hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ＲＸＲアゴニストを用いた免疫制御療法の開発

レチノイン酸受容体(RAR)からのシグナルはT細胞の分化を制御する。RARはRXRとヘテロ二量体から形成するが、RXRからのシグナルがT細胞分化に与える影響は不明である。今回我々はRXRシグナルが制御性T細胞(Treg)とTh17細胞の分化に与える影響を検定した。RXRアゴニストは、in vitroではTregへの分化を促進しTh17細胞への分化を抑制することが示された。また、in vivoでもRXRアゴニストは同様の効果を示した。さらにTh17細胞が原因となって発症する自己免疫病マウスにRXRアゴニストを投与したところ、比較対照群に比べ有意に発症を遅延させることに成功した。RXRアゴニストを用いることで、制御性T細胞の分化誘導を促進し、Th17細胞の分化誘導を抑制することを示す結果が得られた。また分子機構を解析することによって、RXRシグナルは制御性T細胞分化とTh17細胞分化では、異なる伝達経路を使用している可能性を示唆する結果が得られた。特に、Th17細胞の分化においては、RXRシグナルはレチノイン酸受容体非依存的に働いている可能性が推測され、このことからTh17細胞分化を人為的にコントロールする新たな方法を探索する基盤が得られたものと考えられる。前年度までの結果から、in vitroではRXRアゴニストが、制御性T細胞(Treg)への分化を促進し、Th17細胞への分化を抑制することが示された。この結果を踏まえて、本年度はin vivoにおいてもRXRアゴニストが同様の効果を示すことが出来るかどうかを調べた。まず、RXRアゴニストを用いることによりin vivoでTh17細胞への分化に影響を与えるかどうかを検定した。主にTh17細胞が原因となって発症する実験性自己免疫性脳脊髄炎(EAE)マウスに、RXRアゴニストであるトリブチルスズ(TBT)を経口投与し、経過を観察した。その結果、TBT投与群では、比較対照群に比べ有意に発症を遅延させることに成功した。また、TBT投与をされたEAEマウスの所属リンパ節中のT細胞を解析したところ、比較対照群と比べTh17細胞の比率が有意に低下していた。これらの結果から、RXRアゴニストの投与により、in vivoでのTh17細胞分化が抑制できることが示唆された。また、卵白アルブミン(OVA)-特異的なT細胞受容体をもつナイーブT細胞を移入し、OVAを腹腔内注射することによって抗原感作させる実験モデルを使い、RXRアゴニストであるPA024がTreg分化に与える影響を検定した。その結果、PA024投与群では、脾臓において移入されたナイーブT細胞がFoxp3陽性に転じる割合が有意に高いことが確認された。このことは、RXRアゴニストの投与によって、生体内でTregへの分化が促進される可能性を示唆している。以上の結果から、RXRアゴニストはin vivoでもT細胞の分化に影響を与え、その投与により生体内での免疫制御を行うことが可能であることが示唆された。9cisレチノイン酸(9cRA)はレチノイン酸受容体(RAR)とレチノイドX受容体(RXR)の両方に結合できるリガンドとして働くことが知られている。この9cRAを制御性T細胞(Treg)誘導系に添加した結果、高濃度(100 nM)存在下では、all-transレチノイン酸(AtRA)よりも強くFoxp3の発現を誘導できることが示された。次に、合成RARアゴニストAm80と合成RXRアゴニストPA024をTreg誘導系に添加したところ、それぞれ単独ではFoxp3の発現を弱い増強作用を示した。さらにこれらを組み合わせて添加した結果、強い増強作用を示した。一方、PA024を他の核内受容体アゴニストと組み合わせて添加しても増強作用は一切認められなかった。以上の結果から、合成RXRアゴニストPA024は、RARシグナルと協調してin vitroでのTreg誘導を高効率に増強する働きを持つことが明らかになった。当初の計画通り、RXRアゴニストを用いた制御性T細胞の分化を促進するin vitro系が確立された。またin vivoにおいても、RXRアゴニスト投与により、炎症抑制効果を示す結果が得られた。さらに、RXRシグナルの分子メカニズムにおいても、レチノイン酸シグナル依存的または非依存的な2通りの伝達経路が存在し、T細胞分化の方向性によって、それらを使い分けていることを示唆する結果が得られた。以上から、現在の達成状況を当初の申請計画に対して、おおむね順調に進展していると考えられる。本年度の研究計画通り、制御性T細胞を効率良く誘導するために必要なRXRアゴニストを検定し、その条件を決定した。In vivoにおける、RXRアゴニストの働きには、以前不明な点が残っている。

特に生体内でのRXRシグナルの働き方は、in vitroと異なり、様々なシグナルおよびリガンドと協調/拮抗しながら働いている可能性が高い。そのような状況でRXRシグナルを効率よく機能させるためには、さらにin vivoでの分子メカニズムについての解析が必要である。これまでin vivo実験系としては、EAEを主に用いてT細胞の分化を解析してきたが、移入細胞を主体としたin vivo分化誘導系の構築を行なっていく予定である。RAとRXRアゴニストを組み合わせて自然発生型Treg(nTreg)に小腸ホーミング特異性を付与し、小腸型nTregをin vitroで作製する。この小腸型nTregを炎症性腸疾患モデルマウスに移入することで、RXR刺激を加えた場合により効果的に病態の改善がみられるかどうかを調べる。RAとRXRアゴニストを組み合わせて作製された誘導型Treg(iTreg)を自己免疫病モデルマウスに移入し、あるいはRXRアゴニストを直接投与することで、それらの処置が病態の進行に与える影響を検定する。上記の方策に示した移入細胞を用いたin vivo分化誘導系を構築するため、特異抗原に対するTCRを持つトランスジェニックマウスOT-II及びDO11.10マウスを使用する必要がある。またトランスジェニックマウス由来のT細胞を導入するレシピエントマウスも必要となる。さらにマウスからT細胞を単離するための試薬や導入後の細胞を解析するための各種標識抗体が必要となる。以上のことから、i)マウスの購入・維持費用、ii)細胞の単離・培養用試薬、iii)細胞を解析するための標識抗体等の試薬、を購入するために、次年度の研究費を使用する予定である。次年度以降はTregの移入実験が中心となる予定である。したがってドナーやレシピエントとしての実験動物を多く使うため、一貫して動物維持のための経費が必要となる。そのため、マウスの購入・飼育に必要な費用を算出し、研究費として計上した。また実験計画に記したとおり、Tregの細胞分離・精製・解析のために、標識抗体やカラムが必要となる。これらについても、次年度以降の研究費として計上した。
新規インスリン分泌能評価法の開発およびその遺伝因子との関連に関する研究

クランプ法によるdispositionindex (clamp DI)は、正常耐糖能(NGT)、耐糖能異常(IGT)、2型糖尿病(T2DM)と病態が進行するにつれて低下しており、病態の進行とともに低下する膵β細胞の機能を的確に表現できる指標であると考えられた。また遺伝因子との関連では、日本人で同定された最も重要な疾患感受性遺伝子であるKCNQ1のSNPにおいて、リスクアリル保持者は非保持者に対し、IGTの段階でclamp DIの低下を示した。平成22年度は、2型糖尿病患者(T2DM)36例、耐糖能異常者(IGT)12例、正常対糖能者(NGT)31例の計79例において、インスリン分泌能および抵抗性の評価を行った。すなわち、DeFronzoが提唱した高血糖クランプ法および高インスリン正常血糖クランプ法(DeFronzo RA : Am J Physiol 6 (237) E214-233, 1979)を連続して行った。これら高血塘クランプによる第1相インスリン分泌と、高インスリン正常血糖クランプによるISIの積を新規インスリン分泌評価法dispositionindexとすると、NGT 40.2士15.3、IGT 23.6±17.3、T2DM 48±3.3と3群間で有意な差を認め(P<0.05)、NGT、IGT、T2DMと進行するにつれて低下していた。また、同意を得たうえで、末梢血よりDNAを抽出し、TCF7L2、KCNQ1などの報告された遺伝子多型のタイピングを開始した。グルコースクランプの施行数も順調に増加しており、C-DIの解析が進行している。また遺伝因子についても徐々に解析対象を増加させており、解析が進行している。24年度が最終年度であるため、記入しない。グルコースクランプの施行数をさらに増やし、計画書に記している2型糖尿病150例を目標にする。また遺伝因子の解析数をさらに増やし、日本人のインスリン分泌能に関する遺伝因子の関与を明らかにしていく予定である。
社会の歴史的変動とエートスの関係についての研究

本研究は、社会変動とエートスの相関関係を明らかにすることを目的にしていた。このために本研究は、歴史的手法と学際的研究を総合するというアプローチを用いた。このために、研究それぞれを別々に見るならば、われわれは異なる見解をもつようになったように見える。だが、むしろわれわれのあいだには一つの共通了解が生まれたのであり、その共通了解の概要を述べるならば、それは以下の通りである。原理的には、次の時代の支配的なエートスになる新しいエートスは、社会の変動のなかから言わば自生的に生まれてくるが、その一方で、そうした新しいエートスが定着する上では、ある段階での、人為的な、あるいは主体的な動きが不可欠であること、また現象面では、エートスの変化は社会変動に応じて多様な現れ方をするが、いつの時代にも、その時代の正義観においてそれは凝縮的に表現されること、以上である。本年度の研究は、成果を論文にまとめて公表した研究者もあったが、どちらかといえば資料収集とその整理が中心となった。本研究は、社会の変動と人間の観念的・思念的世界との関わりについて、従来、哲学、倫理学、歴史学、政治学、経済学、経営学、社会学といった個々の研究分野ごとに進められてきた研究を統合することによって開かれる視点から、新たに見えてくるものを明みに出そうとする試みであるが、この研究のための組織は、以前から研究を進めてきた三名と新たに加わった三名の研究者から成っていることもあって、先ずはおのおのの出発点を確定し相互の役割を確認するところから始められた。それゆえ、継続して研究に携わっている者は、これまでの知見にあらたな資料から得られたものを加え、それを論文にまとめるという作業を遂行する形で研究を進めたが、新たに参加してきた研究者は先行の研究を押さえながら、新しい視点を切り開いていくための資料の収集とその整理から作業を開始した。もう少し研究内容に立ち入る形で述べるなら、研究代表者神野、分担者長沼や石崎は、17-18世紀における人間性やエートスの国家社会への影響を確認する作業をさらに継続して進める一方、長沼、石崎、太田はグローバリゼーションという形で進行する最近の社会の変動を視野に入れ、それとエートスの関係についての研究へと研究枠を広げていった。そのような成果を踏まえ、石崎は「倫理的パラダイム」や「エートス的視点」の必要性に言及し始めた。また研究分担者佐藤、吉田、太田は、それぞれ経営思想や経済思想、女性や被抑圧者たちの人権意識が社会の動きや経済発展に対して及ぼす作用に目を向ける作業に取り掛かった。本年度も、研究分担者がそれぞれ分担作業を進めるとともに、その成果の共有をはかるべく会合をもった。そのなかで前年度から継続する作業として17-18世紀における人間性やエートスの国家社会への影響を確認する作業をさらに進展させるべく集中的に資料を収集した。収集された資料に対する分析の成果としては、研究代表者神野によって、ヨーロッパ近代の社会変動がエートスの変容に与えた影響を再定義する試みが、D.ヒューム哲学における知識論と道徳理論に対する新たな総合的理解を解明することを通して深められた。また研究分担者石崎も、僭主政治に関する古代から現代にいたる議論をめぐる先行研究の整理を進めた。同時にヨーロッパ近代と日本の近代化とを比較するとの観点から研究分担者佐藤が、明治期の近代化に果たした儒教エートスの役割をとくに澁澤栄一の思想を通じて明らかにする作業にとりかかった。一方で現代社会のエートスに重点をおいた研究も、研究分担者吉田による地理学に現れたジェンダーについての研究と、研究分担者太田による、とりわけ正義と暴力の関係に引照しつつなされたグローバリゼーションの進む今日の社会におけるエートスの変容についての研究によって進められた。これらの研究成果の一部は、神野が「"luxury"の観念について」、石崎が「『僭主政治論』ついて」、太田が「正戦論の現代における適用可能性」において中間報告書で公にする。本研究によって明らかになったのは、第一に、何らかの社会変動があるとき、それは特定の社会にあらかじめ内包されていたエートスに規定されて方向付けられていくという一方的な関係にあるのではないということである。このことは、佐藤がいわゆる儒教資本主義論を日本の歴史的実態に即して検討し、日本の勤勉観が儒教倫理に由来するよりも、むしろ企業活動の中で生み出された側面が強いことを明らかにした研究において具体的に示されている。

第二に、本研究によって明らかになったのは、今日の社会変動を方向付ける新しいエートスとして正義観に着目することが有益であるということである。このことは、太田による今日のグローバリゼーションを前提に、正戦論が理論的には通時的にみて比較的安定しているにもかかわらず、その適用においては変動が見られることを示した研究、および石崎による市民社会に関する古代と近代の比較を通じて、同じ正当性という枠組みのなかで古代において重視されていた徳目が近代においてはその重要性を低下していることを解明した研究によって具体的に示されている。研究成果を総じて言うならば、社会の歴史的変動とエートスとの関係について、原理的には、次の時代の支配的なエートスになる新しいエートスは社会の変動のなかから言わば自生的に生まれてくるが、その一方で、そうした新しいエートスが定着する上では、ある段階での人為的な、あるいは主体的な動きが不可欠であるということが明らかになり、現象面では社会変動に応じてエートスの変化はさまざまな現れ方をするが、それはいつの時代にも正義観において言わば凝縮的に表現されていることが明らかになった。
排卵機構における卵巣局所調節因子に関する研究

本研究では、卵胞発育、排卵、卵胞閉鎖機構に卵巣局所に存在する各種サイトカイン、成長因子の関与を明らかにする一環として、幼弱メスラットを用い、卵巣におけるインターロイキンやケモカイン、細胞増殖因子の存在、ならびにそれが排卵機構に関与するホルモンあるいは成長因子、サイトカインなどにより調節を受けるか否かを検討し、以下の知見を得た。1.白血球細胞の遊走を刺激するケモカインのGRO-CINCが、ラット卵巣の莢膜細胞層にも存在することを免疫組織染色にて明らかにした。2.ラット排卵過程において、PMSGだけではGRO-CINCの産生は亢進しないが、PMSGの投与後にhCGを投与するとその4時間後から48時間後にかけてGRO-CINCの産生が亢進した。卵巣細胞培養系で、FSH、hCG、IL-1βおよびTNFαはCINC/groの産生を濃度依存性に促進させた。3.PMSG/hCG刺激による排卵過程における卵巣内のGRO-CINCおよびその調節因子と考えられるIL-1β,TNFα産生の推移は、PMSG-hCG処理ラットでは、卵巣内のCINC/gro、IL-1β、TNFαの産生量はhCG投与後に急激に増加し、IL-1β、TNFαではhCG投与の4時間後、CINC/groは6時間後といずれも排卵以前にピークに達した(P<0.01、0.05、0.01、ピーク値vs投与前値)。CINC/groのピーク値は投与前値の3.7倍であった。CINC/gro mRNAもhCG投与後に強く発現した。このようにPMSG/hCG刺激による排卵過程ではGRO-CINCのピークに先だって、IL-1b, TNFaの産生のピークが見られた。4.GRO-CINCの中和抗体をラット腹腔内へ投与し、PMSG/hCG刺激を行い、卵管内に排卵された卵を実体顕微鏡下に観察し、排卵過程におけるGRO-CINCの生理的役割を検討した。排卵数は、正常家兎血清を投与した対照の64.0±18.2個(平均±標準偏差)に対し、抗CINC/gro抗体を投与した群では42.8±14.3個と有意に少数で(P<0.05)、抗CINC/gro抗体の腹腔内投与により、排卵数は33%減少した。以上より、ケモカインのCINC/groは、LHサージ後のIL-1βおよびTNFαの上昇を介して卵巣の莢膜細胞に発現し、好中球を卵胞周囲に遊走させることにより、ラットの排卵現象に関与している可能性が示唆された。排卵機構には白血球の関与が示唆され、特に好中球が排卵期の卵胞周囲に集まって来ることが観察されている。そしてその好中球の集蔟を制御しているのがケモカインであることが推定されるが、詳細は明確ではない。

そこで、平成13年度の研究では、ラット排卵機構におけるケモカインの意義を調べるため、まずラットのケモカインで好中球を走化させる作用のあるGRO-CINCについて、その産生部位および排卵過程での量的変化を検討し、以下の結果を得た。なお、ラットは生後25日齢幼若雌ラットを用いた。1.ラット卵巣を摘出し、免疫組織学的手法でGRO-CINCの産生部位を検討したところ、成熟卵胞の莢膜細胞層領域に免疫染色を認めた。2.PMSG-hCGで刺激したラットから卵巣を摘出し、ELISA法を用いて卵巣中のGRO-CINC蛋白の産生量の変化を検討したところ、hCG投与後にGRO-CINC蛋白の産生量が急増し、hCG投与後6時間目にピーク(排卵刺激前の3.7倍、p<0.01)に達した。またGRO-CINCmRNAについてPT-PCR法を用いて定量的に検討したところ、mRNAも同様にhCG投与後に増加することが判明した。以上より、ラットでは莢膜細胞層領域でケモカインであるGRO-CINCが産生されており、排卵の直前に最も産生が増加することが明らかとなり、排卵期の好中球の集蔟にGRO-CINC、すなわちケモカインが関与していることが推定された。本研究においては、卵巣での卵胞発育、排卵、卵胞閉鎖機構に局所に存在する各種サイトカイン、成長因子が関与調節する機構を明らかにする一環として、実験動物として幼弱メスラットを用い、卵巣におけるインターロイキンやケモカイン、細胞増殖因子の存在、ならびにそれが排卵機構に関与するホルモンあるいは成長因子、サイトカインなどにより調節を受けるか否かを検討している。これまでに、莢膜細胞層にGRO-CINCが存在すること、ラット排卵過程において、PMSGだけではGRO-CINCの産生は亢進しないが、PMSGの投与後にhCGを投与するとその4時間後から48時間後にかけてGRO-CINCの産生が亢進することを明らかにした平成14年度は、GRO-CINCの産生を調節する因子を明らかにする目的で、ラット卵巣穎粒膜細胞培養系を用いて、排卵に関与する各種ホルモンやサイトカインを添加して検討を行った。培養上清中のGRO-CINCの濃度をELISA法で検討した。その結果、FSH、hCG、IL-1bおよびTNFaはCINC/groの産生を濃度依存性に促進させた。特にIL-1bおよびTNFaは著しく促進させた。エストラジオール、プロゲステロンはGRO-CINCの濃度に影響を及ぼさなかった。莢膜細胞層に発現するGRO-CINCは、FSH、hCG、およびIL-1bおよびTNFaなどのサイトカインによって活性化され、排卵時の卵胞壁破裂において重要な役割を担っていることが示唆される。本研究では、卵胞発育、排卵、卵胞閉鎖機構に卵巣局所に存在する各種サイトカイン、成長因子の関与を明らかにする一環として、幼弱メスラットを用い、卵巣におけるインターロイキンやケモカイン、細胞増殖因子の存在、ならびにそれが排卵機構に関与するホルモンあるいは成長因子、サイトカインなどにより調節を受けるか否かを検討している。これまでに、莢膜細胞層にGRO-CINCが存在すること、ラット排卵過程において、PMSGだけではGRO-CINCの産生は亢進しないが、PMSGの投与後にhCGを投与するとその4時間後から48時間後にかけてGRO-CINCの産生が亢進すること、FSH、hCG、IL-1βおよびTNFαはCINC/groの産生を濃度依存性に促進させることを明らかにした。
光電マルチマイクロプローブの開発とマイクロバブルの機能発現

マイクロ・ナノバブルが注目されているが,PDA(Phase Doppler Anemometer)や粒子干渉画像法では,高数密度下における計測は原理的に不可能である.これを克服し,混相流技術に新たな展開を拓くために,研究代表者がこれまでに研究開発してきたマイクロ光ファイバープローブに,新たに電気信号伝播と物質輸送機能を付与することにより,多機能化(光,電気,物質の3要素によるマルチ機能)して,以下を実施した.(1)光信号(相変化による界面反射特性)と電気信号(電気伝導度)とを同時利用して,マイクロバブルや液滴の物理的特性:径,速度,界面電位,動的表面張力等を高精度に同時計測するシステムを確立した.(2)フェムト秒レーザーにより石英等の透明物質を微細加工する技術を確立した.(3)機能発現に伴うマイクロバブル・液滴の動力学的特性の変化,周囲相との動力学的干渉性の変化を解明し,素材製造用の動力学データを取得した.(4)上記の光ファイバープローブの微細加工に必要とされる基礎データと基礎技術(石英等の透明物質のフェムト秒レーザーによるナノ加工)を収集,確立した.研究の全期間で,論文30報(査読有,国内誌4,海外誌26),国際会議24編,海外での招待講演・招聘17件,国内学会招待講演28件,特許出願3件(国内2件,海外1件)を得た.マイクロ・ナノバブルが注目されているが,PDA(Phase Doppler Anemometer)や粒子干渉画像法では,高数密度下における計測は原理的に不可能である.これを克服し,混相流技術に新たな展開を拓くために,研究代表者がこれまでに研究開発してきたマイクロ光ファイバープローブに,新たに電気信号伝播と物質輸送機能を付与することにより,多機能化(光,電気,物質の3要素によるマルチ機能)して,以下を実施した.(1)光信号(相変化による界面反射特性)と電気信号(電気伝導度)とを同時利用して,マイクロバブルや液滴の物理的特性:径,速度,界面電位,動的表面張力等を高精度に同時計測するシステムを確立した.(2)フェムト秒レーザーにより石英等の透明物質を微細加工する技術を確立した.(3)機能発現に伴うマイクロバブル・液滴の動力学的特性の変化,周囲相との動力学的干渉性の変化を解明し,素材製造用の動力学データを取得した.(4)上記の光ファイバープローブの微細加工に必要とされる基礎データと基礎技術(石英等の透明物質のフェムト秒レーザーによるナノ加工)を収集,確立した.研究の全期間で,論文30報(査読有,国内誌4,海外誌26),国際会議24編,海外での招待講演・招聘17件,国内学会招待講演28件,特許出願3件(国内2件,海外1件)を得た.マイクロバブル混相流技術に新たな展開を拓くために,研究代表者がこれまでに研究開発してきたマイクロ光ファイバープローブに,新たに電気信号伝播と物質輸送機能を付与することにより,多機能化(光,電気,物質の3要素によるマルチ機能)して,以下を実施する.1.光信号(相変化による界面反射特性)と電気信号(電気伝導度)とを同時利用して,マイクロバブルや液滴の物理的特性:径,速度,界面電位,動的表面張力等を高精度に同時計測するシステムを確立する.2.上記計測後直ちに,本マルチプローブを用いてマイクロバブルや液滴に物質を注入することによりその物理的特性(表面張力,光感応性)や化学的特性(表面電位,反応性)を改質,改変,制御する手法を確立する.3.フェムト秒レーザーと上記注入物質の融合作用により,マイクロバブルや液滴に今までにない新たな機能を選択的に発現させる手法を開発する.4.機能発現に伴うマイクロバブル・液滴の動力学的特性の変化,周囲相との動力学的干渉性の変化を解明し,素材製造用の動力学データを取得する.平成17年度には,以下を実施した.1.光電マルチマイクロプローブ単一プローブにより径,重心速度,界面速度,表面張力,界面電位を同時計測する光電マルチマイクロプローブの基礎技術を確立した.2.単一プローブによる径・速度の同時計測充填する液体の屈折率により切断角度を変化させ,端面における反射光量を変えることができる.この性質を利用して,単一プローブで界面移動速度を計測した.3.マイクロレベルの動的表面張力同時計測マルチ機能光ファイバープローブでは,プローブが気泡に接触した際の電気信号は,光信号より速く検知される.この時,気泡界面の変形はない.電気信号検知と光信号検知との遅れ時間からマイクロレベルで動的界面張力を計測する手法を開発した.また気泡の表面電位を電気信号から計測する手法を開発した.マイクロバブル混相流技術に新たな展開を拓くために,研究代表者がこれまでに研究開発してきたマイクロ光ファイバープローブに,新たに電気信号伝播と物質輸送機能を付与することにより,多機能化(光,電気,物質の3要素によるマルチ機能)して,以下を実施する.1.光信号(相変化による界面反射特性)と電気信号(電気伝導度)とを同時利用して,マイクロバブルや液滴の物理的特性:径,速度,界面電位,動的表面張力等を高精度に同時計測するシステムを確立する.2.上記計測後直ちに,本マルチプローブを用いてマイクロバブルや液滴に物質を注入することによりその物理的特性(表面張力,光感応性)や化学的特性(表面電位,反応性)を改質,改変,制御する手法を確立する.

3.フェムト秒レーザーと上記注入物質の融合作用により,マイクロバブルや液滴に今までにない新たな機能を選択的に発現させる手法を開発する.4.機能発現に伴うマイクロバブル・液滴の動力学的特性の変化,周囲相との動力学的干渉性の変化を解明し,素材製造用の動力学データを取得する.平成18年度には,以下を実施した.1.光電マルチマイクロプローブ計測の高精度化(1)中空マイクロプローブヘのビーム入射をナノレベルで位置制御することにより,入射光量効率を高め,相変化による戻り光量を50%アップさせた.(2)計測時と気泡改質時とで光の波長を変えることが必要となる.これを計測と気泡の機能化には波長の異なる光を巧みに利用することにより実現した.2.機能発現気泡の動力学特性の解明(1)物質注入後,気泡(径50μm)の動力学特性(界面運動,重心運動)がどのように変化するかを高精度の可視化により解明した.(2)加えて,物質注入後の気泡周囲の液相運動の変化を,マイクロPTVにより解明した.(3)レーザー光により改質した気泡の動力学特性(界面運動,重心運動)を高精度の可視化により解明した.(4)また,この時の近傍の液相運動を解明した.(1)フェムト秒レーザーにより精密加工した単一光ファイバープローブにより最小径10μm,最大移動速度1m/sまでのマイクロバブルの径と速度を高精度に計測すると同時にこの被測定マイクロバブル界面に界面活性剤を注入する技術を完成させた.また,これらの成果を国内特許出願3件,海外特許出願1件として,とりまとめた.フェムト秒レーザーによる石英ファイバーの加工条件(パルス強度,照射パルス数,焦点サイズ)と加工精度との関係を明らかにした.また,加工痕と同プローブに入力されたレーザー光信号との関係を明らかにした.(2)上記の技術を利用して,単一光ファイバープローブによりマイクロバブルの径と速度を同時計測するとともに,この計測結果をリアルタイムで処理して光機能性物質をマイクロバブルに選択的に吸着させる技術を開発した.これにより,マイクロバブルの界面運動,重心運動を変化させる基盤技術を開発した.加えて,気泡周囲の液相運動を解明し,気泡界面のコンタミと周囲液相運動との相互干渉性を考察した.(3)上記で開発した機能発現気泡(表面電位改質等)の医療応用を検討した.(4)さらに,電気信号と光信号を導波することができる光電マルチマイクロプローブを開発し,局所の濃度を計測することに成功した.分散する気泡や液滴から周囲の液相への物質移動を高い応答速度で計測することができるプローブを開発した.また,これを医療に応用する方法を検討した.
歯の移動による歯根膜細胞の応答〜細胞周期的な解明とコラーゲン産生能の変化〜

本年度はまずラットの歯を含んだ顎骨の凍結未固定非脱灰切片の作製法を確立することから着手した。未固定ラットを麻酔下で断頭屠殺後、ただちに下顎骨を摘出し、液体窒素にて凍結し、さらに時々冷やしながら、注意深く臼歯歯冠エナメル質をエンジンバーで削り取った。CMC(5% sodium carboxymcthyl cellulose solution)に包埋し、cryostatで切片化した。同時に今まで行ってきた実験との対比を考え、マウスの凍結切片の作製も行った。この場合エナメル質のトリミングは行う必要はなかった。次に抗ヒトKi-67モノクローナル抗体による免疫組織化学染色を試みたが、結局、今までに文献上発表されていた抗ヒトKi-67モノクローナル抗体とラットとの交差反応は、ないことが判明し、これ以後、凍結切片→免疫組織化学的手法という道筋を断念し、グルタールアルデハイド固定→テクノビット包埋→切片化という手法と、3H-Thymidine投与→オートラジオグラフィーによる細胞増殖の判定を行う事とした。マウス下顎第一臼歯をワイヤースプリング法で頬側に移動し、18時間という比較的短期間の移動期間中の増殖細胞の出現様相について、詳細な検討を加えた。3H-Thymidineは歯の移動開始後、8、16、24、32、40、48時間後に投与し、その1時間後にグルタールアルデハイド固定を行った。この実験の結果については73rd IADR(Singapore)にて発表を予定している。さらに、本実験を発展させ、cell migrationについて検討をするため、長時間(2週間)に実験についても、既に着手している。
ベンゼン類の高選択的直接水酸化を実現する新規可視光応答型光触媒系の開発

本研究では、新規に開発した可視光応答型の酸化タングステン系光触媒を用い、ベンゼンからの直接水酸化反応などの有機合成反応を、光のエネルギーを利用することによって、酸素と水分子のみを反応剤として高選択的に進行させうる新規な光触媒有機合成系の開発を目指して検討を行った。これまで光触媒材料として主に用いられてきた酸化チタン系とは異なり、酸化タングステン系光触媒は有機物が溶解した水溶液中においても水分子を選択的に酸化して水酸化ラジカルを生成することが可能であり、この水酸化ラジカルがベンゼンなどの基質と反応することにより、酸化分解が抑制されて、水酸化物または部分酸化物が高選択的に得られることを見出した。本研究では、難易度の極めて高い化学反応として知られる「ベンゼン環の直接水酸化による高選択的フェノール類の合成」を、新規酸化タングステン系光触媒を用い、酸素と水分子のみを反応剤として可視光照射下で実現することを目的としている。本年度の実績の概要を以下に記す。(1)酸化タングステン系光触媒における選択的ベンゼン直接水酸化反応の機構解明酸素の安定同位体を用いた機構解明から、酸化タングステン系光触媒では、水溶液中にベンゼンやアルコールなどの有機化合物が存在する場合であっても、光照射によって生成した正孔は水分子を優先的に酸化して水酸化ラジカルを生成し、これがベンゼンと反応することで選択的なフェノール生成が進行することが示された。一方で、一般的な酸化チタン光触媒を用いた場合には、水溶液中に含まれる有機化合物が酸化チタン表面に強く吸着し、正孔によって直接酸化されて芳香環開裂や過全酸化が進行し、フェノールへの選択性が低下することが示唆された。また、アルコール類からのケトンの選択酸化などにも有効であることを見出した。(2)白金を代替可能な卑金属系助触媒の探索これまで、酸素還元活性の高い白金助触媒を担持することが必要であったが、クラスター状で銅イオンを担持させることにより、この銅クラスター上において励起電子による酸素の2電子還元が促進され、白金助触媒と同等以上のベンゼン水酸化活性を示すことを見出した。(3)流通系への展開の予備検討光触媒粒子を反応溶液中で撹拌しながら光照射を行う「バッチ式」の反応では、生成したフェノールの逐次酸化による選択率の低下を完全に抑制することは困難である。そこで、固定化した光触媒を用い、流通式での反応を検討した結果「バッチ式」に近い効率でフェノール生成が進行し、また生成物の定性・定量からベンゼンおよびフェノールの芳香環開裂が効果的に抑制されていることが示された。本研究では、難易度の極めて高い化学反応として知られる「ベンゼン環の直接水酸化による高選択的フェノール類の合成」を、新規酸化タングステン系光触媒を用い、酸素と水分子のみを反応剤として可視光照射下で高効率かつ高選択的に進行させることを目的としている・本年度の実績の概要を以下に示す。(1)酸化タングステン系光触媒において「ベンゼン環への直接水酸化導入」が高選択的に進行する最大の理由が、有機物が含まれる水溶液中においても選択的に水分子を酸化して「水酸化ラジカル」を生じる点にあることが明らかとなった。様々な物性を有する酸化タングステン粒子を用いて、その選択性への影響を検討した結果、酸化タングステン粒子に露出した特異な結晶面が反応選択性に強く影響を与えることが示唆された。そこで独自の水熱合成法によって3種類の結晶面が選択的に露出した酸化タングステン粒子を合成することに初めて成功し、これらが水の酸化に高い選択性を示すことを実証した。(2)助触媒として酸化パラジウムを担持した酸化タングステン光触媒が、2プロパノールの部分酸化によるアセトン生成に80%以上の極めて高い選択性を示すことを見出した。一方で、酸化チタン系光触媒や、白金助触媒を担持した酸化タングステン光触媒では、生成したアセトンの過酸化が進行し、低選択率にとどまった。詳細な反応機構検討の結果から、酸化パラジウム助触媒上において酸素分子の2電子還元による過酸化水素生成が進行することが鍵であることが明らかとなった。そこで、この特性を活かした、過酸化水素合成系の検討も開始し、酸素分子から高選択的に過酸化水素を合成できることを見出した。(3)流通系への展開バッチ式で進行する過酸化反応を抑制するために流通系への展開を進め、ベンゼンーフェノール系のみならず、アルコールの部分酸化に対しても有効であることを実証した。当初の研究計画において掲げていた3つの研究目標のうち、「酸化タングステン系光触媒における選択的ベンゼン直接酸化反応の機構解明」についてはほぼ目的を達成している。「高活性化および選択性の向上指針と実証」については、今年度において特異な結晶面が与える影響が明らかとなり、次年度においてそれを詳細に解明する予定である。そして第3の目的であった「流通系への展開」については、当初予定のベンゼンーフェノール系のみならず、アルコールの選択酸化にも有効であることを実証しており、予定を前倒しで検討を進めている。以上のことから、本研究計画の現在までの達成度は、おおむね順調に進展している、と結論できる。本年度は、これまで展開してきた貴金属型酸化タングステン光触媒を用いる有機物選択酸化反応のさらなる展開を目指した検討を進め、以下のような成果が得られた。

(1)従来のバッチ式光反応装置では、目的生成物が光触媒粒子と同じ相に存在し接触し続けるため、一度生成した生成物の逐次酸化を完全に抑制することは困難であると考えられる。そこで酸化タングステン光触媒粒子をガラス基板上に固定化して、その上を反応物を通過させながら光照射を行う流通系反応システムを構築し、各種アルコールからの高選択的アルデヒドおよびケトン類の生成を目指した。流量と光触媒粒子のガラス基板への固定化法の最適化により、バッチ式に比べて高い選択率を達成した。(2)上記では直鎖のアルコール類の選択酸化を検討したが、さらにベンジルアルコールなどの選択酸化反応などへの適用も検討した。パラジウム種を助触媒として担持した酸化タングステン光触媒を用いると、従来の酸化チタン光触媒を用いた場合よりも高い選択率でベンズアルデヒドが生成し、かつ完全酸化による二酸化炭素の生成が著しく抑制されることを見出した。さらに、選択酸化反応の展開を目指し、直接反応が極めて困難とされるアダマンタンへの水酸基導入による高付加価値生成物の合成を試みた。少量の水を含むアセトニトリル中で反応を行うと、1-アダマンタノール、2-アダマンタノール、2-アダマンタノンの生成が確認され、アダマンタンの水酸化が進行することを明らかにした。(3)昨年度までに水熱反応により結晶面が露出した酸化タングステン光触媒を合成し、これが水の酸化に対して高い選択性を示すことを見出してきた。平成28年度は、水熱反応を行う際の前駆体溶液のpHやアルカリ金属を添加することが生成物に与える影響に着目し、微量のナトリウム源を加えることにより水の酸化活性が飛躍的に向上することを見出した.本研究では、新規に開発した可視光応答型の酸化タングステン系光触媒を用い、ベンゼンからの直接水酸化反応などの有機合成反応を、光のエネルギーを利用することによって、酸素と水分子のみを反応剤として高選択的に進行させうる新規な光触媒有機合成系の開発を目指して検討を行った。これまで光触媒材料として主に用いられてきた酸化チタン系とは異なり、酸化タングステン系光触媒は有機物が溶解した水溶液中においても水分子を選択的に酸化して水酸化ラジカルを生成することが可能であり、この水酸化ラジカルがベンゼンなどの基質と反応することにより、酸化分解が抑制されて、水酸化物または部分酸化物が高選択的に得られることを見出した。当初の研究計画において掲げていた3つの「研究の目的」のうち、「酸化タングステン系光触媒における選択的ベンゼン直接水酸化反応の機構解明」については、ほぼ目的を達成しており、次年度からはこの結果を基にして、2つ目の目的である「高活性化および選択性向上の指針確立と実証」を進める予定である。また、3つ目の目的であった「流通系への展開によるフェノール類への選択性向上と連続抽出の実証」に関しては、初年度に予備検討を終え、その有効性を確認している。さらに、これまで本光触媒系の1つの課題であった、高価な白金助触媒の使用、についても、銅イオンのクラスターを用いることによって、同等以上の反応速度が得られることを確認している。以上のことから、本研究計画の現在までの達成度は、おおむね順調に進展している、と言える。最終年度となる平成28年度は、各研究項目の絞り込みも行い、最終目標である「流通系への展開によるフェノール類の選択的向上と連続抽出の実証」を目指して、検討を進めるが、これまでの研究成果を発展させる意味において、アダマンタンへの選択的水酸基導入による高付加価値生成物の合成にも挑戦する。
カタバミ科が行う就眠運動に影響を与える光波長について

○研究目的生物がもつ概日時計は多くの場合約24時間周期であり、光や温度などの環境サイクルへ同調することで正確に24時間の周期を保っている。動物の場合、光波長も概日時計を調節する能力を決める重要な因子であるとして研究が進んでいるが、植物では研究があまり進んでいない。よって本研究では、カタバミ科が概日時計の制御の下で行う就眠運動に対し、特に影響を与える光波長を明らかにすることを研究目的とした。○研究方法まず、温度を20度で一定にしたインキュベータ内に野外から採取したムラサキカタバミとイモカタバミを静量した。その後、赤・青・緑の波長の異なる3色のLED蛍光灯を用いてそれぞれ光を照射し、就眠運動の様子を観察した。用いたLED蛍光灯の波長は、赤色光が615635nm、青色光が464475nm、緑色光が520535nmであり、与える光周期は(1)明期:暗期=12:12、(2)明期:暗期=3:3、(3)明期:暗期=1.5:1.5の3パターンとした。観察には赤外線Webカメラを用い、カメラを通じてパソコン上に写した画像を常時記録した。撮影終了後、10分おきに葉の開閉状況を調べ、各時間帯に葉が開いている割合を百分率で表し、光周期と合わせてグラフを作成した。○研究成果ムラサキカタバミとイモカタバミの両方において、(1)(3)のいずれの光周期の場合であっても、光周期に同調して就眠運動を行う様子が観察できたが、暗期に光照射してから就眠運動が行われるまでの時間を各光波長で比較したところ、青色光が照射後約40分、緑色光が約50分、赤色光が約90分後であった。就眠運動は葉枕細胞内の容積変化によって引き起こされると考えられているので、この容積変化については青色光の効果が最も大きく、赤色光の効果が最も小さいことが明らかになった。
都市空間上での大規模モバイルワイヤレスネットワークにおける効率的な情報共有方式

無線LANなどの無線通信技術の発展に伴い,既存のバックボーンを介さず臨時に敷設した中継端末や携帯移動端末同士で通信を行うモバイルワイヤレスネットワークの研究が進められている.このようなワイヤレス通信に基づくネットワークでは,人や車などの移動端末のモビリティがネットワークの性能に大きな影響を与えることが知られている.本研究では,都市空間での人や車のモビリティを評価・検討し,その結果に基づき都市空間を移動する人や車の行動モデル(モビリティモデル)を構築すると共に,単位時刻毎に指定された人や車の位置・移動方向・速度等を計算するプログラムを自動導出するコンパイラを作成し,既存のモバイルアドホックネットワークシミュレータと連動させることで,人や車のモビリティに基づくワイヤレス通信の性能評価を効率よく行えるようにした.また,車車間アドホック通信を用いて先行道路情報を効率よく高信頼で伝搬させるための方式や,危険車両の走行履歴を周辺車両で共同でモニタする方式,地震などで既存のネットワークインフラが遮断された際に被災者間で自律的に効率よく緊急情報を蓄積・交換するための方式,などを考案するとともに,作成したネットワークシミュレータを用いて,提案方式の性能やモビリティによる影響などを詳細に評価・検討した.無線LANなどの無線通信技術の発展に伴い,既存のバックボーンを介さず臨時に敷設した中継端末や携帯移動端末同士で通信を行うモバイルワイヤレスネットワークの研究が進められている.このようなワイヤレス通信に基づくネットワークでは,人や車などの移動端末のモビリティがネットワークの性能に大きな影響を与えることが知られている.本研究では,都市空間での人や車のモビリティを評価・検討し,その結果に基づき都市空間を移動する人や車の行動モデル(モビリティモデル)を構築すると共に,単位時刻毎に指定された人や車の位置・移動方向・速度等を計算するプログラムを自動導出するコンパイラを作成し,既存のモバイルアドホックネットワークシミュレータと連動させることで,人や車のモビリティに基づくワイヤレス通信の性能評価を効率よく行えるようにした.また,車車間アドホック通信を用いて先行道路情報を効率よく高信頼で伝搬させるための方式や,危険車両の走行履歴を周辺車両で共同でモニタする方式,地震などで既存のネットワークインフラが遮断された際に被災者間で自律的に効率よく緊急情報を蓄積・交換するための方式,などを考案するとともに,作成したネットワークシミュレータを用いて,提案方式の性能やモビリティによる影響などを詳細に評価・検討した.
トップアスリートの跳躍パフォーマンス評価と個別性トレーニング方法の検証

高い跳躍能力の選手をさらに向上させるためにトレーニング科学、バイオメカニクス、運動学習の知見を総合し、選手個人の特性に合ったトレーニングを処方する必要がある。本研究ではまず、高い跳躍高を可能にする跳躍動作のバイオメカニクス的特徴を明らかにする。その知見を基に選手を「力不足型」、「パワー不足型」、「バランス型」のタイプに分け、それぞれの欠点を強化するためのレジスタンストレーニングおよび拡張フィードバックトレーニングを行い効果を明らかにする。
ミトコンドリア輸入装置と前駆体タンパク質の間のソフトな相互作用に基づく分子認識

ミトコンドリア内部へ輸送されるタンパク質はN末端にプレ配列が付加されて生合成される.Tom20タンパク質はミトコンドリア外膜にあって,プレ配列を最初に認識する受容体である.Tom20とプレ配列の複合体を共有結合で安定化する技術を新規に考案して,結晶構造解析とNMR緩和時間解析を行った.複数の結合状態が存在するが,それぞれは認識としては不完全である.この複数の状態の間の速い動的平衡が,Tom20が多様なプレ配列を認識するメカニズムであることを提唱した.ミトコンドリア内部へ輸送されるタンパク質はN末端にプレ配列が付加されて生合成される.Tom20タンパク質はミトコンドリア外膜にあって,プレ配列を最初に認識する受容体である.Tom20とプレ配列の複合体を共有結合で安定化する技術を新規に考案して,結晶構造解析とNMR緩和時間解析を行った.複数の結合状態が存在するが,それぞれは認識としては不完全である.この複数の状態の間の速い動的平衡が,Tom20が多様なプレ配列を認識するメカニズムであることを提唱した.ミトコンドリアを構成するタンパク質の大部分は細胞質のリボソームで合成された後に、ミトコンドリアへと輸送される。ミトコンドリアタンパク質の多くはN末端に余分な配列(プレ配列)が付加された前駆体として合成される。本年度は、プレ配列受容体であるTom20サブユニットの構造生物学的な解析を進めた。プレ配列ペプチドのC末端にグリシン残基からなるリンカーを介してシステイン残基を付加して、ラットTom20に存在する唯一のシステイン残基(偶然に良い位置にある)とSS結合を形成させ、複合体を安定に単離することができる。このシステムをつかって、新しいペプチドライブラリアプローチを考案し、Tom20結合のコンセンサス配列の詳細とALDHプレ配列が配列空間において局所的に最適化されているという結論を得た。次に、Tom20タンパク質のコア構造(NMR実験で得られた構造に基づいて残基番号59-126とした)をGST融合タンパク質として発現し、アフィニティ精製と逆相カラムで調製した。これに化学合成によって調製したペプチドを銅イオン存在下、pH8で混合し、SS結合を生成させた。逆相カラムとゲル濾過で精製して結晶化用試料とした。同様にセレノメチオニン体を調製した。結晶化スクリーニングを行い、1415% PEG6000,1M NH_4Cl,0.1M HEPES pH7.0,20°Cの条件で結晶を得た。SPring8 BL40B2においてクライオ条件(エチレングリコール添加)下でデータ収集を行い、空間群C2、分解能2.8Åの回折データを得た。現在解析中であるが、非対称単位中に6個程度の分子が存在した。予想外の結果として、一部はプレ配列ペプチドを交換した変則的なダイマーを形成していた。Tom20分子の構造はNMRによって決定した溶液構造と似ていること、プレ配列ペプチドはαヘリックスを形成していることがわかった。ミトコンドリアを構成するタンパク質の大部分は細胞質のリボソームで合成された後に、ミトコンドリアへと輸送される.ミトコンドリア・マトリクスへ輸送されるタンパク質はN末端にプレ配列が付加された前駆体として合成される.今年度はプレ配列受容体であるTom20サブユニットとプレ配列との複合体の結晶構造解析をおこなった.我々は過去にTom20分子の細胞質ドメインとALDH由来のプレ配列との複合体のNMRによる構造決定をおこなっている.しかし,プレ配列の速い結合・解離の問題と,Tom20タンパク質のアグリゲーションの問題があった.そこで,Tom20の両末端にあるフレキシブル領域を削除した68残基からなるフラグメントを大腸菌で発現し,これにALDHプレ配列を分子間SS結合で固定した複合体を調製した.リンカーのデザインを多少変えることで,2つの異なる結晶を得て構造精密化を終了した.リンカー配列はYAGCとAAGCであり,YリンカーおよびAリンカーと呼ぶことにする.Yリンカー結晶(分解能2.1Å)は非対称単位中に7分子,Aリンカー結晶(分解能1.9Å,PDB 1WT4)は2分子が含まれていた.Y結晶ではすべてのTom20分子がプレ配列ペプチドを交換し,インターツインドダイマーを形成していた.ここから,5つのファンクショナルユニットを切り出した.Tom20タンパク質の68残基フラグメントは4本のαヘリックスからなり,最初の3本のαヘリックスがプレ配列を結合する溝を形作っている.NMR構造(溶液中,分子間SS結合なし)と比較すると,Tom20タンパク質の部分はほぼ同一であった.プレ配列ヘリックスの位置と方向もNMR構造と結晶構造でよく重なった.両方の結晶でTom20に認識される部分のアミノ酸配列部分(R^<14>LSRLL^<19>)はαヘリックス構造をとることがわかった.ミトコンドリアを構成するタンパク質の大部分は細胞質のリボソームで合成された後に、ミトコンドリアへと輸送される.ミトコンドリア・マトリクスへ輸送されるタンパク質はN末端にプレ配列が付加された前駆体として合成される.

Tom20のNMR構造をもとにコア構造だけを切り出し,さらにプレ配列を分子間SS結合で固定した複合体を調製した.リンカーのデザインを多少変えることで,2つの異なる結晶を得て構造決定を行った.結晶1(分解能2.1A,2CUV)は非対称単位中に7分子,結晶2(分解能1.9Å,1WT4)には2分子が含まれていた.結晶1の結晶化では脱水とアニーリング操作が質の高い回折データを得るのに必須であった.プレ配列ペプチドはTom20分子表面の溝にαヘリックスを形成して結合していることが確定した。なお,人工的なSS結合を導入しないで,Tom20とプレ配列ペプチドを混合しても結晶は得られない.Tom20側の結合溝には疎水性ポケットは2つある.1つ目の疎水性ポケットは2つの結晶構造においてプレ配列ペプチドのコンセンサス配列φ_1χχφ_2φ_3(φは疎水性アミノ酸,χは任意のアミノ酸のうちφ_2を結合する.興味深いことにもうひとつの疎水性ポケットは,結晶1ではφ_1を結晶2ではφ_3を認識している.一方,認識されていない残りの疎水性残基はTom20タンパク質との接触はほとんどない.プレ配列は基本的にリジッドなαヘリックスを形成しているので,2つの認識様式が可能となるには,Tom20側の若干の構造変化とプレ配列ヘリックスの大きな動きが必要である.どちらか一方の構造だけではコンセンス配列を説明できない.したがって,プレ配列のコンセンサス配列φ_1χχφ_2φ_3をTom20が少なくとも2つの異なる結合様式を使って,動的に認識しているという極めて斬新な分子認識機構を示唆する.ミトコンドリアを構成するタンパク質の大部分は細胞質のリボソームで合成された後に、ミトコンドリアへと輸送される.ミトコンドリア・マトリクスへ輸送されるタンパク質はN末端に余分な配列(プレ配列)が付加された前駆体として合成される.昨年度までにプレ配列受容体であるTom20サブユニットとプレ配列との複合体を分子間SS結合を用いて安定化して結晶構造を決定した.プレ配列のコンセンサス配列φ_1XXφ_4φ_5(φは疎水性残基)をTom20が少なくとも2つの異なる結合様式を使って,動的に認識しているという極めて斬新な分子認識機構を提案した。これを証明するためにNMR^<15>N緩和時間解析を行った。Tom20のコア構造にプレ配列を分子間SS結合で固定した複合体を調製した.シグナルの重なりを最小限に抑えるために,プレ配列ペプチドのみに^<15>N標識したものと,Tom20にのみ^<15>N標識したものをそれぞれ調製し,R_1, R_2, heteroNOEの測定を298Kで600MHzNMR装置を用いて行った.モデルフリー解析から各残基のR_<ex>を推定した.また,transverse CSA/dipolar cross-correlation rate(η_<xy>)測定からもRexを推定した.2つの方法によるR_<ex>の値は良く一致した.R_<ex>の大きい残基(1s^<-1>以上)をX線結晶構造解析による2つの立体構造にマッピングした。疎水性接触面に存在するTom20の174、Q75及びペプチドのS16、L19、S20のアミド^<15>Nで大きなR_<ex>が観測された.
シングルセル遺伝子発現解析による多段階白血病発症機構の解明

ダウン症児において、染色体21番のトリソミーにGATA1変異が入ることで前白血病芽球(TAM)を発症し、さらにエピゲノム制御因子のゲノム変異によって一部のTAM患者は急性巨核芽球性白血病(DS-AMKL)へと進展する。我々は、これまでにTAMとDS-AMKLの境界を同定するために、TAMおよびDS-AMKLを発症したダウン症患者の血液サンプル、骨髄サンプル、寛解時の正常血液サンプルの微量RNAseqを行い、正常血液細胞、TAMおよびDS-AMKLの芽球における遺伝子発現のプロファイリングを行い、PCA解析によりTAM/AMKLと正常血液細胞は大きく発現プロファイルが異なることを明らかにしている。また、AMKLで発現が更新している遺伝子の同定にも成功しており、GSEAによりそれらが増殖に関連する遺伝子群であることを突き止めている。また、infiniumヒトメチル化アレイを用いた検討では、正常血液細胞、TAMおよびDS-AMKLの芽球におけるDNAメチル化のプロファイリングを行い、正常血液細胞とTAM、DS-AMKLを分けるプローブの抽出にも成功していた。今年度は、上記の解析につき、サンプル数を増やして再解析を行った。さらに、TAMからDS-AMKLに進展するサンプルと、寛解するサンプルを区別するために、infiniumヒトメチル化アレイを用いて、TAMおよびDS-AMKLの芽球におけるDNAメチル化のプロファイリングを実施し、DS-AMKLへ進展するサンプル特異的なメチル化プローブの検出を試みたところ、DS-AMKLへと進展するTAMと進展しないTAMを予想するためのプローブの抽出に成功した。これらプローブは、マウスを使った異種移植モデルでも、再現されることを確認した。当初の予定通り、以前行っていた正常血液細胞、TAMおよびDS-AMKLの芽球における遺伝子発現プロファイリング、正常血液細胞とTAM、DS-AMKLを分けるメチル化プローブの抽出を、サンプル数を増やして再解析することができた。また、今年度開始した、TAMからDS-AMKLに進展するサンプルと、寛解するサンプルを区別するプローブの抽出にも成功している。これらのことから、当初の計画通りに進行していると考えている。前年度までに、TAMからDS-AMKLに進展するサンプルと、寛解するサンプルを予想するプローブの抽出には成功したが、これらのメチル化の差は大きくなかった。今年度は、抽出したプローブの精度評価と、より特異的なプローブの選定を行うために、患者サンプルを増やし、追加解析および検証を行う予定である。また、bulkのRNAseqのデータから、TAMからDS-AMKLに進展するサンプルと、寛解するサンプルを区別できるかについても検討を行う。さらに、TAMからDS-AMKLへの進展において、メチル化が転写制御に与える影響についても検討を行う予定である。この際、メチル化の差が小さかったことから、bulkのRNAseqでは遺伝子発現への影響が検出しにくいことも考えられるため、scRNA-seqを用いて、芽球のみを抽出し、それらの遺伝子発現プロファイルとメチル化パターンの相関について検討する予定である。