hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
単離小腸K細胞を用いたGIP合成・分泌機構の解明

代謝学Chem., 2013)、本年は小腸におけるRfx6の発現や他の転写因子の発現をノックダウンさせることにより、K細胞の分化系譜やそれににおけるRfx6の位置づけを明らかにする。3)我々は、K細胞からのGIP分泌低下がFABP5欠損による高脂肪食負荷下の体重減少に関与していることが明らかした。本年度は、FABP5欠損マウスのK細胞のマイクロアレイ解析やYeast Two Hybrid Systemを用いた研究によりFABP5シグナルに関与する分子やFABP5と結合するたんぱく質を単離・同定することにより、脂肪酸刺激によるFABP-5を介するGIP分泌のメカニズムを明らかにする。前述した成果は、論文化しすでにThe Journal of Biological Chemistryに掲載された。GIP-GFPマウスを用いたK細胞と非K細胞をマイクロアレイや半定量的PCRの結果から、GIP分泌や合成に関わるいくつかの新たな分子に注目し、機能解析を行っている。またこれまでGLP-1分泌への関与が報告されているいくつかの脂肪酸受容体に注目し、K細胞における遺伝子発現量を評価したところ、K細胞が発現する腸管部位によって腸管脂肪酸受容体の発現局在が異なることを明らかにした。27年度が最終年度であるため、記入しない。申請者らが単離したK細胞に発現する新規分子(脂肪酸結合蛋白ならびにG蛋白質共役受容体)のGIP合成や分泌への関与については、マウス腸管内分泌細胞STC-1細胞を用いてin vitroで解析中である。これらの分子のうち、脂肪酸結合蛋白質については、欠損マウスを他大学との共同研究により入手し、in vivoでのK細胞におけるGIP合成や分泌能を評価中である。G蛋白質共役受容体については、K細胞における役割を評価するため、ノックアウトマウスを作製しGIP合成や分泌能を解析中である。
注意の遠近・奥行き移動機構の解明

視覚的注意の移動研究はこれまで2次元空間内で検討されてきた。しかし、奥行き距離の異なる対象間でどのように注意の移動、切り替えが行なわれるのかという3次元空間内での問題は検討されていない。この点を明らかにするために、新しい実験手法を開発、適用した。得られた主な結果は、以下の通りである。1.注意距離よりも近い対象には遠い対象に対してよりも注意は速く働く。2.予備情報・予期は、2次元平面上での注意事態よりも、奥行き・遠近注意事態で顕著な効果を示す。横方向注意と比較しての奥行き注意の特性、および移動事態と静止事態での奥行き注意の相違がさらに追及すべき課題の一つに挙げられる。3.移動事態での注意の切り換えは、「遠→近」の方が「近→遠」の切り換えよりも効率よく行なわれる。このことを移動事態における注意移動の"RUBBER BAND METAPHOR"と呼んだ。この特性は、静止状態では示されない。「注意の切り替えの異方性が移動状態が大きく出ること」が見い出された。これらは、人間の遠近注意移動機構の生態学的妥当性、空間表象の観察者中心性を示す新しい知見である。これらに関連する実際的な問題として、4.カ-・ナビゲイションの注視前後で前方の危険事象の発見反応時間が、ナビゲイションを使用しない事態に比べ長くなるという、注意転導の事前・事後効果を見いだした(事後効果は少なくとも2秒間は存続する)。しかし、奥行き距離の異なる対象間でどのように注意の移動、切り替えが行なわれるかという3次元空間内での問題は検討されていない。このことを移動事態における注意移動の“RUBBER BAND METAPHOR"と呼んだ。「注意の切り替えの異方性が移動状態で大きく出ること」が見い出された。これは新しい知見であるとともに、今後さらに追求すべき意義深い問題である。注意の奥行き特性、移動事態の持つ意味という二つの観点から、これらの概念を引き続き実証的に精緻化していく。

これらは、人間の遠近注意移動機構の生態学的妥当性、空間表象の観察者中心性を示す新しい知見である。これらに関連する実際的な問題として、4.カ-・ナビゲイションの注視前後で前方の危険事象の発見反応時間が、ナビゲイションを使用しない事態に比べて長くなるという、注意転導の事前・事後効果を見いだした(事後効果は少なくとも2秒間は存続する)。
海洋性ピコプランクトンを指標とした簡便な溺死診断法の開発

昨年度までに海水,河川水,水道水等を実験的に血液へ添加した試料を用いて,海洋細菌を選択的に且つ簡便に検出可能な平板培地の諸条件を決定した。今年度は,その選択培地を用いて溺死体の血液試料から海洋細菌の検出を試みた.各水域で発見された溺死体(海水域9例,汽水域2例,淡水域4例,浴槽内1例)の血液試料を順次3%NaClで希釈し,平板培地(2-4% NaCl加Todd Hewitt培地,pH8.0,及びTCBS培地)に塗沫した.25°Cで24-36時間培養後,菌の生育を認めた平板は暗所で発光細菌の検索を行い,続いてCytochrome oxidase test(以下COT)による呈色試験を行った.結果の判定は,4%NaCl加Todd Hewitt培地及びTCBS培地において,発光細菌ないしCOT陽性菌のいずれかを認めた例を陽性とした.その結果,海水域での9例については,8例が陽性,1例が陰性であった.陰性の1例は後に淡水域で入水したことが明らかとなった.他方,汽水域・淡水域・浴槽内の計7例については,5例で菌の生育を全く認めず,残り2例も菌の生育はみられるものの,発光細菌及びCOT陽性菌は観察されず,何れも陰性と判定された.陽性であった8例について,各平板からコロニーを12-20個採取し,16S rRNA遺伝子を解析し簡易同定を行ったところ,すべて海洋細菌(Vibrio属,Photobacterium属,Shewanella属,Pseudoalteromonas属,Psychrobacter属等)であることが示された.また各事例における細菌種は,何れも1,2種類と少ない属によって構成されていることが明かとなった.以上の結果から,本検査を用いて溺死体の血液試料から海洋細菌が優勢的に検出されれば,海水の吸引を強く示唆するものであり,溺死診断の一助と成り得ると考えられた.本研究の目的は、生前に海水が肺から血中に侵入したことを証明する検査方法を確立することであり、海洋細菌をその指標としている。本年度は血液から簡便に海洋細菌の検出が可能な選択培地について検討をおこなった。先ず、溺水を吸引した血液を想定して、健常者の血液1.6mlに、海水、河川水、水道水、泥水を0.4ml添加後、25°Cで24時間インキュベートした(計35例)。次いで、これらの血液を順次希釈したものを試料とし、三種の培地(Todd Hewitt Agar培地、Marine Agar 2216培地、TCBS培地)を用いて、NaCl濃度、pH等を変えて培養を行った。その結果、Todd Hewitt Agar培地及びMarine Agar 2216培地では、4%NaCl、pH8.0において、海水を添加した血液試料を10^6倍希釈しても細菌の増殖がみられた(但し、コロニーの大きさといった点を考慮するとTodd Hewitt Agar培地の方が優れていた)。またその中には発光する細菌も認めた。続いて、細菌の増殖を認めた平板についてChytochrome oxidase testを行ったところ、すべて陽性であった。他方、河川水・水道水・泥水では、O-10^2倍希釈まで細菌が増殖したが、いずれもChytochrome oxidasetestは陰性であり、発光する細菌も観察されなかった。また、Vibrio属細菌の選択培地として知られるTCBS培地では、海水を添加した血液試料でのみ細菌が増殖し、ごく一部の細菌に弱い発光を認めた。これまでの実験結果から、Todd Hewitt Agar培地のNaCl濃度を4%とし、ph8.0、培養温度25°Cのすることで、海洋細菌を選択的に検出できることが示されている。今後は、今回検討した条件を用いて実際に海水域での溺死体から海洋細菌の検出を試み、海洋細菌検査が溺死診断の一助になり得るかについて検討したい。今年度は,その選択培地を用いて溺死体の血液試料から海洋細菌の検出を試みた.各水域で発見された溺死体(海水域9例,汽水域2例,淡水域4例,浴槽内1例)の血液試料を順次3%NaClで希釈し,平板培地(2-4% NaCl加Todd Hewitt培地,pH8.0,及びTCBS培地)に塗沫した.25°Cで24-36時間培養後,菌の生育を認めた平板は暗所で発光細菌の検索を行い,続いてCytochrome oxidase test(以下COT)による呈色試験を行った.結果の判定は,4%NaCl加Todd Hewitt培地及びTCBS培地において,発光細菌ないしCOT陽性菌のいずれかを認めた例を陽性とした.その結果,海水域での9例については,8例が陽性,1例が陰性であった.陰性の1例は後に淡水域で入水したことが明らかとなった.他方,汽水域・淡水域・浴槽内の計7例については,5例で菌の生育を全く認めず,残り2例も菌の生育はみられるものの,発光細菌及びCOT陽性菌は観察されず,何れも陰性と判定された.陽性であった8例について,各平板からコロニーを12-20個採取し,16S rRNA

遺伝子を解析し簡易同定を行ったところ,すべて海洋細菌(Vibrio属,Photobacterium属,Shewanella属,Pseudoalteromonas属,Psychrobacter属等)であることが示された.また各事例における細菌種は,何れも1,2種類と少ない属によって構成されていることが明かとなった.以上の結果から,本検査を用いて溺死体の血液試料から海洋細菌が優勢的に検出されれば,海水の吸引を強く示唆するものであり,溺死診断の一助と成り得ると考えられた.
癌の浸潤とアポトーシスにおけるチロシンキナーゼシグナル伝達の制御機構の解析

癌細胞の浸潤能とアポトーシスにおけるチロシンキナーゼシグナル伝達の役割を、v-src導入ヒト上皮細胞HAG-1で解析した。HAG-1はv-srcを導入すると浸潤能をを獲得するが、アデノウイルス組み込み変異抑制Ras分子により内因性Ras機能を抑制すると造腫瘍能が完全に阻害され、さらにRas下流で細胞の遊走能に関与する低分子GTP結合蛋白RacとRhoの変異抑制分子は、Srcによる浸潤能や造腫瘍能を完全に抑制した。このためSrcによる癌悪性化や浸潤能の獲得には少なくともRas機能は必要であり、その下流のRac/Rhoが重要な働きをしていることが明らかにされ、Racを含む低分子GTP蛋白が癌浸潤の重要な分子標的となることがわかった。SrcをヒトHAG-1細胞に導入すると活性型Srcはチュブリンの脱重合を阻害するタキソテールの薬剤感受性を上げることを発見し、この機序はSrcが抗アポトーシス作用のあるBc1-2をリン酸化することによりその機能を抑制するためであることが明らかになった。さらにEGF受容体阻害剤であるZD1839はヒト上皮細胞HAG-1をアポトーシス誘導するが、RasおよびSrc導入細胞は50-100倍の抵抗性を示した。アポトーシスの機序を解析するため、アポトーシス関連蛋白であるBcl-2、Baxの発現を蛋白レベルでみたところHAG-1細胞ではZD1839処理でBaxの発現が見られたが、Ras, Src導入細胞ではBaxの発現は認められなかった。またアポトーシスに平行してBaxのミトコンドリアへの移動が見られた。Baxの発現を抑えるため,BaxのsiRNAを導入してBax蛋白を抑制するとZD1839によるアポトーシスが回避された。BaxのmRNAは変化なく、このためBaxの増加はBaxの分解の抑制によるものと考えられた。以上の結果はZD1839はproapoptotic蛋白であるBaxを介してアポトーシスを惹起させることが推測された。またSrc阻害剤を使用してZD1839によるBax発現がみられ、耐性を克服できるかどうか、またEGFRの下流のAktやErkの活性化をの状態を調べることによってシグナル伝達とZD1839の作用機序の詳細を解析している。HAG-1はv-srcを導入すると浸潤能を獲得するが、アデノウイルス組み込み変異抑制Ras分子により内因性Ras機能を抑制すると造腫瘍能が完全に阻害され、さらにRas下流で細胞の遊走能に関与する低分子GTP結合蛋白RacとRhoの変異抑制分子は、Srcによる浸潤能や造腫瘍能を完全に抑制した。SrcをヒトHAG-

1細胞に導入すると活性型Srcはチュブリンの脱重合を阻害するタキソテールの薬剤感受性を上げることを発見し、この機序はSrcが抗アポトーシス作用のあるBcl-2をリン酸化することによりその機能を抑制するためであることが明らかになった。さらにEGF受容体阻害剤であるZD1839はヒト上皮細胞HAG-1をアポトーシス誘導するが、RasおよびSrc導入細胞は100-300倍の抵抗性を示した。アポトーシスの機序を解析するため、アポトーシス関連蛋白であるBcl-2、Baxの発現を蛋白レベルでみたところHAG-1細胞ではZD1839処理でBaxの発現が見られたが、Ras, Src導入細胞ではBaxの発現は認められなかった。P53の阻害剤であるPifithrin-_で処理するとBaxが抑制されアポトーシスも回避された。以上の結果はZD1839はp53を介してproapoptotic蛋白であるBaxを発現させアポトーシスを惹起させることが推測された。今後はBaxのAntisenseによりZD1839のアポトーシスが回避できるかどうか、またSrc阻害剤を使用してZD1839耐性を克服できるかどうか、Src阻害剤でIZD1839によるBax発現がみられるかを調べることによってシグナル伝達とZD1839の作用機序の詳細を解析している。癌細胞の浸潤能とアポトーシスにおけるチロシンキナーゼシグナル伝達の役割を、v-src導入ヒト上皮細胞HAG-1で解析した。HAG-1はv-srcを導入すると浸潤能をを獲得するが、アデノウイルス組み込み変異抑制Ras分子により内因性Ras機能を抑制すると造腫瘍能が完全に阻害され、さらにRas下流で細胞の遊走能に関与する低分子GTP結合蛋白RasとRhoの変異抑制分子は、Srcによる浸潤能や造腫瘍能を完全に抑制した。このためSrcによる癌悪性化や浸潤能の獲得には少なくともRas機能は必要であり、その下流のRac/Rhoが重要な働きをしていることが明らかにされ、Racを含む低分子GTP蛋白が癌浸潤の重要な分子標的となることがわかった。SrcをヒトHAG-1細胞に導入すると活性型Srcはチュブリンの脱重合を阻害するタキソテールの薬剤感受性を上げることを発見し、この機序はSrcが抗アポトーシス作用のあるBcl-2をリン酸化することによりその機能を抑制するためであることが明らかになった。さらにEGF受容体阻害剤であるZD1839はヒト上皮細胞HAG-1をアポトーシス誘導するが、RasおよびSrc導入細胞は50-100倍の抵抗性を示した。またアポトーシスに平行してBaxのミトコンドリアへの移動が見られた。Baxの発現を抑えるため, BaxのsiRNAを導入してBax蛋白を抑制するとZD1839によるアポトーシスが回避された。BaxのmRNAは変化なく、このためBaxの増加はBaxの分解の抑制によるものと考えられた。以上の結果はZD1839proapoptotic蛋白であるBaxを介してアポトーシスを惹起させることが推測された。
振替株式制度に関する法的研究

わが国の上場株式はすべて「社債、株式等の振替に関する法律」(以下、「振替法」という)に基づく振替制度が適用される振替株式であり、株式の譲渡や株主の権利の行使・管理は同制度のもとで行われている。本研究の目的は、比較法的考察を踏まえながら、かかる振替株式に通底する基礎理論を開明したうえで、それを基盤にして、振替株式をめぐる多数の実務的諸問題につき、体系的・整合的かつ妥当な解決策を提示することにある。こうした目的を達成するため、平成30年度も、平成28年度および平成29年度に引き続き、1振替株式制度の法的性格および基礎的理論の解明、2先進諸外国における上場株式の取引をめぐる制度・法的ルールの比較法的検討、3実務的諸問題の洗い出しに関する研究を行った。さらに、本年度は本研究の最終年度に当たることから、本研究全体のとりまとめを行った。より具体的には、1について、引き続き振替株式の譲渡に伴う株主地位の移転に関し、当該株主情報の振替株式発行会社への伝達手段としての総株主通知および個別株主通知の機能および発行会社の株主名簿の意義について検討した。2については、平成30年11月にアメリカ合衆国に出張し、ニューヨーク証券取引所およびブロードリッジ・フィナンシャル・インクを訪問し、インタビューおよび資料収集を行った。3については、研究代表者および分担者を含む研究会を複数回実施し、実務的な問題点につき検討を行った。また、上記の研究のための基礎的作業として、非上場会社を含めた、株主の権利行使に関する研究を行い、その研究成果を公表した。平成28年度は、研究実施計画に従い、1振替株式制度の法的性格および基礎的理論の解明、2先進諸外国における上場株式の取引をめぐる制度・法的ルールの比較法的検討、3実務的諸問題の洗い出しに関する研究を平行して行った。1については、振替株式制度の法的性格の解明を、上場株式の取引に関する歴史的経緯(株券という有価証券を利用した制度→株券を残しつつ任意利用の制度としての株券保管振替制度→振替株式制度)の連続性と断絶性の相関関係を念頭に検討した。2については、文献を中心とした資料に基づき比較法的検討を行った。予定していたアメリカ合衆国への調査出張は、準備が調わず来年度以降に実施することとした。3については、株式会社証券保管振替機関および証券代行会社へのヒヤリングを実施し、実務的課題の洗い出しを行った。予定していたアメリカ合衆国への調査出張を実施することができなかったため。わが国の上場株式はすべて「社債、株式等の振替に関する法律」(以下、「振替法」という)に基づく振替制度が適用される振替株式であり、株式の譲渡や株主の権利の管理・行使は同制度のもとで行われている。振替株式制度は、わが国の経済社会において極めて重要な制度であるにもかかわらず、従来の研究は主に判例評釈を通じた個別的問題に関する解釈にとどまっている。本研究の目的は、比較法的考察を踏まえながら、かかる振替株式制度に通底する基礎理論を解明したうえで、それを基盤にして、振替株式をめぐる多数の実務的諸問題につき、体系的・整合的かつ妥当な解決策を提示することにある。こうした目的を達成するため、平成29年度も、平成28年度に引き続き、1振替株式制度の法的性格および基礎的理論の解明、2先進諸外国における上場株式の取引をめぐる制度・法的ルールの比較法的検討、3実務的諸問題の洗い出しに関する研究を行った。より具体的には、1については、振替株式の譲渡に伴う株主地位の移転に関し、当該株主情報の振替株式発行会社への伝達手段としての総株主通知および個別株主通知の機能および発行会社の株主名簿の意義について検討を行った。2については平成29年8月にドイツ連邦共和国に出張し、フランクフルト証券取引所およびハイデルベルク大学を訪問して資料収集を行った。3については、研究代表者および/または研究分担者が参加する研究会を計5回実施し、実務的な課題について検討を行った。1本研究課題につき、研究会を開催し、研究を着実に進展させている。2ドイツ連邦共和国に出張し、ドイツ上場株式に関する資料収集を行った。3平成28年度に実施予定であったアメリカ合衆国への出張を今年度実施予定である。

アメリカ合衆国への調査出張を除き、概ね順調に実施計画通りに研究が進んでいるので、平成29年度以降も研究実施計画に沿った形で研究を進める。平成30年度は本研究課題の最終年度となることから、アメリカ合衆国への出張を予定しており、比較法的検討のための資料収集を行う予定である。その結果を踏まえて、研究成果のとりまとめ作業を行いたい。予定していたアメリカ合衆国への調査出張を実施しなかったため。平成28年度予定していたアメリカ合衆国への出張が実施できず、その分平成29年度への繰り越しが生じていた。その関係から平成29年度も若干の繰り越しが生じたが、平成30年度はアメリカ合衆国への出張を実施する予定である。アメリカ合衆国への調査出張は平成29年度以降に実施する予定である。
建築文化財における伝統的な塗装彩色材料の再評価と劣化防止に関する研究

建築文化財の外観塗装材料は劣化が著しく、修理作業時に従来の塗装材料をある程度除去してから新たに塗り替え作業を行う場合が多く、創建当初やその後の修復履歴を確認することは極めて困難であったが、塗装彩色の色調は、建造物自体のイメージを大きく左右するため大切である。さらに、近年の塗装彩色修理では、真実性を重視して過去の材料や技術を調査する必要性も認識されつつある。本研究では、1幾つかの建造物の外観塗装彩色に関する基礎調査、2伝統的な塗装彩色材料及び合成樹脂をブレンドした手板試料の作成と曝露試験、3個別の建造物修理施工(日光東照宮・平等院鳳凰堂・小野家住宅など)への応用、を実施して成果を得た。平成24年度は4年計画の第2年目として、1:幾つかの建造物(文化財建造物)の外観塗装および彩色材料の性質や色相、年代別塗装材料の変遷などに関する基礎調査、2:伝統的な塗装彩色材料である膠・ドーサ・乾性油系塗料およびこれらと合成樹脂をブレンドした手板試料の作成と曝露実験の開始、3:特に三次元形状であるために保存・修復・管理に苦慮することが多い欄間などの木彫彩色の保存活用方法の試考、などを実施した。以下、具体的な実施内容成果を述べる。1:以下の建造物(文化財建造物)部材の塗装彩色材料に関する基礎調査を行った。1瑞巌寺本堂欄間麻古調の塗装彩色材料、2豊国神社唐門木彫の塗装彩色材料、3醍醐寺三宝院惣門の塗装彩色材料、4平等院鳳凰堂の塗装彩色材料、5厳島神社本社本殿および客神社拝殿などの塗装材料、6厳島神社摂社荒胡子神社本殿の塗装彩色材料、7伝伏見城欄間木彫である詩仙堂所蔵欄間木彫の彩色材料、8二条城唐門の塗装彩色材料2:伝統的な塗装彩色材料の再評価手板を作成し、曝露実験を実施した。手板は、顔料として赤色塗装を想定して市販の弁柄(放光堂製)使用し、以下20種類の膠着材料に交ぜた塗料を作成して暴露試験台に固定した。1膠のみ、2膠+明礬、3膠+明礬+プライマル、4膠+明礬+鵬砂、5膠+鵬砂、6膠+プライマル、7桐油+プライマル、8膠+明礬+桐油、9膠+桐油、10桐油+プライマル、11プライマルのみ、12日光法:膠+明礬、13日光法:膠+明礬+プライマル、14日光法:膠+明礬+鵬砂、15膠+桐油+鵬砂、16膠+プライマル、17桐油+プライマル、18日光法:膠+明礬+桐油、19桐油のみ、20桐油+鵬砂、である。暴露試験台は、当初は平等院鳳凰堂の南に位置する南橋の欄干東外側、その後、平等院鳳凰堂南正面池須浜に移動して据え付けた。この曝露試験自体は平成24年7月8日から開始し、3ヶ月および6ヶ月評価とした。本研究では、伝統的な塗装彩色材料の正当な再評価を行った。そのうえで、これらを修理作業に使用した場合でも、これらの長所を生かした新塗料開発に向けての基礎データの蓄積を図ることを主目的とした研究を行った。以下、主な実績を纏める。1:幾つかの文化財建造物の外観塗装および彩色材料の性質や色相、年代的塗装材料の変遷などに関する基礎調査、2:伝統的な塗装彩色材料である膠・ドウサ・乾性油系塗料及びこれらと合成樹脂をブレンドした手板試料の作成と曝露試験の継続、などを実施した。2:基礎調査を行った実際の塗装彩色材料=1瑞巌寺本堂欄間木彫、2日光東照宮唐門・透塀・陽明門、3厳島神社反橋・摂社荒胡子神社本殿など、関係する文献史料=4史料1:日光方諸方本途村上、5史料2:寛政九巳正月改御宮御霊屋塗師方本途直段6史料3:社堂本途書下巻、7史料4:建築物其他装飾品彩色仕様など、である。3:上記の塗装彩色材料の分析調査と文献史料の検討を行った結果、これまで伝統的な文化財建造物の塗装彩色材料は漆塗装であるか膠材料であるのか二者択一の感があったが、それ以外の塗装材料として乾性油系塗料の存在がクローズアップした。特に、本年度の日光東照宮陽明門において東西壁の塗装彩色修理に伴い新たに唐油蒔絵が見出されたため、この分析調査も実施した。その結果、文献史料に登場する唐油彩色の乾性油塗料は桐油や荏胡麻油といった従来漆工分野で使用されてきた物とは性質が異なる可能性、すなわち亜麻仁油系の油画彩色である可能性も想定された。ただし史料1も言及するように、漆塗装に比較して色のバリエーションは多くできるものの、耐候性に乏しいようである。この状況は、陽明門で見出された唐油蒔絵においても変退色が著しく剥落し易い点からも理解された。

さらに、近年の塗装彩色修理では、真実性を重視して過去の材料や技術を調査する必要性も認識されつつある。本研究では、1幾つかの建造物の外観塗装彩色に関する基礎調査、2伝統的な塗装彩色材料及び合成樹脂をブレンドした手板試料の作成と曝露試験、3個別の建造物修理施工(日光東照宮・平等院鳳凰堂・小野家住宅など)への応用、を実施して成果を得た。本年度は、4年計画の第1年目(初年度)として幾つかの建造物(建築文化財)の外観塗装材料や彩色材料に関する色相、変遷などに関する基礎調査を実施するとともに、とくにこれまで行ってきた建造物のベンガラ塗装に関する基礎調査の成果を纏めて一冊の報告書として纏めた。木造建造物のベンガラ塗装の性質と変遷に関する調査を行った建造物は、(1)元興寺五重小塔の取り外し部材、(2)海龍王寺五重小塔、(3)平等院鳳凰堂の取り外し部材と正面扉の裏面、(4)浄瑠璃寺本堂、(5)三佛寺奥院(投入堂)の取り外し部材、(6)海住山寺五重塔内陣柱、(7)島田神社本殿、(8)元興寺極楽坊取り外し部材、(9)厳島神社摂社大元神社本殿、(10)興福寺東金堂ほかの取り外し部材、(11)蓮華王院本堂(三十三間堂)、(12)初期の日光社寺建造物群、(13)浅草寺二天門、(14)白山神社境内の廃棄部材、(15)弁柄窯元旧片山家住宅、(16)厳島神社社殿、(17)銀閣寺観音殿、(18)旧岩崎家住宅室内壁紙の西洋顔料、などであり、これらの部材などに確認されるベンガラ塗装を調査した結果を纏めた。一方、建造物の彩色材料に関する調査は、瑞巌寺本堂の塗装彩色材料、都久夫須麻神社本堂の木彫彩色、荒胡子神社本殿の外観および木彫彩色材料などであり、瑞巌寺本堂の欄間木彫では、創建当初は基本的には白木にメインの動物のみに簡単な墨線を入れるもの、元和七年に塗装彩色を行った際に金箔を多用した極彩色とした履歴が明確となった。また、荒胡子神社の木彫の塗装彩色材料のは近代の合成顔料(エメラルドグリーンなど)が使用されていた。さらに、作業続行中ではあるが、今日使用されている天然岩絵具の彩色材料に関する色相、顔料粒子の形態と大きさ・集合状態、化学組成に関するデータベースの作成も並行して実施している。文化財科学上記で述べたように、(1)文化財建造物の塗装彩色材料(主に外観塗装材料)としては代表的で汎用性が高いベンガラ塗装および乾性油塗装に関する基礎的な調査を行ない、この成果を、平等院鳳凰堂や塩尻小野家住宅などの実際の文化財建造物の塗装修理の施工に生かすことができたこと、(2)伝統的な塗装彩色材料の性状と使用法に関する基礎資料として、具体的には極彩色の加飾が台頭した桃山文化期を代表する幾つかの塗装彩色材料に関する調査を行い、これらの基礎的な情報を得ることができたこと、(3)今日入手可能な顔料などの材料の耐候性に関するデータベースを作成する道筋を構築するために、20種類の手板を作成するとともに、これらの曝露試験を実施することで、これらの再評価を具体的にできたこと。(4)木彫彩色に関する具体的な活用方法を模索しするための三次元計測、これを使用した樹脂レプリカを作成し、分析調査を実施した成果から理解された彩色復元図のデータを参考とした資料を作成する資料活用の方法を模索できたこと。などが主な成果である。以上の実績を考慮に入れた結果が、第2年目の成果としての達成度はおおむね良好であると自己評価の判断を行った理由である。上記で述べたように、(1)建造物の塗装彩色材料(おもに外観塗装材料)としては代表的で汎用性が高いベンガラ塗装に関する基本的な調査成果を纏める事ができ、今後これらの塗装彩色修理の施工や基本的な建築史や歴史・考古系の学問分野の進展に寄与するための基礎資料とすることができたこと。(2)伝統的な塗装彩色材料の性状と使用法に関する基礎資料として、具体的に桃山文化期の3つの建造物に関する調査を行うことができ、これらについても基礎的な材料の性状と適応法を理解することができたこと。(3)今日手に入れることが可能な顔料などの材料のデータベースを作成する道筋を構築することができたこと。
心電図RR間隔変動の解析における歯科治療時の自律神経活動の研究

近年、ストレスを示す指標として、自律神経活動の評価法の一つである心電図RR間隔変動の解析が応用されている。今回われわれは、障害者に対する歯科治療とストレスの関係をみるために、心拍変動と血圧変動から自律神経活動の解析を試みた。データーは、全身麻酔下歯科治療のときに患者17名(男性12名、女性5名、平均年齢21,5±8,1歳)から採取し、心拍変動の低周波成分の積分値(以下,LF-RR),心拍変動の高周波成分の積分値(以下,HF-RR),心拍変動のLF成分とHF成分の積分値の比(以下、LF/HF-RR),収縮期血圧変動のLF成分の積分値(以下,LF-SBP),収縮期血圧(以下,SBP),拡張期血圧(以下,DBP),心拍数(以下,HR)の項目を解析した。Wilcoxon順位和検定を行い、危険率5%未満を有意差ありとした。(1)局所麻酔注入時、印象採得時、咬合採得時では、SBP,DBP,HRに変動は認められなかった。(2)HF-RRは、局所麻酔注入時に有意差が認められた。(3)LF-RR,LF/HF-RRおよびLF-SBPは、局所麻酔注入時、印象採得時、咬合採得時に有意差が認められた。これらのことから、SBP,DBP,HRに変化がみられなくても、患者は局所麻酔注入および印象採得、咬合採得をストレスとして受けとっていると考えられた。SBP,DBP,HRの測定だけでは、患者がこうむるストレスを反映するのに不十分と思われた。一方、患者がこうむるストレスを反映するのにLF-RRおよびHF-RR,LF/HF-RR,LF-SBPの測定は適している。障害者の歯科治療において問題となることは、診療への適応行動が得られ難いことである。そのため,患者の発達レベルに対応した行動調節法や、薬理学的行動調節法(笑気吸入鎮静法、静脈内鎮静法,全身麻酔法)を用いて歯科治療を施行する事が多い。しかし、精神鎮静法や全身麻酔法を用いても、歯科治療は患者にストレスを与えており、その侵襲の程度によっては、鎮静や麻酔深度に変化が生じることがしばしばある。近年、歯科治療中のストレスを示す指標として、自律神経活動の評価法の一つである心電図RR間隔変動の解析が応用されている。そこで今回われわれは、障害者を対象(N=5)に全身麻酔下での歯科治療時の心電図RR間隔変動にみられる高周波成分の積分値(以下、HF-RR:0.150.40Hz)と低周波成分の積分値(以下、LF-RR:0.040.15Hz)、低周波成分の積分値と高周波成分の積分値の比(以下、LF/HF-RR)の周波数解析から、歯科治療が自律神経活動へ及ぼす影響について調査した。(結果)1.SBP、DBPは、明らかな経時的変動は認められなかった。2.LF-RRは、局所麻酔注入時、印象採得時、咬合採得時に上昇が認められた。3.HF-RRは、局所麻酔注入時、印象採得時、咬合採得時に上昇が認められた。4.LF/HF-RRは、局所麻酔注入時、印象採得時、咬合採得時に上昇が認められた。これらのことから、全身麻酔中でも生体は、局所麻酔注入および切削、印象採得、咬合採得をストレスとして受けとっていることが示唆された。また、局所麻酔奏功後の切削時もHF-RRとLF-RRの上昇がみられることから吸引あるいはガーゼ交換などによる舌圧排もストレス発生の誘因になると考えられた。

今回われわれは、障害者に対する歯科治療とストレスの関係を模索するために、心拍変動と血圧変動から自律神経活動の分析を試みた。対象は、岩手医科大学附属病院歯科医療センター障害者歯科診療センターに来院した患者9名(男性6名、女性3名)(平均年齢22,4±6,0歳)。データー採取環境は、全身麻酔下とした。解析項目は、心拍変動の低周波成分の積分値(以下、LF-RR)、心拍変動の高周波成分の積分値(以下、HF-RR)、心拍変動のLF成分とHF成分の積分値の比(以下、LF/HF-RR)、収縮期血圧変動のLF成分の積分値(以下、LF-SBP)、収縮期血圧(以下、SBP)、拡張期血圧(以下、DBP)、心拍数(以下、HR)とした。統計的検討は、Wilcoxon順位和検定を行い、危険率5%未満を有意差ありとした。(結果)2.LF-RRは、局所麻酔注入時および印象採得時、咬合採得時に有意差が認められた。3.HF-RRは、局所麻酔注入時に有意差が認められた。4.LF/HF-RRは、局所麻酔注入時および印象採得時、咬合採得時に有意差が認められた。5.LF-SBPは、局所麻酔注入時および印象採得時、咬合採得時に有意差が認められた。これらのことから、SBP、DBP、HRに変化がみられなくても、患者は局所麻酔注入および印象採得、咬合採得をストレスとして受けとっていると考えられた。SBP、DBP、HRの測定だけでは、患者がこうむるストレスを反映するのに不十分と思われた。一方、患者がこうむるストレスを反映するのにLF-RRおよびRF-RR、LF/HF-RR、LF-SBPの測定は適している。障害者の歯科治療において問題となることは、診療への適応行動が得られ難いことである。そのため,患者の発達レベルに対応した行動調節法や、薬理学的行動調節法(笑気吸入鎮静法、静脈内鎮静法,全身麻酔法)を用いて歯科治療を施行する事が多い。しかし、精神鎮静法や全身麻酔法を用いても、歯科治療は患者にストレスを与えており、その侵襲の程度によっては、鎮静や麻酔深度に変化が生じることがしばしばある。近年、ストレスを示す指標として、自律神経活動の評価法の一つである心電図RR間隔変動の解析が応用されている。今回われわれは、障害者を対象(N=8)に全身麻酔下での歯科治療時における心舶変動の低周波成分の積分値(以下、LF-RR)、心拍変動の高周波成分の積分値(以下、HF-RR)、心拍変動のLF成分とHF成分の積分値の比(以下、LF/HF-RR)、収縮期血圧変動のLF成分の積分値(以下、LF-SBP)、収縮期血圧(以下、SBP)、拡張期血圧(以下、DBP)、心拍数(以下、HR)の周波数解析から、歯科治療が自律神経活動へ及ぼす影響について調査した。一方、患者がこうむるストレスを反映するのにLF-RRおよびHF-RR、LF/HF-RR、LF-SBPの測定は適している。
マウス顎顔面発生における突起間癒合の分子制御機構の解析

本研究では、胎生期マウスの下顎突起と二次口蓋突起の癒合現象に寄与する分子シグナルを解明する目的で、発生時期・領域特異的な遺伝子発現の網羅的解析と定量分析、ならびに免疫染色による翻訳産物の局在観察を行なった。両突起間で発現パターンに顕著な違いが認められた遺伝子群としては、下顎突起の癒合時期の被蓋上皮と間葉組織にIgfファミリーが発現していることと、二次口蓋突起ではTgfB3とCaskが突起間接着と癒合に働くことが明らかとなった。本研究では、顎顔面領域の癒合現象における突起先端上皮細胞(MEE細胞)の役割・運命に関連して、組織形態学的な表現型解析とその背景をなす分子間ネットワークを調べるとともに、器官培養系での遺伝子ノックダウンによる表現型異常と細胞動態への影響を明らかにする。初年度においては、これまでの科研費補助により蓄積してきたDNAマイクロアレイ法(45000プローベをプロットしたAffymetrixのMouse Expression430Aアレイを使用)による下顎突起と口蓋突起の発生時期・部位特異的な遺伝子発現パターンのデータベースに基づき、下顎突起と二次口蓋突起の発生段階での時期・部位特異的な発現を示す遺伝子群)のgeneリストを完成した。現在までの解析から、下顎突起の癒合ではIGFファミリー、二次口蓋形成ではCask関連伝子が特異的な発現変動を示すことを見出しており、KEGG、GenMAPP、Cytoscapeを併用したパスウェイ解析から、これらの遺伝子を中軸とした分子ネットワークを構築し、遺伝子発現局在と分子局在を免疫組織化学とマイクロダイセクション・リアルタイムPCR法で検証した。また、マウス胎仔頭部の器官形成プロセスを立体観察する目的で、上皮・内皮・神経線維に対する特異抗体を用いて、連続薄切標本の多重免疫標識による立体構築法を確立した。上皮マーカにより頭部輪郭・歯胚・唾液腺原基を分画するとともに、頭部全域での血管網と神経網を再現できている。3次元形態情報に基づき、突起形成と血管・神経発達、歯胚・唾液腺発生の左右対称性について検討を進めている。これらの研究成果については、論文公表するとともに、関連学会で発表、Web公開している。前年度までにマウス胎仔下顎突起および二次口蓋突起の癒合部位を対象としたDNAマイクロアレイ解析により発生時期特異的な発現変動を示す遺伝子群の抽出を完了した。本年度では、得られた発現プロファイルに基づいた分子ネットワーク解析を実施し、下顎突起癒合におけるWnt,Hedgehog,Bmpシグナル系の発現変化を見出した。特に下顎突起癒合時(胎生9.510.5日)ではIGFファミリ-分子の発現が高まるとともに、筋分化を示すマーカー遺伝子群(MyoD,Myf5,Myogenin)の急激な発現変動を捉えており、これに一致して発現上昇を示す8個の転写因子も同定した。In silicoでのパスウェイ解析によって、これらの転写因子が筋分化マスター遺伝子の上流に働くことを突き止めた。二次口蓋突起では、TGFβ、レチノイン酸シグナル系が高い発現変動を示し、接着期において発現変動するCask分子については、MEE細胞におけるマイクロダイセクション・リアルタイムPCR法での発現検証と、CaskタンパクおよびF11rなどの複合体関連分子について蛍光免疫染色による口蓋突起での局在を確かめた。これまでの研究課題において集積した口蓋裂を表現型とする遺伝子変異マウス試料(TGFβ3,Endothelin-1,δEF1)については、免疫染色試料の組織立体構築をすることにより、野生型と変異型での顎顔面構造の解析が可能となる立体画像データベースを整備した。これらの研究成果については、関連学会で発表、Web公開している。前年度までにマウス胎仔下顎突起および二次口蓋突起の癒合部位を対象としたDNAマイクロアレイ解析により発生時期特異的な発現変動を示す遺伝子群の抽出を行なった。得られた発現プロファイルに基づいた分子ネットワーク解析を実施し、下顎突起癒合におけるWnt、Hedgehog、Bmpシグナル系の発現変化を見出した。二次口蓋突起では、TGFβ、レチノイン酸シグナル系が高い発現変動を示し、接着期において発現変動するCask分子については、MEE細胞におけるマイクロダイセクション・リアルタイムPCR法での発現検証と、CaskおよびF11rなどの複合体関連分子について蛍光免疫染色による二次口蓋突起での局在を確かめた。最終年度では、今までに得られたデータを精査し、想定された分子ネットワークについて検証した。

下顎突起では、正中癒合領域の間葉細胞が高度な増殖活性を有していることが確かめられ、下顎突起の癒合現象では間葉細胞による増殖圧が上皮層の分断と間葉合流を促すことが示唆された。これらの間葉細胞の増殖活性の制御には上皮側からのShh、Wnt5a、Bmp4/5、Tgfb2を起点とするシグナル回路が働くと推定された。二次口蓋突起では、Tgfβ3シグナルの制御下で、SyndecanはCdc42などと協働して糸状仮足の形成と糸状仮足間での初期接触に働き、キナーゼ活性をもつCaskはSyndecanの細胞内ドメインと結合して、リン酸化を介した情報伝達に関与することが示唆された。
制度と人間行動の相互作用に関する実証研究

本研究の目的は、社会・経済変化の過程における制度と人間行動との相互作用について多角的に研究することである。平成30年度は、本プロジェクトの最終年度にあたり、平成29年度までの作業を踏まえて、学術論文4編の執筆・改訂作業と成果報告を行った。本研究の目的は、社会・経済変化の過程における制度と人間行動との相互作用を研究することである。平成27年度は、本プロジェクトの初年度にあたり、主として、必要なデータ収集とデータベース化の作業を行った。一部のデータについては、入手が遅れているものの、概ね予定通り、作業を進めることができた。また、本研究プロジェクトに関連する経済学、社会学、政治学、社会心理学の既存文献を幅広く検討し、本研究プロジェクトの学術的意義・貢献を明確化する作業も行った。また、本研究プロジェクトを実施するための実証戦略についても検討した。特に、時空間データを用いた因果推論に関する関連研究を精査し、分析を進める際に注意すべき点を明らかにした。これらの成果の一部をとりまとめた内容で研究報告をそれぞれ行った。関連分野の多数の研究者との意見交換を通じて、研究に対するフィードバックを受けることができた。現地カウンターパートと緊密に連携することにより、概ね計画通り、本プロジェクトに必要なデータを収集することができた。平成28年度は、本プロジェクトの2年目にあたり、主として、以下の4つの研究活動を行った。(1)「難民の経済的帰結」に関する実証研究に取り組み、その成果を論文に取りまとめて、国際会議で研究報告した。具体的には、ポル・ポト政権崩壊時(1978年1980年)に大量発生したカンボジア難民を対象として、1998年人口センサス全個票を用いて、タイとベトナムからの帰還者と非難民を識別し、労働や子供の教育アウトカムを比較検討した。タイからの帰還者は、非難民に比べて労働アウトカムが低いが、ベトナムからの帰還者にはそのような影響が見られないことを明らかにした。(2)「カンボジア大虐殺の長期的影響」に関する論文を改訂し、査読付き国際学会誌に投稿した。具体的には、実証分析の結果の頑健性を示す証拠をさらに追加し、大虐殺が親の教育投資に与えるメカニズムの考察をさらに深めた。(3)歴史出来事が現代の経済成果に与えるミクロレベルでの因果効果の識別に関して、既存研究の精査をさらに進めて、その成果を論文に取りまとめて、研究報告を行った。標準的な分析枠組みである潜在アウトカムアプローチ(potential outcomes framework)に基づいて、ミクロデータを用いた既存の実証研究が直面している概念的・計量経済学的問題を明らかにし、代替的アプローチを提案した。(4)現地カウンターパートを連携し、一部遅れが生じていたデータ収集作業を継続した。本研究プロジェクトに密接に関連する時空間データを用いた因果推論の考察をさらに深める必要が生じ、当初の研究計画の見直しを行ったため。平成29年度は、本プロジェクトの3年目にあたり、主に以下の研究活動を行った。(1)査読付き国際学術雑誌に投稿していた、「カンボジア大虐殺の長期的影響」に関する論文について、編集長と査読者から得たコメントを踏まえて改訂作業を行い再投稿した。(2)平成28年度より取り組んできた、「歴史出来事が現代の経済成果に与えるミクロレベルでの因果効果の計測に関する考察」について、新たにディスカッションペーパーに取りまとめて、査読付き国際学術雑誌に投稿し、編集長と査読者から得たコメントを踏まえて改訂作業を行い再投稿した。また、本論文を8月5日に一橋大学社会科学高等研究所で開催された国際会議(HSI2017ー3rd Hitotsubashi Summer Institute)で研究報告を行い、参加者と意見交換を行った。(3)地理空間に立地・分布する対象(空間事象)の因果効果を計測するため、地理情報システム(GIS)を活用した新たな分析枠組みを論文に取りまとめて、査読付き国際学術雑誌に投稿した。本論文を11月25日、台湾国立政治大学で開催された国際会議(2017 CSEAS-CSEAS Workshop of Young Scholars on Southeast Asian Studies)で研究報告を行い、参加者と意見交換を行った。(4)「難民の経済的帰結」の論文の改訂作業を行い、国内研究集会で研究報告を行い、参加者と意見交換を行った。平成28年度に本研究プロジェクトに関連する時空間データを用いた因果推論の考察を深める必要が生じ、当初の研究計画の見なしを行ったため。平成29年度は、関連論文2編を執筆し、査読付き国際学術雑誌に投稿した。初年度に収集・整理したデータを利用して、次年度以降、本格的にデータ分析作業に着手する。そして、適宜その成果を論文にまとめて発表する。一方、データ収集作業に遅れが生じているものについては、引き続き、現地カウンターパートと緊密に連携しながら、作業を継続する。引き続き、研究計画に基づいて、作業を進める。また、平成28年度の研究成果を踏まえて、時空間データを用いた因果推論の一般化にも取り組む。当初の研究計画に基づいて、作業を進める。平成29年度の研究成果を踏まえて、「難民の経済的帰結」の論文をさらに改訂し、査読付き国際学術雑誌への投稿を目指す。

また、政治権力の形成についても検討していく。平成27年度は、概ね計画通り研究費を使用したが、効率的な使用を心がけたところ未使用額が発生した。平成28年度は、作業の進捗にあわせて、効率的な研究費の使用を心がけたところ、未使用額が発生した。理由:平成29年度は、作業の進捗にあわせて、効率的な研究費の使用を心がけたところ、未使用額が発生した。使用計画:平成29年度の未使用額は、平成30年度の研究費とあわせて、主に、国内・国際学会等への参加旅費、デスクトップパソコン・専門書の購入、英文校閲費、論文投稿料などに使用することを予定している。本研究プロジェクトで使用しているセンサス個票データの解析を円滑に遂行するため、高性能のデスクトップパソコンを購入する必要が生じた。平成30年度は、まず高性能のデスクトップパソコンを購入し、それから効率的な研究費の使用を心がける。平成27度の未使用額は、平成28年度の研究費とあわせて、主に、カンボジアへの調査研究旅費、国内・国際学会への参加旅費に使用する。また、歴史図書、専門書の購入、そして論文の校閲などにも研究費を使用する。平成28年度の未使用額は、平成29年度の研究費とあわせて、主に、国内・国際学会等への参加旅費、専門書の購入、論文の校閲などに使用することを予定している。
GLUT4小胞のインスリン・カルシウム依存性膜融合を促進する新規蛋白の同定と解析

神経シナプスにおける開放放出は、v-、t-両SNARE蛋白のカルシウム依存性重合に始まる膜融合反応である。脂肪細胞におけるGLUT4小胞の膜融合も同様であると考えられている。ところが、シナプス末端にはカルシウムセンサーとなる蛋白が多数存在するのに対して、脂肪細胞ではカルシウムセンサーとなる蛋白はまだ同定されていない。そこで、我々はSNARE関連蛋白のDOC2に注目し、脂肪細胞での糖輸送における役割について検討した。ノーザンプロット法を用いて脂肪細胞に発現するDOC2のアイソフォームを検討した結果、DOC2bのみが発現していることを確認した。GFP-DOC2bを3T3-L1脂肪細胞に発現させ、インスリン刺激するとDOC2bは細胞質内から細胞膜へトランスロケーションした。このトランスロケーションは、膜透過性カルシウムキレート剤により抑制された。一方、Wortmanninを加えても抑制は認められなかった。以上より、DOC2bはカルシウム依存性、PI3キナーゼ非依存性にトランスロケーションしていると考えられた。またアデノウイルスベクターを用いてDOC2bを過剰発現すると、インスリン依存性に糖取り込みが促進された。一方RNAiでDOC2bをノックダウンするとインスリン依存性の糖取り込みが抑制されることから、DOC2bはインスリン依存性の糖取り込みを促進することがわかった。更に、DOC2bをノックダウンすると、GLUT4小胞の細胞膜へのtranslocationは障害されないが、細胞膜との融合が阻害されることを見いだしている。DOC2bはカルシウム依存性に細胞膜にトランスロケーションし、GLUT4小胞の細胞膜への融合を促進することによりインスリンによる糖の取り込みを促進する。
シオミズツボワムシのストレス耐性に関わる遺伝子群の同定

シオミズツボウムジのストレス耐性に関わる遺伝子群を同定するために,ストレス応答に重要な役割を持つ転写因子であるHSF-1遺伝子をクローニングし,本転写因子によって発現を調節される遺伝子群の同定を進めた.また,活性酸素を産生する薬剤であるユグロンを用いた実験を行った.まず,(1)ユグロン濃度に依存した死亡が観察されたことから,本薬剤はワムシ類にも効果があることが分かった.次に,(2)低濃度でユグロンを投与し.1時間48時間にわたって回復させた後に,致死濃度のユグロンに暴露する実験を行った.その結果,24時間の回復時間をとった場合に,ユグロンに対する耐性が高まることが分かった.こうした効果はホルミシスと呼ばれ,ワムシ類においては初めての発見となった.続いて, (3)シオミズツボワムシと,その近縁種であるBrachionus rotundiformisの2種間でユグロン耐性を比較したところ,後者の方が高い耐性を有することが分かった.これは,急速の酸化ストレスに対する防御機構の違いを反映しているものと考えられた.さらに,(4)ユグロンの投与によってホルミシスを誘導したワムシに急速な熱ストレスを与えた場合,熱に対する耐性も向上することが分かった.すなわち,ワムシにおいて酸化と熱によるストレス防御機構は,共通し九分子によってもたらされている可能性が示唆された.(5)ユグロンの投与によって発現が誘導される遺伝子群を同定するために, cDNAライブラリを構築した.このライブラリを用いてcDNAマイクロプレイを作成し,ストレスの種類や強さと発現する遺伝子のプロファイルについて解析を進めている.本研究課題は,海産魚類の種苗生産において不可欠な餌料生物であるシオミズツボワムシ(以下,ワムシ)を対象として,本種のストレス耐性に関わる遺伝子群を網羅的に解析して同定することを目的としている.本年度に得られた成果の概要は以下の通りである.1.ワムシ坑ストレス耐性遺伝子ライブラリの構築ストレス条件下で発現する転写産物に富むライブラリを構築するために,熱ストレスを与えたワムシ個体群由来のcDNAライブラリを構築した.これをワムシ抗ストレス遺伝子ライブラリとした.2.簡便なワムシの健康診断法の確立家庭用の電子レンジを利用することで,簡便なワムシの健康診断法を開発した.15-35Cの3段階の水温でそれぞれ馴致したワムシに,45Cの熱ストレスを与えた.その際,電子レンジを用いて加温した.その結果,馴致水温が高いワムシほど,熱ストレス耐性が高くなることが分かった.3.ワムシにおけるホルミシスの検証軽度の環境ストレスにさらすことで,逆に有益な効果が誘導される現象をホルミシスという.そこで,ワムシにおいてホルミシスが起こるかどうかを検証した.酸化ストレスを引き起こす薬剤(ジュグロン)を実験に用いた.0.02mMのジュグロンで1時間の前処理を行った後,24時間の回復培養を行った.続いて,致死レベルである0.1mMのジュグロンにさらした場合の生残率を求めた.その結果,処理区の生残率が高くなり,外因性の酸化ストレスがワムシにおいてホルミシスを誘導することが分かった.さらに,上記の条件で前処理を行ったワムシに,30Cを上昇させる熱ストレスを与えた場合も,同様に無処理区よりも生残率が高くなった.シオミズツボウムジのストレス耐性に関わる遺伝子群を同定するために,ストレス応答に重要な役割を持つ転写因子であるHSF-1遺伝子をクローニングし,本転写因子によって発現を調節される遺伝子群の同定を進めた.また,活性酸素を産生する薬剤であるユグロンを用いた実験を行った.まず,(1)ユグロン濃度に依存した死亡が観察されたことから,本薬剤はワムシ類にも効果があることが分かった.次に,(2)低濃度でユグロンを投与し.1時間48時間にわたって回復させた後に,致死濃度のユグロンに暴露する実験を行った.その結果,24時間の回復時間をとった場合に,ユグロンに対する耐性が高まることが分かった.こうした効果はホルミシスと呼ばれ,ワムシ類においては初めての発見となった.続いて, (3)シオミズツボワムシと,その近縁種であるBrachionus rotundiformisの2種間でユグロン耐性を比較したところ,後者の方が高い耐性を有することが分かった.これは,急速の酸化ストレスに対する防御機構の違いを反映しているものと考えられた.さらに,(4)ユグロンの投与によってホルミシスを誘導したワムシに急速な熱ストレスを与えた場合,熱に対する耐性も向上することが分かった.すなわち,ワムシにおいて酸化と熱によるストレス防御機構は,共通し九分子によってもたらされている可能性が示唆された.(5)ユグロンの投与によって発現が誘導される遺伝子群を同定するために, cDNAライブラリを構築した.このライブラリを用いてcDNAマイクロプレイを作成し,ストレスの種類や強さと発現する遺伝子のプロファイルについて解析を進めている.