hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マウスゲノム上に見つけた新しい領域CSCTの役割

ゲノム配列が解読された現在でも、機能が明らかになっていない遺伝子や未知の配列が多く存在している。我々は、遺伝子トラップ法により得られた配列がマウスゲノム上に反復する領域(CSCT2,4,12,13と呼ぶ)を発見した。さらに、CSCT2とCSCT4には転写抑制に働くKRAB-ZFP遺伝子が集積していることや、それぞれのCSCT内の遺伝子の発現に共通性が見られるといった特徴を見出し、CSCT2とCSCT4が何らかの意味をもつ領域であることが示唆された。本研究では、ゲノム編集によりCSCT2とCSCT4を除去したマウスを作製し、表現型を解析することにより、CSCTの機能を探索する。
核酸立体構造の選択的修飾による遺伝子調節技術の開発

核酸立体構造のひとつグアニン四重鎖(G4)は、その配列モチーフが染色体末端のテロメア、遺伝子プロモーター、mRNAの非翻訳領域に存在し、細胞寿命、転写、翻訳に関わることが示唆されている。しかし、個々のG4を特異的に修飾する方法や選択的に結合するリガンドがなく、G4の生物学的な機能解明が進んでいない。本研究では標的G4を精密に認識し、光照射により可逆的に共有結合を生成する「G4光クロスリンク試薬」を創製する。立体構造が明らかなbcl-2プロモーターG4の選択的捕捉をベンチマークに設定しin silicoスクリーニングによる分子設計を指針として候補化合物の合成を行う。
脳細胞ミトコンドリア呼吸に対するプロスタグランジンの作用機構の解明

脳虚血後などに、リン脂質よりアラキドン酸が切り出され、プロスタグランジン(PGと略す)などのアラキドン酸代謝物が激増することが知られている。このような病的状態の際に、PGなどがどのような役割を担っているかを調べることが、本研究の目的である。研究の初年度は、PGD_2、PGE_2、PGF_<2α>が、脳局所のグルコース利用能を抑制する効果を見い出したので、本昭和63年度は、直接に、エネルギー代謝の源であるミトコンドリア呼吸系に対するPG類の効果を検討した。即ち、脳を低温室で取り出し、直ちにホモジェネートを作って、ミトコンドリアを単離し、一方で、分光光学的方法によりミトコンドリアのチトクロム電子伝達系の酸化還元を、他方で、酸素電極により、State 3.State 4の呼吸速度、呼吸比を測定した。アラキドン酸は、脂肪酸のうちでも特に脱共役作用が強く、10μMの濃度で、双方の測定に大きな効果を与えたが、PG類や他のアラキドン酸代謝物は、この2つの系で、どちらにも有意な作用を示さなかった。インドメサシンなどで、ミトコンドリア調整中の内在性PGを抑えても、与えたPGの効果を有意に見ることはできなかった。現在、チトクロムオキシダーゼに対するPG類の直接効果を検討している。また、糖輸送系や解糖系酵素に対するPG類の効果についても検討する必要が生じてきた。更に、アラキドン酸自身のミトコンドリア呼吸素に対する効果の分子機構も非常に興味深く、研究を進めている。浮遊ミトコンドリアを用いて,分光学的にチトクロム類の差スペクトルを見ることによって,プロスタグランジン類緑体の添加効果を調べたが,有意な変化を見ることができなかった.これは,ミトコンドリア調整時に,リン脂質の急速な分解が起こり,フォスフォリパーゼの働きにより脂肪酸が遊離して,その結果,チトクロム電子伝達系が脱共役状態に陥ったか,あるいは,脂肪酸遊離の結果プロスタグランジンが産生されて,既にその効果を及ぼしてしまったのか,という2つの原因が考えられる.従って,現在,ミトコンドリア調製時の温度条件を変えたり,調製時にフォスフォリパーゼ・プロスタグランジン合成酵素の阻害剤を用いることにより,プロスタグランジン類の効果を再検討している.また一方で, ^3H標識デオキシグルコースを用いて,脳のエネルギー代謝,即ち,脳細胞にミトコンドリア呼吸に対するプロスタグランジンの効果を検討した.初めに,麻酔下及び覚醒状態のラットの脳の局所糖利用能をソコロフの方法で測定し,プロスタグランジンD_2, E_2, F_<2α>をそれぞれ静脈内に持続注入したが,脳内への到達量が少ないためかコントロールと比べて有意な糖利用脳の変化が得られなかった.そこで,無麻酔・半拘束状態のラット脳に留置カニューレを埋め込み,脳室内に各プロスタグランジンを一定時間注入し,脳局所糖利用能を調べたところ,大脳皮質を中心に2割程度の糖利用能の低下を示す部位があり,プロスタグランジンの鎮痙・鎮静作用の分子機構として,この細胞呼吸の変化を位置付けし得る可能性が示唆された.脳虚血後などに、リン脂質よりアラキドン酸が切り出され、プロスタグランジン(PGと略す)などのアラキドン酸代謝物が激増することが知られている。
細胞増殖因子徐放性生体内吸収材料による胸腔内充填組織誘導の研究

生体吸収性材料であるゼラチンより様々な成長因子を徐放させることに成功した。塩基性線維芽細胞成長因子(b-FGF)は酸性ゼラチンと水素結合しゼラチン吸収過程で約2週間かけて徐放される。骨形成蛋白(BMP-2)は塩基性ゼラチンに結合し約1週間除放される。FGF徐放ゼラチンマイクロスフェアー(FGF-GMS)を作成し、ウサギ胸腔内で自己組織再生を促進し呼吸器外科術後に問題となる肺切除後の死腔閉鎖を試みた。乳酸とカプロラクトンの共重合体のスポンジ状立方体(PLA-C)を自己組織の再生の足場とした。BMP-2徐放ゼラチンは板状とし、イヌ気管軟骨部分切除部位に移植し気管軟骨再生の足場とした。ウサギ左肺全摘後にPLA-C留置後FGF-GMS混濁液を撒布した。PLA-Cのみ移植群、なにも移植しない全摘群と比較したところPLA-C+FGF-GMS群では移植1ヶ月より線維芽細胞のPLA-Cのスポンジ孔内への浸潤をみとめPLA-Cの生体吸収過程を促進し自己組織である肉芽形成を促進した。移植後6ヶ月でPLA-Cは吸収された。12ヶ月で誘導された肉芽組織は再吸収された。PLA-C群では1ヶ月ではPLA-C孔内には細胞を認めず、3ヶ月後も異物巨細胞、類上皮細胞などの炎症細胞が豊富にみられPLA-C生体吸収も遅れる傾向にあった。6ヶ月でPLA-Cは痕跡を残すのみとなり12ヶ月では肉芽組織は再吸収された。全摘群では肉芽形成はみられなかった。同様に左肺上葉切除後死腔に対してもPLA-C+FGF-GMAは肉芽組織の形成を促進した。BMP徐放ゼラチンおよびFGF徐放ゼラチン板で気管軟骨再生が可能であり、BMR, FGF共徐放ゼラチン板は最も軟骨再生誘導が早くこのため気管軟骨切除部位の瘢痕収縮を予防できた。材料の作成:直径約100μmのポリ乳酸(PLA)ビーズを作成した。このPLAビーズにFGFを含浸させ徐放化した。ついでPLAとカプロラクトンの共重合体のスポンジ状立方体(PLA-カプロラクトン共重合体キューブ)を作成した。移植実験:日本白色家兎左肺を全摘し全摘モデルを作成した。実験群1は全摘モデルにPLA-カプロラクトン共重合体キューブを移植後を生理食塩水で混和したPLAビーズを撒布した。それぞれの群で1,2,3,6ヶ月後にCT撮影後に犠牲死し肉眼所見、組織学的所見を検討した。結果:全摘モデルではCT所見、肉眼所見ともに術後時間経過と共に心臓を含む縦隔が左側へ偏位し、いわゆる全摘後症候群を呈した。実験群ではその縦隔偏位は軽度であった。組織学検討では、全摘群では胸腔は全摘後症候群のため縦隔胸膜が骨性胸壁胸膜と癒着し炎症性に肥厚していた。実験群1では胸腔は保たれており縦隔胸膜が肉芽組織により力学的強度を増していることがわかった。6ヶ月でもPLA-カプロラクトン共重合体キューブは吸収されず、スポンジ状の空隙に肉芽組織の侵入を認めた。対側肺の気腫化は全摘群に比べ軽度であった。

結論:PLA-カプロラクトン共重合体キューブとPLAビーズが移植局面でFGF徐放により肉芽形成を促進し縦隔の力学的強度を増した。これによりいわゆる全摘後症候群の予防が可能なことを示した。径100μmのゼラチンビーズを作成しFGFを含浸徐放化(bFGF-GMS)した。ポリ乳酸とカプロラクトンの共重合体スポンジ状立方体(PLA-co-CL)を作成した。実験1:兎左肺を全摘し全摘モデルを作成した。全摘モデルにPLA-co-CLを移植後bFGF-GMSを撒布した。1,2,3,6、12月後にCT撮影後犠牲死し移植しなかったコントロール群とX線画像、組織学的に比較した。実験2:兎左上葉切除モデルにPLA-co-CLを移植後bFGF-GMSを撒布した。実験1:コントロール群は術後時間経過と共に全摘後症候群を呈したが実験群では縦隔偏位は軽度であった。コントロール群は炎症性にわずかに肥厚していた。実験群では胸腔は保たれており縦隔胸膜が肉芽組織により肥厚し肥厚胸膜厚は有意に厚かった。6ヶ月でもPLA-co-CLは吸収されずそのスポンジ状空隙に肉芽組織の形成を認めた。(平成15年度成果)実験2:コントロール群では上葉切除後死腔は認めなかった。胸膜肥厚は軽度であった。実験群では有意に厚い胸膜肥厚を認めた。実験1の胸膜肥厚に対しても有意差を持って厚かった。6ヶ月後もPLA-co-CLは残存し内部に肉芽組織の侵入を認めた。12ヶ月後は実験群1、2共にPLA-co-CLは吸収され認めなかった。肥厚胸膜はそれぞれ実験群で保たれていた。(平成16年度成果)PLA-co-CLとbFGF-GMS胸腔内移植により肉芽形成を促進し肺全摘においては縦隔の力学的強度を増し全摘後症候群の予防が可能なこと、肺葉切除に置いては死腔閉鎖の可能性を示唆した。
超高速・省エネ動作を目指したゲルマニウムスズ・ナノワイヤＭＯＳＦＥＴの創製

本研究得られた研究成果を以下に示す。(1)絶縁膜上Ge1-xSnx結晶の超高品質化昨年度作製した絶縁膜上Ge1-xSnxワイヤには、溶融成長時にバルクシード(750 μm厚)からのSi拡散が生じるため、Ge1-xSnxの電気物性評価には不十分であった。そこで、本年度は、Siシードを50 nmに薄膜化すること、ワイヤ長さを200 μmから1 mmに増大することで解決を試みた。その結果、薄膜シード構造を採用すれば、ワイヤ中へのSi拡散量を5割程度に削減できることが判明した。また、ワイヤ長1 mmの試料では、格子置換位置Sn組成が4%以上の領域を320 μm以上の長距離にわたって形成できること、すなわち電気物性評価に適した試料の作製に成功した。加えて、オーミック電極形成プロセスを確立し、四探針測定法による電気特性評価を行なった。Si拡散領域ではSi混入による電気伝導度の低下が、Ge1ーxSnx領域ではSn組成変調あるいは結晶性向上によると思われる電気伝導度の増加が観測された。(2)基板非加熱・高濃度ドーピング技術の応用昨年度構築した水中パルスレーザードーピング法の応用先として、高濃度n型およびp型ドーピングが必須の熱電素子を300°C以下の低温プロセスを用いて作製し、その熱電変換動作に成功した。本手法で形成したn型多結晶Ge1ーxSnxは、InP基板上にエピタキシャル成長したGe1ーxSnxと同等のSeebeck係数と電気伝導率を有することが判明した。熱電材料としての多結晶Ge1ーxSnxの優れた性能を示した重要な成果である。一方、デバイス動作時においては、金属(Al)/n型多結晶Ge1ーxSnx界面における寄生抵抗の存在により、n型多結晶Ge1ーxSnxの性能を完全に引き出すことができなかった。熱電素子においても、MOSFETと同様に寄生抵抗の抑制が重要であることを示した。当初の計画通り、電気物性評価に適した絶縁膜上Ge1-xSnx薄膜の形成に成功した。さらに、予備実験としてオーミック電極形成プロセスを確立し、電気特性評価を一部先駆けて実施した。上記と並行し、昨年度開発した基板非加熱・高濃度ドーピング技術(水中パルスレーザードーピング法)の応用例として熱電素子の作製なども進めた。これらの成果は、Spotlights論文への選出やポスター賞受賞にも結実している。最終年度は、Ge1ーxSnx領域で観測された電気伝導率の増加の理由を突き止めるべく、研究を推進する。具体的には、移動度とキャリア濃度の分離をする必要があるため、Hall効果測定を実施するとともに、その場観察により結晶成長速度との相関も明らかにする。加えて、バックゲートMOSFFETの試作を行い、トランジスタの電流ー電圧特性からオフリーク電流低減の方策を練るとともに、本研究を総括する。本研究では、既存のSi-ULSIプロセスと親和性が高い直接遷移型Ge1-xSnxを用いて、Si-ULSI融合型Ge1-xSnxナノワイヤーMOSFETを創製すると共に、Ge1-xSnx物性を系統的に理解・制御し、超高速・省エネ動作を実証することを目的としている。初年度に得られた研究成果を以下に示す。(1)基板非加熱・高濃度n型ドーピング技術の開発水中パルスレーザーアニール法を用いたドーピング技術の基礎を確立すべく、Ge1-xSnx薄膜に対してドーパント種(B,Al,Ga,In,P,As,Sb)依存性を調査した。レーザー照射後に膜中に残存しやすいドーパント(Sb,As)とそうでない場合があることを見出した。酸素のケミカルポテンシャルが低い(即ち酸化しやすい)ドーパントほど残存しにくい傾向が見られるため、本プロセスではSb、As等の酸化されにくいドーパントを選択すること、あるいは、酸素のケミカルポテンシャルがより低いアセトンを水の代わりに使用することが望ましいと結論づけられる。(2)絶縁膜上Ge1-xSnx薄膜の高品質形成SiGeミキシング誘起溶融成長法をGe1-xSnx細線に適用した場合の課題を明らかにすべく、実験を行なった。具体的には、開口部(シード領域)を有するSiN膜を形成し、その上に非晶質Ge1-xSnx膜を堆積しウエットエッチングにより細線加工した。SiO2層堆積後Ge1-xSnxの融点以上で1秒熱処理しシードから成長を誘起した。シードからの距離(d)が150 um以下ではSi拡散が生じていたこと、細線長軸方向を軸とした回転を伴っていたことなどが判明した。d>150 umでは、Sn組成傾斜したGe1-xSnx薄膜が形成されたことも判明した。シードからのSi拡散抑制に加え、Si拡散と回転成長との相関やエピタキシャル成長の可否を明確化することが今後の課題となる。当初計画の通り、水中レーザーアニール法を用いることで、基板非加熱・高濃度n型ドーピング技術の構築に成功した。本手法がp型ドーピングにも適用可能であること、n型とp型両方のドーピング技術が必要なデバイス応用例として熱電素子試作も行なった。また、SiGeミキシング誘起溶融成長法をGe1-xSnx細線に適用した場合の課題を顕在化することができた。(1)絶縁膜上Ge1-xSnx結晶の超高品質化昨年度作製した絶縁膜上Ge1-xSnx

ワイヤには、溶融成長時にバルクシード(750 μm厚)からのSi拡散が生じるため、Ge1-xSnxの電気物性評価には不十分であった。そこで、本年度は、Siシードを50 nmに薄膜化すること、ワイヤ長さを200 μmから1 mmに増大することで解決を試みた。その結果、薄膜シード構造を採用すれば、ワイヤ中へのSi拡散量を5割程度に削減できることが判明した。また、ワイヤ長1 mmの試料では、格子置換位置Sn組成が4%以上の領域を320 μm以上の長距離にわたって形成できること、すなわち電気物性評価に適した試料の作製に成功した。加えて、オーミック電極形成プロセスを確立し、四探針測定法による電気特性評価を行なった。Si拡散領域ではSi混入による電気伝導度の低下が、Ge1ーxSnx領域ではSn組成変調あるいは結晶性向上によると思われる電気伝導度の増加が観測された。(2)基板非加熱・高濃度ドーピング技術の応用昨年度構築した水中パルスレーザードーピング法の応用先として、高濃度n型およびp型ドーピングが必須の熱電素子を300°C以下の低温プロセスを用いて作製し、その熱電変換動作に成功した。本手法で形成したn型多結晶Ge1ーxSnxは、InP基板上にエピタキシャル成長したGe1ーxSnxと同等のSeebeck係数と電気伝導率を有することが判明した。熱電材料としての多結晶Ge1ーxSnxの優れた性能を示した重要な成果である。一方、デバイス動作時においては、金属(Al)/n型多結晶Ge1ーxSnx界面における寄生抵抗の存在により、n型多結晶Ge1ーxSnxの性能を完全に引き出すことができなかった。熱電素子においても、MOSFETと同様に寄生抵抗の抑制が重要であることを示した。当初の計画通り、電気物性評価に適した絶縁膜上Ge1-xSnx薄膜の形成に成功した。さらに、予備実験としてオーミック電極形成プロセスを確立し、電気特性評価を一部先駆けて実施した。上記と並行し、昨年度開発した基板非加熱・高濃度ドーピング技術(水中パルスレーザードーピング法)の応用例として熱電素子の作製なども進めた。これらの成果は、Spotlights論文への選出やポスター賞受賞にも結実している。研究実績(2)に記載した課題(シードからのSi拡散抑制に加え、Si拡散と回転成長との相関やエピタキシャル成長の可否を明確化すること)の解決に向け、結晶成長プロセスの高度化を実施する。シードからのSi拡散抑制には、Ge1-xSnx溶融時間の短時間化、Siシードの薄膜化、あるいはシードにSiを用いないことが望ましい。今後は、これらの推測を元にGe1-xSnxに適した溶融結晶成長プロセスを構築し、Ge1-xSnxの基礎的な電子物性(欠陥密度、キャリア移動度)や光学物性(バンドギャップなど)を明らかにする。最終年度は、Ge1ーxSnx領域で観測された電気伝導率の増加の理由を突き止めるべく、研究を推進する。具体的には、移動度とキャリア濃度の分離をする必要があるため、Hall効果測定を実施するとともに、その場観察により結晶成長速度との相関も明らかにする。加えて、バックゲートMOSFFETの試作を行い、トランジスタの電流ー電圧特性からオフリーク電流低減の方策を練るとともに、本研究を総括する。
住血吸虫虫卵性肉芽腫中に存在する痙攣誘発因子のアポ蛋白に関する研究

(1)痙攣誘発活性を持つリポ蛋白が住血吸虫感染マウスのみならず、感染していない通常の飼育環境で飼育されたマウス、SPF飼育された各種近交系マウス、重度免疫不全マウス、さらにはラットやウサギといった動物の各種臓器(肺、リンパ節、脾臓、大腸、小腸)、ヒトの肺、脾臓、大腸組織にも存在することが明らかとなった。これらの痙攣誘発物質は、(1)全く同じ方法で精製が可能、(2)マウスやラットに投与すると同じ症状をもたらす、(3)同じ機構を介してマウスに作用する、(4)よく似た物理化学的性状を示すことから、痙攣誘発因子が種を越えて動物組織に広く分布する物質であることが推定された。(2)痙攣誘発因子免疫ウサギ及びマウス血清は住血吸虫感染マウス由来の痙攣誘発因子の活性を抑制でき、さらには感染していないヒト及び各種動物から精製した痙攣誘発因子の活性をも抑制しうることから、これらの痙攣誘発因子には共通のエピトープをもった分子が存在し、この分子が痙攣誘発に直接関わっていることが示唆された。(3)各種動物から精製した痙攣誘発因子の構成アポ蛋白には痙攣誘発因子免疫ウサギ血清によって検出される共通のペプチド分子(分子量61KDaで等電点が7.78.0のペプチド、分子量60KDaで等電点が8.08.2のペプチド)が存在することが二次元電気泳動を用いたWBで明らかとなった。(4)痙攣誘発因子を免疫したマウスから29種類のモノクロナル抗体(MoAb)が樹立された。これらのMoAbは抗原(痙攣誘発因子、虫卵抗原、成虫抗原)に対する反応性に違いがみられたが、いずれも痙攣誘発因子の痙攣誘発活性を中和することはできなかった。以上の成績から、痙攣誘発因子が各種動物の様々な組織に広く分布する物質であること、そしてこれらの痙攣誘発因子には共通のアポ蛋白が存在し、このアポ蛋白がマウスに痙攣を誘発している可能性が推定された。(1)痙攣誘発因子は住血吸虫感染マウスだけではなく、感染していない通常の飼育環境で飼育されたマウス、SPF飼育された各種近交系マウス、重度免疫不全マウス、さらにはラットやウサギといった動物の各種臓器(肺、リンパ節、脾臓、大腸、小腸)、ヒトの肺、脾臓、大腸組織にも存在することが明らかとなった。しかも、これらの痙攣誘発因子は同じ方法による精製が可能で、密度勾配超遠心及びゲル濾過で単一バンドを示し、同様な性状を示すことが明らかとなった。(2)各種動物から精製した痙攣誘発因子をあらかじめ投与されたマウスは致死量の住血吸虫感染マウス由来痙攣誘発因子に対して抵抗性を示した。(3)痙攣誘発因子の構成アポ蛋白にはマウスIgG、IgM、IgA、IgE、住血吸虫成虫や虫卵由来の物質が含まれていることが明らかとなったが、抗マウスIgG、IgM、IgA、IgE抗体は痙攣誘発因子の活性を中和することはできなかった。これに対して、痙攣誘発因子免疫ウサギ及びマウス血清は住血吸虫感染マウス由来痙攣誘発因子の活性を抑制でき、さらには感染していない各種動物から精製した痙攣誘発因子の活性をも抑制しうることが明らかとなった。(4)各種動物から精製した痙攣誘発因子の構成アポ蛋白には痙攣誘発因子免疫ウサギ血清によって検出される共通の分子が存在することがWBを用いた解析で明らかとなった。(5)痙攣誘発因子を免疫したマウスから21種類のモノクロナル抗体(MoAb)が樹立された。

これらのMoAbは抗原(痙攣誘発因子、虫卵抗原、成虫抗原)に対する反応性に違いが認められたが、いづれも痙攣誘発因子の痙攣誘発活性を中和することはできなかった。(6)以上の成績から、痙攣誘発因子が各種動物の様々な組織に広く分布する物質であることが推定された。しかも、これらの痙攣誘発因子には共通のアポ蛋白が存在し、このアポ蛋白が同じ機構を介してマウスに痙攣を誘発している可能性が推定された。(1)痙攣誘発活性を持つリポ蛋白が住血吸虫感染マウスのみならず、感染していない通常の飼育環境で飼育されたマウス、SPF飼育された各種近交系マウス、重度免疫不全マウス、さらにはラットやウサギといった動物の各種臓器(肺、リンパ節、脾臓、大腸、小腸)、ヒトの肺、脾臓、大腸組織にも存在することが明らかとなった。これらの痙攣誘発物質は、(1)全く同じ方法で精製が可能、(2)マウスやラットに投与すると同じ症状をもたらす、(3)同じ機構を介してマウスに作用する、(4)よく似た物理化学的性状を示すことから、痙攣誘発因子が種を越えて動物組織に広く分布する物質であることが推定された。(2)痙攣誘発因子免疫ウサギ及びマウス血清は住血吸虫感染マウス由来の痙攣誘発因子の活性を抑制でき、さらには感染していないヒト及び各種動物から精製した痙攣誘発因子の活性をも抑制しうることから、これらの痙攣誘発因子には共通のエピトープをもった分子が存在し、この分子が痙攣誘発に直接関わっていることが示唆された。(3)各種動物から精製した痙攣誘発因子の構成アポ蛋白には痙攣誘発因子免疫ウサギ血清によって検出される共通のペプチド分子(分子量61KDaで等電点が7.78.0のペプチド、分子量60KDaで等電点が8.08.2のペプチド)が存在することが二次元電気泳動を用いたWBで明らかとなった。(4)痙攣誘発因子を免疫したマウスから29種類のモノクロナル抗体(MoAb)が樹立された。これらのMoAbは抗原(痙攣誘発因子、虫卵抗原、成虫抗原)に対する反応性に違いがみられたが、いずれも痙攣誘発因子の痙攣誘発活性を中和することはできなかった。以上の成績から、痙攣誘発因子が各種動物の様々な組織に広く分布する物質であること、そしてこれらの痙攣誘発因子には共通のアポ蛋白が存在し、このアポ蛋白がマウスに痙攣を誘発している可能性が推定された。
小腸及び腎尿細管上皮細胞のプロトン共役能動輸送系による薬物動態制御機構

薬物の吸収・分泌過程は、薬物生体内動態を支配する重要な因子である。我々は、細胞膜小胞系を用いて薬物輸送研究を進め、尿細管刷子縁膜のH^+/有機カチオン対向輸送(分泌)、尿細管及び小腸刷子縁膜のH^+/アミノ-β-ラクタム抗生物質共輸送(吸収)等の新知見を得た。本研究では、H^+と共役する薬物輸送系を中心にして、それらのエネルギ-共役・調節機構・薬物輸送キャリア-の構造と機能等を明確にし、イオン性薬物の吸収・分泌過程における能動輸送機構の解明を目的とした。1.尿細管刷子縁膜のH^+/有機カチオン対向輸送系:H^+勾配非存在下でtetrathylammonium(TEA)取り込みに及ぼすpHの影響を調べたところ、初期取り込みはpH7付近で最大を示し、酸性領域ではK_mの上昇、アルカリ性領域ではVmaxの低下することが明らかになった。この輸送系の活性調節には、駆動力であるH^+勾配のみならず、膜内外のpHが密接に関連しており、中性pH領域が至適であると考えられた。2.小腸刷子縁膜のH^+/β-ラクタム抗生物質共輸送:cephradine等のアミノ基とカルボキシル基を有する両性イオン型アミノ-β-ラクタム抗生物質はジペプチド輸送系を介して輸送され、これはH^+勾配を駆動力とする起電性の共輸送系であることが明らかになった。また、アミノ基を持たず2つのカルボキシル基を有する新規経口用cefiximeもジペプチド輸送系を介して輸送されることが示されたが、cephradineの場合とは至適pHが異なるなどの二種のジペプチド輸送系の存在を示唆する知見を得た。3.膜蛋白修飾試薬で処理した膜小胞系による薬物輸送:ヒスチジン残基修飾試薬、チロシン残基修飾試薬、SH基修飾試薬、カルボキシル基修飾試薬を用いて検討した結果、H^+/有機カチオン対向輸送系ではヒスチジン残基とSH基、H^+/β-ラクタム抗生物質(ジペプチド)共輸送系では、ヒスチジン残基が各々輸送活性の調節に関与していることが判明した。我々は、細胞膜小胞系を用いて薬物輸送研究を進め、尿細管刷子縁膜のH^+/有機カチオン対向輸送(分泌)、尿細管及び小腸刷子縁膜のH^+/アミノーβーラクタム抗生物質共輸送(吸収)等の新知見を得た。本研究では、H^+と共役する薬物輸送系を中心にして、それらのエネルギー共役・調節機構、薬物輸送キャリアーの構造と機能等を明確にし、イオン性薬物の吸収・分泌過程における能動輸送機構の解明を目的とした。1.尿細管刷子縁膜のH^+/有機カチオン対向輸送系:H^+勾配非存在下で刷子縁膜小胞によるtetraethylammonium(TEA)取り込みに及ぼすpHの影響を調べたところ、取り込み平衡値には差がなかったが、初期取り込みはpH7付近で最大となった。pHによる輸送活性変化は可逆的であり、酸性領域ではKmが上昇し、アルカリ性領域ではVmaxの低下することが明らかになった。

従ってこの輸送系の活性調節には、駆動力であるH^+勾配のみならず、膜内外のpHが密接に関連しており、中性pH領域が至適であると考えられた。2.小腸刷子縁膜のH^+/βーラクタム抗生物質共輸送:cephradine等のアミノ基とカルボキシル基を有する両性イオン型アミノーβーラクタム抗生物質は、ジペプチド輸送系を介して輸送され、これはH^+勾配を駆動力とする起電性の共輸送系であることが明らかになった。またアミノ基を持たず2つのカルボキシル基を有する新規経口用cefiximeもジペプチド輸送系を介して輸送されることが示されたが、cephradineの場合とは至適pHが異なるなど二種のジペプチド輸送系の存在を示唆する知見を得た。更にH^+勾配存在下での刷子縁膜小胞による取り込み速度と小腸からの吸収速度との間には極めて良好な相関性が認められた。microclimate pH(pH5.56.0)と呼ばれる小腸粘膜近傍の酸性pHは、経口用βーラクタム抗生物質吸収の駆動力として重要な役割を果たしていると考えられる。前年度に引き続き、代表的薬物としてp-アミノ馬尿酸(アニオン)、tetraethylammonium(TEA、カチオン)、アミノ-β-ラクタム抗生物質(両性イオン)等を選び、H^+と共役する薬物輸送系を中心にして、それらのエネルギ-共役・調節機構、薬物輸送キャリア-の構造と機能等について検討を加えた。1.膜蛋白修飾試薬で処理した膜小胞系による薬物輸送:(1)尿細管刷子縁膜のH^+/有機カチオン対向輸送系。H^+勾配非存在下におけるTEAの取り込みは著しいpH依存性を示し、またSH基修飾試薬PCMBSでの前処理によって顕著に阻害された。一方、ヒスチジン残基修飾試薬diethylpyrocarbonate(DEPC)で前処理した場合、TEA輸送はpH6-7で抑制されたがpH7.5では阻害されなかった。またDEPC処理によって、Vmaxが低下した。従って尿細管刷子縁膜のH^+/有機カチオン対向輸送系の活性調節には、SH基及びヒスチジン残基の関与していることが明らかとなった。(2)小腸刷子縁膜のH^+/アミノ-β-ラクタム抗生物質共輸送系(吸収)。ヒスチジン残基修飾試薬(DEPC)、カルボキシル基修飾試薬、チロシン残基修飾試薬を用いて刷子縁膜を前処理し、cephradine輸送における各残基の寄与について検討した結果、DEPCで処理することによってcephradineの輸送が特異的に阻害された。従って他のH^+共役輸送系と同様に、この輸送系においてもヒスチジン残基が輸送活性の調節に寄与しているものと考えられる。2.病態時における薬物輸送の解析:急性腎不全ラット(ウラニル処理)の腎尿細管側底膜では、有機アニオン輸送能が低下し、刷子縁膜では有機カチオン輸送能の低下することが示された。従って、腎不全時における薬物の尿細管分泌能低下の機序は、両細胞膜に局在する有機イオン輸送系の違いによって異なることが推察された。
ハイポウイルスの多機能性蛋白質ｐ２９により誘導されるレオウイルスゲノム再編成

クリ胴枯病菌(Cryphonectria parasitica)は子のう菌の一種でクリ樹を枯死させる植物病原菌である。クリ胴枯病菌は少なくとも5科のメンバーの宿主となっている。本研究では、異種ウイルス(ハイポウイルス)の蛋白質(p29)で誘発可能なレオウイルス(MyRV1)ゲノムセグメントの遺伝子再編成を多方向から解析した。今年度は上記目的のため以下の3項目を実施した(申請書に記載した実施項目3,4の実施状況については昨年度のC-7-1を参照されたい)。5p29のmiRNAへの影響糸状菌ではsiRNAは同定されているが、miRNAは未だ発見されていない。そこで、miRNAのクローニングを試みた。しかし、それらの同定には至らなかった。但し、これを相殺する成果として、アカパンカビあるいは植物でsiRNAの増幅に関与すると考えられるRNA依存RNA合成酵素遺伝子(rdr1)の破壊株を得るのに成功し、破壊株では再編成誘導が起らないことを明らかにすることに成功した。6植物ウイルス由来RNAサイレンシング抑制蛋自質の遣伝子属編成誘導能予定していた実施項目を遂行してきている。さらに、興味深い課題(下記)の発見に結びついている。上記実施項目5で述べ左ように、CHVI p29のmiRNAへの影響は不明のままである。仮にクリ胴枯病菌にmiRNAが存在する場合、それらの標的も不明である。遺伝子再編成の誘導との関連を調べる必要がある。また、ag12とdc12破壊株でのMyRV1/S4sss再編成誘導において質的に異なることが明らかとなった。すなわち、dc12破壊株で速く再編成株が誘導される。この現象を、さらに解析する必要がある。本研究では、異種ウイルス(ハイポウイルス)の蛋白質(p29)で誘発可能なレオウイルス(MyRV1)ゲノムセグメントの遺伝子再編成を多方向から解析する。今年度は上記目的のため以下の2項目を実施した。1)p29再編成促進に関与する機能領域の同定p29は少なくとも4つの機能領域が同定されている。ウイルス複製に必須のN末端領域(コドン1-24)、病徴決定領域(コドン25-72)、糖鎖付加部位(N151)、システインプロテアーゼ領域(C末端半分)。RNA結合領域、RNAサイレンシング抑制ドメインは不明である。これらの機能(領域)とレオウイルス再編成促進活性との関係を各々の機能欠損変異株(C70,C72,N151,C162)を用いて調べた。その結果、C162を除く変異株ではMyRV1再編成誘導能が欠失していた。2)p29細胞内所在様式共焦点レーザー顕微鏡観察法(間接蛍光抗体法)を用いて、野生型p29形質転換体での局在をマイコレオウイルス感染および非感染体で調べた。その結果、野生型p29は細胞質内でパッチ状の分布を示した。今年度は上記目的のため以下の2項目を実施した(申請書に記載した実施項目1,2の実施状況については昨年度のC-7-1を参照されたい)。3 p29相互作用性ウイルス因子の解析既にp29およびマイコレオウイルス全セグメントの昆虫細胞発現に成功した(Sun et al., 2006 ; Supyani et al., 2007)。p29とマイコレオウイルス蛋白質との相互作用を免疫沈降法および他の手法で調べた。その結果、S9コードのVP9がp29と相互作用することが明らかとなった。また、p29がセグメントの配列(例えば、セグメント特異的末端配列等)特異的結合親和性を示すかどうかをStrepto Tag法により調べた。しかし、期待される結果は得られなかった。4 p29応答性宿主/ウイルス遺伝子の同定および遺伝子再編への関与p29がRNAサイレンシング抑制蛋白質である。再編成誘導能とRNAサイレンシング経路とのリンクを解明するため、RNAi主要宿主成分(DCI,RDR,AGL)欠損株を作成あるいは入手した。それら変異株でMyRV1ゲノム再編成誘導を調べた結果、大変興味深いことに△dc1-2,△ag1-2でウイルス系統特異的再編成が認められた。すなわち、MyRV1/S4ssのみが△dcl-2でゲノム再編成をうけ、野生型を含む他の宿主菌系統では再編成は認められなかった。今年度は上記目的のため以下の3項目を実施した(申請書に記載した実施項目

3,4の実施状況については昨年度のC-7-1を参照されたい)。5p29のmiRNAへの影響糸状菌ではsiRNAは同定されているが、miRNAは未だ発見されていない。そこで、miRNAのクローニングを試みた。しかし、それらの同定には至らなかった。但し、これを相殺する成果として、アカパンカビあるいは植物でsiRNAの増幅に関与すると考えられるRNA依存RNA合成酵素遺伝子(rdr1)の破壊株を得るのに成功し、破壊株では再編成誘導が起らないことを明らかにすることに成功した。6植物ウイルス由来RNAサイレンシング抑制蛋自質の遣伝子属編成誘導能予定していた実施項目を遂行してきている。予定していた実施項目を遂行してきている。さらに、興味深い課題(下記)の発見に結びついている。3)p29相互作用性ウイルス因子の解析p29とマイコレオウイルス蛋白質との相互作用を免疫沈降法および他の手法で調べる。また、p29がセグメントの配列(例えば、セグメント特異的末端配列等)特異的結合親和性を示すかどうかをStrepto Tag法により調べる。4)p29応答性宿主/ウイルス遺伝子の同定および遺伝子再編への関与申請者はマイコレオウイルス感染特異的に蓄積し、しかもp29によってその蓄積が抑制される蛋白質(p22、暫定名)を同定した。現在、その配列を決定中である。他にも2次元電気泳動法により発現が誘導あるいは抑制される蛋白質をMALDI-TOF MS解析し、クリ胴枯病菌ゲノム配列情報を活用しながら同定する。そこで、miRNAのクローニングを試み、成功した場合にはp29によるそれらmiRNAへの影響を調べる。さらに、それらmiRNAの標的の同定を行い、遺伝子再編成の誘導との関連を調べる。この点については、dcl2破壊株で再編成が促進されるという興味深い現象を既に見つけている。6植物ウイルス由来RNAサイレンシング抑制蛋白質の遺伝子再編成誘導能7p29の他のレオウイルス遺伝子再編成誘導能他のレオウイルス/宿主(動物、イネ、白紋羽病菌)でp29を発現させ遺伝子再編成を誘導するかを調べる。上記実施項目5で述べ左ように、CHVI p29のmiRNAへの影響は不明のままである。仮にクリ胴枯病菌にmiRNAが存在する場合、それらの標的も不明である。遺伝子再編成の誘導との関連を調べる必要がある。また、ag12とdc12破壊株でのMyRV1/S4sss再編成誘導において質的に異なることが明らかとなった。すなわち、dc12破壊株で速く再編成株が誘導される。この現象を、さらに解析する必要がある。
ハイブリッドペトリネットによる多細胞動物形態形成の遺伝子発現制御ネットワーク表現

〈目的〉遺伝子発現調節の解明に必要不可欠である遺伝子制御ネットワークのモデル化手法やシミュレーション手法を,特に多細胞動物形態形成メカニズムを意識して,ハイブリッドペトリネットを基盤技術に用いて確立する。〈検討結果〉多細胞動物形態形成メカニズムとして,側方抑制におけるNotch情報伝達系をとりあげた。数理モデル化の研究グループでは,Notch情報伝達系の遺伝子制御ネットワークをハイブリッドペトリネットを用いてモデル化し,Deltaタンパク質について,その生成量や隣接細胞への伝達量の変化が細胞パターンに及ぼす影響を調べた。さらに,生物システムのモデル化手法を確立するため,遺伝子制御ネットワーク,代謝経路,及びシグナル伝達経路の各々について,生物学的に知られた系を取り上げ,Visual Object Net++によってこれらの系を記述し,シミュレーションを行った。ショウジョウバエ消化管の形態形成を研究しているグループでは,Notch情報伝達系のモデル化やシミュレーションのための基礎データを実験によって収集することと並行して,適確な実験計画を立案するための思考活動を助けることを目的としたシミュレータのプロトタイプを作成した。以上によって得られたモデル化手法や生物学的データ,作成したシミュレーションツールを公開するため,webサーバを立ち上げた。これらに加えて,これまでに蓄積された生物学的事実を効率よく獲得するための知的文献検索ツールを作成し,パン酵母ミトコンドリアの遺伝子ネットワークに関するMEDLINEアブストラクトをこのツールによって収集した。〈考察〉生物学者はハイブリッドペトリネットによる生物システムの記述法を自然に受け入れることから,これが数理モデル化手法として有効であることが確認できた。さらに,発生生物学の研究者自身がシミュレータのプロトタイプの作成を行ったことで,生物学者にとって使いやすいツールを開発するための基本的な方針を得ることができた。
生活習慣病におけるマクロファージの時空間多様性をもたらす作動原理の解明と医療応用

マクロファージは極めて多彩な機能を発揮する。生活習慣病と癌の基盤病態である慢性炎症では、その開始から遷延化、組織機能障害と組織リモデリングまで、すべてのプロセスで主要なエフェクター細胞として働く。一方でマクロファージは炎症の収束や組織修復にも働き、また常に組織恒常性を維持する機能も持つ。そのため、老化や病態に伴うマクロファージの機能変化は、組織恒常性やストレスへの応答を変調させ、組織機能障害をもたらすことが想定される。本研究では、マクロファージの内因的な機序(発生学的由来、老化による変化)と外因的な要因との複雑な交互作用によって決まるマクロファージ機能の多様性の制御機序を明らかにすることを目的とする。マクロファージの由来は加齢や病態によって変動し、また、微小環境も変わる。特にマクロファージは、本質的にその置かれる環境の変化にダイナミックに応答して多彩な役割を果たすことから、時空間と病態といった多様な軸から解析することが、その作動原理(制御プログラム)を解明するために必須である。この点から本研究では、時間(年齢)、空間(複数組織)、組織の状態(定常状態と疾患)を横断的に解析する。前年の解析に加え、ストレス下(心不全モデルや加齢マウス、肥満マウス)ならびにシグナルへの介入のもとで心臓、脂肪組織の組織マクロファージならびに骨髄由来マクロファージにおける、ゲノムワイド解析を行った。また、組織における細胞間相互作用を模す共培養でのトランスクリプトーム解析を行った。シングルセル解析の結果も合わせ、各軸での固有な変化をバイオインフォマティクスで検討した。また、骨髄移植により、幹・前駆細胞レベルでのエピゲノム変動の解析を行った。昨年に引き続き、RNA-seq、ChIP-seq、ATAC-seqによるゲノムワイド解析を、さらに多様な状態で行った。また、シングルセル解析の結果と合わせ、マクロファージサブタイプのさらなる同定を行い、微小環境応答についても新たな知見を得た。マクロファージの時空間・疾患エピゲノムの解析を引き続き進めるとともに、その制御機構の解析へと研究を進める。さらに、in vivoでの変化については、心不全モデルや加齢マウス、肥満マウスにおける解析を追加し、データを蓄積する。また、微小環境の作用については、心筋細胞や線維芽細胞、がん細胞等の相互作用を模したシステムを用い、遺伝子発現やエピゲノム変化のダイナミズムを明らかにするとともに、メディエータの同定を進める。また、シングルセルの解析結果から、組織マクロファージにおいてもさらにサブポピュレーションが分かれることが分かってきた。この結果に応じて、フローサイトメトリーでさらにサブタイプ毎に単離した解析を行うとともに、シングルセルレベルでのRNA-seq、ATAC-seqや小数細胞でのChIP-seq解析法を確立し、マクロファージのダイナミズムに迫る解析を行う。また、骨髄幹細胞レベルでの変化についてもさらに移植により検討する。脳、心臓、腎臓、脂肪組織、肝臓の組織マクロファージならびに骨髄由来マクロファージ、胎児肝臓由来マクロファージについて、定常状態、老化、肥満、心負荷といった状態で、ゲノムワイド解析を行った。RNA-seqによるトランスクリプトーム解析、ChIP-seqやATAC-seqによるエピゲノム解析を行った。これらの解析結果から、各組織マクロファージに固有なオープンクロマチン領域を同定するとともに、その差異をもたらすシスエレメントの解析を進めた。また、ex vivoの解析により、微小環境シグナルの同定を進めた。ATAC-seqによるオープンクロマチン領域のゲノムワイド解析法を確立し、多様なマクロファージのオープンクロマチンの変化を解析した。これらの解析により、時空間的なエピゲノムの相違を同定した。

特にマクロファージは、本質的にその置かれる環境の変化にダイナミックに応答して多彩な役割を果たすことから、時空間と病態といった多様な軸から解析することが、その作動原理(制御プログラム)を解明するために必須である。この点から本研究では、時間(年齢)、空間(複数組織)、組織の状態(定常状態と疾患)を横断的に解析する。前年の解析に加え、ストレス下(心不全モデルや加齢マウス、肥満マウス)ならびにシグナルへの介入のもとで心臓、脂肪組織の組織マクロファージならびに骨髄由来マクロファージにおける、ゲノムワイド解析を行った。また、組織における細胞間相互作用を模す共培養でのトランスクリプトーム解析を行った。シングルセル解析の結果も合わせ、各軸での固有な変化をバイオインフォマティクスで検討した。また、骨髄移植により、幹・前駆細胞レベルでのエピゲノム変動の解析を行った。昨年に引き続き、RNA-seq、ChIP-seq、ATAC-seqによるゲノムワイド解析を、さらに多様な状態で行った。また、シングルセル解析の結果と合わせ、マクロファージサブタイプのさらなる同定を行い、微小環境応答についても新たな知見を得た。マクロファージの時空間・疾患エピゲノムの解析を引き続き進める。心不全モデルや加齢マウスにおける解析を追加し、マクロファージエピゲノムの時空間・ストレスの多様な軸での変化を明らかにする。特に各軸での固有な変化をバイオインフォマティクス解析で同定する。微小環境に応じたエピジェネティック制御機構の解析を進め、各組織マクロファージの炎症や代謝変化、老化に共通した機序と、各組織で固有の機序とを明らかにする。加齢に伴う内在的なエピゲノム変化の影響を検証するため、若年と老化マウスの骨髄を若年・老化マウスに移植し、各組織マクロファージのエピゲノムを解析する。肥満や心不全、老化の微小環境によって変動した組織マクロファージの機能やストレス応答の変調を明らかにするため、疾患モデル、老化モデルの組織マクロファージを単離し、対応する組織への移植を行い、組織機能の変化を解析する。また、骨髄幹細胞レベルでの変化についても移植により検討する。マクロファージの時空間・疾患エピゲノムの解析を引き続き進めるとともに、その制御機構の解析へと研究を進める。さらに、in vivoでの変化については、心不全モデルや加齢マウス、肥満マウスにおける解析を追加し、データを蓄積する。また、微小環境の作用については、心筋細胞や線維芽細胞、がん細胞等の相互作用を模したシステムを用い、遺伝子発現やエピゲノム変化のダイナミズムを明らかにするとともに、メディエータの同定を進める。また、シングルセルの解析結果から、組織マクロファージにおいてもさらにサブポピュレーションが分かれることが分かってきた。
温度受容分子の統合的機能解析

我々が温度を感じ取るメカニズムを明らかにすることを目的に、末梢感覚神経に発現し温度を感知するTRPチャネルファミリーを対象に、分子の構造と機能の解析を行った。卵母細胞を用いた機能解析を行い、野生型および変異体TRPチャネルに対して温度に依存した活性の測定を行った。温度感知に重要な働きを持つドメインとして知られる、TRPV1とTRPM8の細胞内コイルドコイルドメインおよびTRPA1のアンキリンドメインの蛋白質の発現・精製を大腸菌を用いて行った。TRPM2およびTRPM3のコイルドコイルドメインの、高解像度の結晶構造を解析することに成功した。各種TRPコイルドコイルドメインの熱安定性を解析した。(全体構想)我々は36.5°Cの体で恒常性を保って生きています。そして、時に火や氷雪を「熱い」「冷たい」と感じて回避します。本研究では、我々が温度を感じ取るメカニズムを分子構造のレベルから明らかにします。(具体的目標)温度を感知するイオンチャネル(Thermo TRP)の温度を感知するドメインの結晶構造を高解像度で解き、そのタンパク質ドメインの温度特性を熱力学的に解析します。Thermo TRPのイオンチャネルとしての機能を電気生理学的に温度変化と対応させて解析します。温度という「共通のパラメターで解析軸を統一」して結晶構造ータンパク質ー分子機能とシームレスな解析を行い、「イオンチャネルの温度感知機構」の普遍的な概念の確立を目指します。上記目的を達成するため、本年度は、Thermo TRP(TRPV1,V2,V4,A1,M8)サブファミリーに対して、アフリカツメガエル卵母細胞を用いた発現機能解析実験を行い、温度に依存した活性の測定を行った。温度を感知するに対して重要な働きを持つドメインとして知られる、TRPV1とTRPM8の細胞内コイルドコイルドメインの蛋白質の発現、精製を大腸菌を用いて行った。同じく、TRPA1の細胞内アンキリンドメインの蛋白質に対して、大腸菌を用いて発現精製を行った。本年度は、上記目的を達成するため、本年度は、TRPサブファミリーに対して、アフリカツメガエル卵母細胞を用いた発現機能解析実験を行い、温度に依存した活性の測定を行った。報告されたTRPV1の結晶構造を基にして変異体を作成し機能解析を行った。TRPM2、およびTRPM3のコイルドコイルドメインの蛋白質を大腸菌を用いて発現、精製を行い、結晶を作成することに成功した。回折実験では高分解能の回折像を得られた。TRPA1の細胞内アンキリンドメインの蛋白質に対して、大腸菌を用いて発現精製を試みた。上記目的を達成するため、本年度は、TRPチャネルサブファミリー間のキメラチャネルに対して、アフリカツメガエル卵母細胞を用いた発現機能解析実験を行い、温度に依存した活性の測定を行った。昨年度、結晶作成に成功した、温度を感知するに対して重要な働きを持つドメインとして知られる、TRPM2とTRPM3の細胞内コイルドコイルドメインの蛋白質の結晶の回折像に対して、分子置換法を用いて構造を解析した。TRPM6のコイルドコイルドメインの結晶を作成し、解説実験をおこなった。TRPV1およびTRPV2の細胞内ドメインの蛋白質に対して、大腸菌を用いて発現精製を試みた。TRPM

2およびTRPM3のコイルドコイルドメインの、高解像度の結晶構造を解析することに成功した。各種TRPコイルドコイルドメインの熱安定性を解析した。発現系を用いての機能解析に成功しており、今後の研究進展の礎となる解析法の確立に成功した。発現系を用いて蛋白質断片の発現精製に成功しており、今後の研究進展の礎となる解析法の確立に成功した。温度感知に重要な働きを有するドメインの蛋白質結晶を得ることに成功し、回折像を得られた。生理学TRPチャネルが温度を感知できる機構を解明するため、学際的な方法を取り入れて解析を行なう。本年度行った、発現系を用いた機能解析と、温度受容特性を決定するドメインのタンパク質結晶を利用して、(1)回折実験を行い、構造を解析する。(2)部分構造の詳細からチャネル機能を理解すること目的に結晶構造を元にした機能解析を行う。(3)細胞内ドメイン蛋白の熱力学的性質でイオンチャネルの温度受容特性が決まるのかどうかを知ることを目的に、温度上昇に伴うタンパク質の二次構造変化と、その温度閾値・温度依存性を解析する。(4)膜貫通領域のチャネルゲートとの連携を知るために、他のチャネルとのキメラチャネルを作成し、機能解析を行なう。当初計画では平成26年8月までにTRPV1の構造を解析し、平成27年3月までに温度感知機構に対して蛋白質レベルでの解析を行い、研究成果の取りまとめを行う予定であった。しかし、平成26年7月に、他の研究グループからTRPV1の構造が報告されたため、構造情報を基にしたTRPVファミリーの機能解析を行う必要性が生じ、その解析を優先した。そのため、蛋白質レベルの実験のやむを得ない遅延が生じた。TRPチャネルが温度を感知できる機構を解明するため、学際的な方法を取り入れて解析を行なう。本年度行った、発現系を用いた機能解析と、温度受容特性を決定するドメインのタンパク質断片のを発現・精製を足がかりに、(1)部分構造の詳細とチャネル機能の理解を目的に結晶構造解析を行う。(2)細胞内ドメイン蛋白の熱力学的性質でイオンチャネルの温度受容特性が決まるのかどうかを知ることを目的に、温度上昇に伴うタンパク質の二次構造変化と、その温度閾値・温度依存性を解析する。(3)膜貫通領域のチャネルゲートとの連携を知るために、大腸菌膜貫通領域を用いたFull-lengthキメラチャネルを作成し、構造解析を行なう。試薬購入に(500,000円)。実験補助員の雇用費に(1,100,000円)。国内学会参加旅費に(100,000円)。その他印刷出版費に(100,000円)。(研究方針決定の困難)平成25年10月、国外の他の研究グループからTRPV1チャネルの構造解析の報告が行われた。
日本人におけるミエロペルオキシダーゼの遺伝的欠損と易感染性の関連

本年度はミエロペルオキシダーゼとともに好中球に存在し、ミエロペルオキシダーゼに過酸化水素又は【O^-_2】などの活性酸素種を供給するNADPHオキダーゼ系およびその欠損症である慢性肉芽腫症について解析を行い下記の知見を得た。1.NADPHオキシダーゼ系の反応初産物の同定:活性化された状態にある好中球は【H_2】【O_2】,【O^-_2】をはじめとする多種類の活性酸素を生成しそれらが殺菌剤として利用される。しかしそれらが別々かつ同時に生成されるのか、あるいは最初に【O^-_2】が発生し,それから逐次的に他の活性酸素種が生ずるのかについては確証がなかった。我々はこの点を人工的に修飾した西洋ワサビペルオキシダーゼを【H_2】【O_2】ならびに【O^-_2】の捕捉剤として用いる新しい方法を用いて解明し,【O^-_2】がNADPHオキシダーゼ系の初産物であり,【H_2】【O_2】,OHラジカル,【^1O-2】などはこれから派生することを証明した(発表論文1,Makino,R.ら)。2.NADPHオキシダーゼ系の実体:低温スペクトル法を用いて好中球のチトタローム類の解析を行い,これが健常者の好中球に存在するが慢性肉芽腫症患者の好中球には欠損していることを再確認し,各種の反応動力学的な解析とあわせてbタイプのヘムタンパクがNADPHオキシダーゼ系の一員であることを示唆する結果を得た。又,系の精製を試みブタ好中球から強い活性を有する無細胞系標品を取り出すことに成功し,種々の脂肪酸がこの系を活性化することを見い出した(発表論文3,Tanaka,T.ら)。3.非TPAタイプ発癌プロモーターによる好中球の活性化:パリトキシンならびにタプシガルギンがヒトおよびブタ好中球を活性化して【O^-_2】を生成することを初めて見い出し,その大略を報告した(発表論文2,Kano,S.ら)。今後はミエロペルオキシダーゼ系とNADPHオキシダーゼ系を統合して好中球の殺菌機構を解明したい.本年度はミエロペルオキシダーゼとともに好中球に存在し、ミエロペルオキシダーゼに過酸化水素又は【O^-_2】などの活性酸素種を供給するNADPHオキダーゼ系およびその欠損症である慢性肉芽腫症について解析を行い下記の知見を得た。今後はミエロペルオキシダーゼ系とNADPHオキシダーゼ系を統合して好中球の殺菌機構を解明したい.