hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
グレリン併用運動療法の多面的抗生活習慣病作用に関する研究

グレリン併用運動療法の多面的抗生活習慣病作用を解明する事を本研究の目的としているが、運動時の内因性グレリンの分泌動態をまず明らかにするために、健常人男性9名(25.2 ±0.5歳)を対象として、50%VO2maxの強度で60分間サイクリング運動を実施し、さまざまな血中パラメーターの測定を経時的に行った。運動中の血中グレリン濃度は有意に低下し、運動終了30分後には回復傾向を示したが、デスアシルグレリンは運動中も運動後も有意な変化は認めなかった。また、成長ホルモンは運動開始45分後に約18 ng/mlにまで著明に増加し、インスリン値は運動開始3060分後に有意に低下した。また、血中カテコラミン3分画は運動後にそれぞれ著明に増加した。血糖値は運動中に低下傾向となり、運動終了30分後には開始前と比べて有意に低値となった。グレリン値と成長ホルモンまたは血中カテコラミン3分画は有意な負の相関を認めた。以上より、中等度運動によりグレリン分泌低下、グレリン-O-アシルトランスフェラーゼ(グレリンの脂肪酸修飾≒グレリンの活性化を行う酵素)の活性低下、または末梢組織でのグレリン取込(消費)亢進が惹起されると考えられ、運動に伴うアドレナリン系活性上昇にグレリン低下が関与している可能性が示唆された。Akamizuらの報告によれば、健常人にグレリン1.0 μg/kgを早朝空腹時に投与すると、約120 ng/mlにまで上昇する(Eur J Endocrinol. 2004;150: 447-55)ため、運動中に通常は低下するグレリンを外来性に投与することで、運動により得られる成長ホルモン分泌量よりもさらに多くの分泌を期待できることを確認できた。当初の計画よりは若干の遅れを認めている。理由としては、予想以上に対象患者のリクルートに時間を要していることや、人事の関係により実際的に現場で手を動かす人員が予定よりも減少していることが挙げられる。その理由として、実際的に研究に参加予定であった人員が、東日本大震災における医療支援のために本院を不在にする時期があり、臨床試験に対する見直しが必要になったことや、グレリン製剤の製造や流通への影響が挙げられる。今後は当初の計画を推進すべく、対象者のリクルートについて宮崎県医師会治験促進センター機構にも協力を依頼し、本院だけでなく関係医療機関への働きかけを強めて、患者のスクリーニング、本研究の説明・同意、実施中のサポートなどを得て研究を進めていく。今後は当初の計画を推進すべく、対象者のリクルートについて関係医療機関への働きかけや、グレリン製剤の安定供給に向けた製造会社との連絡・連携の強化を行っていきたい。また、グレリンの投与経路について、当初は皮下投与を予定していたが、安定した血中濃度維持などに問題がある可能性があり、過去に投与経験のある点滴静注での投与への変更も考慮する。人件費、研究協力者への謝金、血液検査の測定費用(外注検査費用、ELISAキットの購入費用)、研究成果発表や研究推進の情報収集のため糖尿病学会年次学術集会などへの旅費等として使用する計画である。人件費、研究協力者への謝金、グレリン製剤の購入費、血液検査の測定費用(外注検査費用、ELISAキットの購入費用)、研究成果発表や研究推進の情報収集のため糖尿病学会年次学術集会などへの旅費等として使用する計画である。
RNAiの機構に依存するイネのシュート形成に関する解析

本研究の目的はRNAiの機構により生じる低分子RNAシグナルとその標的となる分子の同定を行い、茎頂分裂組織形成に働く「低分子RNAを介したシグナリング」の一端を明らかにすることを目指している。これまでに胚や頂端分裂組織の器官分化に関連のあるshootless(sh1)およびshoot organization(sho)変異体から原因遺伝子の単離を行い、RNAiに関連するタンパクをコードする遺伝子を同定した。これらは低分子RNA結合タンパクであり、結合している低分子RNAが茎頂分裂組織の分化を制御するシグナルとして機能している可能性が高い。したがって、これらのRNAを同定することにより、発生を制御するシグナル分子の生成・伝搬・受容という一連の茎頂分裂組織形成過程が明らかになることが期待できる。今年度は野生型イネから2124ntの低分子RNAをクローニングし約1000の低分子RNAのシーケンスを得た。本年度はこの中から、マイクロRNAに分類されるものをその一次構造から分類した。さらに、マイクロRNAの前駆体がEST情報に登録されているものを選抜した。これにより、マイクロRNAとして確実に発現しているものを濃縮した。その結果、9個の新規イネマイクロRNAを同定した。この中に、シュート構築に関連するマイクロRNAが存在するか否かを現在検討中である。これまでに胚や頂端分裂組織の器官分化に関連のあるshootless (shl)およびshoot organization (sho)変異体から原因遺伝子の単離を行い、RNAiに関連するタンパクをコードする遺伝子を同定した。これらのほとんどはtRNAやrRNAの一部であった。また、マイクロRNAの前駆体の特徴であるヘアピン構造をとる遺伝子や進化的にできて間もないと考えられるマイクロRNAの前駆体の存在も明らかになった。これらのマイクロRNAの一部が植物で形態形成と密接に関連していると考えられているMADSボックスやホメオボックスといったDNA結合領域を持つ転写因子をターゲットとすることが明らかになった。来年度、茎項分裂組織の構築に関わる低分子RNAを同定するのに必要な予備的な情報を今年度は収集した。
自己組織化による光機能発現

本研究では自己組織化と光機能性分子/ナノ材料を組み合わせ、高効率エネルギー変換や新規生体機能を発現する次世代人工光合成を創成していくことを目指した。すなわち、ナノ領域での光機能性分子/ナノ材料、メゾ-マイクロ領域の自己組織化の鍵となる相互作用を理解し、制御することを目的とした。特に次のような学際的な手法により、特異な巨視的特性-機能を発現させることを行った。(1)種々の分子/ナノ材料を階層的に自己組織化するための構造ー機能相関の学理を解明することを目指した。特にフラーレン・カーボンナノチューブ・グラフェンを半導体電極上に同時に自己組織化し、光電変換特性を発現することに成功した。(2)ポルフィリン、共役ポリマー、フラーレン誘導体などの光機能性分子/ナノ材料を合理的に電極上に自己組織化させることで高効率太陽光エネルギー変換を実現することを目指した。特に浸漬溶媒を変化することで酸化チタン上の色素分子の吸着状態を変化させ、結果として色素増感太陽電池性能を制御できることを見いだした。一方、有機薄膜太陽電池では共役ポリマーの主鎖構造にハロゲン原子を導入することでフラーレン誘導体との混合膜状態を変化させ、太陽電池特性を制御することに成功した。(3)光電荷分離分子と生きた細胞を自己組織化を通じて融合することで細胞機能を光で制御することを行った。具体的には光電荷分離分子を生きた細胞膜に導入し光照射を行うと、細胞膜電位の脱分極が起こること、また光電荷分離寿命と脱分極の大きさに相関があることを見いだした。25年度が最終年度であるため、記入しない。
走査型トンネル顕微鏡による分子内機能単位での有機分子・生体分子の観察

本研究は、液体・固体界面を利用して有機分子及び生体分子を基板上に配向させ、これらの分子の高分解能でのSTM観察に成功した。まず、固液界面に有機分子を配向させる方法を開発した(95年論文発表)。さらに、この手法による有機分子のSTM観察は、当初の目的だった分子内の官能基単位の分解能を越え、有機分子中の個々の原子の識別にまで到達した(論文準備中)。このことから、有機分子のSTM像はフロンティア軌道の最高被占軌道や最低空軌道を単純に示しているのではないことが確認された。加えて、有機分子内の1原子の置換による2次元配向への影響を直接示すことに成功した。さらに、固液界面における2次元配向した分子の動的振る舞いを示した(論文印刷中)。この分子レベルの振る舞いを詳細に解析することによって、我々は、これまでに測定されてきたバルクな状態で観察されてきた現象を熱力学のフリーエネルギーの視点から分子レベルで統一的に述べることに成功した(論文準備中)。タンパク質のSTM観察において最大の疑問は、「絶縁体のタンパク質分子がなぜSTMによって観察することができるのか?」という点にある。しかしながら、これまでの報告で、再現性の高いSTM像が得られたことはほとんどない。1番の理由は、STM観察中に探針とサンプルの相互作用によって、サンプルが移動することにある。そこで、タンパク質分子を基板に共有結合することにより、この問題点を解決した。この方法によって、我々は簡便に、しかも、再現性の高いSTM像を得ることに成功した。この結果から我々は、タンパク質のSTM観察における新しいメカニズムを提唱している(論文準備中)。
カテプシンD欠損が中枢神経細胞の機能に与える影響

カテプシンD(CD)は神経性セロイドリポフスチノーシス(NCL)の動物モデルと考えられる。同欠損マウスで認められる神経変性の原因を明らかにする目的で、培養小脳顆粒細胞を用いた解析を行った。9日齢マウス脳より調整した小脳顆粒細胞を47日間培養し、位相差顕微鏡および抗MAP2抗体、抗tau抗体を用いた免疫染色法で観察した結果、神経突起の伸長やネットワーク形成に正常細胞との差は認められなかった。しかし、細胞体には正常細胞では認められないsubunit cの免疫反応が認められ、またリソソーム膜蛋白であるlamp 1/lamp 2の免疫反応も増加していた。さらに電子顕微鏡観察では、細胞体および神経突起内に高電子密度の物質を有するオートファゴゾームあるいはリソゾーム/エンドゾーム様構造物が蓄積しており、そのいくつかは腫瘤様構造物となって神経突起を内側より圧迫していた。以上の結果は、同培養細胞系においてもNCL様病態を摸倣できることを示しており、突起内の巨大リソゾーム/エンドゾーム様構造物が本病態に関与している可能性を示唆する。次にCD欠損細胞が細胞死刺激に対して脆弱であるかどうかをMTTアッセイにより解析した。血清除去による細胞死誘導およびグルタミン酸投与による興奮毒性刺激においては、CD+/-とCD-/-との間で生存活性に有意な差は認められなかったが、naphthazarin投与による酸化ストレスに対してはCD-/-細胞の生存活性がCD+/-に比してやや高かった。これら結果は、個々の細胞の生存活性のみでCD欠損マウスに認められる神経変性機序を説明することは困難であることを示し、一方では酸化ストレスで引き起こされる細胞死過程にカテプシンDが何らかの役割を有していることを示唆する。
「中途上がりイントネーション」の社会言語学的位置づけに関する研究

上記研究課題について、平成10年度は聞き手の認知面を中心に研究を行った。平成9年度の研究から、中途上がりイントネーションには、話し手がこまめに聞き手の反応を伺い、それを考慮しながら話を進める姿勢を示すという「丁寧さ・柔らかさ」という面と、「聞いていますか?」「わかりますか?」などの意味を、言語形式を使わずに上昇イントネーションによって表現し、またそれに応じた反応を聞き手に要求する「反応要求」という面の、異なる二つの面があることがわかった。そこで今年度は、このイントネーションに対する聞き手の印象を調べ、上で述べた中途上がりイントネーションの二面性との関わりについて分析を行った。その結果、聞き手の中途上がりイントネーションに対する全体的な印象は、否定的であるということがわかった。具体的には、「甘えた」「依存的な」「ふてぶてしい」「押しつけがましい」という印象を持つ人が多く、逆に「責任感のある」「知的な」「丁寧な」「控えめな」という印象を持つ人が少ないという結果になった。この結果を上で述べた二面性の観点から分析すると、話し手は「聞き手の反応を伺いながら談話を進めようとする協調的姿勢」を示す意図でこのイントネーションを使用しているが、その意図は伝わらず、逆に「相手の反応を見なければ話が進められない」という印象を与えた結果、「依存的」「甘え」と判断され、「責任感」「知的」とは遠いイメージで受け取られたと考えられた。またこのイントネーションの後者の面、すなわち、音調だけで話し手の要求を理解し、それに反応することを求めているという面が、「ふてぶてしさ」を感じさせ、「丁寧」「控えめ」という印象を与えないのではないかと考えられた。上記研究課題について、平成9年度は以下の点を中心に研究を行った。1発話データの収集2中途上がりイントネーションの特徴に関する分析(音声的特徴・統語的特徴)3談話における機能の分析その結果、特に3の談話における機能について、以下の点が明らかになった。まず「中途上がりイントネーション」の基本的な機能は、「聞き手の反応を伺いながら、聞き手との協調関係のもとに談話を進めようとする、話し手の姿勢を示す」ことにあると考えられた。さらにその機能を下位分類したところ、1発話継続の確認2不確かな情報の確認3聞き手の知識・理解の確認4同意・共感要求5注目要求に分類された。またこのイントネーションには、こまめに聞き手の反応を伺い、それを考慮しながら話しを進める姿勢を示すという「丁寧さ・柔らかさ」という一面もあるが、同時に、「聞いていますか?」「わかりますか?」「そう思いませんか?」などの意味を、言語形式を使わずに上昇イントネーションによって表現し、またそれに応じた反応を聞き手に要求する「反応要求」という、相反する二つの面があると考えられる結果になった。平成10年度はこの結果を踏まえ、さらに談話的特徴(このイントネーションに対する聞き手の言語・非言語行動を中心に)を明らかにし、また「中途上がりイントネーション」に対する聞き手の認知を調べ、上で述べたこのイントネーションの二面性との関わりを分析していく。
黄色ブドウ球菌の膜孔形成毒素における膜孔形成及び標的細胞崩壊機構の解明

先に私共は、γヘモリジンの『超チャネル』形成までの11行程のリアルタイムでの可視化に成功し、膜上における『超チャネル』の形成機構を明らかにした。しかしながら、膜孔の精密構造、毒素分子が膜に突き刺さるタイミング、標的細胞膜のレセプターの同定、及びロイコシジンにおける膜孔を介するシグナル伝達の仕組みは未解決である。本研究で私共は「1分子測定技術」を駆使して、毒素分子が膜に突き刺さるタイミングをナノメートルオーダーでリアルタイムに解析した。最初に我々は、黄色ブドウ球菌γヘモリジンにおいて、LukFのステムのT117Cの位置に、疎水環境で蛍光を発する色素BADANを導入した誘導体、並びにHlg2において[LukF-Hlg2]複合体形成に重要な位置にあるT29Cへ、紫外線照射により離脱する保護基nitrobenzyl bromide(NB)を導入した誘導体を作製した。次に、両誘導体を赤血球ゴースト膜上に添加後、紫外線照射により膜孔形成を開始させた。その結果、LukF-BADAN誘導体とHlg2が分子集合し、膜上で疎水領域を貫通したステムが形成された時に発する蛍光現象が1分子技術で観察された。黄色ブドウ球菌が大量に分泌し、感染に重要な役割を果たす2成分性毒素ロイコシジン(LukFとLukSから成る)並びにγヘモリジン(LukFとHlg2から成る)は標的細胞膜上にヘテロ7量体の中間体を経て膜孔を形成し、70100個の膜孔が集合して『超チャネル』を形成し溶血を促進する。ロイコシジンによる白血球崩壊には膜孔形成のほかに、さらにLukSの白血球膜上のプロテインキナーゼによるリン酸化が必須である。2003年2004年に申請者らは、γヘモリジンの『超チャネル』形成までの6行程のリアルタイムでの可視化に成功し、膜上における『超チャネル』の形成機構を明らかにした。さらに膜孔形成における重要アミノ酸残基を同定した。本研究でわれわれは毒素の各成分の標的細胞膜への結合のか如する因子を探索するとともに、1分子測定技術を駆使して毒素分子が膜に突き刺さるタイミングをナノメートルオーダーでリアルタイムで解析した。また、上記毒素遺伝子の発現調節遺伝子の同定を行った。その結果、(1)LukFの赤血球膜への結合に関与するアミノ酸残基を同定し、コリン残基結合部位変異体の詳細な解析を行って、stem伸長のタイミング及び膜上の因子との結合に必須なアミノ酸残基を同定した。(2)疎水的な環境におかれると蛍光を放つBadanをLukF成分のprestemに導入し、一分子技術を用いてstemの細胞膜中への貫入の可視化に成功した。Stemの貫入に伴う蛍光の増加は第2の成分(Hlg2)を作用させた後にのみ観察され、一つの膜孔を開口するには少なくとも3分子のLukF分子が必要であることを明らかにした。(3)Luk及びHlgが膜孔を形成する過程で、標的細胞膜上の脂質ラフトが重要な役割を果たしていることを明らかにした。黄色ブドウ球菌が大量に分泌し、感染に重要な役割を果たす2成分性毒素ロイコシジン(LukFとLukSから成る)並びにγヘモリジン(LukFとHlg2から成る)は標的細胞膜の上にヘテロ7量体の中間体を経て膜孔を形成し、200300個の膜孔が集合して直径が約0.1μmの『超チャネル』を形成し溶血を促進する。
明瞭な自由発話を対象とした頑健な大語彙連続音声認識の研究

自由で明瞭な話し言葉の音声認識のための,頑健かつ高精度な大語彙連続音声認識の研究を行った.最終年度の研究の具体的内容は以下の通りである.1.記述文法と統計言語モデルを統合した頑健な音声認識アルゴリズムの研究音声認識の言語モデルにおいて,コーパスから出現頻度を学習する統計的言語モデル(N-gram)は,確率に基づく柔軟な認識が可能だが,タスク固有の単語(例:商品検索システムにおける商品名)などの認識が難しい.逆に,発声文パターンをトップダウンに記述する小規模な記述文法はタスク内において高精度であるが,様々なユーザの発話の変動を考慮することが困難である.これに対して,N-gramにおいて文法を併用し,文法上で接続しうる単語のN-gram接続確率を補正する言語モデル統合手法を提案した.評価実験の結果,N-gramのみの場合の80%から88%へ認識精度を改善できた.2.音声認識アルゴリズムの改善研究担当者が開発している汎用大語彙連続音声認識エンジンJuliusにおいて,(a)音響尤度計算量の削減,(b)話し言葉認識のマルチパス音響モデルの提案,および(c)対話システムのための認識文法の動的切り替え機構の考案,を行った.これにより,話し言葉をより高精度に認識すると共に,ユーザの状態ごとに言語制約を切り換えるより緻密な音声対話インタフェースを構築することができる.この成果は一般に無償公開されており,誰でもプログラムが入手可能である.3.音声対話システムの構築とデータ収集・評価音声認識エンジンJuliusを用いた音声対話システムを構築し,ユーザの実発話データの収集と評価を行った.エージェントを用いたWeb検索システム,および生駒市コミュニティセンターの音声情報案内システムを構築し,データの収集と性能の評価を行った.コミュニティセンターでは26000発話以上のユーザ発話を収録した.また音声切り出しについて検討を行った.自由で明瞭な話し言葉の音声認識のための、頑健な大語彙連続音声認識(ディクテーション:自動書き起こし)の研究を行った。初年度である本年度は認識システムのアルゴリズム改善、話し言葉モデルの基礎的検証およびデータ収集を行い、成果を挙げた。以下に具体的内容を述べる。1.話し言葉認識のための音声認識アルゴリズムの改善多様な話し言葉音声の現象に対処するため、音声認識ソフトウェアJuliusの認識アルゴリズムを拡張した。「あー」「えっと」などの間投語をスキップする透過単語処理、認識結果を入力中に逐次確定する逐次デコーディング、複数の音韻モデルを並列適用するマルチパス音韻モデルに対応したViterbiアルゴリズムの高速化を行った。RWCP対話データベースやATR旅行対話コーパスで評価を行い、対話音声に対する認識精度と処理速度を向上させた。2.話し言葉用言語モデル・音響モデルの検討話し言葉の性質をより適切に捉える認識用モデルを、言語および音響の側面から検討した。話題に依存したテキストコーパスをWWWから自動収集して話し言葉言語モデルを自動構築する手法、機械との対話における音声特徴の分析、話し言葉における発話速度と音韻の崩れを考慮した高精度なマルチパス音韻モデルの学習と適用に関する研究を行い、話題や発話速度などの依存モデルを用いることによる認識精度の改善を示した。3.話し言葉を対象とした音声対話プラットフォームにおけるデータ収集と分析検証の場として、音声による受付案内対話タスクを設定し、数十人を対象とした実発話データや応答文コーパスの収集を行った。発話速度の変化に伴う認識精度の劣化、無声化などによる音韻の変形、対話用言語モデルの認識率への影響などが明らかになった。4.認識デコーダーJuliusの実装改善音声認識に用いられる認識エンジンJuliusの実装改善を行った。外部API整備や記述文法モードとの統合を行い、話し言葉認識のプラットフォームとしての開発を継続中である。自由で明瞭な話し言葉の音声認識のための,頑健かつ高精度な大語彙連続音声認識の研究を行った.最終年度の研究の具体的内容は以下の通りである.1.記述文法と統計言語モデルを統合した頑健な音声認識アルゴリズムの研究音声認識の言語モデルにおいて,コーパスから出現頻度を学習する統計的言語モデル(N-gram)は,確率に基づく柔軟な認識が可能だが,タスク固有の単語(例:商品検索システムにおける商品名)などの認識が難しい.逆に,発声文パターンをトップダウンに記述する小規模な記述文法はタスク内において高精度であるが,様々なユーザの発話の変動を考慮することが困難である.これに対して,N-gramにおいて文法を併用し,文法上で接続しうる単語のN-gram接続確率を補正する言語モデル統合手法を提案した.評価実験の結果,N-gramのみの場合の80%から88%へ認識精度を改善できた.2.音声認識アルゴリズムの改善研究担当者が開発している汎用大語彙連続音声認識エンジンJuliusにおいて,(a)音響尤度計算量の削減,(b)話し言葉認識のマルチパス音響モデルの提案,および(c)対話システムのための認識文法の動的切り替え機構の考案,を行った.これにより,話し言葉をより高精度に認識すると共に,ユーザの状態ごとに言語制約を切り換えるより緻密な音声対話インタフェースを構築することができる.この成果は一般に無償公開されており,誰でもプログラムが入手可能である.3.音声対話システムの構築とデータ収集・評価音声認識エンジンJuliusを用いた音声対話システムを構築し,ユーザの実発話データの収集と評価を行った.エージェントを用いたWeb検索システム,および生駒市コミュニティセンターの音声情報案内システムを構築し,データの収集と性能の評価を行った.コミュニティセンターでは26000発話以上のユーザ発話を収録した.また音声切り出しについて検討を行った.
インスリン受容体細胞内ドメインは転写因子となりうるのか?

申請者らはインスリン受容体細胞外ドメイン(αサブユニット)がヒト血中に遊離して存在している事を発見し、それが糖尿病発症と関連している事を見出した(論文投稿中)。そこで、インスリンシグナル伝達に関して新たな展開が予想された。すなわち、インスリン受容体と類似のEGF受容体はその細胞外ドメインが切断されると、それが引き金となり、細胞膜内でγ-secretase(presenilin)によりEGF受容体の細胞内ドメインが切断され(RIP : Regulated Intramembrane Rroteolysis)、核内に移行し、転写因子となることが報告された。いくつかの受容体で同様の報告がされている。この事実はEGF受容体と基本構造が類似したインスリン受容体の場合も、細胞外ドメインの切断が引き金となり、細胞内ドメインがRIPにより切断され、核内に移行し、転写因子として働く可能性が充分予想される。事実、申請者らがヒト胎盤よりインスリン受容体タンパク質を精製してくると、必ず、βサブユニットの細胞膜直下で切断された48kdの断片が回収される。またインスリン受容体の場合もEGF受容体と同様にトランスメンブレイン直下に核移行シグナル様のアミノ酸配列が存在する。CHO・hIR細胞を用いIRb'またはpIRb'(48kd)が核内に存在するか否か、形態学的に抗β抗体を用い検討している。現在までの所、インスリン受容体βサブユニットの一部が核内に移行しているという事実はつかんでいない、今後はさらに検出感度を上げるようシステムを改良する必要がある。申請者らは世界に先駆けてヒトインスリン受容体cDNAのクローニングに成功し、それに引き続き、細胞膜上にあるインスリン受容体を介するシグナル伝達の分子メカニズムの解明と、糖尿病の研究を精力的に行ってきた。最近、申請者らはインスリン受容体細胞外ドメイン(αサブユニット)がヒト血中に遊離して存在している事を発見し、それが糖尿病発症と関連している事を見出した(論文投稿中)。すなわち、インスリン受容体と類似のEGF受容体はその細胞外ドメインが切断されると、それが引き金となり、細胞膜内でγ-secretase(presenilin)によりEGF受容体の細胞内ドメインが切断され(RIP:Regulated Intramembrane Poteolysis)、核内に移行し、転写因子となることが報告された。CHO・hIR細胞を用いIRβ'またはpIRβ'(48kd)が核内に存在するか否か、形態学的に抗β抗体を用い検討している。
一細胞ゲノム解析へ向けた高性能ＤＮＡ増幅マイクロチップの開発

本研究では、規則性細孔を有するナノ空孔材料(メソポーラスシリカ)とDNA合成酵素を複合化することにより、ナノ空孔を反応場とした選択的かつ高感度のDNA増幅システムを構築することを試みた。本法では、シリカ細孔径の最適化によりDNA増幅効率を制御でき、従来法では増幅が困難である極微量DNAの増幅を実現した。また、酵素固定化マイクロチップによるハイスループットなDNA増幅を試み、ゲノムDNA増幅における流通式での繰り返し反応の実行可能性が示唆された。DNA合成酵素と規則性細孔を有するナノ空孔材料(メソポーラスシリカ)の複合材料を利用した高効率・長寿命のDNA増幅システムを構築することを目的とし、本年度前半までに、細孔径の異なる7種類のメソポーラスシリカと耐熱性DNA合成酵素(Taq DNAポリメラーゼ)の複合材料を用いたバッチ式PCRにおいて、基質DNAの非特異的吸着の抑制と酵素の繰り返し使用を同時に達成できる可能性を示した。本手法ではシリカの細孔径の違いにより酵素活性の最適化が可能であり、又、バックグラウンドDNA増幅を抑制できるため、一細胞レベルの極微量サンプルからの高精度DNA増幅手段としての利用が期待できる。また、本手法による効果の再現性を確認するとともに、国内特許出願ならびに第35回日本分子生物学会での成果発表を行った。本年度は更に、タイプの異なる耐熱性DNA合成酵素(KOD DNAポリメラーゼ)のシリカ材料に対する吸着挙動の評価および環状プラスミドDNAを鋳型とした長鎖(1000塩基対)のDNA増幅反応試験を行った。その結果、DNA合成酵素はシリカ材料に対して強固に吸着できており、また、未吸着のDNA合成酵素と比較して、固定化酵素では副反応を抑制でき、その結果、DNA増幅活性が増大できるという新たな効果に関する知見を得た。又、DNA合成酵素ーメソポーラスシリカ複合体を流通式マイクロチップを用いた反応に適用するために、流路幅0.5 mm、流路深さ0.1 mmのマイクロ流路(全長250 mm)を掘削したシリコーン樹脂基板(52×76 mm)を作製した。さらに、マイクロ流路中でのDNA合成反応を可能にするための温度制御装置の設計を行い、透明導電膜を介してマイクロ流路近傍を局所的に加熱可能である、既存の装置にはない新規のマイクロチップ用温度制御装置を製作した。従来のMultiple Displacement Amplification(MDA法)等のDNA増幅技術では、市販のDNA合成酵素溶液に混入しているバックグラウンドDNAの増幅問題などが指摘されている。我々は、この技術的課題を克服するために、バックグラウンドDNAの吸着を抑制しながらDNA合成酵素を選択的に固定化できる無機担体の開発を進めてきた。これまでに、短鎖DNAを対象としたPCRにおいて、無機多孔質材料(メソポーラスシリカ)が酵素の安定な固定化場として好適であることを見出した。当年度は、細孔径の異なる7種類のメソポーラスシリカ(細孔径:2.624.5 nm)に固定化したKOD DNAポリメラーゼを用いて、環状プラスミドDNAに挿入した4種類の長鎖DNA(0.6、1.2、2.6、5.0 kbp)の増幅を試みた。その結果、基質DNAの鎖長が長いほど反応が阻害される傾向が示されたが、全ての基質DNAを増幅可能なシリカ材料の至適細孔径が明らかになった。また、固定化酵素を回収、洗浄することによって反応溶液中に含まれているバックグラウンドDNAを除去した後、基質DNAを添加しPCRを行ったところ、ターゲットDNAのみを選択的に増幅することができた。当年度は更に、鎖置換型DNAポリメラーゼ(phi29およびBst DNAポリメラーゼ)ーメソポーラスシリカ複合体を担持した流通式マイクロリアクターを作製した。シリカに固定化したDNAポリメラーゼによる大腸菌数細胞レベルの染色体からのDNA増幅(MDA法)はバッチ反応にて困難であったが、固定化Bst DNAポリメラーゼによるLoop-Mediated Isothermal Amplification(LAMP法)では、バッチ及びマイクロフロー反応での増幅が認められ、さらに複数回にわたる酵素の繰り返し利用が可能であることが示された。ナノ空孔を反応場とした高効率・長寿命のDNA増幅システムを構築することを目的とし、本年度は、規則性細孔を有するナノ空孔材料(メソポーラスシリカ)と耐熱性DNA合成酵素の複合材料を用いたバッチ式PCRにおいて、ナノ空孔材料に対するDNA合成酵素の吸着挙動を解析するとともに、手始めとして、100塩基対のDNAを鋳型としたDNA増幅反応を試みた。具体的には、2.524.5 nmの細孔径を有する7種類のナノ空孔材料(FSMおよびSBA型)を合成し、これらシリカ材料に対するPCR用DNA合成酵素(Taq DNAポリメラーゼ)の吸着挙動の評価ならびに固定化酵素によるDNA増幅反応を実施した。その結果、DNA合成酵素はいずれのナノ空孔材料に対しても強固に吸着しており、また、FSMおよびSBA型どちらの場合も、細孔径が小さいほどDNA増幅活性が増大することを見出した。

また、本系が、1本鎖DNAではなく、2本鎖DNAに対して選択的に作用することを明らかにした。次に、ナノ空孔材料に吸着させていないDNA合成酵素のDNA増幅活性を基準にし、DNA合成酵素ーナノ空孔材料複合体の酵素活性が安定に保持されているかどうかを検証した。DNA増幅反応における繰り返し使用による耐久性評価を実施した結果、DNAの増幅効率は低下したものの4度の繰り返し耐久性を示した。以上の結果は、DNA合成酵素が繰り返し使用可能な状態でナノ空孔材料に安定に固定化されていることを示唆している。また、細孔径が酵素より小さい場合(2.55 nm)に、より高いDNA合成活性が認められたことより、酵素は細孔深部に内包化されず細孔入り口付近に固定化された時に鋳型DNAと相互作用可能になることが考えられる。一昨年3/11の大震災およびその後の大型余震の影響により、研究インフラおよび研究機器等の復旧に時間を要したため、初年度及び本年度に計画していた全ての実験項目について検討することはできなかった。しかし、PCR用DNA合成酵素と7種類のナノ空孔材料を用いたバッチ式反応を詳細に試験することによって複合化に最適なナノ空孔材料を見出すとともに、複合体の製造方法および用途に関する国内特許を出願することができた。また、これまでに達成できていなかった、環状DNAからの長鎖の増幅反応に成功し、これを流通式反応に適用するためのマイクロチップ(プロトタイプ)を作製することができた。以上のことより、本研究の目的に対する達成度は現時点で60%程度であると考えられる。昨年3/11の大地震およびその後の大型余震の影響により、研究インフラおよび研究機器等の復旧に時間を要したため、本年度に計画していた全ての実験項目について検討することはできなかった。しかし、1種類のDNA合成酵素と7種類のナノ空孔材料を用いたバッチ反応および繰り返し耐久性試験を実施し、複合化に最適なナノ空孔材料を見出すことができた。以上のことより、本年度の目標を80%以上達成することができたと考えられる。次年度は、交付申請書に記載の実施計画のうち、これまで実施できなかった実験と平成25年度の研究実施計画について検討する。具体的な推進方策としては、本年度に得られた研究成果を基に、DNA合成酵素ーナノ空孔材料複合体のマイクロチップへの実装について検証する。また、ここで作製した酵素固定化マイクロチップをPCR法に適用するとともに、最終的には、南極大陸由来の難培養性微生物一細胞から抽出したゲノムDNAを鋳型としたMultiple Displacement Amplification(MDA法)に適用し、本マイクロチップの性能を評価する。上述の理由により、本格的な実験の開始時期が本年度後半となったため、交付申請書に記載の実施計画通りに研究を展開することが困難であり、60万円強の次年度使用額が発生した。そこで、次年度は、これまで実施できなかった実験と計画書に記載の実験を検証するために次年度分の研究費を全て充当する。
ろう児に対する手話を活用した日本語リテラシー習得支援に関する研究

本研究は、手話を活用した日本語リテラシー習得支援に向けて、1)子どもの日本手話の力を評価できるテストの開発、2)手話を活用したリテラシー指導の実践収集、3)手話言語学を活用したリテラシー指導のモデル授業の開発、の3つの柱からなる。その結果、日本手話文法理解テストを試作し、一定程度の妥当性が確認された。また、手話の力を活用したリテラシー指導について、これまでのろう学校における実践を踏まえ、配慮すべきことについての提言を行った。ろう児に対して手話を活用した日本語習得支援を行う際、まず対象となるろう児の手話力と日本語力のアセスメントが重要になる。しかし、わが国にはろう児の手話力を評価できるテストバッテリーは存在しない。そこで、平成19年度は、ろう児の日本手話能力を評価するテストバッテリーを試作することを行った。わが国のろう学校で実際に使用するには、子どもの手話力を容易に評価でき、また評価を行う側に高い手話力や手話言語学の知識を必要としないテストの作成が求められる。イギリス手話理解テスト(Assessing British Sign Language Skills Development)がその条件を満たすものであったため、そのテストの作成者であるHerman氏を訪問し、ロンドンで資料収集と調査を行った。得た資料をもとに、日本手話ネイティブのろう者の協力を得て、日本版日本手話理解テストを試作した。その際、日本手話独自の文法項目や表現などを付け加え、47問からなるテストバッテリーを作成した。テストは、手話表現をビデオ収録したDVDと手話表現にあった絵が複数描かれた選択肢からなる。このテストは、30分程度で実施でき、またテスト終了後、すぐにスコアリングが可能であるため、学校現場で使用しやすいものになった。試作したテストは、2つのろう学校に在籍する3歳から12歳まで88名のろう児に実施し、個人差は非常に大きかったものの、3歳から9歳頃までは年齢に比例して獲得得点が上昇する傾向が見られ、9歳頃までの手話力を測定するテストとして使用可能であることを明らかにした。平成20年度は、大きく3つの研究を行った。第一に、聴覚障害児の日本語力、特に文法理解能力という観点から、J-COSSというテストバッテリーを用いて、111名の聴覚障害児に実施した。学年で平均を取ると、非常に個人差が大きく次一貫した傾向が見られなかったため、20の文法カテゴリーの通過率ごとにグループに分け、成績上位群から4つのグループに分けグループごとに分析を行った。成績上位群であっても、聴児ではもっと早い時期に通過する比較表現や受動文の理解の落ち込みが見られ、聴児とは異なる文法理解方略を用いていることが推察された。これにより、具体的な日本語指導の在り方や内容について、検討することが可能になった。また、手話力と日本語力の相関を見たところ、やや強い相関があったことも明らかとなった。第二に、手話を積極的に活用しているろう学校の授業実践を観察し、その後ろう学校教員とディスカッションする機会を計8回作った。その中で、日本語学習のうち、手話の力が活用できる点として、語彙や文法、心情理解や物語の楽しさを味わうことなどが挙げられたが、活用や音韻の部分は、手話だけでは指導が難しく、聴覚活用やドリルなどを用いながら、日々の積み重ねの指導が重要であることが明らかとなった。なお、観察した授業やディスカッションの内容については、一定のフォーマットで記録を行い、次年度も継続して調査を行う中で、日本語習得支援のモデル授業を作る上での参考資料としたい。第三に、日本手話の言語学的特徴について、これまでの日本手話に関する言語学的研究を整理し、ろう学校教員に身につけてほしい手話言語学の基礎的な知見をまとめる基礎資料を収集した。さらに資料を集め、次年度には日本手話の言語学について簡単なパンフレットを作成したい。本年度は、3年間にわたる本プロジェクトのまとめとして、聴覚障害児の持っている手話力をどのように日本語リテラシー習得につなげていくのかについて、現在ろう学校で行われている実践を整理した。実践は、1)手話ビデオを活用した指導、2)リライト文と手話による話し合いを活用した指導、3)手話文法と日本語文法を関連付けた指導、の3つが見られた。1)は、小学校国語科教科書を手話翻訳した手話ビデオ教材を用いた指導であり、教科書を開く前に手話ビデオを通して内容を深め、深めた内容について、教科書の日本語本文を通して、日本語そのものを学んでいくという授業である。2)は、授業者が教科書の内容を対象児が自力で読める程度の長さの日本語文(リライト文)に作り替え、リライト文を使って手話で話し合い活動をし、内容を深めたうえで、教科書本文を通して日本語を学習していくというものである。3)は、日本語の自動詞と他動詞、受身形、比較などの文法を学習する際、すでに獲得している手話の文法を日本語文法と比較しながら学習していく授業である。1)と2)は、訪問した学校の多くで行われ、学力的に厳しい聴覚障害児に対して国語の授業をする際、対象児のモチベーションを下げずに日本語の学習ができ、また語彙や字句の意味にとどまらず本文の内容に踏み込んだ指導ができるという利点があった。

一方、手話を活用しにくい聴覚障害児がいることも明らかになった。特に、本研究によって開発した「日本手話文法理解テスト」で一定水準以下の手話力しかない子どもの場合、手話の力が十分でないため手話による話し合いでも議論や理解が深まらず、日本語につながりにくい事例もあった。3)の事例は、指導実践としてはまだ多くはなく、手話文法を使った日本語指導の実践集を作る上で、このような実践記録をを基礎資料として集めていくことが必要であろう。
漸近展開法とモンテカルロ法を用いたキャリブレーション手法の開発

第一に、解析的な価格式を持たないヨーロピアン・オプションを対象にした並列化コードを実装し、並列化による計算速度の向上を確認した。ここでは、漸近展開を用いた分散減少法付きモンテカルロ法のアルゴリズムとしてTakahashi and Uchida(2006)で提案済みのものをアルゴリズム利用した。漸近展開や分散減少法を用いない既存アルゴリズムとしてオイラー・丸山法によるモンテカルロ法のアルゴリズムを利用した。並列・分散処理にかかる制御手法はsocketをもちいたサーバー・クライント型とした。数値実験の結果として、並列化手法を用いれば、一般的なモンテカルロ法では計算時間が長くて現実的でない「実用的な精度のキャリブレーション」が低次の漸近展開式を得るだけで可能になる、と考察した。第二に、漸近展開法とモンテカルロ法を組み合わせたアルゴリズムの応用範囲を広げることを目的として、漸近展開法を用いてヨーロピアン・オプションの初期値微分(グリース)を計算する計算式を導出した(Matsuoka, Takahashi and Uchida(2006))。この計算式を上記の並列化手法を用いて並列化することは容易である。第三に、アメリカン・オプションを対象にした漸近展開を用いたモンテカルロ法の開発を目的として、Rogers(2002)の方法に漸近展開法を組み合わせたアルゴリズムについて、基本的な数値実験を行った。この結果、単純なペイオフをもつアメリカン・オプションに対してはマルチンゲール項としてヨーロピアン・オプションの漸近展開式が有効であることが分かった。さらに、一般的なペイオフを持っアメリカン・オプションに対して有効なマルチンゲール項の計算を統一的な方法で行うことは必ずしも容易でないことが分かった。
「回復的司法」モデルの展開とわが国における適用可能性

本研究においては、近年刑事司法におけるパラダイム転換を図る理論として注目されている「回復的司法」(修復的司法)モデルの、わが国での可能性について検討した。もっとも、「応報的司法」モデルが支配的である(と解される)わが国の現況を前提とするならば、「回復的司法」モデル急な導入は、却ってこのモデルを「変質」させるおそれも危惧される。その意味で、現行司法制度の枠組みを維持しつつ、「回復的司法モデル」の段階的に導入する方向が考慮に値するように思われる。「回復的司法」モデルの内容自体、多岐にわたるものであるが、特に注目すべき点は、犯罪への対応の中心に「被害者」を位置づけようとしたことにあるといってよい。そこで、本研究では、被害者との関係修復という要因を、刑事司法過程においていかに捉えていくべきかを検討することとし、その主眼は、「量的段階」におくこととした。同モデルをめぐる議論の焦点の1つは、「刑罰の意義・目的」との関係であり、それが最も先鋭化した形で現れるのが量刑段階であると解されるからである。量刑においてこの問題を検討する際に重要となるのは、刑種・刑量の決定に際して「被害者関係的事情」をどこまで、どのように考慮していくかである。本研究では、すでに実体刑法理論との関係で、従来の量刑基準に「被害感情の充足」を代置し、あるいは付加することには多くの疑問があることが明らかにされた。また、処断形成過程における減免事由、特に中止未遂規定の本質に「被害者関係的」な要因を見出そうとする(わが国およびドイツで主張されている)見解にも問題があることが判明した。もとより、現行の刑法体系と「訣別」して、量刑においても「被害者関係的事情」を全面的に考慮することが、将にわたって否定されるものではない。しかし、同モデルの実証研究が十分ではなく、内容自体も論者による多様性が認められる現時点においては、慎重な対応が求められよう。今年度は、回復的司法モデルに関する国内および国外の主要文献を収集・分析し、わが国の量刑および行刑段階において、回復的司法モデルの適用が可能かどうか、可能であるとすればどのような形態であるべきかについて若干の検討を行った。特に量刑段階における問題に関しては、量刑事情として被害者関連的要素を考慮することが妥当か否かという点を含めて、いくつかの論稿を発表した。国内の文献を調査して明らかになったことは、現段階においては主として欧米での制度や学説などを紹介することに主眼をおいたものが多く、まだわが国での本モデルの具体的な適用可能性について論じたものは少ないという点であった。もっとも、昨年の法改正でわが国の刑事手続に被害者の意識陳述件が導入されたことは、たとえばイギリスにおけるVISに内在する問題点が、わが国においても顕在化するのではないかという危惧とともに、回復的司法モデルの日本独自の展開を跡づける必要性を生じさせたといえよう。また、行刑段階においても、少年に対する処遇プログラムの中に、被害者関連要素を取り入れる試みが実務レベルではすでに実施されていることが矯正関係者に対する聴き取りで明らかになった。現時点では、回復(関係修複)モデルと応報モデルを対立するものとして図式化することが、(議論の整理としては有効であるとしても)今後のわが国における議論にとって有益であるかどうか再検討する必要がある-と研究代表者および分担者は認識している。

本研究では、近時、刑事司法制度の新たなパラダイムとして欧米で注目されている「回復的司法(修復的司法」(restorative justice)モデルを分析し、併せてわが国における同モデルの適用可能性について検討を行った。同モデルは、従来の「応報型刑事司法」モデルと比較するとき、刑事手続きにおいて「忘れられた存在」とされてきた被害者の保護を直接的な形で考慮できる点で、確かに優れた面を有している。問題は、これまでの「応報型刑事司法」モデルと完全に訣別するならば格別、わが国のように同モデルを基盤とした刑事司法制度を前提とする場合に、「回復的司法モデル」の要請をどこまで受容していくことが可能かである。本研究では、主として量刑および行刑段階に着目した。まず、量刑段階においては、わが国でも刑事訴訟法の一部改正によって既に導入されている「被害者の意見陳述」が特に問題となる。実体法的観点からは、被害者が陳述した意見(英米におけるVISに相当)をどのような量刑事情として位置づけるかが、また手続法観点からは、被害者の刑事手続関与を当事者主義といかに調和させるかが重要となる。結論的には、被害者の意見陳述を「権利」として構成することは後者との関係で難点が多く被害者にとってマイナス面もあること、前者との関係でも量刑を不安定化する要因があることが明らかになった。次に行刑段階においては、アメリカで実施されているような受刑者の仮釈放に際しての被害者の意見表明が問題となるが、これについても現在の更生保護制度の構造に沿わない面が多いことが判明した。以上のように、従来の制度を維持したままで「回復的司法」モデルをわが国に導入することは却って被害者支援に結びつかない面があり、(その是非は別にしても)完全なパラダイム転換を前提としなければ同モデルの本来の有効性が発揮できないことが重要な知見として得られた。
色素性乾皮症の遺伝子変異の種類・頻度および分布

過去の結果を含めた現在までの日本人XPの相補性群はA群120例、B群0例、C群8例、D群15例、E群10例、F群17例、G群1例となった。日本人A群XP患者のXPA遺伝子の突然変異を制限酵素多型で検索した結果、56例のAlwNI-/-(intron3,G→C)、4例のAlwNI+/-and HphI-/+(codon228C→T)、2例のAlwNI+/-and MseI-/+(codon116T→A)、1例のAlwNI+/-and MacII-/+(codon225G→C)、1例のAlwNI-/-and MseI+/-、2例のHphI-/-患者を見いだした(過去の報告を含む)。2例を除く全ての患者はAlwNIの突然変異をホモまたはヘテロに持ち、いわゆるfounder effectが日本人A群XP患者に顕著に見られることがわかった。臨床症状が軽いA群XP患者を見いだし、患者のXPA遺伝子の塩基配列を決定したところ、片方のアレルではイントロン3の最後の塩基がGからCに、他方のアレルではエクソン5の最後(コドン225)の塩基がGからCに変異していた。この変異はこれまでに報告がない新たな変異である。mRNAをRT-PCR法で増幅し、塩基配列を決定すると、いずれのアレルからのmRNAも異常なスプライシングを起こし、終止コドンを生じていた。しかし、片方のアレルからわずかながら転写されるmRNAとそれによってできる蛋白には機能的に重要な部分(Znフィンガードメイン)が含まれるので、細胞はわずかにDNA修復能を持ち、紫外線感受性が中程度で、患者の症状が軽いと考えられる。我々はanti-ERCC1抗体を用いた免疫学的手法によって、XPF細胞に特異的に欠損する蛋白を探すことを試みた。正常細胞ではERCC1蛋白と120kD蛋白が複合体を形成しているが、XPF細胞ではどちらの蛋白の存在も少ないことがわかった。120kD蛋白はXPF遺伝子産物である可能性が高いと考えられる。臨床症状が軽い日本人A群色素性乾皮症(XP)患者を見いだした。その患者皮膚繊維芽細胞は紫外線に高感受性であるが、典型的A群患者細胞より感受性は低く、紫外線照射後の不定期DNA合成(DNA修復能)も正常の10%程度持っていた。患者のXPA遺伝子の塩基配列を決定したところ、片方のアレル(アレル1)ではイントロン3の最後の塩基がGからCに、他方のアレル(アレル2)ではエクソン5の最後の塩基がGからCに変異していた。アレル2のmRNAから翻訳される蛋白は正常より小さいがわずかな活性があるため、患者の細胞はDNA修復能を持ち、臨床症状が軽いと考えられる。今回見いだしたA群患者のXPA遺伝子のエクソン5の変異は世界でこれまでに報告のない新たな変異であった。チュニジアと日本のXP患者の相補性群の分布の違いを調べるため、チュニジア(アラブ)人の新たなXP患者の相補性を調べ、2例のA群と3例のC群XPを見いだした。C群XP患者のXPC

遺伝子の変異の検索には、cDNAをRT-PCRで増幅し、プラスミドにクローニングして塩基配列を決定する方法を用いたが、この方法ではPCRの際のTaqポリメラーゼによる変異と本来の変異との区別ができず、この研究には不適切であることがわかった。F群色素性乾皮症(XP)の原因遺伝子は7つ(AG)の遺伝的相補性群の中で現在までのところ唯一クローニングの報告がない。ヒトの除去修復機構の構成蛋白であるERCC1のイ-ストのホモログRAD10蛋白はRAD1蛋白と複合体を形成し、エンドヌクレアーゼ活性を持つ。同様に哺乳類細胞ではERCC1複合体形成のパートナーとしてXPF蛋白が(すなわちRAD1ホモログとして)予想されている。我々はanti-ERCC1抗体および精製ERCC1蛋白を用いて免疫学的手法によって、XPF細胞に特異的に欠損する蛋白を探すことを試みた。anti-ERCC1抗体を用いたwestern blot法で各XP細胞相補性群におけるERCC1蛋白の発現を調べると、全てのXPF細胞で極度に低下していた。正常ヒト細胞において^<125>IでラベルしたERCC1蛋白と結合する約120kDのバンドがfar western blot法によって検出されたが、XPF細胞では検出されなかった。^<35>S-メチオニンでラベルした細胞抽出物をanti-ERCC1抗体で免疫沈降すると正常細胞では126kDの蛋白が共沈したが全てのXPF細胞では共沈しなかった。全ての細胞においてXPA蛋白はanti-ERCC1抗体によって沈降しなかった。以上のことからERCC1蛋白と126kD蛋白は正常細胞では複合体を形成して存在しているが、XPF細胞ではどちらの蛋白の存在も少ないことがわかった。126kD蛋白はXPF遺伝子産物である可能性が高いと考えられる。平成7年度終わり頃、イギリスのWoodとオランダのHoeijmakerらによって、XPFのcDNAがクローニングされた。我々はWoodと共同研究を始め、F群XP患者のXPF cDNAの突然変異の同定を開始した。これまでに3人の患者についてその変異を見いだした。それらは10塩基の欠失、21塩基の欠失、1塩基の挿入であった。
プロラクチン遺伝子導入ラットを用いた外分泌腺組織再生の検討

プロラクチンは下垂体前葉から産生されるホルモンで、妊娠時に増加し、乳汁の分泌促進や乳腺の発達を促すことが知られていることから、涙腺・唾液組織に与える影響を検討する目的で、プロラクチンの組織特異的な遺伝子発現が可能なプロモーターを用いトランスジェニック・ラットを作成し以下の結果得た。1.parotidssecretory protein(PSP)のpromoterであるLamaを用いることにより唾液腺・涙腺特異的に導入遺伝子を発現するモデル動物を確立出来、導入発現が検出された臓器は耳下腺と涙腺で肺、肝臓などには明らかな発現は認めなかった2.プロラクチン(PRL)を高発現するこのトランスジェニックラット(PRL-TG)では明らかな細胞浸潤や腺組織障害を認めなかった。3.PRL-TGは正常ラットとの唾液・涙液の分泌量を比較したところ、唾液量や涙液量共に亢進していた。4.放射線照射後(15Gy)の唾液・涙液量は著しく減少したが、PRL-TGでは32週で回復した。5.ヒト唾液腺腫瘍細胞株(HSY)にPRLをin vitroで添加すると線組織の分泌マーカーであるアミラーゼの発現が亢進した。6.唾液腺腫瘍細胞由来のHSY細胞をPRLで刺激すると唾液・涙液の分泌を制御する転写因子CREBのリン酸化が誘導された。以上の結果からプロラクチンの局所投与や遺伝子導入は乾燥症状の改善や腺組織の再生に役立つ可能性が示唆された。涙腺、唾液腺の組織破壊により惹起される眼乾燥、口腔乾燥を主徴とした慢性的臓器機能欠損疾患の治療法として、近年再生医学による臓器の機能再生が試みられている。そこで今回、Lama promoterを用いたプロラクチン(PRL)トランスジェニックRatが作製し、その解析を行うことにより、PRLの唾液腺、涙腺組織に及ぼす影響を検討する。すなわち涙腺組織、唾液腺組織にPRLを過剰発現させることにより、涙腺細胞、唾液腺細胞の再生能や加えて分泌機能に及ぼす影響について検討する。導入遺伝子を局所発現させるためにLama promoterを用いた。このpromoterはparotid secretory protein(PSP)遺伝子の上流に位置し、PSPの発現を調整している。PSPは涙腺においてもその発現が報告されており、Lama promoterを用いる事で、導入遺伝子の唾液腺、涙腺への局所発現が可能と考えられる。Eco RI-Bst Iリンカープライマーを付与したLama promoter-rat PRL cDNAクローンを、wister rat受精卵の前核へマイクロインジェクションにより導入した。続いて、生存している受精卵を、偽妊娠マウス(仮親)の子宮に約20個移植し出産させた後、出産後4週目に、尾の先端の細胞から抽出したDNAを用いPRLに対するプライマーによりPCRを行うことで遺伝子導入の成否を確認し、そのF0マウスを交配させ継代維持すると共に検討を加え、一部の受精卵を凍結保存した。1.parotidssecretory protein (PSP)のpromoterであるLama6を用いることにより唾液腺・涙腺特異的に導入遺伝子を発現するモデル動物を確立出来、導入発現が検出された臓器は耳下腺と涙腺で肺、肝臓などには明らかな発現は認めなかった2.プロラクチン(PRL)を高発現するこのトランスジェニックラット(PRL-TG)では明らかな細胞浸潤や腺組織障害を認めなかった。

5.ヒト唾液腺腫瘍細胞株(HSY)にPRLをin vitroで添加すると線組織の分泌マーカーであるアミラーゼの発現が亢進した。6.唾液腺腫瘍細胞由来のHSY細胞をPRLで刺激すると唾液・涙液の分泌を制御する転写因子CREBのリン酸化が誘導された。以上の結果からプロラクチンの局所投与や遺伝子導入は乾燥症状の改善や腺組織の再生に役立つ可能性が示唆された。