hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
森林環境の変化が林地の保水および土砂扞止機能に及ぼす影響に関する研究

ここに、1m×1mのプロットを設け、ほぼ2カ月に1回の割でこのプロットに流入及びこのプロットから流出していく土砂量の推移状況を調べた。今年度明らかになった成果は以下のようである。すなわち前者についてであるが、今年度は当該流域内での林業関係の施業は年明け早々に、量水堰上流左岸側に延長500mほどの作業道が開設され、わずかばかり間伐作業が進んでいた他はなんら手が加わっていない。試験流域には今年度何度かの中小の出水があったが、上流からの土砂の流出は見られなかった。逆に、量水堰直上流の治山ダムの堆砂地で若干の侵食現象が見られた。これは、ダム施工時の掘削土を竣工後ダム堆砂地に残土として埋め戻したものが2次侵食を受けたものである。試験流域内の山腹には崩壊地もないことと、森林の状態も良好なことを考慮すると、森林の水土保全機能が十分に発揮されたためである。水質については、上記の間伐作業の影響はなく、出水によっても溶存物質の濃度が薄まっただけにとどまっていた。後者のヒノキ林での土砂移動形態としては、雨および風による不安定土砂の斜面下方への移動が見られている。1年少しの観測の結果であるが、冬季にプロット内への流入が多く、その量は降雨量とは無関係であって大きな値を示す。プロットからの流出は当然期間内の降雨によるものであるが、侵食量は流入量の1/4-1/6にしか達しておらず、減少はサイクリックな動きを見せている。森林のもつ水漁函養機能と土砂扞止機能を定量化するための観測を実施してきている。高知県高岡郡梼原町川井水源地に設置された量水施設と雨量観測からなる観測施設での観測は主として前者の機能の解明のためのものである。森林に何らかの人為が加えられたことによる影響は直ちに流出に表れる、それと同時に渓流内への土砂流入、渓流内での移動も生じるが、本研究では量水施設の直上流の治山ダムにまで流出して堆積する土砂の動態から把握することができる。また、鬱閉して林内が暗くなったため下層植生の消えたしまったヒノキ林で行ってきた観測は後者の機能についてのものである。地表が裸地化しており、降雨や落石等により表土の撹乱・移動の始まっている場所に、1m×lmのプロットを設け、ほぼ2カ月に1回の割でこのプロットに流入及びこのプロットから流出していく土砂量の推移状況を調べてきた。3年間の観測期間中に明らかになった成果は以下のように要約できる。である。すなわち前者についてであるが、2年目に当該流域内で左岸側に延長500mほどの作業道が開設され、それに続いて下流部の斜面で軽度の間伐作業が行われた.試験流域には2年目に何度かの中小の出水があったが、上流からの土砂の流出は見られなかったが、3年目には5回の台風の影響が顕著であった。そのため、量水堰直上流の治山ダムの堆砂地には流域内から多量の土砂が流出して堆積した。全般に見て試験流域内の山腹には崩壊地もなく森林の状態も良好ではある。2年目と3年目の比較から、森林の水土保全機能の発揮のための限界雨量値が得られた。水質については、水質形成に関して洪水時と平水時とでは異なる傾向の示されることが明らかとなった。最終年の平成9年度に高知県に多大の雨量をもたらした5回の台風の風雨による影響を見るために豪雨直後ごとの観測も行った。その結果、冬季の土砂の変動の活発さがあらためて明確となったほか、豪雨による影響はそれほど顕著ではないことも明らかとなった。なお、平成9年の10月にこの林で間伐が行われた.
空間フィルターを用いた火災内局所ラジカル自発光の測定による火災微細構造の観察

火災構造の基礎研究に不可欠な、活性化学種(ラジカル)濃度をはじめ、高温雰囲気中の諸量の光学測定のために、高空間分解能を有する受光光学系を最適化設計・製作するために以下のことを行った。1.測定範囲、焦点距離、凹凸面鏡の直径などと空間フィルターを組み合わせ、測定体積が最も小さくなるように、非近軸幾何光学に基づく光線追跡法を用いたシミュレーションに基づき最適設計を行った。2.波長分離フィルターや分光器など、多種の測定器に対応できる光ファイバーコネクタの設計・製作を行った。3.光ファイバーの測定器側からレーザー光を逆に入れ、測定点に焦点を結ばせる方法により、正確な光学配置が容易に可能な補助装置の設計・製作を行った。4.マイクロトーチ火災を用いて光学系の測定体積の検定を行い、光線追跡法を用いたシミュレーション結果と同等の空間分解能を有していることを確認した。また、その受光光学系を予混合噴霧火災に適用し、火災の微細構造を観察するために、以下の実験を行った。1.噴霧火災中において、レーザシート光による火災内の噴霧断層可視化と本受光学系を用いた火災中の局所ラジカル自発光を同時に測定し、噴霧領域と燃焼反応領域の位置関係を調べた。2.位相ドップラ計(PDA)とラジカル自発光の同時測定を行い、火災中の局所の噴霧特性と燃焼反応強度の相互関係を調べた。3.噴霧火災中の流れ場計測と局所からのラジカル自発光計測を同時に行い、噴霧の消失速度および燃焼速度を求めた。その結果、以下の結果を得た。1.噴霧火災には、噴霧領域と燃焼反応領域が重畳した、厚い反応帯が存在する。2.噴霧火災には、予混合的な燃焼反応領域と拡散燃焼反応領域が存在する。3.噴霧の局所特性の空間的・時間的な変動により、火災伝ぱに最適な局所噴霧特性を有する噴霧領域を、選択的に火災が伝ぱする。火炎構造の基礎研究に不可欠な,ラジカル濃度をはじめ,高温中の諸量の測定の光学測定に高分解能な受光光学系を製作するために以下のことを行った.1.測定範囲,焦点距離,凹凸面鏡の直径などと空間フィルターを組み合わせ,測定体積が最も小さくなるように,非近軸幾何光学に基づく光線追跡法により最適設計を行った.2.波長分離フィルターや分光器など,多種の測定器に対応できる光ファイバーコネクタの設計・製作を行った.3.光ファイバーの測定器側からレーザー光を逆に入れ,測定点に焦点を結ばせる方法により,正確な光学配置が容易に可能な補助装置を設計・製作を行った.4.マイクロトーチ火炎を用いて光学系の測定体積の検定を行った.また,その受光光学系を用いて以下のことを行った.1.噴霧火炎中においてレーザーのシート光による火炎内の噴霧の断層可視化と本受光学系を用いた火炎中の局所からのラジカル自発光を同時に行い,火炎の微細構造を観察した.2.位相ドップラ計(PDA)とラジカル自発光の同時測定を行い,噴霧の存在の有無と火炎の有無の相互関係を明らかにした.火災構造の基礎研究に不可欠な、活性化学種(ラジカル)濃度をはじめ、高温雰囲気中の諸量の光学測定のために、高空間分解能を有する受光光学系を最適化設計・製作するために以下のことを行った。
尿中代謝物測定による有機溶剤高感受性作業者スクリーニング法の開発

化学物質取り扱い職域において、同じ量の曝露をうけても感受性が高く中毒を発症しやすい作業者のスクリーニングは、職場での適正配置と就業後の健康管理を行う上で重要な課題である。本研究では、有機溶剤の1つトリクロロエチレン(TCE)使用職場で数百人にひとりが発症する重症型皮膚肝障害に関して、感受性に関連のあるN-アセチル転移酵素2(NAT2)によるTCE代謝物量(S-1,2-ジクロロビニル-N-アセチルシステイン(DVNAC))を、遺伝子改変動物及び患者・曝露作業者で測定した。遺伝子解析を職場作業者に行うことは倫理上の問題により実施困難であるが、尿中代謝物の測定により高感受性者を予測できれば、有害物取扱者の健康管理手法に新しい考え方を導入することにつながる。平成19年度においては、0,1000,2000 ppmのTCEに1日8時間、連日7日間曝露したCYP2E1-nullマウスおよび野生型マウスから採取した尿中のDVNAC濃度をメチル誘導体化法により測定した。しかし定量下限値以下だったため、GST系の代謝を誘導するオルティプラズを経口投与し、2000 ppmのTCEをnullマウスに曝露させたところ、最大11.6 mg/lのDVNACを検出した。患者及び作業者の尿中濃度は検出限界値以下だったため、感度を向上させるために誘導体化法の検討をさらに行う必要があると考えられた。一方、TCEに曝露させた上記マウスのうち、野生型マウスにおいてのみ肝小葉中心性の炎症がみられ、メチル誘導体化法により測定したトリクロロ酢酸、トリクロロエタノール濃度はnullマウスに比べ有意に高く、CYP2E1がこれらの産生に関わる主要なチトクロムP450であること、この経路の代謝物が肝障害を起こすことが確認された。化学物質取り扱い職域において、同じ量の曝露をうけても感受性が高く中毒を発症しやすい作業者のスクリーニングは、適正配置を行うための重要な課題である。本研究では、トリクロロエチレン(TCE)使用職場で数百人にひとりが発症する重症型皮膚肝疾患の感受性に関連のある、N-アセチル転移酵素2(NAT2)によるTCE代謝物量(S-1,2-ジクロロビニル-N-アセチルシステイン(DVAC))を遺伝子改変動物及び患者・作業者で測定し、倫理面で実施へのハードルが高い遺伝子解析を実施することなく、高感受性者を曝露開始後早期に予測するモデルの確立をめざす。平成18年度においては、米国NIHより供与されたCYP2E1ノックアウトマウスおよび野生型マウスを繁殖させ、雄マウスを10週齢まで飼育後3群にわけ、0,1000,2000ppmのTCEに1日8時間、連日7日間曝露した。24時間尿を採取するとともに8日目に解剖し、血液生化学検査、肝、腎、生殖器重量の測定、定法に従った病理標本の作製を行った。結果については現在解析中である。ガスクロマトグラフ質量分析計を用いたDVACの定量には誘導体化が不可欠であるが、トリクロロ酢酸、トリクロロエタノールとともに、メタノール硫酸法(グルクロン酸抱合体も酸加水分解されトリクロロエタノールとして測定)にて誘導体化する方法を検討した。トリクロロ酢酸、トリクロロエタノールは曝露作業者の代謝物量を定量する感度が得られたが、DVACについては検出限界以下であり、現在検討を続けている。
PLC活性のリアルタイム測定法を用いた細胞内シグナルのクロストニクの解析

1.細胞内シグナル伝達系間のクロストークを調べるために,1個の細胞内のシグナル伝達の大きさをリアルタイムでモニターする方法の開発を試みた。初年度は,PLCの代謝産物であるジアシルグリセロールにより活性化されるチャネル(TRPC6チャネル,を培養海馬ニューロンに強制発現させ,PLC活性をモニターする方法を用いて実験を行った。その過程で,内因性カンナビノイド放出量がGq共役型受容体-PLCbetaシグナル伝達系の活性を反映することが明らかとなった。そこで次年度は1個の細胞から放出される内因性カンナビノイド量を電気生理学的方法によりモニターするという方法を用いて,Gq共役型受容体-PLCbetaシグナル伝達系とNMDA型グルタミン酸受容体-Ca2+シグナル伝達系の聞のクロストークについて調べた。本年度は,Gq共役型受容体-PLCbetaシグナル伝達系をモニターする別の系の開発を試みた。2.培養海馬ニューロンにmAChRアゴニストを投与すると、多くの細胞では一過性の脱分極が発生した。この効果は、PLC阻害剤により抑制されることから、Gq共役型受容体-PLCbetaシグナル伝達系を介していると考えられた。またmAChRアゴニスト投与による脱分極の大きさが細胞内Ca2+濃度に依存すうことが判明した。よって、Gq共役型受容体-PLCbetaシグナル伝達系とMDA型グルタミン酸受容体-Ca2+シグナル伝達系の間のクロストークを、この脱分極信号を指標にして調べることも可能であると考えられた。PLCbetaの基質であるPIP2の濃度変化に鋭敏に反応するチャネルを強制発現することにより、より感度の高いモニター系を開発することができると期待される。1.細胞内シグナル伝達系間のクロストークに関しては、1個の細胞内のシグナル伝達の大きさをリアルタイムでモニターすることが困難なため、不明の点が多い。本研究では、ホスホリパーゼC(PLC)産物DAGにより活性化されるチャネル(TRPC6チャネル)を培養海馬ニューロンに強制発現させ、PLC活性をリアルタイムでモニターすることを試みた。また、この方法を用い、受容体-PLCβシグナル伝達系が他のシグナル伝達系によりどのような影響を受けるのかを調べた。2.膜透過型DAGアナログであるOAGを投与すると、TRPC6チャネルを強制発現したニューロンでのみ大きな内向き電流が誘導された。したがって、TRPC6チャネルはニューロン内で正常に機能していることが確かめられた。3.PLCに共役している受容体(group I代謝型グルタミン酸受容体、M_1/M_3ムスカリン受容体)のアゴニストを投与すると、大きなTRPC6チャネル電流が観察された。この電流は、PLC阻害剤U73122処理により消失した。したがって、このTRPC6チャネル電流はPLC活性を反映していることが確かめられた。4.アゴニスト投与により誘導されるTRPC6チャネル電流は、PLCβ1欠損マウスの海馬ニューロンでは消失していた。したがって、アゴニスト投与により誘導されるTRPC6チャネル電流はPLCβ1活性を反映していると考えられた。5.アゴニスト投与によるTRPC6チャネル電流を、さまざまな細胞内Ca^<2+>濃度で調べたところ、Ca^<2+>濃度が高いほど大きな電流が誘導された。したがって、受容体を介するPLCβ1の活性化は細胞内Ca^<2+>濃度に強く依存していることが判明した。6.以上より、受容体-G蛋白-PLCβシグナル伝達系は、細胞内Ca^<2+>濃度を変化させる他のシグナル伝達系の影響を強く受けることが予想された。1.細胞内シグナル伝達系間のクロストークに関しては、1個の細胞内のシグナル伝達の大きさをリアルタイムでモニターすることが困難なため、依然不明の点が多い。昨年度は、ホスホリパーゼC(PLC)産物DAGにより活性化されるチャネル(TRPC6チャネル)を培養海馬ニューロンに強制発現させ、PLC活性をリアルタイムでモニターするという方法を用いて、受容体-Gq蛋白-PLCβシグナル伝達系が、電位依存性Ca^<2+>チャネルを通って流入するCa^<2+>イオンにより促進されることを証明した。また、Gq共役型受容体活性化による内因性カンナビノイドの放出はPLCβ活性に依存しており、TRPC6チャネル電流の代わりにカンナビノイド放出量を指標にして、受容体-Gq蛋白-PLCβシグナル伝達系をリアルタイムでモニターすることが可能であることを見いだした。そこで本研究では、この方法を用いて、受容体-Gq蛋白-PLCβシグナル伝達系が他のシグナルによりどのような影響を受けるのかをさらに調べた。2.内因性カンナビノイド放出量は、培養海馬ニューロンのカンナビノイド感受性シナプス電流の大きさを指標にして調べた。得られた結果は以下の通りである。(1)NMDA型グルタミン酸受容体の活性化は、Gq共役型受容体(group I代謝型グルタミン酸受容体、M1/M3ムスカリン受容体)-PLCβシグナル伝達系を著しく促進した。(2)この効果は、高濃度のBAPTAにより阻害された。(3)一方、Gq共役型受容体の活性化は、NMDA型グルタミン酸受容体の働きに影響を及ぼさなかった。3.以上より、受容体-G蛋白-PLCβシグナル伝達系は、電位依存性Ca^<2+>チャネルおよびNMDA型グルタミン酸受容体の活性化により著しく促進されると考えられた。

1.細胞内シグナル伝達系間のクロストークを調べるために,1個の細胞内のシグナル伝達の大きさをリアルタイムでモニターする方法の開発を試みた。初年度は,PLCの代謝産物であるジアシルグリセロールにより活性化されるチャネル(TRPC6チャネル,を培養海馬ニューロンに強制発現させ,PLC活性をモニターする方法を用いて実験を行った。その過程で,内因性カンナビノイド放出量がGq共役型受容体-PLCbetaシグナル伝達系の活性を反映することが明らかとなった。そこで次年度は1個の細胞から放出される内因性カンナビノイド量を電気生理学的方法によりモニターするという方法を用いて,Gq共役型受容体-PLCbetaシグナル伝達系とNMDA型グルタミン酸受容体-Ca2+シグナル伝達系の聞のクロストークについて調べた。本年度は,Gq共役型受容体-PLCbetaシグナル伝達系をモニターする別の系の開発を試みた。2.培養海馬ニューロンにmAChRアゴニストを投与すると、多くの細胞では一過性の脱分極が発生した。この効果は、PLC阻害剤により抑制されることから、Gq共役型受容体-PLCbetaシグナル伝達系を介していると考えられた。またmAChRアゴニスト投与による脱分極の大きさが細胞内Ca2+濃度に依存すうことが判明した。よって、Gq共役型受容体-PLCbetaシグナル伝達系とMDA型グルタミン酸受容体-Ca2+シグナル伝達系の間のクロストークを、この脱分極信号を指標にして調べることも可能であると考えられた。PLCbetaの基質であるPIP2の濃度変化に鋭敏に反応するチャネルを強制発現することにより、より感度の高いモニター系を開発することができると期待される。
自己支持性高分子ナノ薄膜からなる革新的細胞デリバリー担体の創製

本研究では加齢黄斑変性症のような難治性網膜疾患に対する治療策として、狭小な網膜下への網膜色素上皮細胞の移植を狙い、柔軟な高分子ナノ薄膜からなる細胞移植担体の創製を目的とした。ポリ乳酸グリコール酸共重合体からなる微細パターン化ナノ薄膜を調製し、細胞をナノ薄膜上で選択的に培養した。医療用注射針を用いて細胞担持ナノ薄膜の注入操作を試みたところ、針内部のずり応力にも関わらず射出後もナノ薄膜上の細胞は90%近く生存することが判明した。さらに、ラット網膜下に細胞担持ナノ薄膜を移植したところ、黄斑部近傍に細胞層の移植が示唆された。以上より、細胞移植療法におけるナノ薄膜の有用性を初めて示すことに成功した。高齢者の失明原因の一つである加齢黄斑変性に対する根本的治療策として、細胞移植療法の開発は焦眉の急である。本研究では、狭小な眼底下等の生体組織下へ効果的に細胞を送達するために、柔軟かつ拒絶反応の少ない自己支持性高分子超薄膜(ナノ薄膜)からなる細胞デリバリー担体の創製を目指す。平成25年度の成果は以下のとおりである。(1)自己支持性高分子ナノ薄膜の調製と物性評価:任意の疎水性高分子(例:ポリスチレン、ポリ乳酸、ポリ乳酸グリコール酸共重合体)を水溶性高分子からなる犠牲膜上にスピンコートし、これを水中で剥離することで膜厚数十nmの自己支持性ナノ薄膜を作製した。AFMナノメカニカルマッピングによって、ナノ薄膜の材料特性を評価したところ、膜厚が数十数百ナノメートル領域において弾性変形能が増大することが明らかになり、極めて柔軟なナノ薄膜を得ることができた。(2)ナノ薄膜表面における細胞運動の制御:ナノ薄膜上に担持した細胞(例:骨格筋細胞、網膜色素上皮細胞)の免疫染色像から細胞接着や組織化挙動を解析した。ナノ薄膜上にカーボンナノチューブや磁性ナノ粒子を複合化させたところ、接着した細胞は微小繊維や表面粗さを認識することで、異方的な伸長挙動や高い成長率を示し、組織化挙動を増強することに成功した。(3)医用高分子からなるナノ薄膜の微細加工化:注射器による網膜下への細胞移植を達成するために、ポリ乳酸グリコール酸共重合体からなる自己支持性ナノ薄膜をシリンジ投与可能なサイズに成形した。マイクロコンタクトプリンティング法を利用することで、数百マイクロメートルサイズの微細化ナノ薄膜を作製した。作製した微細化ナノ薄膜の表面には、網膜色素上皮細胞を担持することが可能であり、注射針口径の約2倍程度の直径までのナノ薄膜であれば、細胞を安定に担持した状態で注射針内に吸引し、射出できることが明らかになった。平成26年度の成果は以下のとおりである。(1)細胞担持ナノ薄膜の機能評価:平成25年度で作製に成功した細胞担持ナノ薄膜に関して、ナノ薄膜上での網膜色素上皮細胞(RPE細胞)の分化挙動、および、医療用シリンジによる吸出し操作前後での細胞生存率を評価した。RPE細胞とナノ薄膜を異なる蛍光色素で各々染色したところ、ナノ薄膜上でRPE細胞が単層組織を形成することが見出された。この時、単層組織中のZO-1タンパク質を免疫染色にて可視化したところ、RPE細胞に特徴的なタイトジャンクションの形成が認められた。(2)医療用シリンジによる細胞担持ナノ薄膜の吸出し試験: RPE細胞担持ナノ薄膜(直径400 μm)を25 G針で吸引・射出したところ、針管内における力学的ストレス負荷にも関わらず、吸出し前後で細胞生存率に大きな変化が生じないことが明らかになった。また、異なる直径を有するナノ薄膜(直径300-1000 μm)を用いた場合の細胞生存率を評価したところ、ナノ薄膜の直径に関わらず、吸出し前後で80%以上の細胞生存率を維持することに成功した。(3)動物実験による網膜下への細胞担持ナノ薄膜の移植および操作性の評価:ブタ網膜下にナノ薄膜を注入したところ、ナノ薄膜は網膜下で円盤状に展開し、黄斑部近傍に生着する様子が認められた。さらに、RPE細胞担持ナノ薄膜をラット網膜下へ移植したところ、病理組織切片観察より層状の細胞集団が黄斑部に観察された。

以上より、ナノ薄膜は、網膜のような狭小な生体組織下に対する細胞移植手術において、移植細胞の構造および機能を保持する担体として有用であることが示された。(1),(2):早稲田大学の所属研究室および学内関連研究所のホームページ(3),(4):前所属機関(東北大学原子分子材料科学高等研究機構)が発行する研究紹介用オンラインコンテンツ"AIMResearch"ナノバイオ材料平成25年度の研究計画では、ナノ薄膜の微細化まで目途をつけることが目標であったが、マイクロコンタクトプリンティング法によるナノ薄膜の転写技術の確立により、平成26年度で計画しているナノ薄膜の形状制御や担持細胞の安定性評価まで踏み込むことができた。平成25年度の研究成果より、細胞担持ナノ薄膜の安定性評価(接着形態、細胞生存率)には目途がついたので、平成26年度では、細胞担持ナノ薄膜の機能評価を中心に研究を進める。また、作製した細胞担持ナノ薄膜の生体内安全性・安定性を評価するため動物実験を実施する予定である。平成25年度から26年度にかけて所属機関の変更が生じたが、テレビ電話会議や研究出張を通じて共同研究者との連携関係は密であり、研究計画遂行に大きな支障は無い。国際会議出張旅費として計上していたが、所属機関の異動に伴い平成25年度での使用には至らなかった。平成26年度における国際会議出張旅費として計上する。既に参加する国際会議は決定しており、現在参加登録の手続き中である。
酢酸摂取が腸内細菌叢構成に与える影響に関する研究

本研究の目的は、酢酸摂取が宿主の腸内細菌叢構成にどのような影響を及ぼすか明らかにすることである。平成29年度には、酢酸摂取が腸内細菌叢構成を変化させ、糞便中の酢酸量を増加させることを明らかにした。糞便中の酢酸量の増加は、摂取した酢酸ではなく、腸内で生成された酢酸量が増加したことが要因である。最終年度である平成30年度では、酢酸摂取によってどのような細菌種の割合が変化したかを、リアルタイムPCRによる門レベルでの解析および次世代シーケンサーを利用したメタゲノム解析により明らかにした。その結果、酢酸あるいはペクチン摂取を始めてから1週間および4週間後に、肥満と相関があるとされているFirmicutes門とBacteroidetes門の比が水を摂取させたコントロール群と比較して低下することが分かった。さらに、メタゲノム解析の結果、いくつかの細菌種の増減が確認できたが、細菌種を特定できるものは少なかったが、Lactobacillus属のある細菌種が酢酸を摂取することで増加することが明らかとなった。このLactobacillus属の細菌種は、潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患の病態を改善することが報告されており、酢酸摂取が腸内細菌叢構成を改善し、炎症性腸疾患の病態を改善することが期待される。本研究の目的は、酢酸摂取が腸内細菌叢に与える影響を明らかにすることである。平成29年度は、SDラットへ1%重水素酢酸(d4-酢酸、Ace群)もしくは飼育水(Wat群)を体重100 gあたり0.5 mL、1日1回体重測定後に胃ゾンデにより、1か月間にわたり投与した。Ace群とWat群で体重増加量に変化はなく、解剖時に異常も見られないことから、d4-酢酸の投与量は妥当なものであると判断した。投与前および投与期間においては1週間ごとに、1日に排出された糞便を回収し、糞便サンプルより細菌DNAおよび短鎖脂肪酸を抽出し、それぞれPCR-DGGE、GC-TOFMSに供し、腸内細菌叢構成に変化がみられるか、また糞便サンプル中の短鎖脂肪酸量を調べた。各個体のPCR-DGGE法による腸内細菌叢構成の比較を行い、泳動パターンのクラスター解析の結果、Wat群とAce群でクラスターが分かれ、明確なパターンの変化が見られ、酢酸の継続摂取が腸内細菌叢構成に変化を及ぼすことが明らかとなった。糞便サンプル中の短鎖脂肪酸解析の結果、d4-酢酸を摂取させた個体の糞便中に存在する酢酸は、分子量が60であり、摂取させたd4-酢酸の分子量64とは異なることが判明し、摂取させたd4-酢酸の多くは大腸まで到達せず、上部消化管で吸収されていることが示唆された。また、Wat群と比較してAce群では統計的に有意に酪酸量が低下し、酢酸量が増加することが分かった。以上のことは、酢酸摂取により腸内細菌叢構成が変化した結果、腸内細菌叢により生成される短鎖脂肪酸分子種が変化することを示唆している。来年度は計画通り、どのように腸内細菌叢構成が変化しているのかを、リアルタイムPCRによる門レベルでの細菌の定量解析により明らかにし、メタゲノム解析により変動している細菌種を同定する予定である。当初の計画の通り、実験動物への酢酸摂取、糞便サンプル中の腸内細菌叢構成の解析、GC-TOFMSによる短鎖脂肪酸の解析を行い、期待通りの結果が得られているため。平成30年度は所属機関が変更になり研究環境が変化するが、必要な機器を揃え、計画通り研究を実施する予定である。計画していた消耗品を購入したが、キャンペーンなどで定価より安く購入したため差異が生じた。次年度は、大型の機器を購入する予定になっており、購入費として使用する予定である。
耐故障性を有する制御系の設計に関する研究

近年,制御系の耐故障性を,故障検出によらず制御理論によって保証するインテグリティに関する研究が始められている.既に設計されたせ制御系に対して,故障が生じても制御性能が確保されるかどうかは故障に対応した伝達特性を計算することで検証が可能である.しかし,故障が生じても制御性能が確保されるようにあらかじめ制御器を設計することは難しい.これに対して,これまでに十分条件と必要十分条件を求め,それぞれに基づいた設計法を提案した.十分条件に基づく設計法は,従来なかった許容する故障の数を陽に考慮した設計法である.数学的には,従来考えられてきた誘導ノルムではなく,フロベニウスノルム有界な不確かさを持つシステムを考え,この不確かさに対してロバスト安定性を保証する設計法を提案した.十分条件であるため保守的な設計法ではあるが,繰り返し計算が必要なく,解の収束性などの問題がない,必要十分条件に基づく設計法は,故障が生ずるすべてのパターンを一つずつモデル化し,それらすべてを同時に安定化する同時安定化問題として定式化するという設計法である.この同時安定化問題は非常に解くのが難しい問題であるが,繰り返し計算により解く方法を提案した.同時安定化問題に基づく定式化において,必要十分条件であるので保守性はないが,解の収束性や最適性については残念ながら保証されない.ただし,数値実験の結果からは有効であると言える.さらに,この同時安定化問題の解法は耐故障性で優位と考えられている分散制御系の設計問題へも拡張が可能であり,分離制御系の設計法として提案した.ただし,分散制御系の耐故障性という観点での優位性については今後の課題である.近年,制御系の耐故障性を,故障検出によらず制御理論によって保証するインテグリティに関する研究が進められている.既に設計された制御系に対して,故障が生じても制御性能が確保されるかどうかは故障に対応した伝達特性を計算することで検証が可能である.しかし,故障が生じても制御性能が確保されるようにあらかじめ制御器を設計することは難しい.最近の研究では,故障による特性の変動を不確かさとみなしてH_∞制御をはじめとするロバスト制御系の設計手法を用いる方法が提案されている.この手法においては,不確かさを加法的,あるいは乗法的な不確かさとしてモデル化することが多い.しかし,このようなモデル化では保守性が生じ,十分な制御性能が得られないこともわかってきた.本研究では,故障による特性の変動をモデル化する際,線形分数変換による不確かさの表現が保守性を生じないモデル化であることを明らかにした.ただし,この線形分数変換を用いた表現は接続する制御器に依存している.そのため,次善の策としてモデル化と制御系設計を交互に行う制御系設計法を提案した.今後は,線形分数変換を用いたモデル化手法の分散制御系の設計へ応用や,現在交互に行っているモデル化と制御系設計を,同時に行う場合の数値最適化手法についての研究を行う必要がある.近年,制御系の耐故障性を,故障検出によらず制御理論によって保証するインテグリティに関する研究が始められている.既に設計されたせ制御系に対して,故障が生じても制御性能が確保されるかどうかは故障に対応した伝達特性を計算することで検証が可能である.しかし,故障が生じても制御性能が確保されるようにあらかじめ制御器を設計することは難しい.これに対して,これまでに十分条件と必要十分条件を求め,それぞれに基づいた設計法を提案した.十分条件に基づく設計法は,従来なかった許容する故障の数を陽に考慮した設計法である.数学的には,従来考えられてきた誘導ノルムではなく,フロベニウスノルム有界な不確かさを持つシステムを考え,この不確かさに対してロバスト安定性を保証する設計法を提案した.十分条件であるため保守的な設計法ではあるが,繰り返し計算が必要なく,解の収束性などの問題がない,必要十分条件に基づく設計法は,故障が生ずるすべてのパターンを一つずつモデル化し,それらすべてを同時に安定化する同時安定化問題として定式化するという設計法である.この同時安定化問題は非常に解くのが難しい問題であるが,繰り返し計算により解く方法を提案した.同時安定化問題に基づく定式化において,必要十分条件であるので保守性はないが,解の収束性や最適性については残念ながら保証されない.ただし,数値実験の結果からは有効であると言える.さらに,この同時安定化問題の解法は耐故障性で優位と考えられている分散制御系の設計問題へも拡張が可能であり,分離制御系の設計法として提案した.ただし,分散制御系の耐故障性という観点での優位性については今後の課題である.
硬Ｘ線高感度観測で探る銀河系最高エネルギー宇宙線の研究

本研究は、銀河系における高エネルギー宇宙線の加速源として有力な、GeVエネルギー帯域でガンマ線を強く放射する超新星残骸(SNR)をターゲットとして、X線観測を用いた宇宙線加速の解明を目的としている。これまでにSNR 3C 391から発見した加速宇宙線の有力なプローブとなる中性鉄輝線放射について、1編の査読論文として仕上げた。当該年度は、新たにX線衛星「すざく」を用いて、GeVガンマ線の強い放射が確認されているSNR Kes 79から中性鉄輝線と見られる有意な超過放射を発見した。銀河面リッジX線放射バックグランドを正確に評価し、これまでのX線観測では達成できなかった精度でのX線スペクトル解析を可能とした結果である。理論との検証から中性鉄輝線放射は、鉄過剰未電離プラズマからの放射、あるいは周辺分子雲が加速宇宙線に励起された放射であると結論した。またKes 79のX線放射が、主に低温と高温の2温度プラズマ放射から形成されていることを新たに発見し、その輝線強度比から重力崩壊型のSNRであることを裏付けた。また、これまでのX線観測で指摘されていた放射よりもさらなる外縁部に、バックグラウンド放射から有意に超過するX線放射を発見した。このX線放射は、Kes 79中心部の低温プラズマと同じ温度を持つことから、超新星爆発の衝撃波が星周物質を熱化したプラズマの最外殻構造を示していると結論した。本研究は、SNRにおけるX線観測を用いた宇宙線加速現象の解明に、中性鉄輝線をプローブとした手法を提案し初めて実際のデータへと適用したことで、将来的なX線高精度観測への展望を示す重要な意義を持つこととなった。26年度が最終年度であるため、記入しない。このようなSNRとして3C 391のX線衛星「すざく」による観測データについて、銀河面リッジX線放射バックグランドを正確に評価することで、これまでにない精度でのX線スペクトル解析を可能とした。これにより3C 391が、通常進化では得られない過電離という特異な非平衡プラズマ状態にあることを明らかにした。このようなSNRプラズマ中の特異な非平衡状態は、全てがGeVガンマ線で明るいSNRで見つかっていることから、この発見はこれらの相関を示唆する新たな証拠として非常に重要である。その起源としては、親星の超新星爆発が非常に濃い星周ガスに覆われていたことで、爆発初期に高温プラズマを形成、電離が促進されたが、進化の過程でプラズマ温度の断熱冷却が進んだ結果ではないかと結論した。3C 391のX線観測から新たに6.4 keVの中性鉄輝線とみられる超過放射の兆候を発見した。このような過電離プラズマをもつSNR中に中性鉄輝線放射が混在することは考えられず、加速宇宙線がSNR周辺分子雲のような冷たい物質を励起した蛍光X線放射なのではないかと結論した。このような放射は、宇宙線加速源における宇宙線のエネルギースペクトル情報を得るために重要である。この発見はSNR中における加速宇宙線のプローブとしての、中性鉄輝線測定の重要性を観測的に示した意義のあるものとなった。X線帯域での連続放射成分からの宇宙線探査を当初の目的としていたが、バックグラウンドプラズマ等の放射の混入が課題となった。しかし、GeVガンマ線の強いSNRである3C 391の過電離プラズマは非常に重要な発見である。

また中性鉄輝線放射の発見は、思いもよらぬ成果として観測的な加速宇宙線探査の研究の発展へと繋がった。今後の研究では、宇宙線加速とSNRにおける鉄輝線放射の関係性をより深く掘り下げるため、3C 391同様にGeVガンマ線で明るいSNRをセレクトし中性鉄輝線の超過放射を探査していく。ただし次期X線衛星ASTRO-Hは平成27年度に打ち上げが延期されたため、本研究における将来計画へ向けた開発作業はウェイトを下げ、今後よりX線衛星「すざく」のデータ解析を重点的に行う。当初ASTRO-Hのために予定していた計算機環境の強化も、観測器のX線応答、天体からのX線放射強度の精確なシミュレーションに計算コストを要するため、研究推進の協力なサポートとして活躍する。26年度が最終年度であるため、記入しない。
上皮間葉相互作用を制御するシグナル経路におけるSox13の役割

毛は、成長期、退行期、休止期からなる周期を繰り返して成長する。本研究は、細胞の運命決定、分化関わる転写因子Sox13の役割を、独自に作製したSox13変異マウスを用いて解析した。その結果、Sox13の発現は毛周期の間にダイナミックに変化し、Sox13が毛周期の新たなマーカーとして有用であること明らかになった。Sox13の周期性を制御するメカニズムの解明は、脱毛症の病因解明に役立つ可能性がある。本研究は、転写因子Sox13の役割を、上皮間葉相互作用や幹細胞の研究モデルとして注目されている皮膚を用いて解析することを目的としている。私たちが独自に作製したSox13変異マウスを用いた解析がその中心を占めるが、21年度にマウスの飼育施設で感染があったため、マウスのコロニーを縮小せざるを得ず、マウスを用いた研究を計画通りに進めることができなかった。研究計画の「皮膚の発生、毛包形成過程におけるSox13の発現パターンを調べる」一環として、脱毛実験を行った。マウスの背部を脱毛テープで脱毛すると、通常脱毛後4日ほどで毛包が現れ、8日目で成長期に、20日目前後で退行期から休止期に入る。10週令のSox13ヘテロ変異マウスを用いて脱毛4日後、8日後、16日後、20日後、28日後に皮膚を採取し、X-gal染色を施行してSox13陽性細胞の局在を調べた。その結果、4日目の切片においては毛球の一部に、8日目以降の切片においては外毛根鞘の一部にSox13陽性細胞が存在していることが判明した。これは、毛包の形成にSox13が関与していることを示しており、今後ホモ欠損マウスも用いて、分化マーカーや幹細胞マーカーの発現との関連を詳細に調べる予定である。研究計画の「基底細胞癌(BCC)におけるSox13の発現の検討」については、ヒトのBCCの手術標本を用いてSox13の免疫染色を試みたが、用いた抗体のバックグランドが高く、はっきりした結果を得ることが出来なかった。そこで、マイクロダイセクションシステムを用いて正常部分と腫瘍部分を切り取り、mRNAレベルでSox13の発現を比較検討している途中である。本研究は、上皮間葉相互作用や幹細胞の研究モデルとして注目されている皮膚における転写因子Sox13の役割を、独自に作製したSox13変異マウスを用いて解析することを目的としている。研究計画の「皮膚の発生、毛包形成過程におけるSox13の発現パターンを調べる」一環として、マウス皮膚におけるSox13の発現を、毛包形成が始まるE14.5から第1毛周期の終止期にあたる生後20日頃まで、Sox13変異マウスを用いてX-gal染色により詳しく解析した。その結果、Sox13は、当初考えていた毛球部よりも上方の、皮膚の幹細胞が存在すると考えられているバルジ部、あるいは、そのさらに上部の部分に発現していることが明らかになった。バルジ上方の領域にはLgr6が発現しているが、Lgr6陽性細胞は、皮膚の毛包、脂腺、表皮全ての細胞系譜の幹細胞になりうることが報告され、最近、バルジ上方の領域への注目が高まっている。現在、Sox13の発現領域をより厳密に特定すべく、種々の幹細胞マーカーや分化、増殖マーカーの発現部位とSox13の発現部位を比較し、幹細胞との関連を調べているところである。研究計画の「基底細胞癌(BCC)におけるSox13の発現の検討」については、BCCの充実型、表在型、嚢腫型、腺腫型、モルフェア型、Pinkus型など、種々の病理組織型を集め、Sox13の発現をSox9,Patchedの発現と比較検討している途中である。皮膚は上皮間葉相互作用や幹細胞の研究モデルとして注目されている。本研究の目的は、皮膚における転写因子Sox13の役割を、独自に作製したSox13変異マウスを用いて解析することである。研究計画の「皮膚の発生、毛包形成過程におけるSox13の発現パターンを調べる」では、次の結果を得た。1.毛周期におけるSox13の発現パターンをLacZ染色で調べた結果、Sox13の発現は毛周期の間にダイナミックに変化することがわかった。すなわち、Sox13の発現は、生後直後に外毛根鞘にドット状に始まり、成長期にはその発現がピークに達すること、その後、退行期になると発現が一旦消失し、そして、休止期後半に再び発現することがわかった。これは、Sox13が毛周期の新たなマーカーとして有用であることを意味しているだけでなく、毛周期の周期性の制御に関わることを示唆している。2.Sox13の発現を毛嚢バルジ幹細胞マーカーであるkeratin15の発現と比較したところ、両者の発現部位が一部重複していることがわかった。これは、Sox13陽性細胞が一部毛嚢バルジ幹細胞としての機能を担っていることを示唆している。

現在、keratin15以外の毛嚢バルジ幹細胞マーカー(Sox9など)との局在を検討している。3.研究計画の「基底細胞癌(BCC)におけるSox13の発現の検討」については、市販の複数のSox13の抗体を購入して検討したが、LacZ染色でみられたSox13発現パターンを再現できた抗体は見つかっておらず、進展しなかった。
強磁場による金属葉フラクタル成長の形態制御の研究

拡散律速凝集(DLA)によってフラクタル的に成長する金属葉のパターン形成が強磁場下でどのように変化するかを調べた。金属葉としては、典型的なDLAパターンを示す銀葉と、異方的なDLAパターンを示す鉛葉について実験を行った。両者とも2枚のガラス板の間で、水溶液からの無電解析出法により、2次元的に成長させた。磁場は東北大金研の強磁場センターにある大口径超伝導マグネットを用いて、8T(テスラ)まで印加した。設備備品として購入したCCDカメラとVTRを用いて磁場中での金属葉の成長の様子を動的に記録することができた。また、同じく設備備品として購入したビデオコピープロセッサーとスチルビデオレコーダーにより各時刻における金属葉の静止画像を記録することができた。これら観測、記録装置が充実したことにより、以下に示すような成果を得ることができた。1.銀葉の成長はゼロ磁場では無秩序なフラクタルパターンを示すが、磁場中では成長端のゆらぎが小さい緻密なパターンになる。この傾向は強磁場下で成長したものほど顕著であった。2.銀葉の成長パターンのフラクタル次元を見積もってみたところ、ゼロ磁場では1.62となり、DLAのコンピュータシミュレーションの結果とほぼ一致する結果が得られた。他方、8Tでは1.70から2への次元のクロスオーバーが観測された。3.鉛葉の成長は、ゼロ磁場では主枝の両側に側枝が対称的に伸びた樹枝状パターンを示すが、磁場中では主枝の片側にだけ側枝が伸びる非対称なパターンが観察された。これらの成果は、磁場によって樹枝状結晶の形態を制御できることを示したものである。
真猿類マーモセットの口腔内細菌メタゲノムを活用した次世代型口腔衛生の先駆モデル

ヒトの口腔内細菌叢のコントロールによる病気の予防は、新しい予防医歯学の中心命題となる。口腔内細菌叢においては生理機能との関連など不明点が多く、全身の健康維持における重要性が十分に認識されていない。本研究で用いる真猿類コモンマーモセットは、平均寿命14年で、ヒトでは20-30年かけて起きる口腔内の加齢変化が2-3年で観察され、ヒト老化の歯科研究モデルとして最適である。本研究の目的は、マーモセットを使って、口腔内細菌叢・代謝産物プロファイル作成により、口腔環境の分子的特徴を明らかにし、腸内細菌叢との比較解析により、口腔内細菌叢と全身の健康維持、身体機能との関連を調べることである。
高温加圧法によるシリコン結晶ウェハーの変形加工と形状制御限界の研究

本研究では、硬くて脆いSi結晶を、三次元的に自由な形状に変形加工するための加工条件(加工温度範囲、ウエハー厚さ、荷重、形状、面方位)を明らかにし、Si結晶ウエハーの高温加圧加工と形状ウエハー結晶の利用という新しい研究分野を拓くことを目的とした。また、三次元的に加工したウエハー結晶の太陽電池やX線集光レンズへの応用を検討した。Si(100)およびSi(111)結晶について、加工条件(加工温度、加工荷重、ウエハー厚み)を変化させて系統的に加工実験を行い、それぞれの結晶において、最適な変形加工条件を特定した。この条件を用いれば、板状の結晶を半球状や波状など三次元的に自由な形状に加工できることを実証した。また、本高温加圧加工法により、さまざまな曲率を有する半導体結晶レンズの作製に成功した。本手法により作製したSi結晶レンズを用いて太陽電池を試作し、加工条件と変換効率の相関を調べた。Si結晶レンズ太陽電池の変換効率は、加工温度や加工後のアニーリングにより結晶内の転位密度を低減することにより改善されることを示した。このSi結晶レンズ太陽電池を集光レンズ型太陽電池として応用した新しい太陽電池システムを提案し、本システムを用いることにより、太陽電池の変換効率を向上できることを示した。さらに、この半導体結晶レンズの表面の結晶格子面が曲率にあわせて変形することを見出し、この特徴を利用することにより、本手法により作製される半導体結晶レンズがX線用の一点集光レンズに応用できる可能性を示した。以上のように、本研究におけるSi結晶の3次元的加工という萌芽的な研究から、様々な応用分野への発展が期待できる成果が得られた。
葉緑体活性酸素種消去システムにおけるペルオキシレドキシンの役割

葉緑体は、光合成による酸素発生に伴い、多くの活性酸素種(Reactive oxygen species, ROS)を生成する。そのため、葉緑体は抗酸化ストレスシステムとして、アスコルビン酸ペルオキシダーゼをはじめとして、複数のROS消去システムを備えている。複数のROS消去システムのうち、ペルオキシレドキシンという一連のペルオキシダーゼが、葉緑体で機能していることがわかってきた。しかし、葉緑体ROS消去システムにおけるペルオキシレドキシンの生理的な役割は、明らかになっていない。本研究は、葉緑体ROS消去システムのうち、ペルオキシレドキシンについて、その機能欠失が植物体に与える影響を調べることで、葉緑体ROS消去系に対する寄与を明らかにする。これまでの研究から、PrxのROS消去反応に必要な電子はすべてTrxから供給されることもわかっている。そこで本研究では、葉緑体の4つのPrxすべてに対して、ROS消去に必要な電子供給を断つことができる実験系を構築するため、Trx変異体を用いる。葉緑体Trxは、葉緑体のレドックス制御で機能するf型、m型以外にx型、y型、z型のサブファミリーが存在し、このうち、x型とy型がROS消去システムであるPrxへ電子を供給すると考えられる。そこで、x型Trx、y型TrxのT-DNA変異体を用いることで、葉緑体Prxへ電子供給を遮断する。最終年度の今年度は、昨年度に引き続きこれらのT-DNA変異体の取得を行い、複数の変異体を取得することができた。これまで取得してきた変異体と合わせて、各変異体の活性酸素種消去能などを指標に各変異体の性質を比較検討することで、葉緑体ペルオキシレドキシンの生理機能、抗酸化ストレスシステムに対する寄与度を明らかにすることを試みた。葉緑体は光合成による酸素発生に伴い、多くの活性酸素種(ROS)を生成する。そのため、抗酸化ストレスシステムとして、葉緑体はアスコルビン酸ペルオキシダーゼをはじめとして、複数のROS消去システムを備えている。このうち、ペルオキシレドキシンという一連のペルオキシダーゼの葉緑体ROS消去システムにおける生理的な役割は、明らかになっていない。シロイヌナズナ葉緑体には3グループ4種類のPrxが存在し、機能重複しているため、これまでの個々の機能欠失変異体を用いた解析では、このファミリーのタンパク質が、葉緑体ROS消去系にどの程度寄与しているかを評価することができない。そこで、葉緑体に存在する複数のペルオキシレドキシンをひとつのファミリーとして機能解析し、ROS消去系での評価を行うことで、葉緑体ROS消去系システムにおけるペルオキシレドキシンの役割を明らかにする。これまでの研究から、PrxのROS消去反応に必要な電子はすべてTrxから供給されることがわかっている。そこで、葉緑体の4つのPrxすべてに対して、ROS消去に必要な電子供給を断つことができる実験系を構築するため、Trx変異体の取得を試みた。初年度は、これらの変異体を取得を目指して実験を進め、一部の変異体が取得できた。残りの変異体についても、順次取得を進めている。変異体の取得は進んでいるが、一部に取得できていない変異体があるため、それらの取得を優先して進める。そのため、葉緑体は抗酸化ストレスシステムとして、複数のROS消去システムを備えている。シロイヌナズナ葉緑体には3グループ4種類のPrxが存在しているため、これまでの個々の機能欠失変異体を用いた解析では、Prxアイソフォームの機能重複により、このファミリーのタンパク質が葉緑体のROS消去系に、どの程度寄与しているかを評価することができない。

今年度は、昨年度に引き続きこれらのT-DNA変異体の取得を行い、複数の変異体を取得することができた。変異体の取得はおおむね済んだが、一部に取得できていない変異体があるため、これらを取得し、機能解析を行う。葉緑体は、光合成による酸素発生に伴い、多くの活性酸素種(Reactive oxygen species, ROS)を生成する。そのため、葉緑体は抗酸化ストレスシステムとして、アスコルビン酸ペルオキシダーゼをはじめとして、複数のROS消去システムを備えている。複数のROS消去システムのうち、ペルオキシレドキシンという一連のペルオキシダーゼが、葉緑体で機能していることがわかってきた。しかし、葉緑体ROS消去システムにおけるペルオキシレドキシンの生理的な役割は、明らかになっていない。本研究は、葉緑体ROS消去システムのうち、ペルオキシレドキシンについて、その機能欠失が植物体に与える影響を調べることで、葉緑体ROS消去系に対する寄与を明らかにする。これまでの研究から、PrxのROS消去反応に必要な電子はすべてTrxから供給されることもわかっている。そこで本研究では、葉緑体の4つのPrxすべてに対して、ROS消去に必要な電子供給を断つことができる実験系を構築するため、Trx変異体を用いる。葉緑体Trxは、葉緑体のレドックス制御で機能するf型、m型以外にx型、y型、z型のサブファミリーが存在し、このうち、x型とy型がROS消去システムであるPrxへ電子を供給すると考えられる。そこで、x型Trx、y型TrxのT-DNA変異体を用いることで、葉緑体Prxへ電子供給を遮断する。最終年度の今年度は、昨年度に引き続きこれらのT-DNA変異体の取得を行い、複数の変異体を取得することができた。これまで取得してきた変異体と合わせて、各変異体の活性酸素種消去能などを指標に各変異体の性質を比較検討することで、葉緑体ペルオキシレドキシンの生理機能、抗酸化ストレスシステムに対する寄与度を明らかにすることを試みた。現在取得できていない変異体を順次取得する。取得後には、計画に従い、各変異体の活性酸素種消去能などを比較検討することで、葉緑体ペルオキシレドキシンの生理機能、抗酸化ストレスシステムに対する寄与度を明らかにする。現在取得できていない変異体を取得後、計画に従って各変異体の活性酸素種消去能などを指標に各変異体の性質を比較検討することで、葉緑体ペルオキシレドキシンの生理機能、抗酸化ストレスシステムに対する寄与度を明らかにする。今年度購入したビーズ式破砕機が、当初想定していた機種と同等の性能を持っているにも関わらず、安価に購入できた。また、次年度には消耗品として物品費が多く必要であり、かつ、成果発表のための旅費、論文出版費などの費用も必要であるため、繰り越しを行う。(理由)変異体の取得が当初計画より遅れているため、次年度により多くの消耗品を必要であり、かつ、成果発表のための旅費、論文出版費などの費用が必要なため繰り越しを行う。(使用計画)抗体作成などのための物品費として210万円、成果発表用の旅費として25万円、論文出版費として15万円を使用予定である。
再生医療に資する腹膜透析排液の資源化

腹膜透析排液由来の細胞の約4%が接着細胞で、その97%が中皮細胞(CK-18陽性)であった。密度勾配遠心分離を1.021.07g/mLまでの5つの勾配で行い、分離後、細胞機能評価を行った。密度が1.051.07g/mLの細胞群では細胞面積が小さい;細胞間結合が強い;老化の程度が低い;抗酸化能が高いことが明らかとなった。二次元電気泳動とTOF-MASS解析から、密度分画別に発現タンパクの違いが存在することを明らかにした。高密度分画の細胞をさらに細かく精査することで、機能性を維持した細胞を分離できることが示唆され、細胞の密度分布が腹膜機能を評価する一手段になることが示された。腹膜透析は在宅治療が可能な末期腎不全の対症療法の一つである。その腹膜透析排液には老廃物のみならず腹膜を形成している腹膜中皮細胞や白血球系の細胞も失われている。本研究では、腹膜透析排液中の腹膜中皮細胞(PDE-HPMC)に着目し、正常な中皮細胞を分離・有効活用し、腹膜損傷部位へ治療の細胞源として応用することを目指した。腹膜透析患者24名の腹膜透析排液をからPDE-HPMCを採取し、その細胞増殖率や初期細胞接着率、中皮細胞マーカーであるCytokeratin-18(CK-18)の陽性率、膜間電気抵抗(TER)測定や細胞老化(SA-β-Gal)、細胞抗酸化能(DCFH)測定を行った。より正常な機能を持つ細胞を分離するため、Percoll密度勾配遠心分離法を用い細胞分離を行ない、分離後の細胞を上記の評価方法を用いて評価した。さらに、密度分布が異なる患者間で発現している細胞タンパクの違いを検討するため、二次元電気泳動を行い、発現タンパク質の増減を調査した。腹膜透析排液中のPDE-HPMCの割合は約4%と示され、CK-18陽性率が97%を示した。このことから中皮細胞であることが示された。Percoll密度遠心分離を1.021.07g/mLまでの5つの勾配で行い、それらのキャラクタリゼーションを行った結果、密度が1.051.07g/mLの細胞群では細胞間結合が高く、老化の割合が低く、抗酸化能が高いことが明らかとなった。二次元電気泳動とTOF-MASS解析から、密度分画別に発現タンパクの違いがあることを明らかにした。HPMCには密度分画別に細胞機能が異なり、密度が1.051.07g/mlの分画では細胞がより正常な機能を示した。この分画の細胞をさらに詳細に分画することで、正常細胞を分離できる可能性が示唆された。また細胞密度分布が腹膜機能を評価する手段になる可能性が示唆された。血液浄化療法部で腹膜透析を受けている14名の患者より、本研究期間内(1年)、計63回の排液を採取した。シャーレに接着した細胞は回収された全細胞の3.1%であり、その約98%は上皮マーカーであるcytokeratin-18(CK-18)陽性細胞であった。今年度得られたこれらの基本データは、本研究以前の自験例と同程度であることが確認できた。CK-18陽性細胞に対し、1細胞の形態、2上皮-間葉系形質変換マーカα-SMAの発現率、3老化マーカであるβ-ガラクトシダーゼ活性、4DCFによる抗酸化測定、5膜間電気抵抗測定による細胞間結合の評価を行うとともに、6本年度購入した二次元電気泳動装置の立ち上げを行った。1細胞形態:先行研究(Mo他:N Eng J Med, 2003)では得られた細胞の形態は玉石状が58%、紡錘状が42%であったが、本研究で得られた中皮細胞は88%近くが玉石状の形態を有しることが明らかとなった。2α-SMAの発現率:玉石状の形態に関わらず、約30%がα-SMA陽性であり、形態のみから上皮-間葉系形質変換を判定することは困難であることが示唆された。3β-Gal活性:β-Gal陽性細胞は8.5±4.1%から23.5±4.1%と腹膜透析期間12か月未満と以上で有意に上昇していた。4抗酸化能測定:抗酸化性も減少し、0.1M過酸化水素添加による活性酸素産生はDCF測定により15.8±6.1から23.4±3.1と上昇し、抗酸化能の現象が明らかとなった。5細胞間結合測定:排液中から得られた中皮細胞の形成する膜間電気抵抗値は17±3とヒト