hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
プロテア-ゼ阻害剤によるセンダイウイルス感染マウスの発症阻止

マウス肺器官培養を用いてセンダイウイルスの増殖を阻害するプロテア-ゼインヒビタ-をスクリ-ニングした結果、アプロチニンとロイペプチンが最も有効にウイルス増殖を阻害することが、昨年度の研究で明らかになった。今年度は当初の計画に従い、上記の結果に基づいて、これらの阻害剤のうちアプロチニンについてセンダイウイルス感染マウスに対する発症阻止効果を検討した。1.アプロチニンのセンダイウイルス感染マウス発症阻止効果.(1)センダイウイルス感染マウスの発症阻止効果を示す最適投与法を検討した。その結果、センダイウイルスを経鼻感染後、12時間以内に250単位のアプロチニンを6回経鼻投与した場合が最も強く発症を阻止した。この条件下では、気管支上皮細胞内で産生される子孫ウイルスは、非開裂型のF糖蛋白を持った非感染性ウイルスで、そのために肺内でのウイルス感染の拡大が阻止され、発症が抑えられることが明らかになった。(2)アプロチニンの投与回数を3回に減らすと、上記のウイルス感染阻止効果は減弱し、1回投与した場合には、殆んど阻止効果を認めることはできなかった。(3)アプロチニンを腹腔内投与した場合には、経鼻投与に用いた8倍量を用いても、感染拡大を阻止する効果は見られなかった。2.以上の成績から、アプロチニンが気管支上皮細胞内のプロテア-ゼ活性を阻害することによってF糖蛋白の開裂が阻止され、その結果、肺内では感染性を失ったウイルスが産生され、感染の拡大が阻止されると云う機構が明らかになった。この結果は、プロテア-ゼ阻害剤をウイルス感染症の治療に用いる一つのモデルを提供したものと思われる。本研究はおおむね当初の計画に沿って順調に進んでいる。1.マウス肺器官培養によるスクリーニングの技術的検討。本研究に必要な以下の方法を確立した。3週令ICR雄マウスに2X10^6ケのセンダイウイルスを経鼻接種2時間後に肺を摘出し、これを2mm角以下に細切、一匹分の肺を4mlの培養液に浮遊し、6cm径のシャーレに移し34°CのCO_2ふらん器で培養した。本条件下でウイルスは常に活性型の状態で回収され、これまでの成績通り多段増殖を営む事が確認された。2.プロテーゼ阻害剤のスクリーニング。上記培養系に培養開始時に種々の濃度のプロテアーゼ阻害剤を入れ、5日間にわたり24時間ごとに培養上清の一部を取り、それぞれについて活性型ウイルスと全ウイルス(活性型および非活性型ウイルス)量を、蛍光抗体法およびトリプシン存在下のプラック法により別々に測定し、両者の差および阻害剤無添加対照のウイルス量との差から阻害効果を判定した。その結果、市販のプロテアーゼ阻害剤7種のうち3種に、また非市販品13種(血栓止血研:岡本名誉教授提供)のうち3種に阻害効果が認められた。3.マウス感染系におけるプロテアーゼ阻害剤の効果。予備的実験として、上記の肺器官培養で阻害効果を認めた阻害剤のうち、アプロチニン製剤のトラジロールを用いて、in vitroの増殖阻害効果がマウス生体系に於ても認められるか否かを調べた。3週令ICRマウスに0.1LD50のウイルスを経鼻感染させ、4時間後からトラジロールの頻回経鼻投与を行い、経日的に肺を摘出し、活性型ウイルスと全ウイルス量とを測定した。その結果、トラジロール投与群では対照に比し両ウイルス量とも有意に低値を示した。今後ウイルス量を増やして、プロテアーゼ阻害剤の発症阻止効果を調べる。
次世代高温ガス炉の安全性に関わる冷却材流量急減に伴う過渡対流熱伝達現象の解明

次世代高温ガス炉の安全性に関わる冷却材流量急減に伴う過渡対流熱伝達現象を解明するため,流量が減少する場合の過渡対流熱伝達実験を行い,種々の流量減少時定数の条件下で発熱体温度,熱流束,熱伝達係数の実験データを収集した。また,数値解析を行い,実験データとの比較検討を行い,流量減少時間,時定数,初期流速による熱伝達特性を明らかにした。研究結果として,流量の減少に伴い,表面温度が急激に増加することが解った。また,流量減少時定数が短いほど,熱伝達係数の減少速度が速いことが解った。さらに,数値解析結果より,数値解析結果は発熱体表面温度の実験結果と±7%以内で一致していることがわかった。次世代高温ガス炉の安全性に関わる冷却材流量急減に伴う過渡対流熱伝達現象を解明するため,水平円柱発熱体を用い,種々の流量減少時間,初期流速の条件下で発熱体温度,熱流束,熱伝達係数の実験データを収集した。流量減少時間,初期流速による熱伝達特性を明らかにした。実験装置は,ガス伝熱試験装置,発熱率制御システム,比例制御弁,データ計測・処理システムから構成されている。試験部はステンレス製の円形流路(内径20mm)で試験発熱体を流路中心部に流れに平行した状態で水平に設置した。試験発熱体は,直径1mm,有効長さが80.4mmの白金線の両端に,同じ直径を持つ銅線を溶接したものである。その銅線の両端に圧着端子をつけ,支持具をかねた銅電極とつなぎ固定した。強制対流実験装置を用い,ヘリウムガスを循環させ,ガス温度及び流速を十分安定させた後に,発熱体に電流を流し,初期発熱率を与えた。定常状態になってから,比例制御バルブにより流量減少時間内において,初期流量からゼロまで減少させ,それに伴う過渡対流熱伝達実験データを収集した。発熱体の平均温度は,電気抵抗法で計測した。熱流束は,発熱体におけるエネルギーの保存式より求めた。発熱体の表面温度は,計測した平均温度と熱流束を用い,発熱体における非定常熱伝導方程式より求めた。実験データは,系圧力が503 kPa,ガス温度が292 K,流速が4 m/s10 m/s,流量減少時間が5 s15 sの条件下で収集した。また,流量減少時間が短いほど,熱伝達係数の減少速度が速いことが解った。今後,広い範囲での実験データ及び数値解析のデータ収集し,冷却材流量急減に伴う過渡対流熱伝達現象を解明する予定である。実験データの収集がおおむね順調に進めている。それらの研究成果をまとめて,雑誌論文及び国際学会の講演論文での発表が計15編行った。また,3編の論文が平成28年に発表される予定である。次世代高温ガス炉の安全性に関わる冷却材流量急減に伴う過渡対流熱伝達現象を解明するため,流量が指数関数状に減少する場合の過渡対流熱伝達実験を行い,種々の流量減少時定数の条件下で発熱体温度,熱流束,熱伝達係数の実験データを収集した。時定数,初期流速による熱伝達特性を明らかにした。試験部はステンレス製の円形流路(内径20mm)で水平円柱発熱体を流路中心部に流れに平行した状態で水平に設置した。定常状態になってから,比例制御バルブにより指数関数状に流量を初期流量から減少させ,それに伴う過渡対流熱伝達実験データを収集した。実験データは,系圧力が505 kPa,ガス温度が301 K,流速が4 m/s10 m/s,流量減少時定数が4.3 s15.4 sの条件下で収集した。今後,広い範囲での実験データ及び数値解析のデータを収集し,冷却材流量が指数関数状に減少した場合の過渡対流熱伝達現象を解明する予定である。数値解析もおおむね順調に進めている。それらの研究成果をまとめて,雑誌論文及び国際学会の講演論文での発表が計14編行った。また,2編の論文が平成29年に発表される予定である。

また,数値解析を行い,実験データとの比較検討を行い,時定数,初期流速による熱伝達特性を明らかにした。実験データは,系圧力が505 kPa,ガス温度が301 K,流速が4 m/s10 m/s,流量減少時定数が3.0 s15.4 s,発熱体表面の初期温度差が100 K300 Kの条件下で収集した。具体的に以下の研究実績を得た。(1)ガス流速が減少するにつれて発熱体表面温度差が急激に上昇する。また熱流束は発熱体表面温度差の増加の割合がプラスのときに減少,増加の割合がマイナスの時には増加する。(2)ガス流速が減少するにつれて熱伝達係数は減少し,いずれの初期ガス流速においても流量減衰時定数が小さくなればなるほど減少のスピードは速くなる。(3)発熱体表面の初期温度差が高いほど,流量急減に伴う発熱体表面温度差の増加が高くなる。(4)ガス流速が減少するにつれてヌセルト数及びレイノルズ数は減少し,流量減衰時定数が小さくなればなるほど減少のスピードは速くなる。(5)数値解析結果より,RNG k-εモデルを適用した場合,数値解析結果は発熱体表面温度の実験結果と±7%以内で一致していることがわかった。次世代高温ガス炉の安全性に関わる冷却材流量急減に伴う過渡対流熱伝達現象を解明するため,流量が減少する場合の過渡対流熱伝達実験を行い,種々の流量減少時定数の条件下で発熱体温度,熱流束,熱伝達係数の実験データを収集した。また,数値解析を行い,実験データとの比較検討を行い,流量減少時間,時定数,初期流速による熱伝達特性を明らかにした。研究結果として,流量の減少に伴い,表面温度が急激に増加することが解った。また,流量減少時定数が短いほど,熱伝達係数の減少速度が速いことが解った。さらに,数値解析結果より,数値解析結果は発熱体表面温度の実験結果と±7%以内で一致していることがわかった。今後,平成27年度の研究内容に続き広範囲における実験データの収集と数値解析を行い,流量急減に伴う過渡熱伝達のメカニズムを明らかにする。今後,平成28年度の研究内容に続き広範囲における実験データの収集と数値解析を行い,流量が直線的に減少及び指数関数状に減少した場合の過渡熱伝達のメカニズムを明らかにする。熱工学昨年度では,計画していた実験データを収集することができた。一部の論文出版費が別の経費より賄うことができたこと,また予定していた会議の参加も日程の都合で取りやめたことから,研究費の一部が翌年度に繰り越すこととなった。昨年度では,計画していた実験データを収集することができた。また,数値解析も行った。一部の論文出版費が別の経費より賄うことができたこと,また予定していた国際会議の参加も日程の都合で取りやめたことから,研究費の一部が翌年度に繰り越すこととなった。翌年度の研究費と合わせて成果発表のための旅費やヘリウムガスなどの消耗品の購入に当てる予定である。研究計画に特に変更がない。翌年度の研究費と合わせて成果発表のための旅費や実験消耗品などの購入に当てることを計画している。
microRNAとエピゲノム解析によるHPV関連中咽頭癌予後不良因子の同定

ヒト乳頭腫ウイルス(HPV)関連中咽頭癌は化学放射線治療に対する感受性がよく、HPV陰性の従来型の中咽頭癌と比べ予後が良好である。そのため、2018年に改訂された頭頸部癌取り扱い規約においても中咽頭癌はHPV感染の有無により大きく異なる病期分類となった。しかしながら、HPV陽性中咽頭癌の中にも予後不良な経過をたどる例は依然として存在しており、その理由は明らかではない。一方で、我々は先行研究としてHPV関連頭頸部癌細胞株に対し次世代シークエンサーにターゲット濃縮手法を組み合わせることで全組み込み部位の詳細な解析を施行し、その結果、HPV関連頭頸部癌細胞株において、HPVは遺伝子間領域に組み込まれていることを確認している。そのため、HPV関連頭頸部癌では遺伝子変異だけでなく、エピゲノム変化が関連していると考え、同細胞株にバイサルファイトパイロシークエンスを行った結果、ゲノムワイドな低メチル化が生じていることを確認した。そのため、本研究ではまずHPV関連頭頸部癌細胞株を用いて網羅的マイクロRNAプロファイリングを行い、HPV感染により発現が変動するマイクロRNA群の中から予後に影響を及ぼすと考えられる細胞増殖、浸潤、転移に関連するマイクロRNAを同定することより開始した。その結果、細胞増殖、浸潤に関連する結果が得られたため、今回同定したマイクロRNAがOncomiRである可能性が考えられた。HPV関連頭頸部癌細胞株に対し網羅的マイクロRNAプロファイリングを施行し、さらに、公共データベースと当科で施行した結果照合することにより、HPV感染の有無と相関するマイクロRNAを絞り込み、同定した。これらのマイクロRNAの発現をRNAiにより増加および抑制し、細胞増殖能、遊走能、浸潤能の変化を確認しており、順調に進展している。今後、HPV陰性細胞株に対しHPV16遺伝子ベクターを導入し、今回同定したマイクロRNAの発現変動を確認する。さらに同RNAの発現変動により変動する下流の遺伝子変化群の解析を行う。その後、今回同定したマイクロRNAが予後予測因子となりえるかの検証のためHPV関連中咽頭癌臨床検体においてその発現を検討する。研究効率を工夫したことにより試薬をはじめとする消耗品の使用を削減することができ、物品費の支出を抑制することができたため。研究進捗をより推進するため、次年度へ謝金を充填する予定である。
大陸における風成堆積物の均質化過程の解明と上部大陸地殻の平均化学組成の再評価

本研究では、中国大陸の砂漠地域の風成堆積物や黄土の運搬・堆積作用を通しての均質化過程を検討し、黄土が中国大陸の上部地殻の平均化学組成であるとの考えの妥当性を検証した。1.中国タリム盆地のタクラマカン砂漠の風成堆積物について堆積学的・鉱物学的研究を行い、次のことを明らかにした。タクラマカン砂漠の風成堆積物は、サウジアラビア等の砂漠の風成堆積物と比較すると、石英の割合が相対的に少なく、石英粒子の円磨度が悪いなど、堆積学的には未成熟である。しかし、タクラマカン砂漠の風成堆積物は、鉱物組成や化学組成において地域差が認められないことから、タクラマカン砂漠風成堆積物の均質化の原因として、供給物質の周辺の山脈における氷河による堆積・運搬過程での均質化の重要性を指摘した。氷河作用により均質化された物質がタクラマカン砂漠に供給され、砂漠内部における風成作用によりさらに均質化が進行したと考えることが妥当であることを示した。2.黄土高原とオルドス地域の黄土は、主成分元素組成・希土類元素存在度・Sr同位体組成の特徴が中国北西部のタリム盆地の黄土とタクラマカン砂漠の砂丘堆積物と類似していることを明らかにした。この結果から、黄土高原とオルドス地域の黄土の主要な供給源は、中国北西部のタリム盆地の風成堆積物であることを指摘した。3.ジュンガル盆地・ナイマン地域・南京の黄土は、タリム盆地の砂丘堆積物や黄土とはSr同位体組成・主成分元素組成・希土類元素存在度の特徴が異なることを明らかにし、黄土高原やオルドス地域の黄土とは供給源が異なっている可能性を指摘した。4.中国の黄土は、中国北西部のタリム盆地から由来した黄土とそれ以外の場所から由来した黄土の、少なくとも2種類に大別できる事を明らかにした。この結果は、「中国各地の黄土が同一の物質であり、その化学組成が中国大陸の上部大陸地殻の平均化学組成を表している」とする従来の見解に再検討の必要があることを示している。黄土高原やオルドス地域の黄土などの中国北西部のタリム盆地から由来した黄土は、比較的広い範囲の地殻物質の平均的な化学組成を示している可能性が高いことが結論される。本研究では、中国大陸の砂漠地域の風成堆積物や黄土の運搬・堆積作用を通しての均質化過程を検討し、中国大陸の上部地殻の平均化学組成の推定を行う。本年度は、中国西部のタクラマカン砂漠の風成堆積物について、堆積学的・鉱物学的・地球化学的研究を行った。主な成果は次の通りである。1.サウジアラビア等の砂漠の風成堆積物と比較すると、タクラマカン砂漠の風成堆積物は、石英の割合が相対的に少なく、長石・方解石が多く含まれる。また石英粒子の円磨度は、タクラマカン砂漠の方が悪い。このように、タクラマカン砂漠の堆積物は、堆積学的には未成熟であることが明らかになった。2.タクラマカン砂漠の、西部、南部、中央部の3つの地域の風成堆積物において、鉱物組成および化学組成に地域差は認められないことが示された。3.堆積学的に未成熟であるにもかかわらず、鉱物組成・化学組成において地域差が認められない観察事実から、タクラマカン砂漠風成堆積物の均質化の原因として、供給物質の周辺の山脈における氷河による堆積・運搬過程での均質化の重要性を指摘した。氷河作用により均質化された物質が砂漠に供給され、砂漠内部における風成作用によりさらに均質化が進行したと考えることが妥当であることを主張した。4.タクラマカン砂漠堆積物においては、黄土の構成粒子の主体となる10-40μmの粒径の粒子が非常に少ないことを指摘した。さらに、この粒径の粒子の化学組成が、砂漠堆積物と黄土では異なっていることも明らかにした。この化学組成の違いの原因を明らかにすることが、中国大陸の上部大陸地殻の化学組成の推定する際に重要であることを指摘した。

3.ジュンガル盆地・ナイマン地域・南京の黄土は、タリム盆地の砂丘堆積物や黄土とはSr同位体組成・主成分元素組成・希土類元素存在度の特徴が異なることを明らかにし、黄土高原やオルドス地域の黄土とは供給源が異なっている可能性を指摘した。4.中国の黄土は、中国北西部のタリム盆地から由来した黄土とそれ以外の場所から由来した黄土の、少なくとも2種類に大別できる事を明らかにした。この結果は、「中国各地の黄土が同一の物質であり、その化学組成が中国大陸の上部大陸地殻の平均化学組成を表している」とする従来の見解に再検討の必要があることを示している。黄土高原やオルドス地域の黄土などの中国北西部のタリム盆地から由来した黄土は、比較的広い範囲の地殻物質の平均的な化学組成を示している可能性が高いことが結論される。
金ナノロッドによる放射線癌治療増強法の開発

金ナノロッドによる放射線増強機構の解明を目的に実験を行った。ヒト白血病細胞株Molt-4を使用して、金ナノロッド100ngあるいは500ngで照射前18時間処理し、放射線照射6時間後に、細胞死(アポトーシス)とその関連事象について調べた。金ナノロッド単独100ng使用群では調べたすべての指標は殆ど変化しなかったが、500ng処理群では、アポトーシスの誘発は僅かであったものの、生細胞数の有意な減少を認めた。関連する指標の中では特に細胞内活性酸素の増加は顕著であった。また、細胞内GSHの低下も有意であった。一方で、ミトコンドリア膜電位の低下や細胞内カルシウムイオンン濃度の変化は殆どなかった。放射線2.5Gyとの併用では、100ngあるいは500ng使用ともに細胞死、アポトーシスともに増強作用が認められた。特に500ng併用時には全ての指標で増強効果が認められた。一方、100ng使用時に放射線併用で顕著な増強が認められた関連指標は、ミトコンドリア膜電位の低下だけあった。増強効果の程度を考えると、500ng併用が望ましいが、単独での毒性を考慮すると毒性のない100ngが適すると思われる。今後、1)最適用量の検討および上皮系癌細胞株での単独処理および放射線併用効果の検討、2)細胞毒性と放射線増感効果を示す濃度について金ナノ粒子と比較、3)金ナノ粒子および金ナノロッドの増強の分子水準でのメカニズムの解明等が必要となる。細胞水準の実験では妥当なレベルと思われる。1)最適用量の検討および上皮系癌細胞株での単独処理および放射線併用効果の検討、2)細胞毒性と放射線増感効果を示す濃度について金ナノ粒子と比較、3)金ナノ粒子および金ナノロッドの増強の分子水準でのメカニズムの解明が必要となる。代表者3,536円、2名の分担者の物品費に各残額17,989円が生じたので、次年度と合わせて使用予定。
次世代シーケンシング技術を利用したアブラムシ社会の分子基盤および進化に関する研究

本研究課題では、階級分化、社会行動、分業といった興味深い生物現象を示す社会性アブラムシを対象にRNAseq解析をおこない、兵隊階級の分化や社会機能に関わる分子基盤およびその進化について解析した。その結果、調べた4種すべての兵隊で共通して発現亢進する遺伝子など、多数の興味深い遺伝子を同定した。兵隊特異的かつ大量に発現していたカテプシンB遺伝子およびカルパイン遺伝子については、その分子進化プロセスについても明らかにした。また、同一ゲノムから生じたゴール世代と2次寄主世代の比較から、両世代の兵隊において共通の遺伝子、特に筋肉やクチクラに関わる遺伝子が高発現していることを明らかにした。本研究課題では、階級分化、社会行動、齢差分業といった興味深い現象を示すさまざまな社会性アブラムシを対象に、次世代シーケンサーを用いたRNAseq解析をおこない、アブラムシ類における社会機構の至近メカニズムを網羅的かつ包括的に探るとともに、進化起源や表現型が異なる兵隊間でのトランスクリプトームの比較から、兵隊がいくつもの系統で独立に複数回進化してきたアブラムシ類における社会性の進化を遺伝子レベルで解明することを目的とする。今年度は、ハクウンボクハナフシアブラムシ、ササコナフキツノアブラムシ、ウラジロエゴノキアブラムシ、ジャムリッツエゴアブラムシ、ヨシノミヤアブラムシのゴール世代と、ササコナフキツノアブラムシの二次寄主世代を野外から採集し、さまざまな発生段階および階級(兵隊幼虫、非兵隊幼虫、無翅成虫、翅芽幼虫、有翅成虫など)のcDNAライブラリーを作成し、Illumina Hiseq2000によるシーケンスをおこなった。得られた配列を用いて、de novoアセンブリ、相同性検索、マッピング、遺伝子発現解析、クラスター解析などをおこなった。また、一部の種を除き、反復実験(Biological replicates)をN=3でおこない、サンプル間で遺伝子発現量に有意な差があるかどうかを検定した。本研究では、兵隊と普通幼虫の遺伝子発現を比較し、兵隊で発現が有意に亢進している遺伝子を抽出した。これまでの結果、様々な種の兵隊に共通して発現亢進する遺伝子や、特定の種の兵隊にのみ発現亢進する遺伝子など、多数の興味深い遺伝子が得られている。本研究課題では、階級分化、社会行動、齢差分業といった興味深い現象を示すさまざまな社会性アブラムシを対象に、次世代シーケンサーを用いたRNAseq解析をおこない、アブラムシ類における社会機構の至近メカニズムを網羅的かつ包括的に探るとともに、進化起源の異なる兵隊間でのトランスクリプトームの比較から、兵隊がいくつもの系統で独立に複数回進化してきたアブラムシ社会性の進化を遺伝子レベルで解明することを目的とする。今年度は、昨年度ライブラリー調整が間に合わなかったウラジロエゴノキアブラムシとジャムリッツエゴアブラムシの反復実験をおこない、昨年度の結果と合わせて、社会性アブラムシ4種(上記2種のほかに、ハクウンボクハナフシアブラムシ、ササコナフキツノアブラムシ)についてのデータ解析をおこなった。それぞれの種において兵隊での遺伝子発現量が有意に変化している遺伝子を抽出したところ、リパーゼを含む脂質代謝関連遺伝子やシトクロムP450といった遺伝子が4種に共通して発現亢進していることが明らかになった。また、ハクウンボクハナフシアブラムシの攻撃毒物質として既に報告があるカテプシンB遺伝子については、他3種の兵隊ではほとんど発現しておらず、これらの種では攻撃毒として機能していない可能性が示唆された。その一方で、ササコナフキツノアブラムシにおいてはカルパインという別のプロテアーゼが、またウラジロエゴノキアブラムシとジャムリッツエゴアブラムシにおいてはグリコシダーゼの一種が、いずれも兵隊でのみ大量発現していたことから、新規の攻撃毒タンパク質として機能している可能性が考えられた。本研究課題は、階級分化、社会行動、齢差分業といった興味深い現象を示すさまざまな社会性アブラムシを対象に、次世代シーケンサーを利用したRNAseq解析をおこない、アブラムシ類における社会機構の至近メカニズムを網羅的かつ包括的に探るとともに、進化起源の異なる兵隊間でのトランスクリプトームの比較から、兵隊がいくつもの系統で独立に複数回進化してきたアブラムシ類における社会性の進化を遺伝子レベルで解明することを目的とする。今年度は、昨年度までに同定されたササコナフキツノアブラムシのゴール世代兵隊で発現亢進するカルパイン遺伝子に関する詳細な解析をおこなった。定量RT-PCR解析の結果、兵隊におけるカルパイン遺伝子の発現は普通幼虫に比べて約500800倍亢進しており、RNAseq解析の結果とほぼ一致した。特異的ペプチド抗体を用いたイムノブロット解析では、90kD付近に兵隊特異的バンドが認められた。RNAseq解析から得られた遺伝子配列を精査したところ、ササコナフキツノアブラムシには少なくとも4つのカルパイン遺伝子が存在し、兵隊特異的タイプを除く3遺伝子はどの個体でも同程度に発現する構成的発現タイプであることがわかった。近縁種のエゴノネコアシアブラムシのRNAseq解析をおこなったところ、カルパイン遺伝子はすべて構成的に発現していた。これらの結果から、ササコナフキツノアブラムシの兵隊特異的タイプは多重遺伝子族の中の1コピーから進化したこと、この分子進化イベントはササコナフキツノアブラムシでのみおこったことが明らかになった。現在、兵隊特異的カルパイン遺伝子の生物機能について手がかりを得るため、in situハイブリダイゼーションや免疫組織化学により発現組織を解析中である。兵隊

特異的かつ大量に発現していたカテプシンB遺伝子およびカルパイン遺伝子については、その分子進化プロセスについても明らかにした。また、同一ゲノムから生じたゴール世代と2次寄主世代の比較から、両世代の兵隊において共通の遺伝子、特に筋肉やクチクラに関わる遺伝子が高発現していることを明らかにした。今年度は、予定していたすべてのシークエンスを完了し、データ解析に取り組み、以下の成果が得られた。1.兵隊特異的な攻撃毒として報告されているカテプシンBプロテアーゼについては、ハクウンボクハナフシアブラムシの兵隊で特異的に発現していた一方で、それ以外の種ではまったく別の酵素遺伝子が兵隊で特異的に発現しており、これが攻撃毒として機能している可能性が示唆された。以上の結果は、社会性アブラムシにおける攻撃毒タンパク質の多様性と進化について重要な示唆を与える大きな進展である。2.社会性アブラムシ4種に共通して兵隊で発現亢進している遺伝子を探索し、リパーゼやP450など複数の遺伝子を同定した。これらは兵隊の階級分化や生物機能に関わる共通の遺伝子と考えられる。これらの研究はいずれも申請書の計画通りに進められ、順調に成果が得られていると評価できる。社会性昆虫学、昆虫分子生物学攻撃毒として機能している可能性が示唆されたカルパインやグリコシダーゼを中心に、詳細な遺伝子発現定量解析、組織発現解析、機能解析などをおこない、実際に毒という機能を持つかどうかを精査する。またその他の興味深い遺伝子についても、同様の解析をおこない、生物学的機能を推定する。さらにRNAseqの結果について、より詳細な検討をおこない、兵隊分化および生物機能に関わる遺伝子基盤やその進化について、包括的な理解を得ることをめざす。今年度は、計画していたすべての社会性アブラムシについてRNAseq解析に着手し、サンプル調達が間に合わなかったジャムリッツエゴアブラムシとウラジロエゴノキアブラムシを除き反復実験まで実施することができた。よって、今年度はおおむね計画通りに研究を遂行することができたと言ってよい。受託サービスによる特異的ペプチド抗体の作製を来年度に延期したため。今年RNAseqのためのサンプルが十分に調達できなかったジャムリッツエゴアブラムシとウラジロエゴノキアブラムシについて、反復実験をおこない、シーケンスを完了させる。その上で、全アブラムシ種について、統計検定も含めた解析をおこない、その種間比較から、兵隊で優勢的に発現している遺伝子の共通性と種特異性を見いだす。また、それぞれの種において当初設定した研究目的に沿って、興味深い遺伝子を抽出し、それらの発現定量解析、組織発現解析、機能解析などをおこなう。今年度は、昨年度外注するはずだったペプチド抗体を作製するほか、その他の様々な分子生物学実験に必要な試薬類を購入する。その他、成果発表や野外採集に必要な旅費を支出する。
膵星細胞のマトリックス・リモデリングにおける免疫細胞の役割とその制御

本研究の目的は癌細胞の悪性度や治療抵抗性と深く関わっている細胞外マトリックスのリモデリングの機序や膵星細胞、炎症細胞の担う役割を明らかとし、新たな治療戦略を開発することである。初代培養した活性化型膵星細胞が作成するコラーゲンマトリックスは低酸素培養条件下ではより平行化し、癌細胞の浸潤を促進した。また、低酸素下で発現が誘導されるコラーゲン修飾因子としてPLOD2を同定した。活性化膵星細胞が作成するコラーゲンマトリックスは、正常脂肪組織由来の間質細胞が作るコラーゲンマトリックスと比較して、密で硬い構造であることを同定し、間質細胞の多様性がマトリックスの構造に影響を与えることが示唆された。膵星細胞によるマトリックス・リモデリングを検討するために、まず、膵癌切除組織からヒト膵星細胞を樹立した。これまでに当研究室では50株以上作成しており、本年度も10株以上のヒト膵星細胞を樹立した。またヒト免疫抑制作用の存在が近年明らかになった間葉系幹細胞の一つとして、脂肪前駆細胞に注目した。脂肪組織内の毛細血管周囲には間葉系細胞が存在し、乳癌など他癌腫ではその相互採用によって癌の浸潤・転移を促進することが報告されている。ヒト膵癌切除組織および膵癌マウスモデルから脂肪組織由来幹細胞を樹立した。膵癌細胞と脂肪組織由来幹細胞の共培養では、癌細胞の増殖能・浸潤能・遊走能を増強することが明らかとなった。コラーゲンゲルを用いた、3次元培養下での膵星細胞によるマトリックス・リモデリングの評価を行った。膵癌細胞株とヒト膵切除組織から樹立した膵星細胞の単培養・共培養をおこなったところ、膵癌細胞と膵星細胞の共培養群において、膵癌細胞の増殖・浸潤遊走能は亢進した。膵癌細胞の浸潤に先立って、膵星細胞の浸潤がみられ、膵星細胞の浸潤がみられたコラーゲンゲル層は明らかに収縮し厚みが増し、そのコラーゲン線維の方向に変化がみられるなど、膵星細胞によるマトリックス・リモデリングが観察された。また、膵星細胞によるマトリックス・リモデリングと腫瘍微小環境因子の関係を検討したところ、低酸素環境で平行な線維の割合が増えることも明らかにした。昨年度に引き続き、膵星細胞によるマトリックス・リモデリングを検討するために、膵癌切除組織からヒト膵星細胞を10株以上樹立した。また、ヒト免疫抑制作用の存在が近年明らかになった間葉系幹細胞の一つである、脂肪前駆細胞に注目し、ヒト膵癌切除組織および膵癌マウスモデルから脂肪組織由来幹細胞を樹立した。膵癌細胞と脂肪組織由来幹細胞の共培養では、癌細胞の浸潤能・遊走能を増強し、また抗癌剤耐性に関与することが明らかとなった。また、コラーゲンゲルを用いた、3次元培養下での膵星細胞によるマトリックス・リモデリングの評価を行った。さらに、膵癌細胞の浸潤に先立って、膵星細胞の浸潤がみられ、膵星細胞が浸潤することによりコラーゲン線維の方向を変化させた。以上のように、膵星細胞は基質リモデリングにより、leading cellとして膵癌浸潤を先導する、といった膵癌細胞の新たな浸潤機序を明らかにした。また、膵星細胞の基質リモデリング因子の一つとしてEndo180を同定し、膵星細胞でのEndo180を標的とすることで膵癌細胞の浸潤を抑制する可能性を明らかにした。また、膵星細胞によるマトリックス・リモデリングと腫瘍微小環境因子の関係を検討したところ、低酸素環境で平行な線維の割合が増え、膵星細胞での低酸素誘導因子であるPLOD2の発現が関与していることを明らかにした。免疫細胞の一つとして脂肪組織由来幹細胞を樹立でき、膵癌細胞との共培養において、癌細胞の浸潤・遊走能が増加すること、また抗癌剤耐性に関わることなど、免疫細胞と膵癌の関連について検討を行えた。さらに、膵癌細胞、膵星細胞を用いて三次元培養を行うことで、コラーゲンで構築した細胞外マトリックスを膵星細胞がリモデリングし、leading cellとして膵癌浸潤を先導する、といった膵癌細胞の新たな浸潤機序を明らかにすることができた。また、膵星細胞のマトリックス・リモデリングに関して、低酸素環境で平行な線維の割合が増え、膵星細胞でのPLOD2の発現が関与していることを明らかにした。以上のように、細胞外マトリックスと膵星細胞の関連について検討を行うことができたことなど、一定の成果がみられたことから、本研究はおおむね順調に進展していると考えられた。本研究の目的は膵癌微小環境に豊富に存在する細胞外マトリックスのリモデリングの機序の解析および免疫細胞の役割を明らかにすることである。今年度は膵星細胞が産生する3次元コラーゲンマトリックスをin vitroで作成し、その3次元構築に着目した解析を行った。このコラーゲンマトリックスは膵癌微小環境の特徴である低酸素環境下では通常酸素下での培養と比較して、その線維方向が有意に平行化することを見出した。更に、このコラーゲンマトリックス上に膵癌細胞株であるPANC1を撒いて、その運動軌跡を解析すると、PANC1の移動距離がより遠くなることが分かり、低酸素化で形成されたコラーゲン線維の配向が癌細胞の浸潤に影響することを見出した。

このコラーゲンの線維配向を制御する遺伝子として、網羅的な遺伝子解析からPLOD2を同定した。膵星細胞におけるPLOD2の発現抑制を行うと、低酸素環境下においてはコラーゲン線維の平行化が抑制された。これらの知見から、細胞外マトリックスの制御因子として低酸素環境およびPLOD2の発現が重要であることが示唆された。更に、膵外浸潤におけるマトリックスのリモデリングに焦点を絞り、脂肪組織由来幹細胞がつくるコラーゲンマトリックスの構造について評価を行った。通常培養下でのマトリックスの構造は粗な構築であるが、癌細胞の上清添加によってその構造は密となり、PANC1細胞の運動性を促進した。これら、マトリックスのリモデリングに及ぼす免疫細胞の影響を解析するため、末梢血中の好中球の単離をCD45, CD11b, Ly-6Gを用いて行った。単離した好中球を用いたマトリックスへの影響については今後実験・解析を進めていく必要がある。本研究の目的は癌細胞の悪性度や治療抵抗性と深く関わっている細胞外マトリックスのリモデリングの機序や膵星細胞、炎症細胞の担う役割を明らかとし、新たな治療戦略を開発することである。初代培養した活性化型膵星細胞が作成するコラーゲンマトリックスは低酸素培養条件下ではより平行化し、癌細胞の浸潤を促進した。また、低酸素下で発現が誘導されるコラーゲン修飾因子としてPLOD2を同定した。活性化膵星細胞が作成するコラーゲンマトリックスは、正常脂肪組織由来の間質細胞が作るコラーゲンマトリックスと比較して、密で硬い構造であることを同定し、間質細胞の多様性がマトリックスの構造に影響を与えることが示唆された。免疫細胞の一つとして脂肪組織由来幹細胞を樹立でき、膵癌細胞との共培養において、癌細胞の増殖・浸潤・遊走能が増加することなど、免疫細胞と膵癌の関連について検討を行えたこと、膵癌細胞、膵星細胞を用いて三次元培養を行うことで、コラーゲンで構築した細胞外マトリックスを膵星細胞がリモデリングすることが確認できるなど、細胞外マトリックスと膵星細胞の関連について検討を行うことができたことなど、一定の成果がみられたことから、本研究はおおむね順調に進展していると考えられた。その一方で、本年度に予定していた、膵切除組織の免疫組織化学染色法で癌間質特有の細胞外基質の質的性状や量、マトリックス・リモデリングをヒト組織内で確認を行うことはできなかった。引き続き、膵癌組織から膵癌細胞や免疫細胞の分取を行い、三次元共培養モデルを用いて培養し、さらに膵癌の浸潤・増殖・転移に関連する免疫細胞の同定を行う。膵癌細胞、膵星細胞、免疫細胞の三次元共培養実験を行い、細胞外マトリックス・リモデリングを評価する。また、TGFβやMMPなど関連因子の抑制を行い、細胞外マトリックスに与える影響を検討する。十分な結果が得られない場合には、網羅的解析を行って、細胞外マトリックス・リモデリングに関連する因子の同定を行う。また、同定されたマトリックス・リモデリングに関連する因子を抑制して、抑制実験を行う。またマトリックス・リモデリングを抑制する治療薬の検討を、膵癌マウスモデルを用いて行う。医歯薬学今後は、膵癌組織から膵癌細胞や免疫細胞の分取を行い、三次元共培養モデルを用いて培養し、さらに膵癌の浸潤・増殖・転移に関連する免疫細胞の同定を行う。
男女医師のワークライフバランスとキャリア形成の研究

本研究では、医師と法曹という専門職のワークライフバランスとキャリア形成の比較研究の一部として、男女医師に対してwebモニター調査を実施した(2010年実施、有効回答数1876票)。また、『就業構造基本調査』の再分析やインタビューの分析もあわせて行い、医師の就業形態、勤務先、専門分野、地位、職業履歴におけるジェンダー差や、婚姻率や家庭における家事・育児分担等のジェンダー差の状況を明らかにした。本研究の全体構想と目的は(1)医師のキャリア形成や、家庭における性別役割分業の実態を明らかにする為に、質的・量的な調査を行い、医師(特に女性医師)のキャリア形成やワークライフバランスを阻害する要因や改善点を明らかにし、(2)さらに将来的には、すでに行った「法曹に対する質問紙調査(平成18-20年度科研費研究基盤C「医療・法曹職女性の研究」研究代表者中村真由美)」の結果とあわせ、医師と法曹の比較研究を行うことで、2つの専門職の間の制度の差異に着目し(労働の柔軟性など)、制度が女性の性別役割分業やキャリア形成に与える影響について検証することを目的とする。医師のキャリア形成と性別役割分業についての調査・分析を行うことの意義としては、それが、現在大きな社会問題になっている医師不足の改善や、女性の人的資本の有効活用に資することにある。現在、女性医師の割合は増えているが、その専門分野や働き方・キャリアパスには男性医師との差があり、それが現場における医師不足につながっている。従来の医師のキャリア研究では、ジェンダー差に焦点をあてたものはまだ少なく、医師の家庭内役割分業に焦点をあてた研究も少なかった。本研究においては、ジェンダー差に焦点をあて、社会学の理論や知見・手法を用いて、キャリア履歴の詳細や、家庭内役割分業の実態を量的・質的な調査・分析によって明らかにすることで、女性医師が直面している問題に新たな視点から光をあてることができる。なお平成22年には、男女医師のキャリア形成と家庭と職場における性別役割分業(専門分野や働き方、および家事育児分担等のジェンダー差)についての量的調査(web調査)を実施した。有効回答数は1876票であった。医師のキャリア履歴と家庭内役割分業についての詳細かつ貴重なデータを得ることができた。今後は、このデータの量的な分析を一層進めていきたい。本研究の全体構想と目的は、(1)医師のキャリア形成や、家庭における性別役割分業の実態を明らかにする為に、質的・量的な調査を行い、医師(特に女性医師)のキャリア形成やワークライフバランスを阻害する要因や改善点を明らかにし、(2)さらに将来的には、すでに行った「法曹に対する質問紙調査(平成18-20年度科研費研究基盤C「医療・法曹職女性の研究」研究代表者中村真由美)」の結果とあわせ、医師と法曹の比較研究を行うことで、2つの専門職の間の制度の差異に着目し(労働の柔軟性など)、制度が女性の性別役割分業やキャリア形成に与える影響について検証することを目的とする。従来の医師のキャリア研究では、ジェンダー1差に焦点をあてたものはまだ少なく、医師の家庭内役割分業に焦点をあてた研究も少なかった。本研究では、医師と法曹という専門職のワークライフバランスの比較研究の一部として、医師に焦点をあて(平成18年度科研費で実施した、弁護士に対する調査と比較可能な設計とした)、男女医師に対してwebモニター調査を実施した(2010年3月実施、有効回答数1876票、女性306票、男性1570票)。まず、医師の就業形態、勤務先、専門分野、地位、職業履歴におけるジェンダー差や、婚姻率や家庭における家事・育児分担等のジェンダー差の状況を明らかにした。初期のキャリア(研修や研修先など)については、ジェンダー差はほぼ見られないが、その後の子育て期に就業形態や就労先に違いが現れる。専門分野については、当初、女性医師は家庭と両立するために途中で専門分野を変更すると予想したが、専門分野を変更した比率は男女でほぼ同じ(10%程度)であった。ただし、当初の専門分野選択の理由は男女で異なっていた。

男性医師は興味を理由に専門分野を選択する傾向が女性医師より強く、女性医師は男性医師に比べて、家庭との両立のしやすさ(理解のある上司や同性の先輩の多い医局を選ぶ、夜間呼び出しの少ない科を選ぶ等)を考慮して選ぶ傾向があった。この傾向が(医師不足の一因ともみなされている)女性医師の「専門分野選択の偏り」につながっていると考えられる。また、有配偶率は女性医師が53.3%であり、男性医師が84.0%で大きな差があった。配偶者が医師である比率は、男性医師が10.2%であるのに対し、女性医師が57.1%であり、大きなジェンダー差が見られた。男性医師は専業主婦と結婚している傾向が強い。また、子育てを5割以上負担している比率は、男性医師がわずか4%であるのに対し、女性医師は97%だった。男性医師の配偶者は専業主婦である傾向があり、家事育児の多くを妻に頼ることが可能であるが、女性医師は医師同士で結婚する傾向にあり、家事育児の大半を担っていた。
糖尿病性網膜症における網膜硝子体の血管新生の機序解明のための実験モデル作製

1)昨年度から継続して網膜硝子体の新生血管を作成する実験を進めている。人の糖尿病網膜症で神経を早める要因となる、高血圧、妊娠、頚動脈閉塞等の因子を糖尿病ラットに負荷して、網膜無血管帯を形成するモデルを作成した。このモデルを下記の研究とあわせて第33回日本網膜剥離学会総会のシンポジウム眼疾患と動物モデルで、糖尿病網膜症と題して報告した。2)本年度新たに、細胞成長因子の一つであるvascular endothelial growthfactor(VEGF)に注目し、ストレプトゾトシン糖尿病ラットの網膜における局在を検討した。VEGFは血管の透過性を亢進させ、内皮細胞の増殖すなわち血管新生も促進する。さらに虚血状態で産生が亢進するため、上記モデルで形成される糖尿病ラットの網膜無血管帯では産生が亢進することが予想された。研究の結果、網膜のグリア細胞および神経節細胞におけるVEGFの産生が、糖尿病状態ではコントロールより顕著に増加しており、VEGFは糖尿病網膜症の進行に重要な役割を果たしていることが明らかになった。(Ophthalmic Research,in press)。3)in vitroでは血管内皮細胞と周皮細胞の共培養をおこない、正常酸素分圧では血管新生を抑制する周皮細胞が、低酸素分圧下では血管新生を促進することを証明した。これは糖尿病網膜症で無血管帯が血管新生に先だって生じることの機序を説明する研究結果であった。(Ophtahlmic Research,1994:26:23:31)。
不活性X染色体の単離による不活性化因子の網羅的解析

1.X染色体の不活性化因子を網羅的に同定することを目的に、不活性X染色体を単離するため、微小核を効率よくソーティング出来る条件検討を行った。Lamin-GFPを恒常的に発現する細胞株で核膜を標識した上で、大きさ・DNA含量量を指標にソーティングを行い、回収された試料の観察を行った。微小核を大量に回収するためには更なる条件検討が必要だが、今後の実験において重要な検討となった。2.これまでに培養細胞及び胚盤胞期胚において、MacroH2A-EGFPを利用し、不活性X染色体を1点の強いシグナルとして標識出来ることを示してきた。今年度は、X染色体の活性状態を胚発生過程で追跡出来るシステムの確立に向けて、トランスジェニックマウスの初期胚発生過程におけるMacroH2A-EGFPの挙動を解析した。その結果、マウス着床前胚において、MacroH2A-EGFPのシグナルがX染色体の活性状態に応じて、集積及び消失すること、着床後胚においてもMacroH2A-EGFPが不活性X染色体を標識することを確認した。このことから、MacroH2A-EGFPがライフサイクルを通してX染色体の活性状態を追跡するのに有用であることが示唆された。3.またX染色体不活性化をリアルタイムに可視化出来るシステムの構築を目指し、X染色体不活性化に関与する因子を蛍光タンパク質で標識するためのコンストラクトの作製、及びトランスジェニックマウスの作製を行った。これまでに作製したマウスと掛け合わせることで、X染色体不活性化をリアルタイムに可視化出来ることが期待される。1.微小核形成効率の良い培養細胞にMacroH2AとEGFP融合タンパク質(MH2A-EGFP)発現プラスミドを遺伝子導入し、不活性X染色体を恒常的にMacroH2A-EGFPで標識した細胞株を作製した。今後、作製した細胞株を用いて微小核の形成、分離を行い、MH2A-EGFPが不活性X染色体に顕著に集積することを利用して、GFP強度を指標に不活性X染色体を含む微小核のソーティングを行っていく。その後、不活性X染色体に集積するタンパク質やRNAを網羅的に解析することで、X染色体不活性化に関与する因子を新たに同定出来ると考えている。2.これまでに、CAGプロモーターの制御下でMH2A-EGFPを発現するトランスジェニック(Tg)マウスを作製し、独立した8ラインのマウスを得ている。マウスを実体蛍光顕微鏡下で観察したところ、全身で緑色蛍光が観察され、拡大すると緑色蛍光は皮膚の核に局在しているように見られた。更に組織切片を作製し、詳細に観察したところ、緑色蛍光は核に局在し、雌の核内では1点の強いシグナルの観察されるものがあった。またTgマウス由来胚でも核に緑色蛍光が観察され、雌では8細胞期頃から核内に見られた強いシグナルの一部が、不活性X染色体のマーカーとなるXist RNAと共局在し始めることがRNA FISHによって明らかとなった。更に胚盤胞期では、核内に強いシグナルが1点観察され、そのシグナルの大部分はXist RNAと共局在した。雄では雌の組織や胚の核内で見られた1点の強いシグナルは観察されなかったことから、我々のMH2A-EGFP Tgマウスを利用することで、初期胚および個体レベルで、不活性X染色体を追跡出来ることが示唆された。今後このTgマウスの詳細な解析を行うことで、X染色体が初期胚でどのような時間制御によって不活性化されるのかを明らかに出来ると期待される。1.不活性X染色体をMH2A-EGFPで標識した細胞株を用いて微小核の形成、分離を行い、不活性X染色体を含む微小核のソーティングを試みた。そのためにまず、微小核がフローサイトメーターでどのように検出されるか調べた。FSC-SSCで解析したところ、特異的な細胞集団は検出されなかった。そのため、6、1μmの標準ビーズを用いて、微小核の存在範囲を限定し、更に染色体を含む微小核をDAPIで染色することで、大きさ・GFP強度・DNA含量量を指標に効率良く、微小核集団を特定出来るフローサイトメーターの条件検討を行った。これまでに微小核のソーティングは行われたことがなかったため、微小核がフローサイトメーターでどのように検出され、ソーティングを行うためにどのような条件が必要かを検討したことは今後の実験において重要な検討であった。2.これまでに培養細胞及び胚盤胞期胚において、MH2A-EGFPを利用し、不活性X染色体を1点の強いシグナルとして標識出来ることを示してきた。今年度は、X染色体の活性状態を胚発生過程で追跡出来るシステムの確立に向けて、トランスジェニックマウスの初期胚発生過程におけるMH2A-GFPの挙動を解析した。その結果、不活性X染色体が再活性化される内部細胞塊においては、栄養外胚葉で観察される核内の1点のシグナル数が減少し、不活性X染色体のマーカーとなるXist RNA、H3K27me3のシグナル数も減少していた。このことから、MH2A-EGFPはX染色体が不活性化する際は不活性X染色体上へ集積し、不活性X染色体が再活性化する際は不活性化していたX染色体上から消失することが考えられた。これらの結果から、MH2A-EGFPを利用して、初期発生過程におけるX染色体の活性状態を追跡出来ることが示唆された。

1.X染色体の不活性化因子を網羅的に同定することを目的に、不活性X染色体を単離するため、微小核を効率よくソーティング出来る条件検討を行った。Lamin-GFPを恒常的に発現する細胞株で核膜を標識した上で、大きさ・DNA含量量を指標にソーティングを行い、回収された試料の観察を行った。微小核を大量に回収するためには更なる条件検討が必要だが、今後の実験において重要な検討となった。2.これまでに培養細胞及び胚盤胞期胚において、MacroH2A-EGFPを利用し、不活性X染色体を1点の強いシグナルとして標識出来ることを示してきた。今年度は、X染色体の活性状態を胚発生過程で追跡出来るシステムの確立に向けて、トランスジェニックマウスの初期胚発生過程におけるMacroH2A-EGFPの挙動を解析した。その結果、マウス着床前胚において、MacroH2A-EGFPのシグナルがX染色体の活性状態に応じて、集積及び消失すること、着床後胚においてもMacroH2A-EGFPが不活性X染色体を標識することを確認した。このことから、MacroH2A-EGFPがライフサイクルを通してX染色体の活性状態を追跡するのに有用であることが示唆された。3.またX染色体不活性化をリアルタイムに可視化出来るシステムの構築を目指し、X染色体不活性化に関与する因子を蛍光タンパク質で標識するためのコンストラクトの作製、及びトランスジェニックマウスの作製を行った。これまでに作製したマウスと掛け合わせることで、X染色体不活性化をリアルタイムに可視化出来ることが期待される。MH2A-GFPが不活性染色体領域特異的ヒストンH3のメチル化と同様の挙動を示し、X染色体の活性状態に応じて、集積及び消失することを確認し、MH2A-GFPが不活性X染色体を標識するのに有用であり、不活性X染色体の単離に向けての基礎的な基盤が確立したので。X染色体不活性化因子を網羅的に調べるために、不活性X染色体のソーティングを引き続き行うと同時に、培養細胞において、siRNAライブラリーを用いた因子の探索を行う。また、X染色体不活性化の全体像を可視化するために、不活性化に関与の示唆されている因子と蛍光タンパク質の融合タンパク質を用いて、リアルタイムにX染色体が不活性化していく様子を追跡出来るモデル細胞の確立を目指す。
カプサイシンによる味覚修飾；軸索反射放出ペプチドの甘味受容経路に与える影響

唐辛子の辛味成分カプサイシン(CAP)は、TRPV-1を刺激することが報告されている。我々は、CAPが糖類に対するマウス味覚神経応答を増強する可能性を見出した。特にこの増強は、近年発見された糖輸送体SGLT-1を介して生じることが示唆された。しかし、その分子機序の解明には未だ至っていない。仮にこのCAPによる甘味修飾はTRPV-1を介して生じるとすると、甘味受容細胞に発現するTRPV-1活性化による直接的な効果、あるいは三叉神経末端のTRPV-1活性化に起因する軸索反射で分泌されたペプチドを介した味細胞への間接的な影響に起因することが予想された。そこで、マウス味蕾を回収し、神経ペプチド受容体の発現を調べた。この結果、少なくともカルチトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)、およびアドレノメデュリン(AM)の受容体が発現していることを見出した。CGRPは甘味受容細胞を含む味蕾II型味細胞ではCGRP刺激によるCa応答や味神経への情報伝達に必要なATP分泌が生じないこと(Huang AY, Wu SY. 2015)が報告されている。一方で、AMは腸内皮細胞においてSGLT-1発現量の増加を生じる(Fernandez de Arcaya I et al. 2005)が、味覚受容機構へのAMの関与は現在に至るまで報告されていない。そこで、このAMに注目し、野生型マウスに静脈内投与後、鼓索神経応答に変化が生じるかを調べた。その結果、単糖や蔗糖で応答の増大が認められた。人工甘味料や他の味質では応答の変化は認められず、同様の結果は甘味受容体構成分子T1R3の遺伝子欠損マウスでも得られた。さらにこれらの効果は、AM受容体阻害薬AM22-52前処理により消失することが分かった。現時点までの結果から、CAPによる甘味応答の増強作用に、AMが関与していることが示唆された。神経ペプチド受容体のマウス味蕾での発現を調べるため、茸状乳頭、および有郭乳頭を回収し、RT-PCRを行なった。その結果、CGRP受容体構成分子であるreceptor activity-modifying protein (RAMP)1、AM受容体構成分子RAMP2、そして両受容体に共通する分子であるcalcitonin receptor-like receptor (CRLR)が発現していることが明らかになった。次に、野生型マウスにAMを静脈内投与し、鼓索神経応答解析を行った結果、単糖および蔗糖で味神経応答の増大が認められた。この効果は、同様に甘味物質である人工甘味料SC45647や、他の味質[塩味; NaCl(アミロライド依存性)、KCl(アミロライド非依存性)、苦味;キニーネ塩酸塩、酸味;HCl、うま味;グルタミン酸カリウム(MPG)]では認められなかった。これらの効果は、AM受容体阻害薬AM22-52の事前投与により消失した。以上の結果から、AMによる甘味応答の増強作用は、単糖や蔗糖を含む糖類から人工甘味料まで広く受容するT1R依存性甘味受容経路ではなく、人工甘味料を細胞内に取り込むことができない糖輸送体によるT1R非依存性の甘味受容経路を介して生じていることが予想された。甘味受容体構成分子T1R3遺伝子欠損マウスにAM投与を行った結果、単糖、蔗糖で増強が認められた。この効果は、野生型マウス同様、AM22-52により消失した。併せて考えると、AMによる甘味応答の増強作用は、T1R非依存性の甘味受容経路を介して生じていることが示唆された。先述したように、AMによる甘味応答の増強は糖輸送体を介して生じていることが予想された。当研究室では、糖に10mM NaClを混合することにより、甘味受容細胞での発現が報告されているSGLT-1を介した甘味応答の増強が生じることを見出している(未発表)。そこで、野生型マウス、およびT1R3遺伝子欠損マウスを用い、糖+10mM NaCl混合溶液に対する、AM投与による影響を調べる。応答に変化が認められた場合は、AM22-52、さらにSGLT-1の阻害薬であるフロリジン処理が応答の変化に与える影響を検証する。さらに、各種緑色蛍光蛋白質遺伝子導入マウス(GFPマウス)[Ggustducin-GFP;TRPM5-GFP(II型味細胞:甘・苦・うま味受容細胞マーカー)、T1R3-GFP(甘・うま味受容細胞マーカー)、GAD67-GFP(III型味細胞:酸味受容細胞マーカー)]を用い、TRPV-1や神経ペプチド受容体の各種味細胞における発現様式を調べる。また、GFP発現細胞を指標に各種味細胞を回収し、single cell RT-PCR法を用い神経ペプチド受容体の発現を検索する。同時に、AM投与により、SGLT-1発現量に変化が生じるかqRT-PCRを用いて検証する。実際に甘味受容細胞で糖取り込み量の変化が生じるかに関しては、蛍光標識グルコース2-NBDGを用いることにより、AM投与による蛍光強度の変化を調べる。増大が認められた場合は、さらにフロリジン処理による影響を検証する。また、同様の手法を用い、CGRPによる味応答への影響に関しても調べる。