hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
歯周病ワクチン開発の基礎的研究, B.gingvalis遺伝子のクローニング

B.gingivalis381(B.g)株染色体DNA Sau3A切断断片のλL47.1ファージベクターによる遺伝子バンクを作成し, B.g菌体から分離した細胞表層抗原に対する抗血清と免疫学的に反応するクローンをスクリーニングした.その中からλMDBGIを選択した. λMDBGIのクローン蛋白質は他のBacteroides細胞表層抗原で免疫して得た抗血清とは反応せず, B.gに対して良く反応した. λMDBGIクローンDNAを^<32>P標識したプローグを用いて,種のBacteroides染色体DNAとSoutharn gel DNA-DNA hybridizationを行ったところ, B.gの染色体DNAとのみ反応した.以上の結果から,クローン蛋白質はB.gに特異的な抗原蛋白質であることが判明した.次にB.g菌体から莢膜分画を調整しウサギに免疫し抗血清を作成し, 27K蛋白質と反応するかを調べたところ,良く反応することから,このクローン蛋白質を莢膜蛋白質であると推定した.さらに,正常人,歯肉炎,軽度,中等度,重度歯肉炎患者から血清を採取し, 27K蛋白質に対する抗体価をWestern-Blot ELTSA法により分析を試みた.その結果,歯肉炎でわずかに,軽度でもっとも高い抗体価を示し,中等度,重度ではむしろ低いことが判明した.このことから, 27K莢膜蛋白質に対し,免疫応答の高いヒトはB.gの感染に抵抗して軽度のまま経過する可能性もあると考えられた.さらに, B.g培養上清より,赤血球凝集素(H.f)を精製し,ウサギ抗血清を作成し, B.g遺伝子バンクから免疫学的スクリーニングを行った結果,クローン蛋白質40Kを産生するクローンλMDBG2を得た, λMDBG2よりpTZ19プラスミドにサブクローン化したpMD123より40K蛋白質を高度に精製し,抗血清を作成した.抗40K蛋白質抗血清は,著明にB.gのH.f活性を阻害した.さらに抗40KIgGは補体依存性でB.gに対してADCC活性を有することも明らかとなった.以上の事から27K, 40K蛋白は免疫学的診断ワクチン療法の開発に有用となろう.B.gingivalis381(B.g)株染色体DNA Sau3A切断断片のλL47.1ファージベクターによる遺伝子バンクを作成し, B.g菌体から分離した細胞表層抗原に対する抗血清と免疫学的に反応するクローンをスクリーニングした.その中からλMDBGIを選択した. λMDBGIのクローン蛋白質は他のBacteroides細胞表層抗原で免疫して得た抗血清とは反応せず, B.gに対して良く反応した. λMDBGIクローンDNAを^<32>P標識したプローグを用いて,種のBacteroides染色体DNAとSoutharn gel DNA-DNA hybridizationを行ったところ, B.gの染色体DNAとのみ反応した.以上の結果から,クローン蛋白質はB.gに特異的な抗原蛋白質であることが判明した.次にB.g菌体から莢膜分画を調整しウサギに免疫し抗血清を作成し, 27K蛋白質と反応するかを調べたところ,良く反応することから,このクローン蛋白質を莢膜蛋白質であると推定した.さらに,正常人,歯肉炎,軽度,中等度,重度歯肉炎患者から血清を採取し, 27K蛋白質に対する抗体価をWestern-Blot ELTSA法により分析を試みた.その結果,歯肉炎でわずかに,軽度でもっとも高い抗体価を示し,中等度,重度ではむしろ低いことが判明した.このことから, 27K莢膜蛋白質に対し,免疫応答の高いヒトはB.gの感染に抵抗して軽度のまま経過する可能性もあると考えられた.さらに, B.g培養上清より,赤血球凝集素(H.f)を精製し,ウサギ抗血清を作成し, B.g遺伝子バンクから免疫学的スクリーニングを行った結果,クローン蛋白質40Kを産生するクローンλMDBG2を得た, λMDBG2よりpTZ19プラスミドにサブクローン化したpMD123より40K蛋白質を高度に精製し,抗血清を作成した.抗40K蛋白質抗血清は,著明にB.gのH.f活性を阻害した.さらに抗40KIgGは補体依存性でB.gに対してADCC活性を有することも明らかとなった.以上の事から27K, 40K蛋白は免疫学的診断ワクチン療法の開発に有用となろう.B.gingivalis381(B.g)株染色体DNA【Sau^3】A切断断片のλL47.1ファージベクターによる遺伝子バンクを作成し、B.g菌体から分離した細胞表層抗原に対する抗血清と免疫学的に反応するクローンをスクリーニングした。その中からλMDBGIを選び、ファージDNAを抽出精製し、プラスミドベクターpACYC184にサブクローン化した。サブクローンMD109のcell freeextractsからクローン蛋白質を精製し、ウサギに免疫して抗血清を作成した。クローン蛋白質は分子量27Kdalの疎水性の高い蛋白質で、他のBacteroides細胞表層抗原で免疫して得た抗血清とは反応せず、B.gに対して良く反応した。また、抗27Kクローン蛋白質抗体は可溶したB.g細胞表層抗原分画とは反応したが、他のBacteroidesとは反応しない。

さらに、PMD109クローンDNAを【^(32)P】標識したプローグを用いて、種のBacteroides染色体DNAとSoutharn gel DNA-DNA hybridizationを行ったところ、B.gの染色体DNAとのみ反応した。以上の結果から、クローン蛋白質はB.gに特異的な抗原蛋白質であることが判明した。次に、B.g菌体から莢膜分画を調製しウサギに免疫し抗血清を作成し、27K蛋白質と反応するかを調べたところ、良く反応することから、このクローン蛋白質を莢膜蛋白質であると推定した。さらに、正常人,歯肉炎,軽度,中等度,重度歯肉炎患者から血清を採取し、27K蛋白質に対する抗体価をWestern-Blot ELISA法により分析を試みた。その結果、歯肉炎でわずかに、軽度でもっとも高い抗体価を示し、中等度,重度ではむしろ低いことが判明した。このことから、27K莢膜蛋白質に対し、免疫応答の高いヒトはB.gの感染に抵抗して軽度のまま経過する可能性もあると考えられた。以上のことから、27K蛋白質はB.gの感染に対する免疫学的診断、および、歯周病ワクチンの材料として有用であることが示唆される。
自動車・電機産業における海外生産支援工場の役割と課題

本研究は、調査対象企業の海外生産を支援する親工場と本社の役割をテーマとしており、とりわけ生産現場の技術移転の問題を焦点としている。インタビューなどの実地調査を通じて明らかになった、技術移転における本社・親工場の役割と意義は以下の通りである。1.製品技術・生産設備・部材など日本からの出来合いのモノを移転する「モノ結果」の移転が現地工場のパフォーマンスを支える重要な要因となっている。2.設備の保全、品質管理など「モノ方式」面での技術移転を重視しており、またかなりの成果をあげている。その際、親工場からの日本人出向者はもちろん、出張ベースで派遣された日本人要員の果たす役割が大きい。3.上記の「モノ方式」面を中心とした教育訓練に力を入れている。訓練はOJTはもちろんであるが、基幹要員を日本の親工場に長期間派遣して実地に訓練する方式がしばしばとられている。おそらく、教育訓練への金銭的・非金銭的投資が際立って大きいのが日本の多国籍企業の特色であるといって良いのではないか。しかし、こうした技術移転には、以下のような問題点もまた見逃せない。1.「モノ方式」に比べて多能工化や参加型経営といった「ヒト方式」面での技術移転は進んでいない。それが、部門間の連係プレーを通じた品質や設備などへの異常への対処能力を低めている可能性がある。2.「モノ結果」への依存は、受け入れ国にとっては対日貿易赤字、現地工場にとっては高コストをもたらしている。本社や親工場の権限が強すぎて、現地従業員のモチベーションを阻害したり、日本側にかかる情報処理の負荷が大きすぎるという問題点がある。平成4年度における主な研究活動は、本研究の中心部分をなす調査対象企業の海外生産を支援する親工場と本社におけるインタビューである。具体的には、7月に東北地方の自動車と電機のそれぞれの部品工場、2月に関西に本社を持つ電気組立企業の本社インタビュー、3月に中国・九州地方の自動車組立工場を訪問し、海外工場に対する支援体制、ことに作業組織のありかたや熟練形成の面での技術移転に関するインタビューを行なった。そこから得られた知見を列挙しておく。1.70年代から80年代にかけての海外工場の新設と拡張のラッシュが一段落したことと、海外生産の経験が一定程度蓄積されたことなどによって、親工場の支援体制も一時の混乱期を脱しより安定的なものとなりつつある。ただし、以下のそれぞれの産業ごとの事情により、親工場の役割は相変わらず重要かつ大きい。2.自動車組立は北米にまだ相当数の派遣要員が存在しており、イギリス工場を立ち上げたばかりの企業もある。3.電機や自動車の部品メーカーでは、80年代後以降の急激な円高に対応するために、内外の工場の質的強化が急務の課題となっており、セットメーカーに比べて遅れていた日本的生産管理と人材育成の手法の本格的な導入が親工場と海外工場とで若干のタイムラグを伴ないながらもほぼ同時並行的に進行しつつある。4.電機の組立と部品では、アセアン諸国への進出に際して、操業経験が長くかつ中国系のネットワークが使える台湾工場を経由して日本的技術が移転されるとも予想されたが、そうした事例は稀であり、日本からの直接支援が主となっている。ことにマレーシアは輸出基地として新鋭の量産設備が導入されており、台湾・韓国のNIES諸国よりむしろ日本との技術的連続性が強い。平成5年度も、前年度に引き続き本研究の中心部分をなす調査対象企業の海外生産を支援する親工場におけるインタビューが、主な研究活動の内容であった。具体的には、九州の半導体工場、中国・近畿・中部地方におけるカラーテレビやVTRを中心とする家電工場を訪問した。前年度が自動車組み立てと自動車部品を主な調査対象としたのに対して、今年度は半導体を含む電機産業に焦点をあてた。インタビューのポイントが、海外工場に対する支援体制、ことに作業組織のありかたや熟練形成の面での技術移転の問題である点についても前年度と同様である。インタビューから得られた知見は以下の通りである。

1.80年代にみられた世界的な規模での海外生産の急拡大は一段落したものの、中国大陸における工場の新設やアセアンにおける生産体制の拡充(新規工場の設立と既存工場の能力増強の両者を含む)のために、親工場は依然として大きな役割を果たし続けている。2.欧米の工場に比べて、アジア地域における工場への親工場からの出向者の数は相対的に少ない。これは、アジア地域においては操業経験が長くしたがって技術移転がかなりの程度進んでいる工場が少なからずあること、言葉の問題を含めて現地人経営者の日本方式に対する理解がかなり深いこと(特に韓国と台湾において)、などが大きな要因と考えられる。3.しかし、アジア地域への出張者の数と頻度が相当に高く、これが数少ない出向者を補っていることを同時に勘案せずばならず、ここにも親工場のはたす役割と負担の大きさが示されている。4.アセアンの国内市場の急拡大と輸出基地としての役割の増大により、新鋭設備や機軸部品の供給、より本格的な日本方式の導入など、親工場の支援体制も量的にだけでなく質的にもより高度なものが要求されつつある。
金属ポルフィリン錯体の光電子移動反応の研究

(1)光電子移動反応に対する中心金属の効果及び光電荷分離反応の高効率化:レーザー光分解法によりインジウム(【III】)テトラメチルポルフィリンに二つのトリエタノールアミンが配位したIn(【III】)TPP【(TEA)_2】は励起三重項状態においてメチルビオローゲン(【MV^(2+)】)へ効率よい電子移動をおこすことを見いだした。この電子移動反応はまずポルフィリン環から【MV^(2+)】へ電子移動し、続いて中心金属Inに配位した電子供与体(TEA)から、ポルフィリン環力チオンラジカルへの電子移動をおこすので電子移動の結果In(【III】)TPP(TEA)+【TEA^+】+【MV^+】となる。従って金属ポルフィリン錯体を用いることにより、高効率の電荷分離をおこし、逆電子移動反応をおさえることに成功した。クロルロジュウム(【III】)テトラメチルポルフィリンではTEA存在下において基底状態で化学変化をおこすので配位子をTEAからピリジン(Py)に変えて実験を行った。基底状態で一ツのPyが配位したClRh(【III】)TPP(Py)は、励起三重頂状態において、Pyを配位させないものに比較し2.5倍も効率よく【MV^(2+)】へ電子移動することを見いだした。これは中心金属ヘピリジンが配位することにより、In(【III】)-TPP【(TEA)_2】錯体の場合と同様にポルフィリン環のイオン化電圧がわずか減少して、【MV^(2+)】への電子移動の効率が高くなるのではないかと思われる。この様に金属テトラフェニルポルフィリンのアキシャル位に電子供与性分子を配位させることにより、励起三重項状態においてポルフィリン環からの電子受容体【MV^(2+)】への電子移動反応の高効率化が可能となる。(2)配位子ピリジンの離脱及び付加反応: ClRh(【III】)TPP(Py)錯体は電子受容体である【MV^(2+)】が存在下では励起三重項状態で電子移動をおこすが、【MV^(2+)】が存在しないと三重項状態で配位子のピリジンが離脱することを見いだした。基底状態では、また再びClRh(【III】)TPPへピリジンが付加し、出発物質にもどる。レーザー光分解法により、これらの極めて興味ある基礎過程が明らかとなった。
HIV-1の脱殻(侵入後逆転写に至る過程)に関与する宿主因子の同定

HIV-1マトリックス蛋白質(MA)は、感染後期過程におけるウイルスのアセンブリー、細胞質膜へのtargeting、エンベロープ蛋白質のウイルス粒子への取り込みなどに重要であることが知られている。しかしながら、MAのウイルス感染前期過程(特に侵入直後の脱殻、逆転写)における役割についてはまだよくわかっていない。そこで我々は感染後期過程への影響が少ないと考えられるMA変異体(6VR、49LD、86CS)を選び、後期過程への影響を検証した後、HIV-1感染前期過程に対する影響を種々の方法を用いて検討した。シュードタイプウイルスを用いたsingle round感染系や逆転写過程の各過測定するための種々のプライマーを用いたリアルタイムPCR法の結果から、MA変異体49LD、86CSがウイルス侵入後の逆転写に至る過程(いわゆる脱殻)、6VRが逆転写そのものに欠損を有していることが強く示唆された。また、感染前期過程に欠損を有する変異体ではこの過程に関与する宿主因子とMAとの結合親和性が野生型とは異ることが予想される。そこで、MAに結合する宿主因子をMA強制発現細胞抽出液からの免疫沈降と質量分析の組み合わせで探索し野生型とMA変異体で比較した。その結果、逆転写に欠損を有する変異体(20LK)を用いたtagged-MS法によるMAと相互作用する宿主因子の探索においてtRNAシンセターゼ複合体構成メンバーがその候補として同定された。現在、相互作用の詳細や相互作用のウイルス複製における役割などを検討中である。まず逆転写の効率と合成されたDNAの安定性を低下させるマトリックスタンパク(MA)の変異(20LK)とその復帰変異(20LK/73EK/82AT)に細胞依存性があるかを種々のT細胞株を用いて検討した。293T(HeLa)細胞を野生株、MA変異株、復帰変異株でトランスフェクトして得られたウイルスを種々のT細胞株に感染させ増殖を比較した。20LK変異によるウイルス増殖阻害は細胞によってその程度が大きく異なっていた。一方、復帰変異はほとんどのT細胞株で20LK変異を補償していたがCEM(12D7)細胞では全く補償しなかった。以上の結果は、MA変異、復帰変異によって次に、ウイルス侵入後に欠損を有する他のMA変異株の探索を行った。検討した変異株は、6VR,49LD,86CSの3つで、シュードタイプしたウイルスのsingle round感染における感染価を比較することにより、3つのMA変異株がウイルス侵入後に欠損を有するか否かを検討した。6VRはNL4-3Envでシュードタイプしたウイルスで野生株の約10%の感染価を示し、その欠損はampho-tropicMuLv Env、VSV-Gのいずれのエンベロープタンパクでシュードタイプしても回復しなかった。これに対して、49LD,86CSはNL4-3Envでシュードタイプしたウイルスで野生株の約数%の感染価を示し、その欠損はampho-tropicMuLv Envでは回復しなかったが、VSV-Gのエンベロープタンパクでシュードタイプすることによってほぼ野生株並みに回復した。以上の結果は、3つのMA変異株の中2つ(49LDと86CS)は20LK変異とは異なる(おそらく少し前の)ウイルス侵入過程に欠損があると予想され、宿主因子探索の材料としても有用であると期待される。

シュードタイプウイルスを用いたsingle round感染系や逆転写過程の各過測定するための種々のプライマーを用いたリアルタイムPCR法の結果から、MA変異体49LD、86CSがウイルス侵入後の逆転写に至る過程(いわゆる脱殻)、6VRが逆転写そのものに欠損を有していることが強く示唆された。また、感染前期過程に欠損を有する変異体ではこの過程に関与する宿主因子とMAとの結合親和性が野生型とは異ることが予想される。そこで、MAに結合する宿主因子をMA強制発現細胞抽出液からの免疫沈降と質量分析の組み合わせで探索し野生型とMA変異体で比較した。その結果、逆転写に欠損を有する変異体(20LK)を用いたtagged-MS法によるMAと相互作用する宿主因子の探索においてtRNAシンセターゼ複合体構成メンバーがその候補として同定された。現在、相互作用の詳細や相互作用のウイルス複製における役割などを検討中である。
数値地図情報を用いた水生昆虫群集と河川物理環境の解析

河川の中上流域において動物群集の主要な構成要素である水生昆虫は,流速や水温のような河川物理環境に対応して分布している.また,河川環境を判断する指標として注目されており水質判定基準なども作成されている.水生昆虫群集と河川物理環境との密接な関係を理解することは,地球環境の保全に関連する諸問題を考える上で重要な要素となりえる.そこで本研究では,水生昆虫群集と河川物理環境が容易にわかる地図情報を作成することで,両者の因果関係を明らかにすることを目的として研究を実施した.本研究では宮城県中央部に位置する名取川流域内の源流域を10地点選定し,現地調査による水生昆虫群集のサンプリングと水温,水深,流速, pH, ECの河川物理環境の測定を行った.採集した水生昆虫は実態顕微鏡を用いて同定を行い分類群ごとに個体数を計測した.地図情報の作成については,対象流域の数値地図情報を国土数値地図情報から抽出を行い,基盤となる地図情報を作成した.現地調査によって得られた各測定項目のデータ化を行い基盤データ上に表示する.さらに,水生昆虫群集の計測データを重ね合わせることで水生昆虫群集と河川物理環境との関係性を可視化できる地図情報を作成した.本研究の結果から,水生昆虫群集と流速の関係から生活型による好適生息場に違いが見られた.これは瀬と淵のそれぞれに適した水生昆虫を示すものであり,流速と水生昆虫群集の個体数との相関関係は得られなかった.カワゲラ目に着目すると,水温が上昇するにしたがって個体数が減少する傾向が見られた.この結果から,カワゲラ目の個体数を調査することで水温上昇の指標として活用できると考える.また,水深, pH, ECは降雨による影響を受けて変動するため,水生昆虫群集との関係を考えるうえで,降雨量を考慮した解析が必要であると考察された.河川の中上流域において動物群集の主要な構成要素である水生昆虫は,流速や水温のような河川物理環境に対応して分布している.また,河川環境を判断する指標として注目されており水質判定基準なども作成されている.水生昆虫群集と河川物理環境との密接な関係を理解することは,地球環境の保全に関連する諸問題を考える上で重要な要素となりえる.そこで本研究では,水生昆虫群集と河川物理環境が容易にわかる地図情報を作成することで,両者の因果関係を明らかにすることを目的として研究を実施した.本研究では宮城県中央部に位置する名取川流域内の源流域を10地点選定し,現地調査による水生昆虫群集のサンプリングと水温,水深,流速, pH, ECの河川物理環境の測定を行った.採集した水生昆虫は実態顕微鏡を用いて同定を行い分類群ごとに個体数を計測した.地図情報の作成については,対象流域の数値地図情報を国土数値地図情報から抽出を行い,基盤となる地図情報を作成した.現地調査によって得られた各測定項目のデータ化を行い基盤データ上に表示する.さらに,水生昆虫群集の計測データを重ね合わせることで水生昆虫群集と河川物理環境との関係性を可視化できる地図情報を作成した.本研究の結果から,水生昆虫群集と流速の関係から生活型による好適生息場に違いが見られた.これは瀬と淵のそれぞれに適した水生昆虫を示すものであり,流速と水生昆虫群集の個体数との相関関係は得られなかった.カワゲラ目に着目すると,水温が上昇するにしたがって個体数が減少する傾向が見られた.この結果から,カワゲラ目の個体数を調査することで水温上昇の指標として活用できると考える.また,水深, pH, ECは降雨による影響を受けて変動するため,水生昆虫群集との関係を考えるうえで,降雨量を考慮した解析が必要であると考察された.
自閉スペクトラム症児者同士の仲間集団が社会性の発達とQOLに及ぼす影響

ASD児者は特有の認知特性を有するがゆえ同世代の仲間集団への所属が難しい。学齢期の長期に渡る孤立は社会適応やQOLに深刻な影響を及ぼす。本研究ではASDの学齢児が余暇サークルなど仲間集団への所属による心理的影響を検討する。方法として、1A市の通級指導教室の保護者に質問紙を実施し、仲間集団への所属経験の有無とQOLとの関係を横断的に検討する(研究1)。2特定の余暇サークルに所属するASD児の小集団を3年間追跡調査し、社会性の発達およびQOLの実態を縦断的に検討する(研究2)。
がん細胞由来エクソソームの中枢との相互作用メカニズムの解明

本研究ではエクソソームが血液脳関門を透過する分子機構の解明を目標としている。前年度は、脳転移性メラノーマ細胞株SK-Mel-28由来エクソソームが、ヒト脳毛細血管内皮細胞株hCMEC/D3細胞へ内在化する過程で、ウイルス受容体CD46が高い寄与を有する可能性を示した。今年度は、CD46のバリデーションを進めるとともに、血液脳関門透過性の高いエクソソームを明らかにすることを目的とした。前年度CD46に対するsiRNA処理で、エクソソーム内在化活性が低下したことに関して、CD46の発現量が低下しているかを検証した。定量PCR及び免疫染色の結果、CD46のmRNA及びタンパク質発現量はコントロールsiRNAを処理したhCMEC/D3細胞に比較して顕著に91、38%低下した。これらの結果から、hCMEC/D3細胞におけるCD46が、SK-Mel-28細胞由来のエクソソームの内在化に寄与することが示唆された。ヒト脳切片を用いた免疫染色の結果、CD46の蛍光は内皮細胞マーカーであるGLUT1に一致した。従って、CD46がin vivoにおいても脳毛細血管内皮細胞において発現し、エクソソーム受容体として機能する可能性が示された。次に、エクソソームの血液脳関門透過性を検証するため、hCMEC/D3細胞をトランスウェルに培養してin vitroトランスサイトーシス実験を行った。過去に脳毛細血管内皮細胞株由来のエクソソームが高い血液脳関門透過性を示した報告からhCMEC/D3細胞由来エクソソームの移行性を評価した結果、SK-Mel-28細胞由来エクソソームと比較して2倍高い移行能が示され、これらのエクソソームに発現する分子を比較することで、透過性を決定する因子を同定できる可能性が示された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、がん細胞由来のエクソソームの血液脳関門透過機構を定量的に明らかにすることを目的としている。本年度は、血液脳関門透過の最初の段階である、血中エクソソームが脳毛細血管内皮細胞へ内在化するのに関与する受容体候補分子を同定した。脳転移性の高いがん細胞由来のエクソソームが脳毛細血管内皮細胞に多く内在化するとの報告から、脳転移巣由来のヒトがん細胞株をエクソソームのドナーとした。従来のエクソソーム受容体の同定法は、エビデンスに基づいた仮説から受容体分子を推定し、阻害実験で検証するものがほとんどであった。しかし、エクソソームと細胞の相互作用は複数の分子間相互作用によって担われているため、仮説ベースの方法では有力な候補分子を見逃す可能性があった。そこで本研究では、エクソソーム上の受容体を網羅的に同定するために、光親和性反応基を有する架橋剤を用いて、エクソソームの内在化に関与する相互作用分子画分を回収し、網羅的プロテオミクスで同定する手法を確立した。確立した回収法でヒト脳毛細血管内皮細胞株hCMEC/D3細胞上のエクソソーム相互作用分子画分を調製した。これを高感度・高再現性をもつ網羅的プロテオミクス;SWATH法で解析した結果、約400タンパク質に由来するペプチドを疑陽性率5%未満で同定した。これらのタンパク質の中で、細胞膜に発現し、タンパク質同士の接着機能を有する分子を絞り込んだ結果、複数のエクソソーム受容体候補分子を見出した。別角度からエクソソームの受容体分子を絞り込むために、同定された約400タンパク質のパスウェイ解析を行った。その結果、エクソソーム受容体候補分子として同定した接着分子が関与する3つのパスウェイに関わる分子がエクソソームの相互作用分子画分に多く含まれることが示され、この接着分子がエクソソームの内在化に関与する分子であることが示唆された。当初、脳毛細血管内皮細胞への内在化活性の違うエクソソームを比較して、脳毛細血管内皮細胞におけるエクソソーム受容体を同定する計画であったが、複数のがん細胞株由来のエクソソームの内在化活性に差が見られなかった。そこで、架橋剤を用いた受容体探索法を新たに樹立することで、受容体候補分子の同定に成功した。前年度では脳転移性メラノーマ細胞株から放出されるエクソソームを用いて、脳毛細血管内皮細胞株hCMEC/D3細胞における取込受容体を探索した。本年度はスクリーニングから同定された候補タンパク質約400種類の中でも、既に報告されている脳転移性がん細胞由来のエクソソームに発現する接着分子と相互作用しうる接着分子X, Yのバリデーションを行った。接着分子の結合阻害ペプチドを添加した結果、エクソソームのhCMEC/D3細胞への取込はコントロールに比べ有意に約30%低下した。また、接着分子X, Yに対するアンタゴニスト抗体処理でも、hCMEC/D3細胞へのエクソソーム取込は有意に低下した。よって、このエクソソーム取込みに、接着分子X, Yが関与していることが示唆された。本研究では更に、スクリーニングで同定されたウイルス受容体Zに着目した。ウイルス受容体Zは上記接着分子Xと共に、ある種のウイルスの標的細胞へのエンドサイトーシスに関与することが報告されている。

ウイルス受容体Zに対するsiRNAを処理したhCMEC/D3細胞へのエクソソームの取込はコントロールに比べ有意に約40%低下した。よって、エクソソームの取込にウイルス受容体Zが寄与することが示唆された。ウイルス受容体Zに対するsiRNAを処理したhCMEC/D3細胞に、上述の結合阻害ペプチドを添加した結果、コントロールに比べエクソソームの取込が有意に約60%低下した。これはウイルス受容体Zに対するsiRNAのみ処理した条件に比べると、20%の低下傾向であったことから、接着分子X,Yとウイルス受容体Zは脳転移性メラノーマ細胞株由来エクソソームのhCMEC/D3細胞における取込において、共役して関与することが示唆された。同定したエクソソーム受容体候補分子の中から、新規の分子を含め、in vitroでのバリデーションに成功した。ただし、in vivoでの受容体としての機能証明には至っていない。本研究ではエクソソームが血液脳関門を透過する分子機構の解明を目標としている。前年度は、脳転移性メラノーマ細胞株SK-Mel-28由来エクソソームが、ヒト脳毛細血管内皮細胞株hCMEC/D3細胞へ内在化する過程で、ウイルス受容体CD46が高い寄与を有する可能性を示した。今年度は、CD46のバリデーションを進めるとともに、血液脳関門透過性の高いエクソソームを明らかにすることを目的とした。前年度CD46に対するsiRNA処理で、エクソソーム内在化活性が低下したことに関して、CD46の発現量が低下しているかを検証した。定量PCR及び免疫染色の結果、CD46のmRNA及びタンパク質発現量はコントロールsiRNAを処理したhCMEC/D3細胞に比較して顕著に91、38%低下した。これらの結果から、hCMEC/D3細胞におけるCD46が、SK-Mel-28細胞由来のエクソソームの内在化に寄与することが示唆された。ヒト脳切片を用いた免疫染色の結果、CD46の蛍光は内皮細胞マーカーであるGLUT1に一致した。従って、CD46がin vivoにおいても脳毛細血管内皮細胞において発現し、エクソソーム受容体として機能する可能性が示された。次に、エクソソームの血液脳関門透過性を検証するため、hCMEC/D3細胞をトランスウェルに培養してin vitroトランスサイトーシス実験を行った。過去に脳毛細血管内皮細胞株由来のエクソソームが高い血液脳関門透過性を示した報告からhCMEC/D3細胞由来エクソソームの移行性を評価した結果、SK-Mel-28細胞由来エクソソームと比較して2倍高い移行能が示され、これらのエクソソームに発現する分子を比較することで、透過性を決定する因子を同定できる可能性が示された。同定したエクソソーム受容体候補分子が、エクソソームの内在化に寄与することをin vitroおよびin vivoの系で明らかにする予定である。さらに内在化したエクソソームが脳毛細血管内皮細胞から脳側へと放出される機構に必要な分子をin vitroの系で同定することを目指し研究を進める予定である。バリデートした受容体分子がin vivoで血液脳関門の血液側に発現することを証明するとともに、取込に寄与することを阻害剤を用いて示す。更に、内在化したエクソソームが脳毛細血管内皮細胞から脳側へと放出される機構に必要な分子の同定を目指し、研究を進める予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
新規がん抑制遺伝子型ｍｉｃｒｏＲＮＡの探索と創薬への展開

今年度は、microRNAの腫瘍選択的な送達を達成するため、1) DDS分子のリンカー構造の最適化と2)ポリアミン修飾によるリガンドコンジュゲートの細胞膜透過性の改善を行なった。1)リンカー構造を簡易に最適化するために、リンカー分子のアミダイト体を合成し、その配列を組み替えることでリンカー長の異なるDDSコンジュゲートを合成することに成功した。また、リンカーのアミダイトを用いて、DDS分子のスペーサー長を調節することにより、コンジュゲートsiRNAの細胞内導入効率を向上させることに成功した。2)では、RNAのリン酸ジエステル結合に由来する潜在的な低細胞膜透過性を改善するために、ポリアミン修飾を試みた。オリゴヌクレオチドへのポリアミン修飾法として市販されているポリスペルミンアミダイトを用いて、siRNAのパッセンジャー鎖にスペルミンを5-15分子結合したRNAを合成し、リガンドをコンジュゲートしたsiRNAのガイド鎖と組み合わせることで、ポリアミン-リガンド-siRNAコンジュゲートを新たに調整した。ポリアミン及びリガンドの単独修飾ではsiRNAの細胞膜透過性が見られなかった一方で、両分子を修飾したsiRNAは細胞内導入試薬を用いることなくsiRNA活性を示し、効率よく細胞内へデリバリーされていることが確認された。今後は昨年度探索したがん抑制遺伝子型microRNAに対して1)及び2)様の科学修飾を行い、microRNA医薬品への応用を検討していく。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的はmicroRNA医薬品の創出であり、そのために1新規がん抑制遺伝子型microRNAの探索と2microRNAの化学修飾法の開発を行う必要がある。本年度は1新規がん抑制遺伝子型microRNAを探索するためのRNAプローブ開発に注力して研究を行った。プローブの合成には、これまでに開発した新規光反応性ヌクレオシド及びビオチン分子を用い、それぞれガイド鎖に導入したmiRNA-145 (miR-145)プローブを合成した。本プローブを導入したDLD-1細胞へUVを照射し総RNAを抽出したところ、既知標的遺伝子であるFSCN1とKLF4が光架橋反応によってビオチン標識されていることが確認できた。本プローブを用いることでmiR-145が発現調節している未知のmRNAも検出できると考えている。また2について、microRNAに酵素耐性を付与するために2′-O-methyl(2′-OMe), 2′-deoxy-2′-Fluoro (2′-F), Phosphorothioate (PS)修飾を行い、その活性評価を行なった。さらに、microRNAの腫瘍選択的な送達を達成するため、DDS分子をコンジュゲートしたsiRNAの設計・合成と細胞膜透過性の検証も行った。その結果、数種の配列でmicroRNA活性を維持しつつ酵素耐性を上昇させることに成功した。また、DDS分子をコンジュゲートしたsiRNAはトランスフェクション試薬無しでもRNAi活性を誘起し、細胞膜透過能を持つことが明らかとなった。当初の計画通り、microRNAの機能解析に有用なRNAプローブの開発を達成したため。細胞膜透過性を有するsiRNA-DDSコンジュゲートの合成に成功した。今後はこの修飾法をmicroRNAに応用し、当初の計画通りmicroRNA医薬品としての機能を評価する。
アメリカ大統領の立法活動が及ぼす政党間二極化の効果の実証分析

本研究は、アメリカ大統領の立法活動が、20世紀後半以降進行している、議会における二大政党の分極化の原因となっていることを論じるものである。このことを実証するために、本研究は、議員および大統領の行動の計量分析や、クリントン政権期およびオバマ政権期の議会-大統領関係の事例研究といったミクロな分析、および、分極化の起源を辿るマクロ歴史分析を行った。分析の結果、(1)他の条件が同じならば大統領の立法活動は議会の党派性を強める効果をもつこと、(2)1960年代以降の様々な制度改革によって、その傾向は年々強まっていること、(3)大統領の活動の内容によっては、議会における超党派的な多数派形成が促されることが明らかとなった。本研究は、アメリカ大統領の立法活動が、概して議会の分極化の原因となっていることを、議員や大統領のミクロな行動と、マクロな制度・歴史のそれぞれについて、様々な分析手法を用いて論じるものである。今年度は、本研究の中でも、1)「大統領の立法活動と議会の点呼投票の関係に関する計量分析」・2)「政党再編成論を軸としたマクロ歴史的な理論の検討」・3)「クリントン政権の「第三の道」型改革の比較事例研究」に加え、当初の計画にはなかった、4)「クリントン政権の立法活動と議会の立法生産性に関する計量分析」5)「オバマ政権の立法活動と議会」の5つを中心に研究を行った。研究の結果、当初の予想どおり、「他の条件が同じならば」大統領の立法活動は議会を分極化させること・その傾向は年々強まっていること・大統領の活動手段やレトリックという「他の条件」によっては超党派的な多数派が形成されることの三点に加えて、以上の議論は2009年のオバマ政権と議会の関係にとくに合致することが明らかとなった。以上の成果は、学会報告1件(日本政治学会)・研究会報告3件として公表された。学会報告は、一部を加筆修正した上で、上記1)・5)の一環として、平成22年6月に、図書(論文集)の一編として刊行される予定である。その他、1は『名城法学』に連載中の論文の後編として平成22年に、3)の一部および4)は、平成22年4月に行われる中西部政治学会(アメリカ合衆国・シカゴ)にて報告する予定である。今年度は、本研究の中でも、1)「大統領の立法活動と議会の点呼投票の関係に関する計量分析」・2)「クリントン政権の「第三の道」型改革の比較事例研究」・3)「点呼投票以外の数量データを用いたクリントン政権の立法活動の計量分析」に加え、当初の計画にはなかった、4)「分極化と大統領選挙」5)「オバマ政権の立法活動と議会」の5つを中心に研究を行った。研究の結果、当初の予想どおり、「他の条件が同じならば」大統領の立法活動は議会を分極化させること・その傾向は年々強まっていること・大統領の活動手段やレトリックという「他の条件」によっては超党派的な多数派が形成されることの三点に加えて、以上の議論は、オバマ政権と議会の関係にとくに合致することが明らかとなった。本年度は、以上の成果を学会報告1件(Midwest Political Science Association)と論文3本として公表した。研究機関が終了した平成23年度に、以上の研究業績および未公表の研究を基に、単著の執筆作業を行い、平成24年の刊行を目指す。並行して、本研究の分析枠組によるオバマ政権の同時代的分析を、単独の論文として執筆・公表する。
炎症機序を標的とした肺動脈性肺高血圧の新規治療法の開発

肺動脈性肺高血圧(PAH)患者でBMPR2という遺伝子の異常が見られるがその役割は明らかではない。PAHでは実験的にも、臨床的にも炎症機序の関わりが示唆されている。BMPR2の減少した肺動脈内皮細胞ではGMーCSFを含むサイトカイン産生が亢進し、病変血管での炎症細胞集積に関与し、抗GMーCSF抗体は肺高血圧を改善することを示した。また、ヒトPAHと同様の病変を形成する、新しいPAHモデルの病変部位では、炎症細胞集積、サイトカイン(IL6, MCP1, MMP9, cathepsin-S, ,RANTES)の上昇が確認された。これらから、炎症機序のPAHに対する治療標的としての可能性が示された。肺動脈性肺高血圧の責任遺伝子(BMPR2)が同定されたが、BMPR2遺伝子変異の肺動脈性肺高血圧の病変形成における役割は明らかではない。炎症機序は、肺動脈性肺高血圧の病態において臨床的にも実験的にも関与が示されている。これまでに、BMPR2減少と炎症機序の亢進と病変との関連を示したが(Sawada H, J Exp Med. 2014)、今回は、GM-CSFを会する炎症機序を標的として新たな治療を開発する事を目的に研究を進めている。まず、ラット肺高血圧モデルでは、モノクロタリンモデルでは肺組織のGM-CSFmRNAが投与2週後に認められ、病変出現時期と一致する結果であった。SU5416/Hypoxiaにおいて、肺組織のGM-CSFmRNAレベルは亢進の傾向を認めるが、その変化が一貫せず、現在、血管病変、炎症細胞浸潤と時間空間的な関連を、解析しているところである。また、炎症機序は、肺動脈性肺高血圧の病態において臨床的にも実験的にも関与が示されているが、如何に病変を形成するかは明らかではない。培養肺動脈内皮細胞を用いて、siRNAによりBMPR2を減少させた場合、TNF-αなどの炎症刺激や低酸素によるストレス応答が増強され、炎症性サイトカインが異常制御されることを示した。異常制御されたサイトカインが、ヒト肺動脈性肺高血圧でも上昇し、血管病変への炎症細胞浸潤を来しうることを確認した。(Sawada et al, J Exp Med 2014)従って、肺動脈性肺高血圧の主要な遺伝子変異と炎症機序との関連が示された。さらに、GMーCSFを含む同機序の抑制は、マウスの低酸素誘発肺高血圧の抑制につながることが示されたが、ヒト肺動脈性肺高血圧の治療標的となるか否かは、明らかではなかった。そこで、最近開発された、ヒト肺動脈性肺高血圧に極めて類似する病変を持つSugen/ Hypoxia肺高血圧ラットモデルを用い、炎症と肺血管病変の関連を調べた。同モデルでは、免疫染色と、肺組織でのPCRにより、IL6、MCP1、GMーCSFの上昇が径時的に認められ、、肺血管病変の形成に時間的空間的な関連が認められた。また、炎症機序の病変形成における役割をさらに検討するため、病変形成細胞の単離培養を試みた。当初予定していた、GMーCSFの上昇が、顕著でなく、研究の方向の再考を要し、培養細胞系の実験系に確立に時間を要した。BMPR2遺伝子変異は肺動脈性肺高血圧(PAH)患者で見られるがその役割は明らかではない。PAH血管病変形成には、血管壁を構成する、血管内皮、血管平滑筋、繊維芽細胞ばかりでなく、マクロファージ、樹状細胞、リンパ球などの炎症細胞も重要な役割を担っていると考えられさらに、PAH患者ではIL-1、IL-6、TNF-,GM-CSFなど炎症性サイトカインの上昇が認められ、臨床的にも炎症機序の関わりが示唆されている。BMPR2の減少した肺動脈内皮細胞では、p38MAPKの活性化がみられ、サイトカイン産生が亢進し、ヒトIPAH病変の病変血管への炎症細胞集積に関与する事さらに、抗GMーCSF抗体投与は低酸素誘発肺高血圧を改善することを示した(Sawada H, 2014)。しかし、ヒトPAHにおいて、その病態を規定する病変、つまり治療の標的とすべき病変は、血管閉塞性の内膜肥厚であり、従来、モノクロタリンモデルや低酸素暴露モデルなど、PAH研究に用いられる動物モデルの血管病変は中膜肥厚が主体であり内膜肥厚を来すモデルの報告は非常に限られていることが課題であった。本研究では、最近報告された、血管内皮増殖因子受容体阻害剤SU5416投与と低酸素環境に暴露された叢状病変などヒトPAHと類似の病変を形成するモデルを用いた。本モデルの、病変部位では、平滑筋細胞形質転換と炎症細胞集積、さらに肺組織のサイトカイン(IL6, MCP1, MMP9, cathepsin-S, and RANTES)上昇が確認された。これらの所見から、炎症機序のヒトPAHに対する治療標的としての可能性が示された。(Otsuki S, 2015、Shinohara T, 2015)肺動脈性肺高血圧(PAH)患者でBMPR2という遺伝子の異常が見られるがその役割は明らかではない。

BMPR2の減少した肺動脈内皮細胞ではGMーCSFを含むサイトカイン産生が亢進し、病変血管での炎症細胞集積に関与し、抗GMーCSF抗体は肺高血圧を改善することを示した。また、ヒトPAHと同様の病変を形成する、新しいPAHモデルの病変部位では、炎症細胞集積、サイトカイン(IL6, MCP1, MMP9, cathepsin-S, ,RANTES)の上昇が確認された。これらから、炎症機序のPAHに対する治療標的としての可能性が示された。仮説を全面的に支持する結果が得られておらず、方針を転換するか否か、検討が必要である。当初のGMーCSF抑制実験では、顕著な効果は、得られないと考えられたことから、炎症機序内の、別の標的も含めて検討するとともに、同モデルの肺血管培養細胞を用い、炎症機序の亢進のメカニズムと増殖や形質転換といった細胞機能への影響を、検討することも視野に入れて、研究を継続する予定である。小児循環器学本研究では、ヒトの肺血管病変に非常に類似する肺高血圧モデルを用いて、治療標的としての炎症機序の有力な経路を提示する事を目標にしている。仮説を全面的に支持する、実験結果は得られておらず、前臨床的研究に進むためには、対象とする経路に関して検討を要する。これまでの研究で、マクロファージや、Tリンパ球の関与が明らかにされており、炎症機序の経路に関しては、他のマクロファージ、Tリンパ球の誘導性に関する因子を含めて検討し、今後、研究を展開していく予定である。当初の予定の結果に基づいた研究計画の変更が必要な状態となり、再検討のための解析、情報収集をすすめたため、今年度中の、当初の予定の、実験動物購入、研究試薬の購入の額が、予定を下回ったため。研究の方針を変更し、細胞培養系の確立を新たに計画し、本年度分とした額をその、試薬等の購入に充てる予定である。
植物生産施設における気化冷房法の最適化

湿潤な日本において,現在の細霧冷房法は細霧噴霧速度や噴霧時間は気象条件などによらず一定であり,日射強度や換気速度を考慮して可変とする制御法の検討が十分でないために,温室内気温の不均一化,高相対湿度,蒸発しきれなかった水滴の植物表面への付着による病害発生などの問題がある.本年度は,比較的小規模の実験用植物生産施設において,上記の問題を解決することを目的として(1)細霧発生方法の改良および(2)細霧発生量制御方法の改良について,短期的な効果の検証を行った.(1)日射のない室内において細霧ノズルに直径10cmの送風装置を取り付けて強制通風した場合の細霧蒸発率は,従来の送風装置のない場合に比べて1.6倍の95%となり,ノズル直下の気温水平分布もより均一となった.送風装置の効果により発生させた細霧のほとんどが蒸発するために,植物に未蒸発細霧が付着して病害が発生する危険を回避でき,細霧冷房システムを連続運転できることが示された.(2)従来,細霧冷房システムは未蒸発細霧を蒸発させるためにタイマー制御による断続噴霧を行うが,これにより気温および相対湿度の急激な変動が起こる.また,噴霧速度および噴霧時間は気象条件などによらず一定であった.(1)の細霧冷房システムを小型植物生産施設内に設置し連続運転を行った結果,未蒸発細霧の植物表面への付着は見られず,施設内気温を外気温より常に低く維持でき,かつ,気温および相対湿度の変動を減少させることができた.さらに,噴霧速度を可変とすることにより気温低下幅も可変となったため,連続運転制御法を確立するための基礎知見を得ることができた.植物生産施設内気温の測定には,通常,通風乾湿球計を用いるが,細霧冷房システム運転中には未蒸発細霧がセンサー部に付着して,実際の気温よりも低い数値を計測してしまう問題があることが本研究中に明らかとなった.そのため,細霧冷房システム運転中の正確な気温の測定法についても検討を行い,新たな測定法を提案した.湿潤な日本において,現在の細霧冷房法は細霧噴霧速度や噴霧時間は気象条件などによらず一定であり,日射強度や換気速度を考慮して可変とする制御法の検討が十分でないために,温室内気温の不均一化,高相対湿度,蒸発しきれなかった水滴の植物表面への付着による病害発生などの問題がある.本年度は,比較的小規模の実験用植物生産施設において,上記の問題を解決することを目的として(1)細霧発生方法の改良および(2)細霧発生量制御方法の改良について,短期的な効果の検証を行った.(1)日射のない室内において細霧ノズルに直径10cmの送風装置を取り付けて強制通風した場合の細霧蒸発率は,従来の送風装置のない場合に比べて1.6倍の95%となり,ノズル直下の気温水平分布もより均一となった.送風装置の効果により発生させた細霧のほとんどが蒸発するために,植物に未蒸発細霧が付着して病害が発生する危険を回避でき,細霧冷房システムを連続運転できることが示された.(2)従来,細霧冷房システムは未蒸発細霧を蒸発させるためにタイマー制御による断続噴霧を行うが,これにより気温および相対湿度の急激な変動が起こる.また,噴霧速度および噴霧時間は気象条件などによらず一定であった.(1)の細霧冷房システムを小型植物生産施設内に設置し連続運転を行った結果,未蒸発細霧の植物表面への付着は見られず,施設内気温を外気温より常に低く維持でき,かつ,気温および相対湿度の変動を減少させることができた.さらに,噴霧速度を可変とすることにより気温低下幅も可変となったため,連続運転制御法を確立するための基礎知見を得ることができた.植物生産施設内気温の測定には,通常,通風乾湿球計を用いるが,細霧冷房システム運転中には未蒸発細霧がセンサー部に付着して,実際の気温よりも低い数値を計測してしまう問題があることが本研究中に明らかとなった.そのため,細霧冷房システム運転中の正確な気温の測定法についても検討を行い,新たな測定法を提案した.
脳微小血管のアクアポリンサブタイプの同定と発現調節:その病態生理学的意義

脳微小血管のアクアポリン(AQP)サブタイプの発現調節機構を解析し、その病態生理学的意義を明らかにしようとした。微小血管を、ラット大脳皮質から高濃度アルブミン溶液を使用した浮遊遠心分離とグラスビーズろ過法を用いて調製した。AQPサブタイプ1-5のmRNAは、逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)で解析した。AQP1 mRNAの発現量は少なく、ポジティブコントロールとして用いた腎での発現の1/100以下であった。AQP4 mRNAは、腎と同程度発現していた。脳微小血管のAQP1蛋白は28kDaで、その発現量は腎の1/10以下であった。腎で40kDaのバンドとして検出された糖付加型は発現していなかった。AQP4蛋白は、30kDaのバンドとオリゴマーと考えられる高分子量のバンドと、さらに分子量の高い不溶性のバンドとして検出された。免疫組織化学染色ではAQP1シグナルは非常に弱かったが、AQP4は、微小血管内皮細胞の細胞膜に局在していた。初代培養脳微小血管内皮細胞に培養アストロサイトの培養液を添加し培養するとAQP1 mRNAレベルは20%減少した。また、SV40で不死化したラット脳微小血管内皮細胞GP8では、アストロサイト培養液の添加により70%減少した。一方、GP8を1% 0_2の低酸素下で培養すると、AQP1 mRNAは18時間後に2.5倍に増加した。AQP1は、アストロサイト由来因子により発現が抑制されていること、また低酸素により発現が増加することよりAQP1は細胞障害性浮腫を生じる原因分子である可能性が示唆された。脳微小血管に発現しているAQPのサブタイプを同定した。また、それらの高濃度グルコースまたはNaClによる変化を解析した。さらに、脳虚血・低酸素による発現の変化を調べた。ラット大脳皮質から脳微小血管を、高濃度アルブミン溶液を使用した遠心分離とグラスビーズ濾過法を用いて調製した。AQPサブタイプ15のmRNAを逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-RCR)で解析すると、AQP4のみが特異的に発現していた.AQP4蛋白は、30kDaのバンドとオリゴマーと考えられる高分子量のバンドと、さらに分子量の高い不溶性のバンドとして検出された。さらに、免疫組織化学染色で、AQP4は脳微小血管内皮細胞の細胞膜に局在していた。これらのことから、AQP4が、脳微小血管の水輸送を担っていることが判明した。脳微小血管内皮細胞を1%酸素下、高濃度(45mM)グルコース存在下、または高濃度(250mM)NaCl存在下で培養したが、AQP4のmRNAレベルには、変化は無かった。さらに、Willis大脳動脈輪の欠損しているスナネズミの頸動脈を結紮し、大脳皮質、海馬、小脳のAQP4レベルを、ウエスタンブロットで解析したところ、虚血によって減少傾向であった。現在、脳微小血管にAQP69のサブタイプが発現しているかを調べると共に、マンニトールやグルココルチコイド等の脳浮腫の治療に用いられる薬物によって脳微小血管のAQPサブタイプの発現変化を解析している。脳微小血管のアクアポリン(AQP)サブタイプの発現調節機構を解析し、その病態生理学的意義を明らかにすることを目的とした。微小血管は、ラット大脳皮質から高濃度アルブミン溶液を使用した浮遊遠心分離とグラスビーズろ過法を用いて調製した。AQP1mRNAの発現量は少なく、ポジティブコントロールとして用いた腎での発現の1/100以下であった。AQP4mRNAは、腎と同程度発現していた。

脳微小血管のAQP1蛋白は28kDaで、その発現量は腎の1/10以下であった。腎で40kDaのバンドとして検出された糖付加型は発現していなかった。AQP4蛋白は、30kDaのバンドとオリゴマーと考えられる高分子量のバンドと、さらに分子量の高い不溶性のバンドとして検出された。免疫組織化学染色ではAQP1シグナルは非常に弱かったが、AQP4は、微小血管内皮細胞の細胞膜に局在していた。初代培養脳微小血管内皮細胞に培養アストロサイトの培養液を添加し培養するとAQP1mRNAレベルは20%減少した。また、SV40で不死化したラット脳微小血管内皮細胞GP8では、アストロサイト培養液で70%減少した。一方、GP8を1% 02の低酸素下で培養すると、AQP1mRNAは18時間後に2.5倍に増加した。AQP1は、アストロサイト由来因子により発現が抑制されていること、また低酸素により発現が増加することよりAQP1は細胞障害性浮腫を生じる原因分子である可能性が示唆された。