hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
代謝工学によるアスコルビン酸強化植物の作出に関する研究

アスコルビン酸(ビタミンC,AsA)は動植物の生存に必要不可欠な物質である。本研究では代謝工学によるAsA生合成酵素の発現やAsA生合成経路を最適化し、植物のAsA量の大幅な強化を目指した研究を展開している。最初に低AsA含有植物のAsA量の強化を行うため、AsA量を劇的に向上させるAsA生合成酵素の過剰発現の組み合わせを決定した。次いでアセロラのAsA生合成機構の基礎的知見を得るために、アセロラGDP-L-galactosephosphorylase(GGP)遺伝子プロモーターの活性評価とアセロラGalLDHのミトコンドリア局在シグナルの同定を試みた。アセロラではAsA生合成経路の上流3つ(GDP-D-mannose pyrophosphorylase;GMP、GDP-D-mannose-3',5'-epimerase;GMEおよびGGP)の酵素遺伝子が高く発現していることが明らかになっている。そこで、それら上流3つの酵素に着目して過剰発現によるAsA量を評価した。低AsA含有植物としてトマトを用いて評価した結果、GGPの過剰発現が特に重要であるが、残り2つ酵素遺伝子の共発現もAsA量の強化に必要であることがわかった。一方、下流3つの酵素遺伝子(GDP-L-galactose phosphorylase;GPP、L-galactose dehydrogenase;GDHおよびL-galactono-1,4-lactone dehydrogenase;GalLDH)の共発現ではAsA量の増加は認められなかった。次にアセロラGPP遺伝子プロモーターの活性評価を試みた。シロイヌナズナのプロトプラストを用いてアセロラとシロイヌナズナのGGPプロモーターを比較したところ、アセロラGGPプロモーターはシロイヌナズナと比べて高いことが明らかになった。以上の結果から、植物のAsA量の強化に生合成経路の上流3つの酵素遺伝子の過剰発現が必要であることと、アセロラではAsA生合成酵素遺伝子の上流は高いプロモーター活性を有することが明らかになった。植物のAsA生合成経路は少なくとも6つの酵素が関わっている。そのため、植物のAsA量の強化には、どの生合成酵素に着目する必要があるかを明らかにするために、これまでに我々が開発したシロイヌナズナのプロトプラストを用いた96ウェルフォーマットの一過的過剰発現系を改良して、一過的にAsA生合成酵素を過剰発現させたプロトプラストのAsA量を評価できるようにした。当初は低AsA含有植物であるシロイヌナズナを対象としていたが、より実用を目指した応用研究を展開するためにトマト(マイクロトム)に変更した。トマトのプロトプラストを用いたAsA生合成酵素の過剰発現によるAsA量の評価に関する結果をまとめ、学会発表と共にBioscience, Biotechnology, and Biochemistry誌に発表することができた。さらにアセロラの生合成経路の基礎的知見を得るためにアセロラGGP遺伝子プロモーターを評価し、シロイヌナズナと比べて高いプロモーター活性を有することが明らかになった。さらにアセロラGalLDHの一次構造内にあるミトコンドリア局在シグナルを特定するためにGFP融合GalLDH発現コンストラクトを作製することもできた。そのため、本研究は計画通りに進展したものと考えられる。アセロラAsA生合成酵素の過剰発現については、AsA生合成経路の上流3つの酵素が重要であることがわかったため、今後、これら3つのAsA生合成酵素を過剰発現させるための植物発現ベクターを作製し、組換え植物の作出を試みることを予定している。またAsA生合成経路の強化にはアセロラの基礎的知見は重要であるため、アセロラGGP遺伝子のプロモーター解析を行い、高発現に関わるシス因子の同定を試みる。今回はシロイヌナズナのプロトプラストを用いてアセロラGGP遺伝子のプロモーター活性を評価したが、種間におけるプロモーター活性を評価するために、アセロラを用いたプロモーター解析系を構築し、GGP遺伝子のプロモーター活性の評価することも検討する。そしてアセロラGalLDHの一次構造内にあるミトコンドリア局在シグナルについても解析する。

次にアセロラGPP遺伝子プロモーターの活性評価を試みた。シロイヌナズナのプロトプラストを用いてアセロラとシロイヌナズナのGGPプロモーターを比較したところ、アセロラGGPプロモーターはシロイヌナズナと比べて高いことが明らかになった。以上の結果から、植物のAsA量の強化に生合成経路の上流3つの酵素遺伝子の過剰発現が必要であることと、アセロラではAsA生合成酵素遺伝子の上流は高いプロモーター活性を有することが明らかになった。植物のAsA生合成経路は少なくとも6つの酵素が関わっている。そのため、植物のAsA量の強化には、どの生合成酵素に着目する必要があるかを明らかにするために、これまでに我々が開発したシロイヌナズナのプロトプラストを用いた96ウェルフォーマットの一過的過剰発現系を改良して、一過的にAsA生合成酵素を過剰発現させたプロトプラストのAsA量を評価できるようにした。当初は低AsA含有植物であるシロイヌナズナを対象としていたが、より実用を目指した応用研究を展開するためにトマト(マイクロトム)に変更した。トマトのプロトプラストを用いたAsA生合成酵素の過剰発現によるAsA量の評価に関する結果をまとめ、学会発表と共にBioscience, Biotechnology, and Biochemistry誌に発表することができた。さらにアセロラの生合成経路の基礎的知見を得るためにアセロラGGP遺伝子プロモーターを評価し、シロイヌナズナと比べて高いプロモーター活性を有することが明らかになった。さらにアセロラGalLDHの一次構造内にあるミトコンドリア局在シグナルを特定するためにGFP融合GalLDH発現コンストラクトを作製することもできた。そのため、本研究は計画通りに進展したものと考えられる。アセロラAsA生合成酵素の過剰発現については、AsA生合成経路の上流3つの酵素が重要であることがわかったため、今後、これら3つのAsA生合成酵素を過剰発現させるための植物発現ベクターを作製し、組換え植物の作出を試みることを予定している。またAsA生合成経路の強化にはアセロラの基礎的知見は重要であるため、アセロラGGP遺伝子のプロモーター解析を行い、高発現に関わるシス因子の同定を試みる。今回はシロイヌナズナのプロトプラストを用いてアセロラGGP遺伝子のプロモーター活性を評価したが、種間におけるプロモーター活性を評価するために、アセロラを用いたプロモーター解析系を構築し、GGP遺伝子のプロモーター活性の評価することも検討する。そしてアセロラGalLDHの一次構造内にあるミトコンドリア局在シグナルについても解析する。
OX40を標的としたアレルギー・自己免疫治療法の開発

目的:アレルギー・自己免疫発症機序におけるCD4+エフェクター細胞は重要な働きをする。OX40シグナルはCD8+T細胞機能や抗体産生にはほとんど影響を与えず、CD4+エフェクター細胞に選択的に関与することから、CD4陽性エフェクターT細胞の産生・生存におけるOX40の役割を明らかにすることにより、OX40を標的としたアレルギー・自己免疫治療法を検討する結果・考察:アレルギー・自己免疫において重要な働きをするCD4陽性エフェクターT細胞の産生には、前期の抗原依存性過程と後期の抗原非依存性過程が存在することが知られている。我々は、OX40L遺伝子導入マウスを用いたCD4陽性T細胞移入実験系において、OX40シグナルがCD4陽性T細胞恒常性維持増殖に促進的に機能することを見出した。また、我々が樹立した阻害性抗OX40L抗体を投与するとCD4陽性エフェクター記憶T細胞の恒常性維持増殖が抑制されるが、さらにそれに加えて抗IL-7受容体抗体を投与すると、CD4陽性エフェクター記憶T細胞の恒常性維持増殖が完全に抑制された。一方、CD4陽性ナイーブT細胞恒常性維持増殖には、上記のようなOX40とIL-7シグナルの相加効果は見られず、恒常性維持増殖におけるOX40とIL-7シグナルの役割は、ナイーブT細胞とエフェクター記憶T細胞とで異なる可能性が示唆された。他方、抗原提示細胞特異的と考えられていたOX40Lの発現が、受容体であるOX40とともに長期生存T細胞上に見られることが明らかとなった。さらに、OX40L-Tgマウスは間質性肺炎と潰瘍性大腸炎を自然発症することから、OX40L-TgマウスとIL-13欠損OX40L-Tgマウスの間質性肺炎および潰瘍性大腸炎発症の程度を、体重減少、組織像を比較した。その結果、IL-13欠損OX40L-TgマウスにおいてはOX40L-Tgマウスに比較して間質性肺炎および潰瘍性大腸炎の発症が抑えられ、体重減少も抑制された。また、OX40L-TgマウスのCD4陽性T細胞をリンパ球欠損RAG-KOマウスに移入すると、間質性肺炎と潰瘍性大腸炎の発症が再現されることを利用して、IL-13欠損OX40L-Tgマウス由来CD4陽性T細胞がRAG2-KOマウスにこれら疾患を再現できるかどうかを検討した結果、CD4陽性T細胞が産生するIL-13が疾患発症に直接的に関与することを明らかにした。以上のことから、OX40-OX40LのシグナルはCD4陽性エフェクターT細胞生存に重要であり、また、OX40/OX40Lの下流においてIL-13が重要な働きをしていることが明らかとなった。従ってOX40を標的とした治療は新たなアレルギー・自己免疫治療法の方向性を示す。以上のことから、OX40-OX40LのシグナルはCD

4陽性エフェクターT細胞生存に重要であり、また、OX40/OX40Lの下流においてIL-13が重要な働きをしていることが明らかとなった。従ってOX40を標的とした治療は新たなアレルギー・自己免疫治療法の方向性を示す。目的:アレルギー・自己免疫発症機序におけるCD4+エフェクター細胞は重要な働きをする。OX40シグナルはCD8+T細胞機能や抗体産生にはほとんど影響を与えず、CD4+エフェクター細胞に選択的に関与することから、CD4陽性エフェクターT細胞の産生・生存におけるOX40の役割を明らかにすることにより、OX40を標的としたアレルギー・自己免疫治療法を検討する。結果・考察:アレルギー・自己免疫において重要な働きをするCD4陽性エフェクターT細胞の産生には、前期の抗原依存性過程と後期の抗原非依存性過程が存在することが知られている。これまで、CD28などのT細胞補助シグナル分子のT細胞恒常性維持増殖への関与は否定的であったが、我々は、OX40L遺伝子導入マウスを用いたCD4陽性T細胞移入実験系において、OX40シグナルがCD4陽性T細胞恒常性維持増殖に促進的に機能することを見出した。また、我々が樹立した阻害性抗OX40L抗体を投与するとCD4陽性エフェクター記憶T細胞の恒常性維持増殖が抑制されるが、さらにそれに加えて抗IL-7受容体抗体を投与すると、CD4陽性エフェクター記憶T細胞の恒常性維持増殖が完全に抑制された。一方、CD4陽性ナイーブT細胞恒常性維持増殖には、上記のようなOX40とIL-7シグナルの相加効果は見られず、恒常性維持増殖におけるOX40とIL-7シグナルの役割は、ナイーブT細胞とエフェクター記憶T細胞とで異なる可能性が示唆された。他方、抗原提示細胞特異的と考えられていたOX40Lの発現が、受容体であるOX40とともに長期生存T細胞上に見られることが明らかとなった。さらにOX40L欠損T細胞の移入実験により、OX40-OX40L結合がT-T細胞相互作用を介して、T細胞生存を促進することを見出した。このことは、CD4陽性T細胞の恒常性維持にT細胞自身の有するOX40Lが自己分泌的に作用している可能性を示唆する。以上の知見から、OX40-OX40LのシグナルはCD4陽性エフェクターT細胞生存に重要であり、従ってOX40を標的とした治療は新たなアレルギー・自己免疫治療法の方向性を示す。目的:間質性肺炎と潰瘍性大腸炎を自然発症するOX40L-Tgマウスでは血清中に高濃度のIL-5とIL-13が検出される。IL-13はアレルギー反応や粘膜臓器(肺や腸管)の炎症に関与するとされるrh2サイトカインである。エフェクターTh2細胞は、in vitroではIL-13を産生するが、生体内炎症反応でのIL-13の産生細胞は種々の候補があり、確定されていない。他方、OX40L-TgマウスをIL-13欠損マウスと交配したところ、(予備実験レベルではあるが)潰瘍性大腸炎発症が有意に抑制された。一方、間質性肺炎の発症にはそれほど影響を与えなかった。そこで、本研究では、アレルギーや組織炎症におけるIL-13の役割を、アレルギー・自己免疫疾患自然発症モデルマウスであるOX40L-Tgマウスを用いて明らかにする。結果・考察:OX40L-TgマウスとIL-13欠損OX40L-
次世代通信網における動画像信号の可変レ-ト符号化に関する研究

非同期転送モ-ド(Asynchronous Transfer Mode:ATM)は,様々な通信接続形態が可能であること,また,統計的多重化により,ネットワ-クリソ-スの有効利用が図られることなどから,次世代ISDN(広帯域ISDN)における情報転送方式として優れた方式と考えられている.このATMを用いた動画像通信においては,ユ-ザはネットワ-クに対してレ-トフリ-なアクセスが可能となり,これまでの伝送レ-ト一定の情報伝送方式から,品質一定の情報伝送方式への転換が図られるため,動画像符号化方式の枠組みを根底から変更する必要がある.本研究では,このような環境下での動画像符号化問題を,符号化モデル構築部とエントロピ-符号化部との2つの機能ブロックに分け,それぞれに適した方式を開発している.第1の符号化モデル構築に関する研究では,空間フィルタ処理に基づく階層的符号化を利用した動画像符号化方式を提案する.これによって可変レ-ト符号化における重要な問題点であるセルの廃棄による品質劣化を効果的に抑えることができる.また,シミュレ-ション実験を行い,提案方式のセル廃棄対策としての有効性を確認した.第2のエントロピ-符号化に関する研究では,国際標準符号化方式にとり入れられるなどして話題となっている算術符号をとりあげ,これを動的構成とすることにより,一般の画像に対する効率的なエントロピ-符号化用符号を開発した.提案する手法では算術符号の符号化パラメ-タである劣勢シンボルの実効確率を2のべき乗の多項和近似した値から選択し,また,符号化パラメ-タの遷移法は符号化静特性および動特性から決定している.シミュレ-ションの結果,本提案方式はエントロピ-符号化用符号として有効であることを確認した.また,最後に本提案の階層的符号化法により,新たな形態の動画像通信の可能性を示している.非同期転送モ-ド(Asynchronous Transfer Mode:ATM)は,様々な通信接続形態が可能であること,また,統計的多重化により,ネットワ-クリソ-スの有効利用が図られることなどから,次世代ISDN(広帯域ISDN)における情報転送方式として優れた方式と考えられている.このATMを用いた動画像通信においては,ユ-ザはネットワ-クに対してレ-トフリ-なアクセスが可能となり,これまでの伝送レ-ト一定の情報伝送方式から,品質一定の情報伝送方式への転換が図られるため,動画像符号化方式の枠組みを根底から変更する必要がある.本研究では,このような環境下での動画像符号化問題を,符号化モデル構築部とエントロピ-符号化部との2つの機能ブロックに分け,それぞれに適した方式を開発している.第1の符号化モデル構築に関する研究では,空間フィルタ処理に基づく階層的符号化を利用した動画像符号化方式を提案する.これによって可変レ-ト符号化における重要な問題点であるセルの廃棄による品質劣化を効果的に抑えることができる.また,シミュレ-ション実験を行い,提案方式のセル廃棄対策としての有効性を確認した.第2のエントロピ-符号化に関する研究では,国際標準符号化方式にとり入れられるなどして話題となっている算術符号をとりあげ,これを動的構成とすることにより,一般の画像に対する効率的なエントロピ-符号化用符号を開発した.提案する手法では算術符号の符号化パラメ-タである劣勢シンボルの実効確率を2のべき乗の多項和近似した値から選択し,また,符号化パラメ-タの遷移法は符号化静特性および動特性から決定している.シミュレ-ションの結果,本提案方式はエントロピ-符号化用符号として有効であることを確認した.また,最後に本提案の階層的符号化法により,新たな形態の動画像通信の可能性を示している.広帯域ISDNにおける伝送交換方式としては,非同期転送モ-ド(ATM)が有力候補に上げられている.ATMを利用して映像伝送を行なう際の問題点として,伝送路におけるオ-バ-フロ-や伝送誤りによるパケットの損失などがあるが,われわれは,このような誤りに対して耐性のある映像伝送方式として,画像のおおまかな情報を先に送る段階的な伝送法を提案している.これらの具体的な実現例としては,帯域分割符号化法や階層的符号化法なでがある。本研究では,まず,帯域分割符号化における主要な問題点の一つである完全再構成FIRフィルタの構成法について新たな提案を行なった。提案方式は,(1)構成フィルタ数が従来の手法の1/2で済むこと.(2)少タップ数のフィルタで完全再構成が可能であることなどの特徴がある.また,本提案方式のフィルタは,直線位相フィルタと非直線位相フィルタの組合せで構成されるため,画像の段階的表示の際に位相歪の問題を引き起こすが,これについては,鏡像関係を利用した線形フィルタの挿入によって計算量の大きな増加をまねくことなく解決できることを示した.さらに,本研究で提案した手法により、階層的符号化と帯域分割符号化とを融合させ,統一的に取り扱えることを明らかにした。次に,符号化効率特性の向上を目的として,現在、高能率エントロピ-符号化用符号として着目されている算術符号をとりあげ、その性能改善に関する研究を行った.最終的には動画像信号への適用を目的としているが,本年度は,その基本的特性を明らかにするため,対象を2値静止画像に限定し,静特性および動特性の両面から最適化を図ることにより算術符号の効率的な動的適応化手法を提案した.シミュレ-ション実験の結果,従来の動的算術符号に比べ96パ-セント程度の符号量で符号化が行えることを明らかにした.非同期転送モ-

ド(Asynchronous Transfer Mode:ATM)は,様々な通信接続形態が可能であること,また,統計的多重化により,ネットワ-クリソ-スの有効利用が図られることなどから,次世代ISDN(広帯域ISDN)における情報転送方式として優れた方式と考えられている.このATMを用いた動画像通信においては,ユ-ザはネットワ-クに対してレ-トフリ-なアクセスが可能となり,これまでの伝送レ-ト一定の情報伝送方式から,品質一定の情報伝送方式への転換が図られるため,動画像符号化方式の枠組みを根底から変更する必要がある.本研究では,このような環境下での動画像符号化問題を,符号化モデル構築部とエントロピ-符号化部との2つの機能ブロックに分け,それぞれに適した方式を開発している.第1の符号化モデル構築に関する研究では,2つの機能ブロックに分け,それぞれに適した方式を開発している.第1の符号化モデル構築に関する研究では,空間フィルタ処理に基づく階層的符号化を利用した動画像符号化方式を提案する.これによって可変レ-ト符号化における重要な問題点であるセルの廃棄による品質劣化を効果的に抑えることができる.また,シミュレ-ション実験を行い,提案方式のセル廃棄対策としての有効性を確認した.第2のエントロピ-符号化に関する研究では,国際標準符号化方式にとり入れられるなどして話題となっている算術符号をとりあげ,これを動的構成とすることにより,一般の画像に対する効率的なエントロピ-符号化用符号を開発した.提案する手法では算術符号の符号化パラメ-タである劣勢シンボルの実効確率を2のべき乗の多項和近似した値から選択し,また,符号化パラメ-タの遷移法は符号化静特性および動特性から決定している.シミュレ-ションの結果,本提案方式はエントロピ-符号化用符号として有効であることを確認した.また,最後に本提案の階層的符号化法により,新たな形態の動画像通信の可能性を示している.
HGFによるEGFR活性型変異陽性肺癌の分子標的薬耐性を克服する個別化医療開発

HGFによるEGFR-TKI耐性に対する新規肺癌治療法を開発し、HGFによる耐性を予測するバイオマーカーを確立することを目的に研究を行った。EGFR変異を有する肺癌細胞株を用いた検討より、HGF-Met阻害薬はHGFによるEGFR-TKI耐性をin vitroのみならずin vivoにおいても克服することを明らかにした。また、日本人EGFR変異肺癌症例から得た臨床検体を用いた検討において、HGFは、EGFR-TKIの獲得耐性のみならず自然耐性をも誘導し、少なくとも今回の日本人EGFR変異肺がん症例においては最も頻度の高い耐性因子であることを示した。さらに、治療前の血漿中HGFがEGFR-TKI治療の効果予測バイオマーカーになる可能性を示した。以上の成果から、HGFはEGFR-TKIを用いた肺癌の個別化医療において重要な標的およびバイオマーカーであることが明らかとなった。上皮成長因子受容体(EGFR)チロシンキナーゼ阻害薬(EGFR-TKI)はEGFR遺伝子変異を有する肺癌に著効を示す重要な分子標的薬であるが、EGFR変異を有するにもかかわらず25-30%の症例ではEGFR-TKIが奏効しない(自然耐性)ことや著効例においても獲得耐性を生じ再燃する(獲得耐性)ことが臨床上の大きな問題となっている。本研究では、HGFによるEGFR-TKI耐性に対する新規治療法を開発するとともに、HGFによる耐性を予測するバイオマーカーを確立し、これらを用いた個別化医療に展開することを目的とし、以下のような成果をあげた。1)肺癌手術検体を用いた解析で、肺癌組織中にはHGFを高発現する線維芽細胞が存在すること、HGFを高発現する線維芽細胞がin vitroおよびin vivoにおいてEGFR遺伝子変異を有する肺癌細胞のゲフィチニブおよびエルロチニブ耐性を誘導することを明らかにした。2)線維芽細胞によるゲフィチニブ耐性は、抗HGF抗体やHGFと受容体METの結合を阻害する物質(NK4)をゲフィチニブと併用することで克服できることを、in vitroおよびin vivoにおいて明らかにした。3)近年、不可逆型EGFRチロシンキナーゼ阻害薬(EGFR-TKI)はゲフィチニブやエルロチニブの獲得耐性機構として最も頻度の高いEGFRの二次的遺伝子変異(T790M)による耐性を克服する薬剤として期待されているが、HGFはゲフィチニブやエルロチニブのような可逆型EGFR-TKIのみならず不可逆型EGFR-TKIに対しても耐性を誘導することを見出した。さらに、抗HGF抗体やHGFと受容体METの結合を阻害する物質(NK4)を不可逆型EGFR-TKIと併用することで克服できることを明らかにした。4)以上のような研究成果をもとに、「分子標的薬に対する感受性が低下している癌の治療薬および分子標的薬に対する感受性を増強する医薬組成物」という発明名称で特許出願した。本研究では、HGFによるEGFR-TKI耐性に対する新規治療法を開発するとともに、HGFによる耐性を予測するバイオマーカーを確立し、これらを用いた個別化医療に展開することを目的としている。本年度は以下のような成果をあげた。1)HGFの受容体であるMetに着目し、その下流シグナル伝達分子PI3KがHGFによるEGFR-TKI耐性に重要な役割を果たしており、治療法的となることを明らかにした。具体的には、HGFによりEGFR-TKI耐性となるマウスの皮下腫瘍モデルにおいて、PI3K阻害薬単独では腫瘍増大を阻止できないがEGFR-TKIと併用することで耐性が解除され腫瘍増大をほぼ完全に阻害できることを示した。さらにその分子機構は、PI3K阻害薬とEGFR-TKIの併用がPI3K-Akt経路を強力に遮断するためであることを明らかにした。2)大阪市立大学のグループとの共同研究において、肺癌患者のEGFR遺伝子変異の有無に関わらず血漿中HGF濃度がEGFR-TKI治療の効果と相関を示すことを報告した。また、免疫染色による肺癌組織中のHGF発現と血漿中HGF濃度は必ずしも相関しなかったことから、臨床的に肺癌患者のEGFR-TKI感受性を予測するバイオマーカーとしては、血漿中HGFが優れている可能性を示した。

今後も、HGFによる耐性を解除する新たな薬剤や、耐性を予測するよりよいバイオマーカーを探索する予定である。上皮成長因子受容体(EGFR)チロシンキナーゼ阻害薬(EGFR-TKI)はEGFR遺伝子変異を有する肺癌に著効を示す重要な分子標的薬であるが、EGFR変異を有するにもかかわらず25-30%の症例ではEGFR-TKlが奏効しない(自然耐性)ことや著効例においても獲得耐性を生じ再燃する(獲得耐性)ことが臨床上の大きな問題となっている。本研究では、HGFによるEGFR-TKI耐性に対する新規治療法を開発するとともに、HGFによる耐性を予測するバイオマーカーを確立し、これらを用いた個別化医療に展開することを目的としている。本年度は、HGFによる耐性の臨床的意義を検討するために、われわれは12施設の共同研究として日本人EGFR変異肺がん症例においてEGFR-TKI耐性を示した症例の組織中のHGF, 790M, Met増幅の頻度を解析した。獲得耐性を示した23腫瘍のうち、HGF高発現は14例(61%)、T790Mは12例(52%)、Met増幅は2例(9%)に認められ、HGF高発現が最も高頻度に検出された。一方、EGFR変異を有するにもかかわらずEGFR-TKIが奏効しなかった45腫瘍において、HGF高発現は13例(29%)、T790Mは0例(0%)、Met増幅は2例(4%)に認められ、HGF高発現が最も高頻度に検出されることが明らかになった。よって、HGFは、EGFR-TKIの獲得耐性のみならず自然耐性をも誘導し、少なくとも今回の日本人EGFR変異肺がん症例においては最も頻度の高い耐性因子であることが示唆された。耐性症例におけるHGFの産生源としては、獲得耐性症例においては全例がん細胞であった。一方、自然耐性症例においてはがん細胞以外に間質の細胞がHGFを高発現している症例が2/13例(15%)あった。また、血液中のHGF測定によりEGFR-TKI感受性を予測しうることも報告できたことから、HGFをバイオマーカーとしたEGFR-TKI耐性の新規治療法開発を今後も行っていく予定である。
腎糸球体足細胞における恒常性維持機構の解明と糖尿病性腎症治療戦略への応用

本研究では、腎臓の濾過装置として重要な役割を果たしている糸球体足細胞が種々のストレスに対して恒常性を維持する機構について検討を行った。酸化ストレス負荷により足細胞骨格の変化が観察されたことを踏まえ、様々な代謝調節機構に関与するSIRT1を足細胞特異的に欠失したマウスを用いて検討を続けた。実験腎炎を誘導すると、SIRT1欠失マウスではより顕著な腎障害を呈した。培養細胞においてSIRT1活性が低下した状態では酸化ストレス下の細胞骨格障害が強く観察された。この機序として、細胞骨格重合に関連するcortactin分子の細胞内局在にSIRT1による脱アセチル化が関与している可能性が示唆された。平成25年度は糸球体足細胞におけるエネルギー関連因子と足細胞恒常性維持機構の相互作用の解析を行った。当研究室で確立した糸球体足細胞特異的SIRT1欠失(SIRT1pod-/-)マウスに対して、マウスにおける足細胞傷害モデルの1つである抗糸球体基底膜抗体モデルを誘導したところ、野生型マウスに同様の疾患モデルを惹起したものと比較して蛋白尿・腎機能・糸球体組織傷害ともにSIRT1pod-/-マウスで増悪が認められた。この欠失マウスでは足細胞特異的なマーカー分子の発現量が低下しており、電子顕微鏡所見でも足細胞傷害が増強していた。SIRT-1欠失が足細胞傷害に及ぼす影響を検討する目的で、研究代表者が分離・確立した温度感受性不死化マウス培養足細胞を用いて検討を行った。抗糸球体基底膜抗体モデルで足細胞に著明な酸化ストレスが認められることを背景として、この培養細胞系においても過酸化水素による酸化ストレス刺激を行ったところ、足細胞の細胞骨格の傷害が惹起された。SIRT1阻害剤を用いてSIRT1活性を低下させた細胞ではこの変化がより顕著となった。この変化には、actin関連蛋白であるcortactinの脱アセチル化による細胞内局在の変化が関与していると考えられた。現在、以上の成果について論文投稿中である。一方、代謝性ストレスに対する足細胞応答と糸球体足細胞におけるオートファジーに起因する細胞応答の変化については上記検討を優先させたため、まだ十分な成果が得られていない。平成24年度は糖尿病関連の代謝性ストレスに対する糸球体足細胞の応答について検討を行った。細胞生物学的に詳細に検討するために研究代表者が分離・樹立したマウス温度感受性培養糸球体足細胞を用いている。I.糖尿病関連の代謝性ストレスに対する糸球体足細胞の応答:糖尿病性腎症に関連するストレスとして、過酸化水素を用いた酸化ストレスの負荷・高グルコース負荷・低酸素負荷をそれぞれ行った。酸化ストレス刺激に関しては、小胞体ストレス応答(分子シャペロン蛋白の発現誘導と小胞体ストレス誘導性細胞死誘導因子であるCHOPの発現誘導)と細胞骨格の変化が観察されており、この確認を行っている。高グルコース負荷に対しては足細胞は抵抗性を示し、明らかな細胞応答の変化を検出することは出来ていない。細胞外からの高グルコース単独の刺激のみでは足細胞の変化をもたらすには不十分な可能性がある。低酸素負荷については強度の刺激に反応してCHOPの発現誘導が認められ、その後の細胞死に至る経路に影響を与えていると考えられている。現在、CHOP以下の分子応答について詳細な検討を試みている。II.オートファジー制御に起因する細胞応答の変化:上記各代謝性ストレスに対するオートファジー誘導について検討を試みた。LC3に対するウエスタンブロット法・LC3に対する細胞免疫染色を試みているが、現時点で抗体と実験条件の最適化に時間を要しており、確実な結果を得るに至っていない。現在、更なる実験条件の検討を行っている。III.エネルギー関連分子と恒常性維持機構の相互作用の解析:研究計画書で平成25年度の計画として記載したエネルギー関連分子(AMPK/SIRT1)の足細胞における役割について予定を早めて検討を始めている。当研究室で確立した足細胞特異的遺伝子改変マウスにおける生化学的変化・病理組織学的変化について検討中である。本研究課題では糸球体足細胞におけるエネルギー代謝・恒常性維持機構を解明し、それを利用した糸球体硬化抑制法の開発を目指し、研究を開始した。まず初めに、糖尿病関連の代謝性ストレスに対する足細胞の応答について検討を行った。酸化ストレス負荷・高グルコース負荷・低酸素負荷を行ったが、酸化ストレス負荷により小胞体ストレス応答と細胞骨格の変化が観察された。低酸素負荷については、強度の刺激に反応して小胞体ストレス応答関連分子であるCHOPの誘導が認められ、その後の細胞死に至る経路に影響を与えることが示唆された。また、これに並行してエネルギー関連分子であるSIRT1の足細胞における役割を早めて検討を行った。

SIRT1欠失マウスを作製し、これに抗基底膜抗体を用いて腎炎を惹起したところ、アルブミン尿・BUN・糸球体障害がいずれも野生株マウスに比べて高度であった。Nephrin, synaptopodin, WT-1のような足細胞優位発現蛋白はSIRT1欠失マウスに腎炎を惹起した場合には発現の低下度が強く、電子顕微鏡で足細胞障害の増強が観察された。培養細胞系での検討において、酸化ストレス下のアクチン細胞骨格障害はSIRT1活性を低下させた足細胞でより強く観察された。このメカニズムを明らかにする過程で、我々はSIRT1によって脱アセチル化を受ける基質の一つであるcortactinに注目した。siRNAによるノックダウン実験やSIRT1活性化薬・阻害薬を用いた実験により、SIRT1の活性化により脱アセチル化したcortactinは核内から核外へと細胞内局在が変化することが観察され、SIRT1によるcortactinの翻訳後修飾がアクチン細胞骨格の維持に寄与するものと考えられた。このように、エネルギー代謝関連分子であるSIRT1の翻訳後修飾機能による足細胞恒常性維持機構を明らかにすることができた。腎臓内科学現在まで、糖尿病関連の各種代謝性ストレスについての検討は相当部分まで進んでおり、詳細な実験条件の確立とそれに対する細胞応答の変化を確認することが出来ている。細胞死や細胞骨格の変化について、これらの現象をもたらす分子生物学的機序の解明を試みているところである。一方、足細胞に対する代謝性ストレスに対してオートファジーが保護的に作用しているという仮説を立てて検討を行っているが、上記記載のとおり、現時点では予定よりもやや遅延している。一方で、エネルギー関連分子SIRT1の検討については、当初は最終年度の課題であったが、遺伝子改変マウスが当研究室で確立したことから優先して検討を進め、上記の通りSIRT1の足細胞特異的な細胞保護的効果とその機序を見出して複数の学会・研究会で発表を行い、論文も投稿中である。現在まで、糖尿病関連の各種代謝性ストレスについての検討は相当部分まで進んでおり、詳細な実験条件の確立とそれに対する細胞応答の変化をマクロ的に確認することが出来た。細胞死や細胞骨格には変化が認められており、これらの現象をもたらす分子生物学的機序の解明を試みているところである。一方で、エネルギー関連分子AMPK/SIRT1の検討については、遺伝子改変マウスが当研究室で確立し解析が進んでいる。このマウスではある疾患モデルにおいて疾患感受性が明らかに亢進しているという結果を得ており、足細胞傷害・糸球体硬化の進行におけるエネルギー関連分子の保護的役割が強く示唆されている。現時点では、研究計画書の初年度に記載した糖尿病性腎症モデル動物よりも優先してこの遺伝子改変モデルの疾患感受性について検討を進めている。エネルギー代謝調節
音である言語の発達過程

言語を学習するため,子どもは発話中の語や句,文などの言語的側面に注意を向け,単語あるいは文レベルのピッチパタンなどは無視しなければならない場合もある。しかし,単語レベルのピッチバタンは,日本語を含むいくつかの言語で単語の区別に用いられ,文レベルのピッチパタンは,話者の感情を言語内容より正確に伝達する場合がある。本研究では,(1)乳児はいつから,どのような手がかりを用いて,モノの名前を,それ以外の発話音声と区別するようになるのか,(2)単語の区別や話者感情の推測に,単語や文レベルのピッチパタン情報を利用するということに関して,日本の子どもはどのような発達経路を示すのか,の解明を目指した。本研究課題の目的は、子どもはどのような手がかりを使って、指示対象を対応づけるべき単語をそうでない音や音声と区別し学習していくのか、また、このような音声の記号化過程において、単語が持つ音響的側面に対する子どもの感受性はどのような発達的変化をとげていくのか、について明らかにすることであった。本年度は、1)単語導入のタイミングが子どもの単語解釈に及ぼす影響、2)隣接する助詞を手がかりとして、初めて耳にした単語を、子どもが統語的にカテゴライズできるようになる時期、3)子どもの単語表象におけるピッチアクセント情報の位置づけ、について検討するため、3歳くらいまでの子どもを対象とした実験を行ってきた。その結果、以下のことが見出された。1)16か月児では、単語音声の導入がオブジェクトの動きと同期したかたちでなされないと、単語音声とイベントとの結びつき自体が不安定なものになる。しかしその一方で、単語音声がオブジェクトの動きと同期したかたちで導入されると、その単語音声は、オブジェクトやその動きなど構成要素どうしが緊密に結びついたイベント全体と結びつけられてしまう。このように、イベントから特定の概念だけを切り出して結びつけ、音声を単語として学習するのは、16か月児にはまだ困難である。2)15か月になるまでに子どもは、新しく耳にした単語のあとに助詞「が」が続くということを手がかりとして、単語を(あとにほかの助詞「は」や「を」が続くのはかまわないが、「る」や「らない」などの動詞活用語尾は来ることが出来ないという意味での)"名詞"に分類できるようになる。3)24か月児は、既知の単語とアクセントの位置のみが異なる単語を、新しいオブジェクトに結びつけ、既知の単語とは別の意味を持つ単語として学習するのは困難である、しかし、3歳ころまでには、このようなことができるようになっている。本年度は、1)単語導入のタイミングやその文法形態が言語始発期の子どもの単語解釈に及ぼす影響、2)母親発話において単語(名詞や動詞)の現れる文法的文脈とその頻度、3)子どもの単語表象におけるピッチアクセント情報の役割、について検討した。1)は、オブジェクトが特定のやり方で運動している場面に対して、日本語のオノマトペ的な音韻形式の新しい語が、「を見て」のような名詞文法フレームに埋め込んで呈示された場合と、そのような文法フレームなしに呈示された場合で、16か月児、18か月児の解釈を比較した。結果、16か月児は、語が文法フレームに埋め込まれて呈示されようと文法フレームなしで呈示されようと、オブジェクトがそのような動きをしているイベント全体に語を対応づけてしまいがちであること、しかし、18か月児は、名詞文法フレームに埋め込んで語が呈示された場合には敢えて、その語を(動きとは独立な)オブジェクトそのものに対応づけるようになることが見出された。すなわち、子どもは18か月ころから、単語の文法形式に応じて、語の意味としてふさわしい概念を選択するようになることが明らかになった。2)は、母親の乳児に対する話しかけのコーパス分析を行った。その結果、具象名詞については、助詞をつけることなく発話されることが大部分であり、助詞がつく場合どの助詞がつくかの頻度は複数の助詞で似たレベルであること、動詞については、「ている」という語尾がつく場合が圧倒的に多く、同じ動詞語幹はいつも特定の語尾とともに用いられる傾向にあり、同じ動詞語幹がさまざまな動詞語尾をとりうることの学習は困難なインプットの分布となっていること、などが示唆された。3)については、24か月児は、既知の単語とアクセントの位置のみが異なる単語を、即座に、既知単語とは異なる指示対象の名称として学習しようとはしないことが見出された。本年度は、1)乳児はいつから助詞を利用して発話から単語(名詞)を切り出すようになるのかを明らかにするための実験を実施、データ収集を進めるとともに、2)言語獲得期の子どもはいつから、対象に対するラベルづけの発話と、対象に対する(好悪などの)態度を表明する発話(感嘆詞など)とを区別して適切にラベルを学習していくようになるのか、また、3)幼児は、言語内容と話す調子(抑揚、音色など)がそれぞれ異なる感情を示唆している発話に出あって、言語内容と話す調子のいずれに基づいて話者の本当の気持ちを読み取ろうとするのか、という問題について検討するための実験パラダイムを開発し、予備的なデータの収集を行った。1)では、日本語環境で育つ子どもは生後15か月までには、助詞「が」を手がかりとして、その直前にある単語を発話の中から適切に切り出せるようになっていることを見出した。

2)については予備的なデータ収集を通じて、子どもは少なくとも生後12か月までには両者を区別し、対象と結びつけるべきラベルは前者の発話のみから学習するようになっている(後者の発話やそこに含まれる単語は発話時に話者の目の前にあった対象と結びつけることはしない)との結果が得られそうであるとの見通しを得た。3)については、実験の結果、幼児期の子どもは、言語内容と話す調子(抑揚)それぞれが示唆する感情が異なる発話を聞いて、主に言語内容にもとづいて話者の気持ちを推測するようなバイアス(レキシカルバイアス)を持つことを見出した。本年度、予定していた研究については予定どおり実施でき、一定の知見を得ることができた。本年度は、これまで実施してきた研究プロジェクトの中でも、1)子どもは、いつから名詞や動詞などの統語カテゴリーを形成するようになるのか、2)子どもはいつから、(「Xがある」などの文フレームを含む)対象オブジェクトに対するラベルづけの発話と、(名づけの文フレームを含まない、感嘆詞など)対象に対する好悪などの態度を表明する発話とを区別して適切にラベルを学習していくようになるのか、という問題の検討をさらに進めるとともに、これまでの研究で得られた知見の発信(学会や学術誌における発表)につとめた。本年度に新たに得られた知見として、1)に関しては、動詞統語カテゴリーの形成に焦点をあてて検討を行うことにより、母親の発話における「動詞がどのような語尾を伴っているか」の分布には偏りが見られ、子どもの形成する最初期の動詞統語カテゴリーは、その分布に影響を受けた、大人の動詞統語カテゴリーより狭いものであることが示唆された。また2)については、前年度までの検討で、12か月児が、「Xがある」といった発話はそのとき話者が注意を向けていたオブジェクトと結び付けるが、「わあ、いいでしょう」などの発話は結び付けないことが示されていた。そこで本年度は、さらに,ラベルづけ条件の刺激ビデオの音声を消して呈示するコントロール条件を実施し、音声がなくなれば、やはり子どもは、オブジェクトに向けられた話者の行動をオブジェクトとは結び付けたりしないことを確認した。つまり、12か月児は、名づけ場面を見たとき、ラベルづけ発話にともなう話者のオブジェクトに対するふるまい方(それに目を向ける、手にとる、など)を手がかりに、それとオブジェクトを結びつけていたのではなく、発話の中のラベルづけフレームを聞き分けた上で、その発話とオブジェクトを結びつけていたことがわかった。言語を学習するため,子どもは発話中の語や句,文などの言語的側面に注意を向け,単語あるいは文レベルのピッチパタンなどは無視しなければならない場合もある。しかし,単語レベルのピッチバタンは,日本語を含むいくつかの言語で単語の区別に用いられ,文レベルのピッチパタンは,話者の感情を言語内容より正確に伝達する場合がある。本研究では,(1)乳児はいつから,どのような手がかりを用いて,モノの名前を,それ以外の発話音声と区別するようになるのか,(2)単語の区別や話者感情の推測に,単語や文レベルのピッチパタン情報を利用するということに関して,日本の子どもはどのような発達経路を示すのか,の解明を目指した。予定していた研究について、予定どおりに実施し、一定の知見を得ることができた。成果を、国内外の学会や学術雑誌に発表していくとともに、これまで得られた見通しに基づいてさらに研究を展開していく。
1980年代ドイツ中等学校の学校経営様式に関する研究

今回の科研費による研究では、ギムナジウムを対象として、1980年代のドイツ中等学校の学校経営様式を明らかにすることを目的とした。ドイツでは1970年代に各州において父母、生徒の学校参加が法制化されて、これを受けて1980年代はその定着が見られた時期にあたる。同時に州によっては総合制学校が導入され、このことによってギムナジウムの位置づけも相対的に変化することとなった。中等学校全体のバランスを見ると、ギムナジウムへの進学者が増加したこともあり、1980年代には質的にも量的にもギムナジウムの役割や機能が変化することになったという点は見過ごせない。こうした中で、ギムナジウムの学校経営様式に関して、その特質として次の点が明らかとなった。すなわち、大学進学を主目的とするギムナジウムでは、とくに教育内容や教育方法に関する事項に関して、父母や生徒の学校参加が活発になされており、これにより学校側も意思形成において父母、生徒との連携・協力を強める傾向にあるという点である。しかしながら今回の研究をとおして、ギムナジウムの学校経営様式は、実科学校、基幹学校、総合制学校といった、他の中等教育の学校における学校経営様式との関連においても把握する必要があることが明らかとなり、ギムナジウムにおける学校経営様式の全体像を明らかにするという点では課題を残している。したがって、今後さらに、他の学校種別における学校経営様式と並行して考察を深めていくという作業が必要となる。これによって、学校経営様式を分析する枠組み自体も、より精緻化することができると考える。
ボツリヌス菌由来のADPリボシル化酵素による神経突起誘導の分子機構の解析

ボツリヌスADPリボシル化酵素C_3はC及びD型ボツリヌス菌より産生される25KDaの菌体外酵素であり、低分子量GTP結合蛋白質の一つrho蛋白質を特異的にADPリボシル化する。rho蛋白質は脳を初めとする神経組織に極めて高含量に存在するがその機能は不明である。今回の研究では、この蛋白の神経細胞での役割とその機能発現の機構を明らかにするため以下の実験を行った。1.C_3酵素を用いるrho蛋白の細胞内機能の解析精製C_3酵素を神経由来の培養細胞、組織に添加しその効果を観察した。その結果PCー12褐色細胞腫細胞やGOTO神経芽腫細胞ではC_3添加に伴いはっきりした核小体をもつ核と大きく多角形の胞体の形成がおこり長い神経突起が誘導されることがわかった。これらの形態変化は細胞内のrho蛋白のADPリボシル化に並行した。神経突起の誘導は、また、ヒヨコ脊髄後根神経節にC_3酵素を添加したときにもみられた。以上の結果はrho蛋白質が神経細胞における分化過程に関与している可能性を示唆するものであった。また、ADPリボシル化がこの蛋白のエフェクタ-反応部位におこることより、この修飾がrho蛋白を介する情報伝達経路を活性化している可能性が示唆された。2.rho蛋白を介する情報伝達経路の解析生理条件下におけるrho蛋白質の情報伝達経路を明らかにするため、この蛋白のGTP総合、GTP水解活性に影響を与える因子を検索した。その結果、副腎上清中にGTP水解活性を亢進する蛋白質を検出し、これを均一にまで精製した。この蛋白(rhoーGAP)は分子量28Kの蛋白で、rho蛋白特異的にGTPaseの活性化をおこし、ras蛋白には無効であった。これはrho蛋白の活性調節因子の一つと考えられ、神経細胞分化、過程に伴う活性の変動などを検討中である。
DNA損傷と合成をモニターするチェックポイント機構

DNA損傷と合成をモニターするチェックポイント機構を解明するため、新しい遺伝子の単離や新たなチェックポイント機構の解明につながる解析を分裂酵母をモデルとして行ってきた。まず、細胞周期のDNA合成期にチェックポイント機能を発揮するcds1遺伝子の下流で働くと思われる分裂酵母の変異株の単離に成功した。まだ、原因遺伝子のクローニングは行っていないが、新たな機能を有する遺伝子である可能性が高い。次に、cds1遺伝子破壊株のDNA合成阻害剤感受性をマルチコピーで回復する遺伝子のスクリーニングを行った結果、分裂酵母のrad25遺伝子とsuc22遺伝子を単離した。DNA損傷のチェックポイントシグナルがどの段階で発信されているかは、現在まで大きな謎であった。抗がん剤を用いた解析から、分裂酵母の除去修復酵素からそのシグナルが発信されていることを明らかにした。新たなチェックポイント制御因子を単離する目的で、M期に強制的に進入する変異株を抑圧する遺伝子のスクリーニングを行った結果、分裂酵母のste9遺伝子を単離した。この遺伝子の破壊株の機能解析から、細胞周期全体を制御するcdc2キナーゼのG1期における阻害因子であることが判明した。このことより、分化と細胞周期を結ぶチェックポイント機構の存在が示唆された。高等動物のcds1ホモログ遺伝子の探索は機能相補スクリーニングや、構造を利用したPCR法を用いて行っているが未だ成功してはいない。
小児慢性炎症性疾患に伴う成長障害の炎症性サイトカイン制御不全からみた解析と治療法

全身型若年性特発性関節炎(sJIA)患児においてみられる成長障害は、全身炎症をもたらすキーサイトカインであるIL-6の軟骨幹細胞増殖抑制作用と、ステロイドの骨伸長抑制作用との双方が影響すると考えられている。抗IL-6受容体抗体であるトシリズマブ(TCZ)はステロイド抵抗性・依存性sJIAの治療に用いられているが、TCZにより治療を行ったsJIA患児について身長・成長速度を調査し、年齢、性別、罹病期間、ステロイド投与量といった各因子との相関を分析したところ、治療開始までの罹病期間と身長標準偏差の逆相関、TCZ開始後のステロイド減量と成長速度の改善の強い相関が明らかになった。難治性全身型若年性特発性関節炎(systemic juvenile idiopathic arthritis: sJIA)は持続する弛張熱、リウマトイド疹、関節炎を三主徴とする全身性炎症性疾患である。長期経過の中で治療にステロイドを用いることもあり、発症と同時に患児の成長が停止することが問題であり、また約7%の患児は感染症などを契機にマクロファージ活性化症候群へ移行して約3日の経過で予後不良となり、炎症を抑制する治療が待ち望まれていた。2000年当初よりわが国で開発された抗IL-6レセプター・モノクローナル抗体(tocilizumab:TCZ)が本症に著しい効果を示し(2008, Yokota S. Lancet)、わが国では2008年に本症への適応が承認され、現在では広く用いられるようになった。ところで、すでに報告したようにIL-6はin vitroの研究で成長板軟骨幹細胞の培養系に添加すると分化・増殖を著しく抑制する(2009, Nakajima S. Cytokine)。TCZはIL-6機能を阻止するので、患児の成長も回復が期待される。そこでTCZを長期にわたり投与したsJIA患児の成長を検討した。TCZを144週以上投与したsJIA 45例のうち38例(84%)は成長を果たした。残りの7例はすでに最終身長に達していたため評価はできなかった。年齢により成長の度合いが異なること、ステロイドの減量速度が症例により異なるなどの問題はあるが、TCZ治療開始後の成長速度には著しいものがあった(2012, Miyamae T. submitted)。現在、ステロイドの影響を除きTCZのみに関わる成長改善の分析を行っている。全身型若年性特発性関節炎(sJIA)の患児にみられる成長障害は、全身炎症をもたらすキーサイトカインであるIL-6によって軟骨幹細胞の増殖が抑制されること、sJIAの治療に用いるステロイドが骨伸長を抑制することの双方が影響すると考えられる。抗インターロイキン(IL)-6受容体抗体であるトシリズマブ(TCZ)は高用量ステロイドに抵抗性もしくは不耐容である難治性sJIAの治療に用いられるが、TCZはIL-6阻害作用とステロイド減量の双方から成長障害の改善に寄与するものと期待されていた。TCZの身長・成長速度に与える影響を検討するために、TCZの投与を開始されているsJIA患児45名について、身長の標準偏差(HTSDS)・成長速度の標準偏差(HVSDS)と、年齢・性別・罹病期間・ステロイド投与量・JIA core setによる治療効果といった各因子の相関について調査した。治療開始までの罹病期間と身長標準偏差は逆相関を示した。またステロイド投与量の減量と成長速度の改善にも強い相関が認められた。(2013, Miyamae T, Modern Rheumatology[epub])本検討においては、TCZによるステロイド減量効果と独立した因子として、sJIAという疾患自体がもたらす成長遅延に対してTCZがどのように寄与するかを明らかにすることができなかった。その理由としては、、ほぼ全ての症例において成長速度に影響を及ぼす程度のステロイドがTCZ開始前に投与されていたことが考えられた。難治性全身型若年性特発性関節炎(s-JIA)において、トシリズマブ(TCZ)の臨床効果は既に立証されている(Yokota S, et al. Lancet. 2008;371:998-1006.)が、本症における成長障害の実態と、それに対するTCZが及ぼす影響について検討した。TCZ治験第III相に登録し、144週(約3年間)まで継続観察し得たs-JIA 45例(男児17例、女児28例、治験開始時8.1±4.2才、平均罹病期間4.1±3.2年)を対象とした。TCZは6週間のopen-label phase (実薬8mg/kg, 2週毎に3回投与)に引き続き12週間のrandomized, double-blind withdrawal phase (実薬あるいは偽薬8mg/kgを2週毎に投与)を経て、Extended studyにて実薬投与を継続した(8mg/kgを2週毎に投与)。

成長は、(1)身長の標準偏差(SDS-height)、(2)治験開始時からのSDSの変化(⊿SDS)、(3)⊿SDSと他の因子(年齢、性別、罹病期間、ステロイド投与量、JIA core setによる治療効果)との相関を評価検討した。38/45例(84.4%)がTCZ有効と判断され、治験開始時の平均のSDS-heightは-2.67±1.97で顕著な成長障害が認められた。治験開始時SDS-heightと治験開始時までの罹病期間は明らかな逆相関を示した。治験期間中のステロイド投与が相対的に少ない集団(平均プレドニゾロン(PSL)投与量6.7 mg/body未満、22例)と多い集団(平均PSL投与量6.7 mg/body以上、23例)の2群に分けての⊿SDSとの単変量解析では2群間に優意差がみられた(p=0.001)。In vitroの研究においても、実際のsJIA患児の成長の解析によっても、IL-6の持続的な暴露が成長障害に強い影響を与えていることが明らかになった。IGF-1が直接の成長阻害因子であるとの報告もあるが、in vitroではIGF-1は検出されないので、IL-6の直接作用であることも明らかにした。今後は、分子レベルでIL-6の成長板幹細胞に与える影響の検討をすすめる。これまでの検討により、成長障害の実態とアクテムラ導入経過に伴う改善効果が確認できた。今後成長障害改善のメカニズムについて、更なる検討を行っていくsJIAではIL-6過剰状態が長く続くことにより成長障害が生じることが明らかになった。また、同時に治療薬にステロイドを使用することにより成長障害はさらに加速される。したがって、本症に対するTCZの適応についてさらに検討を重ねて、できるだけ早期より使用できる条件の検討を行うことになる。これまでの結果より、難治性s-JIAは既存療法での治療期間に比例して、成長障害の進行がみられ、難難治例へのより早期のTCZ導入の必要性が成長障害の観点からも確認された。本検討では、TCZ導入後の成長障害の改善はステロイドの減量・中止に寄与する結果であったが、IL-6の生理学的活性遮断が成長障害改善へ貢献したとも推察される。サイトカインの動向に加え、インスリン様成長因子(IGF-1)、骨年齢の測定により成長障害の原因を多視角的に検討する。例年より選り安価な試薬等を使用したため、今年度は予定額より抑えることが出来たので繰越金が生じました。繰越金も含めH25年度は以下の研究を進めるのに研究費を使用する。In vitroでは、成長板軟骨幹細胞ATDC5をモデルに、IL-6による幹細胞の分化・増殖の抑制メカニズムについて膜結合型IL-6レセプターとgp130の機能を明らかにし、STAT3など伝達因子の動態について検討を加える。臨床的には、患児の年齢ごとにTocilizumab治療による成長の改善に関わる因子の解析をすすめる。血清サイトカイン(IL-6, IL-18, IL-1β)、IGF-1の測定、骨年齢の評価とその解析、およびこれまでの成果発表に研究費を予定している。