hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
家畜卵巣の還流培養による卵細胞の効率的利用

卵巣に含まれる数十万の卵細胞の大部分は個体に発生する機会を得ずに死滅する。卵巣における排卵やステロイドホルモンの生成などの機構は十分には解明されていない。家畜卵巣の機能を明かにし卵細胞の有効利用をはかる手段として卵巣の還流培養装置を試作し、ヤギ卵巣の還流培養を試みた。培養装置は、卵巣を入れる卵巣容器、酸素化装置をかねた還流培養液容器、ロ-ラ-ポンプ、ガスボンベ(95%O_2、5%CO_2)などからなっている。培養液にはTCM199を用い、1020%ヤギ血清を含む場合と含まない場合があった。一部の実験ではこれに6%デキストラン、6%グルコ-ス、3.5%PVP、インスリン、ヘパリンを加えた。培養液のpHを調整するため、一部の実験ではHEPESを加えた。2.57時間の還流培養によってグラ-フ卵胞は膨潤し、卵巣に水腫が認められた。グラ-フ卵胞をもった卵巣を用いた9回の実験のうち1回のみグラ-フ卵胞(2個)が破裂した。しかしこの破裂は自然排卵でなく、おもに物理的要因によるものと思われる。還流培養中も卵巣の解糖能は維持されていた。光顕レベルでは、結合組織の細胞間隙は培養によって大きくなったが、卵胞の顆粒層細胞、卵胞膜内層細胞は還流卵巣と対照との間に形態的差異は見られなかった。両者間には3β-HSD、17β-HSD、G6PDH活性などの強さにも差異は認められなかった。しかし電顕レベルでは、還流卵巣の顆粒層細胞の間隙が広がり、細胞が収縮した。これらの細胞の核は収縮し不整形になり、細胞の変性を示している。これらの組織学的結果は、現在の実験条件下ではヤギ卵巣の還流培養条件が不十分であり、改善の余地が大きいことを示している。還流培養装置と培養液の組成をさらに改良すれば、家畜卵巣の還流培養法は、卵巣機能の解明と卵細胞の効率的利用をはかるための有益な手段として使用できるであろう。1.本研究費で購入したローズ氏還流式培養装置を利用して,家畜卵巣の還流培養装置を作製した.この還流培養装置の特長は卵巣を長時間培養でき,恒温器は透明アクリル樹脂製で観察しやすく,ヒーター,サーモスタット,排気ファンなどにより恒温を維持できる.さらに培養瓶中のコンデンサー(テフロンチューブのコイル)へ95%0_25%CO_2の混合ガスを流すことにより,培養中のpHをできるだけ一定に保とうとしている.マイクロチューブポンプを利用して卵巣内を流れる単位時間当りの培養液量を調節できる.2.ヤギの卵巣摘出および卵巣脈管系の洗浄技術を修得した.発情閉止数時間後のヤギを開腹し,卵巣動脈卵巣枝,同子宮枝,同卵管枝を結紮し,卵巣動脈にカニューレを挿入した.卵巣摘出後,カニューレより冷却したヘパリン加TCM199液を5分間流し卵巣脈管系の血液を洗い出した.3.7頭のヤギを用い,成熟したグラーフ卵胞をもつ各1側の卵巣を36時間還流した.このうちグラーフ卵胞1個が破裂した.いくつかの実験では,培養によって直径23mmの卵胞が若干大きくなるのが認められた.

しかし,培養によって卵巣が膨潤するのが肉眼的に観察されパラフィン包埋後のヘマトキシレリン・エオジン染色,マッソン・ゴールドナー染色によって組織学的にも認められた.4.培養によって培養液中のブドウ糖量は減少し,乳酸量は増加する傾向があった.5.今後,卵巣摘出手術のじん速化,培養液の組成,適正pHの維持,卵巣への十分な酸素供給などにつき改善する必要があり,現在それらにつき実験を実施中である.昨年度、還流培養装置の作製とヤギの卵巣の還流培養を試みたが、一部の実験において卵胞の破裂が確認されたものの、還流後の卵巣の組織学的および酵素組織化学的観察の結果、開発した還流培養装置を改善する必要のあることが明らかになった。そこで本年度は、昨年度の還流培養装置を改良し、成熟ヤギ卵巣について5回、生後1ケ月以内の仔ウシ卵巣について2回の還流培養実験を行った。還流培養システムの基本は昨年度と同様であり、卵巣を保定するチャンバーとガス交換瓶より構成され、培養液はローラーポンプにより循環させた。95%0_2、5%CO_2混合ガスは洗浄瓶を通してチャンバーおよびガス交換瓶導入した。下記の点について改良した。1.培養温度の設定に関して、培養装置の周囲の空気を加温する方式は、温度が不安定なため取り止め、チャンバーとガス交換瓶を恒温水槽中に温水浴させる方式を採用した。2.培養液は昨年度と同様にTCM199を基本とし、膠質浸透圧を上昇させるためにヤギ血清、デキストラン、グリコース等を加えたが、本年度はさらに細胞成長因子としてのインシュリンと、血液凝固阻子因子としてのヘパリンを添加した。3.環流培養に先だって卵巣脈管系を脱血するとき、フラッシング液をガス平衡させて虚血時間を短縮した。この結果、ヤギ卵巣において酵素組織化学的観察から、培養後の卵巣に培養前とほぼ同程度のエネルギー代謝酵素およびステロイド代謝酵素の活性が認められた。また培養液中の乳酸濃度の増加や、グラーフ卵胞の膨潤等肉眼的観察結果を総合すると、家畜卵巣還流培養装置の原型は完成したと考えられる。今後はさらに装置を改良するとともに、家畜や実験動物の卵巣を用いた実験例を増やすことが必要であると思われる。これまで2年間実施してきた実験では、ヤギ卵巣の還流培養によってグラ-フ卵胞が破裂したのは1件のみであった。このため還流培養装置と培養液の組成に改良を加えた。卵巣を入れている卵巣容器と還流培養液容器を従来は空気中に置いていたが、これらを温水槽中において培養温度(39°C)が一定に保てるようにした。さらに従来の実験では培養液のPHが上昇する傾向にあったので、粉末TCM199に22mMNaHCO_3と5.985/μ1HEPESを加えてPHを7.27.4に保てるようにした。今年度は数々の予備実験と4回の本実験を行なった。グラ-フ卵胞をもった卵巣を還流培養した4回の本実験では還流培養によって卵胞の破裂は認められなかった。しかしグラ-フ卵胞と小卵胞が膨潤した。卵巣の解糖能を検討した。培養開始時と培養6時間後のグルコ-ス量は110.8および79.9mg/100mlであり、乳酸量は1.4および21.6mg/100mlであった。これらの結果から卵巣は6時間の還流培養後も解糖能を維持していることがわかった。またステロイドホルモンの合成に関与している3βーステロイド水酸基・脱水素酵素、グルコ-スー6ーリン酸・脱水素酵素などの活性を組織化学的に検討したが、これらの酵素活性は還流培養によっても低下は認められなかった。光学顕微鏡観察では、還流培養によって結合組織の細胞間隙が大きくなったが、卵胞の顆粒層細胞と卵胞膜内層細胞は培養による差異は認められなかった。
動物細胞のアポトーシスを制御する微生物代謝産物の研究

癌抑制遺伝子産物であるRB蛋白質は多くの癌細胞においてその機能が失われているが、このような細胞はアポトーシスを起こしやすいと考えられている。そこで、アデノウイルス癌遺伝子によりRB蛋白質を失活させた細胞に対して選択的にアポトーシスを誘導する微生物代謝産物を探索した。アデノウイルスE1A遺伝子で形質転換したラットグリア細胞を用いて、土壌分離菌約3,500株より探索した結果、Nocardiopsis sp.と同定した放線菌の生産物にE1A癌遺伝子導入細胞に対して選択的に細胞死を誘導する活性が認められた。活性物質を単離したところ、分子式C_<58>H_<96>O_<21>の新規物質と判明し、apoptolidinと命名した。各種2次元NMRを中心とした機器分析の結果、apoptolidinの構造は全く新しいタイプの20員環マクロライドであることが明らかとなった。本化合物による細胞死は、DNAの断片化とクロマチンの凝縮を伴うことからアポトーシスであると判明した。また、この細胞死はアデノウイルス12型がコードする2種のアポトース抑制蛋白質、E1B19KおよびE1B54Kの遺伝子導入によっても抑制されなかった。Apoptolidinのアデノウイルス癌遺伝子細胞に対するIC_<50>が、1017ng/mlであったのに対し、正常グリア細胞や線維芽細胞に対するIC_<50>は100μg/ml以上であった。一方、apoptolidinはSV40形質転換細胞など、他のRB蛋白質失活細胞に対しては無効であったことから、そのアポトーシス誘導活性はRB蛋白質の失活ではなく、E1A遺伝子の存在に依存しているものと考えられる。今後、apoptolidinの活性発現機構をさらに解析するとともに、その抗腫瘍活性を検討することにより、癌細胞に対して選択的な抗癌剤の開発が期待される。
窒素含有担体を利用した新規不均一系パラジウム触媒の創製と有機反応への高次利用

医薬品をはじめとする機能性物質の化学構造の多様化により、精密合成に対する依存度は一段と高くなっており、その一角を担う官能基選択的還元法の開発は、合成ルートの簡略化や選択肢拡大のために重要である。特に均一系触媒と異なり、再使用や生成物中への金属残留が少ない不均一系金属触媒による反応開発は、プロセス化学の観点からも重要である。窒化ホウ素担持型パラジウム触媒(Pd/BN)はこれまでの有機合成化学では困難であった様々な還元性官能共存下アジド、アルキンおよびアルケンを選択的に官能基変換できる。加えて弱塩基を添加することでアルキンをアルケンに変換する部分水素化にも適用可能であり、現在試薬として実用化される段階に到達している。一方、水素の安定同位体である重水素(D)で標識された化合物(重水素標識体)は薬物動態研究、反応機構解明あるいは重水素標識医薬品(ヘビードラッグ)など幅広い分野で注目を集めており、官能基変換が容易なアルキンやアルケンに位置選択的に重水素を導入する手法の開発は標識前駆体の供給に直結する重要な研究課題である。この課題を克服すべく不均一系Pd/BN触媒を使用し、水素あるいは重水素によるアルキンの部分還元反応を利用することによって、効率的な重水素標識アルケン体合成法を確立した。平成25年度は24年度から継続して、水素雰囲気下Pd/BNを触媒としたピリジン溶媒中における改良条件(H_2-Pd/BN-pyridine)を用いた。その結果、代表的な接触還元触媒であるPd/Cの使用では容易に還元が進行するアジド基などの還元性官能基存在下、アルキンからアルケンへの選択的な部分水素化反応を確立することに成功した(ChemCatChem. 203, 5, 2360-2366)。さらに当研究室で開発した他の不均一・系触媒と併せて含窒素(酸素)高分子担持型不均一系触媒と還元活性の関連性を示すことに成功し、その成果がperspecttveとしてCat. Sci. Technol誌に採択された。(抄録なし)医薬品をはじめとする機能性物質の化学構造の多様化により、精密合成に対する依存度は一段と高くなっており、その一角を担う官能基選択的還元法の開発は、合成ルートの簡略化や選択肢拡大のために重要である。また、アルキンからアルケンへの部分水素化反応においては、Lindlar触媒が良く知られているが、一置換アルキンの部分水素化や分子内に他の還元性官能基が共存する基質では、アルカンの副生や共存する還元性官能基の過剰還元などが併発するため官能基選択性の低下が問題であった。一方、水素の安定同位体である、重水素(^2HあるいはD)で標識された化合物(重水素標識体)は薬物動態研究、反応機構解明あるいは重水素標識医薬品(ヘビードラッグ)など幅広い分野で利用されている。従って、官能基変換が容易な一置換アルキンやアルケンに、位置選択的に重水素を導入する手法の開発は、標識前駆体の供給に直結する重要な研究課題である。現在、窒化ホウ素を担体としたBN担持型Pd触媒(Pd/BN)の開発に成功しアルキンからアルケンの効率的部分水素化法を確立するとともに[Adv.Synth.Catal.354,1264-1268(2012)]、反応条件をコントロールすることでアジド、アルキンおよびアルケンの官能基選択的接触水素化法の確立に成功している。更に、反応機構の解明あるいはヘビードラッグや多重重水素標識高分子の材料合成に利用することが出来る重水素標識前駆体である重水素標識アルケンの位置選択的で効率の良い調製法を見出しており、今後の更なる発展が期待される[Chem.Eur.J.19.484-488(2013)]。

その結果、代表的な接触還元触媒であるPd/Cの使用では容易に還元が進行するアジド基などの還元性官能基存在下、アルキンからアルケンへの選択的な部分水素化反応を確立することに成功した(ChemCatChem. 203, 5, 2360-2366)。さらに当研究室で開発した他の不均一・系触媒と併せて含窒素(酸素)高分子担持型不均一系触媒と還元活性の関連性を示すことに成功し、その成果がperspecttveとしてCat. Sci. Technol誌に採択された。昨年度のペースを維持して研究を遂行する。(抄録なし)
造血幹細胞の増殖を制御するシグナル伝達分子群の解析

近年造血幹細胞の増殖と分化を制御する造血因子とその受容体の多くがクローニングされている。これら造血因子の細胞内シグナル伝達機構を明らかにすることは造血幹細胞の試験管化増幅および分化の調節を行ううえで重要である。造血因子の作用はそれぞれに応答する遺伝子の発現調節を介して発揮される。そこで我々はサブトラクション法を用いて、まず各種造血因子によって共通に誘導される遺伝子を複数クローニングした。今回SH2ドメインを有する新規遺伝子CIS(cytokine-inducible-SH2protein)を発見しその機能解析を行った。CISは未分化な骨髄系細胞においてIL2、IL3、GM-CSF、エリスロポエチン(EPO)など各種因子によって極く短時間に誘導された。誘導の分子機構を解析するためにプロモーター領域約1キロベースをクローニングしレポーター遺伝子に融合させた。このレポーター遺伝子はIL3などで強力に誘導された。今後転写活性化に必要なシスエレメントを同定し、そこに作用する転写因子を明らかにする。さらにCISのシグナル伝達における役割を解析するためCIS遺伝子をステロイドで誘導可能なプロモーターに融合し血液株細胞に導入した。この結果EPOやIL3による増殖作用の抑制がみられ、かつCISが活性化されたEPO受容体やIL3受容体に会合することが明らかとなった。今後CISを経由するシグナル伝達経路を明らかにし、またトランスジェニックマウスなどで生理機能を明らかにしたい。
初期視覚系における輸郭線の折れ曲がり、分岐の表現の神経メカニズムの研究

本研究課題は物体の形状を認識する過程を明らかにすることを目的として、図形の輪郭に含まれる折れ曲がりが初期視覚野でどのように検出されているのかを調べた。(1)注視課題遂行中の二頭のサルの第二次視覚野(V2野)第II/III層から単一細胞外記録を行い、二本の半直線を組み合わせて作成した受容野を横切るような大きな折れ曲がり刺激に対する選択性を調べた。その結果、(1)多くのV2野細胞が折れ曲がりに対して選択性を示す一方、個々の半直線成分に依らずに折れ曲がりの角度や刺激の方向を表すものは見つからなかった。(2)多数の細胞で刺激セットに対する反応が12方向の半直線成分に依存しており、それらは個々の半直線成分に対する選択性とよく合致した。(2)折れ曲がり選択性が形成されるメカニズムを明らかにするために、特定の傾きの半直線を表現するサブユニットの出力を線形加算するモデルを最適化して先に記録した折れ曲がり選択性を説明できるかどうかを解析した。二本の半直線成分を表す興奮性サブユニットと一様な抑制性サブユニットを仮定することによりその選択性をよく説明した(79/91細胞)(P<0.01、ブートストラップテスト)。特異的な折れ曲がり選択性は最適でない半直線成分への抑制とスパイク発生時の整流作用により説明された。(3)V2野の主要入力源である第一次視覚野(V1野)が果たす役割を調べるためにV2野で使用したものと同じ刺激セットを用いて記録した。V1野では60°、120°の開きを持つ折れ曲がりに選択的な細胞がほとんど見られず、またこれとは別に受容野内にのみ提示される短い線刺激にのみ反応する細胞が認められた。従ってV1野が折れ曲がり選択性の形成に果たす寄与は直線ないしは直角の表現およびそれに類するものに限定される一方、V2野では方位選択的な線情報の組み合わせにより輪郭線に含まれる様々な折れ曲がりを表すことが示された。本研究課題は物体の形状を認識する過程において図形の輪郭に含まれる折れ曲がりや接合パターンが初期視覚野でどのように検出されているのかを調べることを目的とし、課題前半部分では単一細胞記録中に刺激のパラメーターを操作して輪郭線の折れ曲がりに対する反応選択性を詳細に調べることを計画した。本年度は二頭のサルをあらかじめ注視課題で訓練し、課題遂行中に第二次視覚野のII/III層より細胞外記録を行った。2本の直線成分を組み合わせて刺激セットを作成した。第二次視覚野の神経細胞は受容野を横断しかつその中央部分で折れ曲がるような輪郭線刺激に対してもよく反応するものが多く、刺激セットのいずれかの刺激に反応するものを145細胞記録した。89細胞は受容野内に呈示した短線分よりも輪郭線刺激に対して強く反応した。126細胞(86.9%)は輪郭線の折れ曲がりに対して緩やかな反応選択性を示し、さらにある特定の折れ曲がりに対して選択的に反応する細胞も少数ながら存在した。94細胞(64.8%)では反応選択性が12方向の直線成分に依存しており、各直線成分を単独で呈示して調べた方位選択性とよく合致した。組み合わせ刺激に対する平均の発火頻度と直線成分に対する平均の発火頻度の比は1.01であった。多くの場合、折れ曲がりに対する選択性は12方向の直線成分に対する興奮性反応とある特定の方向の直線成分に対する抑制性反応との組み合わせにより説明することができた。抑制性作用は線成分の傾きだけではなく線成分が受容野のどちら側にあるかにも依存することから受容野周囲の不均一な抑制性入力によると考えられる。

32細胞では折れ曲がりに対する選択性が特異的である一方、殆どの場合各直線成分に対する反応が弱かった。これらの結果は第二次視覚野が方位選択的な線情報の組み合わせにより輪郭線の折れ曲がりや分岐を検出する最初のステップであることを示唆する。本研究課題は物体の形状を認識する過程を明らかにするために図形の輪郭に含まれる折れ曲がりや接合パターンが初期視覚野でどのように検出されているのかを調べることを目的とする。課題前半部分では第二次視覚野を対象に単一細胞記録中に刺激のパラメーターを操作して輪郭線の折れ曲がりに対する反応選択性を詳細に調べることを計画した。二頭のサルをあらかじめ注視課題で訓練し、課題遂行中に第二次視覚野のII/III層より記録した。2本の半直線成分を組み合わせて刺激セットを作成した。これまで記録した114の単一細胞外記録のうち91細胞は刺激セットのいずれかの刺激に反応し、41細胞(36.0%)は受容野を横断しかつその中央部分で折れ曲がるような60°150°の折れ曲がり刺激に対して選択的な反応を示した。従って従来考えられてきた以上に多くの細胞が折れ曲がりに対して選択性を示し、一方個々の半直線成分に依らずに折れ曲がりの角度や刺激の方向を表すものがないことが明らかになった。多数の細胞で刺激セットに対する反応が12方向の半直線成分に依存しており、それらは半直線成分を単独で呈示して調べた方位選択性とよく合致した。それらの多くは二本の半直線成分の特異的な組み合わせに依存し、単に個々の半直線成分に反応するものではなかった。組み合わせ刺激に対する最適反応と半直線成分に対する最適反応の大きさがほぼ同じことから、折れ曲がり選択性の形成に方位選択的な抑制性入力との組み合わせが関与することが示された。我々は受容野周囲の不均一な抑制性入力が寄与しているのではないかと考え、今年度からは半直線成分の長さを変えることによる折れ曲がり刺激に対する反応の変化を調べている。これまで、注視課題を遂行中の二頭のサルの第二次視覚野のII/III層より単一細胞記録を行い、従来考えられてきた以上に多くの細胞が折れ曲がりに対して選択性を示し、一方個々の半直線成分に依らずに折れ曲がりの角度や刺激の方向を表すものがないことが明らかにした。今年度はこうした折れ曲がり選択性の形成のメカニズムを明らかにすることを目的にさらに実験解析を行った。(1)方位選択的な抑制性入力の寄与を評価するために第二次視覚野の結果をもとに抑制入力を含む線形モデルによる解析を行った。その結果、各半直線成分に対する反応による比較的単純な線形モデルで折れ曲がり選択性の形成を説明できることが明らかになった。
高齢者乳癌治療最適化に向けての包括的研究

近年、高齢者乳癌は急増しているが、高齢者乳癌についての系統立った研究は少なく、予後や薬剤の副作用については不明な点が多い。そのため臨床的対応は、一般の閉経後乳癌と同様か、さもなければ担当する医師の裁量によるところが大きく、過不足なく治療が行われているかは極めて疑わしい。高齢者乳癌では、患者背景の多様さに加え、アポクリン癌や粘液癌といった特殊型が多いことも事態を複雑化させている。本研究ではこれらの点を考慮し、(i)高齢乳癌患者、およびアポクリン癌・粘液癌患者におけるホルモン代謝動態の解明、(ii)アポクリン癌・粘液癌の予後や、予後予測マーカー、新規特性の解明、(iii)高齢乳癌患者における内分泌療法の副作用の特徴解明、の3つの方向からアプローチを加え、高齢者乳癌の治療最適化への貢献を目指す。平成30年度の上記(i)(iii)についての進捗状況は以下の通りである。(i)これまでに収集した検体の解析を行うと同時に、引き続き検体収集を行い、症例を蓄積している。(ii)これまでに抽出したアポクリン癌症例群、粘液癌症例群につき、種々の免疫組織化学的検討を行っている。(iii)年齢群(45-55歳、56-69歳、70歳以上)、あるいは薬剤種(アロマターゼ阻害剤か、selective estrogen receptor modulatorか)により、副作用の出現の出方に違いがある、との結果をまとめた論文が発刊された。上記に加え、高齢者乳癌についての他施設共同研究にも加わり、研究の一端を担っている。凍結検体の収集が遅れている。凍結検体採取については、患者に対する十分な説明を行った上で同意を取る必要がある。もともと対象となる患者が限られる上、同意が得られないケースが続いた。同意をとるための臨床の人員不足も解消されていない。凍結検体の収集に遅れがある。他施設とも協力し、より多角的な観点から研究を進める。28年度の上記(i)(iii)についての進捗状況は以下の通りである。(i)検体収集の段階。症例を蓄積している。(ii)アポクリンマーカーを含む種々の免疫組織化学的・臨床細胞学的検索を行ってきた。高齢者粘液癌の特徴を臨床細胞学的、病理組織学的、免疫組織化学的に示した。また、アポクリン癌との鑑別が問題となる低分化扁平上皮癌の臨床細胞学的特徴についても検討を行った。(iii)副作用情報についての統計解析を行い、年齢群(45-55歳、56-69歳、70歳以上)、あるいは薬剤種(アロマターゼ阻害剤か、selective estrogen receptor modulatorか)で、副作用の出現の出方に違いがあることを示した。副作用研究と特殊型癌の研究の一部については概ね順調だが、凍結検体の収集と特殊型癌研究の規模拡大が遅れている。臨床医の協力が必須だが、28年度は臨床サイドの人員減少等、不測の事態が生じた。特殊型癌については症例抽出のための十分な時間をとることができなかった。29年度の上記(i)(iii)についての進捗状況は以下の通りである。(ii)28年度までに、粘液癌や、アポクリン癌との鑑別が問題となる扁平上皮癌についての報告を行っているが、昨年度までとは異なる観点から、アポクリン癌症例群、粘液癌症例群を抽出し、免疫組織化学的解析を行っている。

(iii)昨年度までに得られた、年齢群(45-55歳、56-69歳、70歳以上)、あるいは薬剤種(アロマターゼ阻害剤か、selective estrogen receptor modulatorか)により、副作用の出現の出方に違いがある、との結果を論文としてまとめ、現在投稿中である。凍結検体の収集と特殊型癌研究の規模拡大が遅れている。凍結検体採取については、患者に対する十分な説明を行った上で同意を取る必要がある。もともと対象となる患者が限られる上、同意が得られないケースが続いた。同意をとるための臨床の人員不足も解消されていない。特殊型癌については症例抽出に予想以上に時間がかかった。近年、高齢者乳癌は急増しているが、高齢者乳癌についての系統立った研究は少なく、予後や薬剤の副作用については不明な点が多い。そのため臨床的対応は、一般の閉経後乳癌と同様か、さもなければ担当する医師の裁量によるところが大きく、過不足なく治療が行われているかは極めて疑わしい。高齢者乳癌では、患者背景の多様さに加え、アポクリン癌や粘液癌といった特殊型が多いことも事態を複雑化させている。本研究ではこれらの点を考慮し、(i)高齢乳癌患者、およびアポクリン癌・粘液癌患者におけるホルモン代謝動態の解明、(ii)アポクリン癌・粘液癌の予後や、予後予測マーカー、新規特性の解明、(iii)高齢乳癌患者における内分泌療法の副作用の特徴解明、の3つの方向からアプローチを加え、高齢者乳癌の治療最適化への貢献を目指す。平成30年度の上記(i)(iii)についての進捗状況は以下の通りである。(i)これまでに収集した検体の解析を行うと同時に、引き続き検体収集を行い、症例を蓄積している。(ii)これまでに抽出したアポクリン癌症例群、粘液癌症例群につき、種々の免疫組織化学的検討を行っている。(iii)年齢群(45-55歳、56-69歳、70歳以上)、あるいは薬剤種(アロマターゼ阻害剤か、selective estrogen receptor modulatorか)により、副作用の出現の出方に違いがある、との結果をまとめた論文が発刊された。上記に加え、高齢者乳癌についての他施設共同研究にも加わり、研究の一端を担っている。凍結検体の収集が遅れている。29年度は臨床サイドのスタッフ数が増えたため、凍結検体の収集の増加が見込まれる。特殊型癌の大規模研究については、症例抽出が律速段階であり、この段階が過ぎれば順調に研究が進むと考えている。症例抽出を急ぐ。凍結検体の収集については、他施設への依頼も検討する。特殊型癌の大規模研究については、律速段階だった症例抽出の段階が過ぎたため、今後は順調に進むと考えている。凍結検体の収集に遅れがある。他施設とも協力し、より多角的な観点から研究を進める。凍結検体の収集が思うように進まなかったため、予定していた解析費用(委託を含む)に未使用額が生じた。また、特殊型癌については比較的小規模な研究に留まったため、免疫組織化学用試薬購入費用に未使用額が生じた。
単体分割を用いた結び目と枠付き3次元多様体の量子不変量の研究

1984年のジョーンズ多項式の発見を転機として,3次元位相幾何学は大きく発展し,量子不変量に関連した様々な方向への研究が現在活発に行われている.量子不変量は数理物理を背景に持つ結び目や3次元多様体の新しい研究手法であり,古典的なトポロジーの研究との関係が明らかではない.本研究では,結び目や3次元多様体の量子不変量を古典的なトポロジーの道具である単体分割を用いて理解することで,低次元位相幾何学を多角的に発展させる.1984年のジョーンズ多項式の発見を転機として,3次元位相幾何学は大きく発展し,量子不変量に関連した様々な方向への研究が現在活発に行われている.量子不変量は数理物理を背景に持つ結び目や3次元多様体の新しい研究手法であり,古典的なトポロジーの研究との関係が明らかではない.本研究では,結び目や3次元多様体の量子不変量を古典的なトポロジーの道具である単体分割を用いて理解することで,低次元位相幾何学を多角的に発展させる.
不妊治療中夫婦のリプロダクティブ・ヘルスケア-夫婦支援のための看護介入の検討-

不妊治療を受けている夫婦の心理的支援に必要な看護介入プランを検討することを目的として2目標を掲げ研究を遂行した。(1)我が国における生殖医療施設の心理専門職者在籍施設は約半数であり、心理専門職者の設置割合は十分とはいえない状況であることが明らかになった。(2)不妊治療をともにうける男性の不妊経験理解は重要であり、男性へのインタビューより「治療」「社会」「病院」「妻」の4側面への感情・考え・行動に集約されており、治療を含めた生活に対する「平静さ」や「非言語化された気遣い」が特徴的であった。本研究目的は、不妊治療中夫婦の関係性の調整に必要な看護介入指針を作成することである。不妊女性の心理や不妊女性の心理面への影響要因として不妊治療中夫婦の関係性が大きいことはすでに論じられている。しかしながら、その夫婦の構成要因である不妊治療中男性の心理に関する情報は少なぐ、本研究に先立ち、不妊治療を受けている男性の心理に関する文献検討を実施した。不妊治療中男性の心理に関連した118文献(国内49文献・海外69文献)の検討の結果、1.従来、不妊に関連した心理ストレスは女性に多く見受けられるとされていが、男性も不安定な心理状態である。特に、男性不妊であった場合の男性性への影響は多大である。2.不妊という現象や治療の継続に関して、性差による認識、心理面への影響に相違がみられる。3.治療を継続上生じる日常生活での困難は明確に示されていない。4.ストレス対処資源をどの程度持っているか、明らかになっていない。上記の視点より、「2.性差による認識や反応の相違」が夫婦の関係性に何らかの影響を与えると推測された。そこで、不妊夫婦を対象に認識の相違や反応の相違の要因検討を目的にアンケート調査を実施した。その結果、不妊男性は不妊に関連する知識(治療・検査・助成システムなど)など基本的な情報が少なく、情報収集のためのサポート源を求めていること、反面女性は治療が成功しないことや夫婦の違和感など、心理面に関する悩みやそれを打ち明ける場所を探していることなどが示されていた。この結果から、治療過程における支援方法には、性差により関わり方の工夫が必要であることが示唆されたと考えられる。また、今後の研究計画として、「3.不妊男性の日常生活での困難さ」を明確にし、男性への支援方法の検討を深め、男性の心理的安定を図るためのより具体的な支援方法を明らかにする。さらに、その結果を受け、夫婦の関係性調整への介入指針を導く予定である。不妊患者に対する心理支援の充実化は、治療の円滑化に加え、患者の心理的安定を図るために必要不可欠な要素である。厚生労働省が政策的な支援を展開している一方、不妊患者に対する個別的な支援の多くは医療施設が担うことが多く、また施設の自助努力に任されており全貌が明らかにされていない。今回、不妊治療施設で実施されている心理面への患者支援の現状を把握することを目的とし調査を実施した。日本産婦人科学会における体外受精・胚移植等生殖医学の臨床実施登録施設594施設を対象にアンケートを郵送した(平成20年4月5月)。回収率19.3%(115施設)であり、医療法人60(51.8%)、独立行政法人19施設(16.7%)、公立8施設(7.0%)、その他28施設(24.6%)であった。1.不妊に関連した専門職者(不妊カウンセラー・体外受精コーディネーター・臨床心理士)の設置割合は、50%程度であった。2.支援状況として、個別面接、体外受精説明会は80%程度の施設で実施されているが、勉強会、電話相談は50%以下であった。3.個別面接担当者は、大部分が看護師によって実施されている。面接所要時間は、1060分とばらつきが見られていたが、30分もしくは60分で実施される施設が最も多い。4.男性へのサポート実施施設は約50%、個別面接実施施設は35%程度であった。心理専門職者は全体の約50%の定置であり十分な心理支援体制が整っているとは言い難い現状であり、看護師が通常業務の傍らで支援を実施していることが面接時間、料金形態などの面より推測された。さらに、男性への支援割合も非常に低いことが明確になった。心理的支援の具体的内容や提供方法の明確化、生殖療施設における均質な患者支援体制の定着に向けた取り組みが求められると考える。不妊治療を継続中の夫婦において、心身社会面への負担は女性のみならず男性においても生じている。夫婦双方へのサポートの必要性が論じられているが、不妊治療中の男性の経験は明確になっていない。

インタビューにより明らかになった不妊男性の経験は1.配偶者へのいたわりの思い、2.間接的に治療を支える役割意識、3.将来にむけての検討、4.治療への期待と不安、5.社会とのかかわり方、という大きく4つの要素が示唆された。また、男性は「配偶者へのいたわりの思い」を強く抱いているものの、その思いを配偶者へ言語化される機会が少ないこと、また、夫婦の将来設計などへの関心も強く、純粋に治療に没頭することは少ない、もしくは心理的に抑制している傾向が見られた。不妊治療を担う女性において、男性の思いが直接的に受けられないことや治療へ没頭しない男性の姿勢は、治療を継続する上で夫婦の関係性へ否定的な影響を与える要素として看護者が認知すべき点であることが示された。また、不妊治療施設で実施されている患者支援の現状を把握することを目的とし、不妊に関連した心理専門職者の在籍と支援の実態を郵送法アンケート調査にて実施した(実施登録施設594施設)。有効回答は115施設(19.3%)、心理専門職者在籍施設数は、不妊カウンセラー58施設(50.4%)、体外受精コーディネータ-55施設(47.8%)、臨床心理士19施設(16.5%)。心理専門職者の在籍状況は、医療法人がその他の設置主体の施設より多い傾向がみられた。初診時個別面接の実施施設は82施設(71.3%)、治療中希望個別面接は71施設(61.7%)であり、いずれも看護師が担当する割合が最も多かった。本調査から心理専門職者の設置割合は十分とはいえない現状が明らかとなった。患者が心理支援を受ける機会増加の為には、看護師の専門的教育を普及することが必要になると推測される。
C/EBPβの制御による慢性骨髄性白血病幹細胞の維持機構の解明と治療への応用

慢性骨髄性白血病(CML)の根治には、CML幹細胞の根絶を目指した制御機構の解明が必要である。本研究では低酸素に注目し、CML幹細胞の分化・枯渇を誘導する転写因子C/EBPbetaの発現・機能について検討した。低酸素下でCML細胞株のC/EBPbetaの発現が低下し、この変化は試験管内のサイトカイン刺激では解除されなかった。しかし、BCR-ABL導入骨髄を移植したマウスモデルでは、サイトカイン投与によりC/EBPbetaの発現上昇を介したCML幹細胞の枯渇が誘導された。以上から、サイトカインは、直接作用に加えて低酸素を含む微小環境のリモデリングによってCML幹細胞に作用することが示唆された。慢性骨髄性白血病(Chronic Myeloid Leukemia: CML)の幹細胞の制御機構はCMLの根治、すなわちCML幹細胞の根絶のために解明しなければならない喫緊の課題である。我々は転写因子C/EBPbetaがBCR-ABLのシグナルの下流に位置し、骨髄球系細胞への分化を促進するとともに、CML幹細胞を枯渇させる作用を持つことを明らかにした。しかし、CML幹細胞は生体内で長期にわたり維持されることから、C/EBPbetaの発現や機能を負に制御するような骨髄中の微小環境因子の存在が示唆される。本研究の目的は低酸素環境に着目し、C/EBPbetaの発現および機能を抑制するメカニズムを解明するとともに、その抑制を解除することでC/EBPbetaによるCML幹細胞の枯渇を促進するというCMLの根治に向けたストラテジーを樹立することである。我々は、この目的のためにCML細胞株を低酸素環境下に馴化させた細胞株(hypoxia-adopted: HA株)を樹立した。HA株は通常の酸素分圧で培養する親株と比してC/EBPbetaの蛋白質レベルでの発現が低下していることを見出した。mRNAの低下も伴っていることから、この発現低下は転写レベルで起こっていることが示唆された。我々はC/EBPbetaのプロモーター領域の単離を終えており、この範囲内に低酸素環境下の転写抑制に必要な領域が含まれているかどうかの検討を予定している。また、このC/EBPbetaの低下が、少なくとも試験管内ではインターフェロンや顆粒球コロニー刺激因子、トロンボポイエチンなどそれぞれ単独のサイトカイン刺激によってはは変化しなかったことから、低酸素状態では、急性の刺激によっても解除されないC/EBPbeta抑制機序の存在することが示唆された。チロシンキナーゼであるBCR-ABL融合蛋白質が原因となって生じる慢性骨髄性白血病の予後は、チロシンキナーゼ阻害剤の登場によって大きく改善している。しかし、多くの症例では治療中止後の再発が問題となっている。このような再発や治療抵抗性の根源には白血病幹細胞が関わっていることが明らかとなってきた。したがってCML幹細胞の根絶を目指した制御機構の解明は喫緊の課題である。近年我々は、転写因子C/EBPbetaがBCR-ABLの下流で活性化され、骨髄球系への分化を促進するとともに白血病幹細胞を枯渇させる方向で作用することを見出した。しかし、実際にはCML幹細胞は長期に維持されることから生体内の微小環境ではC/EBPbetaの発現あるいは機能を抑制的に制御するメカニズムが働いていることを示唆する。本研究では骨髄の低酸素環境に注目し、C/EBPbetaの発現・機能を制御するメカニズムを解明するとともに、その抑制を解除することで、C/EBPbetaによるCML幹細胞の枯渇を誘導するというCMLの根治に向けた新たな治療戦略の確立を目指している。我々は、まずCML細胞株を低酸素環境下で馴化させた細胞亜株(hypoxia-adopted: HA株)を樹立した。HA株は通常の酸素分圧で培養している親株と比較してC/EBPbetaのmRNAおよび蛋白質レベルでの発現が低下し、この変化は可逆的であった。また、低酸素下でのC/EBPbetaの発現低下は、試験管内でのインターフェロンや顆粒球コロニー刺激因子、トロンボポイエチンなどのサイトカイン刺激では解除されなかった。しかし、マウス骨髄細胞にレトロウイルスを用いてBCR-ABLを遺伝子導入した後に骨髄移植したマウスCMLモデルでは、サイトカイン投与によるC/EBPbetaの発現上昇を介して、CML幹細胞が枯渇するという予備的実験結果が得られた。BCR-ABL融合蛋白質が原因となって生じる慢性骨髄性白血病(CML)の予後は、チロシンキナーゼ阻害剤の登場によって大きく改善しているが、治療抵抗性や治療中止後の再発が問題となっている。このような問題の根源には白血病幹細胞が関わっていることが明らかとなっており、CML幹細胞の根絶を目指した治療法の開発は喫緊の課題である。しかし、実際にはCML幹細胞は生体内で長期に維持されることから、造血微小環境ではC/EBPbetaの発現・機能は抑制されていることを示唆する。本研究では骨髄の低酸素環境に注目し、C/EBPbetaの発現・機能を制御するメカニズムを解明するとともに、その抑制を解除することで、C/EBPbetaによるCML幹細胞の枯渇を誘導するというCMLの根治に向けた新たな治療戦略の確立を目指した。

CML細胞株を低酸素環境下で馴化させた亜株は、通常の酸素分圧で培養している親株と比較してC/EBPbetaの発現が低下し、この変化は可逆的であった。また、低酸素下でのC/EBPbetaの発現低下は、低酸素環境を維持したままの試験管内でのインターフェロンや顆粒球コロニー刺激因子、トロンボポイエチンなどのサイトカイン刺激では解除されなかった。しかし、レトロウイルスを用いてBCR-ABLを遺伝子導入した後に骨髄移植したマウスCMLモデルでは、サイトカイン投与によるC/EBPbetaの発現上昇を介して、CML幹細胞が枯渇するという結果が得られた。以上の結果から、サイトカイン投与は、CML幹細胞への直接の効果に加えて、低酸素環境を含む造血微小環境のリモデリングによって治療効果が得られることが示唆された。慢性骨髄性白血病(CML)の根治には、CML幹細胞の根絶を目指した制御機構の解明が必要である。本研究では低酸素に注目し、CML幹細胞の分化・枯渇を誘導する転写因子C/EBPbetaの発現・機能について検討した。低酸素下でCML細胞株のC/EBPbetaの発現が低下し、この変化は試験管内のサイトカイン刺激では解除されなかった。しかし、BCR-ABL導入骨髄を移植したマウスモデルでは、サイトカイン投与によりC/EBPbetaの発現上昇を介したCML幹細胞の枯渇が誘導された。以上から、サイトカインは、直接作用に加えて低酸素を含む微小環境のリモデリングによってCML幹細胞に作用することが示唆された。低酸素により、C/EBPbetaの発現が負に制御されているという現象は、用いた二種類の細胞株で示すことができた。また、この変化は酸素分圧の変化に対しては可逆的に変化するということも明らかとなった。試験管内ではサイトカインによってC/EBPbetaの発現低下を解除させることはできなかったが、生体モデルではサイトカインによりC/EBPbetaの機能亢進が誘導できたことを示しており、本来の目的であるC/EBPbetaによるCML幹細胞の枯渇誘導という狙いは達成されている。実験動物施設の度重なる微生物汚染によって計画は遅延気味であるが、目的にむかって着実に進行している。血液学上述のように、サイトカイン刺激に対するC/EBPbetaの変化は試験管内と生体内のモデルにおいて、それぞれ結果が異なっている。この差を生じるメカニズムについて明らかにするために、1)低酸素のマスター遺伝子であるHIF1alphaのC/EBPbeta発現制御における関与について、レトロウイルスによる過剰発現系、ノックダウン系と骨髄移植を組み合わて、明らかにする。2)生体内でのサイトカイン投与が骨髄中の低酸素環境の分布や広がりを変化させている可能性について明らかにする。この結果によって、サイトカイン投与によってCML幹細胞を枯渇させるという治療背略におけるC/EBPbetaと低酸素の関与を明らかにする予定である。低酸素によりC/EBPbetaの発現が負に制御されるという仮説は、用いた二種類の細胞株で示すことができた。また、この変化が酸素分圧の変化により可逆的に変化することも明らかにすることができた。したがって、酸素環境によりC/EBPbetaが負に制御されているという本プロジェクトの仮説は少なくとも部分的には支持することができたと考えられる。
アジア太平洋における専門・技術職国際移動者の生存戦略とネットワーク

オーストラリアの専門・技術職国際移動者受入政策については、政策の進展、また州レベルでの独自の政策について、その推移を把握した。さらに、現在のハワード政権の下で、経済的多文化主義(Economic Multiculturalism)ともいうべき政策が推進されており、アジア系専門・技術職従事者の状況がこうした政治状況に影響を受けていることも明らかとなった。アジア系専門・技術職国際移動者の階層状況については、彼らの多くは中間層に位置し、就労および生活上、大きな問題を抱えてはいなかった。これは既存の研究からも予想されるところであった。しかし、生存戦略とエスニック・ネットワークという点では、当初彼らはホスト社会での生活に満足し、オーストラリアにおける政治・社会参加にはそれほど関心を持たず、主に自らのアイデンティティ保持や経済的利益を最大化するために国内外のエスニック・ネットワークを利用しているのではないかと考えていたが、エスニック・アソシエーションの代表者などへのインタビューを通じて、この仮説に修正の必要が生じた。彼らの多くは市民権を取得しており、出身国・社会とのつながりよりもむしろオーストラリア市民としての立場を重視している。そして、本調査を通じて、彼らのなかには政治的関心を持ち、エスニック・アソシエーション活動を通じてオーストラリア社会のメインストリームに参画することが自らの立場をより強めるものであり、またオーストラリアに「貢献」できる道だと考えて、社会活動を行う者が少なからず現れていることが明らかになった。その際には、彼らの専門性が大きなアドバンテージとなっている。さらに、本調査ではアジア系政治家への直接のインタビューにより、上記のような政治・社会統合を志向する専門・技術職「移民」の政治参加のあり方を部分的に実証することを試み、一定の成果を得ることができた。本研究は、アジア太平洋における専門・技術職国際移動者(professional migrants)の生存戦略およびネットワークに関して、オーストラリアの状況を中心に考察している。主な調査対象は、華人(マレーシア、シンガポール、香港等の出身者)であるが、比較の上から、東アジア、東南アジア出身の「アジア系」も視野に入れている。本年度は、まず1990年代以降のオーストラリアの専門・技術職国際移動者の受入政策、多文化主義政策について、基本的文献の収集を終え、分析を始めている。オーストラリアの受入政策はより経済、技術的に「強い」移民を増加させており、それがこれまでの「社会福祉的」多文化主義像の再考を促していることが明瞭になってきた。また、マレーシア、シンガポール出身者による複数のアソシエーションのリーダーへのインタビュー、活動のフィールドワークにより、彼らの活動がまさに専門・技術職従事者の集団であるからこその自律性とときに国境を超える拡がりを持ち、またオーストラリアの多文化主義に貢献し得ている状況が浮き彫りとなった。調査を続け、私的領域、公的領域におけるオーストラリア市民意識と文化的遺産やルーツの使い分けの様相と、その多文化主義との関係を理論化することが来年度の課題である。さらに、上記のインタビューを通じて、より進んだ社会統合の様相としての専門・技術職国際移動者の政治参加というテーマが新たに鮮明になった。現在連邦、州レベルで9名のアジア系政治家が活躍し、市長、市議会議員も生まれている。その多くが専門・技術職のキャリアを持つ。本年度は連邦、州レベルの5名を含めて、10名の政治家にインタビューを行った。来年度もインタビューを継続し、彼らにとっての「アジア系」であることの意味と戦略的位置付けについて、オーストラリアとアジア諸国との国際関係を踏まえつつ、分析を進める予定である。本研究計画は、今年度が計画の最終年度である。本年度は、8月にオーストラリア現地追加調査を行い、また、最終年度ということで、調査内容の検討、分析に力を入れた。2年間の研究の成果は、次のように要約される。まずオーストラリアの専門・技術職国際移動者受入政策については、受入政策の進展、また州レベルでの独自の政策に関して、その推移を把握した。

さらに、現在のハワード政権の下で、経済的多文化主義(economic multiculturalism)ともいうべき政策が推進されており、アジア系専門・技術職従事者の状況もまた、こうした政治状況に影響を受けていることが明らかになった。アジア系専門・技術職国際移動者の生存戦略とエスニック・ネットワークという点では、当初、彼らはホスト社会での生活に満足し、政治や社会への参加にはそれほど関心を持たず、主に自らのアイデンティティ保持や経済的利益を最大化する戦略のために国内外のエスニック・ネットワークを利用しているのではないかと考えていたが、この仮説に修正の必要が生じた。彼らの多くは市民権を取得しており、出身国・社会とのつながりよりもむしろオーストラリア市民としての立場を重視している。そして、彼らのなかには政治的な関心を持ち、エスニック・アソシエーションの活動を通じてオーストラリア社会のメインストリームに参画することが自らの立場をより強めるものであり、またオーストラリアに「貢献」できる道だと考えて、社会活動を行う者が少なからず現れていることが明らかになった。その際には、彼らの専門性が大きなアドバンテージとなっていることも確認することができた。また、本研究では、アジア系政治家への直接のインタビューにより、上記のような政治・社会統合を志向する専門・技術職「移民」の政治参加のあり方を部分的に実証することを試み、一定の成果を得ることができた。
過分極誘発陽イオンチャネルを標的とした慢性疼痛の遺伝子治療法の開発

HCNチャネルファミリーであるHCN4の脊髄後角における局在をさらに詳細に調べるため、HCN4の翻訳開始点にルシフェラーゼ遺伝子をノックインしたマウス(HCN4 +/Lcu)を作製した。中枢神経系におけるHCN4由来の化学発光を検索したところ、脊髄後角に一致したシグナルを認めることができた。このHCN4+/Lcuマウスを用いて、炎症性疼痛モデルを作成した。ルシフェリンを腹腔内投与した後に脊髄膨大部を採取し、その化学発光の変化を調べたところ、ホルマリン注入側の化学発光が24時間、48時間後に低下していることが明らかとなり、脊髄後角に発現するHCN4が炎症性疼痛に関与する可能性が示唆された。過分極誘発陽イオンチャネルはHCN14のサブタイプがあり、そのうちHCN2は疼痛治療のターゲットとして注目されつつある。そこでHCN2の優性抑制変異体を作成し、アデノ随伴ウイルスベクターを使って脊髄後根神経節細胞に発現させ、局所的かつ選択的にHCN2の機能を抑制する。これによって炎症性疼痛を軽減することができるか検討し、疼痛治療の新たな戦略を開発することを目的とした。現在HCN2-AAAのcDNAをレンチウイルスベクターにサブクローニングし、実際のウイルス粒子の作成ステップまできている。また、マウスの後根神経節の摘出、酵素処理後の初代培養に成功した。ホールセルパッチクランプ法を用いて、初代培養後3日目の単離後根神経節細胞から、自発活動電位の記録に成功した。さらに、同一細胞において過分極で時間依存性に増大し、caesium sensitiveであるHCN電流の記録に成功した。次にウイルス粒子の作動確認を行う予定である。一方でHCN2と同様に細胞内cAMP感受性を持つHCN4の痛覚伝導路に対する関与を調べた。マウス生体内におけるHCN4の分布を調べるため、HCN4の翻訳開始点にルシフェラーゼ遺伝子をノックインしたマウス(HCN4 +/Lcu)を作製した。さらに免疫組織染色を用いてHCN4発現部位を詳細に検討したところ、脊髄後角第II層のニューロンに選択的にHCN4が発現していることが判明した。このHCN4 +/Lcuマウスを用いて、炎症性疼痛モデルを作成した。ホルマリン注入側の脊髄後角における化学発光が24時間、48時間後に低下していることが明らかとなった。HCN4は脊髄において後角第2層に特異的に発現しており、炎症性疼痛によりHCN4発現が変化することが明らかとなった。ウイルス粒子作成段階まで研究は進行中である。後根神経節に発現するHCN2が疼痛治療のターゲットになるか明らかにするため、現在後根神経節の初代培養、電気生理学的機能解析を継続している。また、HCN2の優性抑制性変異体のウイルスベクターの作動確認を今後行う予定である。一方で、同じHCNチャネルファミリーであるHCN4の脊髄後角における局在をさらに詳細に調べるため、HCN4遺伝子の翻訳開始点にテトラサイクリントランスアクチベータ(tTA)とその応答配列(TRE)をノックインしたマウス作成した。このマウスとテトラサイクリン応答配列制御下でGFPを発現するトランスジェニックマウスとを交配したマウスを利用して蛍光免疫染色を行った。このマウスはHCN4とGFPが共発現するが、頸髄、胸髄、腰髄いずれにおいても脊髄後角第2層に発現していることが見いだされた。脊髄の急性スライスでのGFP陽性ニューロンの同定は困難であり、電気生理学的な解析までは至っていない。ウイルス粒子作成段階まで研究が進行している。HCN4発現部位をニューロンレベルで同定することができている。一方で、同じHCNチャネルファミリーであるHCN4の脊髄後角における局在をさらに詳細に調べるため、HCN4の翻訳開始点にルシフェラーゼ遺伝子をノックインしたマウス(HCN4 +/Lcu)を作製した。このHCN4 +/Lcuマウスを用いて、左足底部に4%ホルマリンを20 μl皮下注することで、炎症性疼痛モデルを作成した。しかしながら、qPCRを用いて炎症性疼痛によるHCN4のRNA発現量の変化を調べたが、明らかな有意な変化を認めなかった。加えて、HCN4遺伝子の翻訳開始点にテトラサイクリントランスアクチベータ(tTA)とその応答配列(TRE)をノックインしたマウス作成した。このマウスはHCN4とGFPが共発現するが、頸髄、胸髄、腰髄いずれにおいても脊髄後角第2層に発現していることが見いだされ、よりHCN4の局在を詳細に検索することが可能となった。

HCNチャネルファミリーであるHCN4の脊髄後角における局在をさらに詳細に調べるため、HCN4の翻訳開始点にルシフェラーゼ遺伝子をノックインしたマウス(HCN4 +/Lcu)を作製した。中枢神経系におけるHCN4由来の化学発光を検索したところ、脊髄後角に一致したシグナルを認めることができた。このHCN4+/Lcuマウスを用いて、炎症性疼痛モデルを作成した。ルシフェリンを腹腔内投与した後に脊髄膨大部を採取し、その化学発光の変化を調べたところ、ホルマリン注入側の化学発光が24時間、48時間後に低下していることが明らかとなり、脊髄後角に発現するHCN4が炎症性疼痛に関与する可能性が示唆された。今後、培養後根神経節細胞を用いてウイルスベクターを投与し、パッチクランプ法も用いて、作動確認を行う。加えて、HCN4の脊髄後角における生理的機能も電気生理学的に解析する。HCN2の優性抑制性変異体の作動確認を行う予定である。当初の計画では後根神経節をターゲットとして研究を実施する予定であったが、脊髄後角に特異的にHCNチャネルが発現することが見いだされており、脊髄後角もターゲットとしてさらなる機能解析を行い、遺伝子治療のターゲットとなりうるか検討していく。麻酔学27年度に後根神経節の単離培養を行う予定であったが、脊髄後角を用いた実験解析を多く行ったため、培地等の消耗品の使用が少なく、未使用額が発生した。当初のターゲットと異なる脊髄後角を用いた実験を多く行い、脊髄の急性スライスを用いた実験技術の習得に時間を要したため。28年度に実際に培養後根神経節を用いた実験系を行うこととし、未使用額はその経費に充てることとした。引き続き、後根神経節の培養やウイルス導入に必要な諸経費に充当する。