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転写統合装置複合体を標的としたリウマチ性疾患制圧法の開発

関節リウマチの主病変である滑膜細胞の過増殖と活性化、および軟骨細胞の変性の制御はリウマチ性疾患制圧の標的である。これまで、リウマチ滑膜細胞に転写亢進状態が存在し、その病態に深く関与していることが討議されている。本研究ではCREB結合蛋白質(CBP)に代表される転写統合装置の機能異常がリウマチ滑膜細胞の転写亢進状態、ひいては同細胞の異常増殖に関与するのではないかと仮定し、本仮説の検証、さらには創薬開発を行うことを目的とした。その結果、CBP結合因子としてリウマチ滑膜細胞由来cDNAライブラリィーより神経系の発生・分化に重要なNotch1が得られ、リウマチ滑膜細胞ではTNFαによりPresenilinを介してNotch-1シグナルが活性化されることが示され、その特異的抑制剤により培養リウマチ滑膜細胞の増殖を制御可能であることを報告した。さらに、同様の方法により軟骨細胞のライブリィーから、細胞周期制御因子p34が得られ、CBPとの複合体形成がCREB転写系を調節し、同細胞の分化・増殖に影響を与える可能性を報告した(Hiroseらin press)。また、CBP自体の機能亢進現象(hypernuclear acetylation)がリウマチ滑膜細胞に存在し、転写亢進を介して、その過増殖に関与している可能性を見出した(Nakazawaら2002)。今後もこれらの研究を推進し、リウマチ制圧法の開発を推進したい。私たちを含む幾つかの研究グループによりCBP(CREB binding protein)をはじめとする転写コアクチベーターの機能解析が進められた(Cell 1996 & 1997など)。さらに、転写コアクチベーター分子が複数のシグナル伝達系の協調・拮抗の最終ターゲットとして存在し、シグナル伝達の多様性・巧緻性を規定していること。また、細胞増殖・分化・アポトーシスなどの非常に多くの生物学的現象に関与していることが示された。これらのことより、わたしたちは転写コアクチベーターをコンピューターの集積回路(IC)に相当すると考え転写統合装置と命名した(Nature 1996)。慢性関節リウマチの主病変である滑膜細胞の過増殖と活性化の制御はリウマチ性疾患制圧の標的である。本研究ではCREB結合蛋白質(CBP)に代表される転写統合装置の機能異常がリウマチ滑膜細胞の転写亢進状態、ひいては同細胞の異常増殖に関与するのではないかと仮定し、本仮説の検証、さらには創薬開発を行うことを目的とする。CBP結合因子としてリウマチ滑膜細胞由来cDNAライブラリィーより神経系の発生・分化に重要なNotch1が得られた。Notchは発生において、主として神経系の側方抑制に関与していることが古典的に知られている。器官幹細胞が分化する際、分化する細胞はそのリガンドを発現し、その周囲の細胞はNotchレセプターが活性化され、分化シグナルが抑制される。Notch-1は神経系細胞の膜表面でヘテロ二量体として存在し、レセプターとしての機能を有する。リガンドと結合し、Notch-1シグナルが活性化される際、同分子はプロセシングを受け、核内に移行し転写調節因子としNF-κBなどのシグナルを活性化すると考えられている。今回、滑膜細胞でのNotch-1の発現と局在を検討した結果、同分子はリウマチ滑膜細胞で強発現し、かつTNFαのシグナルにより細胞表面から核内への移行を示した。さらに、リウマチ滑膜細胞ではTNFαによりpresenilinを介してNotch-1シグナルが活性化されることが示され、その特異的抑制剤により培養リウマチ滑膜細胞の増殖を制御可能であった。今後、本経路の詳細な分子機構を理解することにより、新たなるTNFαの分子標的としてのNotch-1の位置付け、リウマチ制圧法の開発が明らかになることが期待される。

これまで、リウマチ滑膜細胞に転写亢進状態が存在し、その病態に深く関与していることが討議されている。本研究ではCREB結合蛋白質(CBP)に代表される転写統合装置の機能異常がリウマチ滑膜細胞の転写亢進状態、ひいては同細胞の異常増殖に関与するのではないかと仮定し、本仮説の検証、さらには創薬開発を行うことを目的とする。昨年度、CBP結合因子としてリウマチ滑膜細胞由来cDNAライブラリィーより神経系の発生・分化に重要なNotch1が得られ、リウマチ滑膜細胞ではTNFαによりPresenilinを介してNotch-1シグナルが活性化されることが示され、その特異的抑制剤により培養リウマチ滑膜細胞の増殖を制御可能であることを報告した。今年度は、さらに、(1)本経路の詳細な分子機構を解析した。また、(2)同様に軟骨細胞のライブリィーより、細胞周期制御因子p34が得られ、CBPとの複合体形成がCREB転写系を調節し、同細胞のgenesisに影響を与える可能性を報告した(Hiroseらin press)。さらに、CBP自体の機能亢進現象(hypernuclear acetylation)がリウマチ滑膜細胞に存在し、その過増殖に関与している可能性を見出した(Nakazawaら2002)。今後もこれらの研究を推進しリウマチ制圧法の開発の糸口をしたい。
細菌が生産するプロテアーゼインヒビター機能構造についての蛋白工学的研究

蛋白分解酵素プロテアーゼとそのインヒビター蛋白質の相互作用を分子または分子下レベルで研究した。放線菌のプロテアーゼ・インヒビターSSIは日本で発見され、集中的に研究された蛋白質の一つであるが、この蛋白質を中心にプロテアーゼ・インヒビターを遺伝子操作で改変してプロテアーゼとの相互作用の変化を追究した。SSI遺伝子をクローニングし、作用部位その他の改変を行なった。反応部位の中心を基質と同様なアミノ酸に置換すると、それが接触し易い酵素に対してインヒビターとしての役割を果たすことを明らかにした。また、反応部位以外の部分を改造してプロテアーゼとの接触にどのように効果を挙げることができるかを調べた。さらに2システイン残基によるS-Sの架橋をアミノ酸の置換によってとり払うと、SSIはもはや阻害剤でなくて基質になってしまうことがわかった。野生型ではしっかりした三次元構造をとれるようになっているSSIにそれを破壊するような変化を与えたとき、阻害活性は低下し、インヒビターが基質に転化してしまうことを見いだした。この結果により、プロテアーゼ・インヒビターの設計のための原理が明らかにされた。SSIの改変体と種々の酵素との複合体の結晶のX線解析からは、プロテアーゼとインヒビターの接触の具合を明らかにした。また、同位元素置換したSSIの構造をNMRで調べると、反応部位付近とC末端寄りの部分がプロテアーゼとの接触において構造変化を起こし易く、誘導適合を起こし得ることを示した。野生型SSIとアミノ酸置換変異体の熱安定性の比較からはSSIの高次構造に大きな変化がないのにもかかわらず、特定位置については協同的なゆらぎが増加していることが示された。この他に放線菌や他の細菌、かび、レトロウイルスあるいは植物種子のプロテアーゼと蛋白性インヒビターの相互作用及び夫々の物性につき多角的に研究を行なった。プロテア-ゼとそのインヒビタ-の系は蛋白質相互作用のモデルとして好適である。まず種々の細菌からプロテア-ゼやインヒビタ-のスクリ-ニングを行い、カビの一種より基質特異性の非常に高いセリンプロテア-ゼを、土壌菌よりレトロウイルスプロテア-ゼやペプシンなどの酸性プロテア-ゼに対する低分子量のインヒビタ-を、海洋細菌よりパパインを阻害するペプチド性のインヒビタ-を分離精製した。この一部については構造決定を行った。また有機合成法によりプロリルエンドペプチダ-ゼのインヒビタ-の構造活性相関の研究を行った。金属プロテア-ゼに対する蛋白性のインヒビタ-SMPIについてはその遺伝子をクロ-ニングし、塩基配列も決定した。さらに、その構造について詳細に研究されている<Streptomyces>___ーSubtilisin Inhibitor(SSI)については、種々の変異体を作製し構造と機能の相関について詳細に解析するという蛋白工学的研究を進めた。まず作用部位周辺のアミノ酸残基を変換し、ズブチリシン、アクアライシンの他、金属プロテア-ゼに対する阻害活性やkineticsを測定した結果、プロテア-ゼの基質特異性との高い相関関係が明らかになった。P1部位がLysである変異SSIについてはカロリメトリ-によりズブチリシン及びトリプシンとの相互作用について熱力学特性を調べた。またこの変異体とズブチリシンの複合体のX線構造解析を行い、野生型との局所的な構造変化の違いが明らかになった。Trp86→Hisの変異体については種々の物理化学的測定により、この変異体の一時阻害がその構造不安定化によることが示された。また安定同位体ラベルとアミノ酸置換体の組合せにより、主鎖のカルボニル炭素のNMRシグナルの帰属を進め、構造変化についても検討した。

以上のようにSSIについては変異体の利用によって多角的に構造と機能の関係を追究している。蛋白質は生物体の中での諸機能に中心的役割を果たすが、その活性化や代謝に関係する蛋白質分解酵素プロテア-ゼとそのインヒビタ-の機能に必要な構造を特定の材料について共同研究している。主に用いている系は細菌由来の系で、特に放線菌由来のズブチリシンとその阻害剤SSI(Streptomyces Subtilisin Inhibitor)であるが、遺伝子操作を利用した改造により特異性を変換させることに成功した。今年度特に進んだ点はこのような改変SSIの構造変化や相手プロテア-ゼとの相互作用を核磁気共鳴NMRやカロリメトリ-などにより詳細に調べる研究が成果を示しはじめたことである。プロテア-ゼとSSI改変体の種々の組み合せによる複合体を結晶化し、X線解析を進める点でも前進があった。ここで研究しているプロテア-ゼインヒビタ-が蛋白質でありながらなぜプロテア-ゼによって分解されないかを明らかにするための研究でも成果が得られた。たとえばフレキシブルル-プと呼ばれる反応部位付近のル-プ状の張り出し構造を短くしたり長くすることが活性低下に導くことや、ダイマ-形成に必要なβーシ-ト構造に歪みを起こさせることが活性低下を引き起こすことなどが明らかになった。このような研究を進めるために異なった専門家による同一対象の総合研究は非常に役立っているといえる。遺伝子工学的改変蛋白質の作製は蛋白質の構造ー機能相関の研究に有用であるが、このグル-プの最近の結果のように効果的に用いられた例は極めて少い。この研究班では一方でSSI以外に細菌またはかび類由来のプロテア-ゼ・インヒビタ-の検索とキャラクタリゼ-ションを行なっており、改造研究にも役立てようとしている。それはプロテア-ゼ・インヒビタ-としての構造上の共通性と相違点の二面を知ることにより、機能に必要な構造を解析するためのヒントを与えるからである。蛋白分解酵素プロテアーゼとそのインヒビター蛋白質の相互作用を分子または分子下レベルで研究した。放線菌のプロテアーゼ・インヒビターSSIは日本で発見され、集中的に研究された蛋白質の一つであるが、この蛋白質を中心にプロテアーゼ・インヒビターを遺伝子操作で改変してプロテアーゼとの相互作用の変化を追究した。SSI遺伝子をクローニングし、作用部位その他の改変を行なった。反応部位の中心を基質と同様なアミノ酸に置換すると、それが接触し易い酵素に対してインヒビターとしての役割を果たすことを明らかにした。また、反応部位以外の部分を改造してプロテアーゼとの接触にどのように効果を挙げることができるかを調べた。さらに2システイン残基によるS-Sの架橋をアミノ酸の置換によってとり払うと、SSIはもはや阻害剤でなくて基質になってしまうことがわかった。野生型ではしっかりした三次元構造をとれるようになっているSSIにそれを破壊するような変化を与えたとき、阻害活性は低下し、インヒビターが基質に転化してしまうことを見いだしたこの結果により、プロテアーゼ・インヒビターの設計のための原理が明らかにされた。
磁性ナノ粒子プローブを用いた新型インフルエンザの超高感度迅速診断チップ

従来の簡易診断法の最小検出限界を低減できる超高感度・迅速な磁気バイオセンサチップを開発した。その実現のための要素技術は次の3点に集約され、これらの達成が本申請研究の目的である。1)一次抗体被覆ナノ粒子・抗原複合体の磁気濃縮(微小空間での磁気分離による、希薄検体からの抗原抗体複合体の高効率捕捉)と、二次抗体によるシグナル増幅。2)マイクロ流路内のブラウン運動活性化と層流による抗原抗体反応の活性化。3)高い交流磁界応答を示す磁性粒子プローブ、高感度センシング、磁性粒子-免疫複合体の物理的捕捉、トンネル磁気抵抗効果型磁気センサーと駆動回路技術から構成)。・本成果により、新型インフルエンザの超早期診断率の大幅な向上が見込まれる。迅速・適切な対応が可能になるため、重症化・蔓延の防止に大きく貢献する。急増している新型インフルエンザは、従来型よりも致死率が高く、本申請は緊急性の高いテーマである。・日本が世界をリードするナノテクノロジーを応用するため、日本の強みを活かせる。・手のひらにのるサイズのハードディスクドライブのように小型化が可能で簡便なツールとなりうる。量産技術がある程度確立しているので、使い捨てと考えても余りコストがかからない。・他疾患の診断にも応用できるため、大きな波及効果が期待できる。本年度は、抗原抗体反応を迅速・鋭敏に検出できる磁気バイオセンサチップを完成させ、特許出願、論文投稿、学会発表を行っている。
アテローム硬化性・解離性大動脈瘤における間質線維成分代謝に関する分子病理学的検討

血管壁に血行力学的負荷な負荷がかかる解離性大動脈瘤、下肢静脈瘤、門脈圧亢進下の門脈、心筋架橋部及びこの近位の冠状動脈壁を対象として、これらに対応する部位の正常血管壁を対照群として、電顕的ならびに膠原線維・弾性繊維代謝に関わるMMP、TIMPに対する抗体を用いた免疫組織化学的観察を試みた。電顕により、解離性大動脈の破裂部周囲の内膜・中膜には、通常の数倍の太さを持ち、螺旋状に捻れを示すが、通常の横紋周期を呈するspiraled collagenが多量且つ高頻度に出現していた。同時に弾性繊維も細くなり、断裂を示していた。これらの周囲に存在する平滑筋細胞の基底膜にも菲薄化、消失がみられた。すなわち、これらの所見は、線維性蛋白の変性性の所見と考えられた。又、免疫組織化学により上記部分の平滑筋細胞の胞体中に、MMP-1, -2, -9の発現が亢進し、これらの阻害酵素のTIMP-1、-2の亢進も見られたが、層板状の壊死部分には、これらの発現は見られなかった。即ち、大動脈解離の生じる前から、これらの酵素が作用し、線維性蛋白の変性を起こして、解離に連なったものと思われた。解離発生には、ずり応力などの血行力学的負荷が重要と考えられ、更に、高血圧が、この過程を強調させる負荷となるものと思われる。その他下肢静脈瘤の大伏在静脈、内腔圧の上昇した門脈、ずり応力の上昇下にある心筋架橋部の冠状動脈にも、spiraled collagenと上記の間質線維分解酵素にも同様の結果が見出された。平成10年度の研究計画に従い、蒐集された20例の解離性大動脈瘤と、これらの症例に年齢・性が一致し、さらに高血圧を持たない同数例の対照群を設定した。解難性大動脈瘤例のうち、電顕観察の可能であった10例を検索すると、何れの例の解離部においては、弾性線維の変性像のみでなく、同時に膠原線維も高頻度かつ多量に及ぶ螺旋型膠原線維の出現を認めた。又、これら細胞外基質の代謝に関与する、matrix metalloproteinase-1,2,9及びtissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1-,2の発現が、解離部において、対象群の対応部位における発現率に比して、有意に亢進を示していた。解離性大動脈瘤の解離部における弾性線維の変性は、線維性蛋白の分解に深く関わると考えられるMMP 2,9の発現と対応した所見として考えられる。螺旋型膠原線維は、膠原線維が、一度、変性を起こしたものが、再重合を示した結果として考えられるが、MMP-1,2の発現は、この過程に関与している可能性が高いものと想定される。一方、MMPsの発現と呼応するようにTIMPsの発現も亢進を示しており。脈管内における組織構築の把持は、これら酵素系の恒常性に依っており、この過程の破綻により、解離性大動脈瘤の発生に連なるものと思われる。この際、解離性大動脈瘤患者の9割にみられた高血圧の合併は、上行大動脈に後発する解離発生に、血行力学的な負荷を与えることによって、契機を与えることが考えられた。解離性大動脈瘤を対象として、年齢・性の一致する対照群との間で、電顕的ならびに膠原線維・弾性線維代謝に関わるMMP、TIMPに対する抗体を用いた免疫組織化学的観察を試みた。同時に弾性線維も細くなり、断裂を示していた。

これらの周囲に存在する平滑筋細胞の基底膜にも菲薄化、消失がみられた。すなわち、これらの所見は、線維性蛋白の変性性の所見と考えれるた。又、免疫組織化学により上記部分の平滑筋細胞の胞体中に、MMP-1,-2,-9,の発現が亢進し、これらの阻害酵素のTIMP-1、-2の亢進も見られたが、層板状の壊死部分には、これらの発現は見られなかった。即ち、大動脈解離の生じる前から、これらの酵素が作用し、線維性蛋白の変性を起こして、解離に連なったものと思われた。解離発生には、ずり応力などの血行力学的負荷が重要と考えられ、更に、高血圧が、この過程を強調させる負荷となるものと思われる。
死者への記憶に基づく宗教的情操の哲学的考察―死者倫理の基盤形成

全4年計画の本研究課題のうち2年目にあたる平成30年度は、申請時の計画としては、平成29年度に着手した宗教哲学的な死者倫理の基盤形成を洗練させつつ、それに基づき、その成果を宗教学分野の死者研究(特に場所論や事物論)や記憶論へと接続させることを課題としていた。平成30年度は、まず死者倫理の基盤形成として、英語圏における分析哲学的な死者論の現状と課題を整理しつつ、そこから立ち上がる死者倫理の可能性を明らかにした。その成果は、論文「〈死者の尊厳〉の根拠ー下からの死者倫理の試み」および学会発表「死者への敬意の基礎づけは可能かー死者倫理と宗教哲学」にて発表した。特に、ネーゲル以降の「死の害の哲学」をめぐる先行研究をもとに、死者に、通常の意味での人格とは異なる「象徴的・言説的人格」を認めることによって死者に対して生者と近い意味での「尊厳」を認めるための論理的基盤の一端を明らかにできた。また、死者倫理の問題と、宗教学的な場所論・事物論とを接続させるための準備的考察として、物質文化論と哲学との接合点をさぐる研究をおこなった。その成果は論文「考古学者が読んだハイデガー考古学者はそこに何を発掘したのか」として刊行した。物質がもつ痕跡としての性質という主題と、死者が残す痕跡という主題との接点が、死者倫理の考察のうえで重要であることが明らかになった。同様に、死者倫理と哲学的記憶論の接点を探るため、申請時の計画通り、哲学者リクールの物語的記憶論を参照し、死者に適用可能な人間の尊厳概念の拡張の可能性を探った。その成果は、学会講演「悪しき人間とその尊厳」にてその一端を発表した。カントおよびリクールの議論を手がかりとして、人間の尊厳概念そのものの拡張を目指したものであり、この尊厳概念を死者へと適用させるための手がかりとすることができた。全4年計画の本研究課題のうち2年目にあたる平成30年度は、申請時の計画としては、平成29年度に着手した宗教哲学的な死者倫理の基盤形成を洗練させつつ、それに基づき、その成果を宗教学分野(特に場所論や事物論)や記憶論へと接続させることを課題としていた。第一に、平成30年度は、前年度からの継続課題として、死者倫理の基盤形成の洗練を目指し、英語圏における分析哲学的な死者論の現状と課題を整理しつつそこから立ち上がる死者倫理の可能性を明らかにした研究成果(論文、学会発表)を公刊した。平成29年度から続けてきた研究が、着実に進展し、成果を挙げていると評価できよう。また、そのなかで、当初は予定になかった日本語圏の哲学領域における死者論の意義や位置づけについても論じることができ、計画よりも研究に広がりが生じることとなった。第二に、死者倫理の問題と、宗教学的な場所論・事物論とを接続させるための準備的考察を、論文として刊行した。これにより、宗教学的に死者の記憶や痕跡を論じるための理論的基盤を整えることができ、次年度への準備とすることができた。第三に、死者倫理と哲学的記憶論の接点を探るため、申請時の計画通り、哲学者リクールの物語的記憶論を参照し、学会講演をおこなった。これにより明らかになった「拡張された人間の尊厳」概念を、死者へと適用するための準備が整い、平成31年度の課題へ向かうための準備を整えることができた。以上より、本研究課題は、当初の計画通りにおおむね順調に進展していると評価できるだろう。研究計画がおおむね順調に進展していることを鑑み、平成31年度は、申請当初の計画通り、宗教学と宗教哲学とを架橋するかたちで、より具体的な死者倫理の構築を目指す。具体的には、宗教学における祭祀・埋葬論を宗教哲学的に捉えなおし、人がなぜ、なんのために死者を敬うのかを、連携協力者らの協力をもとに、哲学的視点から明らかにする。また、その成果を各種学会や学術雑誌に投稿することを目指す。特に、平成30年度に講演のかたちでのみ発表した人間の尊厳概念の拡張可能性については、早急に論文として公刊することを目指す。本研究課題は、人間存在において記憶と物語が倫理形成に果たす役割に着目し、死者に対する敬意の根拠を明らかにすることを目指すものである。H29年度はその初年度にあたり、以下の二点において、具体的な成果を挙げることができた。第一に、現代思想において物語論の重要な参照項とされているリクールとアーレントの思想、とりわけ二人の「言論」観を比較することによって、リクールがアーレントの活動概念に対して一定の留保を与え、言論が倫理性と同時に反倫理性(暴力)の可能性をつねに秘めていることを指摘していると、解明することができた。本研究は、アーレント研究会のシンポジウムにおいて講演をおこない、またそれを同研究会の会報において論文として公開した。第二に、死者倫理の様々な可能性として、従来強調されがちだった大陸系思想の他者論に基づく死者倫理とは異なるしかたで、英語圏の分析哲学において展開する「死の害の哲学」に着目し、そこから成立しうる死者倫理の姿を明らかにすることができた。死者をことさらに他者として強調するのではなく、生きている人に対する倫理的配慮と同程度に、同一根拠において死者に対しても倫理的配慮が求められうるという点について、解明することができた。本研究は、宗教哲学会のシンポジウム「その続きを生きているー死者との関わりの諸相」(筆者もその企画に携わった)において講演として発表し、H30年度、同学会の学会誌に論文として投稿する予定である。

本研究課題では、計画の時点では、H29年度は主にリクールの物語論を検討対象とし、物語化の作用が人間の倫理をどのように生じさせるかを明らかにすることとなっていたが、H29年度は、アーレントとリクールの比較研究を通じて、おおむねその計画通りの成果を挙げることができたと思われる。当初の計画では、渡仏してリクールの草稿などを調査する予定であったが、国内調査で相応の文献を入手することができ、一部計画の変更をおこなった。また、分析哲学における死者倫理の成立可能性の検討は、本来、H30年度以降におこなう予定であったが、宗教哲学会のシンポジウム企画に携わるなかで、その予定を一部早めておこなうことが有益であることが分かり、前倒ししてその研究にも着手した。なお、国内より研究者を招聘して研究会を開催するという予定については実施しなかったが、上述のとおり、宗教哲学会のシンポジウムを自身が企画し、堀江宗近氏(東京大学)らと登壇し議論をおこなったことで、十分その代わりとなる進捗を得ることができたと思われる。結果、本研究課題は、当初の計画通りにおおむね順調に推移していると評価できる。全4年計画の本研究課題のうち2年目にあたる平成30年度は、申請時の計画としては、平成29年度に着手した宗教哲学的な死者倫理の基盤形成を洗練させつつ、それに基づき、その成果を宗教学分野の死者研究(特に場所論や事物論)や記憶論へと接続させることを課題としていた。平成30年度は、まず死者倫理の基盤形成として、英語圏における分析哲学的な死者論の現状と課題を整理しつつ、そこから立ち上がる死者倫理の可能性を明らかにした。その成果は、論文「〈死者の尊厳〉の根拠ー下からの死者倫理の試み」および学会発表「死者への敬意の基礎づけは可能かー死者倫理と宗教哲学」にて発表した。特に、ネーゲル以降の「死の害の哲学」をめぐる先行研究をもとに、死者に、通常の意味での人格とは異なる「象徴的・言説的人格」を認めることによって死者に対して生者と近い意味での「尊厳」を認めるための論理的基盤の一端を明らかにできた。また、死者倫理の問題と、宗教学的な場所論・事物論とを接続させるための準備的考察として、物質文化論と哲学との接合点をさぐる研究をおこなった。その成果は論文「考古学者が読んだハイデガー考古学者はそこに何を発掘したのか」として刊行した。物質がもつ痕跡としての性質という主題と、死者が残す痕跡という主題との接点が、死者倫理の考察のうえで重要であることが明らかになった。同様に、死者倫理と哲学的記憶論の接点を探るため、申請時の計画通り、哲学者リクールの物語的記憶論を参照し、死者に適用可能な人間の尊厳概念の拡張の可能性を探った。その成果は、学会講演「悪しき人間とその尊厳」にてその一端を発表した。カントおよびリクールの議論を手がかりとして、人間の尊厳概念そのものの拡張を目指したものであり、この尊厳概念を死者へと適用させるための手がかりとすることができた。全4年計画の本研究課題のうち2年目にあたる平成30年度は、申請時の計画としては、平成29年度に着手した宗教哲学的な死者倫理の基盤形成を洗練させつつ、それに基づき、その成果を宗教学分野(特に場所論や事物論)や記憶論へと接続させることを課題としていた。
認定こども園への移行に伴う課題と改善策－私立保育所と私立幼稚園の比較を通して－

子ども・子育て新制度の実施を機に、私立保育所や私立幼稚園から移行するかたちで、認定こども園の数が急増している。本年度は、認定こども園への移行過程で、何が課題となり、どのように対応してきたのか実態調査を行った。兵庫県下の認定こども園のうち、私立保育所からの移行園を3園、私立幼稚園からの移行園を2園抽出し、各園で勤務する管理職5名と保育教諭6名に対して聞き取り調査を行った。質問内容は、認定こども園への移行の理由、移行過程での課題と対応であった。。聞き取り調査の記録は許可を得て、ボイスレコーダーで録音し文字起こしによりデータ化した。移行過程での課題と改善策のうち、2018年度は、園舎の改築や改装、保育室や園庭など既成の設備の使い方の見直しなど園の環境に着目して分析を行った。認定こども園への移行において、11号認定児と2号認定児の経験差や仲間関係、2多様な背景を持つ保護者の意識の相違や人間関係が課題として挙げられた。1の課題への対応として、(a)1号認定児と2号認定児が共に活動する場、(b)各々の生活が充実するための環境、(c)互いの生活の違いを可視化し認め合う場の設定等が明らかになった。2の課題への対応として、(d)保護者同士の交流の場、(e)ドキュメンテーションによる子どもの生活や学びの過程の可視化、(f)教育課程・保育計画の掲示等が示された。2018年度の成果は、園の環境に限定してはいるが、認定こども園への移行過程における課題に即して、具体的な対応や解決策を明らかにした点にある。得られた知見は、2019年度の学会で発表予定である。今後、移行に伴う様々な課題と対応に視野を広げて、分析、検討を進めていきたい。兵庫県下の認定こども園の中から、私立保育所からの移行園を3園、私立幼稚園からの移行園を2園抽出して、半構造化面接により聞き取り調査を行った。調査の実施に当たって、先行研究を精査すると共に、現場の実態について意見交換を行い、移行過程での課題と改善策について、簡潔かつ全体的に把握するための質問項目を検討した。その結果、1園の環境、2全体的な計画、3保育内容(特に認定の違いによる課題、3歳未満児保育)、4保護者との連携や対応、子育て支援、5職員配置及び勤務体制(管理職)、職員間の情報共有及び連携(保育教諭)の5点に集約した。聞き取り調査の記録は許可を得て、ボイスレコーダーで録音した。録音データを文字起こしし読み合わせを行った。上記の通り、2018年度は、園の環境に着目して詳細な分析を行った。同時に、移行に伴う課題と対応に関する他の項目についても、基礎的な分析に着手している。2018年度の課題として、私立幼稚園からの移行園について、当初の予定よりも、十分なデータを得られなかったことが挙げられる。理由としては、(a)私立保育所に比べて、私立幼稚園からの移行園が少ないこと、(b)申請者が、私立幼稚園からの移行園をフィールドとして有していなかったこと等がある。これまで得られたデータの分析を進める中で、補完すべきデータを確認し、協力園の選定を行いたい。以上を踏まえ、現在までの進捗状況を「おおむね順調に進展している」とした。聞き取り調査のデータを多角的に分析することで、認定こども園への移行に伴う課題と改善策について、仮説モデルの生成を試みる。さらに、生成されたモデルに基づき、3年目の量的研究に向けて調査項目の原案を作成する。仮説モデルと調査項目の原案については、認定こども園の管理職と保育教諭数名から意見を求め、修正を行う。研究の過程で見いだされた知見については、学会発表や研究論文等の媒介を通じて、積極的に情報発信をしていく。まずは、園の環境に焦点を当て、移行過程における課題と対応について、2019年度の日本保育学会第72回大会で発表予定である。研究を遂行していく上での課題としては、分析枠組の検討が挙げられる。これまで資料収集を進める中で、たとえば、認定区分毎の定員及び在籍園児数、全体的な計画の内容等、運営上の基盤においてさえも、認定こども園により多様になっていることが分かった。したがって、認定こども園を一括りにして調査を行っても、曖昧な知見しか得られない可能性がある。本研究では、移行前施設の違い(私立保育所と私立幼稚園)に着目しているが、これに加えて下位の分析カテゴリを検討し、必要に応じて導入していきたい。。

認定こども園への移行において、11号認定児と2号認定児の経験差や仲間関係、2多様な背景を持つ保護者の意識の相違や人間関係が課題として挙げられた。1の課題への対応として、(a)1号認定児と2号認定児が共に活動する場、(b)各々の生活が充実するための環境、(c)互いの生活の違いを可視化し認め合う場の設定等が明らかになった。2の課題への対応として、(d)保護者同士の交流の場、(e)ドキュメンテーションによる子どもの生活や学びの過程の可視化、(f)教育課程・保育計画の掲示等が示された。2018年度の成果は、園の環境に限定してはいるが、認定こども園への移行過程における課題に即して、具体的な対応や解決策を明らかにした点にある。得られた知見は、2019年度の学会で発表予定である。今後、移行に伴う様々な課題と対応に視野を広げて、分析、検討を進めていきたい。兵庫県下の認定こども園の中から、私立保育所からの移行園を3園、私立幼稚園からの移行園を2園抽出して、半構造化面接により聞き取り調査を行った。調査の実施に当たって、先行研究を精査すると共に、現場の実態について意見交換を行い、移行過程での課題と改善策について、簡潔かつ全体的に把握するための質問項目を検討した。その結果、1園の環境、2全体的な計画、3保育内容(特に認定の違いによる課題、3歳未満児保育)、4保護者との連携や対応、子育て支援、5職員配置及び勤務体制(管理職)、職員間の情報共有及び連携(保育教諭)の5点に集約した。聞き取り調査の記録は許可を得て、ボイスレコーダーで録音した。録音データを文字起こしし読み合わせを行った。上記の通り、2018年度は、園の環境に着目して詳細な分析を行った。同時に、移行に伴う課題と対応に関する他の項目についても、基礎的な分析に着手している。2018年度の課題として、私立幼稚園からの移行園について、当初の予定よりも、十分なデータを得られなかったことが挙げられる。理由としては、(a)私立保育所に比べて、私立幼稚園からの移行園が少ないこと、(b)申請者が、私立幼稚園からの移行園をフィールドとして有していなかったこと等がある。これまで得られたデータの分析を進める中で、補完すべきデータを確認し、協力園の選定を行いたい。以上を踏まえ、現在までの進捗状況を「おおむね順調に進展している」とした。聞き取り調査のデータを多角的に分析することで、認定こども園への移行に伴う課題と改善策について、仮説モデルの生成を試みる。さらに、生成されたモデルに基づき、3年目の量的研究に向けて調査項目の原案を作成する。仮説モデルと調査項目の原案については、認定こども園の管理職と保育教諭数名から意見を求め、修正を行う。研究の過程で見いだされた知見については、学会発表や研究論文等の媒介を通じて、積極的に情報発信をしていく。まずは、園の環境に焦点を当て、移行過程における課題と対応について、2019年度の日本保育学会第72回大会で発表予定である。研究を遂行していく上での課題としては、分析枠組の検討が挙げられる。これまで資料収集を進める中で、たとえば、認定区分毎の定員及び在籍園児数、全体的な計画の内容等、運営上の基盤においてさえも、認定こども園により多様になっていることが分かった。したがって、認定こども園を一括りにして調査を行っても、曖昧な知見しか得られない可能性がある。本研究では、移行前施設の違い(私立保育所と私立幼稚園)に着目しているが、これに加えて下位の分析カテゴリを検討し、必要に応じて導入していきたい。
霊長類における顔認識の比較認知論的・比較発達学的研究

本年度は、前年度までに引き続き、ヒト以外の霊長類であるマカクザル乳児における顔認識を調べる研究をおこなった。本実験では、刺激に含まれる全体的、あるいは部分的特徴が、被験体の偏好追視反応に与える影響と、その発達的変化を明らかにすることを目的とした。生後02ヶ月齢のマカクザル乳児が実験に参加した。刺激として、以下の4種類の図形を用いた:(1)顔図形(各構成部品の形状と全体的配置が顔様)、(2)部品顔図形(構成部品のみが顔様)、(3)顔配置図形(全体的配置のみが顔様)、(4)縦配置図形(部品も配置も顔様でない)。これらのうち、(1)-(2)、(3)-(4)を組み合わせ、対にして被験体に呈示し、各刺激に対する追視反応を測定した。その結果、マカクザル乳児は顔のように見える図形に対して偏好を示し、またそうした偏好反応は発達に伴って質的に変化することが明らかとなった。生後0ヶ月齢の乳児は、全体として顔配置をもつ刺激に対してのみ偏好を示した((1)顔≒(2)部品顔、(3)顔配置>(4)縦配置)。生後1ヶ月齢になると、乳児は、全体と部分のいずれもが顔様である刺激に対してのみ、偏好反応を示すようになった((1)顔>(2)配置顔、(3)顔配置≒(4)縦配置)。しかし、生後2ヶ月齢を過ぎると、どの刺激ペアに対しても偏好反応が見られなかった。本実験で示されたマカクザルの結果は、ヒト乳児における顔図形偏好とその発達的変化に極めて類似しており、発達初期の顔認識において、ヒトとヒト以外の霊長類が共通の基盤を有していることを示唆しているだろう。なお、以上の実験は京都大学霊長類研究所における平成15年度共同利用研究としておこなわれた。本年度は、ヒト以外の霊長類であるマカクザル乳児における顔認識を調べる研究をおこなった。まず、刺激に含まれる全体的、あるいは部分的特徴が、被験体の偏好追視反応に与える影響を明らかにすることを目的とし、以下のような実験をおこなった。この実験では、生後021週齢のマカクザル17個体が被験体として実験に参加した。刺激として4種類の図形を用いた:(1)顔図形(各構成部品の形状と全体的配置が顔様)、(2)対称非顔図形(構成部品のみが顔様)、(3)顔配置図形(全体的配置のみが顔様)、(4)縦配置図形(部品も配置も顔様でない)。実験の結果、マカクザル乳児は顔のように見える図形に対して偏好を示すが、そのような視覚的偏好は、全体と部分のいずれもが顔様である刺激に対してのみ示されることが明らかとなった((1)顔図形>(2)対称非顔図形、(3)顔配置図形≒(4)縦配置図形)。また、このような顔図形に対する偏好は、生後4週齢以降に顕著に現れることが示唆された。本実験で示されたマカクザルの結果は、ヒト乳児における顔図形偏好とその発達的変化に類似しており、発達初期の顔認識において、ヒトとヒト以外の霊長類が共通の基盤を持つことを示唆しているかもしれない。なお、以上の実験は京都大学霊長類研究所における平成14年度共同利用研究(対応者:松沢哲郎)としておこなわれたものである。また、本実験は、「霊長類の乳児における顔図形認識の発達(3)」(第66回日本心理学会)として発表された。

本実験で示されたマカクザルの結果は、ヒト乳児における顔図形偏好とその発達的変化に極めて類似しており、発達初期の顔認識において、ヒトとヒト以外の霊長類が共通の基盤を有していることを示唆しているだろう。なお、以上の実験は京都大学霊長類研究所における平成15年度共同利用研究としておこなわれた。
農業現場での栽培情報センシングとその解析システムの構築

水耕栽培で得られたトマト葉、および露地栽培のコーヒー葉を対象に、可視光・中赤外光領域の分光スペクトルと蛍光X線スペクトルの取得を行った。可視光・中赤外光領域では、クロロフィルなどの色素に加え、硝酸態窒素などの成分の測定が可能であり、蛍光X線では植物体の栄養診断に用いられるP、K、Caなどの陽イオン成分の分析が行える。また、蛍光X線スペクトルの経時変化とトマト葉のイオンバランスの経時変化からCaの変化が特徴的であることが判明した。また、コーヒー葉の蛍光X線分光データから得られたイオンバランスは、養液栽培により生育状況が制御されているトマトと異なり、明らかな違いが認められた。また、色彩や形状から品質、色彩から栄養状態、分光スペクトルから含有成分や栄養状態といった解析が栽培現場レベルでも可能である事が示された。さらに、ハウス栽培では生育環境の相違が比較的少なく、均一な管理作業が行えるが、露地圃場では土壌条件・日照条件など生育環境に大きな相違が生じるため、各植物体に対する栽培管理作業も異なる事が示された。このため、精度の高い生育管理を行なうためには、生育環境情報や生育管理作業情報も植物体情報として付加しこれらの情報を加味した解析の必要性が認められた。また、果菜でも言える事であるが、特に果樹では生育履歴情報も必要であることも明らかとなった。三重大学農場を水分センサのテスト圃場として用いる一方、フィールドサーバ・MetBroker・水分センサを連携させるためのフィールドサーバ設置形態についても検討を行った。その結果、三重大学農場を無線LAN空間化することには成功し、建物内のみならず圃場を含む広い範囲でネットワーク接続可能となったため、簡単にデータ収集できるようになった。計測データの活用範囲を広げるために、フィールドサーバのWebページの本来の記述形式であるHTML形式からCSVファイルへの変換ソフトをPerlを用いて作成した.水耕栽培で得られたトマト葉、および露地栽培のコーヒー葉を対象に、可視光・中赤外光領域の分光スペクトルと蛍光X線スペクトルの取得を行った。計測データの活用範囲を広げるために、フィールドサーバのWebページの本来の記述形式であるHTML形式からCSVファイルへの変換ソフトをPerlを用いて作成した.
異常通電効果による非晶質合金の構造緩和および結晶化過程の研究

非結晶合金に電流を通じると構造緩和過程および結晶化の均一核形成過程が促進される.この現象を利用して相変態に関する原子スケールでの知見を得る目的で、非晶質Pd_<80>Si_<20>合金についてパルス通電による結晶化過程を調べた。パルス通電はジュール熱による温度サイクル効果とそれ以外の電気的・磁気的効果からなっており、前者は独立に測定した。結晶化完了温度まで連続昇温した後に得られる結晶相は主としてfccーPd(Si)とPd_3Siで文献報告と合致する。一方、結晶化初期まで一旦昇温後室温へ冷却した部分結晶試料中ではfcc-Pd(Si)とPd_3Siが主成分のように見えるが、再昇温での結晶化完了後ではfcc-Pd(Si)が消え、Pd_9Si_2とPd_3Siからなる。パルス通電では結晶化開始温度が低温側に大きく移行し部分的結晶が起き、fcc-Pd(Si)とPd_3Siに加えてbct-Pd(Si)に近いと推測される未知の結晶相が出現する。その後の通常の昇温による結晶化完了後は回折反射が鋭くなるが成分は変わらない。文献では一軸応力下では結晶化開始温度が低温側に大きく移行しfcc-Pd(Si)が主生成相になること、静水圧下では結晶化開始温度が高温側に移行しfcc-Pd(Si)とbct-Pd(Si)が生成することが報告されている。また、我々は通電により一軸性内部応力が誘起されることを報告している。以上から、電気的・磁気的効果(通電効果)は(1)昇・降温サイクル効果の顕在化を抑止しており、(2)結晶化過程を大きく加速するが従来知られている応力効果のみでは説明が付かないことが分かった。例えば、一軸応力効果として核形成が原子変位により促進され、静水圧下では拡散型の核形成過程は抑止されるなどの機構が考えられるが、通電効果では未知の機構により関連する自由エネルギーが変化している可能性がある。興味深い現象であり、この追究と機構解明は今後の課題である。
歯髄幹細胞における多分化能の解析

ラット歯髄細胞を採取しチャンバースライド上にて分化誘導した後、増殖率に対する影響について検討を行った。次に一定期間、骨髄幹細胞の方法を応用して分化誘導を行った。ヒト乳歯歯髄細胞には未分化な細胞が多く存在することが考えられることから、ヒト乳歯歯髄細胞の多分化能を解明する足がかり的な研究である。再生医療は、細胞移植・組織移植によってこれまでの医療を根本的に変革する可能性を有する新しい医療であり、その実用化は我が国の経済活性化のみならず、国民福祉の観点から極めて重要であると考えられる。今日、医科のみならず歯科の分野においても再生医療への需要が高まってきている。我が国の少子高齢化は急速にすすんでおり、それに対応して歯科の疾患構造も変わりつつある。齲蝕を代表とする感染性疾患の時代から歯周病のような変性性疾患が急増し、さらにはインプラントや審美歯科のような高度のQOLを求める医療に歯科界は対応を求められている。歯科領域での細胞を用いた再生医療としては、粘膜の再生、顎骨の再生、歯周組織の再生が試みられており、さらに歯の再生プロジェクトも開始されている。患者自身の細胞を用いて歯や歯周組織だけでなく生体組織・臓器を自在に再生させるこの技術は、これまで治療が不可能といわれてきた多くの重要課題を解決に導くことができる。本年度は、ラット歯髄細胞を採取しチャンバースライド上にて分化誘導した後、増殖率に対する影響について検討を行った。
mRNAスプライシングにおけるエキソン認識と反応制御の分子機構に関する研究

真核生物のスプライシング反応では選択的スプライシングの場合を除き、基本的に隣り合ったエキソン同士が順繰りにつなぎ合わされる(構成的スプライシング)。我々は、スプライシング反応においてエキソンをとばすことなく順次連結するメカニズムを明らかにするために、特別に設計されたレポータープラスミドを用いて分裂酵母でエキソンスキッピングを引き起こすura^+性変異株34株(内、温度感受性変異株8株)を分離した。平成20年度は、Tif213の過剰発現がどのようにods4の変異を相補したのかを調べるため、まずTif213を過剰発現させたods4からRNAを回収し、RT-PCRによってスプライシングパターンを解析した。その結果、Tif213を過剰発現させるとエキソンスキッピングが抑制されている事が分かった。さらに、Tif213の過剰発現がスタートコドンに変異のあるods4のCwf16の翻訳を促進することによって、ods4変異株の機能を相補したのではないか、という可能性を検証するため、Cwf16-FLAGと変異Cwf16-FLAGタンパク質の発現量を、Tif213を過剰発現させた場合と過剰発現させていない場合で比較した。その結果、Tif213を過剰発現させても変異Cwf16-FLAGの発現量に変化は見られなかった。これらのことから、Tif213はCwf16と直接相互作用する事によってods4の機能を相補している事が分かった。我々は、スプライシング反応においてエキソンをとばすことなく順次連結するメカニズムを明らかにするために、分裂酵母でエキソンスキッピングを引き起こす変異株を単離し、それらの原因遺伝子の同定を進めている。エキソンスキッピングをモニターするレポーター遺伝子として、ura4^+遺伝子内にβ-tubulinをコードするnda3^+遺伝子のエキソンとその両側のイントロンを挿入したプラスミドpURA4βを構築した。エキソンスキッピングが生じると正常なUra4pタンパク質が合成でき、ウラシル欠失培地でも生育可能となることを利用して、現在までに、ウラシル欠失培地で成育する温度感受性変異株ods1-1,ods1-2,ods2-1,ods3-1(ordered splicing)を分離した。これらの変異株について原因遺伝子クローニングを行った結果、ods1,2,3はそれぞれPrp2p/U2AF^<59>、U2AF^<23>、SF1タンパク質をコードしていることを明らかにした。さらに温度感受性を示さない変異株の原因遺伝子クローニングも進め、新たにods4,5を分離することに成功した。また、転写速度を遅くする薬剤(マイコフェノール酸:MPA、および6アザルラシル:6AU)を用いて、転写速度がods変異株のスプライシングにどのように影響するかを調べた。その結果、これらの薬剤を添加した培地ではods変異株におけるレポーターmRNAのスキッピング効率が減少していることが分かった。このことから、転写速度が遅くなったことによって変異SF1-U2AF複合体が3'スプライス部位をより認識しやすくなり、スキッピングが抑制されたと考えられた。以上の結果は、転写速度とスプライシングの正確性が関係していることを示唆する。平成19年度は、温度感受性を示さないura^+性変異株の中から、ods13とは相補性グループの異なる変異株を新たに分離しods4と命名した。原因遺伝子クローニングの結果、ods4はスプライシング因子Cwfl6をコードしている事を明らかにした。Cwfl6はスプライシングの第一段階において、U5snRNPとU6snRNPを安定にmRNA上に位置づける役割が示されている。さらにods4のマルチコピーサプレッサーとしてSrp2,Tif214を同定した。Srp2はSRタンパク質の一つであり、哺乳動物ではU2AFとUlsnRNPを架橋してエキソン同士を近接させる役割があると言われている。また、Tif213は翻訳開始因子の一つであるが、スプラしイングへの関与はこれまでに報告されていない。現在これらの因子について、エキソン認識機構との関連を調べている。

さらに、Tif213の過剰発現がスタートコドンに変異のあるods4のCwf16の翻訳を促進することによって、ods4変異株の機能を相補したのではないか、という可能性を検証するため、Cwf16-FLAGと変異Cwf16-FLAGタンパク質の発現量を、Tif213を過剰発現させた場合と過剰発現させていない場合で比較した。その結果、Tif213を過剰発現させても変異Cwf16-FLAGの発現量に変化は見られなかった。これらのことから、Tif213はCwf16と直接相互作用する事によってods4の機能を相補している事が分かった。
脳・神経細胞におけるインパルス・シグナリンの分子機構

本年度は第2年度ということで、当該研究は凡ね順調に進展した。主な研究成果は以下のようである。(1)ラット小脳ニュ-ロンの情報伝達系の構築を生後発達を追って、調べた。その結果キスカル酸受容体は主としてプルキンエ細胞に、そしてNMDA受容体は主に顆粒細胞層に局在することを見いだした。(吉岡)(2)走査型トンネル顕微鏡を用いて生細胞の表面のトポロジ-を観察出来た。これによりインオチャンネルや、レセプタ-の直視の可能性が生まれた。(吉岡)(3)神経伝達物質の放出の調節に関与すると思われるPAF受容体のクロ-ニングに成功した。(清水)(4)パルスレ-ザ-顕微鏡を用いることにより、リポソ-ムの膜融合の現場をリアルタイム(時間分解能100 μSec.)で撮影することに成功した。(5)2波長蛍光像を同時に、かつ連続的に観察できる顕微光学系を用いて細胞内Ca^<2+>や、pHのビデオレ-ト(毎秒)30コマの測定に成功した。(いずれも木下)(6)Furaー2を負荷した海馬スライスにおけるグルタミン酸受容体の分布の局在を検出することに成功した。また同じ切片を用いて、長期増強現象成立時の細胞内Caの上昇部位に持続性が認められた。(工藤)(7)哺乳類の脳におけるジヒドロピリジン受容体とωコノトキシン受容体は異なるCaチャネル分子であることを明らかにした。(阿部)(8)マウス小脳より2種類のグルタミン酸受容体サブユニットのCDNAをクロ-ン化しその全一次構造を明らかにした。(三品)(9)ラット脳シナプトゾ-ムから再構成した巨大ベシクルにパッチクランプを適用し、3種類のKチャネルの存在を確認した。(桐野)この他、香川のシャペロニン、日高のCaーCaMIIキナ-ゼ阻害剤の開発、久場のウシガエル交感神経節における長期増強機序の解明など、話題性のある成果が数多く得られた。
高効率加圧・熱溶媒分解によるバイオマスの生分解性プラスチック化

石油などの化石資源から作られるケミカルスや合成プラスチックは、工業、農業、生活、医療などあらゆる分野に必要不可欠な素材であるが、化石資源の枯渇と地球の温暖化が深刻化するにつれ、これらをバイオマスから体系的に生産することが強く求められている。一方、21世紀の科学を切り拓く新たな化学反応場として超臨界流体が注目を集めており、特にプロトン性溶媒が超臨界状態となることでイオン積が増大し、加溶媒分解能が付与されることが知られている。そこで本研究では、このような超臨界流体のもつ加溶媒分解能を活用して、バイオマス廃棄物などを無触媒で効率的に可溶化させ、得られた液化物から溶媒を除去した木質分解物を用いて新規なバイオプラスチックを創製することを試みた。まず、当研究室で開発済みのバッチ型及び流通型の超(亜)臨界流体処理装置を用い、その特性を引き出しながら、種々のアルコールを用いた超(亜)臨界状態でのバイオマスの高速・高効率の加溶媒分解を試みた。その結果、特にオクタノールを用いた液化物で、溶媒を除去した分解物から熱可塑性バイオ樹脂が得られた。さらに、グリセロールを用いて液化した木質分解物にエポキシ基を導入することで熱硬化性バイオ樹脂が得られることを明らかにした。これまでの超(亜)臨界流体技術によるバイオマスからのバイオ燃料や有用ケミカルスの研究では液化に主眼がおかれていたが、本研究では、加溶媒分解によるバイオマス成分の化学修飾に注目しており、高分子状態のまま熱可塑性を有する組成へと変換する点に特徴がある。今後、バイオマスを構成するセルロース、ヘミセルロース及びリグニンの超臨界流体による加溶媒分解での化学修飾状態を精査し、その化学修飾液化のメカニズムを明らかにしながら新規な生分解性バイオプラスチックの創製を進めていく。そこで本研究では、このような超臨界流体のもつ加溶媒分解能を活用して、バイオマス廃棄物などを無触媒で効率的に可溶化させ、得られた液化物から新規なバイオプラスチックを創製することを試みている。その結果得られた液化物の物性評価により、熱可塑性を有する素材に変換されていることが判明した。これまでの超(亜)臨界流体技術によるバイオマスからのバイオ燃料や有用ケミカルスの研究では液化に主眼がおかれていたが、本研究では、液化よりもむしろ高速・高効率な加溶媒分解によるバイオマス成分の化学修飾に注目しており、高分子状態のまま熱可塑性を有する組成へと変換する点に特徴がある。今後、バイオマスを構成するセルロース、ヘミセルロース及びリグニンの化学修飾(加溶媒分解)状態を個々に調査し、超臨界流体によるバイオマスの化学修飾液化のメカニズムを明らかにしながら新規な生分解性バイオプラスチックの創製を進めていく予定である。
遺伝子改変マウスを用いたヘム生合成系異常疾患遺伝子治療の基礎的研究

本研究の目的は、赤血球型5-アミノレブリン酸合成酵素(ALAS-E;遺伝子名はAlas2)の遺伝子破壊マウスを作成し、その解析を通して、ヘム合成系の疾患の病態を理解することである。この目的を達成するために、ALAS-E遺伝子破壊マウスを作成し、その解析を行った。その結果、ALAS-E遺伝子破壊マウスは胎生致死であり、死因は一次造血でのヘム合成障害による貧血によることが明らかになった。ALAS-E欠失ES細胞を含むキメラマウスでは、骨髄中にX染色体連鎖性鉄芽球貧血で高頻度に認められる環状鉄芽球が確認された。これらはALAS-E欠失ES細胞に由来するものと予想される。これらの結果は、造血組織における細胞内鉄代謝はヘムによる制御をうけていることを示すものである。次に、ALAS-E遺伝子破壊マウスに対して、ヒトのX染色体連鎖性鉄芽球貧血患者と同じALAS-E変異分子を発現するトランスジェニクマウスを作成し、それらマウスを交配した。この結果、ALAS-E遺伝子破壊マウスの表現型が部分的にレスキューされたが完全なレスキューには至らなかった。遺伝子発現制御領域としてはGATA1遺伝子の制御領域を使用したため、赤血球系細胞におけるALAS-E分子の発現については問題がないものと考えられる。したがって、ALAS-E分子の変異に起因するその活性低下により、完全なレスキューがかからなかったものと考えられる。本研究により、赤血球造血におけるヘム代謝の重要性がマウス個体レベルで明らかになった。さらに、最近に至り、ALAS-N欠失マウスの作出にも成功し、併せて、ヘム合成と鉄代謝についての解析系として有用なマウスが創出された。本年度は、x染色体連鎖鉄芽球性貧血(XLSA)の原因遺伝子であることが判明しているヘム合成系律速酵素の赤血球型5.アミノレブリン酸合成酵素(ALAS一E)の遺伝子ターゲティング実験を行い、以下のような結果が得られた。1)キメラマウスより得られALAS-E-/+(♀)へテロマウスと野生型(♂)との交配により得られるALAS-E欠失体(ALAS-E-/ly)は胎生1111.5日で死亡した。ALAS-E-/11は卵黄嚢および胎児とも蒼白で、全くヘモグロビンは観察されないものの、血管および血球は正常に認められた。組織切片におけるベンチジン染色でもヘモグロビン陽性細胞は全く観察されなかった。一方、胎児性グロビンタンパク質は免疫染色により発現を確認したことから、ALAS-E欠失マウスの死因は一次造血組織でのヘム生合成不能によるヘモグロビン欠乏性貧血と推定される。このことからハウスキーパー型アイソザイムであるALAS-Nが一次造血組織においてALAS-E機能を代償できないことが明らかとなった。2)ALAS-E-/y胎児の有核赤血球に環状鉄芽球とは異なる様態の細胞質に一様な鉄の沈着が観察された。一方、雄マウス由来のES細胞株を用いたALAS-E欠失ES細胞からキメラマウスを作成したところ、骨髄中にXLSAで観察される典型的な環状鉄芽球が確認された。ALAS-EはX染色体上にコードされており、ES細胞自体が完全なALAS-E欠失体となるため、キメラマウスのES由来細胞が環状鉄芽球となったと考えられる。このことから、一次および二次造血における細胞内鉄代謝はヘムによる制御を受けていることが示唆された。今後、ALAS-E遺伝子破壊マウスに対してヒトXLSA患者由来のALAS-E変異体を用いたレスキュー実験を行い、動物モデルの確立を目差す。