hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
地方の活性化の動向と課題

3.大量のそして多種多様の情報は、行政上の区分施策のテーマ毎に集められているので細分化されすぎで、地方の実態を必ずしも反映していない。地域社会は住民の包括的な生活の場としての生きられる共同体であり、またアイデンティの根源としての準拠される共同体であり、総合的な把握が必要である。地方をめぐる動きは、時代とともに変化している。'60年代の高度経済成長期前半までは、集団就職が象徴しているように、地方の過剰人口が問題とされた。'70年代の高度成長期後半以後は、逆に地方の過疎化が注目され,高令者対策とともにコミュニティの機能の維持が課題であった。'80年代には、都市化の急激な進行と併行して、地方の活性化・地域振興が重要な課題とされて、今日に到っている。ふるさと創生・一億円事業を契機として、'90年代以降は、人々のふるさとへの関心が高まり、各地でまちづくり、むらおこしなどの地域振興活動が活発化している。これらの動向は、次の諸点に要約されるが、内発的活性の道は多様で、課題も多い。1.行政側を中心に、各地域でまちづくり活性化のための諸事業が大量に企画され、政府の補助事業として実施中である。2.行政側の動きと併行して、住民のふるさとへの関心・意識が著実に高まり、伝統文化・郷土芸能・町並みの復活保存などに自発的に参加するまちづくりの住民グループが育っている。3.地域間交流事業が地方の情報発信と並んで活発になっている。4.自然環境・エコロジー問題への高い関心に支えられ、都市から地方への移住が見られる。5.福祉によるまちづくり・地域活性化の動向も注目される。地方の活性化の動向は、社会状況・時代の流れとともに変化している。'60年代の高度経済成長期の前半までは、地方の過剰人口の解消が主要な課題であった。'70年代の高度成長期の後半以降は、一転して地方は過剰流出となり、高齢者対策とともに、コミュニティ機能の維持が課題となった。'80年代には、都市化の急激な進行と併行して、地方の復権が唱えられ、地方の活性化が重要課題とされて今日に到っている。'90年以降は、ふるさと創生一億円事業を契機として、ふるさとへの関心が高まり、各地で内発的なまちづくり、地域おこしなどの地域振興活動が活発になっている。各地の活性化の動向は多様であるが、その特徴は以下の諸点に要約される。1.各地域で、自然・文化・歴史・産業・人などの地域資源の創意工夫による積極的な活用による活性化が進行している。2.地域振興のための諸事業が、行政側を中心に大量に企画され、政府の補助事業として実施される事例が多いが、その中でも過疎地域の方がより積極的に取り組んでいる例が多い。3.地域振興事業を契機として、住民のふるさとへの関心、意識が高まり、まちづくりに自発的に参画し行動する住民が増加した。4.一部地域内部だけの活性化は限界があり、巾広く柔軟な地域間の交流連携が必要で、都市との交流・地方からの情報発信などが活発化している。5.自然環境問題への関心の高まり、高齢化に伴う福祉によるまちづくりの動向が、都市との交流にも反映している。6.住民の日常生活の場である生きられる共同体と、心のより所としての準拠する共同体の両側面の有機的統合が、地域社会の今後の重要課題である。
部分多様体の剛性の研究

本研究においては種々の部分多様体の剛性を研究することが、主要な目標であった。交付申請書に書いたとうり、代表者の剱持は複素射影空間内の定ガウス曲率極小曲面の分類を行った。その結果このような曲面の族は剛性を許容することが、確かめられた。この研究の遂行過程では本研究分担者達との非公式、且つ随時に行われた情報交換が有益であった。また部分的に正であるリーマン空間内の部分多様体の剛性問題を研究するときに役に立つ交叉性定理を証明して、Pacific Journal of Mathematics誌より発表した。この定理の結論は、従来知られていた正曲率リーマン空間内の場合の交叉性定理と同じであるが、我々の拡張により非常に広いクラスの多様体に対して適用することが出来るようになったことが特徴である。分担者の尾形は実施計画書にある代数的部分多様体を研究し、特にHilbert-Picardモジュラーカスプ特異点の符号数不足指数を特異点に対応するL関数の特殊値で表した。分担者の長澤は偏微分方程式の研究を行い次の成果を得た:摩擦項を持つ半線形双曲型偏微分方程式の時間大域的弱解を時間差文法によって構成した。非柱状領域における半線形双曲型偏微分方程式の時間大域的弱解を時間差分法によって構成した。この時、領域が時刻とともに増大するという仮定の下で考察し、初期領域と微分同相である必要はない。分担者の清水は無限小正則自己同型環が多項式からなる2次元チューブ領域を研究して、その正則同値問題を解いた。
植物ホルモン応答の新規シグナル伝達制御メカニズムの解明

シロイヌナズナにおいてヒストンタンパク質が糖鎖によって修飾されていることを示した。本糖鎖は、非還元末端にGlcNAcを有していた。これまでに植物ヒストンが糖鎖修飾されることを示した報告例はなく、本成果が初めての報告となる。動物ヒストンの化学修飾はエピジェネティックコードとして高い注目を集めているのに対し植物の解析例は極めて少なく、この点において植物分子細胞生物学的に有益な報告である。加えて、被子植物界におけるα-チューブリンのアセチル化修飾の普遍性を証明するとともに、ファストプランツをモデル植物として植物成長過程や組織依存的なα-チューブリンアセチル化の動態・変動を解明した。平成25年度の研究実施計画、および、平成24年度研究実施状況報告書記載の今後の研究の推進方策に基づき、シロイヌナズナ培養細胞内在性ヒストンタンパク質につき、真にO-GlcNAc構造の糖修飾を有することを詳細に検証することとした。まず、高純度のヒストン画分を調製し、二次元電気泳動により高解像度で各ヒストンタンパク質を分離した後、複数の抗O-GlcNAc特異抗体を用いたウエスタンブロッティングを行ったところ、ヒストンH2A、ならびにH2Bは抗O-GlcNAc抗体陰性であったが、H3、ならびにH4は陽性であった。この検証において、ハプテン阻害実験による抗原抗体反応特異性を確認し、ヒストンH3、ならびにH4が抗O-GlcNAc抗体反応性の糖鎖を有すると結論した。そこで、ヒストンH3、ならびにH4の糖修飾の化学構造を分析するため、各ヒストンタンパク質の大量調製を行った。本調製にかなりの時間と労力を要したが、現在、大量調製したヒストンタンパク質を用いて糖組成分析を進行中である。なお、本研究の遂行過程において、細胞分画の指標として用いたα-チューブリンのSDS電気泳動による挙動が細胞の状態に応じて変化することに気付いた。そして、この要因としてα-チューブリンのアセチル化レベル変動が関与していることを見出した。動物細胞では、α-チューブリンのアセチル化は微小管の動的不安定性の調節機能をもち、細胞増殖や遊走と密接に関わる翻訳後修飾であることが多数の知見から明らかであるが、植物細胞においては殆ど解析例がなく、アセチル化α-チューブリンの存否すら明確ではなかった。そこで、シロイヌナズナをはじめ、被子植物界におけるアセチル化α-チューブリンの存否、ならびに、植物成長過程や組織におけるα-チューブリンのアセチル化動態等を早急に解析し、2報の学術論文として発表した(雑誌論文の稿参照)。平成24年度の研究実施計画に基づき、シロイヌナズナ培養細胞から内在性O-GlcNAc修飾タンパク質の生化学的同定を試みた。培養細胞、あるいはカルスから調製した細胞溶解サンプルに対し、抗O-GlcNAc抗体(モノクローナル抗体CTD110.6、ならびにRL2)を用いたウエスタンブロッティングにより、O-GlcNAc修飾タンパク質をサーベイした。その結果、複数の抗O-GlcNAc抗体陽性タンパク質の存在を認めた。同サンプルから、小麦胚芽アグルチニンアフィニティークロマトによりO-GlcNAc修飾タンパク質の精製を試みたが、本法では特異タンパク質の精製は困難であった。この原因として、細胞溶解サンプル中に夾雑する糖類が考えられた。そこで、細胞溶解方法を変更し、細胞分画して核画分ならびに細胞質画分を調製し、このうち特に核画分に注目してO-GlcNAc修飾タンパク質の存否を検証したところ、分子量10-20 kDa付近に2種の抗O-GlcNAc抗体陽性タンパク質の存在を認めた。核画分に豊富に存在する分子量10-20 kDaのタンパク質としてヒストンが挙げられるので、粗ヒストン画分を調製して検証したところ、ヒストンH3が抗O-GlcNAc抗体陽性を示すことを突き止めた。動物細胞においては、ヒストンのO-GlcNAc修飾はエピジェネティックコードとして注目を集めている。本研究において、植物細胞においてもエピジェネティックコードとしてO-GlcNAc修飾が用いられている可能性を示す最初の知見となりうる。よって、今後この点に特に注目して解析を進める予定である。シロイヌナズナ培養細胞の核画分から、抗O-GlcNAc抗体を用いたウエスタンブロッティングにより分子量10-20 kDa領域に2種の抗体陽性バンドを検出した。核画分における分子量10-20 kDaの主要タンパク質はヒストンであることから、抗体陽性バンドがヒストンである可能性を検証し、ヒストンH3、およびH4が抗O-GlcNAc抗体陽性であることを突き止めた。ヒストンH3、およびH4が有する糖鎖構造について、ヘキソサミニダーゼを用いた解析より、非還元末端にGlcNAcを有する糖鎖であることを示した。これまでに植物のヒストンが糖鎖を有するという報告例はなく、本成果は初めての報告となることから、現在、成果発表の準備段階に入っている。

なお、動物細胞では、ヒストンの化学修飾はエピジェネティックコードとして高い注目を集めているが、植物においての解析例は極めて少なく、この点において有益な報告となるであろう。また、シロイヌナズナ植物体タンパク質のトリプシン消化産物を用いたショットガン法によるLC-MS/MS解析により7種のO-GlcNAc修飾候補タンパク質を同定した。本研究の遂行過程において、細胞分画の指標としたα-チューブリンのSDS電気泳動による挙動が細胞の状態に応じて変化することに気付いた。この要因としてα-チューブリンのアセチル化レベル変動が関与していることを見出した。動物細胞では、α-チューブリンのアセチル化は微小管の動的不安定性の調節機能をもち、細胞増殖や遊走と密接に関わる翻訳後修飾であることが多数の知見から明らかであるが、植物細胞においては殆ど解析例がなく、アセチル化α-チューブリンの存否すら明確ではなかった。そこで、シロイヌナズナをはじめ、被子植物界におけるアセチル化α-チューブリンの存否、ならびに、植物成長過程や組織におけるα-チューブリンのアセチル化動態等を解明した。細胞生物学本研究の目的は、O-GlcNAc修飾に着目し、全く新しい切り口から植物ホルモン応答のシグナル伝達制御メカニズム解明に迫ることである。その最優先事項は、植物内在性O-GlcNAc修飾タンパク質を同定することである。平成24年度の研究実績として、シロイヌナズナ培養細胞を用い、ヒストンH3がその候補タンパク質であることを突き止めた。そして、平成25年度の研究実績では、ヒストンH3に加え、H4も候補タンパク質であり、二次元電気泳動後のウエスタンブロッティングよって、両者ともにGlcNAcを含む糖修飾を有することを結論付けた。計画では、これらの糖修飾構造の同定を平成25年度内に完了する予定であったが、化学構造同定のためのサンプル調製に時間と労力を要したため、化学構造の同定は平成26年度研究計画に継続課題として加えることになった。しかしながら、これは当初の平成26年度研究実施計画の支障となるものではなく、概ね当初の計画通りに遂行しているといえる。本研究の目的は、O-GlcNAc修飾に着目し、全く新しい切り口から植物ホルモン応答のシグナル伝達制御メカニズムの解明に迫ることである。平成24年度の研究実施計画では、シロイヌナズナ培養細胞、ならびにカルスを材料として内在性O-GlcNAc修飾タンパク質候補を同定することを目指しており、現在までにヒストンH3を候補タンパク質として同定できている。よって、概ね当初の計画通りに遂行しているといえる。平成25年度からの継続課題として、シロイヌナズナ培養細胞由来ヒストンH3、ならびにH4につき、糖修飾の化学構造を同定する。これと並行して、当初に設定した平成26年度の研究実施計画に基づき、ヒストンH3、ならびにH4がSPY/SECの標的となる植物ホルモン応答性O-GlcNAc修飾タンパク質であるか検証する。
遺伝子・細胞療法を用いた次世代血友病療法の開発と非ヒト霊長類モデルへの展開

血友病A遺伝子治療:AAV8ベクターと強力な肝臓特異的なHCRHAAT一プロモーターを用い肝臓に限定してイヌFVIIIを発現させることで、血友病AマウスにおいてイヌFVIII活性を免疫抑制なしに正常イヌFVIII活性の100%以上に保つことができ、遺伝子導入による免疫寛容が可能であることが示唆された。一方、ヒトFVIIIはマウスにおける血液半減期が極めて短く血液レベルを高めることがこれまで困難であったが、HCRHAAT-プロモーターをAAV8ベクターに用いることで血友病AマウスにおいてヒトFVIII活性を10-50%に維持することが可能となった。SIVベクターを用いて血液幹細胞へFVIII因子遺伝子を導入しGPIbαプロモーターを用い血小板へ特異的にFVIIIを発現させることで血友病マウスの出血症状を改善しえ、さらに、活性化型FVII因子を血小板に発現させることでも血友病Aマウスの全血凝固が改善し尾切断後の死亡率も改善しえた。血友病B遺伝子治療:ヒトFIX特異的モノクロナル抗体で検出可能な変異カニクイザルFIX(FIXT262A:262位のThrをAlaに置換)を発現するAAV1ベクターを3頭のカニクイザル骨格筋に投与することで変異カニクイザルFIXの血液レベルを4-40%で長期間維持することが可能であった。しかし、マウスで1000%以上のFIX発現をえることができるAAV8、AAV9ベクターをサルに門脈から投与したが、サルに既存するAAV8、AAV9に対する中和抗体が低力価でも存在すると血中に期待レベルのFIXの長期発現は得られなかった。しかし、それぞれ1頭においては20%前後と治療域に達するFIXの発現が得られた。これらの成果から、安全なAAVベクターを用いた血友病遺伝子治療が可能であることが示唆された。研究計画に従い血友病モデル動物を用いて検討した。凝固第VIII因子遺伝子搭載AAVベクターを血友病Aマウスに投与することにより、治療域レベルN正常値以上の発現を長期間安定し得られ、AAVベクターを用いた安全性が高い血友病A遺伝子治療法の可能性が示された。また、血小板特異的プロモーターの下流に第VIII因子遺伝子を配置したSIVベクターを用い遺伝子導入を行った血液幹細胞を骨髄移植することにより血小板特異的第VIIII因子発現がえられ血友病Aマウスの出血症状を改善しえ、血小板を標的とした遺伝子遺伝子治療法の可能性が示唆された。組織・臓器特異的遺伝子導入をめざした試みにおいて、PAI-1プロモーターを用いた血管内皮細胞をターゲットとすることで、炎症反応時における導入遺伝子発現低下を防ぐことができ、血友病B遺伝子治療法の可能性と優位性が示された。マウスで得られた成果をもとに、血友病B遺伝子治療の前臨床実験を非ヒト霊長類カニクイザルにおいて検討した。血友病カニクイザルは存在しないが、ベクターの有効性や安全性などを検討するうえで重要なモデル動物である。内在性カニクイザル第IX因子と識別可能に改変した変異カニクイザル第IX因子遺伝子を搭載したAAV1ベクター、AAV9ベクターを用い変異カニクイザル第IX因子遺伝子をカニクイザルに発現させたところ、治療レベルに達する導入遺伝子由来の変異第IX因子の長期発現がえられた。血友病Aマウス胸腺へのヒト第VIII因子投与、血友病A新生仔マウスの肝臓への遺伝子導入によりヒト第VIII因子に対する免疫寛容が誘導されることが示された。これらの結果は安全な血友病遺伝子治療が可能であることを示唆するとともに、臨床でも遺伝子治療においても問題となるインヒビター対策への手がかりとなるものと考えられる。

血友病A遺伝子治療:血友病Aマウスにおいて,AAV8ベクターと強力な肝臓特異的なHCRHAAT-プロモーターを用い肝臓に限定してイヌFVIIIを発現させることで,イヌFVIII活性を免疫抑制なしに正常イヌFVIII活性の100%以上に保つことができた。一方,ヒトFVIIIはマウスにおける血液半減期が極めて短く血液レベルを高めることがこれまで困難であったが,HCRHAAT-プロモーターを用いることで血友病AマウスにおいてヒトFVIII活性を10-50%に維持することが可能となった。SIVベクターを用いて血液幹細胞へFVIII因子遺伝子を導入しGPIbαプロモーターを用い血小板へ特異的にFVIIIを発現させることで血友病マウスの出血症状を改善しえ,さらに,活性化型FVII因子を血小板に発現させることでも血友病Aマウスの全血凝固が改善し尾切断後の死亡率も改善しえた。血友病B遺伝子治療:ヒトFIX特異的モノクロナル抗体で検出可能な変異カニクイザルFIX(FIXT262A:262位のThrをAlaに置換)を発現するAAV1ベクターを3頭のカニクイザル骨格筋に投与することで変異カニクイザルFIXの血液レベルを4-40%で長期間維持することが可能であった。しかし,マウスで1000%以上のFIX発現をえることができるAAV8,AAV9ベクターをサルに門脈から投与したが,サルに既存するAAV8,AAV9に対する中和抗体が低力価でも存在すると血中に期待レベルのFIXの長期発現は得られなかった。しかし,それぞれ1頭においては20%前後と治療域に達するFIXの発現が得られた。
窒化クロムの元素置換による正方晶化:要因解明と超高硬度材料の新規合成

ドリル等の切削工具に被覆される硬質薄膜の高硬度化は、切削の高効率化に直結する。そのための新しい硬質材料を開発した。窒化クロムに酸素を固溶させた新物質Cr(N,0)が高硬度と高い耐酸化性を示すことを確認した。酸素含有量の増加に伴いCrサイトの空孔が導入されて岩塩型構造を保つことが分かった。酸化マグネシウム単結品基板上にも同様の薄膜を作製することにより結晶子サイズの大きな結品が作製でき、酸素の置換が明確となり、さらに高い耐酸化性の要因を明らかにした。金属の切削加工は、もの作りの重要な基本工程の1つである。この工程に使われるドリルやエンドミル等の切削工具には、極めて硬い材料が薄膜としてコーティングされている。本研究では遷移金属窒化物の構成元素の一部を他元素に置換固溶し、結晶構造を立方晶から正方晶に転移させる。この正方晶転移は塑性変形を司るdislocationの運動を妨げ、すべり系の数を減少させるため、高硬度化に直結することとなる。薄膜の作製には、研究室に現有のパルスレーザー堆積装置を用いた。(NH_3+O_2)雰囲気中で回転CrターゲットにNd:YAGレーザーを照射し、発生したアブレーションプラズマを対向位置に設置した基板上に堆積させることにより薄膜を作製した。大気からのリークを利用し、雰囲気ガス圧、到達真空度を調整して酸素量を制御した。作製したCr(N,O)薄膜を、In-plane、Out-of-Planeの2種類のX線回折で格子定数を測定した結果、軸比c/a=1.01程度の正方晶に歪んでいる事が確認できた。ビッカース硬度はCrNの約2000に対して、3700程度となった。さらなる高硬度化を狙い、第4元素として、MgやSiの添加を試みた。Mgの場合は、CrNとMgOの擬二元系の固溶体(Cr,Mg)(N,O)が作製できたと考えられた。ビッカース硬度は(Cr,Mg)(N,O)は4500程度と極めて高硬度を実現した。一方、Siを添加した場合は(スパッタ法で作製した結果ではあるが)、SiはCrNもしくはCr(N,O)の結晶粒中には殆ど固溶しないと思われ、Siリッチな酸窒化物相が粒界層となるナノコンポジット構造を形成することが判明した。結晶粒の大きさは5nm程度であり、ビッカース硬度が5000程度と高硬度であった。本研究でターゲットにしてきたCr(N,O)および第3元素Meを添加した(Cr,Me)(N,O)を作製した。ここでMeは、現在、Mg,Al,Si,Zn,Vなどである。基本となるCr(N,O)の作製は、金属Crにパルスレーザーを照射することによりアブレーションプラズマを発生させ、対向位置に設置した基板に700°Cで堆積させた。以前の研究では、アンモニアガスとチャンバーへのリーク酸素を利用していたために、Cr(N,O)の酸素量の制御が非常に困難であった。そこで、新しく導入した超高真空用成膜チャンバーを使用し、チャンバー内を1E-6Pa以下の超高真空まで排気した後、1E-5Pa程度まで酸素を導入し、さらにRFラジカル源を用いて窒素をプラズマ化させて、1E-2Pa程度とした。導入する酸素量を調整することにより、作製するCr(N,O)薄膜の酸素量を精密に制御することが可能となった。窒素と酸素の組成が同程度のCr(N,O)薄膜を作製するためには、極めて低い酸素分圧が不可欠であることを突き止めた。CrNにOが固溶していくと、格子定数が減少することも判明した。作製したCr(N,O)薄膜は、結晶質であるが、結晶粒が微細である点に加えて、各結晶粒で酸素含有量に揺らぎがあることが疑われた。そこで格子定数が近いMgO基板を用いて、Cr(N,O)薄膜をエピタキシャル成長させることを試みた。エピタキシャル成長させた大きな結晶粒のCr(N,O)薄膜は、精密な結晶構造の判定や耐酸化性メカニズムの解明に大きく貢献する。期間の後半では、エピタキシャル成長させるための成膜条件の設定に努めた。現時点で、目的のCr(N,O)薄膜が1枚作製できた段階であり、解析等を来年度に持ち越すこととなった。また(Cr,Mg)(N,O)の作製にも成功した上、その基本となるが作製の困難が予想された酸素を含まない(Cr,Mg)N薄膜の作製にも成功したことを付記しておく。

酸素含有量を精密制御して作製したCr(N,O)薄膜の組成分析の結果、O含有量の増加に従いCr濃度の低下が見られ、金属元素と非金属元素の比は、2:3つまりCr2O3に近づく事が確認できた。以前のCr(N,O)薄膜は結晶粒が数十nmと非常に微細であるために、種々の評価が困難であった。このため格子定数が近いMgO基板を用いて単結晶に近いCr(N,O)薄膜を作製した。X線回折のφスキャンは90度毎にピークが出現しており、高分解能透過電子顕微鏡観察では基板に対して格子縞が連続していることから、薄膜がエピタキシャル成長していることを確認した。基板拘束による若干の正方晶化は見られるものの、基本的に岩塩型構造であった。これら組成分析と構造評価の結果より、Crサイト空孔の存在が示唆された。ただし、制限視野電子線回折にて2倍の超格子が確認できた試料も存在し、空孔による原子配列の秩序化の可能性が浮上した。Cr(N,O)薄膜の電気伝導性は酸素含有量の増加に伴い、電気伝導性が低下した。電子相関によるd電子の局在化と考えられる。局在化は、当初の予想であるヤーン・テラー効果の発現を期待させるが、Cr空孔の存在はヤーン・テラー効果の発現を否定する要因である。過去に見られた正方晶化は、秩序化等の構造起因である可能性が浮上してきた。多結晶Cr(N,O)薄膜の酸化挙動は、系外から供給された酸素が粒界拡散によりCr(N,O)を酸化させるモデルが考えられていたが、粒界が極めて少ないエピタキシャル膜で評価した結果、酸素はCr(N,O)結晶粒内を拡散していることが判明し、結晶粒内の酸素量が増加しても岩塩型を維持していた。構造を維持した固溶限内での酸素量の増加は、高硬度化に直結することから、Cr(N,O)は、高温の酸化雰囲気中で材料自らが高硬度化するインテリジェントマテリアルと捉えられることが判明した。目標としていた(Cr,Mg)(N,O)薄膜の作製には成功した。24年度が最終年度であるため、記入しない。正方晶化の判定は、微結晶の薄膜では非常に難しいことが判明したため、エピタキシャル成長させ結晶粒の大きな薄膜で検証を行うこととした。
デジタル電子顕微鏡三次元再構築法による嗅球カルレチニン免疫陽性ニューロンの解析

嗅球は匂い分子受容体を発現した嗅受容細胞からの入力を受ける領域で、嗅受容細胞から入力された情報を処理し、嗅球投射ニューロンの興奮としてより高次の領域へと投射する。この嗅球内での情報処理が、少数の匂い分子受容体により無数の匂いを識別するメカニズムに関連すると考えられており、嗅受容細胞および嗅球投射ニューロンの双方が接続する嗅球糸球体の神経回路の解析が進められている。本研究は、糸球体の主要な細胞群であるカルレチニン免疫陽性ニューロンを、デジタル電子顕微鏡を用いた連続切片再構築法によって解析し、その神経回路を形態学的な観点から明らかにするものである。
神経成長円錐におけるactin繊維束とfilopodiaの形成機構

本研究は、actin繊維束やfilopodiaの形成過程におけるlaspファミリー分子とfascinの役割を明らかにすることを目的とし、次の三つの実験を行った。(1)Lasp-1、lasp-2およびfascinの成長円錐内動態解析:filopodiaを伸長しつつある成長円錐にEGFPを融合した各分子を発現させ、蛍光消光回復過程を観察した。その結果、観察したすべてのタンパク質において、アクチン繊維束と細胞質間で分子の急速な交換が観察された。(2)Actinとfascinの動態比較:成長円錐にECFP-actinとEYFP-fascinを共発現させ、蛍光消光回復過程を比較した。その結果、fascin分子はactin繊維束全体にわたって急速に交換されていたが、actin分子はactin繊維束の先端からのみ付加されることが観察された。また、fascin分子の交換速度に比べ、束の形態変化は遅かった。(1)と(2)の結果から、filopodiaのアクチン繊維束は、fascinなどの細胞質に存在するactin繊維束化因子によって誘導されるのではないことが示された。(3)Lasp分子機能ドメインの解析:LIMやSH3ドメインなどを欠損したlasp分子とEGFPの融合タンパク質を成長円錐に発現させ、lasp分子のactin繊維束への局在を制御する分子内領域を解析した。その結果、LIMドメインがlaspファミリー分子の接着斑やactin繊維束への局在に必須であることが明らかになった。ラメリポーディア内でおこるアクチン繊維の束化は、フィロポーディアの形成と伸長に重要な過程である。これまでに、ファシン、lasp-1やlasp-2といったアクチン繊維結合タンパク質が、この過程に関与している可能性が報告されている。しかし、それらの分子がどのようにアクチン繊維の動態をラメリポディア内で制御しているのかは、不明であった。そこで、蛍光タンパク質を融合したアクチン、ファシン、lasp-1やlasp-2を培養細胞に発現させ、蛍光消光回復を観察した。この回復過程を解析することで、それらの分子の生きた細胞内での動態が分かる。蛍光消光後、蛍光標識アクチン分子はラメリポディアやフィロポディアの先端から取り込まれ、消光領域は細胞内部方向に移動していった。しかし、ファシン、lasp-1とlasp-2の消光領域はすべて細胞質側から急速に蛍光が回復した。蛍光アクチン分子と蛍光ファシン分子を同時に発現させた細胞の蛍光消光回復を観察したところ、単一のフィロポーディア内で、アクチンの蛍光は先端から回復したのに対しファシンの蛍光は細胞質側から急速に回復した。これらの結果は、ファシン、lasp-1とlasp-2はアクチン繊維結合タンパク質であり細胞内局在もアクチン繊維と一致しているにも関わらず、その細胞内動態はアクチン繊維とは異なっていることを示している。したがって、ラメリポーディア内のファシン、lasp-1とlasp-2は、アクチン繊維の束化を誘導しているのではなく、他の要因によって形成が始まったアクチン繊維束を安定化していると考えられる。
紡錘体チェックポイントからG1期にスリップした四倍体化細胞の細胞死の新規機序解明

微小管阻害剤など紡錘体チェックポイントを発動させる薬剤の抗癌作用は、M期停止中の細胞死、加えてM期完了せぬままG1期にスリップした四倍体での細胞死(PSD)誘導にある。PSDに必要な分子として我々が同定したSIRT2は、配下の二つの経路、オートファジー-Myc経路、p53-p21経路でPSDを制御する。PSDを標的とする制癌をめざし、本課題ではSIRT2配紡錘体チェックポイントは、全ての染色体が紡錘体と正しく結合するまで分配されないようM期停止させる監視機構である。紡錘体を標的とする抗癌剤(微小管阻害剤)としての作用機序は、紡錘体チェックポイントを発動させ、二つの細胞死を誘導することにある。一つはM期停止中のアポトーシス(Death in Mitosis;以下DiM)である。しかしM期停止は永続せず、紡錘体が破壊されたままでも一定時間後にM期停止は終了し、DiMで死ななかった細胞は、染色体分配されないままG1期へスリップし四倍体化する。このとき一部の細胞で第二の細胞死(Post-Slippage Death;以下PSD)が起きる。この二つの細胞死が紡錘体を標的とする抗癌剤の感受性を左右する。この2つの細胞死について、SIRT2の機能解明を進め、制がんに重要な知見を目指している。既にこの解明のキーとなるSIRT2の下流として、p53-p21経路、オートファジー経路、微小核形成を見出しているのでその機序を探る。なお、SIRT2タンパクがp53を制御する新たな機序については今年度報告した。(Biochem Biophys Res Commun. 2019Jan 1;508(1):230-236)p53のユビキチン化酵素MDM2に対するユビキチン化酵素の一つにP/CAFがある。SIRT2はP/CAFとタンパク同士で結合→脱アセチルによるP/CAF不安定化→MDM安定化でp53発現を抑制していた。SIRT2がp53蛋白安定性を制御する機序については、日本癌学会発表で報告し、さらに論文として報告した。これまでの研究でp53の代表的標的遺伝子であるp21が微小管阻害剤処理でM期停止した細胞の細胞死を抑制するという、制がんにおいては負の側面を見出している。この場合のp21の作用機序は不明であり、従来想定されていたCDK1阻害ではない。本研究ではオートファジーや他の候補経路に着目してp21がM期停止した細胞死を探った。多数の候補経路の中からp21蛋白との結合が報告されているある蛋白がSIRT2低下に伴い(このときp21蛋白は増加する)分解されることを見出した。また予想と異なり、p21はPSDではなくM期停止中の細胞死を抑制していることが分かった。同時にSIRT2はPSDだけでなくp21を介してM期停止中の細胞死を制御していること明らかになった。PSDへのSIRT2の関与については標的としてMycおよびオートファジー関連分子に着目し今後解析する。まずはがん抑制因子であるp21の負の側面である、抗がん剤によりM期停止した細胞の細胞死を抑制する機序について、その候補標的として見つけたタンパクの機能と制御を探ることで、SIRT2の機序を解明する。一方のPSDへのSIRT2の関与については標的としてMycおよびオートファジー関連分子に着目し今後解析する。p21は四倍体化した細胞のG1期停止にも関与しており、これがPSD抑制にも働く可能性もあるので、この可能性も同時に検討する。(Biochem Biophys Res Commun. 2019Jan 1;508(1):230-236)p

53のユビキチン化酵素MDM2に対するユビキチン化酵素の一つにP/CAFがある。SIRT2はP/CAFとタンパク同士で結合→脱アセチルによるP/CAF不安定化→MDM安定化でp53発現を抑制していた。SIRT2がp53蛋白安定性を制御する機序については、日本癌学会発表で報告し、さらに論文として報告した。これまでの研究でp53の代表的標的遺伝子であるp21が微小管阻害剤処理でM期停止した細胞の細胞死を抑制するという、制がんにおいては負の側面を見出している。この場合のp21の作用機序は不明であり、従来想定されていたCDK1阻害ではない。本研究ではオートファジーや他の候補経路に着目してp21がM期停止した細胞死を探った。多数の候補経路の中からp21蛋白との結合が報告されているある蛋白がSIRT2低下に伴い(このときp21蛋白は増加する)分解されることを見出した。また予想と異なり、p21はPSDではなくM期停止中の細胞死を抑制していることが分かった。同時にSIRT2はPSDだけでなくp21を介してM期停止中の細胞死を制御していること明らかになった。PSDへのSIRT2の関与については標的としてMycおよびオートファジー関連分子に着目し今後解析する。まずはがん抑制因子であるp21の負の側面である、抗がん剤によりM期停止した細胞の細胞死を抑制する機序について、その候補標的として見つけたタンパクの機能と制御を探ることで、SIRT2の機序を解明する。一方のPSDへのSIRT2の関与については標的としてMycおよびオートファジー関連分子に着目し今後解析する。p21は四倍体化した細胞のG1期停止にも関与しており、これがPSD抑制にも働く可能性もあるので、この可能性も同時に検討する。
第二言語習得が及ぼす思考過程への影響

言語は思考に影響を及ぼすという仮定のもとに、第二言語を習得した話者の思考過程を調査した。英語母語話者で日本語を第二言語として習得した被験者に心理実験を行った結果、日本語の能力が高い被験者は一言語しか話さないモノリンガル話者とはことなる傾向を示した。つまり、二つの言語に影響を受けた『バイリンガル』話者としての思考過程を保持することが明らかになった。また日本人の子供に同じ実験を行い発達段階によって思考過程に変化が起きるかを調査した結果、日本語の習得が行われる年代と、英語を学び始める年代により思考過程に変化が起きることが明らかになった。これまでの調査から、英語を第二言語として習得した日本人の認知レベルに変化が起こることがわかった。当研究は、日本語を習得した英語母語話者にも同じような変化が思考過程に見られるかを調査する。研究の背景にはImai&Gentner(1997,2002)がある。『形と素材』を識別する心理実験で、日本語母語話者は物を選択する際に『素材』に焦点を当てて選択する一方、英語母語話者は『形』に焦点を当てることが報告されている。更にCook,Bassetti,Kasai,Sasaki,&Takahashi(2006)は、日本人で英語を習得したバイリンガル話者は、日本語母語話者とも英語母語話者とも異なる傾向を示すことを明らかにした。第二言語を習得することにより思考過程に変化が起きることを示唆している。つまり、言語は思考過程に影響を及ぼすことが証明されたのである。Cookその他の調査に参加した被験者はイギリス在住の日本人ゆえ、文化や生活習慣などの影響をのぞくことができなかった。平成19年度から21年度に採択された科学研究費で、Cookその他の調査を補てんする方法で調査を行った。日本に在住する日本人を対象に実験を行い、日本で習得した英語が思考過程に影響を及ぼすことを明らかにした。この結果を信頼性の高いものにするため、当研究では英語母語話者で日本語を習得した人たちを対象に同じ実験を行う。英語だけを話すモノリンガル話者とは異なる傾向を示すことが期待される。本年度は調査の準備として、(1)実験刺激の充実化(2)被験者の募集(3)試験的実験に着手した。(1)に関しては、心理実験後に計画しているfMRIを使った実験に応用できるものに改良を進めた。またこれまでの心理実験で課題となっていた内容に改良を加えた。(2)と(3)に関しては、改良を加えた実験刺激を用い県内に在住する英語母語話者に参加してもらい試験的な実験を行いデータを収集した。本研究のテーマである、『日本語を習得した英語母語話者は認知レベルに影響を受けるか』について心理実験を行った。主な実績は実験改良である。すでに「色と形」を題材にした心理実験を行いデータ収集を行っていたが、より精度が高いデータを収集できるよう改良を加えた実験パターンをいくつか制作しパイロット実験を繰り返した。従来の、被験者の第一印象で刺激を選択する形式を改良したもので、刺激同士の類似性・距離感を尺度を持って均一に変化させることが可能になった。つまり、被験者の第一印象は刺激同士が何パーセント類似している際により顕著に示されるかが明らかになった。本研究の目的は、英語母語話者は『日本語を習得すると認知変化が生ずるか』を調査することである。着想に至った経緯は、『英語を習得した日本語話者の認知変化が明らかになった』ことに起因する(基盤研究(C)90352450)。今回はその逆パターンである、英語母語話者も『日本語を習得すると認知に変化が生ずるか』を調査した。調査の結果、日本語を習得した英語母語話者にも思考に変化が起き、母語のみを話すモノリンガル話者とは異なる考え方を保持する確証を得ることができた。一連の研究の背景には、言語は思考に影響を及ぼすというテーマが存在する。日本語話者は日本語という言語が持つ性質によって考え方を決定され、英語話者は英語という言語の性質によって考え方を決定されるという理論である。では、日本語と英語の二言語を話すバイリンガル話者はどのような思考過程を保持するかを追求した結果、母語のみを話すモノリンガル話者とは異なることが分かった。つまり、第二言語を習得することで認知レベルが影響を受けることが明らかになった。当初の計画に実験の改良を加えたことで時間のずれが生じたが、当初予定した13の研究計画に基づき調査を行い、各項目で計画した内容を達成できた。1.英語を母国語とする被験者からのデータ収集-英語を母語とし日本語を第二言語として習得したイギリス、アメリカ、カナダ国籍の被験者を対象に心理実験を行い、日本語を習得することで彼らの認知レベルに変化が起きることを明らかにした。

2.日本人の子供を対象にしたデータ収集-5歳から18歳までの日本人を対象に心理実験を行い、日本語の習得率とともに思考過程にも変化が起きることを明らかにした。3.学会発表の準備-国内外の学会で計8回の成果報告を行い、計2本の論文を執筆した。24年度が最終年度であるため、記入しない。第二言語習得が認知に影響を及ぼすことを明らかにできたことから、次の段階では「どのレベルで習得した第二言語が影響を及ぼし始めるか」をテーマにより詳しい調査を行いたいと考えている。日本では英語教育が盛んであるが、認知の観点から英語教育に貢献できるか模索している。例えば従来テストの点数で判断されていた英語力を、認知レベルの変化を測る新しい英語力測定が可能か調査したい。実際には英語を習得しているのに、テストの点数が低いという理由で習得していないと判断される学習者が存在するかもしれない。認知レベルの変化を考慮したクラス編成や教授法など、新しい試みに貢献したい。
クッシング病の下垂体腺腫におけるPOMC遺伝子転写制御機構の異常解明

クッシング病下垂体腺腫細胞および、対照として正常ラット下垂体前葉(rAP)細胞、AtT20細胞の各培養系を用いて、c-fos、c-jun mRNAの発現と、アンチセンスFos、JunのPOMC mRANにおよぼす作用を検討した。1.各種下垂体細胞におけるc-fos、c-jun mRNAの発現;クッシング病下垂体腺腫細胞、rAP細胞、AtT20細胞の全てにおいて、CRH添加により一過性にc-fos mRNAの発現を認めた。そのタイムコースは30分をピークとし、3種の細胞間で明らかな差はみとめなかった。c-jun mRNAは、全ての細胞において基礎レベルで検出され、CRHにより増加を認めなかった。このc-jun mRNAのconstitutiveな発現は、rAP細胞に比し、他の2種の腫瘍細胞で多い傾向が見られた。2.アンチセンスFos、JunのPOMC mRNAにおよぼす作用:c-fos、c-junに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを作成し、3種細胞に添加後、POMC mRNAのCRHに対する反応を検討した。rAP細胞では、アンチセンスFos、Jun5時間の前処置により、CRHに対するPOMC mRNAの増加反応が抑制された。一方AtT20細胞では、5時間の前処理では効果を認めず、アンチセンスJunとの24時間の前処置により、初めてCRH作用の抑制がみられた。まとめ:以上の結果より、CRHよりPOMC mRNA増加作用の少なくとも一部は、Fos、Junを介すると考えられ腫瘍化によりFos、Junを介した調整に変化が生ずる可能性が示唆された。これらの結果は、平成5年度日本内分泌学会秋季学術大会のシンポジウムにて発表し、一部、平成6年度日本内分泌学会総会で発表の予定である。
教員のストレスとキャリア発達に対するコンサルテーションシステムの開発

教職員のコンサルテーションを行う場合、ストレスにおいては、質問紙でコンサルテーションは可能であるが、職位によって職務が異なるため、そのニーズが異なる。管理職対象には、ストレスチェック票を用いること、また、学校の状況・ニーズに応じて、コンサルテーションを行った。教職員の関係性といじめ問題の解決、学力向上が課題であることが明らかになった。そこで、管理職向けには、ストレスマネジメントの研修会を行うと共に、その後に各学校に応じたコンサルテーションを行った。その結果、いじめ問題の対応や教職員のストレス軽減のために何が必要なのかの明らかになった。24年度は、23年度にサンプル校で行った質問紙調査の精緻化をおこなった。また、事例校3校に質問紙調査と校長・教職員の面接調査を行い、学校で困っていること、臨床心理士や大学教員にどのようなことを求めているのかのニーズ調査も行った。その際に、初任者は、授業方法や保護者の対応の仕方・懇談会の進め方など、具体的な教員としてのスキル取得が課題であることが明らかになった。10年以上のベテラン教師では、今まで身につけてきた授業スキルや学級経営スキルが通用しなくなってきていること、保護者の対応に困っていることが語られた。主幹教諭は、教務主任として、先生達のモチベーションアップと学力の向上に課題を持ち、また、中間管理職として、校長・教頭と教員の狭間で悩みを抱えていることが明らかになった。事例校3校では、教職員研修会を年に3回行うと共に、校長・教務主任のコンサルテーションをおこなった。学校経営とメンタル面で課題を抱える教員へのサポート、いじめの対応について、継続的なコンサルテーション及び支援を行った。海外では、フィンランドのオウル市の総合学校(小・中学校)でフィールドワークを行い、教師の授業力・教師の課題、管理職の役割と教員との関係、教員の一日の行動についての調査を行った。制度的に教育にかける人的・経済的支援が大きく、日本と異なることが明らかになった。また、スイスの日本人学校での調査も行ったが、現在の日本以上に、日本の学校教育・教職員の関係のよさが、児童生徒の成長に繋がっていることが明らかになった。本研究では、「教員のストレスとキャリア発達についての診断ツールの開発」と「ツールによる診断結果を利用したコンサルテーションシステムの開発」を行うことを目的とした。教職員のコンサルテーションを行う場合、ストレスにおいては、同じで質問紙でコンサルテーションは可能であるが、職位によって職務が異なるため、そのニーズが異なる。その結果、いじめ問題の対応や教職員のストレス軽減のために何が必要なのかのが明らかになった。学級担任は、学級経営の悩みといじめの対応、授業力向上のニーズが高かった。そこで、学級経営については、既存の学級満足度尺度であるQUアンケートを行うとともに、筆者らで開発した小学生版ストレスアンケートの結果の分析をもとに、研修会を開き、学級経営のポイント、気になる児童生徒の支援・指導の方法など学校経営上のコンサルテーションをおこなった。5小学校・1中学校で、アクションリサーチの方法で、筆者らがコンサルタントととして経年で関わったが、そのうち2校は、自校で、アンケート分析をもとに、研修会を開き、学級経営改善、授業改善の方略を考えられるまでになった。学校別・キャリア別での研修会を継続的に行い、また、同じツールを使用することによって、学校の自立性が高まり、コンサルテーションが有効であることが示唆された。本研究は教員のストレス対処を支援するコンサルテーションシステムの開発を目的としている。本年度は、教員のストレスの要因は何であるのか、その対処法はどのようなものであるのか、予備調査として、教員面接調査を10名行った。また、教育センターでは教員のストレスやコンサルテーションをどのような形で行っているのか、福岡市教育センターと札幌市教育センターで担当主事の面接調査を行った。それらをもとに、質問紙調査を作成し、初任者430名に対して、調査を行い分析中である。先行研究での知見、キャリア別に筆者が行った質問紙調査の結果の再分析を行い、初任者対象質問紙調査と合わせて、本調査の質問紙調査の質問事項の検討を行っている。また、事例校3つに対して、質問紙調査を行うと共に、ストレスマネジメント研修会を3回行い、その研修がどのような効果をもたらしているのか、検討を行った。コンサルテーションに関しては、1校に対して、週1回、学校訪問をし、校長・教頭・教務主任・担任へのコンサルテーションを行い、その結果を分析中である。さらに、もう一校の事例校では、授業観察・授業研究に参加し、研修会を実施すると共に、授業づくりにおけるコンサルテーションのあり方を模索している。

教員のストレスは多忙感と授業力不足、学校組織文化の中でのコミュニケーション不足からきていることが、現段階では示唆されている。また、ストレスについて、教務主任に相談すると逆効果であるという結果も得られた。学校組織が変革されていく中で、全体性の問題か、個別の学校の問題か、明らかにしていくことが課題として残されている。事例校のフィールドワーク、コンサルテーションは進んでいるが、教員のキャリア発達の質問紙調査が質問紙を精査し、パイロットモデルで行った学校調査の分析が遅れており、質問紙作成が遅れている。共同研究者が調査している学校の調査結果と、過去に行った質問紙調査の再分析を通して、質問紙調査の作成が遅れている。やや遅れている要因は以下の3点である。1.研究者全員が集まる合同会議が1回しかもてなかったこと、何人かで集まる会議も3回程度しかもてず、後は、メール・電話でのやりとりであったことである。2.先行研究の収集・分析に時間が多くかかり、質問紙作成が遅れたことである。教員のストレスの研究は先行研究として膨大にあり、それらの中から参考になる文献・質問紙を検討し、教員への面接調査と合わせた質問紙作成に多くの時間を費やすこととなった。キャリア別での質問紙調査を行う予定であったが、本年度は初任者教員に対象を絞り、その結果をもとに、本年度以降、対象者を増やしていく予定である。3.事例校選定に時間がかかったこと、事例校の中で、相手のニーズと研究の意図のすりあわせなど事前の打ち合わせに時間がかかり、実際に学校に入るのが遅くなったことである。事例校でのデータは、質問紙調査・面接調査・授業観察記録など膨大な量となり、それらのデータ処理に多くの時間を費やした。以上のことにより、質問紙調査及び学校改善のためのツール開発の計画まで行く予定であったが、そこまでいかなかったことが(3)にした理由である。本年度は最終年度であるため、質問紙を作成後、小学校・学校で質問紙調査を行い、フィールドワークなど、質的調査で得た学校の課題と質問紙調査で得られた結果を基に、教員の自己診断ツールを開発するとともに、研修会の方法とコンサルテーションの方法のモデルの提案を行うことを目標とする。研究者合同会議を2回開き、それぞれの研究の進捗状況を確認する。昨年度収集したデータを基に、本調査の質問紙調査の作成を行い、サンプル数を増やすために、対象学校の拡大を行う。その分析によって、キャリア発達の課題が明らかになると考える。また、面接調査の人数も拡大し、半構造化面接によって、教員がどの発達段階でどのようなストレスを持っているのか、明らかにした上で、コンサルテーションの方法、支援ツールの開発を行いたい。個人のストレスと学校のストレスは重なる部分と独自性の部分がある。また、校長のリーダーシップのあり方も大きな影響を与えている。管理職の有り様、学校組織文化をポジティブに変容していく方法の開発も行う。その際は、研修会をどのように行うかが課題である。
緑膿菌の鉄環境応答遺伝子群の研究

緑膿菌の病原因子である鉄獲得系や多くの外毒素産生を支配する遺伝子群は鉄レギュロンの構成員であり、生育環境の鉄濃度に依存した各遺伝子の転写は、統括的レブレッサーであるFurと多面的アクティベーターであるPvdSにより制御される。本研究では、fur遺伝子と周辺領域の解析と、FurとPvdSの両因子が転写制御する遺伝子群の同定と同定遺伝子の発現制御様式の検討を、遺伝学的手法とプロテオーム解析を連関させて実施した。1.本菌のfur遺伝子を含む約14kbの染色体断片をクローニングし、furを含む1,280bpの塩基配列を決定した。furのプロモーター領域にはFur boxは検出できず、大腸菌等の場合とは異なり、furの転写はautoregulationされている可能性は少ないことが示唆された。2.染色体のfur遺伝子及びその下流の7kb領域の特定部位は、対立遺伝子置換系並びに研究代表者が構築した効率的な部位特異的欠失法の両手法を用いても、破壊できなかった。ゲノム全塩基配列のデータベースではfur遺伝子下流には主要シャペロンの遺伝子群が存在し、本研究で破壊が困難であった特定部位はgrpEとdnaJ内に存在していた。このことから、Furは本菌の生存に必須で未知の機能を正に制御しているとともに、GrpEとDnaJは本菌の生存・増殖に必須であると結論された。3.幾つかの膜画分蛋白質の産生は生育環境の鉄濃度により制御されることが報告されており、プロテオーム解析には膜画分蛋白質の解析も必須である。そこで、本菌を対象にして、全細胞蛋白質と膜画分全蛋白質をおのおの二次元電気泳動により分画する手法を確立した。4.プロモーターを欠くgfp遺伝子をレポーターとして採用したトランスポゾンが緑膿菌染色体に挿入された突然変異体を多数取得し、この中から培地中の鉄イオンが欠乏時に転写量が増大する挿入突然変異体を3株、また、過剰時に増大する株を3株取得し、各トランスポゾン挿入部位の近傍の染色体断片をクローニングした。また、同様の突然変異株を類縁のセパシア菌で取得するとともに、セパシア菌のFurは菌の生存には必須でないことを見出した。緑膿菌の病原因子である鉄獲得系や多くの外毒素産生を支配する遺伝子群は鉄レギュロンの構成員であり、生育環境の鉄濃度に依存した各遺伝子の転写は、統括的レプレッサーであるFurと多面的アクティベーターであるPvdSにより制御される。本研究では、FurとPvdSの両因子が直接並びに間接に転写制御する遺伝子群の網羅的な同定と同定遺伝子の発現制御様式の検討を、遺伝学的手法とプロテオーム解析を連関させて行っている。1.相同組換えによる遺伝子置換法並びに研究代表者が構築した効率的な部位特異的欠失法の両手法を用いても、染色体fur遺伝子の機能完全欠損突然変異の単離はできなかった。相補性検定の結果をも踏まえて、緑膿菌のFurは本菌の生存に必須で未知の機能を制御していると結論された。2.FurやPvdSにより直接並びに間接に転写制御されるプロモーターを緑膿菌背景下で同定するためのトランスポゾンを構築した。

リボゾーム結合部位を細菌用に変え、プロモーターを欠くGreen fluorescence protein遺伝子(gfp)をレポーターとして採用したトランスポゾンが緑膿菌染色体に挿入された突然変異体を多数取得した。現在、実体蛍光顕微鏡等を用い、培地中の鉄濃度変動によりgfpの発現が制御される誘導体株を検索している。3.幾つかの膜画分蛋白質の産生は生育環境の鉄濃度により制御されることが報告されており、プロテオーム解析には膜画分蛋白質の解析も必須である。そこで、本菌を対象にして、全細胞蛋白質と膜画分全蛋白質をおのおの二次元電気泳動により分画する手法を確立した。この手法を用い、培地中の鉄濃度変動により産生が変動する膜画分蛋白質と可溶性画分蛋白質の同定を行っている。緑膿菌の病原因子である鉄獲得系や多くの外毒素産生を支配する遺伝子群は鉄レギュロンの構成員であり、生育環境の鉄濃度に依存した各遺伝子の転写は、統括的レプレッサーであるFurと多面的アクティベーターであるPvdSにより制御される。本年度は、fur遺伝子と周辺領域の解析と、FurとPvdSの両因子が転写制御する遺伝子群の同定と同定遺伝子の発現制御様式の検討をめざした。1.本菌のfur遺伝子を含む約14kbの染色体断片をクローニングし、furを含む1,280bpの塩基配列を決定した。furのプロモーター領域にはFur boxは検出できず、大腸菌等の場合とは異なり、furの転写はautoregulationされている可能性は少ないことが示唆された。2.染色体のfur遺伝子の下流の7kb領域の特定部位はfurと同様に、対立遺伝子置換系を用いても破壊できなかった。ゲノム全塩基配列のデータベースではfur遺伝子下流には主要シャペロンの遺伝子群が存在し、本研究で破壊が困難であった特定部位はgrpEとdnaJ内に存在していた。このことから、GrpEとDnaJは本菌の生存・増殖に必須であると結論された。3.プロモーターを欠くGreen fluorescence protein遺伝子(gfp)をレポーターとして採用したトランスポゾンが緑膿菌染色体に挿入された突然変異体を多数取得し、この中から培地中の鉄イオンが欠乏時に転写量が増大する挿入突然変異体を3株、また、過剰時に増大する株を3株取得し、各トランスポゾン挿入部位の近傍の染色体断片をクローニングした。また、同様の突然変異株を類縁のセパシア菌で取得した。さらに、セパシア菌ではfur遺伝子の機能完全欠損突然変異の取得が可能であったことから、Furは本菌の生存には必須でないことを見出した。