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20世紀社会主義経済体制の崩壊とその将来的含意に関する理論的実証的研究

来るべき知識社会的資本主義はポスト社会主義でもあり、ポスト社会主義とは、社会主義崩壊の影響があるとともに社会主義崩壊の教訓を生かすべき社会でもあって、そうしたポスト社会主義という特性が、21世紀に、つまり生産力のあり様が産業社会から知識社会に大きく変わる中で、どのような含意を持つかが問題である。そうした将来的含意を探る目をもって20世紀社会主義経済体制の経緯と崩壊原因を再考すべきだと考えている。20世紀社会主義経済体制を資本主義に必然的に伴う社会病理に対する実験的ではあるが19世紀的であった療法とみなす立場から、その体制の存在の経緯と崩壊原因を現時点のレベルにおいて再考することが本研究の目的である。本年度は、(1)昨年度に引き続き本研究テーマに関係する文献資料の全般的、系統的な購入・収集と整理、検討をおこない、(2)先行研究についてのサーベイと1990年代に提起された諸説の検討を継続するとともに、(3)関連する学会や研究会への出席により意見交換と情報収集をおこない、また国内主要研究機関・図書館等において文献・資料を調査した。あわせて、社会主義体制崩壊の根本原因探求の一環として、21世紀社会主義体制をリードしたマルクス主義の根本思想である唯物史観(史的唯物論)について、近年注目されたいくつかの歴史観(歴史解釈と歴史展望の理論)の到達点から批判的検討を加えた。来るべき知識社会的資本主義はポスト社会主義でもあり、ポスト社会主義とは、社会主義体制崩壊の影響があるとともに社会主義体制興亡の教訓を生かすべき社会でもあって、そうしたポスト社会主義という特性が、21世紀に、つまり生産力のあり様が産業社会から知識社会に大きく変わる中で、どのような含意を持つかが問題である。本年度は、(1)昨年度に引き続き本研究テーマに関係する文献資料の全般的、系統的な購入・収集と整理、検討をおこない、(2)先行諸説および関連する諸テーマについての検討を継続するとともに、(3)関連する学会や研究会への出席により意見交換と情報収集をおこない、また国内主要研究機関において文献・資料を調査した。従来私は社会主義体制崩壊の根本原因としてマルクス自身の社会主義経済構想の問題点を重視してきたが、マルクスの唯物史観自体の問題点、とりわけ社会様式への社会的心理・倫理領域の影響の軽視なども大きな要因であると考えるに到った。そうした諸点の考察は崩壊の将来的含意考察にとっても重要であると思われる。
酵母のシグナル伝達機構を制御するショウジョウバエ遺伝子の分離と解析

動物細胞の増殖・分化を制御するシグナル伝達系において、MAPキナーゼの活性化を介したカスケードが、重要な役割を果たしている。最近、西田らによりショウジョウバエにおいて、Draf-1の下流で作用するDsor-1がMAPキナーゼキナーゼと相同性を示すことが明らかにされた。そこで、Dsor-1が酵母のMAPキナーゼキナーゼの機能を相補するか検討した。酵母には、プロテインキナーゼC(PKC1)を介したシグナル伝達系におけるPKC1-BCK1-MKK1/MKK2-MPK1の系と、接合因子によるシグナル伝達系におけるSTE11-STE7-FUS3/KSS1というMAPキナーゼカスケドが作用している。このうち、MKK1/MKK2とSTE7がMAPキナーゼキナーゼに相当する。野生型のDsor-1をmkk1mkk2二重変異株およびste7変異株に導入したが、それらの機能は回復しなかった。ところが、Dsor-1の活性型変異Dsor-1^<Su1>はMKK1/MKK2とSTE7の機能を相補することが明らかになった。次に、酵母のシグナル伝達系をモデル系として、ショウジョウバエにおけるシグナル伝達系に関与する遺伝子を分離する目的で、Schneider細胞から作製されたショウジョウバエのcDNAライブラリーを用いて、酵母のMAPキナーゼの活性化を介したシグナル伝達機能を制御する遺伝子を分離した。そのDNA配列の解析から、この遺伝子はショウジョウバエのMAPキナーゼをコードし、すでに分離されていたMAPキナーゼDErkAとは異なることからDErkBと命名した。
微視的手段による金属磁性体常磁性相の研究

昭和62・63年度米国ブルックヘブン研究所との共同で行った中性子散乱実験の結果Y(Mn-Al)_2系は従来の巨視的実験から予測されていた通り、遍歴電子磁性【double arrow】局在電子磁性の転移を示す系であることが直接確認され、スピンの揺らぎの局所密度の大きさ及びそれらの間の空間的相関の温度依存性についての定量的情報が得られた。この系の常磁性相における核磁気共鳴実験は高温部を除き既に他のグループによって行われている事が解った。この(未発表)データを利用した中性子散乱実験データとの組み合わせによる総合的解析は現在進行中である。また、Y(Mn_θ._9Al_<θ.1>)_2の中性子散乱実験中、散乱中性子のエネルギー幅がピングラス転移温度付近で異常に大きな温度変化を示すことを発見した。この系のスピングラス転移に関する研究は当初予定していなかったが、極めて興味深い事柄であるため、本年度この点に関して更に詳しく実験を行った。その結果、散乱中性子のエネルギースペクトルはローレンツ型であり、その幅の温度依存性Γ(T)は10K-680Kの範囲(実験温度の全範囲)にわたってΓ(T)=Γ_θexp(-E_a/KT)によって表わすことができるが、パラメータΓ_θの値はほぼ同じスピングラス転移温度を示す。Ni_<θ.784>Mn_<θ.216>に比べ100倍以上大きいことが解った。この結果は、YMn_2自身の特異な磁気構造(長周期螺旋反強磁性)の起源でもある異符号の大きな交換相互作用の競合の存在を直接表わすものと考えられる。アーク溶解炉による純良試料の作成は順調に進み、アルミニウム濃度0-5%の多数の試料についてSQUID磁化率計による低磁場磁化測定によって、長距離秩序相からスピングラス相への転移の様子を確認した。これらの内の代表的の試料について、中性子散乱・核磁気共鳴測定は現在進行中である。米国ブルックヘブン国立研究所との共同研究によって,中性子散乱実験は,昭和63年度に予定していた分まで含めて,すべての実験・解析を終了した. YMn_2, Y(Mn_<0.9>Al_<0.1>)_2の2種類の資料に対して各々, 10600K, 5750K迄の温度範囲に渡って偏極解析法による磁気散乱断面積を測定することにより,スピンのゆらぎの局所密度の大きさ(即ち"局在モーメント"の大きさ)及び,それらの空的相関の強さの温度依存性に関する知見を得た.これらの結果は全体として,この系が遍歴震子系一局在モーメント系の転移をするという予測通りであった.結果は3編の論文として発表した.(内一編は現在投稿準備中である. )核磁気共鳴に関しては,資料作成のおくれ(後述)との関係上,主として装置の性能向上の為の改造に努めた.特に本年度末に最高磁界6テスラの超伝導マグネットが入る事になったので,この高磁界を利用して極めて短かいと考えられるTMn2系におけるスピンー格子緩和時間の測定に適するように周波数域を高く変更する改造,増設等を行なった.本年度の設備・備品費で購入した,アーク溶解炉は納入直後の故障のためメーカー(米国)へ返送して修理したため試料作成のスケジュールがかなり遅れた.しかし,修理は順調に完了した.現在アルゴンガスの純度,溶解条件等について検討を重ねながら,核磁気共鳴に使用する良質の試料作成に努力している.昨年度(米国ブルックヘブン研究所との共同で)行った中性子散乱実験の結果

Y(Mn-Al)_2系は従来の巨視的実験からの予測通り、遍歴電子磁性【double arrow】局在電子磁性の転移を示す系であることが確認され、スピンの揺らぎの局所密度の大きさ及びそれらの間の空間的相関の温度依存性について定量的情報が得られた。またこの実験の際、Y(Mn_<0.9>Al_<0.1>)_2からの散乱中性子のエネルギー幅はスピングラス転移温度付近で異常に大きな温度変化を示すことを発見した。この系のスピングラス転移に関する研究は当初予定していなかったが、極めて興味深い事柄であるため、本年度この点に関して更に詳しく中性子散乱実験を行なった。散乱中性子のエネルギースペクトクルはローレンツ型であり、その幅の温度依存性Γ(T)は10K-680Kの範囲(実験温度の全範囲)にわたってΓ(T)=Γ_0 exp(-Ea/kT)によって表わせる。パラメータΓ_0の値はほぼ同じスピングラス転移温度を示すNi_<0.784>Mn_<0.216>に比べ100倍以上大きい。これはYMn_2自身の特異な磁気構造(長周期螺旋反強磁性)の起源でもある異符号の大きな交換相互作用の競合の存在を直接表すものと考えられる。本補助金で購入したアーク溶解炉による純良試料の作成はその後順調に進み、アルミニウム濃度0-5%の試料についてSQUID磁化率計による低磁場磁化測定によって、長距離秩序相からスピングラス相への転移の様子を確認した。これらの試料について、中性子散乱・核磁気共鳴の微視的測定を行ないつつある。常磁性相に於ける核磁気共鳴測定は高温部を除いて既に他のグループによって結果が出された。このデータ(未発表)と今回の中性子散乱実験の結果をまとめた解析は現在進行中である。
無脊椎動物由来生体防御タンパク質の分子レベルでの異物認識機構の解析

線虫由来の抗菌ペプチドASABF及びABFについて、そのクローニング及びメタノール代謝酵母を宿主として用いた大量発現系の構築を行い、活性、立体構造に関する解析を進めた。その結果、モデル生物として重要性の高いC.elegansにおいて世界で初めて抗菌ペプチドの同定に成功し、NMR法による立体構造解析を進め、インセクトデフェンシンファミリーと類似性の高いものであることを明らかにした。またカブトガニ由来の抗菌ペプチドであるタキサイチンについて、大腸菌を宿主として用い、インクルージョンボディーからのリフォールディングを行うことで、大量発現系の構築に成功し、安定同位体ラベル試料を調整することで、立体構造と活性の関係について詳細な検討を進めた。その結果、タキサイチンのキチン結合能を有する抗真菌活性発現と電荷が重要である推定される抗グラム陰性、抗グラム陽性活性発現では分子内の異なる部位が重要な役割を果たすことを明らかにした。この他、メタノール代謝酵母を用いた大量発現系により生産した、カイコガ由来リゾチームについてその立体構造解析、安定性解析などをすすめ、ニワトリや哺乳類などの一般的なリゾチームには見られない低温活性などの活性を有すること、またその活性と構造の関連性に関して知見を得たほか、鱗翅目昆虫由来の異物排除に関連する血球活性化因子GBPについて変異体を用いて立体構造と活性に関する研究を展開した。
社会主義中国の憲政論・憲政体制を再考する――20世紀中国憲政史の視角から

20世紀初頭から現在までの中国は、共和国という名称に象徴されるように、憲政のあり方を追求してきた歴史でもあった。本科研プロジェクトは、20世紀中国憲政史のうち、とりわけ社会主義建設期に相当する1950年代から1970年代までの憲政史に焦点をあて、それが民国史とどのように接続され、1980年代以降のいわゆる改革開放期の現代中国にどのように継承されているのかを検討した。その成果は、『憲政から見る現代中国(仮)』として2018年春に出版予定である。2013年度は、二年目・三年目の活動方針を確定しつつ、科研テーマに関わる研究基盤の強化に努めた。四度開催した研究会の内容と意義は下記のとおりであり、二年目の海外研究者との交流、三年目の国際シンポジウムの開催へとつなげていきたい。村田報告は、中国に「憲政」概念が導入された清末・民国初期の歴史を辛亥革命期から北京政府期を中心に再考したものである。憲政か革命かという従来の歴史理解を超越した事実を整理し、以後の歴史的視座を提供した点に意義がある。中村報告は、1950年代から1970年代にかけての中国憲政史の一部を為す国際法の受容過程を検討したものである。国内法と国際法との一体化を説いたケルゼン学説が社会主義建設期の中国においても依然として注目されていた事実を解明した。決してソ連法学一辺倒ではなかったわけである。王報告は、民国期から人民共和国期にかての法学教育・法学体制の変遷について報告した。この報告から、20世紀中国史における1950年代から1970年代にかけての中国法学の特色と1949年前後の連続性(≒関連性)が浮かび上がった。あわせて、1950年代の憲政史を分析する上で、董必武に着目する重要性を新たに認識できた。潘報告は、国際法をはじめとする法学が近代の日本・中国・韓国・台湾の東アジアでいかに共有されていたのかを解明した。とりわけ、日本から中国への影響が大きかったことを具体的に列挙した意義は大きい。今年度の主たる活動は、次のとおりである。水羽信男「第1回全国人民代表大会と中国民主建国会」、中村元哉「戦後香港における憲政論の背景ー1950年代から1970年代を中心に」、小野寺史郎「清末民初のミリタリズムとその課題」、および、国際Workshop(香港樹仁大学本部棟、2015年3月14日)での區志堅(香港樹仁大学)「香港為中心的跨區域表述ー五十年代『自由陣綫』批評國共及歐美政策的言論」、加茂具樹「全國人民代表大會的政治機能與其可能性」である。今年度の活動のねらいは、1950年代の憲政史を民国憲政史の視点から考察して現代中国理解へと発展させると同時に、1950年代から1970年代の香港の視点を重視することで、大陸中国と台湾と香港との多角的な関係性を分析し、戦後香港史を中国近現代憲政史のなかに定位することであった。つまり、1949年に民国から大陸中国、台湾、香港へと分散した歴史的流れのうち、民国と香港との関係性を重点的に考察して、香港から大陸中国と台湾の憲政史を再考することに重点をおいた。これらの研究活動から、戦後香港の憲政思想が国民党内の反蒋介石派や青年党、民社党系の知識人によって担われ、戦後台湾とは協調と対立を繰り返しながら、次第に独自の動きを活発化させていったことが分かった。代表的な政論誌は、『民主評論』、『自由陣線』、『自由人』、『聯合評論』、『自由報』、『七十年代』であることも分かった。2015年度は、近現代中国の憲政史を戦後香港から再考することを試みた。その研究活動が、中村元哉「中台分断のなかの戦後香港政治思想ー1950年代から1970年代を中心に」である。続いて、このような中国周縁からの視点も考慮しながら、三年間の研究成果を整理し、公開する国際会議を東京大学駒場キャンパスで開催した(2015年7月25日)。報告内容は、次のとおりである。章清(復旦大学)「憲政史の断絶と連続ー民国時代の“遺産"」、小野寺史郎(埼玉大学)「ミリタリズムとデモクラシー1920年代中国における軍事教育と兵制構想を中心に」、孫宏雲(中山大学)「自由主義派法政学者と1954年憲法の制定およびその宣伝」、水羽信男(広島大学)「中国社会と選挙ー1954年の人民代表大会選挙を中心に」、孫揚(南京大学)「改革開放の起源を探究するー1970年代中国の再考察」、加茂具樹(慶應義塾大学)「権威国家のデモクラシー中国共産党はどのように“問題"を解決するのか」。本科研の目的である社会主義中国の憲政史を時間軸と空間軸のなかで再考しようとする試みは、少しずつ輪郭をみせ始めている。以上のような研究成果をベースとして、2015年度後半は論文集の構想を練り上げ、年度末から少しずつ編集作業に入っていった。当初の計画どおり、すすんでいる。最終年度である今年度は、論文集の刊行にむけて、複数回の打ち合わせと研究会を予定している。

最終年度であった今年度も、研究計画どおりに、科研プロジェクトを運営できた。過去三年間の調査・研究に基づき、各メンバーの最終成果報告を2度にわたり検討した。いずれのメンバーも、20世紀中国の憲政史を、法制度・法思想(中村元哉)、政治史(水羽信男)、政治制度史(加茂具樹)、政治思想(村田雄二郎・小野寺史郎)、経済制度・経済思想(久保亨)の視角からまとめた。村田は、清末民初の憲政経験が現代中国の憲政史にどのような影響を与えているのかを分析した。小野寺は、リベラリズムとナショナリズムの葛藤に注目すべく、軍事史の視点から20世紀前半の憲政史を総括した。水羽は、1950年代の人民代表大会の選挙制度史を再考し、加茂は、その過程が現在の人民代表大会にどのように影響を及ぼしているのかを見通した。中村は、民国から人民共和国にかけて中国でも受容されていたケルゼンの法思想に注目し、その効果について論じた。久保は、経済学者の憲政論を分析し、憲政をささえる経済基盤の意味を中国史の文脈で検討した。また、過去3年間で把握した本研究テーマに関連する史料集・資料集および研究文献を精査し、データ一覧を作成した。今後の中国憲政研究の発展を支える基礎データとなるだろう。なお、これらの研究成果は、『憲政からみる現代中国(仮)』(東京大学出版会)として公刊する予定であり、現時点で最終原稿がほぼそろっている。2018年4月の出版を目ざしている。20世紀初頭から現在までの中国は、共和国という名称に象徴されるように、憲政のあり方を追求してきた歴史でもあった。本科研プロジェクトは、20世紀中国憲政史のうち、とりわけ社会主義建設期に相当する1950年代から1970年代までの憲政史に焦点をあて、それが民国史とどのように接続され、1980年代以降のいわゆる改革開放期の現代中国にどのように継承されているのかを検討した。その成果は、『憲政から見る現代中国(仮)』として2018年春に出版予定である。昨年度に作成した研究計画をほぼ達成できたため。過去の三年間で検討が不足していた点(戦後台湾の民主憲政論)を補いつつ、論文集の取りまとめをおこなう。28年度が最終年度であるため、記入しない。中国近現代史、東アジア国際政治当初の計画どおり三年目の夏に国際シンポジウムを開催し、共同研究の成果として論文集の刊行をめざす。2013年度は研究会を四回開催し、次年度以降の方針を確定した上で、基礎的な情報を収集し整理することができた。あわせて、中国および台湾の研究者を招聘し、今後の研究協力体制の基礎を構築できた。本科研が共催した国際会議が年度末におこなわれ、その諸経費を次年度に処理することになった為。次年度以降は香港の研究者との交流をおこない、その後は中国、台湾、香港から研究者を招へいして国際シンポジウムを開催する予定である。共催した国際会議でかかった謝金や交通費などに使用する。
空間構造の動的非線形挙動に関する理論的および実験的研究

シェル、スペースフレーム、膜構造で代表される空間構造において、大規模化および軽量化が進むにつれて、地震や風に対する動的構造挙動の調査と評価は重要な課題となっている。本研究では、1.偏平構造の上下動外乱に対する動的挙動と安定、2.不安定構造物の動的挙動、に関する実験および理論解析を実施した。項1では、周期成分を含む外乱に対する動的挙動とその結果として発生する動座屈を調査している。動座屈を理論解析する場合、動的分岐現象の数理解析が不可欠であり、本研究では、多数のアトラクターや不連続ジャンプ等が存在する非線形現象を調査し、初期状態から過渡状態を経て、安定状態に至るまでの解析を実行している。結果として、動座屈における減衰効果および周期成分の影響等が得られている。項2では、膜構造やケーブル構造等、不安定状態で生じる動的挙動を調査、研究している。リンク構造を解析モデルとして採用し、幾何学的拘束条件と運動学的拘束条件を利用し、伸びなし変異モードに着した動的解析法を開発している。この解析法では、直交射影行列にる運動方程式の分解を有効に利用している。さらに、精度の向上を計るため、高次項の導入とNewton-Raphson法による収束解法を組み込んでいる。自由落下および指定速度を与えた数値解析をおこない、提案した解析法の有用性を示している。本研究は、シェル、スペースフレーム、膜構造等の空間構造の動的非線形挙動を調査するもので、本年度は以下の項目の研究を実施した。1.偏平シェルの上下動外乱に対する動的挙動と安定EPシェルおよび偏平アーチを対象として、周期成分を含む外乱に対する動的挙動とその結果として発生する動座屈を調査した。偏平シェルと偏平アーチの幾何学的非線形性を考慮した基礎方程式を誘導し、上下動外乱の作用する場合の数値解析をおこない、外乱の有している周期性、構造性状(減衰や偏平度)等が動座屈へ与える影響を定量的に評価した。その際、動座屈荷重の評価法として、スペクトルを用いる方法を提案している。2.スペースフレームの波動伝播性状プラスチック製偏平シェル模型と同一形状のスペースフレーム模型を2種類製作し、衝撃力を作用したときの波動伝播を実験的に調査した。また、フーリェ変換を利用した波動伝播解析プログラムを開発し、単層スペースフレームの波動伝播解析を行った。以上の結果より、部材配置の租密による波動伝播性状の変化や減衰効果が明らかにされている。不安定スペースフレームの安定化移行過程をビデオトラッカーシステムを利用して観測し、理論解析結果との比較をおこなった。3.風荷重を受ける膜構造の非線形振動既存の風洞実験データに基づいて、偏平屋根に作用する平均風圧の分布、変動風圧の分布、および変動風力のパワースペクトルのモデル化を行い、風荷重の人工合成を行うための数値シミュレーション手法を提案した。次いで、矩形境界を持つ任意形状の偏平膜構造に対して、時刻歴応答解析を行い、変位応答における線形解析と非線形解析の差、移流速度の影響、変動風圧の相関性の効果等を調査した。動座屈を理論解析する場合、動的分岐現象の数理解析が不可欠であり、本研究では、多数のアトラクターや不連続ジヤンプ等が存在する非線形現象を調査し、初期状態から過渡状態を経て、安定状態に至るまでの解析を実行している。リンク構造を解析モデルとして採用し、幾何学的拘束条件と運動学的拘束条件を利用し、伸びなし変位モードに着した動的解析法を開発している。この解析法では、直交射影行列による運動方程式の分解を有効に利用している。

さらに、精度の向上を計るため、高次項の導入とNewton-Raphson法による収束解法を組み込んでいる。自由落下および指定速度を与えた数値解析をおこない、提案した解析法の有用性を示している。
霊長類の食性と腸内細菌との共進化（国際共同研究強化）

本研究の目的は、腸内細菌が霊長類の消化機能にどう影響しながら、生態学的時間スケールと、進化的時間スケールの両方で、霊長類と共進化してきたかを明らかにすることである。進化的時間スケールの研究では、多種の野生霊長類について、糞試料を収集し、腸内細菌叢を比較して、霊長類の食性や系統に応じて、腸内細菌叢がどのように変化するのかを明らかにする。基課題で収集してきた日本、マレーシア、ウガンダでの調査に加え、本研究ではガボン、中国、タイで新たに試料の収集を行う。本年度は、一昨年度収集したガボンの8種の野生霊長類の糞試料の遺伝子解析を進めるとともに、中国で昨年度収集した糞試料の遺伝子解析を、中国の中山大学で行った。対象となった霊長類は、広東省、広西チワン族自治区、雲南省、陝西省、安徽省に生息する、野生のアカゲザル、シロアタマラングール、ウンナンシシバナザル、キンシコウ、チベットモンキーである。また、タイでも共同研究者に試料の収集を依頼し、カニクイザル、ベニガオザル、アッサムモンキー、キタブタオザル、ファイヤールトン、ダスキールトンの糞試料を収集し、日本に輸出した。生態学的時間スケールの研究では、屋久島の上部域と海岸域のニホンザルの新鮮な糞試料を採取し、試験管内発酵実験を行うことで、食性の異なる2地域での消化能力の違いを明らかにしようとしている。一昨年度、チューリッヒ大学でこれらの試料の遺伝子解析を行った。本年度は、それについての結果の解析を行い、現在学会発表に向けて準備中である。内定年度:2015本研究の目的は、腸内細菌が霊長類の消化機能にどう影響しながら、生態学的時間スケールと、進化的時間スケールの両方で、霊長類と共進化してきたのかを明らかにすることである。進化的時間スケールの研究としては、多種の野生霊長類について、糞試料を収集し、腸内細菌叢を比較して、霊長類の系統や食性に応じて、腸内細菌叢がどのように変化するのかを明らかにする。基課題で収集してきた日本、マレーシア、ウガンダでの調査に加え、本研究ではガボンと中国で新たに試料の収集を行う。本年度は、ガボン、ムカラバ・ドゥドゥ国立公園での野外調査を2月から3月に実施し、野生霊長類6種(ゴリラ、チンパンジー、クチヒゲグエノン、キタタラポワン、ホオジロマンガベイ、シロエリマンガベイ)の試料を収集した。生態学的時間スケールの研究としては、5月に屋久島の上部域と海岸部で新鮮なニホンザルの糞を採取し、それを用いて葉の乾燥粉末の試験管内消化実験を行った。その結果、食性の異なる屋久島の上部域と海岸部で、ニホンザルの腸内細菌が葉を基質にして発酵する能力も異なっていることが明らかになった。この糞試料をスイス、チューリヒ大学進化生物・環境学研究所で分析した。細菌のバーコード領域である16S rRNAの分析、およびすべての塩基配列を網羅的に解読するメタゲノム解析を行った。実験は終了し、現在配列データの解析を行っている。予定通り、2回の長期海外渡航を終え、それぞれ試料収集及び遺伝子解析という、当初の目的を順調に終えることができた。本年度は、昨年度収集したガボンの8種の野生霊長類の糞試料の遺伝子解析を進めるとともに、中国で糞試料の収集を行った。広東省、広西チワン族自治区、雲南省、陝西省、安徽省を訪れ、野生のアカゲザル、シロアタマラングール、ウンナンシシバナザル、キンシコウ、チベットモンキーの試料を収集した。これらの試料は、現在、共同研究者のZhang Peng教授が保管している。昨年度、チューリッヒ大学でこれらの試料の遺伝子解析を行った。本年度は、それについて追加の実験を日本で行い、配列解析をチューリッヒ大学の共同研究者に依頼した。予定通り試料収集のための渡航を順調に終えることができた。

対象となった霊長類は、広東省、広西チワン族自治区、雲南省、陝西省、安徽省に生息する、野生のアカゲザル、シロアタマラングール、ウンナンシシバナザル、キンシコウ、チベットモンキーである。また、タイでも共同研究者に試料の収集を依頼し、カニクイザル、ベニガオザル、アッサムモンキー、キタブタオザル、ファイヤールトン、ダスキールトンの糞試料を収集し、日本に輸出した。生態学的時間スケールの研究では、屋久島の上部域と海岸域のニホンザルの新鮮な糞試料を採取し、試験管内発酵実験を行うことで、食性の異なる2地域での消化能力の違いを明らかにしようとしている。一昨年度、チューリッヒ大学でこれらの試料の遺伝子解析を行った。本年度は、それについての結果の解析を行い、現在学会発表に向けて準備中である。2017年度は中国に渡航して新たに霊長類の糞試料を収集し、あわせて中国滞在中に遺伝子解析を行う。ガボンで収集した糞試料の遺伝子解析を、日本で行う。スイスでの遺伝子解析の結果をまとめ、論文執筆する。中国に再度渡航して、本年度収集した糞試料の遺伝子解析を行う。これまで、基課題も含めて、配列解析を行ってきた試料も合わせて解析する。屋久島の発酵実験について、結果を論文にまとめる。
発がんに関わるゲノム刷り込み遺伝子の網羅的解析と制御機構解析

本研究においては、刷り込み遺伝子の発現異常と発がんとの関連の全体像を明らかにするため、1)新規刷り込み遺伝子を単離2)刷り込み遺伝子の機能解析3)がんにおける刷り込み遺伝子の発現異常を網羅的に解析した。1)ヒト正常細胞において142ヶ所のdifferential methylated region(DMR)候補領域が明らかにした。さらに、親起源の明らかなヒト染色体を保持するマウス雑種細胞株を利用して、19番染色体上のDMR候補領域から2つの新規刷り込み遺伝子を同定した。この染色体上には、脳腫瘍の発生に関与する刷り込み遺伝子の存在が示唆されている。グリオーマ細胞株における発現解析の結果、高頻度な新規刷り込み遺伝子の発現異常が認められ、グリオーマの発生・進展に関与する可能性が示唆された。2)noncoding RNA LIT1刷り込み遺伝子の発現制御機構を理解するために、可視化させてRNA分子の動的挙動を観察する解析アプローチとしてRNA FISHを試みた。その結果、LIT1 RNAは細胞周期を通して安定にLIT1 DNA周辺領域に局在し、刷り込み領域における発現制御機構の中でRNA分子の関与によるクロマチン構造の変化が重要な働きをしている可能性が示唆された。3)刷り込み異常ががんの進展に関与することが示唆される中、多検体の刷り込み状態を迅速かつ簡便に解析する方法として定量PCRによる刷り込み遺伝子PEG1/MESTの発現解析法を確立し、肺腺がん、胃がん、大腸がんとの関連性を検討した。その結果、がん部において高頻度の両アレル性発現を示し、PEG1/MESTががんの進展に関与していることが示唆された。また、大腸がんにおいては、高頻度にLIT1のLOIも認められた。さらに、LIT1-DMRのメチル化状態、ヒストンテール修飾とCDKN1Cの発現とに相関が観察され、がんの発生進展に重要な役割を担っている可能性が示唆された。このように、刷り込み遺伝子がかかわるエピジェネティクスな遺伝子発現制御の解明は、発がんの分子機構の理解およびがん診断・治療面などの幅広い領域への発展に貢献できるものと考えられる。69検体のがん部および非がん部大腸組織を用い、代表的な刷り込み領域であるヒト11p15.5に位置するH19、IGF2、HASH2、LIT1、IMPT1、p57^<KIP2>についての発現解析を行った。IGF2では、25例中14例と高頻度でLOIが認められ、さらにこれらの症例ではその非がん部組織でも両アレルから発現しており、IGF2の発現が大腸がんの易罹患性に影響を与える可能性が示唆された。LIT1では17例中9例でLOIが認められたが、IGF2とは異なり、がん特異的にLOIを生じていることから、大腸がんの進展に何らかの関わりがあることが示唆された。また、p57^<KIP2>の発現量は大腸がん組織において様々に変化していたことより、p57^<KIP2>は少なくても大腸がんにおいては、がん抑制能を持たないことを示唆している。さらに、親由来特異的なメチル化を受け、LIT1の発現制御に関与しているLIT

1 DMRのメチル化状態を解析し、発現様式との相関を検討したが、それらに相関は認められず、がんにおいては、発現調節機構自体が異常をきたしていることが示唆された。以上、大腸がんにおいて特定遺伝子の発現やメチル化状態の異常がかなり高頻度に引き起こされること、LIT1のインプリントセンターとしての役割に破綻が生じるなど後成的修飾の異常により正常な遺伝子発現調節機構が維持されていないことが明らかとなった。ヒト11p15.5領域のインプリントクラスター内に存在するnoncoding RNA LIT1が関わる発現制御機構および核マトリックスとゲノムDNAの特異的結合機構の解析を通してクロマチンドメインレベルにおける遺伝子発現制御機構を明らかにするために,1)Fluorescence in situ hybhdization(FISH)法による可視化させたLIT1 RNA分子の細胞内の発現動態の解析,2)活性クロマチンに認められるループ構造を維持するために機能的な構造体として細胞核内に存在する足場(核マトリックス)に結合する領域(Matrix Attachment Region, MAR)の機能解析を試みた。1)LIT1 RNAはヒト正常リンパ球由来細胞株,ヒト正常線維芽細胞において各々96%,98%と高頻度に間期核内で検出され,LIT1 DNA近傍に局在していた。さらにFiber RNA-FISHにより,クロマチン上に集積するLIT1 RNAが観察された。一方,UBE3a遺伝子は65%,59%で間期核内にRNAシグナルが検出され,クロマチンファイバーに沿ったシグナルも認められなかった。これらのことより,LIT1,RNAは細胞周期を通して安定にLIT1 DNA周辺領域に局在し,noncoding RNAによるクロマチン構造の変化がドメインレベルの遺伝子発現制御に重要な役割を担っていることが示唆された。2)LIT1,IGF2刷り込み遺伝子のMAR候補領域をMAR予想解析ソフト(MAR-wiz software)を用いて検索した。その結果,各々遺伝子近傍領域を含めLIT1では2個,IGF2では,3個の候補領域を同定した。薬剤耐性遺伝子の両側におよそ5kbの相同領域を組み込んだターゲティングベクターを構築し,ヒト11番染色体を保持するDT40細胞内で相同組み換えによりMARを欠失させた候補クローンを単離し,PCRおよびサザンブロット解析を通してMARのターゲティングを確認した。さらに,改変したヒト染色体をチャイニーズハムスター細脚(CHO)株へ微小核細胞融合法を用いて導入し,現在単離した組胞クローンの解析中である。このように本年度において,MARの機能解析を行うための基盤は整った。ヒト11p15.5領域は、Wilms腫瘍をはじめとする小児がんを多発するBWSの染色体転座点に位置し、この領域に存在するLIT1刷り込み遺伝子が高頻度に異常(LOI)が認められることより、LIT1はBWSの主要な責任座位の可能性が示唆された。BWS患者から樹立した7つの細胞株においてLIT1領域およびその近傍に存在する4種類のPAC probeを用いてFISH解析を行った結果、LIT1内にmicrodeletionをもつ2つの細胞株を同定した。
エコシステムから考える志賀毒素ファージ多様化のメカニズム

大腸菌O157の3種類のStx2ファージについて、大腸菌K-12溶原株を作成し、細胞性粘菌に感染させた。しかし、細胞粘菌の生育には全く影響しなかった。O157親株も毒性を示さなかったため、アメーバーを用いて同じ実験を行ったが、全く毒性がなかった。過去の報告と異なり、本研究では、O157は原生生物に無害であることが明らかとなった。今後は、異なる原生生物を用いた解析を行う。また、大腸菌O26には、環境中において、Stx2ファージの高頻度な感染と脱落が繰り返し起きていることが明らかとなった。環境中では、Stx2獲得が有利に働く選択圧の存在が示唆された。本研究では、腸管出血性大腸菌(EHEC)の主要病原因子である志賀毒素(Stx)をコードするStxファージについて、ファージ-大腸菌-原生生物というエコシステムの観点からStxファージの進化を捉えることにより、その多様化のメカニズムを解明する。EHECが産生するStxには、Stx1、Stx2a、Stx2cが存在するが、それぞれ異なるファージがコードしている。また、Stx2aファージは、さらに少なくとも4つのサブタイプ(Stx2a_α, Stx2a_β, Stx2a_γ, Stx2a_δ)に分類される。まず、同じ遺伝的バックグラウンド下でファージ比較を行うため、各ファージの大腸菌K-12溶原株の作成を試みた。各StxファージをもつO157菌株から、マイトマイシンCにより誘導されるファージライセートを調整し、大腸菌K-12株へ感染させた。Stx2a_α, Stx2a_β, Stx2a_γの各ファージについては、多数の溶原株が取得できた。一方、Stx1、Stx2c、Stx2a_δの各ファージについては、プラークが形成されなかったため、実験系をスケールアップし、繰り返し行ったところ、いずれも数個の溶原株を得ることができた。現在、各溶原株について、Stxファージに組換えなどの構造変化が生じていないか確認中である。また、原生生物の感染モデル系の構築を試みた。原生生物としては、取り扱いが容易であり、凍結保存が可能な細胞性粘菌(Dictyosteluim discoideum AX2株)を用いる。NBRPの細胞性粘菌プロジェクトが実施しているトレーニングコースを受講し、基本的な培養技術を取得した。ラボ内での培養系を確立し、大腸菌との2員培養系も問題なく実施できる実験環境を構築した。各Stx2ファージの大腸菌K-12溶原株の作成に予想以上の時間を要した。Stx1、Stx2c、Stx2a_δの各ファージについては、宿主菌のStx産生量が低く、ファージの誘導活性もかなり低い可能性が考えられるため、ファージライセートに十分なファージが存在していなかったと考えられる。また、大腸菌K-12へ感染させた際も、形成されるプラークが非常に小さく検出できないレベルにあったと考えられる。ファージライセートの調整スケールを大幅にあげたことと、大腸菌K-12へ感染後のプレーティングの際には、培地に低濃度のマイトマイシンCを加えることで、プラーク形成能を行進させたことで、溶菌株の作成に成功した。原生生物感染系の構築については、問題なく進行している。腸管出血性大腸菌(EHEC)の志賀毒素(Stx)をコードするStxファージについて、ファージ-大腸菌-原生生物というエコシステムの観点からその多様化のメカニズムを解明する。大腸菌O157のStxには、Stx1、Stx2a、Stx2cが存在するが、それぞれ異なるファージにコードされている。Stx2aファージは、さらに4つのメジャーサブタイプ(Stx2a_alpha, Stx2a_beta, Stx2a_gamma, Stx2a_epsilon)に分類される。各ファージの大腸菌K-12溶原株の作成を行った。Stx2a_alpha, Stx2a_beta, Stx2a_gammaについては、多数の溶原株が取得でき、シーケンスにより、ファージゲノムに変異がないことを確認した。一方、Stx1、Stx2c、Stx2a_epsilonについては、プラークが形成されなかったため、実験系をスケールアップし、繰り返し行ったところ、いずれも数個の溶原株を得ることができた。しかし、シーケンスを確認したところ、すべて配列が組み変わったキメラファージとなっていたため、これらの溶原株の取得は断念した。細胞性粘菌の感染モデル系は、昨年度、構築した。しかし、予想と反して、細胞性粘菌は、Stxを産生する大腸菌を捕食しても、生育に影響しなかった。興味深いことに、Stxを産生する大腸菌をより積極的に捕食する傾向があった。今後は、この要因についても解析したい。また感染モデル系としては、アメーバーなど他の原生生物の使用を検討する。また、大腸菌O26間におけるStxの伝播を解析した。O26の優勢系統では、Stx1が安定的に保持されているのに対し、Stx2ファージは、様々な亜系統の株に散発して存在していた。このことから、Stx2ファージのO26への高頻度な

感染と脱落が自然界で繰り返し起きていることが推察された。大腸菌O157の3種類のStx2ファージについて、大腸菌K-12溶原株を作成し、細胞性粘菌に感染させた。しかし、細胞粘菌の生育には全く影響しなかった。O157親株も毒性を示さなかったため、アメーバーを用いて同じ実験を行ったが、全く毒性がなかった。過去の報告と異なり、本研究では、O157は原生生物に無害であることが明らかとなった。今後は、異なる原生生物を用いた解析を行う。また、大腸菌O26には、環境中において、Stx2ファージの高頻度な感染と脱落が繰り返し起きていることが明らかとなった。環境中では、Stx2獲得が有利に働く選択圧の存在が示唆された。作成したStxファージのK-12溶原株について、ファージ全長(約60 kb)を5セグメントに分けたPCRスキャニングプライマーを用いて、溶原株作成の際に他のファージとの組換え等が起こっていないことを確認する。確認ができたStxファージ溶原株について、ファージ誘導効率、宿主溶菌効率、Stx産生量の測定を行う。また、構築した原生生物共培養系により、原生生物への抵抗性を試験する。これらの実験により得られた数値データを用いて、数理モデルを構築する。さらに、自然組換えファージのスクリーミングを行い、これらの組換えファージについても、同様の実験データを取得する。構築した数値モデルを用いて、遺伝子組換えも考慮した数十年という長期シミュレーションを行い、Stxファージ多様化機構の検証を行う。これまでの解析結果から、O157は様々な系統の菌株が存在するが、O157が保持するStxファージの種類とサブタイプは系統依存的であることが分かっている。捕食圧回避の影響、負の選択圧なども組み込んだ確率シミュレーションモデルにより、今後、どのようなStxファージをどのような組み合わせで保持するO157が優勢系統として出現してくるかを長期シミュレーションにより予想する。細菌学
MOCVD法による金属薄膜の合成と反応解析

現有のLPMOCVD装置に有機金属錯用の蒸発器が接続できるように改造した。また、成膜最適温度と推測される250°C前後で均熱温度分布を得る事ができるように反応炉の改造を行った。Cu金属膜原料として2種類のアセチルアセトナト錯体を購入し、現在最適蒸発温度の探索を行っている。反応解析に必要なセミミクロ・マクロシミュレーションコードを改良した。マクロシミュレーションについては従来から単純な線形反応モデルに限らず、圧力及び逆反応等を考慮したシミュレーションを行う事ができるようにした。減圧反応条件下のCVDに限らず平均自由行程が短い常圧CVDにおいても実用的な速度で計算可能であるようにセミミクロシミュレーションコードのアルゴリズムの改良を行った。本コードの膜成長に選択成長アルゴリズムを導入するべく検討を行っている。膜結晶化過程、反応解析を行うために分子動力法に基づくシミュレーションコードの開発を行った。手始めに、2体ポテンシャルモデルを採用し、従来から数件報告されているリチウムニオブ酸のMD計算を行った。温度変化による格子間距離、結晶系の変化をある程度まで説明できた。本研究のために購入したパーソナルコンピュータでこれらの結晶構造等の計算結果の視覚かを行うために、現在プログラムの開発を行っている。今後、最適の蒸発温度を決定できしだい成膜実験をおこない、上記のマクロ・セミミクロシミュレーションコードによる反応解析、MD計算による結晶化過程の計算を行う予定である。
HIV-1 vif遺伝子の構造と機能

本年度は,HIV-1 vif遺伝子を対象に,下記の2つの研究課題を遂行した。(1)大腸菌で発現した可溶性Vifタンパク質の精製:大腸菌で発現した可溶性Vif-6xHis融合タンパク質を,Ni-アフィニティーカラムにて精製を試みた。条件を種々変えたがNiカラムに全く吸着されなかった。そこで,異なった方法を試み,陰イオンカラムの非吸着画分をゲルロ過することで,タンパク質がかなりの程度まで精製できることが明らかになった。(2)vif遺伝子変異導入ウイルスの許容細胞での増殖:vif遺伝子欠失ウイルスは,ある種の細胞(非許容細胞)では増殖できないが,その他の細胞(許容細胞)では増殖可能である。許容細胞は,Vifタンパク質の欠失を補償するVif様因子を産生すると考えられている。昨年度に報告したvif遺伝子変異導入ウイルスは,Vif完全欠失ウイルスとは異なり,完全長の変異Vifタンパク質を産生する。従って,非許容細胞で増殖しない変異ウイルスであっても,部分的Vif活性を保持している可能性が考えられる。許容細胞中のVif様因子と何らかの相互作用をする可能性も有る。そこで,その疑問を解くために,許容細胞におけるvif変異ウイルスの挙動を調べた。SW480細胞にトランスフェクトして回収したウイルスをM8166細胞に感染させた結果,16種中2種の変異ウイルス(KS407とKS415)が増殖しなかった。SW480,M8166細胞共に,vif欠失ウイルスが増殖可能な許容細胞である。これらウイルスの変異Vifタンパク質が,細胞由来のVif様因子を拮抗阻害している可能性も有る。KS407とKS415が,いわゆるDominant Negativeの性質を持つか否かは検証中である。一方,HeLa細胞にトランスフェクトして回収したウイルスをM8166細胞に感染させた場合,KS407とKS415は良く増殖した。このSW480とHeLaとの違いの原因は不明である。許容細胞の産生するVif様因子の各種細胞での量的或いは質的差異がその原因となっているのであろうか。解明すべき問題である。
多重強秩序を示す溶質元素添加ビスマス鉄酸化物の第一原理計算と材料設計

本研究は,多重強秩序物質であるビスマス鉄酸化物へのドーピング効果を,理論計算に基づき調査することを当初の目的とした.そのために,第一原理計算に基づいてBi-Oの原子間ポテンシャルを構築し,第一原理計算では実施できないようなサイズでの格子静力学ならびに動力学のシミュレーションを行うことを計画していた.しかしながら,研究途中にBi系についてのポテンシャル構築が,とくに3価Biについての非共有電子対の取り扱いに関して,困難であることが判明した.そこで,それまでに培った知見をもとに,研究ターゲットを修正した.すなわち,同様の複合酸化物であるBaTiO3, BaZrO3, SrTiO3を対象に,原子間ポテンシャルを構築して,第一原理計算では実施できないようなサイズでのシミュレーションを実施した.これらの系は,適切なドーピングを行うことでプロトン伝導体として有効であることが知られており,燃料電池等への応用が期待されている.まずプロトン伝導については,ZrO2とYSZ(Y:ZrO2)に関して検討した.バルクにおける結果と,対称傾角粒界モデルについての結果を比較した.さらにMnO2については,YおよびSnの共添加系について,プロトン伝導への添加元素の影響を詳細に調べた.MnO2粒界に関しては,リチウムイオンのインターカレーション挙動についても理論計算により明らかにした.これらの成果は,研究員として滞在した2年間に10報以上を主に斯界の一流雑誌への原著論文として出版している.途中で研究ターゲットの軌道修正をしたにもかかわらず,顕著な成果を挙げていることは,論文成果としても客観的にも示されている.26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は,マルチフェロイック(多重強秩序)物質であるビスマスフェライトへの希土類や遷移金属元素のドーピング効果を,とくに誘電率および強誘電性,さらに磁気構造に及ぼす効果について注目し,理論計算に基づいて無限希薄領域から固溶体領域までを系統的に調査するものである.このような情報は,合成実験を行う研究者のドーパント選択指針において,極めて重要である.BiFeO3における点欠陥を,これまで報告のない複空孔を含めて詳細に検討し,次に希土類ドープ系について,その熱力学的安定性の議論と,結晶構造・強誘電特性・磁気構造に与える影響を詳細に調査した.さらにペロブスカイト構造のBサイトにMn, V, Niなどの遷移金属元素を置換固溶させたときの影響を同様に調査した.BiFeO3中に内在する点欠陥に関するエネルギー諸値や,点欠陥の存在が磁気構造に与える影響を知るために,原子間ポテンシャル法による静力学計算ならびに平面波基底PAW法による系統的な第一原理計算を実施した,またFeの価数変化が,電気伝導度に影響を与えるという仮説のもとで,欠陥の存在による価数変化について,第一原理計算により系統的に解明した.これらBiFeO3の結果を解釈するために,これらの計算と並行して,類似の構造を持つSrTiO3およびBaTiO3についての同様の計算を実施した,これらの物質については,実験結果も多く,計算結果と実験との対応が,検討しやすい.本研究は,多重強秩序物質であるビスマス鉄酸化物へのドーピング効果を,理論計算に基づき調査することを当初の目的とした.そのために,第一原理計算に基づいてBi-Oの原子間ポテンシャルを構築し,第一原理計算では実施できないようなサイズでの格子静力学ならびに動力学のシミュレーションを行うことを計画していた.しかしながら,研究途中にBi系についてのポテンシャル構築が,とくに3価Biについての非共有電子対の取り扱いに関して,困難であることが判明した.そこで,それまでに培った知見をもとに,研究ターゲットを修正した.すなわち,同様の複合酸化物であるBaTiO3, BaZrO3, SrTiO3を対象に,原子間ポテンシャルを構築して,第一原理計算では実施できないようなサイズでのシミュレーションを実施した.これらの系は,適切なドーピングを行うことでプロトン伝導体として有効であることが知られており,燃料電池等への応用が期待されている.まずプロトン伝導については,ZrO2とYSZ(Y:ZrO2)に関して検討した.バルクにおける結果と,対称傾角粒界モデルについての結果を比較した.さらにMnO2については,YおよびSnの共添加系について,プロトン伝導への添加元素の影響を詳細に調べた.MnO2粒界に関しては,リチウムイオンのインターカレーション挙動についても理論計算により明らかにした.これらの成果は,研究員として滞在した2年間に10報以上を主に斯界の一流雑誌への原著論文として出版している.途中で研究ターゲットの軌道修正をしたにもかかわらず,顕著な成果を挙げていることは,論文成果としても客観的にも示されている.26年度が最終年度であるため、記入しない。原子間ポテンシャル法による静力学計算ならびに平面波基底PAW法による系統的な第一原理計算を実施し、点欠陥の存在が磁気構造に与える影響を解明するなど、予定した内容が概ね順調に進展している。研究は順調に進んでおり、計画通り第一原理計算を多数実施し、BiFeO3のLaドーピングによる構造と強誘電性への効果を解明する。
CDPKを利用した植物Ca2+情報伝達網の追跡及びキナーゼ基質特異性変更への挑戦

我々は、カルシウム情報伝達の中核として機能する植物特有のカルシウム依存性タンパク質キナーゼ(CDPK)では、基質認識能と触媒活性が分離可能であることを解明した。この結果から、CDPKは、キナーゼ基質特異性変更研究のモデルに適していると評価している。この成果を足掛かりとしてキナーゼ基質特異性変更の実験系を確立すれば、構成的生物学分野と連携して理論的に計画された情報伝達経路をもつ多細胞生物の創出に挑戦するための有効な実験的基盤を提供できる。本研究では、植物CDPKを利用したキナーゼ基質特異性変更のための実験系の確立を最終目的に、まず、植物CDPKの基質認識機構の詳細について解明を進めた。カルシウム情報伝達は、真核生物に普遍的な細胞内情報伝達系の一つであり、幅広い細胞応答を誘導する。動物と異なり、植物はC-キナーゼを持たない。さらに、カルシウム貯蔵庫やチャンネル等、多くの点で動物と異なる特有の機構を進化させてきた。そのため、植物のカルシウム情報伝達網を包括的に理解するためには、植物独自の研究展開が必要となる。第一に標的とすべきは、鍵となる因子の機能解明である。植物においてC-キナーゼの代わりを果たしているのは、植物界特有のカルシウム依存性タンパク質キナーゼ(Ca2+-Dependent Protein Kinase; CDPK)である。様々な植物細胞応答で中核的役割を果たす事が知られているが、その生理的基質については不明な点が多い。植物細胞のカルシウム情報伝達を追跡するためには、CDPK群の生理的基質を同定いく事が必須となる。我々は、植物ホルモン・ジベレリン内生量調節を司りフィードバック制御機構の解明を進めてきた。その過程で転写因子RSGをリン酸化し、RSGと負の制御因子・14-3-3タンパク質との結合を促進してRSGの機能を抑制するキナーゼとしてCDPKの一つ、NtCDPK1を同定している。まず、CDPK群はリン酸化により活性制御を受ける事が広く知られている。そこで、CDPK1の自己リン酸部位を同定し、自己リン酸化が触媒活性に与える影響、及び、その生理的意義について解析を進めた。キナーゼ基質特異性変更による新規情報伝達系の創出に向けて、我々がジベレリンフィードバック情報伝達系の解析において同定した植物特有のCDPK1を用いた研究を進めている。C-キナーゼを持たない植物において、CDPK1はカルシウム情報伝達の中核を為すタンパク質キナーゼである。我々は、リン酸化触媒活性と基質認識部位が分離できるCDPK1を情報伝達の中核を担うキナーゼの基質特異性変更の実験基盤確立のための標的とし、解析を進めている。CDPK1活性化を評価する指標として、これまではin-gelキナーゼアッセイ、in vitroキナーゼアッセイ等を用いてきた。しかしながら、これらの手法では細胞を破砕し、総タンパク質を抽出した後にキナーゼ活性を評価する事になる。CDPK1活性をリアルタイムに追跡するためには、in vivoでの活性測定が望ましいと考えた。そこで、キナーゼの活性を蛍光タンパク質を利用した人工的なin vivoレポーター分子で測る手法の確立に着手した。この手法では、分離した蛍光タンパク質のドメインとCDPK1によってリン酸化される転写活性化因子RSGのリン酸化ドメインからなるレポーターを用いる。RSGのリン酸化ドメインがCDPK1によりリン酸化されると、分離された蛍光タンパク質の立体構造が再構成され、対応する励起光により特異的な蛍光を放射する様にレポーター分子を構築する。この手法は、これまでに動物のMAPKファミリーに属するキナーゼで成功が報告されている。生物は進化の過程において遺伝情報の重複させ多様性を獲得してきた。即ち、一から新奇の情報伝達系を創出する事なく、様々な環境刺激への応答が可能となったのである。この多様性に基付く分化は、情報伝達の鍵となる相同性の高い構造を持つタンパク質キナーゼ群が如何にして特異的基質を認識し、情報の特異性を確保しているのかという、情報伝達の根幹となる課題を提起している。植物は、動物界においてカルシウム情報伝達の中核を担うC-キナーゼを持たない。その代わりとして、植物では植物界特有のCDPK(Calcium-Dependent Protein Kinase)がカルシウム情報伝達の中心的役割を果たしている。我々は、植物ホルモン・ジベレリン情報伝達系路解析の過程において、植物特有のCDPKでは、基質認識能と触媒活性が分離可能である事を解明した。この結果から、CDPKは、キナーゼ基質特異性変更研究のモデル系として適していると評価している。この成果を足掛かりとして、キナーゼ基質特異性変更の実験系を確立すれば、構成的生物学分野と連携して理論的に計画された情報伝達経路をもつ多細胞生物の創出に挑戦するための有効な実験的基盤を提供できると考えられる。又、生物が進化の過程において獲得した多様性から特異性を創出した過程の追跡が可能となる。さらに、応用的に有用な組み換え生物の開発にも重要な支援となると期待している。キナーゼ基質特異性変更の解析に進むために、まず、植物におけるCDPK作用機構及びジベレリン情報伝達系における機能をより深く理解するための解析に取り組んだ。

この成果を足掛かりとしてキナーゼ基質特異性変更の実験系を確立すれば、構成的生物学分野と連携して理論的に計画された情報伝達経路をもつ多細胞生物の創出に挑戦するための有効な実験的基盤を提供できる。本研究では、植物CDPKを利用したキナーゼ基質特異性変更のための実験系の確立を最終目的に、まず、植物CDPKの基質認識機構の詳細について解明を進めた。N末端ドメインとC末端ドメインに分割した蛍光タンパク質とRSGのリン酸化ドメインとの繋ぎ部分のバリエーションを様々試しているが、in vivoリン酸化レポーターの作製に手間取っている。分子生物学引き続き、リン酸化レポータータンパク質の作製を進め、in vivoでCDPK1活性をリアルタイムに可視化する手法の確立を試みる。質量分析法によりCDPK1のリン酸化部位の同定を行ったが、特異的なアミノ酸の繰り返しにより検出できなかったペプチド配列が複数あった。又、リン酸化ペプチドの回収率が低く、結果が得られなかった。そのため、ペプチド精製に数種のプロテアーゼを試みた。さらに、2種のプロテアーゼで動じに切断する事も試みた。リン酸化レポータータンパク質の作製に手間取っているため、次の過程に進む事が出来なかった。網羅的解析にはゲノム情報が明らかとなっているシロイヌナズナを用いるのが適当と考えられる。シロイヌナズナの全CDPK、34種のN末端可変領域をクローニングし、この部位と相互作用するタンパク質の検索を進める。リン酸化レポータータンパク質の作製を速やかに完成させ、CDPK1活性の可視化を実現する。リン酸化レポータータンパク質、、基質特異性を変更したキナーゼを形質転換植物で発現させ情報伝達の流れを操作した個体の作製に進む。予定していた実験を次年度に御子泣く事になったため。