている。可視分光・透過電子顕微鏡複合法により、ナノ構造とそれに付随する電子状態の変化を原子レベルで理解ができた。今後はこの装置を、空間的に組成や構造の異なる様々な不均一試料に適用していきたい。
モルモットコロニーにおける新型パラインフルエンザウイルスの分子疫学的研究

当施設において分離された、モルモットパラインフルエンザ3型ウイルス(GPIV3)のゲノムに関して遺伝子解析を行っている。平成7年度はM,F,HNの膜タンパクについての遺伝子解析を行い、今年度はさらにゲノム全長にまで解析を進めた。その結果、GPIV3は15462塩基から成るnegative strandのRNAウイルスで、ゲノムは少なくとも6つのタンパク(NP,P/C/D/V,M,F,HN,L)をコードしていることが明らかになった。現在パラインフルエンザ3型ウイルス(PIV3)には、ヒトのHPIV3とウシから分離されたBPIV3が知られている。GPIV3の塩基配列を各タンパク毎に他のPIV3と比較すると、WA株と3.8%-6.5%、JS株とは2.1%-4.4%、BPIV3とは20.4%-29.0%の相違がみられ、GPIV3はBPIV3よりもHPIV3に近縁のウイルスであることが示唆された。また、F、HNの膜タンパクにおける糖鎖結合部位およびリン酸化部位、Lタンパクの酵素活性部位等のアミノ酸配列に関して、GPIV3とHPIV3との間に差異は認められなかった。NJ法およびUPGMA法を用いてGPIV3、HPIV3(WA株、JS株、JScp12,45変異株)およびBPIV3間の分子系統樹を作製したところ、遺伝的距離の点でGPIV3はBPIV3からは遠く離れており、HPIV3の範疇にあること、さらに、WA株とJS株とのおおむね中間に位置し、相対的にWA株よりはJS株に近縁のウイルスであることが証明された。従って、GPIV3はモルモット固有のウイルスというより、HPIV3モルモットコロニーに侵入し、それが幾世代も維持されてきたものと考えられる。また、各タンパクの各種活性部位のアミノ酸配列の類似性から、モルモットのGPIV3染をヒトにも感染しうる人獣共通伝染病ととらえることができる。この研究は、動物飼育施設におけるパラインフルエンザ3型ウイルスのヒトからモルモットへ、モルモットからヒトへという相互の感染について警鐘を鳴らすものである。(1)これまでのウイルス構造蛋白レベルの研究から、モルモットから新分離されたパラインフルエンザ3型ウイルス(GPIV-3)は、ヒトのPIV-3(HPIV-3)との類似性を示唆していたが、さらに本年度3種の構造タンパク質(M,F,HN)をコードする遺伝子解析を行った。(2)すなわち、PIV-3の構造タンパク質の遺伝子配列については、ヒト型(HPIV-3)で2株(Wash/47885/57株,JS株)、ウシ型(BPIV-3)で1株の報告がすでにあるのでそれらと比較・検討した。その結果、新たに分離されたGPIV-3は、M,F,HNの3種の構造タンパク質の遺伝子配列に関してHPIV-3と極めて類似性の高いウイルスであることが明らかになった。宿主細胞に感染する際に、F,HNの両タンパク質が共同して機能することが示唆されているので、両タンパク質をコードするRNAがともに酷似すること、ならびに前回の血清学的検査結果を考慮すると、過去にHPIV-3がヒトからモルモットに感染し、それがモルモットのコロニー内で維持されていたことを示唆している。さらにこの結果は、現在もなおヒトとモルモットとの間でHPIV-3が相互に感染する可能性が高く、ゾ-ノ-シスの一種だと考えられる。次年度の計画としては、他のタンパク(NP,P,L)とbothendsのNu sequenceを決定すること、及びそこから導き出されるPhylogeneticな解析を行う予定である。

当施設において分離された、モルモットパラインフルエンザ3型ウイルス(GPIV3)のゲノムに関して遺伝子解析を行っている。平成7年度はM,F,HNの膜タンパクについての遺伝子解析を行い、今年度はさらにゲノム全長にまで解析を進めた。その結果、GPIV3は、15462塩基から成るnegative strandのRNAウイルスで、ゲノムは少なくとも6つのタンパク(NP,P/C/D/V,M.F.HN.L)をコードしていることが明らかになった。現在パラインフルエンザ3型ウイルス(PIV3)には、ヒトのHPIV3とウシから分離されたBPIV3が知られている。GPIV3の塩基配列を各タンパク毎に他のPIV3と比較すると、WA株と、3.8%-6.5%、JS株とは2.1%-4.4%、BPIV3とは20.4%-29.0%の相違がみられ、GPIV3はBPIV3よりも、HPIV3に近縁のウイルスであることが示唆された。また、F、HNの膜タンパクにおける糖鎖結合部位およびリン酸化部位、Lタンパクの酵素活性部位等のアミノ酸配列に関して、GPIV3とHPIV3との間に差異は認められなかった。NJ法およびUPGMA法を用いてGPIV3、HPIV3(WA株、JS株、JScp12,45変異株)およびBPIV3間の分子系統樹を作製したところ、遺伝的距離の点でGPIV3はBPIV3からは遠く離れており、HPIV3の範疇にあること、さらに、WA株とJS株とのおおむね中間体に位置し、相対的にWA株よりはJS株に近縁のウイルスであることが証明された。従って、GPIV3はモルモット固有のウイルスというより、HPIV3がモルモットコロニーに侵入し、それが幾世代も維持されてきたものと考えられる。また、各タンパクの各種活性部位のアミノ酸配列の類似性から、モルモットのGPIV3感染をヒトにも感染しうる人獣共通伝染病ととらえることができる。この研究は、動物飼育施設におけるパラインフルエンザ3型ウイルスのヒトからモルモットへ、モルモットからヒトへという相互の感染について警鐘を鳴らすものである。
癌細胞表面に存在するRNA構造と機能に関する研究

1.非白血病性腫瘍細胞の表面に存在するRNAの種類を明らかにする目的で,二種類のマウス腹水型非血病性性腫瘍細胞(エールリッヒ癌,及び,サルコーマ180)及び,そのコントロールとして,細胞表面にRNAの存在しない二種類のマウス腹水型白血病性細胞を(L1210,及び, C1498)について,細胞表面を軽くプロナーゼ処理して得た上清中のRNAを,庶糖密度勾配遠心法により解析した.その結果,エールリッヒ癌細胞とサルコーマ180細胞をプロナーゼ処理した上清中にはRNAが抽出され,リボゾーマルRNA(r-RNA)量が,プロナーゼ非処理細胞に比べて約80%多く抽出された.しかしL1210細胞とC1498細胞をプロナーゼ処理した上清中には,プロナーゼ非処理細胞にくらべて, RNAの遊離量に増大は認められなかった.これらの結果から,非白血病性腫瘍細胞の表面に存在するRNAは,主に, r-RNAであることが示唆された.2.非白血病性腫瘍細胞の表面に存在するRNA(r-RNA)の分布状態とその構造を明らかにする目的で,エールリッヒ癌細胞,及び,そのコントロールとしてL1210細胞について,細胞表面超微形態をプラズマ重合レプリカ膜法,及び超薄切片法を用いて観察した.すなわち,細胞を先ずウサギ抗RNA抗体と,次ぎに,金コロイド結合抗ウサギ抗体と4°Cで反応させ,細胞表面のRNAを金コロイド粒子でラベルした.その細胞表面のレプリカ膜を電子顕微鏡を用いて観察した結果,エールリッヒ癌細胞にのみ,細胞表面に金コロイド粒子の集合個所を認め,また,その個所に紐状の構造物を認めた.超薄切片法を用いた観察では,エールリッヒ癌細胞の表面に,抗RNA抗体の結合するリボゾーム様構造体を見いだした.これらの結果から,非白血病性腫瘍細胞の表面に存在するRNAは,リボゾーム様構造体をもつことが示唆された.1.非白血病性腫瘍細胞の表面に存在するRNAの種類を明らかにする目的で,二種類のマウス腹水型非血病性性腫瘍細胞(エールリッヒ癌,及び,サルコーマ180)及び,そのコントロールとして,細胞表面にRNAの存在しない二種類のマウス腹水型白血病性細胞を(L1210,及び, C1498)について,細胞表面を軽くプロナーゼ処理して得た上清中のRNAを,庶糖密度勾配遠心法により解析した.その結果,エールリッヒ癌細胞とサルコーマ180細胞をプロナーゼ処理した上清中にはRNAが抽出され,リボゾーマルRNA(r-RNA)量が,プロナーゼ非処理細胞に比べて約80%多く抽出された.しかしL1210細胞とC1498細胞をプロナーゼ処理した上清中には,プロナーゼ非処理細胞にくらべて, RNAの遊離量に増大は認められなかった.これらの結果から,非白血病性腫瘍細胞の表面に存在するRNAは,主に, r-RNAであることが示唆された.2.非白血病性腫瘍細胞の表面に存在するRNA(r-RNA)の分布状態とその構造を明らかにする目的で,エールリッヒ癌細胞,及び,そのコントロールとしてL1210細胞について,細胞表面超微形態をプラズマ重合レプリカ膜法,及び超薄切片法を用いて観察した.すなわち,細胞を先ずウサギ抗RNA抗体と,次ぎに,金コロイド結合抗ウサギ抗体と4°Cで反応させ,細胞表面のRNAを金コロイド粒子でラベルした.その細胞表面のレプリカ膜を電子顕微鏡を用いて観察した結果,エールリッヒ癌細胞にのみ,細胞表面に金コロイド粒子の集合個所を認め,また,その個所に紐状の構造物を認めた.超薄切片法を用いた観察では,エールリッヒ癌細胞の表面に,抗RNA抗体の結合するリボゾーム様構造体を見いだした.これらの結果から,非白血病性腫瘍細胞の表面に存在するRNAは,リボゾーム様構造体をもつことが示唆された.非白血病性腫瘍細胞の表面に存在するRNA(ribosomal type)の分布状態と構造を明らかにする目的で、マウス腹水型非白血病性腫瘍細胞(エールリッヒ癌)、及び、そのコントロールとして、細胞表面にRNAの存在しないマウス腹水型白血病細胞(L1210)について、細胞表面超微形態をプラズマ重合膜レプリカ法を用いて観察した。すなわち、細胞をウサギ抗RNA抗体と4゚Cで反応させた後、金コロイド結合抗ウサギ抗体と4゚Cで反応させ、細胞表面のRNAを金コロイド粒子でラベルした。細胞表面のレプリカ膜をプラズマ重合膜レプリカ法により作成し、そのレプリカ膜を、電子顕微鏡を用いて観察し、細胞表面超微構造と、レプリカ膜に付着した金コロイド粒子の分布状態とを調べた。その結果、金コロイド粒子は、エールリッヒ癌細胞表面のところどころに集合して存在し、それら金コロイド粒子の存在する個所には紐状の隆起した構造が認められた。抗RNA抗体のかわりに正常ウサギ血清を用いると、エールリッヒ癌細胞の表面には、金コロイド粒子のついていない紐状構造が観察された。なお、L1210細胞の表面には、金コロイド粒子も紐状構造も認められなかった。以上の結果より、非白血病性腫瘍細胞の表面に存在するRNAは、細胞表面のところどころに集合して存在すること、及び、紐状構造をとることが示唆された。
磁場中状態図と強磁場反応促進効果を利用した強磁性磁材料の創出

本研究の目的は、磁気エネルギーの利得で進む化学反応や合成過程、相変態過程を解明し、これを基に磁場による選択的結晶成長を示すことである。試料を自発磁化が大きく基礎・応用研究も盛んなMn基及びFe基強磁性体に絞り、[A]強磁場中状態図の系統的評価、[B]強磁場中熱処理による強磁性合成(強磁場試料合成・特性評価)、[C]強磁場安定強磁性相の特性評価(基礎特性評価)を計画した。研究目的を達成するために、鹿児島大学所属の研究代表者と分担者2名で、[A]から[C]の実験班を分担して行った。H30年度研究に合成した試料は、MnAl, MnAlC、MnCuAl、Fe系である。出発試料の合成は鹿児島大学で行った。H30年度後半に本研究専用の5Tマグネットをレンタル導入した。磁場5Tまでの実験は鹿児島大学で行われ、10T以上の強磁場実験は東北大学金属材料研究所の共同利用設備を利用した。以下に主な結果を示す。(1)MnAl:磁場0-10Tの範囲では相変態温度Tp1及び活性化エネルギーEaが減少し、12-15Tの範囲ではTp1およびEaが急激に増加する結果を得た。この実験結果に対し、磁場抑制型相変態と磁場促進型相変態の競合という、実験結果をよく説明できる新たなモデルを提案した。MnAlの磁場中状態図を計算し、磁場で強磁性相が出現できることを示した。(2)MnAlC:Cの添加によってMnAl母相(ε相)の状態図上の組成と温度の範囲が拡大、強磁性相の安定化に寄与していることを見出した。(3)CuMnAl系:現時点で、規則不規則変態に対する明確な磁場効果は見出されていない。しかし、強磁性相の結晶子成長が磁場で抑制されることを見出した。(1)試料合成はFeAl系を除きほぼ計画通りに行われた。(2)計画していた強磁場合成、強磁場分析などはほぼ全て終えた。(3)前年度から進めてきた、MnAl強磁性相の磁場誘起現象について、熱力学的計算で示すことができた。(4)MnAl強磁性相の磁場誘起現象のメカニズムについて、強磁場中熱分析の結果からより詳細に解明できた。(5)MnCuAl系の相変態に対する磁場効果の研究に着手、一定の結果を得た。(6)FeAl系の研究の発展性については検討中である。本年度は研究最終年度である。(1)磁場中実験を加速するために、本年度も本研究専用のマグネットを鹿児島大に導入して実験を進める。(2)MnCuAl系について、研究を進めるとともに、内容等について発展性を検討する。(3)Fe系物質についての評価を進め、発展性を検討する。(4)MnBi系、MnAl系、MnAlZn系、MnAlC系、MnCuAl系の実験で補強すべき内容について、実験を進めるとともにFe系実験について検討し、本研究を総括する。研究の目的は、磁気エネルギーの利得で進む化学反応・合成過程(強磁場反応促進効果)を解明し、これを基に磁場による選択的結晶成長と分離プロセスを示すことである。試料を自発磁化が大きく基礎・応用研究も盛んなMn基及びFe基強磁性体5種に絞り、[A]強磁場中状態図の系統的評価、[B]強磁場中熱処理による強磁性合成(強磁場試料合成・特性評価)、[C]強磁場安定強磁性相の特性評価(基礎特性評価)を計画した。研究目的を達成するために、鹿児島大学所属の研究代表者と分担者2名で、[A]から[C]実験班を分担し、さらに大学院生3名らが参画した。H28年度研究に用いた試料は、MnBi, MnAl, Mn-Al-Cである。磁場8Tまでの実験は鹿児島大学で行われ、10T以上の実験は東北大学金属材料研究所強磁場施設の共同利用設備を利用した。[A] MnAlについて磁場中示差熱分析を行った。非磁性エプシロン相から強磁性タウ相への相変態温度が、磁場によって低下することを見出した。これは、Mn-Al系の状態図が強磁場で制御できることを示している。[B]Mn-Al-C溶解試料のゼロ磁場熱処理では、Cの添加により非磁性エプシロン相の領域が拡大するのを確認した。現在磁場中合成に向けて準備中である。[C}粉体原料によるMn-Al-C焼結試料では、強磁性タウ相(強磁場安定強磁性相)の合成可能組成範囲を見出した。さらに、強磁場中熱処理急冷炉を制作、MnBiを15T強磁場中急冷試料の合成に成功した。(1)試料合成はほぼ計画通り行われた。(2)計画していたMn-Al系の磁場中示差熱分析を成功させ、相変態温度の磁場依存性を見出した。これは、Mn-Alの平衡状態図が磁場で制御できるだけではなく、ゼロ磁場で準安定相でも強磁場で安定相として状態図上に出現することを示唆している。(3)Mn-Al-C系の合成に成功し、強磁性安定相を出現組成範囲を決定した。(4)強磁場中熱処理急冷炉の開発に成功した。

本研究の目的は、磁気エネルギーの利得で進む化学反応・合成過程(強磁場反応促進効果)を解明し、これを基に磁場による選択的結晶成長を示すことである。試料を自発磁化が大きく基礎・応用研究も盛んなMn基及びFe基強磁性体に絞り、[A]強磁場中状態図の系統的評価、[B]強磁場中熱処理による強磁性合成(強磁場試料合成・特性評価)、[C]強磁場安定強磁性相の特性評価(基礎特性評価)を計画した。研究目的を達成するために、鹿児島大学所属の研究代表者と分担者2名で、[A]から[C]実験班を分担し、さらに大学院生3名らが参画した。H29年度研究に合成した試料は、MnBi、MnAl, Mn-Al-C、Mn-Al-Zn、Fe系である。出発試料の合成は鹿児島大学で行った。H29年度に本研究専用の5Tマグネットをレンタル導入し、磁場5Tまでの実験は鹿児島大学で行われ、10T以上の強磁場実験は東北大学金属材料研究所の共同利用設備を利用した。[A]MnBi:H28年度に完成した世界最高磁場中熱処理急冷炉を用いて、MnBiの19T中熱処理急冷を行い、強磁場中熱分析による状態図の磁場変化の結果と整合する相を得ることに成功した。Mn-Al-Cの磁場中熱分析測定の準備を整えた。Mn-Al-Znの磁場中熱分析測定の準備を整えた。Fe系強磁性体の分解過程における磁場中熱分析を行ったが、自作熱分析装置の感度の範囲では未だ磁場効果は見出されていない。[B] MnAl:新たな焼結法を見出した。MnAl系で強磁性タウ相から非磁性ベータ相への磁場による相変態抑制効果を見出し、この物質系の磁場効果に関わるモデルを提案した。Mn-Al-Cの合成過程の磁場効果を見出した。Mn-Al-Znの強磁性タウ相創出に関わる基本的条件を見出した。[C]MnAl:強磁場磁化測定の結果をもとに分子場モデルで磁化の温度変化を見積もり、計算強磁場状態図作成の準備を整えた。これまでに合成されたMn-Al-C、Mn-Al-Zn、Fe系の基礎特性評価を進めた。(1)試料合成はほぼ計画通りに行われた。(2)計画していた強磁場合成、強磁場分析などほぼ全て終えた。(3)前年度に完成した強磁場中熱処理急冷炉を用いてMnBiの強磁場中の試料合成が強磁場状態図から予想されるものと一致していることを確認した。これは、本研究の強磁場中熱分析による強磁場平衡状態図決定手法の妥当性を示している。(4)Mn-Al系の強磁場による強磁性タウ相出現のメカニズムをモデルとして提案した。(5)Mn-Al-Zn系の特性を解明、Mn-AlおよびMn-Al-C系と比較し、それぞれ長所と短所を指摘した。(6)Fe系の研究に着手した。本研究の目的は、磁気エネルギーの利得で進む化学反応や合成過程、相変態過程を解明し、これを基に磁場による選択的結晶成長を示すことである。研究目的を達成するために、鹿児島大学所属の研究代表者と分担者2名で、[A]から[C]の実験班を分担して行った。H30年度研究に合成した試料は、MnAl, MnAlC、MnCuAl、Fe系である。H30年度後半に本研究専用の5Tマグネットをレンタル導入した。
イメージングによるNF-κBシグナル細胞内伝播動態の１細胞解析

本研究では、光照射で活性化されるchemical dimerizerを用いてTRAF6を細胞膜直下の局所で活性化させ、そこから伝播するNF-κBシグナルの1細胞レベルでのダイナミクスをIκBαの分解とNF-κBの核移行をライブイメージングすることで解析する。代表者は以前TRAF6を細胞内で二量体化させるとLys63型ポリユビキチン鎖合成が誘導されNF-κBが活性化されることを報告している。一方、連携研究者の上野はRapamycinがFKBP(FK-506 binding protein)とFRB(FKBP-rapamycin binding protein)と同時に結合することを利用してFKBP融合タンパク質とFRB融合タンパク質を細胞内で二量体形成させることに成功している。さらに光照射依存的に細胞膜透過能を獲得するRapamycin誘導体(cRb-A:Rapamycinにavidinが共有結合した化合物で紫外線照射によりavidinが切断除去され細胞膜を透過する)を利用することで細胞膜近辺の限られた領域で任意の時間にFKBP融合タンパク質とFRB融合タンパク質を二量体化させることにも成功した。今年度はTRAF6のC末にFKBPを融合させたTRAF6-FKBPとTRAF6のC末にFRBを融合させたTRAF6-FRBを安定発現した細胞を作成しRapamycinを添加することでNF-κBを活性化する系を確立した。さらにこのTRAF6の二量体化によって誘導されるIκBαの分解とNF-κBの核移行を細胞に蛍光タンパク質とIκBαおよびRelAとの融合タンパク質を発現させることでイメージングにより1細胞レベルで解析できる実験系を確立した。今後は本実験系をもとにcRb-Aを用いて光依存的に細胞局所でNF-κBを活性化する条件検討を実施する予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。
移動体オペレータの行動特性から観た船舶運航安全性評価に関する研究

本研究では着桟操船を行う操船者特性を明らかにすると共に力学的観点から着桟能力を評価する手法の開発を行った。着桟能力は船の操縦性能と風や曳船などの外的条件の組み合わせ及び操船者の特性によって決定される。はじめに数値シミュレーションにより操船者の特性を除く着桟能力の推定を行った。本シミュレーションにおいては着桟能力指標:T.M(Tugboat force Margin)を定義し、種々の条件下における着桟操船の実現性を評価することが可能となった。次に操船シミュレータを用いた実務者による着桟操船実験を行ない着桟操船の評価を行った。1本研究は移動体の安全な運航環境を実現するための環境条件(人間とそれ以外の要素)を論理的に明らかにし、一般社会に対し移動体操縦者いわゆるオペレータの重要性を正しく認識させることを目的としている。近年、移動体、大型プラントで発生した事故及災害の原因はそのシステムを運用する人間(オペレータ)にあるとされ、その割合は非常に高いと理解されている。特に船舶運航においては事故の原因の80%以上は人間、すなわち海技者に原因があるとされている。本研究では船舶運航を例に安全な移動体運航を達成するための必要条件を移動体操縦者の行動を詳細に分析することによって明らかにすることを目的としている。近年、ヒューマンファクターの視点から事故災害の原因分析、対策が提案されているが、その多くは心理学を基本とした研究がほとんどである。本研究では工学的な視点から人間の行動分析を行い安全運航実現のための客観的な評価指標を開発することを目的としている。操船者の行動特性を詳細に分析するためには、船舶の操縦室で海技者の行動を正確に観察する必要がある。船舶操縦室を模擬したブリッジモックアップ内には船舶運航のために必要となる航海計器、双眼鏡等が設置されている。海技者の行動観察はこれらの計器類の使用状況についても対象とする必要がある。現在、船橋モックアップ内に設置した、ビデオカメラ、マイク及び一部の計器情報を一つの画面に統合し収録する装置の開発を行っている。しかし、解析対象とすべき計器情報や船位決定状況及び精度を確認するためのシステムは無い。また、船舶運航を行う操船者の行動分析を行うためのシステムも開発されていない。本年度は行動記録装置の設置及び行動分析のための予備実験を行った。本研究は移動体の安全な運航環境を実現するための環境条件(人間とそれ以外の要素)を論理的に明らかにし、一般社会に対し移動体操縦者いわゆるオペレータの重要性を正しく認識させることを目的としている。本年度は昨年度開発を行った行動記録装置を用いて行動分析を行った。行動分析の対象とした操船局面は複数の曳船を用いて行う着桟操船である。本研究においては特に風圧外乱下の操船を対象とした。着桟操船の評価は、着桟能力指標に対する操船目標の達成度および着桟操船時の船体運動状態を比較検討することによって可能となる。本比較より、着桟能力指標と人間が制御可能な船体運動、すなわち、人間の制御余裕量を推定することが出来ることなった。

近年、ヒューマンファクターの視点から事故災害の原因分析、対策が提案されているが、その多くは心理学を基本とした研究がほとんどである。本研究では工学的な視点から人間の行動分析を行い安全運航実現のための客観的な評価指標を開発することを目的としている。操船者の行動特性を詳細に分析するためには、船舶の操縦室で海技者の行動を正確に観察する必要がある。船舶操縦室を模擬したブリッジモックアップ内には船舶運航のために必要となる航海計器、双眼鏡等が設置されている。海技者の行動観察はこれらの計器類の使用状況についても対象とする必要がある。現在、船橋モックアップ内に設置した、ビデオカメラ、マイク及び一部の計器情報を一つの画面に統合し収録する装置の開発を行っている。しかし、解析対象とすべき計器情報や船位決定状況及び精度を確認するためのシステムは無い。また、船舶運航を行う操船者の行動分析を行うためのシステムも開発されていない。本年度は行動記録装置及び解析システムの設計を行った。H24年度に開発を行った、船橋内行動記録システムの製作と有用性を検証するための予備試験を実施することが出来ている。本予備試験結果の解析結果より、記録システムの有用性が明らかとなっている。最終年度は被験者数を増やし、操船者行動の分析を行うことが可能となっている。研究開始年度(2011年度)は震災の影響により研究経費の減額等が検討されていたために研究経費の執行方法の再検討を行っていた。その後、減額はなく当初予算が認められたことから、当初の計画に従い行動記録装置及び解析システムの設計を行った。2011年秋頃に必要機材の購入を計画し業者に在庫の確認を行ったが、関係業者からの回答は震災の影響で製造が出来なくなり、年度内に必要機材の購入が出来なかった。しかし、デモ機材等による仮製作及び性能確認を終えることができているので次年度は当初計画通りに研究を進めることが出来ると判断している。本年度は、行動記録装置解析システムを用いて代表的な操船環境条件として他の船舶との衝突を回避する操船(避航操船)及び離着桟操船を対象に操船者行動の解析を行う。操船者の行動特性分析は研究分担者である小林教授の研究により明らかにされた船舶運航に必要な要素技術の実行状況を対象とする。避航操船においては船位決定、見張り、操縦、機器取扱い及び情報管理技術の各技術の実行状況を調査対象とする。離着桟操船においては目的運動の達成とタグの使用状況について解析を行う。操船シミュレータを用いて調査対象となる技術を必要とする航行環境を再現し、その状況における操船者が実行する各技術の実行状況を詳細に観察する。海技レベル及び乗船経験が異なる海技者の操船状況を調査、比較することによって、海技士レベル毎の技術行使状況や各技術の実行内容の違いを明らかにすることを目的としている。本年度は、行動記録装置解析システムの製作と有用性を検証する。さらに、代表的な操船環境条件として他の船舶との衝突を回避する操船(避航操船)を対象に操船者行動の収集解析を行う。操船は1名による単独当直とよばれる状態とする。操船を行う海技者は乗船経験を基準に設定を行う。その概要は下記に示す。
RB経路とp53経路の相関性の解析

RB経路とp53経路で働く蛋白質に関して解析を行った。1.RB蛋白質については、約13ヶ所に存在するin vivoのリン酸化部位を区別して認識する抗体をほぼすべて作製して用いることにより、E2F-1との解離には主にCdk4-cyclin D1特異的なリン酸化部位のリン酸化が、逆に、ヒストンンデアセチラーゼをリクルートしてくるRBP1やクロマチンリモデリング蛋白質Brg1などLXCXEモティーフを持つ蛋白質類との解離にはCdk2-cyclin E特異的なリン酸化部位のリン酸化が使われるらしいことを明らかにした。さらに、DNAダメージを細胞に与えると、E2F種のうちE2F1のみがRB蛋白質と強く結合するこようになることを見出した。この時、RB蛋白質のSer612のリン酸化がこの複合体形成を促進することも見出した。しかも、このリン酸化はCdkインヒビターで阻害されないのでCdk以外のキナーゼによってなされると推定される。2.MdmxはMdm2と共同作用してp53の活性をネガティブに調節すると考えられているがメカニズムは不明であった。このMdmxのSer367がリン酸化されると14-3-3蛋白質が結合し、Mdm2によってMdmxがユビキチン化されて分解され、p53が活性化されることを明らかにした。3.エンドサイトーシスに際して、膜小胞の構造形成に重要な役割を演じることが知られているクラスリンの重鎖が核内にも存在してp53と結合し、p53の転写活性化能に必須の働きをするという全く予想外のことを発見した。さらに、クラスリンの軽鎖とp53とがクラスリンの重鎖のC末端領域への結合で競合することを明らかにした。1)p53はある場合にはG1停止を誘導するけれども別の場合にはアポトーシスを誘導する。この選択のメカニズムは重要な問題でありながら不明であったが、我々は、p53の新規リン酸化部位Ser46がアポトーシス誘導を制御することを見いだした。この部位は細胞のDNAが深く傷ついてアポトースが誘導される時期に一致してリン酸化が誘導される。しかも、この部位を他のアミノ酸に置換すると、p53のアポトーシス誘導能が大きく変化する。そして、p53によって発現誘導されることが知られているターゲット遺伝子のうち、東大医科学研究所の中村祐輔教授の所で単離された新規遺伝子p53AIP1の発現のみがSer46のリン酸化と一致することも見出した。p53AIP1蛋白質はミトコンドリアで働き、アポトーシスを誘導する。したがって、DNAの傷が深くて、G1停止やDNA修復が不可能になるとSer46キナーゼが活性化されて、p53のSer46がリン酸化され、p53AIP1遺伝子のプロモーターへのアフィニティーが高まり、p53AIP1が発現して細胞はアポトーシスで死ぬと考えられる。2)Rasからのシグナルがc-Mycの安定化からE2F-1の発現誘導を通じてp53依存性のアポトーシスを誘導することがあるが、この時のc-Mycの安定化にMyc-box1に存在する2つのリン酸化部位が関係するということが以前からの研究で推定されたので、Thr58とSer62のリン酸化部位特異的抗体を作製して解析を進めた。その結果、RasからのシグナルでSer62がリン酸化されるとc-Mycの半減期が長くなって安定化し、逆に、Thr58がリン酸化されるとc-Mycの分解が促進されることがわかった。1.RB蛋白質上のリン酸化部位の使い分けの意義RBと複合体形成する蛋白質には、RBP1のようにLXCXEというモチーフを持つものと、E2Fのように、それとは異なったモチーフをもつものとがある。

これらとRBとの解離がRB上の異なったリン酸化部位で制御されている可能性が高いので、それをすでに我々が作製してきた約15ケ所のリン酸化部位特異的抗体を用いて試した。そのために、これらの蛋白質と共沈澱してくるRBのリン酸化部位を、特異的抗体を用いて解析した。その結果、E2F-1との解離には主にCdk4-cyclin D1特異的なリン酸化部位のリン酸化が、逆に、RBP1やBrmなどとの解離にはCdk2-cyclin E特異的なリン酸化部位のリン酸化が使われるらしいことがわかった。2.p53のアポトーシス誘導能を制御するSer46のリン酸化酵素細胞がDNAダメージなどのさまざまなストレスを受けたとき、p53が活性化されて、ある場合にはG1期停止を誘導するが、別の場合にはアポトーシスを誘導して細胞を自殺させる。この2つの経路の選択がどのようにしてなされるかは重要な問題であったが、われわれは昨年度、p53のSer46がリン酸化されるとミトコンドリアのアポトーシス誘導蛋白質p53AIP1の発現が起こり、アポトーシスが誘導されることを示した。その後、このSer46キナーゼの精製と同定を進めた結果、東大医科研の中村祐輔らのグループによってクローニングされたp53によって誘導される蛋白質p53DINP1を含み、カゼインキナーゼ2と他の転写のメディエーターとからなる蛋白質複合体であることがわかった。p53のターゲット遺伝子産物であるサイクリンG1の生理機能はこれまで不明であったが、他のサイクリンと違って、Cdkとは結合せずにPP2Aフォスファターゼと結合することを初めて見つけた。さらに、サイクリンG1/PP2A結合体はMdm2のThr216を脱リン酸化し、その結果、53の分解を促進することを示した。また、細胞のDNAがダメージを受けた際、c-AblがMdm2に結合してTyr394をリン酸化し、Mdm2によるp53の分解を阻害することを見いだした。さらに、p53と結合してアポトーシス誘導能を高める新しい蛋白質を同定した。これは細胞質である重要な役割を演じることが知られている蛋白質であるが、核内ではp53と結合して全く別の役割を演じるらしい。一方、RB蛋白質については、E2F-1との解離には主にCdk4-cyclin D1特異的なリン酸化部位のリン酸化が、逆に、ヒストンンデアセチラーゼをリクルートしてくるRBP1やクロマチンリモデリング蛋白質Brg1などとの解離にはCdk2-cyclin E特異的なリン酸化部位のリン酸化が使われるらしいことを明らかにした。1.小胞体ストレスがp53依存性アポトーシスを阻害することを明らかにした。この阻害はグリコーゲン合成酵素3β(GSK-3β)でSer315とSer376がリン酸化されるとp53の細胞質における局在が増加することに,よって起きる。小胞体ストレスは核内におけるp53へのGSK-3βの結合を誘導し、p53の細胞質における局在を増強する。小胞体ストレスによって引き起こされたアポトーシス阻害はGSK-3βを必要とし、Ser315かSer376をAlaに置換した変異p53を発現する細胞では起きない。細胞質局在の増加の結果、小胞体ストレスはDNAダメージ後のp53の安定化とp53依存性アポトーシスを阻害する。p53の不活性化は小胞体ストレスに適応するために細胞が用いる防御機構であると結論された。
部位特異的アストロサイト機能不全に着目した環境毒誘発パーキンソニズムの病態解析

環境毒ロテノン慢性皮下投与パーキンソン病モデルマウスを用いて,中枢および末梢の神経障害ならびにアストロサイト(様グリア細胞)における抗酸化分子の発現変化とその賦活による影響について検討した.雄性C57BL/6Jマウス(8週齢)に低用量ロテノン(2.5 mg/kg/day)を4週間慢性持続皮下投与したところ,黒質ドパミン(DA)神経細胞および腸管筋間神経叢の有意な脱落がみられた.また,ロテノン慢性皮下投与マウスにコーヒー成分であるカフェイン酸(CA: 30 mg/kg/day)あるいはクロロゲン酸(CGA: 50 mg/kg/day)をロテノン投与開始の1週間前からロテノン投与期間中の計5週間,連日経口投与を行った.その結果,CAあるいはCGA投与により,ロテノンによる黒質DA神経および腸管筋間神経叢の変性脱落が有意に阻止された.さらに線条体および腸管のアストロサイト(様グリア細胞)における抗酸化分子メタロチネイン(MT)の発現変化を検討したところ,CA,CGA投与により線条体アストロサイトにおけるMT発現が有意に増加した.ロテノン投与マウスの腸管切片ではCA, CGA投与によるMT発現変化を捉えることができなかったが,15日齢SDラット胎仔の腸管からの初代培養細胞を用いて検討したところ,低用量ロテノン(1-5 nM)曝露により腸管グリア細胞におけるMT発現が低下すること,CAあるいはCGA処置により,このロテノンによるMT発現低下が減弱されることがわかった.以上の結果より,低用量ロテノン曝露であってもDA神経障害および腸管神経障害が惹起され,これらの部位におけるグリア細胞での抗酸化分子発現誘導により神経障害を阻止しうることが明らかとなった.環境毒ロテノン暴露により中脳ドパミン(DA)神経細胞が選択的に障害される条件下でアストロサイトが部位特異的に発現変化する分子を探索した.15日齢SDラット胎仔の中脳・線条体からの初代培養アストロサイトにロテノン(1-5 nM)を48時間添加し,アストロサイト培養上清を回収し,メタロチオネイン(MT)のELISAを行った.その結果,線条体アストロサイトではロテノン曝露による培養上清中のMT量に変化はみられなかったが,中脳アストロサイトではロテノン曝露により有意なMT量の減少がみとめられた.この結果より,中脳アストロサイトではロテノン曝露により抗酸化分子放出が低下していることが示唆された.また,中脳アストロサイトがもたらすロテノンのDA神経障害へのDAの関与を検討した.中脳神経細胞にα-methyl-p-tyrosine(AMPT)を添加し,DA神経細胞内のDA量を低下させておいて,ロテノン曝露した中脳アストロサイトの培養液(Rot-GCM)を48時間添加し,チロシン水酸化酵素(TH)陽性細胞数をカウントした.その結果,Rot-GCM添加によるTH陽性細胞数の有意な減少はAMPT処置によりほぼ完全にキャンセルされた.さらに,ロテノン曝露した中脳神経細胞において,GABA含有神経細胞,セロトニン含有神経細胞についてそれぞれ神経障害性を検討したが,いずれの神経細胞も生存率に影響はみられなかった.以上の結果より,ロテノン曝露による中脳アストロサイトを介した神経障害はDA神経特異的であり,またその神経障害にはDAが関与することがわかった.ロテノン曝露によるアストロサイトの部位特異的な機能異常について検討した結果,強力な抗酸化能を有するメタロチオネインの有意な低下がみとめられ,ドパミン神経障害をもたらす部位特異的分子として同定できた.さらに,ロテノン曝露による中脳アストロサイトを介したドパミン神経障害に細胞内ドパミンが関与することが明らかとなった.これらの結果を踏まえ,次年度は腸管神経細胞を用いた実験を発展させることができる.環境毒ロテノン曝露による中脳アストロサイトを介したドパミン神経障害へのドパミンの関与について検討した.ロテノン(5 nM)を48時間暴露した中脳あるいは線条体アストロサイトからの培養液を中脳神経細胞に添加したところ,ロテノン曝露中脳アストロサイトの培養液添加では中脳神経細胞におけるドパミンキノン生成の指標であるキノプロテイン量が有意に増加したが,ロテノン曝露線条体アストロサイトからの培養液添加では変化がみられなかった.また,ロテノンによる腸管神経障害とアストロサイト様グリア細胞の関与ならびに抗酸化分子の発現変化について検討した.妊娠15日齢SDラット胎仔の腸管からの初代培養を行い,腸管神経細胞単独培養あるいは腸管神経細胞+腸管グリア細胞共培養にロテノン(1-5 nM)を48時間添加した.その結果,グリア細胞共存下においてのみロテノン曝露による腸管神経障害が惹起され,アストロサイト様グリア細胞の脱落およびグリア細胞における抗酸化分子メタロチオネイン(MT)の発現低下がみられた.また,ロテノン慢性皮下投与したパーキンソン病モデルマウスでは腸管筋間神経叢においてβ-tubulin III陽性神経細胞の変性脱落およびアストロサイト様グリア細胞のGFAPシグナル低下がみとめられた.以上の結果より,ロテノン曝露による腸管神経障害には,中枢神経系と同様に腸管グリア細胞におけるMT発現低下が関与することが明らかとなった.また,ロテノン曝露による中脳アストロサイトを介したドパミン神経障害においてドパミンキノン生成が関与することが示唆された.