hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
角膜内皮の健常性に関与する原始繊毛の存在意義の解明

米国アイバンクより提供され、移植に使用した角膜の内皮細胞を調べると、死細胞が5%程度存在していた。角膜移植後の内皮細胞数減少の一因として、保存中の死細胞増加が考えられた。また、ウサギ角膜を移植時と同様の角膜保存液を用いて4°Cの状態で保存すると、角膜内皮細胞に存在する原始繊毛が消失したが、37°Cで培養することにより再出現した。原始繊毛の存在は細胞のviabilityと何らかの関係があると考えられた。米国および日本においては、献眼された角膜はOptisol-GS中に低温で数日保存されたのち角膜移植に使用されている。Optisol-GS中に保存され,角膜移植に使用した中心部以外の周辺部角膜の内皮について、バイアビリティを調べるPropidium Iodide (PI), Hoechst 33342, Calcein-AMを使用した3重染色を実施した。検査した28例で、総内皮細胞のうち、平均4.9%の細胞核がPIで赤く染色された。これらの細胞は細胞質がCalcein-AM陰性であり、死細胞の状態であることが分かった。さらに、PIで核が染色される細胞の組織学特徴を詳細に検討したところ、アネキシンに陽性であったことから、少なくとも一部はアポトーシスを起こしていると考えられた。また、それらの細胞は細胞骨格タンパクであるアクチンに結合するファロイジンに陰性、間葉系細胞の細胞骨格を構成する中間径フィラメントであるビメンチンと特異的に反応する抗ビメンチン抗体に陰性で、電顕用エポンブロック厚切り切片のトルイジンブルー染色では細胞質が淡染していた。以上より、核がPI陽性を示した細胞は細胞骨格等の細胞成分が乏しい状態であることが分かった。培養細胞の共焦点レーザー顕微鏡観察において、死細胞は培養前には生細胞と同一面上に認められたが、培養1日後では生細胞より浮き上がった位置に観察された。さらにタイムラプス観察では、PI陽性の死細胞核が生細胞によって押しのけられるように移動し、脱落する様子が観察された。生体においても、内皮の死細胞は同様な脱落様式を示すと考えられた。ウサギの角膜を固定し、抗アセチル化αチューブリン抗体を用いて蛍光抗体法により蛍光標識し、共焦点レーザー顕微鏡下で立体観察を行ったところ、角膜内皮細胞表面から伸びる1本の原始繊毛(シリア)が観察された。角膜の透明性維持に重要な役割を果たしている角膜内皮細胞には、腎臓の上皮細胞や原始結節の細胞と同様に原始繊毛が存在することが報告されているが、その機能は未だ明らかにされていない。一方、我々は、角膜移植時のドナー角膜組織を用いた組織学的研究を行い、保存液中で一定期間低温保存されたドナー角膜組織の角膜内皮細胞のなかに、abilityが低下した非健常細胞が存在することに気付いた。そこで本研究では、ドナー角膜組織、および角膜移植時に摘出された患者角膜組織を用いて、非健常角膜内皮細胞の出現率および、角膜内皮細胞の健常性と原始繊毛の形態学的、組織学的異常の関係について検討を行い、角膜内皮細胞における原始繊毛の機能を明らかにする。本年度の研究実績(1)超微形態観察:ウサギ角膜内皮を走査型電子顕微鏡で観察したところ、原始繊毛は全内皮細胞の約2-3割程度に存在し、その位置は細胞の中央部であることが分かった。一方、保存ヒト角膜の内皮では原始繊毛は観察されなかった。(2)固定した培養内皮細胞の観察:ウサギの角膜内皮培養細胞および角膜組織を固定後、アセチル化αチューブリン抗体を用いて蛍光標識し、共焦点レーザー顕微鏡で立体観察した。その結果、細胞外に突出した原始繊毛と細胞内の核周囲がアセチル化αチューブリン抗体陽性を示した。(3)未固定培養内皮細胞の観察:顕微鏡用培養装置を用いてウサギ角膜内皮培養細胞のアセチル化αチューブリン抗体を用いた蛍光免疫染色、微小管に特異的に結合するオレゴングリーン488パクリタキセルならびにDiIを用いたlive-imagingを行ったが、バックグラウンドが高く原始繊毛の観察は出来なかった。そこで細胞内移行性が良好な蛍光標識パクリタキセルであるTubulinTrackerを用いたところ、原始繊毛の観察が可能であったが、今後条件の最適化が必要と思われた。角膜の透明性維持に重要な役割を果たしている角膜内皮細胞には、腎臓の上皮細胞や原始結節の細胞と同様に原始繊毛の存在が報告されているが、その機能は未解明である。我々はこれまでに、角膜移植に使用するドナー角膜の組織学的研究において、保存液中で低温保存されたドナー角膜の内皮細胞中に、非健常細胞が存在していることに気付いた。

そこで本研究では、ドナー角膜、および角膜移植時に摘出された患者角膜を用いて、非健常角膜内皮細胞の出現率および、角膜内皮細胞の健常性と原始繊毛の形態学的、組織学的異常の関係について検討を行い、角膜内皮細胞における原始繊毛の機能を明らかにすることを目的とした。本年度の研究実績:1移植用ヒト保存角膜においては原始繊毛が全く観察されなかったことから、日本白色家兎の新鮮角膜を角膜保存液中で保存した際に、角膜内皮細胞の原始繊毛がどのように変化するかを検討した。摘出直後の角膜では抗アセチル化αチューブリン抗体陽性の原始繊毛を有する細胞が約20%の内皮細胞に認められた。保存1および7日後では抗体に陽性を示す原始繊毛は観察されなかった。しかし7日間保存した組織を37°Cで2日培養したところ、原始繊毛を有する内皮細胞が再び観察された。21のサンプルの一部を走査型電子顕微鏡で観察したところ、摘出直後には角膜内皮細胞表面に突出した1本の原始繊毛が認められ、4°C保存による細胞表面の原始繊毛の消失と保存後の培養による細胞表面へ突出した原始繊毛の再出現が観察された。3SV40large TantigenとhTERTのプラスミドをレンチウイルスで感染させ、不死化ウサギ角膜内皮細胞を作製し、保存液中に4°Cで保存したところ、5時間で原始繊毛の減少が観察され、保存1日で原始繊毛の消失が観察された。ウサギ角膜内皮の原始繊毛は、角膜保存液で保存すると消失するが、回復性がある変化と考えられた。今年度の実施予定項目をほぼ達成している。24年度が最終年度であるため、記入しない。TubulinTrackerによる生細胞の染色条件を最適化して、未固定ウサギ角膜内皮における原始繊毛の働きを調べる。また輸入ドナー角膜を入手し、原始繊毛の存在の有無を再検討する。必要があれば器官培養を実施する。輸入ドナー角膜で好ましい結果が得られない場合は、ウサギ角膜を眼球保存液で保存して検討する。角膜内皮疾患の患者から得られた角膜が入手できれば、原始繊毛について詳細に検討し、疾患との関連を調べる。
炎症性サイトカインを介したクローン造血の拡大機序に基づく新規白血病予防法の創成

急性骨髄性白血病や前白血病状態のクローン造血に機能喪失型のTET2変異が高頻度に検出されている。申請者らはこれまでにTET2の機能喪失がクローン造血を引き起こすことを明らかにした。最近、TET2変異を有する血液細胞が炎症性サイトカインであるIL-1βの産生を介して様々な炎症を惹起することが明らかになってきた。そこで本研究では、TET2の機能喪失がIL-1βを介してクローン造血の拡大をもたらすメカニズムを明らかにし、そのメカニズムの阻害がクローン造血発生を抑制しうるかを検討する。本研究の成果は、TET2変異陽性クローン造血の発生機序の解明と、新たな白血病発症予防法の開発につながると期待される。
びまん性胃癌におけるRhoA遺伝子変異の役割

H28-29年度はLSL-RhoAY42Cマウスを作成しTFF1-BAC Creマウスと交配しイムノブロットにてRhoA Y42Cの発現を確認した。4w齢では野生型に比して軽度粘膜の萎縮の傾向を認めたが、6mではHE染色による胃底腺の構造、炎症は野生型と同等であり、炎症細胞浸潤がみられず、また印鑑細胞癌(signet ring cell carcinoma)からなるびまん性胃癌は認めなかった。胃底腺のの分化について検討したところTFF1-BAC Cre; LSL-RhoA Y42Cマウスにおけるこれら胃底腺細胞の配置、および数は野生型マウスと同程度であった。またTFF1-BAC Cre; LSL-RhoA Y42Cマウス胃粘膜よりオルガノイドを作成し、野生型オルガノイドと細胞増殖の程度を比較し、ほぼ同程度の増殖能を有することが分かった。H30年度はTFF1-BAC Cre; LSL-RhoA Y42Cマウス胃粘膜オルガノイドのTFF1、TFF2、pepsinogenなどの発現を検討したが、これらの分化マーカーの発現低下は見られなかった。さらにびまん性胃癌で異常が報告されているCDH1遺伝子の果たす役割をTFF1-BAC Creマウスを用いて検討した。一過性に発生した印鑑細胞癌はすぐに管腔側に脱落し、12wには小彎頭側から伸びだしてきた扁平上皮により完全に置換された。さらにRhoA Y42Cを導入したところ、やや扁平上皮化生が促進している傾向がみられたが、統計学的な有意差はみられなかった。これらの結果から、マウス胃粘膜におけるRhoA Y42C変異がびまん性胃癌の発生に与える影響はCDH1遺伝子異常に比べて限定的であることが明らかになった。またびまん性胃癌と腸型胃癌の発癌形式の違い、びまん性胃癌に多い幽門狭窄を伴う進行癌の治療法を臨床的に検討した。H28年度はLSL-RhoAY42Cマウスを作成した。LSL-RhoA Y42Cベクターをクローニングし、遺伝子導入してトランスジェニックマウスを作成した。第一世代のマウスをPCRでスクリーニングし、トランスジェニックの系統を四系統作出した。現在このTFF1-BAC Cre; LSL-RhoA Y42Cマウスの胃粘膜の表現系を経時的に検討を始めている。4w齢マウスの病理所見では、野生型に比して軽度粘膜の萎縮の傾向を認めた。さらに誘導型creリコンビナーゼ発現モデルであるK19-creERTマウスとの交配を開始した。H29年度はTFF1-BAC Cre; LSL-RhoA Y42Cマウスの胃粘膜の表現系を経時的に検討した。4w齢マウスの病理所見では、野生型に比して軽度粘膜の萎縮の傾向を認めたが、6mまで観察期間を延長すると、HE染色による胃底腺の構造、炎症は野生型と同等であり、炎症細胞浸潤がみられず、また印鑑細胞癌(signet ring cell carcinoma)からなるびまん性胃癌は認めなかった。免疫染色と系譜追跡法により胃底腺の構成細胞である腺窩上皮、頸部粘液細胞、壁細胞、主細胞などの分化について検討した。TFF1-BAC Cre; LSL-RhoA Y42Cマウスにおけるこれら胃底腺細胞の配置、および数は野生型マウスと同程度であり、腺窩上皮のRhoA Y42C変異は、胃底腺の分化異常を誘導しないことが明らかになった。またTFF1-BAC Cre; LSL-RhoA Y42Cマウス胃粘膜より三次元培養を行い、オルガノイドを作成した。遺伝子変異のない野生型オルガノイドと細胞増殖の程度を比較し、ほぼ同程度の増殖能を有することが分かった。またTFF1、TFF2、pepsinogenなどの発現について現在q-PCRで検討している。LSL-RhoA Y42Cトランスジェニックを樹立しTFF1プロモーターを用いて胃粘膜での発現を確認した。また腺窩上皮におけるRhoA Y42Cの役割を検討し、異常分化や異常増殖に関連しないことを明らかにした。これらの結果より腺窩上皮におけるRhoA Y42C変異は、びまん性胃癌のドライバー変異ではない可能性が考えられる。H30年度はTFF1-BAC Cre; LSL-RhoA Y42Cマウス

胃粘膜オルガノイドのTFF1、TFF2、pepsinogenなどの発現を検討したが、これらの分化マーカーの発現低下は見られなかった。さらにびまん性胃癌で異常が報告されているCDH1遺伝子の果たす役割をTFF1-BAC Creマウスを用いて検討した。一過性に発生した印鑑細胞癌はすぐに管腔側に脱落し、12wには小彎頭側から伸びだしてきた扁平上皮により完全に置換された。さらにRhoA Y42Cを導入したところ、やや扁平上皮化生が促進している傾向がみられたが、統計学的な有意差はみられなかった。これらの結果から、マウス胃粘膜におけるRhoA Y42C変異がびまん性胃癌の発生に与える影響はCDH1遺伝子異常に比べて限定的であることが明らかになった。またびまん性胃癌と腸型胃癌の発癌形式の違い、びまん性胃癌に多い幽門狭窄を伴う進行癌の治療法を臨床的に検討した。TFF1-BAC Cre; LSL-RhoA Y42Cマウスの胃粘膜を経時的に病理検索し、びまん性胃癌の発生の有無を検討する。また胃粘膜の分化異常について、胃上皮の分化マーカーによる免疫染色、TFF1陽性細胞の細胞系譜追跡で検討する。また遺伝子発現部位および生体における一過性の誘導の影響を検討するためにK19-creERT;RhoA Y42Cマウスにタモキシフェンを投与し、RhoA変異導入の影響を検討する。またこれらマウスの胃粘膜から胃底腺を分離し、三次元培養を行い、オルガノイド発育におけるRhoAの機能について検討する。またこれらマウスの胃粘膜から胃底腺を分離し三次元培養を行い、オルガノイド発育やin vitroの分化におけるRhoAの機能について検討する。もともと実験動物費を物品費として100万円で請求していたが、動物実験施設利用料として947610円の請求となり、若干の次年度使用額となった。来年度の動物実験施設利用料および、細胞培養関連の消耗品費として合わせて使用する予定である。
音声認識のための動的特徴を効果的に用いる隠れマルコフモデルに関する研究

本研究では、音声の動的特徴に対するHMMの性能を改善するため、複数の連続するスペクトルを1つの特徴ベクトルとして扱うセグメント単位入力HMMを改良して用いることと、音声の動的特徴をより正確にモデル化するために音響モデルとして従来の音素より長い音節あるいは音節連鎖を用いることの2つの方法を導入した。セグメント単位入力HMMの改良では、可変長セグメントの可能性を探ったが、現在までに確固たる成果を得ることはできなかった。音素よりも長い音響モデル単位を用いる方法については、最初に音素環境依存音節モデルについて検討を行った。まず左音素環境依存モデルとして、5母音、撥音、促音の7モデルを左音素とする音節モデルを作成したが、通常の音節モデルに対して有意な認識精度を向上を得られなかった。次に、右音素環境依存モデルとして、摩擦音、破擦音などの8グループを右音素とする音節モデルを作成したが、こちらも有意な認識精度の向上を得られなかった。続いて、音節連鎖モデルについての検討を行った。このモデルは現在一般的に広く用いられているトライフォンモデルよりも長い音素環境に依存したモデルとなる。音節連鎖モデルの作成においては、「音節モデルを2つ連鎖させることによる音節連鎖モデル」と「音素モデルを4つ連鎖させることによる音節モデル」の両者を検討した。音素モデルを4つ連鎖させる場合は、同じ音素の状態で分布を共有することによりモデル当たりの学習データの減少を防いだ。また、両手法で状態ごとに最小記述長(MDL)基準を導入しガウス分布数を最適化することで、学習データを効率よく利用した。これにより、文法を用いない連続音節認識実験(音節タイプライタ)において、従来使用していた音節モデル(音節正確率77.5%、音節正解精度64.9%)から、大きく認識精度を改善(音節正解率84.8%、音節正解精度77.8%)することができた。本年度は以下の項目について研究を行った.1.音素環境依存音節モデルの基本的な検討最初に,先行音素依存音節モデルの検討を行った.日本語の場合,先行音素は主として母音となるため,全ての先行音素別モデルを作成してもモデル数は極端に増加しない.そこで,母音(5種類),發音,促音・無音の7カテゴリーを先行音素とした.音素環境依存独立の音節モデルと比べて,認識精度の向上が見られた.次に,後続音素依存音節モデルの検討を行った.後続音素依存モデルの場合,全ての音素について可能性を考慮する必要があるため,モデル数が爆発的に増加する.そこで,音素を摩擦音群,破裂・破擦音群,半母音群,鼻音群,母音群(3種類),無音群の8カテゴリーに分割し,後続音素依存音節モデルを作成した.音素環境依存独立の音節モデルと比べて認識性能は改善されるものの,先行音素依存音節モデルの方が高い認識率を示した.また,先行/後続音素環境を考慮したモデルを作成するよりも,音素環境独立モデルで単純にガウス分布の混合数を増やす方が認識精度が向上することが分かった.2.可変長セグメント単位入力HMMと計算量削減セグメントを2フレームから構成することとし,隣接する2フレーム(セグメント長2フレーム)の場合,セグメント長4フレームの両端の2フレームの場合,セグメント長8フレームの両端の2フレームの場合と,セグメント長の異なるセグメント統計量を同時に使用した場合について検討を行い,認識精度に効果があることを確かめた.しかし,この方法は全てのセグメント長について計算を行うので,計算量の問題が無視できない.そこで,計算量を削減する方法として,特徴量の性質そのものからセグメント長を自動的に決定するデータドリブンな手法について検討中である.本研究では、音声の動的特徴に対するHMMの性能を改善するため、複数の連続するスペクトルを1つの特徴ベクトルとして扱うセグメント単位入力HMMを改良して用いることと、音声の動的特徴をより正確にモデル化するために音響モデルとして従来の音素より長い音節あるいは音節連鎖を用いることの2つの方法を導入した。
局所複雑地形における風力エネルギー評価に関する研究

我が国で風力エネルギを普及するためには、まず最適な風車設置予定地点を選定する必要があり、選定地点における風力エネルギ賦存量の予測が必要である。国土の大半が複雑な地形に覆われており、平野部の利用率が高く、風車を設置できる地点が丘陵・山岳地にならざるをえないため、これらの地形において風力エネルギ賦存量を正確に予測する必要がある。さらにまた我が国の気候風土に特有な風の流体力学的特性を明らかにし、それに適した風車の設計資料を提供しなければならない。本研究は複雑地形における風モデルとそれに基づく高精度の地域風況予測システムの確立とを目的としている。本研究では地形起伏、地表粗度の影響について明らかにするために、以下の風洞と実在の地形の2つを対象として実験と計算を行った。1.風洞モデル風洞の中に断面形状がベル型断面と呼ばれる2次元丘陵を設置し、乱流境界層が発達した状態において丘陵周りの流れを計測した。また3次元汎用流体シミュレーションソフトα一FLOWおよび風況予測シミュレーションソフトWASPの計算結果と風洞実験結果とを比較検討した。2.実在の地形モデル最上川の上流に位置する山形県立川町を解析対象として取り上げ、WASPを用いて風況予測シミュレーションを行った。また立川町において行われた風況観測のデータとWASPによるシミュレーション結果を比較検討した。これらの結果から、地形起伏、地表粗度の影響をより明らかにするためには、実際の地形における風況観測を行うため以下の観測システムを構築した。(1)複数の超音波流速計により高さ約13mまでの平均値および瞬時値の速度分布の計測。(2)熱線流速計により高周波成分を含む乱流成分の計測。風車設置予定地点を選定する場合,各地点における風力エネルギ賦存量の予測が必要である.風車を設置できる地点が丘陵・山岳地にならざるをえない我が国において,今後風力エネルギの導入を進めるには,複雑な地形において風力エネルギ賦存量を正確に予測する必要がある.本研究は複雑地形における高精度の地域風況予測システムの確立を目的としており,地形起伏,地表粗度の影響について明らかにするために,「風洞モデル」と「実在の地形モデル」の2つのモデルを用いて研究を実施し以下の成果を得た.1.風洞モデル風洞の中に断面形状がベル型断面と呼ばれる2次元丘陵を設置し,乱流境界層が発達した状態において丘陵周りの流れを計測した.また3次元汎用流体シミュレーションソフトa-FLOWおよび風況予測シミュレーションソフトWASPの計算結果と風洞実験結果とを比較検討し,以下の結果を得た.(1)粗度の影響が小さい場合,風洞実験の結果と数値シミュレーションの結果は比較的一致する.(2)粗度の評価において寸法効果の問題が生じるため風洞実験の結果をそのまま実際の地形に適用するには問題がある.2.実在の地形モデル最上川の上流に位置する山形県立川町を解析対象として取り上げ,WASPを用いて風況予測シミュレーションを行った.また立川町において行われた風況観測のデータとWASPによるシミュレーション結果を比較検討し,以下の結果を得た.(1)地表粗度と地形起伏のデータの与え方によっては丘陵・山岳地においても精度よく予測できる.(2)境界条件が複雑すぎて風況に影響を与えている因子を特定できない.我が国で風力エネルギを普及するためには、まず最適な風車設置予定地点を選定する必要があり、選定地点における風力エネルギ賦存量の予測が必要である。
ナノ構造制御光触媒の開発

モリブデンメッシュ上にめっきによってCu/Sn/Zn金属多層膜を作製して硫化水素雰囲気下において焼成することによりCu2ZnSnS4光触媒電極を得た。これに独自に開発したディップCBD法によってCdSを積層し、コンポジット型光触媒電極を作製した。さらにPtを光電析法によって担持することによって非常に高い効率で、光と水のみから水素を生成することができた。走査型電子顕微鏡等による構造解析から、Cu2ZnSnS4光触媒電極はめっき条件によって電極構造がナノスケールで変化することが確認でき、最も高性能なCu2ZnSnS4光触媒電極ではチムニー状のナノ粒子の集合体で構成されることを明らかにした。Cu2ZnSnS4光触媒電極を用いて膜電極集合体(MEA)を試作し、光電極表面にトルエンと水が共存する状況下で光照射を行うと、光触媒電極の還元能によりメチルシクロヘキサンが生成した。この反応ではトルエンに6個の水素原子を付加されることから、貯蔵困難な水素を貯蔵が比較的容易な有機溶媒として貯蔵できる。4時間の反応で0.24μmolのメチルシクロヘキサンの生成を確認した。一方で0.16Cの電子が反応中に流れた事から0.27μmolのメチルシクロヘキサンの生成が期待され、反応の選択率は88%と非常に高い値であり本手法の有用性が確認できた。本研究成果はJournal of theAmerican Chemical Societyの134巻頁に掲載された。本研究課題は主として1)プラズモン共鳴で動作する金属光触媒、2)コンポジット型光触媒、3)形状制御光触媒、の3つに取り組み、エネルギー問題の解決、ナノテク分野への学術的寄与を目指すものである。平成22年度は主に2)コンポジット型光触媒、3)形状制御光触媒に関する研究を行った。光触媒電極を用いた水分解においては電極表面に生じる水素の気泡が高効率化の妨げになることから、ガス捕集室に直接水素を放出するシステム開発を行った。要となる膜電極集合体(MEA)の試作も行い、実際に動作確認を行うことにより本システムの有用性を確認した。これまでに得られた成果を今後さらに発展させることにより、再生可能エネルギーの代表格である太陽エネルギーを利用し、水のみを原料としてクリーンな燃料あるいは化成品の原料である水素を高効率かつ安価に得る技術実現に貢献するものと考えられる。
TOLLIPによる蛋白凝集体の分解除去(アグリファジー)とIPF

TOLLIP遺伝子多型がIPFの発症や予後の規定因子であることが報告されている。TOLLIPはTLRシグナル制御に関わるだけでなく蛋白凝集体の選択的オートファジー分解のアダプターとなることが報告されている。不十分なオートファジー分解がIPF病態に関与するため、TOLLIP発現低下が自然免疫応答だけでなく喫煙などのストレス時の蛋白凝集体分解(アグリファジー)の制御により細胞運命を規定し、IPF病態に関与する可能性を考えた。本研究ではIPF肺組織でTOLLIP発現を確認し、分離培養細胞やマウスモデルにおける細胞老化と細胞死、筋線維芽細胞分化、肺線維化進展でのTOLLIPの役割を明らかにする。
有毒アオコの八郎湖データベースの構築とリスク予測手法への応用に関する研究

富栄養化の進行やアオコの発生などから平成19年12月に湖沼法の指定を受けた秋田県八郎湖において、アオコ形成藻類が産生する強力な肝臓毒microcystinの実態調査と分子生物学的な手法によるアオコ形成藻類の解析を行った。その結果、八郎湖のアオコはAnabaena属からMicrocystis属に劇的に変遷しているとともに、microcystinを産生する有毒アオコはMicrocystis属が主となっていることを明らかとした。秋田県八郎潟残存湖(八郎湖)は、その富栄養化の進行とアオコの発生などから平成19年12月より湖沼法の指定を受け、その水質改善対策が急務となっている。アオコを形成するMicrocystis属などはmicrocystinという極めて強力な毒素を産生することから、その発生は八郎湖汚濁における県民および近隣住民の最大の懸念となっている。また、湖水が農業用水に使用されていることや流入河川の末端付近に上水施設があることを鑑みてもその改善やリスク予測は焦眉の課題といえる。しかしながら、それらアオコやmicrocystinに関連する一貫したデータの蓄積は進んでおらず、周辺住民が求める『リスク予測』に必要な知見は不足しているのが現状である。そこで、本年度は八郎湖を対象湖沼としてmicrocystinの産生量(濃度)について実態調査を行うとともに、八郎湖におけるmicrocystin産生藍藻類およびアオコ形成藻類のデータベース=『八郎湖データベース』の構築を目的とした分子系統解析とmicrocystin合成酵素遺伝子(mcy)の検出を試みた。その結果、八郎湖の各地点において8月以降に高濃度のmicrocystinが検出され、アオコが高濃度に集積した地点では一時期その濃度がmicrocystinRR:364.3μg/L、YR:87、5μg/L、LR:320.0μg/Lであった。また、分子系統解析の結果、7月から8月にかけて藍藻類はAnabaena属からMicrocystis属に変遷していることが分かった。この結果は、顕微鏡観察の結果とも一致した。一方、microcystinの産生に必須であるmcy遺伝子を検出した結果、mcy遺伝子を保存する有毒株は、Microcystis属が優占した8月以降のサンプルにおいて観察された。このことから、八郎湖の有毒アオコはMicrocystis属が主となっていることが示唆された。また、湖水が農業用水に使用されそいることや流入河川の末端付近に上水施設があることを鑑みてもその改善やリスク予測は焦眉の課題といえる。そこで、本年度は平成20年度に引き続きデータの蓄積が不十分であったアオコ毒microcystinの発生量(濃度)について実態調査を行うとともに、『有毒藍藻の分類にmcy遺伝子群を使用する』という画期的な着想に基づき、mcy遺伝子群に着目した分子系統マーカー(遺伝子)により、八郎湖から単藻化した有毒藍藻の毒性などに関するデータを収集した。その結果、本年度はアオコ発生が少なく、microcystin濃度はアオコが発生した地点でmicrocystin RR:3.6μg/L、YR:3.9μg/L、LR:1.1μg/Lであった。また、平成20年度はアオコ集積サンプルのDNAに対して16S rRNA遺伝子領域の解析を行ったが、Anabaena属が優占しているサンプルのmcy遺伝子を解析した結果、全てMicrocystis属近縁であり八郎湖の有毒アオコがMicrocystis属であるという昨年度の仮説を支持する結果となった。加えて、単藻化したAnabaena属からmcy遺伝子が検出されなかったことから、八郎湖の有毒株はMicrocystis属であることが強く示唆された。
在日外国人集住地区のコミュニティとその住環境整備に関する研究

本研究は、外国人集住地区における住環境整備上の課題を明らかにするため、70年近い定住の実績を持つ在日韓国・朝鮮人の居住する地区を主な事例とした。研究を開始するにあたって、次の三つの課題に着目した。第一に、住環境の面で著しく質の低い状況にある外国人集住スクォッター(不法占拠地区)に対する行政上の対応がどうであったのかということ。第二に、実際の事業を考慮に入れる場合に外国人集住地区一般の課題がどうなるのかということ。そして第三に、地域アイデンティティの表現を考慮に入れながら行う住環境整備が外国人集住地区でどのように発現するのかということ、の三つの課題である。第一部では、スクォッター地区の課題について考察した。工業化という一般的な社会現象を背景とするスクォッター地区は、同様の外部不経済でありながら、公害のように法的措置によって一律に対処されず、個々の行政判断に委ねられてきた。その結果、現場の担当行政職員とコミュニティの関係が決定的に重要になり、できるところだけやるという、非合理的な状況が生み出されていた。第二部では、実際に事業が行われつつある集住地区において、住環境整備上の課題を探った。ここでは、持家率において外国人の方が日本人よりも高いことがわかった。従って、こうした地区における住環境整備を考えるとき、地域生活空間の向上に一定の寄与をしている外国人、と見る方が有意である。「外国人は社会的弱者」という考え方がマクロなレベルで正しいとしても、集住地区の生活空間というミクロなレベルでは必ずしもそうではない。このレベルにおいては、「外国人は生活空間の維持の担い手」と言ってよい。第三部では、大阪市における都市基盤整備の過程をレビューし、外国人の集住の現況とあわせて考察した。その結果、もっとも集住の著しい地区として、鶴橋耕地整理組合区域が浮かび上がった。その区域内に位置し、近年、地域アイデンティティの表現活動を行っている商店街について悉皆調査を行ったところ、借家商店を中心とする、若くて新しい商店層から発意がなされていた。流動性の高いコミュニティが、定住地としてのアイデンティティを主張していたわけである。JR京都駅の南に、かってスラムと称された京都市南区東九条地区がある。東九条地区のさらに南部、鴨川と高瀬川の合流点に至る約500メートルの二重堤防に沿って「松ノ木地区」がある。住民のおよそ8割が在日韓国・朝鮮人で占められる当地区は、全国的にみて最大規模の在日韓国・朝鮮人集住地区であり、長い間、「不法占拠(スクォッター)地区」として行政施策の対象外となってきた。高瀬川堤防によって隔絶されているということもあって周辺地域から孤立化し、「0番地という差別的な名称で呼ばれてきた。住民たちは居住地を自ら「松ノ木町40番地」と呼ぶようになった。当地区は1970年代に人口増のピーク(200世帯、600人程度)を迎え、以後は減少を続けている。現在では、総人口もその半分以下になっている。後期高齢層の割合が京都の中でもとりわけ多く、特に一人住まいの高齢者が目立つ。北部の東九条地区においても同じことが言えるが、高齢者対応の適切な福祉施策が求められている。

かねてから住民自治会は当地区の整備を断続的に行政側に要望していたが、1989年、建都1200年記念事業の流れもあって行政側は積極的な姿勢を見せ、地区内での立て替え事業案を打ち出すに至った。こうした対行政交渉におけるパイプ役-いわばNGO活動-を努めて来たのが地元・外部青年層であった。彼らは住民自治会の組織化を行うばかりではなく、子ども会や夏祭り等のレクリェーション活動の運営を行っており、住環境整備の過程においても少なからぬ影響を及ぼしている。本年度は上記のような生活実態の調査・分析と住環境整備事業の過程を整理するとともに、青年層の果たしたNGO活動の役割を考察した。また、分析から得られた整備課題をもとに集合住宅設計の可能性についても検討した。本研究は、不利な状況にありながら自力活動を基調として居住環境を確保してきた在日韓国・朝鮮人集住地区の形成過程を明らかにする。その方法としては、行政区レベルの社会資本整備の経緯を俯瞰しつつ、さらに細かなレベルの集住環境を分析する。対象地としては、昭和初期の集住傾向が旧東成区で顕著であり、その範囲が現東成区、生野区にほぼ重なること、統計や他の既住研究からみて、現在の在日韓国・朝鮮人の集住傾向が戦後も顕著であり続けていたこと、などの理由から東成区と生野区を選定した。大正期、工業化・都市化が進み、急激に人口が増加する中で、既成市街地に接するという立地性が東成・生野地区の宅地需要を高める。地代・家賃の収益性の高さが主な動機となり、民間地主組合による宅地整備が推進され同時に河川改修も進むが、基本的な部分の整備にとどまった。極めて短期間に長屋建設が進んだ鶴橋耕地整理組合事業では、建築線指定後も本格的な区画改造がなく、道路の設計条件がもともと貧しかったのに加えて、大きすぎた街区スケールが原因となって、零細敷地を生み出し、偶発的な行き止まり道路等の問題を生じさせた。在日韓国・朝鮮人の集住が最も著しい東成・生野地区、とりわけ鶴橋区域は以上のような文脈を持つ地区であった。本年度(最終年度)は以下のような調査研究を実施した。(1)大阪市における住宅集積パターンの実態調査ここでは、現地調査と1/2500地図上の街区変遷パターンとを併用することによって、大阪市生野区の機能複合型市街地の特質を明らかにした。(2)在日朝鮮人集住地区における公共事業の特質に関する調査ここでは、大正期から実施されてきた耕地整理事業および土地区画整理事業の変遷と新規来住者コミュニティの分布特性との関係を明らかにした。(3)地域コミュニティにおける新規来住者の受容形態に関する調査ここでは、大阪市生野区のコリアタウンを事例として、既存の地域住民たちが新規来従者を受け入れつつ新たなコミュニティを形成するプロセスと、既存コミュニティの維持・継承もしくはそれらの崩壊、新規コミュニティの形成パターン等を明らかにした。(4)スクワタ-地区の住環境整備に関する分析ここでは、京都市におけるスクワタ-地区の住環境整備事業のその後の進捗状況を追跡調査し、環境改善のプロセスを記録した。(5)文献・資料の分析ここでは、アメリカ合衆国における住宅政策、イタリアにおける地方分権政策とマイノリティ問題に関する既存資料を再度検討し、本研究の理論的枠組みを構築した。
ドパミン刺激薬の長期投与後に生ずる抑制性行動に関する研究

Cocaine反復投与からの離脱初期に見られるSCH23390カタレプシーの抑制およびHaloperidoカタレプシーの増強はGi-蛋白質おおよびGs-蛋白質のADP-リボシル化は関与していないことが示唆された.一方、長期離脱時に生ずるSCH23390おびHaloperidolカタレプシーの増強は百日咳毒素の脳室内(i.c.v.)投与によっていずれも増強された.コレラ毒素のi.c.v.投与によってSCH23390によるカタレプシーは増強されたが、Haloperidolによるカタレプシーは影響されなかった.離脱後期に生ずる後シナプスのドパミンD_1およびD_2受容体の感受性の低下はGs-およびGi-蛋白質の両者のリボシル化、あるいはGi-蛋白質のみのリボシル化が関与していることが考えられる.また分裂病の陰性症状に有効であると言われているClozapineおよびRisperidoneの単回投与は用量反応的にSCH23390によるカタレプシー反応を増強した.さらに、CocaineとClozapineあるいはRisperidoneを併用投与するとClozapineはSCH23390カタレプシーの増強効果を抑制したがRispeidoneは影響を与えなかった.さらに、Cocaine最終投与の15日以降に強制水泳による無動状態の増強はClozapineおよびRisperidoneの単回投与によってさらに増強された.Clozapineの併用投与によってこの無動状態の増強効果は抑制されたが、Risperidoneの併用投与によっては有意の抑制効果は認められなかった.強制水泳による運動量の増減は必ずしもアニメックスによる運動量の増減と一致しなかった.Cocaine反復投与からの長期離脱時に生ずるSCH23390およびhaloperidolカタレプシー反応の増強と強制水泳による無動状態の増強効果は互いに共通性を有することが示唆された.Cocaine反復投与からの離脱初期に見られるSCH23390カタレプシーの抑制およびHaloperidoカタレプシーの増強はGi-蛋白質おおよびGs-蛋白質のADP-リボシル化は関与していないことが示唆された.一方、長期離脱時に生ずるSCH23390おびHaloperidolカタレプシーの増強は百日咳毒素の脳室内(i.c.v.)投与によっていずれも増強された.コレラ毒素のi.c.v.投与によってSCH23390によるカタレプシーは増強されたが、Haloperidolによるカタレプシーは影響されなかった.離脱後期に生ずる後シナプスのドパミンD_1およびD_2受容体の感受性の低下はGs-およびGi-蛋白質の両者のリボシル化、あるいはGi-蛋白質のみのリボシル化が関与していることが考えられる.また分裂病の陰性症状に有効であると言われているClozapineおよびRisperidoneの単回投与は用量反応的にSCH23390によるカタレプシー反応を増強した.さらに、CocaineとClozapineあるいはRisperidoneを併用投与するとClozapineはSCH23390カタレプシーの増強効果を抑制したがRispeidoneは影響を与えなかった.さらに、Cocaine最終投与の15日以降に強制水泳による無動状態の増強はClozapineおよびRisperidoneの単回投与によってさらに増強された.Clozapineの併用投与によってこの無動状態の増強効果は抑制されたが、Risperidoneの併用投与によっては有意の抑制効果は認められなかった.強制水泳による運動量の増減は必ずしもアニメックスによる運動量の増減と一致しなかった.Cocaine反復投与からの長期離脱時に生ずるSCH23390およびhaloperidolカタレプシー反応の増強と強制水泳による無動状態の増強効果は互いに共通性を有することが示唆された.さらに、Cocaine(10,20mg/kg s.c.)の最終投与の3日後には強制水泳による無動状態は抑制され、この抑制は1週間後まで持続した.Cocaine最終投与の15日後には無動状態は、逆に、増強した.離脱3日後の無動状態の抑制効果はClozapine(1-10mg/kg i.p.)およびRisperidone(0.1-0.5mg/kg i.p.)の単回投与により対照群のれべるまでに回復した.しかしながら、15日間離脱後の無動状態の増強作用に対してこれらの薬物はさらに増強効果を示した.したがって、ClozapineおよびRisperidoneの単回投与では、Cocaine反復投与離脱初期に見られるD1受容体の興奮に対しては抑制効果が認められた.また、離脱後期に生ずるD1受容体の抑制作用をさらに増強させる結果が得られた.Cocaine(10mg/kgs.c.)を1日毎に21日間ラットに投与し、最終投与の20日後に見られるSCH23390(ドパミンD_1受容体遮断薬:0.1mg/kgi.p.)およびHaloperidol(ドパミンD_2受容体遮断薬:0.1mg/kg,i.p.)によって生ずるカタレプシー反応の増強効果(ドパミンD_1およびD_2受容体のSubsensitivity)は百日咳毒素(1μg,i.c.v.)の投与によっていずれも増強された.一方、コレラ毒素(1μg,i.c.v.)の投与によって、SCH23390によるカタレプシーは増強されたが、Haloperidolによるカタレプシーは影響されなかった.

マウスにおいて、コレラの毒素を静脈内(i.p.)に投与した場合にも同様の結果が得られた.分裂病の陰性症状に有効であると言われているClozapineおよびRisperidoneをCocaineと併用投与するとClozapineはSCH23390カタレプシーの増強効果を抑制したがRisperidoneは影響を与えなかった.一方、Cocaine 21日間(11回)の最終投与の15日以降に生ずる強制水泳による無動状態の増強はClozapineの併用投与によって抑制された.Risperidoneによっても抑制される傾向を示したが有意差は認められなかった.以上の結果により、Cocaine反復投与後長期離脱時に生ずる後シナプスのドパミンD_1およびD_2受容体の感受性の低下はコレラ毒素および百日咳毒素に感受性の強いGs-およびGi-蛋白質の両者のADP-リボシル化、あるいはGi-蛋白質のみのリボシル化のいずれかが関与することが示唆された.また、Cocaine反復投与からの長期離脱時に生ずるSCH23390およびHaloperidolカタレプシー反応の増強と強制水泳による無動状態の増強効果は互いに共通性を有することが考えられた.
回転機械に発生するき裂の振動学的検出法の研究

クラック(き裂)の生じた弾性軸のばね特性は折れ線の形をしており,断片線形系であるといえる.また,そのばね特性は軸とともに回転する.このようなばね特性を考慮した1個の回転体をもつ弾性回転軸系の運動方程式をたて,計算機によって数値シミュレーションを行った.その結果,主危険速度付近で不つりあいの方向によって共振曲線の形状が変化し,不安定領域が発生したり消えたりする特異な現象を検出できたとともに,主危険速度以外の共振点で,分数調波振動,和差調波振動などの各種の非線形強制振動を確認した.また,これらの振動の発生状態が,水平軸と垂直軸,ジャイロ作用のある系とない系などで異なることも明らかにした.これらの振動の実機による発生を確認するため,実験装置を作成した.その主危険速度は約1100rpmである.これをまず垂直に立て,いろいろな回転速度で運転し,振動の発生を確認,観察した.現在,主危険速度付近の現象を調べ終り,副共振点を調べているところである.前者では,不つりあいの方向により様々な様式の共振曲線を得ることができ,またその内容は数値シミュレーション結果と一致することを確認した.今後は,副共振点付近の振動の研究,水平軸と垂直軸との違い,などについて主に研究をすすめてゆく予定である.クラック(き裂)の生じた弾性軸のばね特性は折れ線の形をしており,断片線形系であるといえる.また,そのばね特性は軸とともに回転する.このようなばね特性を考慮した1個の回転体をもつ弾性回転軸系の運動方程式をたて,計算機によって数値シミュレーションを行った.その結果,主危険速度付近で不つりあいの方向によって共振曲線の形状が変化し,不安定領域が発生したり消えたりする特異な現象を検出できたとともに,主危険速度以外の共振点で,分数調波振動,和差調波振動などの各種の非線形強制振動を確認した.また,これらの振動の発生状態が,水平軸と垂直軸,ジャイロ作用のある系とない系などで異なることも明らかにした.これらの振動の実機による発生を確認するため,実験装置を作成した.その主危険速度は約1100rpmである.これをまず垂直に立て,いろいろな回転速度で運転し,振動の発生を確認,観察した.現在,主危険速度付近の現象を調べ終り,副共振点を調べているところである.前者では,不つりあいの方向により様々な様式の共振曲線を得ることができ,またその内容は数値シミュレーション結果と一致することを確認した.今後は,副共振点付近の振動の研究,水平軸と垂直軸との違い,などについて主に研究をすすめてゆく予定である.
単核貪食細胞系の分化における遺伝子発現制御機構の包括的解明

単球や樹状細胞(DC)は単核貪食細胞と呼ばれ,生体防御に必須である。これらの細胞は骨髄造血幹細胞から中間的な前駆細胞段階を経て分化するが、その過程での遺伝子発現調節の分子機構には不明な点が多い。本課題ではマウス生体から様々な分化段階の細胞を分離し、エンハンサー分布や遺伝子発現、さらには鍵となる転写因子のクロマチン結合の動態を全ゲノム規模で解析した。その結果、単核貪食細胞の分化においては、前駆細胞の段階で転写因子IRF8がPU.1とともにゲノムに結合することで単球とDCに共通のエンハンサーが形成され、単核貪食細胞としての性質を賦与する遺伝子群の最終分化段階での高い発現が導かれることがわかった。細胞分化のプロセスにおいては転写因子やエピジェネティック制御因子による遺伝子発現制御が極めて重要である。しかし、生体内に微量にしか存在しない造血幹細胞や前駆細胞における全ゲノム規模での解析は未だ限られている。研究代表者らは単球と樹状細胞を含む単核貪食細胞の分化について転写因子IRF8を切り口に解析してきた。本研究課題では我々が開発した微量細胞でのクロマチン免疫沈降シーケンス(ChIP-seq)解析法により単核貪食細胞系における転写因子結合とヒストン修飾を全ゲノム規模で同定し、単球・樹状細胞に特徴的な遺伝子発現パターン確立の分子メカニズムの解明を目指す。平成27年度はFACSにより高純度で分離したミエロイド系の前駆細胞(GMP、MDP、cMoP、CDP)と成熟細胞(単球、樹状細胞、好中球)を用いて、エンハンサー関連ヒストン修飾であるH3K4me1と活性化遺伝子発現制御領域に蓄積するH3K27ac、そしてプロモーターにおける転写開始のマークであるH3K4me3のChIP-seqデータの取得を行った。また転写因子PU.1のChIP-seqデータについても取得することができた。これによって上記7つの細胞集団におけるエンハンサー領域を同定し、分化に伴うその動態をバイオインフォマティクス解析した。その結果、単球や樹状細胞のエンハンサーは、遺伝子発現が起こる前に前駆細胞段階から徐々に準備されていることがわかった。また各分化段階で新たに形成されたエンハンサー領域においてはPU.1の結合が増加することを確認した。1.単核貪食細胞系の分化におけるエピジェネティックランドスケープの解読単球と樹状細胞に特徴的な遺伝子発現パターンが確立されていく過程を、前駆細胞段階からの転写因子によるエンハンサー制御の観点から明らかにしていく。例えばエンハンサーのプライミングにどのような転写因子が関与するのかをDNAモチーフ解析で予測し、その転写因子のノックアウトマウスやノックダウン等の手法を用いて、その役割を検証・解析する。また、スーパーエンハンサーに着目した解析も進める。2.単球と樹状細胞における転写因子のChIP-seq解析マウス生体内組織からFACSを用いて精製した単球と樹状細胞では、IRF8のChIP-seqを行なってもほとんどピークが得られないことがわかった。これはおそらく細胞種によってはFACSによる分離の過程で転写因子とクロマチンの結合が傷害されるからではないかと推測している。そこで細胞への傷害がより少ない分離方法(MACSなど)によって分離した細胞を用いてIRF8等の転写因子のChIP-seqを試みる。3.更なる分子メカニズムの解明転写因子が形成する複合体の精製と質量分析は、これまでの予備検討によって難易度が高いことがわかりつつあるが、条件検討をさらに行なう。これによって転写因子がエピゲノムを制御するメカニズムの理解を試みる。血液学
鍼灸医学における経絡・経穴系の特異的機能の解明に関する研究

経絡・経穴系は鍼灸医学の根幹を成すものである.しかるにその実態はいまだに明らかではない.筆者はこれまでの研究から経絡・経穴系は特異な組織構造をもつものではなく,機能系として捉える方が適切であると考える.そこで経絡・経穴系の特異的機能について体表一内蔵反射という枠組から現象論的なアプローチを試みた.方法としては胆嚢を標的臓器としてその形態変化(断面積)を指標に検討した.刺激部位は丘墟穴,胆嚢穴,胆兪穴,日月穴,合谷穴,丘墟穴と解谿穴の中間の非経穴とし,それぞれの部位の針刺激(通電刺激も含む)に対する胆嚢の形態変化を超音波診断装置で測定した.なお,卵黄負荷によって誘発された胆嚢縮小状態下の丘墟穴,合谷穴,非経穴刺激の反応についても検討した.その結果は以下に示す通りである.1)丘墟穴刺激では胆嚢の断面積は増大する傾向を示した.2)胆嚢穴刺激では胆嚢の断面積は縮小する傾向を示した.3)日月穴,胆兪穴刺激では胆嚢の断面積は,有効な変化を示さなかった.4)合谷穴刺激では胆嚢の断面積は縮小傾向を示した.5)卵黄負荷時では丘墟穴刺激および合谷穴刺激は胆嚢の縮小反応を抑制した.6)非経穴部の刺激では胆嚢の断面積は有効な変化を示さなかった.このことは卵黄負荷時でも同様であった.以上の結果より経絡・経穴の特異的作用はある程度存在することが示唆された.経絡・経穴系は鍼灸医学の根幹を成すものである.しかるにその実態はいまだに明らかではない.筆者はこれまでの研究から経絡・経穴系は特異な組織構造をもつものではなく,機能系として捉える方が適切であると考える.そこで経絡・経穴系の特異的機能について体表一内蔵反射という枠組から現象論的なアプローチを試みた.方法としては胆嚢を標的臓器としてその形態変化(断面積)を指標に検討した.刺激部位は丘墟穴,胆嚢穴,胆兪穴,日月穴,合谷穴,丘墟穴と解谿穴の中間の非経穴とし,それぞれの部位の針刺激(通電刺激も含む)に対する胆嚢の形態変化を超音波診断装置で測定した.なお,卵黄負荷によって誘発された胆嚢縮小状態下の丘墟穴,合谷穴,非経穴刺激の反応についても検討した.その結果は以下に示す通りである.1)丘墟穴刺激では胆嚢の断面積は増大する傾向を示した.2)胆嚢穴刺激では胆嚢の断面積は縮小する傾向を示した.3)日月穴,胆兪穴刺激では胆嚢の断面積は,有効な変化を示さなかった.4)合谷穴刺激では胆嚢の断面積は縮小傾向を示した.5)卵黄負荷時では丘墟穴刺激および合谷穴刺激は胆嚢の縮小反応を抑制した.6)非経穴部の刺激では胆嚢の断面積は有効な変化を示さなかった.このことは卵黄負荷時でも同様であった.以上の結果より経絡・経穴の特異的作用はある程度存在することが示唆された.鍼灸医学における臓腑-経絡経穴系はそれぞれ固有の機能を有し、生体を調節している。しかし、その機能に特異性があるかどうかについては明らかではない。そこで胆のう形態を指標に経穴の特異性について超音波診断装置を応用して検討した。刺激部位として胆のう機能に関係あるといわれている胆経の丘墟穴(原穴),胆のう穴(新穴)および陽陵泉穴(合穴)とした。刺激方法は1分間雀啄,1分間置針を3回繰返えし、刺激後は20分間記録した。なお、対照として無刺激安静臥床30分間の胆のう形態の自然動揺変化をあわせて測定した。被験者は4名,同一被験者に45回,同じ刺激を作用させ、胆のう形態への影響の再現性を検討した。被験者の条件として昼食を抜き、午後4時から実験を開始した。胆のう形態の計測はポラロイドフイルム上の胆のうをコンピュータに入力し、関心領域設定によって面積を求めた。なお、胆のう形態の変化率は刺激前値を100とした場合の増減率から算出した。以上の方法により実験を行なったところ以下の成績を得た。1)30分間安静臥床時における胆のう形態の変動は約10%以内であった。2)丘墟穴刺激では胆のう形態は増加し、拡張を示した。3)胆のう穴刺激では胆のう形態は縮少し、収縮を示した。4)陽陵泉穴刺激では胆のう形態は増加し、拡張を示した。以上の成績より経穴には特異的作用があることが示唆された。しかし、これらの反応は被験者により若干個体差を示し、経穴の特異性を解明するにはさらに検討が必要である。次年度は人工的に胆のうを収縮,拡張させ、経穴の作用について分析を行なう。
脱窒細菌を用いる低酸素条件下での環境修復技術の開発

1)生体系における芳香族化合物分解性脱窒細菌コンソーシアの動態解析従来、トルエンやフェノールを分解する脱窒細菌はThauera属およびAzoarcus属細菌に限られていたが、本研究では、多様な土壌試料より、Magnetospirillum属に属する新しい細菌を多数分離した。これらは系統樹からさらに3グループに分けられ、分解できる芳香族化合物の種類と対応した。2)脱窒細菌による芳香族化合物分解経路の解明(1)Thauerasp. DNT-1株によるトルエンの嫌気・好気分解:本菌は好気と嫌気条件で、全く異なる分解経路でトルエンを分解することを見出し、それぞれの鍵酵素であるトルエンモノオキシゲナーゼ(tod)とベンジルコハク酸シンターゼ(bss)をコードする遺伝子クラスターをクローニングした。各遺伝子群の発現調節機構を調べ、tod遺伝子群は好気条件でのみ転写され、bss遺伝子群は嫌気を好気の両条件で発現することを見出した。bss遺伝子産物は酸素に感受性であるため、tod遺伝子産物が好気条件、bss遺伝子産物が嫌気条件で、それぞれ特異的に機能することを明らかにした。(2)Magnetospirillum属細菌の芳香族化合物分解遺伝子のクローニング:TS-6株を用い、嫌気的なトルエン分解経路にかかわる主要な酵素遺伝子を全てクローニングし、経路の全体像を明らかにした。3)脱窒細菌の添加がin situ環境修復に及ぼす効果の検証2)の結果から、ベンゾイルCoAレダクターゼが嫌気的な芳香環開裂の共通の鍵酵素であることを認め、この遺伝子に基ずくプローブを用いることによって、環境修復過程での当該細菌群の動態をモニターできることを示した。1)生態系における芳香族化合物分解性脱窒細菌コンソーシアの動態解析と活用本申請者が新たに見出した、らせん状脱窒細菌の培養条件を適用して、広く自然界に同種の菌を探索し、新たに10種の菌株を水田土壌など異なる資料から分離し、それぞれの性質を明らかにした。今回分離した細菌は、全て脱窒条件下で安息香酸に生育でき、フェノール資化性菌とトルエン資化性菌の2つのグループに分類できた。また、一分離菌はフェノールを好気・嫌気両条件で分解した。16S rDNAの塩基配列より、これらの菌株はいずれもProteobacteriaのα-サブクラスに属するMagnetospirillumの菌種に類縁であったが、系統樹上ではトルエン資化性菌とフェノール資化性菌が2つのグループに分かれることが明らかになった。Magnetospirillum属細菌の共通の性質は走磁性であり、非脱窒性であるが、分離菌はいずれも走磁性を示さず、生理的にも顕著に異なる菌群であることが判明した。以上のことは、嫌気あるいは微好気環境で、これらの菌種が自然界に広く存在し、生態系の物質循環に一定の役割を果たしていることを示すものである。2)脱窒細菌による芳香族化合物分解経路の解明本申請者らが単離したThauera sp.DNT1株は、好気・嫌気両条件でトルエンを分解でき、両条件で全く異なる代謝経路でトルエンを分解する。この代謝変換が起こる環境応答因子を遺伝子レベルで調べるための基盤的手法となる変異条件を検討し、トランスポゾンによる変異が有効であることを見出し、その条件を設定した。1)生態系における芳香族化合物分解性脱窒細歯コンソーシアの動態解析と活用前年度までに取得したMagnetospirillumに属する新規な10種の脱窒細菌について、系統分類学上の位置、および生理的性状を精査し、これらは16S rDNAの塩基配列から3群に分けることがでた。3群とも安息香酸を利用できる点て共通しており、環開裂経路としてベンゾイルCoA経路をもつことが示唆された。