hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
破骨前駆細胞活性化機構解析による生体吸収制御可能な医療用セラミックの開発

今後は、得られたデータをまとめて、学会発表や論文投稿に繋げていきたいと考えている。当初予定していた研究実施計画については、ほぼ予定通り完了しており、年度内の到達目標は、ほぼ達成していると考えられるため。平成24年度に得られた結果を基にして、継続して下記の研究を行う予定である。(1)阻害剤によるシグナル伝達経路を特定する。平成24年度に行った遺伝子発現量の網羅的解析、および活性化されたタンパク質の網羅的発現解析により同定された結果をもとに、HHAディスク上での破骨細胞の培養により活性化され、破骨細胞内RANKLシグナルを促進し、骨吸収を促進すると考えられるシグナル伝達経路を特定する。特にHHAとSHAでは、Ca/P比やアスペクト比が異なることに着目し、1溶出イオン由来シグナル(例:Caイオン流入等)、2接着斑由来シグナル(例:RhoやpaxillinによるLIMKシグナル等)のいずれかに差があると仮定し、1および2に由来するシグナルの抽出に注力する。(2)特定されたシグナル伝達経路と溶出イオンや細胞接着との関係の検討し、平成24年度の実験により特定されたシグナル経路について、イオン溶出由来シグナルまたは接着斑由来シグナル(もしくはその他のシグナル経路)によるRANKLシグナル経路の調節メカニズムを検討する。平成23年度に得られた結果を基にして、継続して下記の研究を行う予定である。(1)SHAディスク上のRAW細胞培養を比較対照としながら、HHAディスク上培養での特徴的なタンパク質分子を2次元電気泳動法により網羅的に抽出する。→得られた結果は、HHA依存性に破骨細胞分化誘導の調節を担うシグナル伝達経路の特定に活用する。(2)阻害剤によるシグナル伝達経路の特定する。平成23年度に行った遺伝子発現量の網羅的解析、および活性化されたタンパク質の網羅的発現解析により同定された結果をもとに、HHAディスク上での破骨細胞の培養により活性化され、破骨細胞内RANKLシグナルを促進し、骨吸収を促進すると考えられるシグナル伝達経路を特定する。特にHHAとSHAでは、Ca/P比やアスペクト比が異なることに着目し、(1)溶出イオン由来シグナル(例:Caイオン流入等)、(2)接着斑由来シグナル(例:RhoやpaxillinによるLIMKシグナル等)のいずれかに差があると仮定し、(1)および(2)に由来するシグナルの抽出に注力する。(3)特定されたシグナル伝達経路と溶出イオンや細胞接着との関係の検討し、平成23年度の実験により特定されたシグナル経路について、イオン溶出由来シグナルまたは接着斑由来シグナル(もしくはその他のシグナル経路)によるRANKLシグナル経路の調節メカニズムを検討する。該当なし細胞学および材料学的検討はすべて東北大学にて実施することが可能である。破骨前駆細胞株RAWとGFP蛍光標記骨芽細胞は当研究室にて保有している。
顎関節症における3-D MRIによる顎動態観察

顎関節の準動態観察を3-D MRI volume scanにて行い、得られた画像データをWorkstationに転送し、独自の顎顎運動解析ソフトにより顎関節症症例の顎動態について解析した。使用MRI機種は1.5-T MRI(SIGNA,advantage ver.4.8)で、3-inch duralsurface coilを使用した。3-D fast GRASSsequenceを用い、至適撮像条件はFOV 15cm,TR/TE/Flip angleは16.5/3.9/30とし、1 NEX,matrixは256x128,バルク厚は42mmで60partition,スライス厚さは0.6mmに設定した。正常ボランティア2例において開閉口運動を5分割し、それぞれの顎位で3-D volume scanを施行し、Workstation上で、関節頭の滑走経路の評価を行った。また、顎関節症症例10例(男性1例、女性9例、平均年齢30歳)において同様の方法で解析した。コンピュータ解析では、関節頭の運動経路とともに、関節頭の水平移動距離、垂直移動距離、関節頭の回転角度について評価した。正常例では、関節頭の運動経路は開口路、閉口路ともに一致した。顎関節症症例における解析結果では、開閉口路の一致しなかった症例は4例に認められた。これらの症例で、関節頭の前方移動量の左右差については、開閉口路の一致した症例と有意差を認めなかったが、垂直距離では有意に増大していた。また、関節頭の回転量については有意差を認めなかった。関節頭の前方滑走による垂直移動の増大は異常顎運動の分析のひとつの要素と考えられた。また、3-Dvolume scanによる関節頭、関節円板の任意の断層面での評価が可能である他、顎運動自動解析による運動経路の分析は従来の顎運動記録装置の分析の上で、補助的診断法と考える。2.臨床的に顎関節症と診断された症例において上記パルス系列を用い一開閉口運動を分割し、両側顎関節の準動態撮像を施行した。得られたvolume imageから矢状断像、冠状断像の再構成画像を作製した。冠状断像は矢状断像よりも空間分解能の劣化を認めたが、関節円板の同定は容易であった。3.顎関節動態解析プログラムを作成し、得られた再構成画像を転送し、分析中であるが、従来の臨床で用いられている顎運動記録装置の結果と同様の傾向を示した。さらに両側顎運動の不均衡は関節円板の位置異常と動態異常が深く関連し、関節円板の位置異常を認めない顎関節症症例において、従来のMRI撮像法では検出困難な関節頭の動態異常が把握された。本法では、関節円板の観察が可能であるため、従来の顎運動解析装置による分析に寄与する補助的診断法として有益と考える。3-D fast GRASSsequenceを用い、至適撮像条件はFOV15cm,TR-TE/Flip angleは16.5/3.9/30とし、1NEX,matrixは256x128バルク厚は42mmで60partition,スライス厚さは0.6mmに設定した。

また、顎関節症症例10例(男性1例、女性9例、平均年齢30歳)において同様の方法で解析した。コンピュータ解析では、関節頭の運動経路とともに、関節頭の水平移動距離、垂直移動距離、関節頭の回転角度について評価した。正常例では、関節頭の運動経路は開口路、閉口路ともに一致した。顎関節症症例における解析結果では、開閉口路の一致しなかった症例は4例に認められた。これらの症例で、関節頭の前方移動量の左右差については、開閉口路の一致した症例と有意差を認めなかったが、垂直距離では有意に増大していた。また、関節頭の回転量については有意差を認めなかった。関節頭の前方滑走による垂直移動の増大は異常顎運動の分析のひとつの要素と考えられた。また、3-Dvolume scanによる関節頭、関節円板の任意の断層面での評価が可能である他、顎運動自動解析による運動経路の分析は従来の顎運動記録装置の分析上で、補助的診断法と考える。
ジフテリア毒素リセプター複合体の解析

ジフテリア毒素リセプター(DTR)複合体構成未知因子の探索これまでのわれわれの研究から、DTRには、その活性を制御する膜蛋白質DRAP27/CD9及び細胞接着分子インテグリンα3β1がアソシエ-トして複合体を形成していることが明らかとなっているが、さらにこの複合体に別の複数の蛋白質が含まれることが、われわれのDTRに対するクロスリンク実験などから示唆されていた。そこで本年度はDTR複合体に含まれる未知の蛋白質の同定とDTR活性発現における機能の解析を目的として研究を開始した。まずDTRと共沈降する蛋白質を特異的に認識するモノクローナル抗体の作製を行なった。DTRを高発現しているサル腎由来Vero細胞の膜分画をマウスに免疫して、その脾臓B細胞からハイブリドーマを作製した。そしてVero細胞のライセ-トをジフテリア毒素(DT)及び抗DT抗体で免疫沈降したときの沈降物を特異的に認識するような抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングを行ない、複数のクローンを得た。これらのなかの一つで1C9-2と名付けたモノクローナル抗体の認識する抗原(分子量約19kDa)は、抗DTR抗体よりもDTを用いた免疫沈降においてのほうが、DTRとの共沈降が強く観察された。抗DTR抗体が複合体を形成していないフリーのものも含む全てのDTRに結合するのに対し、DTがCD9と複合体を構成しているDTRにのみ結合することを考えあわせると、1C9-2抗原もDTR活性に関与する新たな複合体構成因子であることが強く示唆された。現在この分子のcDNAのクローニングを行なっているところである。
軟骨の発育と成長における力学的刺激の役割

結合組織、とくに骨格の発生や成長に対して重力などの機械的な刺激が著明な影響を及ぼすことはよく知られているが、その刺激がどのような機構で骨格に伝えられるのかという点については全く解明されていない。成長軟骨は骨の成長の中心であり、また関節軟骨はクッションの役割を果たす意味で、それぞれ重要である。そこで本試験研究では、我々が独自に開発した「軟骨細胞を遠心管内で培養する高密度浮遊培養系」を利用して成長軟骨細胞および関節軟骨細胞の増殖と分化に対する遠心力負荷の影響を検討した。ウサギ肋軟骨より調製した成長軟骨細胞(RC)をペレット状で浮遊状態で培養すると増殖軟骨細胞から成熟軟骨細胞を経て肥大軟骨細胞へと順次、分化し、初期石灰化現象をin vitroで再現させることができた。しかし、in vivoでも石灰化しない関節軟骨細胞(AC)は成長軟骨細胞と同じ条件で培養しても全く石灰化の段階には到達しなかった。この培養系に遠心力を負荷するとACでは^3HーチミジンのDNAへの取り込みが上昇したが、RCでは殆ど影響がみられなかった。一方、^<35>Sー硫酸のプロテオグリカンへの取り込みは、ACおよびのいずれの場合でも著明に促進された。遠心負荷によるプロテオグリカン合成の促進機講は不明であるが、インドメサシンによってこの取り込みが阻害されないので、少なくとも、この過程にプロスタグランジンが関与するとは考え難い。軟骨細胞はインスリン様成長因子(IGF)をはじめ、線維芽細胞成長因子(FGF)、トランスフォ-ミング成長因子ーβ(TGFβ)やコンドロモジュリン(ChM)・ファミリ-を自ら産生しているので、機械的刺激に対する応答性がこれらの局所因子(オ-ト・マトリクライン因子)を介して発現している可能性が考えられる。以上のような我々の研究結果は遠心負荷のような物理的刺激が直接、軟骨細胞に作用してその増殖や基質産生に影響を及ぼすという証拠を示したものである。骨格の発育に運動や重力が影響することはよく知られているが、細胞レベルでの生体力学的影響については不明な点が多い。そこで本研究では、申請者らが考案した遠心管軟骨細胞培養系を用いて軟骨分化と増殖におよぼす遠心力の影響を検討する。本年度は、生後4週齢のウサギの肋軟骨および関節軟骨から分離した軟骨細胞をそれぞれ別々に遠心管内に播種して、軽く遠心してペレット状にした後、10%血清存在下で培養した。培養10日目に、これらの細胞を、1.3gから27gの遠心力を負荷して、DNA合成およびプロテオグリカン合成に及ぼす影響を検討した。なお遠心力はCO_2インキュベ-タ-内に小型遠心機(ヤマト社製RCー11)を設置し、プロピレン製遠心管を遠心することによって負荷した。「結果」1、培養10日目の成長板軟骨細胞に1.3ー27gの遠心力を負荷すると、DNA合成はほとんど影響されなかった。しかしプロテオグリカン合成は3ー27gの遠心により対照の約2倍に増加した。このプロテオグリカン合成促進作用は遠心する時間に依存していた。2、一方、培養10日目の関節軟骨細胞に3gの遠心力を負荷すると、DNA合成およびプロテオグリカン合成は対照の約2倍に亢進した。DNA合成の促進は、22時間の遠心負荷によって最大に達した。以上の結果より、遠心管軟骨細胞培養系は、軟骨における生体力学的刺激の役割を追求するための良い実験モデルとなることが判明した。

ウサギ関節軟骨細胞培養系に遠心力を負荷するとDNA合成が上昇したが、成長軟骨細胞培養系では、殆ど変化は見られなかった。一方、プロテオグリカン合成は両細胞系とも著明に促進された。このような遠心力の影響がどのようにして軟骨細胞に伝えられるかについては全く解明されていない。しかし軟骨細胞が自ら産生する局所因子を介して発現している可能性が示唆されている。そこで最終年度では、上記の機構を解明する一助として軟骨細胞の増殖・分化制御因子の実体の解明を試みた。すでに我々はウシ胎仔軟骨から、軟骨細胞自身の増殖と分化を促進するペプチド群を精製してこれを軟骨由来因子(Cartilage-derived factor;CDF)と命名した。その後CDFと線維芽細胞成長因子(FGF)を共存させると軟骨細胞のDNA合成が相乗的に促進されることを報告した。今回、我々は2kgのウシ胎仔骨端軟骨より50μgの活性因子を完全精製することに成功し、これをコンドロモジュリン-I(ChM-I)と命名した。ChM-IはSDS-PAGEで分子量が約25kDの幅広いバンドを示すヘパリン親和性の糖蛋白質である。精製したChM-IのN末端28残基とリジル・エンドペプチダ-ゼ消化断片の21残基のアミノ酸配列を基にしてウシ胎仔骨端軟骨λgt10cDNAライブラリ-からChM-I前駆体cDNAをクロ-ニングした。成熟ChM-Iは121個のアミノ酸から成り、N末端から9番目と22番目のThrおよび30番目のAsnに糖鎖が0-グリコシドおよびN-グリコシドとして結合している。成熟ChM-IのN末端側にArg-Glu-Arg-Argのプロセッシング・シグナルが隣接しているので、ChM-I前駆体が膜に組み込まれた後に、成熟ChM-Iがマトリックス中に切り出されるものと思われる。成長軟骨細胞培養系にChM-Iを添加するとDNA合成およびプロテオグリカン合成が促進される。今後はChM-Iのような局所因子が遠心力などの物理的刺激のmediatorとして作用している可能性を追究したい。
作物栽培におけるVA菌根菌の利用に関する比較作物学的研究

本研究では、作物栽培におけるVA菌根菌の有効な利用法の確立を目指し、成育特性の異なる作物数種を用いて種々の作物のリン要求量と感染状況ならびに接種時における効果の有無を比較した。得られた結果は次の通りである。1.マメ科作物は、イネ科作物に比べ、リン要求量が高くより多くのリンを必要とすることが明らかにされた。2.マメ科作物はイネ科作物に比べ全根長が短く、根毛が少なく、長さも短いことが明らかにされた。リンは土壌中での移動性の小さい元素であることから、マメ科作物でリン要求量が高かったのは、根の形態がリン吸収に不利な構造になっているためと考えられた。3.VA菌根菌は、イネ科作物よりマメ科作物で感染しやすいことが明らかにされた。特に、インゲンマメとアズキでは他の作物に比べ極めて高い感染率を示した。4.VA菌根菌の感染は、作物の根から浸出される糖やアミノ酸によって促進させることから、種々の作物の根の全糖とアミノ酸含有量を調べたところ、イネ科作物に比べマメ科作物では糖やアミノ酸の含有量が高いことが明らかにされ、これらの物質の含有量とVA菌根菌感染率との間には正の相関関係が認められた。5.低リン土壌下で種々の作物にVA菌根菌を接種したところ、多くの作物で生育や収量が向上した。菌の接種による生育改善程度はイネ科作物よりマメ科作物のほうが著しかった。これは、マメ科作物の根がリンを吸収しにくい構造をしていることと、VA菌根菌が感染しやすいためと思われた。6.VA菌根菌の接種効果の最も著しかったインゲンマメに種々のVA菌根菌を接種したところGlomus sp.(y)を2400胞子接種すると低リン下においてもリン肥料を十分に与えた時とほぼ同様の子実収量を得ることができた。
酸発酵細菌群の特定と機能解析による都市下水汚泥の効率的な嫌気性消化技術の開発

MAR-FISHとRNA-SIPを嫌気消化汚泥へ適用し、糖、プロピオン酸、酢酸を資化する微生物群をそれぞれ検出、同定した。優占的なグルコース分解菌はActinobacteria門に属する微生物であり、プロピオン酸分解にはSmithella sp.LR、Syntrophobacter、Smithella sp.SRが関与した。酢酸は酢酸資化性メタン生成古細菌であるMethanosaetaおよびSynergistes group 4が利用した。このように嫌気性消化汚泥内にはプロピオン酸分解菌は3種、酢酸分解菌は2種が少なくとも存在することが確認された。続いて酢酸、プロピオン酸分解に着目し、基質濃度がその分解に関与する微生物の群集構造や活性にどのように影響するかについて、基質濃度0.515mMの範囲で定量的に評価を行った。その結果、基質濃度により活性を示す微生物構成が変化した。プロピオン酸に関しては2.55mMで最も構成種が多様であり、低濃度側ではSmithella sp.LRが優占した。酢酸の利用に関しては、低酢酸濃度ではMethanosaetaが優位的であったが、濃度が高くなるとSynergistes group 4が優位となった。Synergistes group 4はMethanosaetaと基質を競合することによりメタン生成効率に影響を与える可能性が示唆された。嫌気性消化汚泥にはプロピオン酸分解および酢酸分解に関与する微生物が複数存在した。各微生物の基質親和性はそれぞれ異なり、その結果、基質濃度の違いにより活躍する微生物種の菌体数および構成が変化したと考えられた。嫌気性消化汚泥内に基質親和性の異なる微生物が共存することにより、基質濃度の変化に対応でき、このことが処理の安定性に繋がるのではないかと考えられた。MAR-FISHのための条件を、ラクトースおよびグルコースからメタン生成までの一連の分解を約40時間の培養で追跡できる培養条件を設定できた。MAR-FISH法には放射性同位体元素で標識された[U-14C]Glucose、[1-14C]Propionate,[1-14C]Acetate,[14C]bicarbonateを用い、回分試験の結果に基づきMAR-FISH法のための培養条件を設定した。さらに、グルコース存在下で[1-14C]Propionateを投与して行った培養系に対しMAR-FISH法を適用した。[1-14C]Propionateの放射能量を20μCi、培養2時間、Microautoradiographyでの露出時間を5日間に設定することにより、顕微鏡観察下においてEUBプローブにより検出された微生物細胞周辺に銀粒子の形成が認められ、プロピオン酸を分解する微生物群を検出できた。プロピオン酸を分解する微生物はいずれも数μm程度の特徴的なクラスターを形成していた。都市下水濃縮汚泥の嫌気性消化槽汚泥の微生物群集および複合基質としてミルクを用いたラボスケールの嫌気性消化リアクター内汚泥の微生物群集(バクテリアおよびアーキア)の解析を行い微生物データベースを構築した。門レベルでは主にFirmicutes, Bacteroidetes, Chloroflexi, δ-Proteobacteriaが多く検出された。ラボスケールリアクターの群集構造は門レベルでは実プラントの消化汚泥と類似する結果であったが、各グループ内の多様性は小さく、より単純化する傾向が見られた。アーキアの群集構造については都市下水嫌気性消化汚泥ではMethanosaeta sp.に近縁な種が解析したクローンの50%を占め、優占種であると考えられた。一方、ラボスケールの消化汚泥ではMethaosaetaとMethanothrixの両者で解析したクローンの約80%を占めた。複合基質としてミルクを用いたことで酢酸経由のメタン生成反応が優占化されたと推察される。また、MAR-FISH法を嫌気性酸醗酵プロセスに適用するために培養から検出までの各種条件(基質濃度、培養時間、トレーサー濃度、バイオマス濃度)を最適化した。最適化した条件に基づきMAR-FISH法を嫌気性酸発酵プロセスに適用し、Syntrophobacterをはじめプロピオン酸酸化細菌を担う微生物群を特異的に検出できた。また、嫌気性消化汚泥内におけるプロピオン酸分解微生物群の多様性は低いことが示唆された。

Synergistes group 4はMethanosaetaと基質を競合することによりメタン生成効率に影響を与える可能性が示唆された。嫌気性消化汚泥にはプロピオン酸分解および酢酸分解に関与する微生物が複数存在した。各微生物の基質親和性はそれぞれ異なり、その結果、基質濃度の違いにより活躍する微生物種の菌体数および構成が変化したと考えられた。嫌気性消化汚泥内に基質親和性の異なる微生物が共存することにより、基質濃度の変化に対応でき、このことが処理の安定性に繋がるのではないかと考えられた。
タウオパチー伝播モデルを用いたアルツハイマー病危険因子の役割の解明

短期間でタウ病理の伝播を観察できるタウオパチーモデルマウスとして利用することを目的として、Tau-CTF過剰発現マウスの作出を試み、2系統において目的遺伝子の導入を確認できた。しかし脳におけるTau-CTF発現を確認した結果、期待した量のTau-CTF発現が認められなかった。今後、全長タウ発現Tg601マウスをベースとして、ゲノム編集によるTau-CTF過剰発現マウスの作製を行う予定である。<タウオパチーモデルマウスにおけるAD危険因子TREM2の役割の検討>野生型マウスおよびTREM2ノックアウトマウスの脳内に不溶性タウを投与することによりタウ伝播モデルを作製した。また、TREM2 R47Hノックインマウスを作製した。今後TREM2の欠損や変異がタウ病変の伝播に与える影響を検討する。<培養細胞モデルを利用したTREM2の役割の検討>タウ蓄積におけるミクログリアおよびTREM2の役割を検討することを目的として、タウ蓄積細胞とミクログリアとの共培養モデルの確立を試みている。SH-SY5Y細胞のタウ蓄積モデルにミクログリア細胞株BV-2を加え共培養を行った結果、SH-SY5Y細胞内の不溶性タウ蓄積が減少した。また、細胞間伝播モデルの作製を目的として、不溶性タウを蓄積させたドナー細胞と、新たにmCherry-タウを過剰発現させたレシピエント細胞との共培養を行った。その結果、ウエスタンブロッティングにより不溶性画分へのmCherry-タウの蓄積が確認されたことから、何らかのメカニズムによりドナー細胞からレシピエント細胞へと不溶性タウが伝播し、新たに不溶性のmCherry-タウが形成されたと考えられる。今後このモデルにミクログリアを共存させることにより、TREM2欠損や変異の影響を検討する予定である。<タウC末端断片発現マウスの作出>代表者らは約24kDaのタウC末端断片が全長のタウと比較して凝集・伝播しやすいことを既に報告している。短期間でタウ病理の伝播を観察できるタウオパチーモデルマウスとして利用することを目的として、タウC末端断片過剰発現マウスの作出を試みた。CaMKIIプロモーター配列を利用して中枢神経特異的にタウC末端断片を発現するコンストラクトDNAを作製し、C57BL/6系統の受精卵にインジェクションを行ったが、初回では目的の仔マウスを得ることが出来なかった。現在再度インジェクション作業を行っている。<ADモデルマウスにおけるAD危険因子TREM2の役割の検討>ADモデル動物である3xTg-ADマウスでは約12ヶ月齢頃にタウの病理が出現する。3xTg-ADマウスとTREM2 KOマウスを交配することによって、ADモデルマウスのタウ病理におけるTREM2の役割の検討を進めている。脳海馬スライスの免疫組織染色の結果、TREM2の欠損によりタウ病理が減弱する傾向が観察された。今後バーンズ迷路による学習記憶試験を行い、TREM2欠損によるタウ病理の減弱が実際に学習記憶機能の改善につながるかどうか検討する。<培養モデルを利用したTREM2の役割の検討>ミクログリアとタウ蓄積培養細胞モデルとの共培養を行うことによってタウ蓄積におけるミクログリアおよびTREM2の役割を検討することを目的として、MACS磁気分離システムおよびセルソーターを用いてマウスの脳からミクログリアを分取し、共培養モデルの確立を試みている。Tau-CTF発現マウスの作出がうまくいっておらず、in vivo伝播モデルの確立に至っていない。インジェクションに用いるDNAの再精製を行い、再度インジェクションを試みている状況である。<タウC末端断片発現マウスの作出>応募者らは約24kDaのタウC末端断片が全長のタウと比較して凝集・伝播しやすいことを既に報告している。CaMKIIプロモーター配列を利用して中枢神経特異的にタウC末端断片を発現するコンストラクトDNAを作製し、C57BL/6系統の受精卵にインジェクションを行った結果、2匹の仔マウスにおいて目的遺伝子の導入を確認できた。現在F2世代まで繁殖しており、今後脳におけるTau-CTF発現を確認する予定である。3xTg-ADマウスとTREM2 KOマウスを交配することによって、ADモデルマウスのタウ病理におけるTREM2の役割の検討を進めているが、病理のばらつきが大きく現時点ではTREM2欠損による影響を見出すことはできていない。そこで、タウオパチーモデルであるPS19マウス、及び不溶性タウの脳内投与によるタウ伝播モデルマウスを導入し、TREM2欠損の影響を検討している。<培養モデルを利用したTREM2の役割の検討>タウ蓄積におけるミクログリアおよびTREM2の役割を検討することを目的として、タウ蓄積培養細胞モデルとミクログリアとの共培養モデルの確立を試みている。ニューロブラストーマ細胞株SH-SY5Y細胞のタウ蓄積モデルにミクログリア細胞株BV-2を加え共培養を行った結果、SH-SY5Y細胞内の不溶性タウ蓄積が減少した。今後、BV-2や初代培養ミクログリアを用いて、不溶性タウの蓄積が減少するメカニズムの解明を行う。

3xTg-ADモデルマウスを用いたTREM2の影響の検討がうまくいっていないため、新たに広く使われているタウオパチーモデルであるPS19と、伝播モデルマウスを導入した。今後TREM2 KOマウスとの交配を進め、タウの病理とその伝播におけるTREM2の影響を検討する。短期間でタウ病理の伝播を観察できるタウオパチーモデルマウスとして利用することを目的として、Tau-CTF過剰発現マウスの作出を試み、2系統において目的遺伝子の導入を確認できた。しかし脳におけるTau-CTF発現を確認した結果、期待した量のTau-CTF発現が認められなかった。今後、全長タウ発現Tg601マウスをベースとして、ゲノム編集によるTau-CTF過剰発現マウスの作製を行う予定である。<タウオパチーモデルマウスにおけるAD危険因子TREM2の役割の検討>野生型マウスおよびTREM2ノックアウトマウスの脳内に不溶性タウを投与することによりタウ伝播モデルを作製した。また、TREM2 R47Hノックインマウスを作製した。今後TREM2の欠損や変異がタウ病変の伝播に与える影響を検討する。<培養細胞モデルを利用したTREM2の役割の検討>タウ蓄積におけるミクログリアおよびTREM2の役割を検討することを目的として、タウ蓄積細胞とミクログリアとの共培養モデルの確立を試みている。SH-SY5Y細胞のタウ蓄積モデルにミクログリア細胞株BV-2を加え共培養を行った結果、SH-SY5Y細胞内の不溶性タウ蓄積が減少した。また、細胞間伝播モデルの作製を目的として、不溶性タウを蓄積させたドナー細胞と、新たにmCherry-タウを過剰発現させたレシピエント細胞との共培養を行った。その結果、ウエスタンブロッティングにより不溶性画分へのmCherry-タウの蓄積が確認されたことから、何らかのメカニズムによりドナー細胞からレシピエント細胞へと不溶性タウが伝播し、新たに不溶性のmCherry-タウが形成されたと考えられる。今後このモデルにミクログリアを共存させることにより、TREM2欠損や変異の影響を検討する予定である。代表者が所属する研究室では以前から自然免疫受容体としてのTREM2についての研究を進めており、タウオパチーにおけるTREM2の役割を解明するに当たって有用な研究資源や知見が蓄積されている。TREM2欠損3xTg-ADマウスの免疫組織学的解析の結果から、タウ病理の進展にTREM2が関与する可能性が考えられたことから、いくつかあるAD危険因子の中から主にTREM2に的を絞って研究を進めていく。今後はタウ病理伝播の動物モデル、細胞モデルを確立し、各モデルを用いてタウの伝播におけるTREM2の役割を検討する。Tau-CTF過剰発現モデルマウス、PS19マウス、不溶性タウ脳内投与による伝播モデルマウス等のin vivoモデル、および培養細胞を用いた不溶性タウ伝播のin vitroモデルを確立しつつある。今後はこれらの実験系を用いて、TREM2欠損や、TREM2 R47
高い交尾競争力をもったウリミバエ大量増殖オスの選抜

1、ウリミバエのメスから発せられる交尾の受容と拒否のキュ-ウリミバエの配偶行動をビデオ撮りし、メスが配偶行動の連鎖の中で交尾を拒否する場合と受容する場合に発するキュ-を調べた。その結果、オスの求愛に対し、メスが1)翅を垂直に立て前方に向ける、2)脚で翅や体を擦る、3)産卵管を突出させる4)方向転換する、のいずれかを行った場合、オスは翅振動による求愛をいつまでも継続させた。これに対し、メスが1)中脚を横に延ばし、2)2本の前脚を前で合わせ、3)翅をたたみ、4)オスと向い合うと、オスはメスにマウントを試みた。2、オスの体サイズと交尾成功翅長を体サイズの指標として、成虫を大型と小型にわけ、両タイプのオスをペア-にし、小型容器(200ml)に入れ、ここに小型メスと大型メスをそれぞれ1匹ずつ入れた。その結果、メスが小型の場合は、小型オスは大型オスよりも有意に高い割合で交尾した。一方、メスが大型の場合は、小型オスは大型オスと同時に交尾した。従って、大量増殖されたウリミバエでは、大型オスよりも小型オスの方が交尾に有利となり、これまで多くの昆虫で得られた結果とは異なった。3、体のサイズの遺伝率親子回帰により、体サイズの遺伝率を求めたところ、0.62を得た。従って、現在行われているウリミバエの大量増殖システムでは、成虫の体サイズのかなりの部分が遺伝的支配を受けていることになり、今後、交尾競争力にとって最適サイズとなるオスを選択することが可能と考えられた。
電子サイクロトロントーラスプラズマにおける荷電分離電流の研究

電子サイクロトロントーラスプラズマの平衡形成の主要素である荷電分離電流の形成機構をLATE球状トカマクにおいて調べた。トロイダル磁場中のイオン及び電子は、磁場の勾配および湾曲ドリフトによりそれぞれ上方向および下方向にドリフトする。真空容器が導体である場合、容器上部および下部において、同じ大きさの電流が流入および流出することによって真空容器導体を経た電流循環が形成される。LATE装置において、半径方向に並べた12分割電極を容器上部および下部に設置し、この垂直方向荷電分離電流の径方向分布を初めて計測した。その結果、上部にイオン、下部に電子が流入しそれらの分布が同じであることが分かり、さらにこの分布がプラズマ中の2pe/RB.分布とほぼ一致することを明らかにした。電子サイクロトロントーラスプラズマにおいて、その平衡形成の主要素である荷電分離電流の形成機構を検証するための計測装置を設計・制作してLATE球状トカマク装置に設置し、計測を開始した。(1)荷電分離による垂直方向電流(荷電分離電流)は真空容器上部へイオン電流、下部へ電子電流が流れることで形成される。これらの大半径(R)方向分布を計測するため、真空容器内に上部イオンコレクタ、上部リミタ、下部リミタ(すべてR方向に12分割)を設置した。真空容器上部へ流れ込む電子を上部リミタにより遮り、上部コレクタでイオン電流を計測する構造とした。上部コレクタは12枚のSUS板(29mmx40mm)よりなり、トロイダル方向に一箇所で計測した。下部への電子電流は下部リミタにより計測した。(2)2.45GHzマイクロ波電力0.5-2.5kW、垂直磁場を印加しない下で、電子サイクロトロン共鳴加熱により水素プラズマを生成して計測した結果、下部リミタにおいて負電流(すなわち電子電流)、上部コレクタに正電流(イオン電流)が検出され、それらのR方向分布が一致していることが分かった。上部リミタ電流はほぼゼロであった。上部と下部での電流のR方向分布が一致することは流体モデルによる平衡理論解析の結果と整合した。(3)上部コレクタに数十Vの正電圧を印加すると負電流が検出され、コレクタに電子が流れ込むことがわかり、イオンエネルギー分解を行うことができなかった。また、コレクタがトロイダル方向に一箇所であったため、全イオン電流値を計測できなかった。(4)イオンエネルギー分解を行うために、電子リペラを備えたイオンコレクタ、全イオン電流値を同時に計測するために、トロイダル方向全面を覆う上部パネル(R方向に分割)を設計・制作中である。昨年度に引き続き、電子サイクロトロントーラスプラズマの平衡形成の主要素である荷電分離電流の形成機構をLATE球状トカマク装置において調べ、以下のことを明らかにした。1.トロイダル磁場中のイオン及び電子は磁場の勾配および湾曲ドリフトによりそれぞれ上方向および下方向にドリフトし、荷電分離電流を形成する。LATE真空容器上部に大半径方向に12分割された分割イオンコレクタおよび分割リミタ、真空容器下部に分割リミタを置き、流れ込むイオンおよび電子の大半径方向分布を計測した。上部イオンコレクタ表面は、上部リミタ先端よりも6.2cm上に設置した。また同時にラングミュアプローブにより主プラズマ中の電子温度、密度分布の2次元分布を計測した。その結果、下部リミタに電子、上部イオンコレクタにイオンが流れ込み、それらの大半径方向分布が一致していることを初めて明らかにした。また、その分布がプローブ計測より求めたプラズマ中の2p_e/RB_phiの分布(p_e:電子圧力、R:大半径、B_phi:トロイダル磁場強度)と一致することを明らかにし、真空容器上部・下部での流入・流出電流分布が、プラズマ中の電子の垂直方向ドリフトの分布に一致することが分かった。2.イオンセンシティブプローブによる計測を行い、イオン温度がプラズマ中では1eV程度であることを確認した。一方で、電子温度は4eV12eVであり、プラズマ中の垂直方向ドリフトは主に電子ドリフトによるものであることと整合することを確認した。3.上部イオンコレクタに電圧を印加し、-40Vから40Vまで掃引して、電流電圧特性を計測した結果、浮遊電位は最大で15V程度あり、最大で15eV程度のイオンが上部に流入していることを示唆した。主プラズマ中のイオン温度が1eV程度であったことから、真空容器上部と主プラズマ間においてイオンが運動エネルギーを得る機構が存在していることが示された。プラズマ中の空間電位は真空容器上部付近に正のピーク(約40V)を持っていることから、真空容器上部との電位勾配によりイオンがエネルギーを得て真空容器上部へと流れこむとした理論予測モデルを裏付けた。さらに、コレクタ電圧がOVから-40Vの負電圧を印加した領域で、流れこむイオン電流は本質的に変化せずの定であった。

これより、イオンコレクタに流れ込む電流は、プラズマ中からのイオン流入によるものであり、プラズマ中からの電子の流入および、2次電子放出による寄与はほとんどないことが分かった。
分化に伴って発現が消失する蛋白FT27の機能と遺伝子転写調節因子の研究

哺乳動物の初期胚が分化し、その方向を獲得していく一連の過程は、遺伝情報の切り替えによって制御されていると考えられる。in vitroでの分化が容易なマウスF9テラトカメシノ-マ幹細胞は、分化に伴う遺伝子発現調節機構の解明に適した材料としてよく使われている。事実、F9細胞ではレチノイン酸による分化誘導処理によって、RNAポリメラ-ゼIIによって転写される遺伝子の発現に関与する複数の転写調節因子の活性が変動する。我々は、未分化F9細胞のcDNAライブラリ-をスクリ-ニングして、F9細胞に発癌プロモ-タ-であるTPAを作用させた後に顕著な発現の減少を示すクロ-ンpFT27を単離している。このcDNAは323アミノ酸からなり、複数のトランスメンブレン領域を有していた。このことから、FT27遺伝子は細胞の未分化状態維持に寄与する、重要な役割を演じていることが予想される。この研究では、哺乳動物細胞の分化機構をさらに遺伝子レベルで明らかにするために、細胞を分化していく過程で、非常に早い時期に発現が抑制されるFT27遺伝子の構造及びその発現調節機構の解明を目的としている。FT27cDNAをプロ-ブにして、マウス遺伝子ライブラリ-をスクリ-ニングし、単離したファ-ジクロ-ンの塩基配列を決定した結果、以下のことが明らかとなった。遺伝子は26kb以上の大きさで、6個のエクソンにより構成されていた。(2)エクソン/イントロン境界部位は全てGT/AG則に従っていた。(3)転写開始点より上流400bpは78%とGC含量が高く、TATA配列は存在しなかった。また興味深いことに、cAMPで発現が誘導される遺伝子のプロモ-タ-領域に共通して見られるcAMP responsive element(CRE)が認められた。CREとレチノイン酸及びcAMP処理によるFT27遺伝子発現消失との関係はどのようなものか興味が持たれる。
電気粘性流体応用超精密・高速位置決めテーブルシステムに関する研究

本研究では,電界を印加することにより粘度が変化する電気粘性流体を応用した新たな概念に基づく超精密・高速テーブルシステムを構築し,そのテーブルシステムを用いた要素研究を行った.その結果,以下のような研究成果が得られた.(1)電気粘性流体応用テーブルシステムにおいて,電気粘性流体に電界を印加することにより,テーブルの動的特性,具体的にはテーブルの送り方向減衰能及び駆動中の振動特性が改善されることを確認した.(2)テーブルの微小位置決め動作時において,電気粘性流体に電界を印加することにより,テーブルの整定時間や行き過ぎ量などが減少し,位置決め動作特性が向上することを確認した.(3)電気粘性流体に印加する電界をテーブルの運動状態に応じて能動的に制御することによって,テーブルの位置決め運動特性がより一層向上することを示した.(4)電気粘性効果の基本的な特性として,電界の印加により電気粘性効果が発現あるいは消失するまでに遅れ時間が存在することを明らかにするとともに、遅れ時間を考慮した能動的印加電界制御を行うことにより,テーブルの運動を最適化することが可能であることを示した。
各種吸入麻酔薬の虚血肝エネルギー代謝に及ぼす影響

非選択的NOS阻害剤はそれ自体に心抑制作用があり、臓器血流維持に必要な構成型NOSも抑制することなどにより、敗血症性ショック時の主要臓器の循環、代謝系を著しく抑制してしまう。今年度我々は、循環、代謝系への副次的作用がないとされる最近開発されたNO消去剤であるimidazolineoxyl N-oxide誘導体(carboxy-PTIO)の肝に対する保護的作用の有無について実験を行った。〈対照と方法〉Varian社製の動物実験用高磁場NMR装置により肝エネルギー代謝および細胞内pHを測定した。麻酔下の動物(日本白色ウサギ)を気管切開、挿管し、人工呼吸とした。右内頚動静脈にカテーテルを留置し、平均動脈圧、心拍数、中心静脈圧を持続モニターした。開腹後、左肝葉上にin vivo ^<31>P-NMR測定用表面コイルを設置、部分閉腹後、ウサギを仰臥位にてbore magnet内に入れNMRシグナルを測定した。動物を以下の3群に分けた。1)コントロール群、2)LPS(lipopolysaccharide,400μg/kg)投与群、3)LPS+carboxy-PTIO投与(0.17mg/kg/minの速度にて3時間)群。〈結果〉血行動態と血液ガス分析:carboxy-PTIOの投与はLPS投与による2相目の血圧の低下と代謝性アシドーシスの進行を抑制した。In vivo ^<31>P-NMR分析:LPS投与120分後より生じたβ-ATP値の減少、無機リン値の増加、細胞内pHの低下をcarboxy-PTIOの投与は有意に抑制した。動脈血代謝物質濃度の変化:LPS投与7時間後において、血清乳酸、ピルビン酸値は有意に増加した。carboxy-PTIOの投与群では、血清乳酸値の増加を軽度抑制した。また、動脈血ケトン体比(アセト酢酸/β-ヒドロキシ酪酸)を改善した。〈まとめ〉ウサギ敗血症性ショックモデルにおいてNO消去剤の投与は、肝障害を引き起こすことなく血行態を正常化した。この結果は、敗血症に対する新しい治療薬として、NO消去剤の投与が有効である可能性を示唆するものである。エンドトキシンショック時の肝障害に対して、NO(nitric oxide)のはたす役割を検討する目的で、以下の実験をおこなった。[結果]endotoxin投与群において、約2時間後より、β-ATPの低下とPiの増加が認められ、β-ATPは、そのまま低値が持続した。7時間後の血中GOT,OCT,LDH,乳酸値は有意に増加した。動脈血、細胞内pHとも徐々に低下し、進行性のアシドーシスが認められた。Carboxy-PTIO投与群では、循環動態が安定すると共に、β^ATP、Piともに有意差なく推移し、肝エネルギー動態はほぼ正常に維持された。(今回の結果は、第43回日本麻酔学会総会に発表予定である。)[対象および方法]日本白色ウサギ18羽を実験動物として使用した。ケタミン、キシラジン麻酔下にウサギを気管切開し、人工呼吸を行った。右内頚動静脈にカテーテルを留置し、平均動脈圧、心拍数、中心静脈圧を持統モニターした。開腹後、左肝葉間にin vivo 31P-MRシグナル測定用表面コイルを設置、部分閉腹後ウサギを仰臥位にてSiemens社製MR Systemo4.7Tに入れMRシグナルを測定した。ウサギは1)コントロール群、2)LPS群、3)LPS+carboxy-PTIO群に分けた。LPSは400μg/kgとし、carboxy-PTIOはLPS投与60分後より0.17mg/kg/minの速度にて3時間投与した。β-ATP、Piの割合を肝エネルギー代謝の指標とし、また、Piのケミカルシフトから細胞内pHを測定した。各群2時間毎に動脈血ガスを、そして7時間後の血中GOT、OCT、LDH、乳酸値その他を測定した。[結果]LPS投与により30分以内の急峻な血圧の低下と180分以降の緩徐な血圧低下が認められた。NO消去剤の投与は(a)2相目の血圧の低下を抑制した。(b)肝内ATP濃度を保持し、肝細胞アシドーシスを防止した。(c)乳酸、アラニンなどの水溶性代謝物質の肝内濃度を正常化した。一方、(d)生体膜の基本的な構成成分であるリン脂質総量、各種リン脂質量、細胞膜流動性の指標であるコレステロール/リン脂質比には影響せず、本方法においてNO消去による肝細胞障害は観察されなかった。

動物を以下の3群に分けた。1)コントロール群、2)LPS(lipopolysaccharide,400μg/kg)投与群、3)LPS+carboxy-PTIO投与(0.17mg/kg/minの速度にて3時間)群。〈結果〉血行動態と血液ガス分析:carboxy-PTIOの投与はLPS投与による2相目の血圧の低下と代謝性アシドーシスの進行を抑制した。In vivo ^<31>P-NMR分析:LPS投与120分後より生じたβ-ATP値の減少、無機リン値の増加、細胞内pHの低下をcarboxy-PTIOの投与は有意に抑制した。動脈血代謝物質濃度の変化:LPS投与7時間後において、血清乳酸、ピルビン酸値は有意に増加した。carboxy-PTIOの投与群では、血清乳酸値の増加を軽度抑制した。また、動脈血ケトン体比(アセト酢酸/β-ヒドロキシ酪酸)を改善した。〈まとめ〉ウサギ敗血症性ショックモデルにおいてNO消去剤の投与は、肝障害を引き起こすことなく血行態を正常化した。この結果は、敗血症に対する新しい治療薬として、NO消去剤の投与が有効である可能性を示唆するものである。
対数的トレリ問題

ホッヂ理論における無限小変形の方法は代数幾何において様々な成果をもたらしている.もともとのアイデアはGriffithsによるもので、射影空間内の超曲面の族のコホモロジーから生ずるホッヂ構造の無限小変形をヤコビ環を用いて計算して、これをトレリ問題に応用した.その後もホッヂサイクルに対するNoether-Lefschetz問題や代数的サイクルへの応用など様々な成果がこの方法によりもたらされている.本研究ではこの方法を,「Beilinson-Hodge予想にたいするNoether-Lefschetz問題の類似」へ応用した.Beilinson-Hodge予想とは,非特異コンパクトな複素多様体上のホッヂサイクルにたいするホッヂ予想のコンパクトでない複素多様体にたいする類似の予想である。ホッヂ予想は所謂ホッヂサイクルが代数的サイクルのコホモロジー類であると予想する.コンパクトでない複素多様体のコホモロジーにたいしてもDeligneの混合Hodge構造の理論によりホッヂサイクルの類似(Beilinson-Hodgeサイクル)が定義される.この予想はこれらがレギュレーター写像によりBlochの高次代数的サイクルからくると予想するものである.予想は1次元(コンパクトリーマン面)の場合には成立することが知られている.実際この場合にはアーベルの定理に同値である.本研究では以下の成果を得た.これにより一般の完全交差多様体に対してはBeilinson-Hodge予想が成立することを示した.さらに,上述のNoether-Lefschetz locusをある場合に詳しく研究し,最大次元をもつ既約成分が無限個存在するというまったく新しい現象を発見した.またそれら既約成分を全て幾何学的に記述することに成功した.本研究の目的は"超曲面の退化をHodge構造の退化の様子により統制すること"である。歴史的にはGriffithsがHodge構造の変動の理論の基本的な枠組みを構成した後,これを用いてDonagiが非特異な超曲面の幾何学的同型類がそのコホモロジー群上のHodge構造により決定されることを示した。これを特異点をもつ超曲面に拡張することが目的である。本年における成果として、上記問題に対する基本的な技術的道具であるヤコビ環の理論の一般化を得た。ヤコビ環の理論はもともと超曲面のTorelli問題を研究するために開発され、超曲面に付随するHodge構造の無限小部分を統制するものである。当該研究では、これを完全交叉多様体から何枚かの超局面切断を除いた開多様体(以下、開完全交叉多様体と呼ぶ)の混合Hodge構造の無限小部分を統制する理論に拡張した。さらに応用としてBeilinson-Hodge予想にたいする肯定的な結果を得た。この予想はC上の非コンパクトな代数多様体Uにたいしレギュレータ写像が全射であると主張するのもで、コンパクトな代数多様体にたいするHodge予想の類似である。主結果はUが一般な開完全交叉多様体にたいしこの主張が正しいことを示した。さらに次のようなこの問題の変形版も考察した。SをC上の非特異代数多様体、π:U→Sをsmoothな写像でファイバーがアファイン代数多様体で次元がmとする。このときUにたいするレギュレータ写像が次の写像を誘導する。ここで右辺は混合Hodge加群の理論により自然に混合Hodge構造が与えられている。当該研究では、π:U→Sが開完全交叉多様体のモヂュライ空間M上の普遍族のdominantな写像S→Mによる引き戻しである場合にreg^<m+q>_<U/S>がq=0,1にたいして全射であることを示した。によって定義される。ここでH^2(X_t,Q(1))_<triv>はX_t⊂P^3の超平面切断のコホモロジー類によって生成される1次元の部分空間である。古典的なNoether-Lefschetzの定理とはd【greater than or equal】4のとき、S(d)_<NL>がS(d)の真部分集合であることを主張する。M.GreenとC.VoisonはS(d)_<NL>の既約成分で次元が最大のものを、P^3の直線を含む曲面のなす部分集合として具体的に決定した。が全射であると主張するもので、コンパクトな代数多様体にたいするHodge予想の類似である。ここでCH^q(U,q)はBlochの高次Chow群である。これにたいするNoether-Lefschetz問題の類似として、P^3内のd次曲面から、次数がそれぞれe_1,e_2,...,e_rの超曲面切断を除いた開曲面のモヂュライ空間S=S(d; e_1,...,e_r)にたいし、そのNoether-Lefschetz locusをによって定義する。ここでH^2(U_t,Q(2))_<triv>はCH^2(U_t,2)のある特殊な元のレギュレータ写像の像によって生成される部分空間である。当該研究の成果は、これにたいしてなNoether-Lefschetzの定理とGreen-Voisonの定理の類似を証明したことである。ホッヂ理論における無限小変形の方法は代数幾何において様々な成果をもたらしている.もともとのアイデアはGriffithsによるもので、射影空間内の超曲面の族のコホモロジーから生ずるホッヂ構造の無限小変形をヤコビ環を用いて計算して、これをトレリ問題に応用した.

その後もホッヂサイクルに対するNoether-Lefschetz問題や代数的サイクルへの応用など様々な成果がこの方法によりもたらされている.本研究ではこの方法を,「Beilinson-Hodge予想にたいするNoether-Lefschetz問題の類似」へ応用した.Beilinson-Hodge予想とは,非特異コンパクトな複素多様体上のホッヂサイクルにたいするホッヂ予想のコンパクトでない複素多様体にたいする類似の予想である。ホッヂ予想は所謂ホッヂサイクルが代数的サイクルのコホモロジー類であると予想する.コンパクトでない複素多様体のコホモロジーにたいしてもDeligneの混合Hodge構造の理論によりホッヂサイクルの類似(Beilinson-Hodgeサイクル)が定義される.この予想はこれらがレギュレーター写像によりBlochの高次代数的サイクルからくると予想するものである.予想は1次元(コンパクトリーマン面)の場合には成立することが知られている.実際この場合にはアーベルの定理に同値である.本研究では以下の成果を得た.これにより一般の完全交差多様体に対してはBeilinson-Hodge予想が成立することを示した.さらに,上述のNoether-Lefschetz locusをある場合に詳しく研究し,最大次元をもつ既約成分が無限個存在するというまったく新しい現象を発見した.またそれら既約成分を全て幾何学的に記述することに成功した.
高特異性・高感受性・低コストな熱帯感染症診断キットの開発

熱帯地域を中心とした途上国では、貧困層を中心に多くの感染症が流行している。その中で、デング熱・出血熱を引き起こすデングウイルスは、他の熱性感染症との鑑別診断が非常に困難である。本研究では、高感度、高特異性、安価、かつ簡易に取り扱い可能な迅速診断キットの開発を、イムノクロマトグラフ法を用いて行った。本研究では、デングウイルス、チクングンヤウイルス、及びインフルエンザウイルスをターゲットとした。熱帯地域には数々の熱帯感染症があり、これらの多くはこれまで「顧みられない熱帯病(Neglected Tropical Diseases)」とされてきたものに含まれる。特に、蚊媒介性の感染症、たとえばデング熱・デング出血熱やチクングンヤ熱は熱帯、亜熱帯地域に分布しており、未だにこれらの感染症に対する診断技術も確立されていない。私たちは、デング患者の末梢リンパ球を用いて、デングウイルスの4つの血清型(1型4型)のいずれとも交差反応するヒト単クローン抗体を作製し、この抗体を用いて日本の企業との共同研究としてイムノクロマト法による迅速診断キットを開発した。また、マウスにチクングンヤウイルスを免疫することによりマウス単クローン抗体を作製し、同じく日本の企業との共同研究として迅速診断キットを開発した。現在、タイのマヒドン大学熱帯医学部およびこの熱帯医学部内に設置した大阪大学微生物病研究所の感染症共同研究拠点であるMOCID (Mahidol-Osaka Center for Infectious Diseases)との共同研究として、これらキットの感度と特異性に関する、患者サンプルを用いた評価を実施しているところである。また、2009年に豚に由来するインフルエンザの原因ウイルスとして出現したウイルスH1N1pdm (2009)を高感度に、しかも特異的に検出できるイムノクロマト迅速診断キットを企業との共同研究として開発し、その評価を日本で実施し、また現在はタイでも実施している。熱帯地域には数々の感染症があるが、そのほとんどが正確に診断する技術も確立されていない。本研究の目的は、熱帯地域において大きな問題となっている、蚊媒介性の感染症であるデングウイルスおよびチクングンヤウイルス感染症の高特異性、高感受性、低コストな迅速診断キットを、日本とタイの診断キットメーカーとの共同研究として開発し、普及させることである。本年度は、大阪大学微生物病研究所と、文部科学省の新興・再興感染症研究拠点形成プログラム「大阪大学感染症国際研究拠点タイ感染症共同研究拠点」として、タイのマヒドン大学熱帯医学部に設置している共同研究拠点「Mahidol-Osaka Center for Infectious Diseases, MOCID」との共同研究として、このキット開発に必要な単クローン抗体の作製を行った。デングウイルスに存在する4つの血清型のいずれにも交差反応する単クローンは、Capsid蛋白質に対しては得られず、NS1やEnvelpe蛋白質で得られた。一方、チクングンヤウイルスはタイの臨床分離株と強く反応する、Envelpe蛋白質に対する単クローン抗体が得られた。現在、これらを用いたイムノクロマトキットの開発が進行中だ。すでに、デングウイルスおよびチクングンヤウイルスと強く反応する単クローン抗体の作製は完了し、現在迅速診断キットの開発が進行中であり、ほぼ予定通りである。まず、キットの評価を行う。培養細胞で増殖させた実験室株、臨床分離株をできるだけ多く検討し、すべてに特異的に、高感受性に反応することを確認する。また、感染価、PCR法との比較から、どの程度のウイルス量が必要であるか等の情報を蓄積する。培養細胞で増殖したウイルスで特異性、感受性を試験し、高い評価が得られたイムノクロマトキットについて、マヒドン大学熱帯医学部内の熱帯医学病院で感染者血液を用いて評価を行う。その上で、学外の関連病院にもその有用性を説明し、治験への参加を依頼する。また、日本のメーカーで開発したイムノクロマトキットの特異性、感受性を維持した状態で、低コスト開発を目指し、タイの診断キット開発メーカー(i+MED等)と共同研究として試作品を作製し、同様な手順で評価する。高感受性、高特異性、低コストと評価された迅速診断イムノクロマトキットについて、ワークショップ、ホームページ等での普及活動を行う。培養細胞を用いるキットの評価については日本で実施するので、その消耗品が必要である。一方、タイで実施する臨床サンプルの入手のための費用が必要である。また、日本からタイへの派遣費、タイからの日本への招聘費が必要である。研究を進めていく上で必要に応じて研究費を執行したため当初の見込み額と執行額は異なったが、研究計画に変更はなく、前年度の研究費も含め、当初予定通りの計画を進めていく。