hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
鉛直浸透型ヨシフィルターによる小規模排水の高度名理に関する研究

その際、ヨシフィルター内にポーラスカップを設置して、各深さにおけるこれらの濃度も計測した。一方、窒素源を15N安定同位体窒素を含む硝酸に変えた人口排水を作成し、ヨシフィルターに連続的あるいは間欠的に流入させ、流出水濃度が一定になった段階で、地上部のヨシ全体を覆えるようなフタを固定し、フタ内の15N安定同位体窒素濃度の経時変化を求めるとともに、流出水中の15N安定同位体窒素濃度もヘッドスペース法で、毎月測定した。その結果、ヨシフィルターの脱窒速度は、0.05.5(平均2.27)gN/m^2/日で季節変化した。窒素除去量のうち、脱窒の割合、60%であった。鉛直型ヨシフィルターの持つ窒素除去能力を明らかにするため、鉛直型ヨシフィルターに人工排水を供給し、ヨシフィルターへの排水の流入方式の違い(連続流入方式と間欠流入方式)が窒素除去能力に及ぼす影響を評価すると共に、ヨシフィルター内での脱窒速度を実測し、ヨシフィルターの窒素除去能に対する脱膣の寄与を評価した。間欠流入方式において、ヨシ植生装置およびヨシ無し装置のT-N除去率はそれぞれ4797、759%であったのに対し、連続流入方式においてヨシ植生装置およびヨシなし装置のT-N除去率はそれぞれ495%、025%であった。また、間欠ヨシ植生装置では、冬期でもT-N除去率が50%を下回ることがなかったが、連続ヨシ植生装置では気温の下がる冬期に低下した。間欠流入は連続流入に比べると特に冬期に有効であった。このことは、間欠的に流入させることにより土壌内がより好気的に保たれ、冬期でも水質の浄化に適した状態となっていたためと思われた。また、ヨシ植生装置とヨシ無し装置の年間の平均脱窒速度はそれぞれ、2.27、1.48[g-N/m^2/day]で、ヨシの存在により脱窒がよく進むことが示唆された。ヨシフィルターは、ヨシが脱窒を促進する効果とヨシ自身の取り込みにより窒素を除去し、土壌のみよりも窒素除去において効果があることが確認できた。ヨシフィルターにおける脱窒速度は気温に対しよく回帰し、ヨシフィルターにおける脱窒能は温度に影響されることがわかった。また、ヨシが枯死する冬期でも、気温を高く保つことで脱窒能が維持できる可能性が示された。
ストレス回路を制御する脳内ノルアドレナリン神経-発生工学的神経破壊法による検討

本研究では、いかなる種類のストレスに応答して脳内NA神経系がはたらくか、複数存在するNA神経核のうちいずれが関与するのか、NA系と他の調節系はいかなる関連性を有するか、などの問題を探求した。この目的達成のため、NAニューロンにヒトIL2受容体蛋白を発現させたトランスジェニック(Tg)マウスを用いた実験を行った。我々はTgマウスのNA作動性神経核にヒトIL2受容体に特異的なイムノトキシンを注入し、NAニューロンのみを局所的に破壊するモデルの開発に成功し、このモデルマウスを用い、神経内分泌学的ならびに行動学的手法を用いた検討をおこなった。LC内イムノトキシン投与後1週間で、大脳皮質や海馬などの脳領域でNA含量が半減し、2週後に90%以上の減少が認められた。LCからNA作動性ニューロン投射を受けるこれらの領域内チロシン水酸化酵素陽性神経終末が著明に減少した。LC破壊後1週の実験では高架式十字迷路、open field、marble burying試験などにおいて、対照と比較し不安の減少する傾向が認められた。LCと不安の関連性が強く示唆された。青斑核(LC)は脳内最大のノルアドレナリン(NA)含有神経核である。本年度はLC標的イムノトキシン法により作成した「LC特異的NA作動性神経破壊マウス」を用い、糖質コルチコイド分泌調節および情動反応におけるLCの役割を明らかにした。DBHプロモーター制御下にヒトIL2受容体導入遺伝子を発現させたトランスジェニックマウスを用いた。麻酔下で定位脳固定装置を用いイムノトキシンを微量注入した。実験終了後組織切片を作成し、それぞれの神経核の破壊状態をチロシン水酸化酵素の免疫染色によって確認した。イムノトキシン投与1週間後、LCにおけるNA作動性神経は完全に破壊され消失した。主としてLCからNA作動性神経が投射する大脳皮質や海馬におけるチロシン水酸化酵素免疫陽性神経終末および組織中NA含量が激減した。LC破壊による副腎皮質系の基礎レベルへの影響を評価するため、TgにLC破壊手術を施し、1週間後、躯幹血中ACTH基礎値を定量した。対照として、LCにPBS投与を行ったsham手術群を用いた。次に、LC破壊マウスと対照マウスを用い、30分間拘束ストレスおよび腹腔内リポポリサッカライド投与1時間および2時間後に血中ACTH濃度を定量した。LC破壊により視床下部-下垂体-副腎系のストレス応答は影響を受けなかった。10分間の高架式十字迷路テスト、10分間のopenfieldtest、30分間のmarble burying testを行い両者の情動応答を比較した。これらの行動実験においては、いずれもLC破壊マウスで不安情動の減弱を示唆する結果が得られた。以上の結果、LCは不安の形成に関与することが示唆された。内分泌性ストレス応答への関与は認められなかった。ストレスは様々な疾病の成り立ちに深く関わっているが、ストレス防御の中枢として視床下部のはたらきが重要である。さらに視床下部調節系として脳内ノルアドレナリン(NA)作動性神経系の重要性が指摘されている。視床下部調節系として橋領域の青斑核(LC)、延髄領域の孤束核(NTS)、および延髄腹外側部が重要とされるが、質的量的な関与の度合いは不明である。本研究の目的は、いかなる種類のストレスに応答して脳内NA神経系がはたらくか、複数存在するNA神経核のうちいずれが関与するのか、NA系と他の調節系はいかなる関連性を有するか、などの問題を解明することである。

LC破壊後1週の実験では高架式十字迷路、open field、marble burying試験などにおいて、対照と比較し不安の減少する傾向が認められた。LCと不安の関連性が強く示唆された。
チルト型ドローン群のピニング協調制御理論の確立及び実機実験による性能評価

本研究では複数台のチルト型ドローンに対して,少数のドローンのみを制御するだけで群として最適な編隊を組むピニング制御理論を確立する.チルト型ドローンは機体形状を変形できるチルト運動が可能で,通常のドローンに比べて運動能力が高いオリジナルな機体である.このチルト運動を最大限利用して,バッテリー消費を抑えつつ観測対象を最大限観測できる最適フォーメーションを形成する.1人の観測者によるチルト型ドローン群を用いたモニタリングシステムを構築し,実機実験により設計したピニング制御器の有効性を確認する.本研究成果は特にトンネルや橋梁のインフラ点検に最適であり作業の劇的な効率化が期待できる.本研究では複数台のチルト型ドローンに対して,少数のドローンのみを制御するだけで群として最適な編隊を組むピニング制御理論を確立する.チルト型ドローンは機体形状を変形できるチルト運動が可能で,通常のドローンに比べて運動能力が高いオリジナルな機体である.このチルト運動を最大限利用して,バッテリー消費を抑えつつ観測対象を最大限観測できる最適フォーメーションを形成する.1人の観測者によるチルト型ドローン群を用いたモニタリングシステムを構築し,実機実験により設計したピニング制御器の有効性を確認する.本研究成果は特にトンネルや橋梁のインフラ点検に最適であり作業の劇的な効率化が期待できる.
理学・作業療法士の臨床実習における学生支援のためのeポートフォリオの開発と検証

理学・作業療法士養成校数は,他に類をみない状況で激増している.この激増は,志望学生の質的低下をもたらすのみでなく,理学・作業療法士養成課程で重要な役割を担う臨床実習(学外実習)指導者の若年化や教育経験の未熟さをもたらし,「臨床家を育てる上で最も重要な臨床実習であるにもかかわらず,質が低下した学生を経験が少ない学外指導者が指導する」といった問題をもたらしている.本研究では,学生の学修到達度の向上,社会に求められる人材育成を目的に,複数臨床実習施設での指導内容の一貫性の構築や臨床実習における大学教員による若年指導者への介入,学外での臨床実習における学生のストレスの緩和などを図るため,eポートフォリオとその運用ネットワークシステムの開発と検証を実施する.本研究課題の最重要因子は,臨床実習で有効に利用できるeポートフォリオとその運用システムの開発にある.eポートフォリオは1)学内用ポートフォリオと2)臨床実習用ポートフォリオの2つを柱として構成する.このeポートフォリオは,学生の学修到達度を中心とした学内の情報と,臨床実習での提出課題や学修到達度を中心とした学外の情報を融合させる.ネットワークを通じて,教員ー学生ー臨床実習指導者が共有することで,教員ー学生ー臨床実習指導者との間での情報交換はもちろん,これまではほとんど不可能であった臨床実習指導者間の情報交換が可能となる.ここまでの進行状況としてはインターネットクラウドサービス「Evernote」を使用して,eポートフォリオの実用段階に入った.プラットフォームに「Evernote」を使用し,ファイル共有システムを利用して,情報共有およびセキュリティー対策を行っている.現在,一通りの実践を終え,データの整理,その後のシステム改善の段階まで入っている.当初,eポートフォリオを運用するプラットフォームの作成に苦戦していたが,「Evernote」を利用することで概ね解決した.作成したポートフォリオは以下である.1)デイリーノート:臨床実習指導者と学生が毎日交換するノート,2)症例レポート:実習期間中に担当した症例の検査結果,治療方法とその結果などをまとめたレポート,3)臨床実習到達度:臨床実習に対する学生と臨床実習指導者による到達度評価,4)大学ー施設間連絡票,施設間連絡票大学と施設間の連絡や実習施設同士での申し送りに使われる票これらの情報を,学外実習地,学生の自宅,大学といった距離の離れた場所で供覧する必要がある.また,日めくりで使われる内容や1度きりで終わる内容などが混在し,ファイル管理が複雑にもなる.供覧によるプライバシー保護とアクセスのしやすさなども共存させる必要もあり,課題も多かった.「Evernote」の共有システムを利用することで概ね解決が可能となった.平成30年度より具体的な運用を開始した.本システムへの参加について同意の得られた大学4年生および学外実習指導者に対し,学外ポートフォリオの使用を開始した.タブレットの貸し出しおよびeポートフォリへの入力を開始し,同時にインターネットを介した遠隔地との情報共有を行った.ここまでeポートフォリオの運用を終え,実際の使用感や問題点の調査を終えている.今後は生じた課題に対するシステムの改善とそれに対する再調査を行っていく.また,得られたデータをまとめ成果報告の段階に移っていく.理学・作業療法士養成校数は,他に類をみない状況で激増している.この激増は,志望学生の質的低下をもたらすのみでなく,理学・作業療法士養成課程で重要な役割を担う臨床実習(学外実習)指導者の若年化や教育経験の未熟さをもたらし,「臨床家を育てる上で最も重要な臨床実習であるにもかかわらず,質が低下した学生を経験が少ない学外指導者が指導する」といった問題をもたらしている.本研究では,学生の学修到達度の向上,社会に求められる人材育成を目的に,複数臨床実習施設での指導内容の一貫性の構築や臨床実習における大学教員による若年指導者への介入,学外での臨床実習における学生のストレスの緩和などを図るため,eポートフォリオとその運用ネットワークシステムの開発と検証を実施する.初年度である今年度は学内教育と臨床実習(学外実習)の問題点の整理および新しいeポートフォリオとその運用システムの開発が最重要課題である.今年度はeポートフォリオは臨床実習用ポートフォリオの作成を中心に行った.運用システムの概要:現在の臨床実習における学生,教員,臨床実習指導者におけるコミュニケーションの問題がある.最も本質的問題は,学内と学外という物理的な距離,およびリアルタイムな問題収集の困難さに集約できる.そのため本研究課題では,eポートフォリオをネットワーク上で運用することで,教員ー学生ー臨床実習指導者との間での情報交換はもちろん,これまではほとんど不可能であった臨床実習指導者間の情報交換が可能となる.すなわち,eポートフォリオを軸に仮想キャンパスとして関係者が学生を支援できる.平成27年度はeポートフォリオのシステムの試作を行った.実際の運用は平成28年度以降を予定している.eポートフォリオは,「Evernote」で作成する.作成したeポートフォリオはインターネット上での運用を考えている.学生は各々タブレット端末から,eポートフォリオにアクセスする.教員や臨床実習指導者は各自のPCからもアクセアス可能とするが,学生からタブレット端末を手渡しでやりとりする方法も想定している.臨床実習用ポートフォリオは以下のものを基幹情報とする.1)デイリーノート:臨床実習指導者と学生が毎日交換するノート.2)症例レポート:実習期間中に担当した症例の検査結果,治療方法とその結果などをまとめたレポート.3)臨床実習到達度:臨床実習に対する学生と臨床実習指導者による到達度評価.4)大学ー施設間連絡票,施設間連絡票:大学と施設間の連絡や実習施設同士での申し送りに使われる.現在は大学の講義でアクティブラーニングを導入し,その一環として学内ポートフォリオの基幹情報である自己到達度評価票を試験的に導入している.臨床実習ポーフォリオの基幹情報であるデイリーノート,症例レポートは紙面上では運用できている.

このように紙媒体レベルではいくつかの基幹情報の準備ができている.理学・作業療法士養成校数は,他に類をみない状況で激増している.この激増は,志望学生の質的低下をもたらすのみでなく,理学・作業療法士養成課程で重要な役割を担う臨床実習(学外実習)指導者の若年化や教育経験の未熟さをもたらし,「臨床家を育てる上で最も重要な臨床実習であるにもかかわらず,質が低下した学生を経験が少ない学外指導者が指導する」といった問題をもたらしている.本研究では,学生の学修到達度の向上,社会に求められる人材育成を目的に,複数臨床実習施設での指導内容の一貫性の構築や臨床実習における大学教員による若年指導者への介入,学外での臨床実習における学生のストレスの緩和などを図るため,eポートフォリオとその運用ネットワークシステムの開発と検証を実施する.本研究課題の最重要因子は,臨床実習で有効に利用できるeポートフォリオとその運用システムの開発にある.eポートフォリオは1学内用ポートフォリオと2臨床実習用ポートフォリオの2つを柱として構成する.このeポートフォリオは,学生の学修到達度を中心とした学内の情報と,臨床実習での提出課題や学修到達度を中心とした学外の情報を融合させる.ネットワークを通じて,教員ー学生ー臨床実習指導者が共有することで,教員ー学生ー臨床実習指導者との間での情報交換はもちろん,これまではほとんど不可能であった臨床実習指導者間の情報交換が可能となる.ここまでの進行状況としては平成27年度に作成したシステムを一部運用を開始した.ただし,当初予定では,ファイルメーカープロを使用し,ネットワークシステムを構築する予定であったが,システムの汎用性や学外での使用を考え,一般的に普及しているクラウドシステムでの運用を考えており,大幅なシステムの変更をはかっている.作成するeポートフォリオの内容は多岐にわたる.具体的には以下の通りである.1)デイリーノート:臨床実習指導者と学生が毎日交換するノート.2)症例レポート:実習期間中に担当した症例の検査結果,治療方法とその結果などをまとめたレポート.3)臨床実習到達度:臨床実習に対する学生と臨床実習指導者による到達度評価.4)大学ー施設間連絡票,施設間連絡票大学と施設間の連絡や実習施設同士での申し送りに使われる.これらの情報を,学外実習地,学生の自宅,大学といった距離の離れた場所で供覧する必要がある.また,日めくりで使われる内容や1度きりで終わる内容などが混在し,ファイル管理が複雑にもなる.供覧によるプライバシー保護とアクセスのしやすさなども共存させる必要もある.以上の点を踏まえ,十分にシステムを構築し直す必要がある.理学・作業療法士養成校数は,他に類をみない状況で激増している.
ヒアルロン酸ネットワークと破骨細胞制御による骨転移治療の確立

骨転移は悪性腫瘍において患者のQOLを低下させる。ヒアルロン酸を中心とした細胞外マトリックスの制御に焦点を当て、既存の骨転移治療薬への相互作用を評価した。4-methylumbelliferone (MU)の乳がんと肺がんのセルラインに対するヒアルロン酸発現と腫瘍原性への影響を評価した。MUとゾレドロン酸の増殖能、運動能、浸潤能への影響を評価し、相乗効果についても評価した。これらの薬剤を組み合わせることによりin vivoの骨転移病変を相加的に抑制し、MUのヒアルロン酸蓄積や破骨細胞の抑制がみられた。骨修飾薬に加え、ヒアルロン酸合成を抑制することは骨転移治療のターゲットとなりうる。各種癌細胞株の細胞外マトリックス・細胞膜上受容体・細胞内シグナル伝達のネットワーク抑制の作用を明らかにするために、ヒト乳癌細胞のセルラインであるMDA-MB-231とマウス肺癌細胞のセルラインのルイス肺癌細胞を用いてヒアルロン酸合成酵素のmRNAやヒアルロン酸やヒアルロン酸合成酵素の蛋白発現の評価を行った。Particle Exclusion Assayを行い細胞外マトリクスの評価も実施した。各セルラインにおける細胞外、細胞周囲、細胞内のヒアルロン酸量をSandwich-ELISA法によるヒアルロン酸定量により評価した。各細胞株における細胞外マトリックスへの影響ついてParticle Exclusion Assay、細胞自身のヒアルロン酸発現についてヒアルロン酸免疫染色を施行した。MDA-MB-231とルイス肺癌細胞において、ビスフォスフォネート製剤であるゾレドロン酸を用いた場合のCellviability assay (MTT)、Motility assayによる運動能、Invasion assayによる浸潤能、アポトーシスの評価を行った。各セルラインにおいてヒアルロン酸合成阻害薬4-methylumbelliferone(4-MU)とゾレドロン酸の共投与下のMTT、運動能、浸潤能、アポトーシスの評価を行った。また、CD44の免疫染色を行い4-MUやヒアルロン酸オリゴ糖投与後の各セルラインにおける発現の解析を行った。これらの実験により乳癌、肺癌のセルラインにおける細胞外マトリックス・細胞膜上受容体・細胞内シグナル伝達のネットワークに対するヒアルロン酸合成阻害剤とゾレドロン酸の影響を評価した。また、破骨細胞分化させた培養骨髄細胞に対する4-MU投与の影響を評価した。癌細胞の細胞外マトリックス・細胞膜上受容体・細胞内シグナル伝達のネットワークと骨転移治療薬やヒアルロン酸合成阻害薬、ヒアルロン酸オリゴ糖などによるそれらの変化を明らかにするために、各種癌細胞のセルラインを用いた実験を行ってきた。In vitroの実験においてヒアルロン酸合成阻害薬の4-MUは各癌細胞株の腫瘍増殖を抑え、運動能、浸潤能を抑制し、ゾレドロン酸など既存の骨転移治療薬による癌細胞の細胞外マトリックス・細胞膜上受容体・細胞内シグナル伝達のネットワークへの影響が評価できた。当初の計画では平成27年度以降にヒアルロン酸制御による破骨細胞分化への影響、HAS2強制発現マウスを用いゾレドロン酸やOPGーFcなどのRANKL阻害剤による骨転移増大に対する影響、生命予後の解析、ヒアルロン酸・ヒアルロン酸関連細胞外マトリックス分子・細胞膜上受容体発現の評価、破骨細胞数・分布への影響、組織標本の分子イメージングによる薬物分布の解析を野生型マウスとの比較を実施する予定であったが動物実験に関して進行が遅れている。

各細胞株における細胞外マトリックスへの影響ついてParticle Exclusion Assay、細胞自身のヒアルロン酸発現についてヒアルロン酸免疫染色を施行した。MDA-MB-231とルイス肺癌細胞において、ビスフォスフォネート製剤であるゾレドロン酸を用いた場合のCellviability assay (MTT)、Motility assayによる運動能、Invasion assayによる浸潤能、アポトーシスの評価を行った。各セルラインにおいてヒアルロン酸合成阻害薬4-methylumbelliferone(4-MU)とゾレドロン酸の共投与下のMTT、運動能、浸潤能、アポトーシスの評価を行った。また、CD44の免疫染色を行い4-MUやヒアルロン酸オリゴ糖投与後の各セルラインにおける発現の解析を行った。これらの実験により乳癌、肺癌のセルラインにおける細胞外マトリックス・細胞膜上受容体・細胞内シグナル伝達のネットワークに対するヒアルロン酸合成阻害剤とゾレドロン酸の影響を評価した。また、破骨細胞分化させた培養骨髄細胞に対する4-MU投与の影響を評価した。HAS2強制発現マウスを用いたゾレドロン酸やRANKL阻害剤による骨転移増大に対する影響、生命予後の解析する実験の準備が遅れたため、当初の計画より遅延が生じた。その他、ゾレドロン酸およびデノスマブの投与を受けていた患者検体についてはマスイメージングによる薬物分布の解析を行い組織ヒアルロン酸量との関係について解析を行う予定であったが遅れが生じている。各種癌細胞株の細胞外マトリックス・細胞膜上受容体・細胞内シグナル伝達のネットワーク抑制の作用を明らかにするために、ヒト乳癌細胞のセルラインであるMDA-MB-231とマウス肺癌細胞のセルラインのルイス肺癌細胞を用いてヒアルロン酸合成酵素のmRNAやヒアルロン酸やヒアルロン酸合成酵素の蛋白発現の評価を行った。Particle Exclusion Assayを行い細胞外マトリクスの評価も実施した。各セルラインにおける細胞外、細胞周囲、細胞内のヒアルロン酸量をSandwich-ELISA法によるヒアルロン酸定量により評価した。
細胞外マトリックスを標的とする新たな治療技術の開発

本研究の目的は、作用候補因子を配合した人工細胞外マトリックス(ECM)を作製し、それを体内に移植しECMの中より、創傷治癒に伴うECMの再構築や細胞の振る舞いに影響を与える薬効分子を探索する試みである。この研究の成果としてミズクラゲ(Aurelia aurita)コラーゲンに再上皮化と肉芽形成両方を促進するはたらきが見出され、最終的にその生物効果を最大限発揮できる様に最適化した人工真皮を作製した。これは将来的に創傷をより綺麗に修復できる新たな生体素材として研究を継続している。この実例によって埋め込み型人工ECMを用いた生体作用分子探索の試みは成功したと言うことができる。平成27年度は実験計画の開始年度であり、コラーゲンを基材としたバイオマトリックス担体の試作と、同担体をマウス体内に移植し、生体内における人工マトリックス環境と宿主細胞の相互作用等を調べる実験を行った。1バイオマトリックス担体(以下、担体)は当初のデザイン通り、ブタ由来I型コラーゲンと20%V型配合I型コラーゲンを基本成分としたものを作製した。凍結乾燥はt-ブチルアルコール溶媒下で行い、100% I型コラーゲンスポンジでは直径100nm程度の分岐のない線維構造、20%V型を含む含有スポンジでは直径50nm程度の分岐を持つ線維構造が再現されることを走査電子顕微鏡観察において確認した。2作製した担体をマウスの皮下と体腔内に1週間設置し、宿主細胞の担体内への遊走とコラーゲンマトリックスの再構築状況を調べた。その結果として100% I型コラーゲンでは線維芽細胞、20% V型を含むものでは上皮細胞様の細胞が生着しやすいという、再生医学において興味深い成果が得られた。移植後1週間では生着した線維芽細胞による宿主コラーゲン線維の構築は殆ど観察されず、人工マトリックスの分解が先行して認められた。人工的なコラーゲン線維と自己再生で合成される宿主由来のコラーゲンは明瞭に見分けられた。3先行実験において細胞遊走活性の促進作用が認められたミズクラゲコラーゲンを担体の機能性成分として45%含ませた試作品を作製した。これを皮内移植してバイオアッセイを行ったところ、ミズクラゲコラーゲンを含有する試料に限り、線維芽細胞の著しい細胞誘引効果が確認された。ミズクラゲコラーゲンは、本実験において組織再生を促進する有用な機能因子として継続して検討される素材に加えられた。本実験の初年度において計画されたバイオマトリックス担体の作製と、動物実験の施行は順調に進められている。計画はスタートしたばかりであるが、コラーゲンの精製方法、コラーゲンスポンジの作製方法、特にコラーゲンのもつ微細な線維構造が失われる通常の凍結乾燥法でなく、コラーゲン線維構造を凍結乾燥体で維持できるt-ブチルアルコール溶媒置換による凍結乾燥手法など、本研究を遂行する上で必要となるノウハウが先行研究である20122014科研費基盤研究(C)研究課題名「5型コラーゲンα3鎖が有する癒着防止活性の治療法への応用」課題番号(24591918)によって確立出来ていたことが大きく寄与している。一方で解決されるべき検討課題も抽出され、例えばマトリックス形成にはたらきかけて癒着防止にはたらく機能分子として検討されているV型コラーゲンα3鎖は、完全長で単離することが難しい状況である。このようなの成分のアッセイ系として、ペプチドのような合成できる低分子化合物としてバイオマトリックス担体内に導入し、in vivoにおいて生物効果を評価する方法を検討している。平成28年度は前年度に確立出来たコラーゲンを基材としたバイオマトリックス担体の作製技術を基盤とし、薬剤候補成分を添加した人工マトリックスをマウスに包埋することにより、in-vivoで組織再生・ECM構築にはたらく薬効成分を探索した。その結果、前年度に見出されていたミズクラゲコラーゲンは表皮角化細胞による再上皮化と線維芽細胞による肉芽形成について、両方を活性化することが改めて確認され、皮膚再生を促進できる新しい人工皮膚を開発できる可能性が示された。さらに、この新素材を社会に還元できる製品とするための追加実験を行なった。1素材の形状の最適化。バイオマトリックス担体の加工形状を変え、最適な生物活性を示す形状の探索を行なったところ、再上皮化の促進についてはフィルム形状が、線維芽細胞による真皮様組織の再構築には、コラーゲン線維を模したスポンジ形状(t-BA溶媒下凍結乾燥法・27年度開発)が最もよく、最終的に表皮側に極薄のコラーゲンフィルムをコーティングした二層性スポンジによる新規人工皮膚素材を作製した。2ミズクラゲコラーゲンの添加最適量の検討。ミズクラゲコラーゲンの添加量を増量すると、表皮角化細胞の遊走活性は増加したが同時に剥離し易くなる傾向が増すことが示された。組織学的に良好な表皮角化細胞の形態を維持し、その遊走を促進する最適添加量は4045%であった。3生物活性の確認。上記1、2を組み合わせて作製した人工皮膚をマウスの背部皮膚の全層欠損モデルに移植し、6日経過後の回復をバイオアッセイにて調べた。計測の方法は移植片の組織標本を作製し、創傷部辺縁からの表皮角化細胞が人工皮膚上を伸長した距離と、人工皮膚内部に侵入した細胞の単位面積あたりの数を画像解析することで行った。

数値化した表皮角化細胞の伸長距離、線維芽細胞の遊走数をミズクラゲコラーゲン容量別に統計処理を行い、有意であることを確認した。本実験計画の目的である細胞外マトリックスから組織再生に働く有益な作用分子を発見することが出来、当初の予定どおり生体内のバイオアッセイにフィードすることで、効果を詳細に検証することも出来ている。特に本年度の実験系に用いた人工皮膚のモデルはコラーゲンスポンジの作製手法、有効成分の配合によるバイオマトリックス担体の技術を、そのまま用いる事が可能であった。今回、ミズクラゲコラーゲンが先行したことにより、移植担体の人工皮膚への応用、フィルム素材をスポンジ素材上に薄くコーティングする技術等、応用範囲が拡げられた。バイオマトリックス担体でスクリーニングしている作用分子の中で、当初からの候補分子であるV型コラーゲンα3鎖は全長を用いる事が出来なかったため、ペプチドとしてミズクラゲの事例と共に29年度実験に用いる事にしている。これまでの探索実験からECMより働きかけ、欠損皮膚の表皮再上皮化と肉芽形成を促す新規皮膚再生促進薬候補としてミズクラゲコラーゲンが見出された。一連の探索実験の仕上げとして本年度は、このミズクラゲコラーゲンの性状精査を中心に行なった。1ミズクラゲコラーゲン含有人工皮膚を用いた移植実験の経過検証:マウスを用いた人工皮膚移植モデルについて、3週間後の経過を調べた。その結果、ミズクラゲ成分を含む生体材料はブタI型コラーゲンのみの従来品より吸収が速く、早期に宿主組織に置換されることがわかった。これは人工皮膚よりも再生促進薬として有益な性状と考えられた。2in vitro実験系によるミズクラゲコラーゲンが表皮細胞に与える効果の検証:ヒト不死化表皮角化細胞HaKaTを用いたscratch assayにおいてはミズクラゲコラーゲンの添加による遊走能の直接促進作用は認められなかった。次にヒト新生児初代表皮角化細胞NHEKを用いて、ミズクラゲコラーゲンまたはブタI型コラーゲン存在下における表皮の各種階層分化マーカーと細胞接着分子の発現変動を定量的PCRで比較した。その結果ではミズクラゲコラーゲンを添加した群で角化マーカーであるロリクリンとインボルクリン、密着結合構造蛋白質であるオクルディンとクロ-ディンの発現増加が認められた。これはin vivoの移植実験で見られた角質化上皮の形成促進とあわせて、ミズクラゲコラーゲンに上皮の角質分化を促進する作用があることを示唆すると考えられた。本実験計画の目的は生体埋め込み素材を用いて、in vitroで探索できないECMの構築と組織の再生にはたらく未知の薬理分子を探索することであった。当初の目的は概ね達成することが出来た。ミズクラゲコラーゲンの再生医療の応用技術はこれからの課題である。本研究の目的は、作用候補因子を配合した人工細胞外マトリックス(ECM)を作製し、それを体内に移植しECMの中より、創傷治癒に伴うECMの再構築や細胞の振る舞いに影響を与える薬効分子を探索する試みである。この研究の成果としてミズクラゲ(Aurelia aurita)コラーゲンに再上皮化と肉芽形成両方を促進するはたらきが見出され、最終的にその生物効果を最大限発揮できる様に最適化した人工真皮を作製した。これは将来的に創傷をより綺麗に修復できる新たな生体素材として研究を継続している。
悪性黒色腫の増殖、分化におけるMYC/MAD遺伝子発現の検討

ヒト悪性黒色腫培養細胞株において、癌遺伝子であるc-mycおよびそのアンタゴニストとされているmad-1gene(product)の発現を検討した。さまざまな培養条件下、たとえばSerum-freeなど増殖の抑制/分化誘導などと通常条件での比較では、Steady-state levelのmRNA発現は必ずしもmycとmadで逆相関がみられず、一定した傾向はなかった。現在、Dr.Eisenmanより供与されたhuman c-mad geneを、Expressionベクターに組み込み、mad geneを過剰発現した際のcell growthの変化を検討する実験を予定している。増殖速度などcell characterizationを行っている。
Notchシグナル伝達系の細胞内調節因子群の研究

以前ショウジョウバエMastermind (Mam)のヒト相同体として同定したhMam-1と、30%、20%の相同性をもつヒトタンパク質hMam-2、hMam-3を新たに同定した。hMam-2は限局した組織で発現していたのに対し、hMam-3はhMam-1同様多くの組織で発現がみられた。hMam-2、hMam-3はhMam-1と同様、1)4種すべてのNotch細胞内ドメイン(NICD)およびRBP-Jと複合体を形成して標的プロモーターに結合する。2)MCD、RBP-Jそれぞれ単独とは結合せず、これら両者が存在してはじめて複合体へ参加し、これを安定化する。さらに全4種のNICDの発現による転写活性化を全3種のMamが増強したが、Notch3、とNotch4による転写活性化はhMam-2がより強く増強した。以上よりMamは哺乳動物において類似の機能を持った3つの要素からなるファミリーを形成しており、Notchシグナルの強度に多様性をもたらしている可能性が考えられた。Neurotic (Nti)は、ショウジョウバエで見いだされた新しいNotchシグナル伝達系の必須の要素であり哺乳動物のO-フコース転移酵素と相同性を有する。Notch細胞外ドメインはO-フコシル化しており、このフコースにFringe (hg)がGlcNAcを付加するとNotchとそのリガンドDeltaとの親和性が増強することが知られていた。培養細胞において、Ntiの発現を阻害するとNotchとDeltaの結合が消失した。さらにNtiとFngの共発現の結果この親和性が大きく増強した。とれらの操作時、Notchの細胞膜上での発現に変化がなかった。以上よりNotchのフコシル化がリガンドとの物理的会合に必須であること、Notchの糖鎖修飾がリガンドとの親和性を変化させることでシグナル強度を調節する可能性が考えられた。われわれはすでにショウジョウバエMastermind(Mam)のヒトホモログhMam-1を同定し、さらにこれらの機能を見いだし報告している。今回新たにhMam-1とそれぞれ30%、20%の相同性をもつ二つのヒトタンパク質を同定し、それぞれhMam-2、hMam-3と命名した。Northern blotting法により各組織でのこれらのmRNAの発現を検索したところ、hMam-2は前立腺、精巣、卵巣等の比較的限局した組織で発現が見られたのに対し、hMam-3はhMam-1と同様多くの組織で発現が見られた。次にこれらのタンパク質について機能を検索した。hMam-2、hMam-3はいずれもhMam-1と同様に、1)Notch1細胞内ドメインおよびRBP-Jと複合体を形成して標的プロモーター内の塩基配列に結合する。2)Notch1細胞内ドメインあるいはRBP-Jそれぞれ単独とは結合せず、これら両者が存在してはじめて複合体へ参加できる。3)Notch1細胞内ドメインによる標的プロモーターの転写活性化を上昇させる。さらにこれら3種のMamタンパク質と哺乳動物の4種のNotchの細胞内ドメインとの相互作用を検索したところ、考えられる12種の組み合わせすべてにおいて、RBP-Jを含むDNA結合性の複合体が形成した。また標的プロモーター転写の4種のNotchいずれによる活性化も全3種のMamにより上昇したが、hMam

-2は他の2種に比べNotch3とNotch4による転写活性化をより強く増強した。以上よりMamは高等真核生物においては類似の機能を持った少なくとも3つのメンバーを有するファミリーを形成しており、その存在が各種細胞におけるNotchシグナルの強度に多様性をもたらしている可能性が考えられた。Neurotic(Nti)は、ショウジョウバエで見いだされた新しいNotchシグナル伝達系の必須の構成要素であり哺乳動物のO-フコース転移酵素と高い相同性を有している。Notchの細胞外ドメインはO-フコシル化していることが知られている。さらにこのフコースにN-アセチルグルコサミン転移酵素であるFringe(Fng)がN-アセチルグルコサミンを付加すると、NotchとリガンドであるDeltaとの親和性が増し、その結果細胞内に発生するシグナルが増強することが知られていた。われわれはショウジョウバエ培養細胞において、RNAi法によってNtiの発現を阻害したところNotchとDeltaの結合が完全に消失することをみいだした。さらにこのNtiの発現抑制で上記のFngによる結合増強効果が消失し、NtiとFngを共発現させると親和性が大きく増加した。これらのNtiの発現変化時、Notchの細胞膜上での発現には大きな変化がなかった。これらの結果からNotchのフコシル化はリガンドDeltaとの物理的会合に必須であると考えられた。これは細胞膜上の受容体タンパク質に付加された糖鎖がリガンドとの結合に不可欠であることを示した最初の例である。さらにNtiとFngの発現変化でリガンドー受容体の親和性を大きく変化させることができることから、これらの因子による糖鎖修飾によりNotchシグナルの強度が調節されている可能性が考えられた。Mastermind(Mam)-1、Mam-2、Mam-3それぞれの遺伝子欠失マウスの作製には引き続き取り組んでいる。現在相同組換えのおこったES細胞のクローンが得られてきている。
上皮integrity維持機構多様性の生物学的意義の解明

本研究では、CDH1座へのp53結合依存的・非依存的上皮integrity維持機構に焦点をあて、同様なことが正常上皮細胞や個体でも見られるのか、もしくは、不死化や癌化過程ではじめて誘起されるものなのかを明らかにし、その生物学的意義を解明するものである。1ヒト正常乳腺上皮細胞での検討2上皮integrity多様性の分子基盤RNA-Seq解析、CDH1座の当該ヒストン修飾状態、さらにはヒストン修飾の元となる細胞内代謝等の解析によって、p53結合依存性あるいは非依存性に影響を与える要因や初発となる因子(群)の特定を継続している。細胞内外の酪酸濃度に依存したCDH1座のヒストンアセチル化がp53結合性を決める要因の一つであることが分かった。増殖の遅いHMEC細胞からクローンを複数調製し、p53結合性を確認する作業に時間を要しているが、本質的な技術的障害ではなく、概ね順調に進捗していると言える。1前年度から行ってきたヒト乳腺由来正常上皮細胞を用いた解析を引き続き行う。すなわち、不死化していないHMECを用い、上皮性がp53結合依存的か、あるいは非依存的かに関する解析を継続する。増殖の遅いHMEC細胞からクローンを複数調製し、p53結合性を確認する作業となるため、時間を要する。2マウス初代培養上皮細胞での検討を行う。正常乳腺上皮細胞をマウス個体から調製し、初代培養したもの、SV40LTにて不死化したものを、各々複数クローンを調製し、ヒト細胞の場合と同様の解析を行い、上皮integrity維持に多様性が存在するか否かの検討を行う。ヒストン修飾解析やRNA-Seq解析に加え、CDH1座のヒストン修飾やp53結合性に影響するacetyl-CoAなどの代謝活性、酪酸濃度や細胞外pHの影響なども含め、解析を行う。
ユビキチン化を標的とした難病CFの創薬研究

遺伝病である嚢胞性線維症(CF)はCFTR変異体タンパク質が細胞内で分解されるため発病する。現在CF治療薬が開発されているが、CFTRの分解シグナルとなるユビキチン化を阻害できないため、治療効果が非常に弱い。本研究では、新規同定したCFTRユビキチン化酵素の作用機序を解明し、その作用機序を阻害する薬剤を探索する評価系の構築を行なった。その結果、CFTRユビキチン化酵素RFFLはアミノ末端の変性領域でCFTR変異体の立体構造が崩れた細胞質領域を直接認識して分解へ導くことがわかった。また、本研究により新規CF治療薬の探索に有用なRFFL-CFTR変異体相互作用評価法を確立した。1. ΔF508CFTRとの相互作用に必要なエンドソーム局在ユビキチンリガーゼ機能領域をpulldown法で解析した結果,アミノ末端領域が相互作用に必要であることが明らかとなった.また,ΔF508 CFTR発現量に対するエンドソーム局在ユビキチンリガーゼ変異体の影響解析の結果,アミノ末端領域以外に,ユビキチン化に関わるRINGドメインもΔF508 CFTR発現制御に必要であることが明らかとなった.さらに,我々が同定した新規ユビキチンリガーゼ2種に関しても,上記と同様の実験により,相互作用領域と機能領域を明らかにした.2.蛍光タンパク質Venusの一部を融合することにより,ΔF508 CFTRとエンドソーム局在ユビキチンリガーゼの細胞内相互作用を簡便に評価するBiFC法を確立した.同様に,細胞内におけるユビキチンリガーゼとCFTR NBD1領域との相互作用を評価するBiFC法を確立した.In vitro相互作用解析を行うために,高純度のユビキチンリガーゼを精製する手法を確立し,エンドソーム局在ユビキチンリガーゼによるCFTR in vitroユビキチン化の再構成実験に成功した.相互作用領域が同定され,また,精製タンパク質の準備が整い,in vitroでの相互作用解析を実施可能な状況となったため.1.成熟型ΔF508CFTRとの相互作用に必要なエンドソーム局在ユビキチンリガーゼ領域をプルダウン法で解析した結果,アミノ末端領域に存在するdisordered regionsが相互作用に必要であることが明らかとなった.精製タンパク質を用いた再構成実験により,エンドソーム局在ユビキチンリガーゼは直接的に成熟型ΔF508 CFTRと相互作用し,K63型ポリユビキチン化を促進することが明らかとなった.さらに,エンドソーム局在ユビキチンリガーゼはΔF508 CFTRのNBD1と直接的に結合し,ポリユビキチン化することが明らかとなった.発現系の改良により,エンドソーム局在ユビキチンリガーゼ精製タンパク質の収量および純度が改善された.2.前年度に確立したBiFC法によるエンドソーム局在ユビキチンリガーゼとΔF508CFTRの相互作用の定量化を行ったが,検出感度が不十分であり,96 well plateを用いた定量解析が困難であった.3. HECT型ユビキチンリガーゼにおいて,変異体表現系解析から,ΔF508 CFTRとの相互作用にはアミノ末端領域が必要であることが明らかとなった.現在,精製タンパク質の準備を行っており,直接的な相互作用解析を行う予定である.ユビキチンリガーゼ精製タンパク質の収量が悪く,発現系の最適化が必要であったことに加えて,BiFC法での定量が困難であったため,化合物スクリーニングまで到達していない.3. HECT型ユビキチンリガーゼタンパク質精製を大腸菌および哺乳類動物細胞から試みたが活性がある十分量のタンパク質の精製が達成できなかった.しかしながら,共同研究による無細胞発現系により,HECT型ユビキチンリガーゼタンパク質の精製に成功した.今後,CFTR相互作用解析の評価系を構築予定である.遺伝病である嚢胞性線維症(CF)はCFTR変異体タンパク質が細胞内で分解されるため発病する。in vitro相互作用解析を用いたユビキチン化阻害薬探索を進めていくと共に,in silicoで予測されたCFTR結合薬物候補に関してもスクリーニングを行う.NanoBiTを用いたCFTR-ユビキチンリガーゼin vivo相互作用定量法および,前年度に準備した精製タンパク質を用いたin vitro相互作用定量法の確立を行い,既存薬を含めた化合物スクリーニングを行う.29年度が最終年度であるため、記入しない。分子細胞生物学29年度が最終年度であるため、記入しない。
ヒステリシスを含む数理モデルの解析方法の開発と妥当性の考察

コンクリート中性化や形状記憶合金の形状変化を記述する非線形偏微分方程式のシステムでは,ヒステリシスの数学的扱いが困難なため,適切性を示すことが容易ではなかった。本研究では,非線形偏微分方程式の古典的な結果を適用することで,システムに対する初期値境界値問題の解の一意性を示すことができた。また,コンクリートの腐食過程を表現するマルチスケールを用いた数理モデルの適切性や解の時間無限大での挙動に関する結果を得ることができた。この考察を通して,ヒステリシスのマルチスケールを用いた表現を着想するに至り,水分吸着現象を記述する自由境界問題を導出し,解の時間に関する大域的存在と一意性を証明することができた。交付申請書に記載した「研究の目的」において,1.コンクリートの中性化現象,2.コンクリートの腐食問題,3.形状記憶合金,について数理モデルを導出し,解析することとした。2については,前年度で十分な研究成果を挙げることができたので,今年度は,1と3について研究を進めた。今年度の研究成果は,それぞれ次の通りである。1.前年度に,コンクリート中性化現象において重要な役割を果たす水分吸着過程を記述する数理モデルとして1次元自由境界問題を導出し,その適切性を示すことができた。今年度は,まず,時間無限大において,自由境界問題の解が収束することかどうかを,数値実験によって確かめ,収束するという予想を得た。そして,自由境界の成長に関し,より詳細な仮定を設けることで,自由境界が領域の内部に留まるという条件のもと,解が収束することを証明することができた。次年度は,自由境界が領域内部に留まるための条件に付いて考察する予定である。また,多次元のコンクリート中性化問題を記述する方程式の一つである水分の質量保存を記述する準線形放物型偏微分方程式に対する初期値境界値問題の解の一意性を得ることができた。この証明において,準線形方程式の解の正則性の評価を利用している。3.今年度は,以前,考察した炊飯器に属している形状記憶合金でできている栓の動きを記述する数理モデルの妥当性を検証するために,数値実験を行った。まず,第一段階として,そのモデルを単純化した常微分方程式を用いた数理モデルを取り上げた。その結果,このモデルの解の挙動は,予想していたものと大きく異なっており,従来のモデルを再構築する必要性が明らかとなった。「研究の目的」で次の3点(1.コンクリートの中性化現象,2.コンクリートの腐食問題,3.形状記憶合金)について数理モデルを導出し,解析することとした。1と2に対する成果は,それぞれ次の通りである。今年度,1と2に集中的に取り組んだため,3に関する成果を挙げることはできなかった。1.コンクリート中性化現象に現れる水分の吸着過程を自由境界問題として表現し,その問題の解の時間に関する局所存在と一意性を証明することができた。また,この自由境界問題の近似解を求めるアルゴリズムを開発した。さらに,そのアルゴリズムで数値解が,ヒステリシス的な挙動を示した。このことから,このモデルが,今後,水分吸着過程を表現するモデルの候補の一つになりうる可能性を示したといえる。2.コンクリートの腐食問題においては,ヒステリシス効果を無視した場合において,問題の適切性と解の時間無限大での強収束を証明した。その過程で,定常問題の解の存在と一意性も得ることができた。当初,この問題では,コンパクト性が十分ではないと考えていたので,強収束を得られたのは,予定より進んだ結果である。「研究実施計画」で述べた計画に従い,共同研究者と何度か直接討議をした。その結果として,上述のような数値解析に関する十分な成果を得ることができた。また,国際会議にも予定通り参加し,成果を発表するとともに,外国人研究者との交流を進めることができた。特に,チェコのKreiji教授との討議により,コンクリート中性化問題に対する新たな課題を発見することができた。これについては,次年度に集中的に取り組む計画である。研究業績に記載した3つの「研究の目的」は,1.コンクリートの中性化現象,2.コンクリートの腐食問題,3.形状記憶合金,に関するものである。2は前年度までに,当初計画していた研究成果を上げることができた。また,3については,前年度の研究によって,予定していた数理モデルでは,考えている現象を再現するのは難しく,新たな数理モデルを構築しなければいけないことが分かった。そこで,本研究の最終年度ということもあり,本年度は成果が期待できる「1.コンクリートの中性化現象」を考察対象とすることとした。コンクリート中性化現象に関する具体的な研究課題は,「多孔質媒体における水分吸着現象を記述する自由境界問題の解析」である。この課題に対する研究成果を述べる。水分吸着現象を記述する数理モデルとして,本研究で提案する自由境界問題が妥当であることは,前年度までに,数値実験の結果から分かっている。

また,解の存在,一意性も既に証明している。本年度は,境界条件に対する物理的に意味のある仮定の下で,自由境界が固定境界に近づくことなく,解が時間無限大まで存在すること,さらに,自由境界や未知関数が時間無限大にしたとき,定常問題の解に収束することを証明することができた。前年度は,自由境界が固定境界に近づかないことを仮定して議論していたので,これは大幅な進展と言ってよい。また,数値実験の結果から,自由境界の収束速度が,定常問題の解の構造に依存するという予想を得た。さらに,当初の計画にはなかったコンクリート内における泥の粒子の成長を記述する方程式系に対しても,解の存在と一意性を証明し,それを均質化して得られる方程式を導くこともできた。非線形偏微分方程式研究の目的(1.コンクリートの中性化現象,2.コンクリートの腐食問題,3.形状記憶合金)に対し,2については,当初の目的のうち,ヒステリシスを考慮しない場合については,前年度で達成できたので,今年度は2を除いた1と3について研究を進めた。その達成度は以下の通りである。1.コンクリートの中性化問題においては,前年度に導出した水分吸着過程を記述する自由境界問題の解が,自由境界が固定境界近づかないという条件のもと,時間を無限大にしたとき収束することを証明することができた。次年度は,この条件が成り立つための十分条件を考察する予定である。また,数値実験から,解の収束速度が水分吸着度に対する仮定と関連があると予想できた。次年度はこの予想についても考察する。この予想は計画時には,気づいていなかったことである。さらに,3次元領域におけるコンクリート中性化問題においても,準線形放物型方程式の解に対する評価を適用することで,解の一意性を示した。これも,研究計画を上回る成果である。このように,1においては,当初の計画を大きく超える成果を上げることができている。3.形状記憶合金問題に対しては,従来のモデルの妥当性を検証するために,まずは,単純化した常微分方程式によるモデルに対し数値実験を行った。その結果,解の挙動が予想と大きく異なることがわかり,現象をもう一度見直し,モデリングをし直さなければいけないことが分かった。そのため,3については,次年度に当初の計画の大幅な見直しを予定しており,当初の計画通りには進んでいるとはいえない状況にある。今年度,研究の目的(1.コンクリートの中性化現象,2.コンクリートの腐食問題,3.形状記憶合金)に対し,1や2が予定より良い結果が得られそうだったので,1や2に研究時間を大きく割いたため,3については十分な研究ができなかった。そのため,項目1,2に対する達成度について述べる。1.コンクリートの中性化問題においては,水分吸着過程の新しい表現と従来の数理モデルに対する数学的結果に進展があった。より詳しく述べると,1次元領域上におけるヒステリシス効果を取り入れた水分吸着過程を記述する自由境界問題の導出に成功し,その適切性を証明することができた。
末梢循環癌細胞のＫＲＡＳ遺伝子測定によるＥＧＦＲ抗体薬の効果測定

大腸癌に対する分子標的治療薬であるEGFR抗体薬(Panitumumab, Cetuximab)はKRAS遺伝子変異型には効果を認めない。末梢循環大腸癌細胞(CTC;circulating tumor cell)中のKRAS遺伝子変異を測定することで、原発巣または転移巣の病理組織が入手できない症例においてもEGFR抗体薬の薬効を予測することが可能となり、またCTCは臨床経過中経時的に採取可能であり、治療による後天的な遺伝子変異を検索可能である。CTCの収集は、CellSearch SystemにおけるProfile kitを用いて行った。収集されたDNAからi-densyで高感度KRAS測定を試みた。12Aspに対する高感度プライマーの不具合が判明し、現在プライマーの再構築中である。高齢者や転移巣の場合では、手術で大きな組織をとってくることが困難な場合がある。そのため、内視鏡等で回収した微量な検体にてi-densyによるKRAS測定を施行した。術前に施行した内視鏡検査時の生検組織32検体測定し、KRAS陽性13症例(うちG13D 3症例)、KRAS陰性18症例、判定不可1症例であった。後に手術にて切除された原発巣の組織から得られた結果と今回内視鏡で結果が得られているものに関しては一致率100%であった。(論文投稿中)大腸癌に対する分子標的治療薬であるEGFR抗体薬(Panitumumab, Cetuximab)はKRAS遺伝子変異型には効果を認めない。(論文投稿中)大腸癌症例の血液からCellSearch systemを用いて、CTCを回収しサンプルの集積を行った。回収したCTCからDNAを抽出し、遺伝子変異検査を行うことは可能となった。i-densyにおけるKRAS遺伝子変異解析のシステムを構築した。特にprimer作成に時間を要したが、高感度検査が可能であることを明らかにした。微量なDNAから高感度にKRAS遺伝子変異解析の構築がほぼ完成した。構築できた高感度にKRAS遺伝子変異解析の装置を用いて、CTCからDNAを抽出したサンプルの検査を行う。またDirect Sequence法との整合性について組織サンプルを用いて解析する。構築できた高感度にKRAS遺伝子変異解析の装置を用いて、治療耐性時のCTCにおけるKRAS遺伝子変異の後天的変化を解析する。