hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
イメージ・感性開発のためのメディア活用型総合学習パッケージの開発-美術館等におけるワークショップ及び学習デザインの教材開発に関する調査・研究

3年間の本研究の成果として、以下の3点に整理できる。(1)表現が重要性を増す情報ネットワーク時代のイメージや感性を大事にした新しい学びの創出を目的として企画された本研究は、学校教育における総合学習や美術館・博物館において活用できる学習環境のデザインを踏まえた「(アート)ワークショップ型の学び(学習方法)」の有効性を理論的・実践的に初めて実証し、具体的な装置・教材として発表、完成できた。(2)実践的研究では、3つのワークショップを実施、分析した。1)「あさひdeアート2003」(実践研究I)、「あさひdeアート2004」(同III)では、「コミュニケーションの可視化」「身体性や感覚の拡張と変換」などを目的にした世界的にも類例をみない重度障害児に対するメディアアート・ワークショップを実施し、メディアアートを活用したワークショップの構造を明らかにした。2)「あの時あの場所色図鑑@ちるみゅー」では、「色によるコミュニケーションの発生や協同学習」を検討した。その結果、ワークショップ型学習のデザイン(作り方)と問題点を明らかにした。(3)(2)に基づいて、メディア活用型ワークショップのデザインを理論的に検証した。特に、従来ワークショップ型学びが無視されてきたその評価に関し、ファシリテーターと参加者(子ども)の発話記録分析を実施し、相互の特性や成果について考察し、その結果、構成主義的教育論に立脚したワークショップ型学習の学習と評価の関係を明らかにし、体験型の教育方略が参加者の認知的社会的発達を促すことを究明した。以上、広義の造形(色や形の発生)をメディアとして捉えた表現型の学びは、従来の作品制作主体の美術教育を超えて、総合的な学習の基盤となることがわかった。同時に、そのようなイメージ・感性開発型の学びは情報メディア時代にふさわしいものであることを証明できた。メディアと美術教育に関する全体研究について、3回の研究会(第1回6月1日(土)於東京工芸大学、第2回6月16日(日)於国立民族学博物館、第3回10月4日(金)於多摩美術大学)を開催し、第3回は須永剛司・多摩美術大学教授による「情報デザイン・学習環境デザインと教育」に関する講演会を実施し、「メディア教育・感性教育理論の構築」に大きな示唆を得た。総合学習のためのイメージ・感性情報の学習に関する理論的研究のうち、(1)「総合学習・マルチメディア学習の基礎理論研究」では、福本・永守・森、佐藤による国際美術教育学会(INSEA)ニューヨーク大会での発表などがある。(2)「メディア・アート・デザインとイメージ・感性情報処理の学習への展開の可能性に関する基礎的理論研究」では、茂木の障害児を対象としたメディア教材の研究、直江による無意識と身体感覚による研究、原田泰らによる「仮想世界と現実世界を連携させた一つの遊びの世界としての空間」(日本デザイン学会、2002年11月、和歌山大学)、などがある。メディア活用型総合学習パッケージの開発に関する調査・実践研究のうち、(1)学習環境デザインに基づくワークショップ実践及び調査では、阿部の「ふわふわ粘土で作るお菓子やアイスクリーム」幼児造形研究会高野山集会(2002年8月)、森岡祥倫の「メディアでつくる」東京都図画工作研究大会城南大会(2002年12月)、佐藤の「My Little Museum-ふでばこ展覧会-」「My Little Museum-らしさコレクションボックス-」NPO学習環境デザイン工房(2002年10月)、「ふでばこてんらん会」ICC『コミュニケーションの現在2003』(2003年3月)などがある。

(2)感覚・身体性の拡張を意図したメディア装置のモデル開発では、森・福本・永守による装置開発、CD-ROM出版、博物館・美術館等で行われる鑑賞教育の内容と方法に関する実践研究では、佐藤の「第三の学びの場としての博物館」日本デザイン学会などがある。メディアと美術教育に関する全体研究について、2回の研究会(6月28日(土):京都芸術センター、12月7日(日):群馬県立あさひ養護学校)を開催し、メディア・アート・ワークショップ及びメディア教材について、制作・実施等について研究し、「あさひdeアート-障害にのためのメディア・アート・ワークショップ」(12月7日、群馬県立あさひ養護学校)と「色彩ワークショップ」(2月14・15日、多摩美術大学)を実施し、具体的な成果や問題点を得た。前者では、原田、森、森岡による映像、光、音などを用いた重度の肢体不自由児を対象とした身体性や感覚の拡張をねらいとしたメディア・アート教材とワークショップを実施し、ハイテク・メディア・アートの障害児教育における有効性を検証し、成果を得た。後者では、佐藤による「あの時あの場所、色図鑑」と題する2004年度予定の子ども用ワークショップのプレ企画を実施した。多摩美術大学情報デザイン学科(原田指導)の学生15人を対象に具体的なアイデア(ツールの開発等)や実施上の問題等を探るために行った。3年間の本研究の結論として、学習環境のデザインを踏まえた「(アート)ワークショップの理論と実践」をまとめとすることに決定し、「色彩をテーマとするワークショップ(あの時あの場所色図鑑):佐藤優香コーディネイト(研究協力者)」と「障害児を対象とするメディアアート・ワークショップ(あさひdeアート2004:茂木一司コーディネイト」を実施した。前者は、2004年2月に多摩美術大学の学生を対象にプレバージョンを参考にし、兵庫県篠山チルドレンズ・ミュージアムで夏バージョン(7月4日)と秋バージョン(11月4日)を実施した。その結果、ワークショップ型学びの利点・問題点を明らかにし、そのことを中心に、「イメージ・感性開発のためのメディア活用型総合学習パッケージの開発-美術館等におけるワークショップ及び学習デザインの教材開発に関する調査・研究-」のまとめに関するパネル・ディスカッション(9月26日、同志社女子大学)を実施し、特に「ワークショップの作り方とその評価」について成果を得た(内容については、刊行予定の成果報告書を参照)。個人研究の成果としては、茂木一司他のケータイを障害児の表現学習のツールとして活用した「知的障害児の美術教育の実践研究-ケータイというメディアの可能性-」(第37回日本美術教育連合研究発表会、2004年10月、於武蔵野美術大学)、福本謹一の総合学習に関する研究「図画工作・美術科における教科再編・統合に関する考察」(INSEA国際美術教育学会第7回ヨーロッパ会議(トルコ大会)プロシーディング)、阿部寿文の中国・上海におけるキッズゲルニカ・ワークショップ(2004年10月、「Japanese Visual Culture and the Possibility of Mural Expression」成果報告書所収)。
胃がん発癌蛋白としてのヘリコバクター・ピロリ菌CagA蛋白の役割

ヘリコバクター・ピロリ菌由来cagA遺伝子を胃上皮細胞に一過性導入・発現させる系を樹立した。発現されたCagAタンパク質は細胞内で細胞膜近傍に局在し、Srcファミリーキナーゼによりチロシンリン酸化を受けた。CagAはチロシンリン酸化依存的にSHP-2チロシンホスファターゼのSH2ドメインと特異的に結合し、この結合を介してSHP-2のホスファターゼ活性を増強した。また、CagA-SHP-2相互作用の結果、胃上皮細胞には細胞質の著しい進展で特徴付けられる形態的変化(hummingbird表現型)が誘導された。CagAのチロシンリン酸化に関わるEPIYAモチーフは単離される菌株ごとにその数ならびに周辺アミノ酸組成が変動する。欧米諸国で単離されるピロリ菌由来CagAのSHP-2結合活性ならびにhummingbird表現型誘導活性はEPIYAモチーフの数に比例した。一方、胃癌の多発する日本、韓国など東アジア諸国で単離されるピロリ菌CagAは、欧米型CagAと周辺アミノ酸を異にするEPIYAモチーフを有し、この東アジア特異的EPIYAモチーフは欧米型EPIYAモチーフに比べはるかに強いSHP-2結合能ならびにhummingbird表現型誘導活性を示した。CagAとチロシンリン酸化特異的に結合する第二の細胞性蛋白としてCskを同定した。CskはCagAとの結合により活性化され、Srcを抑制することによりCagAのリン酸化レベルを低下させた。CagAによるSHP-2の構成的活性化は胃上皮細胞のapoptosisを誘導することから、CagA-Csk相互作用はCagAの細胞毒性を現弱させるフィードバック制御に関与するものと推察された。
退院支援における専門職連携実践の質評価尺度の開発

文献検討、回復期リハ病棟入院料1の施設基準に該当する病棟に勤務する専門職への面接調査、回復期リハ病棟から退院した患者・家族への聞き取り調査から指標項目の候補を抽出し、類似性により収束させ、地域看護学の研究者2名と内容や表現について検討し、構造指標33項目、過程指標63項目、成果指標30項目の指標案の原案を作成した。その後、原案の安定性の確認と内容妥当性の検討のため、回復期リハ病棟に勤務する専門職を対象に質問紙調査を行った。安定性の確認は原案の指標項目毎に、適切性、重要性、実施可能性について7段階で回答を求め、1か月後に同じ調査を行った。分析はWilcoxonの符号付順位和検定で有意差を確認した。内容妥当性については各指標項目に対して意見を求め、その内容を検討した。原案による質問紙調査では、医師・言語聴覚士・介護福祉士・社会福祉士が各1名、理学療法士・作業療法士・看護師が各2名の合計10名から協力が得られた。分析の結果、構造指標の1項目が実施可能性で、過程指標の5項目が適切性で、3項目が実施可能性で、有意差を認めた。有意差のあった項目や各項目への意見を検討し、地域看護学の研究者2名と項目の精錬を行った結果、構造指標27項目、過程指標62項目、成果指標29項目の合計118項目からなる指標案となった。本研究の目的は、回復期リハビリテーション病棟の退院支援における専門職連携を客観的にかつ包括的に測定する尺度を開発することである。平成26年度は退院支援および専門職連携実践について記述された国内外の文献検討を行い、尺度開発に必要な情報収集を行った。その結果、国外では退院支援における連携・協働の要素や、連携・協働のあり方が明確化されており、更に多職種で協働した無作為比較試験を含む様々な介入研究が存在し、その効果の検証がなされていた。介入研究のアウトカムには死亡や再入院などの健康アウトカムのほかに、患者のQOLや満足度、費用、更には専門職の行動の変化など、幅広いアウトカムが採用されており、評価尺度の項目の候補が得られた。一方、国内の文献を検討した結果、退院支援における専門職連携実践に関する調査は、その効果を検証するような報告はなく、カンファレンスや連絡調整の実施率の報告や、看護師の連携に対する認識を調査した報告にとどまっていた。これらは主に退院支援に示唆を得るための調査の一部に含まれているのみであった。その一方で、連携が退院支援における今後の課題としてとらえる文献は複数存在していた。このことから、日本では退院支援における連携・協働の研究はこれから実証研究を積み重ねていく段階にあることが確認された。一方、退院支援の評価に関する調査では日本でも国外の調査と同様に患者の転帰や満足度がアウトカムとして採用されているほか、家族介護者の不安、介護負担感など日本の文化を反映していると思われるアウトカムが採用されていた。今後は、国外文献を参考にしながら、文化や保健医療福祉制度の異なる日本での退院支援の連携・協働の要素やあり方を明らかにし、構成概念を明確化していくことが必要である。本研究の目的は、回復期リハビリテーション病棟の退院支援における専門職連携実践を客観的かつ包括的に測定する尺度を開発することである。平成27年度は評価尺度に含むべき項目を検討するため、これまでの文献検討を補完するための国外のリハビリテーションに関する文献検討を行うとともに、回復期リハビリテーション病棟の視察および病棟スタッフへの面接調査、回復期リハビリテーション病棟から退院し在宅療養を行っている療養者の現在の生活や退院支援に関する聞き取りを行った。その結果、国外のリハビリテーションに関する先行研究のアウトカムは近年、心理社会的機能に焦点があてられ、重要なアウトカムになりつつあることが確認された。また、病棟の視察および看護師5名、介護福祉士1名、理学療法士1名、作業療法士1名、言語聴覚士1名、医療相談員(社会福祉士)1名を対象にした面接調査では、専門職は連携に必要なものはコミュニケーションであると認識しており、具体的な行動としては日常的なコミュニケーションと定期的なカンファレンスがあった。一方、支援の評価は一部のスタッフによる限られた項目のみで行われており、入院中及び退院後の患者の状況から支援の評価を多職種で行う機会が少ないことが、連携不足の認識につながっている可能性があると考えられた。また、連携が不足しているとの認識には差があり、その背景には人員配置を含む環境やカンファレンスの体制、個人の認識など様々な要因が考えられた。回復期リハビリテーションから退院した療養者は、入院中に在宅療養へ向けた準備よりも、退院後の生活での調整により生活の再構築を行っており、支援の評価がなされていないことは退院支援のサービスの質向上においても課題となっていると考えられた。平成27年度は尺度の項目の検討および決定であったが、まずは前年度の文献検討の結果から課題として残された、現在の退院支援の連携・協働の要素やあり方を明確化する必要があった。そのためには研究者が回復期リハビリテーション病棟に一定期間スタッフの一員として加わっての視察が必要であり、そのための時間を要したため、項目の決定までには至らなかった。本研究の目的は、多職種からなるチームが提供する退院支援の質向上に資するため、回復期リハビリテーション病棟の退院支援における専門職連携実践を客観的にかつ包括的に測定する尺度を開発することである。

当初の研究計画において平成28年度は、尺度案を作成し、予備調査を行うという予定であった。しかし、これまで行ってきた国内外の文献検討の結果と、回復期リハビリテーション病棟の視察や面接調査の結果から、連携により提供された支援を評価する方法が確立していないこと、連携の程度の認識に職種間で差が生じていたこと、また、支援において何をどのように改善すべきかが明確になりにくい評価を行っている現状であったことが課題であるとの知見が得られたことから、開発すべき尺度の方向性に疑問を感じ、既存の専門職連携を測定する尺度をもとに検討した。その結果、これら連携を評価する尺度はチームの人間関係を主としたチームの状況の自己評価を可能とする傾向があり、提供された支援や成果とのつながりは不明であり、専門職が連携して提供する支援の良否や改善するための具体的な方策を導くことができないと考えた。専門職連携による退院支援の質向上に資するためには、連携そのものを測定する尺度よりも、連携による支援の良否を評価し、かつ、改善すべき点が明確となる評価指標を開発することが必要と考え、その枠組みと今後の計画の再考を行った。現在、再考した枠組みに沿ってガイドラインや書籍、先行研究から指標項目の候補を抽出する作業を継続中である。また、指標開発のための方法を再検討し、対象者の抽出を行うなど、質問紙調査へ向けた準備を行っている。平成28年度は尺度案を用いた予備調査の予定であったが、これまでの文献検討や現場視察等で明らかとなった課題から、研究成果の質を上げるために枠組みや調査方法の再考と修正を要し、そのための時間が必要となった。本研究の目的は、多職種からなるチームが提供する退院支援の質向上に資するため、回復期リハビリテーション病棟における専門職連携実践による退院支援の質評価指標を開発することである。平成29年度は指標項目の作成のために回復期リハビリテーションに勤務する専門職(医師、看護師、介護福祉士、理学療法士、作業療法士、言語聴覚士、社会福祉士)を対象に面接調査を行った。現在、得られたデータをKJ法を用いて解析中である。また、退院支援の成果として最も注目すべきは患者と家族の退院後のQOLであるため、回復期リハビリテーション病棟から退院した患者や家族へ退院1か月後に聞き取り調査を行った。その結果、自宅退院が可能となった患者はADLの自立度が比較的高く、日常生活において不自由さはあるもののほぼ自立して生活できており、病院から受けた支援に対して患者・家族ともに高い満足度を示した。また、仕事や趣味など家族の都合に合わせたサービス調整に対して、家族は満足していた。退院支援の成果として最も注目すべきは患者と家族の退院後のQOLであること、また、包括的な指標とするためには支援を受けた患者や家族の意見を取り入れる必要があることから、回復期リハビリテーション病棟から退院した患者や家族を対象に、退院1か月後に聞き取り調査を実施することとした。しかし、自宅退院となる患者が予測よりも少なく、コミュニケーション障害や施設への退院等の理由から調査への協力が得られず、研究遂行に時間を要した。文献検討、回復期リハ病棟入院料1の施設基準に該当する病棟に勤務する専門職への面接調査、回復期リハ病棟から退院した患者・家族への聞き取り調査から指標項目の候補を抽出し、類似性により収束させ、地域看護学の研究者2名と内容や表現について検討し、構造指標33項目、過程指標63項目、成果指標30項目の指標案の原案を作成した。
大Maf群転写因子によるネフロン分化の解明と腎臓再生基盤の確立

(背景)腎の発生において上皮化したネフロン前駆細胞は、糸球体上皮細胞、近位尿細管、遠位尿細管のそれぞれに分化し、ネフロンでは、大Maf群転写因子のMafB, c-Mafが発現している。我々はMafBノックアウトマウスに糸球体上皮細胞の発生障害があることを報告したが、近位尿細管、遠位尿細管にも発生異常があることを新たに見出した。腎の発生において、上皮化したネフロン前駆細胞(Six2陽性細胞)は、糸球体上皮細胞、近位尿細管、遠位尿細管のそれぞれに分化する。大Maf群転写因子は、哺乳類においてMafA, MafB, c-Maf, Nrlの4種類が知られ、ネフロンでは、MafB, c-Mafが発現している。MafBにGFPノックインしたマウスの解析からMafBは糸球体上皮細胞に発現している。また、c-MafにLacZをノックインしたマウスの解析から、c-Mafは近位尿細管に発現していることが分かった。(方法)MafBノックアウト(KO)マウスは、生後すぐに死亡するため、胎生18.5日目で解析し、腎臓の組織学的評価、RT-PCRを行なった。(結果)胎生18.5日目のMafB KOマウスにおいて、糸球体上皮細胞(WT1陽性)、近位尿細管細胞(LTL;Lotus tetragonolobus lectin陽性)、遠位尿細管細胞(Slc12a3陽性)は野生型マウスに比べ有意に減少していた。また、腎のRT-PCRでネフロン分化に必要なNotch2の発現の減少がみられた。培養糸球体上皮細胞にMafBを過剰発現するとNotch2の発現が上昇した。年次計画どおりに推移している。大Maf群転写因子のネフロン発生と分化における役割を明らかにし、大Maf群転写因子(MafB, c-Maf)の発現を制御することで上皮化したネフロン前駆細胞から、糸球体上皮細胞、近位尿細管細胞、遠位尿細管細胞のいずれかの狙った細胞に分化誘導させることを可能とする目標に近づきつつある。1、ネフロン発生における大Maf群転写因子の発現変化のメカニズムを明らかにすること。上皮化したネフロン前駆細胞にはMafBが発現している。ネフロン分化の過程で、MafB発現が維持されていると糸球体上皮細胞となり、MafB発現が低下すると尿細管細胞となる。尿細管細胞のうちc-Maf発現が上昇するものは近位尿細管となり、そうでないものは遠位尿細管となる。その大Maf群転写因子の経時的変化とメカニズムを明らかにする。2、大Maf群転写因子制御によるネフロン前駆細胞からネフロン構成細胞への分化誘導可能かどうか。

2、大Maf群転写因子制御によるネフロン前駆細胞からネフロン構成細胞への分化誘導可能かどうか。購入抗体が輸入品で時間がかかり、次年度購入としたためである。
プリオン様蛋白の神経回路伝播と細胞応答

本研究では、様々な疾患の剖検脳に蓄積するタウの生化学的解析から、患者脳に蓄積するタウは疾患ごとに異なる異常構造をとっていること、それが生化学的に区別できることを明らかにした。またADの原因遺伝子であるAPPがタウの伝播に促進的に働くことが示された。TDP-43の凝集に関わる配列を同定し、その合成ペプチドが線維を形成してプリオン様活性を有することも報告した。また断片化したαシヌクレイン線維が最も高いプリオン様活性を示すことを明らかにした。さらに、ヒトにより近いモデルとしてαシヌクレイン伝播を再現するマーモセットモデルを構築した。1)接種部位の違いによる病変形成と広がりの解析:脳の様々な部位、脊髄、末梢神経、あるいは筋肉、腹腔などに、線維化αシヌクレインを接種し、36ヶ月後を目処に解剖し、免疫組織染色を行って異常リン酸化病変の形成と分布を観察した。その結果、脳内に接種した場合には、接種部位の違いによって明らかに異なる異常αシヌクレイン病変の出現が観察され、神経回路を介して病変が広がることが確認された。しかしながら、筋肉や腹腔内に接種した場合には数ヶ月から半年以上経過した個体においても脳の病変は観察されなかった。この結果は最近PNASに発表された遺伝子改変マウスの結果とは異なる結果であり、野生型マウスと遺伝子改変マウスの違いによるものと考えられた。また線維化タウについても類似の結果がえられており、αシヌクレインの広がりとどのように異なるか検討を行っている。2)凝集体形成と伝搬の可視化:EGFP等の蛍光を発するタンパク質を融合させたαシヌクレイン、あるいはタウを発現するプラスミドを構築し、細胞内に発現させ、細胞外から繊維化αシヌクレインを導入することにより、細胞内の凝集を可視化することに成功し、それを経時的に観察することができるようになった。3)異常タンパク質の侵入、細胞間伝播機序の解明:まずどのような状態の異常αシヌクレインが最も細胞内に取り込まれ、それが正常分子を異常型に変換して増殖させるかを検討し、断片化された繊維が最もシード活性が高いことを見出した。また繊維化したタウの取り込みにAPPとの相互作用が重要であり、APPを過剰発現させるとタウの取り込みと細胞内タウの凝集が促進することを明らかにした。実際の患者脳において、タウ、TDP-43等の異常タンパク質がプリオン様性質を有していることを明らかにすることができた。また、培養細胞において患者脳と非常によくにた病変を再現することに成功し、その可視化も可能となった。マウスモデルにおいても野生型マウスで病変の広がりの違いがどのように生じるのか明らかになりつつある。合成αSyn fibrilsについて、ヒトαシヌクレインを一過性に発現するSH-SY5Y培養細胞モデルと野生型マウスで、プリオン様活性を示す最小量を決定した。次に実際の患者脳におけるαSynについてのプリオン様seeding活性を検討するため、MSA患者剖検脳から調製した不溶性αSynとDLB患者剖検脳から調製したαSynについて検討をした結果、Prusinerらの報告にあるように、その活性に大きな違いが認められた。また、MSAとDLBの不溶性αSynについて、WBとImmunoEMで検討したところ、バンドパターンに違いがあり、形態的にも違いが観察された。患者脳由来の不溶性αSynを培養細胞に導入し、細胞内で形成されるリン酸化αSynの量を定量した結果、MSAはDLBより強いシード活性をもち、その活性は合成αSynとほぼ同じかそれ以上であった。さらにマウスに接種しそのin vivoでのプリオン様シーディング活性も調べた結果、DLB由来のαSynは接種後3ヶ月ではほとんど病変が検出されなかったのに対し、MSA患者由来のαSynはレビー小体様の病変が認められた。最後に不活性化について検討し、合成synとMSA synについて培養細胞とマウスで検討し、その不活性化には12%SDS中でのオートクレーブ処理、あるいは134°Cでのオートクレーブ処理が必要であることが示された。1. TDP-43の蓄積と疾患特徴的病態形成機構核タンパク質のTDP-43は、ALSや前頭側頭葉変性症(FTLD)患者で線維化、凝集し、リン酸化やユビキチン化を受けて蓄積する。TDP-43のC末側領域の部分欠損体を作製し培養細胞に発現させ、その凝集に関係する配列を同定した。さらにその領域のペプチドを合成し、線維化、凝集傾向を調べた結果、274-313、314-353のペプチドが線維化しやすいこと、さらにはそれぞれのペプチド線維は細胞内の正常TDP-43を異なる構造の異常型TDP-43に変換することが示された。以上の結果は、C末端の重合領域の違いによって構造の異なる異常型TDP-43が形成されることを示唆する。

得られた知見は、TDP-43凝集モデルの構築、ALS/FTLDの治療薬開発に役立つことが期待される。2.プリオン様伝播の原因となるαシヌクレイン(αS)分子種パーキンソン病(PD)やレビー小体認知症(DLB)の特徴病理を形成し、その病態進行に関わるαSについて、どのような性状の分子種がプリオン様伝播を引き起こすか検討した。精製リコンビナントヒトαSを様々な条件下に置いて分子形態や性状を観察し、プリオン様活性を細胞モデルおよび野生型マウス脳への接種実験により調べた。その結果、アミロイド様線維構造をもつαSのみがシード活性を有し、異常リン酸化αS病理を引き起こすことが示された。次に線維を超音波処理し、処理時間の違いでシード活性が変化するか検討した結果、試験管凝集系、細胞モデル、マウス脳への接種実験のいずれにおいても、超音波処理の時間が長く、断片化αS線維の量が増加するほどシード活性が高くなることが示された。TDP-43の凝集に必要な配列の同定に成功し、それを用いて培養細胞モデルを構築することができた。またαSについては、プリオン様伝播をもっとも効率よくひきおこす分子種を特定することができ、今後の他のタンパク質のプリオン様伝播モデルの構築に役立つものと思われる。28年度は以下の項目について検討を行う予定である。1正常タンパクのみを発現した細胞と、そこへ線維化タンパク質を導入して細胞内にタンパク質を凝集させた細胞において、発現タンパク質の違いを明らかにし、細胞内応答系がどのように働いているか検討する。2細胞内で増殖する異常タンパク分子に付随する分子の網羅的解析を行う。細胞内に異常分子が生じた場合、これを分解、排除するために、様々な分子が何らかの形で接触し、攻撃すると考えられる。そこで、界面活性剤などを用いないソフトな調製法である免疫沈降法と、イオン性界面活性剤などを用いて不溶性画分を回収するハードな調製法により、異常タンパク分子を単離し、そこに含まれる分子を網羅的に同定する。この際、異常タンパク質が形成されない細胞を対照とし、定量質量分析を行うことで非特異的吸着分子をできるだけ排除する。3同様の実験を培養細胞だけでなく、マウスを用いても行う。すなわち、異常タンパクを接種したマウスとそうでないマウスについて、発現、局在変化の解析を行う。29年度が最終年度であるため、記入しない。神経病理学今後、これらの実験系を利用して、タウやTDP-43のプリオン様伝播動物モデルの構築を試みる。特にTDP-43については成功例の報告がなく困難が予想されるが、単純な実験として、線維化した合成ペプチドを野生型、あるいは変異TDP-43などを発現する遺伝子改変マウスの脳に接種し、マウスの脳内に発現する正常TDP-43が異常型に変換するかどうかについて検討する。またαSについては蛍光色素などを用いてその可視化を試みる。
白血病治療における微小残存白血病の評価に関する研究

目的:Bリンパ性白血病の寛解期の微小残存白血病細胞を、免疫グロブリン重鎖遺伝子の超可変領域(CDR III)を特異的プローブに用いて検出することにより、治療効果の評価を行い、あわせて、この方法の臨床応用の可能性を検討する。対象および方法:Bリンパ性白血病10例。VHおよびJH領域に設定したプライマーでCDRIII領域をPCR法により増幅し単離。その塩基配列よりクローン特異的プローブまたはプライマーを合成して寛解期骨髄をPCR-サザンブロット解析または特異的PCR法で解析する。結果:10例中8例がCDRIII領域を保持し、その内6例で単離、同定した。6例中4例でプライマーを作成し、寛解期骨髄を検索した。症例1ではPCR-サザンブロット法、特異的PCR法とも経過中に陽性所見はなく、臨床経過と一致した。症例2では、寛解後6ケ月は陽性所見がみられたが再寛解導入療法以後消失し、治療効果を確認できた可能性がある。症例3でも、完全寛解を維持しているが、PCR-サザンブロット法の結果と一致していた。症例4では、臨床的に寛解を維持しているにも関わらず、PCR-サザンブロット法で持続的に残存陽性であった。この症例のDH領域は21塩基しかなく、点変異もないため、他と相同性の高い領域がそのままプローブになってfalse positiveが出現したと考えられた。再発行例がないため、再発前の微少な白血病細胞の増加を検討することはできなかった。結論:症例2のように強力な治療で再発が予防できた可能性をうかがわせる結果や、臨床経過と一致した結果などから本方法の有効性が認められるが、症例4で見られるようにCDRIII領域が特異性に乏しい場合もあることが明らかになった。また、最終結果を得るまでの実験の行程が長く、技術的にも習熟を要するため、日常検査として導入するのは困難であると考えられた。より簡便な検出法の開発が望まれる。1.免疫グロブリン重鎖遺伝子超可変領域(DH)の患者白血病細胞特異的塩基配列の決定当初の計画のとおり、Bリンパ系の白血病患者の初発時骨髄細胞よりDNAを抽出し、このうちの10例についてPCR(Polymerase Chain Reaction)法を用いてDH領域のDNAを増幅した。PCR産物のアガロースゲル電気泳動を行ったところ、10例中8例では単一のバンドが認められ、単クローン性のDNA増幅が確認された。しかし残る2例ではDNAが増幅されず、原因としてDH領域の再構成が起こっていないためと考えられた。次に、DNA増幅の得られたDNAのうち5例について、Dideoxy法を用いて患者白血病細胞特異的な塩基配列を決定した。このうちの4例について詳細な解析を行い、最も特異性の高い部分の塩基配列をもとに、サザンブロットハイブリダイゼーション用のプローブをデザインし、これを作成した。2.完全寛解中の骨髄における微小残存白血病細胞の同定プローブを作成した4例の患者について、寛解期骨髄よりDNAを抽出し、同様にPCRを行い、DH領域を増幅した。得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動し、ナイロンフィルターに移した後、先の作成したプローブを用いて、サザンブロットハイブリダイゼーションを行い、その結果を解析した。完全寛解以降、強化療法を継続するに従ってバンドは薄くなり、最終的に消失すると予想されたが、臨床経過や形態学的所見とは無関係に非特異的バンドが出現してしまった。

原因として、(1)PCRの設定条件による非特異的塩基配列の出現、(2)ハイブリダイゼーションの温度設定等による非特異的バンドの出現、(3)特異的プローブのデザイン不良による特異性の低下、等が考えられ、現在、これらの条件について再度検討中である。1.免疫グロブリン重鎖遺伝子超可変領域(DH)の患者白血病細胞特異的塩基配列の決定当初の計画のとおり、10例のBリンパ系白血病患者についてPCR(Polymerase Chain Reaction)法を用いてDH領域のDNAを増幅し、5例についてDideoxy法を用いて患者白血病細胞特異的な塩基配列を決定した。このうちの4例について詳細な解析を行い、最も特異性の高い部分の塩基配列をもとに、サザンブロットハイブリダイゼーション用のプローブをデザインし、これを作成した。2.完全寛解中の骨髄における微小残存白血病細胞の同定プローブを作成した4例の患者について、寛解期骨髄よりDNAを抽出し、同様にPCRを行い、DH領域を増幅した。得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動し、ナイロンフィルターに移した後、先に作成した患者白血病細胞特異的プローブを用いて、サザンブロットハイブリダイゼーションを行い、その結果を解析した。4例中2例では、初発時に強いバンドを認め、完全寛解以降はバンドは認められなかった。このことは白血病細胞と同一のDH領域の塩基配列をもった細胞が寛解期には消失していることを意味し、この所見は患者の臨床経過と一致していた。これは遺伝子レベルでの完全寛解を示していると考えられた。完全寛解の"質"、すなわち白血病細胞の残存する量については、現在コントロールDNAを用いた段階希釈法により検討しているところである。しかし残りの2例については、臨床経過や形態学的所見とは無関係に非特異的バンドが出現してしまった。原因として、【.encircled1.】PCRの設定条件による非特異的塩基配列の出現、【.encircled2.】ハイブリダイゼーションの温度設定等による非特異的バンドの出現、【.encircled3.】特異的プローブのデザイン不良による特異性の低下、等が考えられた。【.encircled1.】【.encircled2.】については条件設定をより厳密なものとし、再度検討を行ったが、やはり非特異的なバンドが出現してしまい、現在【.encircled3.】について検討中である。再度の早期発見に関しては、いまだ再発をきたした症例がないために検討に至っていない。
最適化問題を解くカオス的力学系の漸近測度の自動設計

非線形かつ多峰性の目的関数を最適化する新しい手法として,決定論的カオスによる大域的最適化手法が近年開発されている。単純なアルゴリズムで記述されるカオスによる最適化手法は,少ない計算量で優れた大域的最適性を実現する。ただし,汎用のアルゴリズムとして実用化するためには,様々の最適化問題を効率良く解くような漸近測度を持つカオスを設計する一般的手法を確立することが必要不可欠となる。このようなカオスの設計問題に対して,昨年度は学習則を新しく導入し、学習則によって最適化効率の高い漸近測度を有するカオスの自動設計が可能であることを示した。今年度は,カオスニューラルネットワークに基づく組み合わせ最適化問題の解法に学習則を拡張し,カオスニューラルネットワークにおいても学習が有効であることを確記した。さらに,学習則が,カオスニューラルネットワークの探索領域を徐々に局在化し,カオス的探索のダイナミクスを最適解に漸近収束させる「アニーリング」の機能を持つことを確認した。これは学習に基づくカオスの最適化手法が,非線形関数の最適化問題だけでなく,工学の諸問題に現れる組合せ最適化問題にも応用可能であることを意味しており、大きな研究成果と考えられる。なお,研究成果については国内の様々の研究会で研究発表を行なうことにより専門家の公正な判断を仰ぎ,開発手法の実用性を確認した。非線形かつ多峰性の目的関数を最適化する新しい手法として,決定論的カオスによる大域的最適化のアルゴリズムが開発されている。ただし,汎用のアルゴリズムとして実用化するためには,様々の非線形最適化問題を効率良く解くカオスの漸近測度の一般的設計手法の確立が不可欠となる。このようなカオスの自動設計問題に関して,今年度は,以下のような研究成果を得た。1.最適化問題を解くカオスの漸近測度を最適に設計する手法として,自動学習則を新しく導入した。学習則によって最適化効率の高い漸近測度を有するカオス的力学系の自動設計が可能であることを計算機実験を通して,一・二次元の問題について確認した。これはカオスによる大域的最適化手法が汎用のアルゴリズムとして広く実用化できる可能性を示唆しており,大きな研究成果と考えられる。なお,計算機実験に際して,補助金により購入した電子回路プロセッサを活用した。2. 1で導入した学習則は,カオスの探索領域を徐々に局在化し,カオス的探索のダイナミクスを最適解に漸近収束させる「アニーリング」の機能を持つことを確認した。これは,今年度得られた新しい知見であり,今後,カオス的アニーリングの有力な手法として学習則をさらに検討してゆく予定である。
単一パルスの複式検出法による部分放電劣化診断に関する研究

印加する高電圧の位相差と放電々荷分布の形状は絶縁劣化診断の一つのパラメータである。平成8年度においては印加電圧を位相的に20等分し、各位相角範囲における放電々荷分布と放電発光強度分布について解析を行った。そのうち、位相角領域Φ7(位相角40°)およびΦ17(位相角220°)で発生で発生する放電が最も放電々荷が大きく、トリ-の先端まで到達している。この領域の放電がトリ-の進展に最も寄与していると見られ、またこの領域は単位時間当り、電極を通して試料中に最もエネルギが注入されていることも理論的にも導びくことができた。平成9年度は単一パルスについて研究を進めた。放電々荷から見て、一発の放電として観測されていても、Φ7、Φ17以上の位相角領で発生する比較的大きな放電では何本かのトリ-に分岐して放電が発生することが確認された。この傾向は放電々荷が大きい場合に顕著に発生が見られ、放電々荷が小さい場合にはトリ-中にまで放電が達せず、ボイド放電に止まった。また印加電圧の傾きとここで定義した実効瞬時値の積と放電々荷の相関係数の急増する点の検出により、トリ-の発生の有無を診断できることも見出した。印加する交流高電圧の位相差と放電々荷分布の分布形状は絶縁劣化診断の一つのパラメータである。平成8年度の研究では印加電圧を20等分し、各位相角範囲における放電々荷分布と放電発光強度分布について解析を主に行なった。その結果、Φ7(60゚70゚)およびΦ17(330゚340゚)で発生する放電が最も放電々荷が大きく、トリ-先端まで達していることがわかった。Φ7およびΦ17の位相角領域は電極から試料に最も単位時間当り充電されるエネルギーが大きい期間であり、いわゆる印加電圧vとdv/dtの積が最大となる時間に相当することを明らかにした。本研究の目的である1発の放電と、これに伴う放電々荷と放電発光の対応は計測が可能となり、単一の放電パルスによって多数のトリ-のチャネルで同時に放電が起っていることも判明しつつある。これ以降の検討は次年度に行い、明瞭な結論が得られる目処はついたものと思われる。交流高電圧によるトリ-劣化プロセスとして、印加電圧の位相差によって、トリ-進展への寄与が異る。最も寄与の大きいのはφ7(位相角40°)とφ17(位相角240°)であることを前年度明らかにした。今年度はφ7φ9で発生する放電ではトリ-先端まで達している放電が多いこと。これがトリ-の進展に寄与していることが明らかになった。また一発の放電(単一パルス)であっても、複数のトリ-にトリ-が発生する場合も見られ、このような放電は放電々荷が大きい。φ_1φ_3の範囲では放電の発生は殆ど見られず、φ_4φ_6の位相範囲では放電はトリ-先端に達することは僅かで、その多くはボイド中で発生していて、トリ-の進展にはあまり寄与していないこと等を明らかにした。
エクソームを基盤とした統合的ゲノム解析による片頭痛の分子病態解明

片麻痺性片頭痛家系においてエクソーム解析を中心としたゲノム解析を行い、病因遺伝子の同定を目指した研究を行った。既知病因遺伝子変異を認めない、網膜色素変性症を伴う重症片麻痺性片頭痛の一家系において、複数発症者のエクソーム解析を行い、網膜における遺伝子発現に注目することで、3つの病原性変異候補が得られた。さらに、29例においてエクソーム解析を行い、2例に既知病因遺伝子の変異を認めた。病因遺伝子変異未同定の27例において、データベース未登録の非同義性塩基置換を述べ2473個認めた。このうち複数症例で共通する塩基置換は188個であった。今後病因遺伝子の探索を継続していく。H25年度は、検体の収集、既知遺伝子変異のスクリーニングなど、エクソーム解析を行うための基盤作りに集中した。まず、家族性片麻痺性片頭痛の家系収集を推進し、新たに5家系の追加家系を得た。それらに対して、DNAマイクロアレイを用いた病因遺伝子解析を施行し、一例においてCACNA1A p.Thr666Metの既知の変異を認めた。4例は変異未同定の家系であり、エクソーム解析の候補であると考えられた。一方、2011年に発作性運動原性ジストニア(paroxysmal kinesigenic dystonia: PKD)の病因遺伝子としてPRRT2が同定されたが、その後2012年に同遺伝子の変異により片麻痺性片頭痛も呈しうることが報告された。従って、本研究においても家族性及び孤発性片麻痺型片頭痛において直接塩基配列解析法によるPRRT2全エクソンの変異解析を追加した。その結果、孤発性片麻痺性片頭痛の一例において、c.649dupCの既知のヘテロ接合性挿入変異を認めた。この変異は、アジア人集団に多いことが報告されており、PKDや片麻痺性片頭痛など多彩な臨床像を呈することが報告されている。本解析結果は、孤発例においても変異が認められるという点において、重要な所見であると考えられた。これらの研究成果については、American Society of Human Genetics 63rdAnnual Meetingにおいてポスター発表を行った。一方で、エクソーム解析については、本年度は解析ファシリティにおいて多施設からの解析依頼が集中しており、十分な解析を行うだけのスループットを確保できなかった。従って、H26年度に集中的に解析を行う予定で、現在準備を進めている。平成26年度は、検体の収集、既知遺伝子変異のスクリーニングを行うともに、エクソーム解析の準備を進めた。本年度は新たに3家系を追加することができた。稀少疾患である片麻痺性片頭痛の家系収集は順調に進捗しているものと考えている。これらの家系において、既知遺伝子変異のスクリーニングを行った。これまでのところ明らかな変異は認めていない。一方、発熱を伴う意識障害が長期に持続し、急性期に頭部MRAで著明な血管拡張と、脳血流SPECT検査で片側性の著明な血流上昇を認める家族性片麻痺性片頭痛の家系を経験した。発症者は全例で網膜色素変性症を合併していた。てんかん発作を合併する症例も存在した。網膜色素変性症の合併からミトコンドリア病も考えられたが、ミトコンドリア遺伝子解析では明らかな変異を認めなかった。また、マイクロアレイによる家族性片麻痺性片頭痛の既知遺伝子のスクリーニングではいずれも変異を認めず、新規病因遺伝子の存在が強く疑われた。てんかん、片麻痺性片頭痛、網膜色素変性症を合併する特徴的な臨床像から、臨床的にも重要な家系例と考えられたため、まずこの家系に集中して解析を行うこととした。発端者及び家族に協力を得てゲノム検体を取得した。そして、発端者においてエクソーム解析を遂行した。現在データを取得しており、分析を進めている段階である。今後は、得られたエクソームデータから、中枢神経と網膜に発現している遺伝子を中心に、神経細胞の電気的活動を修飾しうる遺伝子に着目して、候補遺伝子を絞り込む。得られた遺伝子について、他の家系における解析も進めていく予定である。網膜色素変性症を伴い重篤な臨床症状を呈する家族性片麻痺性片頭痛の家系におけるエクソーム解析を行った。発端者において、データベースに登録されていない新規非同義性塩基配列置換は67個であった。内訳は、ミスセンス変異62個、ナンセンス変異1個、フレームシフト変異4個であった。さらに、26個の変異は他の既知の病因遺伝子に存在しており、残りの41遺伝子が病因遺伝子の候補として有力であると考えられた。現在非発症者の親の解析を進めている。さらに、研究期間内に29例の家族性片頭痛のエクソーム解析を行った。1例においてATP1A2の新規遺伝子変異を、1例においてSCN1Aの既知遺伝子変異を認めた。残り27例全体としてのべ2473個のアミノ酸置換を伴いデータベースに報告のないバリアントを認めた。このうち複数症例で共通するバリアントは188個であった。これらの遺伝子の中には、電位依存性カルシウムチャネルサブユニットやイオントランスポーターなど既知の片麻痺性片頭痛の病因遺伝子と機能的に関連している遺伝子や、他の疾患の病因遺伝子として報告されているものの、臨床的に片頭痛を合併することが報告されている遺伝子など、興味深い遺伝子が含まれていた。今後は前述の家系解析の結果も含め、病因遺伝子を探索していく。

既知病因遺伝子変異を認めない、網膜色素変性症を伴う重症片麻痺性片頭痛の一家系において、複数発症者のエクソーム解析を行い、網膜における遺伝子発現に注目することで、3つの病原性変異候補が得られた。さらに、29例においてエクソーム解析を行い、2例に既知病因遺伝子の変異を認めた。病因遺伝子変異未同定の27例において、データベース未登録の非同義性塩基置換を述べ2473個認めた。このうち複数症例で共通する塩基置換は188個であった。今後病因遺伝子の探索を継続していく。H26年度中に、エクソーム解析を開始しており、おおむね順調に進展している。特に、臨床的に非常に特徴的な家系に集中して解析を開始したことで、より効率的に新規病因遺伝子の同定に向けた研究が遂行できていると考えている。分子遺伝学今後は、エクソーム解析の結果から、病因遺伝子を絞り込む作業を進めていく。ヴァリアントデータベースの情報を活用し、新規の変異を絞り込む。遺伝子発現、遺伝子機能等に基づき、候補遺伝子を選定する。特に、既知の病因遺伝子と機能的に関連しうる遺伝子群を、パスウェイデータベースなどを用いて絞り込んでいく。これらの遺伝子に関して、類似の臨床像を呈する他の家系での解析も進める。また、エクソーム解析を追加することで、病因遺伝子の探索を進める。本年度において、さらなる片麻痺性片頭痛の家系収集に成功したこと、また新規に同定された病因遺伝子に関してスクリーニングを行い、変異同定を行ったことは、当初の予定を上回る成果であったと考えられる。一方で、エクソーム解析の進展については、やや遅れている印象もある。この点については、新規家系も含めて、H26年度に集中的に解析を行うことで、当初の目標を達成したい。平成26年度は、エクソーム解析を、臨床的に重要な家系に集中して行ったた。従って、一部の解析を次年度に持ち越して行う事になったため。収集した家系についてのエクソームデータを取得することが第一に必要である。解析ファシリティにおける解析スループットの向上と、In-house variant databaseのさらなる充実により、H26年度に計画課題の達成は十分可能なものと考えている。本年度に、追加家系についてエクソーム解析を行い、研究費を使用する。当初はH25年度にエクソーム解析を開始する予定であったが、追加家系の存在、解析施設のスループットなどの理由から、H26年度に集中的にエクソーム解析を行うこととなったため、H25年度の物品費の一部を繰り越してH26年度に使用することとした。H25,26年度の使用額を合わせて、エクソーム解析を集中的に行う。H26年度中に当初の目的としていたエクソーム解析を終了する予定である。
東洋の健康体操に見られる姿勢とその変化による生体反応の解析

本申請では,皮膚圧迫をともなう姿勢の変化による生体反応の誘発とその解析を目的としていた.そのために,まずどのような姿勢が人間にとって最もリラックスした姿勢か,緊張した姿勢か,あるいは少ない酸素でも耐え得るのかを検討する方向で研究を進めてきた.そのことは短期的には,皮膚圧迫反射(Nakamura al.,1990)の概念を導入することによって,身体各部の圧迫刺激が体位変化を誘起すると同時に,中枢神経機能の促進・抑制を誘発可能とし,この研究結果の解析からMinimum Energy(体温の第二次化学調節)での生存域を規定できる事も期待されるという狙いがあったし,また長期的には,これらの研究から,もしセルフコントロールにより人間の体温調節が可能であったり,あるいは基礎代謝量を意図的に低下させることが可能であるのならば,例えば急激な温度変化にも短期間で順化できる,冷房病などの予防になる,遭難時の延命に結びつくなどといった効果が期待できるものと考えられていた.具体的には,「東洋」という地域的枠組みの中から,まずネパールの女性を対象に,その体格を調査し(発表結果裏面参照),同時に24時間の生活時間調査を実施した.そうしてその中からどのような姿勢が,日常生活の中に多く見られるかを検討した(発表結果裏面参照).しかし,フィールドワーク(実地調査)においては,予測できない事態が多発し(発表結果裏面参照),生活の中での姿勢パターンは見いだせたものの,期待すべき生体反応の解析データを収集するには至らなかった.今後はフィールドワークを重視しつつ,本申請課題について,より深い研究へと発展させていきたい.本申請では,皮膚圧迫をともなう姿勢の変化による生体反応の誘発とその解析を目的としていた.そのために,まずどのような姿勢が人間にとって最もリラックスした姿勢か,緊張した姿勢か,あるいは少ない酸素でも耐え得るのかを検討する方向で研究を進めてきた.そのことは短期的には,皮膚圧迫反射(Nakamura al.,1990)の概念を導入することによって,身体各部の圧迫刺激が体位変化を誘起すると同時に,中枢神経機能の促進・抑制を誘発可能とし,この研究結果の解析からMinimum Energy(体温の第二次化学調節)での生存域を規定できる事も期待されるという狙いがあったし,また長期的には,これらの研究から,もしセルフコントロールにより人間の体温調節が可能であったり,あるいは基礎代謝量を意図的に低下させることが可能であるのならば,例えば急激な温度変化にも短期間で順化できる,冷房病などの予防になる,遭難時の延命に結びつくなどといった効果が期待できるものと考えられていた.具体的には,「東洋」という地域的枠組みの中から,まずネパールの女性を対象に,その体格を調査し(発表結果裏面参照),同時に24時間の生活時間調査を実施した.そうしてその中からどのような姿勢が,日常生活の中に多く見られるかを検討した(発表結果裏面参照).しかし,フィールドワーク(実地調査)においては,予測できない事態が多発し(発表結果裏面参照),生活の中での姿勢パターンは見いだせたものの,期待すべき生体反応の解析データを収集するには至らなかった.今後はフィールドワークを重視しつつ,本申請課題について,より深い研究へと発展させていきたい.
疎水化多糖ナノゲルのイムノトランスポーター機能の機構解析と新規がん治療法への展開

疎水化多糖が水溶液中で形成するナノゲル(50 nm)の内部には、ペプチドや蛋白等を包埋することができる。本研究では、がんペプチド抗原をナノゲル中に包埋し、がんワクチンとしてマウスに皮下投与したときのナノゲルのデリバリーシステムとしての機能を検討した。その結果、ナノゲルがペプチド抗原を近傍リンパ節内に細胞非依存的に輸送すること、ナノゲルの粒子径や表面電荷が輸送に大きな影響を及ぼすこと、輸送先は抗原提示活性の高い特定のマクロファージであることを見出した。このナノゲル応用リンパ節マクロファージ指向型がんワクチンは、従来型のがんワクチンよりも格段に優れた免疫誘導能力と抗がん効果を示した。これまでに疎水化多糖ナノゲルが細胞非依存性輸送により物質をリンパ節内に輸送すること、輸送先は抗原提示活性の高い特定のマクロファージであることを見出した。本年度は、この知見に基づく新規がん治療法の創製を試みた。具体的には腫瘍所属リンパ節内のマクロファージに活性化物質、例えばCpGオリゴヌクレオチド(CpG ODN)等のToll様受容体のリガンドなどを選択的に送達することを目的とし、疎水化多糖ナノゲルにCpGオリゴヌクレオチドを包埋する方法を検討した。疎水化多糖ナノゲルに包埋される物質は、ある程度の疎水性を有する必要がある。CpG ODNは疎水性が低いため、コレステロール基などで修飾することで疎水性を付与することとした。これを疎水化多糖ナノゲルと混合し複合体化反応を行った後に、マウスに皮下投与して従属リンパ節内のマクロファージの活性化を評価した。その結果、疎水化多糖ナノゲルと複合体化したか否かに関わらず、CpG ODNをコレステロール基修飾するだけで、マクロファージ活性化能が劇的に向上した。原因として、疎水性を付与したCpGオリゴヌクレオチドが両親媒性となり、ミセル形成により自発的にナノ粒子化した可能性があると考えた。そこで現在、ミセル形成防止のために疎水性を抑えた官能基をCpG ODNに付与する試みを継続している。一方で、疎水化多糖ナノゲルがリンパ節内マクロファージ選択的に物質輸送することを利用し、疎水性多糖ナノゲルを用いたリンパ節内マクロファージ指向性がんワクチンを設計し、従来の樹状細胞依存性がんワクチンと性能比較した。その結果、Toll様受容体リガンドをアジュバントとして併用すると、疎水性多糖ナノゲルがんワクチンは従来型ワクチンより格段に優れた免疫誘導能力と抗がん効果を示した。今後は、この疎水化多糖ナノゲルを用いた高性能がんワクチンの臨床応用が期待される。デリバリーシステム「疎水化多糖ナノゲル」がどのようにリンパ節選択的に物質を輸送するのか、マウスを用いたin vivo系で解析した。輸送が細胞依存性か非依存性かを知るため、2種類の蛍光標識ペプチドを用意し、それぞれの疎水化多糖ナノゲル複合体を離れた部位、ただし従属リンパ節は同じとなる部位に皮下投与した。この系では、細胞依存性に輸送される物質は従属リンパ節内で異なる抗原提示細胞に含まれ、細胞非依存性に輸送される物質は同じ抗原提示細胞に含まれる形で検出される。結果として、疎水化多糖ナノゲル・ペプチド複合体の場合は後者のケースが認められ、細胞非依存性輸送が関わることが明らかになった。細胞非依存性輸送を妨げるような電荷や粒子径の疎水化多糖ナノゲルでは、リンパ節への輸送能力が低下した。疎水化多糖ナノゲルがペプチドを送達する標的細胞を同様の手法で調べたところ、従属リンパ節内のマクロファージに効率良く取り込まれることを見出した。マクロファージが疎水化多糖ナノゲルを用いるワクチンでどのような働きを担っているかを知るため、ワクチン投与マウスの従属リンパ節からマクロファージと樹状細胞を回収し抗原提示活性を評価したところ、マクロファージだけに活性が認められた。また、薬剤投与によりマクロファージを除去したマウスでは、ワクチン抗原に特異的な免疫誘導が顕著に減弱した。以上の結果より、(1)疎水化多糖ナノゲルは細胞非依存性輸送により物質をリンパ節内に送達すること、(2)標的細胞は樹状細胞ではなくマクロファージであること、(3)ワクチンにおいてマクロファージは有用な抗原提示細胞となり得る可能性を明らかにした。交付申請書に記載した方法とは異なるが、デリバリーシステム「疎水化多糖ナノゲル」の輸送機構を計画通りに明らかにすることに成功した。さらに、輸送の標的細胞が予想していた樹状細胞と異なり、マクロファージであることを新たに見出した。疎水化多糖ナノゲルを用いたワクチンの薬理効果にマクロファージが必要であることなど、免疫学・ワクチン学的に新しい知見を見出した。

以上の情報は、平成25年度に予定している「疎水化多糖ナノゲル」を用いた新しいがん治療戦略の設計に非常に有用である。交付申請書に記載の計画の通り、平成25年度は前年度に得た知見を基に、リンパ節指向性デリバリーシステム「疎水化多糖ナノゲル」を応用した腫瘍局所リンパ節環境の人為的制御によるがん治療技術の創出を進める。腫瘍微小環境や腫瘍従属リンパ節中には、がんに対する免疫応答を抑制する骨髄系の免疫細胞が存在し、一部の低分子化合物や免疫刺激剤(TLRアジュバントなど)が、抑制性細胞の働きを抑えられることが知られている。これら薬剤と疎水化多糖ナノゲルの複合体の作製を検討したのち、完成した薬剤を腫瘍付近に投与し、腫瘍周辺の免疫的環境の変化と抗がん効果の評価を行う。物品費:40万円旅費:30万円人件費・謝金:45万円その他:5万円物品費は、主に薬剤や免疫学試薬の購入に充てる。旅費は成果発表のための学会参加に用いる。その他として、論文投稿費用を計上した。