hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高等植物の生活環と重力　－宇宙植物工場の基礎－

現時点では概要に述べた結果を得られており,概ね順調に進展していると判断される.本研究課題の主目的である宇宙植物工場の基礎研究遂行に関連し,申請者は2020年までの国際宇宙ステーションISS「きぼう」利用シナリオに沿った大型装置プロジェクトに関わっており,その推進母体である宇宙環境利用科学委員会リサーチティームにおいて,大型の植物栽培装置の計画が急速に具体化してきた.この装置計画の推進のためには宇宙および微小重力環境の影響解析が必要であり,本年度はSpace Seed宇宙実験の解析を優先的に行った.現時点では概要に述べた結果を得られており,概ね順調に進展していると判断される.これまでの解析により,果実および種子に関する解析の結果,宇宙実験においては地上1 G区と比較して,長角果の長さは短く,1つの長角果内の種子数は少なくなる傾向が見られる一方で,宇宙実験区の中で比較すると,微小重力区で生育された種子の重量は宇宙1 G区と比較して大きい傾向が見られている.これらの原因を探るためには,まず果実や種子の解剖学的解析が必要である.そのためには,人工産物を伴うことなく化学固定・包埋をすることが困難な種子に適用でき,かつ宇宙で得られた貴重な試料を非侵襲で内部観察を行うことができるX線マイクロCTが大変有効であり,本年度は予備的にその解析に着手した.次年度はSPring-8のビームラインBL20XUに共同研究者と共に採択されたので,引き続きこれを用いた種子の解剖学的解析を進める.また引き続き宇宙実験を念頭においた準備として,また宇宙大型植物栽培装置計画の基礎研究として,植物の物質生産の視点からの研究を行う.これおいては,これまでまったくわかっていなかった重力環境が根系に与える影響も含めて過重力環境が植物の生活環に与える影響を含めて解析する.宇宙および微小重力環境の影響に関して,Space Seed宇宙実験の継続解析として,具体的には次のような解析を行う.shootの成長方向の制御は,個体レベルでの光合成の効率すなわち生産性にも影響する可能性がある.従って宇宙植物工場での栽培を実現するためには重力がない環境でshootの成長方向の制御がどうなるかを調べることは重要である.しかし,重力がない場合に,光だけでshootの姿勢制御が地上と同程度になされるのかについては,shootレベルでは定量的には調べられていない.また光環境による植物の成長方向の制御の強さが1G環境と比べてどの程度かについてもはっきりしていない.そこで,ダウンリンク画像を用いて花茎の成長角度を定量化し,宇宙環境が花茎の成長方向に与える影響の解析を行う.またこれまでの解析により,微小重力がが栄養成長の期間の長さに影響する可能性が示唆された.そこで,長角果形成や開花日について,ダウンリンク画像を用いた詳細な解析を行う.また既に開始しているが,宇宙環境がトランスクリプトームに与える影響の解析を進める.宇宙環境が植物内部組織の発達に与える影響について,花茎の維管束組織等の支持構造の発達に与える影響の解析を進める.これに関連し,細胞壁成分であるリグニン分析について解析をすすめる.また,SPring-8を用いて宇宙環境が種子内部構造に与える影響の解析を進める.地上実験によるSeed to
運動のプログラムと制御のメカニズム

分担課題に従い、生理学的立場、行動学的立場および計算論的立場からそれぞれから随意運動発現と制御の過程についての研究を進めた。すなわち、1)佐々木らは随意運動の発現と制御に関する前頭連合野の機能について、サルを用い、色光刺激に対するGOーNO GO弁別反応時の皮質電位を計測、GO反応を抑制する神経機構を推定した。2)篠田らは小脳から頭頂野への入力の性質を生理学的方法と解剖学的方法を用いて解析し、二つの異なる頭頂野の部位への種類の異なる視床皮質投射系が存在することを明らかにした。この結果は、頭頂野の随意運動制御での重要な役割を示唆している。3)丹治らは二次運動野の所在と機能の分類を進め、内発的運動発現に関わると思われる部位を求めた。また、長期間単純動作の学習実験から一次運動野と補足運動野の相補的機能を明らかにした。4)彦坂らは大脳基底核が脱抑制の機構を用いて随意的な眼球運動の発現を足進し、特に、記憶にもとづいて予測的に眼球運動を起こすための情報伝達機構について調べた。具体的にはGABA系およびド-パミン系に注目した実験を行った。5)笠井らは暗中で頭の回転角を知覚する精度を視線制御機能のけいそくによって調べ、次に前庭動眼反射ゲインを人為的に低下または上昇させた場合に視線制御機能がどのような影響を受けるかを実験的に調べた。一方、随意運動の計算論的立場からの研究を吉沢と鈴木が進めた。6)吉沢らは、神経回路網における時空間パタ-ンの学習機構、神経系と物理的力学系の協調現象の数理モデル、誘発脳電位の多点計測による信号源推定法の研究を行った。7)鈴木らは、上腕を最適に運動させる神経回路モデルを学習によって構成する方法および把持対象の形状を認識し、手の形を決定する神経回路モデルの構成法を明らかにした。なお、班会議を2回開催し、情報交換と今後の研究課題の討議を行った。
新規ＣＤ４陽性Ｔ細胞サブセットＴｈ９細胞のアレルギー性鼻炎における役割の解明

アレルギー性気道炎症における上・下気道におけるTh9細胞の効果をT細胞移入モデルを用いて解析した。気管支喘息モデル、アレルギー性鼻炎モデルいずれの場合も、Th9細胞を移入したマウスでは、Th2細胞移入マウスと同様の好酸球浸潤が認められた。また、気管支喘息モデルでは気道過敏性の亢進が、アレルギー性鼻炎モデルではくしゃみの増加が認められた。また、気管支喘息モデルにおいては、Th2細胞移入マウスとは異なりTh9細胞移入マウスによるAHRには好酸球の関与は比較的小さいことが示唆された。昨年度までの結果を基に、T細胞移入マウスを用いて鼻炎症状の検討を行った。具体的にはOVA特異的T細胞レセプターを強制的に発現し、遺伝子再構成活性化遺伝子2を欠損しているDO11.10Rag2-/-マウスの脾臓から各種T細胞を培養した。培養上清中のサイトカイン濃度をELISA法にて測定したところ、それぞれのサブセットに特異的なT細胞に分化していることが確認されたことから、この細胞をマウスに移入し、OVAを点鼻投与し、鼻粘膜過敏性の亢進の指標として点鼻ヒスタミンに対するくしゃみ反応を指標として、Th9細胞のアレルギー性鼻炎への関与を検討した。Th9細胞移入マウスにおいてくしゃみ亢進が認められたが、他のサブセットにおいても同様に反応がみられた。昨年度にうまくサンプルの調整ができなかったマイクロアレイに関しては、Th9細胞培養方法や細胞内サイトカインの測定方法を再検討した。この検討により、細胞内のIL-9、IL10が安定して測定できるようになったことから、Th9細胞のソーティング、RNAの回収を行い、マイクロアレイ解析の準備を行った。しかしながら、本年度半ばにマイクロアレイに関する実験が他研究者から論文として報告されたことから、計画を変更することとした。本年度は、まず、感作マウスを用いて鼻炎症状の評価系を確立した。具体的には、OVAで感作したマウスにOVAを点鼻投与することにより、抗原によるくしゃみ反応の亢進や鼻腔洗浄液中への好酸球の浸潤が認められる、鼻粘膜特異的なアレルギー性炎症反応の誘発モデルマウスを樹立した。加えて、本モデルを改良し、鼻粘膜過敏性の亢進を評価できる系も確立した。また、OVA特異的T細胞レセプターを強制的に発現し、遺伝子再構成活性化遺伝子2を欠損しているDO11.10Rag2-/-マウスの脾臓からCD4+T細胞を採取し、当研究室にてTh2細胞を培養する方法や既報の論文を参考にして、Th9細胞へ分化させる培養条件を検討した。培養上清中のIL-9濃度をELISA法にて測定したところ、IL-9の産生が認められたが、FACS Cantoを用いた細胞内サイトカインの測定では、IL-9産生細胞の測定がうまく行えていない。その為、Th9細胞の培養時間やTGF-β等のサイトカインの添加濃度等の条件を細かくとって検討すると共に、細胞内サイトカインの染色条件や測定方法等の技術の向上を図っている。IL-9産生細胞の検出はできていないものの、培養上清中でのIL-9産生が認められたことから、分化させたTh9様細胞をマウスに移入した。Th2細胞を移入後に経気道的に抗原を投与することにより、炎症細胞の浸潤等を指標とした気管支喘息様症状を安定して測定できるモデル系が当研究室で確立されているから、本モデル系でTh9様細胞の機能を解析したところ、気管支肺胞洗浄液中への好酸球の浸潤が認められ、本細胞が気管支喘息様の症状を引き起こすことが明らかとなった。Th9細胞移入マウスにおいてもくしゃみ亢進が認められ、Th9細胞が鼻炎にも関与していることが明らかとなった。しかしながら、他のサブセットにおいても同様の反応がみられており、Th9細胞特有の特徴とはいえなかった。そこで各種マウスを用いて、Th9細胞に特徴的な役割を明らかとするための検討を行った。鼻炎モデルにおいてはTh9細胞特有の特徴は明らかとできなかったものの、一連の検討をする中で、コントロール実験として行っていた喘息病態モデルにおいて、Th9細胞特有の特徴が明らかとなった。すなわち、正常マウスにTh2細胞ならびにTh9細胞を移入すると、抗原暴露によりどちらも好酸球浸潤がみられ、またメサコリンによる気道過敏性の亢進がみられた。そこで、好酸球欠損マウスを用いて、浸潤してくる好酸球の影響を排除したところ、Th2細胞を移入したマウスでは気道過敏性亢進が抑制されたが、一方、Th9細胞を移入したマウスにおいては気道過敏性亢進は抑制されないことが明らかとなった(2014年アレルギー好酸球研究会にて発表)。

これは、Th2細胞による気道過敏性亢進とは異なり、Th9細胞はIgEや好酸球に非依存的に直接気道過敏性亢進を引き起こすことを示唆しており、すなわちTh9細胞自身が気管支収縮性のメディエーターを放出するエフェクター細胞として作用する可能性を示した。アレルギー学本年度は、Th9細胞移入マウスを用いて、アレルギー性鼻炎の病態の評価を行うと共に、Th9細胞のマイクロアレイによる発現遺伝子の網羅的な解析を実施する予定であった。マイクロアレイによる網羅的な解析に関しては、本年度の半ばに他研究者から論文として報告されたことから、計画を変更し、現在は病態解析を中心に実験を行っている。アレルギー性鼻炎モデルマウスはおおむね順調に進行しているが、Th9細胞に特徴的な反応をつかむには至っていない。本年度は、アレルギー性鼻炎モデルマウスを作成し、病態の評価法を確立するとともに、Th9細胞の培養法を検討し、IL-9産生細胞をFACS Ariaで精製して、マイクロアレイによる発現遺伝子の網羅的な解析を実施する予定であった。現在、アレルギー性鼻炎モデルマウスの樹立と解析は計画通り順調に進行している。一方、Th1細胞やTh2細胞の培養上清と比較すると、分化させたTh9細胞の培養上清中ではIL-9濃度が有意に上昇しているものの、FACS Cantoを用いた細胞内サイトカインの測定でIL-9産生細胞を確認できていない。マイクロアレイ解析の結果の精度を高める上で、純度の高いIL-9産生細胞をソートすることが非常に重要なポイントとなることから、現在、Th9細胞の培養法を細かく検討すると共に、細胞内サイトカインの染色条件や測定方法の技術の向上を図っている。アレルギー性鼻炎モデルマウスを用いた病態の評価法は計画通り順調に確立され、Th9細胞がアレルギー性鼻炎に関与することが示されたものの、Th9細胞に特徴的な反応を見出すことができていない。そこで、現在その原因の解明を進めている。具体的には関与の可能性のあるサイトカインに関して中和抗体を用いた実験を行っており、その研究を進めていく。さらに、現在、Th9細胞に関連するサイトカインのノックアウトマウスを入手したことから、そのマウスの交配をすすめている。実験に供することのできる数になり次第、このノックアウトマウスを用いた検討も進めていく予定である。アレルギー性鼻炎モデルマウスを用いた病態の評価法は計画通り順調に確立された。そこで、今後は研究計画に記載したとおり、当研究室所有の種々のTgマウス等を用いた鼻炎状態の評価を行い、Th9細胞やIL-9の関与を明らかとする予定である。本年度中にTh9細胞の培養条件を確立し、Th9細胞に分化している細胞をFACS Ariaで精製して、マイクロアレイによる発現遺伝子の網羅的な解析を実施する予定であった。マイクロアレイ解析を行う上で、Th9細胞を高純度にソートすることが非常に重要なポイントとなるが、IL-9産生細胞の測定が難しく、IL9産生細胞の同定が行えていない。現在、サイトカイン濃度や培養日数等を細かく検討し、Th9細胞の培養条件の確立を目指している。一方、分化させたTh9細胞の培養上清中においてはIL-9濃度の上昇が認められていることから、細胞内サイトカインの染色条件等の測定方法に問題がある可能性も考えられる。
高濃度CO_2,高圧海水での石灰岩溶解実験(CO_2中和隔離のための基礎実験)

本研究の目的は,室内実験から,常圧100気圧までの圧力条件下で,高濃度CO_2の海水を石灰岩と反応させ,その溶解速度を測定して,溶解速度に関わる条件を明らかにすることである.この実験は,サンゴ礁地下の石灰岩層にCO_2を注入して,海水に溶解,石灰岩と中和させてCO_2を炭酸水素イオンとして海洋に隔離する(下記化学式)技術開発のための基礎実験である.本研究では,溶解実験のために,常圧条件と高圧条件の2つに対応した実験装置をそれぞれ新規に開発した.前者は高圧実験の予察的な実験のためのもので,同時に将来の地球温暖化に伴う海洋表層の石灰岩質の外殻を持った生物(有孔虫・サンゴ)へのインパクトを解析に有益なものであった.本研究の結果から,海洋表層における各鉱物種の溶解速度が定量化され,既存の研究結果との整合性が確認されている.高圧実験の結果からは,注入されたCO_2が,石灰岩の溶解により,数分程度の短い時間内に海水中に隔離されたことが確認された.また,同時にCO_2の溶解による海水の酸性化の抑止やCO_2分圧の減少も確認されており,石灰岩を利用したCO_2隔離法が有効な手法であることが示されている.注入する海水のCO_2分圧が高いほど,石灰岩溶解による隔離の効率が下がることも確認されており,注入する海水のCO_2分圧が全圧に対して数数十%の場合が,最も効率的であると予想される.実験で得られた石灰岩溶解によるCO_2隔離量は,海水1m^3あたり10^<-1>10^0kgのオーダーであった.また,本実験からは,従来の研究では確認されなかった,溶解速度の流速に対する強い依存性が検証されており,実際のCO_2注入の際の,CO_2隔離や石灰岩溶解の動態の解析に重要な知見を与えるものである.本研究の目的は,室内実験から,常圧100気圧までの圧力条件下で,高濃度CO_2の海水を石灰岩と反応させ,その溶解速度を測定して,溶解速度に関わる条件を明らかにすることである.この実験は,サンゴ礁地下の石灰岩層にCO_2を注入して,海水に溶解,石灰岩と中和させてCO_2を炭酸水素イオンとして海洋に隔離する(下記化学式)技術開発のための基礎実験である.本研究では,溶解実験のために,常圧条件と高圧条件の2つに対応した実験装置をそれぞれ新規に開発した.前者は高圧実験の予察的な実験のためのもので,同時に将来の地球温暖化に伴う海洋表層の石灰岩質の外殻を持った生物(有孔虫・サンゴ)へのインパクトを解析に有益なものであった.本研究の結果から,海洋表層における各鉱物種の溶解速度が定量化され,既存の研究結果との整合性が確認されている.高圧実験の結果からは,注入されたCO_2が,石灰岩の溶解により,数分程度の短い時間内に海水中に隔離されたことが確認された.また,同時にCO_2の溶解による海水の酸性化の抑止やCO_2分圧の減少も確認されており,石灰岩を利用したCO_2隔離法が有効な手法であることが示されている.注入する海水のCO_2分圧が高いほど,石灰岩溶解による隔離の効率が下がることも確認されており,注入する海水のCO_2分圧が全圧に対して数数十%の場合が,最も効率的であると予想される.実験で得られた石灰岩溶解によるCO_2隔離量は,海水1m^3あたり10^<-1>10^0kgのオーダーであった.また,本実験からは,従来の研究では確認されなかった,溶解速度の流速に対する強い依存性が検証されており,実際のCO_2注入の際の,CO_2隔離や石灰岩溶解の動態の解析に重要な知見を与えるものである.研究初年度の本年は、炭酸カルシウム溶解実験システムの構築に成功した。本システムは、最大2000ppmまでの異なる濃度のCO2をシステムに導入することによって、様々な炭酸カルシウムの飽和度条件を作り出すことができる。また、システムは、本研究室で開発された連続全炭酸・アルカリ度測定システムに直結され、飽和度と溶解速度をアルカリ度と全炭酸によって連続的にモニターすることができる。またシステム全体をインキュベーター内に格納して、080度の温度条件で溶解実験を行うことができる。さらに、溶解実験の際に、これまでのように攪拌せず、定常的な海水流量中で実験を行うフローシステムとした。本年度は、新たに開発した本実験システムの試運転とその評価を行った。システムは安定して作動し、溶解速度をアルカリ度の変化としてモニターできることがわかった。予察的にアラレ石粒子の溶解実験を行った結果、従来実験室で求められたより溶解速度が小さいことが明らかになった。飽和度と溶解速度の関係は、で表される。来年度は、様々な飽和度、水温、攪拌条件で溶解実験を行って、溶解速度を規定する要因を明らかにする。さらに、高圧条件で実験を行うために、システムを高圧容器に接続して、その試運転を行う。平成18年度は高圧条件下での溶解実験を行うための事前実験として、常圧条件下で海水のCO2濃度を様々に変え、石灰岩の溶解速度を測定した。石灰岩は元素組成、鉱物組成を測定し、アラレイシ型と方解石型に分けて測定した。

方解石型についてはそのマグネシウム/カルシウム比にも着目した。溶解速度の測定結果は、2007年2月に米国ニューメキシコ州サンタフェで行われたAmerican Society of Limnology and Oceanographyの会合において発表した。また、これまでに得られたフィールドにおける測定結果を見直して、夜間の高CO2環境下で、石灰質堆積物の溶解が起こっていることを確認した。飽和度は十分なので、溶解を促す何らかの要因を考えないとならない。高圧実験は、圧力容器、恒温槽、加圧用ポンプ、恒温槽を用いた実験システムの構築を行い、水深100-1,000m(圧力10-100気圧)まで一定温度下で段階的に圧力を変化できる事を確認した。またこの圧力容器内に海水と液化CO2を連続的に定量ポンプで圧入し、圧力容器に付属している圧力制御弁から一定圧になるように内部液をリークできるようにした。この圧力容器内に石灰岩試料を設置し、海水と液化CO2を連続的に圧入し、リークした内部液のアルカリ度を測定する事で、高圧、高濃度CO2条件下での石灰岩の溶解速度を測定する事が可能である。1.高圧力,高CO2濃度下の炭酸系計測平成19年度は,初年度に設計,評価した高圧実験システムを東京大学の連続炭酸系計測装置に結合し,高圧力,高CO2濃度下での炭酸系計測を行なった。圧力容器に付属している圧力制御弁で一定圧になるように内部液をリークさせ,その内部液を連続炭酸系計測装置に導入し,全炭酸,アルカリ度を計測した。以上により,高圧力,高CO2濃度下での石灰岩溶解実験システムが完成した。2.溶解実験ついで,実際の石灰岩試料を実験システムに供し,溶解速度測定を行なった。初年度に明らかにした溶解速度と石灰岩の形状(砂岩体)との関係に従い,石灰岩を最適な形状にして溶解実験システムに導入した。用いる石灰岩は,初年度の元素,鉱物組成分析結果に従い,特徴ある数グループに分類した。分類した各石灰岩を定圧,定温にコントロールした圧力容器に入れて,海水および液化CO2を定圧ポンプにより圧入して石灰岩を溶解し,その後圧力容器に付属している圧力制御弁で一定圧になるよう内部液をリークさせてこの溶液中の全炭酸,アルカリ度を連続炭酸系計測装置で計測した。これにより,圧力容器内の石灰岩の体積あたりの溶解速度を求めることに成功した。
Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属アーキアにおける膜内在性電子キャリアの生合成

1.我々は前年度に、メタン生成アーキア由来のカロテノイド生合成酵素CrtIのホモログタンパク質を、ユニークな位置選択性を示す新奇プレニル基還元酵素として同定した。本年度はこの研究を論文1報に取りまとめ学術雑誌に掲載した[FEBS J. (2014) 281,3165]。また、本酵素の反応特異性に注目し、非天然型新奇化合物の創出への応用を試みた。本酵素と変異型フシコッカジエン合成酵素をゲラニルゲラニル二リン酸と順次反応させ、新奇構造をもった二環式ジテルペンの合成に成功した。2.ドリコールは一部のアーキアに必須の糖キャリア脂質である。同化合物は直鎖状ポリプレノールの構造をもつが、水酸基に隣接するイソプレン単位が飽和している。我々は、アーキアにおいてこの部分飽和構造を生じる未同定の還元反応をCrtIホモログが担う可能性を考え、ドリコール生産菌である好熱好酸性アーキア由来のCrtIホモログについて機能解析を行った。組換えタンパク質を用いたin vitroアッセイ、および同タンパク質の異種発現宿主を用いたトレーサー実験を実施したが、目的の還元活性は検出されなかった。3. Methanosarcina属やその近縁種のメタン生成アーキアが生産する2,6,10,15,19-ペンタメチルイコサン(PMI)は、地球化学の分野において脂質バイオマーカーとして有用である。しかし、PMI生合成に関する知見は一切ない。我々は、Methanosarcina属アーキアに特異的に保存されるcis-プレニル基転移酵素(cPT)ホモログがPMI生合成に関わる可能性を考えた。この仮説を検証するため、組換えタンパク質を用いた機能解析および生成物の構造解析を行った。その結果、本酵素が通常のcPT活性に加え、ユニークなプレニル基転移反応を触媒する二機能性のプレニル基転移酵素であることが明らかになった。26年度が最終年度であるため、記入しない。1.Methanosarcinamazeiゲノムからゲラニルファルネシル基転移酵素(GFT)をコードすると予想される遺伝子クローニングし、メタノール資化性酵母を宿主とした発現系を作製した。その結果、組換えタンパク質の発現に成功したため、同タンパク質を精製した後、ゲラニルファルネシル二リン酸(GFPP)とフェナジン類縁体を基質としてアッセイを行った。目的の転移活性は確認されなかったが、同組換えタンパク質はGFPPに対して脱リン酸活性を示した。推定GFTのホモログであるUbiAプレニル基転移酵素においても副反応としてプレニル二リン酸に対する脱リン酸活性が報告されており、今後も推定GFTの活性を検討する必要がある。2.ゲラニルファルネシル基還元酵素(GFR)の基質と推定されるGFTの反応生成物が得られなかったため、呼吸鎖キノン生合成に関わるプレニル基還元酵素(PR)の機能解析を先行して行った。数種の生物種から推定PR遺伝子をクローニングし、その大腸菌発現株を作製した。現在、同菌株を用いたin vivo実験、および精製組換えタンパク質を用いたin vitro実験を実施中である。なお、推定GFRの発現系構築、大量発現および精製に成功しており、今後、同組換えタンパク質の活性測定を予定している。また、アーキア膜脂質生合成酵素の探索において見出したMethanosarcina acetivorans由来ゲラニルゲラニル基還元酵素の機能解析も行った。同酵素はGFRやPRといった還元酵素に相同性をもたない新奇酵素であり、新奇構造化合物の創出に役立つと期待される。同酵素の大腸菌大量発現株の作製、および組換え酵素の抽出・精製が完了しており、現在、同酵素の基質特異性と生理的役割の解明を進めている。3.遺伝子破壊が可能とされるM.acetivoransを用いて、推定メタノフェナジン生合成遺伝子の破壊株の作製に取り組んだ。現在までに目的の遺伝子を欠損した株は得られておらず、引き続き破壊株の取得を目指す。1)我々はこれまでに、メタノフェナジン(MP)の生合成にゲラニルファルネシル基転移酵素(GFT)が関わると想定し、酵母を宿主とした推定GFT発現系を作製している。次に、精製した組換え酵素を用いて、in vitroでGFT活性を検討した。プレニル基アクセプタの構造が未知だったため、アッセイではフェナジン類縁体や真正細菌型フェナジン生合成前駆体、あるいはキノン様化合物といった種々の化合物を用い、また、プレニル基ドナーとして放射標識したゲラニルファルネシル二リン酸を用いた。いくつかの条件下でアッセイを行ったが転移生成物は得られず、昨年度}ご報告した通り、脱リン酸生成物のみが観察された。遺伝子破壊が可能とされるメタン生成アーキアMethanosarcinaacetivoransを用いて、推定MP生合成遺伝子欠損株の作製にも取り組んだ。現在までに目的の遺伝子欠損株は取得できておらず、MPが呼吸鎖電子キャリアとしてATP産生に寄与していることを考えると、MP生合成遺伝子の欠損が致死性の表現型を示すことが推察された。2)M. acetivoransから見出した新奇ゲラニルゲラニル基還元酵素(GGR)の特性評価を行った。組換え酵素を用いたin vitroアッセイの結果、同酵素は炭素数20のゲラニルゲラニル基をもつ化合物にのみ還元活性を示し、かつ、その4つの二重結合のうち1つを還元することが明らかになった。

さらにその還元位置を決定するため還元生成物をGC-MS解析に供したところ、ω-末端の二重結合が特異的に還元された構造が推定された。同酵素は既知タイプのGGRに相同性をもたない新奇酵素であり、還元部位選択性についても他に例を見ないものである。また、これらの基質特異性および位置選択性から、本酵素がM.acetivorans生体中で部分飽和型の糖キャリア脂質の生合成に関わる可能性が考えられた。そこで、同菌の脂質抽出物をLC-MS分析に供したところ、二重結合が一カ所飽和した糖キャリア脂質が検出された。この結果は、我々が予想した生理的役割を支持している。1.我々は前年度に、メタン生成アーキア由来のカロテノイド生合成酵素CrtIのホモログタンパク質を、ユニークな位置選択性を示す新奇プレニル基還元酵素として同定した。本年度はこの研究を論文1報に取りまとめ学術雑誌に掲載した[FEBS J. (2014) 281,3165]。また、本酵素の反応特異性に注目し、非天然型新奇化合物の創出への応用を試みた。本酵素と変異型フシコッカジエン合成酵素をゲラニルゲラニル二リン酸と順次反応させ、新奇構造をもった二環式ジテルペンの合成に成功した。2.ドリコールは一部のアーキアに必須の糖キャリア脂質である。同化合物は直鎖状ポリプレノールの構造をもつが、水酸基に隣接するイソプレン単位が飽和している。我々は、アーキアにおいてこの部分飽和構造を生じる未同定の還元反応をCrtIホモログが担う可能性を考え、ドリコール生産菌である好熱好酸性アーキア由来のCrtIホモログについて機能解析を行った。組換えタンパク質を用いたin vitroアッセイ、および同タンパク質の異種発現宿主を用いたトレーサー実験を実施したが、目的の還元活性は検出されなかった。3. Methanosarcina属やその近縁種のメタン生成アーキアが生産する2,6,10,15,19-ペンタメチルイコサン(PMI)は、地球化学の分野において脂質バイオマーカーとして有用である。しかし、PMI生合成に関する知見は一切ない。我々は、Methanosarcina属アーキアに特異的に保存されるcis-プレニル基転移酵素(cPT)ホモログがPMI生合成に関わる可能性を考えた。この仮説を検証するため、組換えタンパク質を用いた機能解析および生成物の構造解析を行った。その結果、本酵素が通常のcPT活性に加え、ユニークなプレニル基転移反応を触媒する二機能性のプレニル基転移酵素であることが明らかになった。26年度が最終年度であるため、記入しない。当初作製した推定GFT大腸菌発現系が機能せず、組換えタンパク質の取得に時間を要した。また、メタノフェナジン生合成中間体についてはほとんどが不分明であり、フェナジン類縁体を基質として組換えタンパク質の活性を評価したが、この反応条件ではGFT活性は見出されなかったため。MP生合成については、想定されるプレニル基転移反応のアクセプタ分子の構造が不分明であり、未だ基質となる化合物を模索している段階にあったため、当初計画したほど進展しなかった。また、推定MP生合成遺伝子の欠損株の作製も、おそらくは致死的な表現型のために困難だと考えられた。
景観群集ゲノミクス・アプローチによる群集生態－進化動態の統合的解明

石狩川流域において、最上流部から河口までの15地点でヤナギルリハムシ(以下ハムシ)の迅速な進化動態を調べた。継続的にハムシのサンプリングを行い、摂食形質に関連する一塩基多型マーカーによるジェノタイピングと昨年開発したマイクロサテライトマーカーによるジェノタイピングを行った。その結果、形質関連マーカー頻度の各集団での時間変化のパタンは場所によって異なっており、大きく変動する集団から安定的に推移する集団までさまざまであった。自然選択の検出をするために、時間ポイントごとの集団内の多型頻度を用いてFst(p)を算出し、それをマイクロサテライト・マーカーを用いて算出したFst(n)と比較した。その結果、形質関連マーカー頻度が大きく変動する集団では、Fst(p)がFst(n)より高い値となり、選択によって頻度が変わる迅速な進化が生じていることが示唆された。さらに、この頻度変化に景観要素NDVIが関わることも分かった。また、ケヤマハンノキ(以下ハンノキ)に共生する窒素固定細菌の遺伝的多様性について継続して調べた。ハンノキ根の根粒共生体・ハンノキ直下の根圏土壌中・広域での土壌中という多階層空間スケールにおける遺伝構造を明らかにするために行っていたメタゲノム解析の結果が出揃った。その結果、ハンノキ直下の根圏土壌中には非常に遺伝的に多様な共生細菌が存在するが、根粒共生体と広域土壌中では、遺伝的多様性はかなり低いことが分かった。したがって、ハンノキの根の付近の土壌でのみ、共生細菌の多様化が進む一方、ごくわずかなタイプのみが樹木との共生関係を結ぶことに成功する最適化が働いている実態が見えてきた。さらに、この最適化のパタンには環境要因のかかわりが示唆された。以上から、野外の群集における生物間相互作用では、ダイナミックな進化的挙動があり、そこに景観要素が関わるという新規知見が得られた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。河畔林の生物群集における生態-進化フィードバックの統合解明に向けた景観ゲノミクス・アプローチに着手した。まず、群集の主要構成者であるヤナギに優占するヤナギルリハムシのゲノム配列情報の解読を行った。125150塩基長の270bp、500bp、800bpペアエンドについて、それぞれ430億、134億、439億本以上のリード情報を得られた。さらに、49塩基長の2000bpと5000bpのメイトペアについて、それぞれ90億、100億本以上のリード情報を得られた。次に、北大雨龍研究林の4河川18地点において同ハムシのサンプリングを行い、形質変異と関連する既知のSNP(一塩基多型)マーカーを用いた遺伝解析を行った。このSNPマーカーの対立遺伝子頻度は、ハムシの局所個体群間で異なっていた。2014年のデータと比較すると、各個体群間で遺伝子頻度が異なる時間変化をしていることが示唆された。付随して、このハムシの個体群はメスに偏った性比構造を持っていることが分かった。性比には顕著な時間変化は認められなかった。このハムシは分散の小さい近交系で、局所的な自然選択によってそれぞれの個体群の対立遺伝子頻度が振動している可能性がある。同様に、河畔林群集の主要構成者であるハンノキに共生する窒素固定バクテリア(フランキア)についてもサンプリングと遺伝解析を進めた。これについても北大雨龍研究林の4河川を調査地とした。合計211個体のケヤマハンノキの根より根粒を採取しフランキアのDNAを抽出した。nifD-Kスペーサー領域の塩基配列を解析した結果、類似度98%閾値のOTUが27種類も得られた。さらに、異なるOTUのフランキアを単離培養し、ハンノキ実生に添加する温室栽培実験を行ったところ、実生のパフォーマンスはフランキアOTUによって変化することが分かった。最初に着手する予定であったハムシのドラフトゲノム解析について、大規模ゲノムデータが得られ、de novoアセンブリの工程に予定通りに進むことができた。de novoアセンブリには大きなメモリによる大規模演算が必要で、現在は遺伝研のスーパーコンピュータを使用して解析を進めているところである。また、河畔林の拡散共進化系の核となるメンバーとして本プロジェクトで注目しているハムシとフランキアについて、野外の河畔林における遺伝解析が順調に進展した。北海道大学雨龍研究林に生育するケヤマハンノキ(以下ハンノキ)のゲノムワイドな一塩基多型情報を取得し、その遺伝変異の情報によって樹上の昆虫群集の構造がどの程度予測できるかを調べた。周辺植生情報や空間地理情報という景観情報に比べ、ハンノキ遺伝情報は遥かに高い予測精度を示した。複雑な自然生態系において,植物の遺伝子が従来考えられていたよりかなり強く生物の集合に影響していることを示す。一方,遺伝変異はハンノキの基礎的な機能形質にも影響していたが、それらの形質群による昆虫群集の予測制度は高くなかった。二次代謝物質など多様な植物形質が昆虫の集合に波及効果を持つかもしれない。この成果は国際誌に受理された。次に、ハンノキに共生する窒素固定細菌フランキアについて、樹木個体・局所・景観という多階層空間スケールにおける遺伝構造を明らかにするために特異領域アンプリコンのメタゲノム解析を行った。85個体のハンノキ(上の昆虫群集を調べた個体)から7個ずつ根粒塊を採取してこれを行った。あわせて12地点の周辺土壌からDNAを抽出し、同領域についてメタゲノム解析を行った。

その結果、木1個体は普遍的に複数遺伝子型のフランキアと共生していることが明らかになった。どの木もほぼ共通して有する遺伝子型が4タイプあり、それらは系統的に離れていた。加えて特定の遺伝子型タイプがさらに共生しているグループがあること、個体ごとに特異な遺伝子型とも共生していること、などのパターンが検出された。さらに土壌には共生する遺伝子型より5倍も多様な遺伝子型のフランキアが存在することが分かった。これらはすべて新規な知見である。同時に今年度は、この各調査地点において、土壌の無機体窒素量の計測、ロガーによる温湿度情報の収集、ハンノキ葉の窒素同位体の計測、ヤナギルリハムシのSNP解析と性比解析を進めた。それによって厚いデータが得られている。本年はケヤマハンノキのゲノムワイドな遺伝変異情報による自然生態系における昆虫群集の構造の予測、というテーマについて解析が進み、Molecular Ecology誌に受理されるにいたった。この成果についてはプレスリリースを発行し、日本語媒体/英語媒体のさまざまなウェブニュースサイトやSNSで取り上げられるというインパクトがあった。まだ公開されていない媒体でも取材を受けているところである。また、窒素固定細菌のメタゲノム解析が順調に進んだことも大きな進展である。サンプル採取から始まり、DNA抽出、PCR増幅、ライブラリ調整までを自らの手で行うことができ、データとしても実績欄で記述したように非常に興味深い新規なものが得られてきている。本科研費で雇用していたポスドクが今年度異動になり、新たに雇用した技術補助員への技術指導が難航するといった問題点も出たが、土壌の無機体窒素量の計測、ロガーによる温湿度情報の収集、ハンノキ葉の窒素同位体の計測、ヤナギルリハムシのSNP解析と性比解析なども実施することができた。以上により、本研究課題はおおむね順調に進展させることができている。石狩川流域において、最上流部から河口までの15地点でヤナギルリハムシ(以下ハムシ)の迅速な進化動態を調べた。継続的にハムシのサンプリングを行い、摂食形質に関連する一塩基多型マーカーによるジェノタイピングと昨年開発したマイクロサテライトマーカーによるジェノタイピングを行った。その結果、形質関連マーカー頻度の各集団での時間変化のパタンは場所によって異なっており、大きく変動する集団から安定的に推移する集団までさまざまであった。自然選択の検出をするために、時間ポイントごとの集団内の多型頻度を用いてFst(p)を算出し、それをマイクロサテライト・マーカーを用いて算出したFst(n)と比較した。その結果、形質関連マーカー頻度が大きく変動する集団では、Fst(p)がFst(n)より高い値となり、選択によって頻度が変わる迅速な進化が生じていることが示唆された。さらに、この頻度変化に景観要素NDVIが関わることも分かった。また、ケヤマハンノキ(以下ハンノキ)に共生する窒素固定細菌の遺伝的多様性について継続して調べた。ハンノキ根の根粒共生体・ハンノキ直下の根圏土壌中・広域での土壌中という多階層空間スケールにおける遺伝構造を明らかにするために行っていたメタゲノム解析の結果が出揃った。
肝細胞癌再発関連遺伝子のDNA異常に基づく血液からの再発予測シ ステムの開発

肝細胞癌における術後1-2年での肝内再発予測システムの開発を目的とした。再発関連遺伝子の網羅的スクリーニングとして、DNAマイクロアレイとHiCEPの2つの異なる解析を行った。real-time PCRによる検証を経て、無再発生存期間と有意に関連する9遺伝子を再発関連遺伝子として同定した。4つの遺伝子発現レベルを組み合わせた術後2年以内再発予測式の性能は、Training (正確度88%)及びValidation (正確度80%)と示された。我が国では、肝細胞癌(HCC)の発生主因の一つとされているC型肝炎ウィルス感染者が多数存在しており、HCCに対する新たな診断・治療薬の開発が切望されている。本研究では肝内再発に対する再発予測システムの開発を行う。1)再発関連遺伝子の同定と検証マイクロアレイ解析より得られた肝細胞癌(HCC)再発関連遺伝子を定量的real-time PCR (qPCR)により検証したところ、3つの再発特異的なup-regulated遺伝子、5つのdown-regulated遺伝子の同定に成功した。また、マイクロアレイ解析及びqPCRによる検証から、肝細胞癌の分化度やステージで発現に変動の見られず、中程度の発現量を示す新たなリファレンス遺伝子として2遺伝子の同定に成功した。2)再発関連遺伝子のDNA異常の解析上記1)にて同定した再発関連遺伝子について、プロモーター領域のCpGアイランドの有無を解析したところ、3つの遺伝子のプロモーター領域にCpGアイランドが確認された。それぞれの遺伝子につき2箇所のメチル化特異的PCRを行うためのプライマーを設計し、条件検討を行いMSP条件を確立した。再発関連遺伝子のABCB6については、遺伝子の増幅・欠失に関するコピー数多型(CNV)解析をqPCRによって検証したが、遺伝子の増幅・欠失は観察されなかった。また、再発関連遺伝子のプロモーター領域をダイレクトシーケンスしたが、再発特異的な変異を見出すことはできなかった。再発関連遺伝子として同定したABCB6の肝細胞癌及び肝臓組織におけるmRNAレベルとDNAメチル化レベルとを組み合わせての術後2年以内の再発予測性能は、ROC曲線解析の結果、曲線下面積0.88、感度86%、特異度100%と高い性能を示した。1.再発関連遺伝子の同定と検証前年度に実施したDNAマイクロアレイ解析に加えて、High Coverage Expression Profiling( HiCEP)法により新たに6つの肝細胞癌(HCC)再発関連遺伝子候補を得た。得られた再発関連遺伝子を定量的real-time PCR (qPCR)により検証したところ、1つの再発特異的なup-regulated遺伝子、2つのdown-regulated遺伝子の同定に成功した。これらの遺伝子それぞれの癌部/非癌部発現比は、有意に無再発生存期間と関連していた。2.再発関連遺伝子のDNA異常の解析上記1)にて同定した3つの再発関連遺伝子について、プロモーター領域のCpGアイランドの有無を解析し、1つの遺伝子においてCpGアイランドが確認され、これに対するメチル化特異的PCR条件を確立した。HCC患者血清より、cell-freeDNAの抽出を行った。しかしながら、その収量は予備試験の段階よりも低く、定量的メチル化特異的PCRによる再発予測には、測定標的遺伝子を絞り込む必要が生じた。4,再発予測システムの構築血液からの再発予測システム構築には課題が見られたことから、手術標本からの再発予測システムの構築を行った。これまでの研究から同定した再発関連遺伝子も合わせて、合計9遺伝子のmRNA発現レベルから再発予測式を構築した。その結果、その内の5つの遺伝子発現レベルを組み合わせた式は、術後2年以内再発に関してROC曲線下面積0.983を示し、検証サンプルにおいても陽性的中率100%の性能を示した。我が国では、肝細胞癌の発生主因の一つとされているC型肝炎ウィルス感染者が多数存在しており、新たな診断・治療薬の開発が切望されている。1.再発関連遺伝子のDNA異常前年度までにDNAマイクロアレイ解析及びHiCEP解析から同定された再発関連遺伝子についてメチル化特異的PCRによる解析を行った結果、ABCB6遺伝子におけるDNAメチル化異常に加えて、新たに1遺伝子の再発と関連したDNAメチル化異常が示された。加えて、非癌部におけるグローバルメチル化マーカーであるAlu-repeatメチル化率による術後2年以内肝内再発識別能を解析した結果、ROC曲線下面積0.77 (感度66.7%、特異度93.3%)を示した。Alu-repeat低メチル化群は高メチル化群と比較して有意に無再発生存期間が短かった。2.再発予測システムの構築

再発関連遺伝子としてABCB6に加えて、網羅的スクリーニングとreal-time PCRによる検証から、TSPAN8, CYP2A6, SLC22A1, NQO1, SLC10A1, GLYAT, COL15A1を再発関連遺伝子として同定した。さらに上流配列解析からESR1も再発関連遺伝子と同定された。上記9遺伝子の発現は、無再発生存期間における有意な差を示した。手術標本からの再発予測システムの構築を行った。上記9遺伝子の中から4つの遺伝子発現レベルを組み合わせた術後2年以内再発予測式の性能は、Training (ROC曲線下面積0.99、正確度88%)及びValidation (正確度80%)と示された。異なる原理からなるトランスクリプトーム解析から、優れた再発予測性能を得ることが出来た。本研究による再発リスク予測からの患者層別化は、新たな再発抑制治療の開発への貢献が期待される。研究成果の特許出願(海外)に関して時間を費やした。また、再発予測システムについて、手術標本からは優れた性能のシステム構築に成功したが、当初目標の血液からのシステム構築には至っていない。これは予備試験から見積もっていた血液中のcell-freeDNAよりも本研究における血清からのcell-free DNAの収量が低かった事による。24年度が最終年度であるため、記入しない。再発予測については、手術標本を用いることで達成される。その後の、モニタリングには血液からの予測システムが必要である。手術標本からの再発予測システムの改良と共に、血液中の微量DNAの増幅やmulti-plexな解析方法をさらに検討し、研究を推進する。
酸化チタン光触媒作用による抗菌・防汚性薄膜コーティングの歯科用材料への応用

各種義歯用レジンやコンポジットレジン,セラミックス,純チタンを作製し,酸化チタンの薄膜コーティングが可能か検討した.その結果,スプレーコーティングによって,いずれの材料でも厚さ約0.7μmの酸化チタン薄膜を形成することができた.コーティング膜の表面分析を行ったが,いずれの基板で形成された薄膜も酸化チタンであり,結晶構造はアナターゼであることが判明し,薄膜の光触媒作用が期待できた.しかしながら,コーティング膜の基板との接着強さは,加熱温度が低かったレジンでは,約10MPaと低い値を示し,チタンやセラミックスでは80MPa以上の接着強さを示し,その有用性が示唆された.コーティングしたチタンでは耐摩耗性が向上したが,レジンではその密着強度が小さかったことから,簡単に剥離し耐摩耗性の向上が全く認められなかった.一方,Streptococcus mutansに対する抗菌性を,鋳造純チタン試験片撤去後,直下の培地の色調変化よって評価した.紫外線照射時間が3時間までは培地が黄変し,6時間では若干黄色を呈していたが,12時間と24時間では赤色のままであった.また,酸化チタンのコーティング処理は施してあるが紫外線照射を行わなかったコントロールの培地は黄変した.したがって,紫外線照射を行った光触媒活性をもつ酸化チタン薄膜は,S.mutansに対して抗菌活性を示すことがわかった.以上のことから,酸化チタンの薄膜コーティングは耐摩耗性の改善の上でも,チタンにはきわめて有効であり,6時間以上の紫外線照射を行うと,短期的にはS.mutansに対して抗菌効果を示すことが明らかになった.各種義歯用レジンやコンポジットレジン,セラミックス,純チタンを作製し,酸化チタンの薄膜コーティングが可能か検討した.その結果,スプレーコーティングによって,いずれの材料でも厚さ約0.7μmの酸化チタン薄膜を形成することができた.コーティング膜の表面分析を行ったが,いずれの基板で形成された薄膜も酸化チタンであり,結晶構造はアナターゼであることが判明し,薄膜の光触媒作用が期待できた.しかしながら,コーティング膜の基板との接着強さは,加熱温度が低かったレジンでは,約10MPaと低い値を示し,チタンやセラミックスでは80MPa以上の接着強さを示し,その有用性が示唆された.コーティングしたチタンでは耐摩耗性が向上したが,レジンではその密着強度が小さかったことから,簡単に剥離し耐摩耗性の向上が全く認められなかった.一方,Streptococcus mutansに対する抗菌性を,鋳造純チタン試験片撤去後,直下の培地の色調変化よって評価した.紫外線照射時間が3時間までは培地が黄変し,6時間では若干黄色を呈していたが,12時間と24時間では赤色のままであった.また,酸化チタンのコーティング処理は施してあるが紫外線照射を行わなかったコントロールの培地は黄変した.したがって,紫外線照射を行った光触媒活性をもつ酸化チタン薄膜は,S.mutansに対して抗菌活性を示すことがわかった.以上のことから,酸化チタンの薄膜コーティングは耐摩耗性の改善の上でも,チタンにはきわめて有効であり,6時間以上の紫外線照射を行うと,短期的にはS.mutansに対して抗菌効果を示すことが明らかになった.今年度はまず,酸化チタンの光触媒薄膜コーティングができる歯科用材料を決定することを主眼にした.各種義歯用レジンやコンポジットレジン,セラミックス,純チタンを作製し,酸化チタンの薄膜コーティングが可能か検討した.その結果,スプレーコーティングによって,いずれの材料でも厚さ約0.7μmの酸化チタン薄膜を形成することができた.薄膜の基板との密着性を高めるためには加熱することが必要であるが,チタンやセラミックスでは450°Cまで加熱できたが,レジンに関しては基板材料の変形を考慮して,50°C前後までしか加熱できなかった.次に,コーティング膜の表面分析を行ったが,いずれの基板で形成された薄膜も酸化チタンであり,その結晶構造はアナターゼであることが判明し,その光触媒作用が期待できると思われた.しかしながら,コーティング膜の基板との接着強さは,加熱温度が低かったレジンでは,約10MPaと低い値を示し,チタンやセラミックスでは80MPa以上の接着強さを示し,その有用性が示唆された.さらに,薄膜にステンレス球を滑走させてその摩擦係数を測定した.コーティングしたチタンでは耐摩耗性が向上したが,レジンではその密着強度が小さかったことから,簡単に剥離し耐摩耗性の向上が全く認められなかった.また,滑走部表面を電子顕微鏡で観察したところ,コーティングしたチタンでは明瞭に塑性変形しているのがわかったが,レジンでは膜にクラックが入り,チタンのような摺動痕が認められなかった.以上のことから,酸化チタンの薄膜コーティングは,チタンとセラミックスにきわめて有効であることがわかった.ブラックライトブルーランプ(波長が380nm付近の紫外線)を設置したブラックボックス内で、酸化チタンの光触媒薄膜をコーティングした鋳造純チタン表面に、2.0mW/cm^2の紫外線強度になるように、紫外線を1時間、2時間、3時間、6時間、12時間、または24時間照射した。Brain Heart Infusion中で24時間前培養したStreptococcus mutansを滅菌蒸留水で約10^5 cell/mlに調整した。これを0.5% saccharose含有Phenol Red Broth Base(PRBB)寒天培地中央に10μl(10^3 cell)滴下し、その上に滅菌後各時間紫外線照射した板状の鋳造純チタンを静置し、37°Cで6時間培養した。

試験片撤去後直下の培地の色調変化を観察し、抗菌性の有無を評価した。また、紫外線照射を行わなかったものをコントロールとして同様に測定した。PRBBはS.mutansの糖代謝に伴う酸(主として乳酸)産生により漸次pHが低下し、赤色から黄色へと色調変化(pH7.8)を起こす。この現象を抗菌効果の指標とし、寒天培地に含有されたPRBBによって、試験片直下の培地の黄変が観察されなければ抗菌性を示すと判断した。その結果、紫外線照射時間が3時間までは培地が黄変し、6時間では若干黄色を呈していたが、12時間と24時間では赤色のままであった。また、酸化チタンのコーティング処理は施してあるが紫外線照射を行わなかったコントロールの培地は黄変した。したがって、今回行った光触媒活性をもつ酸化チタン薄膜では、6時間以上の紫外線照射を行うと、短期的にはS.mutansに対して抗菌効果を示すことが明らかになった。
食塩過剰摂取高血圧に対する運動の改善効果

食塩過剰摂取が原因となる高血圧に対する運動の影響を降圧作用のあるANP,BNPの分泌の面から研究を行った。その結果、高血圧状態では安静時よりかなり多量のANP,BNPが分泌されることを予想していたが、意外にも少なくともANPについては分泌量が運動中に低下していることが示唆された。これは高血圧状態では運動することによって何らかの機序によって血圧を低下させているためと考えられるが、詳細については今後の課題である。Deoxycorticosterone acetateをラットに投与し、その後1%の食塩水を飲料として飼育することによって高血圧モデルラットを作成した。通常に飼育したラットに比べ血圧は有意に高くなった。3時間の水泳を通常血圧群、高血圧群に行わせた。水泳終了後心臓から採血し遠心分離後血漿を冷凍保存した。そして心臓を摘出した。心臓重量は高血圧群で有意に大きく、これらのことからモデルラットの作成には成功したと考えられる。右心房、左心房、右心室、左心室に分け、ホモジナイズした。その後ANP(心房性ナトリウム利尿ペプチド)、BNP(脳性ナトリウム利尿ペプチド)を抽出し放射免疫測定法あるいは酵素免疫測定法で測定した。血漿のANP濃度右心房、左心房のANP含量は高血圧群で高く、高血圧に対する反応でANP合成、そして分泌が増加していることが示唆された。ANP濃度のBNP濃度は高血圧、水泳に対し概して同様の変化を示し、相補的な分泌傾向は見られなかった。通常血圧群のラットでは水泳後の血漿ANP濃度は増加する傾向にあった。これは以前の実験結果と同様であり、運動中に増加する血圧に反応して分泌が高まったものと考えられる。右心房のANP含量は運動後低下する傾向にあり、これも以前の研究と同様であり、血漿ANP濃度上昇に貢献しているものと考えられる。そのほかの組織のANP含量については、はっきりした変化が現在のところ認められていない。これについてはさらに研究を進めていく計画である。BNPについても組織ごとの水泳、高血圧の影響ははっきりしていなかった。これについても今後研究を進めていく計画である。前年度に引き続き、Deoxycorticosterone acetateおよび1%食塩水を用いて作成した高血圧モデルラットを用いて心筋、血中ANP濃度、BNP濃度の測定をおこった。特に前年度、右心房のANP含量、血中ANP濃度については右心房のANP含量が運動により低下する傾向がみられ血中ANP濃度の運動による上昇の1要因と考えられたが、その他の部位についてははっきりとした傾向が見られなかったので、これらについてさらに検討した。しかしながら昨年と同様、明解な差異は見られなかった。今年度は心筋中のANP、BNPの合成過程の変化にも注目し、ANPmRNA、BNPmRNAの測定をRT-PCR法を用いて行った。これらの結果にも残念ながら運動による有意な傾向はみられなかった。とくに右心房、左心房の組織は小さく、RNAの収量が十分でないことも原因のひとつになった可能性がある。また今回用いたRT-PCR法はこれまでも、定量的な測定法というよりは半定量的な測定法と考えられてきた。現在、定量的な測定法としてリアルタイムRT-PCRがある。これを行うためには専用の測定機器が必要である。開発された当初はこの測定機器は非常に高価なためリアルタイムRT-PCR法による測定は難しかった。しかし近年この測定機械が普及するにしたがって価格も低下してきた。このような事情もあり最近、この機械を導入することができた。そこでリアルタイムRT-PCR法を用いて、水泳後のANPmRNA、BNPmRNAの変化について測定を心臓の各部位を用いて行っていく計画である。これらの測定と心臓各部位のANP、BNP含量、血中濃度の測定を進めていけば運動後の回復過程の状況が明らかになると考えられる。