hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ジャガイモXウイルスによる病徴発現に関わる宿主植物因子の網羅的解析

Potato virus X(PVX)はポテックスウイルス属に属し、約6kbのプラス1本鎖RNAゲノム上に、複製酵素、TGBタンパク質1、2、3、および外被タンパク質(CP)の5遺伝子をコードしている。PVXがタバコに引き起こすモザイク、輪状斑、無病徴の3種類の病徴を決定しているPVXゲノム上の配列を、次の2箇所とすでに同定した。a)ゲノムの5'非翻訳領域にある58番目の塩基がAならば輪状斑を、Gならばモザイクを引き起こす。b)ただしそれは複製酵素の1422番目のアミノ酸がAspの場合であり、このアミノ酸がGluになると、58番目の塩基にかかわらず無病徴となる。そこで、同じポテックスウイルス属に属するPlantago asiatica mosaic virus(PlAMV)のN.benthamianaに引き起こすモザイク、枯死の病徴についても、同様にそれらを決定しているゲノム上の配列を調べた。その結果、複製酵素の1154番目のアミノ酸がTyrの場合にモザイク、Cysの場合に枯死となることを明らかにした。PVXのゲノムの58番目の塩基のみが異なるOS系統(輪状斑)とOS58G系統(モザイク)の感染植物体およびプロトプラストにおける蓄積量を比較したところ、系統間に有意な差はなかったが、ウイルスが植物体内で拡散する速度はOS系統が有意に遅かった。また、OS系統感染植物では、輪状斑の部位で過敏感細胞死(HR)に似た植物の反応が見られ、さらにin situハイブリダイゼーションで、ウイルスは輪状斑の外側に拡がっていることがわかった。前年度に引き続き、酵母two hybrid系による宿主因子の探索を進めた。植物ウイルスの病徴発現機構には不明な点が多い。Potato virus X(PVX)およびPlantago asiatica mosaic virus(PlAMV)の複数の分離株を用い、病徴発現に関わるウイルス側および植物側の因子を解析した。タバコに同心円状の輪状斑を生ずるPVXのOS系統と、モザイクを生ずるBH系統を用いた解析により、ウイルスゲノムの58番塩基が病徴決定因子であることをすでに明らかにしたが、さらにOS系統感染植物の輪状斑部分で活性酸素種が検出され、細胞の過敏感反応死(HR)により誘導されるPR-1a遺伝子の発現が見られた。さらに、OS系統感染植物では輪状斑の外側にもウイルスが検出された。よって輪状斑の形成機構として「植物はOSの感染を感知し感染部位の周囲を輪状に細胞死させて感染の拡大を抑えようとするが、OS系統はそれを越えて拡がり、植物はその外側に新たな輪状斑を次々に形成する」というモデルを提案した。タバコ野生種に対して植物全体の枯死を引き起こすPlAMVのLi1株とモザイクを生じるLi6株を用いた解析により、ウイルスのコードする複製酵素の1154番目のアミノ酸が病徴の決定因子であることをすでに明らかにしたが、Li1株による全身枯死では活性酸素種が検出され、イオンリークが検出されたことから、全身枯死はHR様の細胞死であると示唆された。さらに、ウイルスの全身移行は、Li1株のほうが遅れていた。よって、全身枯死病徴の機構として「植物がLi1株の感染を感知し、それを封じ込めようとHR様の反応を起こすが、移行が遅れるのみで封じ込めはできず、全身の細胞がHR様反応をおこすので植物全体が枯死する」というモデルを提案した。
「記念祷設定簿」にもとづく中世パリ大学と学寮の社会史的研究

本研究では、ヨーロッパ中世大学史研究の主要な課題の一つである大学と当該期の社会との関連を究明しようとする「社会史的大学研究」をプロソポグラフィーの手法を採り入れ行ったものである。そのさい、主要な史料として、従来のプロソポグラフィー研究では利用されていなかった中世パリ大学関連の学寮の(COLLEGE)の「記念祷設定簿」(OBITUARY)を利用し、研究にあたってはソルボンヌ学寮をはじめとする合計26学寮の「記念祷設定簿」に記載されている約650件の人物情報を析出した(ソルボンヌ学寮関連322件、他の学寮関連311件。ただし、ソネボンヌ学寮関連のうち、「記念祷設定簿」記載分は122件、残り200件はグロリユ-の研究による)。研究成果を次のようにまとめることができる。ソルボンヌ学寮の「記念祷設定簿」に記載された人物は、学寮の創立期に書籍の寄付などを通して学寮を支援した人物(フランス王を含む)のグループが確認できる。また、「記念祷設定簿」からは、かつて寮生であつたsociusとそうでなかった者non-sociusに分けることができるが、寮であった者の社会的経歴については、教会関係者が大多数を占める。non-sociusについてもほぼ同様のことが言える。さらに、「記念祷設定簿」記載人物122人中87人がmagisterの称号を有し、学位取得者にはsociusが多い。考察対象の人物の出身地については、今日の北フランス、ベルギー出身者が優勢である。ソルボンヌ学寮以外の学寮の「記念祷設定簿」からも、考察対象人物のほとんどが教会関係者で占められており、また、シヨレ学寮の例では、magisterの称号の所有者が高い割合を占める。社会史的に見た中世パリ大学の学寮は、教育の中心であると共に、教会人輩出養成の機関として機能したと言える。今後、「記念祷設定簿」に基づく、学寮の経済的基盤の研究が要請される。平成8年度科学研究費補助金「記念祷設定簿にもとづく中世パリ大学と学寮の社会史的研究」は二年度継続して補助金を交付されるが、一年目にあたる今年度は、中世パリ大学のもっとも重要な学寮である「ソルボンヌ学寮」(College de la Sorbinne)の「記念祷設定簿」(Obituaire)に記載されている人物に関する情報-出身地、出身階層、社会的地位、役職、さらには「記念祷設定簿」に記載される(永代供養を享受する)にさいして、当該人物が設定(寄進)した財をなど-を分析した。これまでの研究成果を次のようにまとめることができる(1)ソルボンヌ学寮の「記念祷設定簿」に記載された人物は、かつてソルボンヌ学寮で大学生活を送った者が中心を占める。それ以外に、ソルボンヌ学寮の創立期に書籍の寄付などを通して学寮を支援した人物(フランス王を含む)などがいる。(2)社会的経歴については、教会関係者が大多数を占める。(3)設定簿記載の人物の出身地については、北フランス出身者がもっとも多い。(4)記念祷を設定するために提供された財については、金銭がもっとも一般的である。しかし、それ以外に、家屋の寄進、レントの寄進も少数だが見受けられる。(5)さらに、記念祷の設定の財として書籍を提供する者も複数いる。これは学寮の性格を強く示している。

今後、これらの研究成果と他のパリ大学の学寮の記念祷設定簿の記載内容の分析結果との比較検討を行う。平成9年度に交付された科学研究費補助金(研究課題名「記念祷設定簿にもとづく中世パリ大学と学寮の社会史的研究」)は、継続交付二年目にあたる。平成9年度は、中世パリ大学の最も重要な学寮であった「ソルボンヌ学寮」(College de la Sorbonne)以外の24学寮の「記念祷設定簿」(Obituaire)を対象として研究を行った。これら24学寮のうち、ディズ・ユイットなど3学寮は13世紀に、バイユ-、プレール、ランスなど19学寮は14世紀に、セ-、サント、バルブの2学寮が15世紀に設立された。研究の対象とした「記念祷設定簿」は、これらの学寮が1763年にルイ・ル・グラン学寮に統合されたさいに作り上げた、それぞれの学寮に貢献した篤志家のリストである。リスト作成の事情から、厳密な意味で「記念祷設定簿」とは言い難いものも含まれており、記載の内容についても一定の限界があるが、そこに記載された人物情報の分析を通して、総括の中間的段階であるが、中世、とくにその末期の学寮と社会との関係を照射するいくつかの知見が得られた。(1)学寮関係の篤志者のなかで、当然のことではあるが、創立者が必ず記念祷の対象となっている。さらに、記念祷の対象となる者は、学寮に「ブルサ」を設定した人物、学寮の役職者を対象とする記念祷が多く見られる。(2)記念祷の対象とされている人物のほとんどが聖職者であり、俗人はごく少ない。このことから理解されるように、学寮のもつ「教会的性格」が顕著である。(3)記念祷の対象となった者でmagisterの称号を持つ者、あるいは当該学寮の出身者は少ない。これらの知見と、前年度に得られた知見とを総合し、学術論文の形で研究成果を公刊することにしたい。
妊産婦の非対称性骨盤アライメントと骨盤帯痛の関連性

本研究の目的は、産前産後を通して、骨盤アライメントを3次元画像でとらえ、分析し、アライメントの変化と産後持続する骨盤痛の関連性を明らかにすることである。平成28年度はリクルートが滞っており、リクルートのコンプライアンスを上げるために、平成29年度は研究機関を増やし改善を図った。平成30年度は、産後の骨盤アライメントの変化を3次元画像でとらえ、分析し、骨盤帯痛との関連性を明らかにし、その成果を学会や論文で報告することであった。実施状況は、計画では分析を終了し、論文または学会で報告する予定であったが、研究代表者の妊娠と出産により、予定よりも計測、分析が遅れ、論文作成が滞っている。分析方法については、寛骨の3次元変化を定量的に評価できるように分析方法を改良することができた。この分析方法により、精密に骨盤関節の6自由度の変化を捉えることができる。本研究は産後の骨盤アライメントの変化を骨モデルを作成し、評価するため、従来使用されている体表からの評価よりも精密に評価できる。また、骨盤変化と産後12週以上持続する骨盤痛の関連性について明らかにし、産後持続する骨盤痛の一因を明らかにし、疼痛増悪を予防するための運動療法を検討するのに重要な研究の一つである。遅れている理由として、研究代表者が2018年5月から2019年1月まで、妊娠、出産したため、残りのデータ収集、分析が遅れてしまい、研究成果をまとめることができていない。対象者は妊婦、産後の女性であるため、研究へ協力していただくことが難しく、研究者の研究活動とリクルートのタイミングが合わなかったため、予定よりも遅れてしまった。今後の推進方策については、2019年4月より研究活動に復帰し、2019年7月までに残りの計測と分析を行い、12月までにはジャーナルや学会にて結果を報告する。結果を踏まえ、2020年2月までに有効な運動療法を検討し、効果について検証を行う。本研究の目的は、産前産後を通して、骨盤アライメントを3次元画像でとらえ、分析し、骨盤帯痛との関連性を明らかにすることであった。平成28年度の計画は、対象者20名とし、産前の疼痛評価(Visual analog scale,Pelvic girdle questionnaire)とMRI画像産後2週以内と産後3か月目の2回実施し3次元骨モデルの画像を作成し、骨盤アライメントを評価することであった。実施状況は、現在予備研究2名、本研究4名のデータを収集しており、データ解析中である。当初の予定よりもリクルートがやや遅れているが、現在、リクルートのコンプライアンスを上げて、実施している。3次元骨モデルの分析については、順調に解析方法を検討し、予備研究の解析は終わっている。予備研究の結果を踏まえ、分析方法の改善を行っている。疼痛調査に使用している質問紙について、Pelvic Girdle Questionnaire日本語版の信頼性、妥当性については、先行研究で報告はないため、Pelvic Girdle Questionnaire日本語版の信頼性、妥当性についても同時に研究を進めている。予備研究からわかった内容として、産後1か月の間に疼痛は軽減傾向にあり、骨盤アライメントも大きく変化する。特に両寛骨は初期に外転、下方回旋していたものが、徐々に角度が小さくなっていた。また仙腸関節の近接距離も産後1か月内で大きく変化した。従って、本研究は、産後の骨盤アライメントの変化を骨モデルからとらえることが可能なため、体表評価よりも有効であると考える。また、骨盤アライメントの変化と骨盤帯痛の関連性について調べることで、産後骨盤帯痛が持続する一因を明らかにすることが可能な重要な研究といえる。やや遅れている理由として、当初20名のデータを平成28年に収集する予定であったが、現在、2回目のデータを取り終えた者が4名である。平成29年1月より、リクルートのコンプライアンスをあげ、リクルートを強化している。リクルートがやや滞っている理由として、対象者が妊婦であり、育児や体調の変化により、同意を得ることがやや難しいことがあげられる。しかし、妊婦の健康教室への参加者も多いため、妊婦が集まる場所を調査し、リクルートを行っていく。また、スノーボールサンプリング式に協力者の知り合いに声をかけていただく。平成28年度は、リクルートが滞っており、リクルートのコンプライアンスを上げるために、平成29年度は研究協力機関を増やすこととSNSなどを使用しリクルート方法を改善、実施した。未だ目標人数に達していないが、リクルート状況は改善してきている。また、主観的疼痛評価として、国際的に使用されているPelvic Girdle Questionnaireの日本語版を作成し、その信頼性と妥当性を明らかにした。さらに、3次元骨モデル作成の信頼性を高めるために、MRI撮影の条件を改善し、セグメンテーションの質を向上させた。分析方法に関して、現在、再度検討中であるが、仙腸関節の形状の変化を明らかにできるように改善中である。これまで予備研究2名、本研究5名の研究データを収集、データ解析し、分析方法の改善点を検討中である。平成29年は、産後2週以内から12週の仙腸関節の近接距離の分布の変化をとらえることができた。平成30年度は寛骨の3次元変化を定量的に評価できるように分析を進める。

本研究は、産後の骨盤アライメントの変化を骨モデルを作成し、評価するため、体表評価よりも精密で、6自由度の変化をとらえることができる。また、この骨盤変化と産後12週以上持続する骨盤痛の関連性について明らかにし、産後持続する骨盤痛の一因を明らかにする重要な研究の一つである。遅れている理由として、対象者のリクルートである。当初16名のデータを平成29年に収集する予定であった。平成29年は4名リクルートしたが、出産が帝王切開になったり、母子の体調により、3名が辞退することとなった。リクルートが滞っている理由として、対象者が妊婦であるため、出産方法の変更、育児や体調の変化、研究機関への移動が難しいことなど、同意を得たり、産後直ぐに研究に協力していただくことが難しい。しかし、MRI撮影協力機関を東京都内で開拓し、リクルートのコンプライアンスを挙げ、平成30年5月までに10名の妊婦をリクルートできた。出産方法の変更や母子の体調の変化により辞退者が考えられるため、引き続きリクルートを行い、20名に到達するように実施していく。平成29年に開始予定であった産後の持続する骨盤痛について対称化ディバイスを用いた介入研究を行い、疼痛と歩容の変化を明らかにする予定であったが、リクルートが難しく、実施できなかった。リクルートの困難な理由は、MRI撮影と3次元動作解析を行う施設への移動が困難なこと、育児で介入を行う時間が取れないことである。本研究の目的は、産前産後を通して、骨盤アライメントを3次元画像でとらえ、分析し、アライメントの変化と産後持続する骨盤痛の関連性を明らかにすることである。平成28年度はリクルートが滞っており、リクルートのコンプライアンスを上げるために、平成29年度は研究機関を増やし改善を図った。平成30年度は、産後の骨盤アライメントの変化を3次元画像でとらえ、分析し、骨盤帯痛との関連性を明らかにし、その成果を学会や論文で報告することであった。実施状況は、計画では分析を終了し、論文または学会で報告する予定であったが、研究代表者の妊娠と出産により、予定よりも計測、分析が遅れ、論文作成が滞っている。分析方法については、寛骨の3次元変化を定量的に評価できるように分析方法を改良することができた。この分析方法により、精密に骨盤関節の6自由度の変化を捉えることができる。本研究は産後の骨盤アライメントの変化を骨モデルを作成し、評価するため、従来使用されている体表からの評価よりも精密に評価できる。また、骨盤変化と産後12週以上持続する骨盤痛の関連性について明らかにし、産後持続する骨盤痛の一因を明らかにし、疼痛増悪を予防するための運動療法を検討するのに重要な研究の一つである。遅れている理由として、研究代表者が2018年5月から2019年1月まで、妊娠、出産したため、残りのデータ収集、分析が遅れてしまい、研究成果をまとめることができていない。対象者は妊婦、産後の女性であるため、研究へ協力していただくことが難しく、研究者の研究活動とリクルートのタイミングが合わなかったため、予定よりも遅れてしまった。
南インドにおけるブラーマン文化の現在:ケーララ州ブラーマン宗家の事例研究を中心に

(1)ネドゥムピリ・タラナネルール家が所蔵する十一の写本(ヴェーダ祭式補助文献「チャダンガ」、ヒンドゥー王権儀礼儀軌など)を撮影した。(2)ヴァードゥーラ派の宗家であるタラナネルール家の歴史と現状を詳しく調査し、その過程で「タントリ」と呼ばれるヒンドゥー寺院の首席司祭に関する情報を収集した。(3)現代におけるヴェーダ祭式挙行の実態を調査した。平成20年度は、平成21年2月に18日間、ケーララ州中部のトリチュール市を拠点とし調査を行った。本課題は、(1)ケーララ州のブラーマン宗家(=マナ)が所蔵するヴェーダ写本の画像収集とその内容調査、(2)マナに属するブラーマンの「現代インド人」としての生活実態に関する調査、および(3)ケーララ州とその近隣州に散在する他のブラーマン家系の現状に関する情報収集、という三つの調査項目を含む。これらのうち、本年度は主に(1)と(2)にあたる調査を集中的に行った。まず項目(1)については、イリンジャラクダ市のネドゥムピリ家が所蔵するサンスクリット語ヴェーダ関連写本4点と、マラヤーラム語による非ヴェーダ系写本2点の撮影を行った。非ヴェーダ系写本2点のうち、一つはかつてトラヴァンコール藩王家と深い結びつきのあった同家に伝わるヒンドゥー王権儀礼(バドラディーパ・ヤーガ)の儀軌であり、もう一つは近世において同家で作成された種々の文書を集めたものである。これらは、ブラーマンの人々が単にヴェーダ伝承者としてだけでなく、王権や地域民衆とも深くかかわる存在として、社会的なプレゼンスを持ってきたことを窺う貴重な資料と言える。また項目(2)については、現代インド人としてのネドゥムピリ家の生活実態を調査した。所属メンバー間の関係や各人の生活に関する聞き取り調査に加え、彼らが「タントリン」と呼ばれるヒンドゥー寺院の司祭でもある点に着目し、その活動を取材した。特に今回は、エルナクラム地区の寺院建立祭(ナヴィーカラナ)への出仕に立ち会い、その儀礼の様子を取材することが出来た。建立祭以後にはヒンドゥー教徒以外の寺院立入りが禁じられているため、今回の取材で得た情報は、寺院におけるブラーマン司祭の所作・役割の一端を窺わせる貴重な資料と位置づけられる。平成22年2月24日から3月10までケーララ州に滞在し、下記の調査活動を行った。1.「ブラーマン諸家系での訪問インタビュー調査」:前回、重点的な調査対象としたネドゥンピリ家の家主をガイドとし、同じヴァードゥーラ派の十五家系を訪問した。とくに各家系間の血統的および法統的関係、ブラーマン社会における位置づけ・役割、および所蔵写本の有無(所蔵有りの場合はその内容)等を中心に調査した。2.「ブラーマン宗家でのヴェーダ祭式ビデオ撮影」:3月1日(満月日)の早朝、バウダーヤナ派宗家であるカイムック家にて行われた「満月祭」をビデオ撮影した。さらに、バウダーヤナ派内でのヴェーダ祭式の現存状況、および近年における古代祭式復興のムーヴメントについて、インタビュー調査を行った。3.「ヴェーダ祭式文献古写本の写真撮影」:ネドゥンピリ家が蔵する写本群のうち重要かつ未撮影のものを選び、画像にして約400ショット撮影した。今回は、近現代のブラーマンたちがヴェーダ祭式の執行に際し直接依拠している「チャダンガ文献」を集中的に撮影した。上記のうち「1」の活動では、前回の調査で主にネドゥンピリ一家から得た情報を、多数の家系から得た情報と突き合わせ、複眼的な「クロスチェック」を行った。その過程で、未確認写本群、過去に断絶した有力家系、ケーララ州以外の地域における関係家系などについて、学界未知の重要な情報を得ることが出来た。「2」の活動は、前回調査で撮影した「新月祭」の映像を補完し、ヴェーダ家系における主要祭式である「新満月祭」の具体像を明らかにする目的で行った。同祭式の挙行を記録したビデオ資料は知られていないため、今回の成果が学界初のものである可能性が高い。「3」の活動では、サンスクリット語による古代文献の陰に隠れ、これまで着目されることのなかった「チャダンガ文献」の基礎資料を組成するための重要資料を確保した。平成23年3月7日から3月12日までケーララ州に滞在し、下記三種の調査活動を行った。1.「ブラーマン宗家とヒンドゥー寺院の関係に関する調査」:これまでも主な調査対象としてきたネドゥンピリ家(イリンニャーラクダ市)が、ヒンドゥー寺院とどう関わっているかを調査した。特に、同家が所有する十六寺院のうち、イリンニャーラクダ近辺にある六つを訪問し、各寺院の所有者(ウーラーラン)と主席司祭(タントリ)の構成を調査した。また、近代における寺院運営形態の変遷史について、寺院関係者から聞き取り調査を行った。

2.「ペルヴァナン村所属ブラーマン家系の訪問調査」:これまでの主な調査地であったイリンニャーラクダ市に隣接するペルヴァナン(ペルマナンとも呼ばれる)村は、前者と並ぶヤジュルヴェーダ伝承の中心地である。今回はその村で指導的立場にあるムーライル・ペドゥンパダップ家を訪問し、同村所属のブラーマン家系の現状を聞き取るとともに、現在の各家系構成員を詳しく記した非公刊印刷物も入手した。これにより、他のヴェーダ伝承地と比較した同村の特色を把握し、今後調査を進める足掛かりを得た。3.「マントラヴァーディン家系の調査」:ケーララ州のブラーマン社会において、注目すべき役割を果たす家系の種類に「マントラヴァーディン」がある。ケーララには六つのマントラヴァーディン家系があるが、その一つであるカーヴァナート・アーマルール家を訪問し、現代におけるマントラヴァーディンの活動、地域社会での役割等について聞き取り調査を行った。これらのうち、「1」と「2」の調査は、過去2年度に主な調査対象としてきたヴァードゥーラ派宗家・ネドゥンピリ家の特徴や、周辺のブラーマン社会における位置を確認するために有意義であった。また「3」の調査を通じては、従来学界において未詳であったケーララ・ブラーマン社会の重層性を具体的に把握するための重要な知見が得られた。
インスリンによるWNKシグナル調節機構の解明

近年我々はKLHL3-Cullin3複合体によるWNKキナーゼ分解が塩分再吸収に重要であることを示した。またインスリン-PI3K-AktシグナルはWNKを制御するがその機序は不明だった。このため質量分析を用いてKLHL3のリン酸化部位を検索し、KLHL3 S433が同定された。S433リン酸化はKLHL3とWNK4の結合を障害していた。キナーゼアッセイではAktはS433をリン酸化した。培養細胞ではインスリン刺激でS433リン酸化が亢進した。以上からAktによるKLHL3リン酸化がWNK4との結合を制御することが示された。これはインスリンによるWNK制御のメカニズムの1つと考えられた。遺伝性塩分感受性高血圧疾患である偽性低アルドステロン症II型は腎臓遠位尿細管におけるWNK-OSR1/SPAK-NCCリン酸化カスケードの亢進によって起こる。最近、申請者西田は高インスリン血症モデルマウスであるdb/dbマウスにおける塩分感受性高血圧における、インスリン-PI3K-AktシグナルによるWNKカスケードの亢進を報告したが、AktとWNKをつなぐ機序は不明なままである。最近、Cullin3とKLHL3というE3 ligeseを形成する2つの分子が偽性低アルドステロン症II型を発症する事が明らかになったが、Cullin3とKLHL3がどのように発症に関わるかは不明であった。ヒトのKLHL3変異を有するKLHL3 R528H/+ノックインマウスを作成し、そのメカニズムを明らかにするべく研究を行った。結果、KLHL3は生体の腎臓においてWNK1、WNK4を基質としてユビキチン化し分解に導くことで、WNK1、WNK4の蛋白発現量を適切に保ち、塩分再吸収のNCCを介した調節を行っていることが明らかになった。KLHL3変異はWNK1、WNK4との結合能を失い、WNK1、WNK4のユビキチン化が現象して、結果、蛋白が増加するためにPHAII発症へと至ることを明らかにした(Hum Mol Genet, 2014)。この事実は塩分摂取がどのように血圧につながっているかを明らかにした事で非常に有意義なものと考えられた。さらにインスリン、AktとWNKシグナルをつなぐ因子としてKLHL3のタンパク修飾に注目し、KLHL3リン酸化によってWNKとの結合能が減弱するためにWNK分解が低下して、塩分感受性高血圧がおこる可能性を論文投稿中である。遺伝性塩分感受性高血圧疾患である偽性低アルドステロン症II型(PHAII)は腎臓遠位尿細管におけるWNK-OSR1/SPAK-NCCリン酸化カスケードの亢進であることが明らかとなっている。近年、PHAIIの原因遺伝子としてCul3及びKLHL3が同定され、Cul3-KLHL3-WNKのユビキチンリガーゼ複合体形成がPHAIIの病態形成に関わることが示唆されている。本研究では同複合体の調節におけるインスリンの果たす役割を解析による高インスリン血症における塩分感受性高血圧の病態解明を目的としていた。質量分析を用いてKLHL3のkelch-repeat内のS433がリン酸化サイトであると同定された。WNK4によって免疫沈降されたKLHL3はS433リン酸化が減少しており、S433リン酸化でKLHL3はWNK4との結合を減少させることがわかった。In vitro kinase assayではAktによるKLHL3 S433のリン酸化が確認され、さらに培養細胞ではinsulinの刺激でKLHL3 S433リン酸化が各々亢進した。結果、我々はAktによるKLHL3リン酸化がWNK4との結合を制御することを明らかにした。これはインスリンによるWNKシグナル制御の生理的調節機構の1つであると考えられ、肥満患者など、高インスリン状態における塩分感受性亢進にも重要な役割を果たしていると考えられた。Human Molecular Geneticsに共著者として報告を行い、国際学会にも3演題の報告を行った。さらに現在、共著者として論文投稿中である。腎臓内科学直接的なKLHL3のWNKシグナル調節のメカニズムを明らかにするために、質量分析(LC-MS/MS)を用いてKLHL3のリン酸化部位のスクリーニングを行った。その結果、KLHL3がリン酸化による調節を受けている事を明らかにした。今後、この生理的な制御を明らかにしていく。
タバコ抽出液によるラット肺気腫モデルにおける薬剤の抑制効果の検討

肺気腫の発症機序と治療法の確立を目的として、動物モデルの作製に取り組んだ。まず、タバコ抽出液(CSE)によるラット肺気腫モデルの作製を行った。CSEを6週齢オスSDラットの腹腔内へ週1回投与し、3週後に肺組織を摘出した。対照群との比較では、気腔の拡大は有意であるが肺胞の破壊は明らかでなく、確実に肺気腫モデルを作製することはできなかった。そこで、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)によるラット肺気腫モデルの作製に切り替えた。HUVECを6週齢オスSDラットの腹腔内へ単回投与し、3週後および6週後の肺気腫形成を調べたが、対照群と比べ明らかな気腔の破壊、拡大は確認できなかった。最初に、タバコ抽出液(cigarette smoke extract; CSE)によるラット肺気腫モデルの作製に取り組んだ。ケンタッキー大学のリファレンスシガレット1本分の煙をリン酸緩衝液(PBS)1 mLに溶解させ、独自のシステムを用いてCSEを作製した。CSE 1 mLを週1回、第1、8、15日にオスSDラット(6週齢、体重200-250 g)の腹腔内へ投与し(n = 12)、第21日に麻酔下に肺組織を摘出した。Hematoxylin and eosin(HE)染色を行い、肺気腫の指標として、mean linear intercept(MLI)およびdestructive index(DI)を計算した。コントロールラット(PBSを腹腔内投与、n = 6)との比較では、MLIに有意差を認めたものの、DIはばらつきが大きく有意な差は得られなかった。すなわち、既報と異なり、気腔の拡大は有意であるが肺胞の破壊は明らかでなく、確実に肺気腫を再現することはできなかった。次に、このモデルにおいて、peroxisome proliferator-activated receptor(PPAR)γのアゴニストであるピオグリタゾンを用いた予備実験を行った。ピオグリタゾンは、低用量(1.0 mg/日、n = 6)あるいは高用量(2.5 mg/日、n = 7)を、第1日から第21日まで連日経食道的に投与した。その結果、高用量ピオグリタゾン群はコントロール群と比較し、MLIの有意な減少を認めたが、低用量群あるいはDIにおいては有意差を認めなかった。ピオグリタゾンの肺気腫抑制効果が期待できる結果ではあるが、肺気腫の形成が不十分と判断し、CSEの投与方法を変更したモデルの作製に取り掛かっている。タバコ抽出液(cigarette smoke extract:CSE)によるラット肺気腫モデルの作製に取り組んだ。既報に従い、ケンタッキー大学のリファレンスシガレット1本分の煙をリン酸緩衝液(phosphate buffered saline:PBS)1 mLに溶解させ、独自のシステムを用いてCSEを作製した。すなわち、気腔の拡大は有意であるが肺胞の破壊は明らかでなく、確実に肺気腫モデルを作製することはできなかった。そこで、CSEからヒト臍帯静脈内皮細胞(human umbilical vein endothelial cell:HUVEC)によるラット肺気腫に切り替え、モデルの作製に取り掛かっている。HUVECを投与されたラット血清中には抗内皮細胞抗体が存在し、自己免疫機序により肺気腫が形成されることが報告されている。現在、HUVECの培養、増殖、継代維持を行っており、実験に耐えうるだけのHUVECが保持できた。今後、準備が整い次第、1x107個のHUVECをオスSDラット(6週齢、体重200-250 g)へ腹腔内投与し、肺気腫の形成を確認する。既報のような肺気腫形成に至らない原因として、抗体形成にさらに時間を要する可能性が考えられたため、標準である6週令HUVEC投与・9週令解剖群に加え、6週令HUVEC投与・12週令解剖群を作製した。両群ともに、HUVEC群はコントロール群に比べて、MLIの増大傾向を認めたが、有意差はなかった。HUVECを用いたラット肺気腫モデルの確立のために2回の検討を行ったが、残念ながら有意な気腔の拡大所見が得られなかった。そこで、血管内皮成長因子(vascular endothelial growth factor: VEGF)受容体阻害薬(SU5416)と低酸素(hypoxia)による肺気腫モデルの作製に着手している。6週令雄性SDラットにSU5416(20 mg/kg)を1回皮下投与し、FIO2 10%の低酸素チャンバーにて、13週間、26週間、39週間、それぞれ飼育する。肺組織を摘出しHE染色を行い、MLIおよびdestructive index(DI)を計測する。近年、肺毛細血管密度の減少が肺気腫をきたす一因であると考えられている(CHEST 2010; 138: 1303-8)。

動物実験では、培養されたヒト臍帯静脈血管内皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell:HUVEC)をラットへ腹腔内注入(または皮下注入)すると、抗HUVEC抗体が産生されることにより肺血管内皮に障害を与え、肺気腫を形成すると報告されている(Am J Respir Crit Care Med 2005; 171: 734-42)。この自己免疫性肺気腫モデルにおいて、Western Blot法やBIACORE3000を用いてラット血清中の抗血管内皮細胞抗体の存在を明らかにし、さらに対応抗原を確認、同定することを研究の目的とした。動物モデルを作製するため、passage 1(P1)のHUVECを培養、継代し、P4になったところで実験に用いた。既報に基づいて、HUVECを6週齢のオスSDラットに腹腔内注入し、3週後の肺気腫形成を試みた。ブースター効果の目的で、HUVECとアジュバントを追加投与する群も用意したが、対照群と比べ明らかな気腔の破壊・拡大は確認できなかった。そこで、9週齢解剖群に加え、HUVEC投与後6週で解剖する長期観察群を置き、同様に肺気腫形成の有無を調べた。12週齢解剖HUVEC投与群では、対照群に比べ気腔の拡大傾向を認めたものの、統計学的な有意差には至らなかった。抗血管内皮細胞抗体などin vitroの実験に移る前段階において、HUVECを用いたラット自己免疫性肺気腫モデルの作製は困難と判断せざるを得ない結果となった。肺気腫の発症機序と治療法の確立を目的として、動物モデルの作製に取り組んだ。まず、タバコ抽出液(CSE)によるラット肺気腫モデルの作製を行った。CSEを6週齢オスSDラットの腹腔内へ週1回投与し、3週後に肺組織を摘出した。対照群との比較では、気腔の拡大は有意であるが肺胞の破壊は明らかでなく、確実に肺気腫モデルを作製することはできなかった。そこで、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)によるラット肺気腫モデルの作製に切り替えた。HUVECを6週齢オスSDラットの腹腔内へ単回投与し、3週後および6週後の肺気腫形成を調べたが、対照群と比べ明らかな気腔の破壊、拡大は確認できなかった。MLIおよびDIを、既報の正常ラットおよび肺気腫ラットと比較し、肺気腫の完成を確認したのち、以下の方法を用いて発症機序の解明を行う。1.炎症性サイトカインの検討:血清および肺のホモジネートを用い、肺気腫と関連するtumor necrosis factor(TNF)-αおよびinterleukin(IL)-1βの濃度をELISA法にて測定する。3.アポトーシスの検討:肺組織のTUNEL染色を行い、TUNEL陽性細胞の数をカウントし、アポトーシス指数を計算する。さらに、caspase-3の免疫染色とWestern blotting法によるアポトーシスの定量を行う。呼吸器内科学まず、ヒト臍帯静脈内皮細胞(human umbilical vein endothelial cell:HUVEC)によるラットの肺気腫モデルを確立する。1x107個のHUVECをオスSDラット(6週齢、体重200-250 g)へ腹腔内投与し、3週間後に肺を摘出して組織学的に気腫性病変の有無を確認する。対照群として、adjuvantのみを投与したコントロールラットを置く。
膜電位感受性色素を用いた蛙腰部交換神経節シナプス伝達機構の光学的解析

膜電位感受性色素を用いたニューロン活動の多領域同時測定法をウシガエル腰部交換神経節に適用し、次のような成果を得た。1.メロシアニン・ローダニン系またはオキソノール系の膜電位感受性色素で神経節を染色し、ニューロン活動を測定するための基本的な染色[色素濃度、染色時間、結合織除去法など]および光学的測定の条件を確立した。2.神経節から延びる節前線維および節後線維の各神経束に吸引電極を取り付け、電気刺激をおこない、それにより誘発される光学的(吸光)シグナルを神経節内の多数の部位から同時に検出した。この光学的シグナルは、膜電位感受性色素特有の波長依存性を示し、未染色の標本では検出されないことから、刺激によって誘発された神経節内のニューロン活動に由来する色素の吸光変化による光学的シグナルであることが明らかになった。3.シグナルの波形を分析した結果、節後線維の逆行性刺激により誘発される光学的シグナルは、比較的単純で、持続時間約10msecのスパイクとそれに続く後過分極相からなるパターンを示すが、節線維の順行性刺激によって誘発される光学的シグナルは、持続時間1520msecの複雑な形状のスパイク状のシグナルで、しばしば二峰性を示すことが明かとなった。4.節前線維刺激により誘発される光学的シグナルは、低Ca^<2+>リンゲル液やクラーレの投与により、神経節内のシナプス伝達を抑制することにより、神経終末部を含む節前ニューロンの電気的活動に由来する成分と、節後ニューロン(神経節細胞)の電気的活動に由来する成分に分離可能であることが明らかにされた。これらのシグナルの各成分の生理的特性については、現在、さらに詳細な解析を進めている。膜電位感受性色素を用いたニュ-ロン活動の多領域同時測定法をウシガエル腰部交感神経節に適用し、次のような成果を得た。1.メロシアニンロ-ダニン系またはオキソノ-ル系の膜電位感受性色素で神経節を染色し、ニュ-ロン活動を測定するための基本的な染色条件[色素濃度、染色時間、結合織除去法など]および光学的測定の条件を確立した。この光学的シグナルは、膜電位感受性色素特有の波長依存性を示し、未染色の標本では検出されないことから、刺激によって誘発された神経節内のニュ-ロン活動に由来する色素の吸光変化による光学的シグナルであることが明らかになった。3.シグナルの波形を分析した結果、節後線維の逆行性刺激により誘発される光学的シグナルは、持続時間約10msecの単純なスパイク状を示すが、節前線維の順行性刺激によって誘発される光学的シグナルは、持続時間1520msecのスパイク状のシグナルと、それに続く数十msecの持続時間を持った遅いシグナルの二つの成分から構成されることがわかった。これらのシグナルの各成分の生理学的特性やその由来については、現在、詳細な解析を進めている。膜電位感受性色素を用いたニューロン活動の多領域同時測定法をウシガエル腰部交感神経節に適用し、次のような成果を得た。1.メロシアニン・ローダニン系またはオキソノール系の膜電位感受性色素で染色した神経節から延びる節前線維および節後線維の各神経束に吸引電極を取り付け、電気刺激をおこない、それにより誘発される光学的(吸光)シグナルを神経節内の多数の部位から同時に検出した。

この光学的シグナルは、膜電位感受性色素特有の波長依存性を示し、未染色の標本では検出されないことから、刺激によって誘発された神経節内のニューロン活動に由来する色素の吸光変化による光学的シグナルであることが明らかになった。2.シグナルの波形を分析した結果、節後線維の逆行性刺激により誘発される光学的シグナルは、比較的単純で、持続時間約10msecのスパイクとそれに続く後過分極相からなるパターンを示すが、節前線維の順行性刺激によって誘発される光学的シグナルは、持続時間1520msecの複雑な形状のスパイク状のシグナルで、しばしば二峰性を示すことが明かとなった。3.節前線維刺激により誘発される光学的シグナルは、低Ca^<2+>リンゲル液やクラーレの投与により神経節内のシナプス伝達を抑制することにより、神経終末部を含む節前ニューロンの電気的活動に由来する成分と、節後ニューロン(神経節細胞)の電気的活動に由来する成分に分離可能であることが明らかにされた。これらのシグナルの各成分の生理学的特性については、現在、さらに詳細な解析を進めている。
セマフォリン、プレキシン相互作用による神経回路網形成の制御

DISC-1(Disrupted- In- Schizophrenia 1)はスコットランドにおける精神疾患多発家系を対象とした遺伝学的解析より発見された、統合失調症の脆弱性遺伝子である。上記の家系においては高頻度で1番染色体と11番染色体の間で転座を有しており、これに伴ってDISC-1遺伝子の切断が生じる。翻訳タンパクであるDISC1の機能については知見も多くは得られておらず、統合失調症の病態との関連も不明であった。本研究では新規のDISC1の相互作用分子として14-3-3εおよびGrb2を同定した。神経細胞において14-3-3εはNUDEL/LIS1タンパク複合体の神経軸索への選択的輸送に必須であると考えられている。DISC1は14-3-3ε/NUDEL/LIS1とタンパク複合体を形成することが明らかになった。また培養海馬神経細胞においてDISC1は14-3-3ε、LIS1およびGrb2と軸索先端部において共局在することが示された。さらにDISC1が微小管モータータンパク質として知られているキネシン1と複合形成することを見いだした。以上の結果から、DISC1は14-3-3ε/NUDEL/LIS1複合体もしくはGrb2の輸送におけるカーゴタンパクとして機能している可能性が示唆された。発生過程における神経回路網形成においては、多様なガイダンス因子およびその受容体分子の相互作用が重要な役割を担っていることが現在までに明らかになっている。しかしながらこのガイダンス因子-受容体の相互作用と実際の神経細胞の動態とを結びつけられる知見が乏しいのが現状である。申請者はこれまでに新規のガイダンス因子候補としてSema6Dを同定している。さらに神経軸索ガイダンス因子受容体として知られるPlexin-A1にSema6Dが結合する事を明らかにしている。本研究では軸索ガイダンス因子からのシグナルと神経細胞の形態変化を統合的に結びつけることを最終目的としている。本年度はPlexinを介した細胞内シグナル伝達経路の解明を遂行してきた。研究実績を以下に示す。(1)アフィニティーカラム法および免疫沈降法によりPlexin-A2,-A3と相互作用する候補分子を複数同定した。(2)ガイダンス因子受容体であるDCC、神経細胞特異的な細胞接着因子として知られるX-CAM、X-cadherin及びL1の細胞内領域に相互作用する分子の同定をアフィニティーカラム法にて試みた。その結果Heat shock 105KD-alphaがDCC細胞内領域に結合することを見いだした。以上の結果をふまえて、Plexinを介したシグナル伝達系の解明に向けた研究を継続していく予定である。整然とした神経回路網の形成には、あるニューロンからそのターゲットへの正確な神経投射が保証されなければならない。古典的な移植実験より、神経軸索の標的特異的な投射、すなわち神経軸索のガイダンスには分子レベルでの制御メカニズムが存在することが示唆されていた。セマフォリンは神経軸索の身長を阻害する因子として同定された分泌型/膜貫通型のタンパク分子である。現在までに、脊椎動物には約20のセマフォリン相同分子が存在することが示されている。本研究では、新規に単離したセマフォリン、Sema6Dの機能解析を行っている。現在までに、in vitro binding assayを用いた実験より、Sema6Dの受容体としてPlexin-A1と呼ばれる膜貫通型タンパク分子を同定している。In situ hybridization法により、マウス脳においてのSema6Dおよびplexin-A1の発現部位および発現時期の検討を行った。その結果、胎生15-17日においてPlexin-A1は下丘に、Sema6Dは下丘を囲む領域に強い発現が見られることが明らかになった。培養下における下丘由来の神経細胞に対するSema6Dの作用を検討した結果、Sema6D存在下では下丘神経細胞の神経突起伸長が阻害されることが明らかになった。更にSema6Dの機能解析を行うためにSema6D遺伝子機能破壊マウスの作成を進めている。
レチノイン酸ミセルを用いたCED法による膠芽腫新規治療法の開発研究

新規脳内薬剤送達技術であるConvection-enhanced delivery(CED)法により、新規薬剤担体であるミセル化薬剤を投与する悪性脳腫瘍新規治療法の開発を実施した。第3世代レチノイン酸Am80が脳腫瘍細胞に対してテモゾロミドと相乗的に作用し抗腫瘍効果を高めることを証明した。また、脳腫瘍頭蓋内移植モデルを用いた検討で、この薬剤の相乗効果はin vivoでも認められることを示した。すでに報告しているガドリニウムミセル製剤を用いた薬剤送達モニタリング法と合わせて、これら一連の研究でAm80ミセルのCED投与という新規治療法に向けた基礎を構築出来た。U87MG悪性神経膠腫培養細胞を用い実験を行った。in vitroでAm80を投与し、MTS assayを行い抗腫瘍効果を判定した。結果として100-200uMの濃度においてAm80の抗腫瘍効果が認められた。さらにTemozolomideとの併用において効果が増強された。続いて、Am80投与24時間後で培養細胞を回収しタンパク質を抽出し、ウエスタンブロット法でタンパク質の発現を解析した。phospho-MAPKはAm80単独投与で発現の低下を認めたが、phospho-AKTはAm80+TMZの併用において発現低下が単剤に比較し増強された。以上からIn vitroでのAm80の腫瘍増殖抑制効果が確認され、その作用機序がphospho-MAPKの抑制によるものであることが示唆された。さらにTMZの投与により腫瘍増殖の抑制効果は増強されたが、これはphospho-AKTの発現抑制によるものである可能性が示唆された。続いて、6-8週齢、正常Suprague-Dawleyラットを使用し、in vivoにおけるAm80ミセルの毒性試験を行った。Am8012,6,3mg/m2をCED法により投与後、観察期間は21日および60日とし、神経脱落症状出現の有無、体重減少出現の有無等注意深く観察した。観察期間終了後にラットは安楽死させ、脳組織の組織学的解析を加え毒性を評価した。結果として、すべての濃度においてラットに明らかな神経脱落症状を認めず、組織学的評価でも神経毒性は認められなかった。このことから、Am80はラット脳内に安全に投与できる薬剤であることが確認された。引き続き、生存試験を行った。ヌードラット脳内にヒト膠芽腫培養細胞U87MGを移植し、脳内に腫瘍を形成させたのち、投与7日目にAm80、Am80ミセルをCEDにて投与し、生存試験を行った。結果として、Am80はコントロールに比較し有意な生存期間の延長を認めなかったが、Am80ミセルは有意な生存期間の延長を認めた。この結果からAm80ミセルは膠芽腫に対する抗腫瘍効果を持つことがin vivoでも明らかとなった。昨年度までの研究で、膠芽腫細胞U87MGをラット脳内に移植しラット膠芽腫モデルを作製それに対しAm80ミセルをCED法で投与すると抗腫瘍効果が認められ、さらにテモゾロミドを全身投与することでその効果が増強することが明らかとなった。作用機序としては、膠芽腫細胞表面に発現するレチノイド受容体にAm80が結合することでapoptosisが誘導されると報告されているが、MAPK pathwayの抑制により細胞増殖抑制が起こるとも考えられている。そこで本年度はその増強効果がレチノイド受容体を発現するU87MG特有のものではなく、他の膠芽腫細胞でも認められるか否かを明らかにすることを目的とし以下の実験を行った。今回はU87MG,U251MG,9L,F98の4種類の悪性神経膠腫培養細胞を用いた。in vitroでAm80を投与し、さらにTemozolomideを追加投与することで相乗効果が認められるか否かを検討した。解析方法はMTS assayを行い抗腫瘍効果を判定した。Am80の濃度を段階的に上げていくと、100-200uMの濃度においてAm80の抗腫瘍効果が認められた。さらにTemozolomideを1-5日間連続投与を行いその相乗効果を検討した。するとTemozolomide単独でも抗腫瘍効果を認めたが、さらにAm80との併用において効果が増強された。この結果からAm80とTemozolomideの併用療法は膠芽腫に対し相乗的に抗腫瘍効果を持つことが示唆された。今後はラット脳内移植モデルを用い、ラット脳腫瘍モデルを作製し、in vivoでさらなる検討を行う予定である。レチノイン酸Am80が脳腫瘍培養細胞U87MGにおいてテモゾロミドと相乗的に作用し抗腫瘍効果を高めること、その機序がアポトーシス誘導にあること、また、この薬剤の併用効果はin vivoでも証明されることを昨年度報告した(Yokosawa M,et al.Tohoku J Exp Med. 2010;221 (4): 257-64.)。

これを受けて本年度は、まずAm80とテモゾロミド併用による相乗的抗腫瘍効果の普遍性の確認を目指して研究を進めた。ヒトグリオーマ細胞U251MG,T98,ラットグリオーマ細胞9L,F98,マウスグリオーマ細胞GL261を用いて検討し、いずれの細胞でもAm80の抗腫瘍効果とテモゾロミドとの併用効果を確認した。この研究の中で、ラット脳内に薬剤を投与した際の局所変化を観察したことから、引き続く研究として薬剤をCED投与した後の脳内局所変化について詳しく検討。とくに薬剤投与後の血液脳関門の状態の研究を進め,主に化学療法剤を使用する際に血液脳関門が一過性に破綻することを見出し、報告した。同時並行で当科にて進行している抗癌剤を用いたCED法の臨床研究で、投薬システムの開発を行い、臨床例に対する投薬の方法論を確立した。この方法で再発悪性神経膠腫症例に対する有効例を示すことができた。これら一連の研究でAm80ミセルのCED投与という新規治療法に向けた基礎を固めることが出来た。
共生非依存的に進化したオルガネラによるマトリョーシカ化機構

マラリア原虫が赤血球を隷属化するマトリョーシカ化発展機構の成立と分子機序を理解するため、赤血球侵入・改変に関わる分泌オルガネラに局在するタンパク質の網羅的同定とオルガネラへのタンパク質輸送機序の解析を行った。熱帯熱マラリア原虫にて赤血球侵入・改変の役割を担う25の新規分子、および、赤血球侵入型原虫の分泌器官への輸送に必要な領域を新たに同定した。また、感染赤血球内に輸送される原虫分子の一つであるSURFINが寄生胞膜を透過し、赤血球内の新規膜構造物マウレル裂に到達するために必要な領域およびSURFINの膜透過を担う分子装置、さらにマウレル裂から赤血球表面への移行に必要とされる領域を明らかにした。二次共生由来オルガネラという「オルガネラ二重構造」を内部に持つアピコンプレクス門原虫は、さらに真核細胞へ侵入・改変することでマトリョーシカ構造を発展させる。本研究では赤血球に侵入・改変して発育するマラリア原虫について、種々の分泌オルガネラに局在するタンパク質の網羅的同定と各オルガネラへの輸送に関わる分子の同定を通じて、細胞侵入と寄生成立を可能とする特殊化された分泌オルガネラの機能と起源を明らかにし、マラリア原虫が赤血球を隷属化するマトリョーシカ化発展機構の成立と分子機序を包括的に理解することを目的とする。平成23年度は、赤血球侵入型原虫のオルガネラ形成が開始される時期、および感染赤血球のマウレル裂が形成される時期に転写が見られ、N末端の粗面小胞体移行シグナルもしくは細胞膜貫通領域を持つ事を指標として種々のマラリア分子群を選択し、抗体を作製した。微細局在解析に供するため、蛍光顕微鏡を用いてこれらの抗体の局在解析のための適切な抗体価を決定した。また、マラリア原虫の種々のオルガネラの代表分子を蛍光タンパク質標識した熱帯熱マラリア原虫の作製を開始した。また、感染赤血球内に輸送されるSURFINの細胞内輸送には細胞膜貫通領域、N末端の配列および細胞内領域の一部が必要である事を明らかにした。細胞内領域のトリプトファンに富んだ領域が、赤血球内に新たに形成されるマウレル裂と呼ばれるオルガネラ構造物から、さらに、感染赤血球への移行に必要であることも見出した。平成25年度も赤血球侵入型原虫のオルガネラに局在すると予想されるマラリア分子群に対して作製した抗体により、オルガネラへの局在と機能の解析を継続した。その結果、RON5と呼ばれる分子がロプトリー頚部に局在し、RON2、RON4、AMA1と複合体を形成していること、赤血球侵入型のメロゾイトのみならず肝細胞侵入型のスポロゾイトにも発現していることを明らかにした。また、ネズミマラリア原虫のメロゾイトを侵入能力を保持したまま精製する方法を確立し、超解像顕微鏡により、RON5等の赤血球侵入中の動態を明らかにすることに成功した。感染赤血球内に輸送される原虫分子SURFINの細胞内輸送の機序をより明らかにするために、種々のタグを付与した部分組換えSURFINを作製し、SURFINと相互作用する分子の分離に取り組み、分子量70 kDa程度の分子がSURFINに強く結合していることを見出した。平成26年度も赤血球侵入型原虫のオルガネラに局在すると予想されるマラリア分子群に対して作製した抗体により、オルガネラへの局在と機能の解析を継続した。その結果、熱帯熱マラリア原虫メロゾイトのデンスグラニュールに局在する新規の分子としてPfPV1を同定した。さらに、PfPV1の赤血球侵入後の動態を超解像顕微鏡を用いて詳細に観察し、寄生胞膜に局在することを明らかにした。また、感染赤血球内に輸送される原虫分子SURFINの細胞内輸送の機序をより明らかにするために、種々のタグを付与した部分組換えSURFINを作製し、SURFINが分子量700 kDa以上の複合体を形成することを見出した。プロテオーム解析により複合体を構成する分子の同定に成功した。また、感染赤血球表面に組換えタンパク質が露出しているかどうかを検証するアッセイ系を構築した。