hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
歯肉幹細胞由来エクソソームを用いた新規歯周病治療の開発

【研究目的】間葉系幹細胞(MSC)による疾病治療効果には、エクソソームと呼ばれる分泌小胞が中心的役割を果たしていることが近年明らかになっている。申請者はMSCの中でも、エクソソームの分泌量が多く採取が容易な特性を持つ、ヒト歯肉幹細胞(hGMSCs)を用いて研究を進めている。本研究では、hGMSCs由来エクソソームの持つ免疫制御および抗炎症作用に着目し、最小限の幹細胞から効果的に歯周病の炎症を収束させ組織リモデリング・再生シグナルを誘導するための新規歯周病治療の開発を目的とする。【研究結果】歯肉幹細胞由来エクソソームによる歯周病治療への応用の検証のため、組織修復性(M2)マクロファアージの誘導能および、歯根膜細胞におけるLPS刺激時のRANKL発現に及ぼす影響について確認を行った。患者の歯肉から単離したhGMSCsについて、培養上清から回収されたエクソソームは、マーカー蛋白の発現および電子顕微鏡撮影にて確認された。hGMSCs由来エクソソームによるM2マクロファアージの誘導が認められた一方、hGMSCsをTNF-α刺激することで、その効果が促進されることもわかった。同時に、CD73の発現亢進が認められたことから、エクソソーム由来の免疫制御分子であるCD73が、M2マクロファアージの誘導を担っていることが明らかとなった。一方、歯根膜細胞におてLPS刺激によるRANKL発現に及ぼす影響を検討した結果、hGMSCs由来エクソソームのRANKKL抑制効果が認められ、さらにTNF-α刺激後のエクソソームではさらに抑制効果が増強した。エクソソームの活性中心を担うとされるmiRNAの変動についてマイクロアレイ解析を行ったところ、miR-1260bの発現が亢進していることがわかった。miR-1260bはwnt5aの抑制を介してRANKLの発現を抑制することも明らかとなった。in vitroでの解析に時間がかかったが、現在、歯周炎モデルマウスを用いての検証の準備を進めているhGMSCs由来エクソソームの持つ、組織修復性(M2)マクロファアージ誘導能と歯根膜細胞におけるRANKL抑制効果から、歯周組織における抗炎症効果がin vitroで確認された。今後はさらなるシグナル経路の解明と、歯周炎モデルマウスを用いたin vivoでの治療効果を組織学的に検証予定である。【研究目的】近年、間葉系幹細胞による疾病治療効果には、その多分化能のみならず、分泌されるエクソソームが中心的役割を果たしていることが明らかされている。申請者は間葉系幹細胞の中でも歯肉幹細胞(hGMSCs)のエクソソームを多量に分泌する特性とその活性を担うエクソソーム内miRNAに注目した。その中でも、本研究において、歯肉幹細胞が分泌するエクソソームによる修復性(M2)マクロマージ誘導作用に着目し、最小限の幹細胞から歯周病の炎症の収束・組織リモデリング・再生シグナルを効果的に誘導する新規歯周病療法の開発を目的とする。【研究内容】歯肉幹細胞エクソソームに含まれるmiRNAについて、炎症の収束・組織のリモデリングに必須である修復性マクロマージ誘導に関わる標的miRNAの同定を行うこととした。まず患者の歯肉サンプルよりhGMSCsを単離し、これらの細胞について、幹細胞陽性マーカーCD105, CD73,CD90を発現しており、陰性マーカーCD45, CD34,CD11bは発現していないことをフローサイトメトリーで確認した。また、石灰化・脂肪分化の多分化能についても確認し、幹細胞の表現型を有していることを確認した。さらに細胞培養上清からのエクソソーム回収を、エクソソームマーカータンパクであるCD9, CD81, CD63の発現で確認した。さらに、hGMSCsをTNF-α刺激の有無の群に分けてエクソソームを回収し、エクソソームmiRNAの発現変動について、マイクロアレイ法により解析を行った。現在、TNF-α刺激で発現亢進のみられたmiRNA上位5種について、それぞれのmimic miRNAをとPMA分化マクロファージ様細胞を用いて、M2マクロファアージ誘導の中心となるmiRNAの解析を進めている。ヒト歯肉幹細胞(hGMSCs)由来エクソソームのもつ修復性マクロファアージ誘導能の中心的役割を果たすエクソソーム内miRNAの解析について、hGMSCの単離とその幹細胞特性の評価に時間がかかったため。

hGMSCs由来エクソソームによるM2マクロファアージの誘導が認められた一方、hGMSCsをTNF-α刺激することで、その効果が促進されることもわかった。同時に、CD73の発現亢進が認められたことから、エクソソーム由来の免疫制御分子であるCD73が、M2マクロファアージの誘導を担っていることが明らかとなった。一方、歯根膜細胞におてLPS刺激によるRANKL発現に及ぼす影響を検討した結果、hGMSCs由来エクソソームのRANKKL抑制効果が認められ、さらにTNF-α刺激後のエクソソームではさらに抑制効果が増強した。エクソソームの活性中心を担うとされるmiRNAの変動についてマイクロアレイ解析を行ったところ、miR-1260bの発現が亢進していることがわかった。miR-1260bはwnt5aの抑制を介してRANKLの発現を抑制することも明らかとなった。in vitroでの解析に時間がかかったが、現在、歯周炎モデルマウスを用いての検証の準備を進めているM2マクロファージ誘導に重要なmiRNAを同定後は、歯肉幹細胞にTNF-α刺激もしくは同定したmiRNAの強発現(mimic)を導入しながら以下のin vitro機能解析実験を行う。1.蛍光標識(PKH26)エクソソームによる細胞内取り込みの確認2.標的miRNA過剰発現によるM2(修復性)マクロファージ転換促進の検証3.標的miRNA過剰発現によるマクロファージのSignal Transduction解析4.マクロファージの機能測定(貪食能や炎症性サイトカインの分泌量以上の結果をIn vivoにおいて、歯肉幹細胞由来エクソソームのマウス歯周炎モデルにおける検証が進められるよう準備を進めてゆく。hGMSCs由来エクソソームの持つ、組織修復性(M2)マクロファアージ誘導能と歯根膜細胞におけるRANKL抑制効果から、歯周組織における抗炎症効果がin vitroで確認された。今後はさらなるシグナル経路の解明と、歯周炎モデルマウスを用いたin vivoでの治療効果を組織学的に検証予定である。(理由)消耗品試薬を一括購入により、予定よりも低価格で購入できコストを下げられた(使用計画)次年度の解析項目が多岐にわたるため、試薬購入にまわす予定である。動物実験にかかる費用を見越して繰り越したため
口腔前癌病変と扁平上皮癌の細胞解析による早期診断システムの構築

細胞診断システムの構築を目的に「細胞診の正診性に関する研究」というタイトルで、他施設との共同研究が行われた。423例の細胞診標本について専門医11名で再検鏡した結果、癌細胞の判定において、感度は71.5%、特異度は87.0%であった。また、他の細胞診専門医らとともに、口腔細胞診の診断基準を示すためにガイドラインを作成した。免疫染色では、内在性レクチンタンパクであるGalectin-1に着目し、液状細胞診標本を用いて細胞診断における有用性について解析した。腫瘍性病変では高い陽性率を示し(79.0%)、感度、特異度、陽性的中率においても、75.0%、75.0%、91.3%と高い値を示した。本邦において口腔癌による死亡者数は30年前と比較して2倍以上に増加している。この傾向は若年層を含めどの年齢層においてもみられることから、癌の早期発見という点で問題があると考えられる。一方、口腔領域における細胞診の普及率は現状ではまだ低いが、癌を早期に発見するための一つの方法として、歯科診療の場や口腔癌検診等で用いられるようになってきている。本研究では、口腔粘膜擦過細胞診で得られた検体から、細胞形態学的・免疫組織化学的解析および遺伝子変異の検索をすることにより、細胞診断システムを構築することを目的とする。平成25年度は、大阪大学歯学部附属病院の病理診断データベースから歯肉扁平上皮癌症例を抽出し、癌関連蛋白・増殖マーカーに関する免疫染色所見も含めてデータベースの再構築を行った。癌関連蛋白質については、癌の増殖能、細胞周期、アポトーシス、免疫等に関連する蛋白を免疫組織化学的染色により検出した。具体的にはKi67, p16, p21, p53, cyclin D1, EGFR, IMP3, E-cadherin, Laminin5γ2, HLA-1, CD3, CD4, CD8, CD68に対する抗体を用いて染色し、予後データとの相関について解析した結果を「口の難病プロジェクト・2013年度進捗状況報告会」にて発表した。細胞診については、組織学的診断結果の出ている症例を細胞診データベースから抽出し、他施設と共同で「細胞診の正診性に関する研究(倫理委員会にて承認済H25-E15)」として、細胞診標本の検討を行った。口腔領域における細胞診の普及率は現状ではまだ低いが、癌を早期に発見するための一つの方法として、歯科診療の場や口腔癌検診等で用いられるようになってきている。平成26年度は、昨年度に引き続き大阪大学歯学部附属病院の病理診断データベースから歯肉扁平上皮癌を追加抽出し、癌関連タンパクや増殖マーカーに関する免疫染色所見について解析を行った。昨年度と同様に計14種類の抗体を用い、予後データとの相関について解析し、まとめた結果を、「口の難病プロジェクト・2014年度成果報告会」にて発表した。細胞診については、他施設との共同研究で「細胞診の正診性に関する研究(倫理委員会にて承認済H25-E15)」として、423例の標本について細胞診専門医11名で再検討し結果の解析を行った。口腔領域における細胞診の普及率は現状ではまだ低いが、癌を早期発見するための1つの方法として、歯科診療の場や口腔がん検診等で用いられるようになってきている。本研究では、口腔粘膜擦過細胞診で得られた検体から、細胞形態学的・免疫組織化学的解析等により、細胞診断システムを構築することを目的とする。平成26年度までに、大阪大学歯学部附属病院の病理診断データベースから抽出した歯肉扁平上皮癌症例を用いて、癌関連タンパクや増殖マーカーに関する免疫組織化学的所見について解析を行い、まとめた結果を「口の難病プロジェクト・2014年度成果報告会」にて発表した。細胞診については、他施設との共同研究で「細胞診の正診性に関する研究」として、423例の標本について細胞診専門医11名で再検鏡し、結果の解析を行い、現在成果をまとめて論文投稿中である。平成27年度は、免疫染色に使用した癌関連タンパクの中から、Galectin-1という内在性レクチンタンパクに着目し、転移や予後、そして腫瘍免疫との関連について解析を行い、「第26回日本臨床口腔病理学会」、「International Symposium 2015Oraland Craniofacial Development and Diseases」にて発表した。細胞診については、前年度から共著者として執筆を行っていた「細胞診ガイドライン5消化器」(金原出版)が発行され、口腔細胞診の新たな診断基準を示した。また、Galectin-1については、細胞診断における有用性についても解析を行い、「第54回日本臨床細胞学会秋期大会」で発表し、論文にまとめた(Human Pathology 2016;52:101-9)。

腫瘍性病変では高い陽性率を示し(79.0%)、感度、特異度、陽性的中率においても、75.0%、75.0%、91.3%と高い値を示した。扁平上皮癌の組織解析についてもほぼ結果が出ており、細胞診標本の検討も他施設との共同研究が進められている。医歯薬学扁平上皮癌の解析結果と、細胞診標本の検討結果の関連付けを行う。分担執筆を行っている「細胞診ガイドライン」も近日中に出版される予定であるので、新たな診断基準を用い、再検討を行う。部分的ではあるが、扁平上皮癌の組織解析結果も出ている。細胞診標本の検討も比較的順調に進んでいる。研究に使用する消耗品について、予算よりも節約することができた。扁平上皮癌のデータベースを充実させ、その免疫組織化学的解析結果から、細胞診標本への応用を検討する。また、細胞診断については、ただいま作成中の細胞診ガイドラインにより診断基準をより明確なものとし、形態学的解析を加えて検討する。研究の遂行のために、抗体や試薬類に費用がかかることが予測されるため、その増額分とする。研究に使用する消耗品(試薬類)と旅費について、予算よりも節約することができた。研究の遂行のために、消耗品(抗体・試薬類等)に費用がかかることが予測されるため、物品費の増額分とする。
リガンドータンパク質複合型抗腫瘍性天然物の三次元構造と機能

リガンドータンパク質複合型抗腫蕩性天然物C-1027クロモフォアは、ホロタンパク中で保存中にかなり分解することが分かった。そこで新鮮なサンプルを新たに発酵によって生産し、3DNMR測定を行い、シグナルの完全帰属と距離情報等を求めた。アポタンパク質の分解機構は、Gly96のメチレン水素がクロモフォアにより引抜かれて進行していることが判明した。そこで、Gly96のメチレン基を重水素化したd_2-Gly96-c1027アポタンパク質の合成を検討した。特異的にGly96だけを重水素化することは出来なかった。しかし、放線菌アポタンパク質遺伝子を大腸菌内で発現させ、d_2-Gly96を培地に導入して、全てのグリシンを重水素化(重水素化率74%)した改変アポタンパク質を合成することができた。これにクロモフォアを会合させ、分解速度を求めた。重水素化率100%に換算すると、6.8倍遅いことが分かった。これは、クロモフォアによる水素引き抜きが、ラジカル機構で進行していることを支持する。そして、クロモフォアを6倍以上安定化する超タンパク質の開発に成功した。また、天然物C-1027を発酵生産し、精製したばかりの新鮮な試料は従来観測していたEPRと異なるスペクトルを示すことが分かった。この高磁場EPRスペクトルを詳細に測定し、中間体p-ベンザインビラジカル三重項の観測を試みたが、成功しなかった。クロモフォア合成モデル分子がp-ベンザインビラジカル形と平衡になっている。その溶液のESRスペクトルがp-ベンザインビラジカル3重項を含むかどうかを確認するため、ビラジカルを発生するC3またはC6位を^<13>Cラベルしたモデル分子を合成することに成功した。そのESRを詳細に検討した結果C3およびC6位には、ラジカルが存在していることがわかった。リガンドータンパク質複合型抗腫瘍性天然物C-1027クロモフォアは、ホロタンパク中でも長時間のNMR測定中にかなり分解することが分かった。そこでまずモデル系として、アポタンパクと安定な芳香環化合物との複合体の^1HNMR測定を行い、シグナルの完全帰属と距離情報等を求めた。中間体p-ベンザインビラジカル三重項の観測を目的として、天然物C-1027やケダルシジンについてEPRスペクトルを測定した。二次元FT-NMRニューテーション分光法によって、観測したスペクトル中には三重項の吸収が含まれることが証明された。しかし、ゼロ磁場分裂定数から2つのラジカル間距離は8Åであり、p-ベンザインビラジカルとしては大きすぎることが明らかになった。即ち、観測された三重項シグナルは、アポタンパク質のGly96のアルファ水素が引き抜かれたペプチド鎖ラジカルとフェニルラジカル間のラジカル対であることが分かり、NMRによる複合体三次元構造解析の結果もこれを支持した。従って、p-ベンザインビラジカル三重項の観測には成功しなかったが、エンジインとp-ベンザイン間の平衡の存在と、クロモフォアがアポタンパク質中で分解(失活)する分子機構が明らかになった。リガンド-タンパク質複合型抗腫瘍性天然物C-1027クロモフォアは、ホロタンパク中でも長時間のNMR測定中にかなり分解することが分かった。そこでモデル系として、^<13>Cや^<15>Nでラベルしたアポタンパク質と、安定な芳香環化化合物との複合体の3DNMR測定を行い、シグナルの完全帰属と距離情報等を求めた。

その結果、クロモフォアとアポタンパク間の結合は、疎水性ポケットにおける鍵と鍵穴式形状認識、および、主に疎水的親和性に由来することが明らかとなった。前年度明らかにした、アポタンパク質の分解機構によると、Gly96のメチレン水素がクロモフォアにより引抜かれている。そこで、Gly96のメチレン基を重水素化したd_2-Gly96-C1027アポタンパク質の合成を検討中であり、クロモフォアを再構成させて、同位体効果に基づく反応性低下によって、安定度がどの程度向上するか検討する予定である。また、中間体p-ベンザインビラジカル三重項の観測を目的として、天然物C-1027を発酵生産し、精製して、高磁場EPRスペクトルを詳細に測定するための新鮮なサンプルを調製した。このサンプルを用いて2DNMRも測定中である。一方、クロモフォア合成モデル分子がp-ベンザインビラジカル形と平衡になっている。その溶液のESRスペクトルがp-ベンザインビラジカル3重項を含むことを最終的に確認するため、適当な位置を^<13>Cラベルしたモデル分子の合成法を確立した。リガンドータンパク質複合型抗腫瘍天然物C-1027クロモフォアは、ホロタンパク中で保存中にかなり分解することが分かった。そこで新鮮なサンプルを新たに発酵によって生産し、3DNMR測定を行い、シグナルの完全帰属と距離情報とを求めた。前年度明らかにした、アポタンパク質の分解機構によると、Gly96のメチレン水素がクロモフォアにより引抜かれていることが判明した。そこで、Gly96のメチレン基を重水素化したd_2-Gly96-C1027アポタンパク質の合成を検討した。特異的にGly96だけを重水素化することは出来なかった。しかし、放線菌アポタンパク質遺伝子を大腸菌内で発現させ、d_2-Gly96を培地に導入して、全てのグリシンを重水素化(重水素化率74%)した改変アポタンパク質を合成することができた。これにクロモフォアを会合させ、分解速度を求めた。重水素化率100%に換算すると、6.8倍遅いことが分かった。これは、クロモフォアによる水素引き抜きが、ラジカル機構で進行していることを支持する。そして、クロモフォアを6倍以上安定化する超タンパク質の開発に成功した。また、天然物C-1027を発酵生産し、精製したばかりの新鮮な試料は従来観測していたEPRと異なるスペクトルを示すことが分かった。この高磁場EPRスペクトルを詳細に測定し、中間体p-ベンザインビラジカル三重項の観測を試みたが、成功しなかった。クロモフォア合成モデル分子がp-ベンザインビラジカル形と平衡になっている。その溶液のESRスペクトルがp-ベンザインビラジカル3重項を含むかどうかを確認するため、ビラジカルを発生するC3またはC6位を^<13>Cラベルしたモデル分子を合成することに成功した。そのESRを詳細に検討中である。
概均質ベクトル空間の研究

本研究は代数群、リー代数または、それに関する対称空間、概均質ベクトル空間やヘッケ環などの上で定義される特殊関数を主に表現論の立場から研究したものであり、表現論はもとより整数論や数理物理学と関連した多くの成果が得られた。(1)行者は有限体上定義された概均質ベクトル空間を研究し「レフシェッツ原理」の立場から、総体不変式の複素巾にあたるもののフーリエ変換の決定に成功した(ベルギーのデネフ氏との共同研究)。この結果は有限体上の概均質ベクトル空間の基本定理と呼ぶべきものであり「数論的不変式論の構成」という目標に向けての実質的進歩である。(2)さらに行者は(1)の結果の表現論への応用を見出し、特に一般化されたヴァーマ加群の既約性、および、それらの間の準同形写像との関連を明らかにした。(3)後者はすでにルスティックの意味のセルとの関連が知られていたが、行者はさらにセルとヘッケ環のモジュラー表現との間の関係を与えた。(4)また、この研究の過程で、永田環を係数環とするモジュラー表現の一般論を構成した。(5)西山と行者は共同してワイル群の既約表現に対して、ある種の不変量を定義し、コンピューターを用いて、これを詳しく調べた。とくに、この不変量がセルおよびヘッケ環のモジュラー表現と密接に関連していることを示し、(3)の研究をさらに深化・発展させた。(6)行者は京大数理解析研究所において概均質ベクトル空間をテーマとした短期共同研究を主催し、(1)の研究を含む多くの成果につき国内の研究者と情報を交換した。この研究集会の報告集は準備中であり、当該分野の発展に大きく寄与するものと期待される。(7)以上では詳述しなかったが、(5)も含め研究分担者の間の協力関係はきわめて活発であり、実り豊かなものであったことを報告しておく。
自由確率変数の作用素論的研究

Hilbert空間上の作用素論・作用素環論およびそれらの非可換確率論への応用を研究した.近年D.Voiculescuが開拓した自由確率論は,非可換確率論の一つとして大きな発展を遂げている.これに関連して,ランダム行列に対する漸近的自由独立性や大偏差原理について研究した.自由積の手法を用いて,(補間型)自由群環上の自己同型について研究した.また,作用素(特に行列)のノルムやトレースに関する不等式についても研究した.最近の成果として,(1)D.Petz氏との共同研究で,ランダム・ユニタリ行列の標本固有値分布に対する大偏差原理を示した.これのレイト関数は,単位円周上の自由エントロピー(2重対数積分の負符号)を主要項にもつ.また,ランダム行列に対するVoiculescuの漸近的自由独立性が,平均収束よりも強い概収束の意味で成立することを証明した.(2)安藤毅氏,大久保和義氏と共同研究で,2つの半正定値行列の正数ベキの多重積に対するトレース不等式を対数マジョリゼーションの方法を用いて考察した.(3)半正定値行列A_1,...,A_nを変数とするいくつかの多変数関数F(A_1,...,A_n)に対して,そのトレースがA_1,...,A_nについて同時凹関数となることを,Pick関数を使うEpsteinの方法を改良することにより証明した.さらに,Hadamard積や作用素平均を含むトレース関数についても考察した.(4)植田好道氏との共同研究で,自由積の手法を用いて,(補間型)自由群環上にaperiodicな自己同型が連続無限個存在することをて示し,その接合積の性質を解明した.さらに,自由積作用と自由シフト作用の双対的な関係を明らかにした.Hilbert空間上の作用素論・作用素環論およびそれらの非可換確率論への応用を研究している.近年D.Voiculescuが開拓した自由確率論は,非可換確率論の一つとして大きな発展を遂げている.これに関連して,ランダム行列に対する漸近的自由独立性や大偏差原理について研究した.また,作用素(特に行列)のノルムやトレースに関する不等式についても研究した.最近の成果として,(1)自由確率論では,ランダム行列が自由確率変数の(漸近的)モデルとして重要な役割を果たしている.D.Petz氏との共同研究で,ランダム・ユニタリ行列の標本固有値分布に対する大偏差原理を示した.これのレイト関数は,単位円周上の自由エントロピー(2重対数積分の負符号)を主要項にもつ.また,ランダム行列に対するVoiculescuの漸近的自由独立性が,平均収束よりも強い概収束の意味で成立することを証明した.(3)半正定値行列A_1,...,A_nを変数とするいくつかの多変数関数F(A_1,...,A_n)に対して,そのトレースがA_1,...,A_nについて同時凹関数となることを,Pick関数を使うEpsteinの方法を改良することにより証明した.さらに,Hadamard積や作用素平均を含むトレース関数についても考察した.Hilbert空間上の作用素論・作用素環論およびそれらの非可換確率論への応用を研究した.近年D.Voiculescuが開拓した自由確率論は,非可換確率論の一つとして大きな発展を遂げている.これに関連して,ランダム行列に対する漸近的自由独立性や大偏差原理について研究した.自由積の手法を用いて,(補間型)自由群環上の自己同型について研究した.また,作用素(特に行列)のノルムやトレースに関する不等式についても研究した.最近の成果として,(1)D.Petz氏との共同研究で,ランダム・ユニタリ行列の標本固有値分布に対する大偏差原理を示した.これのレイト関数は,単位円周上の自由エントロピー(2重対数積分の負符号)を主要項にもつ.また,ランダム行列に対するVoiculescuの漸近的自由独立性が,平均収束よりも強い概収束の意味で成立することを証明した.(2)安藤毅氏,大久保和義氏と共同研究で,2つの半正定値行列の正数ベキの多重積に対するトレース不等式を対数マジョリゼーションの方法を用いて考察した.(3)半正定値行列A_1,...,A_nを変数とするいくつかの多変数関数F(A_1,...,A_n)に対して,そのトレースがA_1,...,A_nについて同時凹関数となることを,Pick関数を使うEpsteinの方法を改良することにより証明した.さらに,Hadamard積や作用素平均を含むトレース関数についても考察した.(4)植田好道氏との共同研究で,自由積の手法を用いて,(補間型)自由群環上にaperiodicな自己同型が連続無限個存在することをて示し,その接合積の性質を解明した.さらに,自由積作用と自由シフト作用の双対的な関係を明らかにした.
分子時計を基盤にした体内金属元素の日周リズムの成因解明：金属と分子時計の相互作用

本研究において、colon26腫瘍移植モデルマウスを対象に、がん組織中において鉄代謝機構に日周リズムが認められた。また、TfR1(Transferrin Receptor 1)を介して、細胞内の鉄量を調節しているIRP2(Iron Regulatory Protein 2)の発現量には、鉄量と相関する日周リズムが認められた。さらに、IRP2による転写後調節により発現量が安定化される、TfR1の発現量にも同様の日周リズムが認められ、TfR1発現の日周リズムにIRP2による安定化が重要であることが明らかとなった。生体には体内時計が存在し、がんをはじめとする様々な病態の日周リズムとの関連性が示唆されている。一方、生体内金属は、酵素やタンパク質の構成成分として必須であり生体の恒常性維持に重要な働きをしている。生体内金属の一つである鉄は、酸素運搬やミトコンドリアにおけるエネルギー産生のみならず、DNA合成に必須なリボヌクレオチド還元酵素をはじめとした、多くの酸化還元酵素の活性に必要な生体に不可欠な金属である。また、がん細胞中では過剰なDNA合成及び細胞増殖のため、鉄代謝機構が亢進しており、がん細胞中における鉄量の調節はがん細胞の増殖において非常に重要である。しかし、この鉄代謝機構と概日時計機構との関連については未解明である。そこで本研究では、colon26腫瘍移植モデルマウスを対象に、がん細胞中の鉄量の日周リズムの存在とその制御機構の解明を目的として、鉄代謝機構関連因子であるIRP2(Iron Regulatory Protein 2)に着目し検討した。がん組織中における鉄量には、暗期前半に高値を示す有意な日周リズムが認められた。がん組織中において鉄代謝機構に日周リズムがあることが示唆された。そこで、TfR1(Transferrin Receptor 1)を介して、細胞内の鉄量を調節しているIRP2に着目してそのメカニズムを検討した。その結果、IRP2の発現量には鉄量と相関する日周リズムが認められた。また、IRP2による転写後調節により発現量が安定化される、TfR1の発現量にも同様の日周リズムが認められ、TfR1発現の日周リズムにIRP2による安定化が重要であることが明らかとなった。次に、IRP2の日周リズム制御機構を明らかにするためIRP2遺伝子のプロモーター領域を対象としてルシフェラーゼアッセイを行った。その結果、IRP2遺伝子の発現リズムが、時計遺伝子であるBMAL1/CLOCKにより転写レベルで制御されていることを明らかにした。生体内金属は、酵素やタンパク質の構成成分として必須であり生体の恒常性維持に重要な働きをしている。そこで本研究では、がん細胞中の鉄代謝機構に及ぼす分子時計の影響を明らかとし、鉄代謝機構を介した細胞増殖に及ぼす分子時計の影響を明らかにした。時計遺伝子CLOCKのexon19を変異させ転写活性機能が失活したCLOCKD19を安定発現させたcolon26細胞(以下、colon26D19)をマウスに移植し、同様に鉄、及び鉄代謝機構関連因子の発現リズムを検討したところ、それらの日周リズムの消失と、発現量の低下が認められた。このことから、鉄代謝機構は時計遺伝子により転写レベルで制御されていることが示唆された。さらに、colon26細胞とcolon26 D19細胞の細胞増殖能を評価したところ、colon26 D19細胞では増殖能が有意に低下していた。この結果より、時計遺伝子の変異が鉄代謝機構の低下を引き起こし、細胞増殖能の低下を引き起こしていることが示唆された。本研究の結果から、鉄代謝機構に日周リズムが存在し、この日周リズムは時計遺伝子による転写レベルの制御に加え、mRNAの安定化という新規機序での制御により生じることが明らかとなった。また、鉄代謝機構を介して分子時計が細胞増殖を制御している可能性が示唆された。その他の金属および細胞についても解析を進めており、同様の成果をあげている。時間薬理学colon26腫瘍移植モデルマウスを対象に、がん細胞中の鉄量の日周リズムが存在することを明らかにした。その機序として、TfR1を介して細胞内の鉄量を調節しているIRP2の発現量およびIRP2による転写後調節により発現量が安定化されるTfR1の発現量の日周リズムが関与していることが明らかとなった。TfR1発現の日周リズムにIRP2による安定化が重要であることが明らかとなった。IRP

2遺伝子の発現リズムは、時計遺伝子であるBMAL1/CLOCKにより転写レベルで制御されていることが明らかとなった。その他の金属についても解析を進めており、おおむね順調に進展しているといえる。昨年実施した実験に加えて、がん細胞中の鉄代謝機構に及ぼす分子時計の影響を明らかとし、鉄代謝機構を介した細胞増殖に及ぼす分子時計の影響を明らかにする。またこれまでに得られた成果の論文投稿を予定している。
マルチスケールバイオセンサを基盤とする次世代細胞工学支援システムの構築

本研究は10lmからmmのオーダーまで対応可能なマルチスケーラブルバイオセンサを基盤として、単一細胞から組織まで対応できる次世代のマルチスケーラブルな細胞工学支援システムの構築を目指して行った。具体的には研究代表者がこれまで開発してきたマルチスケーラブルな化学・バイオセンサ技術と、研究代表者が企業と共同開発した単一細胞の自動回収技術とを統合し、単一細胞(微粒子)レベルのpH、酸素センシング結果に基づく特定細胞(微粒子)の回収を行った。本年度は特に呼吸活性の差異に基づく特定単一細胞の回収を行った。倒立顕微鏡の透過照明ユニットの代わりに、簡易型自動細胞回収装置(セルポータミニ、スギノマシン)を装着し、蛍光画像測定のためにカメラ接続部に、高速共焦点レーザスキャナユニット(CSU-10、横河電機)を装着した。まず倒立顕微鏡に対応可能なマルチスケール酸素センサチップを作製するために、これまで不可能であったウェルの中だけに均一に、酸素センサ膜であるルテニウム錯体含有ナフィオン膜を形成することに成功した。そして酸素濃度変化に基づく検出・回収実験としてまずグルコースオキシダーゼ固定化微粒子の回収を行い、目的の微粒子のみを回収できることを確認できた。そして同様に生死細胞を混合したマウスリンパ球をウェルアレイに配置し計測したところ、生細胞の入ったウェルでのみ酸素濃度の減少を確認でき、さらにその結果に基づき指定した細胞1個のみを回収することにも成功した。本研究は10μmからmmのオーダーまで対応可能なマルチスケーラブルバイオセンサを基盤として、単一細胞から組織まで対応できる次世代のマルチスケーラブルな細胞工学支援システムを構築するものである。研究代表者は、極微小なマイクロウェルアレイに対応可能なオプティカルpH及び酸素センサや2次元SPR免疫センサを開発し、それを元に本特定領域研究(H18-19)において、これらのセンサ技術が10μmからmmオーダーまで対応可能なマルチスケーラブルなバイオセンサであることを実証した。一方、研究代表者は知的クラスター創成事業において、単一細胞の自動回収が可能な技術を開発した。本研究ではこれらの成果を元に、マルチスケーラブルバイオセンサを基盤として、単一細胞レベルまで対応可能な細胞操作ツールや細胞刺激ツールなどを統合することで、単一細胞から組織まで対応できる次世代の細胞工学支援システムを構築する。またこれを用いた組織中での個々の細胞の機能解析や細胞集団における個々の細胞の環境刺激応答などの解析が可能であることを実証する。本年度は、まず高速共焦点スキャナユニットを装着した倒立型顕微鏡に単一細胞回収装置を装着することで、酸素、pHセンサを基盤とするマルチスケール細胞工学支援システムを構築し、システム全体の特性評価及び最適化を行ない、酵素固定化微粒子を用いたモデル回収実験にも成功した。また2次元SPRイメージングセンサに鉄骨製のレール付フレームを介して単一細胞回収装置を設置してマルチスケール2次元SPR免疫センサを基盤とするマルチスケール細胞工学支援システムを構築し、その特性評価及び最適化を行った。
血管新生ペプチドSVVYGLR改変による創薬とドラッグデリバリーシステムへの応用

生体内に存在するペプチダーゼを利用したDDSペプチドをデザインし、その徐放性を確認した。修飾SVVYGLRのDDSとしての作用期間の検討としてSVVYGLR,GGGGGG-SVVYGLR、GGG-SVVYGLR-GGGを合成し動物実験をおこなった。更に、SVVYGLR、GGGGGG-SVVYGLR、GGG-SVVYGLR-GGGをそれぞれ単体のもの、2種類ずつ組み合わせた物、3種類全てを組合わせたものをin vitroで実験しその血管新生度を評価した。今回、SVVYGLRに徐放性を持たせるためにグリシンを付加した結果、全てのペプチドにおいて、Wild typeよりも血管network形成度が高くなった。また、全てのペプチドで、5日よりも10日の方がnetwork形成度が高くなった。5days,10days共に3種組合わせたものが最も効果が高かった。現在薬物の徐放にはゼラチンが使用されるのが主流だが、昨今、BSEの問題により、ゼラチンを使った徐放が危険視されている。したがって、今回の実験のような、ペプチダーゼを利用した徐放が実用化されれば、より、安全な薬物の開発に役立つと思われる。キーとなる最小アミノ酸単位の特定から実験を始めた。SVVYGLRの構造のどのアミノ酸が血管新生に効いているのか、という点である。そこでSVVYGLR配列内のアミノ酸残基の一つをアラニン残基に置換して合成した7種類のミュータントペプチドのAla-Scan assayを行った。SVVYGLR配列内のアミノ酸残基をアラニン残基に置換して合成した7種類のミュータントペプチドの内、4番目のチロシン残基をアラニン残基に置換したペプチドにおいてのみ、血管新生作用が全く認められなかったことより、4番目のチロシン残基が重要となっていることが解った。そこでこのSVVYGLRをビルディングユニットとしてコンビナトリアルケミカルライブラリー構築することによりさらなるアミノ酸誘導体をデザインできるであろう。また、チロシン残基が重要になっていることからSVVYGLRのうち、少なくともN末端とC末端は、血管新生作用にとって重要ではないことが明らかになった。よって血管新生作用を損なうことなく、SVVYGLRのN末端またはC末端を、キャリアタンパク質との結合部位として利用することが可能となり幅広い応用が期待できる。このSVVYGLRペプチドは、その血管新生能から人工臓器の移植時や虚血生心疾患などの多くの医療分野において有効に利用できる可能性を秘めている。さらには、このペプチドの機能を阻害させるデザインを構築することにより、新たな抗癌剤の開発や軟骨再生治療にも有効となりうると考える。以前の研究でチロシン残基が重要になっていることからSVVYGLRのうち、少なくともN末端とC末端は、血管新生作用にとって重要ではないことが示唆された。そこでN末端とC末端にGを結合させた合成ペプチドを用いて動物実験をおこなった。GSVVYGLR,SVVYGLRG共に血管新生作用を損なうことがなかった。よってSVVYGLRのN末端またはC末端を、キャリアタンパク質との結合部位として利用することが可能となり幅広い応用が期待できる。修飾SVVYGLRのDDSとしての作用期間の検討としてSVVYGLR,GSVVYGLR,GGGSVVYGLRを合成し動物実験をおこなった。ペプチドはGの修飾の数に対応して血管新生作用に作用時間の違いが生じた。
ヒトVHL癌抑制遺伝子産物に結合する細胞性蛋白質の同定と単離

遺伝病であるvon Hippel-Lindau(VHL)病の原因遺伝子は、本症に合併する腎癌のみならず自然発生の腎癌(clear cell type)でも高率にC末端に変異を起こしていることが報告されている。最近アメリカのグループは免疫沈降により、VHL蛋白はelongation factor S-IIIのsubunitであるelonginBおよびCと結合することを報告しVHL蛋白の転写伸長抑制作用を示唆した。一方申請者らは2-hybrid systemを用いてLHVに結合する蛋白を独自にクローニングしelonginCの他に未知の遺伝子(クローンV67)を単離した。クローンV67のコードする蛋白はエピトープタッグシステムを使った免疫沈降にてもVHL蛋白との結合が確認された。また免疫沈降による解析では、C末端の166アミノ酸を欠失したVHL蛋白との結合能を失っていた。すたわちクローンV67のコードする蛋白は、VHL蛋白の領域のうち特に種を超えて保存されている部分に結合することが明らかになった。この領域は先に示したように、腎癌で変異を起こしている。腎癌で種々の変異を起こしたVHL蛋白のうちいくつかについてはelonginとの結合能を失うことが報告されている。しかしVHLの変異体のうちいくつかはelonginとの結合能を失わないことから、VHLとelonginの結合による転写伸長抑制作用のみでは腎癌発生の機序は説明できない。我々はクローンV67のコードする蛋白とVHL蛋白の変異体との結合能を調べ、このクローンV67の腎癌発生における役割を解明していきたい。
心電図同期セグメント再構成を併用した256列コーンビームCTによる冠動脈造影

心拍数90-100/分前後の状態で造影剤注入前から注入中、造影剤の洗い出し時相までの、連続50秒間の心臓大血管領域の撮影を行った。得られた画像データはセグメント数を1(ハーフスキャン)から8まで変えたものを作製し、得られた冠動脈画像の画質を視覚的に評価した。その結果、1-4セグメントにおいて、段階的に冠動脈画像の鮮明度は向上した。4セグメント、5セグメントの間では視覚的にはほぼ同等の画質であった。以上より、心電図同期を併用した256列CTにおけるセグメント再構成によるブタ冠動脈の描出し、心拍数90-100/分の条件下では、4-5セグメント再構成において最も明瞭な冠動脈画像が得られた。平成18年度は研究計画書に沿った256列CTを用いた内容の実験を、ブタ2頭(20kg)について実験を行った。その結果、以下の知見が得られた。1.心拍数90-100/分前後の状態で造影剤注入前から注入中、造影剤の洗い出し時相までの、連続50秒間の心臓大血管領域の撮影を行った。CT装置の条件としては管電圧120kVp,管電流220mAとした。2.得られた画像データはセグメント数を1(ハーフスキャン)から8まで変えたものを作製し、得られた冠動脈画像の画質を視覚的に評価した。3.まず、1心拍のなかのどの時相で最も冠動脈が明瞭に認識されるかを検討した。その結果、心電図RR間隔の60%における時相(収縮末期から拡張期早期)が最も適していることがわかった。4.つぎに、連続した数心拍分の画像データを用いる場合の、造影の均一性が画質に及ぼす影響を検討した。この結果、セグメント構成に使用する画像の問で造影剤の染まりの差異が著しい場合には、アーチファクトが増加することを確認した。5.最後に、心電図RR60%の時相における画像を、1,3,3,4,5,8セグメント使用条件下で、順次再構成した。6.その結果、1-4セグメントにおいて、段階的に冠動脈画像の鮮明度は向上した。これらと比較して、8セグメントでは軽度、画質が低下した。これはセグメント数があまり多いと、造影剤染まりの不均一がセグメント問で起こり、アーチファクトが発生し、画質に悪影響を及ぼしている可能性が示唆された。7.以上より、以下のように結論された。1)心電図同期を併用した256列CTにおけるセグメント再構成によるブタ冠動脈の描出に成功した。2)心拍数90-100/分の条件下では、4-5セグメント再構成において最も明瞭な冠動脈画像が得られた。3)平成19年度以降は、さらに心拍数を頻拍にした条件で、実験を繰り返し、適正なセグメント再構成の条件を明らかにする予定である。平成19年度は研究計画書に沿った256列CTを用いた内容の実験を、ブタ2頭(20kg)について実験を行った。この結果、セグメント構成に使用する画像の間で造影剤の染まりの差異が著しい場合には、アーチファクトが増加することを確認した。これはセグメント数があまり多いと、造影剤染まりの不均一がセグメント間で起こり、アーチファクトが発生し、画質に悪影響を及ぼしている可能性が示唆された。

心電図同期を併用した256列CTにおけるセグメント再構成によるブタ冠動脈の描出し、心拍数90-100/分の条件下では、4-5セグメント再構成において最も明瞭な冠動脈画像が得られた。平成20年度は研究計画書に沿った256列CTを用いた内容の実験を、ブタ1頭(20kg)について実験を行った。その結果、以下の知見が得られた。心拍数90-100/分前後の状態で造影剤注入前から注入中、造影剤の洗い出し時相までの、連続50秒間の心臓大血管領域の撮影を行った。CT装置の条件としては管電圧120kVp,管電流220mAとした。得られた画像データはセグメント数を1(ハーフスキャン)から8まで変えたものを作製し、得られた冠動脈画像の画質を視覚的に評価した。まず、1心拍のなかのどの時相で最も冠動脈が明瞭に認識されるかを検討した。その結果、心電図RR間隔の60%における時相(収縮末期から拡張期早期)が最も適していることがわかった。つぎに、連続した数心拍分の画像データを用い、造影の均一性が画質に及ぼす影響を検討した。最後に、心電図RR60%の時相における画像を、1,3,3,4,5,8セグメント使用条件下で、順次再構成した。その結果、1-4セグメントにおいて、段階的に冠動脈画像の鮮明度は向上した。4セグメント、5セグメントの間では視覚的にはほぼ同等の画質であった。これらと比較して、8セグメントでは軽度、画質が低下した。これはセグメント数があまり多いと、造影剤染まりの不均一がセグメント間で起こり、アーチファクトが発生し、画質に悪影響を及ぼしている可能性が示唆された。以上より、以下のように結論された。
自閉症児の療育を目的とした定型性逸脱人工物の開発

今年度の主な成果は以下の2点である.(1)自閉症スペクトラム障害児が目的レベルでの振舞い抽象化方法を獲得することを支援するロボット(可変抽象粒度ロボット)の開発「意図」をセンサ入と行動出力の対応関係のまとめあげの単位として捉え,異なる入出力の複雑性(抽象度)を提示可能な移動ロボットを開発した.入出力の対応関係はフルカラーLEDの点灯色によって表象される.対応関係は1対1,1対多,多対多の3段階である.(2)可変抽象粒度ロボットの有効性の検討成人定型発達者を対象に可変抽象粒度ロボットの有効性の検討を行った.検証のために各抽象粒度における機能発見能力,抽象粒度の選好,予測違反に対する理解を指標とした実験を行い,抽象粒度に対する選好が意図帰属に影響することが確認された.26年度が最終年度であるため、記入しない。26年度が最終年度であるため、記入しない。今年度の主な成果は以下の2点である.(1)認知粒度に基づくASDの社会コミュニケーション障害の説明理論の検討自閉症スペクトラム障害(ASD)はDSM-5によって1)社会的コミュニケーション障害と2)限定された興味,常同行動という明確に分かれた二つの特徴によって規定されている.後者の特徴は誤差に対する許容性の小ささによって説明されている.本研究では,目的志向的な世界の分節における認知粒度の小ささによって,他者の心が読めないという前者の特徴も説明可能であるという仮説を導いた.また,この仮説を検証するために,Webブラウザを用いたオンライン実験を行った.(2) ASD児が目的レベルでの振舞い抽象化方法を獲得することを支援するロボット(定型性逸脱人工物)の構築ASD者の定型性への選好という特質を利用し,ASD児が単機能ロボットの振舞いの規則性を発見した後,ロボットが段階的に定型的振舞いを逸脱することで,振舞いの抽象化粒度の拡大を促し,目的(意図)レベルでの抽象化方法を獲得することを支援するロボットを作成した.今年度の主な成果は以下の2点である.(1)自閉症スペクトラム障害児が目的レベルでの振舞い抽象化方法を獲得することを支援するロボット(可変抽象粒度ロボット)の開発「意図」をセンサ入と行動出力の対応関係のまとめあげの単位として捉え,異なる入出力の複雑性(抽象度)を提示可能な移動ロボットを開発した.入出力の対応関係はフルカラーLEDの点灯色によって表象される.対応関係は1対1,1対多,多対多の3段階である.(2)可変抽象粒度ロボットの有効性の検討成人定型発達者を対象に可変抽象粒度ロボットの有効性の検討を行った.検証のために各抽象粒度における機能発見能力,抽象粒度の選好,予測違反に対する理解を指標とした実験を行い,抽象粒度に対する選好が意図帰属に影響することが確認された.26年度が最終年度であるため、記入しない。(1) ASD児の発達を支援するためのロボット設計に活かすことが可能な理論の構築を行った.(2)定型性逸脱人工物の基本設計を行い,プロトタイプを作成した.定型性逸脱人工物を実際にASD児とインタラクションさせることによって,発達支援が可能であるかどうかの検証を行う.
胸部大血管術後患者に対する神経筋電気刺激の効果に関する非タンダム化比較試験

大血管手術患者は呼吸器合併症のリスクが高く,そのなかでも長期人工呼吸器管理(MV)は予後不良因子で全身性筋力低下のリスク因子でもある。神経筋電気刺激(NMES)は術後早期の骨格筋タンパク分解を抑制する可能性が報告されており,術後安静期でも筋力や運動耐容能の維持改善が期待できる。しかしながら,胸部大血管患者においてNMESによる下肢筋力維持・改善効果は明らかではない。本研究の目的は,胸部大血管患者へのNMESの効果を明らかにすることである。まず,当研究代表者所属施設にて待機的な胸部大血管手術患者における術後筋力低下の関連因子を検討した。検討結果を踏まえ, NMESの研究対象者は,待機的に胸部大血管手術を施行し,術後24-168時間のMVを要した65歳以上の患者とした。介入群は通常の術後理学療法に加えて術後2週間のNMESを施行し,対照群は通常の術後理学療法のみを施行した歴史的対照群とした。主要評価指標は術後14日目の膝伸展筋力とし,副次的評価指標は術後握力,術後MV, ICU在室及び術後在院日数とした。術後筋力低下のリスク因子は,年齢,手術時間,術後MV,術後離床経過であった。まず,歴史的対照群を抽出した。該当症例は46名となり(中央値;年齢72歳,膝伸展筋力低下率18%,握力低下率18%,術後MV63時間, ICU在室5日,術後在院日数26日),9割が自宅退院であった。本報告書作成時までに終了したNMESの介入群は2例と少なかったが,これは倫理審査手続きが長期にわたったことが大きい。NMESは日常臨床で用いられているが,本検討は前向き介入前後比較試験となるため,倫理委員会に申請した。下記に対象特性を示す。年齢74-79歳,膝伸展筋力低下率43-47%,握力低下率35-38%,術後MV117-166時間, ICU在室10-11日,術後在院日数29-45日で2例とも自宅退院した。本研究は介入群の症例数が少なく,今後さらに検討が必要と考えられた。
放射線感受増殖型アデノウイルスを用いた膵胆道系悪性腫瘍治療の検討

A)放射線照射により活性が誘導されるプロモーターの開発radiationによって活性化するプロモーターとしてegr-1プロモーター(early growth response-1)が知られている。このプロモーターに変異を入れることによる活性増強について基礎的な検討を行い、最も感受性が高まる方法を検討したが、著しい増強効果をもつ変異プロモーターは得られていない。B)放射線感受増殖型アデノウイルスの作成研究計画では、前項で開発した放射線増強効果の強い変異egr-1プロモーターを用いる予定であったが、それほど増強した放射線感受性をもつ変異プロモーターが得られないため、野性のegr-1を用いて実験を行った。egr-1によりアデノウイルスの増殖を規定するE1A遺伝子が発現するようなウイルスを作成した。このウイルスは理論的には放射線照射によりE1A遺伝子を発現し増殖するウイルスとなるが、現在のところ著明な放射線感受性増殖を示すアデノウイルスは得られていない。これは、作成した組換えアデノウイルスでegr-1がE1A遺伝子を発現させる効果が不十分である可能性があり、さらに検討中である。C)自殺遺伝子を組み入れたウイルスの作成上記と平行して、前項で作成したウイルスに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼとガンシクロビルの系を用いた自殺遺伝子を組み入れ、無制限なウイルス増殖の抑制手段をウイルス内に組み入れることを検討した。このウイルスはガンシクロビルの投与により誘導される細胞死は確認できた。A)放射線照射により活性が誘導されるプロモーターの開発既にradiationによって活性化するプロモーターとしてegr-1プロモーター(early growth response-1)が有用であることが報告されているが、このプロモーターに変異を入れることによる活性増強について基礎的な検討を行い、放射線照射に感受性が高くかまることは確認さているが、最も感受性が高まる方法をさらに検討中である。B)放射線感受増殖型アデノウイルスの作成アデノウイルスの増殖はE1A遺伝子の発現により規定されており、前項で開発したプロモーターによってこの遺伝子を発現するような組換えアデノウイルスを作成した。このウイルスは理論的には放射線照射によりE1A遺伝子を発現し増殖するウイルスとなるが、実際に放射線感受性増殖を示すかどうかを検討中である。C)自殺遺伝子を組み入れたウイルスの作成上記と平行して、前項で作成したウイルスにこの自殺遺伝子を組み入れ、無制限なウイルス増殖の抑制手段をウイルス内に組み入れることにを検討している。来年度は、上記より効率的なプロモーターを確立し、放射線により著名な増殖を示し、かつ胃殺遺伝子を組み込んだアデノウイルスを作成し、これを用いた遺伝子治療の基礎的検討を行う。A)放射線照射により活性が誘導されるプロモーターの開発radiationによって活性化するプロモーターとしてegr-1プロモーター(early growth response-1)が有用であることが報告されている。
景観遺伝学的解析をもちいたツキノワグマの遺伝構造を形成する環境要因の解明

東北地方ではツキノワグマの個体群は大きく連続しているが、遺伝的な構造化が進んでいることが示唆されている。ツキノワグマの遺伝構造が形成される要因を景観生態学的手法を用いて検討した。宮城県および山形県北部から青森県南部にかけて捕獲されたツキノワグマの肉片およびヘアートラップで回収されたツキノワグマの体毛をサンプルとし、148個体分のマイクロサテライトDNA16遺伝子座の遺伝子座を決定した。Bray-Curtis指数によって計算した個体間の遺伝的距離を用いて、距離による隔離の効果(Isolation-by-distance)、抵抗による隔離の効果(Isolation-by-resistance)の影響を検討した。抵抗による隔離の効果は標高と土地利用の影響について解析した。その結果、個体間の直線距離が大きくなるほど遺伝的距離も大きくなり、距離による隔離の効果が確認された。標高による抵抗の効果は、2個体間の標高差が大きいほど遺伝的距離が大きく、また、個体間の平均標高が高いと遺伝的距離が小さかった。土地利用による影響は、耕作地と住宅地が個体間の遺伝的交流に対して25倍の抵抗となっていることが明らかになった。これらを雌雄に分けて解析したところ、全てのテストにおいてメスの方がオスよりも影響を受けていることがわかった。特に耕作地と住宅地の抵抗値はオスの25倍に比べて、メスでは100倍だった。この成果は英語論文としてまとめ、Ecology and Evolution誌に受理された。当初予定していた東北地方のツキノワグマの遺伝構造について解析が進み、成果が英語論文として国際誌に受理された。中部地方のツキノワグマの遺伝構造を明らかにし、その構造化を引き起こす景観的な要因を明らかにする。過去の気候変動の影響について、最終氷期最寒期の気温分布や植生図を作成し、ミトコンドリアDNAの遺伝構造と比較する。一方、近年の人為的な影響を検討するためにマイクロサテライトDNA解析を行う。今年度中に予定していた国際学会が主催者都合により翌年度に延期になり、旅費が不要となったため。翌年度はこの残額を利用して、国際学会で成果発表を行う予定である。他は申請時の予定通り、遺伝解析消耗品、研究打ち合わせ・国内学会での成果発表の旅費、GISソフトのライセンス料などに使用する。