hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
臨床看護師の成長を促すリフレクション思考のアセスメントツール開発と有用性の検証

25年度は、臨床看護師を対象としたリフレクションのアセスメント尺度の信頼性と妥当性の検証過程を進めた。126項目に項目精選したアセスメントツール原案2の尺度項目の信頼性と妥当性の検証結果を、第33回日本看護科学学会学術集会で公表した。2さらに、26項目からなるアセスメント尺度原案2を、さらに精選をして27項目とし、尺度の外部職度との併存妥当性の検証を行った。[方法]対象は、平成25年度に研究者らが実施した「リフレクション研修」を受講した病院に勤務する看護師約300名。調査内容は、リフレクションのアセスメント尺度原案2(27項目)と批判的思考態度(33項目):5段階(1.全く当てはまらない、2.あまり当てはまらない、3.どちらとも言えない、4.少し当てはまる、5.とても当てはまる)のリッカート法尺度。批判的態度尺度の使用は開発者から許諾を得た。結果を分析中である。26年度27年度にかけて公表をする予定である。3外部研究協力者との打ち合わせ会議で、26年度の具体的なデータ収集・研修計画案を策定した。26年度は最終年度で、当初の目標達成に向かって、1リフレクション思考の深さと看護実践能力との関連から調査を実施する。また、2リフレクションの思考の深さと学習する組織への変革の観点から調査を実施する。これらにより、リフレクションの思考のアセスメントツールの活用の有用性を検証する。諸処の事情により26年度の本研究助成事業での研究続行が出来なくなったが、本研究は、活用できるリフレクション思考のアセスメントツール開発が目標であるため、継続可能な対策をとって目標を達成し、27年度には成果を公表していく予定である。結果を分析中である。臨床看護師を対象としたリフレクションのアセスメント尺度の開発に向けて、構成概念を抽出し、アセスメント指標の原案作成を行った。2「Reflector」に分類された16編の記述内容を質的機能的に分析し、3カテゴリー「(その)場面における状況の描写」「思考の認識と意味付けの描写」「新たな気づきの描写」、9サブカテゴリー「場面の概要」「対象者の状況・言動」「場面における私の状況・言動」「場面における私の感情と理由」「場面における私の判断」「私の思考と判断との関係」「援助が対象者に与えた影響」「今後活用したい気づき」「明らかになった目標や行動計画」を抽出した。3臨床看護師が自分自身であるいは指導者とともに活用することを想定し、表現を考慮して30項目の下位項目を作成し、4段階(1.全く当てはまらない、2.あまり当てはまらない、3.少し当てはまる、4.とても当てはまる)のリッカート法でアセスメントする原案を作成した。(第21回日本看護学教育学会で公表した。)430項目から成るアセスメント原案を、研究者らが実施しているリフレクティブ学習研修に参加した臨床経験110年の看護師を対象に予備調査を実施し、内容的妥当性を検証した。さらに、因子妥当性、構成概念妥当性(収束妥当性)、並びに安定性及び内的整合性の信頼性を検証した。5看護におけるリフレクションの牽引校のひとつである英国オックスフォードブルックス大学の研究者らと意見交換した後、26項目に項目精選しアセスメントツール原案2とした。当初30項目で作成したリフレクティブな思考のアセスメントツールの原案を、海外の研究者らと意見交換することによって、本ツール開発の方向性が同じであることが確認でき、26項目まで精選することができた。当初のツール原案の妥当性・信頼性検証の統計処理もほぼ終わり、25年度に予定していた、精選した26項目から成るツール

原案2を用いて、更なる信頼性・妥当性検証の研究準備をしている。倫理審査についても、すでに申請を済ませている。研究の順調な進展の背景には、看護実践の質向上とリフレクティブな思考を実践の中で活用することの重要性がリンクしていることへの気づきがあり、研究者らが臨床看護師を対象としたリフレクションを学習する研修に積極的に貢献しているため、研究協力を得やすいことがあると考える。研究計画のとおりに進める。25年度は、24年度作成した26項目から成るリフレクティブな思考のアセスメントツール原案2の信頼性・妥当性検証を行い、その結果を国内外で公表する計画である。さらに、26年度に計画している、リフレクティブな思考のアセスメントツール活用の有用性の研究に向けて準備をする。臨床実践の変化のみならず看護組織の変革の視点で有用性を検証することを計画しているため、25年度後半は、研究協力者である組織学習の研究者の専門的知識を得る。ノート型パソコン並びにセキュリティソフト、Office professionalソフト、統計解析ソフトSPSS一式(25年度PCを2台購入予定のところ1台のみ購入した)国内外での成果発表のための旅費研究協力者(組織学習の研究者)との研究打合せ及び、専門的知識の提供を得るための費用関連図書購入費(看護におけるリフレクションの改訂5版が出版されたため)
婦人科悪性腫瘍のPloidyと予後との関連

当科で治療を行った原発性卵巣症例101例について、病理組織診のために作成されたパラフィン包埋ブロックを用い、Flow Cytometryにより、核DNA histogramを作成し、組織型、組織分化度、臨床進行期、予後、化学療法に対するresponseとploidyとの関連について検討を行った。その結果(1)組織型とPloidyとの関連についてみると、aneuploid症例の頻度はムチン性嚢胞腺癌(35%)、類内膜癌(43%)に比し、類中腎癌(67%)、漿液性嚢胞腺癌(65%)において高い傾向を示した。(2)漿液性嚢胞腺癌52例について組織分化度とPloidyとの関連についてみると、高分化型でのaneuploed症例の頻度は76%と高い傾向にあり、中等度分化型、低分化型ではいずれも58%であった。(3)漿液性嚢胞腺癌における臨床進行期とPloidyとの関連についてみると、aneuploid症例の頻度はI期89%、II期61%、III期61%IV期64%と一定の傾向は認められなかった。(4)症例数の最も多いIII期症例28例について、diploid症例(11例)とaneuploid症例(17例)をKaplan-Meier法により、生存率を比較すると、両群ともほぼ同様の傾向を示し、両群間の生存率には差は認められなかった。(5)漿液性嚢胞腺癌III、IV期症例においてCisplatinを中心とした化学療法を行った29症例について、化学療法に対するresponseとPloidyとの関連についてみると、aneuploid症例の頻度はCR症例(29%)、PR症例(50%)の奏効例では41%(7/17)であったのに対し、NC症例(83%)、PD症例(67%)の非奏効例においては75%(9/12)と高頻度にaneuploid症例が認められた。パラフィン包理ブロックを用い、flow cytometryにより婦人科悪性腫瘍細胞の相対的核DNA量を測定し、DNA ploidyと化学療法あるいは放射線療法に対するresponseとの相関について、retrospectiveに検討することを目的にした。本年度はまず放射線療法を行った子宮頸癌症例の予後とDNA ploidyとの関連について検討した。当科で手術、術後放射線療法を行った子宮癌症例のうち、5年予後の判明した症例について放射線照射野内に再発した25例、照射野外に再発した25例、それに再発の認められなかった31例の計81例についてパラフィン包理ブロックを用いて腫瘍細胞の相対的核DNA量を測定した。更に、放射線単独治療例14例の治療前及び治療中の生検材料を用いてDNAhistogramの経時的変化を観察し、予後との相関について検討を行った。その結果、放射線照射野内に再発した群においては25例中16例(64.0%)にaneuploidyの存在を認めた。一方、照射野外に再発した群においては25例中6例(24.0%)、再発を認めなかった群では31例中6例(19.4%)にaneuploidyの存在を認めたにすぎず、照射野内に再発群におけるaneuploidy症例の比率は有意に高かった。またIIIb期以上の放射線単独治療例の治療開始前の生検材料によるDNA ploidyと放射線治療効果をみると、5年生存を確認し、かつ再発を認めない放射線感受性群6例中2例(33.3%)にaneuploidyを認めたのに対し、放射線照射終了後1年以内に照射野内に再発した放射線抵抗群では8例中5例(62.5%)にaneuploidyを認め、放射線抵抗群では高頻度にaneuploidyを認めた。また病理組織型とploidyとの間には相関は認められなかった。

(5)漿液性嚢胞腺癌III、IV期症例においてCisplatinを中心とした化学療法を行った29症例について、化学療法に対するresponseとPloidyとの関連についてみると、aneuploid症例の頻度はCR症例(29%)、PR症例(50%)の奏効例では41%(7/17)であったのに対し、NC症例(83%)、PD症例(67%)の非奏効例においては75%(9/12)と高頻度にaneuploid症例が認められた。
助産師と考える妊産褥婦への心理的アプローチ

研究方法1として産科外来の受診中の妊婦と出産後入院中の褥婦、1か月検診で来院した母親を対象に行った、妊娠出産時期における子どもに対する感情と妊婦・褥婦が抱える不安な事項等を聞き取った面接での内容と様子、母子画の内容と質問紙調査(対児感情評定や母性不安や出産体験の振り返り、マタニティ・ブルーズ傾向等)への回答の結果から、妊娠期から産褥早期の妊婦・褥婦の心理状態の分析を続けている。そしてこれまで行ってきた妊婦における色彩円環家族イメージ画の特徴を分析し、イメージ画に表される母子の関係性と色の選択や色の塗り方との関係について明らかとなった事柄を、第17回ウーマンズヘルス学会学術集会にてポスター発表を行った。さらに妊娠期の色彩円環家族イメージ画の特徴と産後1か月・産後3か月の時点で実施した質問紙調査の結果から、妊娠期に描かれるイメージ画の特徴(円の大小)と産後うつとの関連を検討し、色彩円環イメージ画が産後のうつ傾向を早期発見する1つの指標となりうる可能性があることを第59回日本母性衛生学会学術集会にて口頭発表した。さらに研究方法2として前年度に引き続き妊産褥婦にかかわる専門家である助産師・保健師を対象にインタビューを実施し、妊産褥婦の外来・病棟での様子や出産して退院後の健診の様子、保健センターが中心として実施している家庭訪問を行ったときの母親たちの様子などから、現代の妊産褥婦の特徴や助産師・保健師の対応の困難感や工夫について聴き取りを行った。助産師・保健師の業務が忙しく、インタビュー調査の計画が遅れていた。現在ある程度の人数の方々(助産師3名・保健師5名)に協力していただき、インタビューを実施できている。平成31年度は母性心理学研究会を立ち上げ、3月から月1回の会合を開いている。そこではインタビューの結果から得られた、助産師・保健師の妊産褥婦へのかかわりについて分析を進め、まとめていく。そして7月の母性心理学研究会ではインタビューに応じた助産師・保健師をはじめ、妊産褥婦への心理に関心を持つ助産師・保健師に声をかけ、本研究で明らかになったことを発表し、そこからグループディスカッションを行う予定である。平成31年度は、29年度30年度に病院や産院にて勤務しているあるいは勤務経験がある助産師や、出産して退院後1か月以降に保健センターを中心に実施されている家庭訪問事業に携わっているあるいはその経験を持つ保健師・助産師に対して実施してきたインタビューの逐語録から、助産師が妊産褥婦や母親たちへの対応で問題や困難に感じている事柄と、保健師が母親たちへの対応で問題や困難に感じている事柄とを抽出し、これまでの研究結果との一致している点や異なっている点、現場のニーズについて質的に検討する。さらにそれぞれの事柄について、心理職としてはどのような提言ができるかについて検討し、母性心理学研究会を開催して、助産師・保健師へもフィードバックしながら実現可能な対処方法を考えていく。まずは研究方法1として産科外来の受診中の妊婦と出産後入院中の褥婦、1か月検診時の母親を対象に調査を行った。妊娠期・産褥早期・産後1か月の縦断的調査を依頼した。その際、3期の推移を把握できれば最善ではあるものの、1期のみでも調査した。妊娠期・産褥早期、産後1か月の妊産褥婦に、面接と投映法・質問紙調査を実施した。その内容は妊娠出産時期における子どもに対する感情と不安な事項等を面接で聴き取り、母子画の実施と質問紙調査(対児感情評定や母性不安や出産体験の振り返り、マタニティ・ブルーズ傾向等)を依頼し、妊婦・褥婦の心理状態を分析している。そして、それまで199192年と201216年の妊産婦に実施した対児感情評定尺度結果と、201216年に女子大学生を対象に実施した結果をもとに因子分析を行い、接近感情を表す因子と回避感情を表す因子に属する項目を抽出しさらに全体のデータで再度因子分析を行い、接近感情を表す形容詞9項目と回避感情を表す形容詞9項目をそれぞれ抽出した。それを第58回日本母性衛生学会学術集会にてポスター発表した。さらに妊娠期の色彩円環家族イメージ画の描線の特徴と産後うつとの関連についても同じ第58回日本母性衛生学会学術集会にて口頭発表した。さらに研究方法2として妊産褥婦にかかわる専門家である助産師・保健師を対象にインタビューを実施し、妊産褥婦の外来・病棟での様子や保健センターでの様子、対応の困難感や工夫について聴き取りを行った。今後はさらにインタビュー協力者を増やしていく。助産師・保健師の業務が忙しく、インタビュー調査が計画より遅れている。30年度も引き続きインタビュー協力者を拡大(インタビュー協力者にも紹介していただいている)して、インタビュー調査を行い、収集する予定である。

そしてこれまで行ってきた妊婦における色彩円環家族イメージ画の特徴を分析し、イメージ画に表される母子の関係性と色の選択や色の塗り方との関係について明らかとなった事柄を、第17回ウーマンズヘルス学会学術集会にてポスター発表を行った。さらに妊娠期の色彩円環家族イメージ画の特徴と産後1か月・産後3か月の時点で実施した質問紙調査の結果から、妊娠期に描かれるイメージ画の特徴(円の大小)と産後うつとの関連を検討し、色彩円環イメージ画が産後のうつ傾向を早期発見する1つの指標となりうる可能性があることを第59回日本母性衛生学会学術集会にて口頭発表した。さらに研究方法2として前年度に引き続き妊産褥婦にかかわる専門家である助産師・保健師を対象にインタビューを実施し、妊産褥婦の外来・病棟での様子や出産して退院後の健診の様子、保健センターが中心として実施している家庭訪問を行ったときの母親たちの様子などから、現代の妊産褥婦の特徴や助産師・保健師の対応の困難感や工夫について聴き取りを行った。助産師・保健師の業務が忙しく、インタビュー調査の計画が遅れていた。現在ある程度の人数の方々(助産師3名・保健師5名)に協力していただき、インタビューを実施できている。平成31年度は母性心理学研究会を立ち上げ、3月から月1回の会合を開いている。そこではインタビューの結果から得られた、助産師・保健師の妊産褥婦へのかかわりについて分析を進め、まとめていく。そして7月の母性心理学研究会ではインタビューに応じた助産師・保健師をはじめ、妊産褥婦への心理に関心を持つ助産師・保健師に声をかけ、本研究で明らかになったことを発表し、そこからグループディスカッションを行う予定である。平成30年度は、助産師・保健師のインタビュー調査についてインタビュー協力者にも紹介していただいて、協力者を引き続き確保する予定である。インタビュー調査の手続きとしては、助産師・保健師に研究の趣旨の説明を行う。そして、これまで行ってきた母性心理学研究の中で明らかになった25年前と現在の妊産褥婦との母性不安や対児感情の比較や現在の妊産婦を対象にした母子画研究から得られた結果について研究者が話す。そのうえで現在の助産現場でそれぞれの助産師・保健師が、特に心理面の問題で対応が困難に感じる妊産褥婦や明確な問題ということはできないものの今後の子育て等の経過が気になる妊産褥婦の様子についてインタビューを行う。そしてそのインタビューの逐語録から内容を分析し、これまでの研究結果との一致している点や異なっている点、現場のニーズについて質的に検討する。さらに引き続き妊産褥婦への調査研究を行いながら、データの分析を行う。これまでに得られた結果と助産師・保健師へのインタビューで得られた現在の妊産褥婦の客観的な様子からハイリスクな問題ではないものの妊産褥婦と助産師のどちらかあるいは双方が気になる事柄とその対処方法を分析する。平成31年度は、29年度30年度に病院や産院にて勤務しているあるいは勤務経験がある助産師や、出産して退院後1か月以降に保健センターを中心に実施されている家庭訪問事業に携わっているあるいはその経験を持つ保健師・助産師に対して実施してきたインタビューの逐語録から、助産師が妊産褥婦や母親たちへの対応で問題や困難に感じている事柄と、保健師が母親たちへの対応で問題や困難に感じている事柄とを抽出し、これまでの研究結果との一致している点や異なっている点、現場のニーズについて質的に検討する。さらにそれぞれの事柄について、心理職としてはどのような提言ができるかについて検討し、母性心理学研究会を開催して、助産師・保健師へもフィードバックしながら実現可能な対処方法を考えていく。
大学におけるキャリア教育等が卒業後の就業に与える影響に関するコホート研究

2017年度末2018年度初めにおいて、大学新卒者1096名を対象にwebによる調査を行った。質問項目は(1)基本属性、(2)就職先、(3)在学中の就職活動、(4)大学生活の取り組み尺度、(5)大学生の就職活動における親とのかかわり尺度、(6)人生キャリア・レディネス尺度、(7)社会的スキル、(8)一般性格、(9)精神健康。この分析を基に以下の2つの学会発表を行った。研究1:就職活動における活発さを表す指標を定め「受動就活スコア」「能動就活スコア」とし、これらに関連する要因の検討を行った。能動的な就職活動と学内就労支援のサービスを受けることが独立したものであることが示唆された。また、これらに関連する要因には共通のものが多いが、異なる働きを示すものがあることが示唆された。但し重回帰分析の説明率は低く、より精緻な分析が望まれる。研究2:大学が提供するキャリア支援の利用状況とそれへの評価が就職先の満足度とどのような関係にあるのか検討した。利用したサービスの種類数(0-4/5以上)と有効性評価(平均値3.51未満/以上)から、回答者を5つの類型に分類した。もっとも満足度が高いのは「利用多・評価高」層であるが、それに続くのは「利用少・評価高」や「利用なし」層であった。(1)キャリア支援を利用すればするほど一概に就職先の満足度が高まるわけではないこと。(2)自身のキャリア形成に必要なサービスの見極めといった側面が満足度の高い就職先の獲得に関与している可能性も示唆された。(3)パーソナリティ特性などが有効性評価に影響を与えている可能性も検討の余地があることが示唆された。卒後1年目の調査を行う予定であったが、現在計画中であり、実施時期がずれ込んでいる。卒後1年目の調査を5月に実施し、2年目の調査を来年2月に実施する。本研究は若年労働者の早期離職などのキャリア上の諸問題に関して、大学時代の諸経験から説明し、キャリア教育への提言などを目的とするものである。本年度は大学におけるキャリア教育と早期離職に関して文献研究を行った。「大学」&「キャリア教育」でCiNiiで検索を行うと2500余の論文が抽出される。発行年別に見ると、20世紀中は年間一桁の報告であるが、2000年代半ばより報告が増え、2006年以降は常に3ケタ台の報告数があり、非常にポピュラーなテーマとなっていた。しかしながらその大半は、キャリア教育の実践報告であり研究報告は数少なかった。研究報告の中でもキャリア教育の効果に注目したものは、事前事後のキャリア意識の測定が主であり、長期的測定となっておらず、卒業後のキャリアそのものに注目することが重要と思われる。「早期離職」に関しては、文献検索では120件ほどヒットはするものの、実際の早期離職に関して扱った研究は極めて少ないことが明らかとなった。また、その中で報告例が多い職種は、看護、介護、保育等のヒューマンサービスに偏る傾向があった。しかし、実際の離職率はこれらの業種では全産業の平均と大差なく現実の早期離職の全体像を描くためには、より広範な職種について調査する必要性が示唆された。また、早期離職を導く要因については、(1)給与・労働時間・人間関係などといった職場ストレス、(2)業種や会社規模といった職場属性、(3)就職活動期間や学生時代の活動性、キャリア教育などの大学時代の経験、の3点に集約される。(1)(2)は入職後の要因であり、研究例もこれらに分類されるものが大半を占めているが、これらに関しては厚労省などによる公的な調査が比較的充実しており、また、早期退職の早期予防という観点からも大学時代の諸経験に一層注目することの重要性が示唆された。H28年度に実施する予定であった調査が調査方法に関して検討を要しているため、いまだ未実施である。2018年3月に4年制大学を卒業した1096名を対象にリサーチ会社に委託しweb上でのアンケート調査を行った。質問項目は、1)フェイスシート、2)業種と雇用形態、3)就職活動の概要と満足感、4)キャリア教育の有用感、5)大学生活の過ごし方、6)就職活動に関しての保護者とのコミュニケーション、7)入学時の人生キャリアレディネス(回想)、8)現在の人生キャリアレディネス、9)ソーシャルスキル、10)基本的パーソナリティ、11)精神健康度であった。主な従属変数は、上記の内、8)現在の人生キャリアレディネスおよび、8)-7)すなわち卒業時と入学時の人生キャリアレディネスの変化であった。相関分析を行ったところ、8)の3因子全てに対して有意な正の相関を示した変数は、5)-2「就職活動関係」(r=.273.292)5)-3「アクティブラーニング型授業」(r=.226.292)、9)ソーシャルスキル(r=.377.451)であり、キャリア教育により、キャリアレディネスを高めうることが示唆された。このほか、5)-1「授業全般」5)-4「プライベート」、6)-1「相談関係」、10)基本的パーソナリティ、11)精神的健康度なども部分的に人生キャリアレディネスとの有意な相関がみられた。

従属変数の2つ目の人生キャリアレディネスの変化に関しては、6割強の者が増加しているが、有意な関連を示した変数は、10)基本的パーソナリティの「協調性」(r=.216.262)のみであり、変化に影響する要因は明確にならず、一層の精査が必要である。調査の時期が平成30年の3月末から4月初めとなり、年度をまたぐ結果となり、やや遅れている。本研究はコホート研究であり、同一対象に繰り返し調査を行うものである。調査を重ねるうちに、対象者が脱落する恐れがある為、調査に関して念入りに調整を行った結果、遅れが生じた。具体的にはリサーチ会社3社から見積もりを取り、モニター数の多寡、30年度以降の調査におけるインセンティブの程度などを比較検討し、研究が完遂できるよう図った。2017年度末2018年度初めにおいて、大学新卒者1096名を対象にwebによる調査を行った。質問項目は(1)基本属性、(2)就職先、(3)在学中の就職活動、(4)大学生活の取り組み尺度、(5)大学生の就職活動における親とのかかわり尺度、(6)人生キャリア・レディネス尺度、(7)社会的スキル、(8)一般性格、(9)精神健康。この分析を基に以下の2つの学会発表を行った。研究1:就職活動における活発さを表す指標を定め「受動就活スコア」「能動就活スコア」とし、これらに関連する要因の検討を行った。能動的な就職活動と学内就労支援のサービスを受けることが独立したものであることが示唆された。また、これらに関連する要因には共通のものが多いが、異なる働きを示すものがあることが示唆された。但し重回帰分析の説明率は低く、より精緻な分析が望まれる。研究2:大学が提供するキャリア支援の利用状況とそれへの評価が就職先の満足度とどのような関係にあるのか検討した。利用したサービスの種類数(0-4/5以上)と有効性評価(平均値3.51未満/以上)から、回答者を5つの類型に分類した。もっとも満足度が高いのは「利用多・評価高」層であるが、それに続くのは「利用少・評価高」や「利用なし」層であった。(1)キャリア支援を利用すればするほど一概に就職先の満足度が高まるわけではないこと。(2)自身のキャリア形成に必要なサービスの見極めといった側面が満足度の高い就職先の獲得に関与している可能性も示唆された。(3)パーソナリティ特性などが有効性評価に影響を与えている可能性も検討の余地があることが示唆された。卒後1年目の調査を行う予定であったが、現在計画中であり、実施時期がずれ込んでいる。H28実施予定であった調査を5月中に行う。H29年度以降に関しては、計画通り行う。30年度の2月に及び31年度の2月に、今回の調査対象者に対し調査を行う。調査内容は調査時点での就業状況・転職の有無、職場環境、職業モラール、人生キャリアレディネスなどである。脱落者を極力少なくするために、予算を見ながら、インセンティブを調整する。30年度より学会報告論文執筆を行っていく。卒後1年目の調査を5月に実施し、2年目の調査を来年2月に実施する。調査内容、方法に検討を要すべき事項が生じ、年度末に実施予定であった調査が未実施のため。平成29年度内に実施予定の調査が、年度末の実施となったが、より多くのデータを収集するため、年度を越えてからも継続され、次年度使用額が大きく膨らんでいる。この調査は完了しており、支払いについては本年の4月の中下旬に行う。
優性遺伝性皮膚疾患(ダリエー病、ヘイリー・ヘイリー病)治療薬のスクリーニング

本研究は、難治性の皮膚角化症であるダリエー病、ヘイリー・ヘイリー病に対する外用治療薬の開発を目標とする。ダリエー病およびヘイリー・ヘイリー病は、各々SERCA2遺伝子、SPCA1遺伝子の変異による比較的頻度の高い優性遺伝性の角化皮膚疾患であり、醜形・悪臭を伴う皮疹が思春期以降の顔や胸部などの脂漏部位、あるいは腋窩などの問擦部に発症するが、現在の所、有効な治療法が存在しない。両遺伝子より転写される小胞体、ゴルジ体のカルシウムポンプであるATP2A2、ATP2C1蛋白の蛋白量が低下し、表皮角化細胞が正常な角化プロセスより逸脱することで発症する。我々は、ハプロ・インサフィシエンシーと呼ばれるこの発症メカニズより、SERCA2あるいばSPCA1遺伝子の転写を亢進し、患者皮膚でのポンプ蛋白の発現量を変異体・正常蛋白ともに増加させることで、皮膚症状を改善しうると考えた。そこで培養ヒト表皮角化細胞を用い、SERCA2・SPCA1遺伝子の発現を増強させる薬剤を、脂溶性薬剤ライブラリーをスクリーニングすることで網羅的に探索した結果、カンナビノイドとバニロイドと呼ばれる作動薬の1群が、ヒト皮膚でのATP2A2蛋白の発現を亢進することを発見し特許を申請した。ln Vitroの解析結果より発見した各作動薬群の薬剤を今後、モデル動物を用いたEx Vivoの実験を通して、より効果的で安全性の高い薬剤を検討することで探索するとともに、近い将来の臨床治験などへ向けたより効果的な薬剤の選定を進めている。さらにヘイリー・ヘイリー病の治療薬となるべき薬剤のスクリーニングも継続している。培養表皮角化細胞をその形態を保ったまま、市販のKGM培地で培養し、60mmディッシュに多数使用可能な状態とした。培養したヒトの表皮角化細胞に、脂溶性の薬剤ライブラリーより各種の内因性作動薬や合成試薬を添加し、3,6,9時間後の表皮角化細胞内でのSerca2遺伝子のmRNA量をノザンブロットにより定量化した。その結果WIN55,212-2というカンナビノイド受容体の合成作動薬を比較的高濃度(10^<-5>10^<-6>モル)培養液中に加えた際に、6-9時間をピークとして目的であるSerca2遺伝子のmRNAの転写が亢進することを見いだした。さらに薬剤ライブラリー中の他のカンナビノイド作動薬にも同様のSerca2遺伝子の発現を誘導する効果のあることを見いだし、ダリエー病の原因遺伝子であるSerca2遺伝子、ATP2A2蛋白の発現を亢進させる活性を発見した。このカンナビノイド受容体は、内因性のモルフィネの受容体であり、これまでにCB1、CB-2の2つの同位体の存在が知られており、また我々のノザンブロットの結果より、両者の受容体が表皮角化細胞に存在することを確認した。しかしながら合成カンナビノイド作動薬によりSerca2遺伝子の誘導には、10^<-5>10^<-6>モルという生理的濃度を上回る高い濃度の薬剤の添加を必要とするため、この効果がカンナビノイド受容体を介するものか、あるいは近似の受容体を介した作用なのかを現在検討中である。
希土類金属イオン親和性を示すフォトクロミック配位子の分子設計と応用

本研究では、希土類金属イオンに高い親和性を示す光応答性イオノフォアとして新規なクラウン化スピロベンゾピランを分子設計し、その希土類金属イオンに対する錯形成能ならびに錯体の光物性や磁気特性を調べ、分析化学および材料化学への応用研究を行った。光学および磁気特性に興味が持たれる重希土類金属イオンに大きな親和性を示す化合物について、希土類金属イオン錯体の光物性を詳細に調べ、その光制御ならびに光増幅を追求した。その結果、テトラアザ-14-クラウン-4誘導体のユウロピウム錯体は強い発光を示し,可視光による希土類発光の制御の可能性を見出した。また、新たなホスト化合物であるカリクスアレーン誘導体を金属イオン捕捉中心として用い、スピロベンゾピランとともにカルボキシル基の導入を試み、希土類金属イオン錯形成反応と光物性を調べた。その結果、スピロベンゾピラン部位の励起により希土類金属イオン由来の発光が観察された。1)光学および磁気特性に興味が持たれる重希土類金属イオン(Eu^<3+>,Tb^<3+>,Gd^<3+>)への大きな親和性を付与するために昨年度合成した化合物について、希土類金属イオン錯体の光物性をさらに詳細に調べ、その光制御ならびに光増幅を追求した。その結果、テトラアザ-14-クラウン-4誘導体(1)のEu^<3+>錯体は,メタノール/水(9/1)溶液中において,Eu^<3+>に基づく特徴的な強い発光を示した。この発光量子収率は可視光の照射前後で2倍に増大し,可視光による希土類発光の制御の可能性を見出した。2)新たなホスト化合物であるカリクスアレーン誘導体を金属イオン捕捉中心として用い、スピロベンゾピランとともにカルボキシル基の導入を試み、前年度のクラウン化スピロベンゾピラン系と同様、希土類金属イオン錯形成反応と光物性を調べた。その結果、そのEu^<3+>錯体では,スピロベンゾピラン部位の励起によりEu^<3+>由来の発光が観察された3)スピロベンゾピラン部位とともにカルボキシル基を有するアザクラウン誘導体との希土類金属イオン錯形成能ならびに物性を比較検討するため、非環状モデル化合物を合成し希土類金属イオンに対する錯形成能を調べた。その結果、顕著な作成性能ならびに希土類発光特性を見出すことはできなかったので、テトラアザ-14-クラウン-4構造が希土類発光特性に重要であることが判明した。分析化学、機能有機材料化学
BTBドメインを持つ新規転写因子GetBの転写制御機構の解析

1、転写制御。レポーターアッセイを用いてCIBZが二つ独立する転写抑制ドメイン、活性化ドメインをそれぞれ同定した。転写抑制ドメインをbaitにしyeast two-hybrid assayを行った結果、CtBPという転写制御因子と結することを見出した。CIBZはCtBPとin vitroとin vivoにて結合すること、過剰発現のCIBZがCtBPをセントロメアクロマチンにリクルートすること、CIBZの転写抑制にはCtBPとの結合が重要であること、CIBZ・CtBP転写抑制には脱アセチル化酵素が関与することを明らかにした。2、CIBZ遺伝子破壊マウス。CIBZはマウスES細胞を用いたジーントラップ法により同定されため、この遺伝子の"ノックアウトマウス"を作製した。生まれた"KO"と思われるマウスの臓器から蛋白を抽出し、抗CIBZ抗体でWestern blotした結果、CIBZの発現は野生型と同じであることが分かった。4、メチル化。CIBZのZF3-5はメチル化されたCpGジヌクレオチドに結合することがゲルシフトアッセイにより確認した。1、転写制御。4、メチル化。申請者はランダムなジーントラップ法を行い、BTBドメインを有する新規遺伝子GetBを同定した。GetBのエピジェネティックな転写調節機構と、GetBのin vivoでの機能を明らかにすることも目的で以下の成果が得られた。1、翻訳後修飾(1)、脱アセチル化。GetBの二つ転写抑制ドメイン(BTBとそのすぐ下流のRD2:repression domain 2)のうち、RD2の転写抑制活性のみがHDACの阻害剤であるTSAによって解除されたことと、免疫沈降法を用いた実験でGetBとHDACsはin vivoで結合していることから、脱アセチル化がGetBの転写抑制に関わることが分かった。(2)、SUMO化。SUMO化アッセイを行った結果、GetBはin vivoでSUMO化されることを確認した。E2酵素反応を特異的に阻害するdominant negative-ubc 9或いはSUMO specific protease-3をGetB及ひSUMO1と共発現させた場合、GetBのSUMO化か顕著に低下した。さらに、PIASyはGetBのSUMO化のE3酵素の一つであることも明らかにした。(3)、メチル化。GetBはpericentromeric heterochromatinへの局在に必要なドメイン(Zinc finger 1-5)を決定した。ゲルシフト解析の結果、GetBがメチル化CpG dinucleotidesに結合することを判明した。2、ノックアウトマウス。GetBはジーントラップ法によって同定されたため、ノックアウトマウスを作製した。抗GetB抗体を用いたWestern blot及びNorthern blotの解析を行った結果、作製した"ノックアウトマウス"ではGetBが破壊されておらず、ジーントラップベクターがGetB遺伝子プロモーターの上流に挿入されたことを判明した。GetBの遺伝子破壊マウスを作り直す目的で、GetB遺伝子エクソンの両端を導入した約17Kbのtargeting vectorを作製した。Targeting vectorをマウス由来のES細胞に導入し、約250のG418耐性のクロンを回収した。相同組換え体を検出するためPCR及びサザンブロットを行った結果、2クロンが相同組換え体であることを確認した。現在、この2クロンを胚盤胞期の受精卵にインジェクションした。1、転写制御。転写抑制ドメインをbaitにしyeast two-hybrid assayを行った結果、CtBPという転写制御因子と結合することを見出した。CIBZはCtBPとin vitroとin vivoにて結合すること、過剰発現のCIBZがCtBPをセントロメアクロマチンにリクルートすること、CIBZの転写抑制にはCtBPとの結合が重要であること、CIBZ・CtBPの転写抑制には脱アセチル化酵素が関与することを明らかにした。2、SUMO化。3、メチル化。4、CIBZ遺伝子破壊マウス。この遺伝子エクソンの両端を挿入した約17Kbのtargeting vectorを作製し、エレクトロポレーション法によりES細胞に導入し、G418を用いて252個の薬剤耐性ESクローンを選択した。得られたESクローンからゲノムサザンを行い、二つ相同組み換えが確認されたESクローンを樹立した。
腫瘍シンチグラムにおける血流動態の組織学的、流体学的解析

(動物実験)成熟家兎(体重約2kg)の大腿部にVX2癌を移植し、移植後10日15日に、双方向超音波血流計(DVM-4200P)を使用し、大腿部動脈(腫瘍側、対照側)の血流速(cm/秒)、血流量(ml/分)を測定した。その後、腹腔動脈を剖出し、生理食塩水で大腿部の血管を潅流し、造影剤(硫酸バリウムあるいはオムニパークを注入して、腫瘍部の血管造影を実施した。さらに、腫瘍部の単位面積当たりの血管量の組織学的検索を試みた。結果:腫瘍部の血管量は造影像、組織像で豊富であり、血流速、血流量とも腫瘍側で著明に亢進し、今回の検討では約23倍に増加していた。(臨床的検討)約100例の口腔癌患者についてシンチ検査を実施し、うち47例について腫瘍血管量を病理組織学的に検索した。血流像は、99mTc-HMDPシンチにより、静注3040秒の静脈相、13分の貯留相について腫瘍部と対照側の放射能活性を測定し、両者の比を各々VR、BPRとした。TcシンチのEarly像を静注5分後に、Ga像は静注72時間後に撮像し、VR、BPR、Early像、Ga像、病理組織像の血管量を相互に比較した。結果:VR、BPRは各々1.610.73、1.720.95の値であり、1.1以下、1.11.3、1.3以上の3群に分けられた。病理組織像の血管量はrich群10例、intermediate群21例、poor群16例であった。両者の比較では、rich群のVRは平均1.39、BPRは平均1.31、intermediate群のVRは平均1.16、BPRは平均1.16、poor群のVRは平均0.97、BPRは平均1.02であり、腫瘍部の放射能活性は血管量(血流量)を反映している事が証明された。さらにEarly像の陽性像は血管量の多いrich群の78%がVR13以上、100%がBPR1.3以上を示し、血流量と明らかな相関が見られた。今回の検討ではGa像は血流量より腫瘍サイズに影響され、小サイズの腫瘍の検出率はGa像単独では42%であったが、Early像(血流像)との組み合わせで62%に向上した。結論:動物実験の結果からactive grpwthの時期の腫瘍は比較的小サイズであるにも関わらず、血流は正常に比較して有意に増加しており、Early像(血流像)による比較的小サイズの腫瘍の検出の可能性が示唆された。(対象)

臨床検査において117名の口腔癌患者についてシンチグラム検査を実施し、そのうち47名について腫瘍血管量を病理組織学的に検索した。(方法)血流について^<99m>Tc-HMDPにより、静注3040秒の静脈相、13分の貯留相について腫瘍部の放射能活性を測定し、対照側との比を各々VR、BPRとした。Earlyシンチグラム像は^<99m>Tc-HMDP静注5分後に撮像し、Delayedシンチグラム像は^<67>Ga-citrate静注72時間後に撮像し、VR、BPR、Earlyシンチグラム像、Delayedシンチグラム像、病理組織像を比較検討した。(結果)VR、BPRは各々1.610.73、1.720.95の値であり、1.1以下、1.11.3、1.3以上の3群に分けた。病理組織像による血管量は3群に分かれ、rich群10例、intermediate群21例、poor群16例であった。両者の比較では、rich群のVRは平均1.39、BPRは平均1.31、intermediate群のVRは平均1.16、BPRは平均1.16、poor群のVRは平均0.97、BPRは平均1.02であり、腫瘍部の放射能活性の増加は血管量(血流量)を反映している事が証明された。さらにEarlyシンチグラム像の陽性像は血管量の多いrich群で78%がVR1.3以上、100%がBPR1.3以上を示し、血流量と明らかな相関が見られた。このことはactive growthの時期にある比較的小サイズの腫瘍は血管に富む事から、Earlyシンチグラム像による比較的小サイズの検出の可能性が示唆された。Delayedシンチグラム像は血流量よりも腫瘍サイズと相関を示し、小サイズの陽性率は42%と血流による陽性率65%に劣った。さらに、家兎に腫瘍を移植し、各病期における組織像の評価、血流計による血流動態を計測中で平成8年度に終了する予定である。(動物実験)成熟家兎(体重約2kg)の大腿部にVX2癌を移植し、移植後10日15日に、双方向超音波血流計(DVM-4200P)を使用し、大腿部動脈(腫瘍側、対照側)の血流速(cm/秒)、血流量(ml/分)を測定した。その後、腹腔動脈を剖出し、生理食塩水で大腿部の血管を潅流し、造影剤(硫酸バリウムあるいはオムニパークを注入して、腫瘍部の血管造影を実施した。さらに、腫瘍部の単位面積当たりの血管量の組織学的検索を試みた。結果:腫瘍部の血管量は造影像、組織像で豊富であり、血流速、血流量とも腫瘍側で著明に亢進し、今回の検討では約23倍に増加していた。(臨床的検討)約100例の口腔癌患者についてシンチ検査を実施し、うち47例について腫瘍血管量を病理組織学的に検索した。血流像は、99mTc-HMDPシンチにより、静注3040秒の静脈相、13分の貯留相について腫瘍部と対照側の放射能活性を測定し、両者の比を各々VR、BPRとした。TcシンチのEarly像を静注5分後に、Ca像は静注72時間後に撮像し、VR、BPR、Early像、Ga像、病理組織像の血管量を相互に比較した。結果:VR、BPRは各々1.610.73、1.720.95の値であり、1.1以下、1.11.3、1.3以上の3群に分けられた。病理組織像の血管量はrich群10例、intermediate群21例、poor群16例であった。両者の比較では、rich群のVRは平均1.39、BPRは平均1.31、intermediate群のVRは平均1.16、BPRは平均1.16、poor群のVRは平均0.97、BPRは平均1.02であり、腫瘍部の放射能活性は血管量(血流量)を反映している事が証明された。さらにEarly像の陽性像は血管量の多いrich群の7.8%がVR1.3以上、100%がBPR1.3以上を示し、血流量と明らかな相関が見られた。今回の検討ではGa像は血流量より腫瘍サイズに影響され、小サイズの腫瘍の検出率はGa像単独では42%であったが、Early像(血流像)との組み合わせで62%に向上した。
半導体型検出器およびダイバージングホールコリメータを用いた超高分解能SPECT

平成18年度は主にシミュレーションによって、ダイバージングコリメータとCdTe半導体検出器によるSPECTシステムの有効性の検証を行った。また、半導体検出器ならびにダイバージングコリメータを設計する上で重要となるパラメータをシミュレーションによって求め、決定した仕様に基づいたダイバージングコリメータの試作並びにCdTe半導体検出器の試作を行った。作成した検出器は有効視野が44x44mm^2であり、1画素の大きさは0.5x0.5mm^2である。また、コリメータとしては厚さ40mmのパラレルホール型、厚さ20mmで有効視野の拡大率、約1.5倍のダイバージングコリメータである。同時に、正確なデータ収集が可能となるための治具も製作した。平成19年度においては、作成したSPECTシステムを用いたさまざまな実験を行い、提案システムの有効性を実証した。行った実験は、検出器そのものの性能をNEMA規格の方法によって測定する実験、ロッドファントムを用いた実験などであり。この実験からホットロッドに関しては直径1mmのロッドを、コールドロッドに関しては直径1.6mmのロッドを分解することができた、また、ダイバージングコリメータを装着したシステムにおいて、検出器の有効視野よりも大きな物体の放射能分布を映像化することに成功した。これらのシミュレーション、ならびに試作システムを用いた実験から、半導体検出器のような画素の大きさが小さなピクセル型検出器を用いることで、検出感度が低下するというような状況下でも、高画質のSPECT画像を得ることができるということを実証した。本研究ではSPECT装置の空間分解能の問題を抜本的に解決するために、常温で使用可能なCdTe半導体型検出器を用い、これに視野拡大可能なようにダイバージングコリメータを試作、装着し、超高分解能形SPECT装置の有効性を検証する。研究は以下のように進められた。まず、シミュレーションから提案手法の有効性を検証するために、ダイバージングコリメータを用いた場合のガンマ線のデータ収集がどのようになるかを、モンテカルロシミュレーションで検証した。シミュレーションでは、円筒などを組み合わせた単純なファントムおよび実際の脳の形状を用いたファントムなどを用いた。このシミュレーションによって、計測できるカウントと画質の関係、ダイバージングあるいはパラレルホール形のコリメータの使用による空間分解能の劣化を定量化した。次に、このプログラムを用いてコリメータの仕様を決定した。コリメータの仕様に関しては、空間分解能、感度、拡大率などを総合的に判断して、2種類のコリメータの形状を決定し試作に入った。検出器の画素サイズが0.5x0.5mmなので、コリメータの基本的な孔の大きさは0.3x0.3mmであり、隔壁厚を0.2mmとするように設計した。コリメータは0.1mm厚のタングステン板に対して位置と大きさの異なる孔をエッチング処理によって開け、これを積み重ねることで実現させた。このようにして製作したコリメータを半導体検出器に非接触で精度良く位置あわせするための治具を考案して、これを製作した。この治具でコリメータの種類を取り替えながら、種々の実験ができる環境が整った。このシステムを用いた実験は、3月に開始されたばかりであるが、概ね良好なSPECT画像が再構成されており、基礎実験を積み、精度良くコリメータの孔と検出器の画素を一致させることで、高い空間分解能の画像が得られると考えている。昨年試作した検出器を用いた詳細な実験を実施し,シミュレーション結果との比較検討を主に行った。まず,検出器ならびにダイバージングコリメータの基本性能を調べるために,NEMA規格に準じた実験を行った。これにより,均一性,感度,空間分解能などのさまざまな性能を明らかにした。次に,分解能調査用のロッドファントムを作成し,これを用いた基礎実験を実施した。この結果,直径1mmのホットロッドと1.6mmのコールドロッドを,CdTe半導体検出器とパラレルホールコリメータで映像化することができた。

パラレルホールコリメータのSPECTシステムで解像できる限界は今まで,最高でも6mm程度であったが,実験結果は従来の最高値を大きく上回るものとなり,世界的にみても最高の分解能が実現できた。また,この検出器に試作したダイバージングコリメータを装着し,有効視野を1.5倍に拡大する実験を行ったが,この実験から本研究でねらっていた視野の拡大も実証することができた。ダイバージングコリメータを装着したSPECTシステムでも,直径1mmのホットロッドとL6mmのコールドロッドを解像した。この他,コリメータと検出器問の隙間の影響や,回転軸のずれがダイバージングSPECTのイメージングに与える影響をシミュレーションから明らかにした。また,従来,検出器のピクセルを小さくして,高い空間分解能を実現することは,統計雑音を増大するため好ましい方法ではないと一般に認識されているが,半導体型検出器のようなピクセル検出器では,統計雑音が増大してもコントラスト分解能が高いため画質的に有利になることを,初めて明らかにした。
オートファジー活性の指標となる新規分泌性マーカー分子の探索

細胞内異常分子の分解を担うオートファジーは、老化やそれに伴う幅広い疾病の予防戦略として注目される一方、生体における活性強度を簡便に評価する手段に乏しい。本研究では、オートファジー活性を反映する新規分泌性マーカー分子の同定を目的とした。培養細胞から分泌される分子に対して質量分析装置を用いた網羅的解析を行い、オートファジー活性と相関して分泌されるタンパク質としてpyruvate kinase M1/M2を同定した。しかし、本分子は、オートファジー活性化条件だけでなく、オートファジー分解を阻害した条件においてもその分泌量が増加することが明らかとなり、マーカー分子としての応用は難しいと考えられた。細胞内異常分子の分解を担うオートファジーは、老化やそれに伴う幅広い疾病の予防戦略として注目される一方、生体における活性強度を簡便に評価する手段に乏しく、オートファジー活性を調節する活性物質の研究開発は遅れている。本研究では、細胞外分泌分子に着目し、オートファジー活性を反映する新規分泌性マーカー分子の探索・同定を目的とした。以下に、平成26年度における研究成果について記載する。リソソーム酸性化阻害剤であるbafilomycinによりオートファジー分解を阻害したマウス胚性繊維芽細胞(MEF)の培養上清から、低分子画分およびタンパク質画分を回収し、質量分析装置(LC-Q-TOF MS, TripleTOF 5600, AB SCIEX)を用いて網羅的解析を行った。まず、低分子画分に関して、bafilomycin処理によるC-16 ceramideの増加を認めたが、再現性の確認のため異なる質量分析装置による分析を行ったところ、同様の結果を得ることができなかった。続いて、タンパク質画分に対して高精度な定量的解析(SWATH)を実施したところ、bafilomycin処理により計17種のタンパク質分泌が増加することを見出した。WBによる解析の結果、興味深いことに、これらのタンパク質の中でもpyruvate kinase M1/M2(PKM)は、オートファジー活性化条件であるアミノ酸飢餓条件においてもその分泌量が増加し、オートファジーに必須な遺伝子であるAtg7をノックアウトしたMEFからはほとんど分泌されないことが明らかとなった。これらの刺激条件において、PKMの細胞内発現量に大きな変化は認められなかったことから、細胞内に発現しているPKMのごく一部がAtg7依存的に分泌される可能性が示唆された。現在、PKMの細胞内局在の変化に着目し、分泌機構の解析を行っている。平成26年度、培養細胞の培養上清に対して質量分析装置による網羅的定量解析を行い、Atg7依存的に分泌される分子としてpyruvate kinase M1/2 (PKM)を見出した。しかしPKMは、オートファジー活性化条件下だけでなく、bafilomycin処理によるオートファジー阻害条件においてもその分泌量が増加することが明らかとなり、マーカー分子としての応用は難しいと判断した。平成27年度においては、PKMの分泌機構の解明を試みた。近年、オートファゴソームが細胞膜と融合し、小胞内分子を細胞外へ分泌する機構(exophagy)が報告され、PKMの分泌においても多くの共通点が認められたことから、まず、PKMのオートファゴソームへの局在性について検証した。アミノ酸飢餓条件においてPKMの細胞内膜構造への移行を認めたが、オートファゴソームを形成できないAtg7ノックアウト細胞においても同様の現象が認められたため、PKMはexophagyとは独立した機構を介して細胞外へと輸送される可能性が高い。続いて、網羅的定量解析においてPKMと同様の分泌挙動を示したスフィンゴ脂質C-16ceramideに着目した。異なる質量分析装置(LC-MS/MS)を用い、C-17 ceramideを内部標準として培養上清中C-16 ceramideの絶対定量を行ったが、その分泌量とオートファジー活性との間に相関性は認められなかった。尚、ceramideの定量分析のために、API3200質量分析装置(Sciex社)をレンタルした。平成26年度における研究により、オートファジー活性の変化に応答してPKMの細胞外分泌が増減することを見出した。しかし、PKMの分泌量は、オートファジー活性化条件であるアミノ酸飢餓により、Atg7(オートファジーに必須な遺伝子)依存的に増加する一方で、リソソーム酸性化阻害剤であるbafilomycinによりオートファジー分解を阻害した条件においても増加した。このように複雑な結果が得られたことから、PKMの分泌量を指標にオートファジー活性を簡便に評価することは難しいと考えられえる。オートファジーマーカーとなりうる分泌分子を同定できなかった点で、本研究は当初の計画から少し遅れていると評価せざるをえない。

しかし、PKMがAtg7依存的に分泌される機構を検証することは、オートファジーと細胞外分泌機構との関与を理解する上で重要と考えられる。現在、アミノ酸飢餓またはbafilomycin処理条件におけるPKMの細胞内局在の変化に着目し、分泌機構との関与を検証している。農芸化学平成26年度における研究により、オートファジーに必須な遺伝子であるAtg7に依存してPKMの細胞外分泌が増減することを見出した。しかし、オートファジー活性化条件および阻害条件のいずれにおいても、その分泌量が増加することから、本分子の分泌量の変化を指標としてオートファジー活性を評価することは難しいと考えられる。そこで、当初計画していたELISAによるオートファジー評価系の確立を取りやめ、PKM分泌機構の解明に取り組む予定である。近年、成熟したオートファゴソームが細胞膜と融合し、小胞内部の分子を細胞外に分泌する現象が報告されており、exophagyと呼ばれている。PKMの分泌に関しても、Atg7のノックアウトにより分泌量が減少する点や、bafilomycinによりオートファジー分解を後期で阻害することで分泌量が増加する点など、共通点が多く認められたことから、exophagyにより分泌される可能性を想定し、その検証を行う予定である。現在、アミノ酸飢餓またはbafilomycin処理条件におけるPKMの細胞内局在について検証している。研究計画当初は、マーカー分子を指標としたオートファジー評価系として、新規特異的抗体の作製およびその抗体を用いたELISAの確立や、実験動物の血液および尿を用いたオートファジー活性の評価を予定していた。しかし、前述したように、平成26年度における研究においてオートファジー活性の指標となるマーカー分子を同定することができなかったため、これらの予定していた実験を実施するに至らなかった。平成26年度において、PKMがオートファジーに必須な遺伝子であるAtg7依存的に分泌されることを見出した。PKMは、オートファジー活性化条件および阻害条件のいずれにおいてもその分泌量が増加することから、マーカー分子としての利用は難しいと考えられる。しかし、PKMのAtg7依存的な分泌機構を検証することは、オートファジーと細胞外分泌機構との関与を理解する上で重要である。本年度においては、まず、PKMの分泌が確かにオートファジー依存的なものであるかどうかをsiRNAによりAtg遺伝子群をノックダウンした細胞を用いて確かめる予定である。その後、アミノ酸飢餓およびbafilomycin処理条件におけるPKMのオートファゴソームへの局在性について評価し、本分子がexophagyにより分泌されている可能性について検証する。従って、次年度利用額に関しては、多種類のsiRNAや細胞分画に用いる試薬を購入するために利用する予定である。