hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ストロンチウム安定同位体と元素分析による灌漑農地の塩分起源の 同定

研究の結果、ストロンチウム安定同位体比とそのイオン濃度による混合解析により、排水中における塩分の起源を定量的に明らかにすることができた。排水中に含まれる塩分の起源は主に灌漑水、肥料、海水であり、それらの混合比は灌漑期と非灌漑期で明確な違いを示すことが明らかになった。NaとCaの起源について定量的な解析は未だ検討中であるが、ストロンチウム安定同位体比、Na/Sr, Ca/SrのトレーサーとSrの解析結果を用いることで、これらの環境中の動態を定性的に解釈することが可能であることが示された。本研究は、乾燥地の灌漑農地において、土壌塩性化の改良・防止および農業排水による環境負荷の削減に向けて塩分の起源を考慮した塩分管理手法を策定するための基礎研究である。具体的な目的は、高塩分濃度の農業排水再利用が行われ土壌塩性化が発生している地域を対象として、ストロンチウム安定同位体と元素濃度の組み合わせにより塩分の起源を同定することである。塩分起源の同定とは、塩分の構成要素について定性的かつ定量的に明らかにすることを意味する。平成22年度の計画は、1.現地研究者・研究機関との打合せ、試料のサンプリング、2.同位対比と元素濃度測定、3.データ解析(構成要素とトレーサーの検討)である。まず1.については、これまでの研究協力関係者と研究計画について協議し、従来より研究を進めてきた方法で継続的に試料のサンプリングを実施していくことで合意した。次に、2.については、サンプリングデータの分析を実施し、3.のデータ解析につなげることができた。データ解析の結果、ストロンチウム安定同位体比(^<87>Sr/^<86>Sr)とNa/Sr、Ca/Sr(イオン比)を用いることで排水における塩分に関し、土粒子表面での吸脱着反応プロセスを考慮すると、ナトリウムとカルシウムのそれぞれの起源を定性的かつ定量的に分析することができる見通しがついた。この結果は、従来までのトリリニアダイアグラム等によるイオン構成比による塩分起源の分析に対して、同位体を用いた物質起源を同定する手法を用いたことで、より科学的に精度の高い分析を可能にするものである。平成23年度の計画は、1)試料のサンプリング(夏,冬の年2回を予定)、2)同位対比と元素濃度測定、3)データ解析(構成要素とトレーサーの検討)、4)結果整理・考察(土壌塩性化防止,排水負荷,環境負荷などの検討)、5)論文執筆・投稿および国内外での成果発表である。まず1)については、研究協力関係者と共同で実施した。ただし、今回は日程等の関係で冬のサンプリングを実施することができなかった。2)以降は主に日本において実施し、分析を進めデータの蓄積を進めることができた。サンプル水を用いたデータを分析した結果、昨年度に引き続きストロンチウム安定同位体比(87Sr/86Sr)とNa/Sr、Ca/Sr(イオン比)の分析プロットが、これまでのサンプルと同様の傾向を示したことから、これらがNaとCaのトレーサーとして利用できる可能性が高まった。これらの結果と土壌表面における吸脱着反応プロセスを組み合わせることで、塩性化を生じさせる塩分起源を定量的に分析することができるようになると考えられた。本研究は、乾燥地域おいて塩性化が発生している灌漑農地の水・塩分管理について、塩分起源を考慮した灌漑排水の手法を開発するためのものである。中心課題は塩分起源の推定である。ここでは、特に灌漑ブロックの排水に着目し、ストロンチウム安定同位体比を軸として、塩分起源の定量的な分析を行った。その結果、特に次のような結果を得た。1) 87Sr/86Sr同位体比(以下Sr比)の値は、排水中に含まれると想定していた灌漑水、肥料、海水で明確に異なる値を示した、2)海水のSr比は文献の通り季節に関係なくほぼ均一で0.70917であった、3)灌漑水のSr比は季節によって若干変動があり、0.768510.70876であった、4)排水のSr比は季節によって、また採取地点によって大きな差があった。

特に、冬期における排水のSr比は排水ブロックによって明確な差が認められた、5)冬期における排水のSr比は3つの幹線排水路において、それぞれ0.70854、0.70843、0.70835であった、6)肥料分のSr比はサンプル中もっとも低く、0.70817であった、8)混合モデルを用いた結果、塩分としてのSrの起源は、灌漑ブロックによって大きく異なった、9)いまだ海生起源の塩分が残る灌漑ブロックでは、塩分中における灌漑水:肥料分:海水の割合は9%、64%、27%で、排水改良や除塩作業が進んだブロックでは、その比が3%、87%、10%となっていた、10)以上の結果から塩性化した灌漑農地の塩分起源は、特に冬期における幹線排水路の末端における排水サンプルの分析により、その灌漑ブロックの塩分起源の傾向を明らかにすることができることがわかった。これらの成果を用いれば、排水改良や除塩作業の内容や優先順位を決定でき、塩分起源を考慮した灌漑排水手法の開発に役立てることが可能であることが示された。分析機器の不良および元素抽出メソッドの改良による。24年度が最終年度であるため、記入しない。土壌の吸脱着プロセスについて文献レビューを行い、土壌表面に吸着している物質の分析を行うことで、塩性化を引き起こしている塩分起源をさらに正確に同定できるようになる。
各種開放隅角緑内障眼の線維柱組織における細胞外基質の同定

原発性開放隅角緑内障、落屑性緑内障、先天性及び若年性緑内障、血管新生緑内障、ステロイド緑内障、ぶどう膜炎続発緑内障、スタージ・ウエーバー症候群などの全身疾患に続発する緑内障などの多種類の緑内障について、線維柱帯切除術時に線維柱組織を摘出し、固定後、ロビクリルK4Mに冷包埋し超薄切片を作成した。1.緑内障眼における免疫組織電顕切片に対し、既知の細胞外基質であるI、III、IV、V、VI型コラーゲン、エラスチン、ラミニン、ビトロネクチン、フイブロネクチン、トロンボスポンジン、ケタラン硫酸、ヘパラン硫酸に対する抗体と各種レクチンを用いて、イムゴールド法にて標識を行い、ウラン鉛染色後、透過型電子顕微鏡にて観察した。その結果、原発性開放隅角緑内障眼の細胞外基質にはエラスチンの増加、落屑緑内障眼には、ガラクトース、マンノース、シアル酸を含む糖残基の増加、先天性及び若年性緑内障眼には、シアル酸を含む糖残基(特にフイブロネクチン)の増加が見られた。2.In sutuハイブリダイゼーション手法原発性開放隅角緑内障に対し、パラフィン包埋した組織片を準備し、ランダムプライマー法でラジオアイソトープを標識したDNAプローブを用いて、オートラジオグラフィーにてmRNAの検出を行ったが、非特異的反応が強く、シグナルが明瞭に認識出来なかった。
社会的困難を有する若年者のリテラシー実態とその支援に関する実証的研究

本調査研究では、困難を有する若者の実態とその支援のあり方について、リテラシーという概念に着目して整理・検討することを目的とした。そうした問題意識のもと、困難を有する若者を支援する団体や当事者(若者)に対する聞き取り調査を実施した。その結果、支援にあたっては、居場所の提供や信頼できる人間関係の構築、基本的な生活習慣の確立がまず必要であること、そのうえで、若者の背景をつかみ、寄り添いながら、かれらの主体性を育んでいくことが求められる、ということが明らかになった。くわえて、関係する団体や機関が連携することで、重層的かつ継続的な支援が可能となることもわかった。2013年度は、まず、1科学研究費補助事業以前に実施していた調査研究成果を研究誌や学会発表にて中間報告を行った。そこでは、更生保護施設、自主夜間中学、識字学級等における、「困難を有する若年者」の実態とその支援について、リテラシー(支援)という観点からどのように読み解けるのか、ということを議論し、「困難を有する若年者」支援のあり方についていくつかの提案を行った。具体的には、「困難を有する若年者」への生活支援(生活習慣の確立や人間関係の回復など)がリテラシー支援の前提、あるいは基盤となっていること、各地域における関係諸機関とのネットワークの中で支援が行われていること等を、各組織・団体の活動・実践の共通点として見出した。あわせて、2「困難を有する若年者」を対象に学習支援等を実施している団体・組織(高知朝倉夜間中学校/高知市、NPOスチューデント・サポート・フェイス/佐賀市、えんぴつの会/東京墨田区)への訪問聞き取り調査をあらたに実施した。それぞれにおいて、活動の見学、支援者ならびに学習者への聞き取りを実施し、各団体・組織の概要と経緯、現状と課題、そして対象となる学習者の実態等とその支援のあり方について把握することに努めた。科学研究費事業以前に実施していた、更生保護施設、自主夜間中学、識字学級等における活動・実践との比較・検討も行い、事例調査は順調に進めることができた。その間、1と2、さらには2014年度以降の本調査研究の方向性を検討するために、3研究会を計4回実施した。ニートやフリーター、ひきこもり等の問題が格差・貧困と関連づけて社会問題化される中、とりわけ「困難を有する」子ども・若者への支援については喫緊の課題として研究・実践が積み重ねられてきている。そうした中、本調査研究では、「リテラシー」という概念に着目し、社会的に困難を有する若年者の実態とその支援のあり方ついて検討・整理することを目的とする。そのため、本調査研究では、社会的に困難を有する若年者を対象として支援等を行っている団体・組織の、支援者ならびに被支援者に対する聞き取り調査等を実施してきた。2013年度は、更生保護施設、自主夜間中学、識字学級等を調査対象としたが、2014年度は、それらに加えて、地域若者サポートステーション、公立夜間中学、フリースクール、進路多様校(中退者)等を調査対象とした。それぞれの支援団体・組織の支援者ならびに被支援者に対する聞き取りをとおして、各支援団体・組織の現状と課題、被支援者(困難を有する若年者)の実態と、かれらに対する支援のあり方について検討を進めた。あわせて、国内における若年者支援に関連する制度・施策や海外(イギリス、アメリカ、韓国)の成人基礎教育施策・実践の動向、PIAAC(国際成人力調査)の結果の検討をしたうえで、上記の各支援団体・組織を対象とした聞き取り調査の結果もふまえながら、「リテラシー」概念の整理を行った。それらの成果については、2013年度と同じく、研究代表者ならびに、分担者・協力者が学会発表や論文等にて個人・共同で報告を行った。また、これらの調査研究を円滑に展開するために、研究代表者ならびに、分担者・協力者による会議を隔月ペースで実施した。ニートやフリーター、ひきこもり等の問題が格差・貧困と関連づけて社会問題化される中、とりわけ「困難を有する」子ども・若者への支援については、重要な課題として研究・実践が積み重ねられてきている。そのような背景のもと、本調査研究では、「リテラシー」という概念に着目し、社会的に困難を有する若年者の実態とその支援のあり方について検討・整理することを目的とする。このような問題意識にもとづいて、本調査研究では、社会的に困難を有する若年者を対象として支援等を行っている団体・組織を訪問し、そこの支援者ならびに被支援者に対する聞き取り調査等を実施してきた。2013年度の調査対象は、更生保護施設・自主夜間中学・識字学級で、2014年度の調査対象は地域若者サポートステーション・公立夜間中学校・フリースクール・進路多様校であった。これらの調査をとおして、各支援団体・組織の現状と課題、被支援者(困難を有する若年者)の実態とかれらに対する支援のあり方について考察を進めた。上記の調査結果とあわせて、日本国内における若年者支援に関連する諸制度・施策や海外(イギリス、アメリカ、韓国)の成人基礎教育施策・実践の動向、PIAAC(国際成人力調査)の結果の検討などをしたうえで、「リテラシー」概念の整理を行った。最終年度となる2015年度は、それらの調査結果をもとに、共同研究会メンバーが学会発表や論文執筆をそれぞれで行うとともに、最終報告としてまとめる準備を進めた。2016年度の前半に、書籍というかたちで発刊する予定である。

その結果、支援にあたっては、居場所の提供や信頼できる人間関係の構築、基本的な生活習慣の確立がまず必要であること、そのうえで、若者の背景をつかみ、寄り添いながら、かれらの主体性を育んでいくことが求められる、ということが明らかになった。くわえて、関係する団体や機関が連携することで、重層的かつ継続的な支援が可能となることもわかった。2013・2014年度と、「困難を有する」若年者に係わる支援団体・組織を対象として、支援者・被支援者の聞き取り調査を実施し、その成果について随時、学会発表や研究論文として報告してきた。調査ならびに、その成果報告については順調に進んでいる。社会教育最終年度となる2015年度は、2013-14年度に実施してきた調査研究のまとめとして、報告書等の作成を進める。そのために、研究代表者、分担者・協力者等による成果報告の検討会を重ねる。並行して、本調査研究の成果と課題をふまえて、次なる調査研究の展開についても検討する。研究実績の概要でも記しているとおり、2013年度は、科学研究費補助事業以前の調査研究のまとめを行いつつ、新たな事例調査研究も実施し、2014・2015年度に実施する調査研究の準備を整えることが十分にできた。2013年度の調査が当初予定していた以上に進展し、2014年度の聞き取り調査に係わる旅費と人件費・謝金について、その費用をおさえることができた。2014年度は、PIAAC(国際成人力調査)の再分析(量的調査)と、引き続き「困難を有する若年者」を対象とした支援団体・組織の訪問調査(質的調査)を実施する予定である。後者については、これまでに実施してきた支援者・学習者に対する聞き取り調査にくわえて、各団体・組織における一定期間の参与観察を行うことを考えている。そのことによって、「困難を有する若年者」のリテラシーの実態について、より正確に把握することに努める。また、地域若者サポートステーションの取組等についても、新たな調査対象として検討していく。2015年度には、それらの調査結果をまとめ、学会報告や報告書等にて最終結果を報告する。2015年度は、調査研究の成果のまとめに際して、打合せや学会発表等に係わる旅費が必要となる。また、調査データの整理等に係わる人件費・謝金も一定必要となる。研究分担者の聞き取り訪問調査への参加が予定より少なかったために、旅費相当分が繰越しとなった。2014年度は、2013年度以上に研究会・訪問調査の実施の頻度が増すので、その旅費に充てる。
微粒子から分子までを視野に入れた超音波分離・計測

超音波を用いた粒子分離法の確立のため、以下の検討を行った。1.電場を用いて粒子濃縮を行い、その後超音による粒子の選別を行えるようなチャンネルの設計、製作2.イオン交換樹脂などを膨潤状態の違いによって識別するための基礎検討3.金属など高密度粒子の音場内挙動に基づく分離の可能性の検討1では電場を用いた濃縮の有用性とそのための技術を確立し、単一粒子の音場内挙動を定量的にとらえることが可能であることを確認した。しかし、音場による粒子分離は粒子間相互作用などのために困難であった。2では、イオン交換樹脂を圧縮率の違いによって識別できることを見出し、その挙動は対イオンの水和状態によってきまることを明らかにした。これにより、超音波を用いてイオン交換現象を種々の方向から計測、評価可能であることが明らかになった。3では、超音波は高密度粒子であるが圧縮率の小さい金属をむしろ軽い粒子であると認識しており、それらを音場内に浮揚させることが容易であることを見出した。密度による選別機構が強く働くために、金属間の分離は容易ではないが、音場の調節によって鉄とステンレスのような比較的性質の似通った粒子を分別することが可能であった。前年度に見出した流れ特性を分子分離にまで拡張することを検討した。流れ特性を流路の長さ、径、流れの速さ、拡散の大きさから定量的に評価し、それに基づいて非拡散性、拡散性物質を見かけ上異なる位置に溶出させることができる。この機構は、溶存分子のように比較的似通った拡散係数を持つものでは分離機構として働き得ない。しかし、ミセルやベシクルのように溶存分子に比べて1桁以上拡散係数が異なるものとの相互作用を利用すると、分子の特性に応じた分離が可能である。この現象を定量的に評価し、それを利用して種々の有機分子、無機イオンなどを、中空キャピラリーを通過させるだけで分離できることを示した。今年度は、超音波を用いた粒子分離法の確立を目指して研究を展開した。その結果、国内外を問わず、始めて超音波とそれに直交する流れ特性を利用した粒子分離法を開発することに成功した。この方法を用いると、密度が異なるポリスチレンとアクリル系のポリマー粒子だけでなく、圧縮率が異なるポリスチレンとポリビニルトルエン粒子を分離することができる。また、音場の設計として、一方向からの超音波を他方の端で反射させることによる定在波発生と両方から位相の異なる超音波を発生させ、それらの干渉により定在波の節を移動させる方法を確立した。その結果、いずれの方法においても粒子のトラッピングが可能であることがわかった。さらに、一度トラップした粒子を音場の強さを変化させることによって、その流出時間を制御できることを示した。また、狭いチャンネル内を粒子が移動する際の静水的特性についても詳細に検討した。一つは静水揚力に関する検討である。粒子が壁際を移動するとき、壁から離れようとする静水揚力を受けることが知られているが、定量的に測定、議論した例はない。電場によって粒子を壁に引きつけ、静水揚力と拡散力を見積もる実験を行ったところ、マイクロメーター程度の粒子では、前者の効果が大きく、サブマイクロメーターでは後者の寄与が大きくなることがわかった。また、粒子のように拡散が本質的に小さな物質では、その拡散特性から流れプロファイルをそのまま反映して移動することがわかった。この場合、最大流速と共に移動する粒子も存在し、その結果流れの下流で検出を行うと、2カ所にピークを与えることが判明した。

この現象をシミュレーションと実験によって詳細に検討し、新しく分離系における拡散特性を示す指標を提案することができた。また、従来広く用いられているTaylor法に比べて容易に物質の拡散係数を評価できる新しい手法へと発展させた。超音波を用いた粒子分離法の確立のため、以下の検討を行った。1.電場を用いて粒子濃縮を行い、その後超音波による粒子の選別を行えるようなチャンネルの設計、製作2.イオン交換樹脂などを膨潤状態の違いによって識別するための基礎検討3.金属など高密度粒子の音場内挙動に基づく分離の可能性の検討1では電場を用いた濃縮の有用性とそのための技術を確立し、単一粒子の音場内挙動を定量的にとらえることが可能であることを確認した。しかし、音場による粒子分離は粒子間相互作用などのために困難であった。2では、イオン交換樹脂を圧縮率の違いによって識別できることを見出し、その挙動は対イオンの水和状態によってきまることを明らかにした。これにより、超音波を用いてイオン交換現象を種々の方向から計測、評価可能であることが明らかになった。3では、超音波は高密度粒子であるが圧縮率の小さい金属をむしろ軽い粒子であると認識しており、それらを音場内に浮揚させることが容易であることを見出した。密度による選別機構が強く働くために、金属間の分離は容易ではないが、音場の調節によって鉄とステンレスのような比較的性質の似通った粒子を分別することが可能であった。前年度に見出した流れ特性を分子分離にまで拡張することを検討した。流れ特性を流路の長さ、径、流れの速さ、拡散の大きさから定量的に評価し、それに基づいて非拡散性、拡散性物質を見かけ上異なる位置に溶出させることができる。この機構は、溶存分子のように比較的似通った拡散係数を持つものでは分離機構として働き得ない。しかし、ミセルやベシクルのように溶存分子に比べて1桁以上拡散係数が異なるものとの相互作用を利用すると、分子の特性に応じた分離が可能である。この現象を定量的に評価し、それを利用して種々の有機分子、無機イオンなどを、中空キャピラリーを通過させるだけで分離できることを示した。
光干渉法による極短時間植物ナノ動態計測に基づく光化学オキシダントの作物影響評価法

超高感度な統計干渉法を用いて秒オーダーの極短時間における植物の葉などの成長挙動をサブナノメータの分解能で計測できるシステムを用いて,環境汚染物質として主にオゾンに焦点を絞り,イネなどの作物に対するオゾンストレスを早期にかつ定量的に評価することを目的とした実証研究を行った。その結果、従来法に比較して数時間の短時間のオゾン曝露によるストレスを高感度にモニタ可能であり、また品種間のオゾン耐性の差を評価することが可能であった。本研究では、提案する統計干渉法に基づいて,秒オーダーの極短時間における植物の葉などの成長挙動をサブナノメータの分解能で連続的にin situ計測できるシステムを用いて,新しい植物の環境ストレスモニタリング技術を確立することである。具体的な環境汚染物質としてオゾンに焦点を絞り,イネなどの作物に対するオゾンストレスを早期にかつ定量的に評価することを目的とした実証研究をおこなった。1.植物成長の極短時間形態応答の計測システムの構築に関しては、ノートパソコンを基本としたコンパクトで可搬性のある計測システムを構築し同時に計算速度の向上も図っている。また,必ずしも本計測装置に精通した者でなくとも簡便に操作できるよう扱いやすい計測ソフトウェアをGUIを用いて新規に構築した。2.植物の極短時間成長動態と環境ストレスおよび長期的生育状態予測の指標としての有効性の検証の検証に関しては、作物植物としてイネに注目し、オゾンに対して収量の点から比較的耐性の弱い品種と強い品種であるコシヒカリとフサオトメを対象として実験をおこなった。120,240ppbのオゾン濃度で3時間の暴露実験を3日間繰り返した。葉の成長のナノメータ揺らぎの標準偏差は、両品種ともオゾン濃度に対応して明らかな低下を示した。また、オゾン抵抗性の強いフサオトメではその低下はコシヒカリに比べてほぼ半分であった。また低濃度の暴露では、24時間後に回復傾向も確認することができた。以上のことから本研究でオゾンストレスの指標として注目している成長のナノメータ揺らぎに基づいて品種間の耐性の差および濃度に依存した変化を確認することができた。このような短時間でのオゾン暴露に対して従来法であるクロロフィル蛍光法では変化を検出できなかった。本手法は従来法に比べて感度が高いことから短時間(1時間程度)の測定によりストレス評価が可能であり実用上意義がある。本研究では、申請者が提案している統計干渉法に基づいて,秒オーダーの極短時間における植物の葉などの成長挙動をサブナノメータの分解能で連続的にin situ計測できるシステムを用いて,新しい植物の環境ストレスモニタリング技術を確立することである.本年度はイネに加えて、ハツカダイコン、ダイズ、ホウレンソウに対して環境汚染物質として,主にオゾンに焦点を絞り,オゾンストレスを早期にかつ定量的に評価することを目的とした実証研究を行った。今年度は植物活性を評価する従来法として光合成速およびクロロフィル蛍光法と比較するため比較的長期である30日間のオゾン除去した大気(CF)、通常の大気(NF)、および通常の1.5倍の濃度のオゾン(1.5NF)の曝露実験を行い提案手法と比較してその有効性を検討した。その結果、従来法である光合成速度では値の低下は確認されるが必ずしも有意な低下が認められなかった。例えばハツカダイコンに対してCFとNF,ダイズに関してNFと1.5NFとの差異など。これに対して植物生長のナノメータゆらぎに基づく本手法ではいずれの条件でも有意なナノメータゆらぎ量の低下が認められた。これにより、大量のオゾン曝露では従来法との相関が認められることから、本手法で提案しているナノメータ成長ゆらぎ量はオゾンストレスの指標となりうることが示された。さらに従来法に比べて感度が高いことから短時間(1時間程度)の測定によりストレス評価が可能であり実用上意義がある。もう一つの研究目標であるナノメータゆらぎの生理学的起源の解明に関しては、細胞の水の輸送を制御している細胞膜上に存在するアクアポリンを阻害する実験を行った結果、濃度により50%程度の低下が引き起こされた。したがって、ナノメータゆらぎの起源として細胞内の水の輸送が関係していることが示唆された。本研究の目的は、提案する統計干渉法を用いて秒オーダーの極短時間における植物の葉などの成長挙動を精密に計測できるシステムを用いて,新しい植物の環境ストレスモニタリング技術を確立することである。環境汚染物質としてオゾンに焦点を絞り,作物に対するオゾンストレスを早期にかつ定量的に評価するための研究をおこなった。植物の極短時間成長動態においてナノメータスケールの自発的成長揺らぎ(NIF)を発見し、この現象の環境ストレスおよび長期的生育状態予測の指標としての有効性の検証実験をおこなった。作物植物としてハツカダイコン、ダイズ、2品種のイネに注目した。長期間の暴露による慢性的オゾンストレスハツカダイコン、ダイズに対して0ppb,通常大気,オゾン濃度1.5倍のオゾン大気を1ヶ月間の長期間の暴露実験をおこなった。

NIFの応答を従来法である光合成速度による結果と比較した結果、従来法と高い相関があり、かつ、より高感度であることを確認した。短時間の暴露による急性オゾンストレス120,240ppbのオゾン濃度で3時間の暴露実験をコシヒカリとフサオトメを対象として3日間繰り返した。NIFの標準偏差は、両品種ともオゾン濃度に対応して明らかな低下を示した。また、オゾン抵抗性の強いフサオトメではその低下はコシヒカリに比べてほぼ半分であった。また低濃度の暴露では、24時間後に回復傾向も確認することができた。以上のことから本研究でオゾンストレスの指標として注目しているNIFに基づいて品種間の耐性の差および濃度に依存した変化を確認することができた。このような短時間でのオゾン暴露に対して従来法であるクロロフィル蛍光法および光合成速度、気孔伝導度などでは変化を検出できなかった。本手法は従来法に比べて感度が高いことから短時間(1時間程度)の測定によりストレス評価が可能であり実用上意義がある。実施計画で挙げている(1)ナノメータゆらぎの環境ストレスの指標としての有効性の検証、および(2)植物生理応答との比較検討に関して、従来法との相関を実証しさらに従来法に比べて短時間かつ高感度の評価が可能であることを実証した。(3)ナノメータゆらぎの生理学的起源の解明に関しては、細胞の水の輸送が関連していることを明らかにした。以上のように研究は順調に進展している。24年度が最終年度であるため、記入しない。1.作物植物に関してさらにサンプル数を増やして実験を行い、ナノメータ生長ゆらぎのオゾンストレス応答をより明確にする。2.データ解析法としてスペクトル解析を試みる。3.ナノメータ生長ゆらぎの起源に関してさらに検討し、実験を進める。
脆性塑性遷移における間隙流体圧変化の地震サイクル挙動への影響

本研究では、大断層の地震発生帯の下限部、脆性・塑性遷移(BPT)領域の剪断帯の地震サイクルを通じての挙動を明らかにするため、実験的手法と数値実験的手法を組み合わせた研究を行う。BPTにおける岩石の間隙率の変化に注目し、BPTを含む広い実験条件下においてアナログ物質を用いた室内変形実験を行い、剪断強度に加えて模擬剪断帯試料の幅、間隙率の変化を実測する。実験結果をふまえ、BPTを記述できる既存の構成則モデルの検証・高度化を行い、地震サイクルシミュレーションへ実装する。
モデルマウスを用いた解析と罹患同胞対連鎖解析による変形性関節症原因遺伝子の探索

変形性関節症(OA)の成因に関わる遺伝子の解明を目印として、モデルマウスからのアプローチと罹患同胞対連鎖解析を計画した。1.変形性関節症症例のDNA収集これまでに、複数の関節に外傷の影響のないOAをきたしている弧発例173例、姉弟例29家系38sibpairsを収集した。2.モデルマウスの遺伝子遺伝性に関節の石灰化と変形をきたすankマウスにおける原因遺伝子ankのヒトhomologueであるANKH遺伝子について、その完全長cDNAとプロモーター領域の塩基配列を決定した。日本人40例のDNAを用いて、PCR-SSCP法、ダイレクトシークエンス法により、SNPs(一塩基多型)の検索を行った。その結果、翻訳領域にA1303Gの1カ所、5'非翻訳領域に8塩基の挿入欠失多型、3'非翻訳領域にG1831A、プロモーター領域に-785A/G、-639delCの2カ所、合計5カ所の多型を同定した。OA202例とコントロール103例のDNAを用いて、これら5カ所の多型とOA発症との相関解析を行った結果、5'非翻訳領域の8塩基挿入欠失多型において、OA発症に有意な相関をみとめた。したがって、ANKH遺伝子がOAの発症に関与する司能性が示された。3.罹患同胞対連鎖解析現在まで、家系例のDNAは29組38sibshipsであり、罹患同胞対連鎖解析を行うに十分な症例数にいたっていない。さらに収集を継続し、罹患同胞対連鎖解析を行いたい。変形性関節症(OA)の成因に関わる遺伝子の解明を目的として、モデルマウスからのアプローチと罹患同胞対連鎖解析のための症例のDNA収集を行っている。1.モデルマウスの遺伝子遺伝性に関節の石灰化と変形をきたすankマウスについて、ポジショナルクローニングによる原因遺伝子の同定を試みていたが、他の研究グループによりその原因遺伝子は先に同定された。(AndrewM et al.2000,Science)その報告によると、ankマウスの原因遺伝子ankは、新規遺伝子であり、そのコードする蛋白は石灰化抑制物質であるピロリン酸の細胞内外の輸送に関わる膜蛋白であった。遺伝子内のnonesense mutationにより、細胞外のピロリン酸濃度が上がらないため組織の石灰化をきたすと報告された。ヒトOAへのAnk遺伝子の関与を調べるため、ヒトAnk遺伝子のgenomic structureを解析し、SNPs(一塩基多型)を同定した。報告されたヒトcDNA sequenceを用いて、ゲノムプロジェクトで進行中のゲノムシーケンスとのhomology searchを行い、exon-intron junctionとイントロンのシークエンスを同定した。その結果ヒトAnk遺伝子は12のexonからなっていた。exon-intronjunction部のシークエンスから各エクソンを増幅するPCR primerを設定し、20例のOA症例のgenomic DNAを対象として、SSCP解析を行った。A1031G G1559Aの2カ所のSNPsを同定した。今後さらにSNPsの同定を進めていき、OA症例とコントロールのDNAを用いて、相関解析を行う。2.変形性関節症症例のDNA収集罹患同胞対連鎖解析および相関解析のためのDNA収集を行っている。現在までに、複数の関節に外傷の影響のないOAをきたしている弧発例50例と姉弟例数例を収集した。1.変形性関節症症例のDNA収集罹患同胞対連鎖解析および相関解析のためのDNA収集を行っている。現在までに、複数の関節に外傷の影響のないOAをきたしている弧発例141例と姉弟例24組33sibshipsを収集した。平成14年度はこれを用いて罹患同胞対連鎖解析を行う計画である。

2.モデルマウスの遺伝子遺伝性に関節の石灰化と変形をきたすankマウスにおける原因遺伝子ankのヒトhomologueであるヒトAnk遺伝子について、SNPs(一塩基多型)の検索を引き続き行った。これまでに、A1031G、G1559Aの2カ所のSNPsを同定しており、OA症例とコントロールのDNAを用いて、相関解析を行ったが、有意な相関はみられなかった。今後さらにSNPsの検索を進めていき、相関解析を継続する。3.候補遺伝子アプローチによる相関解析OAの成因に関わる可能性のある遺伝子を候補遺伝子として、その遺伝子内のSNPsについて相関解析を行っている。今年度は、軟骨変性に関わる可能性のあるMMPs(Matrix Metalloproteinases)遺伝子について相関解析を行った。OA患者138例とコントロール93例を用いて、MMP-1,3,9ののプロモーター部分の多型(これらは機能的に差異を有する多型であることが報告されている)について相関を検討したが、有意な相関はみられなかった。引き続き候補遺伝子アプローチによる相関解析を継続する。変形性関節症(OA)の成因に関わる遺伝子の解明を目的として、モデルマウスからのアプローチと罹患同胞対連鎖解析を計画した。1.変形性関節症症例のDNA収集これまでに、複数の関節に外傷の影響のないOAをきたしている弧発例173例、姉弟例29組38sibpairsを収集した。2.モデルマウスの遺伝子遺伝性に関節の石灰化と変形をきたすankマウスにおける原因遺伝子ankのヒトhomologueであるヒトAnk遺伝子について、その完全長とプロモーター領域の塩基配列を決定した。日本人40例のDNAを用いて、PCR-SSCP法、ダイレクトシークエンス法により、SNPs(一塩基多型)の検索を行った。その結果、翻訳領域にA1031G、G1559Aの2カ所・5'非翻訳領域に8塩基の欠失多型、プロモーター領域に-785A/G、-639delCの2カ所、合計5カ所の多型を同定した。OA202例とコントロール103例のDNAを用いて、これら5カ所の多型とOA発症との相関解析を行った結果、5'非翻訳領域の8塩基欠失多型において、OA発症に有意な相関をみとめた。したがって、Ank遺伝子がOAの発症に関与する可能性が示された。3.罹患同胞対連鎖解析現在まで、家系例のDNAは29組38sibshipsであり、罹患同胞対連鎖解析を行うに十分な症例数にいたっていない。さらに収集を継続し、罹患同胞対連鎖解析を行いたい。
熱電性能向上を目指したＮａｘＣｏＯ２ナノ構造体の形状・サイズの精密制御

本研究課題の目的は、様々な形状・サイズを精密に制御したNaxCoO2またはLixCoO2のナノ粒子を作製することで、ナノ粒子と熱電性能の相関を実証することである。昨年度までは、粒径が均一に制御された層状LixCoO2ナノ粒子を作製し、その形成プロセスを解明することにも成功した。また、粒径の差異による熱伝導率への影響の調査に向けた、層状LixCoO2ナノ粒子の粒径制御にも成功している。そこで本年度は、ナノ構造体の形状の差異が熱電特性に及ぼす影響を調査することを目指し、層状LixCoO2ナノ多孔体を作製した。当初、昨年度までの鋳型(多孔質カーボン)を用いて層状LixCoO2ナノ多孔体の作製を試みたが、層状LixCoO2の前駆体であるCo(NO3)2・6H2Oとカーボンとの相互作用が非常に弱いため、ナノ粒子の作製成功に留まっていた。そこで、Co(NO3)2・6H2Oとの相互作用が強いSiO2を鋳型に選択し、まずCo3O4ナノ多孔体を作製し、それを出発物質として多段階的に反応させることで、層状LixCoO2ナノ多孔体の作製に成功した。まず、SiO2ナノ粒子が規則集積したSiO2コロイド結晶を鋳型として、その構造を反映したCo3O4ナノ多孔体を作製した。その後、Co3O4ナノ多孔体とLiNO3を反応させ、スピネル型LixCoO2ナノ多孔体を作製した。得られたスピネル型LixCoO2ナノ多孔体表面にジルコニウム系酸化物を形成させた後、さらに高温での焼成により相転移させることで層状LixCoO2ナノ多孔体を作製した。鋳型に用いたSiO2はSiO2コロイド結晶以外にも様々な形状を有するSiO2ナノ多孔体が存在するため、様々な形状の層状LixCoO2ナノ多孔体の作製が期待される。また、この作製手法の確立は無機材料合成技術の開拓や新規熱電変換材料の創製に貢献しうる非常に重要な成果である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題の目的は、様々な形状・サイズを精密に制御したNaxCoO2またはLixCoO2のナノ構造体を作製することで、ナノ構造体と熱電性能の相関を実証することである。本年度は、形状・サイズが制御されたLixCoO2ナノ構造体の作製及びその焼結条件の検討に焦点を絞って研究を推進した。1.形状・サイズが制御されたLixCoO2ナノ構造体の作製LixCoO2は、平均自由行程が約35nmのフォノンが熱伝導率に大きく寄与することが理論的に示されているため、作製するナノ構造体の壁厚を35nm以下で制御することを試みた。まず、細孔径約30nmの球状細孔が規則集積した3DOMカーボンを鋳型に用い、その鋳型細孔内にCo源とLi源を導入し、水熱処理を行うことで鋳型内部にLixCoO2を析出した。そのご、焼成により鋳型を除去することで、粒径が約30nmで均一に制御されたLixCoO2ナノ粒子の作製に成功した。熱電物性の測定に必要な、グラムスケールでの合成には至っていないものの、形状・サイズの精密制御に成功したことは、ナノサイズ化による熱電性能向上の効果を実証する上で、重要な成果である。2.LixCoO2ナノ構造体の焼結条件の検討一般的に粉末の熱電性能の測定には、放電プラズマ焼結機で作製したペレットを用いる。焼結前後でナノ構造体の構造が保持するペレットの作製条件を検討する予定であったが、ペレット作製に必要な収量は得られなかった。そこで、平均粒径約35nm(16-65nm)で粒径が不均一なLixCoO2粒子を用いて、形状が保持する焼結条件を検討したところ、焼結前後でLixCoO2結晶の形状が保持する条件を見出した。このことは、ナノ構造体においても適応可能な焼結条件であることが期待できるため、ナノ構造体のペレット作製に向けた指針となりうる重要な成果である。1.形状・サイズが制御されたLixCoO2ナノ構造体の作製フォノン散乱による熱伝導率の低減を調査するために適した、粒径が約30nmで均一に制御されたLixCoO2ナノ粒子の作製に成功した。当物質については、熱電物性を測定可能なほどの試料量を得る手法が確立できていないものの、最も困難であると予想していた鋳型外部でのLixCoO2結晶の析出を抑制したことは、本研究課題を推進する上で、非常に価値のある成果である。また、LixCoO2をナノサイズ化することで、バルク体のLixCoO2結晶と比較してCoO2層間のアルカリ金属イオンの拡散速度が向上することが予想されるため、平成29年度に予定しているキャリア濃度の制御が比較的容易に行うことが期待される。さらに、鋳型合成法を用いて、層状金属酸化物のナノ構造体の形状・サイズを精密に制御したことは、無機合成化学の観点からも、極めて興味深い成果である。2.LixCoO2ナノ構造体の焼結条件の検討上記で作製したLixCoO2ナノ構造体において、ペレット作製に必要な収量は得られなかった。

そこで、平均粒径約35nm(16-65nm)で粒径が不均一なLixCoO2粒子を用いて、ペレットを作製する際の温度や圧力条件の検討を行った。その結果、焼結前後でLixCoO2結晶の形状・サイズが保持する最適な条件を見出しつつある。このことから、形状・サイズが制御されたLixCoO2ナノ構造体の合成が熱電物性の測定に必要なグラムスケールで確立でき次第、LixCoO2ナノ構造体のペレット作製に円滑に移行することが可能である。したがって、熱電特性の評価およびナノ構造化による性能向上効果の実証に向けて、順調に進行していると言える。本研究課題の目的は、様々な形状・サイズを精密に制御したNaxCoO2またはLixCoO2のナノ粒子を作製することで、ナノ粒子と熱電性能の相関を実証することである。本年度は、「1.粒径が異なるLixCoO2ナノ粒子の作製および形成プロセスの解明」と「2. NaxCoO2ナノ粒子の形状・サイズの精密制御」に着手した。1.粒径が異なるLixCoO2ナノ粒子の作製および形成プロセスの解明平成28年度は、細孔径約30 nmの球状細孔が規則配列した3DOmカーボンを鋳型に用い、その鋳型細孔内でLixCoO2を析出することで、粒径が約30 nmで均一に制御されたLixCoO2ナノ粒子を作製した。そこで昨年度は、粒径の差異による熱電特性への影響を調査するため、細孔径20 nmの3DOmカーボンを鋳型に用いたところ、粒径が約20 nmで均一に制御されたLixCoO2ナノ粒子の作製に成功した。また、各反応段階の詳細な分析により、3DOmカーボンにはナノ粒子の形状・サイズを規定する鋳型としての役割と、Li+を供給しLixCoO2を生成する反応場としての役割を併せ持つことが分かった。この結果は、金属酸化物ナノ構造体の組成制御も可能であることが期待されるため、無機合成化学・材料化学の両観点から、極めて興味深い成果である。上記で確立したLixCoO2ナノ粒子の作製手法を用いて、NaxCoO2ナノ粒子の作製を試みたところ、一部ではあるものの鋳型の形状・サイズを反映したNaxCoO2ナノ粒子の作製に成功した。さらに、NaxCoO2ナノ粒子の形成過程での圧力が、ナノ粒子の形状・サイズを制御する際に重要な要因であることを見出しつつある。また、熱電特性の測定に必要なグラムスケールでの合成を確立するには、3DOmカーボンを除去する焼成条件を検討する必要があることも分かった。1.粒径が異なるLixCoO2ナノ粒子の作製および形成プロセスの解明LixCoO2は、平均自由行程が35 nm以上のフォノンを散乱することで、熱伝導率が大幅に低減することが理論的に示されている。そのため平成28年度は、細孔径約30 nmの3DOmカーボンを鋳型に用いて、粒径が約30 nmで均一に制御されたLixCoO2ナノ粒子を作製した。そこで平成29年度は、粒径と熱伝導率との相関解明に向けて、細孔径20 nmの3DOmカーボンを鋳型に用いたところ、粒径が約20 nmで均一に制御されたLixCoO2ナノ粒子を作製した。さらに、各反応段階の詳細な分析により、鋳型細孔内でLixCoO2ナノ粒子が形成するプロセスを解明することにも成功した。これらの結果は、LixCoO2ナノ粒子の形状・サイズを精密に制御する手法の確立に大きく貢献する成果である。上記でLixCoO2ナノ粒子の形成プロセスを解明したことで、作製が困難であると考えていたNaxCoO2ナノ粒子の作製が可能であると考え、NaxCoO2ナノ粒子の形状・サイズの精密制御にも着手した。その結果、一部ではあるものの、所望の形状・サイズに制御したNaxCoO2ナノ粒子の作製に成功した。さらに、NaxCoO2ナノ粒子の形状・サイズを制御するには反応系内の圧力を適切な条件に調節することが必要であることを見出しつつある。
生態系改変におけるシロアリの役割

生態系改変におけるシロアリの役割を考察するために、イエシロアリ職蟻を実験動物としてメタン生成量測定方法の確立、イエシロアリ職蟻あるいは兵蟻のメタン生成量測定メタン生成量の経時的変化、イエシロアリ後腸内の共生原生動物の分布(Localization)や生存数の季節的消長などを実験室コロニーと野外コロニーを用いて研究した。シロアリに起因するメタン生成量測定は、気中でのメタン濃度測定と同様に、検出器として水素炎イオン検出器を装着したガスクロマトグラフによって可能であった。イエシロアリ職蟻の場合、メタン生成量の測定開始後72時間位は比較的一定の速度でメタンを生産することが経時的側定から明らかになった。その間のメタン生成速度は、1頭1時間当り0.70.8nmolであった。イエシロアリ後腸内に存在する3種の共生原生動物は、季節に関係なく種類によって後腸内の特定部位に局在することが観察された。原生動物の局在化が木材多糖類の消化に関係することが木材摂食活性との関係から示唆されたが、各々の役割についての確実な説明は不可能であった。原生動物数の季節による変動は、実験室飼育コロニーでも野外コロニーでも明確には認められなかった。シロアリが地球大気中のメタン濃度の上昇に影響を与え、地球の温暖化に関与していること、自然界での植物質の分解を促進していることが今回の研究でも質的に証明できたが、生態系改変へのシロアリの影響を量的に推定する上での碓度を高めるには、より多くのシロアリ種を対象に同様の研究を継続する必要がある。シロアリと微生物との関係には、共生、寄生あるいは病原性などが考えられるが、イエシロアリと後腸内に存在する原生動物とは共生関係にあることが知られ、3種の原生動物が木材消化に深く関連しているとされている。このことを反映して、イエシロアリの生理にも原生動物が関与していることは明白であり、当然のことではあるがメタンや二酸化炭素などのガス生成への影響も想定される。そこで、(1)先ず、原生動物数のコロニ-間の違いや原生動物の種類によって後腸内での存在部位が限定されていることを、実験室飼育コロニ-及び野外コロニ-から採集したイエシロアリの職蟻について明らかにした。(2)次いで、ガス採取装置付閉鎖系シロアリ飼育室を設計・試作し、改良を加えながら設営した。この飼育室を利用して3カ月にわたる人工飼育を行ったところ、イエシロアリの木材食量活動や原生動物数などに変化を生じることはなく、一定温度下での恒常的な人工飼育が可能になった。このことによって、今後の研究、とくに、種々の前処理を施したイエシロアリを用いてのガス生成量測定に応用できるようになった。(3)また、分析用ガスの採取方法やガス分析の方法についても検討してきており、ガスクロマトグラフによるガス分析の基本的方法をすでに確立した。(4)野外でのガス生成量の測定に関しては、イエシロアリが土中に営巣するため、ガスの的確な採取が困難であるとの結論に達した。そのため、日本には存在しない地上にシロアリ塚を繁造するシロアリ種を研究対象にする必要があり、将来的には、海外との共同研究を考慮すべきであろう。イエシロアリ後腸内に存在する3種の共生原生動物の分布(局在性)の季節的変動を、複数の実験室飼育コロニーと野外コロニーについて検討した。また、木材摂食活性についても検討し次の知見を得た。*イエシロアリ共生原生動物の分布は季節的変動が認められず、数的変動も季節的な特徴を示さないことが実験室飼育と野外コロニーに関係なく認められた。*木材摂食活動は、冬期よりも夏秋期の方が高かった。*原生動物の分布(局在性)と存在数については、(1)最大型種であるPseudotrichonympha grassii Koidzumiは後腸前部に偏在し、存在数は最少であった。

(2)中型種のHolomastigotoides hartmanni Koidzumiは、後腸内全域に均一に分布し、存在数はP.grassiiよりも多かった,(3)最小型のSpirotrichonymphaleidyi Koidzumiは後腸後部に偏在し、存在数は最大であった,(4)実験室飼育コロニーと野外コロニーとの比較では、大型と中型の原生動物数が著しく少なく、木材食下量も同様に少ないことが野外コロニーについて観察された。シロアリのメタン生成測定に関しては、供試シロアリ数や実験容器サイズの影響をイエシロアリを用いて考察した。大型容器では30頭以上、小型容器では5頭以上を同時に供試することが測定誤差を少なくする上で肝要であった。イエシロアリ職蟻は容器の大小に関係なく測定開始後72時間は定常的にメタンを生成し、その速度は、1頭1時間当り0.70.8nmolであった。兵蟻のメタン生成への寄与はごく僅少であることも確かめられた。全地球的規模でのメタン生成量に占めるシロアリの割合は、地球上の生存する全シロアリ数の推定には不確定要素が多く、明確な数値を示すことは困難であるが、地球環境への影響を無視できないメタン量をシロアリが生産していることは疑う余地がないと言えよう。
微細形態学的アプローチによる分裂期スピンドル構築メカニズムの解析

従来、高等動物の紡錘体は、中心体および染色体近傍で生成される微小管によって形成されると考えられてきた。しかし最近、ショウジョウバエ培養細胞を用いた全ゲノム規模のRNAiスクリーニングによって、紡錘体内部からの微小管生成に必須の新規タンパク質複合体"オーグミン"が発見された(Goshima et al.2007 Science)。オーグミンは動物から植物まで広く保存されており、ヒト培養細胞において、機能的な紡錘体形成に必須であることがわかった(Uehara et al.2009 PNAS)。オーグミンは、微小管重合核形成因子のγ-チューブリン複合体を紡錘体内部の既存の微小管上にリクルートすることで、そこからの新たな微小管生成に携わると考えられている。しかし、これまでに行われた蛍光顕微鏡解析では、紡錘体内部の構造を微小管一本一本のレベルで観察することが不可能であるため、微小管依存的微小管生成の実体は明らかになっていない。そこで本研究は、オーグミンによる微小管依存的微小管生成に焦点を当て、紡錘体内部の構築を微細構造学的に追究することを目的とした。まず、ヒト培養細胞U2OSの加圧凍結置換固定法を確立し、この方法で作製した試料を用いて、未処理およびオーグミンをRNAiした細胞の中期紡錘体の三次元トモグラフィー像を取得した。次に、これらの画像に含まれる微小管などの微細構造をトレースすることによって三次元モデルを作成し、定量解析した。その結果、未処理細胞において、微小管のclosed endと直近の1本の微小管との間にend-linkが見られ、この構造が微小管依存的微小管生成の第一段階を担っている可能性が推察された。た。本研究により、オーグミン依存的に形成される紡錘体内部の新規微細構造を同定し、紡錘体の構築に関する新たな基本的情報を与えた。本年度は、RNAiによる機能解析と、蛍光顕微鏡および電子顕微鏡観察を完全に対応させた方法Functionl & Correlative Microscopyを確立した。実験にはGHP-チューブリン/H2B(ヒストン)-mCherry発現した、ショウジョウバエS2細胞を用い、Cnn RNAi(コントロール)とCnn/Dgt5(オーグミン)RNAi細胞を比較した。これらの細胞を氷上で2時間処理することによって微小管を脱重合させた後、室温に戻し、微小管の回復を経時的に観察した。回復0分では、コントロールおよびオーグミンRNAi細胞のいずれにおいても、微小管が完全に脱重合していた。また、蛍光抗体法による解析から、γチューブリンの局在も消失していた。その58分後では、蛍光顕微鏡レベルでの微小管の回復は同様であったが、異なる微細構造が見られた。コントロール細胞では、微小管束が染色体からスピンドルの極方向に伸長していた。これに対し、オーグミンRNAi細胞ではコントロールよりも緩い微小管束がまばらに観察された。この時、γチューブリンはコントロール細胞の微小管束には局在していたが、オーグミンRNAi細胞では観察されなかった。この結果から、オーグミンは氷温処理からの回復初期から、スピンドル微小管の生成に関与する可能性が推察された。次に、サファイアディスク上に培養したヒト骨肉腫由来細胞U2OSの加圧凍結置換固定法を確立した。その試料はスピンドルの微細構造がよく保存されており、今後の各種解析に使えるクオリティであることが分かった。現在、三次元トモグラフィー法および免疫電顕法による解析のため、準備を進めているところである。これらの解析によって、スピンドル内部における微小管のマイナス端の存在様式とオーグミンの局在性に関する情報が得られると考えられる。中心体非依存的に紡錘体内部で微小管を生成するのに必要であるオーグミン複合体は、γチューブリン複合体を既存の微小管上に局在させることによって、新たな微小管を生成する核として働くと予想されている。しかし、オーグミンによって紡錘体にどのような微小管構造が形成されているのかは明らかにされていない。そこで本研究では、RNAi法と三次元トモグラフィー法を組み合わせることによって、紡錘体の微細形態解析を進めている。まず初めに、サファイアディスク上に培養したヒト骨肉腫由来U2OS細胞の加圧凍結置換固定法を確立し、状態の良好な試料をコンスタントに得ることに成功した。次に、加圧凍結置換固定した有糸分裂中期の野生型細胞とオーグミンRNAi細胞の準超薄連続切片を作製し、それらの紡錘体の領域を超高圧電子顕微鏡で傾斜撮影した。こうして得られた三次元トモグラフィー画像を解析することによって、現在、紡錘体における微小管のマイナス端およびプラス端を同定し、さらにそれらの分布を可視化しているところである。最終的には、野生型細胞とオーグミンRNAi細胞における中期紡錘体の微細構造モデルを、形態的および定量的観点で比較する予定である。また、紡錘体微小管とオーグミンの局在性の関係を知る手がかりを得る目的で、GFPラベルしたオーグミンサブユニット発現細胞を加圧凍結置換固定し、免疫電顕用試料も作製した。現在は、免疫染色の条件検討を行っている。

本研究は、紡錘体形成におけるオーグミンの機能を明らかにする上で重要な側面を担い、さらに紡錘体構造の新たなモデルを提唱し得ると期待される。従来、高等動物の紡錘体は、中心体および染色体近傍で生成される微小管によって形成されると考えられてきた。しかし最近、ショウジョウバエ培養細胞を用いた全ゲノム規模のRNAiスクリーニングによって、紡錘体内部からの微小管生成に必須の新規タンパク質複合体"オーグミン"が発見された(Goshima et al.2007 Science)。オーグミンは動物から植物まで広く保存されており、ヒト培養細胞において、機能的な紡錘体形成に必須であることがわかった(Uehara et al.2009 PNAS)。オーグミンは、微小管重合核形成因子のγ-チューブリン複合体を紡錘体内部の既存の微小管上にリクルートすることで、そこからの新たな微小管生成に携わると考えられている。しかし、これまでに行われた蛍光顕微鏡解析では、紡錘体内部の構造を微小管一本一本のレベルで観察することが不可能であるため、微小管依存的微小管生成の実体は明らかになっていない。そこで本研究は、オーグミンによる微小管依存的微小管生成に焦点を当て、紡錘体内部の構築を微細構造学的に追究することを目的とした。まず、ヒト培養細胞U2OSの加圧凍結置換固定法を確立し、この方法で作製した試料を用いて、未処理およびオーグミンをRNAiした細胞の中期紡錘体の三次元トモグラフィー像を取得した。次に、これらの画像に含まれる微小管などの微細構造をトレースすることによって三次元モデルを作成し、定量解析した。その結果、未処理細胞において、微小管のclosed endと直近の1本の微小管との間にend-linkが見られ、この構造が微小管依存的微小管生成の第一段階を担っている可能性が推察された。た。本研究により、オーグミン依存的に形成される紡錘体内部の新規微細構造を同定し、紡錘体の構築に関する新たな基本的情報を与えた。