hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
時間治療のための腫瘍内低酸素と生物時計の相互作用の解明

腫瘍とホストの概日リズムの相互作用を明らかにするためのモデルシステムを得ることができた。担癌マウスの行動リズムの光周期からの脱同調モデルの報告は見られないためメカニズムを解明する意義は大きい。これまでの研究で担癌マウスの脱同調は明暗周期への同調力の低下によることが分かったため今後の研究の方向性が明らかとなった。担癌動物(Balb/c, nu/nu)の作成および解析を引き続き行い、統計学的解析を可能とするための例数を増やした。行動リズムの明暗周期からの脱同調すること、リズム周期が恒常暗条件下で変わらないことを確認した。光入力が原因として予想されるため網膜の観察を行ったが形態学的な変化を見出すことはできなかった。一方、担癌動物の腫瘍内低酸素細胞のリズム評価に関連して、1日のうちでの様々なタイミングでの低酸素自体がマウス個体の行動パターンを変化させることを見出した。明期開始から9hの低酸素はそれに続く暗期の活動量の上昇を抑制し活動終了期の活動量を上昇させた。この2相性の反応は明暗条件下で活動量の日内変動を示している時計遺伝子欠損マウスにおいても見られた。このマウスでは恒常暗条件に移行すると活動量の日内変動が消失するが、2相性の反応は明暗条件下から恒常暗条件に移行した直後においてのみ見られた。これにより、2相性の行動変化は活動量の日内変動が存在するならば時計遺伝子は必要ないことが明らかとなった。明期の低酸素暴露直後の前脳mRNA網羅的解析によりこの2相性の行動変化を調節する因子が2つ明らかとなった。明期の低酸素は脳内の睡眠物質として知られる生理活性物質のレベルを低下させた。さらにこの生理活性物質の阻害剤を明期の開始時に投与することにより明期の低酸素によりみられた2相性の行動変化と同様の行動変化が見られた。一方、明期の低酸素は中枢神経を活性化するホルモンレベルの上昇をもたらした。このホルモンの合成阻害により明期の低酸素による暗期の活動量の上昇の抑制が大きくなった。担癌マウスの活動リズムの明暗サイクルからの脱同調を安定的に再現することができた。低酸素暴露による個体レベルでの行動変化のメカニズムが明らかとなった。予定通り担癌マウスを作成し、腫瘍内リズム構築の解析を行う。また担癌マウスのリズム解析を行う。担癌マウスの腫瘍切除手術は成功率が低く手術例数を増やして現象を確定する。現在の飼育照度が比較的低いため照度コントロールによるリズム異常の改善を試みる。行動リズムを脱同調させる腫瘍由来の物質の検索を行う。腫瘍の大きさが脱同調の大きさと相関するため腫瘍低酸素で生じる物質について特に調べる。引き続き担癌マウスを作成し、腫瘍内リズム構築の解析を行う。また担癌マウスの明暗周期からの脱同調の原因を検索する。低酸素暴露による個体レベルでの行動変化解析の結果を論文として発表する。担癌マウスの作成およびin vivo連続発光測定ユニットの作成に時間を要したため。担癌マウス作成、表現型の検出に時間を要した。今年度はメカニズム解明のために担癌マウス作成のスケールアップと原因物質のスクリーニングを行う。
球状ミニ蛋白質のデノボ合成による蛋白質の構造安定化要因および折れ畳み機構の解明

蛋白質の折れ畳みメカニズム、タンパク質表面やタンパク質内部の残基のパッキング等のタンパク質の構造安定化への寄与の精密な評価等、基礎化学的研究を目的として、69残基からなる球状蛋白質に似たミニ人工モデル蛋白質SGPのデザイン,合成をおこなった。この蛋白質は中心に短い脂溶性のα-ヘリックス,その周りを3つのより長い両親媒性塩基性α-ヘリックスでとりまかれた構造からなる。CDによるコンホメイション解析や変性実験などを通じて、この蛋白質がfoldingのメカニズムや球状人工タンパク質の合成の基本モデルになると考えられた。そこで、今回、このSGPを、より天然球状蛋白質に似た状態に近ずけるために、色々なanalogを合成し構成アミノ酸側鎖のパッキング状態を調べた。SGPの4つのα-ヘリックスのうち、中心の脂溶性部は11残基のAla oligomerから、また3本の両親媒性部は16残基からなっており、Leu,Lysを適当に配してα-helixを取ったときに両親媒性になるようにデザインしてある。各々のhelixはGlyを含むβ-ターンループでつなげてある。このSGP関連タンパク質の3つのアナログをデザイン合成してその物性をしらべた。脂溶性α-helixを、より脂溶性の高いLeu oligomerに変えたもの(Leu-SGP)、3つの両親媒性部のLysの一部をGluに変え、荷電相互作用させたもの(SGP-Glu)、βターン部全てをGlyに変えてループ部のフレキシブル度を高めたもの(SGP(Gly))てある。その、物性を調べたところ、Leu-SGPは、SGPより、さらに変性しにく、高濃度のグアニジン塩酸塩の添加後でも変性しない。このことは、脂溶性中心部分が安定化に強く寄与していることを示す。この溶液中の分子量を、Gel-HPLC、及び超遠心沈降法を用いて、調べたところ三量体であった。SGP-Gluも同様に安定化されたが、その度合いはSGPとLeu-SGPの中間に位置した。このものは、水溶液中で、二量体であった。また、SGP(Gly)がSGPとほとんど同じ溶液物性を示したことは、ループ部分は、foldingの要因ではないことを示す。そして、このものは、SGP同様単量体であった。このことは、SGPの適当な改変が会合体の様子を決定しうることをしめし、今後蛋白質の構造と会合体の相関を調べる、格好のモデルとなることをしめす。
社会的選択規則の虚偽申告防止性能と情報的基礎

「個人の選好が少し変化したときに社会的選択は変わらないか,少ししか変化しない」という公理(bounded response)提示し,「耐戦略性」をbounded responseを含むいくつかの性質に分解できることや,bounded responseと「効率性」を満たすものが独裁制のみであること等を示した.また,ある意味で望ましい方法の中で最も少ない情報量で遂行できるのは決選投票を伴う最多得票制であることを示した.さらに,preference-approvalモデルにおいてevaluationwisestrategy-proofnessと呼ばれる新しい概念を提示し,不可能性・可能性を得た.社会的厚生関数の虚偽申告防止性能の定式化についてはいくつかの可能性があるが,耐隣接操作性を含むほとんどの定式化において,「Bounded response +虚偽申告防止性能」⇔「無関連対象からの独立性+単調性」となることを示した.ここで「bounded response」は選好プロファイルの変化が最少である時には,社会的厚生関数の値である社会的選好は変化しないか,変化する場合は最少の変化であることを要求する条件である.本稿は,ディスカッションペーパーとして公開済みであり,現在,国際的専門誌にて査読中である.虚偽申告によって社会的選択が満足できないものから満足できるものに変わるときのみ,虚偽申告が行われる,という想定に基づく虚偽申告防止性能の基準を提示し,その基準を満たす社会的選択関数の設計可能性について,一定の結果を得た.例外的な場合を除いては不可能性定理と呼べる内容であり,上記のように通常よりも弱い虚偽申告防止性能の基準を用いても,それを満たす社会的選択関数の設計は非常に困難であることを示した.しかし,本稿で得た結果は個人の数が偶数であるという制約的な仮定に基づくなど,改善の余地が多く,未公開である.複数の個人の選好に基づいて社会的な選好を構成する規則である社会的厚生関数に関する研究である.特に,虚偽の選好を表明することによって得をしないという性質について分析した.昨年度の「実施状況報告書」においてはディスカッションペーパーであったが,査読者や編集者からの批判・提案に基づいて改訂し,国際的学術誌であるSocial Choice and Welfareに掲載された.社会的選択理論やメカニズムデザインといった分野において最も重要な概念のうちの1つである耐戦略性(strategy-proofness)を3つの公理に分解できることを示した.耐戦略性は,虚偽申告によって得をしないことを求める公理であるがその要求が厳しい.よって,耐戦略性を含むいくつかのもっともらしい公理を満たす社会的選択の方法が存在しないという不可能性定理を得ることが多い.本稿では,耐戦略性を3つの公理に分解したうえで,それらのうち2つの公理を満たすルールの設計可能性を考えた.特に,現実によく使われるルールである最多得票制を支持する興味深い結果が得られた.2.社会的選択の情報的基礎に関する研究の成果として,ある意味で望ましい規則の中で最も少ない情報量で遂行できるのは,決選投票を伴う最多得票制であることを示した(Sato, 2016, Mathematical Social Sciences).3.虚偽申告防止性能と情報的基礎の両方に関わる研究について,最近注目されている枠組みであるpreference-approvalモデルを考えた.Preference-approvalモデルにおいては各個人は選択対象の順序のみではなく「許容可能」か「許容不可能」という評価も持つ.伝統的なモデルよりも豊富な情報を含むので,「虚偽申告によって社会的選択が許容不可能なものから許容可能なものに変化するときのみ,虚偽申告が行われる」といった条件を定式化できる.この条件に基づいた虚偽申告防止性能を定式化し,不可能性・可能性の両方の結果を得た(Erdamar, Sanver, and Sato, 2016,学術誌にて査読中).「個人の選好が少し変化したときに社会的選択は変わらないか,少ししか変化しない」という公理(bounded response)提示し,「耐戦略性」をbounded responseを含むいくつかの性質に分解できることや,bounded responseと「効率性」を満たすものが独裁制のみであること等を示した.また,ある意味で望ましい方法の中で最も少ない情報量で遂行できるのは決選投票を伴う最多得票制であることを示した.さらに,preference-approvalモデルにおいてevaluationwisestrategy-proofnessと呼ばれる新しい概念を提示し,不可能性・可能性を得た.総合的には順調であるが,研究トピックごとに差があるので,それぞれについて記す.1.虚偽申告防止性能に関する研究は,国際的学術誌への掲載,新しい結果の導出と論文執筆,コンファレンス,セミナー,ワークショップにおける発表と非常に順調に進んでいる.社会的選択理論研究計画期間の最終年度となるので,各研究トピックにおいて具体的な成果が挙げられるように努力するが,特に「インセンティブと情報的基礎の両方に関わる研究」に注力したい.他の研究トピックについては比較的多くの時間を割いた結果,研究が順調に進んでいるがこの研究トピックについては1年以上目立った進展がない.2人の海外の研究者との共同研究であり,連絡を密にとるのが難しいという事情もあると考えている.私がより多くの時間をこの研究トピックに割くのはもちろん,可能であれば共著者が集まる機会を作り,集中的に議論して研究を進めたい.1.虚偽申告防止性に関する研究は,結果を出して研究発表を行い論文にまとめ,国際的専門誌に投稿する,という当初の計画以上の順調な進展を見せた.また,その論文中において提示した「bounded response」という概念が,横浜国立大学の無藤望氏との共同研究(未発表)につながっている.2.社会的選択の情報的基礎に関する研究として,"Informational requirements of social choice rules to avoid the Condorcet loser

" (2012)のモデルを検討し,2ステージからなる社会的選択を考えることに伴い発生してる複雑な点をより簡潔にすることを目指したが,望んだような結果を得ることができなかった.現在の複雑な点を許容するほかはないかもしれないと考えている.3.インセンティブと情報的基礎の両方にかかわる研究としては,「研究実績の概要」にも記したように,順調に結果が出ている.まだやるべきことは多く完成までは遠いが,1年目の成果としては十分,満足のいくものと考えている.前年度に生じた繰越額がほぼそのまま次年度使用額となった.したがって今年度についてはほぼ当初の予定通りの使用額だったが,前年度の繰越額を使って購入予定であった「画面に直接ペン入力可能なノートパソコン」の購入を見送ったため,その分が次年度使用額として生じた.1.虚偽申告防止性能,特に耐隣接操作性にかかわる研究について.すでに学術雑誌に投稿済みの論文については編集者や査読者のコメントを基に改訂し,より意義深い結果となるように努力する.新たな試みとしては,当初の研究計画通りに社会的選択対応を考えた場合に耐隣接操作性を満足する規則の設計可能性を探る予定である.2.情報的基礎について.これまで申請者や他の研究者が採用している情報の測り方とは異なるものはないかを探り,社会的選択規則の実際的な面として重要にもかかわらず研究成果の蓄積が少ない情報量に関する研究を進める.3.インセンティブと情報的基礎の両方にかかわる研究については,「研究実績の概要」に記したように,既存の結果は制約的な仮定の下で導かれているので,それを緩和できないか探る.図書・雑誌・旅費等の当初予定していたものに加え,上で書いた「画面に直接入力可能なノートパソコン」があれば論文の校正等で非常に便利なので購入する.当初,海外の学会における研究発表を予定していたが7月に子供が生まれ,その育児に積極的に参加するために研究発表は国内のみにとどめた.それに伴い,使用額が当初の予定を下回った.研究分野の関連図書・雑誌,研究発表の際の旅費に加え,画面に直接ペン入力可能なノートパソコンがあれば論文の校正等で非常に便利なので可能であれば購入する予定である.
高頻度に標的組換えを起こすニワトリ細胞を使った細胞周期解析

現在、2つのテーマを研究している。第一のテーマは(i)Poly[ADP ribose]polymerase-I (PAR P-I、染色体断裂発生後1分以内に活性化されるタンパク修飾酵素)の欠損DT40細胞の作製であり、第二のテーマは(ii)細胞周期フェーズ毎の、Rad51(大腸菌RecAホモログで、相同DNA組み換えで最も重要な分子)の活性制御である。(i)par p-I,par p-I/ku70 2重欠損,par p-I/atm 2重欠損を既に作製した。par p-Iとatmのそれぞれの単独欠損株はほぼ正常に増殖できるが、2重欠損はきわめて病的であり、Par p-IとAtmとのあいだで、これまで知られていなかった機能的相互関係があることが示唆されている。その相互関係の内容を解明するべく、いま詳細な表現型解析を行っている。(ii)第二のテーマでは、CDK inhibitor(ルスコビチン)によりRad51の活性化が抑制されることを証明した。ただし薬剤を使った実験結果のみでは論文に十分でないので、以下のプロジェクトを計画した。ヒト(ニワトリ)では9種類のCDK様分子が存在する。このうちCDK1/Cdc2、CDK2が分裂周期で主要な役割を持つらしい。また、相同DNA組換えによる修復機構は、DNA損傷発生後、酵母では常に活性化されうるがヒトではS/G2フェーズでしか活性化されない。CDKは細胞周期の各フェーズ毎に多様な機能を持つので、同調培養した細胞で一瞬にしてCDK機能を可逆的にOFFにできないと(条件変異と呼ぶ)、詳細な機能解析はできない。ニワトリBリンパ細胞株、DT40からCDK条件変異株をDT40から作製するプロジェクトを現在遂行中である。(1)細胞周期制御機構が相同DNA組み換えに及ぼす影響についての解析Dr.H. Hocheggerは、Cdk kinase(細胞周期を動かすエンジンであり、複数種類ある)を薬剤で抑制したときの相同DNA組み換え活性を、放射線照射したときに形成されるDNA損傷部位へのRad51(大腸菌のRecA相同タンパク分子)の集合で評価した。そして、薬剤処理によってRad51の集合も強く抑制されることを明らかにした。PARPは、DNA損傷部位に損傷発生後数秒で集合し、周辺にある分子をADP ribose修飾する酵素である。PARPは、5種類存在し、PARP-AとPARP-Bの単独欠損マウスは生存できるが2重欠損は胎生致死である。PARP-A単独欠損は、マウスおよびニワトリ細胞株の放射線感受性を上昇させる。Dr. H. Hocheggerは、PARP-A/Ku70(2重鎖DNA切断修復経路、end-joiningに必須の因子の1つ)2重欠損細胞を既に解析し、さらに、PARP-A/rad54(2重鎖DNA切断修復経路、相同組み換えに関与する因子の1つ)2重欠損細胞およびPARP-A/atm(2重鎮DNA切断により活性化されるチェックポイント経路に関与するキナーゼ)2重欠損細胞を作製中である。
新炎症性サイトカイン・OPNによる補体・MMPを介する関節リウマチ発症の分子機構

リウマチ患者の炎症病巣である関節においてオステオポンチン(OPN)の発現亢進が認められる。OPNのKOマウスに抗II型collagen抗体(抗II C抗体)およびリポポリサッカライド(LPS)投与による関節炎(抗体誘導型関節炎)を誘導した結果、野生型マウスに比べOPN-KO miceでは、関節腫脹、関節軟骨破壊および軟骨細胞のアポトーシスが抑制されることを我々は報告した(PNAS 99,4556-4561,2002)。免疫染色により関節炎を誘導した野生型マウスでは関節軟骨細胞においてOPN蛋白の発現増加が認められたことから、炎症による軟骨障害に対するOPNの作用を検討した。炎症性サイトカイン・TNF-αは野生型マウスより採取した肋軟骨細胞からのLDH(細胞障害マーカー)遊離を濃度依存的に促進し、TUNEL positive細胞(アポトーシス細胞)を増加させた。OPN-KO mice由来軟骨細胞にTNF-α刺激を行ったところ、野生型由来軟骨細胞に比べTNF-α刺激によるLDHの遊離が有意に低値を示し、かつOPN-KO由来軟骨細胞ではTNFによるTUNEL positive細胞(apoptotic cells)の増加が野生型に比して有意に抑制された。さらにTNF刺激によるCaspase-3活性の増加も野生型に比して有意に抑制された。また、OPN-KO mice由来軟骨細胞にアデノウィルスを用い、OPNをoverexpressionした結果,OPNのoverexpressionのみではLDHの遊離にほとんど影響は認められなかったが、TNF-α刺激によるLDHの遊離は有意に増加し、レスキューされることが認められた。これらの結果から、TNF-αによる軟骨細胞障害にOPNは必要であり、またひとつのメカニズムとしてTNFによるCaspase-3の活性化による軟骨細胞障害にOPNが働くことが示唆された。以上のことから関節リウマチにおけるOPNの関節における発現増加は関節破壊を増強することが考えられる。リウマチ患者の関節においてオステオポンチン(OPN)の発現亢進が認められるが、その役割を検討する目的で、我々はOPN-deficient miceに抗II型collagen抗体(抗II C抗体)およびリポポリサッカライド(LPS)投与による関節炎(抗体誘導型関節炎)を誘導した結果、野生型マウスに比べOPN-deficient miceでは、関節腫脹、関節軟骨破壊および軟骨細胞のアポトーシスが抑制されることを報告した(PNAS 99,4556-4561,2002).関節軟骨破壊においてOPNが促進的に働くメカニズムを検討するために,TNF-αによる軟骨細胞障害についてOPN-deficient miceから採取した肋軟骨細胞を用い調べた.TNF-αは、濃度依存的にwild-type由来軟骨細胞からのLDH(細胞障害マーカー)の遊離を促進し、またアポトーシスを誘導することも確認した。OPN-deficient mice由来軟骨細胞では,wild-type由来に比べTNF-α刺激によるLDHの遊離が有意に低値を示した。また、OPN-deficient mice由来軟骨細胞にアデノウイルスを用いOPNを過剰発現することにより,レスキュー実験を行った結果、OPNの過剰発現だけではLDHの遊離は促進されないが、TNF-α刺激によるLDHの遊離はOPNの過剰発現により有意に増加し、レスキューされることが認められた。これらの結果から、OPNはTNF-αによる軟骨細胞障害に促進的に働くことが示唆された。また、軟骨細胞だけでなく炎症における免疫系細胞や破骨細胞の活性化におけるOPNの役割についても検討中である。さらに関節炎自然発症マウスにおけるOPNの発現部位およびOPN中和抗体投与の影響についても検討中である。
自己組織化制御に基づいたユビキタス元素よる超分子発光の創製

多環式芳香族(機能団)と種々のアミン化合物(構造制御部位)からなる超分子複合体を基盤とし、ユビキタス元素だけを用いた高効率、高輝度で安定な超分子発光素子を創出することを目的として研究を行った。その結果、分子間相互作用による分子振動抑制、機能団の水平および垂直方向への配列制御、および第三成分の結晶への包接などによって、青から赤橙色までの非常に幅広い発光変調と200倍以上の発光増強を達成した。本研究では、(1)多環式芳香族などのπ系分子を機能団とし、種々のアミン化合物を構造制御部位として超分子複合体を得て、分子集合に応じた基本物質を作成する。(2)これらの基本物質に、機能モジュレーター分子を導入することで、ユビキタス元素だけを用いた高効率、高輝度で安定な超分子発光素子を創出すること、を目的としている。上記目的を達成するため本年度は、以下の4項目を行った。1、多環式芳香族化合物に酸性基を導入した機能団分子を合成した。具体的には、アントラセンジスルホン酸の複数の位置異性体、ピレンおよびジフェニルアントラセンのスルホン酸誘導体を合成した。2、得られた機能団分子を種々のアミンと組み合わせて複合体物質(スルホン酸アミン塩等)を作成した。また、複数の機能団分子、あるいはアミンを用いて、3成分混合複合物質を作成した。3、多量に作成した有機塩を様々な有機溶媒から結晶化させ、得られた結晶中における超分子構造の化学的、物理化学的性質を紫外可視分光法、赤外分光法、固体核磁気共鳴分析によって明らかにした。4、良好な結晶を作成し、単結晶X線構造解析により超分子集合を明らかにした。放射光施設SPring8(ビームラインBL38B1)を利用し、研究室では測定が困難な極めて小さな結晶の構造解析にも成功した。5、発光特性・発光挙動について測定した。蛍光分光法により、発光スペクトル、発光量子効率、発光寿命を明らかにし、構造データとともに詳細に検討することによって、発光団の超分子集合様式と発光挙動の相関について、体系的に整理できた。上記目的を達成するため本年度は、以下の3項目を行った。1.昨年に引き続き、多環式芳香族化合物に酸性基を導入した機能団分子を合成した。得られた機能団分子を種々のアミンと組み合わせて、複合体物質(スルホン酸アミン塩等)を作成した。2.良好な結晶を作成し、単結晶X線構造解析により超分子集合を明らかにした。放射光施設SPring8(ビームラインBL38B1およびBL19B2)を利用し、研究室では測定が困難な極めて小さな結晶の構造解析にも成功した。3.ユビキタス元素のみで作成した有機発光体が外部刺激に応じて、発光強度および発光色を変化させることを発見した。この発光変換では単結晶状態を保ちながら、ミクロスコピックに構造が変化していることが分かった。この結果と、種々の分光学的測定により、これらの作用機序を明らかとした。本課題では、多環式芳香族などのπ系分子(機能団)と種々のアミン化合物(構造制御部位)からなる超分子複合体を基盤とし、ユビキタス元素だけを用いた高効率、高輝度で安定な超分子発光素子を創出することを目的として研究を行った。アントラセン-2,6-ジスルホン酸の脂肪族アミン塩結晶中での蛍光挙動を、アミンの脂肪鎖の大きさ・形状に応じた構造の固さおよびCH-O相互作用により制御できることを見出した。これにより、20倍以上の発光増強が達成できた。また、アントラセン-1,5-ジスルホン酸の脂肪族アミン塩が、結晶中における多様なπスタック集合体を構築し、アントラセンのend-to-face型の配列は励起二量体形成による緑色発光を与え、face-to-face型のレンガ壁様配列になると多分子間で励起会合体を形成することによって黄色まで発光色調を変化させた。さらに、アントラセン-1,8-ジスルホン酸の脂肪族アミン塩を用いて、πスタック方向に加えて並進方向の配列制御に成功した。アントラセンがほぼ平行にend-to-endの配列で並んだ時、特異的な光電子物性を示すことを発見した。

これにより、青から赤燈色までのほぼフルカラーな発光変調と200倍以上の発光増強、そして異方的かつ大きな電荷移動特性の発現が可能となり、有機光電子材料の設計・開発における重要な指針が得られた。一方、嵩高いトリフェニルメチルアミンを用いたアントラセン有機塩は電荷補助型の水素結合によりナノクラスターを形成し、クラスター同士がアントラセン間のπ-π相互作用により連結されたビーズ状集合体を強固に構築した。このπスタック型ビーズ状集合体は結晶中で極性分子から非極性分子まで多種多様な有機分子を包接し、包接分子に応じて青色から橙黄色まで幅広く発光色調を変化させた。これらの結果は包接超分子あるいはセンシング材料の創出の新しいアプローチを示唆している。
亜鉛代謝異常による難治性造血障害および高血圧発生メカニズムの解明

これまでに中等度亜鉛欠乏下での血中エリスロポエチン濃度の変化および腎臓中エリスロポエチン濃度の変化を報告してきた。本研究では対照群(Control)、中等度亜鉛欠乏群(ZD)、pair-fed群(PF)の3群を設定し、腎臓の皮質および髄質のtotalRNA、housekeeping-geneおよびエリスロポエチン発現量をRT-RT-PCRにより測定した。データはFisherのPLSDで統計処理を行い、有意水準は5%とした。結果は、腎臓のエリスロポエチンの発現は亜鉛欠乏によって減少することを示唆していた。また、total RNAの減少に関しては亜鉛欠乏よりも食餌制限の影響が大きいと考えられた。現代の日本における健康問題として、低血圧を伴う貧血や高血圧が挙げられる。一方で、日本人の全世代を通して亜鉛の摂取不足という栄養問題が挙げられている。また、亜鉛の摂取不足では一般的に食事量の減少が生じる。そこで、本研究では、亜鉛欠乏と食事摂取量の制限の2つの要因が貧血もしくは高血圧にどのように影響を与えているのかを動物モデルを用いて検討している。当該年度前半は、亜鉛がタンパク質の合成に重要な働きを持つ栄養素であるために、RT-PCR解析に一般的に用いられるhousekeeping-geneであるGapdhやActbの遺伝子発現量にどのような影響がみられるかを、ラットの腎臓を用いて検討することとした。また、total RNA量自体の変化についても検討した。Sprague-Dawley系雄性ラットを用いて、各群あたり10匹ずつになるように群別し、基準飼料であるAIN-93G飼料を与えた対照群(CON)、中等度亜鉛欠乏飼料(4.5 ppm Zn)を与えた亜鉛欠乏群(ZD)、pair-fed対照群(PF)とし、4週間飼育し、解剖時に腎臓を皮質と髄質に分けて採取したものを測定のサンプルとした。Real-time PCRで分析したデータはGrubbstestで棄却検定を行った後、PLSDで群間比較を行なった。危険率は5%を有意とした。研究成果は国内外の学会で発表を行った。また、造血に関連すると考えられる各種遺伝子のmRNA分析を行い、亜鉛欠乏および食餌摂取量の制限が与える影響について検討した。亜鉛欠乏と食餌摂取量の制限では遺伝子の発現自体に違いがあることが分かった。また、亜鉛の摂取不足では一般的に食事量の減少を伴う。本研究は遺伝子レベルでの亜鉛の作用を精査し、亜鉛代謝異常により発生する「難治性造血障害」および「亜鉛欠乏性高血圧」の新規治療法の開発を目指し,実験を行っている。本年度から来年度にかけては、「難治性造血障害」へのアプローチを主とする。これまでに、腎臓中のエリスロポエチン濃度を髄質と皮質に分けて測定した結果、亜鉛欠乏による影響が見られた。そこで本年度は、腎臓中のエリスロポエチンのmRNAを髄質と皮質に分けて測定した。亜鉛欠乏では、食餌摂取量が低下する。そのため、通常の動物実験のように対照群だけを設定した検討では、亜鉛欠乏による影響なのか、食餌摂取量の低下による影響なのかを明らかに出来ない。そこで、Pair-Fed群を設定し、検討している。腎臓皮質中のエリスロポエチンのmRNA量は、対照群とPair-Fed群との間には差は見られなかった。しかし、対照群と亜鉛欠乏群の間およびPair-Fed群と亜鉛対照群との間では有意な差が見られ、亜鉛欠乏によりエリスロポエチンの遺伝子発現量が大幅に減少していた。髄質中のエリスロポエチンのmRNA量は、皮質と同じく対照群とPair-Fed群との間に差は見られなった。しかし、対照群に比べ亜鉛欠乏群では減少する傾向が見られた。また、Pair-Fed群に比べ亜鉛欠乏群では有意に減少していた。これらの結果から、腎臓におけるエリスロポエチンのmRNA量は、亜鉛欠乏によって減少するが、食餌摂取量の減少では変化しないことが明らかになった。平成25年度の予算を使用して実験を実施することができなかったので、平成26年度に持ち越して使用することになった。当初は、血圧調節機構について検討する予定だったが、実験内容を変更し、遺伝子の発現量を分析することとした。遺伝子解析の基礎となるハウスキーピングジーンのActbとGapdhが中等度の亜鉛欠乏もしくは食餌摂取量の制限でどのような影響を受けるのかを検討するために、腎臓中のこれら遺伝子の発現量を調べた。3週齢のSprague-Dawley系雄ラットを各群

10匹ずつになるように、対照群(Control)、中等度亜鉛欠乏群(ZD)そして食餌摂取量制限群のPair-Fed群(PF)に分け、対応する飼料とイオン交換水を与えて飼育し、各種組織を採取した。腎臓を皮質と髄質に分け、Bio-Rad社製のQuantitative real time RT-PCR(リアルタイム定量PCRシステム)およびTaq-Man probeで測定した。各群間の比較はFisherのPLSDで検定し、危険率は5%とした。結果は、髄質のGapdh発現量はControl群に比べて、ZD群とPF群が有意に減少していた(それぞれ、P<0.05)。髄質のActb発現量には3群間に有意な差は見られなかった。髄質のActb発現量はControl群に比べて、ZD群とPF群で有意に減少していた(それぞれ、P<0.05)。皮質のActb発現量も3群間に有意な差は見られなかった。微量元素多種類の遺伝子のmRNA分析を行うことができた。これにより、亜鉛欠乏と食餌摂取量の制限によって造血に関与すると考えられる遺伝子が発現レベルでどのような違いがあるのかが明らかになった。また、タンパク同定を行うスポット選定も行ったので、来年度の研究計画もスムーズに実行できる目途が立った。本年度は数種の遺伝子のmRNA分析を行うことができた。これにより、亜鉛欠乏と食餌摂取量の制限によって造血に関与すると考えられる遺伝子が発現レベルでどのような違いがあるのかを解明する端緒になった。しかし、実際に予定していた研究に充てる時間を確保できず、予定していた全ての実験内容が完了していない。本年度は震災が起こり、研究費の分割支給および大規模な輪番停電が実施された。研究協力者の所属する大学が輪番停電の対象になり、研究に用いる機械の使用が困難になった。また、震災後に研究費が3割減額されるとの通知を受け、大幅な研究計画の変更を行ない、当初予定してた亜鉛欠乏によって変化が見られたタンパク質の同定および追加分析ではなく、エリスロポエチンのmRNA発現について検討することとした。平成24年度の実施計画は、平成23年度に得られた結果を基にして、タンパク質の同定を行う予定だったが、平成23年度の進度が当初の予定よりも遅れたため、当該年度の前半をリカバリにあてた。年度後半は当初の予定通りタンパク分析に関する作業を行った。当該年度の後半はタンパク分析の準備を行い、分析を外注するためのスポット選定を行った。平成25年度はタンパクのスポット分析を依頼し、解析を行う。並行して、亜鉛欠乏および食餌摂取量の制限が血圧調節機構にどのような影響を与えるのかを検討する予定である。職場の異動に伴い平成24年度及び25年度の進度が当初の予定よりも遅れたため、当初の予定にあった研究計画をすべて実行できていない。本年度の研究費を次年度に移行し、来年度に研究を続行することとした。平成24年度は、これまでに腎臓中のエリスロポエチン濃度およびエリスロポエチンのmRNA発現に変化が見られたことから、腎臓中のタンパク質の変動等を精査する。今年度が終了した時点で、一部の研究費を次年度に使用することにした。
高分子量蛋白質のNMR構造解析を目指したスパース選択標識とNMR自動解析法の開発

研究成果発表のための学会参加費と論文等の出版にかかると経費が,予定よりもかからなかったため.次年度は,初年度の成果を発表する機会が増えるため,残った分の経費は次年度の成果発表の経費として使用予定.新規計算機を購入予定であったが,目的の性能を満たす装置の年度内での発売がされなかったため,次年度に購入することとした.繰り越した費用は,新規計算機の購入と実験消耗品の購入に充てる予定である.
クロマチンリモデリングによる幹細胞老化と癌の制御機構の解明

本研究は、クロマチンリモデリング因子CHD8による幹細胞老化制御メカニズムの全貌を解明すると共に、神経変性疾患やがんなどの加齢関連疾患にこのシステムがどのように関与しているのかを明らかにすることを目的とし「組織幹細胞の若返りによる疾患治療」を目指している。最近、CHD8は自閉症スペクトラム障害の最も有力な原因候補遺伝子として同定され、われわれはヒト自閉症患者のCHD8変異を再現したCHD8ヘテロ欠損マウスを作製し行動解析を行ったところ、このマウスが自閉症様の行動異常を再現することが明らかとなった[Katayama et al., Nature 537: 675-679 (2016)]。さらに、われわれは各種の組織幹細胞(神経、間葉系、造血)特異的CHD8ノックアウトマウスを作製したところ、各組織における著しい分化異常を来すことからCHD8の幹細胞における重要性が明らかとなった。特に、CHD8を欠損した造血幹細胞は、老齢マウスの造血幹細胞と類似した異常な増加が観察され、骨髄移植実験における骨髄再構築能力が著しく障害されていた。われわれは今までに、CHD8がヒストンH1のリクルートによりがん抑制タンパク質p53を抑制し、発生期の器官形成に重要な役割を果たすことを発見しているが、造血幹細胞においてCHD8/p53ダブルノックアウトマウスを作製すると、上記の造血幹細胞の異常な増加が顕著に抑えられ、骨髄移植実験における骨髄再構築能が回復することがわかった。これらの結果から、CHD8による幹細胞制御システムは各種の組織幹細胞の機能維持において重要であり、特に造血幹細胞においてはCHD8-p53系が重要な役割を担っていることが明らかとなった。28年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は「組織幹細胞の若返りによる疾患治療」を目指し、クロマチンリモデリング因子CHD8による幹細胞老化制御メカニズムの全貌を解明すると共に、神経変性疾患やがんなどの加齢関連疾患にこのシステムがどのように関与しているのかを明らかにすることを目的としている。われわれはCHD8が神経幹細胞、造血幹細胞および間葉系幹細胞において高発現していることを明らかにした。最近、自閉症スペクトラム障害の最も有力な原因候補遺伝子としてこのCHD8が同定され、世界中で大きな反響を呼んでいるが、われわれはヒト自閉症患者のCHD8変異を再現したモデルマウスを作製し行動解析を行ったところ、このマウスが自閉症様の行動異常を再現することを確認した。われわれが作製した神経幹細胞特異的なCHD8ノックアウトマウスは神経の発生異常により幼少期に死亡することが明らかになっている。またCHD8ヘテロ欠損マウスは高脂肪食誘導性の肥満に対して抵抗性を示すことが分かっているが、間葉系幹細胞特異的にCHD8を欠損させたマウスは著しい脂肪組織の減少を来すことから、CHD8へテロ欠損マウスの抗肥満表現型は脂肪分化異常が原因であるものと考えられた。さらにCHD8を欠損した造血幹細胞は、老齢マウスの造血幹細胞と類似した異常な増加が観察され、骨髄移植実験における骨髄再構築能力が著しく障害されていることが明らかになった。これらの結果から、CHD8による幹細胞制御システムは神経発生、脂肪分化および造血幹細胞の機能維持において重要な働きを担っていることが明らかになった。いくつかの組織幹細胞においてCHD8欠損による幹細胞制御システムの破綻が幹細胞機能を障害することが判明したことにより、CHD8による幹細胞制御の重要性が明らかになりつつある。神経幹細胞、間葉系幹細胞および造血幹細胞特異的CHD8ノックアウトマウスを作製し、自閉症、肥満症および骨髄機能不全に関して詳細な機能解析を行い、これらの病態にCHD8による幹細胞機能障害が関与していることが明らかになった。これらの知見は当初の研究目的に適っており、順調に達成されつつあると考えられる。

これらの結果から、CHD8による幹細胞制御システムは各種の組織幹細胞の機能維持において重要であり、特に造血幹細胞においてはCHD8-p53系が重要な役割を担っていることが明らかとなった。プロテオーム、ChIP-SeqおよびRNA-Seq解析によって、幹細胞におけるCHD8の標的遺伝子を網羅的に探索することにより、CHD8による幹細胞老化の制御機構を解明する。またCHD8のプロモーター領域を解析し、遺伝子発現に影響を与えるシス領域を決定すると共に、そこに結合するトランス因子を同定する。さらに組織幹細胞へのCHD8の発現誘導が生体内でがんを起こすかどうかを検討するために、発現誘導型CHD8トランスジェニックマウスの自然発がんまたは誘発がん(神経・造血・腸管・皮膚など)の発生率と生命予後について検討する。最終的には、がんを起こさずに個体老化を抑制する発現レベルを決定する。28年度が最終年度であるため、記入しない。
環境問題の国際化に伴う最適地域森林資源管理とスロバキアにおける森林資源政策分析

スロバキアなど多くのヨーロッパ諸国における環境規制の一つである傘伐伐採による天然更新問題を隣接空間制約問題として定式化し、最適化モデルの構築により規制の評価を行った。その結果、伐採の組み合わせを時空間的に変化させることにより、規制の影響を軽減できることが分かった。また、個別分散林分の集約化に対する最適モデルも開発し、その応用として暴風害防止規制による伐採方向の保持について最適伐採計画を探求できるモデルを開発した。環境問題のグローバル化に伴い、国家レベルにおいて様々な政策が打ち出されている。森林資源に対する政策についても、木材輸出国、輸入国など各国の資源的及び経済的特質などの違いにより、森林資源管理に関する政策への対応も様々である。地球規模での環境問題に対する国家レベルの対応と同時に、地域においては、その物理的・経済的あるいは地域社会的特質を反映した地域主導の地域森林資源管理モデルが必要不可欠である。こうした状況下、国家レベルかつ地域レベルに対し、適正な地域森林資源管理政策を打ち立てて行くには、資源管理に対し、両レベル、同時、すなわち多目的階層別の地域森林資源管理評価モデルが必要不可欠となる。本研究では、地球規模での環境問題として地球温暖化防止に対する森林資源管理政策について、スロバキアを事例とし1.国レベルでの森林資源管理評価、2.地域レベルでの森林資源管理評価、最後に3.国家レベルおよび地域レベル同時の森林資源管理評価、を行うことができる森林資源管理評価モデルを構築し、国家レベルでの森林政策目標達成下における地域レベルでの最適地域森林資源管理を探求することである。また、環境リスク及び経済リスクをモデルに取り込み、将来的なリスク環境下における適切な管理政策の探求も同時に行う。平成18年度の研究成果は以下の通りである。●スロバキアにおいて研究対象とする森林においてフィールド調査を行い、森林の成長に関わるデータ収集を行った。●スロバキアにおける森林管理の現状について聞き取り調査を行った。●植林放棄の経営メカニズムの解明に取り組んだ。●放棄オプションの導入による経営放棄リスク管理モデルを構築した。●多変量線形モデルによる林分成長要因探索のための変数選択法を開発した。●動的計画法に基づく森林資源管理モデルを構築した。平成19年度の研究成果は以下の通りである。・スロバキアにおいて地域森林資源管理制約の調査を行った。・九州にて地域組織構造継続調査を行った。・スロバキアにおいて研究対象とする森林成長モデル構築を行った。・地域市場価格データに対する時系列分析を行った。・日本における木材市場モデル及び森林政策評価モデルの構築を行った。本研究では、地球規模での環境問題として地球温暖化防止に対する森林資源管理政策について、スロバキアを事例とし

1.国レベルでの森林資源管理評価、2.地域レベルでの森林資源管理評価、最後に3.国家レベルおよび地域レベル同時の森林資源管理評価、を行うことができる森林資源管理評価モデルを構築し、国家レベルでの森林政策目標達成下における地域レベルでの最適地域森林資源管理を探求することである。平成20年度の研究成果は以下の通りである。1)スロバキアにおける地域森林資源管理事例に対しGISシステムにてモデルケースを構築した。2)スロバキアにおける地域森林資源管理として進められている傘伐による伐採計画を、ストリップ伐採問題として定式化し、解探求のためのモデルを構築した。3)日本における地域森林資源管理事例として個別分散林分の団地問題を定式化し、解法手段の構築を行った。4)温暖化防止政策として熱帯林地域を対象に必要バイオマスエネルギー量を推定した。5)繰り返し計算が不必要なスプライン平滑化法を提案した。6)成長曲線モデルと変化係数モデルの関係を明らかにした。環境問題のグローバル化に伴い,国家レベルにおいて様々な政策が打ち出されている.森林資源に対する政策についても,木材輸出国,輸入国など各国の資源的及び経済的特質などの違いにより,森林資源管理に関する政策への対応も様々である.地球規模での環境問題に対する国家レベルの対応と同時に,地域においては,その物理的・経済的あるいは地域社会的特質を反映した地域主導の地域森林資源管理モデルが必要不可欠である.本研究では,地球規模での環境問題として地球温暖化防止に対する森林資源管理政策について,スロバキアを事例とし1.国レベルでの森林資源管理評価,2.地域レベルでの森林資源管理評価,最後に3.国家レベルおよび地域レベル同時の森林資源管理評価,を行うことができる森林資源管理評価モデルを構築し,国家レベルでの森林政策目標達成下における地域レベルでの最適地域森林資源管理を探求することである.平成21年度の研究成果は以下の通りである.1)スロバキアにおける地域森林資源管理で適応されている傘伐計画問題をCPLEX最適化プログラムにてモデル構築を行い,傘伐導入の影響を分析した.2)スロバキアにおける地域森林資源管理として進められている暴風害防止のための方向性を保持したストリップ伐採問題の定式化法を開発した.3)炭素吸収源に関わる国際気候政策問題と適格な炭素吸収量(eligible carbon sinks)を分析し,森林経営に対するポスト京都議定書の適切な気候合意を提示した.
ブラジル消費者法における広告・表示規制の私法的効果に関する基礎研究

本研究は、広告やラベル表示に対する消費者の関心や問題意識の高まりを背景に、(1)一貫性・一覧性ある消費者法典としての完成度の高さ、(2)制定後20年近く経過した今なお健在の先進性ならびに(3)実務的要請の存在の三点から、ラテンアメリカ諸国の消費者法のスタンダードとされるブラジル消費者法研究の大きな意義を認め、同法の規定を参考に、わが国の広告表示規制の適切な私法的効果を考えるものである。当年度の研究では錯誤規定のあり方に関する比較法的研究を通じ、相手方の信頼保護という要請が、消費者法においては事業者に(情報提供義務など)行為義務を課す形で目的逹成されていることが確認された。とりわけこの点に開するブラジハ法の特質は、「広告的申込み」を通じて、みの相手方の信頼保護という要請に関し、単に同意の瑕疵を治癒するにとどまらず、錯誤や詐欺がない場合でも、不誠実な取引行為を行う事業者に対して、同様に一律の債務不履行責任を負わせる点にある。例えば、消費者を欺く等の目的ではなく、サイトの広告収入を期待して、通信販売のサイトで不在の商品広告を掲載するような事業者に対しても同一の法的効果を生じさせている。つまり、事業者の取引行為はかなり広義に捉えられており、社会が要請する一定の行動義務を前提に、それに違反する場合のサンクションとして債務不履行責任を負い、消費者の選択によっては「契約解消」を受け入れなければならない。なお、わが国の民法改正案との関係では、消費者契約法から取り込まれた「不実表示」による取消しにつき、本研究からの結論によれば、消費者契約法上はブラジル法と同様のサンクションとしての契約解消であり、民法改正案上は原状回復的賠償に代わる契約解消であると考えられる,以上の契約解消に関する性質上の違いから、賠償の範囲についても、前者は履行利益まで及ぶと考えることが可能であるのに対し、後者は原則として信頼利益の賠償に止まるものと考えられる。当年度の研究では、契約締結過程において情報面・交渉力面で問題のある消費者契約の効果面に関して、民法上の契約取消権や解除権・損害賠償請求権、ならびに、消費者法上のクーリング・オフ権等について、ブラジルおよびスペイン語圏の法律を参考に比較法的な検討を行った。ブラジル消費者法その他では、8日間のクーリング・オフ期間の起算点を契約締結時ではなく目的物受領時まで遅らせている。この点、時効期間の起算点と比較すると、事業者の側での目的物引渡債務については同債務が請求可能となる時期、すなわち、契約成立時が起算点となり、これ以前にも以後にも当該期間をずらすことは法的安定性を害することになるわけだが、クーリング・オフ期間では、同権利がそれ自体すでに消費者のための特別な権利であることに加えて、起算日まで遅らせていることになる。このことの正当性について考えると、とりわけインターネットを通じた通信販売においてホームページ等で掲載されていた商品と実際に届いた商品の間に何らかの差異がある場合に、その効果は、従来の契約締結過程の問題として、情報面の暇疵から引き出される取消権あるいは契約不適合による解除権や損害賠償請求権が付与されるにとどまらず、交渉力面からも、店舗販売とは異なる販売方式を採用した上でそれを濫用した場合には(例えば店舗販売では買い手がつかないような商品の場合など)、それに対するサンクションとして、クーリング・オフその他による契約解消や損害賠償義務を負う場合があると考えられる。当年度の研究では、契約の締結過程において、交渉力の面で問題のある契約を中心に比較法的考察を行った。これは、平成22年度および23年度を通じて行った情報量の面で問題のある契約を中心とした考察との連続性を有する研究である。平成22年度から23年度では、「錯誤」「詐欺」の周辺領域として、「不実表示」「情報提供義務」の考察を中心に行ったのに対して、当年度では、「強迫」の周辺領域として、「窮迫状態」「経済的強迫」「レジオン」「不当威圧」といった類型の成立要件ならびに効果を検討した。これらの類型について、諸外国の既存法典や法典草案では、「強迫」とは異なる別個の蝦疵類型に主る立法的解決が図られており、その要件論における着眼点として、(1)依存状況を前提とした交渉力格差の存在、(2)同依存状況からの濫用的搾取(つけ込み)→交渉力格差を利用した意思形成過程への不当な干渉、(3)その結果としての契約内容の不均衡を挙げることができる。例えば、ヨーロッパ契約法原則(PECL)、フランス民法改正に際しての債務法改正草案(カタラ案)、2002年ブラジル民法157条、スペイン民法草案1301条は、過度の利益の引き出しが要件化され、さらにケベック民法では契約内容の明らかな不均衡が存在した場合に搾取を推定するのに対し、オランダ民法44条、フランス民法改正に際しての司法省契約法改正案(司法省案)は、契約内容の不当性を要件化しない。ただオランダ民法およびPECLは相手方の主観的事情を要件化するため、このフィルターを通して過度の利益の引き出し等が考慮され得る。

また、効果については、相対無効や取消しだけでなく、取消権者の請求により裁判所による契約改訂がなされるほか(PECL,スペイン民法草案)、十分な額が追完されるか、利得した当事者がその利益の減額に同意する場合は無効とならないとの規定もみられる(ブラジル民法157条)。平成24年度に、主たる研究対象であったブラジル消費者保護法典に対する改正草案たる三種類の上院執行部草案が提出された。三種類の内訳は、1電子商取引に関する草案、2多重債務問題に関する草案、3消費者団体訴訟に関する草案、である。このうち、1の電子商取引草案は、平成25年3月に大統領が署名し、ブラジル消費者保護法典中、(1)第1編「消費者の権利」第1章「総則」中の複数の条文に合計四つの新しい項および号が追加され、(2)同編第5章「取引行為〔取引実務〕」に第7節「電子商取引」が新設され、また(3)同編第6章「契約上の保護」第1節「総則」中の放棄権(撤回権、クーリングオフ権)に関する第49条に、新たな八つの項(2項から9項)が追加されることになった。(1)については、四つの改正案中、「消費者にとって最も有利な」という文言がそのうちの三つで加えられた。(2)については、不招請勧誘規制を明文化し、(ブラジル消費者保護法典では既存の)民事罰制度を適用して、事前的・抑止的救済を図っている。(3)については、放棄権(撤回権、クーリングオフ権)の拡充を図り、店舗取引でも製品の中身が確認できなかった場合などに放棄権行使を認め、違反に際しては民事罰制度が適用される。わが国においても、不招請勧誘規制として、「状況濫用」の要件論を参考に、「退去・不退去」の亜種として消費者契約法上の取消権を付与するのが妥当である一方で、契約の無効や取消しといった事後的救済のみならず、特に過大なリスクを伴う金融商品についての不招請勧誘に伴う甚大な利用者被害に鑑みれば、一定の事前的・抑止的救済が求められる。正面から民事罰制度を導入することが難しければ、要件を緩和した不法行為責任(709条)としての導入があり得よう。研究を進めていく過程で、現行法に限った比較法的考察では解明仕切れない点の比重が次第に大きくなり、ラテンアメリカ諸国の法制について時代を遡った考察も必要となったため。24年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は当該研究課題の完成年度にあたるため、これまでどおりの現行法の比較法的考察を行いつつ、今後の比重を制定法の時代背景や法文化的観点に移し、全体像を把握・提示できるように進めていきたい。
触覚刺激による介入が皮質間ネットワークおよび知覚学習に及ぼす影響

近年,ヒトの身体機能の向上には皮質領域単独の活動だけではなく,複数の皮質領域間の相互的な活動(皮質間ネットワーク)が重要であることが示されている.そこで我々は触覚刺激によってこの`皮質間ネットワーク'を変化させることで知覚学習を促通できるのではないかと考えた.よって,具体的には,1)感覚機能向上に特異的に関連する皮質間ネットワークを明らかにする,2)触覚刺激の刺激方法が皮質間ネットワークに及ぼす影響を明らかにする,3)触覚刺激によるプレコンディショニングが知覚学習に及ぼす影響を明らかにすることを目的とし,研究を実施する.近年,ヒトの身体機能の向上には皮質領域単独の活動だけではなく,複数の皮質領域間の相互的な活動(皮質間ネットワーク)が重要であることが示されている.そこで我々は触覚刺激によってこの`皮質間ネットワーク'を変化させることで知覚学習を促通できるのではないかと考えた.よって,具体的には,1)感覚機能向上に特異的に関連する皮質間ネットワークを明らかにする,2)触覚刺激の刺激方法が皮質間ネットワークに及ぼす影響を明らかにする,3)触覚刺激によるプレコンディショニングが知覚学習に及ぼす影響を明らかにすることを目的とし,研究を実施する.
単一神経細胞マイクロアレイによる大脳皮質GABAニューロンの解析

我々はタカラバイオ社のSuper Smart cDNA PCR synthesis kitとAffymetrix社のOne cycle RNA labeling kitを組み合わせて行うことができる単一細胞マイクロアレイ法を開発した。この方法の再現性、信頼度を確かめるために、E18-P0のGAD67-GFPノックインマウスの大脳皮質よりGFP陽性細胞をセルソーターにより分離して得た1μgのtotalRNAからOne cycle RNAlabeling kitでマイクロアレイ解析を行なった場合と、このtotalRNAを10万倍希釈してから我々が確立した方法で増幅を行なった場合の結果を比較したところ、希釈して増幅した場合は、約56%の遺伝子をPresent callとして検出することができた。この方法を用いて、10個のE18-P0のGAD67-GFPノックインマウスの大脳皮質の脳室下帯のGAD67陽性細胞の単一シングルセルマイクロアレイ解析を行ったところ、細胞ごとに異なった発現プロファイリングを得ることができた。この解析した細胞のDNA replication関連遺伝子群を調べたところ、1個の細胞において、たくさんのDNA replication関連遺伝子の発現を検出することができた。この細胞はDNA合成期にあったと考えられる。また、他の細胞においても、DNA replication関連遺伝子の一部の発現が認められたことから、この細胞はGO期にあってもまだ分裂能を秘めた細胞であった可能性が考えられる。これらの結果はGABAergic intermediate progenitorが脳室下帯に多く含まれていることを示唆している。我々のこれまでの研究で、GAD67-GFP knock-in mouse大脳新皮質脳室下帯のGFP陽性細胞では、GABA合成酵素(GAD67)と神経細胞マーカーのMAP2、Tuj1陽性の細胞の一部で、細胞増殖マーカーであるKi-67、リン酸化ピストンH3、BrdUが共存することがわかっていた。また、El8のGAD67-GFP knock-in mouse大脳新皮質脳室下帯のGFP陽性細胞を用いたシングルセルRT-PCR解析ではGAD67,Tuj1,MAP2,β-actinは全ての細胞で検出できたが、同時に12/10の確立で、細胞増殖マーカーであるKi-67陽性の細胞も見つかっている。本研究でこれらの細胞の特性やその発現プロファイリングを詳細に解析するため、単一細胞マイクロアレイ法を開発した。本方法は市販のキットを組み合わせて解析を行うことができる非常に簡便な方法である。この方法を用いて、7個のGAD67-GFP knock-in mouse大脳新皮質脳室下帯のGFP陽性細胞で解析を行った。7個の細胞中、Ki-67陽性細胞は1個、別の細胞増殖マーカーであるPCNA陽性細胞は2個見つかった。DNA replicationに関わる遺伝子の発現を調べたところ、PCNA、Ki67二重陽性の細胞で多くの遺伝子が発現していたので、この細胞はDNA合成期にあったと考えられる。また、他の細胞も何らかのDNA replication関連遺伝子が発現しており、GO期にあってもまだ分裂能を秘めた細胞であった可能性が考えられる。