hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
癌細胞に毒性を示すサイトカインの電離放射線による誘導に関する基礎的検討

電離放射線によるヒト癌細胞からの細胞毒性を示すサイトカイン産生誘導に関する基礎的検討を始めた。ヒト肺癌由来AOI細胞(放影研秋山實博士により分与)以外からのX-線による細胞毒性を示すサイトカイン誘導は調べた限り認められなかった。25Gy照射したAOI細胞からの誘導に関して、当初予定していた無血清培地よりもα-MEMで得たconditicned mediaの方が細胞毒性が強かった。これをミリポアフィルターで濾した後、AOI腫瘍を担っているKSN miceに投与し続けた所、腫瘍の増殖抑制が認められた。そこでmonoclonal untibodyを用いて、ELISAにより既知のサイトカインが含まれているかどうかを検討したが、AOI細胞に毒性を示さないIL-lα、IL-6、GM-CSFのみが検出された。細胞毒性を示す物質の同定を試み、限外濾過した後、硫安沈殿分画が細胞毒性を示すことを観察した。またtrypsin、OTT処理によってその活性が失われることも確認し、活性が蛋白質にあることが示唆された。およその分子量を知る目的で、ceutricon 3、10、30を用い、各々のfiltrate分画の細胞毒性を検討した。その結果、活性は分子量30,000以上の分画に認められた。しかし、その後、CM cellulcseクロマトグラフィー、DEAE-クロマトグラフィーなどの検討をした所、活性分画が少なくとも、三つ以上に分かれ、しかも一つ一つの分画の活性がそれ程、強くないことが明らかとなってきた。すなわち、X線によるAOI細胞からの細胞毒性を示す蛋白質の誘導が確認されたが、そけは単一の蛋白質ではなく、既知のサイトカインでもなく、産生が誘導された少なくとも3種類の比較的細胞毒性の弱い、分子量30,000以上の蛋白質の作用によることが示唆された。
人工分子を導入した光合成反応中心での電子移動

植物光化学系I反応中心での電子移動反応における蛋白質の機能を明らかにし、電子移動の最適化機構を探った。ホウレンソウから光化学系I粒子を単離、凍結乾燥し、ジエチルエーテルで電子受容体であるphylloquinoneと約80%のアンテナクロロフィルを抽出、これにエネルギーレベルの異なる種々の合成キノン、キノン類似分子を再導入しピコナノ秒レーザ閃光分光装置でクロロフィル(A_o)→キノン(Q)の電子移動速度を測定した。速度定数(k)の、反応の自由エネルギー差(△G)依存性をマ-カスの電子移動理論をもとに解析した。得られたデータへの理論曲線のfittingから、まわりの溶媒(蛋白質)の*再配置エネルギー(λ)は0.12eV、反応分子(A_oとQ)のλは0.18eVと得られた。さらに、蛋白質の誘電率が2.4、A_o-Q間距離が7.8Åと計算された。紅色光合成細菌、Rb.sphaeroidesでの同様の実験結果(GUnner et al.,1989)と比較すると、系I反応中心の方が、蛋白質のλ値が約1/5で、反応分子間距離が約2Å短いと推定された。光化学系1では反応分子間距離を縮め、周辺に誘電率の低いポリペプチド構造を配し、電子移動が最適化されていることが明らかにされた。
搬送波位相制御・オクターブ幅・赤外波長帯域・サイクルパルスレーザー光の高出力化

タイリング型大口径の光パラメトリックチャープパルス増幅レーザーシステムの最適化設計を実施した。提案したダブルパスで532 nmの励起レーザーの出力パワーは最大で2.7倍まで増加することが実験で示された。また、微小な位相不整合ファクターを第二高調波発生過程に取り入れることによって、基本波レーザーパルスの先頭強度の安定性を7%から2%に上げることが実験で示した。さらに、特性パラメータΔSと非線形光学結晶の最適な長さとの解析関係を明らかにした。本研究は、アト秒物理学及び高強度レーザー科学の研究に必要なレーザードライバーの光学設計法を考案し、BIBO結晶及びそのタイリング化をしたものを光パラメトリックチャープパルス増幅器(OPCPA)とした搬送波位相安定・ペタワット出力・オクターブバンド幅・赤外波長帯域・サイクルパルスレーザー光の発生を目的とする。本年度では、搬送波位相制御光学系の最適化と白色光コンティニュームの発生及びその差周波数混合の超広帯域化による搬送波位相制御の実証や、BIBO結晶を用いた第一段OPCPAの最適化設計は主な研究内容である。このため、研究代表者が開発した光ファイバーにおける非線形光学効果を記述する非線形波動方程式数値計コードを生かし、OPCPAの信号光の発生源として中空ファイバー等による白色光コンティニューム発生に関する数値計算法の確立に取り組んだ。また、研究代表者が開発した第二高調波発生の数値計算コードを差周波数混合に応用し、オクターブ幅信号光の発生に関する定量評価法の確立を図った。これまでの研究では、主にIgor Proというグラフィクスソフトを用いて展開してきたが、より汎用性の高いMathematicaやMaple、EXCELでも数値計算を行えるよう、これまでに開発した計算コードのこれらのソフトへの適応性評価を行った。本年度では、EXCELのVBA機能を利用した超広帯域OPCPAの最適化設計を実現することができた。実証実験については、レーザー装置の故障で期待した成果が挙げられなかったが、装置の修理は既に完了し、OPCPAの励起源であるグリーンレーザーの高効率化において独自な成果を挙げることができた。本年度では、研究代表者が提案したOPCPAにおける励起光と信号光を時間的に遅延させ励起光パルスを信号光パルスの立ち上りと立下り部分に別々に合わせる増幅方式を用いた蛍光の寄生増幅の抑制について理論的に検証した。また、タイリング型BIBO結晶を用いた大口径OPCPAの最適化設計も行った。これらの研究の実施に当たって、OPCPAの基礎となった二次の非線形光学効果における小信号区域と飽和区域の動的特性を解析的に明らかにすることができた。特に位相不整合による最適な非線形光学結晶長の最適化に関しては解析的手法を完成することができた。これまでの研究で信号光の増幅結果が励起光のピーク強度の安定性に大きく左右されることから、励起光レーザー強度の安定化は新たな課題として浮上してきた。OPCPAシステムとして非線形光学効果を用いることから、励起光の安定性のためには同じく二次の非線形光学効果の利用が望まれている。このようなニーズに応えるために、研究代表者は励起光のレーザー光強度の安定化を新たな研究内容として取り入れ、第二高調波発生による励起光の安定化方式の検討を始めている。安定したサイクルパルレーザー光の発生に必要な技術として、位相不整合を利用したレーザー光の安定化の可能性が明らかになった。これまでの二年間の研究で、励起レーザー光のピーク強度の安定性が新たな課題として浮上し、安定したサイクルパルスレーザーを発生するには、励起レーザー光の安定性向上が求められてきた。研究代表者は既に微小な位相不整合を取り入れた第二高調波発生を用いた基本波ピーク強度レーザー光の安定性技術を新たに開発し、それに関する数値計算および実験検証を今年度の研究内容として新たに加え、その実用化を目指してきた。主な研究成果は以下の通りである。1、微小な位相不整合を第二高調波発生過程に取り入れることによって、基本波及び第二高調波レーザーパルスにおける先頭強度の安定性向上を理論解析で明らかにした。2、波長1053 nmのナノ秒高繰り返しQ-Switched固体レーザーを用いて基本波レーザーパルスの先頭強度における安定性を実験でも示すことができた。

また、第二高調波レーザーパルスの先頭強度における安定性も初期の実験結果より明らかになった。3、光電場の量子化によってサイクルパルス搬送波位相制御に関する光学設計法を確立し、従来の非線形波動方程式とともにOPCPA光学システムの増幅や位相制御に関する理論評価法と光学システムの設計法を確立することができた。今年度内に実験成果として得られなかったが、搬送波位相安定の初期実験システムの構築ができ、特に励起レーザーパルスの先頭強度における安定性課題の解決ができた。4、二次の非線形光学過程におけるΔS値を基本波及び第二高調波の飽和区域への評価方法を確立した。新たな技術課題として励起光レーザー強度の安定性向上が実験研究の壁になってきて、実験に関する内容はやや遅れている状況にあるが、第二高調波発生を利用したレーザーピーク強度の安定化技術を新たに考案し、研究全体としては概ね順調に進んでいると言える。24年度が最終年度であるため、記入しない。励起光レーザー強度の安定性課題を次年度の早い時期に解決することが最も急務である。また、当初計画の通り、搬送波位相安定・第一段OPCPA・ビームエクスパンダ・第二段OPCPA等の全光学系の最適化設計法を確立する。
ルテニウム単核錯体の構造制御に基づく高機能酸素生成触媒の開発

本課題では、高活性酸素発生触媒の創製を目的とし、触媒活性サイト近傍の構造と触媒活性との相関について詳細に比較検討を行ってきた。特に、酵素の触媒メカニズムに倣い、配位子上に機能性の置換基を導入することで金属中心との共同効果による触媒の高機能化・高活性化を図り、酵素のような高活性触媒を開発することを最終目的としている。前年度、酸化剤であるセリウム(IV)へと配位可能なスルホ基をルテニウム触媒上に導入したルテニウム触媒の開発に成功した。本年度は、結晶構造解析・反応速度論解析等を用いてその反応機構の詳細解明に着手し、またこの研究を進める過程で得られた興味深いルテニウム二核錯体の構造・物性評価も行った。スルホ基を導入した新規ルテニウム錯体、及び対照実験として無置換の錯体を触媒とし、セリウム(IV)を酸化剤として用いて酸素発生の検討を行った。その結果、スルホ基を導入した錯体の触媒反応速度が加速されていることを見出した。一方で無置換の錯体に対し遊離のスルホン酸を添加した際には活性の低下がみられたことから、今回の活性の向上はスルホ基そのものの性質ではなく、スルホ基がセリウム(IV)に配位することで得られたものだと示唆された。さらに、錯体上のスルホ基がセリウムへと配位した結晶構造を得ることにも成功した。一方、この想定した成果に加え、研究を進める過程で見出されたオキソ架橋混合原子価ルテニウム二核錯体が非常に興味深い電子状態をとることも見出した。この成果はルテニウム錯体の電子状態・反応性に関する研究の大家である米ノースカロライナ大のT.J.Meyer教授からも非常に高い評価を得ている。以上のように、本課題では酸素発生触媒において初めての「能動的に酸化剤を捕捉し、触媒反応を有利に進行させる『人工酵素』」の開発に成功した。このような新概念の錯体群を世界に先駆けて開発した重要度は極めて大きい。本課題では、高活性酸素発生触媒の創製を目的とし、触媒活性サイト近傍の構造と触媒活性との相関について詳細に比較検討を行っている。本年度は、ルテニウム単核錯体による酸素発生反応において、触媒活性部位であるルテニウムへと配位している三座配位子を変化させることにより、その酸素発生メカニズムが大きく変化することを初めて見出した。具体的には、三座配位子を変化させることでルテニウム中心の電子状態を系統的に変化させた場合、その触媒反応の鍵となる段階が、触媒1分子による反応から触媒2分子による反応へと変化するということが判明した。この事実は、配位子で電子状態をコントロールすることにより、触媒反応を自在にコントロールできるという新たな可能性を示すものであり、今後詳細に検討することで高活性触媒の開発へとつながることが期待できる。また、この配位子の系統変化による触媒活性への影響に加え、酸化剤であるセリウム(IV)の特異的な反応性が重要な役割を果たしていることを世界に先駆けて見出した。ルテニウム触媒による酸素発生において、セリウム(IV)以外の酸化剤を用いた場合に反応は全く進行しない。DFT計算を用いてこの詳細について検討した結果、セリウム(IV)に配位した水酸化物イオンがラジカル的な反応性を帯びているという、特殊な性質が酸素発生に大きな役割を果たしていることを提案した。これまで30年間酸素発生の研究において一電子酸化剤としてセリウム(IV)が用いられてきたが、セリウム(IV)の反応性に着目したこの発見は30年間の酸素発生の研究の歴史に大きな疑問を投げかける、非常に重大な発見であり、その意義は大きい。さらに前年度、ルテニウム錯体による酸素発生反応において酸化剤であるセリウム(IV)の特殊な反応性が重要な役割を果たしているということも見出している。そこで本年度は、セリウム(IV)へと配位可能なスルホ基をルテニウム触媒上に導入し、酵素反応のようにセリウム(IV)を捕捉し協奏的に酸素発生を進行させる触媒の開発を行った。スルホ基を導入した新規ルテニウム錯体の合成、および結晶構造解析に成功し、この錯体を用いて酸素発生触媒反応の検討を行った。その結果、確かにスルホ基を導入した錯体においてその触媒活性を大きく向上させることに成功した。さらに、ルテニウム錯体上のスルホ基がセリウムへと配位した錯体の単離・結晶構造解析にも成功し、確かにスルホ基がセリウムを捕捉する「腕」として働いていることを明確に証明した。この触媒は、酸素発生触媒において初めての「能動的に酸化剤を捕捉し、触媒反応を有利に進行させる『人工酵素』」であり、このような触媒を世界に先駆けて開発した重要度は大きい。さらに今後、酸化剤による熱的な反応であったこの酸素発生系を光化学的な人工光合成へと応用することで、高効率で水を分解し酸素とエネルギーを生成するシステムの開発へとつながることが期待できる。

特に、酵素の触媒メカニズムに倣い、配位子上に機能性の置換基を導入することで金属中心との共同効果による触媒の高機能化・高活性化を図り、酵素のような高活性触媒を開発することを最終目的としている。前年度、酸化剤であるセリウム(IV)へと配位可能なスルホ基をルテニウム触媒上に導入したルテニウム触媒の開発に成功した。本年度は、結晶構造解析・反応速度論解析等を用いてその反応機構の詳細解明に着手し、またこの研究を進める過程で得られた興味深いルテニウム二核錯体の構造・物性評価も行った。スルホ基を導入した新規ルテニウム錯体、及び対照実験として無置換の錯体を触媒とし、セリウム(IV)を酸化剤として用いて酸素発生の検討を行った。その結果、スルホ基を導入した錯体の触媒反応速度が加速されていることを見出した。一方で無置換の錯体に対し遊離のスルホン酸を添加した際には活性の低下がみられたことから、今回の活性の向上はスルホ基そのものの性質ではなく、スルホ基がセリウム(IV)に配位することで得られたものだと示唆された。さらに、錯体上のスルホ基がセリウムへと配位した結晶構造を得ることにも成功した。一方、この想定した成果に加え、研究を進める過程で見出されたオキソ架橋混合原子価ルテニウム二核錯体が非常に興味深い電子状態をとることも見出した。この成果はルテニウム錯体の電子状態・反応性に関する研究の大家である米ノースカロライナ大のT.J.Meyer教授からも非常に高い評価を得ている。以上のように、本課題では酸素発生触媒において初めての「能動的に酸化剤を捕捉し、触媒反応を有利に進行させる『人工酵素』」の開発に成功した。このような新概念の錯体群を世界に先駆けて開発した重要度は極めて大きい。本課題では、酸素発生触媒の活性サイト近傍の構造を制御することで効率的に酸素発生を進行させる「人工酵素」の創製を目的としているが、本年度、この「人工酵素」の創製を達成したばかりか、機能性置換基であるスルホ基がセリウム(IV)を捕捉している中間体の単離についても世界で初めて成功し、この触媒が「人工酵素」として働いていることを明確にした。この結果は当初の計画をも上回る大きな成果であるということができる。近年、エネルギー問題や環境問題を背景に、太陽光エネルギーを貯蔵する「人工光合成」システムの開発が求められている。本研究では酸化剤としてセリウム(IV)を用い、その性質を利用して「人工酵素」の設計を行っているが、今後は酸化剤による熱反応ではなく光反応で酸素発生を行うことが求められる。そこで、セリウム(IV)を電子伝達剤として少量用い、別途光増感剤などを利用することで、「人工酵素」の性質を生かしながらも「人工光合成」を指向した高効率の光触媒酸素発生システムの構築を目指している。
ケネス・アローの正義論

本研究の目的は、主に一般可能性定理と厚生経済学の基本定理に対するケネス・アローの解釈と彼の思想の変遷を追い、彼の正義論を明らかにすることをつうじて、経済学的手法の適用範囲を定め、社会契約論による財の再分配を正当化する理論を提示することである。また本研究はテキストをデータ解析し、単語の頻度や共起分析などを行うテキストマイニングの手法を用いてこれらの解釈を裏付ける。最終的に、これらの研究成果は英語の単著として公表される。
高容量・高電圧作動ハイブリッドキャパシタに関する研究

平成30年度はLi3VO4(LVO)ナノ粒子と多層カーボンナノチューブ(MWCNT)の複合体を新規ハイブリッドキャパシタ用負極材料として絞り、その合成法について検討した。様々な手法を試行したところ、LVOの液相合成後に遊星ボールミルを用いてメカノケミカル的に微粒子化すると、結晶構造が徐々に変化することを見出した。さらに本手法について検討を進めたところ、比較的強い破砕力の回転数で36時間ほどボールミリングすると、その結晶構造が前年度に報告した電気化学活性化によるLVOと同等になることを見出した。このメカノケミカル手法によって得られたLVOをMWCNTと複合化し、電気化学特性を確認したところ、前年度に報告した電気化学的に活性化したLVO/MWCNTと同じ挙動であることを確認した。この結果を踏まえてX線回折(XRD)並びにX線吸収超微細構造解析(XAFS)により結晶構造を確認したところ、Liイオン拡散に有利な構造へ変化していることを見出した。さらに組み合わせる炭素材料について検討したところ、MWCNTより安価な導電性カーボンブラックを用いてもキャパシタ用途に十分な電気化学特性を示すことを見出した。さらにカーボンブラックとともに合成後のLVOを遊星ボールミリングすることによりカーボン含有量を減少できることがわかり、得られたLVO/Carbon black複合体はLVO/MWCNT複合体よりもレート特性が向上していることがわかった。以上の結果より、メカノケミカル手法で作製したLVO/Carbon black複合体はキャパシタ用途として十分な性能を有することを明らかにした。上記研究実績概要の通り、LVO/nano Carbon複合体の合成法について新規手法を見出し、電気化学特性の向上を確認した。このことは電池電極材料によってはメカノケミカル手法により結晶構造を変えることができ、その結果として電気化学特性を変更できる可能性を示唆しており、電池材料以外への応用も期待できる重要な知見と考えられる。LVO/MWCNT複合体について、結晶構造的にLiイオン拡散性の向上に対してメカノケミカル的手法が有効であることを解明した。また、本手法は電気化学活性化処理よりもセル毎のばらつき、すなわちLiイオンの拡散経路を平均的にするものであることを見出した。今後はメカのケミカル手法で作成したLVO/MWCNT複合体の電気化学特性、特に充放電サイクル特性についてさらに試験を進めるとともに、正極材料としてすでに候補としているLi3V2(PO3)3/MWCNT複合体と組み合わせてフルセルを作成し、その電気化学挙動がキャパシタとして有効であることを検証し、実用化に向けた指針を得ることが目的となる。平成29年度は新規ハイブリッドキャパシタ用負極材料として有望と考えられる,Li3VO4(LVO)ナノ粒子の多層カーボンナノチューブ(MWCNT)複合体の電気化学特性及びその充放電メカニズムについて検討した。一般的なLVO合成法である液相中クエン酸錯体合成法と独自技術である超遠心力下ナノハイブリッド技術を組み合わせ,LVOをMWCNT上に高分散担持することに成功した。その電気化学特性はこれまでのLVOの電気化学特性を大きく上回る出力特性を示した。さらにin-situ XRD測定により,複合体の充放電メカニズム解析を行なったところ,初期放電において約0.8-0.5 V Li/Li+で1段階目の二相共存反応が生じた。放電をさらに進めると0.3-0.1 V Li/Li+で2段階目の二相共存反応が生じることを見出した。この反応は可逆的でなく0.1 V Li/Li+から充電を行うと元の結晶構造から変化していることを見出した。詳細なXRD測定により,0.1 V Li/Li+まで放電を行うことにより,アニオン(酸素)骨格を維持したままLiとVがcation mixingするという電気化学的活性化が生じ,その構造変化がLiイオンの結晶内における拡散挙動を高速化していることを見出した。また,これまで報告してきたナノTiO2(B)/ナノ炭素材料複合体についても,高容量・高出力特性を維持したまま大気下で温和に加熱することにより複合体中の炭素含有量を減らすことに成功した。この炭素燃焼TiO2(B)は電極密度の大幅な向上を達成し,単位体積あたりの容量を増加することができた。上記に示した通り,LVO/MWCNT複合体において,Liイオンの固体内拡散が結晶構造変化によることを明らかにした。このことは既知のリチウムイオン電池材料においても結晶構造変化により固体内のリチウム移動現象が変化し,ハイブリッドキャパシタ材料候補となり得ることを示唆している。すなわち,ハイブリッドキャパシタ電極となり得る材料が今後さらに見つかる可能性があることを意味する重要な知見と考えられる。その意味で順調に進展していると思われる。

さらに組み合わせる炭素材料について検討したところ、MWCNTより安価な導電性カーボンブラックを用いてもキャパシタ用途に十分な電気化学特性を示すことを見出した。さらにカーボンブラックとともに合成後のLVOを遊星ボールミリングすることによりカーボン含有量を減少できることがわかり、得られたLVO/Carbon black複合体はLVO/MWCNT複合体よりもレート特性が向上していることがわかった。以上の結果より、メカノケミカル手法で作製したLVO/Carbon black複合体はキャパシタ用途として十分な性能を有することを明らかにした。上記研究実績概要の通り、LVO/nano Carbon複合体の合成法について新規手法を見出し、電気化学特性の向上を確認した。このことは電池電極材料によってはメカノケミカル手法により結晶構造を変えることができ、その結果として電気化学特性を変更できる可能性を示唆しており、電池材料以外への応用も期待できる重要な知見と考えられる。LVO/MWCNT複合体については電気化学的に活性化することで,これまでにLVOとしては報告例の無い電気化学特性の発現を確認し,さらにその特性向上メカニズムが低電位までの充電による結晶構造変化にあることを見出した。しかし,電気化学的活性化はセル毎のバラツキが生じる原因となることから,電気化学的手法以外による活性化を検討する必要がある。また,現状では複合体中のMWCNT含有量が多いことによる単位質量当たりにおける複合体の発現容量が少ないという課題に取り組む必要がある。炭素燃焼TiO2(B)についてはこれまでの研究から,電極密度の増加に成功し,電気化学特性もキャパシタとして十分な性能を有していることがわかった。今後は本TiO2(B)を負極,活性炭やカーボンナノチューブなどのナノ炭素材料を正極とした試験用フルセルによるキャパシタ特性を検証する予定である。LVO/MWCNT複合体について、結晶構造的にLiイオン拡散性の向上に対してメカノケミカル的手法が有効であることを解明した。また、本手法は電気化学活性化処理よりもセル毎のばらつき、すなわちLiイオンの拡散経路を平均的にするものであることを見出した。今後はメカのケミカル手法で作成したLVO/MWCNT複合体の電気化学特性、特に充放電サイクル特性についてさらに試験を進めるとともに、正極材料としてすでに候補としているLi3V2(PO3)3/MWCNT複合体と組み合わせてフルセルを作成し、その電気化学挙動がキャパシタとして有効であることを検証し、実用化に向けた指針を得ることが目的となる。必要物品費の端数分として発生した金額である。3月初旬に修理しようとした器具(電極打ち抜き機)の修理が助成金執行期限内に終了しないことがわかったため、翌年度へ繰り越しが必要となった。
転写エンハンサー導入細胞を用いる生理活性物質応答系の開発と応用

タバコ葉肉細胞から調製したプロトプラストにエンハンサーを導入し、アトラジン耐性を示すカルスを得ることをことを試みた。得られたカルスを増殖させた後、α-アミラーゼ生産細胞の選抜を目的として、二層培養法を用いてスクリーニングを行ったが、陽性のカルスを得ることは出来なかった。そこで、ジベレリンやアブシジン酸、2,4-D,ベンジルアデニンおよびウニコナゾール等を組み合わせた培地で、増殖速度や再分化等に変化の見られる細胞をスクリーニングすることを試みたが、カルスを一定量以下にすると増殖がほとんど見られなくなり、これらの系で特異な応答を示すカルスを得ることは困難であると判断した。また、一部増殖したカルスについて、エンハンサーの導入を確認するために再度アトラジン耐性を確認する実験を行ったところ、耐性が認められなかった。増殖の過程で形質転換されたカルスが脱落したものと考えられる。したがって、このような方法で、生理活性物質のスクリーニングに用いることの出来る安定した性質のカルスを得ることは困難であると考えられた。そこで、改めて形質転換を行い、アトラジン耐性を示すカルスを得た。現在、このカルスから再分化個体を得、遺伝子導入を確認している。この再分化した個体から改めてカルスを誘導し、均一なバックグランドをもつ細胞を得て、液体培地あるいは固体培地において、植物ホルモン等の様々な生理活性物質に対して、特異な応答を示す細胞を得ることを目的としたスクリーニングの系の確立を続行中である。エンハンサー導入用バイナリーベクターを用いて、タバコ葉肉細胞から調製したブロトプラストにエンハンサーを導入し、アトラジン耐性を示すカルスを得た。α-アミラーゼ生産細胞の選抜を目的として、二層培養法を用いて二次スクリーニングを行った。すなわち、カルスを、第一層にα-アミラーゼの基質となるデンプンを含む寒天培地を敷き、その上に濾紙を置き、その上にジベレリンとオーキシン、サイトカイニンを含むMS培地に懸濁させた形質転換タバコプロトプラストを拡げ、5日間培養し、第一層のデンプンが加水分解されているか否かの判定をヨードデンプン反応により行ったが、加水分解は認められなかった。現在までのところ、α-アミラーゼを分泌する細胞塊の検出には至っていない。現在、培養期間、検出法について再検討を行っている。また、第一層にアサガオ篩管液や、さまざまな植物の抽出液を溶媒分画により部分精製したものを加えて、エンハンサーの導入された細胞を培養し、特異な増殖、形態形勢を行う細胞が出現するか否か観察中である。多くの場合、細胞の増殖速度が遅くなる傾向が認められるものの、特異な形態形成の認められる細胞は検出されていない。今後、アブシジン酸やブラシノステロイドに対する反応性を指標としたスクリーニングを行うと共に、エンハンサーを組み込む細胞の植物種についても範囲を広げて検討する予定である。タバコ葉肉細胞から調製したプロトプラストにエンハンサーを導入し、アトラジン耐性を示すカルスを得て、α-アミラーゼ生産細胞の選抜を目的として、二層培養法を用いてスクリーニングを行ったが、陽性のカルスを得ることは出来なかった。さらに、形質転換カルスは継代培養中に増殖能が低下し、枯死するものが多かった。そこで、あらためて形質転換カルスの調製を試みた。アトラジン耐性を示すカルスを選抜したが、いずれも増殖力が弱く、これまでのところ生理活性物質スクリーニングの検定に用いることの出来るようなカルスを得ることには成功していない。従って、エンハンサー導入による特異な形質の発現を観察することにも成功していない。プロトプラスト調整用の酵素(セルラーゼ)に問題がある可能性が高いと考えられるので、様々なロットの酵素を用いてあらためて形質転換カルスの調製を行っている。選抜、継代培養の際の細胞密度、培地組成、特にサイトカイニンとオーキシンの種類と濃度についてあらためて検討し、継代培養可能な、生理活性物質のスクリーニングに耐えられる形質転換細胞を選抜する必要がある。さらに、形質転換に用いるタバコの品種についても検討を加えている。十分な常食力を持つ形質転換カルスが得られていないので、研究の進展が遅れているが、形質転換カルスを得、さらに再分化個体を得ることが出来れば、これまでとは異なったスクリーニング系を用いることになり、新たな生理活性物質検出の可能性が期待できるので、積極的に形質転換体の作成を試みている。

そこで、改めて形質転換を行い、アトラジン耐性を示すカルスを得た。現在、このカルスから再分化個体を得、遺伝子導入を確認している。この再分化した個体から改めてカルスを誘導し、均一なバックグランドをもつ細胞を得て、液体培地あるいは固体培地において、植物ホルモン等の様々な生理活性物質に対して、特異な応答を示す細胞を得ることを目的としたスクリーニングの系の確立を続行中である。
難治性感染根管治療に対するE.faecalisのpH耐性・抵抗機構に関する研究

昨年度までの研究で、菌体膜耐久性について、E.faecalisはS.mutansと同等の耐酸性とS.mutansよりも高い耐アルカリ性を持つが、エネルギー獲得に必要な糖代謝能(酸産生活性)の耐酸性はS.mutansよりも低く、更に耐アルカリ性は共に高いことが明らかとなった。今年度は、プラーク細菌の酸産生阻害効果が既に知られているフッ素およびタンパク変性作用を有するエタノールを用い、酸性環境からアルカリ環境における糖代謝阻害効果について比較・検討した。【方法】嫌気培養したE.faecalis JCM8728、S.mutans NCTC10449にフッ化カリウム(F:0-10mM)または99.9%エタノール(E:0-4%)を加え、10mMグルコース添加時のpH5.0-10.00における酸産生速度を、嫌気条件下でpHスタット装置を用いて測定した。【結果と考察】pH5.0(F:0.2mM)での酸産生活性は、E.faecalis、S.mutans共に0%(F:0mM、E:0%での酸産生速度を100%とした。以下同様)を示したが、pH9.0では共に100%を保持した.一方、pH5.0(E:3%)での酸産生活性は、E.faecalis、S.mutans共に80%を保持したが、pH9.0ではそれぞれ19%と66%を示し、更にpH10.0ではそれぞれ0%と27%に低下した。以上のことから、う蝕病巣のように糖が多量に供給され低pHが持続する環境ではフッ素による細菌の糖代謝阻害が有効であり、水酸化カルシウム製剤(pH12.4)を貼薬してもなお難治性感染根管を呈する環境では、低濃度エタノールによる細菌の糖代謝阻害が有効であり、さらに菌体膜融解による細胞死が示唆された。Enterococcus faecalisは、歯内う蝕病巣(酸性環境)から水酸化カルシウム製剤が奏功しない難治性病巣(アルカリ性環境)にわたる広範な歯内疾患において、高頻度で分離される。その理由としてE.faecalisの有するpH耐性機構が考えられているが、未だ不明である。そこで本研究では、E.faecalisの酸・アルカリ耐性とその生化学的機構について、他の代表的口腔レンサ球菌と比較し、検討することを目的とした。E.faecalis JCM8728、Streptococcus mutans NCTC10449、Streptococcus sanguinisATCC10556を、0.5%グルコースを含む複合培地(pH3-11)で48時間嫌気培養し、増殖限界pH値を求めた。さらにpH感受性蛍光色素を負荷した菌体を用いて、菌体外pH(pHo)を酸性からアルカリ性の広範囲(pHo 3-10)に変化させた場合の菌体内pH(pHi)及び同色素の漏洩率から菌体膜のpH耐久性を測定した。S.sanguinisの増殖可能pHは5-9であったのに対し、S.mutansでは4-9、E.faecalisでは4-11であった。pH感受性蛍光色素法で求めたE.faecalisのpHi維持能は、酸性側pHoではS.mutansと同等であったが、アルカリ側pHoではS.mutansよりも優れていた。さらにE.faecalisはpH2.5-12で高い菌体膜のpH耐久性を示した。以上より、E.faecalisのS.mutansと同等の耐酸性とS.mutansよりも高い耐アルカリ性は、同菌種の高い菌体膜のpH耐久性によってもたらされていることが明らかになった。次年度は、この3菌種の糖代謝能(酸産生活性)に関する耐酸・耐アルカリ性について比較・検討する予定である。昨年度の研究で、菌体膜耐久性および菌体内pH維持能について、E. faecalisはS. mutansと同等の耐酸性と&〃観αη3よりも高い耐アルカリ性を持つが、S. sanguinisはこれらの菌と比較し耐酸性と耐アルカリ性が共に低いことが明らかとした。今年度は、この3菌種の糖代謝能(酸産生活性)に関する耐酸・耐アルカリ性について比較・検討した。グルコースを含む複合培地(pH7)で嫌気培養したE. faecalis JCM8728、S. mutans NCTC10449、S. sanguinis ATCC10556に10mMグルコース溶液を加え、pH3.50-10.00における酸産生速度を、嫌気条件下でpHスタット装置を用いて測定した。E. faecalisはpH4.50-10.00で酸を産生し、S. mutansではpH3.75-9.50、S. sangunisではpH4.25-9.50で酸を産生した。pH9.50での酸産生活性は、S. mutansでは60%(pH7.00での酸産生速度を100%とした。以下同様)を示したが、S. sanguinisでは15%と低かった。一方、E. faecalisはpH10.00でも50%を保ち、糖からの酸産生においても耐アルカリ性が高いことが分かった。

一方、E. faecalisは、既報のように菌体膜耐久性および菌体内pH維持能についてはS. mutansと同等の耐酸性を持つが、エネルギー獲得に必要な糖代謝の耐酸性はS. mutansよりも低いことが分かった。このことが、う蝕病巣のように糖が多量に供給され低pHが持続する環境ではS. mutansが多く、E. faecalisは少ない一因であると考えられる。昨年度までの研究で、菌体膜耐久性について、E.faecalisはS.mutansと同等の耐酸性とS.mutansよりも高い耐アルカリ性を持つが、エネルギー獲得に必要な糖代謝能(酸産生活性)の耐酸性はS.mutansよりも低く、更に耐アルカリ性は共に高いことが明らかとなった。今年度は、プラーク細菌の酸産生阻害効果が既に知られているフッ素およびタンパク変性作用を有するエタノールを用い、酸性環境からアルカリ環境における糖代謝阻害効果について比較・検討した。【方法】嫌気培養したE.faecalis JCM8728、S.mutans NCTC10449にフッ化カリウム(F:0-10mM)または99.9%エタノール(E:0-4%)を加え、10mMグルコース添加時のpH5.0-10.00における酸産生速度を、嫌気条件下でpHスタット装置を用いて測定した。【結果と考察】pH5.0(F:0.2mM)での酸産生活性は、E.faecalis、S.mutans共に0%(F:0mM、E:0%での酸産生速度を100%とした。以下同様)を示したが、pH9.0では共に100%を保持した.一方、pH5.0(E:3%)での酸産生活性は、E.faecalis、S.mutans共に80%を保持したが、pH9.0ではそれぞれ19%と66%を示し、更にpH10.0ではそれぞれ0%と27%に低下した。以上のことから、う蝕病巣のように糖が多量に供給され低pHが持続する環境ではフッ素による細菌の糖代謝阻害が有効であり、水酸化カルシウム製剤(pH12.4)を貼薬してもなお難治性感染根管を呈する環境では、低濃度エタノールによる細菌の糖代謝阻害が有効であり、さらに菌体膜融解による細胞死が示唆された。
言語学・文献学的観点からみた西夏とチベットの相関についての基礎的研究

本年度も昨年度に引き続き、ロシア所蔵西夏語文献の調査、マイクロフィッシュで得たデータの分析と入力作業を行い、研究成果の一部を国際学会で発表した。チベット語文献から訳された西夏語仏典が、本研究のテキストデータの基礎となる。ロシア科学アカデミー東方学研究所サンクト・ペテルブルグ支所において西夏語資料の閲覧・調査を行った。本研究の中心対象は、西夏語訳『聖勝慧彼岸到集頒』上・中・下巻である。本年度はチベット語から翻訳された西夏文の言語学的特徴に関して取り纏めを行い、特に「チベット語風」西夏文の文法的特徴を明らかにした。2006年11月、ロシア、サンクト・ペテルブルグ大学で開催された国際西夏学会("Tangut civilization : scientific traditions and perspective of research")において、"On the "Tibetan-style" Tangut sentences in some Buddhist materials"と題して研究成果の一部を発表した。これは本研究の集成となる、西夏語訳『聖勝慧彼岸到集頒』のテキスト・訳注・研究のプレ・ワークの一つである。本研究の課題の一つは、チベット語がどのように西夏語に翻訳されるかを考察することにあり、その目的のための、西夏語-チベット語逐語訳・対照資料の作成作業は公開に向けてデータを整理中である。本年度は、この他、一般向けの雑誌などに西夏語学、西夏史、考古などの視点から寄稿した。本年度は、ロシア所蔵西夏語文献の調査、マイクロフィッシュで得たデータの分析と入力作業を行った。ロシア科学アカデミー東方学研究所サンクト・ペテルブルグ支所において西夏語資料の閲覧・調査を行い、選定した資料をマイクロフィッシュの形で入手した。研究の中心対象となる資料は、西夏語訳『聖勝慧彼岸到集頌』上・中・下巻である。マイクロフィッシュの画像は電子データに変換し、保存・整理している。まず、この画像データを1コマずつ整理し、いかなる文献の、何ページ目に相当するかを確定した。次に、既存の西夏文字フォントを利用し、入手したテキストの全文をテキストデータとして入力し、この作業を完了した。本研究の課題の一つは、チベット語がどのように西夏語に翻訳されるかを考察することにある。この目的を見据えた次のステップは、西夏語仏典に対応するチベット語文献のテキスト入力、及び、西-夏語チベット語逐語訳・対照資料の作成であり、これらの作業は現在進行中である。また本年度は、西夏仏教・西夏語学(特に音韻に関係する)についての論文と書評とを発表した。前者は西夏語仏教文献中の陀羅尼(呪文)をもとに、サンスクリット音が西夏語音でどのように表記されたかの分析である。後者は台湾の西夏語学者の論文集の書評である。近年主流になりつつある、彼の西夏語音韻理論について整理・紹介するとともに、適宜問題点を指摘した。本年度も昨年度に引き続き、ロシア所蔵西夏語文献の調査、マイクロフィッシュで得たデータの分析と入力作業を行い、研究成果の一部を論文として発表した。本研究の中心対象は、西夏語釈『聖勝慧彼岸到集頌』上・中・下巻であるが、同種の資料であり、分量の少ない西夏語訳『大千国守護吉祥頌』に関して、既存の西夏文字フォントを利用し、全文をテキストデータとして入力した。この文献についてはテキストを提示し、訳注・研究を発表した。これは本研究の集成となる、西夏語訳『聖勝慧彼岸到集頌』のテキスト・訳注・研究のプレ・ワークとなる。本研究の課題の一つは、チベット語がどのように西夏語に翻訳されるかを考察することにあり、その目的のための、酉夏語-チベット語逐語訳・対照資料の作成作業は現在進行中である。本年度は、数年来の課題となっていたロシア人研究者との共編著、『西夏語辞典:西夏語-ロシア語-英語-中国語対照辞典』(露文)の公刊に至った。本辞典の項目にも、チベット語・西夏語の対応から判明した知見が盛り込まれている。また本年度は、別の西夏語文献を用いて、西夏仏教についての論文を執筆した。西夏語仏教文献『般若心経註』のテキスト・訳注・研究・マイクロである。当該の文献は、チベット語からではなく漢語からの西夏語訳であるが、これまで研究のなかった文献であり、また内容的に西夏仏教学に益するものと言える。

2006年11月、ロシア、サンクト・ペテルブルグ大学で開催された国際西夏学会("Tangut civilization : scientific traditions and perspective of research")において、"On the "Tibetan-style" Tangut sentences in some Buddhist materials"と題して研究成果の一部を発表した。これは本研究の集成となる、西夏語訳『聖勝慧彼岸到集頒』のテキスト・訳注・研究のプレ・ワークの一つである。本研究の課題の一つは、チベット語がどのように西夏語に翻訳されるかを考察することにあり、その目的のための、西夏語-チベット語逐語訳・対照資料の作成作業は公開に向けてデータを整理中である。本年度は、この他、一般向けの雑誌などに西夏語学、西夏史、考古などの視点から寄稿した。
アメリカ合衆国の科学技術教育における技術および工学の教育内容の研究

本研究では,わが国の科学技術教育の充実をはかることを目的として,アメリカ合衆国の主に技術科の全国標準のスタンダードカリキュラムおよび各州ごとのカリキュラムの教育内容および教育方法について調査および研究を行う。このためアメリカ合衆国内の教員養成系学科で技術科教育法を担当する大学教員との共同研究プロジェクトで,中学校や高等学校の授業に参加する。またアメリカ合衆国内の技術教育に関する会議で研究発表を行い,具体的な教科内容や方法について議論を深めて,これからのわが国の技術科教育のあり方について検討するための知見または示唆を得る。本研究では、わが国の技術科教育の充実をはかることを目的として、アメリカ合衆国の全国標準のスタンダードカリキュラムおよび各州ごとのカリキュラムの教育内容および教育方法について調査および研究を行うことである。アメリカ合衆国の国際技術教育協会(ITEA)は、2000年に技術リテラシーのスタンダードを出版し、2002年に学校教育用カリキュラムの作成、2003年度には教員養成カリキュラムの整備などを進め、その後さまざまな教育実践を経て、全米に普及しつつある。アメリカ合衆国では州ごとの教育制度が確立している。このためアメリカ合衆国内の教員養成系学科で技術科教育法を担当する大学教員との共同研究プロジェクトで、中学校や高等学校の授業に参加した。またアメリカ合衆国内の技術教育に関する会議で研究発表を行い、具体的な教科内容や方法について議論を深めて、わが国の技術科教育のあり方についての知見または示唆を得ている。このようにアメリカ合衆国における技術科教育カリキュラムについて、カリキュラム開発と教育実践の現場に参加することにより、それらが形成される実践的過程を実地に調査を行っている。我が国の中学校における技術教育の課題のひとつは、教科内容の体系性にある。このため本研究を通して、我が国の技術立国の基礎を支えている工学を義務教育段階から連続して学習内容として見直し、技術または工学の基礎となるような内容を中学校の技術科として位置づけるような技術科教育カリキュラム開発の資料を提供したいと考えている。本研究では、わが国の技術科教育の充実をはかることを目的として、アメリカ合衆国の全国標準のスタンダードおよび各州ごとのカリキュラムの教育内容および教育方法について調査および研究を行った。アメリカ合衆国における実地調査は,主に平成23年度,24年度,および25年度の3回ともミシシッピー流域技術教師会議(MVTTEC)に出席して行った。この会議はアメリカ合衆国で最も長く継続して開催されている技術教育に関する会議で,最新の技術教育の動向を捉えて,それを的確に発表できる研究者を指定発表者にして,参加した会員でそれぞれのテーマ毎に1時間近く議論するものである。私はこの会議に1997年度からほぼ毎年参加していることもあり,17年間の議題の変遷から常にアメリカ社会の変化に対応した教育内容を考え続けていることが分かった。1985年から始まった数学,理科,工学,技術(STEM)の統合型カリキュラムの考え方は,2000年の技術リテラシーの標準発表以降に加速し,従来の技術科は,工学準備教育としての特徴を持つようになってきた。Technology educationは,Engineering by Designと名称変更し,STEMまたはSTEAM(芸術を含む)は,さらに科学,技術,デザイン,工学,数学(STDEM)の統合型カリキュラムに発展することで21世紀に必要な教育内容を準備しようとしている。この調査結果から,わが国の将来の技術教育を考える場合にデザインや工学を取り込んだ教育内容を検討する必要があることが分かってきた。将来の中学校技術・家庭(技術分野)では,構想,設計,制作・製作,評価の各段階を4つの内容として捉え,この各内容に必要な知識・技術として現在の材料・加工,エネルギー変換,生物育成,情報の各内容を再構成することでデザインや工学的な視点を持った教育内容にすることができると考える。

1昨年度に続き,昨年度1年間検討を続けてきた本研究のテーマである中学校技術科の教科内容に関する内容の論文が、今年3月日本産業技術教育学会の査読付き論文として掲載された。また昨年度日本産業技術教育学会全国大会(2012年9月),日本産業技術教育学会九州支部大会(2012年10月),日本産業技術教育学会情報部会(2013年3月)で口頭発表した。昨年11月にアメリカ合衆国のミシシッピー技術教師教育学会(MVC)と南技術教育学会STECに参加した。この1年間検討を続けてきた本研究のテーマである中学校技術科の教科内容に関する内容の論文が、日本産業技術教育学会の査読付き論文として掲載された。本研究のテーマは、アメリカ合衆国の科学技術教育における技術および工学の教育内容の研究であるが、最終目標は、アメリカ合衆国の技術教育の調査結果をもとに我が国の技術科教育の内容を検討することにある。本研究の目標が達成できるように、アメリカ合衆国への渡航費に当てる。また国内においても議論が重要であることから、研究打ち合わせのための国内旅費に当てる。
日本犬と弥生豚を中心とする従来家畜の渡来と系統に関する考古学的、分子遺伝学的研究

本研究は縄文時代から弥生時代の遺跡から出土する動物遺存体に残存する遺伝子を分離・増幅して古代家畜を遺伝子面で復元し、古代家畜の遺伝的系統を現生のデータベースと比較することにより、家畜化の変遷を明らかにするものである。本年度は北海道内に持ち込まれた家畜について詳細に分析し、以下の成績を得た。1)北海道内の縄文時代、続縄文時代、オホーツク文化期にかけて人と共に持ち込まれた犬について、各時代の遺跡から出土した犬の骨より古ミトコンドリア(mtA)DNAを分離・増幅して現生のデータベースと比較した。その結果オホーツク文化期の礼文島・浜中遺跡、弁天島貝塚、トーサッポロ貝塚から得られた古代犬のハプロタイプは現生犬のM5型に分類された。M5型はサハリン鈴谷貝塚でも多く出土しており、オホーツク文化期の古代犬には遺伝的にかなり均一であることが明らかとなった。2)北海道内に持ち込まれたイノシシ属について古mtDNA分析を行った。その結果、縄文時代の遺跡から出土するイノシシ属の骨は多くが焼骨であり、古mtDNAは増幅できなかったが、続縄文時代の遺跡から出土した骨はニホンイノシシに分類され、人により本州から持ち込まれたものであった。オホーツク文化期の香深井A遺跡から出土したイノシシ属(通称:カラフトブタ)の骨42本について解析を行った処、分析ができた39個体から9種類のハプロタイプが検出され大きく4群(A,B,C,D)に分類された。A群はサハリン南貝塚から、またC群はロシア・ピシェーニエ遺跡から検出されており、沿海州のイノシシ属がサハリン経由で北海道にもたらされたことを強く示唆した。
雑誌『小天地』（金尾文淵堂発行）の基礎的研究―明治期大阪文芸メディアの戦略分析―

本研究は、大阪という地方で刊行され、関西文壇と東京文壇の合流する場でもあった文芸誌『小天地』に関して、データベースを作成し、それを分析することで、この文芸誌の特異性や多面性を明らかにしていくことを目的とする。また、さらにこの雑誌を分析・検討を通して、個人の作家研究に限らず、散文・韻文両方を含めた日本近代文学研究全体、さらには美術・風俗・出版・ジャーナリズム・社会史といった多分野において、意義のある見解を導き出すことを最終目標とする。
ミクログリアを用いた新しい脳内遺伝子導入方法の基礎的検討および虚血脳損傷への応用

ミクログリアの血液脳関門を通過出来る能力を利用し、目的遺伝子をtransfectionしたミクログリアを作製し、末梢血管より、動物個体に投入するシステムの開発に着手し、まず、虚血モデル動物へ応用し、その治療効果について、検討することを目的とし基礎的研究を開始した。GFPをマーカーとして組み込んだアデノウイルスベクターを作製し、株化されたミクログリアを用い、transfectionするための至適条件を検討した。動物へのミクログリアの至適投与方法としては末梢動脈投与(内頚動脈、鎖骨下動脈)、心臓穿刺による方法が良好であった。LacZを組み込んだアデノウイルスベクターを作製し、無処置動物での脳内分布について検討した所大脳皮質、視床、視床下部、小脳、海馬、線状態への分布が認められたが、特に視床に顕著であった。続いて、砂ネズミ一過性虚血後の海馬CA1遅発性神経細胞死に対するglialcell line-derived neurotrophic factor(GDNF)の保護効果を調べる目的で、ヒトGDNFアデノウイルスベクターを脳室内に虚血前投与し、免疫組織学的に検索した。GDNFアデノウイルスぺクター投与群では虚血再開開通後CA1錐体細胞層におけるapoptag陽性細胞の著明な減少を伴う錐体細胞の残存、樹状突起の保持が認められ、虚血再開通後7日ではウイルスベクター非投与群の残存神経細胞7.1%に比較して、ウイルスベクター投与群では、62.8%とたかく、GDNFアデノウイルスベクター前投与により、砂ネズミ一過性脳虚後の海馬CA1錐体細胞に生じる遅延性神経細胞死が効率に抑制されることが本実験から明らかになった。メカニズムに関しては明らかではないが、GDNFはGDNFreceptor αとRetとの複合体形成を誘導し、神経細胞の生存や分化に関わると考えられているので、一過性脳虚後の海馬ではGDNFreceptor αやRet、あるいはその他のレセプターの発現あるいは増加が推定される。ミクログリアのblood-brain barrier(BBB)を通過出来る能力を利用し、目的遺伝子をtransfectionしたミクログリアを作製し、動物個体に投入するシステムの開発に着手し、その応用として、脳虚血モデル動物へ応用し、その治療効果について、検討することを目的とした。平成10年度はcell line化されたミクログリアを用いる方法と砂ネズミ、マウス、ラット各脳から分離培養されたミクログリアを用いる方法とを比較検討し、培養条件を確立した。続いて、GFPをマーカーとして組み込んだベクターを作製し、cell line化されたミクログリアを用いtransfectionするための至適条件を検討した。市販の各種transfectionの方法として、リポゾーマル法として、DOTAP liposomal,Effectene,lipofectamine plus,Superfectの各方法、リン酸カルシウム法、その他の方法として、electroporation法、gene gun法を検討したが、いずれの方法にてもl-5%以下のtransfection効率であり、これらの方法は断念し、続いて、ウイルスを用いた方法の検討を開始した。アデノウイルスを用いた方法では約50%ぐらいの効率でtransfectionできることが確認された。なお、センダイウイルスを用いたtransfectionではtransfectionされたミクログリアは数的にはアデノウイルスよりも少ないが、個々の細胞へのGFPの取り込みは非常につよいことが確認できた。現在、Semliki Forest Vitusを用いた方法を開始するべくその準備段階である。また動物へのミクログリアの至適投与方法をを確立するため、末梢静脈投与(大腿静脈)、動脈投与(内頚動脈、鎖骨下動脈)、心臓穿刺による方法につきラット、砂ネズミにつき検討中である。

静脈投与、腹腔内投与は脳への移行が少ないので、動脈投与が比較的よい結果を得ている。ミクログリアの血液脳関門を通過出来る能力を利用し、目的遺伝子をtransfectionしたミクログリアを作製し、末梢血管より、動物個体に投入するシステムの開発に着手し、まず、虚血モデル動物へ応用し、その治療効果について、検討することを目的とし基礎的研究を開始した。GFPをマーカーとして組み込んだアデノウイルスベクターを作製し、株化されたミクログリアを用い、transfectionするための至適条件を検討した。動物へのミクログリアの至適投与方法としては末梢動脈投与(内頚動脈、鎖骨下動脈)、心臓穿刺による方法が良好であった。LacZを組み込んだアデノウイルスベクターを作製し、無処置動物での脳内分布について検討した所大脳皮質、視床、視床下部、小脳、海馬、線状体への分布が認められたが、特に視床に顕著であった。続いて、砂ネズミ一過性脳虚血後の海馬CA1遅発性神経細胞死に対するglialcell line-derived neurotrophic factor(GDNF)の保護効果を調べる目的で、ヒトGDNFアデノウイルスベクターを脳室内に虚血前投与し、免疫組織学的に検索した。GDNFアデノウイルスベクター投与群では虚血再開通後CA1錐体細胞層におけるapoptag陽性細胞の著明な減少を伴う錐体細胞の残存、樹状突起の保持が認められ、虚血再開通後7日ではウイルスベクター非投与群の残存神経細胞7.1%に比較して、ウイルスベクター投与群では、62.8%とたかく、GDNFアデノウイルスベクター前投与により、砂ネズミ一過性脳虚後の海馬CA1錐体細胞に生じる遅延性神経細胞死が高率に抑制されることが本実験から明らかになった。メカニズムに関しては明らかではないが、GDNFはGDNFreceptor αとRetとの複合体形成を誘導し、神経細胞の生存や分化に関わると考えられているので、一過性脳虚後の海馬ではGDNFreceptor αやRet、あるいはその他のレセプターの発現あるいは増加が推定される。