hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
敗血症ラット持続的血液濾過透析モデルにおける膜素材の検討とバイオマーカーの探索

また,血液浄化器前後及び濾液を経時的に採取し,タンパクアレイを用いて,各種炎症性サイトカイン,ケモカインの吸着・除去特性を包括的に測定しており,この結果を平成27年度の関連学会にて報告する予定である.また,生存率に影響しうることが知られている既知の蛋白質(バイオマーカー)における膜素材の吸着能の違いを比較検討したところ,ある物質において膜素材の吸着能に違いが認められた.この結果は,敗血症性多臓器不全の生存率の向上に寄与しうる知見であり,ラットの生理学的,組織学的評価などと併せて関連雑誌に投稿する予定である.集中治療医学本研究の実施計画における平成25年度の計画ではラット敗血症ショック,CHDF治療モデルを用い,膜素材を用いた検討において,IL-6の吸着,除去能の相違を証明し,関連学会に発表した.さらに長時間の血液浄化療法を安定的におこなうことが可能となり再現性のあるデータを得る準備が整い,IL-6ほかの液性因子の吸着・除去特性を検討し始めており,ほぼ順当な進捗状況であると思われる.本研究の実施計画における平成24年度の計画ではラット敗血症ショック,CHDF治療モデルの確立である.平成24年度には3時間程度の施行に耐えうる血液浄化器,回路を作成し,更には2種類の膜素材を用いた検討において,IL-6の吸着,除去能の相違を証明し得たことから,ほぼ順当な進捗状況であると思われる.平成26年度は当初の研究計画に準じる.ラット敗血症ショック,CHDF治療モデルを用い膜素材毎に8匹程度実施する.比較検討項目としては,観察期間内の生存率,生理学,生化学,病理組織学的な評価を行う.また,血液浄化療法によって除去された蛋白質のプロファイル,各膜素材群間の比較,バイオマーカー候補蛋白質の同定を行う予定である.平成25年度以降は当初の研究計画に準じる.ラット敗血症ショック,CHDF治療モデルを用い膜素材毎に8匹程度実施する.比較検討項目としては,観察期間内の生存率,生理学,生化学,病理組織学的な評価を行う.また,血液浄化療法によって除去された蛋白質のプロファイル,各膜素材群間の比較.バイオマーカー候補蛋白質の同定を行う予定である.本研究の為に開発された血液浄化器の納入が遅れ,ラットを用いた実験の一部が次年度に持ち越されたため.サイトカイン測定試薬の購入額が予定より下回った.血液浄化器の不足は解決したため,繰り越した分は実験計画に従い,上記試薬やラットの購入,維持の費用として使用する.該当なし
肝アポトーシスでのミトコンドリアを介したカスパーゼ活性化―IAPとSmacの役割

肝細胞のアポトーシスでは、ミトコンドリアが放出するチトクロームcを介したカスパーゼの活性化が重要である。この活性化したカスパーゼはIAPと結合すると不活化されるが、チトクロームcと共に放出されるSmacがIAPと結合するとIAPはカスパーゼとの結合能を失うとされている。TNFαにはアポトーシス誘導作用と抑制作用とが存在するが、後者の成立機序は不明である。当該研究者らは、平成1112年度基盤研究(C)(2)でTNFαをマウスに単独投与するとIAPの肝での発現が増強して肝細胞のアポトーシスは起きないが、d-galactosamineを前投与しておくと、TNFαによって増強されるIAPの発現は有意に抑制され、肝細胞のアポトーシスと広範な肝壊死が起ることを報告した。今回は、肝でのアポトーシスとサバイバルのシグナルクロストークにおけるSmacとIAPの役割を明らかにする目的で、マウス正常肝細胞株におけるIAPの動態と両者の相互作用を検討した。1 TNFαを添加すると、3時間後からIAPに属するIAP-1、IAP-2及びXIAPの細胞内mRNA量はTNFα添加量依存的に増加した。Actinomycin D(Act D)をTNFα添加30分前に添加しておくと、TNFαのみを添加した場合に比べ、各IAPの発現はmRNA及び蛋白レベルにおいて夫々TNFα添加12及び24時間後に抑制された。また、カスパーゼ3活性はTNFαのみ添加しても変わらなかったが、Act Dを前添加するとTNFα添加6時間後より上昇した。2 Smacをリポフェクションした細胞では、カスパーゼ3活性が対照細胞に比べ、TNFα添加後12時間目において有意に高かった。IAPのアポトーシス抑制作用をSmacが弱めた結果と推測された。IAPの発現低下がカスパーゼ活性化を介した肝細胞アポトーシスの発生要因として一義的である可能性がある。肝における壊死と再生の調節因子であるTNFには、アポトーシスの誘導作用と抑制作用が存在する。この抑制作用はNFκBの活性化を介するとされるがその機序は不明である。NFκBにより転写が促進されるinhibitor of apoptosis protein(IAP)は、カスパーゼと結合してアポトーシスを抑制する。肝細胞のアポトーシスでは、ミトコンドリアが放出するcytochrome-cによるカスパーゼの活性化が中心となるが、同時に放出されるsecond mitochondria-derived activator of caspases(Smac)は、IAPと結合してそのカスパーゼとの結合能を失わせる。本研究者は平成1112年度基盤研究(C)(2)において、d-galactosamine/TNFマウス肝障害モデルで、TNFを単独投与するとIAPに属するIAP-1とIAP-2の肝組織における発現が増強して肝細胞のアポトーシスは起きないが、これにd-galactosamineを前投与しておくと、TNFによって増強される両IAPの発現は有意に抑制され、肝細胞のアポトーシスと広範な肝壊死が起ることを報告した。本研究では、TGFαのトランスジェニックマウス由来の肝細胞株(AML12)を用いて、カスパーゼの活性化におけるIAPとSmacの役割を検討した。TNFを培地に添加すると、3時間目から細胞中のIAP-1とIAP-2の発現は増強したが、Actinomycin D(Act D)をTNF添加30分前に添加すると、TNF添加3時間後の両者の発現は有意に抑制された。

また、細胞内カスパーゼ3活性は、TNFのみ添加しても変わらなかったが、Act Dを前添加するとTNF添加6時間後より有意に上昇した。現在、SmacをAML12にトランスフェクションの上でTNFの効果を検討中である。肝細胞がアポトーシスに陥る際には、ミトコンドリアが放出するチトクロームcを介したカスパーゼの活性化が中心となる。この活性化カスパーゼはIAPと結合すると不活化されるが、チトクロームcと共に放出されるSmacがIAPと結合するとIAPはカスパーゼとの結合能を失うことが報告されている。一方、TNFにはアポトーシス誘導作用と抑制作用が存在するが、後者の機序は不明である。本研究者は、平成1112年度基盤研究(C)(2)において、TNFをマウスに単独投与するとIAPの肝での発現が増強して肝細胞のアポトーシスは起きないが、これにd-galactosamineを前投与しておくと、TNFによって増強されるIAPの発現は有意に抑制され、肝細胞のアポトーシスと広範な肝壊死が起ることを報告した。今回は、肝でのアポトーシスとサバイバルのシグナルクロストークにおけるSmacとIAPの役割を明らかにする目的で、マウス正常肝細胞株におけるIAPの動態と両者の相互作用を検討した。1)TNFを培地に添加すると、その3時間後からIAPに属するIAP-1、IAP-2及びXIAPの細胞内mRNA量はTNF添加量に依存して増加した。Actinomycin D (Act D)をTNF添加30分前に添加しておくと、各IAPの発現はmRNA及び蛋白レベルにおいて夫々TNF添加12時間後及び24時間後で、TNFのみを添加した場合に比べ抑制された。また、カスパーゼ3活性はTNFのみ添加しても変わらなかったが、Act Dを前添加するとTNF添加6時間後より上昇した。2)Smacをリポフェクションした細胞では対照細胞に比べ、TNFのみ添加後12時間目においてカスパーゼ3活性が有意に高かった。IAPのアポトーシス抑制作用をSmacが弱めた結果と考えられた。IAPの発現低下が肝細胞アポトーシスの発生要因として一義的意義をもつ可能性がある。
腎癌におけるフェロトーシスの分子機構の解明と新たな治療戦略の構築

多くの癌治療は、癌細胞を細胞死に誘導し、抗腫瘍効果を発揮する。細胞死には、ネクローシスとアポトーシスが知られているが、鉄キレーターで細胞死が抑制される鉄に依存する細胞死=フェロトーシスが存在することが最近知られるようになった。本研究では腎癌におけるフェロトーシスの病理学的役割をin vitro / in vivo研究で網羅的に解析を行うことが目的である。癌治療において誘導される「細胞死」へのフェロトーシスの関与についての報告はなく、本研究が初めての解析となる。本研究の成果は、腎癌を含む多くの癌種での細胞死、治療標的、予後予測の議論に新たな展開を与え得る有益な情報になると期待される。
巨核球胞体突起形成刺激時におけるRho/Rac・Cdc42伝達シグナル系の解析

1.マウス巨核球がPPF刺激因子(HDL/TAT)で刺激を受けた際、どのようなシグナル伝達系を介してPPFを引き起こすかについてキナーゼ阻害剤を用いて検討する。マウス巨核球をPercoll比重遠心法、BSA濃度勾配法を用いて部分精製した。PPFはRhoキナーゼの阻害剤Y27632(10μM)添加で有意に増加し、PI3K阻害剤LY294002(100μM)、Srcfamilyキナーゼ阻害剤PPI(20μM)で有意に減少したことからRho/Rac系が関与していると考えられる。HDL/TATの刺激はRac/cdc42系を介してPPFを引き起こす。その上流にはPI3キナーゼとSrc familyキナーゼが存在する。RhoはRac/cdc42とは拮抗的に作用しているものと考えられる。AutoMacsを用いて、マウス骨髄細胞からstem cell antigen(SCA-1)陽性細胞を精製した。血清存在下でc-kit ligandならびにTPOと培養してCD61陽性細胞の比率をフローサイトメトリにて測定したところ、純度は約5060%でマウス巨核球を精製することが可能となったが、9x10^7のマウス骨髄細胞から3.6x10^3のSca-1(+)細胞しか得られなかった。それらを培養しても5x10^4程度しかマウス巨核球が得られないという結果となった。Western blotに必要な10^6程度のマウス巨核球を得ることは、上記の方法では難しいと考えた。が、一部の実験ではマウス20匹を用いて上記の方法でマウス巨核球を精製し、シグナル伝達系蛋白のWestern blotを検討した。マウス巨核球をPPF刺激因子で刺激し、Racの活性化を検討した。活性型Racは60分で増加し180分でもとに復した。リン酸化cofilinは60分で増加し以後低下した。以上により、HDL/TATの刺激はPI3キナーゼとSrc familyキナーゼを介してRac/cdc42を活性化する。活性化したRac/cdc42はcofilinをリン酸化しアクチンのdepolymerizationを阻害し、アクチンの伸展を引き起こすものと考えられた。1.マウス巨核球がPPF刺激因子(HDL/TAT)で刺激を受けた際、どのようなシグナル伝達系を介してPPFを引き起こすかについて検討する。マウス骨髄細胞からPercoll密度勾配法とBSAグラデイエントを用いて巨核球を精製した。無血清下でPPF刺激因子(HDL/TAT)と下記の阻害剤とを加えて培養し、24時間後の胞体突起形勢(PPF)をきたす巨核球の比率を測定した。PD98059(MAPK阻害剤10μM:116.8±15.9%, n=4)、SB203580(p38 MAPK阻害剤10μM:120.6±27.6%, n=4)は巨核球PPFを阻害しなかった。KT5720(Protein kinase A阻害剤1μM,10μM)ではほとんどの巨核球が生存していなかった。

BIM(PKC阻害剤1μM:12.1±6.8%, 10μM:1.2±1.2%, n=4)では85%以上の生存率がありながら、巨核球PPFは阻害された。LY294002(PI3K阻害剤1μM:89.3±7.8%,10μM:67.5±7.5%,100μM:9.6±5.4%)も同様に阻害された。Y27632(Rho kinase阻害剤)はHDL/TAT存在下(1μM:117.4±12.8%,10μM:137.7±12.4%(p<0.05),100μM:168.0±15.7%(p<0.01))、非存在下(1μM:151.3±8.5%(p<0.01),10μM:229.9±22.5%(p<0.01),100μM:345.2±28.9%(p<0.01),n=4)で巨核球PPFを刺激した。以上より、巨核球PPFはPKC、PI3K、最終的にはRho/Rho kinaseシグナル系が関与していることが強く示唆された。2.マウス巨核球の精製AutoMacsを用いて、マウス骨髄細胞からstem cell antigen(SCA-1)陽性細胞を精製した。血清存在下でc-kit ligandならびにTPOと培養してCD41陽性細胞の比率をフローサイトメトリにて測定した。8x10^7のマウス骨髄細胞からlineage抗体を用いて1.5x10^6のlineage陰性細胞を得た。最終的に得られた5x10^3のSca-1(+)細胞を上記の条件で培養した。CD61陽性細胞比率は8日後9.7%、10日後22.0%、13日後40.7%、15日後39.5%であった。以上より、マウス骨髄細胞から前駆細胞を精製しc-kitligandならびにTPOと培養すれば、かなりの純度で巨核球を単離することが可能と考えられた。1.マウス巨核球の精製前年度の報告したように、AutoMacsを用いて、マウス骨髄細胞からstem cell antigen(SCA-1)陽性細胞を精製した。血清存在下でc-kit ligandならびにTPOと培養してCD61陽性細胞の比率をフローサイトメトリにて測定したところ、純度は約50-60%でマウス巨核球を精製することが可能となったが、8x10^7のマウス骨髄細胞から5x10^3のSca-1(+)細胞しか得られなかった。それらを培養しても5x10^4程度しかマウス巨核球が得られないという結果となった。Western blotに必要な10^6程度のマウス巨核球を得ることは、上記の方法では難しいと考えた。が、一部の実験ではマウス20匹を用いて上記の方法でマウス巨核球を精製し、シグナル伝達系蛋白のWestern blotを検討した。マウス巨核球をPPF刺激因子で刺激したところ、活性型Racは60分で増加し180分でもとに復した。リン酸化cofilinは60分で増加し以後低下した。2.マウス巨核球がPPF刺激因子(HDL/TAT)で刺激を受けた際、どのようなシグナル伝達系を介してPPFを引き起こすかについて検討する。マウス巨核球をPercoll比重遠心法、BSA濃度勾配法を用いて部分精製した。PPFはRhoキナーゼの阻害剤Y27632(10μM)添加で有意に増加し、PI3K阻害剤LY294002(100μM)、Src familyキナーゼ阻害剤PPI(20μM)で有意に減少したことからRho/Rac系が関与していると考えられる。上記のRacの活性化の結果と合致した。1,2の結果から、PPF刺激因子はRacを活性化し、その下流でcofilinのリン酸化をおこすものと考えられた。
酸化還元感受性転写因子の抗酸化性フェノール関連化合物による調節作用を探る

抗酸化性フェノール関連化合物であるユージノール、ビスユージノール、ホーノキオール、マグノロール、p-クレゾール、p-クレゾール二量体、p-ヒドロキシアニソール(pHA)、pHA二量体、トコフェロール誘導体、生体活性物質インドール、メラトニンを使用して培養細胞刺激後の酸化還元感受性転写因子活性化調節作用について検討した。抗酸化作用を持ち,自動酸化しにくい二量体化合物及びメラトニンはNF-κBの活性化とシクロオキシゲナーゼ-2発現を抑制した。この結果は、フェノール二量体化合物およびメラトニンの転写因子調節作用がこれらの抗酸化性に起因することを示し、慢性炎症や発癌性を予防する可能性を示唆した。酸化還元感受性転写因子はラジカルの酸化的攻撃により活性化され炎症やアポトーシス、発癌に関与する。著者らは以前、自動酸化し難い構造の抗酸化性フェノール関連化合物がいわゆるフェノール作用を介して炎症性サイトカイン発現を抑制することを発見した。この結果はラジカル化し難いフェノール関連化合物が酸化還元感受性の多くの転写因子の転写を調節できることを示唆した。今年度の研究では、低細胞傷害性で自動酸化し難い抗酸化性フェノール関連化合物をさらに探査し、それらが生理活性物質発現を抑制できるか調査することであった。Eugenol、bis-eugenol、thymol、indol、melatonin、L-menthol, 1,8-cineol, honokiol、magnololを使用し、マウスマクロファージ細胞株RAW264.7細胞における細胞傷害性をCCK-8 kitを使用して検討したところ、これらの化合物は100&#61549;M以下の濃度で細胞傷害性を示さなかった。一方、LPSや細菌線毛などの細菌構成成分刺激TNF-&#61537;、COX-2の発現はいくつかのフェノール関連化合物によって顕著に抑制された。同様に、これらの化合物のいくつかは酸化還元感受性転写因子のうちNF-&#61547;Bの調節作用を有することが判明した。p-Cresol、DDBP、thymol、DTBP、TTBBD、α-tocopherol、β-tocopherol, δ-tocopherol、γ-tocopherolを使用し、マウスマクロファージ細胞株RAW264.7細胞における細胞傷害性をCCK-8 kitを使用して検討したところ、これらの化合物は100μM以下の濃度で細胞傷害性を示さなかった。一方、LPSや細菌線毛などの細菌構成成分刺激COX-2の発現はいくつかのフェノール関連化合物によって顕著に抑制された。同様に、これらの化合物のいくつかは酸化還元感受性転写因子のうちNF-κBの調節作用を有することが判明した。今年度の研究では、さらに低細胞傷害性で自動酸化し難い抗酸化性フェノール関連化合物を探査し、それらが生理活性物質発現転写因子活性化を調節できるか調査することであった。p-Cresol、p-cresol dimer、p-hydroxyanisole (pHA)、pHA dimer、2-t-butyl-4-hydroxyanisole (BHA)を使用した。マウスマクロファージ細胞株RAW264.7細胞を用いた細胞傷害性試験ではこれらの化合物は100μM以下の濃度で細胞傷害性を示さなかった。LPS刺激COX-2の発現は10μM以下の濃度のdimer compoundsで顕著に抑制された。さらに、これらのdimer compoundsはNF-κBを強力に抑制できることが判明した。医歯薬学平成24年度の予定は伝統的な漢方薬や伝承医薬などに介在している多くのフェノール関連化合物の・細胞傷害性試験および生理活性物質の発現調節作用を検討することであった。現時点では研究実績に示すように概ね当初予定を達成していると考える。しかし、生理活性物質の発現調節作用が十分とは言えず、今後の課題になると考える。昨今は国民の健康志向の高まりの中で、自然食品や天然産物の医薬品への応用が報じられている。

国民医療のさらなる向上に向けて、新しい抗酸化性植物フェノール関連化合物の酸化還元感受性転写因子の調節作用を探査することは興味がある。平成25年度の予定は植物性のフェノール関連化合物や工業製品で使用しているフェノール関連化合物の細胞傷害性試験および生理活性物質の発現調節作用を検討することであった。現時点では研究実績に示すように概ね当初予定を達成していると考える。しかし、生理活性物質の発現調節作用が十分とは言えず、今後の課題になると考える。昨今は国民の健康志向の高まりの中で、自然食品や天然産物の医薬品への応用が報じられている。平成23年度の当初予定は実験材料の準備・細胞傷害性試験および生理活性物質の発現調節作用を検討することであった。より良い国民医療の向上に向けて、さらに新しい抗酸化性植物フェノール関連化合物の酸化還元感受性転写因子の調節作用を探査することは興味がある。平成24年度の研究達成度は概ね達成をしている。一方、伝統的な漢方薬や伝承医薬などの成分中のフェノール関連化合物だけでなく、既存のフェノール関連化合物にも新たなる活性の存在が示唆された。自動酸化しにくい構造のフェノール関連化合物はいわゆるフェノール作用によって抗酸化性と抗炎症性を発揮できることから、多くの天然フェノール関連化合物の医薬品への応用を検討することに興味がある。よって抗腫瘍性・抗炎症性をもつとされる植物性の抗酸化性フェノール化合物の細胞傷害性を引き続き検討し、さらに拡充した生理活性物質の発現の調節作用を検討する。そして表題にあるような酸化還元感受性転写因子の調節作用の検討を始める。より効果的なNSAIDs様作用をもつ抗酸化性フェノール関連化合物を発見しPDTにおける転写調節に応用することが必要と考える。平成25年度の研究達成度は概ね達成をしていると考える。一方、植物性や工業製品成分中のフェノール関連化合物だけでなく、今まで抗酸化性が謳われていたビタミンを構成するフェノール関連化合物にも新たなる活性の存在が示唆された。
LPSシグナルを用いた口腔粘膜疾患モデルの開発

口腔内は多数の細菌が存在しているにもかかわらず、炎症が抑制された状態に維持されている。このバランスが破綻すると、歯周病などの炎症が惹起され、歯肉の腫れや歯槽骨の喪失に至る。抗生剤の投与により炎症も抑制されることから、口内細菌はTLRやNODなどの受容体を介して自然免疫反応をしていると考えられる。本研究は、TLRやNODといった自然免疫受容体を口腔粘膜細胞で過剰発現したり欠損させたりすることで、炎症発生の機序を明らかにすることである。平成22年度は、TLR4遺伝子やNOD2遺伝子のショートヘアピンRNAを設計し、間質系細胞に導入して遺伝子のノックダウンを行なった。リポ多糖(LPS)刺激によるERKのリン酸化や、グラム陰性細菌の夾膜成分によるIkBのリン酸化と分解を、TLR4shRNAやNOD2shRNAによって抑制できる結果がそれぞれ得られた。また、IFNの亢進は、ノックダウンした細胞では認められなかった。昨年度作成した過剰発現株もあわせて、単層培養細胞シートの作成を試みた。いずれの細胞でもマトリックスを分泌してシート状に培養できることを確認した。マウス口腔内への生着については検討中である。本研究によって、マウス口腔内に自然免疫受容体を介するシグナルを制御した細胞を導入するためのツールを作成することが出来た。消化管における炎症疾患であるクローン病におけるLPSシグナルの変異は、リガンド認識領域の欠損や多量体化の欠損によりNF-κBシグナルが活性化しないにもかかわらず、炎症をむしろ惹起することが知れれている。一方、口腔内の粘膜組織は、多くの細菌叢にさらされているにもかかわらず、自然免疫応答は通常サイレントな状態に維持されており、炎症の惹起は抑えられている。また、さまざまな外来性の異物に暴露されるにもかかわらず、その応答は低い。口腔関連組織における自然免疫応答の抑制が、その受容体発現やシグナル分子の有無に依存するのか否か明らかにし、歯周病などにおける炎症・骨破壊のLPS惹起による口腔粘膜疾患モデルの作成を本研究では試みている。平成21年度は、マウス口腔組織の一部として骨髄からのRNAの単離を行い逆転写RTPCR法により、TLR1-9およびNOD1,2の遺伝子発現を検討した。TLR4やNOD1は強く発現していた。マウス口腔内への菌体成分のin vivo投与の解析は行なわなかった。マウスNOD1およびマウスNOD2のcDNAをレトロウイルスベクターにクローニングして過剰発現のシステムを作成した。今年度の結果より、口腔内では自然免疫受容体の発現はしており、そのシグナルの不応答性が示唆された。以上の結果をもとにして、LPSシグナルを用いた口腔粘膜疾患モデルの開発を最終目標として、実験を遂行していきたい。
運動様式・種目の相違が女性の温熱的環境適応能に及ぼす影響

女性の陸上長距離選手は陸上短距離選手や水泳選手(シンクロ選手を含む)よりも優れた発汗機能を有した.この優れた発汗機能は入力系(皮膚温度感受性を指標),中枢系(発汗開始平均体温閾値)ではなく,優れた末梢機構【出力系(軸索反射性発汗を指標)と効果器系(直接刺激性発汗を指標)】に起因した.この女性陸上長距離選手の優れた発汗機能は頭部・下肢後面を除いた躯幹部・上肢・下肢前面で観察された.シンクロ選手が陸上短距離選手より劣った汗腺機能を示したものの,水泳選手と陸上短距離選手は入力系,中枢系,出力系,効果器系でほぼ同等の発汗機能を示した.本研究では,女子のシンクロナイズスイミング選手,陸上長距離選手,陸上短距離選手に対し,28°C,45%RHの人工気象室内で35%・50%・65%VO2max自転車運動をそれぞれ20分ずつ,計60分間負荷した.直腸温と平均体温(Tb)は各群とも運動強度の増大に伴い有意に増加したが,安静時および各運動強度時にも有意な群差は認められなかった.前額・胸・前腕における発汗開始時間およびTb閾値は短距離群vs.長距離群vs.シンクロ群の間に有意な群差はみられなかった.3群とも運動強度の増大に伴い前額・胸・前腕の発汗量(SR)は有意に増加した.いずれの運動強度時も前額のSRは有意な群差が認められなかったが,胸と前腕では長距離群が短距離群およびシンクロ群より有意に高かった.前腕のSRでは,60%VO2max時のみシンクロ群が短距離群よりも低い傾向だった.胸および前腕で測定した活動汗腺数は,全ての運動強度で3群間に有意な差はみられなかった.単一汗腺あたりの汗出力は,胸ではいずれの強度においても長距離群>短距離群=シンクロ群,前腕では45%・60%VO2maxで長距離群が短距離群およびシンクロ群より有意に高く,60%VO2maxでシンクロ群が短距離群より有意に低い値を示した.皮膚血流量の増加率(%CVC)は,3群とも前額・胸・前腕において運動強度の増大に伴い有意に増加した.しかし,全ての部位および運動強度で3群間に有意な差はみられなかった.以上の結果,長距離群は短距離群よりも運動時の熱産生量が多いにもかかわらず,短距離群より優れた熱放散反応により,短距離群と同等の体温上昇に抑えることができた.この優れた熱放散機能は皮膚血管拡張より末梢の汗腺機能で顕著だった.シンクロ群は同等のVO2maxを有する短距離群より劣った発汗機能を有することが窺われた.本研究では,女子の大学陸上競技短距離選手・長距離選手・水泳選手および非運動鍛錬者に対し,(1)皮膚温度感受性テスト,(2)イオントフォレーシス発汗テストを実施し,運動種目・様式の相違が体温調節機序の入力系・出力系・効果器系に及ぼす影響を検討した.(1)皮膚温度感受性テスト(入力系の指標):熱流束温冷覚閾値計を使用し,身体8部位(前額・胸・背・前腕・手背・大腿・下腿・足背)の冷覚閾値と温覚閾値を測定した.冷覚閾値の熱流束差では,手背で非運動鍛錬者が短距離・長距離選手より有意な低値(鋭敏な冷覚を意味する)を示したが,他の身体7部位では4群間で有意な差はみられなかった.温覚閾値の熱流束差では,下腿で長距離選手が非運動鍛錬者・短距離選手より有意な高値(鈍感な温覚を意味する)を示したが,他の身体7部位では有意な群差はみられなかった.(2)イオントフォレーシス発汗テスト:軸索反射性(交感神経節後線維の要素を反映する:出力系)の発汗量は前腕で非運動鍛錬者が他の3群より有意に低く,大腿で長距離選手が他の3群より有意に高かったが,いずれの部位でも3群間では有意差はみられなかった.直接刺激性(汗腺それ自体の要素を反映する:効果器系)の発汗量は前腕・大腿とも非運動鍛錬者<短距離選手=水泳選手<長距離選手の関係がみられた.これらの発汗量の群差は,活動汗腺数ではなく,単一汗腺あたりの汗出力の相違に起因した.以上の結果,女子において皮膚の温度感受性からみた入力系は運動種目・様式のみならず,運動トレーニングそれ自体によっても修飾されなかったが,軸索反射性発汗からみた出力系および直接刺激性発汗からみた効果器系には運動トレーニングそれ自体の効果とともに,運動種目・様式の相違が示唆された.効果器系の運動種目・様式差はコリン感受性and/or汗腺サイズに起因することが示唆された.平成27年度は研究実施計画通り,女性の陸上長距離選手,陸上短距離選手,水泳選手,非運動鍛錬者の皮膚の温度感受性とアセチルコリン誘発性発汗を比較し,運動トレーニングの効果のみならず,陸上運動種目の相違(長距離選手vs.短距離選手)および運動様式の相違(水中運動vs.短距離選手)に伴う入力系,出力系,効果器系への影響を検討できた.本研究では,運動時の身体17部位の発汗量(SR)を女子陸上選手(長距離群・短距離群)と女子水泳選手(水泳群)で比較し,運動種目・様式の相違が運動時の発汗反応に及ぼす影響を検討した.各被験者は,28°C・50%RHに

設定された環境制御室内で心拍数(HR)130135拍/分に相当するトレッドミル走を30分間実施した.テスト中,直腸温(Tre),胸・上腕・大腿の皮膚温,SR,総発汗量を測定した.局所発汗量は,吸収シートを身体17部位に貼付し,運動前後のシート重量差から求めた.VO2maxは,長距離群が短距離群・水泳群より有意に高かったが,短距離群と水泳群には有意な差はみられなかった.発汗テスト時の走行速度は,長距離群が水泳群と短距離群より有意に速かったが,水泳群と短距離群はほぼ同一だった.HRは,運動開始5分目(130135拍/分)には3群間で有意差は認められなかったが,その後長距離群が短距離群や水泳群より有意な低値を示した.テスト中におけるTre(運動終了時:38.0 °C程度)・平均体温(Tb)および発汗開始Tre・Tb閾値には3群間に有意な差はみられなかった.身体17部位で測定したSRでは,長距離群が胸中央・胸左・腹中央・腹右・脇腹・背右・腰中央・腰右・上腕・下腿前で短距離群と水泳群より,背中央・前腕・大腿前・下腿前で短距離群より,大腿前で水泳群よりも有意に多いもしくはその傾向を示した.しかし,SRは水泳群と短距離群の全17部位で,水泳・短距離・長距離群の前額・右頬・大腿後・下腿後でぼぼ同等だった.以上の結果,女子陸上長距離選手は短距離選手や水泳選手より優れた発汗能力(特に末梢機構)を有するものの,水泳選手は有酸素能力に相違がない陸上短距離選手とほぼ同等の発汗中枢機構および末梢機構を有することが示唆された.女性の陸上長距離選手は陸上短距離選手や水泳選手(シンクロ選手を含む)よりも優れた発汗機能を有した.この優れた発汗機能は入力系(皮膚温度感受性を指標),中枢系(発汗開始平均体温閾値)ではなく,優れた末梢機構【出力系(軸索反射性発汗を指標)と効果器系(直接刺激性発汗を指標)】に起因した.この女性陸上長距離選手の優れた発汗機能は頭部・下肢後面を除いた躯幹部・上肢・下肢前面で観察された.シンクロ選手が陸上短距離選手より劣った汗腺機能を示したものの,水泳選手と陸上短距離選手は入力系,中枢系,出力系,効果器系でほぼ同等の発汗機能を示した.平成26年度は研究実施計画通り,女性の陸上長距離選手,陸上短距離選手,水中運動選手における低・中・高強度運動時の発汗・皮膚血管拡張反応を比較し,陸上運動種目の相違(長距離選手vs.短距離選手)および運動様式の相違(水中運動vs.短距離選手)が熱放散反応に及ぼす影響の解明に努めた.平成27年度の研究で見出した,発汗反応における効果器系で観察された運動種目・様式差を身体部位差の観点から詳細に検討する.すなわち,女性の陸上競技中長距離選手・短距離選手,水泳短距離選手に対し,同一の心拍数になるトレッドミル走行運動を負荷し,その間身体多部位【前額,頬(右),胸部(左と中央),腹部(右と中央),背(右と中央),腰部(右と中央),脇腹部(右),上腕部(右),前腕部(右),大腿部(右の前面と後面),下腿(右の前面と後面)】の局所発汗量をシート法で測定し,身体部位差の観点から女性の運動種目・様式の相違が女性の発汗反応に及ぼす影響を検討する.さらに実験中,深部体温とともに背部発汗量(カプセル換気法)を連続的に測定して発汗開始時深部体温を求め,運動種目・様式の相違が体温調節機序の中枢系に及ぼす影響を検討する.中枢系の結果と27年度実施した運動種目・様式の相違に伴う入力系,出力系,効果器系の結果と考え合わせて,運動様式・種目の相違が温熱的環境適応能に及ぼす影響機序を全身協関的視点から検討する.スポーツ科学平成26年度の研究で見出した,熱放散反応における運動様式・種目差のメカニズムを全身協関的視点で求心性(入力系),出力系,効果器系から検討する.すなわち,女性の水中運動実施者,陸上競技の中長距離選手,短距離選手,一般人に対し,(1)皮膚の温覚・冷覚閾値テスト,(2)イオントフォレーシステストを実施する.
悪性神経膠腫に対するヒト抗TRAIL受容体抗体による新規治療法の開発

ヒトglioma細胞株を使用し,完全ヒト抗ヒトTRAIL受容体モノクローナル抗体による治療効果を検討した.ヒトglioma細胞では,TRAIL受容体のDR5に対するモノクローナル抗体(E11, H48, KMTR2)のみで殺腫瘍細胞効果が認められた.抗DR5抗体治療によりglioma細胞はTUNEL陽性となり,caspaseの切断・活性化が認められ,同時にBidの切断・caspase9の活性化も誘導された.12種類のヒトglioma細胞株に対する抗DR5抗体治療の感受性は,DR5の細胞膜上発現量と相関する傾向が認められ,細胞内細胞死抑制因子のc-FLIP_LやAkt,細胞周期関連蛋白のCyclin D1発現量とは有意に相関した.c-FLIP_Lの発現量を特異的siRNAを用いてdownregulationすると,抗DR5抗体治療の感受性が増強した.また,c-FLIP_Lの発現が陰性で,抗DR5抗体に強感受性を示すT98G細胞にc-FLIP_Lを強制発現すると,抗DR5抗体に耐性となった.Nude miceの皮下にヒトglioma細胞を移植した皮下腫瘍モデルでは,抗DR5抗体の腹腔内投与により有意に腫瘍増大が抑制された.また,ヒトglioma細胞をnude miceの脳内に移植した脳腫瘍モデルでは,抗DR5抗体腹腔内投与により有意に生存期間の延長が観察された.以上より,ヒトグリオーマでは,TRAILの細胞死シグナルを伝達する主たる細胞膜受容体はDR5であり,その感受性は,DR5の細胞膜発現と細胞内因子発現が規定因子として抽出された.予後がきわめて不良な悪性gliomaに対する新規治療法としての可能性が示唆された.ヒトglioma細胞株を使用し,完全ヒト抗ヒトTRAIL受容体モノクローナル抗体による治療効果を検討した.ヒトglioma細胞では,TRAIL受容体のDR5に対するモノクローナル抗体(E11, H48, KMTR2)のみで殺腫瘍細胞効果が認められた.抗DR5抗体治療によりglioma細胞はTUNEL陽性となり,caspaseの切断・活性化が認められ,同時にBidの切断・caspase9の活性化も誘導された.12種類のヒトglioma細胞株に対する抗DR5抗体治療の感受性は,DR5の細胞膜上発現量と相関する傾向が認められ,細胞内細胞死抑制因子のc-FLIP_LやAkt,細胞周期関連蛋白のCyclin D1発現量とは有意に相関した.c-FLIP_Lの発現量を特異的siRNAを用いてdownregulationすると,抗DR5抗体治療の感受性が増強した.また,c-FLIP_Lの発現が陰性で,抗DR5抗体に強感受性を示すT98G細胞にc-FLIP_Lを強制発現すると,抗DR5抗体に耐性となった.Nude miceの皮下にヒトglioma細胞を移植した皮下腫瘍モデルでは,抗DR5抗体の腹腔内投与により有意に腫瘍増大が抑制された.また,ヒトglioma細胞をnude miceの脳内に移植した脳腫瘍モデルでは,抗DR5抗体腹腔内投与により有意に生存期間の延長が観察された.以上より,ヒトグリオーマでは,TRAILの細胞死シグナルを伝達する主たる細胞膜受容体はDR5であり,その感受性は,DR5の細胞膜発現と細胞内因子発現が規定因子として抽出された.予後がきわめて不良な悪性gliomaに対する新規治療法としての可能性が示唆された.ヒトglioma細胞株を使用し,完全ヒト抗ヒトTRAIL受容体モノクローナル抗体による治療効果を検討した.TRAIL受容体のうち,death signalを伝達するDR4及びDR5に対する各モノクローナル抗体(B12-抗DR4,E11とH48-抗DR5抗体)にてヒトglioma細胞株T98G,LNZ308を治療すると,E11及びH48で濃度依存性に細胞死が誘導された.一方,B11は全く治療効果がみられなかった.Soluble TRAIL(sTRAIL)に対する耐性を獲得したT98G.TR及びLNZ308.TRはともにE11,H48に対する感受性が低下していた.E11,H48治療は,sTRAILと同様にこれらの細胞株でcaspaseの切断・活性化が認められ,同時にBidの切断・caspase9の活性化も誘導された.12種類のヒトglioma細胞株に対する感受性を検討すると,E11,H48は過半数の細胞株で効果的に細胞増殖抑制効果が認められ,sTRAILに対する感受性と非常に強い相関性を認めた.一方で,全ての細胞株はB12に耐性を示した.これらの細胞株のwhole cell lysatesを用いてWestern blot法による各種細胞死関連蛋白・腫瘍関連蛋白の発現を定量解析し,E11,H48への感受性との関連を検討した.TRAIL受容体(DR4,DR5を含む)の発現量や各caspases,FADDの発現量は,感受性との相関が認められなかった.しかし,flowcytometryによる細胞膜表面のDR5発現量を解析すると,E11及びH48への感受性と相関関係の傾向が認められ,細胞全体の発現量と膜表面の発現量の間に相違がみられた.現在,nude mouseを用いた担腫瘍マウスモデルにて,本モノクローナル抗体の治療効果を評価する実験を施行中である.ヒトglioma細胞株を使用し,完全ヒト抗ヒトTRAIL受容体モノクローナル抗体による治療効果を検討した.ヒトglioma細胞では,TRAIL受容体のDR5に対するモノクローナル抗体(E11,H48,KMTR2)のみで殺腫瘍細胞効果が認められた.抗DR5抗体治療によりglioma細胞はTUNEL陽性となり,apoptosisが誘導された.

12種類のヒトglioma細胞株に対する抗DR5抗体治療の感受性を,これらの細胞株における各種細胞死関連蛋白・腫瘍関連蛋白の発現量(Western blot解析で定量化)と比較検討したところ,DR5の細胞膜上発現量と弱い相関関係が認められた.更に,細胞内細胞死抑制因子であるAktなどや細胞周期関連蛋白のCyclin D1発現量と有意に相関関係が認められた.ある細胞死抑制因子の発現量を特異的siRNAを用いてdownregulationすると,抗DR5抗体治療の感受性が増強した.また,その因子の発現がほとんど認められず,抗DR5抗体に強感受性を示す細胞株にその蛋白を強制発現すると,抗DR5抗体に抵抗性となることが明らかになった.Nude miceの皮下にヒトglioma細胞を移植した皮下腫瘍モデルでは,抗DR5抗体の腹腔内投与により有意に腫瘍増大が抑制された.また,ヒトglioma細胞をnude miceの脳内に移植した脳腫瘍モデルでは,抗DR5抗体腹腔内投与により有意に生存期間の延長が観察された.以上より,ヒトグリオーマでは,TRAILの細胞死シグナルを伝達する主たる細胞膜受容体はDR5であり,その感受性は,DR5の細胞膜発現と細胞内因子発現が規定因子として抽出された.予後がきわめて不良な悪性gliomaに対する新規治療法としての可能性が示唆された.
偏光赤外分光法を用いたロドプシンの構造変化過程の原子レベルでの解析

ロドプシンは光受容後の構造変化により、情報伝達タンパク質との相互作用を変化させ、細胞内に光情報を伝達する。このようなタンパク質間の相互作用機構を明らかにすることを目的に、フォボロドプシンppRと情報伝達タンパク質pHtrIIとの相互作用を赤外分光法で解析した。その結果、pHtrIIとの結合が100倍程度弱くなるM中間体において、pHtrIIのAsn74側鎖のC=O伸縮振動が1693cm^<-1>から1684cm^<-1>へと低波数シフトすることが明らかになった。前年度の結果と併せて考察すると、K中間体の形成に伴って生じたタンパク質骨格の摂動およびThr204の水素結合強度の変化はM中間体の形成に伴って消失し、ppR-pHtrII間の相互作用変化はAsn74の水素結合強度を強くすると考えられる。M中間体形成時にpHtrIIとの結合が弱くなるという事実との整合性を考えると、Asn74の水素結合の相手はppRのTyr199から、Asn74の近傍に存在するpHtrIIのThr33などにスイッチする可能性が示唆される。もしくは、Asn74とTyr199の水素結合がM中間体でも維持され、その強度が強くなっているのであれば、他の部位、例えばppRのThr189とpHtrIIのSer62およびGlu43の水素結合もしくはppRとpHtrII間の疎水的な相互作用が弱まることが示唆される。また、pHtrIIに由来するタンパク質骨格の構造変化が認められなかったことから、ppR-pHtrII間の情報伝達機構は膜貫通ヘリックスの剛体的な運動を介していることが示唆された。ロドプシンは、視覚ではたらく光受容タンパク質であり、レチナールの光異性化反応によりタンパク質の構造を活性化状態に変化させ、Gタンパク質の一種であるトランスデューシンを活性化する。その過程において構造の異なる中間体(バソ、ルミ、メタI、メタII)を順次形成するが、活性化状態であるメタIIにおいてヘリックスの再配列を伴う大きな構造変化が生じる。本研究では、タンパク質の局所的な構造の違いに敏感な赤外分光法を用いることにより、活性化過程で生じるタンパク質の大域的な構造変化を明らかにしようと試みた。その結果、構造変化が制限されている77Kでの光反応により、ルミがロドプシンに戻し得る一方、メタIでは戻せずに構造の異なる光産物を生成することを明らかにした。このことはルミからメタIの過程において初めて、タンパク質の大きな構造変化が生じることを意味している。また、ロドプシンの内部結合水のO-D伸縮振動を解析したところ、全ての中間体において水素結合の強い水分子の変化は認められなかつた。このことから、レチナールシッフ塩基の脱プロトン化を伴うメタIIの形成において水分子は積極的な役割を果たしていないことが示唆され、光駆動プロトンポンプであるバクテリオロドプシンとは異なるプロトン移動機構が存在することが示唆された。また、タンパク質間の相互作用機構を明らかにすることを目的に、フォボロドプシンppRと情報伝達タンパク質pHtrIIとの相互作用を赤外分光法で解析した。その結果、ppRはpHtrIIと複合体を形成することにより、初期中問体において水素結合強度を変化させるX-H基が存在することが見いだされ、最近の研究により、それが204番目のThrのO-H基に由来することを明らかにした。このことは、情報伝達タンパク質との相互作用により、光受容タンパク質だけでは生じない構造変化がもたらされることを示唆している。
DNA損傷の認識と修復の分子機構

本研究においては、研究代表者らが分離したXPC/HHR23B複合体の機能を中心に、哺乳類細胞のヌクレオチド除去修復(NER)における損傷の認識機構とそれに続く修復反応について詳細な解析を行い、以下にまとめるような知見を得た。1)マウスにも、ヒトと非常によく似たXPC/HHR23B複合体およびHHR23BのホモログであるHHR23Aに相当する蛋白質が存在する。3) HHR23Bは無細胞NER系において、XPC蛋白質のNER活性を促進する。4) HHR23A蛋白質は、HIV1のVpr蛋白質と複合体を形成し、細胞周期の進行に影響を与えている。5) HHR23B蛋白質のごく一部がXPC蛋白質との結合に必要で、その結合だけでXPCのNER促進活性に充分である。7) XPC/HHR23B複合体は、NERの二つの経路のうち、ゲノム全体の修復に与るglobal genome repair(GGR)の最初のステップ、すなわちDNA損傷の認識に働いている。8)酵母の2ハイブリッドシステムを用い、HHR23B蛋白質と相互作用する因子として見出された26Sプロテアソームの構成因子の一つであるS5a蛋白質は、細胞粗抽出液中でも相互作用している。研究代表者および研究分担者は、哺乳類細胞のヌクレオチド除去修復(NER)の分子機構解明を目指して、以下に述べる研究を行った。1)色素性乾皮症(XP)C群蛋白質の機能解析XPC蛋白質複合体のNERにおける役割を明らかにするために、その構成成分の一つであるHHR23B蛋白質の様々な欠損変異体を作成し、XPC蛋白質との結合部位が分子のC末端側に近い約55アミノ酸の領域にあること、そして同じ領域がXPC蛋白質のNER活性の促進にも必須であることを明らかにした。2)転写と修復のカップリングの解析と修復蛋白質複合体の分離NERに必要な蛋白質因子(XPB、XPDなど)を含む基本転写因子TFIIHを精製し、これが他のNER蛋白質(XPGおよびXPC)と相互作用していることを見い出した。3)C群以外のXP蛋白質の精製と新たな修復因子の同定昆虫細胞の多量発現系を用い、XPG蛋白質を単一なまでに精製し、構造特異的なエンドヌクレアーゼ活性も検出した。4)ヌクレオチド除去修復を制御する機構の解析やはり昆虫細胞の多量発現系を用いて精製したp53蛋白質の無細胞NER系に対する影響を調べたところ、p53蛋白質の量に依存した促進が見られた。無細胞NER系を損傷部位の切断までと、それ以降のDNA合成反応の2段階に分けて調べたところ、p53蛋白質は、後者の段階を促進していることが判明した。研究代表者および研究分担者は、哺乳類細胞のヌクレオチド除去修復(NER)の分子機構解明を目指して,以下に述べる研究を行った。1)色素性乾皮症(XP)C群蛋白質の機能解析XPC蛋白質複合体のNERにおける役割を明かにするために、その構成成分の一つであるHHR23B蛋白質とその類縁蛋白質であるHHR23A蛋白質のXPC蛋白質との関係を調べた。その結果、HHR23A蛋白質もHHR23B蛋白質と同様に、XPC蛋白質と複合体を形成し、NERにおいて機能することを見出した。また精製蛋白質を用いた再構成NER系においても、HHR23B蛋白質およびHHR23A蛋白質がXPC蛋白質のNER活性を促進することを示した。2)転写と修復のカップリングの解析NERに必要な蛋白質因子(XPB、XPDなど)を含む基本転写因子TFIIHのコンポーネントの中で、p62及びXPBが他のNER蛋白質(XPGおよびXPC)と直接相互作用していることを明らかにした。3)新たな修復因子の同定酵母の2ハイブリッドシステムを用い、HHR23B蛋白質と相互作用する因子を検索した。その結果、26Sプロテアソームの構成因子の一つであるs5a蛋白質が相互作用する因子として見出された。これら2つの蛋白質は、細胞抽出液中でも相互作用していた。

4)C群以外のXP蛋白質の精製と新たな修復因子の同定XPF蛋白質とERCCI蛋白質とを昆虫細胞の系で共発現させ、活性のある形で精製することに成功した。研究代表者および研究分担者は、哺乳類細胞のヌクレオチド除去修復(NER)の分子機構解明を目指して、以下に述べる研究を行った。1)色素性乾皮症(XP)C群蛋白質の機能解析XPC蛋白質複合体のNERにおける機能として重要と考えられる損傷DNA結合能を調べるため、大きさの異なる2つの損傷DNAを用いた競合実験系を確立した。その結果、XPC蛋白質複合体は他のNER蛋白質に先だって損傷DNAに結合することが明らかとなった。またDNase Iフットプリント法を用いて、XPC蛋白質複合体が損傷をはさんで約35塩基対の領域をカバーすることを見出した。2)転写と修復のカップリングの解析Solubleな系での転写と修復のカップリングが困難なことから、核マトリクスなどの細胞構造体を有した分離核系の構築を試みた。この系で紫外線照射後のRNA合成を観察したところ、RNAポリメラーゼIIによる転写がコケイン症候群のB群細胞でHeLa細胞やXP-C群細胞に比べて顕著に低下しており、in vivoを反映した系が出来たと考えられた。3)新たな修復因子の同定HHR23B蛋白質と26Sプロテアソームの構成因子の一つであるs5a蛋白質との相互作用の解析を進め、HHR23B蛋白質がプロテアソームの活性を抑制することを見出した。4) C群以外のXP蛋白質の精製と新たな修復因子の同定XPE蛋白質と考えられるp125及びp48蛋白質を昆虫細胞の系で共発現させ、損傷DNA結合活性のある形で精製することに成功した。
ＭＡＰ推定ノイズ除去と単一話者区間推定に基づくブラインド音源分離に関する研究

本研究では,2つのマイクロホンを用いて,複数の音源を分離する方法について検討した.実環境においては,環境ノイズと残響が分離性能を劣化させる要因となるため,音源分離の他に,これらを取り除く技術が必須となる.そこで提案法では,単一話者区間(いずれか一人のだけが発話している区間)を検出し,この区間を利用して各発話者の位置を特定し,音源分離を実行する.また,MAP(maximum a posteriori)推定ノイズ除去が音源分離の後処理として有用なことを示す.本手法が残響およびノイズに対して頑健であることを実環境における音源分離実験により示した.25年度は,MAP推定ノイズ除去法と,直交軸射影をDUETに組み込み,システム全体を構築した.ノイズが定常的に存在する環境では,DUETで必要となるW-DO仮定が成立しないため,音源分離性能が著しく劣化する.本システムではこの問題を,MAP推定ノイズ除去を音源分離の前段に導入することで解決する.これは, MAP推定ノイズ除去によりW-DOが満たされ,DUETが効果的に実行されることを期待するものである.データベースの音声にノイズを付加した信号に対し,構築したシステムでノイズ除去および音源分離を実行した.評価結果から,予想に反して分離性能が改善しないことがわかった.原因を調査したところ,ノイズ除去後の信号から音源方向を特定できておらず,音源分離に失敗していた.MAP推定によるノイズ除去は,振幅スペクトルの劣化を改善できるものの,位相スペクトルの劣化は改善できない.これが原因となり,音源方向が特定できなかったと考えられる.よって,ノイズ除去後の音声を使用して音源分離を実行することは得策でない.そこで,観測信号にノイズ除去を行わず,音声が優勢となるスペクトルだけを用いて音源方向を特定した.そして,ノイズが含まれたままの観測信号に対し音源分離を実行する.分離した音声にはノイズが含まれているので,これに対してMAP推定によるノイズ除去法を適用する.結果として,音源分離を実行した後にノイズ除去を行った方が,高い分離性能が得られることがわかった.ただし,今回の評価は客観評価のみで実行した.今後は人間の感覚に近いとされる数値評価法のひとつである,PESQを用いて分離結果の評価を行う.また,最終的な音声にミュージカルノイズと呼ばれる耳ざわりな信号が生じていたため,これに対する除去方式の検討も合わせて行う必要がある.本研究では,2つのマイクロホンを用いて,複数の音源を分離する方法について検討した.実環境においては,環境ノイズと残響が分離性能を劣化させる要因となるため,音源分離の他に,これらを取り除く技術が必須となる.そこで提案法では,単一話者区間(いずれか一人のだけが発話している区間)を検出し,この区間を利用して各発話者の位置を特定し,音源分離を実行する.また,MAP(maximum a posteriori)推定ノイズ除去が音源分離の後処理として有用なことを示す.本手法が残響およびノイズに対して頑健であることを実環境における音源分離実験により示した.24年度は,単一話者区間に基づく直交軸射影法の確立と,直交軸射影法とICAとの関係を明確にすることの2つを目標とした.まず,直交軸射影法を,瞬時混合と時間遅延を含む混合のそれぞれに対して導出した.直交軸は,音源がひとつで,残りの音源が休止している単一話者区間において得られる.この区間内では,2つのマイクロホンで得られる観測信号は,定数倍を除いて同一波形となる.よって,両者の比は混合行列のいずれかの列ベクトル,すなわち音源の到来方向を表わすベクトルを与える.これと直交するベクトルが直交軸である.ここで,音源がひとつだけとなる,単一話者区間の検出が重要となる.今回は,2つの観測信号の比が定数となる区間として推定した.しかしながら,実際にはマイクロホンノイズ等の影響で観測信号の比にゆらぎが生じる.そこで,あるしきい値により,比のゆらぎを吸収する方法を検討した.結果から,ゆらぎの吸収性能と,音源分離性能にトレードオフの関係があることがわかった.今回は実験的にしきい値を決定したが,将来的には適応設定する必要がある.次に,上述の「直交軸」と,ICAで得られる「基底軸」の関係を明らかにした.両者は,いずれも同一の単位ベクトルを定数倍したものとして表現できる.ICAでは,基底軸に信号を射影することで,音源分離を実現する.我々の直交軸射影も全く同じ原理で音源分離を実行する.異なる点は,ICAが独立性を評価して軸を探索することに対し,直交軸射影では音源がひとつとなる区間から軸を探索する点である.我々の方法は必ずしも独立性を必要としないという点において,ICAよりも汎用性が高いといえる.その他,関連会議への参加により,最新の2マイクロホン音源分離法について他の研究者と積極的な意見交換を行った.その結果,NMFと呼ばれる技術が,本音源分離へ応用できる可能性を見出した.ぜひ今後の検討に加えたい.本研究では,MAP推定ノイズ除去と単一話者区間推定に基づくブラインド音源分離に関する研究を実施した.提案法は,2チャンネルの観測信号から,複数の音源を分離し,さらにノイズ除去を実現するものである.25年度までの成果により,単一話者区間に基づく音源分離を実施した後に,MAP推定ノイズ除去を適用することが望ましいことがわかった.すなわち,提案法は,部屋の残響や環境ノイズを含む観測信号に対して,音源分離性能を保持しなければならない.そこで最終年度では,実環境での提案法の利用を重視し,残響および環境ノイズに対応できる,音源分離技術の開発を主体とした.25年度までの方法では,部屋の残響が十分小さいことを想定したシミュレーションにおいて,単一話者区間に基づく音源分離法が有効であることを確認していた.