hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
CLIC4チャネルによる核内クロライド濃度変化を介した細胞増殖メカニズムの解明

胃ガン由来細胞株であるMKN28細胞を低Cl-濃度培地で培養を行ったところ、細胞周期のG1期からS期への進行が抑制されることが明らかとなった。また低Cl-処理は、mitogen-activated protein kinase (MAPK)の活性化を誘発することで、細胞周期のG1期からS期の進行を抑制するp21タンパクの発現を亢進することが明らかになった。MAPKを介した転写制御は核内で起こることや、p21などの細胞周期調節タンパク質は細胞の核内で機能していることから、細胞質内のCl-濃度変化が核膜に存在するCl-チャネル(CLIC4)を介し核内のCl-濃度に対しても大きく影響を与え、その結果核内の細胞周期調節タンパクの活性に影響を与えているものと考えられた。これまでの我々の研究結果より,細胞質内のCl^-濃度変化によって細胞周期が調節されていることが明らかになったが,その調節メカニズムの詳細は明らかになっていない。細胞周期調節タンパク質は細胞の核内で機能していることから,細胞質内のCl^-濃度変化が核内のCl^-濃度に対しても大きく影響を与え,その結果核内の細胞周期調節タンパクの活性に影響を与えているものと考えることができる。そこで本研究では,細胞内Cl^-濃度変化が核内の細胞周期調節タンパクに与える影響と,核膜に存在するCl^-チャネル(CLIC4)による細胞周期調節メカニズムの解明を目的とした。胃ガン由来細胞株であるMKN28細胞を低Cl^-濃度培地で培養を行ったところ,有意な細胞増殖の抑制が認められた。また,同条件で細胞周期の解析を行ったところ,G_0/G1期細胞の割合が増加していた。以上のことから,MKN28細胞では低クロライド環境下においてG_1期からS期への進行が抑制(G_1/Sarrest)されることが明らかとなった。低クロライド環境が細胞周期関連タンパクに与える影響について調べたところ,CDK inhibitorであるp21の発現が有意に増加していた。また,p21の発現増大にはextracellular signal-regulated kinase(ERK)の活性化が必用であることが明らかになった。ERKを介した転写制御は核内で起こることが明らかにされており,Cl^-が核内におけるERKの活性調節に重要な働きをしている可能性が強く示唆された。これまでの我々の研究結果より、細胞質内のC1-濃度変化によって細胞周期が調節されていることが明らかになった。胃ガン由来細胞株であるMKN28細胞を低Cl-濃度培地で培養を行ったところ、有意な細胞増殖の抑制が認められた。また、同条件で細胞周期の解析を行ったところ、GO/G1期細胞の割合が増加していた。以上のことから、MKN28細胞では、低クロライド環境下においてG1期からS期への進行が抑制(G1/S arrest)されることが明らかとなった。そこで、細胞周期進行に対するCl-の影響をさらに詳しく検討するため、MKN28細胞の細胞周期を同調させ、各細胞周期ステージの進行に対するC1一の影響について検討を行った。各細胞周期ステージに同調させたMKN28細胞に低Cr処理を行ったところ、G1期からS期への進行が著しい遅延を受けたが、その他の細胞周期ステージの進行には有意な影響は認められなかった。また低C1^-処理は、mitogen-activated protein kinase(MAPK)の活性化を誘発することで、細胞周期のG1期からS期の進行を抑制するp21タンパクの発現を亢進することが明らかになった。MAPKを介した転写制御は核内で起こることや、p21などの細胞周期調節タンパク質は細胞の核内で機能していることから、細胞質内のC1-濃度変化が核膜に存在するC1^-チャネル(CLIC4)を介し核内のC1^-濃度に対しても大きく影響を与え、その結果核内の細胞周期調節タンパクの活性に影響を与えているものと考えられた。
大型スパレ-ションパルス中性子源を用いた中性子散乱による物質の動的構造研究

本研究は「連合王国科学工学会議(SERC)及び日本高エネルギ-物理学研究所(KEK)間のSERCラザフォ-ド・アプルトン研究所(RAL)スポレ-ション中性子源(ISIS)を用いた中性子散乱研究に関する協定」(1986年12月締結)に基づく研究を実施することを目的としている。この協定に基づき、我々は我が国の予算により高性能チョッパ-型中性子分光器′′MARI′′をISISに設置し、これまでの原子炉中性子では達成できなかった新しい中性子散乱研究の開拓を目指した。具体的には、ISISより得られる非常にパルス幅の短い世界最大強度の熱外中性子ビ-ムを用いてはじめて可能となる凝集体の高エネルギ-励起及び液体・非晶体の動的構造の測定を2つの研究の柱とした。まず研究の第一段階として、RALの研究者の多大の協力を得てMARIの建設が行なわれた。建設は1986年に開始、本研究の第1年次である1989年度に完成。第2年次よりオンビ-ムコミッショニングに入り、世界最高性能を確認した。つづいて予備実験に入り、最終年次には本格的に中性子散乱研究を実施、初期の目的を達成できた。総ての実験は、我が国の中性子研究者より広く公募または英国の研究者と共同で申請し、我が国及びSERCでの課題採択委員会で採択されたものについてのみ実施された。次に研究成果について述べる。凝集体の高エネルギ-励起の代表例として金属水素化物中の水素原子の非調和ポテンシャル及び波動関数の研究(S.Ikeda他)がある。ZrH_2及びNbH_<0.3>について水素局在モ-ドを励起エネルギ-数百meVまで種々の散乱角で測定し、散乱強度の運動量変化依存性を求め、これをモデル計算と比較することにより、これまで考えられて来たNbH_<0.3>の非調後ポテンシャルモデルを検証した。第3年次には代表的な強誘電体KDPの相転移に重要な係りを持つ水素結合を狙う水素原子について同様の研究がなされ、非常に重要な結果が得られた。高エネルギ-磁気励起については非常に多くの研究がなされた。まず希土類元素を含む化物合には“重い電子系"あるいは濃厚近藤物質と呼ばれるものがあり、その磁性についてはあまり明らかでない。これらの物質の結晶場分裂スペクトルの観測は、その磁性の基本的理解の重要な手がかりを与えるため、CeSi_x系及びYbN系等について測定がなされ、新しい知見が得られた(M.Kohgi他)。低次元磁性の研究は磁性の基礎的な理解を深めるうえで重要で、その高エネルギ-磁気励起の実測が持たれていた。先ず一次元反強磁性体KFeS_2単結晶の測定がなされ、励起エネルギ-2百数十meVまでのスピン波の分散関係かはじめて観測された。次に準2次元反強磁性体としてLa_2NiO_4(スピンS=1)及びLa_2CuO_4(S=1/2)の単結晶試料について高エネルギ-磁気励起が調べられた。前者では約130meVまでスピン波が存在することがはじめて確認され、その磁気相互作用についての理解が深まった。後者は第一世代の高温超伝導体の親物質で、高エネルギ-磁気励起が超伝導機構に深い係りをもつと考えられ、その測定が持たれていたが、散乱強度はスピンの大きさから予想されるより遥かに小さく、そのことが超伝導機構に関係があるのではないかとも考えられつつある。これまで得意でないとされて来たチョッパ-型分光器による単結晶試料の磁気励起の測定が、低次元磁性体の場合には極めて効率よく行なえることがわかり、今後のこの方面の研究の進展が期待される。液体・非晶体の構造研究は通常の中性子回折では一次元的デ-タしか得られず、短距離構造しか決定できない。中性子非弾性散乱により動的構造が求まると、その三次元的運動の解析より三次元構造に関する知見が得られ、これらの物質系を理解するうえで極めて重要な中距離構造が明かとなる。基本的なガラスであるSiO_2について詳細な動的構造S(Q,ω)が観測され、三次元構造が明かとなりつつある(M.Arai他)。同様の研究が金属・非金属系ガラスPd_<0.8>Si_<0.2>及びPd_<0.8>Ge_<0.2>についてなされ、動的構造について重要な見知が得られつつある。そのほかにも重要な研究があるが添付の発表論文を参照されたい。

まず研究の第一段階として、RALの研究者の多大の協力を得てMARIの建設が行なわれた。建設は1986年に開始、本研究の第1年次である1989年度に完成。第2年次よりオンビ-ムコミッショニングに入り、世界最高性能を確認した。つづいて予備実験に入り、最終年次には本格的に中性子散乱研究を実施、初期の目的を達成できた。総ての実験は、我が国の中性子研究者より広く公募または英国の研究者と共同で申請し、我が国及びSERCでの課題採択委員会で採択されたものについてのみ実施された。次に研究成果について述べる。凝集体の高エネルギ-励起の代表例として金属水素化物中の水素原子の非調和ポテンシャル及び波動関数の研究(S.Ikeda他)がある。ZrH_2及びNbH_<0.3>について水素局在モ-ドを励起エネルギ-数百meVまで種々の散乱角で測定し、散乱強度の運動量変化依存性を求め、これをモデル計算と比較することにより、これまで考えられて来たNbH_<0.3>の非調後ポテンシャルモデルを検証した。第3年次には代表的な強誘電体KDPの相転移に重要な係りを持つ水素結合を狙う水素原子について同様の研究がなされ、非常に重要な結果が得られた。高エネルギ-磁気励起については非常に多くの研究がなされた。まず希土類元素を含む化物合には“重い電子系"あるいは濃厚近藤物質と呼ばれるものがあり、その磁性についてはあまり明らかでない。これらの物質の結晶場分裂スペクトルの観測は、その磁性の基本的理解の重要な手がかりを与えるため、CeSi_x系及びYbN系等について測定がなされ、新しい知見が得られた(M.Kohgi他)。低次元磁性の研究は磁性の基礎的な理解を深めるうえで重要で、その高エネルギ-磁気励起の実測が持たれていた。先ず一次元反強磁性体KFeS_2単結晶の測定がなされ、励起エネルギ-2百数十meVまでのスピン波の分散関係かはじめて観測された。次に準2次元反強磁性体としてLa_2NiO_4(スピンS=1)及びLa_2CuO_4(S=1/2)の単結晶試料について高エネルギ-磁気励起が調べられた。前者では約130meVまでスピン波が存在することがはじめて確認され、その磁気相互作用についての理解が深まった。後者は第一世代の高温超伝導体の親物質で、高エネルギ-磁気励起が超伝導機構に深い係りをもつと考えられ、その測定が持たれていたが、散乱強度はスピンの大きさから予想されるより遥かに小さく、そのことが超伝導機構に関係があるのではないかとも考えられつつある。これまで得意でないとされて来たチョッパ-型分光器による単結晶試料の磁気励起の測定が、低次元磁性体の場合には極めて効率よく行なえることがわかり、今後のこの方面の研究の進展が期待される。液体・非晶体の構造研究は通常の中性子回折では一次元的デ-タしか得られず、短距離構造しか決定できない。中性子非弾性散乱により動的構造が求まると、その三次元的運動の解析より三次元構造に関する知見が得られ、これらの物質系を理解するうえで極めて重要な中距離構造が明かとなる。基本的なガラスであるSiO_2について詳細な動的構造S(Q,ω)が観測され、三次元構造が明かとなりつつある(M.Arai他)。同様の研究が金属・非金属系ガラスPd_<0.8>Si_<0.2>及びPd_<0.8>Ge_<0.2>についてなされ、動的構造について重要な見知が得られつつある。そのほかにも重要な研究があるが添付の発表論文を参照されたい。
不整脈源性右室心筋症における疾患感受性デスモゾーム多型の機能解析手法の確立

本研究課題初年度(2018年度)は、準備段階で得たデータの再現と、後述の安定発現細胞取得(および学内の遺伝子組み換え実験申請手続き)に多くの時間を割いた。また、2018年7月より研究留学のため渡米し実験を継続し、2019年5月までの期間中、本課題の今後の推進に関わる主要な技術を習得した。本研究の成果発表は、セミナーでの発表などを含めて、現時点では達成出来ていない。目的1-[1]マウスDsg2によって維持される細胞接着性を検証する、[2] Dsg2多型D494A発現細胞では細胞間分布密度が減少している、[3] Dsg2安定発現細胞を用いた、細胞間接着密度と強度の定量評価。Dsg2非発現細胞(非ヒト細胞)に異種強制発現させた場合、変異型デスモグレイン2(以下Dsg2)を介する細胞間接着の緊密性が乏しいことを示した。目的1-[3]について、デスモグレイン2蛋白の安定発現細胞株の取得に時間を要している。従来のトランスフェクション-選択抗生剤を用いる手法ではチャイニーズハムスター卵巣細胞での安定発現は得られなかったため、ウイルス感染を介した安定発現株取得を目指し、学内の遺伝子組み換え実験の申請手続きを行った(2018年4月-6月)。目的2[4] Fc-Dsg2分子を用いたDsg2の細胞間接着機能スクリーニング未着手である。目的3[5] Dsg2と相互作用しうる候補蛋白の同定と機能解析Dsg2と相補的に結合しうる未知の蛋白の検出は、マウス心筋サンプル内に存在すると想定し、大腸菌体内で作成したGST融合型Dsg2をbait(餌)にしてpull downし、TOF-MSを複数回行ったが、質量分析過程でノイズ値が高く、候補蛋白の絞り込みは出来なかった(原因と対策は次項で後述)。目的3[5] Dsg2と相互作用しうる候補蛋白の同定と機能解析十分量のマウス心筋サンプルを用いたにも関わらず、Dsg2と相補的に結合しうる未知の蛋白が検出されない原因として、1Dsg2が何ものとも協同していない、2協同しているが、結合の達成に糖鎖が関与しているために、大腸菌体内で作成したGST融合型Dsg2とは結合できない、可能性を考えた。2は、ヒト由来培養細胞を用いて分泌型蛋白を回収し、糖鎖を保存して蛋白を大量精製することで達成可能性がある。申請者は、2018年7月より研究留学のため渡米することとなった。留学先研究室(以下、現研究室)では、遺伝性不整脈の感受性遺伝子多型の機能解析を、主にヒト細胞(培養ヒト細胞および人工多能性幹細胞)を用いて継続している。現研究室で、本課題実現上の問題点であった安定発現株取得に関して、遺伝子改変型ヒト細胞を用いた安定発現株取得を短期間で行う技術を習得した。また、現研究室でCRISPR/Cas9システムを用いた遺伝子ノックイン/ノックアウト技術を習得した。帰国後、すでに日本で保有しているヒト上皮系細胞の内因性DSG2をノックアウトし、そこにDSG2を安定発現させて細胞間接着距離を計測することが可能となる。本来シート状に生育するヒト上皮系細胞を用いることで、細胞あたり、単位面積あたりの細胞間接着インシデントが高くなることが期待でき、より細胞間接着能評価に信憑性を持たせることができる。2019年7月1日以降、現研究室での雇用形態の変更に伴い、日本での課題の遂行が困難となった(現研究室の研究のエフォートを100%とする必要が生じた)ため、同日をもって研究中断承認申請を行い、一旦本課題の実験を休止し、留学予定期間満了後帰国してから、上記の技術をもって、実験を再開する予定である。

目的3[5] Dsg2と相互作用しうる候補蛋白の同定と機能解析Dsg2と相補的に結合しうる未知の蛋白の検出は、マウス心筋サンプル内に存在すると想定し、大腸菌体内で作成したGST融合型Dsg2をbait(餌)にしてpull downし、TOF-MSを複数回行ったが、質量分析過程でノイズ値が高く、候補蛋白の絞り込みは出来なかった(原因と対策は次項で後述)。目的3[5] Dsg2と相互作用しうる候補蛋白の同定と機能解析十分量のマウス心筋サンプルを用いたにも関わらず、Dsg2と相補的に結合しうる未知の蛋白が検出されない原因として、1Dsg2が何ものとも協同していない、2協同しているが、結合の達成に糖鎖が関与しているために、大腸菌体内で作成したGST融合型Dsg2とは結合できない、可能性を考えた。2は、ヒト由来培養細胞を用いて分泌型蛋白を回収し、糖鎖を保存して蛋白を大量精製することで達成可能性がある。申請者は、2018年7月より研究留学のため渡米することとなった。留学先研究室(以下、現研究室)では、遺伝性不整脈の感受性遺伝子多型の機能解析を、主にヒト細胞(培養ヒト細胞および人工多能性幹細胞)を用いて継続している。現研究室で、本課題実現上の問題点であった安定発現株取得に関して、遺伝子改変型ヒト細胞を用いた安定発現株取得を短期間で行う技術を習得した。また、現研究室でCRISPR/Cas9システムを用いた遺伝子ノックイン/ノックアウト技術を習得した。帰国後、すでに日本で保有しているヒト上皮系細胞の内因性DSG2をノックアウトし、そこにDSG2を安定発現させて細胞間接着距離を計測することが可能となる。本来シート状に生育するヒト上皮系細胞を用いることで、細胞あたり、単位面積あたりの細胞間接着インシデントが高くなることが期待でき、より細胞間接着能評価に信憑性を持たせることができる。2019年7月1日以降、現研究室での雇用形態の変更に伴い、日本での課題の遂行が困難となった(現研究室の研究のエフォートを100%とする必要が生じた)ため、同日をもって研究中断承認申請を行い、一旦本課題の実験を休止し、留学予定期間満了後帰国してから、上記の技術をもって、実験を再開する予定である。課題の遂行に遅延が生じたため、未使用額が生じた。
風の海面摩擦係数に及ぼすうねりの影響

うねりの方向別に構築したデータセットを風の海面摩擦係数と風波レイノルズ数の関係図にプロットした結果、これまでの既往研究では、うねりの影響の詳細を見ることが出来なかったが、本研究によってうねりの影響による風の海面摩擦係数の変動の以下の知見が得られた.(1)高風速ではうねりの影響は見られない.(2)交差するうねりの場合は方向差が大きいときに大きく変動する.(3)同一方向のうねりの場合の影響は見られない.うねりの方向別に構築したデータセットを風の海面摩擦係数と風波レイノルズ数の関係図にプロットした結果、これまでの既往研究では、うねりの影響の詳細を見ることが出来なかったが、本研究によってうねりの影響による風の海面摩擦係数の変動の以下の知見が得られた.(1)高風速ではうねりの影響は見られない.(2)交差するうねりの場合は方向差が大きいときに大きく変動する.(3)同一方向のうねりの場合の影響は見られない.本年度は、現場海洋において風波と共存する種々のうねりの方向スペクトルを含む風の海面摩擦係数データの収集を行い、風波に対していろいろな方向から来るうねりのパターンのデータセットの構築を行った。1.データの収集平塚沖約1kmの所に位置している独立行政法人防災科学技術研究所平塚実験場所有の観測塔における2000年10月と2001年2月の6日間分のデータ、田辺湾にある京都大学防災研究所白浜海象観測所所有の田辺中島高潮海洋観測塔における2003年7月から2007年11月までのデータの収集を行った。また、データ量を増やすことを考え、波の方向の算出を行うために、波浪予報モデルと計算用PCの環境のセットアップを行った。2.データの選別上記の収集した観測データについて風の海面摩擦係数及び方向スペクトルを算出し、風波に対するうねりの方向毎に同一・逆・横方向の3パターンのデータセットを構築した。本研究において波の方向スペクトルを含むデータを収集し、うねりの方向別に構築したデータセットを風の海面摩擦係数と風波レイノルズ数の関係図にプロットした結果、これまでの既往研究では、プロットが大きく変動しているだけであり、うねりの影響の詳細を見ることが出来なかったが、風波に対して逆方向のうねりがある場合に風波レイノルズ数の増加に対して風の海面摩擦係数が急激に増加する傾向が明らかに示された。本年度は、まず昨年度と同様に風波と共存する種々のうねりの方向スペクトルを含む海面フラックスデータ収集とうねりのパターンのデータセットの構築を行った。そして構築したデータセットを用いて風の海面摩擦係数の変動の調査を行った。1.データの収集およびデータセットの構築昨年度と同様に田辺湾にある京都大学防災研究所白浜海象観測所所有の田辺中島高潮海洋観測塔でデータの収集を行った。そして風の海面摩擦係数及び方向スペクトルを算出し、風波に対するうねりの方向毎に同一・逆・横方向の3パターンのデータセットを構築した。2.風の海面摩擦係数の変動の調査うねりの方向別に構築したデータセットを風の海面摩擦係数と風波レイノルズ数の関係図にプロットした結果、これまでの既往研究では、うねりの影響の詳細を見ることが出来なかったが、本研究によってうねりの影響による風の海面摩擦係数の変動の知見が得られた。(1)風・風波に相対的にさまざまな方向を持つうねり、特に、逆行・交差・多方向のうねりが存在する場合が、風の海面摩擦係数に大きな影響を及ぼすことが示された。(2)風波に対するうねりの方向によって、変動が異なっていることが示された。(3)高風速域では、うねりの影響は見られなかった。また、風の海面摩擦係数を表すパラメータとして他のパラメータ共に風波レイノルズ数を用いることの有効性が示された。
新規気管支喘息治療薬開発に向けた気管支平滑筋過敏性発現メカニズムの解明

喘息患者では、気道がわずかな刺激でも過剰に収縮して発作を引き起こす。この過剰な収縮が引き起こされるメカニズムについては不明な点が多く、したがって喘息を根治する薬物の開発には至っていない。本研究では、気道収縮をつかさどる細胞である気管支平滑筋細胞に焦点を当てて検討を行い、喘息時にはこの気管支平滑筋細胞の種々の遺伝子発現がダイナミックに変化しており、その結果過剰な収縮がもたらされる可能性を示した。平成23年度に行った網羅的解析の結果同定されたmiRNAの一つmiR-140について、気管支平滑筋細胞における機能解析を行うとともに、アレルギー性気管支喘息時の気道過敏性発現との関連性について検討を行った。バイオインフォマティック解析の結果、miR-140-3pのターゲット遺伝子の一つとしてCD38の可能性が強く示唆された。CD38は、細胞内カルシウム動態に寄与するcADPRの合成酵素として知られており、喘息時の気管支平滑筋におけるmiR-140-3p発現低下によりCD38 up-regulationが惹起され、これが気道過敏性発現の一因となっている可能性が考えられる。事実、抗原誘発気管支喘息モデルマウスの気管支平滑筋組織において、CD38発現の著明かつ有意な増加が認められた。miR-140-3pのantagomirをトランスフェクションした培養ヒト気管支平滑筋細胞において、CD38タンパク質発現の有意な増加が認められた。また、IL-13処置した培養ヒト気管支平滑筋細胞において、miR-140-3p発現の低下およびCD38タンパク質発現の増加が認められ、人工合成miR-140-3pをトランスフェクションした細胞においてこのIL-13誘発CD38タンパク質up-regulationが有意に抑制された。以上の結果より、気管支平滑筋細胞においてmiR-140-3pがCD38タンパク質発現を抑制的に制御しており、喘息時にはmiR-140-3p発現低下によりCD38タンパク質up-regulationが引き起こされ、これが気道過敏性発現に関与している可能性を示唆した。平成23年度に行った網羅的解析の結果同定されたmiRNAの一つmiR-140-5pについて、気管支平滑筋細胞における発現解析を行うとともに、アレルギー性気管支喘息時の気道過敏性発現との関連性について検討を行った。バイオインフォマティック解析の結果、miR-140-5pのターゲット遺伝子の一つとしてToll-like receptor 4 (TLR4)の可能性が強く示唆された。TLR4はリポ多糖(LPS)の受容体として知られており、喘息時の気管支平滑筋におけるmiR-140-5p発現低下によりTLR4 up-regulationが惹起され、これが気道過敏性発現の一因となっている可能性が考えられる。事実、抗原誘発気管支喘息モデルマウスの気管支平滑筋組織において、TLR4タンパク質発現の著明かつ有意な増加が認められた。この時、TLR4 mRNA発現レベルには変化が認められず、マウス気管支平滑筋細胞においてはmiR-140-5pがTLR4発現を直接制御している可能性が示唆された。次に培養ヒト気管支平滑筋細胞(hBSMCs)を用いて検討を行ったところ、IL-13処置によりmiR-140-5p発現の低下およびTLR4タンパク質発現の増加が認められた。しかしながら、人工合成miR-140-5pあるいはmiR-140-5pinhibitorをトランスフェクションしてもTLR4タンパク質発現レベルに変化は認められず、一方、IL-13処置したhBSMCsにおいてTLR4 mRNA発現増加が認められた。したがって、ヒト気管支平滑筋細胞においてはIL-13がTLR4の転写レベルでの変化をもたらす可能性が示唆された。以上の結果より、喘息時の気管支平滑筋細胞においてTLR4発現が増加しており、気道過敏性発現に関与している可能性が示唆された。さらに、このTLR4 up-regulationのメカニズムに種差が存在する可能性が示唆された。マイクロRNA (miRNA)は、ターゲットとなる遺伝子のメッセンジャーRNA (mRNA)の3'非翻訳領域に相補的に結合して、翻訳を阻害することによりタンパク質発現を抑制的に制御しており、さまざまな生理機能、病態形成に関与していることが示唆されてきている。すなわち、過敏性気管支平滑筋においてある種のmiRNAの機能が低下し、その結果RhoAタンパク質発現が増加して気管支平滑筋細胞の過剰な収縮反応が惹起され、これが喘息患者に認められる気道過敏性の発現に関与している可能性が考えられる。そこで、過敏性気管支平滑筋において発現変化しているmiRNAsについて網羅的に調査した。まず、研究代表者が開発した従来の方法を用いて、抗原感作および抗原反復吸入チャレンジを施すことによりアレルギー性気管支喘息モデルマウスを作製し、その左主気管支平滑筋組織よりtotal RNAを抽出した。一方、研究代表者のこれまでの研究成果において培養ヒト気管支平滑筋細胞(hBSMCs)にinterleukin-13 (IL-13)を処置することによりRhoAタンパク質発現が増加することを示しているが、このIL-13処置したhBSMCsより同様にtotal RNAを抽出した。これらtotal

RNAサンプルについて、miRNAマイクロアレイ解析を行ったところ、miRNA-31 (miR-31)、miR-133、miR-140など、十数種類のmiRNAが増加あるいは減少していた。これらマイクロアレイ解析で変化が認められたmiRNAについて、リアルタイムPCR法を用いてその発現変化を確認するとともに、データベースを用いたバイオインフォマティクス解析を行い、気道過敏性発現に関与するmiRNAの候補の一つとしてmiR-140を同定した。交付申請書に記載した研究実施計画の通り、ほぼ当初の計画通り順調に進展している。miRNAは、ある特定の遺伝子のみではなく多種の遺伝子の機能を制御していることが知られている。事実、バイオインフォマティック解析の結果、miR-140-3pのターゲット遺伝子の一つとしてRhoAの可能性も示唆された。平成25年度では、このmiR-140-3pとRhoAの関連性について検討するとともに、平成23年度のmiRNA網羅的解析の結果を受けて、miR-140-3p以外のmiRNAsについても喘息時の気道過敏性発現との関連性について検討して行く予定である。平成23年度に行った網羅的解析の結果同定されたmiR-140について、気管支平滑筋細胞における機能解析を行うとともに、アレルギー性気管支喘息時の気道過敏性発現との関連性について検討を進めていく。すなわち、人工合成miR-140あるいはinhibitorとしてmiR-140に対するantagomirを薬理学的ツールとして用い、培養ヒト気管支平滑筋細胞におけるRhoAタンパク質発現、あるいはその他の収縮関連タンパク質の発現に対する効果を観察する。さらに、IL-13やIL-17などのサイトカインを用いてmiR-140発現を低下させる条件を見出し、この条件をマウス摘出気管支平滑筋組織に適用してその収縮反応に及ぼす効果を観察し、気道過敏性発現との関連性について検討を行う。該当なし平成24年度に請求する研究費のうち直接経費は、研究計画の遂行に必要な試薬、キット、実験動物などの物品費(消耗品費)にすべて充当する予定である。なお、平成23年度に交付された助成金について預貯金利息(77円)が生じ、その一部(62円)は平成24年度に請求する研究費と合わせて使用する。
基礎医学研究のツールとしての幹細胞動員・増幅能をもつ体内インキュベータの開発

増殖・分化の能力が高い幹細胞を利用した細胞移植治療や再生医療が期待されている。本研究では、この分野の基礎研究を加速するための新しい実験手法として、幹細胞を体内で集めて増殖させるための材料に関する基礎研究を行った。具体的には、幹細胞を集めるためのタンパク質を効率よく作用させるための徐放化技術、ならびに、集めた幹細胞を効率よく増殖させるための、タンパク質を配向固定化したバイオマテリアルを開発した。本研究では、幹細胞の体内動態を制御する因子を固定化した、幹細胞の動員・増幅能をもつ生体材料からなる"体内インキュベータ"を創製することである。平成21年度は、ゼラチン、アルギン酸、ヒアルロン酸などからなるスポンジ状の多孔質材料を作製後、フィブロネクチンなどの細胞接着分子や細胞増殖因子を固定化するためのヘパリンの固定化を行い、細胞接着性や細胞増殖因子の徐放性について検討した。アルギン酸を用いて多孔質材料を作製した場合、1週間以上にわたって細胞を材料内で維持できることがわかった。一方、細胞増殖因子の徐放性生については、in vitroならびにin vivoいずれの場合も2週間以上にわたって徐放化できることを明らかにした。また、徐放化された細胞増殖因子の生物活性について、創傷治癒モデルを用いて評価したところ、生物活性が維持されていることがわかった。幹細胞の動員を確認する方法として、蛍光標識した細胞を用いて、多孔質材料内の細胞を観察可能かどうかについて、共焦点レーザー顕微鏡を用いて評価した。その結果、配向ボア構造をもつ多孔質材料と蛍光標識細胞とを組み合わせることにより、材料内における細胞の挙動を観察できることを明らかにした。一方、核酸アプタマーを作製するために、細胞接着分子であるフィブロネクチン、ラミニンあるいは細胞増殖因子の一つである幹細胞増殖因子について、RT-PCR法による遺伝子クローニングを行い、大腸菌でタンパク質の発現を確認した。現在、得られたタンパク質を精製し、核酸アプタマーの作製を行っている。平成21年度に引き続き、核酸アプタマーを作製するために、細胞接着分子であるフィブロネクチン、ラミニンあるいは細胞増殖因子の一つである幹細胞増殖因子について、RT-PCR法による遺伝子クローニングを行い、大腸菌でタンパク質の発現を確認した。一方、近年、幹細胞の増殖・分化が材料の軟らかさで変化することが明らかにされつつある。そこで、平成22年度は、幹細胞の多孔質材料として、刺激に応答して軟らかさなどの物性が変化する生体材料に関する研究を行った。糖応答性をもつフェニルボロン酸残基を導入したゼラチンハイドロゲル、あるいは間葉系幹細胞の骨分化にともなって発現するアルカリ性フォスファターゼの酵素刺激に応答するリン酸基を導入したハイドロゲルを設計し、刺激応答性、ならびに軟らかさを評価した。さらに、得られた刺激応答性ハイドロゲル表面に幹細胞の分化を制御するEphrinB2などのタンパク質を固定化し、骨髄間葉系幹細胞の接着と増殖について評価した。平成23年度は、この刺激応答性ハイドロゲルをベースに幹細胞の増殖・分化を制御し、体内インキュベータの培養基材として検討を行う。近年、幹細胞の増殖・分化が材料の軟らかさで変化することが明らかにされつつある。平成23年度では、昨年度に引き続き、幹細胞の多孔質材料として、刺激に応答して軟らかさなどの物性が変化する生体材料に関する研究を行った。まず、昨年度、分子設計を行った糖応答性をもつフェニルボロン酸残基を導入したゼラチンハイドロゲルでは、ハイドロゲルに細胞の増殖・分化を制御する細胞増殖因子を包含させたところ、糖添加に応答して任意のタイミングで細胞増殖因子を放出することに成功した。一方、間葉系幹細胞の骨分化にともなって発現するアルカリ性フォスファターゼの酵素刺激に応答するリン酸基を導入したハイドロゲルを作製したところ、アルカリ性フォスファターゼによりハイドロゲルが軟らかくなり、骨分化がより効率よく誘導されることがわかった。これは、細胞の増殖と分化とでは、最適なハイドロゲルの硬さが異なるため、硬さを変化させることができる生体材料が有用であることを示唆している。さらに、得られた刺激応答性ハイドロゲル表面に幹細胞の分化を制御するEphrinB2などのタンパク質を配向固定化し、骨髄間葉系幹細胞の接着と増殖について評価したところ、EphrinB2を配向固定化することにより、通常の化学固定と比較して、より高い生物活性を示し、骨髄間葉系幹細胞の接着形態が変化することがわかった。以上のように、本研究期間を通じて、体内インキュベータのkeyとなる、生体材料と幹細胞との相互作用を、細胞増殖因子の放出制御ならびに生体材料の硬さの二つの方法で制御する技術を開発することができた。
アルコール慢性摂取が動脈硬化の進展に及ぼす影響の免疫分子生物学的解析

神戸大学医学部法医学教室における剖検例のうち、遺族の同意を得た剖検例から大動脈(腹部)及び冠状動脈(前下行枝)を採取した。生前にアルコール依存症と診断されていたか、日常生活歴等から常習アルコール多飲者と考えられる剖検例をアルコール多飲酒群(男6例、女2例の計8例。平均年齢59.6±8.98歳)とし、年齢その他の動脈硬化促進因子についてアルコール多飲酒群と条件が同様で、適量以下の飲酒者又は無飲酒者の剖検例を対照群(男4例、女5例の計9例。平均年齢66.0±10.7歳)として比較した。動脈硬化の程度を肉眼的に判定した。動脈をホルマリン固定後、パラフィン包埋組織切片を作成した。一般的組織染色の他、血管内皮におけるC型ナトリウム利尿ペプチド(C-type Natriuretic Peptide, CNP)と血管内皮増殖因子(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)を各々抗CNP抗体、抗VEGF抗体を用いて免疫染色し、多飲酒群と対照群との動脈壁内皮における染色性を比較した。結果(1)肉眼的及び一般組織染色では動脈硬化の程度は、冠状動脈では多飲酒群が対照群より軽度であるが、大動脈では両群間に差異はなかった。多飲酒群では大動脈に比べて冠状動脈の硬化が軽度となる傾向があった。(2)CNPの発現は、多飲酒群と対照群共に大動脈よりも冠状動脈で強く認められた。両群の大動脈内皮におけるCNPの発現に明らかな差異を認めなかったが、冠状動脈内皮は多飲酒群の方が強く染色された。従って多飲酒群で冠状動脈内皮におけるCNP発現の亢進が考えられた。(3)多飲酒群では、大動脈と冠状動脈のいずれもVEGF陽性細胞は対照群に比べて少なく、VEGFの発現が少ないと考えられた。即ち、アルコール多飲者の動脈硬化が軽度である事に、アルコールによるVEGF発現の抑制が関係する可能性が考えられた。1.神戸大学医学部法医学教室における剖検例のうち、遺族の同意を得た剖検例から大動脈(腹部)及び冠状動脈(前下行技)を採取した。生前にアルコール依存症と診断されていたか、日常生活歴等から常習的アルコール多飲者と考えらる剖検例をアルコール多飲酒群(男3例、女1例、計4例。平均年齢60.5±4.0歳)とし、年齢その他の動脈硬化促進因子についてアルコール多飲酒群と条件が同様であり、適量以下の飲酒者又は無飲酒者の剖検例を対照群(男3例、女4例、計7例。平均年齢66.7±11.2歳)として集めた。動脈をホルマリン固定後、常法に従いパラフィン包埋組織切片を作成した。新鮮凍結切片に対する染色条件に準じて、血管内皮におけるC型ナトリウム利尿ペプチド(C-type Natriuretic Peptide、CNP)を抗CNP抗体(Rabbit Anti-CN Peptide 22)を用いて免疫染色した。多飲酒群と対照群との動脈壁内皮における染色性を比較すると共に、パラフィン包埋切片に対する染色条件を検討した。2.(1)肉眼的には、冠状動脈では多飲酒群の方が対照群より動脈硬化の程度は低く、大動脈では両群間に差異はなかった。

(2)多飲酒群及び対照群の何れにおいても、大動脈及び冠状動脈の内皮が抗CNP抗体で強く染色され、CNP陽性であった。しかし、一部の内皮は染色されなかった。(3)多飲酒群においては、動脈硬化により内膜の肥厚のある部分における内皮の染色性は、大動脈では特に差異はなかった。一方、冠状動脈では肥厚部内皮の染色性がやや亢進し、内膜の線維層もやや強く染色される傾向が見られた。(4)多飲酒群と対照群とを比較すると、大動脈内皮におけるCNPの発現に明らかな差異は認められなかったが、冠状動脈内皮においては、多飲酒群の方が強く染色された。従って、多飲酒群の冠状動脈内皮におけるCNP発現の亢進が考えられた。前年度に引き続き、神戸大学医学部法医学教室における剖検例のうち、遺族の同意を得た剖検例から大動脈(腹部)及び冠状動脈(前下行枝)を採取した。生前にアルコール依存症と診断されていたか、日常生活歴等から常習的アルコール多飲者と考えられる剖検例をアルコール多飲酒群(男3例、女1例の計4例。平均年齢58.8±13.02歳)とし、年齢その他の動脈硬化促進因子についてアルコール多飲酒群と条件が同様で、適量以下の飲酒者又は無飲酒者の剖検例を対照群(男1例、女1例の計2例。平均年齢63.5±12.02歳)として集めた。動脈をホルマリン固定後、パラフィン包埋組織切片を作成した。一般的組織染色の他、血管内皮におけるC型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)と血管内皮増殖因子(VEGF)をそれぞれ抗CNP抗体、抗VEGF抗体を用いて免疫染色し、多飲酒群と対照群との動脈壁内皮における染色性を比較した。結果(1)肉眼的及び一般染色所見では、冠状動脈では多飲酒群の方が対照群より動脈硬化の程度は低く、一方、大動脈では両群間に差異は認められなかった。(2)両群共に、大動脈よりも冠状動脈でCNPの強い発現が認められた。多飲酒群と対照群の大動脈内皮におけるCNPの発現に明らかな差異は認められなかった。冠状動脈内皮は、多飲酒群の方が動脈硬化による肥厚部内皮の染色性が軽度亢進し、内膜繊維層もやや強く染色され、冠状動脈内皮におけるCNP発現の亢進が考えられた。(3)多飲酒群では、大動脈と冠状動脈のいずれにおいてもVEGF陽性細胞は対照群に比べて少なく、VEGFの発現が少ないと考えられた。即ち、アルコール多飲者の動脈硬化が軽度である事に、アルコールによるVEGF発現の抑制が関係する可能性が考えられた。
自然界への二酸化炭素,吸収能増大技術の評価と複合化

1.珪酸塩岩石の風化による二酸化炭素吸収(1)原理岩石の風化による二酸化炭素の吸収は、以下で示される。珪酸塩岩:CaSiO_3+2CO_2+H_2O→Ca^<2+>+2HCO_3^-+SiO_2(1)炭酸塩岩:CaCO_3+CO_2+H_2O→Ca^<2+>+2HCO_3^-(2)(2)速度論的実験方法二酸化炭素飽和水に粉末状岩石を加えた。恒温漕内で攪拌しながら、二酸化炭素を流した。一定時間後、一定量採取し、ICP-AES(京都光研製UOP-1 MKII)により主分元素の定量分析を行った。(3)結果窒素飽和水を用いた実験では終始陽イオンの溶出がみられない。二酸化炭素飽和水を用いた実験では、反応の初期の過程で多量の陽イオンの溶出がみられ、その後は安定した。仕込量、粒子径を変えた実験を行い、解平衡濃度近くあるいは全岩石が溶解するまで、表面積あたり(58)x10^<-4>mol/m^2h程度の一定速度で溶出した。溶出後の試料についても、表面積あたりの速度には違いがなく、生成物の溶解速度への影響は小さかった。(4)エネルギー評価olivineの場合、粉砕に要する電力を火力発電所からの二酸化炭素発生量に換算すると21mg-CO_2/g-mineralとなり、二酸化炭素の吸収量、1200mg-CO_2/g-mineralの2%程度であった。珪灰石の場合には30μmの粉砕では10%程度となった。理想的にはこの数分の1になると期待される。2.海洋施肥法による二酸化炭素吸収の可能性(1)輸送エネルギー一方散布、輸送に要するエネルギーは、港から500kmの場合に、100kmの半径に蒔いた場合でも二酸化炭素吸収量の0.4%程度と非常に小さい。(2)下水汚泥を栄養源とする場合肥料生産エネルギーは不要となるが、水分を含む。92.5%水分の汚泥の場合、吸収量の10%以上が輸送時に放出される。散布後の栄養塩の海洋での利用率は、本散布条件では約75%である。汚泥は脱窒によりPに比してNの含有量が小さく、P基準で同様の計算を行うと、効率は大幅に改善される。
青年期・成人期自閉症者の表情認知に関する基礎的研究

研究代表者は、自閉症の年長児・者を対象として、写真やイラストなどを用いて表情の認知能力に関する実験を行った(若松、1989)。しかしながら、本研究においては、写真カード等を用いた従来の方法と比べて、より精密で多様な刺激作成が可能なこと、厳密な実験統制が可能なこと、さらにはデータ収集の効率性などの理由から、パーソナルコンピュータによる刺激作成、刺激提示および反応の記録を行うことを計画した。また、その際には、カラースキャナを用いて刺激材料をパーソナルコンピュータに入力して実験刺激を作成したり、刺激提示や反応記録のためのソフトウェアを自作する予定であった。ところが、このソフトウェアの作成に、当初予想したよりもかなり多くの時間を要することが、研究を進めていくうちに次第に明らかとなり、結果的に期間内での本研究の実施は困難であった。しかし、本科学研究費補助金によって、コンピュータやスキャナなどのハードウェアは全て揃い、実験刺激作成の準備は整った。また、対象者の反応をコンピュータ内部に記録するための入力装置に関しても、ほぼ目処をつけることができた。さらには、研究を行う場所として予定している某精神薄弱者更正施設においては、研究協力の依頼に対する承諾は既に得られている。以上のような研究の進行状況から、近い将来には必ず、本研究の実施が可能となると考えられる。
薬物スクリーニングキットのための限外ろ過フィルタを用いた溶血液前処理法

○研究目的:血液を簡易薬物スクリーニングキット(アキュサイン等)に適用させる方法として限外ろ過フィルタ(アミコンウルトラ,ミリポア社製)を用いる方法を以前の研究で開発した。この方法の実用化に向け,本フィルタを用いたときの薬物の回収率などを検討する。○研究方法:ベンゾジアゼピン系睡眠薬の一つであるトリアゾラムを対象薬物としてウマ溶血液に添加し,本フィルタで処理後有機溶媒で抽出し,ガスクロマトグラフ質量分析装置(GC/MS)で測定,定量する。また,フィルタろ過後のろ液の量を測定する。フィルタろ過後のろ液をアキュサインに滴下し,検出下限を求める。○研究成果:トリアゾラムを添加した水溶液をアミコンウルトラでろ過し,抽出後GC/MSで分析したところ,フィルタへの吸着が認められた。そのため,膜の材質が異なるフィルタを用意し,吸着率が変化するか検討を行った。6種類のフィルタを用いて比較した結果,ビバスピン2(分画分子量30,000,膜材質Hydrosart〓,ザ〓トリウス社製)が最も回収率が良好であった。トリアゾラムを添加したウマ溶血液をビバスピン2でフィルタろ過し,分析したところ,トリアゾラム量は水溶液の場合の1割程度であった。これはトリアゾラムの血漿蛋白結合率が9割程度であることに起因している。一方,ウマ溶血液をビバスピン2でろ過したときのフィルタ透過率は3040%であった。このことから,ろ液中のトリアゾラム量は1割程度に低下するものの,ろ液中の濃度としてはその2,53倍程度に上がることが期待できる。血液約0.5mlをビバスピン2で10分間遠心すればアキュサインBZO(関東化学社製)に滴下するのに十分なろ液量が得られ,血中トリアゾラム濃度が1ppm程度でも陽性を示した。
日本語を母語としない子女に対する日本語の指導課程・指導方法の実践的基礎研究

本研究の目的は、教育心理学、言語学、音声学、システム工学、異文化間教育学等の学際的研究から外国人子女の日本語習得過程を分析し、言語習得理論を基礎として日本語習得を促す教育方法論を構築し、日本語を母語としない子女に対する外国語(日本語)の指導のカリキュラム開発することであった。指導理論研究としては、わが国の外国人子女教育に関する指導資料の実態調査をまとめるとともに、外国人子女に対する教育的対応の基本構造、世界における教育言語の政策の検討を行い、外国人子女に対する日本語教育の課題をまとめた。カリキュラム開発に関しては、先年度までに行ってきた、外国人子女を受け入れ学校全体で取り組んでいる学校の実践観察に基づく資料や、コンピューターを利用して外国人子女に日本語を教えているプログラムについて検討を加えた。また、言語指導のための基礎資料を得るため、国内で最もよく使用されている小学校の教科書の日本語表現(語彙等)についてデータベースを作成し、小学校6年生までに必要とする言語表現,文型,さらに教科ごとに必要とされる表現を分析した。また、学校での日本語指導カリキュラムの実態,母語の保持を目標とする地域での指導の実際などについても調査を行った。そして、これらの知見をふまえ、総合的な研究報告書をまとめた。本研究の目的は、教育心理学、言語学、音声学、システム工学、異文化間教育学等の学際的見地から外国人子女の日本語習得過程の分析することにより、日本語習得を促す教育方法論を構築し、日本語を母語としない子女に対する日本語指導のカリキュラム開発を行うことである。本年度は、その初年度として、以下の2点から研究を進めた。1.指導理論研究:ESL(English as a Second Language)・EFL(English as a Foreign Language)教育の文献研究を行い、外国人子女に対する言語教育の理論と、その問題点を明らかにし、外国人子女の教育対応の諸層として、(1)日本の学校を理解し学校への適応を促す適応教育、(2)日本語の習得ならびに母語の保持を目標とする言語教育、(3)教科に属する目標を達成する教科教育の3つの層を構想し、これらを有機的に関係づけることにより、総合的に研究課題を追求することにした。2.指導方法開発:(1)外国人児童・生徒に対する日本語指導、教科指導、母語指導、外国人児童・生徒の生活、学習態度等を調べる質問紙を作成・実施し、現在分析中である。(2)大学生に対して日本語教育を行っている実践家の体験に基づく問題提起とそのカリキュラムを参考にして、日本語指導テキストの原理、方法論、手続きを検討した。(3)さらに国内の公立学校において外国人子女に対する日本語教育の訪問実地調査を行い、日本語指導目標、方法の問題点等を明らかにした。本研究は,過去1年間の総合研究の上にたって、(1)語彙分析を引き続き行い、日本語を母語としない子女の日本語指導のための教材開発の本系的基礎データ作りを行ってきた。小学校6年生の教科書(日本でもっともよく使用されているものを各教科とも上・下を対象にして)について悉皆的分析を試みた。分析の視点は、教科特有の言語表現、各教科に跨って使用されている言語表現、使用さている文型などについて、高頻度順に産出できるプログラムの作成と、実際の言語出現の頻度を産出し、基礎的なデータベースを作成した。このデータベースは、特に、日本語を母語としない外国人子女の学習言語習得のための教科書作成に際して、小学校6年生までに、どのような言語を習得しておく必要があるのかのヒントを与えてくれるものと思われる。なお、この分析は、平成5年度も継続し、小学校で使う教科書の全てについてデータベースを作成する。これを基に、小学校段階で、どのような言語をいつ、どのように教えるべきかなどについて、幅広い手掛かりが得られるものと期待できる。(2)教育心理学、言語学、異文化間教育学なでの学際的研究から、特に、学習言語の習植のための指導方法・モデルカリキュラムを開発してきた。アメリカのESLの指導法やその教科書を入手し、バイリンガル教育について実践的な指導法やカリキュラムの検討を始めた。外国人子女を受れ入れ、学校全体で通り組んでいる学校の実践を直に観察したり。コンピュータを使って、外国人子女に日本語を教えているプログラムを入手し、これらのプログラムの幅広い実践的活用について検討を加えてきた。本年度は、国内で最もよく使用されている小学校の教科書の日本語表現(語彙等)についてデータベースを作成し、日本語を母語としない外国人子女の日本語指導のための教材開発の体系的基礎データを完成させた。これは本邦初めての仕事である。また、教育心理学、言語学、異文化間教育学などの学際的研究から、外国人子女の日本語教育のための指導理論ならびに指導方法について検討を深めた。データベース作成に関しては、平成4年度までの分析を引き続き行い、各教科ごと、あるいは教科共通の言語表現なり、語彙出現頻度などをもとめ、今後の教材開発の基礎資料を作成した。さらに、データベースを日本語教育のカリキュラムや教科書作成にどのように活用するかに関して検討を行った。指導理論、指導方法に関しては、わが国の外国人子女教育に関する指導資料の実態調査をまとめるとともに、外国人子女に対する教育的対応の基本構造、世界における教育言語の政策の検討を行い、外国人子女に対する日本語教育の課題をまとめた。

本研究の目的は、教育心理学、言語学、音声学、システム工学、異文化間教育学等の学際的研究から外国人子女の日本語習得過程を分析し、言語習得理論を基礎として日本語習得を促す教育方法論を構築し、日本語を母語としない子女に対する外国語(日本語)の指導のカリキュラム開発することであった。指導理論研究としては、わが国の外国人子女教育に関する指導資料の実態調査をまとめるとともに、外国人子女に対する教育的対応の基本構造、世界における教育言語の政策の検討を行い、外国人子女に対する日本語教育の課題をまとめた。カリキュラム開発に関しては、先年度までに行ってきた、外国人子女を受け入れ学校全体で取り組んでいる学校の実践観察に基づく資料や、コンピューターを利用して外国人子女に日本語を教えているプログラムについて検討を加えた。また、言語指導のための基礎資料を得るため、国内で最もよく使用されている小学校の教科書の日本語表現(語彙等)についてデータベースを作成し、小学校6年生までに必要とする言語表現,文型,さらに教科ごとに必要とされる表現を分析した。また、学校での日本語指導カリキュラムの実態,母語の保持を目標とする地域での指導の実際などについても調査を行った。そして、これらの知見をふまえ、総合的な研究報告書をまとめた。