hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
C型慢性肝炎, 肝癌マウスモデルの構築とC型肝炎ウイルス特異的T細胞の効果的誘導

本研究ではまずC型肝炎ウイルス(HCV)の構造蛋白のcDNAをマウス肝内あるいは筋肉内にelectroporation法を用いて導入発現しそれぞれに対する免疫応答を検討した。肝細胞内では16週後にもHCV構造蛋白の発現が認められ、特異的抗体や細胞障害性T細胞(CTL)活性が認められたが明らかな肝炎像は認められなかった。筋肉内接種ではin vitroでstableなHCVcore蛋白の発現が報告されているelongation facter 1 a geneのpromoterを用いて免疫した場合には単回免疫で充分な特異的CTLが誘導されたが、CMVのpromoterを用いたベクターでは特異的CTLは誘導されなかった。従ってHCVに対する充分な免疫応答を誘導するためには長期間安定した抗原発現が必要と考えられた。そこで筋肉内接種した後に肝内にHCV遺伝子を導入したところ炎症細胞浸潤を伴う肝細胞障害が認められた。さらに、HCVに対する特異的細胞性免疫応答を効果的に誘導するためにcore蛋白に対する抗原cpitopeを用いて特異的CTLの誘導をおこなった。その結果core蛋白のCTL-epitope単独の免疫では特異的CTLは誘導されないが、HCVのhelperT細胞に対する抗原であるhelper-epitopeを結合したキメラペプチドで免疫することで特異的CTLを誘導できた。またheper-epitopeで前もって免疫した後、HCVのcore領域のrecombinait vacciniavirusを投与したところ速やかに高いCTL活性が得られた。これらのことはHCVのhelper-epitopeによって活性化されたhelperT細胞がCTLの誘導に重要であるとともに、helper-epitopeによる免疫がHCVの感染に対する素早い免疫応答を誘導できることを示唆するものである。現在われわれは、co-stimulatory molecule等を用いたより効果的なCTLの誘導や、HCV抗原epitopeを組み込んだBCG接種によるHCV特異的CTLの誘導にも成功しており、今後CTL誘導型ワクチンの有用性を検討することが重要な研究課題であると考えられた。(1)HCV遺伝子導入マウスの作製:平成8年度の研究業績報告書でin Vivoelectroporation法を用いてマウス肝に直接HCVのcDNAを導入することに成功したことをすでに我々は報告している。平成9年度においてはまず、導入したcDNAによるHCV蛋白の発現を経時的に検討した。vectorはhuman polypeptide chainelongation factor-1αを用いたpEF321にHCVの構造蛋白であるcore,E1およびE2のcDNAを組み込んだplasmidを用いた。in Vivoelectroporationによる遺伝子導入後最長16週まで肝でのHCV蛋白発現を免疫組織染色とWestern blotting法で確認した。そして肝で発現したHCV蛋白に対する免疫応答を検討するため、遺伝子導入したマウス脾細胞を用いてCTLassayをおこない、HCV蛋白特異的なCTLが誘導されていることを確認した。しかしながら、遺伝子導入後16週までの肝組織での検討では明らかな肝炎像は認められなかった。(2)HCVに対するワクチンの基礎的検討:In vivoelectroporation法による細胞内への遺伝子等の導入は非常に簡便で効率的であり、我々はこれを用いて、マウス筋肉内に上述のplasmid、あるいはHCVのCTLエピトープペプチドを導入した。そして脾細胞をもちいてCTLassayをおこない、plasmid,CTLエピトープともに特異的CTLが誘導されることを確認した。また、組替え結核菌ワクチンの可能性を検討しており、現在結核菌へのHCV遺伝子導入と蛋白発現に成功している。

このような知見をもとに、現在HCV遺伝子導入マウスやrecombinantvirusによる感染モデルを用いてCTL誘導型ワクチンによるHCV蛋白発現細胞の排除や感染予防の有用性を検討している。またトランスジェニックマウスへの骨髄移植による慢性肝炎モデルの作製を準備中である。
記憶の超長期永続性の検討

9個の白・黒の正方形(□,■)で作られた無意味な図柄の,■の数を数えるという偶発学習を披験者に行わせ,その2,3カ月後,間接再認課題を行うと,以前に呈示された図柄と呈示されなかった図柄を,被験者が無自覚的に弁別するという,驚くべき事実が昨年度までに確認された.本年度,この現象の再現性の検討に加え,パターン情報に色情報を組み合わせた刺激を作成し,より複雑な視覚情報を人間が長期に保持するか否かを実験的に検討した.非常に複雑な色パターン刺激を,実験条件に合わせて個人ごとに出力するためのプログラム開発に困難をきたしたが,購入したカラーレーザープリンターを用いて実験材料を作成し,約600人の被験者を対象に実験を実施した.実験1では,赤と青を色として,色の一致・不一致,および学習時に呈示されたか否かにより条件を統制した.インターバルは2カ月であった.実験の結果,学習時に呈示されたパターンで,なおかつ色も同じであった刺激に対する虚再認率が,学習時に呈示されなかったパターンのそれよりも有意に高くなることが明らかとなった.さらに,色が一致しない条件の虚再認率が,無学習と一致条件の間に落ちることが示された.実験2では,黄色と青を用いて同様の実験を実施した結果,今回はヒット率について実験1と同様の現象が観察された.長期的な効果が得られた指標が実験1と違う点は非常に興味深い.実験3では,赤,青,緑,黒を用い,先行学習の効果に与える色の効果を検討した.この実験では,色の効果は認められたが,長期的な学習効果に影響を与える色の効果は検出されなかった.一連の実験で,人間が無意味なパターン情報を少なくとも2カ月保持することはほぼ確実といえる.さらに,色情報が加わった複雑な色パターン情報についても,それを人間が長期に保持する可能性は極めて高いといえる.今後,色の波長と長期記憶に関する研究に新しい展開が見込める可能性が高い.昨年度,1つの実験で,人間が無意味なランダムな視覚的パターン情報を,数カ月という長期間保持するというデータが得られたことを受け,その再現性の検討を本年度最初に行った.2つの実験を実施した結果,その両者で,無意味なランダムパターン情報の長期的な保持(2カ月)が確認された.これらの実験結果は,記銘を要求されない状態で,ただ見ただけのパターン情報を,被験者が2カ月後に弁別できることを明確に示している.これまでの研究成果から,人間が詳細なパターン情報を,従来の記憶研究では予想し得なかったほど長期に蓄える能力を有すと明言できる.上記実験で用いたランダムパターンは白黒のパターンであったが,本年度の後半は,新たに購入したカラーレーザープリンターを用い,形情報に色情報を加え,ランダムなパターンと色の組み合わせといった,さらに詳細な情報を長期に保持するか否かを検討した.材料作成の困難さから実施した実験は1つだけであったが,そこで得られた結果は,パターンと色の組み合わせという非常に詳細な情報を,人が2カ月間保持することを概ね示している.また,パターンは赤色もしくは青色で描かれているが,その色の種類によって長期的な効果の現れ方に違いが出てくる可能性が示唆された.具体的には,赤で描かれたパターンに比べ,青で描かれたパターン情報を被験者は2カ月後に弁別しやすい可能性がある.今回用いた色は,明度がほぼ等しい色を用いた.したがって,この実験で示唆されたことが事実であるならば,色の波長と記憶に関する研究に,全く新しい展開が見込める可能性が高い.9個の白・黒の正方形(□,■)で作られた無意味な図柄の,■の数を数えるという偶発学習を披験者に行わせ,その2,3カ月後,間接再認課題を行うと,以前に呈示された図柄と呈示されなかった図柄を,被験者が無自覚的に弁別するという,驚くべき事実が昨年度までに確認された.本年度,この現象の再現性の検討に加え,パターン情報に色情報を組み合わせた刺激を作成し,より複雑な視覚情報を人間が長期に保持するか否かを実験的に検討した.非常に複雑な色パターン刺激を,実験条件に合わせて個人ごとに出力するためのプログラム開発に困難をきたしたが,購入したカラーレーザープリンターを用いて実験材料を作成し,約600人の被験者を対象に実験を実施した.実験1では,赤と青を色として,色の一致・不一致,および学習時に呈示されたか否かにより条件を統制した.インターバルは2カ月であった.実験の結果,学習時に呈示されたパターンで,なおかつ色も同じであった刺激に対する虚再認率が,学習時に呈示されなかったパターンのそれよりも有意に高くなることが明らかとなった.さらに,色が一致しない条件の虚再認率が,無学習と一致条件の間に落ちることが示された.実験2では,黄色と青を用いて同様の実験を実施した結果,今回はヒット率について実験1と同様の現象が観察された.長期的な効果が得られた指標が実験1と違う点は非常に興味深い.実験3では,赤,青,緑,黒を用い,先行学習の効果に与える色の効果を検討した.この実験では,色の効果は認められたが,長期的な学習効果に影響を与える色の効果は検出されなかった.一連の実験で,人間が無意味なパターン情報を少なくとも2カ月保持することはほぼ確実といえる.さらに,色情報が加わった複雑な色パターン情報についても,それを人間が長期に保持する可能性は極めて高いといえる.
細胞増殖と分化の特異的調節分子の化学研究

細胞の増殖と分化という最も生命にとって基本的な現象を調節する低分子の有機化合物の化学的研究を進めた。最も重点を置き、また進歩があった成果は、レチノイドに代表される細胞分化調節分子の構造活性相関の研究である。ビタミンAの誘導体であるレチノイン酸に代表されるレチノイドの構造を大きく変化させ、構造的にヴァライエティに富む、そして、物性にも特徴のある化合物を合成した。そしてそれらの立体構造をnmrおよびX線結晶解析によって明らかにした。新しいタイプの化合物としては、構造活性相関の研究に基づいて、トリメチルケイ素やトリメチルゲルマニウム基をもつ化合物を合成し作用を評価した。細胞分化においてフォルボ-ルエステルは強力であり、また、それとは構造の異なるテレオシジンも強力かつ特異的である。これらの構造的対応関係を各種合成化合物の活性と計算機を用いるレセプタ-マッピングによって明らかにした。この結果から新しい発ガンプロモ-タ-やその阻害剤が合成可能である。この研究はさらにフォルボ-ルエステルのレセプタ-探索へと進行した。ヒト細胞(HeIaおよびHL-60)にフォルボ-ル特異的結合タンパクの存在をみとめた。このタンパクは細胞質に存在し、フォルボ-ルが存在すると核へ移行する。またテレオシジンはフォルボ-ルの結合と競合する。さらに、非TPA型発ガンプロモ-タ-といわれていたタプシガルギンも競合的であり、このタンパクこそ、発ガンプロモ-ションに関与するレセプタ-タンパクであると考えられる。ビタミンD活性体の合成研究、核酸の認識物質、酵素類似機能物質の研究成果をえた。植物の細胞分裂誘起物質のレセプタ-探索のためのプロ-ブを合成した。細胞分化調節分子の研究は強力な分化誘導分子である芳香族アミドカルボニ酸の立体構造の解析を行ない.新しい構造の分化誘導分子の構造設計に役立ちつつある.これらの生物活性に関しては特に血球の分化を精査した.一方,これらの分子は角化を阻害する.植物由来の分化誘導分子としていくつかのフラポン誘導体を発見した.これらは新しい構造の活性物質のためのリード化合物となる.分化と関連する化合物としてアルカロイドテレオシジンに関連する研究が進んだ.特に9員環の立体構造が二つの安定型をとりうることを基として構造活性相関の研究を進めた.構造的に特徴のあるレチノイドーグリセリドを合成した.またフォスファケジルリピドの系統的合成を果した.細胞増殖調節物質は,従来発見したT_2植物細胞の分裂促進物質の応用面での展開をすすめた.特に花期における遍用において果実の着果に著しい促進がみられることを明確にした.また,緑葉の保持にも強い効果をもつ.アフィディコリンの合成研究が進みつつある.新しい活性分子を求めて,種々の細胞増殖因子(ペプチド)の立体構造を解析するための基礎として,ペプチドの立体構造を分析した,特に核磁気共鳴吸性が多くの情報を与えてくれた.ペプチドのNをメチル化するとアミド結合がcisになる傾向をみつけた.細胞分化,増殖の制御は遺伝子の発現調節と密に関連するが,上記芳香族アミドは血液ガン細胞HL60で発現しているcーmyc遺伝子の発現を強く抑制する.これが分化の引き金であるかもしれない.機能性オリゴヌクレオチドとして核酸塩基ーアミノ酸複合体を合成し,正常核酸との相互作用をたしかめた.細胞の増殖と分化という基本的な生命現象を調節制御する物質のうち低分子の有機化合物による特異的なコントロールは生物学ばかりでなく薬学における医薬の開発という点でも重要である。本課題ではこのような有機分子についての化学的研究を主たる目的としている。分化誘導因子の立体構造の解析は、主としてビタミンA酸と同じ効果をもつ合成物質について研究した。

特に、立体構造をかなり固定した化合物の合成とその構造活性相関の研究から、これらの活性物質は疎水性のかなり大きな基と親水性ー水素結合性のカルボン酸が一定の位置関係にあることが必要なことを明らかにした。この結果は、さらに新しい活性化合物をデザインするのに有効である。テレオシジンは細胞の情報伝達系に強く作用する重要な化合物であるが、関連誘導体の合成をすすめ、その立体構造を核磁気共鳴吸収で推定し、種々の計算化学の支援をえて、活性発現に関与しているとみられる構造を明らかにした。この結果に基いて、拮抗物質の合成に進んでいる。ビタミンA酸の研究はさらにその作用機構の研究に進み、真のレセプターとみられるタンパクを同定した。このタンパクは核に存在し、分子量は約9万で二量体とみられる。その構造は、独立に分離されていた核レセプターファミリー遺伝子でコードされていることがわかり、本研究の結果、我々が主として進めてきたビタミンA酸は、核において、細胞の増殖・分化を直接に支配している因子であることを証明したことになる。この核内レセプターとビタミンA酸の重要性に鑑み、次年度はこれに焦点をあて研究を完了させる計画である。最も基本的な生命現象である細胞の増殖と分化を特異的に調節する低分子化合物有機化学的研究を進めた。細胞分化調節分子としてテレフタル酸アニリド、カルコンカルボン酸アニリドの構造活性相関と立体構造の解析を行った。アニリド類については立体化学を固定した化合物を同定し、構造中のカルボキシル基と脂溶性基との立体関係が活性の発現に重要であることを示した。またカルコンカルボン酸についても、部分的に立体構造の固定した化合物を合成し、それらに強い細胞分化誘導活性をみとめた。新しいタイプの細胞分化誘導物質としては、ケイ素やゲルマニウムを含む化合物を合成した。とくにトリメチルケイ素、トリメチルゲルマニウム基が脂溶性基として活性発現に関与することを見い出した。この結果は広く応用化できる。細胞分化においてフォルボ-ルエステルとテレオシジンは特異的であるが、本研究においてはこれらのレセプタ-と思われるタンパクの存在を示した。このタンパクへの結合物質、結合阻害物質は生理活性が期待されるので、このレセプタ-と思われるタンパクの大量調整と構造研究を進めている。関連してテレオシジンの立体構造の解析を行ない、三次元物理的性質に基づく構造活性の研究を進めた。活性に必須な構造を推察できるようになったので、新しい構造の化合物の分子設計が可能になった。ビタミンDの活性体の研究、ビタミンEの活性体の研究を進めている。現在、いくつかの化合物の合成が終了し、生物活性の検定を進めている。もう一つの重要な低分子化合物である甲状腺ホルモンチロキシンのアナロ-グの合成を進めている。目的は抗高脂血症剤の発見である。核酸の配列特異的認識物質の合成を行った。
イソプレノイド化合物による細胞のアポトーシスに関する研究

ラット胸腺を研究材料に、種々のイソプレノイド化合物によるアポトーシス誘導能を調べた。炭素鎖長15のファルネソール(FOH)と20のゲラニルゲラニオール(GGOH)において顕著な誘導能がそれぞれ25μMと15μMの濃度でみられた。更に有機化学的に合成したFOHとGGOHの派生物【ファルネシルアルデヒド(FCHO)、ファルネシル酸(FCOOH)、ファルネシルリン酸(FP)、(R,S)-2,3-ジヒドロ-FOH、(R,S)-2,3-ジヒドロ-FCHO、(R,S)-2,3-ジヒドロ-FCOOH、(R,S)-2,3-ジヒドロ-FP、ゲラニルゲラニルアルデヒド(GGCHO)、ゲラニルゲラニル酸(GGCOOH)、ゲラニルゲラニルリン酸(GGP)、Z,E,E-GGOH.Z,E,E-GGCHO、そしてE,Z,E-GGOH】の効果も調べた結果、GGOH、GGCHO、そしてGGCOOHが強いアポトーシス誘導能を示した。この3者による作用点を追究するために、ジアシルグリセロール(DG)あるいはホスファチジルコリン(PC)共存下での効果を調べた。GGOHはPC合成を直接阻害すること、GGCOOHは、恐らくPC分解を促進することにより間接的にPC合成を阻害すること、そしてGGCHOは部分的にPC合成を阻害することが判明した。また、これらの化合物の代謝を調べた結果、GGOHとGGCOOHではその化合物が代謝されにくいのに対してGGCHOはすぐに代謝されてしまうことが分かった。放射性GGOH、GGP、そしてゲラニルゲラニル二リン酸を用いてのプレニル化蛋白質の分析では、GGPでの21-28kDaへの蛋白質に取り込みが最も高かった。以上の研究から胸腺細胞においてイソプレノイド代謝系とアポトーシス誘導現象はGGOH、GGCHO、GGCOOHとPC合成系あるいは未知な系との作用を介して関連することが明らかとなった。ラット胸腺を研究材料に、種々のイソプレノイド化合物によるアポトーシス誘導能を調べてきた。この研究を進展させるために行った今年度の成果を以下に示す。鎖長C15のファルネソ-ルとC20のゲラニルゲラニオールにおいて顕著な誘導能がそれぞれ25μMと15μMの濃度でみられた。胸腺細胞では自発的なアポトーシス極力おさえる為に、作用させる時間において振蕩せずに静置させることが必要であった。HMGCoA還元酵素阻害剤のコンパクチンは、胸腺細胞のアポトーシス誘導能を示さないが、ファルネソ-ル共存下ではより顕著な促進を示した。これらの化合物の胸腺への取り込みとその代謝を理解するために、放射性のファルネソ-ルとゲラニルゲラニオールを用いて、とりこまれるプレニル化蛋白質の分析をSDSポリアクリルアミド電気泳動法によって調べた。ファルネソ-ルの蛋白質への取り込みは低く、ゲラニルゲラニオールは相対的に21kDaから28kDaへの蛋白質に主に取り込まれた。化合物の膜透過を考慮し、ゲラニルゲラニオール、ゲラニルゲラニルモノリン酸、そしてゲラニルゲラニルジリン酸を用いて比較したところ、同様の蛋白質へのゲラニルゲラニルモノリン酸による取り込みが最も高いことが判明した。またコンパクチン存在下での放射性メバロン酸とゲラニルゲラニオールの取り込み研究では、およそ22kDaの相当する蛋白質への集中した取り込みが観察された。

今後これらの放射性蛋白質がプレニル化蛋白質であるのか、どのような蛋白質が特異的に脂質修飾を受けるのか、そしてそれらの蛋白質とアポトーシスがイソプレノイド化合物をとうしてどのように関連しているのかに焦点を当てて追究していく予定である。ラット胸腺を研究材料に、種々のイソプレノイド化合物によるアポトーシス誘導能を調べた。9年度に引き続き行った今年度の成果を以下に示す。炭素鎖長15のファルネソール(FOH)と20のゲラニルゲラニオール(GGOH)において顕著な誘導能がそれぞれ25μMと15μMの濃度でみられたことからこれらの派生物(ファルネシルアルデヒド(FCHO)、ファルネシル酸(FCOOH)、ファルネシルリン酸(FP)、(R,S)-2,3-ジヒドロファルネソール、(R,S)-2,3-ジヒドロ-FCHO)、(R,S)-2,3-ジヒドロ-FCOOH、(R,S)-2,3-ジヒドロ-FP、ゲラニルゲラニルアルデヒド(GGCHO)、ゲラニルゲラニル酸(GGCOOH)、ゲラニルゲラニルリン酸、Z,E,E-GGOH.Z,E,E-GGCHO、そしてE,Z,E-GGOH)を有機化学的に合成した。この一連の化合物では、GGOH、GGCHO、そしてGGCOOHが強いアポトーシス誘導能を示した。この3者による作用点を追究するために、ジアシルグリセロールとホスファチジルコリン(PC)共存下での効果を調べた。GGOHはPC合成を直接阻害すること、GGCOOHは恐らくPC分解を促進することにより間接的にPC合成を阻害すること、そしてGGCHOは部分的にPC合成を阻害することが判明した。また、これらの化合物の代謝を調べた結果、GGOHとGGCOOHではその化合物の代謝が遅いのに対してGGCHOはすぐに代謝されてしまうことが分かった。以上の研究から胸腺細胞においてGGOH、GGCHO、GGCOOHを介してイソプレノイド代謝系がPC合成系と未知な系の双方によってアポトーシス誘導現象と関連することが明らかになった。
メリライト族鉱物に見られる構造ゆらぎの温度変化の研究

本研究は、メリライト族鉱物に見られる変調構造について、転移温度下での構造変調の変化と転移温度直上の正常構造の解析を行い、変位型変調構造の生じる原因を明らかにする事を目的とした。本研究の目的達成のためには、相転移前後のX線回折強度を精密に測定することが重要である。このため、試料温度を精密に制御できる電気炉を新たに作成した。現有する四軸型回折計(CAD-4:ENRAF NONIUS)の幾何学的制約のため、この電気炉はガスフロー型とした。この材料費は消耗品費からまかなった。電気炉の温度制御は設備備品費で購入した温度コントローラにより行い、約200°Cで±0.5°Cの温度安定性を実現した。メリライト族鉱物の一つであるコバルトオケルマナイトについて以下の実験を行った。試料はFZ法により合成されたものを用いた。まずイメージングプレートを用いた写真法により衛星反射の出現を確認した。次に今回作成した電気炉を用いて加熱実験を行った。試料近傍の熱電対で温度を制御し、室温から270°Cの範囲で格子定数(正方晶系のaとc)及び衛星反射の回折強度を測定した。また、室温及び転移点近傍の数点の設定温度で主反射の強度を測定し、インコメンシュレート相の平均構造またはノーマル相の構造を解析した。温度の増加に伴い衛星反射の回折強度は減少し220°Cで急激に零に近づく事から、転移点は220°Cと判った。また210°Cから230°Cまでの範囲でc軸の長さは減少し、a軸の増加率は大きくなっていることが判った。この温度範囲では、格子の体積はほぼ一定になっている事も判った。室温,200°C,220°C,225°C,230°C,235°Cの各温度で構造解析を行い、温度の増加に伴い温度因子が小さくなるという異常な振る舞いを見いだした。この結果と格子定数の変化は共に変調振幅の減少と関連があると思われ、変位型変調構造の生じる原因を検討中である。
高移動度酸化亜鉛二次元界面における強相関希薄電子系の金属絶縁体転移

本研究の目的は電気抵抗を測定することで、酸化亜鉛における二次元電子の金属状態から絶縁体状態への転移を観測することである。極低温中において酸化亜鉛二次元電子に強磁場を印加することで、電気抵抗が急激に増大し、金属絶縁体転移が観測された。しかしながら、この抵抗増大の前後でキャリア濃度を反映するホール抵抗に異常は見られず、量子ホール絶縁体と呼ばれる、高移動度の低キャリア濃度系に特徴的な状態が実現されていることが明らかとなった本研究の目的は電気抵抗を測定することで、酸化亜鉛における二次元電子の金属状態から絶縁体状態への転移を観測することである。しかしながら、この抵抗増大の前後でキャリア濃度を反映するホール抵抗に異常は見られず、量子ホール絶縁体と呼ばれる、高移動度の低キャリア濃度系に特徴的な状態が実現されていることが明らかとなった金属絶縁体転移は半導体を扱う上で最も基礎的で重要な現象である。従来、二次元以下の系はすべて絶縁体であることが理論・実験両面より証明されたと考えられていたが、1990年代中ごろに非常に清浄な半導体二次元界面が作られ、極低温でも金属的状態が観測された。現在でもその起源は明らかになってはおらず、盛んに研究が行われている。また、このような研究は主にSiの表面反転層とGaAs/(Al,Ga)As系に限られている。本研究では近年得られるようになった、非常に清浄な(Mg,Zn)O/ZnO二次元界面において金属絶縁体転移を観測・解析を行うことを目的とする。この系は他の系に比べ電子相関が大きく他の系とは非常に異なるパラメータ空間に位置する。最終的には各種の臨界指数を求め、理論と比較検討し、二次元系における金属絶縁体転移の理解を飛躍させることを狙う。H22年度は二次元の金属絶縁体転移が観測できるより清浄な界面を作製することに主眼をおいた。酸素源として100%オゾンを用いることで、不純物を極限まで減らし、結果として、これまでの2倍以上の500,000cm^2/Vsの移動度を示す酸化亜鉛二次元界面の作製に成功した。また、この試料を用い、極低温・強磁場において量子ホール効果の観測を行ったところ、v=1/3の分数量子ホール状態をこの物質で初めて観測した。また、強磁場施設においてさらに磁場を印加するとv=1/3以上の磁場では急激に抵抗が上昇し、絶縁化することが明らかとなった。この絶縁体状態ではホール抵抗は通常のキャリア濃度で与えられる値を取る特別な状態であり、量子ホール絶縁体と呼ばれ、酸化亜鉛系では今回が初めての観測である。また、このような研究は主にSiの表面反転層とGaAs/(A1,Ga)As系に限られている。本研究では近年作製技術の向上により得られるようになった、ZnOヘテロ構造における高移動度電子の金属絶縁体転移を観測し、他の系と比較することを目的とした。前年度までの研究成果は、ZnOヘテロ構造の高品質化により、移動度500,000cm^2/Vsのヘテロ構造を作製可能となり、量子ホール絶縁体と呼ばれる状態への転移を観測した。この転移はZnOの大きな有効質量に基づく強い電子間相互作用が効いていると考えられる。本年度はZnOヘテロ構造の高品質化を引き続き行うとともに、高移動度二次元電子系において、金属絶縁体以外に電子相関が強く表れる現象観測を行った。結果として、本年度は次のような成果を得た。ZnOヘテロ構造品質の改善により移動度は800,000cm^2/Vsまで向上した。このヘテロ構造を用いて磁気抵抗振動を測定すると、高次の分数量子ホール効果が観測でき、その温度依存性から、複合フェルミオンの有効質量の解析を試みた。電子相関によって有効質量が増大すると期待されたが、その値は電子のものと大きく変化せず、一見相関の影響は見られなかった。しかし、電子が金属的な振る舞いを示すのに対し、複合フェルミオンは絶縁体的に振る舞い、その原因は複合フェルミオン間の強い電子間相互作用に基づいていることが明らかとなった。この結果は、従来自由粒子として捉えられる複合フェルミオン描像に新たな疑問を投げかける桃であり、今後精力的にその詳細を調べていく予定である。
ジベレリン受容に関する分子生物学的研究

ジベレリン受容体GID1の結晶構造解析を行い、GID1のGA分子結合の機構を解明した。GID1はホルモン受容体リパーゼ(HSL)の構造と類似しており、HSLの活性サイトがGAの結合サイトに対応することが分かった。さらに、下等植物から高等植物に進化する過程で、GID1のGAと相互作用するアミノ酸が適切に変異することにより、GAに対する親和性や特異性が改良されたことが確認された。本研究はイネおよびシロイヌナズナにおけるジベレリン(GA)のシグナル受容の分子機構を解明することを目的とする。我々が本研究期間中で具体的に明らかにしたい事柄は以下の6点である。(1) GA受容体GID1におけるGA結合サイトはどこか。(2) GID1とDELLAタンパク質との結合サイトはどこか。(3) GID1と結合したDELLAタンパク質はどのような変化を受けるか。(4) DELLAタンパク質はどのような機構によりGAシグナルを抑制するのか。(5) DELLAタンパク質とGID2との結合サイトはどこか。(6) GAシグナル受容複合体の再構成。以上の研究項目について、研究代表者はイネを材料に、分担者はシロイヌナズナを材料として研究を行う。ジベレリンと結合したジベレリン受容体GID1は、ジベレリン信号伝達の抑制因子であるSLR1と結合し、SLR1を分解に導くと考えられている。GID1は、hormone sensitive lipase(HSL)に類似した一次構造を有しており、本プロジェクトでは、HSL様の構造のうち、どの領域においてジベレリンやSLR1と結合するのかは非常に重要な問題である。我々がこれまでに行ったGID1のデリーションコンストラクトを用いた実験結果から、GID1のN末15アミノ酸を除くほぼ全ての領域がジベレリン結合に必要であることが予想されていた。このことから、受容体全体の立体構造の維持がジベレリン結合に必須であると考えられたので、今年度は、3次構造の変化を最小にしつつアミノ酸変異の影響を見る目的でアラニンスキャニングを行った。イネGID1とアラビドプシスの3つのGID1ホモログの間で保存されているアミノ酸をそれぞれアラニンに置換した94個の変異型GID1タンパク質を作製した。さらに、そのジベレリン結合能とジベレリン依存的SLR1結合活性を、現在詳細に測定している。我々のもう1つの興味は、植物内におけるジベレリン依存的なGID1とSLR1の結合である。そこで、GID1-GFPを過剰発現した形質転換カルスを作製し、±ジベレリン処理後にGFPに対する抗体で免疫沈降を行った。その結果、ジベレリン処理したカルスのみからSLR1タンパク質が共沈したことから、in vivoにおいても、両タンパク質はジベレリン依存的に結合することが明らかとなった。DELLAタンパク質はGAの信号伝達を負に制御する。イネのDELLAタンパクSLR1質は、GA受容体であるGID1がGAと結合した状態の場合、これらと相互作用することにより、F-boxタンパク質であるGID2の標的とされ分解される。これまで我々が収集してきたイネGA関連変異体中のSLR1タンパク質量は、変異体の矮性度とよく一致しており、SLR1タンパク質量が多ければ多いほど矮性度合いも強くなる。しかし、F-box変異体であるgid2は、これが当てはまらず、SLR1蓄積量は他のGA関連変異体よりも多いにも関わらず、矮性度合いはgid1やGA欠損変異体のcpsなどに比べて弱い。この現象はSLR1タンパク質のGA抑制に関する未知の分子機構に起因すると考え以下の解析を行った。gid2をGA合成阻害剤処理やGID1タンパク質機能欠失させるとSLR1量は減少し、GA処理やGID1過剰発現状態ではSLR1量は増加した。この際、GA合成阻害剤処理やGID1機能欠失はgid2の矮性度を増加させた。一方、GA処理やGID1過剰発現はgid2の矮性度合いを緩和した。これらの結果は、gid2変異体中ではSLR1のGA信号伝達抑制活性がGAやGID1の量により制御されていることを示している。また、GA信号伝達により発現が制御される遺伝子、GA20ox1、GID1、SLR1の発現を調べたところ、これらの発現はgid2変異体中でGAレベルにより制御されていることが解った。これらの結果から、SLR1のGA信号制御活性はこれまで信じられていたGA-GID1-SLR1複合体がF-boxにより認識されて分解に導かれるために引き起こされるだけでなく、GA-GID1-SLR1複合体が形成されること自体が、抑制活性の脱抑制化を導いていると結論した。GA_4またはGA_3と結合したイネGID1結晶を用いて1.9Aの解像度でX線解析を行い、GID1タンパク質構造の全体及びGA結合サイトの構造を明らかにした。GID1受容体の全体構造はアミノ酸配列の相同性から予想されたように、酵素の一種であるHSLの構造とよく似ていた。

また、HSLの活性ポケットの部分がGA結合ポケットに対応していた。HSLの活性部位を構成する2つのアミノ酸残基(Ser198とAsp296)やオキシアニオン結合部位はGID1にも保存されており、これらの部位がGA分子のC-6に位置するカルボキシル基と水素結合を形成することが分かった。また、GAとGID1との結合はこれらの水素結合以外に疎水的結合も関与していることが分かった。解析された立体構造に基づき、GAとの結合に関与することが予想された残基をアラニンに変異させ、GA結合能を検討した。その結果、17種類のうち13種類について結合活性はなくなり、残りの4種類についても大きく活性が低下した。このことは、構造解析により推定されたGA結合に関与するアミノ酸が、実際にGAとの結合に重要であることを示している。HSLは微生物、動物、植物に広く存在する酵素タンパク質であることを考えると、高等植物に存在するGA受容体は、HSLを起源として植物の進化過程で確立されたと推論された。そこで、この仮説を検証するために、GID1を有する最も原始的生物と予想される小葉類(シダの一種)のSelaginellaGID1 (SmGID1)と進化が進んだイネのGID1 (OsGID1)のGA結合に関与するアミノ酸残基の比較を行い、GID1はHSLを起源とし、GA受容活性を獲得した後も、植物進化の過程で活性型GAの固有な構造を特異的に認識するべく構造を調整し続けたことを明らかにした。イネGA受容体欠損変異体gid1-8の矮性を回復する変異体(suppressor gid1-1, sgd1)を単離し、その原因を解析した。その結果、その変異はGID1遺伝子上に存在するイントラジェニック変異であることが確認された。GA受容体GID1立体構造に基づき、その変位箇所を調べたところ、GID1とGAとの結合の際に蓋の役割をするリッドの開閉に関与することが予想された。そこで、GA非存在下においてSGD1タンパク質とSLR1との結合を測定したところ、SGD1はイネDELLAタンパク質(SLR1)とGA非存在下でも相互作用することが確認できた。さらに、様々な欠失を持つSLR1を用いて、SGD1との相互作用を調べたところ、その結合様式はGID1がGA存在下で示すものと同様であった。このことから、SGD1はGA非存在下で、GID1がGAと結合した状態を模倣していると考えられた。シロイヌナズナGA受容体は3種類有り、その内AtGID1bはGAの非存在下でDELLAタンパク質と相互作用する。そこで、このAtGID1bのGA非存在下DELLAタンパク質相互作用が、イネのSGD1と同様な機構によるかを検討した。アライン解析により、SGD1の変異の原因となった箇所に対応する部分が、AtGID1bは他のシロイヌナズナのGID1と異なっていることが確認された。このAtGID1bに特異的な違いがAtGID1bのGA非存在下DELLAタンパク質相互作用の原因だと考え、AtGID1aの配列と置き換えた結果、AtGID1bのGA非存在下DELLAタンパク質相互作用は無くなり、GA依存的DELLAタンパク質相互作用が残った。
3D画像と3Dプリント技術を融合した実践的な解剖学知識を高める学習システムの開発

解剖学の基礎的な知識と看護実践との統合を経験する機会の不足から、看護学生が解剖学知識を臨床場面で活用できていない現状にある。よって本研究では、看護学生の解剖学の基礎的知識に基づく実践的知識の形成と定着を目指し、解剖学知識を看護臨床場面で活用する力を培うことを目的とした学習支援システムを開発し、有用性と導入可能性を検証することを目的とした。本年度は、看護系大学学生を対象として行われている解剖生理学に関する教育についての知見や課題を整理するために、国内外の文献レビューを行った。本研究で作成予定の解剖生理学学習支援システムを設計する際に参照できるよう、先行研究で報告されている解剖生理学の教育手法について整理した。また、日本国内の看護教員が抱える、解剖学教育に対する困難や課題の実態を把握するために、日本看護系大学協議会の会員校に、解剖生理学に関する教育手法についての実態調査を実施することを目的として、文献レビューで整理した内容に基づき、調査票を作成している。その一方で、3Dプリンターを購入し、物理的・人的・時間的コストを抑えつつ、効率・効果的に解剖模型を作成するための手法の検討を行っている。解剖模型を3Dプリンターで作成する際に活用可能な3D画像の提供元についても合わせて検討中にある。さらに、海外の医学教育学会に参加し、海外の医療系大学での3Dプリント技術や模型教材を活用した解剖学教育についての情報収集を行い、先駆的な事例や解決すべき課題について知見を得た。3Dプリンターを活用した解剖学教育教材の作成をいかに効率的に行うかについて、繰り返し慎重に検討する必要があり、そのための議論等に時間を要している。また教育支援システムの設計についても適宜専門家の意見を取り入れ、話し合いを行っているため、時間を要していることから全体的に研究進捗はやや遅れている。学習支援システム作成の参考とするために、今年度中に日本看護系大学協議会の会員校に、解剖生理学に関する教育手法についての実態調査を実施し、解剖学教育に対する教員側のニーズを把握する。また、看護学生側に対しても、面接調査により、解剖学を習得する上での教育に対するニーズ等を把握する。年度末までには、学習支援システムのデモ版の構築を目指す。予算を有効かつ効率的に使用したことに伴い、未使用額が発生した。また、今年度実施予定であった質問紙調査を次年度に予定しているため、未使用額については質問紙調査実施費用として計上する予定である。
獣医学教育の抜本的改善の方向と方法に関する研究

本研究の目的は、我が国の獣医学教育の抜本的改善の方向と方法を明らかにすることである。2年目に当る今年度で研究を終了するが、本年度は獣医学教育の現状を把握するために、3つの調査を行った。1番目は国・公・私立全大学獣医学部・学科の自己点検、2番目は国・公・私立全大学獣医学部・学科における当面の教育改善に関するアンケート調査、第3に私立獣医系5大学の入学志望者に対するアンケート調査である。また、欧米における獣医学教育の現状把握のために、2回の海外調査を行った。その他、多数の研究班会議を開催した。その結果の詳細はそれぞれの報告書として公表しているが、概略は以下のとおりである。わが国における獣医学教育は、5つの方向の改善が必要である。第1は、教育組織の充実である。すなわち、新制国立大学では平均して9.5の講座しかもたず、この数では獣医師国家試験出題18科目の教育も十分に行うことができない。私立大学においては、入学定員に比べて教員数が充分とはいえない状況にあることが明らかと成り、早急な改善のための方策を検討した。第2は、教育内容の検討である。獣医学に対する社会の要求が日々新たになっている。獣医学教育は基本的な部分と、時代の要請に応じて変化すべき部分とに分けられるが、これらについて検討を行った。第3は、教育方法の検討である。獣医学に限らず、PBL方式の採用など教育方法の改善が望まれているが、この点について資料を収集し検討を行った。第4は、獣医学教育に対する自己点検及び相互評価を実施した。第5は、獣医学教育についての国民の理解を得る努力である。外部の有識者による懇談会を設置し、ご意見をいただいた。以上の結果を得て、獣医学教育改善の方向と方法について取りまとめを行った。初年度においては獣医学教育の抜本的改善の方向を中心に研究を行うこととし、獣医学の理念と獣医学教育の方向について国内外の調査を行い、検討を重ねた。主な検討内容は以下のとおりである。我が国の獣医学教育体系は、戦後、獣医学教育が再出発した50年以上前からほとんど変わっていない。すなわち、基礎、応用、臨床のいわゆる3本柱をもって教育を構築することを標榜しながら、技術教育を軽視し、特に臨床分野と応用分野の教育は極めて不足している。基礎分野については臨床、応用より「相対的」には充実してはいるが、実質的内容は決して満足すべきものではない。そして、このような現状は獣医学教育の理念に基づくものではなく、講座数と教員数の大幅な不足という現実により止むを得ず生じたものであり、新制国立大学平均9.5講座では獣医師国家試験出題18科目の教育も十分に行うことができない。さらに、授業科目とその配置については、最近の獣医学の進歩と動物愛護の精神の高揚に応じて新たな授業科目の設置が求められているが、この50年間に授業科目の本質的な変化はない。さらに、欧米諸国においては広範な獣医学教育を教授するためには最低100名の教員が必要とされているが、新制国立大学平均25名程度の教員数はこれに遠く及ばない。このような獣医学教育の現状は教員、学生、そして学生の受入先の3者にとって極めて不満足であり、教育組織の早急な拡充・改組が必要である。獣医学教育の抜本的改善の方法については、公務員総数の大幅な削減の時代に純増を望んでも実現の可能性はほとんどなく、従って国立大学獣医学科の再編整備がもっとも可能性がある方法であろう。

本研究の目的は、我が国の獣医学教育の抜本的改善の方向と方法を明らかにすることである。2年目に当る今年度で研究を終了するが、本年度は獣医学教育の現状を把握するために、3つの調査を行った。1番目は国・公・私立全大学獣医学部・学科の自己点検、2番目は国・公・私立全大学獣医学部・学科における当面の教育改善に関するアンケート調査、第3に私立獣医系5大学の入学志望者に対するアンケート調査である。また、欧米における獣医学教育の現状把握のために、2回の海外調査を行った。その他、多数の研究班会議を開催した。その結果の詳細はそれぞれの報告書として公表しているが、概略は以下のとおりである。わが国における獣医学教育は、5つの方向の改善が必要である。第1は、教育組織の充実である。すなわち、新制国立大学では平均して9.5の講座しかもたず、この数では獣医師国家試験出題18科目の教育も十分に行うことができない。私立大学においては、入学定員に比べて教員数が充分とはいえない状況にあることが明らかと成り、早急な改善のための方策を検討した。第2は、教育内容の検討である。獣医学に対する社会の要求が日々新たになっている。獣医学教育は基本的な部分と、時代の要請に応じて変化すべき部分とに分けられるが、これらについて検討を行った。第3は、教育方法の検討である。獣医学に限らず、PBL方式の採用など教育方法の改善が望まれているが、この点について資料を収集し検討を行った。第4は、獣医学教育に対する自己点検及び相互評価を実施した。第5は、獣医学教育についての国民の理解を得る努力である。外部の有識者による懇談会を設置し、ご意見をいただいた。以上の結果を得て、獣医学教育改善の方向と方法について取りまとめを行った。
低タンパク食又は高タンパク食投与による摂食量抑制の因子について

低タンパク食又は高タンパク食で動物を飼育すると摂食量が著しく抑制される。本研究ではこの摂食抑制因子を脳・血漿・肝臓中の遊離アミノ酸濃度や肝臓中のアミノ酸分解酵素活性の変化を観察、検討することにより明らかにすることを試みた。卵アルブミンをタンパク源とし、飼料中のタンパク含量を3%、5%それ以上は5%刻みに75%までの16種の飼料を用い、成長期のラットを1群5匹として10日間飼育し、この間の毎日の摂食量、体重を計測し摂食状況を観察した。また飼育期間終了後、各群ラットの血漿・肝臓・脳中の遊離アミノ酸濃度を自動アミノ酸分析計にて測定し、肝臓のSDH活性を2,4ージニトロフェニルヒドラジン法により測定した。結果の概要はアルブミン10%食を基準にすると15%以外の全群で総食餌摂取量は有意に少なくことに3%及び50%以上の各群で著くし少量であった。体重増加量は摂食量に応じて3%、5%、5575%群で有意に低い値であった。各組織中の遊離アミノ酸濃度については、総必須アミノ酸濃度は血漿・肝臓・脳の何れでも3%、5%群で低く、食餌タンパク含量の増加に伴って高くなるが、血漿は30%以上、肝臓は35%以上、脳では45%以上の群で反対に低下し高タンパク食群では低値になる傾向であった。特徴的なアミノ酸を上げると、脳中のMet、Trp濃度は低タンパク及び高タンパク食で低くなる傾向を示し、Hisは3%群で高濃度であったが、他の群ではほぼ一定であった。血漿Trp濃度は3%群が有意に低く、食餌タンパク含量の増加に伴って高くなった。肝臓SDH活性は食餌タンパク含量の増加に応じて高まり、それとは逆に各組織中のThr、Ser、Gly濃度が低下した。またミルクカゼインをタンパク源とした同様な実験を行ったが、全般的にアルブミン実験とほぼ同じ結果を得た。以上より摂食抑制因子として血漿・脳中のMet、His及びTrpの各濃度の動きに注目した。低タンパク食又は高タンパク食を動物に投与し飼育すると,摂食量が著しく抑制される. A.E.Harperらはこの摂食抑制は脳中遊離AAの総量を維持する能力に関連することを示唆している.本研究では低タンパク食又は高タンパク食時の摂食量抑制因子を脳・血漿中の遊離AAの動きや,肝臓中のAA分解酵素活性の変化より解明することを試みた.卵アルブミンをタンパク源とし,飼料中のタンパク含量を3%, 5%, 5%以上は5%刻みに75%までの16種のタンパク含量の異なる飼料にて,成長期のラットを一群10匹として10日間飼育した.この間の毎日の摂食量,体重を計測し摂食状況を検討した.11日目にラットをエーテル麻酔し心臓より血液採取,肝臓・脳を摘出した.血液は血漿を分離し脳は生食水を加えて均質化後,それぞれの遊離AA濃度を自動AA分析計にて定量した.

肝臓は均質にしたのちSDH活性をFreed-laudらの方法により測定した.結果の概要は最大成長を示した10群を基準とすると3, 5%群と50%以上の群では有意に摂食量が減少し,これに伴って体重増加も劣った.血漿遊離AAの中で特長的なものは分岐鎖AAで3, 5%群で有意に低く, 60, 65%群でやヽ低値を示した.またThr, Serはタンパク含量の高くなるのに比例して低下した.これと関連して肝SDH活性も25%より急増し,タンパク過剰摂取分が肝臓で分解されていることを裏付けた.脳中遊離AAも血漿同様3, 5%群で分岐鎖AAが有意に低く, 50%以上の群でも殆んど低い値であった. Ser.も血漿と同じ動きであったがThrは群別の差は認められなかった.またHisが3%群で最高となり25%群までは順次下降し,それ以上の群ではほヾ低い値で一定であった.脳の総EAAはタンパク含量の高くなるのに反比例して低下する傾向が認められ, NEAAではさらにこの傾向が著しかった.摂食量抑制因子については,これらの結果から今後検討を進め解明してゆきたい.昨年度に引き続き、ラットにおいて低タンパク食や高タンパク食投与時に見られる摂食抑制の因子を、脳・血漿中の遊離アミノ酸の動きや、肝臓中のSDH活性の変化より解明するために、本年度は食餌中のタンパク源にミルクカゼインを用い、飼料中のタンパク含量を5%から75%まで5%刻みとした15種の飼料にて、成長期のラットを1群5匹として10日間飼育した。この間毎日の摂食量、体重を計測し摂食状況を観察した。また飼育期間終了後の各群のラットの血漿・肝臓・脳中の遊離アミノ酸濃度を自動アミノ酸分析計にて測定し、肝臓のSDH活性は2,4-ジニトロフェニルヒドラジン法により測定した。また本年度はアルブミン群も含めて1部の群の動物について各組織中のTrp濃度を蛍光法にて定量した。結果の概要は20%食群を基準にすると5%、10%群及び60%以上の群で10日間の総食餌摂取量は有意に少なく、これらの各群において明らかに摂食抑制が認められた。体重増加量は摂食量に応じて15%以下の群と60%以上の群で有意に低い値であった。各組織中の遊離アミノ酸濃度については、血漿では総必須アミノ酸濃度は5、10%群と40%以上の各群で低い値となり総分枝鎖アミノ酸も同様であった。また、Met濃度は低タンパク、高タンパク何れにおいても低値となり摂食抑制との関連が示された。His濃度は低タンパク群にて有意に高値となった。脳中では総必須アミノ酸、総分枝鎖アミノ酸が高タンパク群において低くなる傾向があり、個々のアミノ酸でもHisにこの傾向が示された。Cys濃度は55%以上の群で有意に低い値となった。肝SDH活性は食餌タンパク含量の増加と共に著しく増大し、これに伴って各組織中のThr、Ser及びGlyは反対に低下し、タンパク過剰摂取分が肝臓で分解されていることを裏付けた。以上より摂食抑制因子として血漿・脳中のMet、His,Cys及び総分枝鎖アミノ酸の動きに注目した。
消化器癌細胞におけるEカドヘリン依存性細胞接着による増殖阻害機構の解明

研究目的:正常上皮細胞は,相互に接着するとその増殖を停止すること,すなわち接触阻害を示すことが古くから知られてきた.癌細胞においても,完全ではないが,細胞同士が密に接着することにより,増殖が抑制される現象(contact dependent growth suppression)があることが明らかになってきた.しかし,その増殖停止シグナルが細胞表面からどのように伝達されるのか,詳細な機構は未だ明らかでない.我々はこれまで,Eカドヘリンのみならず,その裏打ち蛋白であるβカテニンが接着に極めて重要な役割を担っていることを,遊離細胞として増殖し続けるヒトスキルス胃癌株HSC39(βカテニンに異常がある)を用いて証明してきた(Mol Cell Biol 1995Mar;15(3):1175-81).最近我々は,このHSC39細胞から細胞接着性を示す亜株HSC39Ad細胞を分離することに成功した.そこで本研究では,HSC39Ad細胞を用いて,Eカドヘリン依存性contact dependent growth suppression機構の全容を解明することにより,癌の増殖・進展における接着阻害の意義を明らかにすることを目的とする.研究成績:1)HSC39Ad細胞が,なぜ接着能を有するのかを検討する目的で,3種のカテニンをウエスタンで検出した.その結果,HSC39Ad細胞におけるαおよびγカテニンの発現は,親株と比較してそれぞれ約1.7倍と2.0倍と,明らかな増加が認められた.また,HSC39Ad細胞が発現するβカテニンは,親株と同様な欠損型であった.2)HSC39Ad細胞において,発現の亢進したγカテニンrがβカテニンを補っている可能性を検討する目的で,HSC39Ad細胞におけるγカテニンの発現を,特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドで抑制した.その結果,HSC39Ad細胞の細胞接着は抑制され,増殖能は亢進した.更に,p21/WAF1の発現は低下し,非脱リン酸化型のRbは滅少した.3)Eカドヘリンおよびγカテニンからp21/WAF1および脱リン酸化型Rbの滅少へ至る増殖抑制のシグナルが,Rhoを介する可能性を検討する目的で,HSC39AdをEカドヘリン中和抗体で処理したところ,Rhoの活性化が観察された.また,γカテニンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した際にも同様の結果が得られた.更に,Rhoの阻害剤であるC3を添加すると,Eカドヘリン中和抗体によるp21/WAF1の発現滅少および増殖能の亢進は抑制された.結論:以上,本研究において我々は,Eカドヘリンとγ,αカテニン複合体からシグナルされる接着阻害は,Rhoおよびp21/WAF1を介することを明らかにした.研究目的:正常上皮細胞は,相互に接着するとその増殖を停止すること,すなわち接触阻害を示すことが古くから知られてきた.癌細胞においても,完全ではないが,細胞同士が密に接着することにより,増殖が抑制される現象(contact dependent growth suppression)があることが明らかになってきた.しかし,その増殖停止シグナルが細胞表面からどのように伝達されるのか,詳細な機構は未だ明らかでない.我々はこれまで,Eカドヘリンのみならず,その裏打ち蛋白であるβカテニンが接着に極めて重要な役割を担っていることを,遊離細胞として増殖し続けるヒトスキルス胃癌株HSC39(βカテニンに異常がある)を用いて証明してきた(Mol Cell Biol 1995Mar;15(3):1175-81).最近我々は,このHSC39細胞から細胞接着性を示す亜株HSC39Ad細胞を分離することに成功した.そこで本研究では,HSC39Ad細胞を用いて,Eカドヘリン依存性contact dependent growth suppression機構の全容を解明することにより,癌の増殖・進展における接着阻害の意義を明らかにすることを目的とする.研究成績:1)HSC39Ad細胞が,なぜ接着能を有するのかを検討する目的で,3種のカテニンをウエスタンで検出した.その結果,HSC39Ad細胞におけるαおよびγカテニンの発現は,親株と比較してそれぞれ約1.7倍と2.0倍と,明らかな増加が認められた.また,HSC39Ad細胞が発現するβカテニンは,親株と同様な欠損型であった.2)HSC39Ad細胞において,発現の亢進したγカテニンrがβカテニンを補っている可能性を検討する目的で,HSC39Ad細胞におけるγカテニンの発現を,特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドで抑制した.その結果,HSC39Ad細胞の細胞接着は抑制され,増殖能は亢進した.更に,p21/WAF1の発現は低下し,非脱リン酸化型のRbは滅少した.3)Eカドヘリンおよびγカテニンからp21/WAF1および脱リン酸化型Rbの滅少へ至る増殖抑制のシグナルが,Rhoを介する可能性を検討する目的で,HSC39AdをEカドヘリン中和抗体で処理したところ,Rhoの活性化が観察された.また,γカテニンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した際にも同様の結果が得られた.更に,Rhoの阻害剤であるC3を添加すると,Eカドヘリン中和抗体によるp21/WAF1の発現滅少および増殖能の亢進は抑制された.