hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
制癌の標的分子としての糖脂質糖鎖遺伝子(ガングリオシドGM3合成酵素遺伝子)

当該研究期間内に、以下の諸点を明らかにした:(1)酸性糖脂質ガングリオシド合成系のキーエンザイムであるヒトGM3合成シアル酸転移酵素の遺伝子のゲノム構造解析を行った。ヒト染色体DNAのBACライブラリーをスクリーニングすることによって、ゲノム全長を含むゲノミックローンを単離し、さらにエクソン・イントロン構造の解明と転写開始点の決定を行い、FISH法により当該遺伝子の染色体上の位置(2p11.1)を確認した。マウスの当該遺伝子の染色体上の位置は6Cであった。(2)マウスでは5'-RACE法で最上流エクソンのみが異なる3種類の転写物(L型、B1型、B2型)が明らかになった。ノーザンブロット解析で組織及び種特異性が明らかになった。ラット及びサルGM3合成酵素cDNAをクローニングしヒト及びマウス遺伝子と比較検討した。これらの単離ホモローグにもヒト及びマウスで見られたアミノ酸置換(アスパラギン酸がヒスチジンに置換)が確認され、哺乳類でこのアミノ酸置換の重要な意味が内包されていることが示唆された。(3)本酵素はペプチド部が41.2-41.7kDaの糖蛋白質であると推定され、C末端をMyc-tag標識したConstructでWestern blot解析した。N結合型糖鎖結合可能部位に突然変異を入れ、野生型と糖鎖欠損型酵素の酵素活性・動態を比較し、シアリルモチーフL中の特異的なHis177残基の変異体を作製し、酵素活性・動態を比較したが、明確な結論には至っていない。ガングリオシドの包括的生物機能解析のためGM3合成酵素欠損マウス作出のためのターゲッチングベクターの構築を行い、ES細胞への導入を開始した。(4)ヒト遺伝子ノックアウト細胞作成のため、GM3合成酵素ゲノムDNAからpositive and negative selectionvector及びpromoter less vectorを作成、数種類の付着性及び浮遊性がん細胞株に導入しホモ相同組み換えを起こした細胞のクローニングを開始した。(5)またメラノーマ12日本人症例から4症例の細胞株化に成功した。コーカシアン系のメラノーマ細胞株を含め5株の培養細胞に、GD3合成酵素cDNAを組み込んだsense及びantisense vectorを導入し、変異株を複数分離した。antisense vector導入株の一部に、GD3産生能低下と増殖能低下を認めた。本年度は、以下の諸点を明らかにした:(1)世界に先駆けcDNAクローニングに成功したヒトGM3ガングリオシド合成酵素(シアル酸転移酵素-1)遺伝子及びその発現蛋白について、構造・機能解析を行った。ヒト酵素cDNAクローンは全長2,359塩基対からなり、1,089塩基対のORFを含む。推定アミノ酸一次構造には、短い細胞質部位、膜貫通部位、長いC末端部位が存在し、II型膜蛋白質の構造的特性を示した。推定分子量は41.7kDa、ゴルジ体内腔領域には、シアル酸転移酵素ファミリーで共通に見られる2つ(LとS)のシアリルモチーフ配列が同定された。シアリルモチーフLでは、保存性の高いアミノ酸残基の一つでC末端付近に位置するアスパラギン酸がヒスチジンに置換していた。

α2-3又はα2-6結合でシアル酸を転移する酵素群とアミノ酸一次配列で27.1-41.2%の相同性を示したが、α2-8結合でシアル酸を転移する酵素及び末端N-アセチルガラクトサミンを受容体とするものとは有意な相同性は認められなかった。(2)マウスホモローグcDNAの全長は2,121塩基対で、1.080塩基対のORFを含み、ヒト由来のものと核酸レベルで72.4%(コード領域では84.8%)、アミノ酸レベルで85.5%の相同性を示した。シアリルモチーフL中に特異的Asp→His置換が認められた。さらに、ラット並びにサルcDNAライブラリーからの単離ホモローグにも同様のアミノ酸置換が確認され、哺乳類でこのアミノ酸置換の重要な意味が内包されていることが示唆された。(3)cDNA産物はGM3合成酵素活性を示した。ヒト及びマウス酵素ともにラクトシルセラミドのみを糖脂質基質(受容体)とし、極めて厳しい基質特異性を持っていた。cDNAクローン導入3LL-ST28細胞を酵素源とすると、僅かではあるがTLC上ガングリオシドGT3と同定される糖脂質分子の合成を観察した。(4)ヒト及びマウス遺伝子ともに、2.4kbの主要な遺伝子転写物mRNAを与えた。また、全ての臓器に当該遺伝子の発現が認められたが、発現パターンには、かなりの種特異性、臓器特異性が観察された。ヒトでは脳・胎盤・骨格筋・精巣で、またマウスでは肝臓で高い発現量を示した。
黎明期広告業界誌『プレスアルト』広告現物全調査に基づく関西の広告史研究

今年度は年初に前年度までに構築した作品データベースの精度向上に取り組んだ。データベースに登録した来歴(広告業界誌『プレスアルト』に記載されていたリストの情報)と、広告現物スナップ写真(画像情報)との照合の精度を高めるための調査を行った。この結果およそ8割だった画像情報と文字情報との合致率を9割超にまで上げることができた。また作品データベースとは別に、冊子体のためのデータベースを構築した。『プレスアルト』311冊のうち戦後版の238冊の目次の文字を起こしし、これに2年目に行った全ての冊子のページをPDF化したデータと、巻号と発行年月日とを加えたもので、冊子体のPDF資料を目次タイトルで検索・閲覧できるデータベースとなった。年度中盤には二つのデータベースの直近の安定的な運用と、将来的な公開を目指すことを目的として、立命館アート・リサーチセンターの2018年度共同研究課題に応募し採択された。同センターの支援を受け、11月から12月にかけて、上記二つのデータベースを同センターが管理するサーバーに移行する作業を行った。これにより以降は共同研究者が同一のデータを確認しながら研究を進めた。(現時点では共同研究者限定公開)研究成果の一般公開を目的として、展覧会「プレスアルト誌と戦後関西の広告」を大阪市江之子島文化芸術創造センターに於いて開催した。期間は10月2日10月13日で、展示は「プレスアルト」の広告現物中身が見える工夫をしたガラスケース、付帯広告物の一部として広告およそ60点、プレスアルトの表紙を見せる形での30冊の連続展示、および参考資料を加えて構成した。期間内(6日(土))に同会場で共同研究者5名とともにシンポジウム「関西広告を開梱する」を開催した。多彩な広告文化と、評価の途上にある戦後関西の広告とデザインの新たな側面を、展示とシンポジウムという方式で広く一般の方々にわかりやすく示すことが出来た。概要に記載の通り前年度(3年度)までで、およそ6000点の広告作品の記録(スナップ写真)とそのリスト情報(来歴)とを照合したデータベースを構築、PDFデータ化した解説冊子と戦後版の目次のデータベースも298冊分作成できた。またこれらを学術用サーバーに上げることで安定的な運用が可能となった。サーバーでの管理の開始によって、データベースを利用した作品の検索と、その作品の詳細情報の解説冊子からの読み取り、という二つのデータベースを往来する研究が容易になったし、これを遠隔の研究者にも提供できる環境の基盤ができた。実際に今年度終盤にはシンポジウム登壇の共同研究者に4名を加えた9名の研究者とサーバー上のデータベースを共有し研究を進めることが出来た。このチームによる共同研究で当科研の最終的な成果報告ともなる『プレスアルト』作品図録解説書を出版する予定である。対外的な報告については、研究者対象としては1月に研究代表者が本研究の概要を学会で報告した。また概要に記載の通り、広く一般市民の来場を念頭に置いた展覧会を開催することができた。シンポジウムも合わせ多数の一般来場者があり、この時代の広告が持つデザイン思想や、デザイン資源の意義を広めることができた。以上のようにともに三年度に実施予定であったデータベースの構築および成果報告のいずれも実現した。研究は順調に進捗している。四年度となる最終年には、三年度までに構築したデータベースの設計変更を実施し利便向上をはかる。現状は立命館アート・リサーチセンターが所有する別のデータベースの形式を利用している。項目やレイアウトも元のデータベースを踏襲しているため、多くの点で違和感があり検索がわかりにくい。このままでは幅広い研究者への公開が難しい。また、蓄積してきたデータベースを利用し、戦後を中心とした広告史研究を共同研究者と共に推進し、報告書にまとめる計画である。具体的には共同研究者10名が各自異なるテーマで『プレスアルト』資料の調査と研究を行い、研究会で相互共有と意見交換し内容を深める。戦後版『プレスアルト』を中心に広告制作者の動向や印刷種別、広告主の意図などを検討していく予定である。これによりこれまで知られていない戦後日本の広告史の一端を明らかにしたい。報告書は精度の高い写真で広告作品の図像を撮影し報告書に掲載する計画である。このため必要な作品については専門の撮影者による精度の高い写真を撮影する。このほか研究代表者が執筆する『プレスアルト』研究の概要を学会誌に投稿し掲載を目指す。本年度は本研究の基幹である広告業界誌『プレスアルト』誌の所在調査に注力し、全冊の目録化を終えた。発行者の遺族から同誌コレクションを譲り受けた際には目録等がなく、段ボール箱およそ50箱に規則性なく収納されている状態であった。『プレスアルト』誌は、戦時・戦後5年の停止期をはさみ昭和61年まで、およそ45年間月刊で発刊された雑誌で、冊子体の各巻に20点余りの広告現物が付帯されている。作者の記述等当時の現況が記された冊子と、広告現物の双方が貴重な存在だが、発行部数が毎号100部と極めて少なく長らく幻の存在とされてきた。本研究は事前調査で当該コレクションにはこの現物が多く残されていると予想していた。作業は、同誌の現在の所蔵者であり研究協力者である大阪新美術館の協力の元、同収蔵庫において上記の段ボールを開封し、1号づつ冊子と広告資料の確認を行った。全ての付帯広告資料に作品番号を採番し、全作品のスナップデジタル写真を撮影し、写真名称を作品番号につけかえ整理した。

確認が終わった冊子と広告資料は中性紙箱に収納し劣化防止の対策を施した。この作業の結果、広告資料はポスターの他、企業発行のリーフレットやちらし、パッケージ、ラベルなど多義にわたるグラフィック作品類であることが判明した。またそれらの資料の多くは雑誌の台紙に貼り付けられて外すことができない状態であることが判明した。このため撮影やデータベース化計画の一部を変更した。一部の資料は水濡れや、印刷直後乾燥前に折りたたんだなどの要因で、広げることができ無い状態であった。これについては今後専門家のアドバイスを得ることうを検討する。以上のように本年度で全冊の所在確認・目録化が終了、第一次段階の整理は完了した。現存する冊子は278冊(号)、付帯広告現物はおよそ5560種類であることが判明した。概要に記載の通り『プレスアルト』誌を発行者の遺族から譲り受けた際には目録等がなく、何号が存在しているか、またそこに付帯すべき現物が何点揃って残っているかなど詳細が確認できていなかった。初年度の調査で現存するものが278冊(号)であることが確認でき、付帯している広告現物はおよそ5560種類であることが判明した。初年度の調査手順は所在を確認し目録化するとともにスナップ写真で現物の状態を記録する方法をとった。リストとの対照が容易となるようスナップ写真には作品番号を映しこんだ。当初計画では目録作成と並行してデータベース化を進めることとしていたが、作品の種別が多義にわたることが判明し、データベースに必要とされる項目を最初から決定することが難しく、全ての目録完成後にデータベース化を行うこととした。そのため当初予定より早く初年度で全作品を目録化することが可能となった。このような一部計画変更を行ったが全体の進捗としては順調である。研究2年目はまず広告業界誌『プレスアルト』の冊子体に記載されていたリスト情報を元に、広告作品の詳細来歴情報(広告主やデザイナー、印刷手法など)についての文字起こしを行なった。情報は5619作品分取得することができた。次にこの文字情報と、初年度撮影済の広告現物スナップ写真(画像情報)6183枚との照合作業を行い、画像情報に適切な文字情報を紐づけて行く作業を行った。およそ8割の画像情報について合致させることができた。最後にデータベースソフトを用いてこの結果を管理する仕組みを構築し、文字情報(例えば企業情報やデザイナー名)から関連する画像情報を呼び出すなどの一括検索が可能な形式に生成した。一方このデータベースとは別に、現存またはコピーが確認できている冊子体298冊の全ページのPDF化を行った。これは脆弱な冊子の記事を研究時に確認閲覧可能とするために必要な作業であった。広告印刷物というエフェメラメディアの研究では、たとえ現物が残っていたとしても制作年すら同定が難しく、まして印刷形式や色数、紙の質などの確定は著しく困難である。この不確かな状況がこれまで広告研究の推進を阻害して来たといえる。本研究の固有性は、破棄され後世に残りにくい広告の実物が現存すること、そしてのみならず、その制作時の来歴が冊子体により明確であるという点にある。
喉頭・気管狭窄に対するDNA合成阻害薬の効果についての基礎的研究

1.喉頭・気管狭窄動物モデルの作成ニュージーランドホワイトラビットを用い、喉頭・気管狭窄モデルを作成した。麻酔下に成ラビット(リタイア)の喉頭を截開し、内腔を露出、輪状軟骨内側の粘膜および軟骨膜を切除した。術後、数週間で瘢痕狭窄を来した。2.喉頭・気管狭窄モデルにおけるマイトマイシンC塗布の効果喉頭・気管狭窄動物モデルにおける瘢痕切除後のマイトマイシンC塗布の効果を検討した。上記処置後4週間後に再度、麻酔下に喉頭を截開。瘢痕を切除し、(1)生理食塩水のみ塗布するコントロール群(2)0.04%マイトマイシンCを3分間塗布する群に分け、各群につき1週間、2週間、1ヵ月目に喉頭・気管を摘出した。10%EDTAで脱灰後パラフィン包埋し、喉頭内腔の断面積の測定用、光学顕微鏡観察および免疫組織染色用とした。マイトマイシン塗布群では、コントロール群と比較し、線維芽細胞、膠原線維、血管の増生が抑制されていた。PCNA、TGF-β、b-FGFによる免疫組織染色においても細胞増殖阻害作用が認められた。3.マイトマイシンC塗布時間の比較検討上記モデルにおけるマイトマイシンCの塗布時間を(1)3分間塗布(2)10分間塗布の2群に分け、各群につき、1週間目、2週間目に喉頭・気管を摘出した。両群における断面積および細胞増殖阻害作用については、有意差が認められなかった。1.喉頭・気管狭窄動物モデルの作成実験動物として汎用されているニュージーランドホワイトラビットを用い、喉頭・気管狭窄動物モデルを作成した。生後8週のラビットを導入麻酔下にて、喉頭を截開し、内腔を露出。輪状軟骨内側の約1/2リングの範囲の粘膜・軟骨膜を切除した後、喉頭、皮膚を閉創した。2.喉頭・気管狭窄動物モデルにおけるマイトマイシン塗布の効果喉頭・気管狭窄動物モデルにおける瘢痕切除後のDNA合成阻害薬であるマイトマイシン塗布の効果を検討中である。上記処置4週後に再度、麻酔下に喉頭を截開。瘢痕を切除し、(1)追加処置を行わないコントロール群(2)0.04%のマイトマイシンを3分間塗布する群に分け、各群につき処置後2週間、1ヵ月、2ヵ月、3ヵ月目に喉頭・気管を摘出。10%EDTAで脱灰後パラフィン包埋し、喉頭内腔の断面積の測定用および光学顕微鏡観察用試料とした。現在切片作成およびPCNA(proliferation cell nuclear antigen)、TGB-β(transforming growth factor-β)、b-FGF(basic fibroblast growth factor)、I型、III型コラーゲンの観察のため免疫組織染色を施行する準備を進めている。また一部のラビットでは線維芽細胞の詳細な観察をするため、グルタール・アルデヒド固定し、エポキシ樹脂で包埋、透過型電子顕微鏡試料とした。
第一原理計算によるナノ磁性体の超微細構造定数に関する理論研究

2009年4月より、(1)シリコンクラスターにおける磁性、及び超微細構造、(2)水素添加グラフェンシートの電気的、磁気的構造、(3)CeMnNi_4における相安定性、磁性、及びスピン依存性の三つのテーマについて研究してきた。(1)に関して、M=Cr,Mn,Feといった遷移金属原子を添加したSi_<16>H_<16>フラーレンの磁性、及び超微細構造について密度関数理論を用いて研究を行った。[1]全ての条件においてフラーレンは自由原子Mに関して同じ磁気モーメントを持ち、それはSi_<16>H_<16>上への部分的な再分配により局在化した。しかしながら、フラーレンと自由原子Mについて等方的な超微細構造パラメーターA_<iso>の結果を比較するとMn,Fe添加の場合は定量的にも定性的にもCr上での振る舞いはほとんど同じにもかかわらず、かなり異なる結果が得られることがわかった。Mn、Fe原子の添加はM原子の核におけるスピン密度ρ(R_M)、及び類似したA_<iso>の値を増加させる。SOMOs(Singly Occupied Molecular Orbitals)によって引き起こされた殻スピン分極の傾向の解析を行うことで、MnとFe原子によるA_<iso>の値の増加の直接的な原因が、SOMOsの増加によるρ(R_M)の変化と間接的には原子殻のs,p軌道において添加物の3d軌道が混成することにあるということがわかった。後者は結果として、殻内2s,3s軌道のスピン分極の減少を示し、ρ(R_M)への寄与を減らす結果となった。上記テーマとは別に、私は水素原子が添加したグラフェンシートの電気的、磁気的構造について広い範囲で研究を行った。この研究は近年のSTM(Scanning Tunneling Spectroscopy)の研究[2]によって動機づけされており、これは楕円、恒星状の特徴によってイメージを与えている。そのようなほとんどグラフェン上に水素原子が貯蔵されていない単一的な幾何学的配列から提案されたものである。グラフェンシートに関するSTM第一原理計算を基に表面に吸着した水素二量体、三量体クラスターから創出するためにそれぞれの特徴は以前に研究した。[3]我々の研究では三量体及びいくつかの二量体クラスターは大きな磁気モーメントを表面上で示す事がわかっている。そのような磁気特性は結局、表面上の構造変化が原因であることがわかった。加えて、グラフェンの電気的な構造は大きな変化を伴なった。そのため、大きなスピン分極の値を小さなバイアスをかけるだけでフェルミレベルに達する値まで引き上げる可能性がある。最終的に、私はCeMnNi_4の金属中不純物の相関的な構造安定性、磁性、及びピン依存遷移について電気相互作用の効果を調べるために第一原理計算を行った。[4]実験的に観察されたCeMnNi_4の立方晶系の再現を行うために決定的な役割を得るため、遷移スピン分極の割合(66%)だけでなくMn-3d電子のクーロン反発力の正しい値を示した。これらはこの組成において二つの基本的な特性であり、これは従来の密度関数理論においては正しく予測することはできないものである。この失敗の原因はMn-3d電荷の非局在化過多によるものであり、MnとNi原子の間に斜方晶系の相の下でd-dの混成を引き起こす。そのような人工的な混成は次々に斜方晶における禅エネルギーの相対値を下げる。これは正方晶のものに関してのことである。これはキャリア密度、フェルミ準位における駆動力において不正確な値を与え、結果的に半分に近い金属添加物において輸送スピン分極のずっと低い割合を導くこととなる。独自開発の超微細構造計算プログラムを用いて遷移金属M=Cr,Mn,Feを内包したSi16H16の磁性と超微細構造を求めた。全ての系で内包されている状態にある金属原子は孤立系と同じ磁気モーメントを持っており、それは主に金属原子に局在し、わずかにSi16H16にも分布していた。孤立系の金属原子と比較すると等方的な超微細構造パラメーターA_isoは大きく異なっていた。CrはSi16H16と弱い相互作用を持っているが、Mn,Feは強い混成が見られた。SOMOを起源とする核スピン偏極の傾向の解析から、CrではA_isoの減少がSOMOの金属原子核への寄与が小さくなることに起因し、一方、Mn,Feでは3sと価電子帯のRMへの寄与がSOHOからのスピン偏極よりも相対的に小さくなるため、Aisoの絶対値が大きくなることが分かった。本研究ではさらに水素原子をドープしたグラフェンシートの電子構造、磁気構造を計算対象にした。この系に関して、L.Hornekaerらは楕円形と星形のSTM像を報告している(Phys.Rev.Lett.96,156104(2006))。この像はグラフェンシート上に数個の水素原子がある特定の配置に並んでいるためと思われるが、詳細は不明であった。グラフェンシートの第一原理STM像計算から、それぞれの形状は水素原子が2個、3個吸着したものに由来していることが明らかになった。さらに、表面の構造変化により3量体とある2量体は表面上に大きな磁気モーメントを持つことが分かった。同時にグラフェンシートの電子構造は大きく変化し、小さいバイアス電圧でフェルミ準位に大きなスピン分極を持つことが示唆された。

この研究はグラフェンライクな系において水素誘起磁性研究の発展に寄与する。2009年4月より、(1)シリコンクラスターにおける磁性、及び超微細構造、(2)水素添加グラフェンシートの電気的、磁気的構造、(3)CeMnNi_4における相安定性、磁性、及びスピン依存性の三つのテーマについて研究してきた。(1)に関して、M=Cr,Mn,Feといった遷移金属原子を添加したSi_<16>H_<16>フラーレンの磁性、及び超微細構造について密度関数理論を用いて研究を行った。[1]全ての条件においてフラーレンは自由原子Mに関して同じ磁気モーメントを持ち、それはSi_<16>H_<16>上への部分的な再分配により局在化した。しかしながら、フラーレンと自由原子Mについて等方的な超微細構造パラメーターA_<iso>の結果を比較するとMn,Fe添加の場合は定量的にも定性的にもCr上での振る舞いはほとんど同じにもかかわらず、かなり異なる結果が得られることがわかった。Mn、Fe原子の添加はM原子の核におけるスピン密度ρ(R_M)、及び類似したA_<iso>の値を増加させる。SOMOs(Singly Occupied Molecular Orbitals)によって引き起こされた殻スピン分極の傾向の解析を行うことで、MnとFe原子によるA_<iso>の値の増加の直接的な原因が、SOMOsの増加によるρ(R_M)の変化と間接的には原子殻のs,p軌道において添加物の3d軌道が混成することにあるということがわかった。後者は結果として、殻内2s,3s軌道のスピン分極の減少を示し、ρ(R_M)への寄与を減らす結果となった。上記テーマとは別に、私は水素原子が添加したグラフェンシートの電気的、磁気的構造について広い範囲で研究を行った。この研究は近年のSTM(Scanning Tunneling Spectroscopy)の研究[2]によって動機づけされており、これは楕円、恒星状の特徴によってイメージを与えている。そのようなほとんどグラフェン上に水素原子が貯蔵されていない単一的な幾何学的配列から提案されたものである。グラフェンシートに関するSTM第一原理計算を基に表面に吸着した水素二量体、三量体クラスターから創出するためにそれぞれの特徴は以前に研究した。[3]我々の研究では三量体及びいくつかの二量体クラスターは大きな磁気モーメントを表面上で示す事がわかっている。そのような磁気特性は結局、表面上の構造変化が原因であることがわかった。加えて、グラフェンの電気的な構造は大きな変化を伴なった。そのため、大きなスピン分極の値を小さなバイアスをかけるだけでフェルミレベルに達する値まで引き上げる可能性がある。最終的に、私はCeMnNi_4の金属中不純物の相関的な構造安定性、磁性、及びピン依存遷移について電気相互作用の効果を調べるために第一原理計算を行った。[4]実験的に観察されたCeMnNi_4の立方晶系の再現を行うために決定的な役割を得るため、遷移スピン分極の割合(66%)だけでなくMn-3d電子のクーロン反発力の正しい値を示した。これらはこの組成において二つの基本的な特性であり、これは従来の密度関数理論においては正しく予測することはできないものである。
気管切開を行う児の気管切開処置をうけることに対する家族の意思決定に関する研究

1目的:気管切開の適応と診断された児、家族への看護援助の方向性を得る。2.方法:既に気管切開術を行った児の家族を対象に気管切開の実施を選択するまでの体験について倫理的配慮に留意し半構成的面接を実施した。データは質的帰納的に分析した。3.結果:5人の母親の語りから以下のカテゴリーが抽出された。気管切開の必要性を診断され、実施を意思決定するまでの思い、体験には、【実施するしかないと状況を受け入れる】ようとしつつ【様々な情報源から様々な情報を得ることによっておこる混乱や感情の揺れ】を体験し、【家族なりに子どもの身体的状況を改めて見直し】ながら【気管切開処置によっておこる外観の変化やケアの負担】など処置に対するマイナスの予測ももちつつ、【子どもの将来に対する希望】を見出し【漠然とながらも今後の家族の生活の見通し】をつくりだしながら意思決定するプロセスであった。またこのプロセスは医師、看護師の医療者からの言葉やかかわり、既に気管切開術を行った児や母親から実施後の具体的な児の変化や生活の変容を実際に見たり、聞いたりしながら、現状に対する評価や決定案に対する評価を繰り返しながら意思決定するというプロセスであった。看護職者は、家族が意思決定にいたるまでのプロセスにおいて、単に情報提供するだけでなく、家族の主体的な意思決定プロセスが促進されるように情緒的サポートを行いながら、家族自身が客観的に一つ一つの選択を評価し、修正し最終的な「気管切開処置の実施の有無」を決定できるよう、家族のもつ力を引き出しながら支援していく必要があることが明らかになった。1.目的:(1)H18年度の目的:児に気管切開の適応が診断され、家族が気管切開術の実施を意思決定し、実施されるまでの間に家族が経験すること、思いを明らかにする。H18年度は所属機関の変更に伴い、データ収集の場所の再検討を行った。面接ガイド作成の為に看護学修士論文の研究データにおいて「疾患及び気管切開適応の診断」に対する思いについて分析を行った。2.研究方法:質的記述的研究方法、因子探索的研究デザイン。3.結果:対象は喉頭気管疾患のために気管切開をおこない、治癒するまでのあいだ、現在気管カニューレを装着して在宅療養をおこなっている乳幼児の母親5名。母親の疾患および気管切開適応の診断に対する思いには、【出生時の児の健康に対する思い】、【疾病に対する思い】が影響していた。【出生時の健康に対する思い】には、喉頭気管疾患が呼吸に関連していることから、症状悪化による身体状況の変化に対する医療者からの説明の中で「生」と「死」を想起し、大きな衝撃をうけ、児の状態を受け入れることに困難を感じていた。その一方で妊娠中から抱いていた児に対する愛情を感じていた。【気管切開の適応の診断に対する思い】には、診断を受け入れるまでに時間がかかり、意思決定するまでに時間を要すること、その期間に児の成長を感じることができる、医療者へ感情を表出することができることをとおして児の状態を受け入れ、児の気管切開の必要性を認識し、気管切開後の児の身体的変化を想像し、気管切開の実施を意思決定していく過程であった。4.H19年度の方向性:本年度は、データ収集の場所の検討を行う中で重症心身障害の子どもと母親とのかかわりをもつことができたので、作成した面接ガイドを用い喉頭気管分離術のように永久的に気管切開を行う児の母親へ面接を行い、分析、検討、介入の示唆を得る。
正電荷リポソーム包埋ヒトInterferon-β遺伝子を用いた食道癌遺伝子治療

本研究代表者らは、リポゾーム包埋ヒトInterferon-β(hIFNβ)遺伝子(IAB-1)のヒト食道癌培養細胞株に対するin vitroでの抗腫瘍効果について検討し、増殖抑制効果を検討してきたが、これをヌードマウス可移植ヒト食道癌細胞株WSSCを用いたin vivoモデルで確認した。ヌードマウス皮下腫瘍(WSSC)内にIAB-1ないしはhIFNβを投与後24時間、48時間での腫瘍内hINFβ濃度をELISA法で測定すると、測定可能な検体はIAB-1投与例のみであり、不安定ながらhINFβ遺伝子導入に伴うhINFβ産生が確認された。ヌードマウスモデルにおける治療実験では、IAB-1(DNAにして3μg相当)隔日腫瘍内投与、5FU20mg/kg週5回腹腔内投与、S-1 10mg/kg週5回経口投与のいずれの治療も単独では顕著な腫瘍増殖抑制効果には至らなかった。また、IAB-1といずれかの抗癌剤の併用では、各々の単独治療に比べ良好な増殖抑制効果を示したものの、著効は示さなかった。次に、同じモデルを用いてIAB-1の腫瘍内隔日投与、2Gyの放射線一括照射、IAB-1+放射線照射の併用での比較を行ったところ、IAB-1・照射併用群で顕著な増殖抑制効果が確認され、3週間にわたって腫瘍の増大を認めなかった。有害反応として照射単独群で1匹死亡したが、他の群では体重減少も軽度であった。以上、IAB-1と放射線照射との併用で優れた相乗効果が確認され、臨床応用に向けて重要な知見となった。われわれはInterferon-βのヒト食道癌に対する抗腫瘍効果、Interferon-βgene包埋リポソームIAB-1のヒト食道癌に対するin vitro腫瘍増殖抑制効果を報告してきた。今回臨床応用するための前段階としてIAB-1のヒト食道癌に対するin vivoの治療効果、特に食道癌に対して臨床で最も多く投与されている5-FU製剤との併用効果を検討した。ヒト食道扁平上皮癌であるWSSCをヌードマウス皮下に移植し、IAB-1単独、5-FU単独、IAB-1 +5-FUの3群で治療効果を比較した。5-FUは20mg/kg 5回/w腹腔内投与を行い、IAB-1はDNA量として3μg(40μl)を1日おきに3回/w腫瘍内に投与した。2週間で2サイクルの治療を行い、腫瘍重量および体重減少の有無を比較した。いずれの群においても体重減少はほとんどみとめられなかった。腫瘍増殖抑制効果はIAB-1単独群、5-FU単独群は同程度の増殖抑制効果があり、IAB-1 +5-FU群において最も強い増殖抑制効果が認められた。また、経口抗癌剤であるTS-1を用いてIAB-1との併用効果を調べた。TS-1 10mg/kg 5回/w経口投与を行い、IAB-1は5-FUの場合と同量を1日おきに3回/wスケジュールで腫瘍内投与した。2サイクルの治療を行い、体重減少は軽度であった。5-FUと同様に併用効果が認められ、腫瘍増殖抑制効果はIAB-1 + 5-FUと同等であった。現在、腫瘍内IFN-βの測定を行っており、さらに放射線との併用効果を調べ、臨床応用の可能性を検討する。われわれはInterferon-βの食道癌に対する抗腫瘍効果、Interferon-βgene包埋リポゾームIAB-1の食道癌に対するin vitro, in vivoでの効果、IAB-1のin vivoでの5FU, S-1との併用効果について検討してきた。

今回、IAB-1腫瘍内投与後の腫瘍内Interferon-β量を測定し、さらに、食道癌治療にしばしば用いられる放射線治療とIAB-1の併用効果についてin vivoで検討した。ヒト食道扁平上皮癌の細胞株であるWSSCをヌードマウス皮下に移植し、IAB-1をDNA量として3μg腫瘍内投与する群、Interferon-βを100U腫瘍内投与する群、生食を腫瘍内投与する群(コントロール)各6匹ずつに無作為に分けた。各群3匹ずつを24時間後、48時間後にsacrificeして得られた腫瘍組織を凍結保存し、腫瘍内Interferon-β濃度を測定した。その結果、個体間にばらつきがあったものの、24時間後、48時間後にInterferon-βが測定可能であったのは、IAB-1与例のみであり、in vivoにおけるInterferon-β遺伝子のtransfectionに伴うリポゾームの産生が確認された。次にWSSC皮下腫瘍に対しIAB-1を3μg腫瘍内隔日投与、2Gyの放射線一括照射、IAB-1+放射線照射の併用、コントロール(生食腫瘍内投与)の4群(1群5匹)に分けて治療を行ったところ、IAB-1投与群、照射単独群では明らかな腫瘍増殖抑制効果がみられなかったのに対し、併用群で顕著な抑制効果を認め、3週間にわたって腫瘍の増大を認めなかった。以上、IAB-1はin vitroでは食道癌培養細胞株に対して抗腫瘍効果、5FUとの併用効果を認めるものの、in vivoでの効果は顕著ではなかったが、放射線照射との併用で優れた相乗効果が確認され、臨床応用に向けて重要な知見となった。
Pループ型ATP加水分解酵素の機能発現機構の解明

本研究は,Pループ型ATP加水分解酵素の機能発現機構について,分子シミュレーション及び,統計力学解析を用いて解析することを目的としている.本年度は,DNA相同組換えで働く,Pループ型ATP加水分解酵素であるRad51について,分子構造モデリングと分子動力学シミュレーションを行った.Rad51は,DNAの周囲にらせん状のフィラメントを形成する.酵母のRad51に対する結晶構造が決定されているが,そのらせんピッチは130Aであり,電子顕微鏡などの実験値である90100Aと比較すると若干大きかった.その結晶構造を元に,分子動力学シミュレーションを遂行したが,らせんピッチは増加する一方で実験値に近くはならなかった.そこで,らせんピッチが90A程度とほぼ実験値に近い古細菌のホモログであるRadAの結晶構造を元にして,Rad51のモデリングを行ったところ,ATP塩基のパッキングが,ピッチ130Aの構造と90-100Aの構造で大きく異なることが判明した.ピッチ130Aの構造ではATPが結合していないので,塩基パッキングの影響でATPの安定的結合が形成されなかったと考えられる.また,統計力学理論に基づく水のエントロピー解析を,やはりPループ型ATP加水分解酵素であるF1-ATPaseについて適用した.水のエントロピーは,タンパク質の密なパッキングをもたらす駆動力として効くことが知られている.水のエントロピー解析をF1-ATPaseに適用した結果,サブユニット間インターフェースのパッキングが場所によって,大きく異なっていることが明らかになり,ATP加水分解に付随して起こるγサブユニットの回転の際,大規模なパッキングの移動が起こっており,回転機構に重要な役割を果たしていることが明らかになった.P-loop型ATP加水分解酵素である、相同組換えで機能するRecA/Rad51/RadAファミリータンパク質のうち、RecAタンパク質についてフィラメントモデルを作成した。フィラメントモデルは、活性型と非活性型の二通りを作成した。プロトマー間相互作用を計算したところ、活性型はATP結合時に安定化されていた。さらに、RecA/Rad51/RadAファミリータンパク質の活性を向上させるメディエーターSwi5/Sfr1タンパク質の存在が分裂酵母において知られている。このSwi5/Sfr1について、溶液構造をX線溶液散乱によって決定し、上記のフィラメント構造との結合モデルを提案した。また、別なP-loop型加水分解酵素である分子モーターF1-ATPaseの回転メカニズムについて、京都大学の木下グループと共同し、木下グループで開発されている水のエントロピー計算法を適用した。この方法で計算されたF1-ATPaseの水のエントロピーの結果は、我々のグループでの分子動力学シミュレーションで得られたF1-ATPaseのサブユニット間パッキングにおける非対称構造を見事に再現しており、その熱力学的基盤を与えた。ここから、水のエントロピーが分子モーター回転機構において、重要な役割を果たしていることを示した。本研究は,Pループ型ATP加水分解酵素の機能発現機構について,分子シミュレーション及び,統計力学解析を用いて解析することを目的としている.本年度は,DNA相同組換えで働く,Pループ型ATP加水分解酵素であるRad51について,分子構造モデリングと分子動力学シミュレーションを行った.Rad51は,DNAの周囲にらせん状のフィラメントを形成する.酵母のRad51に対する結晶構造が決定されているが,そのらせんピッチは130Aであり,電子顕微鏡などの実験値である90100Aと比較すると若干大きかった.その結晶構造を元に,分子動力学シミュレーションを遂行したが,らせんピッチは増加する一方で実験値に近くはならなかった.そこで,らせんピッチが90A程度とほぼ実験値に近い古細菌のホモログであるRadAの結晶構造を元にして,Rad51のモデリングを行ったところ,ATP塩基のパッキングが,ピッチ130Aの構造と90-100Aの構造で大きく異なることが判明した.ピッチ130Aの構造ではATPが結合していないので,塩基パッキングの影響でATPの安定的結合が形成されなかったと考えられる.また,統計力学理論に基づく水のエントロピー解析を,やはりPループ型ATP加水分解酵素であるF1-ATPaseについて適用した.水のエントロピーは,タンパク質の密なパッキングをもたらす駆動力として効くことが知られている.水のエントロピー解析をF1-ATPaseに適用した結果,サブユニット間インターフェースのパッキングが場所によって,大きく異なっていることが明らかになり,ATP加水分解に付随して起こるγサブユニットの回転の際,大規模なパッキングの移動が起こっており,回転機構に重要な役割を果たしていることが明らかになった.
キラリティープローブを用いた短寿命反応中間体の動的構造解析

昨年度、キラル側鎖を有する光学活性ナフタレン化合物とオルトクロラニルとの光反応において、オルトクロラニルはナフタレンのジアステレオ面を高度に区別して[4+2]付加すること(最高92:8)を見出し、生成物の立体化学およびキラル分光測定の結果から光電子移動で生成するナフタレンラジカルカチオンに対するキラル側鎖の求核的相互作用の寄与が示唆された。今年度、1)求核的作用に関与する官能基の特定、および2)一電子酸化する前の中性基質と酸化後のラジカルカチオンとの間の動的構造の変化の有無について研究を行った。光付加反応の高い面選択性と円二色性(CD)スペクトルにおける比較的強いコットン効果とがともに見られる側鎖には酸素官能基とベンゼン環とが含まれていて、ともにラジカルカチオンに対して電子供与可能である。そこで、ベンゼン環に置換基を導入しπ電子密度を変化させ、面選択性およびCDスペクトル測定を行った。MeO基およびCN基を導入しても面選択性およびCDスペクトルともに大きな変化は見られず、ベンゼン環π電子よりも酸素の孤立電子対が求核的相互作用に重要であると考えられる。一電子酸化する前の中性基質の動的構造について情報を得るため、一重項酸素の付加反応を行った。この場合にはほとんど面選択性は発現せず、中性状態においては側鎖はナフタレン面区別付加に寄与せず、高い構造的自由度をもっていることが示唆される。したがってラジカルカチオンと中性状態とで動的構造が大きく変化していることが判明した。このように、キラル生成物分析とキラル分光分析とを組み合わせることで、短寿命反応活性種に働く相互作用および、その構造的特徴を明瞭にすることに成功した。キラル側鎖を有する光学活性ナフタレン化合物を合成し、オルトクロラニルとの光反応を行った。オルトクロラニルはナフタレンのジアステレオ面を区別して[4+2]付加することを見出した。キラル側鎖を系統的に変え、面区別付加の選択性を調べたところ、1)孤立電子対を有する酸素原子を側鎖の適切な位置に組み込む、2)その酸素官能基として比較的かさ高い置換基を用いる、この二つの条件を満たすときに高い選択性(最高92:8)が得られた。この光反応について、レーザー閃光光分解による過渡吸収スペクトル測定を行った。ナフタレンラジカルカチオンに由来する過渡吸収スペクトルが750-550nmの領域に確認できた。この結果から、オルトクロラニルの励起状態からナフタレン化合物への光電子移動が進行しナフタレンラジカルカチオンが生成していることがわかった。次に光学活性ナフタレンラジカルカチオンの円二色性(CD)スペクトル測定を行った。その結果、光付加反応において高い面選択性を示したナフタレン化合物のラジカルカチオンにのみ、可視領域での比較的強いコットン効果が観測できた。キラル側鎖がラジカルカチオン部に面区別して求核的に相互作用し、面性キラリティーが生じていると考えられる。光付加反応においてオルトクロラニルがキラル側鎖に対して逆側から付加した生成物が優先していることからも、側鎖の求核的相互作用の存在が示唆される。このように、光付加反応のキラル生成物分析とラジカルカチオンの円二色スペクトル分光分析とを組み合わせることで、短寿命反応活性種に働く相互作用の存在の実証および、その構造的特徴を明瞭にすることに成功した。
筋肉アクトミオシン複合体の結晶化と構造解析

G-アクチンは二価性試薬m-maleimidobenzoic acid N-hydroxysuccinimide ester(MBS)で処理すると塩存在下でも単量体であるが、ミオシンフィラメントに頭部当り2モル結合することを発見している。この結合がS1の25K/50Kトリプシン切断部位でおこり、2番目が50K/20Kでおこることが示唆された。これら2つの切断部位はF-アクチンとの結合にも関与した。今年度はMBS化学架橋法を用いて、ミオシン頭部のアクチン結合部位がATPにより変位するかを調べた。MBS反応を停止しないでMBS-アクチンとS1を混合すると見かけ上180K架橋物ができる。ATPまたはADP存在下では180Kと140Kができ、140KはSH1修飾S1では形成されないのでS1のSH1残基とアクチンとの架橋と思われる。ファロイジンで重合させたMBS-F-アクチンでは同様にヌクレオチド非存下やADP存在下では180Kができ、ATP存在下でのみ180Kと140Kができた。アクチン単体・S1とF-アクチン・S1の結合はよく似ており、特にATP存在下のF-アクチン・S1はATPまたはADP存在下のアクチン単体・S1の結合に似ていると考えられる。そこでアクチン単体・ミオシン頭部の構造を知れば、F-アクチン・ミオシン頭部の構造を推定できる。ATP非存下でアクチン単体と架橋したHMM分子を電顕観察するとミオシン頭部のやや先端、ロッド接合部から14.3nmにアクチン結合が見られるが、ATP存在下で架橋した場合は約1nm短くなった。このことはアクチン・ミオシン接触面がATPによりずれることを示唆している。現在X線溶液散乱、結晶化により結合立体構造の詳細を明らかにする試みを進めている。G-アクチンは二価性試薬m-maleimidobenzoic acid N-hydroxysuccinimide ester(MBS)で処理すると単量体のまま、ミオシン頭部当り2モル結合する。結合部位構造を検索するため、頭部SIのトリプシン切断部位へのMBS-アクチン結合の影響を調べた。アクチン/S1比約1では25K/50K/切断が保護され、2では25K/50Kと50K/20Kの両方が保護された。保護率の加算値はアクチンのミオシン頭部への結合度とよく一致した。このことは1番目の結合が25K/50K切断部位でおこり、2番目が50K/20Kでおこることを示唆する。25K/50Kと50K/20Kの両切断部位への結合はATP存在下でかなり弱くなった。F-アクチンの結合によっても両方の切断が保護され、これら2つのアクチン結合部位がF-アクチンとの結合にも関与すると考えられる。MBS反応を停止しないでMBS-アクチンとS1やHMMを混合すると、180K架橋物ができる。ATP存在下では見かけ上180Kと140Kができ、140KはSH1修飾S1では形成されないのでS1のSH1残基とアクチンとの架橋と思われる。F-アクチンとS1についても同様の架橋物ができた。ATP非存下でMBS-アクチン/ミオシン頭部比2で架橋したHMM分子を電顕観察すると、頭部のやや先端すなわち頭部-ロッド接合部から14.3nmにアクチン結合が見られた。結合アクチンの大きさは頭部長軸方向7-15nm、短軸方向7-10nmであることから、アクチンは頭部長軸方向に1-2個並んで結合していることを示唆する。

現在ATP存在下の架橋物ならびにアクチン/頭部比1で架橋した架橋物さらにMBS-F-アクチン-HMM架橋物を脱重合させた標品を電顕観察している。末精密計測であるが結合部位はほぼ同じ位置であり、大きい結合部位移動がないことを示唆している。今後はX線溶液散乱、結晶化により結合立体構造の詳細を明かにしたい。G-アクチンは二価性試薬m-maleimidobenzoic acid N-hydroxysuccinimide ester(MBS)で処理すると塩存在下でも単量体であるが、ミオシンフィラメントに頭部当り2モル結合することを発見している。この結合がS1の25K/50Kトリプシン切断部位でおこり、2番目が50K/20Kでおこることが示唆された。これら2つの切断部位はF-アクチンとの結合にも関与した。今年度はMBS化学架橋法を用いて、ミオシン頭部のアクチン結合部位がATPにより変位するかを調べた。MBS反応を停止しないでMBS-アクチンとS1を混合すると見かけ上180K架橋物ができる。ATPまたはADP存在下では180Kと140Kができ、140KはSH1修飾S1では形成されないのでS1のSH1残基とアクチンとの架橋と思われる。ファロイジンで重合させたMBS-F-アクチンでは同様にヌクレオチド非存下やADP存在下では180Kができ、ATP存在下でのみ180Kと140Kができた。アクチン単体・S1とF-アクチン・S1の結合はよく似ており、特にATP存在下のF-アクチン・S1はATPまたはADP存在下のアクチン単体・S1の結合に似ていると考えられる。そこでアクチン単体・ミオシン頭部の構造を知れば、F-アクチン・ミオシン頭部の構造を推定できる。ATP非存下でアクチン単体と架橋したHMM分子を電顕観察するとミオシン頭部のやや先端、ロッド接合部から14.3nmにアクチン結合が見られるが、ATP存在下で架橋した場合は約1nm短くなった。このことはアクチン・ミオシン接触面がATPによりずれることを示唆している。現在X線溶液散乱、結晶化により結合立体構造の詳細を明らかにする試みを進めている。
B細胞アポトーシスを誘導する歯周病細菌毒素の精製と誘導に関わる細胞内因子の同定

歯周炎の病巣である歯周ポケット中には,多種・多様の細菌が生息して複雑な生態系が形成されている.これまでの細菌学的および免疫学的な研究の結果,数種のグラム陰性嫌気性菌が主たる原因菌と考えられ,これらを中心に歯周病の発症に関わる病原因子が解析されてきた.我々の研究室では,若年性歯周炎あるいは難治性歯周炎の原因菌の一つと考えられているActinobacillus actinomycetemocomitansがこれまで報告されている外毒素とは異なる新規毒素を産生していることを見出した.今回の研究プロジェクトでは,我々が新たに見出した毒素の精製をすすめ,ほぼ完全精製された新規毒素とすでに遺伝子がクローニングされているcytolethal distending toxin(CDT)の細胞周期停止機構アポトーシス誘導機構を比較検討した.CDTがHela細胞でG2/M期で著しい細胞周期の停止を引き起こすのに対し,新規毒素はこの細胞でアポトーシスを誘導することが明かとなった.さらに,CDTも白血球系の細胞株であるU937細胞に作用させると,新規毒素と同じようにアポトーシスを誘導することが明かとなった.この現象を細胞内情報伝達といった観点から解析したところ,CDTと新規毒素はともに,G2/M期での細胞周期の停止の過程で,cyclin-dependent kinase inhibitor p21が重要な役割を果たしていることが明らかとなった.さらに,CDTのサブユニットCDT-A, CDT-B, CDT-Cのリコンビナントタンパクを用いて調べたところ,活性発現に直接関わっているのはCDT-Bであり,CDT-AとCDT-Cは,CDT-Bの細胞内移入にのみ関与していることが示唆された.以前,論文で報告したように,新規毒素には本菌が産生するロイコトキシンやCDTなどは含まれていないことを確認しているが,今回,新規毒素にCDT-Bの混入はないことをあらためて確認することができた.歯周炎の病巣である歯周ポケット中には,多種・多様の細菌が生息して複雑な生態系が形成されている.これまでの細菌学的および免疫学的な研究の結果,数種のグラム陰性嫌気性菌が主たる原因菌と考えられ,これらを中心に歯周病の発症に関わる病原因子が解析されてきた.我々の研究室では,若年性歯周炎あるいは難治性歯周炎の原因菌の一つと考えられているActinobacillus actinomycetemocomitansがこれまで報告されている外毒素とは異なる新規毒素を産生していることを見出した.今回の研究プロジェクトでは,我々が新たに見出した毒素の精製をすすめ,ほぼ完全精製された新規毒素とすでに遺伝子がクローニングされているcytolethal distending toxin(CDT)の細胞周期停止機構アポトーシス誘導機構を比較検討した.CDTがHela細胞でG2/M期で著しい細胞周期の停止を引き起こすのに対し,新規毒素はこの細胞でアポトーシスを誘導することが明かとなった.さらに,CDTも白血球系の細胞株であるU937細胞に作用させると,新規毒素と同じようにアポトーシスを誘導することが明かとなった.この現象を細胞内情報伝達といった観点から解析したところ,CDTと新規毒素はともに,G2/M期での細胞周期の停止の過程で,cyclin-dependent kinase inhibitor p21が重要な役割を果たしていることが明らかとなった.さらに,CDTのサブユニットCDT-A, CDT-B, CDT-Cのリコンビナントタンパクを用いて調べたところ,活性発現に直接関わっているのはCDT-Bであり,CDT-AとCDT-Cは,CDT-Bの細胞内移入にのみ関与していることが示唆された.以前,論文で報告したように,新規毒素には本菌が産生するロイコトキシンやCDTなどは含まれていないことを確認しているが,今回,新規毒素にCDT-Bの混入はないことをあらためて確認することができた.我々は,これまでの研究で,若年性歯周炎の原因菌であるActinobacillus actinomycetemcomitansが,これまで報告されている外毒素とは異なる新規毒素を産生していることを見出し,その生物学的活性を報告してきた.それを踏まえて,今回の研究プロジェクトでは,我々が新たに見出した毒素の精製を開始した.精製に先立ち,A. actinomycetemcomitans Y4株の培養上清を採取して,HPLC(Waters社)を用いて精製を進めた.最終精製タンパクをSDS-PAGEで泳動し,銀染色を行って均一性を確認したところ,複数のバンドが検出された.現在,そのうちのどれが,活性タンパクであるかを確認しているところである.次年度は,まず,その結果をいち早く得られるように実験を行ない,銀染色を行って均一性を確認した後,アミノ酸配列をマイクロシークエンサーで明らかにする予定である.さらに,既知のタンパクのアミノ酸配列と比較検討して,新規タンパク毒素であることが判明した段階で,そのタンパクを担っている遺伝子のクローニングを行なう.一方,我々は,A. actinomycetemcomitansが,細胞を膨化させる毒素cytolethal distending toxin (CDT)を産生して,G2/M期で著しい細胞周期の停止を引き起こすことを確認している.加えて,我々が見出した新規毒素は,G2/M期での細胞周期の停止のみならず,アポトーシスをも誘導することが見出している.そこで,両者の作用機序の違いを,細胞内情報伝達といった観点から解析したところ,CDTと新規毒素は,ともに,G2/M期での細胞周期の停止の過程で,cyclin-dependent kinase inhibitor p21が重要な役割を果たしていることが明らかとなった.

次年度は,アポトーシスの誘導がどのような機序で引き起こされているのかを詳細に検討する予定である.歯周炎の病巣である歯周ポケット中には,多種・多様の細菌が生息して複雑な生態系が形成されている.これまでの細菌学的および免疫学的な研究の結果,数種のグラム陰性嫌気性菌が主たる原因菌と考えられ,これらを中心に歯周病の発症に関わる病原因子が解析されてきた.我々の研究室では,若年性歯周炎あるいは難治性歯周炎の原因菌の一つと考えられているActinobacillus actinomycetemcomitansがこれまで報告されている外毒素とは異なる新規毒素を産生していることを見出した.今回の研究では,まず,すでに遺伝子がクローニングされているcytolethal distending toxin (CDT)の細胞周期停止機構と新規毒素の活性発現機構を比較検討した.CDTがHela細胞でG2/M期で著しい細胞周期の停止を引き起こすのに対し,新規毒素はこの細胞でアポトーシスを誘導することを明らかにした.さらに,CDTも白血球系の細胞株であるU937細胞に作用させると,新規毒素と同じようにアポトーシスを誘導することが明かとなった.さらに,CDTのサブユニットCDT-A, CDT-B, CDT-Cのリコンビナントタンパクを用いて調べたところ,活性発現に直接関わっているのはCDT-Bであり,CDT-AとCDT-Cは,CDT-Bの細胞内移入にのみ関与していることが示唆された.以前,論文で報告したように,新規毒素には本菌が産生するロイコトキシンやCDTなどは含まれていないことを確認しているが,今回,新規毒素にCDT-Bの混入はないことをあらためて確認した.しかしながら,今回,部分精製標品をより純度の高めてきたが,アミノ酸配列を決定するまでには至らなかった.さまざまな精製方法で単一タンパクまで精製してきたにも関わらず,成功に至らなかったことを踏まえ,今後は遺伝子工学的な方法を取り入れて,新規タンパクの遺伝子のクローニングを行っていかざるを得ないと考えている.