hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ＤＮＡメチル化に着目したメタボリックメモリーの分子機構の解明と医学応用

新生仔期の肝臓では新規脂肪合成の律速酵素GPAT1遺伝子プロモーター領域がDNAメチル化されているために抑制されるが、離乳期にはDNA脱メチル化により誘導されることが判明し、GPAT1遺伝子発現と肝臓脂肪合成はDNAメチル化により制御されることが示唆された。一方、出生直後から離乳前の新生仔マウスの肝臓ではDNAメチル化が減少して発現が増加する遺伝子の多くが脂肪酸β酸化経路を構成する酵素群であり、このDNA脱メチル化はPPARα依存的であることが明らかになった。以上より、胎仔期新生仔期の肝臓における脂質代謝のエピゲノム制御には乳汁中の脂質リガンドが関与する可能性が示唆された。多くの疫学調査により、胎生期の栄養環境が成人期に発症する肥満やメタボリックシンドロームに関連する可能性が指摘されている。一方、胎生期のみならず個体の成長が著しい新生児期も全身臓器の可塑性が高い時期であり、離乳前後の急激な栄養環境の変化がエピゲノムに記憶され、成人期の疾患感受性を決定する可能性がある。本研究は、従来全く知見のなかった新生児期の肝臓における新規脂肪合成のエピゲノム記憶の分子機構の解明を目指す新しい試みである。具体的には、マウスの新生仔期にプロモーター領域のDNAメチル化と遺伝子発現が変動する肝脂肪合成酵素を同定し、成獣期に発症する肥満やインスリン抵抗性あるいは脂肪肝との関連を検討するものである。本年度は、肝臓新規脂肪合成の律速酵素グリセロール3リン酸アシル基転移酵素(GPAT1)遺伝子プロモーターにおけるDNAメチル化の程度は遺伝子発現と逆相関していることを初めて明らかにした。DNAメチル化の変化はGPAT1遺伝子プロモーターに特異的であり、他の脂肪合成遺伝子(FAS、SCD1)には認められなかった。又、培養細胞を用いた検討により、DNAメチル化を有するGPAT1遺伝子プロモーターはDNAメチル化を有しないものと比較して転写活性が抑制されることが明らかになった。以上より、マウスの胎仔期新生仔期にかけて肝臓においてDNAメチル化の変化によりGPAT1遺伝子はエピゲノム制御を受けることが示唆された。ゲノムのDNAメチル化修飾は細胞分裂を経て遺伝子発現情報や細胞の性質を次世代に安定的に伝達する分子機構であり、原則として遺伝子転写を抑制する。即ち、DNAメチル化と発現の変化が逆相関する遺伝子はDNAメチル化により転写制御を受ける可能性が高い。本研究ではDNAメチル化の網羅的解析法であるMIAMI法(Microarray-based Integrated Analysis of Methylation by Isoschizomers)(Oncogene 25: 3059-3064, 2006)により、出生直後から離乳前の新生仔マウスの肝臓においてプロモーター領域のDNAメチル化と遺伝子発現が逆相関する脂質代謝関連遺伝子を多数同定した。興味深いことに、これらの多くが脂肪酸β酸化経路を構成する酵素群であること、バイオインフォマティクス解析により、これらの遺伝子のプロモーター領域に核内受容体peroxisome proliferator-activated receptor-α(PPARα)との結合配列が高頻度に出現することを予備的に見出した。PPARα欠損マウスを用いた検討と母獣マウスのPPARαリガンド投与実験により、出生直後から離乳前の新生仔マウスにおける脂肪酸β酸化経路のDNA脱メチル化はPPARαに依存的であることを明らかになった。以上により、塩基配列特異性を有する核内受容体PPARαが活性化されて標的遺伝子のプロモーター領域にDNAメチル化制御因子をリクルートしてDNAメチル化と転写活性の変化をもたらすことが示唆された。本研究は、従来全く知見のなかった新生児期の肝臓におけるde novo脂肪合成のエピゲノム記憶の分子機構の解明を目指す新しい試みである。本年度までの研究により、新生仔期の肝臓では、新規DNAメチル化酵素Dnmt3bにより肝脂肪合成の律速酵素グリセロール3リン酸アシル基転移酵素(GPAT1)遺伝子プロモーター領域がDNAメチル化されることにより転写因子SREBP-1cのリクルートが阻害され、GPAT1の遺伝子発現が誘導されず、一方、離乳期には脱メチル化されてSREBP-1cがリクルートされるようになり、GPAT1の遺伝子発現が誘導され、脂肪合成が行われることが判明した。

すなわちGPAT1遺伝子発現と肝臓脂肪合成はDNAメチル化により制御を受けることが示唆された(Diabetes 61: 2442-2450, 2012)。DNA脱メチル化の分子機構の解明は今後の課題であるが、過栄養にした母マウスより産まれた仔マウスを用いた検討により、少なくとも一部は栄養環境の影響を受けるものと考えられた。今後、DNAメチル化の網羅的解析法であるMIAMI法を用いて新生仔成獣マウスの肝臓サンプルについてDNAメチル化と遺伝子発現の網羅的な解析を進める予定である。本研究課題は動物個体を用いたin vivoの解析と培養細胞を用いたin vitroの解析の両者を施行している。動物個体の実験は、ほぼ予定通り進行している。一方、in vitroの解析は当初の計画以上に進展しており、全体としては概ね順調に進展している。25年度が最終年度であるため、記入しない。一方、in vitroの解析は当初の計画以上に進展している(Diabetes 61: 2442-2450, 2012)。本研究課題の成果は英文誌に掲載されており、全体としては概ね順調に進展している。本研究課題は、当初の研究計画に関して現時点で特に変更はない。今後、着実に成果を報告していきたい。
脳代謝マッピングによる鎮痛薬の作用に関する研究

中枢神経系の代謝マッピングにより、脊髄から脳幹・視床および大脳皮質にいたる痛覚伝導系や下行性抑制系に対する鎮痛薬の作用について検討した結果、以下のことが判明した。1.モルヒネ10mg/kg静注時の脳・脊髄局所の代謝変化、モルヒネ10mg/kg静注時の脳・脊髄局所のブドウ糖消費を【^(14)C】-deoxyglucose法を用いて測定し、覚醒時と比較検討した結果、脚間核、青斑核および上オリーブ核の代謝はそれぞれ20%,17%および24%低下するが、下行性抑制系に関与する中脳水道周囲灰白質,縫線核,巨大細胞網様核,傍巨大細胞網様核や脊髄から視床・大脳皮質にいたる痛覚伝導系など57部位では代謝変化がみられないことがわかった。2.モルヒネ10mg/kg静注時の末梢神経刺激に体する中枢神経系の代謝反応、モルヒネ10mg/kg静注時には四肢のピンチなどの刺激にまったく反応せず一見深い麻酔状態にあるように思えるが、モルヒネ10mg/kg静注後、一側坐骨神経を電気刺激して能・脊髄の代謝変化を検討した結果、エンフルレン深麻酔時と異なり大脳皮質において刺激に対する代謝が認められ、大量の鎮痛薬投与による無反応状態は全身麻酔薬による深麻酔状態とは異なることがわかった。3.モルヒネ硬膜外投与時の脊髄各層の代謝変化、モルヒネ15μgを腰部(腰椎【L_(4-5)】)硬膜外腟に投与し、下肢の鎮痛を確認した後、腰髄各層のブドウ糖消費量を測定し、覚醒時と比較検討した結果、モルヒネ硬膜外投与時には脊髄の糖代謝は変化しないことがわかった。モルヒネくも膜下投与時の脊髄代謝も覚醒時と比べて差がないことがわかった。今後は、代謝マッピングに電気生理学的手法やsubstance Pの脳内分布測定などを併用して、鎮痛薬の中枢神経系への作用をより多角的に究明していくことが重要であろう。脊髄から脳幹・視床および大脳皮質にいたる痛覚伝導と鎮痛作用を解明するために、以下の事項について検討した。1.全身麻酔時、末梢神経刺激の局所脳・脊髄代謝に及ぼす影響エンフルレン麻酔時、末梢神経刺激の局所脳・脊髄ブドウ糖消費量に及ぼす影響を【^(14)C】-deoxyglucose法を用いて検討した結果、脊髄後角の代謝亢進は麻酔深度の影響を受けないが、大脳知覚野の代謝亢進は深麻酔によく消失することがわかった。2.電気・温熱およびホルマリン刺激時の代謝変化末梢神経の電気刺激では、脊髄後角および大脳知覚野の代謝が亢進するが、四肢末梢の小範囲の温熱およびホルマリン刺激では明らかな代謝亢進は認められず、代謝変化をひきおこすためにはより広範囲の刺激を加える必要があることがわかった。3.モルヒネまたは局所麻酔薬のくも膜下腔および硬膜外注入法薬物をくも膜下腔または硬膜外に注入する方法は手技的に確立した。モルヒネまたは局所麻酔薬のくも膜下腔および硬膜外注入の鎮痛効果を検討した結果、くも膜下腔投与の方が効果が確実で再現性に優れていることがわかった。

4.モルヒネまたは局所麻酔薬のくも膜下腔注入時の脊髄代謝およびその刺激に対する反応モルヒネまたは局所麻酔薬をくも膜下腔に注入し脊髄局所のブドウ糖消費量を測定した結果、局所麻酔薬の方が脊髄代謝が低く、また刺激時の代謝亢進に対する抑制作用も局所麻酔薬の方が強いことが判明した。今後、モルヒネの下行性抑制系への作用を含め、痛覚の中継核の代謝変化についてさらに微細に検討を進める。
ヒトiPS細胞を用いた遺伝性進行性難聴DFNA５の病態解析と創薬スクリーニング

2018年度は、研究計画に基づいて正常iPS細胞にCRISPR/Cas9を用いてDFNA5変異を導入した、DFNA5疾患特異的iPS細胞を3ライン樹立した。これまでに、我々は、正常細胞からの内耳DFNA5陽性細胞の誘導法を確立している。(Hosoya etal, Cell Reports, 2017)これまでの予備実験による検討では、正常iPS細胞からDFNA5陽性細胞を高効率で誘導することが可能であることを確認していた。本研究においては、この方法を用いてDFNA5変異iPS細胞から同様の方法で変異DFNA5発現細胞を誘導することを予定していた。今年度は、実際にこれまでに樹立した疾患特異的iPS細胞から、DNFA5陽性細胞を誘導が可能であるか検討した。遺伝子変異を加えたDFNA5変異iPS細胞からもこれまでの正常細胞に対する誘導法と同様の方法によってDFNA5発現する内耳細胞を誘導することが可能であった。実際樹立した3ラインに対して誘導を行いライン間の差も検討したが、ライン毎に大きな差がなく、DFNA5の発現を確認することが可能であった。DFNA5の発現に関しては、RNAレベルおよびタンパクレベルでの発現を確認することが可能であった。並行して、正常細胞におけるDFNA5の発現の変化をRNAレベルおよびタンパクレベルで解析した。細胞ストレスXを負荷した場合、DFNA5の発現量はRNAレベルで増加することが分かった。一方、その後タンパクとして合成されたDFNA5はストレスの増加に伴い切断され分子量が変化することが確認された。今後、疾患ラインにおいて本現象が影響されるかどうかを検討する。当初の予定通り、複数の疾患ラインを準備することができた。今後は、これらのラインを用いて実験計画に基づき機能解析を行っていく。疾患ラインからも目的とするDFNA5陽性内耳細胞の誘導が可能であることが確認された。本細胞と、正常ラインから誘導された内耳細胞を比較検討することで、今後の研究が順調に進められると考えられる。また、正常ラインにおけるDFNA5の発現誘導、タンパク合成後の切断などの現象などの基礎的なプラットフォーム作成が2018年度に終了した。このため、予定通り、今後のこの系を用いたDFNA5変異の細胞に与える影響を解析することが可能であり、研究はおおむね順調に進展していると考えられる。正常ラインにおけるDFNA5の発現誘導、タンパク合成後の切断などの現象などの基礎的なプラットフォーム作成が2018年度に終了した。今後、この系を用いて、DFNA5の変異が細胞生物学的に、どのような変化をもたらすかを検討する。具体的には、正常細胞由来内耳細胞と同様に、DFNA5変異内耳細胞に細胞ストレスXを加え、発現量に変化がみられるか、細胞ストレスに対する脆弱性がどのように変化するか、また、正常細胞にみられたタンパクレベルでの切断が影響されるかについて検討を加える。正常細胞と変異細胞の間で違いがみられた場合、それが、難聴の原因を説明しうる可能性が高かった場合は、2019年度の実験計画通り、薬剤スクリーニングを試みる予定である。

正常ラインにおけるDFNA5の発現誘導、タンパク合成後の切断などの現象などの基礎的なプラットフォーム作成が2018年度に終了した。今後、この系を用いて、DFNA5の変異が細胞生物学的に、どのような変化をもたらすかを検討する。具体的には、正常細胞由来内耳細胞と同様に、DFNA5変異内耳細胞に細胞ストレスXを加え、発現量に変化がみられるか、細胞ストレスに対する脆弱性がどのように変化するか、また、正常細胞にみられたタンパクレベルでの切断が影響されるかについて検討を加える。正常細胞と変異細胞の間で違いがみられた場合、それが、難聴の原因を説明しうる可能性が高かった場合は、2019年度の実験計画通り、薬剤スクリーニングを試みる予定である。今年度予定の実験計画が順調に進んだため消耗品費を減少させることが可能であった。2019年度は薬剤スクリーニングを予定しており、次年度使用額と合わせてより規模の大きい薬剤スクリーニングを展開する。
高大連携を意識した学習指導要領「商業」における会計分野に属する科目教育法の開発

2018年度は先行研究のレビューを実施し,その取りまとめ作業に着手した。本研究は,高等学校学習指導要領「商業」における会計分野に属する科目教育法の開発を,高大連携の観点から行うことを目的としている。そのために,日本における商業教育の変遷を明らかにすることは重要であるため,「学制」発布以前から発布以降にかけての日本における商業教育ないしはビジネス教育の発展を分析した。それとともに,学習指導要領の変化と新学習指導要領「商業」の概要の検討を行った。その結果の一部を大学における公開講座等で公開した。研究成果の一部を公開した大学の公開講座等は2つであり,1つ目は,国際経営学部創設10周年記念サロン講座「聞いてナットク!研究よもやま話」での講義である。講義の題名は「大学・高校現場から考える現代におけるビジネス教育」(2018年10月27日)である。この講義では,主として高校と大学で展開されているビジネス教育の問題点と将来課題を扱った。2つ目は,別府大学公開講座「一世紀を越えて」での講義である。講義の題名は「変貌を遂げるビジネス教育ー授業改革ヒストリー」(2019年1月8日)である。この講義では,学制発布前後の商業教育・ビジネス教育の変遷を捉え,新学習指導要領の公表とともに,商業教育・ビジネス教育がどのように変化しているのかという点を扱った。これらの成果発表は公開講座等の枠内のものであり,当該講座は「教育」には貢献したものの,学会への貢献ではない。そのために2019年度は学会において成果を公表していく予定である。ただし,これらの2つの講義を準備するのための文献収集・文献研究などが今後の本研究進捗の足掛かりとなったことは間違いない。そのため,これらの公開講座等での成果をさらに発展させていき,学術的な研究成果を2019年度に公表する。研究初年度であった2017年度は本研究テーマとは直接関連性のないテーマでの博士学位論文の執筆に大幅に時間をかけたため,先行研究のレビューは実施できていたものの本研究課題に関する研究に十分に時間を割くことができなかった。そのため,実質的には2018年度から本格的な研究を開始することとなった。2018年度の研究の成果は国際経営学部創設10周年記念「サロン講座」や別府大学の公開講において公表した。これらによって,「学制」発布前後の日本における商業教育の概要と,それ以降の商業教育・ビジネス教育の発展を理解することができた。さらに,新学習指導要領「商業」における考え方について理解を深めることができた。これらの活動により,研究の基礎が完全とはいえないが整ってきたと考えている。2019年度はこれまでの研究の遅れを取り戻すべく積極的に研究を遂行していきたい。そのための具体的な方策は以下の通りである。1.学会にて,現在,高校における商業教育の抱えている諸問題と高大連携教育の将来あるべき姿について,報告を行う。2.高校教員に対するアンケート調査を実施する。調査内容は,主として会計分野に属する科目教育法に関するものを予定している。3.高校教員に対するヒアリング調査を実施する。4.上記の研究結果に基づき論文を執筆する。本研究の目的は,学習指導要領「商業」に基づいた会計科目教育を「高大連携」の視点から捉え,より良い教員養成システムの開発を高校側・大学側の双方から行うことを目的としている。上記目的の達成のため,平成29年度においては,主としての先行研究のレビューを行った。教科教育に関する先行研究は少なくないものの,商業科教育に関するものは非常に少ない。その中でも本年度は重要と思われる先行研究(図書)をまずは収集し,分析を試みた。ただし,その中には研究内容と密接に関連している,「高大連携」と「会計科目教育」との関係を「教員養成」の視点から明確かつ体系的に述べている最新の文献は見当たらなかった。むろん,今後も継続的に先行研究のレビューを実施していかなければならないが,現時点においては,この点が本研究の新規性のある部分であると考えられる。このようなレビューは図書がメインであったため,引き続き研究論文のレビューを行っていかなければならない。平成29年度は先行研究のレビューのみならず,学会で教員養成に関する他大学における取り組みを学ぶため,教育系学会における研究報告に参加した。しかし,そこでは「商業」に係る事例紹介は行われなかった。そのため,教育学系の学会において,本研究テーマに関連した報告を行う必要性があると思われる。さらに,参加した会計学に関する学会では高大連携に関して研究代表者の研究趣旨に比較的近いと思われる報告も実施されていた。ただし,そこでは,ある大学と,ある高等学校との専門教育の連携に焦点が絞られており,教員養成システムを意図する本研究とは異なるものであった。これらの先行研究のレビューや学会における研究動向調査により,平成30年度から本格的に実践される高大連携を意識した会計科目教授方法の研究の下準備を行うことができたことは明らかであり,本研究の新規性がより明白になったといえる。平成29年度は会計学に関する本研究テーマとは異なる他の研究テーマの論文執筆に大幅な時間を要したことに起因し,本研究テーマにおける研究が大幅に遅延した。さらに,同年度は,先行研究のレビューと学会における研究動向調査が主たる本研究テーマにおける研究活動であったため,それらの結果を受けての論文執筆などを実施することができなかった。それゆえに,平成30年度からはこのような遅延を取り戻すための計画を再度見直すとともに,進捗を改善していく。

2018年度は先行研究のレビューを実施し,その取りまとめ作業に着手した。本研究は,高等学校学習指導要領「商業」における会計分野に属する科目教育法の開発を,高大連携の観点から行うことを目的としている。そのために,日本における商業教育の変遷を明らかにすることは重要であるため,「学制」発布以前から発布以降にかけての日本における商業教育ないしはビジネス教育の発展を分析した。それとともに,学習指導要領の変化と新学習指導要領「商業」の概要の検討を行った。その結果の一部を大学における公開講座等で公開した。研究成果の一部を公開した大学の公開講座等は2つであり,1つ目は,国際経営学部創設10周年記念サロン講座「聞いてナットク!研究よもやま話」での講義である。講義の題名は「大学・高校現場から考える現代におけるビジネス教育」(2018年10月27日)である。この講義では,主として高校と大学で展開されているビジネス教育の問題点と将来課題を扱った。2つ目は,別府大学公開講座「一世紀を越えて」での講義である。講義の題名は「変貌を遂げるビジネス教育ー授業改革ヒストリー」(2019年1月8日)である。この講義では,学制発布前後の商業教育・ビジネス教育の変遷を捉え,新学習指導要領の公表とともに,商業教育・ビジネス教育がどのように変化しているのかという点を扱った。これらの成果発表は公開講座等の枠内のものであり,当該講座は「教育」には貢献したものの,学会への貢献ではない。そのために2019年度は学会において成果を公表していく予定である。ただし,これらの2つの講義を準備するのための文献収集・文献研究などが今後の本研究進捗の足掛かりとなったことは間違いない。そのため,これらの公開講座等での成果をさらに発展させていき,学術的な研究成果を2019年度に公表する。研究初年度であった2017年度は本研究テーマとは直接関連性のないテーマでの博士学位論文の執筆に大幅に時間をかけたため,先行研究のレビューは実施できていたものの本研究課題に関する研究に十分に時間を割くことができなかった。そのため,実質的には2018年度から本格的な研究を開始することとなった。2018年度の研究の成果は国際経営学部創設10周年記念「サロン講座」や別府大学の公開講において公表した。これらによって,「学制」発布前後の日本における商業教育の概要と,それ以降の商業教育・ビジネス教育の発展を理解することができた。さらに,新学習指導要領「商業」における考え方について理解を深めることができた。これらの活動により,研究の基礎が完全とはいえないが整ってきたと考えている。平成30年度・平成31年度は本研究の重要な研究手法であるアンケート調査に入る。サンプルは,研究代表者の所在する県における高校で「商業」を担当する教員を予定している。アンケート調査から得られた研究成果により,高校で教鞭を取る高校教員の会計学関連科目教育に際しての問題点を洗い出す。
サプリメント摂取による微量元素の過剰摂取が老人性神経障害に及ぼす影響

天然原料より作られたサプリメントには、高齢者に多い神経変性疾患との関連性が指摘されているアルミニウム(Al)およびマンガン(Mn)が多く含まれているものがあった。動物試験において、AlおよびMnの長期間曝露は活動量の低下を引き起こす可能性があること、また、Mn投与群において、用量依存的に記憶能の低下が認められることが明らかになった。アンケート調査の結果では、現在サプリメントを摂取している人は,健康に気を使って食事をしている人が多く、現在摂取している人の66%が毎日飲用していた。また、サプリメントの種類としては、天然原料のものが多かった。以上の結果より、サプリメントの常用による微量元素の過剰摂取の可能性があることが示唆された。微量元素が不足すると欠乏症状が生じ、体調に異変が生じる。しかし、これらの元素を過剰摂取すると健康被害を起こすことも知られている。この欠乏症が現れる量と過剰症が現れる量の間が狭いのが微量元素の特徴である。近年、人々の健康への関心が高まり、種々のサプリメントを常用する人が増えている。食品とサプリメントを合わせて摂取することにより、食品のみから摂る場合には注意する必要のなかった栄養素の過剰摂取が起こる可能性があり、長期間のサプリメント摂取により老人性神経障害が起こる危険性も考えられる。そこで、本研究ではサプリメント中に含まれる老人性神経障害に関与する疑いのあるアルミニウム(Al)、マンガン(Mn)などの微量元素量を調べた。さらに、AlおよびMnの長期にわたる過剰摂取が神経系に及ぼす影響をマウスによる行動試験や生化学臨床検査により調べた。その結果、植物や動物などの天然原料由来のサプリメントで微量元素量が高いものが多かった。特に、野菜、ウコン、田七人参などを原料にして製造されたサプリメントでAlおよびMn量が高いものがあった。サプリメントの多種類常用摂取による微量元素の過剰摂取に注意する必要がある。マウスを用いた回転カゴによる行動試験では、対照群に比べて、Al投与群で活動量の低下が認められた。Mn投与群では、変動幅が大きかったものの長期間投与で活動量の低下が観察された。ただし、AlとMnの組み合わせ投与による相乗効果は認められず、単独投与群とほぼ同じ活動量の低下であった。以上の結果より、AlおよびMnの長期曝露は動物行動の低下を引きこすことが示唆された。一方、生化学臨床検査の結果よりマウスへのAlおよびMn投与による腎毒性や肝毒性は認められなかった。近年,種々のサプリメントを摂取するヒトが増えており,これまでより微量元素の過剰摂取が起こっている可能性がある。昨年度までの研究で,天然原料より作られたサプリメントには,高齢者に多い神経変性疾患との関連性が指摘されているアルミニウム(Al)およびマンガン(Mn)が多く含まれているものがあること,また,AlおよびMnのマウスへの長期間曝露が動物行動(回転カゴでの活動量)の低下を引き起こす可能性があることを示した。本年度の研究では,まず,サプリメントの摂取状況および意識調査を行い,サプリメント過剰摂取の可能性を調べた。その結果,1820歳の男子では22.2%,女子では20.2%の人に摂取経験あり,摂取しているサプリメントの種類はビタミン類,プロテインが多かったのに対し,20歳以上では,女性で51.7%,男性で47.4%に摂取経験があった。また,現在摂取している人は,健康に気を使って食事をしている人が多く,63.0%が毎日飲用していた。サプリメントの種類としては,天然原料のものが多かった。以上の結果より,サプリメント摂取に伴う微量元素の過剰摂取の可能性が示唆された。次に,AlおよびMnの長期曝露がラットの記憶能力に及ぼす影響を調べるため,32週齢Wister系雄性ラットに,乳酸アルミニウムおよび塩化マンガン水溶液(それぞれAlおよびMnとして10,100,1000mg/L)を19ヶ月間飲料水として自由摂取させ,ステップ・スルー型受動的回避学習試験を行った。その結果,対照群に比べて,Al投与群では,記憶能の低下は認められなかったが,Mn投与群においては,用量依存的に記憶能の低下が認められた。天然原料より作られたサプリメントには,高齢者に多い神経変性疾患との関連性が指摘されているアルミニウム(Al)およびマンガン(Mn)が多く含まれているものがあること,また,AlおよびMnの加齢マウスへの長期間曝露が回転カゴでの活動量の低下を引き起こす可能性があることを昨年度までの研究で明らかにした。

また,32週齢ラットに,乳酸アルミニウムおよび塩化マンガン水溶液(それぞれAlおよびMnとして10,100,1000mg/L)を19ヶ月間飲料水として自由摂取させ,ステップ・スルー型受動的回避学習試験を行った結果,対照群に比べて,Al投与群では,記憶能の低下は認められなかったが,Mn投与群においては,用量依存的に記憶能の低下が認められることが明らかになった。今年度は,行動試験終了後,ラットを解剖し,血清について生化学検査を行った。さらに,脳を摘出し,AlおよびMnの脳への蓄積性をマイクロウェーブ分解後,ICP-MS法により調べた。また,人の微量元素の過剰摂取の可能性を調べるため,幅広い年代層の人を対象にアンケートにより,サプリメントの摂取状況および意識調査を行った。血清の生化学検査の結果,コントロール群に比べて有意に値が上昇している指標はなかった。このことより,AlおよびMnの長期投与により,肝毒性,腎毒性,膵臓毒性,電解質異常は認められないことが示された。脳へのそれぞれの元素の蓄積性については,コントロール群と比べてAl低用量投与群でAlが,Mn高用量投与群でMnの若干の脳への蓄積が見られた。アンケート調査の結果,現在サプリメントを摂取している人は,健康に気を使って食事をしている人が多く,現在摂取している人の66.0%が毎日飲用していた。また,サプリメントの種類としては,天然原料のものが多かった。サプリメントの常用による微量元素の過剰摂取の可能性があることが示唆された。
超音波の分子標的治療増強効果に関する基礎的研究

1.目的超音波を利用して、分子標的治療の効果の増強を計るための基礎的検討を行う。2.方法と結果(1)使用細胞株:ほぼ100%の細胞にCD20抗原が発現していることを確認したヒトリンパ腫由来の細胞株SU-DHL-4を用いた。(2)分子標的治療薬:非ホジキンリンパ腫の治療に用いられている抗CD20モノクロナール抗体(rituximab)を用いた。(3)超音波と分子標的治療薬による細胞死の誘導Rituximabの使用量の設定:10^<-1>μg/mlから10^<-3>μg/mlの濃度で培養を行ったところ、10^<-2>μg/mlで有意な抗腫瘍効果がみられた。したがって実験には10^<-2>μg/mlの濃度を用いた。超音波照射方法の検討:rituximabと超音波照射の併用による効果のみを検討するために、超音波による熱作用とフリーラジカル発生が生じない条件を決めた。40°C以下では熱作用は認められなかったため、実験は37°Cで行った。フリーラジカルの発生は、細胞培養シャーレ内の炭酸ガスを充満する方法で検討したところ、完全に抑制されることが明らかになった。細胞死の観察:照射後に24時間培養して、フローサイトメトリーにより早期アポトーシス、二次ネクローシスを観察した。3.成果と今後の展開(1)超音波照射によるrituximabの作用増強効果:抗腫瘍効果のみられる最低濃度(10^<-2>μg/mlに2.5W/cm^2の超音波照射を加えることで、相乗的な殺細胞効果が得られた。(2)機序:本研究から殺細胞効果の増強はアポトーシスによるものであり、アポトーシスに陥った細胞はさらに二次ネクローシスへと至るものと推定される。超音波照射は、分子標的治療薬の殺細胞効果を相乗的に増強することが明らかになり、今後の臨床応用に向けての基礎的データが得られた。1.目的超音波を利用して、悪性腫瘍に対する分子標的治療の効果の増強を図るための基礎的検討を行う。2.方法(1)使用細胞株:フローサイトメーターを用いてほぼ100%の細胞の表面にCD20が発現していることを確認したヒトリンパ腫由来細胞株SU-DHL-4を用いた。(2)分子標的治療薬:CD20抗原陽性非ホジキンリンパ腫の治療に用いられている抗CD20モノクローナル抗体(rituximab)を用いた。(3)細胞死の誘導超音波照射方法の検討:超音波照射によるフリーラジカル発生にともなう細胞傷害を無くし、rituximabと超音波そのものによる細胞死の誘導を検討するために、細胞培養シャーレ内に炭酸ガスを充満して照射を行った。超音波は2.5W/cm^2で2分間照射し、rituximabは10^<-1>から10^<-3>μg/mlまで濃度を変えて検討した。細胞死の観察:照射後24時間培養し、フローサイトメトリーによりannexin Vおよびpropidium iodideを用いて早期アポトーシス、二次ネクローシスを観察した。さらに、細胞死のメカニズムの解明のための細胞内カルシウムイオンの濃度を測定した。3.成果と今後の展開(1)超音波照射によるrituximabの作用増強

効果:低濃度のrituximab (10^<-2>μg/ml)と超音波照射を併用することにより、それぞれ単独で作用させるよりも有意な殺細胞効果の増強が得られた。なお、本結果は、超音波のsonomechanicalな効果と考えられた。(2)機序の推定:今回の実験からは、誘導される死はアポトーシスであることが明らかになった。しかし、細胞死を誘導した際に、細胞内カルシウムイオン濃度が明らかに上昇することが分り、細胞膜の変化も大きく関与している可能性が考えられた。この変化は細胞の膨化(oncosis)と関連があり、誘導される細胞死が必ずしもアポトーシスのみではないか、あるいは早期アポトーシスに陥った細胞の細胞膜に変化が生じ、このために細胞膜の透過性が亢進したとも考えられる。今後他の分子標的治療薬での超音波併用増強効果の検討を行うとともに、メカニズムの検討を進める予定である。1.目的超音波を利用して、悪性リンパ腫を中心とする悪性腫瘍に対する分子標的治療の効果の増強を計るための基礎的検討を行う。2.方法と結果(1)使用細胞株:フローサイトメーターによりほぼ100%の細胞にCD20抗原が発現していることを確認したヒトリンパ腫由来の細胞株SU-DHL-4を用いた。(2)分子標的治療薬:CD20抗原陽性非ポジキンリンパ腫の治療に用いられている抗CD20モノクローナル抗体(rituximab)を用いた。(3)超音波と分子標的治療薬による細胞死の誘導Rituximabの使用量の設定:10^<-1>μg/mlから10^<-3>μg/mlの濃度で培養を行ったところ、10^<-2>μg/mlで有意な抗腫瘍効果がみられた。したがって実験には10^<-2>μg/mlの濃度を用いた。超音波照射方法の検討:rituximabと超音波照射の併用による効果のみを検討するために、超音波による熱作用とフリーラジカル発生が生じない条件を決めた。熱作用については37°Cから43°Cの間で検討した。40°C以下では熱作用は認められなかった。実験は37°Cで行われた。フリーラジカルの発生は、0.5W/cm^2から2.5W/cm^2の超音波強度について細胞培養シャーレ内に炭酸ガスを充満する方法で検討したところ、完全に抑制されることが明らかになった。細胞死の観察:照射後に24時間培養して、フローサイトメトリーによりannexin Vおよびpropidium iodideを用いて早期アポトーシス、二次ネクローシスを観察した。3.成果と今後の展開(1)超音波照射によるrituximabの作用増強効果:抗腫瘍効果のみられる最低濃度(10^<-2>μg/ml)に2.5W/cm^2の超音波照射を加えることで、相乗的な殺細胞効果が得られた。(2)機序:本研究から殺細胞効果の増強はアポトーシスによるものであり、アポトーシスに陥った細胞はさらに二次ネクローシスへと至るものと推定される。超音波照射は、分子標的治療薬の殺細胞効果を相乗的に増強することが明らかになり、今後の臨床応用に向けての基礎的データが得られた。
流通チャネル構造変化に組織能力と動的取引費用が及ぼす効果の理論的・実証的研究

2007年度は主に(1)卸売業者と小売業者の関係、(2)製造業者のコミュニケーション・チャネル構造、(3)製造業者と卸売業者の協調的関係について研究を行った。(1)がテーマとした流通チャネル構造における卸売業者の介在は、高度経済成長期から現代に至るまでの我が国の流通研究の大きな論題であったが、組織能力論の観点からの研究はほとんど行われておらず、意義があるものと考えられる。この研究では、卸売業者の小売業者への依存度を従属変数として、それに対して卸売業者が物流・金融・販売の諸活動について卓越した組織能力を持つ程度、その移転が困難である程度、そして卸売業者が特定の小売業者に対して関係特定的投資を行っている程度がそれぞれ影響を及ぼすものと仮説が設定された。卸売業者へのアンケート調査の結果、これらの仮説を実証的に支持する結果が得られた。(2)については、マス・カスタマイゼーションを行っている製造業者のコミュニケーション・チャネル構造の設計問題を取り上げた。多くの産業で増加しているマス・カスタマイゼーションは双方向型のコミュニケーションを必要とするが、この問題はこれまで我が国では研究されておらず、欧米でも生産財を対象とするものに限られていた。製造業者が販売員・ウェブサイトの2つの販売方法を、垂直統合するか分離するかという問題をたてて、組織能力および動的取引費用の観点からのモデル化を試みた。モデルは製造業者を対象としたアンケート調査によって分析され、概ね支持された。(3)は、昨年度からの継続で行った研究である。流通チャネルにおいて、製造業者と卸売業者がスポット的な取引関係を選択せず、長期にわたる協調的関係を形成することを、資産特殊性を加味した関係的契約モデルに基づいてモデル化した。形成された仮説は製造業者について収集されたアンケートデータを用いて実証分析され、実証的に支持された。初年度は主として、文献研究に基づく理論研究およびアンケート調査に基づく実証研究の2本立てで研究を行った。理論研究では、企業間での流通機能分担関係の変質にフォーカスして、垂直的企業境界の変質をめぐる議論を集中的にレビューした。とりわけ、動的取引費用と組織能力に着目する論者であるRichard Langloisを中心として生じた近年の「消えゆく手」論争に注目し、取引費用モデルとモジュール化のアプローチに基づいた企業間関係の構造変化モデルを検討した。その上で、流通チャネル構造変化への応用可能性を探った。実証研究では、日本企業を対象としたアンケート調査を2度行った。第1に、流通チャネルの川下からの視点として、日本の自動車流通において頻繁に観察されている製品形態確定の延期化とそれを可能とする組織能力にフォーカスして、自動車小売業者(ディーラー)の各事業所を対象としたアンケート調査を行った。その結果、意思決定者たる小売業のマネジャーの技術革新および需要不確実性への知覚が製品形態確定および発注の延期化を促進していることが発見された。第2に、流通チャネルの川上からの視点として、流通チャネルにおける製造業者と流通業者との長期継続的取引関係の維持のメカニズムにフォーカスして、東証一部上場の製造業者の事業部を対象としたアンケート調査を行った。その結果、流通チャネル構造および取引関係を安定的に維持する要因は、取引主体が抱く「将来の重要性」であり、資産特殊性はそれらを媒介してのみ影響を与えていることが発見された。川中である卸売業者についての調査は現在準備中であり、次年度の課題として残された。本年度の研究成果は現在、学術雑誌に投稿中である。平成18年度は、企業対象のアンケート調査に基づく実証研究を中心に研究を行った。流通チャネルの構造変化に影響を及ぼす要因である動的取引費用と組織能力に関する前年度の文献研究に基づいて、製造業者による卸売機能の内部化一外部化問題を取り上げた。製造業者は製品の販売にあたって卸売機能を必要とするが、その卸売機能は誰が担っても構わない。このとき、卸売業者が持つ卸売機能遂行の組織能力が高く、しかもその組織能力を製造業者が模倣困難であるならば、製造業者は卸売機能を外部化することとなる。この仮説について実証研究が行われ、研究成果は国際学会にて報告された。また、前年度に行ったアンケート調査に基づいた研究について、精緻化が進められた。第1に、日本の自動車流通において頻繁に観察されている製品形態確定の延期とそれを可能とする組織能力についての研究である。この研究については、国内・海外の複数の学会報告で査読者・討論者から頂いたコメントをふまえて修正し、現在、学術雑誌に投稿中である。第2に、流通チャネルの川上に位置する製造業者と流通業者との長期的取引関係に関する研究については、理論分析を中心としたマーケティング・サイエンス的な論文と、行動科学的な関係性マーケティング的な論文とに分割され、それぞれ国際学会で採択された。18年度の最後には、流通チャネル構造の川中に位置する卸売業者を対象として、アンケート調査を行った。現在、情報通信技術の革新に伴って、卸売業者の中抜きが社会的に問題視されている。しかし、卸売業者の介在・排除については、製品特性に基づく産業効果が大きく、卸売業者が持つ組織能力とその移転にかかわる動的取引費用についての研究は行われていなかった。研究成果については、現在、回収されたデータの分析を進めている。

(1)がテーマとした流通チャネル構造における卸売業者の介在は、高度経済成長期から現代に至るまでの我が国の流通研究の大きな論題であったが、組織能力論の観点からの研究はほとんど行われておらず、意義があるものと考えられる。この研究では、卸売業者の小売業者への依存度を従属変数として、それに対して卸売業者が物流・金融・販売の諸活動について卓越した組織能力を持つ程度、その移転が困難である程度、そして卸売業者が特定の小売業者に対して関係特定的投資を行っている程度がそれぞれ影響を及ぼすものと仮説が設定された。卸売業者へのアンケート調査の結果、これらの仮説を実証的に支持する結果が得られた。(2)については、マス・カスタマイゼーションを行っている製造業者のコミュニケーション・チャネル構造の設計問題を取り上げた。多くの産業で増加しているマス・カスタマイゼーションは双方向型のコミュニケーションを必要とするが、この問題はこれまで我が国では研究されておらず、欧米でも生産財を対象とするものに限られていた。製造業者が販売員・ウェブサイトの2つの販売方法を、垂直統合するか分離するかという問題をたてて、組織能力および動的取引費用の観点からのモデル化を試みた。モデルは製造業者を対象としたアンケート調査によって分析され、概ね支持された。(3)は、昨年度からの継続で行った研究である。流通チャネルにおいて、製造業者と卸売業者がスポット的な取引関係を選択せず、長期にわたる協調的関係を形成することを、資産特殊性を加味した関係的契約モデルに基づいてモデル化した。形成された仮説は製造業者について収集されたアンケートデータを用いて実証分析され、実証的に支持された。
ユビキチン結合酵素を標的とした癌抑制蛋白質の分解阻害による抗癌作用の解析

ユビキチン結合酵素を標的とした癌抑制蛋白質の分解阻害による抗癌作用の解析の研究を行い、以下の成果を認めた。1 E2ドミナント変異体遺伝子の調整P53の分解に関与するとされるE2としてUbcH7を対象とし、p27の分解に関わるE2としてCDC34の他UbE2Nを対象とした。これらの完全長cDNAを遺伝子バンクより入手しpBluescript vectorに組み込み、部位特異的変異誘発法を用いて各E2のactive Cys残基(ユビキチン運搬活性部位)をコードする塩基をSer残基の塩基に置換した。こうしたE2遺伝子変異体の発現産物は、野生型E2に対してドミナントネガチィブに働くことが知られている。得られた各変異遺伝子のうちUbcH7、UbE2Nについては哺乳類細胞での発現が可能なpTRE2 vectorに組み込んだ。(Takada K. etal. Biochem J(2001)356 199-206)2 E2変異体遺伝子の導入標的遺伝子の定量的発現制御を行なうためそれぞれの培養細胞(p53モデルとしてHBE4-E6/E7、p27モデルとしてHL60)にpTet-On vectorをトランスフェクトした後、E2変異体遺伝子の入った発現ベクターをトランスフェクトした。これによりテトラサイクリン誘導体で導入遺伝子(E2変異体遺伝子)の発現調節が可能な細胞株の樹立を試みているが、現在まで同誘導体の濃度に依存した発現誘導が認められていない。ドミナント変異体遺伝子の再調整を行なっているが、small interfering RNA (siRNA)による発現阻害についても検討している。また食道癌においてE2の一つであるE2-EPFの発現が亢進していることをDNAチップを用いた検討により見出したため、あわせてこの発現抑制の検討も行なっている。ユビキチン結合酵素を標的とした癌抑制蛋白質の分解阻害による抗癌作用の解析の研究を行い、本年度は以下の成果を認めた。1)培養癌細胞の選定と癌抑制蛋白質の検出実験に用いる培養細胞は、正常なp53またはp27を有し、分解亢進によって各蛋白レベルが低下していることが必要とされる。その条件を満たす細胞株としてp53についてはHBE4-E6/E7(HPV-16由来E6/E7遺伝子で不死化した肺気管支上皮細胞)を選定し、p27についてはHL60(前骨髄性白血病)、HeLa(子宮頚癌)を選定した。各細胞においてノザンブロットによる遺伝子発現を確認し、またイムノブロットにより蛋白質レベルの発現が抑制されていることを確認した。2)E2ドミナント変異体遺伝子の調整P53の分解に関与するとされるE2としてUbcH4、UbcH5を対象とし、p27の分解に関わるE2としてCDC34、UbcH5を対象とした。これらの完全長cDNAを遺伝子バンクより入手でき次第pBluescript vectorに組み込み、部位特異的変異誘発法を用いて各E2のactive Cys残基(ユビキチン運搬活性部位)をコードする塩基をSer残基の塩基に置換する。得られた各変異遺伝子を哺乳類細胞での発現が可能なpTRE2 vectorに組み込む予定である。
新世紀にそなえる数学教育の理念・内容・教師像の総合研究

本研究が次の目標を掲げて遂行された;1)21世紀の日本の命運を左右する数学教育の改善を,その理念/哲学および内容/方法の根底から見直す.2)若者の理工“離れ"数学嫌いの傾向を挽回し,科学技術創造の新国是を担う人材育成の道を数学教育の立湯から探る.3)次期教育課程編成への寄与となる知見を提出・集約する.この目的に向けて,新世紀を担う数学教育の理念・内容,そうして教師の在り方について検討を重ね,つぎに要約するような知見が得られた.1.数学的リテラシーと数学的思考力を2焦点の目標とする理念は,新世紀の数学教育の指導原理であり,時間数の制約が厳しくなる次期指導要領の編成にあたっても尊重されるべきである.2.現指導要領に基づく高校数学の教育は,(コンピュータ単元の不振を別として)成果をあげている.3.第1項に述べた考え方は,科学技術者の養成を目指す大学における数学教育の指針でもあり得る.4.科学・技術を真にリ-ドする人材の育成には,科学的思考力の根幹である数学的知性の育成が肝要である.5.次期教育課程においても,高校数学教育については,現行指導要領の作成の根底に据えられた,生徒の分極化に対処するための「数学的リテラシーおよび数学的思考力を2焦点とする目的意識」ならびに「コア・オプション型カリキュラムによる選択性の拡大」を,継承するのが妥当である.6.上記の目標の実現のための決め手は,教師の見識の深化と資質の向上である.7.コンピュータ・グラフ電卓の活用推進の努力を継続するべきである.15EA09:最後に,数学教育に対する国際的な視野からの考察の重要性も認識され,とくに,ICME-9(2000年に日本で開催)の意義が確認された.本研究が次の目標を掲げて遂行された;1)21世紀の日本の命運を左右する数学教育の改善を,その理念/哲学および内容/方法の根底から見直す.2)若者の理工“離れ"数学嫌いの傾向を挽回し,科学技術創造の新国是を担う人材育成の道を数学教育の立湯から探る.3)次期教育課程編成への寄与となる知見を提出・集約する.この目的に向けて,新世紀を担う数学教育の理念・内容,そうして教師の在り方について検討を重ね,つぎに要約するような知見が得られた.1.数学的リテラシーと数学的思考力を2焦点の目標とする理念は,新世紀の数学教育の指導原理であり,時間数の制約が厳しくなる次期指導要領の編成にあたっても尊重されるべきである.2.現指導要領に基づく高校数学の教育は,(コンピュータ単元の不振を別として)成果をあげている.3.第1項に述べた考え方は,科学技術者の養成を目指す大学における数学教育の指針でもあり得る.4.科学・技術を真にリ-ドする人材の育成には,科学的思考力の根幹である数学的知性の育成が肝要である.5.次期教育課程においても,高校数学教育については,現行指導要領の作成の根底に据えられた,生徒の分極化に対処するための「数学的リテラシーおよび数学的思考力を2焦点とする目的意識」ならびに「コア・オプション型カリキュラムによる選択性の拡大」を,継承するのが妥当である.6.上記の目標の実現のための決め手は,教師の見識の深化と資質の向上である.7.コンピュータ・グラフ電卓の活用推進の努力を継続するべきである.15EA09:最後に,数学教育に対する国際的な視野からの考察の重要性も認識され,とくに,ICME-9(2000年に日本で開催)の意義が確認された.新世紀の到来に象徴される世界的な社会の変容ならびに日本が特に直面する危機的困難を視野におき,さらに,中央教育審議会等で方針の策定が図られつつある次期教育課程の編成への提言を意図しつつ研究を行い,次の知見を得た.1.数学的リテラシーと数学的思考力を2焦点の目標とする理念は,新世紀の数学教育の指導原理であるのみならず,時間数の制約がいっそう厳しくなる次期指導要領の編成の根拠である.また,この考え方は科学・技術教育にまで拡張され得るとの認識が確認された.2.新教育課程の編成においては,小学校における現代版3R'Sの一翼をになう算数教育は,国語につぐ基幹教科として認知され尊重されるべきである.また,中学における教育課程は,義務教育的な,あるいは小学校延長的な理念の功罪を見直し,今後はとくにクラス授業のなかでの個別能力の尊重と学問的萌芽育成をはかるべきであることが確認された.高校における数学教育は生徒の分極化に対処する数学的リテラシーおよび数学的思考力を2焦点の教育を,教師の見識の深化とコンピュータ・グラフ電卓の全面活用により構築するべきであることが確認された.3.未来の計算機科学を担う人材の育成のために中等教育で欠かすことのできないものの第一は「しっかりした論理性/独創性の育成であり,それを実現するためのしっかりした数学の教育」が致命的に重要である.このことについて,当研究班と計算機科学の指導的学者と意見の一致を見た.4.数学教育の専門学会(日本数学教育学会,数学教育学会,数学教育協議会)のみならず数学自体の研究学会(日本数学会,日本応用数理学会)も,若者の理工・数学"離れ"の挽回,産業の空洞化を克服しての科学技術立国への血路打開のために学校教育において格段に数学教育を重視することを訴えている.これらの総意を具体化し,かつ,物理および計算機科学の振興の努力と連携するための討論・研究を行った.

その成果は日本学術会議数学研究連絡委員会付置の数学教育委員会がまとめた中教審会長への要望および付属論説集「数学教育の重要性をあえて訴える」に反映されている.研究の第2年度であり,完結年度でもある今年度においては,世界的な社会の変容ならびに日本が特に直面する危機的状況(生徒の数学"離れ"を含む)を視野におき,さらに,次期教育課程への参考・戦訓を提供する趣旨をこめて、現指導要領の理念・構成の反省,同実践面での検討を行い,次の知見を得た.1.数学的リテラシーと数学的思考力を2焦点の目標とする理念は,新世紀の数学教育の指導原理であり、時間数の制約が厳しくなる状況下で、教師の資質向上と並ぶ次期指導要領編成の拠り所である.2.小学校における算数教育は、国語につぐ基幹教科として尊重されるべきであり,また,中学における数学教育は,クラス授業のなかでの個別能力の尊重と学問的発芽をはかるべきである.これに対し,授業時間減少への対策を「全教科一律削減」に求めるかに見える一部当局者の構えには失望せざるを得ない.高校における数学教育は、現指導要領においてすでに選択性の拡大を先取りしている.次期には,さらに生徒の分極化に対処する数学的リテラシーおよび数学的思考力を焦点とする教育を,教師の見識の深化とコンピュータ・グラフ電卓の全面活用により実現すべきである.3.最近唱道される科学技術振興策は,性急な果実を求める工学振興に流れがちである.新時代における国の知的生命線というべき計算機科学をリ-ドする人材,繁栄を回復に導く科学/技術の進歩をもたらす人材,さらに,知的パラダイム変換のなかで学問の新方法論を構築し得る人材の育成は,科学的思考力の根幹である数学的知性の育成なくしては不可能である.4.現指導要領に基づく高校数学の教育は,コンピュータ単元の不振を別とすれば,順調に進行し成果をあげている.一方,多くの大学がそれぞれの個別試験からコンピュータ単元を排除していることは認識不足による怠慢であるかもしれないが,その近未来への悪影響は深刻である.早急な改善を求めねばならない.
ワクシニアウイルスをベクターとした多価生ワクチン開発のための試験研究

ワクシニアウイルスに種々の外来遺伝子を挿入し、多価ベクターとして利用するために、血球凝集素(HA)遺伝子と、牛痘のA型封入体(ATI)遺伝子の分析を行なった。1.HA遺伝子内に、成人T細胞白血病ウイルス(HTLV-I)のenV遺伝子を2種類の方法で挿入し、その発現をまずinvitroで調べた。その結果、1)HA遺伝子内に外来遺伝子を含んでも、ワクシニアは増殖できる。2)外来抗原を持つ、組換えワクシニアウイルスは、プラークの色の違い(野性株はニワトリ赤血球で赤く染るが、組換えウイルスのプラークは無色のまま)で容易に分離できる。3)HAのプロモーターの強さは、今までよく使用されてきたp7.5プロモーターと匹敵することが判明した。これらの結果は、HA遺伝子部位が外来遺伝子挿入部位として適していることを示している。2.作成した組換えウイルスで兎を免疫してから、HTLV-Iをチャレンジして、兎が守られるかどうか調べた。その結果は、1)兎の血中に、高い抗env抗体が誘導された。2)チャレンジ後27週、観察を続けても今だ、HTLV-Iの抗原は認められず、感染は防御されたと思われる。3.ATI遺伝子をクローニングするために、牛痘DNAをSalIで消化しライブラリーを作成した。それを、トランスフェクションすることによりATT遺伝子を含むプラスミドを得た。さらに分析することにより以下の結果を得た。1)コーディング領域の上流には、ワクシニア後期プロモーター群と共通の塩基配列が存在した。2)分子量15万ダルトンの蛋白質をコードしている。3)ワクシニアウイルス中9万4千ダルトンのATI類似蛋白質を有している事が判明した。【i】)ワクシニアウイルスDNAの中で、外来DNAを挿入し得る箇所として血球凝集素(HA)遺伝子が考えられる。本年度は、HA蛋白質のアミノ酸分析を行なう事によって、既に私が決定していたHA遺伝子の塩基配列が正しい事を確証した。【ii】)次に、HA遺伝子内に、実際に、外来遺伝子を挿入し、発現させ得る事を例証するために、成人T細胞白血病ウイルスのenv遺伝子を二種類の方法でHA遺伝子内に挿入し、組換えワクシニアウイルスを作成した。この際種々のワクシニア株を用いた。A)1つの挿入方法は、HA遺伝子のプロモーターの直下にenv遺伝子を挿入するものであり、他は、アメリカのMOSS博士の用いているプロモーターの下流に連結した後でHA遺伝子の中に挿入するものである。両者の方法で、env蛋白質を発現する組換えウイルスが出来た。発現量はHAプロモーターを用いた方法の方がやや多かったが、その詳細については、現在検討中である。これらは、免疫沈降法,蛍光抗体法で調べた。B)実際にワクチンとして用いる時には、ワクシニア株の弱毒性と免疫賦与能との関係が重要である。この点を調べるために、WR株,LO株,LC16mO株,LC16m8株(順に弱毒化されている)をベースにした。種々の組換えウイルスを作った。C)以上各種の組換えウイルスをウサギに接種して、抗env抗体価の上昇を調べた。現在のところ、m8をベースにした組換えウイルス接種により、低いながら抗体価が上昇する事が分った。【iii】)他の外来遺伝子挿入可能箇所を捜すために、牛痘及びワクシニアのDNAをHind【III】又はSal【I】で切断し、大腸菌のプラズミドのPUC18及びPUC13にクローニングした。現在、ハイブリッドアレスト法により、A型封入体遺伝子のマッピングを進めている。