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肝臓透明化技術を用いた臓器内部可視化による膵島移植の移植後病態解明

不安定1型糖尿病の治療法として膵島移植が注目されている。門脈を介した移植のため侵襲性の低い細胞移植療法であり、欧米ではすでに標準的な治療法となっている国もある。一方で、膵島移植の課題の一つに低い生着率があり、その原因の解明が必要であるが、門脈注入後は、直接観察できなくなることが大きな障害になっている。そこで、臓器の透明化技術とセンチメートル単位で観察可能なシートレーザー蛍光顕微鏡と併せて用いることで、マウス肝臓内部を可視化し、3次元構造を保ったままで移植後膵島を観察した。その結果、膵島の全体分布、生着、膵島数の増減などを経時的に検証できた。結果を国際学会で発表した。不安定1型糖尿病に対し、近年同種膵島移植が行われている。膵島は門脈内に注入されるため低侵襲の細胞移植治療として期待されているが、課題の一つに門脈注入後の低い生着率があり、移植後早期に半数以上が破壊されるとされている。さらに、長期的にもグラフト機能は低下していく。その原因・メカニズムの解明が必要であるが、門脈注入後は外部から膵島が見えなくなり、直接観察することができなくなることが大きな障害になっている。最近、我々はマウス肝臓を構造および抗原性を保持したまま全体を透明にする画期的な技術を開発した。この技術とミリメートルセンチメートルの単位で観察可能なレーザー蛍光顕微鏡を用いると肝臓内部を可視化してマクロ視野および微細構造の双方で3次元構造のまま詳細に観察可能である。本研究では移植後膵島を3次元的に観察し、膵島の全体分布、生着、炎症、血管新生、免疫反応、膵島数の増減、インスリン産生量の変化、β細胞量の変化などを経時的に検証を行うことを目的とする。平成27年度は、マウス肝臓を用いて、方法を改良してさらに臓器中心部まで十分な透明化を得ることに成功した。その成果を国際学会で発表した。さらにGFPマウスから単離した蛍光を発する膵島を、他のマウス肝臓に門脈経由で注入移植し、肝臓全体を透明化してライトシートレーザー蛍光顕微鏡で観察した。その結果、肝臓全体に分布する膵島を切片を作成することなくマクロ視野で3次元的に観察することができた。平成27年度の研究計画は「1マウス肝臓の最適な透明化方法を確立する。その際、2抗体を用いた染色が可能となるよう抗原性を十分に保持される方法を開発する。3膵島を門脈内移植し、特異的に染色するかGFP発現マウスから単離した膵島を移植し、マクロ3次元的に蛍光顕微鏡観察する。」であった。このうち、「1マウス肝臓の最適な透明化方法を確立する。」については、透明化方法に改良を加えて臓器全体、特に中心部までが十分な透明度を得る方法を開発した。また「2抗体を用いた染色が可能となるよう抗原性を十分に保持される方法を開発する。」については、血管などの抗原に対する抗体を用いた染色は可能となった。他の一部の抗原に対しては、まだ検証が必要である。また「3膵島を門脈内移植し、特異的に染色するかGFP発現マウスから単離した膵島を移植し、マクロ3次元的に蛍光顕微鏡観察する。」については、GFP発現マウスから単離した膵島を門脈内移植し、マクロ3次元的に蛍光顕微鏡観察する実験を行った。透明化処理後も移植膵島は十分な蛍光を発していたため、顕微鏡観察は容易であった。現在1型糖尿病の根治的治療として膵臓移植や膵島移植が行われており、特に膵島移植は負担が少ない治療として有望である。通常膵島は門脈内に注入され、肝臓内に生着する。しかしながら、移植後早期にinstant blood mediated inflammatory reaction(IBMIR)と呼ばれる凝固・炎症反応が引き起こされ、さらに分離時に血管網も寸断されているため半数以上の膵島が破壊されるとされている。さらに長期的には拒絶反応、免疫抑制剤毒性、脂質毒性、高血糖毒性、自己免疫再燃などにより徐々に機能が低下することも課題である。これらの克服のためには各現象の原因・メカニズムの解明および解決法の開発が必要である。しかし、現実的には門脈注入後の肝臓内の膵島は外部から観察できず、その分布や経時的細胞数の変化を直接検証するのが難しかった。これまでにも肝臓を薄切して2次元的に観察するか、超音波やMRIなどで外部から検査する方法はあったが、簡便性、解像度、染色不可等の問題で微細な検証はできていなかった。近年、小動物の臓器を形態・3次元構造を保ったまま透明化する技術が発展してきた。また、顕微鏡が発達し、ライトシートレーザー蛍光顕微鏡というシート状の励起光を照射する蛍光顕微鏡を用いることで、数cm程度の厚みであれば3次元の構造を詳細に観察することが可能となった。そこで申請者は、膵島移植の移植生着部位である肝臓全体の透明化を試み、これに成功した。次段階として膵島モデルの蛍光ビーズを肝臓内に注入後、肝臓の透明化し、3次元イメージングを図った結果、これにも成功した。さらに蛍光標識された膵島を門脈から肝臓内に移植し、移植した膵島を3次元構造を保持したままマクロレベルで詳細に解析することにも成功した。

一方で、膵島移植の課題の一つに低い生着率があり、その原因の解明が必要であるが、門脈注入後は、直接観察できなくなることが大きな障害になっている。そこで、臓器の透明化技術とセンチメートル単位で観察可能なシートレーザー蛍光顕微鏡と併せて用いることで、マウス肝臓内部を可視化し、3次元構造を保ったままで移植後膵島を観察した。その結果、膵島の全体分布、生着、膵島数の増減などを経時的に検証できた。結果を国際学会で発表した。研究はおおむね順調に進捗しているので、当初の計画通り平成28年度の研究を進める。すなわち、1膵島移植後のマクロ視野観察および2膵島移植後のミクロ視野観察を行っていく。1では、マクロ視野での全体的な膵島分布と、経時的な変化を検証する。多くの場合長期的に移植膵島機能は低下するが、膵島数の減少と各膵島のインスリン分泌能の低下の割合は定かでないので、本研究で検証する。2では、門脈内移植後膵島や周囲の微細な組織を多重染色した上で多光子共焦点顕微鏡(超微細構造)やシートレーザー蛍光顕微鏡(微細マクロ構造)で3次元的に観察する。さらに、IBMIR抑制、炎症・免疫反応抑制、血管新生促進を目指した候補薬剤を投与して影響を検証し、膵島の生着率向上を目指す。膵島移植
資源およびその関連産業における先端技術の開発-日・加共同プロジェクト-

本研究の実績内容は以下の7項目に大別される。1.カナダ側の研究分担者が来日した後、鉱山現場を訪問し、日本の資源産業の現状、資源工学上の問題点の分析、ならびに今後の技術開発のあり方について現場技術者を含めて検討する討論会を開催した。見学・討論会場の対象とされた鉱業所および製錬所は以下の3社である。・花岡鉱業株式会社深沢鉱業所・小坂製錬株式会社小坂製錬所・秋田製錬株式会社飯島製錬所2.秋田大学において、Queen's大学の研究分担者を講師とする特別講演会を開催し、本研究計画に携わっている研究者以外の学生、教職員、研究者間の意見交換を行なった。その講演題目は以下の通りである。3.本研究グループが金属鉱業技術センターを訪問し、センター研究員ならびに国際資源大学校研修生を含めた技術開発に関する討論会を開催した。なお、同センターの所在する小坂町とセンター共催の国際シンポジウムに参加し、民間技術者に対する研究交流を配慮した。4.専門分野別に構成された4グループ体制で研究資料の交換が行なわれ、問題点の分析が進められた。カナダ側研究者の滞在中には、小グループ別に各自分担研究テーマに関する共同研究を行ない、研究打ち合せを繰り返した。5.カナダ側共同研究機関のクイーンズ大学に研究代表者ならびに研究分担者計6名を派遣し、各専門分野の研究室を訪問するとともに、日加両国の、専門領域を同じくする研究者間で、小グループ別の共同開発研究を進めた。本研究プロジェクトによって、クイーンズ大学-秋田大学間の研究上の協力体制が固められ、この研究・情報ネットワークが今後の国際的な技術開発の進展に寄与するところは、極めて大であると考えられる。6.オタワのCAMET(カナダ国立鉱物・エネルギー研究センター)を訪問し、資源工学における技術開発およびカナダの資源産業の現状、現在CAMETが抱える問題点ならびに今後の技術開発の在り方等について、活発な意見交換を行なった。7.1993年8月2326日、クイーンズ大学において開催された"21世紀に向けての資源(Mining into the 21th Century)"と題する鉱山計画国際会議に参加し、各国の研究者との意見・情報交換を計るとともに、研究資料の入手に努めた。なお、日本側の研究分担者が発表した論文は以下の4件である。本研究は、補助金交付の連絡を受けた後、直ちに日加両国の研究者間で、共同研究計画を十分に検討し、各自の専門分野の違いを考慮して、1)Rock Mechanics、2)Mine Design and Environmental Problems in Mines、3)Mechanization in Mines and Hydraulic Transport、4)Mineral Processingの4グル-プ構成とする研究体制を作り上げた。また、日本側のメンバの一人が7月にアメリカ合衆国で開催された国際会議に出席した折、共同研究を関する学術的な資料の収集と国際的な資源工学上の問題を討議・検討した。会議終了後はクイ-ンズ大学を訪問し、日加両国の研究代表者の相互受け入れの準備・調整と意見交換を行った。このときの合意内容に基づき、10月には日本側の研究代表者が訪加し、クイ-ンズ大学の研究状況を診察するとともに、クイ-ンズ大学研究グル-プのメンバ-(研究分担者)との間で次年度以降の共同研究プロジェクトに関する全体的な打ち合せを実施した。

さらに、11月にクイ-ンズ大学側の研究代表者が来日して、日本国内の代表的な製錬所・鉱山である秋田製錬株式会社飯島製錬所、小坂製錬株式会社、花岡鉱金株式会社ならびに金属鉱業研修技術センタ等を訪問し、現場担当者を含めて日本・カナダ両国の資源産業における問題点を検討するとともに、研究資料の交換や資源工学全般にわたる検討会を開催した。一連の検討会・会議では、資源産業における経済的、技術的な問題ならびに大学における資源工学の教育問題等が様々な角度から検討されたが、とくに取り上げられた内容を要約すると、次のとおりである。1)今後の大学における研究・技術開発の在り方2)一般企業あるいは公的機関の研究所との共同研究3)日加両国における研究費の問題4)研究分担者各自が進めている研究上の問題5)日加双方の研究分担者間で協力して研究・開発できる点6)次年度以降の共同研究に関する詳細かつ具体的な検討本研究の実績内容は以下の4項目に大別される。1.カナダ側の研究分担者が来日した後、鉱山現場を訪問し、日本の資源産業の現状、資源工学上の問題点の分析、ならびに今後の技術開発のあり方について現場技術者を含めて検討する討論会を開催した。見学・討論会場の対象とされた鉱業所および製錬所は以下の3社である。・花岡鉱業株式会社深沢鉱業所・小坂製錬株式会社小坂製錬所・秋田製錬株式会社飯島製錬所3.金属鉱業技術センターを訪問し、センター研究員ならびに国際資源大学校研修生を含めた技術開発に関する討論会を開催した。なお、同センターの所在する小坂町とセンター共催の国際シンポジウムに参加し、民間技術者に対する研究交流を配慮した。4.専門分野別に構成された4グループ体制で研究資料の交換が行なわれ、問題点の分析が進められている。カナダ側研究者の滞在中には、小グループ別に各自分担研究テーマに関する共同研究を行ない、研究打ち合せを繰り返した。以上のとおり、本研究では種々の角度から資源工学における最先端技術の開発が十分に検討され、今後の日・加両国の資源産業の発展ならびに研究体制の強化に大いに寄与する成果が得られたものと考えられる。
膜性腎症動物モデルにおける病因抗原および発症機序の解明

難治性成人ネフローゼ症候群の発症機序を解明する目的でその動物モデルであるラットハイマン腎炎の研究を我々は続けてきた.我々が、物理化学的および免疫学的手法で分離し得た膜性腎症モデルの病因抗原は、分子量が120KDの現在まで報告された抗原の中ではもっとも小分子で、従って最も純化の進んだ抗原分子と考えられる.この抗原は約1100個のアミノ酸よりなるが、その部分的分析を行なった結果、Low density lipoprotein receptor蛋白と相同性が認められた.さらに、この1100個のアミノ酸配列の中で、腎炎を惹起するに必要最小限のペプチド鎖を決定すべく研究を進めた.すなわち、我々の分離した腎炎惹起抗原分子を任意に区分した各部位のcDNA鎖を作成し、それをベクターを用いて大腸菌に組み込んで該当する蛋白を産生させ、それらの蛋白の腎炎惹起性を鋭意検討中である.他方、in vitroの検索法として、どのリコンビナント蛋白が、腎炎発症ラットの血中に存在する自己抗腎抗体と反応するエピトープを有しているかを並行して検討しており、近い将来、目的とする蛋白を同定することが出来ると確信している.上記のリコンビナント抗原が得られれば、そのDNAプローブを合成して、病因抗原の産生部位をin situ hybridization法により明確にしたいと考えている.さらに、リコンビナント抗原と、モノクローナル抗体を用いた血中病因抗原のELISA測定法を確立し、腎炎発症機序の解明を行ないたいと考えている.難治性成人ネフローゼ症候群の発症機序を解明する目的でその動物モデルであるラットハイマン腎炎の研究を我々は続けてきた.我々が、物理化学的および免疫学的手法で分離し得た膜性腎症モデルの病因抗原は、分子量が120KDの現在まで報告された抗原の中ではもっとも小分子で、従って最も純化の進んだ抗原分子と考えられる.この抗原は約1100個のアミノ酸よりなるが、その部分的分析を行なった結果、Low density lipoprotein receptor蛋白と相同性が認められた.さらに、この1100個のアミノ酸配列の中で、腎炎を惹起するに必要最小限のペプチド鎖を決定すべく研究を進めた.すなわち、我々の分離した腎炎惹起抗原分子を任意に区分した各部位のcDNA鎖を作成し、それをベクターを用いて大腸菌に組み込んで該当する蛋白を産生させ、それらの蛋白の腎炎惹起性を鋭意検討中である.他方、in vitroの検索法として、どのリコンビナント蛋白が、腎炎発症ラットの血中に存在する自己抗腎抗体と反応するエピトープを有しているかを並行して検討しており、近い将来、目的とする蛋白を同定することが出来ると確信している.上記のリコンビナント抗原が得られれば、そのDNAプローブを合成して、病因抗原の産生部位をin situ hybridization法により明確にしたいと考えている.さらに、リコンビナント抗原と、モノクローナル抗体を用いた血中病因抗原のELISA測定法を確立し、腎炎発症機序の解明を行ないたいと考えている.ヒト膜性腎症モデルであるラット・ハイマン腎炎の病因抗原の同定と、発症機序の解明の研究を行った。ラット近位尿細管刷子縁を含む分画をプロナーゼ処理して可溶化し,それをゲル濾過分離用アクリラマイド・ゲル電気泳動等を行い、単一のバンドとして抗原を取り出した。さらに、それを高速液体クロマトグラフィーにかけさらに精製度をたかめた。この様にして得た抗原を、同種ラットに免疫すると6-8週後には、典型的な膜性腎症が発症した。次に、この抗原を用いてモノクロナール抗体を作成し、この抗体を用いて蛍光抗体間接法により、腎炎ラットの糸球体基底膜に沈着する免疫複合体が、我々の分離した抗原より構成されていることを明らかにした。すなわち、病因抗原を分離し得たことになる。この病因抗原は近位尿細管、十二指腸上皮にのみ存在し、糸球体には存在していない。この分離した抗原をモモクロナール抗体を結合したアフィニティ・カラムを用いて、さらに精製した。精製抗原の分子量は約120キロダルトンで、アミノ酸分析の結果、アミノペプチダーゼ・Nと相同性がみられた。目下、正確なアミノ酸分析と、それに基づいてDNAプローブを合成し、病因抗原のmRNA発現部位を明確にすれば、現在、論争の的となっている腎臓に於ける病因抗原の局在部位について結論を下すことが可能となる。更に、病因抗原のELISA法による微量測定法を確立し、病因抗原の血中における存在と、腎炎発症時の動態を経時的に測定して、腎炎発症機序の解明を試みる。難治性成人ネフローゼ症候群の発症機序を解明する目的でその動物モデルであるラットハイマン腎炎の研究を我々は続けてきた.我々が、物理化学的および免疫学的手法で分離し得た膜性腎症モデルの病因抗原は、分子量が120KDの現在まで報告された抗原の中ではもっとも小分子で、従って最も純化の進んだ抗原分子と考えられる.この抗原は約1100個のアミノ酸よりなるが、その部分的分析を行なった結果、Low density lipoprotein receptor蛋白と相同性が認められた.さらに、この1100個のアミノ酸配列の中で、腎炎を惹起するに必要最小限のペプチド鎖を決定すべく研究を進めた.すなわち、我々の分離した腎炎惹起抗原分子を任意に区分した各部位のcDNA鎖を作成し、それをベクターを用いて大腸菌に組み込んで該当する蛋白を産生させ、それらの蛋白の腎炎惹起性を鋭意検討中である.

他方、in vitroの検索法として、どのリコンビナント蛋白が、腎炎発症ラットの血中に存在する自己抗腎抗体と反応するエピトープを有しているかを並行して検討しており、近い将来、目的とする蛋白を同定することが出来ると確信している.上記のリコンビナント抗原が得られれば、そのDNAプローブを合成して、病因抗原の産生部位をin situ hybridization法により明確にしたいと考えている.さらに、リコンビナント抗原と、モノクローナル抗体を用いた血中病因抗原のELISA測定法を確立し、腎炎発症機序の解明を行ないたいと考えている.
国際的な資質をリーガルマインドの視点から育成する中学校社会科学習

本研究は,中学校社会科における法教育において,法的思考力(リーガルマインド)を育てる教育に重点を置きつつ,グローバル社会の中でも希望を持って生き抜くことのできる国際的資質を有した市民を育成していくための授業のあり方を研究するものである。そのために,系統的に法的思考力を身に付けることができる単元開発並びにその実践に取り組んだ。開発した単元は, (1)新しい人権自己決定権について考える(積極的安楽死について考察する実践)(2)新しい人権臓器移植をめぐる法律問題(脳死,臓器移植について考察する実践),である。また,単元の実践においては,生徒に法的な問題について意見をたたかわせる場を提供することができた。他者の異なる意見に耳を傾け,具体的な根拠を挙げて議論し,同時に自由や平等,公正さ,幸福追求といった基本的価値に留意しつつ,関連する法制度や具体的な問題を理解しようとする姿勢が見られた。次に,法的思考力を系統的に実践するために開発した,上記2つの単元を含めた,中学校社会科3分野全体にまたがる総合的単元「法教育プログラム」の概要を説明する。このプログラムは,以前に開発した単元を含め,大きく以下のように構成するものである。1法の歴史(基本的人権の誕生,大陸法及び英米法の視点も含みつつ,地理的空間認識と関連させたもの。), 2アメリカの人種問題(独立戦争,南北戦争から現代のアファーマティブアクションまでを網羅したもの。地理的空間認識とも関連させることができる。),3法的思考力育成のためのケースメソッド(A :刑法を中心とした正当防衛に関する単元, B :労働契約法を中心とした労働問題に関する単元, C・D :上記2単元)。本研究を実施することは,知識面では,法的な価値・原理に関する理解,制度手続きについての知識が,また技能面では,知識を応用させる技能と参加の技能を育むことにつながるものと考えられる。
5-HT_<2A>受容体遮断薬の分子薬理学的な構造活性相関の解析に関する研究

本年度の研究内容は、セロトニン受容体(5-HT受容体)の機能解析に関する内容である。近年、薬物受容体の構造もTwo state theoryの理論的な考察から受容体構造も薬物の結合によっておこる反応系から活性型(active state)および不活性型(inactive state)となることが分子生物学的方法やコンピュータモデリングを使った研究から明らかとなってきた。そこで、5-HT_<2A>(Asp322)および5-HT_<2C>受容体(Asp3.22)をそれぞれAlanineに置換した変異体を作成することにより構成的活性(constitutively active)を持つ受容体を見出した。この構成的活性受容体はTwo state theioryの受容体の活性型を意味し、またアゴニストがなくても活性化される受容体であることを明らかにした。すなわち、IP産生能が5-HTが存在しなくとも上昇する変異体であることを明らかにした。そして、これらの構成的活性を有する受容体に対する遮断薬であるサルポグレラート(sarpogrelate)、ケタンセリンやシプロヘプタジン(5-HT_<2A>遮断薬)などが、逆活性薬インバースアゴニスト(innverse agonist)であることを明らかにした。これらの研究成果は、病態時における受容体の変異体が起こっている場合は、従来のニュートラルアンタゴニストでは薬理効果を持たず、インバースアゴニスト活性を持っている薬物でなければ薬理効果が期待できないことを意味していることになる。なお、5-HT2B受容体においてもこのサブタイプの第3ヘリックスのAsp135がサルポグレラートの重要な結合部位であることも証明した。1.5-HT_<2A>作用薬-受容体の相互作用部位の解析に関する研究:既知の5-HT_<2A>作動薬(サルポグレラート)と5-HT_<2A>受容体サブタイプとの三次元構造での結合部位および結合様式をモデリングにより解析をおこなった。その結果、1)サルポグレラートの各置換基は、5-HT_<2A>,5-HT_<2B>および5-HT_<2C>の第3,4,5,6および7ヘリックスのアミノ酸残基とelectrostaticあるいは疎水結合すること、2)Ser242(TM5)の水酸基の酸素原子とサルポグレラートのメトキシ基の酸素原子の静電気的な反発によってサルポグレラートの芳香環の向きが逆転するため、芳香環が5-HT_<2A>疎水領域へ深く入り込むことができないこと、3)5-HT_<2A>のIle206(TM4)の側鎖はサルポグレラートをSer242(TM5)から引き離し、Asp155(TM3)の負に荷電したカルボン酸と第4級アミンとのelectrostatic結合を可能にすること、4)Trp151(TM3)のカルボキシル基とサルポグレラートの第4級アミンがイオン結合しTrp336(TM6)のアミンがサルポグレラートのカルボキシル基とelectrostatic結合すること、を明らかにした。2.薬理学的手法による各5-HT_<2A>作用薬の力価測定に関する研究:1)セロトニン受容体を介するブタ冠動脈収縮に対する5HT_2遮断薬の抑制効果、2)5-HTによるブタ冠動脈の弛緩反応におよぼす5-HT_2遮断薬の作用、3)結合実験法による5-HT_2遮断薬の5-HT_2受容体からの解離能の比較について検討を行った。結果、遮断作用強度や親和性の順位は、リタンセリンミアンセリン=ケタンセリン=メチセルジドシプロヘプタジンサルポグレラートの順位であることがわかった。3.これらは構造活性相関の解析に関する研究の基礎的なデータであり、次年度の研究計画に十分役立つ結果が得られた。今年度は以下に示す結果を得た。

1)モデリング解析によって合成した新規化合物の結合部位の各5-HT_2-受容体サブタイプのアミノ酸残基を推定したところ、第3ヘリックスのAsp3.32,Trp3.28および第6ヘリックスのTry6.48であることが判明した。2)COS-7細胞を利用して各5-HT_2-受容体の3種の変異体(Asp3.32Ala,Trp3.28AlaおよびTry6.48Alaを作成し,新規化合物の結合親和性を結合実験法を用いて評価した。3)第3ヘリックスのAsp3.32,Trp3.28および第6ヘリックスのTry6.48は、サルポグレラートの結合部位として高い親和性を示した。4)第3ヘリックスの2つの変異体(Asp3.32AlaおよびTrp3.28Ala)は、3H-ケタンセリンの結合親和性が著しく減少した。従って、3H-ケタンセリンを使用した場合これらの変異体にはサルポグレラートの結合する力価がないことを示唆しているものと考えれる。5)さらにこれらの2つの変異体(Asp3.32AlaおよびTrp3.28Ala)は、アゴニスト(5-HT)によるIP産生能も減弱していることが判明した。6)第6ヘリックスのTry6.48Alaは、Wild typeの受容体と比較するとおおよそ2.5倍3H-ケタンセリンの親和性が低かったし、またケタンセリンの親和性も低かった。7)さらにこの変異体(第6ヘリックスのTry6.48Ala)は、アゴニストによるIP産生能もサルポグレラートの力価も最も低かった。従って、これらの結果から、5-HT2Aアンタゴニストであるサルポグレラートの結合するアミノ酸の重要性が明らかとなった。本年度の研究内容は、セロトニン受容体(5-HT受容体)の機能解析に関する内容である。近年、薬物受容体の構造もTwo state theoryの理論的な考察から受容体構造も薬物の結合によっておこる反応系から活性型(active state)および不活性型(inactive state)となることが分子生物学的方法やコンピュータモデリングを使った研究から明らかとなってきた。そこで、5-HT_<2A>(Asp322)および5-HT_<2c>受容体(Asp3.22)をそれぞれAlanineに置換した変異体を作成することにより構成的活性(constitutively active)を持つ受容体を見出した。この構成的活性受容体はTwo state theoryの受容体の活性型を意味し、またアゴニストがなくても活性化される受容体であることを明らかにした。すなわち、IP産生能が5-HTが存在しなくとも上昇する変異体であることを明らかにした。そして、これらの構成的活性を有する受容体に対する遮断薬であるサルポグレラート(sarpogrelate)、ケタンセリンやシプロヘプタジン(5-HT_<2A>遮断薬)などが、逆活性薬インバースアゴニスト(inverse agonist)であることを明らかにした。これらの研究成果は、病態時における受容体の変異体が起こっている場合は、従来のニュートラルアンタゴニストでは薬理効果を持たず、インバースアゴニスト活性を持っている薬物でなければ薬理効果が期待できないことを意味していることになる。
免疫プロテアソームの機能異常による自己炎症病態の分子基盤解明

申請者は、発熱、結節性紅斑、脂肪萎縮等を特徴とする新規自己炎症症候群(JASL)がPSMB8の遺伝子異常に起因しており、免疫プロテアソームの機能破綻が自己炎症病態に関与することを明らかにしたが、分子機構は不明である。本研究では、分子機構を解明するために、JASL罹患者と同じPsmb8変異をもつノックインマウスとMHCクラスIIプロモーター下に変異Psmb8を発現するトランスジェニックマウスを樹立した。その結果、若年の遺伝子改変マウスは野生型と比べて、炎症応答や脾臓細胞の表現型等に有意な差は見られなかった。一方、ノックインマウスでは脂肪細胞の分化異常が観察され、脂肪萎縮症の原因と考えられた。自己炎症症候群は、自然免疫系を制御する分子群の遺伝子異常により自然免疫系が過剰に活性化することが病態であると考えられている。我々は、発熱、結節性紅斑、脂肪萎縮などを特徴とする新規自己炎症症候群(JASL)を見いだし、免疫プロテアソームの構成分子の一つであるPSMB8の遺伝子異常を同定した。この発見は、免疫プロテアソームの機能破綻が自己炎症病態に関与するという新たな視点をもたらしたが、その分子機構は明らかにされていない。以上の背景から、本研究では、JASL罹患者と同変異を持つノックインマウスおよびトランスジェニックマウスを樹立し、炎症を誘導する主要な分子を明らかにするとともに、PSMB8の遺伝子変異が免疫プロテアソームの機能を低下させる分子メカニズムを明らかにすることを目指している。本研究の成功により、炎症を誘導する分子群およびタンパク分解機構の障害に起因する自己炎症応答の分子基盤が明らかになることが期待でき、ヒト炎症病態の研究分野に大きなインパクトをもたらしうると考えられる。当該年度は、(1) PSMB8の遺伝子変異により自己炎症応答が誘導される分子機構を個体レベルで検討するために、JASL罹患者と同変異を持つノックインマウスおよびトランスジェニックマウスを樹立した。(2) PSMB8の遺伝子変異により免疫プロテアソームの活性が低下する分子機構を解明するために、JASL罹患者由来のBリンパ球を用いて、免疫プロテアソームの分子集合が阻害されることを確認した。現在、レトロウイルスベクターを用いて、JASL罹患者由来のBリンパ球に野生型PSMB8を高発現する細胞を作製している。(3) JASLの症状の特徴である脂肪萎縮とPSMB8の関連性を解明するために、脂肪細胞の分化を調節するPSMB8の上流のシグナルの同定を目指した。その結果、PSMB8のプロモーター領域を決定し、その領域に結合する転写調節因子を同定した。当該年度は、(1)平成25年度に樹立したJASL罹患者と同変異を持つPsmb8ノックインマウス及びトランスジェニックマウスについて、経時的に免疫担当細胞の数、血清中の各種サイトカイン、抗体価を測定し炎症応答の有無を検討した。(2)さらに、二系統2系統の遺伝子改変マウスの脾臓細胞を分離し、フローサイトメーターを用いてTリンパ球、Bリンパ球、樹状細胞、マクロファージの活性化マーカーについて検討した。(3)遺伝子改変マウスの体重を経時的に測定し、動物用CTを用いて脂肪量を測定した。以上の背景から、本研究では、JASL罹患者と同変異を持つ遺伝子改変マウスを樹立し、炎症を誘導する主要な分子を明らかにするとともに、PSMB8の遺伝子変異が免疫プロテアソームの機能を低下させる分子メカニズムを明らかにすることを目指している。研究計画に従い、(1) JASL罹患者と同じPsmb8遺伝子変異をもつノックインマウス及びMHCクラスIIプロモーター下に変異Psmb8を高発現するトランスジェニックマウスを樹立し、経時的に免疫担当細胞の数、血清中の各種サイトカイン、抗体価を測定し炎症応答の有無を検討した。その結果、若年齢の遺伝子改変マウスでは、表現型に有意な差は見られなかったため、老齢マウスを作製し、表現型の差を検討中である。

(2)二系統の遺伝子改変マウスの脾臓細胞を分離し、Tリンパ球、Bリンパ球、樹状細胞、マクロファージの活性化マーカーについて検討したが、若年齢の遺伝子改変マウスでは表現型に有意な差は見られなかったため、老齢マウスを用いて検討中である。(3)ノックインマウスの経時的な体重変化および動物用CTを用いて脂肪量を測定したところ、コントロールマウスに比べて脂肪量は少ない傾向であった。また、ノックインマウスでは脂肪前駆細胞数の低下が観察され、脂肪細胞の分化異常が脂肪萎縮症の原因になっていると考えられた。申請者は、発熱、結節性紅斑、脂肪萎縮等を特徴とする新規自己炎症症候群(JASL)がPSMB8の遺伝子異常に起因しており、免疫プロテアソームの機能破綻が自己炎症病態に関与することを明らかにしたが、分子機構は不明である。本研究では、分子機構を解明するために、JASL罹患者と同じPsmb8変異をもつノックインマウスとMHCクラスIIプロモーター下に変異Psmb8を発現するトランスジェニックマウスを樹立した。その結果、若年の遺伝子改変マウスは野生型と比べて、炎症応答や脾臓細胞の表現型等に有意な差は見られなかった。一方、ノックインマウスでは脂肪細胞の分化異常が観察され、脂肪萎縮症の原因と考えられた。当該年度は、交付申請書に記載した研究計画に従い、(1)平成25年度に樹立したJASL罹患者と同じPsmb8遺伝子変異をもつノックインマウス及びMHCクラスIIプロモーター下に変異Psmb8を高発現するトランスジェニックマウスについて、経時的に免疫担当細胞の数、血清中の各種サイトカイン、抗体価を測定し炎症応答の有無を検討した。その結果、若年齢の遺伝子改変マウスでは、表現型に有意な差は見られなかったため、来年度には老齢マウスを用いて検討を行う予定である。(2)二系統の遺伝子改変マウスの脾臓細胞を分離し、フローサイトメーターを用いてTリンパ球、Bリンパ球、樹状細胞、マクロファージの活性化マーカーについて検討したが、若年齢の遺伝子改変マウスでは表現型に有意な差は見られなかった。来年度には老齢マウスを用いて検討を行う予定である。(3)遺伝子改変マウスの体重を経時的に測定し、動物用CTを用いて脂肪量を測定したところ、コントロールマウスに比べて脂肪量は少ない傾向であった。現在、高脂肪食を与えて、脂肪蓄積の程度を検討している。以上のように、当初の計画通りに研究は順調に進展している。医歯薬学平成25年度に樹立した2系統のPsmb8遺伝子改変マウスについて、自己炎症応答および脂肪萎縮病態の有無の検討を継続して行う。(1)二系統の遺伝子改変マウスについて、老齢マウスを用いて、免疫担当細胞の数、血清中の各種サイトカイン、抗体価を測定し炎症応答の有無を検討する。(2)二系統の遺伝子改変マウスについて、老齢マウスを用いて、脾臓細胞を分離し、フローサイトメーターを用いてTリンパ球、Bリンパ球、樹状細胞、マクロファージの活性化マーカーについて検討する。(3)二系統の遺伝子改変マウスの脾臓細胞を分離し、それぞれの細胞を抗CD3抗体(Tリンパ球に対して)、LPS (Bリンパ球、樹状細胞に対して)で刺激して、その増殖能、サイトカイン産生能をコントロール細胞と比較検討する。(4)Psmb8
創薬におけるヒト型肝臓動物モデルを利用した体内動態の個体間変動予測法

近年、医薬品開発の中で、薬物代謝酵素の遺伝多型などによる薬物動態の個人差が大きな障害になっている。個体差の大きな医薬品は、安全性、有効性の観点から臨床においても使用が難しい。本研究では、マウスに異なる個体のドナーのヒト肝細胞を移植した「ヒト肝細胞移植キメラマウス」を用い、それぞれ種々の検証医薬品を投与することで、その体内動態を比較検証した。その結果、創薬においてヒト個体間における医薬品の体内動態予測に有用なモデルとなる可能性を示した。近年、医薬品開発の中で、薬物代謝酵素の遺伝多型などによる薬物動態の個人差が創薬での大きな障害になっている。本研究では、ヒト代謝の個別化予測が精度よくできる新規評価系の構築を目標とする。様々な薬物代謝酵素活性を有するドナーのヒト肝細胞をマウス肝臓に移植した「ヒト肝細胞移植キメラマウス」は、そのドナーを反映した薬物動態を示すことが期待でき、その血中動態から薬効や副作用の発現の予測も可能となる。本研究では、男性と女性のドナー肝細胞をそれぞれマウスに移植したヒト肝細胞移植キメラマウスを用いた。マウス肝臓におけるヒト肝細胞の置換率は概ね、80%であった。まず、薬物代謝酵素のうち最も薬物代謝の寄与が大きいとされるチトクロームP450(CYP)のCYP3A4の代謝活性に着目し、CYP3A4で代謝されることが知られる医薬品(Qunidine, Repaglinide, Verapamil, Midazolam, Diazepam)を本マウスに投与し血中動態を評価した。投与後のクリアランスは、2倍を最大に概ね女性ドナーの肝細胞を移植したキメラマウスの方が高い値を示した。この要因として、ドナー間のCYP3A4の発現量差、遺伝多型による差異が考えられたが、とくにQunidine, Diazepamでは、キメラマウスの残存するマウス肝細胞で代謝される寄与も含まれ、2ドナー間の動態の差異に原因を明確にはできなかった。今後、ドナー個体差を明確にするには、ヒト肝細胞の置換率がさらに高いマウスを用い、マウス肝細胞の寄与の少ない検証化合物を使って評価を行っていく予定である。近年、医薬品開発の中で、薬物代謝酵素の遺伝子多型による薬物動態の個人差が創薬での大きな障害となっている。様々な薬物代謝酵素活性を有するドナーのヒト肝細胞を入手し、マウス肝臓に移植した「ヒト肝細胞移植キメラマウス」は、そのドナーを反映した薬物動態を示すことが期待でき、その血中動態から薬効や副作用の発現の予測も可能となる。さらには、in vivoを反映したin vitro評価系も構築することにより、創薬段階で導入しやすいヒト体内動態予測アプローチとなる。23年度は、薬物代謝酵素活性が低い肝細胞から高いものまでをキメラマウスに移植し、ドナー肝細胞が有する代謝活性を反映させた「ヒト肝細胞移植キメラマウス」を作成することを計画していた。しかし、今のところ、これら様々な肝細胞すべてをキメラマウスの肝臓に効率よく定着させたマウスの産生には至っていない。現在、別のアプローチとして、従来より生産されている「ヒト肝細胞移植キメラマウス」の薬物代謝酵素の発現を低下させることで、当初計画していたヒト代謝の個別化予測が精度よくできるモデルマウスとして、有用になるのではないかと考えている。In vitro評価からの予備検討の結果、その可能性が示されたため、従来計画していた方法と平行して、本アプローチも検討していくことが24年度の課題となる。当初計画していた方法論に、遂行上、一部課題もあるものの、別のアプローチも考案し、現在、検討を進めている。従来計画していた方法も継続して検討しながら、計画通り進行しない場合の対応策も平行して実施していく。まずは、臨床で問題となっている薬物代謝酵素活性の個体間変動のうち、その酵素を限定し、効率的に進めていくことを計画している。主に消耗品費として使用する。特に、キメラマウスに移植する肝細胞購入費のみならず、キメラマウスの薬物代謝酵素の発現を低下させるための試薬についても購入予定である。
骨格筋ＡＭＰキナーゼと関連情報伝達分子を対象とした食品、生薬の作用機序の解明

本研究では、ラット骨格筋を用いた検討で、1.抗糖尿病作用を有する黄連、カフェ酸、サリチル酸及びメトホルミンが、運動(筋収縮)に類似して、エネルギー状態の低下を伴った5'-AMP-activated protein kinase(AMPK)の急性的活性化を示すこと、2.カフェインがAMPKの活性化とともに、運動と異なりインスリン受容体シグナルの抑制を示すこと、3.プーアル茶及びその主成分である没食子酸がAMPK活性化を示さない一方、Akt活性化を示すこと、4. AMPK活性化剤(AICAR)が筋収縮よって生じるメタボローム変化と類似した変化を引き起こすことを明らかにした。近年の疫学調査により、カフェイン含有飲料の習慣的摂取が糖尿病発症リスクを低下することが報告され、カフェインが抗糖尿病効果をきたすメカニズムが注目されるようになった。我々は、カフェインが、体内最大の糖代謝器官である骨格筋に存在する蛋白質リン酸化酵素5'AMP-activated protein kinase(AMPK)を活性化することで、糖代謝の活性化を誘導する可能性を明らかにしてきた。しかし、一方で、コーヒーの抗糖尿病効果がカフェインレスコーヒーによっても認められることが報告されている。そこで我々は、コーヒーに含まれるカフェイン以外の主要生理活性物質であるカフェ酸とクロロゲン酸とに注目し、これらによるAMPK活性化の可能性を検討した。その結果、ラット単離骨格筋インキュベーション系において、カフェ酸が、AMPK活性化の指標であるαサブユニットThr172リン酸化及びAMPKの内因性基質の一つであるacetyl Co-A carboxylaseのリン酸化を、用量・時間依存的(≧0.1 mM、≧30分間)に亢進することが明らかになった。クロロゲン酸はこれらの作用を示さなかった。カフェ酸は、カフェインと同様に、骨格筋のエネルギー状態(クレアチンリン酸含有量)を低下させ、糖代謝活性の指標である3-O-methyl-D-glucose輸送活性を有意に亢進した。AMPKはα、β、γサブユニットからなる3量体で、その酵素活性はαに存在し、骨格筋ではα1、α2の2種類が発現している。我々はすでにカフェインがα1を優先的に活性化することを報告しているが、カフェ酸はα2を優先的に活性化する性質を有した。以上の結果は、カフェ酸がカフェインとは異なった機序を介して骨格筋AMPKを活性化するとともに、コーヒーの抗糖尿病効果発現にカフェ酸による骨格筋AMPKが関与している可能性を示唆するものである。まず第1に、主に中国において健康飲料として用いられてきたプーアル茶の骨格筋代謝活性化作用を検討した。ラット単離骨格筋インキュベーション系において、プーアル茶水溶性抽出物はAMPキナーゼ活性に変化を与えない一方で、インスリンシグナルを用量・時間依存的に急性的に活性化した。HPLC解析上、水溶性抽出物の主要成分は没食子酸であったが、実際、没食子酸はインスリン非依存的にインスリン受容体基質IRS1-PI3キナーゼ-Akt系を活性化し、糖取り込みを促進した。以上より、プーアル茶による骨格筋代謝活性化の有効成分として没食子酸の可能性が示唆された。第2に、赤ワインなどに含まれるポリフェノールであるレスベラトロールについて、ラット単離骨格筋インキュベーション系を用いて検討した。レスベラトロールはAMPキナーゼを用量・時間依存的に急性的に活性化した。しかしその一方で、レスベラトロールはインスリンシグナルを顕著に抑制し、インスリンによる蛋白質合成促進及びグリコーゲン合成促進を減弱した。以上より、レスベラトロールが骨格筋AMPKの活性化とインスリン拮抗作用を併せ持つことが示唆された。なお、レスベラトロールはインスリン受容体脱リン酸化酵素PTP1Bの活性には影響しなかった。第3に、ラット単離骨格筋インキュベーション系を用いてAMPキナーゼ活性化剤AICARを骨格筋に作用させ、骨格筋内に生じる代謝的変化をメタボローム解析にて検討した。その結果、糖代謝や核酸代謝に関連する分子を中心に、AICAR刺激と筋収縮が類似した代謝動態変化を引き起こすことが示された。没食子酸やレスベラトロール及びこれまでの研究で骨格筋への代謝的影響を検討してきた化合物(カフェイン、カフェ酸など)についても、メタボローム解析を用いて筋収縮やインスリン刺激との比較検討を行うことの有用性が示唆された。近年コーヒーや緑茶などカフェイン(Caf)含有飲料の摂取が糖尿病発症リスクを低下することが報告され、Cafの糖尿病予防効果に関する分子機序が注目されている。これまで我々は、ラット単離骨格筋を用いた検討で、Cafが骨格筋に存在する5'AMP-activated protein kinase(AMPK)を活性化することによって糖代謝を活性化する可能性を明らかにしてきた。一方、Caf摂取は糖尿病患者においてインスリン感受性を急性的に低下させることも報告されている。そこで本年度の研究では、Cafがインスリンシグナルを阻害しインスリン依存性糖

輸送を抑制するかについての解析を行った。その結果、Caf(3 mM、15分刺激)は、insulin recepor substrate-1(IRS-1) Tyr612リン酸化、phosphatidylinositol-3 kinase Tyr458リン酸化、Akt Ser473リン酸化を阻害するとともに、インスリン依存性糖輸送活性を減弱することが明らかとなった。またCafは、インスリンシグナルに対して抑制的に作用するIRS-1 Ser307リン酸化とその制御因子inhibitor κB kinase(IKK) Ser176/180のリン酸化を亢進させた。さらに、CafによるIRS-1 Tyr612およびAkt Ser473、インスリン依存性糖輸送の阻害作用は、IKK阻害剤caffeic acidによって減弱した。またラットに生理量のCafを静脈投与することで、インスリンによるIRS-1 Tyr612及びAkt Ser473のリン酸化の抑制が認められた。以上の結果から、糖尿病患者におけるCafによるインスリン感受性の低下に、骨格筋におけるIKK/IRS-1 Ser307リン酸化を介したインスリン依存性糖輸送阻害が関与している可能性が示唆された。運動生化学,内分泌代謝学(糖尿病学)コーヒーの抗糖尿病作用に関して、従来検討してきたカフェインに加え、カフェ酸、クロロゲン酸に関しての検討を行い、カフェ酸が骨格筋AMPKを活性化する可能性を明らかにした。また、古来東洋において健康飲料として用いられてきたプーアル茶の骨格筋AMPKに対する検討を行い、その研究過程で、プーアル茶水溶性抽出物が骨格筋AMPK活性に変化を与えない一方で、糖および蛋白質代謝の重要な制御分子であるAktの活性化作用を持つことを明らかにした。以上の知見はいずれも原著論文として世界に先駆けて国際的専門誌に報告した。以上のことから、研究が順調に進展しているものと判断した。これまでの研究成果と本年度の研究成果とに基づいて「カフェイン摂取は急性的にインスリン感受性を悪化させるものの、長期的な摂取によるAMPKの反復的活性化によって糖尿病予防効果が誘導される」との仮説を提唱することができた。この仮説は、カフェインの長期投与実験による検証を必要とするものではあるが、複数の疫学的研究において示されてきたカフェイン含有飲料(コーヒー、緑茶など)の糖尿病予防効果を説明すると同時に、糖尿病患者における糖代謝悪化のメカニズムを同時に説明することが可能な学術的・社会的意義の高い仮説と考えられた。また、カフェイン以外のコーヒー由来生理活性物質の検討も行い、カフェ酸が骨格筋AMPK活性化作用を持つことを明らかにすることができた。以上より研究が順調に進展しているものと判断した。コーヒーの抗糖尿病作用に関しては、カフェインとカフェ酸が、安静状態(非収縮時)の骨格筋代謝のみならず、運動時(収縮時)の骨格筋代謝に与える影響を含めて検討してゆく予定である。
１分子計測による電位依存性プロトンチャネルのサブユニット間の協調性の解析

電位依存性イオンチャネルは複数のサブユニットが協働してはたらくが、そのメカニズムに関しては不明な点が多い。そこで2量体を形成する電位依存性プロトンチャネルを用いて、その活性化における構造変化を解析することで協働性の実体を明らかにすることを目指した。細胞外側に2種類の環境応答性の蛍光物質を付加し、膜電位存在下で計測を行ったところ、FRETが観測され、かつそのFRET効率が経時的に変化することから活性化時に2段階の構造変化が起きていることが判明した。この構造変化はサブユニット同士が近づくことを示唆していることから、このような動きがイオンチャネルの協働性を担っているものであると考えている。電位依存性プロトンチャネルHv1/VSOPは単量体でイオン透過路とチャネルの開閉を制御する機構を持つにもかかわらず、2量体を形成し、サブユニット間で協調してチャネルの開閉を制御している。本研究ではこのメカニズムを、再構成系による単一チャネル電流計測と蛍光変化計測による構造変化の追跡によって“電位依存性プロトンチャネルのサブユニット間の協調メカニズム“を解明する。本年度は、Hv1/VSOPの単一チャネル電流計測に向けての実験を行った。(1)単一チャネル電流計測:マウス由来のHv1/VSOPを用いた計測ではpH差を極端にするなどの工夫をしたものの、再現性よく電流を計測できていない。そこで、この原因を探るために蛍光タンパク質を付加したHv1/VSOPを作製した。脂質へ再構成後、ジャイアントリポソームを作製して、共焦点顕微鏡にて観察したところ、Hv1/VSOPは膜に一様に分布しておらず、局所に集合してしまっていることが判明した。これはジャイアントリポソームを形成する過程に問題があることを示唆しており、現在リポソーム作製法から再検討している。(2)発現コンストラクトの最適化:予備実験で大きな電流が通ることが予想されたウニ由来のHv1/VSOPの大腸菌による発現を試みた。ある程度の発現をすることが確認されたが精製するには不十分であり、大量発現を目指すにはさらなるコンストラクトの改善が必要であることが判明した。本年度は単一チャネルの電流計測を実施したが、概要でも述べたように再現性よく電流を計測できていない。原因の一つとして、Hv1/VSOPの再構成リポソームの生成に問題があることが判明し、改善を試みている最中であり、研究実施状況はやや遅れていると評価した。本研究では、再構成系による単一チャネル電流計測および蛍光変化計測を用い“電位依存性プロトンチャネルのサブユニット間の協調メカニズム“を解明する。本年度は、Hv1/VSOPにラベルした蛍光プローブの膜電位依存的な蛍光変化を検出する試みを行った。(1)マクロな蛍光変化計測の確立:蛍光標識の導入部位を最適化するために、アフリカツメガエル卵母細胞を用いてマクロな蛍光変化を測定できる系を立ち上げ、計測した。具体的には2量体界面を形成するS3,S4ヘリックスをつなぐ細胞外側リンカーのSer188にCysを導入、代表的な蛍光物質であるCy3, Cy5マレイミド体にてラベルを行った。その結果膜電位依存的な蛍光変化が観測され、かつCy3, Cy5を同時にラベルすることで時定数の異なるFRET変化が観測された。これは各サブユニットにおいて別々の蛍光物質が導入されていることを表している。また、膜電位依存的な構造変化が1段階ではなく数段階あることを示唆し、FRET効率が上昇する方向に変化することから、膜貫通ヘリックスが2量体界面方向に開く動きを反映していると見られる。(2)全反射照明蛍光顕微鏡(TIRF)計測条件の確立:上記マクロ系にて蛍光変化が観測されたので、さらに詳細な解析をすべくTIRFでの実験条件の確立を試みた。当研究室の保有しているTIRFには電気生理学の装備がなかったので、装置の立ち上げから行い、現在では培養細胞などを用いて膜電位コントロール下でTIRF観測を行うことが可能となった。過剰発現させた系においては膜電位依存的な蛍光変化を観測できたため、1分子での計測条件の確立を試みている。(1)単一チャネル電流計測:前年度に引き続き、Hv1/VSOPのリポソーム作製・再構成法の改良および発現コンストラクトの改良を通じて、単一チャネル電流計測を目指す。(2)蛍光変化を利用した解析:サブユニット間で異なる蛍光標識をしたHv1/VSOPをリポソームに組み込み、膜電位存在下での構造変化を1分子の蛍光シグナル変化として全反射蛍光顕微鏡TIRFを用いて観測する。

蛍光標識の導入部位は研究計画では一例を挙げたが最適な部位を探る必要があるので、1分子ではなくマクロで測定できる系を立ち上げ、培養細胞やアフリカツメガエル卵母細胞などを用いて大量のコンストラクトを評価できるようにする。生物物理学、生理学本年度は当初想定よりも人工脂質・界面活性剤などの試薬の購入にコストがかからなかったたため剰余が生じた。タンパク質を発現・精製・再構成するのに必要な培地・界面活性剤・人工脂質、遺伝子操作のための制限酵素・ポリメラーゼ・プライマーの購入で使用する。顕微鏡で使用するミラー・フィルターなどや電気生理学実験で使用する消耗品などにも充てる。国内および国際学会に研究成果を発表するための旅費や成果を論文に投稿するための投稿料などとしても使用する予定である。
幾何プログラミング・システムに関する研究

平成3、4年度に渡る本研究の成果として以下のものを得た。1.幾何プログラミング言語処理系GPL・図形や画像といった幾何学的対象の構造や相互関係を宣言的に記述し、多様な幾何学的対象の処理を統一的に行うためのソフトウェア・システムとして、拡張項書換えに基づく代数的制約プログラミング言語GPLを設計し、そのインタープリタを試作した。GLPの特徴としては、(a)大域変数を持つ関数型言語(b)関数のオーバローディング機能(c)不定長の構造を持つ配列(d)制約の多重継承機能(e)異なったデータ型間の自動型変換機能がある。・GPLを用いて2次元の図形や画像など多様な幾何学的対象のモデル記述を行い、従来の手続き型プログラミング言語では記述が複雑、冗長になっていた様々な幾何学的情報処理が簡潔に表現できることを示した。・GPLインタープリタにおける名前の管理法、項の内部データ表現、書換え規則の探索法に改良を加え、実行効率の向上を図ったが、実用的な言語処理系とするにはコンパイラが必要で、今後はGPLの実用化に向けての研究開発を予定である。2.幾何推論システム・幾何学的関係が、順序概念を内包するか否かによって順序関係、非順序関係に分類できることを明かにし、順序関係に基づいた論理的推論と非順序関係に基づいた代数的推論を融合した融合幾何推論方式を新たに開発した。・融合幾何推論方式の推論能力が従来のものより優れていることを理論的に証明するとともに、融合幾何推論に基づく幾何定理証明システムを設計、試作し、その有効性を実証した。本年度の研究実績として以下のものを得た。1.幾何プログラミング言語処理系GPLの設計と試作(1)幾何学的対象の構造や相互関係を宣言的に記述し、多様な幾何学的対象を操作・処理・表示する機能を実現するための代数的制約プログラミング言語GPLカ-ネルを設計、試作した。処理系(インタ-プリタ)は、高速グラフィック機能付きワ-クステ-ション上でC++を用いて作成した。(2)GPLカ-ネルを用いて2次元、3次元の図形や画像、3次元物体などの多様な幾何学的対象のモデル記述を行うとともに、XーWindowを用いた図形、画像の表示機能を実現し、GPLによるプログラミング技法、実行速度などを検討した。その結果、現在のGPLカ-ネルの持つインヘリタンス機能の限界が明らかになった。こうした検討結果を踏まえ、来年度にGPLカ-ネルの機能拡長を行う予定である。2.幾何学的推論アルゴリズムの考案Grobner基底法に基づく代数的推論とPrologによる論理的推論を融合した幾何推論システムを構築し、従来の幾何推論アルゴリズムでは証明できなかった。幾何学の証明問題が融合推論によってうまく証明できることを明らかにした。来年度は、今回の融合推論方式をさらに発展させ、より強力な幾何学定理証明システムの開発を目指す。平成4年度の研究実績として以下のものを得た。1.幾何プログラミング言語処理系GPL・平成3年度に設計したGPLの言語仕様を見直し、多重断承機能を付加した。これにより、複数の上位概念を表すデータ型からの制約の継承が可能となった。・幾何学的情報処理では、同じ対象(たとえば長方形)を表すために異なったデータ構造、データ型を用いることがよくある。こうしたデータ構造、データ型の間の自動変換を行う機能をGPLに新たに加えた。・以上の2点の言語仕様の拡張により、画像や図形といった多様な幾何学的対象が統一的に記述できるようになった。・GPLインタープリタにおける名前の管理法、項の内部データ表現、書換え規則の探索法に改良を加え、実行効率の向上を図った。2.幾何推論システム・平成3年度に開発した、論理的推論と代数的推論を融合した融合幾何推論方式の能力を向上させるために、論理的推論の強化を図った。具体的には、2次元平面上において、ある直線に対して2つの点が同じ(異なる)側にあるという幾何学的関係を表す同異側関係を新たな述語として導入した。

これによって角の位置関係に基づく角度推論や多角形概念に基づく知識表現が可能となり、論理的推論の能力が大幅に向上した。・改良した融合幾何推論方式に基づいた幾何定理証明システムを開発し、その有効性を実証した。