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インスリン抵抗性改善を目指したDGKδによる筋分化促進機構の解明

ジアシルグリセロールキナーゼδ(DGKδ)は骨格筋においてグルコースの取り込みを正に制御するが,2型糖尿病のインスリン抵抗性改善のためには,2型糖尿病患者で減少する骨格筋量を増加させ,グルコース取り込み量を増加させることが重要である.本研究により,DGKδは,プロテインキナーゼCの活性を減少させ,cyclin D1の発現抑制に関わることで,筋分化を正に制御することを明らかにした.さらに,DGKδの発現はミリスチン酸により増加するが,この発現増加は,グルコースの取り込みを正に制御することも明らかにした.本研究の目的は,インスリン抵抗性改善を目指したジアシルグリセロールキナーゼδ(DGKδ)による筋分化促進機構の解明へ向けて,研究計画書に基づき,1.細胞レベルでのミリスチン酸によるDGKδの転写調節機構と2. DGKδによる筋分化促進機構を解明のために研究を遂行し,以下の成果を得た.1.マウスC2C12筋芽細胞へのミリスチン酸添加は,DGKδの発現を転写レベルで増加させ,グルコースの取り込みを増加させる.従って,グルコースの取り込み増加がミリスチン酸によって発現増加したDGKδによって制御されているのか否かを確認するために,DGKδの発現を抑制したところ,ミリスチン酸添加によって増加するグルコースの取り込みが抑制された.逆に,DGKδを安定高発現させた細胞ではグルコースの取り込みが増加することがわかった.以上より,ミリスチン酸によるDGKδの発現増加は,グルコースの取り込みを正に制御することが強く示唆された.2. C2C12筋芽細胞を用いて,筋分化過程におけるDGKδと筋分化マーカーの発現パターンを調べたところ,筋形成制御因子myogeninと細胞周期からの分化移行に関与するcyclin D3は分化48時間後に誘導され,逆に,細胞周期調節因子cyclin D1は分化24時間以内に顕著に減少した.一方で,DGKδの発現は分化48時間に半減していた.この分化過程においてDGKδの発現を抑制したとき,分化48時間後のmyogeninとcyclin D3の発現が抑制され,逆に,cyclin D1は増加することがわかった.さらに,筋形成に関わるmyosin heavy chainの発現細胞数は半減していた.以上より,DGKδは,細胞周期から分化への移行を正に制御する役割を担うことが考えられた.細胞レベルでのミリスチン酸によるDGKδの転写調節機構の解明に関しては,ミリスチン酸によるDGKδの発現増加は,グルコースの取り込みを正に制御することが強く示唆された.一方で,DGKδによる筋分化促進機構を解明においては,DGKδは,細胞周期から分化への移行を正に制御する役割を担うことが考えられ,予定通りの成果を得ることができた.従って,全体的に本研究は平成27年度の実施計画に基づきおおむね順調に進展していると判断した.インスリン抵抗性改善を目指したジアシルグリセロール(DG)キナーゼδ(DGKδ)による筋分化促進機構の解明へ向けて,前年度,1C2C12筋芽細胞の筋分化過程において,細胞周期調節因子cyclin D1は分化24時間に顕著に減少し,DGKδの発現はcyclin D1の発現減少より遅れて分化48時間後に減少することを示した.さらに,2DGKδの発現を抑制したときには,分化48時間後の筋形成制御因子myogeninの発現誘導とcyclin D1の発現減少は抑制されることを示した.本年度においても,DGKδの発現を抑制したところ,分化48時間後のmyogeninの発現誘導とcyclin D1の発現減少は抑制されることを示し,昨年度同様の解析結果を得ることが出来た.従って,次にDGKδによる筋分化制御メカニズムを明らかにすることにした.DGKの基質DGはconventional/novel protein kinase C(cnPKC)を活性化し,一方で,代謝物PAはmammalian target of rapamycin(mTOR)を活性化する.そこで,DGKδの発現抑制によるPKC及びmTORシグナルへの影響を評価したところ,分化48時間後のcnPKCの発現量及びリン酸化レベルは有意に増加することがわかった.分化24時間後においてもDGKδの発現抑制により,myogeninの発現誘導は殆ど抑制されないにも関わらず,cyclin D1の発現量とcnPKCのリン酸化レベルは増加することが示された.筋分化過程において,DGKδの発現減少はcyclin D1の発現減少より遅れることから,DGKδは筋分化の誘導のためにPKC活性を減少させ,cyclin D1の発現抑制に関わることが示された.ジアシルグリセロールキナーゼδ(DGKδ)は骨格筋においてグルコースの取り込みを正に制御するが,2型糖尿病のインスリン抵抗性改善のためには,2型糖尿病患者で減少する骨格筋量を増加させ,グルコース取り込み量を増加させることが重要である.本研究により,DGKδは,プロテインキナーゼCの活性を減少させ,cyclin D1の発現抑制に関わることで,筋分化を正に制御することを明らかにした.さらに,DGKδの発現はミリスチン酸により増加するが,この発現増加は,グルコースの取り込みを正に制御することも明らかにした.1.細胞レベルでのミリスチン酸によるDGKδの転写調節機構の解明ミリスチン酸によるDGKδの発現増加は,グルコースの取り込みを正に制御することが強く示唆されたことから,28年度はDGKδのプロモーター領域をルシフェラーゼ遺伝子上流に組み込んだプラスミド(作製済み)を用いてプロモーター解析を行い,ミリスチン酸に関連する転写因子を同定する.2.細胞レベルでのDGKδによる筋分化促進機構の解明

DGKδの発現をsiRNAを用いて抑制したとき,myogeninとcyclin D3の発現が抑制され,逆に,cyclin D1は増加していた.さらに,筋形成に関わるmyosin heavy chainの発現細胞数は半減していたことから,DGKδは,細胞周期から分化への移行を正に制御する役割を担うことが考えられた.従って,28年度は,DGKδの高発現株をレンチウイルスを用いて作製し,DGKδの発現を高発現したときには,逆に,分化が促進されるか否かを明らかにする.さらに,ミリスチン酸はDGKδの発現を増加させることから,ミリスチン酸添加時に分化が促進されるか否かを調べる.最近,申請者らは,筋細胞におけるグルコースの取り込みのために,DGKδはPCに由来するパルミチン酸含有DG分子種を選択的に代謝することが重要であることを示した.従って,筋分化過程においても,DGKδはPCに由来するパルミチン酸含有DG分子種を代謝するのか否かを明らかにする.3.骨格筋におけるミリスチン酸によるDGKδ発現増加と骨格筋量の増加(グルコース取り込み増加)との関連性野生型マウスの餌にミリスチン酸を添加し,マウス骨格筋中のDGKδの発現が増加するか否かを調べる.また,DGKδの発現増加時には,骨格筋量が増加することを確認する.さらに,増加した骨格筋量とグルコース取り込み量増加との関連性について,血中グルコースの濃度の変化を調べることで明らかにする.脂質生化学本研究の遂行のためには多くの細胞培養用の試薬・器具を必要とするが,研究が順調に遂行でき,結果的に,予算の節約に繋がった.生じた使用額については,次年度,DGKδの安定高発現株を新たに作製する必要があるため,その発現株の作製のための試薬類に使用する予定である.
非定温加熱殺菌における微生物耐熱性変動の解析とその予測理論の適用

加熱加工食品の微生物学的安全性の確立のために、より信頼性の高い殺菌条件の設定方法を開発する必要がある。本研究においては、従来から当研究室で問題視してきた非定温過程における微生物の耐熱性の上昇反応の解析を行い、それをもとに熱死滅のデータベース作成に反映させ、さらに殺菌予測理論の構築とその適用へ展開することを企図した。平成10年度においては、37°Cで培養した大腸菌を各予備保温温度で処理後、55°Cに希釈法によって加熱し、その温度でのD値を指標に予備保温温度の耐熱性に及ぼす影響を検討した。加熱時の希釈率が10倍のときには、22°C前後以下で次第に耐熱性が連続的に低下したのに対し、100倍希釈の場合、この温度で不連続となり、急激な低下を示した。50倍希釈ではこれらの中間的な挙動を示した。さらに、37°C以上の予備保温では全く異なった様相を示し、各予備保温温度に依存した熱耐性値で一定にならずに耐性が上昇しつづけた。一方、培養温度を37°Cの代わりに15°Cで行うと、予備保温が比較的短時間の間は予備保温温度によらずほぼ同じ耐熱性を示したが、長期の保温では耐熱性が上昇する傾向にあった。平成11年度においては、予備保温中の耐熱性化の過程を解析した。D値上昇の初速度を計算したところ、10°Cでは極めて緩慢に、15°C以上では温度に応じて耐熱性化の速度が大となることがわかった。最終到達定常のD値として得られる平衡の耐熱性値は15°C以上で60秒と一定となったが、10°Cでは低い値で一定となった。このことは、比較的急速な昇温過程を伴う加熱処理では、加熱前の温度がその後の熱死滅の程度に大きく影響することを確証づけるものである。得られた耐熱性化反応の速度定数の予備保温温度依存性を見るため、アレニウスプロットをとったところ、15°C以上で直線となり、その勾配から得られた活性化エネルギーは111.7kJ/moleとなった。関連研究として、熱死滅データベース作成作業を進め、本研究で得られた成果をこれに反応させた。殺菌プロセスの信頼性の高い評価法と加熱加工食品の賞味期限設定の理論的基礎の確立が要求されていることから、非定温加熱過程による微生物の耐熱性の変動を考慮した殺菌理論の構築を図ることを目的とし、本研究では大腸菌を用いて予備保温温度の変化による死滅過程を系統的に解析した。まず、37°Cで培養した大腸菌を各予備保温温度で処理後、55°Cに希釈法によって加熱し、その温度での90%死滅時間であるD値を求めることにより、予備保温温度の耐熱性に及ぼす影響を検討した。加熱時の希釈率が10倍のときには、既報のような膜脂質相分離開始温度に相当する22°C前後以下で次第に耐熱性が連続的に低下したのに対し、100倍希釈の場合、この温度で不連続的で急激な低下を示した。

さらに、37°Cを超える温度での予備保温の場合には全く異なった様相を示し、各予備保温温度に依存した熱耐性値で一定にならずに耐性が上昇しつづけた。一方、培養温度を37°Cの代わりに15°Cで行うと、予備保温が比較的短時間の間は予備保温温度によらずほぼ同じ耐熱性を示したが、長期の保温では耐熱性が上昇する傾向にあった。これらのことは、比較的急速な昇温過程を伴う加熱処理では、加熱前の温度がその後の熱死滅の程度に大きく影響すること、この要因としては細胞膜脂質の相転移、相分離が有力視されること、しかし、生育温度以上の温度での保温はおそらく熱ショック応答に依存した熱抵抗性化が関与するものと推察された。またこれらの知見は非定温過程が加熱殺菌の効果や成否に著しい影響本与える可能性を指摘するものであることが判明した。信頼性の高い殺菌プロセスの評価法と加熱加工食品の賞味期限設定の理論的基礎の確立が要求されている。非定温加熱過程による微生物の耐熱性の変動を考慮した殺菌理論の構築を図ることを目的とし、前年度に引き続き、予備保温温度の変化による大腸菌の死滅過程について検討し、今年度においては予備保温過程の細胞耐熱性化反応を解析した。37°Cで培養した大腸菌洗浄細胞をリン酸緩衝液中で0°Cから各予備保温温度へ10培希釈法によって昇温後、各時間試料をとり、それぞれ55°Cに100倍希釈法によって加熱後、その生存曲線の死滅速度(D値)を耐熱性の指標とした。予備保温中の耐熱性化の過程をD値上昇の初速度から計算したところ、10°Cでは極めて緩慢に、15°C以上では温度に応じて耐熱性化の速度が大となった。最終到達定常のD値として得られる平衡の耐熱性値は15°C以上で60秒と一定となったが、10°Cでは低い値で一定となった。このことは、比較的急速な昇温過程を伴う加熱処理では、加熱前の温度がその後の熱死滅の程度に大きく影響することを確証づけるものであり、またこの現象の要因として、細胞膜脂質の相転移、相分離の関与の仮説と矛盾しないものである。得られた耐熱性化反応の速度定数の予備保温温度依存性を見るため、アレニウスプロットをとったところ、15°C以上で直線となり、その勾配から得られた活性化エネルギーは111.7kJ/moleとなった。おそらく細胞膜脂質の物性変化に依存した細胞膜内の反応が耐熱性化に寄与しているものと推察した。
c-Met キナーゼ Allosteric 部位を主標的とした新規制癌剤の創製

癌遺伝子c-Metの産物であるc-Metキナーゼは、癌発達・進展の全ステップに関与するマスター的分子である。私共は、c-Metのキナーゼ活性を抑制的に制御するタンパク質分子を見い出し、その相互作用解析から、この制御タンパク質はc-MetキナーゼのAllosteric部位に結合することを明らかにした。さらに、この制御タンパク質ミメティック阻害ペプチド(Vpep)を分子設計した。このVpepの結合配座をコンピュータシミュレーション手法により解析し、その予測複合体モデルを基にVpepミメティック低分子化合物(Ai : Allosteric inhibitor)への変換設計を、私共が開発したCOSMOS法を用いて行い、2種のAiを見い出した。その内の一つのAi1を用いて、既存c-Met Catalytic inhibitors(Ci)の阻害効果への影響を解析した。その結果、興味深いことに、Ai1はほぼ全てのCiのc-Met阻害効果を増強した。AiのCi増強効果を理解するために、顕著な阻害効果を示すAi1とCiとしてPHAを用いて、Ai1/PHAの結合様式を高エネルギー加速研究機構の支援の下に、複合体のX線結晶構造解析により明らかにすることを進めた。しかし、リコンビナイトc-Metの多量作製、及びAi1とPHAとの共結晶化が難航している。そこで、コンピュータシミュレーション手法を用いて、Ai1/PHAのC-Met複合体予測モデル構造の構築を行った。ここでは、その複合体予測モデル構造解析からAi/Ci Dual inhibitorの分子設計を詳細に行い、その複合体予測モデル構造の精度を上げることによって、Ai-Ciとの連結によるDual inhibitorsの最適化分子設計を行った。現在、その化学合成を行い、阻害活性を評価している。このin silico設計手法により、Ai-Ci連結による新規c-Met Dual inhibitorsの創製ができることが期待される。c-Met癌遺伝子産物は、癌発達・進展の全ステップに関与するマスター的なシグナル伝達タンパク質分子である。私共は、c-MetのKinase活性を抑制的に制御するタンパク質分子を見い出し、その結合領域解析から、Allosteric部位に結合する阻害ペプチド(Vpep)を分子設計した。このVpepの結合配座を基にVpepミメティック低分子化合物(Ai : Allosteric inhibitor)への変換設計を、私共が開発したCOSMOS法を用いて実施した。その結果、2種のAiを見い出すことに成功した。その内の一つのAi1を用いて、既存c-Met Catalytic inhibitors(Ci)の阻害効果の変化を解析した。その結果、興味深いことに、CiとしてPHAをはじめとする既知c-Met阻害剤がAi1と相乗効果を示すことが明らかとなった。現在、顕著な阻害効果を示すAi1/PHAを用いて、Ai1/PHAの結合様式を高エネルギー加速研究機構の支援の下に、複合体X線結晶構造解析から解明することを行っている。しかし、リコンビナイトc-Metの作製、及びAi1とPHAとの共結晶の作製等が難航していることから、X線結晶解析まで行っていないのが現状である。そこで、コンピュータシミュレーション技術より、Ai1/PHA結合複合体予測モデル構造の構築を進めている。実際には、X線結晶構造解析データから詳細なAi/Ci Dual inhibitorの分子設計をしたい所であるが、現状では、その複合体予測モデル構造の精度を上げることによって、Ai-Ciとの連結による新規Dual inhibitorsの設計を行う計画を進めている。このような方向からも、新規c-Met Kinase阻害剤の創製ができることが期待される。本研究は、c-Met Kinaseの新たなDual inhibitorsの創製を、そのAllosteric部位を主標的に分子設計することが主眼となっている。c-Met KinaseのAllosteric inhibitor(Ai)として新規低分子化合物をCOSMOS法により、2つ見い出しており、既存のc-Met Catalytic inhibitor(Ci)であるPHAとの相乗的な阻害効果も明らかになった。そこでその共結晶によるAi1/PHAの複合体X線結晶構造解析を高エネルギー加速研究機構の協力によって進めているが、難航している。これが(3)やや遅れていると判断した理由である。顕著な阻害効果を示すAi1とCiとしてPHAを用い、Ai1/PHAの結合様式を高エネルギー加速研究機構の支援の下に、複合体のX線結晶回折からの解明を進めているが、リコンビナイトc-Metの作製、及びAi1とPHAとの共結晶の作製等が難航している。そこで、コンピュータシミュレーション技術を用いて、Ai1/PHA結合複合体予測モデル構造の構築を行った。つまり、X線結晶構造解析データからAi/Ci Dual inhibitorの分子設計を詳細に行いたい所であるが、現時点では、その複合体予測モデル構造の精度を上げることによって、Ai-Ciとの連結によるDual inhibitorsの分子設計を行う方針に変えている。現在、分子設計した化合物の化学合成を行っている。このin silico手法により、Ai-Ci連結による新規c-Met Dual inhibitorsの創製ができることを期待したい。X線結晶解析に必須なリコンビナイトタンパク質の作製、及びX線結晶解析の依頼がスムーズにいかないことは、非常に残念である。これでは海外との競争に遅れをとってしまう。

癌遺伝子c-Metの産物であるc-Metキナーゼは、癌発達・進展の全ステップに関与するマスター的分子である。私共は、c-Metのキナーゼ活性を抑制的に制御するタンパク質分子を見い出し、その相互作用解析から、この制御タンパク質はc-MetキナーゼのAllosteric部位に結合することを明らかにした。さらに、この制御タンパク質ミメティック阻害ペプチド(Vpep)を分子設計した。このVpepの結合配座をコンピュータシミュレーション手法により解析し、その予測複合体モデルを基にVpepミメティック低分子化合物(Ai : Allosteric inhibitor)への変換設計を、私共が開発したCOSMOS法を用いて行い、2種のAiを見い出した。その内の一つのAi1を用いて、既存c-Met Catalytic inhibitors(Ci)の阻害効果への影響を解析した。その結果、興味深いことに、Ai1はほぼ全てのCiのc-Met阻害効果を増強した。AiのCi増強効果を理解するために、顕著な阻害効果を示すAi1とCiとしてPHAを用いて、Ai1/PHAの結合様式を高エネルギー加速研究機構の支援の下に、複合体のX線結晶構造解析により明らかにすることを進めた。しかし、リコンビナイトc-Metの多量作製、及びAi1とPHAとの共結晶化が難航している。そこで、コンピュータシミュレーション手法を用いて、Ai1/PHAのC-Met複合体予測モデル構造の構築を行った。ここでは、その複合体予測モデル構造解析からAi/Ci Dual inhibitorの分子設計を詳細に行い、その複合体予測モデル構造の精度を上げることによって、Ai-Ciとの連結によるDual inhibitorsの最適化分子設計を行った。現在、その化学合成を行い、阻害活性を評価している。このin silico設計手法により、Ai-Ci連結による新規c-Met Dual inhibitorsの創製ができることが期待される。c-Met-Ai/Ci複合体結晶構造解析を引き続き高エネルギー加速研究機構と進めていく一方で、コンピュータシミュレーション技術を駆使して、Ai/Ci複合体予測モデル構造を構築することを実施する。この様な方策により、Ai1/PHAの結合様式のモデル構造を予測することから、Ai/CiのTetheringによる、新たなDual inhibitorsを分子設計する。これによって、新規c-Met阻害制癌剤リード化合物を創製することを第2戦略として目指す予定である。
金属多結晶材料における遺伝的局所組織情報の抽出と結晶粒組織転写技術の開発

本年度は組織情報の蓄積として、5083アルミニウム合金板の摩擦攪拌処理実験と950Mpa級鋼用溶接金属組織のEBSP解析実験を行った。結晶粒転写技術開発用の実験としては、モンテカルロ法による計算機シミュレーション実験を行った。以下にそれぞれの概要を説明する。摩擦攪拌処理を5083アルミニウム合金板(3mm厚)に対してビードオンプレート法により施し、板断面組織の詳細を光学顕微鏡法ならびにSEM-EBSP法にて解析した。攪拌条件は、回転速度を3002000rpm、送り速度を100500mm/min.の範囲で変化させた。攪拌部には微細結晶粒組織が形成され、最小結晶粒サイズとして1.7μmを達成した。この組織の特徴は高温で不安定であることにあり、773K以上の温度域で異常粒成長が発現することを確認した。すなわち、遺伝的組織情報として、ガン細胞のように周囲の組織を侵食して成長する結晶粒が材料内に埋め込まれたと考えることができる。溶接金属組織の解析では、予熱温度が高くなるにつれてフェライト粒の形状がラス状から塊状へと変化することが明らかになった。この組織状態は本材料特有の結晶粒形状として特徴的な変化を示しており、組織転写基礎情報として有用である。結晶粒組織変化過程のモンテカルロシミュレーション実験では、第2相粒による粒界移動のピン止め効果を再現することに成功し、さらに溶質元素の排出を伴うタイプの析出過程の計算では析出物のフロントにおいて溶質濃度の上昇が析出駆動力を下げることにより析出反応速度を減ずることを見出した。これらの計算結果は目的とする材料の上に粒界移動を抑制する元素をコーティングすることによる結晶粒組織の転写が可能であることを裏付けるものである。本年度は、組織転写用チャンバーの試作ならびにA1合金摩擦攪拌接合(FSW)組織の解析を行った。チャンバーは真空環境下でレーザビームを導入して試料表面を局所的に加熱することができるようになっている。さらに、外部から電力を供給して試料全体を加熱できるようにも設計されている。レーザビームを照射して組織変化を制御する実験は次年度に予定している。次に、7075Al合金同種材のFSW組織の解析を行った。この接合法により摩擦攪拌部の結晶粒サイズは5ミクロン以下に微細化されるが、硬さは最も低い値を示すことが明らかになり、その原因としては析出物の固溶が考えられた。Electron Back-Scattering Pattern(EBSP)法により結晶方位の空間的分布状態の詳細を調べ、本接合法で得られた組織の特徴としては板厚方向へ、すなわち接合ピンに平行な位置関係において(111)面が存在する確率が高いことを見出した。5083と6061Al合金の異材FSW実験においては、摩擦攪拌部の外周部近傍ではMgが完全に固溶しておらず、オニオンリングの層状組織に対応するようにMgの濃度ゆらぎが観察された。上記同種材接合と同様に結晶粒サイズは10ミクロン程度まで微細化されていることが明らかになった。EBSP解析より、板面方位集合組織では接合ピンの両側で対象的な図形となることがわかった。これは方位形成過程においてピン周囲の塑性流動の対象性を示していると考えられた。空間的方位分布については、局所領域内で大きな方位変化を生ずるような結晶粒の配置となっており、複雑な組織形成過程が生じたことを示している。また、この接合体では高温熱処理により母材よりも早く粒成長が開始し、異常粒成長モードで組織が粗大化することを実験的に確認した。この異常粒成長現象の原因となる組織状態がFSW処理により材料内に書き込まれたことになる。
新規構造体の創製による金属インプラント力学機能の生体模倣化

報告者らは、種々のスケール、機能を有する材料の複合化による骨類似の低ヤング率、衝撃吸収性を併せ持つ構造体の創製を目指している。本年度では、粉末充填型ポーラス構造体が低ヤング率および高衝撃吸収性を示すことを明らかにするとともに、両力学機能の支配因子を解明するなど、これまで全く知られていなかった以下のような知見を見出し、学術論文、学会発表として発表した。1.「粉末」部と「壁」部を共存させただけの構造体は、最大応力到達後に破断していたのに対し、熱処理を行ない「粉末」部と「壁」部での物理的接着が認められた粉末充填型ポーラス構造体では、最大応力に到達後、一定の応力で変形が進行するプラトー領域の発現が認められた。さらに、熱処理時間の増大にともなうプラトー応力が上昇していた。以上の結果より、三次元形状設計および電子ビーム照射条件を最適化による、「粉末」部と「壁」部からなる新規複合構造体の創製が、生体骨組織類似の低ヤング率および高衝撃吸収性を有した材料の開発に有効であることが明らかとなった。2.粉末充填型ポーラス構造体のヤング率の、「壁」部の気孔率および気孔形状に対する強い依存性、さらに気孔形状の最適化による異方性の付与が明らかとなった。3.一方、衝撃吸収性は「粉末」部のマクロスケールの構造に強く依存した。さらに、複合則により導出された「粉末」部のヤング率はネックサイズ比の2乗に比例しており、複合構造体の力学機能制御には、「粉末」部に存在する粉末間のネックサイズ比の制御が重要であることが明らかとなった。本年度では、電子ビーム積層造形法を駆使することで、粉末充填型ポーラス構造体という、非常に新規性の高い構造体の創製に成功した。さらに、本構造体の構造制御手法や微細組織について、既に、これまで全く知られていなかった以下のような知見を見出し、学術論文、学会発表として発表した。(a)ポーラス構造体と本研究にて作製した構造体の中央断面のCT画像を比較すると、気孔部でコントラストが変化したことから、構造体中での粉末の残存が確認された。これは、三次元形状設計および電子ビーム照射条件を最適化させることで、「粉末」部と「壁」部からなるTi-6Al-4V製複合構造体の作製に本邦で初めて成功したことを示す。(b)複合構造体の構成相はほぼα相であり、さらにラス状の均一な微細組織を呈するなど、これまでの研究にて作製された三次元多孔体と同様の結果を示した。従って、微細組織に対する粉末充填の影響は小さいと考えられる。(c)粉末充填型ポーラス構造体中の「壁」部においては、造形方向に進展した柱状晶の形成が確認された。これは、「壁」部が、一方向性溶融凝固の繰り返しにより形成されるためだと考えられる。溶融凝固後の冷却過程では、形成されるβ粒から変態するときに、α相へと変態するが、この際バリアントの選択性は見られなかった。(d)変態点直下で、種々の時間保持により、構造体中の「粉末」部間でのネックサイズ比が制御可能であった。ネックサイズ比の熱処理時間依存性から、ネック形成機構は、体積拡散によることが明らかとなった。本研究では、同一組成を持ちながら異なる力学機能を有する材料の複合体、すなわち粉末充填型ポーラス構造体という新規構造体の開発を行い、低ヤング率、衝撃吸収性を兼ね備えた生体用インプラント材料の創製を目指す。

研究実績の概要にもあるように、初年度に計画していた粉末充填型ポーラス構造体の作製に成功し、その微細組織の解明を行うとともに、熱処理の実施により、「粉末」部の構造制御に成功するとともに、そのメカニズムを明らかにした。粉末充填型ポーラス構造体の作製およびその微細組織や構造の制御因子の解明に成功したことから、今後は当初の計画通り力学的解析を実施し、力学機能の支配因子の解明を行う。併せて、力学機能最適化のための構造体の最適設計を行い、最終的には骨類似の力学機能が発揮可能なインプラントの創製を目指す。その具体的項目は以下の通りである。(1)圧縮試験による応力-ひずみ曲線の取得、変形挙動直接観察およびヤング率、衝撃吸収特性の定量化(2)パウダー部のネック構造を含む組織・力学特性の最適化(3)力学試験、FEM法による応力解析結果をフィードバックしての、構造体の再設計と、作製・評価(4)研究の総括
採餌選択の心理学的機制に関する研究

本研究は、ラットを被験体として、継時選択場面および同時選択場面,で餌選択並びに餌場の使用の問題を検討した。餌選択の問題では、相対的によい餌(大強化量)とわるい餌(小強化量)の2種の餌の出現頻度が独立に増加する場合と減少する場合の効果を並立連鎖スケジュールを用いた同時選択場面で検討した。この結果、頻度増加条件では、大強化量選択肢の頻度が増加すると、大強化量の選択率は増加するが、小強化量選択肢が増加しても大強化量の選択率はあまり変化しなかった。頻度減少条件では、大強化量選択肢の頻度が減少すると、大強化量の選択率は減少したが、小強化量選択肢の頻度が減少しも大強化量の選択率はわずかな増加しか示さなかった。これらの事実は、強化量最大化原理にもとづく選択モデルからの予測とおおむね一致した。また、餌場の使用の問題では、餌の分布型の効果を新たに構成した継時選択場面で検討した。用いた餌の分布型は、ランダムな分布のモデルとしてポアソン分布、一様な分布のモデルとして2項分布、さらに、ある場所に集中して分布する場合のモデルとして負の2項分布の3種とした。各餌場は平均3個の餌があるものとした。探索時間と得られた餌の数との関係あるいは探索時間と最後に餌を捕ってからその餌場を去る時間(あきらめ時間)の関係からは、いずれの分布型でも探索時間の増加とともに餌の数あるいはあきらめ時間が増加するという結果となり、餌の分布型の効果は見いだせなかった。この結果にHerrnsteinのマッチングモデルを適用したところ、かなりよくあてはまることが見いだされた。以上の結果は、餌選択の場合も餌場の使用の場合も選択行動モデルの適用が可能であり、従って、これらの場面では、選択行動モデルが仮定した採餌選択の心理学的機制が働いていることを示唆していると考えられる。本研究は,ラットを被験体として,強化量の選択行動に及ぼす大強化量および小強化量選択肢の頻度の増加・減少の効果を並立連鎖スケジュールにより同時選択場面で検討した.強化量は1個(45mg)3個のペレットとし,第2リンクの定間隔(F1)スケジュールにより呈示された.本研究では,いずれの選択肢ともF15秒とした.各選択肢の頻度は第1リンクの変動問題(V1)スケジュールにより決められた.頻度増加条件では,一方の選択肢へ導く第1リンクの長さを一定(V160秒)とし,他方の選択肢へ導く第1リンクの長さをV126秒, V17秒と短くし,第2リンクへ移行する頻度を増加させた.一方,頻度減少条件では,同様に一方の選択肢へ導く第1リンクを一定(V160秒)に保ちながら,他方の第1リンクの長さをV190秒, V1140秒と長くし,第2リンクへ移行する頻度を減少させた.1セッション60強化とし,各条件ごとに,最低14セッションの訓練を安定規準をみたすまで行った.この結果,頻度増加条件では,大強化量選択肢の頻度が増加すると,大強化量の選択率は増加するが,小強化量選択肢が増加しても大強化量の選択率は, V126秒条件ではあまり変化しなかった.頻度減少条件では,大強化量選択肢の頻度が減少すると,大強化量の選択率は減少したが,小強化量選択肢の頻度が減少しても,大強化量の選択率はわずかな増加しか示さなかった.以上の結果は,頻度増加条件および頻度減少条件のいずれにおいても,大強化量選択肢の頻度増加・減少が小強化量選択肢のそれよりも大きな効果をもつことを示す.

この事実は,強化率最大化原理に基づく選択行動モデルからの予測と概ね一致するものであり,したがって,この場面での採餌選択が強化率最大化原理という心理学的機制に基づいて行われていることを示唆するものと考えられる.本年度は、ラットを被験体として、餌の分布状態が餌場(パッチ)の使用にどのような効果をもつかを、切り替えキイ型並立スケジュールにもとづいて新たに構成した継時選択場面で検討した。この手続きは、餌場(パッチ)内で餌を探す探索(search)事態、探索の結果、見つけた餌を食べる摂食(food)事態、餌場間の移動時間に相当する切り替え遅延(changeover delay:COD)事態という3つの部分から構成されている。最初に、中央レバーと右(または左)のレバーが出ている探索事態から始まる。ここで右(または左)のレバーに反応すると平均30秒で強化子が呈示(摂食事態)され、3秒後再び探索事態にもどる。一方、探索事態で中央レバーに連続3回反応すると、次の餌場へ移動中となる切り替え遅延事態へと移行する。この事態で中央レバーへ反応していると、一定時間経過後、前とは反対のレバーが呈示され、次の餌場での探索事態となる。餌場は18あるものとし、第18番目の餌場をあきらめて、切り替え遅延事態へ移行した時点で実験を終了した。餌の分布型は、ランダムな分布のモデルとしてボアソン分布、一様な分布のモデルとして2項分布、さらに、ある餌場に集中しているような分布のモデルとして負の2項分布の3条件とした。また、切り替え遅延時間の長さを2条件(15秒と60秒)設けた。いずれの餌場にも平均3個の餌があるものとした。この結果、(1)探索時間と捕った餌の数と(2)探索時間とその餌場で最後に餌を捕ってから、その餌場を去るまでの時間(あきらめ時間)という測度では、いずれの分布型でも探索時間の増加とともに餌の数もあきらめ時間も増加し、分布型による相違は見いだせなかった。また、CODの長さの効果も上記の測度では見いだせなかった。この結果にHerrnsteinのマッチングモデルをあてはめてみると、比較的よくあてはまることが見いだされ、餌場の使用における心理学的機序の一端が示されたといえる。
膜結合型アミノペプチダーゼファミリーに属する新規酵素類の生理的役割の解明

妊婦血中の酵素、胎盤性ロイシンアミノペプチダーゼ(P-LAP、オキシトシナーゼ)は、オキシトシンレベルの調節を通じて妊娠の維持に働く。当グループが行ったcDNAクローニングにより、P-LAPはアミノペプチダーゼAやアミノペプチダーゼNなどと、一次構造上の相同性が高く、活性中心に亜鉛分子を共通してもつ一つのファミリーをなすことが示されるとともに、非妊娠時にも種々の組織で発現していることが判明し、多様な機能をもつことが示唆された。前年度の研究より、P-LAPはMet-エンケファリンやニューロキニンAなどの神経ペプチドをも分解することが判明し、脳・神経系においても重要な機能を担う可能性が示唆されたため、本年度はその解明を目指し、P-LAPの脳・神経系における発現について詳しく調べた。P-LAPタンパク質の発現は、ラット脳内の広い部域で神経細胞のみに認められた。またラット培養神経細胞PC12では、分化に伴いP-LAPの発現が約2.5倍上昇した。この細胞でP-LAPは膜画分に存在し、免疫染色により神経突起および神経細胞体中にドット状のシグナルが確認されたため、ベシクルの膜に存在することが示唆された。またアデニル酸シクラーゼの活性化剤フォルスコリンによる刺激で、細胞表面P-LAPが約30%増加したため、P-LAPはフォルスコリン調節性ベシクルに存在すると考えられた。一方、ブレフェルジンA処理により細胞表面P-LAPは約二分の一に減少し、P-LAPが局在するベシクルはトランスゴルジネットワークに関与していることが示唆された。一方、同じファミリーに属し、P-LAPと特に相同性が高い脂肪細胞由来ロイシンアミノペプチダーゼは、組み換え型タンパク質にアンギオテンシン分解作用とキニン変換作用が認められ、腎臓の遠位尿細管および集合管に発現していたことから、血圧調節に関与している可能性が示唆された。妊婦血中に存在する酵素、胎盤性ロイシンアミノペプチダーゼ(P-LAP、オキシトシナーゼ)は、子宮筋収縮作用をもつオキシトシンの分解を通じ妊娠の維持に働くと考えられている。当グループが行ったP-LAPのクローニングによって、P-LAP、アミノペプチダーゼA、アミノペプチダーゼNなどは一次構造上の相同性が高く亜鉛結合モチーフH-E-X-X-H-(18X)-Eを有する一つのファミリーをなすことが示されるとともに、P-LAPは非妊娠時にも種々の組繊で発現していることが判明し、妊娠維持の他にも多様な機能を有することが示唆された。そのためP-LAPの生理的役割の全体像を把握することを本研究の第一の目標とした。本年度はまずCHO細胞を用いた大量発現系によりヒト可溶性P-LAPを調製し、単一に精製して生化学的性状を調べたところ、溶液中におけるホモダイマーの形成、サブユニットあたり1分子の亜鉛の含有など、このファミリーの酵素に共通する特徴がみられた。また各種アミノアシルーMCAのうちLeu-及びS-Benzyl-Cys-MCAに対し分解活性が高かった。さらにアミノペプチダーゼ阻害剤のアマスタチンに加え、キレート剤1,10-フェナントロリンによってもP-LAP活性の阻害がみられ、活性発現に亜鉛が必須であることが示唆された。次に生体内における基質を探索する目的で、種々の生理活性ぺプチドの分解産物を逆相HPLCで分離、分析し、切断部位を特定したところ、P-LAPは15アミノ酸残基以下のペプチドのみを分解し、P'1部位にプロリンを持つペプチドは分解しないことが示唆された。またオキシトシンや抗利尿ホルモンに加えて、いくつかの神経ペプチドがP-LAPにより分解され、本酵素が脳神経系においても重要な機能を担う可能性が示唆された。目標の第二は、ファミリー全体の生理的意義の解明である。P-LAPと特に相同性が高く、機能が未知である脂肪細胞由来ロイシンアミノペプチダーゼの組み換え型タンパク質を作製し、生理活性ペプチド分解作用を解析したところ、アンギオテンシンの分解が認められ、血圧調節への関与の可能性が示唆された。

一方、ブレフェルジンA処理により細胞表面P-LAPは約二分の一に減少し、P-LAPが局在するベシクルはトランスゴルジネットワークに関与していることが示唆された。一方、同じファミリーに属し、P-LAPと特に相同性が高い脂肪細胞由来ロイシンアミノペプチダーゼは、組み換え型タンパク質にアンギオテンシン分解作用とキニン変換作用が認められ、腎臓の遠位尿細管および集合管に発現していたことから、血圧調節に関与している可能性が示唆された。
統合型タブレットCALLシステムの構築とその評価に関する研究

本研究では、従来のデスクトップ型CALL教室の後継として期待できる、iPadなどのTablet端末を利用したCALL教室を構築し、アクティブ・ラーニングを軸とした授業モデルを実施した。構築では、無線システムを構築し、最大70台のタブレット端末が接続されている環境の下で、Learning Management System (LMS)接続、マルチメディア教材の配布、サーバに蓄積している映像視聴等の実証実験を行った。その上で、実際にプレゼンテーション授業として音声認識機能、ビデオ撮影、振り返り活動などの授業を実施した。また、オンライン環境の下で収集したログデータに基づいた分析も行うことができた。本年度は補助金を活用して,無線システムとタブレット端末を利用することで,普通教室でも比較的簡単に構築できる,外国語教育用コンピュータ教室(CALL教室)の構築を行った.無線システムの問題として,無線電波の輻輳化にともなう不安定さ,大容量のデータ通信の限界が指摘されている一方,近年の一人一台タブレット端末推進という国家戦略の中で,適切な環境構築が望まれている.外国語教育におけるCALLシステムの特徴は,音声データや映像データなどの大容量データを通信する点,そして,一般に30名から40名となるクラスサイズの中での利用となる点が挙げられる.このような背景の中,本研究では,Windows OSやiOSタブレットを利用できる40人規模のタブレットCALL教室を構築した.2つの比較的安価で実現可能性の高い製品を利用している.2つのアクセスポイントを設定し,40台の端末の同時アクセスに耐えられるようにチューニングを行った.本年度実施した試験運用実験では,windows端末においてAD認証を行う際に非常に時間がかかってしまい,授業が開始できない事態や,一斉ダウンロードに時間がかかってしまうなどの問題点が起こった.この点については,論文や講演会などで発表を行った.さらに,20MB程度の映像データの配信や,課題データの受信についてもスムーズに動作しなかった状況もあった.その後,さまざまな試行錯誤と修正を行った.例えば,ネットワーク設定の問題点の整理,端末のカスタマイズ,ベータ版ソフトウエアの改良などが改善されている.平成27年度からの正規の授業として本格運用を開始するが,そのための基盤整備としての構築はほぼ完了したと考えている.今年度は、構築した80名収容可能な教室に2つの比較的安価で現実的な導入が可能とされる無線アクセスポイントを設置し、45台のWindows 8タブレットと本科研費で購入した20台のiPadを組み合わせ、本科研費で購入した授業管理システムを介して実際の授業の試行的実施を行った。これらの授業はマルチメディア、オンラインリソースを活用するもので、比較的重い音声、画像、映像に関するデータに対する同時アクセス、同時ダウンロードなどを伴う授業を実施した。授業に大きく支障をきたすようなことは起こらなかったが、ある場面になると、アクセスポイントやその他の箇所で、通信上のボトルネックとなる個所が確認できたため、通信の輻輳化を回避させる機器を導入し、その効果を検証するところまで行い、安定的な通信環境を提供するためのシステム的な標準化へ向けた実証実験を行った。さらに、タブレットCALL架橋で実現できる授業モデル、特に反転授業モデルに注目し、タブレット端末を活用しながら知識を構築し、相互評価活動を取り入れ振り返りを促しながら、インプットとアウトプットの強化を実現する授業を実践研究として行った。この授業モデルはよりコミュニカティブな姿勢の育成を目的とした授業であったが、そればかりではなく、学習者の動機づけ、メタ認知にも影響をを与えている可能性が示された。今後は、教材を精緻化し、さらに多くの授業の中での実証試験を行うことになるが、今年度ではその道筋を与えるような形となった。まず構築面については、ほぼ快適な通信環境のもとで50人規模のクラス環境を実現することが可能になった。この成果については、各種学会、ワークショップ等で発表を行った。特に音声教材、学習者が作成した映像のアップロード、ダウンロード、YouTubeなどのオンラインリソースの閲覧、オンラインリソースを利用した学習支援システムの利用などの観点で、快適性に関して良好な評価を得ることができた。ただし、本実験を行った教室に関していうと、とある状況のもとでネットワーク上にボトルネックが発生し、いわゆる輻輳化と呼ばれる現象が観察されている。そこで、輻輳化を和らげるためのツールを試験的に利用し、輻輳化の原因とされるパケットロスの軽減などの効果が軽減された。ただし、ボトルネックがインターネット側に存在する場合の対応についての課題が浮き彫りになったことも踏まえ、安定的な運用へ向けた新たな方策の必要性が確認されている。本研究課題では、無線LANとタブレット端末を活用したCALLシステムの構築と、その教室環境を活用した実践研究を扱ってきた。平成28年度の研究成果を踏まえ、80人収容可能な教室80台のタブレット端末を接続した環境で、協同学習などの授業実践を行った。ただし、平成27年度の研究の中で、大容量の映像などの送受信には限界があり、無線システム利用上の指針を設定した。それは、大容量のデータは送受信はしない、写真や音声などのデータはできるだけ圧縮を施したうえで送受信する、一斉ログインをしなくても済むように80人のログ行動をある程度統制することなどであった。その結果、基本的なテキストデータの送受信や小容量のデータの送受信は無理なく行うことができた。平成28年度においても、輻輳化によって通信に影響を及ぼす状況は継続していたために、設置型の輻輳化抑制装置を設定することで、アクセスポイント付近のパケットロス現象はある程度抑えられる点などを実証した。

以上を確認した上で、平成28年度は実際の授業の中での実践研究を行った。持ち歩くことが可能で、録音、カメラ撮影、ビデオ撮影などを容易に行うことが可能なタブレット端末の特性を生かし、従来型デスクトップCALLシステム環境よりもより動きのある、協同学習、グループ学習を行うことができた。これらの研究成果は、協同学習支援、より深い振り返りなどの文脈における有効なタブレット端末の利用という観点ばかりでなく、Learning Analyticsの枠組みの中で、オンライン環境で得られた学習ログデータを分析する研究にも発展した。学習ログデータから学習行動傾向などを予測する研究にも着手し、スピーキング活動におけるログデータを分析すると、学習者の行動パターンは3種類に分けられる点、しかも、学習者の習熟度とは独立に、教材の難易度に応じて変動する点が明らかになった。本研究では、従来のデスクトップ型CALL教室の後継として期待できる、iPadなどのTablet端末を利用したCALL教室を構築し、アクティブ・ラーニングを軸とした授業モデルを実施した。構築では、無線システムを構築し、最大70台のタブレット端末が接続されている環境の下で、Learning Management System (LMS)接続、マルチメディア教材の配布、サーバに蓄積している映像視聴等の実証実験を行った。その上で、実際にプレゼンテーション授業として音声認識機能、ビデオ撮影、振り返り活動などの授業を実施した。また、オンライン環境の下で収集したログデータに基づいた分析も行うことができた。今後は、1ネットワークのさらなる安定的運用へ向けたチューニングおよび評価実験、2タブレットCALLシステムを有効に活用したコミュニカティブな授業モデルの構築および実践、3その上で、本研究の総括、を行う予定である。平成27年度からは、構築した無線CALLシステムの実際の授業での運用を行っていく。その中で、タブレット端末の特徴とされる、音声録音、映像収録などを活用した活動、グループによる協調学習の支援、音声に関する個別学習に関する支援、小テスト活動、課題提出などのそれぞれの活動がどの程度可能なのかを実証実験の中で行いながら、外国に有効な活動のモデル構築を試みる。具体的には、授業の中でより質の高い協働学習、アクティブラーニングを仕掛ける一つの手法として「反転授業(Flipped Classroom)」がある。この枠組みにおける、映像配信、授業の中での協働学習を効果的に進めていくための教材作成、そして、授業モデルの構築を行い、授業評価を行っていく予定である。今年度に引き続き、研究成果については学会などで発表を行っていく。予定していたタブレット端末に関する物品が予定よりも安く購入できたことにより、残額が生じたため。物品費として算入する。
西洋形而上学における「無」の研究-カントおよび京都学派を着手点として-

1.存在を主題とする西洋形而上学の歴史に絶えずついてまわる「無」の問題を検討する上で、まずカントの「無」の概念に関する叙述を解明する予定だったが、さらにそれに先立ってベルクソンの哲学を参照する必要性が出てきた。というのも彼は、西洋形而上学の根本的な誤りを「無」の概念のうちに読み取り、それを繰り返し批判しているからだ。しかも興味深いのは、ジル・ドゥルーズが慧眼をもって洞察しているように、この概念が一種の仮像性を帯びており、その限りにおいて人間知性にとって不可避だということをベルクソンが認めていたということ、そしてカントと同様の手法を用いてこれに対処しているということである。ベルクソンが「かくてわれわれは絶対無の観念を獲得するが、こうした無の観念を分析するならば、それが実際には全体の観念である...ということを知る」と語っていることからも、彼がカントと同一の問題圏のうちに立ちながら、これを批判していたのではないかという見通しを得ることができた。2.次いで、ジョルダーノ・ブルーノの思想を検討した。彼の無限宇宙論の主張の背後には絶えず、空虚ないし無に対する拒絶があるからである。ここでもまたベルクソンの場合と同じように、カント的な問題意識が根底に存することが認められた。「ありうるもののすべてであるものは、自らの存在のうちにあらゆる存在を含む唯一のものです。他のものはみなそうでなく、可能態は現実態に等しくありません。なぜなら、現実態は絶対的なものではなく、制約されたものだからです」と彼が語るとき、念頭に置かれているのはスコラ的な空虚の概念である。3.またスアレスの原因論においては、「自然物の生成」という非本来的な原因性が論じられる際、「欠如」の概念が、形相と質料と並列されたかたちで、「生成の出発点」としての意味を持たされていることを確認した。
ゾル・ゲル法を利用したフッ素ドープシリカの合成とキャラクタリゼーション

1.含フッ素シリカゲルの評価に関する研究:SiF_4気体の加水分解で作成した含フッ素シリカを主体にその特徴を比表面積測定、密度測定および走査電顕観察によって評価した。SiF_4の加水分解で作成したゲルは比表面積が40170m^2/g程度で熱分解法で作成されているシリカ微粉体(1000m^2/g)に比較して微粉ではない。しかし、かさ密度は非常に小さい(1.11.6ml/g)。電顕観察によればこのゲルはシリカネットワークが2次元的に発達した薄膜状を呈しており、その内部に多数の"閉じた気孔"が存在していると考えられる。これがゲルを加熱してガラス化する際の脱フッ素挙動や焼結挙動と関連していることが明らかとなった。2.部分置換したケイ酸エチルを用いたゾル・ゲル反応:ケイ酸エチルを出発原料とし、種々のアルコールとの間でトランスエステル化反応を行い、部分置換したケイ酸エチルを作成した。この反応の触媒として非水用イオン交換樹脂のアンバーリスト15が有効であることが分った。また、置換される割合はケイ酸エチルとアルコールの混合比で定まり、目的とする置換体を得る条件も明らかになった。一方、この置換体を用いたゾル・ゲル反応におけるシリカネットワーク形成反応の制御に関してはメトキシド基、n-プロポキシド基についてはケイ酸エチルに対する水の混合割合ほど顕著な項かは見い出されなかった。現在、ブトキシド基に効果について検討中である。部分フッ化したケイ酸エチルを原料とするゾル・ゲル反応はゲル化が速く、シリカネットワークの形成反応を充分に制御出来るまでに至っていない。しかし、部分フッ化ケイ酸エチルから作成したゲルと通常のシリカゲルとの混合体をガラス化することによってシリカガラスとの屈折率差で-0.3程度のガラス繊維の作成が可能となった。
腎細胞癌におけるcDNA microarrayにより得られた予後予測遺伝子群の検定

われわれは、約20,000のcDNAをspotしたmicroarrayを用いて、様々な病期、細胞分化度、予後の異なる淡明型腎細胞癌組織のgene expression profilingを行い、gene expression profilingは、淡明型腎細胞癌の予後と強く相関することを同定した。これを基に、統計学的解析を行い、淡明型腎細胞癌の予後予測可能な51の遺伝子からなる遺伝子群を同定した。これらは、いわゆるtraining setから導き出された遺伝子群であるため、われわれは、解析をしていない淡明型腎細胞癌、いわゆるtest setにおいても、これらの予後予測遺伝子群が、予後を予測可能かどうか検討した。各サンプルから得られたデータから、それぞれわれわれが同定した予後予測可能な遺伝子群の発現データを抽出した。それぞれの遺伝子の発現が、2群の鑑別にどれくらい関連があるか、また2群の中央値からどれだけ発現値が離れているかを計算し、これらを各群にvoteする"weightedvotes"を行った。これらの総計としてprediction strengthを計算し,新しく解析した淡明型腎細胞癌が予後の良い群と不良群のどちらの遺伝子発現を持っているか統計学的に判定した。(Golub et al. Science Vol.286 531-537,1999)。新しく解析した淡明型腎細胞癌10例のうち経過観察期間が十分でない患者が含まれていたため、正確に予見された患者の割合は求めることができなかったが、2例は正確に予見され,一般に予後の悪いgrade 3の2例はpooroutcome groupに,一般に予後の良いgrade 1の2例はgood outcome groupと診断された。この予後予測可能な遺伝子群は、最初に検討したtraining setに比べて、精度はやや低下したが、淡明型腎細胞癌症例の予後予測がある程度可能ではないかと考えられた。現在、さらに症例数を増加し、予後予測遺伝子群そのものの再検討を施行中である。淡明腎細胞癌は腎細胞癌の中で最も頻度の高いsubtypeで全腎腫瘍の70%以上を占める。われわれは、約20,000のcDNAをspotしたmicroarrayを用いて、まだ十分に検討されていない淡明腎細胞癌組織gene expression profilingを行い、同定されている予後予測可能な遺伝子群が淡明腎細胞癌の予後を識別可能かどうかを検討した。その結果、淡明腎細胞癌の予後を予測可能な51の遺伝子からなる遺伝子群を同定した。さらに、新しい淡明腎細胞癌の凍結組織から同様にRNAを抽出し、それぞれ同じ患者の正常腎部から抽出したRNAとともに、同じcDNAmicroarraychipを用いてcompetitive hybridizationを行った。各サンプルから得られたデータから、われわれが同定した予後予測可能な遺伝子群の発現データを抽出し、それぞれの遺伝子の発現が正常と癌の鑑別にどれくらい関連があるか、また2群の中央値からどれだけ発現値が離れているかを計算し、これらを各群にvoteする"weightedvotes"を行った。これらの総計としてprediction strengthを計算し、各サンプルが予後の異なる2群のどちらの遺伝子発現を持っているか統計学的に判定した。計8例のうち、2例は正確に予見され、4例は予後予測の傾向が見られた。grade 3の2例はpooroutcome groupと,grade 1の2例はgood outcome groupと診断された。症例数は少ないが、この予後予測可能な遺伝子群で、かなりの割合で症例の予後予測が可能であると考えられた。