hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
植物細胞壁を介する病原体認識・応答のダイナミズム

これら2系統を使って、flg22誘導性のROS生成とカロース生成について調べたところ、いずれの応答も抑制され、病原細菌や糸状菌に対する罹病性が促進されることが明らかとなった。一方、PRX34過剰発現体では、ジフェニレンヨードニウム(DPI;NADPHオキシダーゼ阻害剤)非感受性のROS生成が観察されるとともに、病原細菌および糸状菌に対する抵抗性が付与された。以上から、PRX34はPTIを構成する因子の1つであり、細胞壁におけるROS生成やカロース生成を正に調節していることが明らかとなった(Zhao et al.,印刷中)。植物感染生理学研究の分野では2000年以降、細胞膜受容体(PRR)や下流因子の同定に関心が寄せられてきた。このような状況の中、申請者らは植物細胞壁に存在するエクト型ATPaseが自身の加水分解活性を通して細胞内外の情報伝達系を調節することなどから、植物細胞壁を「異物認識と応答を行う防人器官」として提唱している。中でも、2012年の発表論文では、植物細胞壁に防御応答に関連する巨大複合体(300750 kDa)が存在することを世界で初めて明らかにし、防人器官としての植物細胞壁の役割を決定的なものにした。本複合体には、エクト型ATPaseの他にクラスIII型ペルオキシダーゼ(活性酸素産生酵素)などを含んでおり、細胞壁を起点とする病原体認識・応答を調節する仕組みが明らかになりつつある。実際、今年度の研究から本複合体に糸状菌起源のキトサンオリゴ糖に対する特異的結合タンパク質を見出した。次年度は、その全容の解明に向けて、さらに生理・生化学および遺伝学的解析を進め、申請者が推測している情報伝達の流れを明らかにしていく予定である。植物細胞壁に含まれる巨大複合体は塩化ナトリウムで組織から容易に可溶化される。また、構成するペルオキシダーゼ(活性酸素産生酵素)は可溶化後もエリシターやサプレッサーに対する応答性を保持しており、さらに同複合体に含まれるATPaseはサプレッサーに応答してモノマー化する。31年度は本複合体を二次元Blue-Native PAGEで分画して構成する全タンパク質を明らかにする。これによって巨大複合体の実体が明らかとなり、複合体からのROS生成やATPaseによる調節機構の解明が期待される。鍵となる分子については、ノックアウト変異体を用いた解析を展開し、状況に応じて既知のシグナル変異体を利用して他の情報伝達系とのクロストークについて解析する。また、これまでの予備的な解析から、植物組織または分離細胞壁をエリシターで処理すると急速なROSの生成に伴って未同定の抗菌性物質(付着器からの侵入を阻害する)の生成が起こるが、抗酸化剤やサプレッサーを与えた場合にはその生成は顕著に阻害される。これは、遺伝子発現を伴って合成されるファイトアレキシンとは異なり、細胞壁(アポプラスト)で速やかに生成されるポストインヒビチン様の物質と推測している。31年度はその構造を明らかにし、定量法を確立して組織での生成速度や時期について調べ、防人器官としての植物細胞壁の役割を確かなものとする。
Gタンパク質シグナル伝達を可視化する発光プローブの開発

本申請研究では,Gタンパク質共益受容体(GPCR)とそのシグナル伝達に重要な細胞質局在タンパク質β-arrestinとの相互作用を,生きた細胞下で検出する発光プローブを開発する.プローブの原理は2断片に分割した発光タンパク質ルシフェラーゼを用い,それぞれをGPCRおよびβ-arrestinへ融合させる.GPCRとβ-arrestinが相互作用した場合,ルシフェラーゼ断片が接近し再構成の原理により全長ルシフェラーゼが構成され,発光能が回復する.前年度までに,発光強度の高いエメラルドルシフェラーゼの断片を用いて,複数種類のGPCRに融合させることで検出プローブを開発した.実際にGPCRの活性を上昇させるリガンドを加えた場合に相互作用が発光として検出される事を確認した.また,顕微鏡下での発光イメージングを行い,GPCRとβ-arrestinの相互作用からその解離までを発光イメージングで追跡できることを証明した.今年度は,検出プローブとは別に赤色波長ルシフェラーゼを細胞に導入する事で,検出プローブの発光を基準化することを試みた.この操作により,細胞の状態,発光基質濃度の変動等の影響を除いてより正確な薬剤応答を検出することが可能となる.これまでに確立していた検出プローブを安定的に発現する培養細胞株に対して,赤色波長ルシフェラーゼを導入し,安定発現株を樹立した.実際にリガンドを加え,プローブの発光および赤色発光をそれぞれ分光検出した.赤色発光値で基準化を行った結果,薬剤以外の影響で発光値が増加もしくは減少していた問題を修正でき,既存の方法よりも高感度なGPCR薬剤スクリーニングを実現した.本申請研究では,Gタンパク質共益受容体(GPCR)とそのシグナル伝達に重要な細胞質局在タンパク質β-arrestinとの相互作用を,生きた細胞下で検出する発光プローブを開発する.プローブの原理は2断片に分割した発光タンパク質ルシフェラーゼを用い,それぞれをGPCRおよびβ-arrestinへ融合させる.GPCRとβ-arrestinが相互作用した場合,ルシフェラーゼ断片が接近し再構成の原理により全長ルシフェラーゼが構成され,発光能が回復する.検出プローブに使用するルシフェラーゼとして,発光強度の高いエメラルドルシフェラーゼを選択した.このルシフェラーゼ断片をそれぞれGPCRおよびβ-arrestinへ融合して,GPCRの種類に応じて複数の検出プローブを作製した.さらに,この検出プローブを安定的に発現する培養細胞株を樹立した.実際にGPCRの活性を上昇させるリガンドを加えた場合に相互作用が発光として検出される事を確認した.通常,GPCRは細胞膜に局在し,リガンドの結合によってβ-arrestinと結合し膜から解離して細胞質中へ局在が移行する.そのダイナミクスを1細胞下で検出することを目的として,顕微鏡下での発光イメージングを行った.細胞株に対して基質ルシフェリンを投与し,リガンドを加えることでその発光反応の検出を試みた.結果,リガンドを加えて10-20分後に膜上で発光の輝点が確認され,そのうちのいくつかは細胞質中へ移行する様子が観察された.またこの発光輝点は時間経過とともに消失することから,GPCRとβ-arrestinの相互作用をその解離までを発光イメージングで追跡できることが証明された.本申請研究では,Gタンパク質共益受容体(GPCR)とそのシグナル伝達に重要な細胞質局在タンパク質β-arrestinとの相互作用を,生きた細胞下で検出する発光プローブを開発する.プローブの原理は2断片に分割した発光タンパク質ルシフェラーゼを用い,それぞれをGPCRおよびβ-arrestinへ融合させる.GPCRとβ-arrestinが相互作用した場合,ルシフェラーゼ断片が接近し再構成の原理により全長ルシフェラーゼが構成され,発光能が回復する.前年度までに,発光強度の高いエメラルドルシフェラーゼの断片を用いて,複数種類のGPCRに融合させることで検出プローブを開発した.実際にGPCRの活性を上昇させるリガンドを加えた場合に相互作用が発光として検出される事を確認した.また,顕微鏡下での発光イメージングを行い,GPCRとβ-arrestinの相互作用からその解離までを発光イメージングで追跡できることを証明した.今年度は,検出プローブとは別に赤色波長ルシフェラーゼを細胞に導入する事で,検出プローブの発光を基準化することを試みた.この操作により,細胞の状態,発光基質濃度の変動等の影響を除いてより正確な薬剤応答を検出することが可能となる.これまでに確立していた検出プローブを安定的に発現する培養細胞株に対して,赤色波長ルシフェラーゼを導入し,安定発現株を樹立した.実際にリガンドを加え,プローブの発光および赤色発光をそれぞれ分光検出した.赤色発光値で基準化を行った結果,薬剤以外の影響で発光値が増加もしくは減少していた問題を修正でき,既存の方法よりも高感度なGPCR薬剤スクリーニングを実現した.
看護職のストレス対策のためのマインドフルネス・アサーションプログラムの開発

本研究の目的は、マインドフルネスとアサーションを組み合わせたプログラムを開発・実施し、看護職のメンタルヘルスに対する効果を評価することである。看護職向けにプログラム(6回の研修+フォローアップ1回)を作成し、関東の1総合病院の看護職で、同意の得られた9名に実施した。研修前、6回の研修直後、フォローアップ時の3時点で、同内容の質問紙調査を実施し、6回の研修全てに参加した7名について分析した。精神的健康度と活気の尺度得点では、3時点で差がある傾向にあり、研修後に改善の傾向があった。自由記述でも、気持ちの安定、他者への思いやりの増加などが挙げられ、看護職のメンタルヘルスに役立つ可能性が示唆された。本研究の目的は、病院に勤務する看護師を対象に、マインドフルネス・アサーショントレーニングプログラムを作成・実施し、その有効性を評価することである。病院に勤務する看護職のストレスは依然として高い状況にあり、看護職が活き活きと働くために、自分自身の心身の状態に気づき、対処していくことは不可欠である。初年度の平成25年度は、マインドフルネス・アサーションプログラムの内容と実施方法の検討を行った。方法として、国内外のマインドフルネス、アサーションに関する書物や論文等の文献、専門家が作成した信頼できるウェブサイトの情報等から、実施内容や方法についての情報を集め、看護職が日常で実践できる、効果的な研修の方法について検討した。また、既存のマインドフルネスの研修会やアサーション・トレーニングへ参加することで、具体的な方法について検討を行った。それらを基に、より効果的なプログラムを作成するため、マインドフルネスとアサーションの位置づけを整理した。マインドフルネスは、今という瞬間に注意を向けることであり、マインドフルネスの様々な瞑想法により、状況を客観的に観る力や物事に捉われない力を養うことができる。また、様々な身体的症状や精神的症状を改善することが明らかにされていることから、まずマインドフルネスを基盤として習得し、心身の状況を整え、物事を客観的に観る力を高めた上で、実践的なコミュニケーションスキルであるアサーションを学ぶという構成でプログラムを考案した。マインドフルネスは、先行研究より8週間実施することでメンタルヘルスへの有意な効果が明らかとなっているため、2週間に1回半日×4回の計8週間のマインドフルネスの研修の後、アサーション・トレーニングを半日×4回実施する形のプログラムを考案した。今年度は、前年度に作成したプログラムを、協力の得られた1総合病院に勤務する看護職9名に対して実施し、自記式質問紙による調査を行った。協力の得られた1施設に勤務する看護職全員に、各部署に研修・研究のお知らせと内容についての資料を配布し、参加を呼びかけるポスターを掲示してもらった。その結果、9名の参加希望があった。参加者数が少なかったため、今回は対照群を置かず、9名に対してマインドフルネス・アサーションプログラムを実施した。プログラムは、対象施設の看護部と現実的に参加可能な回数を検討し、全6回(2週間に1回、3時間)のプログラムとした。前半3回は、マインドフルネスについて学び、体験する内容で、後半3回は、マインドフルネスの瞑想をはじめに行い、その後、アサーションの理論や考え方、方法について、講義とグループワークを通して学ぶ内容とした。プログラムの講師は、マインドフルネスの実践指導者研修とアサーション・トレーニングのトレーナー研修を受けた研究代表者が行った。プログラムの評価は、1回目の研修実施前と、6回目の研修実施直後、研修終了2ヵ月後(フォローアップ研修時)に、質問紙調査を行った。質問紙調査の内容は、基本属性(年齢、性別、経験年数、勤務形態、職種など)、日本語版POMS(Profile of Mood States)、K6日本語版(精神的健康度を測定する尺度)、日本語版Maslach Burnout Inventory -General Survey、職業性ストレス簡易調査票の一部、日本語版Utrecht Work Engagement Scale、研修参加の感想(自由記載)とした。現在9名の質問紙調査のデータを分析中であり、参加者へのインタビュー調査も進めている。今年度は昨年度に実施した質問紙調査の分析を行い、マインドフルネス・アサーション研修の効果について評価した。質問紙調査は、研修の実施前、6回の研修終了直後、フォローアップ時(6回の研修が終了した2ヵ月後)の3時点で行った。(インタビュー調査は協力者が集まらず、1名のみに実施した為、今回は参考資料とした。)調査内容は、基本属性(年齢、性別、経験年数、勤務形態、職種など)、日本語版POMS(気分の状態)、K6日本語版(精神的健康度)、日本語版MBI-GS(バーンアウト)、職業性ストレス簡易調査票(一部)、日本語版UWES(ワーク・エンゲイジメント)、研修参加の感想(自由記載)であった。分析の対象は、プログラムに参加した1病院の看護師9名のうち、6回の研修に全て参加した7名とし、分析方法は、反復測定一元配置分散分析を用いた。分析対象者は全て女性、平均年齢は32.86(±7.67)歳、平均看護師経験年数は、10.29(±7.76)年であった。分析の結果、「精神的健康度」、バーンアウト尺度の「職務効力感」、ワーク・エンゲイジメント尺度の「活力」、「上司のサポート」においては、測定時点による差がある傾向があった。(各時点ごとの多重比較では、職務効力感以外は有意ではなかった。)それ以外の測定項目は有意な差はなかった。

研修後に、「精神的健康度」は改善の傾向、「職務効力感」は低下の傾向、「活力」は増加の傾向、「上司のサポート」は低下の傾向があった。研修の感想の自由記述を分析したところ、「瞑想による気持ちの安定」「他者への思いやりの増加」「今の自分の呼吸や感情への気づき」「自分で出来る役立つ方法への気づき」「話しやすい雰囲気でのメンバーとの共有」などのカテゴリーが生成された。対象者が少なく限界はあるが、マインドフルネス・アサーション研修は、看護師のメンタルヘルスの改善に役立つ可能性が示唆された。本研究の目的は、マインドフルネスとアサーションを組み合わせたプログラムを開発・実施し、看護職のメンタルヘルスに対する効果を評価することである。看護職向けにプログラム(6回の研修+フォローアップ1回)を作成し、関東の1総合病院の看護職で、同意の得られた9名に実施した。研修前、6回の研修直後、フォローアップ時の3時点で、同内容の質問紙調査を実施し、6回の研修全てに参加した7名について分析した。精神的健康度と活気の尺度得点では、3時点で差がある傾向にあり、研修後に改善の傾向があった。自由記述でも、気持ちの安定、他者への思いやりの増加などが挙げられ、看護職のメンタルヘルスに役立つ可能性が示唆された。今年度、作成したマインドフルネス・アサーションプログラムを、対象施設の協力により、プログラムに興味・関心を持ち、研究の同意を得られた参加者9名に実施することができた。対象者は、9名と少なかったが、計画した全てのプログラム内容を実施することができた。プログラム実施前、実施直後、プログラム終了2ヵ月後(フォローアップ研修時)の3時点で、参加者への質問紙調査による、プログラムの評価を実施することができた。現在、質問紙調査のデータを分析中である。参加者が少なかった点については、勤務部署の状況によってなかなか研修に参加する時間をとることが難しく、関心があっても参加できなかった対象者がいる可能性があった。研修実施にあたっては、講師1名に9名の参加者で、講師は一人一人の状態や理解度を把握して進めることができた。また、研修の回を重ねるごとに、講師1名と9名の参加者のグループの相互作用が高まり、お互いの気づきを深めることができた。質問紙調査では測定できない、研修による参加者への影響を調べるために、現在、インタビュー調査を進めている。精神看護学今後は、調査の量的データを分析し、プログラムの効果について検討するとともに、インタビュー調査の参加者を引き続き募集し、質的な変化についても明らかにしていく予定である。インタビュー調査の対象者が必要な人数集まらない場合は、インタビューの方法についても検討していく(個別インタビューでなく、フォーカスグループインタビューにするな等)。学会等で、実施したマインドフルネス・アサーションプログラムの内容と参加者の変化について発表し、様々な視点からの意見を踏まえ、今後さらに効果的なプログラムにするための示唆を得る。文献検討や、既存のマインドフルネスやアサーションに関する研修に参加することで、情報収集を行い、本研究の研修内容と方法について検討を行った。
転写抑制因子として機能するセリン/スレオニンキナーゼの肉芽腫形成への影響

ブラウ症候群患者の末梢血でNOD2を発現するCD14陽性細胞より単離したmRNAに発現する遺伝子網羅解析の結果、転写抑制因子として機能するセリン/スレオニンキナーゼHIPK2(homeodomain-interacting protein kinase 2)の発現亢進を認めた。変異NOD2遺伝子をTHP1細胞に導入したが、HIPK2の発現は野生型と比べ差異がなかった。HEK293細胞にHIPK2とNOD2遺伝子を同時に遺伝子導入したところ、NOD2の発現亢進とNF-κBの転写活性亢進を認め、HIPK2遺伝子はNOD2遺伝子の発現を亢進させることで、肉芽腫形成を促進する可能性が示唆された。ブラウ症候群/若年発症サルコイドーシス(EOS)は、NOD2遺伝子の変異を基盤とし、明らかな外来因子の存在なしに肉芽腫をきたす疾患であるが、なぜNOD2の活性化が肉芽腫の形成に関わるかは依然として不明である。EOS患者の末梢血でNOD2を発現するCD14陽性細胞より単離したmRNAに発現する遺伝子網羅解析の結果,転写抑制因子として機能するセリン/スレオニンキナーゼの発現亢進を認めた。この結果より,我々はNOD2変異が関わる肉芽腫形成の候補遺伝子としてそのキナーゼ活性を持った分子に着目し検討した。代表的な変異NOD2遺伝子をウイルスベクターを用いてHEK293細胞に遺伝子導入し、そのキナーゼ活性を持った分子のmRNAおよびタンパクの発現を検討した予備実験では、いずれも発現は認めるものの、野生型と比べ発現亢進を認めなかった。そのため、よりEOS患者の状態に近い単球系のTHP1細胞に変異NOD2遺伝子をAmaxa法を用いて遺伝子導入し、同様に検討したが差異は認められなかった。次に、そのキナーゼ活性を持った分子の過剰発現が、NOD2の発現やNF-κBの転写活性に影響を与えるか評価するため、THP1細胞よりそのキナーゼ活性を持った分子のDNAを抽出し、過剰発現するウイルスベクターを作成した。現在、作成したそのキナーゼ活性を持った分子を過剰発現するウイルスベクターをTHP1細胞に導入し、NOD2の発現やNF-κBの転写活性に差異が認められるか検討中である。また、HEK293細胞にそのキナーゼ活性を持った分子と変異NOD2遺伝子を同時に遺伝子導入したときのNF-κBの転写活性も検討中である。EOS患者の末梢血でNOD2を発現するCD14陽性細胞より単離したmRNAに発現する遺伝子網羅解析の結果,転写抑制因子として機能するセリン/スレオニンキナーゼHIPK2(homeodomain-interacting protein kinase 2)の発現亢進を認めた。この結果より,我々はNOD2変異が関わる肉芽腫形成の候補遺伝子としてHIPK2に着目し検討した。代表的な変異NOD2遺伝子をウイルスベクターを用いてHEK293細胞に遺伝子導入し、HIPK2のmRNAおよびタンパクの発現を検討した実験では、いずれも発現は認めるものの、野生型と比べ発現亢進を認めなかった。そのため、よりEOS患者の状態に近い単球系のTHP1細胞に変異NOD2遺伝子をAmaxa法を用いて導入し、同様に検討したが差異は認められなかった。次に、HIPK2の過剰発現が、NOD2の発現やNF-κBの転写活性に影響を与えるか評価するため、THP1細胞よりHIPK2のDNAを抽出し、HIPK2を過剰発現するウイルスベクターを作成した。HIPK2を過剰発現するウイルスベクターをTHP1細胞に導入し、NOD2の発現やNF-κBの転写活性に差異が認められるか検討を試みたが、THP1細胞への遺伝子導入がAmaxa法を用いても困難であったため、検討を行うことができなかった。また、HEK293細胞にHIPK2とNOD2遺伝子を同時に遺伝子導入したところ、HIPK2はNOD2の発現を亢進させ、そのためNF-κBの転写活性も亢進した。したがって、HIPK2遺伝子はNOD2遺伝子の発現を亢進させることで、肉芽腫形成を促進する可能性が示唆された。皮膚科学目的の分子の分子量が大きいため、THP1細胞よりそのキナーゼ活性を持った分子のDNAを抽出し、過剰発現するウイルスベクターを作成する手順が難解であったこと、およびAmaxa法を使用しているが、浮遊細胞であるTHP1細胞への遺伝子導入が困難であったことが計画がやや遅れている原因であると考える。

現在、作成したそのキナーゼ活性を持っている分子を過剰発現するウイルスベクターをTHP1細胞に導入し、NOD2の発現やNF-κBの転写活性に差異が認められるか検討中である。また、HEK293細胞にそのキナーゼ活性を持った分子と変異NOD2遺伝子を同時に遺伝子導入したときのNF-κBの転写活性も検討中である。また、実験結果をまとめ,論文化して専門誌に投稿する予定である。
高CO_2濃度が木本植物の気孔反応と光合成・蒸散作用に及ぼす影響

本研究では,安定した流量を供給するダイアフラムポンプと高精度のマスフローコントローラーをもちい,CO_2濃度を高精度に制御可能な光合成・呼吸速度および蒸散速度を測定するシステムを安価に自作し,高CO_2濃度に対する樹木の光合成特性について気孔反応を中心に調べた.このシステムは,通常濃度下でもちいている赤外線CO_2ガス分析計のレンジを比較的簡単,かつ柔軟に高濃度範囲に対応させうる点に特徴がある.具体的には,0-600ppmの絶対値型の赤外線CO_2分析計をもちい,測定空気を正確に希釈することによって高濃度域の測定をおこなった.測定にもちいた同化箱は,温度調節可能なものを自作した.測定条件は,温度25°C,照度3540klx,同化箱への通気量2.51min-1の最適条件下で,針葉樹(スギ,アカマツ,カラマツ)は通常濃度(350ppm)から約5000ppmまで,広葉樹(シラカバ,ブナ,コナラ)は通常濃度から約3000ppmまでCO_2濃度を上昇させ,その時の光合成速度,蒸散速度を測定した.その結果,15002000ppmで光合成速度が飽和し,広葉樹は3種とも,10001500ppmと針葉樹に比べ,多少低いCO_2濃度で飽和した.また,その時の気孔コンダクタンスの変化は,広葉樹は針葉樹に対し,濃度上昇とともに気孔コンダクタンスが急激に低下した.そのため,針葉樹の葉内CO_2は,広葉樹よりも高くなった.このことから広葉樹では気孔の開閉による葉内CO_2濃度の調節能力が大きいことが考えられる.一方,それぞれの樹種間にも種による違いがみられ,針葉樹の中ではアカマツ,広葉樹の中ではブナの気孔コンダクタンスの変化割合は,それぞれ他の2種とくらべて小さかった.今回は,分析計の精度上,光,温度条件が一定の場合のみの測定しかおこなえなかったが,今後装置の改良を続け,様々な条件下におけるCO_2濃度特性を調べ,それぞれの樹種特性を明らかにしていく必要があろう.本研究では,安定した流量を供給するダイアフラムポンプと高精度のマスフローコントローラーをもちい,CO_2濃度を高精度に制御可能な光合成・呼吸速度および蒸散速度を測定するシステムを安価に自作し,高CO_2濃度に対する樹木の光合成特性について気孔反応を中心に調べた.このシステムは,通常濃度下でもちいている赤外線CO_2ガス分析計のレンジを比較的簡単,かつ柔軟に高濃度範囲に対応させうる点に特徴がある.具体的には,0-600ppmの絶対値型の赤外線CO_2分析計をもちい,測定空気を正確に希釈することによって高濃度域の測定をおこなった.測定にもちいた同化箱は,温度調節可能なものを自作した.測定条件は,温度25°C,照度3540klx,同化箱への通気量2.51min-1の最適条件下で,針葉樹(スギ,アカマツ,カラマツ)は通常濃度(350ppm)から約5000ppmまで,広葉樹(シラカバ,ブナ,コナラ)は通常濃度から約3000ppmまでCO_2濃度を上昇させ,その時の光合成速度,蒸散速度を測定した.その結果,15002000ppmで光合成速度が飽和し,広葉樹は3種とも,10001500ppmと針葉樹に比べ,多少低いCO_2濃度で飽和した.また,その時の気孔コンダクタンスの変化は,広葉樹は針葉樹に対し,濃度上昇とともに気孔コンダクタンスが急激に低下した.そのため,針葉樹の葉内CO_2は,広葉樹よりも高くなった.このことから広葉樹では気孔の開閉による葉内CO_2濃度の調節能力が大きいことが考えられる.一方,それぞれの樹種間にも種による違いがみられ,針葉樹の中ではアカマツ,広葉樹の中ではブナの気孔コンダクタンスの変化割合は,それぞれ他の2種とくらべて小さかった.今回は,分析計の精度上,光,温度条件が一定の場合のみの測定しかおこなえなかったが,今後装置の改良を続け,様々な条件下におけるCO_2濃度特性を調べ,それぞれの樹種特性を明らかにしていく必要があろう.
極域氷床コアを用いた過去の大気中一酸化炭素濃度の導出

1.産業革命以前の大気中一酸化炭素濃度を測定するために、サンプル容器に銅と真鍮を用いた極域氷床コアからの空気抽出装置の改良を行った。分析精度を検討した結果は以下の通りである。(1)サンプル容器に濃度既知の標準ガスを充填し、1日以上経過した時の濃度ドリフトを観察した結果、容器製作直後は6680ppbvの一酸化炭素濃度の増加が見られたが、テストを繰り返した後には濃度増加が429ppbvにまで減少した。これは容器内壁に吸着していた微量の有機物が酸化によって除去されたためと考えられる。また、同様な方法で従来氷床コア分析で使用されてきたステンレス製のサンプル容器を試験したところ、62115ppbvの濃度増加を示し、一酸化炭素の分析には銅製のサンプル容器が適していることが確認された。(2)空気抽出装置全体の総合検定を行うために、液体ヘリウムを使用して標準ガスの転送テストを行った結果、6993ppbvの一酸化炭素の増加がみられた。これは、短時間ではあるが、標準ガスが空気抽出装置の配管に使用しているステンレスに接触した影響であると考えられる。2.上記の空気抽出装置を用いて、南極みずほ基地で掘削された氷床コアのうち、深度301.15301.22mの試料を分析した結果、一酸化炭素濃度は219ppbvであった。この値は、空気転送によるドリフト量を差し引いても現在の南半球の濃度に比べて高い。同時に分析されたメタン濃度は723ppbvであったので、空気抽出時の配管のリ-クはなかったと思われる。従って、一酸化炭素の濃度が高い原因は、みずほコアに見られるクラックに含まれる空気による汚染や、サンプル量が少ないことによるドリフト量の増加などが考えられる。今後はクラックの無いコアを用いた、ステンレスを使用しない空気抽出装置での分析が望まれる。
マルチスペクトラルカメラのノイズ推定と分光反射率復元

デジタルミュージアムは貴重な絵画を画像データベースとして蓄積し、画像をディスプレイ上にリアルに再現することを試みるものである。作品の印象は昼光や燭光など照明光の分光分布やその強度などの照明環境で大幅に変化する。このように多様な照明環境で人間が見た時の色彩を視覚系の色順応を考慮し画像再現する研究が極めて活発に行われている。本報告書では日本画、油彩画および水彩画の3種類の絵画の分光反射率を絵画を描くのに用いた色材の先験情報を用いずに画像データから正確に復元し、多様な照明環境の下で観察したときの美術作品の色彩を忠実にディスプレイ上に再現するための研究成果について述べる。本テーマは美術絵画の撮影画像データから各画素に対応する被写体の分光反射率を正確に復元し、多様な照明環境下で絵画をカラー画像再現することを目的としている。本年度は美術絵画の分光反射率復元精度評価方法について研究を行った。その結果、評価方法に関して理論的な予測と実験結果が一致し、当該分野で従来一般的に用いられてきた方法よりもより厳密な評価方法を確立することができた。この評価方法を用いて、分光反射率の特徴を用いる高精度な分光反射率の復元方法を美術絵画に適用し、高精度な復元が可能であることを確認し、国際会議で発表を行った。分光反射率の復元精度がカラー画像再現精度に及ぼす影響を明らかにするためにディスプレイの高精度な測色的な較正を行った。この方法では、室内照明光がディスプレイ表面で反射する現象を補償するような較正を行い極めて正確な再現が可能になり、次年度国際会議で発表予定である。マルチスペクトラルカメラのノイズ分散の推定をベィーズ推定とMaximum Likelihood(ML)の2つの方法に関して解析的な方法から定式化を試みた。現在解析的な困難さから簡潔な定式化までに至っていないがコンピュータシュミレーションで強引に計算可能なレベルまでには達しているが、当初予定していた簡潔な美しい定式化のレベルにはさらなる努力が必要と思われる。多様な照明環境下で絵画等の美術作品を鑑賞したときの色彩の見えや印象などを忠実にディスプレイ上に再現するために、マルチスペクトラルカメラで撮影された画像データから被写体の各画素に対応する微小面積の分光反射率を正確に復元し、見えモデルを用いてディスプレイ上に再現する研究を行った。被写体の分光反射率に関する先験情報なしに正確に分光反射率を復元するために学習サンプルを用い画像入力系のノイズを正確に推定し、復元誤差が最小になるように分光反射率の特徴を用い復元することにより分光反射率の復元精度を向上させた。特に本年度は室内照明下にあるディスプレイを測色的に較正する方法の確立に注力した。通常ディスプレイは蛍光灯などの室内照明のもとで観察するのが一般的である。そのため観察者の視覚系にはディスプレイそのものに再現された光とディスプレイ表面上で反射した室内照明の光の二つが入力される。従って忠実に意図した色彩をディスプレイ上に再現するためには画像を再現するためのフレームデータからこのディスプレイ表面上で反射する室内照明光のR,G,B成分を減じる必要がある。この方法を用いることによりディスプレイ表面の反射を考慮しないで較正した場合より色差が1/3以下になることを明らかにした。美術絵画の分光反射率復元・評価のための新たなモデルの提案を行いその有効性を明らかにし、学会発表を行った。この評価法では分光反射率用計測装置の計測範囲にある複数の画素について復元された分光反射率を積分する方法が正確な評価方法であることを実証し、初めて美術絵画の分光反射率復元の復元精度評価に用いた。この分光反射率復元では適応的な復元方法を用いこの評価方法の有効性を明らかにした。(関連研究発表:国際会議発表1件、国内学会発表2件)マルチスペクトルカメラのノイズ分散行列推定に関する研究を行った。推定は2つの方法について実施した。第一は最尤法を用いた推定方法であり、第二はBayes推定の枠組みで、maximum pasterior(MAP)による推定である。前者の方法では学習サンプルについては従来以上の正確な推定ができているが、テストサンプルについては推定精度が落ちることからオーバーフィツティングの問題が生じている。後者についてはノイズ分散推定式を導出する解析式が複雑で現在簡潔な表現形式を導く解析方法に注力中。(関連研究発表:国際会議1件)学習サンプルにオーバーフィッティングしないノイズ分散行列の推定方法を最尤法を用いた簡潔なノイズ分散行列の定式化を試みているが、現在解析的な困難さから簡潔な定式化までに至っていない。また、ベィーズ推定方法によるノイズ分散行列の推定式の定式化を行っているが、分光反射率についての確率密度分布の定式化に時間を要した。

特に従来この確率密度分布は多次元のガウス分布を用いているがこの方法はいくつかの本質的な問題を抱えており、新たな密度分布の定式化に注力中である。分光反射率の復元精度がカラー画像再現精度に及ぼす影響を明らかにするために、ディスプレイの高精度な測色的較正方法を確立し、かつ同一画像に分光反射率の特徴を用いた高精度な復元方法を適用し再現精度を評価する準備は順調に進んでいる。このディスプレイの高精度な較正方法については次年度国際会議で発表予定である。更に、分光反射率の特徴を用いた高精度な復元方法並びにその結果についても既に国際会議で発表済みである。本研究の大きな目的は、被写体の先験情報を用いないで、撮影データから正確に被写体の分光反射率を復元することであり。美術絵画の分光反射率復元・評価のための新たなモデルを提案しその有効性を明らかにし、関連学会発表を行った。入力系のノイズ分散の推定方法について最尤法とMAPの二つについて解析を行った。MAPについては継続研究中で、関連研究において学会発表を行った。学習サンプルにオーバーフィッティングしないノイズ分散行列の推定方法に最尤法を用いた簡潔なノイズ分散行列の定式化のために幾つかの解法を試みる。この解析的な解法と並行して、研究計画調書に記載した、既に開発したノイズ分散推定方法で求められた分散を対角要素にもつ対角行列と学習サンプルにオーバーフィッティングしているノイズ共分散行列の線形和の形で最適な分散行列を求める方法についても研究を実施する。この方法のどちらかについて分光感度の最適化を図りマルチスペクトラルカメラを構築する。分光反射率の復元精度がカラー画像再現精度に及ぼす影響を明らかにするために、高精度に測色的較正されたディスプレイに複数の復元精度で復元された美術絵画の分光反射率を用いカラー画像を再現し評価を行う。1.被写体の先験情報を用いないで正確に分光反射率を復元するための適応的な復元方法において新たな復元予測指標の研究を行う。2.MAPを用いた入力系のノイズ分散行列推定において簡潔な表現方法に関する解析方法の研究3.マルチスペクトルカメラの分光感度の最適化に関する研究・開発ディスプレイの高精度な較正方法やノイズ分散行列の推定に関するいくつかの成果を国際会議で発表するための旅費とノイズ分散推定に必要な数冊の書籍の購入に費用を充てる予定である。マルチスペクトルカメラ分光感度最適化に関する研究開発費、関連書籍購入費並びに成果発表のための出張費等
RNA結合蛋白のアイソフォームに内在する食道癌促進分子スイッチの分子機序の解明

RNA結合蛋白であるTIA1の食道扁平上皮癌促進作用は、セリン・スレオニンに富んだ天然変性領域を持つアイソフォームTIA1a特異的であった。TIA1a特異的領域周囲の候補リン酸化部位に変異を導入するとTIA1aの細胞内局在と細胞増殖が変化し、この領域を含むペプチドはTIA1aの細胞質局在を阻害した。CHK1がキナーゼ候補と考えられた。一方、細胞質でTIA1aと結合するmRNA候補の3'UTR上で、TIA1aが他のRNA結合蛋白と結合して共同または拮抗的に働くと考えられた。以上から、天然変性領域のリン酸化修飾が分子スイッチとなってTIA1aが細胞質に移行し、癌化促進作用を持つと考えられた。これまで癌には抑制的に働くとされていたRBPであるTIA1が、食道扁平上皮癌(ESCC)の発生と進行に伴い発現・局在に変化を生じ癌促進的に働き、これがexon 5でコードされる11アミノ酸を含むヒンジ領域を持つアイソフォームTIA1a特異的あること、ヒンジ領域がセリン・スレオニンに富んだ「天然変性領域(intrinsically disordered region、IDR)」と呼ばれる不安定構造を形成することを見出した。そこで、IDRの修飾による構造変化がスイッチとなって局在が変化し、癌特異的パートナー分子と集合体を形成することで病態特異的な機能モジュール内の癌関連分子群の転写後調節を行い癌化を促進すると予測し、分子スイッチの分子機構の全容を解明する研究を進め、以下の成果を得た。1.TIA1aの11アミノ酸内外のIDR内における予測リン酸化アミノ酸の活性化・不活性化変異体を作成し細胞で強制発現することで、細胞質局在に関与すると考えられるリン酸化部位を特定した。また、予測される各候補キナーゼをノックダウンするまたは特異的抑制剤を用いTIA1aの局在に対する影響をみることで候補キナーゼを絞り込んだ。2.RIP-seqによる細胞質におけるTIA1a結合mRNA候補を同定し、さらにその3'UTRを合成しin vitropull-downアッセイで結合部位を決定すると共に共同あるいは拮抗的に働きうる他のRNA結合蛋白を同定した。3.ヒンジ部を含むペプチドをTIA1aと共に発現させて、TIA1aの細胞質局在への阻害効果を検証できた。平成28年度に計画した2つの大項目の中で、局在や機能の調節作用に関しては、TIA1aアイソフォーム特異的な天然変性領域を形成する11アミノ酸を含むヒンジ領域周囲で、細胞内局在調節に関与しうる有力なリン酸化候補部位を同定でき、さらにこれに関わるキナーゼを同定できた。また、この領域をペプチドとして発現させることで、細胞内局在を調節できる可能性も確認でき、TIA1aを標的とした治療法開発につながる成果を得られた。一方、下流の標的分子・モジュールに関しては、標的候補ならびに標的候補分子に対し共同あるいは拮抗的に働きうる他のRNA結合蛋白を同定できた。これらは、当初の平成29年度計画分を含めて進展している。一方、候補標的分子の癌組織内での発現やその病態との関連についての検討は、評価可能な結果が得られる例数に達していないが、当初から平成29年度にかけて継続して行う計画になっており、特に遅れは無い。研究代表者は、RNA結合蛋白(RBP)のひとつであるTIA1が、食道扁平上皮癌(ESCC)の発生と進行に伴い発現・局在に変化を生じて癌促進的遺伝子として働くことを証明し、この働きがexon 5でコードされる11アミノ酸を含むヒンジ領域を持つ長いアイソフォームTIA1a特異的あること、ヒンジ領域がセリン・スレオニンに富んだ「天然変性領域(IDR)」と呼ばれる不安定構造を形成することを見出した。そこで、IDRの修飾がスイッチとなって局在が変化し、癌特異的パートナー分子群と細胞質で集合体を形成することで癌関連分子群の転写後調節を介して癌化を促進すると予測し、この分子スイッチの分子機構の全容を解明する研究を進め、以下の成果を得た。1.TIA1aの細胞質局在の癌促進作用との関連性を、子宮頸癌でも確認した。2.TIA1aのIDR周辺における予測リン酸化アミノ酸の活性化・不活性化変異体を作成し、細胞に強制発現して局在を観察することで、細胞質局在に関与すると考えられるリン酸化部位候補を特定できた。また、予測候補キナーゼのノックダウンまたは特異的抑制剤により、TIA1aの局在に影響する候補キナーゼを同定した。3.RIP-seqを実施して細胞質分画においてTIA1aに結合するmRNA候補群を同定した。TIA1aの強制発現やノックダウンにより、候補mRNAの発現量の変化から調節標的を絞り込んだ。さらにそれらの3'UTRを合成しin vitro pull-downアッセイで結合の確認、結合部位の同定、および同じmRNA候補に結合して共同あるいは拮抗的に働きうる他のRBPを同定した。4.ヒンジ部に対する合成阻害性ペプチドをTIA1aと共発現させることで、TIA1aの細胞質局在への阻害効果は検証できたが、持続時間が短く腫瘍増殖抑制は確認できなかった。

一方、細胞質でTIA1aと結合するmRNA候補の3'UTR上で、TIA1aが他のRNA結合蛋白と結合して共同または拮抗的に働くと考えられた。以上から、天然変性領域のリン酸化修飾が分子スイッチとなってTIA1aが細胞質に移行し、癌化促進作用を持つと考えられた。平成28年度は、計画をやや上回って成果が得られたことから、平成29年度も当初の計画を継続することを基本とする。研究をさらに加速するために、技術革新の目覚しいゲノム編集技術を導入して、平成28年度に得られた成果をもとに、アイソフォーム特異的発現細胞や標的分子のノックアウト細胞を作成し、効率的に治療標的となりうるTIA1aの癌促進作用への介入部位や上流・下流の介入分子・モジュールの同定を行うことを追加する。ゲノム医科学候補リン酸化部位の同定と確認や候補標的分子の同定が予測を上回って効率的に決定できたことから、大幅に試薬の購入量を少なくすることが出来た。また、標的分子の癌での発現の検討が、次年度に主に行うことになり、mRNA/miRNA発現や免疫染色(蛋白発現)に必要な試薬の購入を控えた。標的分子の癌での発現の検討のためのmRNA/miRNA発現や免疫染色(蛋白発現)に必要な試薬の購入を行う。また、計画を上回って効率的に進んだ治療法開発をさらに効率よく行うために計画に追加して行うゲノム編集用の試薬の購入にあてて、研究を遂行する。
極低温強磁場多周波ESRによる量子スピン及びフラストレーション系の研究

定常磁場中で0.1ケルビン、パルス磁場中で0.6ケルビンまでの極低温度(ケルビンは絶対温度の単位で摂氏0度がおよそ273ケルビン)で測定のできる強い磁場中(ネオジム磁石表面磁場のおよそ数十倍)で多くの周波数(マイクロ波帯から遠赤外線)を用いて測定のできる電子スピン共鳴(略してESR、MRIで用いる核磁気共鳴と同様な磁気共鳴の一種で電子スピンによる磁気共鳴)装置を開発した。これらの装置を用いて、量子効果(量子力学に基づく効果)の顕著な量子磁性体や磁気的相互作用の競合するフラストレート磁性体の測定を行い、前者では高い磁場領域でこれまで観測されてこなかった新たなシグナルを観測してこの磁性体の新たな相転移の起源を明らかにし、後者ではESRシグナルの現れる磁場の変化を見出した。今年度はヘリウム3とヘリウム4混合気体を用いたダイリューション冷凍機を利用した極低温で測定が可能な電子スピン共鳴(ESR)装置を開発した。夏までに混合器の温度を160mKまで冷却が可能なシステムを構築し、1K以下でESRシグナルの現れる磁場が変化する量子スピン系の一つである擬一次元反強磁性体Cu-benzoateの単結晶試料の鎖方向に磁場をかけた190GHzの測定に成功し、その結果を8月にオランダで行われた低温の国際会議で発表した。また、あわせて1K以下で長距離秩序を示す一次元反強磁性体NDMAPの極低温測定を行い、同じ国際会議で結果を発表した。その後、熱輻射フィルターを入れるなどしてさらに改良を進めて、混合器の温度を80mKまで冷却が可能であるようにし、それまで温度計が試料位置から15mmも離れていた点を改め、試料温度を直接測れるようにするために試料ホルダーの改良を行ってサンプル位置から1mmのところに温度計を入れられるようにした。その結果、Cu-benzoateの鎖に垂直な方向の温度変化がきちんと測定でき、およそ200mKまでは確実に冷却できることが明らかになった。この結果を世界的によく知られている装置開発関係の英文ジャーナルReview of Scientific Instrumentsに近々に投稿予定である。また、平成20年9月の物理学会秋季大会及び平成21年3月の物理学会第64回年次大会で発表を行い、かつ、行う予定である。今後およそ1K以下で長距離秩序をする量子スピン系や幾何学的フラストレーション系の研究を行っていく予定である。今年度はダイリューション冷凍機を利用した極低温電子スピン共鳴(ESR)装置に対して昨年度後半に改良を行って試料位置においておよそ100mKまでの極低温が達成できた装置を使って1K以下で長距離秩序を示す一次元ハイゼンベルグ反強磁性体NDMAP(化学式:Ni(C_5H_<14>N_2)_2N_3(PF_6))の極低温測定を行った。その結果、量子多体効果により出現するエネルギーギャップをゼーマン効果によりつぶした臨界磁場以上の磁場中、磁気秩序相での低エネルギー励起を詳細に調べることができた。これまで30mKで中性子散乱実験でしか測定されていなかった最低エネルギー励起を観測し、この磁気励起エネルギーが磁場と共に一度高くなった後、14テスラに向けて低くなる変わった振る舞いをすることを明らかにした。鎖方向における14テスラはこれまでに比熱でアノマリーが観測された磁場で、オーダーしているスピンの向きが変化する磁場になり、この磁気構造の変化に対応したものであると考えられる。この結果を磁性に関する国際会議(International Conference on Magnetism 2009, Karlsruhe, Germany)で発表した。この結果を装置開発関係の英文ジャーナルReview of Scientific Instrumentsに近々に投稿予定である。これ以外におよそ60テスラまでのパルス磁場中でヘリウム3の減圧により0.6Kまでの極低温でESR測定ができる装置を開発した。幾何学的フラストレーション系のーつである三角格子反強磁性体NiGa_2S_4の1.3K以下のESR測定を行い、共鳴磁場がさらに低磁場側にシフトしていくことを観測した。今年度は昨年度までに開発したダイリューション冷凍機を利用した極低温電子スピン共鳴(ESR)装置を用いて磁場誘起の秩序-無秩序転移を示す擬一次元イジング型反強磁性体BaCo_2V_2O_8のスピン励起を調べたが、混合ガス回収ラインが詰まってしまって思うように実験はできなかった。この系に関しては以前極低温までの比熱測定で4テスラ以上に新たな磁気秩序相が現れることがわかり、中性子散乱実験で鎖方向に磁場をかけた際にスピン密度波的な磁気秩序を示すことを明らかにしたが、その状態でのスピン励起に興味をもって極低温のESR測定を試みた。しかし残念ながらこれに関して測定に成功していない。

この他に60テスラまでのパルス磁場中で1.3Kまでの極低温でESR測定ができるESR装置の改良整備を行い、いくつかの幾何学的フラストレーション系での測定を行った。三角格子反強磁性体NiGa_2S_4の類縁物質であるNi_<0.7>Al_2S_4でESR測定を行い、帯磁率で予想された大きな異方性とは異なり、大変異方性が小さいことがわかり、現在その起源に関して調べている。また、容易軸型の異方性を有する三角格子反強磁性体Rb_4Mn(MoO_4)_2での反強磁性磁気転移温度以下でのESR測定を行い、磁化過程で予想された磁気構造で計算した共鳴モードで実験結果を説明できることが分かった。この系は実験系では初めてのイジング型異方性を有する三角格子反強磁性体で理論との比較がなされ、良い一致をみた。また、スピネル化合物HgCr_2O_4では磁場中で格子変化することが知られていたが、ESR測定と共鳴モードの解析により、磁化プラトーが観測される磁場以上で歪みが解消され等方的になることが相互作用の大きさを調べることにより明らかになった。
肺疾患の画像診断学発展を目指した画像、病理の比較検討

1.研究の目的呼吸器疾患の画像診断の精度を向上させるため、画像と標本の緻密な比較・検討を行った。特にCTと伸展肺標本の比較に留意した。2.研究の方法呼吸器と病理の専門医の協力を得て、臨床画像と標本像の整備を行った。臨床画像の中心はCTであり、びまん性肺疾患には拡大高分解能CTを、腫瘍性疾患にはヘリカルCTとそれから得られる3D像をそれぞれ重視した。対象疾患は主に肺癌とびまん性肺疾患である。肺標本から的確な情報を得るために手術への立ち会いは必須であった。肺標本は空気または固定液で伸展させた状態で観察した。標本画像の種類は肉眼像、CT、実体顕微鏡像、組織像であった。本研究では末梢肺組織の観察に威力を発揮する実体顕微鏡像を特に重視した。3.研究の成果(1)肺癌:高分化腺癌で見られる胸膜陥入の理解が術野の観察により進んだ。直下に到達した腫瘍により伸展性を失った胸膜は腫瘍と共に胸壁を離れ、その隙間を隣接する肺が埋める所見が確認された。埋める際に胸膜の襞が形成されそれらが集中する傾向が見られた。標本割面の実体顕微鏡観察で見られた肺胞隔壁の肥厚には癌の肺胞壁置換型浸潤に対応した。その部分のCTはスリガラス状態を示した。(2)胸膜下リンパ管網:空気で伸展された肺標本のCTで胸膜下のリンパ管が描出された。それを3D像で見ると肺表面の大小の亀甲紋様に相当した。この亀甲紋様は正常CTでは見られないが、リンパ路に沿う疾患肺の上中葉間を通る像で見られた.(3)肺気腫:早期の細葉中心性肺気腫の観察に実体顕微鏡が有用であった。標本CTによる肺血管の追跡結果も参考にして気腫巣に関係する小血管は肺動脈であることが確認され、臨床CT解析の有用な所見となった。I肺腺がんについての画像・病理対応X線写真で認識され難い肺腺がんのCT像の特徴は(1)サイズが15mm以内と小さいこと,(2)正常肺との境界が平滑でなく,(3)結節周囲がスリガラス状を示すことであった。特に(3)は肺高分化腺がんの特徴としてCT診断上有用な所見であり,組織標本上腫瘍が肺胞壁を被露するように進展すると共に含気を少なからず保持する部分に相当した。CT上のスピキュラ形成は腫瘍で厚みを増した肺胞隔壁が正常肺に移行する部分で重なり合った結果と考えられた。腺がんの中心部に線維化がある例では特徴的な胸膜陥入が見られた。胸膜陥入はヘリカルCTと3次元表示技術により肺表面に形成される複数の集中する溝として描出されることが分かった。胸膜陥入の画像診断は鮮鋭な線状影のみ注目されているが,術野と標本との対比で陥入に平行にスキャンされると淡い帯状影となることが確認できた。ヘルカルCTの導入で胸膜陥入について以下の興味ある所見が発見された。即ち,腫瘍の肺門側の境界が凹凸不整であっても腫瘍の胸壁側境界が複数の陥入線の深部で平滑で直線状又は緩く凹む所見である。

このCT像を術野,伸展標本,虚脱標本などと比較検討した結果腫瘍は肺胸膜と面で接し,その部分が胸壁から離れて引き込まれると共にその面が隣接肺によって覆われることで説明できた。腫瘍が2枚の胸膜で境される結果、境界が平滑となると説明された。II間質性肺炎に於ける蜂巣肺のCT診断肺胞領域の構造改築を示す重要所見が蜂巣肺であるが,近年HRCTの精度が高まり蜂巣肺を構成するのう胞が1mm内外でも診断しうるかどうかが問われている。CT上胸膜下にスリガラス状影があり,それに微細な網状影と胸膜下の微小のつ胞影が同時に見られる場合、顕微鏡的蜂巣肺に相当することが生検肺との比較で分かった。本研究では、各種肺疾患のCT所見と肺標本を対比させることによって、CTの読影技術の向上を目指している。この目的のために、伸展固定肺標本の実体顕微鏡による観察が非常に有用であることが確認された。手術で得られた標本は、気管支にホルマリン液を注入して伸展固定された。気管支が得られない場合は、細い注射針にて固定液を直接肺胞領域に刺入した。スライスされた標本を水に浸し、実態顕微鏡による観察と写真撮影を行った。正常肺胞領域が伸展されるため、病変部が容易に観察された。各種疾患で以下のような実体顕微鏡所見が得られた。1.腺癌......高分化腺癌で、内部の充実部と周辺の含気に富む腫瘍部分が明瞭に区別された。後者は正常肺胞領域と肺胞隔壁の厚み、色調、硬度などの違いで区別できた。この手法は、標本内に10mm以下の小結節やAAHを発見する際に大いに役立った。その他、腫瘍内の壊死組織、粘液、のう胞、取り込まれた気管支・肺血管、リンパ管への浸潤などが観察できた。2.肺気腫......肺癌を含む手術標本で肺気腫を観察した。初期病変は5mm以内の広がりで肺胞領域の破壊が見られ、それに関係する細気管支と小胞銅動脈が確認された。これらの病変は肺の2次小葉の中間域に分布し、小葉の中心にある細気管支・肺動脈の小葉の境界にある小葉間隔壁と肺静脈には接しなかった。これら細葉中心性肺気腫が拡大融合すると、隣接する2次小葉の境界近くの肺胞領域が帯状に残され、気種域を囲む不等辺多角形を呈した。3.間質性肺炎......肺腔鏡下で採取された肺組織内に顕微鏡的蜂巣肺を確認するのに、実体顕微鏡が有用であった。顕微鏡的蜂巣肺は1mm以内の気腔と気腔壁の肥厚として捉えられた。他に粘液、浸出物の有無も観察された。本研究の最終年度に入り、症例と蓄積と共に画像ー病理対応の方法の確立と精錬化を目指した。これにより研究成果の向上が見られた。1.研究方法の確立、精錬(1)臨床画像・・臨床画像の根幹をなすのはCTであった。びまん性肺疾患の場合はスライス厚を2-3mmとした拡大高分解能像を用いた。片肺の拡大像は微細病変、例えば小葉中心や胸膜下に分布する粒状影、を正確に診断するために必須であった。また軽度の肺野のスリガラス状影の診断にはウインドウ幅の広い画像は不適切であった。肺癌の場合は高分解能像に加えてヘリカルCTによる3D像が有用であった。3D像の内胸膜陥入を描出する肺表面像が特に重要であった。(2)標本の扱い・・外科的切除肺の場合、その解析に先立っての手術への立ち会いと術野の観察が重要であった。各症例の画像診断的ポイントは術前に推測されるもの、術中に明らかになるもの、そして標本で始めて分かるものがあり、それらが総合されて各症例の特徴が加味された画像ー病理対応が可能となった。肺標本は必ず空気または固定液で膨らませた状態で観察した。通常の肉眼像、組織像の他に未固定標本のCTと割面の実体顕微鏡による拡大像が有用であった。2.研究の成果代表的疾患について成果を要約する。(1)肺癌・・胸膜陥入の画像の理解が進んだ。
出芽酵母VDEエンドヌクレアーゼによる遺伝子ホーミングの研究

出芽酵母のVDEホーミングエンドヌクレアーゼは、減数分裂時に自己が挿入されていないVMA1遺伝子(VAMA1(Δ))の、挿入されるべき箇所を認識して切断する活性を持っている。ホーミングエンドヌクレアーゼによるDNA切断後、VDE遺伝子が挿入されているVMA1遺伝子(VMA1(+))を鋳型にして切断修復が行われた結果、切断された箇所にVDE遺伝子が挿入されることによって自己伝播する。今年度は、VDEエンドヌクレアーゼによる二重鎖切断が減数分裂特異的に起きることを利用して、減数分裂時の非相同末端結合の活性について調べた。VDEの切断配列をホモでもつ二倍体を用いて、二重鎖切断がおきた場合にそれを修復するための鋳型が存在しない条件下で実験をおこなった。切断配列のホモ二倍体に減数分裂を誘導し生じた胞子の生存率を調べたところ、VDEによる二重鎖切断が誘導された場合、殆どが致死となる中わずかながらに生存する胞子が存在した。また、生存胞子において切断配列周辺の配列を解析したところ、切断部位付近に非相同末端結合後によく見られる短い挿入や欠失が検出された。さらに、非相同末端結合に必要な遺伝子を欠失した変異株において、生存胞子の割合がさらに低下した。以上の結果より、減数分裂期においては、低頻度ではあるが、ある条件下では非相同末端結合修復がおきているということを見いだした。非相同末端結合に必要な遺伝子として、LIF1がある。減数分裂期におけるLif1pの局在を調べるために、Lif1-EGFPをLIF1ブロモーターより発現させた細胞を観察した。体細胞分裂時においては、一倍体の細胞ではLif1-EGFPは核に蓄積しており、二倍体の細胞では著しい核局在は観察されなかった。一方減数分裂を誘導じた細胞においては、Lif1-EGFPが核に蓄積している細胞が頻度は低いながらも観察された。さらに、別の非相同末端結合に必要な遺伝子な遺伝子の破壊株であるnej1次損株においては野生型でみられたLif1-EGFPの核局在が観察されず、むしろ核の部分にLif1-EGFPは観察されなかった。以上の結果より、減数分裂期の非相同末端結合修復はNej1pを介したLif1pの核局在により制御されている可能性が示唆された。Saccharomyces cerevisiaeの第四染色体上にあるVMA1遺伝子中には、細胞全体との協調を図らず、自己の遺伝子を残すためだけに存在する利己的遺伝子が挿入されている。この利己的遺伝子産物(VDE:VMA1-derived endonuclease)は、自己遺伝子が挿入されていないVMA1遺伝子の、挿入されるべき箇所を認識・切断し遺伝子ホーミングする部位特異的エンドヌクレアーゼである。興味深いことに、VDEには、もう一つの重要な機能がある。VDEはVma1との融合蛋白質として翻訳された後、自分自身を自己触媒的に切り出し、無傷のVDEとVma1蛋白質をつくり出す。