hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中赤外電場パルスによる強相関電子系の非摂動光学応答と相転移の実時間観測

本研究の目的は、高強度の中赤外レーザーパルスを物質に照射することで、従来の可視光励起では実現できなかった、物質の新規な光応答を見出すことである。前年度は、位相安定な中赤外パルスを発生させるための、新しい周波数変換手法の開発を行った。更に、その手法で発生させた励起用の中赤外パルスと、検出用の可視超短パルスを組み合わせることにより、励起中赤外光の振動電場に対応した物質の光学応答を観測可能なレーザー測定システムを構築した。本年度は、その測定システムを用いて、有機電荷移動錯体テトラチアフルバレンパラクロラニル(TTF-CA)における中赤外光励起の測定を行った。まず、TTF-CAのイオン性相において、中赤外領域に存在する分子内振動を共鳴励起することで、電子ー分子内振動結合を介して高速の分子間電荷移動が生じる様子を実時間で観測することに成功した。このような現象が観測可能になったのは、本レーザーシステムでは、前述したように、励起中赤外光の電場波形に対応する固体の応答が観測可能だからである。さらに、電子ー分子内振動結合によって波動関数の混成が生じたことにより、基底状態であるイオン性相から中性相への光誘起相転移が生じることも分かった。TTF-CAのような分子性固体において、分子内振動励起をきっかけとする相転移が観測されたのは、本研究が初めてである。一方、分子内振動に非共鳴な励起条件であっても、励起中赤外光の強度が強い場合には、量子トンネル過程という別の機構によって分子間電荷移動が生じ、中性相への相転移が生じることも分かった。これらの結果は、中赤外光励起によって従来とは異なる機構による光誘起相転移を実現しており、光物性の分野において重要な成果であると考えられる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、高強度の中赤外レーザーパルスを物質に照射することで、従来の可視光レーザーパルスの照射では実現できなかった、物質の新奇な光応答を実現することである。同時に、レーザーパルス照射に対する物質の光応答を、より精密に検出するため、中赤外パルスの電場位相を安定化する技術の開発にも取り組んでいる。当該年度においては、大きく分けて二つの研究を行った。一つは位相安定な中赤外レーザーパルスを発生させるための新しい周波数変換手法の開発、もう一つはその中赤外パルスを励起光に用いた、有機電荷移動錯体TTF-CAにおける電子状態制御の研究である。位相安定な中赤外パルスを周波数変換によって発生させる手法は、これまでほとんど報告されていなかった。本研究では、フィラメンテーションと呼ばれる現象を利用した周波数変換前のパルスの周波数広帯域化と、非線形光学結晶を用いたパルス内差周波発生を組み合わせた、新たな周波数変換手法を開発した。この手法は従来のものと比べて必要な光学系が簡便なことが特徴である。この成果はApplied Physics Express誌に投稿した。また、上記の手法で発生させたパルスを用いて、有機電荷移動錯体TTF-CAにおける中赤外光励起の実験を行った。隣り合う分子が二量体化したイオン性相に中赤外光を照射することで、イオン性状態を保ったまま二量体化消失したことを示すかと反射率変化が観測された。このような応答は過去に行われた可視光励起では観測されておらず、中赤外光励起に特徴的な光応答であると考えられる。当初の計画では、当該年度には周波数変換手法の開発と、それを用いたレーザー測定システムの構築を行う予定であった。上述した通り、当該年度においてはこれらの課題を解決、遂行したうえで、対象物質における測定を行い、新規の光応答を観測することに成功した。この意味で、本研究は当初の計画以上に進展しているといえる。

これらの結果は、中赤外光励起によって従来とは異なる機構による光誘起相転移を実現しており、光物性の分野において重要な成果であると考えられる。今後は有機電荷移動錯体において観測された、中赤外光励起の二量体化消失について詳細な研究を進める予定である。具体的には、反射率変化の励起光強度、温度依存性を詳細に測定することで、電子状態の変化をより詳しく調べる。これらに加えて、第二高調波発生の強度変化も測定することで巨視的な電気分極の変化についても調査する。得られた結果から、中赤外光励起特有の光応答が生じる機構を解明することが最終的な目標である。また、TTF-CAだけでなく、他の分子性固体やモット絶縁体においても中赤外光励起の祖k杖意を行う予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。研究室webページ
リンパ球の分化・増殖におけるアナモルシンの役割の解明

申請者らが、抗アポトーシス分子としてクローニングしたAnamorsin(AM)は、その後の継続した研究により、鉄・硫黄(Fe-S)クラスターを形成する分子として機能していることが示されている。In vivoでの種々の細胞におけるAMの機能を解析し、それらの細胞において、重要な働きをしているFe-Sクラスター蛋白を明らかにする目的にて、AMコンディショナルノックアウトマウス(AM Flox/Floxマウス)を作製した。本研究では、Bリンパ球、Tリンパ球特異的に、AMを欠損させたマウスを作製し、それらのフェノタイプの解析をおこなった。Bリンパ球特異的にAMを欠損したマウスを、CD19 Creトランスジェニック(Tg)マウスとAM Flox/Floxマウスを交配し作製したところ、脾臓に局在するFOLIの分化段階のBリンパ球が極端に減少していることが明らかとなった。また、その分化段階にて、アポトーシスの亢進がみられることも確認した。その分化段階のAM欠損Bリンパ球と正常Bリンパ球の遺伝子発現の違いをRNA seqをおこない比較し、発現に差のあった分子の中で、Bリンパ球の分化・増殖に関与するシグナル伝達に関わる分子群にしぼって検討したところ、FOLI細胞のみならず、FOLIの前分化段階のT1細胞においても、P38MAPK遺伝子の発現が有意に低下していた。ウェスタンブロット法をおこない、蛋白レベルにおいてもP38MAPKの発現は低下していることが示され、Bリンパ球の最終分化におけるAMの標的蛋白はP38MAPKであることが明らかとなった。P38MAPKの発現は、正常Bリンパ球においても、T1、T2からFOLIに分化する際に、上昇することがわかっており、AMが欠損することで、この発現上昇が抑制されることがFOLI細胞の低下につながっていると考えられた。申請者らが抗アポトーシス分子としてクローニングしたAnamorsin(AM)は、その後の継続した研究により、鉄・硫黄(Fe-S)クラスターを形成する分子として機能している可能性が示されてきている。In vivoでの種々の細胞におけるAMの詳細な機能を明らかにするためAMコンディショナルノックアウトマウス(AM Flox/Floxマウス)を作製した。本研究では、リンパ球の分化・増殖におけるAMの機能を明らかにするため、Bリンパ球、Tリンパ球特異的にAMを欠損させたマウスを作製し、それらのBリンパ球、Tリンパ球の機能を解析する予定である。最初に、Bリンパ球のAMの機能を解析する目的に、CD19Creトランスジェニック(Tg)マウスとAM Flox/Floxマウスを交配し、CD19陽性Bリンパ球特異的にAMを欠損したマウスを作成し、その表現型を解析したところ、最終分化段階のBリンパ球のみが減少することが明らかとなった。さらに、各分化段階のBリンパ球を単離し、RNAseqによって、遺伝子の発現変化を野生型マウスのBリンパ球と比較したところ、AM KO Bリンパ球では、B cell receptorのシグナルでは、p38MAPKの活性化が起きていることが想定される結果であった。さらに、ウェスタンブロッティングなどで、p38MAPKのリン酸化を検討する予定である。また、Tリンパ球のAMの機能を解析する目的に、CD4Creトランスジェニック(Tg)マウスとAM Flox/Floxマウスを交配し、CD4陽性Tリンパ球特異的にAMを欠損したマウスを作成し、その表現型を解析したところ、CD4陽性Tリンパ球のみならず、CD8陽性Tリンパ球の減少もみられた。今後、AMの作用点などを検討していく予定である。先行しているBリンパ球でのAnamorsin(AM)の機能解析は、CD19陽性Bリンパ球特異的にAMを欠損させることで、マウス脾臓の白脾髄に存在するFOLIの分化段階(最終分化段階)Bリンパ球のみが、有意にアポトーシスを起こし、減少していることが判明した。この表現型は、B cell receptorからのシグナル伝達を担うBtkの欠損マウスと類似しているため、AM欠損Bリンパ球のBtkを検討したが、リン酸化などには野生型と比較し、差を認めなかった。そこで、AMのBリンパ球における作用点を明らかにするため、RNAseqをおこない、遺伝子発現の差を検討したところ、p38MAPKの活性が亢進している所見が得られた。現在、ウェスタンブロッティングをおこない、蛋白レベルでの解析をおこなっている。Tリンパ球でのAMの機能解析は、CD4陽性Tリンパ球特異的にAMを欠損させることで、CD4陽性Tリンパ球のみならず、CD8陽性Tリンパ球も減少を認めた。今後、AMの作用点を検討するために、Bリンパ球のときと、同様に、RNAseqをおこない、遺伝子発現の差を検討する予定である。まずは、Bリンパ球特異的にAMを欠損したマウスを、CD19 Creトランスジェニック(Tg)マウスとAM Flox/Flox

マウスを交配し作製したところ、脾臓に局在するFOLIの分化段階のBリンパ球が極端に減少していることが明らかとなった。また、その分化段階にて、アポトーシスの亢進がみられることも確認した。その分化段階のAM欠損Bリンパ球と正常Bリンパ球の遺伝子発現の違いをRNA seqをおこない比較し、発現に差のあった分子群のシグナルパスウェイ解析をおこなったところ、AM欠損Bリンパ球では、p38MAPKの活性化が起こっていることが予想された。その後、フローサイトメトリー法を用いた細胞内リン酸化蛋白の検出法(ホスホフロー)をおこない、p38MAPKのリン酸化状態の差を比較検討している。次に、Tリンパ球特異的にAMを欠損したマウスを、CD4 Cre TgマウスおよびLck Cre Tgマウスと交配し作製したところ、両方とも、胸腺の委縮、末梢血中のTリンパ球の減少を認めた。それらの細胞を用いてAM欠損Tリンパ球内で何が生じているか、RNA seqなどをおこない、検討している。Bリンパ球特異的AM欠損マウスにおいて、明らかに差を認めたのは、Bリンパ球の最終分化段階に近いFOLIという分化段階の細胞が有意に減少していることであった。この分化段階の一つ前の分化段階のFOLIIは、細胞数に差を認めなかった。以上のことから、正常およびAM欠損FOLIおよびFOLIIの細胞を用いて、遺伝子の発現パターンの差をRNA seqをおこない、差のある遺伝子群から、パスウェイ解析をおこなったところ、p38MAPKがAM欠損Bリンパ球において亢進していることが予想された。それを証明するために、ウェスタンブロットをおこなったが、細胞数が少ないため、決定的な結果が得られなかった。別の方法を検討した結果、ようやく、フローサイトメトリーにて、細胞内の蛋白リン酸化の変化を検出する方法(ホスホフロー)によって、安定したデータが取れるようになった。Tリンパ球特異的AM欠損マウスの解析においても、AM欠損細胞は数が減少するため、解析するのが困難となるという問題があったが、上記の方法を用いることで、少ない細胞においても、細胞内のシグナル蛋白のリン酸化の変化を検出することが可能となったため、研究が進展すると期待している。申請者らが、抗アポトーシス分子としてクローニングしたAnamorsin(AM)は、その後の継続した研究により、鉄・硫黄(Fe-S)クラスターを形成する分子として機能していることが示されている。In vivoでの種々の細胞におけるAMの機能を解析し、それらの細胞において、重要な働きをしているFe-Sクラスター蛋白を明らかにする目的にて、AMコンディショナルノックアウトマウス(AM Flox/Floxマウス)を作製した。本研究では、Bリンパ球、Tリンパ球特異的に、AMを欠損させたマウスを作製し、それらのフェノタイプの解析をおこなった。Bリンパ球特異的にAMを欠損したマウスを、CD19 Creトランスジェニック(Tg)マウスとAM Flox/Floxマウスを交配し作製したところ、脾臓に局在するFOLIの分化段階のBリンパ球が極端に減少していることが明らかとなった。
温度感受性変異p53遺伝子を持つマウス赤白血病細胞の生物特性

フレンドウイルスgp55遺伝子導入トランスジェニックマウス由来の赤白血病細胞系より温度感受性変異p53(p53^<val-135>)遺伝子を発現する赤白血病細胞株を樹立し、その亜株(El-gp55-1-2-3)を分離した。同細胞株では変異p53は細胞質に局在するが、温度シフトにより野生型p53の発現を誘導するとp53は核内に移行し標的DNAに結合する。即ち、1-2-3細胞を37°C、あるいは32°Cで培養した後、抗p53モノクローナル抗体(PAb421)を用いて免疫染色を行った。37°Cでは細胞質が、32°Cでは核が染色された。さらに、野生型p53の発現に伴いこの赤白血病細胞系の細胞増殖能が顕著に低下し、アポトーシスが誘導されることを明らかにした。即ち、32°Cで培養した場合アポトーシス特徴的な染色体DNAの断片化が観察された。またこの時、細胞周期制御に関与するp21、gadd45、およびcyclin Gの発現は活性化されるが、アポトーシス関連遺伝子bcl-2、bax、fas、およびfas ligandの発現上昇は認められないことを再現性よく確認した。p53遺伝子変異により細胞周期制御に関与する遺伝子の機能が抑制され、細胞の腫瘍性が維持される可能性が示唆された。この細胞系の腫瘍増殖シグナルはgp55が結合するEPORの下流にあるが、検索した結果JAK1,STAT5が恒常的にチロシン燐酸化していることが明かになった。しかしSTAT5は核内移行ができず、他の経路のシグナルを用いている可能性が示唆された。
介護ストレス症候群のバイオマーカーの確立

認知症の介護疲れによる心身のストレスから、介護者のうつや虐待の増加が社会で問題になっている。認知症専門外来に通院中で、老老介護34夫妻の介護者のストレス状態の把握を目的として心理検査とストレスマーカーの測定を行った。介護者は高頻度でうつ、不安を有していた。GDS15(うつ状態)、POMSの抑鬱(p=0.05)、STAIの特性不安(p=0.02)は介護者(妻)の方が有意に悪い結果であった。配偶者の認知症進行に伴い、介護者(夫)は、心理的QOLが低く、特性不安とGDSが高くなった。一方、介護者(妻)は、POMSの怒り-敵意と特性不安が軽快した。介護者のストレス評価も認知症診療で取り入れる必要がある。また、介護ストレスには性差があり、それに基づく対応が重要と考えた。認知症患者は年々増加しており、その介護負担は、非常に大きなものである。介護が原因で病気になる家族も増えており、なんらかの心身の症状がでる病態を「介護ストレス症候群」と名づけた。介護ストレス症候群の診断・治療について検討すべく本研究を計画した。これまでは、Zarit介護負担尺度による気分的な評価しかなかった。しかし、血液検査、唾液検査から「介護ストレス症候群」の程度をバイオマーカー(血液中コルチゾール、唾液中コルチゾール・アミラーゼなど)で診断することで、適切な処置が講じられ、高齢者の虐待、心中、自殺が減るのではないかと期待できる。21年度は、唾液バイオマーカーのコルチゾール・アミラーゼの安定した測定方法を確立した。高齢者は、唾液分泌量が少なく、予定していた方法では、唾液が十分採取できなかったため、唾液採取方法を再検討し、研究が軌道に乗るまで時間がかかった。研究に同意された患者(21年度20組)の認知症の程度・生活機能の評価・睡眠評価・唾液採取を行い、介護者の身体症状聴取・うつ、不安、QOLなどの心理検査・血液検査・唾液採取を行っている。臨床心理士によるカウンセリングも同時に行い、前後でのストレスマーカーの変化も検討している。認知症患者、介護者の睡眠時間は、actiwatchで実測しているが、介護者の方が患者に比べ、睡眠時間が短い傾向はみられる。また、介護者に高血圧患者が多く、24時間自由行動下血圧計による血圧変動の評価も研究に組み入れることにした。介護者のストレス状態の把握を目的として心理検査とストレスマーカーである唾液アミラーゼの測定を行った。認知症専門外来に通院中の介護者に心理検査(QOL26、STAI、POMS、GDS15、Zarit介護負担尺度)、ストレスのバイオマーカーとして唾液アミラーゼの簡易測定(自宅)を施行した。50組の参加者の中で、老々介護34組を解析した。介護者の属性は、妻18名(平均年齢73±8歳)、夫16名(77±4歳)。患者の要介護度は、要介護122名、要介護2以上12名。要介護度、介護時間に差はないが、介護者の平均GDS15は妻6.4±3.8点、夫4.3±3.0点、POMSの抑鬱(p=0.05)、STAIの特性不安(p=0.02)も妻の方が有意に悪い結果であった。介護者の症状は、妻はイライラ50%、疲労79%と訴えが多く、夫は15%、23%と少なかった。しかしながら、夫の自宅での唾液アミラーゼは平均322±116kU/lと男性認知症患者の平均134±56kU/lに比べ有意に高値だった。女性患者のMMSEとその夫のZarit介護負担尺度(r=0.67,p<0.01)およびGDS(r=0.78,p<0.01)は負の相関を示した。要介護1と2以上を比較すると、夫は、心理的QOLが低く、特性不安とGDSが高くなった。妻は、夫の認知症進行に伴う有意な症状の増悪はみられなかった。老々介護ストレスの実態を調査し、介護者は高頻度でうつ、不安を有しており、介護者のケアも認知症診療で取り入れる必要がある。男性介護者のストレス把握には、愁訴だけでなく、バイオマーカーの評価も重要と考えられた。
ナシの花芽分化に関する研究、特に生長点の微細構造と核酸・蛋白質の変化

ニホンナシの花芽分化の機構を解明するために、品種新水の短花枝の芽を新梢上の葉芽と比較しながら、頂端分裂組織の細胞形態、細胞の微細構造、さらには細胞内Ca^<2+>の分布などについて主として電子顕微鏡によって観察した。形態的花芽分化の徴候は6月26日に認められ、内体細胞の活動が高まった。7月10日にがく片原基が分化しはじめた。7月17日に花弁原基が、7月30日に雄ずい原基が、9月20日頃に雌ずい原基が分化した。茎頂は外衣、内体、静止帯および髄部に分けることができた。花芽分化の進行につれて外衣層数は減少したが、内体層数は増加して茎頂が肥大した。静止帯細胞ではデンプン粒とが著しく増加したが、がく片期以後ではほとんど消失した。一方新梢上の葉芽では同じ時期に茎頂の肥大もデンプン粒の蓄積も観察されなかった。6月26日から7月10日にかけて、花芽分化中の茎頂の細胞の微細構造に著しい変化が認められた。ゴルジ体の数は増加し、多数の分泌小胞が認められた。小胞体は分布密度が高まり付着する数や大きさも増加し形も楕円または球状となった。細胞核はクロマチンが増加し、染色濃度も濃くなった。核仁も大きくなった。ピロアンチモン酸カリでCa^<2+>を沈殿させる方法で電子顕微化学的に細胞内のCa^<2+>を検出した。Ca^<2+>粒子は花芽分化前には少なかったが、6月26日茎頂の内体細胞が活発になった時に最も増加し、その後7月10日のがく片原基分化にかけて減少した。核内においてCa^<2+>は主に核液中に分布し、花芽分化時に著しく増加した。細胞質内において小胞体、ゴルジ体、ミトコンドリア中のCa^<2+>も6月26日の花芽分化時に増加したが、その後減少した。以上の結果は形態的な花芽分化の直前に、茎頂細胞で核酸、タンパク質合成が活発になること、Ca^<2+>が花芽分化に重要な役割を果たしていることを示唆している。核仁も大きくなった。1.新梢に花芽をつけにくい`新水'と比較的花芽をつけやすい`幸水'の新梢の頂芽および頂部近傍の側芽を5月末より8月にかけて経時的に採取し、解培顕微鏡(マイクロウォッチャー)で生長点を観察した。筑波における`新水'および`幸水'の形態的花芽分化期が7月初旬であることを確認した。また`新水'の新梢側芽の花芽分化は著しく少なかった。2.これら成長点を常法で固定、包埋、電子染色を行い、透過型電子顕微鏡で観察した。頂端分裂組織の細胞の細胞活性が高いことが伺えたが、花芽と未分化の芽、または葉芽との間の質的な違いを明らかにするには至っていない。3.被覆栽培下においては`幸水'も花芽分化しにくく、花芽が減少する。

これらの樹に矮化剤のパクロブトラゾール、天然型アブシジン酸を散布すると、新梢の生長を抑制したが、その効果は前者が高かった。またこの両生長調節物質ともに花芽の着生を増加させたが、その効果もパクロブトラゾールの方が高く、露地でのアブシジン酸の方が効果が高いこととは異なった。これらの点からパクロブトラゾールは栄養生長の盛んな条件下で新梢の生長を抑制して間接的に花芽分化を促進し、一方アブシジン酸は好適生長条件下でも直接的に生長点に作用して花芽分化をひきおこすものと示唆された。4.今後`幸水'と比較しつつ`新水'の生長点の花芽分化過程における生長点の微細構造の変化、花芽と葉芽の細胞の質的な違いを追求するとともに、被覆条件下、さらには生長調節物質により影響をうけた花芽分化過程についても、これらの変化を追求する予定である。ニホンナシ`新水'の短果枝上の芽の花芽の分化に伴う頂端分裂組織の細胞の形態と構造およびその微細構造の変化を観察した。花芽分化の兆候は6月26日に認められ、りん片が緩み、茎頂が肥厚し始めた。ついで、7月3日に側花原基が出現し、7月10日に萼片原基も分化し始めた。花芽分化の進行につれて、特に静止帯細胞中のでんぷん粒の蓄積が増加し、やがて内体細胞の活性が高まった。そして内体細胞と静止帯細胞の形態に変化が認められ、さらに外衣層数が減少し、逆に内体の層数が増加した結果、茎頂が肥大し始めた。一方、新梢上の葉芽となる芽では茎頂の肥大、外皮、内体細胞の変化、静止帯細胞中のでんぷんの蓄積などは認められなかった。6月26日から7月17日の間にすべての細胞内の微細構造は激しい変化を示した。花芽分化の進行にしたがって、ゴルジ体の数が顕著に増加し、また大きな分泌小胞の増加とゴルジ体の短縮現象など、形態の変化も認められた。小胞体の分布密度も明らかに高まり、付着するリボゾームも増加した。また、これらの小胞体に関連した活発なゴルジ体も存在した。ミトコンドリアは数も大きさも明らかに増加する傾向があった。特に形態の変化は明らかで、体積が増加するとき、形状も楕円または球状となった。一方、色素体の数には大きな変化はなかった。花芽分化の開始とともに花芽の細胞核内のクロマチンが増加し、また染色濃度も濃くなった。これはまた核仁の増大を伴った。以上のような茎頂細胞の細胞質および核で観察された微細構造の変化は、分化中の花芽に特有のもので、葉芽となる芽では観察されなかった。花芽分化におけるCa^<2+>の役割を究明するために、ニホンナシ`新水'の短果枝上の芽を材料にし、ピロアンチモン酸カリでCa^<2+>を沈澱する方法とEGTA処理により電子顕微化学的にCa^<2+>の検出を行った。Ca^<2+>粒子密度は細胞の分裂活性の程度によって異なった。短果枝上の芽においては6月5日までは粒子は少なかったが、6月26日、茎頂の内体細胞が活発になった時、粒子数は急激に上昇して最高になった。しかし、その後は7月3日、7月10日と減少した。7月17日がく片原基分化時に最も少なくなった。花芽分化の前には細胞核中のCa^<2+>粒子の密度は低く、その密度の増加は形態的な花芽分化が始まる兆候であった。核内においてCa^<2+>は主に核液中に分布し、核仁の顆粒区域と核仁から放出されたようにみえる物質中にも存在したが、核仁の繊維区域と染色体および集団クロマチンには存在しなかった。細胞壁はCa^<2+>粒子の主な分布場所であったが、花芽分化開始後細胞内Ca^<2+>粒子密度が高い時期には細胞壁のCa^<2+>粒子は逆に減少した。一方、液胞中には通常Ca^<2+>粒子がきわめて少ないが、細胞中のCa^<2+>粒子密度は急激に上昇した時には、液胞中にもCa^<2+>が一次的に多量に分布した。色素体は6月5日までCa^<2+>粒子の大部分をその中に保持し、それ以後もCa^<2+>粒子の主な分布場所であったが、細胞内Ca^<2+>
植物の環境適応・被食防衛に応答するカルシウム依存リン酸化・ユビキチン化制御機構

食害や環境ストレスによって活性されるカルシウム依存性タンパク質リン酸化酵素(Calcium-Dependent Protein Kinase:CPK)とそれらの基質タンパク質に着目し、食害および高温ストレスに曝されたシロイヌナズナにおける遺伝子転写制御の分子機構の解明を試みた。CPK変異体を用いた解析等により、CPK3とCPK13による基質タンパク質(HsfB2a[転写因子]など)のリン酸化は防御遺伝子と熱ショック遺伝子の発現誘導において重要であり、これらのCPKはリン酸化する基質ターゲットを変化させ、様々なストレス環境下において多様な役割を担うことが示唆された。植物の食害防御シグナル伝達系においては植物細胞内のカルシウムのダイナミックスが初期シグナルとして重要な役割を担うことが示唆されつつある。本研究では、昆虫の食害によって活性されるカルシウム依存性タンパク質リン酸化酵素(Calcium-Dependent Protein Kinase : CPK)とCPKと相互作用する転写制御系に着目し、それらのシグナル伝達系を介した遺伝子転写制御機構の解明を試みた。シロイヌナズナCPK遺伝子のT-DNA挿入変異体を取得し、ヨトウガ幼虫に被食された変異体における防御遺伝子の発現誘導を解析した。19系統の変異体の中でCPK3とCPK13の変異体は、野生株と比べ、防御遺伝子PDF1.2の発現誘導が著しく抑制されていた。コムギ無細胞タンパク質合成系を用いて作成された植物転写因子ライブラリーから、CDPKによりリン酸化される基質ターゲットに探索した結果、CPK3とCPK13がHsfB2aなどの転写制御因子、タンパク質のユビキチン化に関与する酵素ATL2(E3 ubiquitin ligase)に対してリン酸化活性を示した。また、CPK3あるいはCPK13を植物にHsfB2aと一過的に共発現することにより、PDF1.2の転写制御は促進された。しかし、シロイヌナズナの高温ストレス応答においてHsfB2aは抑制因子として機能したことから、CPK-HsfB2aの相互作用は食害ストレスと高温ストレスでは異なるメカニズムにより機能することが示唆された。植物細胞内のカルシウムのダイナミックスが食害応答初期シグナルとして重要な役割を担うことが示唆されつつある。本研究では、食害によって活性されるカルシウム依存性タンパク質リン酸化酵素(Calcium-Dependent Protein Kinase : CPK)とCPKの基質タンパク質に着目し、それらのシグナル伝達カスケードに依存した遺伝子転写制御機構の解明を試みた。シロイヌナズナCPK遺伝子のT-DNA挿入変異体を用いて、ヨトウガ幼虫(害虫)に被食された変異体における防御遺伝子PDF1.2の発現誘導について解析した。19系統のCPK変異体および野生株の食害後のPDF1.2の発現量を定量した結果、CPK3とCPK13変異体における遺伝子発現が著しく抑制されていることが見出された。したがって我々はCPK3とCPK13に着目し、コムギ無細胞タンパク質合成系を用いて作成された植物転写因子ライブラリーから防御応答に関与する100種の転写因子をCPKの基質候補として選抜し、CPKによるリン酸化実験を実施した。その結果、CPK3/13はHsfB2aなどの3種の転写制御因子およびユビキチンリガーゼであるATL2をリン酸化することがわかった。また、CPK3/13を植物にHsfB2aと一過的に共発現することにより、CPKによるHsfB2aのリン酸化作用はPDF1.2の転写制御にin vivoでも機能することが見出された。CPK-HsfB2aカスケードは、高温ストレスに曝されたシロイヌナズナの防御応答にも関与していたことから、CPKカスケードはリン酸化する基質ターゲットを変化させ、様々なストレス環境下においても多様な役割を担うことが示唆された。
JMJD2Aは進行胃癌においてエピジェネティック調節により薬剤感受性を制御する

本年度の研究では、進行胃癌におけるJMJD2Aの治療標的因子あるいは効果予測マーカーとしての有用性を立証するために、そして、JMJD2Aによるエピジェネティック調節を介した薬剤感受性の制御のメカニズムを明らかにするために、以下の2つの検討を行った。2)Gene expression arrayにより抽出されたJMJD2Aが制御する標的遺伝子のバリデーションを以下のように行った。1JMJD2A標的遺伝子の発現をsiRNAによりノックダウンし、その発現の抑制をTaqmanPCR及びWestern blot法により確認した。2JMJD2Aのノックダウンを確認したサンプルを用いて、各標的遺伝子のmRNAレベルおよび蛋白質レベルの発現を確認した。3以上からJMJD2Aが各標的遺伝子の発現を調節することを検討した。今後の研究の展開として、JMJD2AによりmRNAおよび蛋白質発現に影響を受ける遺伝子を標的として、胃癌培養細胞株を用いて、標的遺伝子の発現をsiRNAによりノックダウンし、5-FU, CDDP, docetaxelに対する感受性の変化を検討する。申請時から所属研究機関を異動したため、研究環境が大きく変わった。初年度は機器や試薬の購入など研究環境を整えることに注力したため、当初の計画より実験の進捗が遅れることとなった。今後の研究では、標的遺伝子座におけるJMJD2Aの蓄積部位の探索およびヒストンメチル化状態を明らかにする。MKN45親株細胞とJMJD2Aノックダウン細胞を用いて以下の検討を行う。2Chip/Chip-seq解析により、JMJD2Aの基質であるヒストンH3K9のメチル化状態を調べる。3以上によりJMJD2Aがどの部位で蓄積し、JMJD2AノックダウンによりH3K9のメチル化の状況がどのように変化するのかを確認できる。研究計画通りに進まなかったため、本年度に使用する予定だった物品を購入するに至らなかった。そのため、進捗状況に応じて、次年度に必要な物品費として用いることとなった。使用計画としては、抗体などの試薬類や培養デッシュ、測定キットなどの消耗品に用いる。
大型店舗における万引きに対する社会的反作用についての実証的研究(その2)

1.少年非行の第三のピーク(昭和58年)から第四のピーク(平成10年)にかけて、刑法犯少年の万引き事犯の増減が非行統計の増減に影響を与えていることが明らかになり、万引き事犯は昭和63年(88年)に激増期、平成3年(91年)に激減期、平成9年(97年)に再増加期を示している。2.このような万引き事犯の増減は、調査対象とした全国6都市の約20店舗の事例からみると、(1),大型店舗が少年を顧客の対象に設定し、少年たちが店舗を消費や遊びの場とする程度によって、(2),各店舗が保安業務を警備会社に委託し、万引き事犯を画一的に警察へ通報する程度によって、(3),不況による保安業務や従業員の合理化によって、万引きが暗数として潜在化する程度によって、(4),警察通報の後に、管轄警察署が当該事犯を微罪処分とするか簡易送致等と処理するかによって、非行統計全体に対して多様な影響を与えてきたことが明らかになった。3.上記「激増期」には(1)の増加と(2)の強化が大きく作用し、「激減期」には(1)の低下と(3)の進行が大きく作用し、「再増加期」には少年を顧客対象とする店舗(専門店や量販店等)の(2)の強化が大きく作用しているとみることができる。また、店舗での万引き事犯の処遇が、寛容型から厳罰型へ移りつつあることも確認できた。4,成人の万引き事犯に変化が表れてきた。ホームレスや失業者による「生活型」の万引きが急増し、外国人による万引きも増加している。5.警察の処遇基準(微罪か簡易送致等か)は解明できなかったが、各店舗の処遇類型は、警備実務型・道徳的事業型・少年教育型・経営機能型に分けることができる。平成元年度の科学研究費補助金による本研究から8年が経過し、その後の少年非行統計は「万引き」も含めて平成7年度まで漸減傾向にあり、平成8年度以降に漸増傾向を示している。この統計化プロセスと「大型店舗における万引き」との関係を解明する上で、本年度の調査研究等で明らかになった事実は次の通りであった。1.これまでの調査対象地域(東京23区・京都市・岡山市・鹿児島市)における追跡調査では、百貨店で少年の万引きが激減し、結果的に中高年の割合が急増していること、大手スーパーで系列警備会社による画一的処遇が徹底して資料の保存が短期化していること、新たな調査対象地域(札幌市・那覇市)では大型店舗がまだ万引きの場になっていて、特にスーパーや専門店への「場の移動」が進んでいることである。2.当該地区の警察機関への聞き取り調査については、警察の担当部署の協力を得て「調査票」の作成を行ない、一部の地域で調査を進めているが、警視庁の「簡易送致事件」判断の基準に概ね準じた処遇が行なわれ、また簡易送致以前の「署限りの措置」が統計化に大きく影響する事実も見受けられた。昨今の少年非行報道がこの措置を減少させることが十分予想される。3.さらに、各都市の店舗・学校・警察の連絡指導組織のあり方の変化も特徴的であり、「早期発見・早期治療」方針と「人権擁護」の配慮のバランスの変化が見受けられた。4.今後の研究の展開に関する計画としては、平成1011年度予定の補助金配分にもとづき、(1)平成10年まで3年間の各都市の大型店舗における実態を調査整理する、(2)同じく当該地区の警察に対する聞き取り調査を進めて「措置・送致」の実態と傾向を捉える、

(3)平成11年度に調査報告書を作成して論分化を検討する。平成元年度の科学研究費補助金による本研究から9年が経過し、その後の少年非行統計は「万引き」も含めて漸減傾向から漸増傾向へ転じて、平成910年度は「戦後第四のピーク」を形成しつつあると言われ、万引きも統計上再び増加している。この統計化プロセスと「大型店舗における万引き」との関係を解明する上で、本年度の調査研究等で明らかになった事実は次の通りであった。1,これまでの調査対象地域(東京23区・京都市・岡山市・鹿児島市)における追跡調査では、百貨店で少年の万引きの激減傾向が止まり、中高年と共に増加しつつあること、大手スーパーで系列警備会社による画一的処遇が進んで警察への通報率が高まっていること、新規調査対象地域(札幌市・那覇市)では特に専門店への「場の移動」が進んでいることである。2,当該地域の警察機関への聞き取り調査については、昨年度に作成済の「調査票」にもとづいた調査を行なった結果、引き続き警視庁の「簡易送致事件」判断の基準に準じた処遇が行なわれているが、昨今の少年非行報道が「署限りの措置」を減少させ、非行統計の増加に影響を与えていると見られる事実も見受けられた。3,本年度で調査全体の概要を集約する計画であったが、平成10年までの万引きの実態について、大型店舗と警察機関に対する聞き取り調査が全対象地域で終了しておらず、店舗現場と統制機関との処遇結果の比較も含めて、平成11年度の前半に行ないたい。4,今後の研究の展開に関する計画としては、平成11年度予定の補助金配分により、(1)平成10年までの大型店舗の実態調査の総仕上げを行なう、(2)同じく当該地域の警察に対する聞き取り調査を仕上げて、「措置・送致」の実態と傾向をまとめる、(3)平成11年度に調査報告書(冊子)を作成して、論文化を検討する。平成元年度科学研究費補助金による第1回の本研究から10年が経過し、その後の少年非行統計は「万引き」も含めて漸減傾向から漸増傾向に転じ、平成911年度は「戦後第四のピーク」を形成しつつあると言われ、万引きも統計上再び増加して、平成10年には久しぶりに5万人を越えた(犯罪少年中)。この統計化プロセスと「大型店舗における万引き」との関係を解明する上で、以下の事実が11年度の調査研究等で明らかになった。1,この3年間の調査対象地域(東京23区他5都市)における追跡調査では、引き続き百貨店での少年の万引きの激減傾向が止まり、中高年を含めて増加しつつあること、大手スーパーでの系列警備会社による画一的処遇が進んで、警察への通報率が高まっていること、経営の合理化のため保安担当者を減らした店舗では、現認数も減っていることである。2,当核地域の警察署への聞き取り調査については、調査協力が得られた署では、引き続き警視庁の「簡易送致事件」判断の基準に準じた措置が行われているが、多くの署(生活安全課)で十分な調査協力が得られず、統計化プロセスの最終段階を明らかにすることができなかった。3,11年度調査において、上記調査対象地域の大型店舗における万引きの実態については、平成10年分までほぼ集計することができた。残る課題は、平成11年分の実態の集計及び上記の警察署に対する再調査の依頼と実施である。4,以上の調査結果から、平成11年度に調査完了して調査報告書を作成する予定を多少延期して、平成12年度に上記の追跡・再調査を行い、12年度内に調査報告書を作成した上で論文化を検討する。
細胞質脱アセチル化酵素の活性消失がもたらす情動障害とその分子メカニズムの探求

我々はうつ病などの情動障害の原因を解明するために、ヒトの情動障害とよく似た行動を示すHDAC6遺伝子欠損マウスを用いて研究を行った。その結果、HDAC6の働きがなくなると脳内のセロトニン神経の働きが悪くなり、同時にドーパミン神経の働きも不全となることが判った。この原因の一つとしてHDAC6が失われると神経細胞の中でエネルギー代謝が異常となり神経の働きに影響を及ぼすことが考えられた。これらのことからHDAC6の働きを正常に保つことが神経細胞の正しい機能発揮に重要であり、その乱れが精神疾患を引き起こす原因となると考えられた。HDAC6(ヒストン脱アセチル化酵素6)欠損がもたらすマウス情動障害様行動異常の原因について、中脳背側縫線核に存在するセロトニン神経細胞のエネルギー代謝異常を疑い検討を進めている。今年度は、細胞レベルでの実験を行う目的で神経系培養細胞のHDAC6ノックダウン細胞を作製樹立した。この細胞においても脳組織でみられたエネルギー代謝異常と同様の現象が観察されたため、より詳細な分子レベルの検討を進めることとした。初め疑問となったのはミトコンドリアに存在しないはずのHDAC6がなぜミトコンドリアのエネルギー代謝(ATP産生)に影響を及ぼすのかについてであるが、多くのHDACの活性を阻害する化合物(HDAC活性阻害剤)も同様にミトコンドリアのATP産生に影響を及ぼすこと、この現象にHDAC10が関与しておりこの脱アセチル化酵素はミトコンドリアに存在すること、HDAC6はこのHDAC10と細胞内で結合する可能性が示唆されたことから、HDAC6はまず細胞質でHDAC10と結合しその働きを調節することによりミトコンドリアのエネルギー代謝に影響を及ぼす可能性が考えられた。これとは別に本年度は脳内のモノアミンの定量を実施し野生型マウスとHDAC6遺伝子欠損マウスとの比較を行った。その結果、セロトニン量について背側縫線核では野生型と差はみられなかったが、その投射先である黒質や腹側被蓋野においてHDAC6遺伝子欠損マウスでは減少する傾向にあった。このことから黒質や腹側被蓋野のドーパミン神経細胞の働きが不全となっている可能性が考えられ、実際にそれらの投射先である前頭前野や側座核でドーパミン量の低下傾向が観察された。既に我々はこのマウスにドーパミン神経系に依存した行動の異常も観察しており、HDAC6欠損はセロトニン神経系やドーパミン神経系に影響を及ぼし情動障害様行動異常を引き起こすことが明らかとなった。HDAC6欠損がマウスに抗うつ様行動を誘発することについて、その分子メカニズムを明らかにするために脳におけるHDAC6の基質候補分子と考えられたCaMK2分子とピルビン酸脱水素酵素複合体分子(PDC1)に着目してHDAC6との関連を調べた。細胞内におけるHDAC6との分子間相互作用についてはPDC1にHDAC6との結合が観察されたがCaMK2については見られなかった。さらにPDC1を含むピルビン酸脱水素酵素複合体の形成に及ぼすHDAC6欠損の影響を検討したところ、HDAC6分子欠損においてもHDAC6酵素活性阻害剤存在下においても酵素複合体形成は正常であった。これらのことから、1)PDC1が本件のキープレーヤーであること、2)HDAC6はPDC1を含む酵素複合体の形成には影響しない、3)従って酵素複合体の活性に影響を及ぼすことが疑われたこと、4)CaMK2は本件とは関連がないこと、が明らかとなった。この結果を受けて、HDAC6ノックアウトマウスの脳内縫線核(HDAC6が特に多く含まれる部位)のピルビン酸量を調べたところ、他の部位と比べて縫線核ではピルビン酸の蓄積が見いだされた。続いて、縫線核セロトニン神経細胞の機能不全を疑いセロトニン合成酵素Tph2の分子発現量を調べた結果、神経細胞の末端部分でTph2量の低下を見いだした。以上の本年度の研究から、HDAC6ノックアウトマウスの脳内では縫線核セロトニン神経細胞のピルビン酸の蓄積を伴うエネルギー代謝異常が示唆され、その分子メカニズムとしてPDC1を含むピルビン酸脱水素酵素複合体の機能不全が考えられた。また縫線核セロトニン神経細胞では末端におけるセロトニン量の低下が示唆されたことから、末梢部位でのセロトニン伝達異常が起きている可能性が考えられた。この視点は、新しい作用メカニズムに基づく抗うつ薬の開発に期待される。我々はHDAC6が脳内では縫線核セロトニン神経細胞に多く含まれること、この遺伝子欠損マウスにヒトの情動障害と良く似た行動異常を発見した。

この背景にあるメカニズムを分子レベルで解明するために脳内のHDAC6分子の基質となるタンパク質分子を検索したところ幾つかの候補分子の中からPDC1(ピルビン酸脱水素酵素複合体分子1)を見出し、HDAC6欠損ではこの分子の働きが不全であるために行動異常が誘発されると予想した。実際にHDAC6遺伝子欠損マウスの脳では特に背側縫線核においてピルビン酸が蓄積しており、HDAC6分子の発現が著しく低下した神経培養細胞ではATPの減少も観察した。HDAC6分子によるPDC1分子の機能制御については現在も解析中であるが、本研究からHDAC6遺伝子欠損マウスの脳ではミトコンドリアのエネルギー代謝異常が起きていることを見出した。また、このマウスの脳における異常を調べるために脳内のモノアミン量や受容体量、トランスポーター量、モノアミン合成酵素量を通常のマウスと比較した結果、セロトニン神経細胞の投射先である黒質や腹側被蓋野ではセロトニン量の減少、さらにそれらの投射先である前頭前野と側坐核でドーパミン量の減少を観察した。またこのマウスの薬物に対する反応を様々な行動学的方法に基づいて調べたところ、通常のマウスと比べて明らかに異なる反応を示しドーパミン神経系の異常を見出した。以上のことから、HDAC6が欠損するとセロトニン神経細胞でPDC1機能異常によるエネルギー代謝の異常が起こりセロトニン神経伝達が不全となり、さらにはその投射先のドーパミン神経系にも影響を及ぼし行動異常を誘発したと考えられた。これらの成果はHDAC6が情動障害の症状形成に深く関わっていることを示すと同時に、その脱アセチル化活性制御が新規治療戦略のターゲットとなることを意味している。神経科学神経系培養細胞のHDAC6ノックダウン細胞が樹立できたことにより、分子レベルでの解析が進んだことや、脳内のモノアミン量を測定したことによりセロトニン神経系だけでなくドーパミン神経系の異常という新しい視点が見出されるに至ったため。本件のキープレーヤーとなる分子が絞り込めたことや、さらにはその分子が関与する生理現象の異常をHDAC6ノックアウトマウスの脳で実際に見いだせたことから、今後の研究の方向性を明確にすることが出来た。来年度は、セロトニン神経細胞やドーパミン神経細胞で起こっている異常をより深く分子レベルで追求しHDAC6の標的となる分子を明らかにしたい。最終的には本研究に基づいた情動障害様行動異常を規定する新たな分子メカニズムを提唱し、ヒトの情動障害の解明や新規治療戦略に役立てたい。ピルビン酸の蓄積を伴うエネルギー代謝異常の分子メカニズムをPDC1分子およびその酵素複合体分子の機能異常から明らかにしていく。またこのようなエネルギー代謝異常が起こっている神経細胞でTph2の神経終末部位での発現低下を見いだした点について、エネルギー代謝異常との関連を明らかにするとともに、末端におけるセロトニン神経伝達の異常や投射先での神経活動の異常を調べる。本年度は動物実験よりも培養細胞実験が主であったため物品費が大幅に減少したこと、旅費やその他の支出が無かったことで次年度使用額が発生した。次年度は再び動物実験や機器を用いた実験が多くなると予想されるため、必要な物品の購入に使用する。次年度の研究費については物品購入費に使用する。また翌年度の研究費については本年度同様に試薬や器具やマウスの維持費など物品購入費、研究補助としてアルバイトを雇う人件費、学会参加を予定しているため旅費に使用する。
話者の視線が解き明かす形容詞表現の産出プロセスとその言語文化比較

本研究課題は実験参加者の視線の動きを観察して人間が形容詞表現を使って何らかの評価をする際にどのような認知過程を経ているかを明らかにする。評価対象となるモノだけでなく、その周りにあるモノやコトにも注意を払って評価をすることが予想されるが、具体的に何に対してかは疑問である。しかし、視線計測器を使うことによってその点が明らかになり、それにより形容詞表現の使用方法が分かるだけでなく、評価という広く一般的な現象に対して人間が行っている認知処理の内実が垣間見られる。普遍的傾向があると同時に個人差や文化差があると想定され、特に文化に関しては、複数の言語で実験し比較することで、文化心理の対照性が明らかになる。
戸建・小規模共同住宅排水の水質特性と合併処理浄化槽による処理

本研究では,水質汚濁防止のために普及・整備が急がれている小規模合併処理浄化槽についての,その設計・管理に求められる,小規模な生活排水からの各種汚濁負荷量を算出し,さらに排出特性を多変量解析等を用いて明らかにして,それらの排水を処理している合併処理浄化槽の機能評価を行なっている。平成10年度では,主に家族人数46人程度の戸建住宅排水を対象に,各種汚濁負荷量(BOD,窒素,リン,陰イオン界面活性剤など)等を算出し,さらに生活様式を考慮した排出特性をふまえ,合併処理浄化槽の処理機能を評価した。得られた成果をまとめると以下の通りである。1.戸建て住宅排水の汚濁負荷量は既往の知見と同程度であり,その負荷特性についても,平日と休日の汚濁負荷量を比べると,休日の方が平日に比べて1.01.4倍高かった。一方,排水の排出特性は個々の生活様式によって異なり,農家よりもサラリーマン家庭,さらに家族人数の少ない家庭ほど短時間に多量の排水が排出された。またBODおよび陰イオン界面活性剤について時間平均負荷量に対する時間最大負荷量の比を求めたところ,両方とも休日よりも平日の比の方が大きかった。2.総負荷量に対する3時間最大負荷量の割合および総排水量に対する3時間最大排水量の割合と,処理水中の平均BOD,陰イオン界面活性剤濃度との関係を検討したところ,負荷量については関係がみられなかったが,排水量についてはその割合が大きくなるに従い,処理水中の平均濃度が上昇する傾向がみられ,処理機能に対する流量変動の影響が示唆された。水質汚濁防止のために,小規模合併処理浄化槽などの設置が進められているが,水質・水量変動が大きな小規模の生活排水を対象としているため,その処理性能は安定しにくい。また,その設計に使用されている標準汚水は一定のままで,使用実態に即していない。本研究では,小規模合併処理浄化槽の設計・管理に求められる,小規模な生活排水からの各種汚濁負荷量を算出し,さらに排出特性を多変量解析等を用いて明らかにして,それらの排水を処理している合併処理浄化槽の機能評価を行なっている。平成9年度では,戸建住宅団地排水を対象にして生活排水の特性を評価するとともに,アンケート調査によって生活様式と水使用状況の関係を検討した。1)戸建住宅団地排水の汚濁負荷量は,BOD値を除けば従来の報告値の範囲内であった。つぎに,戸建住宅団地排水水質の主成分分析結果では,第1主成分は生活排水中の有機汚濁負荷,第2主成分は洗剤負荷を示していた。とくに,第2主成分は使用水量の大きい洗濯行動を表していた。各主成分のscore値の時系列変化から,第2主成分の正のピークは第1主成分のそれより12時間遅れており,生活排水特性が明らかになった。2)排水調査とともに排出者の生活様式をアンケート調査で検討したところ,対象家族の平均家族数は3.7人であり,休日の方が在宅人口が多いために洗たく活動,入浴頻度が増えた。それに伴って汚濁負荷量が増える傾向があった。
D-アミノ酸による生体制御：分子機構の解明とその応用

D-アミノ酸は様々な生理機能を有するがその分子機構は必ずしも明確ではない。本研究では我々が構築した定量法などを用いて、D-SerやD-Aspなどの機能の分子レベルでの解明とその応用を目指した。具体的には、セリンラセマーゼやD-セリンデヒドラターゼの反応機構解析、細胞性粘菌の発生・分化におけるD-Serとセリンラセマーゼの役割、哺乳動物におけるD-Asp生合成酵素の解明、D-Aspによる動物培養細胞への抗酸化性付与の分子機構、D-Ser定量法の改良、PEG修飾D-セリンデヒドラターゼの投与によるマウス脳内D-セリンの制御、D-アミノ酸を認識するタンパク質構造などを検討し、一定の成果を得た。1)ピリドキサール5リン酸(PLP)と亜鉛に依存する真核生物型D-セリンデヒドラターゼ(Dsd1p)において、PLPのピリジン窒素と相互作用するY203の役割を検討した。Y203F、Y203A、Y203S、Y203R変異型酵素は、WTと同程度のデヒドラーゼ活性を保持したが、Y203D、Y203E変異体では活性は顕著に減少した。Y203DとD-Serを重水中で反応させたところ、WTでは見られないα水素の重水素置換が観察された。この結果から、Y203D反応が明瞭なカルボアニオン中間体の形成を伴うE1機構で進行すること、野生型酵素においてY203はカルボアニオン中間体の安定な存在を妨げることでデヒドラーゼ活性を高めている可能性があることが考えられた。2)哺乳動物におけるD-アスパラギン酸(D-Asp)生合成機構について、アスパラギン酸トランスアミナーゼ(GOT)と高い相同性を持つGOT1L1がアスパラギン酸ラセマーゼであるとの報告がなされていた。これを検証するために、GOT1L1を動物細胞で発現、精製して酵素活性を測定した結果、GOT活性は認められたがラセマーゼ活性は検出されなかった。一方、got1l1遺伝子のノックアウトマウスを作製し、種々の組織のD-Asp含量を測定したが野生型との差は認められず、GOT1L1はアスパラギン酸ラセマーゼではない可能性が高いと結論された。3)細胞性粘菌におけるD-セリンの生理的役割を解析する目的で、Dsd1p遺伝子をノックアウトした。Klebsiellaを播種した培地状での粘菌の増殖速度をプラーク半径の増加速度から判定した。ΔdsdはWTに比べ大きなプラーク半径の増加速度を示し,二員培養の単細胞期においては, ΔdsdがWTと比べてより大きな増殖速度を示すと推測された。一方、ΔdsdはWTと比べて多細胞体の発達に顕著な遅延を示した。1)D-, L-セリンのラセミ化反応とデヒドレーション(DH)反応を触媒する真核生物型セリンラセマーゼは、両基質に対してほぼ等しいラセミ化活性を示す一方、DH反応ではD-セリンに対する活性がL-セリンと比べ顕著に低い。この非対称性の理由として、D-セリンは本来DH反応を受けず、ラセミ化反応を経てL-セリンに変換された後にデヒドレーションされる、との仮説を想定し、細胞性粘菌由来セリンラセマーゼを用いて検証した。この仮説が正しければ、重水中ではD-セリンのDH反応にのみ溶媒同位体効果が予想されるが、実際には重水中と軽水中でのDH反応速度の比はD-、L-セリンで等しかった。この結果上記の可能性は否定された。2)細胞性粘菌においてD-セリン分解に働くdsd遺伝子をノックアウトしたΔdsd株では、菌体内にD-セリンが蓄積するとともに多細胞期での発達遅延や子実体形成率の顕著な低下が見られた。ΔdsdではcAMPシグナル経路に関わるacaA(アデニル酸シクラーゼ遺伝子)やcarA(AMPレセプター遺伝子)の転写量の低下が認められ、これがΔdsdフェノタイプの一因として示唆された。なおこれらのフェノタイプはdsdの導入によって相補された。3)マウスにD-アスパラギン酸を経口投与し、糞便から抽出したDNAをリアルタイムPCR法、DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis :変性剤濃度勾配ゲル電気泳動)法で解析した。その結果、D-アスパラギン酸の投与が全バクテリア数に対するFirmicutes門バクテリア比率を減少させることや、Bacteroidetes門バクテリア比率を増加させる可能性を見いだした。本年度は以下の研究を行った。(1)細胞性粘菌セリンラセマーゼは基質であるD-,L-セリンと反応して次第に活性を失うが、完全には失活しない。重水中では失活速度が上昇したことから、この現象は基質2位の水素が酵素によって引き抜かれ生成したアニオン性の中間体が酵素の活性中心近傍の残基を修飾する事により起こると予想された。失活反応に際して吸収スペクトルにはほとんど変化が見られず、酵素とPLPとのシッフ塩基は維持されると考えられた。分裂酵母のセリンラセマーゼの結晶解析において活性中心リジン残基がD-アラニンによって修飾された構造が見出されているが、これは上記反応により生じたと推測される。(2)他の研究グループから、D-Aspの添加が皮膚繊維芽細胞の抗酸化性を上昇させるとの報告がなされたが、今の所その続報はない。