hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多形性腺腫細胞の低酸素応答性細胞外基質改変における転移形質獲得機構

1)で報告したように、低酸素下でECM合成が促進された結果をうけて、これら低酸素応答性ECMが細胞機能にどのように関わっているのかを検討するために、SM-AP細胞系にsiRNAを用いたECM発現抑制した系を作成し、増殖および遊走能の比較検討をおこなった。対象のECMとして昨年度のperlecanに続き、今年度はfibronectinについて検討した。siRNAでfibronectinの発現抑制をおこなったところ、SM-AP1とSM-AP4の両細胞ともに、fibronectinの遺伝子発現がコントロールに比して、12割程度まで抑制された。そこでsiRNAでfibronectinの発現抑制による細胞機能について検討したところ、SM-AP1とSM-AP4ともに細胞増殖は抑制され、前年度のperlecanの発現抑制時と同様の結果がえられた。遊走能はSM-AP1では亢進する結果が得られたものの、SM-AP4では抑制された。perlecanの発現抑制時では、SM-AP1とSM-AP4ともに遊走能の亢進がみられたのに対し、fibronectinの発現抑制では異なる分化をしめすSM-AP1とSM-AP4で遊走におけるfibronectinの役割が異なることが示唆された。2)実験結果の評価と総括これまでの実験結果より以下のように結論した。(a)多形成性腺腫由来細胞では、低酸素下でのHIF-1α蛋白質の高発現により細胞外基質(ECM)合成が促進される。(b)低酸素状態で促進されたECM合成は多形成性腺腫由来細胞の増殖を維持・促進するための組織構築背景となっている可能性が示唆された。医歯薬学これまでに多形性腺腫由来SM-AP細胞を用いた試験管内における細胞レベルでの検討で、中長期低酸素培養下で低酸素応答を司る転写因子であるHIF-1αの遺伝子および蛋白質ともに高発現をしめす培養条件を確定できた。このことは「乏血管性の間質を特徴とする唾液腺多形性腺腫には低酸素状態があり、その中で腫瘍細胞増殖が維持されている」という仮説が証明されたことであり、さらには癌の微小環境である低酸素環境を多形性腺腫由来SM-AP細胞をもちいて試験管内で再現することができたことを意味する。さらにこの低酸素環境下において、ECM分子であるfibronectinおよびtenascinに加え、perlecanおよびcollagen type IVの遺伝子発現が高いことが定量的RT-PCR法にて確認できた。よって、すくなくとも低酸素環境の構築にかかわる責任あるECMの候補として、これらの蛋白質が同定できたことを意味する。さらにこれらの分子のうちsiRNA法をもちいたperlecan発現抑制による細胞機能を検討したところ、細胞増殖は抑制された、遊走能は亢進したことから、機能的には低酸素下でECM合成は細胞の増殖を維持し、促進するための組織構築背景となっている可能性が示唆された。現在fibronectinについて同様に検討中である。これまでに多形性腺腫由来SM-AP細胞を用いた試験管内における細胞レベルでの検討で、中長期低酸素培養下で低酸素応答を司る転写因子であるHIF-1αの遺伝子および蛋白質ともに高発現をしめす培養条件を確定できた。
神経難病那須ハコラ病の脳分子病態解明に関する基礎的研究

【目的・方法】那須・ハコラ病(Nasu-Hakola disease; NHD)は多発性骨嚢胞による病的骨折と白質脳症による若年性認知症を主徴とする常染色体劣性遺伝疾患で、DAP12遺伝子またはTREM2遺伝子の機能喪失変異を認める。脳ではTREM2(リガンド受容体)-DAP12(アダプター)複合体はミクログリア(microglia; MG)に限局して発現しているが、ヒト脳のTREM2リガンド(TREM2L)は明らかでない。NHD白質脳症におけるMGの役割は明らかでない。本研究では白質脳症発症機構を明らかにするため、「NHDではMGがTREM2-DAP12系を介するネガティブフィードバック機構の欠失により持続的に活性化されて、炎症が慢性化して白質脳症が誘導される」との仮説を考案した。この仮説を検証するために、研究期間3年間で(1)NHD剖検脳でMGの活性化状態を免疫組織化学的に解析し、(2)TREM2Lを同定し、(3)ヒトMG培養モデル系でTREM2-DAP12シグナル伝達系ネットワークを明らかにし、(4)MG異常活性化の制御薬をスクリーニングし、NHDの脳分子病態の解明と治療薬の開発を目指す。初年度はNHD剖検脳でMGの活性化状態を免疫組織化学的に解析した。【結果】NHD脳のIba1陽性MGは、遊走や突起の伸長を制御しているGi/o共役型プリン作動性受容体P2RY12を高発現していた。NHD脳でreactive oxygen species(ROS)産生に関与するNADPHoxidase catalytic subunits p22phox, gp91phoxの発現を解析した結果、両者はMG限局的に発現し、コントロール脳に比較してgp91phoxの発現上昇を認めた。【結論】NHD白質脳症の発症機序としてMGが産生するROSを介するオリゴデンドロサイトの傷害が考えられた。【概要】那須・ハコラ病(Nasu-Hakola disease; NHD)は多発性骨嚢胞による病的骨折と白質脳症による若年性認知症を主徴とする常染色体劣性遺伝疾患で、19q13.12染色体上のTYROBP(DAP12)遺伝子または6p21.1染色体上のTREM2遺伝子のloss of functionを認める。NHD白質脳症発症におけるMGの役割は明らかでない。また(5)NHDを次世代シークエンサーによるtargeted sequencing法で迅速かつ網羅的に診断する方法を開発する。【推進方策】最終年度(平成30年度)は、ヒトMG培養モデル系(iMG)をTREM2L(cardiolipin)で刺激し、遺伝子発現プロフィールをDNAマイクロアレイで経時的に解析し、TREM2-DAP12シグナル伝達系ネットワークの全容を明らかにする。またiMGでsiRNAを用いてTREM2をノックダウン(NHDの病態を反映)した時に、発現変動する遺伝子群(TREM2標的遺伝子群)をDNAマイクロアレイで同定する。そのうちTREM2ノックダウンiMGで、顕著に発現上昇した遺伝子を指標に、指標遺伝子の発現レベルを正常化する薬剤(MG異常活性化制御薬)を既存薬(抗炎症薬など)の中からqPCRやウェスタンブロットでスクリーニングする。TREM2欠損はADモデルマウス脳においてアミロイドベータ(Abeta)の蓄積を増加する方向に働く。TREM2-DAP12シグナリングの欠失したNHD脳において、Abetaとneurofibrillary tangle(NFT)の蓄積が認められるか調べる。那須ハコラ病の遺伝子変異の一つTREM2 c.482+2T>CはTREM2 intron 3のsplicedonor siteが破綻し、exon 3がスキップされ、full lengthのTREM2 proteinが出来なくなる変異である。この変異に着目して、exon 3のスキップが起こらないように矯正出来るmodified small nuclear RNAs(snRNAs)をデザインする。平成28-29年度の研究の遅れにより、次年度使用額が生じた。平成30年度では遅れを取り戻すために、主としてNHD脳MGの活性化マーカーの解析およびTREM2-DAP12シグナル伝達系の解明に、次年度繰越金を使用する。第2年度(平成29年度)は初めに繰越金を使用して、前年度に予定していた課題を完成させる。すなわちNHD剖検脳におけるMG活性化状態(M0, M1, M2a,b,c)の解析とプロテインマイクロアレイによるTREM2Lの同定を完了させて、遅れを取り戻す。

またNHDの遺伝子変異c.141delG in exon 3 of DAP12(frameshift mutation)に関して、CRISPR/Cas9によるゲノム編集で変異を修復する新しい計画が浮上した。この計画の遂行のためにも繰越金を使用する。
量子流体力学の構築

超流動ヘリウム、中性原子気体ボース凝縮系(BEC)といった低温の量子凝縮系を対象に、量子流体力学の構築を行った。これらの系の流体力学は量子力学に支配され、その最小の構成要素としての量子渦が出現する。超流動ヘリウムでは、量子乱流と古典乱流の対比、振動物体が引き起こす量子乱流遷移などを明らかにした。原子気体BECでは、量子乱流の生成方法を提示し、スピノールBECの磁気共鳴などを明らかにした。超流動ヘリウム,および中性原子気体ボース凝縮系(BEC)といった低温の量子凝縮系を対象に,これらを統括的に扱い,量子流体力学の構築を目指す.これらの系の流体力学では,その最小の構成要素としての量子渦が出現する.超流動ヘリウムでは,古典乱流と量子乱流の対応(共通点および相違点)を明らかにする.それにより,量子乱流を,古典乱流よりも簡単な乱流の雛形と位置づけ,乱流研究のブレイクスルーを行うことを目指す.また中性原子気体BECでは,光格子(周期ポテンシャル),ボースーフェルミ混合系,多成分BECなど多彩な状況の下で,量子渦を中心とした量子流体力学がどのように発現するかを明らかにする.本年度の主な研究実績は以下の通りである.1.巨視的波動関数が従うグロス・ピタエフスキー方程式と熱的励起を記述するボゴリューボフ・ド・ジェンヌ方程式の連立数値解析を行うことにより,量子乱流における散逸機構を明らかにした。2.回転する超流動ヘリウム3において,種となる量子渦が系全体に発展する時に示す,「ねじれた渦状態」を,数値解析およびNMR実験により発見した。3.回転する光周期ポテンシャル上の原子気体ボース凝縮体において,動的渦格子状態を明らかにした。4.回転する2成分ボース凝縮体において,ブージャムと呼ばれる特異な位相欠陥が境界面に現れることを見いだした。5.交流超流動流中の量子渦のダイナミクスを数値的に調べ,十分流れ場の振幅が大きいとき,ケルビン波の非線形励起を経て量子乱流へ遷移することを示した。超流動ヘリウム、および中性原子気体ボース凝縮系(BEC)といった低温の量子凝縮系を対象に、これらを統括的に扱い、量子流体力学の構築を目指す。これらの系の流体力学では、その最小の構成要素としての量子渦が出現する。超流動ヘリウムでは、古典乱流と量子乱流の対応(共通点および相違点)を明らかにする。それにより、量子乱流を、古典乱流よりも簡単な乱流の雛形と位置づけ、乱流研究のブレイクスルーを行うことを目指す。また中性原子気体BECでは、光格子(周期ポテンシャル)、ボースーフェルミ混合系、多成分BECなど多彩な状況の下で、量子渦を中心とした量子流体力学がどのように発現するかを明らかにする。今年度の主な成果は以下の通りである。1.中性原子気体BECで2軸同時回転を用いて量子乱流を作る方法を提案した。またその乱流のエネルギースペクトルがコルモゴロフ則に従う事を示した。2.振動物体が作る量子乱流の研究を行い、振動物体が渦輪を供給されたとき、振動数等に依存して量子乱流を生成する事を示した。これは大阪市大で行われた実験結果と良い一致を示し、その物理の理解に貢献した。3.2次元量子乱流の研究を行い、通常のエネルギーカスケード過程に加えて、エネルギーが高波数から低波数へ輸送される逆カスケードが存在する事を示した。超流動ヘリウム,および中性原子気体ボース凝縮系(BEC)といった低温の量子凝縮系を対象に,これらを統括的に扱い,量子流体力学の構築を目指す.これらの系の流体力学では,その最小の構成要素としての量子渦が出現する.超流動ヘリウムでは,古典乱流と量子乱流の対応(共通点および相違点)を明らかにする.それにより,量子乱流を,古典乱流よりも簡単な乱流の雛形と位置づけ,乱流研究のブレイクスルーを行うことを目指す.また中性原子気体BECでは,光格子(周期ポテンシャル),ボースーフェルミ混合系,多成分BECなど多彩な状況の下で,量子渦を中心とした量子流体力学がどのように発現するかを明らかにする.今年度の主な成果は以下の通りである。1.振動球が作る量子乱流において、球に働く抗力を求める定式化を作った。渦糸モデルによる数値計算と組み合わせる事により、抗力を求め、それが典型的な実験結果とあうことを示した。2.スピノールBECにおける磁気共鳴現象を調べた。通常の磁気共鳴で起こるスピンエコーがこの系で起こる事を示し、それがこの系特有の成分の相分離に影響される事を明らかにした。3.絶対零度における原子気体BECでの、ケルビン波のランダウ不安定性による放出を示した。これはその後の量子渦の発達により、量子乱流に転じる事を明らかにした。4,振動する原子気体BECにおいて自発的に粒子が放出されること、および放出された粒子がボルツマン分布に従う事を示した。これは、曲がった時空における場における粒子生成を意味し、宇宙論と深い関係がある。
低マグネシウム血症の回避に向けた革新的創薬基盤の構築

低マグネシウム(Mg)血症は薬物療法において重大な障害になるが、その発症機序は大部分が不明であり、有効な治療法は全く開発されていない。Mg輸送体の分子実体が未解明であったことが、Mg代謝疾患と創薬研究の遅延を招いたと考えられる。申請者は低Mg血症におけるMgチャネルの発現異常機構を検討し、薬剤性および遺伝性低Mg血症の発症機序を分子レベルで解明した。さらに、低Mg血症の治療につながる化合物の同定に成功した。本研究により、低Mg血症の回避に向けた薬剤の開発基盤が構築された。本研究では、低Mg血症におけるMgチャネルの発現異常機構の全容を分子レベルで解明し、低Mg血症の回避及び治療につながる薬剤の開発基盤を構築する。さらに、従来の血液検査で見逃されていた低Mg血症を早期診断するための予防バイオマーカーを開発することを目的とする。今年度は、CLDN16 Mgチャネルの細胞内輸送蛋白質を探索し、PDZRN3と呼ばれる蛋白質を同定した。免疫沈降実験により、PDZRN3はPDZ結合モチーフを介してCLDN16と結合することが明らかになった。尿細管上皮細胞において、PDZRN3は細胞質とタイトジャンクションに分布した。CLDN16の細胞内局在はリン酸化によって制御されており、PKA阻害剤のH-89は細胞質におけるCLDN16とPDZRN3の共局在量を増加させた。PDZRN3 siRNAを用いてPDZRN3の発現量をノックダウンすると、H-89によるCLDN16の細胞質への移行が阻害された。以上の結果から、PDZRN3は脱リン酸化型CLDN16の細胞内への移行調節に関与すると示唆された。抗がん剤のゲフィチニブやエルロチニブは、TRPM6 MgチャネルのmRNA量を低下させた。そのメカニズムを調べたところ、ERKとc-Fosのリン酸化阻害が関与することが明らかになった。この発現低下を回復させる因子を探索し、TNF-aを見出した。TNF-aはERKやc-Fosのリン酸化に影響を及ぼさず、NF-kBのリン酸化を介してTRPM6の発現量を増加させることを解明した。これまでにTRPM6の発現量がNF-kBで調節されるという報告はないため、低Mg血症の回避に向けた新たな治療薬の開発につながることが期待できる。今年度計画していたMgチャネル(TRPM6、CLDN16)の細胞内輸送蛋白質の同定、薬剤性低Mg血症の発症機序の解明、薬剤性低Mg血症回避型薬剤の開発といった3課題を、順調に進めることができた。しかし、当初予定していた研究分担者の遠藤が海外留学で抜けたため、薬剤性低Mg血症の予防バイオマーカーと予測診断法の開発がやや遅れている。さらに、従来の血液検査で見逃されていた低Mg血症を早期診断するためのバイオマーカーを開発することを目的とする。今年度は、下記の3点について研究成果が得られた。1.ヒトCLDN16 Mgチャネルの腎尿細管における新たな生理機能として、細胞膜に発現するナトリウム交換体の機能調節に関与することを見出した。また、CLDN16の細胞膜へのトラフィッキングにFXYD2が関与することを解明した。2.腎尿細管上皮細胞において、抗がん剤のゲフィチニブ処理によりTRPM6 Mgチャネルの発現量が低下した。この発現低下を回避する因子を探索し、TNF-alphaを見出した。TNF-alphaはNF-kBのリン酸化を介して、TRPM6の転写活性を増大させた。また、TRPM6プロモーター領域へのNF-kBの結合は、NF-kB選択的阻害薬の共処理によって阻害された。TNF-alpha以外の因子の同定にも成功し、その作用機序を検討中である。3.低マグネシウム血症の新規診断マーカーの探索において、マイクロアレイ解析によりTRPM7を見出した。TRPM7は全身に普遍的に発現するが、血球細胞を低Mg状態で培養するとTRPM7の発現量が低下した。この他にも、新たなマーカー分子が見出されたため、その有用性について検討する必要がある。今年度予定していた3つの課題について、ほぼ計画通りに進んでいる。本研究では、低Mg血症におけるMgチャネルの発現異常機構の全容を分子レベルで解明し、低Mg血症の予防及び治療につながる薬剤の開発基盤を構築する。今年度は、下記の研究成果が得られた。1.遺伝性低Mg血症患者で同定されたCLDN16の遺伝子変異により、CLDN16はタイトジャンクションに分布せず、細胞質内に分布することが明らかになった。

マラリア治療薬のプリマキンがCLDN16変異体の局在異常を改善し、細胞間Mg透過性を亢進させることを発見した。プリマキン処理によって細胞障害が改善したため、CLDN16の細胞内蓄積が障害を惹起させることが示唆された。遺伝性低Mg血症の治療において、プリマキンが有用であると考えられる。2.腎尿細管上皮細胞において、抗がん剤のゲフィチニブ処理によりTRPM6 Mgチャネルの発現量が低下した。この発現低下を改善する化合物を探索し、糖尿病治療薬のロシグリタゾンを見出した。ロシグリタゾンはPPARgammaのリン酸化と核移行を介して、TRPM6の転写活性を増大させた。PPARgammaとヘテロ二量体を形成するRXRの核内分布量は変化しなかった。また、TRPM6プロモーター領域へのPPARgammaの結合は、PPARgammaアンタゴニストの共処理によって阻害された。抗がん剤などの薬剤性低Mg血症の治療において、ロシグリタゾンが有用であることが示唆された。低マグネシウム(Mg)血症は薬物療法において重大な障害になるが、その発症機序は大部分が不明であり、有効な治療法は全く開発されていない。Mg輸送体の分子実体が未解明であったことが、Mg代謝疾患と創薬研究の遅延を招いたと考えられる。申請者は低Mg血症におけるMgチャネルの発現異常機構を検討し、薬剤性および遺伝性低Mg血症の発症機序を分子レベルで解明した。さらに、低Mg血症の治療につながる化合物の同定に成功した。本研究により、低Mg血症の回避に向けた薬剤の開発基盤が構築された。平成27年度の課題がおおむね順調に進展したため、平成28年度は当初の計画通りに進める予定であるが、代表者と分担者が密に連絡をとり、研究の進行を加速させる。研究成果の一部を学会発表したが、より積極的に学会発表することにより、研究成果を社会や国民に広く発信する。さらに、研究成果を論文にまとめ、国際学術雑誌に発表する。平成28年度の課題がおおむね順調に進行したため、平成29年度は当初の計画通りに進める予定であるが、代表者と分担者が密に連絡をとり、研究の進行を加速させる。29年度が最終年度であるため、記入しない。生化学29年度が最終年度であるため、記入しない。
合成糖鎖による抗腫瘍効果の解析-新規抗がん剤の開発を目指して-

化学合成にて得られた糖鎖コレスタノールは、In Vitroでもマウス癌性腹膜炎での検討でも濃度依存性に増殖を抑制しアポトーシスを誘導することが明らかとなった。シクロデキストリンに包摂した糖鎖は細胞膜のマイクロドメインに集積し細胞内に入ることが確認された一方、糖コレスタノールの細胞における分子レベルの作用機序については、ミトコンドリアを中心としたカスパーゼカスケードの活性化によりアポトーシスが誘導されことを証明し、糖コレスタノールの細胞死誘導のメカニズムが明らかになった。実用化に抜けた検討では、腹腔内投与による血中濃度は2峰性を示し、腹膜播種組織への選択的な取り込みが明らかとなった化学合成にて得られた糖鎖コレスタノールは、In Vitroでもマウス癌性腹膜炎での検討でも濃度依存性に増殖を抑制しアポトーシスを誘導することが明らかとなった。実用化に抜けた検討では、腹腔内投与による血中濃度は2峰性を示し、腹膜播種組織への選択的な取り込みが明らかとなった1.化学合成糖鎖の合成と抗腫瘍効果のスクリーニング既報(Glycobiology,12:545-53,2002.)により細胞内に取り込まれ代謝される候補の中から、腫瘍増殖抑制が期待できる単糖また2糖を10数種類化学合成しこれらにβ-cholestanolを結合させた。この中でMTT Assay法にて抗腫瘍活性の高かった糖鎖としてGlcNAcβR(R=(-) or Galβ)cholestanolsを選択した。2.化学合成糖鎖のリポ化と細胞内への取り込みの観察細胞内への取り込みを増強する目的でリポソームに結合させた試薬を作成した。Colon26を用いて細胞内への取り込みを、1.liposomeを直接蛍光標識する2.糖鎖の一部にbiotinを結合させ、avidin結合蛍光物質を作用させることで糖鎖を標識の2つの方法で蛍光顕微鏡下に細胞内への取り込みを経時的に観察した。その結果、リポ化された糖鎖は、投与後数時間で細胞質内に取り込まれ、核の近傍に集積していることが確認された。ミトコンドリアとの重染色にでは、ミトコンドリア内への取り込みが示唆された。3.GlcNAcβ-Galβcholestanolによるアポトーシス誘導の機構GlcNAcβ-Galβcholestanolの作用後DNA ladderが観察されアポトーシスが誘導されていることが確認された。アポトーシス関連たんぱくの発現をWestern Blottingにて確認したところBax-familyの活性化を介したmitochondrial-intrinsic pathwaysが関与していることが明らかとなった。Balb/cマウスの皮下腫瘍に局所注射すると腫瘍の消失が観察され、In vivoにおける抗腫瘍効果が認められた。腹膜播種のモデルにおいても腫瘍増殖抑制効果とマウス生存の延長効果が認められた。1.糖鎖のキャリアーの比較検討糖鎖-Chlestanolを細胞内に取り込ませるキャリアーを検討し、これまでのLiposomeに加えシクロデキストリンの安全性、経済性、効果につき実験を行った。細胞内の取り込みは、シクロデキストリンとLiposomeは同等であったが、Liposomeに含まれるステアリン酸が高濃度で細胞増殖抑制があるためシクロデキストリンが安全性の面から優れていることが判明した。以下の検討はシクロデキストリンを用いて検討することとした。2.マウス腹膜播種モデルにおける抗腫瘍効果の検討17年度に抗がん剤として有望とされたGlcNacβ-Chlestanolの効果をIn vivoで検討した。まずマウス腹膜播種モデルでマウスにおける毒性試験からMTDを求め、その結果を元に腹膜転移モデルでの治療実験を行った。単回投与で有意に腫瘍重量の減少が認められ、前年の皮下腫瘍に対する効果以上の有用性が示された。3.マウス腹膜転移モデルにおける生存期間1.の投与での生存期間を検討した結果、薬剤投与による生存期間の延長が認められた。4.アグリコンの影響糖鎖に結合させた疎水基を変化させた合成糖鎖を作成し、in vitroでの効果を検討したところCholesterol、Chlestanolが有効であったが、それ以外の複数の疎水基では全く効果を示さなかった。5.中皮腫細胞に対する効果近年アスベストとの関係で社会問題となってきている中皮腫細胞に対しても、代表的な3種類の中皮腫細胞を用いて検討し、in vitroにおいて同様の抗腫瘍効果を確認した。抗腹膜播種以外への糖鎖コレスタノールの新たな応用も考えられた。19年度報告書1.糖鎖コレスタノールの作用機序の検討糖鎖コレスタノール(GlcNac β-Chlestanol)のシクロデキストリン包接体によってガン細胞にアポトーシスを誘導することにより細胞死を引き起こすことを明らとした。この細胞死の誘導メカニズムとしてミトコンドリアを介する内因性のアポトーシス経路の関与を明らかとした。2.腹腔内投与を想定した製剤剤型の検討水不溶性の本剤を安全に投与するための剤型を検討した結果,シクロデキストリン包接の時間などの製剤時の条件を調整ことにより有効濃度で投与するために必要な溶解度を得ることができた。

3.細胞内分布の検討培養細胞への投与実験で細胞内の分布を検討したところ1-2時間内に細胞膜のmicrodomeinを通過し細胞質内に取り込まれることが判明した。4.微量測定系の確立LC MASを用いた系によりfmolレベルの測定が可能となった。5.血管内投与時の薬物動態の検討4.の方法を用いてマウスに投与後の体内薬物動態の検甜を行った。血中の停滞率,腹膜停滞率,血中半減期の測定を行った。その結果ヒトに投与する場合の容量的な問題が解決した。以上の結果をふまえてGlycoconjugateJ 2008に論文として発表した。またアメリカ癌学会とEORTCの合同シンポにて発表した(サンジエゴ2007)。糖鎖コレスタノールの抗腹膜播種効果が確認されたことから。新規特許申請を出願した(2008.3.8)。今後は,Phase I試験を念頭に置いた大動物での毒性試験,倫理委員会への提出資料の根拠となるデーターの蓄積を行う予定である。研究の最終年にあたり今までに得られた成果を基に、臨床試験に必要なデーターの蓄積とともに作用機序の解明を詳細に行なった。1.細胞内へ取り込みcolon26細胞にGGCを処理すると細胞内及びミトコンドリア分画で経時的にGGC濃度は増加した。ショ糖濃度勾配遠心によって得られた分画ではGGC濃度を示すグラフのピーク位置とマイクロドメインのマーカー分子の分布が一致した。また、GGC処理細胞ではミトコンドリアから細胞質へ経時的なcytochromecの放出が認められた。細胞膜表面のマイクロドメインはコレステロールに親和性が高いため、コレステロール誘導体であるコレスタノールをアグリコンとする糖コレスタノールを培地中に加えると、細胞のマイクロドメインを経由して細胞内へ取り込まれ、ミ卜コンドリアに集積し、cytochromecの放出につながると考えられた。2.Caspase-cascade GGC及びGC処理細胞では、apoptosisの抑制分子であるBCL-XLの抑制と、apoptosis誘導分子であるtBit、BaxをはじめApaf-1、caspase-9、caspase-3からPARPに至るー連のcaspase-cascade関連分子の連続した活性化が明らかになった。またこれらの反応はいずれも糖存在下でのみ観察され、糖を合まないChol処理ではこれらの変化は認められない。従って、糖コレスタノールによる細胞死は、caspase cascade活性化による糖特異apoptosis誘導が明らかになった。3.糖コレスタノールの体内動態糖コレスタノールの体内動態は、既報通り、糖コレスタノールのLC/MS分析から定量してその分布を調べた。腹腔内及び尾静脈投与後の血中濃度の推移を比較すると前者では投与後短時間内に2峰性のピークが認められ、いずれも24時間内にほぼバックグランド値を示した。腹腔内及び尾静脈投与後の組織内分布を見ると前者では腸間膜への集積が、後者では肝臓.腎臓などへの集積ガ注目された。なお、特許の関係で本年度の論文化は控えた。
好中球の貪食におけるリピッドラフトの役割の解明

ラクトシルセラミド(LacCer, CDw17)は、好中球の成熟に伴い細胞膜表面に発現する分化抗原である。LacCerは細胞膜に約10%が局在しているが、大半は顆粒膜に存在している。これまでに、LacCerが細菌と選択的に結合することや、好中球の活性酸素産生を引き起こすことが報告されていることから、LacCerが好中球の貪食や活性酸素の産生に関与していると考えられている。しかしながら、菌体のどの物質と結合するかを含めて、LacCerを介した菌体の認識機構の詳細についてはいまだに良く分かっていない。そこで、本研究では、食細胞の食胞形成過程が異なることが分かっているザイモサンと非定型抗酸菌に着目して、LacCerに富むGSDに対する菌体のリガンドが何であるかについて、ザイモサンと非定型抗酸菌を材料として検討することと、顆粒に局在するLacCerが好中球の食胞形成過程にどのようにコミットしているかをリアルタイムに観察することで、自然免疫において重要な役割を果たしている好中球の食胞形成におけるLacCerの役割を明らかにすることを目的としている。本年度は、まず好中球の貪食過程におけるLacCerのリピッドラフトの動きをリアルタイム解析するために、共焦点レーザー顕微鏡を用いて条件検討を行った。その過程において、非定型抗酸菌であるMycobacterium avium complex(MAC)をオプソニン化せずに貪食させた場合、細胞膜上のLacCerが非常に大きなクラスターを形成すると共に、MACは細胞膜のLacCerを結合させたまま、細胞内に進入し、さらにほとんどの顆粒由来のLacCerがMACに集中することが分かった。一方、オプソニン化していない大腸菌及びザイモサンを貪食させた場合、大腸菌とザイモサンの周囲に細胞膜と顆粒のLacCerの一部が集まったが、MACの様に大きなクラスターを形成して集中することはなかった。これらの結果は、非定型抗酸菌と大腸菌やザイモサンではLacCerのリピッドラフトの貪食過程への関与が全く異なっており、非定型抗酸菌は強くLacCerのリピッドラフトを菌に集中させることを示すものである。
病院職員における経営参画度と職務満足との関連要因

職務への取組み方や職場環境が,病院職員の職務満足にどのように影響しているかを検討した。平成18年12月に15県立病院のうち同意を得た9病院,全職員2,182人に質問紙「病院職員の職務満足および職場環境に関する意識調査」を配布した。質問紙は,属性を除いた63項目を,研究分担者と支援者の6人でKJ法を使用してグループ化した。質問群の信頼性はCronbachα係数を算出し,0.6以上のα係数を採用した(5項目が削除となった)。項目内容からグループの命名した:I.職務満足(0.70),II.上司との適切な関係(0.91),III.評価方法の明示(0.67),IV.経営理念・方針への評価(0.80),V.経営理念達成を目指した仕事(0.65),VI.主体性ある仕事の取組み(0.63),VII.病院理念や目標の伝達(0.81),VIII.主体的な仕事を認める雰囲気(0.76),IX.他人と協働できる職場(0.73)(α係数)。質問紙の回収数は1,185人であり,有効回答は926人であった。対象者の背景は女性742人(80.1%),平均年齢39.5(SD10.6),平均勤務年数8.1(SD8.0)であった。9職種からの回答があった。職務への取り組み方や職場環境が,病院職員の職務満足にどのように影響しているかを検討した。その結果は,上司との適切な関係があり,他人と協働できる職場において職務満足が高く,良好な人間関係の構築が重要と考えられた。なお,職務満足は医師が最も高く,看護者が最低得点であった。また,職務の取り組み意識や職務への評価は薬剤師が低いという特徴があった。職務満足を独立変数にして重回帰分析をおこなった。職務満足への影響要因は9グループから年齢と職種を補正し,ステップワイズ法を選択した。結果はII上司との適切な関係,IV経営理念・方針への評価,IX他人と協働できる職場,V経営理念達成を目指した仕事の4グループは正の影響要因があった。VII病院理念や目標の伝達は負の影響要因であった。病院と職員の関係には,どのようにして職務満足が提供できるかである。以上から職種間の差が明確にみられることから,職種の特異的な要因は,今後の検討課題と考える。1.質問紙の作成3月には私立総合病院の524人を対象に質問紙のプレテストを実施した。その結果を基に表面的妥当性,内容的妥当性を検討し,質問紙を作成した。質問紙の内容:1)属性職業,職位,雇用形態,研修経験の有無,研修した内容,管理・経営に関する講義の受講経験の有無と受講時期2)質問内容運営・経営参画度に関する項目(構造的側面,機能的側面,人間関係的側面,風土的側面,多忙度),職務満足度に関する項目の63項目2.質問紙の配布対象施設は15新潟県立病院とした。

県立病院とした理由は,県立病院の経営状況が報告されているので経営がスムースにいっている病院(いわゆる黒字)とそうではない病院との比較検討が可能と考えた。11月全職員を対象にした質問紙配布の協力依頼を15県立病院院長宛に郵送した。その結果9病院からの協力受諾を得た。12月協力を得た病院の対象者2,128人へ質問紙を配布した。質問紙の回収は受取人払いにして欲しいという施設側の依頼があった。それによって,施設問の職員の経営感覚および職務満足は比較できなくなった。そこで,急遽1私立病院の全職員を対象に質問紙を配布し,回収した。これによって私立病院と県立病院の比較検討が可能になった。また,受取人払いは回収率の低下をきたす可能性も出てきた。そこで,〆切1週間前には各対象者へお願い文を送った。その結果1,185人からの回収できた(55.7%)。現在(3月22日)全データ入力を終え,データ分析にあたっている。分析をスタートする前に紛らわしい回答は削除した。その結果926人の有効回答となった(有効回答率43.5%)。平成18年12月に15県立病院のうち同意を得た9病院,全職員,の2,182人に,質問紙「病院職員の職務満足および職場環境に関する意識調査」を配布した。質問紙は,属性を除いた63項目を,研究分担者と支援者の6人で,KJ法を用いてカテゴリー化した。カテゴリー化した質問群の信頼性はCronbach α係数を算出し,0.6以上を採用した。その結果は9カテゴリーとなり,項目内容から,職務満足,上司との適切な関係,評価方法の明示,経営理念・方針,病院理念や目標の伝達,主体的な仕事を認める雰囲気,主体性ある仕事の取り組み,人と協働できる職場,経営理念を目指した仕事,と命名した。いずれも高得点ほど満足度や職場環境が良好であることを表す。質問紙の回収数は1185人であり,有効回答は926人(有効回答率78.1%)だった。対象者の背景は女性742人(80.1%),平均年齢39.5(SD l0.6),平均勤務年数8.1(SD 8.0)であった。職種は9職種であり,看護師635人(68.6%)が最も高い割合であり,事務職80人(8.6%)が続いた。一般職が755人(85.7%),常勤は798人(86.2%),最終学歴は専門学校卒601人(65.5%)だった。各カテゴリー間の相関関係は,r=.76r=.22の係数の範囲であり,正の相関があった(p<.001)。職務満足との各カテゴリーの関係では,上司との適切な関係(r=.65),経営理念・方針(r=.60),主体的な仕事を認める雰囲気(r=.60)であり,経営理念を目指した仕事と他のカテゴリー間では,経営理念・方針(r=.60),職務満足(p<.50),主体性ある仕事の取り組み(p<.52),とそれぞれが高い相関係数を示した。職務満足を独立変数にして,重回帰分析を行った。上司との適切な関係,評価方法の明示,経営理念・方針,病院理念や目標の伝達,経営理念を目指した仕事,人と協働できる職場が職務満足への正の影響要因であった。本調査では,主な職種の回答は得られたが,女性が80.1%を占め,そのうち看護師が85.6%であったことは,看護師の回答が結果に反映されていると推察できる。しかし,病院経営をより豊かな経営に導く示唆は得られたといえる。
高感度脂質分子種分析法の開発

(目的)ライフサイエンスやバイオテクノロジーの分野で生体膜は重要な研究対象の一つとなっている.とくに,細胞膜レセプターや生体膜2重層構成資質の構造と機能の解明が急がれている.膜脂質の場合,従来から行われている放射性同位元素を用いる研究手法では,膜脂質を定量的に取扱うことは不可能である.本研究では,高感度脂質分子種分析法を開発することにより,膜脂質の代謝変化を分子種のレベルで定量界面活的に追跡することを計画した.(成果)生体膜よりリン脂質を抽出後, TLCによりリン脂質種に分離した.ホスホリパーゼCにより極性頭部を除きジラジルグリセロールとし,ジニトロベンゾイルクロリドと短時間反応させてジニトロベンゾイルジラジルグリセロールに転換した.ODS逆相HPLCによって254nmで分離定量するが10500ピコチルの範囲すべての分子種が定量できた.移動層を変化させることにより,ジアシル型,アルキルアシル型,アルケニルアシル型が分離定量できた.本法を用いて,ヒト血小板のアゴニスト刺激に対する応答過程におけるリン脂質分子種の変化を質量レベルで完全に解明することができた.とくに,アラキドン酸を含有する分子種の特異的水解の重要性がクローズアップされた.一方,チャイニーズハムスターVF細胞を用いてエンドサイトシスにおけるリン脂質分子種の役割を調べた.この場合,オクタデカチノエン酸2モルを結合したリン脂質が形質膜からのエンドソーユム形式に重要な役割を果たしていることが明らかとなった.今回開発することに成功した高感度脂質分子種分析法を使用することにより,生体膜脂質の構造と機能との関係を解明する研究はさらに発展するものと期待される.(目的)ライフサイエンスやバイオテクノロジーの分野で生体膜は重要な研究対象の一つとなっている.とくに,細胞膜レセプターや生体膜2重層構成資質の構造と機能の解明が急がれている.膜脂質の場合,従来から行われている放射性同位元素を用いる研究手法では,膜脂質を定量的に取扱うことは不可能である.本研究では,高感度脂質分子種分析法を開発することにより,膜脂質の代謝変化を分子種のレベルで定量界面活的に追跡することを計画した.(成果)生体膜よりリン脂質を抽出後, TLCによりリン脂質種に分離した.ホスホリパーゼCにより極性頭部を除きジラジルグリセロールとし,ジニトロベンゾイルクロリドと短時間反応させてジニトロベンゾイルジラジルグリセロールに転換した.ODS逆相HPLCによって254nmで分離定量するが10500ピコチルの範囲すべての分子種が定量できた.移動層を変化させることにより,ジアシル型,アルキルアシル型,アルケニルアシル型が分離定量できた.本法を用いて,ヒト血小板のアゴニスト刺激に対する応答過程におけるリン脂質分子種の変化を質量レベルで完全に解明することができた.とくに,アラキドン酸を含有する分子種の特異的水解の重要性がクローズアップされた.一方,チャイニーズハムスターVF細胞を用いてエンドサイトシスにおけるリン脂質分子種の役割を調べた.この場合,オクタデカチノエン酸2モルを結合したリン脂質が形質膜からのエンドソーユム形式に重要な役割を果たしていることが明らかとなった.今回開発することに成功した高感度脂質分子種分析法を使用することにより,生体膜脂質の構造と機能との関係を解明する研究はさらに発展するものと期待される.(目的)ライフサイエンスやバイオテクノロジーなどの分野で生体膜は重要な研究対象となっている。細胞膜レセプターや脂質2重層の構造と機能の解明が急がれており、1985及び1986年度のノーベル賞がこの分野の研究に与えられている。本研究では、従来からアイソトープにのみ頼って行われてきた生体膜脂質の代謝研究の限界,すなわち膜脂質分子種の質量変化を定量的に追跡することの不可能さを克服するために、高感度分子種分析法を開発することを目的とした。(成果)生体膜よりリン脂質を抽出・分離したのち、ホスホリパーゼCにより極性頭部を除きジラジルグリセロールを調製し、これをピリジン中で3.5-ジニトロベンゾイルクロリドと短時間反応させてジニトロベンゾイルジラジルグリセロール(DNBC-DG)を得た。回収率は94.2%であった。移動層にアセトニトリル/2-プロパノール(80120)を用いるODS逆相HPLCでDNB-DGを254nmで分析した。飽和,モノ-,ジ-,トリ-,ポリ-エン分子種は良好な分離を示した。そして、個々の分子種の定量分析を行ったところ、分子種の種類とは無関係に10500ピコモルの範囲で同一直線が得られた。したがって、補正することなくすべての分子種の絶対量をHPLCによって求めることができることが明らかとなった。また、ジアシル型,アルキルアシル型,アルケニルアシル型のいずれのタイプの分子種も完全に分離定量できることを示した。これらの成果に基き、各種生体膜試料に対する応用面の研究を現在行っている。
アカゲザル種群の進化過程の解明

アカゲザル種群はアカゲザル(Macaca mulatta)とその地域集団として分岐したニホンザル(M. fuscata)とタイワンザル(M. cyclopis)からなる。本種群はカニクイザル(M. fascicularis)と約194万年前に分岐後、更新世の後半において人類と共存してアジアの中緯度域で進化したと考えられる。その地理的分布は、東・東南・南アジアの北緯14度から41度にまでわたり、ヒト(現代人)についで広い。過去の気候変動および人類による改変された環境へ適応したと推測される。その進化過程を生息環境・形態・ゲノムの面から明らかにする。
東アフリカの国民国家成立過程における民族集団の「生成」と「同化」

本年度は本研究の最終年度であり、これまで申請者が中心的に行なってきたケニア・ルオの研究を基盤に、隣接するスバについて、さらにはほかの隣接民族集団などとの関係性にも視野を広げ、研究の成果の集大成を行なった一年であった。したがって、既に収集した参与観察による民族誌的データ、ケニア共和国とその宗主国であったイギリスにおいて、大学やその付属図書館、公文書館で収集した文献データ等の整理をし、さらにそのデータ化、データの分類、そしてそれらの分析を行なった。同じく国内の大学、研究所付属の図書館、とくに国立民族学博物館所蔵の資史料の検索やデータ化とその分析も行なった。そうした作業により、イギリスによる植民地化過程で人びと(主にルオとスバ)がどのような政策的・文化的影響を受けたのか、それによって現在『ルオ」あるいは『スバ」とよばれる人びとの社会はどのように「生成」され「同化」し、民族社会が築かれて現在にいたるのか、その動態的一面が明らかになった。とくに注目したのは、植民地化以前から、そして植民地化過程、ケニア共和国としての独立後から現在にいたるまでの人びとの居住形態の変化と居住集団の構成の変化である。移動性の高い、系譜にはさしてこだわらないゆるやかな居住集団を構成していた人びとが、イギリスによる定住化政策、統治が容易なピラミッド型社会組織をもつ「部族」の生成とその固定化などによって、急激にその社会組織を変化させた。すなわち、現在観察される強い父系の理念が働く社会であり、そのなかでは序列を重んじる慣習的規範やその違反にまつわる信念で律されるようになったのである。現地調査での聞き取りによると、ルオとスバはその移動の途中で共住することもあったが、植民地化政策の圧力も加わってスバはさらに南方や西南方に移動していった。現在の観察からも両者は文化的には酷似したところがみられるが、1920年代の植民地行政官による記録によると、当時すでに両者は「類似」していたという。つまり、植民地化以降、早い時期にスバはルオに吸収されつつあったと推察される。今年度は、従来から着手しているルオ研究を継続すると同時に、スバについては主に植民地行政官によって残された記述資料のなかにスバに関連するものがどのように言及されているか、文献調査に着手した。年度の前半に開催された民族学会研究大会においては、これまでの研究成果を発展させ、「コンパウンド」をはじめ居住に関する人類学的用語の歴史的変遷についての発表を行なった。これは、ルオとスバという人びとがどのようにヴィクトリア湖沿岸北部から現在の東南部の居住地まで移動してきたのか、また彼らの居住形態が植民地時代をへてそれぞれどのように変化してきたのかを考察するうえでの、前座的研究である。現代ルオが自分のアイデンティティの拠り所として強調するコンパウンドは、植民地政府の政策によるクラン間戦争、野獣の減少、また植民地化以後の土地区画制度の実施といった外的要因によってその内容を変えてきた。三世代にわたる複婚の拡大家族を単位として暮らしていた時代から、一人の妻が個別にコンパウンドを形成を行なうようになってきていると同時に結婚の形態も変わってきているといえる。それぞれの民族がどのように「生成」され変化あるいは「同化」てきたかは、こうした居住形態の変遷をみることによっても描出できるのではないかと考えている。ルオ地域では引き続き調査を行なうと同時に、スバ地域においてもおって調査する予定である。年度の中間期には、資料調査と代表的ルオ研究者デビッド・パーキン(オックスフォード大学)と研究連絡するためにイギリスに滞在し、そののち実地調査のためにケニアへ赴いた。ナイロビにおいては国立公文書館において植民地時代の調査地付近についてのアニュアル・レポート、民族間の抗争、結婚、葬送等の民族文化に関する植民地行政官による報告を限られた時間で調査した。短期であったため、また引き続き行なう予定である。村落地域においては、調査者の関心のあった寡婦を引き継ぐというルオ特有の伝統的慣習について、とくにマーケット周辺の寡婦を中心に聞き取り調査を行なった。スバの居住地域と比較的近いため、両民族の地域をこえて行き来する人びとも観察された。近日中にその成果をまとめ、発表する予定である。今年度は、本研究の対象である「ルオ」氏族と「スバ」民族について、前者については昨年度までに行なってきた諸村落での調査資料の整理・分析を扱うと同時に、「スバ」民族については「ルオ」民族とともに主に植民地時代に記録された行政資料のなかに関連するものがあるかどうか、文献調査を継続して行なった。年度の前半には、日本民族学会研究大会と、日本アフリカ学会研究大会において口頭発表を行なった。「ルオ」民族と「スバ」民族の民族文化比較のための一つのトピックである、社会が用意している寡婦の処遇に関する制度についてとりあげた。そしてその成果は、年度の中間期、後半に学術誌に発表された。年度の中間期には、別研究課題のために赴いたナイロビにおいて、本研究とも関係のある公文書調査を短期間、行なった。「ルオ」民族と「スバ」民族の「生成」がどのようになされ、「同化」されていったのか、それに関連する史料の調査を試みた。そのために「ルオ」民族が居住する地域とその近隣の民族との関係について記載された資料を扱った。「ルオ」民族の居住地域はケニアにおける赤道をはさんで南北にわたるため、植民地行政官によって残された植民地行政資料は大量である。

ファイルリストの作成を行ないながらの作業は難航しているが、「スバ」に関するごくわずかな記載は抽出できた。年度の後半期は、大阪の国立民族学博物館に赴き、当館の所蔵庫とアフリカ研究者の所蔵するにおけるアフリカ関連資料の検索と収集を行なうとともに、これまで私自身が行なってきた実地調査による資料の整理と分析にとりくみ、博士論文の執筆作業に着手している。「ルオ」民族の葬式と宴についての聞き取りと実地調査による成果も共著で出版された。来年度発表予定の、ルオランドにおける諸「民族」の移動と居住に関する歴史的変遷についての論考も執筆を着手している。本年度は本研究の最終年度であり、これまで申請者が中心的に行なってきたケニア・ルオの研究を基盤に、隣接するスバについて、さらにはほかの隣接民族集団などとの関係性にも視野を広げ、研究の成果の集大成を行なった一年であった。したがって、既に収集した参与観察による民族誌的データ、ケニア共和国とその宗主国であったイギリスにおいて、大学やその付属図書館、公文書館で収集した文献データ等の整理をし、さらにそのデータ化、データの分類、そしてそれらの分析を行なった。同じく国内の大学、研究所付属の図書館、とくに国立民族学博物館所蔵の資史料の検索やデータ化とその分析も行なった。そうした作業により、イギリスによる植民地化過程で人びと(主にルオとスバ)がどのような政策的・文化的影響を受けたのか、それによって現在『ルオ」あるいは『スバ」とよばれる人びとの社会はどのように「生成」され「同化」し、民族社会が築かれて現在にいたるのか、その動態的一面が明らかになった。とくに注目したのは、植民地化以前から、そして植民地化過程、ケニア共和国としての独立後から現在にいたるまでの人びとの居住形態の変化と居住集団の構成の変化である。移動性の高い、系譜にはさしてこだわらないゆるやかな居住集団を構成していた人びとが、イギリスによる定住化政策、統治が容易なピラミッド型社会組織をもつ「部族」の生成とその固定化などによって、急激にその社会組織を変化させた。すなわち、現在観察される強い父系の理念が働く社会であり、そのなかでは序列を重んじる慣習的規範やその違反にまつわる信念で律されるようになったのである。現地調査での聞き取りによると、ルオとスバはその移動の途中で共住することもあったが、植民地化政策の圧力も加わってスバはさらに南方や西南方に移動していった。現在の観察からも両者は文化的には酷似したところがみられるが、1920年代の植民地行政官による記録によると、当時すでに両者は「類似」していたという。つまり、植民地化以降、早い時期にスバはルオに吸収されつつあったと推察される。
高学習能ラットを規定する分子制御機構の包括的解析

学習や記憶機能は、単一遺伝子のみではなく、多くの遺伝子が協調し複雑な伝達ネットワークを形成していくことで成立する。レバー押しによる学習試験において好成績を示すTokai High Avoider(THA)ラットを用いて、学習・記憶に関わる新しい分子機構の解明を目指した。本研究において、THAラットの表現型には、免疫応答や酸化ストレス応答など生体防御機構を担う遺伝子群が関与することが示唆された。代謝産物の主成分分析の結果から、WistarラットとTHAラットは明らかに異なる系統であることが分かった。THAラットは様々なアミノ酸量に変動が認められ、学習や記憶の制御に関与する可能性が示唆された。本研究の目的は、遺伝子改変操作を行わずに作成された高学習能モデル動物(Tokai High Avoiderラット)と野生型のWistarラットを比較し、新たな学習と記憶に関わる分子とその制御機構を解明することである。本年度は、6週齢時に10日間のシドマン型レバー押し電撃回避学習試験を行い、高学習能ラット(THAラット)と低学習能ラット(Wistarラット)を選別し、学習能の違いによる遺伝子発現を検討した。脳を分画後、海馬から全RNAを抽出し、マイクロアレイを実施し網羅的に遺伝子発現の比較を行った。その結果、THAラットの海馬において61個の遺伝子発現が優位に高いことが明らかとなり、THAラット特有の高学習能を規定する遺伝子であることが示唆された。優位に増減した遺伝子発現パターンについて、クラスター解析を行い詳細な検討を引き続き継続している。本研究の最大の目的は、遺伝子改変操作を行わずに作成された高学習能モデル動物(THAラット)と野生型のWistarラットを比較し、学習と記憶に関わる新たな分子とその制御機構を解明することである。低学習能のWistarラットと高学習能THAラットの海馬画分から抽出したRNAを用いて、マイクロアレイで比較した結果をさらに補強すべく、同一サンプルから抽出したタンパク質を二次元電気泳動で展開し、質量分析装置を用いてタンパク質の同定を試みた。増減が認められたタンパク質のうち、ほとんどが酸化ストレス応答、およびミトコンドリア呼吸やエネルギー代謝に関わるタンパク質であった。昨年度までの研究で得られた結果から、高学習能を支える多くの分子やタンパク質が示唆された。最終年度は、表現型に最も近い物質である代謝産物に着目するため、メタボローム解析による網羅的な代謝産物の検討を行った。低学習能と高学習能を示すWistarラットの海馬組織を用いて比較したところ、ポリアミン類の代謝産物の一つに著明な差を見出すことに成功した。加えて、THAラットに特徴的な代謝産物は、必須アミノ酸や抗酸化酵素に関連した物質であった。高学習能WistarとTHAラットの両グループにおいて共通して亢進している代謝産物は少なく、THAラットに特徴的に認められる代謝産物の増加は、高学習能を含めたTHAラット独自の表現型を規定していることが示唆された。当初の計画通り遺伝子発現とタンパク発現の両面から、THAラットの高学習能を規定している要因に迫ることが出来たと考えている。当初予想していなかったこれまで知られていない分子が高学習能に関与する可能性を見出した。現在は、解析結果の相互連関を知るため、クラスター解析などを行い、より詳細な分子基盤の解明に取り組んでいる。脳神経科学高学習能ラットを規定する要因の一つにmiRNAの存在を考えている。高学習能という表現型が、non-coding RNA (miRNA)、遺伝子、およびタンパク質発現がどのように相互作用し、高次脳機能を構築しているのかをより詳細に検討したいと考えている。本年度は、THAラット固有の学習・記憶に関与する遺伝子発現について網羅的に検討することを目的としていたため、研究計画は順調に進展していると考えている。網羅的な遺伝子発現解析結果を補強すべく定量的RT-PCRを行っているが、全ての遺伝子について検討するに至らなかったが、おおむね順調であると言える。また、プロテオーム解析の予備的検討を開始出来ている。組織、および血液サンプルからのmiRNAの抽出条件の検討に時間を要し、予定していたmiRNAの網羅的解析を実施するまでに至らなかったため。また、遺伝子の網羅的発現の再現性を確認する作業や、比較検討する群をさらに増やす必要があり、実験計画の都合上、翌年度に請求する必要があったため。遺伝子発現解析と併せて、プロテオーム解析を開始する。また、標的タンパク発現の結果を補強すべくウェスタンブロッティングを行う。さらに、Wistarラットを高学習能群と低学習能群に学習試験を用いて選別し、網羅的な遺伝子発現解析結果を得ることで、高学習能を規定する遺伝子のみならず、THAラット固有の高学習能遺伝子に迫る事ができるため、追加して実施することが望ましいと考えている。miRNAの抽出、及び網羅的発現解析を行うための一般消耗品の購入に充当する。また、実験動物の維持管理に必要な消耗品の購入に充てる。