hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
シアノバクテリオクロムの縦断・横断的解析によるフィトクロム型光受容機構の解明

本研究課題では、植物において様々な光応答を制御する赤/遠赤色光受容体・フィトクロムと似て非なる新規光受容体群シアノバクテリオクロム(CBC)の網羅的解析を行った。シアノバクテリオクロムはフィトクロムとは異なり、多様な分光特性を持つ。特に、緑/赤色光受容体・AnPixJに着目し、構造解析・詳細な分光解析を行い、それ以外のCBCについても網羅的解析を推し進めることで、開環テトラピロール結合型光受容体の光変換機構について、理解を深めることができた。AnPixJの縦断的解析:AnPixJの色素結合GAFドメインの赤色光吸収型(Pr)の結晶構造を1.8Aの高分解能で決定した。その結果、色素とアポタンパク質はそれぞれ、フィトクロムのPr型とよく似ていたが、アポタンパク質に対する色素の相対的な結合位置は異なっていた。それにより、色素結合ポケットは両者で全く異なっていた。特に、フィトクロムにおいて、C環の窒素にプロトンを供給し、A,B,c環の窒素に水素結合している水分子がAnPixJには存在していなかった。AnPixJでは、アスパラギン酸残基が水素結合を形成し、かつ、プロトンドナーとしても機能し、独自のプロトネーション機構が存在することが示唆された。また、AnPixJ独自のPg型が形成されるのに重要だと示唆されるアミノ酸をPr型の結晶構造から推測し、部位特異的変異導入解析を行った。その結果、トリプトファン残基がPr型だけでなく、Pg型の形成にも重要な役割を果たしていることが示唆された。また、先行研究の時間分解吸収変化測定から、Pg型からPr型への変換では、二つの中間体が同定されている。これらの中間体の生成速度の温度・粘度依存性を調べた。その結果、最初の中間体の生成には影響は見られなかったが、それ以降の反応においては、温度低下に伴い、中間体の生成速度が低下し、粘性増大により、生成速度が低下した。これらの反応過程では、タンパク質の構造が大きく動き、変化していることが推測される。他のシアノバクテリオクロムGAFドメインの横断的解析:推定概日リズム光センサーである、SyCikAのGAFドメインをシアノバクテリアと大腸菌からそれぞれ精製し、その分光特性を調べた。その結果、ともに紫色光吸収型から黄色光吸収型への片方向光変換とその逆方向への暗反転を示すという、特異な分光特性であった。結合している色素は、TePixJやSyPixJ1と似たフィコビオロビリンだと推測された。AnPixJの縦断的解析:AnPixJの色素結合GAFドメインの赤色光吸収型の結晶構造と、分光的特徴から、AnPixJのPr型の色素はプロトン化されている可能性が示唆された。そこで、Pr型の吸収スペクトルのpH依存性を調べたところ、塩基性バッファーでは、Pr型のQyバンドの吸光係数が有意に低下し、Pr型がプロトン化されていることが確かめられた。先行研究の時間分解吸収変化測定から、Pg型からPr型、Pr型からPg型への変換過程それぞれの中間体が得られている。低温で中間体をトラップする実験も行っており、Pr型からPg型への変換においては、時間分解とほぼ同様な中間体が得られた。一方、逆反応では、時間分解ではトラップできなかった新たな中間体が得られている。また、AnPixJの色素への特異的なラベリングのためのアポタンパク質の精製とPCBとの再構成実験を行い、効率はあまりよくないものの、ホロタンパク質の再構成に成功した。さらなる条件検討の後に、実際に色素をラベリングし、NMRやFTIR解析を行う予定である。他のシアノバクテリオクロムGAFドメインの横断的解析:走光性の光受容体であるSyPixAについて、生化学・分光解析を行った。SyPixAをシアノバクテリアとフィコシアノビリンを合成する大腸菌のそれぞれから精製し、分光特性を調べたところ、ともにフィコビオロビリンを結合し、紫色光吸収型と緑色光吸収型の間の可逆的な光変換を示した。これらの分光特性は先行研究のTePixJとよく似ている。TePixJとSyPixAは色素績合ドメイン全長では保存性が低いが、TePixJの分光特性に重要な役割を果たすシステイン残基が保存されており、局所的なアミノ酸が分光特性を決定していることが示唆された。AnPixJの縦断的解析AnPixJの色素結合GAFドメインのアポタンパク質を精製し、フィコシアニン色素と再構成することにより、タンパク質と色素とのフォールディング過程を解析した。その結果、再構成直後に、AnPixJのPr型よりも長波長のピークを持つ中間体が観察され、その後速やかにPr型が形成された。

また、安定同位体ラベルされた色素と再構成したホロタンパク質のFTIR解析を行い、Pg型からPr型への光変換過程で、アミノ酸のカルボン酸のプロトン脱離反応が起こっていることが示唆された。Pr型の結晶構造と考え合わせると、Pr型において、アスパラギン酸のカルボン酸のプロトンが色素に付加していたものが、Pg型において脱離していることを反映ししていると示唆された。さらに、中間体のFTIR解析も行っており、AnPixJの光変換過程を詳細に解析できている。他のシアノバクテリオクロムGAFドメインの横断的解析好熱性シアノバクテリアに存在する新規シアノバクテリオクロムTlr1999について分光特性を解析したところ、青/緑色光変換型であったが、通常の緑色光吸収型よりも短波長シフトしていた。さらに、青/緑色光変換型GAFドメインにおいては、高度に保存された第二のCys残基が過渡的に色素に共有結合することで青色光吸収型ができると考えられている。Tlr1999においてJAAというCysをブロックする試薬を加えることで、確かに青色光吸収型ができず、その代わりに長波長吸収型が生成されたことから、やはり第二のCys残基が過渡的に共有結合することで短波長吸収のあ青色光吸収型が形成されることが強く示唆された。以上の解析から、シアノバクテリオクロムの光受容機構について、システインの色素への脱着やプロトンの色素への脱着が重要な役割を果たしていることが示唆された。
セメント質の発生制御機構に基づいた歯周組織再生医療の開発

研究代表者はこれまでセメント質特異抗体の作製に成功してきたおり、そこで同抗体を指標にセメント質過形成モデルの作製を試みた。ウシ歯胚より歯根部分を取り出し移植実験を行った結果、移植片ではセメント質が移植前と比較して約20倍以上肥厚することが観察された。肥厚したセメント質内では多数のセメント細胞が存在し、これらはセメント質特異抗体に陽性なセメント細胞であることが確認された。この結果は、ウシ歯小嚢細胞中に存在するセメント芽細胞芽細胞前駆体が、移植実験によりこれらの細胞は活性化され象牙質上にセメント芽細胞に分化し大量のセメント質を形成した事を示唆している。そこで研究代表者の齋藤はウシ歯小嚢細胞よりセメント芽細胞前駆体下部あるDNA libraryの作製を試みた。その結果平均インサート1.5kbp、1x10^6独立クローンを有するcDNA libraryの作製に成功した。現在は抗セメント質抗体を用いてCSFsをスクリーニングしている。ヒトゲノムデータベースが公表されて以来、海外および国内でヒトおよびマウスの各種臓器で発現する遺伝子がゲノムワイドに解析されている。一方、遺伝子の網羅的解析により従来困難であった組織の遺伝子発現プロファイリングの解析も可能になりつつある。その中で研究代表者は腱および軟骨に発現している腱特異的新規細胞外マトリックス(ECM)因子に着目し、これが歯根膜発生に関与するかを検索した。免疫染色で解析した結果、腱特異的新規ECM因子は歯根膜細胞の走行に対して垂直に走行するオキシタラン繊維オキシタラン繊維を構成する新規細胞外マトリックスであることが判明した。次に腱特異的新規ECM因子発現細胞を調べる目的で、マウス歯小嚢細胞を分離培養し解析したところ、同細胞を長期間培養することにより腱特異的新規ECM因子陽性の微小繊維様構造物を形成することが確認された。そこで同細胞を免疫不全マウスへの移植実験を行ったところ、移植後一ヶ月で腱特異的新規ECM因子陽性の微小繊繊維を形成することが確認され、このような特徴的な染色像はNIH3T3やC2C12などのマウス由来細胞株では形成されなかった。以上の結果より、腱特異的新規ECM因子は歯小嚢細胞から分泌される新規細胞外マトリックスで、歯根膜形成過程でオキシタラン線維を構成することが判明した。本研究はセメント質マーカー分子(Cementum Specific Factors:CSFs)を同定し、これらの遺伝子を指標に歯周組織中に存在する組織型幹細胞および前駆体細胞を同定する事にある。平成15年度はCSFs同定のため、研究代表者の齋藤らが開発したセメント質過形成モデルより遺伝子ライブラリー作製を行った。セメント質過形成モデルとは、歯根形成期ウシ歯胚の歯小嚢が付着している歯根部分を免疫不全症マウスに移植してセメント質を肥厚させる動物実験モデルである。混合歯列期ウシ歯胚より歯根部分を取り出し移植実験を行い、2ヶ月後に移植片のセメント質形成能を組織学的に評価した。

その結果、移植片ではセメント質が移植前と比較して約20倍以上肥厚することが観察された。肥厚したセメント質内では多数のセメント細胞が存在し、これらは研究代表者の齋藤らが作製したセメント質特異抗体(3G9)に陽性なセメント細胞であることが確認された。また移植片内のセメント芽細胞およびセメント細胞はウシ特異的ビメンチン抗体に陽性反応を示す事から、肥厚したセメント質はウシ由来である事も確認した。この結果は、ウシ歯小嚢細胞中に存在するセメント芽細胞芽細胞前駆体が、移植実験によりこれらの細胞は活性化され象牙質上にセメント芽細胞に分化し大量のセメント質を形成した事を示唆している。そこで研究代表者の齋藤はウシ歯小嚢細胞よりセメント芽細胞前駆体下部あるDNA libraryの作製を試みた。その結果平均インサート1.5kbp、1x10^6独立クローンを有するcDNA libraryの作製に成功した。この結果を基に次年度はCFSのスクリーニングを行う予定である。昨年度までウシセメント質ライブラリーを作製し、抗セメント質抗体である3G9を用いてセメント質マーカー分子の同定を試みてきた。一方、ヒトゲノムデータベースが公表されて以来、海外および国内でヒトおよびマウスの各種臓器で発現する遺伝子がゲノムワイドに解析され、毛や歯などの特殊な臓器で発現する遺伝子群に関しても明らかにされつつある。中でもERATO関口細胞外環境プロジェクトでは、理化学研究所で作製されたマウス完全長cDNAデータベースより新規細胞外マトリックスを選択的に探索したところ、胎児期の歯胚で特異的に発現する分子群を同定した。そこで研究代表者はこれらの分子をさらに詳細にスクリーニングしたところA Disintegrin And Metaroproteases thrombospondin motif like : ADAMTSLfamilyに属するADAMTSL4が歯小嚢で特異的に発現することを見出した。そこで発生期歯胚におけるADAMSTSL4の発現パターニングを抗ADAMTSL4ポリクロナール抗体を用いて解析したところ、同分子は鐘状期歯胚の歯小嚢で発現し、その後歯根形成の過程に沿って発現が強まることが確認された。そして生後一ヶ月以降のマウス歯根の非脱灰凍結切片を用いて成熟した歯根膜での発現を免疫染色で確認したところ、ADAMTSL4は歯根膜細胞の走行に対して垂直に走行する微小繊維構造を呈することが判明した。これらの結果よりADAMTSL4は歯根膜中に特異的に存在する微小繊維であるオキシタラン繊維である可能性が考えられたので、同繊維を選択的に染色するフクシン染色にて対比染色を行った。その結果、フクシン染色と抗ADAMTSL4ポリクローナル抗体を用いた免疫染色の分布が完全に一致することが判明した。これらの結果より、ADAMTSL4は歯根膜中のオキシタラン繊維を構成する新規細胞外マトリックスであることが判明した。次にADAMTSL4発現細胞を調べる目的で、マウス歯小嚢細胞を分離培養し解析したところ、同細胞を長期間培養することによりADAMTSL4陽性の微小繊維様構造物を形成することが確認された。そこで同細胞を免疫不全マウスへの移植実験実験を行ったところ、移植後一ヶ月でADAMTSL4陽性の微小繊繊維を形成することが確認され、このような特徴的な染色像はNIH3T3やC2C12などのマウス由来細胞株では形成されなかった。
アジア高山域の氷河上雪氷微生物群集の季節変化とその環境要因

アジア内陸部天山山脈のウルムチNo.1氷河の雪氷微生物の調査を行った.その結果,氷河表面には3種のシアノバクテリア,2種の緑藻の繁殖が明らかになった.上流部で採取したサンプル分析の結果,春から夏の融解期に緑藻が繁殖し,さらに融解が激しい年にはシアノバクテリアが繁殖することが明らかになった.この季節変化の要因は主に融解量で,大気降下物として供給される窒素も関与している可能性があることが示唆された.アジア内陸部天山山脈のウルムチNo.1氷河の雪氷微生物の調査を行った.その結果,氷河表面には3種のシアノバクテリア,2種の緑藻の繁殖が明らかになった.上流部で採取したサンプル分析の結果,春から夏の融解期に緑藻が繁殖し,さらに融解が激しい年にはシアノバクテリアが繁殖することが明らかになった.この季節変化の要因は主に融解量で,大気降下物として供給される窒素も関与している可能性があることが示唆された.本年度は,調査対象氷河での予備調査を中心におこなった.本研究の対象氷河は中国新彊ウイグル自治区のウルムチNo.1氷河である.この氷河を選定した理由は,もっともアクセスがいい中国の氷河のひとつであり,古くから氷河変動のモニタリングが行われているためである.まず,調査を前に中国側の共同研究者と研究計画の打ち合わせを行った.氷河に関する過去のデータを提供してもらい,氷河の物理,化学環境の整理を行った.また,昨年度までに採取された氷河上の積雪サンプルを中国側から提供してもらい,積雪中の微生物の試験的な分析を行った.提供された積雪サンプルの分析の結果,光合成微生物シアノバクテリアが含まれていることが明らかになった.7月から8月にかけて,ウルムチNo.1氷河にて実際に予備的な調査をおこなった.調査は,氷河表面の積雪または氷のサンプリングを行うとともに,融解水のpH,電気伝導度などの水質測定や携帯型分光放射計をつかった表面の反射スペクトルの測定等をおこなった.調査で得られたサンプルは,冷凍のままもしくは薬品にて固定したのち,日本へ輸送し,顕微鏡による微生物の同定,定量のほかに,クロロフィル測定装置による色素の定量,微生物同定のためのDNAシークエンスの分析,有機物の炭素,窒素安定同位体比測定等をおこなった.調査の結果,この氷河表面には主に3種のシアノバクテリアが存在し,そのバイオマスは他の氷河に比べ,極めて大きいことが明らかになった.また衛星画像をつかった雪氷藻類の分析方法の開発もおこない,赤い色素をもつ雪氷藻類に関しては定量できることが明らかになった今年度は,二回にわたる氷河の調査およびサンプルの分析を行った.調査は前年度に対象氷河として選定した中国新疆ウイグル自治区のウルムチNo.1氷河である.調査は,2008/6/27,2008/7/29-8/6の二回行った.微生物分析のための氷河表面の高度別のサンプリング,および表面のスペクトルアルベドの測定を行った.さらに融解期の氷河表面の形態,アルベドの時間変化を明らかにするために,自動気象測器,自動デジタルカメラを設置した.氷河表面のサンプルの顕微鏡分析の結果,昨年同様,シアノバクテリアおよび緑藻が繁殖していることが確認できた.また,今年度のサンプルには昨年にはみられなかった緑藻の1種(シリンドロシスティス属)が大量に含まれていた.このことは,年によって繁殖する藻類の群集構造が大きく変わることを示している.全体の藻類バイオマス,クロロフィルについては,ほぼ昨年と同様の値であった.また,6月から7月にかけての季節変化は,氷河上流部でバイオマス,クロロフィルともに上昇することが明らかになった.氷河上に設置した自動観測機の結果から,融解期の氷河表面はアルベド,表面構造の変化が激しいことが明らかになった.このような変化は,表面の微生物相にも大きく影響していると考えられる.今後,これらのサンプルやデータの分析をすすめ,季節変化の環境要因を整理していく予定である.今年度は,ネパールヒマラヤ氷河の微生物群集の調査,および富山県立山の残雪上の微生物調査をおこない,またこれまでに得られてサンプルの分析をすすめた.昨年度まで2年間に渡って調査を行った中国のウルムチN0.1氷河については,今年度も調査を予定していたが,新彊ウイグル自治区の政情不安のために今年度は調査をみあわせた.ヒマラヤの調査はその代わりに行ったものである.ヒマラヤのランラン地域のヤラ氷河の調査の結果,この氷河は過去11年間で末端位置が約200m後退していることが明らかになった.ヤラ氷河表面の微生物の分析の結果, 9種の雪氷藻類が確認された.ヤラ氷河の90年代の調査結果と比較した所,雪氷藻類の分布に変化があることが明らかになり,これは近年十数年の氷河変動が,微生物群集に影響を与えていることが新たに示唆された.一方,富山県立山での残雪上の微生物調査の結果,藻類の繁殖は融解の激しく日射も強い初夏に最大になるわけではなく,春から夏まで単調に増加し, 8月から9月の新雪の降る直前に最大になることが明らかになった.

この季節変化の要因は,日射や融解などの条件では単純に説明できなく,いまのところはっきりしたことはわからない.黄砂や降雨で供給される栄養塩などが関係しているのかもしれないが,今後これらの化学的な分析を行う必要がある.以上,本研究による中国,ヒマラヤの氷河,及び立山の残雪の調査によって,それぞれの雪氷微生物群集の季節変化が定量的に明らかになった.さらに,氷河上の微生物群集は,年によって群集構造が変化すること,過去数十年で氷河変動の影響により変化している可能性があることがわかった.微生物群集の季節変化の環境要因は,融雪や栄養塩供給が関わっている可能性が考えられたが,今後化学的な分析などをさらに行いながら明らかにする必要がある.
アストロサイトの多様性の分子基盤解明

Intersectional法を用い、アストロサイトの誕生する神経上皮の部位とアストロサイトの最終的に分布する脳部位との対応地図を作成した。背側前脳のアストロサイトはEmx1発現領域から、線条体のアストロサイトはGsh2発現領域から、視床のアストロサイトはOlig3発現領域から、視床下部のアストロサイトはNkx2.1発現領域から、小脳・中脳のアストロサイトはEn1発現領域から、脊髄のアストロサイトはHoxb8発現領域から、産生されることを明らかにした。また、アストロサイトが脳部位により異なる機能を持つことを明らかにしたA.アストロサイトの誕生する神経上皮の部位・マーカー遺伝子・アストロサイトの最終的に分布する脳部位との対応地図の作成申請者は既に、3種類のcreマウスとfloxed-GLT1マウスを交配し、GLT1の免疫染色を行うことにより、大脳皮質、間脳・脳幹、小脳のアストロサイトの誕生部位とマーカー遺伝子を同定している。平成26年度は、線条体・視床下部・延髄のアストロサイトの誕生部位とマーカー遺伝子を同定するため、Emx2-Cre, Gsh2-Cre, Nkx2.1-Cre,En1-Creとfloxed-GLT1マウスを交配し、GLT1の免疫染色を行った。線条体の背側部のアストロサイトはGsh2発現神経幹細胞マウス由来であること、視床下部の一部のアストロサイトはNkx2.1発現神経幹細胞由来であること、延髄・小脳のアストロサイトはEn1発現神経幹細胞由来である事を明らかにした。B.大脳皮質・線条体・小脳・延髄・視床下部のアストロサイトの発現遺伝子プロファイリング特定の脳部位のアストロサイトをセルソーターで単離するため、脳部位特異的にアストロサイトに蛍光蛋白質GFPを発現させる新規アストロサイトレポーターマウスを作成する。平成26年度は、β-actin遺伝子のpolyAシグナルの下流にtetO-DIO-GFP(tetOプロモーターの下流に蛍光蛋白質GFP cDNAを逆向きに挿入したベクター。cDNAの両端にはloxP, lox2722サイトがあり、Creにより正常な向きになる)をノックインしたマウス(βactin: tetO-DIO-GFP)を、改良型ゲノム編集技術(CRISPR/Cas9)を用いて作成した。A.アストロサイトの誕生する神経上皮の部位・マーカー遺伝子・アストロサイトの最終的に分布する脳部位との対応地図の作成平成26年度で同定した大脳皮質・視床・視床下部・中脳/小脳のアストロサイトをマーキングできるCreマウス(Emx1-Cre, Olig3-Cre, Nkx2.1-Cre, En1-Creマウス)を、βactin: tetO-DIO-GFPマウス、Mlc1-tTAマウス(アストロサイト特異的にtTAを発現しているマウス)と交配した。交配したマウスは、当初の目的通り、大脳皮質・視床・視床下部・中脳/小脳のアストロサイト特異的にGFPを発現していることを蛍光顕微鏡で確認した。B.大脳皮質・線条体・小脳・延髄・視床下部のアストロサイトの発現遺伝子プロファイリングTRAP (translating ribosome affinity purification)法を用いて、培養やセルソーターを用いずに、脳をホモゲナイズするだけで特定部位のアストロサイトからのみmRNAを精製するためのβactin: tetO-DIO-GFP-L10マウス(tetOプロモーター下流に蛍光タンパク質GFPとリボゾームタンパク質L10を融合したキメラcDNAを逆向きに挿入したベクター。cDNAの両端にはloxP, lox2722サイトがあり、Creにより正常向きになる)をCRISPR/Casシステムを用い作成した。目的のマウスを作成することができたが、GFP-L10の発現量が少なく、当初の目的に使用できないことがわかった。現在、βactin以外の遺伝子座にtetO-DIO-GFP-L10をノックインしたマウスを作成中である。当初予定した、大脳皮質・視床・視床下部・中脳/小脳のアストロサイト特異的にGFPを発現しているマウスの作成に成功した。A.アストロサイトの誕生する神経上皮の部位・マーカー遺伝子・アストロサイトの最終的に分布する脳部位との対応地図の作成いままでの研究でカバーできていない脳部位である線条体のアストロサイトをマーキングできるCreマウスの作成を行った。Gsh2遺伝子座にCreをノックインしたマウスをCRISPR/Casシステムを用い作成した。作成したマウスは、現在βactin: tetO-DIO-GFPマウス、Mlc1-tTAマウス(アストロサイト特異的にtTAを発現しているマウス)と交配中である。。B.大脳皮質・線条体・小脳・延髄・視床下部のアストロサイトの発現遺伝子プロファイリングTRAP (translating ribosome affinity purification)法を用いて、培養やセルソーターを用いずに、脳をホモゲナイズするだけで特定部位のアストロサイトからのみmRNAを精製するためのROSA: tetO-DIO-GFP-L10マウス(tetOプロモーター下流に蛍光タンパク質GFPとリボゾームタンパク質L10を融合したキメラcDNAを逆向きに挿入したベクター。目的のマウスを作成することができ、現在、Emx1-Cre・Nkx2.1-CreマウスおよびMlc1-tTAマウスと交配中である。背側前脳のアストロサイトはEmx

1発現領域から、線条体のアストロサイトはGsh2発現領域から、視床のアストロサイトはOlig3発現領域から、視床下部のアストロサイトはNkx2.1発現領域から、小脳・中脳のアストロサイトはEn1発現領域から、脊髄のアストロサイトはHoxb8発現領域から、産生されることを明らかにした。また、アストロサイトが脳部位により異なる機能を持つことを明らかにした当初予定した、線条体・視床下部・延髄の一部のアストロサイトの誕生する神経上皮のマーカー遺伝子を同定することができた。また、CRISPR/Cas9システムを改良し、長い外来遺伝子を約50%の高効率で標的部位にノックインする方法を確立し、目的のレポーターマウスの作製を完了した。特定の脳部位のアストロサイト特異的にGFP-L10を十分量発現させることのできるレポーターマウスを作成する。そのために、挿入するβactin遺伝子座の位置や遺伝子座そのものを変更して、新しいノックインマウスをCRISPR/Casシステムを用い作成する。28年度が最終年度であるため、記入しない。分子神経科学培養やセルソーターを経ずに、脳をホモゲナイズするだけで特定の脳部位のアストロサイトからのみmRNAを精製するため、新規アストロサイトレポーターマウスを作成する。具体的にはβ-actin遺伝子のpolyAシグナルの下流にtetO-DIO-GFP-L10をノックインしたマウス(βactin: tetO-DIO-GFP-L10)を、改良型CRISPR/Cas9を用いて作成する。大脳皮質・線条体・小脳・延髄・視床下部のアストロサイトにCreを発現しているマウスとMlc1-tTAマウス(アストロサイト特異的にtTAを発現しているマウス)およびβactin: tetO-DIO-GFP-L10マウスを交配し、TRAP(translating ribosome affinity purification)法で、特定の脳部位のアストロサイトのリボゾームに結合しているRNAを精製する。DNAチップを用い、発現遺伝子のプロファイリングを行い、各脳部位特異的に発現している遺伝子群を同定する。
BRAG2-Arf6シグナル経路による新たなシナプス可塑性制御機構の解明

本研究では、酵母ツーハイブリッドスクリーニングで新たにBRAG2と結合することが判明したPSD-95とendophilin 3に着目し、BRAG2のPSDでの局在制御機構を解明すると共に、BRAG2-Arf6シグナル経路を介した興奮性シナプスのシナプス可塑性の一つである長期抑圧(LTD)におけるAMPA型グルタミン酸受容体の輸送調節機構を解剖学および生化学的手法やライブセルイメージング手法を用いて解明することを目的として研究を遂行している。これまでの解析から、BRAG2とPSD-95の培養海馬神経細胞での強制発現解析によってPSDにおけるBRAG2のC末端領域とPSD-95のPDZドメインとの相互作用による局在制御機構を明らかにすると共に、BRAG2のプロリンリッチ領域とendophilin 3のSH3が相互作用に重要であることを明らかにした。また、培養海馬神経細胞を用いてmGluR刺激によるシナプス可塑性(LTD)誘導時のBRAG2ノックダウン法によるAMPA受容体のシナプス表面発現量変化の解析を行い、BRAG2がノックダウンされているとmGluR刺激によって誘導されるAMPA受容体のシナプス表面発現量の減少が抑制され、BRAG2のshRNA耐性ミュータントによる機能回復実験も成功した。さらに、培養神経細胞での解析からmGluR刺激によるシナプス可塑性(LTD)誘導時にBRAG2とendophilin 3との結合量が増加すること、それに伴ってArf6の活性化が上昇することを明らかにした。これらのことから興奮性シナプス後部においてBRAG2がendophilin3との相互作用を介してシナプス可塑性を調節することが示唆された。2018年度以降は、2017年度から継続している解析と新たにシナプス可塑性誘導に伴った活性化Arf6の量的な変化とBRAG2とendophilin3との相互作用の変化の解析を行う研究計画で解析を進めてきたところ、予定通りの進捗で結果が得られている。具体的には、培養海馬神経細胞を用いてmGluR刺激によるシナプス可塑性(LTD)誘導時のBRAG2ノックダウン法によるAMPA受容体のシナプス表面発現量変化の解析を行い、BRAG2がノックダウンされているとmGluR刺激によって誘導されるAMPA受容体のシナプス表面発現量の減少が抑制され、BRAG2のshRNA耐性ミュータントによる機能回復実験やendophilin3およびPSD-95との相互作用部位を欠損させたミュータントによる実験でBRAG2とendophilin3との相互作用のAMPA受容体の表面発現量調節における重要性を明らかにした。さらに、培養海馬神経細胞を用いてmGluR刺激によるシナプス可塑性(LTD)誘導時にBRAG2とendophilin 3との結合量が増加すること、それに伴ってArf6の活性化が上昇することを明らかにした。これらの結果から、ほぼ研究計画の予定通りに研究が進んでいる。2018年度までの解析結果を踏まえ、研究計画に沿って以下の解析を進める予定である。海馬培養神経細胞のDHPG処理によるシナプス可塑性誘導時にBRAG2分子がスパイン内部もしくは樹状突起内部においてダイナミックに移動しているかどうかを検証するためにEGFP標識したBRAG2もしくはPSD-95を発現させた海馬培養神経細胞のライブセルイメージングを行う。ライブセルイメージングでは倒立型共焦点レーザー顕微鏡のステージに温度、酸素および二酸化炭素濃度を一定に保つ培養装置を装着させてイメージングを行い、DHPG添加によってLTDを誘導した後に経時的にイメージングを行う。LTDの誘導に伴ってBRAG2およびPSD-95のスパインおよび樹状突起内部での蛍光強度の変化を定量するとともにmCherryで細胞全体を可視化させておいてスパインの大きさや形の動態も観察する予定である。これらの解析からBRAG2-Arf6シグナル経路の分子ネットワークの変化とスパインの動態を同時に観察することでBRAG2-Arf6シグナル経路のシナプス可塑性発現時の機能的役割の一端を解明できると考えている。記憶や学習の基盤と考えられているシナプス可塑性は、興奮性シナプス後部のAMPA受容体の表面発現量によって制御されている。近年、シナプス可塑性の1つである長期抑圧時のAMPA受容体のエンドサイトーシスが、小胞輸送に関与するArf6の活性制御因子であるBRAG2によって調節されることが報告された。しかしながら、どのような分子ネットワーク機構を介してBRAG2が興奮性シナプスの機能調節や高次脳機能に関与するのかは不明な点が多い。そこで本研究課題では、酵母ツーハイブリッド解析によってBRAG2と相互作用することが明らかとなったPSD-95とendophilin 3に着目し、BRAG2のPSD局在制御機構を解明すると共に、BRAG2-Arf6シグナル経路を介した興奮性シナプスの長期抑圧におけるAMPA型グルタミン酸受容体の輸送調節機構を解剖学および生化学的手法やライブセルイメージング手法を用いて解明することを目的として研究を行っている。これまでの解析から、PSD-95結合領域欠損ミュータントのBRAG2とPSD-95の培養海馬神経細胞での強制発現解析によってPSDにおけるBRAG2の局在制御機構を明らかにすることができた。また、酵母ツーハイブリッド法によるBRAG2とendophilin 3の相互作用責任領域の解析を行い、BRAG2のプロリンリッチ領域とendophilin 3のSH3が相互作用に重要であることを明らかにした。さらに、培養海馬神経細胞を用いてmGluR

刺激によるシナプス可塑性(LTD)誘導時のBRAG2ノックダウン法によるAMPA受容体のシナプス表面発現量変化の解析を行い、BRAG2がノックダウンされているとmGluR刺激によって誘導されるAMPA受容体のシナプス表面発現量の減少が抑制されることを明らかにした。平成29年度は3つの解析を行う研究計画で、予定通りの進捗で結果が得られている。具体的には、PSD-95結合領域欠損ミュータントのBRAG2とPSD-95の培養海馬神経細胞での強制発現解析によってPSDにおけるBRAG2の局在制御機構を明らかにすることができた。また、酵母ツーハイブリッド法によるBRAG2とendophilin 3の相互作用責任領域の解析を行い、BRAG2のプロリンリッチ領域とendophilin 3のSH3が相互作用に重要であることを明らかにした。さらに、培養海馬神経細胞を用いてmGluR刺激によるシナプス可塑性(LTD)誘導時のBRAG2ノックダウン法によるAMPA受容体のシナプス表面発現量変化の解析を行い、BRAG2がノックダウンされているとmGluR刺激によって誘導されるAMPA受容体のシナプス表面発現量の減少が抑制されることを明らかにした。これらの結果から、ほぼ研究計画の予定通りに研究が進んでいる。本研究では、酵母ツーハイブリッドスクリーニングで新たにBRAG2と結合することが判明したPSD-95とendophilin 3に着目し、BRAG2のPSDでの局在制御機構を解明すると共に、BRAG2-Arf6シグナル経路を介した興奮性シナプスのシナプス可塑性の一つである長期抑圧(LTD)におけるAMPA型グルタミン酸受容体の輸送調節機構を解剖学および生化学的手法やライブセルイメージング手法を用いて解明することを目的として研究を遂行している。これまでの解析から、BRAG2とPSD-95の培養海馬神経細胞での強制発現解析によってPSDにおけるBRAG2のC末端領域とPSD-95のPDZドメインとの相互作用による局在制御機構を明らかにすると共に、BRAG2のプロリンリッチ領域とendophilin 3のSH3が相互作用に重要であることを明らかにした。また、培養海馬神経細胞を用いてmGluR刺激によるシナプス可塑性(LTD)誘導時のBRAG2ノックダウン法によるAMPA受容体のシナプス表面発現量変化の解析を行い、BRAG2がノックダウンされているとmGluR刺激によって誘導されるAMPA受容体のシナプス表面発現量の減少が抑制され、BRAG2のshRNA耐性ミュータントによる機能回復実験も成功した。さらに、培養神経細胞での解析からmGluR刺激によるシナプス可塑性(LTD)誘導時にBRAG2とendophilin 3との結合量が増加すること、それに伴ってArf6の活性化が上昇することを明らかにした。これらのことから興奮性シナプス後部においてBRAG2がendophilin3との相互作用を介してシナプス可塑性を調節することが示唆された。
臨床ビッグデータを活用した新規抗てんかん作用の解明

現代においてもてんかんは、患者の約20%は複数の抗てんかん薬を服用しても治療コントロールが困難な難治性てんかんであり、新規抗てんかん薬の開発が望まれている。しかし、「難治性てんかん」の病態メカニズムおよび確実な治療法は未だ明らかにされておらず、基礎研究および臨床研究を取り入れた科学的根拠に基づく薬物治療法を確立することが喫緊の課題である。本研究では、データーベース解析から見いだされた、ドラッグリポジショニングによる新規抗てんかん薬の候補薬剤を主に動物実験による基礎実験で評価し、新規抗てんかん薬の開発および難治性てんかんの病態を解明する。データーベース解析により見いだされた、新規抗てんかん薬候補をてんかんの実験モデル動物を作成し、そのモデル動物に投与し、候補薬物の抗てんかん作用の検討を昨年度より引き続き行っている。抗てんかん作用を評価するため、既存薬の抗てんかん薬も投与しながら比較検討を行っている。数種類の抗てんかん薬と併用実験を行った結果、特定の抗てんかん薬との併用により用量依存性の抗てんかん作用が確認され、抗てんかん作用の相加作用がみとめられた。次に候補薬の抗てんかん作用を別の観点で評価を行うため、てんかんモデルを用いて単剤投与または抗てんかん薬の併用投与を行い、脳波を指標として抗てんかん作用を評価した。脳波の評価も行うことで抗てんかん作用として考えられる作用機序が検討できうると考えられる。今後は、てんかんモデル動物のてんかんによって生ずる症状について、行動薬理学的に解析を行い、抗てんかん作用の特徴を明らかにしていく予定である。また、作用機序を明らかにするため、てんかんモデルに対する免疫染色などの検討を現在実施中である。データベース解析より見いだされた抗てんかん薬候補薬の抗てんかん作用を評価するため、既存薬の抗てんかん薬と併用投与しながら効果の比較検討を行い、現在組織学的な検討を行いながら作用機序について検討中である。従って、当初の計画通りおおむね順調に進展している状況となっている。今後は、てんかんモデル動物のてんかん誘発性の症状について、行動薬理学的に解析を行い、抗てんかん作用の特徴を明らかにしていく予定である。また、慢性投与を行うことで、実臨床における実用性に関して、てんかんモデルを用いて検討を行っていく予定である。てんかんは、未だに患者の約20%は複数の抗てんかん薬を服用しても治療コントロールが困難な難治性てんかんであり、新規抗てんかん薬の開発が望まれている。しかし、「難治性てんかん」の病態メカニズムおよび確実な治療法は未だ明らかにされておらず、基礎研究および臨床研究を駆使して科学的根拠に基づく適正な薬物治療法を確立することが喫緊の課題である。本研究では、データーベース解析から見いだされた、ドラッグリポジショニングによる新規抗てんかん薬の候補薬剤をin vivoyやin vitroの基礎実験で評価し、新規抗てんかん薬の開発および難治性てんかんの病態を解明する。現在、データーベース解析より見いだされた、新規抗てんかん薬候補をてんかんの実験モデル動物を作成し、そのモデル動物に投与し、候補薬物の抗てんかん作用の検討を行っている。その結果、用量依存性の抗てんかん作用が確認され、特定の既存薬と併用することで、抗てんかん作用の相加作用がみとめられた。次に候補薬の抗てんかん作用を別の観点で評価を行うため、てんかんモデルを用いて単独投与または抗てんかん薬の併用投与を行い、抗てんかん作用の一つである「抗けいれん作用」の評価を脳波を測定し検討を行う。また、作用機序を明らかにするため、てんかんモデルに対する免疫染色などの検討を行っていく予定である。現在、データベース解析より見いだされた抗てんかん薬候補薬の抗てんかん作用を評価するため、既存薬の抗てんかん薬も投与しながら比較検討を行っている。その結果、用量依存性の抗てんかん作用が確認され、特定の既存薬と併用することで、抗てんかん作用の相加作用がみとめられ、抗てんかん作用の評価は計画通り実施されている。

脳波の評価も行うことで抗てんかん作用として考えられる作用機序が検討できうると考えられる。今後は、てんかんモデル動物のてんかんによって生ずる症状について、行動薬理学的に解析を行い、抗てんかん作用の特徴を明らかにしていく予定である。また、作用機序を明らかにするため、てんかんモデルに対する免疫染色などの検討を現在実施中である。データベース解析より見いだされた抗てんかん薬候補薬の抗てんかん作用を評価するため、既存薬の抗てんかん薬と併用投与しながら効果の比較検討を行い、現在組織学的な検討を行いながら作用機序について検討中である。従って、当初の計画通りおおむね順調に進展している状況となっている。今後は、てんかんモデル動物のてんかん誘発性の症状について、行動薬理学的に解析を行い、抗てんかん作用の特徴を明らかにしていく予定である。また、作用機序を明らかにするため、てんかんモデルに対する免疫染色などの検討を行っていく予定である。また、慢性投与を行うことで、実臨床における実用性に関して、てんかんモデルを用いて検討を行っていく予定である。計画当初は脳波測定機器を初年度に購入予定であったが、予備検討に時間を要したため機器の購入に関しては次年度以降に行う計画になり、次年度使用額が生じた。昨年度までに組織学的検討に必要な試薬等をすべて購入予定であったが、予備検討の結果、予定していたよりも一部の購入だけにとどまったため。次年度に残りの必要試薬等を購入する予定である。
放射線による転移抑制機構の分子基盤の確立

腫瘍には、様々なジェネティック・エピジェネティックな異常、すなわち、個性が存在し、結果として、放射線に対する感受性・抵抗性に違いが出てくると考えられる。しかしながら、放射線感受性・抵抗性におけるエピジェネティックな側面からの研究はほとんどなされていない。そこで、本研究では、放射線によるエピジェネティックな転写制御の分子基盤を確立することを目的とし、放射線に応答する転移関連遺伝子・小胞体ストレス関連遺伝子の発現制御機構について検討した。そこで、本研究では、放射線によるエピジェネティックな転写制御の分子基盤を確立することを目的とし、放射線に応答する転移関連遺伝子群の発現を制御するエピジェネティックなメカニズムを明らかにする。マウス扁平上皮がん細胞、肺がん由来の細胞にガンマ線2Gy, 15Gyを照射した。転移関連遺伝子Twist, Snail-1, Snail-2,および、MMP2, MMP9の発現をqRT-PCRにて検討した結果、Twist, Snail-1, MMP2, MMP9ではガンマ線照射1日後にその発現が非照射と比較して減少した。さらに、近年、小胞体ストレスが転移に関与することが報告されつつある。そこで、小胞体ストレスにおいてタンパク質分解に機能するシノビオリンの発現を検討した結果、放射線照射によりシノビオリンの発現が抑制されることが明らかとなった。次に、ガンマ線によるエピジェネティックな制御を明らかとすることを目的とし、ガンマ線照射後のヒストン修飾の変化をWestern blottingにより検討した。その結果、ガンマ線照射1日後において、転写活性化に関わるヒストンH3のアセチル化、ヒストンH3 Lys4ジメチル化が減少する傾向が認められた。以上の結果より、ガンマ線照射によりヒストン修飾が変化することが明らかとなり、ガンマ線照射がエピジェネティックな制御機構を介して遺伝子発現に関わる可能性が考えられた。これまで、放射線感受性・抵抗性に関与するSNPなどの遺伝子多型、ゲノムのコピー数異常など、ジェネティックな側面に関して多くの研究がなされてきている。マウス扁平上皮がん細胞のNR-S1による肺転移モデルを用いた。マウス下肢にNR-S1を移植して1週間後(約7mm腫瘍)、ガンマ線15Gyを局所腫瘍に照射した。照射1時間後と1日後に局所腫瘍からRNAとタンパク質を回収し、腫瘍の転移に関連することが報告されている遺伝子Twist, Snail-1, Snail-2,および、腫瘍が転移するときに基底膜を破壊する働きを有するMMP2, MMP9の発現をqRT-PCRにて検討した。その結果、Twist, Snail-1, MMP2, MMP9ではガンマ線照射1日後にその発現が非照射と比較して減少した。一方で、Snail-2の発現は照射の有無により影響されなかった。以上のことより、ガンマ線により転移関連遺伝子の発現が抑制されることが明らかとなった。Preliminaryな結果ではあるが、ガンマ線照射1日後においてヒストンH3の修飾が変化する可能性が示唆されている。。研究計画に記載がある1年目の転移関連遺伝子の発現解析をおこない、Twist, Snail-1, MMP2, MMP9遺伝子がガンマ線照射により変化することを明らかとした。また、放射線照射によりヒストンH3の修飾に変化が認められた。したがって、一年目の計画はおおむね順調に進んでいると考えられる。放射線照射は細胞にストレスを与えることが考えられるが、近年、このストレス応答遺伝子が転移に関与していることが明らかにされつつある。そこで、転移関連遺伝子のみならず、ストレス応答遺伝子にも着目し、その発現解析も行う。放射線照射によるエピジェネティックな変化を同定するとともに、発現解析より得られた結果をもとに、上記遺伝子のプロモーターに着目し、放射線照射による遺伝子発現制御機構の詳細な分子基盤について解析を行う。放射線特異的ヒストン修飾の探索を行う。in vivo肺転移モデルマウスを用いて、放射線を照射後、腫瘍サンプルを回収する。転移における放射線照射特異的なヒストン修飾の変化を種々のヒストン修飾特異的な抗体を用いたWestern blottingにて検出する。同様に、培養細胞を用いてヒストン修飾の変化を探索する。本実験にて、マウスの維持、培養細胞の維持、細胞からRNA、タンパク質、DNA回収に関わる試薬、および、抗体を購入する。

ヒストンの多様な修飾は遺伝子発現の活性化・抑制化に関与することが報告されている。そこで、放射線照射による転移関連遺伝子の発現制御にヒストン修飾の変化が関与しているかどうかを明らかとするため、これら遺伝子のプロモーターにおけるヒストン修飾を検出する。in vivoマウス肺転移モデル、および、in vitroの培養細胞を用いて行う。本実験にて、オリゴDNA, PCR酵素、クロマチン免疫沈降キットなど分子生物学的、生化学的実験に関する試薬を購入する。
Ca^<2+>/カルモデュリン依存性プロテインキナーゼIIの分子的多様性の解析

Ca^<2+>/カルモデュリン依存性プロテインキナーゼII(キナーゼII)の分子的多様性を解析するために、ノーザンブロットでキナーゼIIの転写産物を検索したところ、キナーゼIIαのcDNAの3'末端側プローブにのみ反応し、5'末端側プローブには反応しないmRNAが、ラット骨格筋に検出された。この結果は、キナーゼIIαのN末端側のキナーゼドメインを持たないが、C末端側と同じ配列を持つ新規タンパク質が骨格筋に存在する事を、示唆していた。ラットの骨格筋から抽出したmRNAを試料に用いて、cDNAライブラリーを作製し、キナーゼIIαのcDNAの3'末端側をプローブとしてスクリーニングした。得られた陽性クローンの塩基配列を解析した。このcDNAクローンは、200アミノ酸残基からなる分子量22、583のタンパク質(αKAP)をコードしており、αCaMキナーゼIIのC末端側の配列315478に対応し、キナーゼドメインは無かった。N末端の25アミノ酸残基は、αCaMKキナーゼIIには含まれない非常に疎水性の高い領域であった。従って、新規タンパク質αKAPは、膜タンパク質、或は、分泌タンパク質であること強く示唆していた。キナーゼIIαのC末端のアミノ酸配列のペプチドを合成し、この合成ペプチドに対する抗体を作製した。得られた抗体を用いて、細胞分画法により、αKAPのラット骨格筋における細胞内局在を調べると、核画分及び膜画分に検出され、細胞質画分には検出されなかった。また、大腸菌で組換えタンパク質としてαKAPを発現させ、この組変えタンパク質と骨格筋中のαKAPを、ウエスタンブロットで比較したところ、同一の分子量であった。これらの結果から、αKAPは、N末端に疎水性部位を有する膜タンパク質であると推定された。αKAPの組織分布を、ノーザンブロットにより解析したところ、主に骨格筋、心筋に発現が検出された。従って、αKAPは筋収縮などの筋肉の生理機能に関与している可能性が考えられる。
血小板凝集機能及び好中球貧食能に与える麻酔薬の影響

全ての麻酔薬は血液中に一定の濃度で溶解しこれが中枢神経系に到達することでその作用を発揮する。その過程において麻酔薬と直接接触する血液成分に与える影響についての報告はほとんどない。血小板は凝集物質により活性化されるとdense tubularsystemより細胞質内へカルシウムイオンが遊離されこれが収縮蛋白に働き、形態変化、凝集反応となって現れると考えられている。また好中球を細菌由来のフォルミル化ペプチドにより刺激すると小包体より細胞質内へカルシウムイオンが遊離されることよりその貧食能の発現にカルシウムイオンが大きく関わっていると考えられている。従ってカルシウムイオンを指標とすることにより従来の方法に比べはるかに正確に血小板凝集能及び好中球貧食能を測定することができる。そこで著者が既に確立したシナプトゾームのカルシウムイオン濃度の変化を測定するシステムを用い、麻酔薬がこれらの血液成分の機能に与える影響を調べ、麻酔薬の作用機序の解明の一助にしたいと考え本研究を行なったものである。まず、血小板内カルシウムイオン濃度の測定では、安静時及び凝集時の濃度変化は安定して測定できる系が出来上り、現在、各種麻酔薬、各種血管拡張薬お影響を測定しつつあり、データもいくつか得られておりまもなく報告できると考えている。また好中球内カルシウムイオン濃度の測定では、刺激剤としてのフォルミル化ペプチドの種類を変え、貧食能を惹起する適正濃度を求めているところで未だカルシウムイオン濃度を求めるに至ってはいないが、早急に実験系が確立するよう努力する所存である。
モノカルチャー化進行地域の生活レジリエンス向上を実現する土地利用に関する研究

アカシア林業へのモノカルチャー化が急激に進行しているベトナム中部山岳地域の少数民族農村において現地調査を行い,ミクロな視点の地域情報を用いて各世帯における救荒植物(災害時や困窮時の食糧備蓄となる有用植物)の実態把握および栽培実態の分析を行った。対象地では特に,ホームガーデンを中心に救荒食となるような作物が備蓄されており,特に近年は世帯によって栽培作物の構成にも変化がみられることが明らかになった。聞き取り調査および現地踏査によって収集した,各ホームガーデンにおける救荒作物の種類と株数,栽培環境,入手方法,利用方法,栽培主の情報はとりまとめ,インベントリを作成した。このインベントリの情報を用いて傾向分析を行っており,中でも世帯のアカシア林業への依存度とホームガーデンにおける作物栽培の傾向を分析した結果は,各種研究会や学会にて報告している。また,栽培世帯の特徴を明らかにする研究として,森林資源の利用状況をまとめた成果は原著論文として発表した。現在は救荒作物が栽培されているホームガーデン/世帯の特徴を明らかにすべく分析を試みている。本研究では,救荒植物や作物を取り巻く環境を人間活動も含めて総合的に考慮し,生態条件と社会条件を合わせた学際的な視点から議論することが一つの課題であったが,作物の生態情報や生育状況の調査に加え,各世帯の現在営んでいる生業や過去に営んでいた生業,森林資源の利用状況,世帯間の関係性など,作物栽培の選択要因に間接的に影響を及ぼす情報に至るまで丁寧な聞き取り調査によって情報収集することに成功した。本研究で明らかになった「救荒植物を保持した土地利用」が成立するための人間活動も含めた環境条件をもとに,それらを住民が持続的に利用できる自然共生型土地利用モデルを構築・提案することが今後の課題である。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
分子識別能を有するインテリジェント錯体

1.糖質は蛋白質や脂質と並んで生体内における基幹物質の一つであり、近年では、生体内における活性中心での糖質の存在が確認され、特に分子識別を司る糖タンパク、抗生物質、制ガン剤などにおいて糖質の役割が注目されている。従って、糖質と金属イオンとの相互作用を検討することは重要な研究課題である。本研究では、配糖錯体の配位環境の制御により、分子識別及び基質特異的化学変換を促進する酵素モデルと成り得るような新しい反応場を構築することを目的としている。2.アミンとして分枝状のテトラミンであるトリス(2-アミノエチル)アミン;trenを用いることにより糖部分を強制的に接近させてCage Complexのように金属まわりを取り囲んだCo(II)の配糖錯体の分子設計を目指して、コバルト配糖錯体の合成を行い、それらの立体構造をX線結晶構造解析により解明した3.糖部分として中心金属から糖のピラノース環が遠ざかるように配向するD-glucose(D-Glc)の場合は2つのCo原子間を空気中から取り込まれた酸素分子が架橋したμ-ペルオキソコバルト(III)複核配糖錯体:μ-O_2-[((D-Glc)_2-tren)CoO_2Co((D-Glc)_2-tren)]Cl_3・4H_2O・3CH_3OHが生成することが判明した。この錯体はコバルト2価から3価への合成中間体とみなされるものである。糖質の選択により酸素分子の接近の制御しうることを見いだした本研究はインテリジェント錯体の設計にとって有用な情報を与えるものである。
細胞特異的遺伝子導入を用いた癌の標的化

【目的】モノクローナル抗体を用いた細胞選択的遺伝子導入による癌の標的化を行う目的で、まず既知の膜抗原に対するモノクローナル抗体を作成し、これを用いた遺伝子導入を試みる。ついで、モノクローナル抗体からペプチドを用いた遺伝子導入の展開を図る。さらに、モノクローナル抗体を用いた遺伝子導入を一般化する目的で、未知膜抗原に対するモノクローナル抗体を作成と、これを用いた遺伝子導入を行う。【結果】1.既知膜抗原としてレセプター型チロシンキナーゼRETに対するモノクローナル抗体(以下NB-1)を作成し、遺伝子導入を行った。その結果、RETを発現する神経芽腫細胞や造血幹細胞に対する遺伝子導入が可能になった。2.モノクローナル抗体からペプチドへの遺伝子導入法の展開.リコンビナントRET蛋白質に結合するペプチドをランダムペプチドライブラリーからスクリーニングし、8個のアミノ酸からなるRET結合ペプチド(RBP-1;RET binding peptide)を同定した。そして、これを用いて神経芽腫細胞に対する遺伝子導入を行った。3.肝臓転移大腸癌に対する標的治療を可能にすると考えられるモノクローナル抗体の作成.大腸癌細胞に反応し、肝臓癌細胞には反応性を示さない抗体(LIC;Large intestinal carcinoma)を得た。さらに、LICを用いた大腸癌細胞への遺伝子導入を行った。【考察】今回の研究から、既知膜抗原に対するモノクローナル抗体を用いた細胞選択的遺伝子導入の可能性が明らかにされるとともに、未知膜抗原に対するベクター抗体の作成が可能であることが示された。さらにベクター機能を抗体からペプチドへ展開することにより、より簡便で安全な癌の標的化が可能になると考えられた。今後、LIC抗体の認識膜抗原を同定し、そのリコンビナント蛋白質に結合するペプチドを用いた遺伝子導入と癌細胞の標的化の可能性について明らかにすることが肝要と思われる。