hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
炎症性Tヘルパー細胞の記憶獲得・維持機構の解明

抗原特異的なT細胞の記憶獲得・維持が、感染症に対する長期的なワクチン効果に重要である。一方、自己抗原に特異的な自己免疫性T細胞の記憶獲得・維持機構が、自己免疫疾患の増悪、再発因子であるかどうか明らかでない。加えて、生体内で同定が困難である自己抗原特異的なメモリーT細胞に関しては研究が進んでおらず、基礎的な分子基盤および自己免疫惹起能に関しても詳しく分かっていない。本年度、エフェクターTh17細胞とメモリーTh17細胞間の可塑性を解析した。Th17細胞依存性の自己免疫性関節炎モデルを用いて、炎症関節局所のIL-17産生エフェクター(IL-17-eGFP陽性またはTh17細胞系譜レポーター陽性)Th17細胞を分画後、RAG2-/-マウスに養子移入し、移入細胞の生存と表現型解析をおこなった。これら最終分化した炎症組織内エフェクターTh17細胞は、生存・増殖能が極めて低く、移入後早期に生体内での細胞数が激減した。また、メモリーTh17細胞への可塑性も示さないことから、炎症関節局所のTh17細胞はエフェクター機能に強く固定されていることが明らかとなった。逆に、関節炎を発症したマウスからメモリーTh17細胞を分画後にRAG2-/-マウスに養子移入すると、メモリーTh17細胞からエフェクターTh17細胞への可塑性を示し、関節炎を惹起した。これらの結果から、メモリーTh17細胞とエフェクターTh17細胞間の可塑性およびメモリーTh17細胞の関節炎惹起能を明らかにした。本研究課題では、炎症性Tヘルパー細胞の記憶獲得・維持機構の分子基盤を理解するため、これまで実態が掴めていないメモリーTh17細胞の表現型解析を進めている。本年度の成果として、IL-17-eGFPマウスおよび細胞系譜レポーターマウスを用いてメモリーTh17細胞とエフェクターTh17細胞間の可塑性を明らかにし、メモリーTh17細胞の疾患惹起能を明らかにした。次世代シークエンサーを使った実験がやや遅れているが、少数の細胞での解析手法を確立しつつあり、来年度、メモリーTh17細胞の遺伝子発現プロファイル解析を進めていく。平成31年度は、30年度の研究計画の継続に加えて、メモリーTh17細胞について以下の解析を進める。自己免疫性関節炎モデルマウスを用いて、関節炎惹起性メモリーTh17細胞と炎症局所のエフェクターTh17細胞をセルソーターで分取し、少ない数のTh17細胞サンプルからの遺伝子発現プロファイル解析を次世代シークエンサーを使って進める。得られたデータをクラスター解析、ネットワーク解析などバイオインフォマティクスの手法を用いてメモリーTh17細胞特異的な遺伝子群の同定を進める。機能的な候補遺伝子については定量的PCRをおこない発現差を検証し、病態モデルにおける意義について検討を進めていく。本年度、生体内で分化したエフェクターTh17細胞、メモリーTh17細胞の同定手法の開発および細胞表現型の解析を進めた。これまでサイトカイン産生細胞は、生体から分離したTh細胞を試験管内で再刺激、固定、染色することで検出しており、生体内のエフェクターTh17細胞とメモリーTh17細胞を同一個体内で分離・同定するシステムは確立してなかった。Th17細胞系譜レポーター系統(IL-17-iCre R26R-eYFP)およびIL-17産生Th17細胞レポーター系統(IL-17-IRES-eGFP)を用い、レポーター蛍光と細胞表面マーカーを組み合わせることでエフェクターTh17細胞とメモリーTh17細胞の分離・同定に成功した。エフェクターTh17細胞は、リンパ節、脾臓、腸管組織、炎症関節など幅広い臓器で分布が認められた。逆に、メモリーTh17細胞の分布は脾臓に偏在しており、炎症組織内ではほとんど存在しなかった。これらの結果から、メモリーTh17細胞とエフェクターTh17細胞は明らかな組織分布および表現型の違いを示し、次年度以降の解析に向けた足がかりがえられた。本年度の成果として、細胞系譜レポーターマウスを用いてメモリーTh17細胞とエフェクターTh17細胞を比較し、メモリーTh17細胞特異的な表現型と生体内での性質が明らかになってきた。期待した研究の進展が得られており、得られた表現型をマーカーとして次年度以降のさらなる遺伝子発現プロファイル解析を進めていく。

Th17細胞依存性の自己免疫性関節炎モデルを用いて、炎症関節局所のIL-17産生エフェクター(IL-17-eGFP陽性またはTh17細胞系譜レポーター陽性)Th17細胞を分画後、RAG2-/-マウスに養子移入し、移入細胞の生存と表現型解析をおこなった。これら最終分化した炎症組織内エフェクターTh17細胞は、生存・増殖能が極めて低く、移入後早期に生体内での細胞数が激減した。また、メモリーTh17細胞への可塑性も示さないことから、炎症関節局所のTh17細胞はエフェクター機能に強く固定されていることが明らかとなった。逆に、関節炎を発症したマウスからメモリーTh17細胞を分画後にRAG2-/-マウスに養子移入すると、メモリーTh17細胞からエフェクターTh17細胞への可塑性を示し、関節炎を惹起した。これらの結果から、メモリーTh17細胞とエフェクターTh17細胞間の可塑性およびメモリーTh17細胞の関節炎惹起能を明らかにした。本研究課題では、炎症性Tヘルパー細胞の記憶獲得・維持機構の分子基盤を理解するため、これまで実態が掴めていないメモリーTh17細胞の表現型解析を進めている。本年度の成果として、IL-17-eGFPマウスおよび細胞系譜レポーターマウスを用いてメモリーTh17細胞とエフェクターTh17細胞間の可塑性を明らかにし、メモリーTh17細胞の疾患惹起能を明らかにした。次世代シークエンサーを使った実験がやや遅れているが、少数の細胞での解析手法を確立しつつあり、来年度、メモリーTh17細胞の遺伝子発現プロファイル解析を進めていく。平成30年度は、29年度の研究計画の継続に加えて、メモリーTh17細胞について以下の解析を進める。上述したシステムを用いて、メモリーTh17細胞とエフェクターTh17細胞をセルソーターで分取し、これらサンプルの遺伝子発現プロファイルを次世代シークエンサーを使って進める。得られたデータをクラスター解析、ネットワーク解析などバイオインフォマティクスの手法を用いてメモリーTh17細胞特異的な遺伝子群の同定を進める。機能的な候補遺伝子については定量的PCRをおこない発現差を検証する。平成31年度は、30年度の研究計画の継続に加えて、メモリーTh17細胞について以下の解析を進める。自己免疫性関節炎モデルマウスを用いて、関節炎惹起性メモリーTh17細胞と炎症局所のエフェクターTh17細胞をセルソーターで分取し、少ない数のTh17細胞サンプルからの遺伝子発現プロファイル解析を次世代シークエンサーを使って進める。機能的な候補遺伝子については定量的PCRをおこない発現差を検証し、病態モデルにおける意義について検討を進めていく。29年度に予定していた遺伝子発現プロファイル解析を30年度の研究計画に変更したため。30年度研究費と合わせて次世代シークエンサー解析をおこなう予定である。
有機非線形光学材料としての光学活性ヘテロヘリセン

ビアリール・カップリング反応および分子内カルボニル・カップリング反応を用いる光学活性ヘテロヘリセンの新合成法の開発:ヘリセンのような高ひずみ分子の合成には光環化反応が不可欠である。この方法では,分子間の副反応を抑えるため希薄溶液中で反応を行う必要があり,また酸化条件下で強力な紫外線照射を行うため,用いられる化合物や置換基の種類に制限がある。このため,一度の光反応で得られるヘリセンの量が少ないのが欠点となっている。光環化反応を用いない光学活性ヘリセン合成法が開発できれば,さまざまな官能基を有するヘリセン分子を大量に合成することが容易となる。この目的のため,研究代表者はビアリール・カップリング反応とカルボニル・カップリング反応を組み合わせたヘリセン分子の新しい合成法の開発を行ない,これに成功した。この手法では,光環化反応を用いる場合よりも10倍から100倍の濃度で反応を行うことが可能である。これらの方法で得られたヘテロヘリセンはいずれも高い光学純度を持つ新規化合物であり,その絶対配置は結晶構造解析によって決定することができた。また,CDスペクトルの測定によりヘリセンの絶対構造とCDスペクトルとの関係を明らかにした。以上のように,官能基を有する光学活性ヘテロヘリセンの新合成方法を確立することができたため,光学活性ヘテロヘリセンの物理的,化学的性質が今後一層明らかになっていくものと期待される。
光プローブ法による表面新物質相の研究

異なる光プローグを使って総合的に表面の物質相を調べるために研究会などの機械を通じて相互連絡を深めつつ,各分担者は次のような研究を行った.[潮田]Ni(111)表面に吸着したニトロベンゼンのラマン散乱を測定し,約5単分子層までの分子振動のスペクタトルをとらえることに成功した.また,レーザー照射中に錯乱強度が変化する新しい現象を発見した.この原因を現在究明している.同時に吸着分子のラマン錯乱断面積の絶対値を決定した.[太田]軟X線領域で使用可能なUHV仕様の蛍光X線検出器を開発し, (5 3x2)/Ni(111)の表面EXAFSと軟X線定在波法による測定を行った. Ni(111)の表面第一層が疑似的なC(2x2)S/2Ni(100)に再配列していることと, P(2x2)から(5 3x2)構造への変化にともない表面原子層が約10%収縮することが分かった.[菅]スピン偏極光電子エネルギー分析器の設計と製作を行った.エネルギー分析器はJOST型半球アナライザーとし,スピン検出器はW(001)面からのLEEDパターンの非対称性を利用するものである.半球型グリッドとBaO熱カソードを用いた電子銃を製作した.異なる光プローグを使って総合的に表面の物質相を調べるために研究会などの機械を通じて相互連絡を深めつつ,各分担者は次のような研究を行った.[潮田]Ni(111)表面に吸着したニトロベンゼンのラマン散乱を測定し,約5単分子層までの分子振動のスペクタトルをとらえることに成功した.また,レーザー照射中に錯乱強度が変化する新しい現象を発見した.この原因を現在究明している.同時に吸着分子のラマン錯乱断面積の絶対値を決定した.[太田]軟X線領域で使用可能なUHV仕様の蛍光X線検出器を開発し, (5 3x2)/Ni(111)の表面EXAFSと軟X線定在波法による測定を行った. Ni(111)の表面第一層が疑似的なC(2x2)S/2Ni(100)に再配列していることと, P(2x2)から(5 3x2)構造への変化にともない表面原子層が約10%収縮することが分かった.[菅]スピン偏極光電子エネルギー分析器の設計と製作を行った.エネルギー分析器はJOST型半球アナライザーとし,スピン検出器はW(001)面からのLEEDパターンの非対称性を利用するものである.半球型グリッドとBaO熱カソードを用いた電子銃を製作した.
マイクロカプセル化技術によるフッ素徐放性とその制御機能のレジン材料への導入

フッ化物配合レジンでは,フッ化物の溶解度の大きなものほど高いフッ素徐放性を示すが,早期にフッ素を徐放し尽くし,その持続性に乏しい.そこで,フッ化物を疎水性の被膜で被覆することで,フッ化物の溶解性を抑制し,持続的徐放性を得ることを試みた.その際の疎水性の被膜形成は,NaFをシランカップリング剤であるγ-MPTSで処理することで可能であり,シラン処理の際の処理溶液のγ-MPTSの濃度は3wt%以上で,加熱処理を行うことが必要であることがわかった.シラン処理NaFのXPS分析の結果,シランカップリング済に起因するSi 2p電子のピークが観察されこのピークはスパッタリングにより減少した.この結果から,フッ化物をシラン処理することでフッ化物はポリシロキサンの被膜で被覆されたものと考えられた.γ-MPTS濃度で処理したNaFを配合したレジンからのフッ素子徐放性を測定すると,早期の徐放量は低下したものの経時的な徐放量の低下は少なくなり,7週目以降は無処理群よりも高い徐放性を示した.さらに,このように長期間持続的フッ素徐放性を示すレジンを牛歯エナメル質に充填し,その齲蝕抑制効果を検討した.顕微X線像から,フッ化物を配合していない群は高度に脱灰した層が確認されたのに対し,無処理,シラン処理群ではともにほとんど脱灰層は確認されず,多量のフッ素を徐放する無処理群とシラン処理群の脱灰抑制の程度は同等であった.これらの結果から,シラン処理群は長期間フッ素を徐放するため,無処理群に比ベエナメル質が獲得した耐酸性を長期間維持できる可能性が示唆された.以上のように,フッ化物であるNaF表面をシランカップリング剤でコーティングするという方法でマイクロカプセル化して,それらを配合することで,レジン材料に持続的フッ素徐放性を付与することができることがわかった.フッ化物配合レジンでは,フッ化物の溶解度の大きなものほど高いフッ素徐放性を示すが,早期にフッ素を徐放し尽くし,その持続性に乏しい.そこで,フッ化物を疎水性の被膜で被覆することで,フッ化物の溶解性を抑制し,持続的徐放性を得ることを試みた.その際の疎水性の被膜形成は,NaFをシランカップリング剤であるγ-MPTSで処理することで可能であり,シラン処理の際の処理溶液のγ-MPTSの濃度は3wt%以上で,加熱処理を行うことが必要であることがわかった.シラン処理NaFのXPS分析の結果,シランカップリング済に起因するSi 2p電子のピークが観察されこのピークはスパッタリングにより減少した.この結果から,フッ化物をシラン処理することでフッ化物はポリシロキサンの被膜で被覆されたものと考えられた.γ-MPTS濃度で処理したNaFを配合したレジンからのフッ素子徐放性を測定すると,早期の徐放量は低下したものの経時的な徐放量の低下は少なくなり,7週目以降は無処理群よりも高い徐放性を示した.さらに,このように長期間持続的フッ素徐放性を示すレジンを牛歯エナメル質に充填し,その齲蝕抑制効果を検討した.顕微X線像から,フッ化物を配合していない群は高度に脱灰した層が確認されたのに対し,無処理,シラン処理群ではともにほとんど脱灰層は確認されず,多量のフッ素を徐放する無処理群とシラン処理群の脱灰抑制の程度は同等であった.これらの結果から,シラン処理群は長期間フッ素を徐放するため,無処理群に比ベエナメル質が獲得した耐酸性を長期間維持できる可能性が示唆された.以上のように,フッ化物であるNaF表面をシランカップリング剤でコーティングするという方法でマイクロカプセル化して,それらを配合することで,レジン材料に持続的フッ素徐放性を付与することができることがわかった.フッ素徐放性とその制御機能をレジン材料に導入するにあたり,本年度は,フッ素徐放源となるフッ化物のマイクロカプセル化技術の検討を主に行った.芯物質としてはフッ化カルシウム,懸濁安定剤としてゼラチンを,コート剤としてMMAとTEGDMAを選択した.確立したマイクロカプセルの作製方法は以下のとおりである.フッ化カルシウムとゼラチンを加えた水溶液を耐熱性ガラスリアクター内で窒素ガス気流下毎分1000回転で撹拌しながら,70°Cまで加熱し,その後MMAとTEGDMAに過酸化ベンゾイル(重合禁止剤)を加えたモノマーを滴下した.70°Cで1時間撹拌し100°C,30分間加熱でマイクロカプセルを最終重合させた.得られた溶液にはマイクロカプセルとゼラチンが浮遊しているため,カプセルのみを取り出す必要がある.そこで,100°C,30分間でゼラチンを加熱分解させ,溶液を静置し,カプセルを沈殿させてから上清を除去した.さらに濾過しカプセルを取り出し,50°Cで乾燥させた.マイクロカプセルの粒度はレジン材料に混合することを考え,直径10μm以下となるように篩いを用いて調整した.フッ化カルシウムのマイクロカプセル化は,形態の走査型電子顕微鏡観察,さらにカプセル縦断面のエネルギー分散型X線元素分析で内部にフッ化カルシウムが存在していることにより確認した.マイクロカプセルからのフッ素徐放性については,カプセルを脱イオン水中に浮遊させ,イオン電極法により溶解せずフッ素が徐放されることを確認した.

また,徐放されるフッ素による歯質強化は,マイクロカプセルを市販低粘度レジンに配合して,抜去歯を用いて窩壁歯質の耐酸性強化作用を顕微X線法によって確認した.今後は,カプセル化物質と芯物質であるフッ化物の種類を変えてフッ素の徐放特性を調べ,フッ素の徐放制御可能なマイクロカプセル化技術を検討する予定である.前年度は、CaFをMMA及びTEGDMAでコートすることでマイクロカプセル化できることがわかったが、これをレジンに混入しフッ素徐放量を測定するとCaFは低溶解性で徐放量が少なく、臨床応用に際し重要な窩壁歯質の耐酸性向上効果が弱いことが危惧された。そこで本年度は、さらに高いフッ素徐放性が得られるマイクロカプセル作製法を検討した。臨床応用されフッ素徐放性の良好なNaFと、予備実験で高い徐放性が確認されたNa_2SiF_6とTiK_2F_6をフッ化物として選択し、コート剤としては前年度研究でMMA及びTEGDMAでは薄膜化が困難であったので、歯科用コンポジットレジンのフィラー表面処理に応用されるシランカップリング剤に注目した。γ-MPTSを99.5%エタノール溶液に5wt%添加し、等量のフッ化物と混和してエタノール揮発後130°Cで24時間加熱処理した。TEGDMAとBis-GMAを等量含むモノマーにシラン処理フッ化物を50wt%配合したレジンを試作し、フッ素途放量を10週間にわたり測定した。その結果、無処理NaF配合レジンはフッ素徐放性は初期には高いが短期間で急激に低下したのに対し、シラン処理NaF配合レジンは徐放量は減少するが急激な徐放低下はなく、持続的徐放性を示した。また、シラン処理Na_2SiF_6とTiK_2F_6配合レジンからの徐放量は大幅に低下したが、長期持続的徐放が期待できる様相を示した。一方、シラン処理フッ化物の配合でレジンの機械的強さも向上した。さらに本レジンにより窩壁歯質の強化も生じることを人工二次う蝕作製実験で確認した。以上より、シラン処理によりフッ化物の溶解性を抑制し、フッ素の長期持続的徐放性が得られることが示された。また、シランカップリング剤濃度によってフッ化物の溶解性の抑制効果を調整でき、抑制方向のみではあるがフッ素の徐放制御が可能である。フッ化物配合レジンでは,フッ化物の溶解度の大きなものほど高いフッ素徐放性を示すが,早期にフッ素を徐放し尽くし,その持続性に乏しい.そこで,フッ化物を疎水性の被膜で被覆することで,フッ化物の溶解性を抑制し,持続的徐放性を得ることを試みた.その際の疎水性の被膜形成は,NaFをシランカップリング剤であるγ-MPTSで処理することで可能であり,シラン処理の際の処理溶液のγ-MPTSの濃度は3wt%以上で,加熱処理を行うことが必要であることがわかった.シラン処理NaFのXPS分析の結果,シランカップリング剤に起因するSi 2p電子のピークが観察され,このピークはスパッタリングにより減少した.この結果から,フッ化物をシラン処理することでフッ化物はポリシロキサンの被膜で被覆されたものと考えられた.γ-MPTS濃度で処理したNaFを配合したレジンからのフッ素徐放性を測定すると,早期の徐放量は低下したものの経時的な徐放量の低下は少なくなり,7週目以降は無処理群よりも高い徐放性を示した.さらに,このように長時間持続的フッ素徐放性を示すレジンを牛歯エナメル質に充填し,その齲蝕抑制効果を検討した.顕微X線像から,フッ化物を配合していない群は高度に脱灰した層が確認されたのに対し,無処理,シラン処理群ではともにほとんど脱灰層は確認されず,多量のフッ素を徐放する無処理群とシラン処理群の脱灰抑制の程度は同等であった.
胚性幹(ES)細胞からリンパ管内皮細胞への分化調節機構の解明

リンパ管は血管とともに生体内の恒常性の維持、代謝、免疫応答など生理的に重要な役割を担っているだけでなく、悪性腫瘍の転移などの病的状態にも関与していることが示唆されている。しかし、リンパ管の発生・新生を調節する分子機構には未解明な部分が多い。ホメオボックス転写因子Prox1は脈管系においてはリンパ管内皮細胞に特異的に発現し、そのノックアウトマウスにおいて静脈からのリンパ管の発芽が停止することから、リンパ管の発生に必須の転写因子であることが知られている.私は血管内皮細胞がリンパ管内皮細胞へと分化する過程でのProxlの機能を解析するために、ES細胞由来血管細胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)におけるProx1の作用を検討した。HUVEC及びES細胞由来の血管細胞にProx1を発現させることで、血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR)-3の発現亢進が認められ、HUVECではVEGFR-2の発現の減少も認められた。これらの受容体の発現変化に伴ってProx1を発親した血管内皮細胞ではVEGF-A(VEGFR-2に対するリガンド)に対する走化性が低下し、VEGF-C(VEGFR-3に対するリガンド)に対する走化性が上昇した。また、Prox1を発現した血管内皮細胞ではシート形成が阻害され、integrin α9の発現が亢進していた。integrin α9の中和抗体により内皮シート形成阻害および運動性亢進が抑制されたことより、その分子メカニズムのひとつと考えられた。また近年、血小板由来増殖因子(PDGF)シグナルが成熟個体のリンパ管新生を起こしうることが報告されたが、Prox1を発現したHUVECではPDGF受容体(PDGFR)-βの発現が上昇しており、PDGF-BBに対する走化性が亢進した。しかし、このPDGFR-β発現亢進はES由来血管細胞では認められなかった。以上より、Prox1は血管内皮細胞において、VEGFR、PDGFR、integrin α9などの発現を調節することで、内皮細胞の運動性や走化性を調節し、リンパ管発生・新生において重要な役割を果たしていることが示唆された。血液は心臓から動脈へ送り込まれ毛細血管・静脈を経て心臓へ戻る。この血管系とは別個に組織液の排水路を形成するものがリンパ管である。この能力のために、炎症巣から病原体を運んで炎症の波及をきたしたり、癌組織から癌細胞を運んで癌の転移を引き起こしたりもする。上記のようにリンパ管内皮形成機構の解明は医学的に必要性が高いが、リンパ管形成の研究の歴史は比較的新しく、まだ不明な点が多く残されている。そこで本研究において申請者はES細胞からの血管分化系を用いて、血管内皮細胞がリンパ管内皮細胞などへと分化するダイナミクスを司る機構を、分子生物学的・生化学的なレベルでの解明を試みる。本年度は主にProx1に焦点を当てて解析を進めた。近年の発生生物学の知見によりリンパ管が静脈から分化する過程においてまずLYVE-1というリンパ管マーカーが発現し、続いてLYVE-1発現領域の一部に発現するProx1というホメオボックス転写因子がさまざまな遺伝子発現の調節をすることによりリンパ管内皮前駆細胞が分化することが示されている。

血管内皮細胞からリンパ管内皮細胞への分化におけるProx1の役割を検討するために、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)にアデノウィルスによりProx1を発現させて、その効果を分子生物学的、細胞生物学的手法を用いて解析した。リンパ管内皮細胞マーカーであるVEGFR-3とPodoplaninの発現が亢進し、血管内皮細胞マーカーであるVEGFR-2とVE-cadherinの発現が減少した。またProx1によりHUVECsの増殖とVEGF-Cに対する走化性が亢進した。リンパ管の発生においてProx1陽性細胞が静脈から発芽し、VEGF-Cへと遊走する現象が観察される。以上の結果からProx1は遺伝子発現調節を介して細胞の増殖とVEGF-Cへの遊走能を亢進させることによりリンパ管発生を進めることが示唆された。血液は心臓から動脈へ送り込まれ毛細血管・静脈を経て心臓へ戻る。この血管系とは別個に組織液の排水路を形成するものがリンパ管である。この能力のために、炎症巣から病原体を運んで炎症の波及をきたしたり、癌組織から癌細胞を運んで癌の転移を引き起こしたりもする。上記のようにリンパ管内皮形成機構の解明は医学的に必要性が高いが、リンパ管形成の研究の歴史は比較的新しく、まだ不明な点が多く残されている。そこで本研究において申請者はES細胞からの血管分化系を用いて、血管内皮細胞がリンパ管内皮細胞などへと分化するダイナミクスを司る機構を、分子生物学的・生化学的なレベルでの解明を試みる。本年度は昨年度に引き続き主にProx1に焦点を当てて解析を進めた。近年の発生生物学の知見によりリンパ管が静脈から分化する過程においてまずLYVE-1というリンパ管マーカーが発現し、続いてLYVE-1発現領域の一部に発現するProx1というホメオボックス転写因子がさまざまな遺伝子発現の調節をすることによりリンパ管内皮前駆細胞が分化することが示されている。血管内皮細胞からリンパ管内皮細胞への分化におけるProx1の役割を検討するために、マウス胚性幹(ES)細胞由来の血管内皮細胞にtetracycline依存的にProx1を発現させて、その効果を分子生物学的、細胞生物学的手法を用いて解析した。Prox1の発現によりリンパ管内皮細胞マーカーであるVEGFR-3とPodoplaninの発現が亢進し、血管内皮細胞マーカーであるVEGFR-2とVE-cadherinの発現が減少した。またProx1により血管内皮細胞の運動性とVEGF-Cに対する走化性が亢進した。以上の結果からProx1は遺伝子発現調節を介して細胞の運動性とVEGF-Cへの遊走能を亢進させるこどによりリンパ管発生を進めることが示唆された。
ストレス反応伝達系としての脳内ノルアドレナリン神経路の意義に関する研究

ストレスから生体を防御し恒常性を保つためには、視床下部-下垂体-副腎(HPA)系が不可欠である。その中心的役割を担っているのはCRHニューロンである。最近ラットPVNにおいてノルアドレナリン(NA)がCRHmRNA発現を強力に刺激することが明らかとされ、脳内NA系によるHPA系調節機構が注目されている。CRHニューロンにはバゾプレッシン(AVP)が共存し、CRHとともにHPA系調節に与っている。しかしながら、NA系がCRHおよびAVP遺伝子転写に及ぼす影響はこれまで明らかでなかった。我々は無麻酔ラットPVN内にNAを注入後、CRHおよびAVPの一次転写産物をin situハイブリッド形成により半定量した。NAはCRH転写を速やかに刺激することが明らかとなった(Itoi K et al.,J.Neurosci 1999)。その立ち上がりは極めて迅速であり、新たな転写因子の合成を伴わないプロセス(例えば転写因子のリン酸化による活性化など)が想定された。現在検討中である。AVP転写に関しては、大細胞領域、小細胞領域の両者者について、それぞれ定量を行ったが、いずれの領域においてもNAによる有意の刺激効果が認められなかった。血中糖質コルチコイドの両遺伝子に及ぼす影響が異なることにより、NAの異なった効果が認められた可能性があり、現在検討中である。また、従来の成果をまとめて総説(井樋、化学と生物1999)を著した。現在検討中である。現在検討中である。ストレスから生体を防御し恒常性を保つためには、視床下部-下垂体-副腎(HPA)系が不可欠であり、その中心的役割を担っているのはCRHニューロンである。我々は無麻酔ラットPVN内に神経伝達物質ノルアドレナリン(NA)を注入後、CRHおよびAVPの一次転写産物をin situハイブリッド形成により半定量した。NAはCRH転写を速やかに刺激することが明らかとなった。AVP転写に関しては、大細胞、小細胞いずれの領域においてもNAによる有意の刺激効果が認められなかった。大量のデキサメサゾン前投与により、ラット遊泳ストレスによるCRH遺伝子転写が抑制された。

両側副腎摘出ラットに低用量コルチコステロンを補充し、PVN内NA注入後、CRHおよびAVP遺伝子転写レベルをsham群と比較した結果、生理量のコルチコステロンはCRH遺伝子よりもAVP遺伝子転写を強く抑制することが明らかとなった。従って、糖質コルチコイドの用量によってCRH遺伝子転写に及ぼす影響が大きく異なることが明らかとなった。また、CRH産生ヒト神経芽腫BE(2)-M17細胞系において、TPAによりCRH mRNA発現が増加したことから、CRH遺伝子発現におけるCカイネース系の関与が示唆された。
日本語母語話者の英語学習のための韻律評価および文法誤り検出の高度化

コンピュータによる英語学習(CALL)システムにおいて「話す」練習を可能にするために,学習者の英語発話のイントネーション・リズムを自動評価する方法,および学習者発話に含まれる文法誤りを自動的に指摘する方法を開発した。イントネーション・リズム評価においては,決定木により単語の重要度を推定する手法を開発し,ネイティブ評定者間の評定値相関に近い相関を持つスコアが計算できた。文法誤り検出では,自動生成文からn-gramを学習する手法を開発し,単語正解精度89.2%が得られた。今年度は,合成音声を用いた日本人英語音声のイントネーション評価を中心に研究を行った.まず,イントネーション評価のための教師音声として合成音声を用いることの有効性を検証した.英語母語話者音声を教師音声とした場合と,合成音声を教師音声とした場合について,システムによる評定がどの程度人間による評定と整合するかを相関関数により評価した.その結果,ユークリッド距離を用いた評定値計算を用いた場合には,合成音による評定の信頼性は母語話者音声を用いる場合に比べて信頼性が低下した.しかし,距離尺度としてマハラノビス距離を用い,また評価の重要度によって距離を重みづけすることにより,合成音声を用いた評定でも母語話者音声と同等の信頼性が得られることがわかった.次に,評定値の計算方法について検討した.従来法では,学習者の音声のイントネーションパタンと最も近い教師音声のイントネーションパタンに対する距離のみによって評定値を計算していた.これに対し,提案法では,学習者と全ての教師音声との距離を用い,これらの距離の線形結合によって評定値を計算する.線形結合の重みの最適化には重回帰分析を用いた.実験の結果,合成音を教師音声とした場合,人間による評定との相関は0.203から0.288に増加した.さらに,イントネーション評定システムに対し,イントネーションのための特徴量だけでなく,リズム評価のための特徴量を導入することを検討した.その結果,人間による評定との相関は0.36まで上昇した.今年度は、日本人英語イントネーション評価の高精度化と、文法誤り検出に関する基礎検討を行った。日本人英語イントネーション評価を行うためには、学習者による英語文の発話と、複数の英語母語話者(教師話者)による同じ文の発話のイントネーションを比較する必要がある。この際に、イントネーションを直接表す特徴量と、文のリズムを表す特徴量をそれぞれ計算するが、従来はひとつの学習者発話についてそれらのスコアを独立に計算してから重み付きで足し合わせることで最終的なスコアを計算していた。これに対し本研究では、2つのスコアを教師話者ごとに最適に組み合わせ、さらにそれを重回帰分析によって統合するという方法を開発した。提案法により、人間による評定平均値とシステムの評価値の相関は最大0.54となった。英語母語話者による評定値の評定者間相関が最大0.55であることを考えると、提案法によって英語母語話者による評価と同等のイントネーション評価が実現できたと言える。次に、日本人が話した英文に含まれる文法誤りを自動検出する手法の改良について検討した。この方法は、以前我々が開発した方法と同じく、文法誤りルールによる誤り文生成と、生成した誤り文からのn-gram学習に基づく認識方法である。以前の研究では、一つの単語に対して文脈に関係なく誤りルールを適用していた。これに対して、我々は単語の置かれた文脈まで考慮した誤りルールを作成し、実際に適用した。また、以前の研究ではきちんと取り扱われていなかった短縮形(I'm等)をルールに組み込み、短縮形と非短縮形どちらも同様に生成できるようルールを構成した。誤りルールを改良した結果、単語認識率は88.3%から89.2%に改善した。本年度は,日本人による英語発話からの文法誤り検出の高精度化について検討した.まず,日本人英語音声の認識を高精度化するため,発話者レベル別の音響モデル学習について検討した.音響モデル学習に用いる学習用音声(ERJデータベース中の95名分,約21万単語)を発話者の英語レベル別に均等に3つに分け,それぞれについてモノフォン音響モデルを学習する.HMMの混合数を512混合まで増加させたところ,少い混合数では分割学習の効果が高かったが,256混合以上では分割せずに学習した場合と同等以下の性能であった.これは,パラメータ数に対する学習データ数が少ないためであると考えられた.そこで,学習データの減少を補うため,MLLR話者適応を繰り返し適用する.この方法により,混合数が多い場合でも分割学習の効果により認識性能を改善することができた.さらに,誤り指摘の精度を向上させるための基礎的な方法として,学習者の発話が想定される正解文と一致するのかどうかを識別する方法を開発した.

従来は学習者発話を一旦認識し,その内容と正解文を比較して誤りを指摘していたが,提案法ではまず発話が誤りを含むのかどうかをいったん識別し,誤りがあると識別された場合のみ音声認識を行って誤りの指摘を行う.識別には,音声認識の尤度と正解文の強制アラインメントによる尤度の差を利用する.提案法により,単語正解精度は1.0ポイント上昇し,また誤り指摘の性能を示すF値は0.032(パーセント表示で3.2ポイント)改善した.
インターロイキン18とオステオポンチンの相互作用と腎線維化に関する役割解明

炎症性サイトカインの1つであるIL-18の腎障害における役割を検討した。野生型マウスに対して、片腎摘出、塩分負荷、アルドステロン投与を行ったところ、尿細管にIL-18が誘導され、糸球体の腫大、メサンギウム基質の増加、間質の線維化が認められたのに対して、IL-18欠損マウスでは、これらの変化が抑制されていた。腎臓の線維化を誘導するオステオポンチンは、野生型マウスでは尿細管で著明に誘導されていたが、IL-18欠損マウスでは抑制されていた。これらの結果からアルドステロンは、IL-18誘導し、オステオポンチン介して腎線維化、腎障害を惹起することが考えられた。慢性腎臓病(CKD)において腎臓の線維化を抑制できれば、末期腎不全への移行を回避することが可能と考えられる。これまでに申請者らは、腎線維化においてオステオポンチン(OPN)が重要な役割を演じていることを明らかにしてきた。また、最近インターロイキン18(IL-18)がアルドステロンによって誘導され、組織の線維化に関与すること、さらにIL-18がOPNを誘導することが報告された。IL-18の作用は、OPNの作用と類似する点が多く、IL-18の作用の多くが、OPN介している可能性が考えられる。そこでIL-18の腎線維化における役割およびオステオポンチンとの関連を明らかにするため、IL-18欠損マウスおよび野生型マウスを用いて、アルドステロン誘発高血圧モデルを作成した。アルドステロン投与4週後の腎臓を摘出し、以下の結果を得た。アルドステロン負荷によって、腎臓の重量は約1.3倍に増加した。野生型の血漿IL-18濃度はアルドステロン負荷で上昇しなかったが、腎尿細管におけるIL-18発現は有意に増加していた。また、アルドステロン負荷で、野生型では著明に腎線維化が誘導されたが、IL-18欠損マウスではこの線維化は抑制されていた。線維化関連因子のうち、腎内TypeIおよびTypeIIIコラーゲンの発現がアルドステロンで誘導されたが、IL-18欠損マウスでは上昇は軽度であった。また、腎尿細管オステオポンチン発現も野生型ではアルドステロン負荷で上昇していたが、IL-18欠損マウスではこの上昇は認められなかった。以上の結果から、IL-18は、オステオポンチンを介して腎線維化に重要な役割を演じていることが明らかとなった。慢性腎臓病(CKD)において腎臓の線維化を抑制できれば、末期腎不全への移行を回避することも可能である。腎線維化においてオステオポンチン(OPN)が重要な役割を演じているが、最近インターロイキン18(IL-18)がアルドステロンによって誘導され、組織の線維化に関与することが報告された。IL-18の作用はOPNの作用と類似する点が多く、IL-18の作用はOPN介している可能性が考えられる。本研究では、IL-18欠損(KO)マウスを使用して、この二つのサイトカインの相互作用・役割を解明し、これらの制御が腎線維化抑制につながるかを検討した。腎線維化モデルとしてアルドステロン負荷+片腎摘出+食塩負荷(AD)を作成した。AD負荷4週後の腎組織では、野生型マウス(WT)では間質の腎線維化とともに尿細管にIL-18,の発現増加が認められた。しかし血漿中のIL-18の上昇は認められなかった。IL-18KOマウスではADによる間質の線維化は著明に抑制されていた。腎線維化に関連する遺伝子発現の検討で偉、WTにおいてAD負荷はType Iおよびブイブロネクチンの発現を著明に増加させたが、KOではコントロール群と同等の発現量でその増加は抑制されていた。腎でのOPN遺伝子および蛋白発現はADにより著明に誘導されていたものの、KOではその発現増加は認められなかった。また、腎尿細管細胞(NRK-52E)を用いたin vitroの検討では、アルドステロン負荷によって、12時間後より有意にIL-18の遺伝子発現が増加し、用量依存性も認められた。これらのことから、アルドステマンによって誘導される腎臓の線維化は、IL-18を介して行われ、その下流にはOPN炉存在するこどが示された。、また、IL-18の発現を抑制することは、腎線維化の抑制につながることが明らかとなった。これまでの研究で我々は、アルドステロン誘発高血圧や糖尿病性腎症における腎線維化にオステオポンチン(OPN)が重要な役割を演ずることを報告してきた。またこれまでの他施設で報告されたInterleukin (IL)-18の作用はOPNのそれと極めて類似していた。

このことから、我々は、IL-18の作用の一部はOPNの作用を介している可能性を考えた。そこで本研究では、IL-18欠損(KO)マウスを用いて、IL-18の腎症における役割、IL-18とOPNの相互作用を検討した。IL-18KOおよび野生型(WT)マウスに対して、片腎摘出を行い、1%食塩負荷、腹腔より0.15μg/hourのアルドステロン(ALD)の投与を4週間行った。その結果、血清クレアチニンおよび尿中アルブミン量にWT群とIL-18KO群で差を認めなかったが、血圧に関しては、ALD処置によってWT群で上昇したが、KO群では有意な上昇を認めなかった。ALD投与によって、WTおよびIL-18KOマウスともに糸球体の腫大、メサンギウム基質の拡大が認められたが、ALDによる腎線維化はWTに比較して、IL-18KOでは著明に抑制されていた。ALD投与によってWTマウスでは尿細管にIL-18の発現が著明に誘導された。一方、ALD投与によって、WTマウスでは尿細管にOPNの発現が誘導されたのに対して、IL-18KOマウスではOPNの発現誘導は認められなかった。in vitroの研究で、腎尿細管細胞であるNRK-52EにALDを添加することによって、IL-18の遺伝子は時間および用量依存性に増加した。また、ALD拮抗薬であるスピロノラクトンの投与でIL-18の増加は完全に抑制された。これらの結果からALDは、腎尿細管細胞に作用しIL-18誘導し、オステオポンチン介して腎線維化、腎障害を惹起することが考えられた。本研究によって、腎線維化におけるIL-18の役割を明らかにし、IL-18を抑制することでアルドステロンによって誘導される腎線維化も抑制できることが判明した。このことで、腎線維化が関与する慢性腎臓病対策として、IL-18が治療対象分子であることを明らかにすることができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究で、アルドステロン負荷+塩分負荷で誘導される血圧上昇は抑制されていた。これまでにもIL-6などのサイトカインのKOによって、高血圧モデル動物の作成を行っても血圧上昇が抑制されることが報告され、炎症の抑制が血圧上昇を抑制することが報告されている。IL18にも同様な作用があるものと推測されるが、その作用機序は木明である。今後この作用機序に関して検討していく予定である。また、IL-18とOPNの関連では、Invivo.においてIL-18の抑制はOPN発現を抑制した。しかしInVitroの検討では、IL-18の発現を抑制してもOPNの発現は抑制されなったことから、この二つの分子は直接的ではなく、様々な分子を介して認められる可能性が示唆された。
軌道自由度を有する有機強相関系の圧力下電子状態

本研究では、金属元素Mのd軌道とtmdt分子のπ軌道から成る、多軌道有機強相関系[M(tmdt)_2]の電子状態の統一的な理解と新しい電子相の発見を目指した。昨年度のNMR実験の結果、π軌道系のM=Ni, Pt塩においてM(tmdt)2分子特有の運動の存在が示唆された。またπ-d縮退系のM=Cu塩では、圧力下で磁気転移の急激な消失とともに圧力誘起の分子運動を示唆する結果を得た。この系では分子運動が電子の自由度と絡んで物性に寄与している可能性を指摘した。本年度は、まず反強磁性転移するM=Au, Cu塩の^<13>C-NMRスペクトル測定を磁場掃引下で行い、また分子運動とπ-d混成の関係を調べるため、M=Pd, Zn塩の^1H-NMR測定を行った。M=Pd, Zn塩はMの電子配置がそれぞれd^8、d^<10>で、対応するπ軌道、dpσ軌道のレベルは前者ではM=Ni, Pt塩と同じくπ軌道、後者ではdpσ軌道がそれぞれ下になっている。分子構造はM周りの配位子場の影響で前者は平面、後者は84°捻じれた構造をしている。NMR緩和率はM=Pd塩はM=Ni, Pt塩と同様の振舞いを示したが、M=Zn塩は絶対値、温度依存性とも大きく異なったため、[M(tmdt)_2]系の分子運動は分子構造、π-d混成の違いに依存すると考えられる。さらにM=Pd塩ではT_N50Kで反強磁性転移を観測した。この有機導体として非常に高いT_Nは、M=Au塩(T_N=110K)と共にこの系で他の有機導体と異なる新たな電子状態の実現を示唆している。以上のように[M(tmdt)_2]系のスピン状態および分子運動の違いはπ-d軌道混成に関係していること指摘した。本研究課題は平成26年度が最終年度のため、記入しない。本研究では、金属元素Mのd軌道とtmdt分子のπ軌道から成る、多軌道有機強相関系[M (tmdt)_2]を用いて、電子相関と軌道混成の2つのパラメータ制御による新しい電子相・現象の発見を目指している。まず、π軌道系であるM=Ni, Pt塩の^<13>CNMR測定を行い、常磁性金属的な振舞いを観測した。また圧力下測定も行い、加圧による緩和率の減少、すなわちバンド幅の増大を明らかにした。さらにMHz以下の遅い揺らぎを示唆するNMR緩和率の周波数依存性がtmdt配位子の末端にある^1H核と中心に位置する^<13>C核の両方で観測された。これは他の有機導体において観測されているような分子末端のエチレン基やメチル基の運動では説明できず、M (tmdt)_2分子特有の運動の存在を示唆しており、その運動として金属M回りのtmdt配位子の回転運動を提案した。また、π-d縮退系の[Cu (tmdt)_2]における圧力下^1H_NMR測定を行った。4kbar程度の圧力印加により常圧の反強磁性転移が急激に消失し、緩和率の絶対値、温度依存性は室温以下の全温度域で変化した。この圧力変化は、同じくπ-d縮退系の[Au (tmdt)_2]と同様であり、両塩における電子状態の変化が示唆される。その起源としてバンド幅増大によるd軌道のモット転移やπ-d混成の変化による価数転移を提案した。さらに両物質の緩和率が磁気転移の消失と同時に変化したことに対し、電子状態の変化に伴ってd軌道の価数の揺らぎが誘起され、その結果、上述のtmdtの回転運動が圧力下で増強されるというモデルを提案した。以上のように、[M (tmdt)_2]系の電子状態についてπ-d軌道縮退、バンド幅(電子相関、軌道混成)の観点から理解を深め、さらにM (tmdt)_2分子の特異な運動の存在とそのd軌道の価数の揺らぎとの相関を指摘した。

NMR緩和率はM=Pd塩はM=Ni, Pt塩と同様の振舞いを示したが、M=Zn塩は絶対値、温度依存性とも大きく異なったため、[M(tmdt)_2]系の分子運動は分子構造、π-d混成の違いに依存すると考えられる。さらにM=Pd塩ではT_N50Kで反強磁性転移を観測した。この有機導体として非常に高いT_Nは、M=Au塩(T_N=110K)と共にこの系で他の有機導体と異なる新たな電子状態の実現を示唆している。以上のように[M(tmdt)_2]系のスピン状態および分子運動の違いはπ-d軌道混成に関係していること指摘した。本研究課題は平成26年度が最終年度のため、記入しない。[M(tmdt)_2系の電子状態について^1HNMRと^<13>CNMRを駆使することで、各電子相を特徴づけることに成功し、π電子とd電子の役割を実験的に初めて明らかにした。さらに本研究の過程で、[M(tmdt)_2]系が特異な分子運動を有することを見出し、周波数や圧力を系統的に変化させたNMR実験により、電子間相関と軌道自由度に加えて分子の内部運動自由度が強く関与することにより様々な物性が発現していることを明らかにした。これは電子と有機物質特有の分子内部自由度との相互作用を用いた創発現象の開拓に向けて新たな切り口を与えたと言える。これまでの研究でπ-d縮退系M=Au, Cu塩において、電子状態および分子運動の大きな圧力変化が明らかとなった。これらの軌道状態と物性変化の関係を明らかにするため、^<13>C置換体(粉末試料)を用いた圧力下^<13>CNMR測定を行う。^<13>C核はtmdt分子の中心に位置するため、電子系との相互作用が大きく、電子の軌道状態を知ることができると期待される。微量な粉末試料での測定になるため、圧力媒体のオイル中の^<13>Cに由来する信号強度が大きくなり、解析が困難になるという問題が予想される。この対応策として、有機物質である[M(tmdt)_2]は水に溶けにくいため、純水を圧力媒体に用いることを考えている。また、圧力下での急激な電子状態変化は、結晶構造や分子構造の変化を伴っている可能性があるため、大型放射光施設(spring-8)にて微小単結晶を用いてX線構造解析を行い、低温および圧力下における構造変化を調べることを計画している。さらに構造パラメータの温度因子を解析し、M(tmdt)_2分子に特有な運動の温度・圧力変化を観測することも試みる。以上の結果を総括し、この系の電子状態および分子運動について統一的な理解を目指す。
遺伝的変異マウスを用いたミクログリアのサブタイプの性質の解析

申請者はミクログリアには少なくとも2つのサブタイプが存在することを見いだした。本研究では遺伝的変異によって1つのサブタイプがほとんどないop/opマウスを用いることと、FACSにより2つのサブタイプが分離することを利用して各サブタイプを単離する方法を確立し、その性質を調べた。この2つのサブタイプは両者とも貪食能があり、マクロファージ様の性質をもつ細胞であるが、そのうち一方はMac1陰性であり今までにない新たな性質のものと考えられる。このサブタイプの性質をさらに調べたところ、通常のマクロファージやミクログリアには反応しないER-MP12抗体で染色できることがわかった。またFACSによってソーティングした細胞からRNAを抽出してRT-PCRにより検索したところ、ミクログリアに通常発現しているCD14やMHC class lのmRNAの発現がきわめて低いことがわかった。成熟動物脳にみられるミクログリアはMac1陰性でしかもCD14やMHC抗原を発現していないことより、この新たなミクログリアのサブタイプが正常脳で見られるミクログリアに対応すると考えられる。したがって今後さらにこのサブタイプの性質を明らかにすることによって今までよくわからなかったミクログリアの性質や多様性の解明の糸口になると考えられる。
東アジア市民性の育成のための日韓の社会科授業分析と共通教材開発

東アジアにおいては,人権や平和の問題,環境問題,多文化共生社会の構築など,共同で取り組むべき社会的課題は益々多くなってきている。東アジア諸国全体に存在する様々な課題を解決するには,それらを一つの大きな「市民社会」として捉えたうえで,そこに共通する“市民性"の育成こそが,教育における重要な一手段と考えられる。そこで本研究では,東アジア市民性の育成に焦点を当て,日韓両国において共通する社会的課題に関連した中等社会科教育の実践を比較分析し,両国で使用可能な共通教材を開発・提案することを目指す。それによって,両国の隣国理解と相互協力を増進し,東アジアに生きる生徒の認識変容を促すことが期待される。
異常分泌タンパク質のペリプラズム生産に対する大腸菌のストレス応答の解析

これまでの実験ではストレスの原因となる、異種タンパク質のペリプラズムへの分泌生産の誘導は、アルカリ性ホスファターゼのプロモーターを利用して行っていた。これにはリン酸を含む培地から欠乏する培地への培地交換を必要とする。そこでより簡便に融合遺伝子の発現を誘導するため、強力でしかもIPTGによる制御が可能なtacプロモーターの下流に当該融合遺伝子を導入した。tacプロモーターから遺伝子発現を誘導したところこれまでのペリプラズムプロテアーゼDegPを欠損する大腸菌を宿主に用いた場合だけでなくdegP^+株を宿主とし場合にもPreS2のペリプラズムへの蓄積が認められた。この際これまでの3種類のタンパク質に加え48kDaのタンパク質が誘導合成を認めた。分子量およびDegP欠損株では誘導されないことからこの48kDaタンパク質はDegPであると予想された。そこでストレス下の大腸菌からmRNAを調製しノザン解析によりdegPmRNA量を調べたところその転写量は非ストレス下の大腸菌のものと比較し5倍から7倍に上昇していた。Prinston大のSilhavyらは、大腸菌外膜リポタンパク質NlpEの過剰生産によりDegPの発現が誘導されることを示している。そこでこの現象との比較を行うためにnlpEをtacプロモーターの下流にクローン化し、パルスチェイス実験をおこなったところNlpEそのものに加え既に報告のあるDegP(48kDa)とまだ未報告の37Kdaのタンパク質の発現量が顕著に上昇した。私の現象とDegP以外は異なるタンパク質が誘導されてくることから両者は異なる現象であると予想される。以上の経緯のように交付申請書作製時の34kDaタンパク質にかえ48kDaタンパク質の解析を行う結果となった。その結果、異種タンパク質のペリプラズム生産に伴いペリプラズムプロテアーゼDegPが誘導合成されることおよびこの誘導は転写レベルで行われることを明らかにした。
齧歯類精子の室温保存法開発に関する基礎的研究

精子の室温保存法の開発は、バイオリソース事業において革新的な技術である。現在、室温保存実現に最も近い精子保存法はフリーズドライ法であると言える。フリーズドライ法は、液体窒素を必要としない低コストでの保存・簡易輸送が可能な方法である。本研究では、ラットにおけるフリーズドライ法の開発を目的とした基礎的研究を行った。その結果、ラット精子はフリーズドライ後4°Cで1年間の保存後も高い受精能を保持しており、これら精子と受精した卵子から正常な産子を得ることができた。また、精子クロマチンの正常性が室温での長期保存に重要なファクターであることが明らかとなった。本研究では、受精後の胚の体外での発生を観察することで、保存精子の受精能を評価する実験方法を計画している。しかしながら、いくつかの動物種においては体外培養における胚の発生能が低いものがあり、ラットはその動物種の一つとしてあげられる。そこで本年度は、本研究において得られる精子の受精能評価の成績の信頼度をより高いものにするため、ラット胚の体外培養条件について再検討するとともに、開発された培養法を用いてラットフリーズドライ精子の4°Cにおける長期保存後の受精能について検討した。その結果、ラット胚は初期の培養条件がその後の発生に強く影響を及ぼすことが明らかとなった。すなわち、ラット胚は初期に高浸透圧培養液を用いて一定期間培養することにより従来の培養法と比較して有意に高い発生能を示すことが明らかとなった。この培養法を用いて、ラットフリーズドライ精子の4°Cでの保存後の受精能を評価した結果、高率に胚盤胞へ発生することが示された。また、1年間の長期保存後のフリーズドライ精子と受精した卵子においても正常に産子にまで発生することが示された。本年度の研究により、フリーズドライ精子はマウスのみならずラットにおいても4°Cでの長期保存が可能であることが示された。本年度のラット胚の体外培養法の開発とフリーズドライ精子の4°Cでの長期保存の成功を応用し、長期保存に必要なファクターを検出することで精子常温保存法の可能性を見いだしたい。本研究では、実験動物として汎用性の高い齧歯類におけるフリーズドライ法を用いた精子室温保存法の開発に関する基礎的研究を行った。精子の室温保存法の開発は、バイオリソース事業において革新的な技術であり、フリーズドライ法は現在、最も室温保存が可能な方法として挙げられる。マウスにおいては、これまでに多くの研究が行われているが、ラットにおいては研究報告が少ないのが現状である。そこで本年度は、ラット精子のフリーズドライに対する耐性および保存後の受精能についての評価を重点的に行うことで、室温保存開発に必要な基礎的研究を行った。まず、ラット精子をTrisおよびEDTAからなる保存液に懸濁した後フリーズドライを行い、これら精子を4°Cで長期保存した。その結果、4°Cで1年間長期保存した精子においても高い受精能を保持しており、得られた胚は産子にまで発生することが明らかとなった。保存中の精子において経時的にクロマチン解析を行った結果、フリーズドライ直後の精子においてはクロマチンが正常に保たれていたが、保存環境がクロマチンにダメージを与えることが明らかとなり、これにより受精能が低下すると考えられた。本研究期間において、ラットフリーズドライ精子の4°Cでの長期保存が可能であることが示唆された。また、クロマチンの正常性が室温での長期保存に必要なファクターであることが明らかとなった。今後の研究の継続により、齧歯類精子の室温保存法実現に向けたアプローチを展開したい。