hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
火山直下のマグマの状態と将来を知る方法の提案：粘弾性測定と浸透流・破砕の実験

地下のマグマが現在どのような状態にあるかを知り、そのマグマが今後どのような活動をするのか予測することは学術的にも防災上も重要な課題である。本研究では溶融マグマの粘弾性測定を行い、地下にあるマグマが地震波観測でどのように観測されるか推測する為に必要な物性値を明らかにする。また、マグマとマグマ中の火山ガスの分離効率を明らかにする浸透率測定、および、噴火の様式を左右する破砕実験を行い、マグマが今後どのような活動をするのか予測する為に必要な素過程を明らかにする。本研究は、地震波観測から地下のマグマの状態を推定したり、地下のマグマが今後どのような噴火を起こし得るのかを推定するために必要な基礎データを室内実験により取得する。室内実験では、気泡を含むマグマの弾性定数と減衰率、それに高温・高圧下のマグマを用いた浸透率と破砕現象などを調べることを予定している。本研究の学術的価値は、熔融マグマの粘弾性測定を行い、気泡を含むマグマの弾性定数と減衰をマグマ中の気泡量と温度の関数として整理することで、地震波観測から地下のマグマの状態を推定する方法を提案する点にある。特にこの実験では、1200度まで高温に加熱したマグマの粘弾性と1000度までの弾性的性質が明らかになることが期待される。
LTBP-4タンパクフラグメントを用いた弾性線維含有基質再生の基礎的研究

平成29年度の研究において弾性線維の形成促進を確認できた、latent TGF-βbinding protein 4 (LTBP-4)リコンビナント蛋白を複合化したコラーゲンスポンジについて、さらに検討をすすめた。平成29年度の検討の結果を受けて、コラーゲンスポンジに複合化するLTBP-4の濃度をそれぞれ0、1、5μg/cm2としてコラーゲンスポンジに含侵し、再凍結乾燥する事により基材を作成した。この基材においてヒト皮膚由来の線維芽細胞(passages 5-8)の培養を3週間行い、免疫組織学的染色にて弾性線維の形成を確認した。3シリーズ終了した時点で結果を検討したところ、複合化スポンジ作成後、一定期間を超過すると弾性線維の形成促進作用が失われる可能性が示唆された。その後、LTBP-4複合化基材を作成後、早期に使用するよう改善することにより弾性線維の形成促進作用が確認できた。LTBP-4複合化基材においては1、5μ/cm2いずれにおいても、0μg/cm2の基材と比較して1.5-2倍の厚みで弾性線維の形成を認めた。LTBP-4複合化基材を作成後、弾性線維の形成促進作用が失活するまでの期間については、さらに検討を要する。上記にて形成された弾性線維を三次元的に評価する方法として2光子顕微鏡を用いた検討を行った。これにより弾性線維の描出は可能であったが、より明瞭な評価のためにはさらなる検討が必要である。2年間を通じ、弾性線維可能なLTBP-4のフラグメントタンパクの同定には至らなかったが、上記の新規基材の開発を行い、弾性線維再生の実用化により近付いた。これまでの研究において弾性線維の再生促進作用が確認されている全長のlatent TGF-βbinding protein 4(以下LTBP-4)リコンビナントタンパクをポジティブコントロールとしてLTBP-4フラグメントタンパクの弾性線維再生促進作用について実験を行った。部分フラグメントの発現ベクターを293T細胞に導入してLTBP-4のN末+C末のフラグメントタンパクを精製した。インフォームドコンセントを行った上で同意を得て採取したヒト皮膚由来の線維芽細胞を平面培養する培地に全長のLTBP-4リコンビナントタンパクを添加する郡と、N末+C末フラグメントタンパクを添加した郡およびタンパクを添加しない郡に分け、2週間培養後に免疫組織学的染色を行い、弾性線維の形成状況を確認した。N末+C末タンパクフラグメントについては、まず凍結保存していたものを用いて検討した結果、弾性線維再生促進作用が認められなかったため、凍結保存しない精製直後のタンパクフラグメントについても検討したが、弾性線維再生促進作用は認められなかった。この検討と並行して、LTBP-4リコンビナントタンパクを複合化したコラーゲンスポンジにおける弾性線維再生促進作用についても検討を行った。我々が報告した線維芽細胞の3次元培養によって弾性線維の形成が可能なコラーゲンスポンジにリコンビナントLTBP-4を含浸して再凍結乾燥してLTBP-4複合化基材を作成し、免疫組織学的染色にて基材にLTBP-4が局在していることを確認した。また、LTBP-4複合化基材において線維芽細胞を3週間培養後に免疫組織学的染色を行った結果、LBTP-4を複合化しない基材と比較して弾性線維の再生が促進されることを確認した。LTBP-4タンパクフラグメントを精製する方法は確立された。弾性線維再生促進作用をもつLTBP-4タンパクフラグメントの型については引き続き検討を要する。線維芽細胞の3次元培養の手技も確立しており、LTBP-4複合化基材は弾性線維再生促進作用が確認され、よい結果を得ている。弾性線維再生促進作用を有するLTBP-4タンパクフラグメントの型の検討を行う。

本年度の研究によりN末+C末のみでは弾性線維再生促進作用を有さないことが判明したため、それ以外の部位を含む異なる長さのタンパクフラグメントによる検討を行う。LTBP-4複合化基材については、複合化するLTBP-4の濃度の検討や保存期間、保存方法による弾性線維活性の変化について検討する。また、in vivoにおける作用についても検討を行う。細胞組織培養、細胞生物・生化学試薬等は、培地、添加剤、培養容器・器具については当初見積りしていたよりも使用量が少なかったが、次年度にもフラグメントタンパクの型の検討等を行う必要がある。また、上記の検討がすすめば本年度行えなかったReal-time PCRなどを次年度に行う必要があり、これらのことに使用していく計画である。
新規昆虫由来機能性多糖の魚類免疫系への分子作用機構の解明と実用化への展開

1.シルクロースの魚類免疫系への分子作用メカニズムの解明:シルクロースを経口投与したメダカ(Oryzias latipes)に、エドワジェラ症の原因菌であるEdwardsiella tardaを強制感染し、生残率を観察した。その結果、シルクロースの経口投与により、メダカの生残率が有意に向上し、メダカにおいてもシルクロースは耐病性付与効果があることが明らかとなった。そこで、メダカにシルクロースを経口投与し、腸、肝臓、皮膚での遺伝子の発現変化を次世代シーケンサーによる遺伝子発現差解析により調べた。現在、得られたデータの解析を行なっている。2.シルクロースの産生メカニズムの解析と効率的な生産・加工方法の開発:シルクロースに対するポリクローナル抗体を作製した。3.シルクロースの養殖対象魚への作用の解明:世界規模の養殖対象エビであるバナメイエビ(Litopenae vannamei)にシルクロースを経口投与し、ビブリオ菌(Vibrio penaecida)に対する耐病性が付与されるか否かを調べた。その結果、シルクロースの経口投与により、ビブリオ菌に対する抗病性が著しく向上した。4.シルクロースの養殖漁場での実証:愛媛県宇和島市須下の養殖漁場(西川報徳水産)で、養殖シマアジ(Psudocaranx dentex)を実験材料にシルクロース0.1%添加飼料の給餌試験を行なった。同漁場は、体表寄生虫カリグス症の発生漁場で、以前より養殖魚への害が認められていた。試験の結果、シルクロース添加飼料給餌群のカリグス(Caligus longipedis)寄生数が対照群に比較して有意に減少するとともに、生残数も著しく向上した。さらに魚体の成長も著しく向上した。養殖漁場でのシマアジを用いた試験において、当初の予想をはるかに上回る効果が認められた。当初の計画通り、研究を推進する。
都市広域化の環境影響とその管理

本研究は都市広域化のもたらす環境影響を、都市圏全域という巨視的な観点から、都市の人工的な小空間における生活環境という微視的な立場まで多面的に調査し、そこで起こりつつある現象を解明し、それへの対策を見いだし、提言へとつなげようとするものである。全体研究は、(1)広域都市圏の環境計画、(2)都市の広域化に伴う環境変化、(3)都市社会基盤システムのもたらす環境影響とその改善、(4)都市人工空間の環境評価、という4つの部門から構成される。本研究会(基礎班)は、このような都市環境に関する総合的な研究を十分な成果をうるように導くために組織され、研究内容の調整、研究成果報告会の開催研究成果のまとめ等を主な業務としている。本年度においては全体会合を計6回開催し、研究計画の調整と確立に努めるとともに、以下のような活動を通じてこのような大組織かつ学際的な共同研究の円滑な遂行とその社会的環元を図った。1)昨年度と同様に本研究会独自のシンポジウムを開催し、環境問題研究者や自治体・民間企業の実務者との議論を積極的に行い、研究の相互理解と研究計画の確認、調整に努めた。共同研究においてはその各段階において各自の研究を整理、報告し、研究内容や問題点に関する情報鋼管を行っておくことが不可欠であり、同様のシンポジウムを最終年度においても開催する予定である。2)本研究会においては、各研究者のこれまでの研究実績や本研究での成果を社会的な教育啓蒙にも役立てることを目的として、都市環境問題やそれへの対策について体系的に論じた書物の出版を計画しており、今年度1年を通じて執筆内容の詳細な打ち合せと調整を行ってきた。現在までに、全ての執筆原稿の読み合わせ、内容調整、原稿の加筆、修正を完了し、次年度当初には出版の予定である。
沿岸海底湧水機構の海洋環境への影響評価及び評価システムの構築

三年目の今年度は,研究のまとめとして,過去2年間で新たに発見された問題を解決しつつ,近年開始した東アジア沿岸域海底湧水研究の結果と比較し,地球規模での議論に発展させ,海底湧水機構の評価システム構築を目的としている。その成果を下記に要約する。a).富山湾モデルの確立:湾内へ流出する海底湧水は標高8001200mの山間部に起源を置き,1020年をかけて海底から湧き出ている;その湧出量は世界的にも屈指であり,河川水の25-60%にも及び,これによる溶存態リンと窒素の供給量は河川水のそれに匹敵し,沿岸海域の基礎生産量に大きく貢献していることを実証した。また,日本地球化学会誌「地球化学」に沿岸海底湧水の科学特集号を出版すると同時に,一般への教育用番組作成にも協力している(NHKスペシャル『神秘の海富山湾海の中までアルプスがつづく』;『NHKサイエンスZERO不思議の海富山湾』)。b).富山湾モデルを利用し,利尻島・大槌湾・駿河湾において海底湧水による栄養塩供給の実態を明らかにし,海外においても台湾初の海底湧水の発見と流量計測に成功している。また,陸棚面積が世界トップレベルの東シナ海において,沿岸海底湧水の探査と量的評価に成功した。c).パターン化:各々湧出海域における地質条件と湧出メカニズムによって,3種類:(1)扇状地型(2)火山島型(3)珊瑚礁型に分けられ,湧出量及び湧出メカニズム評価システムの骨組みが整った。d).2005年より始動し世界20ヵ国以上が参加しているSCOR大型国際海洋調査研究計画GEOTRACESに立案から携わり,沿岸海底湧水を重要な研究課題の一つに取り上げることに多いに貢献した。現在運営委員会の委員としてアジアGEOTRACESの推進に力を入れ,平成20年春に出版予定の日本海洋学会英文誌JOにGEOTRACES特集号のゲストエデイターとして総括をしつつ,特に沿岸海底湧水のまとめ(日本・韓国・台湾等からの関係報文は五つに上る)など,その地球規模データベースの構築と評価システム確立の第一歩を踏み出した。本研究のゴールは,これまで富山湾をモデルに行われてきたケーススタディーの研究成果を踏まえ,日本周辺及び近年スタートした極東域沿岸海底地下水系研究の結果と比較し,沿岸海底地下水機構の海洋環境への影響評価を行い,最終的に地球規模での議論・応用が可能な評価システムの構築を目的としている。今年度は具体的に,a)富山湾東部沿岸域における海底湧水の湧出と流動のメカニズムを明らかにする;b)富山湾海底湧水の流出量を正確に見積もり,それによる淡水・栄養塩の供給状況及び沿岸海洋への影響を把握する;c)人為起源物質を視野に入れ海底湧水が藻場を代表する海洋生態系に与える影響を評価する,の3点を目標として研究を行った。まず,a)海底堆積物表層の温度と海底湧水湧出量に相関があることに着目し,堆積物温度から湧出量を求める方法を検討して,広域での海底湧水の湧出量(32m×32m四方の観測域における総湧出量は3.7×10^5L/day)及びその湧出量の分布や季節変化を明らかにした。次に,b)観測船を用いて夏季に海洋調査が行われ,富山湾の水塊構造モデルから,湾内浅層水へ流出される海底湧水は,最大で河川水の25%にも及ぶことが明らかになった。また,それによる溶存態リンの供給量は河川水の55%,溶存態窒素は1.3倍であり,その供給は水深180mまで及ぶことが分かった。更に,c)人為起源物質を視野に入れた海底湧水の沿岸生態系への影響評価を行うため,河川水・地下水・海底湧水及び海藻の窒素同位体比や,クロロフィルaと植物プランクトン計数を行った。その結果,夏季の成層化が進む時期において,沿岸亜表層海水中の栄養塩が枯渇している中,湧水域では海底湧水により絶えず栄養塩が供給され,海藻や植物プランクトンの増殖を促して,藻場の維持等沿岸の生物生産に貢献していることが明らかになった。その他に国内では利尻島において,初めて海底湧水による栄養塩の供給を明らかにし,国外では台湾周辺において初めて海底湧水の発見及び流量計測に成功した。これらの結果をまとめ,日本地球化学会の学会誌「地球化学」の特集号出版が予定されている。本研究は,これまで富山湾をモデルに行われてきたケーススタディーの研究成果を踏まえ,日本周辺及び近年スタートした極東域における沿岸海底湧水系研究の結果と比較し,沿岸海底地下水機構の海洋環境への影響評価を行い,最終的に地球規模での議論・応用が可能な評価システムの構築を目的としている。今年度は具体的に,a)昨年度開発した堆積物温度から海底湧水湧出量を求める方法に基づき,広域連続堆積物温度測定計を開発し,その実地検討を行った。b)昨年度実施された利尻島や台湾周辺での海底湧水調査に加え,大槌湾やむつ湾における海底湧水の探査を行い,海底湧水湧出量及び湧出メカニズムの地域的差異を明らかにした。各々湧出海域における地質条件及び湧出メカニズムによって,これまでに調査してきた沿岸湧水は以下の3種類:(1)扇状地型,(2)火山島型,及び(3)珊瑚礁型に分けられた。c)陸棚面積が世界トップレベルの東シナ海において,沿岸海底湧水の探査に成功した。

東シナ海は,アジア大陸から北太平洋へ流入する最大の河川-長江が注ぎ,水塊構造が大変複雑である。表層水塊(密度躍層以浅)には,外洋系表層水及び河川水(ほとんどが長江水);陸棚水塊(密度躍層以深)には台湾海峡からの流入水,外洋-陸棚間の交換水,黄海水,対馬海峡から日本海へ流出水及び海底湧水等,陸棚縁辺部より以深の水塊は黒潮水と北太平洋中層水からなっている。また,水深40-100mに広域的に低塩・低溶存酸素水塊の存在が分かっており,今年度は,海水の酸素同位体比,pH,栄養塩濃度,特に海水/間隙水の希土類元素組成等の化学トレーサーによって,この水塊は,長江の旧河口域付近から染み出した海底からの湧出水(陸起源地下水と海水の混合)と推測できた。これらの結果を,日本地球化学学会の学会誌「地球化学」の特集号として,7編の報文及び1編の速報からなる「沿岸海底湧水の科学」を出版した。三年目の今年度は,研究のまとめとして,過去2年間で新たに発見された問題を解決しつつ,近年開始した東アジア沿岸域海底湧水研究の結果と比較し,地球規模での議論に発展させ,海底湧水機構の評価システム構築を目的としている。その成果を下記に要約する。a).富山湾モデルの確立:湾内へ流出する海底湧水は標高8001200mの山間部に起源を置き,1020年をかけて海底から湧き出ている;その湧出量は世界的にも屈指であり,河川水の25-60%にも及び,これによる溶存態リンと窒素の供給量は河川水のそれに匹敵し,沿岸海域の基礎生産量に大きく貢献していることを実証した。また,日本地球化学会誌「地球化学」に沿岸海底湧水の科学特集号を出版すると同時に,一般への教育用番組作成にも協力している(NHKスペシャル『神秘の海富山湾海の中までアルプスがつづく』;『NHKサイエンスZERO不思議の海富山湾』)。b).富山湾モデルを利用し,利尻島・大槌湾・駿河湾において海底湧水による栄養塩供給の実態を明らかにし,海外においても台湾初の海底湧水の発見と流量計測に成功している。また,陸棚面積が世界トップレベルの東シナ海において,沿岸海底湧水の探査と量的評価に成功した。c).パターン化:各々湧出海域における地質条件と湧出メカニズムによって,3種類:(1)扇状地型(2)火山島型(3)珊瑚礁型に分けられ,湧出量及び湧出メカニズム評価システムの骨組みが整った。d).2005年より始動し世界20ヵ国以上が参加しているSCOR大型国際海洋調査研究計画GEOTRACESに立案から携わり,沿岸海底湧水を重要な研究課題の一つに取り上げることに多いに貢献した。現在運営委員会の委員としてアジアGEOTRACESの推進に力を入れ,平成20年春に出版予定の日本海洋学会英文誌JOにGEOTRACES特集号のゲストエデイターとして総括をしつつ,特に沿岸海底湧水のまとめ(日本・韓国・台湾等からの関係報文は五つに上る)など,その地球規模データベースの構築と評価システム確立の第一歩を踏み出した。
借上げ型公共賃貸住宅を軸とした高齢者の小規模集住方式に関する研究

(1)高齢者世帯の借家入居とその居住実態、問題点を把握するために、住宅統計調査、高齢者生活調査の独自集計を行い、高齢者世帯の住宅ニーズについての統計解析を実施した。これによると、京都の都心部および郊外の局所的地域での高齢者集住傾向が著しいことが明らかになった。次に、福祉行政担当者および住宅行政担当者へのヒアリング調査によって、これら地域での高齢者の住宅改善事業が着手されているが、ストックの老朽化等、相対的に住宅の低質化が著しく、これを補うための借り上げ型公共賃貸住宅の必要性が浮彫りになった。(2)次に、借り上げ公共賃貸住宅制度の適用について、京都市内における供給者の可能性を検討した。例えば、個別建て替え時のワンルームマンション等の質的向上、戦前長屋住宅の共同建て替え、木造賃貸アパートの建て替え、再開発事業の保留床への参入、高齢者福祉施設空間への併設、学校空き施設など、適切な条件での空間確保が必要となるが、京都市住宅供給公社への問い合わせを分析すると、現在、土地所有者の借り上げ公共賃貸住宅事業への参画要求は都心部およびその周辺部で旺盛であることが明らかになった。(3)借り上げ公共賃貸住宅の運用方式を構想するために、地域社会で受けとめと福祉拠点としての位置づけ、地主・家主の協力体制の在り方、入居条件とケア方式の検討、借り上げ公共賃貸住宅を核とする具体的なコミュニテイ福祉の活性化プランを、都心部の袋路再生事業を想定して作成した。
牛乳中の過酸化水素産生物質の同定および乳房炎との関係

2009年、牛乳中に存在し、自己分解で過酸化水素を発生する低分子物質を発見したことを明らかにした。従来から牛乳中には過酸化水素分解酵素(ラクトパーオキシダゼ)とサイオシアネートの存在が知られ、過酸化水素が存在すると強力な抗菌機構が生まれる(ラクトパーオキシダゼ/過酸化水素/サイオシアネート抗菌システム)。今回の発見は過酸化水素の供給があることになり、乳房炎発症を低めると考えられた。しかしながら程度の実態は不明で、証明するには多くの乳牛で調べる必要があった。本年度(1年目)、230頭の乳牛から920検体の分房乳を採取し、過酸化水素水発生能と電気伝導度の違いによる異常性の関係を調べた。その結果は、「過酸化水素産生能の低い乳牛から高い割合で異常乳が出現する」ことを明らかに出来た。前年に報告した「乳房炎は過酸化水素産生能の低い乳牛に多い」とした結論と一致した。両者の結果から「過酸化水素産生能は乳房炎抵抗性と関係する」と断定でき、研究上と産業上で貢献できる大きな前進が見られた。さらに内因性物質であることから副作用は考えられず、過酸化水素産生物質は乳房炎治療薬として極めて有用と考えられた。申請書に記載した目的、過酸化水素産生物質の同定と構造決定が大きな意義を持つことになった。そのため生成を開始した。最初にゲルろ過で粗精製を行い、次にイオン交換クロマトグラフで精製した。ほぼ単一な状態にしたが、本物質は酸素存在下で分解することで、その後の精製は困難を極めた。
モバイルヘルス技術を用いたメニエール病の時空間的病態解析

本研究はメニエール病における前庭機能、蝸牛機能の時空間的変化を詳細に解析することを目的としている。前庭機能評価には眼鏡型の眼電位計であるJINS MEMEを携帯型ENGとして使用し、蝸牛機能評価には聴力検査アプリを搭載したタブレット端末と聴力検査用のヘッドホンを使用した。平成30年度は、埼玉医科大学病院耳鼻咽喉科、神経耳科に通院中のメニエール病患者に、JINS MEME、メニエール病用アプリを搭載し眼電位を記録・解析するためのノートPC、聴力検査アプリを搭載したタブレット端末、聴力検査用のヘッドホンを実際に貸し出し、前庭機能、蝸牛機能の記録・評価を実際に行った。また、健常者にJINS MEMEを装着した状態でカロリックテストを行い、ENGで得られる波形とJINS MEMEで得られる波形の比較を行った。平成29年度の研究で、JINS MEMEで得られる眼電位は、電極が顔面の皮脂や眼輪筋の運動により容易に影響を受けアーチファクトを生じることが判明していたため、患者に機器を貸し出す際は、機器の操作と共に計測前の皮脂除去などの前処置の指導も行った。平成30年度の貸し出し期間中は、患者はめまい発作を生じることはなかった。従って、JINS MEMEでの眼電位の計測は1日に2回程度施行されていたが、めまい発作を示唆する波形の記録は得られなかった。しかし、健常者に施行したカロリックテストのJINS MEMEとENGの同時計測では、冷水刺激で生じた眼振はJINS MEMEでも確認は可能であり、眼振の定性的な評価は可能であると考えられた。しかし、ENGで得られるような緩徐相速度などの定量的な評価は困難であった。蝸牛機能に関しては、聴力検査アプリで計測した結果と、耳鼻咽喉科外来で施行した純音聴力検査での結果はある程度の一致がみられ、変動する聴力を自宅で評価することは可能であると考えられた。本研究の目的は、時空間的変化に富むメニエール病の病態を、詳細に解析することである。そのためには、患者自身が前庭・蝸牛の両機能を測定・記録することが望ましい。前庭機能の評価のため、耳鼻咽喉科で行われる検査としてENG(眼振電図)があるが、本研究では、眼鏡型の眼電位計であるJINS MEMEを携帯型ENGとして活用することが目的の一つである。平成28年度は、本研究の中心となるJINS MEMEACADEMIC PACKを購入し、さらにJINS MEMEとENGの同時測定を行い、データ採取を行った。また蝸牛機能の評価には、携帯性に優れたタブレット端末にe-audiologia社が公開しているandoroid用アプリ「Hearing Test」と遮音性に優れたヘッドホンを組み合わせることによって、自宅でいつでも聴力を測定できるような環境をつくりだした。今後、据え置き型の聴力検査圭との比較を行い、蝸牛機能の評価もあわせて行う予定である。さらに、JINS MEMEで得られる前庭機能のデータと、Hearing Testで得られる蝸牛機能のデータの統合・管理が可能なメニエール病用アプリの開発中であり、また,前庭系の三次元評価が可能で携帯性に優れた新型VNGの開発、作成も行っている。JINS MEMEとENG(眼振電図)の同時測定を行い、データ採取を行い、JINS MEMEで得られた眼位の波形の解析を行った。蝸牛機能、前庭機能のいずれも障害されるメニエール病の病態把握のため、JINS MEMEで得られる前庭機能のデータと、Hearing Testで得られる蝸牛機能のデータを統合し管理が可能なメニエール病用アプリの開発を行った。新型の携帯型VNGの開発、作成も行った本研究はメニエール病における前庭機能、蝸牛機能、自覚症状の時空間的変化を詳細に解析することを目的としている。平成29年度は最も構築が難しい前庭機能評価に関する研究を行った。前庭機能評価は、眼鏡型の眼電位計であるJINS MEMEを携帯型ENGとして用いることとした。JINS MEMEで得られる眼電位を、従来のENG (電気眼振図)の波形に近づけるため、JINS MEMEで得られる眼電位の解析、再構築を試みた。眼電位の解析のため、メニエール病用アプリを作成した。JINS MEMEで得られる波形を解析した結果、電極が顔面の皮脂や眼輪筋の運動により容易に影響を受け、アーチファクトが生じやすいことが分かった。従って、計測前に顔面の皮脂を拭き取り、計測時にも自発的な眼の運動は控えることが必要であった。それでも計測時のアーチファクトは完全に除去することが難しいため、現時点ではリアルタイムでの解析は困難であるが、記録後のオフラインでの波形の解析をすることにより、一定の精度での眼電位を得ることができた。また、JINS MEME本体の性質を考慮すると、JINS MEMEの眼電位波形をENGの波形と同様なものに再構築することは困難であると判断した。そのため、JINS MEMEで得られる眼電位の波形を病態に応じて解釈することとした。以上の作業に時間を要したため、平成29年度はメニエール病患者への機器の貸し出し、データ採取は行わず、平成30年度の課題とした。平成29年度は、JINS MEMEから得られる眼電位の解析、またその加工のために時間を要した。

そのため、研究実施計画で予定していた実際のメニエール病患者への機器の貸し出し、データの採取は施行できなかった。これについては、平成30年度に施行する予定とした。本研究はメニエール病における前庭機能、蝸牛機能の時空間的変化を詳細に解析することを目的としている。前庭機能評価には眼鏡型の眼電位計であるJINS MEMEを携帯型ENGとして使用し、蝸牛機能評価には聴力検査アプリを搭載したタブレット端末と聴力検査用のヘッドホンを使用した。平成30年度は、埼玉医科大学病院耳鼻咽喉科、神経耳科に通院中のメニエール病患者に、JINS MEME、メニエール病用アプリを搭載し眼電位を記録・解析するためのノートPC、聴力検査アプリを搭載したタブレット端末、聴力検査用のヘッドホンを実際に貸し出し、前庭機能、蝸牛機能の記録・評価を実際に行った。また、健常者にJINS MEMEを装着した状態でカロリックテストを行い、ENGで得られる波形とJINS MEMEで得られる波形の比較を行った。平成29年度の研究で、JINS MEMEで得られる眼電位は、電極が顔面の皮脂や眼輪筋の運動により容易に影響を受けアーチファクトを生じることが判明していたため、患者に機器を貸し出す際は、機器の操作と共に計測前の皮脂除去などの前処置の指導も行った。平成30年度の貸し出し期間中は、患者はめまい発作を生じることはなかった。従って、JINS MEMEでの眼電位の計測は1日に2回程度施行されていたが、めまい発作を示唆する波形の記録は得られなかった。しかし、健常者に施行したカロリックテストのJINS MEMEとENGの同時計測では、冷水刺激で生じた眼振はJINS MEMEでも確認は可能であり、眼振の定性的な評価は可能であると考えられた。しかし、ENGで得られるような緩徐相速度などの定量的な評価は困難であった。蝸牛機能に関しては、聴力検査アプリで計測した結果と、耳鼻咽喉科外来で施行した純音聴力検査での結果はある程度の一致がみられ、変動する聴力を自宅で評価することは可能であると考えられた。JINS MEME、平成28年度に作成した携帯型VOGをメニエール病患者に貸し出し、自宅での眼球運動の測定を行う。また、AndroidアプリのHearing Testを用いて聴力検査も行い、それらで抽出したデータを、平成28年度に作成したメニエール病用アプリを用いて解析を行う。眼球運動の測定は決められた時間帯(例:毎日朝7時)に行い、めまい発作が起こった時は適宜測定を行ってもらう予定。基本的には1ヶ月の測定とし、1ヶ月間の眼振の出現回数と程度、聴力の変動の評価を行う。JINS MEMEを実際のメニエール病患者に貸し出し、自宅でめまい発作時に着用していただき、眼電位を採取する。蝸牛機能評価のため、同時にAndroidアプリHearing Testを用いて聴力検査を行う。以上の採取したデータを解析し、自覚症状との比較も行う。平成28年度に所属していた国立国際医療研究センターから、平成29年4月に埼玉医科大学病院に移動することが決まっていたため次年度使用額が生じた。平成29年度に参加予定であっためまい平衡医学会に参加ができなかったため、旅費が生じなかったため、次年度使用額が生じた。平成30年度は、開発したメニエール病用アプリをメニエール病患者へ貸し出しするため、貸し出し用の機器を購入する予定である。平成29年4月からは他施設に移動の予定はないため、機器開発の物品費にあてる予定である。
マルチメディア時代の地方ソフトウェア産業振興における情報化政策の効果に関する研究

本年度、この研究が遂行されたことによって得られた成果は下記の通りである。1.前年度に引き続き、「地域ソフト法」、マルチメディアソフトウェア供給基盤整備事業についてサーベイし、これらの政策に基づいて設立された各地の機関(群馬・富山・高知などの地域ソフトウェアセンターやリサーチパーク)の調査を行った。2.昨年度に収集した統計データの集計・分析を進めた結果、1980年代から1990年代後半の期間において、上記事業が実施された自治体(都道府県)と実施されなかった自治体の間では各種の指標において明確な差が認められないことが明らかになった。3.現状の地方ソフトウェア産業振興政策、とくに上記二事業の政策効果としては、当初期待された効果が現れていないと見るべきであるが、ソフトウェアの「供給力」を単純に売上高、就業人口など従来から採られてきた指標で評価しうるものか、また、景気変動の影響をどうみるか、などが今後の課題として残された。4.関係者へのレビューなどの結果、今後必要とされる政策として下記の諸点が挙げられた。・中央省庁主導の縦割り的な政策ではなく、ソフトウェア産業を国の基幹産業として育成するための総合的な政策の推進。・「センター」がハード提供にとどまらず技術情報やビジネス情報の提供を通じたソフト面でインキュベート機能の役割も担う。・ネットワーク時代に対応して今後は「センター」などの建物整備ではなく、高速で安価な通信インフラを公的に整備する。・地方自治体が地元ソフトウェア企業へ重点発注することでの供給力・技術力育成、重層的な受注構造の改善を行う。さらに、これらの政策を迅速に推進する地方首長の強力なリーダーシップが必要なことも指摘された。1. 1980年代前半から展開されてきた地方ソフトウェア産業振興政策、なかでも、高度技術工業集積地域開発促進法(「テクノポリス法」)、地域産業の高度化に寄与する特定事業の集積の促進に関する法律(「頭脳立地法」)、地域ソフトウェア供給力開発事業臨時措置法(「地域ソフト法」)、マルチメディアソフトウェア供給基盤整備事業についてサーベイし、その当初の政策意図とその後の経済・社会・技術環境の変化に対する計画変更の推移について明らかにした。2.上記の各種政策によって設立された各地の機関(和歌山・福岡・栃木・静岡などの地域ソフトウェアセンターやリサーチパーク)の実績について調査をふまえて比較検討を行った。その結果、設立時期に想定されていた技術環境や需給関係と現在の状況に大きな齟齬が見られ、計画の見直しが行われているものの、現状では必ずしも十分な成果を挙げていないことが明らかになった。3.平行して実施したマルチメディア情報センターを中心とするヒアリングでは、技術革新に応じた機器更新の遅れや技術指導を行える人材の不足から、その機能を十分に果たしきれていない面が明らかとなったが、これには制度的な制約も問題として指摘された。また、産業界からは地域ソフトウェア開発力の向上のために、センターがハード提供にとどまらず技術情報やビジネス情報の提供といったソフト面での役割も担うべきとの期待があることが明らかとなった。
転写因子導入によるヒト唾液腺細胞の再生

唾液腺再生の方法には唾液腺幹細胞の分化誘導や転写因子による唾液腺細胞への分化転換などが考えられ,これらの方法を確立するための重要なステップは唾液腺の幹細胞や各構成細胞を分離して解析することである.本研究では,成体マウスから顎下腺を摘出し組織切片と単一上皮細胞標本を作製した.CD117,CD66a,E-cadherin,AQP5,CLDN4,NKCC1およびCK5に対する抗体と蛍光標識2次抗体を用いて染色し,共焦点レーザー顕微鏡で観察した.結果として,組織切片観察から,CD66aとCD117は主に上皮組織で発現するが,両者の発現パターンは異なることがわかった.CD66aは腺房で強く,また導管では介在部で強く,線条部と排出部では弱かった.CD117は介在部導管で強く,線条部と排出部の一部の細胞で弱く発現し,腺房では発現していなかった.CD66aとCD117は基底細胞や筋上皮細胞では発現していなかった.CD117とNKCC1は介在部,線条部,排出部の導管で発現していた.CD66aとCD117のこのような発現パターンは単一上皮細胞標本でも確認できた.以上の結果から,唾液腺を構成する腺房,介在部,線条部および排出部導管の各細胞,基底・筋上皮細胞はCD66aとCD117の発現量の違いによって区別できることを示し,これらによって,FACSを用いて各細胞に特異的な遺伝子の同定や幹細胞の濃縮が可能となり,唾液腺再生医療の確立に貢献することが期待される.唾液腺再生の方法には唾液腺幹細胞の分化誘導や転写因子による唾液腺細胞への分化転換などが考えられ,これらの方法を確立するための重要なステップは唾液腺の幹細胞や各構成細胞を分離して解析することである.初年度に続く研究では,唾液腺形成過程で発現している転写因子の同定と機能解析を進め,上皮の分化を制御している転写因子Grainyhead-like 2(GRHL2)についてマウス顎下腺における発現と機能を解析した.本研究では,マウス胎仔顎下腺におけるGRHL2の発現は,E-cadherinとの二重免疫染色法により共焦点レーザー顕微鏡で解析した.顎下腺形成におけるGRHL2の関与を調べるためにGrhl2遺伝子に対するsiRNAおよびネガティブコントロールsiRNAの存在下で胎仔顎下腺を培養して,腺房数を計測した。また, Grhl2および上皮細胞接着関連因子E-cadherin, Cldn3,ZO-1のmRNAとタンパク質の発現をリアルタイムPCR,ウェスタンブロット法で解析した.結果として,顎下腺におけるGRHL2の発現はE-cadherin陽性細胞だけで認められた.Grhl2 siRNA存在下の顎下腺では,コントロールに比べて成長が著しく抑制され,また腺房数およびGrhl2 mRNA量が有意に減少していた.E-cadherin,Cldn3,ZO-1のmRNAおよびタンパク質の発現も有意に減少していた.以上のことから,マウス顎下腺ではGRHL2は上皮で発現し,上皮組織の形態形成と分化に関わっていることが示唆された.これらの研究成果は,第60回日本口腔外科学会総会と,さらに第70回日本口腔科学会総会で発表を行った.唾液腺上皮組織での唾液腺形成に必要なものを選別し,成体マウスから顎下腺を摘出し組織切片と単一上皮細胞標本を作製した.CD117,CD66a,E-cadherin,AQP5,CLDN4,NKCC1およびCK5に対する抗体と蛍光標識2次抗体を用いて染色し,共焦点レーザー顕微鏡で観察した.結果として,唾液腺を構成する腺房,介在部,線条部および排出部導管の各細胞,基底・筋上皮細胞はCD66aとCD117の発現量の違いによって区別できることを示し,FACSを用いて各細胞に特異的な遺伝子の同定や幹細胞の濃縮が可能となり,唾液腺再生医療の確立に貢献することが期待される.続いて,マウス胎仔顎下腺の器官培養系を用いてsiRNAによる発現阻害実験を行っている.マウス胎仔顎下腺の形成過程で発現レベルが上昇する転写因子について,発現データベースの解析を行い,唾液腺上皮組織で発現しているものを選別し,転写因子について発現阻害実験および転写因子ネットワーク解析を行い,マウス胎仔顎下腺の成長・形態形成・細胞分化に影響を与える転写因子を選別した.そして選別した転写因子をマウス線維芽細胞に強制発現させ,唾液腺細胞への分化誘導能を持つものを同定し,さらに,唾液腺細胞への分化転換能を持つかどうかを検証した.形態学的には,概ね予測した器官培養の結果を得られてきているが,実験の手技と行程がきわめて複雑であり,高い成功率での再現性がなかなか獲得できない.我々は唾液腺再生を目指して、マウス胎仔顎下腺形成に必要な転写因子の同定を進めている。転写因子Grhl2は、肝臓や肺のような他臓器の上皮接着の調整およびその発育に重要に関与しているとの報告があるが、唾液腺においてはその報告は未だにない。本研究では、転写因子Grhl2がその標的遺伝子である細胞膜結合型プロテアーゼ阻害因子SPINT1の発現を調節することで顎下腺形成に関与していることを報告する。胎生12日目のマウス胎仔顎下腺をGrhl2 siRNAおよびSPINT1タンパク質の存在下で培養し、顎下腺形成への影響を解析した。

その結果、Grhl2 siRNA存在下では、Grhl2の発現、上皮組織の成長および分枝形態形成が抑制され、siRNA存在下培養胎仔顎下腺でのGrhl2、SPINT1、E-cadherin、claudin、ZO-1の発現をリアルタイムPCR、ウェスタンブロットにより解析した。その結果、それぞれのタンパク発現およびmRNA発現はコントロールと比較して有意に発現が減少していた。Grhl2の標的遺伝子であるSPINT1もまた、上皮接着因子を制御することで知られており、そのコンディショナルノックアウトマウスは、マウス胎盤の栄養微絨毛の発育を阻害する報告があった。このSPINT1に着目し、Grhl2 siRNAによる顎下腺形成抑制効果は、SPINT1タンパク質を添加することで救済された。また、クロマチン免疫沈降qPCR(ChIP-qPCR)を用い、マウス顎下腺においてGrhl2抗体がSPINT1遺伝子と結合していることを確認した。本研究は、Grhl2によるSPINT1の発現調節が器官形成に関わっていることを示す初めての報告であり、SPINT1を唾液腺障害治療薬として利用できる可能性を示唆している。初年度の研究計画により唾液腺上皮組織での唾液腺形成に必要な転写因子の選別・発現を確認した中から,唾液腺形成に必要なものを選別し,マウス胎仔顎下腺の器官培養系を用いてsiRNAによる発現阻害実験を行っている.(1)マウス胎仔顎下腺の形成過程で発現レベルが上昇する転写因子について,発現データベースの解析を行い,唾液腺上皮組織で発現しているものを選別する.(2)上記で選別した転写因子について発現阻害実験および転写因子ネットワーク解析を行い,マウス胎仔顎下腺の成長・形態形成・細胞分化に影響を与える転写因子を選別する.(3)上記(2)で選別した転写因子をマウス線維芽細胞に強制発現させ,唾液腺細胞への分化誘導能を持つものを同定し,さらに,唾液腺細胞への分化転換能を持つかどうかを検証する.形態学的には,概ね予測した器官培養の結果を得られてきているが,実験の手技と行程がきわめて複雑であり,高い成功率での再現性がなかなか獲得できない.初年度の研究計画により唾液腺上皮組織での唾液腺形成に必要な転写因子の選別・発現を確認した転写因子の中から,唾液腺形成に必要なものを選別する.具体的には,マウス胎仔顎下腺の器官培養系を用いてsiRNAによる発現阻害実験を行い,次に,ヒト唾液腺細胞への分化転換能を持つ転写因子の同定を行う.同定した転写因子のヒトホモログが唾液腺で発現していることを確認するために,口唇部の生検試料を用いてin situハイブリダイゼーション解析を行う.さらに,これらのヒト転写因子が唾液腺細胞への分化転換能を持つかどうかをヒト培養線維芽細胞に発現させて検証する.口腔外科初年度の研究計画により唾液腺上皮組織での唾液腺形成に必要な転写因子の選別・発現を確認した転写因子の中から,唾液腺形成に必要なものを選別する.具体的には,マウス胎仔顎下腺の器官培養系を用いてsiRNAによる発現阻害実験を行い,以下のことを調べる.1標的転写因子の発現がsiRNAによって抑制されることを定量PCRによって確認する.2siRNA処理によって唾液腺の成長および形態形成が抑制されるような転写因子を選別する.3siRNA処理によって腺房細胞マーカーAQP5,導管細胞マーカーCLDN5,基底細胞マーカーCK14,筋上皮細胞マーカーSMAの発現が抑制されるような転写因子を選別する.マーカー分子の発現は免疫染色および定量PCRによって解析する.
定量的データベースを用いた焼死体の死因・火災原因判断基準の作成

家屋建材の燃焼ならびにガソリンや灯油などの暴露により吸引される揮発性炭化水素の血液中の濃度を推定可能な新しいNAGINATA-GC/MSスクリーニング法を開発した。続いて生体試料中のシアン化物、チオシアン酸塩ならびにアジ化物の簡便で信頼性の高い定量法を確立し、これをデータベースに登録することで、危険な毒物を所持しなくてもシアン化物とアジ化物の暴露程度が分かる画期的な方法を開発した。さらに、犯罪目的でしばしば用いられる微量の催眠鎮静剤を含む161種の薬毒物の、LC-MS/MSによる定量的スクリーニング法を開発した。本法は多機関に導入され、焼死体の死因・火災原因を判断する上で成果をあげている。火災現場で発見される焼死体の鑑定では、死因の究明だけでなく、焼死か死後焼却かの鑑別、さらには吸引ガスの種類の特定などが必要で、これらの判断には細心の注意が必要である.本研究では、迅速・確実に焼死体の鑑別診断を行うための判断基準を作成することを最終目的とし、本年度は火災時の吸引ガスの種類の特定と吸引程度の判断に有用となる、血液中揮発性炭化水素の定量的スクリーニング法の開発を行った。まず、ベンゼン,トルエンなどのC6からC9までの芳香族炭化水素10種,ペンタン,へプタンなどのC5からC12までの脂肪族炭化水素8種の計18種を分析対象とし、これらを難揮発性薬毒物のスクリーニングに用いているHP-5MSカラム(30 m)を用いて分析したところ18種の揮発性成分は2.0分から16.0分に溶出し,良好な分離が得られた.p-ジクロロベンゼンをリテンションタイムロッキング化合物に設定することで,常に同じ保持時間で各成分が溶出し,再現性のあるデータが得られることが判明した.血液中揮発性炭化水素の抽出も気化平衡法を用いることで、簡便に行うことが可能であった。トルエン-D8を内部標準物質として作成した検量線は0.01-10 μg/mlの範囲で良好な直線性を示した.得られた揮発性炭化水素の保持時間、マススペクトル、検量線データを予めNAGINATAデータベースに登録しておくことで,検量線を作成することなしに,迅速に血液中の燃焼ガス成分の確認と大よその濃度が得られ,火災時の吸引ガスへの暴露程度を速やかに判断することが可能となった.開発したメソッドを焼死事例に応用したところ,死因と火災原因を判断する上で有用な情報が得られることが判明した.今後事例のデータを蓄積し,これを一酸化炭素ヘモグロビン濃度やシアン濃度と比較することで,焼死体の死因・火災原因の判断基準を作成できると考える.火災現場で発見される焼死体の鑑定では、死因の究明だけでなく、焼死か死後焼却かの鑑別、さらには吸引ガスの種類の特定などが必要で、これらの判断には細心の注意が必要である。本研究では、迅速・確実に焼死体の鑑別診断を行うための判断基準を作成することを最終目的とし、本年度は1)昨年度開発したGC/MSによる血液中揮発性炭化水素の定量的スクリーニング法の検証、2)LC/MS/MSによる微量薬毒物の定量的スクリーニング法の開発、3)血液中シアン化物の簡易定量法の検討を行った。1)平成27年度に実施した106体の法医解剖のうち10体が焼死事例で、これらの血液試料について揮発性炭化水素のスクリーニングを実施した結果、一般家屋火災、ガソリン暴露、灯油暴露、混合燃料暴露にそれぞれ特徴的な揮発性炭化水素の検出パターンが認められ、本法の有用性が確認された。作成したデータベースはNAGINATAスクリーニングシステムを導入している33の機関に配布し、データの蓄積と検証が開始されている。2)微量な催眠鎮静剤を含む血液中の161種の薬毒物について、QuEChERS法で抽出し、LC/MS/MSのMRM分析とproduct ion scanで確認を行い、予め登録した検量線からおおよその濃度が算出可能な画期的なスクリーニング法を開発した。3)血液中シアン化物については、アジ化物や硫化物などの陰イオン性毒物も同時に測定可能な誘導体化法を選択した。鹿毛ら(J Chromatogr B. 675(1996) 27-32)の報告を参考に、ペンタフルオロベンジル誘導体化の条件について検討を行ったところ、安定同位体で標識した内部標準物質を用いることで、より正確な定量が可能であることが示唆された。今後さらなる条件の検討を行い、アジ化物や硫化水素も同時に分析可能な方法を開発したいと考えている。開発したGC/MSによる揮発性炭化水素の定量的スクリーニング法については、検証の結果、法医学実務に充分役立つことが判明した。また作成したデータベースは、配布した33機関でもただちに使用が可能なため、今後多くの成果が期待できる。開発したLC/MS/MSによる血液中薬毒物の定量的スクリーニング法は、微量な催眠鎮静剤も検出可能で、焼死事例のみならず、すべての鑑定事例で薬物関与の有無と関与の程度を迅速に判断可能な大変有用な方法である。血液中シアン化物の定量法については、当初の予定を変更して、誘導体化法に切り替えたため、若干進行が遅れているが、すでに基礎実験は終わっているので次年度には、簡易なメソッドが確立できる予定である。

火災現場で発見される焼死体の鑑定では,死因の究明だけでなく,焼死か死後焼却かの鑑別,さらには吸引ガスの種類の特定などが必要で,これらの判断には細心の注意が必要である.本年度は吸引ガスの特定ならびに死因の判断に必要となる,血液中シアン化物の高精度な定量法の確立を試みた.1)シアン化物と代謝物のチオシアン酸塩,ならびにアジ化物を分析対象とした.これらの陰イオン性毒物は,ペンタフルオロベンジル誘導体にしてGC-MSで分析する方法が一般的であるが,検量線が直線性を示す幅が狭い,カラムが劣化する等の問題があり,最適な方法とは言い難い.そこで、既存の方法を元に,除タンパク法,内部標準物質(IS),カラム劣化の原因,GC-MSの条件について検討した.その結果,シアン化物の分析にはトリクロロ酢酸による除タンパクが最も良好な結果を示し,チオシアン酸塩とアジ化物はいずれの除タンパク法でも回収率が低下したので全血のまま分析することとした.ISとしてはシアン化物の分析にはKCNの同位体が最も適しており,アジ化物とチオシアン酸塩はベンジル誘導体,トリブロモベンゼン(TBB)のいずれを用いても良好な結果を示した.カラムの劣化は相間移動触媒がカラムに残存することに起因していることが判明し,強陽イオン交換カラムにより効率的に除去することに成功した.GC-MSの昇温条件を変更することで誘導体化試薬とアジ化物誘導体は良好に分離した.以上の結果,3種の化合物共に信頼性の高い定量法を確立することができた.2)確立した方法を元に3化合物のデータベース化を行い,血液中毒物の存在の有無と濃度推定が迅速に判定可能なNAGINATA-GC/MSスクリーニング法を確立した.本法は危険な毒物を所持することなく,シアン化物やアジ化物の摂取が証明できることから,警察や法医学の鑑定のみならず,救急医療の現場でも大変有用と考える.家屋建材の燃焼ならびにガソリンや灯油などの暴露により吸引される揮発性炭化水素の血液中の濃度を推定可能な新しいNAGINATA-GC/MSスクリーニング法を開発した。続いて生体試料中のシアン化物、チオシアン酸塩ならびにアジ化物の簡便で信頼性の高い定量法を確立し、これをデータベースに登録することで、危険な毒物を所持しなくてもシアン化物とアジ化物の暴露程度が分かる画期的な方法を開発した。さらに、犯罪目的でしばしば用いられる微量の催眠鎮静剤を含む161種の薬毒物の、LC-MS/MSによる定量的スクリーニング法を開発した。本法は多機関に導入され、焼死体の死因・火災原因を判断する上で成果をあげている。血液中揮発性炭化水素の定量的スクリーニング法の開発については予定通り研究が進んだため、次年度以降に予定していたデータベースの構築、解剖事例へ応用を前倒しで行い、一定の研究成果を得た。一方シアン化物の簡易分析法確立については、情報収集などを中心に行い、本格的な研究の実施は次年度以降に行うこととした。1)血液中シアン化物の簡易定量法の開発:安定同位体で標識した内部標準物質を用い、ペンタフルオロベンジル誘導体化による簡易な血液中シアン化物の定量法を確立する。確立した方法の再現性、検出限界、検量線の範囲等を求めてメソッドの信頼性が確認されたら、NAGINATA-GC/MSデータベースに登録する。確立したメソッドは、さらに検討を加えてLC-MS/MSでも分析可能な方法を作成する。2)焼死事例の血液について、作成したデータベースを用いて揮発性炭化水素とシアン化物のNAGINATA-GC/MSスクリーニングを行い、さらにLC/MS/MSによる薬毒物スクリーニングも実施する。得られた結果を総合的に判断して、焼死体の鑑別診断を行うための判断基準の作成を行う。法医中毒学
プリオン蛋白質とそれを捕捉するRNAアプタマーの複合体の構造及び相互作用研究

r(GGAGGAGGAGGA)という配列からなるRNAアブタマーのR12はプリオン蛋白質を高い親和性で捕捉する。本研究ではR12がプリオン蛋白質を認識するメカニズムを高分解能で明らかにし、アプタマーによるプリオン病の治療薬の創製を目指した。申請者はR12の立体構造をNMR法によって決定し、またR12がプリオン蛋白質のN末端ドメインに存在する2つの塩基性クラスターを認識することも明らかにしている。この2つの塩基性クラスターのうち、1つに対応するペプチドとR12の複合体の立体構造を原子レベルの分解能で明らかにした。もう1方に対応するペプチドについても、ケミカルシフトパータベーション法と、R12とペプチドの分子間NOEのパターンにより相互作用様式を同定した。本年度では、プリオン蛋白質のN末端ドメインとR12について相互作用様式を調べたところ、R12の各単量体と各塩基性クラスターと2ヶ所同時の相互作用により、高い親和性を得ていることを明らかにした。R12は正常型と異常型のどちらの状態におけるプリオン蛋白質にも結合するが、正常型には解離定数にして1桁以上強く結合する。よってR12が正常型へ結合して、これにより異常型への構造変換を妨げ、プリオン病の発症を抑えられる可能性がある。これを調べるためにヒトのプリオン病の1つであるGSS病を感染させたマウスの視床下部由来の細胞を用いて、R12の抗プリオン活性を検証した。R12を添加して培養した場合、緩衝液のみを加えた場合と比べて異常型プリオン蛋白質量が65%まで減少した。さらにR12とRNase阻害剤を加えて培養した場合では、異常型プリオン蛋白質量が半分まで減少した。本研究により、R12の抗プリオン活性が見出され、この活性の構造学的基盤も明らかにされた。r(GGAGGAGGAGGA)という配列からなるRNAアプタマーのR12はプリオンタンパク質を高い親和性で捕捉する。申請者等は既にR12の立体構造をNMR法によって決定している。R12はG:G:G:Gテトラッド平面とG(:A):G:G(:A):Gヘキサッド平面をコアとした分子内平行型4重鎖構造を形成し、さらに2つのR12分子がヘキサッド平面のスタッキングを介して二重体を形成していた。次にプリオンタンパク質の結合部位を探索し、N末側の約100残基のディスオーダー領域における、アミノ酸番号25-35(以下P1)及びアミノ酸番号108-119(以下P16)の2つの部位であることを見出した。この2つの部位に対応するペプチドP1及びP16のそれぞれと、R12との相互作用をNMR法によって調べた。特にR12とP16については複合体の立体構造を原子レベルの分解能で決定することが出来た。R12の特異な位置に配置された3つのリン酸基とP16の3つのリジン残基がそれぞれ静電相互作用をしていること、R12のグアニン塩基とP16のトリプトファン残基がスタッキング相互作用をしていることを明らかにした。これと同時に、ウシプリオンタンパク質(bPrP)の107残基のN末端ドメイン(以下bPrP-N)とR12について、NMR法による相互作用の研究を行った。R12へbPrP-Nを加える滴定と、bPrP-NへR12を加える滴定の両実験から、R12とbPrPNは2:1の結合比であること、すなわち二量体として存在するR12とbPrP-Nは1:1め結合比であることを見出した。二量体であるR12の各単量体が、bPrPの2つの結合部位のそれぞれと同時に結合することで、高い親和性を獲得していることを示唆する結果を得た。現在これらの結果をまとめて学術雑誌への投稿の準備を進行させている。

さらにR12とRNase阻害剤を加えて培養した場合では、異常型プリオン蛋白質量が半分まで減少した。本研究により、R12の抗プリオン活性が見出され、この活性の構造学的基盤も明らかにされた。RNAアプタマーであるR12と、プリオンタンパク質の2ヶ所ある結合部位の内の1つに対応するペプチドとの複合体の立体構造の決定に成功した。もう1方の結合部位に対応するペプチドとも、NMR法によって原子レベルの相互作用の情報を得られた。さらにプリオンタンパク質のN末側ドメイン(R12との2つの結合部位を含む107残基からなるドメイン)とR12との相互作用に関する情報も取得し、R12がプリオンタンパク質を捕捉する全体像を構築することに成功した。プリオンタンパク質のもう一方の結合部位に対応するペプチドと,R12との複合体の構造解析を行う。既に共鳴線の帰属を半数以上終えて、分子間NOEの情報なども取得しており、これらの解析を進行させる。さらにR12とプリオンタンパク質のN末側ドメインとの複合体の解析も進行させる。とれについては既に発現及び精製方法を確立し、^<13>C,^<15>N安定同位体標識されたN末側ドメインを取得した。今後R12との複合体について、共鳴線の帰属や分子間NOEの抽出を行う。この他、プリオンタンパク質全長の発現及び精製方法を確立し、R12との相互作用の情報を得ることを目指す。