hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
拡張型心筋症における慢性心筋炎の成因論的意義に関する研究

1.研究成果:末期的拡大不全心に対する治療として左室部分切除術が開始された。心臓移植の機会の少ない我が国の現状に於いて本手術に対する期待は大きい。現在の課題は手術適応基準と予後の検討である。本研究では左室部分切除術を施行された拡張型心筋症患者の切除心筋標本を用いて、心筋in situでの免疫組織細胞化学的、ウイルス学的解析を行った。その結果、一部の拡張型心筋症の心筋において活動性炎症とエンテロウイルス(EV)持続感染が認められ、慢性心筋炎が一部の拡張型心筋症の病因・病態に関与することが明らかにされた。また、サイクルシークエンス法によるEVゲノムの核酸塩基配列の決定により、殆どがコクサッキーB群ウイルスであることが明らかになった。さらに、拡張型心筋症における炎症やEVゲノムの存在は、左室部分切除術に際して術後早期予後不良の因子になる可能性が示唆された。2.今後の展望:我々は拡張型心筋症患者の切除心筋を多数保有している。これを用いてin situ hybridizationによりEVゲノムの心筋内での局在を検討することで、ウイルスによる心筋細胞障害機序を明らかにできる。また現在、左室部分切除術をうけた患者数が増加し、術後の長期成績を明らかにする時期にある。切除心筋の免疫組織化学的、分子生物学的検索を継続し、それらと術後長期予後や臨床諸検査指標とを比較検討することで、左室部分切除術の適応決定に価値ある情報を提供することが期待される。1.研究成果:末期的拡大不全心に対する治療として左室部分切除術(PLV)が日本でも開始された。現在の課題に手術適応基準と予後の検討が挙げられる。本研究ではPLVを施行された拡張型心筋症39例の切除心筋標本を用いて、心筋in situでの免疫組織細胞化学的、ウイルス学的解析を行い、拡張型心筋症における活動性炎症の関与を明らかにし、またそれらと手術予後との関連を比較検討した。その結果、一部の拡張型心筋症において、心筋に高度の炎症性細胞浸潤(活動性心筋炎)やエンテロウイルス(EV)ゲノムが認められ、慢性心筋炎が拡張型心筋症の病因・病態に関与する可能性が示唆された。また、拡張型心筋症における高度の炎症性細胞浸潤やEVゲノムの存在は、PLVに際して早期予後不良の因子になる可能性が示唆された。これを用いてPCR法によるEVゲノムの検索とサイクルシークエンス法による核酸塩基配列決定を行えば本症のウイルス病因がより明らかになる。さらに、切除心筋in situ hybridizationにおけるEVゲノムの局在と障害心筋細胞および炎症性細胞浸潤との関係を検討することでウイルスによる心筋細胞障害機序が明らかにできる。また、炎症性細胞浸潤の原因としてウイルスゲノムの存在以外にも、広義の自己免疫異常、重症心不全の存在、治療目的でのカテコールアミンの投与など一次的、二次的な種々の要因が推測される。今後、リンパ球サブセット、組織適合抗原、接着分子、サイトカインなどを含む種々の炎症および免疫応答のマーカーを分子生物学的手法などを用いて、より詳細に検討することで、拡張型心筋症の病因・病態がさらに明確になることが期待される。本研究では左室部分切除術を施行された拡張型心筋症患者の切除心筋標本を用いて、心筋in situでの免疫組織細胞化学的、ウイルス学的解析を行なった。

また、サイクルシークエンス法によるEVゲノムの核酸塩基配列の決定により、殆どがコクサッキーB群ウイルスであることが明らかになった。さらに、拡張型心筋症における炎症やEVゲノムの存在は、左室部分切除術に際して術後早期予後不良の因子になる可能性が示唆された。2.今後の展望:我々は拡張型心筋症患者の切除心筋を多数保有している。これを用いてin situ hybridizationによりEVゲノムの心筋内での局在を検討することで、ウイルスによる心筋細胞障害機序を明らかにできる。また現在、左室部分切除術をうけた患者数が増加し、術後の長期成績を明らかにする時期にある。切除心筋の免疫組織化学的、分子生物学的検索を継続し、それらと術後長期予後や臨床諸検査指標とを比較検討することで、左室部分切除術の適応決定に価値ある情報を提供することが期待される。
神経細胞特異的なロコモーション移動におけるSrcファミリーキナーゼの役割

大脳皮質形成過程において、脳室帯を出た神経細胞はまず多極性細胞になり、その後極性を獲得して一本の先導突起を持つロコモーション細胞となって脳表層までの長い距離を移動し、整然とした層構造を形成する。この神経細胞移動のうち、最も長い距離を占めるロコモーション様式の移動は、正常に機能する脳を作る上で極めて重要な過程であるにも関わらず従来直接的な解析が難しかった。申請者は独自の観察-解析系を確立し、Srcファミリーキナーゼがこの移動に重要な役割を果たしていることを示してきた。Srcファミリーキナーゼは、がん遺伝子として単離され様々な細胞現象に関わることが知られているが、脳におけるその主要な基質はロコモーション移動に関与しないことから、このキナーゼがどのようにしてロコモーション様式の移動を制御しているかは不明であった。本研究では大脳皮質のスライス培養法や超解像顕微鏡レベルでの細胞内小器官の動態解析、生化学的手法などを用いて、Srcファミリーキナーゼがロコモーション様式の移動をどのように制御しているかを、その上流・下流の経路まで解析して、脳形成における役割を明らかにすることを目的とする。本年度はSrcファミリーキナーゼであるFynやSrcなどの機能抑制によって移動のどの段階が異常になるかの解析として、子宮内エレクトロポレーション法を用いてEGFP発現ベクターおよびSrcファミリーのRNAiベクターを共導入した大脳皮質をミクロトームでスライスし、これを培養装置付顕微鏡下で撮影してロコモーション細胞をタイムラプス観察した。FynやSrcなどの機能抑制によって移動のどの段階が異常になるかの解析として、子宮内エレクトロポレーション法を用いてEGFP発現ベクターおよびSrcファミリーのRNAiベクターを共導入した大脳皮質を振動刃ミクロトームでスライスし、これを培養装置付顕微鏡下で撮影してロコモーション細胞をタイムラプス観察した。その結果、Fynやその上流分子がロコモーション移動の制御に関与していることが示唆された。Srcファミリーキナーゼの既知の大量な基質について、Srcファミリーキナーゼと相互作用するかを大脳皮質の初代培養神経細胞を用いた免疫沈降法で確認する。相互作用が確認された分子について、子宮内エレクトロポレーション法を用いてEGFP発現ベクターをRNAiベクターと共導入した大脳皮質をミクロトームでスライスする。培養装置付顕微鏡下でスライス組織片を撮影してロコモーション細胞をタイムラプス観察し、Srcファミリーキナーゼを阻害したときと類似した表現型が得られるか確認する。また、子宮内エレクトロポレーション法でEGFP-tubulinやEGFP-actinを共導入した大脳皮質をスライス培養し、微小管やアクチン細胞骨格の動態を観察する。ここでSrcファミリーキナーゼや下流候補分子を阻害したときの影響を観察し、形態変化への影響を評価する。さらに、子宮内エレクトロポレーション法でオルガネラ局在型のEGFPを導入した大脳皮質を超解像顕微鏡で観察する。

さらに、子宮内エレクトロポレーション法でオルガネラ局在型のEGFPを導入した大脳皮質を超解像顕微鏡で観察する。年度途中に学部共通機器の共焦点顕微鏡がアップグレードされることになり一時使用できなくなった。次年度は同時に撮影するサンプル数を増やすことにより、当初使用を予定していた助成金と合わせて使用する。
高気圧による酸化ストレスが糖尿病のインスリン非依存的糖代謝経路に及ぼす影響と応用

肥満や糖尿病に対する治療を検討する上で、運動に対して消極的な場合や運動が制限される場合でも実施可能な、運動と類似した効果が期待できる受動的な刺激の開発が必要である。受動的な刺激である高気圧処置は、糖尿病に対する有効性が確認されている。また、その有効性には酸化ストレスの関与が推察される。本研究の目的は、糖尿病に対して有効性のある高気圧処置の作用機序を解明するため、高気圧処置によって発生した酸化ストレスがインスリン非依存的な糖代謝経路に及ぼす影響を検証し、運動を代替・補完する受動的な治療手段の開発へとつなげることである。
Ａ型インフルエンザウイルスＰＡ－ＸのｍＲＮＡ分解機構の解明

A型インフルエンザウイルス蛋白質PA-XはmRNAを分解することで蛋白質の発現を抑制するshutoff活性をもつ。しかしながら、PA-Xがどのような機序でmRNAを分解しているのかは明らかになっていない。そこで、PA-Xによるshutoff機構を解明し、インフルエンザウイルスにおけるPA-Xの重要性を明らかにすることを目的とし、研究を行った。酵母を用いたスクリーニングによりPA-Xのshutoff活性に重要な遺伝子としてN末端アセチル化酵素NatBの構成蛋白質であるNat3とMdm20を同定した。NatBがヒト細胞でのPA-Xの活性に重要かどうか調べるため、Nat3、Mdm20のヒトホモログ遺伝子であるNAA20、NAA25をノックアウト(KO)したヒト細胞株を樹立し、これらの細胞株におけるPA-Xの活性を調べた。するとNAA20やNAA25をKOした細胞株におけるPA-Xの活性は野生型細胞株における活性と比べ著しく低いことがわかった。NatBはM-E、M-DまたはM-Nから始まる蛋白質のN末端をアセチル化する。PA-XはM-EというN末端配列をもち、これまでの結果からNatB認識配列をもつときPA-Xは高い活性を示し、またヒト細胞で発現させたPA-XのN末端はアセチル化されていることがわかっている。PA-XのN末端アセチル化にNatBが重要かどうか調べるため、NAA20やNAA25をKOした細胞でPA-Xを発現させ解析すると、野生型細胞で発現させたときと比べ、KO細胞で発現させたときPA-XのN末端がアセチル化されている割合が低下していた。これにより、ヒト細胞におけるPA-Xのshutoff活性およびN末端アセチル化にNatBが重要であることがわかった。これまでに得られた結果から、PA-Xのshutoff活性にはNatBによるN末端アセチル化が重要であることがわかった。29年度が最終年度であるため、記入しない。A型インフルエンザウイルス蛋白質PA-XはmRNAを分解することで、ウイルス感染時の抗ウイルス応答であるIFN-βおよび抗ウイルス抗体の産出を阻害し、宿主によるウイルスクリアランスに対抗する。しかしながら、PA-Xがどのような機序でmRNAを分解しているのかわかっていない。そこで、PA-XによるmRNA分解メカニズムを明らかにし、インフルエンザウイルスにおけるPA-Xの重要性を明らかにすることを目的とし研究を行っている。これまでに酵母を用いたスクリーニングから、A型インフルエンザウイルス蛋白質PA-Xの酵母におけるmRNA分解活性に必須な遺伝子としてNat3およびMdm20が同定されている。Nat3およびMdm20はヘテロダイマーを形成し、N末端アセチル化酵素複合体NatBとして機能する。このNatBはN末端にM-E、M-DおよびM-Nという配列をもつ蛋白質を認識し、そのN末端にアセチル基を付加する。PA-XはN末端にM-Eという配列をもつため、PA-XはNatBによりN末端アセチル化を受け、それにより活性を有してるのではないかと仮説を立て、その検証を行った。N末端2番目のアミノ酸を置換した変異体PA-Xを作製し、それらの酵母および哺乳類細胞における活性を評価した。NatBによりアセチル化され得る配列をもつ変異体PA-Xは野生型PA-Xと同程度の高い活性をもつ一方で、その他のNatファミリーによりアセチル化され得る配列をもつ変異体PA-Xは低い活性しか示さなかった。この結果から、PA-XはNatBによりN末端アセチル化されることでmRNA分解活性をもつことが示唆された。さらに、免疫沈降法と質量分析法を組み合わせた手法により、哺乳類細胞にて発現させたPA-XのN末端がアセチル化されていることを確認した。PA-XがNatBによるN末端アセチル化を受けることで活性をもつのではという仮説を立て検証を行い、その仮説を示唆するような成果を得ることができた。また実際にPA-XのN末端がアセチル化されていることを質量分析により確認することができた。さらにNatBを哺乳類細胞においてノックアウトした細胞株の樹立にも成功した。これらのことから、これまでの研究はおおむね計画通りに進んでいるといえる。

PA-XのN末端アセチル化にNatBが重要かどうか調べるため、NAA20やNAA25をKOした細胞でPA-Xを発現させ解析すると、野生型細胞で発現させたときと比べ、KO細胞で発現させたときPA-XのN末端がアセチル化されている割合が低下していた。これにより、ヒト細胞におけるPA-Xのshutoff活性およびN末端アセチル化にNatBが重要であることがわかった。これまでに得られた結果から、PA-Xのshutoff活性にはNatBによるN末端アセチル化が重要であることがわかった。NatBをノックアウトした哺乳類細胞の細胞株が得られているので、これらの細胞株におけるPA-Xの活性を評価することで哺乳類細胞においてもPA-Xの活性にNatBが重要であるかどうかを検証する。NatBノックアウト細胞においてPA-Xの活性が低下した場合、哺乳類細胞においてもPA-Xの活性にNatBが重要であることが示唆される。そこで、NatBノックアウト細胞にて発現させたPA-XのN末端がアセチル化されていないことを質量分析により確認する。さらにN末端アセチル化されたPA-XとされていないPA-Xを精製し、そのmRNA分解活性をin vitroで評価する。NatBノックアウト細胞においてPA-Xの活性が低下しない場合、酵母と哺乳類細胞においてNatBの標的蛋白質が異なることが考えられる。ヒトではNatBの他に、N末端アセチル化酵素がNatAからNatFまで存在しこのような別のアセチル化酵素がヒト細胞でのPA-XのmRNA分解活性に寄与している可能性が考えられる。そこで、これらの遺伝子をノックアウトした細胞株を樹立し、それらの細胞におけるPA-XのmRNA分解活性を調べることでヒトでのPA-Xの活性に寄与するアセチル化酵素遺伝子の同定を行う。29年度が最終年度であるため、記入しない。
極微量元素分析のための大電力マイクロ波誘導大気圧ヘリウムプラズマの生成

本研究が先に研究開発した表面波モードのマイクロ波誘導大気圧素プラズマ生成のためのOkamoto cavity(Anal.Sci.7(1991)283)をベースにして、大気圧でヘリウムプラズマを安定に生成することに成功した。そして、その中心部にイオン化電圧の高い極微量のフッソ元素(F:17.5eV)などの非金属元素を含んだ水溶液(1000ppmまたは2000ppm)を、超音波ネブライザーで霧化して直接導入したとき、これまでできなかったこれらの元素の検出に成功した。主な結果は次のとおりである。(2)トーチの内径を7mmに減少すると、ヘリウムガスの流量を実用化レベルの101/min以下に低減できた。(3)電子密度と励起温度は、おのおの2.3x1014/cm^3と5000Kで、他の方法(ICPなど)に比べて、高密度・高温特性が得られた。今後は、このHe-MIPを質量分析装置のイオン源とした極微量元素質量分析法を研究開発する予定である。本研究者が先に研究開発した表面波モードのマイクロ波誘導大気圧窒素プラズマ生成のためのOkamotoキャビティをベースにして、大電力(-1kW)でも安定にしかも低ガス量で大気圧中でヘリウムプラズマを生成することに、世界ではじめて成功した。そして、現在広く用いられているアルゴンガスを用いた高周波誘導結合プラズマ(Ar ICP)では検出できなかったイオン化電圧の高いハロゲン元素を直接高感度で検出することに成功するともに公表した(Y.Okamoto:Jpn.J.Appl.Phys.38(1999)L338。すなわち,Okamoto cavityのE面をより扁平に(8→6mm)、トーチも旋回速度が増すように細く(13→10mm)するとともにガイドを設けることにより、大気圧ヘリウムプラズマを(He MIP)低流量(-10l/min)でも安定に大電力領域(-1kW)でも生成することが出来るようになった。このHeMIPの中に、微量のイオン化電圧の高いハロゲン元素(Cl,Br)を含んだ溶液を超音波ネブライザーで霧化して導入し、発光分光特性を調べた。その結果、これらの元素のイオン線を検出することに成功し、検出限界はCl II(479.5nm):0.1ppm,Br II(470.5nm):0.2ppmであることを明らかにした。さらに、このプラズマの電子密度は2x10^<14>/cc、励起温度(Fe)は4,900Kであることなども明らかにした。前年度、世界で初めて成功した、大電力領域(1kW)でも安定に大気圧プラズマを生成できるOkamoto cavityを用いて、大気圧ヘリウムプラズマを生成し、その中心部に、イオン化電圧の高い(17.5eV)極微量のフッソ元素を含んだ水溶液NaF(5000ppm)を、超音波ネブライザーで霧化して、直接導入したときの発光分光分析特性を調べた。その結果、次のことなどが明らかになった。(1)FI(685.6nm)などの発光をS/N(信号対雑音比)よく検出することが出来た。(2)マイクロ波電力:700watt,プラズマガス:14.5l/min.キャリアガス:0.25l/min.脱溶媒システムの条件:150°Cおよび-9°Cのとき、S/Nは最も大きくなった。(3)このときの、検出限界は、0.15ppmが得られた。この値は、現在世界最高である。これらの成果は、日本分析化学会で発表するとともに、近く、Applied Spectroscopyに投稿する予定である。次年度は、これらの成果をベースとして、質量分析装置を整備し、質量分析特性を明らかにする予定である。前年度に引き続き、世界ではじめて成功した、大電力領域(kW)でも安定に大気圧ヘリウムプラズマを生成できるOkamoto cavityを用いて、ヘリウムプラズマの生成条件の最適化を図った。そして、その中心部にイオン化電圧の高い極微量のフッソ元素(F:17.5eV)を含んだ水溶液(2000ppm)を、超音波ネブライザーで霧化して、直接導入したときの発光分光分析特性を明らかにした。さらに、このプラズマをイオン化源とする質量分析特性を明らかにすべく、質量分析装置を整備した。

(1)トーチの内径を7mmに減少することにより、ヘリウムガスの流量を実用化レベルの10l/min以下に低減することが出来た。(2)このとき、電子密度と励起温度は、おのおの2.3×10^<14>/cm^3と5000Kで、他の方法に比べて、高密度・高温特性が得られた。(3)FI(685.6nm)の検出限界は100ppbで、現在世界最高の特性が得られた。また、これらの成果は、Anal.Sci.18(2002)やICAS-2000などで発表した。なお、質量分析特性は、質量分析計が故障し修理に時間を要したため、今後明らかにしていく予定である。
AchromobacterプロテアーゼIの触媒特性と安定性の基盤解析

AchromobacterプロテアーゼI(API)の一次構造解析の結果、APIはほ乳類型セリンプロテアーゼに分類された。このプロテアーゼ群は触媒中心がAsp102ーHis57-Ser194で形成されており、API中にもこれらの残基に対応する残基が確認された。APIの一次構造上の特徴は他のセリンプロテアーゼに比べてN、C両末端部に長いペプチド鎖の延長がある。ジスルフィド結合で保存されているのはCys36-Cys58のみである、触媒活性に重要な役割を果たしているAsp189Asp193がそれぞれGlu、Serに置換されている等である。APIの触媒特性と安定性の基盤解析を行うにあたり、まずサブサイトの大きさと性質の検索を発蛍光性基質を用いて行った。それによりAPIにはS_1,S_2,S_3の3つのサブサイトが存在することが判明した。サプサイトS_4は存在しないが、その近傍に疎水性基と相互作用できる部位の存在が示唆された。ほ乳類型セリンプロテアーゼとの一次構造比較及びサブサイトの大きさよりAPEのサブサイトS_1,S_2,S_3にはHis213ーGly214ーGly215が対応すると考えられる。ほ乳類型セリンプロテアーゼのサブサイトは一般にSer-Trp(Gly)-Glyで明らかにAPIのそれと異なっている。これがAPIの触媒活性の特異性に何等かの影響を及ぼしていると推測される。一方、本研究では活性部位His残基を蛋白質化学的に同定するため新しく発蛍光性アフィニティーラベル化剤、DLCK、を合成し、これを用いて少なくともHis56とHis57のいずれかが活性部位であることを示した。またアミノ基、特にαアミノ基の構造安定性への寄与を評価するためにアセチル化を試みた。その結果少なくともεーアミノ基がAPIの構造安定性に重要な役割を果たしていることが明らかになった。1.AchromobacterプロテアーゼI(API)に化学修飾による触媒特性と安定性の基盤の解明を行なうにあたり,市販品のAPIの購入に頼る現在の試料入手法ではその絶対量が不足している為,試料を独自に大量調整する目的で,アフィニティークロマトグラフィーを用いた新しい精製法の開発を行なった.CHーセファロース上にεーBocリジナールを固定化後,酸処理によりBoc基を排除してリジナール・セファロース・アフィニティーカラムを調整した.このリジナールはAPIと特異的に結合し,その結合はセミカルバジドによって解離させることができる. AchromobacterはAPIを培養液中に分泌するので,その培養液をDEAEおよびCMセルロファインを用いたバッチ法で余分なタンパク質や色素を除去した後,リジナール・セファロース・アフィニティーカラムに通すことにより, APIを迅速かつ高収率で精製することが可能になった.一方,培養条件のpHを7.2から6.5に変更することにより, APIの産生が著しく増加し約20mg/l以上の産生が可能な系を確立した.今後の研究計画として,以上の系で大量に精製したAPIを用いて, (1)APIの熱,変性剤に対する安定性の検討, (2)N末端部9残基, C末端部24残基の延長ペプチド部分の役割の解明, (3)S+S結合とAPIの熱および変性剤に対する安定性との関係の解明, (4)アミノ基のアシル化によるAPIの触媒活性への影響,(7)プロトンNMRによるHis57のpKgの測定,

(8)Trpの役割の解析(オゾン酸化による),以上の研究を行なう予定である.2.数種類の発蛍光性アミド基質を合成し,これらに対するAPIの反応パラメーター(kcat,Km)を決定してAPIのサブサイトの性質を検討した.これにより,サブサイトS.ナ_<1.ニ>,S.ナ_<2.ニ>,S.ナ_<3.ニ>の存在が明らかになった.現在サブサイトS.ナ_<4.ニ>の存在の有無の検討,およびS.ナ_<1.ニ>′,S.ナ_<2.ニ>′側のサブサイトの存在についての検討を行なっている.7ーアミノー4ーメチルクマリン(AMC)をリジンのカルボキシル基に連結させて作製されたLysーMCAはプロテアーゼによるペプチド結合の切断に放出する蛍光の波長が変化する。この性質を利用してリジンのカルボキシル基側を特異的に加水分解するAchromobacterプロテアーゼI(API)の触媒活性を微量に測定できる。そこで、種々の長さのペプチド鎖をもつ発蛍光性基質XーLysーMCAを合成してAPIのサブサイトの大きさと性質を検索しようと試みた。Boc-Lys-MCAのアミノ基側にアミノ酸残基を1つ付加した基質Boc-AA-Lys-MCA(AA=アミノ酸)を合成してAPIの触媒活性をBoc-Lys-MCAのそれと比較したところ、Km値の減少とkcat値の増加によりkcat/Km値がほぼ2桁増加した。さらにアミノ酸1残基付加すればKm値は殆ど変化しなかったが、kcat値の増加によりkcat/Km値が幾分上昇した。以上の結果から、APIの触媒部位近傍には3つのサブサイトS_1、S_2、S_3が存在すると結論づけられた。ほ乳類型セリンプロテアーゼには基質の加水分解を受けるペプチド結合よりアミノ基側の残基と相互作用する3つのサブサイトS_1、S_2、S_3が存在し、微生物型セリンプロテアーゼにはさらにサブサイトS_4が存在する。APIのサブサイトの個数とアミノ酸配列の類似性よりAPIがほ乳類型セリンプロテアーゼに属すると考えられる。2つの基質Boc-AA-AA-Lys-MCAとH-AA-AA-Lys-MCAに対するAPIの触媒活性の比較より、APIにはサブサイトS_4は存在しないが、疎水性基と相互作用する部位がS_4近傍に存在すると推測される。
大腸疾患の病因、病態におけるneuropeptideに関する研究-局所免疫機構との関連とその臨床応用

1.炎症性腸疾患の成因、病態に及ぼすneuropeptideの関与について、免疫組織学的手法で画像解析装置を用いて検討した.潰瘍性大腸炎(UC)の大腸粘膜固有層のsubstance P (SP)陽性神経線維長は対照例に比して有意に高値を示し、個々のUC症例内においても活動期は緩解期よりもSP線維長が高値を示した.またUC症例のなかでもその臨床像によってSP線維長の分布が異なっていた.すなわち、prednisoloneの多量投与を必要とする症例や、持続的なprednisolone投与を必要を要するような難治例でSP線維長が高値を示した.以上から潰瘍大腸炎の病態および臨床像とUC大腸粘膜固有層のSP線維長との間に密接な関連があることが明らかになった.2.大腸腫瘍性疾患、非腫瘍性ポリ-プ、移行部粘膜および背景粘膜の固有層の神経組織をVIPを中心に形態学的、免疫組織学的に検討し、以下の結果を得た.(1)背景大腸粘膜固有層のVIP陽性神経線維は肛門側腸管で少なく、右側大腸と左側大腸を比較すると、右側では有意に陽性神経線維が多く認められた.(2)癌組織内にはVIP陽性神経線維は認められず、移行部粘膜では背景粘膜より有意に減少していた.(3)表面型および隆起型腺腫、Peutz-Jeghers型ポリ-プ、若年性ポリ-プ、炎症性ポリ-プでは有意にVIP陽性神経線維が減少していた.(4)腺腫においては表面型、無茎・広茎性、有茎性の準にVIP陽性神経線維は減少していた.(5)腺腫を大きさ別に分けると、表面型ではVIP陽性神経線維は大きさによる差は認められなかった.隆起型では腺腫が大きくなるにつれて有意に減少していった。(6)腺腫を異形度別にみると、軽度から中等度に異形度が増すとVIP陽性神経線維は減少し、この傾向は隆起型のもので著明であった.高度異形腺腫ではVIP陽性神経線維は認められなかった.(7)VIPレセプターは正常の粘膜上皮細胞に豊富に分布しており、筋層間神経叢にも存在していた.軽度異形腺腫、中等度異形腺腫、癌に進むにつれたVIPレセプターの陽性率は有意に低下していた.(8)VIPレセプターを有する培養大腸癌細胞はVIPにより増殖が抑制された.以上から、腺腫、癌においてはVIP陽性神経線維の異常があり、このVIP含有神経組織の異常が組織形態学的にも影響を及ぼしていることが示唆された.1.炎症性腸疾患の成因、病態に及ぼすneuropeptideの関与について、免疫組織学的手法で画像解析装置を用いて検討した.潰瘍性大腸炎(UC)の大腸粘膜固有層のsubstance P (SP)陽性神経線維長は対照例に比して有意に高値を示し、個々のUC症例内においても活動期は緩解期よりもSP線維長が高値を示した.またUC症例のなかでもその臨床像によってSP線維長の分布が異なっていた.すなわち、prednisoloneの多量投与を必要とする症例や、持続的なprednisolone投与を必要を要するような難治例でSP線維長が高値を示した.以上から潰瘍大腸炎の病態および臨床像とUC大腸粘膜固有層のSP線維長との間に密接な関連があることが明らかになった.2.大腸腫瘍性疾患、非腫瘍性ポリ-プ、移行部粘膜および背景粘膜の固有層の神経組織をVIPを中心に形態学的、免疫組織学的に検討し、以下の結果を得た.(1)背景大腸粘膜固有層のVIP陽性神経線維は肛門側腸管で少なく、右側大腸と左側大腸を比較すると、右側では有意に陽性神経線維が多く認められた.(2)癌組織内にはVIP陽性神経線維は認められず、移行部粘膜では背景粘膜より有意に減少していた.(3)表面型および隆起型腺腫、Peutz-Jeghers型ポリ-プ、若年性ポリ-プ、炎症性ポリ-プでは有意にVIP陽性神経線維が減少していた.(4)腺腫においては表面型、無茎・広茎性、有茎性の準にVIP陽性神経線維は減少していた.(5)腺腫を大きさ別に分けると、表面型ではVIP陽性神経線維は大きさによる差は認められなかった.隆起型では腺腫が大きくなるにつれて有意に減少していった。(6)腺腫を異形度別にみると、軽度から中等度に異形度が増すとVIP陽性神経線維は減少し、この傾向は隆起型のもので著明であった.高度異形腺腫ではVIP陽性神経線維は認められなかった.(7)VIPレセプターは正常の粘膜上皮細胞に豊富に分布しており、筋層間神経叢にも存在していた.軽度異形腺腫、中等度異形腺腫、癌に進むにつれたVIPレセプターの陽性率は有意に低下していた.(8)VIPレセプターを有する培養大腸癌細胞はVIPにより増殖が抑制された.以上から、腺腫、癌においてはVIP陽性神経線維の異常があり、このVIP含有神経組織の異常が組織形態学的にも影響を及ぼしていることが示唆された.1.neuropeptideによる腸管局所免疫反応の制御-炎症性腸疾患の成因、病態に及ぼす影響について:腸管にはNP含有神経組織が豊富でその分布は腸管リンパ装置に一致しており、炎症・免疫反応に重大な影響を与えている。一方、炎症性腸疾患(IBD)には免疫異常が病態に深く関与しているとされる。

そこで潰瘍性大腸炎(UC)24例、大腸癌(対照)34例の大腸組織を用いてvasoactive intestinal peptide(VIP)、substance P(SP)を免疫組織学的に染色し画像解析装置で定量的に解析することによってIBDにおけるNPの役割について検討した。その結果uCにおいては対照に比べ粘膜固有層のVIP陽性神経線維が減少しており(3.8±0.6μm/1000μm^2V.S.0.9±0.6)、逆にSPは増加していた。(12.8±2.4V.S.5.6±1.3)。VIPは腸管免疫抑制作用を、またSPは促進作用を有すると報告されており、VIPの減少、SPの増加がIBDの成因、病態の変化に重要な役割を演じている可能性が示唆されると共に、神経系と免疫系の関連が明らかとなった。2.transitional mucosa(TM)におけるVIP含有神経組織の異常について大腸癌及びTM間質における神経組織について、特にVIPを中心にその異常の有無について免疫組織学的に検討した。その結果、TMではsialomucinの増加と腺窩長の増加(0.81V.S.0.46mm)がみられた。さらにTMではVIP陽性神経線維(2561V.S.9048μm/mm^2)およびS-100蛋白陽性神経線維(4386V.S.13083μm/mm^2)が共に対照より減少していた。以上の結果からTMでは神経組織の異常があり、形態学的、粘液組織学的異常に影響を及ぼしている可能性が示唆された。2.transitional mucosa(TM)におけるVIP含有神経組織の異常について:大腸癌及びTM間質における神経組織について、特にVIPの異常を免疫組織学的に検討した。その結果、TMではsialomucinの増加と〓窩長の増加がみられ、またVIP陽性神線線維、およびS-100蛋白陽性神経線維の減少が認められた。従ってTMでは神経組織の異常があり、形態学的、粘液組織学的異常に影響を及ぼしていると考えられた。3.大腸ポリープにおける粘膜固有層神経組織の検討:大腸癌および大腸ポリープの粘膜固有層の神経組織の異常を明らかにする目的でS-100蛋白陽性神経線維を免疫組織学的に検討した。その結果、化生性ポリープを除く大腸ポリープでは間質がnormal neural regulationから逸脱していることが明らかとなった。
血中エコール濃度測定を含む症例対照研究による病理組織型別の卵巣癌リスク要因の検討

イソフラボン類、Adiponectin、Insulinの血中濃度を測定して、卵巣がんリスクとの関連性を検討した。2010年11月から2012年7月までに札幌医科大学附属病院に入院した卵巣がん患者を症例群とし、同病院に入院した主として循環器疾患の患者を対照群とした症例対照研究を行った。Unconditional logistic regression modelによって年齢、出産数、BMIを調整して症例群と対照群の比較を行った。症例群71人と対照群80人に関して多変量解析を行った結果、Daizeinの血中濃度が高いことが卵巣がんのリスク低下と有意に関連し(P<0.001)、Insulinの血中濃度が高いことが卵巣がんのリスク上昇と有意に関連していた(P<0.001)。卵巣がんの病理組織型では、serous、clearcell、および、endometrioid adenocarcinomaにおいて、上記の関連がみられた。【目的】イソフラボン類の摂取量が多いほど卵巣がんのリスクが低い可能性が示唆されている。腸内細菌叢の働きによりイソフラボン類のDaizeinはEquolに代謝されるが、Equolを産生できる者(産生者)と産生できない者(非産生者)がいる。そこで、イソフラボン類の血中濃度を測定して、卵巣がんリスク低下との関連性を検討した。【方法】2010年11月以降に札幌医科大学医学部附属病院婦人科に入院した卵巣がん患者を症例群とし、2010年11月以降に同病院第2内科(循環器疾患と代謝性疾患専門)に入院した患者(がん患者を除く)を対照群とした症例対照研究を行った。Equol、Daizein、Genistein、および、Glyciteinの血中濃度を卵巣がん症例群と対照群について測定した。採血は早朝空腹時であった。【結果】2011年2月末までに症例群24人と対照群16人の調査が終了した。症例群と対照群の平均年齢(±標準偏差)は54.3歳(±15.5)と58.4歳(±13.0)であり有意差はなかった。Mann-WhitneyのU検定の結果、症例群は対照群と比較してEquol(P=0.081),Genistein(P=0.140),Daizein(P=0.041),Glycitein(P=0.048)の血中濃度が低かった。Fisherの直接確率検定の結果、症例群は対照群と比較して、Equol非産生者(P=0159),Genistein≦97.0ng/ml(P=0.205),Daizein≦53.8ng/ml(P=0.007),Glycitein≦1.7(P=0.086)の割合が大きかった。Spearmanの順位相関係数検定の結果、Genistein,Daizein,Glyciteinの間には症例群でも対照群でも強い有意な相関がみられたが、Equolとの間には相関はみられなかった。年齢,Equol,Daizeinの3変数を独立変数としたunconditional logistic regression modelによる解析結果、Equol産生者であること(P=0.023)とDaizein>53.8ng/ml(P=0.002)の卵巣がんリスクが有意に低かった。【結語】Equol産生者であることや、血中daizein濃度が高いことが卵巣がんリスク低下と関連している可能性が示唆された。今後は症例数を増やし、病理組織型別の解析をする予定である。腸内細菌叢の働きによってイソフラボン類のDaizeinはEquolに代謝されるが、Equolを産生できる者(産生者)と産生できない者(非産生者)がいる。Unconditional logistic regression modelによって年齢を調整して症例群と対照群の比較を行った。【結果】2011年2月末までに症例群63人と対照群96人の調査が終了した。

症例群と対照群の平均年齢(±標準偏差)は56.6歳(±13.1)と58.1歳(±14.2)であり有意差はなかった。Genistein(P=0.062)、Daizein(P<0.001)、Glycitein(P=0.002)の血中濃度はいずれも症例群の方が対照群よりも低かった。しかし、Equolの血中濃度には両群間に有意な差異はなかった。Adiponectinの血中濃度は境界有意に症例群の方が対照群よりも低く(P=0/055)、また、Insulinの血中濃度は症例群の方が対照群よりも有意に高かった(P<0.001)。【結語】血中daizein濃度が高いことなどが卵巣がんリスク低下と関連している可能性が示唆された。今後は症例数を増やし、病理組織型別の解析をする予定である。【目的】卵巣がんの予防を目的として、そのリスク要因を解明するための研究を行った。【方法】研究期間中に、77人の卵巣がん患者群と102人の対照群(がんや卵巣疾患の既往がない、主として循環器疾患の患者)について調査を行った。早朝空腹時に採血したイソフラボン類アグリコン(ゲニステイン、ダイゼイン、グリシテイン、エコール)、アディポネクチン、および、インスリンの血中濃度を測定した。また、質問紙によって食生活、その他の生活習慣、生殖歴などを調査した。【結果】年齢、出産数、および、BMIを調整したロジスティック回帰分析の結果、ダイゼインとグリシテインの血中濃度が有意に卵巣がんリスクの低下と関連していた。ゲニステインの血中濃度は卵巣がんリスクの低下と関連していたが有意ではなかった。エコールの血中濃度は卵巣がんリスクと関連しなかった。また、アディポネクチンの血中濃度は有意に卵巣がんリスクの低下と関連し、インスリンの血中濃度は有意に卵巣がんリスクの上昇と関連していた。しかし、アディポネクチンとインスリンの血中濃度を同時に共変量に加えると、インスリンの血中濃度のみが有意に卵巣がんリスクと関連していた。【考察】イソフラボン類、その中でもダイゼインとグリシテインの血中濃度が卵巣がんリスクを低下させたことから、大豆製品をよく摂取することが卵巣がんのリスクを低下させる可能性が示唆された。また、耐糖能異常の指標であるインスリンの血中濃度が卵巣がんリスクの上昇と関連していたことから、生活習慣を通した耐糖能異常の予防が、卵巣がんの予防にも寄与する可能性が示唆された。研究の限界として、症例対照研究であることから、卵巣がん発生後の血中濃度であることが挙げられた。イソフラボン類の摂取が卵巣がんのリスクを低下させるという当初の仮説と符合する結果を示すことができている。エコール産生能と卵巣がんのリスクとには関連性が見られていないが、今後の症例数の増加によっては関連性があることを示すことができる可能性がある。24年度が最終年度であるため、記入しない。最後の1年間も、このまま順調に卵巣がん症例群と対照群の調査が進行すると思われるので、特に問題点はないと考えられる。
ヘチマ繊維体を用いた新規バイオリアクターの開発と利用

各種微生物細胞のヘチマ繊維体への固定化についての検討を行った結果、凝集性菌はヘチマ繊維体を設置したリアクターに接種するだけで、短時間で十分に固定化され、菌体はヘチマ繊維体の孔隙で良く増殖することを確認した。非凝集菌の場合、凝集剤(chitosan)を添加することによって、非凝集菌に凝集性を持たせることができ、ヘチマ繊維体の孔隙に効率的に固定化されることを確認した。また、ヘチマ繊維体を設置したリアクターにカビ胞子を接種したところ、胞子の発芽後、菌糸はヘチマ繊維体の孔隙で良好に増殖することも明らかとなった。円筒状ヘチマ繊維体(自然形態)のもので形成した充填層は、物質移動が良く、好気性プロセスに適していることを確認した。一方2cm角にカットしたヘチマ繊維体で充填層を形成することによって、培養槽内空間を減少させると共に充填率を増加させることができた。この場合、物質移動は悪くなるが、嫌気プロセスには有効であった。凝集性(S.cerevisiae IR2)および非凝集性酵母(C. brassicae)をそれぞれヘチマ繊維体に固定化し、気泡塔型培養装置でシュークロースおよび廃糖密からのエタノール生産を行った結果、長時間の安定性を示した。天然の円筒状のヘチマ繊維体にカビ(Aspergillus awamori)を固定化し、好気的な条件下でアミラーゼ生産を行った結果、長時間の連続生産が可能であった。また、ヘチマ繊維体に固定化したA.awamoriとSaccharomyces cerevisae IR2を用いる事によって澱粉からのエタノール連続生産が可能となった。以上の結果は凝集性および非凝集性の代表的な発酵微生物(酵母、細菌およびカビ)をヘチマ繊維体に効率的に固定化することができることを示すものである。また、充填層の形成に関して、筒状およびカットしたヘチマ繊維体を用いることによって、好気性プロセスおよび嫌気性プロセスに適している充填層を形成することができ、ヘチマ繊維体のバイオリアクターは幅広い培養プロセスに応用できることを証明した。凝集性細胞および凝集性を持たせた非凝集性細胞(凝集剤としてキトサンを添加)は短時間でヘチマ繊維体に十分に固定化され、ヘチマ繊維体の孔隙で高菌体濃度まで増殖することを確認した。また、ヘチマ繊維体を設置したリアクターにカビ胞子を接種したところ、胞子の発芽後、菌糸はヘチマ繊維体の孔隙で良く増殖することも明らかとなった。ヘチマ繊維体を用いたバイオリアクターの作製方法と物質移動特性に関する検討を行った結果、ヘチマ繊維体を自然の筒状のもので形成した充填層は、物質移動が良く、好気性発酵プロセスに適しているものと推定された。一方2cm角にカットしたヘチマ繊維体で形成された充填層は充填率を増加させることができ、嫌気性発酵プロセスに有効であると推定された。凝集性(S.cerevisiae IR2)および非凝集性酵母(C.brassicae)をそれぞれヘチマ繊維体に固定化し、気泡塔型培養装置でシュークロースおよび廃糖密からのエタノール生産を行った。

筒状またはカットしたヘチマ繊維体の充填層に固定化したS.cerevisiae IR2およびC.brassicaeを用いた繰り返し回分培養および連続培養を行った結果、500時間以上の培養が可能であったが、カットしたヘチマ繊維体を用いた場合は筒状のヘチマ繊維体を用いた場合と比較して生産性は2倍以上増加した。以上の結果より嫌気性発酵プロセスではカットしたヘチマ繊維体を用いることが適していることが明らかとなった。現在、自然の筒状の繊維体にカビ(Aspergillus awamori)を固定化し、好気的な条件下でアミラーゼ生産の検討を行っており、予想通り好結果が得られつつある。平成7年度では各種微生物細胞のヘチマ繊維体への固定化および嫌気的な発酵プロセスへの応用についての検討を行った。その結果、様々な微生物がヘチマ繊維体に効率的に固定化することができ、固定化酵母を用いて長時間安定したエタノールの生産が可能であることが明らかとなった。今年度は好気性プロセスへの応用についての検討を行った。天然の円筒状のヘチマ繊維体にカビ(Aspergillus awamori)を固定化し、好気的な条件下でアミラーゼ生産の検討を行った結果、600時間以上の連続生産が可能であった。このシステムのアミラーゼ生産性はアルギン酸を用いた包括固定化法で得られた値より高かった。次に以記のリアクターとカットしたヘチマ繊維体に固定化したsaccharomyces cerevisaeを組み合わせて澱粉からの連続的なエタノール生産についての検討を行った。A.awamoriのリアクターの排出培養液(粗酵素)を酵母のリアクターに連続的に添加した。酵母のリアクターではA.awamoriのリアクターから添加した粗酵素による澱粉の糖化と固定化した酵母によるエタノール生産が同時に行われた。このシステムを用いることにより澱粉からのエタノール生産が可能であったが粗酵素と新鮮澱粉培地を同時に酵母のリアクターに添加したため、粗酵素および基質の濃度が低く、システムの生産性は低かった。この問題の解決法として、A.awamoriとS.cerevisiaeを同時に固定化た単槽のリアクターを用いた連続培養を行った。その結果、定常状態におけるエタノールの生産性は上述のA.awamori槽とS.cerevisiae槽の2槽連結システムと比べて6倍以上が得られた。しかしながら、エタノール収率は0.31g-ethanol/g-starchの低い値を示し、このシステムにおいては、グルコースの蓄積が見られず、糖化反応が律速となっていることが明らかとなった。従って、このシステムの生産性を向上させるためには、酵母固定化層をより嫌気的な条件にしたり、固定化槽におけるA.awamoriの割合の増加や他のアミラーゼ生産菌との混合固定化等の検討が必要である。
高齢者にとって望ましい口腔保健行動の検討とガイドラインの作成

本研究は、高齢者にとって望ましい口腔保健行動を検討することを目的とし、質的研究を通じ様々な口腔保健行動を抽出し、それを踏まえ質問項目を作成し、量的研究を行うことにより各行動の口腔健康における役割を評価した。口腔疾患を防ぐ好ましい保健行動として、(1)口腔清掃行動(高い効果):歯間ブラシ・デンタルフロスの頻回な使用、歯みがき時間を充分にとる等、(2)受診行動(中程度の効果)(3)禁煙(歯周病に対しての効果)(4)食生活(歯周病に対しての弱い効果):甘いもの・間食を控える、お茶をよく飲む等が明らかになった。口腔清掃を促進する要因として、<ホジティブな信念><アドヘレンス><口腔健康への自信>などがあり、年齢、高血圧などの身体状態は抑制要因として考えられた。受診行動を促進するものとしても<ホジティブな信念><アドヘレンス><口腔健康への自信>などの認知的変数が認められた。本研究を通じて、口腔健康に関してのホジティブな信念を育成する働きかけ、口腔健康への自信がもてるような援助が重要であることが示唆された。また、好ましい口腔保健行動を援助するためには、年齢や性別などの特性を考慮しながら働きかけることが必要であり、今後は経時的な研究を行ない詳細に検討していく必要があると考えられた。本研究の最終ゴールは、高齢者が適切な口腔保健行動を行えるように口腔保健行動支援プログラムを作成することであるが、本研究期間の範囲では、質的研究を通じ様々な口腔保健行動を抽出し、抽出項目を用いて量的研究によって口腔保健行動を評価し、高齢者にとって望ましい口腔保健行動のガイドライン案を作成することを目的とする。平成18年度は、予備的な調査を行い1.口腔保健行動の要素抽出のための質的検討、2.口腔保健行動調査のための質問紙の作成、3.口腔状態を評価する指標の検討を行った。【対象と方法】高齢者大学に通う60歳以上の方を対象とし、面接により属性、日常生活の様子、保健行動などの聞き取りと口腔診査を行った。【結果と考察】研究への参加者は男性52人、女性42人、計94人で平均年齢は67.3±4.5歳(61歳84歳)であった。口腔保健行動をとらせる要因としては、健康・長寿への願望、口腔保健行動への信念、保健に関する役割の自覚、自己管理能力への信頼、不快感への対応などが抽出された。保健行動としては、様々な口腔清掃方法、食生活への配慮、受診行動などがあげられた。これらをもとに口腔保健行動調査のための質問紙を作成した。口腔状態に関しては、自覚症状、口腔診査(口腔粘膜、歯科疾患、CPITN、歯石、汚れ)、口腔内細菌検査による各指標が用いられたが、今後、対象数を増やして検討することで、各口腔保健行動が口腔健康に及ぼす影響を評価することが可能であると考えられた。平成19年度は、平成18年度に行った予備調査をふまえ、口腔保健行動評価のための量的調査を実施し、高齢者にとって望ましい口腔保健行動のエビデンスを構築することを目的とした。【対象と方法】対象者は、60歳以上の地域住民で、面接により属性、日常生活、保健行動、口腔健康に関する考え方などの聞き取りと口腔診査、口腔内細菌検査を行った。【結果と考察】研究への参加者は男性140人、女性284人、計424人で平均年齢は71.2±6.9歳(60歳93歳)であった。口腔保健行動をとらせる認知変数的要因としては、【ポジティブな信念や規範】、【口腔の問題-周囲の助言】、【口腔健康へのあきらめ】、【効果の実感】、【口の健康に対する自信】の5因子が抽出された。

現在歯数は平均20.0±9.2本、未処置う歯数は平均1.0±2.0本、CPITNは平均2.6±1.1で全国平均と比較し良好な口腔状態であったが、259人(61.2%)は口腔に関する何らかの主訴を持っていた。口腔保健行動として、口腔清掃に関しては、全員が1日1回以上歯磨きを行っていて、歯間ブラシやデンタルフロスを使用しているものは136人(39.9%)であった。食生活に気をつけているものは68人(16.2%)であった。受診行動として、定期的に歯科を受診している者は148人(35.3%)であった。平成20年度はこれらのデータをもとに、各口腔保健行動が口腔健康に及ぼす影響を解析する予定である。平成20年度は、平成18年度、19年度に得られたデータを総合的に分析することにより、高齢者の口腔保健行動を促進するアプローチを検討した。主訴や自覚症状と疾患の関連を検討したところ(坂下ほか、2009)、自覚症状をもつ人は、未処置齲歯、歯周病、欠損歯のリスクが有意に高く(p<0.01p<0.05)、自覚症状を手がかりとして口腔の問題に対処することは有意義であると考えられた。主訴や自覚症状があるものは、口腔清掃をよく実施していたが(p<0.05)、自覚症状がある人は口腔疾患のリスクが高いにもかかわらず、歯科受診に対して消極的な回答をした人が多かった(p<0.05)。好ましい保健行動として、(1)口腔清掃行動(高い効果):歯間ブラシ・デンタルフロスの頻回な使用、歯みがき時間を充分にとる等、(2)受診行動(中程度の効果)(3)禁煙(歯周病に対しての効果)(4)食生活(歯周病に対しての弱い効果):甘いもの・間食を控える、お茶をよく飲む等がみられた。口腔清掃を促進する要因として、<ホジティブな信念><アドヘレンス><口腔健康への自信>などがあり、年齢、高血圧などの身体状態は抑制要因として考えられた。受診行動を促進するものとしても<ホジティブな信念><アドヘレンス><口腔健康への自信〉などの認知的変数が認められた。本研究を通じて、口腔健康に関してのホジティブな信念を育成する働きかけ、口腔健康への自信がもてるような援助が重要であることが示唆された。好ましい口腔保健行動を援助するためには、年齢や性別などの特性を考慮しながら、どのような要因が口腔保健行動を推進するのか、今後は経時的な研究を有ない詳細に検討していく必要があると考えられた。
環境調和型触媒的不斉炭素－炭素結合形成反応の開発と重要医薬品合成への応用

オリゴ糖や複合糖鎖は、細胞分化や免疫応答などの重要な生命現象に関与していることが知られている。そのため合成糖類縁体は、医薬化学や分子生物学の研究領域において最も重要な分子種の一つである。従来の糖類縁体の合成においては、多くの反応を阻害する水酸基を保護することが一般的であった。保護基の使用により高い確実性をもって様々な化学変換を行うことが可能になったが、保護基の着脱に纏わる煩雑な操作のために、合成効率が大きく低下する例も多い。そのような問題点に対し、保護基フリーの糖に対して適用可能な触媒的炭素-炭素結合形成反応を開発することで、保護基の使用を最小限に抑えた効率的な糖誘導体合成法の確立することを目標に据え、研究を行った。前年渡までに、一価銅触媒による末端アルキンと二級アミンを基質とした無保護のアルドースに対するアミノアルキニル化反応においては、各々のアルキン及び単糖基質に最適な反応条件を見出し、本反応が効率的な糖誘導体合成に有用であることが示されたが、今年度は本反応の高い官能基許容性を生かし、bioconjugationを指向した反応の開発に取り組んだ。具体的には、二糖などの多数の水酸基を持つ糖基質や、biotin等生物学的に有用な構造を有するアルキンを基質として、目的のアミノアルキニル化が進行することを見出した。この結果は、本反応が効率的な物質生産のみならず、chemical biology等における有用な方法論を提供するものであることを示しているといえる。また、本触媒反応を基盤として、抗インフルエンザ薬:ザナミビル(商品名リレンザ)の合成研究も行った。現在までに合成中後半に至る合成経路が確立しており、鍵反応であるザナミビルの中心六員環形成反応の開発を行っている。今後は、アミノアルキニル化反応の高い官能基許容性を最大限活用し、多様な置換基構造を有するザナミビル誘導体合成にも展開していく予定である。糖母核を有する複雑な低分子化合物は、医薬品のリード化合物として重要であるが、その合成においては、多くの化学変換を阻害する水酸基を保護することが必須であった。しかしながら、この保護にまつわる煩雑の操作のために、これら医薬化学的に有用な分子の合成効率は一般的に低く、その低効率性が生命科学研究の進展を阻害している場合も少なくない。この問題に対し本研究では、水酸基無保護の糖基質に対し炭素-炭素結合を形成する反応を開発し、本来ならば必須である保護・脱保護の操作を必要としない、糖化合物の効率的な合成法を確立することを目指した。有機合成化学がある程度成熟した現代においても未だ開拓がほとんどなされていない難度の高い研究分野であるが、独自の戦略に基づき詳細な検討を行った結果、望みの炭素-炭素結合形成反応を進行させることに成功した。具体的な反応は、入手容易な無保護のアルドースに対し、末端アルキン・二級アミン・一価銅触媒を用いて、合成化学的に有用なプロパルギルアミン構造を構築する反応であるが、この反応おいて反応の進行に決定的に重要なリガンドおよび添加物を見出した。当条件を用いることで、合成化学的に有用な様々なアルキンを導入できることも分かった。構築されたプロパルギルアミノ基に対しては、多様な官能基変換が可能であり、当反応を起点としてさまざまな複雑糖分子を短工程で合成できる道が開けたと言える。今後はこの開発された反応を用い、重要な抗インフルエンザ薬であるリレンザの効率的合成法の開発に取り組む予定である。また、この研究で得られた知見を基に、本研究のもう一つの目標である、不活性なsp2炭素-水素結合から生成した触媒的活性種を求核的に用いて炭素-炭素結合形成を行う、合成効率の高い新規反応の開発にも取り組む。実際に検討を行った一価銅触媒による、末端アルキンと二級アミンを基質とした無保護のアルドースに対するアミノアルキニル化反応においては、前年度の検討結果を基盤として、各々のアルキン及び糖基質に最適な反応条件を見出した。その結果、合成化学的に有用な多様なアルキン・糖基質を用いて、反応を行うことが可能になった。本最適条件検討により、糖母核を有する生理活性分子の効率的な合成法確立の道が開けたと言える。ザナミビル合成に最適な糖及び高度に官能基化されたアルキンを基質とした反応においても、目的の炭素-炭素結合形成反応が良好に進行することを見出した。この保護基の使用を最小限に抑えた効率的なザナミビル合成法に関しては、現在、合成中盤から後半までルートの確立が進行しており、最後の一年で全合成ルートの確立を目指す予定である。