hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
原発性アルドステロン症診断のためのCYP11B2標的イメージングプローブの開発

今後は、病理診断が付いている患者組織切片が新たに入手可能となったため、そちらのサンプルを用いて評価を進める。in vitroの評価系を見直したところ、組織切片を用いたCPY11B1、CPY11B2の免疫染色法を再構築する必要性が生じた。これまで、免疫染色に関しては上手く行えていなかったので、その条件検討などに想定外の時間を費やしてしまった。しかし、最近市販された抗体を用いることでこの問題を解決出来ることが分かった。in vitroの評価系の構築が遅れたため、化合物のスクリーニングが完全に終わっておらず、全ての化合物の評価までは至っていない。また、モデル動物の作製が難航しており、モデル動物を用いた体内分布実験、PET/SPECTの撮像実験までは至っていない。現在は、患者組織切片を用い、開発したプローブのオートラジオグラフィーで特異性の評価を行っている。本研究の目的は、アルドステロン産生腺腫が引き起こす原発性アルドステロン症(PA)の発症に関わる分子機構を標的として、医薬品化学および薬物動態学的な観点から分子設計を行い、副腎でのPA責任病変を高感度で検出・評価しうるPET/SPECT用分子イメージングプローブの開発を行うことにある。ステロイド生合成系において、アルドステロン合成酵素(CPY11B2)はアルドステロン合成のみに関与する酵素である一方、ステロイド11β-水酸化酵素(CPY11B1)は、アルドステロン及びコルチゾールの両方の合成に関与する。従って、アルドステロンの過剰分泌をコルチゾールの過剰分泌と区別して検出することには、CPY11B2に対する選択性が高いことが好ましい。今年度は、昨年度に引き続きインビトロ評価法の再構築、モデル動物の作製を検討した。インビトロ評価法としては、V79細胞に対してCYP11B1、CYP11B2の導入の確認を、ウエスタンブロッティング、RT-PCRを用いて行った。特にRT-PCRに関しては、独自に作成したプライマー、既報のものを含めて複数のプライマーを用いて評価を行った。その結果、mRNAレベルでCYP11B1、CYP11B2の発現を確認した。さらにウエスタンブロッティングを用いた検討により、各細胞にCYP11B1、CYP11B2タンパクが発現していることを確認した。PAモデル動物の作製に関しては、CYP11B1、CYP11B2を導入したV79細胞を、腎皮下に移植したマウスの作製を検討した。腎被膜下移植後に、HE標本で生着の確認、免疫染色でCYP11B1、CYP11B2の発現を確認した。新規化合物としては、今年度新たに1種のSPECTプローブの合成に成功した。現在は、インビトロの評価を進めている。高血圧は、患者数が35004000万人もいる国民病のひとつである。その分類は、原因が明らかでない本態性高血圧とホルモン異常などによって生じる二次性高血圧に分類される。二次性高血圧の原因疾患のひとつとして、アルドステロン産生腺腫が引き起こす原発性アルドステロン症(PA)の割合が高いことが明らかとなってきた。PAの原因病変としてのアルドステロン産生腺腫においてCYP11B2が特徴的に発現していることに着目し、CYP11B2を標的とするPET/SPECT用分子イメージングプローブの開発を行ったところ、放射性フッ素キノリン誘導体の中で有望な化合物を見出した。プローブ開発においては、H25年度の成果を基に構造活性相関研究を行いCYP11B2への選択性に関与している部位に着目し誘導化を行った。
ニワトリB細胞株を用いたヒトDNA修復遺伝子のSNPの機能評価

ヒト遺伝子のSNP解析で得られた情報は、個々のSNPの機能評価の裏付けがあって初めて生物学的意味を持つ。現在までに膨大な数のSNPが同定されているが、遺伝子のコーディング領域に存在するSNPと遺伝子産物の構造や機能の変化、すなわち質的影響に関してはほとんど解析されていない。本研究では、SNPが遺伝子機能に与える質的影響について、SNPをもつDNA修復遺伝子の機能を細胞レベルで容易に判定できるニワトリDT40細胞株を用いて、ヒトDNA修復遺伝子Rad51、XRCC2について調べた。DT40細胞株の外来DNA断片を導入した時極めて高頻度に相同組換えを起こす性質を利用して、ニワトリRad51、XRCC2を破壊した変異細胞株に、それぞれヒトRad51、XRCC2のアミノ酸変異を伴う一塩基多型を含むcDNAと野生型のcDNAを細胞に導入した。ヒト遺伝子の発現を確認した後、それぞれの細胞株の放射線或はシスプラチンに対する感受性を、生存する細胞数を指標に比較した。Rad51に関しては、野生型、変異型cDNAを導入し、安定に発現する細胞株を数株づつ樹立した。ガンマ線照射、シスプラチン処理の両法を用いてSNPの遺伝子機能に対する影響を調べたが、特に大きな差は見られなかった。XRCC2も同様にヒト遺伝子を安定して発現する細胞株を数株づつ樹立し、Rad51と同様に、ガンマ線照射、シスプラチン処理を行った。ガンマ線照射では野生型、変異型の間に大きな差は見られなかった。これはXRCC2はガンマ線によるDNAダメージの修復には深く関わっていないという報告と一致していた。一方シスプラチン処理では、変異型細胞株が野生型に対して約2倍感受性が高い結果が、第一回目のアッセイで得られた。現在、細胞株の数を増やして再現性の確認を行っているこの系を用いるとSNPを持つヒトDNA修復遺伝子の機能を迅速に決定でき、多型・変異遺伝子の機能評価の方法として、最も感度がよく信頼性のある方法である。現在さらに遺伝子数を増やして、系統的にヒトSNPの機能評価を進めている。
咬筋組織血流解析による顎関節症の理学療法およびスプリント療法の有効性に関する検討

本研究の目的は,顎関節症の筋症状に対して理学療法およびスプリント療法が有効か否かの科学的根拠を咬筋の組織血流状態解析の観点から明らかにすることである.1.方法咬筋組織血流量の測定には,3波長型近赤外分光血流計を用い,酸素飽和度(StO2),総ヘモグロビン量,オキシヘモグロビン量,デオキシヘモグロビン量を解析した.理学療法は,20分間の温罨法および30分間の低周波療法(マイオモニター)とし,被験者は,顎口腔系に異常が認められない健常者とした.スプリント療法の被験者は,筋症状を有する顎関節症患者とし,スタビリゼーションスプリントを用いた.2.結果および考察1)理学療法温罨法では,温め後において,StO2,総ヘモグロビン量,オキシヘモグロビン量に有意な増加が認められた.一方,デオキシヘモグロビン量では有意な変化は認められなかった.マイオモニター後においては,何れの測定項目に関しても有意な変化は認められなかった.これらの結果から,温罨法が深部筋組織の血流に影響を及ぼすことが明らかになり,しかもその効果としては,単なる血流量の増加だけではなく,StO2改善の効果もあることが示された.マイオモニターでは,電気刺激により筋緊張を緩和する作用のほかに,咀嚼筋の不随意的な反復収縮による血行の増大効果があるとする考えもあるが,今回の結果からは明らかな血流の改善を示すデータは得られなかった.2)スプリント療法安静時では,スプリント装着時の方が,スプリント非装着時よりもStO2は高かった.クレンチング中,クレンチング後のいずれにおいてもスプリント装着時の方が,スプリント非装着時よりも総ヘモグロビン量は大きかった.咬筋組織血流状態は短期的には,スプリントにより影響を受けることが示されたが,継続使用の場合の影響について今後さらなる研究が必要と考えられた.本研究の目的は,顎関節症の筋症状に対して理学療法およびスプリント療法が有効か否かの科学的根拠を咬筋の組織血流状態解析の観点から明らかにすることである.1.方法咬筋組織血流量の測定には,3波長型近赤外分光血流計を用い,酸素飽和度(StO2),総ヘモグロビン量,オキシヘモグロビン量,デオキシヘモグロビン量を解析した.理学療法は,20分間の温罨法および30分間の低周波療法(マイオモニター)とし,被験者は,顎口腔系に異常が認められない健常者とした.スプリント療法の被験者は,筋症状を有する顎関節症患者とし,スタビリゼーションスプリントを用いた.2.結果および考察1)理学療法温罨法では,温め後において,StO2,総ヘモグロビン量,オキシヘモグロビン量に有意な増加が認められた.一方,デオキシヘモグロビン量では有意な変化は認められなかった.マイオモニター後においては,何れの測定項目に関しても有意な変化は認められなかった.これらの結果から,温罨法が深部筋組織の血流に影響を及ぼすことが明らかになり,しかもその効果としては,単なる血流量の増加だけではなく,StO2改善の効果もあることが示された.マイオモニターでは,電気刺激により筋緊張を緩和する作用のほかに,咀嚼筋の不随意的な反復収縮による血行の増大効果があるとする考えもあるが,今回の結果からは明らかな血流の改善を示すデータは得られなかった.2)スプリント療法安静時では,スプリント装着時の方が,スプリント非装着時よりもStO2は高かった.クレンチング中,クレンチング後のいずれにおいてもスプリント装着時の方が,スプリント非装着時よりも総ヘモグロビン量は大きかった.咬筋組織血流状態は短期的には,スプリントにより影響を受けることが示されたが,継続使用の場合の影響について今後さらなる研究が必要と考えられた.本研究の目的は,顎関節症の筋症状に対して理学療法およびスプリント療法が有効か否かの科学的根拠を咬筋の組織血流状態解析の観点から明らかにすることである.本年度は,このうち理学療法の咬筋筋組織血流動態に対する改善効果を検討した.1.方法被験者は,顎口腔系に異常が認められない健常者とした.咬筋組織血流量の測定には,3波長型近赤外分光血流計を用い,酸素飽和度(StO2),総ヘモグロビン量,オキシヘモグロビン量,デオキシヘモグロビン量を解析した.理学療法は,20分間の温罨法および30分間の低周波療法(マイオモニター)とした.血流測定時期は,各療法開始前,終了直後,終了後5,10,15,20分経過時とした.2.結果温罨法では,温め後において,StO2,総ヘモグロビン量,オキシヘモグロビン量に有意な増加が認められた.一方,デオキシヘモグロビン量では有意な変化は認められなかった.マイオモニター後においては,何れの測定項目に関しても有意な変化は認められなかった.3.考察温罨法の効果には,組織の温度を上昇させることによる血管の拡張,血行の増大があると言われている.

一方,温罨法では熱が皮膚表面から1cm以上の深さには到達せず,表層を厚い脂肪組織が覆っているような筋組織に対しては,効果はあまり期待できないという考えもある.今回の結果から,温罨法が深部筋組織の血流に影響を及ぼすことが明らかになり,しかもその効果としては,単なる血流量の増加だけではなく,StO2改善の効果もある可能性が示された.マイオモニターでは,電気刺激により筋緊張を緩和する作用のほかに,咀嚼筋の不随意的な反復収縮による血行の増大効果があるとする考えもある.しかし,今回の結果からは明らかな血流の改善を示すデータは得られなかった.このことから,血行の改善に関しては,マイオモニターより温罨法の方が有効であると考えられた.本研究の目的は,顎関節症の筋症状に対して理学療法およびスプリント療法が有効か否かの科学的根拠を咬筋の組織血流状態解析の観点から明らかにすることである.1.方法咬筋組織血流量の測定には,3波長型近赤外分光血流計を用い,酸素飽和度(StO2),総ヘモグロビン量,オキシヘモグロビン量,デオキシヘモグロビン量を解析した.理学療法は,20分間の温罨法および30分間の低周波療法(マイオモニター)とし,被験者は,顎口腔系に異常が認められない健常者とした.スプリント療法の被験者は,筋症状を有する顎関節症患者とし,スタビリゼーションスプリントを用いた.2.結果および考察1)理学療法温罨法では,温め後において,StO2,総ヘモグロビン量,オキシヘモグロビン量に有意な増加が認められた.一方,デオキシヘモグロビン量では有意な変化は認められなかった.マイオモニター後においては,何れの測定項目に関しても有意な変化は認められなかった.これらの結果から,温罨法が深部筋組織の血流に影響を及ぼすことが明らかになり,しかもその効果としては,単なる血流量の増加だけではなく,StO2改善の効果もあることが示された.マイオモニターでは,電気刺激により筋緊張を緩和する作用のほかに,咀嚼筋の不随意的な反復収縮による血行の増大効果があるとする考えもあるが,今回の結果からは明らかな血流の改善を示すデータは得られなかった.2)スプリント療法安静時では,スプリント装着時の方が,スプリント非装着時よりもStO2は高かった.クレンチング中,クレンチング後のいずれにおいてもスプリント装着時の方が,スプリント非装着時よりもの総ヘモグロビン量は大きかった.咬筋組織血流状態は短期的には,スプリントにより影響を受けることが示されたが,継続使用の場合の影響について今後さらなる研究が必要と考えられた.
サツマイモの「つるぼけ」特性を活用した土壌セシウムの吸収浄化と回収植物体の処理

サツマイモは窒素(N)やカリウム(K)吸収能が高く、N多肥で茎葉生育が促進され塊根肥大しないつるぼけになり、K要求が高くなる。これを用いて化学的性質が類似する原発事故で土壌を汚染したセシウム(Cs)吸収を検討した。葉取り用品種すいおうを、砂質と粘土質土壌で非放射性Cs表層施用とN多肥K少肥で栽培した。砂質土ではN多肥でつるぼけになりCs吸収も増加して収支0.420.67で6383%が地上部へ移行集積した。粘土質土ではつるぼけせず、Cs収支は低く大部分が塊根に集積した。回収植物体処理に交換態イオン抽出法を用い、茎葉の乾燥粉砕試料で振盪を十分に行うとKと同様にCsも100%抽出できた。原発事故で放出され半減期が30.2年のセシウム(Cs)-137は、集積した農地土壌等からの除去が必要である。浄化用植物には高い吸収能と大きなバイオマスが必要で、つる性であるがサツマイモを用いた。サツマイモは窒素(N)やカリウム(K)吸収能が高く土壌からの収奪量も大きい。施肥Nが多いと吸収Nも増加して茎葉生育が促進され、塊根は肥大せず「つるぼけ」となり、塊根肥大のためにK要求が高くなる。この特性を活用し、Kと化学的性質が類似しているCs吸収を行うことが可能と考えた。砂質の真砂土畑圃場でコガネセンガンを用い、K少肥でNを標準から多肥として非放射性Csを表層施用して栽培を行った。コガネセンガンはつるぼけし難く塊根は多収で500kg N/ha以上の施肥で塊根生育が停滞し、つるぼけ状態となりCs吸収量も大きかったが、大部分が塊根に集積した。粘土質のグライ土畑圃場に500kg N/haとK無施肥で、コガネセンガンを用いて畦立てとマルチ、鳴門金時を用いて種イモ直播の影響を調査した。マルチ下表層土に細根の密生が認められたが、表層集積したCsが畦立て時に拡散したため吸収増加は認められなかった。Cs吸収は平植えでも大きくマルチによる増加が期待できる。直播は移植栽培より省力化が可能であるが親イモ肥大が大きく地下部および全植物体のCs集積は同等であった。Csを吸収させたサツマイモ茎葉を用い、850°Cで1時間の加熱によるフロー解析と植物体の交換態イオン抽出法を用いた抽出処理に対する試料の乾燥度合いと粉砕程度や酸濃度を検討した。茎葉乾物試料は燃焼で重量は1/10になったがCsの64%が飛灰となり、主灰のCs濃度は3倍になった。焼却による減容化処理ではCs飛散防止対策が不可欠である。1M塩酸での1時間振とう後の放置でCs抽出は新鮮物で60%、その他は80%程度で風乾物細断処理が適切と考えられた。酸濃度の上昇で抽出割合は低下した。原発事故により放出された放射性物質で問題視されているのは半減期が比較的長いセシウム(Cs)-137であり、農地土壌等からの除去が必要でCs集積植物栽培による吸収浄化が有望と考えられる。サツマイモは窒素(N)やカリウム(K)の土壌からの収奪量が大きく、N吸収が増大すると茎葉生育が促進されて根は細根になる「つるぼけ」特性を持ち塊根肥大のためにK要求性が高くなる。この特性を活用して吸収ではKと競合するが、よく似た性質を持つCsの土壌からの吸収浄化を行うことができると考えられる。砂質と粘土質の圃場で、N(3、10、20、30g/m2)とK(5、10g/m2)の施肥レベルを組み合わせ、非放射性の塩化セシウム試薬を50g Cs/m2表層施用した。茎葉生育が旺盛で多収のコガネセンガンのつる苗を30cm間隔で植え付け、栽培後の植物体と土壌を分析した。また、真砂土のポットで3、10g N/m2と5、10g K/m2の施肥で非放射性Csを50g/m2表層施用してベニアズマのポット苗を植え付けて栽培し、Cs動態を調査した。さらに、圃場栽培植物体の茎葉を用いて植物体の交換態イオン抽出法を適用し、試料の性状や形状によるCs抽出を検討した。圃場ではCs吸収は砂質土で高く、粘土ではK等の他の陽イオン吸収量が多く競合によりCs吸収量は低かった。粘土ではビニールマルチでCs吸収が増加し、マルチ下の表層土に根の密生が認められた。ポットでは栽培後に大部分のCsが土壌に残留し、固定態80%、交換態20%で、水溶性はごくわずかであった。圃場栽培植物体茎葉からのK抽出割合は全て100%であったが、Csは新鮮物細断と乾物微粉砕が最大で67%で、抽出でもKとの競合があると考えられた。サツマイモの「つるぼけ」は認められず、Cs施用量が多過ぎたため、植物体移行係数は圃場0.01、ポット0.03の最大値であった。

サツマイモの茎葉はつる性であるがバイオマス生産は大きく、広い環境適応性を持ち、土壌の窒素(N)やカリウム(K)吸収能が高い収奪型で、施肥N増加に伴って吸収も増大して地上部の生育が促進され、塊根は肥大しない「つるぼけ」特性を持ちK要求が高くなる。この特性を活用して化学的性質が類似する原発事故での放射性物質の飛散により土壌を汚染したセシウム(Cs)吸収が可能ではないかと考え、砂質と粘土質土壌で非放射性Csを1g/m2表層施用し、5g K2O/m2でN施肥を変えて葉取りサツマイモのヘルシー菜・すいおうを栽培した。N(g/m2)は基肥5、50、100とし、砂質土壌でのみ50と100を4等分した3回刈取の追肥区を設定した。全区で塊根が形成されたが、砂質土壌でN施肥の増加に伴い茎葉生育が促進され、塊根肥大は抑制されたため、つるぼけ状態となった。地上部の茎葉生育とNおよびKの吸収は全量基肥100N区で最大で、刈取追肥区は刈り取った茎葉を加えた合計の生育量でも小さかったがN吸収は同等でCs吸収は刈取追肥区で大きく、地上部移行集積割合も高かった。茎葉の再生のために養分吸収等が活発に行われるためと考えられたが、繁茂した葉身と葉柄のつるからの刈取は手間と時間を要する作業であった。砂質土壌の多N区ではCs吸収と茎葉への移行割合は高く6479%が地上部に集積し、栽培後土壌のCsの交換態/全量の割合は3035%であった。粘土質土壌でもN施肥の増加に伴って茎葉の生育は増大したが塊根も肥大し、つるぼけは認められなかった。NとKおよびCs吸収も生育と同様でK供給能が高いことが示され、Cs吸収は収支(吸収量/施用量)が0.140.21で砂質土壌よりも小さく、地下部の塊根に8385%が集積した。Csの全量ー交換態の割合は8588%と高く、植物が吸収できない粘土鉱物による固定の多さが示された。サツマイモの茎葉はつる性であるがバイオマス生産量は大きく、窒素(N)やカリウム(K)吸収能が高い収奪型で、施肥N増加で茎葉生育が促進され、塊根は肥大しない「つるぼけ」特性を持ち、K要求性が高くなる。この特性を活用して化学的性質が類似する原発事故で土壌を汚染したセシウム(Cs)の吸収を検討した。バイオマス生産の大きい多収品種コガネセンガンを用いたがつるぼけを起こすことができなかったため、葉取り用ヘルシー菜品種すいおうを用い、砂質と粘土質土壌で多N施肥(標準の1020倍)とK少肥で、非放射性Cs1g/m2表層施用で栽培した。砂質土で多N施肥により生育は地上部>地下部のつるぼけ状態となり、Cs吸収も増加して収支(吸収量/施用量)は0.420.67で、つるぼけに応じて6383%が地上部へ移行集積した。粘土質土でも茎葉は増加したが塊根肥大も大きくつるぼけせず、Cs収支は0.140.29と低く8185%が塊根に集積した。栽培後土壌の固定態Cs割合は砂質土で6573%、粘土質土で8588%であった。回収植物体処理に交換態イオン抽出法を用いると、茎葉の風乾物や乾物の粗粉砕試料で振盪を十分に行うことでKと同様にCsもほぼ100%抽出できた。最終年度には硫安多肥はN収支が1を下回り土壌残存するため、また、刈取追肥でCs吸収が大きかったため、緩効性の肥効調節型肥料で実験を行った。植物による固定態Cs吸収は不可能といわれるが、非交換態K吸収も見出されているので検討する必要がある。Csは放射性と非放射性同位体で挙動が異なると指摘されたが自身で検証できないので、議論が収束してから研究報告等の発表を行いたいと考えている。圃場栽培で意図しなかったが、猪の侵入よって少N施肥で塊根が形成されていれば掘り返して食害されるが、多N施肥で地上部の茎葉が繁茂してつるぼけしていれば掘り返されなかった。サツマイモは窒素(N)やカリウム(K)吸収能が高く、N多肥で茎葉生育が促進され塊根肥大しないつるぼけになり、K要求が高くなる。これを用いて化学的性質が類似する原発事故で土壌を汚染したセシウム(Cs)吸収を検討した。葉取り用品種すいおうを、砂質と粘土質土壌で非放射性Cs表層施用とN多肥K少肥で栽培した。砂質土ではN多肥でつるぼけになりCs
糖尿病の遺伝素因の解明とコホート集団の維持

罹患同胞対法全ゲノム解析により、21番染色体上に2型糖尿病の感受性領域を同定し、2003年に報告した。同領域の原因遺伝子/SNPの同定を継続し、2008年に新規の糖尿病感受性SNPを同定した。2型糖尿病1668人対正常者1700人でOR=1.76(1.37-2.25)、p<1.5x10-6であり、多数例での再現性が確認できた。また、網膜症の感受性SNPとしてVEGF遺伝子2578多型を同定し、特許出願中である。さらに日本で1例目の巨大欠失によるMODY5例を同定し報告した。さらにエクソン欠失例も見出し報告した。薬剤応答遺伝子:糖尿病治療薬のひとつであるメトフォルミンの血糖改善効果と本薬剤の肝細胞での取り込み蛋白であるOCT-1遺伝子多型との関連を66症例で検討した。その結果、2種類の多型のうち一方では薬剤感受性を増強し、他方は低下させる方向に作用する可能性が認められたが、有意には至らなかった(2008年日本糖尿病学会で報告の予定)。2型糖尿病感受性SNP:日本人2型糖尿病感受性SNPの同定が最終目標。全ゲノム解析で我々が見出した領域に存在する感受性SNPの同定作業を継続している。2007年には染色体21番領域で有意なSNPが2箇所見出され(P<0.001)、またハプロタイプ解析でも支持された。新たな集団においても再現性が確認された(2007年糖尿病学会で発表)。従って、現在はSNPの細胞レベルでの機能解析を続行中である。糖尿病網膜症関連SNP:VEGF遺伝子2578AA多型と網膜症の進展に有意な関連(OR=7.5)を認めたので、3年後の眼底所見を追跡調査した。その結果、この多型を有する者においてそれ以外の者に比べて網膜症の進展が有意であった(2007年糖尿病学会で発表)。なお、PEDF遺伝子多型と網膜症との関連は我々の検討では認められなかった。MODY原因遺伝子:最近MODY5(HNF-1β)で、hemizygote症例が報告された。我々のMODYパネルを用いて同様の検討を行い、日本で1例目のMODY5 hemizygote症例を見出して報告した(2007年日本人類遺伝学会)。その後microarrayでの検討によりdeletionの範囲も決定した(2008年糖尿病学会で報告予定)。(1)以前から継続中の、罹患同胞対法による全ゲノム解析の結果に基づいた、日本人2型糖尿病感受性SNPの同定に関しては、21番染色体上の連鎖の可能性が示唆された領域(LOD=2.42)について症例対照相関解析を行い、2つの有意なSNPを見出した。別の2セットのサンプルでさらに検討した結果、1個のSNPにおいてp=6.5x10-3,OR=1.87,p=4.9x10-3,OR=1.58と有意な再現性が確認された。このSNPはインスリン分泌に関連することが示され、risk alleleを有する症例はより早くインスリン治療に移行することが示された。また、risk alleleはmRNAレベルを上昇させた。細胞レベルで該当遺伝子発現を抑制するとインスリン分泌が改善し、インスリン分泌不全を示す糖尿病モデル動物においてsiRNAで本遺伝子の発現を抑制すると、インスリン分泌の回復と血糖の改善が有意に認められた(特許申請済み、現在投稿中)。(2)常染色体優性遺伝を示す糖尿病(MODY)において、巨大欠失によるMODY5遺伝子全体の欠失例を見出した。また、膵体尾部欠損例においても同一領域の欠失を持った症例を同定した。このことから、巨大欠失のホットスポットが示唆された。マイクロアレイ解析では欠失を起こした部分にはゲノム反復配列が認められ、そのためにゲノム構造異常が生じやすいと考えられた。また、同領域の増幅例も同定した。さらに、単独エクソンの欠失例や増幅例についても検討中である。
障害・慢性的疾病等による困難を抱える若者の主観世界の理解とその方法論の検討

本研究では,障害や慢性疾患等によって独自な「生きづらさ」を抱える若者たちを通して,現代社会に生きる若者をいかに理解するかという問題に接近する。そのために1独自な困難さを抱えた若者の「生(Life)の現実」を,質的・事例的な聞き取り調査により明らかにするとともに,2その調査方法とケース記述との相互的な関係の省察を通して,当事者の主観世界に接近するための方法論に関する問題の所在を検討することを目的とする。その際,「障害」や「疾患」という生物的制約を考慮しつつも,さらに彼らの語りの中に潜む「一人称的な世界(主観世界)」に注目し,社会的・文化的な視点を位置づけた若者理解の可能性を探るものである。今年度も昨年度に続き,障害や慢性疾患のある当事者への聞き取り調査及び研究報告会を実施した。加えて,聞き取り調査において,今年度から高口僚太朗が臨床社会学,医療社会学の立場から本研究に研究分担者として加わったことで,昨年度以上に充実した取り組みが可能となった。また,本研究の課題の一つである方法論に関する問題の所在の検討についても進捗があった。ナラティブアプローチを用いた研究に触れたことでそれは得られた。さらに今年度は,ドイツでの調査も実施した。具体的に,「ベルリン自閉症児・発達障害児親の会」への聞き取りを実施した。今年度の実績は,著書1冊,投稿論文3本,学会報告4報,依頼報告1報,全体研究会1回(2018年6月10日実施),海外調査1件である。先述の通り,高口僚太朗が研究分担者として加わったことで,慢性疾患の当事者を対象とした領域で大きな成果を上げたと言える。とくに,小児期発症1型糖尿病,ターナー症候群の当事者を対象とした研究は,本研究課題においても新たな視座を与える結果となった。障害のある当事者の内面理解においては,これまで同様,研究代表者(土岐邦彦)と研究分担者の舩越高樹が行った。今年度の取り組みを契機に,本研究課題が対象とする障害のある当事者と慢性疾患の当事者とで共通点があることが明らかとなった。具体的に,本研究課題が射程としている研究対象者が「一見,普通に生活しているように見える人々」であるという点である。別言すれば,診断名が異なる当事者の背景には,いわば,他者からの眼差しにおいて「一見,普通に生活できているように見える」ことでむしろ生じている困難さやしんどさがあるのではないかと言える。今後は,当事者に孕むそうした背景や事情にも焦点を当てた聞き取り調査を実施してゆく。そして,そのことが当事者の主観世界にどのような影響を及ぼしているのかまで捉えようと考えている。また,ドイツでの調査は次年度も継続し,研究成果として日本臨床教育学会で発表する予定である。平成29年度は、二つのテーマで研究代表者と研究分担者がそれぞれのフィールドでインタビュー調査を行った。研究代表者は、「心身の不調で職を離れた若者が再び社会に登場するまでの心の変化」について肢体不自由の若者を対象にインタビュー調査を行った。本対象者は、肢体不自由という障害によりさまざまな活動を制限されてきたが、その就職・離職の過程においてどのような「自己の育ち」が見られるかを検討した。対象者は「みんなに合わせて頑張らなければならないという信念」を持ち続けており、それが就労における心身のストレスを生み、不適応を経験することになった。インタビューで得られた語りを通して、対象者の就職・離職の過程において、「他者と比較してできない自分という自己認識」から、「そこにいること自体が肯定される実感の体験」への移行が見てとれた。本研究の一部は、日本臨床教育学会第7回研究大会で報告した。研究分担者は、障害学生支援担当としてかかわりを持つことになった、発達障害のある学生の「今」と「これまでの育ちの過程」を比較し、「他者とのかかわり」の中で育ってきた自己と、「現在育ちつつある自己」の比較をし、大学生生活初期の段階での発達障害のある学生の育ちについて明らかにするため、インタビューおよび分析を行っている。この調査は平成30年度も引き続き継続して実施する。上記二つのテーマに関し、関係専門領域(社会学、歴史学、教育学、臨床教育学)の研究者を招聘して「全体研究会」を3回開催し、検討課題の抽出および整理を行った。代表者および分担者、さらに研究協力者との連絡・連携を綿密に行い、それぞれの役割と課題をもとに、逐次相互に点検し合いながら行えたことが、順調な研究の進展に寄与したものと思われる。

また,本研究の課題の一つである方法論に関する問題の所在の検討についても進捗があった。ナラティブアプローチを用いた研究に触れたことでそれは得られた。さらに今年度は,ドイツでの調査も実施した。具体的に,「ベルリン自閉症児・発達障害児親の会」への聞き取りを実施した。今年度の実績は,著書1冊,投稿論文3本,学会報告4報,依頼報告1報,全体研究会1回(2018年6月10日実施),海外調査1件である。先述の通り,高口僚太朗が研究分担者として加わったことで,慢性疾患の当事者を対象とした領域で大きな成果を上げたと言える。とくに,小児期発症1型糖尿病,ターナー症候群の当事者を対象とした研究は,本研究課題においても新たな視座を与える結果となった。障害のある当事者の内面理解においては,これまで同様,研究代表者(土岐邦彦)と研究分担者の舩越高樹が行った。研究代表者は、肢体不自由の若者以外にも発達障害のある若者もインタビュー調査の対象にし、社会との向き合い方に様々な困難を抱える若者の生活意識・自己意識を分析する。研究分担者は、大学在学中にそれまでの育ちの中での経験とは異なる、幅広い経験や出会いの中で認識される、「育ちつつある自己」について明らかにするためのインタビュー調査と、卒業後を意識して自己を見つめなおす機会に触れることになった学生の自己の育ちを経験するプロセスについて明らかにするための平成31年度に向けた予備的調査を実施する予定である。なお、研究協力者(高口)は慢性的疾患をもつ若者の自己の育ちをテーマにインタビュー調査を行う。今年度も関連専門領域の研究者を招聘して「全体研究会」を計画し、各自の研究テーマを深化させるべく理論的学習を行う。今年度の取り組みを契機に,本研究課題が対象とする障害のある当事者と慢性疾患の当事者とで共通点があることが明らかとなった。具体的に,本研究課題が射程としている研究対象者が「一見,普通に生活しているように見える人々」であるという点である。別言すれば,診断名が異なる当事者の背景には,いわば,他者からの眼差しにおいて「一見,普通に生活できているように見える」ことでむしろ生じている困難さやしんどさがあるのではないかと言える。今後は,当事者に孕むそうした背景や事情にも焦点を当てた聞き取り調査を実施してゆく。そして,そのことが当事者の主観世界にどのような影響を及ぼしているのかまで捉えようと考えている。また,ドイツでの調査は次年度も継続し,研究成果として日本臨床教育学会で発表する予定である。研究協力者の職場異動により、旅費として予定していた金額以下の使用におさまったために助成金の余りが生じる結果となった。この次年度使用額は調査に関わる人件費に充てていきたいと考えている。今年度は想定していた以上の調査結果が得られた。このことにより,今年度の調査スケジュールを見直し,次年度実施可能な調査は次年度に変更した。これにより,旅費も次年度に繰り越すことにした。
成長ホルモン放出に関与する新しいG蛋白共役型受容体の遺伝子発現制御機構

平成8年米国のMerck社は、合成の成長ホルモン(GH)放出ペプチド(GHRP)を結合するGH secretagogue(GHS)受容体をヒト、ブタでcloningし、GHの分泌制御には視床下部ホルモンであるGH放出ホルモン(GRH)、GH放出抑制ホルモンであるsomatostatinに加えて、本体が不明の内在性GHS受容体リガンドが関与することが確実となった。このGHS受容体の発現制御機構を明らかにする目的で、まず我々は平成9年度にラットGHS受容体のcDNA断片、即ち翻訳領域の5'端、中央部、3'端の3種のcDNA断片をRT-PCR法でcloningした。そして、RACE法を用い、5'、3'の非翻訳領域を含む1759塩基の全長cDNAのcloningに成功した。このラットGHS受容体は7回膜貫通型の典型的なG蛋白共役型受容体に属し、ヒト、ブタの受容体とは94-95%の高い相同性を認めた。この受容体の視床下部を中心にした脳内分布をdigoxigenin標識cRNAprobeを用いるin situ hybridization検討したところ、GHS受容体のmRNAは視床下部のGRHを産生ずる弓状核、腹内側核に検出された。GHSリガンドがGH分泌調節にGRHを介して関与することを支持する所見である。平成10年度にはGHS受容体のmRNAの定量測定系の確立を詳細に検討した。その結果、Northern法では検出不可能と結論し、ついに極微量のGHS受容体mRNAを定量しうる世界初の高感度RNase protectionassayの確立に成功した。興味あることに、ラットGHS受容体mRNAは下垂体より視床下部に3倍も優位に発現し、ヒトGH処置により下垂体では明確な抑制が観察されたが、視床下部では変動しなかった。GHS受容体の遺伝子発現はGHによりfeedback制御を受けることが示唆されるが、その制御機構は下垂体と視床下部で異なる可能性がある。今年度の研究では、まず成長ホルモン放出因子(growth hormone secretagotue,GHS)のラット受容体の全長cDNAをcloningし、そのmRNAの測定系を確立し、遺伝子発現調節に関して少なくとも予備的実験をおこなうことを目的としたが、この目標を十分に達成し得た。まず最初に我々は、ラットGHS受容体の翻訳領域の5端、中央部、3端の3種のcDNA断片の核酸配列を決定した。この配列をもとに、ほぼ全長に近い約935塩基のcDNAをPCRで増幅した。このラットGHS受容体は7回膜貫通型の典型的なG蛋白共役型受容体の核酸構造を示し、ラット、ヒトの受容体とは94-95%の高い相同性を認めた。次に我々は、この受容体の視床下部を中心にした脳内分布を検討した。この手段として、digoxigeninで標識した935塩基のcRNAprobeを用いるin situ hybridizationを確立した。GHS受容体のmRNAは、視床下部の弓状核、腹内側核のみならず海馬、歯状回にも検出され、GHSリガンドが下垂体機能の調節のみならず、記憶、学習等の高次神経機能にも関与することが示唆された。最後に我々は、微量のGHS受容体mRNAを定量しうる高感度のRNase protection assayの確立にも成功した。活性型のIa型のみ認識するプローブと、C端が欠損したIb受容体も認識するプローブを用いた比較定量の結果、Ib型は存在しても極めて少ないと予想された。

ラットGHS受容体mRNAは下垂体より視床下部に優位に発現し、ヒト成長ホルモンで処置により明確な変動が観察されたので、GHS受容体の遺伝子発現は成長ホルモンにより制御を受ける可能性が強く示唆された。したがって、今後の研究の発展に必要にして十分な初期成果をあげられたと思われる。平成10年度の研究は、前年度にクローニングし、かつ脳内分布をin situ hybridizationで明らかにしたラット成長ホルモン放出因子(growth hormone secretagogue,GHS)受容体の遺伝子発現制御につき基礎的実験を行った。まず、標準的なmRNA検出法であるノーザンブロット法を用いたがほぼ全長に近い953塩基のcRNAプローブを用いてもシグナルは検出できず、遺伝子発現量は極めて少ないことが判明した。そこで、クローニングした翻訳領域の5′′端、中央部、3′′端の3種のcDNA断片からcRNAプローブを作成し、感度と特異性に優れるといわれているRNase protection assayを確立した。その結果、5'端のプローブが最も再現性と定量性に優れており、以後これを測定用のプローブとした。視床下部と下垂体でGHS受容体遺伝子発現量を比較したところ、視床下部に比較して下垂体のmRNA発現量は3-4分の1と低く満足のいくシグナル強度が得られなかった。下垂体のGHS受容体mRNAレベルはGRH受容体mRNAの10%以下であり、さらにラット下垂体前葉細胞の初代培養系ではシグナルが検出できないほど低値であった。そこで、検出感度を向上させるためプローブの^<32>P放射活性を増し、ハイブリの条件を変更し、またimaging plateへの暴露時間を延長して感度を約10倍向上させた。この改良により、極めて安定したGHS受容体mRNA測定系の確率に世界で初めて成功した。ラットGHS受容体mRNAは5日間にわたるヒトGHの処置により下垂体では有意な抑制が観察され、下垂体GHS受容体の遺伝子発現はGHにより負のfeedback制御を受けることが示唆された。一方、遺伝子発現量の多い視床下部ではGHS受容体mRNAレベルはヒトGH処置で変動しなかった。したがって、GHS受容体の発現制御機構は下垂体と視床下部で異なる可能性がある。
強靭性多孔質ヒドロキシアパタイト人工骨素材の開発

1.硝酸カルシウム四水和物とリン酸水素二アンモニウムから半回分式均一系反応によって微細な棒状のヒドロキシアパタイト結晶と球状のヒドロキシアパタイト粒子を調製した。この球状ヒドロキシアパタイト粒子は反応系内に1×10^<-3>mol/lの濃度のクエン酸ナトリウムを共存させることによって得られた。2.寒天ゲル中での球晶状ヒドロコシアパタイトの合成および粒度制御に関する検討を行った。ゲル内に少量の添加物を共存させるとヒドロキシアパタイトあるいは非晶質リン酸カルシウムが球形に近い形で生成することを明らかにした。詳細については検討中である。3.加熱によって生じるヒドロキシアパタイトの他化合物への変化についても検討を行った。ヒドロキシアパタイトのCa/Pモル比が理論値の1.67に近い場合は10001200°Cに3時間加熱しても変化は起こらなかった。Ca/Pモル比の値が小さい場合はβーリン酸カルシウムに変化した。4.仮焼によるヒドロキシアパタイト粒子の粒度変化についても興味深い新しい知見を得た。仮焼温度が低下するにつれて粒度分布の幅が小さくなった。5.ヒドロキシアパタイトの加圧形成体と焼結体について内部の均質性をX線CTスキャナを使用して検討した。加圧形成体より焼結体の方がいくらか不均質であった。6.マイクロストラクチャ-の異なるヒドロキシアパタイトを加圧成形,焼結して,相対密度が49.485.5%の焼結体を得た。これらの焼結体の破壊靭性をSEVNB法によっと測定し0.130.76MPam^<1/2>の値を得た。相対密度の増大にともなって破壊靭性も直線的に増大することを明らかにした。1.補助金で購入したゲル法反応器を用いて、寒天デル中での球晶状ヒドロキシアパタイトの合成および粒度制御に関する検討を、やや遅れはあるが、ほぼ予定通り行っている。特定の添加物をゲルに少量共存させると、ヒドロキシアパタイトあるいは非晶質リン酸カルシウムが球形に近い形態で生成することが確認でき、現在、詳細な検討を行っている。2.既存の半回分式小型反応器を用い、補助金で購入したpH/イオンメ-タなどを利用して反応条件を厳密に制御しながら反応を行うことによって、球晶状ヒドロキシアパタイトの合成を試みている。きわめて微細ではあるが、ピロリン酸と水酸化カルシウムの半回分式不均一系反応によって球形のヒドロキシアパタイトが合成できることを確認した。より大きく成長させることを現在検討中である。3.焼結用粉体について、充填特性など成形条件に関する基礎的検討を行っている。平成2年度からは、予定通りヒドロキシアパタイトの成形条件についての検討に入れる見込みである。4.焼結体の内部観察に関する基礎的検討をCTスキャナを用いて行っている。二酸化チタン含有ゼラチンマイクロスフェアをモデル物質として選び、その加圧成形体についてCT値の分布を測定し、成形体内部の均質性を評価することを試みている。このモデル物質については均質性の評価方法がほぼ確立された段階に至ったが、焼結体そのものについては、まだ実験が始められたばかりである。今後、当初の計画を達成すべく、研究を加速するつもりである。1.精密pHメ-タなどを用い反応条件を厳しく制御して半回分式反応を行うことによって、モルフォロジ-の異なるヒドロキシアパタイトなどのリン酸カルシウム系化合物結晶が合成できることを明らかにした。十分な大きさを有するヒドロキシアパタイトの球晶を得るためにさらに本実験は継続する予定である。2.寒天ゲル中の球晶状ヒドロキシアパタイトの合成および粒度制御に関する検討を、ゲル法反応器を用いて行った。反応系に共存させる第三物質の種類および濃度などの反応条件の調節によって、ヒドロキシアパタイトが球晶状成長することを確認した。

成長速度を速めるための検討を続けて行う予定である。3.ヒドロキシアパタイト球形粒子の粉体特性に関する検討を行った。マイクロ精密篩と電磁式篩震盪機を用いて粉体の単分散化をはかり、粉体特性と充填特性についての基礎的な研究を行うと共に、粉体の成形条件についても検討を行った。4.成形物の焼結条件に関する検討を自動温調型マッフル炉を用いて行った。今後、ヒドロキシアパタイト焼結体をこの炉を用いて調製する予定である。また、調製された焼結体を試験片に加工し、その物理的・機械的強度(圧縮、曲げ、引っ張り、破壊靭性、ヴィッカ-ス硬度など)を測定する予定である。5.焼結体の内部観察に関する研究に関連して、二酸化チタン/ポリエチレン複合体の成形体の内部観察をCTスキャナを用いて行い、良好な結果を得た。1.均一系湿式反応によって合成したヒドロキシアパタイト微粒子(粒子サイズ:数10数100nm)の大気雰囲気中での加熱による粒成長について検討を行い,950°C付近から成長速度が急激に増大することを明らかにした。2.ヒドロキシアパタイトの加圧成形体を一次加圧(一軸加圧)およびそれに引き続いて行う二次加圧(等軸加圧)で調製した。一次加圧を200kg/cm^2の圧力が5分間,二次加圧を1000kg/cm^2で15分間行うことにより,粒子形態,粒子サイズの相違に対応して相対密度が38.353.8%の成形体が得られた。3.上記成形体を自動温調型電気マッフル炉で焼成し,多孔質ヒドロキシアパタイト焼結体を得た。500°Cで30分,1000°Cで30分,1150°Cで12よ分加熱することにより相対密度が49.485.8%の焼結体を調製した。また,焼結体破断面を鏡面仕上げしたのち表面をクエン酸水溶液で処理して走査型電子顕微鏡観察を行い,粒成長の様子および細孔の形態,大きさ,分布などを明らかにした。4.ヒドロキシアパタイト焼結体のいくつかについて,破壊靭性値をSEVNG法によって測定し,0.13±0.020.76±0.02MPa・m^<1/2>の値を得た。まだ十分に大きい値とは言えないが,この点に関してはさらに検討を進めていくつもりである。5.一次と二次の加圧成形体および焼結体について,X線CTスキャナを用いて非破壊内部の均質性評価を行い,線吸収係数に対する線吸収係数の標準偏差の割合で均質性を表す方法を提案した。この方法により,一次加圧成形体が最も均質であり,次が二次成形体であること,焼結体であること,焼結体はこれらに二者に比べて均質性がやや劣ることが明らかにされた。
チミン合成を阻害する薬剤により生じる劇的な細胞死におけるゲノム動態の役割

チミン飢餓による細胞死は約60年前に大腸菌で発見され、その後、他の微生物や真核生物でも同定された。チミン合成の阻害によって複製フォークを止めてチミン飢餓死を誘導する薬剤は、抗がん剤治療や尿路感染症治療での第一選択薬として用いられている。しかし、その細胞死を生じる機構は、真核生物でも微生物でも謎である。複製フォークの動態は、微生物でも真核生物でも未解明である。その解析は大腸菌で非常に困難であった。研究代表者は、細胞内の新生DNA鎖を解析する独自の実験法を開発して、大腸菌の複製フォーク動態をゲノム全域に渡って研究できる道を世界に先駆けて切り開いた。その結果、チミジン不足状態の細胞のDNA複製において、(1)複製フォークが200kbのゲノム領域(FTZ)で遅延し、その領域がチミン飢餓死で消失するゲノム領域と相関すること、(2) FTZの新生DNA鎖において、逆向き反復DNA配列での異常なDNA合成が亢進すること、さらに、(3)ヒストン様タンパク質H-NSの結合部位の密度が高い領域がFTZと相関することを見出した。これらのことから、染色体高次構造での複製停止と、その時の逆向き反復DNA配列での異常なDNA合成がチミン飢餓死に関係する可能性が示唆された。そこで、研究代表者は、「チミン飢餓では、染色体高次構造によりFTZで複製が遅延し、逆向き反復DNA配列での異常なDNA合成からゲノム消失を生じて、細胞が生存力を失う」という新しい仮説を立案した。本研究では、この仮説を検証して、チミン飢餓時の細胞死の機構を解明する。平成30年度の研究では、(1)H-NSがチミジン不足状態におけるFTZでの複製フォーク遅延に関与すること、また、(2)チミジン不足状態だけでなくチミン飢餓時にも、逆向き反復DNA配列での異常なDNA合成を実際に生じていることを支持する結果を得た。(1)FTZでの複製遅延とH-NSタンパク質の関係:通常のチミジン濃度における新生DNA鎖をゲノム全体で解析して、大腸菌ゲノムは複製フォークの進行具合によって4つのドメイン(パッセージ)に分割されることを発見した。このうち、複製ゲートウエイと名付けた二つのパッセージ領域は、FTZとほぼ重なった。この結果は、チミン欠乏時に複製フォークの進行が特定の染色体領域で遅延することを示唆する。(2)複製ゲートウエイ領域では、複製フォークが進行するにつれて複製フォーク停滞の頻度が上昇し、その上昇パターンはH-NSタンパク質の結合部位の密度上昇パターンとほぼ一致した。この結果は、複製遅延にH-NSタンパク質が関与する可能性を支持した。そこで、H-NSタンパク質を欠損した細胞を解析したところ、複製遅延は少なくとも複製ゲートウエイ領域(FTZ)の一部で消失していることが明らかとなった。この結果は、複製フォーク進行を遅延させる染色体構造の形成にH-NSタンパク質が関与することを強く示唆する。(3)チミン飢餓時の異常なDNA合成:これまでに、チミジン不足時に逆向き反復DNA配列での異常なDNA合成の亢進が見出された。逆向き反復DNA配列での鋳型スイッチによる異常なDNA合成は、配列置換変異と呼ばれる特殊な突然変異を誘発する。そこで、逆向き反復DNA配列での配列置換変異を容易に検出できるlacZ変異遺伝子(FTZ外に位置する)を持つ細胞を構築した。この細胞をチミン飢餓状態に短時間さらすと、実際にlacZ変異遺伝子の逆向き反復DNA配列で配列置換変異の発生頻度が上昇することを明らかにした。この結果は、チミジン不足時だけでなく、チミン飢餓時にも確かに逆向き反復DNA配列での異常なDNA合成を生じていることを示す。(1)チミン飢餓時と非飢餓時に、H-NS欠損細胞の複製フォーク動態を次世代シークエンサー等を使ってゲノム全体で解析する。これらの複製フォークの動態解析から、複製ゲートウエイ領域(FTZ)での複製フォーク遅延とH-NSの関係を明らかにする。さらに、複製ゲートウエイ領域(FTZ)の染色体高次構造を高感度なHi-C法を使って解析する。(2)ヒストン様タンパク質H-NSはホモ二量体を形成するだけでなく、他のヒストン様タンパク質と相互作用してヘテロ複合体を形成し、多様な染色体構造に関与する。そこで、H-NSと相互作用するヒストン様タンパク質の欠損変異株で複製フォーク進行を解析して、FTZ領域での複製フォークの進行遅延にホモ二量体が関係するか、あるいはヘテロ複合体が関係するかを明らかにする。(3)鋳型スイッチによる配列置換変異を容易に検出できるlacZ変異遺伝子を、複製ゲートウエイ領域(FTZ)に挿入して、チミン飢餓時に複製ゲートウエイ領域の鋳型スイッチが他のゲノム領域と比べて亢進するかを明らかにする。さらに、複製ゲートウエイ領域で複製遅延しないH-NS欠損細胞を用いて、チミン飢餓時の配列置換変異と細胞死を解析し、H-NSによる染色体構造が鋳型スイッチやチミン飢餓死と関係するかを明らかにする。

研究代表者は、細胞内の新生DNA鎖を解析する独自の実験法を開発して、大腸菌の複製フォーク動態をゲノム全域に渡って研究できる道を世界に先駆けて切り開いた。その結果、チミジン不足状態の細胞のDNA複製において、(1)複製フォークが200kbのゲノム領域(FTZ)で遅延し、その領域がチミン飢餓死で消失するゲノム領域と相関すること、(2) FTZの新生DNA鎖において、逆向き反復DNA配列での異常なDNA合成が亢進すること、さらに、(3)ヒストン様タンパク質H-NSの結合部位の密度が高い領域がFTZと相関することを見出した。これらのことから、染色体高次構造での複製停止と、その時の逆向き反復DNA配列での異常なDNA合成がチミン飢餓死に関係する可能性が示唆された。そこで、研究代表者は、「チミン飢餓では、染色体高次構造によりFTZで複製が遅延し、逆向き反復DNA配列での異常なDNA合成からゲノム消失を生じて、細胞が生存力を失う」という新しい仮説を立案した。本研究では、この仮説を検証して、チミン飢餓時の細胞死の機構を解明する。平成30年度の研究では、(1)H-NSがチミジン不足状態におけるFTZでの複製フォーク遅延に関与すること、また、(2)チミジン不足状態だけでなくチミン飢餓時にも、逆向き反復DNA配列での異常なDNA合成を実際に生じていることを支持する結果を得た。(1)FTZでの複製遅延とH-NSタンパク質の関係:通常のチミジン濃度における新生DNA鎖をゲノム全体で解析して、大腸菌ゲノムは複製フォークの進行具合によって4つのドメイン(パッセージ)に分割されることを発見した。このうち、複製ゲートウエイと名付けた二つのパッセージ領域は、FTZとほぼ重なった。この結果は、チミン欠乏時に複製フォークの進行が特定の染色体領域で遅延することを示唆する。(2)複製ゲートウエイ領域では、複製フォークが進行するにつれて複製フォーク停滞の頻度が上昇し、その上昇パターンはH-NSタンパク質の結合部位の密度上昇パターンとほぼ一致した。この結果は、複製遅延にH-NSタンパク質が関与する可能性を支持した。そこで、H-NSタンパク質を欠損した細胞を解析したところ、複製遅延は少なくとも複製ゲートウエイ領域(FTZ)の一部で消失していることが明らかとなった。この結果は、複製フォーク進行を遅延させる染色体構造の形成にH-NSタンパク質が関与することを強く示唆する。(3)チミン飢餓時の異常なDNA合成:これまでに、チミジン不足時に逆向き反復DNA配列での異常なDNA合成の亢進が見出された。逆向き反復DNA配列での鋳型スイッチによる異常なDNA合成は、配列置換変異と呼ばれる特殊な突然変異を誘発する。そこで、逆向き反復DNA配列での配列置換変異を容易に検出できるlacZ変異遺伝子(FTZ外に位置する)を持つ細胞を構築した。この細胞をチミン飢餓状態に短時間さらすと、実際にlacZ変異遺伝子の逆向き反復DNA配列で配列置換変異の発生頻度が上昇することを明らかにした。この結果は、チミジン不足時だけでなく、チミン飢餓時にも確かに逆向き反復DNA配列での異常なDNA合成を生じていることを示す。(1)チミン飢餓時と非飢餓時に、H-NS欠損細胞の複製フォーク動態を次世代シークエンサー等を使ってゲノム全体で解析する。