hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
シェアストレスの血液網膜関門へ及ぼす作用の解明

血管内皮細胞には血流に起因するシェアストレスが作用し、細胞機能を変化させている。我々はヒト網膜微小血管内皮細胞に、血流低下時の低いシェアストレスを負荷し、炎症分子の遺伝子発現が増加することを報告した。一方で、眼循環における生理的に高いシェアストレスは、タイトジャンクション蛋白の発現を増加させ、内側血液網膜関門の維持への関与を示唆する結果を得た。また、臨床研究において、糖尿病黄斑浮腫を有する患者の内皮機能の低下、糖尿病黄斑浮腫の光干渉断層計(OCT)での形態と腎機能の関連性、糖尿病透析患者における脈絡膜血管障害を報告した。我々は、平成23-24年度科研費のサポートを得て、培養ヒト網膜血管内皮細胞にシェアストレスを負荷する実験系を確立し、特に生理的に高いシェアストレスは、血管拡張性、抗血栓活性に働いていることを明らかにしてきた((2011, IOVS)。また、本年度研究費のサポートの元に、この実験系を継続・発展し、低いシェアストレス、つまり血流低下による低灌流の状態では、網膜血管内皮細胞は炎症性サイトカインや接着分子、凝固因子などの遺伝子の発現を増加させ、低いシェアストレスが網膜血管内皮に炎症促進的に働くことを報告した(Exp.Eye.Res.2013)。次に我々は、当初の研究計画の通り、糖尿病黄斑浮腫の病態に直結する、網膜血管内皮における内側血液網膜関門を形成する閉鎖帯(tight junction:TJ)の形成に注目した。初代ヒト網膜血管内皮細胞に平行平板型流れ負荷装置を用いて、ペリスタポンプで定常的な層流によるシェアストレスを細胞へ負荷後、免疫染色でTJ蛋白、すなわちclaudin、occludin、ZO-1の発現を蛍光顕微鏡で観察した。特にZO-1では、高いシェアストレスによって、細胞間の発現の増加を確認している。更に我々は糖尿病黄斑浮腫をターゲットとした臨床研究において、糖尿病黄斑浮腫と血管内皮機能の関連性にも注目した。黄斑浮腫のある糖尿病網膜症患者では、黄斑浮腫のない糖尿病網膜症患者に比べ、全身の血管内皮機能の指標である上腕動脈の血流依存性拡張反応(Flow-mediateddilation: FMD)が低下していることをARVO2013,第19回糖尿病眼学会、第28回糖尿病合併症学会にて共同研究者の高橋賢伍医員が発表した。また、糖尿病黄斑浮腫の増悪因子として、腎機能にも着目し、体液貯留の原因となる糖尿病性腎症による慢性腎臓病と糖尿病黄斑浮腫の関連性についても、研究代表者(石羽澤)が上記学会で発表した。我々は平成23-24年度科研費で、培養ヒト網膜血管内皮細胞にシェアストレスを負荷する実験系を確立し、生理的に高いシェアストレスは、血管保護的に働いていることを明らかにしてきた(2011, IOVS)。また平成25-26年度研究費でこの実験系を発展し、血流低下による低灌流を擬態した状態(低いシェアストレス)では、網膜血管内皮細胞は炎症性サイトカインや接着分子、凝固因子などを変化させ、炎症促進的に働くことを報告した(2013, Exp.Eye.Res)。我々は、網膜血管内皮における血液網膜関門を形成するタイトジャンクション(TJ)に着目した。シェアストレスを網膜血管内皮細胞に負荷後、免疫染色でTJ蛋白、すなわちclaudin, occludin, ZO-1の発現を観察し、特にZO-1では高いシェアストレスによって細胞間の発現増加を確認した。本実験系は、角膜上皮細胞にも応用を開始した。瞬目により角膜上皮のさらされるメカニカルストレスに注目し、角膜上皮細胞にシェアストレスを負荷し、TJ蛋白の発現変化、角膜上皮の増殖、遊走の変化を捉え、ARVO2016で報告予定である。更に我々は、糖尿病黄斑浮腫(DME)と血管内皮機能の関連性にも注目した。DME(+)患者では、DME(-)患者と比較して、血管内皮機能の指標である上腕動脈血流依存性拡張が低下していることを、ARVO2013などで報告した。また、DMEの増悪因子として、糖尿病性腎症による慢性腎臓病とDMEの関連性についても報告した。更に腎移植がまたは透析導入により劇的に改善するDMEの検討を報告し(2015,あたらしい眼科)、透析前後の脈絡膜厚変化は、糖尿病を有する患者でその程度が大きく、糖尿病患者における脈絡血管障害の関与をARVO2014にて報告した。更なる臨床研究として我々は、光干渉断層計(OCT)で網脈絡膜の微小血管を造影剤無しで描出できるOCT angiographyを導入し、糖尿病網膜症の毛細血管瘤、無灌流領域、新生血管の描出を詳細に検討し報告した(2015, AJO)。医歯薬学

これまで、初代ヒト網膜血管内皮細胞を用いて本研究を進めてきたが、他の研究者にも広く用いられているclaudin, occludinの抗体と本細胞の相性が悪いためか、免疫染色の染色性、ウェスタンブロットでのバンド描出が不良である。もしくは、元々少量の初代細胞から継代を重ねている細胞株であり、タイトジャンクションの形成が不良である可能性も考えられる。また、今後メカニズムを探る上で、遺伝子導入などが可能な細胞を選択すべきであり、成熟細胞であるヒト網膜血管内皮細胞からの変更が必要と考えられる。細胞の変更は既に進めており、現在は株式会社ファクト(仙台)と契約し、ラット由来の網膜毛細血管内皮細胞(TR-iBRB2)の提供を受けている。本細胞は他の研究者にも広く用いられている不死化細胞であり、継代による細胞の劣化の影響を最小限に抑えることが可能で、遺伝子導入も容易である。その他の実験装置、手順に問題は無く、これまで通りの実験が遂行可能である。今後はこの細胞を用いて、網膜血管内皮におけるタイトジャンクションとシェアストレスの関係性を明らかにしていきたい。具体的実験内容としては、灌流液に高濃度グルコースやAGEを含有させ、高血糖状態を擬態したり、また、VEGFやTNF-αを灌流液中に含有させて、慢性炎症循環を擬態して流れ負荷を行う。このような病的状態を作製し、生理的状態と比較し、TJの形成がシェアストレスの下でどのように変化するか検討を行う方針である。先述の通り、これまで使用してきたヒト網膜血管内皮細胞がタイトジャンクションの形成をみる実験には不向きである可能性が考えられ、細胞変更を余儀なくされた。また臨床医として、糖尿病黄斑浮腫の臨床研究に軸足を置いたため、実験のペースが落ちていたことも理由としてあげられる。今後は新しい細胞を用いて、積極的に実験を遂行していく予定である。本年度は、不死化網膜血管内皮細胞の契約維持、培養培地、実験薬剤などの消耗品購入のために研究費を使用する。また実験装置の増台も検討している。さらに、得られた研究成果を国内・国際学会発表、論文発表などで世界に発信するため、旅費および論文校正・掲載料が必要となる。
エスニシティとセクシュアリティ：イスラエルのピンク・ウォッシングを事例に

研究員は、平成30年度の研究テーマを『イスラエルの「新しい」権利を求める左派運動とナショナリズム・シオニズムの関連』とし、研究を進めてきた。前期と後期の二つの機関に分け、以下にその概要を報告する。1.前期昨年度に引き続き、エルサレムに長期に亘り滞在した。ヘブライ大学にて、学期、夏季集中の二つのヘブライ語コース(ウルパン)を受講し、ヘブライ語習得を進展させた。滞在中、6月、8月にテル・アヴィヴおよびエルサレムで行われた性的少数者に関する最大のイベントにてフィールドワークを行った。また、前年度までの研究成果を、日本中東学会刊行の中東学会論文に、「「中東で最もゲイ・フレンドリーな街」イスラエルの性的少数者に関する広報宣伝の言説分析」に投稿、受理された。2.後期研究員は、イスラエルでの現地調査と、前年度からの研究テーマおよびその周辺領域について、9月に日本に帰国したのちに2つの成果報告を行った。2018年12月16日に行われた、パレスチナ/イスラエル研究会で「テル・アヴィヴ、イェルサレム両都市におけるLGBTプライドの比較考察」の報告を行ったほか、2019年1月30日に行われた、イスラーム圏における「ジェンダー化された暴力/苦悩」第三回研究会において、「「LGBTフレンドリー」のその先:イスラエルの事例からLGBTポリティックスを問い直す」の報告を行った。これらの成果報告に並行し、12月1日に、本研究における先行研究であり、重要著作の一つであるIslam in Liberalismに関して、日本中東学会刊行の中東学会年報に書評を投稿、受理された。また、昨年度からの研究の方針を引き継ぎつつ、隣接地域であるイスラエルの動物の権利とヴィーガニズムに関する研究にその方向性を進展させた。この研究の遂行に関し、新たな先行研究の購読を進めつつ、3月にイスラエル人当事者にインタビューを行った。上述の通り、イスラエルによる国際的な広報宣伝に関する考察に関しては、日本中東学会年報にまとめることができた。そのほか、本研究の先行研究であり重要文献と位置付けられるIslam in Liberalismについても書評としてまとめ、日本中東学会年報に投稿、受理された。また、アラビア語・ヘブライ語の習得に期待通りの進展が得られた。1年間にわたるイスラエルのイェルサレムへの渡航によって得られた現地資料及び知見は、帰国後いくつかの研究会で報告を行うことができた。しかしながら、かねてより進めていた動物の権利に関する先行研究の読解は、まだ途上であり、31年度も継続して研究を行う必要性がある。研究員は、本研究課題の遂行のため、以下の方策によって、研究を行う。本年度は、前半部分においてイスラエルにおける動物の権利を求める動きに関する先行研究の読解及び、現地でのフィールドワークを並行して行ってゆく。後半部分においては、シオニズム・ナショナリズムに関する先行研究に集中し、初年度度から行ってきた性的少数者をめぐる運動と理論の分野と、前年度以降行ってきた動物の権利を求める動きに関する考察を統合する形でシオニズム及びナショナリズムの先行研究を批判的に読解してゆく。これらの研究の遂行の為、1.これまで研究を行ってきたジェンダーやセクシュアリティに関する議論、それから動物の権利に関する議論それぞれにおいて研究者が行ってきたシオニズム及びイスラエルのナショナリズムに関する結びつきを統合号して考察し、世俗主義全体を覆う大きなプロジェクトとしてのシオニズムという側面を浮き彫りにし、身体論にひきつけつつ議論を深める。2.引き続き、ヘブライ語及びアラビア語の語学力のさらなる向上及び、一次資料の収集を重点的に行い、運動の細部をより明らか理解する。研究員は、平成29年度の研究テーマを『性的少数者の人権を求める運動とパレスチナ問題の交差』とし、研究を進めてきた。今年度の成果を、前期と後期の二つの期間に分割し以下にその概要を報告する。1.前期研究員は、先行研究の購読を継続しながら、かねてより進めていたピンクウォッシングに関する資料の収集と整理を行った。ここでは主にイスラエル政府による広報の言説の分析と、国内の運動がいかに接続してきたかを分析している。従来地域的視点が欠けがちであったジェンダー・セクシュアリティ研究の視点をイスラエル地域研究に統合する本研究の視座は、イスラエル社会及び政治的変動の考察の仕方に変容をもたらす可能性を秘めている点で重要と考える。これらの成果は、日本中東学会、日本女性学会において報告を行った他、現在論文として執筆を行っているところである。また、有志の市民団体による公開講演会にてイスラエルの性的少数者を取り巻く状況に関する講演を行うなど、社会的アウトリーチ活動にも力を入れた。2.後期8月より、エルサレムに長期に亘り渡航している。エルサレムにあるヘブライ大学ローズバーグ国際学校にてヘブライ語コース(ウルパン)を受講し、ヘブライ語及びアラビア語の習得に大きな進展が得られた。特にヘブライ語に関しては、初級の日常会話レベルを修了し、ヘブライ語での現地資料の収集に必要なだけの十分な語学力を習得した。また、これらの語学の向上と並行し、現地における一次資料(ハ=アレツ紙やエルサレム・ポストといったヘブライ語新聞媒体、活動団体のホームページなどからの情報)の収集を行った。また、エルサレムにて行われた性的少数者に関する最大のイベントにて資料の収集を行った他、現地活動団体とコンタクトを取っている。上述の通り、かねてより取り組んでいたピンクウォッシングとそれを取り巻く諸問題の研究および分析に進展が得られ、その成果を日本女性学会及び日本中東学会の口頭報告にてまとめることができた。また、これらのまとまった成果は、さらに現在執筆中の原稿にて発表するつもりである。また、アラビア語・ヘブライ語の習得に期待以上の進展が得られ、現地の性的少数者の人権をめぐる運動体へのアクセスに見通しがついた。

この点に関しては、収集が未だ十分ではないため、次年度に重点的に情報収集を行ってゆきたいと考えている。研究員は、平成30年度の研究テーマを『イスラエルの「新しい」権利を求める左派運動とナショナリズム・シオニズムの関連』とし、研究を進めてきた。前期と後期の二つの機関に分け、以下にその概要を報告する。1.前期昨年度に引き続き、エルサレムに長期に亘り滞在した。ヘブライ大学にて、学期、夏季集中の二つのヘブライ語コース(ウルパン)を受講し、ヘブライ語習得を進展させた。滞在中、6月、8月にテル・アヴィヴおよびエルサレムで行われた性的少数者に関する最大のイベントにてフィールドワークを行った。また、前年度までの研究成果を、日本中東学会刊行の中東学会論文に、「「中東で最もゲイ・フレンドリーな街」イスラエルの性的少数者に関する広報宣伝の言説分析」に投稿、受理された。2.後期研究員は、イスラエルでの現地調査と、前年度からの研究テーマおよびその周辺領域について、9月に日本に帰国したのちに2つの成果報告を行った。2018年12月16日に行われた、パレスチナ/イスラエル研究会で「テル・アヴィヴ、イェルサレム両都市におけるLGBTプライドの比較考察」の報告を行ったほか、2019年1月30日に行われた、イスラーム圏における「ジェンダー化された暴力/苦悩」第三回研究会において、「「LGBTフレンドリー」のその先:イスラエルの事例からLGBTポリティックスを問い直す」の報告を行った。これらの成果報告に並行し、12月1日に、本研究における先行研究であり、重要著作の一つであるIslam in Liberalismに関して、日本中東学会刊行の中東学会年報に書評を投稿、受理された。また、昨年度からの研究の方針を引き継ぎつつ、隣接地域であるイスラエルの動物の権利とヴィーガニズムに関する研究にその方向性を進展させた。この研究の遂行に関し、新たな先行研究の購読を進めつつ、3月にイスラエル人当事者にインタビューを行った。上述の通り、イスラエルによる国際的な広報宣伝に関する考察に関しては、日本中東学会年報にまとめることができた。そのほか、本研究の先行研究であり重要文献と位置付けられるIslam in Liberalismについても書評としてまとめ、日本中東学会年報に投稿、受理された。また、アラビア語・ヘブライ語の習得に期待通りの進展が得られた。1年間にわたるイスラエルのイェルサレムへの渡航によって得られた現地資料及び知見は、帰国後いくつかの研究会で報告を行うことができた。しかしながら、かねてより進めていた動物の権利に関する先行研究の読解は、まだ途上であり、31年度も継続して研究を行う必要性がある。研究員は、本研究課題の遂行のため、以下の方策に従って研究を行う。
分泌蛋白質特異的Secチャネル複合体の構造・機能

大腸菌における分泌蛋白質輸送装置は、SecYとSecEが形成するチャネルに、SecAが挿入・脱離を繰り返して進行する。この時SecGは、その膜内配向性の反転と復帰を繰り返すことによりSecAの挿入・脱離を促進する。SecAやSecGの構造変化の詳細と、因子間の相互作用を明らかにするため、SecG分子内の様々な位置にシスライン残基を一個導入した変異体を多数作製した。これらの変異体SecGはすべて機能を持っており、SecG遺伝子破壊株で発現させると低温での生育が回復した。そこで、変異体を発現した大腸菌から、反転膜小胞を調製し、SH基特異的化学修飾試薬や化学架橋試薬を用いてSecGの膜内での存在様式、他因子との相互作用様式を調べ、以下の成果を得た。1.SecGの膜内配向性は、これまで提唱してきたモデルが基本的に正しく、N末端、C末端をいずれもペリプラズム側に露出し膜を2回貫通し、膜貫通領域の間の領域は細胞質側に露出している。2.SecAと相互作用する領域は細胞質側に露出した領域である。3.チャネル構成蛋白質SecYとは、細胞質側に露出した領域から、2番目の膜貫通領域である。
ドイツ原発政策の変遷と法問題-ミュールハイム=ケアリッヒ事件と脱原発

前年度,ミュールハイム=ケアリッヒ事件の憲法判例を取り上げ,原発設置許可手続における市民の手続的参加権の保障が基本権保護義務の内容となりうることを明らかにした。本年度は,前年度の研究成果を公表し,さらに計画に従って考察を進めた。まず,憲法判例の前置手続として提起された行政裁判を検討した。この事件は,行政行為の執行差止の仮処分をもとめて争われたものであり,迅速手続であったからこそ,憲法訴願においては手続的参加権が主として争われ,実態的基本権侵害の存否について正面から判断は下されなかったものと考えられる。この行政裁判所の判決を検討したあとで,当憲法判例以降に係属したミュールハイム=ケアリッヒ原発関連の行政裁判に考察を進めた。同原発の設置に関する許可処分に対しては,複数の訴訟が提起され,下級審では,許可処分を適法と認めるものと,無効とするものとに,判断が分かれた。最終的には,連邦行政裁判所で無効が確定した。いずれの判断も,裁判所による原発設置の技術的評価にかかわっており,行政裁判において行政庁の判断を裁判所はどの程度尊重すべきか,逆に裁判所はどこまで技術的判断を下すことができるのか,という観点から判例を検討した。ドイツにおける実地調査は,本務との関係で当初の計画ほど十分に出来なかったが,年度末に近い二月に実施し,同事件に実際にたずさわったコブレンツ行政裁判所のルッツ判事にインタヴューを行うことが出来,ミュールハイム=ケアリッヒ原発問題について,事件の争点と全体状況に関して有益な知見を得ることができた。ドイツでの実地調査が遅れたこと,計画期間中に二度の転勤が重なったことから,最終的な研究報告をまとめるにはいたっていないが,判例の翻訳等,逐次Web上で公開する予定である(URL:http://www/law.tohoku.ac.jp/kabashima/)。ミュルハイム=ケアリッヒ事件は、原発設置手続における市民の手続的参加権が争われた憲法裁判である。ドイツ連邦憲法裁判所は、一般論として、市民の手続的参加権を、憲法上の法益として認めた。その理論的根拠は、ドイツ基本法2条2項の生命および健康に対する基本権が、客観法的機能として基本権保護義務を含んでおり、原子力法上の手続的参加権は基本権保護義務の具体化として理解される、という点に存する。連邦憲法裁判所による本決定は、原告訴願者側が敗訴したものの、原発設置許可における手続的権利を憲法上保護された法益として解釈したリーディング・ケースである。ドイツでは、本事件を含め、多くの原発訴訟を通じて市民の権利が確立されていき、このことが2000年に合意された脱原発政策を促し実現させた一つの契機だと考えることができよう。このような基本権解釈を我が国の伊方原発事件に照らして考えると、法定手続保障(憲法31条)の問題として争われた市民の手続的参加権も、むしろ、憲法13条の生命・幸福追求権の保護義務の問題として、理論的に再構成することができる。環境権を憲法上の基本権として捉える際に、本事件により展開された基本権保護義務論を参照することによって、手続的権利の固有の憲法的意義を明らかにすることができる。この考察によって、我が国の憲法解釈および基本権理論にとっても、有意義な示唆が得られる。
四肢形成時のｓｈｈシグナル作用領域と長い糸状仮足の関係と特性

昨年度までにイモリ再生芽において後方局所的にソニックヘッジホッグ分子(SHH)が局所的に発現する時期、位置について特定した。本年度は昨年度までの結果を応用し、様々な成長段階・個体サイズのイモリ前肢を切断し形成された再生芽をサンプリングし、個体サイズと再生芽の特徴、及びSHHの発現範囲と拡散範囲について比較した。その結果、再生芽は個体サイズに応じて変化するものの、再生芽内部の将来的に再生された腕を作る細胞の密度には大きな変化は見られなかった。一方で、再生芽の前後軸に沿った形態を決めるSHH分子の発現する範囲および拡散する範囲は、再生芽のサイズに応じて大きく変化することがわかった。この様な結果から、SHH分子の発現範囲および拡散範囲は再生芽のサイズに応じて制御されていることがわかってきた。この結果の中から、特にSHH分子の拡散範囲について着目することとして、更に解析するために細胞系譜を追跡できる遺伝子組み換えイモリを作製していたが、解析には至らなかった。ここまでの結果をもとに、組織が再生される際に再生される組織サイズに合わせて、組織内の構造が調整されている仕組みについて明らかになっていくことが期待できる。更にゼブラフィッシュの胸鰭鰭条骨格パターンについて、法則性があることまた他の体の構造による制御を受けずにその骨格パターンが決定されている事を昨年度までに解析しており、その結果を論文として執筆中である。29年度が最終年度であるため、記入しない。当年度はまず鳥類ニワトリ、両生類イベリアトゲイモリ、及び魚類ゼブラフィッシュの各初期発生前肢芽(魚類においては胸鰭芽)におけるソニックヘッジホッグ遺伝子(以下Shh)及びその下流遺伝子の発現領域をin situハイブリダイゼーション方を用いて比較した。その結果これらの生物の持つ肢芽は生物種ごとに数倍の違いがあるもののこれらの遺伝子の発現様式は大きな違いが見られなかった。すなわち肢芽の大きさに合わせて生物種間でShh遺伝子の発現領域およびその拡散が調整され四肢の前後軸パターン形成が行われているものと考えられた。ただし今回の実験で行ったのは主に全身をそのまま用いた解析だったので、肢芽の立体的な構造の差異から正確な比較ができていないと感じたので次年度で切片を用いた解析を更に行う予定である。また、イベリアトゲイモリ初期発生中の肢芽及び前肢を切断した際に形成される再生芽において一細胞の形態または成長再生においてどのように細胞が移動するかを観察するために遺伝子組み換えイベリアトゲイモリを作製する準備を始めた。すでにアフリカツメガエルの同様な実験に使用されている遺伝子組み換え用の手法とプラスミドを今回の実験用に改良し試行実験を行った。しかしながら、当年度のイベリアトゲイモリ産卵数が少なく思うように試行の結果を得られなかった。更にイベリアトゲイモリの再生においてShhおよびその下流遺伝子の発現様式が初期発生の前肢肢芽と比べてどのように変わるのかを調べるために、イベリアトゲイモリの再生芽のin situハイブリダイゼーション法による遺伝子の発現範囲の解析実験の試行をおこなった。本年度はまずニワトリ、イベリアトゲイモリ、ゼブラフィッシュの初期胚を用いて全身を使ったin situハイブリダイゼーション法の解析によりShh及びその下流遺伝子の発現領域を観測した。イベリアトゲイモリとゼブラフィッシュの初期胚の交配に難航したものの一定数を用いて発現の解析を行えた。この結果、前肢の原基となる肢芽(ゼブラフィッシュの場合には胸鰭芽)には他の四足類同様後方にShhの強い発現領域があり、下流遺伝子はそこから前方にある程度の広がりを持って発現している様子が観察できた。しかしながら、肢芽の立体的な構造はニワトリが半円柱型、イベリアトゲイモリが円錐型、ゼブラフィッシュが半球形をしており一概に比較はしにくかった。そこで今後組織の切片を用いて同様の解析を行いより詳細にこれらの遺伝子発現の比較を行う予定である。また、遺伝子組み換えイベリアトゲイモリを作製するために遺伝子組み換え用の手法・コンストラクトをアフリカツメガエルで使われているものをもとに用意したが、イベリアトゲイモリの交配が予想よりもうまく行かず、遺伝子組み換え個体作製を試行することができずこの実験は後倒しにした。イベリアトゲイモリの前肢をした際に再生する前肢の原基となる再生芽におけるShh及びその下流遺伝子の発現を調べるためにまず再生の様子の観察とサンプリングの試行を行った。その結果、変態後が最も状態を揃えやすくサンプルを揃えやすいことがわかったので、今後この時期の個体から再生芽を採取し、初期発生肢芽同様に切片でのin situハイブリダイゼーション法を用いて遺伝子発現の領域を解析したいと考えている。本年度は主に魚類ゼブラフィッシュの胸鰭の基底部分と先端部分、そして両生類イベリアトゲイモリの前肢の初期発生時と前肢再生時に、一般的に四肢の前後のパターン形成に重要なソニックヘッジホッグ(以後Shh)遺伝子の局所的な発現と生産されたShhがどれだけの範囲に勾配を持って広がっているかの状況について、これらの組織の遺伝子発現の状況及びこれらの生物の遺伝子組み換え個体を作製から解析しようと試みた。ゼブラフィッシュの解析では胸鰭基部側(担鰭骨領域)にShh遺伝子及びその下流で働く遺伝子の発現は見られたものの胸鰭先端側(鰭条骨領域)は骨格が形成されるまでこれら前後のパターンを形成するための遺伝子の発現は見られなかった。

一方で先端部分の骨格パターンを多数の個体間で比較した結果、先端部分にもはっきりとした前後パターンが発生の早い段階で形成されていることが確認された。今後は遺伝子組み換え個体を用いた細胞系譜の追跡実験からこれらの矛盾がどのように解消されるか解析する予定である。イベリアトゲイモリの解析では、初期発生時の肢芽と前肢切断後に再生時に形成される再生芽においてShh遺伝子とその下流で働く遺伝子の発現をまず比べた。初期発生時の発現様式はShh遺伝子の発現は他の四足類同様の後方局在を示したが、その下流で働く遺伝子の範囲に違いが見られた。再生芽では発現のパターンは初期発生のものと大きく変わらなかったもののそれぞれが発現されている領域は、大きさに応じて変化している様子が観察された。今後は、遺伝子組み換え個体を用いた細胞系譜追跡の実験からこれらの発現範囲の違いが初期発生と再生で形成される前肢のパターンの違いにつながっていることを確かめたい。また、遺伝子組み換え個体を用いてこれらの範囲の違いに肢芽を構成する細胞の持つ細い糸状仮足がどのように影響しているかを観察する予定である。ゼブラフィッシュのShhおよびその下流遺伝子の発現を初期胚以前の研究で知られていた通り担鰭骨領域には見られたものの、期待していた鰭条骨領域での発現は見られなかった。しかしながら、同時に行っていた鰭条骨の前後軸パターンの観察では鰭条骨は担鰭骨領域から半ば独立した形態形成をしていることがわかった。(この結果については論文にまとめて投稿を準備中)また、遺伝子組み換えにより胸鰭の細胞系譜と細胞形態を観察する事ができる系を用意した。イベリアトゲイモリのShh及びその下流遺伝子の発現を初期発生時の肢芽と成長後の前肢を切断した際に形成される再生芽について解析した。肢芽での発現は順調にデータが集まり組織切片を用いた解析からどの程度の範囲(細胞数)に発現が広まっているのかを調べることができた。一方再生芽の場合には、切断後何日目の時点で前後軸に関わるShh関連遺伝子の発現が見られるようになるのかが判明していなかったので、まず時系列的に追った遺伝子発現の解析を行う必要があり、その解析を行い再生後の特定の時期(ステージ)に肢芽と同様なShh関連遺伝子の発現があることがわかり、現在この遺伝子発現の範囲と再生芽の組織の大きさとの関連を調べるため、試行を重ねている。イベリアトゲイモリについても遺伝子組み換え個体の作製を行っていたが、遺伝子組み換えの導入効率が想定していたよりも低く、当初予定していた遺伝子組み換え第1世代を用いた実験が難しく、大量に遺伝子組み換え個体を得られる子世代での解析を行うこととして予定を後倒しにした。昨年度までにイモリ再生芽において後方局所的にソニックヘッジホッグ分子(SHH)が局所的に発現する時期、位置について特定した。本年度は昨年度までの結果を応用し、様々な成長段階・個体サイズのイモリ前肢を切断し形成された再生芽をサンプリングし、個体サイズと再生芽の特徴、及びSHHの発現範囲と拡散範囲について比較した。その結果、再生芽は個体サイズに応じて変化するものの、再生芽内部の将来的に再生された腕を作る細胞の密度には大きな変化は見られなかった。一方で、再生芽の前後軸に沿った形態を決めるSHH分子の発現する範囲および拡散する範囲は、再生芽のサイズに応じて大きく変化することがわかった。
上皮成長因子受容体を標的としたターゲティング型薬剤導入法の確立

本研究では、1EGFRを標的とした細胞特異的な薬剤導入法の確立2EGFRに関わる抗腫瘍効果の機序の解明と新規癌免疫療法の開発3非臨床動物実験モデルの開発を目的としている。平成30年度は、まず実験を開始するにあたり必要な道具資料の収集、そしてプロトコールの作成を行った。細胞は以前より使用しているヒト扁平上皮癌細胞株であるCa9-22細胞に加え、舌癌細胞株HSC-3、HSC-4、SAS細胞を継代培養を行い、それぞれの細胞のEGFRの発現度を確認し、どの細胞が実験に適しているか検討を行った。また、マイクロバブルに修飾する抗体の検討を行った。また抗体修飾マイクロバブルの作製においても、さらに効率的な薬剤導入を目指して、修飾する抗EGFR抗体の量を調製し、新たなマイクロバブルの作製を検討している。今後の人への応用実験へ向けて、倫理委員会で承認されているプロトコールに基づき、実験の準備を進めている。そのために、口腔外科関連の学会に参加し、現在臨床で行われている実際の化学療法の薬剤や方法について情報収集を行い、研究モデルの検討に役立てている。現在実験に用いる細胞や抗体の選定を行っているが、時間がかかっている。また人への応用実験においては、倫理委員会で承認を得た実験を行っていく予定だが、慎重に症例の選択を行っている段階である。今後は、これまでin vitroの実験系で確立してきた新たな癌治療の効果を、動物実験モデル、ヒトにおいて検討する。超音波も、治療用と画像用のものを両方使用することにより、診断と治療を同時に行うことを期待する。そのために、vivoの実験プロトコールを再度確認し実験を行う。並行して、倫理委員会で承認を得た実験を行う症例を選択し、ヒトに対する当該実験の効果の検討を行いたいと考えている。昨年度の研究はvitroの研究がメインであったため、今後vivo、ヒトの実験に用いる動物や試薬、機材等の購入に費用が掛かる分を今年度に繰り越しを行った。また、今後、病理組織標本の染色についての試薬も購入し、使用する予定である。
深部低周波地震の解析に基づく地下深部での火山活動の解明

火山地域の地下10-50 kmで発生する深部低周波地震という通常の地震よりも低周波な波を放出する地震について、全国の火山地域で網羅的に解析する。この地震は一般に規模が小さく、検出や震源の決定が現状では十分でないため、主に震源位置の再決定と網羅的な検出を行い、深部低周波地震の活動の時空間特徴を明らかにする。深部低周波地震は地下深部での流体の移動が関係していると考えられているので、得られた深部低周波地震の活動と噴火や地上付近で発生する火山性地震を比較することで、火山活動と深部低周波地震の関係を理解し、火山活動への地下深部からの影響を理解するという研究である。
可塑的カオス・ニューロン結合系を用いたポスタリゼーション機能を持つ画像領域分割

高階調濃淡画像にも適用可能な動的画像領域分割システムの基盤技術を開発することを目的として,可塑的結合を有する離散時間カオス・ニューロン結合系について研究した。非線形力学系理論を用いて提案システムのダイナミクスを解析し,その結果に基づいて提案システムのパラメータをチューニングした。医用画像を用いた数値実験を通して動的画像領域分割システムとしての有効性を例証したとともに,提案システムをグラフィック専用装置へ実装することで処理時間を大幅に短縮できることも示した高階調濃淡画像にも適用可能な動的画像領域分割システムの基盤技術を開発することを目的として,可塑的結合を有する離散時間カオス・ニューロン結合系について研究した。医用画像を用いた数値実験を通して動的画像領域分割システムとしての有効性を例証したとともに,提案システムをグラフィック専用装置へ実装することで処理時間を大幅に短縮できることも示した画像領域分割は,画像計測や医用画像診断システムに必須の基礎技術である。研究代表者らは,動的画像領域分割のための離散時間カオス・ニューロンモデルと大域的抑制性素子から成るニューロン結合系を提案している。このシステムは,ニューロンが生成する振動応答に基づいて,静止画像中における画像領域を抽出し時系列表示することができる(この機能を動的画像領域分割とよんでいる)。しかしながら,これまでに提案していたニューロン結合系は,自然画像や医用画像のような高階調濃淡画像に対して巧く機能しないことがあるという課題が残されていた。ニューロン間の結合に可塑性を与えることによりこの課題を解決することが,本研究の主目的である。平成22年度においては,ニューロン間に与える可塑的結合の基本構造について検討した。まず,画像中における連続的階調変化を数段階に減階調するポスタリゼーションシステムの非線形ダイナミクスに基づいて,ニューロン間の結合が自動的に形成される構造とした。階調数が比較的少ない低画素数の白黒濃淡画像に対して,ニューロン結合系における可塑的結合とポスタリゼーション機能の動作検証のための数値シミュレーションを行った。その結果,入力画像の階調数が時々刻々と減少するとともに,その階調変化に応じて類似の濃度値を持つ画素に対応するニューロン間の結合が形成される現象が観測された。また,最終的には,各濃淡画像中の画像領域が正確に動的分割されることも確認した。これら研究成果の一部を雑誌論文などで発表した。研究代表者らは,動的画像領域分割のための離散時間カオス・ニューロン結合系を提案している。提案システムは入力画像における画素数と同数のニューロンから構成され,画素値などの情報に基づいて近傍画素に対応するニューロン間の結合が形成される。ニューロン間の結合強度が不変である従来システムに対して,ニューロン間の結合に可塑性を与えることによって,高階調濃淡画像にも適用可能な動的画像領域分割法の基盤技術を開発することが本研窒の主な目的である。本年度得られた主な成果は以下のとおりである。1.高階調濃淡画像に対する動的画像領域分割は提案システムのポスタリゼーション機能に依存し,ポスタリゼーションはニューロン間の結合ダイナミクス(可塑性)によって決定される。人工的に作成した数階調程度の濃淡画像に対して提案システムのダイナミクスを解析し,適切なポスタリゼーション結果が得られるシステムパラメータ値を見いだした。2.動的画像領域分割処理はニューロンが生成する振動応答に基づいて実行される。濃淡画像入力の場合,類似濃度値を持つ隣接画素に対応したニューロンの振動応答が同相で同期することが望ましい。人工的に作成した数階調程度の濃淡画像に対して提案システムの縮約モデルを構築し,その縮約モデルにおけるニューロンの振動応答を非線形力学系理論に基づいて解析した。解析の結果,類似濃度値を持つ画素に対応するニューロンから同相振動応答が発生するシステムパラメータ値を見いだした。3.上記の解析結果に基づいて,可塑的結合を有するニューロン結合系のシステムパラメータをチューニングし,数千画素程度の16ビット濃淡画像に対して適切な動的画像領域分割結果が得られることを例証した。また,これら研究成果の一部を雑誌論文などで発表した。本研究代表者は,離散時間ニューロン結合系にみられる振動応答の同期現象を有効利用した動的画像領域分割法を考案している。ニューロン間の結合強度を一定とした従来システムに対し,ニューロン間の結合に可塑性を与えることによって,高階調濃淡画像にも適用可能な動的画像領域分割システムの基盤技術を開発することが本研究の目的である。提案法は,並列処理による高速化が容易であり,一度の処理で複数画像領域を抽出できる画期的な手法であることから,その実用化に向けた諸問題を解決することが本研究期間内で実施する研究内容である。前年度,非線形力学系理論を用いた数値解析結果に基づいて可塑的ニューロン結合系のパラメータチューニングを行い,いくつかの高階調濃淡画像に対して適切な動的画像領域分割結果が得られることを例証した。これら研究成果に基づいて,平成24年度は,提案システムをグラフィック専用処理装置(GPU: Graphics Processing Unit)へ実装し,処理速度の向上を図るための研究を実施した。今年度得られた研究成果は次のとおり。前年度に使用した画像とは異なる医用画像(高階調濃淡画像)を用いて動的画像領域分割実験を行い,パラメータチューニングした可塑的ニューロン結合系の有効性を検証した。

次に,可塑的ニューロン結合系をGPU装置へ実装するとともに,その動的画像領域分割処理に要する時間を中央演算処理装置(CPU)で実行する場合と比較した。その結果,提案法をGPU実装することにより処理時間を大幅に短縮できることを確認した。これらの研究成果を国際会議で発表するとともに,論文として学術雑誌へ投稿した。提案している動的画像領域分割システムのパラメータチューニングを行うことが今年度の主な目的である。解析結果に基づいて動的画像領域分割システムのパラメータチューニングを行い,高階調濃淡画像を適切に画像領域分割できることが例証された。24年度が最終年度であるため、記入しない。提案した動的画像領域分割システムの実用化に向けた検討を行う。具体的には,提案システムをグラフィック専用処理装置(Graphics Processing Unit)へ実装するためのプログラム開発を実施し,画像領域分割処理速度などの検討を行う。
イオンチャネルの統計力学理論

本研究の目的はイオンチャネルのイオン透過機構とその選択性を分子レベルて記述する理論的方法論を構築することにある。その主な成果は以下の2点である。(1) 3D-RISM理論に基づき、カリウムチャネル(KcsA)の選択フィルター内部の水分子およびイオン(Li+, Na+, K+)の分布を解析した結果、すべてのイオンがフィルター内部に結合し得ること、その結合のモードはイオンにより大きく異なること、また、イオン選択性はこの結合モードの違いに起因することを明らかにした。(2)チャネル蛋白質の構造揺らぎを記述する新規の方程式を3D-RISM理論と一般化ランジェヴァン理論を結合することにより導出した。最近、リアルな蛋白質に対する分子認識のような複雑な現象を予測する目的で分子シミュレーションが適用され始めている。そのような例のひとつがグリセリンを透過するアクアポリン(GlpF)である。GlpFチャネル内部のグリセリンの平均力ポテンシャル(PMF)を計算した論文が、最近、PNASに発表された。しかしながら、その結果は実験(経験)とは逆に、GlpFがグリセリンを全く透過しないことを予測している。我々は3D-RISM理論により、GlpFチャネル内部のグリセリンの平均力ポテンシャルを評価した。3D-RISM理論はこれまでに生体分子の分子認識の問題に応用され、多くの成功を収めている理論である。3D-RISM理論の結果ではシミュレーションの結果とは対照的にGlpFチャネル内におけるグリセリンのPMFには小さなバリアしか存在しないことがわかった。これはGlpFが実際にグリセリンを透過することを示している。そこで、本研究では分子シミュレーションが、何故、このような複雑な系に関する自由エネルギーを正しく評価できないかについての考察も行ない、不十分なサンプリングが高いPMFの原因ではないかと考察した。一方で、3D-RISM理論の結果はリガンド分子の配向も含む全配置空間をサンプルしたものに相当するため、適切なPMFを算出できたと考えられる。今回の結果は、今後、分子シミュレーションが実験結果の「解釈」ではなく、「予測」を行なう上で、何が必要かを端的に示唆するものである。[J-Phys.Chem.,B,114.7967(2010)に既報]KcsAカリウムチャネルのイオン選択性と透過機構を調べるため、このチャネルの選択フィルター領域内における正イオン(K^+,Na^+,Li^+)および水分子の分布を3D-RISM理論によって計算した。その結果、上記の全てのイオンに関して、フィルター内に顕著な分布を見出した。この結果は、Na^+やLi^+はKcsAフィルター内に結合できないとする従来の直感的描像を否定している。一方、その結合サイトおよび結合モードはイオンによって全くことなることが分がった。K^+はフィルターを構成するアミノ酸残基から出ている8個のカーボニルグループのほぼ中心(cage site)に水分子と交互に結合する。一方、Li^+は4個のカーボニルグループが作る平面の中心(plane site)に結合し、さらにそれを上下のcage siteに結合した水分子が安定化する。また、Na^+イオンはcage siteとplane siteの両方に幅広く分布することが分かった。それでは、イオンの選択性は何に起因するか?この疑問に答えるため、チャネル軸に沿ったK^+とNa^+の平均力ポテンシャルを3D-RISMにより求めた。その結果、まず、フィルターの両端からチャネル内に侵入する場合の活性化障壁の高さを比較するとNa^+がK^+に比べて約2kcal/mol高い値を示した。これは、K^+の方がチャネル内に侵入しやすいことを意味する。さらに、チャネルの内側から抜け出る場合の活性化障壁を比較すると、Na^+は約10kcalの高い障壁をもっているのに対して、K^は障壁の途中(56kcal)に局所的な極小値が存在し、この極小領域を踏み台としてチャネル外に抜け出ることができる可能性を示唆している。我々はこの結果をもとにK^+の透過機構に関する新しいモデル(rock climbing model)を提案した。(PNASの投稿中)イオンチャネルは生物内の情報伝達機構において中心的な役割を担う分子機械である。本研究は、イオンチャネルのイオン透過機構とその選択性を分子レヘルて制御する理論的方法論を構築することを目的に、1. KcsAチャネルのイオン選択性、2. KcsAイオンチャネルの動作機構解析、3.不均一RISM理論の構築、を課題として遂行した。その成果を課題毎に述べる。(1) KcsAチャネルのイオン選択性を明らかにする目的で、その選択フィルター内部でのLi+, Na+,およびK+の水和構造に違いを詳細に調べた。

選択フィルター内のイオンの結合位置は概ね二つ分けることができ、それらが交互に配置されている:8個のカルボニル基に囲まれた空孔(ケージサイト)、および4個のカルボニル基が作る平面の中心(プレーンサイト)。3D-RISM理論に基づく計算の結果、以下のことが明らかになった。イオンが存在しないとき、水分子はケージサイトに結合している。Li+はプレーンサイトに結合し、その両隣のケージサイトにある水分子を配位している。K+はケージサイトに結合しており、水分子を直接配位していない。また、Na+はプレーンサイトとケージサイトにまたがって結合しており、その間の障壁もそれほど高くない。(2)チャネル内部へのイオンの侵入は開口部の開閉(ゲーテイング)によって制御されているが、この機構はチャネル(蛋白質)の構造揺らぎと密接に関わっている。本研究では、3D-RISM理論に基づき蛋白質の構造揺らぎとダイナミクスを記述する計算のアルゴリズムを考案した。(3)チャネル内部の不均一な場の中におけるイオンや水の2体相関関数を求める計算アルゴリズムを考案し、その計算を容易にするため、3D-RISMプログラムとDiscovery Studioとの結合を行った。イオンチャネルは生物内の情報伝達機構において中心的な役割を担う分子機械である。本研究は、イオンチャネルのイオン透過機構とその選択性を分子レヘルて制御する理論的方法論を構築することを目的に、1. KcsAチャネルのイオン選択性、2. KcsAイオンチャネルの動作機構解析、3.不均一RISM理論の構築、を課題として遂行した。その成果を課題毎に述べる。(1) 3D-RISM理論に基づき、チャネル内部のカリウムイオンとナトリウムイオンの平均力ポテンシャルを解析し、それらを比較することによって、KcsAチャネルのカリウムイオン選択性に関するモデル(ロッククラインミングモデル)を提案した。まず、両イオンともチャネルに侵入する際に脱水和に伴う活性化障壁を乗り越える必要があるが、その障壁の高さはナトリウムイオンの方がカリウムイオンに比べて高い。さらに、チャネル内部から外部に出て行く際の自由エネルギー障壁の形状に顕著な違いが見られる。ナトリウムイオンの場合は、非常に障壁を一挙に乗り越える必要があるのに対して、カリウムイオンの場合は障壁の途中に局所的な安定点があり、2段階で乗り越えることができる。3D-RISM理論に基づき、蛋白質の構造揺らぎとダイナミクスを記述する理論を提案した。(3)チャネル内部のイオンのダイナミクス(伝導)を解明するためには、チャネル内部の不均一な場の中におけるイオンや水の2体相関関数が必要となる。本研究では、異なる位置における密度分布関数の積でこの2体相関関数を近似する方法を考案した。3D-RISM理論に基づく計算により、KcsAチャネルのイオン選択性と透過機構に関する従来の概念を否定し、新しいモデルを提案した。
DNA多型を利用した但馬牛繁殖雌牛集団の遺伝・育種学的研究

兵庫県産の黒毛和種「但馬牛」は、その肉質が極めて優れており、わが国の黒毛和種の改良に多大の影響をもたらしているが、その繁殖雌牛集団はわずか2,000頭にすぎない。われわれは本研究課題においてこの繁殖雌牛集団の有効な活用を計るためDNAフィンガープリント(DFP)法と制限酵素切断断片長多型(RFLP)分析によるDNA多型分析を利用した親子鑑別や集団の遺伝的構成など遺伝・育種学的検討を加えた。結果の概要は次のとおりである。1).プローブにM13ファージの反復配列を用してDFPを親子関係の明らかな繁殖雌牛集団の42組に適用したところ、制限酵素としてHae IIIをはじめ、二、三の酵素を用いればどの組でも親子鑑別が可能であった。2).DFPのバンド(ミニサテライト遺伝子)の類似性(X)と血縁係数(Y)の関係をGenetic Similarity法で求めたところ、Y=1.149X-0.026という有意な回帰関係が認められ、バンドの類似性から血縁係数が予側できることが示された。3).DFPのバンディングパターンでクラスター分析を行ったところ、兵庫県美方郡の繁殖雌牛集団は2つの大きなクラスターに分けられた。その原因を調べた結果、評価した20のミニサテライト遺伝子座のうち遺伝子座16と19の頻度により2つのクラスターに分けられることがわかった。4).リポプロテイン・リパーゼ(LPL)のcDNAをプローブとしてウシのRFLP分析を行った。その結果、LPLのcDNAのアミノ酸をコードしている5'の部分をプローブにするとHind III、Pst Iなど5種類の制限酵素を用した場合に多型が観察された。兵庫県の閉鎖繁殖雌牛集団ではこれらのRFLPはハプロタイプ様のクラスターを形成して、個体はAA型,BB型のいずれかに分類された。この多型は単純なメンデル遺伝をし、同集団116頭ではA型のクラスターの遺伝子頻度は0.418、B型のそれは0.582であった。DNAフィンガ-プリント法は、かなり相同性の低いミニサテライト領域まで検出するため、ハイブリダイゼ-ション後の洗浄はかなり甘い条件で行う。そのため条件はかなり厳密に設定しないと再現性に問題が残る。そこで今年度、ウシを用いる場合の最敵条件の設定を試みた。ウシのほか、同時にブタ、ウサギ、ラット、マウス、ニワトリ、ホロホロ鳥で条件設定を行ったところ、哺乳類と鳥類でstringencyに大きな差が見られた。同条件で、哺乳類と比較して鳥類ではより強いシグナルが観察されたが、哺乳類の中では差はなかった。洗浄の温度、塩濃度を変えて調べたところ、哺乳類における洗浄の最適条件は4×SSC,0.1%SDS,55°Cで30分間2回、2×SSC,0.1%SDS,55°Cで30分間1回洗浄であった。3品種のウシ(黒毛和種、褐毛和種、ホルスタイン種)を5頭ずつ用いたフィンガ-プリントでは、どの個体も非常に多数の多型性に富んだバンドが観察され、品種間、品種内に関係なく個体に特有のバンドパタ-ンを示していた。これらの結果から、本法を用いることによって一度の分析で個体識別が可能だと言える。次に、4家系からなる黒毛和種に対して親子鑑別を行った。どの家系においても子供のバンドは両親のどちらかから受け継いでおり、親子関係に矛盾はなかった。

本研究で用いた両親間の血縁は高く、血縁係数は家系1で36.7%であり、以下家系2(43.3%)、家系3(28.2%)、家系4(49.2%)であった。しかし、血縁の最も高かった家系4では雄親のみから受け継いでいるバンドはなく、両親と子供の3個体間に共通のバンドは55.6%と高くなっていた。これらのことから両親間の血縁が高い場合、判別不能のケ-スが生ずる可能性があると思われた。この様な場合の解決策を考慮する必要があろう。兵庫県産の黒毛和種「但馬牛」は、その肉質が優れているためにわが国の黒毛和種の改良に多大の影響をもたらしているが、その繁殖雌牛集団はわずか2,000頭にすぎない。我々はこの繁殖雌牛集団の有効な活用を計るため、DNAフィンガ-プリント法による親子鑑別や集団の遺伝的構成など遺伝・育種学的検討を加えている。本年度得られた成果は次の通りである。1.親子関係の明らかな繁殖雌牛集度の42組について親子鑑別を行ったところ積極的な親子鑑別の行えない親子の組が2組存在した。この原因は分析対象とした兵庫県の繁殖雌牛集団が血縁の高い集団であるためと考えられた。しかしながら、この組でも制限酵素を変えることによりこの問題が解決された。このことから血縁の高い親子の組でも本法を用いた親子鑑別に特に問題はないことが示された。2.バンドの類似性(X)と血縁係数(Y)の関係をGenetic Similarity法を用いて求めた。その結果、両者の間には高い相関(相関係数0.813)があり、Y=1.149x-0.026という式を用いてバンドの類似性から血縁係数が予測できることが示された。3.DNAフィンガ-プリントのバンディング・パタ-ンでクラスタ-分析を行なった。その結果、兵庫県美方郡の繁殖雌牛集団は2つの大きなクラスタ-の分けられた。その原因を調べた結果、評価した20のミニサテライト遺伝子座のうち遺伝子座16と19の頻度により2つのクラスタ-の分けられることが示された。さらに、この2つの遺伝子座は同一の染色体に存在しており、16^+/19^+、16^-/19^-、16^-/19^+のハプロタイプを形成していることが推定された。DNA多型分析は、DNAフィンガープリント法と制限酵素切断断片長多型分析(RFLP)からなっている。前年度までは前者分析法により、但馬牛繁殖雌牛集団の多型分析を行ってきたが、今年度は、後者分析を同集団に適用した。プローブとしてはウシ由来の脂肪代謝の一酵素であるリポブロテイン・リパーゼ(LPL)のcDNAを用いた。結果は次のとおりである。LPLのcDNAを、アミノ酸をコードしている5'の部分と3'の非翻訳領域とに分割し、それぞれをプローブとした。3'非翻訳領域のプローブではHindIIIをのぞいてRFLPは認められず、HindIIIのRFLPも明瞭ではなかった。一方、アミノ酸をコードしている5'の部分をプローブとすると、調査した9種類の制限酵素のうち、HindIII、Pst1、HaeIII、Tag1、Msp1の5種類の多型が観察された。兵庫県の閉鎖繁殖雌牛集団では、それらのRFLP型はハプロタイプ様のクラスターを形成して、お互いに関連しており、個体はAA型、AB型、BB型の何れかに分類された。このように5種類もの制限酵素が一致した挙動を示すことは珍しく、その原因としては5種類の制限酵素で切断される比較的長い断片がイントロン部位で正逆の方向に挿入されている可能性が高いものと推定された。