hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
iPS細胞樹立過程には組織ごとの特異的ルートがあるのか

iPS細胞の樹立過程が発生の逆戻り過程、すなわち「終末分化細胞→組織幹細胞/前駆細胞→多能性幹細胞」を辿っているかは明らかにされていない。本研究では、対象組織を毛包細胞として、毛包細胞からのiPS細胞樹立過程を解析した。iPS細胞樹立過程において、一部毛包幹細胞マーカー(Lgr5)を発現する細胞集団の存在を認めた。しかし、これらは本来の毛包幹細胞とは性質が異なっていた。一方で、Lgr5を一過性に発現する細胞集団は、その後効率よくiPS細胞へと初期化されることを見出した。初期化4因子(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc)を遺伝子導入することで、分化した体細胞から人工多能性幹細胞(iPS細胞)の樹立が可能となった。しかし、初期化経路については未だ不明な点が多く、特に組織特異性については検討がなされていない。本課題では、組織体性幹細胞ステージに焦点をおくことで、iPS細胞の樹立過程に組織ごとの特異性や指向性があるかを明らかにし、iPS細胞樹立メカニズムを解明することを目的としている。対象組織は扱いやすさの点から毛包細胞とし、組織幹細胞のマーカーとしてLgr5を用いた。Lgr5の発現をLacZ発現によってlineage tracingできるマウスから毛包細胞を分離し、Lgr5陽性ステージを通過する細胞の割合を確認したところ、Lgr5陽性ステージを通過する細胞が存在した。体細胞初期化に組織特異性があることが示唆される。しかし、大半は非特異的な経路を辿っており、特異性を有した細胞の割合は非常に低く、対処法を現在検討中である。また、毛包細胞のうち、Lgr5陽性、Lgr5陰性、毛包細胞全体、の3群をフローサイトメーターによって分離し、Lgr5の発現の有無によるiPS細胞の樹立効率を比較したところ、初期化のマーカーのひとつであるアルカリフォスファターゼ染色陽性の割合がLgr5陰性細胞において有意に高かった。Lgr5の発現の有無が初期化効率に関連している可能性が示唆され、さらに検討中である。我々哺乳類は「多能性幹細胞→前駆細胞→終末分化細胞」という各組織特異的な発生過程を辿って受精卵から各組織へと成熟していく。これに対してiPS細胞作製の技術は、分化細胞から多能性幹細胞への初期化を可能にした。しかし、このiPS細胞樹立における初期化の途中過程が、「終末分化細胞→前駆細胞→多能性幹細胞」という発生の逆戻り経路を辿るかは明らかにされていない。そこで本研究では、iPS細胞樹立過程が発生の逆戻り経路、すなわち各組織特異的な指向性を有しながら初期化されていくかを明らかにするため、iPS細胞樹立過程における組織体性幹細胞/前駆細胞ステージ通過の有無を検討した。対象組織として、汎用性の高さから毛包細胞を用いた。レポーターマウスを用いた解析により、毛包細胞からのiPS細胞樹立過程において、割合は非常に少ないものの毛包幹細胞/前駆細胞マーカー発現ステージを通過する細胞の存在が認められた。しかし、初期化過程で出現した毛包幹細胞/前駆細胞マーカー陽性の細胞は、naiveな毛包幹細胞/前駆細胞とは性質が異なっており、組織ごとの特異性や指向性の有無については明らかにできなかった。一方で、iPS細胞樹立過程において一過性に組織体性幹細胞/前駆細胞マーカーを発現した細胞は、その後非常に効率よく初期化されることが明らかとなった。本結果は、効率的なiPS細胞樹立法開発に貢献できると考えている。現在、ヒトiPS細胞樹立への応用を目指し、ヒト細胞を用いた検討を行っている。研究成果を英文雑誌に投稿したが、追加実験が必要となった。そのため、予定していた2年で本課題を終了することができず、1年延長申請を行っている。以上を踏まえ、「やや遅れている」とした。我々哺乳類は「多能性幹細胞→組織幹細胞/前駆細胞→終末分化細胞」という組織特異的な発生過程を辿って受精卵から各組織へと成熟していく。これに対してiPS細胞作製技術は、分化細胞から多能性幹細胞への初期化を可能にした。しかし、このiPS細胞樹立過程が「終末分化細胞→組織幹細胞/前駆細胞→多能性幹細胞」という発生の逆戻り経路を辿るかは明らかにされていない。そこで本研究では、iPS細胞樹立過程における組織体性幹細胞/前駆細胞ステージの通過の有無を検討した。対象組織として、汎用性の高さから毛包細胞を選択し、毛包幹細胞マーカーとしてはLgr5を選択した。Lgr5レポーターマウスを用いた解析により、毛包細胞からのiPS細胞樹立過程において、割合は非常に少ないものの、Lgr5陽性となる細胞集団の存在が認められた。しかし、これら細胞はnativeな毛包幹細胞とは性質が異なっていた。一方で、Lgr5を一過性に発現する細胞集団はその後効率よくiPS細胞へと初期化されることを見出した。Lgr5陽性細胞は毛包細胞だけではなく、マウス胎児性線維芽細胞を用いた初期化過程でも一過性に出現し、Lgr5陽性ステージを通過しなかった細胞と比較すると、Lgr5陽性ステージを通過した細胞集団は、高効率でiPS細胞へと初期化されることが明らかとなった。最終年度ではヒト細胞を用いて同様の解析を実施し、ヒトにおいても、Lgr5陽性ステージを通過した細胞は、通過しなかった細胞と比べてその後効率よくiPS細胞へと初期化されることを見出した。

以上から、Lgr5発現とiPS細胞樹立過程の関連性を示唆する結果を得ることに成功し、論文として報告した。本成果はヒトiPS細胞の高効率な樹立法開発にも寄与することが期待される。iPS細胞の樹立過程が発生の逆戻り過程、すなわち「終末分化細胞→組織幹細胞/前駆細胞→多能性幹細胞」を辿っているかは明らかにされていない。本研究では、対象組織を毛包細胞として、毛包細胞からのiPS細胞樹立過程を解析した。iPS細胞樹立過程において、一部毛包幹細胞マーカー(Lgr5)を発現する細胞集団の存在を認めた。しかし、これらは本来の毛包幹細胞とは性質が異なっていた。一方で、Lgr5を一過性に発現する細胞集団は、その後効率よくiPS細胞へと初期化されることを見出した。Lgr5を毛包細胞の組織幹細胞のマーカーとして初期化経路の組織特異性を検討しており、一部特異性を見出せた。しかし、その割合は非常に少なく、大半が非特異的なルートであることが判明した。そのため、特異性についてのさらなる検討が困難をきわめており、本来の達成度には到達できていない。しかし、本課題を遂行していく中で、Lgr5発現と初期化経路について新たな知見が得られてきている。以上を踏まえ、「やや遅れている」とした。本研究では当初マウスでのみの検討としていたが、より実用的な臨床応用を念頭において、現在ヒト細胞での検討も追加している。幹細胞学これまでに新生児毛包細胞を用いて、体細胞初期化経路に組織特異的なルートの存在があることが認められた。しかし、その割合は非常に少なく、その後の詳細な検討が困難な状況になっている。これを打破するため、生後の毛包細胞ではなく、より未分化な細胞、胎児由来細胞を用いることを検討している。本課題で得た知見を英文雑誌に投稿したが、採択条件として追加実験が必要となった。平成27年度中に再投稿・掲載までを完了することが不可能であったため、1年の事業延長申請をおこなった。そのため、次年度使用額が生じている。年度途中で岐阜大学から名古屋大学への異動があり研究が中断した事と、体細胞初期化経路に組織特異的なルートの存在を見出したものの、その割合が非常に少なく、その後の検討が困難で対処法に時間を要しているため。追加実験および英文校正、雑誌投稿料・掲載料に使用予定である。達成度がやや遅れている分、研究費使用計画もやや遅れているが、平成26年度の購入予定であった抗体等を平成27年度に購入する予定である。
心拍変動を用いた研修医の自律神経機能・ストレス評価と研修プログラム適正化への応用

研修開始2か月目に心拍変動解析を実施した研修医は、研修開始10か月で実施した研修医に比し、副交感神経指標HF成分が高く交感神経指標LF/HFが低い傾向がみられたが、経験が浅く仕事量や担当患者の重症度がコントロールされていたためと推測された。診療科別では、内科系・外科系・救急日勤時に有意な差は認めなかったが、救急夜勤中の研修医において夜間の副交感神経指標が著明に抑制されている例を認めた。当院研修医における蓄積的疲労徴候インデックス(CSF-I)の結果は概ね良好だが、救急では慢性疲労の自覚が高い傾向がみられた。救急科研修中の研修医に関しては特に十分な休養がとれるよう配慮する必要があると考えられる。初期臨床研修医は様々な身体的・心理的ストレスを受けやすい。本研究では研修医を対象とし、疲労、精神的ストレス、睡眠不足が自律神経機能に及ぼす影響を心拍変動解析を用いて検討し、その結果を研修医のヘルスケアや研修プログラムの適正化に応用することを目的として計画、実施した。平成25年度の研究実績概要は以下のとおり。1.1年次臨床研修医14名に対し、24時間Holter心電図を記録し、時間領域指標としてRR50・SDNN、周波数領域指標としてTF・LF・HF・LF/HF・CVHF・CVLF/CVHFを用いた心拍変動解析を行い、同時期に蓄積的疲労徴候インデックス(CSF-I)を用いた疲労度調査を施行した。2.全体では副交感神経機能の指標とされるHF成分の平均は411.9msec2、交感神経機能指標とされるLF/HFの平均は2.49であり、著明な異常はなかった。3.一部に副交感神経指標であるHF成分やRR50が明らかに低下した例を認めた。4.夜間救急研修中の研修医は本来副交感優位である夜間に交感神経の亢進を認める。5.CSF-1の平均訴え数も基準値の範囲内であったが、一般的疲労ならびに慢性疲労徴候の2項目で訴え数が多い傾向を認めた。5.慢性疲労徴候と心拍変動指標との関係では訴え数が多い研修医ではHF成分が低くLF/HFが高い傾向を認めた。また、救急研修中の研修医とその他の研修医の比較では、一般的身体疲労には明らかな差はないが、慢性疲労徴候は救急ローテート中の研修医よりも内科ローテート中の研修医で高い傾向にあり、いわゆるOn-Offの違いが関連している可能性が示唆された。以上のH25年度実績より、臨床研修医において疲労と自律神経機能の間には関連性が示唆され、研修医の健康管理、ならびに臨床研修プログラムの再評価への応用について、研修負荷の程度を評価し適正化をはかるのに有用と考えられる。初期臨床研修医は様々な身体的・心理的ストレスを受けやすいと考えられるため、本研究では研修医を対象に、疲労、精神的ストレス、睡眠不足が自律神経機能に及ぼす影響をホルター心電図を用いた心拍変動解析により検討し、その結果を研修医のヘルスケアや研修プログラムの適正化に応用することを目的として行っている研究である。平成25年度に被験者となった研修医のうち2年次研修中の心拍変動解析を施行した8名における24時間平均値は副交感神経成分HF639.1msec2、交感神経指標LF/HF2.70であった。25年度夜間救急研修中に明らかな副交感神経機能抑制と交感神経機能亢進を示した研修医2名については、両名とも2年次の勤務時間帯中は1年次と同様HF低値、LF/HF高値を認めたが、1名は夜間休息中にはHF上昇、LF/HF低下を認め、この研修医については夜間救急研修中も短時間の仮眠で副交感指標の改善を認めており短期的な研修時間の適切な調整で自律神経機能は良好に保つことができると考えられる。もう1名は2年次も終日副交感神経機能の抑制が認められており、夜間救急研修中も仮眠によるHFの改善が乏しかった。この研修医は他に比し、蓄積的疲労徴候インデックス(CSFーI)における身体疲労、慢性疲労徴候のチェック数が多かった。また2年次のCSFーIのスコアが1年次に比し有意に上昇した研修医が1名あり、この研修医においては2年次の交感神経指標LF/HFが上昇していた。この研修医からはローテート中の病棟患者数に対し研修医の数が少ないので多忙であるとのヒアリングを得ており、各診療科をローテートする研修医数の検討が必要であると考えられる。平成26年度1年次研修医においても同様に心拍変動解析を施行したがH25年度1年次研修医と有意な差は認めなかった。彼らについても同様に本年度2年次における心拍変動解析を行う予定である。本研究では研修医を対象とし、疲労、精神的ストレス、睡眠不足が自律神経機能に及ぼす影響を心拍変動解析を用いて検討し、その結果を研修医のヘルスケアや研修プログラムの適正化に応用することを目的として計画、実施する研究である。平成27年度の研究実績概要は以下のとおり。1.平成26年度に心拍変動解析を実施した平成26年度1年次研修医9名に対し、同様に24時間Holter心電図計を用いて心電図を記録し、時間領域指標としてRR50・SDNN、周波数領域指標としてTF・LF・HF・LF/HF・CVHF・CVLF/CVHFを用いた心拍変動解析を行い、同時期に蓄積的疲労徴候インデックス(CSF-I)を用いた疲労度調査を施行した。

2.平成27年度1年次臨床研修医13名に対し、6月と11月の2回、24時間Holter心電図計を用いて心電図を記録し、時間領域指標としてRR50・SDNN、周波数領域指標としてTF・LF・HF・LF/HF・CVHF・CVLF/CVHFを用いた心拍変動解析を行い、同時期に蓄積的疲労徴候インデックス(CSF-I)を用いた疲労度調査を施行した。平成25年度、平成26年度の1年次研修医には差は認めなかったが、平成27年度1年次研修医の6月期調査は25年度、27年度に比し相対的に副交感神経優位な状態であり、研修開始早期は患者数や重症度が減免されていたり、同時に研修中の2年次研修医の数の差が負荷の里なっていることなどが推測された。また救急ローテート中の研修医における「慢性疲労」の平均訴え数が3.22と高かったがメンタル面での項目の結果は良好であった。以上の結果より、心拍変動による自律神経機能と蓄積的疲労度より研修負荷の程度を評価し研修医のヘルスケアや研修プログラム適正化をはかるのに有用と考え、更に結果を分析中である。研究の実施はおおむね良好に進行したが、結果のまとめや発表、論文作成等がやや遅れている。平成2527年度の1年次研修医に対し心拍変動解析を行った結果を比較検討した。副交感神経機能の指標とされるHF成分が1年次研修後半に調査を行った平成25年度研修医と平成26年度研修医ではそれぞれ539.6msec2、539.1msec2であったのに対し、平成27年度研修医の研修開始後2か月目調査でのHFの平均は1104.3msec2と高い傾向にあった。他方、交感神経指標とされるLF/HFの値は25年度2.44、26年度2.16に対し、27年度研修医は1.58と低い傾向がみられた。平成27年度研修医で副交感神経指標が高く交感神経指標が低かった理由としては、医師としての経験がまだ浅く担当する仕事量や患者の重症度がコントロールされているからではないかと推測された。蓄積的疲労について平成2527年度3年間の1年次研修医にCSF-I調査票による調査を行った結果では、8区分中「気力の減退」「一般的疲労感」「身体的不調」「イライラの状態」「労働意欲の低下」「不安感」「抑うつ感」の7つの区分では女子の平均訴え数が男子よりもやや高い傾向にあったが、越河らの先行研究による医療職の平均訴え数よりは低値であった。「慢性疲労」のみが男子2.88、女子2,72と男子の方がやや平均訴え数が高かった。診療科別では、救急ローテート中の研修医で「慢性疲労」の平均訴え数が3.22と高かった。内科系と外科系の比較では内科系のほうが「慢性疲労」がやや高く、「不安感」が外科系でやや高い傾向が見られたが、いずれも先行研究での医療者の平均よりは低値であった。当院1年次研修医のCSF-Iの結果は概ね良好であったが、救急については慢性疲労の自覚がやや高く、勤務後の休養をしっかりとらせるなど配慮が必要と考える。以上、成果は研修医のヘルスケアやマネージメント上有意義なデータと考えられ、学会にて報告を行った。研修開始2か月目に心拍変動解析を実施した研修医は、研修開始10か月で実施した研修医に比し、副交感神経指標HF成分が高く交感神経指標LF/HFが低い傾向がみられたが、経験が浅く仕事量や担当患者の重症度がコントロールされていたためと推測された。診療科別では、内科系・外科系・救急日勤時に有意な差は認めなかったが、救急夜勤中の研修医において夜間の副交感神経指標が著明に抑制されている例を認めた。
１９世紀英米児童文学および現代日本の児童文学からの職業および労働観形成の研究

本研究において、ニートやフリーターあるいはそのような状況に導く若者の早期離職など、我が国の若者が抱える雇用における問題を解決するために、現代までの経済活動が形成されてきた19世紀以降の時代における職業観を物語の中から検討し、その上で学校教育の中で仕事に対する効果的な職業意識の形成を促す教育プログラムのあり方を検討した。その成果として、主体的に学ぶ教育方法の開発をおこない、それを講義の中で実践し効果を確認し、主体的な学習のスキームとして提案した。また、大学生への就職に関する意識調査を実施し、中国の大学生と比較することで我が国の大学生の特性を明らかにし、若者への職業人教育必要性を確認した。平成25年度の研究は、大きく2つの方向で行った。一つは初年度実施した英国での調査を踏まえて、初年度には不十分であった部分や、調査に於いて必要性を確認した新たな課題を設定し、引き続き英国の職業観に関わる調査を実施した。特に当時から現代までの間、今日まで存続する職業や仕事などについて、社会全体が職業や仕事をどのようにとらえきたのか、そして捉えているのかという視点で産業革命や英国の商業の中心地であったバーミンガム、マンチェスター、リバプールを起点として、博物館、図書館および企業等に対して一昨年度の予備調査の成果を踏まえて調査を実施した。職業教育の教育方法の手法を探るために、既存の一方的な座学を中心として行われる講義方式ではなく、アクティブラーニングの手法を取り入れた学生参加型の双方向講義の新たな取り組みの実践を講義のなかで行い教育の手法について検討し、その結果の一部を論文としてまとめ公表した。講義ではテーマに対する個々人の意見をグループの意見として整理させること、また問に対する回答の中で実験を行うことなどの手法を取り入れることで、自らの認識や意識というのもを再考察させるなどの、試行的講義を実施したうえでの、レポートによって知識の定着度などを測る工夫を行い、教育システムの開発のためのデータ収集を実施した。また、幸福度という視点で様々な指標について検討し整理したものを講義したのちに、個々の受講生に対して意見を聴取するなどを通じて、教育法法の改善をおこなった。また、大学生の就職意識の調査を実施した。さらに、産業とそれに関わる職業に関する研究についても成果の一部を、学会において報告を行っている。研究は3つの方向から実施した。一つは物語がどのように職業観等に影響を与えるかについての既存研究に対する文献研究であり、これは経済学、経営学、また文学、教育学等からの様々な研究についての調査、研究を実施した。特に、親の職業の影響、また19世紀当時の職業のありかたや女性の職業問題などについて当時の社会情勢などについて研究をおこなった。同時に物語り研究の専門家から、文献の取り扱いなどの指導を受けると共に、資料について教授を受け、われわれの不足する専門的な知識を補っており、今後もそのような研究上の助言も求めていく。さらに、19世紀の英国で出版された子どもにとっての職業読本によって、当時の社会が共有する職業について文献から整理するなどの作業を行うことで基礎的な知識について基盤形成の作業を行った。それに加えて英国の産業博物館および図書館での予備的調査を平行することで、当時の子どもにとっての職業観についての基本的なあり方を検討した。これらの調査はわが国においての受用過程を明らかにするための基礎的データとして今後用いられるものである。本研究はニートやフリーター、あるいは増加する新卒採用後の離職など若者を取り巻く雇用問題に対して、教育の過程において就業へのスムーズな移行のために必要とされる教育がどのようもなものであり、また必要とされる職業観や仕事に対する意識を涵養するために必要な教育プログラムをどのように作成すべきかを目的とした研究である。そのために、前年度までに若者の成長の過程において形成される職業観を、現代の職業の基本的な枠組みを形成してきたと考えられる英国産業革命の中でこども達にどのような職業観が形成されたのかを、19世紀の英米児童文学から読み取ることで、社会が有する職業への考え方を検討した。これらの文学は明治以降日本においても読み続けられているものである。そのような調査踏まえ、今年度は我が国の大学生の職業意識あるいは就職意識について調査研究すると共に、中国の大学生の意識の調査によって、その相違を明らかにすることで必要とされる教育について研究した。また、従来の講義型の教育では職業や仕事に対する考え方などについて自分自身で考えるためには限界があることから、アクティブ・ラーニングの手法を用いた教育プログラムの開発を行い、教育方法の改善についての研究とその実践を行ない、その一部を研究成果として公表した。また、アクティブ・ラーニングを講義で行うと共にその成果報告として、大学教育イノベーションセンター第45号(平成26年6月23日)全学モジュール・ニュース-アクティブラーニングの充実に向けて-5「現代経済と企業活動」報告者:藤田渉および「大学教育イノベーションセンター第57号(平成26年12月22日)

同5「現代経済と企業活動」報告者:藤田渉において、教育法の開発およびその実施方法について報告を行うなどを通じてプログラムの検討を行った。労働経済学今年度は、教育手法について担当する2科目の講義時間を用いて様々な取り組みを行い職業教育のための知見を蓄積することができた。また、その成果の一部を論文として発表することで取り組みの成果と考えられる。また、職業と密接に関連する現代の産業の構造変化などについての研究については一部を学会した。他方、英国調査の資料整理は進行しているもののまだ整理中である。平成24年度は英国の基19世紀における子どもにとっての職業に関する文献を専門家等の助言を得るなどして調査することによって、本研究にとって極めて基本的なものとなると思われる文献を入手することができており、その点で重要な進展があったものと判断している。また、親の職業から子どもの職業観に関わる既存研究などからも、職業観形成の理論的研究において多くの仮説をうることができていおり、それらの点からも研究の初年度の進行としては期待される水準にある。また、英国における調査によって、新たな視点をうることやさらなる文献等の所在について示唆を受けることができており、次年度につながるものとなっている。他方、わが国における英国児童文学についての調査は必ずしも十分に調査を実施できておらず、また文献収集、調査においても不十分なものとなっていおり、それ次年度の重要な課題となるものと考えている。ただし、国内の調査であり、平成24年度における実績を踏まえてるものであり、ある程度集中的な取り組みで挽回できるものと考えている。今後はこれまでの調査および成果を踏まえ、さらに教育法の改善を講義等を用いて実施する予定である。また、若者の就職意識調査の結果とこれまでの研究を結びつけることで、研究の進展をはかる予定である。若者の職業意識の調査を踏まえ、教育プログラムのあり方、また若者の雇用政策における教育のあり方について検討し整理することを考えている。平成25年度について、24年度に実施した調査を踏まえて、再度英国での調査を実施する予定である。24年度に実施した産業博物館等での調査は時間的制約も多く、代表的な施設に限定せざる得ない状況にあったと共に、まだ文献調査も不十分な段階であり、さらなる調査の必要性を感じている。また、実際にどのような階層が児童文学の受容者であったのかという読書層の問題につて、新たな視点が課題となっており、その点についても十分な検討を必要としておりその面の研究を追加的に行いたい。この点は識字率の問題と関連しており、児童文学がどのような階層に受け入れられてきたのかは重要なものとなる。これはわが国においても同様であり、既存研究からその点を明らかにしておく必要があるものと判断している。その上で今後の研究の中心は、文献調査と物語からの意識形成の過程についての理論の構築であり、物語が与える影響に関する経営学等における既存研究の成果を援用して、職業形成について他分野の成果も利用しながら作業を進めていく予定である。
磁性体/半導体ヘテロ構造におけるスピン伝導機構の解明と新原理スピン検出技術の創出

平成24年度の後半より開始した垂直磁気異方性を持つ強磁性体とGaAs界面におけるスピンフィルター効果の研究を行った。具体的には、GaAs基板上に強磁性体のNiと非磁性体のCuで構成されるCu/Ni多層膜に着目し、垂直磁化強磁性薄膜/半導体ヘテロ界面における残留磁化状態でのスピンフィルター効果を調査することを目的とした。第1段階として、GaAs基板上にCu/Niの積層回数やCu/Niの膜厚比を適宜変化させた多層膜を作製し、主に磁気特性について評価を行った。第2段階として、第1段階で得られた結果を元に、Cu/Ni多層膜/n-GaAs(001)ヘテロ構造を作製し、円偏光スピン励起法によるスピンフィルター効果の検証を行った。しかし、Cu/Ni多層膜の膜厚は合計で60nmとこれまでの報告例に比べ非常に厚いため、電気的スピン検出の研究が困難であることから、本研究では、試料に微細加工を施してこの困難を回避した。その結果、室温かつ残留磁化状態において、界面バイアス電圧0.41Vにて円偏光依存光電流に特徴的なピーク構造が観察されたことから、正バイアスにおける垂直磁化膜のスピンフィルター効果が顕著となることが明らかとなった。さらに、界面バイアス電圧0.13Vにおける円偏光依存光電流の磁場依存性において、Cu/Niの垂直磁気異方性に起因した角型ヒステリシスループを観測することに成功している。一方で、Cu/Ni多層膜/GaAs QWヘテロ構造における電気的スピン注入においては、印加磁場に依存したスピン注入効率を得るには至らなかった。これは、今回測定された円偏光発光は、注入された電子と正孔による再結合発光よりもZeeman効果が支配的であったためであると考えられる。さらに、磁気光学Kerr効果を用いた磁性超薄膜/GaAsヘテロ構造の円偏光照射下における磁気特性およびスピン相関については、照射した円偏光度に依存したKerrシグナルを得ることに成功したものの、スピン相関を明確化するには至らなかった。(抄録なし)強磁性薄膜/半導体接合界面における電子スピン伝導プロセスを解明することを目的として、特に平成24年度は円偏光スピン励起法によるスピンフィルター効果についての調査を行った。平成24年度前半は、二元系強磁性合金FeGa薄膜とAlGaAs/GaAs量子井戸(QW)ヘテロ構造に対して、GaAsに円偏光を照射することで励起されるスピン偏極電子の接合界面におけるスピン依存光電流についてOblique Hanle効果の原理を用いて調査した。その結果、GaAsのバンドギャップに近いエネルギーを持つ円偏光をFeGa/AlGaAs/GaAsQW試料に照射したときのスピン依存光電流の符号が磁場の印加方向に依存して明瞭に変化することが明らかとなり、FeGa/AlGaAs接合界面においてスピンフィルター効果が発現していることが示された。さらに、このスピンフィルター効果の起源に関連して、照射光の円偏光度とスピン依存光電流の間の位相差に磁場依存性が存在し、この位相差がFeGa薄膜の磁化過程を反映したヒステリシス挙動を示すことを明らかにした。以上により、Oblique Hanle効果を利用することで低磁場において強磁性体/半導体量子井戸構造界面でスピンフィルター効果を検出することに成功した。また、Oblique Hanle効果を利用したスピン検出手法が有効であることが実証された。一方、平成24年度後半は、低磁場においてスピン注入を実現するために、残留磁化状態において垂直磁化を示す強磁性薄膜の成長条件の探索と評価、さらには電気的スピン注入とそれに伴う円偏光発光解析についての研究を行った。その結果、CuとNiから構成される多層膜において垂直磁気異方性が発現するNiおよびCuの膜厚、積層周期の最適条件が見出された。また、電気的スピン注入と円偏光発光解析の研究では、測定温度10K,印加磁場0.2Tにおいて、最大8%の注入電子のスピン偏極率を得ることに成功した。以上の結果より、垂直磁気異方性を有するCu/Ni多層膜はスピン注入源として有用であることを実証された。

さらに、界面バイアス電圧0.13Vにおける円偏光依存光電流の磁場依存性において、Cu/Niの垂直磁気異方性に起因した角型ヒステリシスループを観測することに成功している。一方で、Cu/Ni多層膜/GaAs QWヘテロ構造における電気的スピン注入においては、印加磁場に依存したスピン注入効率を得るには至らなかった。これは、今回測定された円偏光発光は、注入された電子と正孔による再結合発光よりもZeeman効果が支配的であったためであると考えられる。さらに、磁気光学Kerr効果を用いた磁性超薄膜/GaAsヘテロ構造の円偏光照射下における磁気特性およびスピン相関については、照射した円偏光度に依存したKerrシグナルを得ることに成功したものの、スピン相関を明確化するには至らなかった。計画当初に基づいて、多元系強磁性薄膜電極とAIGaAs/GaAs量子井戸構造との接合界面でのスピン伝導に関しての知見が得られ、おおむね順調に進展していると自己評価する。一方、垂直磁気異方性を有する磁性多層膜の作製条件の探索に時間を要したことと日本国内における液体ヘリウムの供給不足が影響して、スピン伝導のメカニズムの詳細についての調査が積み残された。上記で記した垂直磁気異方性を有する磁性多層膜とAIGaAs1GaAs量子井戸構造とのヘテロ構造化界面におけるスピンの伝導特性について詳細に評価することが重要である。そのため、積み残し課題について研究を最優先して進める。一方、次年度に予定している研究については、予定を若干前倒しして進めており、磁気特性評価における測定制度の向上と評価手法の改良を行うことで、計画通り進める予定である。(抄録なし)
細胞分化過程における核膜孔複合体構成因子の糖鎖修飾変化とその生理的意義の解明

本研究は、細胞の核膜上に存在する核膜孔複合体構成因子であるヌクレオポリンが、細胞分化の過程でどのように糖鎖修飾を受け、その機能が制御されているかを明らかにするとともに、ヌクレオポリンの糖鎖修飾が細胞分化にどのような影響を与えるかを解明する事を目的としている。ヌクレオポリンの多くは、そのセリン、スレオニン残基が0結合型N-アセチルグルコサミン(O-GlcNAc)転移酵素(OGT)により、O-GlcNAc付加する事が知られているが、その生理的意義はほとんど明らかになっていない。そこで、本研究ではまず、培養の容易なHeLa細胞を用いて、ヌクレオポリンのO-GlcNAc修飾が、細胞内核-細胞質間輸送にどのように影響しているかを調べた。まず、OGTをsiRNAによりノックダウンし、ヌクレオポリンのO-GlcNAc付加を減少させた細胞を作製した。核内輸送への影響を検討するために、さらにそれをジギトニン処理することによって、核膜をインタクトに保ちつつ、in vitroトランスポートアッセイを行った。その結果、O-GlcNAc付加が減少した細胞では、importinα/βによる核蛋白質の核内移行の効率が高くなる事が明らかになった。特に、O-GlcNAc付加が減少した細胞では、核内移行に必須であるはずのRan非存在下でも核蛋白質基質が核内に移行した。一方で、単純拡散で核内に移行できる小分子蛋白質であるGFPの核内移行効率は、O-GlcNAc付加が減少した細胞でも変化しなかった。今後、この系を利用しつつ、ヌクレオポリンの糖鎖修飾が、細胞分化にどのような影響を与えるかについての研究の進展が期待できる。本研究は、細胞の核膜上に存在する核膜孔複合体の構成因子であるヌクレオポリンが、細胞分化の過程でどのように糖鎖修飾を受け、その機能が制御されているかを明らかにするとともに、ヌクレオポリンの糖鎖修飾が細胞分化にどのような影響を与えるかを解明する事を目的としている。近年、核-細胞質問輸送因子の発現量のスイッチングが細胞分化に重要である事が明らかになった。また細胞分化に伴って、核膜孔複合体の形が変化する事、さらに細胞分化と核膜孔複合体因子であるヌクレオポリンの発現量変化との関わりも明らかになりつつあり、核-細胞質間輸送が細胞分化に密接に関わっている事が示唆されている。一方、ヌクレオポリンの多くはそのセリン、スレオニン残基が糖鎖修飾を受ける事が知られているが、その生理的意義に関しては、あまり明らかにされていない。ヌクレオポリンの糖鎖修飾の多くはO結合型β-N-アセチルグルコサミン(O-GlcNAc)による。そこで、本研究では本年度、細胞を分化させた際に、どのヌクレオポリンの糖鎖修飾が変化するかを明らかにする目的で、ES細胞を神経細胞に分化させ、O-glcNAcを認識するWGAレクチンアガロースを用いて解析した。その結果、核膜孔複合体の強度を維持するサブコンプレックスのコンポーネントであるヌクレオポリンの糖鎖修飾が減少する事を明らかにした。本研究によって、細胞を分化させた際、ヌクレオポリンの糖鎖修飾が変化する事が明らかになりつつある。今後、ヌクレオポリンの糖鎖修飾が、細胞分化にどのような影響を与えるのかについて、さらに解析を進めたい。
電解酸性機能水の創傷治癒の促進効果に関する研究

電解酸性機能水(FW)は、生体に有利な効果を持つことが知られているが、その詳細なメカニズムに不明な点が多い。口腔粘膜由来細胞を用いてFWの効果を検証した結果、IL-1aやbFGF、EMMPRINなどの分泌が誘導された。IL-1aは創傷治癒の促進効果を有している。また骨欠損モデルを用いた実験では、血管新生因子や骨の再生に関与するサイトカインの産生が増強されていた。これらの因子の発現を誘導させることにより創傷治癒が促進されることが示唆された。IL-1αの創傷治癒の促進効果について、IL-1αKO mouseの背部に人為的に作成した創傷に電解酸性機能水(functional water: FW)または生理食塩水および3%H2O2を塗布した後、創傷の面積を経時的に計測したところ、wild typeマウスではFW作用群で作用後1日目で約20%の創傷治癒促進が見られたが、IL-1αKO mouseでは、創傷治癒促進効果は認められなかった。このことより、FWにより誘導されるIL-1αは創傷治癒促進の主体的分子であることが示唆された。さらにIL-1αの効果を検証するためにwild typeマウスの皮膚に同様の創傷を作成し、マウスリコンビナントIL-1αを作用させた実験では、予想に反して創傷治癒促進効果が全く見られなかった。FWのどの成分がIL-1α産生に関与するのか、有効濃度、pH、酸化還元部位を段階的に変え、これらの3要素を様々に組み合わせたFWを100種類ほど作成し、IL-1α産生を指標にして検討を加えた。具体的には、HSC3細胞にこれらのFWを30秒作用させ、ELISAによりIL-1α濃度を測定した。その結果、有効塩素濃度は2050ppmの範囲、pHはより酸性領域で、また酸化還元電位は2,000mV程度の組み合わせで最も効率的なIL-1α産生を認めた。この3要素はすべてが上記要件を満たす必要があり、FWの作用は極めて微妙にコントロールされているものであることが示唆された。平成27年度の基礎的な研究によりFWの有効な成分を特定して、IL-1αの効率的な産生を認めたことを実験的に確認した。また創傷治癒促進についてIL-1αKO mouseでは、創傷治癒促進効果はみられず、FWにより誘導されるIL-1αは創傷治癒促進の主体的分子であることがわかり、おおむね実験計画通りであるため。電解酸性機能水(FW)の創傷治癒促進効果についてさらなるメカニズムを解明するため,Wを口腔上皮細胞(HSC-3, Ca9-22)に作用させたところIL-1α以外にもEMMPRINが増強することを見出した。IL-1αは代表的なalarminであることから, FWによって誘導、分泌されるEMMPRINもalarminの一種ではないかと考えられる。そこで, HSC-3とCa9-22にFWを作用させたところ,培養上清中にEMMPRINの有意な増加を確認した。また, FW群とcontrol群ではEMMPRIN遺伝子の発現に有意差はなかった。FW作用後1時間で培養上清中のEMMPRINが有意に増強し,細胞内溶液中のEMMPRINは有意に減少する一方,遺伝子レベルでは, FWはEMMRPIN発現に影響を及ぼさなかった。このことは,培養上清中のEMMPRIN発現増強は細胞内に含有されているEMMPRINがFWの作用により細胞外に排出される現象であり, IL-1αと同様であった。そこで、FW以外の非感染性刺激でHSC-3とCa9-22を刺激し, IL-1αおよびEMMPRINの分泌の変化を比較検討したところ, IL-1αとEMMPRINの分泌に相関関係があることが分かった。さらに, EMMPRINの基本的作用について,ヒト単球性白血病由来細胞(THP-1)を用いて実験したところ、FWが誘導するEMMPRINはTHP-1においてPDGF遺伝子の発現を増強した。PDGFは血管新生を促進させるので,創傷治癒を促進することが示唆される。EMMPRINは細胞のストレス条件下でIL-1αと同様に分泌促進されたことからalarminの一種である可能性が示唆された。平成28年度の基礎的研究では, FWの刺激によりEMMPRINが誘導されることを見出した。平成27年度ではFWによって創傷治癒促進効果をIL-1αが誘導することを報告したが,創傷治癒促進効果にEMMPRINも関与する可能性が示唆され、創傷治癒促進効果の研究状況としては概ね計画通りである。まず、FWによって分泌促進されるalarminの創傷治癒に対する効果を検証するために、ラット頭蓋骨に作製した骨欠損モデルを用いて実験した。実験には骨補填剤としてcollagenとhydroxyapatiteの複合物(HAP/Col)を用いた。骨の形成量の変化を実験動物用マイクロCTにより観察したところ、HAP/ColまたはFW単独使用群と比較してHAP/ColとFWを併用した群で、新生骨容積と骨密度共に有意に増加していた。さらに、頭蓋骨施術前後の末梢血を採取し、bFGFの濃度変化についてELISAにより測定すると、併用群では他の群と比較して手術後1,6,24時間後で濃度の上昇がみられた。そこで、bFGF分泌亢進に伴う骨増生効果を検討した。

欠損部周囲の組織を採取し、血管新生および骨増生に関与する因子についてreal-time PCRにより遺伝子発現の変化について検索した結果、併用群では他の群と比較して、血管新生因子であるIL-8, VEGF、骨新生に寄与するMCSF、RANKL、BMP7などの因子の発現増強がみられた。FWによって分泌誘導されたalarmin分子が、血管新生や骨の再生に関与するサイトカインなどの産生を増強することにより、創傷治癒が促進される可能性が示唆された。電解酸性機能水(FW)は、生体に有利な効果を持つことが知られているが、その詳細なメカニズムに不明な点が多い。口腔粘膜由来細胞を用いてFWの効果を検証した結果、IL-1aやbFGF、EMMPRINなどの分泌が誘導された。IL-1aは創傷治癒の促進効果を有している。また骨欠損モデルを用いた実験では、血管新生因子や骨の再生に関与するサイトカインの産生が増強されていた。これらの因子の発現を誘導させることにより創傷治癒が促進されることが示唆された。平成27年度の基礎的な研究によりFWにより誘導されるIL-1αは創傷治癒促進の主体的分子であることがわかった。FWによるIL-1α産生誘導の細胞内でのシグナル伝達経路に関する研究は重要であり、追及していく予定である。また、FWが転写因子NF-κBの活性を抑制することはすでに報告しており、これ以外の転写因子の関与についても検討していく予定である。平成27、28年度の基礎的研究により、FWによって誘導されるIL-1α、EMMPRINが創傷治癒促進効果に寄与することが分かってきた。平成29年度は、FWの創傷治癒促進効果を及ぼすその他の因子について検討し、EMMPRINのalarminとしての基礎的作用についてさらなる追及を行う予定である。病理学抗体や試薬などを購入する際に端数が生じたため、47円を次年度使用額とした。おおむね順調に研究が進んでいるが、若干各種抗体によるシグナル伝達遮断の実験系に遅れがあるため一部の抗体を購入しなかった。次年度の研究計画では、IL-1αの細胞内でのシグナル伝達経路の解析やNF-κB以外の転写因子の関与について検討する予定である。これらの研究に必要な消耗品,研究成果発表のための学会参加旅費,論文校正料,掲載料として使用する。27年度研究費の未使用分である47円は消耗品費の余剰分であるが、上記の用途に充てる予定である。次年度の研究計画では、FWの創傷治癒促進効果を及ぼすその他の因子について検討し、EMMPRINのalarminとしての基礎的作用についてさらなる追及を行う予定である。
ガングリオシドの構造と免疫源性の系統的再検討

ガングリオシド特有のシアル酸と骨格中性糖鎖の構造系列との関係における構造と抗原性の系統的な研究をおこなった。ここではモノおよびジシアロガングリオシドを中心にシアル酸としてNーアセチル型のものをもつ分子種のマウスにおける抗原性を検討した。Balb/cマウスにリポソ-ムで免疫し、LILA(liposome immune lysis assay)で抗体を検出する系で調べた。1.モノシアロガングリオシドのみをリポソ-ムに組み込んだ抗原では抗体の産生はみられないか非常に弱いが、ジまたはトリシアロガングリオシドを組み込んだものでは抗体が検出された。2.ラフ型LPSであるサルモネラR595株のLPSとガングリオシドとのハイブリッドリポソ-ムではすべての免疫抗原にたいする抗体の産生がみとめられた。3.抗体の認識抗原の特異性には交差反応の認められるものが多かった。4.アッセイするリポソ-ム表面とガングリオシドの糖鎖部分の相互作用によりリポソ-ム上の抗原決定基の立体構造が変化することが示唆された。
灌流可能な管腔ネットワークを有するｏｎｃｈｉｐ立体組織デバイスの構築

今年度は、立体組織内に灌流可能な管腔ネットワークを形成する手法の確立に向け、下記の二つの小テーマに取り組んだ。1.管腔構築のための犠牲層として利用可能なネットワーク状アルギン酸ゲルの形成:アルギン酸ゲルの加工法として、複数の射出口を有するデバイスを用いた射出成形を発想した。まずシータ管という二つの射出口を有するガラス管を用いて、射出流量を制御することにより、分岐状や鎖状などの複雑な形状のファイバを作製することに成功した。この結果を基に、細胞接着活性配列であるRGDモチーフを修飾したアルギン酸ゲルを用いて分岐状ファイバを作製し、表面に血管内皮細胞を播種してコラーゲンゲル内で犠牲テンプレートとして用いることで、内壁に血管内皮細胞を有した送液可能な分岐状の流路を作製した。さらに、ソフトリソグラフィにより作製した多数の射出口を有する微小デバイスを用いることで、多分岐形状を有するファイバの作製に成功した。2.血管内皮細胞を用いたスフェロイド内部への灌流可能な血管の導入:アルギン酸ゲルのテンプレートにより構築したネットワーク状血管様流路と、立体組織を構成する細胞との種々の相互作用を実現するためには、組織内部における血管新生などの血管内皮細胞のリモデリングが必要となると考えた。そこで、まずは組織モデルとして主に線維芽細胞からなるスフェロイドを用いて、血管新生のアッセイが可能なデバイスの構築を目指した。二つの微小流路からなるデバイスを作製し、一方の流路には細胞外基質の成分を有するゲル中にスフェロイドをアレイ化し、その流路とスリットを介して接しているもう一方の流路には、血管内皮細胞を播種した。これにより、高効率な血管新生アッセイが可能なデバイスを構築した。上述の通り、灌流可能な管腔ネットワークを有するon chip立体組織デバイスの構築に向けて、必要な要素技術の開発がそれぞれ進展した。今年度は、管腔構築のための犠牲層として利用可能なネットワーク状アルギン酸ゲルの形成および血管内皮細胞を用いたスフェロイド内部への灌流可能な血管の導入という、二つの要素技術に関する研究がそれぞれ進展した。結果として、これらの成果を統合することで、来年度以降、灌流可能な管腔ネットワークの構築とその血管としての機能評価へと研究を進展させるための基礎が築かれ、初年度の進捗としてはおおむね順調である。来年度は、多分岐形状を有するアルギン酸ゲルファイバを犠牲テンプレートとして用いることで、ネットワーク状の血管様流路を構築し、さらにバリア機能といった血管としての機能の評価を進めていく。また、デバイスの微小流路とスフェロイド内部を血管新生により接続し、デバイス外部のポンプなどを介してスフェロイド内部への培養液の送液が可能なシステムの構築を目指す。
海馬における神経細胞の新生低下に注目した慢性疼痛の発症機序解明

本研究の目的である、神経障害性疼痛時の海馬神経新生低下のメカニズムを明らかにするため、まず、神経障害性疼痛時に、神経幹細胞から成熟ニューロンに至るまでのどの過程が影響を受けるのかについて、免疫組織化学法により検討した。神経障害性疼痛モデルには、総腓骨神経および脛骨神経を結紮切除して作製するSpared Nerve Injury (SNI)モデルマウスを用いた。海馬における神経新生の場である、歯状回顆粒細胞下帯(SGZ)において、神経幹細胞マーカーであるNestinとGFAPの共陽性細胞数について検討したところ、SNIモデルマウスと擬似手術群の間で、細胞数に有意な差は見られなかった。このことから、神経障害性疼痛時に起こる神経回路の活性変化により、神経幹細胞数は影響を受けないことが示唆された。次に、灌流固定の1時間前に5-bromo-2'-deoxyuridine(BrdU)を投与することで増殖細胞を標識し、神経前駆細胞のマーカーであるTbr2とBrdUとの共陽性細胞数の検討を行ったところ、SNI群において、細胞数の有意な減少が見られた。また、灌流固定の1週間前にBrdUを投与することで、新生ニューロンをBrdUで標識し、新生ニューロンのマーカーであるDCXとBrdUとの共陽性細胞数の検討を行ったところ、SNI群で細胞数の有意な減少が見られた。これらの結果より、神経障害性疼痛による海馬歯状回の神経新生の低下は、SGZの神経前駆細胞数が減少することで生じることが示唆された。また、SGZにおける神経前駆細胞数の低下を引き起こす神経回路を明らかにするために用いる遺伝子改変マウスの作製を行った。Fos-tTAマウスに、アデノ随伴ウイルスベクターを用いてtetO-Cre遺伝子およびCre-DREADD遺伝子を導入した。申請書で計画した内容に沿って問題なく進行しており、実験計画は順調であると言える。結果に関しても、神経新生が低下する原因が、SGZにおける神経前駆細胞数の減少にあることをすでに見出しており、滞りなく計画を進行できている。SGZにおける神経前駆細胞数の低下が、体性感覚を伝える神経回路、または負の情動を生成する神経回路のいずれか、もしくは両者の影響によるものかを検討する。まず、前年度に作製した「tetO-Cre遺伝子」+「Cre-hM4Di遺伝子」を導入したFos-tTAマウスに、ドキシサイクリン(Dox)含有餌を与え、神経障害直前にDox非含有餌に切り替える。神経障害を行った翌日よりDox含有餌に切り替え、遺伝子発現を抑制することで、痛み刺激で活性化した神経細胞のみにDREADDを発現させる。疼痛モデル作製後、CNOを体性感覚経路の起始核である外側視床、もしくは情動経路の起始核である外側腕傍核へ局所投与することで、各領域にある痛みにより活性化した神経回路内の細胞を抑制する。その際のSGZにおける神経前駆細胞数、および痛み閾値や不安行動の変化について解析する。上記いずれかの神経回路の抑制で、SGZの神経前駆細胞数の低下の抑制が起こり、疼痛閾値の低下の抑制が起こった場合、関連する神経回路と同定できる。次に、痛みで活性化する神経回路を個別に活性化した際に、SGZの神経前駆細胞数に与える影響について検討を行う。回路を個別に活性化させるために、前年度に作製した「tetO-Cre遺伝子」+「Cre-hM3Dq遺伝子」を導入したFos-tTAマウスを用いて、単発の痛み刺激を加えた後、外側視床、または外側腕傍核へCNOを14日間持続投与する。こうして体性感覚経路、および情動経路を個別、または同時に持続的に活性化した際にSGZの神経前駆細胞数に与える影響、および痛み閾値や不安行動の変化を解析する。上記いずれかの神経回路の活性化で、SGZの神経前駆細胞数の低下が起こり、疼痛関連閾値の低下が起こった場合、関連する神経回路と同定できる。

これらの結果より、神経障害性疼痛による海馬歯状回の神経新生の低下は、SGZの神経前駆細胞数が減少することで生じることが示唆された。また、SGZにおける神経前駆細胞数の低下を引き起こす神経回路を明らかにするために用いる遺伝子改変マウスの作製を行った。Fos-tTAマウスに、アデノ随伴ウイルスベクターを用いてtetO-Cre遺伝子およびCre-DREADD遺伝子を導入した。申請書で計画した内容に沿って問題なく進行しており、実験計画は順調であると言える。結果に関しても、神経新生が低下する原因が、SGZにおける神経前駆細胞数の減少にあることをすでに見出しており、滞りなく計画を進行できている。SGZにおける神経前駆細胞数の低下が、体性感覚を伝える神経回路、または負の情動を生成する神経回路のいずれか、もしくは両者の影響によるものかを検討する。まず、前年度に作製した「tetO-Cre遺伝子」+「Cre-hM4Di遺伝子」を導入したFos-tTAマウスに、ドキシサイクリン(Dox)含有餌を与え、神経障害直前にDox非含有餌に切り替える。神経障害を行った翌日よりDox含有餌に切り替え、遺伝子発現を抑制することで、痛み刺激で活性化した神経細胞のみにDREADDを発現させる。疼痛モデル作製後、CNOを体性感覚経路の起始核である外側視床、もしくは情動経路の起始核である外側腕傍核へ局所投与することで、各領域にある痛みにより活性化した神経回路内の細胞を抑制する。その際のSGZにおける神経前駆細胞数、および痛み閾値や不安行動の変化について解析する。上記いずれかの神経回路の抑制で、SGZの神経前駆細胞数の低下の抑制が起こり、疼痛閾値の低下の抑制が起こった場合、関連する神経回路と同定できる。次に、痛みで活性化する神経回路を個別に活性化した際に、SGZの神経前駆細胞数に与える影響について検討を行う。回路を個別に活性化させるために、前年度に作製した「tetO-Cre遺伝子」+「Cre-hM3Dq遺伝子」を導入したFos-tTAマウスを用いて、単発の痛み刺激を加えた後、外側視床、または外側腕傍核へCNOを14日間持続投与する。こうして体性感覚経路、および情動経路を個別、または同時に持続的に活性化した際にSGZの神経前駆細胞数に与える影響、および痛み閾値や不安行動の変化を解析する。上記いずれかの神経回路の活性化で、SGZの神経前駆細胞数の低下が起こり、疼痛関連閾値の低下が起こった場合、関連する神経回路と同定できる。(理由)引き続き、遺伝子改変モデルマウスへのドキシサイクリン含有餌の投与のオンオフで遺伝子発現を調節し、SGZにおける神経前駆細胞数の低下の影響の検討を行うため、次年度使用額が生じた。(使用計画)遺伝子導入マウスの飼育や、ドキシサイクリン(Dox)含有餌、Dox非含有餌などの購入費用に充てる。また、遺伝子発現の確認や、疼痛モデルの組織の確認、神経細胞の確認などのための試薬、プラスチック器具などの消耗品の購入費用も必要である。