hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経幹細胞の非対称細胞分裂の研究

Numbを姉妹細胞の神経前駆細胞に不等分配する。本研究では、神経幹細胞を実験系として非対称分裂のメカニズムとその背後にある細胞極性の分子実体を明らかにすることを目標とし、神経幹細胞の非対称性に異常をきたす突然変異の系統的な検索を行ってきた。分離された変異系統のなかで、神経幹細胞とその姉妹細胞の大きさが非対称性を失う変異系統を2種類について解析を進めている。一般に、母細胞の細胞質分裂の際、収縮環の位置が中央からずれるため、娘細胞の大きさが非対称になる。ショウジョウバエの神経幹細胞の場合、紡錘体が非対称性な形態をとることによって収縮環の位置にずれが起きる。分離された二つの突然変異は、ともに、紡錘体が非対称性を失っていること、3量体G蛋白質のβ,γサブユニットをそれぞれコードする遺伝子の変異であることが判明した。一方で、神経幹細胞では、aPKC-Par3複合体とGαi-Pins複合体という二つのシグナル伝達系がapical側に局在し、細胞極性を制御することが知られ、娘細胞のサイズの非対称についても、両者が平行して機能することが判明している。Gβγシグナルとapicalシグナルの関係を追及したところ、Gαi-Pinsの非対称局在にはGβγシグナルが必要とされるが、aPKC-Par3の局在には必須でないことが判明した。さらに、GβγとGαi-Pins等の突然変異系統における上皮細胞と脳前駆細胞の解析から、aPKC-Par3シグナル伝達系は主に運命決定因子の局在に、Gαi-Pinsは分裂軸の方位の決定に関わることが明らかになった。従って、これら2つのapicalシグナル系は互いに協調しながら機能を分担していると考えられる。ショウジョウバエの神経幹細胞は、娘細胞の運命と大きさの異なる典型的な非対称分裂を行い、転写因子ProsperoやNotchシグナルの制御因子Numbを姉妹細胞の神経前駆細胞に不等分配する。これらの運命決定因子が正しく一方の娘細胞に不等分配されるために、分裂軸と運命決定因子の局在の方向が一致するように調節されている。本研究では、ショウジョウバエ神経幹細胞を実験系として、このような非対称分裂のメカニズムとその背後にある細胞極性の分子実体を明らかにすることを目標としている。昨年までに、突然変異の系統的な分離とその分子遺伝学的な解析から、神経幹細胞の娘細胞の大きさの違いが、細胞外シグナルに依存しない3量体G蛋白質の働きによって生じることを明らかにしてきた。他方、神経幹細胞では、リン酸化シグナルを伝達するaPKC-Par3複合体とGタンパクシグナルを担うGαi-Pins複合体という二つのシグナル伝達系がapical側に局在し、細胞極性を制御することが知られ、娘細胞のサイズの非対称についても、両者が平行して機能することが判明している。この2つのシグナルの役割を詳細に解析した結果、aPKC-Par3シグナル伝達系は主に運命決定因子の局在に、Gαi-Pinsは分裂軸の方位の決定に関わることが明らかになり、2つのシグナル系は互いに協調しながら機能を分担していることが判明した。Gαi-Pins複合体が分裂軸の方位の決定を担うことから、Pinsと相互作用する因子が分裂軸の制御を行うと想定し、Pins結合因子を探索した結果、あるpins結合因子の突然変異体で分裂軸の方位の異常が観察された。
抗ジベレリン剤によるデンドロビウムのバルブ熟期の調節

ウニコナゾール処理によるデンドロビウムの草姿改善とバルブの熟期調整を目的として一連の実験を行った。材料にはノビル系デンドロビウム・ピンクドールエレガンス'と'ユキダルマキング'を用いた。早期加温によるバルブの発育促進と矮化剤処理による草姿改善を目的とし、ピンクドールを用い、2/10と3/17にウニコナゾール12.5ppm処理をすると共に2月から7月までの間の25°C加温開始終了時期を検討した。続いて7/1から11/20下旬まで戸外で栽培し、その後再び加温した。その結果25°C加温開始2月区で止め葉の発生、開花が最も早くなったが、矮化剤の効果が個体によりばらつき開花が遅れる個体も見られ、全体として温度処理効果がはっきりと現れなかった。促成栽培における矮化剤処理の適応性を確認するため、ピンクドールを用い、ウニコナゾール12.5ppm,2回処理をして25°C加温開始日を2/10または3/17とし、9/20から10/24まで山上げし、再び18°C加温開始開始を10/25または11/4とした。その結果、加温開始からの到花日数は10月区で51日、11月区で45日であった。また2月加温区で開花が早まる傾向にあった。一方矮化剤処理により、バルブは著しく矮化しかつ肥大した。過剰な肥大のため葉が節より離脱するものが多数見られた。矮化剤処理区の開花は無処理と同様の傾向が見られたが開花節率は、23-49%と低くかつばらついた。ウニコナゾールの残効性を確かめるため、前年の2,4,5,7月にリードに12.5ppm,2回処理または25ppm,1回処理した植物の次世代バルブの生育と開花を調査した。前年の早い時期にウニコナゾール処理した区ほど草丈の伸長が抑制された。止め葉の発生、開花ともにウニコナゾール処理が早い区ほど早くなった。開花節率は差が見られなかった。夏期の強遮光と矮化剤処理の組み合わせによる開花促進を検討するため、ユキダルマキングを用い、2月と4月に12.5ppm,2回処理を行い7/9より40%または70%遮光下の戸外で11/26まで栽培、その後18°Cに加温した。ウニコナゾール処理によりバルブの伸長は90%に抑制された。開花は70%遮光、ウニコナゾール処理区でやや早まったが、開花節率はやや低下した。

1998年度においては、前年までの予備的実験で得られた知見をもとに、主として、ウニコナゾール(抗ジベレリン剤)の使用方法とデンドロビウム2品種の生育・開花における形態学的、生理生態学的反応との関係を追究した.(1)ウニコナゾールの施与量・濃度に対する反応株あたり施与量を一定とし、施与濃度(12.5または25ppm)を変えた場合、いずれの方法でも茎の肥大期は早くなり、茎長は短かくなった.とくに、12.5ppm2回,または25ppm1回の施与で顕著な反応が認められた.それぞれの場合における開花反応を調査したところ、慣行の栽培においては、とくに明確な差はなかった。なお、茎の内部における糖その他の成分については、現在調査中である.(2)ウニコナゾール処理と花熟促進ウニコナゾールは、デンドロビウムの茎の徒長を抑制し、鉢花としての商品価値を高める.この効果と花熟促進とが一致すれば、生産的に有利である.そこで、ウニコナゾール処理と栽培温度条件を組み合わせて、可能性を検討した.その結果、ウニコナゾールにより、茎の矮化と肥大を促進した株は、従来の栽培よりも、生育前期を高温(最低25°C)に保つことによって、開花反応が促進され、とくに花着きが多くなることがわかった。現在、この原因(理由)について検討中である.促成栽培におけるウニコナゾールによる草姿改善の適応性を確認するため、ノビル系デンドロビウム・'ピンクドールエレガンス'を用い、ウニコナゾール12.5ppm,2回処理をして25°C加温開始日を2月10日または3月17日、9月20日から10月24日まで山上げし、再び18°C加温開始開始を10月25日または11月4日とした。その結果、加温開始からの到花日数は10月促成区で51日、11月区で45日であった。また、2月から加温した区で開花が早まる傾向にあった。一方ウニコナゾール処理により、バルブは著しく矮化しかつ肥大した。過剰な肥大のため葉が節より離脱するものが多数見られた。開花は無処理と同様の傾向が見られたが開花節率、23-49%と低くかつばらついた。ウニコナゾール処理の残効性を確かめるため、前年の2,4,5,7月にリードに12.5ppm,2回処理または25ppm,1回処理した植物の次世代バルブの生育と開花を調査した。前年の早い時期にウニコナゾール処理した区ほど草丈の伸長が抑制された。止め葉の発生、開花ともにウニコナゾール処理が早い区ほど早くなった。開花節率は差が見られなかった。夏季の強遮光とウニコナゾール処理の組み合わせによる開花促進を検討するため、ユキダルマキングを用い、2月と4月に12.5ppm,2回処理を行い7月9日より40%または70%遮光下の戸外で11月26日まで栽培、その後18°Cに加温した。ウニコナゾール処理によりバルブの伸長は90%に抑制された。開花は70%遮光、ウニコナゾール処理区でやや早まったが、開花節率はやや低下した。
そのまま食品分析を実現する１Ｈ‐ＮＭＲ‐ＤＯＳＹ法の構築

DOSY法による多成分共存下での食品成分の“そのまま"分析法の確立を試みた(=1H-qNMR-DOSY法)。分析対象成分はグルコース並びにスクロースとした。また、磁場内で同一の拡散性を与えるcellobiose等を外部基準物質として決定した。最適DOSY測定条件下での0.05-0.3 T/m磁場こう配下においてグルコース及びスクロースのプロトンシグナル比と濃度の間に高い相関関係が認められた。構築したNMR-DOSY法をもとに実試料の測定を行ったところ、食品分析用Fキットで得られた値と良好に一致し、本測定法が前処理を行うことなく簡便かつそのまま食品分析できる方法であることを明らかにした。NMR分析法における磁場こう配下での分子の移動拡散性の違いをもとに「1H-NMR法でのプロトン核スピン量の定量性(=qNMR法)」と、「異なる磁場では分子の拡散移動性は異なる(=DOSY法)」との磁気的性質に着目し、多成分共存下での食品成分(糖質)の“そのまま"分析法の確立を試みた(=1H-qNMR-DOSY法)。本年度は、グルコースの非破壊定量を目的としてDOSY測定条件を設定した。対象プロトンとして低磁場において共鳴ピーク(δ5.21 ppm)を与えるα-C1プロトンを選択した。また、磁場内で同一の拡散性を与えるグルクロン酸を外部基準物質として決定した。封印した外部基準物質含有キャピラリー管を5 mm-NMR管に対するインサート管とし、最適測定条件を検討した。その結果、0.05-0.3 T/m磁場こう配下においてグルコース固有の拡散係数(5.0×10-10 m2/s、30°C)が得られ、グルコース濃度0.5-2.0 g/L範囲で得られたプロトンシグナル比との間に相関係数0.9998の高い相関関係が認められた。本NMD-DOSY法をもとに実試料の測定を行ったところ、オレンジジュース(18.3 ±1.0 g/L)、リンゴジュース(26.3±0.4 g/L)及びグレープジュース(45.6 g/L)ともに市販の食品分析用Fキットで得られた値と良好に一致し、本測定法が前処理を行うことなく簡便かつそのまま食品分析できる方法であることを明らかにした。なお、各飲料に対するグルコースの添加回収試験を行ったところ、いずれの飲料にいても回収率96.9-107.0%、相対標準偏差(RSD)として1.2-5.7%が得られ、本NMR-DOSY法が高い再現性を有していることが実証された。多成分が混在する食品成分複雑系からの目的成分の定量は、一般的に均質化、抽出・精製の過程を経てHPLC等の分離分析あるいは酵素法のような特異的検出法を用いて行われる。しかしながら、これらの方法は、煩雑な前処理を要する上に、実際のサンプル中の目的成分の存在状態(遊離・結合状態等)を考慮できないと考えられる。そこで本研究では、磁場こう配下での拡散係数の違いにより分離検出が可能なDOSY-qNMR法を用いた新規食品成分定量法の構築を試みた。なお、本年度は、対象食品成分としてD-(+)-グルコース(Glc)を選択した。まず、Glc-α-C1プロトン(5.21ppm)を最適Glc指標プロトンとした。また、Glc測定の最適条件は、磁場勾配パルス幅1.0 ms、磁場勾配パルス強度50-300 mT/m、90°pulse 10.13μs及びT1 2.989 sであった。D-(-)-フルクトース、Suc、デンプン等の糖類共存下におけるGlc-α-C1プロトンの検出性を評価した。その結果、Glcの拡散係数はD = 5.6×10-10 m2/sとなり、他の糖類共存下においてもD値に基づき2次元DOSY分離が可能となった。また、α-D-glucose-1-phosphate(α-C1プロトン:5.28 ppm)においてGlc濃度と積分値比との間に高い直線関係が得られ(r2 = 0.9959)、定量限界は1.6 mg/mLであることが示された。そこで、最適化した本法を用いて市販飲料中のGlc定量を実施したところ、従来法(Fキット酵素法)とほぼ同等の定量値が得られた(オレンジジュース中Glc濃度(mg/mL):DOSY-qNMR法18.5±1.3,酵素法17.7±0.8)。

NMR分析法における磁場こう配下での分子の移動拡散性の違いをもとに「1H-NMR法でのプロトン核スピン量の定量性(=qNMR法)」と、「異なる磁場では分子の拡散移動性は異なる(=DOSY法)」との磁気的性質に着目し、多成分共存下での食品成分(糖質)の“そのまま"分析法の確立を試みた(=1H-qNMR-DOSY法)。前年度までにグルコースの非破壊定量法を確立した成果をもとに、一般食品成分として重要なスクロース定量法への展開を図った。各種のDOSY測定に関する最適化条件を検討したところ、対象プロトンとして低磁場において共鳴ピーク(δ5.4 ppm)を与えるgluopyranosy-α-C1プロトンを選択した。また、磁場内で同一の拡散性を与えるcellobioseを外部基準物質として決定した。封印した外部基準物質含有キャピラリー管を5 mm-NMR管に対するインサート管とし、最適測定条件を検討した。その結果、0.05-0.3 T/m磁場こう配下においてスクロース分子固有の磁場拡散係数(4.9×10-10 m2/s、30°C)が得られ、スクロース濃度0.5-20.0 g/L範囲で得られたプロトンシグナル比との間に相関係数0.9999の高い相関関係が認められた。本NMR-DOSY法(cellobioseのC1プロトンδ4.5 ppm; 100.0 g/L)をもとに実試料の測定を行ったところ、オレンジジュース(36.1 ±0.5 g/L)、パイナップルジュース(53.5 ±1.1 g/L)及びスポーツドリンク(24.7 ±0.6 g/L)ともに市販の食品分析用Fキットで得られた値と良好に一致し、本測定法が前処理を行うことなく簡便かつそのまま食品分析できる方法であることを明らかにした。なお、各飲料に対するグルコースの添加回収試験を行ったところ、いずれの飲料にいても回収率98.4-105.3%、相対標準偏差(RSD)として1.3-5.7%が得られ、本NMR-DOSY法が高い再現性を有していることが実証された。食品分析学論文成果1件あり。初年度において、DOSY法が食品のような多成分系においても目的とする1成分の定量を可能とする分析法であることが明らかにできた。NMR-DOSY法による食品分析はこれまでに報告例がなく、本知見については現在論文投稿中である。以上のことから、初年度としては順調に成果が上がっていると客観的に判断できる。溶液中での化合物間の相互作用についてNMR-DOSY法で精査し、非破壊での食品品質評価を行う。NMR-DOSY法の食品成分であるスクロース定量への適用性と分析条件の設定を行う。すなわち、1)最適外部基準物質の選定2)スクロース分離を可能とするD値(磁場こう配条件、パルス条件)を選定する3)市販飲料を用いて本法、F-kit法、並びにHPLC法によるスクロース分析を行い、その一致性とNMD-DOSY法の妥当性評価を図る。NMR試薬使用量が少なく、そのため物品日が当初予算よりも少なく推移したため。本年度はDMSO-d4などの新たなNMR用溶媒を必要とするため、この購入予算に充てる予定である。以上、項目の達成に関わる経費として、1)各種外部基準物質の購入経費:20万円2)重水素化溶媒購入費:50万円3)HPLCカラム、溶媒、F-kit代:30万円4)旅費:5万円5)人件費・謝金:10万円
ナノ組織化されたバイオ分子を用いた超高感度光学式免疫センサの開発

本研究では、高感度かつ高選択的でありながら、安価で簡便な検出が可能な免疫反応を利用したイムノアッセイと計測装置とを組み合わせたセンシングシステムについて、表面修飾技術やマイクロチャネル作製技術を駆使することにより、検出が難しい環境中などに存在する低分子化合物を超高感度、高選択的、しかもオンサイトで簡便に多成分同時検出が可能な新しいセンシングシステムを構築することを目的として研究を進めた結果、今年度は以下のような成果を得た。1)サブppbレベルの環境汚染物質のリアルタイム高感度検出タンパクコンジュゲートを金膜上に固定化したSPRセンサにより、間接競合法を用いて、0.1ppb程度の2-ヒドロキシビフェニルを応答時間が約20分で高感度検出できることがわかった。また、この免疫センサ素子はペプシン溶液により20回以上再生して使用することが可能であった。2)マルチチャネルチップを用いたコンパクトでポータブルなSPR免疫センサによる低分子化合物の同時検出4つのマイクロチャネルを用いたコンパクト(16×9×6cm)で軽量のSPRセンサを作製し、ベンゾ(a)ピレンと2-ヒドロキシビフェニルを高感度で同時検出することに成功した。3)単分子タンパク質膜を用いた免疫センサによる環境ホルモンの迅速検出環境ホルモンの一種である2,4-ジクロロフェノキシ酢酸(2,4-D)のトレースレベルの検出を、2,4-D-BSAバイオ単分子膜を形成したセンサチップを用いることにより、SPRセンサにより0.5ppbまで検出できることがわかった。
大腸全摘術後のQOLの向上をめざした空腸肛門吻合術の有用性の検証と臨床応用

1)新しい手法による空腸肛門吻合術モデルの試作:雑種成犬に対して大腸亜全摘術を行いJejunal J-pouch distal anastomosis(JP)を空腸肛門吻合術モデルとして、Ileal J-pouch distal rectal amastomosis(IP)をこれまで臨床で行われている回腸肛門吻合術モデルとして作成した。IPは回腸末端15cmを折り返してJ型嚢として腹膜飜転部より3cmの直腸と側端吻合した。JPは小腸中央部を切離し、肛門側を閉鎖した後、口側空腸端を用いて15cmの折り返してJ型嚢を作成した。その嚢先端からさらに25cm口側でneuro-mascular bridgeを作成し遠位端は閉鎖、近位端は近位回腸と端側吻合し、さらにJ型空腸嚢をIPと同様に吻合した。これらの手術成績はIP,JPともに直接死亡率はゼロであった。また、消化管運動のデータを採取出来るようになった割合はそれぞれ80%以上であり、JPは新しいモデル手術として妥当であることが確認された。2)全身状態および排便状況の比較:JPはIPに比して水様便より半固形便の割合が高く、体重減少も平均値でみると軽微であった。3)筋電図からみた消化管運動の比較:JPではJPい比してJ嚢において高周波数寄りのpacesetter potentialがみられ、さらにIMCのphaseIIIがより多くJ嚢にまで達することが判明した。3)バロスタットによるJ嚢圧の検討:JPはIPに比して静止圧が低く、コンプラアンス高い傾向がみられた。以上の成績は我々の仮説を裏付けるものであったことから、現在両群のN数を各5以上にして成績をまとめて英文誌に投稿すべく準備中である。1)研究方法12頭の雑種成犬(当初ビ-グル犬の予定であったが、購入価高騰につき雑種犬となった)を用いて大腸亜全摘後6頭にまず通常のIleal Pouch(IP)作成した後IPと直腸を端々吻合した(IP群)。他の6頭は小腸中央部で切離し、口側の空腸を用いてJejunal Pouch(JP)をIPと同じ長さで作成して直腸と端々吻合する。JPの口側端から10cm口側にnuromasucular bridgeを作成し、この部位の空腸とJPの間に回腸を間置した(JP群)。両群の消化管各部位に筋電図測定用銀電極を漿膜面に逢着した。pouch用量、compliance、静止圧を測定するために肛門からballon付カテーテルを挿入しelectrical barostatおよび圧センサーと接続した。pouchの筋電図測定時は肛門からカテーテルを挿入して、Motility Indexを測定した。さらにそれぞれのpouch内の細菌叢および組織学的変化についても検索した。2)研究成績JPはIPに比較して有意に平均最大容量が大きく、静止圧は低値を示した。pouchの口側で観察されたMMCのPHase3では19%、JPでは88%がpouchに伝搬した。MIはJPがIPに比して高い傾向がみられた。pouch内の細菌数、細菌叢は両群間で有意さがみられなかった。また、両群とも明らかな組織学pouchitisの所見は認められなかった。3)研究の中間結論JPはIPに比較して静止圧が低く、平均容量が大きいことから良好な排便機能が得られる可能性が示された。
反芻動物脂肪細胞の増殖・分化制御因子の探索とその制御機構

平成15年度から平成16年度に本申請課題に向けて研究を施行した結果、明らかになった点をいかに示す。1.めん羊成熟脂肪細胞と脂肪前駆細胞との共培養法を確立した。その結果、成熟脂肪細胞が脂肪前駆細胞の増殖・分化を制御しているという知見を得た。2.めん羊成熟脂肪細胞はレプチンおよびTNF-αを合成分泌し、それ等は成熟脂肪細胞および脂肪前駆細胞の増殖・分化の抑制因子として作用し、TNFは細胞のアポトーシスによる増殖・分化を抑制すること、レプチンはTNF-αよりもその能力が低いことを立証した。さらに、インスリンおよびIGF-Iがそれ等の合成・分泌を制御していることを立証した。3.めん羊脂肪前駆細胞の増殖はMAP kinase系を介し、分化はPI3-kinase系を介して発現し、転写因子PPAR-γ2の発現誘導の活性化にPI3-kinaseの活性化が必要であることを立証した。4.Adipogenesis過程に関与する遺伝子を探索した結果、(1)脂肪組織で特異的に発現する新規因子、Adipogeninを同定し、それは細胞膜に局在する膜タンパク質であることが確認された。脂肪前駆細胞分化過程においてその発現は上向き調節されることより、Adipogeninは脂肪細胞分化調節作用に重要な役割を演じている可能性を示唆した。(2)Gタンパク共役受容体ファミリーの中、短鎖脂肪酸をリガンドとするGPCR43の発現が脂肪細胞形成の進行に伴い増加し、プロピオン酸による脂肪細胞の分化促進がGPCR43を介する抗脂質分解作用によることを立証した。平成15年度に本申請課題に向けて研究を施行した結果、一部明らかになった点を以下に示す。1.めん羊脂肪細胞の三次元コラーゲンゲルマトリックス培養法を確立し、約1ヶ月に亘り生理活性を維持した脂肪細胞を培養することが可能であることを確認した。2.めん羊成熟脂肪細胞はレプチンおよびTNF-αを合成・分泌し、それ等は成熟脂肪細胞の増殖の抑制因子として作用し、インスリンおよびIGF-Iがそれ等の合成・分泌を制御していることを立証した。3.めん羊脂肪前駆細胞の増殖・分化がレプチンおよびTNF-αによって制御され、TNF-αは細胞のアポトーシスにより増殖・分化を抑制すること、レプチンはその能力がTNF-αよりも低いことを立証した。4.めん羊脂肪細胞と脂肪前駆細胞との共培養法を確立し、成熟脂肪細胞共存下では脂肪前駆細胞の増殖・分化が抑制されるという知見を得た。5.機能的ゲノムルーツを用いて、脂肪細胞の増殖・分化の分子メカニズムの一端を明らかにした。(1)細胞骨格形成に関与する遺伝子、非筋型コフィリンの皮下および腹腔内脂肪組織における発達の違いを半定量RT-PCRにより解析した結果、ブタとは逆に黒毛和種牛においては皮下脂肪で発現が強いことを立証した。(2)めん羊脂肪前駆細胞の増殖はMAP kinase系を介し、分化はPI3-kinase系を介して発現し、転写因子PPARγ-2の発現誘導の活性化にPI3-kinaseの活性化が必要であることを立証した。(3)ラット脂肪細胞においてグレリンがPPARγ-2mRNAの発現を上向き調節することにより、分化を促進し、脂肪細胞形成においてグレリンが重要な役割を演じていることを立証した平成16年度に本申請課題に向けて研究を施行した結果、一部明らかになった点を以下に示す。1.めん羊成熟脂肪細胞と脂肪前駆細胞との共培養法を確立し、成熟脂肪細胞共存下では脂肪前駆細胞の増殖・分化を促進するという知見を得た。2.共培養への低濃度プロピオン酸(1μM以下)添加は、脂肪前駆細胞の分化を促進した。これは、プロピオン酸がGタンパク共役受容体(GRP)ファミリーの中のGRP43を介する抗脂質分解作用によることを立証した。

しかし、高濃度(5μM以上)のプロピオン酸は、逆に脂肪前駆細胞の分化を抑制すること、これはプロピオン酸がTNF-αの分泌を増加させ、そのアポトーシス作用によるものであることを立証した。3.共役リノール酸(CLA)、特にtrans:10-cis12はめん羊脂肪前駆細胞の増殖を用量反応的に抑制したが、分化および成熟脂肪細胞形成を用量反応的に促進した。これは核内転写因子PPARγ2mRNAの増加および脂肪滴形成に不可欠なaP2(fatty acid binding Protein) mRNAの増加によるものであることを立証した。以上の結果は、反芻動物によってのみ産生されるCLAがPPARγ2のリガンドとして作用している可能性を示唆し、ヒト、マウス等で報告されている効果とは逆の作用効果を有しているという新知見を得た。4.転写因子PPARαが反芻動物脂肪前駆細胞の増殖・分化を抑制する遺伝子マーカーとなりうるか否かを検索した結果、分化の進行に伴い細胞内に脂肪滴が増加するとPPARαmRNAの発現は増加し、成熟脂肪細胞でその発現は高く、PPARαのアゴニスト、Wy-14643の培養脂肪細胞への添加はTNF-αの分泌を増加させたこと等により、増殖・分化の抑制マーカーとはなりえないが、脂質代謝制御に関与していることを示唆した。5.Adipogenesis過程に関与する遺伝子を検索した結果(1)脂肪組織で特異的に発現する新しい因子、adipogeninを同定し、それは細胞膜に局在する膜タンパク質であることが確認された。脂肪前駆細胞分化過程においてその発現は上向き調節されることより、adipogeninは脂肪細胞分化調節作用に重要な役割を演じている可能性を示唆した。(2)Gタンパク共役受容体ファミリーの中、短鎖脂肪酸をリガンドとするGRP43の発現がadipogenesisの進行に伴い増加することを明らかにした。
節足動物中枢神経系における行動制御機構に関わる一酸化窒素の役割

動物は、環境への適応機構のひとつとして神経系を進化の過程で獲得した。刻々と変化する状況に即して動物は様々な行動を発現し、外部環境の変化に適応している。では、動物は状況に応じてどの様な神経生理機構で適切な行動を発現し、切替えているのか?本研究では、いかに状況に応じた行動が発現されるのかその神経機構を理解しようとしている。神経の可塑的な性質は行動を切り換える際に必要な生理機構である。この様な神経の可塑的な変化には一酸化窒素(NO)が重要な役割を担っていると考え、節足動物、特にザリガニやコオロギを実験材料として、同定可能な神経回路網においてNOがどの様な修飾効果をもつのか細胞レベルでの詳細な解析を進めるとともに、行動レベルでの効果、役割を解析してきた。その成果として、1.組織化学染色法でNO産生細胞と標的細胞の局在をこれまでに確かめ、さらに、昆虫の脳では常にNOが100-200nM程度放出されていること、刺激により更に放出量が増加することを電極法で計測し示した。2.NOの光学的な計測を行い、中枢神経系の中でどの程度の一酸化窒素が産生されているのか突き止めるため、既存の共焦点レーザー走査顕微鏡を改造するため備品としてレーザー光源ユニットを購入し、NO感受性色素を使って光学的に解析を続けている。3.電気生理学的にNO産生細胞と標的細胞の両方の細胞から活動を計測し、一酸化窒素やcGMPの合成を促進或いは抑制する薬物を灌流投与し、一酸化窒素の修飾効果を解析し、神経系におけるNOの修飾効果を示した。これまでの成果は国際シンポジウム及び国内学会で発表し、また、その一部は既に国際学会誌等に論文として発表し、残りの成果については現在発表の準備に取りかかっている。一酸化窒素(NO)は合成酵素NOSの活性によりアルギニンから合成され標的細胞の可溶性グアニル酸シクラーゼを活性化し、細胞内cGMPレベルを上昇させる。ザリガニやコオロギの神経節において一酸化窒素は神経修飾作用を持ち、神経の可塑的な性質の形成に関与していると考えている。そこで、ザリガニやコオロギなど無脊椎動物の神経節を用いて組織化学的に一酸化窒素産生細胞、一酸化窒素の標的細胞の局在をまず確かめた。1.一酸化窒素産生細胞はanti-uNOS免疫染色法と、NADPH-diaphorase組織化学染色法で特定した。標的細胞は一酸化窒素供与剤により誘導されたcGMPをanti-cGMP抗体を使い免疫染色法で染色し特定した。2.Anti-cGMP抗体を用いて一酸化窒素の標的細胞を蛍光色素で標識し、共焦点レーザー顕微鏡(備品として購入)を用いて特定し、中枢神経系の神経地図を作成した。3.さらに、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、一酸化窒素産生細胞が実際に一酸化窒素を放出するか、一酸化窒素感受性色素(DAF-2DA)を使って光学的な方法で解析を進めている。今後は、感覚神経束を電気刺激し、刺激前後で一酸化窒素の濃度がどう変化するか解析するとともに、同定神経回路網においてNO-cGMPシグナル伝達系がどのような役割を担っているか、神経の可塑的な性質を形成するのにどう働いているか解析していく。これまでの成果は国際学会(FENS2002)及び国内学会で発表し、また、その一部は国際学会誌に論文として発表した。「動物は状況に応じた行動の切り換えをどのような神経機構で行うか」を解明するのが本研究の目的である。行動を切り換える際、中枢神経系では神経の可塑的な変化が起きていると考え、一酸化窒素が行動の切り換えに重要な役割を担っているという仮説をたてた。節足動物、特にザリガニやコオロギを実験材料に選び、同定可能な神経回路網において一酸化窒素がどの様な修飾効果をもつか詳細に解析することで仮説を確かめている。2.個々の細胞を同定するため、備品購入したIR-dic顕微鏡を利用して、Anti-cGMP抗体陽性の細胞をルシファーイエローで細胞内染色し、抗体染色法蛍光標識した細胞を、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察し中枢神経系の神経地図を作成している。3.現在、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、一酸化窒素産生細胞が実際に一酸化窒素を放出するか、一酸化窒素感受性色素(DAF-2DA)を使って光学的な方法で解析を進め、4.一酸化窒素産生細胞と標的細胞の両方から活動を細胞内記録しながら、一酸化窒素やcGMPの合成を促進或いは抑制する薬物を灌流投与し、一酸化窒素の修飾効果を電気生理学的方法で解析を進めている。これまでの成果は国際シンポジウム及び国内学会で発表し、また、その一部は国際学会誌等に論文として発表した。

この様な神経の可塑的な変化には一酸化窒素(NO)が重要な役割を担っていると考え、節足動物、特にザリガニやコオロギを実験材料として、同定可能な神経回路網においてNOがどの様な修飾効果をもつのか細胞レベルでの詳細な解析を進めるとともに、行動レベルでの効果、役割を解析してきた。その成果として、1.組織化学染色法でNO産生細胞と標的細胞の局在をこれまでに確かめ、さらに、昆虫の脳では常にNOが100-200nM程度放出されていること、刺激により更に放出量が増加することを電極法で計測し示した。2.NOの光学的な計測を行い、中枢神経系の中でどの程度の一酸化窒素が産生されているのか突き止めるため、既存の共焦点レーザー走査顕微鏡を改造するため備品としてレーザー光源ユニットを購入し、NO感受性色素を使って光学的に解析を続けている。3.電気生理学的にNO産生細胞と標的細胞の両方の細胞から活動を計測し、一酸化窒素やcGMPの合成を促進或いは抑制する薬物を灌流投与し、一酸化窒素の修飾効果を解析し、神経系におけるNOの修飾効果を示した。これまでの成果は国際シンポジウム及び国内学会で発表し、また、その一部は既に国際学会誌等に論文として発表し、残りの成果については現在発表の準備に取りかかっている。
反復投与可能で腫瘍特異的に複製する組換えアデノウイルスと抗癌剤の併用遺伝子治療

研究目的:これまで癌の遺伝子治療の治療効果が不十分であったのは腫瘍への特異的遺伝子導入効率の低さが一因として考えられる。この解決策として腫瘍特異的に複製可能なAdをあげることができる。最近、ONYX社は腫瘍特異的複製能を有する細胞傷害性の高いAd(ONYX-015)を開発し臨床治験で一定の効果を得たと報告している。しかしONYX-015にはいくつかの問題点がある。まずAdに対する免疫学的問題点を解決しなければならない。さらに同Adは正常細胞でも複製し癌組織特異性が高いとは言えない。そこで本研究では(I)AdのE3を過剰発現させることにより免疫反応を惹起せず反復投与が可能で, (II)複製開始に必須なE1Aを癌胎児性蛋白プロモーター(OFPp)で制御しさらにE1BのE1B-55Kdを除くことにより二重に腫瘍特異性が高く、(III)腫瘍特異的に誘導されるE1Aは抗癌剤感受性を増強することから癌細胞特異的に抗癌剤増強効果を合わせ持つ組換えAd(AdTTS-Rep)を作製し,進行癌に対する臨床応用を目指す。方法と結果:(1)OFPpにdriveされるE1AおよびCMVpでdriveされるE1B-19Kdの二つの発現単位を組み込んだpAdTS-Repを作製した。既報に従いAdTS-Rep(AdAFPep/Rep,AdCEA/Rep)を得た、AdTS-Repは癌細胞特異的細胞傷害性を示した。(2)AdTS-Rep感染によりPLC/PRF/5、M7609はCDDP,5-FUおよびADMに対する抗癌剤感受性が増強した。(3)AdTS-RepはOFP産生癌細胞のxenograftの系(PLC/PRF/5およびM7609)において極少量(10^8pfu/100ul)のウイルス投与により腫瘍の完全退縮した。この様に腫瘍特異的に複製能を有するAdTS-Repは癌の遺伝子治療に有効なmodalityとなり得ることが確認できたことから、現在E3を過剰発現させ反復投与が可能になることを期待しさらにAdTTS-Repを作製中である。遺伝子治療を実際に臨床応用する場合、高度進行癌が対象となることが予想されこの様に反復投与が可能であることは重要と考えられ現在検討を進めている。
細菌自動分類システムの試作

平成1年から平成3年までの研究で得られた主な結果(1).細菌自動分類のためのハ-ドウェアシステムを開発した。(a)細菌計測に適したフロ-チャンバ-を含む光学系を製作した(b)TVカメラ,画像メモリ,コンピュ-タ(LUNA37D)よりなる画像処理のハ-ドウェアを製作した。(2).細菌を収集し,この前処理技術を開発した。長径,短径の異なる様々な桿菌,並びに双球菌,ブドウ球菌,連鎖球菌など様々な形態学的特徴を持った球菌の形態学的情報を上に述べたシステムを用いて分析し,整理した。(3).細菌の識別,分類アルゴリズムを開発した。〔1〕細菌の円形性を表す特徴量としては(a)細菌の面積と周囲長より定義される円形度,(b)細菌の面積と細菌の外接長方形の長径を直径とする円の面積の比,(c)細菌に外接する長方形の長径の長さと短径の長さの比で定義されるアスペクト比〔2〕細菌の輪郭線の変化の度合いを表す特徴量として定義される凸係数〔3〕桿菌と球菌を細分するための特徴量として(a)桿菌の長さ(b)球菌の直径である。これによれば(a)桿菌,単球菌,双球菌,球菌の識別ができる。(b)球菌を連鎖状球菌,並びにブドウ状球菌に細分類できる。(c)菌のサイズ(長径,短径)の測定ができる。(d)菌液中の細菌の総数を画像処理的に推定できる。(4).細菌画像の画像処理,並びにパタ-ン認識のためのソフトウェアが完成した。(a)撮像された画像から細菌を推定できるソフトウェア作成した。(b)赤血球などの細菌以外のものが混入している場合でも,細菌だけ抽出して処理するソフトウェアを作成した。(5)細菌浮遊液に血清蛋白やその他の生体成分を加えて,細菌の自動識別を試みたところ,生理食塩水の場合と同じように細菌の同定(桿菌,球菌の識別)が可能であった。このことから,このシステムが臨床検査に十分適用できることが示された。(6)細菌浮遊液に赤血球,白血球,血小板などの血球成分を混在させても,自動識所による細菌の同定に影響を及ぼさなかった。このことは,臨床検体中の血球成分を前処理することなく直接このシステムで計測できることが示された。(7)取扱が危険な病原微生物を含む臨床検査の減菌方法として,10%ホルマリンを添加することで完全に無菌化することが可能であり,またシステム装置に障害を与えることなく,細菌の同定にもなんらの影響を及ぼさないことが明らかになった。この10%ホルマリンの添加法は,臨床検体の取扱を安全なものにする一方,刺激臭があることが弱点である。このため,システム装置の消毒には70%アルコ-ルの使用が適当であると考えられた。

(7)取扱が危険な病原微生物を含む臨床検査の減菌方法として,10%ホルマリンを添加することで完全に無菌化することが可能であり,またシステム装置に障害を与えることなく,細菌の同定にもなんらの影響を及ぼさないことが明らかになった。この10%ホルマリンの添加法は,臨床検体の取扱を安全なものにする一方,刺激臭があることが弱点である。このため,システム装置の消毒には70%アルコ-ルの使用が適当であると考えられた。本年度の研究計画は、交付申請書に記載したとおり1.細菌分類装置のハ-ドウェアシステムの設計並びに製作、2.細菌デ-タの収集並びに前処理技術の開発であった。以下では、これらのサブテ-マの進捗状況について報告する。1.については(I)細菌計測に適したフロ-チャンバ-を含む光学系を製作した。これにより良好な画像が得られるようになった。(II)TVカメラ、画像メモリ、コンピュ-タ(LUNA37D)よりなる画像処理のハ-ドウェア並びにソフトウェアシステムを完成させた。このシステムを使用して現在細菌のデ-タの収集並びに細菌画像の処理を行っている。2.については、フロ-方式の自動分類システムの精度を解析するために必要な各種細菌の収集を終えた。長径、短径の異なった様々な桿菌並びに双球菌、ブドウ球菌、連鎖球菌など形態学的特徴を持った球菌を冷凍保存し、その形態学的情報を整理した。自動分類システムへの各種細菌の供給が可能になった。総合的には細菌の撮像から解析までを手動で行えるようなシステムができつつある。すなわち、細菌の画像の取り込み、デ-タの蓄積、雑音の除去、画像の強調、画像の2値化、特徴抽出、細線化のソフトウェアが出来上がり自動分類ができる前段階まで進んでいる。その詳細は裏面の文献にまとめている。本年度の研究計画は,交付申請書に記載さたとおり1.細菌分類装置のソフトウェアの設計並びに製作,2.細菌の識別・分類アルゴリズムの開発であった。以下では,これらのサブテ-マの進捗状況について報告する。1.については,細菌を(1)円型度,(2)面積比,(3)アスペクト比(4)凸係数,(5)長さ(桿菌の場合),(6)直径(球菌の場合)により,桿菌,単球菌,連鎖状球菌,葡萄状球菌の4種類に分類するソフトウェアを完成させた.2.については,[1]細菌の円形性を表す特徴量として,(1)細菌の面積と周囲長より定義される円形度,(2)細菌の面積と細菌の外接長方形の長径を直径とする円の面積の比,(3)細菌に外接する長方形の長径の長さと短径の長さの比で定義されるアスペクト比,[2]細菌の輪郭線の変化の度合いを表す特徴量として凸係数[3]桿菌と球菌を細分するための特徴量として(1)桿菌の長さ,(2)球菌の直径により桿菌,単球菌,連鎖状球菌,葡萄状球菌の4種類に分類するアルゴリズムを完成させた.3.その地得られた結果として,<(1)液体培地>___ー:固形培地で増殖した菌を用いてそれぞれ検討した。液体培地で増殖した菌は、凝集も少なくフロ-サイトメトリ-に適したが、固形培地で増殖した菌を溶液中に浮遊させても凝集塊が多く、判定困難な場合が多い。この点生体由来サンプル(血液、尿、滲出液)は適しているものと考えられる。<(2)サンプルの消毒法を検討した>___ー:サンプル中に高濃度のタンパク質が含まれている場合、ホルマリン処理をすると変性タンパク質が析出し、フロ-サイトメトリ-用のサンプルとして適さないことが明らかになった。血液サンプルなどを減菌する際にホルマリン、アルコ-ルなどでの前処理はむずかしい。減菌前処理の方法を検討する必要がある。
人工転写因子ライブラリーを用いた網羅的遺伝子同定

まず、人工転写因子ライブラリー発現ベクターのプリカーサーを作成した。このベクターに人工転写因子遺伝子を導入した発現ベクターを作成し、このベクターでヒト由来細胞HEK293を形質転換し、この遺伝子が効率よく発現されることをウェスタンブロットで確認した。また、人工転写因子ライブラリー作成に必要なすべてのDNAフラグメントのデザインを完了した。まずグアニン(G)が豊富な塩基配列を認識できるように(ヒトのプロモーター配列はGが豊富な場合が多い)、ライブラリー全体の4分の1に該当するDNAフラグメント作成用のDNAオリゴマーを購入し、(部分的な)ライブラリーを作成した。このライブラリーを発現ベクターのプリカーサーに導入したもので大腸菌を形質転換し、生成してきた50個以上のコロニーからDNAベクターを単離し、各々の塩基配列を決定したところ、各DNAフラグメントがランダムにアッセンブルされて、狙い通りの(部分的だが)人工転写因子ライブラリーができることを確認した。こうして得られた人工転写因子ライブラリーをヒト由来細胞に遺伝子導入したが、1回目のセレクション操作における標的の性質を示した細胞の割合が極端に低かったので、現在、遺伝子導入時の実験条件等の最適化を行なっているところである。また、残り4分の3のDNAフラグメント作成用のDNAオリゴマーを購入し、完全なライブラリーの作成も現在行なっているところである。
結晶中の特異点運動に対するフォノン輻射抵抗

結晶中の転位,キンク,亀裂などは弾性論の立場から見れば連続媒質中の特異点あるいは特異線である.弾性論でこれらの特異点を取り扱う際の最大の問題点は,対象が格子の周期で変化する性質を持っていることをあからさまにはとり入れることができない点にある.一般に,特異点は,運動の際に格子の周期性を感じ,それに応じて加速減速を繰り返しながら進むので,フォノン輻射がおき,運動エネルギーの散逸がおきる,この点も考慮して,転位,キンク,亀裂などについて運動方程式が議論されることは非常に少ない.格子振動の輻射に関して,以下のような計算を行った.半導体結晶中にキンク対を持ったらせん転位を導入し,外力をかけた状態でのキンクの運動を計算機でシミュレーションした.原子間相互作用はStillinger-Weberポテンシャルを使用した.キンクの速度は外力とともに増加するが,直線転位で計算したときと同じように,速度が不連続的に増加するところがみられる.直線転位の場合には,転位の運動で輻射されるフォノンのスペクトルが急に変化するところが,速度と外力の関係での不連続な部分になって現れた.キンクの場合も同様なことが起きていると考えられる.外力をさらに大きくすると,キンク対の多重形成も見られた.串団子モデルの単純立方格子に亀裂を入れて,簡単な原子列間ポテンシャルを仮定して,亀裂の運動のシミュレーションをした.ボンドが切れるたびに格子振動が輻射される.しかし,亀裂の場合には表面エネルギーの寄与も大きく,同じ外力を与えても表面エネルギーが大きな系では小さい系と比べて,亀裂速度が大きくはならない.超音速運動も表面エネルギーが小さい系でしかおきない.Peierlsポテンシャルの頂上に転位を置き,自由に運動させると転位はPeierlsポテンシャルの谷底で振動する.振動の途中で格子振動を輻射するが,転位の振動は近似的に減衰振動の式で表現できる.結晶中の転位,キンク,亀裂などは弾性論の立場から見れば連続媒質中の特異点あるいは特異線である.弾性論でこれらの特異点を取り扱う際の最大の問題点は,対象が格子の周期で変化する性質を持っていることをあからさまにはとり入れることができない点にある.一般に,特異点は,運動の際に格子の周期性を感じ,それに応じて加速減速を繰り返しながら進むので,フォノン輻射がおき,運動エネルギーの散逸がおきる,この点も考慮して,転位,キンク,亀裂などについて運動方程式が議論されることは非常に少ない.格子振動の輻射に関して,以下のような計算を行った.半導体結晶中にキンク対を持ったらせん転位を導入し,外力をかけた状態でのキンクの運動を計算機でシミュレーションした.原子間相互作用はStillinger-Weberポテンシャルを使用した.キンクの速度は外力とともに増加するが,直線転位で計算したときと同じように,速度が不連続的に増加するところがみられる.直線転位の場合には,転位の運動で輻射されるフォノンのスペクトルが急に変化するところが,速度と外力の関係での不連続な部分になって現れた.キンクの場合も同様なことが起きていると考えられる.外力をさらに大きくすると,キンク対の多重形成も見られた.串団子モデルの単純立方格子に亀裂を入れて,簡単な原子列間ポテンシャルを仮定して,亀裂の運動のシミュレーションをした.ボンドが切れるたびに格子振動が輻射される.しかし,亀裂の場合には表面エネルギーの寄与も大きく,同じ外力を与えても表面エネルギーが大きな系では小さい系と比べて,亀裂速度が大きくはならない.超音速運動も表面エネルギーが小さい系でしかおきない.Peierlsポテンシャルの頂上に転位を置き,自由に運動させると転位はPeierlsポテンシャルの谷底で振動する.振動の途中で格子振動を輻射するが,転位の振動は近似的に減衰振動の式で表現できる.結晶中の転位,キンク,亀裂などは弾性論の立場から見れば連続媒質中の特異点あるいは特異線である.弾性論でこれらの特異点を取り扱う際の最大の問題点は,対象が格子の周期で変化する性質を持っていることをあからさまにはとり入れることができない点にある.一般に,特異点は,運動の際に格子の周期性を感じ,それに応じて加速減速を繰り返しながら進むので,フォノン輻射がおき,運動エネルギーの散逸がおきる.この点も考慮して,転位,キンク,亀裂などについて運動方程式が議論されることは非常に少ない.半導体結晶中にキンク対を持ったらせん転位を導入し,外力をかけた状態でのキンクの運動を計算機でシミュレーションした.原子間相互作用はStillinger-Weberポテンシャルを使用した.キンクの速度は外力とともに増加するが,直線転位で計算したときと同じように,速度が不連続的に増加するところがみられる。直線転位の場合には,転位の運動で輻射されるフォノンのスペクトルが急に変化するところが,速度と外力の関係での不連続な部分になって現れた.キンクの場合も同様なことが起きていると考えられるが,十分詳細な検討まではできていない.弾性論では,音速を超えるときにエネルギーが無限大になるので,超音速運動は不可能ということになっている.しかし,格子中では,直線状の転位であれ,亀裂であれ,超音速の運動は可能であることがシミュレーションでは確立されている.キンクの場合にも,横波の速度以上の速度でキンクが定常的に運動することが可能であることを確かめた.

キンクは長さが1原子問距離の短い転位線であるが,運動に関する限り,定性的には,無限に長い直線転位の性質を持ち続けているように見える.転位、転位線上のキンク、亀裂などの結晶内の欠陥は、弾性論では連続媒質中の特異線または特異点として扱われる。弾性体の中で特異点(線)か加速度運動をするとフォノンが輻射され、運動エネルギーを失うことはよく知られている。一方、格子を考慮すると、欠陥のエネルギーは格子の周期性に応じた変化をする。転位やキンクの場合には、このエネルギーはPeierls potentialであり、亀裂の場合にはlattice trappingという形で現れる。欠陥が運動する場合には、格子の周期性を感じ、それに応じて加速減速を繰り返しながら進むので、フォノンの輻射がおき、運動エネルギーの散逸がおきる。欠陥は、外力がする仕事とフォノンの輻射で失うエネルギーがつりあったところで定常的な運動に入る。フォノンの輻射に伴うエネルギー損失の大きさの程度を見積もることは、欠陥の運動を考える上で重要である。外力が大きく、キンク速度が横波の音速に近づくと多重キンク対形成が起きることが、第2種のPeierls potentialを無視した転位の線張力近似では予測されていた。実在の結晶では第2種のPeierls potentialがあるので、これを無視した議論は正しくない。第2種のPeierls potentialの効果を調べるために、半導体結晶中にキンク対を持ったらせん転位を導入し、外力をかけた状態でのキンク対の運動を計算機でシミュレーションした。原子間相互作用はStillinger-Weberポテンシャルを使用した。転位速度が横波の音速をこえると、格子で計算しても多重キンク対形成が起きることを確認できた。転位がPeierls potentialを乗り越える際には、キンク対ができ、できたキンクが互いに離れていく結果、転位が前進するというPeierls機構を考えるが、通常は多重キンク対形成のプロセスは考慮しない。本研究の結果は、Peierls機構で多重キンク対形成も考慮する必要があることを示唆するものである。
水素を利用したシリコン中の高温点欠陥研究及び二次欠陥フリー単結晶育成法の開発

チョクラルスキー法で育成したシリコン(Cz.Siと略記)に水素を添加した後、室温で3-MeVの電子線を照射した後、測定温度約7Kで光吸収を測定した。その結果、各種の点欠陥・不純物複合体を検出した。まず、第一は原子空孔・酸素対である。この対の濃度は電子照射量の3/4乗に比例して増加した。直感的には1乗に比例するはずであり、この依存性の原因は未解決である。一方この対の形成速度は酸素濃度の約1/5に比例した。このような小さな依存性は、原子空孔の拡散が速く、かつ酸素との相互作用が小さくて対形成までの拡散距離が大きいためである。浮遊帯溶融法で育成された場合(Fz.Siと略記)と異なり、原子空孔・水素分子複合体はほとんど形成されなかった。これは、酸素濃度が水素分子濃度より約2桁大きいためである。一方、格子間原子・水素分子複合体濃度はFz.Siのばあいより大きかった。これは、格子間原子が対消滅する原子空孔が、酸素と対を形成するためであると考えられる。ドーパント依存性及び照射量依存性から、1870及び1953cm^<-1>ピークがI_2H_2及びI_3H_2(I:格子間原子)という大きな複合体によるものであると同定できた。等時焼鈍実験をして複合体の安定性を研究した。その結果、原子空孔・酸素対が100°C付近より高温側で消滅し、それと同時に2126及び2152cm^<-1>に新しい吸収ピークが出現した。これらは、原子空孔・酸素対と水素分子の複合体による吸収ピークであると考えられる。何故なら、Fz.Siで見いだされている原子空孔・水素分子複合体による吸収ピーク2122及び2145cm^<-1>ピークに近いからである。本研究では、高温点欠陥検出法として、水素・点欠陥複合体の光吸収スペクトル測定法を提案している。そこで、まず水素・点欠陥複合体を形成している水素の振動による光吸収線のピーク位置から、点欠陥の種類を決定する手法を確立するために、各種の不純物をドープしたシリコン単結晶に水素をドープして室温で電子線照射し、それらの光吸収を測定した。その結果、自己格子間原子1個と水素原子2個とを含む複合体が1987&1990cm^<-1>、原子空孔1個と水素原子2個及び水素原子4個を含む複合体がそれぞれ2122cm^<-1>及び2223cm^<-1>に光吸収ピークを持つことを見いだした。点欠陥の種類は、光吸収ピーク強度に対するあらかじめドープしてあった不純物の効果から決定した。また複合体に含まれる水素原子の数は水素、重水素同時ドープによる光吸収ピークの分裂から決定した。次に、自己格子間原子濃度が高いと言われている炭素ドープシリコン結晶を、水素雰囲気中で高温熱処理後急冷し光吸収を測定した。水素・自己格子間原子複合体による1987&1990cm^<-1>ピークが観測されることを予想していたが、それに反して水素・原子空孔複合体による2223cm^<-1>ピークが観測された。この結果は従来信じられ、各種の実験結果解析に用いられてきた「自己格子間原子濃度と原子空孔濃度の積が不純物濃度に依存せず一定である」という仮説を否定する重要な結果である。そしてこの試料中の原子空孔形成エネルギーが約3eVと決定された。

チョクラルスキー法で育成したシリコン(Cz.Siと略記)に水素を添加した後、室温で3-MeVの電子線を照射した後、測定温度約7Kで光吸収を測定した。その結果、各種の点欠陥・不純物複合体を検出した。まず、第一は原子空孔・酸素対である。この対の濃度は電子照射量の3/4乗に比例して増加した。直感的には1乗に比例するはずであり、この依存性の原因は未解決である。一方この対の形成速度は酸素濃度の約1/5に比例した。このような小さな依存性は、原子空孔の拡散が速く、かつ酸素との相互作用が小さくて対形成までの拡散距離が大きいためである。浮遊帯溶融法で育成された場合(Fz.Siと略記)と異なり、原子空孔・水素分子複合体はほとんど形成されなかった。これは、酸素濃度が水素分子濃度より約2桁大きいためである。一方、格子間原子・水素分子複合体濃度はFz.Siのばあいより大きかった。これは、格子間原子が対消滅する原子空孔が、酸素と対を形成するためであると考えられる。ドーパント依存性及び照射量依存性から、1870及び1953cm^<-1>ピークがI_2H_2及びI_3H_2(I:格子間原子)という大きな複合体によるものであると同定できた。等時焼鈍実験をして複合体の安定性を研究した。その結果、原子空孔・酸素対が100°C付近より高温側で消滅し、それと同時に2126及び2152cm^<-1>に新しい吸収ピークが出現した。これらは、原子空孔・酸素対と水素分子の複合体による吸収ピークであると考えられる。何故なら、Fz.Siで見いだされている原子空孔・水素分子複合体による吸収ピーク2122及び2145cm^<-1>ピークに近いからである。
in vitro とin cellの蛋白質動態をつなぐX線１分子動態計測法の開発

X線1分子動態計測法はサブミリ秒時間分解能で蛋白質1分子の分子揺らぎと構造変化を動画として捉える事ができる。この方法を蛋白質1分子構造変化を定量的に評価できる汎用計測法として確立することを目的とした。本手法は、計測目的の生体分子1分子の特定部位に標識した金ナノ結晶の運動を結晶面からの回折点の運動として動画計測し、0.1度程度の高空間分解能で生体分子の動きを計測できる。サイズ制御した観測プローブの開発、および低ノイズ観測チャンバー開発によって定量性・汎用性のある動態計測法として確立することを目指し本年度は下記の成果を得た。(1)サイズ制御した金ナノ結晶の作製:液相法を用いてサイズ制御した観測プローブ開発を試みた。また、基板上に形成した金薄膜をパターンニングし、パターンを崩さないようにアニーリングする条件を検討した。(2)低ノイズ溶液置換観測チャンバーの開発:脈流のない溶液置換ポンプシステムの採用を決定し、ビームラインでの試験運用を行った。観測チップに関しては、表面修飾を行い、動態計測試験を行った。実験のプロセスは研究協力者である平井義和助教(京都大学)、研究協力者である田畑修教授(京都大学)の協力を得て行った。(3)SPring8での実験:SPring8で1.2で作製した金ナノ結晶および観測チャンバーのテストを行った。実験は研究協力者である岩本真幸助教(福井大学)の協力を得て行った。また領域内共同研究(九工大安永卓夫教授)でイオンチャネル蛋白質の単粒子構造解析をすすめ、日本生物物理学会に報告した。本研究の成果は、日本生理学会に報告すると共に、BBA-General Issuesに報告した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。