hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ラクチュロースからの機能性オリゴ糖の酵素的合成よ関する研究

ラクチュロースは4-0ーβ-D-galactopyranosyl-D-fructoseの構造をもつ、ラクトースから誘導されるケトオリゴ糖の一種であるが、人乳哺乳児の腸内に優位を占める菌叢であるビフィドバクテリウムの成育促進効果を示す、いわゆる"ビフィズス活性"を有する。そのため、育児用調整粉乳への添加が行われている他、妊婦の便秘予防薬として用いられたり、成人の慢性門脈系疾患に由来する肝性昏睡に対す防止および治療薬としても用いられている。一方、同様にビフィズス活性をもち、人乳にも多く含まれている機能性オリゴ糖である。6′-ガラクトシルラクトースは育児用調整粉乳とともに、畜産の分野における家畜の便性改良剤とした実用化されている。本研究では、まずラクトースで行なわれていると同様なβ-ガラクトンダーゼによるガラクトシル転移反応をラクチュロースを基質とし、あるいはラクトースを基質とし、ラクチュロースをアクセプターとする反応系で行なった。すなわち、ラクチュロースを構成糖として分子内にもち、さらに6′-ガラクトシルラクトースと同様の骨格を有する機能性ガラクトオリゴ糖の合成を行なった。これらの主要な生成オリゴ糖の構造を調べた結果、ガラクトースがラクチュロースのガラクトース残基にβ-1.6結合したいわゆる"6′-ガラクトシルラクチュロース"および同様な構造をもつ四糖および五糖であった。さらに、ラクチュロースを高濃度に含む培地から収率良くガラクトシルラクチュロース型のオリゴ糖を生成する眞菌(糸状菌および酵母)をスクリーニングし、生成するオリゴ糖の構造を調べた。その結果、β-1.6結合の他にβ-1.4結合ガラクトオリゴ糖の構造を明らかにした。これらのオリゴ糖の分離、調整および定量のために、備品として購入されたHPLC-式が使用しされた。また、糖分析のための新規な技術も開発し、本法を用いたオリゴ糖の分離も行なった。肝性脳症,小児便秘症等の特効薬として知られているラクチュロース(4-0-β-D-galactopyranosyl-D-fructose)に,ガラクトシル基を酵素的に導入し,より付加価値の高いと期待されるオリゴ糖合成を目的とした本研究では,次のような実績を得ている.ラクチュロースを基質とするガラクトシル転移反応を触媒するβ-ガラクトシダーゼのスクリーニングの結果, Asp.ory2ae由来の酵素が最も効率よく転移反応を触媒する能力があり, 40%糖濃度における至適条件では, 28%のオリゴ酸の生成することが明らかとなった.酵母(K,lactis)酵素は,ラクチュロース分解および転移の両反応が,時間の経過と共に平衡に達し,オリゴ糖生成量も約10%であった.細菌(E.coli)酵素による転移反応は起こらなかった.以上の結果から, Asp.ory2ae由来の酵素を用いてラクチュロースの転移反応を行い,生成したオリゴ糖の分離,精製を試みた.

精製は,活性炭カラムにより,単糖,二糖,三糖および三糖以上のオリゴ糖にそれぞれ分離し,最終的には調製用ペーパークロマトグラフィーによって,各オリゴ糖成分の分画,精製を行なった.精製した糖の構造決定は, C_<13>-NMR,完全メチル化糖およびその加水分解物からの部分メチル化アルジトールアセテートのMSによって,行なった.主要な転移糖は6-0-B-D-gal-actopyranosyl-lacturaseであったが,これは人乳中にも含まれている,ピフィダス活性糖である6-galactosyl-lactoseと類似の構造をもち,同糖に比較しても,さらにビフィダス菌に対する選択性の強い資化性糖であることが期待された.四糖および五糖成分についても, 6-0-β-galactose-型のいわゆる直鎖型のオリゴ糖であることが明らかとなった.ラクチュロ-スは4-0-β-D-galactopyranosyl-D-fructoseの構造をもつ、ラクトースのアルカリ転位反応によって誘導される非天然のケトオリゴ糖の一種であり、ビフィズス活性を有することから育児用調整粉乳への添加が行われている他、成人の慢性門脈系疾患に由来する肝性昏睡に対する防止および治療薬としても用いられている。一方、ガラクトースの酵素転移によるガラクトンルオリゴ糖は、ヒトの腸管で消化されず、ビフィズス活性を有することが一般的に知られるようになってきた。本研究はこのような見地から、従来強いビフィズス活性を有するラクチュロースに、β-ガラクトンダーゼによる糖転移を起こさせ、生成するガラクトンルラクチュロース型の新しい機能性オリゴ糖を合成することを目的とし、昨年度までに、ガラクトンル転移能の高いAspergillus onyzaeβ-ガラクトンダーゼをスクリーニングし、主要な生成三糖の構造を明らかにした。今年度はガラクトンル転移反応を糸状菌および酵母による生体触媒反応により起こさせた。そのための菌のスクリーニングを糸状菌51種、酵母23種から行い、生体触媒能の高いAspergillus oryzae S-65およびCryptococcus laurentiiをスクリーニングし、これを用いたがラクトンル転移反応生成糖の構造をしらべた。その結果糸状菌からは主としてβ-1,6結合3,4および5糖を生成することが明らかになり、その構造を決定した。また、酵母からは主としてβ-1,4結合糖が生成した。これらはβ-1,6結合糖を除いて、文献未記載の糖であり、ビフィズス活性の高い機能性糖である可能性の高いものであった。本研究では、糖の分離、調整および定量のために、備品として購入したHPLCが使用された。
マルチプルカルボキシラ-ッゼ欠損症の分子生物学的研究

新生児型マルチプルカルボキシラ-ゼ欠損症は生後間もなくから著明な代謝性アシド-シスを呈する疾患で、ビオチン酵素である4つのカルボキシラ-ゼが著明に低下している有機酸代謝異常症である。我々はこれまで本症の一次性障害がホロカルボキシラ-ゼ合成酵素(HCS)の欠損にあることを明らかにしてきた。HCSはアポカルボキシラ-ゼにビオチンを結合してホロカルボキシラ-ゼにする酵素であり、これらのカルボキシラ-ゼの機能を介して分岐鎖アミノ酸代謝や糖新生、脂肪酸合成系に大きな役割を果たしている。本酵素の生体内での重要性にも拘らず、未だ十分な検索がなされていなかった。その大きな理由はHCS活性の測定法の困難さにあった。本研究では1)HCS活性測定法の開発、HCS欠損症患者由来培養リンパ芽球のプロピオニルCoAカルボキシラ-ゼがほとんどアポ酵素であることに着目し、これを基質とする簡便なHCS活性の測定法を開発した。この測定法の開発によってHCS欠損症を分子レベルでの病態解明するためのHCSの精製が可能となり、また患者の酵素学的解析が可能となった。2)HCSの精製牛肝ミトコンドリアをアセントパウダ-にし、トリス緩衝液で抽出した後硫安分画を行った。045%分画をとり、それをアルミナゲルで処理した後DEAE-Sepharose CL 6BカラムにかけHCS分画を得た。この分画を更にSephacryl S 200HRカラム、HydroxyappatiteカラムおよびPhenyl-SuperoseカラムでHCSの単離精製に成功した。分子量は約40,000で単量体である。ウサギに免疫し、抗HCS抗体を得た。この抗体を用いて現在HCScDNAのクロ-ニング中である。3)患者由来培養線維芽細胞のHCS、患者HCSはいずれも部分欠損であり、高濃度のビオチンにより活性の回復をみた。しかし、ビオチンに対するKmは症例により大きな差がみられた。
巨大カルボン酸配位子の開発と炭素－水素結合活性化を伴う高難度分子変換反応への応用

炭素-水素結合活性化反応は、少ない元素の廃棄で様々な化合物を合成できる点で、資源利用の面で優れた反応である。しかしながら、本反応は高温条件を要するのが現状であり、エネルギーの面では改善の余地がある。本反応をより低温の条件で実現できれば、環境配慮の観点から理想的な反応となる。当研究では、炭素-水素結合活性化反応を可能な限り低温の条件で達成すること、さらには本反応により合成できる化合物の種類を拡張することを目的として、巨大カルボン酸の設計を通じて新規触媒の開発を行う。
妊娠経過における血圧調節液性因子の遺伝子レベルでの発現に関する研究

妊娠時における循環動態調節機構には不明な点が多く、そのために周産期医学の抱える重要な疾患の1つである妊娠中毒症の真の病因は解明されていない。それ故にその真の病因に基づいた適切なる治療方法、予防方法は確立されていない。そこで今回妊娠ラットを用い、液性因子による血圧調節機構について総合的な検討を行い、以下の成果を得た。[妊娠時の液性因子による血圧調節機構]mRNAレベルでの検討を行うことにより、妊娠ラット肝臓においては、アンジオテンシノ-ゲン(AG)、キニノ-ゲン(KG)の生成が有意に亢進しており、これが血中レベルでのレニン-アンジオテンシン系、カリクレイン-キニン系の亢進に大きく関与していると考えられる。また妊娠時にはAGIIに対する末梢での感受性も鈍化しており、この鈍化の要因としてエストロゲン、プロスタグランジンが関与していることが示唆された。またこの鈍化は子宮循環においてより顕著に起こっており、このことが子宮血流の安定した供給に大きな役割を果たしていると考えられる。[AG、KG産生に及ぼすエストロゲンの影響]去勢雌ラットにエストロゲンを負荷した群においてはその肝臓におけるAG、KGの産生は去勢単独群に比して有意に亢進の原因の1つとして、エストロゲンが考えられる。[妊娠SHRにおける血圧変動及び血気圧調節液成因子]正常ラットでは妊娠経過を通じて血圧はほぼ一定に保たれるが、自然発症高血圧ラット(SHR)においては妊娠末期に有意の血圧低下が認められる。塩分負荷により、この妊娠末期の血圧低下傾向は減弱する。SHRでは妊娠時の肝臓でのKGの産生亢進している。妊娠時における肝臓でのAG,KGの産生抗進が正常ラットに比して顕著であるが、塩分負荷による更なる産生亢進は認められない。SHRでは昇圧反応に対する代償機構の破綻が示唆され、この破綻が塩分負荷時の血圧帝下現象の妨げになっていると考えられる。妊娠中毒症は妊産婦死亡の主因を占めているばかりでなく、子宮内胎児発育遅延や胎児仮死などの胎児にとっても大きなリスクとなる重大な疾患である。しかしながら正常妊娠経過での循環動態調節機構さえも未だ混沌としており、妊娠中毒症の本態は解明されていない。今回、血圧調節に密接に関わっているレニン-アンジオテンシン系、カリクレイン-キニン系、そして最近注目を集めている心房性ナトリウム利尿ポリペプチド(ANP)などの液性因子に着目し、ラットを実験動物として用いて以下の点を明らかにすることを目的とする。1)正常妊娠ラットにおけるレニン(Rn)、アンジオテンシノーゲン(Ag)、カリクレイン(KI)、キニノーゲン(Kg)、ANPをmRANレベルで検出することにより、それらの発現部位を同定する。2)妊娠経過におけるこれら液性因子の発現部位での生成量を連続的に定量する。また血中レベルでの推移と比較検討する。3)妊娠、非妊娠ラットに各種ホルモン(性ステロイドetc)、各種薬剤(カプトプリルetc)、Naclなどの負荷を行いこれら液性因子の発現の変化を検討する。4)自然発症高血圧ラットなどの病態モデルを用いて上記と同様の実験を施行し正常ラットでの成績と比較検討を行う。これまでに正常妊娠ラットを用いて妊娠時におけるAg、Kgの主たる生成部位は肝臓であり、また非妊娠時に比して発現が高進していることをmRNAレベルで確認した。また現在去勢雌ラットを用いてエストロゲン負荷を行い、エストロゲンがAg、Kgの発現に及ぼす影響を検討している。また自然発症高血圧ラット(SHR)を交換後、経尾測定により経時的に血圧を測定し、血圧の変動とまたそれぞれの時点での液性血圧調節因子の変動を検討している。SHRでは妊娠経過にともない血圧が低下する傾向が得られており塩分負荷を行い、血圧の変動、液性血圧調節因子の変化も併せて検討している。

妊娠時における肝臓でのAG,KGの産生抗進が正常ラットに比して顕著であるが、塩分負荷による更なる産生亢進は認められない。SHRでは昇圧反応に対する代償機構の破綻が示唆され、この破綻が塩分負荷時の血圧帝下現象の妨げになっていると考えられる。これまでに妊娠時には肝臓におけるアンジオテンシノ-ゲン、キニノ-ゲンの産生が亢進することをmRNAの測定により確認してきたが、この妊娠時の亢進がどの様な因子により調節されているか不明である。そこで今回妊娠時に増加するエストロゲンの影響に関して検討を加えた。週齢7週のWistar ratを両側卵巣摘出術により去勢し、2週間後より1/4日で3回の500ugのEstradiol Valerate腹腔内投与を行った。エストロゲン負荷群ではアンジオテンシノ-ゲン,キニノ-ゲンともそれぞれ3.6倍、4.1倍の有意の産生亢進が認められた。妊娠時における肝臓でのAG,KGの産生亢進の原因の1つとして、エストロゲンが考えられる。高血圧妊娠時におけるキニノ-ゲンの変動、塩分負荷の影響を検討するために自然発症高血圧ラット(SHR)を用いて検討を加え、以下の成績を得た。正常ラットでは妊娠経過を通じて血圧はほぼ一定に保たれるが、SHRにおいては妊娠末期に有意の血圧低下が認められた。正常ラットでは塩分負荷によっても妊娠時血圧の変動は認められなかったが、SHRでは妊娠末期の血圧低下傾向は減弱していた。SHRでは妊娠時の肝臓でのKGの産生亢進が正常ラットに比して顕著であるが、塩分負荷による更なる産生亢進は認められない。SHRでは昇圧反応に対する代償機構の破錠が示唆され、この破錠が塩分負荷の血圧低下現象の妨げになっていると考えられる。
核内受容体・ＮＦ－κＢクロストークを標的とした去勢抵抗性前立腺癌に対する治療戦略

去勢抵抗性前立腺癌に対する新規治療法の確立には,再燃メカニズムの包括的解明は必要不可欠である.核内ステロイド受容体スーパーファミリーに属する,アンドロゲン受容体,グルココルチコイド受容体,エストロゲン受容体の転写系と転写因子NF-κBのシグナル伝達系のクロストークという新たな観点から前立腺癌再燃メカニズムを解明した.また,そのクロストークを標的とした各種シグナル伝達阻害技術を駆使して,去勢抵抗性前立腺癌に対する集学的治療戦略を構築した.さらに,各核内受容体間における転写系シグナル伝達ネットワークの存在が明らかにされ,同クロストークはCRPCに対する新規標的治療となりうる可能性が示唆された.去勢抵抗性前立腺癌に対する新規治療法の確立には,再燃メカニズムの解明は必要不可欠である.本研究は,核内受容体スーパーファミリーに属する,アンドロゲン受容体(AR),グルココルチコイド受容体(GR),エストロゲン受容体(ER)の転写系と,転写因子NF-kBのシグナル伝達系のクロストークという新たな観点から前立腺癌再燃メカニズムを解明すると共に,そのクロストークを標的とした各種シグナル伝達阻害技術を駆使して,去勢抵抗性前立腺癌に対する包括的治療戦略を構築することを目的とした.また,各核内受容体間における転写系シグナル伝達ネットワークの存在を明らかにし,去勢抵抗性前立腺癌におけるAR,GR,ER間クロストークの基礎的及び臨床的意義についても検討を加えた.従来から基礎研究から臨床試験までに渡って去勢抵抗性前立腺癌に対する各種治療戦略が精力的に検討されてきたにもかかわらず,必ずしも大きなブレークスルーがなかったという情勢においても,この研究は,去勢抵抗性前立腺癌に対する新たな治療法の開発に向けたプロローグとして極めて意義深いものであった。平成24年度は,前立腺癌における核内受容体の発現プロファイル,発現ベクターの構築,核内受容体とNF-kBのクロストーク,NF-kBの活性化抑制による殺細胞効果とし,主としてin vitroでの実験を推進した.これ以降の実験のSCIDマウスを用いた担癌モデルの作成,NF-kB阻害薬による抗腫瘍効果,アデノウイルスベクターによる抗腫瘍効果とした.去勢抵抗性前立腺癌に対する新規治療法の確立には,再燃メカニズムの解明は必要不可欠である.本研究は,核内受容体スーパーファミリーに属する,アンドロゲン受容体(AR),グルココルチコイド受容体(GR),エストロゲン受容体(ER)の転写系と,転写因子NF-κBのシグナル伝達系のクロストークという新たな観点から前立腺癌再燃メカニズムを解明すると共に,そのクロストークを標的とした各種シグナル伝達阻害技術を駆使して,去勢抵抗性前立腺癌に対する包括的治療戦略を構築することを目的とする.また,各核内受容体間における転写系シグナル伝達ネットワークの存在を明らかにし,去勢抵抗性前立腺癌におけるAR,GR,ER間クロストークの基礎的及び臨床的意義についてもさらなる検討を加える.従来から基礎研究から臨床試験まで幅広い去勢抵抗性前立腺癌に対する各種の治療戦略が精力的に検討されてきたにもかかわらず,必ずしも大きなブレークスルーがなかったという背景においても,本研究は,去勢抵抗性前立腺癌に対する新たな治療法の開発に向けたプロローグとして極めて意義深いものである.昨年度までは,前立腺癌における核内受容体の発現プロファイル,発現ベクターの構築,核内受容体とNF-κBのクロストーク,NF-κBの活性化抑制による殺細胞効果を中心に,主としてin vitroでの実験を推進してきた.最終研究年度にあたる平成25年度の実験は,SCIDマウスを用いた担癌モデルの作成,NF-κB阻害薬による抗腫瘍効果,アデノウイルスベクターによる抗腫瘍効果で,前年度までのin vitro実験の結果を踏まえた去勢抵抗性前立腺癌に対する分子標的治療あるいは遺伝子治療を試みるin vivo実験を中心に施行され,核内受容体・NF-κBクロストークを標的とした去勢抵抗性前立腺癌に対する治療戦略の確立に大いに貢献した.去勢抵抗性前立腺癌に対する新規治療法の確立には,再燃メカニズムの包括的解明は必要不可欠である.核内ステロイド受容体スーパーファミリーに属する,アンドロゲン受容体,グルココルチコイド受容体,エストロゲン受容体の転写系と転写因子NF-κBのシグナル伝達系のクロストークという新たな観点から前立腺癌再燃メカニズムを解明した.また,そのクロストークを標的とした各種シグナル伝達阻害技術を駆使して,去勢抵抗性前立腺癌に対する集学的治療戦略を構築した.さらに,各核内受容体間における転写系シグナル伝達ネットワークの存在が明らかにされ,同クロストークはCRPCに対する新規標的治療となりうる可能性が示唆された.本年度は,核内受容体スーパーファミリーに属する,アンドロゲン受容体(AR),グルココルチコイド受容体(GR),エストロゲン受容体(ER)の転写系と,転写因子NF-κBのシグナル伝達系のクロストークという新たな観点から前立腺癌再燃メカニズムを解明すると共に,そのクロストークを標的とした各種シグナル伝達阻害技術を駆使して,去勢抵抗性前立腺癌に対する包括的治療戦略を構築することを究極の目的のもと,前立腺癌における核内受容体の発現プロファイル,発現ベクターの構築,核内受容体とNF-κBのクロストーク,NF-κBの活性化抑制による殺細胞効果とし,主としてin vitroでの実験を計画する.AR,GR,ERを介した転写系とNF-κBシグナル伝達系の包括的解明に取り組んだ.その結果,アンドロゲン依存性前立腺癌株LNCaP,アンドロゲン非依存性前立腺癌株PC-3,DU145,正常前立腺上皮細胞PrEC,正常前立腺間質細胞PrSC,乳癌細胞株(コントロール)における,AR,GR,ERαおよびERβの発現プロファイルや,癌化ヒト組織アレイの前立腺癌版における核内受容体の発現を明らかにした.さらに,CMVプロモーターによってGR,ERβがドライブされる発現ベクター(pCMV-GRとpCMV-ERβ)を構築した.

これは,これまでにも基礎研究から臨床試験までに渡って去勢抵抗性前立腺癌に対する各種治療戦略の取り組みが精力的に検討されてきたにもかかわらず,必ずしも大きなブレークスルーがなかったという背景において,去勢抵抗性前立腺癌に対する新たな治療法の開発に向けたプロローグとして大変意義深いものである.NF-kB活性阻害によるin vitro殺細胞効果の検討に必要なドミナントネガティブ,デコイ,siRNA,プロテアソーム阻害薬の作製が難航しているため,進捗状況が若干遅れている.しかしながら,核内受容体の発現プロファイルと発現ベクターの構築に関する進捗状況は良好で,期待された成果が出始めている.また,核内受容体とNF-kBのクロストークに関する検討はおおむね完了した.核内受容体の発現プロファイルと発現ベクターの構築に関する進捗状況は良好で,期待された成果が出始めている.一方,核内受容体とNF-κBのクロストークに関する検討,すなわちそれぞれのリガンドによって誘導されるAR,GR,ERの転写活性がNF-κB転写活性を抑制するか,逆にNF-κB活性を誘導することによってAR,GR,ER転写活性が抑制されるか,についての実験が進んでいない.また,NF-κB活性阻害によるin vitro殺細胞効果の検討に必要なドミナントネガティブ,デコイ,siRNA,プロテアソーム阻害薬の準備作製が完了していない.25年度は,これまでの計画の遅延を取り戻すべく,核内受容体とNF-kBのクロストークに関する検討とNF-kB活性阻害によるin vitro殺細胞効果の検討に重点を置いて実験の遂行に全力を上げると共に,24年度以降の計画に予定されているSCIDマウスを用いた担癌モデル(LNCaP細胞をマトリジェルと共にSCIDマウスの背部皮下に移植し,皮下腫瘍の形成を確認後,除睾術を施行して腫瘍が再形成されたin vivoモデル)の作成に引き続き着手する予定である.同モデルの確立は,今後のNF-kB阻害薬による抗腫瘍効果やアデノウイルスベクターによる抗腫瘍効果を検討するin vivo実験の成否のカギを握る極めて重要な推進課題である.さらには,アデノウイルス発現ベクターの作製を完了させる予定である.24年度は,これまでの計画を取り戻すべく,核内受容体とNF-κBのクロストークに関する検討とNF-κB活性阻害によるin vitro殺細胞効果の検討に重点を置いて実験の遂行に全力を上げると共に,24年度以降の計画に予定されているSCIDマウスを用いた担癌モデルの作成に着手する予定である.同モデルの確立は,今後のNF-κB阻害薬による抗腫瘍効果やアデノウイルスベクターによる抗腫瘍効果を検討するin vivo実験の成否のカギを握る極めて重要な推進課題である.さらには,アデノウイルス発現ベクターの作製に取り掛かる予定である.すなわち,既に構築したpCMV-GR,pCMV-ERβプラスミドからCMVプロモーターとGRあるいはERβをインサートとして切り出し,コスミドベクターに挿入する.
大規模コホートを活用した、思春期におよぶ学校不適応への早期支援方法の解明

本研究の目的は、学校不適応などのウエルビーイングに影響する、乳幼児期の関連要因を明らかにし効果的な早期支援方法を明らかにすることである。生涯発達とエンパワメントの視点から、育児環境や子ども自身の力を引き出し、地域とのつながりを促進する取り組みが学校不適応予防などウェルビーイング促進に貢献する可能性に基づき、支援を要とする子どもと養育者への早期支援プログラム開発と検証を行った。子どもの状態と子どもを取り巻く環境の要因、家族と子どもの属性要因等の影響を踏まえて検討した結果、乳幼児期の育児環境、子どもの睡眠習慣等の生活習慣や社会とのかかわりが思春期に及ぶウェルビーイングを促進する可能性が実証された。本研究の目的は、学校不適応などの学童期、思春期のウエルビーイングに影響する、乳幼児期の関連要因を明らかにし効果的な早期支援方法を明らかにすることである。生涯発達とエンパワメントの視点から、育児環境や子ども自身の力を引き出し、地域とのつながりを促進する取り組みにより、将来の学校不適応を予防する可能性を検証する。子どもと養育者の特性に注目し、支援を必要とする子どもと養育者への早期支援プログラムを開発、実証することより、乳幼児期から、学童期、思春期をつなぐ根拠に基づく子育て支援システムの仕組みづくりに貢献することが期待される。平成27年度は、早期支援プログラム開発に向けた根拠の提示を目的とし、量的な多変量解析、先行研究レビューやインタビュー調査を実施した。具体的には、コホートデータを用いて幼児期の育児環境、貧困、虐待、仲間関係、気になる行動、地域とのつながりなどの予測される影響要因について、発達や、学童期以降の学校不適応に及ぼす複合的な影響を、経年的な多変量解析により検討した。量的解析により、養育者への社会的サポートが乳幼児期の育児環境の改善に関連すること、乳幼児期の育児環境に加え、学童期の社会とのかかわりが学童期および思春期の精神的健康に関連することが示唆された。また、海外のコホート研究のレビュー、乳幼児期および学童期の養育環境の特徴について文献検討やインタビューによる情報収集を行い、乳幼児期から思春期におよぶ育児環境や社会的サポートの構造と影響度について質的、量的に検討した。海外の学童期、思春期支援機関およびコホート研究機関における知見の情報収集に関して、学童期、思春期の学校不適応の改善を目指した早期介入支援プログラムと学童期、思春期の学校不適応のリスク要因、防御要因について海外先進機関の訪問調査、既存研究の系統的レビューとエビデンス・テーブル構築を実施する予定であった。系統的レビューについては、予定通り進捗している。一方、欧州の訪問調査予定については、安全上の懸念により延期している。学童期、思春期の学校不適応をアウトカムとした影響度の検証については、乳幼児期の育児環境や養育者サポート、乳幼児期の社会性、学童期、思春期の社会的かかわり状況などが学童期および思春期の主観的幸福感やストレス反応などの精神的健康に影響していることが示唆された。平成28年度は、昨年度に実施した量的研究と文献レビューで得られた影響要因の重要性に加え、質的研究により、有効な早期支援に関する実践事例を蓄積、類型化を行った。インタビュー調査では、学童期、思春期の子どもをもつ養育者、保育士、保健師、学校関係者、地域学童クラブ職員など、国内外の思春期に及ぶ子育支援に関わる専門職等を対象にインタビュー調査を実施し、支援のニーズ、将来のニーズに対して、乳幼児期から支援の必要性があると考えられること、すでに行っている取組みについて把握した。特に、地域とのつながりが子どものウェルビーイングに及ぼす効果の検証に向けて、専門職とともに検討を重ね次年度調査に向けた協議を行った。なお、平成27年度に実施できなかった海外の先進機関への訪問調査を実施し、「当事者を巻き込み、地域とともに実施可能」という観点から、地域の中で思春期の子どもの育ちを支援するシステムについて関連する施設、機関を訪問するとともに、日本の研究成果を報告し、支援システムと評価に関する討議を行い、評価および支援プログラム開発につながった。これまでに実施した量的研究と文献レビューで得られた影響要因の重要性に加え、質的研究により、有効な早期支援に関する実践事例を蓄積、類型化を行った。

並行して、昨年度実施できなかった海外の先進機関への訪問調査を実施し、支援システムと評価に関する討議を行い、子ども自身の選択や社会文化的背景への考慮の重要性の視点を加えた評価、支援モデルを作成した。本研究の目的は、学校不適応などの学童期、思春期のウエルビーイングに影響する、乳幼児期の関連要因を明らかにし効果的な早期支援方法を明らかにすることである。生涯発達とエンパワメントの視点から、育児環境や子ども自身の力を引き出し、地域とのつながりを促進する取り組みにより、将来の学校不適応を予防する可能性を検証する。子どもと養育者の特性に注目し、支援を必要とする子どもと養育者への早期支援プログラムを開発、実証することより、乳幼児期から、学童期、思春期をつなぐ根拠に基づく子育て支援システムの仕組みづくりに貢献することが期待される。平成29年度は、開発した支援プログラムの実施調整、モデルの評価を実施した。海外の研究機関と協働し、心理学、脳科学、生理学的見地から有効と考えられる、学童期および思春期のアセスメントおよび介入方法に関する研究開発に向けて研究討議、資料収集と整理、評価ツール開発と予備的検討を行った。続いて、保護者に対する調査、専門職に対するインタビュー調査、子どもに対する質問紙調査および認知機能特性、内受容感覚等に関する調査を行い、学童期、思春期のウエルビーイングに関する多角的な調査と多変量解析を実施し、影響要因を検討した。評価の妥当性の検証と並行して、子どもと養育者の特性別に、コホートデータを用いた支援効果に関する評価を行った。子どもを取り巻く環境や、家族と子どもの属性要因の影響を踏まえてウェルビーイングへの影響を検討した結果、乳幼児期の育児環境に加え、子どもの睡眠習慣等の生活習慣や社会とのかかわりが学童期および思春期のウェルビーイングを促進する可能性が実証された。また、思春期の内受容感覚や認知特性は学童期および思春期の精神的健康に関連する可能性が示され、今後は地域社会とのかかわり、生活習慣、心と体の調和を促進する支援プログラム開発の必要性が示された。本研究の目的は、学校不適応などのウエルビーイングに影響する、乳幼児期の関連要因を明らかにし効果的な早期支援方法を明らかにすることである。生涯発達とエンパワメントの視点から、育児環境や子ども自身の力を引き出し、地域とのつながりを促進する取り組みが学校不適応予防などウェルビーイング促進に貢献する可能性に基づき、支援を要とする子どもと養育者への早期支援プログラム開発と検証を行った。子どもの状態と子どもを取り巻く環境の要因、家族と子どもの属性要因等の影響を踏まえて検討した結果、乳幼児期の育児環境、子どもの睡眠習慣等の生活習慣や社会とのかかわりが思春期に及ぶウェルビーイングを促進する可能性が実証された。平成28年度は、質的研究と量的研究のミックスメソッドによる早期支援プログラムの開発と実施を計画している。具体的には、グループインタビューなど質的研究による支援に関する調査、質的量的データの統合と専門職との協働による早期支援プログラムの開発、支援プログラムのプロトタイプの実施と評価である。
アジアの「研究大学」の国際競争力とガバナンス改革に関する比較研究

近年におけるアジアの大学は、従来の理論(欧米の大学への従属から脱することは不可能とする言説)では説明できない発展相を示している。特に、広義の東アジアの大学は、グローバル化に対応した積極的な戦略を展開してきており、いわゆる「研究大学」が確実に誕生しており、国際競争力を増している。本年度(初年度)は、韓国、マレーシアの事例研究を中心に作業を進めた。まず韓国においては、「頭脳韓国21世紀計画(通称:ブレインコリア21)」(第2期)事業を通じ、ソウル所在の有力大学(ソウル大学、高麗大学、延世大学等)及び韓国科学技術大学等が、国際的大学ランキング(例:タイムズ紙)の上位200校入りを果たしたことに見られるように、研究大学としてのレベルアップが図られている。国家的にも教育科学技術部が打ち出したワールドクラス大学育成事業(WCU)がスタートし、研究大学の強化が図られている。また、マレーシアの場合も、従来から有力大学であったマラヤ大学のほかに、2020年を目途とする国家戦略のもと、マレーシア科学大学(ペナン)、国民大学(セランゴール州)、プトラ大学(セランゴール州)が研究大学の仲間入りを果たし、マレーシア科学大学が国内ランキングの上で、マラヤ大学を追い抜いたことに見られるように、大学間競争が熾烈となっている。これらの大学は法人化されており、ますますのガバナンス改革と競争力強化のための戦略が進行中であることが判明した。同時に、大学の質保証機構としてMQA(マレーシア大学質保証機構)が本格的な活動を開始していることも注目される。
組換えDNAによる蛋白質の生産と細胞外への分泌

本研究は、生理的に重要な蛋白質について、細胞内での生合成調節機構、膜構造への組込み機構および細胞外への分泌の機構を組換えDNAの技術を駆使して明らかにすることを目的としている。以下60年度の実績を述べる。(1)二井は大腸菌を用い、【H^+】ATPaseの変異株を解析しサブユニットの分子集合に必須なアミノ酸残基を同定した。またαガラクトシド輸送蛋白の変異株を解析し、輸送反応に趣ける必須残基を同定した。(2)大村は小胞体膜蛋白としてのP450(M1とC21)、ミトコンドリア内膜蛋白質としてのP450(11β)のcDNAのクローニングを行ないアミノ酸配列を決定した。またミトコンドリアのプロセッシングプロテアーゼの解析を行なった。(3)松原はヒトガストリン遺伝子の解析を行ない構造を明らかにした。さらに膵に於て異所性にガストリンを産生する腫瘍ガストリノーマに於ける本遺伝子の活性化機構を明らかにした。(4)安楽は大腸菌呼吸鎖電子伝達系の各種チトクローム蛋白の膜蛋白としての特徴的な性状を明らかにし、各構造遺伝子のクローニングおよびDNA塩基配列の決定を行なった。(5)水島は大腸菌シグナルペプチダーゼ遺伝子を明らかにし、酵素蛋白質の詳細な性状を明らかにした。さらにin vitro膜透過系を作成し、蛋白質の膜透過機構を解析した。(6)香川はヒト【H^+】ATPaseβサブユニットcDNAをクローン化し塩基配列を決定し、さらにgenomi cDNAの配列を決定した。このクローン化したcDNAを用いβサブユニットのミトコンドリアへの輸送機構を明らかにした。(7)岡本はラットインスリノーマで特異的に発現している遺伝子を見出しその構造を決定した。さらにラットのpancreatic polypeptidemRNAとVIP/PHM-27遺伝子の構造を明らかにした。このように膜構造への組みこみと分泌機構に関して多くの先駆的知見が得られた。特にこれらの過程に関与する特異的な酵素が明らかになったこと、膜構造に組込まれるための構造が明らかになったことは大きな進歩である。
貝殻に記録された情報による水域生起事象の推定方法および環境再生への利用方法の開発

貝の成長線を用いて過去の水域の貧酸素発生状況等の水圏事象を推定できるようにすることを目的とした。貝殻の^<14>C比率による貝が生存していた年代推定は、^<14> C比率のばらつきが大きく精度が十分でなかった。この結果を受けて、死亡日の確定している貝を用い、生存期間を対象に成長線間隔を利用して、水圏事象を推定することを試みた。まず、貝殻は成長過程に外殻が溶解することがあり、成長線は腹縁側でしか読み取れないことが明らかになった。さらに、アサリの成長線は既往研究の日輪ではなく、少なくとも2本、それより多いこともあることが判明した。しかしながら、成長線分布は水象とかなり関係があることが示されたので、その利用法の確立は可能性が高い。成長線の発生機構の解明、死亡年代の確定手法の確立が今後の課題である。海域に残存している貝殻を利用してかつての海域の環境条件、特に、底生生物を死に追いやる貧酸素水塊の発生状況を推定できるようにすることを試みた。本年度の研究成果は以下のとおりである。1.貝殻をセンサーとして利用できるようにする検討過程を考案した。この案に基づき、検討を進行させることにした。この過程は、キャリブレーションカーブの作成と現地で対象となる貝殻の収集、分析、解析からなる。2.この検討過程にもとづき、死亡年、生存場所が既知の複数種の貝殻を収集し、C^<14>のキャリブレーションカーブを作成することを試みた。その結果、普遍的に存在するアサリ、サルボウでは、このようなサンプルが意外に少なく、貴重な貝類よりはるかに少ないことが判明した。そのために、自ら収集を開始した。また、収集しえた貝殻のC^<14>はかなり減少してきており、1970年代のような高い値を示さなかった。死亡年代推定の根幹であるC^<14>計測をもう少し幅広く検討する必要があることが判明した。3.有明海海底に存在する貝殻を収集した。その結果、貧酸素水塊が出現する地域では貝殻がほとんど残存しないことが判明した。破砕片も少ないので、キャリブレーションカーブが作成できたとしても、環境変化を追跡できない可能性が生まれてきた。この点を明確にするために次年度調査を継続することにした。4.貝殻が海底に意外と少ないことから、貝殻の分解過程を追跡することを新たに開始した。籠に貝殻を入れ、海中に吊るし、数カ月単位で貝殻の減少速度を追跡するとともに、貝殻表面の劣化状況を把握することにした。5.貝殻の日輪観測の準備貝殻の切断加工、表面研磨、日輪読み取りのための凹凸の転写に習熟し、顕微鏡撮影のソフト等を揃え、準備を整えた。主要解明結果は以下の通りである。1)海水中における貝殻の溶解速度を、貝殻を有明海の佐賀県六角タワーにて海水中に設置して測定した。ほぼ2か月ごとに回収し、当初との質量変化を測定した。その結果、6ケ月で5%減少した。このことは、貝殻の成長線を殻頂付近で読み取ることが困難になる可能性のあることを示している。2)種名、死亡年月日、採取場所(有明海)が明確な貝の殻の^<14>Cを測定したところ、かなりのばらつきがあり、生存年代を推定するには誤差が大きかった。大気中の二酸化炭素の海水への溶解と外洋水との混合、貝による炭酸イオンの摂取について、さらなる検討が要ることが判明した。3)貝殻の成長線の間隔を読み取る手法を確立しえたが、成長線そのものが縞状を呈したり、貝殻の厚さ方向に不連続的になっていたりする上に、殻頂付近では外殻が溶解し読み取りに限界があった。このことは成長線が生じる機構を解明し、それに基づいて成長線数を日にちに換算する必要があることを示している。4)同一種の貝の成長速度(成長線の間隔)と水温や時化による摂餌停止の影響との関係性には、やや関係性を見出すことができた。成長線が生じる機構を解明することができれば、この問題はかなり解決されることになることが明らかになった。5)成長に関する水温の影響が異なるアサリとサルボウを比較しようとしたが、サルボウの成長線が明確に読み取れなかった。そのため、食用に供されていない成長性の読み取りやすい種を利用することにした。
介護の用語の平易化　ー開かれた介護を目指す営みー

EPA(経済連携協定)にはじまり、技能実習制度に介護を含めることが検討されるに至り、介護の現場に外国人を受け入れることが現実化している。介護職を目指す外国人にとって、介護福祉士国家試験の受験にとどまらず、介護現場での日本語の問題は大きい。本研究は、外国人の日本語習得にとって大きな壁となっている難解な介護用語(外来語・医学・看護用語を含む)についてその実態を知り、平易化することを目指したものである。平成24年度にその前年に電子ファイル化したデータの修正作業を行い、そののち、まず、日本語教育の立場から、難語の取り出しを行った。約1万語を抽出し、それを「病名」「体位名」「介護用語」「カタカナ語」「薬品・分泌物」等に分類した。分類した語については、日本語教育、介護の専門家が同時に、国家試験のために覚えるべき語、国家試験に出た場合にわかりさえすればいい語、介護現場で必要な語のいずれに該当するかを検討した。この作業はいまだ継続して行っている。上記作業に並行して、医学用語、介護用語の中国語、英語翻訳作業を行った。中国語については、もともと医学用語の多くは中国から輸入されたものであるが、その後、中国語では平易化したものや日本から逆輸入されたものがあり、その実態を明らかにすることを目指している。また、英語については、日本の介護用語にカタカナ語が多用されているが、それが原義と一致しているか否かの確認を行うためである。翻訳作業自体は、おおむね完了した。介護の新カリキュラムの全テキスト(中央法規、ミネルバ、けんぱく社の3出版社分)をスキャナーで読み込み、電子ファイル化した。量が膨大なため、1社分に限定することも考えられたが、資料としての説得力を重視し、3社分を対象にした。同時に、個人記録に関わるという点でプライバシーに配慮しつつ、介護記録、介護日誌等の介護現場の資料の収集を、異なるタイプの現場において行った。口頭での引き継ぎ等の音声による記録収集も若干行った。これらの現場資料については、介護の専門側と日本語教育の専門側とで内容の確認を行ったが、介護の専門側にとっても、不適切と判断される表現、専門用語が使用されていることが明らかになった。スキャナーで読み込んだテキストについては、語句の修正、分かち書き作業を開始した。また、海外、主に、中国、アメリカ、台湾の介護実体の資料収集を行った。2012年9月22、23日に京都女子大学で開催された「日本介護福祉学会大会」において、「日本人・外国人介護従事者の共生を目指して」と題して、自主企画シンポジウムを行った。シンポジストの一人、中山辰巳氏は、特別養護老人ホームの施設長として、2008年から毎年インドネシア候補者を2名ずつ受け入れている。受け入れの際の問題、その後の介護研修、国家試験に向けての準備などにおいて直面したさまざまな困難と、打開方法が報告され、今後の受け入れのあり方を考えるにあたって大いに参考になった。1平成25年度に作成した介護の難解用語リストから約1300語を選ぶ。2研究組織のメンバーが、介護福祉士養成教育と日本語教育の観点から、必要度が高く、かつ、言い換えが必要と思われる130語を選び出す。3介護のテキストに示された言い換え語や、用語辞典の記述を参考に、言い換え案リストを作成する。4上の言い換え案について、医学・看護学・介護教育学・介護施設職員・米国在住の言語研究者・マスコミ関係者・日本語学の各専門家による合同検討会を開く。5検討会で合意を得た語を言い換え語とする。2014年10月11日には日本語教育学会秋季大会において2時間半のパネルディスカッションを持ち介護用語の平易化の必要性を訴えた。2015年5月の春季大会において再びパネルディスカッションを持つことが決まり、具体的に介護用語の言い換え案をしめすことにしている。また、言い換え案をまとめ、三省堂から書籍として出版することが決まっている。日本語教育翻訳作業については、質の高い協力者を得て、語数を絞ったこともあり、ほぼ完全な翻訳データが得られている。日本語教育、介護の両サイドからの難語の検討は、意見の一致を見ないことも多く、検討に時間を要している。平成24年度は新カリキュラムのテキストデータをファイル化し、読み込んだデータの誤りを修正することが作業目標の一つだった。介護テキストの読み込み作業に当たって、質の高い協力者が確保できたため、おおむね作業は順調に進んだ。ただし、データの修正作業は、すべてのデータについては行えなかった。また、介護記録、日誌等のデータ収集を平行して行ったが、介護の専門家がそれぞれに、介護施設と密接なつながりを持っており、かつ信頼関係が構築されているため、多くの資料が得られた。日本語教育、介護両サイドからの難語の検討を引き続き行う。この中で、難語でかつ平易化が必要と判定された語について、言い換え案を検討する。言い換え案を含め、現場での使用実態をアンケート調査する。また、平成24年度に入手した介護現場における記録(日誌等)を電子ファイル化し、その用語を検討する。

中国語、英語における医学用語、介護用語と日本語のそれとを比較検討し、平易化の参考資料とする。平成24年度電子ファイル化したデータの修正作業を行う。その後、難語の検討を介護と日本語教育の両面から検討し、抜き出し、言い換え案の作成作業を行う。日本語教育の観点からは難語と判断されるものも、医療、介護の現場では使われてきた用語が多い。しかし、現状を変えないでは、外国人にとってだけでなく、日本人にとっても難解な用語が使われつづけることになる。特定の語が使われるに至った経緯や諸外国の用語も視野に入れながら、平易化の作業をすすめる。医学用語、介護用語の翻訳作業を平成25年度中に終了する予定であったが、作業が予定通りに終了しなかったため。翻訳作業の謝金に充てる。平成24年度は、分担者の佐藤氏が経費を執行しなかった。当初、佐藤氏の所属機関の学生に作業を依頼する予定で、実際に作業を試みてももらったが、その結果、介護用語に通じていても、コンピュータの操作に慣れていないと、非常に作業効率の悪いことがわかり、読み取り作業は、代表者の所属機関で行うこととした。この未使用額は、佐藤氏が平成25年度に執行する予定である。平成25年度の研究費は、主に、データの修正作業、難語の取り出し作業の謝金に充てる。また、資料収集のため、医学看護関連の辞書を購入する。語彙の平易化には、業界の多くの人の理解協力が欠かせないので、作業の途中経過を、10月に熊本学園大学で開催される日本介護福祉学会で発表する予定である。
青色光が誘導する口腔領域の酸化ストレス解析と加齢制御

歯牙漂白やレジン修復に用いられる青色光の波長は高エネルギー波長として眼科領域ではすでに防御メガネ等の物理的防御策やサプリメント治療の対策が打ち出されている。歯科の青色光研究は立ち遅れている。そこで術野外でありながら青色光が照射される歯肉線維芽細胞と組織について検討を行った。青色光は細胞に5分間の照射でミトコンドリアが最初のターゲットとし活性酸素種が誘導されることが示唆され,その結果として細胞増殖活性が抑制されることが認められた。また,組織においてもラット口蓋歯肉において酸化ストレスの影響が15分の照射で現れることが認められ,この影響はNアセチルシステインにて抑制されることが見出された。次に,in vivoにおける検討を行った。LEDを用い,ラット歯肉口蓋組織に対する酸化ストレスの検討を行った。酸化ストレスの指標の一つである脂質過酸化の程度を生化学的手法TBARS assayにより検討を行い,歯肉口蓋組織に脂質過酸化の亢進が認められた。また,コラーゲンの検討も行ったが,15分の青色光照射においては変化が認められなかった。青色光による口腔領域の影響は細胞レベルのみでなく組織レベルにおいても歯肉組織において酸化ストレスによる影響が認められたがコラーゲンレベルへの影響は認められなかった。細胞に対する青色光照射にて酸化ストレスが青色光により誘導され,細胞増殖活性を抑制することが見出されただけでなく、ラット歯肉口蓋においても酸化ストレスレベルの亢進が認められ,細胞レベルのみならず生体レベルにおいても青色光は酸化ストレスの影響を引き起こすことが示唆され,この青色光の影響はNアセチルシステイン(NAC)にて抑制されたことよりNACは歯科診療時の青色光照射による口腔組織に対する防御の可能性が認められ今後の歯科臨床に於いて新たな防御法の確立に繋がることが示唆された。審美歯科診療時に用いる青色光は眼科領域では活性酸素種(ROS)による網膜への悪影響をBlue Light Hazardという言葉にて注意喚起が行われている。歯科においては青色光は可視光であることから安全と考えられ,その影響は温度については多くなされているものの光化学においては検討が殆どなされていない。近年,審美歯科診療において青色光が多用されるようになり,その照射範囲・時間が拡大される傾向にあり,また,術野外である口腔軟組織にも照射されるようになりその影響を精査する必要が急務であり以下の検討を行った。血管平滑筋細胞とヒト歯肉線維芽細胞(HGF)に与える青色光の影響について検討を行った。血管平滑筋細胞への歯科用ハロゲン照射器による青色光照射は細胞増殖性活性を抑制し,この抑制にはアポトーシスが関与していた。また,このアポトーシスはN-acetyl-L-cysteineの添加により抑制されたことより活性酸素種の関与が示唆された。また, HGFの検討は,光源にハロゲン(QTH)と発光ダイオード(LED)を用い,HGFへの影響をMTS assayにて細胞増殖活性を解析,また電子顕微鏡による形態学的検討を行った。低出力青色光照射はLEDのみ細胞増殖活性が低下したが,高出力青色光照射はQTH,LEDいずれにおいてもHGFの照射時間依存的に細胞増殖活性は低下し,また,QTHよりもLEDにおいて有意な活性低下を示した。形態学的検討においては青色光の照射によってミトコンドリアに傷害を与えることが確認でき,この傷害は他の細胞小器官には認められなかった。以上のことより,青色光の歯肉線維芽細胞への光照射はミトコンドリアを起点とする細胞障害を引き起こすことが示唆され,今後この詳細なメカニズムの検討と防御法の確立が必要であると考えられる。当該年度は細胞における青色光照射の影響を検討することが目標であった。当初の計画では生化学的検討と活性酸素種の特定をする予定であったが,生化学検討と翌年度の実験計画の一つである形態学的検討を行った。よって,計画の順序は前後したが,概ね順調であると考えます。細胞における検討計画である活性酸素種の特定を行い,この段階で論文執筆にとりかかる。また,当初の計画通り,次年度はin vivoの検討に移行し,動物を用い生体口腔組織における青色光の影響の検討を行なっていく予定である。次年度は動物実験のみを行う予定であったが,細胞実験も引き続き行う予定である。よって次年度使用額は細胞実験における培養および蛍光測定に必要な試薬に充当させ,次年度支給額は当初の予定通り実験動物および動物実験における器具および必要試薬に用いる予定である。
RNA干渉による抗コクサッキーウイルス作用の検討

コックサッキーウイルスは、小児において「ヘルパンギーナ」や「手足口病」の原因となるウイルスで、咽頭痛、口蓋部と咽頭における小水庖・小潰瘍の形成といった口腔症状もあることから、小児歯科領域においても遭遇する可能性の高い疾患である。その治療法は、抗ウイルス剤の投与が一般的であるが、対症療法にすぎず、特効薬は存在しない。そこで我々はRNA干渉によるウイルス抑制を試みてきた。さらに今年度はアンチセンス法に基づいたペプチド核酸(PNA)によるウイルスの増殖抑制実験を行った。RNAiではなく、PNAを利用する利点としては、(i)PNA/DNA、PNA/RNA間の結合力は、DNA/DNA、DNA/RNA、RNA/RNA間の結合力よりも強い、(ii)PNAは天然に存在しない完全人工物質であるため、分解酵素などが存在しないということである。したがって、設計したアンチセンスPNAに抗ウイルス作用が観察されれば、RNAiよりも効果、投与法、保存法において優れた方法と考えられる。PNAの標的遺伝子は、(1)通常のRNAiで標的とされる領域、(2)VPg結合領域を選択し、これらの領域からセンス鎖、アンチセンス鎖の18塩基が抽出し、設計した。また、PNAの細胞内への取り込みは、cell penetrating peptideを修飾すると効率的であることが報告されており、この中でも最も効率が高いことが予想されるTat配列(GRKKRRQRRRPPQ-)を本研究では採用した。また、このペプチドとPNAの間には立体構造を維持するためにリンカー配列を2個付与した。上記の設計により作成されたアンチセンスPNAをコックサッキーウイルス感染細胞に投与し、プラークアッセーにより、抗ウイルス増殖作用を検討した。その結果、RNAi標的領域ではセンス鎖、アンチセンス鎖ともにほとんどウイルスの増殖が認められなかったが、VPg結合領域のアンチセンス鎖では若干のウイルス増殖抑制効果が認められた。今後は投与条件をさらに検討するとともに、RNAポリメラーゼのコード領域等も含め設計し、単独あるいは組み合わせによるウイルス増殖抑制効果も検討する予定である。コックサッキーウイルスは、小児において「ヘルパンギーナ」や「手足口病」の原因となるウイルスで、発熱や咳、下痢などの全身症状の他に、咽頭痛、口首部と咽頭における小水庖・小潰瘍の形成といった口腔症状もあることから、小児歯科領域においても遭遇する可能性の高い疾患である。その治療法は、抗ウイルス剤の投与が一般的であるが、対症療法にすぎず、特効薬が存在しないのが現状であり、効果的な治療法を開発することが望まれている。その一方で近年、アンチセンス効果に基づくRNA干渉(RNAi)により、特異的なmRNAの発現をノックアウトあるいはノックダウンする手法が開発された。この機構は、ゲノム自身をウイルスや転写因子から保護したり欠陥mRNAを除去したりする太古の"免疫系"として機能するということも言われている。そこでコックサッキーウイルスに対して特異的に作用するような相補鎖mRNAを用いてRNAiを行えば、このウイルスが除去される可能性がある。まず、合成RNAを設計し、これを細胞に投与して取り込ませるための条件設定を模索したが、RNA自体が分解しやすいこと、遺伝子導入に使用されるリポフェクトアミンなどの試薬は細胞障害性が高いことなどから、臨床応用は困難であることが予想された。そこで、次に同様にアンチセンス効果が得られるペプチド核酸(PNA)を改めて採用することにした。PNAは、完全に人工の物質であるのでRNAのような分解は起こらない。PNAの塩基配列の設計には、従来のRNAiの設計にしたがったものの他に、ウイルスの複製に関与するVPg結合領域を標的にしたものも採用した。また、PNAの細胞への導入には、HIV由来のCell Penetrating Peptide(CPP)の一つであるTATモチーフなどを付加することによりRNAの場合よりも細胞内への導入が容易となる。これらことから、PNAを用いれば、RNAiにおける問題点が解消されることが示唆された。現在、CPP-PNA結合体を作製中であり、今後これらを用いてウイルスの増殖抑制効果があるかどうかを検討する予定である。

また、このペプチドとPNAの間には立体構造を維持するためにリンカー配列を2個付与した。上記の設計により作成されたアンチセンスPNAをコックサッキーウイルス感染細胞に投与し、プラークアッセーにより、抗ウイルス増殖作用を検討した。その結果、RNAi標的領域ではセンス鎖、アンチセンス鎖ともにほとんどウイルスの増殖が認められなかったが、VPg結合領域のアンチセンス鎖では若干のウイルス増殖抑制効果が認められた。今後は投与条件をさらに検討するとともに、RNAポリメラーゼのコード領域等も含め設計し、単独あるいは組み合わせによるウイルス増殖抑制効果も検討する予定である。