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インビーム・メスバウアー分光法による孤立プローブ核の化学反応の研究

RIビームとインビーム・メスバウアー分光法を応用して固体ガスマトリックス中で孤立しているプローブ核の電子状態や反応生成物についての知見を得ることができる。アルゴン、メタン、エチレンの低温ガスマトリックス試料を作製し、これらに57Mnを注入して核壊変で生じたFe原子のメスバウアースペクトルを観測した。メスバウアーパラメータとDFT計算から、孤立Fe原子の電子状態やマトリックスとの生成物を考察した。固体アルゴンでは励起状態のFe+(3d7)、固体メタン試料では直線二配位の[Fe(CH4)2]+の異なる2つの構造異性体、固体エチレン試料ではFe(C2H4)を帰属し、これらの生成機構を明らかにした。我々が開発したインビーム・メスバウアー分光法は、典型的メスバウアー核種である57Feの短寿命親核57Mn(半減期1.45分)をプローブ核として試料中に直接注入しながらその場でメスバウアースペクトルを測定する高感度の分光法である。本分光法では、極希薄濃度の条件下でのプローブ核の電子状態や化学状態についての知見を発光メスバウアースペクトルから得ることができる。本年度は、放医研HIMACの二次ビームコースで57Mnビームを使った57Feインビーム・メスバウアー分光実験を行なった。まず孤立したプローブ核の単原子反応を研究するため、低温希ガス固体(ArとXe)中に注入した57Mnのインビーム・メスバウアースペクトルを測定した。ガス固体試料作製の時における不純物の凝集を可能な限り排除するために十分真空排気した後、真空度1Eー3 Pa程度を保持しながら希ガスをマスフローコントローラで制御しながら、液体ヘリウムで18 Kに冷却されたAl基板上に凝集させてガス固体試料を作製した。これらをマトリックスとして、57Mnイオンを注入しながら核壊変後生成した57Feの励起準位から放射されるメスバウアーガンマ線を平行平板電子なだれ型検出器を用いてインビーム・メスバウアースペクトルを観測した。得られたメスバウアーパラメータとORCAプログラムの分子軌道計算結果から、Fe原子の電子状態を考察した。アルゴン固体に注入した57Mnインビーム・メスバウアースペクトルには57Fe(I)(3d7)のみが得られた。これはβ壊変によって格子欠陥を作らないこととアルゴンと鉄イオン間の電荷移動によって励起状態である57Fe(I)(3d7)のみが得られたと説明できた。キセノン固体中では自由電子の移動が無視できなくなるため、基底状態の57Fe(I)(3d64s)の他、中性のFe(0)(3d64s2)とFe(0)(3d74s)が観測された。57Mnビームを用いたインビーム手法により新奇化学種の合成研究への発展が十分に可能であることが示された。我々の開発したインビーム・メスバウアー分光法は、典型的メスバウアー核種57Feの短寿命親核57Mn(半減期1.45分)をプローブ核として試料中に直接注入しながら、その場で発光メスバウアースペクトルを測定する高感度な分光法である。得られたメスバウアーパラメータから、極希薄濃度で孤立しているプローブ核の電子状態や化学状態、配位環境、動的振る舞いについての知見を得ることができる。本年度も昨年に引き続き、放射線医学総合研究所重イオン加速器HIMACの二次ビームコースで57Mnビーム用いた57Feインビーム・メスバウアー分光実験を行なった。孤立原子の化学反応や化学結合を調べるために、メタンとアルゴンの混合ガスの原子数比を変化させて低温ガスマトリックス試料を18 Kで作製した。これらに57Mnを直接イオン注入し、β壊変後に生成した57Feの第一励起準位から放出する14keVのγ線を平行平板電子なだれ型検出器を用いて、インビーム・メスバウアースペクトルを観測した。得られたメスバウアーパラメータとORCAプログラムによるDFT計算から、Fe原子の電子状態やメタン分子との化学結合を考察した。メタン濃度100 %のマトリックスで得られたスペクトルには、アイソマーシフトI.S.と四極分裂Q.S.の異なる2成分のFeの化学状態が示された。この成分は、直線二配位の[Fe(CH4)2]+であり、Fe原子とメタン分子の結合角の異なる2つの構造異性体であることを明らかとした。メタンとアルゴンの混合比を変化させると、昨年報告したように、励起状態のFe+(3d74s0)の成分がスペクトルに現われた。現在、CH4/Ar比と[Fe(CH4)2]+生成率の関係について検討している。我々の開発してきたインビーム・メスバウアー分光法は、典型的メスバウアー核種57Feの短寿命親核57Mn(半減期1.45分)をプローブ核として直接試料にイオン注入しながら、その場で発光メスバウアースペクトルをオンライン測定する研究手法である。得られたメスバウアーパラメータとDFT計算より、極希薄濃度で試料中に孤立している57Feプローブ核の電子状態や配位環境、動的振る舞いについての知見を得ることが可能である。本年度も昨年度に引き続き、放射線医学総合研究所重イオン加速器施設

HIMACの二次ビームコースで57Mnビームを用いた57Feインビーム・メスバウアー分光実験を継続して行なった。エチレンとアルゴンの混合ガスを18 Kに冷却した金属基板に凝集させた低温ガスマトリックスを測定対象とした。これに、57Mnを直接イオン注入し、57Mnのβ壊変後に誕生する57Feの第一励起状態から放出した14.4keVのγ線を平行平板電子なだれ型検出器を用いてインビーム・メスバウアースペクトルを観測した。得られたメスバウアーパラメータ(異性体シフト、四極分裂)とDFT計算結果を合わせて、57Fe原子とエチレン分子との化学結合と生成化学種について考察を行なった。今回の実験で得られたスペクトルは、Fe(C2H4)とFe(C2H4)2の2種類の化学種に帰属することができたと考えている。また、57Mnのβ崩壊で放出するβ線とメスバウアーγ線のβ-γ同時計数法を開発し、β崩壊後の時間を分割したインビーム・メスバウアースペクトルの観測にも成功した。これにより、マトリックス分子との化学反応をナノ秒オーダーの時間で追跡することが可能となった。RIビームとインビーム・メスバウアー分光法を応用して固体ガスマトリックス中で孤立しているプローブ核の電子状態や反応生成物についての知見を得ることができる。アルゴン、メタン、エチレンの低温ガスマトリックス試料を作製し、これらに57Mnを注入して核壊変で生じたFe原子のメスバウアースペクトルを観測した。メスバウアーパラメータとDFT計算から、孤立Fe原子の電子状態やマトリックスとの生成物を考察した。固体アルゴンでは励起状態のFe+(3d7)、固体メタン試料では直線二配位の[Fe(CH4)2]+の異なる2つの構造異性体、固体エチレン試料ではFe(C2H4)を帰属し、これらの生成機構を明らかにした。短寿命不安定核57Mnプローブを用いた本研究は、従来の長半減期57Coの発光実験では得られていない化学種の同定に成功した。このことは、壊変様式の相違、57Mnはβー壊変で57Coでは電子捕獲である。EC壊変によるオージェ過程の影響が原因であると考えられる。今回得られた研究成果は、京都大学原子炉実験所専門研究会において講演発表をした。また、現在論文発表に向けてまとめており、2015年夏に開催されるメスバウアー効果の応用に関する国際会議(ICAME2015)で発表を予定している。昨年同様に、放医研HIMAC課題審査委員会からはA評価を頂いた。量子ビーム科学CH4/Ar混合ガス固体での時間分割測定をしたので、そのデータから孤立プローブの電子状態や反応過程のナノ秒時間変化を解析する。孤立原子の化学反応における電子ダイナミクスの知見を得る。平成27年度も放医研HIMAC課題審査委員会からビームタイムが承認され、研究が進展できる環境にある。測定温度をより低温の4.2 Kにした場合に[Fe(CH4)2]+の構造異性体の占有比が変化するかを観測する。不安定核57Mnビームを用いた本研究は、従来の57Coを使った発光実験では得られなかった結果を示した。壊変様式の相違とそれに伴うオージェ過程の影響が原因であると考えられる。今回得られた研究成果は、メスバウアー効果の応用に関する国際会議(ICAME2013)での口頭発表や、Chemical Rhysics Letter誌ならびにHyperfine Interactions誌で報告した。β-γ同時計測法による時間分解メスバウアー分光の開発についても、イオン源国際会議(ICIS13)やアジア太平洋放射化学国際シンポジウム(APSORC)で発表した。以上のことから、本研究は順調に進展していると考える。
DNA二本鎖切断損傷の非侵襲生体イメージング法の開発：次世代DSBセンサーマウス

細胞死、細胞老化、発ガン等の原因となるDNA二本鎖切断(DSB)はヒトを含む生物にとって最も危険なDNA損傷である。培養細胞の実験から、培養細胞では損傷直後からDSBセンサータンパク質がDSBを検知し修復を開始することが明らかになってきた。従って、DSBは生体内でも損傷直後から修復を開始されると予想されるが、生体内でDSBを検出する方法は確立されていない。哺乳動物のDSBは非相同末端結合(NHEJ)と相同組み換えの2つの修復機構で修復されると考えられているが、ヒトを含む哺乳動物の生体では主にNHEJ修復機構により修復されていると予想される。本研究では、生体で損傷直後からDSBを検出し解析するために、生体でリアルタイムに検出しトレースするための次世代DSBセンサーマウスを開発することを目指した。初年度はマウス個体の解析を行うための基礎実験を進めた。また、それまでに作出したGFP-XLFを安定発現するマウスの系統化と保存を行なう目的で、GFP-XLF発現♂とC57BL/6J♀マウスを交配し導入遺伝子が伝達されたGFP-XLF発現♂産仔の精子を凍結保存した。また体外受精を行い受精卵を凍結保存した。次年度以降はマウス個体での解析を行うための基礎実験を進めるとともにGFP-XLF発現マウスの解析を進め、マウス組織の中でDSBを誘導することに成功し、NHEJ修復機構で働くGFP-XLFが誘導したDSBに集積する様子の可視化に成功した。加えて、細胞内の構造をより詳細に検出するためのマウスを作出するために、赤色蛍光タンパク質DsRedを全身発現するマウスと交配し、産仔の中から2つの導入遺伝子を発現するマウスを得たので解析を進めた。以上、これまで解析ができなかった生体内DNA損傷修復に関する研究に本研究で作成したマウスは役立つと期待される。放射線が誘発するDNA二本鎖切断(DSB)は最も危険なDNA損傷で、体内の細胞でも損傷直後から認識され修復を開始されると予想されるが、生体内でDSBを検出する方法は確立されていない。本研究では、生体で損傷直後からDSBを検出し解析するために、DSBと核(染色体)とミトコンドリア構造変化を生体でリアルタイムに検出しトレースするための次世代DSBセンサーマウスを開発することを目指している。本年度は、マウス皮膚におけるDSB修復蛋白質の発現解析を行うための基礎実験等を開始した。また、これまでに作出したGFP-XLFを皮膚表皮基底細胞で安定に発現するマウスの系統化と精子の保存を行う目的で、GFP-XLF発現♂マウスとC57BL/6J♀マウスを交配し、得られた産仔の中から導入遺伝子が伝達されたGFP-XLF発現♂マウスを選択した。このマウス系統の精子は、次年度以降に凍結保存する予定である。年度当初に研究代表者の所属等が変更になったこと、次年度の大きな組織改編に向けた各種調整があったためにやや遅れている。本年度は、マウス個体の解析を行うための基礎実験を進めた。また、これまでに作出したGFP-XLFを皮膚表皮基底細胞で安定に発現するマウスの系統化と保存を行なう目的で、GFP-XLF発現♂マウスとC57BL/6J♀マウスを交配した。得られた産仔の中から導入遺伝子が伝達されたGFP-XLF発現♂マウスを選択し、精子を凍結保存した。また、一部の精子は、過排卵処理したC57BL/6J♀マウスの卵子と体外受精を行い、得られた受精卵の中から2細胞期まで発生した受精卵を凍結保存した。(理由)本年度は、年度当初に研究代表者の所属等が変更になったこと、所属する組織で統合を含む大きな組織改編があったこと、所属施設のマウス飼育施設で感染症の問題が発生したこと等から、マウス飼育が思うようにできず、やや遅れている。X線等の放射線やある種の抗がん剤により誘発される様々なDNA損傷の中で、細胞死、細胞老化、変異や発ガン等の原因となりうるDNA二本鎖切断(DSB)はヒトを含む生物にとって最も危険なDNA損傷であると考えられている。他者や私たちのこれまでの培養細胞を材料とした実験から、培養細胞ではDNA損傷直後からDSBセンサータンパク質がDSBを検知し修復を開始することが明らかになってきた。従って、DSBは生体内の細胞でも損傷直後からDSBセンサータンパク質に認識され修復を開始されると予想されるが、生体内でDSBを検出する方法は確立されていない。ヒトを含む哺乳動物のDSBは、非相同末端結合(NHEJ)と相同組み換え(HR)の2つの修復機構で修復されると考えられているが、ヒトを含む哺乳動物の生体では主にNHEJ修復機構により修復されていると予想される。

本年度は、引き続き、マウス個体での解析を行うための基礎実験を進めた。また、これまでに作出したDNA修復タンパク質と緑色蛍光タンパク質を付加したGFP-XLFを皮膚表皮細胞で安定に発現するマウスの解析を進めるとともに、細胞内の構造とその変化をより高感度に検出するためのマウスを作出するために、同マウスに赤色蛍光タンパク質DsRedを全身で発現するマウス(CAGGS-DsRed)を交配した。そして、得られたマウス産仔の中から2つの導入遺伝子を発現するマウスをスクリーニングし、解析を開始した。本年度は、年度途中に研究代表者の所属等が変更になったこと、所属する組織で統合を含む大きな組織改編後の調整の影響から、諸手続きが遅れたことなどのためにやや遅れている。細胞死、細胞老化、発ガン等の原因となるDNA二本鎖切断(DSB)はヒトを含む生物にとって最も危険なDNA損傷である。培養細胞の実験から、培養細胞では損傷直後からDSBセンサータンパク質がDSBを検知し修復を開始することが明らかになってきた。従って、DSBは生体内でも損傷直後から修復を開始されると予想されるが、生体内でDSBを検出する方法は確立されていない。哺乳動物のDSBは非相同末端結合(NHEJ)と相同組み換えの2つの修復機構で修復されると考えられているが、ヒトを含む哺乳動物の生体では主にNHEJ修復機構により修復されていると予想される。本研究では、生体で損傷直後からDSBを検出し解析するために、生体でリアルタイムに検出しトレースするための次世代DSBセンサーマウスを開発することを目指した。初年度はマウス個体の解析を行うための基礎実験を進めた。また、それまでに作出したGFP-XLFを安定発現するマウスの系統化と保存を行なう目的で、GFP-XLF発現♂とC57BL/6J♀マウスを交配し導入遺伝子が伝達されたGFP-XLF発現♂産仔の精子を凍結保存した。また体外受精を行い受精卵を凍結保存した。次年度以降はマウス個体での解析を行うための基礎実験を進めるとともにGFP-XLF発現マウスの解析を進め、マウス組織の中でDSBを誘導することに成功し、NHEJ修復機構で働くGFP-XLFが誘導したDSBに集積する様子の可視化に成功した。加えて、細胞内の構造をより詳細に検出するためのマウスを作出するために、赤色蛍光タンパク質DsRedを全身発現するマウスと交配し、産仔の中から2つの導入遺伝子を発現するマウスを得たので解析を進めた。以上、これまで解析ができなかった生体内DNA損傷修復に関する研究に本研究で作成したマウスは役立つと期待される。やや遅れている実験を加速すると共に、H28年度に行う予定の研究を並行して進める。今後の推進方策:遅れている実験を推進するために、マウス個体数を増加させる。同時に、H29年度に行なう予定の研究を進める予定である。遅れている実験を推進するために、マウス個体数を増加させる。予定していた研究計画が前記の理由でやや遅れたため、次年度使用額が生じた。次年度使用額が生じた理由:上記の理由で、予定していた研究計画がやや遅れたため、次年度使用額が生じた。(理由)次年度使用額が生じた理由:上記の理由で、予定していた研究計画がやや遅れたため、次年度使用額が生じた。(使用計画)次年度に遅れている研究を実施するために、繰り越した研究費は使用する予定である。
バラ科果樹における自家不和合性の分子の解析

自家不和合性は雌ずいが「自己」花粉を認識・拒絶する遺伝的機構で、他家受精を促進する事を通じて集団の遺伝的多様性の維持に役立っていると考えられている。自家不和合性を示すナシ・リンゴなどの果樹では、安定した果実生産のために人工的な他家受粉を必要とするため、その分子機構の解明は農学的にも重要な課題である。また、好適な受粉樹の選定のため、自家不和合性遺伝子型(S遺伝子型)の信頼でき且つ簡便な同定法の確立も望まれている。今年度は、黒星病などの抵抗性育種の素材として有望視されているナシ品種「巾着」および「大原紅」用いた耐病性育種における基礎的知見を得る目的で、これら品種のS遺伝子型を解析した。「大原紅」のS-RNase遺伝子を解析したところ、S_eS_9であることが判明した。「巾着」のS-RNase遺伝子を既存の方法で解析したところ、S_4遺伝子の存在は確認されたものの、もう一つの対立遺伝子を検出する事ができなかった。自家不和合性のナシがS遺伝子型ホモである可能性は低い事から、「巾着」は既存の方法では検出されない未知の対立遺伝子を持つものと予想された。「巾着」の雌ずいからRNAを抽出してRT-PCRおよびRACEを行った結果、新規のS-RNase cDNAが単離され、この遺伝子をS_k-RNaseと命名した。S_k-RNaseの配列も考慮した新しいプライマーを用いたPCR-RFLP分析により、S_k-RNaseを含めたナシのS遺伝子型判定が可能である事が示された。これらの結果はBreeding Science (2007)57:159-164に掲載された。ナシは自家不和合性を示すため自家受粉では結実せず、栽培現場では和合性品種花粉の人工授粉を行っている。好適な受粉樹を選択する上で、ナシ品種の自家不和合性遺伝子型(S遺伝子型)は必須の情報である。ナシ品種「巾着」「大原紅」は黒斑病抵抗性を持つ貴重な遺伝資源として知られているが、それらのS遺伝子型は不明である。同様にS遺伝子型が不明な品種「若光」「なつひかり」を含め、これらナシ品種のS遺伝子型の分析を試みた。これまでナシのS遺伝子型の分析は、雌ずいS遺伝子であるS-RNase遺伝子の分析によってなされてきた。既存のS-RNase遺伝子分析法で解析したところ、「若光」「なつひかり」は共にS^3S^4と判定された。「大原紅」は「晩三吉」(S^5S^7)×「Max Red Bartlett」(セイヨウナシ;S^eS^i)の交雑由来とされている。しかしながら、「大原紅」の分析の結果、「Max Red Bartlett」由来の8対立遺伝子は検出されたものの、S^5もS^7も検出されず、S^9対立遺伝子が検出された。SSRマーカーの分析によって、「Max Red Bartlett」は「大原紅」の親であるが「晩三吉」は親ではない、とした最近の報告があり、本研究の結果はこの結論と一致した。「巾着」については、既存の分析法では、S^4遺伝子のみが検出された。自家不和合性のナシにおいては、S遺伝子型ホモ(S^4S^4)の可能性は低いため、「巾着」は未知のS対立遺伝子を持つものと考えられた。予想される新規S-RNase遺伝子を単離するため、「巾着」の雌ずいRNAを用いてRT-PCRを行ったところ、データベースに未登録の新規な配列が得られた。RACEによって完全長cDNA配列を決定し、この遺伝子をS^k-RNaseと命名した。既存の方法でS^k-RNase遺伝子断片が増幅されなかったのは、リバースプライマーとS^k_-RNase遺伝子の相同性が低いことに原因があると考えられた。S_k-

RNaseの配列も考慮した新しいプライマーを用いたPCR-RFLP分析により、S_k-RNaseを含めたナシのS遺伝子型判定が可能である事が示された。これらの結果はBreeding Science (2007)57:159-164に掲載された。
VDRリガンド結合領域との相互作用を制御する作用選択薬の創製

CD環を化学修飾したビタミンD誘導体として、収束的な合成法により、いくつかの新しい15位置換誘導体の合成を達成した。本合成で確立した合成ルートは種々の誘導体合成に適用可能な汎用性の高いルートであり、合成効率が高く、今後の新しい誘導体合成につなげることが可能である。得られた誘導体は、それぞれVDR結合親和性や骨芽細胞へのオステオカルシン転写活性等の各種生物活性評価、VDR-リガンド複合体のX線共結晶構造解析を行った。本年度は、ビタミンD誘導体における構造修飾のハイブリッド効果について考察するために、A環部位の化学修飾について、特に2位置換基の代謝について検討を行った。VDR結合親和性の向上や各種生物活性の変化に効果的な構造修飾モチーフである2α-ヒドロキシプロポキシ基はCYP24A1に対し高い代謝抵抗性を示すが、CYP3A4により切断されることが分かった。そこで代謝物候補化合物を化学合成し、それらを比較同定した。この2位置換誘導体の代謝過程の解明は、医薬品リード化合物獲得を目的とする今後のリガンドデザインに大きく寄与するものである。研究期間全体を通じて、CD環を化学修飾したビタミンD誘導体として、A環前駆体とCD環前駆体をそれぞれ合成しそれらを結合する収束的な合成法により、いくつかの新しい15位置換誘導体の合成を達成した。また合成ルートの途中に用いる反応を変えることで、近年抗がん活性で注目される別の誘導体も合成することができた。さらに15位アルキル置換誘導体についてもまだ限定された構造ではあるものの、その合成を達成した。得られた誘導体は、それぞれVDR結合親和性や骨芽細胞へのオステオカルシン転写活性等の各種生物活性評価、VDR-リガンド複合体のX線共結晶構造解析を行うことができ、それら誘導体における構造と活性の関係をVDR-リガンド複合体のレベルで考察することができた。ビタミンD誘導体の15位置換についてはこれまでに報告例がなく、本研究課題の成果は、ビタミンD誘導体の新しい修飾部位として15位置換の可能性を提案し、VDRモジュレーターの候補化合物獲得に貢献するものである。本年度はセコステロイドCD環の化学修飾として、まずこれまでに合成を達成した15α-ヒドロキシ体の合成中間体を基に他の15位置換誘導体を合成した。誘導体合成はA環前駆体とCD環前駆体を別途合成し、それらを結合し収束的に行った。15α-ヒドロキシ体の合成におけるCD環前駆体の合成に従い、ビタミンD2より誘導したtrans-ヒドリンダン骨格を有する化合物を出発物質とし、アルケニルエポキシド経由で活性型ビタミンD3側鎖に相当するユニットの銅試薬を用いたSN2'型の炭素-炭素結合形成反応により重要な合成中間体へと導いた。本反応により立体選択的な20位の側鎖導入と共に、エポキシドの開環に伴い15α-水酸基が得られた。さらに種々の反応を経て、目的のCD環前駆体を合成した。またC16-17位間アルケンの立体選択的な水素添加反応を行なわないことで、近年抗がん活性で注目される16-ene型誘導体を合成した。合成では種々の誘導体合成に適用可能な汎用性の高いルートを確立するために合成効率についても探求し、立体選択性、収率などにおける反応条件の最適化を行った。得られた誘導体についてHPLC精製後、VDR結合親和性や骨芽細胞へのオステオカルシン転写活性等の各種生物活性評価を行った。またVDR-リガンド複合体のX線共結晶構造解析を行い、それら誘導体における構造と活性の関係をVDR-リガンド複合体のレベルで考察した。さらに1α,25(OH)2D3を代謝不活性化するCYP24A1による各誘導体の代謝についても同時に検討した。セコステロイドCD環の化学修飾として、A環前駆体とCD環前駆体を別途合成しそれらを結合する収束的な合成法により、新しい15位置換誘導体を合成を達成した。また途中に用いる反応を変えることで、近年抗がん活性で注目される別の誘導体も合成することができた。本合成で確立した合成ルートは種々の誘導体合成に適用可能な汎用性の高いルートであり、合成効率が高く、さらに新しい誘導体合成につなげることが可能である。また、得られた誘導体の各種生物活性評価、VDR-リガンド複合体のX線共結晶構造解析を行うことができ、それら誘導体における構造と活性の関係をVDR-リガンド複合体のレベルで考察することができた。平成24年度は、平成23年度に得られた結果を基にして、引き続き、17位側鎖の短絡化などCD環の他部位修飾との組合せに着手する。合成した各種CD環部位はA環部位と組合せ、さらなる特性の増強を目的とした修飾のハイブリッド効果について検討を行う。

ハイブリッド化については、これまでに報告されているビタミンD誘導体において、最も高活性なA環前駆体とCD環前駆体が最良の組合せとは限らないことを見出しており、特に強力な活性や作用分離能を有するものを基礎とし、可能な組合せについて誘導体を網羅的に合成し、それぞれについて生物活性評価、X線共結晶構造解析、代謝試験を行い、目的の活性プロファイルに対し最も理想的な組合せを見出し、VDRモジュレーターの候補化合物を獲得することを計画している。平成24年度も多くの誘導体合成を目的とし、原料合成に必要な有機合成用試薬と有機溶媒、また合成した化合物の分離精製に必要なシリカゲル等、主に消耗品について研究費を使用する。また広く意見交換をし、有機合成化学及びビタミンD研究の最前線を知るため、国内外の学会で得られた成果を発表予定である。所属研究機関(帝京大学薬学部)は平成23年度後半から平成24年度にかけてキャンパス移転を行っているため、平成23年度使用予定の研究費の一部を平成24年度に繰り越した。
アジアの文化・インターアクション・言語の相互関係に関する実証的・理論的研究

<H15年度>・話者の文化的基盤の顕現を誘発する談話とは」いかなるものかについて、7回の研究会において討論。文化を映し出す言語データの収集の方法を探るため、既存の自然発話データとして、地図コーパス、Call Homeコーパス等を吟味・検討の結果、新たな談話データ収集の必要性を確認。多言語間(日本語、英語、韓国語、中国語)のデータをビデオ映像とDAT録音をし、言語間比較可能な談話データの収集のパイロット・スタディと書き起こしの試作を完了。<H16年度>・前年度にデザインしたデータを収集(日本人とアメリカ人のビデオ映像とDAT録音の収録)。内容は,(1)共同作業の会話,(2)語りの談話,(3)「びっくりしたこと」について自由会話を親疎関係のペアーを日本人で26セット,アメリカ人で22セット,韓国人,中国人を各4セットデータ収録(IRアルトと共同作業)および書き起こし。日本語については(1)漢字かな混じり(2)ローマ字化(3)オーバーラップ等のマーキング。・クローズドワークショップ,合宿等にて収録データの観察,考察,討論を行う。・翌年にイタリアで行われる国際語用論学会に本プロジェクトとしてパネルのプロポーザルを提出し、審査に合格。<H17年度>・クローズドワークショップを行い、データの分析・考察を行う。第9回国際語用論学会(於:イタリア)においてパネル発表。第7回「言語・脳・認知」国際学術フォーラム(日本女子大学・東北大学共同開催)にて発表(於:日本女子大学新泉山館)するなど、国内外に発表。国際クローズドワークショップを2日間行い、オランダ,イギリス,アメリカ,タイから研究者を招聘、本プロジェクトの成果発表のためのJoP特集号の為のプロポーザル内容について共用討論。・HPの開設(Info Archに外注)し、研究成果・データの一般公開の準備。「話者の文化的基盤の顕現を誘発する談話とは」いかなるものかについて、平成15年11月より平成16年3月までの間に7回の研究会を持ち、討論をおこなった。文化を映し出す言語データの収集の方法を探るため、既存の自然発話データとして、地図コーパス、Call Homeコーパス等を吟味検討した結果、新たな談話データ収集の必要性を確認した。アメリカで行われていた、同一刺激に対し、多言語でのナラティヴ談話データとして知られている"Pear Story""Frog Story"のデータを参考にして、"Mr.O"の話をテーマとする多言語間(日本語、英語、韓国語、中国語、タイ語)のデータをビデオ映像とDAT録音で収集するというデータのデザインを決定した。3月上旬に、言語間比較可能な談話データの収集と書き起こしの試作を完了した。談話データは、(1)共同作業の会話(2)語りの談話(3)トピックを与えた自由会話であり、日本語、英語を扱った。3月26日の研究会においては、試作をしたデータをもとに、統一ゴールである論集作成に向けたテーマの検討、分析の観点、書き起こしに盛り込む要素を決定し、次年度の本格研究のための会議をおこなった。27日には、「話者の文化的基盤の顕現を誘発する談話とは?」というテーマで、第13回社会言語科学会において、海外共同研究者2名(岩崎勝一、Scott Saft)を招いてシンポジウムを開催し、本プロジェクトについて、広く一般的に情報公開すると共に、聴衆からのコメントも受けた。「文化・インターアクション・言語」の関わりを明らかにするために,前年度にデザインしたデータを収集し,観察,分析を行った。具体的な研究活動は次の通りである。【1】データ収集(1)5月22日(土),29日(土),6月5日(土),12日(土)/日本人とアメリカ人のビデオ映像とDAT録音の収録を行った。

内容は,(1)共同作業の会話,(2)語りの談話,(3)「びっくりしたこと」について自由会話を親疎関係のペアーを日本人で26セット,アメリカ人で22セット収録(IRアルトと共同作業)(2)7月24日(土)/韓国人,中国人を各4セット上記の上記の内容のデータタ収録(IRアルトと共同作業)(3)(1)(2)をIRアルト(委託業者)で書き起こし。日本語については漢字かな混じりの他にローマ字化。DVDと書き起こしを共同研究者に配布(4)2月/言い重なりを明示する書き起こしをIRアルトに発注。【2】研究活動(1)6月19日(土)クローズドワークショップ/アメリカの言語人類学の第一人者William Hanks教授を招き,本研究プロジェクトの発表(片桐及び院生チーム)をし,コメントをもらうと共に,そのディスカッションを詳細にわたり行う。本プロジェクトのメンバーからWilliam Hanks教授,片岡邦好氏に加え,コーディネーターとして堀江薫氏が参加。(3)8月22日(日)24日(火)/収録データの観察,考察,討論のための合宿を行う。(4)2005年7月10日15日にイタリアで行われる国際語用論学会に本プロジェクトとしてパネルのプロポーザルを提出した。パネル審査に合格。(5)3月4日(金)6日(日)/研究発表会を行い,共同研究者に加え,院生(金井薫,植野貴志子)が本プロジェクトで収集したデータに基づいた分析発表を行った。特に,7月のパネルに向けた発表を意識した検討を重ねた。「文化・インターアクション・言語」の関わりについて、収録したデータの分析・考察の結果を国際学会、ワークショプ国内学会において発表した。また、HPの開設し、研究成果・データの一般公開を順次行っている。【1】研究活動(1)6月18日(土)・19日(日)...クローズド・ワークショップ(於:日本女子大学)/海外協力者Scott Saft氏を招き、研究発表(井出,Scott Saft,片桐,堀江,阿部及び院生)及びディスカッションを行った。(3)3月15日(水)...第7回「言語・脳・認知」国際学術フォーラム(日本女子大学・東北大学共同開催)にて発表(於:日本女子大学新泉山館)/アメリカの言語人類学者William Hanks先生を招聘し、基調講演および各発表に対するコメントをもらった。また海外協力者としてNick Enfield氏,喜多壮太郎氏を迎え、講演及び討論を行い、司会・デモレーターとして本プロジェクトメンバーのメンバー片桐氏、堀江氏及び海外協力者のScott Saft氏、岩崎勝一氏を迎えて行った。(4)3月16日(木)・17日(金)...クローズド・ワークショップ(於:日本女子大学新泉山館)/研究発表会を行い、国内外よりアドバイザーとしてKrisadawan Hogladarom氏、京都大学より菅原和孝氏を招き、ディスカッションを行い、Journal of Pragmaticsへ特集号を2本出すための趣旨を考察した。
水の構造化による細胞の冷温保存における障害低減効果

本課題では,水の構造化による物質輸送の抑制効果に着目し,キセノンガス加圧溶解と2つの板材料の表面間に挟まれた薄膜液の2つのアプローチによる細胞の冷温保存(温度範囲:ー26°C)における障害低減効果を細胞レベルで明らかにすることを目的とした.成果として,第1に,キセノンガス加圧溶解により細胞障害を低減出来ることと,最適な加圧圧力(0.5MPa)と温度(4°C)を明らかにし,第2に,細胞の冷温保存に2枚のガラス板間に挟み込んだ薄膜液(液厚さ約20μm)を利用することで細胞障害を低減出来ることを明らかにした.移植治療や再生医療における需給バランス確保のために,半永久的保存法である凍結保存に耐えられない細胞・組織・臓器が04°Cで冷温保存されている.しかし,冷温では一定の代謝抑制効果が得られる反面,物質不均衡による細胞障害が起こるので保存可能期間が非常に短いのが現状である.従って,物質不均衡の抑制に有効な手段が有れば保存可能期間を延ばすことが出来る.本研究では,水の構造化による物質輸送の抑制効果に着目し,キセノン(Xe)ガス加圧と固体表面を利用した薄膜液の2つのアプローチによる冷温障害低減効果を細胞レベルで明らかにすることを目的とする.本年度は,第1に,単層培養ヒト皮膚繊維芽細胞の冷温保存におけるXeガス加圧による細胞障害低減効果に及ぼす温度の影響を調べた.その結果,ー2°C4°Cの温度範囲,Xeガス加圧圧力が0.5MPaにおいて,4°Cが最も効果的な温度であることが示唆された.また,特に4°Cについては,先行研究(前科研費課題との共通データ)により細胞障害低減効果の時間依存性が調べられており,Xeガスの最適圧力が0.5MPaであることが示唆されていた.そこで,本年度は細胞障害低減効果の時間依存性のデータ数を増やし検討した結果,少なくとも4°Cでは0.5MPaが最適であることが明らかとなった.このことは前課題の成果と合わせて論文発表された.第2に,2枚のガラス板に細胞と培養液(薄膜液)を挟み込むことで細胞内外における水構造化を実現させることによる細胞の冷温保存(4°C)における障害低減効果の有無について保存時間をパラメータとして調べた.その結果,板状ガラスに皮膚繊維芽細胞と共に溶液を挟み込んで水を構造化させることにより、冷温による細胞障害を低減することが示唆された.また,水構造化の程度については薄膜液の厚みと凍結温度の関係を実験により求めることで確認することが出来た.1.キセノンガス加圧実験当初予定していたのは,Xeガスを任意の温度(04°C)と圧力(01.0MPa)で加圧し一定時間(624h)保存した後に細胞活性を評価し,加圧しない場合と比較し,細胞障害低減効果のXeガス添加圧力依存性と温度依存性を検討することであった.実際には,温度範囲がー24°C,圧力が0.4と0.5MPa,時間は18hで冷温保存実験を行い,細胞障害低減効果の温度依存性がある程度明らかとなった.よってほぼ予定通りと言える.また,Xeガスを試料に加圧した状態で観察可能な透明耐圧容器を用いて各条件における水の構造化の程度を探ることを予定していた.しかし,構造化の程度を探るのは最適温度(圧力)条件が明らかになってから遂行すべきことであるため本年度は取り上げなかった.2.固体表面を利用した薄膜液の実験本年度の予定は,最小限度の厚みを得るためカバーガラスを基質として用いて一定の数の細胞を単層培養し,培養液膜中で同じカバーガラスで挟み込んだ試料と挟まない試料で冷温保存を行い,復温後の細胞活性測定により細胞障害低減効果が得られるかどうか検討することであった.これは,細胞障害低減効果が示唆されたためデータ数が少ないもののほぼ予定通りであった.細胞を使わずにカバーガラス2枚に封じ込んだ培養液で液厚をパラメータとして凝固点測定から各条件における水の構造化の程度を探る実験も予定されていた.これも,ある程度明らかとなったことから,これもほぼ予定通りと言える.本研究では,水の構造化による物質輸送の抑制効果に着目し,キセノン(Xe)ガス加圧と固体表面を利用した薄膜液の2つのアプローチによる冷温障害低減効果を細胞レベルで明らかにすることを目的とし昨年度に続き実験を遂行した.本年度は,第1に,昨年からの継続として単層培養ヒト皮膚繊維芽細胞を用いた冷温保存におけるXeガス加圧による細胞障害低減効果に及ぼす温度の影響についてデータを追加し詳細に調べた.その結果,温度範囲ー2°C4°C,Xeガス加圧圧力0.5MPaの条件(保存時間18時間)において,4°Cが最も効果的な温度であることが明らかとなった.また,水構造化の程度を探り保護効果のメカニズムを検証するため,温度(ー2°C4°C)をパラメータとして落球法による粘度測定の予備実験を行った.その結果,差は小さかったが4°Cにおける粘度が他の測定温度のものよりも高値となることが示唆された.第2に,2枚のガラス板を固体表面として用い,片方のガラス板表面に培養した単層ヒト皮膚繊維芽細胞と薄膜状の培養液をもう1枚のガラス板で挟み込むことで細胞内外における水構造化の実現を狙った試料の冷温保存(4°C)における細胞障害低減効果について調べた.

昨年度よりも作成方法を改善し,ガラス板に挟み込む液厚をより一定値(約10マイクロメートルに制御)に揃えた試料と挟み込まない試料を用いて保存時間(048時間)をパラメータとして詳細に検討した.その結果,保存時間が18時間以上の条件において,板状ガラスに皮膚繊維芽細胞と共に溶液を挟み込んだ試料の方が挟み込まない試料(コントロール試料)よりも冷温による細胞障害が低減されることが明らかとなった.1.キセノンガス加圧実験当初予定していたのは,Xeガスを温度範囲ー24°C,加圧圧力0.4,0.5MPaの条件で一定時間(18時間)冷温保存した後に細胞活性を評価し,加圧しない場合と比較することで,細胞障害低減効果のXeガス添加圧力依存性と温度依存性を検討することであった.実際には,昨年度のデータに本年度のデータを加えることで細胞障害低減効果の温度依存性を明らかにすることが出来た.よってほぼ予定通りである.また,Xeガスを試料に加圧した状態で観察可能な透明耐圧容器を用いて落球法により各条件における粘度測定から水の構造化の程度を探ることも予定していた.実際には,予備実験を行い4°Cにおける粘度が他の温度のものよりも少しだけ高くなることが示唆されたため,これもほぼ予定通りと言える.2.固体表面を利用した薄膜液の実験本年度の予定は,播種細胞数と液膜の厚さが制御された実験試料作りを確立し,培養液膜中で同じカバーガラスで挟み込んだ試料と挟まない試料で冷温保存を行い,復温後の細胞活性測定により細胞障害低減効果が得られるかどうか昨年よりもデータ数を増やすことを含めて詳細に調べることであった.このことについては,試料作りを確立することが出来,しかも,細胞障害低減効果が示されたため,ほぼ予定通りであったと言える.本研究では,水の構造化による物質輸送の抑制効果に着目し,キセノン(Xe)ガス加圧と固体表面を利用した薄膜液の2つのアプローチによる冷温障害低減効果を細胞レベルで明らかにすることを目的とし昨年度に続き実験を遂行した.本年度は,第1に,昨年からの継続として単層培養ヒト皮膚繊維芽細胞を用いた冷温保存におけるXeガス加圧による細胞障害低減効果の温度依存性について,Xeガス加圧圧力0.5MPa,保存時間18時間の条件において,特に4°C付近の温度(3,4,5,6°C)について細かく調べた.その結果,昨年と同様に4°Cにおいて最も細胞障害低減効果が高くなる,つまり冷温保存における最適温度であることが確かめられた.また,研究期間の成果として,細胞の冷温保存におけるXeガス加圧による細胞障害低減効果と,最適な加圧圧力(0.5MPa)と温度(4°C)が明らかになった.第2に,2枚のガラス板(細胞培養用カバーガラス)を固体表面として用い,片方のガラス板表面に培養した単層ヒト皮膚繊維芽細胞と薄膜状の培養液をもう1枚のガラス板で挟み込むことで細胞内外における水構造化の実現を狙った試料の冷温保存における細胞障害低減効果の温度依存性(温度範囲:-26°C)について調べた.試料作製方法を改善し,ガラス板基質に播種する細胞数を昨年度の約2倍に増やし,挟み込む液厚さを約20μmに揃えた試料と挟み込まない試料を用いて,保存時間18時間の場合の冷温保存後の細胞活性を検討した.その結果,温度が高くなるにつれて冷温による細胞障害低減効果も僅かに高くなる傾向になった.また,研究期間の成果として,細胞の冷温保存にガラス板に挟み込んだ薄膜液を利用することで細胞障害を低減出来ることが明らかになった.
タンパク損傷を起源とする放射線発がん経路

本研究は、放射線発がんが、"DNA損傷→突然変異→細胞がん化"とする古典的な経路(突然変異説)ではなく、"タンパク損傷→染色体異数化→細胞がん化"とする経路が主経路であるとする我々の仮説の是非を検証することを目的として計画した。特に、本提案課題では、放射線発がんの第一標的として、染色体分配装置の安定化に関係するタンパク質成分のうち、テロメア、セントロメアおよび中心体の3種に的を絞り、それらの構造および機能異常が細胞がん化の直接の原因であるかどうかを調べた。本研究には、放射線による細胞がん化、突然変異、および染色体解析を定量的に行うことのできるシリアンハムスター胎児由来(SHE)細胞、および、結果のヒトへの応用を念頭においてヒト由来培養(HE)細胞を併用した。その結果、(1)放射線照射後、悪性形態変換頻度を判定するコロニー形成までの時期のどの時期に染色体の数的異常が現れてくるかを染色体のマルチカラーFISH法等を使って詳細に検討し、染色体異数化が放射線発がんの起源であることが判った。(2)染色体異数化は、中心体の構造・機能異常が原因で生ずることが判った。(3)中心体の構造異常は、放射線によって直接誘導されるのではなく、ミトコンドリアにおける電子伝達経路の恒常性崩壊が原因となって上昇する細胞内酸化ラジカルが原因となっていることが判った。(4)二動原体染色体は、極めて低率であるが染色体構造異常の原因となるが、染色体異数化の原因とはならないことが判った。等の成果が得られた。これらの結果は、発がん経路にDNA損傷を起源としない経路が存在し、その経路が発がんの主計路であることを示唆している。従来、放射線発がん機構としては、「DNA損傷-突然変異-細胞がん化」の経路を辿るとする考え方が支配的であったが、本研究では、これまでの我々の研究成果を基盤に、「タンパク損傷-染色体異常-細胞がん化」という経路を辿る発がん経路が存在し、それが主流であるとする作業仮説を提案し、その是非を検討した。平成19年には、従来のハムスター、ラットおよびマウス胎児細胞に加え、p53遺伝子機能を欠失したマウス由来の胎児細胞を用いて検討したが、その結果、p53遺伝子機能を欠失する細胞は、およそ15細胞分裂時期に迎える分裂寿命を容易に乗り越え、不死化し、30細胞分裂時期に造腫瘍性を獲得することがわかりた。一方、正常なp53遺伝子を持つ細胞は、同様に不死化するものの100細胞分裂期を超えても造腫瘍性は獲得しなかった。造腫瘍性を獲得した細胞では、すべての細胞で染色体が三倍体化していたが、造腫瘍性を示さなかった細胞では、すべての細胞で染色体は四倍体化していた。放射線照射は、不死化の時期に影響を及ぼさなかったが、造腫瘍性の獲得時期をおよそ1/3程度まで促進することがわかった。細胞の不死化の時期には、ミトコンドリア機能の昂進が見られ、細胞内酸化ラジカルが増え中心体を攻撃することがわかった。しかし、その時期を超えると細胞内酸化ラジカル量は低下し安定に維持する。これらの研究成果は、我々の仮説を支持するものであり、細胞がん化に結びつく細胞内損傷は、染色体分配装置を構成する中心体である可能性を示唆する。等の成果が得られた。
感染性ぶどう膜炎の病態形成に関与する長鎖ノンコーディングRNAに関する研究

ヘルペス網膜炎は難治性で視力予後不良となり易いが、近年は新しい治療法は開発されていない。病原体感染において働く長鎖ノンコーディングRNA(lncRNARNA)は多数存在すると考えられている。ウイルス感染した視細胞で働くlncRNAについては報告例は今のところ無い。単純ヘルペスウイルス(HSV)感染系で誘導されるlncRNAを探索し、研究することによって、HSV感染性ぶどう膜炎の病態形成において重要な役割を果たすlncRNAを同定できることが期待できる。さらに、ウイルス感染を促進するlncRNAは、その機能を阻害することでHSV感染性ぶどう膜炎の根本的治療薬となることも期待できる。
水疱性類天疱瘡における疾患特異的水疱形成機序の解明

水疱性類天疱瘡は、自己免疫疾患のひとつである。自己抗体が基底細胞に存在する17型コラーゲン(COL17)に結合後に誘導する補体の活性化や炎症細胞浸潤が水疱形成に重要である。本研究では、自己抗体により基底細胞の自己抗原(COL17)が減少することが重要であり、細胞内に取り込まれ減少していく過程の一部を明らかにした。細胞内では多くのシグナルが次々と活性化されて、最終的にCOL17の取り込みが行われる。特にsmall GTPase関連のシグナルが密接に関与していることを示した。このシグナルの阻害は新しい治療になる可能性がある。1)COL17が減少する主要経路を明らかにする。BP-IgG刺激により培養表皮細胞のCOL17が細胞内に取り込まれ、その後分解・減少する。このCOL17の減少はユビキチンのインヒビターを用いた実験により、COL17の減少が抑制されることからを介したプロテアソーム分解経路であることが示唆された。2)COL17が分解経路でユビキチン系のE3リガーゼのひとつTrim21の関与を明らかにする。Trim21は細胞内のFcレセプターとも言われ、抗体のFc部分と非常に強い結合能を有している。細胞内に抗体と取り込まれたアデノウイルスの除去機構に働く重要な分子である。COL17の細胞内での減少に本分子が関与しているか検証するため、培養表皮細胞にsiRNAを用いてTrim21をノックダウンして同様にBP-IgG刺激を加えた。ノックダウンは3種類のsiRNAを用いて行い、2種類で約70%のTrim21のmRNAの減少を認めたが、1種類は20%の減少効果しかなかった。効率の良かった2種類を混合して行ったが、増幅効果は認めなかった。そこで約70%のmRNA減少が十分にタンパク発現低下につながっているかウエスタンブロットにて確認を行った。2種類の検出抗体を用いて、Trim21の定量を行ったがコントロールsiRNA処理と比べ蛋白レベルでの有意な減少は認めなかった。siRNAによるTrim21のタンパクレベルの低下はわずかであったが、BP-IgG刺激によるCOL17の減少をウエスタンブロットにて検証した。結果は非常に大きな標準偏差となり、現在までのところ有意な結果は得られていない。1)水疱性類天疱瘡における自己抗原である17型コラーゲン(COL17)の細胞内取り込みの機序細胞内に取り込まれる機序がマクロピノサイトーシスという事は知られているが、シグナルの伝わり方は不明である。COL17の細胞内が欠損したHEK293細胞を遺伝子操作にて作成した。通常のCOL17を発現するHEK293とくらべてBP-IgG刺激に対する反応性をウエスタンブロット法で比較したところ、細胞内が欠損した細胞ではCOL17が減少しないことが証明された。2)COL17の減少にTrim21の関与があるか検証するケラチノサイトにsiRNAを用いてTrim21のノックダウンを行ったところTrim21の70%以上の減少が得られた。この細胞を用いてBP-IgG刺激によるCOL17の減少を1)同様に検証した。複数回繰り返したが、Trim21のノックダウンした細胞でCOL17の量に優位な差は認めなかった。さらに、細胞内のシグナルの詳細を検討した。ケラチノサイトにBP-IgG刺激を行いCOL17のリン酸化を検証したところ、優位にCOL17のリン酸化が増加することが示された。リン酸化は数分以内に検出され、比較的速やかに起こり1時間以上持続した。1)の結果と合わせてCP-IgG刺激により、COL17の細胞内のアミノ酸がリン酸化されると推察されるため、in-silicoで予測した可能性の高いアミノ酸を置換した変異COL17-HEK293細胞を作成した。しかし、変異無しの細胞と比べBP-IgG刺激に対する反応に差は認めなかった。ヒトCOL17を発現するマウスを用いてBP-IgG刺激に対するリン酸化阻害剤の治療効果を検討したところ、ex vivoでは一定の抑制効果を認めた。siRNAを用いたTrim21のノックダウン効率が一定せず、mRNAレベルでは70%程度減少しているもののタンパクレベルで有意な減少が得られにくい。Trim21のタンパクをウエスタンブロットで検出するための抗体の感度が悪く条件検討に時間を要している。自己免疫性水疱症マウスを用いた実験に進むためには、細胞を用いた検証実験が必要であり引き続きsiRNAを用いたTrim21のノックダウン効率の改善に取り組み実験を継続する。細胞レベルでの一定の結果が出た後にTrim21ノックアウトマウスを用いた実験に着手する。また、本研究を遂行中にBP-IgGの中にCOL17の減少をきたさない自己抗体が存在することが偶発的に発見されたため、こちらも並行して機序解明に向けて実験を進める予定である。
ナフチルアミン分解菌の分子育種に関する研究

本研究では、既知のPseudomnas putida由来のナフタレンジオキシゲナーゼ遺伝子に、我々が先にクローニングしたAcinetobacter sp.YAA株由来のアニリンジオキシゲナーゼ遺伝子の一部を組み込み、この組換えDNA分子を各種細菌に導入し、発癌性を有するナフチルアミンの分解菌を新規に育種することを目的としている。平成9年度は、組換えDNA分子の構築と大腸菌での遺伝子の発現を目的に、まず、ナフタレン分解菌P.putida PpG1064(NAH)から抽出したナフタレン分解ブラスミドNAHを鋳型として、ナフタレンジオキシゲナーゼ遺伝子nahAaAbAcAdをPCR法により増幅し、これを大腸菌にクローニングした。次いで、アニリンジオキシゲナーゼ遺伝子atdA1A2A3A4A5のうち、アミノ基の認識と脱離に関与すると推定されるA1及びA2蛋白をコードしたatdA1A2遺伝子部分を同様に増幅し、ナフタレンジオキシゲナーゼ遺伝子のnahAcとnahAd間にある制限酵素Sal/I部位に挿入し、大腸菌ヘクローニングした(実験の都合上、挿入位置を変更した)。得られたクローンから組換えブラスミドを抽出し、制限酵素分析を行ったところ、設計した組換えDNA分子が得られたことがわかった。平成10年度は、まず、この大腸菌クローンを用いてナフチルアミン分解試験を行ったところ、残念ながらナフチルアミンの分解能を持たないことがわかった。発現の問題を考慮して、この組換えDNA分子を遺伝子供与株の属するPseudomonas属細菌及びAcinetobacter属細菌へ導入するために、グラム陰性菌用ベクターpKT230へつなぎ換え、Pseudomonas putida KT2440株及びAcinetobacter sp.BD413株に導入を試みたところ、KT2440株の組換え体は得られたが、BD413株への導入には成功しなかった。そこで、KT2440株の組換え体を用いてナフチルアミンの分解試験を行ったが、HPLCでの分析の限りでは、その分解は認められなかった。現在、Acinetobacter sp.BD413株へのクローニングを急いでいる。本研究では、既知のPseudomonas putida由来のナフタレンジオキシゲナーゼ遺伝子に、我々が先にクローニンダしたAcinetobacter sp.YAA株由来のアニリンジオキシゲナーゼ遺伝子の一部を組み込み、この組換えDNA分子を各種細菌に導入し、発癌性を有するナフチルアミンの分解薗を新規に育種することを目的としている。このうち、平成9年度は、組換えDNA分子の構築と大腸菌での遺伝子の発現を検討する予定であった。まず、ナフタレン分解菌P.putida PpG1064(NAH)から抽出したナフタレン分解プラスミドNAHを鋳型として、ナフタレンジオキシゲナーゼ遺伝子nahAaAbAcAdをPCR法により増幅した。得られたDNA断片を定法に従い、E.Coli JM109-pUC19の宿主ベクター系でクローニンダしたところ、シャーレ上で藍色色素を蓄積する多数のクローンが得られた。これは、培地中のトリプトファンから宿主大腸菌によって生成されたインドールが、更にナフタレンジオキシゲナーゼによってインドキシルに変換され、自然酸化でインジゴが生成したものである。従って、クローニングは成功し、大腸菌内でナフタレンジオキシゲナーゼ遺伝子が発現したと考えられる。次に、アニリンジオキシゲナーゼのうち、アミノ基の認識と脱離に関与すると推定されるA1及びA2蛋白をコードしたatdA1A2遺伝子部分を、アニリンジオキシゲナーゼ遺伝子atdA1A2A3A4A5を鋳型として、PCR法にて増幅した。増幅されたDNA断片を先にクローニングしたナフタレンジオキシゲナーゼ遺伝子のnahAcとnahAd間にある制限酵素SalI部位に挿入し、E.Coli JM109へクローニングした(実験の都合上、挿入位畳を変更した)。得られたクローンから組換えプラスミドを抽出し、制限酵素分析を行ったところ、設計した組換えDNA分子が得られたことがわかった。現在、このクローンのナフチルアミン分解能の分析を行っており、平成10年度は更にPseudomonas属細菌及びAcinetobacter属細菌への導入を検討する予定である。

得られたクローンから組換えブラスミドを抽出し、制限酵素分析を行ったところ、設計した組換えDNA分子が得られたことがわかった。平成10年度は、まず、この大腸菌クローンを用いてナフチルアミン分解試験を行ったところ、残念ながらナフチルアミンの分解能を持たないことがわかった。発現の問題を考慮して、この組換えDNA分子を遺伝子供与株の属するPseudomonas属細菌及びAcinetobacter属細菌へ導入するために、グラム陰性菌用ベクターpKT230へつなぎ換え、Pseudomonas putida KT2440株及びAcinetobacter sp.BD413株に導入を試みたところ、KT2440株の組換え体は得られたが、BD413株への導入には成功しなかった。そこで、KT2440株の組換え体を用いてナフチルアミンの分解試験を行ったが、HPLCでの分析の限りでは、その分解は認められなかった。現在、Acinetobacter sp.BD413株へのクローニングを急いでいる。