hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イネのUVB抵抗性の主要因子であるCPD光回復酵素のリン酸化修飾に関する解析

イネの紫外線抵抗性を左右する主要因子であるCPD光回復酵素は、細胞周期に関連したリン酸化酵素によっておこる可能性を見出した。またCPD光回復酵素のリン酸化修飾は、イネにおいてはオルガネラ移行性に関与するが、シロイヌナズナにおいては関与しないと考えられた。CPD光回復酵素のリン酸化修飾は、イネ科の一部の植物が獲得した機構であり、これらの植物においてはオルガネラ移行性に関与すると考えられた。イネの紫外線B(UVB:280-320nm)抵抗性を左右する主要因子は、UVBによって生じたDNA損傷(シクロブタン型ピリミジン二量体:CPD)を修復するCPD光回復酵素である。イネにおいて、CPD光回復酵素はリン酸化修飾を受けていることが見出されたが、その生理学的意義は明らかでない。そこで、リン酸化修飾によってCPD光回復酵素のin vitro活性が変化するかを確認するため、イネに含まれるリン酸化型と非リン酸化型のCPD光回復酵素を分離精製する方法を検討した。イネ葉からCPD光回復酵素を精製し、脱リン酸化酵素を反応させることで、非リン酸化型CPD光回復酵素のみを含むタンパク質画分を得ることができた。また、リン酸化タンパク質特異的結合カラムを用い、リン酸化型CPD光回復酵素のみを含むタンパク質画分を得ることができた。これらの画分の酵素活性に関して、解析を進めている。青色光を受容することによってリン酸化修飾を受けるクリプトクロムは、その配列の相同性から、CPD光回復酵素と同じファミリーに分類される。そこで、イネCPD光回復酵素のリン酸化修飾を行うシグナル経路を同定するため、イネ葉に様々な波長の光(UVB、UVA、青色光、赤色光)を照射し、CPD光回復酵素のリン酸化状態を解析した。その結果、イネ葉に対する照射では、波長によってCPD光回復酵素のリン酸化修飾は変化しないことが分かり、イネCPD光回復酵素は、クリプトクロムとは異なるメカニズムによってリン酸化修飾を受けると考えられた。そこで、リン酸化修飾によって酵素活性が変化するかを解析するため、イネに含まれるリン酸化型と非リン酸化型のCPD光回復酵素を分離精製し、活性を測定した。その結果、in vitroにおいて、リン酸化型と非リン酸化型のCPD光回復酵素の活性には差が見られなかった。次にリン酸化修飾がCPD光回復酵素の細胞内局在性に与える影響を明らかにするため、変異型CPD光回復酵素を発現する組換え植物を作製した。リン酸化修飾を受けるアミノ酸残基(セリン)を、非リン酸化型(アラニン)、または偽リン酸化型(アスパラギン酸)に置換したCPD光回復酵素を発現する遺伝子を作製し、CPD光回復酵素を欠損したシロイヌナズナ(uvr2-1)に対して、フローラルディップ法にて導入した。目的の遺伝子が導入された系統を選抜し、後代世代を育成し、変異型CPD光回復酵素遺伝子をホモに持つT3世代の種子を得ることができた。CPD光回復酵素がどのようなシグナルによってリン酸化修飾を受けるかを明らかにするため、リン酸化酵素の同定を試みた。まず、細胞抽出液を用い、試験管内にてCPD光回復酵素のリン酸化修飾する実験系を確立した。様々な金属イオンを用いてリン酸化活性の有無を検出したところ、CPD光回復酵素のリン酸化酵素は、補因子としてマグネシウムを必要とすることが明らかになった。イネの紫外線B(UVB: 280-320nm)抵抗性を左右する主要因子は、UVBによって生じたDNA損傷(シクロブタン型ピリミジン二量体: CPD)を修復するCPD光回復酵素である。そこで、CPD光回復酵素の遺伝子配列が明らかになっているイネ以外の植物からCPD光回復酵素を精製し、リン酸化状態を解析した。その結果、CPD光回復酵素のリン酸化状態はイネ科植物の中でも異なっており、SDS-PAGEを行った際に検出されるリン酸化修飾によるバンドシフトが、検出される植物とされない植物が存在することが分かった。リン酸化部位をアラニンに置換した非リン酸化型、アスパラギン酸に置換した偽リン酸化型のCPD光回復酵素を発現するシロイヌナズナから、核、ミトコンドリア、葉緑体を単離し、CPD光回復酵素のリン酸化修飾の有無を解析した。その結果、シロイヌナズナでは、CPD光回復酵素のリン酸化修飾はオルガネラ移行性に影響しない可能性が考えられた。

酸化部位の周辺配列を用い、既知のリン酸化モチーフとの保存性を比較検索することで、リン酸化酵素を推定した。その結果、細胞周期依存性リン酸化酵素の関与が示唆された。そこで、試験管内リン酸化反応系を用い、各種のリン酸化酵素阻害剤がCPD光回復酵素のリン酸化に与える影響を解析した。これらの解析より、1種類のリン酸化酵素を候補として見出すことができた。
導体の表面状態に起因する受動相互変調歪に関する研究

ハンダ接合の影響を排除した非接触PIM特性評価法を考案した.先端が開放された同軸管の中心導体管内部に被測定試料を設置するという極めて簡便な方法であり,試料の共振を利用することでこれまでにない高感度化を実現している.特に同軸管と試料を互いに4分の1波長程度オーバーラップさせることで,非接触にもかかわらず試料を非常に強力に励振できることが特徴である.この手法の開発により,酸化・汚損を含む導体の表面状態をPIM特性の観点から定量的に評価することに成功した.また半田接続が難しいために評価不可能だったTi, Pd, Pt, Alなどの材料についても,PIM特性の評価が可能となった.さらに本手法をプリント基板型銅箔に適用することで,銅箔表面および裏面の化学的要素と物理的形状要素も分離して評価することも可能となった.なお試料上の電流とPIM発生量の相関関係については,電磁界シミュレーションを用いた検討を実施したが,前年度までに実施した先端短絡伝送線路法ほど明確な結論を得ることはできなかった.一方で,平面型パッチアンテナの近傍界を利用した非接触PIM特性評価法も検討した.アンテナの動作波長に比して十分に小さい試料に適した方法であり,アンテナ近傍に試料を設置することで高感度化を図る点が特徴である.本手法は小型電気接点の評価には適しているが,導体表面状態に起因する相互変調ひずみの評価に対しては感度不足であった.結論として,材料特性の絶対的定量化は先端短絡伝送線路法により達成され,PIM特性の非接触測定は,相対測定ではあるが,定在波同軸管法により達成された.特に定在波同軸管法は,電磁界解析をさらに進めることで,電流分布の観点からのPIM特性評価も可能にするため,今後有望な技術であるといえる.導体の表面状態に起因して発生する相互変調ひずみ(PIM)を高精度に評価するための手法について検討した.本年度は箔状の導体材料を評価試料とするための方法を2種類考案し,2GHz帯で有効性を評価した.一つは試料である銅箔で導波管を形成する方法である.この方法はマイクロストリップ線路と導波管を一枚の銅箔で構成するものであり,PIM測定の障害となる電気接点の少ない構造を実現できる.本年度は線路変換部分での漏れ放射が少なく,かつ導波管部分の電流が内壁面側に集中するようなモデルを目標に,電磁界解析による設計を実施した.その結果,導波管内部にテフロン等の誘電体を充填することで,厚み10mm程度以下であれば漏れ放射を10%以下に抑制できることを示した.また導波管の基本設計および試作を行い,入力特牲の評価までを実施した.一方,同軸線路の先端を測定試料で短絡して評価する方法も検討した.この手法は定在波により測定する点が特徴であり,少ない入力電力で大きな電流を試料に印加できる.試料も波長に比して小さいものを用いるため点状のPIM源とみなすことが可能であり,測定部位が明確である.また線路とDUTの整合を考慮する必要が無いため,試料形状の自由度も大きい.本年度は上記の利点をもつ提案手法の有効性を実験により確認した.基礎検討では,特性既知の細線状円筒導体をDUTとして採用した.これにより試料に印加される電流密度を厳密に評価することが可能となり,発生するPIMの定量的評価も期待できるようになった.またこれらの結果を銅箔材料に対して適用した結果,銅箔材料の差異を,従来の手法に比して高感度かつ安定して検出できることも確認された.なお本手法で用いるDUTは,本年度新規購入した高電流ソースメータによりI-V特性評価も可能であるが,これについては今後詳細な検討を進める予定である.前年度に提案された定在波同軸線路法は,測定試料を同軸線路先端の短絡材料として利用するため,整合終端の概念が不要である.これにより,電気接点の評価などに用いられていた電流ベース測定をマイクロ波帯PIM測定に導入することが初めて可能となった.この定在波同軸線路法について,本年度は主に(1)測定系の性能分析(2)電流密度の観点から見た素材のPIM特性分析(3)プリント基板材料など実用材料への応用,等の検討を行った.(1)システム性能分析測定系内部で発生する残留ノイズは,測定感度を左右する重要要素のひとつである.これに対し定在波同軸線路の長さにより測定システムの残留ノイズ成分を最小化する手法を提案した.これは同軸線路の長さにより定在波の位置が移動することを利用したものである.これ以外に,試料の持つインダクタンスの影響や不要放射の影響について,近似計算や電磁界シミュレーションにより定量的に評価した.(2)電流密度の観点から見た導体材料の定量的PIM特性分析導体材料の有するPIM特性を電流密度により一意に表現できることを初めて定量的に示した.本年度はFe、Ni、Cu、Agおよび真鍮等,ハンダ接続可能な導体細線を対象として検討を行い,基礎データを取得した.(3)導体表面状態とPIM特性無鉛ハンダで表面がメッキされた細線を評価試料として採用した.その結果,「母材の種類がPIM特性に最も大きな影響を与えること」と「ハンダ添加剤(Ni、Bs、Ag、Cu、etc.)によるPIMの差異が,提案手法により識別可能であること」を明らかにした.(4)プリント基板材料など実用材料への応用これまで困難だったプリント基板の構成素材毎のPIM特性評価を試みた.

銅箔材料については,任意幅のストリップ導体で発生するPIM特性評価が可能であることを確認された.また誘電体材料については,容量負荷として定在波同軸線路法に導入する方法を提案し,基礎実験を実施した.ハンダ接合の影響を排除した非接触PIM特性評価法を考案した.先端が開放された同軸管の中心導体管内部に被測定試料を設置するという極めて簡便な方法であり,試料の共振を利用することでこれまでにない高感度化を実現している.特に同軸管と試料を互いに4分の1波長程度オーバーラップさせることで,非接触にもかかわらず試料を非常に強力に励振できることが特徴である.この手法の開発により,酸化・汚損を含む導体の表面状態をPIM特性の観点から定量的に評価することに成功した.また半田接続が難しいために評価不可能だったTi, Pd, Pt, Alなどの材料についても,PIM特性の評価が可能となった.さらに本手法をプリント基板型銅箔に適用することで,銅箔表面および裏面の化学的要素と物理的形状要素も分離して評価することも可能となった.なお試料上の電流とPIM発生量の相関関係については,電磁界シミュレーションを用いた検討を実施したが,前年度までに実施した先端短絡伝送線路法ほど明確な結論を得ることはできなかった.一方で,平面型パッチアンテナの近傍界を利用した非接触PIM特性評価法も検討した.アンテナの動作波長に比して十分に小さい試料に適した方法であり,アンテナ近傍に試料を設置することで高感度化を図る点が特徴である.本手法は小型電気接点の評価には適しているが,導体表面状態に起因する相互変調ひずみの評価に対しては感度不足であった.結論として,材料特性の絶対的定量化は先端短絡伝送線路法により達成され,PIM特性の非接触測定は,相対測定ではあるが,定在波同軸管法により達成された.特に定在波同軸管法は,電磁界解析をさらに進めることで,電流分布の観点からのPIM特性評価も可能にするため,今後有望な技術であるといえる.
治療用液滴バブル製剤の開発と低EPR癌に対する革新的な薬物送達法の構築

当初の計画ではペルフルブタンガスからリピッドバブルを調製しバイアル瓶詰め、ー5°Cの氷浴に設置してバイアル瓶の中に空気を注射筒で注入加圧(600 kPa程度)し、PFBを液化させて液滴バブル(200 nm)とすることを目的としていた。しかしながら、加圧して液滴化する操作に大きな困難が生じ、また常にー10°C前後を保持しなければならず、その後の実験が難しかった。そこで、常温常圧で液体であるペルフルオロヘキサン(PFH)を用いてナノ液滴を作る方法に変更した。NDの調製は2段階で行った。最初に、リポソームを、94:6のモル比でDSPCおよびDSPE-2000を用いて調製した。NDを調製するための第二段階において、1mLのリポソーム溶液をバイアル瓶に移し、続いて60μLのPFHを加えて6%(v / v)にした。次いでバイアルを氷上で35分間浴槽型超音波処理してPFH-NDを得た。ナイルレッド(NR)を疎水性薬物モデルとしてPFH-NDに組み込んだ(NR-PFH-ND)。PFH-NDおよびNR-PFH-NDの平均粒径はそれぞれ205 nmおよび346nmであった。10%ラット血清の存在下、37°Cで90分間インキュベートしても、PFH-NDからの有意なPFH漏出はなかった。In vitroで液滴から気泡へのPFH-NDの相転移は1MHzの周波数と5W / cm 2の強度の治療用低強度超音波によって誘発できることを示した。当初計画の超音波応答性ガスについてパーフルオロブタンからペルフルオロヘキサンに変更し、液滴バブルの調製法を変更した。当初はパーフルオロブタンのマイクロバブルを調製してから低温で加圧して液化する予定であったが、強力な加圧操作が必要で、かつ-10度近くの低温下で操作しなければならず、大きな困難に直面した。超音波応答性ガスには常温常圧で液体のペルフルオロヘキサンがあり、扱いも簡単で、このガスを用いてナノ液滴バブルを作成したところ、超音波照射で液滴から気泡への誘発できることを示した。今後、このナノ液滴を用いて、in vivoで血管開口による薬物送達実験を進める予定でアル。液滴バブルの新規な方法の開発に成功したので、当初の計画通りの動物実験を進めている。
抗肥満薬開発を念頭においた分泌性因子neudesinの解析

研究代表者は分泌性因子neudesinのエネルギー代謝における役割の解明に取り組んでいる。neudesin KOマウスではエネルギー消費の亢進が認められ、肥満しにくいことが分かっていた。研究代表者は本研究期間内にエネルギー消費の亢進が交感神経系の活性化に起因すること、さらにneudesinが交感神経に作用して、交感神経の働きに必須であるノルアドレナリンの産生を抑えることを見出した。またneudesinは神経だけでなく脂肪細胞に作用して、脂肪細胞に対する交感神経の刺激を抑制する働きを担うことも明らかにした。今後の研究の発展がneudesinを標的とした抗肥満薬創出に繋がることが期待される。代表者は所属する研究室で同定した分泌性因子neudesinの遺伝子欠損マウス(以下KOマウス)を用いてneudesinの生理的意義の解明を目指している。特にneudesin KOマウスが高脂肪食負荷により誘導される肥満に耐性を示すことに着目して、エネルギー代謝におけるneudesinの役割の解明、さらに将来的にneudesinを抗肥満薬創出の標的として利用する上で基盤となる知見の獲得を目指している。代表者は研究期間内に、1:交感神経の活性化がneudesin KOマウスの抗肥満の表現型を引き起こすか開明する、2: neudesinが交感神経系活性を制御するメカニズムを解明する、そして3: neudesinによって制御されるシグナル経路を解明する、以上3つの課題に取り組む予定である。代表者は本年度中に、上記の課題に関して次の成果を得た。まず薬物投与により交感神経系を破壊した場合にneudesin KOマウスの抗肥満の表現型が一部消失することを確認した。従ってneudesin KOマウスの抗肥満の表現型に交感神経系の活性化が寄与すると考えられる。次に交感神経の節後ニューロンのモデルとして利用されるPC12細胞に組換えneudesinたんぱくを添加したところ、neudesinがノルアドレナリン産生を抑制する可能性があることが判明した。最後にneudesinによる細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK)の活性化がカンナビノイド受容体アンタゴニスト(SR141716)によって抑制されること、さらに予備的な検討結果ではあるがneudesinによる細胞増殖作用もSR141716の共添加によって抑制される可能性があることが判明した。本研究計画はおおむね順調に進展している。当該期間内に薬物(6-ヒドロキシドパミン)投与による交感神経破壊モデル作製の手技を習得し、このモデルを利用して、neudesin KOマウスの抗肥満の表現型の一部が交感神経系の活性化に起因することを見出した。またneudesinによる交感神経活性制御の解明にも着手して、neudesinが交感神経節後ニューロンに作用してノルアドレナリン産生を抑制する可能性があることや、薬理的にカンナビノイド受容体を阻害することでneudesinによるERK活性化が抑制されることなども見出した。neudesinの神経系以外への作用の解明や、neudesinがカンナビノイド受容体を介して作用する可能性を検討する上で、薬理学的手法以外の方法(たとえばカンナビノイド受容体のノックダウン実験)を用いた解析を今後行う必要があるものの、研究計画全体としては大きな問題なく進んでいると判断できる。研究代表者は前年度までに分泌性因子neudesinの遺伝子欠損マウスがエネルギー消費亢進に伴う抗肥満の表現型を示すこと、エネルギー消費亢進には交感神経系の活性化が関わることを明らかにしていた。これらの結果を踏まえ本年度はneudesinが交感神経系を制御する機序の解明に取り組み、下記の成果を得た。PC12細胞を用いた解析によりneudesinがノルアドレナリン産生の律速酵素であるチロシンヒドロキシラーゼの発現を抑制する可能性があること、さらにカンナビノイド受容体の薬理的な阻害によりneudesin活性が阻害される可能性があることが判明したので、neudesinの作用とカンナビノイド経路の関連性をより正確に評価するためにCRISPR/Casシステムを利用してneudesin欠損細胞株を樹立した。また新たにneudesinが白色脂肪細胞に直接作用する可能性があることを明らかにした。neudesinKOマウスでは一部の白色脂肪細胞が褐色脂肪細胞様の性質を帯びる、白色脂肪の褐色化が認められたが上述の交感神経系の活性化に加えて、neudesinが脂肪細胞に直接作用して交感神経刺激の入力を抑制する可能性が高いことを見出した。すなわちアドレナリン受容体刺激に伴う脂肪分解の亢進や、代表的な褐色化マーカーのUcp1発現がneudesin共添加によって抑制される可能性が高いことを見出して局所的なneudesin作用の一端を明らかにした。上記の成果は各種学会で発表し、また現在論文投稿に向けた準備を進めている。これまでの計画をさらに発展させる方向で研究を推進する。具体的には以下の2つの研究を予定している。

1:予備的な検討結果から、neudesinが脂肪細胞への交感神経刺激の入力を抑制し得ることが判明した。交感神経系は脂肪組織における熱産生・脂肪酸酸化制御において非常に重要な役割を果たす。今後上記の結果の再現性を確認する。また近年では交感神経刺激に伴って、白色脂肪組織に熱産生能を有する褐色脂肪様細胞が出現して、エネルギー消費の亢進に寄与することが分かっている。こうしたいわゆる「白色脂肪の褐色化」におけるneudesinの役割の解明にも着手する。2:カンナビノイド受容体アゴニスト(SR141716)を用いた解析によりneudesinがカンナビノイド受容体を介して作用しうることが分かっている。これまでに行った薬理学的な解析に加えて、今後siRNAないしCRISPR/Casシステムを利用してカンナビノイド受容体を欠損させた細胞株を樹立する。この細胞にneudesinを作用させた場合もSR141716添加時と同様にneudesinによるERK活性化がが消失するか確認する。以上の方針でneudesinによるエネルギー代謝調節機序の解明をさらに進める予定である。分子生物学実験自体は大きな問題なく進んでいたが、既に手元にある試薬類で賄える実験が多かったため、当初の予定よりも当該助成金を使用する機会が少なかったことが大きな理由である。既に昨年度の終盤から当該助成金の使用が著しく増加していた。本年度もその傾向は変わらず、一方で消耗品類の購入や、抗体類やERISAキット、各種代謝パラメータ測定用キットなど比較的高価なものを購入する機会が増える。また、当該助成金を得た研究テーマに関して論文投稿の準備も進めている。従って本年度は、論文投稿に伴う経費(投稿料、英文校正に伴う費用)も計上される予定であり、繰り越し分も含めて、当該助成金を使い切る予定である。
ポリミキシン固定化材料のエンドトキシンショック治療への応用

1)ポリミキシン固定化繊維による敗血症性ショック療法と臨床応用:エンドトキシン注入ショックモデル犬についてのPMX-FによるDHP治療効果から始まり、E、Coli注入敗血症性ショックモデル犬の救命率も向上できることを立証し、種々のパラメ-タ-の改善も認めた。PMX-Fカラムの臨床応用のために滅菌法として種々試みたが、PMX-Fの加価に変化を来たさないオ-トクレブ方式が採用された。又カラムの大きさは170ml容積とし、53gのPMX-Fを充填した。このエト用カラムの生体適合性については、正常犬、ビ-グル犬を用いて行い、血球成合による評価では全く問題ないことが証明され、1989年春から臨床応用に入り現在まで10例の経験をもち、案全性、およびショックに対する効果で成績をあげている。臨床治療は途中であるが、本試験研究の最大の目的を果たした。2)PMX-Fによる治療効果の機序解明:雑犬によるショック治療実験では、ショックの軽減化、早期改善が各種パラメ-タにより立証された。しかし原因物質であるエンドトキシンの除去については、水系については明確な除去の結果が得られたが血中においては、エンドトキシンの測定法そのものに問題があることが判明したので、2年度から新しい測定法の開発を平行して進めた。学会でも臨床上エンドトキシン測定における濃度と病態の相関性が*々され、測定法の問題も提起され始めている。現在ではほぼ測定できないかと思われる検体処理法を含めた測定法が完成に*くまで検討できたと思う。完璧な測定法確立にはもう少し研究検討が必要である。1)PMXーFカラムの臨床応用材料開発前年度までに人間用のPMXーFカラムが開発でき、透析膜を基準とした安全基準が達成できた。しかしこの段階ではラボにて試作された材料であったため、評価の際ロットを一定とした成績評価で、しかも余りにも高価についた。本年度に入りラボ用試作品を大量試作に移すことになり度重なる試作の末、ラボに変わらない材料開発(製造)に成功した。大量試験品ではカラム内充填液を蒸留水とした場合、PMXーFの劣価が著しく、生食に変更した。しかし生食とすると透析膜用の安全基準のうち液のpHが外れる場合があることが判明し、最終的には生食4lにて洗浄することにより合格となった。一方エンドトキシン吸着能は、新しいエンドトキシン測定法にて牛血清中での除去能は、Carrier fiberと比し著しくすぐれ数ngの濃度が30分内に数pgと減少し得た。Endotoxin注入雑犬評価では、最終的に5ml(13g)のPMXーF充填カラムを用いて評価したが、5頭中4頭が生存し、ラボ試験品と同程度のレベルの能力が示された。安全性上も問題はなかった。2)臨床応用上記材料の安全試験結果をもって、厚生省に医用材料の治験届けを提出し受理された。(1月17日)更に当大学においても2月17日をもって臨床治験許可が下され、もっか適応症例を選択中である。3)エンドトキシン測定法血中エンドトキシン測定法は従来から多くの報告がなされているが世界中で国の基準として採用された方法はない。我々は測定法の基本として【○!1】添加回収が一定で高率、安定して得られること【○!2】測定法が他の生物活性による評価又は臨床上の評価と対応することが必須として市販の合成基質法を評価した。水溶液中では高率で安定した回収がなされるが、蛋白含有液や血漿においては添加数分後に12ケタの濃度減少さえみられ、他の活性評価と全く一致しなかった。1989年2月にヒト用に作製、安全性のチェックを終えた。

ポリミキシン固定化(PMX-F)カラムに対し、厚生省から臨床治験の許可が得られ、学内での事務処理を経て、国内2施設で臨床治験を開始した(4月)。対称となる症例は敗血症性ショック状態の患者で詳細なプストコ-ルに定めた。本年度中、我々の施設では、例に対し、同のDHPを行って来た。1回のDHPは2時間かけヘパリンがNatamstat mesilate.を抗疑固剤として用いて行った。種々の安全性評価・生体適合性評価因子が検討された。全例・非常に厳しい状況下にありながら施行中の循環動態要化を経験したことは無く血圧が触知できない症例でも施行可能であった。肝機能、腎機能にも変化なく、ただ血小板が施行後40%程低下する場合が認められた。しかしこうした症例も翌日には元のレベルにまで戻っており、出血傾向がみられた症例は無く、全てのDHPが安全に行われ得た。効果については、発表文献に詳細を記すが、循環動態、血液ガス等、ショックからの離脱もみとめられた。しかしDHPの回数等もあり、枚命につながったのは10中4例であった。カラムの吸着能ではTNF等のサクトカインをも吸着できることが分かっているが、肝心の血中エンドトキシンについては、新しい測定法を検討した。現在までに市販されている方法では前処理や方法そのものに問題があったが、比濁法に新しい前処理を施した方法が、同じく処理を工法したES法にて測定可能の望みが得られた。この方法で測定すると、PMx-Fカラム前後での血中エンドトキシン濃度は低下している。本研究におけるまとめとして、完全な測定法は未だ確立できないが、ほぼ近い手法が開発されていると思われる。臨床治験と今後、施設の拡大も決まっており新しい成果が見込まれる。
腫瘍免疫応答を用いた腋窩リンパ節転移陽性乳癌の腋窩ステージング

1乳癌主病巣、センチネルリンパ節(SN)、非センチネルリンパ節(NSN)の組織標本(パラフィンブロック)を用い制御性T細胞(Treg)のマスター遺伝子の産物であるFoxp3の免疫染色を施行し、Tregの集積数を評価した。臨床病理学的因子(乳癌主病巣の浸潤の程度、組織型、SN転移の有無、NSN転移の有無)とTreg数との相関を解析した。今後、臨床病理学的因子として年齢、閉経状況、BMI、浸潤径、乳管内成分の広がり、組織学的悪性度、subtype(エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、HER2発現の有無、Ki-67の陽性率)を追加し、Treg数との相関を解析する予定である。21と同じ検体を用いて、Tregの主なケモカインであるCCL22の免疫染色を行った。今後Tregの集積数との相関を検討する予定である。31に用いた症例の主病巣の検体よりRT-PCRに用いる為のRNAを注出を試みたがホルマリン固定された組織のパラフィンブロック検体から抽出されたRNA検体の品質にばらつきがあった。今後Foxp3ならびにCCL22のmRNA発現量を半定量し免疫染色の結果と相関するか評価予定である。RNA抽出にあたってはホルマリン固定されたパラフィンブロックからの抽出が可能と謳われている市販のキットを使用したが、現状ではRNA抽出用にRNAlater等を使用し凍結標本を残しておいた方が良いと考えられた。4SPECT-CTとRVSを用いて、術前に同定したSNと手術中に摘出したSNを一致させる事は可能であった。複数個のSNが同定された時の評価は、代表する1つのSNで行うのが良いのか、全てのSNの平均、あるいは総和で行うべきか等の課題が明らかになった。
血管内皮細胞由来の血管収縮ペプチド、エンドセリンの構造活性相関とその変換酵素の研究

1.エンドセリンー1の構造活性相関エンドセリンー1のC末端Trp21ga活性発現に必須であること、SS結合、AspーLysーGluの荷電部分およびル-プ構造が活性に必要であることを明かにした。2.培養内皮細胞上清およびブタ脊髄、脳におけるエンドセリン関連ペプチドの構造解析培養内皮細胞上清の解析から、遺伝子構造解析より推定したエンドセリンの生合成経路の正しさを実証した。また、ブタ脊髄、脳中からエンドセリンー1とー3を単離して、いずれも神経ペプチドであることを示した。3.エンドセリン変換酵素の精製と特性解析ウシ副腎髄質および血管内皮細胞から、エンドセリン変換活性をもつ酸性プロテア-ゼが存在することを明かにし、カテプシンDであることを示した。一方、エンドセリン産生組織である肺、脳から、中性で変換活性をもつ金属プロテア-ゼの存在を見つけ、ホスホラミドンで強力に阻害されることを明かにした。4.ホスホラミドンによる培養内皮細胞への効果およびラットin vitro投与の効果の解析ホスホラミドンはビッグエンドセリンー1のラットin vitro投与による昇圧反応を強力に押えた。また、ホスホラミドンから内皮細胞内に浸透し、エンドセリン変換酵素の活性を阻害することを明かにした。このことは、ホスホラミドン誘導体が降圧活性を持つことになり、今後これらの誘導体が降圧薬として役立つ可能性を示している。1.エンドセリン-1の構造活性相関自動ペプチド合成装置及び酵素法を用いて、a)エンドセリン-1(1-21)およびビッグエンドセリン-1(1-25)、(1-39) b)L-Trp21をD-Trp21に置換したエンドセリン-1(1-21) c)C末端部を欠くエンドセリン-1(1-20)、(1-19)(1-16) d)分子内ss結合および分子内ル-プを切断したカルボキシメチルエンドセリン-1、Lys9-nickedエンドセリン-1を合成し、逆相HPLCにより精製した。ついで、その精製ペプチドをブタ冠動脈血管螺旋標本を用いて、収縮活性を測定した。その結果、C末端Trp21が活性発現に必須であること、SS結合、Asp-Lys-Gluの荷電部分およびル-プ構造が活性に必要であることが分かった。2.培養内皮細胞上清およびブタ脊髄、脳におけるエンドセリン関連ペプチドの化学的解析培養内皮細胞上清より、エンドセリン-1、ビッグエンドセリン-1の他に、ビッグエンドセリン-1(22-39)を単離構造決定し、遺伝子解析より推定したエンドセリンの生合成経路の正しさを示した。また、ブタ脊髄、脳より、エンドセリン-1及びエンドセリン-3を単離構造決定し、いずれも中枢神経に存在する神経ペプチドであることを示した。3.エンドセリン変換酵素の解析ウシ副腎髄質クロム親和顆粒より、ビッグエンドセリンをエンドセリンに変換する活性を持つプロテア-ゼを単離し、ペプスタチンで阻害される至適pH3.5の酸性プロテア-ゼであり、分子量(ゲル濾過法30K、SDS-PAGE法45、30、15K)の比較からカテプシンDであることを突き止めた。1)酸性型エンドセリン変換酵素の精製と特性解析ウシ副腎髄質のクロム親和顆粒より、ビッグエンドセリンー1を基質としてエンドセリンー1に変換する酵素を単離した。その酵素は、至適pH3.5であり、ペプスタチンにより完全に活性は阻害され、分子量解析から、カテプシンDか非常によく似た酵素と考えられた。次に、ウシ血管培養内皮細胞の変換酵素を探索し、同様な酸性プロテア-ゼの存在を確認した。抗カテプシンD抗体を作成し、その酵素を調べた結果、抗体により活性が除去されること、また分子量がカテプシンと同一であることからカテプシンDと結論した。しかし、カテプシンDは、エンドセリンー1そのものも分解することが判明し、非生理的な変換活性と結論した。2)中性金属型エンドセリン変換酵素の精製と特性解析

エンドセリンー1を産生する脳、肺からエンドセリン変換活性をもつ酵素を探索した。その結果、脳および肺のいずれからも膜結合性、至適pHが約7であり、EDTA、ホスホラミドンにより活性が強力に抑えられる中性金属プロテア-ゼを見いだした。3)ホスホラミドンによる培養内皮細胞への効果およびラットin vivo投与の解析ホスホラミドンはビッグエンドセリンー1のラットin vivo投与による昇圧反応を強力に抑えた。また、内皮細胞の培養上清中の解析から、エンドセリンー1濃度が減少し、ビッグエンドセリンー1濃度が増加した。細胞内濃度の解析も同様であった。以上の結果は、ホスホラミドンが細胞内に浸透し、エンドセリン変換酵素の活性を阻害したためと考えられる。
s-過程元素合成を探る天体精密温度計と204Pb中性子捕獲反応断面積測定

本研究では宇宙初期の恒星内温度を調べるため、「天体の温度計」として知られる204Tl-204Pbに注目した。天体温度計として機能させるには娘核204Pbの中性子捕獲反応の高精度断面積値が必要不可欠である。そこで、204Pbの非常に小さい中性子捕獲反応断面積を宇宙初期の恒星内温度に相当するエネルギー(8 keV)で求めるため、高強度のパルス中性子が得られるJ-PARCにおいて、新たにLaBr検出器システムを整備した。そして、中性子捕獲反応直後に放出される不連続な即発γ線のTOF及びエネルギー測定し、keVを含む高エネルギー中性子領域で中性子捕獲反応による共鳴を観測することに成功した。204Tl-204Pb天体温度計は遅い元素合成(s-過程)が起きる恒星内温度を調べる重要なプローブであるが、天体温度計として機能させるには娘核204Pbの中性子捕獲反応の高精度断面積値が必要不可欠である。そこで本研究では、204Tlの娘核204Pbについて、その中性子捕獲反応断面積を宇宙初期の恒星内温度に相当するエネルギー(8 keV)で測定し、s-過程元素合成が起きている恒星内温度を解明する事を目的とする。本研究は中性子捕獲反応断面積の小さい204Pb捕獲反応断面積の捕獲反応直後に放出される不連続な即発γ線(真の信号)を測定する。即発γ線を高感度で検出しその断面積を高精度で決定するため、実験は高強度のパルス中性子が得られるJ-PARCにおいて、新たにLaBr検出器を用いてガンマ線のTOF及びエネルギーを測定する。本年度は主検出器(LaBr)のガンマ線に対する応答特性に関する知見を得た。実験は、Alターゲットに加速した陽子を照射し、発生したガンマ線(10MeV)をアンチコンプトン型LaBr検出器で測定した。Alの共鳴を利用したガンマ線のエネルギーは、110MeVと広い範囲にわたり、検出器の性能を実験的に求めた。当初、本研究の実験的な鍵となる遮蔽体設計のため、J-PARC・BL04のANNRI[Geスペクトロメーター群]の現空きポートにLaBr3検出器を挿入し、パルス中性子と204Pb試料を用いガンマ線の信号/雑音比を測定し、遮蔽体製作に必要な基礎情報を取得する予定であった。しかし、平成25年度初頭にJ-PARCの運転計画が急きょ変更になった事により、本研究も計画を変更し上記の検出器の性能評価を進めた。204Tl-204Pb天体温度計は、遅い元素合成(s-過程)が起きる恒星内温度を調べる重要なプローブであるが、天体温度計として機能させるためには娘核204Pbの中性子捕獲反応の高精度断面積値が必要不可欠である。そこで本研究では中性子捕獲反応断面積の小さい204Pb捕獲反応反応直後に放出される不連続な即発ガンマ線を高感度で検出可能な新型検出器(LaBr)に着目した。この検出器を世界最高強度のパルス中性子が得られる加速器施設J-PARC/MLFに整備し、204Pb中性子捕獲反応断面積の高精度測定を目指す。本年度は、来年度の本実験に向けJ-PARC加速器施設に導入する主検出器(LaBr)の遮蔽体を整備した。本研究ではJ-PARC・MLFビームライン4番(BL04)で生成される高エネルギー領域のパルス中性子を用い中性子捕獲反応断面積の小さい204Pb捕獲反応断面積の捕獲反応直後に放出される不連続な即発γ線を測定した。即発γ線を高感度で検出しその断面積を高精度で決定するため、実験は高強度のパルス中性子が得られるJ-PARC BL04において、新たにLaBr検出器を用いてガンマ線のTOF及びエネルギーを測定した。<平成27年度の具体的な実績>(1)遮蔽システムの製作:BL04に最適化したガンマ線及び中性子遮蔽体を製作し、J-PARCの安全審査を通したうえで据え付けた。(2)製作したガンマ線検出器システムを用いて197Auと濃縮204Pb試料の中性子捕獲反応から発生したガンマ線の観測に成功した。J-PARC加速器施設の運転計画が急きょ変更になったため予定していたテスト実験がキャンセルとなったが、平成27年度に予定している本実験に向け予定通り検出器用の遮蔽体の整備を進めた。原子核物理平成27年度11月に予定されている本実験に向けて、同9月ごろJ-PARC/MLF BL04に検出器システムを導入する。平成25年度初頭にJ-PARCの運転計画が急きょ変更になり、予定していた実験が実施できなくなったため。J-PARC/MLFへの搬入時期が平成27年度に決まり、搬入や検出器架台の製作に必要な費用を確保するため。

平成26年度に、遮蔽体設計のため再稼働したJ-PARCのBL04にてLaBr検出器を用いたテスト実験を行う。パルス中性子と204Pb試料を用い信号/雑音比を測定することで遮蔽体製作に必要な基礎情報を取得する。平成27年度:本実験及び解析:製作した遮蔽体を用いてJ-PARCにて本実験を行う。197Auと濃縮204Pb試料から中性子捕獲反応断面積を決定する。J-PARCに検出器システムを導入するための搬入・据え付け費用及び軽微な遮蔽体の改造費用、検出器用架台の製作費用として使用する。平成25年度初頭に発生したJ-PARCの運転計画の変更により、予定していた実験が実施できなくなったため。再稼働したJーPARCにて基礎実験を実施し、その結果に基づいて実験用消耗品と遮蔽体を購入する。
心筋線維芽細胞よりアンジオテンシンIIで発現誘導される分子の同定とその機能解析-in RNA differential displayを用いた新しい分子クローニング-

アンジオテンシンII(AngII)受容体には全く異なる細胞内シグナルを持つ1型(AT1)、2型(AT2)が存在する。AT1は心血管系に主に存在し、血管収縮・陽性変力といったAngIIの古典的心血管・増殖作用を伝達する。心筋線維芽細胞にはAT1が主として存在し、強力な細胞増殖作用を発揮し、これにはERK増殖キナーゼが深く関与する。AngIIで処理した心筋線維芽細胞由来のmRNAより、dirrcrential displayを用いて単離に成功した誘導蛋白は数個得られた。そのうち1つはSH2基をアミノ端に含む未知のセリン・スレオニン型蛋白ギナーゼであることを見いだした。この蛋白を含む融合蛋白を線維芽細胞に強制発現すると、興味あることに、AT1刺激で誘導されるERK・JNK開殖キナーゼ活性化は抑制された。この増殖キナーゼ抑制機構および上流シグナルに関与する制御機構は現在検索中である。
2足歩行ロボットを利用した脆弱路面におけるヒト歩行戦略の解明

本研究では,ヒトの脆弱路面での歩行運動を計測・解析し,その解析結果を2足歩行ロボットに実装することで検証し,脆弱路面におけるヒト歩行戦略の解明を目指す.歩行解析より, (1)脆弱路面歩行時は遊脚が路面と接触し躓くことを防ぐため足上げ高さを高くしていること, (2)左右方向の重心位置を安定させていることが分かった.以上の解析結果より歩行安定化技術を開発し, 2足歩行ロボットでの実験を通してその有効性を確認した.本研究では,ヒトの脆弱路面での歩行運動を計測・解析し,その解析結果を2足歩行ロボットに実装することで検証し,脆弱路面におけるヒト歩行戦略の解明を目指す.歩行解析より, (1)脆弱路面歩行時は遊脚が路面と接触し躓くことを防ぐため足上げ高さを高くしていること, (2)左右方向の重心位置を安定させていることが分かった.以上の解析結果より歩行安定化技術を開発し, 2足歩行ロボットでの実験を通してその有効性を確認した.本研究課題では,ヒトの軟弱路面での歩行運動を計測・解析し,その解析結果を2足ヒューマノイド・ロボットに実装することで検証し,軟弱路面におけるヒト歩行戦略の解明を目指す.平成22年度は,以下の3点について研究を推進した.(1)軟弱路面でのヒト歩行運動の計測・解析:3次元モーションキャプチャシステム,床反力センサ,姿勢角センサ,足底圧力計測装置を用いて,脚接地面が変形する軟弱路面においてヒト歩行運動の計測を行った.軟弱路面での歩行の特徴としては,軟弱路面では重心の揺動が垂直方向に大きくなることが分かったが,左右方向については有意な差は見られなかった.足の運びに注目すると,歩幅や歩隔に変化は見られなかったが,軟弱路面の変形に応じて足上げ高さが高くなる傾向があった.さらに,軟弱路面では剛体路面に比べ両立脚期が長くなるという解析結果を得た.(2)冗長自由度を持つ2足ヒューマノイド・ロボットのための逆運動学計算法の開発:ロボットの持つ冗長性を活かし,安定に歩行するのみならず,頭部の揺れを最小化する,といったいくつかの要求を優先度の高いものから可能な限り満足するように,各関節角度指令を生成可能な逆運動学計算の開発を行った.その結果,従来手法に比べより少ないパラメータのみを設定するだけで,歩行パターンを生成可能であることを確認した.(3)2足ヒューマノイド・ロボットの下肢機構の改良:ヒトの歩隔・足角を再現可能な2足ヒューマノイド・ロボットの下肢機構を開発した.具体的には,人間の下腿の外寸および足関節の可動角や最大角速度を参考に設計を行った.以上で得られた基盤技術を,次年度のシステム開発に還元することを計画している.本研究課題では,ヒトの脆弱路面での歩行運動を計測・解析し,その解析結果を2足ヒューマノイド・ロボットに実装することで検証し,脆弱路面におけるヒト歩行戦略の解明を目指す.平成22年度の人体計測結果を受け,平成23年度は以下の3点について研究を推進した.(1)歩行パターンの改良脆弱路面では,立脚が路面に沈み込むため遊脚が路面と接触する危険性が高まる.これに対して,ヒトは足の垂直な上げ下ろしと足上げ高さの増加により路面とのクリアランスを増加させていることが前年度に行った歩行解析で示唆された.そこで,歩行パターン作成時に足先軌道を垂直に上げ下ろしながら最大で足上げ高さが50mmに達するように設定した.ヒトの足上げ高さは実際は50mmよりも大きいが,これ以上ロボットの足上げ高さを高くすると下肢関節の角速度の上限を超えてしまうため,ロボットの足上げ高さを50mmとした.(2)重心位置補償制御の開発歩行解析結果より,脆弱路面ではヒトは重心位置を安定化させるような歩行戦略を取っていることが分かっている.そこで,ロボットを倒立振子,脆弱路面を並列のばね要素としてモデル化し,重心の角度偏差をロボットに搭載された姿勢角センサから取得し,それを足関節を回転させることで重心位置を安定化する.これは単立脚期に行い,両立脚期には足部で発生する床反力を目標値に収束させるようにロボットの両脚長を制御することで重心位置の安定化を図る.(3)2足ヒューマノイド・ロボットでの評価実験以上のヒト歩行戦略を等身大の2足ヒューマノイド・ロボットに実装し評価実験を行った.その結果,ウレタンスポンジ上での前進歩行を実現し,提案手法の有効性が確認できた.以上のように,本研究では脆弱路面でのヒト歩行戦略をモデル化し,2足ヒューマノイド・ロボットでの歩行実験を通してその有効性を確認した.
2値・多値融合論理に基づくナノエレクトロニクスの開拓

平成18年度は以下の2項目について研究を行った.1.SET/CMOS混載回路による2値・多値融合論理システムの設計技術の開発(担当:青木および本間)前年度に検討した方式により,SET/CMOS混載回路によって実現される2値・多値融合論理システムの設計技術を開発した.まず,本研究代表者らが提案するハードウェアアルゴリズム記述言語ARITHおよびハードウェアアルゴリズム合成用データ構造CTD (Counter Tree Diagram)を用いた上位設計フローを開発した.この設計フローでは,従来の2値論理ハードウェアアルゴリズムのみならず,多値論理に基づく新しいハードウェアアルゴリズムの記述と検証を可能にした.さらに,ここで記述された2値・多値融合論理ハードウェアアルゴリズムをSET/CMOS混載回路にマッピングすることを目的とした下位設計フローを開発した.SETの物理モデルをSmartSpiceあるいはHSPICEなどに組み込んだSET/CMOS混載回路シミュレーション手法を開発するとともに,これを用いた回路の詳細設計フローの実現を検討した.SET物理モデルの作成とパラメータのチューニングには,NTT物性科学基礎研究所の協力を得た.2.各種応用システムの設計と総合的な性能評価(担当:青木)前年度の主要機能モジュールの設計結果を踏まえ,比較的大規模な応用システムLSIの設計を試みた.具体的には,単電子連想メモリ(CAM)の設計を行った.ここではSETによる4値SRAMセルを使用し,時分割でマルチビット/セルのデータ読み出しを行うとともに,データの照合を多入力SET論理とCMOSプリチャージ論理で実現した.この他にも,ドントケア情報の保持・検索を可能とする単電子CAMを設計し,提案技術のインパクトを総合的に評価した.(a)2値・多値融合論理によるSET/CMOS混載回路の設計論について検討した.まず,SETおよびCMOSによる2値・多値融合論理ゲートファミリーを体系化した.また,ハードウェアアルゴリズム記述言語ARITHおよび合成用データ構造CTDを用いた上位設計フローを確立した.この設計フローでは,ハードウェアアルゴリズムの記述から2値・多値融合論理ゲートのネットリスト(SET/CMOS混載回路)を生成する.さらに,回設計のために,SET物理モデルをSmartSpiceあるいはHSPICEに組み込んだSET/CMOS混載回路シミュレータの開発を検討した.(b)SET/CMOS混載による超低電力機能モジュールの基本設計について検討した.特に,SET/CMOS混載による(i)超低電力論理回路(ランダムロジック),(ii)超低消費電力算術演算回路(データパス),(iii)超高密度多値機能メモリなどの設計法について検討した.これらの設計では,SETの特長的な機能性として,「低消費電力」,「マルチゲート構成」,「多値論理」,「多値メモリ」を駆使することで,従来のCMOS回路と比較して,素子数と消費電力の大幅な削減が可能であることを確認した.平成18年度は以下の2項目について研究を行った.1.SET/CMOS混載回路による2値・多値融合論理システムの設計技術の開発(担当:青木および本間)前年度に検討した方式により,SET/CMOS混載回路によって実現される2値・多値融合論理システムの設計技術を開発した.まず,本研究代表者らが提案するハードウェアアルゴリズム記述言語ARITHおよびハードウェアアルゴリズム合成用データ構造CTD (Counter Tree Diagram)を用いた上位設計フローを開発した.この設計フローでは,従来の2値論理ハードウェアアルゴリズムのみならず,多値論理に基づく新しいハードウェアアルゴリズムの記述と検証を可能にした.さらに,ここで記述された2値・多値融合論理ハードウェアアルゴリズムをSET/CMOS混載回路にマッピングすることを目的とした下位設計フローを開発した.SETの物理モデルをSmartSpiceあるいはHSPICEなどに組み込んだSET/CMOS混載回路シミュレーション手法を開発するとともに,これを用いた回路の詳細設計フローの実現を検討した.SET物理モデルの作成とパラメータのチューニングには,NTT物性科学基礎研究所の協力を得た.2.各種応用システムの設計と総合的な性能評価(担当:青木)前年度の主要機能モジュールの設計結果を踏まえ,比較的大規模な応用システムLSIの設計を試みた.具体的には,単電子連想メモリ(CAM)の設計を行った.ここではSETによる4値SRAMセルを使用し,時分割でマルチビット/セルのデータ読み出しを行うとともに,データの照合を多入力SET論理とCMOSプリチャージ論理で実現した.この他にも,ドントケア情報の保持・検索を可能とする単電子CAMを設計し,提案技術のインパクトを総合的に評価した.
バクテリオファージ尾部リガンド分子を利用した新規迅速細菌同定法の開発

感染拡大防止には、感染管理が極めて有効である。感染管理における迅速な細菌種同定は、患者早期治療、医療費削減、感染拡大防止等に大きく貢献する。それゆえ、より迅速な細菌同定法の開発は急務である。研究代表者は、バクテリオファージ(ファージ;細菌ウイルス)の構造タンパク質が細菌種特異的吸着能に関与していることに着目し、細菌検出法への応用性を検討した。その結果、ファージ尾部分子は迅速細菌検出法に使用できる可能性が明らかとなった。本研究の目的は、バクテリオファージ(ファージ)尾部先端リガンド分子の宿主特異的吸着能力を利用した迅速細菌検査法のモデル構築を行うことである。しかしながら、ファージリガンド分子の詳細はあまり明らかでない。本研究では、独自に分離した黄色ブドウ球菌ファージS24-1、腸球菌ファージφEF24Cのリガンド分子の同定・特徴付けを行い、次に、迅速細菌検査方法への応用を試みた。ファージリガンド分子の特徴付け比較ゲノム解析によりリガンド分子の予想を行った。リガンド分子の調製を行い、ファージリガンド分子の特徴付けを行った。1.黄色ブドウ球菌ファージS24-1リガンド分子ORF16ウエスタンブロット法・質量分析法・免疫電顕法により尾部先端の存在が確認された。また、Blue-native PAGEにより、4あるいは8つで1つの機能ユニットを形成する可能性が示唆された。2.腸球菌ファージφEF24Cリガンド分子ORF31電子顕微鏡の改良により、繊細な尾部繊維の存在が明らかにされ、ウエスタンブロット法・質量分析法・免疫電顕法により尾部繊維に存在することが確認された。リガンド分子のビーズ凝集反応への応用黄色ブドウ球菌ファージリガンド分子ORF16付加ビーズ作製を行った。様々な菌に対する凝集反応を検査したところ、S.aureusに対して特異的凝集能を示した。よって、リガンド分子の検査法への応用の可能性が示唆された。まとめ本研究は、未知のゲノムより比較ゲノムを行い、その予測遺伝子産物の機能証明を行った点で、ファージ工学において極めて重要な研究方法が開発できたと考えられる。また、その分子を利用し臨床検査法に応用するといった独自の研究着想を実行し、当該検査方法に応用できる可能性を示したことは、科学技術的に大きな進歩をしたと考えられ、本年度の研究成果は、極めて意義を有すると考えられる。本研究の目的は、バクテリオファージ(ファージ)尾部先端リガンド分子の宿主特異的吸着能を利用した迅速細菌検査法の開発である。はじめに独自に分離した黄色ブドウ球菌ファージS24-1、腸球菌ファージφEF24Cのリガンド分子の解析を行った。次に、ビーズ凝集法を利用したファージリガンド分子の細菌検査方法の可能性検討を行った。ファージリガンド分子の解析1.黄色ブドウ球菌ファージS24-1リガンド分子ORF16:ウエスタンブロット法・質量分析法・免疫電顕法により尾部先端の存在が確認された。また、構造解析により、3つで一つのユニットを形成することが確認された。さらに、黄色ブドウ球菌の細胞壁に存在するwall teichoic acid特異的に認識・結合することが示唆された。現在、国際論文として報告予定である。2.腸球菌ファージφEF24Cリガンド分子ORF31:電子顕微鏡法の改良により、繊細な尾部繊維の存在が明らかにされ、ウエスタンブロット法・質量分析法・免疫電顕法により尾部繊維に存在することが確認された。研究成果は、オンラインジャーナルPLoSONEへ報告した。ファージリガンド分子の細菌検査方法の可能性検討:黄色ブドウ球菌ファージリガンド分子ORF16結合ビーズの作製を行った。ORF16結合ビーズを様々な細菌に対して凝集反応を行ったところ、黄色ブドウ球菌特異的に凝集反応を示した。よって、ファージリガンド分子を検査法へ応用できる可能性が強く示唆された。まとめ本研究は、比較ゲノムより吸着遺伝子を予測し、その遺伝子産物の機能証明を行った点で、生物学において極めて重要な発見がなされたと考えられる。また、ファージリガンド分子を利用し細菌検出法に応用できる可能性を示した。本法は、2011年9月に特許出願を行っており、細菌検査産業へ新しい可能性を提唱したと考えられる。それゆえ、本年度の研究成果は、産学両面において極めて意義を有する研究であると考えられる。