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身体に根ざした他者視点取得能力の神経機構とその障害

本研究では,社会的コミュニケーションにおいて重要な要素の一つである,他者視点取得の定型・非定型発達変化を明らかにすることを目的としている.他者視点取得とは,他者の見ている景色は自分の見えている景色とは異なることを理解する能力である.近年,非定型発達児における他者視点取得が不得手であるとの報告がなされている.更に,他者視点取得は,心的回転課題とは異なる方略でなされるとの報告がある.また,申請者らは,低年齢定型発達児と非定型発達児は似たようなエラーを示すことを見出している.具体的には,他者視点が自己視点と異なる場合でも自己視点を回答する自己視点バイアスエラーがみられる.本研究課題では,そのエラーに着目し,それが定型発達児ならびに非定型発達児においてどのように異なるかを明らかにすることを目指した.本研究課題では,異なる二つの実験課題を用い,他者視点取得課題時における自己視点バイアスエラーの生起要因について検討した.研究課題1では,視点変換操作を施した際の,運動プラニング能力を定型・非定型発達児を対象に検討し,その発達軌跡を追った.研究課題2では,他者視点取得課題と統制課題として,心的回転課題を実施した際の脳活動を定型・非定型発達児を対象に光トポグラフィーにより計測した.結果,研究課題1では,定型発達児において,視覚座標系の情報から身体座標系のような発達変化がみられるのに対し,非定型発達児では発達によらず,身体座標系の情報を利用する傾向がみられた.また,研究課題2における他者視点取得課題遂行時の脳活動計測において,視点取得課題遂行時には,側頭頭頂接合部付近における活動を見出し,定型・非定型発達児における活動の違いを見出した.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は,身体感覚,身体操作能力と社会的認知能力を一本の線で繋ぐ,「他者視点取得」能力の発達変化に着目し,その定型・非定型発達メカニズムを解明する.これより,本新学術領域において構築中の「身体に根ざした社会的認知モデル」構築の基盤となるデータを提供し,当該モデルを洗練することを目的とする.「他者視点取得」能力とは,同じ景色を見ていても,他人の見ている景色は自分の見ている景色とは異なることを理解する能力である.これは,社会的コミュニケーションにおいて重要な能力の一つである.これまで,社会的コミュニケーションに困難を抱えるとされる自閉症スペクトラム(ASD)児では視点取得能力が困難であるとする知見が多い.しかしながら,「なぜ」困難であるかについて明らかにされていない.従来の研究は,視点取得を「視覚情報処理」の観点から検討し,「自己身体」が果たす役割について十分考慮していない.本研究計画は,「他者視点取得の困難さは,自己身体座標系への偏りによる」仮説を検証する.本研究は,「身体に根ざした社会認知発達モデル」の構築・洗練を射程とする.このため,身体感覚・身体操作能力と社会認知の関係を直接調べることが可能な「他者視点取得」能力に着目する.特に,乳幼児期から青年前期の定型,非定型発達変化に焦点を絞る.本研究の作業仮説を「ASD児の他者視点取得の困難さは,自己身体座標系への偏りによる」とし,本仮説を検証する.一連の実験を通じて身体感覚の偏りが非定型な社会認知に至るプロセスを解明する.本研究課題において,以下の研究項目を実施している.1他者視点取得能力と自己視点操作能力の関係の解明2自己身体座標系への偏りを解明するための運動学習実験予備的検討として,健常成人を対象にした光トポグラフィー計測研究により,他者視点取得に関連した脳活動指標を確立した.本指標を用いることにより,ASD児における他者視点取得に関連した脳活動計測を進めている.現時点において,28名のASD児を対象とした計測が終了した.さらに統制群として定型発達群データを収集しており,現時点において16名のご参加を頂いている.また,運動学習課題も28名のASD児を対象とした研究が終了し,定型発達児においても16名のご協力が得られている.本研究では,社会的コミュニケーションにおいて重要な要素の一つである,他者視点取得の定型・非定型発達変化を明らかにすることを目的としている.他者視点取得とは,他者の見ている景色は自分の見えている景色とは異なることを理解する能力である.近年,非定型発達児における他者視点取得が不得手であるとの報告がなされている.更に,他者視点取得は,心的回転課題とは異なる方略でなされるとの報告がある.また,申請者らは,低年齢定型発達児と非定型発達児は似たようなエラーを示すことを見出している.具体的には,他者視点が自己視点と異なる場合でも自己視点を回答する自己視点バイアスエラーがみられる.本研究課題では,そのエラーに着目し,それが定型発達児ならびに非定型発達児においてどのように異なるかを明らかにすることを目指した.本研究課題では,異なる二つの実験課題を用い,他者視点取得課題時における自己視点バイアスエラーの生起要因について検討した.研究課題1では,視点変換操作を施した際の,運動プラニング能力を定型・非定型発達児を対象に検討し,その発達軌跡を追った.研究課題2では,他者視点取得課題と統制課題として,心的回転課題を実施した際の脳活動を定型・非定型発達児を対象に光トポグラフィーにより計測した.結果,研究課題

1では,定型発達児において,視覚座標系の情報から身体座標系のような発達変化がみられるのに対し,非定型発達児では発達によらず,身体座標系の情報を利用する傾向がみられた.また,研究課題2における他者視点取得課題遂行時の脳活動計測において,視点取得課題遂行時には,側頭頭頂接合部付近における活動を見出し,定型・非定型発達児における活動の違いを見出した.昨年度に引き続き,定型発達児のデータ収集を継続する.結果をまとめた上で論文として公表する予定である.さらにASD児における自己身体操作能力ならびに自己身体への偏りのメカニズムについてさらに実験を進めることにより明らかにする予定である.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。
食餌必須脂肪酸バランスによる腫瘍壊死因子(TNF)産生制御の機構に関する研究

高alpha-リノレン酸(18:3n-3)食をマウスに与えるほうが、高リノール酸(18:2n-6)食を与えるよりも、カゼイン誘導腹腔マクロファージ(Mphi)のリポポリサッカライド(LPS)刺激による腫瘍壊死因子(TNF)産生能が高かった。この機構におけるプロスタグランジンE2(PGE2)の役割を調べた。PGの産生阻害剤であるインドメタシンを添加してTNF産生能を比較したところ、両食餌群のMphiでのLPS刺激によるPGE2産生がほぼ完全に阻害され、両群間での差がなくなった。TNF産生は、両群においてインドメタシンの添加により有意に上昇したが、TNF産生量の差には影響しなかった。以上の結果から、高alpha-リノレン酸食群と高リノール酸食群間でみられたマウスMphiのTNF産生能の差は、PGE2産生量の差だけでは説明できないことがわかった。一方、カゼイン誘導Mphiのリソゾーム酵素である酸性フォスファターゼ活性を測定したところ、高alpha-リノレン酸食群で高リノール酸食群よりも有意に高かった。しかしながら、過酸化水素産生能、貪食能、一酸化窒素産生能、CD14抗原発現量には両群間で差は見られなかった。従って、高alpha-リノレン酸食によるMphiのTNF産生能の上昇には、このMphiにおける活性化/成熟化の亢進が関わっている可能性が示唆された。また、LPS刺激後2時間のカゼイン誘導腹腔MphiでのTNFmRNAを、Northern blot analysisにより比較したところ、両食餌群間で差はなかった。TNF遺伝子発現以降の段階が、食餌脂肪酸により影響されている可能性が示唆された。今後、定量的PCR法を用いてより詳細に検討する予定である。
男性性機能障害患者における内分泌攪乱物質感受性ハプロタイプの同定

エストロゲン受容体α型遺伝子(ESR1)特定ハプロタイプが日本人のみならずイタリア人においても男児外陰部異常症発症と関連することを明らかにした。そして、感受性ハプロタイプの構造解析を行った結果、感受性ハプロタイプから3'側に22 bpのみ離れた部位で感受性ハプロタイプと絶対連鎖不平衡である2,244 bpのイントロン内微小欠失を同定した。一方、精子形成障害とエストロゲン受容体β型遺伝子の間に関連は見出されなかった。1.イタリア人男児外陰部異常症患者におけるエストロゲン受容体α型遺伝子(ESR1)ハプロタイプ解析日本人において男児外陰部異常症発症との関連が見出されたESR1特定ハプロタイプがイタリア人においても男児外陰部異常症発症と関連するか否か検討するために,イタリア人男児外陰部異常症患者(停留精巣患者80例,尿道下裂患者13例)93例とイタリア人正常男性150例を対象にESR1特定ハプロタイプが存在する領域に分布するSNP5個(ESR1 SNIP10-14)の遺伝子型をTaqman法で決定しハプロタイプ解析を行った。その結果,患者および対照において,日本人と同様,ESR1 SNIP10-14を含む領域にハプロタイプブロックが同定された。そして,日本人において男児外陰部異常症発症との関連が見出されたESR1特定ハプロタイプがイタリア人においても男児外陰部異常症発症と関連する(p=0.0062)ことが明らかとなった。この成績は,男児外陰部異常症発症において内分泌撹乱物質に対する個体の遺伝的感受性が関与することを人種を超えて示唆するものである。2.日本人精子形成障害患者におけるエストロゲン受容体β型(ESR2)ハプロタイプ解析日本人精子形成障害患者55例,日本入正常男性50例を対象に,ESR2遺伝子全長にわたって,等間隔で配置され,アリル頻度が15%以上であるSNP9個(ESR2 SNP1-9)の遺伝子型をTaqman法で決定し,ハプロタイプ解析を行った。その結果,患者および対照において,ESR2 SNP3-7を含む領域にハプロタイプブロックが同定された。そして,ハプロタイプブロックを構築するハプロタイプに対し,患者-対照者間で相関解析を行ったが有意差は認められなかった。今後,解析対象SNPを増やしてハプロタイプ解析を行うほか,男児外陰部異常症患者においても同様の解析を行う方針である。1.男児外陰部異常症発症感受性エストロゲン受容体α型遺伝子(ESR1)特定ハプロタイプの構造解析男児外陰部異常症患者におけるESR1ハプロタイプ解析により見出された感受性ハプロタイプの機能を解明するためにハプロタイプ領域の構造解析を行った。具体的には、ESR1感受性ハプロタイプホモ接合体2例とESR1感受性ハプロタイプを持たない2例を対象として、ESR1感受性ハプロタイプ領域(約34kbp)を直接シークエンス法で解析し、両者の配列を比較した。その結果、感受性ハプロタイプから3'側に22bpのみ離れた部位で2,244bpのイントロン内微小欠失が同定された。そして、日本人男性性機能障害患者および正常男性において、微小欠失の有無と感受性ハプロタイプの有無が一致すること、すなわち微小欠失と感受性ハプロタイプが絶対連鎖不平衡状態であることを見出した。以上の成績は、ESRJ遺伝子イントロン内微小欠失が男児外陰部異常症発症感受性亢進を招く構造変化であることを示唆するものである。2.日本人精子形成障害患者におけるエストロゲン受容体β型遺伝子(ESR2)ハプロタイプ解析日本人精子形成障害患者77例および日本人正常男性74例を対象としてESR2遺伝子全長にわたって、等間隔で配置され、アリル頻度が15%以上であるSNP10個(ESR2 SNP1-10)の遺伝子型をTaqman法で決定し、ハプロタイプ解析を行った。その結果、患者および対照において、ESR2 SNP3-7を含む領域にハプロタイプブロックが同定された。そして、ハプロタイプブロックを構築する主要な4種類のハプロタイプに関して患者-対照者間でハプロタイプ解析を行ったところ、最も高頻度であったハプロタイプについて、優性効果モデルにおいて低いP値(P=0.062)が得られた。しかし、permutation testにより多重検定の補正を行ったところ、このP値は有意水準(P=0.0040)を下回る値ではないことが判明した。
MMP,TIMP遺伝子導入による口腔扁平上皮癌転移機構の解析と転移制御への応用

遺伝子導入培養口腔扁平上皮癌細胞株と非導入株をヌードマウスの舌に移植し、以下の検索を行った。1)MMP-2,-9,MT-MMPとTIMP-1,-2の発現状態を凍結切片上で免疫組織学的に検索し2群間の差異を検討した。2)MMP-2,-9,MT-MMP, TIMP-1,-2の発現の発現状態についてin situ hybridizationの手法を用いて2群間の差異を検索した。3)各種MMPs, MT-MMP, TIMPsならびに各種サイトカインの局在を免疫電顕レベルで検索した。4)MMP-2,-9,MT-MMPならびにTIMP-1,-2のmRNAの発現状態を解析した。5)MMP-2,-9,MT-MMP, TIMP-1,-2の発現ならびに活性化をゼラチンザイモグラム、ウエスタンブロットにて解析した。6)遺伝子導入癌細胞での各種サイトカインの発現状態をRT-PCR法にて解析した。以上の研究結果より、遺伝子導入培養口腔扁平上皮癌細胞株と非導入株でのMMP, TIMPの産生、活性化状態を比較検討し、これら酵素の相互作用機序、ならびに腫瘍転移における役割について検討した。さらに、TMP遺伝子導入による口腔扁平上皮癌の転移阻止の可能性について検討した。結果:(1)MMP-2,MMP-9,MT1-MMPの発現が腫瘍の転移に重要な役割を演じていることが確認された。(2)高転移腫瘍株においてもTIMP-1,TIMP-2遺伝子の導入によって転移能の抑制が可能であることが示唆された。(3)MMP阻害剤の投与が腫瘍の発育抑制ならびに転移の予防に効であることが示唆された。これまで検索してきた口腔癌由来の培養細胞株10株(高転移株:6、低転移株:4)を用い、これら細胞にMMP-2,MMP-9,MT-MMP,TIMP-1,TIMP-2の遺伝子を導入し、導入された細胞株と導入前の細胞株について以下の比較検討を行った。1)MMPsならびにTIMPsの発現状態を免疫組織染色ならびに免疫電顕レベルで比較検討した。2)MMPsならびにTIMPsのmRNAの発現状態をノーザンブロットにて解析し比較検討した。3)遺伝子導入細胞株ならびに非導入細胞株の培養上清ならびに培養細胞でのMMPs,TIMPsの発現状態、活性化をゼラチンザイモグラム、ウエスタンブロットにて解析し比較検討した。4)培養線維芽細胞株に遺伝子導入培養口腔扁平上皮癌細胞株の培養上清を加え、MMP,TIMPの発現状態の変化をゼラチンザイモグラム、ウエスタンブロットにて検索し、両者間の相互作用について検討した。5)遺伝子導入細胞株ならびに非導入細胞株の培養上清ならびに培養細胞での各種サイトカイン(TGF-α,β,TNF-α,IL1β,IFN-Υ)の発現状態をウエスタンブロットならびにRT-PCR法にて検索し、これら因子の相互作用について解析した。6)フローサイトメトリーにて遺伝子導入培養口腔扁平上皮癌細胞株での各種MMPs,TIMPsの発現程度を検索し、非導入株のデーターと比較検討した。平成12年度の実験で遺伝子導入状態とその性状について検討した遺伝子導入培養口腔扁平上皮癌細胞株と非導入株をヌードマウスの舌に移植し、両群を細胞移植20日後に屠殺し、組織学的に頚部リンパ節、肝、肺への転移の有無を確認し、さらに移植部位ならびに転移巣について以下の検索を行った。1)MMP-2,-9,MT-MMPとTIMP-1,-2の発現状態を各々のモノクローナル抗体を用いて凍結切片上で免疫組織学的に検索し、2群間の差異を検討した。

2)MMP-2,-9,MT-MMP, TIMP-1,-2の発現の発現状態についてin situ hybridization,ならびにPCR-in situ hybridizationと免疫組織染色の二重染色の手法を用いて2群間の差異を検索した。3)各種MMPs, MT-MMP, TIMPsならびに各種サイトカインの局在を免疫電顕レベルで2群間の差異を検索した。4)血清、血漿を採取し、これに含まれるMMP-2,-9ならびにTIMP-1,-2の量をエンザイムイムノアッセイにて測定し、2群間の差異を検討した。さらに、腫瘍組織での発現量を同様の方法にて測定した。5)MMP-2,-9,MT-MMPならびにTIMP-1,-2のmRNAの発現状態をノーザンブロットにて解析した。6)MMP-2,-9,MT-MMP, TIMP-1,-2の発現ならびに活性化をゼラチンザイモグラム、ウエスタンプロットにて解析し、両群での差異を検討した。7)遺伝子導入癌細胞での各種サイトカイン(TGF-α, β, TNF-α, IL1β, IFN-γ)の発現状態をRT-PCR法にて解析した。以上の研究結果より、遺伝子導入培養口腔扁平上皮癌細胞株と非導入株でのMMP, TIMPの産生、活性化状態を比較検討し、これら酵素の相互作用機序、ならびに腫瘍転移における役割について検討した。さらに、TIMP遺伝子導入による口腔扁平上皮癌の転移阻止の可能性について検討した。
消化器癌の発生に関わるヘッジホッグ経路のエピジェネティクな制御機構の解析

RT-PCRによりShhおよびShhシグナル分子のmRNAを、またShhに対する特異的抗体を用いたWestern blot法および免疫染色法によりタンパク質の発現を解析したところ、多くの細胞株でShhやそのシグナル経路の発現を認めた。2)Shh過剰発現による細胞制御機構の解析ShhをPCR法にてクローニングし、Shh発現ベクターを作成した。各種消化器癌細胞株にShh発現ベクターを遺伝子導入し、細胞形態や細胞増殖能の変化を観察したところ、明らかな変化は認められなかった。3)Shhのプロモーター領域の解析Shhのプロモーター領域の配列をゲノムよりPCR法にてクローニングした。消化器癌にて高発現がみられるクロマチン結合因子のShhプロモーターへの結合性を、in vitroにおいてバンドシフト法で、in vivoにおいてクロマチン免疫沈降で検出した。またShhのプロモーター領域を含むルシフェラーゼベクターを作成し、ルシフェラーゼアッセイによりそのプロモーター活性を検出した。4)クロマチン結合因子とShh発現量の関連性消化器癌細胞株においてクロマチン結合因子をsiRNA導入によりノックダウンし、特異的抗体を用いたWestern blot法によりそのノックダウン効果を定量した。さらにクロマチン結合因子ノックダウンによるShh発現量の変化をreal time RT-PCRや特異的抗体を用いたWestern blot法により定量したところ一部に変化がみられた。
外部応答性ナノシート材料の創製と細胞への適応性

外部(光)刺激応答性分子を利用し、光応答性材料を設計し、作製した。ナノ材料に修飾する光応答性分子は、生体膜内などで組織化している分子に対して相互作用するように考慮して設計し、合成した。作製した光応答性ナノ材料に光刺激を与えることによって、二分子膜中の組織化した分子に対してナノ材料上の光応答性分子が局所的な応答挙動を誘発させ、組織化した分子の配向構造を破壊することに成功した。さらに、枯草菌など細菌の増殖過程に上記光応答性材料を添加して、細胞膜の分子配向状態の乱れを誘発し、光照射時の細菌(細胞)増殖抑制効果を評価した。修飾用アゾベンゼン化合物(MAz)の合成とナノシートへの修飾:これまでのサーモトロピック液晶中での研究結果を踏まえて、ナノシートの修飾に適したトリエトキシシラン基を有するpush-pull型アゾベンゼン化合物の合成を行ない、目的とした化合物MAzを得た。ニオブ化合物ナノシートまたは酸化グラフェンナノシートをMAz溶液に浸漬して、加熱・反応させ、MAzをナノシートに修飾した。また、光応答挙動の評価における参照粒子とするために、MAz修飾マイクロ粒子を調製した。ナノシート上においても、MAzの光応答性が観測された。ナノシート上のMAz修飾量が光応答挙動に影響していることが示唆されたため、分光学的および熱力学的評価により比較検討を行なった。しかし、ナノシートにおいては検討が困難であったため、主にマイクロ粒子を用いてMAz修飾量などの評価を行った。リオトロピック液晶系におけるMAz修飾ナノシートの刺激応答挙動および相変化挙動の評価:リン脂質ベシクル分散系を採用して、MAz修飾ナノシートの刺激応答性を評価した。蛍光色素を内包したベシクルからの蛍光挙動変化を検出することにより、ベシクル構造体の分子構造変化を評価した。その結果、MAzと膜分子との相互作用が弱いことが示唆されたため、より強い相互作用を有するアゾベンゼン化合物を得るための分子設計が必要性となった。そこで、分子内にコレステロール基を有するアゾベンゼン化合物MCAzを新たに合成した。MCAzを用いて検討した結果、内包蛍光色素の放出挙動は僅かに変化した。再現性も含めて、さらなる検討が必要である。MAz修飾ナノシート存在下刺激応答による細菌増殖挙動評価:リオトロピック液晶系における検討において予定より時間を要したため、MAz修飾ナノシート材料を添加した培養実験系における主な評価は次年度とした。(2)リオトロピック液晶系におけるMAz修飾ナノシートの刺激応答挙動および相変化挙動の評価:前年度に引き続き、蛍光色素を内包し、アゾベンゼン分子を含んだベシクル分散液の蛍光挙動を検出する手法を用いて、MAzのモデル分子mAz分子の光刺激応答挙動を評価した。数種類のmAz分子を用いた評価結果より、mAz分子の形状および分子長がベシクル分子膜の不安定化に影響し、膜構造を一部破壊できることが示唆された。さらに、mAz分子を含むリオトロピック液晶の相変化挙動を偏光顕微鏡観察下で観察し、評価した。蛍光色素を用いた評価法と同様にAz分子の形状および分子長がベシクル分子膜の不安定化に影響することが示唆された。これらの結果は修飾用アゾベンゼン化合物の再設計に有用な情報である。(3) MAz修飾ナノシート存在下刺激応答による細菌増殖挙動評価:大腸菌系においては、評価法の検討を実施した。光照射実験に適し、増殖抑制性の評価が可能である評価法を選定した。可視光照射下での培養を検討した結果、高強度光照射下で菌自身の減菌性が確認された。照射強度の最適化が必要となり、照射手法および評価法の条件検討を行った。枯草菌系の培養実験について、培養条件などの条件設定について検討した。(4)修飾用アゾベンゼン化合物MAzの再設計と刺激応答による細菌または細胞系での評価:リオトロピック液晶系実験の結果を踏まえて、分子形状および分子長を考慮したMAz分子を再設計した。細菌増殖挙動評価において、可視光照射下での培養を検討した結果、高強度照射下でAz無添加系においても減菌性が確認された。この結果、照射手法および評価法の条件検討に時間を要した。これに関連する実験項目(3)MAz修飾ナノシート存在下刺激応答による細菌増殖挙動評価において、計画実施にやや遅れが出ているが、全研究期間内には研究目的の達成のための全研究計画を遂行できると考えている。(3)アゾベンゼン(MAz)修飾ナノ材料存在下での刺激応答による細菌増殖挙動評価:光照射下における細菌増殖挙動の評価法を確立した。前年度の結果として、アゾベンゼン無添加系においても可視光照射下で細菌増殖抑制が確認された。これを改善するため、光照射強度などの測定条件と評価法を再検討して、光照射下での大腸菌または枯草菌の培養実験系を確立した。MAz修飾材料を添加して、光照射による細菌増殖挙動を評価した。刺激応答性の向上および抑制機構の解明を行った。(4)修飾用アゾベンゼン化合物(MAz)およびMAz修飾ナノ材料の再設計と細菌増殖抑制実験での評価:前年度までのサーモトロッピック液晶系およびリオトロピック液晶系における結果より、push-pull型アゾベンゼン誘導体が修飾用光刺激応答性化合物として有用であることが示唆された。このことから、細胞増殖抑制評価においても、push-pull型誘導体を採用した。

また、これまでの研究結果より、炭素系ナノシート材料は母材自体に光吸収特性を有し、光応答評価に適さないことがわかった。評価時の母材から影響を抑えるために母材としてシリカ粒子を引き続き採用した。以上のような研究知見から、push-pull型アゾベンゼン誘導体を修飾したシリカ粒子を調製し、細菌増殖抑制評価実験に採用した。母材上でのアゾベンゼン部位の光応答性を確認するとともに、粒径の異なるシリカ粒子を母材として利用して、母材サイズが及ぼす影響についても比較し、評価した。外部(光)刺激応答性分子を利用し、光応答性材料を設計し、作製した。ナノ材料に修飾する光応答性分子は、生体膜内などで組織化している分子に対して相互作用するように考慮して設計し、合成した。作製した光応答性ナノ材料に光刺激を与えることによって、二分子膜中の組織化した分子に対してナノ材料上の光応答性分子が局所的な応答挙動を誘発させ、組織化した分子の配向構造を破壊することに成功した。さらに、枯草菌など細菌の増殖過程に上記光応答性材料を添加して、細胞膜の分子配向状態の乱れを誘発し、光照射時の細菌(細胞)増殖抑制効果を評価した。修飾用アゾベンゼン化合物MAzの合成とナノシートへの修飾において、トリエトキシシラン基を有するpush-pull型アゾベンゼン化合物の合成を行ない、ナノシートへの修飾を目的とした化合物MAzを得ることができた。ナノシートに対してMAzの修飾に成功した。また、ナノシート上においても、MAzの光応答性を観測した。MAz修飾ナノシートを含んだ蛍光色素内包ベシクルにおける蛍光挙動変化を検出する手法を用いて、ベシクル構造体の分子構造評価を行なった。膜分子とのより強い相互作用を目指して、分子内にコレステロール基を有するアゾベンゼン化合物MCAzを新たに合成した。再現性の確認が必要であるが、MCAzを用いた検討の結果、ベシクル構造体の分子構造における光応答性を確認することができた。(3) MAz修飾ナノシート存在下刺激応答による細菌増殖挙動評価:光照射下における細菌増殖挙動の評価法を確立させる。リオトロピック液晶系の結果を基に、単細胞細菌である、大腸菌または枯草菌の培養実験系を確立した上で、MAz修飾ナノシート材料を添加して、刺激照射による細菌増殖挙動を評価する。(4)修飾用アゾベンゼン化合物MAzの再設計と刺激応答による細菌または細胞系での評価:上記、細菌増殖評価実験の結果、刺激応答の有無が検出された場合は、その細菌の生体膜の相互作用に最適となる官能基を探索して、修飾用MAzを再設計して合成する。刺激応答性の向上および機構の解明を行う。光機能材料(2)リオトロピック液晶系における(MAz)修飾ナノシートの刺激応答挙動および相変化挙動の評価:引き続き、蛍光色素内包ベシクル分散液の蛍光挙動を検出する手法を用いて、MAz修飾ナノシートの刺激応答性を評価する。偏光顕微鏡観察または蛍光顕微鏡観察下でアゾベンゼン修飾ナノシートに可視光レーザー光を照射して、ベシクル構造体の膜挙動、内包蛍光色素の放出挙動などを評価する。レーザー光の強度依存性、UV光などの異なる波長の光照射における評価についても実施する。(3) MAz修飾ナノシート存在下刺激応答による細菌増殖挙動
周波数領域適応手法による時間遅延にロバストなインパルス応答同定法に関する研究

インターネットなどに代表される計算機ネットワークや、地上系に比較して伝送距離が長距離となる衛星回線は、信号処理システムから見た場合、大きな固定遅延を有し、かつ時間遅延が変動する伝送路に見えるという性質がある。以上のような伝送路を含む系に対し適応フィルタを応用する場合、時間遅延にロバストな性質を有する適応フィルタが必要となる。この問題に対し、周波数領域サンプリング定理に基づく新しい周波数領域適応手法を提案した。本研究課題では、MチャネルのエリアスフリーDFT(discrete Fourier transform)フィルタバンクを用いて、M個の適応係数により周波数領域でシステム同定を実行する。このとき、時間遅延の変動をDFTが有する規則的な周期性により吸収することにより、遅延にロバストな適応システムを構築可能であることを示した。また、提案法を適応フィルタを用いた近似逆システムの設計問題に利用することにより、従来法で必要であった、適切な値の固定遅延Dを適応系に挿入することが不要となることを示した。これにより、近似逆システムの推定時における自由度を拡大することが可能となった。インターネットに代表される計算機ネットワークや、地上系に比較して伝送距離が長距離となる衛星回線は、信号処理システムから見た場合、大きな固定遅延を有し、かつ時間遅延が変動する伝送路に見えるという性質がある。本課題では、衛星回線にエコーキャンセラを設置する場合を想定し、未知インパルス応答が単純遅延部と主応答部で構成される場合のインパルス応答推定問題に、周波数領域の適応手法を適用する手法を提案した。提案法では、単純遅延の値が異なる場合でも、適応アルゴリズムの収束特性に影響がほとんど生じないこと・適応係数の個数は主応答部に相当する少ない個数で充分であることなどの特徴を明らかにした。さらに、適応フィルタを用いて近似逆システムの推定を行う手法への提案法の適用についても検討を開始している。従来の時間領域のアルゴリズムを用いた推定法の場合、対象伝達関数の近似逆システムを因果性を満たす系として適応フィルタで推定するために、推定系に適切な値の固定遅延を挿入する必要があった。この固定遅延の値が適切でない場合、適応フィルタが収束しないなどの問題があることが知られている。提案法を適用した場合、固定遅延の有無は適応アルゴリズムの収束性には無関係となることを実験的に示した。提案法では、固定遅延を挿入しないことの代償として、近似逆システムのインパルス応答が円状シフトして求められるが、適応アルゴリズムのタップ数に等しい回数の円状シフト結果の中に正しい解が含まれていることが保証されている特徴がある。
交流磁場中で著しく自己発熱する金属コーティング磁性微粒子の開発

本研究では、癌の新しい温熱治療法として提案されている『誘導焼灼治療』を実用化させるため、1交流磁場中で著しく自己発熱するフェライト微粒子の開発、および2交流磁場加熱における新たな発熱メカニズムの学術的解明を行なう。また、本研究では発熱能力の優れたフェライト材料に対し、金属系薄膜コーティングを行うことで発熱能力の更なる向上を目的としており、当該年度において試験的にFeFe2O4へのTi系液相コーティングを行い、交流磁場中での発熱能力が向上することを確認することができた。本研究はフェライト系磁性材料への金属コーティングを行い、交流磁場による自己発熱能力の向上を目指すものである。H30年度は、コーティングを行う前のフェライト粒子自体の発熱能力の向上を目的としており、逆共沈法・錯体重合法により発熱能力が向上する最適な合成条件を明らかにすることに成功した。また、コーティングの効果を検証するため、試験的にマグネタイト微粒子を合成し、TiO2による液相コーティングを行った結果、当初の研究計画において期待していた通りマグネタイト複合粒子の発熱能力の向上に成功している。そこで、H31年度にはMgFe2O4あるいはY3Fe5O12ナノ粒子の合成を行い、H32年度に金属コーティングを行うことで発熱能力の向上と発熱メカニズムの解明に挑戦する。上述のとおり、H30年度にはマグネタイトナノ粒子の合成と液相法によるTiO2コーティング複合粒子の開発を行い、発熱能力の向上に成功している。そこで、次のステップとしてマグネタイトより優れた発熱能力を有するMgFe2O4およびY3Fe5O12に着眼し、それぞれのナノ粒子化を行うとともにマグネタイトと同様にコーティング複合粒子の作製を行う。具体的には、まず逆共沈法により前駆体粉末を合成し、水熱合成により発熱能力の優れたナノ粒子の合成を行う。次いで、液相法によるコーティング複合粒子を合成するとともに、交流磁場中での発熱能力評価を行い、発熱メカニズムの解明に挑戦する。また、現在Mongolian Academy ofScienceの共同研究者と連絡を取り合い、中性子線回折によるフェライト粉末試料の構造解析を依頼しており、磁気構造と発熱能力の関係について学術的に明らかにしていく予定である。Y3Fe5O12を合成する原料となる硝酸イットリウム6水和物がレアアースであり、現在価格が高騰し、納品・入荷時期も不確定ということから購入することができなかった。翌年度には同試薬を早々に購入するよう試みるとともに、初めて水熱合成を行うための装置類その他試薬類を購入する。また研究成果発表のため旅費を計上する。
マイクロX線CTによる証拠資料に付着した皮膚片の同定法とDNA型検出性の検討

本研究では、マイクロX線CT観察という新技術を、現場に遺留した皮膚片の同定に応用できるかを明らかにする。また、マイクロX線照射がDNA型検出に与える影響の有無について確認した上で、観察される皮膚片の量とDNA型の検出性との関連性を明らかにする。本研究により、現場遺留皮膚片を非破壊で定量的に同定できるようになる。また、採取担体に付着した皮膚片の3次元的な分布を知ることで、再鑑定に配慮して残すべき部分とDNA型検査に供する部分とを適正に選別できるようになる。
都市部在住高齢者への前向き調査による運動習慣の獲得と転倒予防に関連する要因の検討

本研究では, 200911年の期間に都市部在住高齢者を対象とした転倒骨折予防実践講座(以下,講座)を開催し,体操や転倒予防に関する講話等を含む包括的な介入プログラムの提供と運動習慣の獲得に向けた動機付けを行った.その上で,講座参加者64名の運動状況と,運動状況が転倒や転倒恐怖感に及ぼす影響について12週間の追跡調査を行い,以下の成果を得た.講座前に比べて12週後では,歩行及びストレッチを毎日行う者の割合が有意に高く,且つ実施頻度も有意に高かったことから,本講座への参加は高齢者の運動の習慣化を促す可能性が示された.一方,運動状況と転倒及び転倒恐怖感との関連は認められなかったため,この点の検討は今後の継続課題であると考えられた.本研究では, 200911年の期間に都市部在住高齢者を対象とした転倒骨折予防実践講座(以下,講座)を開催し,体操や転倒予防に関する講話等を含む包括的な介入プログラムの提供と運動習慣の獲得に向けた動機付けを行った.その上で,講座参加者64名の運動状況と,運動状況が転倒や転倒恐怖感に及ぼす影響について12週間の追跡調査を行い,以下の成果を得た.講座前に比べて12週後では,歩行及びストレッチを毎日行う者の割合が有意に高く,且つ実施頻度も有意に高かったことから,本講座への参加は高齢者の運動の習慣化を促す可能性が示された.一方,運動状況と転倒及び転倒恐怖感との関連は認められなかったため,この点の検討は今後の継続課題であると考えられた.本研究では転倒骨折予防講座の開催により,運動,転倒予防に対する啓蒙,フットケアおよび栄養の指導等からなる包括的な介入プログラムを都市部に居住する高齢者に提供し,講座参加後における調査対象者の運動の実施状況や運動に関する認識を記述すること,及び,上記の講座への参加が調査対象者の転倒予防に向けた運動習慣の獲得におよぼす影響について明らかにすることを目的としている.特にこの研究では,運動習慣の獲得を目指し,カレンダー式の記録用紙を講座の参加者に配布し,その記入を促す取り組みを行うことで生じる変化を把握することに焦点を当てている.平成21年度は6月に,著者の所属施設における研究倫理審査委員会への申請を行い,研究に着手できる準備を整えた.その上で,7月頃には,都市部在住高齢者に対して上記の講座開催に関わるチラシを配布し,調査対象者の公募を行った,さらに,9月末10月の期間には,上記の講座を東京都内で計4日間にわたって開催した.講座には36名の高齢者の参加があり,主としてストレッチや運動の仕方など,転倒予防に役立つ情報を提供した.また,講座終了後3カ月目には,フォローアップを目的とした講座を再度開催するとともに,運動習慣の獲得状況に関わるデータを収集した.平成22年度は,昨年度と同様のスケジュールならびに方法で,上記の講座を開催しデータ収集を引き続き行っていく,それとともに,データ分析が行えるよう準備をすすめていく計画である.また,データ収集や講座開催と並行して運動や転倒予防をキーワードとした文献検討を行い,研究成果の公表に向けた準備も進めていく.本研究の目的は、都市部在住高齢者の運動習慣の獲得に影響する要因について明らかにすることである。平成22年度は「転倒骨折予防実践講座(以下、実践講座とする)」を開催し、体操や転倒予防に関する講話等から構成された包括的なプログラムを提供するとともに、日々の運動状況を記録するための運動カレンダーを配布することにより、運動習慣の獲得に向けた動機づけを都市部在住高齢者に対して行った。加えて、運動カレンダーの記載内容を追跡調査することにより、講座開催期間における参加者の運動の実態について検討した。平成21・22年度に開催した実践講座の参加者は52名であった。このうち、実践講座の開始初日から4週間にわたる運動カレンダーの追跡調査を実施できたのは42名であった。その内訳は、男性8名(19.0%)、女性34名(81.0%)で、平均年齢は75.8歳±6.5歳であった。参加者の運動実施状況について調べたところ、講座開始初日から4週間にわたり毎日運動を実施できた者は7名(16.7%)であった。また、1週間に2日以上の意図的な身体活動を4週間継続して行うことができた者(以下、運動継続者とする)は42名中25名(59.5%)であり、その内訳をみると6574歳の者が14名(56.0%)、75歳以上の者が11名(44.0%)を占めていた。平成19年度国民健康栄養調査では、1年間にわたり1回30分以上の運動を週2日以上継続して実施している者の割合について、6574歳では42.6%、75歳以上は28.5%と報告している。本研究における追跡期間は前述の調査よりも短かったものの、運動継続者に関する高い割合が示された。今後は、他の先行研究との比較等を行いながら都市部在住高齢者の運動の実態の詳細をつかんでいくようにする。【目的】本研究の目的は,「転倒骨折予防実践講座(以下,講座)」に参加した高齢者の運動状況を前向きに調査し,運動の習慣化に影響を及ぼす要因を明らかにするとともに,運動の習慣化と転倒との関連について検討することである,【方法】(1)対象者と講座の開催

方法:65歳以上の都市部在住高齢者を対象として週1回120分の講座を4週連続で実施し,12週後,54週後の2回のフォローアップを含め計6回開催した.毎回の講座では健康教育等に加え,3040分の運動プログラムを提供した.(2)調査の内容と方法:講座開始前,12週後に質問紙調査と計測を行い,対象者の運動状況等を把握した.(3)分析方法:講座開始前と12週後における歩行,ストレッチ,筋力トレーニングの3項目(以下,運動3項目)を習慣的に行う者の割合の比較にはマクネマー検定を,12週後に運動3項目を習慣的に行う者の割合と転倒経験や転倒恐怖感を持つこととの関連の検討には,Fisherの直接法を用いた.【結果】本研究の対象となった高齢者64名の平均年齢は75.7±6.3歳で,女性が55名(85.9%)を占めた.運動3項目を習慣的に行う者の割合は,歩行が講座開始前34名(54.0%),12週後41名(66.1%),ストレッチが講座開始前11名(17.5%),12週後23名(35.9%)で,講座開始前に比べて12週後に先の2項目を習慣的に行う者の割合が有意に高かった.しかし,12週後における運動3項目を習慣的に行う者の割合と転倒の経験や転倒恐怖感を持つこととの有意な関連は認められなかった.【考察】本研究において,運動を習慣的に行うことと転倒の経験や転倒恐怖感を持つこととの有意な関連は認められなかったが,講座開始前に比べて12週後には運動を習慣的に行う者の割合が有意に増していた.したがって,運動を習慣的に行うことへの影響要因については引き続き検討していく必要があると考えられた.
ペプチドーム解析より得られた内在性ペプチド群からの新規抗菌ペプチドの探索

近年、薬剤耐性菌の院内感染が問題となっている。この耐性菌に対する抗菌薬候補として抗菌ペプチドが挙げられる。本研究では新規抗菌ペプチドの同定を目的として、ペプチドーム解析で同定したペプチドに対して抗菌活性を指標にスクリーニングを行い、AMP-IBP5を含め2種の新規ペプチドを発見した。AMP-IBP5は2つのCys残基が分子内架橋し、C末端がアミド化された22残基のペプチドで、β-ディフェンシン-2より強い抗菌活性を示し、新薬候補となりえる。実用的な新規抗菌薬の開発を将来的な目標として、本研究ではその材料となる新規抗菌ペプチドの同定を第一目標とする。ペプチドーム解析(組織、細胞に存在するペプチドの網羅的解析)から得られた内在性ペプチド(単なるタンパク質の分解物でなく、プロセシングによって生じるペプチド)群からの新規抗菌ペプチドの探索では、in silicoでの予測などの従来法では実在が予測できなかったペプチドを候補ペプチドとして選定できる利点がある。当該年度では、60種の候補ペプチドから、抗菌活性を指標にスクリーニングを行い、2種の新規抗菌ペプチド(抗菌ペプチド1、2)を同定した。面白いことに、抗菌ペプチド1は、タンパク質として生物活性をもつ、機能タンパク質から生成していた。従来、機能タンパク質から活性ペプチドが生成するとはほとんど考えられていなかったので、抗菌ペプチド1の発見は、活性ペプチドの探索に新たな可能性を示唆する点で重要である。一方、実用化に向け、グラム陽性細菌4種、グラム陰性細菌3種、真菌1種に対する抗菌スペクトルを測定した。抗菌ペプチド1は8種の菌の内6種に対して強い抗菌活性を、抗菌ペプチド2は真菌に対してのみ活性を示した。これらの抗菌ペプチドは赤血球溶血活性を示さないことから、細胞毒性はないと考えられる。また、抗菌ペプチド1はラット脳、下垂体、小腸に実在していた。以上のことから、特に抗菌ペプチド1は新規抗菌薬の材料となる可能性を秘めており、現在、特許出願中である。実用的な新規抗菌薬の開発を将来的な目標として、本研究ではその材料となる新規抗菌ペプチドの同定を第一目標とした。抗菌ペプチドの多くが塩基性アミノ酸を多く含む分泌ペプチドであることに着目して、培養細胞から分泌される塩基性ペプチドを網羅的に同定し、生物種間での保存性などを基準にペプチドを選定、合成し、抗菌活性を指標に活性ペプチドのスクリーニングを行った。その結果、昨年度に新規抗菌ペプチド(AMP-IBP5)を発見した。当該年度は実施計画に従い、実用化に向け抗菌スペクトルを測定した。具体的には、グラム陽性細菌4種、グラム陰性細菌3種、真菌1種に対する抗菌活性を測定した。AMP-IBP5は調べた8種の菌の内6種に対してヒトβ-ディフェンシン2より強い抗菌活性を示した。一方、哺乳類細胞への細胞傷害性は観察されなかった。したがって、新規抗菌薬の材料となる可能性を秘めており、現在、国際特許出願中である。AMP-IBP5は成長因子結合タンパク質であるIGFBP5から生成するペプチドで2個のCys残基が分子内架橋している。しかし、同じファミリータンパク質であるIGFBP4やIGFBP6の対応するCys残基は架橋されていないことから、in silicoでの予測などの従来法では実在が予測できなかったペプチドである。このことからペプチドーム解析(組織、細胞に存在するペプチドの網羅的解析)から得られた内在性ペプチド(単なるタンパク質の分解物でなく、プロセシングによって生じるペプチド)群から新規抗菌ペプチドを探索するという本研究のアプローチの有用性が示された。実際、AMP-IBP5はラット脳、下垂体、小腸に実在するのも確認した。これらの研究成果は国際的な学術誌(Journal of Proteome Research)に報告した。
難合成糖鎖受容体を分子模倣した修飾ペプチドの活性機構解明

天然リガンドの代わりに認識される分子を合理設計するため、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン(HA)を標的としたペプチドの相互作用解析を行った。糖鎖受容体の代わりに認識されて感染阻害を行う糖修飾ペプチドのHAおよび感染細胞との相互作用解析を行った。糖修飾ペプチドは設計通りHAの糖鎖結合受容体に結合することがわかったが、ペプチド共存下で細胞のエンドサイトーシスを抑制させても感染が抑制されず、HAとの相互作用が感染阻害活性に直接関わっていないことが示唆された。これらの結果は、糖修飾ペプチドが細胞内での膜融合を阻害している可能性を示し、新規な阻害機構を有するペプチドリガンドとして期待出来る。天然リガンドの代わりとしてタンパク質に認識されるペプチドリガンドaltered peptide ligands (ATPLs)を設計する手法を確立することを目指し、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン(HA)に対して結合するペプチドとの相互作用を解析した。[1]組換えHAおよびペプチドの調製:ペプチドとの相互作用の精度の高い熱力学パラメータを得るため、高病原性ウイルスであるH5型HAを大腸菌で発現させ、高純度な組換えタンパク質を得た。H5型HAは全長566残基であるが、リフォールディング作業等を考慮して糖鎖受容体部位を含む330残基程度のHA1ドメインのみとした。リガンドであるペプチドは、以前に報告した5残基から15残基の配列、およびこれらの配列にビオチン化リジンを連結したペプチドをFmoc化学によって有機合成した。すべてのペプチドは、実験に必要な数mg程度の量を95%以上の純度で得ることができ、また質量分析によって目的物であることを同定した。[2]ペプチドとHAの相互作用解析:まず、アビジン-ビオチン複合体(ABC)法を行った。HAを96穴に固定化し、ビオチン化ペプチドを濃度依存的に相互作用させた。ペプチドのHAへの結合は酵素標識したアビジンで検出し、逆数プロットなどから解離定数Kdを算出した。ペプチドは期待通り、HAと結合することがわかった。そこで次により詳細な熱力学パラメータを測定するため、等温滴定型熱量測定(ITC)を行った。まずはすでにパラメータが報告されているレクチンと糖鎖の相互作用を測定した。期待通り、文献値とほぼ一致する結果が得られた。またペプチドとの相互作用を一例測定したところ、以前に得られているABC法によって得られたKd値と同程度の値が得られた。ITCによる測定は、今回新しく調整した組換えHAで可能であることが明らかになった。組換えタンパク質であるHAの発現およびリフォールディングは予定通り行うことができた。またペプチドの合成はすでに確立しているが、相互作用実験に必要なペプチドとビオチン化ペプチドの2種類を必要な配列についてそれぞれ合成することができた。また、組換えタンパク質とペプチドの相互作用をABC法によって結合活性を確認し、ITCによる測定の予備実験を行うことができた。インフルエンザウイルスのヘマグルチニン(HA)の糖鎖受容体の代わりに認識されるペプチドリガンドの相互作用解析および感染阻害機構の解明を行っている。高い感染阻害活性のある糖修飾ペプチドとHAの相互作用をアビジン-ビオチン複合体(ABC)法で解析したところ、HAに結合するとともに、さらにシアリルラクトサミンでこの結合が阻害されたことから、期待通り糖鎖の代わりにペプチドが認識されていることが明らかになった。しかしながら、ABC法で得られた値の逆数プロットから解離定数を算出したところ、糖修飾しないペプチドと糖修飾したペプチドで結合親和性が同じであることがわかった。糖修飾しないペプチドは感染阻害活性が低く、糖修飾によって感染阻害活性が向上する。この向上の理由は、糖修飾によって結合親和性が向上したと予想していたが、この仮説が否定された。そこで次に、糖修飾ペプチド共存下でエンドサイトーシスを抑制させ、その後プラークアッセイを行ったところ、感染が抑制されなかった。糖修飾ペプチドはやはりウイルスの吸着を阻害するわけではないことがわかった。一方、糖修飾ペプチド共存下で感染後4時間の細胞内ウイルスゲノム量をPCRで測定したところ、感染は阻害されていた。これらの結果は、糖修飾ペプチドによる感染阻害は、ウイルス感染過程の最初の吸着過程ではなく、次段階である膜融合が関わることが初めて示唆された。また、ペプチドとHAとの相互作用を等温滴定型熱量測定(ITC)で行い、予備なデータではあるが熱力学パラメータを得ることが出来た。またX線結晶構造解析に用いるため、大腸菌による組換えHA発現に加え、バキュロウイルスによる発現を行うための準備を行った。複数の相互作用データの積み重ねの結果、糖修飾ペプチドの阻害機構がウイルス吸着ではなく、膜融合であるとの新しい知見が得られた。いままで不明であった機構解明に新規な視点が加わり、解明研究を展開できる状況となった。また、ITCによる相互作用解析のため、H1型およびH3型HAの大腸菌による組換え発現および精製を続けている。少量ではあるが得られたHAとペプチドとの相互作用をITCによる解析したところ、予備的ではあるが熱力学パラメータを測定することができた。さらに原子レベルの解析を行うため、X線結晶構造解析のための準備を始めることができた。天然リガンドの代わりとしてタンパク質に認識されるペプチドリガンドを設計する手法を確立することを目指し、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンを標的としたペプチドを設計した。糖鎖受容体の代わりに認識されて感染阻害を行う活性の機構解析を行うため、これまでに最も高い感染阻害活性を示した糖修飾ペプチドのヘマグルチニンおよび感染細胞との相互作用解析を行った。

糖修飾ペプチドとヘマグルチニンと相互作用を測定したところ、糖修飾ペプチドはシアリルラクトサミン共存下で阻害され、設計通りヘマグルチニンの糖鎖結合受容体に結合することがわかった。しかしながら糖を修飾しないペプチドとその解離定数が変化しないこと、また糖修飾ペプチド共存下で細胞のエンドサイトーシスを抑制させると感染が抑制されないことがわかり、ヘマグルチニンとの相互作用が感染阻害活性に直接関わっていないことが示唆された。次に糖修飾ペプチド共存下でウイルス感染後に細胞内に取り込まれたウイルスゲノムを測定したところ、ウイルス感染の吸着過程ではなく、次段階の膜融合が関わることが示唆された。赤血球を用いた溶血試験を行ったところ、糖修飾ペプチド濃度依存的に溶血が阻害された。さらなる詳細な解析を行うため、等温滴定型熱量測定(ITC)およびX線結晶構造解析を見据え、組換えHA発現を大腸菌およびバキュロウイルスによる発現を行うための準備を行った。これらの結果は、糖修飾ペプチドがヘマグルチニンを介した細胞内での膜融合を阻害している可能性を示した。糖修飾ペプチドがHAに結合することでHAの安定性が向上し、膜融合の誘発に必須であるHAの構造変化が起きにくくなった可能性がある。ヘマグルチニンの受容体結合部位に相互作用する化合物が膜融合阻害活性を示す例はこれまでに報告がなく、新規な阻害機構を有するペプチドリガンドとして期待出来る。天然リガンドの代わりに認識される分子を合理設計するため、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン(HA)を標的としたペプチドの相互作用解析を行った。糖鎖受容体の代わりに認識されて感染阻害を行う糖修飾ペプチドのHAおよび感染細胞との相互作用解析を行った。糖修飾ペプチドは設計通りHAの糖鎖結合受容体に結合することがわかったが、ペプチド共存下で細胞のエンドサイトーシスを抑制させても感染が抑制されず、HAとの相互作用が感染阻害活性に直接関わっていないことが示唆された。これらの結果は、糖修飾ペプチドが細胞内での膜融合を阻害している可能性を示し、新規な阻害機構を有するペプチドリガンドとして期待出来る。組換えタンパク質であるHAはH5型のみであるため、H1型およびH3型についても発現ベクターから作製し、発現および調製を行う。またここで、HAの配列が異なるので発現やリフォールディング条件を検討する必要がある。ITCによるペプチドとHAとの相互作用を解析し、deltaGやdeltaH、deltaSなどの熱力学パラメータを測定することにより、計算機シミュレーションなどで必要な相互作用に関する情報の蓄積を行う。糖修飾ペプチドの阻害機構がウイルス吸着ではなく、膜融合であることが示唆されたことから、次に細胞実験を行い、この知見の確証を得る。H1型およびH3型HAの大腸菌による組換え発現および精製条件を確立し、大量にタンパク質を得てITC測定によって熱力学パラメータを同定する。
ユビキタスノードの多様な連携を実現する分散ソフトウェア連携バスの研究

多数の多様な情報機器・システムが、各種ネットワーク介して相互に接続されるユビキタス環境に於いて、各情報機器やシステムの柔軟な連携動作を可能とする分散ソフトウェアバス(分散OS)"LP49"を研究開発し、ソースコード並びにドキュメントをインターネット上で公開した。LP49は、(a)マイクロカーネルとマルチサーバからなる分散OS、(b)各機能やサービスは、"サーバント"と呼ぶ受動的部品と、"サーバ"と呼ぶ能動的部品として実現、(c)サーバントは、各種デバイスや共通サービス機能を実装し、サーバは、DOS,EXT2,RAMの各ファイルサーバなどを実装、(d)別ノード間で論理リソースをExport/Importする機能を実現して、高度な連携処理を可能にしたなどの特徴を持つ。今後のソフトウェア技術の鍵はシステム間連携である。従来のOSはネットワーク機能が後付けで設計されたので、連携処理の機能は十分とは云えない。本OSでは、各コンポーネントがメッセージを交換しあう形で、連携処理を簡潔に実現できることを狙っている。(1)コンポーネント構成OSの簡潔な実現:各OSサービスは、個々のユーザレベルプロセスとして実現しているので、プログラム開発が容易で、障害時もそのプロセスを再起動するだけで済み、頑強である。デバイスドライバプログラムもユーザレベルプロセスないで動くので、プログラム開発と障害時対処が容易化される。(2)ノード間の連携処理:Bell研のPlan9OSのオープンソースを活用して、ノード間でリソースディレクトリのexport/importによる高度で融通性に飛んだ連携処理の実現をすすめている。本システムのセールスポイントである。(3)各種デバイスドライバ:HDD, FDD, Ether, USBなどを実装した。多数の多様な情報機器・システムが、各種ネットワーク介して相互に接続されるユビキタス環境に於いて、各情報機器やシステムの柔軟な連携動作を可能とする分散ソフトウェアバス(分散OS)の研究開発を行っている。今年度は以下を達成した。(1)マイクロカーネルとマルチサーバからなるソフトウェアバス(分散OS)の中核機能LP49を構築し、本方式の有効性を示した。(2)本方式では、各機能やサービスは、“サーバント"と呼び受動的部品と“サーバ"と呼ぶ能動的部品として実現している。サーバントとしては、各種デバイスや共通サービス機能を実装し、サーバとしては、DOS, EXT2, RAMの各ファイルサーバを実装した。(3)別ノード間で論理リソースをExport/Importする機能を実現して、高度な連携処理を可能にした。またUnixの部分名前空間をimportする機能も実現した。本方式では、各機能やサービスは、"サーバント"と呼び受動的部品と"サーバ"と呼ぶ能動的部品として実現している。サーバントとしては、各種デバイスや共通サービス機能を実装し、サーバとしては、DOS,EXT2,RAMの各ファイルサーバを実装した。また、別ノード間で論理リソースをExport/Importする機能を実現して、高度な連携処理を可能にした。本システムのソースプログラムおよび資料をWEBサイトにオープンソースとして公開をしている。Http://research.nii.ac.jp/H2O/LP49(2)予測と実行時フィードバックによる省電力サーバ方式を実装し有用性を確認した。(3)ソフトウェアバスに基づく分散組込みノードを実装した。