hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新しい超解像ライブイメージングシステムの開発と多繊毛協調運動メカニズムの解析

5日間に渡る気管多繊毛上皮細胞の秩序形成過程を研究対象とするため、5日間の長期ライブイメージングを行うわけであるが、顕微鏡下で観察対象がランダムに上下に動くので、これまでは24時間人が張り付き、人力でフォーカスを合わせ続ける必要があった。本年度の特筆すべき進歩としては、これまでになかった新たなオートフォーカスの技術をオリンパス社との共同研究のもと新規に開発し、ライブイメージングの自動化に成功したことである。またこの技術の論文発表を目指して執筆までの計画を立て、本論文発表のためのデータ取得を試みた。また本研究の根幹をになう、繊毛基底小体及び基底小体の方向性を示すBasal footの両方を、蛍光タンパク質でラベリングされたトランスジェニックマウスが、所属研究室内メンバーとの共同研究により樹立された。このトランスジェニックマウスから初代培養した気管多繊毛上皮細胞を用いた、繊毛基底小体及びBasal footを同時に動態観察する二色ライブイメージングに取り掛かりつつある。またBasal footの配列において重要な役割を果たす上皮細胞表層骨格に関わるタンパク質について、論文執筆をすすめており、論文投稿段階に至っている。本研究における5日間に渡る長時間ライブイメージングは、観察対象であるマウス気管多繊毛上皮の初代培養細胞が顕微鏡下でランダムに上下に動くため、24時間人力でフォーカスを合わせ続ける必要があった。またこのオートフォーカス技術の論文作成を目指し、執筆を始めたが、論文に必要なデータの約2/3取得が終わったところで体調不良のため論文作成に必要なデータを取得できなかった。次に本研究の根幹をになう、繊毛基底小体と繊毛基底小体の方向性を示すBasal footの二色ライブイメージングの進展については、所属研究室においてBasal footの構成タンパク質をRFPでラベリングした遺伝子を導入したトランスジェニックマウスが樹立された。このマウスを従来から使用いていた繊毛基底小体がGFPでラベリングされたマウスと交配することにより、繊毛基底小体をGFPでBasal footをRFPでラベリングしたトランスジェニックマウスを研究室内メンバーとの共同研究のもと樹立しつつある。このマウスから初代培養した気管多繊毛上皮細胞を用いた繊毛基底小体及びBasal footを同時に動態観察する二色ライブイメージングに取り掛かったが、このトランスジェニックマウスから得られる初代培養細胞が、従来の基底小体をGFPでラベリングした単色の初代培養細胞と比べ、非常に弱く、ライブイメージングの光毒性に耐えられないという問題に直面した。また、Basal footの配列において重要な役割を果たす上皮細胞表層骨格に関わるタンパク質について細胞生物学的解析を行った成果をまとめた論文執筆もすすめており、データ取得や論文執筆作業が終わり論文投稿段階に至っている。これまでになかった新たなオートフォーカスの技術をオリンパス社との共同研究のもと新規に開発し、ライブイメージングの自動化に成功した技術の論文発表を目指し、特別研究員を再開できれば、データの取得を始める予定である。
セレニウム投与におけるがんの予防およびその機構解明に関する研究

セレニウムはいくつかのガンに対し予防効果を持つと考えられており、この効果が悪性黒色種(メラノーマ)の予防に対しても同様な効果が得られるか否か動物実験を用いて確かめた。本研究において、メラノーマ自然発症モデルマウス(10週程度より腫瘍発生が認められる)に対し、37週間セレニウム化合物(Se-セレノメチルセレノシステイン)を投与した。結果、腫瘍発生初期においてセレニウム投与群の腫瘍発生率はコントロールに比較して発症率が高いものの、15週を経ると逆にセレニウム投与群の腫瘍発生率は低下した。また、一匹あたりの腫瘍体積に関してもセレニウムを4pplDの濃度で投与した場合、30週より顕著に体積の増加の遅滞が認められ、本研究で使用したセレニウム化合物は悪性黒色種の発生及び進展を抑制する事が示唆された。さらに、この腫瘍発生及び進展の抑制がどのようなメカニズムで起こるか確かめる為に、セレニウムががん抑制遺伝子等の発現調節領域の脱メチル化を起こさせ、これら遺伝子が発現することにより腫瘍発生及び進展が抑制される」という仮説をたてて、解析を試みた。発生した腫瘍についてがん抑制遺伝子等の発現及びその調節領域のメチル化の違いを解析したところ、セレニウム投与群の腫瘍はがん抑制遺伝子等の発現が高く、調節領域のメチル化が低いという結果を得た。このことから、セレニウムの悪性黒色種発生及び進展抑制のメカニズムとして、セレニウムががん抑制遺伝子等の調節領域の脱メチル化を引き起こし、がん抑制遺伝子等の発現を上昇させる事により腫瘍の発生及び進展の抑制が起こる可能性がある事が示唆された。c-RET遺伝子は受容体型チロシンキナーゼをコードしており、家族性甲状腺髄様ガン、多発性内分泌腫瘍症などの腫瘍性疾患の原因遺伝子であることが報告されている。がん遺伝子RETを導入したマウス(良性腫瘍形成が認められるが悪性黒色種にならない系統)に紫外線曝露を行うことにより、悪性黒色種を発症した。また紫外線照射によりRET遺伝子の発現増強および、この遺伝子の下流因子であり、がん化との関連が示唆されている分子の活性化が認められたことから、紫外線曝露に伴うこれらの反応は悪性黒色腫発症に対し重要な役割がある事が示唆された。紫外線は悪性黒色腫の発症の原因のひとつと考えられているおり、皮膚組織にあるメラニン色素の紫外線に対する防御効果が疫学的研究において報告されている。またメラニン色素が紫外線によるDNAのダメージを防御していることがin vitroの実験により明らかにされているが、メラニン色素が紫外線によるがん発症に対する予防効果を認めるin vivoによる直接的な証拠は限られている。今回、紫外線照射したメラニン色素過剰マウスと色素の少ないマウスの皮膚のガン化および、ガン化シグナルの活性化を比較することにより、メラニン色素による紫外線の防御効果をin vivoで明らかにした。セレニウムのがん予防効果を確かめるため、悪性黒色腫自然発症マウスに様々な濃度のセレニウム化合物(乳がんの予防効果が非常に高いと考えられているSe-methylselenocysteineというセレニウム化合物)を長期間投与して、投与量に対してどの程度悪性黒色腫の発症を予防できるか、また発症を遅延できるか検討を行っている。また、ガン予防効果機構解明のため、悪性黒色種に同上のセレニウム化合物を曝露してアポトーシス関連因子の発現動向について検討している。また、一匹あたりの腫瘍体積に関してもセレニウムを4ppmの濃度で投与した場合、30週より顕著に体積の増加の遅滞が認められ、本研究で使用したセレニウム化合物は悪性黒色種の発生及び進展を抑制する事が示唆された。

さらに、この腫瘍発生及び進展の抑制がどのようなメカニズムで起こるか確かめる為に、「セレニウムががん抑制遺伝子等の発現調節領域の脱メチル化を起こさせ、これら遺伝子が発現することにより腫瘍発生及び進展が抑制される」という仮説をたてて、解析を試みた。発生した腫瘍についてがん抑制遺伝子等の発現及びその調節領域のメチル化の違いを解析したところ、セレニウム投与群の腫瘍はがん抑制遺伝子等の発現が高く、調節領域のメチル化が低いという結果を得た。このことかち、セレニウムの悪性黒色種発生及び進展抑制のメカニズムとして、セレニウムががん抑制遺伝子等の調節領域の脱メチル化を引き起こし、がん抑制遺伝子等の発現を上昇させる事により腫瘍の発生及び進展の抑制が起こる可能性がある事が示唆された。
日本古代印章の基礎的研究

平安前期までの文書・典籍にみえる印影一覧を作成し、これにそって写真の収集・整備を行ない、一部について原本の調査を行なった。また既往の研究史を補うため、これまで比較的研究の手薄な江戸時代の印譜・印史類や、出土印章に関する文献についても、未刊資料を含めてリストアップし、調査と資料収集を行なった。中国史料にみえる印影についても、比較研究に資するため、英・仏所在の敦煌文献を中心に写真収集に努めたが、撮影状態が必ずしもよくないため、充分所期の目的が達せられたとはいえない。本研究における最も大きな成果としては、東京国立博物館所蔵の香木に押捺された焼印に関する新知見があげられる。香木は2点あり、いずれももと法隆寺伝来で、各々に銘文と焼印のあることは古くから知られていたが、とくに徹底した研究はなされていなかった。古代における焼印の遺存例は現在これのみであるので、今回この香木2点を実物において調査し、その材質が白檀であることを確認すると共に、写真撮影を行なって検討を加えた結果、焼印の文字は78世紀のソグド文字であることを確かめることができた。日本の律令制下の焼印とは直接結びつかないが、焼印の使用例として意義深く、これを手掛りにして焼印の機能のみならず、古代における香木輸入の実態や、さらにはソグド人などによる通商活動まで究明することができる。この成果は別掲の論文で詳細に発表する予定である。
プリオンを制御する細胞システムの解析

感染性タンパク質であるプリオンは単細胞真核生物の酵母にも存在する。本研究では、細胞がプリオンを制御するシステムを解明することを目的に、遺伝学的手法に優れている酵母を利用した。そして、Rnq1のN末端領域の変異体、mRNAの成熟化や分解に関わるLsm4タンパク質、膜輸送タンパク質Dip5の変異体が、酵母プリオン[PSI+]を消失させることが判明した。get3変異体とGFP融合タンパク質の局在解析から、Dip5変異タンパク質が小胞体に局在することがプリオン消失に重要であることが示唆された。狂牛病で知られるプリオンは、タンパク質のみで感染性を持つユニークな感染体である。その実体は、プリオンタンパク質PrPが作る特殊な構造のアミロイド線維である。同様に単細胞真核生物の酵母にも、タンパク質のみから成る感染性粒子、酵母プリオンが存在する。本研究では、酵母プリオンを利用して、細胞がプリオンを制御する分子メカニズムの解明を目的とする。今年度は、酵母プリオンを阻害する因子のスクリーニングを行うことにより、Lsm4タンパク質と異常型膜タンパク質(Dip5変異タンパク質)が酵母プリオンの阻害因子であることを明らかにした。Lsm4タンパク質はmRNAのスプライシングや分解に関わる。このLsm4タンパク質はアミロイド線維を形成することが、プリオン阻害に必要であった。一方、Dip5の正常型タンパク質は本来、細胞膜に局在して膜輸送に働く。この変異型膜タンパク質であるDip5変異タンパク質は小胞体に局在していた。Dip5変異タンパク質が小胞体ストレスを起こして小胞体関連分解(ERAD)が誘導されていると予想されたが、小胞体ストレスは起きていなかった。一方、GET経路はTA膜タンパク質の膜挿入に重要な役割を持つ。このGET経路の一つの遺伝子、GET3の破壊株ではDip5変異タンパク質の小胞体への局在が乱れ、同時にプリオン阻害活性を失った。このことから、GET経路は複数回貫通型膜タンパク質の膜挿入に必要であること、及び、異常型膜タンパク質が小胞体に捕捉されることが、プリオン阻害に重要な役割を持つことが示された。狂牛病等で知られるプリオンは、タンパク質のみで感染性を持つユニークな感染体である。本研究では酵母プリオンを利用して、生体がプリオンを制御する分子メカニズムの解明を目的とする。Rnq1タンパク質はグルタミン・アスパラギンをC末端側に多く含むタンパク質で、酵母プリオンの一種である[RNQ+]プリオンを形成する。[RNQ+]プリオンは他の酵母プリオン[PSI+](翻訳終結因子Sup35のプリオン)の形成を促進することが知られている。Rnq1のN末端100アミノ酸残基を欠損したRnq1Δ100タンパク質によって[PSI+]プリオンが消失することが明らかとなっていたが、N末端側のミスセンス変異タンパク質の発現によっても、[PSI+]プリオンが消失することを明らかにした。[PSI+]プリオンを消失させる複数のN末端側rnq1変異タンパク質の変異分布を調べると、αヘリックスに集中していることが判明した。さらに、[PSI+]プリオンの阻害過程を生化学的なアッセイ法および蛍光相関分光法を用いて測定、観察を行ったところ、Rnq1変異タンパク質によって[PSI+]プリオンが増大することが判明した。酵母は細胞分裂を行いながらプリオンを保持するために、プリオンの増大によってプリオンの核となるシード(たね)が娘細胞に伝播しないことでプリオンの阻害が起きている可能性があり、Rnq1変異タンパク質がそのプリオン制御システムを撹乱していることが示唆された。昨年の東日本大震災により研究室の物品や設備が大量に破壊された。さらには水道の確保、耐震の再補強など研究を開始するためには研究室のセットアップが必要であった。以上の不測の事態から研究の開始が遅れてしまったことが原因である。プリオン制御に働く細胞システム理解のため、プリオン阻害因子の解析を行う。(1)プリオン阻害因子の局在解析:酵母において、プリオンは細胞質に複数のドット状で存在している。プリオン阻害因子が局在する場所はその伸長反応の場の可能性があるので、プリオン阻害因子の詳細な細胞内局在の観察を行う。プリオン阻害因子のGFP融合タンパク質を作製し、各オルガネラに局在するmRFP融合タンパク質マーカーと共に観察する。ここで明らかにしたプリオン阻害因子の局在するオルガネラを乱す変異体や薬剤などを利用して、その場でプリオンが伸長するか検証する。(2)細胞応答の解析:プリオン阻害因子発現時に起きる細胞内応答を調査する。

阻害因子は細胞に何らかのストレスをかけていることが予想されるので、ストレスマーカーを利用して、ストレス強度を測定する。熱ストレスや小胞体ストレスのマーカーはストレス誘導される遺伝子のプロモーター下にlacZ遺伝子を配置したプラスミドを利用して、βガラクトシダーゼアッセイによって測定する。これら2種類のストレスに影響がない場合はマイクロアレイによって遺伝子発現プロファイルを調べて、細胞応答の種類を明らかにする。ここで明らかにした細胞応答が直接プリオンの阻害に関与しているか、その細胞応答を刺激する既知の薬剤を用いて解析する。さらに、突然変異体等を用いて、その応答からプリオン制御に及ぼす一連のカスケードを明らかにする。(3)哺乳類プリオン感染細胞における酵母プリオン阻害因子の活性:酵母と哺乳類間においてプリオンを制御する細胞システムの共通性を検証する。哺乳類細胞の発現用ベクターに酵母プリオン阻害遺伝子を挿入して、プリオン持続感染細胞にトランスフェクションする。そして、プリオン阻害因子発現後のプリオン消失効果をウエスタンブロット法により確認する。次年度使用額は当初計画していた哺乳類プリオン感染細胞に対する研究を次年度に延期することによって生じたものであり、その延期した研究に必要な経費として平成24年度請求額とあわせて使用する予定である。
文字列解析によるウェブソフトウェア開発支援

HTML5構文解析の信頼性の向上を目指した研究を行った.仕様に基づく網羅的なテストの自動生成によるHTML5構文解析器の仕様への適合性検査を実現した.形式化した仕様を条件付きプッシュダウンシステムへ変換し,プッシュダウンシステムに対し到達可能性解析を適用することで,テストの自動生成を行った.ウェブソフトウェアに対するプログラム解析の精度を高めるために,正則表現マッチングの意味論の研究を行い,リストモナドに基づく意味を与えた.また,正規表現に対して,その正規表現によるマッチングの計算時間が,入力文字列の長さに対して線形であるかを判定する手法を木トランスデューサに理論に基づき構築した.文字列解析によるウェブソフトウェア開発支援について以下の研究を行った.(1)HTML5構文解析仕様の形式化に基づき,構文解析器のテストのためのHTML文書を自動生成する研究を行った.本年度は,対象とする仕様のサブセットを広げた,特に,active formatting elementと呼ばれる要素に対し,ネストの深さを制限することで,テストの自動生成を可能にした.この拡張を実装し実験を行った結果,HTML5構文解析ライブラリの主要な実装である. html5lib及びgumboについて,非互換性を発見し問題点を開発者に報告した.(2)HTML5構文解析仕様など,スタックの内部を書き換えるシステムの検証のために,プシュタウンシステムにおいて,スタック内部の書き換えを許す拡張を提案した.拡張したプッシュダウンシステムは,出力付きオートマトン(トランスデューサ)により,スタック内部を書き換える.特に,遷移に用いられるトランスデューサが,合成と商(quotient)に関して閉じている場合には,到達可能性解析が決定可能であることを示した.これにより,この計算モデルをシステム検証に応用することが可能になる.(3)ウェブソフトウェアで用いられる正規表現マッチングに関する研究を行った.プログラミング言語における正規表現マッチングは,バックトラックに基づき実装されており最悪の場合には実行が指数関数時間となる.近年,この実行時間に関する問題が,DoS脆弱性などの大きな問題の原因となることが報告されている.この問題を解決するため,本研究では,正規表現マッチングの実行が線形時間となるか判定するアルゴリズムを開発した.HTML5構文解析の信頼性の向上を目指した研究を行った.仕様に基づく網羅的なテストの自動生成によるHTML5構文解析器の仕様への適合性検査を実現した.形式化した仕様を条件付きプッシュダウンシステムへ変換し,プッシュダウンシステムに対し到達可能性解析を適用することで,テストの自動生成を行った.ウェブソフトウェアに対するプログラム解析の精度を高めるために,正則表現マッチングの意味論の研究を行い,リストモナドに基づく意味を与えた.また,正規表現に対して,その正規表現によるマッチングの計算時間が,入力文字列の長さに対して線形であるかを判定する手法を木トランスデューサに理論に基づき構築した.文字列解析によるウェブソフトウェア開発支援について以下の研究を行った.(1)HTML5構文解析仕様を形式化する研究を行った.HTML5構文解析仕様は,スタックを用いた複雑なアルゴリズムとして自然言語により記述されている.研究の第一段階として,active formatting elementと呼ばれる要素に関する処理を含まないサブセットを,遷移の条件としてスタックの内容を正則言語で検査できる条件付きプッシュダウンシステムとして形式化した.また,active formatting elementに関する処理の形式化のため,スタックを2本持つモデルの導入を行い,到達可能性問題を決定可能にする条件に関して分析を行った.(2)HTML5構文解析仕様の形式化に基づき,構文解析器のテストのためのHTML文書を自動生成する研究を行った.条件付きプッシュダウンシステムに対する効率的な到達可能性判定アルゴリズムを開発し,テストの自動生成に応用した.構文解析仕様のサブセットから約350個のテストが生成でき,SafariやFirefoxの仕様に対する非互換性の発見に成功した.(3)ウェブソフトウェアで用いられる正規表現マッチングの意味論の研究を進め,アトミックグループと呼ばれる正規表現の拡張について研究を行い,その拡張を含む正規表現の言語が正則であることを示した.また,拡張された正規表現からオートマトンへの変換を実装し,サーバサイドプログラムに実際に現れる正規表現に対して,評価を行った.文字列解析によるウェブソフトウェア開発支援について以下の研究を行った.(1)文字列から新たな文字列を生成する計算モデルとしてAlurらにより提案されたストリーミング文字列トランスデューサ(Streaming String Transducer:SST)を,正規表現による文字列置換に関する検証問題に応用した.正規表現による文字列置換を模倣する関数的SSTを構成し,関数的SSTの等価性判定により,その等価性の判定を実現した.また,AlurらによるSSTの等価性判定アルゴリズムを複数のステップに分割・再構成し,より見通しの良い判定アルゴリズムを与えた.(2)一般化された重みの構造を持つ重み付きプッシュダウンシステムについて,その表現力を明らかにする研究を行い,次の二つのプッシュダウンシステムの拡張を表現できることを示した:Well Structured Pushdown System(well-quasi orderを備えた無限集合をスタック記号として許す拡張),スタック全体をトランスデューサによって書き換えることを許す拡張.(3)正規表現マッチングの計算量判定について研究を行った.トップダウントランスデューサに関するAhoとUllmanによる判定アルゴリズムが,先読み付きトップダウントランスデューサに拡張できるかについて分析を行った.この拡張が実現できれば,2乗や3乗などのオーダに対して計算量の判定が可能となり,正規表現マッチングが原因となるDoS脆弱性をより詳細に検査できるようになる.ソフトウェア検証理論面では,スタック内部の書き換えを許すプッシュダウンシステムを提案し,国際会議において発表している.

また,ウェブプログラミングで重要となる正規表現マッチングの実行時間が線形であるかの判定は,実用上非常に有用であり,また,トランスデューサの理論を適用した点でも新規性が高い.ウェブ環境が急速にHTML5ベースに移行しつつあり,ウェブの開発支援技術のHTML5への対応が急がれている.本年度の研究は,この点で成果を上げており,研究はおおむね順調に進展していると評価できる.文脈自由言語及びプッシュダウンシステムに基づくシステム検証の理論に関する研究を行い,同時に,その成果をウェブソフトウェア開発支援に応用する研究を行う.国際会議などへの参加により,国内外の関連分野の研究者との交流を進め,研究を加速する.文脈自由言語及びプッシュダウンシステムに基づくシステム検証の理論に関する研究を行い,同時に,その成果をウェブソフトウェアの開発支援に応用する研究を進める.国際会議などへの参加などにより,国内外の関連分野の研究者との交流を進め,研究を加速する.特に,下記の研究に重点を置き研究を進める.(1)プッシュダウンシステムの拡張として,スタックをトランスデューサで書き換える遷移を考える.この拡張に対する到達可能性解析アルゴリズムを開発し,HTML5に関する研究に応用する.(2)正規表現マッチングに関する研究を進め,マッチングに必要となる計算時間が線形となるか判定するアルゴリズムを開発する.木トランスデューサに関する理論を応用できると考えている.以下の二つの理由から差額が生じた.平成25年度中に購入を計画していた大容量のメモリを持つコンピュータの納品が年度内に間に合わなかった.採録された論文の掲載料の支出が平成26年度に持ち越された.平成26年度の早い時期に大容量のメモリを持つコンピュータを購入し大規模な実験を行い,研究を進める.国際会議における研究成果の発表12回,国内の研究集会における成果発表23回の費用を支出する.また,ウェブソフトウェア開発支援システムの開発に使用するノート型コンピュータを12台購入する予定である.
車いす駆動における運動機能評価と適合支援システムに関する研究

車いす使用者の身体運動機能と身体負荷をリアルタイムに計測・評価し、個々人に最適な車いす寸法・形状を自動的に探索する新しい適合システムを構築するため、車いすのシート高さ、ホイールベース長さ、トレッド幅、シート角度、背もたれ角度、走行抵抗などを変更可能な車いすシミュレータを開発した。本シミュレータの各部の調節箇所には、電動式リニアアクチュエータとリニアガイドウェイがそれぞれ組み込まれており、様々な実験条件を自由にパソコンで設定することができる。また、車いすの寸法・形状だけではなく、駆動方式も同時に検討できるよう、前年度開発したハンドリム式の3次元駆動力計測システムの他に、レバー式の計測システムを駆動部に取りつけることができる、適合評価の指標としては、身体運動と駆動力の計測結果に基づく運動学的・動力学的な評価、上肢7関節(肩関節の屈伸、内外転、内外旋、肘関節の屈伸、手関節の回内外、掌背屈、澆尺屈)の最大関節トルクの実測値に基づく上肢残存機能の評価、酸素摂取量や心拍数などを用いた生理学的な評価、座面や背もたれの体圧分布の評価などを用いる。本シミュレータは、様々な実験条件下での計測・評価を効率良く短時間で行えるため、適合に要する車いす使用者の時間的、身体的負担を軽減することができる。さらに、理学療法士や作業療法士などの経験的な知識、勘に頼ってきた現状に対し、処方された適合の根拠と効果を科学的に評価し、適合現場へとフィードバックすることもできるため、車いす適合水準を向上させるための有効なツールになると考えられる。車いす駆動に伴う身体負荷や効率,操作性などを生体力学的に評価するため,使用者がハンドリムに加える3次元的な操作力(力とモーメント)と車輪の回転角度を同時に検出可能な駆動計測ホイールを製作した.本計測ホイールは,使用者が普段利用している車いすに直接取り付けられるよう,また,屋内外での計測実験が容易に行えるよう,システムの無線化を図ってある.実験では,第12胸髄節から第2腰髄節までの脊髄損傷者8名を対象に駆動計測を実施し,得られた駆動データと上肢の筋電位信号の結果から,上肢関節トルク,関節間力,筋張力などの実測困難な生体内力を推定した.また,等速性筋力評価装置による上肢7関節(肩関節の屈伸,内外転,内外旋,肘関節の屈伸,手関節の回内外,掌背屈,橈尺屈)の最大関節トルクの実測値から,手先力の発揮しやすい方向老発揮しにくい方向をそれぞれ算出し,ハンドリムへの力の加えやすさという新しい観点から車いす操作性を解析した.その結果,車いす使用者は,手先力の発揮しにくい上肢姿勢から駆動を開始しなければならないが,駆動期の後半では手先力の発揮しやすい方向とハンドリム接線方向とが一致し,効率良く推進力を生成できることが示された.また,旋回性や片流れ路面での走行安定性に有効なキャンパー角が,手先力の発揮しやすさという上肢運動特性の観点からも有効に機能し,生体力学的に効率の良い力の伝達をもたらすことが明らかとなった.これらの知見は,身体負荷の少ない,操作性の良い車いすを実現するために,どのような手先軌道でハンドリムを操作すべきか,あるいは,どのような強度とタイミングで駆動をアシストすべきかなど,手動車いすやパワーアシスト車いすに対する一つの設計指標として有効である.車いす使用者の身体運動機能と身体負荷をリアルタイムに計測・評価し、個々人に最適な車いす寸法・形状を自動的に探索する新しい適合システムを構築するため、車いすのシート高さ、ホイールベース長さ、トレッド幅、シート角度、背もたれ角度、走行抵抗などを変更可能な車いすシミュレータを開発した。
薄膜型高温固体電解質燃料電池に関する研究

固体酸化物燃料電池は高効率、低公害の発電システムとして活発に研究がなされている。この型の燃料電池の最大の課題は電池の内部抵抗を下げいかに高出力を得るかという点にある。本研究では固体電解質として一般に用いる方法と電解質の薄膜化の両面から燃料電池の高出力化を試みた。セリアと希土類酸化物との固溶体は安定化ジルコニアよりも高い酸素イオン導電性を有しているが、低い酸素分圧で電子伝導性が現われる。還元の防止策として、セリアの水素極側に耐還元性に優れる安定化ジルコニアの薄膜をコーティングした。コーティングを施した固体電解質により高い開回路電圧と出力の長期安定性が達成できた。また製膜法としては高周波イオンプレーティングが最適で、緻密なピンホールフリーの膜が得られた。安定化ジルコニアの薄膜化についてはプラズマ溶射法及びストリップキャスティング法によって検討した。アルミナ多孔質管上に燃料極、電解質、酸素極の順にプラズマ溶射で製膜し、単セル及び3セルスタックを作製し、いずれにおいても良好な酸素-水素燃料電池発電特性が得られた。740°Cにおいて単セルの開回路電圧は09V、短絡電流75mA/cm^2、最高出力17mW/cm^2となった。ストリップキャスティング法で200μmのジルコニア厚膜を作製しNi及びLa_<0.6>Sr_<0.4>-MnO_3をそれぞれ水素極、燃料極として平板型燃料電池を構成した。膜の緻密度はほぼ100%である。単セルの1000°Cにおける発電特性として開回路電圧1.0V、短絡電流420mA/cm^2、最高出力100mW/cm^2が達成できた。各燃料電池における構成材料の熱膨張係数は耐熱性の上で非常に重要であり、測定の結果ZhO_2-Y_2O_3、La_<0.6>Sra_4MnO_3、LaCrO_3の値はほぼ等しいことがわかった。一方Al_2O_3は熱膨張係数が小さく、La_<0.6>Sr_<0.4>CoO_3は大きすぎるため構成材料としては使用できない。
扁桃体依存性学習・記憶のメカニズムにおけるカルモジュリンキナーゼIIの役割

扁桃体依存性の学習・記憶のメカニズムを探るために、キナーゼ活性を欠損させたカルモジュリンキナーゼII遺伝子改変マウスを用いて、各種解析を行った。その結果、カルモジュリンキナーゼIIのキナーゼ活性が扁桃体依存性学習・記憶の成立メカニズムに重要な役割を果たすこと、しかしながら、海馬依存性学習・記憶とは、そのメカニズムへの関与の度合いが異なることが明らかとなった。このことは、脳部位によって学習・記憶を成立させる分子の組み合わせが異なることを示唆している。恐怖条件付けに代表される扁桃体依存性の学習・記憶は、哺乳動物が身の回りの危険を察知し、回避するという、生存して行く上で非常に重要な学習機能である。また、この学習機能の異常がヒトの心的外傷後ストレス障害(PTSD)と関係することから、そのメカニズムの解明は、今日の神経科学における重要な課題の一つである。本研究においては、キナーゼ活性を欠損させたカルモジュリンキナーゼII遺伝子改変マウス[CaMKIIα(K42R)]を用いて、扁桃体依存性の学習・記憶のメカニズムを明らかにしようとしている。本年度においては、恐怖条件付け学習を取り上げ、「音などの感覚刺激とフットショックとの条件付け(cued conditioning)」並びに、「場所情報とフットショックとの条件付け(contextual conditioning)」の二種類の条件付け学習の解析を行った。その結果、この変異マウスにおいては、海馬・扁桃体の両方に依存する「場所情報とフットショックとを連合させる条件付け学習(contextual learning)」が著しく障害されていたのに対し、扁桃体のみに依存する「音などの感覚刺激とフットショックとを連合させる条件付け学習(cued learning)」は、野生型マウスに比べて明らかに低下しているものの、一定程度の学習と記憶が可能であった。このことから、CaMKIIαのキナーゼ活性は、海馬依存性の学習・記憶のメカニズムには必須であるのに対し、扁桃体依存性の学習・記憶に対しては、重要ではあるが、CaMKIIαのキナーゼ活性以外のシグナル伝達経路を介するメカニズムが存在するものと考えられた。本研究においては、キナーゼ活性を欠損させたカルモジュリンキナーゼII遺伝子改変マウスを用いて、扁桃体依存性の学習・記憶のメカニズムを明らかにしようとしている。本年度においては、マウスが自分の意思で行動した結果、フットショックを受け、その場所情報とフットショックとを関連づけることが必要な、受動的回避反応学習を取り上げ、その解析を行った。その結果、この遺伝子改変マウスにおいては、1回の刺激では全く学習が成立しなかったが、繰り返し刺激では、一部学習が成立したような結果が観察された。このような状態となったマウスを全く異なる環境下においたところ、恐怖反応の指標である「freezing」の増大を示した。一方、この異なる環境下での「freezing」は、その環境下に繰り返し置くことにより、消失した。これらの結果は、フットショックが起こった場所の認識ができないという海馬機能の強い障害を示すとともに、繰り返し刺激に対しては、恐怖反応の全般化が出現するが、それが持続するものではなく、容易に消去されることを示唆している。これまでの解析から、この遺伝子改変マウスにおいては、海馬依存性の学習・記憶に顕著な障害があるが、扁桃体依存性の学習・記憶には部分的な障害しか認められないことがわかってきた。そこで、本年度は、これらの違いが、海馬と扁桃体にそもそも含まれるカルモジュリンキナーゼIIの含量や活性に違いがあるためなのかどうかを明らかにするために、マウス脳より、海馬と扁桃体をそれぞれ分離、抽出し、そのホモジネート中に含まれるカルモジュリンキナーゼIIのサブタイプ毎の蛋白量とキナーゼ活性の測定を行った。その結果、海馬と扁桃体のいずれにおいても、野生型脳に対する遺伝子改変脳でのキナーゼ活性の減少の割合は、ほぼ同じで、かつ、ベータサブタイプの蛋白量には変化がなく、また、アルファサブタイプの蛋白量は若干減少しているものの、その減少のレベルにも違いがないことが明らかとなった。

このことは、遺伝子改変マウスにおける海馬依存性と扁桃体依存性の学習・記憶の障害の程度の違いが、カルモジュリンキナーゼIIの量的違いによるものではないこと、そして、後者においては、カルモジュリンキナーゼII以外にも重要な分子が存在することを示唆している。当初予定していた実験を進め、相応の成果を挙げているため。24年度が最終年度であるため、記入しない。扁桃体依存性の学習・記憶についてさらに理解を深めるために、研究計画にのっとり、学習獲得後の記憶の保持に重点を置いて解析を進める予定である。
中国古代の官僚制と文化-特に漢代の古官箴を中心に-

本年度は、昨年度までの訳注の成果を踏まえて論考編を発表した。そこでは、あらためて前漢から後漢までの官箴書を通観し、それらに通底する基調、および前漢から後漢にかけての内容・表現における変化を明らかにするとともに、その歴史的位置づけについて展望した。すなわち前漢末の揚雄が古典を模倣して創始した官箴は、王莽政権下における政治状況を敏感に反映しつつ、理念と鑑戒の書として後世に大きな影響を与えることになった。その影響のもとに後漢の諸家が継作した官箴は、内容・型式の上で揚雄の作を基本的に継承しつつ、前漢の故事を多々引用し、官名の上でも同時代の緊要な官職がよく選ばれるなど、具象性を増している傾向を指摘できる。これらの諸箴は最終的に胡広によって集大成・注解され、その荘重典雅な文学的美観と儒家的理念ゆえに、政治規範の書として次の魏晋時代に継承され、実際の政治に役立てられるようになった。抽象的で具象性に欠けると言われてきた漢魏の官箴は、むしろそれゆえにこそ儒家的理念の重んじられた後漢・魏晋時代に継作され、活用される必然性を持っていたのであり、大唐六典に結実する六朝期の官制理念の、一つの源流がそこに見られることを予期的に指摘して今年度の作業を終えた。以上の研究を進め、成果として公表するに当たり、交付された補助金で購入された史料および研究書が十分に活用されたことを付言する。本年度は、以前から着手していた古官箴の訳注作業を継続、揚雄の官箴についてはほぼ訳注を終えることができた。その作業を通じて、揚雄官箴の持つ性格・傾向が明らかにされたことが、第一の成果である。次年度に引き続き行う、後漢の胡広らの官箴の訳注作業と相まって、前漢から後漢にかけての官箴の内容・傾向の変化を検討するための土台が、一部作られたことになる。さらに、現在並行して進めつつある胡広『漢官解詁』の分析結果と比較することによって、両者の特徴と歴史的位置は一層明らかになるはずである。第二に、敦煌馬圏湾出土漢簡の全体の傾向を検討、馬圏湾遺址に置かれた官衙について推測した論文を発表したが、この作業は馬圏湾簡のみならず、漢代制度史研究の基礎史料である漢簡一般について、その史料的性格と扱い方に改めて注意を喚起したものである。以上の研究を進めるに当たり、交付された補助金で購入された史料および研究書が十分に活用されたとともに、海外出張旅費による甘粛省での踏査・研究所訪問を通じて、特に上記の第二の研究成果に、日本では未だ知られない最先端の知見を盛り込むことができた。漢代の古典的官箴書「古官箴」の分析を通じて、漢六朝期の官僚制度を支える理念をさぐろうとする目的のもと、本年度は前年度に続き、揚雄および崔〓・胡広の官箴の訳注を行い、論考に先立つ基礎作業としての訳注はほぼ終了した。本年度の作業を通じて、前漢から後漢にかけての官箴書の変化、具体的には、文章の平明化、援引される典故の具体化、周礼や讖緯の影響、漢制の美化・規範化などの点を確認することができた。以上の特徴は、後漢の学術の潮流を反映するものであるとともに、続く六朝期の官制理念に継承されていくものである。以上の作業と並行して、古官箴の集成者・胡広による職官儀注書にして、六朝期の同種の著作に大きな影響を与えた「漠官解詰」の編纂過程と内容を検討し、それによって彼や同時代人たちの漢制に対する姿勢を探った。
高齢者における精神神経系薬の有害作用発現と多剤服用による相互作用の定量的評価

高齢者の医薬品安全対策において特に問題となっている精神神経用剤(催眠鎮静・抗不安薬、抗うつ薬、知症の行動・心理症状(BPSD)治療薬、等)に焦点を当て、適正な用量調節の指針及びポリファーマシー是正に向けた薬物有害事象の把握とマネジメントに資するための体系的な情報収集と利活用のための枠組みの構築を目指す。
放射光Ｘ線を用いた溶接時の低温変態溶接金属の応力と固相変態のその場測定

溶接残留応力を低減するために、低温領域で生じるマルテンサイトの変態膨張を利用することが注目されている。溶接構造物のミクロ組織と機械性能の制御および予測するために、溶接時ミクロ組織および応力の形成メカニズムを明らかにする必要がある。そこで、高輝度である放射光を利用し、溶接時相変態と応力を同時にその場測定できるシステムを開発した。溶接金属熱影響部母材までのミクロ組織状態および応力分布の時間変化を世界で初めて最速的な時間分解(0.1秒)で計測することに成功した。溶接連続冷却過程において、試験片全体の応力形成は熱収縮と固相変態(マルテンサイト変態)が大きく関与することが初めてその場計測成功できた。前年度開発した溶接時応力その場測定システムを改善した。3台のPILATUS二次元検出器(サイズ:40×80mm×2台+120×80mm×1台、ピクセルサイズ(空間分解能):0.172mm2)を利用することで、応力形成と相変態過程の同時計測を可能にした。また、in-situ測定した膨大な2次元X線回折データに対する解析システムも開発した。これらを組み合わせ、0.5平方ミリメートルの空間分解能で、溶接金属熱影響部母材までのミクロ組織状態、および応力分布の時間変化を世界最速0.1秒の時間分解能で計測することに成功した。本手法を炭素鋼試験片における溶接冷却過程その場時分割測定に適用した結果、試験片全体の応力形成は熱収縮と固相変態(マルテンサイト変態)が大きく関与することを実測により初めて明らかにした。一方、その場測定した結果の詳細を明らかにするためには、計測する試験片の高温中におけるヤング率やポアソン比などの物性値を計測し、それらの結果から導かれる応力係数と温度の関係を明らかにする必要がある。そこで、開発した二次元検出器走査システムを活用し、既存の高温負荷装置により炭素鋼の高温物性を実測した。これにより室温から700°Cまで8つの温度域でそれぞれに引張実験を実施し、ヤング率やポアソン比、熱膨張係数などの高温物性値が得られた。またK/R型熱電対を利用し、溶接過程における試験片熱影響部から母材までの温度分布を取得した。これらの技術開発、それを応用した溶接その場測定により、これまで得られなかった溶接過程中の応力評価が可能となり、相変態分野に新しい視点を与えることができると考えている。今後、本結果と有限要素法によるシミュレーションモデルと比較し、さらに検討を進めていく予定である。本研究では、大型放射光施設SPring-8の高輝度X線により、微視的応力分布、ひずみ,集合組織,変態などの結晶状態に起因する物理量をその場測定できるシステムを世界で初めて開発し、本システムを低温変態溶接金属を用いた連続溶接時に適用することにより、低温変態溶接金属中の経時変化に伴う応力と組織との関係を明らかにすることを目的とする。今年度は以下のことを明らかとした。1、二次元検出器走査方式による放射光X線応力測定システムを構築し、その評価を行った。構築したシステムにより、組織状態および応力を迅速測定することが可能となった。また、同システムをショットピーニング面の応力測定に適用し、複数回折面の情報を利用することで、応力の深さ分布を測定できることを示した。2、ビード溶接の二方向応力が測定できるTIG溶接システムを開発し、二次元検出器システムと組み合わせて、スポット溶接直後連続冷却過程、フェライト相の格子定数、および応力の時間変化を0.1秒の高時間分解能で取得することに成功した。残留応力は室温よりも十分高い温度で形成されるのではないかという可能性を示唆する結果が得られた。今後は、開発した溶接時応力その場測定システムを、溶接残留応力発生メカニズムの検証、新規溶接材料開発など、基盤から産業利用(応用)に至る溶接のパイオニアとして成長するに期待できる。開発した二次元検出器走査システムより応力算出手法の検証を行った。また、TIG溶接システムを開発し、二次元検出器システムと組み合わせて、高時間分解能(0.1秒)で溶接時応力の時間変化をその場測定することに成功した。これらは当初の計画通り順調に進展している。1、低温変態マルテンサイト溶接金属の応力と相変態の相互作用のメカニズムを明らかにするために、溶接時その場測定実験を行い、応力変形と変態挙動の時間変化を測定する。2、溶接時温度と時間の関係を明らかにすれば、冶金学的に応力形成と変態挙動の温度変化を明確にできる。そのために、溶接時温度場の時間変化を実測する予定がある。3、溶接材料の高温物性が溶接時加熱・冷却により、変化することは分かっている。定量的に応力変形と変態挙動の温度変化を明らかにするために、溶接材料の高温物性を既存の高温負荷炉より、その場測定する。

4、その場測定実験で得られた結果を解析し、結晶状態(応力、相率などの時間変化)のデーターベース化を行う。さらに、応力変形と変態挙動相互作用メカニズムを明らかにし、溶接材料の残留応力の予測及び評価を提案する。これらの結果をまとめ、成果発表を行う。溶接時応力その場測定システムを改善するために、独自利用できるステッピングモータコントローラ(500千円)を購入する予定である。低温変態マルテンサイト溶接金属の試験片(300千円)を加工する必要がある。研究成果を発表するため旅費(200千円)と参加費(100千円)が必要である。
低酸素環境を利用した短期間トレーニング合宿デザインの開発

本研究の目的は、競技者を対象とした7日間の低酸素トレーニング合宿を実施し、宿泊時に低酸素暴露した場合(LHTL)と、トレーニング時に低酸素暴露した場合(IHT)のトレーニング効果について検討することであった。その結果、常圧低酸素環境における7日間の高強度トレーニングは、同様のトレーニングを常酸素環境で行い低酸素環境で宿泊した場合と比較して競技者の最大無酸素性ランニングテスト(MART)の最大パワーを向上させることが示唆された。したがって、短期間で競技者のパフォーマンスを向上させるためには、低酸素環境での高強度トレーニングが有効であると考えられる。近年、スプリント系競技者に対しての低酸素トレーニングの有効性が示唆されている。我々の研究グループでは、6日間の低酸素環境での宿泊とトレーニングの組み合わせにより、陸上400m、800m競技者の無酸素性パワーが向上することを報告している。本年度は低酸素宿泊を伴わない、低酸素トレーニングのみの効果について検討した。400mおよび800mを専門種目とする女子大学生陸上競技選手8名を対象として、7日間の低酸素トレーニングを実施し、トレーニング効果について常酸素環境での同様のトレーニングと比較した。トレーニングは、午前中にスプリントトレーニングを、午後に持久性トレーニングを、それぞれ5回ずつ合計10回実施した。これらのトレーニングを酸素濃度14.5%(標高3000m相当)に設定した低酸素環境もしくは常酸素環境で行った。トレーニング期間の前(Pre)と7日後(Post)にMaximal anaerobic running test(MART)および最大酸素摂取量(VO2max)テストを実施し、無酸素性および有酸素性の運動能力を評価した。無酸素性運動能力の指標であるMARTにおける最大パワーは、両群ともに有意に増加した。一方、有酸素性運動能力の指標であるVO2maxおよび4mM走速度は、低酸素群のみ有意な増加が認められた。以上の結果から、7日間の低酸素環境でのスプリントトレーニングと持久性トレーニングの組み合わせた高強度トレーニングは、無酸素性運動能力と同時に有酸素性能力を向上させることが示唆された。本研究の目的は、競技者を対象とした7日間の低酸素トレーニング合宿を実施し、宿泊時に低酸素暴露した場合(LHTL)と、トレーニング時に低酸素暴露した場合(IHT)のトレーニング効果について検討することとした。被験者は400mおよび800mを専門種目とする女子大学生陸上選手17名を対象として、7日間の低酸素トレーニングを実施し、トレーニング効果についてIHTとLHTLで比較した。トレーニングは、午前中にスプリントトレーニングを、午後に持久性トレーニングを、期間中それぞれ5回実施した。4日目は疲労回復の目的でトレーニングを実施しなかった。IHTは、これらのトレーニングを標高3000m相当(酸素濃度14.4%)に設定した低酸素トレーニング室内で実施した。LHTLは、夜間睡眠時、1日10時間以上、高度2000m相当(酸素濃度16.4%)に設定した室内で過ごした。トレーニング効果を明らかにするために、トレーニング期間の前(Pre)と7日後(Post)にMaximal anaerobic running test (MART)および最大酸素摂取量(VO2max)テストを実施した。その結果、MARTにおける最大パワーは、IHTがLHTLと比較して有意( P<0.05)に増加したが、VO2maxは両群ともに有意な変化は認められなかった。常圧低酸素環境における7日間の高強度トレーニングは、同様のトレーニングを常酸素環境で行い低酸素環境で宿泊した場合と比較して、競技者のMARTの最大パワーを向上させることが示唆された。トレーニング実験を4回実施しており、貴重なデータが得られている。400mおよび800mを専門種目とする女子大学生陸上競技選手17名を対象として、7日間の低酸素トレーニングを実施し、トレーニング効果についてIHTとLHTLで比較した。被検者は7日間のトレーニングを行い、その前後(Pre、Post)にパフォーマンステストを行った。トレーニング終了後のMARTにおける最大パワーは、IHTがLHTLと比較して有意に向上した。運動時間は、IHTで有意に向上したものの、群間に有意な差は認められなかった。Lamaxは、両群ともに有意な変化は認められなかった。P6mMは、IHTがLHTLと比較して有意に向上した。VO2maxは両群ともに有意な変化は認められなかった。以上の結果より、常圧低酸素環境における7日間の高強度トレーニングは、同様のトレーニングを常酸素環境で行い低酸素環境で宿泊した場合と比較して競技者の最大無酸素性ランニングテスト(MART)の最大パワーを向上させることが示唆された。短期間で競技者のパフォーマンスを向上させるためには、低酸素環境での高強度トレーニングが有効であると考えられる。

本研究の目的は、競技者を対象とした7日間の低酸素トレーニング合宿を実施し、宿泊時に低酸素暴露した場合(LHTL)と、トレーニング時に低酸素暴露した場合(IHT)のトレーニング効果について検討することであった。その結果、常圧低酸素環境における7日間の高強度トレーニングは、同様のトレーニングを常酸素環境で行い低酸素環境で宿泊した場合と比較して競技者の最大無酸素性ランニングテスト(MART)の最大パワーを向上させることが示唆された。したがって、短期間で競技者のパフォーマンスを向上させるためには、低酸素環境での高強度トレーニングが有効であると考えられる。トレーニング実験を2回実施し、貴重なデータが得られた。予定していたトレーニング実験が終了し、学会発表および論文投稿を積極的に行う。トレーニング科学今後は、低酸素環境での宿泊と常酸素環境でのトレーニングを組み合わせた合宿が、運動能力および有酸素・無酸素性運動能力に及ぼす影響について検討する。当初の研究計画では、侵襲的な測定項目を実施することになっていたが、今年度の実験では実施できなかったためである。被検者謝金を非常に少なくおさえられたことが大きな原因である。これは通常、1人あたり1日6000円の謝金を支払うが、今回の被検者は現役アスリートであったことから、実験によるトレーニング遂行は自らの利益にもなるという考えのもと、高額の謝金を辞退してもらったためである。競技力の高い選手を対象に、トレーニング実験を実施し、そのトレーニング効果を各競技会での成績(記録)で判定する予定である。そのため、海外を含む各競技会会場までの交通費での使用を見込んでいる。余りが生じた予算は、次年度における海外学会における成果発表に使用する予定である。すなわち、海外学会の参加費、旅費及び宿泊費に使用する。
ショウジョウバエの近縁種比較に基づく遺伝子量補償機構の分子進化過程の解明

性染色体が一対の常染色体から進化すると、通常Y染色体は組換えの機会を失い退化する。この潜在的不利を補うため、多くの生物はオスのX染色体上の遺伝子の発現量が上昇してY染色体遺伝子の退化による発現量の減少を補っている(遺伝子量補償)。しかし、遺伝子量補償がどのような分子進化過程を経て発達するのかは不明であった。本研究では、約100万年前に新たに性染色体を獲得したミランダショウジョウバエとその近縁種のゲノム・トランスクリプトームを比較解析することで、この謎に迫った。その結果、性染色体になるとY染色体だけでなくX染色体も退化しうること、遺伝子量補償は個々の遺伝子にも作用することが明らかになった。性染色体の出現に伴う遺伝子量補償機構の発達の程度を明らかにするには、性染色体を持つ種と持たない種の遺伝子発現量を網羅的に比較することが有効である。そこで、H25年度は、Neo-neo-性染色体を持つD. mirandaとそれを持たない近縁種D. pseudoobscuraの遺伝子発現量の比較を目的に研究を進めた。まず、種内個体間の遺伝的構成をできるだけ均一にするため、両種のIsogenic系統を確立した。次年度以降の実験に備え、特にD. mirandaについては申請者が保持している4系統すべてについてIsogenic系統を確立した。また、D. obscuraにおけるIsogenic系統確立のための交配実験もスタートさせた。次に、これらIsogenic系統を用いてトランスクリプトーム配列および遺伝子発現解析を行なった。D. pseudoobscuraとD. miranda(系統番号16)の3齢幼虫、蛹、成虫の雌雄それぞれの個体からRNAを抽出し、HiSeq2000用のライブラリを作成した。これらのライブラリを外部業者に委託し、シーケンスを行った。現在解析を行なっているところである。D. pseudoobscuraのゲノム配列決定については、これまでより高精度なゲノム配列が公開されたため、申請者が新たに配列決定を行なう必要性がなくなった。一方、D. miranda(系統番号16)のゲノム配列決定については、染色体の分離実験がうまくいかなかったため、短いインサート(約500bp)のペアエンドライブラリを雌雄それぞれで作成した。すでにライブラリ作成と外部業者委託によるシーケンスが完了し、現在データを解析中である。H26年度は、Neo性染色体を持つDrosophila mirandaの別系統(系統番号17)について、リシーケンスによるゲノム配列決定と様々な組織、発生段階におけるトランスクリプトーム配列の決定を行った。近縁種D.pseudoobscuraについては、引き続きトランスクリプトーム配列の決定を継続した。また、もう少し遠縁でNeo性染色体を持たないD. obscuraのペアエンド及びメイトペアライブラリを作成し、高精度ゲノム配列の決定に着手した。さらに、この種のトランスクリプトーム配列の決定にも着手した。上記の実験、解析の結果、D. obscuraについてはScaffold N50が約470kb、サイズが約180Mbのゲノムアセンブリを得ることができた。また、D. miranda、D. pseudoobscura、D. obscuraにおいて発現しているタンパク質コード遺伝子をそれぞれ約13,000個、14,900個、12,900個同定した。これらのデータからD. mirandaのNeo-Xへの遺伝子量補償の発達を検証したところ、その程度は組織や発生段階によって大きく異なっていることが示唆された。また、Neo-Y遺伝子のタンパク質の減衰の程度とNeo-X上のホモログにおける遺伝子量補償の間に弱いながらも有意な相関が見られた。さらに、H27年度に向けてChIP-seqの準備を開始し、遺伝子量補償複合体(MSL)を構成するタンパク質のうち2つをコードする遺伝子の発現ベクターへのクローニングに成功した。現在抗原タンパクの精製を進めている。H27年度は前年度に引き続き、Neo性染色体を持つDrosophila miranda、およびNeo性染色体を持たない近縁種D. pseudoobscuraとD. obscuraのRNA-seqを行った。過去3年間に渡るゲノム配列データと遺伝子発現データを統合したところ、D. mirandaのNeo性染色体はNeo-YのみならずNeo-Xでも偽遺伝子化の速度が上昇していることが分かった。また、Neo-Y染色体上で偽遺伝子になっている遺伝子は、Neo-X上の相同遺伝子が発現上昇している傾向があることが明らかになった。このことは、遺伝子量補償機構が染色体全体のみならず、遺伝子ごとに作用している可能性を示唆する。また、遺伝子量補償複合体を構成する5つのタンパク質のうちの2つについて抗体を作成した。現在、ウェスタンブロッティングなどにより抗体の質を確認するとともに、ChIP-seqの準備を進めている。当初計画していたゲノム配列決定と遺伝子発現量解析がおおむね終了したため。H28年度は、H27年度に引き続き、過去3年間に得られたゲノム、トランスクリプトームデータを用いて性染色体の分化、特にY染色体の退化とX染色体の遺伝子量補償の関係を調べた。その結果、Drosophila mirandaのNeo-Y染色体は誕生してから約100万年しかたっていないにもかかわらず、染色体上の遺伝子の半分以上がすでに偽遺伝子化していることが明らかになった。また、H27年度に行った解析をより大規模に再解析したところ、(1)Neo-Y染色体だけでなくNeo-