hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
動物腸管付着性プロバイオティック乳酸菌の選抜・作出システムの構築とその応用

ヒトを含む動物の腸管にはビフィズス菌に加えて、アシドフィルス菌(L.acidophilusグループ乳酸菌)が腸管系乳酸菌として存在し、宿主の健康を左右している。近年、動物の生産現場では脱抗生物質の傾向が強く、プロバイオティック乳酸菌を利用した生産性の向上が望まれる。また、ヒトの健康保持にも、同プロバイオティック乳酸菌は発酵乳などに利用され始めている。本研究では、動物の健康に資する有用乳酸菌の新しい選抜系を構築し、それを用いてスクリーニングされた選抜乳酸菌の利用性について検討を進めることを目的とした。1.ニワトリ腸管付着性アシドフィルス菌の選抜とその特性解析:プラズモン共鳴スペクトル法(SPR)を原理として生体分子間の相互作用を解析するBIACORE1000のセンサーチップにニワトリ腸管より調整した腸ムチンを結合させ、各種L.acidophilusグループ乳酸菌を流し、その相互作用解析よりプロバイオティック菌を選抜した。2.ヒト血液型糖鎖プローブを結合させたセンサーチップで、ヒト腸管付着性菌を予備的にマススクリーニングし、ついでヒト大腸ムチンを実際に結合させたセンサーチップで結合性の最終確認を行った。3.ムチン糖鎖の認識性の高い菌体表層からレクチンを特定し、その単離精製とクローニングを試みた。ニワトリ腸ムチンを結合させたチップには、同腸管から単離されたとされる菌株保存機関の菌種は付着性が弱かった。しかし、実際にその腸管より単離した菌株自体は極めて強い付着性を示した。ヒトのABO式血液型のA型糖基質のエピトープ部位への吸着性では、高い付着性を示す菌株3つが選抜された。これは、実際にヒト大腸ムチン(A型)に対しても結合性が強く、その利用性が期待された。BIACOREでの解析による菌体とムチンとの結合性の判定は極めて明解であり、アシドフィルスグループ乳酸菌の中では、突出してL.crispatusが強く結合した。これらレクチンの一部は、単離精製され、クローニングによりそれらの塩基配列の一部が解明された。これらを同種発現させることで、有害菌を競合阻害できる高腸管付着性菌の作出に道を拓いた。本年度には、既に当研究室において確立された「高ヒト腸管付着性プロバイオティック乳酸菌の選抜システム」を用いて、L.acidophilus LA2,LA187(研究室での乳児糞便単離株)およびJCM267(購入株)の3菌株を優れたヒト腸管付着性を有する菌株として選抜した。これらの菌株は、「カルノア固定切片法」によりヒト腸管粘液結合性を確認した。また、選抜菌体より塩酸グアニジン抽出法により細胞表層タンパク質(SLP)を調製した。ヒト大腸ムチンの代替品であるラット大腸ムチン(RCM)を調製し、これを塗布したPVDF膜(これを疑似ヒト大腸粘膜と考える)と、選抜菌の細胞表層タンパク質とを37°C下で温和な親和反応させた。膜に特異的に結合した特定のアドヘシン分子を回収し、付着に関与した主要成分の単離精製を行い、アミノ酸組成分析、N-末端分析、C-末端分析、分子量、等電点測定などの生化学的検討を行い、特性解析を終了した。

L.acidophilus LA2株の20KDaレクチン様タンパク質のN-末端配列分析情報からDNAプローブを合成し、大腸菌の遺伝子組み替え法を用いたクローニングにより構造遺伝子の全塩基配列を決定した。構造遺伝子を発現ベクターに導入し、大腸菌により融合タンパク質法でアドヘシンの大量発現を行い、糖鎖認識性の検討を通して、付着機構の部分的な解明を行った。さらにこの高付着性アドヘシン遺伝子の導入により、低付着性有用菌表層構造を遺伝子改変し、付着性因子を新たに菌体表層に発現させた高付着性アシドフィルス菌を作出を試みている。本年度の成果により、アドヘシン遺伝子を細胞接着性の弱い他のアシドフィルス菌に対して遺伝子導入し、新たな接着性を有する乳酸菌の作出という本年度の成果到達目標は達成出来た。[目的]ヒトを含む動物の腸管にはビフィズス菌に加えて、アシドフィルス菌(L.acidophilusグループ乳酸菌)が腸管系乳酸菌として存在し、宿主の健康を左右している。近年、動物の生産現場では脱抗生物質の傾向が強く、プロバイオティック乳酸菌を利用した生産性の向上が望まれる。また、ヒトの健康保持にも、同プロバイオティック乳酸菌は発酵乳などに利用され始めている。本年度は、動物の健康に資する有用乳酸菌の新しい選抜系を構築し、スクリーニングされた乳酸菌の利用性について検討を進めることを目的とした。[方法]1.ニワトリ腸管付着性アシドフィルス菌の選抜とその特性解析:プラズモン共鳴スペクトル法(SPR)を原理として生体分子間の相互作用を解析するBIACORE1000のセンサーチップにニワトリ腸管より調製した腸ムチンを結合させ、各種L.acidophilusグループ乳酸菌を流し、その相互作用解析よりプロバイオティック菌を選抜した。2.ヒト血液型糖鎖プローブを結合させたセンサーチップで、ヒト腸管付着性菌を予備的にマススクリーニングし、ついでヒト大腸ムチンを実際に結合させたセンサーチップで結合性の最終確認を行った。3.ムチン糖鎖の認識性の高い菌体表層からレクチンを特定し、その単離精製とクローニングを試みた。[結果と考察]ニワトリ腸ムチンを結合させたチップには、同腸管から単離されたとされる菌株保存機関の菌種は付着が弱かった。しかし、実際にその腸管より単離した菌株自体は極めて強い付着性を示した。ヒトのABO式血液型のA型糖基質のエピト-プ部位への吸着性では、高い付着性を示す菌株3つが選抜された。これは、実際にヒト大腸ムチン(A型)に対しても結合性が強く、その利用性が期待された。BIACOREでの解析による菌体とムチンとの結合性の判定は極めて明確であり、アシドフィルスグループ乳酸菌の中では、突出してL.crispatusが強く結合した。これらレクチンの一部は、単離精製され、クローニングによりそれらの塩基配列の一部か解明された。
階層を貫く細胞サスペンジョン力学の新展開

本研究では、「階層を貫く細胞サスペンジョン力学」を徹底的に追求し、実験・理論解析・数値シミュレーションの手法を統合することで、世界の他の研究グループの追随を許さない高みに引き上げることに成功した。そして、海洋微生物から人体の血球細胞にいたるまで、ナノスケールからマクロスケールまでの生命現象を解明し、生物流れに関わる工学・医工学技術の開発へと展開した。これらの成果は、30編の査読付き英文雑誌論文として公表した。本年度は、ナノスケールからマクロスケールまで、幅広い研究課題で当初の予定を上回る成果があがった。気道の繊毛流れに関する研究では、気道繊毛の分子モーターの構造を解明し(Ueno, et al., Cytoskeleton)、この情報を基に、繊毛運動を再現できる数値シミュレーションコードを開発した。さらに、繊毛が作り出す流れに及ぼす粘液粘度の影響を実験的に明らかにし、気道病理の解明に役立つ基礎知見を得た。微生物懸濁液に関する研究では、鞭毛の協調運動メカニズムの解明(Kanehl & Ishikawa, Phys.l Rev. E)や、懸濁液内の拡散特性(Ishikawa & Pedley, Phys. Rev. E)まで、複数のスケールにまたがる研究成果をあげた。カプセルに関する研究では、流れ中の単一カプセルの移動現象を解明し(Nix, et al., Phys. Rev. E)、大規模懸濁液のレオロジー特性を明らかにした(Matsunaga, et al., J. Fluid Mech.)。血流に関する研究も順調に進展し、単一赤血球の運動挙動(Omori, et al., Comp. Mech.)や、小血管内の軸集中現象の解明(Takeishi, et al., Physiol. Rep.)等の成果をあげた。微小流体流路に関する研究も進展し、細胞スケールからcmスケールまで高解像度で計測する新しい技術を開発した(Kawano, et al., PLoS ONE)。さらに、細胞サスペンジョン力学を臨床応用することを目的に、ナノ酸素バブルを含む輸血用懸濁液を開発した(Matsuki, et al., J. Nanomedicine)。こうした応用研究は、最終年度に実施する予定であったが、研究の進展が当初の予定以上であったため、本年度の成果となった。平成27年度は、ナノ・マイクロスケールにおいて、実験と理論、数値シミュレーションを駆使し、バクテリアの鞭毛が歳差運動することを明らかにした(Shimogonya et al., Sci. Rep.)。この成果はASCII.jpや財経新聞で取り上げられ、大きな反響を呼んだ。この他に、遊泳繊毛虫の走地性(Ishikawa et al., Proc. Roy. Soc. A)や精子の走流性(Omori & Ishikawa, Phys. Rev. E)のメカニズムを明らかにした。マイクロ・セミマクロスケールにおいては、血流中のがん細胞の挙動(Takeishi et al., Phys. Rev. E)を明らかにした。この成果はINSIDE SCIENCEに取り上げられ、高い評価を得た。また、微生物群が集団遊泳構造を形成するメカニズムを明らかにした(Kyoya et al., Phys. Rev. E)。ナノスケールから細胞スケール、メゾスケール、マクロスケールまで、当初の計画通りに順調に研究成果が上がっている。さらに、当初の計画では最終年度に行う予定であった新規の細胞操作技術や治療法の開発においても、既に研究成果が上がっている。よって当初の計画以上に進展していると判断した。平成28年は、ゼブラフィッシュの腸内流動を数理モデル化し、蠕動運動のポンプ機能と攪拌機能を解明した(J. Yang, et al., J. Theor. Biol.)。次に、腸内細菌の増殖を数理モデル化し、腸内フローラシミュレーターを開発した。また、ゼブラフィッシュの腸内流動の可視化実験も行い、シミュレーション結果の妥当性を検証した。さらに、応用技術として、赤血球を壁面から遠ざけ、血漿層を厚くする壁面微細構造を開発した(M. Saadatmand, et al., J. Biomechanics)。この成果は、血管内に挿入する医療機器の血栓生成を抑制する技術などに応用できると期待される。また、バイオチップの流路形状と、流路内の細胞挙動を高解像度で同時計測する顕微鏡技術の開発にも成功した(Y. Kawano, et al., PLoS ONE)。ナノスケールから細胞スケール、メゾスケール、マクロスケールまで、当初の計画通りに研究成果が上がっている。さらに、当初の計画では最終年度に行う予定であった新規の治療法の提案についても、既に研究成果が出始めている。本研究課題では、分子スケールからマクロスケールまでの各階層の連続性を考慮した、革新的細胞サスペンジョン力学を構築している。今後も引き続き、ナノスケールからマクロスケールまでの各研究課題を推進し、得られた研究成果を細胞操作技術や診断・治療技術へと展開していく。平成28年度は、血液、クラミドモナス懸濁液、気管上皮流れに関する研究を重点的に推進する。

また、腸内フローラに関する研究を新規で立ち上げ、ゼブラフィッシュを用いた実験と、数値シミュレーションを融合することで、腸内細菌の分布を予測し制御する基盤技術を確立する。さらに、細胞懸濁液流れの可視化計測技術にまで応用範囲を拡張し、新規計測技術を開発する予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。生体力学引き続き、ナノスケールからマクロスケールまでの各研究課題を推進する。細胞懸濁液に関する研究では、クラミドモナスを用いた実験を実施し、細胞スケールの走性の数理モデル化から、バイオリアクター内の流れの解明まで、複数の階層にまたがる研究課題を推進する。また、細胞懸濁液のスケールをまたがる流れを解析するための計算手法を調査し、我々の開発した手法のブラッシュアップも行う。さらに、得られた知見を応用し、細胞操作用のマイクロロボット等を開発する予定である。
無血清培地開発と血清非依存性細胞株樹立法の確立

本研究では、動物血清に含まれる細胞増殖促進/阻害に関わるタンパク因子、脂質、有機酸を、血球系細胞をモデルに同定・プロファイリングし、100%輸入血清(FBS)に頼る細胞培養法の改善を図ることを目的とした。その結果、LDLなどのリポ蛋白質が細胞の増殖制御に有効なことが考えられた。また、クエン酸やピルビン酸など有機酸に増殖促進効果が認められ、組替えアルブミンも重要な増殖促進因子であることが確認できた。さらに、解析したところコレステロールが最も重要な脂質であることがわかり、インスイン、トランスフェリン、亜セレン酸と組換えアルブミンを加えることで、低タンパク質無血清培地の試作品を調製できた。本研究では、動物血清に含まれる細胞増殖促進/阻害や細胞接着制御に関わるタンパク因子群および脂質、有機酸を、浮遊血球系細胞をモデルに同定・プロファイリングし、100%輸入牛胎児血清(FBS)に頼る細胞培養法の改善を図ることを目的としている。また、同定した増殖因子・接着因子群の添加や脂質合成酵素群の遺伝子導入による血清(LDL)に依存しない細胞株の簡便な樹立法も確立したい。平成26年度は、補体成分C4bp, H因子及びリポ蛋白質LDLの浮遊血球系細胞の細胞接着・増殖に及ぼす効果や、FBSやブタ血清から増殖に必須のタンパク因子群の同定、脂肪酸や有機酸の効果などを調べることを計画した。さらに、LDL低依存性のJurkat細胞株を参考に、他の細胞系でも同じ方法でLDL低依存性株の樹立が可能かどうか検討することを計画した。その結果、(1)C4bp,H因子及びLDLの血球細胞接着と増殖への効果をT細胞(Jurkat,Molt-4)で比較し、補体系因子が接着阻害をするものの増殖には影響しないこと、LDLは接着阻害とともに増殖促進効果があることを見出した。補体系タンパクの有効利用が考えられるものの、LDLなどのリポ蛋白質・脂質が細胞の接着・増殖制御により有効なことが考えられた。また、(2)必須脂肪酸であるリノレン酸,リノール酸に増殖促進効果はみられないものの、クエン酸やピルビン酸など有機酸に増殖促進効果が認められた。(3)FBSやブタ血清から血球系細胞の増殖に必須な細胞増殖因子の精製・同定を進めたが、アルブミンと分離することができなかった。しかし、植物細胞で発現させたアルブミンに増殖促進作用が認められたことから、アルブミンも重要な増殖促進因子であることが確認できた。(4)LDL除去血清中で馴化するLDL低依存性細胞株の確立の検討は実施できなかった。また、同定した増殖因子・接着因子群の添加や脂質合成酵素群の遺伝子導入による血清(LDL)に依存しない細胞株の簡便な樹立法の確立を目指した。平成27年度は、(1)LDLを代替する脂質のスクリーニングを急ぎ、市販のコレステロール含有脂質混合物が一定の増殖促進効果を持つこと。さらに解析したところコレステロールが最も重要な増殖促進効果を示す脂質であることがわかった。(2)この脂質と血清量を低減できることがよく知られている、インスイン,トランスフェリン,亜セレン酸(合わせてITSと略す)の混合物、組換えアルブミンを加えることで、低タンパク質無血清培地の試作品を調製できた。この低タンパク質無血清培地を調製する上で、必須の要件である組換えトランスフェリンは植物細胞で発現されたものが市販されていて、天然のトランスフェリンに匹敵する細胞増殖促進効果を持つことが再度確認できた。しかしながら、さらに計画していた(3)この無血清培地の試作品を利用した、新しいLDL非依存性細胞株樹立のための馴化法の確立や(4)コレステロール生合成関連酵素群の遺伝子を細胞に人工的に導入して、LDL非依存性株が簡便に樹立できるかどうか検討する実験計画も着手できなかった。一方で、メタボロミクス解析から、細胞増殖に影響を与える可能性のある低分子性の候補分子を血清中に見出すことができた。(1)C4bp, H因子は補体系の制御因子と知られていているが、一方でその疎水性の性質のためか、浮遊系血球細胞が培養ディッシュに非特異的に接着することを効果的に阻害し得ることがわかった。ただし、補体系因子に増殖効果そのものが認められなかったことから、総括として、今後の研究において補体系因子のさらなる解析は中止することとした。

(2)一方、LDLなどリポタンパク質の増殖に対する効果がさらに確認できたが、リポタンパク質は血液由来成分であり酸化されやすくて細胞毒性を表すこともあるので実際の細胞培養には不向きである。リポタンパク質に代わる代替の脂質成分のスクリーニングが必要とされる。(3)FBSやブタ血清から増殖に必須のタンパク因子群の同定を進めたが、血清の主要タンパク質であるフェツインやアルブミンの画分から増殖活性をうまく分離できなかった。そこで、血清の影響を受けていない植物細胞で発現した組換えアルブミンの増殖活性を調べたところ、明らかな増殖促進効果が認められた。このように、脂肪酸や脂溶性ホルモンの影響を除去した組換えアルブミンが、血清に依存しない細胞培養系のコンポーネントとして利用できることがわかった。(4)今年度、LDL除去血清中で馴化するLDL低依存性細胞株の確立に関して検討ができなかったが、これは充分な量のLDL除去血清が調製できなかったことによる。血清を低減する従来の馴化方法や、組換えアルブミンを利用した新しい馴化培地の開発など再検討する必要がある。細胞生物学当初平成27年度の研究計画は、26年度の研究成果である新規増殖因子の同定にもとづく、増殖因子、脂質、有機酸を組み合わせた細胞培養用カクテル(無血清基礎培地)の試作と、Jurkat以外の細胞でも簡単に低血清(LDL)依存性細胞株を樹立する方法を確立し、さらに血清非依存性細胞株の樹立に至ることであった。無血清培養系から補体因子が除外されたことから、(1)27年度はLDLを代替する脂質のスクリーニングを急ぐ。対象とする脂質についてはすでに検討中であり、LDLには及ばないものの一定の増殖促進効果を示す候補を見出している。(2)この脂質と血清量を低減できることがよく知られている、インスリン,トランスフェリン,亜セレン酸(合わせてITSと略す)の混合物、組換えアルブミン、微量元素、抗酸化物質などを組み合わせた低タンパク質無血清培地の試作品を調製する。この低タンパク質無血清培地を調製する上で、必須の要件である組換えトランスフェリンは植物細胞で発現されたものが市販されていて、天然のトランスフェリンに匹敵する細胞増殖促進効果を持つことを確認している。(3)Jurkatで実施したLDL除去血清中で馴化するLDL低依存性細胞株の樹立法から、組換えアルブミン、組換えトランスフェリンを利用した新しい馴化培地の開発に転換するために再検討を開始する。(4)LDL低依存性Jurkat細胞株の樹立によって、コレステロール生合成関連酵素群の遺伝子を細胞に人工的に導入すれば、LDL非依存性株の簡便な樹立が期待できるようになった。そこで、遺伝子を高効率で導入できるHEK293、CHO細胞などタンパク発現系にも広く利用される細胞株について、コレステロール合成関連遺伝子を導入すれば実際に血清非依存性細胞株が樹立できるかどうか検討したい。第一に今年度の研究において、補体系因子の効果を解析することを中止することとしたために、高価な組換えタンパク質の購入が不要となったことである。また、今年度、LDL除去血清中で馴化するLDL低依存性細胞株の確立に関してほとんど検討ができなかったために、これにかかる消耗品の購入に対する費用がかからなかった。LDL除去
孤発性ＡＬＳにおけるＲＮＡ編集酵素活性制御異常の分子病態の解析

孤発性筋萎縮性側索硬化症(ALS)脊髄運動ニューロンでは,AMPA受容体のサブユニットGluA2に本来行われるべきRNA編集が不充分で、この分子変化はAMPA受容体のCa2+透過性亢進を通じて運動ニューロン死の直接原因であることから、孤発性ALSの病因と密接に関連すると考えられる。GluA2のRNA編集は、adenosine deaminase acting on RNA 2 (ADAR2)により特異的に触媒されることから,孤発性ALS運動ニューロンにおけるADAR2活性低下のメカニズムを明らかにすることは病因解明、治療の分子ターゲットの同定のために極めて重要な課題であると考えられる。昨年度、30例以上の孤発性ALS患者剖検組織を用いた単一運動ニューロンの検討から、GluA2 Q/R部位のRNA編集率低下は疾患特異的分子異常であり、選択的なADAR2の発現低下に依り引き起こされることが明らかになった。本年度は、その下流および上流に生じている分子メカニズムの解析を進めた。下流のメカニズムとしては、TDP-43の局在異常がおこること、それがCa2+透過性AMPA受容体の発現増加によるCa2+依存性プロテアーゼであるカルパインの活性化、カルパインによる特異的TDP-43切断、切断による易凝集性断片の形成、それがコアとなっての封入体形成、というカスケードがin vitro実験系を用いて明らかにした。さらに、患者の病的組織にもカルパインの活性上昇及びカルパイン依存性TDP-43断片が見出されたことから、ALS運動ニューロンにも同様のカスケードが働いていることが想定された。上流のメカニズムとしてADAR2の発現低下が遺伝子の転写活性低下であると考えられるため、ADAR2遺伝子プロモーター領域の、ルシフェラーゼを用いたレポーターアッセイ系を確立した。24年度が最終年度であるため、記入しない。孤発性筋萎縮性側索硬化症(ALS)脊髄運動ニューロンでは,AMPA受容体のサブユニットGluR2に本来行われるべきRNA編集が不充分で、この分子変化はAMPA受容体のCa2+透過性亢進を通じて運動ニューロン死の直接原因であることから、孤発性ALSの病因と密接に関連すると考えられる。GluR2のRNA編集は、adenosine deaminase acting on RNA 2(ADAR2)により特異的に触媒されることから,孤発性ALS運動ニューロンにおけるADAR2活性低下のメカニズムを明らかにすることは病因解明、治療の分子ターゲットの同定のために極めて重要な課題であると考えられる。本研究では患者剖検組織を用いてADAR2活性低下の有無およびメカニズムを検討した。レーザーマイクロディセクターを用いて切り出した単一運動ニューロンの検討から、30例以上の孤発性ALS全例で未編集型GluR2を発現する運動ニューロンが見られ、疾患対照、正常対照では全ての運動ニューロンが編集型GluR2のみを発現していた。ALS運動ニューロンでは3種のADAR酵素の内ADAR2のみ発現量、特異的基質におけるRNA編集率が低下しており、特に未編集型GluR2を発現する運動ニューロンでの低下が著しかった。このことは、孤発性ALS運動ニューロンにおけるGluR2Q/R部位のRNA編集率低下は疾患特異的分子異常であり、選択的なADAR2の発現低下に依り引き起こされることを意味している。本研究により、運動ニューロン死を引き起こす分子異常であるGluR2Q/R部位のRNA編集異常を引き起こす上流の分子変化が明らかになった。

本年度の研究で、孤発性ALS運動ニューロンに見られるGluR2のRNA編集率低下の分子メカニズムが、特異的RNA編集酵素ADAR2の選択的発現低下に依ることが明らかになった。また、ALSの大多数を占める孤発性ALSに共通した分子変化であることも明らかになり、病因解明に一歩近づいたと考える。24年度が最終年度であるため、記入しない。ADAR2発現低下が孤発性ALSの病因に密接に関与することが明らかになり、ADAR2発現の制御機構の解明が孤発性ALSの病因解明、治療の分子ターゲットの同定に繋がると考えられる。ADAR2遺伝子発現調節のメカニズムは未解明であり、プロモーター領域も明らかにされていない。制御機構の全貌を明らかにすることが必須で、時間が掛かるものの、ADAR2の発現に影響を及ぼす物質を探索し、それを用いてプロモーター領域を同定し、レポーターアッセイ系の構築を通じて、ADAR2遺伝子発現制御に関わる分子の同定を行っていく必要がある。
膵癌組織内で構築される免疫寛容・転移促進の分子基盤の解明と新規治療法の開発

申請者らは膵癌組織が豊富な線維性間質を有し、血管外血小板と腫瘍関連線維芽細胞(cancer-associated fibroblast: CAF)を中心としたデスモプラジアな間質が上皮間葉転換、免疫寛容、薬剤抵抗性状態を誘導していることを報告してきた。この間質の応答に関して、申請者らは新規血小板活性化受容体であるCLEC2とそのリガンドであるpodoplaninを発現する線維芽細胞との細胞間相互作用において、CLEC-2受容体/podoplaninを介したCAFの活性化に注目している。さらに近年では間質の「細胞老化」が癌の増殖や進展を誘導することが示唆されているが、老化細胞が長期間生存し続けると、IL-6などの炎症性サイトカインや細胞外マトリックス分解酵素(MMP)など、炎症や発癌を促進する因子を分泌するSASP(senescent associated secretory phenotype)とよばれる現象が惹起されることが明らかになっており、CAFの活性化と細胞老化に着目して実験を計画した。2年目である当該年度には膵癌患者の切除標本を用いて術前化学療法別のpodoplanin陽性CAFを検討し、GnP(ゲムシタビン+ナブパクリタキセル)の術前療法が化学療法未施行群に比べて有意にその発現が低率であることを確認した。さらにヒト膵線維芽細胞に対して放射線照射(10Gy)を行い、DNAダメージを加えると老化細胞に特異的なp16およびSenescence associated β-galactosidaseが発現し、SASP因子であるIL-8やMMP-1の発現上昇も認められ、SASPが誘導されていることが確認された。最終年度となる来年度はSASPが誘導された膵線維芽細胞の上清を膵癌細胞と共培養し、膵癌細胞の浸潤能、移動能、増殖能に対する影響などを検討する予定である。ヒト膵癌切除標本やヒト膵線維芽細胞株を用いて病理組織学的・分子生物学的に検討を行っている。SASPが誘導された膵線維芽細胞の上清を膵癌細胞と共培養し、膵癌細胞の浸潤能、移動能、増殖能に対する影響などを検討する予定である。膵癌組織に特有なdesmoplastic stroma内での腫瘍関連線維芽細胞(CAF)の果たす役割が注目されているが、CAFへと分化していく分子メカニズムはいまだ不明な点が多く、また癌細胞との細胞間相互作用の分子基盤も詳細には解明されていないのが実状である。申請者らは膵癌原発巣の間質内に血管外血小板が存在し、この活性化血小板が膵癌細胞の上皮間葉転換(EMT)を誘導し、浸潤・転移に深く関与していることを内外で最初に報告してきた。一方、膵癌間質内の血管外活性化血小板とCAFとの関連は明らかでない。申請者らはCLEC2受容体を発現する血小板とCLEC2のリガンドであるpodoplaninを発現する線維芽細胞との細胞間相互作用において、CLEC-2受容体/podoplaninリガンドを介した血小板の活性化によるCAFの誘導さらには血小板の貪食によるCAFの細胞老化への誘導の可能性に着目して実験を計画した。初年度である当該年度には膵癌患者の切除標本を用いて膵癌の間質における老化した線維芽細胞の有無を検討した結果、線維芽細胞(αSMA染色)上に老化蛋白(p16染色)の発現が散在性にみられ、老化した線維芽細胞が確認された。またこのように老化蛋白を発現する線維芽細胞の中にはSASP因子(IL-6染色)の発現も認められ、SASPに至った老化線維芽細胞が存在することが示唆された。来年度はヒト膵線維芽細胞に放射線照射によるDNAダメージを与え、細胞の老化さらにはSASPが誘導されるかどうかを検討する予定である。さらにSASPが誘導された膵線維芽細胞を用いて、膵癌細胞の浸潤能、移動能、増殖能に対する影響を検討する予定である。膵癌細胞株およびヒト膵癌切除標本を用いて病理組織学的・分子生物学的に検討を行っている。さらにヒト膵線維芽

細胞に対して放射線照射(10Gy)を行い、DNAダメージを加えると老化細胞に特異的なp16およびSenescence associated β-galactosidaseが発現し、SASP因子であるIL-8やMMP-1の発現上昇も認められ、SASPが誘導されていることが確認された。最終年度となる来年度はSASPが誘導された膵線維芽細胞の上清を膵癌細胞と共培養し、膵癌細胞の浸潤能、移動能、増殖能に対する影響などを検討する予定である。ヒト膵癌切除標本やヒト膵線維芽細胞株を用いて病理組織学的・分子生物学的に検討を行っている。ヒト膵癌切除検体から膵線維芽細胞を樹立し、放射線照射(10Gy)を行うことでDNAダメージを与え、老化細胞に特異的とされるSenescence associated β-galactosidaseによる染色を行い、細胞老化の有無を評価する予定である。SASPが誘導された膵線維芽細胞の上清を膵癌細胞と共培養し、膵癌細胞の浸潤能、移動能、増殖能に対する影響などを検討する予定である。理由:分子生物学的検討のために購入予定であった試薬の一部の購入を来年度に先送りしたため。使用計画:Western BlotおよびRT-qPCRを含めた分子生物学的検討を行う。次年度使用額はその際の試薬購入に使用する。分子生物学的検討のために購入予定であった試薬の一部の購入を来年度に先送りしたため。Western BlotおよびRT-qPCRを含めた分子生物学的検討を行う
ヒト動作における二関節筋の力学的・生理学的役割の解明

ヒト動作に伴う二関節筋特異な力学的・生理学的特性の役割を明らかにするために、二関節筋の活動レベルを不随意的にコントロールし、ヒト動作中の二関節筋の長さと筋活動レベルが力発揮にどのような影響を及ぼしているかを検討した。動作中に二関節筋の活動レベルをコントロールした力発揮能力は随意的筋活動における収縮特性とは異なっていた。このことから、随意的筋活動における力発揮では、二関節筋による神経制御は重要な働きをしていることが示唆された。ヒト動作では各筋肉が力を発揮し、その力学的エネルギーが腱を通して骨に伝わり目的に沿った動作を達成させている。筋には一つの関節を跨いでいる単関節筋、二つ以上の関節を跨いでいる複合関節筋(主に二関節筋)に大別され、それぞれ異なった役割をしている。2つ以上の関節運動を伴う複合関節動作では、単関節筋と二関節筋が関与しており、二関節筋は一端で伸張され他端で短縮する拮抗的な活動が起きている。このことからヒト動作に関わる多くの筋の中でも、特に二関節筋の複雑な神経-筋制御機構はヒト動作を機能的に遂行する上で重要な鍵であると考えられる。しかしながら、これまでヒト動作に伴う二関節筋の活動様式や長さ変化と力発揮の関係は推定の域でしか理解されておらず、実際に測定しその特性を明らかにした例は存在しない。そこで、本研究では、ヒト動作における二関節筋の活動様式や関節角度(筋長)の変化がどのように力発揮に影響をしているかを可視化、定量化する方法論を確立し、ヒト動作に伴う二関節筋特異な力学的・生理学的特性の役割を明らかにすることを目的とする。本研究の成果は、ヒト動作を効率的に機能させるために有効なリハビリテーション法と動作を支持する新しい生体工学装置の開発の基礎となることが期待される。本年度は二関節筋の活動レベルを不随意的にコントロールし、ヒト動作中の二関節筋の長さと筋活動レベルが力発揮にどのような影響を及ぼしているかを検討した。動作中に二関節筋の活動レベルをコントロールした結果、静的動作における長さ-張力関係と動的動作における力-速度関係は随意的筋活動における収縮特性とは異なった。これらの結果から、随意的筋活動における力発揮では、二関節筋による神経制御は重要な働きをしていることが示唆された。しかしながら、これまでヒト動作に伴う二関節筋の活動様式や長さ変化と力発揮の関係は推定の域でしか理解されおらず、実際に測定しその特性を明らかにした例は存在しない。本研究の成果は、ヒト動作を効率的に機能させるだめに有効なリハビリテーション法と動作を支持する新しい生体工学装置の開発の基礎となることが期待される。二関節筋の活動レベルを不随意的にコントロールし、ヒト動作中の二関節筋の長さと筋活動レベルが力発揮にどのような影響を及ぼしているかを検討した。
神経毒性アミロイドβ凝集体構造決定と分子間相互作用解析

アルツハイマー病患者脳内におけるアミロイドβタンパク質(Aβ)の凝集・沈着および毒性体の形成は、疾患の発症メカニズムにおいて重要な過程であると考えられている。近年、脂質膜がAβをその表面へ集積させ、構造変化を誘導することでAβ凝集を促進することが報告されている。本研究では、Aβ-脂質膜間結合、脂質膜上のAβ構造変化およびアミロイド線維形成を、高い正の曲率を持つ脂質ベシクルが促進することを明らかにした。また、脂質膜の物理化学的性質の違いにより、脂質膜上のAβ構造が異なることが明らかとなった。脂質膜に結合したアミロイドβ構造解析をおこなうため、Aβが安定に膜に結合・構造形成する条件の検討をおこなった。これまでにAβとの相互作用が報告されている脂質膜系(負電荷を持つ脂質膜またはゲル相の脂質膜)を用いて、Aβの脂質膜への結合、分子構造変化、および凝集体形成を評価した。蛍光法を用いてAβー脂質膜間結合を評価したところ、粒径の小さい脂質二分子膜ベシクル(膜曲率が高い)に対して、Aβの結合性が増大することが明らかとなった。また、膜上でAβはαヘリックスおよびβシート構造を形成することがCDスペクトル測定により明らかとなった。チオフラビンT蛍光測定および透過型電子顕微鏡観察から、膜上でのAβ密度が高い条件で凝集体の形成が促進されることがわかった。この凝集体形成には、1-2週間程度のインキュベートを要した。膜上でのAβ構造を明らかにするため、蛍光消光法とアミノ酸変異を組み合わせた解析をおこなったところ、脂質膜環境が異なると、膜結合Aβのアミノ酸配列上でのαヘリックス形成部位が異なっていることが示唆された。より詳細な分子構造解析のため、既に確立している二次構造決定法に加え、新たなスペクトル解析・構造決定法を開発した。これを用いて、現在のところモデルタンパク質試料において、立体構造モデルの決定、会合体中のタンパク質分子間相互作用解析が可能であるという結果を得ており、アミロイドβ構造解析にも利用できると考えている。脂質膜に結合したアミロイドβ集合体の構造解析をおこなうため、Aβが膜に結合・構造変化する条件の検討をおこなった。蛍光法を用いてAβー脂質膜間結合を評価したところ、粒径30 nm程度の小さい脂質二分子膜ベシクル(膜曲率が高い)に対して、Aβの結合性が増大することが明らかとなった。チオフラビンT蛍光測定および透過型電子顕微鏡観察によるアミロイド線維形成の評価から、膜上でのAβ密度が高い条件で線維形成が促進されることがわかった。この凝集体形成には、15 μMのAβで1-2週間程度かかることが明らかとなった。膜上でのAβ構造を明らかにするため、蛍光消光法とアミノ酸変異を組み合わせた解析をおこなったところ、脂質膜環境が異なると、膜結合Aβのアミノ酸配列上でのαヘリックス形成部位が異なっていることが示唆される結果が得られた。以上より、脂質膜の曲率が高くなることで、アミロイドβの膜結合、構造変化、線維形成が誘導されることが明らかとなるとともに、膜結合Aβの構造情報を得ることができた。本研究の目的のひとつとしていたアミロイド凝集体試料の作成法が確立できた。タンパク質構造についても一定の情報がすでに得られている。スペクトル解析および構造解析法を開発し、凝集体中のタンパク質の立体構造、分子間相互作用を明らかにするための方法が確立できた。生物物理化学凝集体中のアミロイドβ構造を詳細に解析する。これまでに確立した方法で、アミロイドβ凝集体を調製し、アミロイドβ凝集体の安定同位体標識試料のスペクトル解析をおこなう。次年度使用額が生じた理由として、当初の計画に比べ、研究成果発表のための国内旅費が少なかったことが挙げられる。これは招待講演などで旅費の支援を他機関から受けられたためである。学会参加旅費に充てることで、より積極的に研究成果を発信していく。
気孔孔辺細胞におけるアブシジン酸に応答した蛋白質リン酸化反応の解析

植物ホルモン・アブシジン酸に応答した気孔閉鎖のシグナル伝達を解明することを目的として、孔辺細胞プロトプラストにおける蛋白質リン酸化反応について解析を行い、ソラマメ孔辺細胞プロトプラストにおいて、61kDa蛋白質がアブシジン酸処理により14-3-3蛋白質と結合し、この反応が61kDa蛋白質のリン酸化に依存していることを見出した。さらに、詳細な解析を行ったところ、この反応は、孔辺細胞特異的な反応であり、さらに、61kDa蛋白質は、すでにアブシジン酸に応答した気孔閉鎖に関与することが知られているAAPK(アブシジン酸活性化プロテインキナーゼ)により直接リン酸化されていることが示唆された。以上の結果は、61kDa蛋白質がAAPKの下流で、気孔閉鎖において重要な役割を担っていることを示している。また、同様な実験をモデル植物シロイヌナズナの孔辺細胞プロトプラストを用いて行ったところ、53kDaの蛋白質が、アブシジン酸処理により14-3-3蛋白質と結合することを見出し、この蛋白質がソラマメ孔辺細胞の61kDa蛋白質のオーソログである可能性が考えられた。さらに、アブシジン酸非感受性変異体abi1-1においては、アブシジン酸に依存した14-3-3蛋白質の53kDa蛋白質への結合が見られず、このリン酸化反応が、気孔閉鎖において重要な役割を果たしていることが明らかとなった。この研究と並行して、^<32>Pラベルしたソラマメ孔辺細胞を用いたアブシジン酸に応答したリン酸化レベルの変動する蛋白質の網羅的探索を行い、可溶性の55,50,47,19,15kDaの蛋白質、膜画分の100,85kDaの蛋白質がアブシジン酸処理後、10分以内にリン酸化されることを初めて見出した。本研究では、気孔閉鎖を誘導する植物ホルモン・アブシジン酸に応答した気孔孔辺細胞における蛋白質リン酸化反応の解析を行ってきた。まず、^<32>Pラベルしたソラマメ孔辺細胞プロトプラストにおけるアブシジン酸に応答したリン酸化反応を調べ、可溶性画分の55,50,47,19,15kDaの蛋白質とミクロゾーム膜画分の100,85,80kDaの蛋白質がアブシジン酸添加後、10分以内にリン酸化レベルが上昇することを見出した。また、可溶性画分の35kDa蛋白質は、アブシジン酸添加によりリン酸化レベルが低下した。今後は、2次元電気泳動やリン酸化蛋白質精製カラムを用いてこれら蛋白質の精製を行い、質量分析により同定を進める予定である。一方、様々なリン酸化蛋白質と結合することが知られている14-3-3蛋白質をプローブに用いたファー・ウエスタン法によるリン酸化蛋白質の解析も行い、孔辺細胞の61kDaの可溶性蛋白質がアブシジン酸に応答してリン酸化され、14-3-3蛋白質と結合することを見出した。アブシジン酸による61kDa蛋白質のリン酸化は根や葉において見られず、孔辺細胞特異的なものであり、14-3-3蛋白質に対する抗体を用いた免疫沈降により14-3-3蛋白質と共同沈降することから、実際に孔辺細胞内で14-3-3蛋白質と結合しているものと思われる。また、アブシジン酸に応答した気孔閉鎖において2次メッセンジャーとして関与が考えられているH_2O_2は、61kDaのリン酸化には影響を与えず、61kDaのリン酸化はH_2O_2発生の上流または、別のシグナル伝達で関与していることが示唆された。さらに、61kDaの同定に向けて2次元電気泳動により解析を行ったところ、61kDa蛋白質は、等電点約5.8の単一スポットとして分離されることが明らかとなった。現在、この単一スポットをゲルより切り出し、質量分析による同定を進めている。

この研究と並行して、^<32>Pラベルしたソラマメ孔辺細胞を用いたアブシジン酸に応答したリン酸化レベルの変動する蛋白質の網羅的探索を行い、可溶性の55,50,47,19,15kDaの蛋白質、膜画分の100,85kDaの蛋白質がアブシジン酸処理後、10分以内にリン酸化されることを初めて見出した。
ベトナム二輪車産業における部品取引関係と地場部品企業の成長

本研究は、日本型と中国型という異なる産業組織モデルが移植され、競争的適応を遂げたベトナム二輪車産業を事例として、部品取引関係の変容が地場部品サプライヤーの成長に及ぼした影響を明らかにしようとする試みである。企業レベルの詳細な調査に基づき、部品取引関係の変容は地場部品サプライヤーに対し新たな参入機会を創出したが、サプライヤーが新たな取引機会を通じて自らの能力形成ひいては企業成長を達成し得たか否かは、サプライヤーの学習への投資によって説明されることが明らかにされた。本研究の成果は、日本と中国の産業組織モデルの他の途上国への移転可能性、および、地場企業の能力形成メカニズムにかかわる研究の系譜に新たな視点を提供するものである。ベトナム二輪車産業は、伝統的に日系二輪車企業の寡占市場であったが、2000年代初頭、中国製品が大量に流入する「中国ショック」を契機として、模倣車の生産を手がける地場組立企業が多数参入し、市場を巡る企業間競争を通じた成長のダイナミズムがもたらされた。本研究は、同産業における部品取引関係の変容および地場部品企業の能力構築のプロセスとメカニズムを解明することを目的としている。平成20年度には2回の現地調査を行った。ベトナム地場部品企業約20社を対象とし、1990年代末以降、各社はどのような技術能力を構築してきたのか、能力構築のために必要な知識はどこからどのように獲得されたのかを把握すべく、各社13回の詳細なインタビュー調査を実施した。調査の主なファインディングは次のとおりである。(1)日系二輪車企業のサプライヤーには、生産にかかわる能力(機械・設備・金型などにかかわる能力および生産管理能力)の段階的な向上が考察されるいっぽう、製品企画(開発・設計)能力の向上はほとんどみられなかった。(2)ただし、日系二輸車企業のサプライヤーの間でも能力構築のパフォーマンスには差がみられた。(3)地場組立企業のサプライヤーは、基本機種の設計を模倣し、国内市場の低い品質要求水準を満たすにとどまっているものが多数であり、能力向上はおおむね限定的であった。しかし、独自の市場調査とマーケティング活動を行い、組立企業にかわって基本機種の設計に多様な変更・改善を施すなど、製品企画およびマーケティングの能力を向上させている例も一部でみられた。以上の地場部品企業の能力構築のプロセスの特徴を踏まえ、二輪車企業の外注戦略(製品要求の提示方法、支援、モニタリングまでを含む)およびサプライヤー側の戦略の相互作用が能力構築のプロセスをどのように規定しているのか、さらなる調査と分析を進めることが今後の課題である。ベトナム二輪車産業は伝統的に日系二輪車企業の寡占市場であったが、2000年代初頭、中国製品が大量に流入する「中国ショック」を契機として、模倣車の生産を手掛ける地場組立企業が多数参入し、市場をめぐる企業間競争を通じた成長のダイナミズムがもたらされた。本研究は、同産業における部品取引関係の変容および地場部品企業の能力構築のプロセスとダイナミズムを解明することを目的としている。平成21年度には、(1)二輪車企業の部品取引関係の変容、(2)サプライヤーの能力構築のそれぞれについて分析を進めた。(1)については、ベトナム地場組立企業のうち近年まで存続している5社を対象とした事例考察を行い、(1)地場組立企業の部品取引は、参入当初から標準化された部品の市場取引という性格が強かったが、日系二輪車企業との競争の激化など市場・政策環境が変化した後も依然として市場取引が継続する傾向がみられること、(2)これは、品質向上の必要性の高まりとともに市場取引から徐々に統合型組織へのシフトがみられる中国とは異なった変化の方向であること、(3)この違いは、両国の産業基盤や企業の能力の違いによって説明されること、を明らかにした。以上の成果は、日本語論文(以下11.参照)および英文ディスカッションペーパーとしてとりまとめた。(2)に関しては、平成20年度に実施した地場部品企業21社の調査結果の分析を進め、各社の1990年代以来の能力構築の経路、および、能力構築の過程における知識の源泉および獲得方法を整理した。日系二輪車企業および地場組立企業の間の競争を通じて部品取引関係に変化が生じたことにより、地場部品企業の参入の余地、二輪車企業の部品企業に対する品質等の要求のレベルや支援の有無に変化が生じた一方、それらを自らの能力構築に活かすことができたか否かは多分に部品企業側の学習戦略や活動によっていることが明らかになった。本研究は、伝統的に日系二輪車企業の寡占市場であったベトナム二輪車産業において、中国製模倣車が大量に流入する「中国ショック」が惹起した企業間競争と産業発展のダイナミズムを題材とし、同産業における部品取引関係の変容および地場部品企業の能力構築のメカニズムを解明することを目的としている。本研究の最終年度にあたる平成22年度には、部品取引関係の変容についての分析を進めた。

主なファインディングは次の2点である。(1)ベトナムにおける部品取引関係の変容は、長期的かつ緊密な取引関係をベースとする日本型組織モデル、多数の企業間の激しい競争とスポット的取引に特徴づけられる中国型組織モデルのベトナムの市場・政策環境への適応、および、ベトナム市場を巡る両社間の競争を通じた変容のプロセスとして捉えられる。(2)日本企業は、自らの組織モデルをベトナムで実践するにあたり、日本で育まれてきた組織モデルを新たな環境変化に柔軟に適応させつつも、低価格モデルの開発や国内部品企業の育成など、適応に必要な条件を自ら積極的に作り出してきた。これに対し、中国型の組織モデルを継承したベトナム地場二輪車企業の部品取引関係の変化は、新たなチャンスを捉えた部品企業の成長という偶然の外部的要因を活用することによってもたらされたものであった。本研究は、近年、特徴が解明されつつある中国型の組織モデルが他の発展途上国にも移転可能である一方で、その移転可能性が現地における企業参入およびそれを支える産業基盤の有無に多分に依拠していること、二輪車産業において長らく支配的な位置を占めてきた日本型組織モデルにも、発展途上国における中国型の組織モデルの台頭を契機として適応と変容が生じていることを実証的に論じたほぼ唯一の成果である。
多変量回帰モデルにおける推定理論の展開とその応用に関する研究

1.線形回帰モデルにおいて未知の説明変数を逆推定する問題(線形校正問題)について,決定理論の立場から優れた合理的な推定方式の導出を行った。具体的には,モーメントが存在してかつ最尤推定量を改良する推定量を求めた。2.混合線形回帰モデルにおける分散成分の推定問題について,従来の平均2乗誤差による推定量の良さの評価に代えて,Kullback-Leibler損失関数を用いることにより,推定問題の構造を明らかにすることに成功した。具体的には,筆者らが開発したIERD(Integral Expression of Risk Difference)法を用いて,不偏推定量を改良していてかつ常に正値を取る推定量の導出を行った。また,通常の打ち切り推定量が経験ベイズ推定量として位置づけられることを示すとともに,優れた一般化ベイズ推定量を求めた。これらの結果を,回帰係数の推定及び検定問題とsmall-area推定問題に適用した。分散成分の区間推定についても,いくつかの決定理論的な結果を得た。3.分散比の2重縮小推定量の導出は,この分野の多くの研究者の多くの研究者の興味の対象であり,open problemとして知られてきた問題である。筆者はIERD法を適用することにより,通常の単純宿縮小推定量を改良している2重縮小推定量の導出に成功した。
下側頭連合野における記憶を担う神経回路の解析

本研究の目的は、視覚情報の保持に下側頭連合野のニューロンがどのように関与し、またどのような神経回路がその機能を実現しているのかを明らかにすることにあった。この目的のため、サルに視覚性記憶課題を行わせ、側頭葉前腹側部(側頭極皮質・嗅周囲皮質)およびTE野から、ニューロン活動を記録し解析した。この課題では、サルはモニターに呈示された写真を記憶し、2-5秒後に呈示される写真が記憶した写真と異なるか否かを正しく判断することが要求される。記憶したニューロンのうち、225個のニューロンが記憶すべき写真に応答を示した。このうち30%(68個)のニューロンは、その後情報を保持していなければならない2-5秒の期間(遅延期)にも応答し続けた。この遅延期の持続的な応答は、1)記憶すべき写真に対する応答と強い相関を示す、2)記憶が不必要になるとその応答が止まる、という特徴を示した。このことは、遅延期の応答は視覚情報の保持を反映したものであることを示唆する。側頭葉前腹側部において遅延期の応答を示すニューロンがTE野より多く見つかり、情報の保持による重要であることを示唆する。これらの結果は、論文としてまとめた(Nakamura and Kubota,Journal of Neurophysiology,1995,in press).また、どのような神経回路が持続的な応答を実現しているのかを調べる目的で、スパイクの時系列パターンを解析した。まず、スパイク間隔を解析した。ニューロンが遅延期にランダムにスパイクを出しているのではなく、スパイクが高頻度で見られる期間と有為に少ない期間があることが示された。さらにスパイク列の自己相関を計算してみると、振動現象がみられた。このことは、スパイク群が一定間隔で繰り返し現れることを示す。振動現象は、1)遅延期の後半でより顕著になる、2)遅延期が長いほど顕著になる、という性質から、数秒以上にわたり情報を保持する神経回路の活動を反映したものである可能性がある。振動現象は、相互に興奮しあうニューロン群の結合による可能性が考えられる。結果の一部は、国際シポジウムで発表した(Kubota and Nakamura,1994)本研究の目的は、視覚情報の保持に下側頭連合野のニューロンがどのように関与し、またどのような神経回路がその機能を実現しているのかを明らかにすることにあった。結果の一部は、国際シポジウムで発表した(Kubota and Nakamura,1994)
新奇なγ-アミノ酪酸オキシダーゼを用いるγ-アミノ酪酸の高感度測定法の開発

γ-アミノ酪酸(GABA)は神経伝達物質として知られ,アルツハイマーの予防,ダイエット効果,ストレス軽減,精神安定などの効能があり,健康食品に広く利用されている。このGABAを補酵素や他の基質を添加せず,溶存酸素を用いてコハク酸セミアルデヒド,アンモニア,過酸化水素を生成するGABAオキシダーゼを,Acinetobacter calcoaceticus EN-B-628とPenicillium sp.KAIT-M-117から,世界で初めて見出すことに成功した。EN-B-628株のGABAオキシダーゼ産生能は不安定:で酵素の抽出が困難であったが,KAIT-M-117株のGABAオキシダーゼ産生能は安定しており,酵素の抽出も容易であった。このKAIT-M-117株由来のGABAオキシダーゼを,硫安塩析とOctyl-Sepharose,DEAE-Sepharose,ヒドロキシアパタイトにより比活性11.2U/A_<280>,総活性0.448Uまで精製できた。精製酵素は,Native-PAGEとSDS-PAGEにより,ほぼ単一タンパク質にまで精製できた。精製酵素の基質特異性は高く,GABAに対してのみの酸化反応を触媒し,グリシン,β-アラニン,5-アミノ吉草酸,6-アミノカプロン酸,グルタミン酸には全く反応性を示さなかった。また,本酵素は,pH79,40°C(15分処理)以下で安定,またpH8(0.1Mリン酸塩緩衝液),40°Cで最も高い反応性を示した。本酵素のKm値は,pH7で3.10×10^<-2>M,pH8で1.26×10^<-2>M,pH9で3.14×10^<-3>Mとなり,pHにより大きく変化した。pH9でのGABAに対する検量線は,13mMで直線性を示した。本酵素を用いてヨーグルト中のGABAを測定することができた。平成15年度の研究では、環境にやさしいγ-アミノ酪酸(GABA)の新しい測定法を開発することを前提に、新奇なGABAオキシダーゼを微生物から発見することを目的として本酵素のスクリーニングを実施した。全国から土壌を集め、0.1%GABA含有寒天平板培地を用いる集積培養法によりGABA資化菌を選別した。その結果、土壌24サンプルからGABA資化菌227株(細菌:168株、糸状菌:59株)を取得した。次に、GABA資化菌を一定条件下で液体培養(0.1%GABA、0.05%酵母エキス、および無機塩からなる培地)し、GABA分解能について薄層クロマトグラフィーを用いて調べた。その結果、GABA資化菌166株(細菌:132株、糸状菌:34株)に分解能を確認した。これらの分解菌を上記の培地で液体培養し、菌体内外におけるGABAオキシダーゼの有無について検討した。その結果、細菌1株と糸状菌2株にGABAオキシダーゼ活性を確認した(菌体内酵素)。最も活性の高かった糸状菌を同定した結果、Penicillium属に属する糸状菌で、本株をPenicillium sp.KAIT-M-117と名づけた。