hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
還元ストレス検出蛍光プローブ開発

多くの疾患の発症に、酸化還元反応の変動が関与することが報告されている。我々は、このレドックス変動の中で、特に、還元ストレスの検出を目的とした。そのために、新たにミトコンドリア移行性蛍光ニトロキシドプローブを開発した。その結果、本プローブは、ミトコンドリアでの還元ストレスを引き起こす過剰な電子供与体を細胞内で検出できることが分かった。酸化ストレスは様々な疾患の発症・進展に密接に関与している。しかしこの酸化ストレスを誘発するには、NADHやコハク酸など、還元物質の蓄積が必要である。つまり、還元ストレスが、後の酸化ストレス・生体内組織の障害を惹起する「疾患発症の開始点」であると申請者らは考えた。そこで本研究では、「ミトコンドリア内における還元ストレス検出蛍光プローブの開発とその評価」を目的とした。そのため、1)酸化還元電位を制御した還元ストレス検出蛍光プローブ開発、2)培養細胞モデルを用いた実証実験を、達成目標とした。以上の背景のもと、本年度は以下の研究を行った。1)酸化還元電位を制御した還元ストレス検出蛍光プローブ開発ミトコンドリアでの還元ストレスを測定可能な蛍光プローブを開発し、その評価を行った。この化合物は、通常のROSとは反応せず、還元物質、特に還元型ユビキノンと鋭敏に反応することが分かった。2)培養細胞モデルを用いた実証実験合成したミトコンドリア移行性還元ストレス蛍光プローブを用いて、培養細胞モデルを用いて検討した。ミトコンドリアでの還元刺激として、解糖系の基質のひとつであるリンゴ酸あるいはピルビン酸を添加した。その結果、添加10分以内に、還元ストレス検出プローブの蛍光強度は有意に上昇した。また、ミトコンドリア染色蛍光プローブとの共染色により、開発したプローブは、ミトコンドリアに局在していることがわかった。さらに非常に興味深いことに、この時点では、ミトコンドリアでのROS検出プローブの蛍光強度は上昇せず、24時間後にようやく亢進した。すなわち、ミトコンドリア解糖系の基質を添加することにより、酸化ストレスに先立って還元ストレスが亢進していることが示唆された。還元ストレスをターゲットとしたプローブ開発はこれまでほとんど行われていない。我々は、本年度までにミトコンドリアでの還元ストレスを評価できるプローブの開発に成功した。そこで、次年度以降は、実際に細胞実験を用いた実証実験を行う予定である。これまで、多くの疾患に酸化ストレスの関与が相次いで報告されている。しかし、酸化ストレスの原因である活性酸素の産生には、基質として還元物質あるいは電子が必要である。すなわち、酸化ストレス上昇には、過剰な還元物質が必要であり、生体内では還元ストレスが生じているはずである。事実、高血糖や肥満症などでは、NADHが上昇している。そこで本研究では、疾患における還元ストレスの関与という新たな概念を提唱するために、「還元ストレス検出プローブの開発とその評価」を目的とした。そのために本年度は、下記の点について検討した。1)酸化還元電位を制御した還元ストレス検出蛍光プローブ開発:昨年度までに開発したプローブの評価を行った。一方で、これら評価の際に新たに、還元および酸化ストレス両方に応答するプローブが開発可能であることを見出した。これは、化合物分子内に、金属分子による還元応答、および有機スピン分子による酸化応答に基づき設計されたものである。実際に、モデル実験系を用いて評価したところ、還元剤および酸化剤ともに反応することが分かった。2)培養細胞モデルを用いた実証実験前年度までに新たに開発した還元ストレス検出プローブを用いて、血清飢餓モデルで本プローブが有用であることを見出した。以上の結果より、還元ストレスという新たな概念に着目し、その検出技術開発とモデル実験系および細胞モデルで評価することが可能であった。今後、疾患モデル動物における評価の可能性について検討する予定である。平成28年度までに、還元ストレスをターゲットとしたプローブ開発に成功した。そこで、平成29年度は、以下2点を中心に検討する。1)酸化還元電位を制御した還元ストレス検出蛍光プローブ開発培養細胞モデルでの評価を継続するために、前年度までに選択した還元ストレス選択性蛍光プローブの大量合成を行う。また、本化合物の物性評価も併行して進める。2)培養細胞モデルを用いた実証実験前年度までに新たに開発した還元ストレス検出蛍光プローブを用いて、高グルコースモデル、さらにパルミチン酸添加による脂肪蓄積細胞などに適用し、本手法の有用性を検証する。一方で、興味深いことに予備検討の結果、血清飢餓モデルでも蛍光強度が大きく上昇した。そこで、これら種々の培養細胞モデルを用いて、還元ストレスおよび酸化ストレスとの関係を明らかにし、本研究を総括する。生物物理化学
分子が膜電位を感知する基本原理の理解

心臓の拍動や脳の活動に代表される生体の電気活動を発生させ制御する中心的な役割を担う電位依存性チャネルが膜電位を感知する仕組みを知ることを目的として行った。最小単位の電位依存性チャネルであるH+チャネルを対象に、膜電位センサーが膜電位を感知して動く様子、そしてチャネルが開くまでの分子の構造変化をダイナミックに解析し、電位依存性チャネルが膜電位を感じとるメカニズムを分子構造のレベルから明らかにした。心臓の拍動や脳の活動に代表されるように、細胞膜を介した電気的シグナリングは我々の生命活動にとって重要な役割を果たしています。その電気活動を発生させ制御する中心的な役割を担う分子が電位依存性イオンチャネルです。電位依存性イオンチャネルは分子内のプラスに帯電したアミノ酸残基をセンサーとして利用して、細胞膜にかかる電位(膜電位)を感じ取って構造変化を起こし、イオンの透過を制御しています。本研究では、最小単位の電位依存性チャネルであるH+チャネルを対象に、電気生理学的手法、光学的観測手法を用いて、分子の構造変化、センサー電荷の動きをダイナミックに解析し、電位依存性チャネルが膜電位を感じとるメカニズムを分子構造のレベルから明らかにすることを目的に行います。本年度は、H+電流とゲート電流の関係を定量的に解析することを試みた。H+電流のみが観測される野生型Hv、H+電流とゲート電流両方が観測される変異体チャネル、および、ゲート電流のみが観測される変異体チャネルそれぞれをツメガエル卵母細胞に発現させ、二本刺し膜電位固定法を用いて、観測できるゲート電流、H+電流に対して、電流の発生域値や電流ー電圧関係、膜電位依存性、キネティクスといった基本となる電気生理学的パラメターを定量的に解析した。新たにゲート電流の出現する変異体を検索した。生理的ブロッカーである亜鉛を用いて実験を行い、亜鉛の阻害機構について考察した。分子動力学的解析のための2量体構造モデルの作成、および光学的解析のための変異体作成を行った。本年度は、当初の予定通り、Hvの野生型および変異型チャネルに対して電気生理学的解析を行い、膜電位感受性の基本的な特性が明らかになり、この結果を踏まえ来年度以降の研究を遂行出来るため。また、結晶構造解析をもとに2量体構造モデルの作成に取り組み分子動力学的計算を実行中である。以上より研究課題はおおむね順調に進展している。本年度は、電位センサーの膜電位に応答した動きを観測し、膜電位を感知する動的構造基盤を明らかにする試みを行った。野生型Hvおよび変異体Hvに対して、電位センサーに点変異でCys残基を導入しローダミンを架橋付加しツメガエル卵母細胞に発現させ、二本刺し膜電位固定法による膜電位コントロール下に電位センサーの動きをローダミンから発せられる蛍光シグナルの変化により測定した。蛍光シグナルの発生域値や電流ー電圧関係、膜電位依存性、キネティクスといった基本となるパラメターを定量的に解析し、電気生理学的パラメタと比較した。Hvの結晶構造をもとに2量体モデルを作成し、分子動力学的解析を行った。2量体間機能連携の構造基盤を明らかにし、膜電位依存性との相関を考察した。本年度は、当初の予定通り、Hvの野生型および変異型チャネルに対して光科学的解析を行い、膜電位に応答して変化するシグナルを検出することが出来た。前年度に引き続き分子動力学的解析を行った。これら結果を踏まえ来年度以降の研究を遂行出来るため、研究課題はおおむね順調に進展している。本年度は、電気生理学的解析結果、光科学的解析結果と分子動力学的解析結果の相関を検討し、分子が膜電位を感じる仕組みを検討・考察した。新たに、ゲート電流を発生する変異体を見つけ電気生理学的に解析し、ゲート電流の出現するメカニズムについて検討した。ツメガエル卵母細胞からほ乳類の細胞へ発現形を変更し詳細な解析が出来るか検討した。ゲート電流は通常に発生させるが、イオン電流のキネティクスを著しく遅くする変異体を作成し解析した。温度操作を施すことでイオン電流のみを押さえることが出来ることを見いだし、ゲート電流をより詳細に解析した。

他の電位依存性チャネルに適用するため、Hvチャネルと他の電位依存性チャネルとのキメラ体を作成し、電流の出現について解析を行った。本年度は、当初の予定通り、電気生理学的解析結果、光科学的解析結果と分子動力学的解析結果の相関を検討し、分子が膜電位を感じる仕組みを検討・考察した。前年度からの引き続きで、分子動力学的解析を行い、チャネルの閉状態から開状態への遷移を検討した。さらに新たな変異体や実験温度制御によりより詳細に解析することが可能となった。これら結果を踏まえ来年度以降の研究を遂行出来るため、研究課題はおおむね順調に進展している。心臓の拍動や脳の活動に代表されるように、細胞膜を介した電気的シグナリングは我々の生命活動にとって重要な役割を果たしています。その電気活動を発生させ制御する中心的な役割を担う分子が電位依存性イオンチャネルです。電位依存性イオンチャネルは分子内のプラスに帯電したアミノ酸残基をセンサーとして利用して、細胞膜にかかる電位(膜電位)を感じ取って構造変化を起こし、イオンの透過を制御しています。本研究では、最小単位の電位依存性チャネルであるH+チャネルを対象に、電気生理学的手法、光学的観測手法を用いて、分子の構造変化、センサー電荷の動きをダイナミックに解析し、電位依存性チャネルが膜電位を感じとるメカニズムを分子構造のレベルから明らかにすることを目的に行います。本年度は、これまでに解析したゲート電流を発生する変異体の実験データをまとめ、ゲート電流の出現するメカニズムについて検討した。ツメガエル卵母細胞を用いて電気生理学的解析結果、光科学的解析を行った。その解析結果と構造生物学的解析結果の相関を検討し、分子が膜電位を感じる仕組みを検討・考察した。また、pHに影響を受けない変異体を作成することに成功し、pH感知と膜電位感知の機能的連関について検討した。昨年見いだした温度操作を施すことでイオン電流のみを押さえることが出来る手法を発展させ、ゲート電流をより詳細に解析し、チャネルの電位センサーの細胞膜内可動域について検討した。他の膜電位センサー一般に普遍性を持つか知るため、Hvチャネルと他の膜電位センサーとのキメラ体を作成し、電流の出現について解析を行った。心臓の拍動や脳の活動に代表される生体の電気活動を発生させ制御する中心的な役割を担う電位依存性チャネルが膜電位を感知する仕組みを知ることを目的として行った。最小単位の電位依存性チャネルであるH+チャネルを対象に、膜電位センサーが膜電位を感知して動く様子、そしてチャネルが開くまでの分子の構造変化をダイナミックに解析し、電位依存性チャネルが膜電位を感じとるメカニズムを分子構造のレベルから明らかにした。今後は、光科学的観測手法と分子動力学的手法を用いて、H+電流のみが観測される野生型Hv、H+電流とゲート電流両方が観測される変異体チャネル、および、ゲート電流のみが観測される変異体チャネルそれぞれに対して、定量的な解析を行い、得られた基本的な電気生理学的なパラメータとの相関を解析する。
担癌生体における骨髄由来免疫抑制細胞群の免疫抑制機構の解明

新規的がん免疫治療の開発のため、担がん生体内における免疫抑制性細胞である骨髄由来免疫抑制細胞(Myeloid-derived suppressor cells; MDSCs)の制御機構に関する研究を実施した。MDSCsは腫瘍内環境におけるIL-6が生存、増殖、機能に寄与しており、抗IL-6受容体抗体の投与によって、MDSCsが排除され、抗腫瘍T細胞免疫応答を介して腫瘍増殖が抑制できることを示した。さらに新規MDSCs誘導因子について実験を実施した。健常人PBMCを、IL-11存在下で7日間培養を行った結果、コントロール群に対してIL-11を添加した群で優位にCD11b+CD14+ヒト単球系MDSCsが増加した。また、このIL-11にて誘導された単球系MDSCsのHLA-DRの発現を精査したところ、HLA-DRの発現低下が認められた。このCD11b+CD14+ヒト単球系MDSCsの免疫抑制能についてT細胞との共培養にて検討を行った結果、IL-11を加えた群で強い免疫抑制能が認められた。また、その遺伝子発現を解析したところ、ARG1、iNOS、IL-10などと言った免疫抑制因子の発現上昇が見られた。次にIL-11で誘導される単球系MDSCsの分子メカニズムを解析した結果、IL-11-STAT3経路がMDSCsで活性化しており、STAT3を阻害する事でMDSCsの誘導効率の減少が認められた。また大腸癌患者の腫瘍組織において、IL-11およびリン酸化STAT3の発現が確認された。本研究において、MDSCsには免疫抑制細胞とその前駆細胞が存在し、腫瘍内環境に曝されることによってより強い免疫抑性能を獲得することが明らかとなった。抗IL-6R抗体やゲムシタビンとがん免疫療法、さらにはIL-11-STAT3経路を阻害することによるMDSCsの制御により、がん治療における抗腫瘍効果の増強が期待される。26年度が最終年度であるため、記入しない。MDSC (Myeloid-derived suppressor cells)への誘導はIL-6を阻害するだけでは完全に制御出来ず、どの腫瘍由来因子が起因となっているかは未だに不明である。抑制性MDSCに分化誘導させる因子を同定後、その因子により今までに報告されていない新たな免疫抑制分子の同定を担がんマウスを用いて行った。MDSCの新規免疫抑制機構としてCD73細胞表面分子に着目した。CD73分子は5'-nucleotidase活性によってAMPを脱リン酸化することによりアデノシン産生に関与し、T細胞活性を抑制することが知られている。担がん生体内MDSCにおけるCD73の発現を検討した結果、脾臓内MDSCではCD73の発現が認められなかったのに対し、腫瘍内浸潤MDSCではCD73の発現が認められた。そこで我々は腫瘍由来因子中に含まれるIL-6、TGF-βに着目した。担がんマウス脾臓よりMDSCを単離後、IL-6あるいはTGF-βの存在下でMDSCを培養した。その結果、脾臓内MDSCにおいてIL-6単独で加え培養を行った群ではCD73の発現が認められなかったのに対し、TGF-βを加えた群でCD73の発現が著しく上昇することが明らかとなり、TGF-βによりCD73発現が制御されていることが示された。結果より、腫瘍微小環境内で産生されるIL-6、TGF-β依存的にCD73を増強発現し、強い免疫抑制を示すと考えられる。CD73の発現はTGF-β/IL-6により制御されておりTGF-β/IL-6を介したMDSCの免疫抑制機構を制御することによって、より効果的ながん免疫治療が期待できる。

抗IL-6R抗体やゲムシタビンとがん免疫療法、さらにはIL-11-STAT3経路を阻害することによるMDSCsの制御により、がん治療における抗腫瘍効果の増強が期待される。26年度が最終年度であるため、記入しない。腫瘍内微小環境において、MDSCの誘導因子を同定した。また、新たな免疫抑制因子としてCD73の関与を見出した。当初の目的である2つの重要な課題は達成し、概ね順調であると思われる。今回明らかとした、IL-6/TGF-βを介したMDSC誘導機構を基盤とし、ヒトMDSCの解析を進めていく。ヒト癌患者抹消血において、LIN-HLA-DR-CD33+あるいはCD11b+CD14-CD33+細胞群がMDSCとして報告されている。しかし、腫瘍局所におけるMDSCの意義については解明されておらず、さらなる解析が必要である。
有限次元多元環のホッホシルトコホモロジーのBV-構造についての研究

今年度における計画は、半単純でない中山自己同型をもつ自己入射的多元環のホッホシルトコホモロジー上にBatalin-Vilkovisky構造(BV-構造)が存在するかどうかを調べることを目的とし、自己入射的中山多元環に関してそのことを調べることであった。前年度からの方針では、フロベニウス多元環のホッホシルトコホモロジーのBatalin-Vilkovisky構造の具体計算例はまだまだ少ない。今後は他のフロベニウス多元環のクラスに対して、そのホッホシルトコホモロジー環のBV-構造の具体計算を行い具体計算例を増やすことであった。今年度は、(i)ある多項式増大表現型の自己入射的多元環に対して、そのホッホシルトコホモロジー環の計算、(ii)ある半単純でない中山自己同型をもつ自己入射的中山多元環のホッホシルトコホモロジーに関するBatalin-Vilkovisky構造(BV-構造)の存在性に関する考察を行った。(i)に関しては、射影分解が周期的であることが知られているので、証明に用いられた射影分解を具体的に記述し、ホッホシルトコホモロジー群の構造を決定した。また、米田積を計算することによってホッホシルトコホモロジー環の構造も決定し、BV-構造の計算の準備を行うことができた。(ii)に関しては、2点の巡回クイバーと長さが4の道によって定まる自己入射的中山多元環に関して、BV-構造が存在するのかどうか検証した。この多元環は係数体の標数が2のとき、中山自己同型が半単純でないことが分かっており、ホッホシルトコホモロジー環の構造も知られている。Gerstenhaber bracketとBV-作用素の関係式から、BV-作用素の候補を絞ることができた。当該年度の計画に沿って、中山自己同型が半単純でない自己入射的中山多元環に対して、そのホッホシルトコホモロジーがBatalin-Vilkovisky構造(BV-構造)をもつかどうか考察した。しかしながら、ある自己入射的中山多元環のホッホシルトホモロジーに関しては、BV-作用素の候補を絞ることはできたが、一般化するまでには至っていない。引き続き中山自己同型が半単純でない自己入射的中山多元環のホッホシルトコホモロジー上にBatalin-Vilkovisky構造(BV-構造)をもつのかどうかを考察する。また、多項式増大表現型のホッホシルトコホモロジー上のBV-構造の計算も行う。今年度における計画は、ホッホシルトコホモロジー環のBatalin-Vilkovisky構造(BV-構造)の具体計算例を増やすことを目的とし、中山自己同型が半単純であるフロベニウス多元環の具体的なクラスに対するホッホシルトコホモロジー環のBV構造の具体計算を行うことであった。特に、自己入射中山多元環に対して、そのホッホシルトコホモロジー環のBV-構造を具体的に決定することであった。今年度は、代数的閉体上の中山自己同型が半単純である自己入射中山多元環を対象に、そのホッホシルトコホモロジーのBV-構造を決定することができた。特に、自己入射中山多元環のホッホシルトコホモロジー環の構造は[Bardzell-Locateli-Marcos, 2000]において、生成元とその間の積と関係を定めることによって得られている。Bardzell(1997)による射影分解とbar resolutionの間の複体の準同型を用いることによって、コホモロジー群の各次数における基底に対してBV-differentialによる像をそれぞれ決定し、BV-構造の精密な表示を得ることができた。また、BV-構造からGerstenhaber algebraの構造も決定した。具体的には、Gerstenhaber bracketが零写像になることが分かった。また、中山自己同型が半単純でない自己入射多元環に対しては、Volkov(2016)によって導入されたコホモロジー環を計算し、そのBV-構造の具体的な表示を得ることができた。このコホモロジーに関してもGerstenhaber bracketが零写像になることが分かった。当該年度の研究計画に沿って、中山自己同型が半単純である自己入射中山多元環のホッホシルトコホモロジーのBatalin-Vilkovisky構造(BV-構造)を具体的に決定することができたため、おおむね順調に進展していると考えている。また、中山自己同型が半単純でない場合についても中山自己同型から得られるコホモロジーのBV-構造を具体的に決定することができたことは、中山自己同型が半単純でない場合のフロベニウス多元環に対して、そのホッホシルトコホモロジー上でBV-構造の存在を考える上でも重要な手掛かりになると考えている。

(i)に関しては、射影分解が周期的であることが知られているので、証明に用いられた射影分解を具体的に記述し、ホッホシルトコホモロジー群の構造を決定した。また、米田積を計算することによってホッホシルトコホモロジー環の構造も決定し、BV-構造の計算の準備を行うことができた。(ii)に関しては、2点の巡回クイバーと長さが4の道によって定まる自己入射的中山多元環に関して、BV-構造が存在するのかどうか検証した。この多元環は係数体の標数が2のとき、中山自己同型が半単純でないことが分かっており、ホッホシルトコホモロジー環の構造も知られている。Gerstenhaber bracketとBV-作用素の関係式から、BV-作用素の候補を絞ることができた。当該年度の計画に沿って、中山自己同型が半単純でない自己入射的中山多元環に対して、そのホッホシルトコホモロジーがBatalin-Vilkovisky構造(BV-構造)をもつかどうか考察した。しかしながら、ある自己入射的中山多元環のホッホシルトホモロジーに関しては、BV-作用素の候補を絞ることはできたが、一般化するまでには至っていない。フロベニウス多元環のホッホシルトコホモロジーのBatalin-Vilkovisky構造の具体計算例はまだまだ少ない。今後は他のフロベニウス多元環のクラスに対して、そのホッホシルトコホモロジー環のBV-構造の具体計算を行い、ホッホシルトコホモロジーを得るために構成した射影分解との関係を考察する。引き続き中山自己同型が半単純でない自己入射的中山多元環のホッホシルトコホモロジー上にBatalin-Vilkovisky構造(BV-構造)をもつのかどうかを考察する。また、多項式増大表現型のホッホシルトコホモロジー上のBV-構造の計算も行う。当初の計画であったドイツのシュトゥットガルト大学への在外研究において、大学内の研究費を使用したため、次年度使用額が生じた。次年度では、シュトゥットガルト大学へ研究滞在費に使用する予定である。今年度は2018年度の配分額をほぼ計画通りに使用し、前年度の次年度使用額が残った。次年度使用額はの国際研究集会の旅費に充てる予定である。
養殖魚の春季発動を制御する新規キスペプチンシステムに関する研究

脊椎動物の性成熟を支配する脳-脳下垂体-生殖腺軸(BPG-axis)の活動は,春機発動の開始に伴い活性化すると考えられているが,魚類ではその詳細は明らかでない。これまでBPG-axisの最上位における生殖制御因子として生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)が知られていたが,近年,哺乳類において, GnRHの分泌を促して性成熟の引金を引く因子,キスペプチン(Kiss)が発見された。急速に進展している哺乳類でのKiss研究に比べ,魚類のKiss研究は少なく,現在,メダカ,ゼブラフィッシュ,キンギョ,フグやシーバスでの研究があるに過ぎず,その機能もほとんど明らかでない。本研究では,春機発動機構解明のための解析ツールと全生活史にわたる飼育実験系が整備されているマサバを用いて,期間内(平成23年9月25年8月)に, KissによるGnRH制御機構,およびマサバへのKiss投与による春機発動促進効果を明かにする。本年度(平成25年4月平成25年9月)は, 2種のKiss受容体(KissR1, KissR2)の遺伝子クローニングを行い,合成したマサバKiss1-15およびKiss2-12をリガンドとしたレポーター遺伝子アッセイを行った。その成果、KissR1はKiss1-15の、またKissR2はKiss2-12の固有な受容体であり、それぞれのKiss受容体へのシグナルは、PKC/MAPKs経路で伝達されることが明らかとなった。(抄録なし)(抄録なし)脊椎動物の性成熟を支配する脳-脳下垂体-生殖腺軸(BPG-axis)の活動は,春機発動の開始に伴い活性化すると考えられているが,魚類ではその詳細は明らかでない。これまでBPG-axisの最上位における生殖制御因子として生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)が知られていたが,近年,哺乳類において,GnRHの分泌を促して性成熟の引金を引く因子,キスペプチン(Kiss)が発見された。本研究では,春機発動機構解明のための解析ツールと全生活史にわたる飼育実験系が整備されているマサバを用いて,Kissの機能を明かにする。平成23年度はマサバの2種Kissの遺伝子クローニングの結果に基づき、マサバのKiSS-1およびKiSS-2抗体を作製し神経分泌細胞の脳内局在を調べるとともに,生殖周期に伴う雌雄の脳内における2種KissのmRNA発現量を調べた。その結果,KiSS-1細胞は脳内に広く分布しているのに対し,KiSS-2細胞は視床下部にのみ存在することが明らかとなった。さらに,生殖周期に伴う雌の脳内における2種KissのmRNA発現量を調べた結果,KiSS-2発現量は成熟に伴い減少し,産卵期後に最も低くなったが,KiSS-1の発現量は生殖周期を通して一定であった。以上,マサバではKiss-2がBPG-axisの最上流で性成熟を制御していることが示唆された。次に、孵化仔魚から満1歳になるまでの標本を随時採集し、性分化および生殖腺の発達過程を組織学的に明らかにするとともに、マサバは満1年で初回成熟に達することを確認した。さらに、雌の初回成熟に伴う脳下垂体における生殖腺刺激ホルモン遺伝子の発現解析を行った。その結果、FSHβレベルは、卵黄形成中に既に高い値を維持していた。一方、GPαおよびLHβレベルは卵黄形成後期でピークとなった。さらに3種サブユニットのmRNAレベルは産卵期終了後に低下した。これらの結果より、FSHは卵黄形成に、LHは卵黄形成と卵成熟両方に関与していることが示唆された。Kiss遺伝子の初回成熟に伴う発現変動は、今後行う予定である。魚類の春機発動(初回成熟,Puberty)機構の理解およびその制御技術の開発は,基礎生物学上の重要性のとどまらず,水産増養殖への応用にとっても極めて重要である。例えば,初回成熟の開始までに多年月を要し,親魚の育成に要する時間,餌,労力,施設のコストなどがかさむようなクロマグロや大型ハタ類などで春機発動が制御可能となり,まだ小型のうちに成熟・産卵させることができれば,増養殖事業におけるメリットは計り知れない。本研究では,春機発動機構解明のための解析ツールと全生活史にわたる飼育実験系が整備されているマサバを用いて,期間内(平成23年9月25年8月)に,KissによるGnRH制御機構,およびマサバへのKiss投与による春機発動促進効果を明かにする。本年度(平成24年4月平成25年3月)は,以下の成果が得られた。1)マサバへのKiss投与による成熟促進効果

産卵期前の未熟な生殖腺をもったマサバ雌雄成魚(2歳)に対して,合成したKiss-1(アミノ酸15個)およびKiss-2(アミノ酸12個)を,徐放作用のあるオスモティックポンプに封入し,腹腔内投与して45日後に取り上げた。その結果,Kiss-1投与した雄では精巣の成熟が促進され,排精に至った。また,Kiss-1投与した雌では卵黄形成の開始が起こっていた。一方,Kiss-2投与した雌雄いずれにおいても,生殖腺の成熟促進効果は認められなかった。2)マサバ未成魚に対するKiss投与による春機発動促進効果マサバの初回成熟前の0+魚を対象にして,合成Kiss-1(アミノ酸15個)およびKiss-2(アミノ酸12個)を,カカオバターに封入し,2週間間隔で3回筋肉内投与し,42日後に取り上げた。その結果,Kiss-1投与した雄では生殖腺指数(GsI)が上昇し,精子形成が促進された。一方,Kiss-1投与した雌,およびKiss-2投与した雌雄では,顕著な変化は認められなかった。これらの結果より,マサバではKiss-1が雄の春機発動を促進していることが明らかとなった.脊椎動物の性成熟を支配する脳-脳下垂体-生殖腺軸(BPG-axis)の活動は,春機発動の開始に伴い活性化すると考えられているが,魚類ではその詳細は明らかでない。これまでBPG-axisの最上位における生殖制御因子として生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)が知られていたが,近年,哺乳類において, GnRHの分泌を促して性成熟の引金を引く因子,キスペプチン(Kiss)が発見された。急速に進展している哺乳類でのKiss研究に比べ,魚類のKiss研究は少なく,現在,メダカ,ゼブラフィッシュ,キンギョ,フグやシーバスでの研究があるに過ぎず,その機能もほとんど明らかでない。本研究では,春機発動機構解明のための解析ツールと全生活史にわたる飼育実験系が整備されているマサバを用いて,期間内(平成23年9月25年8月)に, KissによるGnRH制御機構,およびマサバへのKiss投与による春機発動促進効果を明かにする。本年度(平成25年4月平成25年9月)は, 2種のKiss受容体(KissR1, KissR2)の遺伝子クローニングを行い,合成したマサバKiss1-15およびKiss2-12をリガンドとしたレポーター遺伝子アッセイを行った。その成果、KissR1はKiss1-15の、またKissR2はKiss2-12の固有な受容体であり、それぞれのKiss受容体へのシグナルは、PKC/MAPKs経路で伝達されることが明らかとなった。Kissの2種抗体の作製およびそれらを用いた脳内Kiss産生神経細胞の特定ができた。また、孵化直後から初回成熟に至る標本を採集し、Kissの下流で生殖腺の発達を制御する生殖腺刺激ホルモン(GtH)の、初回成熟に伴う発現変動を明かにできた。これまでの1年半で,1)雌の成熟・排卵過程における脳内KissおよびGnRH mRNAの発現解析,2)2種のKiss(Kiss-1,Kiss-2)産生細胞の脳内局在,3)マサバ親魚へのKiss投与による成熟促進効果,および4)マサバ未成魚に対するKiss投与による春機発動促進効果,等の成果が得られ,国際学会,国際学術誌を介して公表してきており,概ね順調に進展していると判断した。(抄録なし)本年度は以下の実験を行い、マサバの春季発動におけるKissの機能を明かにする。1)春機発動前のマサバ雌雄(1歳)に対して,合成Kiss-1およびKiss-2を筋肉内投与し,定期採集を行う。
ECISによる培養血管内皮細胞の動態挙動の解析と評価

研究実施最終年度である本年度は、培養内皮細胞層の電気インピーダンス計測(ECIS)用の流れ負荷システムの改良を行い、流れ負荷時の培養内皮細胞の巨視的な挙動(マクロメーターオーダー)と微視的な挙動(ナノメーターオーダー)の関連性が検討出来るシステムの構築を行った。ECIS計測用電極アレイは、厚さ約0.5mmで、金電極の厚みは数mmである。倒立位相差顕微鏡観察において、倍率20倍の対物レンズでは焦点距離は2mm程度なので、電極アレイが顕微鏡ステージ上に直接接触するようフローチャンバーを製作した。製作したチャンバーを用いて、培養内皮細胞のヒスタミンならびにVEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)に対する内皮細胞間隙変化を調べた。ヒスタミンは炎症部位などで内皮間隙を拡げ、各種血中成分の漏出を促すことがしられているが、ヒスタミンを内皮細胞に投与すると細胞-基質間抵抗成分はほとんど変化が見られなかったが、細胞-細胞間抵抗成分は一過性に低下した。VEGF投与時には、逆に細胞基質間抵抗成分が一過性に減少したが、細胞-細胞間抵抗成分には大きな変化が見られなかった。現在、薬剤に対する内皮細胞の反応が多く研究されているが、インキュベーターの扉の開閉によってインキュベーター内CO2濃度が変化し、その結果内皮細胞間隙が変化することを我々は見いだしている。ECIS用フローチャンバーを用いると、内皮細胞に対して薬剤を投与するとき、CO_2濃度変化ならびにそれにともなうpH変化の影響を除去することが出来、薬剤に対する内皮細胞の反応機構の研究に大変有効であることがわかった。現在使用できる対物レンズは20倍であるが、今後、正立顕微鏡との複合化を図り、より高倍率での観察が可能になるようシステムの改良を行う予定である。通常のECISの計測では、静置培養下の細胞の計測しか行うことが出来ないが、本研究ではフローチャンバー設置用電極アレイ、ならびにECIS計測用のフローチャンバーの製作を行った。装置の妥当性の検証として、細胞を播種せず、フローチャンバー設置用電極アレイのみを用いてインピーダンスの計測を行った。その結果、静置培養用電極アレイと同様の値が得られた。フローチャンバー設置用電極アレイにウシ大動脈由来培養内皮細胞を播種し、大動脈の平均的な値である2Paのずり応力を負荷した。その結果、流れ負荷直後に急激にインピーダンスが上昇し、20分程度後にはほぼ基のレベルに低下した後、さらにインピーダンスの低下が認められた。ずり応力負荷直後の急激なインピーダンスの上昇は、流路内の圧の上昇によって内皮細胞が基質面に押しつけられ、物理的な要因によるものと思われる。その後に見られたインピーダンスが徐々に低下する反応は、ずり応力の負荷によって内皮細胞が形態変化をする過程で、内皮細胞-細胞間、あるいは細胞-基質間のタンパク分布が変化して接着性が変わり、それらの反応を反映したものと思われる。以上より、本装置を用いれば内皮細胞が生体内に置かれているメカノストレス負荷状態におけるバリアファンクションの評価が可能であることが示唆された。現在のところ、電極コネクターなどの既存の装置を流用したシステムとなっているため、流れ負荷状態での内皮細胞の観察が不可能となっている。次年度はさらに装置に改良を加え、細胞を観察しながら計測が可能なシステムを構築する予定である。
新陳代謝機能を有する光触媒機能界面の開発と高効率環境浄化

本研究では、光触媒の高効率化のために、光触媒のもつ酸化分解力と超親水性に加えてモノリス構造がもつ新陳代謝機能を付与し、実用性に富んだ高効率環境浄化材料(空気浄化、セルフクリーニング)を開発することを目的とする。本年度は下記について明らかにした。1.可視光に透明な、酸化チタン微粒子を含むモノリス多孔体の作製方法を確立した。また、透明チタニアモノリス多孔体はチタンイソプロポキシドや塩酸などの量比、熱処理時の温度などを変えることにより、連続的に多孔体の空孔サイズが変化することを明らかにした。2.モノリス多孔体作製時の初期に形成されるスキン層を除去する方法を確立した。具体的には、ダイヤモンド研磨紙を用いて表面研磨機によるモノリス多孔体の表面研磨を行った。その際、ダイヤモンド研磨紙の種類(ダイヤモンドのサイズ、粗さ)や表面研磨時間、表面研磨スピードの最適化を行った。上記表面研磨を行うことによりスキン層が除去でき、モノリス構造の露出を電界放出型電子顕微鏡によって確認することができた。3.上記で作製したモノリス多孔体が連続貫通孔を有しているかどうかを確認する実験を行った。具体的には、色素を溶解した溶液をモノリス多孔体に滴下し、所定時間放置の後にモノリス多孔体表面の色素溶液を拭きとった際、モノリス多孔体を貫通して裏面に移動した色素溶液が残るかどうかを評価した。その結果、裏面のみ色素溶液が残る結果となり、モノリス多孔体が連続貫通孔を有していることが推測された。本評価法はそれ自体が連続貫通孔の確認を行う新しい方法論となりうる。当初の計画では、新陳代謝機能を有するモノリス多孔体を作製することにとどまっていた。しかし、現在の研究では、それに可視光に対する透明性(透過性)が付与することができた。すなわち、新陳代謝機能を有する透明モノリス多孔体が得られ、これは応用・実用を視野に入れた際により有利となる。したがって、当初の警戒区以上に研究が進展した。今後は作製した透明モノリス多孔体の実用化の検討に入る。具体的には耐候試験機を用いて長期間の耐久性や新陳代謝機能の有効性などを評価する予定である。1.酸化チタンをベースとするモノリス多孔体の作製方法を確立した。また、チタニアモノリス多孔体はチタンイソプロポキシドや塩酸などの量比を変えることで連続的に多孔体の空孔サイズが変化することを明らかにした。2.作製したチタニアモノリス多孔体のXRDを測定した。500°C焼成後はアナターゼ型、700°C以上の焼成ではルチル型のチタニアが生成していることがわかった。また、チタニアモノリス多孔体のSEM像では、共連続孔を有する多孔体(モノリス)であることを確認した。また、1300°C以上での焼成後は、チタニアの焼結によってモノリス構造が消失していた。3.各温度で焼成後の細孔分布を測定した。500°Cから110°C焼成後は約1μmのマクロポアをもち、モノリス構造に由来することが推測された。また、500°C焼成後では約10nm、700°C焼成後では約30nmのメソポアもさらにもっていた。次に、ビッカース硬さ測定を行った。チタニアモノリスは、焼成温度が上昇するにつれてビッカース硬さも増加するが、500°Cから700°C、1100°Cから1300°Cの間で特に大きく硬さが変化した。これは前述したように、焼結によるメソポアの細孔経の変化とマクロボアの消失に由来すると推察した。

その結果、裏面のみ色素溶液が残る結果となり、モノリス多孔体が連続貫通孔を有していることが推測された。本評価法はそれ自体が連続貫通孔の確認を行う新しい方法論となりうる。計画通りの結果が得られているため。当初の計画では、新陳代謝機能を有するモノリス多孔体を作製することにとどまっていた。しかし、現在の研究では、それに可視光に対する透明性(透過性)が付与することができた。すなわち、新陳代謝機能を有する透明モノリス多孔体が得られ、これは応用・実用を視野に入れた際により有利となる。したがって、当初の警戒区以上に研究が進展した。今後も計画をもとに、研究を進める予定である。今後は作製した透明モノリス多孔体の実用化の検討に入る。具体的には耐候試験機を用いて長期間の耐久性や新陳代謝機能の有効性などを評価する予定である。
Sema6D-Plexin-A1相互作用の樹状細胞移動制御機構に関する研究

セマフォリンの代表的な受容体であるplexin-Alは、神経系における解析から細胞運動に関与することが知られている。申請者のこれまでの解析から、plexin-Al欠損マウスでは生体内におけるT細胞primingが障害されていることが明らかにされているが、その詳細については不明であった。本研究では、I)樹状細胞のtraffickingにおけるplexin-Alの役割の検討及び、II)plexin-Alの下流のシグナル経路の解析を目的としているが、これまでの研究成果により、1)plexin-Al欠損樹状細胞は末梢組織から所属リンパ節への遊走が障害されていること、2)樹状細胞が末梢から所属リンパ節へ遊走する際の、リンパ管内皮細胞をtransmigrationする過程にplexin-Alが重要な役割を担うこと、3)樹状細胞が内皮細胞をtransmigrationする過程にはSema6D-plexin-Al相互作用よりもむしろ、Sema3A-Neuropilin-1-plexin-Al相互作用が重要であることを、Sema3A, Sema6C, Smea6D欠損マウス及びNeuropilin-1変異マウスの解析から明らかにした。そして本年度の研究成果によりSema3Aによりmyosin light chainのリン酸化が誘導され、樹状細胞移動に必須であるactomyosin contractionが惹起されることを明らかにした。一連の研究成果に関する論文を現在投稿中である。本研究はSema6D-Plexin-Al相互作用による樹状細胞の移動制御機構の解明を目的としている。本年度はplexin-Al欠損樹状細胞を用いたin vivo traffickingの解析を中心に行った。はじめに、plexin-Al欠損樹状細胞を蛍光標識してマウスのfootpadに移入すると、所属リンパ節に遊走してくる樹状細胞の数が、plexin-Al欠損樹状細胞で減少しているとの知見を見出した。また、内因性の樹状細胞の移動を評価する実験系であるFITCskin paintingにおいても、plexin-Al欠損樹状細胞は所属リンパ節への移動が障害されていた。以上より、plexin-Al欠損樹状細胞はin vivoにおいて末梢組織から所属リンパ節への移動が障害されていることが明らかとなった。次に、末梢組織から所属リンパ節へ樹状細胞が移動する過程に着目し更なる検討を行った。Plexin-Al欠損樹状細胞は抗原の取り込み能及びケモカインに対する方向感知能や反応性に障害は認めなかった。また、組織樹状細胞の末梢微小リンパ管への集積も野生型に対し有意な差は認めなかった。しかし、樹状細胞と内皮細胞の相互作用をtime lapseイメージング及び共焦点レーザー顕微鏡により観察したところ、plexin-Al欠損樹状細胞は内皮細胞の細胞間隙をtransmigration出来ないことを見出した。更に樹状細胞と内皮細胞の接着面において認められるF-actinの集積が、plexin-Al欠損樹状細胞ではあまり認められないことが分かった。本年度の研究により、樹状細胞移動に際し、樹状細胞がリンパ管内皮細胞をtransmigrationする過程にセマフォリンシグナルが重要な役割を担っていることを明らかにし、セマフォリンによる免疫細胞移動制御という新たな機能を見出した。申請者のこれまでの解析から、Plexin-Al欠損マウスでは生体内におけるT細胞primingが障害されていることが明らかにされているが、その詳細については不明であった。本研究では、I)樹状細胞のtraffickingにおけるplexin-Alの役割の検討及び、II)plexin-Alの下流のシグナル経路の解析を目的としているが、一昨年の研究成果により、1)plexin-Al欠損樹状細胞は末梢組織から所属リンパ節への遊走が障害されていること、2)樹状細胞が末梢から所属リンパ節へ遊走する際の、リンパ管内皮細胞をtransmigrationする過程にplexin-Alが重要な役割を担うこと、を明らかにした。本年度は更に、3)樹状細胞が内皮細胞をtransmigrationする過程にはSema6D-plexin-Al相互作用よりもむしろ、Sema3A-Neuropilin-1-plexin-Al相互作用が重要であることを、Sema3A,Sema6C,Smea6D欠損マウス及びNeuropilin-1変異マウスの解析から明らかにした。
機能性モノマーの合成方法、純度が接着性、耐久性、歯質との化学反応性に及ぼす影響

歯科ボンディング材は,含有される機能性モノマーによって,接着強さと耐久性が異なることが知られている。これまでに同じモノマーでの接着力や耐久性の差に関する報告はなく,その要因はわかっていない。本研究では,異なる合成方法で作製された10-MDPの純度,安定性,ハイドロキシアパタイトとの化学反応性を解析し,さらに接着強さ測定とナノレベルでの接着界面の観察を行うことにより,モノマーの合成方法,純度が接着強さ,耐久性に影響を及ぼすメカニズムの解明を行った。本研究により,機能性モノマーの純度が,ハイドロキシアパタイトとの化学反応性,接着強さ,耐久性に影響を及ぼすことがわかった。本研究は、歯質接着材料でよく用いられている機能性モノマー10-MDPの純度が、安定性、ハイドロキシアパタイトとの化学反応性を解析し、さらに接着強さ測定とナノレベルでの接着界面の観察を行うことにより、モノマーの合成方法、純度が接着強さ、耐久性に影響を及ぼすメカニズムを解明するものである。また、15w%10-MDP溶液を牛歯象牙質に塗布した時のX線回折測定では、低角側に観察される10-MDP_Ca塩の層状構造に由来するピーク強度が、10-MDP_KNでは非常に強いのに対し、10-MDP_PCM、10-MDP_DMIではそれほど強くなかった。また、10-MDP_DMIでは歯質と反応しなくても層状構造物の存在が確認され、EDS分析からそれがナトリウム塩であることが示唆された。以上から、3種の10ーMDPは純度が異なり、それにより、接着強さ、耐久性に大きく影響を及ぼしていることが示唆された。本研究成果は、2014年12月に神戸で行われた、接着歯学会で発表を行った。現在、Journal of Dental Researchに投稿中である。歯科ボンディング材は、含有される機能性モノマーによって、接着強さと耐久性が異なることが知られている。応募者は、接着耐久性が良いとされている10-MDPであっても合成されるメーカーによって接着強さ、耐久性に差があることを認めた。これまでに同じモノマーでの接着力や耐久性の差に関する報告はなく、その要因はわかっていない。本研究では、異なる合成方法で作製された10-MDPの純度、安定性、ハイドロキシアパタイトとの化学反応性を解析し、さらに接着強さ測定とナノレベルでの接着界面の観察を行うことにより、モノマーの合成方法、純度が接着強さ、耐久性に影響を及ぼすメカニズムの解明を行った。本研究では、3つの異なるメーカーの10-MDPを用い、NMR、FTIRを用いて、その組成を調べた。NMR,FTIRでの分析から、メーカーにより、10-MDPにダイマーや不純物が認められるものもあった。さらに、それぞれの10-MDPを用いてプライマーを作製し、象牙質との接着強さを検討したところ、それら不純物などが含まれるものは、接着強度、耐久性が劣ることもわかった。また、透過電子顕微鏡での界面の観察から不純物を含むものは、象牙質界面の脱灰性や10-MDPとアパタイトが反応して形成される10-MDP-カルシウム塩の形成が少ないこともわかった。また、不純物の存在するものは、アパタイトや象牙質との耐久性も劣ることがわかった。これらから、機能性モノマーの純度が、ハイドロキシアパタイトとの化学反応性、接着強さ、耐久性に影響を及ぼすことがわかった。2年間で進める予定であったが、化学分析の結果が、これまでに得られていた接着試験、耐久性試験の結果を裏付けるものであった。また、2014年12月に学会で発表したことにより、多くの参加者から研究、実験に関するアドバイスをいただき、本研究成果をまず1本目の論文として投稿することができた。さらに研究を進めていく予定である。27年度が最終年度であるため、記入しない。歯科補綴学,保存修復学1)重合への影響異なるメーカーの10-MDPが、重合へ及ぼす影響について、重合率、微小硬さを測定し解明する。2)他のモノマーとの相互作用ボンディング材は、機能性モノマーだけでなく他のモノマーが含まれているが、応募者は、象牙質やアパタイトの脱灰量や層状構造の形成などは、HEMAなどの他のモノマーの影響を受けることを報告した。10-MDPの合成方法、純度が異なる場合に、他のモノマーとの相互作用に影響があるのかを検討する。さらに最近では、他の機能性モノマーGPDMや4-METなどが単独または10-MDPとの混合で用いられれていることが多く、その歯質接着性などを評価する。
酸化的カップリングによる含硫黄縮合芳香族化合物の高効率合成

ロジウム、パラジウム、あるいはルテニウムなどの遷移金属触媒を用いる種々芳香族基質とアルキンおよびアルケンとの酸化的カップリング反応について検討を行い、炭素-水素結合切断を経る様々な新規反応の開発に成功した。これらの開発した反応を駆使して、硫黄などのヘテロ元素を含む縮合へテロ芳香族化合物を効率よく合成できることを示した。本研究の初年度にあたる平成22年度は、おもにロジウム触媒を用いる芳香族基質とアルキンあるいはアルケンとの酸化的カップリング反応について検討を行い、縮合ヘテロ芳香族化合物を始めとするπ共役分子合成反応開発およびそのような反応に適した触媒のスクリーニングを行った。その結果、反応系を適切に設定することで、様々な芳香族基質の炭素-水素結合が位置選択的に切断された後、不飽和化合物の挿入が起こり、種々π共役分子が効率良く合成できることが明らかとなった。さらに触媒のスクリーニング中に、従来のパラジウム、ロジウム、およびイリジウム錯体に加えて、ルテニウム錯体も酸化的カップリングに対して高い活性を示すことを見出した。特に、チオフェンカルボン酸とアルケンとの酸化的カップリングにおいて、パラジウムやロジウム触媒存在下では、脱炭酸を伴ってカップリングが進行するのに対し、ルテニウム触媒を用いると脱炭酸が抑えられ、生成物としてアルケニル基を有するチオフェンカルボン酸が選択的に得られる。生成物中にカルボキシル基が残るため、これを使ってさらなる誘導体化が可能となる。今後、これまで見出したロジウム、パラジウム、イリジウム、およびルテニウム触媒反応を用いて種々含硫黄縮合芳香族化合物の合成を行っていく予定である。その予備的検討として、ベンゾチオフェン、チオフェン、および2-フェニルベンゾチアゾール類のアルケニル化を行った。ここで得られた生成物は、適当な分子内脱水素を行うことで、縮合環化合物へと容易に転換できる。本研究の二年目にあたる平成23年度は、まずこれまでほとんど検討されてこなかったルテニウム触媒を用いる芳香族基質とアルキンあるいはアルケンとの酸化的カップリング反応について検討を行い、新規π共役分子合成反応の開発を行った。その結果、反応系を適切に設定することで、多様な芳香族基質の炭素ー水素結合が位置選択的に切断された後、不飽和化合物の挿入が起こり、複雑なπ共役分子が一段階で効率良く合成できることが明らかとなった。得られた研究成果は、速報二報にまとめ、国際誌に掲載された。特筆すべきは、2-フェニルベンゾチアゾールの直接アルケニル化に初めて成功したことである。この基質の反応は、他の遷移金属触媒を用いた場合にはうまく進行しないことから、含硫黄ヘテロ環を有する基質の直接変換においてルテニウム触媒が有効であることが示唆される。一方で、これまで継続的に検討してきたロジウムおよびパラジウム触媒を用いた反応でも進展があり、それぞれベンジルアルコール類とアルキンとの酸化的環化およびチオフェンやインドール酢酸の直接アリール化反応の開発に成功した。さらに、これまで開発した触媒反応を駆使して、実際にベンゾジチオフェンをコアとするπ共役分子をいくつか合成し、紫外・可視光吸光および蛍光挙動などの光学的および電気化学的特性を調べた。このような分子は、今後有機トランジスタを始めとする有機エレクトロニクスへの応用が期待される。本研究の最終年度にあたる平成24年度は、1これまで見出してきた触媒系を用いた新反応開発、2これまで見出してきた新反応を用いたπ共役分子合成に取り組んだ。まず1の取り組みとして、ごく最近見出したルテニウム触媒系の適用範囲拡張について検討を行ったところ、芳香族アミドやフェニルアゾール類とアルキンとの、非酸化的カップリングを開発することに成功した。これらの反応は、ごく少量のカチオン性ルテニウム触媒と酢酸のみを添加する条件で効率よく進行し、反応系がシンプルで廃棄物の極めて少ない環境調和型カップリング法と言える。芳香族基質の適用範囲が広く、今なお適用できる基質が次々見出されており、今後も継続的に検討を続ける予定である。また、カチオン性ロジウム触媒を用いると、ジフェニル酢酸類の分子内脱水素アリールーアリールカップリングが起こり、フルオレン誘導体が合成できることが明らかになった。フルオレン骨格形成は、分子のπ共役系を拡張する上で、非常に重要な手段であるが、本法のように活性化されていないジフェニルメタン類から二つの炭素ー水素結合の位置選択的切断を経るフルオレンの合成ルートは、これまで困難とされてきた。さらに適当なロジウムおよびイリジウム触媒を用いる条件で、ジフェニルメチルアミンやジフェニルメタノール類の脱水素環化もスムーズに進行し、それぞれ9-アミノおよび9-ヒドロキシフルオレンが高収率で得られることがわかった。一方、2の取り組みとしては、見出した脱水素環化などを用いて、インデノフルオレン骨格を始めとする拡張されたπ電子系を有する分子の合成を行い、固体蛍光等の基礎物性を調べた。これらの分子の応用については、今後他のグループと共同で長期的に取り組む予定である。

当初の予定では、本年度はπ共役分子を効率よく構築するための方法を開発し、その手法に関する適用範囲等の情報を蓄積する予定であったが、予想以上に開発が行えたので、これらを実際に使って少し複雑な構造を有する含硫黄縮合芳香族分子を合成し、物性を調べるところまで進展できた。24年度が最終年度であるため、記入しない。このまま、新規π共役分子合成法開発とそれを利用した含硫黄π共役分子合成を平行して進めて行く予定である。特に、ルテニウム触媒を用いる酸化的カップリング反応については、本研究初年度に最初の反応が見出されたばかりであるため、その触媒作用についてはほとんど未開発である。そのような新規触媒系を用いて、新反応探索を行う。さらにこれまで見出した反応を用いて、より複雑なπ共役分子合成を試みる予定である。