hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ケイ素ー炭素三重結合化学種シリンの合成

さらに平成28年度は、比較的かさの大きなMPind基を用いて、ケイ素ーケイ素三重結合化学種である「ジシリン」の合成について調査した。MPind基を有するトリブロモシランの還元縮合により「ジブロモジシレン」を合成し、分子構造を単結晶X線構造解析により決定した。ジブロモジシレンとt-ブチルリチウムとの反応について調査を行った。本研究では、ケイ素ー炭素三重結合化学種「シリン」の合成に挑戦した。かさ高い縮環型立体保護基(Rind基)をケイ素と炭素に導入することで、安定なケイ素ー炭素三重結合の構築にアプローチした。ケイ素側の反応基質として、ジブロモジシシレンとN-へテロ環状カルベン(NHC)との反応により「ブロモシリレン・NHC付加体」を合成した。炭素側の基質として、「ハーフペアレント型ジアゾメタン」を合成し、分子構造をX線結晶構造解析により決定した。ジアゾメタンの光反応を調査した結果、従来にないニトリル化合物が生成することを見いだした。ジアゾメタンとリチウム試薬との反応について調査した。ジシリンの合成研究も行った。未踏の三重結合化学種「シリン」の合成に向けて、炭素側のユニットは「ジアゾメタン」の合成法を確立した。かさ高いRind基の導入により安定性に優れた「ジアゾメタン」を開発することに成功している。「ジアゾメタン」の分子構造は、共同研究によって解明した。今後の展開が大変楽しみな状況である。平成27年度に開発した「ジアゾメチルリチウム」の反応性について引き続き調査を行い、嵩高いRind基とジアゾメチル基が置換したシリレンの合成を行う計画である。また、平成27年度に調査したジアゾメタンの光反応に関する知見に基づき、「カルベン・シリレン中間体」を経由した「シリン」の合成に取り組む。さらに、実験化学と理論化学の両面から、アルキン、シリン、ジシリンを比較調査することで、シリンの高度に分極した三重結合の電子状態の解明を行う計画である。有機典型元素化学平成26年度に合成した「ジアゾメタン」のリチオ化について反応条件を検討し、「ジアゾメチルリチウム」の生成について調査する。「ジアゾメチルリチウム」と「ブロモシリレン・NHC付加体」との反応によってケイ素ー炭素結合の形成を行い、さらに光照射によって脱窒素することで、カルベン中間体を経由して「シリン」への合成変換を行う計画である。Rind基のかさ高さを精密に制御することで、ルイス塩基(NHC)の配位のないフリーな「シリン」の合成に取り組む。また、Rind基を有するアルケンやアルキンの開発にも着手する。ジアゾメタン類は極めて反応活性で爆発性を有する場合もあり、本研究では安全性を確保できるまでは反応スケールを小さくする場合が多かった。このため、今年度に使用した物品費(試薬代や消耗品代など)は、当初計画よりも小額であった。平成26年度に学生への謝金(二人分)を予定していたが、実質的に一人分となったため、次年度使用額が生じた。本研究で取り扱うジアゾメタン類の安全性が確認され、熱や衝撃に対して十分に安定であることがわかったので、来年度は反応スケールを大きくして、研究を加速させる計画である。平成27年度は、大学院生2名を研究補助者とする計画である。
アンチセンスRNAの高発現系による染色体タンパク質の機能解析

ニワトリ6日胚より調製したCEF細胞にリン酸カルシウム法により,pMMcatとpMMGR(グルココルチコイドリセプタ-)を導入し,デクサメタゾンで誘導をかけたところ,誘導2日目の細胞抽出液はpRSVcatに匹敵する強い転写活性が観察された。またヒト由来HeLa細胞においてもpMMcatとpMMGRの同時導入によるポジティブフィ-ドバックがかかり,強いcat活性が見られることを確認した。次にK.Vorburgerらにより報告されたニワトリラミンB2cDNAの塩基配列をもとにPCR法によりCEF細胞より抽出した全RNA由来のcDNAから約1100bpのニワトリラミンB2cDNAN末側フラグメントを合成取得した。同様にD.Z.Fisherらにより報告されたヒトラミンA/CcDNAの塩基配列をもとにN末側約930bpのPCR産物を,HeLa細胞由来のtotalRNAより合成したcDNAより得た。これらのラミンcDNA断片は1目pUC118にクロ-ン化しMKohらにより作製されたMMTV・LTRを持つpMMEXに順向方,及び逆方向で括入しそれぞれpMMCLB2(トリラミンB2),pMMαCLB2(同アンチセンス),pMMhLA(ヒトラミンA),pMMαhLA(同アンチセンス)を得た。これらのプラスミドはリン酸カルシウム法によりpMMGR及ぴpSV2neoと共に細胞に導入し,マスカルチャ-としてデクサメタゾンによる誘導による細胞集団の変化を追跡している。又HeLa細胞に於して,まずpSV2neoとのcoーtransfectionによりpMMGR導入株を樹立し,これにpMMhLA,及びpMMαhLAをそれぞれpSV2hygとともにcoーtranfectionして,hLA,及びαーhLA(アンチヒトラミンA)RNAの高誘導株を取得する実験を現在行なっている。
確率的コピュラモデルによるリスク管理・最適資産配分

コピュラ関数の相互依存性を表すパラメータが確率的に変動するタイプの確率的コピュラモデルの応用としてリスク管理・最適資産配分問題を研究した。その統計的推定方法では、ハミルトニアン・モンテカルロ法が有効であることを確認した。最適資産配分問題では、下振れリスクを資産間で均等配分するテールリスクパリティ(TRP)投資や、資産クラス間に共和分関係が複数ある場合に、それを利用した連続時間の最適投資戦略、高頻度データから推計される実現尺度を用いた確率ボラティリティ(SV)モデル、確率的コピュラモデルを研究した。更に、VIXに対して、自己励起型強度過程をもつジャンプを付け加えたSVモデルを研究した。まず最初に、リスク・パリティ/バジェット投資モデルとマルチ・ファクター型(外生的Fama-Frenchモデルと内生的ファクターモデルである主成分分析型)で、下方リスクを考慮したモデルを構築し、バックテストを日本株市場における代表的インデックスを用いて行った。下方リスクはコーヒレントリスク尺度の一つである条件付きVaR(CVaR)を用いた。ファクターリスクを等分担するファクターリスクパリティ投資と所与の比率(バジェット)を与えるファクターリスクバジェット投資の特徴を明らかにした。研究成果の一部は、2014年10月末に発表された年金積立金管理運用独立行政法人(GPIF)の基本ポートフォリオのポートフォリオ最適化モデルの構築の際に、賃金上昇率をフロアとする下振れリスク(相対的なCVaR)最小化を行う形で反映されている。次に、高頻度データ分析から推計された実現分散(RV)、実現相関(RC)を用いたHEAVY CAPMモデル(HEAVYモデルはGARCHモデルにRVが追加されたモデルで、CAPMの市場インデックスに関しては、代理変数として市場インデックスETFの高頻度データを利用)を周辺モデルとし、資産間の依存関係をGRASコピュラモデル(スコア変数とRCを説明変数とするモデル)で表現し、更に、多変量化をヴァインコピュラで記述するHEAVY GRASヴァインコピュラモデルを構築し、共和分関係にある複数の個別株式に対して推定を行った。その結果、RV,RCを利用することで、相互依存構造の動的な変動を適格に捉えることができることを見出した。更に、期待効用最大化問題をモーメント近似する方法で、ポートフォリオ最適化できることを確認した。確率的ヴァインコピュラの応用で、まず、共和分投資問題を研究した。通常よく用いられるVECM(Vector Error Correction Model)を次のように一般的なものに拡張した。(1)定数項や誤差修正項に時変構造を導入、(2)残差項には(GH-skewed-t分布に従う)確率ボラティリティモデルを仮定、(3)それらの依存関係は、確率的ヴァインコピュラでモデル化。推定には、最近、開発されたHamiltonian Monte-Carlo法を試み、うまく推定できることを確認した。共和分関係にある資産数が多くなると、共和分ベクトルが複数存在することがある。その場合に、動的計画法による定式化を行い、HJB方程式を解くことで、最適な投資比率を導くことに成功した。実務でペア・トレードを拡張した3銘柄以上の共和分投資に道を開くものと考えられる。次に、確率的ヴァインコピュラを為替エクスポージャの動的ヘッジ問題に適用する研究を行った。外貨建て資産と多通貨の時系列の3変量以上の確率的依存構造のモデル構築に確率的ヴァインコピュラを援用した。その結果、動的なヘッジ比率によるヘッジ効率の優位性を確認した。更に、株式指数とボラティリティ・インデックスの間の負の依存関係および他国間の同指数の相互作用(spillover)を表現するために、確率的ヴァインコピュラを用いた。裾依存の変化を捉えることができ、市場の混乱期と平常時の依存構造の特徴的振る舞いを分析した。最後に、資産間の動的な依存関係を表す別のモデルとして、確率的共分散モデルを研究した。主要先進国の市場インデックスに投資する国際分散投資の枠組みで、マルチ・ファクターモデルの外生的ファクターが多変量確率的共分散構造をもち、各残差項が高頻度データから計算される実現分散で補強された確率ボラティリティに従うようなモデルを開発した。研究成果を4つの論文にまとめ、関連学会での発表を6件行うことができた。共和分投資や最適資産配分、リスクヘッジ問題に対して、確率的コピュラモデルが実装可能であることが確認でき、良好な結果が得られた。具体的には、依存構造の確率変動に関して、下方だけでなく上方にも確率的依存構造を入れたモデルの推定を行い、リスク資産のヘッジ効率向上に役立てることが可能であることを示した。金融実務への応用では、共和分投資の一つであるペア・トレードを拡張して3銘柄以上の共和分投資の可能性を提案した。また、市場参加者の間で相場のリスクオン・オフの目安として利用されているVIX等のモデルフリー・インプライドボラティリティ(VI)と当該指数の間の(負の)確率的依存構造を調べた。確率的ヴァインコピュラの研究では、周辺モデルの選択が重要である。投資の局面分析で、投資家がよく参照する指標にVIXがある。これはS&P500オプションのモデルフリーインプライドボラティリティ(MFIV)である。原資産とVIXの2変量に対して、確率的ヴァインコピュラを適用する際に、VIXのリターンに対する適切な変動過程のモデリングが必要になる。シカゴ・オプション取引所の様々なVIXの系列を見ると、短期のVIXにはジャンプがあり、期間構造全体の変化は単純なパラレル・シフトではないことが観察される。

そのため、VIXのモデルとしてジャンプ拡散(JD)過程を適用する研究を行った。ジャンプの強度は定数ではなく変動し、かつ、地震波のような自己励起的変動過程(Hawkes)に拡散項を更に付けて一般化した確率過程によりモデル化した。VIXはvariance swap rateと見做せるため、その評価式を自己励起型JD過程に基づき導出し、Hamiltonian Monte-Carlo法に基づくBayes推定で各パラメータを求める方法を開発した。その結果、従来のジャンプのない確率ボラティリティ(SV)モデルに比べて、適合度が改善されることを見出した。更に、リスクの市場価格の推定も併せて行い、各リスクの特性を明らかにした。自己励起型JD過程は、確率的ヴァインコピュラの依存構造の構造変化を記述することができる確率過程の一つと考えられる。最適資産配分問題に関して、リスク資産間に複数の共和分依存関係があり、かつ、外生的要因の影響を受ける場合の共和分投資の研究を行った。確率微分方程式で記述された連続時間の誤差修正モデルに外生的要因変数を入れたモデルで、HJB方程式を解き、最適な投資比率を導いた。実務で、外生的要因のもたらすリスク分析が可能な共和分投資を実現する手法を提供するものと期待される。コピュラ関数の相互依存性を表すパラメータが確率的に変動するタイプの確率的コピュラモデルの応用としてリスク管理・最適資産配分問題を研究した。その統計的推定方法では、ハミルトニアン・モンテカルロ法が有効であることを確認した。最適資産配分問題では、下振れリスクを資産間で均等配分するテールリスクパリティ(TRP)投資や、資産クラス間に共和分関係が複数ある場合に、それを利用した連続時間の最適投資戦略、高頻度データから推計される実現尺度を用いた確率ボラティリティ(SV)モデル、確率的コピュラモデルを研究した。更に、VIXに対して、自己励起型強度過程をもつジャンプを付け加えたSVモデルを研究した。申請段階である程度、予備的研究を行っていたため、順調に研究成果を出すことができ、2つの論文を学会で発表することができた。2つの論文のうちの1つで、科研費で購入した高頻度データを利用したが、現在、作成中の続編の研究論文でも有効に活用する見込みである。モデルの頑健性を検証するため、H.27年度は研究費で東証の日本株高頻度データ(HFD)を直近の年度末まで追加購入した。H.28年度は、東証アローズ導入以降の7年分のHFDを用いて、実現分散だけでなく、より高次の実現モーメントやそれらの確率変動を考慮したような新たな資産価格理論、それらに基づくファンド評価、最適マネージャー選択、資産運用モデル等の研究を推進していく。推定方法に関しては、Hamiltonian Monte-Carlo法を用いたが、その他、最近、機械学習の分野で使われる効率的な近似的推定手法である変分ベイズ法などを試し、既存の方法と精度、効率性の比較検証を行う。H.28年度は最終年度となるため、研究を取りまとめて、当該分野の学術雑誌への投稿を行っていく予定である。計量ファイナンス
並列プログラミング環境と言語処理系の研究

配列データの手続き間解析の実現と評価Fortran言語における手続きや関数の呼び出しをまたがるような、プログラム全体に渡る大域的なデータフロー解析方式を考案し、実現した。これは、プログラムの制御フローに従って、配列のアクセス領域を集約・展開し領域解析を行うもので、科学技術計算のベンチマークプログラムにおいてその有効性を確認した。また、この手法では解析できない主な要因が、動的に決まる添え字、別名定義、条件分岐、の3つであることを明らかにした。(→情報処理学会論文誌Vol.36,No.8,pp.1996-2006)条件分岐について並列性を解析するためには、本方式を条件付き領域解析に拡張することを検討し、実現方式を明らかにした。並設プログラミング環境の検討静的な解析情報を補うために動的な情報を必要であるが、その実現のためには統合的なプログラミング環境が必要となる。システムとして保持するべき情報、プログラムの更新やデータの更新に合わせて廃棄すべき情報、などの分類、データ間の関連付けなどの検討をおこなった。データベースを中心とする並列プログラミング環境構築の第一歩である。言語処理系の最適化の検討新しい言語であるFortran90の配列記述のコード生成の問題点を示し、その最適化手法を明らかにし、効果を示した。(→電子情報通信学会論文誌D-I,Vol.78,No.5,pp.504-506)配列データの手続き間解析の実現と評価Fortran言語における手続きや関数の呼び出しをまたがるような、プログラム全体に渡る大域的なデータフロー解析方式を考案し、実現した。(→電子情報通信学会論文誌D-I,Vol.78,No.5,pp.504-506)
スピンバルブ探針を用いることによってスピン偏極トンネル電流の検出は可能か

本年度は,昨年度に作製した超高真空STMを用いて貴金属単結晶表面及びその表面にエビタキシャル成長したCo超薄膜の観察を行った。(1)STMの高さ方向の分解能を,0.002nmに改善し,雑音についても回路の改良等によってノイズレベルを,0.02nm程度に低減した。ノイズとは別にドリフトがあり,走査線間でレベルの変動が見られた。ドリフトの除去については,最小二乗近似による超低周波分の除去を行うとともに,窓関数を定義した畳み込み積分によってクリアなSTM像を得ることができた。(2)面内の分解能についても,ステップ間の段差がやや不鮮明で不十分であったが,走査方向を往復から1方向に変更した結果,バックラッシュによる像のずれがなくなり,0.5nm程度の分解能が得られるようになった。(3)MgO(111)基板上にAg(30nm),Au(60nm)の順に室温でエピタキシャル成長させたAu表面を300°Cで超高真空中で熱処理したところ,100nm程度の範囲で原子レベルで平坦なテラスが観察された。また,テラスの端にはステップが見られ,ステップの高さは1原子層のものから数原子層のものまでにわたっていた。(4)上記のAu(111)表面にCoをエピタキシャル成長させ,その表面をSTMで観察した。観察は,0.2nm,0.5nm,1nmと数回,繰り返して行い,Coがどのように成長していくかを観察した。その結果,Coは成長の初期から島状に成長し,その粒径は7から12nm程度の大きさであった。本年度は、スピン偏極型のSTMの実験を行う前段階として,分子線エピタキシー(MBE)とSTMを連結した超高真空システムを完成させ、STM装置を用いてその性能を確認するとともに、貴金属上にエピタキシャル成長させた、Co超薄膜の構造について系統的な検討を行った。(1)STMの高さ方向の分解能は、0.02nm、ノイズレベルは、0.02から0.04nmであった。ノイズとは別にドリフトがあり、走査線間でレベルの変動が見られた。変動の幅は0.5nm程度であり、回路の修正を行うとともに、データ処理においてドリフトを除去する手法について検討した。(2)面内の分解能についても、ステップ間の段差がやや不鮮明で不十分であったが、走査方向を往復から1方向に変更した結果、バックラッシュによる像のずれがなくなり、0.5nm程度の分解能が得られるようになった。(3)MgO(111)基板上にAg(30nm),Au(60nm)の順に室温でエピタキシャル成長させたAu表面は,数nmのなだらかな凹凸で覆われている。この上にCoを成長させると,ほぼfcc構造を取り、表面形状があまり変化しないことから、ほぼCoはAu(111)上に層状成長していると考えられる。(4)MgO(111)基板上にAg(30nm),Pt(60nm)の順に室温でエピタキシャル成長させた場合もほぼ同様であった。このことから、Au(111)およびPt(111)上のCo超薄膜の垂直磁気異方性への磁気弾性界面異方性の寄与は、Co層が一様に歪んでいるとするモデルで解析できることが分かった。
観測ビッグデータを活用した変分法データ同化の高度化

気象観測技術の高度化に伴い、観測データの高頻度高密度化が急速に進んでいる。膨大な量の観測ビッグデータから得られる大気の詳細な情報を、数値予報モデルの初期値作成に利用できれば、集中豪雨など顕著現象の気象予測の精度向上が期待できる。一方で、密な観測データを数値予報システムに反映する方法は十分に確立しておらず、活用されるのはごく一部である。本研究では、高頻度高密度の観測ビッグデータを十分に活用し気象予測に役立てるために必要となる、データ同化技術の高度化を検討する。
非均一流れ場中の反応拡散系理論の構築

非均一流場中の反応拡散系理論の構築に関する研究を継続的に行った.研究実績は以下の通り.(1)位相カオスによる粒子拡散と反応粒子(坂上・金)昨年度に引き続き位相カオスによる粒子拡散の粒子拡散の数理的研究を行った.対象として理論的扱いが可能な球面4点渦点可積分系を扱った.球面上の渦による粒子拡散は大気中に放出される化学物質の反応系などに応用ができるものである.本問題はH. ArefとM. Stremlerらによる平面4点運動の手法を適用して解くことができ,その結果はPhysics of Fluidsに掲載された.ここから位相カオスを引き起こす渦糸の周期軌道を探すことにも成功し,それによる粒子拡散の統計的性質を調べたが,現在のところ強い拡散を観測しておらず継続的に研究がすすめられている.(2)位相カオスを利用した粒子拡散装置による実験的研究(坂上・森)昨年度から引き続いて,位相カオスによる粒子拡散装置による化学反応の様子を観測した.位相カオスが起こるような場合とそうでない場合では反応物質の反応パターンの様子に大きな違いが現れることも確認した.現在も観測を継続しているが,より定量的な結果を得るためにはさらに精密な機器の導入が必要である.(3)移流が与える効果の方程式論的研究(坂上)移流の効果が反応拡散方程式与える影響を調べるため,三次元ナビエストークス方程式のモデル方程式として導入された一次元DeGregorio方程式の数値的研究を行った.移流がない場合に解が爆発することが解析的に知られているが,移流効果により解は爆発せず,粘性がない場合には新しい解の爆発が起こりうることもわかった.本結果は日本応用数理学会論文誌に掲載済である.以上を総合して位相カオスを利用した移流場における反応拡散系の理論的研究は本質的に新しい現象であることが徐々に解明されてきたと考えている.上記研究課題について、理論的・数値的な研究および実験的研究を行った。理論的・数値的研究では坂上・金のグループが、津田の助言なども受けながら時間周期的に渦糸が明滅する時に、その流れによって粒子がどのように拡散するかについて研究を行った。数学的には位相幾何学におけるThurston-Nielsen Theoryに基づく組紐の分類理論によってそこに見られる複雑な粒子拡散の解析を行った。その結界、二つの渦糸の回転方向が同じ時は粒子の拡散はあまり明確でなく、一方で二つの渦糸の回転方向が互いに異なる時、粒子はカオス的に拡散することが示唆された。このような位相的制約に基づくカオス的粒子拡散は「位相カオス」と呼ばれており、このような系が簡単な物理系で実現できることがこのことからわかった。この理論的成果に基づいて、森らの研究グループは二つのプロペラが周期的に互いに異なる方向に回転するようにした実験装置を作成し、予備的な実験によって、数値計算が示唆するようカオス的拡散装置が実現できることを確認した。今後はこの装置の上で、化学反応を起こすことによって反応拡散パターンと流体パターンの相互作用について研究する予定である。本研究に関連のある研究課題についての調査研究もすすんだ。アメリカ流体力学会の年会に参加し、渦糸を磁力によって発生させる装置を作っているグループとの議論を行い、我々が理論的に示したカオス的拡散装置が実現できるかについて検討を加えた。非均一流場中の反応拡散系理論の構築に関する研究を継続的に行った.研究実績は以下の通り.(1)位相カオスによる粒子拡散と反応粒子(坂上・金)昨年度に引き続き位相カオスによる粒子拡散の粒子拡散の数理的研究を行った.対象として理論的扱いが可能な球面4点渦点可積分系を扱った.球面上の渦による粒子拡散は大気中に放出される化学物質の反応系などに応用ができるものである.本問題はH. ArefとM. Stremlerらによる平面4点運動の手法を適用して解くことができ,その結果はPhysics of Fluidsに掲載された.ここから位相カオスを引き起こす渦糸の周期軌道を探すことにも成功し,それによる粒子拡散の統計的性質を調べたが,現在のところ強い拡散を観測しておらず継続的に研究がすすめられている.(2)位相カオスを利用した粒子拡散装置による実験的研究(坂上・森)昨年度から引き続いて,位相カオスによる粒子拡散装置による化学反応の様子を観測した.位相カオスが起こるような場合とそうでない場合では反応物質の反応パターンの様子に大きな違いが現れることも確認した.現在も観測を継続しているが,より定量的な結果を得るためにはさらに精密な機器の導入が必要である.(3)移流が与える効果の方程式論的研究(坂上)移流の効果が反応拡散方程式与える影響を調べるため,三次元ナビエストークス方程式のモデル方程式として導入された一次元DeGregorio方程式の数値的研究を行った.移流がない場合に解が爆発することが解析的に知られているが,移流効果により解は爆発せず,粘性がない場合には新しい解の爆発が起こりうることもわかった.本結果は日本応用数理学会論文誌に掲載済である.以上を総合して位相カオスを利用した移流場における反応拡散系の理論的研究は本質的に新しい現象であることが徐々に解明されてきたと考えている.
食塩欲求と情動の関係に関する研究

脳弓下器官(SFO)において口渇感と塩欲求を制御するニューロンを同定することに成功し、口渇感と塩欲求を制御するニューロンをそれぞれ「水ニューロン」「塩ニューロン」と名付けた。いずれもAng II受容体1a型(AT1a)を発現する興奮性ニューロンであり、塩ニューロンは情動に関係する扁桃体延長部の分界条床核腹側部(vBNST)に軸索を伸ばしていた。さらに、体液[Na+]が上昇する脱水状態では、Naxが活性化し、乳酸を介してSFOのGABAニューロンを活性化し、塩ニューロンを抑制していた。古くから知られる塩欠乏と情動の関係について、解剖学的に裏付ける神経経路の存在が明らかになった。オプトジェネティクス(神経活動の光操作技術)や電気生理学的解析により、脳弓下器官(SFO)の口渇感と塩欲求を担うニューロンを同定し、それぞれを水ニューロン、塩ニューロンと命名した。さらに、SFOに水ニューロンを抑制するの抑制性ニューロンが存在し、塩欠乏時にコレシストキニン(CCK)によって活性化されること、それとは別に塩ニューロンを抑制する抑制性ニューロンが存在し、脱水時にNaxを発現するグリア細胞からの乳酸によって活性化されることを明らかにした。塩ニューロンは不快情動を司る扁桃体延長部の一部である分界条床核腹側部(vBNST)に軸索を投射していた。vBNSTに投射する興奮性ニューロンの活動をオプトジェネティクスにより抑えると、塩欠乏状態のマウスの塩欲求が抑制された。逆に、このニューロンを活性化すると、塩欲求が亢進し、通常状態ならば避けるような濃い食塩水を摂取するようになった。塩欲求と不安情動の関係については、古くから報告されていたが、そのメカニズムは全くわかっていなかった。本研究によって塩欲求の制御にvBNSTが重要な役割を果たしていることが明らかになり、塩欲求と情動を結ぶ神経機構が初めて明らかになった(Nature Neurosci.2017)。また、塩欲求制御のセンサーであるNaxの下流でEETが産生されてTRPV4が活性化し、飲水行動を活性化するという新しい機構の存在が明らかになった(Am J Physiol, 2016)。さらに、新しい高Na血症発症機構を見出した。原因不明の持続性高Na血症患者を多数解析し、その中にSFOを認識する自己抗体が体内で産生されている患者を複数見出した。患者血清を用いた動物実験から、SFOの炎症により口渇感や高利尿ホルモンの調節機構が失われ高Na血症になる新しい疾患として報告した(Brain. Pathol. 2016)。分子神経生物学
富山県内中世絵画の調査研究

科研費の補助により行った調査は以下の通りである。(1)瑞龍寺(高岡市関本町)所蔵絵画の悉皆調査(2)勝興寺(高岡市伏木)所蔵絵画の悉皆調査(3)個人蔵・親鸞上人伝絵断簡調査(4)個人蔵・扇面源氏絵調査(5)個人蔵・小川破笠筆能絵調査(6)光明寺(新湊市)所蔵・弘法大師行状絵調査(未了)(1)瑞龍寺の悉皆調査は、98年4月20日より開催の国宝指定記念展の予備調査もかねており、高岡市教育委員会の後援を得て行った。瑞龍寺所蔵品は、主に加賀第3代藩主・前田利常の奉納品で、狩野探幽、尚信安信、常信、松花堂昭乗などの作品のほか、中国絵画等から成り立っている。江戸時代より管理がゆき届き新出資料は、祖師絵伝のみであった。調査結果は、記念展図録として出版される予定である。(2)勝興寺所蔵品に関しては、重要文化財に指定されている「洛中洛外図屏風」と、「日月花木図屏風」はよく知られているが、それ以外の作品については目録もない状態であり、全般に作品の質も高いというわけではなかった。ただし、狩野晴川院養信筆「刑和僕・百猿・百鶴」三幅対ほか、狩野養福筆の源氏絵二幅対、狩野探雪筆「寿老人・松に鶴」三幅対などの御用絵師の作品が見つかった。これら御用絵師の作品と、歴代住職と裏方の肖像画のみは、後日写真撮影を行った。(3)、(4)は筆者不明ながら、江戸時代初期にさかのぼる作品であった。(5)は、津軽第五藩主・津軽信寿が、小川破笠に描かせた二十幅対の「能絵」の内の四幅と思われる作品であった。(6)は、調査継続中であるが、富山・千光寺が中心となり、富山県内の真言宗六寺が京都に発注したもので、延享年間の制作。作品の質は極めて高かった。富山県には、数々の名刹があり、個人コレクターも質の高いコレクションを有している。しかしながら、県立の博物館施設がなく人目に触れる機会がなく、絵画作品に関する資料も整備された状況とはいえない。個人の調査とはいえ、科研の補助を受け、高岡市内の巨刹の悉皆調査をはじめとして、数々の調査を行うことができた。今後、逐次、雑誌などにおいて資料公開を行いたいと考える。新湊市・大楽寺(浄土宗)に所蔵される「十王図」「涅槃図」の調査を行った。

「十王図」は江戸時代中期のものであるが、「涅槃図」には、「天文十五年(1546)六月吉日土蔵与三年二十六才筆」と銘があり、筆者は『古画備考』所載の土蔵加賀将監安芸の子孫で、本願寺絵所絵師かと思われる。室町末の絵所絵師の活動実態の一端を示すものとして貴重であり、早急に学術誌に資料紹介を行いたい。また、福野町・安居寺(真言宗)の「涅槃図」の図像が、鎌倉時代の東京国立博物館所蔵の涅槃図の写しであり、版本としても流布した図像であることがわかった。これにより、南北朝から室町時代にかけての地方における絵画の流通の問題を考察すひとつの手がかりが得られた。高岡市・勝興寺(浄土真宗本願寺派)蔵「洛中洛外図」(重文)は、鷹司家息女持参の伝承をもつ。筆者は、同寺所蔵の狩野晴川院養信筆「刑和僕・百猿・百鶴図」が、養信の公用日記に鷹司家のためにえがかれたものとして登場することから、その伝承を裏付けた。今後さらに、同寺所蔵の「花篭図」の年代同定とともに、伝承を史実として解明してゆきたいと考える。婦負群八尾町・本法寺の「法華経曼茶羅」に関して、継続調査中。新湊市大薬寺(浄土宗)に所蔵される「涅槃図」に、「天文十五年(1546)六月吉日土蔵与三年二十六才筆」との年紀、および著名がある。絵師・土蔵は、『蔭涼軒日録』に初出し、永享十二年(1440)から寛正四年(1463)頃まで活躍している。ほか、林屋辰三郎氏の紹介にかかる「苦行釈迦像」(玉龍院蔵)に「土蔵栄崇七十三歳(土蔵)(長昌)」と着賛した、十六世紀に活躍した絵師が見いだせる。『古画備考』などの画伝類によれば、土蔵は、代々仏画を描く家系で南都在住、子孫は本願寺絵所絵師をつとめている。さらに、兵庫県立歴史博物館学芸課長・木村重圭氏の報告によれば、西脇市・多可群内に「土蔵宗種」印「土蔵栄相」印、「土蔵」印の絵画が五件二十七点発見されている。新湊市大楽寺の「涅槃図」は、それらのいずれとも異なる人物の作品とみられることから、不明の点が多い、室町後期の絵師の実態解明のための有益な手がかりを与えることとなろう。印章がなく、描印、年紀も補筆とみられるところから、マイクロスコープによる科学調査を行なう予定である。科研費の補助により行った調査は以下の通りである。(1)瑞龍寺(高岡市関本町)所蔵絵画の悉皆調査(2)勝興寺(高岡市伏木)所蔵絵画の悉皆調査(3)個人蔵・親鸞上人伝絵断簡調査(4)個人蔵・扇面源氏絵調査(5)個人蔵・小川破笠筆能絵調査(6)光明寺(新湊市)所蔵・弘法大師行状絵調査(未了)(1)瑞龍寺の悉皆調査は、98年4月20日より開催の国宝指定記念展の予備調査もかねており、高岡市教育委員会の後援を得て行った。瑞龍寺所蔵品は、主に加賀第3代藩主・前田利常の奉納品で、狩野探幽、尚信、安信、常信、松花堂昭乗などの作品のほか、中国絵画等から成り立っている。江戸時代より管理がゆき届き、新出資料は、祖師絵伝のみであった。調査結果は、記念展図録として出版される予定である。(2)勝興寺所蔵品に関しては、重要文化財に指定されている「洛中洛外図屏風」と、「日月花木図屏風」はよく知られているが、それ以外の作品については目録もない状態であり、全般に作品の質も高いというわけではなかった。ただし、狩野晴川院養信筆「刑和僕・百猿・百鶴」三幅対ほか、狩野養福筆の源氏絵二幅対、狩野探雪筆「寿老人・松に鶴」三幅対などの御用絵師の作品が見つかった。これら御用絵師の作品と、歴代住職と裏方の肖像画のみは、後日写真撮影を行った。(3)、(4)は筆者不明ながら、江戸時代初期にさかのぼる作品であつた。(5)は、津軽第五代藩主・津軽信寿が、小川破笠に描かせた二十幅対の「能絵」の内の四幅と思われる作品であった。(6)は、調査継続中であるが、富山・千光寺が中心となり、富山県内の真言宗六寺が京都に発注したもので、延享年間の制作。作品の質は極めて高かった。
β-カテニン/p53系による子宮内膜癌細胞の増殖制御及び分化誘導作用の解明

1)Ishikawa細胞に変異型β-カテニン遺伝子をtransient transfection法で導入後、β-カテニン及びp53抗体で二重染色し蛍光顕微鏡で観察すると、β-カテニン過剰発現細胞で、内因性p53蛋白発現誘導が確認できた。2)活性型β-カテニン/TCF複合体はp53上流遺伝子であるp14ARFのpromoter活性をTCF4依存性に亢進させ、結果としてp53下流遺伝子のp21WAF1の発現が亢進した。3)Ishikawa細胞で、変異型β-カテニン遺伝子を恒常的に発現する細胞株を作成した。この細胞はコントロール細胞(mock)に比べ、p14ARF,p21WAF1,p53,cyclin D1の発現が亢進していた。又、形態学的に、細胞質が広くなり平面的な変化からなるsenescence様細胞の増加が認められた。4)テトラサイクリンシステムを用いて変異型β-カテニン遺伝子発現誘導系を作成した。この結果、変異型β-カテニン発現誘導と一致してその転写活性の増加とその下流遺伝子(cyclin D1,p14ARF等)発現が生じ、さらに、X-gal陽性を示すsenescence細胞の増加を認めた。5)臨床検体の内膜癌組織では、増殖能を欠く扁平上皮化生巣に一致して核内β-カテニン、p21WAF1,p53,cyclin D1の陽性所見を認めた。以上の結果から、変異型β-カテニン過剰発現はp14ARFのTCF binding siteを介してp14ARFの発現を誘導する。p14ARFはp53遺伝子発現を誘導し、p53/p21WAF系が活性化し、結果として細胞周期の停止作用及び扁平上皮様の形態変化をきたすことが示唆された。平成15年度はβ-カテニン過剰発現によるp53蛋白発現誘導のメカニズムを解析した。12種の子宮内膜癌培養癌細胞におけるβ-カテニン遺伝子(exon 3)及びp53遺伝子(exons 5-9)の塩基配列を検索し、両者が野生型のIshikawa細胞を選択し以下の検索を行った。2)変異型β-カテニン遺伝子導入時におけるβ-カテニン/TCF複合体転写活性能は著しく亢進していた。4)活性型β-カテニン/TCF複合体はp53上流遺伝子であるp14ARFのpromoter活性をTCF4依存性に亢進させた。5)変異型β-カテニン遺伝子導入によりp53下流遺伝子のp21WAF1の発現が亢進した。6)western法にて、変異型β-カテニン過剰発現によりp14ARF, p53及びp21WAF1の蛋白発現増加が認められた。以上の結果から、β-カテニン過剰発現によりβ-カテニン/TCF4複合体が形成され、この複合体がp14ARFのTCF binding siteを介してp14ARFの発現を誘導する。p14ARFはp53遺伝子発現を誘導し、結果として細胞周期停止作用を有すp21WAF1の発現を誘導する。現在、これらの生物学的意義を検索中である。平成16年度は前年度に得られた結果を基に、変異型β-カテニン過剰発現による子宮内膜癌細胞の増殖抑制機構を明らかにした。

前年度と同様にβ-カテニン遺伝子(exon3)及びp53遺伝子(exons5-9)が野生型のIshikawa細胞を用いて以下の検索を行った。1)Ishikawa細胞で、変異型β-カテニン遺伝子を恒常的に発現する細胞株を作成した。この細胞はコントロール細胞(mock)に比べ、p14ARF,p21WAF1,p53,cyclin D1の発現が亢進していた。又、形態学的に、細胞質が広くなり平面的な変化からなるsenescence様細胞の増加が認められた。2)テトラサイクリンシステムを用いて変異型β-カテニン遺伝子発現誘導系を作成した。この結果、変異型β-カテニン発現誘導と一致してその転写活性の増加とその下流遺伝子(cyclin D1,p14ARF等)発現が生じ、さらに、X-gal陽性を示すsenescence細胞の増加を認めた。3)臨床検体の内膜癌組織では、増殖能を欠く扁平上皮化生巣に一致して核内β-カテニン、p21WAF1,p53,cyclin D1の陽性所見を認めた。以上の結果から、変異型β-カテニン過剰発現はp14ARF、のTCF binding siteを介してp14ARFの発現を誘導する。p14ARFはp53遺伝子発現を誘導し、p53/p21WAF系が活性化し、結果として細胞周期の停止作用及び扁平上皮様の形態変化をきたすことが示唆された。
肝内・総胆管結石の非観血的治療法に関する研究:特にマイクロ波を用いる砕石法の開発

1.低損失、低容量型同軸ケーブルの開発。影響する因子として長さ、径を検討した。設備購入淮流機構付細径胆道鏡使用下で、長さは90cmまで短縮、径は1.8mmまで増加可能であった。2.ビリルビンカルシウム結石(ビ石)破壊のためのアンテナ出力、形状の検討。アンテナ出力の大きさは、折り曲げ>双極>球状、単極、尖状アンテナの順であった。結石への刺入性、胆道鏡鉗子孔損傷の可能性、胆道鏡先端の操作性維持を加味すると、至適形状として双極(短)>単極(短)>球状>折り曲げ>尖状(短)アンテナの順が望まれた。構造的に脆弱なビ石は、単極、双極アンテナのみで破壊可能であり、巨大(硬性)ビ石や、さらに硬性なコレステロール系結石(コ石)では、双極、単極アンテナによる刺入操作後、球状、折り曲げアンテナの併用が効果的であった。3.潅流液の検討。潅流液中では誘電効果に加え導電効果の関与も大きく、特に生理的食塩水(生食水)中では顕著であった。効果的砕石には導電効果も積極的に用いる方がよい。ただし硬い結石では生食水への導電損失軽減のため、アンテナ刺入の際に一時5%グルコース液の採用がすすめられた。4.溶解剤との併用。胆石溶解剤Methyltert-Butyl Ether(MTBE)は結石外殻を脆弱化し、マイクロ波砕石法の適応を硬いコ石にまで拡大した。MTBEの副作用を軽減する容積増量性溶媒の開発が望まれ、代用血液として考案された経過をもつフロロカーボンを採用したところMTBEと完全に可溶で、有用であった。5.他の砕石補助法との比較、併用。ビ石では本法単独でも有効であり、コ石についても時間をかけさえすれば砕石でき、また他法にとっての砕石手掛り部位を形成できた。6.今後の展望。双極、単極アンテナでは砕石操作時間が長くなると電極が焼損劣化し、砕石能率が低下するため、球状アンテナの併用がすすめられる。今後アンテナ材質の検討や、テーパを持った球状アンテナの開発が望まれる。3.潅流液の検討。4.溶解剤との併用。6.今後の展望。1.申請許可を受けた灌流機構付細径胆道・腎臓ファイバースープ(FCN-15H)を購入。これへ基礎検討を行った種々の試作マイクロ波伝送ケーブルを押入し臨床応用に供した結果、現在までに非手術的治療終了例は9症例を数え、また1例の治療を終了しかけており、さらに1例を治療中である。以上の症例についてなんらの副作用も認められていない。2低損失型、低容量ケーブルの開発は続行中であるが、低容量型ケーブルについては、内軸と外筒間の容量(キャパシタンス)を低減することによりマイクロ波伝送電力の途中損失を減少させる意味があると同時に、斯くすることにより内軸を太く出来るため、ケーブルの機械的強度を向上させうる利点が判明した。

3.砕石操作に必要なケーブルの長さは約90cmにまで短縮可能と判明した為、電源から砕石用ケーブルまでは肝切除用太径ケーブルで接続し、途中経路の損失分を低減させることによりケーブル先端出力の向上が得られた。4.ケーブル先端アンテナの形状を変えて検討した結果次の成績が得られた。(1)鋭利にテーパーをつけた場合;結石への刺入効果は得られ易いが、胆道鏡鉗子孔内面を傷つけ易く、先端破壊出力も少ない。(2)球状アンテナ;先端出力は大きいが結石への刺入が困難であり、かつ周囲灌流液中へとエネルギーが奪われ易かった。(3)双極アンテナ;硬性結石外殻を傷つけ易く、以後の結石へのエネルギー伝達、破壊効果も良好であった。ただし本試作ケーブルの径は2.4mmとやや大であり細径胆道鏡鉗子孔の通過は困難なので、さらに細径の双極ケーブルを試作予定としている。本アンテナによる効果には誘電効果以外に導電効果も考えられ、そのエネルギーの灌流液中への損失を低減するために非電解質液、たとえば5%グルコース液の使用が望ましいとの基礎データを得た。5、結石脆弱化をはかり、本法の効果を向上させる為に、洗浄液の工夫も行っている。1.臨床経験:肝内・総胆管結石の治療は13例を数え、硬性結石である胆嚢・総胆管結石4例、胆嚢結石の2例にも溶解剤併用下にマイクロ波砕石を試み、全例に砕石効果をみた。2.低損失型ケーブルの開発:ケーブル長は90cmに固定している。これに肝切除用太径ケーブルを用いていたが、専用延長ケーブルを試作した。接続硬性部を省いたため操作に余裕ができた。今後ケーブル長90cmを中心に1/2波長(6cm)の範囲で最適出力(最小反射電力)位置を決定する予定。3.アンテナ形状の検討:(1)双極アンテナ。設備購入の細径胆道鏡挿入可能な試作アンテナを臨床3症例に応用し効果をみた。硬い混合石に対しても刺入性が得られた。(2)出力の最も大きい1/4波長折り曲げアンテナは、細径化が難かしく、折り曲げ部分が胆道鏡に熱損傷をおこす。そのため出力をやや犠牲にし、折り曲げ長を1cmとした。これは太径の胆道鏡CHF-B_3Rを用いれば臨床応用可能である。(3)球状アンテナ。結石刺入性が無く、採用対象からはずされていたが、空中、生理食塩水(生食水)、5%グルコース(5%Gl)中での出力に大きな差が無く、放射効率が良い。単極、双極アンテナによるボーリング部へ挿入すると、以後の砕石が容易であり、臨床1例に成果をみた。(4)短脚アンテナ。結石表面の損傷度は良いが、刺入性、破壊性に乏しい。しかし直接溶解剤と併用すると、非接触的使用法ができ、操作が容易となった。(5)アンテナ電極焼損。単、双極、短脚アンテナ電極は、硬性結石中での長時間操作で焼損する。材質の検討が必要であり、当面は結石中へ到ったら球状アンテナを用いる方法がすすめられる。4.潅流液:アンテナの結石刺入が困難な際には一時5%Gl-を用いる。なおアンテナへの結石成分付着の影響を減じるため、時々解離電流を流すとよい。5.溶解剤:直接胆石溶解剤の併用は、砕石効率を高め、マイクロ波砕石法の適応を、硬いコレステロール結石にも拡げた。
冬眠期のエゾタヌキ生理機能テレメトリーと動物園における生命科学教育の可能性

旭川市旭山動物園内屋外非展示エリアにおけるエゾタヌキのテレメトリーでは、冬季23ケ月の絶食中でも体温の最大低下は2°Cを超えず、巣篭もりも1日を超えるもが無かった。3月の再給餌までに体重はほぼ半減し、血中脂肪、総タンパク質量、尿素窒素など栄養状態の指標物質に減少が認められた以外には、現状では顕著な変化が捉えられていない。2007年8月末より同園第2子ども牧場建物内にて研究の展示をしている。内容は、冬眠とエゾタヌキの研究を概説したパネルと、テレメトリー送信機を腹腔内に留置したシリアン・ハムスターを冬眠に導入し、低温飼育装置内で冬眠を維持しつつ。その様子と共に体温、心電図のリアルタイム記録をコンピューターディスプレイにより展示した。展示を見た来園者にアンケートを依頼し、これまでに127名からの回答が得られている。主な質問項目の概要は1)内容は興味深かったか、2)生体の内部機構に興味がわいたか。3)展示を持続すべきか、とし、5段階評価(5が最大の同意を表す)を依頼した。来園者数に対し回答者数が少ないのは、同建物内の展示時間が1日1時間であることや、そもそも当施設に立ち寄る来園者が少なく、さらにアンケート回答にまで至る来園者が少ないためと思われる。内訳は小学生21、中学生6、高校生9、大学・専門学校生2、社会人38、学齢前5名(親の代筆)、年齢不詳46であった。年代別では10才未満13、10代35、20代20、30代16、40代5、50代4、60代0、70才以上1、年代不詳33であった。回答数が不十分な年代もあるため、全平均で見ると、それぞれの評点は質問1)4.3、2)4.0、3)4.5。概ね興味深い展示と受け取られ、体内の生理機構に対する興味も触発され、展示を発展的に継続してほしいとの結果であった。展示の表現法には工夫が必要との意見も多く、今後の課題も明らかになった。旭川市旭山動物園との協力により、冬季に白然環境を模した人工巣穴を準備し、テレメトリーにより生理学パラメーター(体温、心電図)を連続測定し、1)冬季の巣篭り行動が見られるか、2)その間のパラメーターが通常の睡眠時に見られる変化を上回る変化を示すか調べ、3)エゾタヌキの冬眠可能性について検討。さらに、4)実験室において進行中のハムスターを用いた冬眠研究の成果を含め、記録中の心電図や体温、行動映像をモニター上で展示する等により、来園者に冬眠研究を通じて生体の内部機構に関する興味を喚起し、動物園が生命科学教育の場として利用できるか検討する目的で行われた。園内の比較的静寂な場所、内部が外気に暴露される飼育ケージ内に人工巣穴を設置。晩秋降雪前にテレメトリー送信機を腹腔に留置し、手術からの回復後、飽食するまでエサを与えた。積雪開始後、ケージ内巣穴周囲を雪で被い、2週間かけて段階的にエサを減らし、約2ヶ月間絶食状態とした。・行動記録から、エゾタヌキは2日以上に渡り巣穴内に留まる事は無かった。・覚醒安静時体温は約37°Cであるが、最低体温は絶食開始から約1ヶ月後に記録された35.4°Cであった。・心電図は強い不整脈を示し、他の冬眠動物の冬眠中と似ていたが、心拍数は通常安静時約70から15%程度の減少に留まった。今回の記録結果からは、エゾタヌキの冬籠りを示唆する記録は得られなかった。これらの結果をまとめ、公表した(日本生気象学会雑誌,2006)・園内における記録、計測中の資料を含む生命科学啓蒙用の展示準備が進められている。

年代別では10才未満13、10代35、20代20、30代16、40代5、50代4、60代0、70才以上1、年代不詳33であった。回答数が不十分な年代もあるため、全平均で見ると、それぞれの評点は質問1)4.3、2)4.0、3)4.5。概ね興味深い展示と受け取られ、体内の生理機構に対する興味も触発され、展示を発展的に継続してほしいとの結果であった。展示の表現法には工夫が必要との意見も多く、今後の課題も明らかになった。
ヒト免疫系再構築マウスにおける乳癌膜表面抗原に対する完全ヒト型抗体作成の試み

(1)Her-3発現が報告されている乳癌細胞株AU-565およびBT-474を入手し、フローサイトメトリーでHer-3発現を確認したところ、AU-565では発現を認めたが、BT-474ではHer-3発現を認めなかった。(2)AU-575をin vitro培養の後、MMC処理して10^6ずつ造血幹細胞移植後9週のヒト免疫系再構築が確認されたマウス(CB-NOGマウス)10匹に投与、免疫を行った。マウス2匹は抗体価の測定は不能であった。測定可能なマウス2匹を合わせてKarpas707HとPEG法により細胞融合を行い、これらを96well plate上で培養した。78個のハイブリドーマが観察された。これらに対してAU-575細胞を用いたFACSによるscreeningを行ったが陽性ハイブリドーマの検出は認めなかった。(3)そこで、Her-3のタンパク質の一時構造から推測されるアミノ酸配列で、抗原性が高いと予想されるN:20-34,N167-183,N479-492を選択し、これらの抗原とKLHをconjugateしてpeptide-KLHを作製した。CB-NOGマウスにこれらのペプチド(100ug/head)を別々に、あるいは3種を同時に同一マウスにFCAを初回免疫,FIAを追加免疫のアジュバントとして2週間ごとに免疫を行い、抗体価をELISAサンドイッチ法にて測定した。その結果、ペプチドに対する抗体価は3種同時に5回免疫したマウスにおいて、数ng/mlレベルまで上昇を認めた。しかしこれは非常に低レベルでありこれらについてハイブリドーマを作製するに至らなかった。現在も新たなマウスに免疫を施行中である。本年度は、完全ヒト型Her-3モノクローナル抗体を作製するために、以下の点まで研究を進めた。(1)造血幹細胞を東海大学臍帯血バンクより提供を受けた臍帯血より抗CD34抗体を用いて磁気ビーズ法により採取し、重度の免疫不全マウスであるNOGマウスに経静脈移植してヒト免疫系再構築マウスを作製した。ヒト免疫系再構築の確認は、末梢血より比重分離法によりMNCを分離し、これらの細胞を抗ヒトCD45,CD3,CD20抗体で染色し、フローサイトメトリーにより陽性細胞の比率を解析することにより行った。(2)Her-3を発現している事が報告されている乳ガン細胞である数種類の乳ガン細胞株について、フローサイトメトリーによりHer-3の発現を確認した。この結果、Her-3陽性細胞としてAU-565およびBT-474を選択した。(3)これらのHer-3陽性細胞をin vitro培養の後、MMC処理して10^6ずつ造血幹細胞移植後9週のヒト免疫系再構築が確認されたマウス腹腔に投与し、免疫を開始した。採血は2週間ごとに行い、これらHer-3発現細胞を染色するか否かについてフローサイトメトリーを用いて解析を行っている。(4)フローサイトメトリーによるスクリーニングを簡便にする手段として、マウスmyeloma細胞株A20にHer-3を発現させることを目的として、BT-474よりtota1RNAを抽出し、Her-3のc-DNAをPCRにより得ることを試みた。
シグナル応答性を指標とした造血幹細胞の新たな細分画法の確立

本課題においては、細胞内シグナル応答性プローブを幹細胞に応用する新しい試みとして研究を行った。対象をキナーゼ応答性プローブと造血幹細胞の組み合わせとし、特定のシグナルに応答してリン酸化されることで蛍光を発する(あるいは変化する)プローブを細胞内に導入し、異なる反応性を示す細胞集団を生きたまま分取する技術を用いて、既存の方法では検出し得なかった新たな造血幹細胞の亜分画の同定を目指した。種々の技術的困難に対して改良を重ね、研究期間において次なる成果へとつなげるための研究基盤を確立することが可能であった。大津は前年度に引き続き標的細胞へのプローブ導入に備え、造血幹細胞におけるシグナル伝達様式の解析、細胞表面マーカーによる分画および、幹細胞機能評価法の至適化を行った。特にIL-1/IL-1R、SDF-1/Cxcr4シグナルに着目し、後者においてはレセプター改変後の細胞におけるシグナル分子のリン酸化を評価した。その結果、本研究課題が究極に目指す高品質の造血幹細胞分取に向けて、従来考えられてきたAKTではなく、ERKリン酸化のキネティックスがより幹細胞機能と相関する可能性が示された。片山は高分子イオン錯体型の蛍光プローブの開発を検討した。内部標準としてCy5を濃度消光が起きない程度、カチオン性基質ペプチドを側鎖に有するデキストランに導入し、一方、キナーゼ応答型の蛍光を与えるためのTAMRAをポリアスパラギン酸に導入したポリマーも合成して両者を混合し、ポリイオン錯体型ナノ粒子を調製した。得られたナノ粒子はCy5の蛍光はナノ粒子形成によっても不変であったが、TAMRAの蛍光は大きく消光した。一方、標的キナーゼでデキストラン側鎖の基質ペプチドをリン酸化するとTAMRAの蛍光は大きく回復し、Cy5の蛍光は変化しなかった。そこで、両者の蛍光強度比を取ることで、正確にキナーゼ活性が評価できた。蛍光強度比を用いてキナーゼ阻害剤の阻害定数を評価することも可能であった。本プローブは、キナーゼ蛍光プローブとして、特に濃度や組織・細胞の厚みの影響を受けずにin vivoや培養細胞で正確に活性を評価できる可能性がある。以上、本課題研究期間内には計画の完遂には至らなかったものの、研究分担者との協力によって目的達成のための基盤技術の整備を完了した。造血幹細胞においては細胞表面マーカー発現を指標とした高度な純化が可能であるが、近年、機能・特性における不均一性が指摘され、さらなる純化法の技術革新が望まれている。本研究では、特定のシグナル分子のリン酸化状態を蛍光によって生細胞中で可視化する技術「細胞内シグナル応答性プローブ」を造血幹細胞研究に応用し、従来の方法ではさらなる分画が不可能であった細胞集団を特定の刺激に対するシグナル応答性により細分画し、生細胞として回収することで機能・特性評価までを可能にする新たな細胞分画法を確立することを目的とする。提案する技術の原理証明が主題であるが、造血幹細胞をシグナル応答性により分画し、特性評価までを行なって新たな亜分画の提案を可能にすることが究極の目的である。本年度は特にモデル細胞におけるシグナル応答性の評価系の整備を行った。被験シグナルとしてSDF-1刺激によるCXCR4シグナルを選択肢、至適化をすすめた。シグナル強度を人為的に変化させることでシグナル応答性プローブの反応性をvalidateできると考え、レトロウイルスベクターシステムを構築し、野生型レセプターおよびgain-of-function型レセプターを被験細胞に過剰発現する系を確立した。C57BL/6Jマウス骨髄から造血幹・前駆細胞を分取し、ベクターで遺伝子導入、蛍光マーカーを指標に遺伝子陽性細胞をソートにより得ることができた。SDF-1刺激後に細胞を固定後、シグナル分子のモデルとしてリン酸化Erkを特異的抗体で染色しフローサイトメトリーにて解析した。結果、gain-of-functionを裏付けるシグナル強度の変化が観察され、本研究課題の目的に適うモデル細胞、モデルシグナルの構築を確認した。初年度は本研究課題の目的達成に必須のモデル構築に注力した。分担研究者の片山はさらに自身の有するシグナル応答性プローブの改良に注力した。モデル構築に関しては、申請者所属の研究室における研究の進捗に伴い、シグナル強度を段階的に変化させる系の応用が可能となったため、レトロウイルスベクターの構築を行い、遺伝子導入を行うことで至適モデルを構築することができた。いったんモデルが構築できれば、片山の準備するプローブに合わせて同様の手法にてシグナル強度、シグナル伝達のキネティクスを自在に変化させることが可能になる。このことから次年度に向けての準備が進んだ終と評価し、全体研究は「概ね順調に進んでいる」との自己評価とした。プローブ導入造血幹細胞の活性評価:前年度よりのプローブ導入法の至適化をさらに進める。特に毒性の評価を厳密に行うため、移植によって造血再構築能をプローブ非導入細胞との比較において検討する。