hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
タケの高シンク機能を担う統御機構の解明

本研究は,タケの有する高シンク機能の統御機構の解明を目指して実施したものである。中心的な解析手法としてイネのマイクロアレイを用いた。これは,タケの遺伝子がイネの遺伝子と相同性が非常に高く,イネのマイクロアレイが利用可能であると考えたからである。タケノコ,全長5m39cmの幼竹の第17節間の上部と下部,成葉からmRNAを抽出,cDNAを合成してマイクロアレイ実験に供した。アレイ解析の結果,解析した約9,000個のクローンのうちタケノコで特異的に発現したクローンが78個,節間下部で特異的に発現したクローンが635個あった。タケノコではDNA複製やタンパク合成に関与する遺伝子が多く,細胞増殖が盛んであることが伺われた。また,ジベレリン関連遺伝子の発現量も多く,伸長成長に関与すると言われてることを分子レベルで明らかにすることができた。節間下部でとくに発現量の多いクローン34個を選抜して解析したところ,ショ糖合成酵素やセルロース合成酵素などの糖代謝関連遺伝子が多かった。また細胞間連絡に関与している遺伝子や,水輸送に関与するアクアポリンなどの遺伝子の発現量も多かったことが注目される。節間下部でとくに発現量が多かったショ糖合成酵素の遺伝子(以下Susと略)に着目して解析をおこなった。Susはの3クローンのクローニングに成功した。うち2つのクローンはSus1グループに属し,1つはSusAグループであることがわかった。RT-PCRによる発現解析ならびにSus1抗体を用いたウェスタン解析の結果から,伸長成長期にあたる幼竹段階ではSus1の発現量が多かったのに対して,組織が成熟するにしたがってSusAクローンの発現量が増加した。このように,組織・時期においてショ糖合成酵素内におけるクローンの役割が交代しており,タケの伸長成長期において重要な役割を担っていることが強く示唆された。実験材料としてタケノコ、全長5m39cmの幼竹の第17節間(稈鞘は剥離)の上部と下部、成葉の各組織を用いた。RNA抽出には種々のキットを使用したが、純度の高いRNAが得られなかった。セパゾール(ナカライテスク社)を用い全RNA抽出をおこなった後に、RNeasy kit(QIAGEN社)を用い繰り返し精製をおこなうことで純度の高いRNAを抽出することが可能となった。また、植物でよく利用されるCTAB法ではスメアなDNAしか抽出できなかった。CTAB法を改変しDNAを高濃度溶液にしてアルコール抽出することによりスメアにならないDNAの抽出が可能となった。抽出した各組織の全RNAからmRNAをOligotex dT30を使用して単離し、各mRNA2μgをマイクロアレイ実験に供した。マイクロアレイはイネゲノムプロジェクトで作成されたESTクローンを1枚のガラスプレートに9,000クローン貼り付けたものである。各組織のmRNAを逆転写酵素によってcDNAに変換した後、マイクロアレイプレートにハイブリダイズさせた。このときに蛍光色素を添加し、マイクロアレイプレート上のクローンとハイブリダイズして二重鎖DNAが形成された場合には蛍光を発する。現在、ハイブリダイゼーション処理が終了した段階である。タケノコの伸長成長に関与すると考えられるショ糖合成酵素遺伝子(以下SSと略)の発現解析をおこなった。SSは各組織で発現していたが発現量に差があった。すなわち、第17節間の下部(より未熟な領域)で発現量がもっとも多く、次いで節間上部(より成熟な領域)、成葉、タケノコの順であった。もっともシンク的な器官と考えれるタケノコがもっとも発現量が少なかった。このことから成長の各段階においてショ糖利用の代謝が異なることが示唆された。

タケノコ、全長5m39cmの幼竹の第17節間(稈鞘は剥離)の上部と下部、成葉の各組織から抽出したmRNAからcDNAを合成し、マイクロアレイ実験に供した。マイクロアレイはイネゲノムプロジェクトで作成されたESTクローンを1枚のガラスプレートに4,500クローン貼り付けたものを2枚使用し、9,000クローンの解析をおこなった。ハイブリダイゼーションをおこなった後にスキャナで各スポットの強度を読み取り定量化した。タケノコと第17節間上部、第17節間下部、成葉についてそれぞれ定量化した結果から、それぞれ対応するクローンについてスポット強度を比較した。今回はタケノコにおいて他の組織に対して2倍以上発現量の多いクローンの選抜をおこなった。タケノコにおいて発現量が多い遺伝子として78個の候補遺伝子が選抜できた。78個の遺伝子の内訳はリボソームタンパク質やヒストンなどの遺伝子が多く、タケノコにおいて転写翻訳、DNAの複製が盛んにおこなわれていることが強く示唆された。また。ジベレリン生合成遺伝子の一つやジベレリンによって誘導される遺伝子がタケノコにおいて強く発現しており、従来からタケノコの伸長成長にジベレリンが必要であると言われていたが、今回、ジベレリンがタケノコの伸長成長に重要であることが分子レベルでも明らかとなった。今回のイネのマイクロアレイを使用した実験結果が正しくタケにおける遺伝子の挙動を反映するのかを確認するために、各組織から抽出したmRNAからcDNAを合成しRT-PCRをおこなった。3種類の遺伝子についてRT-PCRをおこないマイクロアレイの結果と比較したところ、両者の発現量の傾向が一致したことから今回のマイクロアレイ実験はタケにおける遺伝子の挙動を正しく反映していることがわかった。平成15年度に実施したマイクロアレイ実験の結果から引き続き解析をおこない,次に示すような結果を得た。なお,実験試料はタケノコ,全長5m39cmの幼竹の第17節間(稈鞘は剥離)の上部と下部,成葉の各組織から抽出したmRNAをcDNA化したものであり,マイクロアレイはイネゲノムプロジェクトで作成されたESTクローンを1枚のガラスプレートに4,500クローン貼り付けたものを2枚使用し,9,000クローンの解析でおこなった。今回は,ハイブリダイゼーション終了後,スキャナで読み取り定量化した各スポットの強度から,もっとも発現量が多かった組織である第17節間下部をタケノコ,第17節間上部,成葉のそれぞれ定量化した結果と比較することによって節間下部で発現量の多いクローンの解析をおこなった。第17節間下部において他の組織より発現量が2倍以上多い遺伝子は635個もの遺伝子が候補として選抜された。解析すべきクローン数が多数にのぼったため,いずれの組織に対しても3倍以上発現量が多かった遺伝子についてさらに解析をおこなった。その結果,34個の候補遺伝子が選抜された。中でも,ショ糖合成酵素,セルロース合成酵素,ヘミセルロースの原料となるキシロースの合成をおこなうUDP-グルクロン酸デカルボキシラーゼなどの糖代謝に関連する遺伝子が約1/3を占めた。
神経系におけるジストログリカンN末端ドメインの未知機能と病態関与の解明

α-ジストログリカン(α-DG)のN末端ドメイン(α-DG-N)は切断され細胞外へと分泌されるが、切断後のα-DG-Nの機能については全く不明のままである。我々はこの点を明らかにするために全身でα-DG-Nを高発現するトランスジェニック(α-DG-N Tg)マウスを作出した。そして同マウス骨格筋においてα-DGの糖鎖を特異的に認識する抗体、IIH6の反応性が著しく減弱していることを明らかにした。一方でα-DGのラミニン結合能は比較的保たれていた。これらの結果より、α-DG異常症の診断にはIIH6反応性のみではなくラミニン結合能の評価が不可欠であると考えられた。α-ジストログリカン(α-DG)はこれまで筋ジストロフィーの原因蛋白質として精力的に研究が進められて来た。しかし近年骨格筋以外におけるα-DGの機能が注目されている。申請者らはこれまでにα-DGのN末端ドメイン(α-DG-N)がproprotein convertaseにより切断され細胞外へと分泌されること、そして切断されたα-DG-Nは脳脊髄液からさらには脳、末梢神経に至るまで神経系に豊富に存在することを明らかにしてきた。しかしこれら神経系におけるα-DG-Nの機能やその生理学的、病態学的意義については全く不明のままである。そこで、本研究では1) α-DG-Nの神経系における未知の生理的機能を明らかにし、2) α-DG-Nの神経疾患における病態への関与を検討することを目的とする。初年度の平成25年度は、α-DG-Nトランスジェニックマウスの作製をおこなった。そしてCAGプロモーターを用いて既定の方法により3系統のF1マウスの作出に成功した。これらマウスはこれまでのところ肉眼的観察においては野生型マウスと差異はないようで、今後in vivoにおけるα-DG-Nの機能、脳神経系に及ぼす影響などを順次検討する予定である。一方で、α-DG-Nと結合してα-DGのムチンドメインの糖鎖修飾を亢進しα-DGとラミニンの結合性を亢進させることが知られている糖転移酵素、LARGEの機能解析を行った。この結果、マウスや培養細胞へLARGEを過剰発現させると筋再生が抑制されること、この一因としてinsulin-like growth facter-1の発現低下が関与していることを明らかにした。このことからα-DG-Nは骨格筋筋損傷後の筋再生を制御している可能性が考えられた。申請者らはこれまでにα-DGのN末端ドメイン(α-DG-N)がproprotein convertaseにより切断され細胞外へと分泌されることを明らかにしてきた。しかしこれら切断後のα-DG-Nの機能やその生理学的、病態学的意義については全く不明のままである。本研究はα-DG-Nの未知の生理的機能を明らかにし、疾患における病態への関与を検討することを目的としている。平成26年度は、申請者らが作出したα-DG-Nトランスジェニック(α-DG-N Tg)マウスにおける骨格筋の検討をおこなった。現在24週齢までのマウスについて解析を行ったが、これまでのところマウスの行動や生育に異常は見られなかった。また光学顕微鏡で観察した骨格筋の形態に関して野生型と比較して大きな差異は認められなかった。しかし免疫蛍光抗体法による観察の結果、ラミニンやβ-DGの発現に変化は見られなかったもののα-DGの糖鎖を特異的に認識する抗体、IIH6の反応性が著しく減弱していることが明らかとなった。これまでα-DGのIIH6反応性とラミニン結合能は正の相関を示すと考えられてきたが、本マウスで初めてこれらに解離が見られたことになる。なぜラミニン結合能が保たれているにもかかわらずIIH6反応性だけが著減したのか、来年度以降の検討が必要である。我々はこれまでにα-DGのN末端ドメイン(α-DG-N)がproprotein convertaseにより切断され細胞外へと分泌されることを明らかにしてきた。この目的を達成するために我々はユビキタスにα-DG-Nを過剰発現するα-DG-Nトランスジェニック(α-DG-N Tg)マウスを作出しその解析を行った。同マウスの表現型の解析の解析の結果、行動や生育に異常は見られなかった。しかし免疫蛍光抗体法の結果、α-DGの糖鎖を特異的に認識する抗体、IIH6の反応性が著しく減弱していることが明らかとなった。このIIH6反応性とラミニン結合能を福山型先天性筋ジストロフィーのモデルマウスであるフクチンノックアウト(FKTN cKO)マウスと比較したところ、明らかな筋ジストロフィーを呈するFKTN

cKOマウスではIIH6反応性の低下は軽度でラミニン結合能の低下がより顕著であることが明らかとなった。以上の結果より、これまでα-DGのIIH6反応性とラミニン結合能は正の相関を示すと考えられIIH6反応性の低下はα-DG異常症の臨床的指標としても用いられてきたが、本例のようにこれらが解離する場合もあることからα-DG異常症の診断にはラミニン結合能の評価が不可欠であることが明らかとなった。α-ジストログリカン(α-DG)のN末端ドメイン(α-DG-N)は切断され細胞外へと分泌されるが、切断後のα-DG-Nの機能については全く不明のままである。我々はこの点を明らかにするために全身でα-DG-Nを高発現するトランスジェニック(α-DG-N Tg)マウスを作出した。そして同マウス骨格筋においてα-DGの糖鎖を特異的に認識する抗体、IIH6の反応性が著しく減弱していることを明らかにした。一方でα-DGのラミニン結合能は比較的保たれていた。これらの結果より、α-DG異常症の診断にはIIH6反応性のみではなくラミニン結合能の評価が不可欠であると考えられた。α-DG-N Tgマウスの作出は予定通り完了し、全身でα-DG-Nを高発現するマウスが得られた。本年度は主として同マウスの骨格筋の解析を行い、α-DG-Nの高発現によりIIH6反応性が著減するにもかかわらずラミニン結合能は保たれていること、また同マウスは筋ジストロフィー発症しないことを明らかにしたことにより一定の成果は得られたものと考えている。しかし予定していた神経系におけるα-DG-Nの局在や形態変化の有無、α-DG-Nの培養細胞への高発現実験やシグナル伝達に及ぼす影響はまだ行えていない状況であるり、これらの点を考慮してやや遅れていると判断した。神経内科学今後の本研究の大きな柱の一つがα-DG-N Tgマウスの神経系の解析である。光学顕微鏡、電子顕微鏡、さらに2光子顕微鏡も併用して脳や末梢神経における形態変化、特に神経軸索の伸長や大脳皮質層構造の形成における変化の有無に焦点をあてて検討する。もしここで何らかの形態変化が見いだされれば、モーリス水迷路試験等により空間認知、学習能力、短期記憶などに変化が生じないかどうか比較検討を行う。もう一つの柱はα-DG-Nを介したシグナル伝達経路の解明である。この経路の最上流に位置するα-DG-Nの受容体を同定することは重要な点であり、同マウスの脳を用いたα-DG-Nによるプルダウンアッセイを行う。さらに下流に位置するシグナル伝達経路を明らかにするために、DNAマイクロアレイ解析やリン酸化アレイ解析を行う。最後に、これら研究課題が順調に進行した場合には、神経疾患の病態との関与に関しての研究に取り組んでいく。現在原因が明らかにされていない神経変性疾患や末梢性ニューロパチーにおけるα-DG-Nの異常の有無を検討する。このためにブレインバンク保存の認知症疾患や神経変性疾患の死後脳、また末梢神経生検や脳脊髄液などの検体を用いてα-DG-Nの発現量や発現部位に変化がないかどうかを検討する。α-DG-Nトランスジェニックマウスの作製は予定通り完了し、今後はその解析をする事になる。またα-DG-Nとの関連で、LARGEの機能解析によりinsulin-like growth facter-1を介して骨格筋再生に影響を与えることを見いだした点は大きな成果であった。
代謝反応パスウェイのコンピュータ比較解析による基本構成原理の解明

本研究では、パスウェイがどのような基本原理に従って構成されているのかを明らかにすることを目的としている.代謝反応パスウェイ中の各反応には複数の基質,生成物が関わってくるために,その構造は分岐を伴う非常に複雑なネットワークを形成している,しかし実際には,パスウェイは反応の種類によって解糖系などの代謝マップごとに分類され,整理されている.それらはネットワークの基本構成単位であると考えられるが,進化の過程で実際にどのような原理でそれらが構成され,パスウェイ全体を作り上げているかは明確には解明されていない.従来,代謝マップはバクテリアから真核生物まで広く保存されているものと考えられていた.しかし,例えば代謝のうち最も中心的な部分を占める解糖系等であっても,生物種によっては全く異なる酵素・反応経路が使用されていることが報告されている.そして,それぞれの経路ごとに,それを持つ生物種の組み合わせが異なっている.ある遺伝子またはタンパク質の生物種間での分布パターンの類似性は,その進化的・機能的な関連性を反映しているとされており,これがサブネットワーク抽出のための一つの基準となるものと考えられる.そこで本研究では,系統プロファイルを利用した,代謝ネットワークからのサブネットワーク抽出手法を提案する.系統プロファイルとは,タンパク質の生物種間の分布パターン,すなわち,オーソログの生物種ごとの有無を1と0のビット列で表現したものである.本手法では,ネットワーク中で隣接した反応間の距離を,系統プロファイルの類似度に基づいて定義し,類似度の閾値を設定することで,系統プロファイルの類似した酵素反応から成るサブネットワークを網羅的に抽出する.本手法を代謝反応データベースKEGGに適用し,進化的に保存されている機能単位と考えられるいくつかのサブネットワークが抽出可能であることを確かめた.本研究では、パスウェイがどのような基本原理に従って構成されているのかを明らかにすることを目的としている.代謝反応パスウェイ中の各反応には複数の基質,生成物が関わってくるために,その構造は分岐を伴う非常に複雑なネットワークを形成している,しかし実際には,パスウェイは反応の種類によって解糖系などの代謝マップごとに分類され,整理されている.それらはネットワークの基本構成単位であると考えられるが,進化の過程で実際にどのような原理でそれらが構成され,パスウェイ全体を作り上げているかは明確には解明されていない.従来,代謝マップはバクテリアから真核生物まで広く保存されているものと考えられていた.しかし,例えば代謝のうち最も中心的な部分を占める解糖系等であっても,生物種によっては全く異なる酵素・反応経路が使用されていることが報告されている.そして,それぞれの経路ごとに,それを持つ生物種の組み合わせが異なっている.ある遺伝子またはタンパク質の生物種間での分布パターンの類似性は,その進化的・機能的な関連性を反映しているとされており,これがサブネットワーク抽出のための一つの基準となるものと考えられる.そこで本研究では,系統プロファイルを利用した,代謝ネットワークからのサブネットワーク抽出手法を提案する.系統プロファイルとは,タンパク質の生物種間の分布パターン,すなわち,オーソログの生物種ごとの有無を1と0のビット列で表現したものである.本手法では,ネットワーク中で隣接した反応間の距離を,系統プロファイルの類似度に基づいて定義し,類似度の閾値を設定することで,系統プロファイルの類似した酵素反応から成るサブネットワークを網羅的に抽出する.本手法を代謝反応データベースKEGGに適用し,進化的に保存されている機能単位と考えられるいくつかのサブネットワークが抽出可能であることを確かめた.
X線回折・ラマン分光同時測定による結晶構造の同時ab initio解析

本研究では,医薬品原末のX線回折データによる結晶構造の解析と,振動分光から得られる分子間相互作用とを同時に行うことで,多角的に結晶構造とその形成プロセス解析を試みた.開発したシステムを用いて,インドメタシン,カルバマゼピン・ニコチンアミド共結晶,テオフィリン水和物の測定を行った.それぞれについて,開発したシステムを用いてXRDパターンとラマンスペクトルを同時に測定することに成功した.得られたXRDパターンとラマンスペクトルから結晶構造の解析を行い,インドメタシン結晶化のプロセス,カルバマゼピン・ニコチンアミドの共結晶形成,テオフィリン水和物の疑似結晶多形転移過程を測定することができた.本研究では,医薬品原末のX線回折データによる結晶構造の解析と,振動分光から得られる分子間相互作用とを同時に行うことで,多角的に結晶構造とその形成プロセス解析を試みた.開発したシステムを用いて,インドメタシン,カルバマゼピン・ニコチンアミド共結晶,テオフィリン水和物の測定を行った.それぞれについて,開発したシステムを用いてXRDパターンとラマンスペクトルを同時に測定することに成功した.得られたXRDパターンとラマンスペクトルから結晶構造の解析を行い,インドメタシン結晶化のプロセス,カルバマゼピン・ニコチンアミドの共結晶形成,テオフィリン水和物の疑似結晶多形転移過程を測定することができた.本研究では,医薬品原末の結晶構造,熱力学的物性を半経験的に求めることを目的としてる.原末の結晶構造や安定性は,その製剤の品質を大きく左右する.そのため,結晶構造やその転移プロセスを詳細に解析し,理解することが必要である.そこで,医薬品原末の粉末X線回折データにもとづく結晶構造候補の選定と,振動分光の非経験的解析と実測値から得られる分子モデリングとを同時に行いうことで,多角的に結晶構造解析を試みる.そのため,当該年度は粉末X線回折(XRD)・熱分析(DSC)測定装置(Ultima III, Rigaku)にラマン分光器を組み込み,それぞれの同時測定システムの構築を行った.ラマン分光測定には,外径1 mmの中空光ファイバーを用い,既存の光ファイバープローブとカップリングさせた.サンプル測定部では片凸・両凸マイクロレンズ2つを組み合わせることで,ラマン分光測定の効率化を行った.これにより,レンズによる蛍光バックグラウンドの上昇が起こってしまうが,それ以上にラマン光の集光効率が向上し,解析に十分な強度のラマン光を検出することが可能になり,1回あたり約3060秒程度での測定が可能である.開発したシステムを用いて,α形インドメタシン(非ステロイド性抗炎症),カルバマゼピン・ニコチンアミド共結晶,テオフィリン一水和物の測定を行った.インドメタシンはα形(不安定結晶)は,加熱によって140°C付近でγ型(安定形結晶)となり,160°C付近で融解する.カルバマゼピンとニコチンアミドの混合粉末は加熱することで,共結晶(cocrystal)を形成する.また,テオフィリン1水和物は,加熱により脱水し無水物結晶に転移する.それぞれのプロセスにおいて,今年度開発したシステムを用いてXRDパターンとラマンスペクトルを経時的に測定することに成功した.有機化合物の結晶構造解析において,赤外分光やラマン分光法などの振動分光によるスペクトルデータは,補足的に用いられている.しかし,それだけでは結晶構造について詳細な情報を得ることは難しく,X線回折とリートベルト法による精密化や熱分析などと合わせて総合的に解析することが多い.近年,振動分光データは,X線回折と同様に密度汎関数理論(Density Functional Theory),など,量子化学計算によるスペクトルシミュレーションから,分子モデリング・分子軌道計算が可能である.量子化学計算を用いた手法は,Gaussian, GAMESSなどの汎用計算ソフトが開発されたことで,飛躍的に普及し,分子間相互作用を解析する有力な解析手段となっている.本研究では,XRD・ラマン分光同時測定システムを開発し, X線回折パターンとラマンスペクトルから結晶構造の解析を試みた.開発した装置を用いて(1)インドメタシンの結晶化,(2)テオフィリンの疑似結晶多形転移,(3)カルバマゼピン・ニコチンアミドの共結晶形成について測定と解析を行った.(1)非晶質状態のインドメタシンは,50°C付近で結晶化する.この結晶化に伴うラマンスペクトルとX線回折パターンの変化を解析することで,(i)カルボニル基(ii)インドール基(iii)ベンゾイル基の順に結晶構造を形成することがわかった.(2)テオフィリン水和物は高温あるいは低湿度状態で無水物へ疑似結晶多形転移を起こす.これまで,テオフィリン水和物における水分子は,テオフィリンの窒素(N, 8)に付加していると考えられていたが,今回の解析から,NH基あるいはC=O基に付加している可能性が示唆された.(3)カルバマゼピン・ニコチンアミドの共結晶形成過程を詳細に解析した結果,共結晶が形成されるまで,不安定な中間体構造を経ていることがわかった.

製剤学,分光学平成25年度の達成目標は,ラマン分光測定用の中空光ファイバープローブを開発し,粉末X線回折装置にラマン分光システムを組み込み,XRDーRaman同時測定を可能にすることであった.該当年度でおいて,同システムを立ち上げ,いくつかの試料について測定を行うことができた.今後の推進方策として,データの解析を中心に行う.その上で,解析に耐えうる精度(強度)のデータを取得できるようにシステムの改善も同時に行っていく.現状では,温度制御とラマン分光測定の焦点決めに関して不十分であるため,(1)試料部断熱性の向上(2)ラマン測定焦点位置の微調整機構の追加を行う.測定,解析については,インドメタシンの結晶化,カルバマゼピン・ニコチンアミド共結晶化,テオフィリン水和物・無水物転移について,それぞれの構造形成プロセスに注目して行う.XRDパターンから,Simulated Annealing法による構造の推定,また,推定された結晶構造から量子科学計算(GAMESS)によるラマンスペクトルの予測をおこない,結晶化,転移における化合物官能基の寄与,相互作用変化について解析を行う.最終的には結晶化,結晶構造転移の測定,解析法の確立を目標とする.購入予定であった設備備品(ラマン分光器,レーザー)の国内での販売終了にともない,性能は同じだが,低価格の代替品を購入した.そのため支出が減り,次年度使用額が発生した.次年度は,システムの改良をおこなうため,試料部の断熱性改善(断熱材の加工)とラマン測定の微調整機構の開発を行う.また,国内,国外における学会発表を1回以上づつ行う予定である.
血液中蛋白質構造異常症の質量分析による短時間高感度高精度検査法の確立

遺伝子の異常によって変異蛋白質が合成され、種々の疾患を引き起こす。変異蛋白質による疾患の種類は多く、診断には高度の技術と時間を必要とする。それぞれの疾患の頻度はあまり高くないが、疾患の種類が多いため患者数は少なくない。これまで変異蛋白質が起因する疾患の代表的なものとして異常ヘモグロビン症が良く研究されており、当グループでも質量分析を用い、構造異常を明らかにし、診断に貢献している。家族性アミロイドポリニューロパチーの原因はトランスサイレチンの変異によることが知られているが、この疾患は壮年期に発症し、診断および保因者の検出に、簡便で信頼の出来る検査法が望まれる。被験血清に抗トランスサイレチン抗血清を加え、免疫沈降物を得、それを質量分析することにより、1時間以内に5μlの被験血清で診断しうることを示した。宮崎医大、熊本大、Unea大との共同で多数症例を集め分析し、6種類の変異が前記方法で検出可能であることを証明した。また、家族歴はないが、臨床症状よりアミロイドーシスを疑う症例に分析を行ったところ、変異トランスサイレチンを検出した。この症例に対し、前述の免疫沈降法と分離用HPLCを用い、トランスサイレチンを精製し、トリプシン消化して質量分析に供し、変異部位を同定した。その結果、この症例は本邦初の変異であることが分かった。これについて現在投稿準備中である。また、アミロイド関連の臨床症状の全くない症例について分析を行った結果、変異トランスサイレチンであることを偶然見いだした。本症例についても、前述と同様の方法で、変異部位を同定した。その結果、これまで報告例のない新たな変異であることを見いだし、現在投稿準備中である。
SPA-1遺伝子改変動物を用いた感染防御と二次免疫応答に関する研究

低分子量G蛋白Rap1特異的GAP、SPA-1の遺伝子破壊マウスは、生後半年を過ぎた時点からT細胞機能不全に陥る。このT細胞機能不全の発症原因を明らかにするために、SPA-1遺伝子破壊マウスのT細胞の性状について解析を行ったところ、negative co-receptorの1つであるPD-1を発現したCD4T細胞(PD-1^+CD4^+T細胞)が増加しているのが明らかとなった。この分画の細胞を精製・解析したところ、抗原刺激に対し無反応(アナジー状態)であり、通常、抗原刺激により活性化されるERKが全く活性化されなかった。しかし、抗原刺激の代わりにPMAおよびイオノフォアで刺激することにより正常増殖を示したことから、PD-1-CD4^+T細胞では増殖機構そのものに異常があるのではなく、T細胞抗原レセプター下流のERKに至る経路でシグナル阻害が起こっていることが示唆された。PD-1^+CD4^+T細胞は、正常マウスにおいても少ないながらも存在しており、やはり加齢とともに増加する傾向があった。PD-1^+CD4^+T細胞を単離し、PD-1^-CD4^+T細胞の間でDNAマイクロアレイ解析を行い、両者の間で変化している遺伝子について解析を行ったところ、後者に比べ前者では、IL-1レセプターβ鎖(CD121b)、B細胞の分化制御に関与するOcaBならびに好中球分化の制御転写因子であるCIEBPα遺伝子の発現が上昇していることが明らかとなった。これらの変化についてはリアルタイムPCR法においても確認された。現在、これらの遺伝子とT細胞アナジーの関係を明らかにするために、これらの遺伝子をマウス正常T細胞に導入し、その機能に及ぼす影響について解析を行っている。一方、本研究においてニワトリTSLPホモログの単離を計画したが、データベース解析からニワトリにおいて本遺伝子は存在していないことが明らかとなった。低分子量G蛋白Rap1に対する負の制御因子、SPA-1の遺伝子破壊マウス(SPA-1-/-マウス:129xB6バック)は、生後1年1年半以内にT細胞機能不全に基づく免疫不全と続発性の骨髄性白血病を発症する。このT細胞機能不全発症の分子メカニズムを明らかにするために、遺伝的背景が異なるSPA-1-/-マウスを作出し、解析を行った。その結果、C57/BL6バックグラウンドのSPA-1-/-マウス(B6 SPA-1-/-)では129xB6バックのSPA-1-/-マウス同様、生後半年を過ぎるころからT細胞の機能不全が観察されたが、BALB/cバックグラウンドのSPA-1/-マウスでは観察されなかった。両マウスのT細胞の相違について解析したところ、B6 SPA-1-/-マウスにおいて加齢に伴いnegative co-receptorの1つであるPD-1を発現したCD4T細胞(PD-1+CD4+T細胞)が増加していることが明らかとなった。この細胞を精製し、抗原刺激を行ったところ、通常抗原刺激により活性化されるERKが全く活性化されないこと、および増殖反応が全くは起こらないことが明らかとなった。しかし、抗原刺激の代わりにPMAおよびイオノフォアで刺激することにより正常増殖を示したことから、PD-1+CD4+T細胞では増殖機構そのものに異常があるのではなく、T細胞抗原レセプター下流のERKに至る経路でシグナル阻害が起こっていることが予想された。正常マウスにおけるPD-1+CD4+T細胞について解析したところ、興味深いことに正常B6マウスにおいても、加齢に伴いPD-1+CD4+T細胞が増加することが、明らかとなった。

現在、PD-1+CD4+T細胞における抗原不応答性の分子メカニズムについて解析を行っている。低分子量G蛋白Rap1特異的GAP、SPA-1の遺伝子破壊マウスは、生後半年を過ぎた時点からT細胞機能不全に陥る。このT細胞機能不全の発症原因を明らかにするために、SPA-1遺伝子破壊マウスのT細胞の性状について解析を行ったところ、negative co-receptorの1つであるPD-1を発現したCD4T細胞(PD-1^+CD4^+T細胞)が増加しているのが明らかとなった。この分画の細胞を精製・解析したところ、抗原刺激に対し無反応(アナジー状態)であり、通常、抗原刺激により活性化されるERKが全く活性化されなかった。しかし、抗原刺激の代わりにPMAおよびイオノフォアで刺激することにより正常増殖を示したことから、PD-1^+CD4^+T細胞では増殖機構そのものに異常があるのではなく、T細胞抗原レセプター下流のERKに至る経路でシグナル阻害が起こっていることが示唆された。PD-1^+CD4^+T細胞は、正常マウスにおいても少ないながらも存在しており、やはり加齢とともに増加する傾向があった。PD-1^+CD4^+T細胞を単離し、PD-1^-CD4^+T細胞の間でDNAマイクロアレイ解析を行い、両者の間で変化している遺伝子について解析を行ったところ、後者に比べ前者では、IL-1レセプターβ鎖(CD121b)、B細胞の分化制御に関与するOcaBならびに好中球分化の制御転写因子であるC/EBPα遺伝子の発現が上昇していることが明らかとなった。これらの変化についてはリアルタイムPCR法においても確認された。現在、これらの遺伝子とT細胞アナジーの関係を明らかにするために、これらの遺伝子をマウス正常T細胞に導入し、その機能に及ぼす影響について解析を行っている。一方、本研究においてニワトリTSLPホモログの単離を計画したが、データベース解析からニワトリにおいて本遺伝子は存在していないことが明らかとなった。
創発性を持つ新しい虫型人工生命の開発と未知関数発見及び画像認識への応用

創発性のある虫型人工生命を提案した。これは工学的観点から人工生命の有効性について検討したものである。本研究では関数発見能力を持つ虫型人工生命を開発した。このシステムを用いていくつかの関数を発見した。虫の遺伝子は種々の関数、定数、変数より構成される。遺伝子の表現には木構造を用いた。観測データを虫の餌とみなし、虫に供給する。虫はデータを捕獲した後、生殖を行う。この際、有性生殖・無性生殖の概念を導入した。また、同種の生息数に制限を設けた。これらの概念が関数探索に有効である。遺伝子の一部は突然変異によって変化する。世代が進むにつてれ、観測データによく一致する虫ほど選択的に生き残る。そして、最終的に観測データに一致する真の関数を発見する。このシステムの妥当性を確認するために、オームの法則、ケプラーの法則等の既知の法則に従うデータを虫に供給すると、観測データに従う関数を発見できた。また、未知データとして、光沢に関する光学データを供給すると、光沢に一致する関数を発見できた。さらに、画像データを虫に与えると、画像中に含まれる複数の曲線を抽出することができ、工学的に応用できる可能性を示した。本システムは遺伝的プログラミングと比較して、解が収束しやすく、安定している。また、人間が発見するのと同様に、得られる解が比較的簡単である。このように、虫型人工生命は創発性を持ち、人工生命が工学的観点からも非常に重要な分野となる可能性を大いに持つ。創発性をもつ新しい虫型人工生命の基本モデルを提案する。今回の研究で提案する人工生命は、人間が直観的に実験データからいろいろな現象を発見できるように、人工生命自身が新しい関数を発見する。その基本モデルを提案する。関数発見を実現する個々の個体を「虫」と呼ぶことにする。虫の遺伝子は種々の関数、変数、定数より構成される。まず、最初に様々な関数を遺伝子として持つ多数の虫をランダムに生成する。生成された様々な虫は観測データを餌として捕獲する。すると、虫の内部エネルギーが高くなる。すべての虫が観測データを捕獲した後、生殖を行う。この時、全く同じ遺伝子構造を持つ虫を同種、異なるものを異種とみなす。今回、有性生殖・無性生殖の概念を提案し、同種と異種によって生殖が異なるようにする。有性生殖とは同種の間で交叉することを意味し、無性生殖とは交叉を行わずに、自分と全く同じ遺伝子構造を持つ虫を複数誕生させることである。生殖後、虫の遺伝子の一部は突然変異によって変化する。世代が進むにつれて、観測データに一致する虫が生き残り、最終的に観測データに一致する虫が出現する。今回のシステムでは、有性生殖・無性生殖の導入、同種の生存数に制限を設けることにより、未知関数の探索能力が大きく向上する。モデルの妥当性を確認するために、ケプラーの法則、スネルの法則等の既知の法則に従う観測データや光学データをシステムに入力すると、入力データに一致する関数を発見できた。また関数発見能力が十分とはいえないが、今回提案する虫型人工生命は未知関数発見能力を有することがわかった。以上より、将来的には発見や直観などの人間のみが有する能力を人工生命が代替もしくは補佐できる可能性が十分にあるといえる。
運動学習の分子機構

運動学習の分子機構を個体レベルで解析するために,中枢神経系において興奮性神経伝達を中心的に担うグルタミン酸受容体(GluR)に焦点を絞り,小脳プルキンエ細胞特異的GluRδ2および,NMDA型GluRε1,ε2の遺伝子ノックアウト(KO)マウスを解析して以下の研究成果を得た.1)条件刺激(CS)である音と非条件刺激(US)である電気ショックを連合させる瞬目反射条件付けを用いた運動学習を測定しGluRδ2 KOマウスは,CSとUSが時間的に重なる課題における学習ができない一方,CSとUSが重ならない課題での学習は可能であることを見い出した.従って,同じCSとUSを用いた運動学習においても課題依存的に学習に関わる脳内システムが異なることが示唆された.2)NMDA型GluRε1KOマウスの瞬目反射条件付けの解析から,NMDA受容体GluRε1はCSとUSが重ならずその時間間隔の長い課題での学習に必要であることが明らかとなった.3)GluRε2 KOマウスは神経回路形成に障害があり生後1日以内に死亡するが,ヘテロ欠損マウスは成長し繁殖も可能である.このGluRε2ヘテロ欠損マウスの解析から,GluRε2が音驚愕反射の制御に特異的に関わることを見い出した.音驚愕反射の1次回路は脳幹より下位にあり,GluRε2サブユニットは成体では前脳特異的に発現することから,GluRε2の発現する前脳が音驚愕反射の機能修飾を行っていることが明かとなった.4)脳部位特異的かつ誘導型の遺伝子操作法を開発するために遺伝子組み換え酵素Creを小脳プルキンエ細胞,海馬CA3野,線条体特異的に発現するマウス系統を作成した.一方,GluRδ2,NMDA受容体,神経栄養因子受容体を標的としてCreによる遺伝子欠損が可能なマウスをC57BL/6系統由来のES細胞を用いて確立した.運動学習の分子機構を個体レベルで解析するために,中枢神経系において興奮性神経伝達を中心的に担うグルタミン酸受容体(GluR)に焦点を絞り,小脳プルキンエ細胞特異的GluRδ2および,NMDA型GluRε1,ε2の遺伝子ノックアウト(KO)マウスを解析して以下の研究成果を得た.1)条件刺激(CS)である音と非条件刺激(US)である電気ショックを連合させる瞬目反射条件付けを用いた運動学習を測定しGluRδ2 KOマウスは,CSとUSが時間的に重なる課題における学習ができない一方,CSとUSが重ならない課題での学習は可能であることを見い出した.従って,同じCSとUSを用いた運動学習においても課題依存的に学習に関わる脳内システムが異なることが示唆された.2)NMDA型GluRε1KOマウスの瞬目反射条件付けの解析から,NMDA受容体GluRε1はCSとUSが重ならずその時間間隔の長い課題での学習に必要であることが明らかとなった.3)GluRε2 KOマウスは神経回路形成に障害があり生後1日以内に死亡するが,ヘテロ欠損マウスは成長し繁殖も可能である.このGluRε2ヘテロ欠損マウスの解析から,GluRε2が音驚愕反射の制御に特異的に関わることを見い出した.音驚愕反射の1次回路は脳幹より下位にあり,GluRε2サブユニットは成体では前脳特異的に発現することから,GluRε2の発現する前脳が音驚愕反射の機能修飾を行っていることが明かとなった.4)脳部位特異的かつ誘導型の遺伝子操作法を開発するために遺伝子組み換え酵素Creを小脳プルキンエ細胞,海馬CA3野,線条体特異的に発現するマウス系統を作成した.一方,GluRδ2,NMDA受容体,神経栄養因子受容体を標的としてCreによる遺伝子欠損が可能なマウスをC57BL/6系統由来のES細胞を用いて確立した.中枢神経系の主要な興奮性神経伝達を担い、神経回路形成、シナプス可塑性に関わるグルタミン酸受容体(GluR)チャネルに焦点を当て、小脳プルキンエ細胞特異的なGluRδ2欠損マウスおよびNMDA受容体チャネルGluRε1欠損マウスにおける瞬目反射条件付けを用いた運動学習の解析を行ない、以下の研究成果を得た。1)瞬目反射条件付けによる運動学習においてGluRδ2ノックアウトマウスは条件刺激(CS)と非条件刺激(US)が時間的の重なるdelay paradigmに障害を示す一方、CSとUSが重ならないtrace paradigmには障害は見られなかった。これらの結果から、GluRδ2ノックアウトマウスで障害されている小脳皮質のLTDがdelay paradigmの運動学習に関わる事を見い出した。またtrace paradigmに障害が見られないことから、学習paradigm依存的に脳内の異なるシステムが機能し学習過程に関わる可能性が示唆された。2) NMDA受容体チャネルGluRε1欠損マウスはdelay paradigmにはほとんど障害は認められなかったが、間隔の長いtrace paradigmに障害を示したことから、,GluRε1ノックアウトマウスで障害されている海馬LTPがtrace Paradigmの運動学習に関与する可能性が示唆された。

運動学習の分子機構を個体レベルで解析するために,中枢神経系において興奮性神経伝達を中心的に担うグルタミン酸受容体(GluR)に焦点を絞り,小脳プルキンエ細胞特異的GluRδ2および,NMDA型GluRε1,ε2の遺伝子ノックアウト(KO)マウスを解析して以下の研究成果を得た.1)条件刺激(CS)である音と非条件刺激(US)である電気ショックを連合させる瞬目反射条件付けを用いた運動学習を測定しGluRδ2 KOマゥスは,CSとUSが時間的に重なる課題における学習ができない一方,CSとUSが重ならない課題での学習は可能であることを見い出した.従って,同じCSとUSを用いた運動学習においても課題依存的に学習に関わる脳内システムが異なることが示唆された.2)NMDA型G1uRε1KOマウスの瞬目反射条件付けの解析から,NMDA受容体GluRε1はCSとUSが重ならずその時間間隔の長い諜題での学習に必要であることが明らかとなった.3)GluRε2 KOマウスは神経回路形成に障害があり生後1日以内に死亡するが,ヘテロ欠損マウスは成長し繁殖も可能である.このGluRε2ヘテロ欠損マウスの解析から,GluRε2が音驚愕反射の制御に特異的に関わることを見い出した.音驚愕反射の1次回路は脳幹より下位にあり,GluRε2サブユニットは成体では前脳特異的に発現することから,GluRε2の発現する前脳が音驚愕反射の機能修飾を行っていることが明かとなった.4)脳部位特異的かつ誘導型の遺伝子操作法を開発するために遺伝子組み換え酵素Creを小脳プルキンエ細胞,海馬CA3野,線条体特異的に発現するマウス系統を作成した.一方,GluRδ2, NMDA受容体,神経栄養因受容体を標的としてCreによる遺伝子欠損が可能なマウスをC57BL/6系統由来のES細胞を用いて確立した.
高等植物の形成層制御に関する分子細胞学的研究

植物の形態形成過程では多数の遺伝子が部位および時期特異的に発現している。しかし、その詳細については未解明な点が多い。現在まで取得している形成層関連の変異体候補のうち、CS36065株について、細胞増殖制御を野生株の様式と比較・検討した。原因遺伝子と考えられるMyosinXI(AtXIF)は必須遺伝子であることが、昨年度の研究で示唆されているが、その表現型への影響をシロイヌナズナ植物体の各部位を観察することで検討した。その結果、根毛では表現系の変化は認められなかった。しかし、花粉管の伸長に関与する可能性を考慮し、発芽培地の組成の検討を行った結果、花粉への影響が認められた。cs36065株では花粉の発芽率が低下し、またその伸長にも阻害が認められた。このことは、cs36065株が必須遺伝子であることの原因であると考えられる。また、植物の形態形成に関わる遺伝子を組織的に取得するために、分裂組織で増殖中の細胞を容易に観察する実験系が必要である。GFPを増殖中の細胞でのみ特異的に発現させるために、細胞増殖関遺伝子(cycA2;al)のプロモータを利用して、GFPを植物中で発現させるプラスミドを構築した。このサイクリンのプロモーターにΩ配列を付加し、さらに発現量の増強をはかった。シロイヌナズナに導入する前段階として、タバコ培養細胞BY-2に導入し、Ω付加がGFPの発現量に与える影響について検討した。分裂組織変異体のスクリーニングを行なうために、GFPが増殖中の細胞で特異的に発現するシロイヌナズナの株の作製を計画した。そこで、サイクリン(cycA2;1)のプロモーターにGFPを接続したプラスミドを作製した。このプラスミドを形質転換したタバコ培養細胞BY-2でGFPが発現することを確認したのちに、シロイヌナズナ野生株に形質転換を行なった.形質転換体に対して抗GFP抗体を用いてウエスタンブロッティングを行ない、GFPが発現していることを確認した。根端分裂組織での発現を蛍光実体顕微鏡で観察したところ、一部の植物体の根端がGFPで標識されたことを確認した。分裂組織の変異体のスクリーニングに用いるにはGFPの発現量をさらに増加させる必要があるため、現在タバコモザイクウイルス由来のΩ配列の組込みを行い、発現量を増加させる作業行なっている。また、植物の増殖中の細胞では、ミトコンドリアが巨大化することをすでに報告しているが、この性質を指標として分裂組織の研究を行うために、ミトコンドリアをGFPで標識したシロイヌナズナを作製した。ミオシンにタグが入ったシロイヌナズナ変異体候補については、RT-PCRで遺伝子の発現状態を確認したところ、タグの挿入されたミオシン遺伝子の発現が確認された。この原因を解明するために、タグの挿入状態について解析を行なったところ、ヘテロ体のみが取得され、タグ挿入がホモの状態の個体は取得出来なかった。これは、タグの挿入されたミオシン遺伝子が必須遺伝子であることを示唆している。
沿岸漁業者の民俗誌的研究－福岡市東区志賀島地区の調査から－

本研究では福岡市東区志賀島地区に在住し、博多湾、玄界灘を漁業として沿岸漁業を営む漁業者について、民俗誌的な検討を行った。平成25年度の科学研究費助成事業(奨励研究)の成果を踏まえ、より調査を深化させたものである。この研究では1938年生まれの漁業者A氏が営む漁撈活動を対象に、おもに聞き取り調査を行った。特に前年度に仕切書に基づいて分析した2012年の漁業暦に挙げられた各種の漁業について、漁具漁法の面から調査した。年間のA氏の漁撈活動は、刺網・ひき縄、一本釣りで構成されるが、これらは活用される民俗知に大きな違いがあり、そこからはA氏の漁撈に関わる多様かつ広汎な知の枠組みを窺い知ることができた。特にシオ(潮汐潮流)の知識は漁撈活動と深く連関し、漁業種類によってその活用に大きな違いがあることを認められた。また、前年度の調査ではA氏の年周的、月周的な漁撈活動の分析を試みたが、今回はA氏の日周的な活動の調査も行った。ここでは出漁の可否が「天気予報」で判断されることや、漁場の選択が「携帯電話」による漁業者間の情報交換によって左右される点を知ることができた。今日の漁撈を考えるうえでは、漁業者が伝承してきた民俗知や、漁撈活動のなかで獲得してきた経験知とともに、こうした現代的なツールについても勘案してゆく必要を指摘できる。さらに、A氏がどういった経緯で漁業に従事することになり、70才を過ぎた現在も漁に出ているのかをライフヒストリー的調査から検討した。そのなかでは特に、彼が「イオ(魚)と遊ぶことが楽しか。」と述べる言葉に着目した。生業が単に生計を維持するための活動ではなく、生きがい論のうえから考える必要を考察した。
大規模災害に関する情報能力の研究

大規模自然災害のみならず、昭和59年11月に生じた世田谷通信ケーブル火災で実証されたような人為災害に対しても現在の社会、特に大都市は脆弱である。正確な情報が円滑に伝達されなければデマが流布しパニックを引き起こす体質を内在している。従って大規模災害から国民の生命、財産を保護し救援復旧を迅速に行うため、大規模災害に対して情報の収集と伝達という情報能力の涵養は重要な研究課題である。本研究では、ハイアラキー構造を有するある程度広域のモデル地域を選定し、その地域における通信システムなどの情報網及び医療・救急施設などの災害時の利用に関し調査分析を行なった。具体的には、モデル地域として、過去に関東大震災という大きな災害があったこと、日本の中心ということで、東京都を設定し、各災害対策本部、警察、消防などの防災機関、報道機関、そして住民の生活に直接かかってくる電気・ガス・水道・電話・鉄道などの各機関の通信連絡系統を調査し、それら機関間および住民への連絡系統及びその伝達手段について調査を行なった。そして大規模災害が起こった場合の被害想定を適当(関東大震災程度)に設定し、各組織への情報伝達が、時間経過とともにどのよう様に行なわれるか検討する上で、まず情報のメディアとその特徴について情報能力の観点から検討した。情報のメディアとしてとくに有線系である電話についての輻輳の予想に対して各トラヒックへの優先順位の設立など通信の集中化に対処するため、現状のシステムにおいての予想と、将来的にどのくらいの規制が必要かを予測検討した。今後は、情報のメディアのうち、通信分断時に有効となる既設システムと衛星回線を統括的に把えた通信方式の企画設計を行なうために調査検討をさらに進めていく。
腸管グリア細胞の動態・ストレス応答からみた機能性ディスペプシアの病態解析

機能性ディスペプシア(functional dyspepsia; FD)患者6名と健常者3名を対象に、質問紙票での調査、十二指腸下行部から組織を採取し下記項目を比較検討した。FD患者群は健常者群に比し、食後のもたれ感などの食後愁訴症候群に属する症状の強度が有意に高かった。FD患者では、十二指腸粘膜内のグリア細胞由来神経栄養因子の発現亢進、および上皮細胞間距離の延長が認められ、ディスペプシア症状の発現に関与する可能性が示唆された。【方法】Rome-III基準を満たす2080歳の機能性ディスペプシア(functional dyspepsia; FD)患者6名と健常者3名を対象に,質問紙票での調査,十二指腸下行部から組織を採取し下記項目を比較検討した.心窩部痛・心窩部灼熱感・早期飽満感・食後のもたれ感の4つのディスペプシア症状強度を7点Likert scaleで,身体化障害はPatient Health Questionnaire-15を用い評価した.上皮細胞間距離を透過型電子顕微鏡で観察,計測した.十二指腸粘膜内グリア細胞由来神経栄養因子(Glialcell line-derived neurotrophic factor; GDNF)蛋白発現量をELISA法で,グリア細胞マーカーであるS100β,細胞接着因子mRNA発現量をRT-PCR法で解析した.GDNFの局在は蛍光免疫染色を行った.【成績】FD患者群は健常者群に比し,食後愁訴症候群に属する症状強度(P=0.02),身体化障害スコア(P=0.04)が有意に高かった.抑うつ・不安は有意差を認めなかった。FDでは上皮細胞間距離が延長し,接着結合の開大を認めた(20.0±1.8 vs. 31.0±2.8 nm, P=0.03).またGDNF蛋白発現量が有意に亢進し(53.3±17.7 vs. 113.8±11.8 pg/mg protein, P=0.01),上皮細胞間距離と正相関を示した(P=0.032, r=0.81)。細胞間距離と食後のもたれ感との相関性は強かった(P=0.06, r=0.86).GDNF発現量と心窩部灼熱感,食後のもたれ感は相関傾向であった(P=0.06, r=0.52; P=0.06, r=0.65).GDNFは絨毛先端部のグリア細胞,陰窩基部の炎症細胞に局在していた.mRNA発現量はいずれも有意差がなかった.【結論】FD患者では十二指腸上皮細胞間距離の開大,粘膜内GDNF蛋白発現の亢進が認められ,症状発現に関与する可能性が示唆された.機能性ディスペプシア(functional dyspepsia; FD)患者6名と健常者3名を対象に、質問紙票での調査、十二指腸下行部から組織を採取し下記項目を比較検討した。本研究対象者である、Rome-III診断基準を満たし身体化障害を有さない2080歳の機能性ディスペプシア患者および健常者の症例を集積中である。集積可能であった症例にてアンケート調査(HADS・PHQ-15)を行い、抑うつ・不安症状、身体化障害の有無を評価した。適格症例に対しては上部消化管内視鏡検査と十二指腸組織の生検を施行し、グリア細胞のマーカーであるS100β、GFAP (Glial fibrillary acidic protein) mRNA発現量の測定を試みている。また定常状態および炎症性サイトカインによる刺激を加えた後での十二指腸組織中GDNF (Glial cell line-derived neurotrophic factor)発現量をELISA法にて測定している。本年度の研究によりELISA法によるGDNF測定系の確立に成功した。さらには蛍光染色法を用いS100β、GFAP、GDNF等の十二指腸組織での局在を検討している。現在登録症例数は機能性ディスペプシア患者5例である。機能性ディスペプシアの病態を修飾する因子を極力除外するために、Helicobacter pylori感染が無く、酸分泌抑制薬や消化管運動調整薬等の薬剤投与を受けていない機能性ディスペプシア患者を選択基準としていることが症例集積に難渋している一因として挙げられるが、機能性ディスペプシアの病態を正確に評価するためには必要な基準だと考えられる。今後さらなる症例集積に努め、引き続きデータ解析を行う予定である。現在登録症例数は機能性ディスペプシア患者5例であり、症例集積にやや難渋している。

今後さらなる症例集積に努め、引き続きデータ解析を行う予定である。抑うつ・不安症状を有する機能性ディスペプシア患者における腸管グリア細胞の動態を明らかにするため、今後さらなる症例集積に努め、昨年度と同様にグリア細胞関連物質の測定を行う。具体的には十二指腸生検組織を用いて、グリア細胞のマーカーであるS100β、GFAP mRNA発現量をreal time RT-PCR法にて測定し、蛍光染色法を用いてグリア細胞の局在を検討する。またグリア細胞が産生する神経栄養因子であるGDNF発現量をELISA法にて測定する。さらには炎症に対する十二指腸グリア細胞の被刺激性の検討として、生検組織を培養し炎症性サイトカインであるIL-1βを添加することにより実験的炎症状態を作成、その後のGDNF発現量を検討する予定である。最終的に上記パラメータと腹部症状の強さとの相関性を解析し、機能性ディスペプシア患者における腹部症状の発生機序解明につながる因子を探索する。本研究における研究経費の主要な用途は消耗品費である。内訳として実験試薬、実験器具、蛍光二重染色用の抗体、real time RT-PCR用のprimer・probe、ELISA kit等の購入に使用する予定である。