hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
空胴共振器型加温アプリケータ内の電磁界分布を利用した非侵襲温度計測

がん組織を43°C前後に加温して治療を行うハイパーサーミアは,放射線療法や制癌剤との併用療法として有効な治療技術であるが,その加温効果の確認のためには熱電対や光ファイバ温度計を使用する必要がある.そこで筆者らは,リエントラント電極間に形成されるTMモードの電界特性および誘電率の誘電率依存性に注目した非侵襲温度計測法を提案している.本研究では,三次元有限差分時間領域法等を用いた数値解析によって,温度変化分布画像の再構成に必要な解析パラメータに関する検討等を実施した.検討の結果,共振器内電磁界分布の位相情報に替えて振幅情報を利用することによって,再構成画像をより高精度化できる可能性を示した.本研究の目的は,がんの温熱療法(ハイパーサーミア)の治療効果向上のため,治療時における体内の温度変化分布を画像化して計測する技術の開発である.がん組織を43°C前後に加温して治療を行うハイパーサーミアにおいて,その加温効果(治療効果)を確認するためには,熱電対や光ファイバ等の温度プローブを生体内に刺入する必要がある.現在のところ,非侵襲に生体内の温度変化分布を計測する手法としては,MRIを利用した方法等があるが,計測装置が大掛かりになってしまうこと等の理由から,臨床応用に耐え得るような非侵襲温度計測法は実現されていない.本研究の目的は,誘電率の温度依存性と加温装置内の電磁界分布の特性を利用して,生体内の温度変化分布を非侵襲に画像化して計測する手法の開発である.今年度の研究計画は,温度変化分布再構成画像の空間分解能や計測感度等に関する検討,および実験的検討で使用するための空胴共振器や計測システムの設計・試作に関する検討である.数値解析による検討の結果,電磁界の振幅情報を利用した分布推定によっても温度変化分布画像が得られる可能性を明らかにした.この振幅情報による新たな時系列波形の解析手法や,従来の位相情報を利用した温度変化推定結果との比較および感度や精度向上の可能性等の詳細については現在検討中であり,本件に関する新たな知見が明らかになり次第,研究成果を公表する予定である.このように,より高精度な温度変化分布推定のために様々なアルゴリズムの修正を行ったため,実験的検討で使用するための空胴共振器や計測システムの設計・試作に関する検討が計画より遅れているが,次年度以降は,研究計画書に記した多岐にわたる検討事項の優先順位を考慮し,また新たに導入した電磁界解析用並列計算システム等を効率的に利用して,研究を進める予定である.本研究の目的は,がんの温熱療法(ハイパーサーミア)の治療効果向上のため,治療時における体内の温度変化分布を画像化して計測する技術の開発である.がん組織を43°C前後に加温して治療を行うハイパーサーミアにおいて,その加温効果(治療効果)を確認するためには,熱電対や光ファイバ等の温度プローブを生体内に刺入する必要がある.現在のところ,非侵襲に生体内の温度変化分布を計測する手法としては,MRIを利用した方法等があるが,計測装置が大掛かりになってしまうこと等の理由から,臨床応用に耐え得るような非侵襲温度計測法は実現されていない.本研究の目的は,誘電率の温度依存性と加温装置内の電磁界分布の特性を利用して,生体内の温度変化分布を非侵襲に画像化して計測する手法の開発である.今年度の研究計画は,温度変化分布再構成画像の空間分解能や計測感度等に関する検討,および実験的検討で使用するための空胴共振器や計測システムの設計・試作に関する検討である.数値解析による検討の結果,電磁界分布(位相や振幅情報等)を利用した画像再構成による逆推定によっても温度変化分布画像が得られる可能性を示し,また温度変化分布画像の高精度化のため,画像再構成フィルタ等の解析パラメータに関する検討を実施した.この電磁界分布の情報による新たな時系列波形の解析手法や,従来の位相情報を利用した温度変化推定結果との比較および感度や精度向上の可能性等の詳細については現在さらに検討中であり,本件に関する新たな知見が明らかになり次第,研究成果を公表する予定である.今年度は,研究計画書に記した多岐にわたる検討事項の優先順位を考慮し,また新たに導入した電磁界解析用並列計算システム等を効率的に利用して,研究を進める予定である.本研究の目的は,がんの温熱療法(ハイパーサーミア)の治療効果向上のため,治療時における体内の温度変化分布を画像化して計測する技術の開発である.がん組織を43°C前後に加温して治療を行うハイパーサーミアにおいて,その加温効果(治療効果)を確認するためには,熱電対や光ファイバ等の温度プローブを生体内に刺入する必要がある.現在のところ,非侵襲に生体内の温度変化分布を計測する手法としては,MRIを利用した方法等があるが,計測装置が大掛かりになってしまうこと等の理由から,臨床応用に耐え得るような非侵襲温度計測法は実現されていない.本研究の目的は,誘電率の温度依存性と加温装置内の電磁界分布の特性を利用して,生体内の温度変化分布を非侵襲に画像化して計測する手法の開発である.これまでの数値解析による検討の結果,電磁界分布(位相や振幅情報等)を利用した画像再構成による逆推定によっても温度変化分布画像が得られる可能性を示した.

さらに現在,温度変化分布画像の高精度化のため,画像再構成フィルタ等の解析パラメータに関する検討を実施している.今年度の研究計画は,昨年度に引き続き,温度変化分布再構成画像の空間分解能や計測感度等に関する検討,および実験的検討で使用するための空胴共振器や計測システムの設計・試作に関する検討である.特に今年度は,これら多岐にわたる検討事項の優先順位を考慮し,また新たに導入した電磁界解析用並列計算システム等を効率的に利用して,研究を進める予定である.本年度は研究計画に基づき,実験的検討で使用するための空胴共振器や計測システムの設計・試作に関する検討等を実施する予定であった.しかし,これまでの数値解析による検討の結果,非侵襲温度計則システムの設計・構築に必要になる知見を得るには至っておらず,システムの設計に取り組むことができていない.これは,温度変化分布推定の高感度化・高精度化のために,新たに高周波電磁界時系列波形の振幅情報の利用を検討したこと,またこれにより高周波電磁界の時系列波形解析方法等の信号処理手法について検討する必要性が生じたこと,さらに高精度な画像再構成のために,共振器内の電磁界を励振するための波形に関して,再検討する必要性が生じたこと等により,当初想定していた温度変化分布推定アルゴリズムの検討に,多くの時間を要しているためである.さらに,これらの検討事項にともない,研究計画書に記載した画像最高に関する検討(最適な画像再構成フィルタや投影数や再構成パラメータに関する検討等)等に関しても再検討の必要が生じ,検討事項の優先順位を決定することがより困難になってしまったことも原因の一つである.さらに,これらの検討事項を評価するために使用している三次元有限差分時間領域法(FDTD法)数値解析にも,多くの計算機リソースを必要としている.この計算のために並列処理が可能な解析システムを構築しているが,解析には想定以上の時間を要してしまっており,これについても研究が遅れている理由の一つである.本研究の目的は,がんの温熱療法(ハイパーサーミア)の治療効果向上のため,治療時における体内の温度変化分布を画像化して計測する技術の開発である.がん組織を43°C前後に加温して治療を行うハイパーサーミアにおいて,その加温効果(治療効果)を確認するためには,熱電対や光ファイバ等の温度プローブを生体内に刺入する必要がある.現在のところ,非侵襲に生体内の温度変化分布を計測する手法としては,MRIを利用した方法等があるが,計測装置が大掛かりになってしまうこと等の理由から,臨床応用に耐え得るような非侵襲温度計測法は実現されていない.本研究の目的は,誘電率の温度依存性と加温装置内の電磁界分布の特性を利用して,生体内の温度変化分布を非侵襲に画像化して計測する手法の開発である.これまでに数値解析等による検討から,電磁界分布を利用した電磁界位相分布の逆推定によって,温度変化分布画像が得られる可能性を示している.本研究実施計画は,温度変化分布再構成画像の高精度化,および実験的検討で使用するための空胴共振器や計測システムの設計・試作に関する検討等である.このうち温度変化分布の高精度化については,三次元有限差分時間領域法を用いた数値解析によって,画像再構成に必要な解析パラメータに関する検討等を実施した.検討の結果,従来利用していた電磁界分布の位相情報に替えて振幅情報を利用して再構成することによって,再構成画像をより高精度化できる可能性を示した.すなわち,より明瞭な温度分布画像が得られ,目標である空間分解能1cmの実現の可能性を示した.本研究計画に記載してある計測システムの設計・試作等の検討までには至らなかったが,今後の実験的検討に必要となる重要な知見を得ることができた.
集団の拡散と文明形成に伴う遺伝的多様性と身体的変化の解明

本研究は、フロンティアに進出した集団が獲得した遺伝的多様性、自然ならびに文化的環境への適応について、その変遷を時間軸に沿って解明する。骨形態と古代ゲノム解析から、新天地への拡散の歴史、人口構造・人口動態、環境への適応進化を解明する。また、ミイラや糞石に残された寄生虫感染症や細菌・ウイルス感染症のメタゲノム解析から、感染症の実相を明らかにする。人類集団モデル動物(メダカ)を用いたゲノム研究によって、好奇心(新奇性追求)遺伝子多型の検出とその進化的解析を行い、メダカとヒトの遺伝子多型の関連性を検証し、新天地への拡散と移動を可能にした人類の心理・行動に関係する適応候補遺伝子の推定および解析をする。
シェーグレン症候群と関連するTAP2遺伝子変異が及ぼすHLA結合抗原ペプチド変化

(2)変異TAP2遺伝子導入細胞株(T2/Bky2)の樹立.(3)TAP2遺伝子導入細胞に発現したHLA結合ペプチドの採取.Protein AcolumnにT2の親株であるT1細胞株に発現している抗HLA-B5抗体である4D12抗体を結合させたcolumnを作成する。T2/Bky2,T2/B細胞をProtease inhibitorの共存下で溶解し、columnに流入させ、それぞれの細胞からcolumnに結合して得られる抗HLA-B5抗体、HLA、peptide複合体分画を採取する。5000dalton cut-off filterで遠心後、ペプチド分画のみを分取した。(4)採取ペプチドの解析.トリフルオロ酢酸とアセトニトリルを溶媒として、Reverse-phase HPLCで得られたピークごとに流出分画を採取し、マススペクトロメトリーにてペプチドレパートリを解析し、そのアミノ酸配列を決定し、自然変異TAP2遺伝子のペプチド選択性と病因的意義を解明中である。(1)変異TAP2遺伝子の作製.贈与されたTAP2^*BcDNAをpBluescriptベクターに挿入し、オリエンテーションを確認した。作成したプラスミドにShuldier.A.R.et al(Analyt.Biochem.194,9-15,1991)に従い突然変異を導入した。nucleotide number 1,729(A→Gの変異導入)と、nucleotide number 170との近傍で両方向に重なり合うプライマーを作成し、cDNAとベクターのPCR片を作成後、両者を混ぜてoverlap extensionを行った。このようにTAP2^*Bky2に特有の置換(エクソン9のコドン577がMet→Val)を入れた変異遺伝子を作製し、全核酸配列を確認した。pREP7のベクターにTAP1,pREP9のベクターにTAP2^*B,又はTAP2^*Bky2cDNAを挿入し、3種類のcDNAを作製した。selection markerとしてG418とhygromycinを選択し、薬剤濃度とエレクトロポレーション時の電圧などの条件の基礎的検討を行った。結果、電圧は220V、975μF、薬剤濃度はG418は1mg/mlでhygromycinは0.2mg/mlの濃度が至適であることを決定した。(3)変異TAP2遺伝子導入細胞株の樹立TAP遺伝子欠損細胞株T2に、エレクトロポレーション法により、TAP1遺伝子とともに、変異TAP2遺伝子あるいはwild type TAP2遺伝子を導入し、TAP2遺伝子のcodon577部分のみが異なる細胞株作製を行っている。現在までのところ、両者がうまく導入でき、長期間安定して生存するトランスフェクタントは得られていない。ベクターや条件も含め、再検討中である。(1)変異TAP2遺伝子導入細胞株の樹立.T2/Bky2とT2/B細胞においてもその発現が確認されたので、それぞれのTAP遺伝子によってトランスポートされHLA-B5に結合している内在性の抗原ペプチドを採取するため、Protein A columnに抗HLA-B5抗体である4D12抗体(熊本大学滝口雅文博士から恵与)を結合させたcolumnを作成した。(4)採取ペブチドの解析.Reverse-phase HPLCで得られたピークごとに流出分画を採取した。現在、T2/Bky2およびT2/B細胞のトHLA-B5結合ペプチドを溶解し、マススペクトロメトリーにてペプチドのレパートリとアミノ酸配列を解析中である(大阪医大清水章博士、中西豊文博士と共同研究)。
バイオインフォマティクスに基づくB型インフルエンザウイルス変異機序の基盤的解析

ランダム変異導入法によりB型インフルエンザウイルス(B/Kanagwa/73)HAの一アミノ酸変異HAを作製した。301変異HAのうち69%の変異が許容され、これはA型ウイルスHAの約1.5倍に相当する。2系統に分岐後のB型ウイルスHA(BHA)も同程度の許容性を示した。また、分岐前後BHA上の同一変異の96%でその影響が一致した。BHAはアミノ酸変異に対する許容性が高く変異の蓄積による構造的変化が少ないため、分岐前後のBHA間でアミノ酸変異の機能への影響にほぼ差がないことが示唆された。本研究では、ランダム変異導入法によりB型インフルエンザウイルスのHA(BHA)の任意の位置に任意のアミノ酸変異を導入し、変異HAの解析によりB型HAの構造と機能の基盤的解析を行うことを目的とした。本年度は主に分岐前BHAを基に変異HAの作製と機能解析を行った。作製した302個の1アミノ酸変異HA(192個はHA1領域、110個はHA2領域)の機能解析の結果を以下に示す。1.変異に対する許容性:HA全体では約80%、HA1領域のみでは76%、HA2領域のみでは88%となった。(ここで許容性は[レセプター結合能(ヒト赤血球に対する血球吸着能)を維持する変異HAの数/全変異HA数]x100で表す。)このBHAの許容性はすでに報告さているAHAの約2倍となる。BHAがAHAに比ベアミノ酸変異率が低い理由はBHAの変異に対する許容性が低いためではないことを示唆している。2.変異非許容部位:主にレセプター結合領域周辺とHA幹部に生じた変異がレセプター結合能を阻害した。さらに、ヒト赤血球と鶏赤血球に対する結合能に差がある変異部位が存在した。3.変異部位とアミノ酸の種類の重要性:同一部位に異なるアミノ酸変異が導入された変異HAの機能解析の結果、変異するアミノ酸の種類より、変異の生じる部位が機能に与える影響が大きいことが示された。4.分岐後HAでの同様の実験結果(未終了)は、Yamagata系統は分岐前HAと同程度の許容性を示すがVictoria系統はYamagata系統に比し変異に対する許容性が低いことを示していた。本年度の結果は、分岐前BHAはアミノ酸変異に対し許容性が高く、変異を許容しない部位は比較的限られていることを示していた。20年度には変異非許容部位の絞込み、および変異がウイルス粒子形成能に与える影響をさらに調べ、BHAの機能を維持する構造の分子的基盤を明らかにする。前年度に引き続き、B型インフルエンザウイルスHA(BHA)のアミノ酸変異に対する許容性をレセプター結合能を基準に検討し、以下の結果を得た。1.分岐前後BHA-KNG73HA(分岐前),YAMAI99HA(分岐後Yamagta系統),VicAI99HA(分岐後Victoria系統))のHA1領域の変異に対する許容性は最終的に、それぞれ62,68,64%となり、既に報告されているA型ウイルスHAの約1.5倍であった。2.抗原的、遺伝的に異なる二分岐系統上の同一部位におけるアミノ酸変異の影響は、96%の変異で一致していた。これは各系統上の変異の蓄積が、その後の変異の影響を変えることは少ないことを示している。この点、A型HAでは影響が一致するのは約75%で、変異の蓄積の影響が大きい。3.HA1頭部の4抗原領域内に生じた変異の大半は許容変異で、非許容変異は分子内部に存在するなど構造的に制約された部位であった。一方、野外分離株に生じた抗原領域内の変異部位のうち90%が両系統間で一致しており、分岐後も抗原性に関与する部位に大きな差はないことが示された。4.BHAのレセプター特異性に関しては詳細な報告はないが、本研究の結果、ニワトリ血球、ヒト血球への結合能が異なる変異が見つかった。両血球上の糖鎖構造解析の結果、2-3シアル酸、2-6シアル酸の違いのみならず、シアリル糖鎖の長さ、量、配列に大きな違いがあり、上記変異がこの差の認識に影響したと考えられる。5.上記変異HAの一部を有するウイルスを作製したところ、その増殖能は変異許容性をほぼ反映していた。BHAの結晶構造は2007年に決定されAHAの構造に類似している。しかし、本研究の結果、進化の過程でHA蛋白質上に蓄積されるアミノ酸変異の影響は、BHAではAHAに比べ少ない。両HAの構造を比較するとBHAの方がAHAに比べ余裕があり、それがアミノ酸変異の蓄積による構造的ひずみを吸収し、アミノ酸変異に対する許容性の高さとして現れていることが示唆された。
水田土壌における脱窒微生物共存系の存在を探る

目的:本研究では単一菌株においてよりも異種細菌の共存状態において脱窒活性の高まる共存系を「脱窒微生物共存系」とし、その発見、機能と生態の解明を目的とした。21年度の結果から、「脱窒微生物共存系」の存在が示唆されたものの、その確定には至らず、その候補となる共存系も2組と少なかった。そこで、より効率的に「脱窒微生物共存系」を分離する方法が求められた。方法:21年度の分離法では、水田土壌ミクロコズムからFSC分離法により共存系を分離するまでの過程で、土壌中で近接していることが予想される「脱窒微生物共存系」が分散してしまっている可能性があり、そのことが「脱窒微生物共存系」の分離を困難にしていると考えられた。そこで、脱窒活性を高めた水田土壌ミクロコズムから土壌懸濁液を調整し、30μlずつを分注したうえで細胞分裂阻害剤を添加した。これにより「脱窒微生物共存系」の存在によって増殖が可能になり、細胞が伸長する菌株が存在した場合、その共存系を構築する菌株はこの30μlの土壌懸濁液中に存在することとなる。このことにより、「脱窒微生物共存系」の分散を抑えることが可能になり、分離した共存系が実際に環境中で共存系を構築している蓋然性を高めることが可能になった。共存系の分離後、単一菌株の純粋分離培養を行い、再び共存系を構築して単一菌株と共存系それぞれの脱窒活性を比較した。結果:34組の共存系について純粋分離培養を行い84菌株を得た。そのなかで3組のについて「脱窒微生物共存系」であることが示唆された。また、21年度に分離した共存系について追試を行った所、あらたに2組が「脱窒微生物共存系」であることが示唆された。目的:水田は、畑土壌で問題となる硝酸の溶脱や温室効果ガスのひとつである亜酸化窒素ガスの生成がほとんど見られない環境保全型の農地である。これは水田土壌の高い脱窒活性に由来し、脱窒反応において脱窒菌が重要な役割をになっていると考えられる。これまで報告されている脱窒菌は単独で脱窒能を示すものであり、異種細菌の共存状態で高い脱窒活性を示す細菌共存系についての知見はない。本研究では共存状態において、単一菌株での場合よりも有意に脱窒活性が高まる共存系を「脱窒微生物共存系」とし、その発見、機能と生態の解明を目的とした。方法:土壌サンプルから共存系を分離する方法として、Functional Single Cell(FSC)分離法を用いた。FSC分離法では、脱窒活性を高めた水田土壌ミクロコズムに細胞分裂阻害剤を添加し、増殖しようとする脱窒細菌の細胞を伸長させ、生菌染色剤を用いて可視化し、蛍光顕微鏡下で伸長細胞をマイクロマニピュレータを用いて分離した。本研究では、あえてサンプル中で近接する複数の生菌細胞を共存系として分離した。分離した共存系について、希釈平板法により菌株の純粋分離を行い、単一菌株での脱窒活性を測定した。その後、単一菌株同士を用いて共存系を再構築し、脱窒活性を測定した。結果:34組の共存系について純粋分離培養を行い、81菌株を得た。そのなかで2組について「脱窒微生物共存系」であることを示唆するデータが得られた。しかし、追試を行ったところ、単一菌株、共存系の脱窒活性が安定せず、「脱窒微生物共存系」として確定するにはさらなる試験が必要であると判断された。
パラメータ変動システムの知識支援型モデルベース故障診断

本研究では、パラメータ変動を伴うダイナミックシステムの知識支援型モデルベース故障診断法の開発に取り組み、以下の研究成果をえた。1。短時間同定法の開発並びにその故障診断及び適応制御への応用非線形連続時間システムの時変パラメータを短時間の入出力データによりオンライン推定できる短時間同定法(SANQ法)を開発した。この同定法は、対象システムをモデル化するシミュレーターのパラメータ調節に基づいた手法であり、予期せぬシステム構造パラメーターの変動に起因した故障の検出・同定のみならず、未知時変システムの適応制御にも適用できる。本法の有効性は、火力発電プラントやサーボ駆動システムの故障診断や制御応用を通して確認された。2。知識支援型モデルベース故障診断法に関する研究カルバック識別情報量規範により検出されたシステム変動が、故障に依るものか単なる正常変動であるかを判断するため、システム運転モードや故障特性に関する知識情報を取り込んだニューラルネットワーク学習機構を構築した。この知識支援型診断法の有効性は、適応制御の下で運転されている2次振動系の故障診断シミュレーションにより確認された。3。モデル化誤差にロバストなモデルベース故障診断法に対する考察モデルベース故障診断法の実用化を目指して、非線形システムの一般的モデリングとして準線形構造モデル化(Quasi-ARMAX Modeling)とそのロバスト同定法を提案し、不確定性を持つ診断対象システムに対する新しいモデル化誤差の評価法を取り込んだロバスト故障検出手法を構築した。1。2。3。本研究では、1.非線形非定常大規模システムとしての電力発電プラント,2.パラメータ変動を伴う線形システムを診断対象として,知識支援型モデルベース故障診断法の開発と応用について考察し,以下の研究成果を得た.1.については,まず,火力発電プラントにおける給水加熱器系やボイラの2次過熱器系に対し,分布定数系を集中定数系で近似した未知時変パラメータを含む非線形の物理モデルを構成した.次いで,物理パラメータの予期せぬ変動に起因した故障のオンライン検出法として,短時間間隔の過度応答データに基づいて物理モデルと同一構造をもつシミュレータのパラメータを微小調節していく,未知時変パラメータの迅速な同定手法(SANQシステム同定法と命名)を開発した.現在,本法の実系応用研究のため,大分火力発電所の所内ボイラに対するモデリングと同定用測定データの集録に取り組んでいる。2.については,故障に起因するシステムパラメータ変動と正常な動作の中でのパラメータ変動とが混在する診断対象システムとして,適応制御の下で運転されている線形システムを考え,カルバック識別情報量規範によりシステムパラメータ変動をオンライン検出すると共に,その変動が故障に起因するものか否かを知識情報に基づいて判断する知識支援型のモデルベース故障診断システムを構築した.特に知識情報の故障判定への利用法として,システムの運転モードに関する様々な知識をファジィルールベースに取り込み,適切なメンバーシップ関数を用いてファジィ推論により故障判定を行う方法や,故障判定機構のニュートラルネットワーク構成とその学習用トレーニングデータ生成への知識情報の利用法について具体的な手法を確立した.更に,研究分担者により,ファジィ推論やニューラルネットワークの学習構成法についての新たな研究成果も得られ,今後それらの故障診断応用について考察していく予定である。本研究では,1.非線形非定常大規模システとしての電力発電プラント,2.パラメータ変動を伴う線形システムを診断対象として,知識支援型モデルベース故障診断法の開発と応用について考察し,以下の研究成果を得た.1.については,モデルベース故障診断における診断情報抽出のためのシステム同定法として,[シミュレータによる非線形システムの短時間同定法]を開発し,火力発電プラントにおける給水加熱器系やボイラの過熱器系の物理モデルに適用しその有効性をシミュレーションを通して確認した.また,大分火力発電所の所内ボイラを実対象システムとしてとりあげ,その物理モデルを構築し,実測データを用いた本同定法の有効性を目下検証している所である.

今後,システム運転モードに関する様々な知識情報の利用法を本同定法と融合させることにより,非線形非定常システムに対する故障診断手法の具体化に取り組んでいく予定である.2.については,故障に起因するシステムパラメータ変動と正常な動作の中でのパラメータ変動とが混在する診断対象システムとして,適応制御の下で運転されている線形システムを考え,カルバック識別情報量規範によりシステムパラメータ変動をオンライン検出すると共に,その変動が故障に起因するものか否かをニューラルネットワークにより判断する知識支援型のモデルベース故障診断手法を考案した.特に,故障判定機構としての階層形ニューラルネットワーク構成とその学習用トレーニングデータ生成への知識情報の利用法を確立した.さらに,研究分担者により,非線形確率システムに対する状態推定法やファジイーフィルタの開発,ニューラルネットワークの最適学習法,並びにMHD発電プラントの特性解析等についての新たな研究成果も得られ,今後それらの故障診断応用について考察していく予定である.本研究では,1.非線形非定常大規模システムとしての電力発電プラント,2.パラメータ変動を伴う線形システムを診断対象として,知識支援型モデルベース故障診断法の開発と応用について考察し,以下の研究成果を得た.1.については,火力発電用ボイラにおける蒸気過熱器系の非線形非定常物理モデルを構築し,先に開発した[シミュレータによる非線形システムの短時間同定法]を適用してモデルの未知時変パラメータをオンラインで推定できることをシミュレーションを通して確認した.かくして,短時間同定法を用いて対象システムの物理パラメータの変動をオンライン監視することにより,パラメータ変動に起因した多様な故障の検出が可能となる.また,発電プラント起動時におけるボイラ主蒸気温度を与えられた規範曲線に沿って上げていくための燃焼制御方式として,本短時間同定法を用いた適応制御法を開発し,目下実プラントへの適用化に向けて企業との協同研究を進めている.2.については,故障に起因するシステムパラメータ変動と正常な動作の中でのパラメータ変動とが混在する診断対象システムとして,適応制御の下で運転されている線形システムを考え,カルバック識別情報量規範によりシステムパラメータ変動をオンライン検出すると共に,その変動が故障に起因するものか否かをニューラルネットワークにより判断する知識支援型のモデルベース故障診断手法を開発した.特に,故障判定機構としての階層形ニューラルネットワーク構成とその学習用トレーニングデータ生成への知識情報の利用法を確立した.また,線形システムとして記述される直流電動機駆動系を対象として,複数個のシミュレータに基づく短時間同定法を用いて各種構造パラメータの急変に起因する故障の検出と識別を行う,分散型故障診断法を考案した.さらに,研究分担者により,非線形確率システムに対する状態推定法やファジイ-フィルタの開発,ニューラルネットワークの最適学習法,並びにMHD発電プラントの特性解析等についての新たな研究成果も得られ,いずれもモデルベース故障診断のための情報抽出に有用であることを確認した.
母ドリから卵黄へのIgY抗体の輸送を担う新規IgY受容体の同定

本研究は、母ドリの卵胞でIgYの取り込みを担うIgY受容体を同定することを目的とした。組換え型のIgY変異体を作出して、それらの卵黄輸送量を調査しところ、363番目のチロシン残基をアラニン残基に置換した変異体は卵黄に輸送されないことが判明した。この変異体の卵胞組織での局在を手掛かりにして、卵胞の最内層からIgY受容体の抽出・同定を行った。その結果、IgYの結合活性が検出された画分から、7種類のタンパク質が同定され、その中には卵黄前駆物質のビテロゲニンが含まれていた。ビテロゲニンを介した卵黄へのIgY輸送機構の存在については、今後、更なる検討が必要である。本研究は、母ドリ卵黄へのIgY取り込みを担う新規な「IgY受容体」を同定することを目的とする。本年度は、独自に作出した組換え型IgY-Fcを使って、母ドリの卵胞組織から候補受容体を抽出することを目指した。得られた結果の概要は以下の通りであった。・雌ウズラ卵巣組織の顆粒膜細胞周辺の組織層から細胞膜を含むミクロソーム画分を調整した。・その画分に組換え型IgY-Fcを加え、組換え型IgY-Fcと特異的に結合するタンパク質をプルダウン法により探索した。・プルダウン後のタンパク質サンプルを電気泳動した所、IgY-Fcと結合したと推察される約180kDaのバンドを検出した。・卵黄への輸送能を欠いた組換え型IgY-Fcの変異体を用いてプルダウン法により同様な実験を実施した。・変異体を用いてプルダウンを行ったタンパク質サンプルを電気泳動した所、この変異体と結合したと推察される約180kDaのバンドを検出した。・卵黄輸送能を持つ正常なIgY-Fcと卵黄へ輸送されないIgY-Fcの変異体の両者で同サイズのバンドが検出されたことから、本実験により確認されたタンパク質は、母ドリ卵黄への抗体輸送を担うIgY受容体ではないと判断した。・本実験では、細胞膜の他に形質膜等の夾雑物を多く含むミクロソーム画分を実験に使用したことから、電気泳動時に多くの非特異的なバンドが検出された。・今後の解析には、卵胞組織から細胞膜のみを単離したサンプルの調整が必要と結論した。本年度は、卵黄に高効率で輸送される野生型の組換え型IgY-Fcとほとんど輸送されることがない組換え型IgY-Fcの変異体を用いて、両組換え体の卵胞組織への浸透度を調査し、IgY受容体が存在する組織層の同定を目指した。また、ウズラの卵胞組織から形質膜画分を調整し、候補受容体の結合活性の検出を目指した。・産卵ウズラに野生型と変異型のIgY-Fcをそれぞれ投与し、経時的に卵胞組織を採取した。卵胞組織から薄切切片を作成し、卵胞組織内に取り込まれた投与IgY-Fcを免疫組織学的手法により可視化した。・卵胞組織内の卵黄部に投与した野生型IgY-Fcの蓄積が確認された。一方、変異型IgY-Fcは卵黄部へは到達していなかった。・卵胞組織の外層にあたる卵胞膜細胞層には変異型IgY-Fcが到達しており、野生型IgY-Fcに匹敵する量が検出された。・以上より、卵胞組織の外層より内側に目的のIgY受容体が存在すると推察された。・雌ウズラ卵巣組織の顆粒膜細胞周辺の組織層から形質膜画分を調整した。得られた細胞膜画分を可溶化後、ニトロセルロース膜に固定化し、組換え型IgY-Fcとの結合活性をドットブロット法により測定した。・固定化された形質膜画分と野生型IgY-Fcとの結合活性を検出した。しかし、卵黄輸送能を欠く変異型のIgY-Fcでも同程度の結合活性が確認された。競合物質を用いた結合試験の結果、本実験で観察された結合活性はIgY固有のものではないことが判明した。・目的とするIgY受容体を見いだすための更なる工夫が必要と判断された。本研究は、母ドリ卵黄へのIgY取り込みを担う「IgY受容体」を同定することを目的とする。本年度は、ニワトリの卵胞組織から形質膜画分を調整し、IgYとの結合活性を有する候補タンパク質を選別し、その候補タンパク質の同定を目指した。

1)受容体の局在部位(ペリビテリン膜と卵母細胞膜)と顆粒膜細胞層の混合組織から形質膜画分を調整し、IgY結合活性の検出を試みた。形質膜画分をSDS-ポリアクリルアミド電気泳動法により分離した後、ブロッティング用メンブレンに転写し、IgYとの結合活性を検出した。その結果、約250-300 kDaの分子サイズにIgYの結合活性を検出した。このIgY結合活性は、未標識IgYを競合させると、減少するかまたは消失した。一方、未標識の牛血清アルブミンや卵白アルブミンを競合させても結合活性は変化しなかった。よって、250-300 kDaの分子サイズに含まれるタンパク質はIgYと特異的に結合することが判明した。2)形質膜画分の約250-300 kDaの領域に含まれるタンパク質を質量分析法によって同定した。その結果、8つのタンパク質が同定された。これらのタンパク質の中に、肝臓で合成・分泌されて卵黄に取り込まれる卵生動物特有のタンパク質「ビテロゲニン」が含まれていた。3)ウェスタンブロッテイング法を用いて形質膜画分でのビテロゲニンの存在を確認した。その結果、IgY結合活性が検出された分子サイズと同じ、約250-300 kDaの位置にビテロゲニンが検出された。4)以上の結果から、IgYはビテロゲニンと結合し、卵胞組織に発現するビテロゲニン受容体を介して卵黄中へ輸送されている可能性が示唆された。卵黄輸送を担うIgY受容体の存在を支持するデーターが蓄積されているものの、IgY受容体を同定するには至っていないため。24年度が最終年度であるため、記入しない。IgY受容体の同定を目指すことに変更はない。具体的な対策として、1)受容体が存在すると思われる形質膜画分の調整方法を変更する、2)形質膜画分のサンプル量を10倍程度にスケールアップする、3)IgYをリガンドとした免疫沈降法ならびにカラム精製法の両手法により目的の受容体の抽出を試みる。また、これまでにない取り組みとして、卵胞細胞のcDNAライブラリーを構築し、IgYと結合活性を持つタンパク質をコードしている遺伝子群を網羅的にスクリーニングする手法を導入する予定である。
細胞膜受容体のエンドサイトーシスによる細胞増殖制御機構の解明

(1)AP180のENTHドメインがPI(4,5)P_2に最も強く結合することを確認した。その後、epsinにおいて脂質結合に必須である63番Arg、76番Lysにそれぞれ相当する各残基、66番Arg、77番LysをAlaに置換すると、PI(4,5)P2結合能を失った。次に、AP180、CALM及びHip1Rの全長タンパクをGFP融合タンパクとしてCOS7細胞内に発現すると、クラスリンと共局在する小胞状の構造が観察された。中でもHip1Rを含む小胞は、細胞膜直下においてアクチン繊維束に沿って分布することから、エンドサイトーシスとアクチン細胞骨格を結ぶキータンパクである可能性が示唆された。(2)Epsinファミリーに属する新規タンパクKIAA0171の機能解析を行った。まず、ENTHドメインに対する各イノシトールリン脂質との結合アッセイを行ったところ、PI(4,5)P2に最も強く結合した。GFP融合タンパクをCOS7細胞内に発現したところ、その細胞内局在はクラスリン、およびTGN輸送に関与するアダプタータンパク、AP-1と一致し、その一部はMVB (multi-vesicular body)構造の周縁部に沿って局在することも観察された。次に、さまざまな変異型コンストラクトをGFP融合タンパクとしてCOS7細胞内に発現し、その細胞内局在を検討した。ENTHドメインを欠損すると、KIAA0171のTGN周辺への局在は観察されず、細胞質中に分散する小胞状の局在を示した。脂質結合に必須の67番ArgをAlaに置換した変異体も同様の異常な局在パターンを示した。逆に、ENTHドメインのアミノ末端にミリスチン酸化シグナルを付加した膜結合型変異体ではTGN周辺への集積が促進された。さらに驚くべきことには、ENTHドメインのみをGFP融合タンパクとして発現させると単独でTGNに局在できることが観察され、その局在は67番Arg変異型ENTHドメインでは観察されなかった。
深層学習とDeep GMDH型人工知能技術による腹部X線CT画像解析と診断支援

本研究では、コンボリューションニューラルネットワーク(CNN)とディープGMDH-typeニューラルネットワークを組み合わせた、Hybrid型人工知能アルゴリズムを提案した。ディープGMDH-typeニューラルネットワークは、たくさんの隠れ層を持つディープニューラルネットワーク構造を自動的に自己組織化できる。そして、Hybrid型人工知能アルゴリズムを、腹部臓器の医用画像認識や、肝臓がんの医用画像診断などに応用した。また、得られた画像認識結果を、学習理論として誤差逆伝播法(BP法)を用いる従来からよく使われているシグモイド関数型人工ニューラルネットワークと比較して、その有効性を確認した。腹部の多列検出器型CT(MDCT)画像を対象にして、人工ニューラルネットワークの新しい理論である深層学習(ディープラーニング)とDeep GMDH(group Method of Data Handling)-typeニューラルネットワーク理論を組み合わせて高精度な画像解析を行う新しい人工ニューラルネットワーク(Hybrid型ディープニューラルネットワーク)のアルゴリズムの開発を行った。さらに、この医用画像診断のための人工ニューラルネットワークのアルゴリズムを組み込んだ、3次元腹部医用画像データを対象にしたコンピュータ支援画像診断(CAD)システムの開発を行っている。アルゴリズムが、大規模かつ複雑であるために、アルゴリズムの開発に時間がかかっている。これは、アルゴリズムの細部の検討がまだ残っているためである。しかしながら、アルゴリズムの骨組みはすでに決定していて、このアルゴリズムを組み込んだコンピュータ支援画像診断システムの開発のための準備作業も並行して進めているので、全体の進捗状況としては、少し遅れている状況である。画像診断機器の進歩により医療における画像診断の役割が拡大している。なかでもX線CT断層撮影装置の発達はめざましく、多列検出器型CT断層撮影装置(MDCT)の登場により撮影の高速化と体軸方向の空間分解能向上がもたらされた。撮影の高速化は広範囲の撮影を可能とし、体軸方向の空間分解能向上は等方向性volume dataの取得を可能とした。これらにより高精細な三次元画像情報が得られるようになったが、1回の検査で撮影される断層画像(2次元画像)の枚数は数百枚から数千枚にも達している。このような膨大なデータは診断的価値の増加をもたらしたが、それを読影する医師に対しては負荷の増大や作業効率の低下を招く可能性が出てきた。このような状況を解決するために、コンピュータを用いて大量に発生する医用画像を効率よく処理して、医師の診断支援を行うためのコンピュータ支援画像診断(CAD)システムの開発が求められている。本研究では、腹部のMDCT画像を対象にして、人工ニューラルネットワークの新しい理論である深層学習(ディープラーニング)とDeep GMDH(Group Method of Data Handling)-typeニューラルネットワーク理論を組み合わせて高精度な画像解析を行う新しい人工ニューラルネットワーク(混合型ディープニューラルネットワーク)理論の開発を行った。そして、この混合型ディープニューラルネットワーク理論を組み込んだ3次元腹部医用画像を対象にした医用画像診断のためのコンピュータ支援画像診断システムの開発を行っている。本年度は腹部臓器の中で肝臓や他の臓器の領域を正確に抽出できることを確認し、腎臓の領域抽出に関する論文を発表し、肝臓領域の抽出および肝臓癌の領域抽出について国際学会にて発表した。新しい混合型ディープニューラルネットワークの理論を組み込んだ3次元腹部医用画像を対象にした医用画像診断のためのコンピュータ支援画像診断システムの開発を行っているが、システムが複雑かつ大規模であるために、開発に時間がかかっている。このため、全体の進捗状況としては少し遅れている。深層学習(ディープラーニング)の一種であるコンボリューショナルニューラルネットワーク(CNN)とDeep GMDH-typeニューラルネットワークを組合せ高精度な医用画像解析を行うHybrid型ディープニューラルネットワークを開発し、これを組み込んだコンピュータ支援画像診断(CAD)システムを開発した。今年度は腹部X線CT画像に対し(1)ディープ多層構造型GMDH-typeニューラルネットワークとCNNによるHybrid型ディープニューラルネットワークを用いた脾臓領域の医用画像認識、(2)ディープロジスティックGMDH-typeニューラルネットワークとCNNによるHybrid型ディープニューラルネットワークを用いた肝臓がんの候補領域抽出を行った。これらX線CT画像解析では、コンピュータ内部に自己組織したHybrid型ディープニューラルネットワークを用いて、(1)では臓器の画像認識とその領域抽出、(2)では肝臓がんの候補領域抽出を行った。具体的には、CT画像のピクセル値を入力してCNNを用いて画像特徴量を発生させた。発生させた画像特徴量と従来から用いられている医用画像の特徴量を合わせて、Deep GMDH-typeニューラルネットワークの入力変数にした。Deep GMDH-typeニューラルネットワークは、有益な入力変数の自己選択機能を備えており、CT画像解析に有益な画像特徴量を自己選択した。その画像特徴量を用いて、予測誤差評価基準(情報量基準AICや予測平方和PSS)を最小にするようCT画像の解析に適したディープニューラルネットワーク構造を自己組織した。自己組織化したディープニューラルネットワークを用いて腹部臓器や肝臓がんの画像認識とその領域抽出を行った。これら研究より、開発したHybrid型ディープニューラルネットワークがCT画像の解析に有効であることを確かめた。

平成27年度では、Deep GMDH-typeニューラルネットワーク理論とディープラーニングを組み合わせたHybrid型ディープニューラルネットワークのアルゴリズムの開発を行ったが、平成28年度ではこのアルゴリズムを組み込んだコンピュータ支援画像診断(CAD)システムの開発を継続して行う。平成29年度は研究の最終年度であり、新しい混合型ディープニューラルネットワークス理論を組み込んだ3次元腹部医用画像用コンピュータ支援画像診断システムの開発を完成させる予定である。そして、臨床データを用いた診断精度の確認などを実行して、29年度末に国際会議で研究成果を発表できるように、本研究を推進していく予定である。放射線診断学購入予定備品がバージョンアップにより機能増強されるのため購入時期をバージョンアップ待ちとしたため、納入が3月初旬となり支払事務処理が次年度となったためである。Deep GMDH-typeニューラルネットワーク理論を用いた腹部医用画像認識の研究成果を発表した論文の掲載が4月に伸びたために、論文の掲載料を次年度に繰り越した。すでに備品調達し、納入済で、次年度4月に会計事務処理される予定である。繰り越した使用額は、論文が掲載されたのちに、論文の掲載料として4月の初めに使用する予定である。
海産魚類のプロバイオティクス養殖に求められる理想的な腸内細菌叢の検討

マウスやニワトリでは健康な状態でも腸内の細菌侵襲が成長に負の効果を示す。そこで、マダイ幼魚において抗生物質投与により腸内細菌の組成が強く影響される条件で飼育実験を実施し成長を比較した。その結果、有意な成長差は抗生物質不投与群との間で認められなかった。一方で遺伝子解析により腸内細菌組成を群間で比較すると明確に異なった。これらの結果は、抗生物質投与による腸内細菌の組成変化の影響はマダイの成長に対して限定的であることを示している。魚類養殖においてプロバイオティクスにより成長を効率化するには腸内細菌の選択的除去よりも有効な細菌の添加が重要と考えられる。3カ月齢のマダイの稚魚(約200個体)から無作為に50個体取り出し、2台の40Lの円形水槽水槽(実験群と対照群)に25個体ずつ収容し、かけ流し式で28日間飼育した。実験期間中の水温は25.026.0°C、照明については、自然光に加えてLED(6000ケルビン、10W)を8:00 22:00に点灯させ、長日条件とした。対照群の飼料は日清丸紅社製おとひめ(EP1)とし、毎日9:0010:00の間に飽食量給餌した。実験群の飼料には抗生物質混合物(テトラサイクリン塩酸塩、カナマイシン、ストレプトマイシン)を添加した。各抗生物質の添加量は、前半の16日間では飼料1kgあたりそれぞれ333mg、100mg、150mg、後半の11日間では666mg、200mg、300mgとした。その結果、実験群の各抗生物質の投与量は、飼育実験の最終日においては、体重1kgあたり28.3mg、8.5mg、12.7mgとなった。実験終了時の体重は、対照群と実験群がそれぞれ25.7±6.3gと23.0±6.6g、内臓除去重量は23.5±5.7gおよび21.2±6.1g(平均±標準偏差)で、どちらにも有意差は認められなかった。生残率は76%と64%だった。総給餌量は、119.0g、148.7gだった。以上の結果は、抗生物質を飼料に添加しても成長は促進されないことを示唆している。総給餌量は実験群が多いことから、摂餌量が抗生物質の添加で抑制されていることは考えにくい。したがって、今年度の実験から、成長を促進するには添加抗生物質が不足している、選択した抗生物質が不適当だった、あるいは、マダイでは腸内細菌が消化吸収に影響を与えていないなどの可能性が考えられる。無菌マウスや抗生物質が投与されたニワトリでは腸内細菌の増殖が強く抑制され、消化管内での細菌侵襲がほとんどないため、成長が著しく促進されることが知られている。本研究の結果はこれらと異なる。次年度に、抗生物質の投与量と種類を検討したい。マダイに抗生物質を投与し、成長が促進されることを予想したが、効果が認められなかった。生残率や飼料の利用性にも特に抗生物質投与の優位性が認められなかった。これらのことは本課題立案時の予想と異なる。投与する抗生物質の濃度を上昇させるか異なる抗生物質を使用する必要がある。計画を立て直し、実験に使用するマダイを準備する必要がある。マウスやニワトリでは腸内細菌の腸上皮細胞への侵襲が成長に負の効果を示し、バンコマイシンなどの抗生物質の投与で成長が改善されることが報告されてきた。本研究では、魚類において腸内細菌の組成が成長に与える効果を検証し、魚類養殖においてプロバイオティクスによる生産性向上のための基盤整備を目的とした。配合飼料で育成したマダイ幼魚において、複数の抗生物質を飼料に添加し、腸内細菌の組成に強く影響する条件で23週間の飼育実験を繰り返した。その結果、いずれの実験でも有意な成長差は抗生物質不投与群との間で認められなかった。このことは、腸内細菌の組成の変化はマダイの成長に影響しないことを示唆している。さらに、バンコマイシンを400mg/kg混じた配合飼料を3週間にわたってマダイ幼魚に給与し体重と全長を比較したが、有意差は認められなかった。そして、実験魚の直腸内容物について、細菌の16S rRNAv3/4領域の解析により腸内細菌の組成を比較した。対照群では、フィルミクテス門に属する細菌が優占したが、バンコマイシン投与群ではフィルミクテス門に属する細菌がほとんど認められず、アルファプロテオバクテリア綱に属する細菌が90%以上を占めた。この結果は、腸内のグラム陽性菌を選択的に除去するバンコマイシンの効果が十分に発揮されたことを示すと共に、複数回繰り返した抗生物質投与実験の結果を支持するものである。したがって、抗生物質の投与による腸内細菌の組成の変化がマダイの成長に与える影響は限定的であると考えられる。

一方で遺伝子解析により腸内細菌組成を群間で比較すると明確に異なった。これらの結果は、抗生物質投与による腸内細菌の組成変化の影響はマダイの成長に対して限定的であることを示している。魚類養殖においてプロバイオティクスにより成長を効率化するには腸内細菌の選択的除去よりも有効な細菌の添加が重要と考えられる。カナマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリンを組みあわせて飼料に添加しても、成長促進効果が認められなかったことから、効果や作用がこれらの抗生物質と異なるものを使用する必要がある。バンコマイシンが現在のところ、次に使用する抗生物質の候補である。魚類生理学消耗品の納品価格が発注時の価格よりも安価だったために予想以上に節約できたため。次年度繰り越しとして消耗品の購入に使用する予定。
核とミトコンドリアによる両生類の性決定機構の解明

ツチガエルから多くの遺伝子(Dmrt1, WT1, CYP17, CYP19, Sox9, AR, SF1, Sox3等)を単離し、FISH法による染色体マッピングと性決定時期におけるそれらの遺伝子の発現解析を行った。その結果、3つの遺伝子AR,SF1,Sox3が性染色体の相同組み替えが起きない領域に存在することが判明した。つまり、これらの遺伝子は塩基置換等による遺伝子の損傷が修復できない領域に存在する事からAR,SF1,Sox3は退化しているか、或はやがて退化する運命にあることが分かった。それを実証するために卵核2倍性発生法によりZZ,WW胚を作製して両胚におけるSF1,Sox3,ARの発現を解析した。ZZ,WW胚ではSF1とSox3の発現が同じであるのに対し、ARの場合はZZ胚(Z-AR)では正常に発現するがWW胚(W-AR)は殆ど発現しない。W-ARが発現しないのは、W-ARの転写調節領域の塩基配列に変異が起きたため、転写調節因子が結合できない可能性を見いだした。その他の常染色体上の遺伝子の発現解析を行ったところ、エストロゲン合成酵素遺伝子CYP19が雌化に、またCYP19の転写調節にSox3が関わること、更にARとCYP17が雄化に深く関わることを見いだした。Sox3蛋白は直接CYP19の転写調節領域に結合して転写を調節することを、ChIPアッセイ、レポーターアッセイ等の分子生物学的手法を用いて明らかにした。多くの動物はステロイドホルモンの投与によって性が転換するが、その性転換では性決定遺伝子は関与しない。そこで、ツチガエルの性決定にはステロイドホルモンが重要である考え、以下の研究を行った。まず最初に未分化性腺では、ステロイド合成酵素遺伝子が発現し、酵素活性があり、雌はエストロゲンを雄はテストステロンを多く合成する事を見いだした。また、前述したW-ARは発現しないため受容体としての役割を果たさないが、Z-ARは正常に発現するため、ZZ(雄),ZW(雌)胚では受容体量が2:1となり、Z-ARとテスステロンの複合体が雄の決定に大きな役割を担う可能性あることも見いだした。更に、ツチガエルの卵細胞質には雌化或は雄化因子の存在が予想されているので、ツチガエル地方4集団のミトコンドリアDNAの塩基配列を決定した。XY型西日本、関東、及び東海集団のミトコンドリアDNAの塩基数は約17-kbpであるのに対し、ZW型新潟集団のそれは約21-kbpであった。塩基配列の解析だけでは雌雄化因子をコードする遺伝子を見つけられなかったので、卵細胞質因子はミトコンドリアのみならずゲノムDNAも深く関わっている可能性があることも分かった。また、脊椎動物の性決定時期は簡便な組織染色法で判定されていたが、基底膜を構成するラミニン蛋白を指標とすると、従来の時期よりもずっと早い時期に性が決定される事も明らかにした。

XY型西日本、関東、及び東海集団のミトコンドリアDNAの塩基数は約17-kbpであるのに対し、ZW型新潟集団のそれは約21-kbpであった。塩基配列の解析だけでは雌雄化因子をコードする遺伝子を見つけられなかったので、卵細胞質因子はミトコンドリアのみならずゲノムDNAも深く関わっている可能性があることも分かった。また、脊椎動物の性決定時期は簡便な組織染色法で判定されていたが、基底膜を構成するラミニン蛋白を指標とすると、従来の時期よりもずっと早い時期に性が決定される事も明らかにした。本論文ではツチガエルの未分化性腺が卵巣或は精巣に分化する所謂、性決定時期にステロイド合成系の全酵素遺伝子及び関連遺伝子のcDNAを単離して発現解析を行なった。その結果、CYP17が雄未分化性腺で、CYP19が雌未分化性腺でそれらの発現が有意に上昇することをreal-time RT-PCR法で明らかにした。両生類で性決定時のステロイド合成系酵素群遺伝子の発現解析を世界ではじめて示した。本論文ではツチガエルのアンドロゲン投与による雌から雄の性転換にステロイド合成系酵素CYP17が性転換性腺で強く発現することを両生類ではじめて見いだした。CYP17の発現は未分化雄性腺で強く発現し発現部位は体細胞であることもin situハイブリダイゼーション法によって明らかにした。CYP17の発現は性腺の雌雄決定時期よりも早く雄性腺で発現することも明らかになった。本論文ではツチガエルのvによる雌から雄の性転換を支配する鍵遺伝子の単離を目的としてディファレンシャルディスプレイ法で探索した。アンドロゲン投与群と非投与群性腺からRNAを単離して解析し有意差のある30遺伝子を解析したところ雌性腺で強く発現する遺伝子が多く支配遺伝子は見いだせなかった。アンドロゲン投与期間か短いのが原因と言う結論に達した。脊椎動物の「性」は主に受精時の性染色体の組み合せで決まる。両生類の多くの種では他の脊椎動物と同様に遺伝的要因で決まるが種によっては環境要因(温度)で決まることもある。本研究は両生類(ツチガエル)を用い遺伝的要因で決まると考えられている性決定機構に核ゲノムのみならずミトコンドリアにコードされている遺伝子も関与していることを実証することを目的とする。ミトコンドリアにコードされている遺伝子が関与していることを明らかにする為にツチガエルの4地方集団(未分化型XY西日本及び関東集団、分化型XY東海集団及びZW型北陸集団のミトコンドリアDNAの塩基配列を解析した。4集団のD-loop領域には明らかな塩基配列の違いがありこの違いが性決定に影響を及ぼしている可能性があることが分かった。一方、核ゲノムの性決定の分子機構を解明するため多くの遺伝子を単離して染色体マッピングをおこなったところ、AR,SF1, Sox3が性染色体に局在していることが分かった。これらの遺伝子のうち、Sox3は性決定時に雌性腺で強く発現し、逆にARは雄で強く、SF1は雌雄同等に発現していることが分かった。特にSox3はCYP19(P450アロマターゼ)の発現を促進するがその場合、プロモーター領域のSox3結合エレメントに直接結合することをChIPアッセイで明らかにし、またSox3結合領域欠失やHMGBox欠失によって促進効果が消失することをツメガエル腎臓由来のA6細胞を用いたプロモーターアッセイで明らかにした。更にツチガエルの性決定には性染色体上の遺伝子のみならずステロイドホルモンが深く関わっていることも明らかにした。