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新規癌関連遺伝子FIP200の肝細胞癌増殖における分子機構解析

新規がん抑制遺伝子FIP200は培養肝がん細胞およびヒト組織において発現していることが確認された。in vitroの実験において肝がん細胞のアポトーシスを誘導することが判明し、また、ヒト肝癌組織においてその発現レベルは、非癌部組織と比較して減弱しており、肝発癌と密接に関連していると考えられた。これらにより肝がん治療における新たな分子標的のひとつとなる可能性が示唆され、また、文化度判定にも有用であることが示された。新規のがん関連遺伝子であるFIP200の肝細胞癌での発現や働きを明らかにし、将来的には治療にも結びつけることを目標として研究を行っている。基礎的検討として、培養肝癌細胞を用いてFIP200蛋白の肝細胞癌内での発現をwestern blotting法で検討した。細胞株としてはp53が野生型であるHepG2、変異型のHuH7およびPLC/PRF/5、発現が欠失しているHep3Bの4種類を用いた。内因性FIP200の発現は各肝癌細胞に発現されており、細胞群間ではわずかに発現度合いに差が認められた。p53および下流蛋白質の発現量の相関性を検討するため、p53や増殖抑制に必須のp21、p53のフィードバック調節因子のMDM2、アポトーシス誘導に関連するBaxやBcl-2について検討中である。また、FIP200の肝細胞癌における細胞増殖やアポトーシスへの関与の検討もおこなった。FIP200の肝癌細胞増殖への関与を検討するためBrdu法を用いた。HA-taggedFIP200を各培養細胞にトランスフェクションし過剰発現させ、蛍光染色にて陽性細胞をカウントして増殖率を計算した。これと対照群と比較し細胞増殖がどう変化するのかを検討した。アポトーシス誘導の同定にはTUNEL法を用い同様に検討した。細胞増殖率の検討においては、HepG2,HuH7,PLC/PRF/5では増殖が抑制されており、特にHepG2で著明であった。一方、p53が失欠しているHep3Bでは増殖はコントロールと有意差がなかった。アポトーシスの検討では、HepG2でFIP200の過剰発現が認められる細胞に高率にアポトーシスが認められた。Hep3Bにおいては過剰発現細胞と対照と比較して有意な差は認められなかった。結果、FIP200は肝細胞癌に対して増殖抑制作用、アポトーシス誘導能を有していると考えられた。臨床的検討として、外科的切除あるいは腫瘍生検で得られた肝癌組織を用いて、FIP200の発現を同定し悪性度や各種背景因子との関連性を明らかにすることであるが、現在IRBの承認を受け、サンプルを収集中である。我々は昨年度に新規癌関連遺伝子であるFIP200蛋白が培養肝癌細胞に発現し、主にp53を介した増殖抑制作用、アポトーシス誘導能を有していることを報告し、今年度から外科的切除で得られた肝細胞癌組織を用いてFIP200蛋白の発現を検討している。また同時に組織学的悪性度との関連性も検討している。これまでの検討では、内因性FIP200は免疫染色およびWestern blottingにおいて全肝癌細胞組織および非癌部組織に発現されているのが確認された。免疫染色においてFIP200は主として細胞質に顆粒状に発現していた。また、全症例においてFIP200は癌部において非癌部より発現の減弱が認められた。さらに、同一組織において分化度が異なる領域を比較した際、高分化、中分化、低分化と分化度が低くなるにつれ発現レベルが減弱している傾向が強く認められた。これらより、FIP200蛋白は培養細胞のみでなく実際のヒト組織においても発現していることが確認された。その発現レベルは癌組織は非癌部組織と比較して減弱しており、肝発癌と密接に関連していると考えられた。又、分化度と発現レベルが相関しており、FIP200は肝癌において悪性度に重要な役割を担っている可能性が示唆された。今後さらに症例数を増やし詳細に解析する予定である。我々は昨年度に新規癌関運遺伝子であるFIP200蛋白が培養肝癌細胞に発現し、主にp53を介した増殖抑制作用、アポトーシス誘導能を有していることを報告し、今年度から外科的切除で得られた肝細胞癌組織を用いてFIP200蛋白の発現を検討している。また同時に組織学的悪性度との関連性も検討した。IRBの承認後、当院消化器外科において切除術を施行された肝細胞癌患者のうちインフォームドコンセントを行い文書にて同意が得られた14例の癌部及び非癌部の組織を用いた。

組織の一部をホルマリン固定し切片を作製し、抗FIP200抗体を用いて免疫染色を行い発現度を検討した。発現の度合いは癌部、非癌部で差があるか比較検討し、さらに、分化度との関連性も検討した。分化度の判定は病理医に依頼した。残りの組織の一部から蛋白質を抽出し抗FIP200抗体を用いたWestern blotting法でも発現を検討した。結果、内因性FIP200は免疫染色およびWestern blottingにおいて全肝癌細胞組織および非癌部組織に発現されているのが確認された。免疫染色においてFIP200は主として細胞質に顆粒状に発現していた。また、全症例においてFIP200は癌部において非癌部より発現の減弱が認められた。さらに、同一組織において分化度が異なる領域を比較した際、高分化、中分化、低分化と分化度が低くなるにつれ発現レベルが減弱している傾向が強く認められた。結論として、FIP200蛋白は実際のヒト組織においても発現していることが確認された。その発現レベルは、癌組織は非癌部組織と比較して減弱しており、肝発癌と密接に関連していると考えられた。また、分化度と発現レベルが相関しており、FIP200は肝癌において悪性度に重要な役割を担っている可能性が示唆された。
職業・専門教育から職場教育へのカリキュラム移行に関する国際比較調査

本研究は、高校生と大学生の「職業生活への移行」過程を、コンピテンシー(職業能力と資質)の形成過程として捉え直した上で、主に学校・大学、キャリア支援機構、企業の3者がいかなる教育(カリキュラム)上の役割(分担)関係を築いているのか、について、3年間にわたる多数の国・地域での実証的調査を通して解明しようとした。以上のような課題設定・目標のもとに、多くの内外の専門家に協力をもとめ、調査研究を進めてきた。結果的には、ドイツ、フランス(国家規制的職業資格志向)、英国、アメリカ合衆国(社会的能力評価志向)、中国(国家主導・制度化途上)、韓国、目本(無規制的潜在能力志向)を対象とした。本研究の成果として、まず第1に、「移行」問題における理論的枠組みを得ることができた。移行問題においてともすると「組織間移行」(労働市揚的側面)のみが注目されるが、重要なことは学習の能力形成の過程や学習の中身からみた学校・大学と雇用・企業との関連の問題である。本研究ではそれを「カリキュラム移行」と名付けた。また、第2に、そういう点から見ると、両者の関連はコンピテンシー形成の面では「補完的」な関係が多かれ少なかれ見られるが、社会的態度形成や価値観形成の面ではしばしば「葛藤関係」「対立的関係」も見られることがわかった。本研究は、高校生と大学生の「職業生活への移行」過程を、コンピテンシー(職業能力と資質)の形成過程として捉え直した上で、主に学校・大学、キャリア支援機構、企業の3者がいかなる教育(カリキュラム)上の役割(分担)関係を築いているのか、について、3年間にわたる多数の国・地域での実証的調査を通して解明しようとしている。本研究には、内外の研究者約15名が関与している。本年度は、まず(1)内外の研究者との調査法・課題の確認のための協議と共同ヒヤリング等を実施した(アメリカ、ドイツ、イギリス)。(2)また、刊行物にはなっていないが、代表者の所属大学で我が国を含む東アジア地域の協力者とともに「カリキュラム移行に関する国際ワークショップ」を開催し、成果の交流と詳細な討論を行った。(3)また、関連した個々の分担研究も行われた。(3)に関する研究成果として、寺田のカリキュラム移行に関する国際比較研究の理論的枠組みに関する論文(業績雑誌論文1参照)、永田の日本の企業内教育における移行促進のための新入社員教育に関する調査研究(業績図書2参照)、海外に関するものとしては、Zirkleのアメリカ職業教育におけるリーダーシップの研究(業績図書3参照)、Pilzの英国スコットランドにおけるコンピテンシーに関する研究(業績図書4参照)、に見られるところである。本研究は、高校生と大学生の「職業生活への移行」過程を、就職・職業配分過程としてよりも職業コンピテンシー(職業能力と資質)の形成過程として捉え直した上で、(1)そのために学校・大学、キャリア支援機構、企業の3者がいかなる教育(カリキュラム)上の役割(分担)関係を築いているのか、いないのか、(2)経済の高度情報化、市場経済化、教育修了・職業資格のグローバル化、大学拡張の中で、その関係構造がいかに変化しつつあるのか、(3)職業教育と高等教育にいかなる改革課題が提起されているのかを、3年間にわたる多数の国・地域での実証的調査を通して解明しようとするものである本年度、上記3つの課題の内おもに(1)について、海外の研究者の協力も得て、企業における学卒者に対する教育訓練措置、その中身について、国際比較調査(アメリカのハイスクール卒レベル、英国の中等教育修了レベル、中国の企業内教育全般、韓国の高卒・大卒レベル、フランスの高卒レベルなど)を行った。また、大卒者の移行過程にかかわって、大学におけるキャリア支援の内容について、アメリカ、ドイツにおける調査研究を進めた。それらの成果は、すべて本研究課題に関わる中間報告書(研究発表欄中の"Interim Report")に納められている。他方、代表者である寺田により、カリキュラム移行過程の国際比較上の分析枠組みの提案もおもに海外の場で行われた(研究発表欄の"The Structural Change"参照)。

本研究は、高校生と大学生の「職業生活への移行」過程を、コンピテンシー(職業能力と資質)の形成過程として捉え直した上で、主に学校・大学、キャリア支援機構、企業の3者がいかなる教育(カリキュラム)上の役割(分担)関係を築いているのか、について、3年間にわたる多数の国・地域での実証的調査を通して解明しようとした。以上のような課題設定・目標のもとに、多くの内外の専門家に協力をもとめ、調査研究を進めてきた。結果的には、ドイツ、フランス(国家規制的職業資格志向)、英国、アメリカ合衆国(社会的能力評価志向)、さらに中国(国家主導・制度化途上)、韓国、日本(無規制的潜在能力志向)を対象とした。本研究の成果として、まず第1に、「移行」問題における理論的枠組みを得ることができた。移行問題においてともすると「組織間移行」(労働市場的側面)のみが注目されるが、重要なことは学習の能力形成の過程や学習の中身からみた学校・大学と雇用・企業との関連の問題である。本研究ではそれを「カリキュラム移行」と名付けた。また、第2に、そういう点から見ると、両者の関連はコンピテンシー形成の面では「補完的」な関係が多かれ少なかれ見られるが、社会的態度形成や価値観形成の面ではしばしば「葛藤関係」「対立的関係」も見られることがわかった。
ネットワークダイナミクスの数理的解析によるインスリン情報伝達機構の解明

インスリン受容によりマウス肝臓で惹起されるタンパク質リン酸化量の経時変化を網羅的に計測し、リン酸化ダイナミクスの統計的・情報学的・数理的な解析を行った。その結果、10,000にも上るノード(タンパク質リン酸化部位)を含めたインスリン情報伝達ネットワークのダイナミクスと、様々な生物学的機能との関連性が明らかになった。さらに、インスリン-インスリン情報伝達分子-その他のタンパク質リン酸化の常微分方程式モデルが大規模に作成され、巨大なインスリン情報伝達ネットワークの全体像に加えて、その動的特性が定量的に明らかになった。本研究では、インスリン受容で惹起されるタンパク質リン酸化の時系列変化を網羅的に計測後、リン酸化のネットワークダイナミクスを定式化し数理的に解析することで、インスリン情報伝達機構の解明を試みる。平成27年度は、タンパク質リン酸化量の時系列データの取得に向けて、以下のように条件検討および計測準備を行った。インスリンの主な標的臓器である肝臓のタンパク質リン酸化を質量分析計で定量可能にするために、まずはマウス肝臓からリン酸化ペプチドサンプルを調製する方法を至適化し、考えられるいくつかの質量分析法を比較検討した。その結果、ラベルフリーでデータ依存的な質量分析をOrbitrap Velos Proで複数回行うのが本目的に最も適しているという結論に至った。その上で次に、実サンプルの調製を次のように行った。C57BL/6J野生型マウスにインスリンを腹腔内投与(0.7 U/kg)し、肝臓を4時間(計13時点)にわたり経時的に採取した。各肝臓より抽出したタンパク質を酵素消化することでペプチドとした後に、リン酸化されたペプチドのみをIMAC法で濃縮し、リン酸化ペプチドサンプルとした。調製したサンプルを分析することにより、各計測時点に存在するリン酸化タンパク質(=ノード)とその量(=ノードの重み)が網羅的に明らかになることが期待される。各種条件検討や肝臓リン酸化タンパク質サンプルの調製は順調に進行しており、時系列データ取得の見通しが立った。平成28年度は、平成27年度までに至適化した計測条件において、タンパク質リン酸化量の時系列データの取得を開始し、取得したデータの定量性の評価やタンパク質リン酸化ネットワークの部分的な推定を行った。C57BL/6J野生型マウスにインスリンを投与後、経時的に採取した肝臓より調製したリン酸化ペプチドサンプルについて質量分析を行い、タンパク質リン酸化量の定量を行った。個体サンプルを用いていることとラベルフリーでの定量であることから、生物学的なばらつきと技術的誤差が共に大きいことが予想されるため、計測時点につき生物学的・技術的にそれぞれ3回ずつ(計9回)反復計測を行った。定量値が得られた13,296のリン酸化部位について、定量データの質とリン酸化量の変動の傾向を確認するために各種統計解析を行ったところ、明らかにタンパク質リン酸化量はインスリン投与後に変化していく傾向があり、インスリンの情報を伝達し得るタンパク質リン酸化の部位(=リン酸化ネットワークのノード)とそれらの各計測時点での量(=ノードの重み)が網羅的に明らかになった。次に、これらのリン酸化を引き起こすタンパク質の探索をkinomeXplorerで行ったところ、3,107種類のタンパク質の10,896のリン酸化部位について、関与が考えられるタンパク質が推定され、インスリンにより惹起されるリン酸化ネットワーク中のエッジが得られた。これらの推定ネットワーク構造とリン酸化定量データを用いることで、ネットワークダイナミクスの定式化が可能となる。肝臓リン酸化タンパク質サンプルの調製は全て終了しているものの、時系列データ取得が予定より遅れている。本研究は、インスリン受容で惹起されるタンパク質リン酸化の時系列変化を網羅的に計測してインスリン情報伝達ネットワークのダイナミクスを解明することを目的としており、平成29年度は、平成28年度までに計測したタンパク質リン酸化量の時系列データを用いて、リン酸化ダイナミクスの統計的・情報学的・数理的解析を行った。計測された約16,500のタンパク質リン酸化部位について、同条件における標準偏差、全時点を通した欠損値の割合や突発的変動などの観点から時系列データをクリーニングした結果、10,700部位のデータが良好であり、以降の解析に使用可能と判断した。この時系列データを用いて種々の統計的解析を行ったところ、明らかにインスリン依存的なリン酸化量の経時的変化が確認され、また、様々な生物学的機能との関連が有意に見られる異なる変動パターンに分類された。このうち159のリン酸化部位については、周辺のアミノ酸配列から既知のインスリン情報伝達分子によりリン酸化が行われていると推定され、既知のインスリン情報伝達ネットワークのダイナミクスとの連動が確認された。さらに、インスリン依存的な時間変動が見られたリン酸化部位について、血中インスリン濃度や肝臓中インスリン情報伝達分子のリン酸化量を入力とする常微分方程式の作成にも成功し、未知のノードを含めたインスリン情報伝達ネットワークのダイナミクスが数理的に表現された。本研究により10,000にも上るノードを含めたインスリン情報伝達ネットワークのダイナミクスとその生物学的機能との関連が明らかになり、特にインスリン-インスリン情報伝達分子-その他のタンパク質リン酸化の数理モデルが大規模に作成され、巨大なインスリン情報伝達ネットワークの全体像の定量的な解析が可能になった意義は大きく、将来的にはネットワーク異常としての糖尿病病態理解への貢献が期待される。

インスリン受容によりマウス肝臓で惹起されるタンパク質リン酸化量の経時変化を網羅的に計測し、リン酸化ダイナミクスの統計的・情報学的・数理的な解析を行った。その結果、10,000にも上るノード(タンパク質リン酸化部位)を含めたインスリン情報伝達ネットワークのダイナミクスと、様々な生物学的機能との関連性が明らかになった。さらに、インスリン-インスリン情報伝達分子-その他のタンパク質リン酸化の常微分方程式モデルが大規模に作成され、巨大なインスリン情報伝達ネットワークの全体像に加えて、その動的特性が定量的に明らかになった。まず調製した肝臓リン酸化ペプチドサンプルの質量分析を行い、インスリン刺激後のタンパク質リン酸化量変動を定量する。次に、それぞれのリン酸化タンパク質(=ノード)がどのタンパク質のリン酸化を促進するのかということ(=エッジ)を、各種リン酸化タンパク質がリン酸化の標的とし得るタンパク質表面の化学的構造(アミノ酸配列)に関する知見を基に推定する。具体的には、リン酸化解析ツールkinomeXplorerを用いて、全てのリン酸化部位について周辺の化学的構造がどのタンパク質の標的構造かを判定することで、エッジの有無を推定する。以上のようにリン酸化ネットワークの構造とノードの重み情報を取得することで、リン酸化のネットワークダイナミクスの定式化を可能にする。まずは引き続きkinomeXplorerにより、各計測時点でのタンパク質リン酸化のネットワーク構造を部分的に推定する。次に、タンパク質がリン酸化されることによって、標的タンパク質のリン酸化の効率が変化するという様な多くの知見に基づき、各計測時点でのノードの重み(=タンパク質リン酸化の量)に応じて次のリン酸化を引き起こす程度が変化すると仮定して、タンパク質リン酸化のダイナミクスを定式化する。定式を用いて、ノードの重要性評価やネットワーク中心性等の特徴量の抽出を行い、インスリン情報伝達機構の数理的特徴を解明する。さらに、ネットワークダイナミクスに大きな影響を与えるリン酸化タンパク質やリン酸化の促進経路を特定した上で、インスリン伝達機構の堅牢性および脆弱性を評価し、それを保証するネットワーク構造を明らかにする。時間的に可能であれば、既知の構造でなくともリン酸化部位周辺の化学的構造が類似している場合、同一のタンパク質によってリン酸化されると仮定し、さらなるエッジの推定を試みる。推定された全ネットワークダイナミクスの数理的構造を解析し、インスリン情報伝達機構の全貌とその特性を解明する。定量生物学タンパク質リン酸化の定量の開始が予定より遅れたため、それに伴い必要経費も次年度に使用する必要が生じた。タンパク質リン酸化の定量が予定より遅れているため、それに伴い必要経費も次年度に使用する必要が生じた。タンパク質リン酸化の定量の見通しは既に立っているため、必要となる消耗品を随時購入しつつ着実に実行する。全てのタンパク質リン酸化
正則写像のなす空間の位相と実特異点論のホモトピー論への応用の研究

本研究では、Segal (Acta Math. (1979))によって得られた有理関数の空間の研究結果をより一般の写像空間の場合に拡張することをを研究の主要目的とした。とくに、写像空間Map(M,N)として、Mが1次元より大きな次元の多様体Mのときの例としてM, Nが実射影空間のときに、無限次元空間Map(M,N)のホモトピー型を研究した。この場合、多項式で表現される代数的写像(正則写像)のなす有限次元空間Alg(M,N)で、これがどの程度の次元まで近似できるかを調べ、A. Kozlowski氏(ワルシャワ大学)との共同研究でその近似次元を具体的に計算することに成功した。(1)実代数的多様体Xから、(実あるいは複素)グラスマン多様体への連続写像fは、X上の任意のベクトル束が実代数的ベクトル束で近似できるとき、写像fのホモトピー類は多項式で表現される代数的写像(正則写像)を代表元にとれることが知られている。この結果の空間への拡張定理を、とくに、実(または複素)射影空間の場合に、M. Adamaszek氏(Univ. Warwick, England)とA. Kozlowski教授(Univ. warsaw, Poland)との共同研究で解明した。この結果は、Quart. J. Math. (2011)に発表した。さらに、この空間が写像の次数によってfiltrationがはいるが、その次数でどの次元まで近似できるか(Atiyah-Jones型原理)を計算できた。(2)(1)で得られた結果を実射影空間から、滑らかなコンパクトな射影的トーリック多様体への拡張を試みた。こお部分的結果については、A. Kozlowski氏と電通大の大野真裕氏との共同研究で証明できた。この結果についての論文準備中である。さらに、関連する実トーリック多様体にも同様な結果が成り立たないかを研究した。(3)異なる結び目から同じレンズ空間が得られる手術の組を研究し、関連する4次元多様体を考察した。(4)昨年に引き続き、Derived categoryの研究を代数幾何学的側面から研究した。さあらに、代数幾何学的側面からトーリック多様体を研究した。(5)Diffeorogyを研究し、関連する微分空間のカテゴリーにおける骨組みでのオモトピー論の構築の研究を行った。・研究代表者は、Atiyah-Jone-Segal型予想の研究に関連して、関連する写像空間Map(M,N)として、Mが1次元の場合には以前からよく研究されていたので、平成23年度以降は1次元より大きな次元の多様体Mを取り扱い、その代表例としてM, Nが実(または複素)射影空間KP(m) (K=R, C)のときに、無限次元空間Map(M,N)のホモトピー型を研究した。しかし、一般に、Map(M,N)は無限次元であまりに巨大な空間でその取り扱いが困難であるので、これを有限次元空間で近似することを、実代数幾何学の手法(とくに、Arnold, Vassiliev達によって開発された手法)を用いて研究した。このような場合には、M,Nは実代数幾何的構造を持つので、多項式で表現される代数的写像(正則写像)のなす有限次元空間Alg(M,N)で、Map(M,N)が近似できるかを研究し、A. Kozlowski氏(warsaw大学)との共同研究でその近似次元を具体的に計算することができた。(この結果は、Quart. J. Math. , Topology Appl.で掲載された)・代数の研究分担者は、代数閉体上定義された斉次1次式を成分にもつ行列のmaximal minorsの性質についてEagon-Northcott複体を用いて,伊東裕也氏(電通大)と野間淳氏(横浜国大)と共同研究を行った.・低次元多様体の手術の研究分担者は、門上氏とのTorsionに関する共著論文の最終仕上げを行なった。また、共同研究者でもある丹下基生氏(筑波大学)が主催する勉強会の立ち上げに協力し,主に若手研究者のためのサーベイ的講演として、RibbonかつFiberedなknotのモノドロミーの分析手法の解説を行なった。(i)実代数的多様体Xから, (実あるいは複素)グラスマン多様体への任意の連続写像は、X上の任意のベクトル束が、実代数的ベクトル束で近似できるときには、任意のXからグラスマン多様体への連続写像は代数的写像(多項式で教示できる写像)でホモトピー敵には近似できることが、ベクトル束上のStone-Weierstrass型定理を利用して示される。この結果の拡張としてm, nが1<m<nを満たす正の整数のとき, m次元実射影空間から、n次元実射影空間への連続写像全体の空間は、その間の代数的写像全体のなす部分空間で近似できることを以前証明した。このとき、多項式の次元によって代数的写像全体の成す部分空間にはフィルトレーションがはいる。

このフィルトレーションデホモトピー型がどの程度近似できるかを調べた。とくに、本年はその近似次元の最良値と思われる次元を決定することが、Truncated simpllical resolutionを利用して成功した。さらにこの結果の類似が実射影空間から複素射影空間への連続写像全体の成す空間に対しても成り立つことも示すことができた。この結果は、同変ホモトピー型への応用でき、その場合の近似次元も求めることができた。ただその次元が成立すには、テクニカル的な条件がつく。今後はその条件をはずすことが課題である。(ii)異なるknotから同じレンズ空間が生じる手術(surgery)の組を研究し、そこから構成される4次元多様体を考察した。基礎的な組については分析を完成することができた。その結果はpreprintに執筆し講演も行った。(iii)Derived categoryの研究を代数幾何学的側面より研究した。とくに、非特異射影的代数的多様体の有界なderived categoryについて考察した。当初考えていたAtiyah-Jones型定理が実射影空間の間の写像空間の場合については、解明でき、すでにQuart. J. Math. (2011)に発表できたことで第1の目的は達成できた。さらに、この結果を利用して実射影空間の間の写像空間のホモトピー群の計算にも応用でき、これについても2012年度に、Math. J. Okayama Univ.に発表できた。またすでに前述のQ.J.M.の結果のうち、近似次元の改良にも、A. Kozlowski氏との共同研究で達成された。(これについても、Topology and its Appl. (2013)で発表される予定である。以上の理由により、おおむね順調に進展してると判断する。最初に考えていたAtiyah-Jones型定理の基本課題を解くことができ、その論文をQuart. J. Math.に、2012年初めに発行することができた。さらに,その結果の安定次元のより良い近似を2011年度夏頃、計算することができQuart. J. Math.の結果の拡張に成功した。また、それに関するプレプリントとその同変ホモトピー論への応用の論文2編を執筆し投稿することができた。以上の理由により、おおむね順調に進展していると判断する。(1)引き続き、実代数的多様体(real algebraic variety)からグラスマン多様体への写像全体の空間をその間の代数的写像の作る部分空間でホモトピー論の立場から近似することを研究すること(いわゆるAtiyah-Jones型定理)を第1の目標とする。(2)とくに、本年度は、(1)の問題に関連して、実射影空間から、滑らかなコンパクト射影的トーリック多様体への連続写像の成す写像空間の場合にも、(1)と同様なAtiyah-Jones型定理が成り立たないかを解明することを主目的に取り組む。そのために、研究分担者の大野先生と以前からのA.Kozlowski教授との共同研究で解明する予定である。(i)引き続き実代数的多様体からグラスマン多様体への実代数的写像全体のなす空間のホモトピー型を、実特異点論をホモトピー論へ応用することを追求する。(ii)
非接触3次元形状計測に基づく意匠設計支援システムの開発

意匠設計マスタモデルの非接触3次元形状オンマシン計測に基づいて生成したCADモデル形状の正当性を検証するために,加工モデルと意匠設計マスタモデルとの比較検討からCADモデルの評価が可能なCADモデル検証システムの開発を目的とした研究を行い,以下のような成果を得た。1.非接触3次元エッジプロファイル測定センサの開発高精度光リング式変位センサによって得られる光リング像に基づいたエッジ検出アルゴリズムを開発し,光線追跡法を用いた光リング強度の計算機シミュレーションおよびエッジ検出の基礎実験によってエッジプロファイル計測センサとしての有効性を示した。また,前年度に開発した非接触3次元オンマシン計測システムにエッジ検出センサを組込み,実際の曲線エッジプロファイル測定を試みた。2.加工モデル形状処理アルゴリズムの構築意匠設計モデルの高密度複合計測データによって生成したCADモデルに基づいて作成された実加工モデルを想定し,意匠設計モデルの計測と同様にして得られる複合計測点群データから計算機加工モデルへの高精度変換アルゴリズムの開発を行った。まず,エッジプロファイルを考慮したB-spline曲面とCoonsパッチを用いた形状処理アルゴリズムを構築し,さらに,エッジ輪郭によって分割された曲面を滑らかに接続するための,擬頂点を用いたB-spline曲線接続技術について基本アルゴリズムを構築した。3.CADモデル形状検証システムの開発意匠設計モデルと実加工モデルの複合計測点群データからB-spline曲線・Coonsパッチモデルへ変換した2つのCADモデルに対して,お互いの位置偏差,角度偏差,曲率偏差などを3次元表示し,比較検討することによって,CADモデルの評価が可能なCADモデル検証システムについての基本技術を開発した。1.意匠設計モデルの形状変位と検出される光リング像の径が直線関係にあることを基本原理とする下記のような構造と特徴を持つ光リング式多機能センサおよび3次元自由曲面形状の自動計測を機上で行うことができるオンマシン計測システムの試作開発を行った.(1)3枚の非球面レンズ,半導体レーザ光源,リングスリツト,拡散板付きマイクロモータ,CCDエリアセンサなどからなる,3.6μm/ピクセルの分解能で1mmの測定範囲を持つ小型で軽量なセンサを試作開発した.(2)光リング像の画像処理に加重平均法と最小二乗法を適用することにより急斜面や金属面においても光リング像の半径を高精度に求めることができる.(3)拡散反射面であれば最大70°の傾斜まで±5μm,また鏡面反射光を含む金属面では±10μmの精度で3次元自由曲面の形状計測が可能である.(4)計測システムは光リング式多機能センサ,NC工作機械,NC装置,3D形状計測コントローラ,パーソナルコンピュータ,ワークステーションなどから構成される.(5)エッジを含む3次元自由曲面からなるアクセサリモデル(高さ5mm×縦12mm×横14mm)を0.2mmの間隔で4200点高精度・高密度に約2時間で自動計測することができた.2.意匠形状モデルのCADシステム構築のために下記のような特徴を持つ曲率を考慮した高精度あてはめが可能な自由曲面生成法を構築した.(1)パッチを形成する曲線群を細密な間隔で計測することにより複雑な曲面形状であっても少ない計測点群データで高精度な曲面あてはめを可能にする高密度計測法である.(2)曲率が大きい形状位置には多くのノットを,緩やかな形状には少ないノットを自動的に決定することができる曲率を考慮したノンユニフォームB-スプライン曲線自動生成法である.(3)ノンユニフォームB-スプライン曲線群によって形成されるネット状パッチからCoonsパッチを生成し,曲線ネットとパッチによるデータ構造を持つ自由曲面データ自動生成法である.意匠設計マスタモデルの非接触3次元形状オンマシン計測に基づいて生成したCADモデル形状の正当性を検証するために,加工モデルと意匠設計マスタモデルとの比較検討からCADモデルの評価が可能なCADモデル検証システムの開発を目的とした研究を行い,以下のような成果を得た。平成8年度は,意匠設計マスタモデルの非接触3次元形状オンマシン計測に基づいて生成したCADモデル形状の正当性を検証するために,加工モデルと意匠設計マスタモデルとの比較検討からCADモデルの評価が可能なCADモデル検証システムの開発を目的とした研究を行い,以下のような成果を得た。1.非接触3次元エッジプロファイル測定センサの開発

高精度光リング式変位センサによって得られる光リング像に基づいたエッジ検出アルゴリズムを開発し,光線追跡法を用いた光リング強度の計算機シミュレーションおよびエッジ検出の基礎実験によってエッジプロファイル計測センサとしての有効性を示した。また,前年度に開発した非接触3次元オンマシン計測システムにエッジ検出センサを組込み,実際の曲線エッジプロファイル測定を試みた。2.加工モデル形状処理アルゴリズムの構築意匠設計モデルの高密度複合計測データによって生成したCADモデルに基づいて作成された実加工モデルを想定し,意匠設計モデルの計測と同様にして得られる複合計測点群データから計算機加工モデルへ高精度変換アルゴリズムの開発を行った。まず,エッジプロファイルを考慮したB-spline曲面とCoonsパッチを用いた形状処理アルゴリズムを構築し,さらに,エッジ輪郭によって分割された曲面を滑らかに接続するための,擬頂点を用いたB-spline曲線接続技術について基本アルゴリズムを構築した。3.CADモデル形状検証システムの開発意匠設計モデルと実加工モデルの複合計測点群データからB-spline曲線・Coonsパッチモデルへ変換した2つのCADモデルに対して,お互いの位置偏差,角度偏差,曲率偏差などを3次元表示し,比較検討することによって,CADモデルの評価が可能なCADモデル検証システムについての基本技術を開発した。
ADHD発症リスクの解明：エピジェネティクス及び環境遺伝交互作用

大規模出生コホートの8歳児に、調査票を用いADHD症状をConners3PとADHD-RSで評価し、胎児期の喫煙や葉酸摂取など環境因子のリスクを検討した。回答者2,545名について解析した結果、妊娠中の喫煙曝露によりADHD傾向が強く胎児期の喫煙のリスクが有意に高かった(OR=2.2;95%CI,1.002-4.631)。さらにコホート内症例対照研究デザインで、ADHD疑い症例群138名と対照群について、EP1システム(Fludigm社製)で神経伝達関連遺伝子(DRD4,DAT1,HTR1B,COMT,SNAP25)と脳由来神経栄養因子(BDNF)についてSNPs解析を200名分終了した。本研究では大規模出生コホートに参加している8歳児に対し、国際的に使用されているConners3P(ADHD関連症状調査票)とADHD-RS、現在の生活環境などについて質問票調査を行い、胎児期の母の喫煙状況や葉酸摂取など環境因子がどのようにアウトカムのリスクをあげているか検討する。さらに、コホート内症例対照研究デザインでDAT1、DRD4ほかADHDに関わりの深い神経伝達遺伝子多型と臍帯血メチル化の測定を行うことにより、発達障害に関わるSNPsとDNAメチル化を介したメカニズムを明らかにする。今年度の実績は次の通りである。(1)8歳児調査票に回答した1,273名(男667名、女606名)の中で、既に医師による診断を受けた児はADHDが24名(1.9%)、発達障害が36名(2.8%、ADHDとの重複6名あり)であった。Conners3Pによる症状得点は、不注意得点平均5.7点/最高30点、多動衝動性得点平均4.5点/最高42点、総合指標得点1.6点/最高20点であった。男女別では、不注意得点、多動衝動性得点が男児で高かった(p<0.001)。(2)妊娠中血漿コチニン濃度により評価した母の喫煙のADHD症状得点への影響を検討した。妊娠中に母親が喫煙していた児は多動衝動性得点が高く(p=0.041)、妊娠中血漿コチニン濃度と不注意得点、多動衝動性得点が正相関(p=0.002,p<0.001)していたが、年収や養育環境などで調整すると関連は消失した。喫煙よりも社会経済環境の影響が大きいことがわかった。今後、層別解析を行って検討する必要がある。(3)妊娠初期血清葉酸値を測定済みの1,174名について、ADHD症状得点と葉酸値との関連を検討した。妊娠初期血清葉酸値は平均8.4ng/ml、葉酸サプリメント摂取は11.1%であった。葉酸値とADHD症状の各得点とは単変量解析で関連が認められなかった。本研究では大規模出生コホートの8歳児に対し、国際的に使用されているConners3PとADHD-RS、現在の生活環境について質問票調査を行い、胎児期の母の喫煙や葉酸摂取など環境因子のリスクを検討する。さらにコホート内症例対照研究デザインでADHDに関与する神経伝達遺伝子多型と臍帯血メチル化の測定を行うことにより環境遺伝交互作用を明らかにすることを目的とした。(1)8歳児調査票に回答した2,545名(男1,306名、女1,239名)の中で、診断を受けた児はADHD36名(1.4%)、発達障害64名(2.5%、ADHDとの重複6名)であった。Conners3Pによる不注意得点平均6.6点/最高30点、多動衝動性得点平均4.0点/最高42点、総合指標得点1.5点/最高20点であった。全ての得点で男児が高かった(p<0.000)。喫煙曝露の影響は、妊娠中の喫煙が、児の性別や出生時体格などで調整をしても有意な影響が示された(AOR=2.2;95%CI, 1.002-4.631)。(2)ADHD-RS質問票からADHD疑い症例群と定義した138名(多動型26名、不注意型64名、混合型6名、ADHD判定不能42名)について、Fludigm社製遺伝子解析EP1システムでSNPs解析を行った。DNA抽出は母体血または臍帯血を用いた。解析は神経伝達関連遺伝子であるドパミン受容体4型(DRD4; C>T)、トランスポーター1型(DAT1; C>

TおよびG>A)、セロトニン受容体1B型(HTR1B; G>C)、カテコール-O-メチル基転移酵素(COMT; G>A)、シナプトソーム関連タンパク質25(SNAP25; A>C)および脳由来神経栄養因子(BDNF; A>G)について行った。統計学的パワーを最大にするためには症例群130名と対照群260名の合計390名となり、現在までに200名の解析が終了した。残り190名の解析を進行中で、今後DRD4とDAT1のメチル化によるエピジェネティクス解析に入る予定である。医歯薬学大規模出生コホート(登録者数20,929名)のうち8歳に達した児を対象としたADHD関連症状調査票(Conners3PとADHD Rating Scale(ADHD-RS))を用いて我が国で出生コホートで検討したのは初めてであり、既に1,905名分を回収している。さらに、ADHDとASD(自閉症スペクトラム障害)を鑑別するためのASQ(Autism Spectrum Questionnaire)や養育者のサポート状況、母親の抑うつ状態など、詳細な追加質問票を1,572名から回収している。一部であるが、対面調査に同意を得られた73名からは、WISC-IV(認知機能)とCBCL、養育者ストレスなどの情報を収集済みである。曝露物質測定として、喫煙を客観的に評価するためのコチニン値は妊娠後期母体血で16,060名、葉酸値は妊娠初期母体血で19,047名分の測定を終了している。ADHDリスク遺伝子多型とメチル化部位の測定では、DNA抽出や分析器機操作に習熟しており、症例対照群を選定次第、分析に取りかかる予定である。引き続き平成25年度と同様の調査を1,590人に対して継続するとともに、下記を行う。(1)ADHD症例群で疾患が疑われた場合は、希望者に対しての相談を行い、必要な場合には医療機関を紹介し、早期介入に繋げる。(2)Conners3Pの信頼性および妥当性の評価を行う。すでに信頼性と妥当性が検証されているADHD-RSを外的基準として、基準関連妥当性を確認する。Conners3P得点を盲検化して、医師によるADHDの臨床診断と対照群の臨床診断に基づいたConners3Pの外部妥当性を検討する。信頼性は、内部一貫性の指標であるCronbachのα係数で算出し、ADHDの不注意や多動衝動性などの症状について、ADHD-RSでの結果と比較検討する。(3)環境遺伝交互作用によるADHD発症のリスク要因を数量化するため、Conners3Pの不注意、多動衝動性、総合指標の各得点のT得点65以上をケースとして、ケースと対照群を各50名抽出し、ADHD発症に係わる環境要因が遺伝要因とどのような交互作用を持つかを解析する。特に、ADHDの候補遺伝子(COMT、DRD1/2/3/4/5TH、MAOAなどの単塩基多型およびDAT1、DRD4のコピー数多型)および葉酸代謝酵素関連遺伝子(MTHFR、MS、MTRR、CBS)、喫煙に関連する遺伝子(CYP1A1、CYP1B1、AhR、AhRRなど)の多型・ハプロタイプ解析を行う。平成25年度に実施予定であった対面調査の一部(約30名分)を次年度に延期したため、謝金(謝礼:図書カード)及びそれに伴う費用(発送物等)の支出が繰り越しになった。平成26年度に前年度実施予定であった約30名分も含めた対面調査の実施により、発生する謝金として使用する。
アミノ酸を不斉源としたアルカロイド類の高効率的不斉合成

著者らは、含窒素複素環に置換基を導入する方法を開発し、更にその方法を不斉反応へと発展させている。それらは、in situで生成する複素環N-アシル四級塩を求核剤で捕捉する方法であり、一般性、実用性の高いことを既に報告している。また、安価で入手容易なアミノ酸をキラル源とする不斉誘起にも成功し(最高98%de)、得られた1位置換イソキノリン類から(-)-homolaudanosine,(S)-2,3,9,10,11-pentamethoxy-homoprotoberberine等のイソキノリンアルカロイドの合成に成功した。昨年度は、キラルな複素環N-アシル四級塩を経由する求核付加反応に際しての不斉発現機構を分子軌道法計算により考察した。これまでに得られている実験結果と計算結果に良い一致が認められたことから、今年度は最も高い選択性の期待できる、アミノ酸から誘導されるキラルなN-アシル化剤を合成しイソキノリン環1位に対する不斉求核付加反応を検討した。その結果、アルカロイド類合成のための基質のみならず、無置換のイソキノリン環に対しても高いジアステレオ選択性で1位に置換基を導入することに成功した。1位のみに置換基を有するテトラヒドロイソキノリン類は、近年、パーキンソン病の発症と抑制に関係する化合物として注目を浴びている。著者らは、不斉求核付加反応により得た1位置換体から光学活性1位置換テトラヒドロイソキノリンへの変換にも成功した。これらの化合物の一般的合成法はこれまで報告されておらず、有用性の高い合成法を提示できたと考えている。
デフォメーションゾーンを利用したより容易な超微細粒組織生成に関する研究

強度上昇を目的とした強ひずみ加工による結晶粒超微細化の研究が盛んである。しかし、さらに強度を上げるために微細な第二相粒子を分散させると、結晶粒超微細化が著しく抑制されてしまう。そこで本研究のねらいは、粗大な第2相粒子を分散させたNi基合金を多軸鍛造(MDF)し、変形拘束によってその周囲に変形集中と転位密度をもたらし、中の結晶粒超微細化の促進を試みることである。当然、第2相粒子は母相強化にも寄与するため、結晶粒超微細化との強度上昇に対する相乗効果が期待できる。粗大な第2相酸化物粒子(d=1-3μm)を含むNi-Fe合金(以下Ni-O材)の冷間押出し材から11.3×9.2×7.5mm^3の矩形状試験片を切り出し、ひずみ速度ε=1.0×10^<-3>s^<-1>、温度T=773K、873Kで、パスひずみΔε=0.4の多軸鍛造(MDF)を行った。比較材として、第2相粒子を含まないNi-Fe合金(以下Ni材)を用いて、同様の実験を行った。873KでMDF加工したときの応力-ひずみ線は、低ひずみ域での加工硬化後、軟化する動的再結晶に類似した曲線となった。高ひずみ域で、室温での硬さはNi-O材がNi材より高いにもかかわらず、873Kでは逆に低くなった。これは結晶粒の超微細化と深く関連している。873Kで累積ひずみ2.4までMDF加工後の結晶方位分散像では、Ni-O材で均一な微細粒組織となり、平均粒径は約0.8μmであった。一方、Ni材では微細粒の発達は不均一で、粗大な初期粒が残っていた。この結果より、粗大な第2相粒子を含むNi-O材は、粒子を含まないNi材よりも、均一な微細粒組織の発達がより早く進行したことがわかった。近年、強ひずみ加工法による結晶粒微細化が提案され、その結晶粒微細化の機構や材料物性についての研究がなされている。しかし、均一結晶粒微細化に必要な加工ひずみが6程度以上であり、より低い不可ひずみでの結晶粒超微細化が求められていた。本研究は、粗大な第2相粒子の分散により、より低いひずみで均一な超微細粒組織を得ることを目的とした。分散強化型Ni-Fe合金(以降Ni-O材)の矩形状試験片に、圧縮試験機を用いて圧縮方向をパス毎に90度ずつ回転させながら、Δε=0.4の多軸多段階鍛造を行った。ひずみ速度は1.0×10^<-3>s^<-1>、試験温度は773K、873Kとした。比較材として分散粒子のないNi-Fe合金(以降Ni材)も同様の実験を行った。Ni-O材、Ni材ともに低ひずみ領域での急速な加工硬化後、773Kではε=1.2付近、873Kではε=0.8付近でピークを示し、その後緩やかに加工軟化を示した。873Kにおいては、低ひずみ領域ではNi-O材の変形応力がやや高いが、ひずみが大きくなるとその違いはほとんどなくなった。また、773KにおいてはNi-O材とNi材の間にほとんど違いは見られなかった。結晶方位分散分析装置による組織観察の結果から、ε=

0.4では特に第2相粒子の周辺で組織の微細化が進んでいることがわかった。一方、ε=2.4では第2相粒子を中心にし、組織全体の微細化が進んでいた。873Kでは平均粒径が約0.9μmの均一超微細粒組織が得られた。微細化が第2相粒子の周りで優先的に起こるのは、粒子が粗大なため、変形の拘束によるDeformation Zoneが形成されたため、と考えられた。Ni材は同じ条件で微細化が遅れていた。以上の実験結果から、第2相粒子は結晶粒の均一微細化を促進し、ひずみの増大とともに微細粒は組織全体に広がっていく事が明らかとなった。申請者等らが考案した強ひずみ加工法、特殊な装置や複雑な加工プロセスを必要としない「多軸鍛造」法を、粗大粒子を含むNi-Fe合金に適用し、より低ひずみでの超微細粒材生成を目指した。これは、1)従来の強ひずみ加工法による超微細粒組織形成には、単相材が主に利用されてきており、超微細粒組織が得られるまでのひずみ量が非常に大きくε≧6、その創製が極めて困難であったこと、また、2)さらに高強度な材料とするために、微細粒子を分散させた強化材では、微細粒子が超微細粒組織の発達を阻害し、超微細粒組織が得られにくかったこと、等の問題点を解決するためである。本研究では、粗大粒子は結晶粒の超微細化を促進する効果があるとの報告から、粗大析出物を分散させた合金に強加工を施し、より低いひずみでより均一な超微細粒組織を得ることを狙ったものである。粗大析出物は材料強度向上にも直接的に寄与するため、従来の単相超微細粒材と比較して大幅な高強度化が期待できる。実際、13μm程度の粗大分散粒子の存在により、Ni-Fe合金の結晶粒の超微細化は著しく促進され、わずか累積ひずみ2.4で平均結晶粒径が0.8μmの均一な超微細粒組織が得られた。この超微細粒組織の発達は、温間加工中の回復と粒子周囲での異質変形組織の発達との相互作用によってもたらされたと考えられた。その確認のため、回復が起こりにくい低温度域での多軸鍛造、粗大粒子を含まないNi-Fe合金への多軸鍛造を行った。そして、均一な超微細粒組織が得られないことが明らかとなり、上述の微細化機構が正しいことが示された。以上の結果から、工業的に重要なより低い加工ひずみでより均一な超微細粒組織が得られる手段が得られた。
ポリオウイルス遺伝情報と神経毒性発現

これまでに1型ポリオウィルスの神経毒性に影響を与えるゲノム領域を同定するために強毒Mahoney株と弱毒Sabin1株間で種々の組換え体ウィルスを作製し,それらの神経毒性をカニクイザルを使用して検討してきた.その結果神経毒素性に影響を与えるゲノム領域は複数存在すること,ゲノム5′noncoding領域,とくに塩基番号480の塩基がアデニン(強毒Mahoneyの塩基)であることが神経毒性発現に重要に関与していることが明らかとなった.ところがこの塩基を弱毒Sabit1株の塩基であるグアニンに置換しても周囲の塩基配列がMahoney型であるときには期待した弱毒性発現が見られないことが判明した.この理由として(1)弱毒性発現には5′noncoding領域が形成する高次構造が機能しており,塩基番号480周辺の単なる一次構造で制御されるものではない.(2)塩基番号480のグアニンが,個体中でのウィルス複製の間にグアニンにもどってしまう可能性がある.の2点が考えられた.そこで(2)の可能性を検討した.まず弱毒性が期待された組換え体ウィルス(塩基番号480がグアニン)をカニクイザルの中枢神経系に接種し, 7日後に臨床的に病変を呈しているサルの中枢神経系からウィルスを回収し,これらウィルス(18株)のゲノム5′noncoding領域の塩基配列を調べた.その結果5′noncoding領域の塩基配列は塩基番号480も含め変化していないことが明らかとなり(2)の可能性は否定された.以上の結果は,最初に接種したウィルスそのものが期待したより強い神経毒性を持っていたことを示唆するものであり(1)の可能性を強く示唆した.このように弱毒性発現のメカニズムは複雑であり,塩基番号480が影響を及ぼす5′noncoding領域の機能構造を解明する必要が生じた.現在はコンピューターを使用した高次構造解析を行っているところである.これまでに1型ポリオウィルスの神経毒性に影響を与えるゲノム領域を同定するために強毒Mahoney株と弱毒Sabin1株間で種々の組換え体ウィルスを作製し,それらの神経毒性をカニクイザルを使用して検討してきた.その結果神経毒素性に影響を与えるゲノム領域は複数存在すること,ゲノム5′noncoding領域,とくに塩基番号480の塩基がアデニン(強毒Mahoneyの塩基)であることが神経毒性発現に重要に関与していることが明らかとなった.ところがこの塩基を弱毒Sabit1株の塩基であるグアニンに置換しても周囲の塩基配列がMahoney型であるときには期待した弱毒性発現が見られないことが判明した.この理由として(1)弱毒性発現には5′noncoding領域が形成する高次構造が機能しており,塩基番号480周辺の単なる一次構造で制御されるものではない.(2)塩基番号480のグアニンが,個体中でのウィルス複製の間にグアニンにもどってしまう可能性がある.の2点が考えられた.そこで(2)の可能性を検討した.まず弱毒性が期待された組換え体ウィルス(塩基番号480がグアニン)をカニクイザルの中枢神経系に接種し, 7日後に臨床的に病変を呈しているサルの中枢神経系からウィルスを回収し,これらウィルス(18株)のゲノム5′noncoding領域の塩基配列を調べた.その結果5′noncoding領域の塩基配列は塩基番号480も含め変化していないことが明らかとなり(2)の可能性は否定された.以上の結果は,最初に接種したウィルスそのものが期待したより強い神経毒性を持っていたことを示唆するものであり(1)の可能性を強く示唆した.このように弱毒性発現のメカニズムは複雑であり,塩基番号480が影響を及ぼす5′noncoding領域の機能構造を解明する必要が生じた.現在はコンピューターを使用した高次構造解析を行っているところである.1型ポリオウイルスの神経毒性発現がどのゲノム領域により影響を受けているのかを知るために、1型ポリオウイルスの強毒Mahoney株と弱毒Sabin1株ゲノムから作製した感染性cDNAクローンの各ゲノム領域に相当する制限酵素断片を入れかえ、動物細胞にトランスフェクトすることにより、両ウイルス株間の組換え体ウイルスを多数作製した。これらウイルス株についてサル神経毒性試験を行った結果、神経毒性発現に関するゲノム領域は複数存在し、特に5'noncoding領域(742塩基)中に神経毒性を強く支配する領域があることが明らかとなった。このことは1型ポリオウイルスの神経毒性発現は、ウイルスの複製効率と密接に関係していることを示唆している。そこでSabin1株ゲノムの5'noncoding領域の塩基配列をMahoney株の相当する塩基配列で置きかえることにより、神経毒性を担う塩基の同定を行った。その結果、5'末端から480番目の塩基がA(Sabin1株ではG)であることがMahoney株ゲノムの5'noncoding部位が担う神経毒性発現にとって必要であることが明らかとなった。しかしながら、その逆にMahoney株塩基配列のうちこのAをGに変化させただけではSabin1株の5'noncoding部位が担う弱毒性発現を説明するには不十分であった。以上の結果は、ポリオウイルス弱毒化には5'noncodingのRNAの各領域間の相互作用が重要に関係していることを示すものである。そこでSabin1株の感染性cDNAクローンを利用し、多くの人工変異を5'noncoding領域に導入し複製効率の低下したウイルス株を作製し、それからの復帰変異株のゲノム構造の解析を行うことで5'noncoding部位内の相互作用を持つ領域をさがしている。

現在のところ、5'末端から200番目前後の塩基と500番目前後の塩基間に相互作用があるらしいとの結果を得ている。これまでに1型ポリオウイルスの神経毒性に影響を与えるゲノム領域を同定するために強毒Mahoney株と弱毒Sabin1株間で種々の組換え体ウイルスを作製し,それらの神経毒性をカニクイザルを使用して検討してきた.その結果神経毒性に影響を与えるゲノム領域は複数存在すること,ゲノムの5′noncoding領域,とくに塩基番号480の塩基がアデニン(強毒Mahoney株の塩基)であることが神経毒性発現に重要に関与していることが明らかとなった.ところがこの塩基を弱毒Sabin1株の塩基であるグアニンに置換しても周囲の塩基配列がMahoney型であるときには期待した弱毒性発現が見られないことが判明した.この理由として(1)弱毒性発現には5′noncoding領域が形成する高次構造が機能しており,塩基番号480周辺の単なる1次構造で制御されるものではない.(2)塩基番号480のグアニンが,個体中でのウイルス複製の間にグアニンにもどってしまう可能性がある.の2点が考えられた.そこで(2)の可能性を検討した.まず弱毒性が期待された組換え体ウイルス(塩基番号480がグアニン)をカニクイザルの中枢神経系に接種し, 7日後に臨床的に病変を呈しているサルの中枢神経系からウイルスを回収し,これらウイルス(18株)のゲノムの5′noncoding領域の塩基配列を調べた.その結果5′noncoding領域の塩基配列は塩基番号480を含め変化していないことが明らかとなり(2)の可能性は否定された.以上の結果は,最初に接種したウイルスそのものが期待したより強い神経毒性を持っていたことを示唆するものであり(1)の可能性を強く示唆した.このように弱毒性発現のメカニズムは複雑であり,塩基番号480が影響を及ぼす5′noncoding領域の機能構造を解明する必要が生じた.現在はコンピューターを使用した高次構造解析を行っているところである.