hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Chlamydia pneumoniae慢性感染症に関する研究

Chlamydia pneumonia慢性・持続感染の引き起こす病態を明らかとするためには、急性株と慢性株をゲノムタイピングし区別することが必要である。そのため単クローンを精製する目的でプラークの作成を試みた。その結果、世界で初めてC. pneumoniaeのプラーク形成に成功し、クローンを精製することを可能にした。純化した菌株を使用し、C. pneumoniaeに特異的な配列部分を解析したところ各株をグループ化することに成功した。しかし、現時点では正確に鑑別できる部位を特定できておらず、今後は異なったゲノム領域の解析を行っていく予定である。肺炎クラミジア慢性持続感染症の特徴は、持続感染菌大が形熊学的・機能的変化をきたしているため分離培養が困難な点にある。このため慢性持続感染症の診断は遺伝手検出法に依存しているのが現状である。一方、遺伝子診断法は感度・特異度ともに優れた検査法であるが、患者検体を使用した場合、施設間での成績は必ずしも一致していない。これは検体中の阻害物質の作用のみでは説明がつかず、プライマーの種類やアッセイ系の相違に起因するものが大きいと考えられる。しかし、これらの方法を比較検討した基礎検討はこれまでになく、実際の臨床検体を用いた場合いずれのプライマーとアッセイ系が最も優れているか判明していない。我々はまずクラミジア菌体を高純度に精製し、これをin vitroにて比較検討した。その結果、我々の確立したreal-timePCR法が感度、特異度、再現性のいずれも優れていた.さらに臨床検体を用いた場合、我々のreal-time PCR法での検出率が最も優れ、in vitroの比較成績と一致した結果が得られた。遺伝子診断法と共に抗体価測定法の評価も行い、各種検査法の利点、欠点を明らかとした。さらに迅速診断法を開発し、現在、多施設協同臨床検討を行っている。Chlamydia pneumonia急性感染と慢性・持続感染を区別するためには菌株をゲノムタイピングすることが必要である。C.pneumoniaeのうち、現在全ゲノムの塩基配列が公開されている4菌株間で塩基配列が異なる領域を検索し(DNAの10塩基以上長さが異なる領域)、その結果poly Cを含む5060塩基からなる特有の配列を示すC.pneumoniae polymorphic protein(ppp)に注目し解析を行った。この領域の配列をシークエンス法で比較検討した結果、菌株(各国株、日本の地域株、集団発生株など)をグループ化することに成功したが、逆に領域ppp7は再現性が悪いことも判明した。再現性の悪い理由がそれぞれの菌株に複数のクローンが存在する可能性を考え、単クローンを精製する目的でプラークの作成を試みた。HEp-2細胞に菌株を感染後、1.1%寒天を重層し、さらに培養液を重層して至適条件を検討した。特殊条件下の12日間培養後、世界で初めてC.pneumoniaeプラークの形成に成功し、クローンを精製することが可能になった。本邦分離株(J183株)を使用してプラークを作成し、初代3継代したものから、それぞれ3つのプラークを選定しPCRを施行した。増幅産物からDNAを抽出し、大腸菌のプラスミドに組み込み、50コロニーずつ選択し増幅産物のシークエンスを行った。結果、領域ppp7のシトシン数は多様で、増幅のたびに異なる数のクローンが現れ、タイピングには不適切であった。今後は異なったゲノム領域の解析も行い、さらにプラーククローニングによる急性株と持続感染株の比較解析も行っていく予定である。
造影高周波超音波画像による口腔癌微小転移リンパ節の検出およびマッピング法の開発

本研究では造影高周波超音波画像(CE-HFUS)を用いたリンパネットワークにおける微小転移リンパ節(LN)の検出を可能にする画像診断システムの開発を検討した。本研究では、リンパ節腫脹転移モデルマウスを用いてLN転移の形成過程のCE-HFUS、マイクロCT画像、生体発光画像解析法および病理組織像を経時的に解析した。その結果、CE-HFUSは微小転移LNの検出に有効であり、さらに、ICGを封入したリポソームを造影剤として用い、近赤外線カメラで蛍光粒子の流れを捉えることにより、微小転移LNの存在が想定されるリンパネットワークにおいて中継点となるLNの検出に有効であることが示された。口腔癌においてリンパ節転移は患者の生死を規定する大きな要因であるが、現在のCT、MRI、PETおよび超音波診断等の画像診断法を駆使しても、長径10mmに満たないリンパ節の微小転移を検出することは困難である。今後、リンパ節転移に対する新たな低侵襲治療法を開発するためには、リンパ節の微小転移の検出と治療の標的とすべきリンパ節の詳細な位置情報の取得を可能にする新たな画像診断法の開発が必要である。本研究の目的は、ナノ・マイクロバブルと高周波超音波を用いた造影超音波三次元画像とCT画像の組み合わせを可能にするボリュームレジストレーション法を開発し、従来の画像診断法では困難であった微小転移リンパ節の検出と詳細な解剖学的位置情報を画像化しマッピングできる次世代の画像診断システムを開発することである。平成26年度において、我々が樹立したヒトと同等の大きさのリンパ節を有するリンパ節転移モデルマウスMXH10/Mo-lpr/lprの転移病巣の形成過程をタイムゼロからナノ・マイクロバブルを用いた血管およびリンパ管造影高周波超音波三次元画像、マイクロCT三次元画像、生体発光イメージング画像および病理組織像を経時的に取得し、転移病巣の形成パターンを解析した。その結果、リンパ節内で腫瘍細胞が増殖するとある段階までは、リンパ行性に輸出リンパ管からリンパネットワークにおいて下流のリンパ節に腫瘍細胞が流出し、転移病巣を形成するが、リンパ節内での腫瘍細胞の増殖がある段階に達すると、腫瘍細胞はリンパ節内の血管に流入し、血行性に転移病巣が形成される可能性が示唆された。これまで、我々が樹立したヒトと同等の大きさのリンパ節を有するリンパ節転移モデルマウスMXH10/Mo /lprの転移病巣の形成過程をタイムゼロからナノ・マイクロバブルを用いた血管およびリンパ管造影高周波超音波三次元画像、マイクロCT三次元画像、生体発光イメージング画像および病理組織像を経時的に取得し、転移病巣の形成パターンを解析した。平成27年度においては、リンパ節内およびその周囲の微小血管およびリンパ管のマイクロCT画像を取得したリンパ節を病理組織学的に解析し、さらに、マイクロCT画像所見を超音波造影剤を用いた超音波画像解析法を用いて確認することができた。現在のところ、造影マイクロCT画像と造影超音波画像との直接のフュージョン画像の作製には至っていないが、本研究で開発されたボリュームレジストレーション法を用いることにより鮮明な造影超音波画像の取得が可能になり、造影マイクロCTの所見を造影超音波画像で検証することが可能となった。これまでの研究において、我々が樹立したヒトと同等の大きさのリンパ節を有するリンパ節転移モデルマウスの転移病巣の形成過程を生体発光イメージング画像造影高周波超音波三次元画像、マイクロCT画像、および病理組織像を経時的に取得し、転、移病巣の形成パターンを解析した。さらに、リンパ節内およびその周囲の微小血管およびリンパ管のマイクロCT画像を取得したリンパ節を病理組織学的に解析し、さらに、マイクロCT画像所見を超音波造影剤を用いた超音波画像解析法を用いて確認することができた。これまで我々は、ヒトと同等の大きさのリンパ節を有するリンパ節転移モデルマウスMXH10/Mo /lprを樹立し、リンパ節転移病巣の形成過程をタイムゼロからナノ・マイクロバブルを用いた血管およびリンパ管造影高周波超音波三次元画像、マイクロCT三次元画像、生体発光イメージング画像および病理組織像を経時的に取得し解析してきた。その結果、リンパ節転移の初期段階において、腫瘍細胞が転移リンパ節近傍の血管に浸潤し血液循環系に侵入し、遠隔転移を来すリンパ節介在血行性転移という新たな転移機構を見出した。

一方、これまで我々は、所属リンパ節の微小転移リンパ節に対するリンパ行性の癌化学療法を検討してきたが、この治療法は、リンパネットワークの上流に位置するリンパ節に抗癌剤を注入し、下流に存在する微小転移リンパ節の治療を意図したものである。この治療法を実現するためには、個々の微小転移リンパ節を同定するばかりではなく、対象となるリンパ節をリンパネットワークの中継点として捉える必要がある。そこで、平成28年度においては、臨床応用可能な蛍光色素であるICGを封入したリポソームを作製し、近赤外線カメラや蛍光実体顕微鏡で蛍光粒子の流れを捉えることにより、対象とするリンパネットワークにおいて中継点となるリンパ節の同定が可能となるかどうかを検討した。その結果、本法が微小転移リンパ節の存在が想定されるリンパネットワークにおいて中継点となるリンパ節の検出およびマッピング法に有効であることが示された。本研究では造影高周波超音波画像(CE-HFUS)を用いたリンパネットワークにおける微小転移リンパ節(LN)の検出を可能にする画像診断システムの開発を検討した。本研究では、リンパ節腫脹転移モデルマウスを用いてLN転移の形成過程のCE-HFUS、マイクロCT画像、生体発光画像解析法および病理組織像を経時的に解析した。その結果、CE-HFUSは微小転移LNの検出に有効であり、さらに、ICGを封入したリポソームを造影剤として用い、近赤外線カメラで蛍光粒子の流れを捉えることにより、微小転移LNの存在が想定されるリンパネットワークにおいて中継点となるLNの検出に有効であることが示された。これまでの研究において、我々が樹立したヒトと同等の大きさのリンパ節を有するリンパ節転移モデルマウスMXH10/Mo-lpr/lprの転移病巣の形成過程をタイムゼロからナノ・マイクロバブルを用いた血管およびリンパ管造影高周波超音波三次元画像、マイクロCT三次元画像、生体発光イメージング画像および病理組織像を経時的に取得し、転移病巣の形成パターンを解析した。その結果、リンパ節内で腫瘍細胞が増殖するとある段階までは、リンパ行性に輸出リンパ管からリンパネットワークにおいて下流のリンパ節に腫瘍細胞が流出し、転移病巣を形成するが、リンパ節内での腫瘍細胞の増殖がある段階に達すると、腫瘍細胞はリンパ節内の血管に流入し、血行性に転移病巣が形成される可能性が示唆された。我々が樹立したヒトと同等の大きさのリンパ節を有するリンパ節転移モデルマウスを用いて、腫瘍細胞の種類や転移病巣の形成時期の違いについて、リンパ節内の血管およびリンパ管のみならず、その周囲の血管およびリンパ管も含めて、生体発光イメージング画像、血管およびリンパ管造影高周波超音波三次元画像、マイクロCT三次元画像、および病理組織像を取得し解析することにより、転移病巣の形成過程をより早期、且つ精確に捉える手法と転移リンパ節のマッピング法の開発を目指す。28年度が最終年度であるため、記入しない。口腔外科学今後、これまで解明されていない、リンパ節内および周囲の細静脈の癌転移における役割を解明し、リンパ節内外のリンパ管および細静脈を造影高周波超音波で描出し、微小転移を検出する新たな微小転移の診断法を検討する。
造精機能障害診断ツールとしての精漿中ｍｉｃｒｏＲＮＡ発現プロファルの解析

精漿中のマイクロRNAの発現プロファイルから、造精機能障害で特異的に発現が変化するmiRNAを見出し、診断や研究に役立つバイオマーカーとしての可能性を検討した。精漿のmiRNAマイクロアレイによる網羅的解析から候補を絞り込み、造精機能障害で変動している8個のマイクロRNAからなる評価パネルを作成した。精漿におけるこれらマイクロRNAの発現量をリアルタイムPCRにて定量した結果、miR891a-5pは閉塞性無精子症において有意に減少し、miR-1229-3pはmaturation arrest群において有意に増加することを見出した。2.精漿からのtotal RNA抽出法の検討:精漿は蛋白濃度や粘性が高く、通常の方法だけでは純度が非常に低いtotal RNAしか抽出できなかったため、精漿からの最適な抽出法を検討した。その結果、まずはグアニジンチオシアネート溶液(Trizol)を用いて抽出、イソプロパノール沈殿の後、スピンカラム(miRNeasy Plasma kit, Qiagen)にて精製する方法が最も純度の高いRNAを抽出することができた。200uLの精漿から抽出したtotal RNAの収量は407ng1306ngで260/280比は1.37-1.55であった。3. miRNAマイクロアレイ解析:RNAの純度が高かった検体からFE 3例、SCO 2例、MA 2例、OA 1例を解析用検体としてDNAチップ研究所に委託してAgilent SurePrintG3 Human miRNAmicroarray (miRBase21)を用いてアレイ解析を行った。RNA integrity numberは1.7-2.8と非常に低かったがmiRNAの解析には問題がないと考え、各検体スタート量small RNA 10ngにて解析した。クラスタリング解析では各群の階層が明確に分かれる傾向は見られなかったが、主成分分析より第三主成分まで含めると累積寄与率が70%を超えることから、これらの主成分によりデータの発現傾向が説明出来た。FEと比較して発現上昇していたmiRNAの数はSCO:178, MA:94, OA:238、発現が低下していたmiRNAはSCO:27, MA:170, OA:12であった。現在までの経過は、検体の選定、RNA抽出、精製、miRNAマイクロアレイ解析による検体ごとのmiRNAプロファイル作成まで進んでいる。精漿は蛋白濃度や粘性が高く、通常の方法だけでは純度が非常に低いtotal RNAしか抽出できなかったため、より良い抽出、精製方法の検討に予想以上の時間がかかってしまった。予定ではマーカー候補miRNAによる評価パネルを作製するところまでが本年度の実施計画であったが、十分に検討できていないため、次年度はそこから検討を続ける。精巣生検組織の病理学的分類からsertoli cell only (SCO, Johnsen score: 2.0)2検体, maturationarrest (MA, Johnsenscore 4-6)2検体, obstructive azoospermia (OA, Johnsen score: 8以上)1検体、ならびに正常検体として妊孕能を有する男性(Fertile men, FE)3検体の精漿を用いてマイクロアレイ解析を行った。各症例群で発現が有意に変動しているmiRNAを抽出したところ、FEと比較して発現が上昇していたmiRNAの数はSCO:178, MA:94, OA:238、発現が低下していたmiRNAはSCO:27, MA:170, OA:12であった。この中から、コントロールであるFE3検体の上限値と比較して2検体とも発現が2倍以上亢進しているmiRNAに絞り込んだところ、SCO,MAともに亢進:7、SCOのみで亢進:17、MAのみで亢進:1であった。同様にFE3検体の下限より2倍以上発現が低下しているmiRNAは、SCO,MAともに低下:1、SCOのみで低下:1、MAのみで低下:4であった。この解析結果をもとに、発現亢進25、発現低下6からなる造精機能障害の評価パネルを作成し、quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR)にてこれらのmiRNAの定量を試みた。しかし、精漿からのRNA抽出が純度・収量ともに安定して行えなかったため、まずは前処理についての検討を行った。フィルター濾過と濃縮により最適な前処理法を確立し、その後qRT-PCRにてmiRNAの定量に着手したが、多数例の解析には至らなかった。現在までの経過は、検体の選定、RNA抽出、精製、miRNAマイクロアレイ解析による検体ごとのmiRNAプロファイル作成、造精機能障害の評価パネルの作成まで進んでいる。本年度は、まずは精漿からtotal RNAを抽出し、候補miRNAについてqRT-PCRにて定量を試みた。しかし、従来の方法を用いた抽出では、精製RNAの純度・収量が低く、qRT-PCRで安定した結果が得られなかった。そこでWangら(Biotechnol Appl Biochem. 61:342-8, 2014)の精漿中のmiRNAは30-90kDaの蛋白と結合しているという報告に基づく前処置を試みた。すなわち精漿を0.1μmのマイクロフィルターにて濾過し、30kDaカットオフのウルトラフィルターにて濃縮後、TRIzol LSを用いた定法にてmiRNAの抽出を行った。この方法により安定してmiRNA抽出を行うことが可能となり、候補miRNAについてqRT-PCRを用いた定量を開始したところである。

造精機能障害の患者と健常者の間で、精漿中のmiRNAの発現プロファイルを比較し、造精機能障害で特異的に発現が変化するmiRNAを見出し、造精機能障害の病因予測や病態把握あるいは精子形成の研究に役立つバイオマーカーとしての可能性を検討するため以下の検討を行った。1)精漿からのtotal RNA抽出法の検討:精漿は蛋白濃度や粘性が高く、通常の方法だけでは純度が非常に低いtotal RNAしか抽出できなかったため、精漿からの最適な抽出法を検討した。その結果、まずはグアニジンチオシアネート溶液を用いて抽出、イソプロパノール沈殿の後、スピンカラムにて精製する方法が最も純度の高いRNAを抽出することができた。3)マイクロアレイ解析結果の検討:各症例群で発現が有意に変動しているmiRNAを抽出したところ、FEと比較して発現が上昇していたmiRNAの数はSCO:178, MA:94, OA:238、発現が低下していたmiRNAはSCO:27, MA:170, OA:12であった。4)造精機能評価パネルの作製と精漿中microRNAの定量解析:FE 3検体に対し、SCO,MAともに発現亢進している6個(miR-200a-5p, 370-3p, 605-5p, 1307-5p, 3170, 3934-5p)、発現低下2個(miR-891a-5p、miR-1229-3p)からなる造精機能障害の評価パネルを作成した。精漿におけるこれらマイクロRNAの発現量をリアルタイムPCRにて定量し、結果を解析中である。精漿中のマイクロRNAの発現プロファイルから、造精機能障害で特異的に発現が変化するmiRNAを見出し、診断や研究に役立つバイオマーカーとしての可能性を検討した。精漿のmiRNAマイクロアレイによる網羅的解析から候補を絞り込み、造精機能障害で変動している8個のマイクロRNAからなる評価パネルを作成した。精漿におけるこれらマイクロRNAの発現量をリアルタイムPCRにて定量した結果、miR891a-5pは閉塞性無精子症において有意に減少し、miR-1229-3pはmaturation arrest群において有意に増加することを見出した。1. miRNA評価パネルの作製:平成27年度の結果よりプロファイルを解析し、症例3群のmiRNA発現をそれぞれ正常対照群のプロファイルと比較し、各症例群で発現が有意に変動しているmiRNAを抽出する。各群を分類するために必要なmiRNAだけを複数個(理想的には20個程度)抽出し、マーカー候補miRNAによる評価パネルを作製する。2.精漿中のmiRNAを指標とした造精機能評価スクリーニングのための検討:様々なタイプの症例を含む多数例の不妊症患者について、精漿中のマーカー候補miRNAをquantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR)で定量する。miRNAの発現量と臨床データとの比較から、造精機能障害の程度や精巣組織・細胞の成熟度、Y染色体の微小欠失の有無などをmiRNAのプロファイルから予測することの可能性を検討する。同様の検討を多様な精液所見を示す正常男性集団についても行なう。3.精巣内
日本人の散発性大腸癌発生におけるMUTYH遺伝子変異の意義の解明と臨床応用

散発性大腸癌のMUTYH変異を解析した。97検体の全エクソン解析で1検体のみで変異が認められた。また、東北大学病院で行っているMSK-IMPACT検査施行患者の解析で、大腸癌患者でMUTYH変異は検出されなかった。日本人の散発性大腸癌におけるMUTYH変異の関与は低いことが示唆され、また変異の種類と病的意義の検討までは至らなかった。塩基除去修復に関わる分子機構に着目し、患者血漿におけるmiRNAについて網羅的解析を行った。健常人と大腸癌患者の比較、大腸癌患者におけるがん薬物療法前後の比較を行ったが、塩基除去修復を含めDNA修復に関する報告のあるmiRNAについて有意なものは検出されなかった。・日本人における散発性大腸癌へのMUTYH遺伝子変異の関与の解明散発性大腸癌患者のコホート(計97例、年齢:中央値61歳(29歳-83歳)、性別:男性66人、女性31人、原発部位:盲腸5例、上行結腸14例、横行結腸8例、下行結腸2例、S状結腸19例、直腸49例、手術時pStage: pStage II 5例、pStage III 30例、pStage IV 62例)の全エクソンシークエンスのデータ解析を行った。97検体のうち1検体にMUTYHのstopgainSNVが認められた。変異を認めた検体は、原発部位はS状結腸で、pstageIVで肝転移を認めた症例であった。MUTYHの変異は生殖細胞系変異ではなく、体細胞変異として検出された。血液検体のMUTYH遺伝子変異解析のために、患者の血液検体を前向きに効率的に収集できるシステムを構築した。経時的に採取を行った患者を含め、22例、42検体を収集した。循環腫瘍DNAの解析のため、効果的なcell free DNA抽出の条件の検討を行った。採血後、2時間以内に1100gで10分間遠心分離を行い、血漿を分離し、凍結、保存する方法とした。腫瘍組織にてKRAS G12D変異が認められている患者において、本方法にて保管した血漿をdigital PCRにて解析し、同変異を検出することができた。また、BRAF V600E変異が認められている患者においても同様にBRAF変異を検出することができ、上記の方法が妥当と判断した。以上のようにcell free DNAのMUTYH変異の検出も念頭に置き、検体収集システムの整備を行った。当初はMUTYHの遺伝子変異を次世代シーケンサーでターゲットシークエンス法で解析する予定であったが、散発性大腸癌腫瘍組織の全エクソンシークエンスのデータ97件が得られたため、それを解析することで、次世代シーケンサーベースでのMUTYHの変異の頻度を得ることができた。MUTYH以外の変異についても解析が可能であり、MUTYH変異検体と変異のない検体との比較も可能である。一方、血液検体については、効率的に検体を収集するシステムを構築するために時間を要し、まだ解析出来てはいないが、一定数の集積はできている。以上を踏まえ、腫瘍組織の解析においては一定の成果が得られ順調だが、血液検体の解析についてはこれからである点から、やや遅れていると評価した。散発性大腸癌患者のコホート計97例の全エクソンシークエンスのデータ解析を行なったところ、腫瘍組織でMUTYH変異が認められたのは1検体のみであった。血液検体におけるMUTYHを解析するため、検体を効率的に収集するシステムを構築し、大腸がん患者49人、のべ128ポイントの検体を収集した。TORAY 3D-GeneR Human miRNA Oligo Chip(搭載プローブ数:2565)を用いて健常人2例、抗EGFR抗体薬の効果が得られた大腸がん患者4例の網羅的な解析をおこなった。大腸がん患者4例については治療前、治療後、治療無効後のポイントで経時的な解析を行なった。塩基除去修復に関する報告のあるmiRNA(miR-16、miR-34c、miR-199a、miR-499)の発現について、健常人と大腸がん患者で有意差は認められなかった。また、大腸がん患者で経時的に有意な変化を認めなかった。他にもミスマッチ修復などDNA修復に関する報告のあるmiRNAについて解析を行なったが、有意なmiRNAは検出されなかった。いずれのmiRNAも治療経過に応じた経時的な変化は示さなかった。また、クリニカルシークエンスでのMUTYH遺伝子変異の検出頻度を調べる目的で、MUTYH遺伝子を含む468遺伝子を解析する次世代シーケンサーを元とした遺伝子パネル検査であるMSK-IMPACT検査を施行した成人13患者(2017年6月の導入から2018年3月までに解析結果が出た全患者)の結果を解析した。大腸がん患者は7人(男性5人、女性2人)でうちS状結腸癌は3人、直腸癌は4人であった。いずれの患者でもMUTYH変異は認められなかった。

塩基除去修復に関わる分子機構に着目し、患者血漿におけるmiRNAについて網羅的解析を行った。健常人と大腸癌患者の比較、大腸癌患者におけるがん薬物療法前後の比較を行ったが、塩基除去修復を含めDNA修復に関する報告のあるmiRNAについて有意なものは検出されなかった。変異症例が少ないので、現時点でMUTYH変異患者を対象とした臨床試験を施行することは困難である。しかし、研究計画書に記載した通り、大腸癌治療におけるバイオマーカーの開発は急務であり、少数例の検討も臨床応用への有効な布石となる。計画通り、MUTYH変異検体における他の遺伝子変異について既存の治療のターゲットとなるような変異があるかの解析を行う。MUTYH変異検体が、MUTYHの変異のない検体と比較し、遺伝子変異数が多いかどうかについても検討を行う。また、血液検体におけるMUTYH変異を調べる。血中の循環腫瘍DNAを解析できるように検体を採取するシステムを構築したので、cell free DNAにおけるMUTYH変異の解析も行う予定である。薬物療法施行患者の血液検体を調べることで、薬物療法の耐性化や、腫瘍の増悪にMUTYH変異が関与しているかどうかを検討する。また、MUTYHに関連するようなncRNAの解析についても検討する。総合生物当初まず腫瘍組織検体について次世代シーケンサーベースでターゲットシーケンスを行う予定であったが、97検体分の全エクソンシークエンスのデータが得られたため、その解析に時間を要した。また、効果的な血液検体の収集システム構築に時間を要し、血液検体の解析をまだ行えていないため、物品費について次年度使用額が生じた。検体の解析に使用する。
凸解析と不動点理論の立場からの非線形問題の究明

本研究では、凸関数や凸集合に適した解析学である凸解析学と非線形写像に対する不動点理論を用いることにより、種々の非線形問題の解の存在性と解の近似法に関する研究を行った。特に、ヒルベルト空間やバナッハ空間などの無限次元線形空間における非線形写像の不動点の存在性と不動点近似列の収束性を中心とした研究成果が得られた。さらに、その成果を凸最小化問題や単調作用素の零点問題などの非線形問題に応用し、それぞれの問題の解の存在性と解の近似法を研究した。また、線形構造を持たない測地的距離空間における凸最小化問題と不動点問題の関係についての重要な成果も得られた。初年度は、凸関数の凸集合上での最小点を求める問題や凸集合族の共通点を求める問題等の非線形問題を、非線形写像の不動点問題の形に定式化する方法について考察した。その際、それらの非線形問題を解く場となる空間の幾何学的構造や位相的構造が、その空間に作用する非線形写像に与える影響に着目し、凸解析や関数解析における手法を用いて研究を進めた。以下では、今年度に発表したそれぞれの論文の概要説明を行う。1.ヒルベルト空間(完備な内積空間)において、非線形写像列の共通不動点を近似する問題とその応用について研究した。応用として、凸関数の最小化問題や凸集合族の共通点問題の解の近似定理を得た。本研究により、それぞれに性質の異なる二つの非線形問題が、同じ共通不動点問題の枠組みで解決できることが分かった。2.ヒルベルト空間の一般化であるバナッハ空間(完備なノルム空間)において、極大単調性を持つ集合値写像の零点を求める問題を、研究代表者ら[Archiv der Mathematik 91 (2008), 166-177]が導入したnonspreading写像を用いて研究した。ここでは、不動点近似列の漸近挙動と不動点の存在性についての必要十分条件が得られた。3.ハイブリッド写像の不動点問題に関する解説を行った。研究代表者ら[Journal of Nonlinear and Convex Analysis 11 (2010), 335-343]が導入したハイブリッド写像は、ヒルベルト空間における非線形問題を議論する上で有用である。内積空間で非線形問題を研究することで、一般的な空間での研究の道筋が見えて来た。4.集合値写像の零点問題と不動点問題の関係についての解説を行った。ここでは、集合値写像の単調性と増大性という二つの性質と非線形写像の関係について考察した。今年度は、非線形問題を解く上で大切な役割を果たす非線形写像の不動点を反復列を用いて近似する方法について研究し、バナッハ空間の幾何学的定数やfirmly nonexpansive type写像の不動点定理などを用いて定まるそれぞれの反復列が非線形写像の不動点に収束することを示した。以下では、今年度に発表したそれぞれの論文の概要を説明する。1.バナッハ空間におけるfirmly nonexpansive like写像の可算族に対する共通不動点問題について研究し、2-一様凸定数を用いた非線形写像列の構成方法を提案した。さらに、この写像列によって定まる反復列が、与えられた写像族の共通不動点に収束することを示した。応用として、極大単調作用素の零点近似定理と凸集合族の共通点近似定理を得た。2.バナッハ空間における有界集合上で定義された極大単調作用素の零点近似法を研究した。ここでは、作用素のリゾルベントがfirmly nonexpansive type写像であることに着目し、不動点定理によって陰的に定まる反復列がノルムが最小となる零点に強収束することを示した。3.ヒルベルト空間におけるquasinonexpansive型の非線形写像列から定まる反復列に対する弱収束定理を得るとともにその応用を議論した。特に、ハイブリッド写像の平均によって定まる写像列に主結果を適用することで幾つかの不動点近似定理を得た。4.ヒルベルト空間の非拡大写像に対するRayの定理[Trans. Amer. Math. Soc. 258 (1980), 531-537]の簡潔な別証明を与えた。ここでは、一様有界性定理と一つの距離射影を用いることにより、ヒルベルト空間の任意の非有界な閉凸集合において、その上で定義された不動点を持たないfirmly nonexpansive写像を構成した。今年度は、非線形写像の共通不動点の存在性および近似法の研究を行うとともに、上に有界な曲率を持つ完備な測地的距離空間における凸最小化問題と不動点問題の相互作用について研究した。以下では、今年度に発表したそれぞれの論文の概要を述べる。1.ヒルベルト空間において、二つの可換なハイブリッド写像の不動点を求める問題について研究を行った。2010年に青山-家本-高阪-高橋によって導入されたハイブリッド写像は非拡大写像の一般化で、閉凸集合の上への最短点射影や極大単調作用素のリゾルベントがその典型例である。この論文では、二つの可換なハイブリッド写像の共通不動点の存在定理を得るとともに、共通不動点への強収束定理と弱収束定理を得た。2.上に有界な曲率を持つ完備な測地的距離空間における凸最小化問題を不動点理論の立場から研究した。このような空間は、ヒルベルト空間の閉凸集合やヒルベルト空間の球面に球面距離を入れた距離空間の一般化である。

1995年のJostや1998年のMayerの研究により、非正な曲率を持つ完備な測地的距離空間における凸関数のリゾルベントが導入され、調和写像や勾配流の研究などへの応用が議論された。今回の論文では、上に有界な曲率を持つ完備な測地的距離空間における凸関数に対し、正接関数と正弦関数の積を用いて定まるリゾルベントを導入し、それがwell definedであることを示した。さらに、そのようにして定まる凸関数のリゾルベントがヒルベルト空間におけるリゾルベントと類似した性質を持つことを示し、不動点の存在性と近似法の研究を行った。3.バナッハ空間におけるfirmly nonexpansive-like写像の不動点近似法に関して最近得られた成果を解説した。この研究により、ヒルベルト空間における極大単調作用素に対する近接点法の収束定理のバナッハ空間への一般化の一つが得られた。前年度までの研究で考察した非線形写像について、非線形問題を研究する上での基本的な空間として知られるヒルベルト空間において、共通不動点の存在定理と共通不動点近似定理が得られるとともに、線形構造を持たない曲がった空間である測地的距離空間における非線形問題と不動点問題の相互作用の研究が進展し、次年度の研究を進める上での基礎が固まったため。今年度は、バナッハ空間における非線形写像に対する不動点問題の研究を行った。さらに、前年度までの不動点理論に関する成果を応用することにより、測地線の構造を持つ距離空間における凸関数の最小化問題について研究した。以下では、今年度に発表したそれぞれの論文の概要を述べる。1.バナッハ空間における微分可能な凸関数に付随して定まるBregman distanceを用いてChatterjea写像の概念を導入し、写像の定義域の凸性を仮定せずに不動点定理と不動点近似定理を得た。この写像概念はヒルベルト空間におけるnonspreading写像の一般化である。主結果の証明において、鈴木[Fixed Point Theory Appl. 2014:47 (2014)]による二重数列に関する補題を用いた。2.アダマール空間(完備CAT(0)空間)における凸最小化問題を研究した。ここで、アダマール空間とは非正の曲率を持つ完備な測地的距離空間のことであり、ヒルベルト空間やヒルベルト球の一般化である。ここでは、凸関数のリゾルベントと凸構造を用いて定義される二つの最小点近似列の漸近挙動に関する結果を得た。3.完備CAT(1)空間における凸最小化問題を研究した。この空間は、アダマール空間やヒルベルト球面の一般化である。ここでは、木村と高阪[J. Fixed Point Theory Appl. 18 (2016)]が導入した凸関数のリゾルベントを用いることにより、近接点法によって生成された点列の漸近挙動を研究した。これは、Rockafellar [SIAM J. Control Optim. 14 (1976)]やBrezisとLions [Israel Journal of Mathematics 29 (1978)]による研究成果のCAT(1)空間版の結果とみなすことができる。本研究では、凸関数や凸集合に適した解析学である凸解析学と非線形写像に対する不動点理論を用いることにより、種々の非線形問題の解の存在性と解の近似法に関する研究を行った。
脊髄後根神経節ニューロンの興奮性に対するIhブロッカーZD7288の作用

体性感覚を司る脊髄後根神経節(DRG)ニューロンは、その軸索に損傷を受けると、損傷部あるいは細胞体を起源とする自発放電を生じる。この異常放電は、神経損傷による慢性疼痛(neuropathic pain)の原因の一つと考えられている。本研究では、DRGニューロンの自発放電の発生機序について、ペースメーカ電流と考えられている過分極誘発内向き電流(Ih)に着目した。実験には独自に開発した「ラットのDRG坐骨神経付着標本」を用い、DRGニューロンからWhole cell patch clamp記録を行った。初年度(11年度)は、DRGニューロンのIhについて以下の知見を得た。1.Ihは、ほとんどのDRGニューロンに認められ、その電流密度は、Aα/β-typeのDRGニューロンで高く、Aδ-及びC-typeのDRGニューロンでは低い傾向にあった。2.ゼネカ社で開発されたIhブロッカーZD7288は、DRGニューロンのIhを選択的に強く抑制した。3.ZD7288によるIhの抑制は、DRGニューロンの興奮性を低下させた。この結果を踏まえて、平成12年度は、神経損傷モデルラットに発現する自発放電に対し、ZD7288によるIh抑制が及ぼす作用を解析した。そして、ZD7288は、少なくともAα/β-typeのDRGニューロンで発生する自発放電の発火頻度を低下させる結果を得た。末梢神経損傷後、脊髄後根神経節(DRG)ニューロンの細胞体を起源として発生する自発放電は、神経損傷による慢性疼痛(neuropathic pain)の原因の一つと考えられている。本研究では、このDRGニューロンの自発放電の発生機序について、ペースメーカ電流と考えられている過分極誘発内向き電流(I_h)に着目し、イオンチャンネル機構のレベルで検討を進めている。実験には独自に開発した「ラットのDRG坐骨神経付着標本」を用い、DRGニューロンからWhole cell patch clamp記録を行っている。今年度は、DRGニューロンのI_hについて以下の知見を得た。1.I_hは、C-typeのDRGニューロンの一部を除き、ほとんどのDRGニューロンに認められた。I_hの電流密度は、Aα/β-typeのDRGニューロンで高く、Aδ-及びC-typeのDRGニューロンでは低い傾向にあった。2.ゼネカ社で開発されたI_hブロッカーZD7288は、DRGニューロンI_hを選択的に強く抑制した。3.ZD7288によるI_hの抑制は、DRGニューロンの静止膜電位を過分極させ、さらに、脱分極性パルスにより誘発されるスパイク放電の発火頻度を減少させた。これらの結果から、I_hはDRGニューロンの興奮性を高める作用があり、神経損傷後、自発放電が発生した場合には、そのスパイク放電を促進する働きがあるものと想定される(平成11年度日本神経科学会[大阪]、1999年国際疼痛学会[ウィーン]にて発表)。今後は、神経損傷モデルラットに発現する自発放電に対し、ZD7288によるI_h抑制が及ぼす作用を解析し、I_hと自発放電、さらにはneuropathic painとの関連を検討する。
ニホンタンポポとセイヨウタンポポの雑種の進化：戻し交配による局所適応仮説の検証

私はこれまで、種子を無性的につける外来種セイヨウタンポポが、有性生殖を行うニホンタンポポと花粉を通して繰り返し交配し、ニホンタンポポの持つ耐病性遺伝子(R-gene)を受け取る事で日本の環境に適応進化している、という仮説を検証する事を目的に研究を行ってきた。平成25年度はまず、雑種が野外でニホンタンポポと繰り返しの交配を行っているという結果を論文にまとめ、Plant Systematcs and Evolution誌に投稿、受理された。耐病性遺伝子の実験では、ニホンタンポポ、雑種、セイヨウタンポポ、レタスについて縮重PCR,クローニングを行い、合計732個のR-geneを得た。その結果、タンポポはレタスの20のRGCサブファミリーのうち14個を共有していたが、各サブファミリー内では、レタスとタンポポは大きく異なり、タンポポ属特有の多様なR-geneが見られた。この結果は菌叢比較で用いられるUniFracによるID Clusteringによっても支持された。これらのR-geneは、タンポポ属に特異的な病原体との共進化の結果生じたと考えられる。また、セイヨウタンポポとニホンタンポポとが高いブートストラップ値で異なるクラスター4つのうち3つは、雑種はセイヨウタンポポと配列を共有しており、更に、雑種特有の配列が11個見られた。これらの結果は、当初の予測に反し、雑種がニホンタンポポの配列をあまり共有していない事を示している。これは、病原体側がニホンタンポポのcommon genotypeに適応している状態を考えると説明出来る。その場合、雑種は同所的な在来種の一般的な遺伝子型を共有しない方が有利だろう。雑種は、雑種化によって受け取った在来種の稀なアリルを保持する事で病原体の感染を逃れているかもしれない。(抄録なし)24年度は、次世代シーケンサーを使用したニホンタンポポ発現遺伝子のデータ解析と、既に知られているdegenerate primerによるPCR,クローニングによって、タンポポの病原体抵抗性遺伝子(R-gene)の探索を行った。まず、次世代シーケンサーによって3集団、計9個体のニホンタンポポの葉の発現遺伝子の配列決定を行い39,904個のcontig配列が得られた。それらのcontigについて、シロイヌナズナ、レタス(タンポポ亜科でR-geneの研究が進んでいる)との相同性検索を行い、107個の候補R-geneを探索した(blastn,tblastxの合計;1×e^<-20>threshold)。これらの配列からNBS領域内に15ペアのプライマーを設計した。また、レタスではR-gene(NBSドメイン)を増幅するプライマーが知られている。そのため、既知のプライマーを使用したPCR産物のクローニングによっても、ニホンタンポポ、セイヨウタンポポのR-geneの探索を行った。3つのプライマーのクローニングを試みたが、タンポポで目的の領域が増幅されたのは1つのプライマーのみだった。目的の領域が増幅されたプライマーでは、コントロールであるレタスでは41配列、ニホンタンポポでは36配列、セイヨウタンポポでは49配列がR-geneと高い相同性を示した。既知のレタスR-geneと、ニホンタンポポの発現遺伝子解析から得られた配列、PCR法によって得られたニホンタンポポ、セイヨウタンポポ、レタスの配列、の計163個の配列についてマルチプルアライメントを行い、629bpについて系統樹を作成した。その結果、contig配列、PCRによる配列ともに、タンポポではRGC4ファミリーの遺伝子が多く得られた。また、レタスの各RGCファミリーにタンポポの配列が含まれていた。そのため各ファミリーはタンポポとレタスが分岐する前から存在したと考えられる。しかし、各ファミリー内のサブファミリーについて見ると、ほとんどがタンポポとレタスで異なるクレードを形成しており、更にニホンタンポポ、セイヨウタンポポ間でも異なるクレードを形成した配列が複数見られた。今後、同様のクローニングを日本3集団のニホンタンポポ、セイヨウタンポポ、雑種について行い、ニホンタンポポが局所的に持っている配列を雑種が取り込んでいるかを明らかにする。

これらの結果は、当初の予測に反し、雑種がニホンタンポポの配列をあまり共有していない事を示している。これは、病原体側がニホンタンポポのcommon genotypeに適応している状態を考えると説明出来る。その場合、雑種は同所的な在来種の一般的な遺伝子型を共有しない方が有利だろう。雑種は、雑種化によって受け取った在来種の稀なアリルを保持する事で病原体の感染を逃れているかもしれない。タンポポの病原体抵抗性遺伝子を探索するという目的での実験は順調に進展し、2年次に行う事を計画していたプライマーの設計、クローニングまで行う事が出来た。しかし、論文発表について、タンポポの野外での雑種形成頻度についての研究を原稿をまとめ投稿したが、24年度中に論文として発表する事が出来なかった。タンポポの野外での雑種形成頻度については、25年度春に追加データを取り、夏までに論文を再投稿する。雑種がニホンタンポポの適応的な遺伝子を受け取って急速な進化が起こっているかについては、東京、愛知、福岡で採集したニホンタンポポ、セイヨウタンポポ、雑種と、次世代シーケンサーの解析に用いた個体のPCR,クローニングを行う。ニホンタンポポで地域毎に違いが見られた配列のうち局所適応に関わっている可能性のある候補遺伝子について、セイヨウタンポポ、雑種が遺伝子を共有しているかを明らかにする。夏までにデータを取り終わり、論文にまとめて投稿する。(抄録なし)
生体イメージングによる造血幹細胞ニッチの加齢変化の解明

当研究課題では造血幹細胞を維持する骨髄の微小環境である造血幹細胞ニッチの加齢に伴う機能低下のメカニズムの解明を目指す。計画課題の初年度にあたる本年度においては、まず造血幹前駆細胞(HSPC)の血流中から骨髄実質への血管外遊走におけるNOの役割の解析に取り組んだ。GFPマウスの骨髄からHSPCをセルソーターとHSPCマーカーを用いて分取し、これらの細胞100万個を麻酔下の野生型のマウスに静脈内投与した。投与されたGFP陽性のHSPCは血流に乗って頭蓋骨骨髄に移行するが、この移行してきたGFP陽性細胞を多光子レーザー顕微鏡を用いたin vivoライブイメージングにより捉えた。その結果、骨髄に移行したHSPCのいくつかは血管外遊走の場である類洞血管の壁に接着し、定常状態では約25分かけて骨髄の実質へと移動した。そこでNOの産生酵素であるNOSの阻害剤、L-NAMEを10 mMの濃度で経頭蓋骨投与したところ、HSPCの血管内から骨髄実質への移行時間は43.6分と約2倍に延長した。また血管内皮に発現するeNOSの欠損マウスであるeNOS KOマウスのHSPCの血管外移行に要する時間は64.1分と野生型マウスと比較して約3倍に延長していた。さらにeNOS KOマウスの頭蓋骨骨髄にNOドナーであるニトロプルシドを100 μMの濃度で局所投与したところ、HSPCの血管外への移行時間は28.6分と、野生型マウスとほぼ同レベルとなった。これらの結果から、HSPCの血流中から造血幹細胞ニッチへと移行する効率は、骨髄中で産生されるNOによって維持されている可能性が示唆された。当該年度は、NOがHSPCの血流中から血管外への移行に寄与しているか否かを明らかにすることを目的としてきた。NOがHSPCの血管内から骨髄実質への移行を支えるメカニズムとしては、類洞血管のshear stressの関与を予測している。Shear stressはex vivoでの検討から、リンパ球に関してその血管外遊走に正の相関をもって関与していることが報告されている。本研究課題で得られた結果では、HSPCの骨髄実質への移行に要する時間と、移行の場となった類洞血管のshear stressには負の相関が見られた。また、L-NAMEによるNOの産生阻害時に骨髄の動脈は収縮することから、NOが定常状態において骨髄の動脈の血管を拡張させ、その下流の類洞血管のshear stressを保持することで、HSPCの血管外遊走が誘導されているとの機序が予測された。一方で多光子レーザー顕微鏡によるライブイメージングを用いた本実験系では、測定時間内に観察エリア内で血流中から血管外へと移行するHSPCの数はマウス1匹あたり数個と、実験郡間で数的な比較をするには不十分であるという懸念が浮上した。これに対応すべくin vivoイメージングを用いた解析系よりも中長期にわたってより多くのHSPCの骨髄腔内への移行を評価するために、GFPマウスのHSPCを骨髄非破壊状態で移植した後、FACSにより骨髄中のGFP陽性細胞の数を測定することを計画している。このようにNOによるHSPCの類洞血管壁透過性に及ぼす影響に関しては一定の成果を得られたものの、その意義に関しては未だ検討中であることから、当該年度の進捗としておおむね予定通りとの評価とした。まず期間初年度に解決に至らなかった、血流中から骨髄実質へ移行するHSPCの数に及ぼすNOの役割を引続き検証する。実験系としてはGFPマウスからセルソーターを用いて分取したHSPCを100万個の単位でeNOS KOマウスに骨髄非破壊的に移植し、一定時間後の骨髄中のGFP陽性のHSPCの数を野生型マウスと比較する。予備実験の結果から、移植後16時間後には数千個のGPF陽性のHSPCが見られたことから、まず16時間を目安にデータを取っていくこととする。またこのとき、骨髄中のGFP陽性のHSPCの数を分化段階ごとにそのマーカーを用いて測定することで、分化段階ごとのNOから受ける影響を評価することが可能となることも期待される。ここで得られるデータからNOによりHSPCの血管外遊走の効率が維持されることの意義についてまとめる。それと同時に2年度目以降に実施を計画した骨髄のNOの産生制御のメカニズムについて検証していく。マウス大腿骨骨髄組織のメタボローム解析の結果アセチルコリンが検出されていることから、eNOSのシグナルの上流にあたる因子として、アセチルコリンに着目する。現在のところアセチルコリンを産生する下肢での副交感神経の存在は明確でないため、血球系によるアセチルコリンの産生の可能性も視野に入れ計画を遂行する。アセチルコリンの産生細胞の探索に当たっては、当初予定していた副交感神経のマーカーを使った免疫組織染色の他、マウスの骨髄から各血球細胞をセルソーターで分取し、質量分析装置を用いてそれぞれの血球の種類ごとのアセチルコリン濃度の比較を試みる。これらの実験データを基に骨髄のeNOSのシグナルの詳細を明らかにし、それらの因子の加齢に伴う変化を研究期間の最終年度に向けて解析していく。

GFPマウスの骨髄からHSPCをセルソーターとHSPCマーカーを用いて分取し、これらの細胞100万個を麻酔下の野生型のマウスに静脈内投与した。投与されたGFP陽性のHSPCは血流に乗って頭蓋骨骨髄に移行するが、この移行してきたGFP陽性細胞を多光子レーザー顕微鏡を用いたin vivoライブイメージングにより捉えた。その結果、骨髄に移行したHSPCのいくつかは血管外遊走の場である類洞血管の壁に接着し、定常状態では約25分かけて骨髄の実質へと移動した。そこでNOの産生酵素であるNOSの阻害剤、L-NAMEを10 mMの濃度で経頭蓋骨投与したところ、HSPCの血管内から骨髄実質への移行時間は43.6分と約2倍に延長した。また血管内皮に発現するeNOSの欠損マウスであるeNOS KOマウスのHSPCの血管外移行に要する時間は64.1分と野生型マウスと比較して約3倍に延長していた。さらにeNOS KOマウスの頭蓋骨骨髄にNOドナーであるニトロプルシドを100 μMの濃度で局所投与したところ、HSPCの血管外への移行時間は28.6分と、野生型マウスとほぼ同レベルとなった。これらの結果から、HSPCの血流中から造血幹細胞ニッチへと移行する効率は、骨髄中で産生されるNOによって維持されている可能性が示唆された。当該年度は、NOがHSPCの血流中から血管外への移行に寄与しているか否かを明らかにすることを目的としてきた。NOがHSPCの血管内から骨髄実質への移行を支えるメカニズムとしては、類洞血管のshear stressの関与を予測している。Shear stressはex vivoでの検討から、リンパ球に関してその血管外遊走に正の相関をもって関与していることが報告されている。本研究課題で得られた結果では、HSPCの骨髄実質への移行に要する時間と、移行の場となった類洞血管のshear stressには負の相関が見られた。また、L-NAMEによるNOの産生阻害時に骨髄の動脈は収縮することから、NOが定常状態において骨髄の動脈の血管を拡張させ、その下流の類洞血管のshear stressを保持することで、HSPCの血管外遊走が誘導されているとの機序が予測された。一方で多光子レーザー顕微鏡によるライブイメージングを用いた本実験系では、測定時間内に観察エリア内で血流中から血管外へと移行するHSPCの数はマウス1匹あたり数個と、実験郡間で数的な比較をするには不十分であるという懸念が浮上した。これに対応すべくin vivoイメージングを用いた解析系よりも中長期にわたってより多くのHSPCの骨髄腔内への移行を評価するために、GFPマウスのHSPCを骨髄非破壊状態で移植した後、FACSにより骨髄中のGFP陽性細胞の数を測定することを計画している。このようにNOによるHSPCの類洞血管壁透過性に及ぼす影響に関しては一定の成果を得られたものの、その意義に関しては未だ検討中であることから、当該年度の進捗としておおむね予定通りとの評価とした。まず期間初年度に解決に至らなかった、血流中から骨髄実質へ移行するHSPCの数に及ぼすNOの役割を引続き検証する。実験系としてはGFPマウスからセルソーターを用いて分取したHSPCを100万個の単位でeNOS KOマウスに骨髄非破壊的に移植し、一定時間後の骨髄中のGFP陽性のHSPCの数を野生型マウスと比較する。