hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
一般座標系による3次元任意形状不整形地盤の地震応答解析

1.半楕円体状不整形地盤モデルに対して,代数に生成した非直交の初期格子を逐次改良することにより「部分的に直交する一般座標系」,即ち「深さ」方向の座標曲線が他の2つの座標曲線と直交する座標系を生成し,リカッチ法を適用することによって地震応答解析を実施した。そして,3次元境界要素法による解析との比較により,その精度について検討を加えた。不整形地盤の応答特性において特に重要な意味を持つ長周期領域では概ね良好な結果が得られた。解析精度および適用範囲(有効帯域)は採用する一般座標系の密度,均質性に強く依存するのに対して,未だ一般座標系の生成過程でこれらの属性を任意にコントロールすることは難しい。従って,広帯域の解析を実現するためには,十分に密な座標系(格子)を採用し,付随する大規模な演算を効率的に行うための解析上のさらなる工夫が必要である。2.2次元,3次元不整形地盤の内部で生成される表面波に注目し,その分散性において等価な平行2層地盤の層厚(等価層厚)をもって,不整形地盤の幾何学的形状が地震応答特性に及ぼす影響を定量化した。等価層厚は外部半無限地盤の不整形地盤に対する拘束の強さに関係し,等価層厚が大きい程拘束が弱く,表面波のエアリー相が長周期側に遷移し,結果として優勢な表面波が生成されることを示した。また,直達波と表面波の干渉として,不整形地盤内の増幅特性の複雑な空間分布を簡易に説明できることを示した。3.レーリー・リッツ法により任意形状不整形地盤の固有振動数,固有振動モードを高精度で評価できることを示した。そして,不整形地盤から外部地盤への波動逸散効果を,不整形地盤内の媒質の減衰の効果として導入することにより,モーダル・アナリシスを展開し,不整形地盤の増幅特性を簡易に評価できることを示した。1.3次元任意形状不整形地盤に適合する一般座標系の生成,及びこれに基づく地震応答解析法の展開(1)解析力学的アプローチにより,3次元一般座標系における支配方程式をハミルトンの正準方程式として再構成し,不整形地盤の波動伝播問題の数理的構造を詳細に調べた。解くべき問題は線形常微分方程式の2点境界値問題に帰着され,リカッチ変換により,リカッチ行列微分方程式と付随する線形常微分方程式の初期値問題に変換される。この2つの微分方程式の物理的意味を明らかにし,それぞれの解の安定性を考慮した積分スキームを再構成した。(2)解析対象の任意形状の3次元不整形地盤に適合する一般座標系を生成する方法の開発に先立ち,2次元一般座標系,特に曲線直交座標系の数値生成アルゴリズムの改良を行った。解析対象内部の座標系をラプラス方程式を用いて生成し,反復計算により境界における座標曲線の直交条件を満足する座標系を生成する方法を開発した。改良された手法では境界上のグリッドの配置を制御することが可能であり,これによって解析精度の向上が期待される。(3)境界要素法により2次元不整形地盤の地震応答解析を行い,本研究で展開する地震応答解析法との比較によりその精度を検証した。2.不整形地盤における地震波動の伝播・増幅機構の解明(1)本研究で展開する手法により,同じ鉛直断面を持つ2次元,3次元軸対象不整形地盤の地震応答解析を行い,両者の比較を行った。3次元問題では,外部地盤の拘束効果の増大と,波線の3次元的集中による焦点効果の存在が確認された。(2)2次元および3次元不整形地盤における表面波の性状を,その分散性において等価な平行2層地盤モデルを導入することにより定量化し,不整形地盤の形状や媒質との関係を調べた。等価平行層地盤の層厚は不整形地盤の幾何学的形状が地震応答に与える影響を示す一つの指標と成り得ることが示された。(1)非軸対称の半楕円体地盤に対して,代数的に生成された非直交の初期格子を逐次改良することにより,本研究で提案するリカッチ法に要求される部分的に直交する一般座標系(深さ方向の座標曲線が他の2つの座標曲線と直交する)を生成する方法を開発した。この方法は,内部に層構造を有する不整形地盤に対しても,層ごとに領域を分割することにより適用することが可能である。しかし,生成される格子の均質性は初期格子の設定に依存し,地震応答の解析精度に影響を与えるため,より均質な格子を生成するための更なる改良が必要である。(2)対称2次元不整形地盤,軸対称3次元不整形地盤に加えて非対称2次元不整形地盤の地震応答解析を実施し,不整形地盤内部で生成される表面波の分散性に関して等価な平行2層地盤の層厚(等価層厚)を指標として,不整形地盤の地震応答性状を分析した。そして,等価層厚は不整形地盤の幾何学的形状が地震応答に与える影響を定量化する有効かつ簡易な指標であることを検証し,更に,等価層厚は不整形地盤の固有振動数と密接な関係を持つことを示した。(3)前項(2)の知見を踏まえ,対称,非対称2次元不整形地盤,及び内部に層構造を有する2次元不整形地盤の固有振動数,固有振動モードをレーリー・リッツ法により簡易に評価する方法を開発し,リカッチ法により得られる伝達マトリクスの固有値解析の結果と比較することにより,その精度を検証した。更に,得られた固有振動数,固有振動モードを用いてモーダル・アナリシスを展開し,2次元不整形地盤における面外せん断波の増幅特性を近似的に評価する方法を開発した。

そして,リカッチ法による応答解析の結果と比較し,モーダル・アナリシスに基づく近似評価法の適用性について検討を加えた。1.半楕円体状不整形地盤モデルに対して,代数に生成した非直交の初期格子を逐次改良することにより「部分的に直交する一般座標系」,即ち「深さ」方向の座標曲線が他の2つの座標曲線と直交する座標系を生成し,リカッチ法を適用することによって地震応答解析を実施した。そして,3次元境界要素法による解析との比較により,その精度について検討を加えた。不整形地盤の応答特性において特に重要な意味を持つ長周期領域では概ね良好な結果が得られた。解析精度および適用範囲(有効帯域)は採用する一般座標系の密度,均質性に強く依存するのに対して,未だ一般座標系の生成過程でこれらの属性を任意にコントロールすることは難しい。従って,広帯域の解析を実現するためには,十分に密な座標系(格子)を採用し,付随する大規模な演算を効率的に行うための解析上のさらなる工夫が必要である。2.2次元,3次元不整形地盤の内部で生成される表面波に注目し,その分散性において等価な平行2層地盤の層厚(等価層厚)をもって,不整形地盤の幾何学的形状が地震応答特性に及ぼす影響を定量化した。等価層厚は外部半無限地盤の不整形地盤に対する拘束の強さに関係し,等価層厚が大きい程拘束が弱く,表面波のエアリー相が長周期側に遷移し,結果として優勢な表面波が生成されることを示した。また,直達波と表面波の干渉として,不整形地盤内の増幅特性の複雑な空間分布を簡易に説明できることを示した。3.レーリー・リッツ法により任意形状不整形地盤の固有振動数,固有振動モードを高精度で評価できることを示した。そして,不整形地盤から外部地盤への波動逸散効果を,不整形地盤内の媒質の減衰の効果として導入することにより,モーダル・アナリシスを展開し,不整形地盤の増幅特性を簡易に評価できることを示した。
土木構造物の診断法の創成に関する研究

3年間の研究成果を取りまとめるに当たって,以下のような7項目について総括することを目標として本年度の研究活動を実施した.その結果,以下のような診断法の創成に関する新たな知見が得られた(1)構造物の非破壊調査と診断法に関する研究総括:研究代表者(大津)が担当し,鋼-コンクリート構造物の点検手法としての非破壊検査法の現状と診断技法としてのエキスパートシステムの動向が調査され,総括を行った.(2)AE法の構造物診断への適用に関する研究:研究分担者(重石)が担当し,AE法の主にコンクリート構造物への適用性と最新の計測法の開発動向が明らかになった.(3)コンクリートの非破壊試験に関する研究:研究分担者(魚本)が担当し,広範囲な調査が実施され,実用化の動向と,そのための開発試験の概要が示された.(4)コンクリート構造の損傷評価と非破壊検査に関する研究:研究分担者の(六郷・鎌田)が担当し,破壊力学及び損傷力学に基づいた定量的な劣化の評価法が非破壊検査法と結び付けられた.(5)鋼構造物の劣化診断と評価に関する研究:研究分担者(三木)が担当し,橋梁を中心に鋼構造物の劣化の状況と診断のための手法が調査・整理され,実用的な検査法が提案された.(6)構造物の劣化診断に関する研究:研究分担者(森川)が担当し,現場試験に基づいた貴重な試験結果が取りまとめられ,診断のための実用的な点検・検査手法が提案された.(7)橋梁の劣化診断システムに関する研究:研究分担者(宮本)が担当し,診断システム構築と適用事例が明らかにされた.3年間の研究成果を取りまとめるに当たって,以下のような7項目について総括することを目標として本年度の研究活動を実施した.その結果,以下のような診断法の創成に関する新たな知見が得られた(1)構造物の非破壊調査と診断法に関する研究総括:研究代表者(大津)が担当し,鋼-コンクリート構造物の点検手法としての非破壊検査法の現状と診断技法としてのエキスパートシステムの動向が調査され,総括を行った.(2)AE法の構造物診断への適用に関する研究:研究分担者(重石)が担当し,AE法の主にコンクリート構造物への適用性と最新の計測法の開発動向が明らかになった.(3)コンクリートの非破壊試験に関する研究:研究分担者(魚本)が担当し,広範囲な調査が実施され,実用化の動向と,そのための開発試験の概要が示された.(4)コンクリート構造の損傷評価と非破壊検査に関する研究:研究分担者の(六郷・鎌田)が担当し,破壊力学及び損傷力学に基づいた定量的な劣化の評価法が非破壊検査法と結び付けられた.(5)鋼構造物の劣化診断と評価に関する研究:研究分担者(三木)が担当し,橋梁を中心に鋼構造物の劣化の状況と診断のための手法が調査・整理され,実用的な検査法が提案された.(6)構造物の劣化診断に関する研究:研究分担者(森川)が担当し,現場試験に基づいた貴重な試験結果が取りまとめられ,診断のための実用的な点検・検査手法が提案された.(7)橋梁の劣化診断システムに関する研究:研究分担者(宮本)が担当し,診断システム構築と適用事例が明らかにされた.土木構造物の診断法について研究を機能的に実施するため、劣化予測WG、点検・調査WG、評価法WGの3つのグループを組織し、それらを中心に以下のようなテーマについて研究を実施した。(1)劣化予測WG(a)塩分浸透予測モデルの開発鉄筋コンクリート構造物の塩分被害に関してコア試験での塩分量調査と現地での飛来塩分量などに基づく、塩分浸透予測モデルを検討した。そして、種々の要因について解析的に予測モデルの実用化を進めた。(b)破壊力学に基づいたコンクリートのひび割れ劣化モデルの検討コンクリート構造体から採取されたコア供試体の力学的データに基づいて、ひび割れによる劣化予測モデルの構築と予測法について検討した。(2)点検・調査WG(a) AE試験装置によるコンクリートの劣化監視法の開発現場用AE試験装置を整備し、定期点検時のひび割れ監視システムの構築について検討した。(b)非破壊検査装置による点検手法の調査現状の鋼およびコンクリート構造物の非破壊検査手法とその点検・検査への適用について検討した。(a)診断システムの文献調査現在までに提案あるいは開発されている種々の診断システム、エキスパートシステム、評価法などについて広範囲に文献調査を実施した。(b)システムの構築法の検討エキスパートシステムに始まり、ファジー、ニューロなどの新たな論理システムの発達により、診断のための意思決定過程には数々のロジックが提案されている。これらの適用性について調査した。土木構造物の診断法について研究を機能的に実施するため、劣化予測WG、点検・調査WG、評価法WGの3つのグループを組織し、昨年度の成果を踏まえて心に以下のような内容について研究を実施した。(1)劣化予測WG鉄筋コンクリート構造物の塩分被害に関してコア試験での塩分量調査と現地での飛来塩分量などに基づく、実用的な塩分浸透予測モデルを開発した。さらに、コンクリート構造体から採取されたコア供試体の力学的データに基づいて、ひび割れによる劣化予測モデルの構築と予測法について検討し、限界応力拡大係数K_<IC>のAE法を用いた決定法を開発した。(2)点検・調査WG現場用AE試験装置を整備し、定期点検寺のひび割れ監視システムの構築について暴露試験に適用して検討した。次に現状の鋼およびコンクリート構造物の非破壊検査手法とその点検・検査への適用について検討した。

その結果、実用的な手法として打音法と超音波法について基礎的な研究を実施した。現在までに提案あるいは開発されている種々の診断システム、エキスパートシステム、評価法などについて広範囲に文献調査を実施した。そして、橋梁診断システムの構築を試みた。エキスパートシステムに始まり、ファジー、ニューロなどの新たな論理システムの発達により、診断のための意志決定過程には数々のロジックが提案されている。これらの適用性について調査しBMS(Bridge Management System)の現状を明らかにした。3年間の研究成果を取りまとめるに当たって,以下のような7項目について総括することを目標として本年度の研究活動を実施した.その結果,以下のような診断法の創成に関する新たな知見が得られた(1)構造物の非破壊調査と診断法に関する研究総括:研究代表者(大津)が担当し,鋼-コンクリート構造物の点検手法としての非破壊検査法の現状と診断技法としてのエキスパートシステムの動向が調査され,総括を行った.(2)AE法の構造物診断への適用に関する研究:研究分担者(重石)が担当し,AE法の主にコンクリート構造物への適用性と最新の計測法の開発動向が明らかになった.(3)コンクリートの非破壊試験に関する研究:研究分担者(魚本)が担当し,広範囲な調査が実施され,実用化の動向と,そのための開発試験の概要が示された.(4)コンクリート構造の損傷評価と非破壊検査に関する研究:研究分担者の(六郷・鎌田)が担当し,破壊力学及び損傷力学に基づいた定量的な劣化の評価法が非破壊検査法と結び付けられた.(5)鋼構造物の劣化診断と評価に関する研究:研究分担者(三木)が担当し,橋梁を中心に鋼構造物の劣化の状況と診断のための手法が調査・整理され,実用的な検査法が提案された.(6)構造物の劣化診断に関する研究:研究分担者(森川)が担当し,現場試験に基づいた貴重な試験結果が取りまとめられ,診断のための実用的な点検・検査手法が提案された.(7)橋梁の劣化診断システムに関する研究:研究分担者(宮本)が担当し,診断システム構築と適用事例が明らかにされた.
生理反応の複数人同時測定による，集団内・間相互作用における潜在的心理過程の解明

本研究の目的は,集団内・集団間の相互作用にかかわる認知機能とそれを支える生物学的メカニズムを明らかにすることであった.まず,数名の小集団が実験課題を行う状況を設定し,全参加者から同時に脳波を計測し,行動モニタリングの指標として行動結果の呈示に対するフィードバック関連陰性電位(FRN)を評価する実験パラダイムを確立した.集団内相互作用については,集団意思決定実験の結果から集団意思決定への関与の仕方がメンバーの行動モニタリングを柔軟に変容することを示した.また2名のチーム2つが協力・競争する事態での検討から,集団間の相互作用は相手集団の行動結果の評価を変容することを示した.本年度は,社会的インタラクション場面において複数人から生理反応を記録するための妥当な計測システムの立ち上げとそれを可能にする心理実験パラダイムの開発を目的とした.この目的を達成するために,実験参加者3名の脳波を同時に測定する実験を行った.この結果,ノイズやアーティファクトを除去して生理反応を測定する技術を構築することに成功した.この測定技術を応用し,集団意思決定がどのように形成され,その結果はどのような認知プロセスにより評価されるのかを検討するための実験を行った.実験では,3名の小集団が多数決に基づき集団で一つの行動を選択し,その選択に成功か失敗の結果が伴う集団意思決定課題を用いた.集団意思決定に伴う結果に着目して事象関連脳電位(ERP)を解析したところ,集団の意思決定の結果が失敗である場合に失敗結果の重要性を反映するフィードバック関連陰性電位(FRN)が観察された.さらに,その振幅は個人の選択が集団の中で少数派のときに減衰を示した.このことは,個人の選択が集団意思決定に寄与しないときには,決定への自己関連度が減衰することにより失敗を重要な結果として評価しないことを示す.また,集団内の他者と意見が異なるときにもフィードバック関連陰性電位(FRN)様の電位が観察されたことから,社会的インタラクションでは他者との意見の相違が重要な社会的シグナルとなることが分かった.これらの結果から,集団の意思決定に伴う結果の評価は集団の意思決定への自己関連度により調節されること,また,他者との意見の葛藤は行動修正の必要を伝える社会的なフィードバックとして評価されていることが明らかとなった.本研究の目的は,集団内・集団間の相互作用に関わる認知機能とそれを支える生物学的メカニズムを明らかにすることである.昨年度までに,3名の脳波を同時記録するための計測システムを立ち上げ,集団意思決定に関わる心理実験パラダイムとして3名の小集団によるギャンブル課題を開発し,多数決による意思決定時の事象関連脳電位(ERP)を検討した.本年度は,3名の小集団によって行われるギャンブル課題で集団意思決定がリーダーによってなされる場合を検討した.左右に2枚のカードが呈示され,まずフォロアー2名が独立にどちらか一方のカードを選択した.次にリーダーがこの2名の選択結果を見て左右どちらかのカードを選択し,これが集団の選択となった.2枚のカードは一方が「当たり」,他方が「はずれ」であり,どちらが当たりかはランダムに決められた.リーダーは3名が交替で務めた.この課題遂行中の3名から同時に脳波を測定し,結果のフィードバックに対するERPを検討した.その結果,「はずれ」のフィードバックに対するERP上に,選択結果の重要性を反映するフィードバック関連陰性電位(FRN)が出現した.このFRN振幅はフォロアーの時に比べてはリーダーの時に大きかった.また,リーダーの時にもフォロアーの時にも「多数派」のときにFRN振幅が大きかった.リーダーの時の「全会一致」は2名のフォロアーに従っただけなのに対し,「多数派」はフォロアーの意見が割れて自らが選択を行ったことになる.また,フォロアーの時の「多数派」は相手ではなく自らの意見が採用された場合である.リーダーとして集団の選択に責任がある場合,さらに,自らの選択が結果に大きく寄与する場合,その決定の結果の重要度が増すことが示された.すなわち,集団意思決定における責任の変容は選択結果の重要性の評価に反映されることが明らかとなった.本研究の目的は,集団内・集団間の相互作用にかかわる認知機能とそれを支える生物学的メカニズムを明らかにすることである.昨年度までの研究では,ギャンブル課題において多数決やリーダー制といった異なる集団意思決定方式を取り入れた実験を実施することで,集団内の他者との相互作用は,集団意思決定に対する責任を変容すること,この責任の変容は選択結果の重要性の評価を反映するフィードバック関連陰性電位(FRN)に反映されることを明らかにした.本年度は,集団メンバー間の親密度が集団意思決定に伴う結果の評価に影響を及ぼすか否かを検討した.実験では,過去の実験で使用した3名の小集団が多数決に基づきカードを選択するギャンブル課題を用いた.親密度は,ギャンブル課題を実施する前の共同作業の有無により操作した.3名一組とする8集団を,課題前に3名で共同作業を行う親密度高群,同じ作業を3名が個別で行う親密度低群の二つの群に分けた.この操作を行った上,課題遂行中の3名から同時に脳波を測定し,集団意思決定に伴う結果の提示により生起するERPを検討した.

その結果,ギャンブル課題において集団の決定が「はずれ」結果時には,「あたり」結果時に比べて選択結果の重要性を反映するFRNの振幅が大きかった.加えて,「はずれ」結果時のFRNの振幅は,3名が同じカードを選択した全会一致時において親密度低群に比べて親密度高群で大きかった.FRNは選択結果の重要性を反映することから,本研究の結果は,全会一致時では集団意思決定に伴う結果の重要性が親密度低群に比べて親密度高群で高いことを示唆する.全会一致時には,他者との意思決定の共有により責任の分散が生じるため,集団意思決定に伴う結果への個人的責任が低減する.この観点から,本研究の結果は,集団メンバー間の親密度の高さは他者との意思決定の共有による責任の分散を妨げ,選択結果の重要性を高めることを示唆する.3名の被験者から同時に脳波を計測する技術を用いて,ギャンブル課題における多数決やリーダー制といった異なる集団意思決定方式での成果に加え,集団メンバー間の親密度の効果を検討し興味深い結果を得ることができたことから,このように判断した.本研究の目的は,集団内・集団間の相互作用にかかわる認知機能とそれを支える生物学的メカニズムを明らかにすることである.昨年度までの研究では,集団意思決定方式を取り入れたギャンブル課題を実施することにより,集団内での他者との相互作用が集団意思決定結果の評価をどのように変容するかを検討してきた.本年度は,集団間相互作用が集団意思決定結果の評価に及ぼす影響を検討した.実験では,2名を一つのチームとして,二つのチームが交代でカードを選択するギャンブル課題を用いた.カード選択では,ペアのうち一人が「あたり」と「はずれ」の大きさを決めるカードを選択した後,もう一人が「あたり」か「はずれ」を決めるカードを選択した.カードの選択結果は各カードの選択直後に呈示した.集団間相互作用を検討するため,カードの選択結果が相手チームに及ぼす影響を操作した.協力条件では,相手チームの「あたり」は自チームの「あたり」,相手チームの「はずれ」は自チームの「はずれ」とした.競争条件では,相手チームの「あたり」は自チームの「はずれ」,相手チームの「はずれ」は自チームの「あたり」とした.ギャンブル課題遂行中の4名から同時に脳波を測定し,結果呈示により生起する事象関連脳電位(ERP)を検討した.その結果,協力条件では,相手チームの「はずれ」結果に対するフィードバック関連陰性電位(FRN)と自チームの「はずれ」結果に対するFRN振幅に差はなかった.一方,競争条件では,相手チームの「はずれ」結果に対するFRN振幅は,自チームの「はずれ」結果に対するFRN振幅よりも小さかった.FRNは選択結果の重要性の評価を反映することから,本研究の結果は,集団が互いに協力する状況では他集団の失敗は自集団の場合と同程度に重要だと評価されるのに対して,集団が互いに競争する状況では,他集団の失敗の重要性は低減することを示している.本研究の目的は,集団内・集団間の相互作用にかかわる認知機能とそれを支える生物学的メカニズムを明らかにすることであった.まず,数名の小集団が実験課題を行う状況を設定し,全参加者から同時に脳波を計測し,行動モニタリングの指標として行動結果の呈示に対するフィードバック関連陰性電位(FRN)を評価する実験パラダイムを確立した.集団内相互作用については,集団意思決定実験の結果から集団意思決定への関与の仕方がメンバーの行動モニタリングを柔軟に変容することを示した.また2名のチーム2つが協力・競争する事態での検討から,集団間の相互作用は相手集団の行動結果の評価を変容することを示した.
多機能デジタル生体顕微鏡による妊娠子宮でのフリーラジカル生成動態と細胞障害の解析

本年度は、多機能デジタル生体顕微鏡を用い、妊娠17日目での子宮胎盤循環での子宮血流流入・流出部の微小循環におけるフリーラジカル、細胞障害の生成過程を組織学的な固定処理を施さずにin vivoに近い状態で観察することを目的とし、研究を実施した。具体的には、研究補助によって購入した画像解析装置を用いて、高感度撮像撮像管(SIT)を用いた生体顕微鏡によってVTR記録されたNADH自家蛍光、DCFH蛍光(hydrogen peroxide感受性)、Rhodamine123(mitochondria membrane potential感受性)、PI(cell viability感受性)の子宮胎盤循環の虚血・再潅流(IR)前後での経時的変化を観察した。結果、子宮胎盤循環のIRは、子宮脱落膜部分の血管内皮細胞の障害をきたしFITC Dextran(MW100,000)の血管外漏出を促進し、血管透過性を上昇させることが判明した。また、DCFH蛍光輝度変化で観察されたIRにともなう子宮脱落膜のフリーラジカルの発生は、時間的・空間的に多様な部位で発生することが示唆された。また、これらの変化は、フリーラジカル消去酵素であるSODを虚血再潅流前に皮下投与することによって抑制されることが判明した。しかしながら、今回の実験系において、IRにともなう子宮脱落膜細胞でのNADH自家蛍光およびRhodamine123の蛍光輝度の変化は認められなかった。今後は、フリーラジカルの発生源についてさらに検討を加えるために、今回購入した画像解析装置を用い、白血球をRhodamine6Gで標識する事によって子宮胎盤循環でのIR障害における白血球の関与について、更に検討を加えていく予定である。
膵胆道癌の浸潤転移の阻止(肝細胞増殖因子を標的とした新治療)

膵胆道癌は消化器癌の中でも予後の悪い癌であるが、その理由の一つとして浸潤や転移が制御できないことにある.我々はこれまで、ヒト胆道癌細胞株を用いて肝細胞増殖因子(HGF)がその浸潤転移を著明に誘導することを明らかにしてきたが、本研究ではHGFのアンタゴニストであるHGF/NK4を用いた遺伝子治療の可能性を検討した.HGF/NK4を細胞に導入する方法として直接導入法とアデノウイルスベクターAdCMV.NK4を用いる方法を比較し、以下に示すように、アデノウイルス感染がNK4の産生効率が良く、ヌードマウスの胆道癌転移を抑制することを明らかにした.モデルには(1)ヌードマウスの腹膜播種転移モデルと(2)皮下接種モデルを用い、癌転移の発生と腫瘍の増大を指標にウイルスの効果を判定した.(1)ヌードマウスを開腹して腹壁に貫通創を作成し皮膚を縫合閉鎖したあとで胆道癌細胞GB-d1を腹腔内に注入すると、創部に一致して癌の転移結節が形成される.このマウスに精製したAdCMVNK4のmoiを変えて腹腔内に投与した.2週間後、コントロールに用いたウイルスAdCMVLacZに比べてmoiが100-200で癌結節の成長が著明に抑制された.ウイルス投与後の腹水中のNK4量を測定したが、発現量は少なく最大1ng/ml程度しか得られなかった.そこでIn vitroでの効果を確認するため腹膜中皮細胞を採取培養してウイルスを感染させた.癌細胞と中皮細胞ともに効率よく感染し培養上清に数100ng/mlのNK4産生が認められ、この上清はHGFにより誘導されるGB-d1細胞の運動能や浸潤性をgel invasion assayで著明に阻害した.(2)皮下結節モデルを作成して、腹腔内にウイルスを注入感染し、癌の発育を経時的に測定した.AdCM VNK4の腹腔内への注入によって癌の発育に大きな影響はなく増殖阻止効果はなかった.腹腔内に投与されたAdCMVNK4ウイルスは癌細胞とともに腹膜中皮細胞に感染して腹水中にNK4を分泌して腹壁への腫瘍の転移発育を阻害したものと思われた.アデノウイルス自体の問題点はあるが、遺伝子導入によるNK4産生の誘導は局所的には効果があると考えられる.膵胆道癌は消化器癌の中でも予後の悪い癌であるが、その理由の一つとして浸潤や転移が制御できないことにある.我々はこれまで、ヒト胆道癌細胞株を用いて肝細胞増殖因子(HGF)がその浸潤転移を著明に誘導することを明らかにしてきたが、本研究ではHGFのアンタゴニストであるHGF/NK4を用いた遺伝子治療の可能性を検討した.HGF/NK4を細胞に導入する方法として直接導入法とアデノウイルスベクターAdCMV.NK4を用いる方法を比較し、以下に示すように、アデノウイルス感染がNK4の産生効率が良く、ヌードマウスの胆道癌転移を抑制することを明らかにした.モデルには(1)ヌードマウスの腹膜播種転移モデルと(2)皮下接種モデルを用い、癌転移の発生と腫瘍の増大を指標にウイルスの効果を判定した.(1)ヌードマウスを開腹して腹壁に貫通創を作成し皮膚を縫合閉鎖したあとで胆道癌細胞GB-d1を腹腔内に注入すると、創部に一致して癌の転移結節が形成される.このマウスに精製したAdCMVNK4のmoiを変えて腹腔内に投与した.2週間後、コントロールに用いたウイルスAdCMVLacZに比べてmoiが100-200で癌結節の成長が著明に抑制された.ウイルス投与後の腹水中のNK4量を測定したが、発現量は少なく最大1ng/ml程度しか得られなかった.そこでIn vitroでの効果を確認するため腹膜中皮細胞を採取培養してウイルスを感染させた.癌細胞と中皮細胞ともに効率よく感染し培養上清に数100ng/mlのNK4産生が認められ、この上清はHGFにより誘導されるGB-d1細胞の運動能や浸潤性をgel invasion assayで著明に阻害した.(2)皮下結節モデルを作成して、腹腔内にウイルスを注入感染し、癌の発育を経時的に測定した.AdCM VNK4の腹腔内への注入によって癌の発育に大きな影響はなく増殖阻止効果はなかった.腹腔内に投与されたAdCMVNK4ウイルスは癌細胞とともに腹膜中皮細胞に感染して腹水中にNK4を分泌して腹壁への腫瘍の転移発育を阻害したものと思われた.アデノウイルス自体の問題点はあるが、遺伝子導入によるNK4産生の誘導は局所的には効果があると考えられる.平成12年度は、予後の悪い胆道癌や膵癌の治療法開発を目的に、その癌進展を誘導している肝細胞増殖因子(HGF)を標的にした以下の基礎研究を行った.我々の開発したHGFのアンタゴニスト(HGF/NK4)を培養癌細胞もしくは癌周囲の正常組織由来の培養細胞に遺伝子導入して、その発現と癌浸潤阻止効果を測定した.

まず主に我々が樹立した胆道癌細胞株(GB-d1,GB-h3,FU-GBC-1、FU-GBC-2、CC-t6、HU-CCT-1)を用いて、HGF/NK4発現プラスミドをelectroporation法で導入して選択培地で発現株を選択した.得られた細胞亜株にはベクターが導入されていたが培地へのNK4発現量は極めて少なく、癌の浸潤を阻止できなかった.発現プロモーターなどの活性が適切でない可能性があった.正常のヒト中皮細胞への遺伝子導入は細胞の増殖率が悪いため導入細胞の選択は成功しなかった.そこでstableな遺伝子発現株の作製に代え、遺伝子発現が高く蛋白の産生効率の良いウイルス感染法を試みた.HGF/NK4遺伝子を組み込んだアデノウィルスAdCMV.NK4(東北大学貫和教授より供与)を上記癌細胞や中皮細胞に感染させ培地中のNK4の発現を測定した.GB-d1細胞の感染では遺伝子導入時に比べ数100倍のNK4発現量を2-3週間持続し、マトリゲル浸潤法で測定した癌の浸潤は阻止された.正常中皮細胞への感染では癌細胞に比べNK4発現量が少なかったが、細胞毒性は少なく次年度の動物実験が可能と考えられた.乎成13年度は12年度の成果をうけ、HGFの働きを阻害するantagonistであるHGF/NK4をアデノウイルスに組み込んだウイルスベクター(AdCMVNK4)を用いて、胆道癌GB-d1転移モデルでの治療実験を行った.モデルとして(1)ヌードマウスの腹膜播種転移モデルと(2)皮下接種モデルを用い、癌転移の発生と腫瘍の増大を指標にウイルスの効果を判定した.<結果>1.ヌードマウスを開腹して腹壁に貫通創を作成し縫合閉鎖したあとで胆道癌細胞GB-d1を腹腔内に注入すると、創部に一致して癌の転移結節が形成された.この腹膜播種転移モデルマウスにアデノウイルスを以下のように投与した.精製したAdCMVNK4のmoiを変えて腹腔内に投与し、2週間後観察すると、コントロールに用いたウイルスAdCMVLacZに比べてmoiが100-200の場合に癌結節の成長が強く抑制された.ウイルスの腹腔内投与時の腹水中のNK4産生量を測定したが、発現量は少なく最大1ng/ml程度が得られた.2.腹腔内でのNK4の産生の場を検討するため腹水や大網から腹膜中皮細胞を採取培養してウイルスを感染させた.中皮細胞培養上清中にNK4の産生が認められ、この上清はgel migration assayでのHGFにより誘導されるGB-d1細胞の運動能や浸潤性を阻害した.3.皮下結節モデルを作成して、腹腔内にウイルスを注入感染し、癌の発育を経時的に測定した.AdCMVNK4の腹腔内への注入によって癌の発育に大きな影響はなく増殖阻止効果はなかった.血清中のNK4の産生は測定限界以下であった.<まとめ>腹腔内に投与されたAdCMVNK4ウイルスは腹膜中皮細胞に感染して腹水中にNK4を分泌して腹壁への腫瘍の転移発育を阻害したものと思われた.
慢性期脳障害における回復機序の脳機能モニタリングによる解明と治療への応用

脳血管障害(CVD)慢性期の脳機能の回復機序を検証するために,CVD慢性期症例のリハビリテーションによる臨床経過と脳波,脳循環動態の関連を縦断的に検討した.脳波は脳波計SYNAFIT 2514(NEC)で症例30例(初診時平均年齢61.2歳,初回検査時平均年齢は62.8歳)で初診かち平均52.6ヵ月の経過中に平均3.9回測定した.脳循環動態は近赤外分光法near-infrared spectroscopy(NIRS)法で光トポグラフィ(Hitachi, ETG-100)を用いて19例(初診時平均年齢57.5歳,検査時平均年齢59.1歳,複数回検査は17例)で検討した.脳循環の検査課題として体位変換(臥床-立位-坐位),記憶課題(三宅式記銘力検査の有関係,無関係の各5項目),物品名の呼称・想起課題(5物品)を用いた.計測は両側頭・頭頂部でtotal-Hb, oxy-Hb, deoxy-Hbを検討した.脳波の測定初期には主に徐波成分が出現し全例で病巣側と一致したが,その分布は広範囲で健常側にも及んだ.経過とともに健常側の除波成分は減少傾向を示し,α帯の出現を認め,社会復帰との関連が示唆された.P300のマッピングではP300の左右差が明らかとなった.記銘力検査の有関係課題で.total-Hbレベルは増加した.無関係課題では,正解率とは無関係の増加例もあった.呼称・想起課題では呼称でtotal-Hbレベルは増加した.以上,CVD慢性期にも脳波は改善した,脳循環動態の変化は課題により個々に相違がみられ,脳循環をより有効に増加させる課題が個々で異なることが推測された.脳機能の回復には脳の健常側の賦活が必要である.リハビリテーションの課題によって脳循環の病変側と健常側の両側の血流を増加させるため,課題を工夫したきめ細かいプログラムの作成が必要である.脳血管障害(CVD)慢性期の脳機能の回復機序を検証するために,CVD慢性期症例のリハビリテーションによる臨床経過と脳波,脳循環動態の関連を縦断的に検討した.脳波は脳波計SYNAFIT 2514(NEC)で症例30例(初診時平均年齢61.2歳,初回検査時平均年齢は62.8歳)で初診かち平均52.6ヵ月の経過中に平均3.9回測定した.脳循環動態は近赤外分光法near-infrared spectroscopy(NIRS)法で光トポグラフィ(Hitachi, ETG-100)を用いて19例(初診時平均年齢57.5歳,検査時平均年齢59.1歳,複数回検査は17例)で検討した.脳循環の検査課題として体位変換(臥床-立位-坐位),記憶課題(三宅式記銘力検査の有関係,無関係の各5項目),物品名の呼称・想起課題(5物品)を用いた.計測は両側頭・頭頂部でtotal-Hb, oxy-Hb, deoxy-Hbを検討した.脳波の測定初期には主に徐波成分が出現し全例で病巣側と一致したが,その分布は広範囲で健常側にも及んだ.経過とともに健常側の除波成分は減少傾向を示し,α帯の出現を認め,社会復帰との関連が示唆された.P300のマッピングではP300の左右差が明らかとなった.記銘力検査の有関係課題で.total-Hbレベルは増加した.無関係課題では,正解率とは無関係の増加例もあった.呼称・想起課題では呼称でtotal-Hbレベルは増加した.以上,CVD慢性期にも脳波は改善した,脳循環動態の変化は課題により個々に相違がみられ,脳循環をより有効に増加させる課題が個々で異なることが推測された.脳機能の回復には脳の健常側の賦活が必要である.リハビリテーションの課題によって脳循環の病変側と健常側の両側の血流を増加させるため,課題を工夫したきめ細かいプログラムの作成が必要である.脳血管障害などによる高次脳機能障害や片麻痺などの連動障害は発症数年を経過した慢性期でも,積極的なリハビリテーションの介入によって,臨床的には改善が認められる.しかし,慢性期脳機能が回復されていく過程の病態機序はいまだ明らかではない.我々は脳機能障害を有する症例において臨床的に脳機能障害の修復過程の機序を検討し,治療への応用を試みる.広島県立保健福祉大学附属診療センターならびに関連施設において脳障害の病因と病変部位が明らかな症例に十分なインフオームドコンセントを行った後に,専門医ならびにリハビリテーション専門医療者による詳細な臨床神経学的評価,高次脳機能ならびに運動機能を評価した.MRIによる画像学的な障害部位とP300・脳波マッピングならびに光トポグラフィ(日立)による脳循環動態との関連について検討をした.今回,臨床検査のための脳波の測定はNEC社製デジタル脳波計EE2514を用い,取り込まれたデータは今回購入したEPLYZER II, ATAMAP IIを用いてマッピング解析を行った.認知障害の生理学的評価には事象関連電位P300を利用した.今年度の研究の一端は平成16年5月に日本神経学会において発表する予定である.演題は「慢性期脳血管障害における記憶課題の脳循環動態への影響-光トポグラフィでの検討-」である.

改変三宅式記名力検査や語想起を使用した記憶課題よって両側頭,頭頂部のoxy-Hb,total-Hbレベルは変化したが,個々の症例においてその循環動態の変化に相違がみられた,今後個々の症例において,より有効なリハビリ手法の選択が可能となることが示唆された.今後も症例を蓄積し,脳波マッピングで得られた徐波の継時的変化との関連について総合的に比較検討をすすめていく予定である。脳血管障害における高次脳機能障害や運動障害は慢性期であっても積極的なリハビリテーションの介入によって,臨床的には改善が認められる.実際には慢性期に積極的なリハビリテーションを継続することは様々な理由により困難となっている.慢性期脳機能が回復されていく過程の病態機序明らかではないこともその理由にあげられると考える.我々は脳機能障害を有する慢性期症例において臨床的に脳機能障害の修復過程の機序を検討し,治療への応用を試みる.広島県立保健福祉大学附属診療センターならびに関連施設において脳機能障害の病因と病変部位が明らかな症例に十分なインフォームドコンセントを行った後に,専門医ならびにリハビリテーション専門医療者による詳細な臨床神経学的評価,高次脳機能ならびに運動機能を評価した.診断に必要なMRIによる画像学的な障害部位確定と,脳波マッピング,ならびに光トポグラフィ(日立),SPECTによる脳循環動態との関連についての検討を行った.認知障害の生理学的評価には事象関連電位P300により検討している.H16年5月には第45回日本神経学会総会において「中枢神経患者における光トポグラフィによる脳循環動態の検討」,「慢性期脳血管障害における記憶課題の脳循環動態への影響-光トポグラフィでの検討-」について発表したが,今年度の研究の一端はH17年5月の第46回日本神経学会総会において発表する予定である.演題は「脳血管障害慢性期の脳波周波数帯域別マッピングの経過と臨床像の比較検討」である.今後も症例を蓄積し,脳波マッピングで得られた徐波の継時的変化と脳循環動態と臨床経過との関連について総合的に比較検討をすすめていく予定である.脳血管障害(CVD)による高次脳機能障害や片麻痺などの運動障害は発症後数年を経過した慢性期であっても,積極的なリハビリテーションの介入により,臨床的な改善が認められる.しかし,慢性期の脳機能障害が回復されていく機序がいまだ明らかになっていないために,慢性期リハビリテーションは十分な評価がなされていない.我々は脳機能障害の回復過程の機序を臨床的に検討し治療への応用を試みた.今回研究成果を総括しその一端は平成17年5月の第46回日本神経学会総会,11月の第6回広島保健福祉学会において発表した.演題名は各々「脳血管障害慢性期の脳波周波数帯域別マッピングの経過と臨床像の比較検討」「脳血管障害慢性期における脳機能回復の検証」である.その要旨は以下のとおりである.インフォームドコンセントを得たCVD慢性期症例で脳波と脳循環動態を検索し臨床経過との関係を検討した.その内複数回の脳波を検討したのは28例(初回平均年齢62歳)で,平均2.3年の経過中に平均3.4回測定した.脳波の含有率マッピングでは測定初期には主に徐波成分が出現し全例で画像検査による病巣側と一致したが,その分布は広範囲で健常側にも及んだ.経過とともに健常側の除波成分は減少傾向を示し,α帯の出現を認め,脳波の改善と社会復帰との関連が示唆された.脳循環動態はNIRS法で光トポグラフィ(Hitachi)で17例(平均年齢59歳)で検討した.
免疫応答パスウェイによるAβ貪食制御機構の解明

アルツハイマー病(AD)に特徴的な老人斑はamyloid βpeptide(Aβ)を主要構成成分とする。孤発性ADではAβクリアランスの低下が報告されていることから、クリアランス機構の解明は重要である。本研究ではクリアランス機構の中でもAβ取り込み過程に着目し、CRISPR/Cas9を用いたゲノムワイドスクリーニングにより新規関連遺伝子を探索した。スクリーニング系を構築し、Aβ取り込みに関わるいくつかの候補遺伝子および候補細胞機能を見出した。また、ADリスク因子がAβ取り込み制御を介してAD病態形成に寄与する可能性を示した。以上の結果からAβクリアランス機構の一端を解明できたと考えられる。アミロイドβペプチド(Aβ)が脳内に蓄積することがアルツハイマー病(AD)の発症原因として考えられているため、脳内におけるAβ量制御メカニズムの解析は重要である。脳内Aβ量は産生とクリアランスの2つの機構により規定されるが、特にAβクリアランスは孤発性AD患者において破綻していることが報告されていることから、その詳細な分子機構の解明は重要と考えられる。本研究ではクリアランス機構の中でもAβ貪食(取り込み)に着目して、この機構に関わる新規遺伝子の探索を行った。すでに1stスクリーニングを終了しており、昨年度はさらにスクリーニングを進めると同時に、さらなる解析にむけ準備を進めた。Aβ取り込みに対する個々の遺伝子の効果を評価するために、1stスクリーニングの結果に基づいて遺伝子を48種ピックアップした。また1stスクリーニング結果に基づくパスウェイ解析から、免疫応答関連因子とCa2+シグナル関連因子の関与の可能性が示唆されたことから、候補として挙がったそれぞれの関連因子についても複数種ピックアップした。解析方法としては、1stスクリーニング同様、ピックアップした個々の遺伝子をCRISPR/Cas9システムによりゲノム編集しノックアウト細胞集団を得たのち、蛍光ラベルされたAβの取り込みをFACSによって評価した。得られた結果を基に、さらなる遺伝子の絞り込みと効果のバリデーションを行っている。さらに将来的なin vivo解析を見据え、マウス脳内におけるゲノム編集について条件検討を行った。Cas9ノックインマウス脳内にレンチウイルスによってgRNAを発現させたところ、免疫組織染色および生化学的解析によって目的遺伝子がノックアウトされていることを確認できた。得られた候補遺伝子の効果をin vivoで解析する実験系を確立できた。最終的な遺伝子の同定にはまだ至っていないが、適宜スクリーニングを進め、候補遺伝子の絞り込みを行っている。またin vivoでの効果の検証にむけて準備も進めている。今後は、遺伝子の同定を最優先にさらなる実験が必要であると考えている。Aβ貪食におけるスクリーニング結果をうけ、研究計画においては、候補遺伝子のバリデーションとAβ受容体分子の同定、免疫応答関連因子やCaシグナルを始めとしたその他パスウェイの関連因子とAβ貪食機構の関連についての解析を考えていた。候補遺伝子のバリデーションとAβ受容体分子の同定について検討を行ったところ、これらの候補遺伝子の中でAβ特異的貪食に関わる受容体分子の同定に至ることはできなかった。膜タンパク質群からの受容体候補分子の同定に至らなかったのは、スクリーニングにおいてAβ特異的であることを指標に検出してきたためであると考えており、Aβ以外にもより広範なターゲットリガンドを持つ受容体がAβ貪食に強く関与している可能性が考えられる。一方、スクリーニングを基にしたパスウェイ解析からは免疫応答を始めとした遺伝子群が、インタラクトーム解析からは既知のADリスク因子の一部が候補として挙がってきた。これらの因子がAβ貪食を変化させるメカニズムの一つとして、上記のような広範なターゲットを持つ故にスクリーニングでは有意に検出できなかったAβ受容体との相互作用が考えられることから、そのような受容体の一つとして既知のLDL受容体ファミリーに属するLDL-related protein 1(LRP1)に着目し、再度解析を行った。これは特に、インタラクトーム/パスウェイ解析からではそれらが正負どちらに制御しているかの情報が得られないことから、改めて個別に評価しなければならないことによる。その結果、ADリスク因子の一つであるPICALMがLRP1依存的なAβ取り込みを制御していることが明らかとなった。これはエンドサイトーシス関連因子がパスウェイ解析から挙がっていることにも合致する。また、ADリスク因子やその細胞機能がAD病理にもたらす影響について新たな知見を明らかにしたといえる。前年度の結果を踏まえた上で、本年度はスクリーニングをさらに進め最終的にAβ取り込みに関与する新規分子を同定する。またこの新規分子に対し、発現プロファイル(脳内での発現、細胞種による発現量の違い、ADモデルマウスを用いてAD pathologyとの関連など)を検討する。またin vivoにおける新規分子の効果を検討するために、昨年度確立した実験系を用いCas9ノックインマウス脳において目的遺伝子のゲノム編集を行い、Aβ量における変化を検討する。

Aβ量の定量に関しては、脳を生化学的に可溶化した画分におけるAβ量測定を行うほか、申請者がすでに実験系を確立しているマイクロダイアリシス法により脳間質液を採取し脳間質液中のAβ量も定量する。さらに詳細なAβ取り込み分子メカニズムを明らかにするために、様々な変異体を作成して培養細胞に発現させ、同定した分子のどのドメイン、あるいはどの機能がAβ取り込みに関与しているのかを明らかにする。パスウェイ解析の結果から得られた免疫応答パスウェイとCa2+シグナルパスウェイの関与に関しては、まず免疫応答を誘発する薬剤による介入実験を行い確かめる。またAβ取り込みをライブイメージングするとともに、同時にCa2+のイメージングも行うことで、細胞内Ca2+量の変動との関連を明らかにする。さらに、前述の最終的に同定されるAβ取り込み関連分子との関係性についても明らかにする。医歯薬学
ICAM-1を標的とした難治性卵巣癌の虚血環境標的治療法の開発

低酸素環境と低血清環境が共存する虚血環境下ICAM1タンパク質は卵巣明細胞癌(CCC)細胞において劇的に発現誘導を受ける。ICAM1が虚血環境下においてアポトーシスを抑制し、腫瘍の増殖を促進することを明らかにした。さらに血清中の長鎖脂肪酸の欠乏がICAM1遺伝子発現の要因であることを突きとめた。さらに網羅的解析を行ない、CCC細胞においてICAM1発現依存的に発現誘導される遺伝子群やフィラグリン等のICAM1発現依存的にリン酸化を受けるタンパク質群を見出した。実際ICAM1は卵巣癌組織で高発現しており、これらタンパク質群がICAM-1の抗アポトーシス機能に重要な役割を担っている可能性がある。多くの癌組織は血管形成不足により慢性的に低酸素環境に暴露されているが、癌細胞はこの劣悪な環境に適応するメカニズムを有している。これまでに血管内皮増殖因子(VEGF)の分子標的薬等、低酸素環境応答分子標的薬が開発、臨床適用されているが、その有効性や副作用に関して問題がある。そこで申請者は癌細胞の低酸素環境適応メカニズムのさらに詳細な理解が有効な環境標的治療法の創製に不可欠と考えた。本計画は申請者がこれまでに見出した"虚血性環境下における転写因子Sp1依存的ICAM1遺伝子発現誘導"とその産物ICAM-1タンパク質による腫瘍増殖促進の詳細なメカニズム解明を目的としている。昨年度は虚血性環境下、卵巣明細胞癌細胞においてICAM-1依存的に発現が増強される遺伝子群をcDNAマイクロアレイ解析により検討した。具体的にはOVISE細胞にICAM-1および陰性コントロールのshRNAをトランスフェクションし、樹立た細胞株について虚血性環境下および正常酸素濃度下培養し、調製したtotal RNAを用いてアレイ解析を行なった。その結果、ICAM-1の細胞生存能増強に関与する可能性がある遺伝子群を見出した。また、虚血性環境下における相乗的遺伝子発現誘導に関与する血清因子について検討を行ない、血清中の長鎖脂肪酸とアルブミンの複合体が除去されると低酸素下ICAM1等の遺伝子発現が相乗的に増強されることを見出した。またヒト外科手術検体を用いた免疫染色により卵巣明細胞腫瘍組織のネクローシス近傍に強度のICAM1発現を見出した。昨年度は明細胞卵巣がん(CCC)培養細胞を用いて(1)cDNAマイクロアレイ解析を行ない、虚血環境下ICAM-1発現と関連して発現変化、活性変化を受ける遺伝子群を同定した。また、低酸素下、その欠乏により相乗的ICAM-1発現を誘発する血清因子を同定(長鎖脂肪酸)に成功した。当初(1)の結果、すなわち虚血環境において変動する細胞内の情報伝達メカニズムを指標に探索する予定であったが、他の実験結果より予想外に早くこの因子を特定することが出来、すでに論文報告した。本年度は実際のヒト腫瘍組織で、虚血様環境におけるICAM-1発現が反映され、臨床データと相関するか検討するためにICAM-1免疫染色を行った。実験に用いたヒト卵巣癌組織アレイは当院の神奈川県立臨床研究・情報機構、腫瘍組織センターにて蓄積され、臨床情報が明らかな外科手術検体を用いて作成され、以下組織型の検体(しょう液性癌53例(化学療法無)、明細胞癌50例、類内膜癌22例、粘液性癌12例、他組織型12例)より構成されている。ICAM1特異的抗体による染色をすでに終えており、結果の解析の段階にある。また、現在プロテオーム解析により虚血環境下CCC細胞においてICAM-1発現依存的に活性化(セリン、スレオニン、チロシン残基のリン酸化)を受けるタンパク質群を解析中である。免疫沈降によるICAM1と相互作用するタンパク質の同定についてはは現時点で成功していない。CCC細胞を用いたICAM1と相互作用するタンパク質の解析について予定の通り進行していない。理由はICAM1の共免疫沈降実験において適切な実験条件(抗体)等を確立出来ていないためである。ゆえにICAM1と相互作用するタンパク質に関しては現時点で未確認あるが、下記のリン酸化タンパク質の解析結果を受けて方針を変更することも視野に入れている。卵巣がん組織アレイを用いたICAM1の免疫染色の結果はすでに得られており、今後染色強度をスコア化し、臨床データとの相関を検討予定である。また、ICAM1発現に伴い、活性化(リン酸化)を受けるタンパク質の網羅的(プロテオーム解析については現在進行中であり、ほぼ予定した進行状況である。我々は、これまでにcDNAマイクロアレイ解析を行ない、低酸素環境と低血清環境が共存する虚血環境下Inter Cellular Adhesion Molecule-1 (ICAM1)をコードするICAM1遺伝子が卵巣明細胞癌(CCC)細胞において劇的に発現誘導を受けることを見出した。その後の研究によりICAM1が虚血環境下においてアポトーシスを抑制し、CCC細胞の生存を増強させることや、ICAM1がCCC腫瘍の増殖を促進することを明らかにしている。この癌進展促進メカニズムを解明するためにさらにcDNAマイクロアレイ解析を行ない、虚血環境下CCC細胞中においてICAM1発現依存的に発現が増加している遺伝子群を見出した。また虚血環境下においてICAM1遺伝子発現を誘導する血清因子についても探索を行ない、アルブミンと結合して血清中に可溶化して存在する長鎖脂肪酸(オレイン酸等)の欠乏がその主原因であることを突きとめている。本年度はさらにICAM1発現と関連して変化する細胞内シグナルメカニズムを解明するために質量分析法により網羅的リン酸化ペプチド解析を行なった。

具体的にはCCC細胞株であるOVISEの非特異的siRNA発現細胞とICAM-1ノックダウン細胞について虚血環境下培養し、その細胞溶解液について液体クロマトグラフィー質量分析法によりICAM-1依存的にリン酸化を受けるタンパク質群を探索した。その結果、興味深いことにフィラグリン等の表皮形成に重要な役割を担うタンパク質がICAM1依存的にリン酸化を受ける可能性が見出された。フィラグリンの脱リン酸化は表皮の形成過程において顆粒層細胞が角化細胞に変化する際のアポトーシス誘導における重要な事象である。従って細胞中のICAM-1依存的なフィラグリンのリン酸化がCCC細胞の抗アポトーシス機能に重要な役割を担っている可能性がある。低酸素環境と低血清環境が共存する虚血環境下ICAM1タンパク質は卵巣明細胞癌(CCC)細胞において劇的に発現誘導を受ける。ICAM1が虚血環境下においてアポトーシスを抑制し、腫瘍の増殖を促進することを明らかにした。さらに血清中の長鎖脂肪酸の欠乏がICAM1遺伝子発現の要因であることを突きとめた。さらに網羅的解析を行ない、CCC細胞においてICAM1発現依存的に発現誘導される遺伝子群やフィラグリン等のICAM1発現依存的にリン酸化を受けるタンパク質群を見出した。実際ICAM1は卵巣癌組織で高発現しており、これらタンパク質群がICAM-1の抗アポトーシス機能に重要な役割を担っている可能性がある。おおむね申請書に記載した当該年度の研究計画どうりに研究が進行しているため。一部の予定した研究計画については未遂行である。卵巣がん組織アレイを用いたICAM1の免疫染色の結果より染色強度をスコア化し、臨床データとの相関を決定する。また、ICAM1発現に伴い、活性化(リン酸化)を受けるプロテオーム解析を完了し、リン酸化誘導タンパク質群を抽出する。さらにこれらについてパスウェイ解析、分子間相互作用ネットワークを解析するなどしてICAM-1による細胞生存能増強に重要な細胞内メカニズムを解明する。ICAM1と相互作用するタンパク質に関してはリン酸化タンパク質の解析結果を受けて当初の方針を変更して研究を遂行することも視野に入れている。最後に一連の実験結果を総括し、論文発表に向けた準備を進める。分子生物学未遂行計画については検討を行なう。今後は当院外科手術検体を用いた組織アレイを用いて免疫染色により臨床データとICAM1発現との関連を検討する。当初予定の研究実行上の問題点が生じたことによる計画遂行遅延のため、当該助成金が生じたと考える。次年度は翌年分として請求した助成金を有効活用し、該当する研究計画を含め研究計画全体の遂行を完了出来るよう努力する。予定した研究計画の一部が未遂行等の理由。主にプロテオーム解析、免疫沈降実験によるICAM-1結合タンパク質の同定等の実験に必要な消耗品購入に使用する。