hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
反芻家畜排泄物から環境へのリン負荷軽減に関する研究

また、従来飼料中フィチン酸分析に用いられていた方法と、本研究で開発したHPLCポストカラム法を比較検討したところ、ほぼ同一であることが示された。さらに本試験の結果から、飼料中に大豆粕を10%添加すると、大豆粕中のフィチン態リンの約10%は反芻胃内で分解を受けずにフィチン酸またはイノシトール35リン酸として十二指腸に到達することが示された。現在は、無処理または熱処理を行ったナタネ粕をメンヨウの飼育中に添加し、熱処理がナタネ粕中フィチン酸の十二指腸流入に及ぼす影響を検討中である。第一試験として加熱処理をしたナタネ粕中フィチン態リンの分解に加熱処理が及ぼす影響を十二指腸カニューラを装着した雌メンヨウ4頭を用いて検討した。メンヨウに無処理または加熱処理をしたナタネ粕を10%含む飼料を給与し、十二指腸内容物を採取した。十二指腸におけるフィチン態リン流量は無処理区と比べて133°C処理、143°C処理区において各々1.65倍、2.42倍増加した。また一日当たりの流量は無処理、133°C処理、143°C処理区においてそれぞれ飼料中フィチン態リンの約21%、35%、55%に相当した。無処理および133°C処理区では飼料給与3時間後のフィチン態リンの流量は一時的に増加してその後減少したが、143°C度処理区は常に高い濃度を維持した。これらの結果から、ナタネ粕中のフィチン酸の一部は分解されずに十二指腸に到達すること、加熱処理はその量を増加することが明らかとなり、加熱処理はナタネ粕中リンの利用性を低下させることが示された。第二試験では乳牛のリン源として乳清の利用を試みた。9頭のホルスタイン種泌乳牛を乳期ならびに乳量が同程度となるように一群4頭または5頭の2群に分け、各期2週間からなる反復試験に割り当てた。乳清区には乾燥乳清を飼料の20%添加し、無機リンの補給は行わなかった。対照区の飼料にはリン含量を一定とするためにリン源としてリン酸カルシウムを添加した。乳量や血清中無機リン濃度は両区の間に有意な差は認められなかった。以上の結果から、乳清はリン源としてリン酸カルシウムと同程度の利用性を有することが示唆された。
生体の警告信号防御系の働きとその物質的基盤

侵害的環境に対する生体の反応を、従来の痛覚系の概念を越えて生体の警告信号・防御系として、全一体としての生体機能調節の視点からその物質的基盤も含めての見直しをはかった。2回の班会議と公開シンポジウム"痛覚系と生体防御系"を開いた。痛覚系の働きは脳内の内因性鎮痛系からの抑制を受けており、逆に痛覚系は鎮痛系を駆動する入力である事が明らかになりつつあり、両者を有機的に結合した研究の必要性が示された。また、痛覚系一次ニューロンにはサブスタンスP等の神経ペプチドが含まれており、内因性鎮痛系ではオピオイドペプチドが重要な働きをしている。これらペプチドの作用、代謝、受容体の研究が、痛覚系ー鎮痛系の相互関連を解明する際の鍵をにぎるものであろうと考えられた。また、痛覚系と生体機能の関わりは、自律系、情動系からさらに極最近、炎症、免疫反応にまで及ぶ非常に広汎なものであることを示唆する実験事実が蓄積しつつあることが明らかになった。痛みによる生体反応は生体防御という面をもつ一方、通常の機能からの歪みとなって、さらに痛みを起こす事もあるように二面的である。そこで、痛覚系と各種生体反応との相互関連の研究も、痛覚系から自律系、情動系、免疫系等の反応系へと、またその逆と、両方向性に進められるべきであるとの結論に達した。今後この領域の発展の為には、従来の縦割りの学問体系に囚われず、神経科学の各種追及方法を有機的に包含した研究体制を樹立することが必要であるとの認識に達し、重点領域研究に申請する為、研究方法、研究体制の具体化についての計画の検討をおこなった。
新規アシルシラン類の合成化学的利用と物性・機能の解明

アシルポリシラン類の合成化学的有用性を明らかにする目的で、3種類の新規なアシルポリシラン誘導体を合成し、その熱異性化反応を検討した。その結果、これらがこれまで例の少ない直鎖共役型シレンなどの良好な前駆体になりうることを見出した。以下に、具体的な研究成果を述べる。その他に、アシルポリシランから調製したシラエノラートアニオンとベンゾフェノンとの反応からジオキサシラシクロペンタン誘導体の合成に成功した。これらの結果は、アシルポリシランおよびシラエノラートアニオンが新規のケイ素活性化学種や環状ケイ素化合物の合成に有用な試剤であることを示している。1)シラエノラートアニオンとフェニル基置換アセチレンの反応から初めてのα-官能基置換アシルポリシランであるアシル-(Z)-エテニルシランの合成に成功した。得られた化合物に100°C以上の熱をかけるとシリル転位を伴う異性化によって2-シラジエンが生成することを確認した。2-シラジエンを比較的低温で発生させた初めての例である。2)ビス(アシル)ジシランの合成法を確立し、その熱異性化によって、1,2-ジシラジエン誘導体が容易に生成することを明らかにした。生成した1,2-ジシラジエン中間体はさらに異性化して、通常の方法では合成が困難なジシラシクロブテンへと導かれた。3)シクロアルカン骨格で架橋したアシルポリシランの熱異性化から大環状ケイ素化合物の合成に成功した。これはシレン経由のオキサコープ転位の初めての例である。リチウムシレノラートとアシルシランを出発原料として、シレンなどのケイ素不飽和化学種の生成と反応挙動に関して検討をおこなった。1リチウムエノラートケイ素等価体のリチウムシレノラートとアセチレン類およびベンゾフェノンとの反応を検討した。その結果、フェニル置換アセチレンとの反応からは、付加に引き続いてシリル基の特異的な転位が進行し、新たにエテニル基がα-ケイ素に置換したエテニルシレノラートが生成することを見い出した。さらに、生成したエテニルシレノラートをハロゲン化アルキルで処埋すると、エテニルアシルシランに、クロロシランで処理すると2-シラジエン誘導体に変換できることを見い出した。これまであまり報告例のない直鎖ジエン型のケイ素等価体を簡便に合成できる手法として興味深い。生成した2ムシラジエンとメタノールとの反応も検討した。一方、リチウムシレノラートとベンゾフェノンとの反応は、幾分複雑になったが、2,5-ジオキサ-1-シラシクロペンテンを与えることを見い出した。オキサジシラシクロペンテンの結晶構造をX線回折で解明した。2 1,2-ビス(トリス(トリメチルシリル)シリルカルボニル)アルカン類の合成に初めて成功し、その熱および光異性化反応を検討したところ、エテンのケイ素等価体であるシレンがまず生成し、さらにC-C結合解裂を含む骨格転位を起こすことを見い出した。シレンのCope型反応の初めての例である。さらに反応の機構を立体選択性の面から詳細に検討し、分子軌道計算の結果と合わせて、本反応が協奏的機構で進行することを解明した。3ビス、テトラアシルシランの合成をスケールアップして行った。今後物性を詳しく検討する。以上の結果は、ケイ素不飽和化学種の基礎的な件質に関して重要な知見を与えるものと考えられる。新規なアシルジシラン誘導体2種の合成化学的有用性を明らかにするために、熱異性化反応を検討した。その結果、これらがこれまで例の少ない直鎖共役型シレンの良好な前駆体になりうることを見出した。

なお当初の研究計画に従って、材料化を目的としたテトラアシルシランの物性検討も並行して行なったが、薄膜化が困難であり、これに関してはさらなる検討が必要である。1)アシル-(Z)-エテニルシランに100°C以上の熱をかけるとシリル転位を伴う異性化によって2-シラジエンが生成することを確認した。2-シラジエンを比較的低温で発生させた初めての例である。シラジエンの生成は、メタノールによる捕捉実験によって明らかになった。メタノールの不在下では、生成する2-シラジエンは、分子内環化を経由する異性化を起こし、定量的にアシル-(E)-エテニルシランを与えた。さらに、反応の経路を確認する目的で、速度論的解析と中間体モデルの分子軌道計算を行なった。その結果、反応は単分子反応で、異性化のドライビングフォースは、オレフィン上の置換基間の立体反発の解消であることが示唆された。2)ビス(アシル)ジシランの熱異性化によって、1,2-ジシラジエン誘導体が生成することを明らかにした。生成した1,2-ジシラジエン中間体はさらに異性化して、ジシラシクロブテンへと導かれた。生成経路は、段階的なシレン生成によることがメタノールによる捕捉実験によって明らかになった。
マウス胚発生過程で特異的に働く遺伝子群の解析

本研究は大規模なcDNA塩基配列解析システムを用いて、マウス胚発生過程の各ステージ、種々の部位において発現する遺伝子をその発現量の情報とともに記載し、さらに新規の遺伝子を探索することを目的としている。方法は(1)mRNAの3′末端のみを持つcDNAライブラリの作成、(2)PCRをベースにした大量シーケンス、(3)ワークステーションに構築されたプライベートデータベースとホモロジー検索プログラムによる遺伝子配列データの解析というシステムにより、各ライブラリより無作為に約1000クローンをシーケンスし、ライブラリ毎に遺伝子の発現頻度を千分率にして表し、ある遺伝子の発現場所と時期、強さを記載したデータベースを構築した。我々はこれを遺伝子の発現地図と呼び本年度は昨年度に続いて、解析ステージ、組織をさらに横に広げ、特に中枢神経でのgeneexpression profileを中心に解析を進めた。これまでに解析したライブラリは昨年度より9ライブラリ(解析クローン数にして約1万)増加し、8細胞期胚、8.5日胚、8.5日胚心臓、7.5日胚神経外胚葉、13.5日胚神経幹細胞を豊富に含む大脳皮質の一部、17.5日胚脳、成体脳、新生児海馬、妊娠6.5日から8.5日までの子宮脱落膜、肝臓、腎臓、繊維芽細胞由来培養細胞が現在解析を終了している。前述の様に各ライブラリ約1000クローンを解析し、全体では解析クローン数、約18.000クローン、遺伝子種は約7500種類となった。3′特異的ライブラリの作成効率は10^6クローン/total RNA 1μgと非常に良く、これが8.5日胚心臓原器や、脳の一部分のライブラリ作製などにつながった。遺伝子の発現地図はノザンブロッティングを数千回くりかえしたのと同等の情報を持っている。今後もさらにライブラリ数を増やし、遺伝子発現の公開データベースとして活用していく予定である。
複合機能性スピンクロスオーバー錯体における光誘起物性変換

鉄(II)スピンクロスオーバー(SC)錯体は、低スピン(LS)・高スピン(HS)状態を熱、光、圧力等の外場により可逆に変換可能なことから、分子スイッチとしての応用が期待される物質系である。しかしながら、SC錯体と他の物性を共存させることによる、複合系に関する研究例は未だに多くない。本研究では、分子性導体にSC錯体を導入することで伝導性一SC複合電子系を構築し、熱・光といった外場により電気伝導性を変換することを目的とした。具体的には、(1)鉄(II)SC錯体一分子性導体からなる複塩の合成、(2)TTF部位をもつSC錯体と分子性導体が連結された複合系の構築。まず、SC錯体カチオン([Fe(dppH)_2]^<2+>)とNi錯体アニオン([Ni(mnt)_2]^1)が1:2の組成をもつ複塩[Fe(dppH)_2][Ni(mnt)_2]_2 MeNO_2(1)を合成した。構造解析および磁化率測定から、錯体1は降温・昇温過程においてそれぞれ、高温相(200K↓)、低温相(140K↓)、準安定相(210K↑)の三つの相をもち、転位温度174Kにおいて鉄(II)イオンとNi錯体アニオンの相乗的構造・磁器相転位を観測した。一方、TTFドナー部位をもつ新規配位子dppTTFを用い[Fe(dppTTF)_2][Ni(mnt)_2]-2(BF_4)・PhCN(2)を合成した。2の温度依存磁化率および電気伝導度測定において、SCの構造・磁性変化と電気伝導性に明らかな相関が観測され、SCと電気伝導性との相乗的性が示唆された。鉄(II)スピンクロスオーバー錯体は熱・光などの外場によって低スピン・高スピン状態を可逆に変換可能な双安定性分子として知られている。特に光によるスピン状態の可逆な変換(LIESST、Light Induced Excited Spin State Trapping)は、配位子と鉄イオンとの結合長の変化に伴う大きな構造・電子状態の変化を与えることが可能である。LIESST現象を示す分子に他の機能性部位を導入することができれば、光などの外場による物性の制御、新規な物性の発現が期待される。本研究では、スピンクロスオーバー錯体にフェロセニル基およびTTF部位を導入することによる複合機能性スピンクロスオーバー錯体の構築に焦点を絞り研究を行った。まず、分子内にフェロセニル基をもつ新規三座配位子dppOCOFcおよびdppCCFcを合成した。dppOCOFcから得られる鉄二価錯体[Fe^<II>(dppOCOFc)_2](BF_4)_2・H_2O(1)は、磁化率測定から転移温度380Kでスピンクロスオーバーを示した。その結果、1はフェロセニル基もつはじめてのスピンクロスオーバー錯体であることがわかった。さらに、1は5Kにおける光照射により、LIESST挙動を示した。これは、1がこれまで報告されたLIESST錯体の中で最も高い転移温度を持つ錯体であることを示している。一方、dppCCFcから得られる錯体[Fe^<II>(dppCCFc)_2](BF_4)_2・2Et_2O(2・2Et_2O)は、一つのジエチルエーテル分子を放出することにより結晶性を損なうことなく[Fe^<II>(dppCCFc)_2](BF_4)_2・Et_tO(2・Et_2O)を生成する。構造解析および磁化率測定の結果、2・2Et_2Oは高スピン錯体であるのに対して2・Et_2Oは転移温度210Kをもつスピンクロスオーバー錯体であることがわかった。すなわち、2・nEt_2Oは溶媒分子の出し入れにより磁気的な挙動を大きく変える非常に特異な系であることがわかった。鉄(II)スピンクロスオーバー錯体は熱・光などの外場によって低スピン・高スピン状態を可逆に変換可能である。特に光によるスピン状態の可逆な変換(LIESST、Light Induced Excited Spin State Trapping)は、光スイッチなどの分子デバイスへの応用が期待される。LIESST現象を示す分子に他の機能部位を導入することができれば、光などの外場による物性の制御、新規な物性の発現が期待される。本研究では、前年度に合成した分子内にフェロセニル基をもつ三座配位子dpPOCOFcおよびdppCCFcをもつ鉄二価錯体の物性について詳細に検討した。dppOCOFcをもつ錯体[Fe^<II>(dppOCOFc)_2](BF_4)_2・H_2O(1)は、転移温度380Kをもつスピンクロスオーバー錯体であり、5Kにおける光照射によりLIESST挙動を示す。この特異なLIESST挙動の機構を解明する為、準安定高スピン状態のX線構造解析を行った結果、低温では分子間相互作用により特異的に高スピン状態が安定化されることが解った。一方、dppCCFcから得られる錯体[Fe^<II>(dppCCFc)_2](BF_4)_2・2Et_2O(2・2Et_2O)は、錯体カチオンとBF_4^-が形成する安定な三次元ネットワーク構造もち、一つのジエチルエーテル分子を結晶性を損なうことなく可逆に出し入れすることが解った。

さらに、溶媒分子の出し入れに伴いスピンクロスオーバー錯体と高スピン錯体の可逆な変換を示す。すなわち、2・nEt_2Oは溶媒分子の出し入れにより単結晶性を保ちつつ磁性を大きく変える全く新しい多孔性材料であることを明らかにした。鉄(II)スピンクロスオーバー(SC)錯体は、低スピン(LS)・高スピン(HS)状態を熱、光、圧力等の外場により可逆に変換可能なことから、分子スイッチとしての応用が期待される物質系である。しかしながら、SC錯体と他の物性を共存させることによる、複合系に関する研究例は未だに多くない。本研究では、分子性導体にSC錯体を導入することで伝導性一SC複合電子系を構築し、熱・光といった外場により電気伝導性を変換することを目的とした。具体的には、(1)鉄(II)SC錯体一分子性導体からなる複塩の合成、(2)TTF部位をもつSC錯体と分子性導体が連結された複合系の構築。まず、SC錯体カチオン([Fe(dppH)_2]^<2+>)とNi錯体アニオン([Ni(mnt)_2]^1)が1:2の組成をもつ複塩[Fe(dppH)_2][Ni(mnt)_2]_2 MeNO_2(1)を合成した。構造解析および磁化率測定から、錯体1は降温・昇温過程においてそれぞれ、高温相(200K↓)、低温相(140K↓)、準安定相(210K↑)の三つの相をもち、転位温度174Kにおいて鉄(II)イオンとNi錯体アニオンの相乗的構造・磁器相転位を観測した。一方、TTFドナー部位をもつ新規配位子dppTTFを用い[Fe(dppTTF)_2][Ni(mnt)_2]-2(BF_4)・PhCN(2)を合成した。2の温度依存磁化率および電気伝導度測定において、SCの構造・磁性変化と電気伝導性に明らかな相関が観測され、SCと電気伝導性との相乗的性が示唆された。
2次元電気泳動法による特定遺伝子欠失変異株の遺伝子産物のマッピング

本年度の本研究課題の成果としては、以下のことが明らかに出来た。●特定遺伝子を欠失した多数の枯草菌変異株の蛋白質を系統的に分析し、変化した産物を特定するための2D-PAGEの装置として、ファルマシア社のMultiphorIIで最も高い再現性が得られることがわかった。●赤い再現性を得るためには、1次元および2次元ゲルともプレキャストゲルが有効であった。●枯草菌の蛋白質は、全体的に狭いpH範囲に集中しており、1次元ゲルはpH4-7の使用が有効であった。●上記pH範囲からずれる蛋白質はpH4-6,pH6-10ゲルを用いて分析が可能であった。微量蛋白質を同定するため、高感度の銀染色法が有効であった。●幾つかのDNA結合蛋白質欠失変異株を用いて予備的に分析した結果、2D-PAGEで蛋白質スポットの変化が認められた。●2D-PAGE後、メンブレンにエレクトロブロットし、幾つかの蛋白質スポットのアミン酸配列を気相シーケンサを用いて決定したところ、かなり微量でも可能であることが明らかになった。
ポストバイナリULSIシステムに関する研究

1兆トランジスタ/チップの時代に向け、極限集積超並列・超高速プロセッサ応用の目指す1つの重要な方向として、コンピュータワールドのみにとどまらず、信号の流れが実世界と融合した知能集積システムへの応用すなわちロボットシステム、計測制御システム、情報通信システムなどのための高度知能システムの実用化が今後ますます重要になることは明らかである。このような応用では、知能処理アルゴリズムの開発はもとより、センサフィードバックなど実世界との密接な情報のやりとりが必須であるため、入力から出力応答までの演算遅れ時間をできるだけ小さくすることが重要となる。このような演算遅れ時間の小さい知能集積システム用プロセッサにおいては、高並列化を種々のレベルで徹底的に活用すると共に、隣接モジュール間のみの通信(ローカル通信)によるパイプライン並列処理アーキテクチャのみではなく、空間的並列構造とともに大局的通信(グローバル通信)が必須となる。ところで、集積回路技術は極限微細化に向けて進展しているが、能動素子自体のスイッチング時間遅れよりも、内部配線の複雑さに起因する性能劣化が避けられない状況になりつつある。特に、上述のようなグローバル通信を伴う超並列アーキテクチャにおいて、セル、基本ブロックやモジュール間通信のための配線が激増し、配線容量・抵抗の増大及び配線遅延が次世代知能集積システム用スーパーチップの本質的重要課題となっている。以上のような観点から、本研究では国際ワークショップ開催や国際研究討論により、次世代集積システムとしての多値情報処理の利点を総合的に討論し、デバイス・回路レベル、演算アルゴリズムレベル、システム・応用レベルの各階層での研究成果を得ることができた。デバイス・回路レベルでは、集積回路の微細化に伴い生じるボトルネックである、内部配線量増大による性能劣化に対し、多値集積化が有用であることを、種々の実例を通じて明らかにした。これらの成果は、LSIにおいて最も権威ある国際会議の1つである1993年ISSCC(固体素子回路国際会議)においても、大学の独創研究として注目された。現在まで、ディジタル集積回路といえば2値論理が常に主役であった。しかしながら、エレクトロニクスシステムの基本概念である配線に基づくシステム構成が限界に近付きつつある現在、多値集積回路が有望となる見通しが得られた。さらに、多値集積回路を一層発展させるためには、現在デバイス延長上のままでは必ずしも容易ではなく、共鳴トンネンリングトランジスタなどのデバイスモデルに基づく回路構成の利点を明確にし、デバイス開発の具体的対象を明示していくことが重要であることも把握された。演算アルゴリズムレベルでは、クリティカルパスを決定するゲート段数を減らす高並列演算回路設計のための符号割り当て方法が考察され、小規模演算ではその高並列化設計法の基礎の確立に成功した。すなわち、線形システムの概念に基づく系統的多値符号割当てによる大規模・高並列演算システムの設計法により、加減算、乗除算、記号処理演算などの基本演算回路をきわめて高並列に構成が可能となった。システム・応用レベルでは、空間的並列性を有する演算遅れ時間の少ない知能集積システム用高集積プロセッサへの応用が考察され、ディジタル制御VLSIプロセッサなどの設計・評価を行なった。また、これらが一般化されたユニバーサルスーパーチップと呼ぶ世界初の知能集積システム用のプロセッサの提案を行った。すなわち、大容量の並列通信能力を有する相互結合回路網によりきわめて細粒度の空間的超高並列処理を可能とするアーキテクチャを考察し、プログラムにしたがって自由自在に結合構造を可変とできるプロセッサを実現することが重要であることを見出した。

さらに、多値集積回路を一層発展させるためには、現在デバイス延長上のままでは必ずしも容易ではなく、共鳴トンネンリングトランジスタなどのデバイスモデルに基づく回路構成の利点を明確にし、デバイス開発の具体的対象を明示していくことが重要であることも把握された。演算アルゴリズムレベルでは、クリティカルパスを決定するゲート段数を減らす高並列演算回路設計のための符号割り当て方法が考察され、小規模演算ではその高並列化設計法の基礎の確立に成功した。すなわち、線形システムの概念に基づく系統的多値符号割当てによる大規模・高並列演算システムの設計法により、加減算、乗除算、記号処理演算などの基本演算回路をきわめて高並列に構成が可能となった。システム・応用レベルでは、空間的並列性を有する演算遅れ時間の少ない知能集積システム用高集積プロセッサへの応用が考察され、ディジタル制御VLSIプロセッサなどの設計・評価を行なった。また、これらが一般化されたユニバーサルスーパーチップと呼ぶ世界初の知能集積システム用のプロセッサの提案を行った。すなわち、大容量の並列通信能力を有する相互結合回路網によりきわめて細粒度の空間的超高並列処理を可能とするアーキテクチャを考察し、プログラムにしたがって自由自在に結合構造を可変とできるプロセッサを実現することが重要であることを見出した。国際ワークショップなどを開催し、次世代集積システムとしての多値情報処理の利点を総合的に検討した結果、デバイス・回路レベル、アルゴリズムレベル、設計レベル、システム・応用レベルの各階層での利点が整理され、今後のポストバイナリULSIシステムに関する国際共同研究のターゲットが明確化された。まず、デバイス・回路レベルでは内部配線の複雑さに起因する性能劣化を解決するため多値信号による通信が有用であることが定量的に明らかにされた。例えば、同じ配線占有面積の条件において、多値では一定電位の配線を1つおきに配置する余裕があるためクロストークノイズが大幅に低減できることになる。しかしながら、回路そのものの利点は現在延長上のままでは必ずしも容易ではなく、共鳴トンネンリングトランジスタなどのデバイスモデルに基づく回路構成の利点を明確にし、デバイス開発の具体的対象を明示していくことが重要であることが把握された。アルゴリズムレベルでは、クリティカルパスを決定するゲート段数を減らす高並列演算回路設計のための符号割り当て方法が考察され、小規模演算ではその局所演算回路化に成功している。設計レベルでは、多値論理の概念を利用した大規模な論理設計、フォールトの影響がアナログ的に出力に現われるロバストフォールトトレラントシステムなどを考察した。
起始部欠損SV40・DNA導入によるジストロフィー筋細胞株の樹立と変異形質の検出

Duchenne型筋ジストロフィー症(DMD)の変異形質・病態検索を目的としてDMD筋のクローン化を試み、成功した。(1)長期培養困難である増殖性の低い筋細胞をクローン化する方法として、癌遺伝子を細胞に導入し形質転換せしめて後クローン化する分子生物学的方法を用いた。ヒト細胞を効率良く形質転換し、かつ時に分化機能を保時する事のある、複製起始部欠損SV40・DNA(oriと略す)を生検骨格筋初代培養系細胞にカルシウム・リン酸法で導入した。(2)形質転換細胞クローンは約50作成され、内9個が筋芽細胞様形態を示し、残りは線維芽細胞様であった。前者を一定の無血清培地に培養する事により筋細胞特有の多核細胞化、筋管細胞形成、筋型CKisomerの発現など、一定程度の分化形質の発現をみた。(3)形質転換細胞クローンは二倍増殖時間は8ー9時間と著しい高増殖性を示し、均一大量の筋細胞を得る事を可能とした。(4)正常筋細胞に比して増殖性の悪いDMD筋細胞も、同様の方法でクローン化された。クローン化DMD筋細胞は正常筋クローンに比して幅広い夛核細胞化を示し、筋管形成は不完全であった。以上、ヒト骨格筋細胞は【ori^-】・DNA導入によりクローン化し得る事を示した。これは均一な筋細胞を常に無制限に供給し得る系であるばかりでなく、分化誘導により分化形質の検索も可能にした。DMDクローンも同様にして確立され、不完全分化が示唆されたことは、DMDが成熟筋の変性のみならず、筋細胞の分化・成熟障害を一次的変異形頂としている可能性を示唆した。
性差が顎関節円板の細胞外マトリックスに及ぼす影響に関する分子生物学的研究

ラット顎関節円板における各種プロテオグリカンのmRNA発現は、成長に伴い変化すること、および領域差を示すことが明らかとなった。このことは、成長に伴うラットの顎口腔機能の発達、あるいは顎関節における生力学的環境の変化が関与していることを示唆した。本研究では、異なる性差のラットを用いることにより、顎関節の細胞外マトリックス(コラーゲンおよびプロテオグリカン)の発現にどのような影響を及ぼしているのかについて解明することを目的としている。今年度は、次年度の研究計画である性ホルモンの影響による細胞外マトリックス(コラーゲンおよびプロテオグリカン)の発現変化を解析するための予備実験として、ラット顎関節円板におけるレーザーマイクロダイセクションによる遺伝子組織学的検討により、雄性Wistar系ラットを用いて正常ラット顎関節円板のプロテオグリカンの遺伝子発現について検討した。関節円板は、前方肥厚部、中央狭窄部、後方肥厚部の3つの部位に分られ、デコリン、バイグリカン、ファイブロモジュリン、ルミカン、バーシカンの5種類のプロテオグリカンについて検討した。その結果、牽引力の負荷部位と考えられる前方肥厚部ではデコリン以外のSLRPsのmRNA発現量は成長に伴い減少し、圧縮力の負荷部位と考えられる中央狭窄部、後方肥厚部ではmRNA発現量は類似した様相を示し、バイグリカン、ファイブロモジュリンは8週齢以降増加を示した。以上のことから,ラット顎関節円板における各種プロテオグリカンのmRNA発現は、領域差を示すことが明らかとなった。このことは、顎関節における生力学的環境の変化が関与していることを示唆している。今後は、性差について、性ホルモンの影響を解明しながら、さらに領域差の検討を行う計画である。前年度に行った性ホルモンの影響による細胞外マトリックス(コラーゲンおよびプロテオグリカン)の発現変化を解析するための予備実験では、ラット顎関節円板におけるレーザーマイクロダイセクションによる遺伝子組織学的検討により、雄性Wistar系ラットを用いて正常ラット顎関節円板のプロテオグリカンの遺伝子発現についての検討を行った。この実験において、関節円板は、前方肥厚部、中央狭窄部、後方肥厚部の3つの部位においてデコリン、バイグリカン、ファイブロモジュリン、ルミカン、バーシカンの5種類のプロテオグリカンについて検討した。以上の結果、ラット顎関節円板における各種プロテオグリカンのmRNA発現は、領域差を示すことが明らかとなった。今年度は、前年度の結果をふまえ、性差についての検討を行った。結果として、コラーゲンおよびプロテオグリカンのmRNA発現において性差による優位差は認められなかった。
喉頭摘出者のための発声代行装置とその実現のための音声知覚処理機構の研究

本研究では,自然な声を表出でき,しかも喉頭摘出者の障害の程度に応じて簡便に扱える発声代行装置の開発を目指す.またその過程で,音声学的知見,生体機能における新しい知見を得ることも目的とする.研究によって得られた成果について以下に示す.1.昨年度の研究の結果から,呼気圧を利用したイントネーション制御型人工喉頭が実用化された.そして現在,約500名の喉頭摘出者が本人工喉頭を使用している.そこで簡便に使える人工喉頭の要件を探り出すため,人工喉頭の使用感やイントネーション制御機能についてのアンケート調査を行った.その結果,人工喉頭の基本機能に関わる形状や音量について,83名中8割の人が満足していることがわかった.イントネーション制御機能については,使いやすさの観点から,「満足している」という評価は得られなかった.その要因を調べるため,呼気圧の検出部部分である気管孔の形状を調べたところ,半数の被検者に陥没等の気管孔の変形が見られた.以上から,使用者個人個人への人工喉頭装置のフィッテングと,使い勝手の面からの人工喉頭装置の評価と改良の必要があることがわかった.また,全ての喉頭摘出者がこの方式を使えるわけではないことから,指圧による制御などの別の制御手段の重要性も明らかになった.2.喉頭摘出者のみでなく他の発声障害者へのイントネーション制御型人工喉頭の適用例として,人工呼吸器使用者での本人工喉頭使用の可能性を探った.その結果,制御に使える呼気情報の抽出は難しく,呼気による制御の可能性は低いことがわかった当初予定していた,発声代行装置のイントネーション制御手段の検討については現在もまだ不十分である.よって,今後も検討を加えていく.最終的には,(1)自然な声を表出できるより簡便な人工喉頭の開発,(2)イントネーションという要因が声の自然さに与える影響を明らかにすること,を目指していきたい.本研究は,喉頭摘出者が簡便に扱え,しかも自然な声を表出できる発声代行装置の開発を目指している.本年度は主に,我々が今まで開発してきた発声代行装置である呼気圧制御型人工喉頭をもちいて,(1)このようなイントネーションを制御する人工喉頭の適用範囲,(2)イントネーションの変化範囲と声の自然さの関係,の2点について検討した.研究によって得られた成果について以下に示す.1.イントネーション制御型人工喉頭がどれだけの人が使うことができるかを調べるため,本人工喉頭の制御に慣れた被験者1名と初めて使う被検者6名でイントネーションをつけて話すことができるかを調べた.また,各被検者の呼気の制御能力についても簡単に調べた.その結果,6名中4名は初めてでもイントネーションをつけることがきること,また,被検者によっては本人工喉頭のパラメータをその被検者用に調整する必要があることがわかった.つまり,本制御方法は有効であることとこのような制御には個人差の検討が不可欠であることがわかった.2.イントネーション制御型人工喉頭を用いて発声した声/aoi-umi/のイントネーションの変化範囲を分析合成により変化させた.そして,どれくらいの変化までその声の自然さが保存されるかを聴取実験により評価した.その結果,被検者が適したイントネーションの変化パターンを生成できていれば,変化範囲を2倍程度変化させても声の自然さを保つことができることがわかった.問題点としては,被検者数がまだ少なく,個人差の検討がまだ不十分であることが挙げられる.イントネーションの制御手法や処理機構,自然な声の要因については次年度に詳しく検討する予定である.本研究では,自然な声を表出でき,しかも喉頭摘出者の障害の程度に応じて簡便に扱える発声代行装置の開発を目指す.またその過程で,音声学的知見,生体機能における新しい知見を得ることも目的とする.研究によって得られた成果について以下に示す.1.昨年度の研究の結果から,呼気圧を利用したイントネーション制御型人工喉頭が実用化された.そして現在,約500名の喉頭摘出者が本人工喉頭を使用している.そこで簡便に使える人工喉頭の要件を探り出すため,人工喉頭の使用感やイントネーション制御機能についてのアンケート調査を行った.その結果,人工喉頭の基本機能に関わる形状や音量について,83名中8割の人が満足していることがわかった.イントネーション制御機能については,使いやすさの観点から,「満足している」という評価は得られなかった.その要因を調べるため,呼気圧の検出部部分である気管孔の形状を調べたところ,半数の被検者に陥没等の気管孔の変形が見られた.以上から,使用者個人個人への人工喉頭装置のフィッテングと,使い勝手の面からの人工喉頭装置の評価と改良の必要があることがわかった.また,全ての喉頭摘出者がこの方式を使えるわけではないことから,指圧による制御などの別の制御手段の重要性も明らかになった.2.喉頭摘出者のみでなく他の発声障害者へのイントネーション制御型人工喉頭の適用例として,人工呼吸器使用者での本人工喉頭使用の可能性を探った.その結果,制御に使える呼気情報の抽出は難しく,呼気による制御の可能性は低いことがわかった当初予定していた,発声代行装置のイントネーション制御手段の検討については現在もまだ不十分である.よって,今後も検討を加えていく.

最終的には,(1)自然な声を表出できるより簡便な人工喉頭の開発,(2)イントネーションという要因が声の自然さに与える影響を明らかにすること,を目指していきたい.
次世代型シーケンサーを用いた種子油脂貯蔵プログラムの発芽後抑制メカニズムの解析

2018年度はDROL1遺伝子の機能の解析をするとともに、それによって触媒されるAT-AC型イントロンの機能の解明を目指した研究を行った。DROL1のスプライシングにおける役割を調べるために、そのホモログを調べた。データベースを検索したところ、酵母のDIB1と類似していることを見つけた。DIB1はスプライシング装置であるスプライソソームに含まれるU5 snRNAに結合するタンパク質であることが報告されており、DROL1も同様の機能を持つことと推測した。一方、シロイヌナズナのゲノム中にはDIB1により近いホモログが存在していることがわかった。様々な生物のデータを検索したところ、イネ、ヒメツリガネゴケ、ヒトおよびマウスにはシロイヌナズナと同様に2つ以上のホモログが存在しており、DIB1型とDROL1型のそれぞれがあった。一方、酵母、線虫(C. elegance)、コナミドリムシにはDIB1型のみがあることがわかった。文献を調べると酵母と線虫には末端の塩基配列がAT-ACであるイントロンをスプライシングするU12型スプライソソームが存在しないことがわかった。昨年度までにdrol1変異株でAT-AC型イントロンのスプライシングが特異的に抑制されていることがわかっており、これらを総合するとDROL1はU12型スプライソソームに含まれるU5 snRNAに結合する因子ではないかと推測した。HD2BおよびHD2Cの3番目のイントロンはAT-AC型であり、drol1変異株でそのスプライシングが抑制されていることを昨年度までに明らかにした。このイントロンが遺伝子の発現に及ぼす影響を調べるために、プロモーターから3番目のエキソンの3'側までをGFPにつないだコンストラクト(HD2Bp3e::GFP)と、4番目のエキソンの5'側までをRFPにつないだコンストラクト(HD2Bp4e::RFP)を作成し、シロイヌナズナに導入した。GFPとRFPの発現には差があり、AT-AC型イントロンの有無によって遺伝子の発現が変化することが示唆された。申請した計画では平成30年度にデータの解析およびDROL1遺伝子の発現パターンの解析を行うとなっている。データの解析によりDROL1がスプライシングを担うイントロンはすでに同定済みで、本年度はDROL1の遺伝子の構造の分析を進めた。計画にはなかったがDROL1のホモログの解析から翻訳開始点を調べる重要性に気づき、これを確かめる実験を計画して実施中である。DROL1の発現パターンを調べるコンストラクトを作成し、植物に導入した。GUSプロモーターを使って発現する組織を同定するとともに、GFP融合タンパク質を発現させて細胞内局在を調べることもできた。ホモログの分析によりDROL1のスプライシングにおける役割が見えてきた。本年度見出したAT-AC型イントロンによる遺伝子発現制御のデータとともに論文発表を行うべく、原稿の作成をすすめながら、翻訳開始点を同定する実験を行う。本研究はシロイヌナズナが種子に油脂を蓄積する遺伝的なしくみを明らかにし、植物を利用した油脂の生産性を向上することを大きな目的としている。その過程で、未熟種子で活性化している油脂を蓄積するための遺伝子が発芽後に抑制されることに着目し、drol1変異株を単離した。drol1変異株では発芽後に発現が抑制されるオレオシン遺伝子の発現が持続していることがわかり、発芽後の種子形成プログラムを抑制するメカニズムに必須の遺伝子であることが期待された。Drol1はスプライシング因子をコードしており、どのような遺伝子のスプライシングを行っているのかに興味を持ち研究を始めた。DROL1がスプライシングを促進する遺伝子を探すために、次世代型シーケンサーNextSeq500を用いてRNA-Seqを行った。野生型株、drol1-1、drol1-2変異株からRNAを抽出し、cDNAライブラリを作成した。シロイヌナズナが持つ約12万のイントロンの発現を調べたところ、drol1-1において132個、drol1-2において62個のイントロンがスプライシングされていないことがわかった。drol1-2の62個のイントロンのうち55個(88%)はdrol1-1でもスプライシングされておらずdrol1-1のほうが広範囲な影響を与えていることがわかった。drol1-1でスプライシングされなくなった132個のイントロンのうち37個はその末端の塩基配列がGT-AGでなく、DROL1は非GT-AG型のイントロンのスプライシングに必要な因子であることがわかった。drol1変異株でスプライシングされなくなった遺伝子の中に3個のヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)をコードしているものがあった。いずれも末端がAT-ACのイントロンを一つだけもち、そのイントロンのみがスプライシングされなくなっていることがわかった。申請した計画では平成29年度に主にRNA-Seq用のサンプルの収集とライブラリの作成を行うとなっており、おおむねこれを実施した。これまでに野生型株、drol1-1変異株、drol1-2変異株、hd2b変異株、hd2c変異株からRNAを抽出し、ライブラリの作成を行った。またヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤であるトリコスタチンAを処理したサンプルも用意し、ライブラリを作成した。作成したライブラリは順次シークエンスを行っており、順調にデータの蓄積を進めている。研究の概要に記したように発現量の変化した遺伝子の同定、スプライシング効率の定量化も行うことができており、おおむね計画通りに進捗している。

DROL1の時空間的な発現パターンを解析するためにDROL1プロモーターの下流にGUSレポーター遺伝子をつないだ遺伝子を作成し、シロイヌナズナへの導入をすすめている。合わせてHD2B、HD2CがもつAT-ACイントロンの役割を明らかにするべく、これらのイントロンをGUS遺伝子につないだ融合遺伝子を作成し、シロイヌナズナへ導入する実験をすすめている。これらのコンストラクトづくりは計画よりも遅れており、形質転換体の作成までは至っていない。2018年度はDROL1遺伝子の機能の解析をするとともに、それによって触媒されるAT-AC型イントロンの機能の解明を目指した研究を行った。DROL1のスプライシングにおける役割を調べるために、そのホモログを調べた。データベースを検索したところ、酵母のDIB1と類似していることを見つけた。DIB1はスプライシング装置であるスプライソソームに含まれるU5 snRNAに結合するタンパク質であることが報告されており、DROL1も同様の機能を持つことと推測した。一方、シロイヌナズナのゲノム中にはDIB1により近いホモログが存在していることがわかった。様々な生物のデータを検索したところ、イネ、ヒメツリガネゴケ、ヒトおよびマウスにはシロイヌナズナと同様に2つ以上のホモログが存在しており、DIB1型とDROL1型のそれぞれがあった。一方、酵母、線虫(C. elegance)、コナミドリムシにはDIB1型のみがあることがわかった。文献を調べると酵母と線虫には末端の塩基配列がAT-ACであるイントロンをスプライシングするU12型スプライソソームが存在しないことがわかった。昨年度までにdrol1変異株でAT-AC型イントロンのスプライシングが特異的に抑制されていることがわかっており、これらを総合するとDROL1はU12型スプライソソームに含まれるU5 snRNAに結合する因子ではないかと推測した。HD2BおよびHD2Cの3番目のイントロンはAT-AC型であり、drol1変異株でそのスプライシングが抑制されていることを昨年度までに明らかにした。このイントロンが遺伝子の発現に及ぼす影響を調べるために、プロモーターから3番目のエキソンの3'側までをGFPにつないだコンストラクト(HD2Bp3e::GFP)と、4番目のエキソンの5'側までをRFPにつないだコンストラクト(HD2Bp4e::RFP)を作成し、シロイヌナズナに導入した。GFPとRFPの発現には差があり、AT-AC型イントロンの有無によって遺伝子の発現が変化することが示唆された。申請した計画では平成30年度にデータの解析およびDROL1遺伝子の発現パターンの解析を行うとなっている。データの解析によりDROL1がスプライシングを担うイントロンはすでに同定済みで、本年度はDROL1の遺伝子の構造の分析を進めた。計画にはなかったがDROL1のホモログの解析から翻訳開始点を調べる重要性に気づき、これを確かめる実験を計画して実施中である。DROL1の発現パターンを調べるコンストラクトを作成し、植物に導入した。
地理情報システムによる世界諸言語の言語類型地理論的研究

研究代表者たちは、世界諸言語の遠い類縁関係の探求や語順研究にとって重要な言語特徴に関して膨大な数の言語から広範なデータを収集してきた。そこで、研究代表者たちは、世界諸言語の言語特徴の地理的分布を示す、GIS(地理情報システム)によってデジタル化した言語地図を作製するプロジェクトを遂行した。このデジタル化した世界言語地図は、膨大な言語情報を単一のシステムに統合し、言語特徴の地理的分布に対する、ミクロな視点とマクロな視点の双方からの効率的な考察を可能にし、様々な言語研究に対して多大な貢献をなすことが期待できる。世界諸言語の諸特徴の分布状況の分析、および従来の言語類型論や言語系統論を統合する新しい言語類型地理論的研究を可能にする目的のため、デジタル化した世界言語地図(世界言語地図ベクトルデータ)を作製し、GIS(地理情報システム)によって、研究代表者たちが収集してきた膨大な諸言語の諸特徴を組み込み、諸特徴のデータを地図に連動させて表示、検索できるプログラムを開発する。本研究は、デジタル化した世界言語地図(世界言語地図ベクトルデータ)を作製し、GIS(地理情報システム)によって、申請者たちが収集してきている膨大な諸言語の諸特徴を組み込み、諸特徴のデータを地図に連動させて表示、検索し、従来の言語類型論や言語系統論を統合する新しい言語類型地理論的研究を行うことを目的としたものであった。そのため、本年度は、世界対象の言語分布をデジタル化し、GISによって汎用的に活用できるような、世界言語地図ベクトルデータを作成した。これは、今後の本研究の基礎となるべきもので、『世界言語地図(Routledge社出版Atlas of the world'sLanguages)』の第1版および第2版を基に、以下のような手順によって作製していった。1.『世界言語地図』の第1版と第2版を詳細に比較し、それぞれによって対象とすべき地図のページを特定する。2.上記で特定した言語地図のページをスキャナーでスキャニングし、デジタルデータ(イメージデータ)として作成し、それらのイメージデータに補正を施し、実座標値を付加する。3.上記の作業によって得られたイメージデータから、指定する地域の言語区域をGISによってベクトルデータ(図形データ)として利用することを可能にするために、対象の言語区域を閉図形化されたポリゴンとして図形化(ベクトル化)した世界言語地図ベクトルデータを作成する。論文としては、山本がこれまでの世界言語地図に基づく研究状況ないし動向を概観し、本研究およびそれによって期待される成果や意義を論じ、乾がGISを利用するクシ・オモ系言語の研究について論じた。本研究の主な目的は、デジタル化した世界言語地図(世界言語地図ベクトルデータ)を作製し、GIS(地理情報システム)によって、申請者たちが収集してきている膨大な諸言語の諸特徴を組み込み、諸特徴のデータを地図に連動させて表示、検索し、従来の言語類型論や言語系統論を統合する新しい言語類型地理論的研究を行うことであった。そこで、本年度は、18年度の繰り越し分によって作製した世界言語地図ベクトルデータに対して、世界言語地図(Rout ledge社出版Atlas Of The World's Languages)の第1版と第2版との間で、表現や仕様が変更になった部分、および地区、地域、大陸、国別についての区分けが変更になった部分に対して、必要な加工修正を行った。これによって、GIS(地図情報システム)で汎用的に利用し得る世界言語地図ベクトルデータとして、現段階で最新のものとすることができた。さらに、今年度は、本研究に関連し得る他の研究者たちとの連携を通じて、研究発表を行い、また共同研究による論文を著すことができた。まず、東ユーラシア諸言語に関する言語地理学的研究を行っている研究会に参加して、山本が、本研究を含む世界言語地図に基づいた研究についての発表を行い、それらの研究者たちとの情報交換を行った。また、情報学の研究者たちとの連携により、山本の語順データをSummer Institute of LinguisticsのEthnologue GIS System上に地図化した結果について、共著論文を発表した。これらは、今後、本研究の世界言語地図ベクトルデータに言語特徴を関連づけていく上で参考になると思われる。本年度は、主として下記のような2つの作業を行った。1.これまでにデジタル化した世界言語地図を作製したが、その地図に我々の言語特徴データを関連づけるためには、このデジタル化した世界言語地図上の言語と我々がこれまで収集してきた種々の言語データ中の言語とを関連づけることが不可欠である。そこで、特に山本データにおいて使用された言語名は主としてEthnologue第12版に基づいたものであったため、まず、山本データにおける言語名とEthnologueの最新版である第15版で使用されている言語名との照合をはかることにした。そのための最初の手順として、両者に対するファイルを作成し、個々の言語に付された種々の別名リストを、方言名リストも加えてファイルに付加した。

その上で、山本データにおけるID番号とEthnologue第15版で使用されているID番号を基本にしつつ、さらに付加された別名や方言名を参照しながら、両者において一致の可能性の高い言語を照合した。これにより、本研究が基にしているRoutledgeの言語地図で使用されている言語名と我々のデータにおける言語名との統合を可能にすることができた。2.昨年度までに作製した、地区、地域、大陸、国別の世界言語地図ベクトルデータに対して、言語属性情報に含まれる言語番号を基準に、言語属性情報を付加加工した。本研究の主な目的は、今までに研究代表者たちが収集した世界諸言語の言語データをもとにGIS(地理情報システム)によるデジタル言語地図を作製し、GISと連動した言語データベースを構築し、様々な表示、検索ができるプログラムを研究開発し、従来の言語類型論や言語系統論を統合する新しい言語類型地理論的研究を行うことであった。そこで、最終年度である21年度は、以下のような研究を実施した。1.これまでにデジタル化した世界言語地図を作製したが、本研究で基にしているRoutledge版の世界言語地図の言語名と、研究代表者等の収集した言語名との間には、しばしば相違があるため、20年度に引き続き、両者の言語名の照合、対応の作業を行った。その際、Summer Institute of LinguisticsのEthnologueで利用されているにISO639-3の、各言語に対する3文字コードを介在させることにより、効率的な照合を可能にした。2.デジタル化した言語地図上に収集してきたデータを結びつけ、地図上のデータを扱うためのソフトを利用して、当該の言語特徴を持つ言語を地図上の位置に対応させ、地図上に自由に表示し、検索でき、複数の言語特徴を組み合わせて重層的に扱うことのできるようなシステムを開発した。3.これまでの本研究による研究成果を、カラー地図のサンプルを付した報告書としてまとめた。報告書では、地図の作製や言語の照合について論述したほか、研究代表者たちが作製してきた世界言語特徴地図の特徴を、従来のものと比較しながら論じ、さらに、研究者代表者の語順分布を地図上に表示させることにより、研究代表者の語順研究が地図上にどのように現れているかについて分析した。
Ｃ型肝炎ウイルス感染による肝発癌メカニズムの解析

C型肝炎ウイルス(HCV)による肝発癌は年齢と関連することが知られ、加齢関連疾患の一面も有していることから本研究では加齢抵抗遺伝子SIRTに注目し、HCV感染による病態、発癌との関連を解析することを目的として臨床検体、培養細胞を用いた検討を行った。肝癌組織では非癌組織と比べてSIRTの発現が低下している傾向を認めた。一方性別や年齢はSIRT発現量に影響しなかった。HCV発現肝癌細胞株を用いた検討ではSIRT遺伝子の活性化、抑制はウイルス複製に影響を与えなかった。老化細胞染色では細胞密度と細胞老化との関連が示唆された。詳細な機序は更なる検討を要するが肝癌とSIRT遺伝子との関連性が示唆された。C型肝炎ウイルス(HCV)感染においてはウイルスの持続感染、加齢や宿主の遺伝子要因、外部ストレスなどの環境要因が複雑に絡んで肝発癌へ至ると考えられる。HCVによる肝発癌は年齢と関連することが知られ、加齢関連疾患の一面も有していることから本研究では加齢抵抗遺伝子SIRTに注目し、HCV感染による病態、発癌との関連を解析することを目的として以下の検討を行った。臨床検体肝組織における肝癌および非癌組織におけるSIRT遺伝子のmRNA発現を検討した。肝癌部において発現量は検体間で多様であったが、SIRT1, SIRT2低下例が多くみられた。一方年齢、性別による明らかな発現量の差は認められなかった。SIRT遺伝子のタンパク発現を免疫染色にて確認した。肝癌組織では非癌組織と比べてSIRT2の発現が低下している傾向を認めた。他のホモログでも発現変化を認めた。一方性別や年齢、B型肝炎ウイルス(HBV)の有無は発現量に影響しなかった。HBV感染非癌細胞系を用いたSIRT阻害剤の検討ではHBV複製に影響しなかった。細胞老化に関する検討では細胞密度は老化細胞の存在量に影響した。クラスI,IIのヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)について検討した。阻害剤を用いた検討ではHDACおよびSIRT遺伝子の発現量に影響しなかった。一方HBV感染細胞における老化細胞数の低下がみられた。HDAC阻害剤はHBV複製肝癌細胞株におけるウイルス複製量に影響した。肝癌細胞における検討ではウイルスは増加した一方、非癌細胞における検討ではウイルスは抑制されたがその機序は現時点で明らかではなく今後の検討を要する。HDAC阻害剤によりHBV陽性肝癌細胞の増殖抑制および細胞周期関連遺伝子の変動が見られた。HCVによる発癌の分子メカニズムを解明するためH24年度は以下の検討を行った。(1)臨床検体肝組織におけるSIRT経路遺伝子の発現解析。肝癌および非癌組織におけるSIRT遺伝子のmRNA発現をReal-time PCR法にて検討し、肝病態、臨床背景との関連性を検討した。肝癌部において発現量は検体間で多様であったが、SIRT1,2低下例が多くみられた。また他のホモログでも発現変化を認めた。(2)培養細胞株を用いた検討。in vitroにおいてHCVレプリコン発現肝癌細胞株を用いた検討を行った。SIRT遺伝子の活性化、抑制はウイルス複製に影響を与えなかった。SIRT遺伝子のウイルス複製に与える影響についてさらにHBV産生細胞株および一過性発現系を用いて検討したところ、SIRT遺伝子はHBV複製に影響しなかった。一方HCVレプリコンはベータガラクトシダーゼ活性測定法によるセネセントセル存在量に影響した。SIRTのヒストン脱アセチル化活性の影響について検討するため他のクラスのHDACについて検討を行った。クラスI,II阻害剤を用いた検討ではHBV複製肝癌細胞株におけるウイルス複製量に影響した。現在詳細な検討をすすめている。H24年度の検討においてSIRT遺伝子が肝発癌と関連することが示唆されたものの、ウイルス感染や老化との関連など詳細なメカニズムについてさらなる検討を要する。おおむね計画内容は遂行されているが、計画の一部に遅れが生じた。不死化細胞を用いたウイルス感染系を作成する計画であったが現在のところ細胞へのウイルス感染性が得られておらず、細胞にウイルス吸着、侵入に関与する因子が不足している可能性がある。

またSIRT関連遺伝子の持続的ノックダウン細胞株を作成する計画について遺伝子の安定的な発現低下が得られていない。一方臨床検体を用いた検討については当初予定より多数例での検討が可能となった。次年度ではSIRT遺伝子がウイルスタンパク発現や感染性に与える影響、さらに腫瘍形成能について検討を行い、また詳細な遺伝子シグナルパスウェイについて解析していく予定である。また加齢や肝硬変からの発癌メカニズムと関連して、細胞老化による影響を解析し、治療標的となりうる因子の同定を目指す。計画に遅れが生じた部分については、in vitro実験系では使用する細胞株の変更や使用するウイルスやレプリコンの変更、遺伝子活性化、抑制剤の変更などにより対応していく。H24年度計画の一部に変更が生じたため当初予定していた細胞購入、抗体購入等を行わなかったため未使用額が生じた。これらはH25年度に購入を計画している。さらにHCV感染細胞株におけるSIRT関連遺伝子の機能解析、HCV感染による不死化肝細胞の形質へ与える影響の解析、HCVコア発現マウスを用いたin vivoでのSIRTの機能解析、肝組織臨床検体を用いたHCV感染や発癌とSIRTとの関連解析を行う。培養細胞実験にかかる費用、抗体など各種試薬、薬剤、消耗品、実験動物使用にかかる費用などを予定している。研究内容に要する設備備品はそろっており、新たな購入計画はない。