hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
“光励起”と“化学励起”を併用した生細胞蛍光観察技術の構築と実証

従来の蛍光顕微鏡システムを駆使して、研究者の独自技術である自己励起蛍光蛋白質・BAF融合体を導入した安定細胞株を対象に、化学発光による細胞観察を試み、生細胞に対する、ルシフェリン-ルシフェラーゼ反応に基づく化学発光イメージングの可能性を提示すると共に、幾つかの課題を新たに見出した。最大の問題は、培地成分に依存し、閉鎖型の灌流細胞培養チャンバーシステムでの培地輸液過程に伴う気泡発生であり、シンプルな原理に基づく、気泡除去装置の開発を試みたが、研究期間中には完成に至らなかった。また、更なる高輝度化のためにBAF分子内で起こる共鳴エネルギー転移の効率を更に改善する手法を見出し、国内特許出願を行った。既構築の変異型H2AX-eBAF-Y安定発現細胞株を用いて、DNA傷害を誘発する条件下での感受性について、小核の形成を指標に経時的に定点観察を実施し、観察タイミングの条件検討を行った。また、蛍光顕微鏡での長時間連続観察を行うに当たり、ペリスタポンプを用いた灌流培養観察系の構築を進め、幾つかの問題点を抽出した。その最たるものが、長時間の培地灌流に伴い、培地輸送ライン中に培地中の成分に由来すると考えられる気泡生成の問題である。輸液ラインで生じた気泡は培地とともに、観察細胞が存在する細胞培養チャンバー部に蓄積して、連続観察における致命的な障害を与える。この気泡生成自体を抑える工夫と、生成した気泡を輸液ラインから効率的かつ自動的に除去するデバイス創出という2点から当該問題解決に取り組んだ。デバイスに関しては実証試験中であり、特許性の有無を調査中である。研究2)BAFを用いたケラチンイメージングによる皮膚表皮角化過程の完全可視化の試み最終的にはマウスの初代培養系を利用する前提で、そのモデル系としてヒト皮膚由来の線維芽細胞株(GM0637細胞)を用いて当該研究で用いるFillagrin-eBAF-Y融合蛋白質の作製を進めた。また、OFP型BAF、或いは、RFP型BAFの融合用発現ベクターを新たに構築した。この過程で、Fillagrinと異なる、哺乳細胞には存在しない“ドメインX"とBAFを融合すると、BAF分子内で生じる共鳴エネルギー転移がより高効率化することを新たに見出した。この“ドメインX"の効果について特許出願を検討している。当該研究に関しては、以下の2系統で取り組んだ。研究1)輸液チューブ内で派生する気泡への対処法の検討昨年度、閉鎖系細胞培養用恒温チャンバーにおいて当初想定しなかった培地輸液ラインでの気泡発生の問題が生じた。情報収集の結果、閉鎖系細胞培養恒温チャンバー特有の構造的問題であり、当該装置の重大懸案であることが判明した。この問題を解決するため考案した、効率的且つ自動的に気泡を除去する“弁デバイス"に関し、既製プラスチック製品の加工や、熱溶融積層型3Dプリンターを用いた部品試作により当該デバイス実現の可能性を探った。当該装置はシンプルな構造だが、試作部品の精度に限界があり使用に耐えるデバイスの作製には至っていない。但し、特許調査並びに弁理士との検討から作製できれば十分な特許性が見込まれる。研究2)BAFを用いた生細胞イメージングへの取組Biorevo BZ-9000を主要装置としてのイメージングに方針変更し、かつ上記の事情により想定した長時間連続観察が難しくなった状況になっている。昨年度、予期せず見出した、BAF分子内で生じる共鳴エネルギー転移をより高効率化させ、且つ細胞に内在しない人工ドメイン“hCBD"とBAFとの融合体“hCBD-BAF"に着目し、BAFの化学発光プローブとしての高輝度化と細胞内局在を示す発光タグとしての可能性を検討した。hCBD-BAFの培養細胞内での局在性を検討しBAF単体と遜色なく細胞全体に分布すること、H2AXとの融合体が、BAFとの融合体同様に核局在示すことを新たに確認し、1件の特許を出願した。研究1)輸液チューブ内で派生する気泡への対処法の検討当該研究で使用する閉鎖系細胞培養用恒温チャンバーにおける培地輸液ラインでの気泡発生の問題解決のための検討を行った。効率的且つ自動的に気泡を除去する“弁デバイス"に関し、低予算での試作品製造は困難であり、既製プラスチック製品と光硬化型3Dプリンターを用いた試作部品の組合せによる当該デバイス実現の可能性を探った。3次元データを作成するための、無償或いは安価な3D-CADソフトの試用とデータ作成を繰り返し試み、試作部品を作製したが、気密性を維持し使用に耐える装置の実現には至らなかった。研究2)生細胞発光イメージングの取組引き続き、BAFを用いた化学発光イメージングによる、H2AXの挙動観察に取り組んだ。輸液ラインでの気泡発生に伴う長時間観察の問題があり、主として培地へ初期添加するセレンテラジン濃度による観察時間の長期化への検討と、DNA傷害を誘発するMMC添加によるH2AXfoci形成のタイミングの検討を行った。結果として、観察初期でのセレンテラジンの添加では、セレンテラジンが脂溶性であることもあり、培地に可溶な最大濃度でも1時間弱の連続化学発光観察しか適わず、また、その観察可能な短時間でのピンポイントのタイミングを見出すことは困難であった。

化学発光プローブとしては、タンパク質レベルで共鳴エネルギー移動効率の改善が観察されたhCBD-eBAF-Yでの高輝度化が期待されたが、細胞発現下での観察ではeBAF-Yと同等の観察時間(最大感度で30秒50秒露光)であり、特段の観察条件の改善は認められなかった。従来の蛍光顕微鏡システムを駆使して、研究者の独自技術である自己励起蛍光蛋白質・BAF融合体を導入した安定細胞株を対象に、化学発光による細胞観察を試み、生細胞に対する、ルシフェリン-ルシフェラーゼ反応に基づく化学発光イメージングの可能性を提示すると共に、幾つかの課題を新たに見出した。最大の問題は、培地成分に依存し、閉鎖型の灌流細胞培養チャンバーシステムでの培地輸液過程に伴う気泡発生であり、シンプルな原理に基づく、気泡除去装置の開発を試みたが、研究期間中には完成に至らなかった。また、更なる高輝度化のためにBAF分子内で起こる共鳴エネルギー転移の効率を更に改善する手法を見出し、国内特許出願を行った。化学発光観察装置使用にあたって、研究連携する想定であった連携研究者の予期せぬ他研究機関への異動に伴い、計画当初に予定していた当該装置の利用が難しい状況で、異動前後の研究機関と私の所属する研究機関との間での3研究機関間の共同研究契約も内々に検討してみたが、異動前の研究機関に連携研究者の足場が既に失われていることから現実的に難しい状況にある。一方で、BAFの高輝度発光により、汎用型蛍光顕微鏡システムでも最大感度条件で化学発光観察は可能である。しかし、その際に用いる長時間の連続観察に必要な観察用閉鎖系灌流培養チャンバー系での培地輸液チューブ内で培地から発生する気泡が観察細胞培養領域へ浸入することにより、長時間培養を行うと細胞が干上がり死滅する事態(本質的なシステム上の欠陥と思われる)に遭遇しており、研究遂行上、計画当初想定しなかった重大な障害となっている。この問題を解決すべく、シンプルな気泡除去用の弁デバイスを考案し、当該弁の試作を精力的に進めたが、2年次中には良好な結果を得られなかった。当該弁デバイスの発想自体は間違っていないと考えるが、当該デバイスを実現するために必要な部品の加工精度を上げる必要がある。目的に合致する既製部品を継続して探してはいるが、現時点では解決の目処が立っていない。更に、年度半ばにチャンバーの液漏れ事故による故障問題も発生し、原因究明と破損部品の調達に時間を要したことも達成度を遅らせている一要因である。細胞生物学プラスチックの金型成形による一点ものの部材作製アプローチは現時点では予算的に困難であるが、密閉精度の高い部材が入手できれば実現可能なデバイスであるので、低予算で試作品製造を請け負ってくれる企業を探す努力を続ける。一方で、引き続き既製のプラスチック・樹脂製品を利用する方策で初年度に生じた未想定の気泡発生問題の早期解決を目指す。また、これと並行して、従来方針を少々修正して輸液チューブ内で発生する気泡の影響を最小化するように、より適切な観察タイミングと当初計画よりも短縮した観察時間での生細胞イメージングを想定する。通常の培養条件での観察がし易いH2AXに関して優先的な観察対象とし、対象タンパク質の挙動を詳らかにするアプローチを進める。そのために、細胞を死滅させない程度に、DNA傷害を誘導する薬剤濃度を大幅に上げるなどして、観察対象細胞の出現比率を増加させると共に、発光プローブの使用に関しては、複数種あるBAFの中から発光輝度が最も高い
逆標的化DDSを用いたアレルギー・免疫疾患治療法の開発

花粉症などのアレルギー疾患では脱感作療法などが行われているが、根本的治療法はない。本研究では、アレルギーの基となる免疫細胞の活性を恒久的に抑える根本的治療法を開発する。すなわち薬物送達システムを利用し、特定の薬物を運ぶキャリアーに抗原を結合することで、抗体産生細胞に特異的にキャリアーを認識させ、特定の細胞のみに薬物を送達し細胞の活性を抑える新たな治療戦略を確立する。本研究では新たなDDSの概念として、reverse targeting DDS (RT-DDS)を提唱する。RT-DDSは、薬剤キャリアを抗原で修飾することで、生体内の抗原認識細胞にキャリアを認識させ、逆標的化によって免疫細胞に薬剤を送達するという新戦略である。これにより抗原特異的に免疫反応をコントロールできる可能性があり、有用な免疫疾患治療法として期待できる。これまでモデル抗原として卵白アルブミン(OVA)を用い、OVA修飾リポソームを用いてRT-DDSの有用性を検証した。本研究ではRT-DDSの免疫疾患治療への応用をめざし、リポソームに内封する薬物として免疫抑制剤FK-506(タクロリムス)を用いた検討を行った。調製したOVA修飾FK506内封リポソーム(OVA-FK)の製剤学的安定性を評価した後、OVA感作マウスにOVA-FKを尾静脈内投与し、体内動態を検討した。その結果、OVA-FKは脾臓に多く集積すること、さらに脾臓内におけるリポソーム局在の検討から、OVA-FKがB細胞および胚中心に局在することが明らかとなった。OVA感作マウスにOVA-FKを尾静脈内投与後、OVA特異的IgGおよびIgE抗体量を測定し薬理作用を評価した。その結果、OVA-FK投与群においてOVA特異的IgGの産生が有意に抑制され、OVA特異的IgEの産生も抑制されることが明らかとなった。次に、OVA未修飾リポソームが、脾臓に胚中心様の構造を形成し共局在する可能性を見出していること、およびABC現象は脾臓摘出動物では見られないことから、抗がん剤DOX内封PEG化リボソームを用いてABC現象の詳細を検討し、ABC現象の発現にT細胞非依存的なB細胞が関与する可能性を見出した。最後にRT-DDSの評価系として、花粉症の抗原タンパク質Cryj1を用いた鼻腔内感作により、花粉症モデルマウスを作製した。昨年度までにRT-DDSの免疫疾患治療への応用をめざし、リポソームに内封する薬物として免疫抑制剤FK-506(タクロリムス)を用いた検討を行った。調製したOVA修飾FK506内封リボソーム(OVA-FK)をOVA感作マウスにOVA-FKを尾静脈内投与した結果、OVA-FKは脾臓に多く集積すること、およびOVA特異的IgGの産生が有意に抑制され、OVA特異的IgEの産生も抑制されることが明らかとなった。本年度はRT-DDSの評価系として、花粉症の抗原タンパク質Cryj 1を用いた鼻腔内感作により、花粉症モデルマウスを作製し、花粉症に対するRT-DDSの有効性を検討することとした。本研究では治療薬を内封したCryj 1修飾リボソームを作成する必要がある。Cryj 1のリポソーム化には、多量の精製タンパク質を要するため、まず花粉から同タンパク質の効率的な抽出法を確立した。次にCryj 1をリポソーム表面に修飾するための技術を確立した。モデル実験として、抗がん剤アドリアマイシンを内封したCryj 1修飾リボソームを用いて、花粉症モデルに投与したところ、症状を緩和する作用が予試験的に見出された。この系をさらに確立し、抗がん剤に変わる薬剤を投与することにより、花粉症が抑えられれば、画期的な研究となり、実用化に結び付くと考えている。本研究では新たなDDSの概念として、reverse targeting DDS(RT-DDS)を提唱すること、およびそのProof of Conceptを提示することを目的としている。さらにこの応用として、花粉症の根本的治療を目指している。。

またRT-DDSの評価系として、花粉症の抗原タンパク質Cryj1を用いた鼻腔内感作により、花粉症モデルマウスを作製し、花粉症に対するRT-DDSの有効性を検討し、抗がん剤アドリアマイシンを内封したCryj1修飾リポソームを用いて、花粉症モデルに投与したところ、症状を緩和する作用が予試験的に見出された。花粉症治療薬としてのCryj1修飾リポソームを作成するために、Cryj1の大量精製法を確立した。方法としては、限外濾過を用いた。またCryj1を修飾したリポソームの抗原性について、BIACOREを用いて、抗血清の結合性を評価した。その結果、Cryj1修飾リポソームは十分に抗体に認識されることも明らかとなった。しかしながら、花粉からの精製には限界があることも分かったので、精製法のさらなる改良を行う必要がある。花粉症が抑えられれば、画期的な研究となり、実用化に結び付くと考えている。RT-DDSの応用として、PEG修飾リポソームの投与により、誘導されるABC現象についても検討を行った。RT-DDSの考えを入れ、抗がん剤DOX内封PEGリポソームでプライミングした場合には、ABC現象が見られないことを明らかにした。
葉の老化に対する光の制御機構

1.葉の老化に伴ってタンパク質が分解され、葉の窒素含量が低下する。通常の植物ではタンパク質分解に対する葉齢と被陰の影響を分離できない。そこで、横に這わせたつる植物(セイヨウアサガオ)を用い、葉を同一光条件で育てることにより、葉齢に伴って窒素含量は低下すること、しかし、葉の置かれた光環境がより強い制御作用を持ち、光強度の低下とともに葉の窒素含量が低下することを見出した。2.群落状に生育させたイネを用い、さらに光の制御作用を詳しく解析した。上部の葉により被陰された古い葉は、強い光強度下で測定した最大光合成活性は次第に低下するものの、光を吸収し、利用する効率は高く維持されていることを見出した。したがって、葉は暗くなった光環境に順化しながら光合成を行なっていると考えられる。さらに、この光合成系の順化的な変化は、被陰によって暗くなる光環境自身が信号となって起きる現象であることが見出された。光の吸収、利用に関与する集光性クロロフィルタンパク質や系Iと系IIの光化学反応中心の分解は非常に弱い光で抑えられるので、被陰されてもかなり安定に存在する。一方、光合成の暗過程に関与するRuBPカルボキシラーゼやATPaseなどの分解抑制には強光が必要であり、このため、少し暗くなるとその分解が進行する。そして、前者は主としてフィトクロム系により制御されており、後者はフィトクロム系、光合成系の他に青色効果も関与する非常に複雑な反応系で調節されていることが示された。3.上記の結果と関連して老化の進行に伴い、葉緑体の数も大きさも供に減少し、このため葉緑体の量が大きく減少することが示された。
気ー液2相媒質を用いた一様非連続媒質における絶縁破壊の基礎研究

A.水滴が存在する環境下での絶縁破壊現象について実験を行い、以下の結果を得た。1)帯電水滴落下時の針対針ギャップの破壊特性を評価し以下の結果を得た。・破壊電圧は水滴落下の無い場合に比べ約8割減少する。・高電界を印加すると水滴は傘状に広がる。2)無電荷水滴落下時の針対針ギャップの破壊特性を評価し以下の結果を得た。・無電荷水滴を落下させた場合,破壊電圧は約5割低下する。・落下水滴量が大幅に(1/8以上)減少しても,破壊電圧は約3割低下する。・電極に広範囲で落下する水滴だけが破壊電圧低下の原因ではなく,電極先端から落下するほんのわずかな雫状の水滴にのみよっても破壊電圧は約4割低下する。3)印加極性の違いによる針対針ギャップの破壊特性を評価し以下の結果を得た。・正および負の直流高電圧を印加したどちらの場合も,水滴落下により破壊電圧は約4割程度減少した。・上部電極から雫状の水滴を落下させた場合,水滴落下により破壊電圧はいずれの極性の場合も約4割程度減少した。ただし,正を印加した場合はギャップ長の変化によって破壊電圧比のばらつきには極性による若干の差が見られた。・破壊特性の落下水量に対する依存性は,f≧9ml/sで若干の上昇傾向が見られるがその上昇は小さい。また,極性に対する依存性はほとんど見られない。B.A.の実験の結果、降雨により絶縁破壊が促進される顕著な現象は観察されなかった。そこで、降雨により荷電雲直下の電界がどのような影響を受けるかについて数値解析による検討を行った。即ち,雷雲の直下の電界は降雨前に最大となり、その後降雨に伴って減少することから降雨直前に雷放電を生ずるとする仮説について解析を行った。解析は一次元モデルを用い,一定密度で分布する雲水滴が電荷を保持したまま集まって大きな水滴となり落下するとの仮定で行なった。その結果、水滴の落下により電界が減少していく過程が示された。(1)絶縁破壊を起こすような強い電界での一様非連続媒質を作るのに、目下、試行錯誤を繰り返している。電荷を帯びた各水滴は極めて激しく反発し、一様非連続媒質とは掛け離れた状態になった。特に、印加された電圧が高くなると、むしろ水滴の無い、空間となる。従って、水滴が飛散らないように閉じ込める工夫が必要である。(2)水滴の大きさの制御も難しく、小さいと電極に付着し、大きいと落下速度が速い。また、高速度撮影にはより強い照射光が必要で、現在は光量が不足で一工夫が必要である。これについても試行錯誤を繰り返している。(3)水滴の振舞いを調べるに当たって、まず、目的である水滴群下の交流電界における絶縁破壊の効果を調べる予備実験を行った。その結果、a)低電界では各水滴は電荷を帯びていても、激しく反発せず、水滴を通して絶縁破壊をした。したがって、乾燥空気の絶縁破壊電圧の20%程度まで低下した。しかも、放電アークは赤く、弱い発光で、低い温度での放電と推測される。これは一様非連続媒質の放電に近い状態と考えられる。b)高電界では各水滴は強い電荷を帯び、極めて激しく反発し、電極付近は水滴の無い、空間となる状態になった。このように強い電界での一様非連続媒質をどのようにして生成して行くかもこの研究の課題であることが分かった。本年度の研究では降雨が絶縁破壊現象に及ぼす影響の評価を室内実験により行った。即ち、室内にて降雨条件を再現し、雨滴の帯電状態、雨滴の落下位置、雨滴の大きさ、落下量に対する絶縁破壊電圧の変化を測定した。実験では、針対針電極を用い、印加電圧は直流とした。得られた結果を以下に列挙する。1)帯電水滴落下時の針対針ギャップの破壊特性の評価・破壊電圧は水滴落下の無い場合に比べ約8割減少する。2)無電同水滴落下時の針対針ギャップの破壊特性の評価・無電満水満を落下させた場合,破壊電圧は約5割低下する。電極に広範囲で落下する水滴だけが破壊電圧低下の原因ではなく,電極先端から落下するほんのわずかな雫状の水滴にのみよっても破壊電圧は約4割低下する。3)印加極性の違いによる針対針ギャップの破壊特性の評価・正および負の直流高電圧を印加した場合,何れの場合も水滴落下により破壊電圧は約4割減少する。・上部電極から雫状の水滴を落下させた場合,水滴落下により破壊電圧はいずれの極性の場合も約4割程度減少する。ただし,正を印加した場合はギャップ長の変化によって破壊電圧比のばらつきには極性によるわずがな差が見られる。4)印加電圧極性針対針ギャップの破壊特件に及ぼす影響の評価・正コロナの発生する電極に水滴が当たる場合に,最大約4割ほど破壊電圧が低下する。・負コロナの発生する電極に水滴が当たる場合は,破壊電圧にほとんど変化しない。負コロナの発生する電極から水滴落下がある場合は,破壊電圧はほとんど変化しない。

破壊電圧低下の要因を知ることは絶縁破壊現象を解明する上で非常に重要であり,特に正ストリーマの振る舞いと水滴の関係を明らかにすることが今後の研究において非常に重要であると考える。A.水滴が存在する環境下での絶縁破壊現象について実験を行い、以下の結果を得た。1)帯電水滴落下時の針対針ギャップの破壊特性を評価し以下の結果を得た。・破壊電圧は水滴落下の無い場合に比べ約8割減少する。・高電界を印加すると水滴は傘状に広がる。2)無電荷水滴落下時の針対針ギャップの破壊特性を評価し以下の結果を得た。・無電荷水滴を落下させた場合,破壊電圧は約5割低下する。・落下水滴量が大幅に(1/8以上)減少しても,破壊電圧は約3割低下する。・電極に広範囲で落下する水滴だけが破壊電圧低下の原因ではなく,電極先端から落下するほんのわずかな雫状の水滴にのみよっても破壊電圧は約4割低下する。3)印加極性の違いによる針対針ギャップの破壊特性を評価し以下の結果を得た。・正および負の直流高電圧を印加したどちらの場合も,水滴落下により破壊電圧は約4割程度減少した。・上部電極から雫状の水滴を落下させた場合,水滴落下により破壊電圧はいずれの極性の場合も約4割程度減少した。ただし,正を印加した場合はギャップ長の変化によって破壊電圧比のばらつきには極性による若干の差が見られた。・破壊特性の落下水量に対する依存性は,f≧9ml/sで若干の上昇傾向が見られるがその上昇は小さい。また,極性に対する依存性はほとんど見られない。B.A.の実験の結果、降雨により絶縁破壊が促進される顕著な現象は観察されなかった。そこで、降雨により荷電雲直下の電界がどのような影響を受けるかについて数値解析による検討を行った。即ち,雷雲の直下の電界は降雨前に最大となり、その後降雨に伴って減少することから降雨直前に雷放電を生ずるとする仮説について解析を行った。解析は一次元モデルを用い,一定密度で分布する雲水滴が電荷を保持したまま集まって大きな水滴となり落下するとの仮定で行なった。その結果、水滴の落下により電界が減少していく過程が示された。
不連続性同定のスペクトル逆問題

海洋音響の散乱では、いわゆるエバネッセンモードの存在により散乱波の遠方場は、散乱源の情報を十分に伝えるものとは言い難い。また、実際の海洋音響の散乱において散乱源の同定に使われる観測データは散乱波の近接場を用いることが多い。そこで散乱源の再構成が可能な二種類の近接場の観測データを提案し、これらの観測データから散乱源を再構成する手続きを与えた。そのうちの一つはエバネッセンモードの存在を回避できるが、実用性に乏しい観測データである。もう一つの観測データは、実際の観測データを数学的に理想化したものであり、エバネッセンモードの存在さえ回避できればこの逆解析手法は実用的に有望とおもわれる。今後は、この研究の発展として波数の二乗を複素化した場合を考えることによりエバネッセンモードを回避し、この場合に散乱源の再構成手続きを与えたい。道路の橋などにみられる鉄材とコンクリートがボルトで接合された梁は、橋を長年使用している間に接合部分が壊れていく。すなわち梁に損傷が生じる。この損傷の程度を調べるのは橋の安全管理上重要な問題である。この間題に関して通常よく使われる非破壊検査法の数理的な基礎づけを与え、損傷部分を正確に同定する方法を与えた。今後は、この理論に基づいて数値実験を行い、この理論の有効性の検証と実用化を計りたい。
顕微ラマン分光法を用いた有機薄膜多層構造における電気化学現象の解明と物性制御

有機発光ダイオード(有機EL)やトランジスタに使用されている有機物(NPD, CBP,銅フタロシアニン,Alq3,ペンタセン,PTCDI誘導体,セキシチオフェン,共役高分子,PEDOT-PSSなど)に関して,金属や絶縁体の上に作製した薄膜の単層・多層構造の顕微ラマンスペクトルを,励起光波長532,633,830nmで測定した.また,デバイス動作中のスペクトル測定を行った.その結果,以下の知見を得ることができた.(1)分子配向.有機トランジスタ材料であるペンタセン,銅フタロシアニン,PTCDI誘導体の配向に関する情報を得ることができ,移動度との関連を明らかにした.(2)結晶構造/アモルファス状態の固体構造.NPDなどのホール移動層材料の固体構造を反映するマーカーを明らかにした.有機発光ダイオードの劣化の原因解明に役立つ.(3)温度.銅フタロシアニン,PEDOTの温度をストークス・アンチストークス線の強度比から求めることができ,ガラス表面と有機薄膜の温度に大きな差があることを示した.NPDなどに関して波数シフトから温度を求めることができることを示した.(4)導電性高分子PEDOTのドーピングレベルをラマンスペクトルから得た.デバイス動作によりPEDOTが還元され,デバイス劣化の一因となっていることを示した.(5)化学変化.電極として金の半透膜を使用すると表面増強ラマン効果により,有機物のラマンスペクトルを測定でき,金属と有機物界面の情報を得ることができた.実際の電子デバイスに関して,これらの実験結果とデバイス機能の低下との関係を研究することにより,デバイスの長寿命化に対する基礎的な知見を得ることができると考えられる.また,キャリアのその場観測には赤外分光法を利用するほうがよいことがわかった.有機電子デバイスの研究に赤外・ラマン分光法は非常に有用であることを示した.有機発光ダイオード(有機EL)やトランジスタに使用されている有機物(NPD, CBP,銅フタロシアニン,Alq3,ペンタセン,PTCDI誘導体,セキシチオフェン,共役高分子,PEDOT-PSSなど)に関して,金属や絶縁体の上に作製した薄膜の単層・多層構造の顕微ラマンスペクトルを,励起光波長532,633,830nmで測定した.また,デバイス動作中のスペクトル測定を行った.その結果,以下の知見を得ることができた.(1)分子配向.有機トランジスタ材料であるペンタセン,銅フタロシアニン,PTCDI誘導体の配向に関する情報を得ることができ,移動度との関連を明らかにした.(2)結晶構造/アモルファス状態の固体構造.NPDなどのホール移動層材料の固体構造を反映するマーカーを明らかにした.有機発光ダイオードの劣化の原因解明に役立つ.(3)温度.銅フタロシアニン,PEDOTの温度をストークス・アンチストークス線の強度比から求めることができ,ガラス表面と有機薄膜の温度に大きな差があることを示した.NPDなどに関して波数シフトから温度を求めることができることを示した.(4)導電性高分子PEDOTのドーピングレベルをラマンスペクトルから得た.デバイス動作によりPEDOTが還元され,デバイス劣化の一因となっていることを示した.(5)化学変化.電極として金の半透膜を使用すると表面増強ラマン効果により,有機物のラマンスペクトルを測定でき,金属と有機物界面の情報を得ることができた.実際の電子デバイスに関して,これらの実験結果とデバイス機能の低下との関係を研究することにより,デバイスの長寿命化に対する基礎的な知見を得ることができると考えられる.また,キャリアのその場観測には赤外分光法を利用するほうがよいことがわかった.有機電子デバイスの研究に赤外・ラマン分光法は非常に有用であることを示した.典型的な低分子有機発光ダイオード(ITO/CuPc/NPD/Alq3/LiF-Al構造)を作製し,励起光波長532,633,840nmで顕微ラマンスペクトルを測定した.532nm励起ではNPDとCuPcのバンドが同じような強度で観測された.Alq3のバンドはほとんど観測されなかった.一方,633と830nm励起ではCuPcのバンドが支配的であった.これは共鳴・前期共鳴ラマン効果によるものである.NPDに関して,結晶/アモルファス状態を反映するバンドを見出した.ラマン分光は,デバイス劣化の一因と考えられているNPDの結晶化の検出に有用であることがわかった.2層型高分子発光ダイオード(ITO/PEDOT-PSS/PF8-F8BT/Li-Al)を作製し,顕微ラマンスペクトルを測定した.PEDOT-PSSはホール注入層材料として,多くの高分子発光ダイオードに使用されている.532と633nm励起のラマンスペクトルにおいて,デバイスの発光動作によりPEDOTのバンド強度の増加が観測された.PEDOT/PSSフィルムの酸化還元に伴うラマンスペクトル測定の結果に基づいて,観測された強度増大はPEDOTの還元を示すことがわかった.還元によりPEDOTの電子状態が変化するので,デバイスのホール注入・移動過程が変化して発光ダイオードの劣化が起こると予想される.PEDTT/PSSに替わるホール注入層材料を開発する必要がある.シリコン単結晶表面に熱酸化により作製したSiO2層をゲート絶縁体層に用いて,ボトムコンタクト型とトップコンタクト型の電界効果トランジスタ(FET)を作製した.MEH-PPVを材料とするFETを作製し,ゲート電圧誘起赤外吸収を測定した.

ゲート電圧をかけることにより正電荷が高分子層に注入されて正キャリア(ポーラロン)が生成することがわかった.ゲート絶縁体界面に生成するキャリアの面密度を見積もることができた.キャリア面密度は,ボトムコンタクト型よりもトップコンタクト型の方が高いことがわかった.有機半導体として,ポリジアセチレンを材料としたFETを作製した.トランジスタ特性を得ることができた.電界効果移動度は,1.3x10<SUP>-3</SUP>cm<SUP>2</SUP>/Vsで,オン・オフ比は1.0x10<SUP>4</SUP>であり,将来,有望な材料であることがわかった.ゲート電圧誘起赤外吸収を測定することができ,幅広い電子吸収と振動遷移のカップリングである電子・振動カップリングが観測された.トップ電極として金薄膜を用いて,Au/Alq3/SiO2/n-Si構造の金属・絶縁体・半導体デバイスに関して,電界効果によるキャリア注入がAlq3に及ぼす化学変化をラマン分光により研究した.表面増強ラマン効果により,ラマン散乱強度の著しい増大が観測され,金電極表面におけるAlq3のラマンスペクトルを測定することができた.さらに,ホール注入・放出を繰り返すと,Alq3は化学変化をすることを観測した.この方法は,金属表面における有機半導体の劣化を研究する標準的な方法となり得ることがわかった.(1)有機薄膜の構造と配向の解析電子デバイスで利用されている有機薄膜の構造を顕微ラマン分光法により検討した.有機薄膜トランジスタの代表的な有機半導体であるペンタセン薄膜の配向に関して検討した.数nm程度の膜厚までラマンスペクトルを観測することができた.b<SUB>3g</SUB>振動バンドの相対強度と偏光解消度から,配向に関する知見を得ることができることを示した.ラマン分光法は有機薄膜の研究法として有用である.ポリジアセチレン薄膜(青色膜)をラングミュア・プロジェット法により作製した.垂直引き上げ法と水平引き上げ法で炭素炭素三重結合の伸縮振動波数に違いが観測された.側鎖の縦揺れ振動のプログレッションが観測された.様々な炭素数のアルカンのスペクトルを基にして,側鎖は全トランス構造をとっていると結論した.(2)有機薄膜の酸化・還元反応の解析n-Si/SiO<SUB>2</SUB>/有機薄膜/Au半透膜の構造をもつ金属・絶縁体・半導体(MIS)デバイスを作製し,キャリア注入前後のラマンスペクトル変化を観測し,キャリア注入に伴う有機物の変化を検討した.励起光は金属半透膜から照射した.有機ELにおいて電子移動層・発光材料として代表的材料であるAlq<SUB>3</SUB>の場合には,ホール注入によりスペクトル変化が観測され,ホールにより酸化反応が起こっている可能性が示唆された.ポリ(3-ヘキシルチオフェン)ではホール注入による変化は観測されなかった.MISデバイスを用いた本方法は有機材料のキャリアに対する安定性を検討する方法として役立つことがわかった.キャリアそのもののスペクトルを観測するには,赤外分光が役立つことがわかった.
空胞性脊髄症の脊髄組織におけるHIV-DNA及びサイトカインmRNAの局在の検討-PCR/in situ hybridization法およびRT-PCR/in situ hybridization法を用いて-

死後13時間以内に剖検されたAIDS患者の脊髄をホルマリン固定後パラフィン包埋し、5μmに切った切片を用いた。HE染色切片で空胞化の程度により、空胞性脊髄症(VM)をgrade Igrade IIIに分け、各gradeから3例ずつ計9例と、コントロールとしてVMのないAIDS患者およびHIV抗体陰性者の脊髄切片を用いた。多核(巨)細胞の見られる、いわゆる“HIV myelitis"を伴う症例では、一部の多核細胞の核およびミクログリア小結節内のマクロファージ/ミクログリア(Mφ/MG)の核にHIV-1 proviralDNA(gag領域)が、PCR/in situ hybridization(PCR/ISH)法により検出された。そのミクログリア小結節近傍の空胞性変性部位におけるMφ/MGにおいても、少数ではあるが同じくHIV-1proviral DNA陽性の細胞がみられた。しかしoligodendrogliaにおける陽性細胞は明らかではなかった。また“HIV myelitis"のないVMでは、空胞性病巣部におけるHIV感染細胞は明らかではなかった。(未発表)HIV感染者における中枢神経障害の間接的な病因の一つとして、サイトカインー特にTNF-αの関与が考えられている。RT-PCR/ISHにより、TNF-αのmRNAの発現および局在について検討した。TNF-αmRNAはおもにMφ/MGに検出された。VMのあるAIDS症例では、VMのないものより多くのMφ/MGに発現していた。さらに症例を増やし、空胞性変性との関連および他のサイトカインmRNAの発現について検討しなければならない。各gradeから3症例ずつの組織標本を5μlに薄切し、In Situ PCR Glass Sides(Perkin Elmer社)にのせたものを用い、HE染色のほかに、Luxol Fast Blue染色、抗CD68抗体および抗gp41抗体を用いた免疫組織染色を施行した。空胞はおもに胸髄の後索や側索に見られたが、症例によっては前索にも少数みられるものもあった。病巣部をはじめ脊髄における細胞浸潤はとくにみられなかったが、空胞内にマクロファージ(foamy macrophages)が散見された。抗CD68抗体による空胞性病巣内のマクロファージ/ミクログリアの染色性は、病巣部以外のミクログリア小結節内のそれらより弱く、判別しにくいものが多かった。多核(巨)細胞の見られる、いわゆる“HIV myelitis"を伴う症例では、それらに一致してgp41が陽性のproductive infectionを示した。
炎症性消化器疾患における制吐剤が持つ新規抗炎症機構の解明

本研究は、制吐剤の抗炎症作用とそのメカニズムを明らかにし、制吐剤が持つ新規抗炎症機構による新たな治療戦略確立の基盤を構築することを目的としている。最終年度である本年度は昨年度に引き続き、抗がん剤である5-フルオロウラシル(5-FU)による腸炎モデルを用い、制吐剤であるセロトニン3A受容体(5-HT3AR)拮抗薬の抗アポトーシス作用機序および標的細胞を明らかにし、その更なる作用機序を明らかにするため解析を行い、以下の知見を得た。(1) 5-FUによるアポトーシス誘導に関与する5-HT3ARシグナルには、炎症性サイトカインであるTNF-αが関与している。(2)腸管内分泌細胞の一つでセロトニン(5-HT)を産生するエンテロクロマフィン細胞(EC細胞)に5-HT3ARが発現している。(3) 5-HT3ARの欠損は5-FU投与による血漿中5-HT濃度を上昇させない。以上より、5-FUによってEC細胞から放出された5-HTが、EC細胞上の5-HT3ARに作用することで5-HT放出が増強され、増加した5-HTが腸管粘膜細胞以外の細胞に作用することでTNF-αの産生に関与していると考えられた。増加した5-HTの標的細胞は明らかにできなかったが、TNF-αの産生に関与することから免疫細胞や神経細胞を介していることが考えられる。よって5-HT3ARシグナルはEC細胞の5-HT放出に関与することで間接的に5-FUによるアポトーシスを調整していることが明らかになった。これらの結果は5-HT3AR拮抗薬の持つ抗炎症作用の作用機序解明に有益であり、制吐剤の新規抗炎症薬としてのドラッグリポジショニングに資するものであると考える。29年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、抗がん剤である5-フルオロウラシル(5-FU)投与による小腸アポトーシス誘導モデル(以下、5-FUモデル)を用いて、制吐剤として臨床で使用されているセロトニン3A受容体(5-HT3AR)阻害薬による抗炎症・抗アポトポーシス作用機序について解析し、以下の知見を得た。(1)5-FUモデルにおいて、5-HT3AR阻害薬は小腸上皮細胞のアポトーシス誘導を有意に減少させた。また、5-HT3AR作動薬はアポトーシス誘導を増加させた。(2)5-HT3AR欠損マウスを用いて5-FUモデルを作成したところ、アポトーシス細胞の減少が認められた。以上より、小腸において5-HT3ARの活性化は5FUによるアポトーシス誘導に関与していることが明らかになった。次に、小腸においてアポトーシス増強作用に関与している5-HT3ARを発現する細胞の同定に着手した。野生型マウスと5-HT3AR欠損マウスの骨髄を入れ替えることで、骨髄由来血球系細胞以外、あるいは骨髄由来血球系細胞のみ5-HT3ARを欠損させたキメラマウスを用いて解析したところ、(3)骨髄由来の血球系細胞は5-HT3AR活性化によるアポトーシス増強作用には関与しないことが明らかになった。今後、消化管において5-HT3ARが発現している可能性が示唆されている小腸上皮細胞と神経細胞の可能性について検討する。本年度は5-HT/5-HT3ARシグナルがアポトーシスの調整に関与していることを、作動薬・阻害薬および5-HT3AR欠損マウスを用いることで、明らかにした。また、骨髄移植モデルを用いることで、その標的細胞が骨髄由来の免疫細胞ではないことを明らかにした。アポトーシス誘導に5-HT3ARが関与しているという報告はこれまでになく、この詳細な分子機構の解明は5-HTシグナルによる新しいアポトーシス増強経路を示す、病態生理学的に重要な知見となる。またアポトーシス誘導経路には炎症と共通する部分も数多くあることから、ほかの炎症疾患に5-HT/5-HT3AR経路が関与する可能性も示唆する。すなわち、制吐剤である5-HT3AR阻害薬は抗アポトーシスならびに抗炎症作用などによる異なる疾患に対する適用拡大の可能性(ドラックリポジショニング)が考えられ、本研究の目的にも合致している。今後、5-HT3ARを発現する標的細胞を同定するなどし、分子機構の解明を目指す。

以上より、5-FUによってEC細胞から放出された5-HTが、EC細胞上の5-HT3ARに作用することで5-HT放出が増強され、増加した5-HTが腸管粘膜細胞以外の細胞に作用することでTNF-αの産生に関与していると考えられた。増加した5-HTの標的細胞は明らかにできなかったが、TNF-αの産生に関与することから免疫細胞や神経細胞を介していることが考えられる。よって5-HT3ARシグナルはEC細胞の5-HT放出に関与することで間接的に5-FUによるアポトーシスを調整していることが明らかになった。これらの結果は5-HT3AR拮抗薬の持つ抗炎症作用の作用機序解明に有益であり、制吐剤の新規抗炎症薬としてのドラッグリポジショニングに資するものであると考える。最終年度は、昨年度から継続している、小腸における5-FUによるアポトーシス誘導を増強する5-HT3ARを発現している標的細胞の同定を行い、研究成果をまとめて論文として公表することを第一の目標とする。そこで、標的候補である上皮細胞ならびに神経細胞の5-FUによるアポトーシス誘導増強作用の関与について解析する。まず上皮細胞に関しては、近年報告された腸管上皮幹細胞を用いた腸オルガノイドを用いて実験を行う予定である(Sato et al, Nature, 2009.)。この腸オルガノイドを用いた実験系で、すでに5-FUなどのアポトーシス誘導物質を共培養することでアポトーシスを評価する方法が報告されており(Grabinger et al, CellDeath and Disease, 2014.)、この方法を野生型マウスおよび5-HT3AR欠損マウスを用いて行うことで、上皮細胞の5-HT3ARがアポトーシスに影響するかを明らかにできると考えている。一方、神経細胞に関しては、5-HT3ARを発現する消化管神経の発現分布の解析と、その神経から放出産生される神経伝達物質や神経ペプチド類の可能性について形態学的手法を用いて解析する予定である。すでに5-HT3ARにHA-tagを遺伝子導入したマウスとGFPを遺伝子導入した二種類の5-HT3ARを標識するレポーターマウスを得ることができており、これらのマウスを用いて解析を進める。29年度が最終年度であるため、記入しない。
ミリ波観測による低質量星形成領域におけるフィラメント形成シナリオの確立

宇宙赤外線望遠鏡ハーシェルによる星形成領域の観測から、0.1pc幅のフィラメント(細長い構造)が至るところで検出され、乱流によりフィラメントが形成、フィラメントの重力により周辺ガスがフィラメントへ流れ込み、フィラメント質量が増加し重力不安定が起こり、フィラメントから星のもととなるコアへ分裂する、といったフィラメント形成シナリオが提唱されている。そのため、フィラメント形成の理解は、星形成の理解に直結する。本研究では、赤外線観測では得ることができなかった運動情報を電波観測により得ることで、運動学の観点からフィラメント形成過程を明らかにし、フィラメント形成シナリオの確立を目指す。
加水分解酵素による不可逆的グリコシド生成系の構築

すでに糖オキサゾリン誘導体が、キチンの加水分解酵素であるキチナーゼにより認識され、糖供与体として働くことを報告している。本研究では、さまざまなオキサゾリン誘導体および糖受容体を用いる不可逆的な酵素的付加反応の開発を目的とした。チオN-グルコサミニドの酵素的ラクトサミニル化反応糖受容体として、各種チオN-グルコサミニドを用いて、N-アセチルラクトサミンに対する酵素的付加反応を試みた。その結果、Sメチル体、SH体、および重合基を持つチオグリコシドの付加反応がいずれも高い収率で進行することを見いだした。また、重合基を有する生成三糖に関しては、アクリルアミドとの共重合を行ない、新規グリココンジュゲートを合成した。現在生成ポリマーの物性評価を行っている。含マンノース新規三糖の合成細胞表層糖タンパク質のコア構造の一つに、Man-GlcNAc-GlcNAc骨格がある。そこで、野口研究所との共同研究として、本酵素反応を用いる上記コア構造の構築を目指した。まず、Man-GlcNAcのオキサゾリン誘導体を化学合成した。次に、各種N-アセチルグルコサミダーゼ存在下、p-ニトロフェニグルコサミニドの付加反応を試みたところ、興味深いことにエンド型グルコサミダーゼにより、付加反応が効率よく進行することを見いだした。従来この反応の収率は非常に低いことが知られており、本研究は細胞表層糖タンパク質の基本骨格の構築に有用な方法論を提供するものである。
高耐ノイズ性を有する高速高分解能サーボコントローラの開発

本研究は,サーボコントローラの誤動作を避けるために用いられているノイズ低減用ロ-パスフイルタを取り除き,従来からこのフイルタの遮断周波数で制限されていたコントローラの動作速度の向上を図る開発研究である.本研究のコントローラは,耐ノイズ特性の向上のために,江村の提案になる2相型PLLが用いられているが,従来の2相型PLLは,アナログ回路主体のため,エンコーダの出力波形の歪みの影響を受けやすく,調整箇所が多い上に,経年変化により定期的に再調整せねばならず,また,高精度のアナログ演算素子を多用するので,製造コストが高く,汎用コントローラへの応用が妨げられていた.そこで,2相型PLLの耐ノイズ性の高さや高速高分解能などの優れた特徴を生かしたまま,回路の一部をマイクロプロセッサやDSPによる演算回路に置き換え,回路定数の変化を抑えるとともに調整箇所を減らし,製造コストが低く耐ノイズ性に優れた汎用サーボコントローラを開発することとした.具体的には,高精度エンコーダから得られる2相正弦波を2相型PLLにより高分解能で内挿し,この内挿パルスを可逆カウンタで計数してエンコーダの回転角を得ているが,内挿に2相型PLLを用いているので,強力なノイズ環境下においても正確な位置が検出できる.平成8年度においては,平成7年度に設計・試作を行ったコントローラの特性を測定し,2相型PLLの応用により,内挿精度が高く,また極めて優れた耐ノイズ特性を有していることが確認された.しかし,サンプリングに基づくエリアシングの影響によりトラッキング誤差のFFTが特定の周波数でピークを生じることが分かった.そこで,DSPによりサンプリング間隔を短縮することを試みた.平成9年度においては,はじめに,エンコーダの波形歪みの影響を除くため,追従側2相信号の波形を非正弦波とすることを試みた.実験の結果,エンコーダの出力波形が多少歪んでも,十分な精度で内挿可能なことが確認された.次に,平成7年度から行ってきた研究成果を集大成したサーボコントローラを試作し,速度,制度,耐ノイズ特性などの諸特性を調べたところ,従来のサーボコントローラに比べて格段に優れていることが確認され,研究の目的を十分に達成していることが分かった.本研究は,サーボコントローラの誤動作を避けるために用いられているノイズ低減用ロ-パスフイルタを取り除き,従来からこのフイルタの遮断周波数で制限されていたコントローラの動作速度の向上を図る開発研究である.本研究のコントローラは,耐ノイズ特性の向上のために,江村の提案になる2相型PLLが用いられているが,従来の2相型PLLは,アナログ回路主体のため,エンコーダの出力波形の歪みの影響を受けやすく,調整箇所が多い上に,経年変化により定期的に再調整せねばならず,また,高精度のアナログ演算素子を多用するので,製造コストが高く,汎用コントローラへの応用が妨げられていた.そこで,2相型PLLの耐ノイズ性の高さや高速高分解能などの優れた特徴を生かしたまま,回路の一部をマイクロプロセッサやDSPによる演算回路に置き換え,回路定数の変化を抑えるとともに調整箇所を減らし,製造コストが低く耐ノイズ性に優れた汎用サーボコントローラを開発することとした.具体的には,高精度エンコーダから得られる2相正弦波を2相型PLLにより高分解能で内挿し,この内挿パルスを可逆カウンタで計数してエンコーダの回転角を得ているが,内挿に2相型PLLを用いているので,強力なノイズ環境下においても正確な位置が検出できる.平成8年度においては,平成7年度に設計・試作を行ったコントローラの特性を測定し,2相型PLLの応用により,内挿精度が高く,また極めて優れた耐ノイズ特性を有していることが確認された.しかし,サンプリングに基づくエリアシングの影響によりトラッキング誤差のFFTが特定の周波数でピークを生じることが分かった.そこで,DSPによりサンプリング間隔を短縮することを試みた.平成9年度においては,はじめに,エンコーダの波形歪みの影響を除くため,追従側2相信号の波形を非正弦波とすることを試みた.実験の結果,エンコーダの出力波形が多少歪んでも,十分な精度で内挿可能なことが確認された.次に,平成7年度から行ってきた研究成果を集大成したサーボコントローラを試作し,速度,制度,耐ノイズ特性などの諸特性を調べたところ,従来のサーボコントローラに比べて格段に優れていることが確認され,研究の目的を十分に達成していることが分かった.本研究は,大出力サーボアンプの発生する電気ノイズによるサーボコントローラの誤動作を避けるために一般に用いられているノイズ低減用ロ-パスフイルタを取り除き,ロ-パスフイルタの遮断周波数で制限されているサーボコントローラの回路の動作速度の向上を図る開発研究である.サーボコントローラの制御分解能を犠牲にすることなく耐ノイズ特性を向上させるために、江村の提案になる2相型PLLを使用することとした.従来の2相型PLLは,アナログ回路主体のため,調整箇所が多い上に,回路定数の経年変化により定期的に再調整せねばならず,また,高精度のアナログ乗算器を多用するため,製造コストが高く,汎用コントローラへの応用が妨げられていた.そこで平成7年度は,2相型PLLの耐ノイズ性の高さや高速高分解能などの優れた特徴を生かしたまま,回路の一部を高速マイクロプロセッサによる演算回路に置き換え,回路定数の変化を抑えるとともに調整箇所を減らし,製造コストが低く耐ノイズ性に優れた汎用サーボコントローラの開発を試みた.

具体的には,高精度エンコーダから得られる2相正弦波を2相型PLLにより高分解能で内挿し,この内挿パルスを可逆カウンタで計数してエンコーダの回転角を得た.内挿に2相型PLLを用いているので,大出力サーボアンプの発生する強力なノイズ環境下においても,正確ない位置が読みとれる.回路は,133MHzの高速マイクロプロセッサで制御されるように設計したが,この作業にはプリント基板用CADシステムが役立った.また,出来上がった制御システムの調整にはサーボアナライザが大変有効であった.現在,実際の工作機械を用いて試作したサーボコントローラの制御特性の試験を行っているところである.本研究は,サーボコントローラの誤動作を避けるために用いられているノイズ低減用ロ-パスフイルタを取り除き,従来からこのフイルタの遮断周波数で制限されていたコントローラの動作速度の向上を図る開発研究である.本研究のコントローラは,耐ノイズ特性の向上のために,江村の提案になる2相型PLLが用いているが,従来の2相型PLLは,アナログ回路主体のため,調整箇所が多い上に,経年変化により定期的に再調整せねばならず,また,高精度のアナログ演算素子を多用するので,製造コストが高く,汎用コントローラへの応用が妨げられていた.そこで,2相型PLLの耐ノイズ性の高さや高速高分解能などの優れた特徴を生かしたまま,回路の一部をマイクロプロセッサやDSPによる演算回路に置き換え,回路定数の変化を抑えるとともに調整箇所を減らし,製造コストが低く耐ノイズ性に優れた汎用サーボコントローラを開発することとした.具体的には,高精度エンコーダから得られる2相正弦波を2相型PLLにより高分解能で内挿し,この内挿パルスを可逆カウンタで計数してエンコーダの回転角を得ているが,内挿に2相型PLLを用いているので,強力なノイズ環境下においても正確な位置が検出できる.平成8年度においては,はじめに,汎用の高速マイクロプロセッサで制御可能なように平成7年度に設計・試作を行ったコントローラの特性を測定した.測定の結果,2相型PLLについては初期の予想通り,内挿精度が高く,また極めて優れた耐ノイズ特性を有していることか確認された.しかし,汎用プロセッサではサンプリング間隔を十分に短くできなかったので,エリアシングの影響によりトラッキング誤差のFFTが特定の周波数でピークを生じることが分かった.そこで,DSPによりサンプリング間隔を短縮することを試みた.DSPを用いた回路は,最近ようやく動き始めたばかりであり,本格的な実験はこれからであるが,簡単な実験により,サンプリング間隔の短縮に対してDSPが極めて有効であることが確認された.なお,制御システムの特性の測定には,サーボアナライザが大変有効であった.本研究は,サーボコントローラの誤動作を避けるために用いられているノイズ低減用ロ-パスフイルタを取り除き,従来からこのフイルタの遮断周波数で制限されていたコントローラの動作速度の向上を図る開発研究である.本研究のコントローラは,耐ノイズ特性の向上のために,江村の提案になる2相型PLLが用いられているが,従来の2相型PLLは,アナログ回路主体のため,エンコーダの出力波形の歪みの影響を受けやすく,調整箇所が多い上に,経年変化により定期的に再調整せねばならず,また,高精度のアナログ演算素子を多用するので,製造コストが高く,汎用コントローラへの応用が妨げられていた.
自食作用系蛋白質分解における調節蛋白質の検索

本研究は、細胞内タンパク質の大部分を占める長寿命タンパク質の分解を担うオートファジ-(自食作用)について、その調節に関わる未知のタンパク質群を検索する試みである。本年度の研究計画に基づいて得られた成果は以下の通りである。A.グルカゴンによりリン酸化されるタンパク質について:自食作用性タンパク質分解を促進するグルカゴン作用に注目し、これがアミノ酸の共存下でのみ再現性が見られることを確かめたあと、自食作用を担う粗リソソーム画分中に標的タンパク質を検索した。^<32>Pラベルによるin vivoリン酸化によりグルカゴンで特異的にリン酸化を受ける数本のタンパク質バンドを検出した。そのうち、特に49kDaのタンパク質(pp49)のリン酸化が再現性が高く、かつ、グルカゴンによるタンパク質分解促進作用と同調したことから、標的タンパク質である可能性が高い。現在、この単離・精製を目指して粗リソソーム画分からミトコンドリアを除去し、自食胞・リソソーム画分での存在を確かめ、PorosR1/Hクロマトグラフィーでの精製を試みている。B.自食作用成熟段階に関わるGTP結合タンパク質について:本計画では細菌毒素ストレプトリジンO(SLO)を用いた膜透過性細胞が自食作用成熟段階を保持していることを利用して、この段階に関わる調節タンパク質を検索するものであるが、サイトゾル中の20-30kDaの低分子量GTPaseがこの成熟段階に関わる候補としてあがってきた。けれどもこの段階でバイオアッセイに用いるSLO標品に問題が出てきた。現在、標品毎の膜透過処理特性を、他の試薬(pore-forming agents)の活用の可能性も含めて再検討している。
核磁気共鳴による磁気MQT(巨視的量子トンネル)の研究

巨視的な変数空間でのトンネル効果(MQT)は宇宙論から超伝導現象、原子分子の運動の有り様など、物理学の多くの分野に遍在する興味深い現象であり、最近多彩な研究が始められている。この研究は強磁気コバルト微粒子の極低温における磁化の緩和をNMRを用いて測定することによって、巨視的な数のスピンが一斉に異方性ポテンシャルをトンネルするMQTを観測しようとするものである。十分な信号を得るだけの量のコバルトの微粒子(直径約6nm)を真空中の島状常着法で作成する方法を確立し、また200MHz帯のスピンエコー方式のNMRスペクトロメーターを作成した。1Kから4Kの温度での測定によれば、0.2Tの外部磁場で整列させた後、0磁場に戻すとき、磁化は約5msecの緩和時間で熱平衡値に緩和することが見られた。現在、測定温度を0.3Kまで下げるべく、クライオスタットの整備中である。研究の進捗が遅れ気味であるため、成果報告書は1年以内に確定的成果を得た上で作成したい。強磁性体の微粒子では、すべての原子磁石の方向がそろった状態(強滋性状態)が基底状態であるが、その磁化の方向は、形状異方牲や結晶異方牲によって定まる。磁化の方向に依存するエネルギーは局所的な極小値をとり得るので、それが最小の極小でなくても、初期条件によっては磁化はその方向に落ちつく。局所的極小からの脱出は、熱的励起によるか、あるいは量子トンネルによる。前者の過程は強く温度に依存し、後者では温度によらない。そのために、極低温では後者が観測可能になる。本研究の目的は、強磁性微粒子の集合体を磁場中に置いた後、磁場を切り、その後の磁化の時間変化を核滋気共鳴を用いて追い、温度、粒子のサイズ、粒子間の相互作用の有無、粒子の置かれた媒質、等に緩和時間がいかに依存するかを調べることである。本年度は2カ年計画の初年度として、測定機器の購入整備と試料作成技術の開発を行った。核磁気共鳴装置(200MHz帯)は液体ヘリウム温度で順調に作動し、バルクの試料の信号を用いて測定系全体の調整をおこなっている。予備的実験として真空島状蒸着法によって作成した平均粒径20Åのコバルトの微粒子の核磁気共鳴信号を液体ヘリウム温度で検出することを試みているが、試料の量の不足のためにまだ成功に至っていない。