hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
セツキシマブの肺癌治療における新しいバイオマーカーの開発

新しい分子標的治療薬抗EGFR抗体セツキシマブの肺癌における有効性が期待されている。本研究ではセツキシマブの効果が期待できる肺癌患者を選択するためのバイオマーカーの開発を行った。我々は肺癌においてもっとも重要なNK細胞活性化因子がULBP2であること、この遊離型である可溶性ULBP2がNK細胞機能とセツキシマブADCC活性を減弱させることを見いだした。本研究により可溶性ULBP2が定値の肺癌患者や、肺癌手術後、化学療法後の末梢血可溶性ULBP2低下時にセツキシマブ投与を行うのが最適であることが明らかになった。セツキシマブは非小細胞肺癌に過剰発現しているEGFRに対するモノクロナール抗体である。肺癌領域における本剤への期待はきわめて高く、本剤が奏功する患者を選択するためのバイオマーカーの開発が急務となっている。我々はこれまでセツキシマブの抗腫瘍効果は主にそのADCC活性によることを明らかにしてきた。最近このADCC活性を担うNK細胞が標的細胞表面上に発現するNKG2Dリガンドにより活性化されることが明らかになってきた。そこで肺癌細胞表面上のNKG2Dリガンド、あるいはそれが血清中へ遊離された可溶性NKG2Dリガンドを測定することで、抗EGFRモノクロナール抗体セツキシマブの肺癌における新しい効果予測因子(バイオマーカー)を開発することを目的とした本研究を計画した。我々は平成21年度研究で、主に培養肺癌細胞株を用いて、腫瘍細胞表面上のNKG2Dリガンド量、培養液中に遊離する可溶性NKG2Dリガンド量を測定し、それらが末梢血単核球のセツキシマブADCC活性に及ぼす影響を検討してきた。その結果、腫瘍細胞表面上のNKG2DリガンドはADCC活性を増強するが、培養液中可溶性NKG2DリガンドはADCC活性を抑制することを明らかにした。この本年度成果の一部を第49回日本呼吸器学会総会International Symposium (2009年6月東京)(招待講演)において発表した。我々は平成22年度研究では主に実際の肺癌患者における可溶性NKG2Dリガンドの測定と、予後との相関を検討した。その結果1.手術を受けた肺癌患者において末梢血可溶性NKG2Dリガンドは残存腫瘍量、手術の根治性と相関した。2.化学療法をうけた肺癌患者において、末梢血可溶性NKG2Dリガンドは治療効果(腫瘍縮小効果)を反映した。また患者予後と可溶性NKG2Dリガンド量は逆相関した。これらのことから可溶性NKG2Dリガンドは体内の腫瘍量や治療効果を反映し、宿主の免疫能に影響を与えることで予後に相関していることが示唆された。これら本年度成果は第101回米国癌学会(AACR2010,ワシントンDC)において発表した。我々は平成23年度研究では昨年度に引き続いて主に実際の肺癌患者における可溶性NKG2Dリガンドの測定と、予後との相関を検討した。

また患者予後と可溶性NKG2Dリガンド量は逆相関した。これらのことから可溶性NKG2Dリガンドは体内の腫瘍量や治療効果を反映し、宿主の免疫能に影響を与えることで予後に相関していることが示唆された。
高波浪・暴風時におけるオイルフェンスの破壊メカニズムとその対策に関する研究

平成12年度は,法定オイルフェンスB型および法定規格外であるD型オイルフェンスの模型を作成し,荒天時におけるオイルフェンスの挙動特性およびオイルフェンススカート部内の上部および下部ケーブルに作用する張力特性に関する模型実験を行い,実験結果を整理すると共に,オイルフェンスの破壊メカニズムとその対策について考究し,以下のことが明らかになった.1)B型およびD型に関わらず,オイルフェンスを展張した場合,オイルフェンスは水中の水粒子運動に追従して円あるいは楕円運動を繰り返す.なお,入射波高および周期の違いによりオイルフェンスが没水あるいは非没水の場合に分類される.特に,没水時の入射波特性は入射波の周期と波高が反比例の関係にある.さらに,同一の入射波周期の場合,没水時におけるD型への波高がB型に比べ大きい.ただし,水槽幅に対してオイルフェンスの長さを増加させることにより,没水は回避できる.2)B型およびD型に関わらずオイルフェンスを展張した場合,オイルフェンス設置端部を波峰および波谷が通過直後に上・下部ケーブルの作用張力に衝撃的な極値が発生する.ただし,作用張力の極値は波峰通過直後に上部ケーブルで発生する張力が最大である.なお,最大張力はB型に比べDの場合に大きくなる.また,最大張力の変化は波高変化に比べて周期変化に対して極めて敏感であり,同一波高の場合,高周期の場合に最大張力は極めて大きくなる.以上の結果より,オイルフェンスの破壊には上部ケーブに作用する衝撃的な張力に対する強度が関連することが明らかになった.同時にオイルフェンスへ滞油性を期待する場合,没水の回避が必要不可欠であることが分かった.ただし,既存のオイルフェンスの耐波特性は,周期に関わらず一律に波高で規定されている.これに対して,本研究の結果より,上述の耐波特性に対して入射波の周期性を考慮する必要性が明らかになった.高波浪・暴風時のオイルフェンスに対する外力の評価および破壊メカニズム解明の第一段階として,平成11年度は,高波浪時におけるオイルフェンススカート部における流体場の特性,特にスカート部で形成される剥離渦の特性に着目し,PIVを用いた可視化実験を行った.この際,作用波力が最大となることが予想されるオイルフェンス展張時を想定し,オイルフェンスの模型には,固定平板を採用した.なお,スカート長さは既存のオイルフェンス寸法を実験スケールで縮尺している.結果として,1)スカート部で形成される剥離渦は平板に対する波の入射側および透過側でその形成過程が異なること,2)特異な現象として,入射波が高周波領域の場合,水表面付近では平板入射波側の渦径および渦度の値が増大することが明らかになった.この中で2)の結果は,滞油性能に影響を及ほす可能性があるため,オイルフェンス展張時の波動場が高波浪かつ高周波領域の場合に,剥離渦の影響を軽減するフェンスの形状あるいは展張方法の必要があることを示唆している.平成11年度内に,想定される高波浪・暴風場の設定条件の抽出が終了し,設定条件に対応した送風設備および外力測定用の小型張力計の納入,さらにオイルフェンスの試作模型の作成が完了している.平成11年度の実験結果を基礎資料として,平成.12年度内に,高波浪・暴風時におけるオイルフェンスの外力評価および破壊メカニズムの解明を行い,最適なオイルフェンスの設計形状の提案を行う.平成12年度は,法定オイルフェンスB型および法定規格外であるD型オイルフェンスの模型を作成し,荒天時におけるオイルフェンスの挙動特性およびオイルフェンススカート部内の上部および下部ケーブルに作用する張力特性に関する模型実験を行い,実験結果を整理すると共に,オイルフェンスの破壊メカニズムとその対策について考究し,以下のことが明らかになった.1)B型およびD型に関わらず,オイルフェンスを展張した場合,オイルフェンスは水中の水粒子運動に追従して円あるいは楕円運動を繰り返す.なお,入射波高および周期の違いによりオイルフェンスが没水あるいは非没水の場合に分類される.特に,没水時の入射波特性は入射波の周期と波高が反比例の関係にある.さらに,同一の入射波周期の場合,没水時におけるD型への波高がB型に比べ大きい.ただし,水槽幅に対してオイルフェンスの長さを増加させることにより,没水は回避できる.2)B型およびD型に関わらずオイルフェンスを展張した場合,オイルフェンス設置端部を波峰および波谷が通過直後に上・下部ケーブルの作用張力に衝撃的な極値が発生する.ただし,作用張力の極値は波峰通過直後に上部ケーブルで発生する張力が最大である.なお,最大張力はB型に比べDの場合に大きくなる.また,最大張力の変化は波高変化に比べて周期変化に対して極めて敏感であり,同一波高の場合,高周期の場合に最大張力は極めて大きくなる.以上の結果より,オイルフェンスの破壊には上部ケーブに作用する衝撃的な張力に対する強度が関連することが明らかになった.同時にオイルフェンスへ滞油性を期待する場合,没水の回避が必要不可欠であることが分かった.ただし,既存のオイルフェンスの耐波特性は,周期に関わらず一律に波高で規定されている.これに対して,本研究の結果より,上述の耐波特性に対して入射波の周期性を考慮する必要性が明らかになった.
動く遺伝子コピアのレトロウイルス様粒子内RNAでの新しい逆転写メカニズムの研究

レトラトランスポゾンcopiaの逆転写のメカニズムを研究すべく、3年間の研究を行った。その結果以下の知見が得られた1.レトロウイルス様粒子内のコピアRNAを鋳型とする逆転写は従来のレトロウイルスのcDNA合成とは異なり、tRNA(コピアRNAの場合はf-met-tRNA)の3'末端が切断され、その上流がプライマ-となることが示されていたが、この様な3'末端を切断する酵素活性はレトロウイルスの逆転写酵素の活性の一部として存在することがわかり、この活性がコピアのレトロウイルス様粒子内の逆転写酵素に特異的な活性ではないことが示された。2.プライマ-となるf-met-tRNAの欠失したと思われる3'末端36ヌクレオチドを合成し、これをプライマ-として、欠失したf-met-tRNAの存在を調べたが明確な結果が得られなかった3.copiaを持つ細胞内の環状copiaDNAの存在を効率良く同定する目的で、又、2LTRと1LTRの構造や量比を調べるため酵素増幅法を用いた。この方法によって2LTR・1LTRのjunction部分を増幅して得ることができ、構造解析が可能になりつつある。4.copiaは従来から細胞内で5kbと2kbのRNAが転写により生ずることが示されていた。このうち2kbは5kbRNAのスプライシングによって生ずること、また、この2kbRNAから生ずるタンパク(33Kダルトン)がレトロウイルス様粒子形成の総ての情報を持つことが示された。又この2kbRNAには、逆転写に必要なプライマ-の結合サイトや2本鎖DNA合成のシグナルサイトも保存されていることが示された。5.逆転写によりcopiaDNAが形成されることをより強く解明するためcopiaを持たないショウジョウバエの培養細胞に5kb copiaを導入し、その細胞においてスプライシングによって生ずる2kb RNAから逆転写によって2kb DNAが形成されるかどうかを調べた。その結果、両端にLTRを持ち宿主の重複配列を持つ2kb DNAが形成されていること、又、本来のcopiaを持つ培養細胞系にも2kb DNAがあることがPCRで確認され、copiaが逆転写によって転移増幅していることがより強く示唆された。レトロトランスポゾンーコピアはショウジョウバエの細胞内で動く遺伝子としての機能を持つと同時に,細胞内に我々によって見い出されたレトロウイルス様粒子を形成する.このウイルス様粒子は逆転写酵素活性を持ち,この酵素によってコピアは遺伝子上で増巾や再配列を起すと考えている.このウイルス粒子内のコピアRNAを鋳型とする逆転写は,従来のレトロウイルスのcDNA合成とは異なり, tRNA(fーMet tRNA)の3′末端からではなく,3′末端が切断され,その上流がプライマーになることを我々は示した.これらの結果をふまえてまず初めに,この様なtRNA3′末端のRNAーRNAハイブリッドから遊離した部分を切り出す酵素が一般的なレトロウイルス中に存在するかどうか検討したところ酵素活性の一部として3′末端から切り出す酵素(エキソヌクレアーゼ活性かエンドヌクレアーゼ活性かは現在検討中)が存在することがわかり,この活性がコピアのウイルス様粒子中の逆転写酵素に特異的な性質でないことが示された.

次に, 3′末端が36塩基欠けたtRNAがプライマーになる場合, 36塩基が切り出されたfーMet tRNAの断片や, 36塩基の遊離したtRNA断片が細胞内やウイルス粒子内に存在する可能性が考えられる.この事を検索するため, MetーtRNA中の一部の塩基に相補的な合成ヌクレオチド(約17塩基)を作成して細胞内のtRNA画分がウイルス粒子内のtRNA画分とハイブリダイゼーションを行なった.その結果, 36塩基欠けたMetーtRNAや36塩基の断片RNAはいずれにも見い出すことが出来なかった.現在,細胞内での逆転写の中間体や環状DNAの検索を行いつつある.レトロトランスポゾン-コピアはショウジョウバエの細胞内で動く遺伝子としての機能を持つと同時に、細胞内に我々によって見出されたレトロウイルス様粒子を形成する。このウスルス様粒子は逆転写酵素活性を持ち、この酵素によってコピアは遺伝子上で増巾や再配列を起こすと考えられている。このウイルス粒子内のコピアRNAを鋳型とする逆転写は、従来のレトロウイルスのcDNA合成とは異なり、tRNA(F-MettRNA)の3'末端からではなく、3'末端が切断され、その上流がプライマーになることを我々は示した。本年は、逆転写によって形成されているコピア環状DNAの解析を行った。コピア環状DNAはショウジョウバエの細胞内に量的に少ないため、大腸菌のプラスミド調整法とほとんど同一のアルカリ法によって調整したがコピア環状DNAのみをクローン化することが出来なかった。そのため、コピア環状DNAの結合部位にあるLTRの部分の解析を主体とすることを目的にPCR(Pelywerase chaiu reaction)法を用いて、5'側にLTRの3'側LTRの5'下流の17塩基を合成し、これをプライマーとしてLTRの結合部分を増巾した。このプライマーを用いることにより、2LTRを持つものは約270塩基のフラグメントが合成されることが予想された。又、この方法の利点は、コピアの両LTRから合成を行わせるためコピア環状DNA以外は合成されないことにある。実験の結果、ほぼ2LTRと1LTRが1:1の割合に合成された。現在これらの分子をクローニングし、環状DNAの2LTR、1LTRの構造、その接合部分の解析を行う予定でいる。これにより環状DNAの形成、宿主DNAの組込みについての知見が得られると期待される。レトロトランスポゾンcopiaの逆転写のメカニズムを研究するため本年は、我々の研究室で見い出したショウジョウバエの培養細胞において5Kbとsplicingにより生じる2Kbの2種のRNAを主に転写することをもとにして、もし、copiaが培養細胞中でRNAを介して転移する場合、その転移産物に転移前と全く同じ構造を持つ5Kb copia DNAとsplicingにより除去される領域を欠く2Kb copia DNAの2種類を考えることが出来る。転移後で構造の異なる2Kb copia DNAの存在を明らかにすることで、copiaが逆転写により転移することを証明することが出来ると考え、この遺伝子の検出を試みた。polymerase chain reaction法により本来copiaを持たない細胞に人為的に5Kb copia DNAを導入して得られた培養細胞においてもsplicing部位の5'側と3'側が結合した塩基配例が見出された。
パインアップルにおけるCAM型光合成制御の特異性に関する研究

パインアップルにおけるCAM型CO_2交換の制御は,部分的にはベンケイソウで認められているPEPCの夜間におけるリン酸化による高活性・リンゴ酸不感受性型PEPCによるものであったが,その程度は小さく液胞膜におけるリンゴ酸蓄積のための高い駆動力と同時に液胞膜のリンゴ酸保持力が高いことも重要な要因となっていることが明らかとなった.さらに,パインアップル葉身のPFPはα,βという2種類のサブユニットで構成されていることが明らかになり,PFP活性制御については他の植物と同様にαサブユニットの関与が示唆された.また,ミトコンドリアの電子伝達鎖におけるチトクロムオキシダーゼ(COX)とオルタネイティブオキシダーゼ(AOX)への電子伝達経路においても,ME型CAMのベンケイソウではAOXへ,PCK型CAMのパインアップルではCOXへ偏った電子の流れが存在することが観察され,このことは昼間のリンゴ酸脱炭酸にATPを必要としないME型CAMとATPを必要とするPCK型CAMの特性と一致することが示された.つまり,パインアップルのCAM型光合成では,ベンケイソウを材料にして明らかにされつつある制御機構が部分的に機能しながらも異なる特性を有していることが明らかになった.今後は,解糖系やミトコンドリアという異なる代謝さらには細胞器官の間での相互関係という視点でCAM型光合成の制御メカニズムの解明が求められる.パインアップルにおけるCAM型CO_2交換の制御は,部分的にはベンケイソウで認められているPEPCの夜間におけるリン酸化による高活性・リンゴ酸不感受性型PEPCによるものであったが,その程度は小さく液胞膜におけるリンゴ酸蓄積のための高い駆動力と同時に液胞膜のリンゴ酸保持力が高いことも重要な要因となっていることが明らかとなった.さらに,パインアップル葉身のPFPはα,βという2種類のサブユニットで構成されていることが明らかになり,PFP活性制御については他の植物と同様にαサブユニットの関与が示唆された.また,ミトコンドリアの電子伝達鎖におけるチトクロムオキシダーゼ(COX)とオルタネイティブオキシダーゼ(AOX)への電子伝達経路においても,ME型CAMのベンケイソウではAOXへ,PCK型CAMのパインアップルではCOXへ偏った電子の流れが存在することが観察され,このことは昼間のリンゴ酸脱炭酸にATPを必要としないME型CAMとATPを必要とするPCK型CAMの特性と一致することが示された.つまり,パインアップルのCAM型光合成では,ベンケイソウを材料にして明らかにされつつある制御機構が部分的に機能しながらも異なる特性を有していることが明らかになった.今後は,解糖系やミトコンドリアという異なる代謝さらには細胞器官の間での相互関係という視点でCAM型光合成の制御メカニズムの解明が求められる.SDS-PAGEで分離したパインアップル(パイン)とセイロンベンケイ(セイロン)のPEPカルボキシラーゼについて,昼夜のリン酸化の変化をNon-RI蛍光法により解析した.両植物とも夜にリン酸化を受け,昼間に脱リン酸化されることが明らかになった.しかし,パインにおいてはPEPCのマイナーサブユニットが確認できなかった.このことを確証するためには,パインPEPCのサブユニット構成を含めプロテアーゼ発現を抑制する抽出条件の確立が必要である.さらに,パインからはPEPカルボキシラーゼ・キナーゼが単離できなかった.このことはパインにおけるRNAase発現抑制条件を検討するとともにSer/Thrタンパクキナーゼなどの他のキナーゼの関与についても検討が必要なことを示唆している.パインとセイロンを20°Cと37°Cの夜温に置いたときのトノプラスト特性の変化について検討した.夜温20°Cと37°C条件下でのリン脂質/タンパク比はパインでは1.82±0.05と1.21±0.08,セイロンでは2.63±0.13と1.50±0.12と20°C及び37°Cのいずれの夜温下でもパインのトノプラストが硬くリンゴ酸保持力が大きいことを示唆していた.パインのトノプラストの飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸の含量は41.5%と58.5%で夜温が変化しても変わらなかった.セイロンのトノプラストにおいては飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸含量は20°C夜温下で52.1%と47.9%,37°C夜温下で46.4%と53.6%と,高夜温下で不飽和脂肪酸含量の割合が高くなった.このことはセイロでは高夜温下で不飽和脂肪酸含量が増し,膜の流動性が高くなることを示唆している.2次元電気泳動によるトノプラストのタンパク構成の特性については,高夜温下で大きい分子量のタンパクが増大するが,セイロンでの変化はパインに較べて小さかった.セイロンベンケイ,コダカラベンケイ,パインアップルの葉から抽出したPEPCの制御特性について検討した.2mMリンゴ酸共存下で測定したPEPC活性は2種類のベンケイソウで12:00に約75%の活性阻害が生じたが,24:00と4:00ではセイロンベンケイでは18%と10%,コダカラベンケイでは27%と25%の阻害しか生じなかった.パインアップルPEPCでは,昼間では70%,夜間には50%の活性阻害が生じた.2種類のベンケイソウのPEPCは20:00にリン酸化が最大となったが,パインアップルPEPCのリン酸化は24:00に最大となった.

3種類のCAM植物でのPEPCのリン酸化の程度は夜間に最大値を示した後,翌朝にかけて減少し,昼間にはリン酸化が観察されなかった.いずれのPEPCのN末端に同様なSer-11のリン酸化ドメインを保持していた.また,2種類のベンケイソウではPEPC遺伝子の発現が日変化し,20 : 00に発現が最大となりWestan BlotでみたPEPCタンパクの日周変化と良く一致した.しかし,パインアップルPEPCでは遺伝子発現の日変化は観察されなかった.さらに,パインアップル葉身のPFPはα,βの2種類のサブユニットで構成されていることが明らかになり,PFP活性制御については他の植物と同様にαサブユニットの関与が示唆された.また,ミトコンドリアの電子伝達鎖におけるチトクロムオキシダーゼ(COX)とオルタネイティブオキシダーゼ(AOX)への電子伝達経路においても,ME型CAMのベンケイソウではAOXへ,PCK型CAMのパインアップルではCOXへ偏った電子の流れが存在することが観察され,このことは昼間のリンゴ酸脱炭酸にATPを必要としないME型CAMとATPを必要とするPCK型CAMの特性と一致することが示された.
結晶強度の基礎してのパイエルス応力

結晶の塑性変形を支配している転位について、その弾性論は完成しているといってよいが、弾性論による近似が成り立たない転位の芯構造が問題となる様なパイエルス応力、転位の拡張などの理論はまだ極めてプリミティブな状態にある。結晶の周期構造に基因する転位のパイエルスポテンシャルは結晶の強度を決めている基本量の一つであり、物質によっては高温の強度もパイエルスポテンシャルによって支配されているので、実際上も重要な問題である。本総合研究は1年という極めて短い研究期間であったが、理論計算や計算機実験の研究者をはじめとして、塑性変形や超音波吸収、内部摩擦の実際及び理論、また結晶としては金属、半導体、イオン結晶など、それぞれ得意とする分野を異にする研究者が研究方法、実験条件などについて立ち入った検討を進めながら研究を進めることができた。1994年7月及び1995年1月にそれぞれ2日間にわたっての研究会を開催し、パイエルス応力について研究結果の検討やその共通理解がかなり進んだ。理論計算については着実な進歩があったが、特に実験上では超高純度銅の内耗測定により、いわゆるボルド-ニピークがこれまでの高純度銅についての常識とまったく異なり、高温焼純度後に極めて大きく成長することがわかった。まだパイエルス応力の完全な解決には程遠い状態であるが、これを契機に大きな研究の進展が期待される。
CRYOPYRINを標的とした新しい炎症制御法の開発

インフラマゾームの活性化とIL-1βの産生が、自己炎症の主な病態であるが、そのメカニズムは充分解明されていない。関節リウマチ(RA)滑膜細胞を用いて自己炎症の機序について検討した。RA滑膜細胞をNLRP3のリガンドであるMSU (modosodium urate)で刺激してもIL-1βは誘導されないが、低濃度の血清アミロイドA蛋白(SAA)で前処理するとIL-1βの産生が誘導された。さらにSAAは、RA滑膜細胞のNLRP3の発現を誘導した。本研究結果により、SAAにより、NLRP3の発現が誘導され、MSUによるインフラマゾームの活性化が促されて活性型IL-1βが誘導できることが明らかになった。cryopyrinの活性化によって、様々な自己炎症性疾患が発症する。家族性地中海熱(FMF)はcryopyrinに対して抑制的に働く分子であるPyrinの機能異常によって発症すると考えられており、Pyrinをコードする遺伝子であるMEFV遺伝子の変異により発症する。近年、FMFでみられるMEFV遺伝子の変異が、血管炎、ベーチェット病、アミロイドーシスなどリウマチ性疾患発症にも関与していることが示唆されている。リウマチ性疾患の代表である関節リウマチ(RA)(n=91)およびアミロイドーシスを合併症RA症例(ア症)(n=35)でMEFVの変異を検討した。変異部位は、日本人でも確認されているMEFVエクソン2のE148Q、L110Pについて検討した。E148Qのアリル頻度は、健常人23.7%、RA24.7%、ア症22.9%、L110Pのアリル頻度は、健常人9.2%、RA9.9%、ア症8.6%と3群間に有意差は認められなかった。以上の結果より、MEFV遺伝子変異は日本人集団で高率に認められるが、RA、アミロイドーシス発症への関与は否定的であった。cryopyrinは、細胞内のストレス分子のセンサー分子でストレス分子を認識すると重合化をおこし、最終的にCaspase-1の活性化がおこり、IL-1β、IL-18の産生がおこり自己炎症が生じる。家族性地中海熱(FMF)においては、cryopyrinの制御蛋白であり、PyrinをコードするMEFV遺伝子の変異で発症する。Pyrinは好中球に発現していることよりFMF患者の好中球の活性化状態を検討した所、FMF患者好中球においてCD64分子の発現亢進が確認された。また健常人の末梢血の好中球をリポポリサッカライド(LPS)で刺激すると、好中球のCD64分子の発現亢進が確認された。以上の結果よりCD64はFMFで生じているcryopyrinの機能異常による好中球の活性化のバイオマーカーになり得ることが示唆された。今後、cryopyrinのリガンドであるムラシルジペプチド(MDP)で刺激しCD64分子の発現の変化、IL-1βの産生等を検討する。さらにこの実験系においてFMF患者の好中球の反応およびコルヒチンの影響について検討する予定である。また、海外で報告のないMEFV遺伝子エクソン1のE84Kヘテロ変異を認めた家族性地中海熱の1例を報告した。本邦例は、滑膜炎を主症状としており、発熱を伴っておらずFMFの一亜型である可能性が考えられた。自己炎症性疾患は、自己抗体、自己反応性T細胞を認めず、反復する炎症を主徴とする疾患である。これら疾患はインフラマゾームを介したIL-1βの活性化が大きな役割を果たしている。インフラマゾームは、cryopyrin(NLRP3)がNODドメインを介し、重合化することにより活性化され、最終的に活性型のIL-1βが産生され、炎症が諾起される。しかし、インフラマゾームの活性化機構は充分解明されていない。関節リウマチ(RA)滑膜細胞を用いインフラマゾームの活性化機構を検討した。その結果、NLRP3のリガンドと考えられているMSU(monosodium urate)でRA滑膜細胞を刺激しても、活性型IL-1βは産生されないが、血清アミロイドA蛋白の前処理により、活性型IL-1βが誘導されることを明らかにした。さらに、SAAはRA滑膜細胞のNLRP3の発現を誘導することより、SAAはNLRP3発現を介して、NLRP3のリガンドに対する反応を誘導することが示唆された。これまでにインフラマゾームの活性化には、LPSなどの菌性成分の刺激によるTLRの活性化やATPによるP2X7受容体の活性化が、前段階で必要とされてきた。

本研究結果により、低濃度のSAA(15μg/ml)により、NLRP3の発現が誘導され、インフラマゾームの活性化により活性型IL-1βが誘導できることが明らかになった。今回用いたSAAの濃度は、慢性炎症性疾患、ウイルス感染等で充分到達可能な濃度であり、生体は常にインフラマゾームが活性化される状態にあり、NLRP3のリガンド等により、活性型IL-1βが誘導され炎症が起こることが明らかになった。
人間の視覚行動からみた都市パターンの設計基準に関する基礎的研究

2種の街路パターンを混在させた場合の、歩行者の分かりやすさを検討した。実験ルートは同一距離で、不規則に曲がった街路(街路IR)、格子状の街路(街路GR)の混合比率を変えた3種類(街路A:街路IR 50%街路GR 50%、街路B:街路IR 30%街路GR 70%、街路C:街路IR 70%街路GR 30%)。案内は街路CGでの動画案内と実験者が先導する歩行案内の2種類。案内後、実験協力者はルートを歩行した。実験データを点数化し、比較した結果、街路B(街路IR 30%街路GR 70%)が最も分かりやすかった。脳波解析によって、記憶の減衰を調べる必要があることが分かった。都市計画の分野では、これまで実在の都市で、異なる都市パターンの混在による分かりやすさについて、連続的な視知覚の実験的データをもとに視覚行動から考察した研究は見当たらない。代表的な街路パターンをどの様に混在すれば、歩行者が実際に歩いて分かりやすい空間になるのかについて、歩行者の個人差を踏まえたうえで検討し、様々な人々が容易に利用可能な空間構造を持つ将来的な都市設計基準として利用できる結果を得ることを目的とする。実験空間は格子状街路(街路A)と不規則に曲がった街路(街路B)が存在する実在の街路を選定し、CADにてモデルを作成、混合比の異なる3種類のルート(街路1(街路A50%、街路B50%)、街路2(街路A70%、街路B30%)、街路3(街路A30%、街路B70%))を設定し、被験者はCGアニメーションによるそれらのルート案内映像(スタートからゴールまで)を見て学習した後、マウスを操作してゴールまでCGモデルの中を歩いた。結果としては、格子状街路、不規則に曲がった街路を混合して構成された3Dの疑似的空間内を歩行した場合、街路の混合比で最も距離を長いと感じ、魅力的と感じたのは格子状街路50%、不規則に曲がった街路50%であった。また、体験する順序が評価に影響する可能性があることが分かった。研究1年目の主な目的はCGの疑似的空間内で混合比の異なる3種類のルートを比較することだったので、予定していた研究結果を得られたと考えているため。本研究では異なる2つのタイプ(不規則に曲がった街路IR、格子状街路GR)の混合比率を変えた3つの実験街路A(IR50%、GR50%)、B(IR30%、GR70%)、C(IR70%、GR30%)において、これからの都市設計を行う際に適切な混合比率を調べる実験を行っている。平成28年度は実在の都市の中で実験を行った。実験協力者数が当初予定の人数に到達していないが、現段階での結果を述べる。街路Aは、歩行案内では進路選択の判断が難しいが、到達率の高さから、進路決定に使用する記憶の精度は高いと推察される。3D案内では、目的地到着までの時間は早いが、到達率の低さから、進路決定に使用する記憶の精度は低いと推察される。街路Bは、歩行案内では、他と比較すると記憶に残りやすい。3D案内では、他と比較すると記憶に残りにくいと考えられる。街路Cは、歩行案内では、目的地到達までの時間は早いが、到達率の低さから、進路決定に使用する記憶の精度が低くなる性質を持っていることが推察される。3D案内では、目的地到達までの時間は遅いが、到達率の高さから進路決定に使用する記憶の精度が良いと推察される。以上により、歩行案内では街路Bが最もわかりやすい街路だと推察される。また、CGによる空間歩行が、設計で重要視されることを考えれば、CG空間内では街路Cがわかりやすい街路として評価される可能性がある。しかし実際に歩くと街路Bが良い結果が出ている。これは、CGによる現実の都市、仮想空間での都市、各々の設計時に分かりやすい混合比が存在する可能性を示唆している。また、2つの異なる街路パターンの接点で前後の歩行速度、認知地図の距離の誤差を比較すると、不規則に曲がった街路と格子状の街路の比率で比例しない。これは異なる性質の街路へ移動する際、生じる空間認識のモードの変化を示している可能性がある。今後、分析方法の検討が必要である。平成28年度は予定していた本実験を80%(実験協力者数が80%という意味)程度、終えることができた。研究2年目に予定している実在の都市空間での実験を行う。CGの疑似的空間は実空間をもとに作成しているので、1年目に行ったCGの疑似的空間内での歩行実験の結果と比較出来るデータを得ることを目的にしている。実空間での実験において、実験者の訓練を行うこと、路上での安全面に関する注意が当面の課題である。

本実験は80%程度、終えた。残り20%程度の実験協力者数を確保して実験データーを量的に完全な状態に近づける。都市計画1年目に2台購入予定であったメーカーのヘッドマウントディスプレイが生産中止となり、他のメーカー品で実験に使用できるものを探したが、品薄な状況で、1台のみしか入手できなかったため、次年度使用額が生じた。平成28年度に実施予定であった実験協力者数が完全ではなく、謝礼の予算が残っている。また、購入予定であったもう一台のヘッドマウントディスプレイを購入しなかったために、次年度使用額が生じた。この理由としては、既に購入している器機を一台を使用することで、実験の遂行について当初予想していたようには遅くならなかったこと、また、製品の型の更新期にあたっており、もう一台の機器について適切なものを選定することが困難であったことがあげられる。ヘッドマウントディスプレイは1台のみでも実験は遂行可能と考えているが、実験の進行状況を見て、2年目に再度、1年目に購入した器機の同等品を探して購入する予定である。平成29年度、不足分の実験協力者を確保し、実験を行う予定なのでその謝礼として使用する。ヘッドマウントディスプレイは現在購入済みの器機とあまり大きな差の生じないスペックを検討し、適切なものがあれば購入する。無い場合は、現在購入済みの機器で、実験を遂行するように実験計画を調整する。
卒前と卒後を連続したリハビリテーション技能の育成に関する評価ツールの開発と検証

リハビリテーション(以下リハ)専門職の役割は、障害を抱える者の自立支援と生活の再建を担うことである。その役割が地域包括ケアで求められ、人材育成が急務となっている。今こそ臨床教育の刷新のため、リハ技能の視覚化が必要である。本研究では「リハ技能とはどのようなものなのか?」を課題とし、リハ技能の評価観点を明らかにし、リハ技能をきめ細かく捉え、リハ専門職を目指す者一人ひとりを成長へと導く評価ツールの構築を目指す。
機能性複硫化物の高圧合成

本研究実績を以下の5項目に分類し、その概要を示す。(高温高圧装置改造)東北大金研に設置されている600トンプレスにKawai型と呼ばれる加圧機構を組み込み、16GPa、1000°Cの条件を安定的に実現可能となった。これにより、放射光施設におけるその場観察実験と試料回収法の圧力温度上限がほぼ一致し、直接比較が可能となった。(硫黄単体の高温高圧挙動)硫黄単体の高温高圧挙動を16GPaまで調べた。特に硫化物の高圧合成に不可欠な硫黄の高圧下における融解曲線を確定した。(硫化鉄の2次相転移)硫化鉄は、鉄原子の電子スピンに由来する相転移が高温高圧下で起こる事が知られていたが、今回その相転移を詳細に調べ、それが2次相転移であると結論づけた。このような現象は酸化鉄では知られておらず、硫化物の高圧物性として興味深い。(亜鉛カルコゲナイドの相転移)酸化物と硫化物の物性の違いについて、対象をカルコゲン化合物にまで広げ、II-VI族半導体の一群である亜鉛カルコゲナイド(ZnX ; X=O, S, Se, Te)の高温高圧挙動の比較をおこなった。その結果、酸化物は単純な高圧挙動を示すが、セレンやテルルなどの重カルコゲンの場合は複雑な高圧挙動を示す事が明らかになった。特にセレン化亜鉛の研究では、従来から理論予想されていた高圧相を、実際に見出すことに成功した。(複硫化物合成)上記の結果を踏まえ、CaTiS_3、SrTiS_3、BaTiS_3などの複硫化物の高圧合成を広い圧力温度条件下で試み、同型の複酸化物との比較を行っている。本年度は本研究の複硫化物の高圧合成において必須基礎データと言うべき硫黄単体の高温高圧挙動を、高エネルギー加速器研究機構物質構造科学研究所のARに設置されているMAX80を用いたその場観察実験と東北大学金属材料研究所の高温高圧装置を用いた凍結実験を交互におこなう事により、調べた。その結果、硫黄は、P<17GPa、T<800°Cの条件下で既知の常圧安定相の他に3種類の高圧相が存在し、これら3種類とも常圧下には凍結出来ないことが明らかになっている。このことは、従来の凍結法こよる研究だけでは、硫黄の高温高圧挙動を確定できない事を如実に示している。また、2番目の高圧相はS_6型環状分子からなる六方晶の構造を有している事も明らかとなった。これは、上記圧力温度範囲で、少なくとも常圧相中に存在する王冠型S_8分子が開環反応を起こしていることを示している。これは、硫黄の高温高圧条件下での化学反応性を考える上で重要な示唆を与える。現在、高圧相1および3の構造についても構造の解析を進めている。これらの研究結果は、すでに平成11年秋の高圧討論会で発表しており、また平成12年の放射光学会および物理学会で報告予定である。また、現在、硫化物の合成に重要な情報であるこれら3種類の高圧相の安定域および化学反応性および高圧下の融点を調べており、これらが明らかになれば、高圧を利用した硫化物の合成の効率化がはかられることが期待される。本年度も昨年度に引き続き複硫化物の高圧合成において必須基礎データと言うべき硫黄単体の高温高圧挙動を、高エネルギー加速器研究機構物質構造科学研究所のARに設置されているMAX80を用いたその場観察実験と東北大学金属材料研究所の高温高圧装置を用いた凍結実験で調べ、硫黄の3種類の高圧相の安定域および融点の圧力依存性を、17GPaまでの範囲で明らかにした。また、本年度は東北大学金属材料研究所の設置されている600トンプレス装置を用い、複硫化物の高圧合成に不可欠な高温高圧技術の確立を目指した。

現在、15GPa、1000°Cの高温高圧条件を数時間保持可能となっている。この高温高圧技術の確立に関しては、J.Crystal Growthに投稿し、現在印刷中である。現在、この発生圧力上限の拡大に伴い、試料容器の最適化を進めており、従来の窒化硼素の試料容器より、酸化マグネシウムを用いた試料容器の方が、上記高温高圧条件下では硫化物合成に適していることが明らかになってきている。さらに現在、酸化物と硫化物を含むカルコゲン化合物の高温高圧挙動の違いについて、酸化亜鉛と亜鉛カルコゲン化合物を例にとり調べている。これまでのところ、イオン結合性の強い酸化亜鉛は単純な高温高圧挙動を示すのに対し、共有結合性の割合が多くなるカルコゲン化合物の場合、複雑な高温高圧挙動が見出されつつある。このイオン性の強い酸化物と相対的に共有結合性が強くなるカルコゲン化合物の高温高圧挙動の違いは、機能性複硫化物の高圧合成に重要な指針を与える可能性がある。本年度は、本研究計画の最終年度に当たり、これまでの研究の結果を基に補足実験をおこない、研究の総括を行った。以下にその研究成果を記す。(1)高温高圧装置改造東北大金研に設置されている600トンプレスにKawai型と呼ばれる加圧機構を組み込み、16GPa、1000°Cの条件を安定的に実現可能となった。これにより、放射光施設におけるその場観察実験と試料回収法の圧力温度上限がほぼ一致し、直接比較が可能となった。(2)硫黄単体の高温高圧挙動硫黄単体の高温高圧挙動を16GPaまで調べた。特に硫化物の高圧合成に不可欠な硫黄の高圧下における融解曲線を確定した。(3)硫化鉄の2次相転移硫化鉄は、鉄原子の電子スピンに由来する相転移が高温高圧下で起こる事が知られていたが、今回その相転移を詳細に調べ、それが2次相転移であると結論づけた。このような現象は酸化鉄では知られておらず、硫化物の高圧物性として興味深い。(4)亜鉛カルコゲナイドの相転移酸化物と硫化物の物性の違いについて、対象をカルコゲン化合物にまで広げ、II-VI族半導体の一群である亜鉛カルコゲナイド(ZnX ; X=O, S, Se, Te)の高温高圧挙動の比較をおこなった。その結果、酸化物は単純な高圧挙動を示すが、セレンやテルルなどの重カルコゲンの場合は複雑な高圧挙動を示す事が明らかになった。特にセレン化亜鉛の研究では、従来から理論予想されていた高圧相を、実際に見出すことに成功した。(5)複硫化合物合成上記の結果を踏まえ、CaTis_3、SrTiS_3、BaTiS_3などの複硫化物の高圧合成を広い圧力温度条件下で試み、同型の複酸化物との比較を行っている。
10属-価遷移金属多核錯体の構造と発光特性に関する結晶化学研究

ヨウ素あるいはイオウ架橋の発光性多核銅および銀錯体の合成と,結晶状態での発光挙動の温度及び圧力依存性について研究を行った。ハロゲン化銅四核錯体において,低温で発光色が変化するルミネッセンスサーモクロミズム現象について,結晶中における多核金属コアが温度により変形することと相関があることを明らかにした。このことは金属錯体の分子性結晶が,固体の温度,圧力などの外場によって結晶構造の微小変化を引き起こし,発光エネルギーの変化として応答することが可能であることを示した。1.キュバン形構造を持つ発光性ヨウ化銅(I)四核錯体の多形結晶の構造と発光挙動の温度依存性の研究(1) [Cu4I4L4](L=トリフェニルホスフィン)において、異なる発光色を示す単斜晶系(黄緑)および立方晶系(青緑)の二種類の多形結晶を見いだした.結晶構造解析により,発光挙動に関係する錯体分子の中心にあるCu4I4キュバン骨格の大きさが多形間で異なることを初めて明らかにした.(2)多形結晶の室温78Kの発光色と結晶構造の温度依存性について測定した.単斜晶系結晶の発光色は温度低下に伴って長波長に移動し,78Kでは橙色になったが,立方晶系ではほとんど変化がなかった.この違いについて、発光極大エネルギーと4つの銅原子でつくるCu4四面体の大きさとの相関に注目し,Cu4四面体体積が縮小するにつれて発光極大エネルギーが低下することを初めて系統的に明らかにした.(3)結晶中でのキュバン骨格の構造変化は,錯体分子の外側を取り囲むトリフェニルホスフィン配位子の分子間相互作用により,その影響が配位子と直接結合する銅原子でつくるCu4コアサイズの変化をもたらすことが明らかになった.2.ピリジンチオール誘導体架橋の銀(I)銅(I)混合一価六核錯体の合成と発光特性に関する研究(1) [Ag(6-n)Cu(n)(Et-pyt)6](n=13; Et-pyt=エチルピリジンチオール)の初めて合成し,その結晶構造を明らかにした.分子構造は、銀および銅6核錯体と同様の構造を持つことが明らかになった.(2)これらの錯体は、固体状態で紫外線照射下で橙赤色の発光を示す.その発光極大は単一でAg/Cuの比によってエネルギーがシフトし,金属原子の組み合わせによって発光を制御できる可能性を見いだした.1.キュバン形構造を持つ発光性ヨウ化銅(I)四核錯体結晶における発光挙動の圧力依存性の研究(1) [Cu4I4L4](L=トリフェニルホスフィン)において、異なる発光色を示す単斜晶系(黄緑発光)および立方晶系(青緑発光)の二種類の多形結晶を見いだした.結晶構造解析により,発光挙動に関係する錯体分子の中心にあるCu4I4キュバン骨格の大きさが多形間で異なることを明らかにした.(2)多形結晶の大気圧10GPaの発光色の圧力依存性に測定し,発光極大エネルギーが圧力上昇にともなって低下することを見いだした.このエネルギーシフトは、どちらの晶系の結晶においても顕著に見られ,昨年度の研究成果の発光の温度依存性とは異なる挙動を示すことを見いだした.(3)立方晶系の高圧粉末結晶構造解析を行った.その結果,4つの銅原子でつくるCu4四面体コアサイズが圧力によって大きく圧縮されることが明らかになった.金属多核錯体が固体状態で圧力により柔軟に変形し発光色を変化させる様子を初めて系統的に明らかにした.2.ピリジンチオール誘導体架橋の銀(I)金(I)および,銅(I)金(I)混合六核錯体の合成,構造,発光特性に関する研究(1)六核混合金属錯体[M4Au(Et-pyt)4X2](M=Ag, Cu ; X=Cl, Br, I ; Et-pyt=エチルピリジンチオール)を初めて合成し,その結晶構造を明らかにした.錯体分子中では六個の金属イオンが八面体状に集合し金原子は対対角の位置に存在することを示した.(2)錯体は固体状態で紫外線照射下で橙黄色の発光を示す.その発光極大は単一で極大エネルギーはハロゲン原子の種類にほとんど依存しないことが明らかになった.(3)発光過程には,4つの銀あるいは銅原子のからなるクラスター中心軌道の遷移が関与していることを明らかにした.d10電子配置をとる一価の銅、銀、金の多核錯体の結晶構造と発光挙動の相関に関して、結晶化学の見地から以下の研究成果を得た.1.キュバン型構造を持つ,発光性ヨウ化銅(I)四核錯体結晶における発光挙動の圧力依存性の研究(1)[Cu4I4L4](L=トリフェニルホスフィン)において、

異なる発光色を示す単斜晶系(黄緑発光)および立方晶系(青緑発光)の二種類の多形結晶を見いだした.結晶構造解析により,発光挙動に関係する錯体分子の中心にあるCu4I4キュバン骨格の大きさが多形間で異なることを明らかにした.(2)多形結晶の大気圧10GPaの発光色の圧力依存性に測定し,発光極大エネルギーが圧力上昇にともなって低下することを見いだした.このエネルギーシフトは、どちらの晶系の結晶においても顕著に見られ,昨年度の研究成果の発光の温度依存性とは異なる挙動を示すことを見いだした.(3)立方晶系の高圧粉末結晶構造解析を行った.その結果,4つの銅原子でつくるCu4四面体コアサイズが圧力によって大きく圧縮されることが明らかになった.金属多核錯体が固体状態で圧力により柔軟に変形し発光色を変化させる様子を初めて系統的に明らかにした.2.ピリジンチオール誘導体架橋の銀(I)金(I)および,銅(I)金(I)混合六核錯体の合成,構造,発光特性に関する研究(1)六核混合金属錯体[M4Au(Et-pyt)4X2](M=Ag,Cu;X=Cl,Br,I;Et-pyt=エチルピリジンチオール)を初めて合成し,その結晶構造を明らかにした.錯体分子中では六個の金属イオンが八面体型に集合し,Au原子は対対角の位置に存在することを示した.(2)錯体は固体状態で紫外線照射により橙黄色の発光を示す.その発光極大は単一で極大エネルギーはハロゲン原子(X)の種類にほとんど依存しないことが明らかになった.(3)発光過程には,4つの銀あるいは銅原子のからなるクラスター中心軌道の遷移が関与していることを明らかにした.
特異なアルキル化機能分子による核酸の選択的修飾・切断反応

植物わらびの発癌物質から化学的に誘導される求電子活性分子(1)はシクロプロパン環を反応点とする強力なアルキル化剤である、DNAを切断する。1.天然求電子活性分子(1)によるテトラヌクレオチドd(GTAC)のアルキル化と切断反応。求電子活性分子(1)とd(GTAC)を反応させると、グアニンのN-7位がアルキル化されたd(GTAC)とアデニンのN-3位がアルキル化されたd(GTAC)が主生成物として得られた。熱加水分解に対して、前者は比較的安定であるが後者は不安定である、脱アデニン反応が容易に起こり、さらに、生成するヘミアセタール部が脱離反応を起こしてデオキシシチジン5'-リン酸を放出することが判明した。以上の結果、求電子活性分子(1)によるd(GTAC)のA部選択的切断の反応機構が解明された。この結果はわらび発癌物質によるDNA切断反応を分子構造レベルで精密に解析する上で重要な知見となるものである。2.人工求電子絶性物質(2)の合成とDNAの反応。不安定な天然求電子絶性物質(1)を規範として、天然分子よりも安定性が高く、且つDNAのアルキル化機能を備えた人工分子(2)を設計し、シクロペンテン-1,2-ジカルボン酸の酸無水物から効率良く合成した。ついで、人工分子(2)さサケ精子DNAを反応させ、熱加水分解して得られるアルキル化塩基の構造を決定し[構造式(3)、(4)]、人工分子(2)のアルキル化反応における特性を明らかにした。
海棲生物に存在するセレン化合物の生体内代謝および環境毒性学的機能の解析

必須微量元素であるセレンは生体内で様々なセレンタンパク質に利用される他、水銀の解毒作用を有する。本研究では海棲生物の主要なセレン化学形態であるセレノネインについて、動物生体内における生物学的利用や代謝、および水銀解毒への関与を検証した。先ずin vitroアッセイにより、セレノネインと水銀との直接的な反応性は低いことが示唆された。動物実験により、セレノネインは消化管吸収されやすく、肝臓に蓄積されたことから、セレン栄養源として有用であることが示された。必須微量元素の1つであるセレンは、生体内で様々なセレン酵素に利用される他、水銀など毒性重金属の解毒作用や、抗酸化能などの生理作用をもつ。本研究では海棲生物の主要なセレン化学形であるセレノネインに着目し、代謝経路や生物学的利用能、生理作用、特に水銀解毒への関与を検証することを目的としている。初年度は、セレノネインを高濃度に含有する海産魚からセレノネインを抽出・精製し、in vitroアッセイにより無機水銀との反応性を評価した。輸液などに利用される無機セレン化合物の亜セレン酸を比較として用い、高速液体クロマトグラフィー/誘導結合プラズマ質量分析計(HPLC-ICP-MS)により反応生成物を解析した。その結果、亜セレン酸は無機水銀と複合体を形成したが、一方セレノネインは無機水銀と直接的な反応性が低いことが示唆された。次に、これまで海産魚類やウミガメ類で存在が報告されてきたセレノネインが、他の生物でも見出されるか、数種の野生海棲哺乳類、食用として流通する家禽類、および実験動物として飼育されたウズラについて、肝臓中のセレン化合物をHPLC-ICP-MSおよびエレクトロスプレー質量分析計(ESI-MS)を用い解析した。その結果、海棲哺乳類の肝臓においてセレノネインが検出され、海洋生物に広く存在することが示された。興味深いことに、実験動物として飼育されたウズラの肝臓においてもセレノネインが検出された。また、ウズラに無機水銀を投与すると、肝臓中のセレノネイン量が減少した。これらのことから、セレノネインは無機水銀と直接的な反応はしないものの、間接的に水銀の解毒に関与することが推察された。必須微量元素の1つであるセレンは、生体内でグルタチオンペルオキシダーゼなどの抗酸化酵素に利用される他、直接的に無機水銀と反応することで、水銀の毒性を軽減することが知られている。自然界には無機態または有機態の様々なセレン化合物が存在しており、生体内における代謝経路や生理作用は摂取するセレンの化学形態によって異なる。本研究では海棲生物の主要なセレン化学形態であるセレノネインに着目し、哺乳類の生体内における代謝経路や生物学的利用能、生理作用、特に水銀解毒への関与を検証することを目的とした。海産魚から抽出・精製したセレノネインを用い、ラットへの経口投与実験を行った。栄養レベルのセレン量としてセレノネインを摂取した時の体内動態を解析するために、ラット生体内に内在するセレンを1つの安定同位体(82Se)リッチな状態にすることで、微量なセレン代謝物の解析を可能にした。ラット体内のセレンを定量的および定性的に分析したところ、セレノネインは比較対象として用いたセレノメチオニンに比べ肝臓に蓄積しやすく、また、セレンタンパク質や尿中セレン代謝物への変換がされにくいことが示唆された。本研究では野生の海棲哺乳類や鳥類の肝臓においてもセレノネインが検出されることも明らかとされており、動物実験の結果はこれらを指示すると考えられた。水銀解毒への関与について、精製したセレノネインと無機水銀およびメチル水銀との反応性をin vitroアッセイにより評価したが、いずれも直接的な反応性が低いことが示唆された。今後は、動物実験によるin vivoでの評価を行う予定である。環境生物化学当初は化学合成したセレノネインを動物実験に使用する計画であったが、セレノネインの化学合成経路の確立が困難であったことから、実験に用いるセレノネインを海産魚類から分離・精製する方針に変更した。海産魚類から得られるセレノネインは収量に限りがあるため、動物実験に先立ち、in vitroアッセイや培養細胞を用いた実験を実施した。In vitroアッセイにおいて、セレノネインと水銀が直接的には反応しないことが示された。また、培養細胞におけるセレン代謝経路には不明な点が多いことから、その基礎情報を収集するためにヒト肝癌由来細胞HepG2に亜セレン酸を曝露し、代謝物の解析および同定を行った。これらの実験で得られた結果は、実験動物または培養細胞を用いた解析の条件を検討するための重要な情報となった。さらに、2年目に計画していた多種の動物におけるセレン代謝物のスクリーニングを実施し、実験動物であるウズラにおいてセレノネインが検出されることを見出した。

このことより、セレノネインと水銀の相互作用を解明するためのモデル動物としてウズラが適している可能性が示された。以上より、当初の計画から変更された部分もあるが、研究全体としては概ね順調に進展しているといえる。初年度の研究成果より、水銀解毒に対するセレノネインの関与を解明するためのモデル動物として、内在的にセレノネインが存在するウズラが適している可能性が示された。そこで本年度はウズラに水銀化合物(無機水銀)を投与し、水銀およびセレンの体内動態を解析する。併せて、毒性影響評価するため、血液生化学パラメータや脂質過酸化、セレンタンパク質の一つであるグルタチオンペルオキシダーゼなどの抗酸化酵素活性を測定し、毒性影響評価に取り組む。また、初年度に引き続き培養細胞を用いた解析も継続する。セレンによる水銀解毒機序として複合体形成の可能性が挙げられるが、HPLC-ICP-MSによる分析結果から何らかの複合体が検出された場合は、その化学形態の同定に挑む。昨年度末には、生体内のセレン代謝物や水銀-セレン複合体の同定において有用なツールとなる四重極飛行時間型質量分析装置(Q-TOF-MS)が大学に導入された。これにより、これまで検出および同定が困難であった代謝物の解析が可能となり、さらなる研究の進捗が期待される。初年度にはセレノネインを化学合成し、それを動物実験に用いる計画であったが、セレノネインの化学合成方法を確立できなかった。そのため海産魚類から抽出・精製したセレノネインを実験に用いたが、動物実験に用いる十分量の確保は難しかった。そこで実験動物を用いた研究計画を変更し、in vitroおよび培養細胞を用いて実験を行った。初年度には動物実験に係る予算を計上していたが、それらが差額となった。初年度の研究成果より、セレノネインを内在的に有するウズラを実験動物として用いる計画が立案された。この動物実験の実施に昨年度の差額分を充てる予定である。従って、期間内の経費執行に問題はない。