hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒト型抗精子モノクロ-ナル抗体を用いた生殖過程における障害機序の解明

(1)不妊外来受診患者684名について抗精子抗体スクリ-ニングを(1)精子凝集試験(2)精子不動化試験(3)酵素免疫測定法(4)イムノビ-ズテスト(5)混合免疫グロブリン反応の5種類の抗精子抗体測定法を用いて行った。その結果抗精子抗体保有者71名を選別し得た。(2)ヒト型モノクロ-ナル抗体作成の予備実験として、capacitation前後のヒト精子でBalb/cマウスを免疫し、抗精子マウスモノクロ-ナル抗体10種を得た。(3)得られた抗精子マウスモノクロ-ナル抗体でヒト精子を処理し、透明体除去ハムスタ-卵への精子貫通試験を行ったところ、いずれも貫通阻害を示した。(4)血中抗精子抗体スクリ-ニングを目的として開発された2種の酵素免疫測定キット〔Syn^<elisa>(Elias社)及びSperm AntibodyEIA(Biotec社)〕を未婚婦人50例、不妊婦人76例について検討した。Syn^<elisa>は未婚婦人に比し不妊婦人において有意に高い陽性率を示したが、精子不動化抗体との交叉性は認められなかった。一方Sperm Antibody EIAは測定値に安定性がなく、その有用性が否定された。(5)先体反応を起こした精子と特異的に結合するモノクロ-ナル抗体MII61をラテックスビ-ズに結合させ、MII61結子ビ-ズを用いて不妊男性の精子先体反応を観察した。正常男性では全例ビ-ズの凝集がみられたが、不妊男性では約1/3に凝集不良や凝集時間の遅延がみられた。本法は従来より精子機能検査検査として行われているハムスタ-テストとしても相関がみられた。(6)体外受精・胚移植を行った症例において、精子機能をMII61結合ビ-ズで判定したところ、凝集不良例では卵割率の低下がみられた。(1)不妊外来受診患者684名について抗精子抗体スクリ-ニングを(1)精子凝集試験(2)精子不動化試験(3)酵素免疫測定法(4)イムノビ-ズテスト(5)混合免疫グロブリン反応の5種類の抗精子抗体測定系を用いて行った。その結果、抗精子抗体保有者71名を選別し得た。(2)ヒト型モノクロ-ナル抗体作成の予備実験として、capacitation前後のヒト精子でBalb/Cマウスを免疫し、抗精子モノクロ-ナル抗体10種を得た。(3)得られた抗精子モノクロ-ナル抗体でヒト精子を処理し、透明帯除去ハムスタ-卵への精子貫通実験を行ったところ、いずれも貫通阻害を示した。(4)抗精子抗体保有患者2名がマウスミエロ-マ細胞とのハイブリド-マを作成した。作成したハイブリド-マのうちIgG産生株48種について、その培養上清とヒト精子との結合を酵素抗体法で検討を行ったが、抗精子モノクロ-ナル抗体産生株は得られなかった。(5)抗精子抗体保有患者の抹消リンパ球中には精子を認識するクロ-ンの存在は僅少と考えられるため、in vitroで特異的クロ-ンの増幅をはかることが必要である。(1)血中抗精子抗体スクリ-ニングを目的として開発された2種の酵素免疫測定キット〔Syn^<elisa>(Elias社)及びSperm Antibody EIA(Biotec社)〕を未婚婦人50例、不妊婦人76例について検討した。Syn^<elisa

>は未婚婦人に比し不妊婦人において有意に高い陽性率を示したが、精子不動化抗体との交叉性は認められなかった。一方Sperm Antibody EIAは測定値に安定性がなく、その有用性が否定された。先体反応を起こした精子と特異的に結合するモノクロ-ナル抗体MH61をラテックスビ-ズに結合させ、MH61結合ビ-ズを用いて不妊男性の精子先体反応を観察した。正常男性では全例ビ-ズの凝集がみられたが、不妊男性では約1/3に凝集不良や凝集時間の遅延がみられた。本法は従来より精子機能検査検査として行われているハムスタ-テストとしても相関がみられた。(3)体外受精・胚移植を行った症例において、精子機能をMH61結合ビ-ズで判定したところ、凝集不良例では卵割率の低下がみられた。
オランウータンにおける食物分配行動と繁殖戦略

オランウータンの雄には「フランジ雄」と「アンフランジ雄」と呼ばれる2つの形態が存在する。このアンフランジ雄は二次性徴の発達を一時的に停止させており、激しい雄間競争を回避する代替繁殖戦略者である可能性が指摘されてきた。本研究は、「オランウータンの雌雄間でおこなわれる食物分配行動が、雄の繁殖戦術として機能しているか」という仮説について、行動観察とDNA分析の2つのアプローチから検証することを目的としている。本年度はマレーシア・サバ州のセピロク・オランウータン・リハビリテーションセンターにおいて母子5ペアを含む22個体から採取した試料を用いてDNAを抽出し、父子判定の分析をおこなった。一部の試料は調査地で保管されている標本から許可を得て採取したものであったため、現地の研究機関で分析をおこなった。雌が雄に対して食物分配をせがんだ場合、フランジ雄は分配に応じず、アンフランジ雄のみが分配に応じることが行動観察から明らかになった。しかしアンフランジ雄は子を残していないことが父子判定から示唆されたため、食物分配行動がアンフランジ雄の繁殖成功度を直接上昇させる機能を持つとは考えられない。一方でアンフランジ雄の発情雌に対する配偶行動がフランジ雄と同程度成功していたことから、アンフランジ雄によっておこなわれる食物分配行動が発情雌へのアクセスと近接状態の維持に寄与する可能性が考えられる。現在この点について行動データの詳細な分析を進めており、これらの研究成果を国際学術雑誌へ投稿するための準備をおこなっている。本研究の目的はボルネオオランウータンを対象として、雌雄間の食物分配行動(食物移動)が繁殖へ与える影響を直接行動観察と遺伝学的分析手法により検証するものである。平成22年度は、1)マレーシア・サバ州のセピロク・オランウータン・リハビリテーションセンターにおいて、個体追跡法によるボルネオオランウータンの雌雄間における食物分配行動と性行動の観察を行った。4頭の雄それぞれについて、受胎可能と考えられる離乳児連れの雌との間で交尾が観察された。さらに雌の周囲では、雄どうしの遭遇とそれに伴って起こる攻撃交渉も頻繁に観察された。本調査地において雄間の攻撃交渉がよく観察される理由として、雄個体の密度が他調査地よりも高い可能性が考えられる。このことは雌雄間の食物分配行動に密接に関連する要因になり得るため、個体密度や性行動のデータについて、他調査地との比較をすることで今後検証する必要がある。2)同調査地において生まれた幼児の父親個体を特定するため、父子判定に必要な糞試料の採取を行った。乳幼児3個体を含む19個体から計44試料を採取した。この試料からDNAを抽出し、マイクロサテライトを用いた父子判定を平成23年度から行う。平成22年度には予備実験を行い、糞試料の採取方法が適当であることを確認した。平成23年度はこれまで採取した試料を使った父子判定を完了させるとともに、同調査地において引き続き野外調査を行い、妊娠雌や乳児連れ雌を観察することで、雌の繁殖状態の違いが食物分配行動に与える影響についても検討したい。平成23年度はボルネオ島マレーシア領サバ州セピロク・オランウータン・リハビリテーションセンターにおいて長期フィールド調査を実施した。本研究の目的のひとつである「オスの繁殖戦略の解明」に向け、オス-メス間の配偶パターンおよびオス間のメスを巡る繁殖競合についての行動データを採取した。またオランウータンにおける食物分配行動について他調査地との比較をすることを目的として、同州ダヌムバレー自然保護区の野生オランウータンを対象とした調査を行った。両調査地で分配される食物や観察頻度、食物分配が行われる個体間関係を中心に分析を進めている。オスの繁殖成功度は、マイクロサテライトマーカーを用いた父性解析によって明らかにする。そのために必要となる遺伝子試料を糞から非侵襲的な手法により野外で採取した。母子4組を含む22個体から52サンプルを採取し、DNAを抽出した。先行研究を参照し、ボルネオオランウータンの父性解析に適したヒト由来のマイクロサテライトマーカーを14領域選抜した。有効性を確認するために野外で採取した試料を用いて予備分析を行ったところ、ほとんどのマーカーで有効性が確認できたが、糞の状態や個体によっては一部のマーカーでDNA増幅が小さい等の課題もあり、引き続き予備分析を進めている。

一方でアンフランジ雄の発情雌に対する配偶行動がフランジ雄と同程度成功していたことから、アンフランジ雄によっておこなわれる食物分配行動が発情雌へのアクセスと近接状態の維持に寄与する可能性が考えられる。現在この点について行動データの詳細な分析を進めており、これらの研究成果を国際学術雑誌へ投稿するための準備をおこなっている。食物分配行動と繁殖戦略に関してのデータが蓄積できたため。特に、雌雄の配偶パターンの分析結果はオランウータンのメスが複数のオスと交尾関係にあることを示しており、父性解析による父親個体の特定がより一層重要なステップとなった。父性解析に必要なマイクロサテライトマーカーの開発も昨年度中に進展しており、これまでのところ研究計画に則り順調に達成できていると考えている。次年度も野外フィールドにおける行動観察と遺伝子試料の採取を続ける。乳児個体の糞サンプルは採取が困難であるという問題があるため、次年度からは尿サンプルの採取も行う。これは同様に糞サンプルの採取が困難なチンパンジーの乳児から採取した尿サンプルから、充分量のDNAが抽出できるという報告に基づいた方策である。
「感情伝染」の適応基盤に関する予備的研究

人間を含む動物が他個体の示す情動反応に半ば自動的に影響されることはよく知られている。心理学において、従来、こうした現象は、共感という言葉で大まかに捉えられてきた。しかし、近年の霊長類学の進展に伴い,従来「共感」という言葉で一括されてきた諸現象の概念的見直しが始まりつつある。本研究で注目したいのは、不安や怒りなどの基礎的な感情が個体間でほぼ自動的に転移する「原初的共感」と呼ばれる現象である。この現象は、いわゆる高次の共感とは異なり、霊長類以外の動物にも幅広く見られることが報告されている。言い換えると、こうした原初的共感とは、人間(あるいは高等霊長類の一部)に特有とされる「思いやり」や「役割取得」などの高次の共感の前哨を成すプロトタイプである可能性が高い。本研究は、こうした観点から、「原初的共感」、その中でもとくに「不安の伝染」と呼ばれる集合的現象の適応的・進化的な成立基盤を検討する。この目的に向けて、平成15年度は、14年度に開発した理論モデルをもとに、LANを用いて接続した一連のネットワーク型心理学実験を実施した。これらの実験の結果、理論モデルの予測どおり、不安伝染の生起において、フリーライダー問題が重要となることが確認された。この目的に向けて、平成14年度は、15年度の実証的研究の前哨となる、理論モデルの開発を行った。具体的には、進化ゲームと呼ばれる数理解析手法を用いて、警戒行動および不安の処理に関するさまざまな「感情戦略」間の適応的な相互依存関係を理論的に定式化した。そしてこのモデルを、コンピュータ・シミュレーションとして実装した。さらに、理論モデルから導かれた命題を部分的に検証するために、LANを用いて接続されたネットワーク型心理学実験を実施した。
細胞間コミュニケーションをイメージングする生物発光センサーおよび解析基盤の確立

細胞間でのタンパク質活性の伝播(コミュニケーション)の様子を視覚化するツール及び観察系の開発を行った.高い発光強度を持つルシフェラーゼを用いて新規に細胞内発光センサーを開発した.並行して,倒立型蛍光顕微鏡を基盤として細胞発光観察に適した暗所観察システムを構築した.同システムを用いて実際に細胞内でのGPCR活性を発光検出し,活性が細胞間で呼応している箇所が複数観察された.従い,開発したセンサー及び観察システムにより,細胞間コミュニケーションを解析することが可能となった.生命が細胞組織的に活動を行う上で,個々の細胞は,集団内での位置情報および細胞間での情報の伝達を基にして自身の振る舞いを決定する.このような“細胞間コミュニケーション"の理解は,組織再生など近年の細胞研究における主要なテーマにおいて不可避である.本研究では,発光タンパク質ルシフェラーゼをベースにした高い定量性を誇るタンパク質活性センサーを開発する.同センサーを用いた生きた細胞集団のイメージングにより,個々の細胞のタンパク質活性が,細胞集団全体ではどのように相関をもち展開しているか経時データを取得する.最終的に,細胞間コミュニケーションを説明付ける制御モデルを構築する.本年度は高発光強度のルシフェラーゼを用いて,タンパク質活性発光センサーの開発を中心に行った.センサーの活性検出原理として,ルシフェラーゼ再構成法もしくは,ルシフェラーゼ発光のエネルギーで近傍の蛍光タンパク質を励起する「BRET」の原理を利用し開発した.使用する高発光強度のルシフェラーゼとしてNanoLucやELucを選択し,対象とする細胞現象に関与しているタンパク質二分子,もしくは一分子の両端にルシフェラーゼをそれぞれ融合させることで,発光のON/OFFで活性を検出できるセンサープローブとして確立させた.具体的な測定対象としてGPCRおよびYAP2タンパク質に注目し,両者間の相互作用を検出する発光プローブの作製に成功した.プローブを培養細胞に導入して,細胞密度や各種シグナル刺激剤の添加により,プローブの発光が期待通り変化する事を確認した.本年度の目標として掲げていた「高発光強度のルシフェラーゼによるタンパク質活性発光センサー」は,これまで原理的には細胞間コミュニケーションの迅速な変化を追跡するツールとして期待はされていたが,ルシフェラーゼの絶対的な発光量が微弱なために実現されなかった課題である.そこで研究代表者は,発光強度が格段に高いルシフェラーゼNanoLucやELucを導入することでこの問題を解決し,細胞間でのシグナルの定量比較実現に向けて道筋をつけた.さらに,研究代表者がこれまで用いてきたルシフェラーゼ再構成法の原理の導入,またBRET法なども検討することで活性のON/OFFに対して変化幅が大きい発光センサーとして確立した.本年度は同センサーを,細胞密度やガン化を感知して細胞増殖を制御すると考えられているHippoシグナルの検出に対して開発したが,さらに応用は可能である.リン酸化などのタンパク質修飾や様々なタンパク質間相互作用といった,タンパク質活性に直接関連するイベントを捉えることが出来る汎用的な原理,方法として期待できる.次年度では,顕微鏡システムの開発を経て同センサーを用いて細胞間コミュニケーションを検出する予定であり,計画通り研究課題は進展している.本研究では,発光タンパク質ルシフェラーゼを基盤とした定量性の高いタンパク質活性センサーを開発する.同センサー及び光学システムを利用した生きた細胞集団のイメージングによって,個々の細胞のタンパク質活性が,細胞集団全体では互いにどのように相関を持っているのか経時データを取得し明らかにする.最終的に,細胞間コミュニケーションを説明付ける制御モデルを構築する.本年度は前年度に引き続き,高発光強度のルシフェラーゼを用いて,ルシフェラーゼ再構成法の原理もしくは,ルシフェラーゼ発光のエネルギーで近傍の蛍光タンパク質を励起する「BRET」の原理を利用したセンサーを開発した.具体的には,細胞内遊離ヘム検出するセンサープローブを, BRET法を基本として開発した.同センサーは細胞のヘムを増減させる条件において発光カウントによるレシオを変化させたことから,ヘムの定量が可能なことを示した.次に,それぞれの細胞のタンパク質活性及び細胞間での経時的な違いをリアルタイムに発光イメージングする顕微鏡システムの構築を行なった.市販の倒立型蛍光顕微鏡を基盤に冷却型EM-CCDカメラを設置し高感度で迅速に発光像を撮影できるようにした.また, 2分岐型分光フィルターを光路に組み込むことで,フィルターの切り替えを行うことなく同時に2派長像を撮影できるシステムとした.さらに蛍光撮影用光源,電動ステージを取り付け,装置の暗箱を開閉することなく発光像,蛍光像,明視野像を任意のXY位置で撮影できる装置とした.前年度及び今年度開発したタンパク質活性発光センサーを用いて,センサーを導入した培養細胞において,細胞密度や各種シグナル刺激剤の添加により発光が予想通り変化する事を発光観察顕微鏡システムによって確認した.細胞間でのタンパク質活性の伝播(コミュニケーション)の様子を視覚化するツール及び観察系の開発を行った.高い発光強度を持つルシフェラーゼを用いて新規に細胞内発光センサーを開発した.並行して,倒立型蛍光顕微鏡を基盤として細胞発光観察に適した暗所観察システムを構築した.同システムを用いて実際に細胞内でのGPCR活性を発光検出し,活性が細胞間で呼応している箇所が複数観察された.従い,開発したセンサー及び観察システムにより,細胞間コミュニケーションを解析することが可能となった.今後は以下の2つを目標として研究開発を進める.(1)各細胞のタンパク質活性をリアルタイムにイメージングする顕微鏡システムの構築(目的)

細胞間でのタンパク質活性のタイムラグを検出するためには,一つの視野に複数の細胞が捉えられた状態で,リアルタイムに発光反応を撮影する必要がある.顕微鏡鏡体,分光フィルター,検出機器,データ解析ソフトウェアのセットアップを行い,発光の強弱を連続撮影にて迅速に捉える観察システムを構築する. (方法)一般の蛍光顕微鏡をベースにする.タンパク質活性発光撮影用(複数) ,細胞マーカー蛍光撮影用それぞれに対して分光フィルターを設置する. -80°Cに冷却したEM-CCDカメラを検出機器として設置し,全ての装置を接続したPC上で,専用制御ソフトにて操作する.微細な発光の変化をノイズで邪魔されないよう装置全体を暗箱で囲い,外部の光を全て遮断する.複数プローブの発光像撮影(波長により分光),蛍光像撮影を繰り返し行い,複数の細胞の発光変化を経時的に追跡できることを確認する.(2)細胞間コミュニケーションの画像化およびパターン変化の解析(目的)開発した発光センサーを導入した培養細胞を(1)のシステムで撮影する.細胞の位置情報および,細胞間の発光のタイムラグから活性伝播の様式,速度,刺激強度との相関を計算する. (方法)細胞種類,温度, CO2濃度,刺激薬剤の濃度,細胞密度など様々な条件を変えて,細胞内のタンパク質活性の変化を発光でモニタリングする.発光が生じた細胞に対して,その周辺の細胞がどのタイミングで発光しているか,縦,横,時間の3次元で座標をプロットする.28年度が最終年度であるため、記入しない。生体計測28年度が最終年度であるため、記入しない。
魚類のストレス応答を制御する脳内機構の解明

魚類のストレス応答を制御する脳内機構の解明を目指して、メダカの脳内で発現するストレス応答遺伝子である副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン(CRH)とその関連遺伝子に着目し、最終年度である本年度は以下の通り研究を行った。昨年度の研究によりCRHの欠損がメダカの性行動に影響を及ぼすことが分かったので、本年度はその追試もかねて、2種類あるCRHの受容体(CRHR1、CRHR2)のうちどちらがその表現型に関与しているのか明らかにすることを目指した。そこでまずはゲノム編集によりこれらの変異体メダカを作製し、行動解析を行ったところ、CRHR2変異体メダカについてのみ、CRH変異体メダカと同じ表現型が確認された。この結果は、CRH-CRHR2カスケードがメダカの性行動を制御していることを示唆するものである。続いて、これらの変異体メダカに対し、不安・恐怖条件を設定して行動解析を行ったところ、CRHR1変異体メダカでは不安様行動が減少した一方で、CRHR2変異体メダカでは逆に、不安様行動が増加した。これは、他の脊椎動物におけるCRH受容体の変異体解析の報告ともおおむね一致する結果であり、魚類においてもCRHとその受容体が不安行動を制御していることがわかった。このようにして本研究により、CRHおよびその受容体は、魚類において、生殖や恐怖・不安といった、ストレスと関係する行動を制御していることが明らかとなった。29年度が最終年度であるため、記入しない。魚類のストレス応答を制御する脳内機構の解明を目的として、メダカ脳内で発現するストレス応答遺伝子であるコルチコトロピン放出ホルモン(CRH)とその関連遺伝子に着目し、本年度は以下の通り研究を行った。まず、CRHとその関連遺伝子の機能を明らかにするために、ゲノム編集技術を用いて変異を導入したメダカ系統の作出を目指した。その結果、多くのCRH関連遺伝子について変異導入に成功し、一部の系統についてはライン化することができた。また、我々の先行研究により、メダカ脳内でのCRHの発現には性差が存在することがわかっているが、その性差が生じるメカニズムについては不明である。我々は「生殖腺由来の性ステロイドが、CRHの発現に性差をもたらしている」という仮説のもと研究を進めている。この仮説を検証する目的でCRHと性ステロイド受容体の共局在の有無を確認したところ、CRHの発現に性差があった神経核では、すべてのタイプの性ステロイド受容体が発現していることが明らかとなった。この結果により、CRHの発現は性ステロイドにより制御されるという仮説が裏付けられた。さらに、CRHの推定プロモーター領域には2つのエストロゲン応答配列様の配列が存在すること、そしてこの領域を含むコンストラクトは、エストロゲンの作用により転写が抑制されることがわかっている。したがってこれらを踏まえると、2つのエストロゲン応答配列様の配列が、CRHの発現に性差をもたらす上で重要な機能を担っていると考えられる。そこで、これらの配列に変異を導入したコンストラクトを作製し、プロモーターアッセイをおこなった。しかし、その結果は予想に反したものであり、これらの配列はエストロゲンによるCRHの発現制御に寄与していないことがわかった。したがって現在は、エストロゲンが作用するシスエレメントが存在する範囲の絞り込みを進めているところである。予想外の結果が生じたことにより一部の研究項目に遅れが生じているものの、ゲノム編集の導入とそれを用いた研究については当初の予定よりも進んでいる。したがって、総合的にみれば、研究はおおむね順調に進展しているといえる。『魚類のストレス応答を制御する脳内機構の解明』を目的として、メダカの脳内で発現するストレス応答遺伝子であるコルチコトロピン放出ホルモン(CRH)とその関連遺伝子に着目し、本年度は以下の通り研究を行った。昨年度にゲノム編集技術によって作出したCRH変異体メダカの表現型を解析したところ、CRHがメダカの行動に影響を与えることを示唆するデータが得られた。この結果は、申請者の課題である『魚類のストレス応答を制御する脳内機構の解明』の礎となる重要な知見であるといえる。しかし、ゲノム編集技術は標的以外の遺伝子を欠損させてしまう可能性があることを考慮すると、今年度に得られたデータがアーティファクトである可能性も排除しきれない。したがって、この結果が科学的に妥当であるかどうか検証するためにも、またCRHがどのような経路で作用するのかを明らかにするためにも、次年度以降に他のCRH関連遺伝子の変異体メダカの表現型解析をする必要がある。また、CRHの発現に生殖腺由来のステロイドが作用している可能性をin vivoで検証したところ、ステロイドはCRHの発現に一定の影響を与えることが明らかとなった。加えて、免疫組織化学によるCRHニューロンの投射先の把握を目的として、市販されているCRHの抗体を幾つか検討したところ、メダカのCRHに対して特異性が高い抗体を見つけることができた。しかし投射の全容を把握するには不十分であったので、今後はさらに条件検討を行う予定である。本年度は、コルチコトロピン放出ホルモンがメダカの行動に影響を与えることを示唆するデータを得ることができたが、これは申請者の課題である『魚類のストレス応答を制御する脳内機構の解明』の礎となる重要な知見である。また、これ以外の知見も着実に蓄積している。したがって当初の計画からは幾つか変更があったものの、総合的に判断するとおおむね順調に進展していると言える。

魚類のストレス応答を制御する脳内機構の解明を目指して、メダカの脳内で発現するストレス応答遺伝子である副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン(CRH)とその関連遺伝子に着目し、最終年度である本年度は以下の通り研究を行った。昨年度の研究によりCRHの欠損がメダカの性行動に影響を及ぼすことが分かったので、本年度はその追試もかねて、2種類あるCRHの受容体(CRHR1、CRHR2)のうちどちらがその表現型に関与しているのか明らかにすることを目指した。そこでまずはゲノム編集によりこれらの変異体メダカを作製し、行動解析を行ったところ、CRHR2変異体メダカについてのみ、CRH変異体メダカと同じ表現型が確認された。この結果は、CRH-CRHR2カスケードがメダカの性行動を制御していることを示唆するものである。続いて、これらの変異体メダカに対し、不安・恐怖条件を設定して行動解析を行ったところ、CRHR1変異体メダカでは不安様行動が減少した一方で、CRHR2変異体メダカでは逆に、不安様行動が増加した。これは、他の脊椎動物におけるCRH受容体の変異体解析の報告ともおおむね一致する結果であり、魚類においてもCRHとその受容体が不安行動を制御していることがわかった。このようにして本研究により、CRHおよびその受容体は、魚類において、生殖や恐怖・不安といった、ストレスと関係する行動を制御していることが明らかとなった。ゲノム編集技術により作出された変異体メダカについて、ライン化と表現型の解析を行う。また、CRHのプロモーターアッセイを進めることにより、エストロゲンがCRHの転写を制御する上で重要なシスエレメントを明らかにすることを目指す。これら2点を重点的に進めることで、CRHの発現制御機構と生理的役割の一端が明らかになると考えられる。CRH変異体メダカの表現型解析で得た結果は、他の変異体メダカの解析結果と一致するのか、そしてCRHはどのような経路で作用するのかを明らかにするために、CRH関連遺伝子の変異体メダカの表現型解析を行う。これ以外にも、CRHの発現制御機構や作用機序解析を進める予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。
無曝気・バルキング制御不要の新規DHS法によるフェノール・アンモニア含有廃水処理

高塩分条件下での効率的有機物除去とアンモニア性窒素の酸化を目的に、DHS(Down-flow Hanging Sponge)を連結した「連結式DHS」プロセスを提案した。本プロセスに、アンモニア性窒素、フェノール、塩化物を大量に含む人口コークス炉ガス洗浄廃水(フェノール;14000-CODmg/L、アンモニア性窒素;500mg/L)を供給した結果、第1段目のDHSで有機物が選択的に除去され、アンモニア性窒素は公団で酸化されることが確認された。最終的にトータルHRT12時間において、COD除去率94%、アンモニア性窒素除去率91%を達成できた。したがって本プロセスを前段に置き、後段に硫黄酸化脱窒素プロセスを置けば、無曝気で省エネルギー的な窒素除去対応型の廃水処理システムとなることが示唆された。さらに基質中の塩化物がアンモニア性窒素の亜硝酸化を促進する可能性が示唆された。したがって、本プロセスで塩化物をコントロールすることにより、ANAMMOXの前処理としても有効であることが考えられた。スポンジ付着汚泥のクローン解析を行ったところ、門レベルで未培養の細菌が多く検出されたことから、DHSのスポンジ担体には、多様な最近を保持する能力があることが示唆された。また窒素サイクルに関与する細菌のみならず、人口排水の希釈に用いた海水由来の硫酸塩を酸化・還元する硫黄サイクルに関与する細菌群などが検出された。本研究では、高有害有機物・高アンモニア廃水のより適切な処理方法の開発を目的に、曝気による処理コストが一切かからず、汚泥浮上やバルキングなどの異常現象も全く発生しない下向流スポンジ懸垂型(DHS)リアクターを、活性汚泥法に代わる新しい排水処理プロセスとして検討した.具体的には、新たなDHSの適用性拡大のため複数のDHSを組合せ、各DHSにそれぞれ生物学的に異なった役割を課す「連結式DHS方式」を開発し、フェノールのような難分解性物質の分解とアンモニアの硝化・脱窒を同時に行う画期的処理方式を提案する.本年度は、連結式DHS実験装置を作成し、フェノール・アンモニア含有人工廃水による、有機物酸化・アンモニア硝化特性を連続実験により把握した.本研究で用いたDHSは1台あたり、底辺28.3mm、高さ14.1mm、幅20mmの三角柱ポリウレタンスポンジを高さ2mのアクリル板に5mm間隔で60個(スポンジ総容量:240cm^3)貼り付けた.実験開始後87日目までは2台を、それ以降は3台のリアクターを連結させた.各リアクターを1st、2nd、3rdリアクターとするCOD平均除去率は全実験期間を通して1stで84%、2ndで91%、3rdリアクターで94%であった.最大COD容積負荷=18.8kg-COD・m^<-3>・d^<-1>で、平均89%もの除去率を得ることができた.全実験期間を通して1stではほとんどNO_2^--NやNO_3^--Nは検出されず、NH_4^+-Nの酸化は主に2nd以降で行われていた.最終的にNH_4^+-Nの酸化を促進するためにHRTをリアクター1台当たり4時間、計12時間とした結果、実験開始後345日目で、3rd流出水中のNH_4^+-N 10mg・l^<-1>、NO_2^--N 179mg・l^<-1>、NO_3^--N 107mg・l^<-1>とほぼ完全にNH_4^+-Nを酸化できた.このように、本研究では、「連結式DHS」を、代表的な高塩分含有排水であるコークス炉ガス洗浄排水に適用したところ、複雑な制御や人為的エアレーションを一切必要とせずに、高い有機物除去能とアンモニア酸化能を有するプロセスを開発できた.高塩分条件下での効率的有機物除去とアンモニア性窒素の酸化を目的に、DHS(Down-flow Hanging Sponge)を連結した「連結式DHS」プロセスを提案した。

本プロセスに、アンモニア性窒素、フェノール、塩化物を大量に含む人口コークス炉ガス洗浄廃水(フェノール;14000-CODmg/L、アンモニア性窒素;500mg/L)を供給した結果、第1段目のDHSで有機物が選択的に除去され、アンモニア性窒素は公団で酸化されることが確認された。最終的にトータルHRT12時間において、COD除去率94%、アンモニア性窒素除去率91%を達成できた。したがって本プロセスを前段に置き、後段に硫黄酸化脱窒素プロセスを置けば、無曝気で省エネルギー的な窒素除去対応型の廃水処理システムとなることが示唆された。さらに基質中の塩化物がアンモニア性窒素の亜硝酸化を促進する可能性が示唆された。したがって、本プロセスで塩化物をコントロールすることにより、ANAMMOXの前処理としても有効であることが考えられた。スポンジ付着汚泥のクローン解析を行ったところ、門レベルで未培養の細菌が多く検出されたことから、DHSのスポンジ担体には、多様な最近を保持する能力があることが示唆された。また窒素サイクルに関与する細菌のみならず、人口排水の希釈に用いた海水由来の硫酸塩を酸化・還元する硫黄サイクルに関与する細菌群などが検出された。
溶原性ファージと接合伝達因子(ICE)の部位特異的組換え装置は交換可能か？

細菌における遺伝子の水平伝播に関わる、溶原性ファージおよび接合伝達因子(ICE)のゲノムには、独自の部位特異的組換え酵素(Int)と切出し因子(Xis)がコードされており、宿主ゲノムへの組み込みと切り出しを制御している。このint-xisは欠陥プロファージにも保存されている。これまでの研究で、枯草菌168株に存在する溶原性ファージ(SPβ)、ICE(ICEBs1)および欠陥プロファージ(skin)のint-xisを入れ換えた、キメラファージ(SPβICEBs1とSPβskin)とキメラICE(ICEBs1SPβ)が作製されている。本年度は、これらのキメラファージとキメラICEを用いて、int-xisの交換によるファージおよびICEの質的な影響について解析を行った。その結果、SPβICEBs1およびSPβskinはストレス条件下で、野生型SPβと同じタイミングで切り出され、ファージ形成数および溶原化効率にわずかな低下が見られた。ICEBs1SPβの切り出しは野生型ICEBs1とほとんど差がなく、接合伝達効率への影響も見られなかった。したがって、int-xisの交換はファージおよびICEの細胞間移動に関わる本質的な機能への影響は少なく、int-xisは組換えに特化した独立性の高いユニットであることが示された。また、SPβと異なるゲノム位置に挿入されるSPβ類縁ファージφ3Tについて、不明だったxis遺伝子を同定し、φ3Tのint-xisを明らかにした。この結果より、φ3Tのint-xis遺伝子が切り出し後のゲノム上で隣接すること、φ3Tのint-xis近傍配列がSPβのint-xis近傍配列と相同性が高いことから、int-xisのセットが相同組換えにより交換され得ることが示唆された。H30年度の解析から、int-xisがファージやICEといった異なる可動性遺伝因子間で交換可能であり互換性を有すること、int-xisの交換がファージおよびICEが細胞間移動に関わる本質的な機能に対してほとんど影響を与えないことを明らかにし、その成果を投稿論文にまとめることができた(現在、査読中)。また今回得られた知見は、可動性遺伝因子におけるint-xisの交換機構の存在を示唆する有用な情報である。そして、φ3Tのint-xisの同定により得られた情報は、最終年度の予定であるint-xisを使ったベクター作製に利用できると期待されるため。枯草菌ファージSPβとφ3Tのように、高い相同性のゲノムを共有し、異なるint-xisシステムをもつファージの存在は、int-xisの交換機構が存在すると考えられる。また、ファージゲノムのintおよびxis遺伝子の配置および周辺のゲノム構造に相同性が高いことから、相同組み換えにより、int-xisをセットで交換可能であることが示唆される。今後は、ファージ間および可能性遺伝因子間におけるint-xisの交換機構について調べていく。これに平行して、同定されている可動性遺伝因子のint-xisを利用した組み込みと切り出しが可能なベクターの作製を行い、in vivoにおける長鎖DNAのクローニング方法について検討する。細菌の遺伝子の水平伝播に関わる可動性遺伝因子の代表として、溶原性ファージと接合伝達因子(ICE)がある。溶原性ファージとICEのゲノムは、異なる方法で細菌間を運搬される一方、宿主ゲノムへの組込みが部位特異的組換え酵素(Int)と切出し因子(Xis)を利用している点で共通している。本年度は、この溶原性ファージとICEのint-xisを交換することで異なる可動性遺伝因子の一部として機能することを明らかにした。枯草菌の溶原性ファージSPβとICEBs1(ICE)のint-xisおよび組換え配列(attL/R)を入れ換えた、キメラファージ(SPβICEBs1)とキメラICE(ICEBs1SPβ)の作製を行った。SPβICEBs1はマイトマイシンC(MMC)処理により感染能を有するファージ粒子を産生し、SPβICEBs1ゲノムがICEBs1の標的組換え部位(attB)へ組み込まれることを確認した。ICEBs1SPβも接合伝達により受容菌へ伝達され、ICEBs1SPβゲノムがSPβのattBへ組み込まれることを確認した。また、欠陥プロファージskinもint-xisを保有しており、このint-xisを交換したキメラファージ(SPβskin)の作製も行い、産生されたファージ粒子の感染能と、SPβskinゲノムがskinのattBへ組み込まれることを確認した。以上から、溶原性ファージと接合伝達因子または欠陥プロファージのint-xisは交換可能であり、互換性を持つことが示された。また、公共ゲノムデータベースを調べたところ、B. subtilisの近縁種に、全く異なるint-xisをもち、組み込まれる位置が変化した、SPβ様ファージの存在を見出した。これらの結果から、可動性遺伝因子の異なるint-xisの獲得機構が存在し、宿主ゲノムへの組込み位置を変える新たな感染手段を獲得していることが示唆された。H29年度の研究の目的は、溶原性ファージとICEのint-xisの変換による機能解析とint-xisの分類である。

前者において、枯草菌の溶原性ファージSPβとICEBs1(ICE)のint-xisを変換したキメラファージおよびキメラICEを作製し、ファージ粒子形成能または接合伝達能に影響しない一方、本来とは異なる位置への組換え装置として機能することを明らかにした。さらに、欠陥プロファージが保有するint-xisのSPβとの変換により、欠陥プロファージのint-xisも感染力をもつファージに利用され得ることを示すことができた。後者においては、公共データベースを利用したint-xisの解析から、枯草菌ファージSPβと相同性の高い遺伝子構成を有する一方、異なるint-xisをもつSPβ様ファージの存在を見出した。これらは自然界における溶原性ファージのint-xisの変換が起きていることを示唆するものである。これまでに、可動性遺伝因子が組換え機構を変換することで組み込み位置を変化させることに関する報告はない。今回の解析結果は、可動性遺伝因子間におけるint-xisの共通性、および可動性遺伝因子がint-xisを変換させる有力な証拠を得ることが出来たため、研究は順調に進展していると言える。細菌における遺伝子の水平伝播に関わる、溶原性ファージおよび接合伝達因子(ICE)のゲノムには、独自の部位特異的組換え酵素(Int)と切出し因子(Xis)がコードされており、宿主ゲノムへの組み込みと切り出しを制御している。このint-xisは欠陥プロファージにも保存されている。これまでの研究で、枯草菌168株に存在する溶原性ファージ(SPβ)、ICE(ICEBs1)および欠陥プロファージ(skin)のint-xisを入れ換えた、キメラファージ(SPβICEBs1とSPβskin)とキメラICE(ICEBs1SPβ)が作製されている。本年度は、これらのキメラファージとキメラICEを用いて、int-xisの交換によるファージおよびICEの質的な影響について解析を行った。その結果、SPβICEBs1およびSPβskinはストレス条件下で、野生型SPβと同じタイミングで切り出され、ファージ形成数および溶原化効率にわずかな低下が見られた。ICEBs1SPβの切り出しは野生型ICEBs1とほとんど差がなく、接合伝達効率への影響も見られなかった。したがって、int-xisの交換はファージおよびICEの細胞間移動に関わる本質的な機能への影響は少なく、int-xisは組換えに特化した独立性の高いユニットであることが示された。また、SPβと異なるゲノム位置に挿入されるSPβ類縁ファージφ3Tについて、不明だったxis遺伝子を同定し、φ3Tのint-xisを明らかにした。この結果より、φ3Tのint-xis遺伝子が切り出し後のゲノム上で隣接すること、φ3Tのint-xis近傍配列がSPβのint-xis近傍配列と相同性が高いことから、int-xisのセットが相同組換えにより交換され得ることが示唆された。H30年度の解析から、int-xisがファージやICEといった異なる可動性遺伝因子間で交換可能であり互換性を有すること、int-xisの交換がファージおよびICEが細胞間移動に関わる本質的な機能に対してほとんど影響を与えないことを明らかにし、その成果を投稿論文にまとめることができた(現在、査読中)。また今回得られた知見は、可動性遺伝因子におけるint-xisの交換機構の存在を示唆する有用な情報である。
覚醒・睡眠に必須な神経細胞種の発現解析による睡眠圧の分子実体の探索

睡眠は個体の恒常性の維持に必須の基本的生命現象であるにも関わらず、睡眠圧の分子的実体、および睡眠によって睡眠圧が解消されて個体が覚醒に移行する分子基盤はいまだ明らかではない。本研究ではまず、先行研究において覚醒もしくはノンレム睡眠を制御することが報告されている各脳領域において、睡眠・覚醒に必須な神経細胞種の特定を行う。次に、特定した覚醒・睡眠を制御する神経細胞種において、睡眠や断眠が引き起こす遺伝子発現変化を網羅的に解析・同定する。最後に、網羅的解析から同定された候補遺伝子が睡眠及び覚醒に果たす機能を解析することで、睡眠圧および睡眠が脳に及ぼす分子的実体を明らかにすることを目指す。
小児HBVキャリアーにおけるHBV遺伝子の網羅的解析

【目的】小児HBVキャリアを対象にHBs抗体エスケープ変異株の存在頻度を明らかにする。【対象と方法】対象は1983年2008年の間に名古屋市立大学大学院病院を受診した小児HBVキャリアのうち、HBe抗原セロコンバージョン(SC)が確認された8人(男4、女4)。ジェノタイプはAが2例、Cが5例、Dが1例。SC前後と、検体の存在する限りで最も古い時点、検体の存在する限り最も新しい時点、の計4点を調査した。全ての患者は臨床的に母子感染と診断している。2例はフォローアップ期間中にインターフェロンによる治療が行われ、HBe抗原が陰性化した。他の6例は抗ウイルス治療は受けていない。フォローアップ開始年齢は1歳3ヶ月11歳11ヶ月で、フォローアップ期間は平均3.0年であった。【方法】特異度の高いプライマーを用いてB型肝炎ウイルスゲノムのうちプレコア、コアプロモータ領域をPCR法にて増幅し、ダイレクトシークエンスにて塩基配列を決定した。HBs抗体エスケープ変異株の感染が推測された母子感染例において、母、姉、弟の3例のHBV遺伝子解析を実施。【結果】8例中2例でプレコア領域に変異(G1896A)を認めた。コアプロモータ領域の変異は認めなかった。SC後は全例が無症候性キャリアとなった。HBs抗体エスケープ変異株の感染が推測された母子感染例について、母、姉、弟の3例のHBV遺伝子解析を実施し、G145R、P120Q変異を認めた。【考察】少数での解析であるが、小児の場合はコア領域、コアプロモータ領域の変異があまりみられない。成人と小児におけるこの差はホストの免疫状態の違いによると考えられた。G145R、P120Q変異はHBs抗体エスケープとなる変異であることが過去に報告されている。同変異株による母子感染例の国内での存在が示された。HBV遺伝子変異と、HBs抗体エスケープ変異ウイルス、肝細胞癌、劇症肝炎、などとの関係が示されており、抗ウイルス治療の際に出現する薬剤耐性ウイルスの存在も問題となっている。B型慢性肝炎におけるHBe抗原からHBe抗体へのセロコンバージョン(以下、SC)では、成人に於いてはコア領域やプレコア領域の変異が関与することが報告されている。小児B型慢性肝炎例のSC前後の検体を用い、SC前後でのHBV遺伝子変異について検討した。【対象】1983年2008年にSCを起こした小児B型慢性肝炎8例。(男4例、女4例)ジェノタイプはAが2例、Cが5例、Dが1例。定期受診中に採血を行い、SC前後と、検体の存在する限りで最も古い時点、検体の存在する限り最も新しい時点、の計4点を調査した。他の6例は抗ウイルス薬の投与は受けていない。【考察】小児B型慢性肝炎例では、HBV遺伝子のコア領域、コアプロモータ領域の変異があまりみられない。成人と小児におけるこの差はホストの免疫状態の違いによると考えられる。セロコンバージョンを起こした小児B型慢性肝炎例を対象にHBV遺伝子のプレコア、コアプロモータ領域の解析を行った。小児の場合は成人と比較してコア領域、コアプロモータ領域の変異があまりみられないことが示された。今年後以降は、セロコンバージョンを起こしていない小児HBVキャリアも対象とし、次世代シークエンサーを用いて、網羅的なHBV遺伝子解析を実施する。近年、本邦ではHBVワクチンが定期接種化されたが、これによりHBs抗体エスケープ変異ウイルスの相対的増加が懸念されている。HBs抗体エスケープ変異ウイルスによるHBV母子感染が疑われた例について遺伝子解析を行った。【結果】HBV遺伝子解析でG145R、P120Q変異を認めた。母、姉にも同じHBV変異株を認めた。HBs抗体エスケープ変異株による母子感染が存在することが示された。未解析の症例もあるため、引き続き、対象症例を収集し、解析を継続したい。

ジェノタイプはAが2例、Cが5例、Dが1例。SC前後と、検体の存在する限りで最も古い時点、検体の存在する限り最も新しい時点、の計4点を調査した。全ての患者は臨床的に母子感染と診断している。2例はフォローアップ期間中にインターフェロンによる治療が行われ、HBe抗原が陰性化した。他の6例は抗ウイルス治療は受けていない。フォローアップ開始年齢は1歳3ヶ月11歳11ヶ月で、フォローアップ期間は平均3.0年であった。【方法】特異度の高いプライマーを用いてB型肝炎ウイルスゲノムのうちプレコア、コアプロモータ領域をPCR法にて増幅し、ダイレクトシークエンスにて塩基配列を決定した。HBs抗体エスケープ変異株の感染が推測された母子感染例において、母、姉、弟の3例のHBV遺伝子解析を実施。【結果】8例中2例でプレコア領域に変異(G1896A)を認めた。コアプロモータ領域の変異は認めなかった。SC後は全例が無症候性キャリアとなった。HBs抗体エスケープ変異株の感染が推測された母子感染例について、母、姉、弟の3例のHBV遺伝子解析を実施し、G145R、P120Q変異を認めた。【考察】少数での解析であるが、小児の場合はコア領域、コアプロモータ領域の変異があまりみられない。成人と小児におけるこの差はホストの免疫状態の違いによると考えられた。G145R、P120Q変異はHBs抗体エスケープとなる変異であることが過去に報告されている。同変異株による母子感染例の国内での存在が示された。引き続き、対象症例の収集を行う。今年後以降は、セロコンバージョンを起こしていない小児HBVキャリアも対象とし、次世代シークエンサーを用いて、網羅的なHBV遺伝子解析を実施し、臨床病態との関連が分かっているHBs抗原変異、コアプロモータ・プレコア変異、X遺伝子変異、薬剤耐性変異等を持つウイルス株の存在頻度も明らかにしたい。セロコンバージョンを起こしていない小児HBVキャリアも対象とし、次世代シークエンサーも用いて、網羅的なHBV遺伝子解析を実施し、臨床病態との関連が分かっているHBs抗原変異、コアプロモータ・プレコア変異、X遺伝子変異、薬剤耐性変異等を持つウイルス株の存在頻度も明らかにしたい。IonOneTouchsystemによるエマルジョンPCRを、作業効率を考慮して次年度に行うこととしたため。解析対象症例が見込みよりも少なかった。引き続き対象症例を収集する。繰越金は新規対象者の遺伝子解析費用に充てる。
サブkeV領域のアト秒科学

物質中の電子の動きを捉えることができるアト秒パルスレーザーは、物理学、化学、生物・医科学等の基礎科学分野のみならず、超高速電子デバイス等ならびに高性能触媒や人工光合成等の化学・材料等の産業分野においても必須のツールとなるとものと期待されているが、未だに利用できる波長域は、光子エネルギーにして100eV以下の極端紫外(XUV)領域に制限されており、今、その波長域の拡大が切望されている。本課題では、独自に開発した高エネルギー中赤外レーザー光源とルーズフォーカス法を用いることにより、その波長域をサブkeV領域にまで拡張するともに偏光制御を含めた新たな利用法を開拓し、アト秒科学の新たな展開を図る。
ヒト歯肉付着上皮とエナメル質表層の構造について

前年度に引き続き、3方向からの切片による光学ならびに透過電子顕微観察に加えて、今年度は新たに走査電子顕微鏡の観察を行い、それらの結果を総合して以下のような知見等を得た。歯小皮を介して歯面に直接接着している付着上皮最表層の細胞は、特に歯面に付着している部位近くで細胞が互いに密接して歯面をほぼ完全に被覆しているため、上皮の細胞間隔と歯質との間の直接的な物質の交通は殆どないように思われた。また、これらの細胞は付着側を機能端とした極性が認められ、走査電顕による付着面の立体観察所見と合わせてみると、上皮側と歯質側との間の物質の交通は、これらの細胞を介して行われている可能性が高いことが示唆された。また、付着上皮最表層の細胞は歯根側端では一般に幼若であるが、そこから歯肉溝側に向かうにつれて発達し、さらに歯肉溝付近に至ると細胞の変性像がみられることから、これらの細胞は歯根側端から歯肉溝側に向かって分化しつつ移動していくことが形態学的に確認された。さらに、付着面付近におけるtonofilamentのラセン状配列は、これらの細胞が歯面を被覆し、かつ歯面と付着関係を保ちつつ歯肉溝側に向かって移動していくことと関連があるように思われた。歯小側第2膜内に認められた顆粒状構造物は、その構造形態からみて少なくとも一部のものは付着上皮最表層の細胞から遊離し、そこにに埋入されていくと思われる状態が認められた。基底膜様構造物と歯小皮第2膜とは、組織化学的にその組成がやや異なる傾向がみられた。歯頸部のエナメル質最表層にはかなり厚い歯小皮第1膜が存在しており、走査電顕の観察所見からこの部は通常のエナメル質よりも酸に対し抵抗性が高いことが再確認された。また、ここには通常のエナメル質に比較してやや幼若な結晶が多い状態が認められた。今後はこれら歯小質の役割に関する再検討が課題であると思われた。ヒト歯肉付着上皮とエナメル質最表層の構造について、それらの間に介在している歯小皮と関連づけて三方向の断面で観察を行った。付着上皮細胞は全般的に扁平な形態をしているが、細胞間隙に白血球などが介在している場合には、それらに隣接している上皮細胞はかなり不規則な外形を呈するものが多く認められる。付着上皮は一般にtonofilamentがよく発達し、通常の口腔上皮の特徴を有しているが、広い細胞間隙には多数のmaicrovilliが認められ、細胞内にはゴルジ装置、mitochondoria、分泌顆粒のほか、各種のvesicleや細胞膜湾入が多数認められていることから、これらの細胞は物質の吸収、合成ならびに分泌を活発に行っている様子がうかがわれる。歯面あるいは歯小皮に直接接している付着上皮最表層の細胞は、核が存在している位置よりも歯質側の細胞内に、ゴルジ装置をはじめ、顆粒や他の細胞小器官がおおく分布している状態からみて、歯面に面する側の細胞領域において、付着などの機能に関連する物質の合成、分泌ならびに代謝を盛んに行っていると思われる所見が得られた。また、最表層の細胞内にみられるtonofilamentは、他の細胞のものと異なって、かなり特異な配列状態を示すことが明かとなり、これらの所見が上皮付着の機構を上皮細胞側から形態学的に解明する一助となるように思われる。付着上皮は基底膜様構造物を介し、歯小皮あるいはエナメル質(セメント質)表面に付着している。基底膜様構造物および歯小皮(第二膜)の領域には、二重膜構造を有する大小の球形ないし卵円形した顆粒状構造物が認められ、これらの顆粒状構造物と歯小皮の形状由来との関連性が問題となった。エナメル質の最表面は、一般の歯小皮第一膜となっている場合が多い。今後これらの歯小皮あるいは歯面と基底膜様構造物との結合メカニズムを形態学的に究明することが重要であることが理解された。

歯小側第2膜内に認められた顆粒状構造物は、その構造形態からみて少なくとも一部のものは付着上皮最表層の細胞から遊離し、そこにに埋入されていくと思われる状態が認められた。基底膜様構造物と歯小皮第2膜とは、組織化学的にその組成がやや異なる傾向がみられた。歯頸部のエナメル質最表層にはかなり厚い歯小皮第1膜が存在しており、走査電顕の観察所見からこの部は通常のエナメル質よりも酸に対し抵抗性が高いことが再確認された。また、ここには通常のエナメル質に比較してやや幼若な結晶が多い状態が認められた。今後はこれら歯小質の役割に関する再検討が課題であると思われた。