hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経損傷における分子画像診断法の確立:細胞移植療法後のアロジニアの解析

Glial fibrillary acidic protein(GFAP)プロモータ下にfirefly luciferase (fluc)を発現するマウスを使用した坐骨神経損傷モデルにおいてシュワン細胞がGFAPを発現し、再髄鞘化に寄与していた。またCox2プロモータ下にflucを発現するマウスを用いた痛みの可視化実験では、神経圧挫モデルにおいて損傷部から末梢部にかけてCox2の発現が確認できた。また神経損傷部位の炎症部位の特定に蛍光プローブを用いることで、その可視化が可能であった。以上のように神経損傷における分子画像診断法は今後の臨床応用も含め極めて重要な手法の一つである。近年のin vivo imagingの進歩は、生きた動物において非侵襲性かつリアルタイムに遺伝子発現や細胞の追跡を可能にした。発光酵素であるfirefly luciferase(flue)とその基質であるluciferinの反応による微弱な発光を超高感度CCDカメラにより検出するbioluminescence imaging(BLI)はimaging法の中で最も注目されている手法の1つである。過去にわれわれは脊髄損傷や脳虚血などの中枢神経損傷に対して各種幹細胞を用いた移植療法の有用性をBLIのimaging法を用いて報告してきた(Stroke,2004、FASEB J,2005)。各種幹細胞の移植効果や動態解析、損傷神経の病態解明のために分子画像診断法の確立は必要不可欠であり、本研究(平成19年度)においてはまず損傷末梢神経における痛みとアロジニアの可視化を実施した。シクロオキシゲナーゼ-2(Cox2)遺伝子プロモーター下にflueを発現するトランスジェニックマウスを購入し、各種坐骨神経損傷モデル(切断、圧挫)を作製後、経時的にflueの発現を観察した。しかしながら、マウスにおいていくつかの臓器にCox2発現が観察されたため、神経損傷部でのflue発現の詳細な検討が不可能であった。そこで、組織別の発現を調査し、脳や腸管などの組織での発現を確認した。それらの発現抑制法を試行錯誤し神経損傷モデルでの実験を継続した。同時に、神経損傷モデルを用いて各種プローブ投与後に蛍光イメージング法を用いて損傷部の状態を可視化した。in vivo imagingの進歩は、生きた動物において非侵襲性かつリアルタイムに遺伝子発現や細胞の追跡を可能にした。発光酵素であるfirefly luciferase (fluc)とその基質であるluciferinの反応による微弱な発光を超高感度CCDカメラにより検出するbioluminescence imaging (BLI)はimaging法の中で最も注目されている手法の1つである。昨年度より本実験に使用しているシクロオキシゲナーゼー2(Cox2)遺伝子プロモーター下にflucを発現するトランスジェニックマウスを用いて、実験を継続した。昨年度はCox2の発現が腸管や脳で常時観察されたことよりバックグラウンドが高くなり、神経損傷部におけるシグナルの検出が困難であった。これを改良すべく、動物の食事を制限し腸管の動きを抑制することにより腸管でのCox2の発現が低下した。この環境下において各種坐骨神経損傷モデルを作成した。神経切断モデルにおいては明らかなCox2の発現が損傷部には観察されなかったが、神経圧挫モデルにおいては損傷部を中心にその末梢へのシグナルが検出された。また、各種プローブを用いた実験系においては、損傷周囲組織に発現するセレクチンをターゲットとして坐骨神経圧挫モデルを用いて蛍光プローブの集積が損傷部に観察された。バックグラウンドの問題はあるものの、今後更なる改良を加えるこにより、痛みや炎症のより鮮明な可視化が実現する可能性が示唆された。
発達障がい児の学習スキルズ・社会スキルズ獲得のための融合的教育支援研究

1.学習スキルズと社会スキルズの相関関係についての検討:注意欠陥多動性症候群(ADHD)のある児童と自閉症スペクトラム障がい(ASD)児に対して,日常生活での行動問題に違いが見られるかを,行動問題チェックリスト(CBCL)を用いて検討し,CBCLの各得点と単語の読み能力や文章理解能力,非言語性知能,さらには認知的処理能力との間に相関関係が見られるかを検討した。その結果,両群ともに文章理解能力はあるが,それを社会スキルズにおける外在的・内在的な行動に移すことが困難であることを示唆した。また,ADHD児群において,異常脳波のある群とない群において,認知面・行動面で違いが見られるかを検討し,その成果を分析中である。さらには,ADHD児群とてんかん群において,注意の抑制機能に違いが見られるかを,近赤外分光法(NIRS)を用いて計測し,分析した。その結果,てんかん群の方が,認知的抑制がかかりにくいことを示唆した。2.学習に付随した神経基盤の変容の解明と学位取得・成果報告:以前開発した学習支援プログラムを再構成し,刺激の提示方法により学習効率が異なるかを検討することとした。まず漢字パーツや漢字全体を時系列に提示した際に,パーツごとを時系列に提示した方が5名の書字困難児にとって漢字書字につながりやすく,維持率が高いことを示した。また,文節単位による繰り返し読みを行うことで,発達障がい児の文章理解が向上しただけでなく,視線停留1回あたりの注視時間が長くなったことを明らかにした。これらの結果は,発達障がい児が文章全体で繰り返し読みをした場合や,定型発達児の結果とは異なる傾向を示し,発達障がい児が文章理解を向上させるためには,文章中から単語を視覚的に同定できるようになることが必要であったことを示唆した。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。本年度の研究の目的は,発達障がい児と定型発達児に対して,発達段階に応じた,社会スキルズの活用段階を「会話と情報交換」「対人コミュニケーション」「サバイバルスキル」の3段階に分けて縦断的な介入研究を行うことであった。その訓練効果を段階の変化に従って「聞く」「話す」「理解する」「表現する」行動の質的な変化・標準化検査の結果・神経メカニズムの変化を縦断的かつ包括的に明らかにし、日常場面での社会性行動の変化や学習の学習段階の変化も縦断的に評価を行うことであった。平成26年度の研究実施状況は,以下の4点であった。1.社会スキルズ獲得支援プログラムの完成と開発評価:「聞く」「話す」「理解する」「表現する」行動の組み合わせで,支援プログラムと指導カリキュラムを完成させる。支援段階として3つの社会スキルズ活用段階に分類し,「会話と情報交換」「対人コミュニケーション」「サバイバルスキル」の各段階に応じた支援を開始した。2.学習支援プログラムの再構成:これまでに開発したコンピュータ教材を用いて、発達障がい児が英単語書字を獲得する際に、刺激の提示順序の影響を受けることを明らかにし、その結果がThe Psychological Recordに採択された。3.支援指導の開始:「会話と情報交換」に関わる研究成果をResearch in Autism Spectrum Disordersに投稿し、現在査読中である。4.研究成果報告: 2014年度には、英語論文が2本採択され、1本を投稿中である。また、5月に参加した国際行動分析学会(ABAI)において、ポスター賞(2014 Society for the Advancement of Behavior Analysis Student Presenter Grant)を受賞した。(理由)英語論文を2本執筆し,採択されたため。

第一著者として,発達障がい児が英単語書字を獲得する際に、英語から日本語の順で提示するよりも、日本語から英語の順で提示した方が効果的であったという結果が国際誌であるThe Psychological Recordに採択され,掲載された。また,第四著者として,ウィリアムズ症候群のある児童における学習障害と遺伝子欠損の度合の相関関係を分析した研究が、国際的な医学雑誌であるCongenital anomaliesに採択され、掲載された。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。研究の推進方策としては,前年から引き続き,同様の支援指導・評価を継続して行う。年次の推移により,標準化検査を参加児の学年相当のもの年次の最初と最後に実施する。研究を遂行する上での問題点は,視線追跡装置(Eye-Link)の測定の際に、頭が過度に動いてしまうことや、胎動が大きい参加児に対しては適切に視線追跡反応を測定できない場合がある可能性がある。そのため,長時間の測定を避けることと,もし体動が過度に大きい場合には、動きに対する耐性がより高いTobiiを用いて計測を行う翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。国際行動分析学会でのポスター賞の受賞
生体組織の凍結過程におけるミクロ/マクロ熱・物質移動に関する研究

本研究では,8つの分担課題を2年度にわたって研究した.ここではその成果の概要をそれぞれの課題について述べる.1.生体の凍結・解凍における輸送現象論と損傷機序の解明(林,多田)では,小麦プロトプラストを用いた凍結・解凍実験とin vivoな浸透圧実験及び生体組織におけるミクロ輸送現象のシミュレーションを行い,マクロな伝熱現象と細胞の生存との関連を明らかにした.2.含水多孔性食品の過冷却の能動的制御による凍結保存の熱工学的検討(稲葉)では,含水性食品の凍結において重要な因子である過冷却について,各種の無機・有機水溶液による実験を行い,水溶液の体積と限界過冷却度の関係その他を明らかにした.3.熱物性値による凍結過程のマクロ的評価とミクロ的構造の対応(谷下)では,神経系クローン細胞であるPC12細胞をマイクロカプセル化したものについて凍結実験を行い,色素排除試験・ドーパミン放出量測定・示差熱分析などにより生存率と氷晶生成の関係を明らかにし,マイクロカプセルの有効性を立証した.4.高分子ゲル中における氷晶形成とガラス化(村勢)では,架橋高分子ゲルを用いた示差走査熱量測定により,冷却時の水のガラス化を観測し,またSEMによるゲルビーズ構造の観察を行った.5.細胞膜透過係数の測定と凍結前処理プロセスの設計(西尾,白樫)では,ガラス化による凍結保存を目指した細胞内への凍結防御剤の浸透プロセスについて,人の内皮細胞を用いた実験を行い,膜透過係数を測定するとともに凍結前処理プロセスについての提案を行った.6.組織細胞の凍結過程における熱・物質移動の微視的観察研究(鶴田)では,タマネギの表皮細胞を用いた方向性凝固の顕微鏡観察を行い,水の膜透過率と細胞の脱水収縮の関係を明らかにし,また細胞内凍結における凍結温度と凍害防御剤濃度との関係を求めた.7.マクロ凍結条件に対する生体細胞懸濁液の凍結過程における氷結晶と細胞のミクロ挙動特性(石黒)では,冷却速度や温度勾配伝播速度が細胞懸濁液の凍結過程での氷結晶の形態や細胞との相互作用などに及ぼす影響を明らかにし,また凍結過程の3次元ミクロ構造の実時間計測を行った.8.総括,生体組織の凍結保存の研究(棚澤)では,これまでの国内外の研究結果の検討から,生体組織の凍結保存の成否を支配する諸因子を整理して体系化を行い,今後さらに研究が必要になる課題を明確化した.本研究では,8つの分担課題を2年度にわたって研究した.ここではその成果の概要をそれぞれの課題について述べる.1.生体の凍結・解凍における輸送現象論と損傷機序の解明(林,多田)では,小麦プロトプラストを用いた凍結・解凍実験とin vivoな浸透圧実験及び生体組織におけるミクロ輸送現象のシミュレーションを行い,マクロな伝熱現象と細胞の生存との関連を明らかにした.2.含水多孔性食品の過冷却の能動的制御による凍結保存の熱工学的検討(稲葉)では,含水性食品の凍結において重要な因子である過冷却について,各種の無機・有機水溶液による実験を行い,水溶液の体積と限界過冷却度の関係その他を明らかにした.3.熱物性値による凍結過程のマクロ的評価とミクロ的構造の対応(谷下)では,神経系クローン細胞であるPC12細胞をマイクロカプセル化したものについて凍結実験を行い,色素排除試験・ドーパミン放出量測定・示差熱分析などにより生存率と氷晶生成の関係を明らかにし,マイクロカプセルの有効性を立証した.4.高分子ゲル中における氷晶形成とガラス化(村勢)では,架橋高分子ゲルを用いた示差走査熱量測定により,冷却時の水のガラス化を観測し,またSEMによるゲルビーズ構造の観察を行った.5.細胞膜透過係数の測定と凍結前処理プロセスの設計(西尾,白樫)では,ガラス化による凍結保存を目指した細胞内への凍結防御剤の浸透プロセスについて,人の内皮細胞を用いた実験を行い,膜透過係数を測定するとともに凍結前処理プロセスについての提案を行った.6.組織細胞の凍結過程における熱・物質移動の微視的観察研究(鶴田)では,タマネギの表皮細胞を用いた方向性凝固の顕微鏡観察を行い,水の膜透過率と細胞の脱水収縮の関係を明らかにし,また細胞内凍結における凍結温度と凍害防御剤濃度との関係を求めた.7.マクロ凍結条件に対する生体細胞懸濁液の凍結過程における氷結晶と細胞のミクロ挙動特性(石黒)では,冷却速度や温度勾配伝播速度が細胞懸濁液の凍結過程での氷結晶の形態や細胞との相互作用などに及ぼす影響を明らかにし,また凍結過程の3次元ミクロ構造の実時間計測を行った.8.総括,生体組織の凍結保存の研究(棚澤)では,これまでの国内外の研究結果の検討から,生体組織の凍結保存の成否を支配する諸因子を整理して体系化を行い,今後さらに研究が必要になる課題を明確化した.本研究は8つの分担課題からなっており,ここでは本年度の研究実績をそれぞれの課題について述べる.1.生体の凍結・解凍における輸送現象と損傷機序の解明(林,多田)では小麦細胞のプロトプラストを用いた凍結・解凍実験とin vivoな浸透圧実験および細胞組織の凍結シミュレ一ションを行い,マクロな伝熱現象と細胞の生存との連関について解明した.2.含水多孔性食品の過冷却による凍結制御(稲葉)では,食品の凍結・氷晶の成長などに関連する重要な因子である過冷却現象について,各種の無機あるいは有機水溶液による実験を行い,水溶液の体積と限界過冷却の関係を明らかにした.3.熱物性値による凍結過程のマクロ的評価とミクロ的構造の対応(谷下)では,細胞外凍結の際の細胞内の状態を推測するための指標として,有効温度伝導率を用いることの有効性の検証を行った.

4.高分子ゲル中における氷晶形成とガラス化(村勢)では,架橋高分子ゲルの吸・脱湿挙動,凍結開始温度と凍結速度の関係の検討,ゲル・ビーズ構造のSEM観察などを行った.5.細胞膜透過係数の測定法の開発(西尾,白樫)では,細胞内と浸透圧の異なる溶液中に置かれた細胞の体積変化から膜透過係数を求める方法について,その誤差の原因を検討した.6.組織細胞の凍結過程における熱・物質移動の微視的観察研究(鶴田)では,タマネギの表皮組織を用いて方向性凝固時の顕微鏡観察を行い,細胞内凍結の発生・伝播および細胞外凍結による脱水現象などを調べた.7.マクロ凍結条件に対する生体細胞懸濁液の凍結過程における氷結晶とミクロ挙動特性(石黒)では,ヒトの赤血球を用いた方向性凝固実験を行い,温度勾配および冷却速度が凍結の様相にどのような影響を与えるかを観察し,その結果から領域分類を行った.8.総括,生体組織の凍結保存の研究(棚澤)では,生体組織の凍結保存の成否を支配する因子を整理し体系化する試みの一環として,過去の内外の研究成果を検討し,今後さらに必要となる研究項目を明確化した.本研究では,8つの分担課題を2年度にわたって研究した.ここではその成果の概要をそれぞれの課題について述べる.1.生体の凍結・解凍における輸送現象論と損傷機序の解明(林,多田)では,小麦プロトプラストを用いた凍結・解凍実験とin vivoな浸透圧実験及び生体組織におけるミクロ輸送現象のシミュレーションを行い,マクロな伝熱現象と細胞の生存との連関を明らかにした.2.含水多孔性食品の過冷却の能動的制御による凍結保存の熱工学的検討(稲葉)では,含水性食品の凍結において重要な因子である過冷却について,各種の無機・有機水溶液による実験を行い,水溶液の体積と限界過冷却度の関係その他を明らかにした.3.熱物性値による凍結過程のマクロ的評価とミクロ的構造の対応(谷下)では,神経系クローン細胞であるPC12細胞をマイクロカプセル化したものについて凍結実験を行い,色素排除試験・ドーパミン放出量測定・示差熱分析などにより生存率と氷晶生成の関係を明らかにし,マイクロカプセルの有効性を立証した.4.高分子ゲル中における氷晶形成とガラス化(村勢)では,架橋高分子ゲルを用いた示差走査熱量測定により,冷却時のガラス化を観測し,またSEMによるゲルビーズ構造の観察を行った.5.細胞膜透過係数の測定と凍結前処理プロセスの設計(西尾,白樫)では,ガラス化による凍結保存を目指した細胞内への凍害防御剤の浸透プロセスについて,ヒトの内皮細胞を用いた実験を行い,膜透過係数を測定するとともに凍結前処理プロセスについての提案を行った.6.組織細胞の凍結過程における熱・物質移動の微視的観察研究(鶴田)では,タマネギの表皮細胞を用いた方向性凝固の顕微鏡観察を行い,水の膜透過率と細胞の脱水収縮の関係を明らかにし,また細胞内凍結における凍結温度と凍害防御剤濃度との関係を求めた.7.マクロ凍結条件に対する生体細胞懸濁液の凍結過程における氷結晶と細胞のミクロ挙動特性(石黒)では,冷却速度や温度勾配伝播速度が細胞懸濁液の凍結過程での氷結晶の形態や細胞との相互作用などに及ぼす影響を明らかにし,また凍結過程の3次元ミクロ構造の実時間計測を行った.8.総括,生体組織の凍結保存の研究(棚澤)では,これまでの国内外の研究結果の検討から,生体組織の凍結保存の成否を支配する諸因子を整理して体系化を行い,今後さらに研究が必要になる課題を明確化した.
明清時代の謎語における俗文学作品の受容に関する研究

本研究においては、「四大奇書」や『西廂記』といった小説や戯曲と関わりのある謎語に着目し、謎話、灯話のような謎語に関する専門書やこれらの小説や戯曲に付けられる批評、またこれらと関わりのある小曲、酒令などの資料と併せて分析することによって、小説や戯曲と関わりのある謎語は実生活のどのような場面で人々に楽しまれたのか、どのように評価されていたのか、さらに小曲、酒令などの関連作品と繋がりがあるのかについても考察を行う。以上の問題を解明することで、前述したこれらの小説や戯曲作品の受容の在り方について、新たな視点を提示したい。
折りたたみ鎖構造を有する天然セルロースIIの特性

(1)酢酸菌変異株の培養条件を種々検討して帯状セルロースの調製条件を確立し、バルク試料でのX線回折から、帯状セルロースがかなり結晶性の良いセルロースIIであることを確認した。(2)帯状セルロースの酸加水分解すると他の天然および再生セルロース試料と同様のレベルオフ挙動を示すが、レベルオフ重合度(LODP)は18.4と非常に小さく、他のものと対照的であった。また帯状セルロースの濃アルカリに溶かした後再生すると、帯状形態は失われてLODPは約50となり、通常の再生セルロースの値と同じ約50になった。これらの挙動は帯状セルロースが約10nmの周期で規則的に折りたたまれているというモデルを強く支持する。(3)シャドウイングによる観察から帯状セルロースの厚みは最頻値で約10nmと決定された。(4)酸加水分解による帯状セルロースの13C固体NMRスペクトルの変化の解析から、分解鎖の折りたたみ部分ではグルコース残基のコンホメーションが乱れており、その部分の寄与はセルロースの非晶部とされる領域と一致することが分かった。(5)以上に基づき、帯状セルロースを構成するヒモ状物は約16本のセルロース分子からなり、これら分子が1列に並んだシートを作ってから規則的に折りたたまれるというモデルを構築した。低温恒温庫を用いて酢酸菌を培養して帯状セルロース試料を新たに調製し、X線回折、固体CP-MAS 13C NMRによる分子構造解析を行なったところ、この物質は高結晶性のセルロースIIであることが確認された。ただし、この菌株の性質は通常の株に比してやや不安定であり、継代培養を繰り返すとセルロースIの成分が混入することがある。液体クロマトグラフィーによる分子量分布解析によれば、セルロースIの成分が多い試料では重合度1000程度の高分子量画分が多い。したがってこの帯状セルロース試料でセルロースIとセルロースIIが混じっている場合には、高分子量成分がセルロースI、低分子量成分がセルロースIIに対応していると考えられる。帯状セルロースに対し酸による加水分解処理を行ない、不溶残渣を集めて分子量分析を行なったところ、重量平均重合度は出発物質では200であったものが19.5に低下し、分子量分布はMw/Mn比で1.1と非常に鋭いことが分った。この長さは以前の電子顕微鏡観察から推定された折り畳み周期(10nm)と完全に一致する。このことは、分子鎖の中で折り畳みによって鋭く曲った部分は、真っ直ぐな部分に比べて酸による攻撃を受けやすく、非常に速やかに切断されることを意味する。加水分解残渣を電子顕微鏡で観察したところ、水洗しただけの試料では帯状の形態はほとんど変化していなかったが、これを超音波処理すると、未処理のものとは異なって、容易に形態が崩壊し、微小な断片に細分された。これも上記の観察を裏付けるものである。以上の知見によって、酢酸菌が作るこのセルロースIIが折り畳み構造に基づく反平行鎖構造をとっていることはほぼ確実となった。これまでの研究において帯状セルロース(セルロースII)を作る酢酸菌変移株(NB株)を恒温庫で培養した時少量のセルロースIが混じってくることが実験上の障害となっていた。そこで培養条件を詳細に検討した結果、以下の点が明らかとなった。i)セルロースIの混入の主要な原因は恒温庫の機械的震動にある。この菌は液体培地の表面で増殖してセルロースを作るが、培地に常時震動が加わると、表面で生成したセルロース被膜が脱落し沈降する。このような条件では正常株(セルロースI産生性の株)が優勢になりやすい。ii)液体培地の初期pHもセルロースIの混入の程度に影響を及ぼす。酢酸菌の通常の培養条件ではpH7.0で出発するが、これを4.0で行なうと正常株の増殖を抑止できる。これらの知見に基づき、高純度の折りたたみ鎖セルロースIIを調製することが可能となった。このセルロース試料についてX線回折、赤外スペクトル、固体^<13> CNMRの測定を行なったところ、いずれの結果もセルロースIIの特徴を示した。

電顕微鏡観察においてシャドウィングの技法により帯状セルロースの厚さを決定した。これらに基づき1個の折りたたみ構造単位(ヒモ状物)が約16本のセルロース分子から構成されるという構造モデルを構築した。セルロースの高次構造における水素結合の役割および人工合成系におけるセルロースIの生成との関わりにおいて、生体系でも分子鎖の折りたたみが起こり得るとの結論を得た。正常株の作るセルロース(セルロースI)にある種の染料を吸着させた複合体に対し、染料を分解する化学的処理を行なうと、帯状セルロースと類似した形態のセルロースIIが生成することを見出した。これはまったく予想外の特異な現象であり、折りたたみ鎖セルロースの生成およびセルロースI→セルロースIIの結晶変態の分子的機構を解明する手がかりを与えると考えられる。
海藻類生殖細胞の放出・着生機構、特に紅藻胞子の自家着生抑制物質の解明

1.紅藻類10種類で不動胞子を放出する際に、同時にこれら胞子が母藻周辺にすぐに着生しないように働く、自家胞子着生抑制物質も分泌されていることが、厳密な至適温度条件で、各種母藻の浸出液及び熱抽出液を用いたバイオアッセイによって明らかにされた。2.これら侵出液・抽出液は他種の胞子着生・発芽も抑制するが、さらに高濃度では胞子を死滅させ、反対に低濃度では発芽・生長を促進する。いわゆるアレロパシ-を示す。3.この現象を引き起こすアレロケミカルは、種特異性を示すものと、共通性を示すものがあり、種によって異なることが示唆され、特に群落形成種において生育園の拡大のための戦略の一つとして考案された。4.共通性を示すアレロケミカルとして、紅藻アカバのメタノ-ル抽出物について、各種クロマトグラフィ-で分画し、質量スペクトルを解析して、この化合物がイコサペンタエン酸(5,8,11,14,17ーicosapentaenoic acid)であることが確認され、同じ不飽和脂肪酸が調べられた他の紅藻4種にも共通して存在していることが明らかにされた。また、同様に褐藻5種からオクタデカテトラエン酸(6,9,12,15ーoctadecatetraenoic acid)が共通して存在することも明らかにされた。これら高度不飽和脂肪酸は、紅藻キブリイトグサ及びダルスの四分胞子の着生・発芽に対して、各種母藻の浸出液や抽出液と同様の抑制・阻害作用を示し、高濃度では死滅、低濃度では生長を促進させるアレロケミカルとしての活性を示すことが証明された。以上のことから、海洋岩礁域の海藻類は互いに生産・分泌するアレロケミカルの相互作用によって生育していることが明らかにされた。紅藻類の生殖細胞である不動胞子は放出されると水中を浮遊し、やがて沈下して基物に付着して発芽するが、多くの種類で胞子放出時に、その着生を阻害する自家着生抑制物質も分泌していることが発見された。本年度の研究では、放出胞子が確実に発芽する実験系を確立するために、まず紅藻数種(アカバ、フジマツモ、ダルス、クシベニヒバ等)の果胞子及び四分胞子について、放出後の着生率と発芽率について、低定温庫内で温度段階を厳密に設定して温度の影響を調べた。その結果、各種とも採集地の海水温度よりも3ー5°C低温条件を保つことによって、マイクロピペットによる洗浄を3ー5回しても90%以上が着生し発芽することが確められた。次に胞子着生の自家抑制物質の単離・同定については、主にアカバを材料として行われた。まず、アカバのメタノ-ル抽出物について、各種クロマトグラフィ-(イオン交換・吸着及び高速液体等)によって分画し、質量スペクトルを解析して、この化合物がイコサペンタエン酸(5,8,11,14,17ーICOSAPENTAENOIC ACID)と推定されたが、この不飽和脂肪酸は他の種類(ダルス、クシベニヒバ等)にも共通して存在していることが確認された。現在これら抑制物質と思われる化合物が、種特異性を示す時にそのまま各種に単に濃度差によって作用しているのか、あるいは何らかの特異物質がプラスされるのかについて実験中である。また同様な発芽・生長抑制物質として、褐藻類のウミトラノオ、マツモ、カヤモノリ等からオクタデカテトラエン酸(6,9,12,15ーOCTADECATETRAENOIC ACID)が共通して存在していることも確められ、この不飽和脂肪酸と前者との関係についても実験が試みられている。

1.紅藻類10種類で不動胞子を放出する際に、同時にこれら胞子が母藻周辺にすぐに着生しないように働く、自家胞子着生抑制物質も分泌されていることが、厳密な至適温度条件下で、各種母藻の浸出液及び熱抽出液を用いたバイオアッセイによって明らかにされた。2.これら浸出液・抽出液は他種の胞子着生・発芽も抑制するが、さらに高濃度では胞子を死滅させ、反対に低濃度では発芽・生長を促進する。いわゆるアレロパシ-を示す。3.この現象を引き起こすアレロケミカルは、種特異性を示すものと、共通性を示すものがあり、種によって異なることが示唆され、特に群落形成種において生育圏の拡大のための戦略の一つとして考察された。4.共通性を示すアレロケミカルとして、紅藻アカバのメタノ-ル抽出物について、各種クロマトグラフィ-で分画し、質量スペクトルを解析して、この化合物がイコサペンタエン酸(5,8,11,14,17ーicosapentaenoic acid)であることが確認され、同じ不飽和脂肪酸が調べられた他の紅藻4種にも共通して存在していることが明らかにされた。また同様に褐藻5種からオクタデカテトラエン酸(6,9,12,15ーoctadecatetraenoic acid)が共通して存在することも明らかにされた。これら高度不飽和脂肪酸は、紅藻キブリイトグサ及びダルスの四分胞子の着生・発芽に対して、各種母藻の浸出液や抽出液と同様の抑制・阻害作用を示し、高濃度では死滅、低濃度では生長を促進させるアレロケミカルとしての活性を示すことが証明された。以上のことから、海洋岩礁域の海藻類は互いに生産・分泌するアレロケミカルの相互作用によって生育していることが明らかにされた。
免疫病発症の分子的基盤

本研究は我が国とフランス国の主だった免疫研究者が種々の免疫病の分子基盤について、共同研究、討議を行い、免疫異常症の解決を目指すものである。平成11年度は個々の研究者がフランスの相手研究者と連絡を密にとり、共同研究を遂行した。日本側研究者を2名フランスに派遣し、フランスの研究者と個々の共同研究を行った。自己免疫性糖尿病、関節リュウマチなど自己免疫病に関する免疫学的分子生物学研究、免疫細胞の細胞死の分子生物学的研究、細胞死に関する分子の異常による免疫病の解析、抗原受容体からの情報伝達、T細胞分化、サイトカイン受容体からの情報伝達、ナチュラルキラー(NK)細胞受容体の分子生物学、ヒトHLAの分子生物学などについてフランスCNRS免疫学研究所を中心に共同研究を行った。さらに、日本側の研究内容として、Fasを介する細胞死誘導におけるシスティンプロテアーゼcaspaseの機能を分子レベルで解明(長田)。IL6受容体からの情報伝達機構(平野)。新しいシグナル伝達アダプター分子の機能解析とノックアウトマウスの作製(菅村)。補助刺激シグナル分子とリンパ球の活性化と不活化の機構(奥村)。サイトカイン受容体からのシグナル伝達の負の制御に関する分子機構(岸本)。B細胞受容体からのシグナル伝達異常と自己免疫病の発症(渡邊)。自己免疫病の分子機構とT細胞分化(谷口)。CD100,CD72,CD40シグナルの解析(菊谷)。免疫プロテアソーム遺伝子の機能解析(田中)。コンディショナルジーンターゲティングを用いた発作性夜間血色素尿症モデルマウスの作製(木下)。T細胞抗原受容体及びCTLA4受容体からの情報伝達機構の解析(斉藤)。B1細胞の分化、活性化の分子機構(本庶)。造血幹細胞初期分化の細胞レベル分子レベルの解析(西川)などの研究を行った。個々の研究者がフランスの相手研究者と連絡を密にとり、共同研究を遂行した。その成果について、平成10年12月4-6日神戸において一堂に集まり共同研究の発表、討議、評価を行った。日本側の研究内容は、Fasを介する細胞死誘導の解明(長田)。IL6受容体からのシグナル伝達(平野)。新しいシグナル伝達アダプター分子STAMの機能解析(菅村)。リンパ球の活性化と不活化の機構(奥村)。サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、HIV補助受容体の機能解析(岸本)。CD40シグナルの解析(菊谷)。免疫プロテアソームの機能解析(田中)。T細胞の正負選択の分子機構の解明(笹月)。コンディショナルジーンタゲティングを用いたGPI型タンパクの機能解析(木下)。ノッチ分子による情報伝達機構の解析(本庶)。ポリコム遺伝子の機能解析(古関)などで共同研究を行った。また本年は2名(古関、渡邊)をフランスに派遣して共同研究を行った。古関はINSERM-CNRSマルセイユ免疫研究所のP.Golstein教授とほ乳類ポリコム群遺伝子産物の細胞死抑制過程における機能解析にっいて共同研究を行った。渡邊は同じくINSERM-CNRSマルセイユ免疫研究所のB.Malissen,EVivier両教授と免疫細胞でのシグナル伝達について共同研究および討議を行った。斉藤はB.Malissen教授と、笹月はC.Benoist教授とそれぞれT細胞の活性化、選択の機構について共同研究を行った。

本研究は我が国とフランス国の主だった免疫研究者が種々の免疫病の分子基礎について、共同研究、討論を行い、免疫異常症の解決を目指すものである。平成11年度は個々の研究者がフランスの相手研究者と連絡を密にとり、共同研究に遂行した。日本側研究者を2名フランスに派遣し、フランスの研究者と個々の共同研究を行った。自己免疫性糖尿病、関節リュウマチなど自己免疫病に関する免疫学的分子生物学研究、免疫細胞の細胞死の分子生物学的研究、細胞死に関する分子の異常による免疫病の解析、抗原受容体からの情報伝達、T細胞分化、サイトカイン受容体からの情報伝達、ナチュラルキラー(NK)細胞受容体の分子生物学、ヒトHLAの分子生物学などについてフランスCNRS免疫学研究所を中心に共同研究を行った。さらに、日本側の研究内容として、Fasを介する細胞死誘導におけるシスティンプロテアーゼcaspaseの機能を分子レベルで解明(長田)。IL-6受容体からの情報伝達機構(平野)。新しいシグナル伝達アダプター分子の機能解析とノックアウトマウスの作製(菅村)。補助刺激シグナル分子とリンパ球の活性化と不活性化の機構(奥村)。サイトカイン受容体からのシグナル伝達の負の制御に関する分子機構(岸本)。B細胞受容体からのシグナル伝達異常と自己免疫病の発症(渡邊)。自己免疫病の分子機構とT細胞分子化(谷口)。CD100,CD72,CD40シグナルの解析(菊谷)。免疫プロテアソーム遺伝子の機能解析(田中)コンディショナルジーンターゲティングを用いた発作性夜間血色素尿症モデルマウスの作製(木下)。T細胞抗原受容体及びCTLA4受容体からの情報伝達機構の解析(斉藤)。B1細胞の分化、活性化の分子機構(本庶)。造血幹細胞初期分化の細胞レベル分子レベルの解析(西川)などの研究を行った。
熱重合可能な相補的ユニットによって制御される光応答性単分子膜の自己集合

本研究では、過去に、開環体に紫外光照射をすると閉環体ではなく縮環体の配列が観察された、アミド基を導入したジアリールエテンについて、単離した開環体、閉環体、縮環体にの表面被覆率の濃度依存性を調査し、吸着挙動に対する知見を得ることを目的とした。その結果、開環体は協同性の無いisodesmicな吸着挙動を示したのに対して、閉環体は非常に高い協同性の吸着挙動を示すことが明らかとなった。また、縮環体は溶液中の分子すべてが吸着されるほど高い吸着能を示すことが分かった。次に、開環体/閉環体の混合溶液での表面被覆率の濃度依存性を調べた結果、閉環体の割合が高い時は閉環体の配列が、開環体の割合が高い時は開環体の配列が観測された。閉環体配列の濃度依存性では、閉環体単独の濃度で予想されるよりも高い表面被覆率が混合溶液で観測されたことから、開環体と閉環体が混ざった混晶の形成が示唆された。さらに興味深いことに、開環体配列の濃度依存性では、開環体のみの場合には協同性を示さずにisodesmicな吸着挙動であったのが、閉環体を混在させることにより、協同性が発現することが明らかとなった。混晶の形成が、配列プロセスにまでも影響を与えていることが分かった。このように、協同的組織化モデルを用いて配列形成を解析することにより、分子配列の形成メカニズムを詳細に検討することができるようになり、光応答性分子配列の設計のための非常に重要な知見が得られることが明らかとなった。27年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、アミド基とアルキル鎖を持つ3-チエニル型のジアリールエテンについて、開環体、閉環体、縮環体のそれぞれについてオクタン酸/HOPG界面上でSTM観察を行い、その配列様式と表面被覆率の濃度依存性について調べた。その結果、いずれにおいても水素結合した2次元配列が確認され、濃度依存性の実験より、開環体は低い協同性の配列、閉環体は高い協同性の配列、縮環体は非常に高い吸着の平衡定数を持つ配列であることが分かった。また、開環体と閉環体では伸長の平衡定数がほぼ同じとなり、配列形成に伴う安定化エネルギーはアルキル鎖に依存することが示唆された。閉環体に開環体を混合した溶液では、閉環体の格子の配列形成が閉環体のみの濃度で予測されるより高い被覆率が観測されたことから、2次元混晶が形成されていることが示唆された。また、開環体に閉環体を混合した溶液では、開環体の格子の配列形成が認められたが、開環体のみのときには見られなかった、高い協同性の配列形成が認められた。系中での紫外光照射実験では、閉環体の配列の形成は認められず、これは、生成した閉環体が開環体配列に取り込まれたと考えられた。我々のグループでは、以前、今回実験に用いたジアリールエテンにおいて、開環体配列に紫外光を照射すると縮環体配列が生成することを見出しており、今年度は、この現象の原因を明らかにすることを当初の目的とした。今回、表面被覆率の濃度依存性を調べることにより、配列形成のメカニズムを詳細に検討することができ、閉環体は開環体より高い協同性を持つこと、縮環体は高い吸着の平衡定数をもつこと、開環体と閉環体は混晶を形成することなどが明らかとなった。おおむね順調に進展しているといえる。

今後は、(1)なぜ縮環体は高い吸着の平衡定数を持つ配列になるのか、(2)開環体と閉環体は混晶を作るが縮環体とは作らないのか、(3)このような現象は他のジアリールエテンでも見られるのか、などの新たな疑問を解決するような実験を行っていくことを予定している。27年度が最終年度であるため、記入しない。
ダイナミック CT による虚血性心疾患の定量評価と被ばく量軽減の試み

320列マルチスライスCTを用いてコンパートメントモデル解析にて局所心筋血流を定量する方法を開発し、虚血性心疾患に臨床応用し、酸素15標識H2O心筋PET画像と比較検討し定量値の妥当性を確認した。さらに虚血心筋病変における造影剤の分布容積や停滞率の定量化をコンパートメントモデル解析で試み、その臨床的有用性を確認した。心筋ダイナミックCT像は、被曝量を軽減するために12心拍おきの撮像が可能になるようにCT装置を改良した。撮像時に20秒を過ぎた時点から息止めを解除し、2心拍おきの心電図同期収集に切り替え、定量解析の安定化を目的とした長時間の心筋ダイナミック収集の試みを行い良好な結果を得た。320列CTを用いた心筋CTPerfusion imagingが実施可能となり、心筋血流を定量する試みが報告されている。心筋血流を定量測定する低線量CT撮像方法を開発した。1心拍あたりの被曝量は0.3mSvである。被曝量を軽減するため、心電図同期心筋CTで収集したダイナミックデータをすべて使用した場合と14心拍おきのデータを使用した場合の心筋血流量を比較検討した。東芝製Aquilion ONE 320-rowCTを用いた。健常男性10名(43±8歳)を対象として、安静時およびATP負荷時の心臓CTを撮像した。それぞれ20秒間、左室拡張末期に心電図同期ダイナミック撮像(1330心拍)を行った。心筋全体の関心領域(ROI)と左室内腔ROIを心筋Perfusion CT画像に設定した。心筋と血液の濃度曲線を1、2、3、4心拍おきに抽出し線形補間し、Single compartment model及びRenkin-Crone modelで解析し、心筋血流量を算出した。その結果、全心拍データで得た血流量と1、2、3、4心拍おきのデータで得た値の相関係数はそれぞれ0.995、0.990、0.983、0.953であった。相関係数の差を検定し、4心拍おきの場合のみ危険率1%未満で有意に相関係数が低くなった。現在の結論としては、320列CTを用いて、被曝量の少ない心筋血流を定量評価する心電図同期撮像方法を開発し、3心拍おきのダイナミックデータでも心筋血流量を正確に測定でき、被曝量を4分の1に軽減可能と考えられた。この研究成果を、2015年5月の第54回日本生体医工学会(名古屋)にて展示発表、および2015年6月の第61回米国核医学会(Baltimore)にて口演発表、および2015年10月の第54回日本生体医工学会北海道支部大会にて口演発表を行った。ダイナミックCTによる心筋血流量を定量する検査において、患者の被ばく量を抑制する方法を考案し、放射性の水を用いた心筋PETと比較、評価して、患者の被ばく量を抑制するアルゴリズムを発表した。本研究課題に予定していた初年度の目標は達成された。320列マルチスライスCTPerfusion imaging画像から局所心筋血流量(MBF)を安定して定量するためのCT画像から局所心筋血流量(MBF)を安定して定量するためのアルゴリズムを改良し、15O-H2O PETとの比較検討を行った。健常者2名と虚血性心疾患患者13名(男性9名女性4名、64±11歳)を対象に安静時とATP負荷時の心筋Perfusion CTと15O-H2O心筋PETを施行した。CTにおける左室内腔血液曲線のハンスフィールド(HU)値を安定化させるために下行大動脈のHU値を差分し、さらにガンマ曲線補正を行った。Single-compartment modelとRenkin-Crone modelにて心臓CTから求めた心筋3区域(LAD、RCA、LCX)のMBFを15O-H2O PETのMBFと比較した。結果は、ガンマ曲線補正を用いた心臓CTから導いたMBFは15O-H2O PETから得たMBFと有意な正相関を認めた(r=0.851, n=93)。相関係数はガンマ曲線補正を用いないとき(r=0.612)よりも有意に高かった(p<0.001)。結論として、心臓CTから安定して局所MBFを導く方法を考案し、15O-H2O PETから得たMBFと良好な相関を得た。この研究の新規性は、現状ダイナミック心筋CTの撮像において造影剤が既に心内腔に入ったタイミングで撮像が開始され、撮像データの時間濃度曲線の初期データが欠落することにより、心筋血流の定量解析が困難な症例がある。心筋血流量を得る微分方程式は漸化式を解いて求めるアルゴリズムを使用しているため、漸化式による解法が困難、不正確になる。そこで、造影剤が心内腔に流入する直前に第1フレームが撮像されたと仮定した曲線をガンマ関数を外挿して推定するガンマ曲線フィッティングという手法を考案した。320列マルチスライスCTを用いた心筋ダイナミック造影検査データから得られた局所心筋血流量を、15O-H2O PETから得た局所心筋血流量と良好な相関を得るように、解析アルゴリズムを改良することを平成28年度の研究目標とした。その目的は達成され、全国レベルの学会に2回発表し、さらに平成29年6月の米国核医学会の口演発表にも採択された。

320列マルチスライスCTを用いてコンパートメントモデル解析にて局所心筋血流を定量する方法を開発し、虚血性心疾患に臨床応用し、酸素15標識H2O心筋PET画像と比較検討し定量値の妥当性を確認した。さらに虚血心筋病変における造影剤の分布容積や停滞率の定量化をコンパートメントモデル解析で試み、その臨床的有用性を確認した。また、心筋ダイナミックCT像は、従来は息止めで約20秒間程度の心電図同期撮像で拡張末期像を連続で撮像していたが、被曝量を軽減するために12心拍おきの撮像が可能になるようにCT装置を改良した。精度の高いコンパートメントモデル解析には約40秒間程度のダイナミックデータ収集が望まれるので、撮像時に20秒を過ぎた時点から息止めを解除し、2心拍おきの心電図同期収集に切り替え、被曝量を抑制しつつ定量解析の安定化を目的とした長時間の心筋ダイナミック収集の試みを行い良好な結果を得た。この成果は、平成27年6月に米国核医学会で口演発表した。さらに、心筋梗塞病変にはヨード造影剤の遅延造影が認められることから、正常心筋と梗塞心筋では、造影剤動態を定量化するコンパートメントモデルが変化すると考える。正常心筋では2コンパートメントモデルだが、梗塞心筋では造影剤が集積し停滞する成分が出現し、3コンパートメントモデルに従うと予想され、造影剤が心筋に集積する速度定数が高く算出されれば梗塞を疑う定量指標になると考え、虚血病変部位の造影剤の分布容積を定量し、良好な結果を得た。平成29年6月に米国核医学会で口演発表し、平成30年4月に日本医学放射線学会総会で口演発表した。今後はこれらの成果を英文論文にて発表を予定している320列マルチスライスCTを用いてコンパートメントモデル解析にて局所心筋血流を定量する方法を開発し、虚血性心疾患に臨床応用し、酸素15標識H2O心筋PET画像と比較検討し定量値の妥当性を確認した。心筋ダイナミックCT像は、被曝量を軽減するために12心拍おきの撮像が可能になるようにCT装置を改良した。撮像時に20秒を過ぎた時点から息止めを解除し、2心拍おきの心電図同期収集に切り替え、定量解析の安定化を目的とした長時間の心筋ダイナミック収集の試みを行い良好な結果を得た。今後の研究として予定している方針は、心筋梗塞病変にはヨード造影剤の遅延造影が認められることから、正常心筋と梗塞心筋では、造影剤動態を定量化するコンパートメントモデルの変化を確認する研究を実施する。正常心筋では2コンパートメントモデルだが、梗塞心筋では造影剤が集積し停滞する成分が出現し、3コンパートメントモデルに従うと予想され、造影剤が心筋に集積する速度定数が高く算出されれば梗塞を疑う定量指標になると期待する。320列マルチスライスCTを用いた心筋ダイナミック造影データを3コンパートメントモデル解析することで、虚血既往のある障害心筋の造影剤停滞率を分布容積から推定するアルゴリズムを開発する予定である。99%以上の冠動脈狭窄を伴う局所心筋のダイナミック造影データから速度定数k1、k2、k3、k4を算出し、分布容積DV (Distribution volume)を計算する。このDV値は、正常心筋より大きい値を示すことが予想され、それが確認されれば、CTを用いた心筋ダイナミック造影データから、虚血心筋の障害程度を定量的に評価できると期待する。
全身病としてのパーキンソン病における神経終末障害とアストログリア 様細胞の関与

農薬でミトコンドリアComplex I阻害剤であるロテノンを慢性皮下投与したラットを用いた検討により,ロテノン神経毒性は中枢よりも末梢神経の方が脆弱であること,また中枢神経系と同様に,腸管神経叢周囲にもGFAP陽性アストログリアが存在し,ロテノン神経障害発現に伴って,GFAP陽性アストログリアの活性化が惹起されることを明らかにした.初代培養細胞を用いた検討により,ロテノン神経毒性発現にはアストログリアが関与しており,とくに中枢神経系においては,ロテノン曝露により中脳アストログリアから特異的に分泌される何らかの因子がドパミン神経障害を惹起すること,さらに抗酸化分子メタロチオネインがこのドパミン神経障害を阻止しうる分子であることを見出した.農薬でミトコンドリアComplex I阻害剤であるロテノンを慢性皮下投与したラットを用いた検討により,ロテノン神経毒性は中枢よりも末梢神経の方が脆弱であること,また中枢神経系と同様に,腸管神経叢周囲にもGFAP陽性アストログリアが存在し,ロテノン神経障害発現に伴って,GFAP陽性アストログリアの活性化が惹起されることを明らかにした.初代培養細胞を用いた検討により,ロテノン神経毒性発現にはアストログリアが関与しており,とくに中枢神経系においては,ロテノン曝露により中脳アストログリアから特異的に分泌される何らかの因子がドパミン神経障害を惹起すること,さらに抗酸化分子メタロチオネインがこのドパミン神経障害を阻止しうる分子であることを見出した.ロテノン慢性投与パーキンソン病モデルの中枢・末梢神経障害およびアストログリア(様細胞)の形態変化雄性Lewis系ラット(7週齢)にロテノン(3mg/kg/day)を浸透圧ミニポンプを用いて3週間慢性皮下投与したところ,黒質のチロシン水酸化酵素(TH)陽性神経細胞数,線条体のTH陽性シグナルに有意な変化はみられなかったが,線条体ドパミントランスポーターのシグナルが低下した個体がみられた.回腸,上行結腸の切片を用いてbeta-tubulin IIIおよびvesicle acetylcholine transporter(VAChT)の免疫染色を行い,腸管神経叢の確認およびアセチルコリン神経障害を評価した.その結果,ロテノン投与群の回腸および上行結腸の腸管神経叢において神経細胞のbeta-tubulin III陽性シグナルの有意な低下が認められた,さらにアストログリアのマーカーであるGFAP,S100bの免疫染色により,腸管神経叢周囲にアストログリア(様細胞)の局在を認め,ロテノン投与群においてGFAP陽性アストログリア様細胞が増加していた中枢の初代培養細胞を用いたロテノン神経障害およびアストログリアの形態変化ラット中脳神経細胞単独培養系,中脳神経細胞と中脳アストログリアの共培養系および中脳神経細胞と線条体アストログリアの共培養系に,それぞれロテノンを曝露した.ロテノン曝露により中脳神経細胞単独培養系,中脳神経細胞と線条体アストログリアとの共培養系では神経毒性は認められなかったが,中脳神経細胞と中脳アストログリアの共培養系では有意なTH陽性細胞数の減少がみられた腸管神経叢の初代培養細胞を用いたロテノン神経障害およびアストログリア(様細胞)の形態変化ラット胎仔の腸管を用いて腸管神経叢の初代培養系を確立した.神経細胞はbeta-tubulin IIIおよびVAChTの免疫染色により,またアストログリア様細胞はGFAPおよびS100bの免疫染色により確認した.腸管神経細胞単独培養系および腸管神経グリア共培養系にロテノンを曝露したところ,腸管神経細胞単独培養系では変化は認められなかったが,神経グリア共培養系ではロテノン曝露により著明なbeta-tubulin III陽性神経細胞数の減少がみられた.また,ロテノン処置によりGFAP陽性細胞の増加がみられた.以上の結果より,ロテノン神経毒性は中枢よりも末梢神経の方が脆弱であること,また神経毒性発現にはアストログリア様細胞が関与していることが示唆された.SDラットからの初代培養細胞を用いたロテノン神経障害およびアストログリアの関与SDラット中脳神経細胞と中脳アストログリアの共培養系および中脳神経細胞と線条体アストログリアの共培養系に,それぞれロテノンを曝露し,アストログリアのマーカーであるGFAPで染色した.線条体アストログリアはロテノンの濃度依存的にGFAP陽性シグナルの増強がみられるのに対し,中脳アストログリアではロテノン曝露によるGFAP陽性シグナルの増強は認められず,むしろ減少傾向があった、線条体アストログリアあるいは中脳アストログリアの単独培養系にロテノンを24時間曝露すると,線条体アストログリアでは細胞外グルタチオン量の増加がみられたが,中脳アストログリアでは細胞外グルタチオン量に変化はみられなかった.また,ロテノン曝露6時間後のミトコンドリアの活性をMito Trackerで検討したところ,線条体アストログリアではロテノン曝露により,Mito Trackerのシグナル増強がみられたが,中脳アストログリアではむしろ減少傾向がみられた.さらに,ロテノンを曝露した線条体アストログリアあるいは中脳アストログリアの培養液を中脳神経細胞単独培養系に添加したところ,ロテノン曝露線条体アストログリアからの培養液添加ではチロシン水酸化酵素(TH)

陽性細胞数に変化はみられなかたが,ロテノン曝露中脳アストログリアの培養液添加ではTH陽性ドパミン神経細胞数が有意に減少した.メタロチオネインノックアウトマウスからの初代培養細胞を用いたロテノン神経障害およびアストログリアの関与メタロチオネインノックアウトマウス(129S7/SvEvBrd-Mt1tm1Bri Mt2tmlBri)からの中脳神経細胞単独培養系,中脳神経細胞と中脳アストログリアの共培養系および中脳神経細胞と線条体アストログリアの共培養系に,それぞれロテノンを曝露した.中脳神経細胞単独培養系では,高濃度ロテノン曝露によりTH陽性ドパミン神経細胞数の減少がみられたが,低濃度ロテノン曝露では変化がみられなかった.一方,中脳神経細胞と線条体アストログリアあるいは中脳神経細胞と中脳アストログリアの共培養系では低濃度ロテノン曝露であっても有意なTH陽性ドパミン神経細胞数の減少がみられた.以上の結果より,ロテノンによるドパミン神経毒性発現には中脳アストログリアから分泌される何らかの分子が関与していること,抗酸化分子であるメタロチオネインがロテノン神経障害に関与することが示唆された.1.メタロチオネインノックアウトマウスからの初代培養細胞を用いたロテノン神経障害およびアストログリアの関与:メタロチオネイン(MT)ノックアウトマウス(129S7/SvEvBrd-Mt1tm1Bri Mt2tm1Bri)からの中脳神経細胞単独培養系に,ロテノンを曝露した線条体あるいは中脳アストログリアの培養液を添加したところ,ロテノン曝露線条体アストログリアからの培養液添加ではチロシン水酸化酵素(TH)陽性細胞数に変化はみられなかったが,ロテノン曝露中脳アストログリアの培養液添加ではTH陽性ドパミン神経細胞数が有意に減少した.2.C57BL/6Jマウスを用いたロテノン慢性投与パーキンソン病モデルの中枢・末梢神経障害:雄性C57BL/6Jマウス(8週齢)にロテノン(50 mg/kg/day)を3,6週間慢性皮下投与した.ロテノン3週間投与では黒質,線条体のTH陽性シグナルに変化はみられなかったが,上行結腸の神経叢におけるβ-tubulin III陽性シグナルが有意に低下していた.ロテノン投与6週後では線条体TH陽性シグナルの低下が認められた.3.MTノックアウトマウスへのロテノン慢性投与:MTノックアウトマウス(8週齢)にロテノン(50 mg/kg/day)を4週間投与した黒質,線条体では著明なドパミン神経障害がみられた.野生型マウスでは線条体のGFAP陽性アストログリアの増加がみられたが,MTノックアウトマウスでは有意な変化がみられなかった.MTノックアウトマウスでは腸管神経叢におけるβ-tubulin III陽性シグナルの低下がみられた.以上より,ロテノンによるドパミン神経毒性発現には中脳アストログリアから分泌される何らかの分子が関与していること,ロテノン神経毒性は中枢よりも末梢神経の方が脆弱であること,また抗酸化分子MTがロテノン神経障害に関与することを明らかにできた.本年度は,研究目的であるロテノン曝露によるアストログリアにおける抗酸化機構に関わる分子の発現変化およびアストログリアでの抗酸化機構の障害と神経障害の関係について検討し,ロテノン曝露により抗酸化分子であるグルタチオンの細胞外への放出とドパミン神経障害との関連性,およびメタロチオネイン欠損によるアストログリアの抗酸化機構の障害によりロテノン誘発神経障害が増悪されることを見出した.24年度が最終年度であるため、記入しない。