hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
鬼ごっこの運動プログラムの検討

映像を用いた質的分析結果から、手つなぎ鬼の子どもの動き(鬼側の動き)は、手を繋いだ仲間同士が移動速度を合わせるため歩幅を調整していることが明らかとなった。3名の手つなぎ鬼の場合、中央に位置する鬼が両端の仲間をかけ声や腕を引くことで誘導している傾向があった。これまでの運動量比較研究結果から、鬼の数を3名にする場合が子どもらの運動量が大きく、方向転換走などの出現回数も多くなることが明らかとなった。そこでB研究で鬼の数を3名の条件にして8週間のトレーニング(1回/週)を実施し、総移動距離、方向転換走出現回数(ステップ様式)のトレーニング効果について検討した。総移動距離ついて見ると、8週間のトレーニングで変化は示されなかったが、スプリントの移動距離についてみると、5週目から有意な増加を示している(P<0.05)。ステップの出現回数についてみると、4週目から両足方向転換走等が有意に増加した(P<0.05)。ジュニア期のトレーニングとして鬼ごっこが推奨されているが、特に3名以上の鬼ごっこをトレーニング法として利用することによって、球技などに必要なステップワークの能力が向上するものと考えられる。本研究は、子どもの敏捷性を伴うランニングトレーニングとして、鬼ごっこの有効性について検討することを目的とした。鬼の数を3名から4名にすると、総走行距離が増加し、ダッシュを含むランニング回数はじめ急激なストップからの方向転換走やサイドステップの動作回数の増加が明らかとなった。また鬼の数を3名にした1週間あたり1回の8週間におけるトレーニングでは、総走行距離および「人をかわす」ための様々なステップ動作回数の増加が示された。本研究は、被験者を8歳以下の子ども(小学校1年生、2年生)を対象に進める予定であった。しかし、実際に子どもの背中にGPSを装着させたところ、体格が小さいことからベスト内に組み込んだGPSが上下に動き子どもらの動作を制限させた。GPSを組み込んだベストを改良して測定を試みたが、やはり子どもらから動きにくいと言う意見が多く出されたことから、8歳以下の子どもを対象として研究を進めることは困難であると判断した。そこで、被験者を9歳、10歳のこども(小学校3年生、4年生)に変更して予備測定を実施したところ、改良したベストがこの年代の子どもにフィットし、GPSの動きも気にしていないため、当初の予定した8歳以下の子どもから9歳10歳の子どもに被験者を変更し研究を進めることとした。予備測定を含め、のべ30回分(教室)の子どもの動きを測定した。現在、鬼ごっことサッカーの試合時の子どもの総移動距離、移動速度毎の移動距離、ステップワーク毎に分類した走り方の分析を終え、鬼ごっこの動作がサッカーの試合中の動作と似ている点や異なる点などの特徴を明らかにすることができたと考える。遊びとしての鬼ごっこは、多くの種類が紹介されている(鬼ごっこ協会等)。その中で、手つなぎ鬼は、2名、3名と鬼の数を増やすことによって、子ども同士の調整方法が変化するのではないかと考える。そこで今後は、子どもらが鬼になって追いかける時、手を引っ張られることによる筋感覚の影響、声掛けに等によるランニング速度やランニング方向の調整等に着目し動作の特徴を検討することを目的とする。特に子どもらの協調性の向上に手つなぎ鬼がどのように影響を及ぼしているのかを検討する。具体的には、手を繋いだ場合の子どもらの並び方、両者の距離、ランニング速度や方向変換のタイミングに焦点をあて、動作のビデオ映像から質的分析を行うことで手つなぎ鬼の特徴を明らかにしたいと考えている。
魚類精子形成関連分子プローブの検索

精子形成各発達段階ごとの試料を容易に入手できるサクラマスならびにアサヒアナハゼをモデル材料として、魚類精子形成関連遺伝子の単離を目指した。これまでに膜7回貫通型受容体共通配列をもとに生殖腺より2種、甲状腺より2種の糖蛋白質ホルモン受容体様遺伝子の部分クローニングに成功している。本年度はこれらの塩基配列をもとにRACE法により、5'側、3'側の完全長クローニングを行い、全構造を明らかにした。その結果、これらは2.0kbから2.5kbの翻訳領域を有しており、哺乳類糖蛋白質ホルモン受容体と同様に特徴的に長い細胞外領域を有していることが判明した。他種との比較では膜貫通領域では60%以上の高い相同性を示したのに対して、細胞外、細胞内領域では30%以下の相同性であった。また、全体的な構造比較から生殖腺より単離した2種は哺乳類の生殖腺刺激ホルモン受容体に、甲状腺より単離した2種は甲状腺刺激ホルモン受容体に近いことが判明した。さらに、4種の遺伝子の発現の組織分布をノーザンブロット法とRT-PCR法にて検索したところ、前2者は生殖腺に強く発現しており、これらが魚類の生殖腺刺激ホルモン受容体をコードしている可能性が高いと考えられる。一方、精巣と他臓器間におけるsubtraction法により精巣特異的遺伝子ライブラリーの構築を行った。作製されたライブラリーの評価のため、既知の精子形成関連遺伝子(受容体遺伝子ほか)含有量の増加、組織非特異的恒常発現遺伝子(βアクチンほか)含有量の減少を調べたところ、明らかに精巣特異的cDNAの濃縮が見られた。今後、このライブラリーに含まれるcDNAについて個別に発現動態(組織分布、精子形成に伴う発現量の変化など)を解析する予定である。精子形成各発達段階ごとの試料を容易に入手できるサクラマスならびにアサヒアハナゼをモデル材料として、魚類精子形成関連遺伝子の単離を目指した。すでにRT-PCR法により2種類の生殖腺刺激ホルモン(GTH)受容体遺伝子断片の単離に成功していたが、今回さらに第3番目の類縁遺伝子の単離に成功した。これら3種の遺伝子についてRT-PCR法によりその発現の組織分布を検討したところ、先の2者は生殖腺で最も強く発現しているのに対し、後者は甲状腺組織を含む鰓弓組織で最も強く発現していた。このことより、今回新たに単離された類縁遺伝子は甲状腺刺激ホルモンの受容体である可能性が高い。また、先に同様の操作によりイトマキヒトデ生殖腺からも類縁遺伝子が単離されたことを報告したが、今回広い範囲の無脊椎動物について類縁遺伝子の検索を行ったところ、新たに海綿動物、腔腸動物、軟体動物にも同様の遺伝子の存在が確認され、本ホルモン受容体族の分子進化に新たな知見を提供した。一方、アサヒアナハゼでは交尾期の精巣を各発達段階ごとの極めて同調性の高い精巣片に分割し、それぞれから個別に調製したmRNAを用いてディファレンシャルディスプレー法により、各段階ごとに特異的に発現量の高まる遺伝子のクローニングを行った。それらの一部について塩基配列を決定し、遺伝子データバンク上での相同性検索を行ったが、現在までのところ既知の遺伝子との相同性は見いだされていない。さらに、他の生物種においてDNA複製(体細胞分裂)ならびに組換え(減数分裂)に関わることが知られている分子として、DNAポリメラーゼα、β、δ、ε、減数分裂特異的DNA組換え因子DMC1などの遺伝子を単離できた。今後、精子形成各段階におけるこれらの遺伝子の挙動を調べる予定である。
炎症性疼痛に対するデクスメデトミジン局所投与による鎮痛効果の検討

局所投与したデクスメデトミジン(DEX)はα2アドレナリン受容体を介して、カラゲニンによって誘発された炎症性疼痛を抑制し、その鎮痛効果は濃度依存性にDEX10μM以上で有意に認められた。またこの鎮痛効果について、DEX100μM以上では局所における抗炎症作用ではなく中枢を介した作用であることがわかった。さらに、DEX局所投与とインドメタシン経口投与を併用した場合の鎮痛効果の相互作用について検討を行ったが、明らかな相互作用は認められなかった。申請者が新たな局所麻酔薬の添加薬として着目しているα2アドレナリン受容体作動薬のデクスメデトミジン(DEX)には、局所麻酔作用の増強作用や局所投与による抗炎症作用など、本来の鎮静作用に加え様々な作用を有していることが報告されている。このように局所投与されたDEXは抗炎症作用を有することから、局所における鎮痛作用が期待される。そこでの本研究課題はDEXの局所投与による炎症性疼痛の鎮痛効果およびそのメカニズムを検討することである。平成27年度は局所投与したDEXが局所の炎症性疼痛に対して鎮痛作用を有するかどうかをラットを用いて検討した。炎症モデルは起炎物質カラゲニンの局所投与による炎症モデルを用いた。カラゲニン(最終濃度1%)とDEX(最終濃度1μM、5μM、10μM、100μM)を混ぜた混合薬液(総量50μl)をラットの後足蹠に投与し、投与後にフィラメントを用いたvon-Fray試験にて疼痛閾値を測定した。その結果10μMDEX以上で優位な疼痛閾値の上昇が観られた。またこの疼痛閾値の上昇はα2アドレナリン受容体拮抗薬のヨヒンビンで拮抗された。これらの結果より局所に投与したDEXはα2アドレナリン受容体を介し、炎症性疼痛に対して鎮痛作用を有することが示唆された。おおむね、当初の計画通り進んでいる。α2作動薬であるデクスメデトミジン(DEX)は、局所麻酔下手術時の鎮静や集中治療室における人工呼吸管理時の鎮静薬として広く用いられている鎮静薬である。当教室(岡山大学大学院医歯薬学総合研究科歯科麻酔・特別支援歯学分野)では、このDEXを局所麻酔薬に混合して併用することによって、局所麻酔効果を増強することや、局所投与したDEXは抗炎症作用を有していることを発表してきた。本研究ではDEXの局所投与による炎症性疼痛の鎮痛効果の検討と、日常臨床で鎮痛剤として広く使用されている非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDs)と併用した際の鎮痛効果の相互作用についての検討を行った。実験にはラットを用いて、起炎物質であるカラゲニンをラット後足蹠に投与することにより疼痛過敏を引き起こし、投与2、4、6、8、12時間後にvon Freyfilament法を用いて鎮痛度を測ることにより、DEXの局所投与による疼痛過敏抑制効果について検討を行った。まず、予備実験としてDEXの局所投与における炎症性疼痛の抑制効果の検討を行い、DEX10μM以上で炎症性疼痛の抑制効果があることが示された。さらにこのDEXの効果はαアドレナリン受容体拮抗薬であるヨヒンビンによって拮抗されたことから、DEXの炎症性疼痛抑制効果はαアドレナリン受容体を介していることも明らかになった。さらに、経口投与されたNSAIDsと局所投与されたDEXによる鎮痛効果の相互作用を検討した実験では、NSAIDsとしてインドメタシン5mg/kgを用いた。その結果、経口投与されたNSAIDsと局所投与されたDEXとの間に相乗作用は認められなかった。平成27年度は局所投与したDEXが局所の炎症性疼痛に対して鎮痛作用を有することがわかった。歯科の日常臨床において、局所麻酔が必要とされる外科処置後には鎮痛剤として非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDs)が処方されることが多い。そこで平成28年度は、この臨床での使用方法を想定し、NSAIDsとDEXの局所投与を併用した際の鎮痛効果、DEXの濃度、時間経過等を単剤使用と比較し、NSAIDsとDEXの鎮痛効果の相乗作用を検討する。28年度が最終年度であるため、記入しない。麻酔学28年度が最終年度であるため、記入しない。
地域の資質を生かした水辺空間の構築のための親水デザインのあり方に関する研究

水路や水辺空間は都市の構成要素として重要度を増している。そのため、水路や水辺空間を調査することで水路の空間的特性を把握した。大研古城は「水の町」と呼ばれ、歴史的で伝統的な建築と街区と水路が水景を生み出している。地域社会の中には水利用上の規約が継承され水利用面での規範意識となった。その結果、観光と社会基盤整備が伝統的住民生活に対して影響を及ぼした。さらに、大研古城が「水の町」として発展するためには、居住者の規範意識を保持することが重要と思われる。研究の目的:水辺に対する社会的要請が高まる中で、今後の都市再生やまちづくりに活用するための検討が進められてきている。特に親水性を伴う水辺空間の整備や生態環境の形成、地域コミュニティの再生等への寄与について期待が向けられている。そこで、水辺の活用事例を国内外から収集整理することで、水辺とのかかわり方や新たなコミュニティ形成、生態環境のあり方、環境学習の場の形成、水辺が形成する地域空間等について考究してきた結果、地域の資質を生かした水辺空間の構築のための親水デザインのあり方が課題と認識するに至り、水辺については、(1)流路の分類:都市やまちづくりにおける水辺の活用は、対象となる水辺が河川、法定外水路、公共溝渠、運河、農業用溝渠など、多様な水路区分に別けられていることを認識した上で、まちづくり水路(環境用水)としての位置づけを検討する。(2)背後地域との関係:水辺は、背後の地域との空間的連続性や歴史性・文化性とも深く関係している。加えて、人間と水辺とのかかわり方について立場(住民あるいは一般利用者)の理解が要され、人間が水辺と係ることで形成される快適性の享受から規範意識や習慣のあり方、コミュニティの形成過程について把握する。(3)水辺の新たな利用法:水辺の利用は、地方では伝統的に地域に根付き生活用水として活用されている一方、都市では快適性享受の場としての親水空間や環境用水としての利用が多く、両者の間には、水辺の利用面で大きな乖離がある。そこで、伝統的な水辺利用や都市的な水辺利用及び社会実験等の成果の相互比較を行うことで、新たな利用法を見出す。こうしたことから、韓国ソウル市清渓川における現地調査を(2011年8月)に実施し、復元的創造空間としての水辺とその利用状況を捉えた。こうしたことから、中国雲南省麗江大研古城における現地調査を(2011年2月)と(2011年3月)を実施した。2012年度は2010年2011年度に実施してきた調査研究をまとめた。本研究は、中国雲南省麗江大研古城を対象にして、そこに見られる地域の資質を生かした水辺空間の構築のための親水デザインのあり方の把握を目指した。その結果、世界文化遺産の大研古城地区では、長年かけて納西族文化が築いた歴史的・伝統的な町並み景観を創出してきており、この町並み景観は住民生活に密着した水路と地区内に点在する固有の水場である三眼井により形成されてきていた。しかし、近年の世界遺産登録後の観光化の進展など外部がもたらす環境圧は、水環境の質的低下を助長したり、水との係わりを形骸化させていた。

一方、大研古城は「水のまち」とも呼ばれてきたが、それに応えてきたのが住民の意識に根付いてきた水環境保全や水利用面での規範意識であった。大研古城の住民生活を取り巻く状況は、97年以降の観光客の増加とそれに対応した社会基盤整備及び新規住民の移入などが相互に影響することで、伝統的な風土風習を重んじた住民の生活形態に対して変化を余儀なくしてきたが、三眼井の利用は住民生活の中では「生きた水」として活用されてきていた。そのため、近年作られた観光用の三眼井設置は、本来の水利用に対する歴史的・文化的・伝統的な思考に基づき生み出されてきたものとは必然的に異なるため、結果として生活に密着した使われ方がなされないため、管理が不十分になり、現在は水もなく休止状態に置かれている。こうしたことからも、持続的に発展するためには、健全な生きた水利用を継続できるように、慣行や規範意識を保持できる環境づくりが重要と思われる。また、韓国ソウル市清渓川における都市河川再生を踏まえ、復元的創造空間としての水辺とその利用状況を捉えた。調査計画に則り作業を進めているが、海外の現地調査においては、相手国の状況により、調査日程が若干予定よりも遅延した。また、研究成果についても建築学会へ研究報告を順次行っているが、投稿時期や審査過程の遅延により、若干遅れていたが、概ね順調に進展している。24年度が最終年度であるため、記入しない。2012年度が最終年となるため、最後の調査とこれまでの成果を踏まえ地域の資質を生かした水辺空間の構築のための親水デザインのあり方について取りまとめを行う予定である。
非対称有機リン二座配位子の直截的合成法の開発

医薬品および機能性材料の合成の鍵となる遷移金属触媒反応では、リン配位子の精密設計を可能にする自在合成法の開発が強く求められている。しかし、有機リン化合物の合成では危険なアルカリ金属、または有毒で取扱いの難しいハロゲン化リンが用いられており、多様な構造を達成するにはきわめて制限が多いのが現状である。その解決策として、これまで種々の単座/二座リン配位子の合成法の開発に成功している。本研究では、リン原子-リン原子単結合を有する化合物のアルケンへの付加反応による、非対称有機リン二座配位子の一段階合成を目指した。非対称有機リン二座配位子は機能性材料の合成等において対称な配位子を上回る触媒活性を示すことが知られているが、合成の難しさから利用例が少なく、その詳細な機能は未解明である。本研究では、多様な非対称有機リン二座配位子の直截的な合成法を開発し、その触媒活性の調査、詳細な反応機構の解明を行った。本年度は、種々の対称および非対称有機リン二座配位子の合成に成功した。種々の末端アルケンまたは環状アルケンに対して、P(S)-P単結合を有する種々のジホスフィンモノスルフィドが選択的に付加することを見出した。本反応は塩基、触媒、または添加物を必要とせず、可視光下でも進行し、種々の対称および非対称リン二座配位子が良好な収率で得られた。また、反応機構解析の結果、ジホスフィンモノスルフィドのリン-硫黄(P(S))部位が、本来意図していた反応位置の制御のみでなく、光吸収およびラジカル連鎖反応の効率化に大きく寄与し、反応を促進することが判明した。さらに、対称な有機リン二座配位子の簡便な合成法として、空気安定なP(S)-P(S)単結合を有するジホスフィンジスルフィドの種々のアルケンまたはアルキンに対する付加反応を開発した。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。第45回有機典型元素化学討論会において、上記の内容で優秀ポスター賞を受賞した。
多剤耐性アシネトバクターの新規病原因子の探索と重症化に関与する宿主側要因の解析

1) A. baumannii(A.b)は緑膿菌に比べて好中球の貪食殺菌作用に抵抗性で、好中球細胞外トラップ形成も少なかった。2)肺感染マウスモデルでの致死性は、緑膿菌がA.bより強かった。3) A.b標準株、多剤耐性株(MDRA)由来のリポ多糖(LPS)で刺激すると、好中球内の炎症性サイトカインの遺伝子発現はほぼ同等に増強した。A.b由来膜小胞は好中球の活性酸素誘導能はないが遊走因子として作用した。4) A.b由来LPSはマスト細胞からのTNF-α, IL-8産生を増強した。5)LAMP法によるMDRAの検出法を開発した。6)液性免疫不全が感染病態重症化要因となる可能性がある。2、A. baumanniiを正常マウス(C3H/HeN)の肺に感染させ生存率を標準株(ATCC19606)と臨床分離株で比較検討した。肺感染後2週間の生存期間で比較すると本菌標準株は臨床分離株より致死性が高かったが、緑膿菌(PAO-1株)の致死性より低かった。3、E. coli由来LPS(B4)とA. baumannii標準株及びMDRA由来LPSを種々の濃度で好中球に作用させ、好中球内のTLR2, TLR4, CD14, TNFαの4種類の遺伝子発現変化を定量解析した結果、MDRAによる遺伝子発現誘導がLPS添加濃度依存的に最も強く、次いでB4であった。本菌由来LPSのヒト好中球活性酸素誘導能に対するpriming効果は緑膿菌由来LPSより強く、E. coli由来LPS(B4)と同等であった。4、ヒト由来マスト細胞株LAD2は、本菌を認識しTNF-αを放出したが、TNF-α、CCL4、IL-8のmRNAの発現増強も見られ、マスト細胞は本菌を認識し応答した。5、家畜由来アシネトバクター属菌の実態調査で、アシネトバクター属菌は牛豚の糞便や鼻汁から分離され、特に豚の20%以上の個体から分離され,どれもセフェム耐性株であった。本研究は、多剤耐性A. baumannii(MDRA)の新規病原因子の探索と発症/重症化に関与する宿主側要因を解析することを目的とするものである。本年度は、被検菌であるMDRA、薬剤感受性A. baumanniiの標準株(ATCC19606)を含め、菌株数を増やし健常人好中球や単球に対する抗食菌性を、多剤耐性緑膿菌(MDRP)などと比較検討した。その結果、A. baumannii (MDRAを含む)の食細胞の食作用に付随する活性酸素産生能は他の細菌に比較して著明に低下していた。血清存在下で、Gram染色/ギムザ染色し鏡検でMDRAとMDRPの好中球による貪食能を比較すると、MDRAはMDRPに比較して、いずれの条件下でも貪食されにくく、これはFITC標識A.baumanniiを貪食させFACS解析した場合もほぼ同様であった。しかし、菌を遊走因子とした場合の好中球の遊走作用に及ぼす影響は同等であった。次に、A. baumanniiの貪食に必要なオプソニン因子を調べるために、多数の型の違うA. baumanniiを用いて、抗体除去血清、補体除去血清、両者除去血清を用いて検討した。その結果、MDRAにおいては、補体よりも抗体除去によりオプソニン作用が低下したので、感染防御因子として血清中の莢膜特異抗体が重要であることが示唆された。次に、ヒト由来マスト細胞株であるLAD2を用いてA.baumanniiへの応答を炎症性サイトカイン遺伝子発現とサイトカイン産生を指標に解析した。標準株と臨床分離株をLAD2細胞と反応させたところ、4時間後の標準株で刺激したLAD2細胞でTNF-α遺伝子発現の増強が観察されたが、MDRAなど他の臨床分離株刺激ではTNF-α遺伝子発現に変化は見られなかった。他のサイトカインなどの遺伝子発現解析と培養上清中のサイトカイン産生は現在解析中である。1)ヒト好中球をA. baumannii(A.bau)標準株や緑膿菌PAO1株で刺激し, 1時間培養後の好中球細胞外トラップ(NETs)形成をみた。緑膿菌株刺激ではNETs形成がみられたが, A.bau刺激ではNETs形成は少なく,殺菌能をみても緑膿菌に比較して殺菌されにくかった(論文掲載)。

2) A.bauと緑膿菌(PAO-1株)肺感染マウスモデルを用いた病原性の比較では,菌接種2週間後においてA.bauの標準株は臨床分離株に比べてやや高い致死性を示したが,緑膿菌ほど強い致死性は示さなかった。肺組織では標準株と臨床分離株で病変組織像に差はみられなかった。3)大腸菌とA.bau標準株及び多剤耐性株(MDRA),緑膿菌,多剤耐性緑膿菌(MDRP)由来のLPSを種々の濃度で好中球に作用させ,好中球内の遺伝子発現変化を定量解析した。LPSの種類に関わらずTLR4, CD14の遺伝子発現は抑制され,炎症性サイトカインとTREM1遺伝子発現は増強した。MDRA由来LPSによる遺伝子発現誘導作用が最も強く,好中球内の炎症性サイトカインやTREM1の遺伝子発現を増強した(論文投稿中)。また,精製A.bau由来膜小胞はヒト好中球活性酸素誘導能を示さなかったが, IL-8やfMLPに比較して弱いものの好中球遊走因子として作用した。4)ヒト由来マスト細胞株LAD2はA.bau菌体刺激でTNF-αを放出し,TNF-α, CCL4, IL-8のmRNAの発現増強もみられたが,その作用にはマスト細胞表面のFcγR II (CD32)の関与が示唆された。A.bau由来LPSもマスト細胞からのTNF-α, IL-8産生並びにその遺伝子発現増強を起し,炎症反応を惹起することが示唆された。5)遺伝子検査技術の一つであるLAMP法を用いてMDRAの迅速検出法を開発した(論文投稿中)。感染免疫学ヒト好中球とアシネトバクターの相互作用の解析に関しては、緑膿菌と比較して貪食抵抗性が高いこと、NETs形成は弱いことなどを明らかにした。マスト細胞も本菌に応答しTNFαなどのサイトカインを産生すること、本菌由来LPSは大腸菌由来LPSと比較しても好中球機能や細胞内遺伝子発現に及ぼす効果に差がないことを示した。また、マウス肺炎モデルでの病原性は緑膿菌より弱いことも明らかにした。さらに、家畜などの腸管保菌調査も実施し現在解析中である。多剤耐性アシネトバクターのLAMP法での迅速検出法も開発した(投稿準備中)。食細胞やマスト細胞との相互作用に関しては当初の予定どおりに進行しているが、トランスポゾンをランダム挿入させ表現型の異なる変異株の作成は現時点でまだ実現できていない。そこで、病原因子としてのリポ多糖体に着目し、現在菌体成分から精製中である。マウスの動物感染実験に関しては、動物倫理委員会の許可を受け、現在実験中である。1、本菌の外膜蛋白(OMP)の薬剤耐性への関与、好中球機能に及ぼす影響も残り1年かけて検討予定である。2、これまで2年間実施してきた上記の研究成果を論文として報告予定である。1、健常人だけでなく,感染防御能低下患者やセプシス/重症肺炎患者などの活性状態が異なる好中球を用いて検討する。2、病原因子の一つと考えられるA. baumanniiのリポ多糖(LPS)を培養後分離・精製し、好中球に及ぼす影響を遺伝子レベルで解析する予定で、現在外注し精製中である。得られたLPSを好中球に添加し、発現するパターン認識受容体遺伝子、炎症性サイトカイン遺伝子、ケモカイン受容体遺伝子、抗炎症性サイトカイン、炎症性ミエロイド細胞受容体遺伝子及びGPCRリン酸化酵素遺伝子の変化を解析する。3、A.baumanniiを肺に感染させるマウス肺炎モデルを用いて、A.baumanniiの標準株と臨床分離株の病原性の比較解析を行う予定である。4、アシネトバクター属菌は土壌など環境中からしばしば分離される環境菌であるが、動物(家畜)の保菌状況については不明な点が多いので、家畜のアシネトバクター属菌の保菌状況ならびに耐性菌の分離状況の調査を行なう。1、計画した予算よりも試薬代金などが安く購入できたため。
地熱地域における経時モニタリングのためのハイブリッド重力測定の最適化

国内の研究対象フィールドとしては、地熱発電所地域としては、鹿児島県霧島市の大霧地熱発電所地域および大分県九重町の滝上地熱発電所地域を設定しているが、大霧地熱発電所地域については、平成26年度は発電所の定期点検の年ではないため、絶対重力計と相対重力計を組み合わせたハイブリッド精密重力測定によるモニタリングは実施せず、もっと広域の地下構造探査のための重力測定を実施した。また、昨年度ハイブリッド精密重力測定を実施した大分県九重町の滝上地熱発電所地域での測定は、計画では今年度も実施する予定であったが、現場の事情により実施できなかった。一方、昨年度から火山活動が活発化している阿蘇火山を研究対象において、引き続き繰り返し精密重力測定を実施し、その重力変化の平面的な分布を説明するために構築した地下の密度変化の3次元モデルから、中岳火口周辺の地下において急激な質量変化が起きていることが推定された。さらに、海外においては、インドネシアのカモジャン地熱発電所地域においてハイブリッド精密重力測定を実施し、過去のデータと比較することで重力値の経時変化を追うことができた。26年度が最終年度であるため、記入しない。国内の研究対象フィールドとして、大分県九重町の滝上地熱発電所地域と鹿児島県霧島市の大霧地熱発電所地域を選定し.両地域でハイブリッド精密重力測定を実施した。特に、大霧地熱発電所地域の測定は発電所の定期点検に合わせて実施して、地熱流体の生産・還元の停止と再開に伴う重力変動を捉えることを試みた。その結果、停止時においては生産ゾーンの重力値の増加と還元ゾーンの重力値の減少が、また発電所の運転再開後は生産ゾーンの重力値の減少と還元ゾーンの重力値の増加という、地熱流体の生産・還元と非常に調和的な結果が得られた。また、噴火活動に伴う地熱流体の質量収支は非常に大きいことが期待されるため、火山活動が活発化した阿蘇火山を研究対象フィールドに加えて繰り返し精密重力測定を実施した。さらに、ニュージーランドのオハアキ地熱発電所地域においては、相対重力計のみの測定ながら精密重力測定を実施し、2012年9月に実施した精密重力測定の結果と合わせて、重力値の経時変化を追うことができた。国内の研究対象フィールドとして大分県の滝上地熱発電所地域及び鹿児島県の大霧地熱発電所地域で重力測定を実施することができるようになり、また、当初の計画に加えて、活動が活発化している阿蘇火山、及び海外の相対重力測定のフィールドとしてニュージーランドのオハアキ地熱発電所地域を追加することができたため。平成26年度も前年度に引き続き、選定されたフィールドにおける絶対重力計と相対重力計によるハイブリッド繰り返し精密重力測定を実施すると共に、地下密度変化に基づいた3次元密度分布モデルを構築し、研究対象フィールドの熱水系についての新たな知見の取得を目指す。
夜勤への適応を促進するための看護基礎教育課程におけるプログラムの検討

夜間に行う看護援助について、これまで文献からみえていたキーワードは、「患者の安全・安楽・安眠」を保障するために「看護師が休息と睡眠を十分にとり万全の態勢でケアに臨むこと」であった。2年目の本年度は、これがどのような取り組みであるのかを具体的に探るため看護師を対象とした面接を行うことを計画し、インタビューガイドの作成に取り組んだ。インタビューガイド作成の過程で、面接内容が抽象的である点に気づいた。夜間に行う看護援助を学ぶために必要な要素を抽出するという目的を達するために、より効果的な面接を計画するには、情報の具体化と整理が必要であると考えられた。よって、更に文献検討を含めた情報の収集に努めたところ、カリキュラム改正を視野に入れた取り組みが今年度から幾つかの学校で始まっており、夜間実習を始めている看護基礎教育課程もあることがわかった。また、今年度に出版された図書においては、初めて夜勤を体験する新人看護師が夜勤を滞りなく過ごすために必要と思われる知識が記述されていた。これらより、患者に対してどのような看護援助を提供するかということだけではなく、看護師自身がどのように自分の体調をコントロールするかという点を明らかにし教育に取り入れていくことの重要性も示唆された。以上の更なる文献検討から、インタビューガイドにおいては、患者に対する看護援助のもつ意味を探るだけではなく、看護師の健康・人生.生活にとってどのような意味をもっかについても同時に考えていく必要があるとわかった。これらを踏まえて、半構成的面接法を用いたインタビューガイドを作成した。次年度は、研究倫理委員会の承認を得てインタビューを実施していくこととなる。研究1年目となる今年度は、図書や文献から夜間の看護に含まれる要素を抽出することが目的であった。看護基礎教育課程の主要なテキストでは、夜間の看護という観点から記載された部分は見当たらなかった。しかし、「睡眠を促進するための技術」「安楽を確保するための技術」「安全を確保するための技術」というように、看護技術の各項目の中で、夜間の看護を意識した記述がされていた。医学中央雑誌による検索によると、夜間の看護に関連した文献では、「患者の安全・睡眠」「看護師の心身の問題・勤務体制」を焦点としていた。以上より、夜間の看護において中心となる焦点は「患者が安全・安楽で安眠を得られること」「看護師が自らの休息と睡眠を十分にとり、万全の態勢でケアに臨むこと」であった。そのため、夜間の看護ケアは、安全・安楽・安眠を目的としたケアであるといえた。その他、新人看護師を対象とした図書では、夜勤を業務の視点から解説しHOW TOについて記述したり、緊急時のドクターコールに必要な看護判断について説明したりと、すぐに活用できるマニュアル的な内容であった。一方、ナイチンゲールは著書である'看護覚え書き'の中で夜気や眠りを妨げない環境づくりといった「看護者の基本となる振る舞い」について記述しており、患者の手記では昼間に表れない「夜の患者の心理」が浮き彫りにされていた。これらのことより、文献やテキストに記載される内容の背景には、文章に表現されていない夜間の看護に関連した本質的な要素が埋もれている可能性があると考えた。それは、現場で働く各々の看護師が抱えているにもかかわらず図書や文献という形式で表現されていないことを推測させた。看護基礎教育課程で実施する学習内容とするためには、業務としての夜勤ではなく、患者および看護師にとって夜間の看護がどのように意味をもつのかといった本質に迫る必要があることがわかった。
鼻アレルギー患者の鼻粘膜血流の検討

鼻閉に対するツボである迎香の刺激により、自覚的に鼻閉が改善されることは経験的に認められている。しかし、鼻腔通気度検査では迎香刺激後に自覚的な通気度の改善と検査上通気度の変化が一致しないことも多い。そこで今回、鼻腔通気度計の代わりに鼻粘膜の血流の変化を指標とし、鼻閉感と血流量の関係について検討した。〈方法〉鼻粘膜血流量の測定にはレーザー血流計を用い、経時的な変化を記録した。1%Xylocaineを用いて下鼻道を麻酔した後、下鼻道、下鼻甲介付着部にレーザー血流計のプローベを密着固定し、定常状態の鼻粘膜血流を測定後、迎香を30秒間用手マッサージし、鼻粘膜血流の変化を経時的に測定した。〈結果〉定常状態の血流量は被検者によりかなりの差を認めた。迎香刺激後、ただちに鼻粘膜血流量の低下(50%程度)を認めるものから、定常状態の血流量と差を認めないものまで結果は多彩であった。RASTでHD&Miteに陽性を示す症例のうち、鼻粘膜の蒼白腫脹を認める症例では血流量の変化が少ない印象を受けた。今後さらに刺激方法による差異、鼻粘膜誘発後の変化等について検討を行いたい。
有機セレン化合物の特異な機能と結合特性を活用した次世代高分子材料の創成

本研究では、セレン化合物を基本骨格(キーマテリアル)として取り上げ、その特異な機能(半導体、光伝導性、高屈折率)と結合特性(動的共有結合、構造の多様性、高反応性・高感受性)を精密重合及び高分子ナノ構造体に関する技術と融合させ次世代高分子材料を創成する事を目的とする。セレンは、主に銅精錬やコピー機感光ドラムのスクラップ精錬の副産物として産出されており、わが国の生産量は世界の約25%にのぼり最大の生産国になっている。このセレンは日本が優位性をもって産出することのできる数少ない資源であり、セレンを有効に機能性材料へと変換できればその社会的意義は極めて大きい。
βCGFによる膵β細胞自己増殖機構の解明に基づく糖尿病治療の開発

2型糖尿病は、生活習慣が誘因となり肝臓、骨格筋などの組織におけるインスリン感受性が低下し、それに伴い膵臓ランゲルハンス島b細胞(膵ラ島b細胞)のインスリン分泌量の増加、その長期化によって負担を強いられた膵ラ島b細胞が減少し、インスリン分泌量が不足することで発症する。現在までの2型糖尿病に対する治療薬は、それらb細胞内でインスリンを貯蓄する小胞の細胞膜への融合を促し、インスリン分泌を促進させることによるが、b細胞におけるインスリン分泌機構の全貌は未だ不明である。一方で、最近の研究成果により、準必須アミノ酸であるアルギニンが膵ラ島b細胞のインスリン分泌を促すとともに、膵ラ島b細胞内に取り込まれたアルギニンと結合する因子が、b細胞のインスリン分泌を制御することを発見した。このアルギニン結合因子として同定されたのがA/PBP (Arginine/Proinsulin-Binding Protein)、bCGF、そして糖代謝関連因子Xを同定した。A/PBPについては、膵ラ島b細胞特異的にA/PBPが過剰発現するトランスジェニックマウス(A/PBP Tgマウス)を作製したところ、野生型マウスと比較して膵島サイズや膵ラ島b細胞の大きさは変化がなく、b細胞のインスリン分泌能が有意に低下していた。さらに、A/PBPのアルギニン結合ドメインに遺伝子変異のある数名の糖尿病患者においてアルギニン負荷試験を執り行ったところ、アルギニン応答性インスリン分泌が抑制された。一方、糖代謝関連因子Xについては、日本人のXの一遺伝子性糖尿病患者のスクリーニングを行った後、糖代謝関連因子X遺伝子の特定のグルタミン酸残基が変異した患者に対するアルギニン負荷試験を行ったところ、アルギニン不耐性の高血糖および低インスリン血症が認められた。今年度の予定していた計画と並行して新規候補因子の機能同定に着手している。糖代謝関連因子X変異体はアルギニン結合能を欠損していることが認められたが、まだ詳細な機能はよくわかっていない。糖代謝関連因子Xが糖尿病病態において膵ラ島b細胞内のアルギニンを介したインスリン分泌機構にいかに寄与するのか、そして、生体内でどのような分子と相互作用をして機能発揮するのかを明らかにする。これまでに、グルコースにリン酸を修飾する糖代謝関連因子X酵素活性の促進剤がインスリン分泌を亢進することが報告されている。本研究において、アルギニンが酵素活性に対してどのように寄与するのか検討する。次に、インフォマティクスの手法を用いて、糖代謝関連因子Xのアルギニン標的ドメインを予測し、それを基に作成したドメイン変異体を膵b細胞株に発現させ、そのアルギニン応答性インスリン分泌能を測定することでアルギニン結合活性ドメインを明らかにする。また、この予測にはすでに明らかとなっているA/PBPのアルギニン結合モチーフをもとにモデリングを行う。選出した結合部位の欠損ベクターを作製し、これらをb細胞株に遺伝子導入し、膵b細胞におけるアルギニンの結合・シグナル活性化ドメインを探る。また、これまでに、糖代謝関連因子X遺伝子の特定領域はユビキチン相互作用ドメインを保有していることが明らかとなっているため、アルギニン結合領域の欠損しているアルギニンのユビキチン-プロテアソーム経路およびオートファジーへの影響を検討する。これまでの研究により、アルギニンが膵臓ランゲルハンス島b細胞のインスリン分泌を強く促すことがわかってきた。特にb細胞内でアルギニンと結合するATIS1(Arginine Target for Insulin Secretion 1))がb細胞のインスリン分泌制御機構に重要な役割を果たす可能性が示唆された。そこで本研究では、ATIS1が糖尿病病態においてb細胞のインスリン分泌にどのように寄与するのかを明らかする。また、b細胞におけるATIS1の機能解明を基盤とした糖尿病治療方法を探索する。本研究の遂行による「インスリン分泌におけるアルギニンを介した新規分子メカニズム」の解明は、現行の対症療法から、糖尿病病態の改善、さらには、根本的治療が可能な新薬の開発につながる可能性を秘めており、糖尿病治療において意義を有する。ATIS1は小胞体上でプロインスリンと結合しており、アルギニンと結合することで、インスリンのプロセシングを促し、その結果インスリン分泌量が増加することが明らかとなった。さらに膵ラ島b細胞特異的トランスジェニックマウス(ATIS1 Tg)は糖尿病病態を呈しており、アルギニン投与刺激によるインスリン分泌能低下が確認された。ATIS1のインスリン分泌制御機構を理解するため、in vitroの解析系においてATIS1活性化ドメイン変異体(あるいはインスリン結合ドメイン変異体)を作成し、ATIS1とアルギニン結合部位およびインスリン結合部位を明らかにした。ヒト糖尿病型ATIS1変異体とインスリン分泌不全との関係性が明らかになったさらにヒト糖尿病患者のゲノム解析、血液検査により、上記ATIS1結合活性化部位の遺伝子変異を確認できた。また、ATIS1変異体を作製し、in vitro解析を行ったところ、アルギニン刺激によるインスリン分泌能が顕著に低下することがわかった。平成29年度に計画していたトランスジェニックマウスの作製ができていない。

一方で、最近の研究成果により、準必須アミノ酸であるアルギニンが膵ラ島b細胞のインスリン分泌を促すとともに、膵ラ島b細胞内に取り込まれたアルギニンと結合する因子が、b細胞のインスリン分泌を制御することを発見した。このアルギニン結合因子として同定されたのがA/PBP (Arginine/Proinsulin-Binding Protein)、bCGF、そして糖代謝関連因子Xを同定した。A/PBPについては、膵ラ島b細胞特異的にA/PBPが過剰発現するトランスジェニックマウス(A/PBP Tgマウス)を作製したところ、野生型マウスと比較して膵島サイズや膵ラ島b細胞の大きさは変化がなく、b細胞のインスリン分泌能が有意に低下していた。さらに、A/PBPのアルギニン結合ドメインに遺伝子変異のある数名の糖尿病患者においてアルギニン負荷試験を執り行ったところ、アルギニン応答性インスリン分泌が抑制された。一方、糖代謝関連因子Xについては、日本人のXの一遺伝子性糖尿病患者のスクリーニングを行った後、糖代謝関連因子X遺伝子の特定のグルタミン酸残基が変異した患者に対するアルギニン負荷試験を行ったところ、アルギニン不耐性の高血糖および低インスリン血症が認められた。今年度の予定していた計画と並行して新規候補因子の機能同定に着手している。2型糖尿病は、肝臓、骨格筋などの組織におけるインスリン感受性が低下し、それに伴い膵ラ島b細胞のインスリン分泌量の増加、その長期化によって負担を強いられた膵b細胞が減少し、インスリン分泌量が不足することで発症する。一方で、MODYは特定の単一遺伝子の異常の有無で発症する糖尿病であり、主に非肥満性のインスリン分泌不全を呈する。これに対して、いまだ特定されていない原因遺伝子も存在し、根本的に病態を回復するような治療薬はない。本研究の遂行による「インスリン分泌におけるアルギニンを介した新規分子メカニズム」の解明は、現行の対症療法から、糖尿病病態の改善、さらには、根本的治療が可能な新薬の開発につながる可能性を秘めており、糖尿病治療において意義を有する。現在までに、培養細胞においてATIS1(MODYx)-インスリン結合はアルギニン投与による解離は抑制されることがわかった。そこで、生体でのインスリン分泌においてATIS1(MODYx)の影響を明らかにするため、ATIS1(MODYx)強制発現トランスジェニックマウスを作成する。また、ATIS1(MODYx)-インスリン結合を元にアルギニン模倣化合物のスクリーニングを行う。これまでの研究によりATIS1に対するインスリン(またはアルギニン)結合部位を同定しているため、ATIS1変異体強制発現b細胞株を作製してスクリーニングの選択性を上げることが可能。さらに、(2)で選択した候補薬剤による糖尿病の治療効果とそのメカニズムを明らかにするため、b細胞のインスリン分泌を亢進させる投与条件を検討する。
英語学習動機減退の詳細分析と実践的提案について

2年間の研究を通し、最終的に英語学習動機減退防止基本方針として、以下の6点があげられた。(1)学習者中心(2)情熱を持つ(3)教師主導(4)言語自体以上の事項提供(5)個に応じた教育(6)将来的使用。(1)と(3)は一見矛盾しているように思えるが、教師が主導した上で学習者中心の授業を行うということであり、(4)(5)は学習指導要領においても強調されている点であり、指導要領に沿った指導を行う事によって、動機減退が防止できる事も示唆している。本研究の目的は、中学高校大学での英語学習者の動機を減退させる要因を明確化し、3校種一貫した英語教育に配慮した、英語学習動機減退に関する実践的ガイドラインを作成することである。平成22年度の目的は、「動機減退要因の複雑性の明確化と実践パイロット」であった。以下に平成22年度の具体的成果を列挙する。(1)シャドーイングを活用した学習者のリスニング自己効力感育成(2)既に動機減退している高校生へのインタビュー調査(3)実際の授業においての細かい動機減退・動機回復の調査。(1)においては、先行研究調査によって、「自己効力感を用いた動機づけ理論」より、理論的に、「シャドーイングを活用したリスニングに対する自己効力感の育成を行う事による、学習者の動機づけ及び動機減退の防止」が考えられたため、実践研究として行った。(2)においては、複雑な動機減退要因の絡み合いの解明を行っている過程で、前提として、動機の高い学習者と既に動機減退している学習者の区別が必要な事も判明した。つまり、同じ動機減退理由と考えられる要因も、動機の高い学習者とすでに動機減退を起こしている学習者では影響の与え方が違い、ゆえに動機減退要因の複雑性も異なる事が分かった。(3)においては、先行研究を基に、動機減退防止を意識した英語の授業を行った後に、学習者に実際の反応をフィードバックしてもらったものを学内紀要として出版した。総合すると、動機減退要因の複雑性の明確化は、今年度発見した新たな事項を基にもう少し突き詰める必要があり、(3)で提唱したいくつかの要因をもとに今後はガイドライン作りに向けて進めていく必要がある。本研究の目的は、中学高校大学での英語学習者の動機を減退させる要因を明確化し、3校種一貫した英語教育に配慮した、英語学習動機減退に関する動機減退防止のマニュアルを作成する事を作成することであり、23年度の目的は、22年度の研究をもとに、収集した情報と実践を基にしたガイドラインの作成を完成することであった。23年度は、量的データ分析により、より一般化したマニニュアルを作成することを目的とし、入念な質問紙作成を行い、実施した。具体的には、まず、質問紙のベースとして、Dornyei(2001)の動機づけストラテジー、それをもとにして作成された篠原(2009)の日本人向け動機づけストラテジーを基盤とした。動機の減退している3名の大学生と動機の高い3名の大学生とのインタビューをもとに項目の添削を行い、2名の大学教員と4名の大学生の最終チェックを行い、41項目の質問紙を作成した。分析の結果、動機減退防止を基本方針として、(1)学習者中心(2)情熱を持つ(3)教師主導(4)言語自体以上の事項提供(5)個に応じた教育(6)将来的使用の6つが挙げられた。(1)と(3)は一見矛盾しているように思えるが、教師が主導した上で学習者中心の授業を行うということである。また、(4)(5)は学習指導要領においても強調されている点であり、指導要領に沿った指導を行う事によって、動機減退が防止できる事も示唆している。本研究の意義は、多くの研究が動機減退の理由を調査するもので、具体的な防止手だては提唱していなかったという現状を踏まえ、どのような方針で動機減退を防ぐ事が出来るかを示唆したという点であろう。結果についてはすでに執筆済みの論文を学術雑誌投稿する。
G蛋白共役型受容体の細胞内局在の分子機構の解析

受容体の細胞内局在、およびその制御機構を解析するために、α1A,α1Bナドレナリン受容体をモデルとし、定量的実験が可能なフローサイトメトリーと、画像として可視化が可能なレーザー共焦点顕微鏡を組み合わせ解析を行ってきた。前年度は、受容体の蛍光標識にはエピトープタグ、GFP(Green Fluorescent protein)を融合した受容体コンストラクトを作製し、細胞内局在、輸送機構の直接的な可視化および、Real-timeでの観察を可能にした(Awaji et al,Mol Endcrino 1998)。さらに、受容体蛋白質を誘導発現できる培養細胞系を作製し、これを用いて局在、輸送機構に関する薬理学的な解析を行った(Hirasawa et al.Brit J Pharmacol 1998)。また、局在の制御に関与すると考えられる蛋白質の検索のため、yeast two-hybrid法を用いα1Bアドレナリン受容体に結合する蛋白質としてgClqBPの単離に成功した。本年度は、この蛋白質とα1Bアドレナリン受容体との相互作用について、より詳細に解析した。gClqBPのcDNAとα1Bアドレナリン受容体cDNAとをco-transfectすると、同一の細胞内局在を示すこと、その培養細胞を可溶化後抗α1Bアドレナリン受容体抗体で免疫沈降を行うとgClqBPが共沈することなどから、発現した細胞内でも相互作用のあることが分かった。さらに、上記蛍光検出系を組み合わせることで、gClqBPが実際にα1Bアドレナリン受容体の発現量を抑制することを明らかにした。また、相互作用するα1Bアドレナリン受容体側の部位をyeast two-hybrid法と顕微鏡での解析を組み合わせて検索したところ、C末端側のArgがクラスターを作った領域を含むことが分かった。以上、受容体の発現を蛋白レベルでの制御する可能性のある新規の因子を同定し、また相互作用部位についても新規のモチーフを見いだすことができた(Zjxu et al J Biol Chem 1999)。受容体の細胞内局在、およびその制御機構を解析するために、alA,alBアドレナリン受容体をモデルとし、定量的実験が可能なフローサイトメトリーと、画像として可視化が可能なレーザー共焦点顕微鏡を組み合わせ解析を行ってきた。受容体の蛍光標識にはエピトープタグ、GFP(Green Fluorescent protein)を融合した受容体コンストラクトを作製し、細胞内局在、輸送機構の直接的な可視化および、Real-timeでの観察を可能にした(Awaji et al,Mol Endcrinol 1998)。また、受容体蛋白質を誘導発現できる培養細胞系を作製し、これを用いて局在、輸送機構に関する薬理学的な解析を行った(Hirasawa et al. Brit J Pharmacol 1998)。さらに、局在の制御に関与すると考えられる蛋白質の検索のため、yeast two-hybrid法を用いalBアドレナリン受容体に結合する蛋白質としてgClqBPの単離に成功した。この蛋白質のcDNAをalBアドレナリン受容体cDNAとともにco-transfectすると、同一の細胞内局在を示すこと、細胞を界面活性剤で可溶化後抗alBアドレナリン受容体抗体で免疫沈降を行うとgClqBPが共沈することなどから、発現した細胞内でも相互作用のあることが分かった。さらに、上記蛍光検出系を組み合わせることで、gClqBPが実際に受容体の発現量の制御にかかわることを明らかにした。
疾患マーカーの検出及びリアルタイムイメージングを目的とした蛍光プローブの開発

私は安価・高感度・高選択的な疾患マーカー検出法の開発を行った。対象として、近年注目を集める疾患マーカーである脂質過酸化物を選択した。脂質過酸化物は、動脈硬化・腎不全・脳卒中・癌など、多くの疾患との関連が報告されている。私は、脂質過酸化物に特有の構造である□,□-不飽和カルボニル基の特徴的な反応性を活用することで高選択的に固相(microbeads)に結合させる戦略を選択した。microbeadsは洗浄が容易く、生体成分に含まれる夾雑物を除去することが可能である。そのため、タンパク質等に由来する自家蛍光を除くことが出来、高感度検出に繋がると考えた。まず、チオール基を有する蛍光団を生体試料に入れ、マイケル付加させる。その後にカルボニル炭素に対する反応性を有するヒドラジン基を持つmicrobeadsに結合させ、それ以外の夾雑成分を洗浄により取り除く。これにより、脂質過酸化物がリンカーとなり蛍光団とmicrobeadsが結合し、HPLCによる分離操作を行わずとも簡便・高選択的な検出が実現出来ると考えた。プローブとして、tetramethylcarboxyrhodamine(TAMRA)を蛍光団としたTAMRA-C2-SHを合成し、Tentagel-NHNH2 micobeadsを用いて脂質過酸化物の検出を行った。反応条件を詳細に最適化した結果、最終的に血漿中において非常に高感度(submicromolar)に測定出来る系の開発に成功した。続いて、Cyclophosphamide(CPA)投与マウスの血漿中アクロレイン濃度測定を行った。CPAは抗悪性腫瘍剤であり、臨床で多く使用されている。しかしながら重大な副作用として、出血性膀胱炎が問題になっており、頻繁に臨床検査(血液、尿)を行うなど、状態を十分に観察することが必要になる。その原因物質とされているのが脂質過酸化物の一つであるアクロレインである。実際にCPA投与マウスの血漿を採取し、開発した方法で測定を行ったところ、生理食塩水を投与したマウスと比較して有意にアクロレイン濃度が増大していることが確かめられた。出血性膀胱炎に対して予防的に対処することで患者のQOLの向上に貢献出来、極めて意義のある結果であると考えている。高齢化社会を迎えている今日、国民が健康で穏やかな老後を迎えるためには、癌や成人病など難治性の疾患を超早期に発見し、予防的に対処することが求められている。このためには、生体内の生物学的変化を追跡でき、疾患の指標となる物質(以下、疾患マーカーと呼ぶ)を尿や血清中から極めて高感度、かつ特異的に検出できる画期的な方法が必要である。疾患マーカーについて多くの研究が行われており、報告数は数千に及ぶ。しかしながら、臨床で実際に診断に使われている疾患マーカーはその中の極少数のものである。その理由としで疾患マーカーを検出する技術が確立していないことが挙げられる。そのため、現在、安価・高感度な疾患マーカー検出法の開発が強く求められている。私は、検出法開発の一環として、α,β-不飽和カルボニル化合物に対する蛍光プローブの開発を行った。α,β-不飽和カルボニル化合物は疾患マーカーとして注目される脂質過酸化物(アクロレイン、4-ハイドロキシ-2-ノネナール等)に多く見られる構造であり、動脈硬化症、慢性腎不全等、多くの疾患との相関が示唆されている物質である。以下にプローブの設計について述べる。α,β-不飽和カルボニルは、チオール含有化合物とマイケル付加することで、カルボニル基を有するS-アルキル生成物を与える。我々はさらに生成したカルボニル基に対してヒドラジン誘導体を反応させることで、アクロレインをリンカーとしてチオール含有化合物とヒドラジン誘導体とを高収率に結合させることに成功した。そこで本反応原理を活用し、microbeadsと蛍光団とを特異的に結合させることでアクロレインを高感度かつ簡易に検出する方法を確立した。このような検出原理は今までなかったものであり、独創性を有している。また、microbeadsは簡易に洗浄を行えるため、未反応の生体成分や蛍光分子を取り除くことが可能であり、生体成分を対象とした場合にも信頼性の高い測定を行うことが期待される。

反応条件を詳細に最適化した結果、最終的に血漿中において非常に高感度(submicromolar)に測定出来る系の開発に成功した。続いて、Cyclophosphamide(CPA)投与マウスの血漿中アクロレイン濃度測定を行った。CPAは抗悪性腫瘍剤であり、臨床で多く使用されている。しかしながら重大な副作用として、出血性膀胱炎が問題になっており、頻繁に臨床検査(血液、尿)を行うなど、状態を十分に観察することが必要になる。その原因物質とされているのが脂質過酸化物の一つであるアクロレインである。実際にCPA投与マウスの血漿を採取し、開発した方法で測定を行ったところ、生理食塩水を投与したマウスと比較して有意にアクロレイン濃度が増大していることが確かめられた。出血性膀胱炎に対して予防的に対処することで患者のQOLの向上に貢献出来、極めて意義のある結果であると考えている。