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ベンサム功利主義とマイノリティー問題

本年度はベンサムの経済学的認識の全体的枠組を確定する作業を行なった。法哲学者という基本的スタンスからのベンサムの経済へのアプローチを理解する為、彼が『民法典』で提示した幸福の副次的目的とする「生存、安全、豊富、平等」の相互関係の検討を行ない、これを2004年7月10日一橋大学で開かれた日本功利主義学会にて「ベンサムにおける平等について」というタイトルで発表した。8月中旬から1ヶ月ほどロンドン大学University Collegeのベンサム・プロジェクトに行き、プロジェクト責任者D.Schofield教授と意見交換を行ない、救貧法や宗教論に関するベンサムの草稿の参照、検討を行なった。秋には、日本経済評論社『経済思想』に提出したベンサムの経済学的認識に関する論文の再検討を行ない、とくに、パノプティコン、救貧法の議論を軸に、再構成を行なった。その延長上に、救貧対策や国際平和の問題と関連して、ベンサムの植民地論の検討を行なった。基本的には植民地反対論を展開するベンサムだが、救貧対策や人口問題への対応という点で、植民地の有益性を指摘するという両義的な議論の特質について、明らかにしつつあるところである。本研究では、J・ベンサムの唱導した「最大多数の最大幸福」の原理が、一方で18世紀末のイングランドにおける貴族の少数者支配に対する多数の民衆利益を代表し、それを擁護するものとして、他方で当時の社会における被抑圧者としての少数者を擁護するものとして、政治・経済・社会改革の原理として掲げられていることを分析し、とくに女性や同性愛者といった被抑圧者に関するベンサムの議論に即して、それらを整合的に理解できることを目的としている。本年度は、ベンサムが3期にわたって執筆し展開した同性愛行為擁護論(Essay on Paedrasty, Essay on Taste)を中心にして、この問題と関わる限りでのベンサムの女性論(ジェンダー的視点など)の考察、同性愛行為の存在が人口減少をもたらすとされることに対するベンサムの批判を検討した。基本的に18世紀の同性愛をめぐる社会状況を念頭に置いて再構成することを心がけ、8月20日9月12日にわたりロンドン大学のUniversity College Londonにあるベンサム・プロジェクトで、ベンサムの同性愛・女性に関する草稿や資料を発掘・整理し、また18世紀イングランドの民衆社会史に関する史料や諸研究を参照しつつ、同プロジェクトのPhilip Schofield氏と意見交換を行ない、研究を進めた。9月には『社会思想史研究』に「ベンサムの快楽主義の位相とマイノリティー問題『男色論』を中心にして」として、ベンサムの同性愛行為擁護論を軸に、ベンサムの快楽主義的功利主義の特質を議論した論文を掲載した。本格的なベンサムの同性愛行為擁護論の前段になるものである。また3月29日にはイギリス哲学会第27回研究大会にて個人研究「ベンサムの女性論」を研究途中経過の成果として報告した。本年度はベンサムが著作や草稿に断片的に示した女性の抑圧や解放に関する議論をまとめ、普通選挙権や結婚制度に関する民法上の規定の改革などをめぐる彼の女性論の特質とその権力論を再構成することを研究の主眼とした。女性の市場参加や雇用関係といった諸問題において、ベンサムは当時の社会的常識とは異なり、女性の解放を主張していたことを確認し、平行してベンサムの経済論の再構成をも行なった。ベンサムの女性論において、当時の女性の置かれていた地位をめぐる諸言説をベンサムが批判的に検討するための理論的道具たる、「功利性の原理」や言語批判などを詳細に検討しておく必要があるので、2003年4月12日に、ポルトガルのリスボンで開かれた国際功利主義学会(International Society for Utilitarian Studies)において、"The Principle of Utility in Bentham's Utilitarianism"と題する報告を行なった。学会の後、ロンドンUniversity Collegeのベンサムプロジェクトにおいて、ベンサム草稿の閲覧および議論を行ない、女性論と関連するベンサムの原理的な枠組みや、「安全」「生存」「豊富」「平等」という4つの目的を掲げるベンサムの分配論の構成についても平行して検討を行なった。また1月14日にはUCLAのDavid Lieberman教授との意見交換、1月17日には2003年に"Imagning Interest"を出版したStephen Engemann教授を迎えての合評会でコメンテーターを務め、意見交換を行なった。今年度は女性論の再構成が難航し、業績として十分なものになるには至らなかったが、ベンサムの経済思想を含めて、次年度において活字化する予定である。
ゲージ理論におけるモジュライ空間の幾何構造とその応用

本研究は主に三つの立場で安定ホモトピーSeiberg-Witten不変量とその周辺問題を考察している.第一は安定ホモトピー論の立場による不変量の性質の考察,第二はこの不変量の幾何的な解釈,第三はゲージ理論を離れて指数定理に関連する問題である.第一については,南範彦氏(名古屋工業大学)などとの共同研究により,連結和に対する安定ホモトピーSeiberg-Witten不変量の消滅定理などを得た.これは既に共同研究で得ている連結和に対する非消滅定理と対照的であり,不変量としてのある種の限界点があることを示している.第二については,スピン4次元閉多様体上のSeiberg-Witten方程式の解空間には自然に同変スピン構造が入り,それから10/8-不等式を自然に導くことができることを示した.更に,既に得られていた10/8-不等式の1次元コホモロジー群上の積構造を加味した場合の改良についてもこの同変スピン構造を平坦接続のモジュライ空間上で考察することにより再証明できることを示した.第三については,研究分担者からGuillemin-Sternber予想を指数の局所化の観点から再証明を与えたという報告を受けた.これはゲージ理論と直接的に関連してはいないが,モジュライ空間におけるこのような考察がゲージ理論の展開へとつながることを期待している.本研究は主に三つの立場で安定ホモトピーSeiberg-Witten不変量とその周辺問題を考察している.第一は安定ホモトピー論の立場による不変量の性質の考察,第二はこの不変量の幾何的な解釈,第三はゲージ理論を離れて指数定理に関連する問題である.第一については,南範彦氏(名古屋工業大学)などとの共同研究により,連結和に対する安定ホモトピーSeiberg-Witten不変量の消滅定理などを得た.これは既に共同研究で得ている連結和に対する非消滅定理と対照的であり,不変量としてのある種の限界点があることを示している.第二については,スピン4次元閉多様体上のSeiberg-Witten方程式の解空間には自然に同変スピン構造が入り,それから10/8-不等式を自然に導くことができることを示した.更に,既に得られていた10/8-不等式の1次元コホモロジー群上の積構造を加味した場合の改良についてもこの同変スピン構造を平坦接続のモジュライ空間上で考察することにより再証明できることを示した.第三については,研究分担者からGuillemin-Sternber予想を指数の局所化の観点から再証明を与えたという報告を受けた.これはゲージ理論と直接的に関連してはいないが,モジュライ空間におけるこのような考察がゲージ理論の展開へとつながることを期待している.ゲージ理論を使ったホモロジー3次元多様体の不変量として円との直積上のインスタントンを使ったものが太田啓史氏などにより考察されている.この不変量はホモロジー3次元多様体と境界の一つにもつコンパクト多様体をインスタントンからなるモジュライ空間の部分空間として得られているので,Rochlin不変量との関係が幾何的に理解できる特徴を持っている.今年度の研究においては上述のインスタントンを使った不変量の構成の一般化を試みた.より具体的には円と直積の代わりに2つのホモロジー3次元多様体の間のコボルディズム,或いは,その幾つかの繋いだものをとると,この上のモジュライ空間の部分空間は円との直積の場合と類似の性質をもつことがわかった.特に,モジュライ空間の部分空間の特異点については円との直積の場合と同様にして調べることが可能であることがわかった.更に,2つのホモロジー3次元多様体の間のコボルディズムからモジュライ空間の部分空間の間のコボルディズムが得られることもわかった.しかし,この空間とホモロジー3次元多様体との関係はまだよくわかっていない.以上の考察は古田幹雄氏が主催するセミナーにおける共同研究によるものである.これまでの古田幹雄氏との共同研究で4次元スピン閉多様体に対する10/8-不等式は1次元ベッチ数が正の場合には改良できることを示していた。しかし、その際に現れる新しい項はあるK群上で定義される組み合わせ的な量であり、その性質まで調べていなかった。本年度はそれを不変量として書き下し,その性質を調べた。まず,その不変量がベッチ数や符号数のようにスピンとは限らない場合にも定義される不変量として表されるかどうかについて考察した。その結果、その不変量を少し弱くしたものは、1次元コホロジー環上の4重積に関する不変量として定義できることがわかった。これは連結和に関して加法的であるなどのよい性質を持っていて,幾何的な解釈が可能と思われるが、その意味についてはこれからの研究する予定である。更に、この不変量自身を組み合わせ的ではなくK-群からの直換的な定義を与えた。これにより不変量の連結和に関する加法性が導かれた。しかし、同変K-群を経由していて幾何的な意味づけがあまり明確ではない。また、スピンとは限らない4次元多様体に対して定義できるかどうかもわからない。これらの問題は4次元多様体のホモトピー形を理解するためにも解決したい問題と考えているが、現時点では方向性すらわかっていない。これから1次元ベッチ数が正の4次元閉多様体の研究全体を推し進めたいと考えている。
カルコン合成酵素の生化学・化学的多様性

ポリケタイド合成酵素III型として理解が急速に深まりつつある、カルコン合成酵素(CHS)の遺伝子(chs)は高等植物において多くの場合マルチジーンファミリーを形成して存在し、その配列には植物種に基づく多様性と、機能の多様性が分かちがたく存在している。本研究では、アサガオ、アサガオと同属のムラサキイモ、デオキシ型フラボンを生合成するコガネバナ、同一植物でスチルベン、カルコン両者を生成するダイオウ、夫々のカルコン合成酵素、カルコン合成酵素関連非カルコン合成酵素タンパク、スチルベン合成酵素を異種発現させ、各種非生理的プライマーを必要に応じて合成し、市販の各種CoAエステル共々上記のCHS関連タンパクで酵素反応を行い、生成物を同定した。するとこれまで想定されなかった多くの非天然型の芳香環を形成した生成物を得ることが出来た。なかでも本研究ではじめてダイオウより得られたベンザルアセトン合成酵素(BAS>において、フェニルアラニン残基(ムラサキウマゴヤシのCHSで215番)がイソロイシンに置換しているだけで、新規触媒活性を獲得していることが明らかとなった。更に本酵素を用いて実験を行ったところ、メチルマロニルCoAを基質として天然には存在しないC6-C5型の化合物を生合成させることが出来た。しかしコガネバナ等のCHSでは上記残基を変異するだけではBAS活性を付与することは出来ず、在来知られている各種トリ、テトラケタイドの副次生成物が生じるに止まった。しかしながら、人工基質をスターター単位とした場合、これらは合成のしにくい新規オリゴケタイド化合物となり、結果として植物の遺伝的多様性を利用して、新規化合物のライブラリーを作成することが出来る可能性を示した。マルバアサガオchs-aとchs-bのコードするタンパクCHS-A,-Bに対し合成基質を用いて酵素反応生成物を検討した。CHS-Aはp-クマル酸CoAに比べ側鎖の炭素数の1つ短いフェニルアセチルCoAを基質とした時マロニルCoA3分子を縮合、芳香環形成を経てフエニルアセトフェノンを生成したことをLC/MS他物理分光法で確認した。多くのCHS同様Claisen縮合と芳香環形成を伴に行う触媒機能の有ることを確認した。安息香酸CoAではマロニルCoA3分子を縮合し、テトラケタイド鎖形成で反応が終了し、芳香環形成に至らなかった。更に脂肪酸合成酵素並にアセチルCoAを受容することも示された。一方脂肪族CoAエステルとしてイソバレリルCoAの時フロログルシン骨格が形成された。CHS-Bの場合、何れでもトリケタイド鎖形成に止まった。CHSは表中にあるように安息香酸CoAをベンゾフェノンへ変換した。本知見はベンゾフェノン、キサントン生合成に関わる酵素もchs-sfに属す遺伝子がコードしている可能性を初めて示したものである。ポリケタイド合成酵素III型として理解が急速に深まりつつある、カルコン合成酵素(CHS>の遺伝子(CHS)は高等植物において多くの場合マルチジーンファミリーを形成して存在し、その配列には植物種に基づく多様性と、機能の多様性が分かちがたく存在している。

なかでも本研究ではじめてダイオウより得られたベンザルアセトン合成酵素(BAS)において、フェニルアラニン残基(ムラサキウマゴヤシのCHSで215番)がイソロイシンに置換しているだけで、新規触媒活性を獲得していることが明らかとなった。更に本酵素を用いて実験を行ったところ、メチルマロニルCoAを基質として天然には存在しないC6-C5型の化合物を生合成させることが出来た。しかしコガネバナ等のCHSでは上記残基を変異するだけではBAS活性を付与することは出来ず、在来知られている各種トリ、テトラケタイドの副次生成物が生じるに止まった。しかしながら、人工基質をスターター単位とした場合、これらは合成のしにくい新規オリゴケタイド化合物となり、結果として植物の遺伝的多様性を利用して、新規化合物のライブラリーを作成することが出来る可能性を示した。
機能性マルチレイヤー型膜・触媒層創成によるPEFC高度化の輸送現象論的展開

本研究の目的は、PEFC(固体高分子形燃料電池)電解質膜および触媒層内の電位・輸送・反応連成現象に着目し、マルチレイヤー型の膜・触媒層構造を創成することにより、一段の高耐久化、高効率化等が求められるPEFCの高度化に、輸送現象論的な視点からの展開を図ることにある。交付申請書記載の通り、今年度はマルチレイヤー型MEA作成方法の確立と基礎実験推進、検討本格化を行った。具体的には、昨年度その作成方法の検討を行った膜、触媒層の製法を確立し、電解質膜については金属プローブ層の挿入により、膜中厚さ方向の電位分布計測を行った。これにより、膜中の電位が混成電位で決定されることを理論モデルとの比較から示し、白金、金プローブの使い分けなどにより、この解釈を裏付けした。触媒層については、二層の触媒層制作を実現し、発電条件、触媒層設計パラメータの違いにより、発電特性が変化する様子を明らかにしている。また、GDLについては、パルスレーザ加工により厚さ方向にスルーホールの径が有意に変化するタイプのGDLを製作可能とするとともに、液水モデルにより、GDL表面での液水の離脱限界を示すことを可能とした。さらに、今年度の検討から触媒層、GDLでの輸送特性について、それぞれの内部での拡散係数の圧力依存性を利用して実験的に分離検討するため、試験装置の加圧化を行い、来年度以降の検討開始に備えた。また、輸送・反応モデルについては、セルレベル、GDL表面のチャンネル内、触媒層内部のそれぞれのレイヤーで構築を始めており、GDL表面のチャンネル内では流動解析用フリーソフトの援用により液水挙動をシミュレートする準備を行った。交付申請書記載に従った進捗を示しているためこれまでの2年間で確立した個々の実験上の要素技術を用い、現象解明のための本格検討に入る。これにあたっては、理論モデル構築も並行して行う。交付申請書記載の通り、初年度は、マルチレイヤー型膜・触媒層の作成方法の検討を行った。電解質膜では、膜中電位分布計測のため、電解質膜の間に細線金属プローブを挟み、ホットプレス法によりマルチレイヤー膜を作成した。また、金属プローブには白金線と金線を使用し、それぞれで膜中の電位計測を可能とした。また、触媒層では、ドクターブレード法とホットプレス法により、アイオノマー、白金担持、担持カーボンそれぞれの量を二層で可変にしたマルチレイヤー触媒層の作成技法を確立した。また、均質な微粒子作成のため、現有のパルスレーザによる加工システムを援用し、液体素子を用いた安価・簡便なビームシェイプ平坦化について検討を行った。また、ガス拡散電極のマルチレイヤー化についても、CCMマルチレイヤー化との整合性を中心に検討を行い、特に、パルスレーザ加工した電極の機水性の影響について検討を行った。以上により、予定通り、マルチレイヤー型膜・触媒層作成の目処をつけている。また、膜、触媒それぞれの厚さ方向の輸送・反応連成モデリングについて、基礎的な検討を開始し、それぞれ輸送を考慮した混成電位モデル、等価回路モデルを基本的なモデルとして用いる可能性を見いだした。また、触媒層の構造と過電圧との関係のモデル構築を行った。あわせて、試験システムの構築を行った。現有の光学的in situ可視化可能なPEFC単セル試験システムを基本としつつ、新たにガス加湿器を導入し試験システムを構築し、次年度以降の本格検討の準備を完了した。
脳機能画像(Functional MRI)による脳神経疾患の解析

肺機能画像による神経疾患の解析を行う目的で、以下の研究を行い結果を得た。臨床研究として、1.手指の運動負荷に伴う大脳運動野の肺機能画像の測定を確立した。次に、2.知覚刺激による大脳知覚野の賦活を行ない、温熱刺激、ローラー鍼刺激、視覚刺激で脳機能画像を得た。さらに、3.従来のGradient Echo法にかわって、超高速撮像法であるエコープラナー法(Echo Planar Imaging: EPI)を用いた脳機能画像法の確立を行い、アーチファクトの少ない脳機能画像を得た。続いて、4.脳機能画像の後処理を検討し、cross corelation法と信号変化の組み合わせが最適であった。また、脳機能画像の基礎的検討を行い、5.血液中のOxy-,Deoxy-hemoglobinの相対的な割合が脳賦活に伴った信号変化に影響する事を検証したが、脳賦活に伴う血液量(循環量)の影響が否定できなかった。一方、実験MR装置では、脳機能画像の基礎的検討として、Functional MRIのパルスパラメーターの最適化を行うためにモデル実験を行なった。1.Gerbilの一過性脳虚血モデルでは、従来のGradient Echo法で虚血に伴うDeoxy-Hbの増加によって脳組織の信号強度が著しく低下することを経時的に捉えた。一方、2.Wistarラットの低酸素脳症では、Gradient Echo法より優れた時間分解能を有するEPI(Echo Planar法)が最適であることを見いだし、EPIの臨床応用のための基礎的検討を行った。さらに、3.局所脳灌流画像(Cerebral Perfusion Imaging)は、このEPIの利用した造影剤の投与による方法を検討したが、臨床応用にふさわしくないために、4.arterial spin labeling法を用いた脳灌流画像を開発し、Wistarラットの脳組織の潅流画像を得と共に、5.acetazolamide投与に伴う、脳潅流量の変化を経時的に得た。しかし、この方法の臨床応用が実現せず、今後の課題となり、現在行っている。以上のように、脳機能画像の臨床応用が基礎研究、臨床研究を通して確立することができた。脳機能画像による神経疾患の解析を行う目的で、平成6年度は、以下の研究を行い結果を得た。臨床研究として、1.手指の運動負荷に伴う大脳運動野の脳機能画像の測定を確立した。2.複雑な手指の運動に伴う大脳前運動野・捕捉運動野の脳機能画像による検討を行った。3.脳機能画像を推計学的に表示するために、交差相関法による画像処理を行い、脳の賦活部位を有意な危険率で求めた。4.知覚刺激による大脳知覚野の脳機能画像の確立を行なったが、この際、被験者の動きを伴わない温熱刺激が知覚刺激として最適であることがわかった。5.脳機能画像の基礎的検討を行い、血液中のOxy-,Deoxy-hemoglobinの相対的な割合が脳賦活に伴った信号変化に影響する事を検証したが、脳賦活に伴う血液量(循環量)の影響が否定できなかった。

1.Gerbilの一過性脳虚血モデルでは、Gradient Echo法で虚血に伴うDeoxy-Hbの増加によって脳組織の信号強度が著しく低下することを経時的に捉えることができた。2.Wistarラットの低酸素脳症では、Gradient Echo法より優れた時間分解能を有するEPI(Echo Planar法)が最適であることを見いだし、今後の臨床応用のための基礎的検討を行った。脳機能画像による神経疾患の解析を行う目的で、平成7年度は、以下の研究を行い結果を得た。臨床研究として、2.すでに確立している、手指運動刺激による大脳運動野の脳機能画像を基に、知覚刺激による脳賦活を手掌のローラー鍼刺激で行い、大脳知覚運動野に賦活されることを見いだし、3.視覚刺激では、刺激側のみのV1野と両側のV5野に賦活領域がみられた。4.しかし、脳賦活に伴う、局所脳灌流量が測定できる脳灌流画像は、非侵襲的な方法としての確立が、実験機では可能であったものの、臨床用装置では、開発が終わらず、継続している。5.脳賦活領域を推計学的に表示するために、交差相関法による画像処理を行っていたが、この波形のフィティングのパラメータをより現実に近い、サイン波形とし、脳の賦活部位を有意一方、実験MR装置では、脳賦活に伴う脳灌流量の変化を定量的に測定するために、脳灌流画像法(Cerebara Perfusion Imaging)の確立と基礎的検討を行ない、1.arterial spin labeling法を2つのコイルとgradient echo法を用いて行い、2.Wistarラットの脳組織の灌流画像を得た。3.この脳灌流画像から、acetazolamide投与に伴う、脳灌流量の変化が径時的に得られた。4.また、この脳灌流画像の定量測定を定量画像として表示することができた。5.しかし、まだ定量的な局所脳潅流画像は、やや不完全であるために、現在パラメータの改良を行っている。以上のように、脳機能画像の臨床応用が基礎研究、臨床研究を通して確立することができた。
ヒト脳におけるプロゲステロン産生と作用-プロゲステロンはneurosteroidか?-

neurosteroidsとは、神経系内でコレステロールから生成されるステロイドホルモンであり、Baulieuらにより初めて示された。近年これらneurosteroidsの中ではプロゲステロン(P)が最も注目を集めており、動物実験では神経系でPが生成され、プロゲステロン受容体(PR)を介して神経に作用することが知られている。そこで我々は昨年度から引き続いて剖検から採取したヒト脳、外科手術から採取した神経系腫瘍などの病理組織標本でプロゲステロン産生に関わる3β水酸化ステロイド脱水素酵素及びプロゲステロン受容体A,B(PRA,PRB)双方の定量RT-PCR,免疫組織化学を用いた検討を進めた。更に中枢神経に加えて末梢神経及び末梢神経に由来する神経鞘腫などでPRA,B、並びにプロゲステロン合成に関与する酵素がが発現しているか否かを検索したところ、中枢神経ならびに脳腫瘍同様にPRA,PRB及びプロゲステロン合成酵素が発現している事が確認された。更にプロゲステロンを神経系の細胞に添加する事による遺伝子発現の変化を広範に検討する目的でmicroarray法を用いてまずは比較的取り扱いがしやすいヒト動脈平滑筋に由来する培養細胞を用いて神経系細胞に応用する前段階としての基礎検討を行った。培養細胞の増殖に関連するプロゲステロン濃度を添加して2倍以上にその遺伝子発現の程度が変化した遺伝子群が幾つか検出され、これらの遺伝子群はいずれも細胞増殖に関係する細胞内情報伝達系の蛋白質をencodingしている事が認められた。neurosteroidsとは、神経系内でコレステロールから生成されるステロイドホルモンそあり、Baulieuらにより初めて示された。今回我々はヒト脳組織の各部位においてもPR及びコレステロールからPを合成するのに必要な酵素(StAR、P450scc、3beta-HSD)が存在していることを初めて示し、ヒト中枢神経系においてもPがneurosteroidsとして作用していることを示した。次にヒト神経細胞由来の神経原性腫瘍におけるPの影響を検討した。PRにはPR-AとBの2つのisoformが存在することが知られており、その発現レベルを比較することでPの作用動態を知ることとなる。いずれの腫瘍においてもPRの発現は広範囲に認められ、髄膜腫はPR-A、Bが同程度の発現、星状細胞腫や神経鞘腫はPR-Bが優勢に発現しているのが認められた。このようにPの作用動態はPRが発現している各腫瘍間で異なっていることが示唆された。また髄膜腫、星状細胞腫においてPR-Aの発現と細胞増殖能を示すKi-67との逆相関が認められた。よってこれらの腫瘍においてPは特にPR-Aを介して増殖を抑制させるとも推察された。
マクロファージの異常な活性化に起因する慢性炎症発症機序の解明

マクロファージの炎症応答を可視化する事を目的に、インフラマソームを介したcaspase-1プロテアーゼ活性をモニターできるFRET型指示薬を開発した。分子設計として、caspase-1が認識・切断するタンデムペプチドモチーフの両端に蛍光タンパク質ECFPならびにcp173Venusを有するFRET解消型指示薬を構築した。試験管内アッセイで十分な応答を示す事を確認した後、細胞内アッセイを実施した。細胞質分布型の指示薬をレンチウイルスを用いて単球系細胞株THP1細胞に導入し、様々な刺激に伴うcaspase-1活性を計測した。その結果、ATP添加によるプリン受容体刺激、シリカビーズもしくは細菌の貪食のいずれにおいても、細胞質分布型の指示薬のFRETシグナルが解消されることを単一細胞レベルで確認した。シグナル変化はall-or-nonタイプで、その時間スケールは応答の開始から10分以内に完了するなど、細胞死を制御する他のcaspaseファミリーの活性化に比べ急峻な反応であること、刺激応答のタイミングは細胞毎に異なり、刺激の強度に応じ待ち時間積算型の分布を示すこと、が明らかになった。なお、caspase-1の活性化に伴い、細胞膜の透過性が急激に上昇し指示薬を含む細胞内容物が放出されるため、刺激応答した死細胞を同定することができないという問題が明らかになった。そこで刺激応答後の細胞も検出できるよう指示薬を細胞内に滞留させる方法を検討したところ、指示薬を細胞膜に局在させる事で刺激応答後の細胞も検出できることを明らかにした。26年度が最終年度であるため、記入しない。IL-1βの産生活性を可視化するため、大きなシグナル変化ならびに十分な感度特性を有するFRET型蛍光指示薬の開発を行った。まずFRETシグナル変化を最大化するため、ドナーアクセプターの配向関係の最適化を行った。その結果、ECFPと円順列変異体Venus(cp173Venus)の間にICE1/casp-1認識配列を挿入したものが550%という大きなシグナル変化を示す事がわかった。また、ICE1/casp-1の活性化を高感度に検出する事を目的に、ICE1/casp-1の認識配列の至適化ならびにタンデム配置による切断効率の最適化を行った。その結果、至適配列を3つタンデム配置した指示薬が、in vitroでの切断効率が最も高くなる事を明らかにした。次に、マクロファージ系列の培養細胞を用いて、刺激応答時のIL-1β産生能をモニターできるかどうか検討した。ATP刺激による指示薬のシグナル変化をアッセイしたところ、後期応答であるアポトーシスに伴うFRETシグナルの解消は検出できるにも関わらず、初期応答でのFRETシグナル変化を検出することが出来ないことが明らかになった。ELISAによる培養上清中のIL-1β産生は正常に検出されたことから、開発した指示薬はin vitroで再構成されたICE1/casp-1の基質にはなりうるが、細胞内では適切な基質とならない可能性が示唆された。この問題を解決するため、細胞内インフラマゾームで正しくプロセッシングされるような指示薬の改良を行う必要があることが明らかになった。in vitroでは十分な性能を発揮することが確認できたプロトタイプ指示薬が、細胞内では十分な機能を有しないという想定外の事態が明らかになったため、全体の進捗が遅れている。すでに問題解決の方針も確定しているため、H26年度には進捗の遅れを取り戻すことができると考えられる。IL-1βの細胞内産生動態を可視化するためには、指示薬がインフラマゾーム中のICE1/casp-1に正しく認識されるよう指示薬の改良が必要である。このため、6アミノ酸からなるICE1/casp-1認識至適配列にかわり、完全長のIL-1βを用いたFRET解消型指示薬を作製する。

感度を優先させるため、ECFP-cp173Venus間のリンカー配列を6-18アミノ酸から269アミノ酸(完全長pro-IL-1β)とすることで、細胞内でもICE1/casp-1の基質となる事を確認する。次に、IL-1β全長配列を基質とした場合、応答の感度は改善する一方で、FRETシグナル変化が著しく減少する事が予想される。細胞内インフラマゾームでの指示薬切断に伴うシグナル変化を最大化するため、ドナーならびにアクセプター蛍光遺伝子に異なる細胞内コンパートメントへの移行シグナルを付加する事で、検出効率の向上を目指す。In vitroでのアッセイでは不十分な事が明らかになっているので、アッセイは培養細胞ならびに初代培養単球細胞を用いて行う。ELISAによる内在IL-1βを指標に、IL-1β産生活性を有する指示薬が完成したら、指示薬をマクロファージ系列で発現するトランスジェニック動物の作出を行う。研究の効率化を図るため、トランスジェニックマウスの作製に先立って、トランスジェニックゼブラフィッシュの作出を進め、慢性ならびに急性炎症反応におけるIL-1β産生動態の生体内イメージング解析を行う。
尿路結石症の原因と予防に関する研究:特に細胞膜の蓚酸担体の機能異常に関して

先に,我々は腎刷子縁膜(BBM)に陰イオン交換による蓚酸輸送系の存在を報告した。今回の研究では,本輸送系の性質をより具体的に研究し,尿路結石症の病因として,膜における蓚酸輸送担体の機能異常の意義を検討することを目的とした。実験計画およビ結果は下記に示した通りであった。(1)まず本輸送系の性質を知るため,ラット腎近位尿細管より刷子縁膜小胞を分離精製し,陰イオン勾配下における蓚酸の取り込みを,小胞外蓚酸濃度50μMより10mMまで検討した。濃度曲線は飽和傾向を示したが,小胞外蓚酸濃度10mMにおいても,平衡状態に違せず,生理的条件では,本輸送系の意義は少ないと考えられた。(2)次に,本輸送系に対するサイアザイドの影響を検討するためラットに臨床的量のサイアザイドを21日間連日投与した。同ラットより分離精製したBBMVにおける蓚酸の取り込み有意差がなく,赤血球膜の陰イオン交換タンパク(BAND3protein)に認められるサイアザイドの効果は観察されなかった。(3)本結果を確認するため,ヒト赤血球膜における蓚酸のFlux rateを測定したが,生理的温度では反応が急速で再現性のある結果が得られなかった。(4)より精度が得られる方法として,蓚酸がカルシウムのキレート物質であることを利用し,赤血球内のカルシウム濃度を細胞内カルシウム測定装置(SHIMAZU FP-5000)を用いて測定した。赤血球の凝集の問題が生じているが,本実験においては,EGTA・EDTA・クエン酸等のカルシウムキレート剤が使えないため,赤血球が凝集する問題や赤血球をghost化する必要があるが,今後さらに検討を加えれば,有効な結果が得られる可能性がある。(5)これらの実験の過程で,サイアザイドのクエン酸排泄に興味深い結果が得られた。臨床的投与量のサイアザイドにより,尿中クエン酸濃度は有意に増加した。低K食により誘発したK欠乏ラットでは,アルカローシスにもかかわらず,尿中クエン酸排泄は有意に低下した。(目的)尿路結石形成の重要な因子である蓚酸・クエン酸の尿中排泄とサイアザイド投与の効果に関し、腎刷子縁膜での蓚酸・クエン酸輸送系を中心に検討した。(方法)8週齢雄ウイスタ-系ラットにhydrochlorothiazide(以下サイアザイド)を21日間以上経口投与し、自由飲食下、代謝ケ-ジを用いて24時間採尿後、Mg沈澱法にて腎皮質より腎刷子縁膜小胞を分離精製し、^<14>Cー蓚酸・クエン酸の小胞への取り込みを測定した。(結果)尿中蓚酸排泄はサイアザイド投与により、尿中濃度は減少、一日尿中総排泄量は有意に増加した。

腎刷子縁膜における陰イオン交換による蓚酸輸送系について検討すると、本輸送系はサイアザイドの投与にかかわらず濃度依存的に増加し(第11回国際腎臓学会、東京、1990)、influx、efluxとも、サイアザイド投与による影響は観察されず、ヒト赤血球膜において報告されたサイアザイド投与による蓚酸輸送担体機能の変化は否定された(第78回日本泌尿器科学会総会)。赤血球膜の蓚酸輸送担体の測定は、^<14>C蓚酸を用いた実験系では測定困難のため、カルシウムキレ-ト作用を利用して測定実験中である。ラット腎刷子縁膜の陰イオン交換タンパクの変化に関しては、電気泳動法を用いて検討中である。尿中クエン酸排泄はサイアザイド投与により、尿中濃度、一日尿中総排泄量とも有意な上昇を示した。^<14>Cークエン酸を用いた実験では、ラット腎刷子縁膜のクエン酸輸送系にはサイアザイド投与による有意な変化を認めなかったが、加齢に伴うクエン酸輸送系の有意な低下を認めた(第79回日本泌尿器科学会総会発表予定)。1.腎刷子縁膜における蓚酸輸送担体の機能測定のため、ラットにhydrochlorothiazide(以下、サイアザイド)懸濁液を21間連日投与し、蓚酸、クエン酸の尿中排泄に関し検討を加えた。(1)尿中蓚酸排泄は、サイアザイド投与により尿中濃度は減少、一日尿中総排泄量は有意に増加した。しかし、ラット腎刷子縁膜での陰イオン交換による蓚酸輸送系には有意な影響を与えなかった。(2)尿中クエン酸排泄量はサイアザイド投与により尿中濃度、一日総排泄量とも有意な上昇を示した。14ーCクエン酸を用いた実験では、ラット腎刷子縁膜のナトリウム依存性のクエン酸輸送系には有意な影響を認めなかった。尿中クエン酸濃度と一日尿量はサイアザイド投与の有無にかかわらず正の相関を示した(r=0.593,p<0.01)(3)8週齢ラットおよび25週齢ラットの腎刷子縁膜小胞におけるクエン酸の取り込みの検討より、加齢に伴いラット近位尿細管刷子縁膜のナトリウム依存性のクエン酸輸送系の有意な機能低下を認めた。2.赤血球膜の蓚酸輸送系の機能測定法の検討(1)Cー14蓚酸を用いて赤血球内への蓚酸のflux rateの測定をおこなったが、30°Cにおいては再現性のある安定した結果を得ることができず、臨床応用は困難であった。(2)ヒト赤血球膜における蓚酸の透過性を測定するため、細胞内カルシウム濃度測定装置を用いてghost赤血球内のカルシウム濃度測定法を検討した。現在、赤血球内のカルシウム濃度を平衡状態においた後、赤血球外に蓚酸を加え、赤血球内のfreeのカルシウムの減少率より赤血球膜の蓚酸輸送機能を測定する方法を検討中である。先に、我々は腎刷子縁膜(BBM)に陰イオン交換による蓚酸輸送系の存在を報告したが、本年度は同輸送系に対するサイアザイド投与の影響についての研究を継続すると供に、昨年までの研究で得られたサイアザイド投与による尿中クエン酸排泄への興味深い効果に関しての検討を進めた。さらに、細胞内カルシウム測定装置(SHIMAZURF-5000)を用いてヒト赤血球でのカルシウムfluxの測定方法を完成させることを目的に実験を行った。残念ながら、尿中クエン酸排泄に関して新しい知見が得られたのみで、他の研究課題に対しては、十分な成果を得ることはできなかった。(1)本研究の主目的である膜における蓚酸輸送担体の機能の検討のため、文献的に証明されているサイアザイド投与による膜機能の変化を期待したが、ラット腎刷子縁膜においては、高濃度の蓚酸を用いても同輸送系に対する影響は観察されなかった。従って、腎刷子縁膜では蓚酸は大部分が拡散により通過しており、本輸送担体の生理学的意義は少ないと推察された。(2)次に細胞内カルシウム測定装置を用いた蓚酸のfluxの測定は、生理的条件での蓚酸の輸送機能をみる方法として有用な方法と考えられるが、赤血球の凝集の問題を解決するにはさらなる検討が必要と思われた。(3)尿中クエン酸排泄に対するサイアザイドの効果に関しては、さらに新しい知見が得られた。
スピロピランの分子修飾による高効率機能性フォトクロミック材料の分子設計

本年度は、基材として順、逆両ミセルとポリイオン錯体を選び、スピロピラン(SP)のフォトクロミック特性がこれ等基材によってどのように変化するか検討した。特にSPに長鎖アルキル基、イオン性置換基を導入した場合の効果について詳しく検討し、発色体メロシアニン(MC)の会合体系成に関し重要な知見を得た。(1)ミセル中での挙動....水不溶性SPはCTAB,SDSなどのミセル水溶液中で正フォトクロミズムを示した。MCのλmaxはSPに長鎖アルキル基を導入すると長波長シフトし、MCがミセル疎水部にとり込まれることを示唆した。MCの熱消色速度(k)は同極性有機溶媒中より小となった。一方、これらSPは逆ミセル中でもミセル近傍の極性領域に存在することを示した。水溶性SPは水中と同様逆ミセル中でも逆フォトクロミズムを示したが、その特性はミセルの電荷とSP置換基の電荷と関係していることを明らかにした。(2)ポリイオン錯体中での挙動....SPを低分子活性剤-高分子イオンからなる標記錯体中にとり込ませたキャストフィルムはフォトクロミズムを示し、その特性はSPの構造に依存して著しく変化した。即ち、通常のSPは錯体中の極性の高い部位にとり込まれ、MCの消色速度は同極性の有機溶媒中よりかなり減少した。長鎖アルキル基を導入するとSPは錯体中の疎水性部位に位置し、アルキル鎖の長さと数によってはMCは安定な会合体を形成した。一般に長鎖(C_<13>C_<30>)アルキル基を二本導入するとJ会合体を、中程度のアルキル鎖(C_<10>C_<12>)を二本導入するとH会合体を形成した。これらの会合体の形成しやすさと錯体中の活性剤のアルキル鎖の効果、SP濃度の関係や会合体の特性を明らかにした。
再生に応答して活性化するゲノム領域から迫る再生能を失うまでの進化プロセスの解明

ほ乳類の再生能は魚類や両生類と比べて限られていることから、進化の過程でその能力を失ったという仮説が提唱されてきた。一方で、ゲノムの比較解析と遺伝子の機能の解析からは、発生再生に関わる遺伝子は、その種類、数、機能が、進化的に高度に保存されていることが示されている。ゆえに進化にともない再生能を失ったという仮説の実体は、遺伝子を失ったというよりも、再生に使う遺伝子の発現システムが変容したと予想される。しかしながら、これまでその実体に迫った研究はなかった。本研究は、再生に応答して活性化する両生類のゲノム領域(再生シグナル応答エンハンサー)を足がかりとして、非コードDNA領域に刻まれた再生能を失うまでの進化プロセスの解明を目指すものであった。両生類の腎尿細管の再生をモデルにして、その再生過程で発現が亢進するlhx1遺伝子に着目した。lhx1の発現を再生中の腎管でオンにするエンハンサーをトランスジェニック・レポーター解析によりスクリーニングしたところ、再生能の高い魚類と両生類間のみで保存されている非コードDNA領域のみならず、ほ乳類でも保存されている非コードDNA領域でも強いエンハンサー活性が見られた。マウスの非コードDNA領域をもつレポータートランスジェニック両生類を作成し、両生類の腎管再生における活性化能を調べたところ、マウスのゲノムにも再生時に遺伝子発現を活性化させる機能があることがわかった。さらに、再生シグナル応答エンハンサーの活性化されるメカニズムを調べたところ、このエンハンサーには転写因子Arid3aが結合すること、これによりArid3aとヒストンH3タンパク質の9番目のリジンのトリメチル化(H3K9me3)を脱メチル化する酵素Kdm4aを呼び込みエンハンサーのエピゲノム状態を変えること、Arid3aの働きを阻害をすると腎管の再生が起こらないことを発見した。失われた体の一部を取り換えることは、動物では一般的によく見られる現象である。例えば魚類では鰭を失ったとしても機能的な組織を再び作り上げる事ができる。一方、ほ乳類は、組織や器官を丸ごと取り換える能力を持っていない。この違いについては、再生能をもつ動物が進化の過程でその能力を適応的に獲得してきたという説と、ほ乳類が進化の過程でその能力を失ってきたとする説が唱えられてきた。一方で、ゲノムの比較解析と遺伝子の機能の解析からは、脊椎動物の発生再生に関わる遺伝子は、その種類、数、機能が、進化的に高度に保存されていることが示されている。これら発生遺伝学や機能ゲノム学的な結果を鑑みれば、再生能の高い動物が進化の過程でその能力を獲得したというよりも、ほ乳類が進化にともない再生能を失った可能性が高く、その実体は遺伝子の消失よりも、再生に使う遺伝子の発現システムが変化したことが要因であると予想される。しかしながらこれまで、ほ乳類の再生能を失わせるに至った発現システムに迫った研究はほとんどない。そこで本研究は、両生類の再生に応答して活性化するゲノム領域を足がかりとして、非コードDNA領域に刻まれた再生能を失うまでの進化プロセスの解明を目指すものである。本年度は、1.再生可能な動物間でのみ保存されている再生シグナル応答エンハンサーが存在するのか、2.ほ乳類のゲノムに再生可能動物の中で再生シグナルに応答して遺伝子発現を活性化できる領域が存在するのか、解析する予定であった。研究計画に基づいて研究を遂行し、両生類の再生過程での遺伝子発現の亢進を担うエンハンサーは、再生可能動物で保存されているゲノム領域を使っているのではなく、ほ乳類ゲノムにも保存されている領域を活用していること、また、ほ乳類のゲノムにも両生類の再生組織で遺伝子発現を活性化させることができるエンハンサーが保存されていることを明らかにした。進化の過程で再生能力を失う要因の1つとして、祖先種に存在した再生シグナル応答エンハンサーが、ほ乳類ゲノムで欠損している可能性が挙げられる。そこで本年度は、まずネフロンの再生に関わるlhx1のゲノム配列の比較解析を行い、ほ乳類にはなく、魚類と両生類の間で高度に保存されている17ヶ所の領域を抽出しした後、それら領域とEGFP遺伝子を融合したレポーターを構築し、トランスジェニックを作製した。次に、レポータートランスジェニック個体の腎管を破壊した後、レポーター遺伝子の発現の有無について検討した。その結果、17ヶ所のうち6ヶ所は、再生中の腎管でエンハンサー活性が認められなかった。一方、11ヶ所についてはエンハンサー活性が認められたのもの、これまでに同定した魚類からほ乳類の間で進化的に保存されている再生シグナル応答エンハンサーと比べると、極めて弱いことがわかった。これらの結果から、少なくとも、再生過程でのlhx1の発現を担うエンハンサーは、再生能の高い動物間のみで保存されているゲノム領域を使っているのではなく、ほ乳類ゲノムにも保存されている領域を活用していることが示唆された。次に、それら魚類からほ乳類の間で進化的に保存されているゲノム領域について、マウスの相同配列が両生類の腎管再生過程で、再生シグナルに応答して活性化する機能が保存されているのかについて検討した。その結果、マウスのゲノム領域は、両生類の再生中の腎管においてエンハンサー活性を示すことがわかった。このことから、ほ乳類のゲノムにも再生シグナルに応答して遺伝子発現を活性化するエンハンサー機能が保存されていることがわかった。両生類や魚類は哺乳類と比べて、損傷により失われた器官や組織を再構築する高い能力を持つ。

この違いについては、再生能をもつ動物が進化の過程でその能力を適応的に獲得してきたという説と、ほ乳類が進化の過程でその能力を失ってきたとする説が唱えられてきた。一方で、ゲノムの比較解析と遺伝子の機能の解析からは、脊椎動物の発生再生に関わる遺伝子は、その種類、数、機能が、進化的に高度に保存されていることが示されている。これら発生遺伝学や機能ゲノム学的な結果を鑑みれば、再生能の高い動物が進化の過程でその能力を獲得したというよりも、ほ乳類が進化にともない再生能を失った可能性が高く、その実体は遺伝子の消失よりも、再生に使う遺伝子の発現システムが変化したことが要因であると予想される。しかしながらこれまで、ほ乳類の再生能を失わせるに至った発現システムに迫った研究はほとんどない。そこで本研究は、両生類の再生に応答して活性化するゲノム領域を足がかりとして、非コードDNA領域に刻まれた再生能を失うまでの進化プロセスの解明を目指すものである。平成28年度は、ネフロンの再生に関わるlhx1のゲノム領域で、再生時に活性化するエンハンサーのスクリーニングを行い、lhx1ゲノム領域の再生シグナル応答エンハンサー配列は再生可能動物とほ乳類の間で保存されていること、ほ乳類のその領域は両生類のネフロンの再生時にエンハンサーとして機能することを明らかにしている。本年度はこれら成果を受けてエンハンサーへの入力因子の探索から、再生可能動物とほ乳類の間での再生能の違いについて検討する予定であった。計画に基づき研究を遂行し、入力因子の候補の1つが再生グナル応答エンハンサーに直接結合すること、その入力因子がエピジェネティック制御因子と協調的に働き、エンハンサー近傍のエピゲノム状態を変えることを明らかにした。進化の過程で再生能力を失う要因の1つとして、祖先種に存在した再生シグナル応答エンハンサーが、ほ乳類ゲノムで欠損している可能性が挙げられる。平成28年度は、lhx1のゲノム領域で両生類の再生時にその発現を担うエンハンサーをトランスジェニック解析より同定し、少なくとも、再生過程でのlhx1の発現を担うエンハンサーは、再生能の高い動物間のみで保存されているゲノム領域を使っているのではなく、ほ乳類ゲノムにも保存されている領域を活用していること、これらほ乳類でも保存されている領域は両生類の再生時にエンハンサーとして機能することを明らかとした。これらからそれらエンハンサーのエピゲノム状態を変える入力因子が両者の再生能の差の要因として挙げられ、本年度は入力因子の同定と、その入力因子と共にエピゲノム状態を変える因子の探索を行う予定であった。計画に基づき研究を遂行し、候補因子の中から直接エンハンサーに結合する転写因子の同定、ならびにその転写因子と協調的に働くエピジェネティック制御因子の同定に成功した。またそれら入力因子の複合体がlhx1ゲノム領域の再生シグナル応答エンハンサーのエピゲノム状態を変化させること、そのエピゲノム修飾を変えることで両生類のネフロン再生が阻害されることを明らかとした。これらより研究は概ね順調に進展していると判断した。ほ乳類の再生能は魚類や両生類と比べて限られていることから、進化の過程でその能力を失ったという仮説が提唱されてきた。
病原酵母が行うマイトファジーの宿主貪食細胞内生存における役割

今年度は、マイトファジー活性を効率よく検出することを目的とし、出芽酵母の液胞内プロテアーゼをコードするPEP4のC. glabrataにおけるホモログであるCAGL0M02211gの破壊株にミトコンドリア移行シグナルとGFPを付加したジヒドロ葉酸リダクターゼ(mtDHFR-GFP)を高発現させた菌株を作製し、蛍光顕微鏡観察によって効率よくマイトファジー活性を測定することができる実験系を確立した。マイトファジーが活性化した場合、ミトコンドリアに局在したmtDHFR-GFPはミトコンドリアと共に液胞へと運ばれて分解を受けるが、CAGL0M02211gの破壊株では液胞内へと運ばれた後分解を受けずに液胞内に蓄積したため、このタンパク質のGFPシグナルを観察することでマイトファジー活性化の有無を確認することができた。感染臓器内におけるマイトファジー活性の測定は病原性における役割解明に不可欠であり、このような菌株を利用することで新たな知見が得られる可能性が高い。また、ヒト血液から調整した好中球とC. glabrata野生株またはマイトファジー欠損株を混合し、貪食効率および貪食後の生存率の測定を行った。野生株とマイトファジー欠損株における被貪食効率に有意な差はなかったが、貪食後の生存率においては、野生株が欠損株と比べて有意に高い事が明らかとなった。今年度実施予定の実験を一部来年度に行うこととし、来年度実験予定の実験を一部前倒しで行った。来年度予定していた実験は既に大半を終えている。一方で、本年度計画していた、貪食細胞内でのミトコンドリア機能維持におけるマイトファジーの役割の解明に関する実験が未実施であるため、来年度に行う予定である。病原真菌Candida glabrataにおけるマイトファジーは、鉄欠乏条件によって活性化し、鉄欠乏条件におけるミトコンドリアの機能維持と長期生存に関与している。また、マイトファジーに必須なATG32の破壊株では病原性が顕著に低下することが明らかにされたが、マイトファジーがどのように病原性に関与しているかは不明である(Autophagy. 2016 Aug 2;12(8):1259-71.)。C. glabrataは、マイトファジーによって機能低下ミトコンドリアを分解することで、鉄欠乏環境である貪食細胞内において生存し、病原性を発揮しているという仮説を立て、この仮説を検証することを目的に研究を行った。今年度は貪食細胞内におけるATG32(マイトファジー活性化に先立って発現量が増加する遺伝子)発現解析およびマイトファジー活性解析を行った。株化されたマクロファージ様細胞、Raw264、J774、分化させたTHP-1細胞、マウス骨髄およびヒト血液から調整した好中球、マクロファージ等とC. glabrataを4時間共培養し、貪食細胞に菌を貪食させた後に菌体を回収し、定量RT-PCRによってATG32の発現量を調べたところ、貪食された菌ではコントロールと比較して最大約6倍の発現増加が認められた。マイトファジー活性に関しては、GFPを付加したミトコンドリア局在型ジヒドロ葉酸リダクターゼ発現株を用いてウエスタンブロットによって測定を試みたが、貪食細胞由来のタンパク質の混入により検出が難しい状況である。今後代替方法によってミトコンドリア分解活性を調べる予定である。今年度計画した実験の大半を終えている。今年度の実験に関しては計画通り進んでいる。来年度以降も計画書通りのスケジュールで進める。(理由)年度末納品等にかかる支払いが平成30年4月1日以降となったため、当該支出分については次年度の実支出額に計上予定。平成29年度分についてはほぼ使用済みである。(使用計画)上記のとおり。
非侵襲脳刺激法を用いた運動認知共通制御神経機構の解明と認知機能促進手法の構築

非侵襲脳刺激法を用いた認知リハビリテーションの開発に向けて、さまざまな基礎的検討をおこなった。まず運動機能障害に対するリハビリテーション効果として、下肢の運動障害を持つ皮質下梗塞の患者に対して経頭蓋直流電気刺激tDCSが有効であることが示された。tDCSによる頭頂葉刺激により計算課題の成績が向上すること、成績改善の程度は事前におこなう機能的MRIの所見で予測できることを明らかにした。また動物実験により、大脳皮質の陰極刺激によって基底核のドーパミン遊離が促進されることを明らかにした。これらの成果は、tDCSを用いた認知リハビリテーションの開発に貢献するものと考える。1.TMSが認知的手続き学習の記憶定着に及ぼす影響の検討単一の認知的手続き課題の学習過程および記憶の定着過程が、TMSどのように修飾されるかを検討した。認知的手続きの複数同時学習課題を開発し、個別集中学習と、同時並行学習という異なるスケジュールによって学習を行わせた。機能的磁気共鳴画像法を用いて、学習に関与する脳部位を被験者ごとに求めたところ、補足運動野が学習スケジュールの違いを反映していることが明らかになった。学習終了後に、低頻度連続TMSによって補足運動野の神経活動を抑制したところ、個別集中学習を行った群では、学習内容の定着が阻害されたのに対して、同時並行学習を行った群では学習定着は阻害されなかった。2.頭頂葉のtDCSが数の計算処理に及ぼす影響数の認知処理に対するtDCSの効果を明らかにするための予備的検討を行った。左角回への陽極刺激とシャム刺激を行い、掛け算課題の成績への影響を比較した。シャム刺激群では時間を追う毎に正答率が上昇する傾向が見られたのに対し陽極刺激群には明らかな変化が見出せず、左角回への陽極刺激は数の認知処理学習を妨害する可能性が示唆された。3.tDCSが線状体ドパミン遊離量に及ぼす影響大脳基底核は運動制御だけでなく、さまざまな認知制御に重要な役割を果たすことが知られている。大脳皮質へのtDCS処置がラットの線条体神経細胞外に放出されるドパミン濃度に対してどのような影響を与えるかを、Invivo microdialysis法を用いて検討した。その結果、陰極電極をもちいて400μAまたは800μAのtDCSを印可した後、線条体におけるドパミン濃度が有意に増加した。tDCS処置によるドパミン濃度の増加は400分以上維持されていた。一方、セロトニン濃度は、いずれの刺激強度においても増加が認められなかった。また、陽極電極をもちいたtDCSでは、800μAの刺激を印可した場合も、ドパミンとセロトニンのいずれも放出濃度に有意な変化は認められなかった。1.頭頂葉のtDCSが数の計算処理に及ぼす影響tDCSの効果には個人差があり臨床応用において課題となるため、暗算課題時のtDCS効果の個人差をあらかじめfMRIによって予測できないか検討した。被験者15名の暗算課題中の左右頭頂葉の脳活動をfMRIで計測し、活性化部位の体積の左右差をLaterality Index(LI)=(L-R)/(L+R)を用いて評価した。次に被験者ごとに同定された左右頭頂葉の活性化部位直上の頭皮に刺激電極を設置し暗算課題施行中にtDCSを印加した。刺激前、刺激中、刺激後30分及び60分の成績を反応時間と動作時間の和(Response time:RT)を用いて評価した。tDCS施行の前後で暗算課題の成績は統計的有意に改善した。また、刺激後のRTの改善の程度はLIと有意な相関を示し、相対的に左の活動が優勢な被験者ほどtDCSによる課題改善効果が顕著であった。2.tDCSが線状体ドパミン遊離量に及ぼす影響tDCSのパーキンソン病への臨床応用を視野に入れ、前頭皮質へのtDCS処置がラットの線条体における細胞外ドパミン濃度に対してどのような影響を与えるかをIn vivo microdialysis法を用いて検討した。麻酔下でラットの右線条体に透析プローブを挿入後、人工脳脊髄液の灌流および回収を10分間隔で開始した。ドパミン・セロトニン濃度の安定を確認後、右前頭皮質直上の頭皮と首に設置した電極から800μAの直流電流を10分間印加した。その結果、前頭皮質側に設置した電極を陰極として直流電流を印加した場合、線条体細胞外ドパミン濃度が有意に増加した。この濃度増加は120分後から統計的有意な水準に達しその後400分以上維持された。一方、前頭皮質側の電極を陽極とした場合には有意な変化は認められなかった。また、セロトニン濃度はいずれの条件でも有意な変化は認められなかった。