hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ラットおよびヒト表皮型ペプチジルアルギニンデイミナーゼの構造と生理機能の解明

タンパク質中のアルギニン残基をCa2^+依存的に脱イミノ化しシトルリン残基に変換するPeptridylarginine deiminase(PAD)には3つのアイソフォームtypeI.II.IIIが存在する。表皮にのみ存在するtypeIIIについては、材料の調製が困難なこともあり殆ど研究が行われていない。本研究では、typeIIIの酵素化学的性質、生理機能、ならびに発現制御機構を解明するうえで極めて重要なステップである。cDNAのクローニングを試みた。精製ラット表皮由来PAD typeIIIの内部アミノ酸配列情報に基づきRT-PCR法、ついで5'RACE法ならびに3'RACE法を組み合わせ解析をすすめた結果、全長3096bpのほぼ完全長と思われるラットPAD typeIIIcDNAのクローニングに成功した。本cDNAは、42bpの5'非翻訳領域と664アミノ酸残基をコードする1995bpの翻訳領域と1059bpの3'非翻訳領域からなり、3'非翻訳領域内の3081番目にはAATAAAのポリA付加シグナルが存在し、その11番目後の3096からポリAが付加すると判断できた。ラットPAD typeIIIは664アミノ酸残基からなる分子量75,036Da、計算上の等電点5.13の弱酸性タンパク質であった。ラットPAD typeIIに対する相同性は、アミノ酸レベルで50.8%、DNAレベルで62.1%であり、特にC末端側の配列での高い相同性が特徴的であった。また、活性発現への関与が示唆される2つのヒスチジン残基および1つのシステイン残基は、typeIIIにおいても保存されていた。ついで、ヒト正常培養表皮細胞を用いヒトPAD typeIIIについてもそのcDNAのクローニングを試みた。本研究で明らかにしたラットPAD typeIIIの特徴的なアミノ酸配列の塩基配列情報によりヒトPAD typeIIIcDNAをRT-PCR法によりクローニングした。その結果、ヒトPAD typeIIIcDNAについても全長の約60%の領域のクローニングを行うことができた。さらに、現在残りの領域についても解析を進めている。このように、本研究ではこれまで困難とされてきた、表皮型PADのcDNAを世界で初めてクローニングをすることに成功することができたことから、同酵素に関する研究は今後大いに進展できるものと確信している。
癌転移を制御する骨髄由来細胞の細胞系譜決定

癌の転移は患者の予後を大きく左右するため、転移メカニズムの解明とその制御は癌患者に大きな福音をもたらす。近年、骨髄球系の造血細胞が癌の進展に関与している可能性が明らかとなりつつある。研究分担者・武藤らは大腸癌のマウスモデルで浸潤や転移の局所にCD34とCD11bを発現する骨髄球系の細胞が集積していることを発見し、immature myeloid cell (iMC)と名づけた。本研究は、このような造血細胞の分化系譜を解明することを目的とした。マウスで大腸癌の肝転移モデルを作製し、肝転移巣から酵素処理によって造血細胞を分離した。分離した細胞を蛍光標識抗体で染色し、フローサイトメトリーを用いてCD34陽性CD11b陽性の集団を同定した。CD34陽性CD11b陽性の細胞集団はFSCおよびSSCのプロファイルからさらに二つの亜集団(A : SSC^<high>, B SSC^<low>)に分類できることが明らかとなった。これまでにiMCはマトリックスプロテアーゼであるMMP2およびMMP9を発現していることが免疫組織の結果から明らかとなっている。そこで細胞集団AおよびBを細胞ソーティングによって回収し、免疫染色したところ、AはMMP9のみをBはMMP2のみが陽性であった。研究分担者・斎藤らの開発した手法を用いて単一細胞からcDNAを増幅し、MMP2およびMMP9のmRNA発現量をリアルタイムPCRを用いて定量したところ免疫染色の結果と一致した。組織で観察されるiMCと細胞ソーティングにより回収した細胞集団のphenotypeが一致しないことから、iMCが不均一な細胞集団である可能性や、現在用いている酵素処理では真のiMCが回収できていない可能性が示唆された。今後、細胞分離法の改善とともに組織切片上での新たなiMCのマーカーを探索して、iMCの細胞系譜の確定を試みる予定である。
数量化による弥生時代打製石器の型式学的研究

弥生時代の打製石器については、石器製作技術の観点から総括的にとらえた研究が少ない。これは打製石器において型式認定の基準となる細部調整技術について、十分な検討がなされていないことにも原因がある。今回、数量的な裏付けのある南河内地域での出土例について従来、私が行った調査を再検討するとともに、前期に限定できる資料である北大和地域での出土例について検出遺物の悉皆調査を行った。その際に細部調整技術を、角度・深度・裏表・位置・様態などについて数量化して記述し、集計することによって、石器における細部調整のあり方をより客観的に記述し比較することができた。このことは、定形的型式に片寄りがちであった分析を、不定形な石器遺物にも適用可能としたことを意味する。細部調整個々にについての検討は従来も行っていたが、今回属性の組み合わせを再検証できた。また、ひとつの個体の中で複数存在している細部調整について、相互の関係の検討を、今回購入したパソコンを利用した統計計算によって詳しく行い、資料本によっては細部調整が独立性の強い存在であることが浮き彫りになった。剥片や対する検討も行ったが、剥片と細部調整のある剥片とを連係させた分析は今後の課題となった。石核に対する検討は、その点数が少ないこともあり、分析方法の再検討も必要であると考えている。また、数値シミュレーションについては基礎的な部分からさらに検討すべき点が多く、今後の研究に期待するところが大きい。
ミクロ計量分析に基づく地域のイノベーション支援制度の評価と設計

本研究は、日本の地方自治体のイノベーション支援(研究開発助成)に注目し、自治体と地域企業への独自のアンケート調査のデータを用いて、1)どのような地域のどのような自治体が研究開発助成を行うのか、また政策設計の違いが何に依るのか、2)市・都道府県・国による研究開発助成は地域企業の生産性を高めるかを、計量的に検証した。1)については自治体側の制約条件(供給要因)と地域企業の潜在的な政策ニーズ(需要要因)の効果が明らかになった。2)については、市と県、市と国の助成の生産性への相乗効果を確認した。平成27年度には、中小企業庁委託事業「ミラサポ」ウェブサイトや各地方自治体のホームページから収集した情報と、いくつかの地方自治体への訪問調査に基づいて、地方自治体による研究開発助成に関するアンケート調査を設計・実施した。全国の250事業について有効回答を得て調査報告書(未公開)を作成し、回答者へのフィードバックを行った。また、研究代表者は、本プロジェクトの内容に関連する研究業績として、日本語の著書(監修と1章の執筆を担当)1冊、英語の共著1冊(連携研究者の池内健太と共同で1章を担当)、査読付き英語論文3本(いずれも研究分担者である西村淳一と共著)、ディスカッション・ペーパーを含む査読なし論文3本(研究分担者の西村淳一、研究協力者の加藤雅俊との共著)を公刊した。さらに、海外の学会(イタリア、フランス、中国)で計4回(うち1回は招待講演)、国内の国際学会・研究会で2回の研究報告を行った。平成28年度には、6月に2件の国際会議報告(ドイツ、米国)、7月(大阪)と9月(東京)に国内学会大会報告を行うことが確定している。これらの他に、連携研究者の池内健太はディスカッション・ペーパー4本(うち国際共著2本)と査読付き英語論文2本を公刊し(掲載決定を含む)、鈴木真也は国内学会報告を1回行った。研究協力者の本多哲夫は査読付き論文1本と査読なし論文1本、日本語の共著1冊(1章を担当)を公刊し、国内で学会報告を1回行った。研究協力者の加藤雅俊は査読付き英語論文3本(うち国際共著1本)を公刊し、学会報告を2回(いずれも国際共著)行った。以上の研究実績をまとめると、著書3冊(監修および共著)、査読付き論文9本(うち英語8,国際共著1)、査読なし論文8本、学会等の報告10回(うち海外への招待講演1)となる。平成27年度には、まず関連文献・資料の探索を行い、近年の研究動向を確認した。科学技術イノベーション政策や地域イノベーションシステムに関する研究関心が高まっているにも拘わらず、地方自治体レベルの政策に関する調査や研究が、世界的に見ても極めて不十分であることが確認された。その主な理由が、地方自治体の施策に関する情報が十分に公開・共有されていないことにあると判断し、中小企業庁委託事業「ミラサポ」のウェブサイトから多くの自治体における中小企業の研究開発支援事業に関する情報を収集するとともに、日本政府の「地方創生」プロジェクトの統括者との面談やいくつかの地方自治体の研究開発助成事業担当者への聞き取り調査に基づいて、地方自治体へのアンケート調査の準備を進めた。さらに、全国の自治体(都道府県と市区)のウェブサイトから施策情報を収集し、平成28年1月以降、一定規模以上の研究開発助成を行う210自治体294事業(予備調査を含む)を対象として「地方自治体による中小企業の研究開発等の助成事業に関する調査」を実施して、助成事業の内容や審査・採択・評価のプロセス等を調査し、250事業(85%)について有効回答を得た。調査票の作成にあたっては、連携研究者や研究協力者からも重要な意見を得た。上記の高い回答率に示されるように本調査の反響は大きく、調査データの集計・分析結果は平成28年9月に開催される日本中小企業学会全国大会の統一論題セッションで報告されることになった。また、研究代表者は平成27年9月にオランダのフローニンゲン大学とドイツのZEW(マンハイム)、平成28年3月にベルギーのルーヴェン大学に滞在し、今後の共同研究や共同調査についての打ち合わせを行った。上記の地方自治体調査を、今後、国際共同研究の基盤として活用できる可能性が確認された。平成28年度には、全国の地方自治体職員へのアンケート調査のデータを集計・分析し、成果論文(研究分担者である西村淳一と共著)を国内外の学会で発表した。日本語の論文は学会大会の統一論題で報告されて注目を集め、査読付きの学会誌に受理された。別の英語論文も査読付き学術誌への投稿を準備している。また、平成29年1月から、全国の製造業中小企業1万2千社を対象として、研究開発への取組みと公的支援の利用に関するアンケート調査を実施している(現在、期限延長・継続中)。さらに、平成29年3月には、研究協力者である加藤雅俊と協力し、海外の気鋭の若手研究者4名を招聘して、Tokyo Workshop on Entrepreneurship and Innovationを開催し、研究報告と討論を行って、今後の国際共同研究に繋げた。研究代表者は、本プロジェクトの内容に関連する研究業績として、査読付き英語論文2本(連携研究者の池内健太・鈴木真也と共著)を刊行し、査読付き日本語論文1本(西村淳一と共著)も平成29年7月に刊行予定である。他に査読なし論文を1本刊行した。また、国際学会等(ドイツ、米国、インドネシア、福岡)で4回、国内学会大会(大阪・東京)で2回の研究報告を行った(うち1回は招待講演)。

これらの他に、連携研究者の池内健太は査読付き英語論文を2本(国際共著)、査読なしの英語論文を3本刊行し、鈴木真也は査読なし論文を1本刊行し、国内学会報告を1回行った。研究協力者の本多哲夫は日本語論文を2本(査読ありと査読なし各1本)刊行し、加藤雅俊は英文のディスカッション・ペーパーを2本執筆した他、国際学会で2回の研究報告を行った。以上の研究実績をまとめると、査読付き論文6本(うち英語4本、そのうち国際共著2本)、査読なし論文8本(うち英語5本)、学会等の報告9回となる。研究実施計画に従い、これまでに全国の地方自治体職員へのアンケート調査(平成27年度)と全国の製造業企業1万2千社へのアンケート調査(平成28年度;期間を延長して現在継続中)を実施した。前者の調査データを集計・分析し、論文を作成して国内外の関連する主要学会で報告し、国内の査読付き学会誌に受理され、もう1本の英語論文も海外の査読制学術誌への投稿を準備している。また、この成果に基づいて、英国の大学に在籍する研究者との共同研究を開始した。ドイツ・マンハイムのZEW研究所とも連絡を取り合い、ドイツのバイオクラスター企業への共同調査と、それに基づく国際共同研究の準備を進めている。さらに、平成29年3月には、関連するテーマで海外から気鋭の若手研究者を4名招聘して国際ワークショップを開催し、研究報告と討論を行った。大学の研究者への調査は予算の制約により実施できなかったが、以上より、それを補って余りある研究の進捗が見られ、研究はおおむね順調に進展していると判断される。平成29年度は、初年度(平成27年度)中に実施した自治体アンケート調査のデータの分析をさらに進め、最終的な成果論文を海外の査読制学術誌に投稿し、審査中である。また、英国エディンバラ大学の北川文美講師と共同で国・県・市という異なる行政レベルのイノベーション支援政策の関連性に関する論文を別の国際的学術誌に投稿し、審査・改訂中である。また、全国の製造業中小企業1万2千社へのアンケート調査を終了し、約1千社から有効回答を得て、回答データの集計と分析を進め、集計結果を回答企業にフィードバックした。一部の回答企業に対するヒアリング調査を実施し、アンケート調査の結果を補完する情報を得た。アンケート調査回答データと帝国データバンクの企業財務データをマッチングして(約600社)、2003年度から2016年度までの14年間のパネルデータセットを作成し、国・県・市による研究開発助成が受給企業の全要素生産性に与える効果について、計量的な分析を行った。企業レベルのパネル固定効果分析により、各行政レベルの研究助成の効果の他に、複数の行政レベルからの助成の相乗効果を確認するとともに、研究助成の効果が長期的に(あるいはタイムラグをもって)現れることを発見した。この研究成果は、研究分担者とともに平成30年度に関連する学会で報告し、国際的な学術誌に投稿する予定である。連携研究者である池内健太とは、総務省「科学技術研究調査」のミクロデータを用いて、文部科学省のクラスター事業の参加大学・企業とクラスター指定地域の製造業事業所への影響を分析し、成果論文をDPにまとめ、海外の学会で報告した。また、国内の査読制学術誌に投稿し、条件付き採択となった。
Webカメラ入力を用いた日本手話-日本語電子辞書のユーザーインターフェースの研究

本研究はWebカメラから手話動作を入力し,その意味を調べることができる辞書システムの開発を行う.研究は主に次の3つからなる.1)手型認識,2)腕の動き認識,3)手話音素データベースの構築.データベースは完成しており,それを基にした辞書システムを開発し,評価を行った.手型と腕の動きの認識も基礎研究が終了した.現在は,認識プログラムと辞書システムの統合を行っている.本研究はWebカメラから手話動作を入力し,その意味を調べることができる辞書システムの開発を行う.研究は主に次の3つからなる.1)手型認識,2)腕の動き認識,3)手話音素データベースの構築.データベースは完成しており,それを基にした辞書システムを開発し,評価を行った.手型と腕の動きの認識も基礎研究が終了した.現在は,認識プログラムと辞書システムの統合を行っている.平成18年度は,主に以下の事柄について研究を行った.1.手型の認識本研究では,手型と腕の動きを別々に入力して,手話の検索を行うこと想定している.Webカメラを用いて手の形を入力し,それが手話のどの手型であるかを認識した.手話の手型には似たような形がある.これは辞書を使うユーザーが間違えやすいのもあるが,システムが区別しにくいといった両面の難点がある.本研究では,それらをグループ化することにした.辞書としては,似たような手話も検索の候補として挙げておき,最終的にはユーザーで絞ってもらうという方法をとることにした.グループ化した手型では,80%以上の認識率が得られた.2.音素の分類手話は,手型,腕の動き,位置などの音素と呼ばれる要素から成り立っている.それらの音素を分類し,データベースの作成を行った.特に手型について,利き手と非利き手の相関を調べたところ,これまで独立していたと思われていたが,一定の相関が見られることが分かった.これにより,辞書の検索は非利き手をキーワードとしなくても検索が容易に行われると考えられる.さらに形態素辞書の概念や記述についても研究を行った.3.手話のコード割り当て手話を辞書化するに当たり,手話のコード割り当てが必要になる.本研究では,日本のみならず,世界中で提案されている手話コードを包括的に記述できる方法について検討・提案をした(Universal Sign Code : USC).このコードは単語だけでなく,音素,形態素,さらには文章までもコード化することができる.したがって,これを用いれば,辞書内のデータベースだけでなく,様々な手話関連の製品に応用することができる.現在,手話データベースには,手話の音素である手型や腕の動き方などについて約2600語の手話の情報が格納されている.平成19年度は主にこのデータベースの充実を行った.まず,腕の動きに関しては,手話の動作が入力できる装置『聾bot』を開発した.これは人型のロボットで,腕を動かすとリアルタイムのその動作を記録することが出来る.これを用いてデータの収集を行う.この装置は入力だけでなく,記録した動作や2台用いて遠隔操作を行うことが出来る.これを用いれば病院でのレントゲン室など様々な場面での応用が期待される.また,手型については左右の手型が異なる手話単語での手型についての調査を行った.日本手話のタイプIII(両手手型が異なるもの)について,手話が表出される位置と動きをそれぞれニュートラルスペースおよび下方直線運動に固定し,両手手型の組み合わせと両手の接触の有無だけを変えた約2300個の手話サンプルを作成・録画し,日本手話母語話者の評価(5段階のリカートスケール)を受けた.その結果にもとづき,両手手型の組み合わせ等を含めて語の適格性について考察する方法を示した.さらにデータベースの管理システムを向上させるために,曖昧な認識結果でも検索が可能になるような方法を検討した.例えば手型認識の場合,伸ばしている指の数の個数程度なら,認識は用意であるが,これだけではデータベースの情報とマッチしない.そこでこのような曖昧な認識結果でも,複数の音素とマッチさせる仕組みを提案した.これはそれぞれの音素が持つ成分を分類し,その成分とマッチする音素を検索キーとして使用する方法である.欠点として,情報が少ないと検索キーとしての音素が多くなり,目的とする手話の候補数が多くなる.これを解決するためにはできるだけ多くの音素成分を入力画像から抽出する必要がある.20年度は,腕の動き認識とデータベース(日本手話・日本語辞書システム)の研究を中心に行った.本研究では,腕の動きを以下の手順で認識する.1) Webカメラの動画像から肌色を認識する.肌色は両腕と顔があるが,初期位置によって腕だけを認識する.2)画面を領域分割し,どの領域に腕が移動したか検知して動きを認識する.腕の追跡には,CamShift法による色情報追跡アルゴリズムを用いた.CamShift法では,画像フレーム中で追跡対象の色相値のヒストグラムに一番近い領域にシフトし続けることにより,色情報が動的に変化する動画像に対しての追跡を実現した手法である.また,Webカメラから得られる画像をいくつかの領域に分割しておき,時間毎にどの領域に腕があるかを記録しておく.その結果から腕が動く方向を認識する.これと並行して,約3,000語の手話を音素(手型,位置,動きなど)に分解し,データベースを設計した.

さらにこのデータベースを管理するシステムとして日本手話・日本語辞書システムを開発した.データベースはマイクロソフト社のAccess形式で構成されており,管理およびGUIはマイクロソフト社のVisual Basicで設計した.データベースとの接続にはADO.NETを用いている.このシステムを用いて手話単語検索を行った場合,書籍の手話・日本語辞書に比較して,平均で半分程度の時間で検索ができることが確認できた.現在は,これまでの研究成果である手型認識と,上記の腕の動き認識の結果を,辞書システムに渡す仕組みを設計している.
マイクログリアのM2化によるアルツハイマー病根本的治療法の開発

アルツハイマー病では、脳内にアミロイドβが沈着し、炎症反応が誘発され、その結果神経回路網が破綻し、記憶障害となる。脳内の唯一の免疫細胞であるマイクログリアには、炎症性のもの(M1)と抗炎症性・組織修復性のもの(M2)が存在する。私は、アルツハイマー病において、M1を減少させM2を増加させることができれば、記憶障害を改善できるのではないかと考えた。私は以前、ヒストン脱アセチル化酵素HDAC3を阻害することにより、損傷脊髄内でM1を減少させ、M2を増加させ、軸索伸長を誘発させ、結果として脊髄損傷マウスの運動機能が回復することを明らかにした。そこで本研究ではHDAC3阻害剤を用いて、M1の減少とM2の増加が、アルツハイマー病において記憶を回復させるかどうか、そしてそれはどのような機序なのかを分子的に明らかにし、“マイクログリアの質的改善によって、病因を除去することに加え、失われた脳機能を積極的に回復させる"というアルツハイマー病の根本的治療のためのストラテジーを確立することを目指した。本年度はまず、アルツハイマー病モデルの5XFADマウスにHDAC3阻害剤を投与することにより、記憶改善作用が生じることを明らかにした。さらに、clophosomeを投与してマイクログリアを除去した5XFADマウスでは、HDAC3阻害剤による記憶改善作用が生じなかった。以上のことから、HDAC3阻害剤は、マイクログリアを介して記憶改善作用を示すことが明らかになった。次に培養マイクログリアを用いた検討を行った。培養マイクログリアにアミロイドβを処置するとM1マイクログリアが増加するが、ここにHDAC3阻害剤を処置するとM2マイクログリアが増加することを明らかにした。以上、HDAC3阻害剤がマイクログリアのM2化を介して抗アルツハイマー病作用を示す可能性を示した。HDAC3阻害剤がマイクログリアのM2化を介してアルツハイマー病モデルマウスの記憶改善作用を示す可能性を示すことができ、当初の実験計画通り順調に進めることができた。ただし、マウスの脳の組織解析を行うことができなかったので、次年度以降の課題としたい。HDAC3阻害剤を投与したマウスの脳内で何が生じているのか、M2マイクログリアは脳内でどのような作用をもたらすのか、そのようにマイクログリアがM2化するのか、を今後明らかにしていく。そしてマイクログリアの機能を制御するエピジェネティックな遺伝子発現制御機構と、記憶改善との因果関係を解明し、マイクログリアをターゲットとする新たなアルツハイマー病根本治療のためのストラテジーを提唱する。当初の研究計画ではマウスの脳の組織解析を行う予定だったが、それを行うことができなかったため、購入予定だった抗体を購入しなかった。そのため使用金額に余剰が生じた。
日本語学習者の視点にたった文章の難易度判定システムの開発と実証研究

本研究の目的は、世界各国の日本語学習者に、よりよい読解支援環境をWeb上で提供することである。代表者らはすでに読解学習支援システム『リーディング・チュウ太』を開発しWeb上で公開している。今回新たに文章の難易度の主要な決定要因である単語の難易度と構文の複雑さに着目し、「学習者の視点にたった文章の難易度判定システム」を開発することを目指した。そのため、本研究では世界各国の母語の異なる学習者を対象にした難易度判定実験を行い、その結果を基に、単語と構文の双方に着目した文章の難易度判定システムを開発した。さらに、チュウ太の辞書ツールにはデータ・マイニングシステムを組み入れ、日本語学習者の辞書利用の実態調査を行った。利用者の推移や言語別の利用者数の変化および辞書のカバー率の調査を通して、辞書開発に関する今後の課題も明らかになった。研究成果は、Web上の読解学習支援ツールとして世界の日本語学習者・教育関係者に無償公開している。本研究は、世界各国の日本語学習者に、よりよい読解支援環境をWeb上で無償提供するために、文章の難易度の主要な決定要因である単語の難易度と構文の複雑さに着目し、「学習者の視点にたった文章の難易度判定システム」を開発することを目指している。そのため、本研究では、単語と構文の双方に着目した文章の難易度判定システムを開発するとともに、辞書ツールにデータ・マイニングシステムを組み入れ日本語学習者の辞書利用の実態調査を行う。さらに世界各国の母語の異なる学習者を対象にした難易度判定実験によって、システムの判定精度を検証する。研究成果は、Web上の読解学習支援ツールとして世界の日本語学習者・教育関係者に公開していく。研究初年度である平成21年度においては、研究の重点を単語の難易度の決定のための複数の単語難易度判定ツールの開発と、文章の難易度判定のための基礎調査におき、以下の研究を行った。a.現行の単語難易度判定ツール「語彙チェッカー」の改良b.単語出現頻度および単語親密度情報をもとにした単語難易度判定ツールの開発c.文書逆頻度を用いた単語難易度判定ツールの開発e.データ・マイニングシステムの基本構想の策定f.文章の難易度判定のための基礎調査一連の研究の成果に関しては、学会、セミナー、論文、書籍等で発表するとともに、開発した各ツールはインターネット上で利用可能なツールとして公開している。研究2年目である平成22年度においては、研究の重点を文章の難易度判定のための基礎調査の分析およびその分析結果をもとにした難易度の決定に関係の深い文法項目の検出システムの開発においた。a.文章の難易度判定基礎調査の分析b.調査名詞修飾節の検出システムの開発c.テ形および連用中止形の検出システムの開発d.主格省略文の検出システムの開発f.データ・マイニングシステムの開発一連の研究の成果に関しては、学会発表、セミナー、論文等で発表するとともに、開発した各ツールはインターネット上で利用可能なツールとして公開している。本研究の目的は、世界各国の日本語学習者に、よりよい読解支援環境をWeb上で無償提供するために、文章の難易度の主要な決定要因である単語の難易度と構文の複雑さに着目し、「学習者の視点にたった文章の難易度判定システム」を開発することにある。研究最終年度である平成23年度においては、研究の重点を文章の難易度判定システムの完成とシステムを活用した専門日本語教育のための教材の開発においた。さらにデータ・マイニングシステムを活用した読解支援システムの利用状況調査とその分析を行った。a.文章の難易度判定システムの開発単語と構文の双方に着目した文章の難易度判定システムの開発をめざし、語彙の難易度と構文の複雑さをもとに、入力された文章の難易度を判定するシステムを開発した。

b.介護分野に特化した難易度判定システムの構築専門分野の日本語教育の一事例として、介護福祉士国家試験の語彙調査をもとにして外国人介護福祉士候補生用の難易度判定システムを構築した。c.難易度判定システムを活用した外国人介護福祉士候補生のための教材作成難易度判定システムを活用して介護福祉士候補生のための教材および副教材を作成した。d.専門分野に特化した教材開発に関する講演およびセミナーの開催専門日本語教育のための教材開発方法に関する講演およびセミナーを行った。e.データ・マイニングシステムを活用した読解支援システムの利用状況調査辞書ツールにデータ・マイニングシステムを組み入れ学習者の辞書利用の実態調査を行った。一連の研究の成果は、学会発表、セミナー、論文等で発表するとともに、開発したシステムはインターネット上で利用可能なツールとして無償公開している。
リン酸化p62とオートファジーが関与するシグナル伝達機構の解明

研究期間内に、p62/Sqstm1に存在するKeap1相互作用領域(KIR:Keap1-interacting region)のセリン残基がリン酸化を介して、p62/Sqstm1とKeap1の結合親和性が増強されること。その結果、Nrf2とKeap1の結合が競合阻害され、Nrf2の遊離、活性化が引き起こされることを見出した。さらに、p62-Keap1-Nrf2経路の活性化は、選択的オートファジーと連動して細胞保護に働くことを明らかにした。一方、p62-Keap1-Nrf2経路の活性化は、がん細胞の悪性化に関与していた。したがって、p62とKeap1の結合阻害は新規抗がん治療となる可能性がある。p62はユビキチン結合ドメインを介して、ユビキチン鎖が結合した変性タンパク質や異常オルガネラの周囲に集積し、それらの標的物とともにオートファジーで選択的に分解されるタンパク質である。オートファジー不全やp62の過剰な発現により、細胞質内にp62は著しく蓄積し、ユビキチンとともに凝集体を形成する。これと類似したp62-ユビキチン陽性凝集体は、癌や神経変性疾患の細胞で認められており、オートファジーによるp62の選択的代謝が細胞の恒常性維持に極めて重要であることを示唆している。Keap1-Nrf2経路は、転写因子Nrf2の活性化制御機構である。通常、Nrf2はユビキチンライゲースのアダプター蛋白であるKeap1と結合してユビキチン化されることでプロテアソームにより分解不活化されている。しかし、酸化ストレスの環境下では、Nrf2はKeap1から解離し、生体防御に関わる遺伝子の転写を促進することで細胞を保護している。今回、p62のKeap1結合領域に存在するセリンがリン酸化されるとKeap1との結合親和性が高まり、Keap1-Nrf2の結合を競合的に阻害し、Nrf2を活性化させることを明らかにした。p62のリン酸化は、凝集体の蓄積、変性ミトコンドリアの出現、細菌の侵入といった選択的オートファジーが誘導される条件下で起きていた。すなわち、オートファジーとKeap1-Nrf2経路が連動していることが明らかにされた。p62-ユビキチン陽性凝集体は、癌や神経変性疾患の細胞で認められており、選択的オートファジーによるp62の代謝が細胞の恒常性維持に極めて重要である。Keap1-Nrf2システムは、ストレスに応答した転写因子Nrf2の活性制御機構である。通常状態では、Nrf2はKeap1と相互作用することでユビキチン化を受けプロテアソームで速やかに分解されている。一方、細胞がストレスに暴露されると、Keap1がNrf2から解離するためNrf2が安定化し、生体防御系遺伝子の発現が誘導され、細胞は保護される。我々は、p62のKeap1結合領域に存在するセリンがリン酸化されるとKeap1との結合親和性が高まり、Keap1-Nrf2の結合を競合的に阻害し、Nrf2を活性化させることを明らかにした。ある種のヒト肝細胞がんでp62の発現が亢進し、リン酸化を受けることで、Nrf2が活性化されていることが見出されている。したがって、リン酸化p62のリン酸化阻害剤、もしくはリン酸化p62とKeap1との相互作用を阻害する化合物は、新規な抗癌剤の候補となる。本年度は、リン酸化p62とKeap1との相互作用を阻害する化合物を化合物ライブラリーからスクリーニングした。今年度は、リン酸化p62とNrf2の結合を特異的に阻害する化合物を創薬機構の化合物ライブラリーからHTSにより取得し、その化合物によるがん細胞増殖抑制効果を細胞レベルで立証、論文報告した(Saito T, Ichimura Y et al. Nat. comm. in press)。p62の責任キナーゼについては、siRNAライブラリーを利用して複数の候補を取得した。今後、阻害剤やノックアウトの手法を用いて、その活性化経路を明らかにしていく予定である。研究期間全体を通じて、選択的オートファジーに応答したリン酸化p62の出現、およびp62-Keap1-Nrf2系の活性化を見出し、選択的オートファジーとKeap1-Nrf2系の連動を明らかにした。さらに、本経路によるNrf2の活性化が肝がん細胞の増殖を促進することを証明した(Ichimura Y etal.MolCell.51,618-631.2013)。リン酸化p62とNrf2結合阻害剤をスクリーニングを実施し、得られたヒット化合物によるがん増殖抑制効果を明らかにした(Saito T, Ichimura Y et al. Nat. comm. in press)。今後、さらにp62の責任キナーゼに関して、その活性化シグナルや制御メカニズムを分子レベルで明らかにしていく予定である。

研究期間内に、p62/Sqstm1に存在するKeap1相互作用領域(KIR:Keap1-interacting region)のセリン残基がリン酸化を介して、p62/Sqstm1とKeap1の結合親和性が増強されること。その結果、Nrf2とKeap1の結合が競合阻害され、Nrf2の遊離、活性化が引き起こされることを見出した。さらに、p62-Keap1-Nrf2経路の活性化は、選択的オートファジーと連動して細胞保護に働くことを明らかにした。一方、p62-Keap1-Nrf2経路の活性化は、がん細胞の悪性化に関与していた。したがって、p62とKeap1の結合阻害は新規抗がん治療となる可能性がある。リン酸化p62とKeap1との結合を阻害する化合物のスクリーニングを進め、候補化合物を同定した。現在、化合物の肝癌細胞への効果を検証し、論文投稿の準備を進めている。生化学、分子生物学p62のキナーゼは複数存在することが示唆されており、未だそれらの全ては同定されていない、今後、siRNAライブラリーなどを用いた新たなスクリーニング法を利用して研究を着実に推進させる予定である。p62のリン酸化の生理的意義と選択的オートファジーの関係を明らかにし、それを論文報告した。p62のリン酸化を制御することは、ある種のガンにおいて、有効な抗ガン治療となり得る。今後、p62のキナーゼとその阻害剤を同定することで、新規抗癌剤の開発へ発展させる予定である。消耗品の共有等により経費節減に努めたため消耗品に使用予定
精神疾患のグリア性マイクロエンドフェノタイプ

グリア細胞が脳の情報処理・発信を制御していることが明らかとなり、脳機能は「神経-グリアネットワーク」コミュニケーションとして捉えられるようになった。従って、本ネットワークの変調は、脳の機能変調、特にシナプス伝達の変調や神経細胞の基礎活動性に影響すると考えられ、これは顕著な神経変性や神経細胞死を伴わない精神疾患の分子病態との関連性を強く示唆する。実際、うつ病や統合失調症患者の死後脳のトランスクリプトーム解析、プロテオーム解析では、グリア関連分子の変動が上位に並ぶ。さらに動物実験ではグリア細胞を阻害すると、抗うつ薬が奏功しないことも示された。神経ーグリアネットワークのコミュニケーション変調と、精神疾患等各種脳疾患の分子病態は密接に関連すると考えられるが、両者の関連性の多くは不明のままである。その大きな理由は、神経とグリア細胞(アストロサイト及びミクログリア)がコミュニケーションを行うインターフェース「ペリシナプスグリア」の1.可視化・機能解析技術、2.グリア伝達(グリア細胞による化学情報伝達)を精密に制御する技術、が欠如していたからである。本研究は、それぞれ1.「膜移行型Ca2+プローブGCaMP3」によるペリシナプス機能解析、2. FASTシステムによる細胞種・時期特異的「グリア伝達制御」、の2つの新技術により、この問題に応えるものである。本年は、上記2の解析を行い、グリア性マイクロエンドフェノタイプとして、アストロサイトのATPグリア伝達の低下がうつ病の分子病態とリンクしていることを見出した。また、抗うつ薬の標的としてアストロサイトが重要で有ること、抗うつ薬がアストロサイトのグリア伝達を亢進させることが、抗うつ作用と関連していることを明らかとした。25年度が最終年度であるため、記入しない。
有機リン殺虫剤フェニトロチオンに特異的な精巣毒性とその機序の解明

1.GC/MSを用いた尿中3メチル4ニトロフェノール(MNP)の高感度測定法の開発ヒト調査及び動物実験でのFNT曝露量を推測するため、有機リン殺虫剤(OP)のフェニトロチオン(FNT)の特異的代謝物である尿中MNPのGC/MSを用いた高感度測定法の開発を行った。本法を用いることにより(1)LC-LC/MS/MSと同等の感度(定量限界1ppb)が簡便な前処理操作を行うことにより得られ、(2)OPのパラチオンの代謝物であるp-ニトロフェノール(PNP)が同時に測定可能であり、(3)尿中排泄されたMNP、PNPのフリー体の測定が可能であった。本法は情報の乏しい一般生活者集団におけるFNT曝露量の推測に応用できる。2.GC/MS高感度測定法を用いた尿中MNP・PNPの生物学的モニタリング上述の測定法でFNT散布者集団と殺虫剤非散布者集団の尿中総MNP濃度を測定した。本調査ではFNT散布の有無に加え、散布の多い夏と少ない冬の季節間の比較も行った。MNP濃度は季節に関わらずFNT散布集団で有意に上昇し、モニタリング指標としての有用性が確認された。FNT散布集団のMNP濃度は冬より夏で有意に高く、特に夏ではFNT総散布時間とMNP濃度の間口有意な相関が見られ、散布作業が1時間上昇するとMNPが12.3μg/gCreatinine上昇することが示された。3.雄ラットにおけるFNT(0,5,10mG/kg)経口投与による精巣及び精子機能への影響10週齢の雄ラットにFNTを週4日、9週間投与した後に解剖した。精巣・精巣上体重量は投与による変化は見られなかったが、精子運動性はFNT投与両群で有意に低下した。
魚類ノダウイルスレセプターの同定と新規ウイルス防除法開発への展開

本研究は、海産魚のウイルス性神経壊死症の原因である魚類ノダウイルスが宿主細胞への感染時に侵入門戸として利用するレセプターの同定・解析を目的とする。さらに、同定したレセプターを新規ウイルス防除法開発へ応用するものである。魚類細胞表面のレセプターと相互作用するのは魚類ノダウイルス粒子の最外層を構成する外被タンパク質(CP)と考えられることから、そのCPと相互作用を示す魚類培養細胞(E-11)タンパク質をYeast Two-Hybrid Systemを利用してスクリーニングした。その結果、3種のレセプター候補タンパク質(CPIP5,CPIP41およびCPIP320)が得られた。これらレセプター候補のホモログ検索を全てのGenBankデータを対象に行ったところ、3種全てが生体防御に関与するタンパク質であることが判明した。この結果からベータノダウイルスCPは、これらレセプター候補タンパク質と結合することでE-11細胞のウイルス感染防御機構を抑制することが予想され、既報のレセプターの特徴とは異なっていた。一方、Yeast Two-Hybrid Systemを用いた結合実験の結果、3種のタンパク質は全てのタイプの魚類ノダウイルスのCPと結合することが判明し、魚類ノダウイルスが共通して利用する重要因子であると示唆される。また、CPIP5の細胞内局在性を確認したところ、E-11細胞の核に存在することが判明した。CPも同様にE-11細胞の核に局在したことから、CPIP5およびCPは細胞の核内で相互作用し、その役割を果たすことが示唆される。これら結果から、3種のレセプター候補は魚類ノダウイルスの感染増殖に重要であることが示唆されたが、既知のウイルスレセプターとは異なる特徴を示すことから、今後ウイルスレセプターか否かのさらなる確認が必要である。本研究は、海産魚のウイルス性神経壊死症の原因である魚類ノダウイルスが宿主細胞への感染時に侵入門戸として利用するレセプターの同定・解析を目的とし、新規ウイルス防除法の開発に迫るものである。レセプター同定の方法として、現在Yeast Two-Hybrid Systemを利用したレセプターcDNAのスクリーニングを行っている。すなわち、魚類細胞表面のレセプターと相互作用するのは魚類ノダウイルス粒子の最外層を構成する外被タンパク質(CP)と考えられることから、そのCPをベイトとして、魚類培養細胞E-11から得た発現cDNAライブラリーに対しCP-宿主タンパク質相互作用を指標としたスクリーニングを行っている。まず、実験の第一段階として、E-11細胞からmRNAを抽出し、oligo dTプライマーを使用してcDNAライブラリーを作製した。その結果、約200万のプライマリークローンを含むcDNAライブラリーを作製することができた。次に、CPをベイトとして、この200万クローンをスクリーニングしたところ、CPと相互作用をしていると思われる候補クローンが3種類得られた。一般的に、Yeast Two-Hybrid Systemを利用したスクリーニングでは、これら候補クローンが"擬陽性"ではないことを他の評価系を用いて証明することが必要である。そのため、得られた候補クローン断片をpGEX-2TKベクター(Amersham Pharmacia Biotech)に繋いでGST-宿主タンパク質融合タンパク質を作製し、in vitroにおいてその融合タンパク質とCPとの相互作用を確認しているところである。

魚類細胞表面のレセプターと相互作用するのは魚類ノダウイルス粒子の最外層を構成する外被タンパク質(CP)と考えられることから、そのCPと相互作用を示す魚類培養細胞(E-11)タンパク質をYeast Two-Hybrid Systemを利用してスクリーニングした。その結果、3種のレセプター候補タンパク質(CPIP5,CPIP41およびCPIP320)が得られた。これらレセプター候補のホモログ検索を全てのGenBankデータを対象に行ったところ、3種全てが生体防御に関与するタンパク質であることが判明した。この結果からベータノダウイルスCPは、これらレセプター候補タンパク質と結合することでE-11細胞のウイルス感染防御機構を抑制することが予想され、既報のレセプターの特徴とは異なっていた。一方、Yeast Two-Hybrid Systemを用いた結合実験の結果、3種のタンパク質は全てのタイプの魚類ノダウイルスのCPと結合することが判明し、魚類ノダウイルスが共通して利用する重要因子であると示唆される。また、CPIP5の細胞内局在性を確認したところ、E-11細胞の核に存在することが判明した。CPも同様にE-11細胞の核に局在したことから、CPIP5およびCPは細胞の核内で相互作用し、その役割を果たすことが示唆される。これら結果から、3種のレセプター候補は魚類ノダウイルスの感染増殖に重要てあることが示唆されたが、既知のウイルスレセプターとは異なる特徴を示すことから、今後ウイルスレセプターか否かのさらなる確認が必要である。
途上国NGOのトランスナショナル化に関する研究―国際発展モデルの比較分析

本研究は、NGO世界における構造転換をテーマとし、フィリピンの開発NGOである「ガワッド・カリンガ」(以下、GK)を事例にとって、多国展開する途上国NGOの事業戦略を分析した。独自のグローバルなリソース調達のネットワークを築きあげ、フランチャイズ制をとりながら活動拠点の拡大を図るGKの開発モデルは、自立性の確保を目指す途上国のNGOのロールモデルであり、オルタナティブな国際NGOのあり方を示唆している。本研究の目的は、フィリピンの開発NGOであるガワッド・カリンガ(以下、GK)の海外展開を事例にとって、途上国NGOのグローバルな活動の拡がり(トランスナショナル化=多国展開)を分析し、欧米のNGOを中心として形成されてきた市民社会レジームを再検討することである。研究初年度の今年は、二つの大きなフィールド・ワークを基にして、GKのグローバルな活動展開の現状を把握することと、その活動を支えるネットワークを精緻化することに努めた。第1の調査では、シンガポールで開催されたGKの世界会議に出席し、海外事業に関するセッションへの参加や、国外オフィスのスタッフに対する聞き取りなどによって、トランスナショナル化の方向性や今後の展望についての知識を深めた。第2の調査は、マニラの本部でインタビューを行い(先進国支部の担当スタッフや、国外オフィスを立ち上げた専門家たち、リソース調達の部署など)、海外事業の実施にかかるネットワーキングの分析を進めた。それらのフィールド・ワークから見えてきたことは、GKが国内外の協力者や支援者を網羅するチャネルを作り上げていることであり、その根幹には、以下にあげる2つの要点を指摘できる。第1の要点は、行政機関とのダイレクトかつ強固なネットワークである。GKは行政機関のニーズに沿った連携の構築に成功し、プログラム規模の拡大に成功している。第2点目は、ファンド・レイジングの拠点を国外にも設立することによって、活動資金などを直接調達していることである。興味深い点は、海外で働くフィリピン人の組織化を活かして拠点づくりを進め、グローバルな支援ネットワークを強化していることである。このようなGKの動きは、途上国のNGOがみずからリソースを獲得するメカニズムを築き上げ、活動のトランスナショナル化に取り組むという、オルタナティブな国際NGOのあり方を示しているといえよう。二年目にあたる本年度は、調査対象であるフィリピンのNGO「Gawad Kalinga」(以下、GK)の海外展開に支えるリソース調達メカニズムの考察を深化させ、そのうえで実際の活動にかかる国外事業モデルの分析を試みた。具体的には、リソース調達の一大拠点であるGKシンガポールと、プロジェクト実施地であるGKインドネシアに焦点に絞って現地調査を行った。本年度の研究から得られた知見は、以下の二点に集約される。一点目は、プロジェクト・ベースの補助金供与からの脱却である。海外政府によるNGO支援は、特定の事業に適用されるのが主流であるが、GKはシンガポール政府の国際的な人材派遣制度を活用して、活動全般への援助を獲得している。さらに注目すべきは、こういった制度を足掛かりとして、GKはボランティア動員の拡大にも成功している点である。つまり、NGOのリソース調達戦略を当該政府の人材育成と社会貢献活動に結び付けることで、両者の目的を満たすwin-winの関係が築かれることとなり、NGOと政府との継続的な協働の仕組みが形作られている。二点目は、多極型の国外事業モデルの体系化である。従来の国際NGOは、意思決定や資源配分の際に本部機構を経由するのが一般的であるが、GKの海外拠点はその多くが独立採算性であり、本部を介さない拠点同士の連携が促進されている。例えば、GKシンガポールで動員されたリソースは、独自の協力体制によりGKインドネシアの活動に直接投下されている。こういった海外拠点間のマルチなパートナーシップの形成は、ローカルな主体を開拓し、そのエンパワーメントを進めるための有効な方法論であるだろう。以上のようなGKの取り組みは、途上国のNGOが自立性を築きながら海外展開を実現させていく一つのロール・モデルであり、多国籍化するNGOの今後のあり方を示唆しているだろう。24年度が最終年度であるため、記入しない。
ラット肝臓における亜鉛・カドミウム、銅の識別的取り込み機構に関する組織化学的研究

生体のもっている重金属種の識別機構を明らかにする目的で、実験動物を使って亜鉛、カドミウム、銅を血管内に注入し、これらの金属について数分間から数時間の間の血液と肝における生化学的動態と組織化学的局在を調べた。ラット(一群5匹)に金属塩水溶液を注入(iv0.8mg metal/kg)して屠殺し、肝と血液を取り出して発光分光法で金属を分析した。銅の組織化学には^<14>Cで標識したp-ジメチルアミノベンチリデンロダニン(ロダニン)を新たに合成して銅の局在を調べる方法を検討した。1)血漿中の金属濃度(単独投与、μg/ml):カドミウムの血漿から消失速度は銅や亜鉛に比べて極めて早く30分後にはほとんどゼロになるのに対して銅や亜鉛は3-4時間後に血漿から消失する。2)血漿中の金属濃度(混合投与):単独投与の場合とほとんど同じ様な傾向を示す。3)肝の金属濃度(単独投与、μg/g):肝へのカドミウムの取り込みは早く、30分後に最高濃度に達し、その後少しずつ傾向を示す。亜鉛は注入直後にいったん高い濃度を示すが一時間後には減少し、2時間経過以降少しずつ増大傾向を示す。同様に銅も2時間後から少しずつ増大傾向を示す。4)肝の金属濃度(混合投与):単独投与の場合とほとんど同じ様な傾向を示す。これらの結果をまとめるとカドミウム(非必須金属)は血液中から肝細胞にすばやく取り込まれるが、なかなか肝細胞の外には出ていかない。これに対して亜鉛や銅(必須金属)も肝細胞に取り込まれるが、肝の細胞膜を比較的自由に出入りし、メタロチオネインが誘導されるとメタロチオネインと結合して肝細胞内に固定される。これらの結果は金属の識別機構が肝細胞に存在していることを強く示唆していると思われる。ロダニンを用いるオ-トラジオグラフイはエタノ-ルによる除染が効果的であり、銅の局在を調べる方法として実用化の見通しが得られた。
水晶体培養細胞中のD-アミノ酸含有タンパク質及びストレス誘導タンパク質の解析

目的:申請者らは最近、水晶体培養細胞NN1003Aの産生するタンパク質中にD-β-アスパラギン酸(D-β-Asp)が存在することを発見した。これまでに種々の代謝の緩慢な老化組織(水晶体、脳、皮膚、歯など)ではD-β-Aspが見いだされているが、分裂の盛んに行われている培養細胞中でのD-β-Aspを含むタンパク質の報告は全くない。本研究ではこれらのタンパク質を同定することを目的とした。方法と結果:水晶体培養細胞NN1003Aを大量に培養し、タンパク質画分を抽出し、2次元電気泳動にかけ、以前我々の調製したD-β-Asp含有ペプチド特異抗体を用いてwestern blottingを行った。その結果、水晶体培養細胞NN1003A中に複数のD-β-Asp含有タンパク質が発現していることが明らかとなった。これらのタンパク質をゲル内酵素処理し、質量分析、タンパク質データベース解析によって同定した。その結果、Calponin H2,ラミン、エノラーゼ、αB-クリスタリンなど10種類のD-β-Asp含有タンパク質が同定された。本研究により微量のD-β-Asp含有タンパク質を同定する手法が確立した。従来の研究で、我々はタンパク質中でのD-β-Asp生成は酵素に依存せず、Asp残基が5員環イミドを形成し、これを介してラセミ化、異性化をするというメカニズムを明らかにした。本反応はAsp残基がイミド形成をしやすいか、しにくいかが、driving forceとなっている。Asp残基のイミド形成はAspの隣接残基がアラニン、グリシン、セリンのような立体障害の小さいアミノ酸の場合は起こりやすいので、この様なアミノ酸残基が隣に位置しているときはラセミ化、異性化が生じやすい環境といえる。本研究で新たに見出した上記のD-β-Asp含有タンパク質のどの残基のAspが反転異性化しているか、周辺の構造はどのようなものなのかを追跡することが重要と考えられた。目的:申請者らは最近、水晶体培養細胞の産生するタンパク質中にD-β-アスパラギン酸(D-β-Asp)が存在することを発見した。本研究ではこのタンパク質を同定し、その生物化学的性質を研究することを目的とした。その結果、水晶体培養細胞NN1003A中に分子量50k DaのD-β-Asp含有タンパク質が発現していることが明らかとなった。現在、本タンパク質のゲル内酵素処理を行い、質量分析計によって、同定中である。そのような意味でD-β-Asp含有タンパク質の一次配列の決定は重要である。次年度は本D-β-Asp含有タンパク質の同定とラセミ化機構の解析を行う予定である。【目的】申請者らは最近、水晶体培養細胞の産生する50kDaのタンパク質中にD-β-アスパラギン酸(D-β-Asp)が存在することを発見した。本研究ではこのタンパク質を同定することを目的とした。【方法】【結果と考察】NN1003A中のD-β-Asp含有タンパク質はalpha B-crystallin, lamin, tau-crystallinと相同性のあるenolase,など、複数存在することが明らかとなった。従来の研究で、我々はタンパク質中でのD-β-Asp生成はAsp残基が5員環イミドを形成し、これを介してラセミ化、異性化をするというメカニズムを明らかにした。次年度は今回同定されたタンパク質中でAspがD-β-化している部位を決定する予定である。

これまでに種々の代謝の緩慢な老化組織(水晶体、脳、皮膚、歯など)ではD-β-Aspが見いだされているが、分裂の盛んに行われている培養細胞中でのD-β-Aspを含むタンパク質の報告は全くない。本研究ではこれらのタンパク質を同定することを目的とした。方法と結果:水晶体培養細胞NN1003Aを大量に培養し、タンパク質画分を抽出し、2次元電気泳動にかけ、以前我々の調製したD-β-Asp含有ペプチド特異抗体を用いてwestern blottingを行った。その結果、水晶体培養細胞NN1003A中に複数のD-β-Asp含有タンパク質が発現していることが明らかとなった。これらのタンパク質をゲル内酵素処理し、質量分析、タンパク質データベース解析によって同定した。その結果、Calponin H2,ラミン、エノラーゼ、αB-クリスタリンなど10種類のD-β-Asp含有タンパク質が同定された。本研究により微量のD-β-Asp含有タンパク質を同定する手法が確立した。従来の研究で、我々はタンパク質中でのD-β-Asp生成は酵素に依存せず、Asp残基が5員環イミドを形成し、これを介してラセミ化、異性化をするというメカニズムを明らかにした。本反応はAsp残基がイミド形成をしやすいか、しにくいかが、driving forceとなっている。Asp残基のイミド形成はAspの隣接残基がアラニン、グリシン、セリンのような立体障害の小さいアミノ酸の場合は起こりやすいので、この様なアミノ酸残基が隣に位置しているときはラセミ化、異性化が生じやすい環境といえる。本研究で新たに見出した上記のD-β-Asp含有タンパク質のどの残基のAspが反転異性化しているか、周辺の構造はどのようなものなのかを追跡することが重要と考えられた。