hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
正常造血細胞および白血病細胞におけるAML1遺伝子の機能解析

AML1遺伝子はDrosophila pair-rule遺伝子であるrunt、およびマウスpolyomavirus enhancer結合蛋白質をコードするPEBP2aAと相同性を持つ転写因子であり、急性骨髄性白血病で認められるt(8;21)染色体転座、慢性骨髄性白血病の急性転化や骨髄異形性症候群の白血化時に出現するt(3;21)染色体転座により再構成され、それぞれAML1/MTG8,AML1/Evi-1融合蛋白質が産生される。すでに我々は生物学的ならびに生化学的解析によりAML1/EVI-1キメラ蛋白質は造血細胞の分化抑制と増殖促進に作用することを示した。すなわち、AML1/EVI-1は、(1)AML1と同様にAML1の特異的結合配列(PEBP2配列)に結合し、AML1によるPEBP2部位に対する転写活性をdominantに抑制する、(2)AP-1活性を上昇させる、ことを明らかにした。これらの機能が、それぞれ造血細胞の分化抑制と増殖促進に関与し、leukemic transformationに至るのではないかと推定される。本研究ではAML1の機能制御を解析することを目的に研究を行い、以下の成果を得た。ASML1遺伝子からは、alternative splicingにより少なくとも2つのタイプの産物が転写,翻訳されるが、これらの両者が競合的に作用することによって転写活性が調節され、血液細胞の分化・増殖がコントロールされる可能性が示された。(2)AML1蛋白質のレドックス制御AML1蛋白質のDNA結合能は還元状態で増加し、酸化状態で低下した。この活性にはrunt領域内のシステイン残基(C72)が重要であり、DNA結合能、転写活性能、NIH3T3細胞における足場非依存性増殖能のいずれの活性にも関与することが示された。(3)MAPキナーゼによるAML1の制御AML1蛋白質がERKによってリン酸化を受けることが明らかになった。AML1蛋白質のERKによるリン酸化は、DNA結合能には影響しないが、転写活性を明らかに上昇させること、およびNIH3T3細胞における足場非依存性増殖に必須であることが示された。AML1蛋白質はERKに構成的に会合し、この会合はERKのキナーゼ活性およびAML1のリン酸化には影響を受けなかった。AML1遺伝子は慢性骨髄性白血病の急性転化や骨髄異形性症候群の白血化時に出現するt(3;21)染色体転座により再構成され、AML1/Evi-1融合蛋白質が産生される。AML/EVI-1キメラ蛋白質は造血細胞の分化抑制と増殖促進に作用する。すなわち、AML1/EVI-1は、(1)AML1と同様にAML1の特異的結合配列(PEBP2配列)に結合し、AML1によるPEBP2部位に対する転写活性をdominantに抑制する、(2)AP-1活性を上昇させる。AML1遺伝子からは、alternative splicingにより少なくとも2つのタイプの産物が転写・翻訳される。

1つは転写活性化に必要とされるproline-,serine-,threonine-rich(PST)regionをもつタイプ(AML1b)、もう1つはPST regionを欠くタイプ(AML1a)である。これら両者のAML1蛋白質の血液細胞の分化・増殖における機能、ならびに転写制御における活性を検討した。その結果、(1)AML1aは32Dcl3細胞の顆粒球への分化を抑制し、さらにAML1bは、このAML1aの作用をキャンセルする。(2)AML1bはPEBP2部位に対し転写活性を有する。AML1aは、それ自身は転写活性化能をもたないが、AML1bによる転写活性をdominantに抑制する。(3)AML1aはAML1bに比べ高いaffinityでPEBP2 siteに結合する。(3)により、AML1aのAML1bに対するdominant negativeな作用は、PEBP2 siteへの結合の競合によると考えられる。(1)と(2)の結果より、AML1による転写活性化が、血液細胞の分化に必須なものであることが推定される。AML1のalternative splicing産物の相対量により転写活性が調節され、これにより血液細胞の分化がコントロールされる可能性が予想される。AML1遺伝子はDrosophila pair-rule遺伝子であるrunt、およびマウスpolyomavirus enhacer結合蛋白質をコードするPEBP2aAと相同性を持つ転写因子であり、急性骨髄白血病で認められるt(8;21)染色体転座、慢性骨髄性白血病の急性転化や骨髄異形性症候群の白血化時に出現するt(3;21)染色体転座により再構成され、それぞれAML1/MTG8,AML1/Evi-1融合蛋白質が産生される.すでに我々は生物学的ならびに生化学的解析によりAML1/EVI-1キメラ蛋白質は造血細胞の分化抑制と増殖促進に作用することを示した.すなわち,AML1/EVI-1は、(1)AML1と同様にAML1の特異的結合配列(PEBP2配列)に結合し、AML1によるPEBP2部位に対する転写活性をdominantに抑制する、(2)AP-1活性を上昇させる、ことを明らかにした.これらの機能が、それぞれ造血細胞の分化抑制と増殖促進に関与し、leukemic transformationに至るのではないかと推定される.本研究ではAML1の機能制御を解析することを目的に研究を行い、以下の成果を得た.AML1遺伝子からは、alternative splicingにより少なくとも2つのタイプの産物が転写・翻訳されるが、これらの両者が競合的に作用することによって転写活性が調節され、血液細胞の分化・増殖がコントロールされる可能性が示された.(2) AML1蛋白質のレドックス制御AML1蛋白質のDNA結合能は還元状態で増加し、酸化状態で低下した.
知的障がいを併せもつ視覚障がい児のためのワンクリック教材の開発

本研究は、知的障がいを併せもつ視覚障がい児を対象に、ワンクリックで操作できる方向認知の学習教材(以下ワンクリック教材)の開発を目的とした。全盲の場合、方向認知の認識が乏しい。しかし、音に対する興味関心が高いことから、従来の教材のような手で探るだけでなく、対象児の好きな音を加えることで意欲的に取り組むことができるワンクリック教材「あてまSHOW!」の開発を行った。パワーポイントでワンクリックすると音が再生される機能を使い、ハイパーリンク機能で指定したところを正確に触ると対象児の好きな音が鳴る。ディスプレイの画面を2分割(左右の識別)、3分割(左右中央の識別)、4分割(上下左右の識別)にした。全盲である小学部2年生の対象児は、通常のディスプレイではフラットであるため画面の分〓を判断することが困難であった。そのため、彼が触察できるようにディスプレイ上に木材の枠を取り付けた。また、分割線を立体にすることで、境界が触察可能となるように工夫した補助具を作成して、授業実践を行った。その結果は、以下の通りである。(1)ワンクリック教材の素材を興味関心がある音にしたため、初回から意欲的に取り組むことができた。(2)習得状況に応じてワンクリック教材と補助具の分割数を増やすカスタマイズを行うことで方向認知が養われ、学校生活の中で下駄箱やロッカーなど自分の置き場所を把握する場面が増え、教材の有効性が確かめられた。パソコンを用いたワンクリック教材は、「映像」ではなく、「音」に力点を置いて開発を行った。また、木材の枠を補助具として用いることにより、触察が可能になったため、視覚に障がいがある子どもにも使用可能な教材になった。今後は、子どもの実態に応じた教材の開発を行っていきたい。具体的には、点字を習得することが可能なワンクリック教材の開発や数の概念を学ぶことが可能なワンクリック教材などを検討したい。
Geobacter属細菌の電極への電子伝達に関する構造生物学的解析

電極へ直接電子を伝達できる微生物、Geobacter sulfurreducensにおいて細胞外に局在するc型シトクロムは電極への電子伝達に必須である。omcZは細胞外シトクロムのうち遺伝子破壊によって電極への電子伝達能力が著しく低下する遺伝子の一つである。また、鉄還元菌であるG. sulfurreducensが持つomcB、omcSはいずれもその破壊株は酸化鉄(III)の還元能力を失う。本研究では、これら3つの細胞外局在c型シトクロムのX線結晶構造解析を行い、c型シトクロム-電極間、c型シトクロム-鉄間の相互作用や電子伝達様式について、分子・原子レベルで明らかにする。
神経軸索・樹状突起の運命決定と神経細胞の極性形成機構

神経細胞は通常一本の軸索と複数の樹状突起という異なる突起を形成し、樹状突起から信号を入力して軸索から信号を出力する。しかし、神経細胞の極性がいかにして形成されるのか、その分子機構はほとんど理解されていない。最近、我々はCollapsin response mediator protein-2(CRMP-2)を一次培養海馬神経細胞に高レベル発現させると、軸索が複数形成されることを見出した。反対にCRMP-2のドミナントネガティヴ体を発現させると、軸索の形成が阻害されて樹状突起のみを持つ神経細胞が生じた。さらに、成長しつつある軸索の遠位側に内在性CRMP-2が濃縮していることも明らかにした。以上の結果は、CRMP-2が神経細胞の極性形成および維持に重要な役割を果たすことを示している。本研究の目的は、CRMP-2を手掛りとして神経細胞の極性形成機構を分子レベルで解明することである。本年度、CRMP-2の作用機構を明らかにする目的で、CRMP-2に特異的に結合する分子をyeast two-hybrid法、アフィニティークロマトグラフィー法及び免疫沈降法により網羅的に検索したところ、tubulin、actin、synaptojanin、copine、ASIP、kinesin、LARG(RhoGEF)などの極めて興味深い分子がCRMP-2に結合することが判明した。同定した結合蛋白質の中でも、tubulinに関して精力的に解析を行った。その結果、CRMP-2は既知のmicrotubules結合蛋白質とは異なり、α-及びβ-tubulinからなるtubulin heterodimerに結合してheterotrimerを形成し、microtubules重合能を著しく高めることを明らかにした。このような形式でmicrotubulesの重合を促進する分子は知られておらず、細胞生物学的にも極めて興味深い。また、我々が同定したCRMP-2結合蛋白質のASIPは線虫からヒトまで保存されている極性決定分子であるとの報告がある。ASIPがCRMP-2と同様に成長しつつある軸索の遠位側に濃縮して存在することも見出した。これらの結果から、CRMP-2による神経細胞の極性形成機構の一部が解明されたと考えられる。従って、平成13年度の研究計画はほぼ達成されたものと考えられる。
ラッカセイの子実形成と転流に及ぼす植物ホルモンの影響

ラッカセイは開花期間が長くまた結莢率が低く低収量である。これは栄養生長と生殖生長の重複する期間が長く、この間の同化産物の子実への転流・分配が効率よく行われていないためと考えられる。さらに、地上部で開花・受精後、子房柄が伸長し地下で結実する。このため、開花数が多い割には正常な子実になる割合が低い。同化産物の転流・分配を改善するために、植物ホルモンの1つであるアブシジン酸(ABA)が有効である事が各種植物ホルモンの外与試験の結果から明らかになった。さらに、子実への同化産物(糖)の転流・分配、および窒素の吸収(^<15>Nトレーサーを用いて)と転流(遊離アミノ酸)に及ぼすABAの影響を明らかにした。子実形成期から成熟期における主茎、分枝、子房柄、莢の出液中の糖含有量は莢で多く、高いシンク能を持つ。また、糖組成は主茎、分枝、子房柄中ではサッカロースは見られず、転流形態は主にグルコース、フラクトースであった。したがって、莢の内側の紙状組織でサッカロースの合成が行われ、子実に転流するものと推測された。ABA処理による全子実収量の増加は認められなかったが、全子実中に占める大きな子実(0.7g以上)数の割合は増加し、特に開花後期における子実の肥大に効果が見られた。これは、ABA処理により処理後10日目、20日目の成熟途中の子実中により多くの^<15>Nが分配されたためである。また、ABA処理により、主茎基部および開花後期の子房柄からの溢必液中のアスパラギン含有量が増加し、さらに種皮中の全遊離アミノ酸の子葉への転流が促進した。以上のことから低濃度のABAは、子実への糖および窒素の転流に多大に影響を及ぼし、特に開花後期の子実の肥大を促進することが明らかになった。ラッカセイは開花期間が長く、また結莢率が低く低収量である。これは、栄養生長と生殖生長の重複期間が長いため、同化産物の子実への転流・分配が効率よく行われていないためと考えられる。本研究の目的は、子実への同化産物の転流・分配に及ぼす植物ホルモンの影響を明らかにすることである。まず始めに、子実形成期から成熟期における各器官(主茎、分枝、子房柄、莢)への糖の転流割合を調べた。次に、ABAの葉面散布による子実肥大効果を調べた。さらに、ラッカセイ種子は、約30%のタンパク質を含むことから、その肥大及び成熟には種子への効率よい窒素の転流が重要である。そこで、窒素転流に及ぼすアブシジン酸(ABA)の影響を明らかにするため、重窒素(^<15>N)を用い子実への転流割合を調べた。また、ABA葉面散布が、窒素の主な転流形態である遊離アミノ酸にどのような影響を及ぼすかを検討した。莢の内側の紙状組織から採取した溢泌液に含まれる糖は、主にサッカロース、グルコース、フラクトースであり、それらの合計含有量は、他の器官と比べて著しく高かった。また、莢実の発育にともなって増加し、高いシンク能を持つことが明らかになった。ABA処理による最終的な子実収量の増加は認められなかったが、全子実数に占める大きな子実(0.7g以上)数の割合は、無処理区と比較して増加し、特に開花後期の子実の肥大に効果が見られた。

これは、ABA処理により処理後10日目、20日目の成熟途中の子実中により多くの^<15>Nが分配されたためと考えられた。また、ABA処理により、主茎基部及び開花後期の子房柄からの溢泌液中のアスパラギン含有率が増加し、さらに種皮中の全遊離アミノ酸の子葉への転流が促進したためと考えられた。ラッカセイは栄養成長と生殖成長の重複する期間が長い。すなわち、茎葉を成長させながら、子実形成を行う無限伸育型の植物である。さらに、地上部で開花・受精後、子房柄が伸長し地下で結実する。このため、開花数が多い割には、正常な子実になる割合が低い。原因の1つに同化産物の転流の悪さが上げられる。同化産物の転流・分配を改善するために、植物ホルモンの1つであるアブシジン酸(ABA)が有効である事が昨年度の結果から明らかになった。さらに、今年度は栄養条件、地下部の観察を容易にする目的で水耕栽培を行い、子実肥大へのABAの効果を子実一粒ごとにその肥大過程を追跡した。その結果、開花前期の莢実では、莢の長さ、幅ともに肥大前半では無処理区と変わらないものの、肥大後半ではABA葉面処理の1ppm、10ppmで肥大が良好に進んだ。また、開花後期の莢実でもABA処理区で肥大は良好であった。したがって、ABA葉面処理による効果は、開花時期を問わず、子実の肥大前半では莢実の肥大にはあまり効果は見られないものの、肥大後半での肥大促進、また開花時期の遅い子実での肥大促進効果が認められた。ABAには莢実の肥大ステージによって異なり、肥大の後半で処理することでより効果的に作用するものと思われた。これらのことは、子実の肥大過程における内生植物ホルモンの動態から、肥大中期から後期にかけてのABAが増加することからも裏付けられた。本研究の目的は、ラッカセイの子実への同化産物の転流・分配、および窒素の吸収と転流に及ぼす植物ホルモンの影響を明らかにすることである。本年度は水耕栽培による養分吸収実験と今までのまとめを行った。1.糖の転流・・・子実形成期から成熟期における主茎、分枝、子房柄、および莢の各器官への同化産物としての糖の転流割合を調べた。開花中期(8月11日)以降の子房柄から莢への糖の転流は少なくなり子実肥大の割合が減少する要因と思われた。2.アブシジン酸(ABA)処理の影響・・・ABAの葉面散布と子実中の全糖含有量の関係から子実肥大中後期での種子中(特に種皮)のABA含有量の増加がサッカロースの代謝を促進し子実肥大に関与したことが示唆された。3.ABA処理の窒素吸収と転流・・・重窒素(^<15>N)を用い子実への転流割合を調べた。また、ABA葉面散布が、窒素の主な転流形態である遊離アミノ酸にどのような影響を及ぼすかを検討した。全子実数に占める大きな子実(0.7g以上)数の割合は、無処理区と比較して増加し、特に開花後期の子実の肥大に効果が見られた。4.ホルモン処理と発芽・・・IAA+ZRの混合処理が発芽を促進した。5.開花期以降の窒素吸収・・・多窒素処理により子房柄数は増加し、反対に結莢率は減少した。6.まとめ
近代伏見酒造業の発展と都市化に関する総合的研究

本研究は、戦前期の京都府伏見町を対象に、1酒造業史研究の視点からの近代産地形成メカニズムの解明、2都市形成史の視点からの伏見酒造業と伏見町の都市拡大との関連性及び市制移行過程の解明、3それらの研究を進めるための地域産業史のアーカイブズの拠点形成を、目的としている。平成30年度は、実施計画に基づき、1及び2について、前年度に引き続き、京都大学経済資料センターに寄託されている伏見酒造組合史料の整理、目録化作業をすすめ、約300簿冊、5500件の詳細目録を完成した。また、京都府立歴彩館(旧・府立総合資料館)に所蔵する伏見町時代の行政文書・統計類の資料調査や鉄道物流統計の整備、他の酒造産地の資料調査などを行った。研究代表者及び研究分担者の多くが、これらのデータや史料をもとに、関係学会での発表、著書の形での公表を行うことができた。また、3について、廃業事業者を含む京都府内酒造家宛ての史料所在調査と京都府内の産業関係機関宛ての資料所在調査を実施し、酒造家資料の所在が判明するなどの成果をえた。併せて、前年度に引き続き「人文・社会科学資料のアーカイブズに関する研究会」を4回にわたって開催し、学内外から講師を迎えて、地域産業アーカイブズ構築のための意見交換を行った。さらに、2019年2月20日には本科研チームも加わって京都大学で公開セミナー「創業の思いをつたえるー京都の企業記念施設と創業者資料」を開催し、住友史料館、宝ホールディングス歴史記念館等のスタッフとの交流が実現した。上記の「研究実績の概要」で述べたように、伏見町における近代酒造産地形成や都市化過程を明らかにするための基礎資料の収集は、年度途中からの二人の研究分担者が加わったほか、作業をしてくれるアルバイトの増強によって、前年度と比べ格段に進展した。ただし、酒造業家の経営資料や伏見酒造組合史料による組合の事業・組織内容の分析、伏見町の都市拡大過程と都市政治に関わる資料の本格的分析は、物流分野等一部を除き、今後の課題となった。また、産業アーカイブズ構築の調査については、上記のアーカイブズ研究会に外部講師を呼んだり、民間の企業記念施設のスタッフとの意見交換ができる場として公開セミナーを開催することができ、一歩前進した。以上から、「おおむね順調に進展している」と自己評価した。平成31年度は、最終年度になるため、引き続き基礎資料の収集、整理、目録化の作業をすすめ、とくに伏見酒造組合史料目録については、同史料寄託先の京都大学経済資料センターと協力しながら、Web公開を目指す。また、昨年度に続き、京都内外の産業アーカイブズの調査と交流を実施し、経済資料センターにおける地域産業アーカイブズの構築とともに他の大学、自治体、民間企業の産業アーカイブズ等との連携を図る。最後に、近代伏見酒造業の形成と都市形成に関わるシンポジウムを開催したり、研究分担者が研究成果を論文化、学会報告することにより、本研究の総括を行う。本研究は、戦前期の京都府伏見町を対象に、1酒造業史研究の視点からの近代産地形成メカニズムの解明、2都市形成史の視点からの伏見酒造業と伏見町の都市拡大との関連性及び市制移行過程の解明、3それらの研究をすすめるための地域産業史のアーカイブズの拠点形成を、目的としている。平成29年度は、実施計画に基づき、1及び2について、基礎的資料の収集、所在確認作業に力点を置き、併せて京都大学経済資料センターに寄託されている伏見酒造組合資料の整理・目録作成・分析に加え、明治・大正期を中心に日本醸造協会発行の『醸造協会雑誌』と『日本醸造協会雑誌』、大阪財務協会発行の『大阪財務』、『大阪朝日新聞』『東京朝日新聞』『東京日日新聞』に掲載されている伏見酒造業及び伏見町に関する記事を探索し、目録化した。また、3について、研究分担者の水島が、国文学研究資料館主催アーカイブズ・カレッジ(史料管理学研修会)長期コースに参加し、修了論文を提出して研鑽を深めるとともに、全国のアーキビストとの情報交換を行った。さらに、滋賀大学経済学部附属史料館、神戸大学経済経営研究所附属企業資料総合センター、九州大学附属図書館付設記録資料館、和歌山大学・紀州経済史文化史研究所の運営担当者を京都大学に招いて、研究代表者岡田が責任者・水島が事務局となって4回にわたって「人文・社会科学資料のアーカイブに関する研究会」を実施し、アーカイブズ運営についての教訓と課題を共有化した。さらに、年度末には、環境アセスメント学会情報委員会主催「民間が保有する環境アセスメント資料のアーカイブ化に関する調査研究」公開研究会が京都大学で開催され、地域産業アーカイブズについて、岡田と水島が報告を行い、同学会員との意見交換を行った。本研究の目的は、1酒造業史研究の視点からの近代産地形成メカニズムの解明、2都市形成史の視点からの伏見酒造業と伏見町の都市拡大との関連性及び市制移行過程の解明、3それらの研究をすすめるための地域産業史のアーカイブズの拠点形成の3点であり、初年度にあたる平成29年度の実施計画では、1と2についての基礎資料の収集、3のアーカイブズの拠点整備のための前提となるアーカイブズ運営及びコンテンツの基礎を構築するところにあり、先行する産業史関連のアーカイブズの情報収集を図ることを掲げた。上記の研究実績概要でも述べたように、基礎資料の収集・整理や、それらのコンテンツのデータベース化によるアーカイブズの拠点整備の土台づくりについては、比較的順調に進捗したといえる。ただし、酒造業の現存資料調査については、調査先リストの作成に留まり、調査自体はこれからである。

また、大学のアーカイブズの実態調査については、4大学の運営担当者を招聘することで大きな成果を得たが、民間企業・団体のアーカイブズ調査については、宝ホールディングス株式会社歴史記念館を訪問調査しただけである。さらに、本研究の成果の一端は、年度末に環境アセスメント学会情報委員会主催公開研究会で報告したものの、独自のシンポジウムの開催には至らなかった。以上から、「おおむね順調に進展している」と自己評価した。本研究は、戦前期の京都府伏見町を対象に、1酒造業史研究の視点からの近代産地形成メカニズムの解明、2都市形成史の視点からの伏見酒造業と伏見町の都市拡大との関連性及び市制移行過程の解明、3それらの研究を進めるための地域産業史のアーカイブズの拠点形成を、目的としている。平成30年度は、実施計画に基づき、1及び2について、前年度に引き続き、京都大学経済資料センターに寄託されている伏見酒造組合史料の整理、目録化作業をすすめ、約300簿冊、5500件の詳細目録を完成した。また、京都府立歴彩館(旧・府立総合資料館)に所蔵する伏見町時代の行政文書・統計類の資料調査や鉄道物流統計の整備、他の酒造産地の資料調査などを行った。研究代表者及び研究分担者の多くが、これらのデータや史料をもとに、関係学会での発表、著書の形での公表を行うことができた。また、3について、廃業事業者を含む京都府内酒造家宛ての史料所在調査と京都府内の産業関係機関宛ての資料所在調査を実施し、酒造家資料の所在が判明するなどの成果をえた。併せて、前年度に引き続き「人文・社会科学資料のアーカイブズに関する研究会」を4回にわたって開催し、学内外から講師を迎えて、地域産業アーカイブズ構築のための意見交換を行った。さらに、2019年2月20日には本科研チームも加わって京都大学で公開セミナー「創業の思いをつたえるー京都の企業記念施設と創業者資料」を開催し、住友史料館、宝ホールディングス歴史記念館等のスタッフとの交流が実現した。上記の「研究実績の概要」で述べたように、伏見町における近代酒造産地形成や都市化過程を明らかにするための基礎資料の収集は、年度途中からの二人の研究分担者が加わったほか、作業をしてくれるアルバイトの増強によって、前年度と比べ格段に進展した。ただし、酒造業家の経営資料や伏見酒造組合史料による組合の事業・組織内容の分析、伏見町の都市拡大過程と都市政治に関わる資料の本格的分析は、物流分野等一部を除き、今後の課題となった。また、産業アーカイブズ構築の調査については、上記のアーカイブズ研究会に外部講師を呼んだり、民間の企業記念施設のスタッフとの意見交換ができる場として公開セミナーを開催することができ、一歩前進した。平成30年度は、前年度に引き続き、伏見町における近代酒造業の発展と都市形成に関わる資料調査を継続するとともに、可能なところから、その成果をデータベース化し、分析を行うようにする。そのために、大学院生や学生を研究補助者として活用するとともに、資料に基づく研究の方法を指導する。また、既に発送リストができている京都府内の酒造業者(廃業者を含む)に対して史料の保存状況と公開の意志についてのアンケート調査を実施し、必要に応じて訪問調査を行って、史料の掘り起しを行う。
老人の虐体に関与する要因の検対一生に介護負担感を中心として-

研究1では、児童虐待と老人虐待の認知の違いを明らかにすることを目的として、女子短大生82名を対象に調査を行った。その結果、児童虐待に比べて老人虐待の認知度は著しく低く、身体的虐待については双方ともに虐待と認識しているが、心理的虐待に関しては老人では児童に比べて虐待と認知する者は1020%低い値にとどまった。また、老人に対する経済的な搾取や意見表明権の剥奪は虐待とは認識されにくかった。虐待理由は、児童虐待の場合は両親の生い立ちや性格に原因が求められやすいのに比べて、老人虐待の場合はストレスや支えの不足、老人自身の問題に原意が求められがちであった。虐待対策は、児童虐待の場合は親への心理的な援助が中心であるのに対して、老人虐待の場合はより社会的な援助を必要とすると認識しているなどの結果が得られた。ほかに、世代間の差異などを検討するために、成人男女300名に対しても調査が実施されており、現在、その結果を集計中である。研究2では、老人専門の施設職員を対象として、老人虐待の促進要因について介護負担感を中心として検討することを目的とした。そこで、ザリットによる家庭介護者を対象とした介護負担感のスケールを、施設の介護職員向けに項目を修正した。その結果、施設の介護職員が負担ありと認識する老人と接することによって生じる介護負担感には、「多忙感や余裕のなさ」の因子と、「心理的な不安定感」の2つの因子があることが分かった。それらの項目と実際の虐待行動には至らないものの、虐待したいと感じてしまう心理、身体、介護放棄などの「虐待感情」項目との相関をみたところ、「多忙感や余裕のなさ」との関連は老人への不快感や心理的虐待感情と0.30.4程度の関連が認められた。また、「心理的な不安定感」との関連は、身体的虐待感情、介護放棄を含めてすべての「虐待感情」項目と0.550.63の相関が認められた。このことから、「心理的な不安定感」を感じるかどうかが、虐待感情を引き起こす要因となっていることが見いだされた。
サルコイド-シスおよび過敏性肺炎の発症機作に関する分子生物学的研究

サルコイド-シスと過敏性肺炎の発症メカニズムの解明を目的として本研究を実施した。サルコイド-シスと過敏性肺炎は肺内病巣部にT細胞の集積をきたす疾患であり、これらのT細胞の活性化が疾患の病勢に強く関与している。過敏性肺炎については原因抗原が明らかとされ、吸入抗原による経気道的感作が発症に結びつくものと考えられるが、サルコイド-シスについてはその原因がまったく不明である。近年気管支肺胞洗滌(BAL)が広くびまん性間質性肺疾患の病態解明のために応用されている。BALは、末梢気道、肺胞の病変部から細胞成分や液性成分を採取して検査する方法であるが、それによって得られる細胞成分は開胸肺生検で得られる組織病変と密接に相関することが知られている。すなわち、BALによって得られる細胞成分を分析することによって肺内の細胞現象を推測することが可能である。ところでT細胞の分化増殖過程にはその細胞表面上へのインタ-ロイオン2(ILー2)受容体の発現とILー2の産生が必須である。またTリンパ球のクロ-ン特異性はT細胞抗原受容体によって決定される。そこで我々は、サ症、HP患者のBALによって得られたリンパ球と末梢血のリンパ球よりRNAを抽出しILー2およびILー2RのmRNAをこれらのリンパ球が発現しているが否かをノ-ザンブロット解析にて検討し、同時にこれらのリンパ球のILー2産生能、ILー2R表面マ-カ-、BAL液、血清中可溶型ILー2Rも測定検討した。さらに、リンパ球よりDNAを抽出し、T細胞抗原受容体β鎖のプロ-ブを用い、抗原変容体特異性もあわせて検討した。その結果、サルコイド-シス、過敏性肺炎の慢満リンパ球は細胞レベルでも、遺伝子レベルでも活性化されていることが判明した。Tリンパ球の抗原特異性については、現得も研究が進行中である。サルコイドーシス(サ症)、過敏性肺炎(HP)の両間質性肺疾患々者より、気管支肺胞洗滌法によって肺胞マクロファージとリンパ球を採取、それぞれの活性化因子として、TNF(腫瘍壊死因子)、IL-2(インターロイキン2)、IL-2R(IL-2受容体)に着目して研究をすすめた。(1)肺胞マクロファージのTNF産生能に関する研究。ヒト材料について実験するに先立ち単球由来細胞株であるTHP-1とU-937を用いて、そのTNF産生能をLM細胞を用いたバイオアッセーにて、TNFのmRNA発現をTNF-cDNAプローブを用いたノーザン解析にて検討した。LPS+PMA刺激により、THP-1、U-937の両細胞株は培養上清中に1050U/mlのTNFを産生した。ノーザン解析でもLPS/PMA刺激により4時間後にはTNFmRNAの発現が観察された。以上の実験結果を踏まえて、健常非喫煙者とサ症患者より得られた肺胞マクロファージを用いて、無刺激およびLPS刺激下でのTNF産生能を検討した。健常者の肺胞マクロファージは無刺激ではTNFを産生せず、LPS刺激下でも12U/mlのTNF産生能を示すのみであった。一方、サ症患者の肺胞マクロファージは無刺激でもすでにTNFを産生しており、LPS刺激によってさらに産生能の亢進が認められた。(2)、肺内リンパ球のIL-2、IL-2R発現に関する研究。T細胞の分化増殖過程にはIL-2Rの発現とIL-2の産生が必須である。

そこでサ症、HP患者の肺と末梢血のリンパ球よりRNAを抽出し、IL-2およびIL-2RのmRNAをこれらリンパ球が発現しているか否かをノーザン解析にて検討することとした。はじめにヒト末梢血よりFicoll-Hypaque比重遠沈法およびナイロンウールカラムを用いてT細胞分画を得、PHA刺激下にIL-2、IL-2RのmRNA発現の動態を検討した。IL-2mRNAは刺激後すみやかに発現し6時間後に最大に達したがIL-2Rの発現はそれより遅れ、刺激後12時間後に最大に達した。肺サルコイド-シス(肺サ症)、過敏性肺臓炎(HP)の両間質性肺疾患患者より、気管支肺胞洗滌法によって肺胞マクロファ-ジとリンパ球を採取し、それぞれの細胞の活性化因子として、TNF(腫瘍壊死因子)、ILー2(インタ-ロイキン2)、ILー2R(インタ-ロイキン2受容体)に着目して研究をすすめた。(1)ヒトリンパ球系細胞株であるMOLT3、MOLT4を用い、ILー2、ILー2Rのノ-ザンブロット解析を行ない基礎的検討を加えた。またヒト末梢血T組胞を用いてこれらmRNAのKineticsを検討した。(2)肺サ症患者の肺胞マクロファ-ジを用い、TNFーαの産生能を測定したところ、健常非喫煙コントロ-ル群と比較してTNFーαの産生の有意の増加を認めた。TNFーαのcDNAプロ-ブを用いたノ-ザン解析が進行中である。以上の結果より肺サ症が肺胞マクロファ-ジの活性化に伴うTNFーαの産生とそれにひきつづくリンパ球ILー2Rの発現によって病勢の進行と拡大の惹起されることが示唆された。(3)一方HP患者において末梢血中と気管支肺胞洗滌液中のILー2およびsoluble IL-2Rのレベルを測定したところ、これらの値は健常非喫煙者群と比較して有意に高値を示した。われわれはすでにHPの代表的疾患例である農天肺(Farmer's lung)において、その患者の気管支肺胞洗滌によって得られたTリンパ球の膜表面上へのHLAーDR抗原とILー2Rの表出が健常人や他の疾患コントロ-ルよりも多いことを報告している。過敏性肺臓炎が外来性吸入性抗原チャレンジによる肺間質のTリンパ球の活性化によって発症するモデル的疾患であることが強く示唆された。サルコイド-シス(サ症)、過敏性肺炎(HP)の両間質性肺症患患者より、気管支肺胞洗滌法によって肺胞マクロファ-ジとリンパ球を採取し、それぞれの活性化因子として、TNF(腫瘍壊死因子)、ILー2(インタ-ロイキン2)、ILー2R(ILー2受容体)に着目して研究をすすめた。(1)肺胞マクロファ-ジのTNF産生能に関する研究:サ症患者とHP患者の気管支肺胞洗滌液を濃縮し、TNFーα,ILー1βを測定したところ、何例かの患者でそれらが高値を示した。肺肉芽腫産生にこれら両物質の関与が推定されたので、モルモットの肺に直接ILー1,TNFーαを経気道的に注入して病理組織像などを観測した。ILー1,TNFーα注入群では、肉芽腫形成を伴う間質性肺炎像が得られた。これらの病理的変化は抗ILー1,抗TNFーαの静注+腹腔内注射によって抑制を受け、肉芽腫形成に対して、ILー1とTNFーαが何らかの形で関与していることが示唆された。サ症とHP患者の肺胞マクロファ-ジよりRNAを抽出し、TNFーαcDNAプロ-ブを用いたノ-ザン解析を現在実施中である。(2)肺内リンパ球のILー
エネルギー供給に関する萌芽技術のコスト構造分析

本研究では、エネルギーに関する萌芽技術の抽出や、コスト構造の調査を行った。計量書誌分析を用いて、研究開発動向の可視化および萌芽的研究領域の抽出した。研究動向を比較評価することで、国内の研究は工学分野に偏っており、自然科学・人文社会科学における国際的な研究成果が少ないことが分かった。また、原子力安全技術、CCS、水素・蓄電池等の導入により、軽水炉、火力発電、再生可能エネルギーのコストが概ね2-3倍程度になることが分かった。加えて、島嶼地域における事例研究を通じ、社会導入における課題を検討した。今後は、エネルギーシステムの設計に基づいたコスト・価値評価、研究開発戦略の立案が必要である。情報工学手法を用いて、大量の論文・特許情報を分析することで、エネルギー供給に関する萌芽技術を抽出した。具体的には、太陽電池、燃料電池、二次電池、二酸化炭素貯留技術をを対象として分析を実施した。論文情報を用いた引用ネットワーク分析により、分析対象とする個々の研究領域における研究開発動向の可視化および萌芽的研究領域の抽出を行った。分析には萌芽技術の抽出に有効であることが分かっている直接引用を用いたモジュラリティ最大化アルゴリズムを用い、萌芽的研究領域の抽出を行った後に、抽出した萌芽技術の産業への展開可能性を、論文と特許の「距離」を測定することで分析した。「距離」の測定は、引用ネットワーク分析を用いたトポロジカルな距離と自然言語処理を用いたセマンティックな距離を組み合わせる方法を用いて行った。これにより、産業応用可能性の評価や産学連携により推進すべきテーマの抽出を行い、学術文献や特許の精査、大学や企業の専門家に対するインタビュー調査を通じ、抽出した萌芽技術の動向等を確認した。本年度は、論文情報を用いた引用ネットワーク分析により、太陽電池、燃料電池、二次電池、バイオマスのエネルギー利用に関する分析を実施した。これにより、グローバルな研究開発動向の把握、萌芽的研究領域の抽出を行った。従来行われてきた萌芽的研究領域の抽出手法である引用ネットワークのクラスタリングにより抽出した論文クラスタの平均出版年に着目する方法に加え、そのクラスタの中心であるハブ論文の出版年と当該クラスタの平均出版年の差分に注目することで、萌芽的研究領域を、クラスタ全体が萌芽的である革新的研究領域と、クラスタ全体は成熟領域であるものの、そこから近年新たなブレークスルー技術が産まれつつある脱成熟領域とを区分する手法を用いて分析を行った。その結果、革新的研究領域として、エナジーハーベスティングのための歪み利用ピエゾ素子などの技術を抽出した。また、産業応用可能性の評価や産学連携により推進すべきテーマの抽出を行うために、技術成熟度評価等の既存の技術評価指標、技術選択モデルの調査を行った。これにより、引用ネットワーク分析により得られた定量的な分析結果を、定性的な情報を加味して解釈し、活用していくための情報の整理を行った。また、燃料電池および水素エネルギー技術に関して、水素製造、貯蔵、利用技術に関するコストデータの収集を行った。また、選定した萌芽技術のコスト構造の評価を行うとともに、コストデータのデータベース化を行うために、製造機器、構成部材、必要な原材料と動力、工場建設費用と必要な人員数などの項目毎にコストデータを格納するための検討を行った。年度計画に即し研究を実施し、当初の成果が得られた。27年度までに分析を行ってきた太陽電池、燃料電池、二次電池、バイオマスのエネルギー利用に関する分析を継続して実施した。これらの分野における萌芽技術抽出、ライフサイクル評価、コスト構造分析に関するデータや情報を収集した。具体的には、論文情報を用いた引用ネットワーク分析により、分析対象とする個々の研究領域における研究開発動向の可視化を行い、萌芽的研究領域を抽出した。また、選定した萌芽技術のコスト構造の評価を行うために、コストデータのデータベース化を行った。製造機器、構成部材、必要な原材料と動力、工場建設費用と必要な人員数などを項目毎に細分化し、それぞれのコストデータを収集し、コスト構造を調査した。また、電解による水素製造や水素エネルギー社会の将来展望と技術的対応策、エクセルギー解析による物質・エネルギーの合理的利用の方向性や材料研究のあり方と計算科学の役割、再生可能エネルギー大量導入時代におけるエネルギーマネジメントについて検討を行った。抽出した萌芽技術等の研究を推進し社会導入を促進するための課題について検討し、エネルギー技術および次世代エネルギー社会の将来展望を描いた上で、エネルギー技術ロードマップとして整理した。また、次世代エネルギーシステムに移行する過程で必要となる要素を知識の構造化と行動の構造化という観点から俯瞰的に整理した。本研究では、これまで、情報工学手法を用いたエネルギーに関する萌芽技術の抽出や、コスト構造の調査を行ってきた。具体的には、論文情報を用いた引用ネットワーク分析により、分析対象とする個々の研究領域における研究開発動向の可視化を行い、萌芽的研究領域の抽出を行った。また、選定した萌芽技術のコスト構造の調査を行ってきた。加えて、抽出した萌芽技術の研究を推進し社会導入を促進するための課題について検討してきた。本年度は、太陽電池、燃料電池、蓄電池、原子力、バイオマスや熱マネジメントに関する現状や課題を体系的に整理するとともに、エネルギーシステムの有する多面的な社会的価値やエネルギーシステムの観点から、目指すべきエネルギー社会像を描画し、実現するための方策に関する検討を行った。

また、種子島における事例研究に基づき、地域に新たなエネルギーシステムを導入する際のポテンシャルや可能性の定量的分析手法を情報システム化するための設計を行った。エネルギー技術に関しては、これまで、個々の要素技術のロードマップ化がなされてきた。また、それら要素技術の集積としてエネルギーミックス等のエネルギーシステム像が提示されてきた。本研究では、そのような要素技術の積み上げによる実現可能性の検討、サプライチェーンを含むエネルギーシステムの設計に加え、目指すべきエネルギー社会像に対する検討や合意形成の両面のアプローチにより、新たなエネルギー社会システムへの移行を志向すべきであるということを提案するとともに、事例研究に基づきその有用性を評価した。本研究では、エネルギーに関する萌芽技術の抽出や、コスト構造の調査を行った。計量書誌分析を用いて、研究開発動向の可視化および萌芽的研究領域の抽出した。研究動向を比較評価することで、国内の研究は工学分野に偏っており、自然科学・人文社会科学における国際的な研究成果が少ないことが分かった。また、原子力安全技術、CCS、水素・蓄電池等の導入により、軽水炉、火力発電、再生可能エネルギーのコストが概ね2-3倍程度になることが分かった。加えて、島嶼地域における事例研究を通じ、社会導入における課題を検討した。今後は、エネルギーシステムの設計に基づいたコスト・価値評価、研究開発戦略の立案が必要である。交付申請書に記載した研究目的である萌芽技術の抽出に関しては順調に実施できた。しかし、次年度以降に実施予定していた項目を前倒しで実施できたわけではないので、本区分の評価とした。太陽電池、燃料電池、二次電池、バイオマスのエネルギー利用に関する分析を継続して実施する。また、それぞれのコストデータを収集しコスト構造分析を実施することで、革新的触媒材料やセル構造等の萌芽技術がコストに与える影響やコスト削減の余地を明らかにする。最終年度では、要素技術の分析や個々の技術のロードマップ化および、それら要素の集積としての次世代エネルギー社会像の提示に留まるのではなく、エネルギーシステムの有する多面的な社会的価値や、エネルギーシステムの観点からの新たな萌芽的技術の提案等に繋げていく。29年度が最終年度であるため、記入しない。技術経営、科学技術政策萌芽的研究領域のコスト構造の評価を行う。のためにまず、ライフサイクルの分析を行う。例えば、太陽電池であれば、シリコン鉱石の精錬から、インゴットの製造、太陽電池セルの製造、モジュールならびにシステムの製造プロセス、運転、廃棄、リサイクルの過程をモデル化する。その上で、製造機器、構成部材、必要な原材料と動力、工場建設費用と必要な人員数などを項目毎に細分化し、それぞれのコストデータを収集する。構築・収集したモデルとデータをもとに、コスト構造の分析を行い、革新的触媒材料やセル構造等の萌芽技術がコストに与える影響やコスト削減の余地を明らかにする。適切な研究補助者が見当たらず雇用が遅れたため。
胆道癌微小転移に対する間葉系幹細胞を用いた癌標的治療の開発

ヒトMSCよりMuse細胞の分離抽出を行い、多分化能を確認できた。Muse細胞は、MSCが持つ多分化能と血管新生作用を特に強く持つ分画であると考えられるため、この移植により胆管癌の血管新生が促進され、抗癌剤の感受性が向上するものと期待される。同時に、腫瘍の血流増加は易転移性にもつながる可能性があるので、Muse細胞による抗腫瘍治療法の確立にはさらなる検証が必要であるとも考えられた。胆道癌の治療の第一は外科切除であり、術式および周術期の管理の向上とともに治療成績は向上しているが、いまだ予後不良の癌の一つである。その理由は、抗癌剤の効果が不十分であり、画像診断では捉えられない微小転移の制御が困難でることが一因である。進行胆道癌に対する抗癌剤はGemcitabine + CDDPが標準治療となり(ABC-02試験)、積極的に抗癌剤が使用され、長期生存例から希と考えられていた遠隔転移を認めている。われわれも骨転移をまとめた検討を報告した。そのため微小転移の制御が必須と考え、われわれは抗体を軸とした免疫療法を研究しているが、今のところ臨床応用は進んでいない。そこで、予後向上のために微小転移の根絶が必須と考え、われわれは間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell,以下MSC)の一つである多能性幹細胞(Multiliniage-differentiating stressenduring cells(Muse細胞))のターゲッティング性を生かした癌標的治療を開発する発想となった。本年度は、間葉系幹細胞の分離し、MSCの確認を表面マーカーにて培養できることを確認した。実験方法1.9-12週齢相当のBALB/cマウスの大腿骨/脛骨より骨髄細胞を採取回収し、培養。血球成分を除去し、MSCsを増殖させる。結果:培養したMSCをフローサイトメトリー測定し、培養された細胞が、MSCであることを確認した。本年度は、間葉系幹細胞の分離し、昨年、フローサイトメトリーにて、Positive marker (CD29, 44, 73, 105, 106, Sca-1)およびNegative marker (CD11b, CD45以下の表面マーカーを用いて、培養された細胞が、MSCであることを確認した。本年度は、多分化能を有するかどうかを、はじめに骨細胞分化と脂肪細胞分化の二つで確認した。結果;免疫染色により、採取培養したMSCは骨細胞分化能と脂肪細胞分化能を有し、多分化能を有することを確した。本研究は胆道癌の予後を改善するため、微小転移の根絶を目指した多能性幹細胞(Multiliniage-differentiating stressenduring cells(Muse細胞))のターゲッティング性を活かした癌標的治療の開発を目指したものである。最終年度に当たる今年度は、ヒト間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell: MSC)よりMuse細胞の分離抽出が可能であるかを検証した。Muse細胞はMSCの中のヒトES細胞のマーカーであるSSEA-3+で陽性を示す細胞であるが、SSEA-3+で標識された細胞をFACSで分離抽出したところ、総細胞数のごく数%のMuse細胞が獲得された。また、微小転移の制御のためには、抗癌剤を病巣に効果的に作用させる工夫が必要と考えられるが、MSCには血管新生誘導作用があるため、この移植で局所的に病巣の血流を向上させることにより、抗癌剤の病巣への効果的な流入が期待できる。その一つのモデルとして、マウスMSCとヒト臍帯静脈血管内皮細胞を温度感応性培養皿で共培養することで、培養皿上に血管の構築が可能であるか検証した。結果、MSCと血管内皮細胞はクラスター化し、その組織学的検討でヒトCD31陽性細胞による管腔形成像が認められた。そしてこれをマウスの腹腔内に移植したところ、移植後14において血流を伴う血管形成が認められた。現在までの達成度は、MSCによる新たな知見が得られ、概ね順調に遂行できたと考えている。今後の検証として、胆管癌動物モデルの確立と、それに対するMuse細胞の移植法の確立、抗癌剤の治療効果の評価とその系の確立が求められる。

同時に、腫瘍の血流増加は易転移性にもつながる可能性があるので、Muse細胞による抗腫瘍治療法の確立にはさらなる検証が必要であるとも考えられた。医歯薬学研究計画よりやや遅れているものの、予定通りの研究は進められているので、細胞集を調整しながら継続する。間葉系幹細胞の分離・樹立に時間を要し、間葉系幹細胞の確認に遅れが生じたため。間葉系幹細胞の多様性の確認を進めて、予定の研究を進める。
細胞外スルファターゼによる細胞貪食抵抗性ヘパラン硫酸糖鎖の分解と制御

アルツハイマー病発症の物質基盤であるアミロイドβペプチド(Aβ)は細胞外において重合沈着し、アミロイド斑と呼ばれる不溶性の蓄積物を脳内で形成する。本研究は、細胞外スルファターゼSulf-2の作用によりAβに結合するヘパラン硫酸糖鎖を分解しそれに付随するアミロイド斑除去の促進を個体レベルで解析する事を目的とし遂行された。我々はアルツハイマー病モデルマウス脳凍結切片を用いた実験から、活性型Sulf-2発現によるアミロイド斑Aβ貪食作用の促進を明らかにした。本研究は順調に進展し予定通り遂行された。アルツハイマー病脳やアルツハイマー病モデルマウス脳では、発症の物質的基盤となるアミロイドβペプチド(Aβ)の細胞外における重合沈着が観察され、アミロイド斑を形成する。脳内のミクログリア細胞はその貪食作用によりアミロイド斑を除去する作用を示す。しかし、アルツハイマー病脳では細胞外分子ヘパラン硫酸糖鎖が重合Aβと複合体を形成し、ミクログリア貪食によるアミロイド斑除去を阻害していると考えられる。申請者らは脳内アミロイド斑に蓄積するヘパラン硫酸糖鎖を報告しその糖鎖がリコンビナントの細胞外スルファターゼSulf-2により分解され得ることを報告した。本研究は、ミクログリア細胞特異的にSulf-2を発現するトランスジェニックマウスを作製し、アルツハイマー病モデルマウス脳においてAβに結合するヘパラン硫酸糖鎖を分解し、ミクログリア細胞貪食によるAβ除去を促進させることを目的とする。活性型Sulf-2または不活性型Sulf-2と緑色蛍光タンパク質GFPを同時にミクログリアで発現させるレンチウィルス発現システムを用いて、これらのSulf-2を恒常的に発現するマウスBV2ミクログリア細胞株を作製した。当該細胞およびアルツハイマー病モデルマウス脳凍結切片を用いた実験から、活性型Sulf-2発現がex vivoでアミロイド斑Aβ貪食作用を促進することが明らかとなった。現在、ミクログリアでSulf-2を発現するアルツハイマー病モデルtriple Tgマウスを作製している。In vivoにおけるSulf-2のAβ貪食作用への影響が明らかになると期待される。アルツハイマー病脳内では、その発症の物質的基盤となるアミロイドβタンパク(Aβ)の重合および細胞外における沈着が観察される。これらはアミロイド斑と呼ばれる。脳内のミクログリア細胞はその貪食作用によりアミロイド斑を除去する。アルツハイマー病の進行にともないこれらの貪食除去が減弱することが確認されている。しかしその理由は明らかになっていない。重合Aβと複合体を形成する細胞外分子ヘパラン硫酸糖鎖がその貪食を阻害すると考えられている。申請者らは脳内アミロイド斑に蓄積するヘパラン硫酸糖鎖を報告した(Hosono-Fukao et al AJP 2012)。本研究は、申請者が以前明らかにした細胞外スルファターゼSulf-2によりAβに結合するヘパラン硫酸糖鎖を分解し、ミクログリア細胞によるAβ貪食作用を促進させることを目的とする。活性型Sulf-2および不活性型Sulf-2をミクログリアで発現させるレンチウィルス発現システムを本年度構築した。Sulf-2の発現と同時に緑色蛍光タンパク質GFPを発現させるベクターを構築することにより、発現細胞を蛍光で標識することを可能にした。これらレンチウィルスをマウスミクログリア細胞株N9に感染させ培養した。フローサイトメーターを使用し、GFPを発現するN9細胞のみを分取し、培養することができた。蛍光標識イムノグロブリン分子を用いN9細胞の貪食能を測定した結果、活性型もしくは非活性型Sulf-2を発現させることで細胞自体の貪食能には影響を及ぼさないことが確認された。現在、蛍光標識合成Aβとヘパラン硫酸糖鎖との複合体に対する貪食作用を測定している。また、脳内アミロイド斑を呈するアルツハイマー病モデルマウス脳の凍結切片を作製し、Sulf-2発現N9細胞のex vivoにおける貪食作用の測定方法構築を行っている。アルツハイマー病発症の物質基盤であるアミロイドβペプチド(Aβ)は細胞外において重合沈着し、アミロイド斑と呼ばれる不溶性の蓄積物を形成する。アルツハイマー病脳では細胞外ヘパラン硫酸糖鎖が重合Aβと複合体を形成し、ミクログリア細胞貪食によるアミロイド斑除去を阻害していると考えられている。申請者らは以前、アルツハイマー病モデルマウスを用いて、脳内アミロイド斑に蓄積するヘパラン硫酸糖鎖が細胞外スルファターゼSulf-2により分解されることを報告した(Hosono-Fukao, AmJPathol 2012)。

本研究は、Aβに結合するヘパラン硫酸糖鎖がin vivoでSulf-2により分解され得るか、それに付随するアミロイド斑除去が促進されるかを明らかにする事を目的とする。我々はアルツハイマー病モデルマウス脳凍結切片を用いた実験から、活性型Sulf-2発現によるアミロイド斑Aβ貪食作用の促進を明らかにした。活性型Sulf-2遺伝子の上流にloxP配列で挟まれたSTOP配列カセットをトランスジーンに含むトランスジェニックマウス系統の作製に成功した。Creマウスとの交配の結果、コンディショナルに脳内のある種細胞でSulf-2を発現するダブルトランスジェニック系統を得ることに成功した。また、当該マウスとアルツハイマーモデルAPP-Tgとの交配によりトリプルトランスジェニックマウスを作製した。交配を継続し加齢育成を行っている。アルツハイマー病脳病変の解析、アミロイド斑の蓄積量測定、Aβ量の測定などを行い評価継続している。本研究は順調に進展し予定通り遂行された。教室HPアドレス医化学一般昨年度の達成度は当初の予定よりやや遅れていたが、今年度は力価の高いレンチウィルスの作製が順調に行きSulf-2発現ミクログリア細胞株が安定して得られるシステムを構築出来たので予定通り進捗した。これらの細胞を使用したex vivoでの貪食能測定方法も確立できた。ミクログリアで細胞特異的にSulf-2を発現するトランスジェニックマウスの作製を行った結果、3,4種のマウス系統を得ることができた。このうちの1系統に関してはLyzs-Creマウスとの交配の結果、コンディショナルにSulf-2を発現するダブルトランスジェニック系統を得ることに成功した。現在、当該マウスとアルツハイマーモデルAPP-Tgとの交配によりトリプルトランスジェニックマウスを作製している。In vivo実験の達成度は順調である。今後の研究が予定通り進捗すると期待される。現在までの達成度は当初の予定よりやや遅れている。その理由としては、力価の高いレンチウィルスの作製が予定より難航したことが挙げられる。しかし、最終的には力価の高いウィルスを得ることができた。また、発現細胞が安定して得られるシステムを構築出来たことは今後の研究が予定通り進捗すると期待される。これらin vitroの実験と並行してミクログリアで細胞特異的にSulf-2を発現するトランスジェニックマウスの作製を行っている。こちらの達成度は順調である。昨年度及び今年度に得られた結果を基にして、exvivo実験を引き続き行う。BV2細胞株の他、MG5マウスミクログリア細胞株およびSulf-2コンディショナルトランスジェニックマウスLyzs-Cre/CAG-flox-STOP-flox-Sulf2-Tgより調製する初代ミクログリア細胞に対しても同様にex vivoの実験を行う。In vivo分子病態解析に必要なtriple Tgマウスの交配を引き続き行い必要な匹数を確保する。アルツハイマー病理変化を観察するには加齢育成が必要なので実施する。沈着Aβと共局在し蓄積するヘパラン硫酸多硫酸化ドメインの検出がtriple Tgマウス