hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規成長ホルモン不応性成長障害の発症機序に関する分子医学的研究

生後の体格決定には成長ホルモン(GH)-インスリン様成長因子1(IGF1)軸が大きな役割を担う。脳下垂体から分泌されたGHは、肝細胞のGH受容体に働き、IGF1産生を促すことにより血中IGF1値を上昇させ、IGF1が内分泌ホルモンとして体の成長に働く。さらに、GHは肝以外の臓器細胞にも働いてIGF1産生を促し、このIGF1が局所で成長促進作用を発揮する。私達はEphA4欠損マウスが成長障害を示すことを見出し、その原因を分子レベルで追及することにより、EphA4がGH受容体と直接結合してその下流シグナル伝達を増幅していることを発見した。EphA4 KOマウスの体格が小さいことから、EphA4が成長ホルモン(GH)のシグナルに関係することを推測した。このマウスは、EphA4の遺伝子量依存性に体格が小さい成長曲線を示す。体重割の食事量はEphA4(-/-)がEphA4(+/+)より多い。GH受容体下流のシグナル伝達系とEphA4との分子間相互作用を詳しく調べるために、EphA4(-/-)マウスの胚由来線維芽細胞(MEF)にレトロウイルスベクターを用いてEphA4を発現させた細胞およびベクターのみを発現させた細胞を用い、GH受容体下流のシグナル分子の活性化を調べた。EphA4はGH受容体と直接結合しGHに対するJak 2以降のシグナルを増強すること、その作用はephrin-A1刺激によりさらに増強することが判明した。IGF1受容体の下流シグナルにはEphA4は影響を与えなかった。また、このMEFではGH刺激のない状態でIGF1mRNAの転写が亢進しており、GHおよびephrin-A1刺激時にはそのmRNA産生がさらに亢進することを発見した。経骨近位部軟骨成長板内の軟骨増殖分化はEphA4(-/-)マウスにおいて全般的に抑制されており、血中GHおよびIGFBP3の値が1/3程度に減少していたことから下垂体でのGH産生障害も疑ったが、GHmRNA産生量には異常は認められなかった。肝臓にはEphA4は発現していた。軟骨成長板内でのEphA4mRNAの発現を調べるためcRNAprobeを用いてIn Situ Hybridizationを実施した。この研究から、生後の軟骨成長板にはEphA4mRNAは検出可能な程度には発現していないことが判明した。以上の結果をまとめると、EphA4が肝臓およびその他の組織でのIGF 1 mRNA転写に関与し、そのリガンド(ephrin-A1)刺激によりGH刺激と相乗的にIGF1mRNAの転写が亢進することが判明した。軟骨成長板でEphA4の発現がないことも含めて考えると、EphA4は内分泌IGF1の産生に影響を与えることで体格の大小を決定する一つの因子であると考えられる。Ephrin/Eph系は種々のシグナル系に影響を与えることが判明してきている。EphA4KOマウスの体格がこの遺伝子の発現量に反比例して小さいことに関して、GH-IGF1系との関わりを調べた。昨年は、Epha4(-/-)マウス由来線維芽細胞にレトロウイルスベクターを用いてEphA4を発現させた細胞およびベクターのみを発現させた細胞を用いてGH受容体下流のシグナル分子の活性化を調べた。その結果、EphA4はGHRと結合することによりJak2より下流のシグナルを増強することを発見した。今回は、GHRのすぐ下流に存在するJak2のノックアウトマウス由来の線維芽細胞を使い、この細胞にレトロウイルスベクターを用いてJak2およびEpha4を発現させ、36時間後のIgf1 mRNA産生を調べた。Ephrin-A1による刺激後のIgf1 mRNA産生はJak2の発現を回復した細胞で高度に増強されていた。Jak2の発現無しでもephrin-A1に反応してIgf1 mRNA産生の増加がみられたが、その反応はJak2の発現を回復した細胞の10%にすぎなかった。以上から、ephrin/EphA4系のIgf1発現に及ぼす影響は大部分Jak2を介するシグナルによるものと考えられた。また、EphA4、GHRおよびJak2は3分子のどの2者も互いに結合することにより3量体を形成することをHEK293細胞での強発現にて確認している。In vivoにおいてもマウスの各種臓器におけるIgf1 mRNA、Ghr mRNA、Igf1r mRNAの発現を調べた。Igf1 mRNAは脳と腎臓を除く多くの組織において、野生型と比べてEpha4(-/-)マウスにおいて著明に減少していた。しかし、調べ得た全ての組織においてGhr mRNAおよびIgf1r mRNAの発現量には両者で差がなかった。調べた組織全てにおいてEpha4の発現を認めた。

以上より、これまではIGF1産生の大きなシグナル経路としてGH-IGF1系が認められていたが、近接した細胞間で働くephrin/Eph系がGHRおよびJak2と共同して働くことにより、IGF1産生が制御されていることが明らかとなった。Ephrin/Eph系とGH/GHR/JAK2系のクロストークがIGF1産生を介して個体の成長に働いていることを発見し、その分子メカニズムを解明しつつある。結論としてEphA4がGHRおよびJAK2を直接結合することにより、(1)GHR/JAK2を介するシグナルを増強し、STAT5bを活性化することによりIGF1 mRNAの転写を亢進すること、(2)EphA4が直接STAT5bを活性化することによりIGF1 mRNAの転写を亢進すること、の2つの経路の活性化が惹起される。この2つの経路が肝臓だけではなくその他の末梢臓器でも機能している。そのため、EphA4KOマウスでは、血中に存在する内分泌性IGF1のみではなく、末梢臓器でのIGF1産生も低下し、成長が障害される。このマウスにGHを皮下注射しても成長が正常化されないが、IGF1を皮下注射することにより成長を回復することができる。これまでの結果を投稿し、改訂指示を受けた。一部追加実験が必要であるため、以下の実験を実施しているところである。(1)EphA4およびGHRの肝細胞での共局在を共焦点顕微鏡で調べること、(2)EphA4、GHR、およびJAK2のそれぞれのKOマウス由来線維芽細胞を用いて、内在性に発現しているいずれの2分子も結合することを証明すること、(3)EphA4KOマウスで肝臓でのIGFBP3およびIGFALSのmRNA発現およびそれらのタンパク質の血清中の濃度を測定すること、(4)EphA4、GHR、JAK2の3分子の結合ドメインを決定すること、等である。1Epha4およびGHRの肝細胞での共局在の実証:HepG2細胞を用いて内在性EphA4およびGHRに特異的な抗体で免疫染色を実施し、共焦点顕微鏡でそれぞれの受容体の局在を調べた。2Epha4KOマウスで肝臓でのIgfbp3およびIgfalsmRNA発現およびそれらのタンパク質の血清中の濃度の測定:IGFBP3およびIGFALSは血中でのIGF1の保持に重要な働きをする分子であり、IGF1の作用機序にも大きな関与をするため、それらの発現は重要である。Igfbp3 mRNA発現はGHの影響を受けないが、Igfals mRNA発現はIgf1 mRNA同様GHによる転写レベルでの調節を受けることが知られている。IGFBP3はELISAにより、IGFALSはWestern blottingによりwild typeマウスを基準として比較した。mRNA発現量に関しては、定量的RT-PCRにより定量した。蛋白レベルではIGF1、IGFBP3、IGFALSすべての値がEpha4KOマウスで低下しており、mRNAレベルではIgf1およびIgfals発現が低下していたが、Igfbp3に関しては正常であった。3内在性のEphA4、GHR、およびJAK2の相互作用の解析:これまでの強制発現細胞での結果を補完するために必要である。それぞれの分子の欠損マウス由来線維芽細胞を用いて2分子間の相互作用を調べた。
北西太平洋における混合層の消長に伴う熱収支・水塊形成に関する研究

NCEP/NCARの再解析による月別風応力、熱フラックスを外力として、北太平洋高解像度数値モデルを用いた1957年から2003年までの47年間のhind cast実験を行い、1ヶ月毎に平均値を出力した時系列データセットを用いて、北西太平洋の混合層の消長と水塊形成過程における経年変動の現れ方とその仕組みを明らかにするための解析を行った結果、以下のことが明らかになった。1.北西太平洋で形成される表層水塊の水温や形成量の年々変動は冬期の大気場の状態、特に大気温によって支配されている。前年と比較して冬期の大気温度が低下した場合、混合層が深くなるため、その前年の有効な水塊形成量は少なくなり、逆に上昇した年には、混合層が浅くなるためその前年の有効水塊形成量は多くなる。2.一方、数年より長い時間スケールの変動に関しては、海洋の内部の状態が効いてくる。海洋上層の蓄熱量が多い場合、水塊の水温自体もあまり低くはならず、逆に蓄熱量の少ない場合、水塊の水温は低くなりやすい。表層の蓄熱量は主に温度躍層の深さで決まっており、その変動は北太平洋中部および東部の風応力curlの変動に起因している。3.北西太平洋の黒潮・親潮続流域の冬期の熱フラックスの変動についても、年々変動は大気温度との変動と相関が高く、それより長い時間スケールに関しては海面水温(上層蓄熱量)との相関が高くなる。これらは、2,3年より長い時間スケールの気候変動に海洋が影響を及ぼしている可能性を示唆している。ヨーロッパ中期予報センターの月別気候値を駆動外力として渦解像北太平洋海洋循環モデルで25年間積分した。最後の5年間の結果から5日毎に平均値を算出してデータセットを作成し、以下の海洋現象に着眼した解析を行った。1.北西太平洋域で冬期に発達する混合層の成長・衰退に強い影響を及ぼす熱的要因を明らかにする。2.北西太平洋で形成される水塊の質と量を明らかにするため、混合層で形成される水塊のうち、海洋の内部循環に入り込んだ量を算出し過去の研究結果と比較する。3.冬期に混合層が発達する海域を囲む閉じた領域を選定して熱・質量収支の時系列を求め、水塊の変質過程を明らかにする。以上の解析の結果、以下のことが明らかになった。1.冬期の混合層の発達には、海面において大気に冷却されることによって生じた対流混合が最も強く働いており、衰退には、黒潮による暖水の輸送が強く働いている。2.北西太平洋で混合層が発達する海域は、形成される水塊の特徴から3つに分けられ、それらは日本東方沖に発達する3つの海洋前線、黒潮続流・黒潮続流北分枝・亜寒帯前線によって区切られている。それぞれの海域では、異なった特徴をもつ水塊が形成され、海洋の内部循環に取り込まれている。3.海面で大量の熱が失われているものの、海面における密度変化はさほど大きくなく、形成された水塊も殆どが亜熱帯循環系内で再循環している。
高い転移温度を示すスーパースピングラス薄膜の創製と脳型メモリーへの応用

スピングラスの理論的モデルは脳の連想記憶の機構との類似性が指摘されて大きな反響を呼び、その後ニューラルネットワークへ応用されて情報工学の領域で大きな成功を収めている。一方、逆にスピングラスを利用して脳の連想記憶に相当する系を確立し、新しいメモリー材料を構築しようとする試みはほとんど見られない。これは、これまでに知られているスピングラスの磁気転移温度が数K数十K程度ときわめて低いことが原因の一つとなっていると思われる。このような現状に対して、研究代表者はすでに不規則亜鉛フェライトにおいて室温以上でスーパースピングラス的挙動が見られることを明らかにしている。同様の現象は他の酸化物でも期待できる。また、スーパースピングラスの起源が結晶構造中に存在する磁気クラスターによるものか、薄膜の微視的形状によるものかは不明であり、これを明らかにすることは、高温でスーパースピングラス相を安定化する機構を明確にする上で重要である。本研究では酸化物磁性体薄膜を気相法により合成し、磁気的性質を測定してスーパースピングラス相の存在を実証する。本年度は、昨年度に見いだした、強磁性転移とリエントラントスピングラスの挙動を示すEu^<2+>系非晶質薄膜に関して詳細な構造解析を進めると同時に、強磁性が現れる機構を理論・実験両側面から調べた。まず、非晶質Euo-TiO_2系に対してEuとTiのx線吸収微細構造(XAFS)測定を行い、Eu^<2+>とTi^<4+>の局所構造を解明し、特にTi^<4+>の配位環境が結晶相とはまったく異なることを見いだした。また、Eu^<2+>の4f軌道と5d軌道を対象にX線磁気円二色性分光(XMCD)を行い、強磁性の起源が5d軌道を介した4fスピン間の間接相互作用であることをつきとめた。さらに密度汎関数法を用いた第一原理計算により、EuTiO_3の格子体積の増加に伴いEu^<2+>間の交換相互作用が強磁性的になることを見いだし、Ti^<4+>の空の3d軌道を介した相互作用との競合がこの系の磁性を決定づけると結論した。スピングラスめ理論的モデルは脳の連想記憶の機構との類似性が指摘されて大きな反響を呼び、その後ニューラルネットワークへ応用されて情報工学の領域で大きな成功を収めている。本年度は、パルスレーザー堆積法で作製した非晶質EuZrO_3薄膜が約8Kで強磁性転移したあと、さらに低温でリエントラントスピングラス相に転移することを見いだした。特に、交流磁化率の周波数依存性から明確なスピングラス転移を確認した。高分解能電子顕微鏡観察、内部転換電子メスバウアー分光を用いた構造解析も行い、得られた薄膜が非晶質であり、ユウロピウムはほとんどすべてがEu^2+の状態であることを明らかにした。アモルファス合金と異なり、非晶質酸化物で強磁性を示す例はめずらしく、特にEuZrO_3系は可視域でも比較的透明であることから、磁気光学材料への展開も考えられる。

また、Eu^<2+>の4f軌道と5d軌道を対象にX線磁気円二色性分光(XMCD)を行い、強磁性の起源が5d軌道を介した4fスピン間の間接相互作用であることをつきとめた。さらに密度汎関数法を用いた第一原理計算により、EuTiO_3の格子体積の増加に伴いEu^<2+>間の交換相互作用が強磁性的になることを見いだし、Ti^<4+>の空の3d軌道を介した相互作用との競合がこの系の磁性を決定づけると結論した。
二重偏波レーダーと数値シミュレーションを用いたスーパーセル竜巻の前兆現象の解明

スーパーセルと呼ばれる特殊な積乱雲に伴って強い竜巻がしばしば発生し甚大な被害がもたらされるが、スーパーセル内部の詳細な構造や竜巻の発生機構は十分に理解されていない。本研究は、数値シミュレーションや二重偏波レーダーによる解析結果を用いて、スーパーセルの構造を詳細に解析して竜巻発生のトリガーとなる前兆現象を特定し、竜巻の発生機構を解明することを目的に実施した。2012年つくば市に甚大な被害をもたらしたスーパーセル竜巻については、竜巻渦の起源となる傾圧性は、フック状の形状をした降水物質の先端付近に位置する降水コアの落下に伴い生成されていたことが明らかになった。気象研究所の固体素子二重偏波レーダーでは、フックエコーは竜巻発生の10分以上前に出現し、時計回りと反時計回りのエコーの内、反時計回りのエコーが顕在化していた。スーパーセル竜巻の前兆現象と考えられるフック先端の降水コアの落下について、数値シミュレーションの結果を用いて評価した結果、レーダーで捉えるには500m程度の水平分解能と1分程度の時間分解能が必要であることが分かった。2018年伊江島に甚大な被害をもたらした竜巻は、背の低い構造で非スーパーセル竜巻であり、2つのシアラインの交点付近で発生していたことが分かった。このような竜巻に対しても、水平解像度1km程度のモデルを用いれば、アップドラフトヘリシティとよばれる指数を用いることで竜巻の発生ポテンシャルをある程度適切に予測できることが分かった。また、2002年から2017年までの全国の気象官署151地点の地上観測データを用いて、日本における突風の統計解析を行った結果、突風の約半数は台風に伴うものであり、多くはミニスーパーセル竜巻の発生しやすい台風の進行方向右前方で発生していたことが明らかになった。これらの成果は、米国気象学会や日本気象学会の論文誌にまとめ、公表している。2013年台風第18号に伴って関東平野で発生した竜巻の事例について、水平解像度50mの数値シミュレーションと二重偏波レーダーのデータを用いて、竜巻を含むストームの解析を行った。その結果、ストームは上空にメソサイクロンを伴い、フック状の降水物質の分布や強い上昇流による丸天井構造など典型的なスーパーセルの構造を有していることが明らかになった。しかし、ストームの上端が約5kmと低く、ミニスーパーセルの特徴をもっていた。また、竜巻発生前に顕在化した上空のメソサイクロンは、下層の環境場の鉛直シアに伴う水平渦を起源としていた。これらの結果は、2012年つくば竜巻をもたしたスーパーセルのメソサイクロンが、ストーム自身によって作り出していることと大きく異なっていた。つくば竜巻の発生前に顕在化した上空のメソサイクロンの構造と発生機構については米国気象学会の論文誌にまとめた。2015年の全国の特別地域気象観測所を含む地上データを用いて、突風事例の抽出を行った。その結果、175事例が抽出され、関東甲信越は11事例であった。その内、8事例は気象庁現業ドップラーレーダーの探知内で、4事例は近傍にメソサイクロンを伴っていたことが明らかになった。2015年8月12日に気象研究所から数kmの位置で発生したストームについて、気象研究所設置の二重偏波レーダーを用いて初期解析を行い、典型的なスーパーセルの構造を有していることが明らかになった。この事例では竜巻は発生しておらず、竜巻をもたらさない事例として、今後ストームの構造について詳細に解析する予定である。数値シミュレーションと二重偏波レーダーのデータを用いて、2013年台風第18号に伴う竜巻や2012年つくば竜巻の典型事例について予定通り解析している。2012年つくば竜巻の事例については、竜巻をもたらした親雲について論文としてまとめている。地上データを用いた突風の統計解析については、必要データを入手し、解析を開始している。また、2015年8月12日の事例では、気象研究所設置の二重偏波レーダーによって、至近距離においてスーパーセルの観測に成功し、貴重なデータが得られている。2012年5月6日に発生したつくば竜巻の発生機構について、水平解像度50mのシミュレーション結果を用いて解析を行った。その結果、竜巻の渦の起源となる傾圧渦は、フック状の降水物質の先端付近に位置する降水コアの落下に伴い生成されていることが明らかになった。また、最近の米国の研究と異なり、竜巻にはストーム後面の下降流域からだけではなく、暖域からの気塊も一部取り込まれていることが明らかになった。これらのつくば竜巻の発生機構について、米国気象学会論文誌にまとめた。2013年台風第18号に伴って埼玉県を中心に竜巻が発生した事例を対象に、米国で近年高解像度モデル用の竜巻発生予測指数として使用されているアップドラフトヘリシティについて、水平解像度依存性を調査した。その結果、2km以上の粗い解像度では突風に関係しない活発な対流域に対応してしまうが、1km以下にすると発達した積乱雲の中からスーパーセルに対応するストームを抽出できることが分かった。突風の実態解明と新たな突風データベースの構築を目的として、全国の気象庁気象官署151地点の1分値地上データを用いて、2002年から2016年までに発生した突風について、統計的に処理し初期解析を行った。その結果3163事例が抽出され、1地点当り平均で1.40回/年、0.82日/年という極めて大きな値となった。JEF0以上に匹敵する強いものに限っても、0.93回/年、0.51日/年という結果になった。

その内の約半数は台風に伴うものであった。台風に伴うものは9月がピークであるのに対し、その以外のものは対照的に12月に最も多く夏季は少なくなることが明らかになった。2012年つくば竜巻の発生機構について、現実的な環境場において再現された水平解像度50mの数値シミュレーション結果を用いて、竜巻の発生機構を明らかにし論文としてまとめている。また、この解析結果から、フック状の降水物質の先端付近に位置する降水コアの落下が竜巻発生の前兆現象となる可能性を指摘している。地上データを用いた突風の統計解析については、全国の気象官署過去15年分の突風抽出作業が完了している。突風の実態解明を目的として、昨年度抽出した過去15年分の全国の気象官署151地点の突風について、詳細な解析を行った。突風は日中、特に午後に発生頻度が高まり、沿岸部では内陸に比べて発生頻度が約3倍大きくなっていた。台風に伴う突風の約半数は進行方向右前方で発生していた。西日本では台風に伴う突風が多く、東日本や北日本では台風に伴わない突風が多いのが特徴であった。また、抽出された事例の約9%が気象庁突風データベースの事例と同じ環境場内で発生していた。観測環境が突風の発生頻度に及ぼす影響についても調査した。これらの結果をとりまとめ論文として投稿した。2010年12月9日新潟県上越市で非スーパーセル竜巻が発生した事例について、水平解像度1kmの実験を行った。その結果、竜巻が発生したストーム後方の局地前線上でアップドラフトヘリシティが大きくなっており、非スーパーセル竜巻に対してもアップドラフトヘリシティがある程度有効な予測指数であることが分かった。しかし、ストームの背が低いため米国で用いられているものよりも、より下層に着目する必要があることが分かった。竜巻の前兆現象及び検知の特徴を明らかにすることを目的に、気象研究所の固体素子二重偏波レーダーを用いて、2012年つくば竜巻と、2015年に発生したスーパーセルlikeな構造をもった積乱雲について解析を行った。その結果、つくば竜巻の事例では、フックエコーは竜巻発生の10分以上前に出現し、時計回りと反時計回りのエコーの内、反時計回りのエコーが顕在化していたことが明らかになった。スーパーセル竜巻の前兆現象と考えられるフック先端の降水コアの落下について、数値シミュレーションの結果を用いてつくば竜巻の事例で評価した結果、レーダーで捉えるには最低でも500m程度の水平分解能と1分程度の時間分解能が必要であることが分かった。地上データを用いた突風の統計解析について、気象学的な特徴を明らかにすると共に、強風の特徴についても明らかにした。また、二重偏波レーダーを用いて2012年つくば竜巻やスーパーセルlikeな構造をもちながら竜巻をもたらさなかったストームの構造を明らかにした。これらの成果について、国内外の学会等で発表を行った。また、スーパーセル竜巻の前兆現象と考えられるフック先端の降水コアの落下をレーダーで捉えるには、どの程度の時間・空間分解能が必要であるか数値シミュレーション結果から評価を行った。スーパーセルと呼ばれる特殊な積乱雲に伴って強い竜巻がしばしば発生し甚大な被害がもたらされるが、スーパーセル内部の詳細な構造や竜巻の発生機構は十分に理解されていない。
融合蛋白質を用いた微生物の水素発生効率の改変

近年、二酸化炭素濃度の増加に伴う温暖化や、石油資源の枯渇問題が深刻化しており、化石燃料に頼らないクリーンなエネルギーシステムの開発は研究者の責務となっている。環境負荷が少なく、コスト面においても最も優れたシステムの一つは、光合成能を有する微生物に太陽光を吸収させ水を光分解することで水素を生産し、その後水素を燃料電池によって電力へと変換するシステムである。天然の微生物では、吸収された太陽エネルギーのごく一部のみを水素発生に利用するために水素発生効率は低いが、蛋白質工学を応用して水素発生を優先的に行うように改良することが本研究の目的である。著者は、プロトン還元酵素であるヒドロゲナーゼを、光合成反応中心(PSI)に直接組み込むことで、PSIで生じた還元力のすべてを強制的にヒドロゲナーゼへと伝達する人工的な電子伝達経路を創製することで、水素発生効率を飛躍的に向上させることを考案した。そこで、PSIとヒドロゲナーゼのX線結晶構造を用いたコンピューターシミュレーションにより、ヒドロゲナーゼのSmall subunitのC末端を、PSIのサブユニットの一つであるPsaEのN末端に融合させることで、ヒドロゲナーゼをPSI複合体に組み込むことができ、さらにPSIとヒドロゲナーの電子伝達サイトを近接させて連結できることを見出した。そこで、PsaE融合ヒドロゲナーゼとPsaE欠損PSIを別々に調製し、細胞外にてヒドロゲナーゼ-PSI複合体を再構築し、水素発生能の評価や最適化を行った。次にPsaE欠損PSIは、シアノバクテリアのPsaE遺伝子破壊株から調製した。PsaE欠損PSIは、別に調整されたPsaEと容易に結合でき、その結果野生型と同様の活性を回復できることを確認した。さらに、PsaE融合ヒドロゲナーゼとPsaE欠損PSIを細胞外にて再構築し、Hy-PSI複合体の形成を確認し、Hy-PSIからの複合体光水素発生を確認した。現在も光水素発生能向上のための検討を続けている。本研究では、21世紀のエネルギー源である水素を、光合成微生物を利用して太陽光から効率よく生産する技術の確立を目標としている。この目標のために、光合成反応中心から光励起反応により生み出される還元力を、プロトン還元酵素であるヒドロゲナーゼへ効率よく受け渡す仕組みが必要である。そのために、光合成反応中心とヒドロゲナーゼを融合させ、生体内では起こることのない両蛋白質間での電子移動を可能とすることを目指した。光合成反応中心とヒドロゲナーゼの融合蛋白質は、近年明らかになった光合成反応中心(photosystem I)とFeNiヒドロゲナーゼのX線結晶構造をもとに設計した。その結果、FeNiヒドロゲナーゼのスモールサブユニットのC末端に、photosystem I構成成分の一つであるPsaEのN末端を結合させた場合、最も効率よく電子伝達が起こることが予想された。photosystem I-ヒドロゲナーゼ融合蛋白質は、光水素発生能を詳細に評価するために、今回は細胞外で作成することを目的とし、PsaEを融合したヒドロゲナーゼとPsaE欠損photosystem Iを別々に作成した後に再構成するというストラテジーを考えた。PsaE融合ヒドロゲナーゼの作成に関しては、遺伝子操作によって相当する遺伝子を作成し、Desulfovibrio vulgaris、Desulfovibrio furctosovorans、Ralstonia eutrophaに形質転換を行い、PsaE融合ヒドロゲナーゼの発現を確認している。また、PsaE欠損photosystem Iに関しては、シアノバクテリアのPsaE欠損株を埼玉大学の仲本先生から譲渡して頂き単離した。今後PsaE融合ヒドロゲナーゼを精製しphotosystem Iに組み込み、光水素発生効率を検討する予定である。
合理的な空間配置による超複合酵素の創成

近年の合成生物学の目覚ましい進展により、複雑な遺伝子回路を人工的に作成する要素技術はほぼ揃ったが、合成効率が低いため、有用化合物の実用的な生産にはまだ至っていない。有用化合物は、通常、多種の酵素が協調・連鎖して簡単な基質から順次合成されるが、個々の酵素の発現量の制御は難しく、その空間的な配置の制御は殆ど考慮されていないことが問題と考え、本研究では任意のDNA配列に結合するTALエフェクターに着目し、発現量と空間配置の制御に利用できるかを探索した。当初の計画に従いモデル代謝系の構築(遊離の酵素)に関する実験を以下のように実施した。1.Acetyl-CoA以後の抗マラリア薬剤の人工合成経路の初期の3種類の酵素(ERG10, ERG13, tHMG1)すべてについて大腸菌無細胞系にて発現系を構築したところ、すべて可溶性に発現が確認され、Hisタグにて精製された酵素標品を得た。2.すべての基質および中間産物(Ac-CoA, AcAc-CoA, HS-CoA, HMG-CoA, NADPH, Mevalonate, Mevalonate 5-Phosphate)についてNMR測定を行い、酵素反応をモニターする際のリファレンス・スペクトルを取得した。3.各酵素のそれぞれについて試験管内で1H-1次元NMRおよび13C-1H HMQCの時間変化を観察し、リファレンスと比較することで、想定された酵素反応が確かに進むこと、および、その反応の時間変化をNMRで非破壊的・継続的に追えることが確認された。4.上記反応系で、特に、Ac-CoA ←→AcAC-CoAについては平衡が逆反応(Ac-CoA側)に大きく偏っており、順反応よりも副反応のモデルとして有用であることが判明した。5.正反応のモデルとして新たな酵素NphT7を追加で設計し、他の酵素同様に必要となる酵素の発現系の構築、酵素の調製を行なった。6.NphT7についてもその基質(malonyl-CoA)のリファレンス・スペクトルを取得するとともに、NMRにより酵素活性が確認された。上記により4種類の酵素からなる正副反応をもつモデル代謝系の構築(遊離の酵素)に関する実験が終了した。本研究の目的は複数の酵素からなる複合酵素の、各要素の発現量および空間配置の調節・最適化に関する基本的な仕組みを構築することにある。前年度(H26年度)に遊離の酵素によるモデル代謝系の構築に関する実験が終了したため、今年度(H27年度)は各酵素が特定のDNA配列に配置されるよう、事前に設計されたDNA配列に結合するTALエフェクターとの融合タンパク質(TAL酵素)の発現系構築に取り組んだ。まず結合される20塩基対(TACTCTATCATTGATAGAGT)のDNA配列を設計した。それを基に異なる変換規則(i.反転(3'-5'を入れ替える), ii置換(A->T, C->A, T->G, G->C), iii置換かつ反転)により直交性が担保された4種の結合配列を認識するTALエフェクターを設計した。次にGFPレポーターおよび前年度に検討したモデル系の酵素4種(ERG10, ERG13, tHMG1, NphT7)の対象遺伝子について、TAL酵素の大腸菌発現用の発現コンストラクトを作成した。これらを大腸菌の発現株BL21(DE3)株を形質転換したところ、残念なことに、検討したコンストラクトはいずれもコロニーが得られなかった。原因を調査したところ、発現されたTAL酵素(タンパク質)による細胞毒性が原因と考えられる証拠を得たため、現在は細胞毒性軽減するために、コンストラクトの再設計による低毒性化、高制御発現菌株の導入、無細胞タンパク質合成系への移植などの条件を検討している。解析に必要な試料調製は本研究の重要なステップであり、試行錯誤が必要なことから時間を要することは事前に予想された。特にTALエフェクターをコードする核酸配列は繰り返し配列を多く含むためDNAシークエンスによる確認が完全では無いため、発現不良であった場合にはその原因がDNA配列にあるのか、タンパク質発現にあるのかの両方を視野に検討を進める必要がある。本課題はその例で、いずれの検討にも試行錯誤が必要であるため時間を要した。対象タンパク質によらず発現不良であることがわかり、個別の遺伝子の発現の問題ではなく、全体に共通する発現条件やコンストラクトの骨格部分に原因を絞り込むことができた。したがって、その改良により、いずれの対象タンパク質の発現も良化する可能性が高いと考えられる。サンプル調製の段階であるため具体的な解析には至らなかったものの、以上の結果より、各要素の発現量および空間配置の調節・最適化に向けて確実な進捗が得られた。近年の合成生物学の目覚ましい進展により、複雑な遺伝子回路を人工的に作成する要素技術はほぼ揃ったが、有用化合物の実用的な生産にはまだ大きな隔たりがある。有用化合物は、通常、多種の酵素が協調・連鎖して簡単な基質から順次合成されるが、個々の酵素の発現量の制御は難しく、まして、その空間的な配置の制御は殆ど考慮されていない。発現量を制御する方法は天然のタンパク質ーDNA相互作用に依存していて、その個数が数種類と限られているため、より複雑な系へ発展の障害となっていた。また、連続する代謝反応を触媒する複数の酵素を空間的に隣接配置する恩恵は知られていたが、配置する仕組みが簡単でないため、実施例はごく限られていた。本研究では任意のDNA配列に結合するTALエフェクターに着目した。

もしTALエフェクターにより個々の遺伝子の発現量の制御に利用できたならば、事実上、独立に制御できる遺伝子の数に制限がなくなるため、格段に複雑な系への発展が期待された。また、TALエフェクターとの融合タンパク質として各酵素を発現させれば、結合するDNAの構造と配列の制御により、酵素の配置を容易に制御できると考え、その可能性を探索した。抗マラリア薬剤の人工合成系系をモデル系として、試験管内で遊離のERG10, ERG13, tHMG1, NphT7と各基質を添加した13C-1H相関2次元NMRスペクトルにより、中間産物を個別に、かつ、数時間のオーダーで定量的に代謝速度を追える観測系の構築に成功した。しかしながら、遊離の酵素でうまくいった系をTALエフェクターとの融合酵素の系に乗せ換える段階で、いずれの遺伝子でも発現は見られなかった。細胞毒性などを考慮した緻密な発現系の設計が必要と考えられた。近年の合成生物学の目覚ましい進展により、複雑な遺伝子回路を人工的に作成する要素技術はほぼ揃ったが、合成効率が低いため、有用化合物の実用的な生産にはまだ至っていない。有用化合物は、通常、多種の酵素が協調・連鎖して簡単な基質から順次合成されるが、個々の酵素の発現量の制御は難しく、その空間的な配置の制御は殆ど考慮されていないことが問題と考え、本研究では任意のDNA配列に結合するTALエフェクターに着目し、発現量と空間配置の制御に利用できるかを探索した。計画に大きな障害などはなく、予定通り進行している。タンパク質発現に向けて、いくつかの改善案の検討を実施している。1.細胞毒性の悪影響の無い無細胞タンパク質合成系での発現。2.発現に有利なTALエフェクターの認識塩基を必要十分な短い鎖長への変更。3.TALエフェクター作成キットを実績の豊富なキットへの変更。4.発現リークが最小に抑えられる大腸菌菌株の導入。これらにより試料を得て、複合酵素の、各要素の発現量および空間配置の調節・最適化に関する評価を実施する。合成生物学遊離の酵素について問題ないことが確認されたので、次のステップとして酵素を足場DNAに配置させるためのTALエフェクターとの融合タンパク質の発現を進めている。研究に不可欠なサンプル調製実験が継続中のため、その結果により変更の可能性のある試薬など一部の消耗品の購入を次年度に持ち越したため。必要となる試薬の一部で在庫切れ・輸入手配が必要であることが判明し、納期が遅れたため。当初計画に加えて、一部の遅れの出ているサンプル調製実験の結果により必要であることが確定した試薬など一部の消耗品の費用に充てる。試薬の納品時期が遅れたものの、実施すべき実験などについては当初計画に大きな変更はない。
Ab Initio遺伝子軌道法を用いた新生児疾患関連遺伝子ネットワークの同定

周産期医療の進歩により、日本の新生児死亡率は現在世界のトップレベルを維持している。しかし、新生児慢性肺疾患、未熟児網膜症などの合併症は増えており、疾患のさらなる病態解明や治療薬開発が急務である。本研究の目的は、早産児から正期産児までの臍帯血を用いてエクソソーム、lncRNA,miRNA,mRNAの発現解析を行い、データベースを構築し、得られたデータベースを研究協力者の森らが開発したAb Initio遺伝子軌道法(国際出願番号: PCT/JP2018/013877)を用いて解析し、新生児疾患関連lncRNA-miRNA-mRNAネットワークや疾患バイオマーカーを同定することである。
転写のチェックポイントとして機能する基本転写因子TFIIEの情報認識機構の研究

1.TFIIEの欠失変異体の調製と情報認識の際の構造一活性相関の生化学的解析1)構造解析に用いるため、2つあるTFIIEのサブユニットを単独あるいは複合体で大腸菌にて産生させ、S-セファロース、mono-Q、phenyl HPLC等のカラムにて精製した。2)TFIIEのTFIIEβサブユニットの欠質変異体を大腸菌にて産生させ、転写への影響や反応に関与する蛋白質との相互作用を解析した。N末端、C末端から削った変異体及び内部を欠失させた変異体を作成し、解析したところ、N末の50アミノ酸までを削っても転写活性は影響を受けず、C末から13個削ると活性は見られるが野生株の10%以下となった。次にTFIIEβがどの基本転写因子と結合するかを調ると、TFIIBとTFIIFβと強く結合したので、TFIIEβ内のこれら因子の結合領域を解析した。その結果、両者は共にC末端近傍の塩基性領域(アミノ酸257番-277番目)に結合した。2.TFIIEの結晶化とX線構造解析による情報認識機構の検討TFIIEの両サブユニットの精製が完了したので、現在それら全長の蛋白質を結晶化する試みを開始している。3.TFIIHおよびIIEとDNA修復関連蛋白質の相互認識機構の研究精製した蛋白質による無細胞DNA除去修復系を構築し、転写とカップルしたDNA除去修復の際にTFIIHとIIEがいかに情報認識を行なっているかを、精製したこれらの蛋白質を用いて生化学的に解析している。具体的には、現在までに修復因子XPC、XPGとTFIIHとの相互作用が見出された。
地域住民を対象とした耳の健康教育プログラムの開発

本研究では,地域住民の加齢性難聴への理解を深め,適切な対処を可能にするための「耳の健康教育プログラム」を開発する。国内外の加齢性難聴の予防と対策に関する実態を調査するとともに,日本の難聴高齢者とその家族を対象に調査を実施し,健康に寄与するコミュニケーション・ストラテジーを明らかにする。これらの研究結果を検討し,「耳の健康教育プログラム」を開発し,その効果を測定する。さらに振り返りセッションを実施し,プログラム内容を検討・修正する。最終年度には修正したプログラムを実施し,難聴に対する認識,健康,社会的行動の側面から効果を測定する。
有機活性種の創製と機能制御

化学の本質である物質変換に関して,理論を形成したりあるいは新しい知識を得るためにも,また高度に制御された生理活性物質や機能性材料の合成のためにも,物質変換の基本的活性種の創製が最も重要な研究課題の一つである.反応速度論,中間体の検出,構造化学,高選択的合成に関する研究は,それぞれの時代で化学の発展にブレ-クスル-をもたらし,化学の基礎を確立してきたが,21世紀に向けてのブレ-クスル-を行なうには,活性種の新たな創製が必須である.日本が世界の基礎化学に大きく寄与して行くためにも,化学反応の基本的活性種の創製を行ない,その機能制御を計ることが急務である.本研究ではこうした背景をもとに,まず次の4つのテ-マ,1)有機遷移金属錯体活性種の創製,2)有機典型金属錯体活性種の創製,3)有機活性種の創製,4)有機活性種の金属錯体の創製を手掛かりとし,これらの機能制御も併せて企画,調査した.新たなブレ-クスル-を行なうためには有機活性種と有機金属活性種の創製が確実な方法であると認識された.ここで,有機活性種は,2価炭素種やラジカル種に関する重要項目が重点領域研究や特別推進研究に採択されたのに鑑み,主題を有機金属種に置くのが最適と認識され,先に右田教授によって申請している重点領域研究「有機金属化合物の機能調整」に本総合研究(B)を合併させ,重点領域研究として「反応性有機金属分子ー合成と機能制御ー」を申請することとなった.本申請の主題はA)有機遷移金属分子の創製B)有機典型金属分子の創製C)有機金属活性分子の創製D)有機金属分子の認識E)有機金属分子の触媒であり,基礎理念に基づく,有機金属分子および有機金属活性分子の創製を行なうと共に,これらの有機金属分子の特性を解明することが最適であるという結論に達した.化学の本質である物質変換に関して,理論を形成したりあるいは新しい知識を得るためにも,また高度に制御された生理活性物質や機能性材料の合成のためにも,物質変換の基本的活性種の創製が最も重要な研究課題の一つである.反応速度論,中間体の検出,構造化学,高選択的合成に関する研究は,それぞれの時代で化学の発展にブレ-クスル-をもたらし,化学の基礎を確立してきたが,21世紀に向けてのブレ-クスル-を行なうには,活性種の新たな創製が必須である.日本が世界の基礎化学に大きく寄与して行くためにも,化学反応の基本的活性種の創製を行ない,その機能制御を計ることが急務である.本研究ではこうした背景をもとに,まず次の4つのテ-マ,1)有機遷移金属錯体活性種の創製,2)有機典型金属錯体活性種の創製,3)有機活性種の創製,4)有機活性種の金属錯体の創製を手掛かりとし,これらの機能制御も併せて企画,調査した.新たなブレ-クスル-を行なうためには有機活性種と有機金属活性種の創製が確実な方法であると認識された.ここで,有機活性種は,2価炭素種やラジカル種に関する重要項目が重点領域研究や特別推進研究に採択されたのに鑑み,主題を有機金属種に置くのが最適と認識され,先に右田教授によって申請している重点領域研究「有機金属化合物の機能調整」に本総合研究(B)を合併させ,重点領域研究として「反応性有機金属分子ー合成と機能制御ー」を申請することとなった.本申請の主題はA)有機遷移金属分子の創製B)有機典型金属分子の創製C)有機金属活性分子の創製D)有機金属分子の認識E)有機金属分子の触媒であり,基礎理念に基づく,有機金属分子および有機金属活性分子の創製を行なうと共に,これらの有機金属分子の特性を解明することが最適であるという結論に達した.
遺伝子導入を用いた肺高血圧症の病態解析と治療に関する研究

【はじめに】肺高血圧症の肺血管病変形成の分子生物学的なメカニズムにおいて、肺血管へのin vivo遺伝子導入法は新しい有力な方法と考えられる。本研究ではHVJ(hemagglutinating virus of Japan)-リポゾーム法を用いて、肺動脈血管壁へのin vivo遺伝子導入が可能か否かと、エンドセリンの強制発現の解析から、肺高血圧におけるエンドセリンの関与を明らかにすることを主たる目的とする。【方法】HVJ-リポゾーム法は、不活化したHVJの融合能を有する膜蛋白を利用しリポゾームに封入した遺伝子を直接細胞に導入する方法で、組織の炎症が少なく導入効率が高いことが特徴である。68週齢のSDラット(200g250g)を開胸下に左肺動脈を表出し、調整したHVJ-リポゾームを左肺動脈に選択的に注入した。遺伝子導入処置後2週間目に肺の病理組織をHE染色ならびに免疫組織化学染色を用いて検討した。遺伝子導入の効果を検討するためにβ-galactosidase(β-gal)geneを、エンドセリンに関してはpreproendothelin-1(ET-1)geneを導入した。【結果】HVJ-リポゾーム法により1)肺動脈血管壁においてβ-galの強い発現を確認した。2)肺血管壁以外では肺胞上皮やマクロファージの一部にβ-galの発現を認めた。3)ET-1導入実験では肺動脈中膜平滑筋細胞においてET-1の高度発現が認められた。さらに、4)ET-1導入群において対照群(目的遺伝子を含まないHVJ-リポゾーム投与群)に比較し中小肺動脈から細小動脈の中膜平滑筋層の有意な肥厚(% medial wall thickness;70.3±7.7%vs.45.9±7.0%)が認められた。【まとめ】HVJ-リポゾーム法によりラット肺動脈血管壁へのin vivo遺伝子導入が可能である。本法によるエンドセリンの高度発現により、肺高血圧症の基本的病理変化である中膜肥厚が再現された。in vivo遺伝子導入は肺血管病変の病態解析の有力な手段となり得ることが示唆された。
高りん含有鉄鉱石からりんを除去するための基礎研究

本研究は鉱石中のりん酸化物を還元し、気体のりんとして除去できるかどうかを検討することを目的とした。市販のFe_2O_3に同じく市販のP_2O_5を拡散させ試料とした。この粉末試料をCO-CO_2混合ガスで還元した。パラメータは酸素分圧(すなわちCO-CO_2の混合比)あるいは混合ガスの流量とした。試料をC粉末と混合させCOで還元することも試みた。1mass%のりん含有率の試料でも、約30%の脱りん率を達成できた。脱りん速度と時間の関係はりん濃度に対する見かけの一次反応として整理できた。ガスの総流量によってみかけの反応速度は変るので、反応の律速段階は試料表面付近に形成された還元ガス側の境膜内の気体りんの移動律速であることが推定された。みかけの反応速度定数の温度依存性はアレニウスの式で記述できた。還元ガスの酸素ポテンシャルが酸化鉄から金属鉄を生成するような領域では、脱りんが進行しないことがわかった。還元後試料をX線分折したところりん化鉄が多量検出されたので、還元生成した気体りんが還元鉄に吸収されるため脱りん率が上がらないものと考えられる。上記研究成果を製鋼スラグからの脱りんにも応用できるかどうかも確かめた。試料は実スラグではなくアルミナるつぼ中でCaO-SiO_2一Fe_2O_3-P_2O_5を溶融作成したものを凝固させた後粉末化したものを用いた。この実験でも酸化鉄から金属鉄を生成するような酸素ポテンシャル領域では脱りんしないことが明かとなった。我が国の鉄鉱石の多くはオーストラリア産の高品位鉱である。近年、この高品位鉱も減少の傾向にあり、価格の上昇が懸念されている。一方、現在使用されている鉱石品位より不純物濃度の高い低品位鉱は既開発鉱山の採掘可能地域に多く賦存している。今後これを有効利用しなければならない。利用の際に問題となるのはりん含有量が多いことである。製鋼工程での脱りんは経済性の問題があるので、鉱石段階で脱りんすることのできるようにすることが、本研究の目的である。本研究は鉱石中のりん酸化物を還元し、気体のりんとして除去できるかどうかを検討した。試料をC粉末と混合させたCOで還元することも試みた。lmass%のりん含有率の試料でも、約30%の脱りん率を達成できた。ガスの総流量によって反応速度は変るので反応生成物は気体りんと推定される。還元ガスの酸素分圧が高いと脱りん率が高いので生成した気体りんは還元鉄に吸収されていることが推定された。本研究の鉱石中のりん酸化物を還元し、気体のりんとして除去できるかどうかを検討することを目的とした。試料をC粉末と混合させてCOで還元することも試みた。
空間グラフの位相幾何学的分類

当初の年次計画に沿って研究を進めようとしたが、私と同様の研究を推し進める海外のグループ(M.Chiodo, D.Heard, C.Hodgson, B.Martelli, C.Petronio, J.Saunderson, N.Sheridan)の存在を知り、彼らの研究を知ることをまず行なった。彼らの手法は私と酷似していたものの、空間グラフを分類する上で必要不可欠となる不変量をコンピュータプログラムで独自に開発していた。一方、私が採用していた多項式不変量はコンピュータプログラムのみで計算させるには多くの問題を抱えている。今後の課題のひとつとしては、それを実現に導くことが挙げられる。Heard氏が2006年11月に大阪産業大学で発表された際には、有意義な意見交換を行なう事が出来たのは僥倖である。7交点以下の手錠グラフの表についてまとめた論文『A table of handcuff graphs with up to sevencrossings』をOCAMIStudiesに投稿し受理されたものの、残念ながら他の空間グラフの数え上げに関しては上記のグループの方が進度は速かった。私は少し目先を変え、空間グラフの性質について研究をし始めた。それまではアンビエントアイソトピーとよばれる標準的な同値関係で分類の研究をしていたが、近傍同値とよばれるもう少し緩い同値関係での空間グラフのふるまいについて考えてみることにした。近傍同値にっいての研究は近年少し停滞気味ではあったので、過去の文献にあたりつつも独自の手法を模索している最中である。平成18年度に行なった最大の事としては、今までの研究を上記の論文にまとめた上で、日本数学会や他分野の研究集会(MSJ-IHES Joint Workshop on Noncommutativity)や院生談話会において一般の数学者に対して出来るだけわかりやすく発表したというのが挙げられる。他分野の研究は理解しにくいとされる中で、初歩的ではあるが多数の質問を得られたので私の研究に興味を持ってもらえたものと確信している。
放射線治療を受ける口腔癌患者の食思傾向を判断するオーラルアセスメントツールの開発

2008年度の調査では、オーラルアセスメントツールを構成する質問項目を検討するため構造方程式モデリングを行い、28項目からなる5段階評価スケールを作成した。この結果をふまえ、2009年度の調査は、208名の口腔癌患者を対象として、患者の食思傾向を判断するオーラルアセスメントツールの信頼性・妥当性を検証した。平成20年度の調査は、本邦の128名の口腔癌患者を対象として、放射線治療にともなう有害事象(味覚障害・口腔乾燥症状・口腔粘膜炎)、唾液分泌量の日内変動、鎮痛剤の使用、口腔ケアの回数、対象特性(性別・年齢・喫煙指数・義歯本数)および食思傾向との関連性を明らかにすることを目的とした。著者がパス解析を用いて20/30/50Gyの食思傾向に影響する項骨を検証したところ、20Gyの食思傾向は喫煙指数、年齢、味覚感度から影響を受け(R2=0.48, p<0.001)、30Gyの食思傾向は口腔ケアの回数、口腔乾燥症状、年齢、味覚感度、口腔粘膜炎から影響を受け(R2=0.52, p<0.001)、50Gyの食思傾向は唾液の出にくい時間帯【朝】、口腔ケアの回数、口腔乾燥症状、味覚感度、鎮痛剤の使用、口腔粘膜炎から影響を受けることが明らかとなった(R2=0.62, p<0.001)。この結果をもとにオーラルアセスメントツールを構成する質問項骨を検討するため構造方程式モデリングを行ったところ、味覚感度に関する6項目、口腔内乾燥症状に関する5項骨、口腔粘膜炎に関する5項骨、喫煙に関する3項目、年齢に関する2項目、口腔ケアに関する3項目、唾液分泌量の日内変動に関する2項目、鎮痛剤の使用に関する2項目の8次元、28項目からなる5段階評価スケールを作成した。これらの成果を踏まえ、平成21年度は放射線治療を受ける口腔癌患者200名程度を対象として、患者の食思傾向を判断するオーラルアセスメントツールを作成し、信頼性・妥当性を検証していく。平成20年度の調査では、オーラルアセスメントツールを構成する質問項目を検討するため構造方程式モデリングを行い、味覚感度に関する6項目、口腔内乾燥症状に関する5項目、口腔粘膜炎に関する5項目、喫煙に関する3項目、年齢に関する2項目、口腔ケアに関する3項目、唾液分泌量の日内変動に関する2項目、鎮痛剤の使用に関する2項目の8因子、28項目からなる5段階評価スケールを作成した。この結果をふまえ、平成21年度の調査は、本邦の208名の口腔癌患者を対象として、患者の食思傾向を判断するオーラルアセスメントツールの信頼性・妥当性を検証した。まず8次元、28項目の信頼性は、折半法でSpearman-Brown法の公式により算出した信頼係数は0.78であり、アセスメントツールの信頼性が確認された。構成概念妥当性については、当初、仮説的概念を8因子にしていた。しかし、項目を除外していく中で因子的妥当性により適合するモデルが示唆され、最終的には7因子となった。基準関連妥当性については、オーラルアセスメントツール得点とAppetite Assessment Scale of Cancer(癌患者の食欲尺度35項目)得点との相関係数を算出したところ、両者の総得点の間には総じて有意な正の相関が認められた。なお、各施設間、対象者の年齢、性別、喫煙の有無、義歯装着の有無別にアセスメントツール平均点をMann-Whitney Utestを用いて比較したところ、施設間や対象属性と得点間に有意な差は認められず、これによりアセスメントツールが施設間および対象属性から影響されないことが確認された。