hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
リニアガイドウェイのスティッキングの発生機構の解明とその低減法の提案

5比較的大きなローリングモーメントを負荷して,リニアガイドウェイをオフセット駆動すると,運転開始時に負荷圏内に等間隔に配置された負荷ボールは,運転時間の経過とともに,キャリッジの浮き上がり側(ローリングモーメントによりキャリッジ中心に対してキャリッジが上方向に変位する側)おいて,負荷圏中央付近以外で接近する.平成29年度1最大直線速度が大きく,ストローク長さが長いほど,駆動力の増加率および浮上り側の負荷圏中央付近における玉間のすきまは低下し,スティッキングは発生しにくくなることを実験で確認した.2キャリッジの寸法を変えて,キャリッジを変形しやすくすると,スティッキングが低減できることを実験で確認した.平成30年度(最終年度)1有限要素法により,予圧によるキャリッジの変形を計算した.そして,実験結果と同様に,変形量の大きいキャリッジでは,スティッキング低減できることを明らかにした.2以上の研究成果をASMEのJournal of Tribologyに公表した.次年度以降は,スティッキングの低減について検討する.具体的な実施項目は,以下の通りである.1今年度の研究結果を踏まえれば,低剛性キャリッジを使用することで,スティッキングの低減または防止が可能となると考えられる.そこで,低剛性キャリッジを軸受メーカと協同して,設計・開発する.2上の1で開発した低剛性キャリッジを使用して,実験を行い,スティッキングの低減効果を確認する.現在までの成果を踏まえて,有限要素法により,キャリッジの寸法,変形のしやすさ,スティッキング低減との関係を定量的に明らかにする,その結果とこれまでの結果をとりまとめ,学会にて発表する.
分子解析による赤唇発生機構の解明～再生に向けた展開研究～

赤唇はヒト特有の組織で、その再建は審美的にも重要である。しかしながら、その特殊性のため、実験動物を用いた研究は不可能である。本研究では赤唇の組織特殊性を解明するために、成人の赤唇にいかなる分子が発現しているかを検討した。赤唇部には、long noncoding RNA(lncRNA)、small nuclear RNA(snRNA)が、粘膜部よりも多く認められ、またホメオボックスを有するPAX遺伝子の発現が認められた。粘膜部に発現せず、赤唇部にのみ強く発現していた分子として、PPDPFなどが確認された。赤唇の特殊性は粘膜部とは非常に違う分子機構により制御されている可能性を示唆している。赤唇をはじめとする皮膚ー粘膜移行組織は生涯にわたり、その境界を拡大・縮小することのない高い恒常性をもつ組織であり、また、全身的に皮膚ー粘膜移行組織に症状が認められるスティーブンス・ジョンソン症候群や固定薬疹も知られる。このことは全ての皮膚ー粘膜移行組織に共通の分子機構が存在することを示唆する。本研究の目的はマウス、ヒトの6つの皮膚ー粘膜移行組織の形態的ならびに分子的解析から、赤唇領域の恒常性維持のための分子を同定する。(1)各皮膚ー粘膜移行組織間の分子格差の解析、(2)器官培養における物理的変化に対する分子変動、(3)recombination法による分子変動解析、(4)同定ヒト赤唇恒常性制御分子の変動(抑制または過剰)を明らかにすることにより、マウスでのヒト様赤唇形成を試みることである。今年度は各皮膚-粘膜移行組織間の分子格差の解析、同定特異的遺伝子の位置の同定、各皮膚ー粘膜移行組織の恒常力解析を主として行った。ヒト口唇から組織切片を作成し、口唇皮膚部、赤唇部、口唇粘膜部からレーザーマイクロダイセクションにて、各組織の上皮、間葉それぞれからRNAを抽出し、各部位における発現遺伝子の差異をマイクロアレイ、qPCR、RNAシーケンスにて検索する予定であった。しかし、予定していた枚数の組織切片からでは、マイクロアレイ、qPCR、RNAシーケンス検索のための十分なRNA量が採取できず、大量の組織切片の作成が必要である事が明らかとなり、現在遂行中である。本研究目的のために必要なヒト口唇皮膚部、赤唇部、口唇粘膜部から摂取できるRNA量が予想以上に少なく、大量の組織切片の作成が必要となったことが、研究遅延の大きな要因の一つである。また、マウスの各皮膚粘膜移行組織(口唇、眼、外陰部、肛門)の皮膚、移行部、粘膜部からのRNA採取予定であったが、ヒトの口唇と組織学的特徴が大きく異なるため、移行部の境界の設定に時間を要し、予定の実験を全て遂行することができなかった。赤唇のような非WHO粘膜移行部は生涯にわたり、その境界を拡大・縮小することのない高い恒常性を持っている。赤唇のこの恒常性維持のための分子を検索した。前年度には十分な量のRNAが取れなかったため、組織標本の枚数を増やし、以下の結果を得た。組織学的観察により、口唇を皮膚部、赤唇部、粘膜部に分け、標本上から赤唇と皮膚のそれぞれ上皮部と結合組織部からRNAを抽出し、RNA-seqによる解析を行った。なお、上皮の形態が違うことから、検索する分子からケラチン関連タンパクは除外した。その結果、赤唇部には、long noncoding RNA(lncRNA)やsmall nuclear RNA(snRNA)が、粘膜部よりも多く認められた。粘膜部でもlncRNAやsnRNAは認められるものの、その多くは赤唇部で認められるものとは、別の種類であった。また、赤唇部にはホメオボックスを有するPAX遺伝子発現が認められ、粘膜部にはFOXOやFOXIファミリーに属する遺伝子発現が観察された。さらに、粘膜部に発現せず、赤唇部にのみ強く発現していた分子として、PPDPF、WDR11、GBX1、SNX19、MTA2、SHOC2、DDT、RPL12、AATF、FAM95C、VAMP8、UBAC2、ZNF185、APOPT1、SAMD12、GJB2、HMGCR、SLC9A3R1、MYC、ZFYVE19、C1QL2、PEX5、PPIB、NEK4、NPTX2、CLCA4、TXNDC5、SAV1、CCR7などが確認された。赤唇部特異的または粘膜部特異的に強く発現する分子の方が、両者に強く発現している分子に比べ、数、発現量ともに多かった。これは、生涯、その境界をほとんど変えないことや、形態的な変化もほとんど生じないという赤唇の特殊性は粘膜部とは非常に違う分子機構により制御されている可能性を示唆する。ヒト口唇皮膚部、赤唇部、口唇粘膜部からのRNA量を獲得できる見通しがおおむねたった。

今後は予定通り、口唇皮膚部、赤唇部、口唇粘膜部、各部位における発現遺伝子の差異をマイクロアレイ、qPCR、RNAシーケンスにて検索する予定である。また、マウスの各皮膚粘膜移行組織(口唇、眼、外陰部、肛門)の皮膚、移行部、粘膜部の境界の設定もおおむね完了し、レーザーマイクロダイセクションにて、各部位の上皮、間葉それぞれからRNAを抽出し、各部位における発現遺伝子の差異をマイクロアレイ、qPCR、RNAシーケンスにて検索する予定である。口腔組織・発生学必要なヒト口唇皮膚部、赤唇部、口唇粘膜部から摂取できるRNA量が予想以上に少なく、大量の組織切片の作成が必要となったため、遺伝子解析に用いる試料の採取に主眼が置かれる結果となり、遺伝子解析が行うことができず、またその研究成果を発表することができなかった。前述した推進方策にしたがい、必要な実験動物、試薬等の消耗品類を購入する。また、国内外の学会における成果発表の旅費に充てる
熱帯・亜熱帯域から極域までの全球海洋観測から明らかにする海洋窒素固定の統合的理解

本研究では、北極海から熱帯・亜熱帯、南極海に至る観測から海洋窒素固定を全球的プロセスと捉え直し、どこでどのような特徴を持った窒素固定生物が存在し、生態系と関わっているかを明らかにすることを目的とする。具体的には、研究代表者が開発を進めてきた窒素固定活性測定法と窒素固定生物群集組成解析法に加えてネットワーク解析を導入することで、生態系と環境の両側面から各海域の窒素固定生物群集の形成要因を明らかにする。さらに集積培養もしくはメタゲノム解析から窒素固定生物のゲノムを復元し、比較ゲノム解析より各海域の窒素固定生物の特徴と共通点を見出す。
子どものヘルスプロモーションのための予防接種介入プログラム・ガイドラインの作成

本研究は、子どものヘルスプロモーション(健康の維持・増進)促進のために、多くの看護師が実施できる予防接種に関する健康教育プログラムを作成することを目的とした。文献や看護師へのインタビュー調査などから、2-3歳、4-6歳、学童の3つの区分を定め、それぞれのプログラムを作成した。この3プログラムに関して10施設の看護師の協力を得、145人の子どものデータ等を得た。その結果、看護師は、子どもや保護者の反応からプログラム実施の効果を感じ、子どもの理解力や頑張る力に保護者が気づく機会になったと認識していた。また、4-6歳と学童では、予防接種の理解がより深まり主体的に接種に臨むことにつながったと考察した。本研究は、子どものヘルスプロモーションの促進に向け、看護師が行う子どもの予防接種プログラムに関連した看護介入のプログラムを作成・実施し、予防接種プログラムとしての汎用性を高め、具体的な看護介入プログラムの普及に向けたガイドラインを作成することを目的としている。本年度前半は、昨年度より作成している3つの予防接種プログラムを精練・完成させ、プログラム実施に向けた流れや手順、プログラム・ガイドラインの評価方法等について検討した。その後、研究計画について研究者が所属する機関の倫理審査を受け、承認を得た。後半は、研究計画に基づき、プログラムを実施し評価を行ってくれる協力者を募り、データ収集を開始した。具体的には、日本外来小児科学会ワークショップで看護師が行う子どもの予防接種プログラムを紹介し研究協力を依頼した。また、研究メンバーを通じて、プログラムを実施し評価するための研究協力施設・研究協力者を募集した。募集に応じ承諾が得られた施設・協力者に、プログラムの実施を依頼し、プログラムの効果およびプログラム・ガイドラインの評価を含めたデータの収集を行った。年度末(3/31)現在、Aプログラム目標数30例に対し11例、Bプログラム目標数(対照群/実施群)30例/30例に対し16例/4例、Cプログラム目標数(対照群/実施群)30例/30例に対し、6例/5例のデータが集められ、継続して次年度もデータ収集の予定である。本年度は、昨年度に引き続き、作成した3プログラムについて協力者を募って実施し、プログラムの評価、およびプログラム普及の方法について検討した。プログラムの実施数は、Aプログラム(4施設):27例、Bプログラム(5施設):対照群34例、実施群26例、Cプログラム(7施設):対照群27例、実施群31例であった。子どもの行動観察や子どもへの質問(B,Cプログラムのみ)、保護者へのアンケート、プログラムを実施した看護師へのアンケートやインタビューから、プログラムの評価を行った。B、Cプログラムの子どものデータから、子どもの予防接種に対する知識の理解がより具体的に深まっていた。保護者のデータからは、Aプログラムでは、付き添う母親も、子どもが子どもなりに体験することにより予防接種について理解することの重要性に気づけていた。B、Cプログラムでは、プログラムに参加することにより子どもへの説明方法を知るきっかけになるなど保護者の予防接種の説明への意識が高まっていた。また、プログラムを実施した看護師のデータからは、A、Bプログラムでは、看護師が子どもの反応(以前との比較を含む)や保護者の反応からプログラム実施の効果を実感したこと、また看護師の語りの中に、保護者が子どもの理解力や頑張る力に気づく機会になったことなどがあげられ、保護者にとっても今後の子育てに効果的であったと認識されていた。Cプログラムでは、看護師が子どもの主体的な行動の変化を感じ、看護師自身の子どもへの説明に対する意識が高まっていた。これらの結果から、プログラム実施により、子ども・保護者・実施する看護師にプログラムの効果が認められ、子どものヘルスプロモーションにつながることが示唆された。また、プログラムの普及の方法については、看護師らのインタビューなどから、インターネットなどを用いた方法の有用性が示唆された。本研究は、子どものヘルスプロモーションの促進に向け、看護師が行う子どもの予防接種プログラムに関連した看護介入のプログラムを作成・実践し、予防接種プログラムとして汎用性を高め、具体的な看護介入プログラムの普及に向けたガイドラインを作成することを目的としている。本年度は、予防接種の健康教育が効果的な対象および場、予防接種介入プログラムの検討を目的とした。効果的な対象および場については、文献検討およびに日本外来小児科学会におけるワークショップや研究協力者等の看護師から意見収集した。それらを踏まえメンバー間で検討の結果、対象については、先行研究では45歳用プログラムを提示していたが、それ以下の年齢の幼児およびそれ以上の年齢の学童についても、予防接種を一つの健康教育のチャンスとして活用する事が可能でありかつ重要であるとの認識から、3歳用と学童用の予防接種介入プログラムを新たに作成する必要があると判断した。また、場については、実践可能性を考慮し、外来やクリニックなど子どもが予防接種を受ける場を想定した予防接種介入プログラムとすることに決定した。

子どもが養育者と一緒に予防接種を受けにくる場で、その場の看護師が通常の業務を行いながら、子どもの発達段階に応じた予防接種介入プログラムの実施が可能なプログラムを目標とした。具体的には、予防接種介入プログラムの45歳用プログラムを見直すとともに、新たに3歳用と学童用を作成し、その実施に関するガイドラインについての検討中である。並行して、具体的なプログラム実施のための準備等を開始した。プログラム実施のための施設・協力者のリクルートやデータ収集数の確保等でやや難航しているものの、次年度のデータ収集期間を数か月延長することによって、目標数のデータが得られるものと考える。効果的な対象および場についての検討、介入プログラムの検討について、当初、看護師へのインタビューを計画していたが、方法を日本外来小児科学会WSでの意見収集および研究協力者数名からの意見収集に変更し、予防接種プログラムを検討し、23歳用と学童用のプログラム作成に進んでいる。平成25年度は予防接種介入プログラムの実施と効果の検証、および実施方法に関する検討のためのデータ収集を平成24年度に続けて行うとともに、予防接種介入プログラムの普及のためのガイドラインを検討し作成する。目標数のデータ収集が当初設定した期間内には難しいため、データ収集期間を延長すること、および当初の予定に加えて、実施者によるグループディスカッションを追加し、効果の検証、実施方法の検討、普及に向けた検討に使用する。平成25年度は最終年度のため、成果の公表(普及を視野に入れた)方法についても検討する。24,25年度は、交付申請書の計画通りに、プログラムの実施と効果検証、プログラム普及に向けてのガイドラインの作成を行う予定である。データ収集期間を延長し、一施設当たりの収集期間が延びるため、プログラムCに必要なPCが不足する。そのため、PCの購入、また実施者によるグループディスカッションを追加したことによる経費(交通費、会議費、謝礼など)、普及についての示唆を得るための日本外来小児科学会WSの開催(参加費・交通費など)が必要となり、研究費はこれらに充当する予定である。インタビュー調査を変更したことにより調査に関わる経費が浮いたこと等により、当該研究費が生じている。次年度以降はプログラムの実施と効果検証を予定しており、プログラム実施の経費および会議にかかる経費に充当する予定である。
大学院の助産師教育における乳児期の継続家庭訪問支援教育プログラムの開発

現在、我が国では児童虐待の問題が深刻化し、妊娠期から育児期までの継続した予防的支援が必要とされている。そこで本研究は、米国で虐待予防に効果があるとされているHealthy Start Programの概念を活用し、大学院での助産師教育において、乳児期の育児支援に関する教育プログラムを開発し、実施・評価することを目的とした。作成した教育プログラムを助産師学生に実施し、学生及び継続支援を受けた母親を対象に評価した。その結果、学生からは「出産施設退院後の母児の生活が理解できた」という評価が得られ、母親からは、「最もストレスが多い時期に長期的に家庭訪問をしてもらえたのはよかった」との評価を得た。1.本研究の目的は(1)米国で虐待予防に効果があるとされているHealthy Start Program(「健康な出発」プログラム)の家庭訪問支援プログラムの方法を活用し、大学院での助産師養成教育を効果的にするための乳児期の継続した家庭訪問支援教育プログラムを開発する(2)作成したプログラムを大学院での助産師教育に導入し、学生の教育評価や家庭訪問対象者のインタビュー等から乳児期の継続した家庭訪問育児支援教育を実施評価することである。2.平成22年度の研究実施計画(1)教育担当者がトレーニングを受ける.(2)関連学会や研究等から必要な情報を収集する.(3)本学の助産師養成教育課程の教育プログラムを考える.(4)プログラムを実施していない(現行の教育)学生の教育評価をする.3.平成22年度の成果(1)HFA(Healthy Family of America)の認可を受けているアメリカ合衆国ケンタッキー州において、家庭訪問支援プログラムのスーパーヴィジョンの研修に参加し、スーパーバイザーに必要な知識と方法について学ぶことができた。この研修を通し家庭訪問支援プログラムにおいて、FSWに対してのスーパーバイザーの役割などが、本学で実施する予定である乳児期の継続家庭訪問支援における、助産師養成課程の学生と教員との関係に活用できる学びとなった。また、他にも教育担当者が教育プログラムを作成する上で必要な研修会に参加することで、乳児期における継続した支援の必要性を再認識できた。(2)大学院での助産師教育課程において身につけるべき知識と技術について先行文献をもとに検討し、助産師教育における目標を検討してきた。また教育プログラムの評価の方法についても先行文献や研究協力者とディスカッションを重ね検討を進めてきた。今後、最終的に検討した目標に照らし合わせ、効果的な教育の時期や方法について具体的にカリキュラムに組み込みプログラムを作成していく予定である。また、現行学生の評価について、学生全体のヒアリングを実施し、様々な課題が抽出された。今後、学生個別のヒアリングを実施し、作成する教育プログラムに活用することも検討している。2.平成23年度の研究実施計画・平成22年度に行なった文献検討や,大学院での助産師養成課程を修了した学生の状況などから,育児期の継続事例の教育目標を考える。・アメリカ合衆国でHFAの認可を受け,Healthy Start Programを実施している施設より,Healthy Startの基本となる12の重大原理,FSWが身につける家庭への介入の姿勢や訪問態度,ケースに必要な支援を見極め適時に提供する技術を,平成22年度にアメリカ合衆国ケンタッキー州において教育担当者がトレーニングを受けてきたため,その研修を活かし,かつ本学の助産師養成教育課程の乳児期の家庭訪問支援の目標にそった教育プログラムを作成する。3.平成23年度の成果大学院での助産師教育課程において身につけるべき知識と技術について、平成22年度に先行文献からの検討や教員の海外研修をもとに、助産師教育における家庭訪問支援プログラムの時期別目標および、最終目標を決定し平成24年度入学生のカリキュラムに、必要な内容を組み込み作成した。また、現行学生全体のヒアリングからも課題を抽出し、プログラム内容の検討材料とした。平成23年度に作成した教育プログラムで、平成24年度入学の学生からプログラムに沿って実施をする予定である。また教育プログラムの評価の方法についても平成22年度から検討を重ねている段階であり、平成24年度にはプログラムの実施と共に、評価方法を決定する予定である。本研究の目的は米国で虐待予防に効果があるとされているHealthy Start Program(「健康な出発」プログラム)の家庭訪問支援プログラムの方法を活用し、大学院での助産師養成教育を効果的にするための乳児期の継続した家庭訪問支援教育プログラムを開発し、実施評価することである。

作成したプログラムを助産師教育に導入し、約6か月間の継続した家庭訪問終了後に、家庭訪問対象者である母親および教育プログラムを実施した学生からインタビューを行い教育プログラムの評価を行った。家庭訪問対象者である母親からは、学生が継続して家庭訪問することに対し【長期的に家庭訪問で様子を見てくれたのはとてもよかった】と答えており、学生の存在について【身近な存在という部分では頼りにしていた】と答え、また、出産に立ち会った学生が継続的にかかわることに対し【出産に立ち会い、出産時の情報を知っている存在だからとても心強い】と出産にかかわった上で継続することに対しプラスに評価していた。継続期間に対しては【もう少し長く関わってほしかったが、関係が終わるわけではなく今後も精神的な支えになる】と答えていた。さらに学生に対し【困ったときも身近に寄り添ってずっと支えてくれた】【とにかく話を聞いてくれることが助かった】と評価し【学生が行う振り返りの機会が自分の気持ちの整理に役立った】とプラスに受け止めていた。教育プログラムを実施した学生からは継続家庭訪問支援実施に対し【最も援助を必要としている時期がわかった】【退院後の個別的な母乳育児の経過がわかった】【育児期の状況を考慮した産後入院中の支援を考えることができた】等の意見が聞かれたが、プログラムの流れについては、演習等の時期を考慮する必要性も語られた。以上のことから乳児期の継続家庭訪問支援のプログラムは学生の育児期の学習や、母親に対する育児支援として効果があるのではないかと推察された。1.本研究の目的は1米国で虐待予防に効果があるとされているHealthy Start Program(「健康な出発」プログラム)の家庭訪問支援プログラムの方法を活用し、大学院での助産師養成教育を効果的にするための乳児期の継続した家庭訪問支援教育プログラムを開発する2作成したプログラムを大学院での助産師教育に導入し、学生の教育評価や家庭訪問対象者のインタビュー等から乳児期の継続した家庭訪問育児支援教育を実施評価することである。2.平成24年度の研究実施計画は、平成22年度の研修を活かし、かつ本学の助産師養成教育課程の乳児期の家庭訪問支援の目標にそって平成23年度に作成した教育プログラムを、平成24年度入学の学生に実施することである。3.平成24年度の成果は、大学院での助産師教育課程において身につけるべき知識と技術について、平成22年度に先行文献からの検討や教員の海外研修をもとに、助産師教育における家庭訪問支援プログラムの時期別目標および最終目標を決定し、平成24年度入学生のカリキュラムに、必要な内容を組み込み平成23年度に作成した教育プログラムを、平成24年入学の学生に実施している段階である。現在、平成25年1月に、対象となる継続事例が決定し、プログラムに沿って家庭訪問を実施している。
超電導マグネット技術の基礎(総括班)

本研究班は、磁気閉じ込め核融合装置に必要とされる高性能超電導マグネットの開発を目標とするエネルギー特別研究(核融合)第4班の研究活動を常時把握し、研究の効果的推進と適切な研究の方向づけを行うために編成されたもので、本年度は下記の諸活動を行った。1.総括班会議:本年度は計6回の総括班会議及び幹事会を開催し、研究活動の方向づけ、重点検討項目の審議を行うとともに、総合総括班事業の提案、日米協力事業への協力、第4班主催のワークショップの企画、次年度の研究計画の検討を行った。2.ワークショップの開催:第4班では、材料→電磁現象→マグネット技術と研究の重点を移すことを当初からの基本方針としており、これまでの研究成果を、最終目標である超電導マグネット技術の研究に結集させる方策を検討するために「核融合実験装置の超電導化」に関するワークショップを企画し、第4班総括班事業として開催した。ワークショップには第4班関係者の他、多数の専門家が参加し、今後の研究の方向づけを行う上で有意義な密度の濃い討論が行われた。なお、この内容は研究成果報告書として印刷配布された。3.課題研究の成果のとりまとめ:第4班の本年度の課題研究は、計画研究4件(内1件総括班)と公募研究15件計19件である。これらの成果は、研究成果報告会で集中的に報告討論され、成果報告書として印刷配布された。3件の計画研究は、各々順調な進展を示し、マグネット材料の計画研究では、超電導基礎物性に加えて中性子照射・歪等に関するデータが蓄積され、またミクロ構造と臨界電流との関係が明確になってきた。基礎現象の計画研究では、従来の線材に対する電磁現象面の解析から、実用導体としての設計に対する指針を得る段階へと進んだ。マグネット技術の計画研究では、マグネットのクエンチ機構や種々のマグネット冷却方式について多くの成果が得られた。
歯周病原菌の生態的生物活性と産生酵素に関する研究

本菌(No26,Mー12)の抗菌活性は菌体結合性であった。抗菌物質はcell-sonicateを各種カラムクロマトで高純度に精製(83倍、回収率30%)した。本物質の分子量は100,000、等電点8.0であった。抗菌スペクトラムは、各種口腔レンサ球菌種、P.acnesを阻止し、その作用は静菌的であった。2.歯周病原菌のMucopolysaccharidaseとneuraminidaseの精製と性状(1)B.heparinolyticusのheparinaseはcell-sonicateを各種カラムクロマトで高純度に精製(1920倍、回収率8.9%)した。本酵素の分子量は64,000、等電点9.5、反応至適pH7.0でheparin、heparan sulfateのみを分解した。(2)B.oralisのhyaluronidaseは菌体外産生性で、培養上清を各種カラムクロマトで精製(12,000倍、回収率5.8%)した。本酵素の分子量は75,000、等電点7.6、反応至適pH5.5でヒアルロン酸のみに作用した。(3)B.gingivalisのneuraminidaseは菌体結合性で、cell-sonicateを各種カラムクロマトによって高純度に精製(230倍、回収率40%)した。酵素の分子量55,000、等電点4.5、作用至適pH5.8であった。この酵素処理血球に対してB.intermediusが凝集能を発現した。また、B.heparinolyticusと口腔スピロヘ-タ(T.denticola)にもneuraminidase活性を認め、各酵素を精製(それぞれ4,400倍、回収率38.1%、2,600倍、回収率16.2%)した。3.口腔スピロヘ-タT.denticolaの生物学的性状とprotease活性歯周病巣からの分離15菌株を電顕的形態、生物学的性状を調べた結果、T.denticolaと同定された。各合成基質を用いて本菌のprotease活性を調べ、菌体結合性のコラゲナ-ゼ様、トリプシン様、キモトリプシン様活性を認めた。本菌のこれらproteaseはイオン交換クロマトで分画・分離されることから、口腔スピロヘ-タのproteaseが極めて多様であることが示唆された。2.歯周病原菌のMucopolysaccharidaseとneuraminidaseの精製と性状(2)B.oralisのhyaluronidaseは菌体外産生性で、培養上清を各種カラムクロマトで精製(12,000倍、回収率5.8%)した。1.歯周病原菌の生態的生物活性歯周病原菌の抗菌活性をstad culture法で調べ、Capnocytophaga ochraceaおよびFusobacterium sp.の菌株に強い活性を見出した。C.ochraced No.26、M-12菌株はS.sanguis(ATCC 10556)に対して強い阻止作用を有し、この活性は菌体結合性であった。抗菌物質を菌体(No.26)から超音波抽出し、イオン交換、ゲル濾過、HAカラムクロマトで精製(精製度、83倍、回収率30%)した。精製物質は、PAGEで高純度の所見を示した。本物質の分子量は、100,000等電点、PH8.0で活性が80°Cで失活した。抗菌スベクトラムは、S.sanguis、S.mitis、S.mutans、Pacnesの発育を阻止し、静菌的であった。Stab culture法で黒色Bacteroidesの発育を阻止したFusobacterium sp.6

菌株の活性は、いずれも菌体からの抽出試料に認められた。しかし、本活性は失活傾向が強くその安定化と精製法について検討中である。2.歯周病原菌の歯周組織破壊に関連する産生酵素Bacteroides heparinolyticusのヘパリナーゼは、菌体(ATCC 35895)の超音波抽出粗酵素をイオン交換、ゲル濾過、HAカラム、等電点電気泳動法で精製(精製度1,920倍、回収率8.9%)した。精製酵素は、PAGE所見で高純度と示唆された。本酵素は易熱性で分子量64,000、等電点、pH9.5、反応至適pH7.0であった。活性はFe^<2+>で促進され、基質特異性はheparin、heparan sulfateのみに作用し、分解産物として不飽和4糖と2糖が検出された。Bacteroides oralis(ATCC33269)のヒアルロニダーゼは菌体外産生性であった。ヘパリナーゼに準じて培養上清から精製(精製度12,000倍、回収率5.8%)した。本酵素の分子量は75,000、等電点、pH7.6、反応至適pH5.5であった。活性はCa^<2+>、Mg^<2+>など金属イオンによる影響はなかった。基質特異性はヒアルロン酸のみに作用し、分解産物として不飽和6糖と4糖が検出された。1.歯周病原菌のneuraminidase活性MUANを基質とし歯周病原菌の活性を調べ、Bacteroides sp.,口腔スピロヘ-タ(T.denticola)に強い活性を検出した。しかし、F.nucleatium,Capnocytophaga sp.(3菌種)には活性がみられなかった。酵素は菌体抽出試料を各種カラムクロマトによって精製した。精製酵素は、PAGEで高純度所見を示し、回収率40%で約230倍に精製できた。酵素の等電点(pI)は4.5、分子量55,000、作用至適pH5.5、50°Cで失活した。活性はCa^<2+>やEDTAで影響はなく、Cu^<2+>、Fe^<2+>で阻害された。このneuraminidaseの定着機構への役割を血球凝集能で調べると、本酵素処理血球に対して、B.intermediusが凝集を発現し、B.gingivalisの凝集能も上昇した。(2)B.heparinolyticusと口腔スピロヘ-タneuraminidaseの精製B.heparinolyticus(ATCC35895)の菌体抽出試料をB.gingivalisに準じて各種クロマトを行い、PAGEで単一バンドまで純化・精製(約26,000倍、回収率38.1%)した。一方、分離・同定したT.denticola(N-2-1)の酵素は菌体外産生性であり、培養遠心上清の硫安飽和画分を各種クロマトによって純化・精製(約26,000倍、回収率16.2%)した。両精製酵素の性状について、B.gingivalisのそれと比較検討中である。2.口腔スピロヘ-タT.denticolaの生物学的性状とプロテア-ゼ活性歯周病巣からの分離15菌株を電顕的形態、生物学的性状を検索した結果いずれもT.denticolaと同定された。各合成基質を用いて本菌(N-2-1)のプロテア-ゼ活性を調べ、菌体結合性のコラゲナ-ゼ様、トリプシン様、キモトリプシン様活性を認めた。各プロテア-ゼはイオン交換クロマトで分画・分離され、口腔スピロヘ-タのプロテア-ゼが極めて多様であることがわかった。各酵素は現在精製中でこれら性状を明らかにしたい。
海洋有機炭素―微生物連鎖系の動態解析：網羅型研究手法を導入した新規アプローチ

3ヶ年計画の最終年度に際し、ここでは研究計画全体の進捗を含めて評価を行う。本研究では、第1年度において実験手法の確立が行われた。第2年度において、これらの過程で得られた結果をまとめた主著論文が出版され、実験系の確立に関する目標(1)が達成されている。目標(1)において確立された実験解析系は、さらに現場環境へ応用した上で、物質循環において鍵となる微生物群を抽出する作業が必要である。第1年度から第2年度にかけてこの現場実験が実施され、分析が実施または一部完了した。研究計画最終年度にあたる本年度は、本実験における代謝物・微生物系統群に関するデータの取得が完了したことで、その両者のデータの統合的な解析を進めた。この作業を通じて、海洋における微生物の系統群情報と代謝物動態との間に不整合な状態が生じる現象を捉えた。今後、本成果の投稿が行われる予定であり、これに伴って、課題(2)が達成することが見込まれる。これにより、本研究において計画されていた課題は概ね達成されると考えられる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。当該年度は、研究一年目として、海洋微生物群集による有機物の変換過程を網羅的に追跡する実験解析系を確立することを目標とした。この目標を達成するために、まず始めに、海水中の微生物群集から代謝物を回収するプロトコルの構築を行った。試料中の菌体を濃縮回収するために、複数の濾紙製品についてその適合性を検討し、最適な製品を選定した。次に、濾紙上に捕捉した菌体を破砕し、菌体の代謝物を回収する手法を確立した。最後に、この試料を核磁気共鳴法メタボロミクスによる分析へ持ち込むことで、代謝物の測定を行った。次に、本手法と安定同位体標識法とを組み合わせ、微生物群集による有機化合物の転換プロセスを追跡する実験解析系を構築した。沿岸域から採取した海水試料に安定同位体標識モデル有機化合物を添加したのち、培養を行った。培養完了後、構築したプロトコルに基づいて試料を処理し、シグナルの取得および各有機化合物の存在量の決定を行った。その結果、培養1日後には、微生物の菌体内にアミノ酸や糖、有機酸といった幅広い有機化合物群が存在することが明らかになり、また、これらの有機化合物群の組成は、添加基質の濃度や培養時間によって大きく変動することが分かった。これらの結果は、安定同位体標識法および核磁気共鳴法を現場環境に適用することで、微生物群集が変換する有機化合物群の動態を網羅的に検出することが可能であることを示している。これにより、初年度の目標を達成した。初年度の目標を達成したことにより、研究は概ね順調に進捗しているといえる。研究第2ヶ年目にあたる本年度は、下記の3つの目標を設定して研究を実施した。(1)前年度(第1ヶ年目)に確立した「実験的解析手法」の成果を公表すること(2)前項(1)において確立した手法の「現場環境への導入」を完了すること(3)前項(1)および(2)の結果を踏まえた新規の実験系を確立することはじめに、「海洋微生物群集の代謝物変換パターン」を網羅的に検出する手法について、安定同位体炭素標識モデル有機化合物および核磁気共鳴法メタボロミクスを導入した実験解析系の確立に取り組み、確立した手法に関する論文発表を行った。これを通じて、目標(1)を達成した。次に、「モデル有機化合物の変換パターン」を現場環境において追跡するために、沿岸海域において培養実験を実施し、この実験によって採取された代謝物・遺伝子に関する試料の分析を完了した。これによって、目標(2)を達成した。また、前項(1)および(2)において得られた知見を一般化するために、現場環境における有機化合物の組成をより反映させた実験系の確立に新たに取り組んだ。具体的には、海洋における主要な有機物生産者である植物プランクトンと、その消費者である微生物との培養系を確立した。確立した実験系において、試料の採取を行った。これにより、目標(3)を達成した。設定した目標を達成したことにより、研究は概ね順調に進捗している。初年度の目標を達成したことにより、次年度以降も、当初の研究計画に沿って研究を実施する。2年度目は、初年度に確立した解析系とその他の分析手法とを組み合わせ、情報を高度化する。

具体的には、本手法と微生物系統群の解析手法とを結合することで、現場において変換される有機化合物群と、その変換に寄与する微生物系統群が抽出されることが期待される。研究の最終年度にあたる第3ヶ年目は、下記の具体的な3点の達成を目指す。(1)2ヶ年目の項目(2)において得られた成果の公表を行うこと(2)2ヶ年目の項目(3)における実験から取得された試料の分析を完了させること(3)研究3ヶ年の結果をまとめ、報告書を提出することはじめに、微生物の「有機化合物変換パターン」を網羅的に検出する現場培養実験(2ヶ年目、項目2)について、得られた代謝物の情報と微生物群集の情報とを統合する。これにより、現場環境における有機化合物の変換パターンと、その変換に関与する微生物群集を抽出する。この成果を公表することで、目標(1)の達成を目指す。次に、研究2ヶ年目に確立した「植物プランクトンー従属栄養性微生物の培養系」について、得られた試料の分析を完了させる。これにより、目標(2)の達成を目指す。また、第3ヶ年目は計画完了年度にあたるため、研究3ヶ年において得られた結果を取りまとめ、本研究から得られた新規的な知見について記した報告書を提出する。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
児童・生徒の主体的な問題解決を促進する生物教材の開発研究

本年度は,本研究の2年目であり,(1)生物学習における児童・生徒の学びのプロセスに関する調査,(2)問題解決を促進する生物教材の開発,(3)問題解決と生物教材の関連性に注目した生物教育カリキュラムの作成,の3つの観点から研究を行った。(1)の研究では,中学校理科「植物の世界」における葉のつき方を核にした単元構想とその実践を分析した結果,自作の立体モデルを利用した活動が,問題解決の予想の段階で葉のつき方と日光との関係や植物による葉のつき方の違いなどに関する疑問を導き,観察後の表現活動において葉の重なり方や規則性に関する気づきに発展させるような効果を発揮したことがわかった。(2)では,昨年度の研究で開発した3つの教材に加えて,(a)身の回りの植物の維管束の観察,(b)ヤドリギの分布調査の2つの教材化を行った。(a)では,従来行われている茎のつくりの観察を問題解決的な活動に発展させるために,身の回りの野草および水草の活用を試みた。教材化のための基礎研究では,37科80種の陸上植物と4科5種の水生植物の茎のつくりを調査して,維管束の配列などの形の観察によって認識可能な特徴を明らかにし,異なる種類の茎のつくりを比較観察することで茎の働きについて考察し,植物の環境への適応や進化を考えるような単元構想,授業計画,教材づくりを行った。この研究については,平成16年度日本理科教育学会四国支部大会および日本生物教育学会第78回全国大会で発表した。(b)では,地域の自然環境を生かした問題解決の事例として,河川敷の公園に生育しているヤドリギに注目し,松山市の石手川公園の分布調査を行った。(3)では,「花のつくり」「光合成」に注目した生物教育カリキュラムの構想について研究を行い,その成果を日本理科教育学会第54回全国大会と平成16年度日本理科教育学会四国支部大会で発表した。本年度は、基礎調査として、(1)観察・実験からみた生物教育カリキュラムの調査と分析、(2)生物教材に関する学習者の実態調査を行い、さらに(3)安全教育と関連させた反応時間を調べる実験教材、(4)動物園を利用した動物の行動に関する学習を支援するデジタル教材、(5)身近な植物の葉のつき方を調べるための教材開発を行なった。(1)の生物教育カリキュラムの調査では、第二次世界大戦後の中学校の教科書に掲載されている観察・実験を分析し、実験を通した学びのプロセスに関係する要素を抽出した。これまでに「花のつくり」「光合成」等についていくつかのポイントを見出しているが、来年度は、さらに検討する教材を増やして、学びのプロセスからみた教材間の関連性や系統性を検討していく予定である。(2)の実態調査については、中学1年生と大学生の「植物の葉のつき方」に関する認識を調査し、その特徴や傾向を分析した。中学生1年生については、多くの生徒が光の受け方との関連で葉のつき方を考えていたが、その推察から導かれる具体的な葉のつき方の表現は生徒によって異なることなどがわかった。なお、この研究は、(1)と(5)の研究と関連させながら実施しているものであり、カリキュラム研究、生徒の実態調査、教材開発を連携させながら進めている。(3)の教材開発は、生徒にとって身近な携帯電話の使用に関する安全教育の観点と、生物教育にけるヒトの反応の実験を関連づけて、主体的な問題解決を図ることを目指したものである。(4)は、小学校低学年から中学年を対象にした教材開発であり、動物園を学習の場として活用するためのデジタル教材を作成した。(5)は、教材開発から実践研究へと発展させたものであり、葉のつき方に関する野外調査の方法とつき方を表現するための教材を開発し、それを利用した学習における生徒の学びのプロセスを調査した。この成果は、日本生物教育学会第76回全国大会で発表した。

(b)では,地域の自然環境を生かした問題解決の事例として,河川敷の公園に生育しているヤドリギに注目し,松山市の石手川公園の分布調査を行った。(3)では,「花のつくり」「光合成」に注目した生物教育カリキュラムの構想について研究を行い,その成果を日本理科教育学会第54回全国大会と平成16年度日本理科教育学会四国支部大会で発表した。
プランク法を応用したヒト免疫不全ウイルス(HIV)の変異に関する基礎的研究

エイズの原因ウイルスであるヒト免疫不全ウイルス(HIV)は、その分離株の遺伝的性状から、非常に変異しやすいウイルスと考えられている。我々は、プラック法を用いて、このHIVをクローニングした。遺伝子構造およびその形質の点で、単一と思われるウイルスARV-C-1を選んだ。このウイルスを再クローニングする事により、プラックの形質(大きさ)が異なる2種のウイルス;ARV-C-1-3とARV-C-1-11を得た。さらにクローニング実験をくり返した。その結果、これらの子孫クローンウイルスの形質は、親のそれを引き継ぎ、同一であった。しかし、得られた数十株のクローンウイルスの遺伝子構造を制限酵素切断地図を用いて解析すると、かなりの頻度で変異が発生している事がわかった。その変異率は0.61.2×10^<-2>/年と計算された。この値は、患者から得られた種々の分離株から推定された値に近似していた。以上の結果から、プラック形成法のようにHIVを継代する実験では、このウイルスは、in vitroでもかなりの頻度で変異すると考えられた。以上の実験結果から、HIVの変異をin vitroで捉え、解析するには、プラック法が最適と思われた。しかし、さらに詳細な検討を行うためには、目的とする遺伝子部位の塩基配列を決定する必要があると思われた。現在、同様の手法を用いて、中和抗体から逃れる変異ウイルスを試験管内で証明しようと試みている。また、温度感受性変異ウイルスの作製も検討中である。これらの実験には、プラック法が重要な役割を果たすと考えられる。
走査型微小光共振器ラマンプローブ顕微鏡の開発と機械刺激に対する細胞応答の動態計測

界面選択的に細胞の力学応答に伴う高感度ラマン分光計測の実現のために、微小光共振器を細胞に接触させ機械刺激を与える方法を検討した。プローブ方法の改良に、レーザー光の圧力を用いた方法に切り替えることで、独自の非接触的なプローブ顕微鏡の開発に成功した。さらに、同一の顕微鏡下で、細胞1個の共鳴ラマン信号と粘弾性特性の両方の検出に成功したことから、細胞1個の粘弾性特性の分子起源に迫れることが期待できる平成24年度はラマン励起方法と、機械刺激に対する細胞応答計測の実験的・解析的検討の両面を進めた。まずラマン励起方法であるが、微小球を先端につけた走査型プローブを、ガラスキャピラリーを引き延ばし、先端を熱して丸める方法で作成したが、充分な光共振を得られるほどの真球を再現性良く作るのが困難であった。微小球共振器を使うことの本質的な理由は、多重反射による信号の増強と、界面選択性であるため、この部分については、界面選択性を獲得するために将来的には和周波発生法などの非線形分光を組み合わせて行うこととした。このとき、信号の増強を得るために、電子共鳴的な方法を使うことを検討し始めるに至った。この方法によれば、界面選択性を保ちつつも非接触で光圧による力学的刺激を与えることが可能になると思われる。試行的に、HeLa細胞を用いて、細胞の場所別の共鳴ラマン計測を行い、細胞突起部分と中央骨格部分でのラマンスペクトルの差異などの計測に成功した。この変更を受けて、非接触で界面選択的に細胞の力学応答に伴う振動分光計測を実現するために、非接触での機械刺激に対する細胞の力学的応答部分の研究を進展させた。具体的には、光子密度を上げて、細胞表面に光圧による変位を生み出して、その緩和応答を計測する手法を進化させ、1kHZから1MHz帯域での非接触力学的刺激に対する細胞応答の計測に成功した。具体的には酵母細胞、がん細胞、線維芽細胞、枯草菌(芽胞を含む)の計測を行い、完全応答できる低周波数機械刺激を高周波数側へ持っていくと、だんだんと細胞が応答できなくなり、最終的に熱揺らぎの中に応答が埋もれていく様子(熱ゆらぎ由来のパワースペクトルが計測でき、非接触での機械刺激に対する細胞応答測定装置を開発することに成功した。豊かな力学応答は10kHzから100KHz帯域で観測されたため、時間分解能は秒程度が今後の目標となる。さらに、同一の顕微鏡下で、細胞1個の共鳴ラマン信号と粘弾性特性の両方の検出に成功したことから、細胞1個の粘弾性特性の分子起源に迫れることが期待できる平成23年度は、細胞への機械的刺激と細胞の動態計測の測定並びに装置開発を中心に行った。具体的には以下の3点について検討した。(1)微小球のサイズと同じマイクロメートルにレーザービームを直接絞り込み、細胞の力学応答を、プローブビームで検出した。(2)走査型原子間力顕微鏡(AFM)探針を用いて、細胞に押し込み、力学的応答を測定、どのくらいの距離から、応答が始まるか、計測した。(3)レーザーラマン分光を行うための、AFMとレーザー光を組み合わせた光学路を設計・試作した。(1)については、HeLa(がん細胞)、Swiss3T3(繊維芽細胞)、酵母細胞について計測を行い、4KHzから1MHzの帯域で周期的力学・機械刺激を与え、その応答を計測し、細胞種ごとの力学応答の周波数依存性に個体差はあるものの明瞭な差異が認められ、機械刺激に対する力学応答の差異を議論する上での、基本的な実験条件等を確立した。(2)については、従来、1つのフォースカーブによって議論されていたが、我々の計測では2か所の傾きの変化する、3段階のフォースカーブが計測された。従来、1つのヤング率の値で、細胞の弾性が議論されていたので、本結果は、押し込み深さによって、その値が定数ではなく、変わり得うることを示していると考えられ、大きな意義を持つものと思われる。本結果は細胞外マトリックスや裏打ち膜蛋白質、サイトゾル等の深さ方向の階層構造を反映している可能性があり、押し込み深さにより、刺激を主に与える場所が変わる可能性が示唆された。この点に関しては引き続き定量的な検討・解析を進めていく。(3)については、基本的な光学設計を完了し、次年度への基盤とした。細胞に対する力学刺激・機械的刺激は比較的順調にかけることができ、細胞種による力学応答の違いが計測された。また、従来1つの値で代表されていた押し込み変形に対するヤング率が、押し込み深さによって、異なる値をとることを見出したのは予想外の成果であり、学術的にも興味深い知見を得た。これらの内容で現在、2報の論文投稿準備中である。上述の点は予想以上の進展であったが、一方で、微小球の最適な取り付け方、またレーザーによる励起方法は、次年度の検討課題として残った。微小球の取り付け部分からの光漏れや、レーザーの集光光学系について、本年度中に検討した結果(1)微小球への光導入を、光導波路を通じて行うこと、

(2)(計画では光の導入、信号の集光は同一の対物レンズで行う予定であったが)、光の導入は、カンチレバー上方から、カンチレバーの先に突き出た光導路を通じて、またラマン信号の取得はカンチレバー側面から行うこと、でより効率的な励起・信号の取得ができる光学系に設計をし直し、基本的な光学路の設計が終了した。以上を総合すると、機械的刺激に対しては予想以上の進展が得られたものの、光学系に対して改善しなくてはいけない困難な点が発見されたので、分光に対しては当初の計画に比べてやや遅れたものの、その解決策を見出しそのための基本設計が終了したので、全体としては概ね順調に進展していると考えている。微小球まわりの光学設計の最適化・実験等は当初の計画よりやや遅れている感があるので、この点に関してH24年度は集中的に進めたい。とりわけ、レーザー光の導入方法、ならびに微小球のAFMのカンチレバーへの取り付け方に、工夫を施さないと、細胞表面以外からの一般のラマン散乱光との識別、共振の効率に難しさが生じる。対応としては、計画設計段階のイルミネーションコレクションモードではなく、カンチレバー上面から微小球に光をin、側面から伝搬ラマン散乱光を拾うなどの対応で、目的のラマン信号を得たい。この点をクリアできたら、時分割測定等は、ミリサブミリ領域であり、電気回路的にも特に問題なく進められると予測している。備品としては、対物レンズの深度方向の調整が、手動では大変厳しいレベル(マイクロメートル以下)であることが判明したので、対物レンズ用のピエゾZステージを導入することで、これを解決する。他は、消耗品、旅費、その他、計画書通りの使用を計画している。
表層微小管の安定性に対する光の影響

植物細胞の伸張方向は、時事刻々と変化する環境情報に従って間期表層微小管が配向することによって制御されている。シクロヘキシミドで蛋白質合成を阻害すると短時間のうちにこの表層微小管が細胞質に移行する事から、我々は表層微小管を細胞膜と結合する因子の中に代謝回転の速い蛋白質が存在し、光屈性などで見られるように時事刻々と変化する情報に対応して微小管の配向を変化させていると考えている(Mineyuki et al. 1994,Plant Physiol. 104,281-284)。光屈性では特定の光受容物質を介して情報伝達が行われているため、微小管の配向制御は照射する光の波長によって影響を受ける。そこで、本研究では表層微小管の細胞膜との結合の安定性が光条件で変化するかどうかを調べることを目的として研究を行った。暗所で4日間育てたタマネギ実生を白色光下でシクロヘキシミド処理を行うと、根端2mmの分裂組織にある間期細胞ではほとんどすべての細胞で表層微小管が細胞質に移転する。まず、青、緑、赤、近赤外光などの異なる光条件下で、タマネギ実生にシクロヘキシミド処理を行った場合、根端分裂組織の間期細胞の微小管が細胞表層にどの程度保たれているか調べた。その結果赤色光下で行った実験では、他の光条件下での実験に比べ表層微小管の細胞質への転移が遅くなることが示唆された。様々な照射条件を検討した結果、シクロヘキシミド処理前に1時間光処理を行ったもので、赤色光下と暗所での表層微小管を持つ細胞の割合の差が一番大きくなった。光屈性の際の微小管の配向変化にフィトクロムが関与しているという最近の報告(Zandomeni and Schopfer, 1993,Protoplasma, 173,103-112)もあるので、この結果が、フィトクロムの関与によるものがどうか、今後調べていきたいと思っている。
ヒトiPS細胞由来3次元培養組織を用いたウイルス大脳感染機序の解析

今回の研究ではヒトCMV中枢神経感染特有の新たな病理機序を研究することを目的としていた。実験を進めるにあたって、iPS細胞から3次元大脳培養組織を作成することが難しく、当初の計画通りに実験は進まなかった。しかしその過程でCMV血行感染における初期感染病理機序の解明が進み、感染初期には血液脳関門がCMV粒子に対して機能的に働き、integrinβ1の分布が大切であることがわかった。これらの結果はAmerican Journal of Pathology誌、Journal of Visualized Experiments誌、Pathology International誌に論文を発表した。日本では毎年約1000人の神経障害をもった症候性サイトメガロウイルス(CMV)患者が発生している。ダウン症につぐ大きな先天異常であり毎年膨大な医療費を必要とする。CMV先天異常の新たな感染機序を解明することは将来の先天CMV感染の予防・治療にとって必要不可欠である。今まで大脳CMV感染機序の解析はマウスモデルを中心に行われた。ヒト大脳でのCMV感染実験には限界があるため、ヒトCMV中枢神経感染機序はほとんどわかっていない。2013年にヒトiPS/ES細胞から大脳立体組織を作成するという画期的な方法が報告された。2012年にはヒトiPS細胞から血液脳関門(BBB)をin vitroで再現する新しい技術も発表された。今回の研究ではこれらの新しい技術を用いて、申請者らが提唱してきたマウス大脳CMV感染モデルをヒトモデルで検証し、ヒトCMV中枢神経感染特有の新たな病理機序の解明や治療法につなげることを目的としている。まず申請者らはヒトiPS細胞より3次元大脳組織を安定的に作成するための技術を獲得する計画である。作成されたヒト3次元大脳組織を用いてHCMVの感染実験を行い、今まで申請者らが提唱してきたマウスCMV大脳感染モデルがヒト大脳モデルにおいても成り立つかを検証する。次に血行性大脳感染時においてHCMVがいかにしてBBBの破綻を引き起こし、脳実質に侵入するのかを検索する予定である。そのためにヒトiPS細胞より血管内皮細胞、血管周皮細胞を分化・分離後にin vitroヒトBBB 3次元モデルを作成し、CMV感染実験を行う計画である。実際のウイルス感染の病理をマウスで解析するために、新生仔マウスを使った血行感染により、ウイルス粒子と感染パターンの詳細な検索をおこなった。MCMVの髄腔内/静脈内投与では、microbeadsの分布とウイルス感染分布はほぼ一致することがわかった。NIH3T3でのCD29のknockdownやfunctional blockingでMCMV感染感受性は低下した。MCMV血行性/髄腔内感染どちらにおいてもCD29高発現細胞とMCMV感染細胞とは90%以上の相関がみられた。これらの結果から大脳における急性期CMV感染分布を規定するうえで、MCMV粒子の物理的な広がりとCD29の発現の両方が重要であると考えられる。今回申請ではヒトiPS細胞由来の大脳組織を安定的に供給できる方法を詳細に検索し明らかにする。そして作成された大脳の高次構造の確認を行った後に、マウス大脳CMV感染モデルの検証・解析を行う予定であった(14)。次にHCMVがBBBの破綻を如何にして引き起こすのかをin vitro BBBヒトモデルで実験し、MMP9, CyPA因子を中心にCMVのBBB破綻機序の解析をする(5,6)。以下が16までの計画の詳細である。1:ヒト3次元培養脳においてHCMV感染で小頭症を誘発するか否かの検討。2:ヒト3次元培養脳におけるSOX2、nestin陽性神経幹/前駆細胞のHCMV感染感受性の確認。3:神経幹細胞より分化した新生ニューロンの移動がHCMVによって阻害されるか否かを解析。4:ニューロンでHCMVが持続感染するのか否か、ヒト三次元培養脳で明らかにする。5:ヒトiPS細胞より血管内皮細胞、血管周皮細胞を分化させ、transwellに付着培養させる。in vitroBBBモデルを確立した後にHCMVを感染させ、BBBの透過性の亢進性を検討する。6:HCMV感染後のBBBにおけるCyPA, MMPの蛋白発現量の変化や、MMPによる蛋白分解能を調べる。またBBB破綻に関わる新規蛋白の検索や、BBB保護作用のある薬物を検索する。現在はヒト新生児皮膚線維