hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
日本人のスズバックグラウンド・曝露量の研究

条件:種々の灰化条件について検討したが、多数検体の灰化を行なうため、最終的に湿式灰化法により食事試料12g+硫酸0.1ml+混酸15ml+硝酸15mlを150170°Cで加熱、透明化、冷却処理後加水、総量20mlとした。さらに、米穀類などの食品、血液、尿検体の灰化の標準化を進めた。2.測定試料(灰化液)保存容器:灰化液は強酸であるため容器からの金属類汚染が懸念され、ガラス、テフロン、プロピレンなど各種容器を検討し、新プワピレン容器を10%硝酸に浸漬・純水洗浄・乾燥使用とした61CPMS用測定容器も酸処理したプロピレンを用いた。3.測定は標準添加法によった。種々検討の結果スズ0,1,2ppbの標準液を用い、インジュウム(In)5ppbを内部標準に3点補正による検量線で測定した。4.回収率:灰化液の酸濃度の影響をみるため5倍希釈から20倍希釈間でスズ添加の回収率をみた。いずれも90100%間で安定であった。5.他元素との同時測定:ICPMSは幾つかの元素を同時に測定が可能である。その利点を利用することを検討したが、現条件下では困難であった。6.実測値:日本都市幼稚園児を対象とした1日スズ摂取量は平均2.5μg、最小1.4μg、最大1092μg、中国都市部成人女子では平均57.3μg、最小0μg、最大2315μg、農村部平均3.4μg、最小0μg、最大20μgで農村部が低値であった。さらに穀類、血液、尿中の測定を検討している.【目的】これまで,金属スズや無機スズは,建材,食器,缶詰容器など日常身近にあるため,有害金属としての認識はなく,人体への取り込み,生理的関与,毒性などの研究は1970年以降の知見に乏しかった。今日,有機スズの毒性が明らかになり,日常生活での日本人のスズ曝露量について,改めて食事からの摂取量を明らかにすることを目的とした。【対象】成人男女501名と幼稚園児41名を調査対象に,陰膳法により旧食事検体を収集した。【方法】食事検体の標本を湿式灰化し,誘導結合プラズマ質量分析装置(ICP-MS)を用いて1日スズ摂取量を測定した。【成績、考察】成人の食事からのスズ摂取量は05407μg/日で,GM(GSD)は16.2(7.73)μg/日であった。この値は従来の1日摂取量14mg/日に比べ極めて低値であった。とくに検出感度2μg以下の対象者が193名(38.5%)も存在し,一方,1日摂取量が1mg以上の対象者は40名(8%)であった。男女別スズ摂取量も同様な傾向で,食事摂取量の多寡と無関係であった。幼稚園児41名では0.41055μg/日の摂取量で,GM(GSD)は10.7(10.5)μg/日あった。対象者中1mg以上摂取者は1名であった。成人対象者と同様男女間に差はなく,食事摂取量との関係は認められなかった。【結語】以上の成績から,従来報告されている,成人1日スズ摂取量14mgを満たす者は10%と少なく,高摂取者も他日での摂取量が数μgの低値であったことから,食品のスズ含有量より,摂取食品へのスズ混入,汚染などを考えるのが妥当で,これまでの報告値は大きく修正する必要があると結論した。数は少ないが幼稚園児の成績もこれを支持するものであった。なお,試料灰化に使用する酸の種類で検出感度に影響があり,精度管理をより厳密にして成績をまとめたい。食品中に多く存在するといわれるスズの測定は困難で未だ確立されたものはない。前年度までにICP-MSを用いIn(115)を内部標準としてSn(120)の測定を行いその成績を検討してきた。検査試料である食事検体のスズをカドミウム、鉛と同時測定をするためには、前処理として湿式灰化法が多数検体を処理する上で最適であることを確認した。ICP-MSによる定量は検量線法により、低濃度用(0,1,2ppb)、高濃度(0,10,20ppb)の3点法で検討したが、低濃度から高濃度まで検量腺は直線上にあり、測定試料濃度からの検討で低濃度用で測定がカバーできることを確認した。試薬ブランク灰化
成長因子を用いた低侵襲で効果の高い顔面神経麻痺救済治療の開発

現在、Bell麻痺16例、Hunt症候群10例に内視鏡下顔面神経再生術を施行している。ENoG値05%のBell麻痺症例の治癒率は、保存的治療に比べて、神経再生術を追加することで治癒率が2倍以上改善している。ENoG値05%のHunt症候群の治癒率も、保存的治療に比べて、神経再生術を追加することで神経再生術を追加することで治癒率が約2倍改善している。Bell麻痺の術後聴力は、0.5kHzから8kHzで聴力の有意な悪化を認めなかった。Hunt症候群の術後聴力は、第8脳神経症状の改善と相まって、聴力が逆に改善していた。現在までの結果から見ると、Bell麻痺・Hunt症候群重症例に対する内視鏡下顔面神経再生術は、経中頭蓋窩法や経乳突法による減荷術の手術成績の報告と遜色ない結果が得られ、かつ一番低侵襲で聴力損失もない術式である。そのため、今後非治癒例を減らすために検討されうるサルベージ治療の選択肢の一つとなると思われた。特定臨床研究の倫理審査で承認済の内容であり、今後も症例を重ねて有効性を実証していきたい。更に、新たな回復因子であるIGF-1についても、有効性を確かめる動物実験を継続している。ビデオカメラ用いた閉眼の観察・筋電図を用いた頬筋枝のCMAP測定・免疫染色による組織学的評価を行っている。現在、実験結果から有効性が確認されてきており、今後の実臨床への応用を目指して準備を進めている。良好なデータが順次出てきている。今後も検討を継続予定である。内視鏡下顔面神経再生術を更に継続し、ナンバーを増やすことで有効性の信憑性を高めたいと考えている。基礎実験も継続し、更に一層臨床応用に近づけたい。ウイルス性顔面神経麻痺の完全麻痺例に対し、ステロイド大量療法で治療を行うことが推奨され、当科においても積極的に行ってきたが、ステロイド大量療法にも限界があり、全例が治癒するわけではなく、麻痺後遺症に苦しむ患者の数が少なくない。そのため、低侵襲で効果の高い救済治療の開発が急務であり、当科では、顔面神経障害に対する神経再生の基礎的研究に取り組んでいる。モルモットの顔面神経をクランプし、顔面神経障害モデルを作製する手技を習得した。また、また、誘発筋電図にて顔面神経再生の生理学的評価を行う手技の習得や、運動評価を評価する方法の確立、病理学的な評価方法の確立を行った。現在、ゼラチンハイドロゲルを用いて、bFGF(Basic fibroblast growth factor)や、その他種々の神経再生因子を投与し、神経再生に差が生じるかどうかを、形態学的・生理学的・分子生物学的に比較検討を行っている段階である。臨床面においても、Bell麻痺重症例(ENoG値5%以下)に対して内視鏡下顔面神経再生術が開始されている、神経再生術群はステロイド大量療法単独群に比べて有意に治癒率・最終スコアの改善を認め、上乗せ効果を認めている。しかし、Hunt症候群においては上乗せ効果が明らかでない現状である。この再生術は、現在経中頭蓋窩法や経乳突法による減荷術の手術成績の報告と遜色ない結果が得られており、一番低侵襲でかつ聴力損失もない術式であることから、今後Bell麻痺重症例に対して検討されうる治療方法となると期待している。一方、Hunt症候群重症例(ENoG値5%以下)においては経中頭蓋窩法でも治癒率が低い現状にあるが、今回の再生術でも経中頭蓋窩法を上回る結果が得られておらず、Hunt症候群重症例に対する治療戦略は今後の課題であると考えている。現段階で、安定して顔面神経障害モデルを作製する手技を習得できている。また、誘発筋電図にて顔面神経再生の生理学的評価を行う手技の習得や、運動評価を評価する方法の確立、病理学的な評価方法の確立も出来ている。薬剤投与を行ってから、最終的な病理の評価まで8週以上かかるため、時間を要しているが、実験の進捗状況としては、概ね当初の予想どうりである。臨床面においても、Bell麻痺重症例(ENoG値5%以下)に対して内視鏡下顔面神経再生術が順調に開始されている。

現在、実験結果から有効性が確認されてきており、今後の実臨床への応用を目指して準備を進めている。良好なデータが順次出てきている。今後も検討を継続予定である。引き続き、、bFGF(Basic fibroblast growth factor)や、その他種々の神経再生因子を投与し、神経再生に差が生じるかどうかを、形態学的・生理学的・分子生物学的に比較検討を行っていく。また、分子生物学的検討も状況に応じて追加を検討している。その他、動物実験でも、実臨床に合わせ、神経への薬剤1週間連続投与と、ゼラチンハイドロゲルによる徐放効果との効果の違いを比較検討する予定である。臨床面においても、内視鏡下顔面神経再生術の症例数を増やして検討する予定である。内視鏡下顔面神経再生術を更に継続し、ナンバーを増やすことで有効性の信憑性を高めたいと考えている。基礎実験も継続し、更に一層臨床応用に近づけたい。当初予定していた超低温槽の購入を、他の研究者が購入してくれたため、繰り越しが生まれた。次年度は、動物実験関係費、試薬関連、神経栄養因子購入、成果の学会発表などに使用する予定である。次年度使用額欄が0より大きくなったが、1万円前後の金額である。概ね予定通りの予算で研究を行えている。翌年度も計画通りに研究を継続する予定である。
血管内皮細胞特異的アポトーシス誘導タンパク質とその受容体に関する研究

本研究では、研究代表者が出血性ヘビ毒から見いだした新規血管内皮細胞特異的アポトーシス誘導タンパク質(VAP)をもとに、生体内で血管内皮細胞のアポトーシスを制御している因子や受容体を見いだし、その構造や作用機序を明らかにすることを目的とする。本年度は、VAPcDNAのタンパク質発現系の確立及び血管内皮細胞特異的アポトーシス誘導因子受容体の検索を試みた。血管内皮細胞特異的アポトーシス誘導因子を特定するためには、VAPに共通するアミノ酸配列をもとに得られた血管内皮細胞特異的アポトーシス誘導因子の候補タンパク質の発現系を確立し、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞を用いてアポトーシス誘導活性を評価することが必要となる。そこで、血管内皮細胞特異的アポトーシス誘導因子発現系の確立を視野に入れてVAPタンパク質発現系の確立を試みた。昨年度までに大腸菌タンパク質発現系を用いてVAPの発現を試みていたが、効率的に発現誘導出来なかった。本年度は昆虫細胞発現系及びほ乳類発現系を用いてVAPのタンパク質発現条件の検討を行ったところ、昆虫細胞発現系で効率的に発現誘導する条件を決定することが出来た。現在この昆虫細胞発現系を用いてタンパク質発現させ、分離精製条件の検討を行っている。次に、血管内皮細胞特異的アポトーシス誘導因子受容体の検索を試みた。これまでの研究の結果からVAPはインテグリンなどを含む特定の膜タンパク質複合体にディスインテグソンドメインを介して結合すると考えられる。そこでVAP受容体の検索にむけて、VAPの活性阻害抗体である抗インテグリン抗体、抗CD9抗体を用いた血管内皮細胞の膜画分の免疫沈降物の解析を行ったが、受容体候補タンパク質は得られなかった。今後さらなる実験方法や条件の検討が必要である。本研究では、研究代表者が出血性ヘピ毒から見いだした新規血管内皮細胞特異的アポトーシス誘導タンパク質(VAP)をもとに、生体内で血管内皮細胞のアポトーシスを制御している因子や受容体を見いだし、その構造や作用機序を明らかにすることを目的とする。本年度は、生体内の血管内皮細胞特異的アポトーシス誘導因子の検索及びVAP cDNAのタンパク質発現系の確立を試みた。3種類のVAPはすべてメタロプロテアーゼ・ディスインテグリンファミリーに属する新規のタンパク質であるが、このファミリーの既知タンパク質には存在せず、VAPのみに共通するアミノ酸配列が見いだされている。そこで、このVAPのみに共通するアミノ酸配列をもとに、各種高等動物cDNAライブラリーから血管内皮細胞特異的アポトーシス誘導因子の候補タンパク質のcDNAを検索した。得られたcDNAの塩基配列を決定し検討した結果、血管内皮細胞特異的アポトーシス誘導因子の候補となるcDNAは得られなかった。他のメタロプロテアーゼ・ディスインテグリンファミリーやアポトーシス誘導タンパク質との比較も含めて再検索を行い、候補タンパク質を決定することを次年度以降の課題とする。血管内皮細胞特異的アポトーシス誘導因子を特定するためには、候補タンパク質の発現系を確立し、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞を用いてアポトーシス誘導活性を評価することが必要となる。そこで本年度は、血管内皮細胞特異的アポトーシス誘導因子発現系の確立を視野に入れ、VAPのタンパク質発現系の確立を試みた。まず、大腸菌タンパク質発現系を用いて完全長及びドメインを欠失させたVAPの発現を試みたが、効率的に発現誘導する条件を決定することは出来なかった。今後は昆虫細胞発現系及びほ乳類発現系を用いてVAPのタンパク質発現条件の検討を行い、血管内皮細胞特異的アポトーシス誘導因子発現系の確立に繋げたい。
プリオンタンパク質の補助レセプター機能発現機構の解明

プリオンタンパク質(PrP)はプリオン病と関連するタンパク質であるが、その機能は未知のままである。本研究ではPrPの機能を補助受容体機能と予測し、そのリガンド候補分子であるp42との相互作用を解析することを目的とした。PrPと青色蛍光タンパク質の融合タンパク質(PrP-EBFP :論文発表済)およびp42と緑色蛍光タンパク質の融合タンパク質(p42-EGFP)を作製し、両分子の相互作用について蛍光エネルギー移動法を用いて明らかにした(論文作成中)。また、p42-EGFPと抗PrP抗体を用いて、PrPとp42の細胞表面における相互作用を蛍光顕微鏡下で観察した結果、両タンパク質が共局在することが分かった(論文作成中)。また、PrPのN末端領域(アミノ酸残基23-124)を遺伝子操作的に削除したΔN-PrPのC末端にEBFPを融合したタンパク質を作製した。その融合タンパク質とp42-EGFPの相互作用について、FRETを用いて測定した結果から、両タンパク質の相互作用が特異的であることが示された。p42は運動神経系において重要な受容体発現を誘導するタンパク質であり、プリオンタンパク質がp42を本来の受容体に運搬する役割を担っていると推測できる結果を得た。本研究で明らかにしたプリオンタンパク質の機能が欠失すると、狂牛病やクロイツフェルトヤコブ病などの海面状脳症を引き起こす可能性があると予測できる。その意味でも、プリオンタンパク質の機能として、現時点で最も可能性が高い結果であると言える。BSEいわゆる狂牛病はヒトに感染する。感染したヒトでは新変異型クロイツフェルト・ヤコブ病を発症する。この種を越えて感染する疾患はプリオン病と呼ばれ、社会的にも食の不安を誘発している。その感染因子は、正常型プリオンタンパク質(PrP^C)が高次構造変換した異常型プリオンタンパク質(PrP^<Sc>)と考えられている。しかし、PrP^Cの本来の機能が不明であるために、プリオン病の発症プロセスが明確でない。本申請課題の目的は、PrP^Cの本来の機能が運動神経におけるシグナル伝達に関与している補助受容体であること、相互作用領域がPrP^CのN末端領域であることを証明することである。プリオンタンパク質のN末端領域と運動神経に関与する候補分子の相互作用について、FRET法やそれを応用したαスクリーニング法などの分子間相互作用解析法を用いて、その動力学的パラメーターを明確にする。両分子の相互作用の定量性を示すことは、両分子の特異的な相互作用の証明に繋がる。また、相互作用した分子複合体について、X線結晶構造解析法を用いて複合体構造を原子レベルで明確にする。複合体の結晶構造が明らかになれば、その相互作用部位が特定できる本年度は、FRET法に必要な分子の内、PrPのN末端側から長さを変えた分子のC末側に青色蛍光タンパク質(BFP)を付加させた6種の融合タンパク質(PrP-BFP)と候補分子のC末側に緑色蛍光タンパク質(GFP)を付加させた融合タンパク質の大腸菌発現系を構築した。PrP-BFPについて低温発現したところ、可溶性画分に全分子が発現された。現在、大量発現を行ない、精製法の確立を行なっている。一方、候補分子については発現ベクターが完成した段階で、今後発現条件を検討して行きたい。また、BFPの付加されていない組換え型PrPの発現系を構築し、低温培養する事で可溶性画分に生産した。その感染因子は、正常型プリオンタンパク質(PrP^c)が高次構造変換した異常型プリオンタンパク質(PrP^<Sc>)と考えられている。しかし、PrP^cの本来の機能が不明であるために、プリオン病の発症プロセスが明確でない。本申請課題の目的は、Prp^cの本来の機能が運動神経におけるシグナル伝達に関与している補助受容体であること、相互作用領域がPrP^cのN末端領域であることを証明することである。複合体の結晶構造が明らかになれば、その相互作用部位が特定できる本年度は、昨年度に構築したPrP-BFPとp42-GFPについて精製法の確立を行った。得られた両タンパク質を用いて、蛍光エネルギー移動法で相互作用を解析した結果、両タンパク質に融合されたBFPとGFPが34Å以内に近接することが分かった。今後は、この方法を用いて、本タンパク質問の相互作用解析について詳細に調べる予定である。

PrPと青色蛍光タンパク質の融合タンパク質(PrP-EBFP :論文発表済)およびp42と緑色蛍光タンパク質の融合タンパク質(p42-EGFP)を作製し、両分子の相互作用について蛍光エネルギー移動法を用いて明らかにした(論文作成中)。また、p42-EGFPと抗PrP抗体を用いて、PrPとp42の細胞表面における相互作用を蛍光顕微鏡下で観察した結果、両タンパク質が共局在することが分かった(論文作成中)。また、PrPのN末端領域(アミノ酸残基23-124)を遺伝子操作的に削除したΔN-PrPのC末端にEBFPを融合したタンパク質を作製した。その融合タンパク質とp42-EGFPの相互作用について、FRETを用いて測定した結果から、両タンパク質の相互作用が特異的であることが示された。p42は運動神経系において重要な受容体発現を誘導するタンパク質であり、プリオンタンパク質がp42を本来の受容体に運搬する役割を担っていると推測できる結果を得た。本研究で明らかにしたプリオンタンパク質の機能が欠失すると、狂牛病やクロイツフェルトヤコブ病などの海面状脳症を引き起こす可能性があると予測できる。その意味でも、プリオンタンパク質の機能として、現時点で最も可能性が高い結果であると言える。
ホヤのホメオボックス遺伝子

(1)胚発生の初期に発現する様なホヤのホメオボックス遺伝子を単離するため受精卵cDNAをOligonucleotideを用いスクリーニングしたところ、LIM型ホメオボックス遺伝子AHox2を単離することができた。AHox2は513アミノ酸残基、典型的な2つのLIMドメインとN末側にアスパラギン酸に富む領域を持ち蛋白をコードする。その発現レベルは受精卵、未受精卵で高く、発生の進行と共に低下する。AHox2に支配される遺伝子群の探索を試みるため、AHox2のホメオドメイン(C末の1残基を除く)と上流103残基を含むcDNA部分をT7の系で発現させ、部分精製した。このホメオドメイン蛋白質はNP配列に対して配例特異的なDNA結合活性を示した。(2)ホヤでは発生初期には脊索が形成され、幼生期までそれが保持される。しかし、やがて起こる変態とともに脊索は消失し、神経系や消化器系の再構築が行われ、体軸や90度回転する。このような発生経過をたどるホヤで、どのような種類のホメオボックス遺伝子が存在するのか、また特異な発生経過が、とくに体軸に沿った領域の決定に関わっていると考えられるHox型ホメオボックス遺伝子群の構造や発現に反映されているのかどうか、興味が持たれる。マボヤゲノムに対しPCRを行なったところ、少なくとも6種のHox型ホメオボックス遺伝子断片が検出された。その中には脊椎動物のものでは見られないイントロンで分断されたホメオボックスを持つものが複合含まれている。またそれらの発生過程での発現を調べてみると、変態後一過的に検出されるものはあるが、現在のところ、初期発生では検出されていない。
動的計画的手法による経路依存型制御の研究

前年度に引き続き、経路依存システムにおける微分ゲームに現れる経路依存型Isaacs偏微分方程式が2次増大の非線形性を持つ場合に、解の離散時間近似の研究を行った。前年度までの研究結果は、システムやコストにL2連続性を課していたため、応用上しばしば現れる離散時間遅れやランニング・マキシマムに依存する場合が含まれていなかった。今年度は上述のケースを含むL∞連続性まで条件を緩和して、離散時間値関数が経路依存型Isaacs偏微分方程式の一意的な粘性解に収束することを証明した。これにより、多様な経路依存構造を持つシステムに対するIsaacs方程式の近似理論の基礎が与えられた。さらにマルコフ的システムにおける線形2次制御を基盤とする冪等代数的手法を経路依存システムに対して発展させることで、現実的に実行可能な数値スキームの開発が見込まれる。連続時間経路依存型確率制御の研究は、後退確率微分方程式や経路依存型粘性解などの先端的理論が必要となり、経路依存型リスク鋭感的確率制御の研究に必要なそれらの理論は発展途上である。まずは経路依存型リスク鋭感的制御における動的構造を見極めるため離散時間問題を考えた。以前行っていた未完の部分可観測問題を再考し、部分可観測離散時間経路依存型リスク鋭感的制御問題をinformation stateと呼ばれる十分統計量に関する完全可観測問題として定式化できることを示した。経路依存型リスク鋭感的確率制御における離散時間ダイナミクスの発見は、今後行う予定の連続時間問題の研究に大きな知見を与えると考えられる。経路依存システムに対する正則性をより一般的な正則性まで緩和することができ、決定論的経路依存型動的計画方程式の研究は予想以上に進展している。一方、前出の研究に時間を費やしたため、冪等代数的手法やリスク鋭感的確率制御の研究の準備・開始に若干の遅れを生じている。連続時間経路依存型リスク鋭感的確率制御の研究を開始する。まずは2次増大後退確率微分方程式の最新の知見がリスク鋭感的確率制御問題に適用可能かどうかを吟味し、先行研究の拡張を試みる。また、2階経路依存型偏微分方程式の粘性解理論の最近の発展を踏まえ、経路依存型リスク鋭感的確率制御に現れる経路依存型Bellman方程式の解析的な特徴付けに関する研究を行う。前年度までに決定論的経路依存型動的計画偏微分方程式の離散時間近似に関する基礎理論を構築した。経路依存型線形2次制御の明示解を利用した経路依存型動的偏微分方程式に対する冪等的手法の可能性を探る。今年度は、経路依存型決定論的制御における動的計画方程式の基礎研究を行った。具体的には経路空間におけるi-smooth calculusやそれに基づく粘性解型の弱解を用いて、応用上重要とされる非有界な制御領域やコストを伴う経路依存型動的計画偏微分方程式の研究を行った。まずは、微分ゲームにおける経路依存型Isaacs偏微分方程式に対して非線形項が2次増大性を持つ場合、離散時間経路依存動的ゲームが経路依存型Isaacs偏微分方程式の粘性解に収束することを示した。経路依存型Isaacs偏微分方程式は無限次元経路空間上で定義されるため解を求めるのは困難である。一方で離散時間動的ゲームは有限次元空間の問題であるので、本研究は経路依存型方程式の有限次元空間上の近似理論を与える。また、先の2次増大条件は明示解が知られてる線形システムを含むため、この明示解を組み合わせた数値解法への展開が期待される。また、Mogulskiiの定理や動的重点サンプリング法に関連する経路依存終末コストを持つ変分問題の研究を行った。Mogulskiiの定理に現れる変分問題のLagrangianは凸で、1次より速いスピードで無限大に発散する(super linear)。本研究でLagrangianが凸でsuper linearの場合、経路依存終末コストを持つ変分問題を経路依存型動的計画問題の値関数とみなし、それを経路依存終末条件を持つHamilton-Jacob偏微分方程式の粘性解として特徴づけることに成功した。これにより、Mogulskiiの定理における収束レートを原理的にはHamilton-Jacobi偏微分方程式を通じて解析的な量として計算できる。また動的重点サンプリングに対しては、Hamilton-Jacobi偏微分方程式の(近似)解を用いた動的サンプリングスキームの構成法への道が開ける。今年度計画していた非線形項が2次増大を持つ場合の経路依存型動的計画偏微分方程式に関しては、当初想定していた手法により順調に研究成果が得られた。研究集会や国際会議に参加しての情報収集は若干遅れているが、独自に文献等により情報を集めている。

まずは経路依存型リスク鋭感的制御における動的構造を見極めるため離散時間問題を考えた。以前行っていた未完の部分可観測問題を再考し、部分可観測離散時間経路依存型リスク鋭感的制御問題をinformation stateと呼ばれる十分統計量に関する完全可観測問題として定式化できることを示した。経路依存型リスク鋭感的確率制御における離散時間ダイナミクスの発見は、今後行う予定の連続時間問題の研究に大きな知見を与えると考えられる。経路依存システムに対する正則性をより一般的な正則性まで緩和することができ、決定論的経路依存型動的計画方程式の研究は予想以上に進展している。一方、前出の研究に時間を費やしたため、冪等代数的手法やリスク鋭感的確率制御の研究の準備・開始に若干の遅れを生じている。経路依存型リスク鋭感的確率制御の研究と、経路依存型動的計画方程式の数値解析に向けた研究に重きをおいていく。経路依存型リスク鋭感的確率制御に研究に対しては後退確率微分方程式の知見が重要である。これに関する情報収集はまだ十分でないが、必要ならば国際会議や研究集会等に参加し情報収集に努めながら研究に着手する。また連続時間問題の理解のため、場合によっては離散時間の問題にも取り組む。経路依存型動的計画方程式の数値解析には、通常の動的計画方程式と同様にmax-plus的手法が有効であることが期待できる。max-plus代数の研究者と意見交換をしながら、max-plus的手法の可能性を探る。また、max-plus的手法に関連する制御問題も必要に応じて取り組む連続時間経路依存型リスク鋭感的確率制御の研究を開始する。まずは2次増大後退確率微分方程式の最新の知見がリスク鋭感的確率制御問題に適用可能かどうかを吟味し、先行研究の拡張を試みる。また、2階経路依存型偏微分方程式の粘性解理論の最近の発展を踏まえ、経路依存型リスク鋭感的確率制御に現れる経路依存型Bellman方程式の解析的な特徴付けに関する研究を行う。前年度までに決定論的経路依存型動的計画偏微分方程式の離散時間近似に関する基礎理論を構築した。経路依存型線形2次制御の明示解を利用した経路依存型動的偏微分方程式に対する冪等的手法の可能性を探る。当初予定していた情報収集を目的とした研究集会に参加できなかったため、その旅費が計上されなかった。それを埋め合わせるべく今年度は国際会議や研究集会等に多く参加する予定である。冪等的手法の研究のなどの遅れに関連し、購入予定の計算機の調達が遅れたため使用額に差額が生じた。翌年度、計算機を購入し関連する研究を進める。
非B非C肝癌におけるHBV-DNA組込みの影響に関する研究

本研究では(1)非B非C肝細胞癌治療後再発におけるHBc抗体陽性の影響、(2)非B非C肝細胞癌発生に関する危険因子、(3)HCV関連肝細胞癌発生に関するHBc抗体の影響を調べたが、いずれもHBc抗体陽性は有意な危険因子とならず、HBV既感染は大きな影響を与えていないと考えられた。また、HBV関連肝細胞癌の再発に関して、初発癌と同様にHBV-DNA量が関与することが示された。本年度は非B非C肝癌の治療後再発について、HBc抗体陽性によって示されるHBV感染既往が影響を与えるか否かを検討した。HCV抗体陰性かつHBs抗原陰性で、アルコール多飲歴のない初発肝細胞癌患者62名において、根治的ラジオ波焼灼療法後の肝癌再発状況を調べ、再発に関するリスク因子を検討した。患者の初回治療時平均年齢は68.7歳で、男性が40名(65%)を占めた。HBc抗体は18名(29%)で陽性であった。観察期間中に26名に肝癌再発を認めた。Cox比例ハザードモデルを用いて解析すると、年齢(1歳につきハザード比1.07、95%信頼区間1.03-1.13)と膀の高さのCT画像上で計測された内臓脂肪面積(10cm^2につきハザード比1.08、95%信頼区間1.01-1.17)が統計学的に有意な肝癌再発リスク因子となった。HBc抗体陽性(単変量解析でハザード比1.68、95%信頼区間0.67-4.18)は有意ではなかった。本研究の対象となった肝癌患者はNASH(非アルコール性脂肪肝炎)が発癌の原因として疑われる集団であり、また、今回の解析で得られたリスク因子からみて、再発肝癌は主として異時性多中心性発癌であると考えられる。したがって、新規の非B非C肝癌発癌リスクと同様の傾向にあると考えられるが、これについてHBV感染既往の有無は大きくは寄与していないことが示唆された。一方、内藏脂肪が有意なリスク因子であることが示され、非B非C肝癌においては内臓脂肪にかかわるアディポサイトカインやインスリン抵抗性などのメタボリックな要素が発癌に関与している可能性が示唆された。わが国におけるHCV-RNA陽性、HBs抗原陰性のHCV関連肝癌症例においてはHBc抗体陽性率が高く、HBV感染既往ないしHBVのoccult infectionがHCV関連肝発癌のリスク因子である可能性が議論されてきた。今回、1262名のHBs抗原陰性C型慢性肝炎患者を追跡観察したところ、1994年からの10年間で339名に肝癌が発生していた。HBc抗体は522名(41.4%)で陽性であり、3、5、10年累積発癌率はHBc抗体陽性者で12.7%、24.5%、41.9%、HBc抗体陰性者で10.6%、17.7%、33.4%であり、発癌率は前者で有意に高かった(P=0.005)。しかしながら、HBc抗体陽性率は男性、高齢者で高く、これらは肝発癌リスク因子であることが知られている。多変量解析を行うとHBc抗体陽性の肝発癌に関するハザード比は1.06(95%信頼区間0.85-1.31)であり、リスク因子として有意ではなかった。なお、HBV-DNAはいずれの患者血清からも検出されなかった(リアルタイムPCR法)。サブグループ解析を行うと、60歳以下の男性に限ってHBc抗体陽性者に肝発癌が多い傾向がみられた(P=0.092)。HBV既感染者において増殖能を有するHBVが肝細胞内に残存し、免疫抑制状態において再活性化する可能性のあることが知られている。しかし、今回の検討において、通常の経過におけるHBV既感染に由来する肝発癌リスクは、たとえあったとしても、C型慢性肝炎患者が元々有する発癌リスクを有意に左右するほどの大きさではないことが確認された。昨年度までにHCV感染者において、HBV感染既往を示すHBc抗体陽性は肝細胞癌の有意な危険因子とはならないことを示したが、H22年度は非B非C肝障害における発癌危険因子について広く検討した。ALTが持続的に高値である非B非C肝障害患者163名において平均6年の観察にて17名に肝細胞癌が発生した。多変量解析では高齢、糖尿病の併存、および超音波検査上の脂肪肝所見の欠如が発癌に関する有意な危険因子であった。時間依存性共変量を用いた解析では、脂肪肝所見の消失により肝細胞癌ハザード比が9.6と上昇することが示された。脂肪肝所見の消失は血小板数の減少など肝障害の進行を示唆する変化を伴っていた。また、HBV関連肝細胞癌の治療後再発と血中HBV-DNA量との関係については、ラジオ波焼灼療法により初発病変が根治された69名について調べた。

累積肝癌再発率は1、3、5年でそれぞれ26.5%、57.8%、74.3%と高頻度であった。多変量解析では初発肝癌の病変数(リスク比4.6)、トロンビン時間(リスク比3.4)とならんでHBV-DNA量(リスク比2.7)が再発の有意な危険因子であることが示され、初発肝癌と同様に再発肝癌についてもHBVのウイルス量がリスクを反映することが示された。
多変量解析による脳内代謝物の拡散・濃度及び緩和時間情報

臨床用MRI装置を使用し、proton MR spectroscopyにて脳内代謝物を測定し、それぞれの代謝物の濃度、拡散能及び緩和時間情報を測定した。それぞれについて多変量解析の手法を用いて検討を行い、それぞれの情報の臨床有用性について検討した。1)正常者による代謝物濃度の年齢変化:20歳から75歳までの正常ポランティアに対して、定量化protonMRSの測定を行い、それぞれの代謝物濃度について検討した。年齢による変化を検討するために共分散分析を多変数について行うMultiple analysis of covariance(MANOVA)の手法を中心にSpermanの相関係数及び因子分析を施行した。その結果、レンズ核及び前頭葉でNAAについてのみ年齢変化の違いが認められ、レンズ核において年齢とNAA値の低下との間に相関が認められ、前頭葉では年齢とNAAとの間に有意な相関は見られなかった。これは、アルツハイマー病における前頭葉でのNAAの低下と対照的であり、加齢に伴う代謝物変化は疾患による変化と区別しうることが示唆された。2)自閉症患児における代謝物変化:脳内各部位における年齢変化が正常者と自閉症とで異なるか検討した。年齢により正常者も自閉症もNAAの濃度の上昇が認められたが、ウエルニッケ野と頭頂葉とでNAA濃度に有意差が認められた。緩和時間は両者で有意差がなく、ほぽ同様の値であった。前頭葉や帯状回、脳幹においては有意差は認めなかった。3)慢性脳虚血における血流と代謝物との比較:慢性脳虚血においてはNAAの代謝物濃度の加齢による変化が消失し、正常よりも低値をとることが多かった。しかし血流とは必ずしも相関せず、以前の虚血のメモリー情報をNAAは提供する可能性が考えられた。代謝物拡散能は水とほほ同様の傾向であった。以上のようにNAA濃度は加齢により変化するが、MRIで異常を呈しない疾患においても加齢性変化を逸脱する変化が認められ、臨床診断や病態の検討に有用と考えられた。(正常者における加齢性変化と部位との相関)正常者におけるNAA,Cr及びChoの代謝物濃度について年齢及び部位との相関性の検討をANCOVA,MANOVA及び因子分析を中心に施行した。ANCOVAではレンズ核においてNAA濃度と年齢に有意差が認められ、前頭葉では認めない。MANOVAにより前頭葉とレンズ核部の加齢に伴うNAA濃度変化に有意差が認められた。レンズ核における因子分析でNAA,Cr,Choを年齢の説明変数とすると80%が可能であるのに対し、前頭葉では40%と低値であり、代謝物濃度の加齢変化はレンズ核で相関性が高いと考えられた。(拡散能に関する検討)脳腫瘍患者における代謝物拡散能の検討では、NAA,Crの拡散能は正常者と大差なく、平均では軽度の低下が認められたが、水拡散能は著名な上昇をみとめ代謝物と水とでは異なる拡散能をとることが示唆された。(まとめ)今回は正常者を中心に測定方法の確認と統計処理を試みた。この結果は疾患による変化のベースラインデータとして使用することができる。加齢性変化と部位による検討では、正常老化の脳局所における相違を反映するのではないかと考えられた。拡散脳についても新たな臨床的パラメータとなりえる可能性が考えられる。

1)正常者による代謝物濃度の年齢変化:20歳から75歳までの正常ボランティアに対して、定量化proton MRSの測定を行い、それぞれの代謝物濃度について検討した。年齢による変化を検討するために共分散分析を多変数について行うMultiple analysis of covariance(MANOVA)の手法を中心にSpermanの相関係数及び因子分析を施行した。その結果、レンズ核及び前頭葉でNAAについてのみ年齢変化の違いが認められ、レンズ核において年齢とNAA値の低下との間に相関が認められ、前頭葉では年齢とNAAとの間に有意な相関は見られなかった。これは、アルツハイマー病における前頭葉でのNAAの低下と対照的であり、加齢に伴う代謝物変化は疾患による変化と区別しうることが示唆された。2)自閉症患児における代謝物変化:脳内各部位における年齢変化が正常者と自閉症とで異なるか検討した。年齢により正常者も自閉症もNAAの濃度の上昇が認められたが、ウエルニッケ野と頭頂葉とでNAA濃度に有意差が認められた。緩和時間は両者で有意差がなく、ほぼ同様の値であった。前頭葉や帯状回、脳幹においては有意差は認めなかった。3)慢性脳虚血における血流と代謝物との比較:慢性脳虚血においてはNAAの代謝物濃度の加齢による変化が消失し、正常よりも低値をとることが多かった。しかし血流とは必ずしも相関せず、以前の虚血のメモリー情報をNAAは提供する可能性が考えられた。代謝物拡散能は水とほぼ同様の傾向であった。以上のようにNAA濃度は加齢により変化するが、MRIで異常を呈しない疾患においても加齢性変化を逸脱する変化が認められ、臨床診断や病態の検討に有用と考えられた。
高等教育費の費用負担に関する政策科学的研究

わが国における高等教育は私立セクターの拡大によって成長し、その結果、教育費の負担は政府よりも家計にその多くを依存してきた。この傾向は1980年以降一層顕著になり、家計の教育費負担は高まるばかりである。ところが、高等教育の政府負担を増やすという政策が選択される社会的雰囲気は存在せず、国立大学の私立化が着実に進みつつある。現状の選択が賢明であるかどうかについては、かなり疑問が残る。現在大学改革がブームになっているが、改革の問題と教育費のあり方の関係を捉えた議論は殆どみられない。費用の問題を抜きにした政策論議は無力であると私達は考えて、教育費の実態とその政策的含意を大きく次の三点から分析した。(1)授業料は何によって決まるか。国立大学と私立大学に分けて、授業料の推移とその規定要因を実証的に分析しただけでなく、政策理念と政治過程を踏まえた検討を行った。(2)奨学金政策は機会の均等化に役立っているか。学部の奨学金だけでなく、大学院を視野にいれて、この分野で充実した成果を上げているアメリカとの比較から分析・検討した。(3)大学類型によって家計所得はどのように異なっているか。国公立と私立、自宅と下宿という選択によって、教育費及び生活費は大きく異なってくる。この差異が家計所得別の大学選択にどのような影響を与えているかを実証的に分析し、国立大学が教育機会の平等化に果たしている役割を明らかにした。最後にこうした分析結果を踏まえて、今後の研究課題を指摘した。現在高等教育は、一つの転換期を迎え、国立、公立、私立というセクター別の役割が不明確になりつつあるし、専門学校、短大、学部、大学院という区別も流動化しつつある。その結果、従来の資金調達方式では新しい高等教育システムの変化に適応できなくなっている。こうした変化に即して、高等教育システムを支える費用負担のあり方を再編すべき時期にきている。本年度は、三年継続研究の初年度にあたり、研究枠組みの構築とデ-タ収集を主たる目的とした。1.全体の研究会を開催し、全体の研究計画および対象領域を確定し、各自の分担テ-マを設定した。大きく、家計セクタ-・大学セクタ-・政府セクタ-の三つに分け、家計に焦点をあてた教育費分析グル-プ、大学の行動を収入・支出から分析するグル-プ、政府の役割を分析するグル-プに分けて検討を深めることにした。2.先行研究のレビュ-を中心としたサブテ-マ別の研究会を行い、資料の収集とデ-タの部分的入力を行った。3.大学といっても、その性格は多様なので、マクロなデ-タ分析と並行して、個別の特色のある大学についての事例研究を来年以降に実施することを確認した。4.日本の特色を明らかにするたろに、戦前の大学および外国の実態を踏まえた分析を行うことにし、そのための部分的資料収集を行った。5.マクロ分析と個別ケ-スの関連を明らかにするためには、文部省調査の個表分析が有効なので、そのデ-タ利用が可能な場合どの様な分析ができるかについて検討した。来年度にその分析が可能になれば、かなり有力な政策研究になると考えている。教育費の費用負担について、次の三点からの分析と検討を深めた。(1)授業料の適正基準に関する分析。これについては、国立大学と私立大学に分けて各々の特性を明らかにするように努めた。国立大学の授業料を考えるには、なぜ国立大学であるかという、教育的、政策的判断の根拠を明らかにしなければならない。この理念的整理と実態を比較して、現状の問題点を把握した。合わせて、国立大学の教育コストを推計し、大学院および研究の費用を考慮すると、教育サービスに見合う負担説(対価説)からみても、現状の授業料が安いとはいえないことを暫定的に示した。私立大学については、大学別に教育環境変数と授業料についてのデータを収集し、授業料決定のメカニズムを分析した。現在のところ、1.固定費用で決まる大学群と入試難易度等の変数を考慮して選択的に決めている大学群の二つがあること、2.関西と関東などの地域的差異、および3.女子学生比率による影響があることなどが明らかになりつつある。(2)奨学金の効果的配分に関する分析。この点については、アメリカの奨学金および授業料のデータおよび研究をレビューしながら、わが国の現状と問題点を把握した。合わせて、大学院生に対する助成も国際比較を踏まえて、検討しつつある。(3)学生生活費の分析。家計調査および学生生活調査のデータを用いて、家計の所得と教育費の関係を、機会均等政策の関係から分析した。80年代以降の消費行動の変化と家計調査の問題点を考慮すると、今までの研究結果が不安定であることを明らかにした。今後、大学グループ別の家庭教育支出、収入、奬学金受給率、アルバイト率などの分析を通じて、機会均等と教育政策の関係を明らかにする予定である。以上を包括して、授業料と奨学金を戦後の教育政策全体の枠組みの中に位置づけ、教育費政策の変遷と特質を追跡する研究も同時に行った。

現在大学改革がブームになっているが、改革の問題と教育費のあり方の関係を捉えた議論は殆どみられない。費用の問題を抜きにした政策論議は無力であると私達は考えて、教育費の実態とその政策的含意を大きく次の三点から分析した。(1)授業料は何によって決まるか。国立大学と私立大学に分けて、授業料の推移とその規定要因を実証的に分析しただけでなく、政策理念と政治過程を踏まえた検討を行った。(2)奨学金政策は機会の均等化に役立っているか。学部の奨学金だけでなく、大学院を視野にいれて、この分野で充実した成果を上げているアメリカとの比較から分析・検討した。(3)大学類型によって家計所得はどのように異なっているか。国公立と私立、自宅と下宿という選択によって、教育費及び生活費は大きく異なってくる。この差異が家計所得別の大学選択にどのような影響を与えているかを実証的に分析し、国立大学が教育機会の平等化に果たしている役割を明らかにした。最後にこうした分析結果を踏まえて、今後の研究課題を指摘した。現在高等教育は、一つの転換期を迎え、国立、公立、私立というセクター別の役割が不明確になりつつあるし、専門学校、短大、学部、大学院という区別も流動化しつつある。その結果、従来の資金調達方式では新しい高等教育システムの変化に適応できなくなっている。こうした変化に即して、高等教育システムを支える費用負担のあり方を再編すべき時期にきている。わが国における高等教育は私立セクターの拡大によって成長し、その結果、教育費の負担は政府よりも家計にその多くを依存してきた。この傾向は1980年以降一層顕著になり、家計の教育費負担は高まるばかりである。ところが、高等教育の政府負担を増やすという政策が選択される社会的雰囲気は存在せず、国立大学の私立化が着実に進みつつある。現状の選択が賢明であるかどうかについては、かなり疑問が残る。
シリル(シリレン)錯体を介した官能性ヒドロシランの立体特異的な重合反応の開発

本研究の最終目標は,ケイ素上に脱離可能な官能基Xをもつ第3級シランHSiR_2Xの脱HXによる縮合重合反応を,後期遷移金属錯体を触媒として行うことである。アルコキシシランは合成・取り扱いが容易であることから,HSiR_2OR'の形のシランと種々の遷移金属錯体との反応を重点的に検討した。Fe(CO)_5とHSiR_2OR'(R=Me,Ph,OMe;R'=アルキル,アリール)との光反応では,'予想とは異なり,遊離のHOR'の生成は観測されず,SiR_2(OR')_2が高収率で生成した。同様の反応をHMPA存在下で行うとFe(CO)_4(=SiR_2・HMPA)が生成したことから,触媒活性種としてシリレン錯体Fe(CO)_4(=SiR_2)が発生していると推定される。Fe(CO)_4(SiR_2OR')_2からSiR_2(OR')_2が脱離してFe(CO)_4(=SiR_2)が発生する機構が有力である。またRu3(CO)_<12>,RhCl(PPh_3)_3,PtMe_2(PEt_3)_2等他の後期遷移金属錯体とHSiR_2OR'との反応でもSiR_2(OR')_2が生成物となることが分かった。この反応形式はこれまで注目されていなかったが,本研究によって,置換基や金属によらない一般性があり,シリレン錯体の生成と関連する可能性が高いことが明らかになった。シリレン錯体からのシリレン放出,またはさらなるHSiR_2Xとの反応によるシリル(シリレン)錯体の形成を経て重合体(SiR_2)_nが生成するという機構が仮定されていることから,この結果によってHSiR_2OR'の重合の現実味がさらに増した。良好な触媒の存在は十分に期待できる。
舞台芸術活動における聴覚障害者アクセシビリティ向上に向けた舞台手話通訳分析研究

本研究では、舞台手話通訳に焦点を当て、その専門性を身につけるための具体的方策を明らかにすることを目的としている。なお、本研究は文化芸術活動に特化した手話通訳者をゼロから養成するものではなく、基本的な手話通訳技術を身につけた者を対象とし、具体的には都道府県等に登録する手話通訳者もしくは手話通訳士の資格を有する者が基本的な技術に加えて舞台手話通訳に特化した技術の習得を目指すものである。舞台手話通訳経験のある手話通訳者と、未経験者の双方が行った舞台手話通訳について言語学的に分析するとともに、舞台手話通訳の先進国の視察調査を行なう。
消化管上皮細胞をターゲットとした遺伝子デリバリーシステムの開発

小腸をはじめとする消化管粘膜は極性を有する上皮細胞で覆われており、広大な表面積を持つと共に、投与の簡便な部位として遺伝子治療の格好のターゲット組織と考えられる。消化管上皮細胞に分泌性の生理活性タンパク質をコードした遺伝子を極性をもつこの細胞に導入し、発現させた後方向選択的に分泌させることができれば、新しいタンパク質医薬品のデリバリー戦略として意義深いものと考えられる。そこで本研究では、消化管上皮細胞に分泌性タンパク質の遺伝子を導入させることによるデリバリーの可能性を検討する目的で、種々の生理活性を有するインターフェロン-β(IFN-β)の遺伝子をモデルとして選択し、培養細胞を用いた検討を行った。実験には、ヒト大腸癌由来で培養初期にはcrypt様の性質を有し、培養日数の経過と共に小腸のvilliに存在する細胞に分化することの知られているCaco-2細胞を用い、マウスおよびヒトIFN-βの遺伝子導入実験を行った。また比較のため、皮膚上皮細胞Pam-T、腎上皮細胞MDCKおよびLLC-PK1を対象に取り上げ、同様の検討を行った。Transwell上で培養した系を用いてカチオン性リポソームによるトランスフェクション実験を行い一時的な発現を検討したところ、IFNの種に関わらずLLC-PK1を除く3種の細胞において遺伝子導入を行った方向に選択的に活性を保持したIFN-βが分泌されることが明らかとなった。さらに興味深いことに、Pam-T細胞において両方向から種の異なるIFN-β遺伝子を同時に導入したところ、添加した種のIFN-βが導入を行った方向に優先的に分泌された。一方、各細胞についてマウスおよびヒトIFN-β安定発現株を作製し、構成的分泌を解析した結果、用いた4種いずれの細胞においても各IFN-βは、頂側膜側および側底膜側にほぼ均等に分泌されてくることが明らかとなった。以上、本研究では消化管をはじめとする上皮細胞をターゲットとした遺伝子デリバリーのアプローチにおける有用な基礎的情報を得ることができた。消化管上皮細胞に遺伝子を導入することで得られる薬物治療上の利点はいくつか考えられるが、とりわけ分泌性の生理活性タンパク質をコードした遺伝子を極性をもつこの細胞に導入・発現させることができれば、消化管管腔内の局所あるいは全身へのタンパク質医薬品のデリバリーが可能になると考えられる。しかしながら、消化管粘膜上皮細胞を対象にした遺伝子導入法に関してはほとんど検討が加えられていないのが現状である。そこで本研究では、消化管上皮細胞に薬物治療上有用と考えられる分泌性タンパク質の遺伝子を導入・発現させるためのデリバリーシステムを確立する目的で、消化管免疫にも関与していることが知られているサイトカイン、インターフェロン-β(IFN-β)の遺伝子をモデルとして取り上げ、培養細胞を用いた検討を行った。実験には、ヒト大腸癌由来で培養初期にはcrypt様の性質を有し、培養日数の経過と共に小腸のvilliに存在する細胞に分化することの知られているCaco-2細胞を用いた。カチオン性リポソームを用いてトランスフェクション実験を行ったところ、Caco-2細胞より活性を保持したIFN-βが分泌されることが示され、消化管上皮細胞への遺伝子導入が可能であることが示された。さらに、発現タンパクの分泌方向性を解析するためCaco-2細胞のIFN-β安定発現株を作製した。

得られた細胞をTranswell上で培養した系を用いて解析した結果、IFN-βは、頂側膜側および側底膜側にほぼ均等に分泌されてくることが明らかとなった。以上のように、消化管上皮細胞をターゲットとした遺伝子治療を実現するための有用な基礎的知見が得られた。小腸をはじめとする消化管粘膜は極性を有する上皮細胞で覆われており、広大な表面積を持つと共に、投与の簡便な部位として遺伝子治療の格好のターゲット組織と考えられる。消化管上皮細胞に分泌性の生理活性タンパク質をコードした遺伝子を極性をもつこの細胞に導入し、発現させた後方向選択的に分泌させることができれば、新しいタンパク質医薬品のデリバリー戦略として意義深いものと考えられる。そこで本研究では、消化管上皮細胞に分泌性タンパク質の遺伝子を導入させることによるデリバリーの可能性を検討する目的で、種々の生理活性を有するインターフェロン-β(FN-β)の遺伝子をモデルとして、培養細胞を用いた検討を行った。昨年度は消化管上皮細胞Caco-2を用いマウスIFN-βの遺伝子導入実験を行ったが、本年度はこれに加え皮膚上皮細胞Pam-T、腎上皮細胞MDCKおよびLLC-PK1を対象に取り上げ、マウスおよびヒトIFN-β遺伝子を用いた。Transwell上で培養した系を用いてカチオン性リポソームによるトランスフェクション実験を行い一時的な発現を検討したところ、IFNの種に関わらずLLC-PK1を除く3種の細胞において遺伝子導入を行った方向に選択的に活性を保持したIFN-βが分泌されることが明らかとなった。さらに興味深いことに、Pam-T細胞において両方向から種の異なるIFN-β遺伝子を同時に導入したところ、添加した種のIFN-βが導入を行った方向に優先的に分泌された。一方、各細胞についてマウスおよびヒトIFN-β安定発現株を作製し、構成的分泌を解析した結果、用いた4種いずれの細胞においても各IFN-βは、頂側膜側および側底膜側にほぼ均等に分泌されてくることが明らかとなった。以上の知見は、上皮細胞をターゲットとした遺伝子デリバリーのアプローチにおける有用な基礎的情報と考えられる。
腸内フローラ変動による自然免疫応答と消化管運動との連関機構の解明

本年度は、Germ freeマウス消化管における、自然免疫応答の異常の有無について解析した。SPFマウス結腸にLPSを曝露すると蠕動運動の顕著な抑制が認められる。この蠕動運動抑制は消化管筋層部の常在型マクロファージがTLR4を介してLPSを認識し、COX-2とiNOSを誘導し産生されるNOが蠕動運動抑制を引き起こすことが示唆された。一方、Germ freeマウス結腸においてはLPSによる蠕動運動抑制は認められず、TLR4を介したiNOS誘導系が不活性化されている可能性が示唆された。事実、LPS刺激によるTLR4のmRNA発現増加はSPF結腸マウスのみで認められ、Germ freeマウス結腸では認められなかった。さらに産生されるNOに対する感受性について検討したところ、NOドナーであるNOR1による蠕動運動振幅の抑制、ならびにニトロプルシドによる結腸輪走筋収縮抑制はSPFマウスで顕著であり、Ger freeマウスで感受性が低下している事が示唆された。すなわち、Germ freeマウス結腸平滑筋細胞においてはNOに対する感受性が低下していることが明らかになった。一方、蠕動運動反射の蠕動回数は神経とICC機能の指標となるが、蠕動運動反射の回数においてはNOドナーであるNORIによる抑制作用はSPFマウス結腸とGerm freeマウス結腸の間に差は認められず、両者ともにNOR1によって同程度蠕動運動反射の抑制が認められた。すなわち、神経とICCの機能もNOに対して抑制性に作用するがGerm freeマウスにおいてのその感受性は変わらないことがわかった。以上の成績から、無菌環境下の消化管はLPSに対する感受性が単に低下するだけでなく、平滑筋細胞のおいてはLPS/TLR4シグナルの下流に存在するiNOS/NO系の不活性化が生じることがわかった。本年度は無菌マウス(10-12週齢)を用いて、無菌状態で飼育されたマウスの消化管(結腸)形態がどのように変化するのか、また、運動生理機能にどのような変化が生じるのかについて検討した。まず、消化管運動を制御する筋層間壁内神経叢、粘膜下神経叢、カハールの介在細胞ネットワークについて、それぞれPGP9.5とckit抗体を用いて免疫染色学的解析を行った。結果、12週齢の無菌マウスにおいては、筋層間壁内神経叢とカハール介在細胞によるネットワークには形態学的異常はみとめられなかった。また、平滑筋層においても、内輪走筋層、外輪走筋層ともに正常マウスとの間に有意な形態学的相違は認められなかった。さらに、筋層部における常在型マクロファージの形態と細胞数についてもF4/80抗体を用いて解析した。結果、無菌マウスにおいても正常マウスと同等の筋層部常在型マクロファージが分布していることがわかった。次に生理学的パラメーターとして、摘出平滑筋条片(輪走筋条片)を用いた平滑筋収縮測定と摘出結腸を用いた管腔内圧刺激誘発蠕動運動反射測定を行った。結果、無菌マウスから摘出した平滑筋組織状片における脱分極刺激やムスカリン作動薬による収縮応答性は、正常マウスにおける収縮応答性と差は認められず、平滑筋細胞自身の収縮能力は無菌マウスにおいても正常であることが示唆された。さらに、無菌マウスにおける蠕動反射も、正常マウスでのそれと有意な差は認めらかった。蠕動反射はカハール介在細胞-壁内神経-平滑筋細胞間の相互作用によって制御されているこ。以上の成績から、生後8-12週齢の無菌マウスにおいては、カハール介在細胞-壁内神経-平滑筋細胞の相互作用は正常に維持されており、正常マウスと同様の消化管運動機能を維持していることが示唆された。

すなわち、神経とICCの機能もNOに対して抑制性に作用するがGerm freeマウスにおいてのその感受性は変わらないことがわかった。以上の成績から、無菌環境下の消化管はLPSに対する感受性が単に低下するだけでなく、平滑筋細胞のおいてはLPS/TLR4シグナルの下流に存在するiNOS/NO系の不活性化が生じることがわかった。