hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肝幹細胞由来の癌の血管新生および腫瘍間質に関する画像解析

(1)細胆管癌は、画像上肝細胞癌と胆管細胞癌の両者を併せ持つ所見を呈した。(2)低分化肝細胞癌と胆管細胞癌は類似性が多いがEOB-MRIのdynamic late phaseで胆管細胞癌の線維性部分が濃染し、鑑別に有用であった。(3)脂肪化は高分化肝細胞癌のみならず低分化肝細胞癌にも高頻度に認められ、それは動脈血流の多寡との関連性が示唆された。研究初年度に当たる本年度は、主として学会参加による情報収集と、肝腫瘤症例のデータベース化を行った。研究代表者(浅山)は、4月に日本医学放射線学会総会に参加し、肝細胞癌の胆汁産生能とMRI所見に関する発表(Eur J Radiol.2010 Nov 23.に掲載済)を行う傍ら、最新のMRI造影剤(Gd-EOB-DTPA、以下EOB)に関する知見を得た。5月には日本肝癌研究会に参加し細胆管癌や混合型肝癌等、肝幹細胞由来の可能性のある癌の病理学的、分子生物学的な研究の進歩について情報を収集した。研究分担者にあっては石神康生が米国RSNAに、中山智博が日本磁気共鳴医学会に出席し、肝腫瘍の画像、特にMRI画像についての情報を収集した。肝腫瘍の画像に関しては、代表者および研究分担者(西江)が、すべての肝腫瘤のMRI画像所見をreviewするため、.2008年以降に肝MRI画像を撮像した911例の症例をデータベース化した。さらにこの911例のMRI所見についてvascularityの評価や造影剤取り込み能に関して詳細に検討した。この中には種々の肝腫瘤が含まれており、肝幹細胞由来の腫瘍のコントロールとして貴重なデータを収集できたと考えている。とくEOBは、細胞の機能の評価が可能であり、各症例における肝細胞機能評価を行うことができた。病理学的には2008年以降に生検および外科的切除を施行した肝腫瘤症例全230例余についてデータベースを作成した。各症例の診断そのものは完了しているが、個々の症例で肝幹細胞由来の癌の成分の有無を改めてreviewし、該当症例を抽出している。これは研究代表者が病理学教室と連携して現在も進行中である。研究2年目に当たる本年度は、学会参加による情報収集ならびに肝腫瘤症例の所見の拾い上げを行った。研究代表者(浅山)は、4月に日本医学放射線学会総会、6月に日本医学放射線学会九州地方会、11月に北米放射線学会、3月に欧州放射線学会に参加し、肝細胞癌をはじめとする肝腫瘤の画像診断の最新の動向を調査した。また5月には日本肝癌研究会に参加し細胆管癌や混合型肝癌等、肝幹細胞由来の可能性のある癌の病理学的、分子生物学的な研究の進歩について情報を収集した。肝腫瘍の画像に関しては、昨年度に代表者および研究分担者(西江・高山)がデータベース化した肝MRI施行911症例をもとに、低分化肝細胞癌と肝内胆管癌の症例を抽出し(西江、石神、柿原、牛島、高山)、画像解析を行った。これらの腫瘍は画像所見、とくにvascularityや悪性度からは類似するところが多く、由来細胞としては非常にimmatureな細胞、すなわち本研究のテーマの幹細胞由来の癌の可能性がある。具体的には両者とも動脈性栄養血管が比較的乏しく、MRI動脈相では鑑別困難な症例が存在することが判明した。拡散強調像でも両者は鑑別困難であった。肝細胞特異性造影剤であるGd-EOB-DTPAを用いた検討では造影180秒後のdynamic late phaseで腫瘍間質(線維化)を捉えることで、両者を鑑別できる可能性があることが示された。また、従来高分化肝細胞癌で頻度が最も高いとされていた腫瘍内脂肪化が、低分化肝細胞癌においても高頻度に認められることが明らかになり、そのメカニズムについて今後の検討課題と思われた。これらの腫瘍の類似点・相違点を画像所見から明らかにすることができると思われる。この結果は論文作成を終え、近日中に投稿予定である。学会発表も2013年4月の放射線学会総会にて行う予定である。研究2年目に当たる本年度は、学会参加による情報収集ならびに研究成果の発表を行った。研究代表者(浅山)は、4月に日本医学放射線学会総会(発表)、6月に日本インターベンショナルラジオロジー学会総会(参加、情報収集)、6月に医学放射線学会九州地方会(参加・情報収集)、11月に北米放射線学会(発表)、2013年1月に医学放射線学会九州地方会に参加した。

これらの腫瘍は画像所見、とくにvascularityや悪性度からは類似するところが多く、由来細胞としては非常にimmatureな細胞、すなわち本研究のテーマの幹細胞由来の癌の可能性がある。具体的には両者とも動脈性栄養血管が比較的乏しく、MRI動脈相では鑑別困難な症例が存在することが判明した。拡散強調像でも両者は鑑別困難であった。肝細胞特異性造影剤であるGd-EOB-DTPAを用いた検討では造影180秒後のdynamic late phaseで腫瘍間質(線維化)を捉えることで、両者を鑑別できる可能性があることが示された。医学放射線学会総会に発表した。現在論文投稿中である。また、従来高分化肝細胞癌で頻度が最も高いとされていた腫瘍内脂肪化が、低分化肝細胞癌においても高頻度に認められた、腫瘍栄養血管数を病理プレパラート上でカウントしたところ、高分化肝細胞癌同様、低分化肝細胞癌でも腫瘍栄養血管の減少が認められ、脂肪化の原因であることを示した。北米放射線学会に発表し、論文執筆中である。各種肝腫瘍の画像解析が順調が進んでいる点は順調である。病理学的解析がやや遅れている。24年度が最終年度であるため、記入しない。悪性度の高い未分化な腫瘍、混合型肝癌や細胆管癌などの幹細胞由来の可能性がある腫瘍を中心に、個々の画像解析を引き続き進めていく。病理解析は病理学教室の協力も得て引き続き継続する。
ヌタウナギの体液ホメオスタシス：体液調節能力はどこから来たか？

昨年度確立した飼育実験系を用い、ヌタウナギを異なる塩分環境に移行するin vivo実験を行った。qPCR解析により、Na+-Cl--K+共輸送体や、水チャネルのアクアポリンといった既知体液調節関連分子が鰓と腎臓に発現することを確認した。このことは「順応型」のヌタウナギが、「調節型」生物と類似の物質輸送系を持つことを示唆する。さらに、後葉ホルモン受容体を2種類同定した。顎口類では7種類、同じ円口類のヤツメウナギでも5種類の受容体が同定されている。ヌタウナギが複数の受容体を持つことは、後葉ホルモン系の分子・機能的多様化の第一段階が、ヌタウナギの分岐以前に完了したことを示唆する。また、後葉ホルモン系が鰓と腎臓を制御するしくみは、「調節型」のしくみに先んじて確立されたと考えられる。交付申請当初は、qPCRに続いてこれら機能分子の組織内局在を調べることを予定していた。しかし本年度の予算状況を鑑みて、RNA-Seqによる網羅的な遺伝子発現変動解析(DE解析)を優先すべきと判断した。DE解析では、鰓・腎臓のいずれにおいても、塩分環境移行に伴うNaCl輸送能の変動は確認できなかった。また、硬骨魚真骨類とは異なり、体液調節における鰓の役割が限定的であることが示唆された。一方で、腎臓が外環境塩分変化に応じてアミノ酸輸送と酸塩基調節を行うことを見出した。ヌタウナギはアミノ酸を細胞内に蓄積して浸透圧調節に用いることが報告されている。このため筋肉でもDE解析を行ったところ、腎臓と連動するアミノ酸輸送系を見出した。本研究結果から、ヌタウナギの適応戦略においては、アミノ酸を用いた細胞単位での体液調節が重要であり、腎臓がこれを補助する可能性が示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、脊椎動物の体液調節能力の進化的起源を解明することを目指し、現生脊椎動物で最も早く分岐した円口類ヌタウナギの体液調節能力を検証している。硬骨魚真骨類では鰓や腎臓が体液調節に働き、これら器官は内分泌系に支配されている。ヌタウナギも鰓や腎臓を持つが、無脊椎動物と同じ体液順応型である。ヌタウナギの鰓や腎臓の機能、特に体液調節への関与と、これら器官を制御する内分泌系の存在について、in vivo飼育実験と大規模遺伝子発現解析を組み合わせて検証する。29年度はヌタウナギ飼育環境の整備と標的組織におけるRNA-Seqを実施した。1.隠岐から輸送した11匹のヌタウナギを7ヶ月間にわたり長期飼育することに成功した。期間中に一部個体が産卵し、飼育環境が良好であることが示唆された。この成果により、30年度に計画している塩分環境移行実験が予定通り実現可能な見通しとなった。2.脳下垂体、鰓、腎臓を含む6組織についてRNA-Seqを実施し、網羅的な遺伝子発現プロファイルを得た。国立遺伝学研究所スーパーコンピューターシステムとラップトップPCを用いた一連のデータ解析作業フローを確立した。トランスクリプトームのde novoアセンブリとアノテーションを行い、得られたアセンブルデータをレファレンスとして、リードマッピングと各転写産物の定量を完了した。これらの結果をもとに、30年度個別解析対象遺伝子(各組織で発現する主要なイオンチャネルや各種輸送体、ホルモン分子とその受容体)の選定を進めている。当初予定の通り、ヌタウナギの飼育実験系を立ち上げ、7ヶ月間にわたって安定的に飼育することが出来た。30年度に実施する塩分環境移行実験では、輸送後の馴致期間も含めて最長3ヶ月程度を見込んでおり、今回確立した飼育系で十分実行可能と考えられる。ヌタウナギが容易に入手できる島根県の地の利に加え、研究室内で生体を維持する環境が整ったことは、本研究のみならず、申請者が今後ヌタウナギ研究を推進していく上で礎となる重要な成果である。RNA-Seqについて、当初は島根大学共通機器のIllumina MiSeqを使用する予定だったが、求めるデータ量と品質、ならびに費用を考慮した結果、Illumina NovaSeq 6000によるRNA-Seqを外注した(費目は「その他」として計上)。これにより費用が大幅に抑えられたため、当初予定していた脳下垂体、鰓、腎臓に加え、脳、肝臓、筋肉についてもRNA-Seqを実施した。脳は脊椎動物の内分泌系における最上位器官であり、肝臓と筋肉はアミノ酸など窒素化合物の代謝に関与する。先行研究では、ヌタウナギの細胞内液に窒素化合物が多く含まれ、浸透圧調節物質として機能することが示唆されている。脳、肝臓、筋肉を解析対象に含めることで、ヌタウナギの体液調節機構をより総合的に検証することができる。各組織のトランスクリプトームから個別解析対象遺伝子を抽出する作業は現在進行中だが、近日中に完了予定である。

ヌタウナギが複数の受容体を持つことは、後葉ホルモン系の分子・機能的多様化の第一段階が、ヌタウナギの分岐以前に完了したことを示唆する。また、後葉ホルモン系が鰓と腎臓を制御するしくみは、「調節型」のしくみに先んじて確立されたと考えられる。交付申請当初は、qPCRに続いてこれら機能分子の組織内局在を調べることを予定していた。しかし本年度の予算状況を鑑みて、RNA-Seqによる網羅的な遺伝子発現変動解析(DE解析)を優先すべきと判断した。DE解析では、鰓・腎臓のいずれにおいても、塩分環境移行に伴うNaCl輸送能の変動は確認できなかった。また、硬骨魚真骨類とは異なり、体液調節における鰓の役割が限定的であることが示唆された。一方で、腎臓が外環境塩分変化に応じてアミノ酸輸送と酸塩基調節を行うことを見出した。ヌタウナギはアミノ酸を細胞内に蓄積して浸透圧調節に用いることが報告されている。このため筋肉でもDE解析を行ったところ、腎臓と連動するアミノ酸輸送系を見出した。本研究結果から、ヌタウナギの適応戦略においては、アミノ酸を用いた細胞単位での体液調節が重要であり、腎臓がこれを補助する可能性が示唆された。当初の計画にしたがって研究を進める。下記2および4では脳下垂体、鰓、腎臓を優先するが、RNA-Seqデータ解析の結果と進捗状況によっては、脳、肝臓、筋肉での解析も行う。1.各組織のトランスクリプトームから個別解析対象遺伝子を選定する。2. 1で選定した個別解析対象遺伝子について、各組織における局在をin situ hybridizationで確認する。3.ヌタウナギを低/高塩分環境に移行し、血液パラメータを測定して体液調節能力を評価する。4. 1で選定した個別解析対象遺伝子について、上記塩分環境移行実験に伴う発現変動をqRT-PCRで解析する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
脂質ラフトの裏側を見る

形質膜上のスフィンゴ脂質とコレステロールに富んだ脂質ドメインである脂質ラフトは、様々な生理機能に重要な役割を果たしていると考えられるが、その微細構造は良くわかっていない。我々は脂質ラフトに結合する新奇プローブタンパク質を開発するとともに、脂質ラフトの分布、動態を測定することにより、脂質セカンドメッセンジャーであるジアシルグリセロールの膜を横切る運動がスフィンゴミエリンによって制御されていること、また腺維芽細胞ではスフィンゴミエリンに富んだ脂質ドメインが形質膜脂質二重層の内層にも外層にも存在することを明らかにした。腺維芽細胞と上皮細胞の比較から、脂質セカンドメッセンジャーであるジアシルグリセロールの形質膜での膜を横切る運動(フリップフロップ)はスフィンゴミエリンによって制御されていることが明らかになった。この結果は形質膜外層にジアシルグリセロールのプールが存在すること、スフィンゴミエリンの分解に伴い脂質ラフトの裏側へのジアシルグリセロールの移行が起こり、ラフトでの情報伝達に関与していることを示唆している。SDS-フリーズフラクチャーレプリカ法(SDS-FRL)は脂質二重層の外層と内層の脂質分布を解析できる数少ない方法の一つである。この方法では試料を液体窒素や液体エタンで急速凍結した後、脂質二重層を疎水性部分で割断する。試料は脂質の炭化水素部分を介してグリッドのプラチナ・カーボンに物理的に固定される。SDSによって非特異的にグリッドに吸着した残渣を除くことにより脂質二重層の内層、あるいは外層を露出した試料の調製が可能である。われわれはSDS-FRLと種々の脂質特異的タンパク質あるいはペプチドを併用して形質膜の内層と外層での脂質分布を詳細に解析した。その結果、核を持たない赤血球や血小板ではスフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンは形質膜の外層のみに存在し、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン/ホスファチジルイノシトールは内層に局在するのに対して、腺維芽細胞や好中球では形質膜内層にもスフィンゴミエリンのドメインが存在することが明らかになった。また脂質ラフトのひとつであるカベオレの外層にはスフィンゴミエリンのクラスターが存在し、内層のカベオレ周辺部にはホスファチジルエタノールアミンとホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸が存在するが、ホスファチジルセリン/ホスファチジルイノシトールは存在しないことが示唆された。平成24年度は新奇の脂質ラフト結合タンパク質、主としてスフィンゴ脂質・コレステロールの複合体を認識するタンパク質の発見と、得られたタンパク質の脂質プローブとしての開発に焦点を絞った。これまで食用キノコ抽出液からスフィンゴ脂質結合タンパク質が報告されていることから、食用キノコとしてエリンギ、マイタケ、ブナシメジを選び、調製した抽出液から脂質結合タンパク質のスクリーニングを行った。スクリーニングは目的とする脂質を用いて人工膜を調製し、抽出液から膜に結合する水溶性のタンパク質を遠心分離によって沈降させ、質量分析によってアミノ酸の部分配列を決定した後、配列情報をもとに目的のタンパクをクローニングし、大腸菌に組み換えタンパクを発現させ、精製した組み換えタンパクの脂質結合活性を確認する、という方法によって行った。その結果、糖脂質であるガングリオシドGM1およびGM1とコレステロールの複合体に結合するタンパク質が得られたが、これらのタンパク質に相当する組み換えタンパクには脂質結合の特異性を示さなかった。一方マイタケおよびエリンギからはスフィンゴミエリンとコレステロールの複合体に結合するタンパク質が得られた。マイタケ由来のタンパクは報告されているタンパクと一次構造の相同性のない新奇タンパク質で、組み換えタンパクを結晶解析した結果、このタンパク質の立体構造はスフィンゴミエリンと結合することが報告されているイソギンチャク毒素、スチコライシンに類似しているが、スチコライシンの毒性に関与するN末近傍の構造だけが大きく異なっていることが明らかになった。またエリンギ由来のタンパク質はスフィンゴミエリンとの結合が報告されているヒラタケ由来のプロロトリシンAと非常に類似していた。どちらのタンパク質にも細胞毒性はなく、GFPを結合したキメラタンパク質もキノコ由来タンパクと同様の脂質結合性を示した。平成24年度の最大の目的は新奇の脂質ラフト結合タンパクの取得にあった。この点で2つの新奇脂質ラフトプローブの開発に成功したことは初年度の研究目的を十分に達成できたと評価できる。一方でGM1結合タンパク質は同定にまでこぎつけながら組み換えタンパクに脂質結合活性の特異性は見られなかった。この点については次年度の検討事項である。平成25年度は24年度に得られた知見をもとに、ラフトへの局在とタンパク質の機能との関係を探る。ラフトタンパク質としてrasを取り上げ、活性型と不活性型の変異株での脂質ラフトへの局在を測定するとともに生理的条件下でのrasの動態の変化を高解像度で追跡する。

このためには共焦点顕微鏡での観察に加え、PALM (Photoactivation localization microscopy)等の超高解像光学顕微鏡や脂質二重層の内外層の脂質を解析できる電子顕微鏡手法であるSDS-FRLを導入する。またイノシトールリン酸に結合するPHドメインやホスファチジルエタノールアミンに結合するデュラマイシンを用い、PALMとSDS-FRLを併用して脂質ラフトの裏側の脂質の分布状態を明らかにする。平成24年度は主としてキノコ由来タンパク質のスクリーニングに集中したため比較的予算の消費を少なく抑えることができた。平成25度には得られたプローブを使用して本格的な解析を始めるため、細胞培養、さまざまな組み換えタンパク質の調製、生化学解析、顕微鏡サンプルの作成、抗体との二重標識等に多額の費用がかかり、これに平成24年度の残額と平成25年度の予算を充てる。
原価改善と全社的利益管理の結合に関する研究

本研究では、ヒアリング調査と文献研究を通じ、トヨタ自動車や日本電気といった日本企業における全社的利益管理システムと原価改善活動との関わりを明らかにした。すなわち、原価低減活動を徹底させるために、予算管理システムと結び付け、全社的な日的と整合するような仕組みが設けられたのである。本研究は「原価改善と利益管理」と「日本電気における原価低減と利益管理」という2度の学会報告と、「日本電気における設備投資プロセスの研究」という研究論文という形で成果を公表している。本研究の目的は、全社的な利益管理と、それぞれの製造現場で実施される原価管理との結びつきを検討するものである。平成20年度は、本研究の一部成果を「原価改善と利益管理」として日本会計研究学会第67回全国大会で報告した。本研究報告では、トヨタ自動車においては、1950年の経営危機の際に、経理部門が行なった経理規定の整備が製造部門をはじめ全社内に原価低減意識を植え付けたこと。他の要因とともにそれも一因となって、経理部門が伝統的な標準原価計算に基づく原価管理を実施するよりも前に、製造現場において原価改善のシステムが生み出されたこと。その結果、製造現場の管理は製造部門に委ねられ、経理部門と棲み分けられるようになったこと。そして、経理部門は原価改善に沿う形の利益管理システムを構築せざるを得なくなったことを明らかにした。すなわち、本研究報告は、管理会計システムを通じて、製造部門の現場組織の自律化が促された可能性があることを指摘した点において意義がある。しかしながら、全社的な予算管理システムと原価低減システムとの結びつきについては、まだ具体的な論及には至っておらず、これを明らかにすることが次年度における研究の課題となっている。本研究報告および次年度の研究のため、本年度は文献研究を中心に行ない、文献・資料については十分に収集した。だが、文献・資料から得られる情報やデータは限られている。そのため、次年度以降はヒアリング調査を中心に研究を進めていき、本研究の目的を遂行する予定である。平成21年度は、本研究の一部成果を「日本電気における原価低減と利益管理」として日本原価計算研究学会第35回全国大会で報告した。本研究報告では、日本電気の原価低減活動はZD運動に端を発することを明らかにした。そして、ZD運動を機に、従業員たちが改善提案をし、原価低減活動に取り組むようになったこと。ZD運動には改善効果を測定する手法がなく、限界があったものの、間もなくIE手法を取り入れ、一般VEへと進化したこと。そして、計画した改善効果額を実現させるため、一般VEから進化してプロジェクトVEが行なわれるようになり、さらに改善効果額の実現を徹底させるため、プロジェクトVEも利益管理システムと結びつけてコントロールが図られるようになったことをも示した。同社が原価低減活動に積極的に管理会計システムを活用したのは、製品の価格競争が激しい上に、原価低減の主たるドライバーが半導体の開発・設計段階にあったからだと考えられる。すなわち、半導体の開発・設計段階には時間を要するが、劇的に半導体の市場価格が低下していくため、数年後でも価格競争力のある製品を生み出すには、どのくらいの原価低減が必要で、どのように実現させるか、キチンと管理会計システムと結びつけて把握しなければならない。それ故、日本電気の原価低減活動は成り行きで行なうのではなく、管理会計システムと結びつけて、その徹底が図られてきたのである。すなわち、本研究報告は、原価低減活動と利益管理システムが結び付いていった過程を明らかにしたことにおいて意義がある。また、本研究報告で明らかになった設備投資と利益管理システムとの関係については、「日本電気における設備投資プロセスの研究」として論説にまとめた。本研究は交付申請段階における目的をある一定程度果たすものであったが、まだ日本電気一社の事例を明らかにしたに過ぎず、研究の余地が大いにある。従って、本研究の質と量を改善させるべく、本研究を継続する予定である。
低酸素細胞イメージングによる腫瘍内酸素化機構の解析

放射線治療後の再発腫瘍の多くは,放射線抵抗性の低酸素細胞の再増殖が主因と考えられている.本研究では,これまで行ってきた^<31>P-MRSやMRIによるperfusion imageにくわえて,低酸素細胞マーカーによる低酸素細胞イメージングを用いて腫瘍の酸素状態を定量し,生物学的に最適な放射線治療法について模索した.また腫瘍に特徴的な癌関連遺伝子の変異が,腫瘍の低酸素状態とどのように関係するのかを解明することを目的とした.特に低酸素環境下でのアポトーシスに関与するp53の変異が,腫瘍に起こる低酸素状態にどのように変化するかを検討した.治療前の腫瘍の低酸素状態を非侵襲的に定量化できれば,治療効果の予測や遠隔転移の確率を推測することが可能と考えられたため,実験腫瘍を用いて種々の低酸素評価法を試みた.電極を腫瘍内に挿入し直接酸素濃度を測定する方法や,31P-MRSなどの方法と比較して,低酸素細胞マーカーであるβ-D-IAZGPは,副作用も軽微で,腫瘍の大きさにかかわらず,その取り込みが評価可能であり,臨床上も有用性が高いと考えられた.子宮頸癌では,実際の腫瘍内の酸素分圧の低下が治療効果と相関することを明らかにした.また子宮頸癌組織内でのHIF-1の高発現が,予後不良因子であり,特に遠隔転移と有意に相関することを明らかにした.また,進行食道癌の化学放射線療法において,HIF-1とともにp53,p21,BAXなどのアポトーシス関連因子を解析した結果,初期治療効果ともっとも相関する因子はHIF-1であり,p53を介したアポトーシスを解析するよりも,低酸素を解析したほうが,治療効果を反映する可能性が示唆された.放射線治療後の再発腫瘍の多くは,放射線抵抗性の低酸素細胞の再増殖が主因と考えられている.本研究では,これまで行ってきた^<31>P-MRSやMRIによるperfusion imageにくわえて,低酸素細胞マーカーによる低酸素細胞イメージングを用いて腫瘍の酸素状態を定量し,生物学的に最適な放射線治療法について模索した.また腫瘍に特徴的な癌関連遺伝子の変異が,腫瘍の低酸素状態とどのように関係するのかを解明することを目的とした.特に低酸素環境下でのアポトーシスに関与するp53の変異が,腫瘍に起こる低酸素状態にどのように変化するかを検討した.治療前の腫瘍の低酸素状態を非侵襲的に定量化できれば,治療効果の予測や遠隔転移の確率を推測することが可能と考えられたため,実験腫瘍を用いて種々の低酸素評価法を試みた.電極を腫瘍内に挿入し直接酸素濃度を測定する方法や,31P-MRSなどの方法と比較して,低酸素細胞マーカーであるβ-D-IAZGPは,副作用も軽微で,腫瘍の大きさにかかわらず,その取り込みが評価可能であり,臨床上も有用性が高いと考えられた.子宮頸癌では,実際の腫瘍内の酸素分圧の低下が治療効果と相関することを明らかにした.また子宮頸癌組織内でのHIF-1の高発現が,予後不良因子であり,特に遠隔転移と有意に相関することを明らかにした.また,進行食道癌の化学放射線療法において,HIF-1とともにp53,p21,BAXなどのアポトーシス関連因子を解析した結果,初期治療効果ともっとも相関する因子はHIF-1であり,p53を介したアポトーシスを解析するよりも,低酸素を解析したほうが,治療効果を反映する可能性が示唆された.放射線照射効果に影響を与える腫瘍の低酸素状態の意義と治療効果への影響を明らかにすることを目的とした.特に,31P-MRSや低酸素紳胞マーカーなどにより測定される腫瘍の低酸素状態と,HIF-1など低酸素関連因子およびp53など腫瘍側のシグナル伝達系を解析する事を目的とした.まずマウス実験腫瘍を用いて,低酸素分画の定量化を種々の方法で試み,比較を行った.酸素濃度測定用電極や31P-MRSを用いた方法では測定できる腫瘍の大きさに限界があった.アイソトープ標識したβ-D-IAZGPの投与により低酸素細胞分画の評価を行った結果,24時間後に腫瘍に特異的な集積が静められ,腫瘍内の低酸素細胞マーカーの取り込みは血液の約8倍を示した.種々の大きさの腫瘍で,薬剤の取り込みについて見ると,大きな腫瘍は低酸素細胞マーカーの取り込みが有意に高く,有用性が高いと考えられた.低酸素と放射線治療効果については,まず子宮頸部扁平上皮癌の治療前生検組織を用いて,低酸素で誘導される腫瘍内HIF-1の発現を検討した.HIF-1発現の有無により5年非再発生存率に有意な差が帯められた.特に遠隔転移率において強い相関が認められ,HIF-1の発現が子宮頸癌の悪性度と相関すると考えられた.次に,食道癌の化学放射線療法におけるHIF-1,p53,p21の治療効果への影響を検討した.初期治療効果ともっとも良く相関した因子はHIF-1であり,HIF-1が高発現した腫瘍は有意に治療効果が不良であった.p53,p21の発現パターンによって初期効果に差が認められた.HIF-1,p53,p21の3者の陽性率をスコア化し,初期効果との関係を検討した結果,高スコア群(p53陰性,p21陽性,HIF-1陰性)群は,有意に初期効果が良好であり,約60%において腫瘍の消失が認められ有用な予後因子となると考えられた.放射線治療後の再発腫瘍の多くは,放射線抵抗性の低酸素細胞の再増殖が主因と考えられている.

本研究では,これまで行ってきた^<31>P-MRSやMRIによるperfusion imageにくわえて,低酸素細胞マーカーによる低酸素細胞イメージングを用いて腫瘍の酸素状態を定量し,生物学的に最適な放射線治療法について模索した.また腫瘍に特徴的な癌関連遺伝子の変異が,腫瘍の低酸素状態とどのように関係するのかを解明することを目的とした.特に低酸素環境下でのアポトーシスに関与するp53の変異が,腫瘍に起こる低酸素状態にどのように変化するかを検討した.治療前の腫瘍の低酸素状態を非侵襲的に定量化できれば,治療効果の予測や遠隔転移の確率を推測することが可能と考えられたため,実験腫瘍を用いて種々の低酸素評価法を試みた.電極を腫瘍内に挿入し直接酸素濃度を測定する方法や,31P-MRSなどの方法と比較して,低酸素細胞マーカーであるβ-D-IAZGPは,副作用も軽微で,腫瘍の大きさにかかわらず,その取り込みが評価可能であり,臨床上も有用性が高いと考えられた.子宮頸癌では,実際の腫瘍内の酸素分圧の低下が治療効果と相関することを明らかにした.また子宮頸癌組織内でのHIF-1の高発現が,予後不良因子であり,特に遠隔転移と有意に相関することを明らかにした.また,進行食道癌の化学放射線療法において,HIF-1とともにp53,p21,BAXなどのアポトーシス関連因子を解析した結果,初期治療効果ともっとも相関する因子はHIF-1であり,p53を介したアポトーシスを解析するよりも,低酸素を解析したほうが,治療効果を反映する可能性が示唆された.
感覚記憶内の時間圧縮に基づく聴覚情景地図の作成

ヒト脳には、聴覚環境の変化を自動的に検出するメカニズムが備わっている。その基盤にある感覚記憶(sensory memory)は一次聴覚野近傍に発生源を持つミスマッチ陰性電位(mismatch negativity、以下MMN)反応に反映される。研究代表者らの研究から、背景音を構成する種々の要素の膨大な情報が、時間統合(temporal integration)機構によって約160-170msの時間方向の神経表現として、感覚記憶に詳細に符号化されている事がわかってきた。ところで、感覚記憶に符号化された(神経的に表現された)聴覚情景(auditory scene)の中に流れる時間は、現実世界の時間の流れとは違っていると思われる。符号化された情報としての時間は現実世界の時間の規則に従う必要性が無いためである。これまでの研究では、複雑音で得られた磁気MMNの潜時に反映されるような前部と後部の欠落セグメント間の符号化された音情報の時間の長さは実時間に較べて短く、時間が脳皮質に神経的に表現された聴覚情景の中で圧縮されている可能性が示唆されている。本研究では、時間分解能の良い全頭型脳磁図(MEG)を使用して、神経的に表現された時間の様態を調べた。本年度は研究最終年度に当たるが、memory traceにおける聴覚情景の中の時間現象の一部の結果について論文、学会報告を行った。現在投稿中の論文を含めて、さらなる成果の公表も引き続き行っていく。これまでの研究では、複雑音で得られた磁気MMNの潜時に反映されるような前部と後部の欠落セグメント間の符号化された音情報の時間の長さは実時間に較べて短かく、時間が脳皮質に神経的に表現された聴覚情景の中で圧縮されている可能性が示唆されている。本研究では、時間分解能の良い全頭型脳磁図(MEG)を使用して、神経的に表現された時間の様態が、周波数を系統的に変えた場合、大脳皮質上にどのように展開するかを詳細に捉えて時間方向の聴覚情景地図を作成する。本年度は研究初年度に当たるが、現実世界での時間の流れと感覚記憶に維持された聴覚情景の中での時間の流れを、複雑音に組み込まれた欠落情報をプローブとして用いて比較する実験データの記録・収集を行っている。成果の公表は次年度以降に行う。その基盤にある感覚記憶(sensory memory)は一次聴覚野近傍に発生源を持っミスマッチ陰性電位(mismatch negativity、以下MMN)反応に反映される。本年度は研究2年目に当たるが、感覚記憶における聴覚情景の中の時間現象の一部の結果について学会報告を行ってきた(2nd SICPB2006(Shanghai),14thIPEG2006(Awaji)2006,第36回日本臨床神経生理学会学術大会シンポジウム(横浜,2006)。論文による成果の公表は最終年度以降に行う。

ところで、感覚記憶に符号化された(神経的に表現された)聴覚情景(auditory scene)の中に流れる時間は、現実世界の時間の流れとは違っていると思われる。符号化された情報としての時間は現実世界の時間の規則に従う必要性が無いためである。これまでの研究では、複雑音で得られた磁気MMNの潜時に反映されるような前部と後部の欠落セグメント間の符号化された音情報の時間の長さは実時間に較べて短く、時間が脳皮質に神経的に表現された聴覚情景の中で圧縮されている可能性が示唆されている。本研究では、時間分解能の良い全頭型脳磁図(MEG)を使用して、神経的に表現された時間の様態を調べた。本年度は研究最終年度に当たるが、memory traceにおける聴覚情景の中の時間現象の一部の結果について論文、学会報告を行った。現在投稿中の論文を含めて、さらなる成果の公表も引き続き行っていく。
標的遺伝子組み換えによる造血幹細胞の新しい受容体型癌遺伝子c-mplの解析

1.129系マウスgenomicライブラリーの200万ファージクローンをスクリーニングし、独立した8個のクローンを得た。8個のクローンは18kbの領域を包括していた。制限酵素地図作製およびDNA配列決定により、c-mpl染色体遺伝子は12個のエクソンから成り全長16kbの領域にまたがっていることが明らかとなった。翻訳開始点は第1エクソンに、1番目のCモチーフは第2エクソンと第3エクソンに、1番目のWSモチーフは第5エクソンに、2番目のCモチーフは第6エクソンと第7エクソンに、2番目のWSモチーフは第9エクソンに、膜貫通領域は第10エクソンに、細胞質内領域は第11エクソンと第12エクソンに、翻訳終止点とポリA添加シグナルは第12エクソンに存在した2.構築したコンストラクトは相同組み換え体の同定をサザン法にて行うものである。第6エクソンのBstEII切断点にPGK1-neo polyA遺伝子を挿入し,5'側に4.5kbおよび3'側に5kbの相同DNA領域をとり、ネガティブ選択マーカーとしてMC1-TK遺伝子を用いた。このコンストラクトでは、2番目のCモチーフの中にneo遺伝子が挿入されるのでc-mplのリガンド結合能と完全に失われると考えられた。3.まず、コンストラクトCにて762個のクローンをスクリーニングし1個の相同組み換え体を同定した。この細胞(W7)は、相同組み換えを起こしたDNAのシグナルがgermlineのシグナルよりも強かった。これは、一部の細胞でもう一方の染色体も相同組み換え体に置き換わったことを示唆している。W7をC57BL/6マウスの胚盤胞に注入しキメラマウスを作成した。11匹のマウスが得られたが2匹のみがキメラマウスで、いずれも雌でキメリズムは低かった。これらのキメラマウスをC57BL/6雄マウスと交配したがES細胞の性質を伝えた(agoutiの)仔マウスは得られなかった。
小児における唾液ペルオキシダーゼ活性と口腔内環境との関係

我々は、4歳から6歳までの男女約40名を対象に唾液採取と齲蝕活動性試験を行った。その結果に基づき統計処理を行ばい、唾液ペルオキシダーゼ活性と齲蝕との関係について研究し、興味ある知見を得た。。CSIの結果は、最低値0最高値75平均値14.51であった。唾液に含まれるチオシアン酸の濃度とpHを測定したところ、チオシアン酸の濃度はCSI=0の群では最低値7.07mM、最高値8.53mM、平均値8.02mM、CSI=+の群では最低値6.76mM、最高値8.55mM、平均値7.96mMであり、pHはCSI=0の群では最低値7.07、最高値8.53、平均値8.02、CSI=+の群では最低値6.76、最高値8.55、平均値7.96であった。このCSI=0とCSI=+の2群についてt検定を行ったところ、両者には有意差は見られなかった。pH8と6における唾液ペルオキシダーゼ活性とチオシアン酸濃度とCSIの3種に関してそれぞれの相関関係を求めた。すると唾液ペルオキシダーゼ活性とチオシアン酸について直線回帰分析を行ったところ、有意な正の相関が認められた。また唾液ペルオキシダーゼ活性とCSIにおいても有意な正の相関関係がある事がわかった。齲蝕活動性試験ではCSI=0とCSI=+との間で比較しt検定を行ったところ、Lactobacillusでのみ有意差を認めた。またDentcult【○!R】の判定と唾液ペルオキシダーゼの活性の間には、Lactobacillusでのみ有意な正の相関関係があった。小児において、唾液に含まれるペルオキシダーゼによる酸素発生が齲蝕とどのような関係にあるのかを調査するため、九州歯科大学小児歯科学診療室に来院した4歳から6歳までの小児を対象に、保護者の承諾を得てから、パラフィンを咀嚼させ、口腔内より唾液を採取した。採取された唾液をもちいて、唾液に含まれるチオシアン酸の濃度を分光光度計にて測定し、また唾液のpHを測定した。さらにその唾液をpH8とpH6の緩衝液で調整し、1mMの過酸化水素を加えて、pH8とpH6における酸素発生を酸素電極で測定した。また唾液採取と同時に、齲蝕活動性試験をデントカルト(dentcult buff,dentcultLB,SM,CA、Orion Corporation)を用いておこなった。これらはそれぞれ、唾液緩衝能、lactobacillus,Streptococcus MutansそしてCandidaを検出し、培養する事でカリエスリスクの判定を行なった。以上の事から得られた結果はまとめられ、次の結論を得た。2.CSIがプラスである唾液からは、LB,SMとも多く検出され、ハイリスクの傾向にある。3.唾液のpHは多くは中性付近であるが一部の唾液の中で酸性を示している唾液があり、これはチオシアン酸濃度も酸素発生も他の唾液と比較しても、極めて高値を示していた。現在、まだ測定された個体数が少ないため、今後、さらに測定数を増やし、統計的処理により以上のことが明らかにされる必要がある。。
金属と高分子材料の直接接合における新しい技術の開発

本研究では,アルミニウムの表面処理により,熱硬化性であるフェノール樹脂および熱可塑性であるポリフェニレンサルファイド樹脂とアルミニウムとの直接接合を行い,接合体における接合部の界面構造,接合強度と接合条件の関係を検討することで,高い接合強度,耐久性が得られる接合条件および接合メカニズムを明らかにした.本研究では,アルミニウムの表面処理により,熱硬化性であるフェノール樹脂および熱可塑性であるポリフェニレンサルファイド樹脂とアルミニウムとの直接接合を行い,接合体における接合部の界面構造,接合強度と接合条件の関係を検討することで,高い接合強度,耐久性が得られる接合条件および接合メカニズムを明らかにした.フェノール樹脂とアルミニウムとの接合特性に及ぼす表面処理剤および繰り返し熱負荷の影響にっいて検討し、その結果は次の通りである。(1).成形収縮率の異なる三種類のフェノール樹脂は熱膨張係数においてAとBがアルミに近く、直接接合が可能であるが,Cでは熱膨張係数がアルミの3倍となっているため、いずれの接合条件でも接合できなかった。(2).いずれの表面処理剤は金属表面およびフェノール樹脂との間に何らかの反応が生じるため、異相界面の接合に有効であり、接合強度が1.62.6倍向上させた。ただし、表面処理剤の種類によりその効果が異なる。(3).接合体に繰り返し熱負荷を与えると、アミノ系の表面処理剤は界面結合効果をさらに促進させ、接合強度が向上するが、エポキシ系の表面処理剤では熱により劣化され、界面結合効果を低下させるため、接合強度が大きく低下した。(4).本研究では表面処理により接合強度の上昇がそれほど大きくないが、電気自動車用バッデリの要求における気密試験では6MPa以上のせん断強度が有れば、問題がないので、接合強度を満足している。ただし、今後、繰り返し熱負荷を受ける場合は表面処理剤の接合特性と熱サイクルとの関係をさらに検討する必要がある。(5)インサート成形は、すべての樹脂において、接合が可能であり、また、残留応力が樹脂の熱膨張係数に強く依存することがわかった。前年度の試験結果を踏まえて、フェノール樹脂とアルミニウムとの接合特性に及ぼす繰り返し温度変化の影響について重点的に検討し、その結果は次の通りである。(1).せん断強度の高い三種類の表面処理剤を用いて作製したせん断試験用試験片に対して室温150°Cで100サイクルの熱負荷を加えると、表面処理剤の種類により、せん断接合強度がそれぞれ、低下(約54%)、ほぼ無変化、向上(23%以上)という全く異なる三つの変化傾向が生じることが分かった。これは繰り返し加熱により、アミノ系のような表面処理剤はさらに化学反応を起こし、界面結合効果を促進させ、接合強度が向上する場合、およびエポキシ系のような表面処理剤では高温により劣化が生じ、界面結合効果を低下させ、接合強度が低下する場合もある。つまり、表面処理剤の特性などは温度変化に強く依存することが考えられる。(2).インサート成形した試験片はアルミの表面をシランカップリング剤で処理すると,いずれの条件において接合強度が向上し、最大せん断強度が11.9MPaに達することもある。また、室温150°Cで繰り返し熱負荷を加えると、熱膨張係数の大きいフェノール樹脂Cの接合体は残留応力の変化幅が大きく、それに繰り返し熱負荷の増加につれて、残留応力が次第に減少する傾向が認められる。一方、熱膨張係数の小さいフェノール樹脂A,Bの接合体では、繰り返し熱負荷を加えても、残留応力の変化が小さく、ほぼ一定のレベルを維持している。つまり、接合体の残留応力が樹脂の熱膨張係数に左右されることが認められる。今年度は主に接合のメカニズムおよび耐久性に関わる疲労破壊特性を重点的に検討した。フェノール樹脂/アルミニウム接合体はホットプレスで成形し、PPS/アルミニウム接合体は射出成形で作製した。その結果は次の通りである。(1).表面処理によって,金属表面粗さが減少した。また、FT-IRの測定結果から、シランカップリング剤とアルミニウムはSi-O-AlもしくはSi-O-H-O-Siを形成して結合し、有機官能基が表面側に残っていることが示唆された。(2).未処理のアルミニウムでは接合することができなかったが、表面処理剤の種類によりフェノールと金属の接合強度が異なり、γ-GPSが14.2MPa、N-(β-AE)-γ-APSが12.5MPa、γ-McPSが10.5MPaの引張せん断強度を示した。(3).表面処理したいずれの接合体の破断面にもフェノール樹脂が付着していた。FT-IRの測定結果より、γ-GPS,N-(β-AE)-γ-APSはフェノール樹脂との化学結合、γ-McPSはCH_2基同士の絡み合いを形成している可能性が示唆された。(4).前処理を施したアルミニウムを3.5wt%濃度のヒドラジンー水和物水溶液に浸漬することにより、射出成形でもPPS/アルミニウム接合体が作製できることがわかった。また、アルミニウムの表面処理時間を長くした方が接合に有利で、例えば、2minで約15MPaのせん断強度が得られた。さらに、表面処理後のアルミニウム表面をSEMにより観察したところ、浸漬時間が長くなるにつれ表面に小さな孔が形成されていたことから,この孔中にPPS樹脂が侵入し,アンカー効果も起きたことが示唆された。(5).接合体のせん断疲労強度は基本的に表面処理方法および静的せん断強度に依存することがわかる。例えば、γ-GPSで処理したフェノール/アルミニウム接合体(せん断強度:約14.2MPa)は疲労負荷7MPaで10_7回に達しており、疲労破壊強度はせん断強度の約1/2である。
ファジイ理論を応用した教育評価システムの研究

近年,多種多様なメディアが開発されてはいるが,教育情報の評価はおもに人間がおこなうため,その判断基準は主観的になりやすい.このため,通常の教育評価には,少なからず「あいまいさ」が存在し,公正さを欠く場合も多い.本研究は,その一つの解決策として,ファジィ理論を応用した客観的な教育評価システムを構築することを目的としている.三年度目の本年度は,(1)ファジィ理論を応用した教育評価法を研究,実践すること,(2)教育情報分析システムを開発をすることなどに努めた.具体的には,教育情報の分析に応用されるファジィ推論法,教材/認知構造の分析に応用されるファジィグラフの近似表現法やクラスター分析法などを実践し,教育評価システムを構築するための方法について研究した.また,これらの理論や実践に関する論文を編集して,研究課題「ファジィ理論を応用した教育評価システムの研究」の報告書とした.近年,多種多様なメディアが開発されてはいるが,教育情報の評価はおもに人間がおこなうため,その判断基準は主観的になりやすい.このため,通常の教育評価には,少なからず「あいまいさ」が存在し,公正さを欠く場合も多い.本研究は,その一つの解決策として,ファジィ理論を応用した客観的な教育評価システムを構築することを目的としている.三年度目の本年度は,(1)ファジィ理論を応用した教育評価法を研究,実践すること,(2)教育情報分析システムを開発をすることなどに努めた.具体的には,教育情報の分析に応用されるファジィ推論法,教材/認知構造の分析に応用されるファジィグラフの近似表現法やクラスター分析法などを実践し,教育評価システムを構築するための方法について研究した.また,これらの理論や実践に関する論文を編集して,研究課題「ファジィ理論を応用した教育評価システムの研究」の報告書とした.近年,CAエシステムをはじめ種々のメディアが開発されてはいるが,教育情報の評価はおもに人間がおこなうため,その判断基準は主観的になりやすい.このため,通常の教育評価には,少なからず「あいまいさ」が存在し,公正さを欠く場合も多い.本研究は,その一つの解決策一として,ファジィ理論を応用した客観的な教育評価システムを開発することを目的としている.初年度の本年度は,ファジィ理論の基礎と応用の研究と,教育情報分析システムの設計をすることに努めた.具体的には,教育情報の分析に応用される近似推論法認知構造の分析に応用されるファジィグラフの近似表現法などを検討し.教育評価システムを構築するための数学的基礎とその応用について研究した.関連して,その研究成果の一部は,Int'l Congress of Mathematicians,日本数学会,日本行動計量学会,日本ファジィ学会などで発表し,それぞれに,ある程度の評価をえた.また,これらの研究を基盤として,次年度以降は,ファジィ理論を応用した実践的な教育評価法,教材/認知構造分析法などの研究を行ないたい.CAIシステムはじめ種々のメディアが開発されてはいるが,教育情報の評価はおもに人間がおこなうため,その判断基準は主観的になりやすい.このため,通常の教育評価には,少なからず「あいまいさ」が存在し,公正さを欠く場合も多い.本研究は,その一つの解決索として,ファジィ理論を応用した客観的な教育評価システムを開発することを目的としている.二年度の本年度は,(1)ファジィ理論の数理とその応用を研究すること,(2)教育情報分析システムを開発をすることなどに努めた.具体的には,教育情報の分析に応用される近似推論法,教材/認知構造の分析に応用されるファジィグラフの近似表現法やクラスター分析法などを検討し,教育評価システムを構築するための準備とその方法について研究した.また,これらの研究を基盤として,次年度には,ファジィ理論を応用した実践的な教育評価システム,教材/認知構造分析システムなどの研究と開発を行ないたい.近年,多種多様なメディアが開発されてはいるが,教育情報の評価はおもに人間がおこなうため,その判断基準は主観的になりやすい.このため,通常の教育評価には,少なからず「あいまいさ」が存在し,公正さを欠く場合も多い.本研究は,その一つの解決策として,ファジィ理論を応用した客観的な教育評価システムを構築することを目的としている.三年度目の本年度は,(1)ファジィ理論を応用した教育評価法を研究,実践すること,(2)教育情報分析システムを開発をすることなどに努めた.具体的には,教育情報の分析に応用されるファジィ推論法,教材/認知構造の分析に応用されるファジィグラフの近似表現法やクラスター分析法などを実践し,教育評価システムを構築するための方法について研究した.また,これらの理論や実践に関する論文を編集して,研究課題「ファジィ理論を応用した教育評価システムの研究」の報告書とした.
IL-2遺伝子導入頭頸部扁平上皮癌への免疫細胞応答

我々はこれまでの研究で、IL-2遺伝子導入後の頭頸部扁平上皮癌培養細胞が、リンパ球を介した腫瘍免疫を賦活化することを突き止めた。本研究ではさらにリンパ球を介した腫瘍免疫の機序に踏み込むこととした。すなわち、あらかじめ樹立された頭頸部扁平上皮癌培養細胞から、腫瘍特異的な抗原物質を抽出、同定し、腫瘍特異的細胞障害性リンパ球(CTL)の誘導を試みた。頭頸部扁平上皮癌培養細胞を大量培養し(約2x109個)、細胞融解液をつくり、これよりAfflnity column,高速液体クロマトグラフ,mass spectrometry等の手法を用いて、腫瘍特異性抗原(抗原ペプチド)を抽出・同定した。得られた抗原ペプチドはアミノ酸配列の異なる16種類であり、既知の生体内高分子化合物・酵素・ウイルス蛋白などとの相同性はまったく見られず、新たな腫瘍特異性抗原と考えられた。これらの抗原ペプチドを合成し、これを抗原として健常者由来の樹状細胞(DC)とリンパ球からCTLの誘導を試みた。ペプチドにより腫瘍特異的なCTLが誘導されたか否かを検討するために、g-IFN ELISPOT assayを行なった。その結果、ペプチド間に差はあるものの、10種類のペプチドにおいて約40個50個に1個の割合いでリンパ球が腫瘍細胞に反応し、g-IFNを分泌したと考えられた。以上の所見から、腫瘍細胞から抽出・同定・合成した16種類のペプチドのうち、10種類が抗原性を有し、DCによる抗原提示を経てリンパ球を腫瘍特異的なCTLへと誘導したことが示唆された。今年度は頭頸部扁平上皮癌細胞のへの免疫細胞応答において、腫瘍免疫に重要な役割を持つと考えられる腫瘍抗原について検討した。(目的)頭頸部扁平上皮癌細胞MHC分子上に提示される腫瘍抗原の抽出を試みる。(材料、方法)頭頸部扁平上皮癌培養細胞(PCI-13)を4x10^9個まで大量培養し、細胞を回収後に蛋白分解酵素阻害剤を加えた緩衝液中で細胞を融解した。遠沈後にその上清のみ採取し、抗MHC class I抗体を吸着させたセファロースゲルカラムを通過させた。カラムには腫瘍抗原が癌細胞MHC分子とともに結合したと考えられ、酸にてこの腫瘍抗原を抽出した。高速液体クロマトグラフィーを用いてこの抽出液から60の分画(ペプチド溶液)を作成した。あらかじめ樹立されていたPCI-13特異的細胞障害性T細胞(PCI-13CTL)を用いて、これらの分画を評価した。これにはELISPOT assayを用いた。96穴のプレートを用い、2000個のPCI-13CTLにそれぞれの分画を加え、24時間のインキュベート後にγ-IFN産生のみられたCTLの頻度を計測した。(結果)ELISPOTassayでは、4ケ所の分画でCTLによる高度のγ-IFN産生が確認され、おそらくこの分画中に目的の腫瘍抗原が含まれていると考えられた。今後、この腫瘍抗原を認識するCTLを誘導する予定であり、誘導できた場合、T細胞の腫瘍に対する免疫機構が明らかになるものと考えられる。(研究によって得られた新知見)1.リンパ球による殺腫瘍効果は、IL-2遺伝子を導入した頭頸部扁平上皮癌培養細胞に対して、より高率に観察された。これはIL-2遺伝子導入頭頸部扁平上皮癌培養細胞がIL-2を持続的に分泌し、リンパ球が活性化された結果であった。2.リンパ球による殺腫瘍効果は腫瘍細胞表面上のMHC class I分子に依存すると予測し、そのMHC class I分子上に発現した腫瘍特異性抗原(ペプチド)の同定を試みた。その結果、9または10アミノ酸配列から成る計16種類のペプチドが同定できた。

これは既知の酵素・癌関連タンパク・ウイルスなどとの相同性が全く見られず、新たな腫瘍特異性抗原であると考えられた。3.得られた腫瘍特異性抗原を合成し、これを用いて以下の方法にて腫瘍特異的細胞障害性Tリンパ球の樹立を試みた。(1)健常者末梢血から単核球を分離後、IL-4とGM-CSFを添加し、単球由来の樹状細胞を樹立した。(2)上記の樹状細胞を抗原提示細胞とし、これに16種類の個々のペプチドを加え、リンパ球を刺激した。低濃度のIL-2添加培地を用い、樹状細胞およびペプチドによるリンパ球の刺激は1週間おきに計2回行った。(3)その結果、用いた16種類のペプチドのうち、数種類のペプチドがリンパ球を活性化し得た。(今後の計画)腫瘍特異的細胞障害性Tリンパ球の樹立を、加えるペプチドの濃度および樹状細胞とリンパ球との比率を変化させ、再度試みる。また、16種類のペプチドをいくつか組み合わせて、より効率的な細胞障害性Tリンパ球の誘導を行う予定である。頭頸部扁平上皮癌細胞のへの免疫細胞応答において、腫瘍免疫に重要な役割を持つと考えられる腫瘍抗原について検討した。頭頸部扁平上皮癌細胞MHC分子上に提示される腫瘍抗原の抽出を試みた。頭頸部扁平上皮癌培養細胞(PCI-13)を4x109個まで大量培養し、細胞を回収後に蛋白分解酵素阻害剤を加えた緩衝液中で細胞を融解した。遠沈後にその上清のみ採取し、抗MHC class I抗体を吸着させたセファロースゲルカラムを通過させた。カラムには腫瘍抗原が癌細胞MHC分子とともに結合したと考えられ、酸にてこの腫瘍抗原を抽出した。高速液体クロマトグラフィーを用いてこの抽出液から60の分画(ペプチド溶液)を作成した。あらかじめ樹立されていたPCI-13特異的細胞障害性T細胞(PCI-13CTL)を用いて、これらの分画を評価した。これにはELISPOT assayを用いた。96穴のプレートを用い、2000個のPCI-13CTLにそれぞれの分画を加え、24時間のインキュベート後にγ-IFN産生のみられたCTLの頻度を計測した。ELISPOTassayでは、4ケ所の分画でCTLによる高度のγ-IFN産生が確認され、おそらくこの分画中に目的の腫瘍抗原が含まれていると考えられた。これら4ケ所の分画を分析し、16種類のペプチドを得た。今後、これらペプチドを抗原としてCTLの誘導を行なう予定である。