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混合溶媒系クラスターの構造化学とそれが支配する反応特性に関する研究

金属イオンは、一連の非プロトン性アミド溶媒中で水よりも強く溶媒和して安定化しているにも関わらず、高い反応性を示す。非プロトン性溶媒中でアニオンの溶媒和は弱いが、これでは説明できない。非プロトン性溶媒の液体構造が水に比べて弱いことが原因であることを見出したる。これをさらに、確認するために非水混合溶媒を用い、溶媒のクラスター構造を変化させて、反応とイオン溶媒和および溶媒クラスター構造の関係を明らかにすることが本研究の目的である。イオン溶媒和に関しては、独自に開発した滴定ラマン分光法を用い、非プロトン性アミド溶媒であるDMF, DMA, DMPA、TMU, DMP中で遷移金属イオンやアルカリ度類金属イオンの溶媒和クラスター構造に関し、溶媒和の立体効果の観点から研究をおこなった。DMPA、TMU溶媒中では5配位溶媒和構造をとること、さらにDMPAには、構造異性体平衡があり、金属イオンに配位すると強い溶媒和の立体効果が働き、立体効果の少ない異性体に平衡がシフトすることを見いだした。異性平衡の熱力学的パラメータをラマンスペクトルの温度依存性から見積もると、エンタルピー、エントロピーが金属イオンの大きさや溶媒分子の配位数に強く依存することを見いだした。ブロモ錯体の生成反応をDMPAとTMUで比較すると、モノ錯体生成だけに大きな違いがあることがわかり、DMPAの構造異性平衡が、この原因であることが示された。構造性の弱いDMFとプロトン性溶媒であるTFEおよびNMFの混合溶媒中でコバルト(II)クロロ錯体生成の溶媒組成依存性を調べた。塩化物イオンのTFEによる選択溶媒和にもかかわず、混合溶媒中の反応エンタルピーは純DMF中とほとんど変わらない。一方、反応エントロピーはTFE分率の増加とともに低下した。金属イオンに選択的に溶媒和していたDMFが脱溶媒和し、TFEとクラスターを形成することがエントロピー低下の原因であることがわかった。さらに、COCl_3(sol)^-+Cl^-=CoCl_4^<2->+sol(sol=DMF, DMA, NMP, DMPA, TMU)およびFe(sol)_6^<3+>+SCN^-=Fe(SCN)(sol)_5^<2+>+sol(sol=DMF, DMA)における反応活性種CoCl_4(sol)^<2->およびFe(SCN)(sol)_6^<2+>の溶媒和の立体効果に関して研究を進展させた。本研究では、独自に開発した滴定ラマン分光法を用い、アミド系非水溶媒であるDMF, DMA, DMPA,中における金属イオン溶媒和クラスター構造に関し、溶媒和の立体効果の観点から研究をおこなった。DMF、DMAおよびそれらの混合溶媒中で、Mg^<2+>, Ca^<2+>, Sr^<2+>, Ba^<2+>イオンの溶媒和錯体の溶媒和錯体の配位数は、それぞれ6, 7, 8および8であった。配位溶媒分子のバルク溶媒分子からの振動数シフトは配位酸素原子の距離と相関し、結合距離が短くなるほどシフトは大きくなる。

DMF中では距離とシフト値に直線関係があるがDMA中では立体効果のためこの関係が成立しない。また、混合溶媒中のシフト値はDMA組成の増加とともにDMFで低下するが、DMAは変化しないことが見出された。一方、DMPAは、カルボニル炭素に結合したエチル基の末端炭素がカルボニル酸素とシス位にある構造が安定であるが、90°回転異性体が共存することが見出された。90°回転異性体はシス体に比べて5.1kJ mol^<-1>だけエンタルピー的に不安定である。しかし、コバルト(II)イオンに配位すると逆に90°回転異性体が-3.4kJ mol^<-1>より安定になることがラマンスペクトルバンドの温度依存性から見出された。この構造異性化は溶媒和の立体効果に起因するものと考えられる。また、ストップトフローによる反応速度の研究では、反応CoCl_3^-+Cl^-=CoCl_4^<2->において、DMF, DMA中で活性化エントロピーが負であり、活性化エンタルピーはDMFに比べDMAでより増大した。DMPA中では活性化エントロピーは0に近く、活性化エンタルピーはDMAよりもさらに増大した。この結果は、DMPAの溶媒和の立体効果がDMAに比べて、一層強く働き、活性化状態での金属-溶媒結合が長くなることを示している。また、活性化エントロピーは、5配位活性化状態[CoCl_4(solvent)]^<2->を生成する会合機構が立体効果の増大のため交替機構へ変化することを示している。金属イオンは、一連の非プロトン性アミド溶媒中で水よりも強く溶媒和し、安定化しているにも関わらず、高い反応性を示す。非プロトン性溶媒中でアニオンの溶媒和は弱いが、これでは説明できない。非プロトン性溶媒の液体構造が水に比べて弱いことが原因であることを指摘した。これをさらに、確認するために非水混合溶媒を用い、溶媒のクラスター構造を変化させて反応とイオン溶媒および溶媒クラスター構造の関係を明らかにすることが本研究の目的である。イオン溶媒和に関しては、独自に開発した滴定ラマン分光洗を用い、非プロトン性アミド溶媒であるDMF, DMA, DMPA、TMU, DMP中で遷移金属イオンやアルカリ度類金属イオンの溶媒和クラスター構造に関し、溶媒和の立体効果の観点から研究をおこなった。DMPA、TMU溶媒中では5配位溶媒和構造をとること、さらにDMPAには、構造異性体平衡があり、金属イオンに配位すると強い溶媒和の立体効果が働き、立体効果の少ない異性体に平衡がシフトすることを見いだした。異性平衡の熱力学的パラメータをラマンスペクトルの温度依存性から見積もると、エンタルピー、エントロピーが金属イオンの大きさや溶媒分子の配位数に強く依存することを見いだした。ブロモ錯体の生成反応をDMPAとTMUで比較すると、モノ錯体生成だけに大きな違いがあることがわかり、DMPAの構造異性平衡が、この原因であることが示された。構造性の弱いDMFとプロトン性溶媒であるTFEおよびNMFの混合溶媒中でコバルト(II)クロロ錯体生成の溶媒組成依存性を調べた。塩化物イオンのTFEによる選択溶媒和にもかかわず、混合溶媒中の反応エンタルピーは純DMF中とほとんど変わらない。一方、反応エントロピーはTFE分率の増加とともに低下した。金属イオンに選択的に溶媒和していたDMFが脱溶媒
バイオ分子実装基板の精密設計

当該研究ではバイオ計測に有効な新たなマテリアル表面の設計を指向し、非得意的な生体分子および細胞の付着(バイオファウリング)を抑制でき、特定のアナライトを効率良く認識するためのバイオ分子を高密度に集積することを可能にする表面の構築について検討した。2-メタクリロイル沖氏エチルホスホリルコリン(MPC)を既報に従い合成した。ナノスケールでの表面改質を実現するために表面が平滑なシリコンウエハを基板として用いた。表面からリビングラジカル重合を開始するための有機シラン化合物、3-(2-ブロモイソブチリル)プロピルジメチルクロロシラン(BDCS)を合成し、トルエン溶液中でシリコンウエハ表面を修飾した。BDCS修飾した基板をアルゴンガスにて酸素を除去したビピリジンおよび臭化銅(1)の水溶液に浸漬し、所定量のMPCを加え室温で重合した。反応溶液に遊離の開始剤を反応液に添加し、溶液中で生成したポリマーからシリコンウエハ表面に形成されたブラシポリマーの分子量を求めた。試料の表面解析は接触角測定、X線光電子分光計、原子間力顕微鏡、エリプソメーターを用いて行った。MPCポリマーの末端すなわちリビングラジカル重合の成長末端を利用して異なるモノマーを引き続き重合することが可能である。そこで、MPCポリマーをグラフトした後洗浄した基板を、ビピリジンおよび臭化銅(I)を含むグリシジルメタクリレートのメチルエチルケトン溶液に浸漬し、ブロックコポリマーブラシを調製した。次年度はこの表面に生理活性分子の集積化を試みる。一方、ポリマーブラシの表面パターニングについても検討した。BDCSを修飾した基板表面にマスクを介して紫外線(λ=185nm)を照射したところ、マスク下部分のみにBDCSが残りポリマーブラシが位置選択的に形成されることがわかった。本年度は、ポリ(2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン)(PMPC)とポリ(グリシジルメタクリレート)(PGMA)からなるブロックポリマーブラシ上に抗体を集積し特定のバイオ分子を高感度に計測するための基板創製を目的とし研究を実施した。効率よくかつ比較的温和な条件でタンパク質や遺伝子を集積するために、PGMAのエポキシ基をピリジルジスルフィド基に変換した。ブロックポリマーブラシを調製したウエハをEDTA、ジチオスレイトールを含む炭酸バッファー(pH8.5)中に浸漬し、ポリマーブラシのエポキシ基をチオール基に変換し、さらに、2,2-ジチオピリジン、2-チオピリドンの混合溶液に浸して、ピリジルジスルヒド基を導入した。ピリジルジスルヒド基の導入はX線光電子分光計により硫黄元素の濃度を測定することにより確認した。ブロックポリマーブラシの密度、分子量、シークエンス制御とピリジルジスルヒド基の導入量の関係を明確にした。Fabフラグメントに断片化した抗体の固定化量はPGMAブラシの分子量が増すにつれ増加し、エポキシ基を末端に持つシランカップリング剤で調製した単分子膜に固定化した量に比べ著しく最大で6倍程度固定化量を増やすことができた。また、トリクロロメチルシランで表面に凹凸を形成させた後にポリマーブラシを調製したところ、平滑な基板を用いた時に比べ約60倍の抗体を固定化できることが分かった。生体膜表面は生体の中で特定の分子や細胞を認識し、それらの機能を誘導する反応場として機能している。つまり生体膜は生体の分子認識において最良の表面を提供していると言える。生体膜を模倣した表面設計としてリン脂質二分子膜を固体表面に物理吸着させる方法が用いられる。この表面は生体膜の働きを理解するために極めて有効であるが、安定性が乏しいため、マテリアルとしての利用を考えた場合には限界がある。そこで、本研究では新たな生体分子認識界面の構築を目指し、生体膜を構成するリン脂質と同じ極性基を持つ高密度ポリマーブラシをリビングラジカル重合により調製し、プローブ分子として抗体フラグメント(F(ab')を固定することを試みた。また、表面積の拡大を図り、シリコーンのナノフィラメントメントを基板上に形成し、その表面にポリマーブラシを修飾することも検討した。FITCでラベルしたF(ab')を固定した表面の蛍光強度を測定したところ、平滑なブラシ表面に比べ、ナノフィラメント上に形成したポリマーブラシには多くのF(ab')が固定されていることがわかった。ピリジルジスルフィド基を導入しないポリマーブラシ表面では、F(ab')の吸着量は少なく、ジスルフィド結合の交換反応によりF(ab')が有意に固定できることも明らかになった。トリクロロメチルシランを用いたナノフィラメントはシリコンウエハのみならずあらゆる基板表面に調製でき、ポリマーブラシと組み合わせることにより、プローブ分子を集積することが可能になることから、計測基板の表面設計に有効な修飾法になると思われる。
初期発生における割球分化の分子機構

生殖系列の増殖と分化の機構が分子から細胞に焦点を充てて、初期胚の発生過程を通して分析され、それらによって得られた結果を利用して医用動物や家蓄生産に応用した。得られた主な成果は(1)実験小動物、サルおよび家蓄を含めた哺乳動物胚の体外受精、培養系や胚操作技術を確立した。(2)始原生殖細胞や性腺細胞を含む生殖系列細胞の増殖過程が発生過程を通して調べた。(3)胚発育に関する詳細な過程と初期胚発育の間の核・細胞質の相互関係に影響する諸要因が、胚培養、胚の核移植、始原生殖細胞の胚細胞への導入、および正常精巣や卵巣と発生異常精巣や卵巣とのキメラなどの細胞工学技術を使って、解析した。細胞に於ける分化機能は細胞質要因によって支配されていることが明らかにされた。(4)胚の増殖と分化に関係している遺伝子発現を調節することを目的とし、分子レベルで分化因子を同定するためや発生の機序をあきらかにするために、それらの遺伝子をクロ-ン化した。マウス初期胚細胞の分化に関与する転写制御因子や、栄養外胚葉特異的遺伝子(End AやEnd B)を同定した。(5)哺乳動物の胚細胞にも発現しているcーmicやHTLのような癌遺伝子やウイルス遺伝子を培養細胞や赤血球細胞に導入して、遺伝子発現の機序や細胞分化の制御の機序を明らかにした。(6)胚奇形腫の未分化細胞に特異的に発現している遺伝子もスクリ-ニングし、未分化状態の維持に機能する、その遺伝子産物の作用機序を調べた。このようにして遺伝子タ-ゲッティングや相同的組替えに関する新技術が遺伝子発現の機序を明かにするために開発され、さらに遺伝子発現を制御することを可能にするエンハンサ-やプロモ-タ-を選んだ。(7)成長ホルモン遺伝子や他の有用遺伝子を導入された胚から得られた遺伝子導入動物を生産した。この系を利用して、細胞だけでなくマウスの個体での性分化などの導入遺伝子の作用を検定した。
顔面表情のカテゴリー分類プロセスに関する仮説の検証:記憶実験パラダイムの導入

本研究の目的は、顔面表情の知覚・認知過程に含まれると考えられるところの意味処理過程の解明にある。得に、顔面表情のカテゴリー分類が、各カテゴリーのプロトタイプとの感情的意味空間距離を関数に行われるのかどうかを検討することを主眼とした。この目的を達成するため、3年間にわたり、下記のように研究を進めた。1)平成10年度最初に、実験用顔画像処理システムの構築を試み、その実験用顔画像処理システムを利用して、本研究に用いる刺激の作成を行った。さらに、作成した表情刺激をセマンティックディファレンシャル(SD)法に従って被験者に評定させる実験を行った。その結果、これまでの過去の研究や本研究代表者が実施した実験結果で見出されてきたと同様の「快一不快」、「活動性」といった基本的な感情的意味次元を抽出することができた。2)平成11年度被験者に上記の表情刺激に対する感情カテゴリー判断を求め、被験者の各判断内容とその判断に要した反応時間を測定する実験を行った。この結果、これまでの実験結果の妥当性が確認できた。3)平成12年度最終年度にあたり、顔面表情の意味的処理のメカニズムに関して記憶の側面から検討を行った。すなわち、ターゲットとなる顔面表情が、感情的意味空間の中で、すでに記憶されているプロトタイプとの照合によってなされるのかどうかについて、実験データからの関数式のあてはめに基づいて検証した。結果としては、そのような仮説が支持され、本研究の当初の目的が達成された。特に、顔面表情のカテゴリー分類が、各カテゴリーのプロトタイプとの感情的意味空間距離を関数に行われるのかどうかを検討することを主眼としている。この目的を達成するためには、顔刺激の表情情報を定量的かつ組織的・系統的に操作する必要がある。そこで、本年度は、まず最初に、それを可能にする実験用顔画像処理システムの構築を試みた。さらに、その実験用顔画像処理システムを利用して、実験に用いる刺激の作成も試みた。具体的には、はじめに、複数の人物の平常時の顔画像を撮影するとともに、各人物のワイヤーフレームモデルとテキスチャデータを作成し、顔画像処理システムによって、各人物の顔画像の表情を定量的かつ組織的・系統的に変化させた顔面表情刺激を作成した。本年度は、そのようにして顔面表情刺激の作成準備と実験的制御の試験を実施するとともに、作成した表情刺激をセマンティックディファレンシャル(SD)法に従って被験者に評定させる実験を行った。より具体的には、はじめに、これまでに本研究代表者や過去の研究者が使用してきたSD法用の評定尺度の中から適切と考えられるようなものを選択するための予備実験を行った。次いで、その予備実験の結果を元に選択した評定尺度を用いて一つ一つの刺激を評定させる本実験を行い、その反応の因子分析を行った。その結果、これまでの過去の研究や本研究代表者が実施した実験結果で見出されてきたと同様の「快-不快」、「活動性」といった基本的な感情的意味次元を抽出することができた。以上のように、本年度は、当初計画した本研究初年度の目的を予定通り達成することができたと考えられる。本年度は、上記の仮説検証を行う為に必要な比較データの採取と、これまでの研究結果の妥当性を確認する意味で、昨年度に準備した実験用顔画像処理システムを用いて、従来型の知覚判断実験を行った。より具体的には、山田が見いだした表情情報を組織的かつ系統的に変化させたときの刺激人物の顔画像を提示して、被験者には各顔画像の表情に対する感情カテゴリー判断を求め、被験者の各判断内容とその判断に要した反応時間を測定する実験を行った。

手続きにおいては、各刺激画像をランダムな順序でシステムのディスプレイに表示した。被験者には、判断をシステムの反応入力キーで回答させ、刺激提示から被験者が反応するまでの時間を測定した。実験は個別に実施した。この結果、これまでの実験結果の妥当性を確認できた。なお、上述の実験と並行して、顔面表情の記憶実験の方法についての検討も進めた。具体的には、記憶実験の実施における刺激呈示のための実験装置の検討を行うとともに、実験手続きの詳細についての吟味を行い、予備実験を実施した。以上のように、本年度は、当初計画した本研究初年度の目的を予定通り達成することができたと考えられる。本年度は、本研究の目的とした仮説検証の為の実施した。すなわち、昨年度までに実施した知覚判断実験で用いた刺激を被験者に記憶させ、それに対するカテゴリー判断を求める実験を行った。刺激提示はすべて昨年度までに作成した実験システムを用いて行い、さらにそれによって、被験者の各判断内容とその判断にかかわるパフォーマンスを測定した。研究目的で述べた仮説の検証にあたっては、次のように行った。まず、前年度のSD法評定実験の結果を基に、刺激の表情情報と感情的意味次元の布置の関係を説明するための関数式を求めた。次いで、その関数式を使って、上記の実験で使用した各刺激を、それぞれの表情情報の値から、感情的意味次元空間に位置づけた。さらに、これまでの山田の研究やEkmanなど他の研究の結果を基に、同じ空間における各感情カテゴリーのプロトタイプの位置を割り出した。そして、各プロトタイプと各刺激の空間上における距離を計算し、その距離を関数として上記の2つの実験で得られた被験者のパフォーマンスの分析を行った。さらに本年度は、以上の実験結果を基に、モデルの改良を試みそれを学術雑誌に発表した。
胚体特異的遺伝子変異マウス胚の高速作製法の開発

遺伝子変異マウスを用いた遺伝子機能の解析は広く用いられているが、胎生致死になる変異体の7割は胎盤の異常に起因する発生異常を示すため、胚体における遺伝子機能を解析できない。この問題を従来の技術で解決するには膨大な時間と労力が必要であり、変異マウスを用いた遺伝子機能研究の大きな障害となっている。本研究では、我々がこれまでの研究で明らかにしてきた、着床前マウス胚の細胞分化制御機構の知見とゲノム編集技術とを活用し、F0において胚体特異的に遺伝子変異をもつマウス胚を簡便かつ効率よく作り出す技術を開発します。
亜熱帯産紅藻類に含まれる感染症媒介性双翅目昆虫に対する新規誘引物質に関する研究

沖縄県石垣島において海洋生物に含まれる有用生理活性物質を探索中、干潮時露出するリーフに分布する紅藻類マクリDigeneasimplexに双翅目昆虫セトウミユスリカClunio setoensisが誘引される特異な現象を発見した。本研究では、この特異な現象に焦点を当て、感染症媒介性衛生害虫の安全で効果的な誘殺駆除剤の開発に関する基礎データとして、誘引効果が期待されるグルタミン酸骨格を有する興奮毒性アミノ酸の含有量を明らかにした。石垣島沿岸域において干潮時出現するリーフ上で観察される双翅目昆虫の紅藻類への誘因現象を再確認するとともに、本紅藻類をマクリDigenea simplexと同定した。他方、マクリに誘引される双翅目昆虫は、非常に単純化した交尾器と極めて短いふ節、また、異常に短い触角先端節などの特徴から河合幸一郎教授(広島大学大学院生物圏科学研究科)によりセトウミユスリカClunio setoensisと同定された。次いで、誘引物質の特定に際し、まず、マクリの遊離アミノ酸組成に検討を加えた。すなわち、乾燥藻体粉末を還流抽出(75% EtOH)することによりエキスを調製した。次いで、このエキスをMeOH - 0.1% TFAにより活性化したSep-Pak C18カートリッジ(Waters)2個を連結させたシリンジを用いて処理し、濃縮・定容することによりアミノ酸分析用試料溶液を調製した。アミノ酸組成分析はこの試料溶液を全自動アミノ酸分析装置(JEOL JLC-500/V2)に負荷し、標準生体アミノ酸分析法により行った。なお、カイニン酸の定量は、カイニン酸一水和物(和光純薬)より調製した標準液を用いて、同法により検量線を作成して行った。その結果、紅藻類マクリには、グルタミン酸骨格を含む複素環化合物であり、興奮毒性神経活性アミノ酸の一種であるカイニン酸が主成分として乾燥藻体100 gあたり89.3±0.1 mg含まれていることが明らかとなった。また、その際、グルタミン酸およびその誘導体(カイニン酸、α-アミノアジピン酸)、アラニンが総遊離アミノ酸含量の80%以上を占めていることが示された。最後に、この特徴的なアミノ酸組成を参考にマクリから、水抽出、透析、活性炭処理、分取ODSカラムクロマトグラフィーにより、誘引現象に関わると推定されるカイノイドと考えられる成分を精製単離した。石垣島沿岸域において干潮時出現するリーフ上で観察される双翅目昆虫の紅藻類への誘因現象の解明を目的とする本研究課題において、本年度得られた成果は以下の通りであり、研究の進捗状況として、おおむね順調に進展していると考えられた。1研究対象とする紅藻類をマクリDigenea simplexと同定した。2本紅藻類に誘引される双翅目昆虫を非常に単純化した交尾器と極めて短いふ節や異常に短い触角先端節などの特徴からセトウミユスリカClunio setoensisと同定した。3本誘引現象に関わると推定されるカイノイドと考えられる成分を研究対象とする紅藻類から精製単離した。前年度、沖縄県石垣島リーフに自生する紅藻類マクリDigeneasimplexに誘引される双翅目昆虫が、セトウミユスリカClunio setoensisと同定されたことから、この特異的な誘因現象をセトウミユスリカの生態、器官の構造と誘引物質の観点から検討した。セトウミユスリカは、口が退化していることから、マクリを直接摂取する可能性は考え難いが、“舐める"あるいは“吸い取る"とすれば、マクリが含有する水溶性成分がセトウミユスリカを誘引する可能性は考えられる。そこで、マクリから興奮性神経活性を有する水溶性カイノイドの精製を試みた。はじめにマクリ乾燥藻体粉末を10倍容の蒸留水中で24時間撹拌・抽出し、水溶性成分を得た。得られた抽出液は、透析チューブ(3000 dalton cut off)により透析し、透析外液を活性炭カラムに付し、水洗後、酢酸酸性MeOHによりカイノイド画分を得た。次いで、ウルトラパックODSカラム(φ26×300 mm、Yamazen)を用い、1%酢酸-5%アセトニトリルにて、水溶性カイノイド類の分取精製を行った。最後に得られた各画分に含まれる水溶性カイノイド類の組成をLiChroCART 125-4カラム(Purospher RP-18e、Merck)を用いる高速液体クロマトグラフィーによって分析した。以上により精製・単離される成分について、双翅目昆虫誘因現象を実験室レベルで再現・検証した。すなわち、モデル生物として人工繁殖が容易なセスジユスリカChironmus yoshimatsuiを用い、ガラスシャーレに脱脂綿(角形)を置き、蒸留水および濃度調整したカイノイドを含ませ、さらに、(一時的に麻酔いした)セスジユスリカを入れ、数日間観察した。その結果、その生物活性は低かったがセスジユスリカがカイノイドに誘引される現象を確認することができた。本研究課題の目的は、紅藻類マクリDigenea simplexへの双翅目昆虫セトウミユスリカClunio setoensisの誘因現象を誘因活性物質の化学構造などの諸性状の解明を踏まえて明らかにし、衛生害虫の誘殺駆除剤を開発するための基礎データを入手することである。以下、本年度得られた研究成果から、研究の進捗状況をおおむね順調に進展していると判断した。

セトウミユスリカの生態、器官の構造と誘引物質の検討結果から、この特異的誘因現象にマクリが含有する水溶性カイノイド類の関与が示唆されたため、本海藻からの興奮性神経活性を有する水溶性カイノイドの精製・単離を試みた。すなわち、マクリ乾燥藻体粉末を蒸留水を用いて撹拌抽出し、水溶性成分を得た。得られた抽出液は、透析チューブ(3000 dalton cut off)により透析し、透析外液を活性炭カラムに付し、水洗後、酢酸酸性MeOHによりカイノイド含有画分を得た。次いで、ウルトラパックODSカラム(φ26×300 mm、Yamazen)を用い、1%酢酸-5%アセトニトリルにて、水溶性カイノイドの分取精製を行った。得られた各画分に含まれる水溶性カイノイドの組成はLiChroCART 125-4カラム(Purospher RP-18e、Merck)を用いる高速液体クロマトグラフィーによって分析した。一方、精製・単離される成分について、セトウミユスリカに代わり人工繁殖が可能なセスジユスリカChironmus yoshimatsuiを用い、双翅目昆虫誘因現象を実験室レベルで検証した。その結果、一部、検討の余地は残るものの、カイノイドがこの特異的誘引現象に関与することが考えられた。また、双翅目昆虫の誘因現象を調べるため、セスジユスリカを用いる実験系を構築したことにより、今後、本誘引物質のスクリーニングが可能となった。干潮時、露出する沖縄県石垣島沿岸のリーフに分布する紅藻類マクリDigeneasimplexに特異的に誘引される双翅目昆虫が、セトウミユスリカClunio setoensisと同定されたため、この特異な誘引現象について、セトウウミユスリカの生態、器官の構造と誘引物質の関わりについて前年度に引き続き検討した。セトウミユスリカの口は退化していることから、“舐める(吸い取る)"を考えたとき、誘引現象を引き起こす因子の1つとして本海藻の特徴的な遊離アミノ酸組成、即ち、カイニン酸(興奮性神経活性アミノ酸)を主成分とする特徴的なアミノ酸組成が考えられた。そこで、マクリから水溶性カイノイドの精製を試みた。はじめにマクリ乾燥藻体粉末を10倍容の蒸留水中で24時間撹拌・抽出し、得られた抽出液を透析チューブにより透析した後、透析外液を活性炭カラムに付し、水洗後、酢酸酸性MeOHによりアミノ酸画分を得た。次いで、ODSカラムを用い、1%酢酸-5%アセトニトリルにて、カイニン酸骨格を有するカイノイドを分取するとともに、得られた各画分に含まれるカイノイドの組成を高速液体クロマトグラフィーおよびアミノ酸アナライザーによって分析した。さらに、本法により得られるカイノイドについて、モデル生物として人工繁殖が容易なセスジユスリカChironmus yoshimatsuiを用い、誘引現象を実験室レベルで検証した。即ち、蒸留水およびカイノイドを含ませた脱脂綿球を等間隔になるように置いたガラスシャーレに、(一時的に麻酔した)セスジユスリカ(♀)を入れ、数日観察することにより誘引現象の再現を試みたところ、明瞭ではなかったが誘引現象を示唆する結果が得られた。加えて、誘引現象を簡易的に調べるため,人工繁殖が可能なセスジユスリカを用いる実験系を構築したことにより、今後の誘引物質のスクリーニングが可能となった。沖縄県石垣島において海洋生物に含まれる有用生理活性物質を探索中、干潮時露出するリーフに分布する紅藻類マクリDigenea
計算科学と統計力学

この研究は計算科学の立場から複雑システムを研究することを目的としている.とくに組合せ最適化と並行プロセスの理論がそれぞれ量的な複雑さを対象とし,計算機システム・プログラミングの枠をこえた普遍性を持つものとして捉え,具体的な系との関係を検討した.いずれの場合もアルゴリズムのランダム化のはたす役割が大きい.特に並行プロセスにおける資源割り当て問題の典型と考えられる「哲学者の食事問題」のランダム化であるRabin等の結果はその方向で最初でかつ基礎的なものであるが問題の設定,証明に不明瞭な点が多く見られた.その定式化を明確にして完全な証明を報告書に記した.さらに今後の課題としてこれらの問題が複雑システムとしての生物の理解にいかに寄与しうるか準備的な検討を行っている.この研究は計算科学の立場から複雑システムを研究することを目的としている.とくに組合せ最適化と並行プロセスの理論がそれぞれ量的な複雑さを対象とし,計算機システム・プログラミングの枠をこえた普遍性を持つものとして捉え,具体的な系との関係を検討した.いずれの場合もアルゴリズムのランダム化のはたす役割が大きい.特に並行プロセスにおける資源割り当て問題の典型と考えられる「哲学者の食事問題」のランダム化であるRabin等の結果はその方向で最初でかつ基礎的なものであるが問題の設定,証明に不明瞭な点が多く見られた.その定式化を明確にして完全な証明を報告書に記した.さらに今後の課題としてこれらの問題が複雑システムとしての生物の理解にいかに寄与しうるか準備的な検討を行っている.良いアルゴリズムのない(NP完全な)組合せ最適化問題、特に「巡回セールスマン問題」に対する斬新な方法である分割統治法に基づく確率解析(Karp)や統計力学的モンテカルロ法(Kirkpatrick)から刺激をうけ計算科学の新しい発展の方向を探っている。一つの方向は従来からの研究の主流である組合せ最適化問題と線形計画法との関係を特にその差のあらわれる部分に焦点をしぼり検討している。他の有望な方向は多数のプロセッサーが互いにメッセージを交換しながら計算を進める分散型計算である。準備的に最短路、最大流など多項式時間で解ける問題の分散的アルゴリズムを検討した。また分散型問題解決における競合と協調の問題は経済学,生物学に類似の問題がありゲーム理論的に考察している。本年度はいくつかの分野に広がるこれらの問題点の把握,具体的目標の設定に重点をおいた。
動物個体における大量分泌タンパク質の小胞体選別機構の解明

本研究では,動物個体において,酵素やホルモンなどの多種多様な分泌タンパク質を効率的に分泌するメカニズムに着目して解析を行っている.昨年度までの成果では,線虫C. elegansが腸細胞から大量に分泌するVIT-2というリポタンパク質を利用して解析を行った結果,SFT-4(哺乳類Surf4)という積み荷受容体ホモログが,VIT-2の小胞体からの輸送に関与することを見出した.積み荷受容体は小胞体における分泌タンパク質の効率的な輸送に重要であると考えられている因子群である.そこで,このSFT-4がVIT-2を含む大量分泌タンパク質の小胞体からの輸送において果たす役割に着目して解析を行った.C. elegansにおいてSFT-4を発現抑制すると,可溶性分泌タンパク質であるVIT-2およびCPL-1が小胞体の内腔に蓄積したが,膜タンパク質であるSYN-1およびPGP-1の輸送に対する影響はほとんどなかったことから,SFT-4の作用には基質特異性があることが判明した.また,SFT-4とVIT-2は生体内で相互作用を示したことから,SFT-4はVIT-2に対する積み荷受容体として機能することも示唆された.そこで,C. elegansおよびヒト肝臓細胞HepG2を用いて詳細な解析を進めた結果,SFT-4/Surf4は,リポタンパク質を含む可溶性分泌タンパク質の小胞体からの輸送を制御すること,リポタンパク質の蓄積に伴い中性脂質も小胞体内腔に蓄積すること,さらにCOPII小胞の出芽部位として知られる小胞体輸出部位(ERES)の形成にも寄与していることが判明し,動物個体におけるSFT-4/Surf4の機能が初めて明らかとなった.29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。1、腸細胞におけるSFT-4の局在C. elegansにおいてGFP-SFT-4を発現させると,腸細胞において小胞体膜マーカータンパク質と共局在を示すことが判明した.またGFP-SFT-4は一部ドット状の構造体を形成しており,これらはCOPIIコートタンパク質であるSEC-23と共局在を示した.以上の結果から,SFT-4は腸細胞において小胞体上のCOPII小胞形成サイト(ERES)に豊富に局在することが示唆された.2、SFT-4の基質特異性の検証SFT-4を阻害するとVIT-2を含む複数の可溶性分泌タンパク質の輸送が阻害されたが,膜タンパク質への影響は軽微であった.そこで可溶性分泌タンパク質のモニタータンパク質としてssGFPを利用して解析した.その結果,ssGFPもまたSFT-4を阻害すると細胞内に蓄積することが判明した.しかしSFT-4とVIT-2は生体内で結合したがssGFPとの間には相互作用が認められなかったことから,VIT-2のような大量分泌タンパク質が小胞体に貯留した結果,二次的影響としてssGFPの分泌が停滞している可能性が考えられた.3、培養細胞を用いた哺乳類Surf4の解析哺乳類ホモログSurf4についてリポタンパク質の分泌に着目して解析を行った結果,ヒト肝臓細胞HepG2においてSurf4を阻害するとVLDLのコアタンパク質ApoBが小胞体に蓄積し,細胞外への分泌が有意に減少することが判明した.この結果から,ヒトにおいてもSurf4がApoBをCOPII小胞へ効率的に濃縮する積み荷受容体として働く可能性が考えられた.本研究では,動物における多種多様な分泌タンパク質を特異的かつ効率的に輸送小胞へ選別する制御機構を明らかにするため,線虫C. elegansを用いた解析を行った.C. elegansが腸細胞から大量に分泌するVIT-2というリポタンパク質に着目し,VIT-2の分泌に関与する因子を探索した結果,SFT-4(哺乳類Surf4)という積み荷受容体ホモログが,VIT-2の小胞体からの輸送に関与することを見出した.そこで,このSFT-4がVIT-2を含む大量分泌タンパク質の小胞体からの輸送において果たす役割に着目して解析を進めた.現在,以下の研究成果を上げている.まずVIT-2の細胞内輸送に働く候補因子として同定したSFT-4の基本的解析を進め,この因子が小胞体の輸出部位に局在化し,VIT-2等の可溶性タンパク質の輸送に関与していることを明らかにした.また,共免疫沈降実験によりSFT-4とVIT-2が相互作用することを示した.これらの結果から,SFT-4が今まで未同定であったリポタンパク質に対する積み荷受容体であることが示唆された.一方,ヒトの肝蔵由来の培養細胞においてSFT-4のホモログであるSurf4を発現抑制すると,リポタンパク質の分泌が阻害されることを見出した.これらの結果は,SFT-4/Surf4がリポタンパク質の分泌において普遍的に働く可能性を示唆している.本研究では,動物個体において,酵素やホルモンなどの多種多様な分泌タンパク質を効率的に分泌するメカニズムに着目して解析を行っている.昨年度までの成果では,線虫C. elegansが腸細胞から大量に分泌するVIT-2というリポタンパク質を利用して解析を行った結果,SFT-4(哺乳類Surf4)という積み荷受容体ホモログが,VIT-2の小胞体からの輸送に関与することを見出した.積み荷受容体は小胞体における分泌タンパク質の効率的な輸送に重要であると考えられている因子群である.

そこで,このSFT-4がVIT-2を含む大量分泌タンパク質の小胞体からの輸送において果たす役割に着目して解析を行った.C. elegansにおいてSFT-4を発現抑制すると,可溶性分泌タンパク質であるVIT-2およびCPL-1が小胞体の内腔に蓄積したが,膜タンパク質であるSYN-1およびPGP-1の輸送に対する影響はほとんどなかったことから,SFT-4の作用には基質特異性があることが判明した.また,SFT-4とVIT-2は生体内で相互作用を示したことから,SFT-4はVIT-2に対する積み荷受容体として機能することも示唆された.そこで,C. elegansおよびヒト肝臓細胞HepG2を用いて詳細な解析を進めた結果,SFT-4/Surf4は,リポタンパク質を含む可溶性分泌タンパク質の小胞体からの輸送を制御すること,リポタンパク質の蓄積に伴い中性脂質も小胞体内腔に蓄積すること,さらにCOPII小胞の出芽部位として知られる小胞体輸出部位(ERES)の形成にも寄与していることが判明し,動物個体におけるSFT-4/Surf4の機能が初めて明らかとなった.現在までの研究成果により,C. elegansのSFT-4が脂質輸送を担うリポタンパク質に対する積み荷受容体であることが示唆されている.また,ヒトの肝蔵由来の培養細胞においても,SFT-4のホモログであるSurf4を発現抑制するとリポタンパク質の分泌が阻害されることを見出している.そこで今後,まず哺乳類のSurf4に着目し,培養細胞においてSurf4を阻害した際のリポタンパク質の細胞内蓄積について,小胞体からの輸送が阻害されているのか,蓄積部位を詳細に解析する.またSurf4とリポタンパク質との相互作用について解析を進め,重要と想定される配列の変異体を構築し,分泌能との相関について検証する.さらにC. elegansのSFT-4について,腸細胞においてSFT-4を欠損させると生じる脂質様構造体に着目し,腸細胞で高発現する遺伝子を対象にRNAiを行い,VIT-2-GFP蓄積の抑制を指標として関連因子を探索する.候補因子が得られた場合,細胞内局在やSFT-4との機能関連性を解析し,小胞体からの脂質輸送に関する機能を明らかにする.29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。
スキャニング・レーザー・オフサルモスコープを用いた視機能検査の研究

本研究ではScanning Laser Ophthalmoscope (SLO)を用いた機能検査(微小視野、視物質再生時間測定)を用いて網膜変性や斜視などの眼科疾患の病態の分析をおこなった。眼底疾患にはSLOを用いたICG、FAG、単色光による層別眼底観察やSLOを用いない機能検査法(多局所ERG)も併用した。研究成果は以下のとおりである。1.SLOでは固視を確認しながら視神経乳頭と黄斑部の位置関係がモニターできるため、眼球の回旋運動をTVモニター上で計算できる。これを斜視患者に応用し、今迄の回旋検査法では検出できなかった微小な回旋異常が発見された。2.ICGを用いてStargart病の脈絡膜の変化を分析し、脈絡膜にかなりの障害があることを報告した。3.黄斑円孔の術前術後に微小視野を施行し、網膜の感度が手術後に回復することを報告した。しかし、感度の回復と黄斑ERGの回復は一致しておらず、黄斑円孔による網膜障害の病態はかなり複雑であることが分かった。4.糖尿病性網膜症においてFAG所見で過蛍光のある部分では錐体視物質の再生が延長することが分かった。網膜血管からの漏出は視物質の代謝にも影響を与えることが示唆された。6.網膜下線虫症においてSLOを用いて眼底をmonitorし、動く線虫を発見し、線虫を光凝固にて焼却したことを報告した。この症例ではSLOを用いることによって治療前、治療後の線虫の動きが経時的に観察された。5.Acute zonal ocuult outer retinopathyにおいてICGとFAGによる眼底造影と多局所ERGを記録したところ、ICGとFAGでは視野欠損部に一致した異常はみられず、多局所ERGは視野欠損部に一致して振幅の著しい低下が観察された。視野異常は網膜性であるが、循環障害は視野欠損の原因ではないことが分かった。平成5年度はSLOを用いてdensitometryを行った。研究者らが以前より行っている方法は中心窩のみのdensitometryであり、眼底を観察することは出来ない。本年度の研究によりScanning Laser Ophthalmoscope(SLO)を利用した眼底直視下のdensitometryに成功した。これにより眼底後極部全体の視物質の状態を観察することができ、多くの眼底疾患の視物質動態が分析できる。まず暗順応後(視物質の豊富な状態)と明順応後(視物質が分解した状態)の眼底の映像をビデオテープに記録する。SLOから眼内に入ったレーザー光は視物質により一部吸収され眼底で反射し、SLOのdetectorに捉えられ画像になる。したがって、視物質の豊富な状態では眼底からの反射光は減少し、視物質の少ない状態では反射光は増加することになる。次に画像をデジタル-アナログコンバーターによりコンピューターに取り込んだ後二つの画像を引き算する。得られた画像は視物質がどの程度存在するかを示す。今後はこの方法を用いて臨床疾患の分析を行う予定である。またフルオレッセンナトリウムやインドシアニングリーンを用いた蛍光眼底造影の映像もコンピューターに取り込み、画像分析を行った。これにより以前は写真の濃淡として読影していた「過蛍光」や「低蛍光」という主観的な所見も数値として表現され、その詳細を解明することが出来た。これをdensitometryと組み合せて網膜脈絡膜の血行動態と視物質の状態の関連も評価することが出来た。平成6年度はスタルガルト病のSLO所見について研究し発表した。この疾患では網膜色素上皮にリポフスチンが蓄積し、フルオレッセンナトリウムによる蛍光眼撮影では脈絡膜を透見することができないが、SLOを用いたインドサイアニングリーン蛍光撮影を行うことによって脈絡膜所見を観察できた。特発性盲点拡大症候群でもインドサイアニングリーン蛍光撮影にて異常所見が発見された。

この疾患は検眼鏡的には眼底が正常であり、フルオレッセンナトリウムによる蛍光眼底撮影も正常であるが、盲点が拡大する。この疾患に研究者等の行っているMultifocal ERGを行うと盲点拡大部位にERGの振幅の低下があり、網膜の機能異常が分かった。この部のインドサイアニングリーン蛍光撮影をよく検討すると異常所見があり、網膜機能不全と脈絡膜循環の関連の有無が検討された。これは平成7年度報告予定である。平成7年度はScanning Laser Ophthalmoscope (SLO)を用いた機能検査(微小視野、視物質回復測定)、SLOを利用した形態学的検査(ICG,FAGなどの眼底造影と単色光による層別網膜観察)、さらにSLOを用いない機能検査(多局所網膜電図など)を臨床疾患に応用し検討した。その結果は以下の通りである。1.ICGを用いてStargardt病の脈絡膜の変化を分析し、脈絡膜にかなりの障害があることを報告した。Stargart病に見られるfleckは脈絡膜循環障害の結果であるか原因であるかは今後の検討課題である。2.黄斑円孔の手術前、手術後に微小視野を施行し、網膜の感度が手術後に回復することを報告した。しかし、局所ERGの回復と比較すると必ずしも視野の回復とERGの回復は一致しておらず、黄斑円孔による網膜障害の病態はかなり複雑であることが分かった。3.糖尿病性網膜症においてFAG所見で過蛍光のある部分では微小視野の感度が低下するばかりではなく、錐体視物質の再生が延長することが分かった。網膜血管からの漏出は視物質の代謝にも影響を与えることが示唆された。4.Acute zonal ocuult outer retinopathyにおいてICGとFAGによる眼底造影と多局所ERGを記録したところ、ICGとFAGでは視野欠損部に一致した異常はみられず、脈絡膜や網膜の循環障害は視野欠損の原因ではないことが分かった。また多局所ERGは視野欠損部に一致して振幅の著しい低下が観察され、この疾患に見られる視野異常は網膜性であることが確かめられた。5.網膜下線虫症においてSLOを用いて眼底をmonitorし、動く線虫を発見し、線虫を光凝固にて焼却したことを報告した。この疾患ではSLOを用いることによって線虫が発見できたばかりでなく、網膜脈絡膜の著しい障害が経時的に観察された。
難治性ネフローゼ症候群におけるB細胞の関与

平成30年度は、ヒトCD20抗原に対するマウスーヒトキメラ型モノクローナル抗体であるリツキシマブ(RTX)治療を行う難治性ステロイド依存性ネフローゼ症候群(SDNS)患者について、これまで登録の50名の血液検体を継続的に免疫フェノタイプ解析を行うと同時に、新たに15名の新規患者の経時的解析を追加した。新規症例においても昨年観察されたようにB細胞がRTX投与後速やかに消失し、初回投与から約20-30週を経過した患者においては多くの患者でB細胞の再構築を認める結果となり、昨年度の結果が検証できた。RTX投与患者の中には一旦寛解したものの再発を認める症例もあり、再発の際に昨年度見出したB細胞におけるCD10の発現が臨床経過と関連する可能性が示唆された。臨床情報の整理も進んでおり、昨年の1名の患者のB細胞のBCRレパトア解析に引き続き、臨床経過に特徴のある3名の患者のRTX治療前後のB細胞のBCRレパトア解析を実施した。その結果、RTX投与前後におけるBCRレパトアに差異が認められるものとあまり変化しないものを認めた。特に今年度はBCRレパトア解析を実施した症例のうち臨床経過が良かった1名が再発をきたしたため、その症例の解析を重点的に行った。まず、B細胞のCD10の免疫フェノタイプは再発に向けて若干の減少傾向が認められた。さらにこの症例について再発時のBCRレパトア解析を追加実施した。その結果としてRTX投与後寛解状態にあった時のBCRレパトアと再発時のBCRレパトアは類似するパターンを示していた。そこで、T細胞のTCRレパトアがRTX治療後に変化するという外部の報告もあることから、この症例についてTCRレパトアの解析を実施した。その結果、寛解時と再発の前後でTCRレパトアに差異が見られる傾向にあった。計画通りに継時的な末梢血単核球のサンプリングを実施し、液体窒素中への細胞保存ならびにB細胞の免疫フェノタイプ解析を行っている。さらに15名の検体を解析することにより、これまでの結果を検証できた。また、臨床情報の整理よりこれまでに再発を認める症例と現時点まで再発を認めない症例を区別できるようになったことから、両症例のB細胞免疫フェノタイプの比較やB細胞のBCRレパトア比較を行うことができている。さらに再発時のBCRレパトア解析では興味深い結果が得られており、今後T細胞のTCRレパトア解析ならびに免疫フェノタイプ解析と併せて検討することにしており、一部はその予備検討まで行い次年度に向けた計画を立てることができた。B細胞のBCRレパトア解析を実施した症例の中で再発を認めた症例について重点的に解析を進める予定である。一方で現時点で長期に再発を認めていない症例もあることから、両者での比較を行う。また、平成30年度に実施したTCRレパトア解析の予備検討において再発前後に差異を認めているので、これまでのB細胞の免疫フェノタイプ解析に加えて、T細胞の免疫フェノタイプ解析を追加解析する計画である。さらに平成30年度に実施したT細胞の免疫フェノタイプの予備検討では、T細胞の免疫フェノタイプにもB細胞のCD10同様に変化を認める分子があるようなので、経時的な解析ならびに多検体の解析を実施し、B細部の変化との関連性を解析する予定である。次年度にマイクロアレイ解析を実施し、最終的には免疫関連遺伝子の発現状況、各種レパトア、免疫フェノタイプを統合的に解析し、ネフローゼ症候群におけるB細胞の関与について考察する。ヒトCD20抗原に対するマウスーヒトキメラ型モノクローナル抗体であるリツキシマブ(RTX)が難治性ステロイド依存性ネフローゼ症候群(SDNS)に有効であることからSDNSの発症にB細胞が関与することが示唆されている。しかしながらB細胞がどの様にSDNS発症へ関与するかという疑問は未だ解明されていない。本研究ではRTX治療を行うSDNS患者末梢血中B細胞の免疫フェノタイプ解析、B細胞受容体(BCR)レパトア解析、マイクロアレイ解析などを通して、SDNS発症におけるB細胞の役割について明らかにすることを目的とした。平成29年度はRTX治療を行う小児SDNS患者について50名の免疫フェノタイプの継時的解析を行った。症例登録の時期などにより経過観察期間に個人差があるため統計学的な評価がまだできない状況ではあるが、RTX投与後速やかにCD20陽性細胞が消失し、RTX初回投与後約20ー30週後からCD20陽性B細胞の再構築を認める症例が多く観察された。また、一般にB細胞分化初期に発現が知られているCD10分子の発現を認める症例も見出された。今後実施予定のBCRレパトア解析やマイクロアレイ解析が液体窒素中保存単核球を試料として可能であったため、本年度は末梢血より単核球細胞を分離し随時液体窒素中保存を随時行った。加えて、研究分担者が臨床情報の整理を順次進めてきた。一名の患者で臨床経過の見通しが立ってきたことから、この症例について次年度計画しているBCRレパトア解析を先行して実施した。RTX治療直前のB細胞とRTX治療後に再構築されたB細胞のBCRレパトアについて比較検討した結果、RTX治療前後においてBCRレパトアに大きな差異が見られた。解析目標の50症例の登録を完了し、計画通りに末梢血単核球の液体窒素中保存を実施している。

単核球細胞が少数しか回収できていない状況も多いため、次年度以降の有効的な解析に重点的に利用できるようDNA/RNAの抽出やタンパク質の抽出を同時には行なわなかった。計画しているBCRレパトア解析やマイクロアレイ解析が液体窒素中保存の末梢血単核球より可能なことから、現時点で支障は少ないと考えられる。むしろ、BCRレパトア解析について平成29年度中にまずは1症例の実施ができ、その結果を解析し、BCRレパトア解析の有効性が示唆されたことから、BCRレパトア解析の拡大的実施の見通しも立てることができた。平成30年度は、ヒトCD20抗原に対するマウスーヒトキメラ型モノクローナル抗体であるリツキシマブ(RTX)治療を行う難治性ステロイド依存性ネフローゼ症候群(SDNS)患者について、これまで登録の50名の血液検体を継続的に免疫フェノタイプ解析を行うと同時に、新たに15名の新規患者の経時的解析を追加した。新規症例においても昨年観察されたようにB細胞がRTX投与後速やかに消失し、初回投与から約20-30週を経過した患者においては多くの患者でB細胞の再構築を認める結果となり、昨年度の結果が検証できた。RTX投与患者の中には一旦寛解したものの再発を認める症例もあり、再発の際に昨年度見出したB細胞におけるCD10の発現が臨床経過と関連する可能性が示唆された。臨床情報の整理も進んでおり、昨年の1名の患者のB細胞のBCRレパトア解析に引き続き、臨床経過に特徴のある3名の患者のRTX治療前後のB細胞のBCRレパトア解析を実施した。その結果、RTX投与前後におけるBCRレパトアに差異が認められるものとあまり変化しないものを認めた。特に今年度はBCRレパトア解析を実施した症例のうち臨床経過が良かった1名が再発をきたしたため、その症例の解析を重点的に行った。まず、B細胞のCD10の免疫フェノタイプは再発に向けて若干の減少傾向が認められた。さらにこの症例について再発時のBCRレパトア解析を追加実施した。その結果としてRTX投与後寛解状態にあった時のBCRレパトアと再発時のBCRレパトアは類似するパターンを示していた。そこで、T細胞のTCRレパトアがRTX治療後に変化するという外部の報告もあることから、この症例についてTCRレパトアの解析を実施した。その結果、寛解時と再発の前後でTCRレパトアに差異が見られる傾向にあった。計画通りに継時的な末梢血単核球のサンプリングを実施し、液体窒素中への細胞保存ならびにB細胞の免疫フェノタイプ解析を行っている。さらに15名の検体を解析することにより、これまでの結果を検証できた。また、臨床情報の整理よりこれまでに再発を認める症例と現時点まで再発を認めない症例を区別できるようになったことから、両症例のB細胞免疫フェノタイプの比較やB細胞のBCRレパトア比較を行うことができている。さらに再発時のBCRレパトア解析では興味深い結果が得られており、今後T細胞のTCRレパトア解析ならびに免疫フェノタイプ解析と併せて検討することにしており、一部はその予備検討まで行い次年度に向けた計画を立てることができた。予定通り、今後も継続してSDNS患者末梢血の免疫フェノタイプについて継時的解析を実施していく。CD19およびCD20を中心とし、B細胞分化初期段階のマーカーならびに調節性B細胞(Breg)のマーカーを重点的に解析する予定である。また、1症例のみの結果ではあるが、BCRレパトア解析の有効性が示唆されたことから、今後、解析対象症例を拡大して実施していく予定である。