hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
HCP分子の異性化遷移状態の直接観測

HCP分子のHCP→CPH異性化反応を分光学的に捕らえることを目的として、HCP分子の高振動励起状態の観測およびその解析を行った。観測には分散蛍光法、及び誘導放出励起分光法を用いた。両者ともに電子遷移を用いるが、その際に赤外-紫外二重共鳴法を用いることで、これまで観測が困難であったCH伸縮振動が励起した状態を観測することに成功した。従来の分光学的解析では単に振動エネルギーの再現を重要視していたが、本研究では、変角振動とCP伸縮振動の間の相互作用を考慮した有効ハミルトニアン行列の固有ベクトル解析を行い、その際に得られる波動関数の形状についての情報に注目した。その結果、高振動励起準位において振動波動関数の形状が大きく異なる準位(異性化状態)が発生することが示された。この解析結果は、理論研究によって予想されていた異性化状態の発生と非常によく一致しており、解析の妥当性が示された。つまり、分光学的に異性化状態のような大きく振動の性質が異なる準位を捕らえたということができる。今後、CH伸縮振動との相互作用を考慮した解析に発展させることでより高エネルギー領域での異性化を含めた分子の振動ダイナミクスを明らかにすることができると期待される。本研究に刺激されていくつかの理論研究グループがHCP分子のHCP→CPH異性化反応の研究を行ってきた。それらの理論研究グループとの議論の結果をもとに、実験、理論両方の立場から見たHCP→CPH異性化反応についての共著の総説が平成11年中に発表される予定である。HCP分子のHCP→CHP異性化反応を分光学的に捉えるために、HCP分子の高振動励起状態を分散蛍光法及び誘導放出分光法を用いて観測した。今回観測した振動準位エネルギーとこれまでに報告されている振動準位エネルギーを用いて、変角振動とCP伸縮振動の相互作用からなるポリアッド構造の解析を行った。その結果、これまでに理論研究で予測され、我々が実験で観測していた“異性化"状態と帰属される振動準位も変角とCP伸縮振動のポリアッドのメンバーとして帰属されることがわかった。ポリアッド構造を記述する有効ハミルトニアン行列の固有ベクトルを解析することで“異性化"状態の波動関数は理論研究で予測されていたように同じポリアッド内の他の振動準位の波動関数とは大きく異なる形状であることが明かとなった。理論研究では“異性化"状態の出現がポリアッド構造の破綻かどうかは判断できなかったが、今回の解析は“異性化"状態の出現はポリアッド構造のなかで起こることを明らかにした。さらに高エネルギー側に存在する“異性化"状態を観測するために、分散蛍光法と誘導放出分光法の励起に赤外-紫外二重共鳴法を用いた高振動励起状態の観測を行った。この方法を用いることでこれまでに観測されていなかったCH伸縮振動の励起した高振動励起状態の観測に初めて成功した。HCP分子の異性化の反応座標はCH結合距離と結合角の変化の両者からなるので、CH伸縮振動の励起した高振動励起状態の解析から異性化反応の理解について新たな情報が得られることが期待される。

その結果、高振動励起準位において振動波動関数の形状が大きく異なる準位(異性化状態)が発生することが示された。この解析結果は、理論研究によって予想されていた異性化状態の発生と非常によく一致しており、解析の妥当性が示された。つまり、分光学的に異性化状態のような大きく振動の性質が異なる準位を捕らえたということができる。今後、CH伸縮振動との相互作用を考慮した解析に発展させることでより高エネルギー領域での異性化を含めた分子の振動ダイナミクスを明らかにすることができると期待される。本研究に刺激されていくつかの理論研究グループがHCP分子のHCP→CPH異性化反応の研究を行ってきた。それらの理論研究グループとの議論の結果をもとに、実験、理論両方の立場から見たHCP→CPH異性化反応についての共著の総説が平成11年中に発表される予定である。
コンクリート・岩石におけるクラック進展解析手法の確立

コンクリートにおける一般的なクラック進展解析手法の開発を行った。変位の不連続面を有する有限要素の定式化を行い、不連続面では引張軟化関係を満足させ、さらに、引張軟化域における除荷経路を考慮し、引張軟化曲線から除荷経路への分岐を厳密に判定した。結果として、通常の切り欠きから進展する1本のクラックの解析だけでなく、切り欠き無しの無筋コンクリートの曲げ試験のように、クラックが最初分布して発生し、やがて1本のクラックに局所化する過程を解析することが可能となった。引張軟化曲線は引張破壊挙動を支配する材料特性であり、一軸引張試験におけるピーク後の開口変位と伝達応力の関係と定義される。しかし、一軸引張試験を実施し引張軟化曲線を得ることは難しい。そこで本研究では、安定した試験が容易であるノッチ付き無筋梁の曲げ試験より引張軟化曲線を得る逆解析法を開発した。この逆解析法は、ノッチ先端の開口変位は常に開口変位の最大値であり、ある時点までに求めた引張軟化曲線の部分からノッチ先端を除いて開口変位増分と伝達応力増分の関係が既知であるという点に着目し、その時点からのノッチ先端の開口変位増分と伝達応力増分の関係を、荷重増分と載荷点変位増分の関係から求め、この増分計算を繰り返すことにより引張軟化曲線を求めるという方法である。さらに開発したコンクリートにおけるクラックの進展解析手法と引張軟化曲線の逆解析法を応用し、近年導入された掘削と覆工を並行して行うトンネルの工法において鋼繊維補強コンクリートを覆工に用いるための設計法を提案した。これは、断面耐力の算定にひびわれの応力伝達を考慮した、破壊力学に基づく新しい設計法である。クラックの進展の解析に適した手法として、境界要素法と有限要素法の重ね合わせに基づく新しい解析手法を開発し、コンクリ-ト・岩石におけるクラック進展の解析プログラムを構築した。この解析手法は別領域をそれぞれの手法で解き、複合させる従来の手法とは全く異なるものである。本解析法では、問題を2つの問題の重ね合わせとし、一方を有限要素法で、他方を境界要素法で解き、両者を重ね合わせた時に全ての条件が満足されるように定式化されている。この手法は、クラック進展解析に適した境界要素法と、材料の非線形性に対応しやすい有限要素法の利点を組み合わせてものであり、これまでにこのような概念が発表されていない全く新しい手法である。解析手法の有効性を示し、その妥当性を検証するために、鋼繊維補強コンクリ-トの一軸引張試験を行ない、コンクリ-トの破壊に関する物性を表す引張軟化曲線の計測に成功した。コンクリ-トの一軸引張試験は大変難しいが、本研究ではクラックゲ-ジを用い、クラックの開口変位にフィ-ドバックをかけることにより、ピ-ク後の挙動を安定に試験することができた。クラックの進展を計測し、開口変位・せん断変位の分布を計測するために必要となる変位場計測システムを構築した。非接触で変位場を1μmの精度で計測可能なレ-ザ-スペックル法を採用し、二重露光したフィルムにレ-ザ-光を照射して干渉縞を出すときに、フィルムをXYプロッタ-により移動することにより変位場計測を自動的に行うことを可能にした。また、画像解析により干渉縞の解析を行うことにより、計測精度を上げることができた。この計測システムは、次年度に予定している曲げ試験、せん断試験におけるクラック進展の計測に有効であると考えられる。

変位の不連続面を有する有限要素の定式化を行い、不連続面では引張軟化関係を満足させ、さらに、引張軟化域における除荷経路を考慮し、引張軟化曲線から除荷経路への分岐を厳密に判定した。結果として、通常の切り欠きから進展する1本のクラックの解析だけでなく、切り欠き無しの無筋コンクリートの曲げ試験のように、クラックが最初分布して発生し、やがて一本のクラックに局所化する過程を解析することが可能となった。引張軟化曲線は引張破壊挙動を支配する材料特性であり、一軸引張試験におけるピーク後の開口変位と伝達応力の関係と定義される。しかし、一軸引張試験を実施し引張軟化曲線を得ることは難しい。そこで本研究では、安定した試験が容易であるノッチ付き無筋梁の曲げ試験より引張軟化曲線を得る逆解析法を開発した。この逆解析法は、ノッチ先端の開口変位は常に開口変位の最大値であり、ある時点までに求めた引張軟化曲線の部分からノッチ先端を除いて開口変位増分と伝達応力増分の関係が既知であるという点に着目し、その時点からのノッチ先端の開口変位増分と伝達応力増分の関係を、荷重増分と載荷点変位増分の関係から求め、この増分計算を繰り返すことにより引張軟化曲線を求めるという方法である。さらに開発したコンクリートにおけるクラックの進展解析手法と引張軟化曲線の逆解析法を応用し、近年導入された掘削と覆工を並行して行うトンネルの工法において鋼繊維補強コンクリートを覆工に用いるための設計法を提案した。これは、断面耐力の算定にひびわれの応力伝達を考慮したが、破壊力学に基づく新しい設計法である。
腸管凝集性大腸菌の凝集関連因子の同定と新規検査法の開発

大腸菌8,729株(20012016年)から腸管凝集性大腸菌(EAEC)301株を検出した。2010年まではEAEC O25がESBL遺伝子CTX-Mと尿路病原性大腸菌の付着因子を高率に保有していた。系統解析では遺伝的多様性が著明で、各O血清群でクラスターを形成していた。2011年以後は、本来のEAEC O111がCTX-Mを獲得しており、さらに髄膜炎の病原因子K1莢膜の遺伝子を持つEAECも出現した。本研究で明らかになった遺伝的多様性は新規EAEC検査法開発の基盤となるとともに、バイオフィルムを形成するEAECが小児腸管内で病原遺伝子と薬剤耐性遺伝子のリザーバーになる可能性が示唆された。本年度は2010年までに鹿児島県で収集した腸管凝集性大腸菌(EAEC)(typical EAEC169株とatypical EAEC44株)および大阪府立公衆衛生研究所で分離されたtypical EAEC 31株の計244株を対象とした。各株のO・H血清群を決定し、病原遺伝子分布状況をPCRで検索し、さらにMLSA(multilocus sequence analysis)による系統解析を行った。その結果、typical EAECではO111・O25・O126・O86などがみられ、付着因子AAFのIからVのうちいずれかの遺伝子を保有していた。O untypableのtypical EAECやatypical EAECでは、既知の付着遺伝子の検出率は低かった。EAEC O25の多くは、尿路病原性大腸菌(UPEC)の付着因子遺伝子afaBとともにESBL遺伝子CTX-M-14を高率に保有していた。系統解析では、EAECはA、B1、B2、Dの4系統群に広く分布し遺伝的多様性が著明であり、O血清群ごとにクラスターを形成していた。EAEC O25は、尿路病原性大腸菌などの腸管外病原性大腸菌が含まれるカテゴリーB2に属しており、ESBL産生菌として世界的に蔓延しているO25:H4:ST131クローンと同じH4とST131を示した。このクローンは鹿児島県で2003年に突然出現しており、それ以前から見られていたEAEC O111・O126にはESBL産生菌がみられなかったことから、UPEC O25:H4:ST131がCTX-M-14とともに新たにEAEC病原プラスミドを獲得して出現したと推定された。また、大阪由来株のうちO111 1株とO86 2株にもESBL産生菌(CTX-M-14/15)が確認され、これらは従来のEAECがCTX-M遺伝子を持つプラスミドを獲得したものと考えられた。本年度は2010年までの結果を論文にまとめ、現在投稿中である。2011年から2013年に収集した大腸菌計1280株を対象に、腸管凝集性大腸菌(EAEC)の検出、O血清群の決定、病原遺伝子分布状況をPCRで検索し、さらにbiofilm形成能を検討した。その結果、EAEC(aggR遺伝子陽性株)の検出率は2011年6.2%、2012年2.8%、2013年4.7%だった。EAECの34.5%が繊毛AAF IIIを保有し、尿路病原性大腸菌(UPEC)の付着因子sfa 25.9%、pap 34.5%を保有していた。2011年以降sfa, pap遺伝子とESBL(CTX-M)遺伝子を保有する株O111、O127が増加していた。本来強いbiofilm形成能を示すO111、O127でもUPECの付着因子を持つ株はbiofilm形成能が弱い傾向がみられた。一方、CTX-M遺伝子の検出率は、2011年8.3%、2012年6.9%、2013年10.7%と増加していた。CTX-M型は14が54%、27が23%だった。CTX-M保有EAECは6株(0.5%)みられ、O111が5株、O127が1株、CTX-M型は14が多く、O127がAAF V、O111の5株がAAF IIIを保有していた。また、6株中5株がEAECの染色体上の病原遺伝子picとaaiCを保有していた。2003年から急に出現していたO25UPEC/EAECハイブリッド株は2011年以降みられなかった。CTX-M保有EAECの出現メカニズムは、2010年まではUPEC O25/ST131がEAECのplasmidとともにCTX-Mを獲得したものであったが、2011年以降はO111やO127などbiofilm形成能の強い従来のEAECがCTX-Mを獲得して新たに出現したことが明らかになった。今年度は2010年までの研究結果を論文にまとめる(投稿中)ことができ、さらに2011年から2013年までに鹿児島県で収集した大腸菌から新たにtypical EAECとCTX-M遺伝子を保有するEAEC株を検出することができた。その結果、2010年までのEAEC株と2011年以降の株では、保有している病原遺伝子やbiofilm形成能に変化が出ていることが分かり課題遂行にたいへん有意義であった。

しかし、2011年以降に分離されたEAEC株のMLSA(multilocus sequence analysis)による系統解析など、さらなる解析が実施できなかったことが今年度の課題であった。昨年度までは2001年から2010年に鹿児島県で収集した腸管凝集性大腸菌(EAEC)(typical EAEC169株とatypical EAEC44株)および大阪府立公衆衛生研究所で分離されたtypical EAEC31株の計244株について検討を行ったが、本年度は2011年から2013年までに収集された大腸菌1,280株からtypical EAECをスクリーニングし、このEAEC株についてO・H血清群を決定、病原遺伝子分布状況をPCRで検討し、MLST(multilocus sequence analysis)による系統解析を行った。その結果、EAEC58株が検出され、2010年までに多く検出されたO25は3株のみで、O111・O126・O127・O158・O86などがみられた。付着線毛は、2010年まではAAF IやVが多くみられていたが、2011年以降AAF IIIの遺伝子を最も多く保有していた。EAECの特徴であるバイオフィルム形成能を検討した結果、biofilm index(BI)が0.2以上の株はEAECの染色体上の病原遺伝子を多く保有していたが、BIが0.2未満の株では尿路病原性大腸菌(UPEC)の付着因子を保有している株が多くみられた。また。基質拡張型βラクタマーゼCTX-M遺伝子を保有している株はO111だけに見られ、多くがBI 0.2以上の株であった。このことから、EAECは強いバイオフィルム形成能を特徴とする大腸菌であるが、2011年以降、バイオフィルム形成能の低いEAECが出現し、その特徴が変わってきていることが分かった。また、本来のEAECであるO111がCTX-M遺伝子を獲得していること、さらにそのCTX-M遺伝子タイプは海外に多い15や1なども増加していることが確認された。今年度は、2011年から2013年までに鹿児島県で収集されたEAECの解析と2010年までのEAECとの比較を行うことができ、課題の遂行に大変有意義であった。また2010年までの結果を論文報告できた。しかし、近年EAECの特徴に変化が生じてきていることが分かり、2014年以降の株の解析とさらなる詳しい検討ができなかったことが本年度の課題であった。本年度は2014年から2016年に収集した大腸菌1,214株について前年と同様にtypical EAECをスクリーニングし、病原遺伝子の分布状況を検討した。その結果、EAEC14株が検出されたがこれまでよりも低い検出頻度であった。2010年まで多数を占めたO25は1株も見られず、EAECの典型的なタイプであるO111が1株、O126が6株、その他O1が1株、UTが6株であった。付着線毛は、2010年まではAAF IやVが多く、その後AAF IIIを多く保有していたが、2014年以降はO1株以外全ての株がAAF IIを保有していた。EAECの特徴であるバイオフィルム形成能を検討した結果、これまでO126のEAEC株はEAECの染色体上のaaiCを保有しbiofilm index (BI)が0.2以上と強いバイオフィルム形成能を示す株であったが、今回はO1株以外の全ての株がaaiCを保有していたにもかかわらずBIが0.2以下だった。また、基質拡張型βラクタマーゼCTX-M遺伝子を保有する株はO111とUTの3株で、すべてBIが0.2以上の株であった。新生児髄膜炎の原因となる大腸菌(NMEC)の多くが保有するK1莢膜遺伝子のneuCは、O126とO1の2株が保有していた。
3次元多層光記録とその再生法に関する研究

レーザー走査顕微鏡を応用し、3次元光メモリ記録・再生システムを試作した。このシステムは、光源に波長488nmのAr^+レーザーを使用し、この光を対物レンズを用いて記録媒体中に集光する。記録媒体には、フォトリフラクテイブ材料を使用する。レーザー光をこれらの媒体中に集光すると、集光点付近でモノマーがポリマー化することにより屈折率が局所的に高くなる。フォトリフラクテイブ材料として、フォトポリマーを用いた光メモリについては、記録光学系ならびに再生光学系の最適化を行った結果、面内のビット間隔2μm,データ層間10μmで、全30層の記録に成功した。これを記録密度に換算すると、2.5X10^<10>Bits/cm^3となり、この値は、従来の光メモリの記録密度の限界10^8Bits/cm^3をはるかに越えるものである。従って、今研究で提案してきた3次元多層記録形光メモリは、現在の光メモリの限界を越える手法として、有効であることがわかった。さらに、実際のシステムの例として、3次元多層記録手法を用いた光メモリカードの試作を行った。これは、クレジットカードサイズのプラスチックカードに1cm×1cm×800μmの光記録部を組み込んだものであり、この部分にデータを3次元的に多層記録する。現在のところ多層記録できる層数は、30層までであるが、これを制限しているのは、現在我々が使用している対物レンズの作動距離のみである。フォトリフラクテイブ結晶を用いた3次元光メモリについては、結晶軸の方向や記録・再生光の偏光状態によって、記録される屈折率分布や、再生される信号光強度がどう影響されるかについて、解析した。解析にはkukhtarevの物質方程式を差分化させることによって行った。その結果、透過型位相差光学系でデータを再生する場合には、結晶は、Z軸CutよりもY軸Cutの方が良く、かつ偏光方向は、C軸と平行な場合の方が垂直な場合と比較して、3倍程度コントラスト良く再生できることがわかった。そして、これを実際の実験結果と比較し、よい一致を示すことを確認した。記録媒体にはフォトポリマーを用いた。レーザー光をこれらの媒体中に集光すると、集光点付近でモノマーがポリマー化することより屈折率が局所的に高くなる。これを利用して、データの記録を行なった。試作システムを用いて、フォトポリマーにビット型データを面内2μm×2μm、層間隔15μmで全15層の3次元記録ができることを確認した。この3次元光メモリの読みだしには、位相差顕微鏡を用いた。位相差顕微鏡は、面内方向に一定の構造をもつ物体に対しては、3次元分解を持つため、対物レンズに対して前後の層に書き込まれたビットデータに影響されることなく、データの読みだしを行なえることを確認した。更に位相差のコンフォーカル顕微鏡を用いて読み出しを行った結果、ビットデータのコントラストが飛躍的に向上した。また、フォトリフラクティブ結晶に同様のデータを面内5μm×5μm、層間隔30μmで全3層を3次元に記録し、位相差顕微鏡を用いて読み出しが行えることを確認した。

これら実験により生じた問題点は、記録媒体の屈折率が高いため、媒体内部深くにレーザー光を集光しようとすると、屈折率の不整合により集光スポットが奥行き方向にデフォーカスしてしまうことである。記録媒体としてフォトポリマーを用いる場合、油浸対物を用いることにより、屈折率がほぼ整合された状態にし、収差を軽減している。実際には、記録、読みだし位置に応じたダイナミックな収差補正方法が必要になると考える。フォトポリマーを用いた光メモリについては、記録光学系ならびに再生光学系の最適化を行った結果、面内のビット間隔2μm、データ層間10μmで、全30層の記録に成功した。これを記録密度に換算すると、2.5X10^<10>Bits/cm3となり、この値は、従来の光メモリの記録密度の限界10^8Bits/cm3をはるかに越えるものである。従って、今研究で提案してきた3次元多層記録形光メモリは、現在の光メモリの限界を超える手法として、有効であることがわかった。実際のシステムの例として、3次元多層記録手法を用いた光メモリカードの試作を行った。これは、クレジットカードサイズのプラスチックカードに1cm×1cm×800μmの光記録部を組み込んだものであり、この部分にデータを3次元的に多層記録する。現在のところ多層記録できる層数は、30層までであるが、これを制限しているのは、現在我々が使用している対物レンズの作動距離のみであるため、もっと作動距離の長い対物レンズを使用することによって100層程度までは可能である。フォトリフラクティブ結晶を用いた3次元光メモリについては、結晶軸の方向や記録・再生光の偏光状態によって、記録される屈折率分布や、再生される信号光強度がどう影響されるかについて、解析した。解析には、Kukhtarevの物質方程式を差分化させることによって行った。その結果、透過型位相差光学系でデータを再生する場合には、結晶は、Z軸CutよりもY軸Cutの方が良く、かつ偏光方向は、C軸と平行な場合の方が垂直な場合と比較して、3倍程度コントラスト良く再生できることがわかった。そして、これを実際の実験結果と比較し、よい一致を示すことを確認した。
疲労機構解明のための疲労き裂先端の塑性変形の実時間測定

材料の開発は高強度材料から高信頼性材料へと移行している。ここで問題となっているのは、繰り返し荷重あるいは温度変化に伴う材料の疲労劣化と破壊である。特に疲労き裂に関しては、その伝播機構が未だ充分に解明されていない。この原因は、疲労き裂先端の極微小な領域で生じる塑性変形が材料表面でしか測定できない点にある。本研究は、き裂内部の極微小な領域で生じる塑性変形を直接観察する方法を開発し、疲労き裂の伝播機構を考察することを目的として行われた。溶液中、定電位で不動態化している金属に塑性変形を与えると、不動態皮膜に覆われていない金属の面が生成し、この面は急速に不動態化し、分極電流が観察される。本研究では、音響学で用いられる原波形解析の手法を応用した波形解析ソフトウェアを作製し、観察される分極電流を解析した。これにより、従来測定できなかったき裂先端で起きる微小な塑性変形の量を実時間で定量化することが可能となった。この手法を用いて、純チタンで疲労き裂伝播試験を行い、負荷荷重の変化に伴って起きる塑性変形量の変化を測定し、従来より提案されている疲労き裂伝播機構のモデルと比較した。従来のモデルのうち最も有力視されているものの一つにき裂先端でふたつのすべり系が交互に働くモデルがある。しかし、このモデルによって予想されるき裂開口量に対する塑性変形量の変化と、今回実際に測定された塑性変形量の変化とは異なっていることが明らかとなった。このことより、き裂先端でふたつのすべり系が交互に働くだけではなく、別の塑性変形がき裂先端付近で起きていることが見いだされた。このことは、従来提案されている疲労き裂伝播モデルでは定量的に示されておらず、疲労き裂伝播モデルに新たな方向を示すものである。
脳動脈瘤血管内治療の術前力学シミュレーション技術の開発と実症例モデルへの応用

Flow diverterと呼ばれるタイプのステントを用いた脳動脈瘤治療を対象として,親血管に対する瘤の発生位置およびステント留置時の回転がステントの血流阻害効果に及ぼす影響を調べた.その結果前者については,血管の走行に対して垂直な位置に瘤が形成されている場合に,断面二次流れの影響により,他の瘤位置の場合よりも流入流量が著しく多くなることが示された.また後者については,ステントの回転による開口率の変化はごく僅かであったにもかかわらず,局所的な流れの変化を介して血流阻害効果に顕著な変化が生じるケースが認められた.昨年度までに構築した,モデル作成から血流評価までの一連の解析手法を応用し,ストラット(ステントを構成するワイヤ状の骨格要素)の本数を変数として,親血管と瘤との境界面における流入流量を定常流条件のもとで評価した.モデル形状は,血管の湾曲部に発生した瘤(sidewallタイプ)を対象とした.解析の結果,今回の血管形状およびステント形状のもとでは,ストラット本数の増加が必ずしも血流阻害効果の向上につながらないこと,また瘤の形成角度によってはそれが特異的に強調される場合があることが明らかとなった.続いて,近年欧米での利用が広がりつつあるflow diversion stentと呼ばれるタイプのステントについて,3次元形状モデルの作成を行った.flow diversion stentの特徴は,従来のステントよりも細いストラットが密に編まれている点であり,流体計算の観点では計算格子数(計算時間)の大幅な増加が問題となる.そこで計算時間の見積りを行うとともに,その対策について検討した.また,ステント留置の対象形状を医用画像ベースの実症例脳動脈瘤へと拡張するために,ソフトウェアを用いたステントの変形解析に着手した.さらに,定常流から拍動流への拡張や,流入条件の違いが結果に及ぼす影響など,より現実に近い条件下でステント留置術の血流解析を実現するための基礎的検討を進めた.脳動脈瘤治療用として近年欧米での利用が広がりつつあるflow diverterと呼ばれるタイプのステントについて,ストラット(ステントを構成するワイヤ状の骨格要素)の交差角度やピッチなど,実際の条件を模擬した3次元形状モデルを完成させた.このflow diverterステントモデルを用い,脳動脈瘤を伴うU字に湾曲した血管のステント留置術を対象として,ステント留置時の条件,特に瘤の位置およびステントの回転角の違いがステントの血流阻害効果に及ぼす影響について調べた.得られた結果は以下の通りである.第一に,血管湾曲部に対する瘤の位置の影響について調べた結果,血管の走行に対して垂直な位置に瘤が形成されている場合に,断面二次流れの影響により,他の瘤位置の場合よりも流入流量が著しく多くなることが示された.またほとんどのケースで,flow diverterステントの留置による流入流量の減少,すなわち正の血流阻害効果が見られたが,湾曲部に対して瘤がどのような位置に形成されているかによって,その血流阻害効果の程度(流入流量の減少割合)に差異が生じていた.第二に,flow diverterステントの回転が血流阻害効果に及ぼす影響を調べるために,ステントを血管に留置する際の中心軸周りの回転角を変化させて解析を行った.その結果,ステントの回転による開口率の変化はごく僅かであったにもかかわらず,局所的な流れ場の変化を介して,血流阻害効果に顕著な変化が生じていた.このことは,実際の留置手技においてステントの回転を細かく制御することは現状では現実的にほぼ不可能であることを考慮すると,留置時の回転に対してロバストな血流阻害効果を有するようなステントを今後開発していくことの重要性を示唆している.Flow diverterと呼ばれるタイプのステントを用いた脳動脈瘤治療を対象として,親血管に対する瘤の発生位置およびステント留置時の回転がステントの血流阻害効果に及ぼす影響を調べた.その結果前者については,血管の走行に対して垂直な位置に瘤が形成されている場合に,断面二次流れの影響により,他の瘤位置の場合よりも流入流量が著しく多くなることが示された.また後者については,ステントの回転による開口率の変化はごく僅かであったにもかかわらず,局所的な流れの変化を介して血流阻害効果に顕著な変化が生じるケースが認められた.現在,脳動脈瘤に対する血管内治療の主流はコイル塞栓術であるが,近年では,ステントグラフト(ステントの周りを薄い膜材で被覆した医療デバイス)を用いた脳動脈瘤治療,あるいはその膜材に多数の細孔を設けたデバイスによる治療が検討され始めている.さらには,ステント単体での治療(膜材で被覆していないベアステントによる治療)についても注目が集まりつつあり,これらステント系の医療デバイスを用いた脳動脈瘤血管内治療は,特に,コイル塞栓の困難な,頸部の広い瘤や巨大瘤に対する有用な治療法として期待されている.これらステント系の医療デバイスによる瘤治療(親血管への留置術)においては術前の力学的評価が重要であり,それを可能とするシミュレーション技術の開発が望まれる.平成23年度はまず,ステント単体での脳動脈瘤治療を対象として,ステントの留置による血流阻害効果の評価を行った.特に,親血管に対する瘤の位置やステントの巻き数が瘤内へ流れ込む血流に及ぼす影響を明らかにすることを目的とし,U字血管の湾曲部に5通りの角度で瘤が生じた場合の血流阻害効果の違いを血流シミュレーションにより評価した.その結果,瘤の形成角度5通りとステントの巻き数2通りの,計10通りの組み合わせにおいて,ほとんどのケースでステント留置による血流阻害効果が確認されたが,一部の瘤位置では瘤への流入流量や流入最大速度がかえって増加する結果となった.

このことから,親血管に対する瘤の位置によっては,ステントの留置が逆効果となり得ることが明らかとなった.興味深い新たな知見がこれまでに得られていること,現実に近い条件下でステント留置術の血流解析を実現するための検討が着実に進められていること,そして本研究課題の最終的な目的である脳動脈瘤実症例モデルへの応用に着手していることから,上記のような達成度評価とした.当初の研究実施計画では,ステントグラフト(ステントの周りを薄い膜材で被覆した医療デバイス)を留置した状態での血流阻害効果の評価までを目標としていた.残念ながら現在までのところその段階まで至ってはいないが,そのベースとなる,ステントを単体で留置した場合の血流阻害効果の評価を行い,新たな知見が得られていることから,上記のような達成度評価とした.脳動脈瘤の実症例モデルに対するステント留置術の力学評価シミュレーションを行うことで,本研究の手法の有用性を実証する.実際の治療において複数のステント候補の中からいずれかを選択するような状況を想定し,その判断材料となるような相対評価が,本研究の手法により可能であることを示すのが目的である.ここではステントの最適設計は計画していない.そのため,評価結果の絶対量そのものを議論するのではなく,評価結果の相対値に注目して手法の有用性を示すものとする.シース内に収められていたステントグラフトがシースからリリースされながら自己拡張するとともに,ステントグラフトと血管壁が接触・変形し最終的にその平衡状態に達するまでの,一連の力学的過程を解析できるようにすることが必要となる.当初の研究実施計画ではこれを全てin-houseの解析コードで行うことを計画していたが,それが困難な部分があること,および,市販のソフトウェアを用いることで一連の力学的過程の解析が行える目処がついたことから,研究実施計画を一部変更し,市販のソフトウェアを用いて対応することとする.これにより,上述のような一連の力学的過程を解析できるようにし,ステントグラフト留置時の血管内の状況を再現する.それを踏まえ,脳動脈の流動条件に基づいた血流シミュレーションを適用することで,ステントグラフト留置時の血流阻害効果の評価を行うとともに,その結果をステント単体の評価結果と比較する.多数の実症例モデルを対象としたシミュレーションを行うため,データ保存用ディスクの購入を計画している.また研究を効率的に進めるため,形状モデリング用ソフトウェアの購入も計画している.旅費に関しては,研究成果発表と情報収集,ならびに研究協力者との研究打合せに使用する計画である.また,研究成果を学術論文として公表するための諸経費と学会参加費にも研究費を使用する予定である.脳動脈瘤の実症例形状において上述のような一連の力学的過程の解析を行うために,比較的複雑な形状に対しても広く適用可能な汎用性の高い構造解析ソフトウェアの購入を計画している.旅費に関しては,国内・国際学会での研究成果発表と情報収集,ならびに研究協力者との研究打合せに使用する計画である.また,研究成果を学術論文として公表するための諸経費(英文校閲料・論文投稿料等)と学会参加費にも使用予定である.
イオンビーム蒸着法による有機エレクトロルミネセンス薄膜の安定化

本研究では有機EL用薄膜の高品質化を目的として、イオン化蒸着法による有機薄膜の形成を試みた。ここで扱う有機ELは、ホール輸送層と電子輸送性発光層を積層し、界面での電荷注入により発光を得るものである。そこでまず発光層としてイオン化蒸着法によりアルミニウムキノリノール(Alq)薄膜を形成し、次に発光層としてポリビニルカルバゾール(PVCz)を用いたEL素子を試作した。本研究で得られた結果は次の通りである。(1)イオン化蒸着によるAlq薄膜の形成蒸着イオンの加速エネルギーを変化させてAlq薄膜を作製し、その基礎的膜物性を評価した。X線光電子分光分析の結果、300V程度のイオン加速電圧を印加することによって膜中の不純物に起因すると考えられる酸素が減少した。さらにフォトルミネセンス測定では、不純物酸素の減少に伴って蛍光強度の増大が観察された。(2)EL素子の試作ITOガラス基板上に50nm厚のPVCz膜をスピンコートし、その上にイオン化蒸着によって50nm厚のAlq膜を蒸着し、さらにアルミニウムまたはマグネシウム電極を真空蒸着して素子を作製した。この素子は約10Vの印加電圧で発光を開始し、20V・10mA/cm^2の動作条件で1200cd/m^2の輝度が得られた。Alq蒸着のイオン加速電圧を印加すると同一動作電圧下での発光輝度が増大したが、加速電圧が高すぎると素子を流れる漏れ電流が増大し、効率は低下する蛍光が観察された。このようにイオン化蒸着法を用いると蒸着条件によって膜物性を制御できるため、有機EL素子の特性を改善できる可能性がある。
相変態を伴うセラミック材料の微細組織形成に関する研究

ジルコニアセラミックスに形成される多様な微細界面構造は、その相変態と密接に関連している。これらの界面構造を系統的に解析し、その形成機構を明らかにするため、人工的に界面構造を作製し、透過型電子顕微鏡法を用いて詳細な原子構造解析を行った。人工界面としては、立方晶ジルコニアの対称傾角粒界を単結晶同士を張り合わせることで作成した。また、界面の原子構造を理論的に評価するために、格子静力学計算を行った。立方晶ジルコニアの人工粒界に対する系統的な研究により、粒界原子構造、粒界エネルギー、粒界偏析といった粒界特性は、その方位関係に大きく依存することが明らかとなった。また、低Σ値を有する整合性の高い方位関係にある粒界において、粒界エネルギー及び粒界偏析に特異な挙動を示すものが存在することが明らかとなった。次に、粒界エネルギー及び粒界偏析挙動に顕著な差異が見られたΣ3,{111}、Σ11,{113}、Σ9,{221}に対して、高分解能電子顕微鏡法と格子静力学計算を用いた詳細な粒界原子構造解析を行った。その結果、実験により得られた粒界構造と、計算で得られた粒界最安定構造は良い一致を示し、どの粒界にも配位数欠損を有する陽イオンサイトが蓄積する傾向にあることが明らかとなった。詳細な解析により、このようなサイトと粒界エネルギー及び粒界偏析には強い相関性が存在することが明らかとなった。このようなサイト形成は、粒界の面方位と密接に関連していると考えられ、粒界特性の方位依存性は、粒界面の変化に伴う局所的なイオンサイトの配位環境変化に起因すると考えられる。つまり、ジルコニアセラミックスの界面構造においては、原子レベルでの局所構造がその特性を支配していると考えられる。
実空間と逆空間で探る生体分子の集団運動と局所運動の相関

蛋白質は、基質結合、光励起などの局所的摂動に対して応答し、分子全体が集団的に構造変化し、機能する。本研究は、分子シミュレーションと、その結果から計算される散乱・分光実験データを、相補的に利用して、蛋白質の局所運動と集団運動の連携機構を明らかにすることを目的とする。平成21年度は、以下の成果を得た。1.蛋白質の集団運動を解析する有効な手段に主成分解析(PCA)があるが、PCAにより求められた2つのモード間には高次相関がない。我々は、PCAを超える試みとして、信号処理の分野で用いられる独立部分空間解析の手法を応用し、分子シミュレーション結果から蛋白質の相関し合う運動モードを抽出する手法を開発した。この手法を、T4リゾチーム蛋白質の分子動力学計算結果に適用し、蛋白質の局所運動が、水素結合を介して集団運動に変換する過程を明らかにした。この結果は、現在専門誌へ投稿中である。2.蛋白質の機能には、ガラス転移温度(約200K)以上で起こる蛋白質の集団的非調和運動が重要な役割を果たす。我々は、Staphylococcal nuclease蛋白質の分子動力学(MD)計算結果からテラヘルツ時間領域分光(THz-TDS)データと中性子散乱データを計算し、蛋白質の集団運動に対する水和の役割を解析した。その結果、約200K以上での水和蛋白質のTHz-TDSデータには、水和水の運動、および、蛋白質と水和水の相互相関運動の寄与が、蛋白質分子運動の寄与より大きいことが明らかになった。また、約200K以上での水和蛋白質の中性子散乱データには、水和水の集団運動の寄与が、ある散乱角方向(Q2A^<-1>付近)に現れることが明らかになった。我々の計算結果は、通常の実験解析では無視される水和ダイナミクスの効果を含めて実験データを解析する必要があることを示す。これらの結果は、現在投稿準備中である。平成20年度は以下の成果を得た。1.我々は、Staphylococcal nuclease (SNase)蛋白質の分子動力学(MD)結果から非干渉性中性子散乱(INS)スペクトルを計算し、蛋白質の集団運動に対する水和の役割を明らかにしてきた。平成20年度は、分子シミュレーション結果からテラヘルツ時間領域分光(THz-TDS)データを計算する手法を開発し、上記SNase蛋白質のMDに適用した。その結果、THz-TDSデータに現れる蛋白質ダイナミクスの水和依存性や温度依存性は、INSスペクトルのものと大きく異なることが明らかになった。さらに、この違いを、THz-TDSデータに対する、原子の自己相関運動の寄与、原子間の相互相関運動の寄与、水分子ダイナミクスの寄与、等を吟味することで明らかにした。2.我々は、蛋白質の分子シミュレーション結果から、分子内の相関モードを抽出する手法の開発も行っている。蛋白質の集団運動を解析する有効な手段に主成分解析(PCA)があるが、PCAにより求められた2つのモード間には相関がない。平成20年度は、分子シミュレーションから求めた4次キュムラント行列を解析することで、多自由度複雑系である蛋白の分子運動を、複数の独立な部分空間に分離し、部分空間内の相関モードを解析する手法を開発した。この手法をT4リゾチーム蛋白質の長時間分子動力学計算結果に適用し、分子内にどのような相関モードが存在するか明らかにした。
線虫における細胞系譜ごとの遺伝子ネットワーク解析

線虫C.elegans卵は受精後不等分割を行い、細胞の運命決定には卵割に伴って活性化・局在化する母性因子が重要な働きをしている。このとき、最も重要なメカニズムが母性mRNAの翻訳制御である。例えばNotchレセプターglp-1のmRNAは全割球に存在するが、タンパクは前側割球のみ検出される。この制御には本研究室で単離されたpos-1が重要で、POS-1はジンクフィンガータンパクであり、初期胚後部割球の細胞質に局在し、生殖顆粒の構成タンパクの一つである。POS-1は複数のRNA結合型タンパクと相互作用し、そのうちの一つであるSPN-4はPOS-1と拮抗的にglp-1 mRNA翻訳を制御する。pos-1変異とspn-4変異の表現型は共通部分もあるが非常に多岐にわたることから、複数のタンパクの組み合わせによる翻訳制御の"fine tuning"の仕組みが示唆された。POS-1およびSPN-4と結合するRNAの同定およびその分子機構の解明、さらにPOS-1と相互作用するタンパクについても同様の解析を行うことにより線虫初期胚発生過程の遺伝子発現の全貌を明らかにすることを目的としている。まず、線虫の初期胚発生における翻訳制御の一例として、酵母tri-hybrid法によりPOS-1およびSPN-4が直接glp-1 mRNAの3'-UTR(非翻訳領域)と相互作用することにより翻訳制御を行っていることを明らかにした。次いで、胚発生に必須な他のRNA結合型タンパクも種々の母性mRNAの3'-UTRと相互作用することを認め、これらのタンパクの組み合わせによる翻訳制御の"fine tuning"を明らかにした。また、POS-1およびSPN-4が相互作用する母性mRNAの3'-UTRの比較することにより共通配列が存在することを認め、変異を導入した実験からそれぞれの結合にその共通配列が重要であることが明らかになった。線虫C. elegans卵は受精後不等分割を行い、細胞の運命決定には卵割に伴って活性化・局在化する母性因子が重要な働きをしている。POS-1は複数のRNA結合型タンパクと相互作用し、そのうちの一つであるPIP-1はPOS-1と拮抗的にglp-1 mRNA翻訳を制御する。pos-1変異とpip-1変異の表現型は共通部分もあるが非常に多岐にわたることから、複数のタンパクの組み合わせによる翻訳制御の"fine tuning"の仕組みが示唆された。POS-1およびPIP-1と結合するRNAの同定およびその分子機構の解明、さらにPOS-1と相互作用するタンパクについても同様の解析を行うことにより線虫初期胚発生過程の遺伝子発現の全貌を明らかにすることを目的としている。まず、線虫の初期胚発生における翻訳制御の一例として、酵母tri-hybrid法によりPOS-1およびPIP-1が直接glp-1 mRNAの3'UTR(非翻訳領域)と相互作用することにより翻訳制御を行っていることを明らかにした。次いで、胚発生に必須な他のRNA結合型タンパクも種々の母性mRNAの3'UTRと相互作用することを認め、これらのタンパクの組み合わせによる翻訳制御の"fine tuning"を明らかにした。また、POS-1およびPIP-1が相互作用する母性mRNAの3'UTRの比較、点変異導入実験からそれぞれの結合配列を同定した。最後に、ポリ(A)鎖の長さは翻訳効率を高めることが知られており、これらのタンパクはmRNAの安定性に関与するポリ(A)結合タンパクと相互作用することを見いだした。以上の結果から、POS-1をはじめとするRNA結合型タンパクは、mRNA3'UTR内の特異的配列に結合し、ポリ(A)鎖の長さを調節することにより翻訳を制御するものと考えられる。まず、線虫の初期胚発生における翻訳制御の一例として、酵母tri-hybrid法によりPOS-1およびSPN-4が直接glp-

1 mRNAの3'-UTR(非翻訳領域)と相互作用することにより翻訳制御を行っていることを明らかにした。次いで、胚発生に必須な他のRNA結合型タンパクも種々の母性mRNAの3'-UTRと相互作用することを認め、これらのタンパクの組み合わせによる翻訳制御の"fine tuning"を明らかにした。また、POS-1およびSPN-4が相互作用する母性mRNAの3'-UTRの比較することにより共通配列が存在することを認め、変異を導入した実験からそれぞれの結合にその共通配列が重要であることが明らかになった。
血管平滑筋細胞内Mgの変動とその生理的役割の解明

モルモットから門脈および盲腸紐平滑筋条片を摘出し、標本とした。標本を蛍光Mg指示薬furaptraのacetyoxy-methylエステルを含むTyrode液中に浸すことにより、細胞内にfuraptraを導入した。細胞内furaptra蛍光信号と細胞内Mg濃度との関係は、furaptraを導入した標本を2個イオンイオノフォアBr-A23187で処理して細胞膜のMg透過性を高め、細胞外Mg濃度を種々に変えて求めた。細胞外潅流液のMg濃度が1.2mMの条件下では、細胞内Mg濃度は平均1.0mMと見積もられた。潅流液中のMg濃度を10mMに増加、または0.6mMに減少させても、細胞内Mg濃度は2時間以内には有意な変化を示さなかった。しかし、潅流液中のCaを除くと、10mM Mgの潅流により、細胞内Mg濃度は1.6mM程度に上昇した。細胞外外Ca存在下にNaを除くと(NaclをN-methy D-glucamineに置換)、細胞内Mg濃度は2.0mM程度に上昇し、細胞外Na濃度を元に戻すことにより回復した。細胞外Naを除くことによる細胞内Mg濃度の上昇は、細胞外Mg濃度に依存し、高濃度細胞外Mg(10mM)により、増強された。また、Ouabain(1-2uM)により細胞膜のNa/kポンプを抑制し、細胞内Na濃度を高めても同様の細胞内Mg濃度の上昇が観察された。以上の結果より、(1)細胞外Ca存在下では細胞膜のMgの透過性が低く抑えられていること、(2)細胞膜には、細胞内外のNa濃度勾配に依存したMgくみだし機構が存在し、細胞内Mg濃度は電気化学的平衡から予測されるよりはるかに低いレベル(約1mM)に保たれていることが示唆された。
樹状細胞に発現する細胞質型チロシン脱リン酸化酵素に関する研究

樹状細胞(dendritic cell:DC)における細胞質型チロシン脱リン酸化酵素Shp-1の機能解析を目標にDC特異的にShp-1を欠損するコンディショナルノックアウトマウス(Shp-l cKO)を作製して解析を行った。その結果Shp-l cKOにおいては、加齢にともない自己免疫性の腎炎が生じ、腎臓内にマクロファージやT細胞が強く浸潤することが明らかになった。また、腎臓内に浸潤する細胞が炎症性サイトカインを強く産生することも判明した。樹状細胞(Dendritic Cell:DC)における細胞質型チロシン脱リン酸化酵素Shp-1の機能解析を目標にCre-loxPシステムを用いてDC特異的にShp-1が欠損するコンディショナルノックアウトマウス(Shp-1 cKO)を作製した。Shp-1 cKOマウスではDCの活性化に加えてT細胞からのIFNγの産生亢進があり、腎臓では加齢に伴い免疫複合体が沈着して糸球体腎炎が発症する。本研究ではShp-1 cKOを用いて、DCおよびT細胞の機能異常がもたらす自己免疫疾患発症の分子機構を詳細に検討する目的で、糸球体腎炎の病理組織学的な解析を行い、腎臓内に分布する免疫担当細胞の変化をフローサイトメーター(FCM)にて解析した。腎臓の組織標本を用いて免疫組織染色を行う場合、固定法によっては染色結果が不安定になることがある。そのため本研究においては、良好な染色性を得る目的でホルムアルデヒドやアセトンまたは亜鉛を用いた各種の固定法を試み、安定した免疫組織染色法を確立した。その結果、cKOでは、コントロールマウスに比べ、糸球体にIgGおよびC3の強い沈着があり、メサンギウム領域の拡大が認められた。また、間質を中心に単核球の浸潤が観察された。免疫組織学的な検討では浸潤する細胞の多くがThy1抗原陽性のT細胞であり、F4/80陽性のマクロファージの増加も認められた。さらに、コラゲナーゼ処理を行うことにより得られる腎臓由来の単核球を用いたFCMによる解析でも、40週齢のマウスではT細胞やマクロファージの増加が確認され、これらの結果は腎の免疫組織染色の結果に一致するものであった。樹状細胞(Dendritic Cell:DC)における細胞質型チロシン脱リン酸化酵素Shp-1の機能解析を目標に、Cre-loxPシステムを用いてDC特異的にShp-1を欠損するコンディショナルノックアウトマウス(Shp-1 cKO)を作製して解析を続けている。Shp-1 cKOのDCはT細胞への抗原提示能がWTに比べて高く、Th1細胞の誘導にも優れていることが明らかにされている。また、Shp-1 cKOマウスは、加齢に伴い糸球体腎炎を発症する事も明らかにされているが糸球体腎炎の発症における詳細な分子機構は明らかになっていない。本研究ではShp-1 cKOに見られる腎炎を解析する目的で、腎臓内に浸潤する炎症細胞を免疫組織染色を用いた方法により同定し、加えて腎臓より単核球を分離してフローサイトメーター(FCM)を用いて解析した。その結果、Shp-1cKOの腎臓内では、加齢に伴いCD4陽性のT細胞とF4/80陽性のマクロファージの浸潤が強く認められる事が明らかとなった。また、Shp-1 cKOの腎臓内に浸潤するT細胞はIFNγを強く産生するTh1タイプ細胞であることが判明し、マクロファージからのTNFαの産生亢進も確認された。これらの結果から、Shp-1 cKOではShp-1を欠損するDCがマクロファージやTh1細胞が活性化し、腎臓内への浸潤を促すことで腎炎が発症することが明らかになった。Shp-1 cKOのDCはT細胞への抗原提示能がWTに比べて高く、Th1細胞の誘導にも優れていることが明らかにされており、また、Shp-1 cKOマウスは加齢に伴い糸球体腎炎を発症する事も明らかにされているが糸球体腎炎の発症における詳細な分子機構は明らかになっていない。本研究ではShp-1 cKOに見られる腎炎を解析する目的で、Shp-1 cKOの腎機能の変化に着目し、血液と尿に関して生理学的な検討を行い、あわせて腎臓内に浸潤する細胞の変化をフローサイトメーターを用いて解析した。その結果、Shp-lcKOでは40週齢を超えるマウスにおいて血清クレアチニンが上昇し尿量の増加が見られた。また、腎臓内に浸潤する細胞数も加齢の影響を受け、40週齢を超えるマウスでは血球系のマーカーであるCD45を発現する細胞が有意に増加することが明らかになった。なかでも、CD4陽性のT細胞とF4/80陽性のマクロファージの浸潤が強く認められた。これらの結果から、Shp-1 cKOではShp-1を欠損するDCがマクロファージやThl細胞を活性化し、これらの活性化した細胞が腎臓内への浸潤することで腎機能が障害され尿量が増加することが明らかになった。

樹状細胞(dendritic cell:DC)における細胞質型チロシン脱リン酸化酵素Shp-1の機能解析を目標にDC特異的にShp-1を欠損するコンディショナルノックアウトマウス(Shp-l cKO)を作製して解析を行った。その結果Shp-l cKOにおいては、加齢にともない自己免疫性の腎炎が生じ、腎臓内にマクロファージやT細胞が強く浸潤することが明らかになった。また、腎臓内に浸潤する細胞が炎症性サイトカインを強く産生することも判明した。本研究課題においてはShp-1 cKOに見られる臓器特異的な自己免疫疾患の解析を目標に研究を進めている。FCMによる炎症細胞の同定と分離が可能になったことから、腎臓内のT細胞やマクロファージの性状が明らかになり、Shp-1 cKOにおける腎炎発症の分子機構の解析が進んだ。膠原病本年度においてShp-1 cKOの腎炎に関して、生理学的および実験病理学的な解析を行う。具体的にはShp-1 cKOの血液や尿を用いて生化学的な分析を行うほか、Shp-1 cKOに腎炎を誘発し、炎症性細胞の動態を確認する。これらの解析により腎臓内に浸潤する炎症細胞の病的な意義がより詳細に明らかになる。本研究課題においてはSHP-1のcKOに見られる腎臓を中心とした臓器特異的な自己免疫疾患の解析を目標に研究を進めており、第一の目標として腎臓における炎症性細胞の同定と分離の準備を行った。本年度の研究により腎臓内のT細胞やマクロファージのFCMを用いた解析の準備が整い、炎症細胞のサイトカインプロファイルを確認する事が可能になった。本研究課題においてはSHP-1のcKOに見られる自己免疫疾患の解析を目標に研究を進めているので、SHP-1cKOの安定的な生産が重要になる。本年度においては当大学の動物実験施設が改修工事により十分な飼養環境を確保することが困難であった。しかし、次年度からは新規の動物実験施設が稼働するため、本年度より多くのcKOを用いた解析が可能になり、研究の円滑な推進が期待されている。また、SHP-1cKOの遺伝的均一性をさらに高めるために行っている戻し交配も順調に進行しているので、次年度以降においてはより純度の高い実験が可能になる。遺伝子改変マウスの飼養環境に制限があったため少数のマウスを用いた予備実験は済んでいるので、次年度以降にサンプル数を増やしてデータを蓄積する。
クラウンゴール腫瘍形成におけるアグロバクテリウムと植物の分子的相互作用

TiプラスミドによるDNAの導入は、Agrobacteriumが植物に感染した際に誘導される多段階の反応により引き起こされる。その内の最も重要な素過程の一つは感染時に誘導されるAgrobacteriumのvir遺伝子の発現であり、その遺伝子産物の働きによりDNAが植物細胞へ転移する。本研究の目的は、このTiプラスミドによるDNA導入の素過程の分子機構を理解する必要がある。本研究では、DNA転移の鍵となる反応であるvir遺伝子の発現は植物からのフェノール物質と単糖による協調的作用により誘導されるが、フェノールによるシグナルはVirAセンサータンパク質のリンカードメインに、単糖のシグナルはペリプラズムドメインに作用することを明らかにした。さらに、Agrobacteriumがタバコ細胞に感染する際に誘導される植物側の反応を検索し、46kDaのプロテインキナーゼが一過的に活性化されることを見出した。このキナーゼの活性は、そのタンパク質のチロシンとセリン/トレオニン残基がリン酸化されることによることがわかった。また、このようなキナーゼはタバコのみならず、シロイヌナズナやイネなどの他の多くの植物にも存在することがわかった。したがって、このキナーゼは植物界に広く分布しており、植物の重要な生理学的過程に関与していると考えられる。今後さらに、Agrobacteriumの植物への感染との関連を研究していく計画である。本研究では、DNA転移の鍵となる反応であるvir遺伝子の発現は植物からのフェノール物質と単糖による協調的作用により誘導されることを明らかにした。さらに、フェノール物質はAgrobacteriumの膜結合型プロテインキナーゼであるVirAタンパク質に作用するが、単糖はペリプラズムに存在するChvEタンパク質に結合し、糖結合型ChvEタンパク質がVirAタンパク質に作用し、フェノール物質によるシグナルを増幅することを明らかにした。これらの結果は、これらのシグナル物質の量と割合を考慮することによりTiプラスミドによる遺伝子導入効率を改良することがでりる可能性も示している。また、Agrobacteriumから植物細胞への遺伝子の転移そのものにはVirBタンパク質群、VirD2、VirD4タンパク質が必須であり、VirE2タンパク質には転移を促進する機能があることを明らかにした。