hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
地域連携における上部尿路感染予防のための清潔間欠自己導尿患者への継続支援の構築

本研究の目的は,高齢者を対象に地域医療連携を活用し,清潔間欠自己導尿指導について継続実施を可能する看護支援について検討を行い支援システムの構築を行うことである.平成29年4月より,A病院において清潔間欠自己導尿が導入され指導を開始した65歳以上の患者に対して独自に作成したインタビューガイドに基づきインタビューを開始し,中でも導入後に残尿量が減少せず,指示回数も守られない継続困難な1事例について分析を行い以下の実績を得た.当該内容については,第25回日本排尿機能学会において「高齢者の清潔間欠自己導尿導入時の課題(一事例)」として口演発表を行っており,日本排尿機能学会に論文投稿の予定である.患者は80歳の男性.観察内容は,導入時から約1年半の間にインタビューガイドに沿ったインタビューの実施および電話相談を行った.また,インタビューで得られた内容について,医師,外来看護師や皮膚・排泄ケア認定看護師と情報共有し追加指導を行った.インタビュー総時間数は,97分で平均14分(範囲:8分ー21分)であった.高齢者が継続して清潔間欠自己導尿を実施するためには,看護師の繰り返しのかかわり,かかりつけ医や看護師との地域医療連携を活用したサポート,患者個々にあった実施の体位の工夫,患者個人の挿入技術や疼痛の確認を行いながらの指導,膀胱用超音波画像診断装置を使用した残尿測定による残尿量の可視化,などの必要性が示唆された.平成31年3月30日現在,清潔間欠自己導尿導入された65歳以上の患者は11名で内8名から研究参加の同意を得てインタビューを行っている.研究申請時は,地域医療連携室主幹(責任者)として勤務していた.その後,平成28年度,29年度と医療安全管理室主幹(責任者)として勤務し,平成30年度には,看護部副看護部長として勤務している.異動に伴う研究に取り組む環境の変化に十分対応ができていなかったことで,やや遅れを生じた.研究に同意を頂いた8名のインタビュー内容の解析を行っている.導入からのその後の経緯は,個々により大きく異なり,自己導尿を終了するまでに至った事例もある.そのため,病気の経過や実施に関する支援の状況,本人の意気込み,外来相談の状況など,大きく影響を及ぼしている因子も多く,事例解析を十分に行う必要がある.平成28年11月8日に名古屋市立大学看護学部研究倫理審査(ID:16017)の承認を受けた後に、平成29年2月7日に名古屋市立病院臨床研究審査委員会(IRB)(16-02-370)の承認を受け、各部署への調整を行い開始予定である。また、本年度は、看護・介護における高齢者の清潔間欠自己導尿の自宅等での現状を明らかにすることを目的に、文献検討を行い以下の実績を得た。清潔間欠自己導尿が必要な患者も入院期間の短縮により住み慣れた環境での生活を早期に確立しなければならず、地域医療連携を活用し、基幹病院は地域のかかりつけ医への紹介を行い自宅等での治療を継続することが通常である。清潔間欠自己導尿は、患者自身が厳密な無菌操作ではなく清潔操作で導尿しても尿路感染症を起こさない療法として普及している。しかし、訪問看護ステーションを対象とした調査報告では、対象者2322名中、おむつ使用が56.0%、留置カテーテルが9.7%で、清潔間欠自己導尿はわずか1.6%であった。このように、病院では、清潔間欠自己導尿を推奨し実施していても他の施設や自宅に戻った場合に、清潔間欠自己導尿を中断している可能性が示唆された。清潔間欠自己導尿は、上部尿路感染を予防し、高齢者が健康で入退院を繰り返すことのない生活に寄与できることは明らかであり、地域医療連携を活用し、清潔間欠自己導尿が継続できるような看護ケアは取り組むべき重要なケアの一つであることが明確になった。平成29年度は、清潔間欠自己導尿を開始した患者に対し継続する上で困難な内容について事例ごとにインタビュー調査を行い地域でも継続可能な実施方法や看護ケアについて検討する予定である。平成28年11月に名古屋市立大学看護学部研究倫理審査及び平成29年2月に名古屋市立病院研究倫理審査委員会の承認を受け、各関係部署に対し調整を行った。平成29年4月から実施の予定である。調整を通して、皮膚排泄認定看護師及び泌尿器外来主任とともに、インタビュー用紙の修正を行った。本研究の目的は,高齢を対象に地域医療連携における上部尿路感染予防のための清潔間欠自己導尿継続実施に焦点をあて,地域医療連携における継続支援の構築を行うことである.地域医療連携での実施状況の把握のため,清潔間欠自己導尿に対する文献検討を行い名古屋市立病院紀要第39巻に投稿をおこなった.文献検討において以下の実績を得た.高植らの調査において,おむつ使用は,4,662名と多数であったが,清潔間欠自己導尿実施者は,訪問看護ステーション30名,介護老人保健施設6名,介護療養型医療施設6名であり,介護老人福祉施設では対象者はいなかった,後藤らの訪問看護ステーションにおける調査では,2,322名中おむつ使用が1301名であり,留置カテーテルは,225名であった.また,田中らの調査において,清潔間欠自己導尿実施の重要な情報として在宅・訪問看護ステーションともに「尿意の有無」と「家族の介護力」を選択していた.

本来なら清潔間欠自己導尿実施時に観察項目となる「残尿量」「1回排尿量」「排尿時間」などの膀胱機能に関する項目を重要視すべきであるが,そのような事業所は少なかった.効果が高い清潔間欠自己導尿を導入した場合でも,排尿管理についての知識や技術,家族からの支援がない場合は,とりあえずおむつを使用することやカテーテル留置がなされることが多く,施設において適切な排尿管理がなされているとは限らないことが明らかとなった.平成29年4月より,A病院において清潔間欠自己導尿が必要と診断された65歳以上の患者に対してインタビューを開始した.平成30年3月30日現在,清潔間欠自己導尿導入患者は7名で内5名から研究参加の同意を得てインタビューを行っている.入院から施設または,自宅へ帰った後も清潔間欠自己導尿が継続して行えるよう継続支援の方法について検討を行う.A病院においては,清潔簡潔自己導尿導入患者は1年間に約10名程度である.そのうち65歳以上の7名に対し研究についての説明を行い,同意を得られた患者は5名である.それぞれにインタビューを複数回行っている.本研究の目的は,高齢者を対象に地域医療連携を活用し,清潔間欠自己導尿指導について継続実施を可能する看護支援について検討を行い支援システムの構築を行うことである.平成29年4月より,A病院において清潔間欠自己導尿が導入され指導を開始した65歳以上の患者に対して独自に作成したインタビューガイドに基づきインタビューを開始し,中でも導入後に残尿量が減少せず,指示回数も守られない継続困難な1事例について分析を行い以下の実績を得た.当該内容については,第25回日本排尿機能学会において「高齢者の清潔間欠自己導尿導入時の課題(一事例)」として口演発表を行っており,日本排尿機能学会に論文投稿の予定である.患者は80歳の男性.観察内容は,導入時から約1年半の間にインタビューガイドに沿ったインタビューの実施および電話相談を行った.また,インタビューで得られた内容について,医師,外来看護師や皮膚・排泄ケア認定看護師と情報共有し追加指導を行った.インタビュー総時間数は,97分で平均14分(範囲:8分ー21分)であった.高齢者が継続して清潔間欠自己導尿を実施するためには,看護師の繰り返しのかかわり,かかりつけ医や看護師との地域医療連携を活用したサポート,患者個々にあった実施の体位の工夫,患者個人の挿入技術や疼痛の確認を行いながらの指導,膀胱用超音波画像診断装置を使用した残尿測定による残尿量の可視化,などの必要性が示唆された.平成31年3月30日現在,清潔間欠自己導尿導入された65歳以上の患者は11名で内8名から研究参加の同意を得てインタビューを行っている.研究申請時は,地域医療連携室主幹(責任者)として勤務していた.その後,平成28年度,29年度と医療安全管理室主幹(責任者)として勤務し,平成30年度には,看護部副看護部長として勤務している.異動に伴う研究に取り組む環境の変化に十分対応ができていなかったことで,やや遅れを生じた.平成29年5月から直接インタビュー及び電話によるインタビュー調査を行う。情報収集した内容を基に皮膚排泄認定看護師とともに、地域連携で継続実施ができるための指導用のパンフレットを作成する。平成30年4月から在宅・施設等と連携して活用できる排尿連携カードを作成し、使用について検討を行う。
レーザー照射による使用済みガラス用研磨材からの酸化セリウムの回収

乾燥させた使用済みガラス用研磨剤に大気中808nm半導体レーザーを照射し、発生するセリウム成分を含む蒸気をガラス基板に堆積させることでセリウム成分を回収した。回収成分は主に酸化セリウムと酸化ランタンで構成される。レーザー照射条件と照射方法の最適化を行った結果、セリウム成分の原子比は75%から88%に上昇し、ランタン成分の原子比は25%から12%と減少した。回収物の厚膜化を行った結果、電流値35Aにおいて研究当初の1.4μmから最大185μmまで可能となった。回収した白色蒸着物をスラリーとして用い、ガラスの模擬的研磨試験を行った結果、照射前と比較し研磨面の最大谷深さPV値が71%低減した。プレレーザー照射試験では、波長808nm、出力20Wの半導体レーザーを使用し、大気中において使用済み研磨剤へのレーザー照射を行った。また、照射前後の使用済み研磨剤の成分分析(EPMA)を行った結果、レーザー照射後はレーザー強度の高い照射中心程に近づく程、Ceの質量濃度が低いことがわかった。そこでレーザー照射中に終始、研磨剤サンプルから蒸気が発生していたことから、その蒸気をカバーガラスに捕捉した。カバーガラスの蒸着物は照射中心になるほど白色が濃いことからレーザーの照射中心で多くの蒸気が補足できた。その蒸着物のEPMA分析結果よりCeが検出できた。照射時間とワーキングディスタンズの最適化及び蒸着物の膜厚測定を行った。なお、レーザー照射により、酸化セリウム研磨材に比較的多く含まれるLaも検出された。次に分光試験を行い高純度の酸化セリウム研磨剤の光吸収特性を調査した。その結果、400nm前後に吸収波長が存在することを明らかにした。メインレーザー照射システムの試作とレーザー照射試験では酸化セリウム回収用半導体レーザー(808nm、405nm)、光ファイバ、コントローラー、水冷システム及び集光レンズの光学系からなる照射システムを構築した。上記システムを使用し、808nmレーザー照射試験では、レーザー照射により発生する蒸気を補足することで、酸化セリウムの回収が可能であった。光学系の最適化により、最も蒸着物が回収できる照射時間を明らかにした。また、微粒子化した蒸着物の厚膜化についても検討した。酸化セリウムの回収は、プレレーザー試験と同様にカバーガラスに蒸着させた。405nmレーザー照射試験については、次年度にさらにシステムの改良・最適化により照射時間、照射出力等を検討する必要がある。下記の研究計画に則り、実験及びメインレーザー照射システムの試作を行い、酸化セリウム成分を回収するためのシステム、照射条件を得ることができたため。1)大気中における使用済み乾燥研磨材への連続波半導体レーザー照射によるレアアース成分の回収(プレレーザー照射試験)2)分光試験3)メインレーザー照射システムの試作とレーザー照射試験による酸化セリウムの分離・回収808nmレーザー照射システムにおいて、レーザー出力を25Aから35Aまで変化させることで、Ceの原子比率を、平均74.2%から88.0%に増加した。Laについては、平均25.2%から12.0%に原子比率の大幅な減少(52%減少)が可能となった。また、808nmレーザーの照射時間と使用済み研磨剤の照射スポットを変化させることで、今年度はさらに最大185μmまでCe成分が含まれる白色蒸着物の厚膜化が可能であった。厚膜化した白色蒸着物を収集し研磨試験を行うための、模擬研磨試験条件の最適化を行った。模擬的研磨試験方法については、トルク式研磨試験、往復摺動方式研磨試験の両方について検討した。そして少量でも可能な模擬的研磨試験方法を確立した。収集した白色蒸着物について、Ceの吸収波長に近い405nmの波長の半導体レーザーを大気中において照射し成分分析を行ったが、照射試験条件内でCe,La成分について照射前後の質量濃度の差は得られなかったため、照射方式の再検討を行った。そこで、使用済み研磨剤へ直接405nm半導体レーザー照射することとし、照射面の成分分析を行った。使用済み研磨剤への直接照射においては、照射システムにおいてビーム整形を行いシート光とした。また、試料台については1軸を自動走行とするシステムに改良を行った。上記システムにおいて、405nmのレーザーを使用済み研磨剤へ直接照射した結果、SiとLaについて照射前後で質量濃度が変化することが明らかとなった。使用済み研磨剤に付着しているガラス成分であるSiについて、大気中において405nmの波長の半導体レーザーに対し反応性があることが示唆された。また、808nm及び405nmレーザーについて強度分布の確認を行った。808nmレーザー照射システムにおいては、出力を35Aにすることで捕捉した白色蒸着物のLaの比率を大幅に減少することが可能となり、Ceの原子比率を増加させることが可能であったため。また、使用済み研磨剤の照射スポットを走査することで捕捉した白色蒸着物についてさらに厚膜化が可能となり、少量でも可能な模擬的研磨試験方法を確立し、使用済み研磨剤と白色蒸着物の研磨特性の比較が可能となったため。また、405nmの短波長のレーザーについては使用済み研磨剤への直接のレーザー照射により蒸気は発生しないものの、表面成分の質量比への影響があることが明らかとなったため。本研究では使用済みガラス用研磨材に対し、大気中ドライプロセスにおいて、酸化セリウムを分離・回収するための手法とそのレーザー照射条件を明らかにした。

具体的には、酸化セリウムの主要な再利用法である薬剤を使用した化学的手法に依らず、乾燥させた使用済みガラス用研磨材に、大気中において808nm半導体レーザーを照射し、発生した蒸気をガラス基板に堆積させ酸化セリウム成分が含まれる白色蒸着物を回収した。回収物の成分分析を行った結果、主にCe、La成分が検出されたことから大気中において複雑な装置を必要とせず酸化セリウム成分の回収が可能となった。さらに光学システムの構築を行い、レーザーの電流値を変化させることで酸化セリウム成分の濃度増加とガラス基板に堆積させた回収物の厚膜化のための実験を行った。電流値は25、30、35Aとした。照射スポットも変化させた結果、最大電流値35Aにおいてセリウム成分の原子比率は平均値で75%から88%に上昇し、ランタン成分の原子比率は平均値で25%から12%と減少した。また、研究当初の1.4μmから最大185μmまで厚膜化しCe成分を回収できた。回収したCe成分を含む回収物に対し模擬的研磨試験を行った。模擬的研磨試験は、ガラス球を使用しステンレスディスクに対し、接触前に研磨スラリーを滴下し、一定荷重を付与した往復摺動とした。研磨試験は2種類(使用済み研磨剤、回収したCe成分を含む白色蒸着物)のスラリーを使用し、その濃度は5%とした。白色蒸着物の摩擦係数は、摩擦回数の増加とともに減少し、定常値では使用済み研磨剤スラリーの約58%の値を示した。使用済み研磨剤と比較し、回収した白色蒸着物のスラリーの算術平均粗さRaの変化はないものの、最大谷深さPVは使用済み研磨剤スラリーと比較し71%低減し、研磨特性向上に有効であることが明らかとなった。乾燥させた使用済みガラス用研磨剤に大気中808nm半導体レーザーを照射し、発生するセリウム成分を含む蒸気をガラス基板に堆積させることでセリウム成分を回収した。回収成分は主に酸化セリウムと酸化ランタンで構成される。レーザー照射条件と照射方法の最適化を行った結果、セリウム成分の原子比は75%から88%に上昇し、ランタン成分の原子比は25%から12%と減少した。回収物の厚膜化を行った結果、電流値35Aにおいて研究当初の1.4μmから最大185μmまで可能となった。回収した白色蒸着物をスラリーとして用い、ガラスの模擬的研磨試験を行った結果、照射前と比較し研磨面の最大谷深さPV値が71%低減した。今後の研究方針は下記となる。・レーザー照射システム及び回収システムの改良・最適化405nmのレーザー照射試験について酸化セリウムの収率を上げるために分離・回収システムの最適化を図る。レーザー強度と照射時間の適正化。照射時温度についても調査する。プレレーザー照射により得られた、蒸着物へのレーザー照射による物質移動・蒸発のメカニズムを明らかにする。・回収された酸化セリウムによる研磨試験回収した酸化セリウムに対し、研磨能力の再生を確認するために、ラッピングマシーンを使用したガラスの研磨試験を行う。未使用酸化セリウム研磨材、使用済み研磨材と比較する。回収された酸化セリウムがレーザー照射プロセスにより活性化されていれば、ガラスとの化学反応が促進され、高い研磨能率が得られると考えられる。
音地図作成による移動ロボットの空間的聴覚とその利用法の研究

昨年度開発したPitch-Cluster-Maps(PCMs)による物音認識手法の実装例として,実験用住宅での日常音認識を行った.車輪型ロボット搭載用32チャンネルマイクロホンアレイおよび、天井設置型128チャンネルマイクロホンアレイに提案法を実装し,マイクロホンアレイで分離した音の認識を行った.PCMs認識の結果を音声フィルタとして利用し,人の声のみを音声認識器へ入力することで,掃除機やテレビといった雑音がある場合でも,雑音の誤認識を防ぐことが可能である.実際に,うめき声を検出してロボットが近づく,雑音下で音声指示による家電操作を行う,といったデモンストレーションを通して,実環境中でのシステムの有効性を確認した.ロボットが移動中に定位した音源の角度情報を用いた三角測量+RANSACによる短区間音源位置推定に,Pitch-Cluster-Mapsによる音の認識結果を加え,より広範囲での音地図作成を行った.移動中の各位置で定位した音の追跡に用いる情報として,角度変化だけでなく音の認識結果を加えることで,同時に追跡可能な音源数の増加や,交差する音の追跡を実現しより広範囲での音源位置推定が可能となった.システムの評価実験では10×18[m]の部屋内に11の音源を配置し,車輪型ロボットに搭載した32チャンネルマイクロホンアレイを用いて,「どこで何の音がするか」を示す音源地図作成を行った.平均0.4m/sで移動するロボットから,過去2sec以内の定位データによる結果では,推定位置誤差の平均282mm,認識の正解率は70.7%であった.広い範囲を動くロボットで、周囲の音をより確実に検出するために、反射や残響、干渉等の影響による精度劣化を低減する音源定位法を提案した。本手法は、点音源に対してマイクアレイで観測される音の感度分布をビームフォーミングのシミュレーションから導出し、メインローブモデルを定義することで、モデルに適合しない反射や干渉によって歪んだ成分を除外し、より複雑な環境で点音源を検出する手法である。提案法をロボット搭載型マイクアレイに実装し、移動中のロボットから、同時に5つの音源を検出可能であることを実証し、従来の音源同士の周波数独立を仮定した手法において問題となっていた、同時に扱い可能な音源数の限界を改善可能であることを示した。また、ビームフォーミング時の感度分布から、音源定位・分離の性能を定量評価するための指標を定義し、シミュレーションによるマイクアレイの最適設計を行った。シミュレーション上で様々なマイク配置について指向特性を自動評価することで、最もビームフォーミングの性能を引き出す、ロボット搭載用の、直径360mm、128chマイクアレイを設計し、S/N比20dB以上を保障する、全方位に高感度なマイクアレイを実現した。最終的なロボット聴覚システムの構築に向けて、音源定位、音源分離、音声認識の各機能を統合したオンラインシステムを構築し、認識の精度向上を目指した各機能の評価を行った。アプリケーション例として、任意の時刻、位置からのロボットへの音声指示認識を目的とした、雑音下で有効な指示語認識システムを構築し、複数人の同時発話や雑音下での離れた場所からの発話など、音圧差のある複数音源を検出可能であることを示した。家庭やオフィス,工場といったロボットが活動する環境での音源認識の実現を目標として,移動ロボットのための物音認識について研究を行った.これらの環境では,ロボット周囲には人の声に限らず様々な音が存在する.自律型ロボットが周囲の音に対しどこで何の音がするのかを知ることは,重要な環境認識機能のひとつである.本年度はロボット聴覚に適した物音認識手法のひとつとして,ベクトル量子化(Vector Quantization,VQ)方式を基本とするPitch-Cluster-Maps(PCMs)法を提案した.提案法は,音声に限らず日常で発生する音全般を扱うために,2値化した周波数スペクトルを特徴量に用いる.また信号の時間構造を用いず,即時データに対する音源認識手法であるため,移動ロボットのような,刻々と音響環境が変化する条件で有用である.PCMsモデルの評価実験から生活環境中の200以上の音を認識可能であることを示した.マイクロホンアレイを搭載した車輪型ロボットに提案法を実装し,走行中の分離音に対する認識率の評価を行った.さらに提案法をロボットノイズの低減に応用し,マイクロホンアレイ入力に対する前処理として適用することで,分離音の認識率が向上することを確認した.走行中のロボットによる分離音の認識率は,64[ms]の入力に対し6音源以下で5060[%],1[s]の入力に対し80[%]以上であった.昨年度開発したPitch-Cluster-Maps(PCMs)による物音認識手法の実装例として,実験用住宅での日常音認識を行った.車輪型ロボット搭載用32チャンネルマイクロホンアレイおよび、天井設置型128チャンネルマイクロホンアレイに提案法を実装し,マイクロホンアレイで分離した音の認識を行った.PCMs認識の結果を音声フィルタとして利用し,人の声のみを音声認識器へ入力することで,掃除機やテレビといった雑音がある場合でも,雑音の誤認識を防ぐことが可能である.実際に,うめき声を検出してロボットが近づく,雑音下で音声指示による家電操作を行う,といったデモンストレーションを通して,実環境中でのシステムの有効性を確認した.ロボットが移動中に定位した音源の角度情報を用いた三角測量+RANSACによる短区間音源位置推定に,Pitch-Cluster-Mapsによる音の認識結果を加え,より広範囲での音地図作成を行った.

移動中の各位置で定位した音の追跡に用いる情報として,角度変化だけでなく音の認識結果を加えることで,同時に追跡可能な音源数の増加や,交差する音の追跡を実現しより広範囲での音源位置推定が可能となった.システムの評価実験では10×18[m]の部屋内に11の音源を配置し,車輪型ロボットに搭載した32チャンネルマイクロホンアレイを用いて,「どこで何の音がするか」を示す音源地図作成を行った.平均0.4m/sで移動するロボットから,過去2sec以内の定位データによる結果では,推定位置誤差の平均282mm,認識の正解率は70.7%であった.
VR技術を利用したプラズマ可視化プログラムの開発

CAVE方式(あるいは没入ディスプレイ方式)のVR(Virtual Reality)装置を利用して、科学研究データを立体的に表示・解析するための汎用プログラムVFIVEを開発した。VFIVEは3次元の場のデータを、そのデータの中に「入り込んで」解析することを目的としており、特に磁気流体力学(MHD)シミュレーションのデータ解析や、流体力学のシミュレーションデータ解析に威力を発揮する。VFIVEプログラムのユーザは、指定されたフォーマットでデータを用意すれば、コマンド一つを打ち込むだけで、すぐにそのデータを立体的・対話的に解析することが出来る。VFIVEはC++言語で書かれており、その内部で利用する基礎ライブラリはCAVEライブラリとOpenGLだけである。そのため核融合研のVR装置CompleXcopeだけでなく、その他のCAVE方式VRシステムに容易に移植可能である。現在のVFIVEが持つ主な機能は以下の通りである。(1)3次元ベクトル場の力線(磁力線や流線など)の対話的な追跡と表示。(2)3次元ベクトル場の立体矢印の表示。(3)手の位置からのテストパーティクルの放出。(4)3次元スカラー場の等値面の表示。(5)スカラー場の断面分布の表示。本年度は、このVFIVEの第1版を完成させた。また、日本語マニュアルの整備も行った。この日本語マニュアルは研究代表者のWebサイトで公開している。これまでに、このVFIVEプログラムは、(a)乱流シミュレーションの解析、(b)太陽コロナ磁場の解析、(c)MHDダイナモシミュレーションデータの解析、等に実際に応用した。
表皮バリアの形成・維持機構の解明とバリア構築に関わる新規因子の探索

皮膚表皮のバリアをうまく保ちながら、バリアを作っている表皮細胞自身はどうやって新陳代謝して入れ替わっているのでしょうか?我々は、この謎を解く鍵が、ひとつひとつの細胞の形にあることが初めて明らかにしました。皮膚の細胞は、ケルビン14面体と呼ばれる、空間を効率良く埋めるために最適な多面体が平たくなった形をしていました。この形をうまく利用して、規則的な順序で細胞が入れ替わることにより、丈夫な皮膚バリアを保ったまま、次々と古い細胞を垢として捨て、常に瑞々しい皮膚を保つことができることが、詳細な顕微鏡観察とコンピュータシミュレーションにより初めて明らかになりました。1.表皮タイトジャンクション(TJ)バリアの恒常性維持機構の解析表皮細胞は、分化して基底層を離れた後、有棘層、顆粒層を経て角化脱核して角質層を形成する。この分化期間の間に、表皮細胞は顆粒層のSG2層において、ただ1回のみTJを形成する。顆粒層において表皮細胞は、細胞膜極性を持たずTJを持たないSG3細胞から、細胞膜極性を示しTJバリアを持つSG2細胞、さらに細胞膜極性とTJを失ったSG1細胞へと分化する。この分化過程におけるTJバリアの挙動を観察するために、ZO-1-Venus融合蛋白質を顆粒層特異的に発現するマウスの耳皮膚を、二光子顕微鏡を用いて3次元タイムラプス観察を行い、固定標本の詳細な3次元観察と対応させることにより、TJバリアのターンオーバー機構を解析した。単層上皮では、脱落する細胞のまわりを多数の細胞が取り囲んで押し上げ、その細胞の周囲の環状のTJを縮小させていき、最終的にまわりの細胞同士で新たなTJバリアを形成し、古い細胞を排除・脱落させることによりTJバリアの恒常性を保つ。今年度、我々は、まるで潜水艦のハッチや宇宙船のエアロックのように、内側の扉が閉じてから(内側に新しいTJが作られてから)外側の扉が開く(外側のTJが失われる)、これまで想定されていなかった全く新しい恒常性維持機構が角化重層上皮には存在することを見出した。2.顆粒層の各分化段階特異的な細胞の単離方法の確立ETAの皮下注によりTJバリアの内側でのみデスモソームを消化するとともに蛋白ビオチン化試薬を皮下注することにより、SG2細胞のみがビオチンラベルされた、SG1/SG2細胞からなるETAシートを得た。ここからSG1、SG2それぞれの細胞を特異的に高純度で単離し、マイクロアレイ法を用いた遺伝子発現解析を行い、SG1/SG2に特異的に発現する複数の新規バリア関連候補蛋白を得た。表皮では角質層と顆粒層タイトジャンクション(TJ)が物理的バリアを構築する一方、ランゲルハンス細胞がTJバリア外から抗原取得を行うことを我々は明らかにし、外界と生体を区切るバリアとしての皮膚の本質的な役割の解明に大きく貢献してきた。TJバリアの恒常性を維持することは、正常な角質バリアの形成に不可欠であり、すなわち我々の身体を外界から守る上で必須である。しかし、常にターンオーバーする重層上皮組織において、ただ1層しか存在しないTJバリアの恒常性をどのように維持するのか、その分子メカニズムは不明のまま残されている。本研究では、In vivoライブイメージング技術によりZO-1/venusトランスジェニックマウスの皮膚の観察をおこない、ダイナミックに形成・消失を繰り返す動的なバリアとして、表皮TJバリアの動態メカニズムを解析した。まず、重層上皮において細胞がTJバリアを通過する際には、TJのハニカム模様において、ひとつひとつのTJの六角形の内側に、新しいTJの六角形が出現し(その結果、二重の六角形が出現し)、その後、古い外側の六角形が消失することにより、細胞が1つずつTJバリアの内側から外側へと、TJバリアの恒常性を保ったまま移動することを明らかにした。次に、この細胞の移動を可能にする表皮の構造がどのようなものであるかを解析した。驚くべきことに、重層上皮シートである表皮において、TJを形成する細胞の基本的な形は、これまでに考えられてきた六角柱ではなく、ケルビン14面体であった。さらに、ケルビン14面体の積み重ね構造として表皮を捉えると、TJバリアの恒常性のみならず、細胞間接着を保ち物理的な頑丈さを保ったまま、表皮細胞をターンオーバーさせるメカニズムが明らかとなった。1.表皮TJバリアの恒常性維持機構の解析ZO-1/venusトランスジェニックマウスの耳皮膚のライブイメージング解析を行った。その結果、重層上皮において細胞がTJバリアを通過する際には、TJのハニカム模様において、ひとつひとつのTJの六角形の内側に、新しいTJの六角形が出現し(その結果、二重の六角形が出現し)、その後、古い外側の六角形が消失することにより、細胞が1つずつTJバリアの内側から外側へと、TJバリアの恒常性を保ったまま移動することが明らかとなった。さらに、その二重のTJが形成されるメカニズムとして、3つの細胞が触れ合うトリセルラー接着構造に形成されるトリセルラーTJを利用した、巧妙な仕組みがあることを見出した。2.顆粒層の各分化段階特異的な細胞の単離方法の確立顆粒層の細胞を単離する方法を確立した。その結果、TJを形成するSG2層の細胞を特異的に単離して固定・染色し、観察することが可能となった。

特筆すべきことに、SG2層の細胞は、単離しても単層上皮細胞のように球形にまるまらず、平板な形状を保っていた。これはケラチン細胞骨格により、角化前に細胞の形状が固定されていることを意味している。さらに、その基本三次元形状は、六角柱ではなく、縦方向に押しつぶされたケルビンの14面体であった。このことから、表皮顆粒層の立体形状が、六角柱の積み重ねではなく、ケルビン14面体の積み重ねであると考えられる。さらに、この新しい表皮構造の概念を導入すると、これまでの六角柱モデルでは説明がつかなかった表皮TJの立体形状やTJハニカムの各六角形の大きさの規則性が説明可能となった。皮膚の最も大切な機能は、私たちの体の表面を覆い、外の世界から私たちの体を守るバリアとしての機能です。皮膚のバリア機能は主に、皮膚の表面を覆う細胞の層(表皮)が担っています。表皮の一番外側にある角層は、死んで角化した細胞(角質細胞)が、何層にも重なり強固に結合することによって作られた頑丈なバリアです。角層の内側にはもう一つ、バリアの働きをする構造があります。細胞と細胞の間をぴったりと隙間なくくっつける、密着結合(タイトジャンクション)と呼ばれる構造です。表皮の細胞は常に新陳代謝しており、日々新しい細胞が生まれ、古い細胞はどんどん垢となって、はがれ落ちていきます。どうやってバリアを保ったまま、バリア本体を作っている細胞を入れ換えることができるのか?その仕組みは長い間ずっと不明でした。我々は、マウスの耳の皮膚とその細胞をコンフォーカル顕微鏡で観察することで、タイトジャンクションバリアを作っている細胞が、“ケルビンの14面体"と呼ばれる特殊な多面体を平たくした形をしており、お互いに組み合わさって規則正しい構造をなすことを発見しました。さらに、皮膚のタイトジャンクションが光るマウスをツーフォトン顕微鏡で観察することにより、細胞が決まった順番通りに、規則正しく入れ替わって行くことを明らかにしました。1つ1つの細胞が入れ替わる時、その細胞の周りでだけタイトジャンクションは一時的に2重になり、新しいバリアができてから古いバリアが消えることで、細胞が入れ替わってもバリアは破れない仕組みになっていました。さらに、規則正しく立体的に配列した細胞たちの間で、お互いの位置とタイミングを合わせながら順序立って細胞が入れ替わることで、皮膚全体のバリアが保たれていることを示しました。皮膚のバリアを保ちながら細胞を新陳代謝させることを可能にする鍵は、ひとつひとつの細胞の形にあることが初めてわかりました。皮膚表皮のバリアをうまく保ちながら、バリアを作っている表皮細胞自身はどうやって新陳代謝して入れ替わっているのでしょうか?我々は、この謎を解く鍵が、ひとつひとつの細胞の形にあることが初めて明らかにしました。皮膚の細胞は、ケルビン14面体と呼ばれる、空間を効率良く埋めるために最適な多面体が平たくなった形をしていました。この形をうまく利用して、規則的な順序で細胞が入れ替わることにより、丈夫な皮膚バリアを保ったまま、次々と古い細胞を垢として捨て、常に瑞々しい皮膚を保つことができることが、詳細な顕微鏡観察とコンピュータシミュレーションにより初めて明らかになりました。1.表皮タイトジャンクション(TJ)バリアの恒常性維持機構の解析平成26年度の目標としていた、1)ZO-1-Venus融合蛋白質を顆粒層特異的に発現するマウスの耳皮膚を用いた3次元タイムラプス観察による表皮TJバリアのターンオーバーのin vivoイメージング、2)
低線量放射線被ばくによる健康不安対策に対する提案

本研究では,ラドン吸入による抗酸化機能の亢進を定量評価するため,ラドン吸入とアスコルビン酸投与による抑制の程度を比較・検討した。スナネズミに,ラドン(2000Bq/m3)吸入を24時間施した。他方,100,300,500 mg/kg体重のアスコルビン酸を腹腔内投与した。その後,定法に従い一過性脳虚血を負荷した。その結果,一過性脳虚血に伴う海馬CA1領域の細胞の損傷は,ラドン吸入やアスコルビン酸投与により抑制した。ラドン吸入による抑制効果は500mg/kg体重アスコルビン酸投与によるそれに相当することもわかった。これは,ラドン吸入による抗酸化機能の亢進が関与していることも示唆できた。本研究課題では,低線量放射線による健康不安を払拭するための提案として,ネガティブなイメージの少ないラドン温泉効果と生活に密着したビタミンCや生活習慣病などと関連付けることにより,公衆の放射線の健康影響に対するイメージの改善のための一助とすることである。平成25年度では,ラドン吸入によるスナネズミにおける一過性脳虚血に伴う細胞障害の抑制効果の有無について検討した。すなわち,8週齢・雌のスナネズミ(MGS/Sea)に2000Bq/m3ラドン(222Rn)または疑似(Sham;対照)の吸入を各々24時間させた。吸入直後にペントバルビタール(50mg/kg体重)を腹腔内投与し,両側の総頸動脈をクリップで10分間血流を遮断した。その4日後に安楽死させ脳を摘出し試料に供した。その結果,1) Sham(擬似)手術またはラドン吸入のみは,海馬CA1の細胞に影響はなかった。2)ヘマトキシリンーエオジン(HE)染色・クリューバー・バレラ(KB)染色いずれの結果も一過性脳虚血によりCA1の損傷細胞数は対照に比べ有意に増加したことから,一過性脳虚血モデルの作製が確認できた。3)HE染色により,一過性脳虚血をした場合,CA1の損傷細胞数は事前にラドンを吸入した方が吸入しないのに比べ有意に減少することがわかった。4) KB染色で同様の結果が得られたことから,ラドン吸入はCA1の神経細胞の損傷を抑制することもわかった。以上の所見などにより,ラドン吸入はスナネズミの一過性脳虚血に伴う海馬CA1の細胞損傷を抑制することを示すことができた。本研究結果は,2件の関連学会(文部科学省復興対策特別人材育成事業「被ばくの瞬間から生涯」を見渡す放射線生物・医学の学際教育,日本原子力学会2014年春の年会で発表し,さらに,英語論文として投稿中である。平成25年度では,ラドン吸入によるスナネズミにおける一過性脳虚血に伴う細胞障害の抑制効果の有無について検討したが,平成26年度ではアスコルビン酸(ビタミンC)投与による一過性脳虚血に伴う細胞障害の抑制効果とラドン吸入による抑制効果を比較検討した。すなわち,スナネズミ(MGS/Sea,8週齢)に,ラドン(2000Bq/m3)吸入を24時間またはアスコルビン酸(ビタミンC;100,300,500mg/kg体重)をそれぞれ腹腔内投与した。吸入または投与の直後に一過性脳虚血モデルを作製し,その4日後に安楽死させ,脳と血清を摘出し試料に供した。ラドン吸入またはビタミンC投与による一過性脳虚血に対するCA1領域の細胞の損傷の程度を比較した。その結果,ラドン吸入による抑制効果は500mg/kg体重ビタミンC投与によるそれよりも大きいこともわかった。以上の所見などにより,ラドン吸入による一過性脳虚血の抑制効果にはSOD活性の増加が関与し,その抗酸化力はビタミンC投与よりも大きいことが示唆できた。しかしながら,個体により細胞死の数のバラつきが大きく,再現実験が必要である。本研究の成果は,国内外4件の関連学会で発表し,さらに,平成25年度の成果はInflammationに掲載された。平成26年度では,一過性脳虚血に伴うスナネズミ脳神経細胞障害に対するラドン吸入とアスコルビン酸投与による抑制効果に関して比較検討をした。しかし,検体数が少なく,細胞障害の程度のばらつきが大きかったことから,追加の実験が必要であった。平成27年度では,一過性脳虚血に伴うスナネズミ脳神経細胞障害に対するラドン吸入とアスコルビン酸投与による抑制効果に関して詳細に検討をした。すなわち,スナネズミに,ラドン(2000Bq/m3)吸入またはsham (対照)吸入を各々24時間施した。吸入または投与の直後に,両側の総頚動脈(CCA)を小血管クリップで10分間閉塞することにより一過性脳虚血を負荷した。その結果,一過性脳虚血に伴う細胞障害の悪化はラドン吸入,アスコルビン酸摂取により共に改善されたが,ラドン吸入による改善効果はアスコルビン酸500 mg/kg体重投与のそれと同程度であった。また,ラドン吸入のみの場合,脳中のスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)活性や総グルタチオン(t-GSH)量が増加し,アスコルビン酸投与のみの場合においても同様に増加した。以上の所見などより,本実験条件下では,一過性脳虚血に伴う神経細胞障害の抑制効果は500mg/kg体重のアスコルビン酸投与のそれに相当することが示唆できた。

本研究では,ラドン吸入による抗酸化機能の亢進を定量評価するため,ラドン吸入とアスコルビン酸投与による抑制の程度を比較・検討した。スナネズミに,ラドン(2000Bq/m3)吸入を24時間施した。他方,100,300,500 mg/kg体重のアスコルビン酸を腹腔内投与した。その後,定法に従い一過性脳虚血を負荷した。その結果,一過性脳虚血に伴う海馬CA1領域の細胞の損傷は,ラドン吸入やアスコルビン酸投与により抑制した。ラドン吸入による抑制効果は500mg/kg体重アスコルビン酸投与によるそれに相当することもわかった。これは,ラドン吸入による抗酸化機能の亢進が関与していることも示唆できた。自家繁殖でかつ繁殖能力の低いスナネズミが想定よりも多く繁殖したため,実験に必要な数を確保できた。しかし,モデル動物作製の再現性が悪く結果が明白ではなかったため,平成27年度に再現実験を実施することで当初の目標が達成できると考えられる。放射線健康科学平成27年度はモデル動物作製の再現実験をし,データの信頼性を高める。すなわち,スナネズミラドン(2000Bq/m3)吸入を24時間またはアスコルビン酸投与した後に一過性脳虚血モデルを作製し,一過性脳虚血に対するCA1領域の細胞の損傷の程度を比較する。さらに,ラドン吸入による一過性脳虚血に対するCA1領域の細胞の損傷の抑制効果が抗酸化機能の亢進であることを再度確認するとともに,ビタミンC投与による脳中の抗酸化作用の変化についても検討することで,健康不安を払拭するため放射能温泉でありながらネガティブなイメージの少ないラドン温泉効果を生活に密着したビタミンの効果などと関連づけることにより,放射線の健康影響に対するイメージの改善を図れるようデータをまとめる。また,本研究の目的が「低線量放射線による健康不安を払拭するための提案」であることから,平成27年度も本研究の成果を広くアピールする必要があるため,国内外の学会発表や論文投稿を通して研究成果を報告するとともに,低線量放射線の健康効果について,学術雑誌に解説や総説を積極的に投稿する。本実験では一過性脳虚血モデル作製に適したスナネズミを材料としたが,本系統のスナネズミは生産中止になったため,岡山大学自然生命科学研究支援センター動物資源部門にて自家繁殖により動物の供給を行っている。不妊率が高く出産数が少ないため当初から動物の供給数を少なめに想定していたが,予想以上の動物数が得られたことが当初の計画以上に進展している主な理由である。また,ラドン吸入はマウスの抗酸化機能を亢進させることは明らかになっていたが動物種の異なるスナネズミでの報告はなかった。しかし,スナネズミにおいても同様にラドン吸入により抗酸化機能が亢進したことも確認できた。また,文献調査により,ラドン吸入により抗酸化機能が亢進すれば一過性脳虚血による障害が抑制されることを想定していたが,本研究の結果,ラドン吸入により一過性脳虚血による障害が抑制されることも明らかとなり,想定通りの結果が得られたことも当初の計画以上に進展している理由である。平成27年3月分のスナネズミの飼育料が想定より高く,予算が不足したため支払いができず,別途の予算で支払いをした。そのため,次年度使用額が生じた。平成25年度での研究成果から,ラドン吸入はスナネズミの脳中の抗酸化機能を亢進させることがわかった。これはビタミンCなどの抗酸化物質と同様の効果であり,その抗酸化作用で一過性脳虚血による障害を抑制することが明らかとなった。
低次元多様体の基本群の高次表現と幾何構造

本研究は低次元多様体(2次元の曲面,3次元多様体)を幾何構造の観点から研究することを目的とする。幾何構造は多様体の基本群の線型表現と密接に関連する。従来は2次元表現(SL(2,R)とSL(2,C)への表現)がよく調べられていたが,近年は高次の表現の研究が活発に行われている。その他,9月16日から19日に名古屋大学で行われたRigidity Schoolと,2月9日から2月11日に早稲田大学で行われた「リーマン面・不連続群論」研究集会に参加した。「研究実績の概要」で述べた結果は,それを用いて分岐被覆を構成することで離散表現を構成するために行ったものであったが,そこまでの進展がなかった。一般に3次元多様体の理想4面体分割を用いて基本群の高次表現を調べる方法がすでに与えられているが,その方向への研究まで至らなかった。「現在までの進捗状況」において当初の想定した結果が得られていないと述べたが,方策は自然なものであり引き続き調べていきたい。例年8月から9月に海外の研究集会に参加することが多いが,今年度はその時期に予定が入っていたため参加する機会がなく,旅費の支出が少なかった。残額は2019年度に主に旅費で使用する予定である。
セントロメアタンパク質は細胞の老化を制御する新たな因子となりうるか?

セントロメアのタンパク質は、細胞が増殖するときに、染色体を均等分配するという重要な役割を担っている。分裂寿命を持つヒト正常細胞を用いて、キネトコア構造の形成と機能に必須のセントロメアのタンパク質であるCENP-Aの低下がp53依存性に老化を導くこと、老化した細胞では、CENP-Aの低下とそれに伴うセントロメアのヘテロクロマチン構造の促進(セントロメアの不活性化)が生じることを明らかにした。本研究の成果は、染色体の機能ドメインであるキネトコアが、テロメア同様に老化を制御する要因となりうることを示している。平成20年度に実施した研究の成果を以下に示す。1.老化したヒト初代培養細胞におけるセントロメアタンパク質の動態ウエスタンブロット解析により、ヒストンH3バリアントであるCENP-Aやスピンドルチェックポイントタンパク質Mad2、BubR1やキネトコアタンパク質Hec1の低下、セントロメアタンパク質CENP-Bやヘテロクロマチンタンパク質HP1の増加など、多くのタンパク質の量的な変化が老化した細胞で認められた。CENP-Aの低下とCENP-Bの増加は免疫染色でも同様に観察された。染色パターンの変化から老化した細胞ではセントロメア構造に質的な変化が起きていることが推測された。2. shRNAによりセントロメアタンパク質を低下させたヒト初代培養細胞の表現型セントロメアという特殊な染色体構造に局在するCENP-Aタンパク質の減少が、老化した細胞で観察された。また人為的にCENP-Aタンパク質を低下させると細胞が老化することがわかった。多くの生物種においてCENP-Aの低下は染色体分配の異常につながることが示されている。本研究は老化に伴う変化や疾患にセントロメアタンパク質の異常が関与することを示唆し、この分子メカニズムを解明することは意義のある研究であると考える。平成21年度は、セントロメアタンパク質のなかで、CENP-Aの動態に着目して研究を遂行した。CENP-Aタンパク質の減少が、どのようなシグナル経路で細胞を老化させるのか、またそのメカニズムの生理的な意義について研究を進めた。以下に研究の成果を示す。ヒトの正常細胞とがん細胞を用いて、CENP-Aタンパク質を消失させ、増殖に対する効果を比較した。正常細胞は速やかに増殖を停止するが、がん細胞は増殖を続けることがわかった。正常細胞の増殖停止は細胞の老化であること、この老化の誘導は、p53に依存することを明らかにした。2.CENP-Aノックダウンによる細胞老化とp53の役割についてCENP-Aの低下によるp53依存性の細胞老化の生理的な意義を調べるために、生細胞観察を行った。p53の不活性化により、CENP-A低下による増殖停止が解除された結果、多くの細胞が染色体分配異常を示すことがわかった。具体的には、染色体が赤道面に揃わず分裂前中期の延長する、赤道面に揃わないまま染色体が分配される結果、微小核を形成する細胞が多く認められた。これらの研究成果から、ヒト正常細胞には、染色体の均等分配を保障するセントロメア・キネトコアの異常に対して、速やかに増殖を停止させる機構が存在することが示唆された。また、セントロメアタンパク質の異常によって引き起こされる老化は、染色体異常を伴う細胞の発生と増殖を抑制する。本研究は癌抑制の観点からも重要かつ意義のある研究である。セントロメアのタンパク質は、分裂細胞では、染色体を均等分配するという重要な役割を担っている。本研究は、老化でその役割がほとんど解析されていないセントロメアのタンパク質が、ヒト正常細胞(分裂寿命を持つ)では、細胞の増殖の停止に関与することを検証し、細胞の老化におけるセントロメアタンパク質の新たな役割を明らかにする事を目的としている。平成20年度、21年度はCENP-Aというキネトコア構造の形成と機能に必須のタンパク質について、その低下が老化を誘導する事を見出した。平成22年度は、CENP-Aの低下がp53依存性に増殖停止に導くこと、また他の老化モデル細胞では、実際にCENP-Aの低下とそれに伴うセントロメアのヘテロクロマチン構造の促進(セントロメアの不活性化)が生じることを明らかにし、Mol Cell Biolや学会で研究成果を発表した。これらの成果は、テロメアと同様にセントロメアタンパク質が、老化を制御する因子となりうることを示している。平成22年度は所属先の変更があったが、当初の計画通り、様々な老化モデル細胞から、ゲノムDNAとRNAを抽出し、DNAのメチル化やヒストン修飾等のエピジェネティックな制御について解析を進めた。発現解析と合わせてゲノムワイドなエピジェネティック環境に注目し、セントロメアタンパク質の低下や機能不全によって誘導される老化や、複製老化、活性化がん遺伝子で誘導される老化の分子メカニズムの一端を、発表する予定である。
腎結石防御における熱受容体（ＴＲＰＶ１）作動薬の抗アポトーシス効果とその臨床応用

本研究は熱受容体(TRPV1)作動薬の腎結石形成防御を確認し、その反応経路にあるCGRPの役割を解明する計画であった。研究の初期段階で、TRPV作動薬カプサイシン投与による動物死が相次いだため、同活性を持つ緑茶・ルイボス茶を投与した。その結果、尿中結晶数の減少傾向を認めたが、結石数・尿生化学に有意な変化を認めなかった。さらにCGRPノックアウトマウスも繁殖に問題が生じ、ミトコンドリア膜物質cyclophilin D(CpD)に注目し、この遺伝子のノックアウトマウス(KO)を導入・繁殖した。このKOは、野生型と比較して、結石形成量が少なく、関連遺伝子発現とミトコンドリア崩壊像の減少を認めた。[1]腎結石形成モデル動物に対するTRPV1作動薬の投与と結石予防効果の検証[2]遺伝子改変マウスを用いた検討CGRPノックアウトマウスに系統維持に困難な事象が発生したため、同様に酸化ストレスによるミトコンドリア傷害の要因となるmPTP(mitochondrial permeability transitional pore)の構成要素であるcyclophilin Dに着目した。ラットによる解析では、cyclophilin Dの抑制作用を持つcyclosporine A, NIM-811を用いて結石が抑制できることを証明した。本年、このcyclophilin Dノックアウトマウスを導入し、繁殖/系統維持することに成功した。今後、このマウスにおける腎結石形成研究を行うことにより、ミトコンドリア保護による結石形成の防御の可能性を追求する。1.腎結石形成モデル動物に対するTRPV1作動薬の投与と結石予防効果の検証8週齢雄マウス(C57BL/6J)に対し、シュウ酸前駆物質であるグリオキシル酸を連日腹腔内投与を行い、腎結石モデルを作成した。腎組織は、(1)結石形成・免疫組織化学用に4%パラフォルムアルデヒド固定よりパラフィン包埋ブロックの作成、(2)RNA抽出用にRNAlater保存後、-80°C保存、(3)蛋白抽出用に組織を液体窒素から-80°C保存(4)透過型電子顕微鏡観察用に一部のマウスにおいて、PBS希釈2.5%グルタールアルデヒドをPERISRAR Pumpを用いて左心室から環流固定し腎を採取した。パラフィンブロックより4μm切片を作成し、偏光顕微鏡による腎結晶の形態学的観察を行い、腎シュウ酸カルシウム結石が皮髄境界部を中心に扇形に形成されているのを確認した。続いて結石形成像をscanし、画像解析ソフトImage Pro Plusによって、結石形成量を定量化する手法を確立した。また組織採取24時間前より、各マウスは代謝ケージ内で飼育し、24時間蓄尿を採取し、保存した。本年はTRPV1作動薬の投与には至らなかった。2.TRPV1作動薬投与による関連遺伝子の発現変化と腎尿細管細胞の微細構造変化の観察1.で採取したRNAlater保存の腎組織よりtotal RNA抽出およびcDNA合成を行い、定量PCR (TaqMan assay)によって腎結石関連遺伝子オステオポンチン(OPN),酸化ストレス関連遺伝子superoxide dismutase (SOD),ミトコンドリア傷害によるアポトーシス関連遺伝子tumor necrosis factor (TNF), Caspase 3の発現解析を行った。[1]腎結石形成モデル動物に対するTRPV1作動薬の投与と結石予防効果の検証[2]遺伝子改変マウスを用いた検討CGRPノックアウトマウスに系統維持に困難な事象が発生したため、同様に酸化ストレスによるミトコンドリア傷害の要因となるmPTP(mitochondrial permeability transitional pore)の構成要素であるcyclophilin Dに着目し、cyclophilin Dの抑制作用を持つcyclosporine A, NIM-811を用いて結石が抑制できることを証明したことを報告した。昨年、このcyclophilin Dノックアウトマウス(CpD-/-)に対する腎結石形成研究を行い、CpD-/-はCpD+/+と比較して、結石形成が少ないことが示された。また電子顕微鏡による観察でも、CpD-/-でミトコンドリアの崩壊像はCpD+/+と比較して軽度であった。現在この結果を論文化中です。医歯薬学[1]腎結石形成モデル動物に対するTRPV1作動薬の投与と結石予防効果の検証[2]遺伝子改変マウスを用いた検討またCGRPノックアウトマウスの系統維持にも問題が生じたため、ミトコンドリア傷害に基づいた尿路結石形成過程を評価するため、他系統のノックアウトマウスを導入するのに時間がかかった。マウスへのシュウ酸カルシウム結晶形成と定量方法を確立できた。現在順次検体を保存し、次への検討へ移る。[1]腎結石形成モデル動物に対するTRPV1作動薬の投与と結石予防効果の検証

[2]遺伝子改変マウスを用いた検討cyclophilinDノックアウトマウスを導入し、繁殖/系統維持することに成功した。今後、このマウスにおける腎結石形成研究を行うことにより、ミトコンドリア保護による結石形成の防御の可能性を追求する。具体的には、尿路結石モデルマウスの手法に準じ、グリオキシル酸の腹腔内投与を実施し、結石の形成を経時的に観察する。併行して、前研究で観察された結石関連因子について、発現を定量PCR,免疫染色によって観察する。1.腎結石形成モデル動物に対するTRPV1作動薬の投与と結石予防効果の検証マウス結石モデルの結石定量化、遺伝子検索プロトコールがほぼ確立したため、TRPV1作動薬の投与を行う。TRPV1作動薬としては、8-methyl-N-vanillyl-6-nonenamide (Capsicine; Cp)を用い、0.1mg/kg連日皮下注射と0.3mg/kg連日皮下注射を予定しているが、脂肪マウスが多い場合や効果が不十分な場合は、投与量の変更も考慮する。採取した腎切片から結石形成量を定量化し、群間における結石形成量をMann-Whitney Utestにて有意差検定を行う。回収尿から、尿量・pHを測定すると共に、結石関連無機物質である尿中カルシウム、リン、マグネシウム、尿酸、シュウ酸、クエン酸を測定する。2.TRPV1作動薬投与による関連遺伝子の発現変化と腎尿細管細胞の微細構造変化の観察1.で採取したRNAlater保存の腎組織よりtotal RNA抽出およびcDNA合成を行い、定量PCR (TaqMan assay)によってOPN, SOD, TNF, Caspase 3、およびTRPV1シグナル経路上の関連因子であるカルシトニン遺伝子関連蛋白(CGRP)およびInsulin like growthfactor-1 (IGF-1)の発現定量を行う。凍結組織より、同遺伝子のWestern Blottingを行う。さらに免疫染色によって同遺伝子の発現局在を観察する。一方、透過型電子顕微鏡によって細胞傷害で生じるミトコンドリアを含めた細胞内オルガネラの構造変化を観察することによって、抗アポトーシス効果を確認する。マウス結石モデルの結石定量化、遺伝子検索プロトコールがほぼ確立したため、TRPV1作動薬の投与を行い、実際のデータ比較に入る。その際の検体保存試薬(4%PFA, RNA-later)、パラフィン切片作成料(外注)、RNA・蛋白抽出試薬が必要となる。また関連遺伝子発現定量のため、OPN, SOD, TNF, Caspase 3、CGRP, IGF-1に関するTaqManプローブと抗体が必要である。また透過型電子顕微鏡の組織準備のため、準備試薬以外にダイヤモンドカッターなどの消耗品が必要となる予定である。