hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生産・加工空間におけるストレス操作によるカンキツ成分制御法の確立

果実の前倒し収穫や,仕上げ摘果などにより廃棄される果実から,健康機能性成分を抽出することができれば,労働力分散と合わせて,廃棄果実の付加価値化が達成できる。そこで,ウンシュウミカン(宮川早生)の生産空間におけるストレス付与を,マルドリ栽培システムを用いた灌水制御により行いながら,収穫時期や貯蔵温度が果実の成分に与える影響を検討した。その結果,ストレス栽培果実の場合,前倒し収穫(適期の一カ月前)時や収穫後の貯蔵がクエン酸含量を減少させる一方,糖含量を増大できることを示した。また,異なる温度ストレス条件で保存した果実や加工処理を行った果実の糖酸組成の変化を確認した。またウンシュウミカン全果に対して,加工空間における物理学的ストレスである磨砕作用を与えるMWMシステムを用い,その粉砕特性を明らかにした。具体的には,粉砕時間が短く,安定して粒径の小さなスラリーを作製できる30 mL/min供給,50 rpm石臼回転の粉砕操作が好ましいことが示された。さらにウンシュウミカン全果を材料に用いて噴霧乾燥で作製した粉末の物理的特性に関しては,良好な物理的特性が得られる賦形剤(マルトデキストリン;MD)60 %以上の試料を使用することが望ましいことがわかった。さらに,MD濃度を変化させた際の粉末の生理化学的特性に与える影響を検証し,機能性成分を保持する粉末を噴霧乾燥により作製するためには,試料が乾燥塔の壁面に付着する課題を改善すべき必要があることがわかった。特に原料に含まれる脂質による影響が大きいと考えられることから,乳化操作を検討する必要性があると考えられた。光環境ストレス制御による応答生成質の評価として,保健機能性成分,すなわち,果皮を中心に果肉内のカロテノイド類,β-クリプトキンサンチン,また抗菌性物質の定量分析をカンキツ類の複数分類群について行うことができた。これらの結果から,供試される宮川早生,興津早生の後代である既成・新規品種での保健機能性成分のプロファイリングを通じて効率的な成分抽出を図ることのできる分類群の比定を行った。さらにSDを用いて,MWMにより粉砕されたカンキツスラリーの噴霧乾燥を行い,スラリーの調整(水分,粒度,賦形剤の有無・濃度など)や供給速度,乾燥温度などの操作条件が,パウダーの物性(粒度特性,水分,流動特性,密度など)および前述した栄養成分や酵素活性に与える影響を明らかにできた。以上の結果から,研究はおおむね計画通りに進行していると判断した。これまでの糖酸の増減や組成の変化のデータを精査し,水分,温度ストレス条件下での糖酸の生成・消費のメカニズムを考察し,新たな知見の作出を試みる。また,生産現場におけるストレスを付与した栽培として光環境でのストレスを取り上げ,照射する光の波長,照射時間,強度などを基に応答生成物質の評価や光合成能力の定量化を行う。また機能性成分については,ウンシュウミカン粉末中のβクリプトキサンチンについて,常温での保存の可能性を示した。さらに,脂質代謝の促進効果のあるアルカロイドのシネフリンを取り上げ,2次代謝生産物の保存方法として行われている温度条件(-20°Cと4°C)を変え,その分解の程度を比較することにより一般化できる保存条件を確定する。これにより今まで活用されずに捨てられていたカンキツの果皮を食品や薬品,家畜飼料として広く製品化できることを提案できる。またウンシュウミカン全果の機能性成分を保持した粉末を作製するため,賦形剤の種類,噴霧乾燥操作条件,乳化剤の選定の条件を検討し,収率や機能性成分の保持率を向上させる条件を策定する。本年度は栽培空間におけるストレス操作の解析として、水環境のストレス制御による応答生成物の評価を行った。温州ミカン(宮川早生)を対象に慣行栽培による収穫果実と、夏季から収穫期まで水分を透湿性プラスチックシートなどで物理的に遮断し、水分ストレス状態で栽培した収穫果実を本年度の試供果実とした。試供果実は収穫時期などの違いから、慣行の12月上旬の収穫時期の果実、以下"通常収穫"と、意図的に1月下旬まで収穫を遅延させ、樹上で完熟させた果実、以下"樹上過熟"とし、さらに収穫果実を1月下旬まで常温貯蔵した果実、以下"過剰保存"として大別した。これらの果実を加工前の生試料として糖成分組成、酸成分組成、クマリン組成などの評価を行った。また加工空間におけるストレス操作の解析として、MWMにおけるストレス操作が栄養成分に与える影響を明らかにするため、MWMを用いた試供果実のスラリー化を行い、その粉砕力、粉砕温度、粉砕時間の評価を行った。具体的には家庭用のミキサーを用いて、ヘタ部分を取り除いた外果皮と果肉を3分間粗粉砕した。粉砕後、レーザ回折式粒度分布測定装置によりメディアン径を計測した。続いて先行研究より、原料供給流量及び石臼回転数が被粉砕物の粒径に影響を与えることが報告されているMWMについて、それら操作条件である原料供給流量を10、20、30、40 mL/min、石臼回転速度を20、29、39、50rpmにそれぞれ調整を行い、粉砕・スラリー化特性を明らかにした。さらに試供果実のスラリー化したものを加工試料とし、同様に糖成分組成、酸成分組成、クマリン組成を評価し、生試料との比較評価、検討を行った。温州ミカン(宮川早生)を対象に慣行栽培による収穫果実と水分ストレス状態で栽培した収穫果実を収穫時期などの違いから大別し、試供果実とした。これらについて加工前の生試料として成分組成を解析した。

糖成分組成、酸成分組成は、果実をハンドプレスにより搾汁したのち、遠心分離によりパルプ部分を除去し、上澄みを0.45μmのフィルターでろ過し試料とした。調製した試料をHPLCにより、糖組成(グルコース・フルクトース・スクロース)、有機酸組成(クエン酸・リンゴ酸・αーケトグルタル酸)について分析した。検出は糖については示差屈折率検出器、酸については電気伝導度検出器により実施した。クマリン組成については、試供果実の果皮および果汁を用いて行った。1g重を試料とし、國賀ら(2005)の方法を用い、脂溶成分を抽出して薄層クロマトグラフィーに展開した。その後紫外線を照射して蛍光を発するクマリンを検出し生成量が予想とより多い処理加工についてHPLCによるスコパロンの定量も試みた。また供試ミカンのMWM粉砕では、原料供給流量が20 mL/minまでは、石臼回転速度を上昇させると粒径も増加した。30 mL/min以上では石臼回転速度が上昇するほど粒径は小さくなった。原料供給速度が10、20 mL/minの時ではメディアン径が最も小さかったが、供給速度が低いため、石臼が空引き状態になることがあった。30と40 mL/minを比較すると30 mL/minの方が小さい粒径を得ることができた。また40 mL/minの場合、MWMの中心軸部分から原料漏れが確認された。試供果実のスラリーについても、同様に糖成分組成、酸成分組成、クマリン組成を評価し、生試料との比較検討を行った。現在、測定データを解析しており、研究は概ね順調に進行している。果実の前倒し収穫や,仕上げ摘果などにより廃棄される果実から,健康機能性成分を抽出することができれば,労働力分散と合わせて,廃棄果実の付加価値化が達成できる。そこで,ウンシュウミカン(宮川早生)の生産空間におけるストレス付与を,マルドリ栽培システムを用いた灌水制御により行いながら,収穫時期や貯蔵温度が果実の成分に与える影響を検討した。その結果,ストレス栽培果実の場合,前倒し収穫(適期の一カ月前)時や収穫後の貯蔵がクエン酸含量を減少させる一方,糖含量を増大できることを示した。また,異なる温度ストレス条件で保存した果実や加工処理を行った果実の糖酸組成の変化を確認した。またウンシュウミカン全果に対して,加工空間における物理学的ストレスである磨砕作用を与えるMWMシステムを用い,その粉砕特性を明らかにした。具体的には,粉砕時間が短く,安定して粒径の小さなスラリーを作製できる30 mL/min供給,50 rpm石臼回転の粉砕操作が好ましいことが示された。さらにウンシュウミカン全果を材料に用いて噴霧乾燥で作製した粉末の物理的特性に関しては,良好な物理的特性が得られる賦形剤(マルトデキストリン;MD)60 %以上の試料を使用することが望ましいことがわかった。さらに,MD濃度を変化させた際の粉末の生理化学的特性に与える影響を検証し,機能性成分を保持する粉末を噴霧乾燥により作製するためには,試料が乾燥塔の壁面に付着する課題を改善すべき必要があることがわかった。特に原料に含まれる脂質による影響が大きいと考えられることから,乳化操作を検討する必要性があると考えられた。光環境ストレス制御による応答生成質の評価として,保健機能性成分,すなわち,果皮を中心に果肉内のカロテノイド類,β-クリプトキンサンチン,
呼吸類似酸化還元反応と共役したイオンの膜透過反応の解析と新規膜分離法の開発

生体内で呼吸-解糖反応が進行するとき、生体膜では、酸化還元に起因する電子の膜透過反応とそれに共役した高選択的なイオンの膜透過反応が生じる。本研究は、このような生体膜反応を、酵素やタンパクを含まず、化学的性質や構造の確定している化合物のみによって構成された人工液膜系で模擬・実現し、この膜透過反応を解析して、生体膜反応の基礎化学的理解を進展させようとしたものである。また、生体膜反応に学んで、新規な金属イオンやイオン性有機化合物の膜分離法を開発することも目指した。主たる研究成果を以下に記す。[1]新タイプの生体類似膜反応一般に、電荷の膜透過反応とは、電荷が一方の水相から取り込まれ、膜を横切り、他の水相へ放出される反応である。しかし、電荷が水相のある場所で膜に取込まれ、膜中を移動して、別の場所で元の水相に戻る反応(平行膜透過反応I)、あるいは電荷がある場所で膜から水相に移動し、水相中を移動し、別の場所で膜に戻る反応(平行膜透過反応II)も膜透過反応と見なすことができる。本年度は、平行膜透過反応IIの全容を解明し得た。[2]水相/有機相界面電荷移動におよぼす界面吸着脂質単分子層の影響水相/有機相界面の研究から生体反応に関する高度な情報を得ようとするなら、水相/有機相界面電荷移動におよぼす界面吸着リン脂質の影響の評価を行わなければならない。この視点に立って、リン脂質の電荷移動におよぼす影響を、液滴電極電荷移動ポーラログラフィーおよび界面張力測定によって明らかにした。[3]水相/有機相界面イオン移動自由エネルギー決定法の開発生体膜界面を水相/有機相界面によって模擬しようとするとき、親水的イオンの水相/有機相界面移動自由エネルギー(ΔG_<tr>^0)に関する知見は不可欠である。本研究では、目的イオンとH^+の2つのイオンの水相/有機相間分配比を求め、これと別途求めておいたH^+のΔG_<tr>^0を利用して、目的イオンのΔG_<tr>^0を決定する方法を確立した。生体内で呼吸-解糖反応が進行するとき、生体膜では、酸化還元に起因する電子の膜透過反応に共役して高選択的なイオンの膜透過反応も生じる。本研究では、この共役膜透過反応に学んだ新規なイオン分離法の開発を目指した。そのために、酵素やタンパクを含まず、化学的性質や構造の確定している化合物のみによって構成された人工液膜系を実現し、そこでの膜透過反応を解析し、生体膜反応の基礎的理解を図った。まず、キノン誘導体であるテトラクロロヒドロキノン(CQH_2)を含む1,2-ジクロロエタンを液膜(LM)とした人工液膜系を構築し、水溶液(W)中の酵素と膜中のCQH_2のW/LM界面酸化還元反応を、界面電位差と界面電流の関数として調べた。その結果、界面酸化還元反応は界面電位差に依存して3種の異なったものになること、W、LM中の生成物も界面電位差によって異なること、また、この酸化還元反応は界面イオン移動反応と共役して自発的に進行し、移動イオンの疎水性度によって、酸化還元反応を選択・制御できることが分かった。次のような新規な膜透過反応の特性も解明した。

一般に、膜透過反応とは、電荷(イオンや電子)の膜(M)を介した一方の水相(W1)から他方の水相(W2)への移動を意味するが、電荷がW1からMに取り込まれ、再びW1に放出される反応も、膜透過反応の1種と見なせる。後者は、生体内でもしばしば生じると考えられる。ここでは、W1/M界面の2地点に電位差を与え、W1→M→W1膜透過反応を実現し、その基礎的特性を解明した。また、この膜透過反応に伴って2地点の中間の地点でも電荷のW1/LM界面移動が生じること、およびその理由を電気化学の基礎理論に拠って明らかにした。一方、膜をイオンが透過するとき生じる膜電位の振動についても、その機構の全容の解明に成功した。本研究は、生体膜での呼吸反応に類似した反応を、酵素やタンパクを含まない人工液膜系で実現し、その反応に関与する素過程を電気化学の基礎概念と方法論によって解明して、生体膜反応の本質の理解を進展させようとするものである。本年度は次の3件の研究が進展した。[1]新タイプの生体類似膜反応一般に、電荷の膜透過反応といえば、電荷が一方の水相から取り込まれ、膜を横切り、他の水相へと放出される反応を意味する。しかし、電荷が水相のある場所で膜に取込まれ、膜中を移動して、別の場所で元の水相に戻る反応、あるいは、電荷がある場所で膜から水相に移動し、水相中を移動し、別の場所で膜に戻る反応も膜透過反応と見なすことができる。後者を平行膜透過反応と呼ぶことにした。検討の結果、(1)平行膜透過反応は、水相中あるいは膜中の2地点間に膜に沿った電位勾配が存在するとき生じること、(2)平行膜透過反応では、水相/膜界面電位差も膜に沿って変化するので、膜のある部分は特定の電荷の水相から膜への取込みや膜から別の水相への放出に適した界面電位差となり得るので、平行膜透過反応は垂直膜透過反応を誘起することが分った。平行膜透過反応およびそれに伴う垂直膜透過反応の理解は、生体膜でのイオンや電子の移動とその共役関係の解明の基礎を与えると期待される。[2]人工液膜系での呼吸類似反応のボルタンメトリー的概念による理解膜と見なせる有機相中のヒドロキノン誘導体と水相中の酸素との界面酸化還元反応と、それと共役したプロトンの界面移動反応をほぼ完全に解析し、水相/有機相界面では均質溶液では生じ得ない特異な反応が生じることを明らかにした。[3]微小水相/有機相界面ボルタンメトリーの開発従来の水相/有機相界面電荷移動ボルタンメトリーのもつ、親水性イオンの移動を観察できない、低誘電率溶媒には適用できないなどの難点を、界面を微小化することによって克服した。生体内で呼吸-解糖反応が進行するとき、生体膜では、酸化還元に起因する電子の膜透過反応とそれに共役した高選択的なイオンの膜透過反応が生じる。本研究は、このような生体膜反応を、酵素やタンパクを含まず、化学的性質や構造の確定している化合物のみによって構成された人工液膜系で模擬・実現し、この膜透過反応を解析して、生体膜反応の基礎化学的理解を進展させようとしたものである。また、生体膜反応に学んで、新規な金属イオンやイオン性有機化合物の膜分離法を開発することも目指した。主たる研究成果を以下に記す。[1]新タイプの生体類似膜反応一般に、電荷の膜透過反応とは、電荷が一方の水相から取り込まれ、膜を横切り、他の水相へ放出される反応である。しかし、電荷が水相のある場所で膜に取込まれ、膜中を移動して、別の場所で元の水相に戻る反応(平行膜透過反応I)、あるいは電荷がある場所で膜から水相に移動し、水相中を移動し、別の場所で膜に戻る反応(平行膜透過反応II)も膜透過反応と見なすことができる。
長繊維強化積層セラミックスの構造設計とプロセッシング

コロイドプロセッシングで長繊維織物/ムライトマトリックス複合材の成形が十分可能で、その加圧焼結性は大変高いことが証明された。複合材料の透過型電子顕微鏡観察で、繊維/ムライトマトリックス界面に10nm幅のグラファイト層及び粒径0.10.2μmのTiC析出物を確認した。グラファイト層は(0002)面が界面に平行に発達しているので、複合材料の引き抜き効果が期待できる。繊維には1030nmのβ-SiCとTiC粒子及び短周期のグラファイト相が認められた。繊維にはアモルファス相のシリカが残存していることも判った。繊維の結晶化は繊維中のアモルファス相の生成と共に進むものと思われる。Si-Ti-C-O織物/ムライト積層材における主クラックスはいずれの試料でもムライト層を加圧方向と平行に貫通し、繊維層で90°に偏向した。積層材中のムライトの破壊靭性はムライト単体のそれより大きく、クラック先端が繊維層に近づくにつれて破壊抵抗が増大することがわかった。積層材のこれらの力学的性質について理論計算を行い、問題点を整理して、微視的かつ巨視的なアプローチが必要であることを指摘した。そして、これらの問題点を実験的な立場から調査し、平織構造繊維とマトリックスの弾性係数、熱膨張の差に起因して形成される内部応力を測定して、破壊強度を考察した。さらに繊維構造の形状の不均一性に起因して積層材料内には、場所的に不均一な応力場が形成されることを実験的に明らかにした。繊維近傍の局所的な応力場ならびに巨視的な長範囲応力場の重畳を考慮することにより、積層材プロセスの問題点並びに破壊挙動が理解できた。鞍状曲げ試験により複合材料の引っ張り/圧縮強度を評価した。その強度はムライト単体のものより低かった。破壊パターンと破面観察により以下の破壊プロセスを仮定した。ムライトと繊維間の熱収縮差により生ずる残留応力により微視亀裂が発生し、鞍状試験のせん断応力により成長、連結して巨視亀裂になる。それがモードII破壊を生じ、主応力と垂直な方向に進展し試験片の破壊に至る。積層材のプロセスの改善を目指し、無機高分子の熱分解法をコロイドプロセスに併用した。ムライト/ポリチタノカルボシラン/キシレン系からドクターブレ-ド法でシートを成形した。これを窒素雰囲気中で加圧焼結し、ムライトとポリチタノカルボシランの反応性を調べた。1400°1600°の生成相はムライト、Si-Al-O-N(Si_2Al_3O_7N又はSi_<12>Al_<18>O_<39>N_8)、α-Al_2O_3、β-SiC及びTiNであった。焼結体の組織観察から生成相はムライト-C(ポリチタノカルボシランから供給)-N_2系の反応によるものと考えられた。当初計画したコロイドプロセッシングで長繊維織物/ムライトマトリックス複合材の成形が十分可能で、その加圧焼結性は大変高いことが証明された。さらに繊維量の調整と加圧焼結条件の選択により、複合材は高い強度と非線形破壊を示すことが明らかになり、本研究の目的に沿った材料が作製可能であると判断された。そして、特定の作製条件と複合材の微細構造の関係、複合材料内に誘起される内部応力の大きさと応力集中については解析法から検討している段階である。この際コンピュータを利用した応力計算は複合材料の組織のあり方に大きく影響を与えるであろう。一方で、プロセッシングの再現性と改善を計りつつある。本研究で合成したアルミナ添加炭化ケイ素の破壊靱性は5-6MPa・m^<0.5>に達し、世界最高値に匹敵している。微構造の制御によりさらに高い靱性が得られる可能性がある。有限要素法を用いて、焼成プロセスによって生じる強化繊維近傍の残留熱応力を求めた。また織物を構成する繊維の一束を楕円柱で近似して、同様の熱応力を求めた。長径端部に応力が集中している様子が把握できた。鞍状曲げ試験を行い、引張/圧縮応力下における繊維強化複合材料の破壊挙動を調べた。破面形態が複雑になっていることから、破壊抵抗値はムライト単体より大きいことが考えられる。

そして、これらの問題点を実験的な立場から調査し、平織構造繊維とマトリックスの弾性係数、熱膨張の差に起因して形成される内部応力を測定して、破壊強度を考察した。さらに繊維構造の形状の不均一性に起因して積層材料内には、場所的に不均一な応力場が形成されることを実験的に明らかにした。繊維近傍の局所的な応力場ならびに巨視的な長範囲応力場の重畳を考慮することにより、積層材プロセスの問題点並びに破壊挙動が理解できた。鞍状曲げ試験により複合材料の引っ張り/圧縮強度を評価した。その強度はムライト単体のものより低かった。破壊パターンと破面観察により以下の破壊プロセスを仮定した。ムライトと繊維間の熱収縮差により生ずる残留応力により微視亀裂が発生し、鞍状試験のせん断応力により成長、連結して巨視亀裂になる。それがモードII破壊を生じ、主応力と垂直な方向に進展し試験片の破壊に至る。積層材のプロセスの改善を目指し、無機高分子の熱分解法をコロイドプロセスに併用した。ムライト/ポリチタノカルボシラン/キシレン系からドクターブレ-ド法でシートを成形した。これを窒素雰囲気中で加圧焼結し、ムライトとポリチタノカルボシランの反応性を調べた。1400°1600°の生成相はムライト、Si-Al-O-N(Si_2Al_3O_7N又はSi_<12>Al_<18>O_<39>N_8)、α-Al_2O_3、β-SiC及びTiNであった。焼結体の組織観察から生成相はムライト-C(ポリチタノカルボシランから供給)-N_2系の反応によるものと考えられた。ムライト/ポリチタノカルボシラン/キシレン系からドクタープレード法でシートを成形した。1400°-1600°Cの生成相は、ムライト,Si-Al-O-N(Si_2Al_3O_7N又はSi_<12>Al_<18>O_<39>N_8),α-Al_2O_3,Si_2ON_2,β-SiC及びTiNであった。焼結体の組織観察から生成相はムライト-C(ポリチタノカルボシランから供給)-N_2系の次式によるものと考えられた。Si-Ti-C-O繊維強化ムライト基複合材料の鞍状曲げ試験片の破面観察から、破壊は繊維束の試料表面最近傍部から発生したき裂から生じていることがわかった。外力とき裂発生部の内部応力の相互作用の観点から、この現象を有限要素法による応力解析を用いて説明することができた。複合材料の透過電子顕微鏡観察から、繊維内のグラファイトが確認できた。また、母材の析出物はTiC、繊維の析出物はグラファイト以外にSiC、TiC、およびシリカガラスであると推察された。Si-Ti-C-O織物/ムライト積層材における弾性挙動に及ぼす織物の影響を調べ,有限要素法並びに弾性論による評価法と比較して、最適なモデリングを行った。積層材中の残留応力を予測するとともに,圧痕法によって実測し、両者の一致を得た。さらに評価された残留応力が破壊強度に及ぼす効果を調べ、良い相関性を見い出した。破壊靱性を増加させる機構としての繊維の引き抜き効果を調べるため、超微小硬度計によるpush-out試験を開始し、実験条件の最適性を有限要素法により評価して試験が実施可能な状態としている。
ＤＮＡアダクトーム解析を応用したｉｎ　ｖｉｖｏ遺伝子傷害性・変異原性試験の確立

LC-MS/MSを用いたDNA adductome解析によるエストラゴール又はルビアジン特異的DNA付加体の検索を行い、本法による網羅的DNA解析の有用性を明らかにした。さらに、本法をレポーター遺伝子導入動物を用いたin vivo変異原性試験へ応用した結果、腎発がん物質であるアリストロキア酸を投与したgpt deltaマウスの腎臓及び肝臓における特異的DNA付加体形成とA:T-T:A transversionを特徴とする突然変異誘発性を明らかにした。以上より、本法は遺伝毒性評価のための有用なツールになりうると考えられた。平成24年度はLC-MS/MSによるDNAアダクトーム解析を用いた化学物質のDNA傷害性評価法の有用性を検討するため、エストラゴール(ES)を4週間強制経口投与したラット肝臓と、ルビアジン(Rub)を1週間混餌投与したラット腎臓及び肝臓について解析を実施した結果、ES又はRubに由来する既知のDNA付加体と複数の未知のDNA付加体を示すスポットが検出され、これらスポットの大きさは各被験物質の投与量依存的に増加することが確認された。以上より、本法を用いることで化学物質の迅速かつ網羅的なDNA傷害性評価が可能であることを明らかにした。平成25年度は本法をレポーター遺伝子導入動物であるgpt delta動物に応用したin vivo遺伝子傷害性・変異原性試験の確立を目的に、雌性6週齢のgpt deltaマウスにアリストロキア酸を0.2、1及び5 mg/kg/dayの濃度で4週間強制経口投与し、発がん標的臓器である腎臓と非発がん標的臓器である肝臓について、DNAアダクトーム解析とin vivo変異原性の検索を実施した。DNAアダクトーム解析の結果、アリストロキア酸に起因するDNA付加体のスポットは腎臓、肝臓ともに検出され、スポットの大きさは投与量依存的に増加した。in vivo変異原性の検索の結果、点突然変異頻度を示すgpt変異体頻度(MF)及び欠失変異頻度を示すSpi- MFsは、腎臓、肝臓ともに用量依存的に増加したものの、発がん標的臓器である腎臓では肝臓に比して高値を示すことを明らかにした。以上より、本法は化学物質の遺伝毒性について迅速かつ正確な評価が可能であることが示唆された。また、非発がん標的臓器である肝臓においてもDNA付加体及び突然変異誘発性が確認されたことから、潜在的な発がん物質の検出にも有効であると考えられた。平成24年度はLC-MS/MSによるDNAアダクトーム解析を用いた化学物質のDNA傷害性評価法の有用性を検討した。【実験1】では、エストラゴールを4週間強制経口投与したラット肝臓を用いて、m/z 300から600の質量範囲でDNAアダクトーム解析を行い、アダクトームマップを作製した。ES投与群ではm/z 398に1つ、m/z 414に2つの新たなスポットが認められ、これらのスポットはES-N6-dA、ES-N2-dG及びES-C8-dGと一致し、ESの投与量依存的大きくなることを確認した。ES高用量群のラット肝DNAでは、m/z 374にESとdCの付加体と考えられるスポットも検出された。また、これらのスポットはいずれもdG、dA及びdCの分子量の平均248.5にESの分子量を足した396.7 ±50の範囲内で検出されており、被験物質の分子量を基に検索質量範囲を限定することで迅速な網羅的DNA付加体解析が可能であると考えられた。【実験2】では、ルビアジンを1週間混餌投与したラット腎臓及び肝臓についてDNAアダクトーム解析を実施した。検索質量範囲は248.5 + 254.2 ±50を基にm/z 453から553とした。Rubを投与したラット腎臓及び肝臓のアダクトームマップではm/z 520、504、502及び480に新たなスポットが認められ、これらのスポットのうち2つはLuc-N2-dG及びLuc-N6-dA付加体と一致した。また、m/z 480はdCの付加体と考えられたものの、m/z 502及び数個のm/z504のスポットについては未知の付加体であった。これらの結果から、DNAアダクトーム解析法を応用することで、化学物質の迅速かつ網羅的なDNA傷害性評価が可能であることを明らかにした。本年度は構築したDNAアダクトームシステムをエストラゴール及びルビアジンを投与したラット肝臓又は腎臓DNAの解析に適用することで、化学物質のDNA傷害性評価法としての有用性を検討した。これらの実験はいずれも当初の研究計画通り進行した。また、得られた結果は化学物質のDNA傷害性評価法としてのDNAアダクトーム解析の有用性を裏付けるものであり、研究計画に変更の必要がないことから順調に進展しているものと考える。平成25年度は、平成24年度に構築したDNAアダクトーム解析法をgpt deltaラットに適用し、in vivo遺伝子傷害性・変異原性試験のアプリケーションを取得する。

雄性6週齢のgpt deltaラットに種々の遺伝毒性発がん物質を発がん用量で4週間投与し、主要臓器である肝臓、腎臓及び肺を用いて、DNAアダクトーム解析によるDNA付加体の検出と、点突然変異を検出するgpt assay及び欠失変異を検出するSpi- assayを実施し、変異原性を評価する。Gpt assayではシークエンス解析によってgpt遺伝子上に生じた変異パターンについても解析を行い、DNA付加体の種類や生成量と遺伝子突然変異頻度及び変異パターンについて考察する。これらの結果を基にDNAアダクトーム解析が化学物質によるDNA付加体形成を探索する有用なツールになることを証明し、さらに、gpt deltaラット組み合わせた化学物質のin vivo遺伝子傷害性・変異原性試験の確立を目指す。平成24年度に実施予定であった役務が当初の予定よりも低価格で行えたことから、予定額の一部を平成25年度分の消耗品費に充てることで、アプリケーションに使用する被験物質数を増やすことを予定している。
神経系の形態形成に関与する膜蛋白質PMP‐22の機能解析

(1)まず哺乳動物由来のbeta-アクチンプロモーターを接続した発現ベクターpBActSTneoBにラット及びヒトのPMP-22cDNAをそれぞれ挿入したベクターを作製した。これらの発現ベクターが正常に蛋白質を発現することを確認するために、COS-1細胞を用いてリポフェクチン法によりtransient transfectionを行った。72時間の培養の後、ラットPMP-22のc末端側12アミノ酸の合成ペプチドに対するポリクローナル抗体を用いて細胞を染色した結果、約20%のCOS細胞がラットPMP-22蛋白質を発現していることを認めた。次にリン酸カルシウム法を用いてCHO-K1細胞にトランスフェクションを行い、ラットおよびヒトのPMP-22蛋白質強制発現細胞株の確立を行った。しかしながらPMP-22蛋白質は増殖停止因子としての可能性も考えられており、理由ははっきりしないがstable transformantは選択できなかった。従って、再度、beta-アクチンプロモーター接続の発現ベクターによるtransfectionを行うと共にデキサメサゾン添加によりプロモーター活性の発現がコントロールされるpMAMneoベクターへそれぞれのcDNAを組み込み、現在、stable transformantの作製を行っている。次に予備的な実験ではあるがtransient transfectantを用いて、PMP-22蛋白質の機能的役割を検討する目的で細胞接着に関する実験を行った。その結果、PMP-22発現細胞と非発現細胞とは一様に混在し、特に発現細胞同士のホモフィリックな細胞接着は観察されなかった。今後、stable transformantを用いて更に詳しい機能アッセイを検討する予定である。(2)ラットDRGの初代培養系を用いて末梢神経系の発生過程におけるPMP-22蛋白質の時間的及び空間的発現様式を検討した。生後2日目のラットからDRGを単離し、コラゲナーゼを含む消化液にて細胞を単離した後、カルチャーデッシュにて培養した。幼若シュワン細胞がDRG軸索を認識し接着する過程におけるPMP-22蛋白質の発現様式を観察した結果、神経軸索を認識していない幼若シュワン細胞はPMP-22を発現しないが、軸索に接着しているシュワン細胞はPMP-22が強く発現していることが認められた。
圧力制御による分子間相互作用と機能発現の研究

これまでの有機ラジカルの磁性発現の研究から介電子の局在系あるいは非局在系の特徴が明らかにされてきたが、当研究ではそれらの磁気特性を圧力パラメータを変化させることによって調べている。加圧下の磁気特性の測定は、測定温度が極低温度領域であることも関係して困難であり、その方法論的確立にかかわる開発研究にも重点がおかれている。ここでは実験手段の改良に関する成果により、えられた実験データの実績について述べる。また、新たに測定した試料はトリフェニルフェルダジルであるが、これまでの結果をふまえて、圧力制御による分子間相互作用と機能発現について概要する。まず、有機ラジカルの磁性は圧力により大きく変化する。特に無機化合物磁性体と比較しその影響は著しい。磁気転移温度の圧力勾配は無機化合物磁性体の一桁あるいは50%程度大きいことが判明した。特に低次元性の著しい局在スピン系で顕著であった。これを分子間相互作用の変化になおしてみると、低次元性の一次元鎖の方向での分子間相互作用より鎖間方向の分子間相互作用の方が圧力に対して影響を受けやすいことが明らかになった。このため無機磁性体にみられない機能発現にかかわってくると思われる。いずれにしろ圧力により低次元物質から三次元磁性体への変化が結論される。また、その圧力依存性が結晶軸方向によって異なるため、無機化合物磁性体ではみられた対応状態の原理が破れていることがわかる。この結論は今研究によって初めて指摘された重要な結果であり、圧力を制御することにより、無機化合物にみられない磁気挙動が発現する可能性を示唆するものである。非局在系有機ラジカルでは常圧においてすでに広がったスピン系のため低次元磁性体といえども三次元的性格がすこし混在するため、圧力依存性は小さかったが、魚のスピン密度を有する骨格をしたラジカルでは分子面のずれに基づく新しい分子間相互作用と機能発現が期待される。
中性子散乱による分子性物質中の電子格子相互作用に関する研究

本補助金によって低温恒温槽(クライオスタット)を購入し、BEDT-FFT化合物のκ-(BEDT-TTF)_2Cu(NCS)_2,α-(BEDT-TTF)_2KHg(NCS)_4および擬1次元性ハロゲン架橋金属錯体;[MA_2][MA_2X_2]Y_2(M=Pt,Pd,Ni,A=en,chxn,X=I,Br,Cl,Y=ClO_4,BF_4,I,Br,Cl)について、室温以下の各温度において、中性子錯乱強度測定を行った。また擬1次元性ハロゲン架橋金属錯体について低温粉末x線回折測定と単結晶x線構造解析も併せて行った。試料として用いたBEDT-TTF化合物結晶は金研の豊田直樹氏(当時)と佐々木孝彦氏から提供されたものであり、擬1次元性ハロゲン架橋金属錯体結晶は各大情報文化学部の山下正広氏と金研の黒田規敬氏から提供されたものである。中性子錯乱実験には高エネルギー物理学研究所の熱中性子分光器LAM-D、同じく冷中性子分光器LAM-40および原研の改造3号炉の冷中性子分光器AGNESを用いた。粉末x線回折測定と単結晶x線回折測定には本学科のRIGAKU-RAD-CとRIGAKU-AFC5をそれぞれ用いた。擬1次元性ハロゲン架橋金属錯体についても詳細な研究を行っている。
エピプラキン遺伝子異常は疾患を惹起するか?遺伝子改変マウス作成と変異遺伝子導入

【目的】エピプラキンは水痘性疾患の原因抗原として同定された蛋白質で、表皮、消化管上皮、唾液腺、毛包等に発現を認める。今回、エピプラキンの生体組織に与える影響について検討するため、エピプラキン欠損マウスを作成し、その機能について解析した。【方法】マウスエピプラキンの翻訳開始点の下流0.5kbの位置にターゲティングベクターを挿入し、エレクトロポレーションにてES細胞内に導入し、エピプラキン欠損マウスを作成した。各組織を野生型と欠損型で比較検討した。また、マウスの背部に皮膚欠損を作成し、野生型と欠損型でその治癒過程を比較した。さらに、生後2日目のマウスの表皮を培養し、ケラチノサイトの移動速度とその形態学的変化について野生型と欠損型の比較検討も行なった。【結果】欠損型マウスは野生型と同様に正常に生まれ、成長し、各組織のHE標本では野生型と欠損型では明らかな差は認められなかった。マウスの背部に皮膚欠損を作成し、その治癒過程を比較したところ、欠損型マウスの方がやや早い上皮化を認めた。生後2日目のマウスの表皮を使用した培養においても欠損型マウスのケラチノサイトが野生型に比べて有意に早い移動速度を示した。マイトマイシンC処理した表皮を使用した培養においても欠損型マウスは有意に早い移動速度を示した。さらに遊走ケラチノサイトをケラチン6及びエピプラキンの抗体で染色し共焦点レーザー顕微鏡で観察したところ、野生型では一部の細胞でケラチン6とエピプラキンとが同一の染色パターンをとっていた。しかし、欠損型ではケラチン6が伸展し染色性が低下している細胞が多く認められた。【考察】エピプラキンは、細胞内に存在し中間径線維と結合し、それらを束ねる役割をしていると考えられている。今回、エピプラキンが欠損することによってケラチン6の性状が変化し、それがケラチノサイトの移動に影響を与えることが示唆された。エピプラキンは、自己免疫性表皮下水庖症の自己抗原として同定された分子量552kDaの表皮細胞内分子であり、その一次構造ならびに遺伝子構造が明らかになったが、この分子の疾患への関与は明らかでない。本研究では、遺伝子改変マウスを作成するとともに、in vitroならびにin vivo実験系で変異遺伝子を導入し、その表現型の変化を探ることを目的とした。平成15年度は、以下の研究を実施した。(1)ノックアウト・マウスの作成1.胎性幹細胞を培養し、ターゲッティング・ベクターをエレクトロポレーション法にて導入した。2.G418陽性細胞を単離し、相同組み換えをおこしたクローンをクローニングし、保存した。3.マウスから胚盤胞を単離し、(2)で得られた胎性幹細胞クローンをマイクロインジェクターを用いて注入した。4.偽妊娠仮親マウスを作成し、(3)で得られた胚盤胞を移植した。5.生まれたキメラマウスをC57BLマウスと交配させ、生殖系キメラマウスを選別した。6.生殖系キメラマウスを野性型129雌マウスと交配させ、F1を得て、genomic southern blotにより、ヘテロ接合体のみを選択した。7.ヘテロ接合体の雄、雌を交配させ、F2を得て、genomic southern blotにより、ホモ接合体のみを選択した。(2)マウス・エピプラキン特異抗体、in situ hybridization用プローブ作成とマウスおよびヒトでの発現検索1.マウス・エピプラキンの特異性の高い部位につき、融合蛋白質を作成し、それに対するポリクローナル抗体を作成した。

【目的】エピプラキンは水疱性疾患の原因抗原として同定された蛋白質で、表皮、消化管上皮、唾液腺、毛包等に発現を認める。今回、エピプラキンの生体組織に与える影響について検討するため、エピプラキン欠損マウスを作成し、その機能について解析した。【方法】マウスエピプラキンの翻訳開始点の下流0.5kbの位置にターゲティングベクターを挿入し、エレクトロポレーションにてES細胞内に導入し、エピプラキン欠損マウスを作成した。各組織を野生型と欠損型で比較検討した。また、マウスの背部に皮膚欠損を作成し、野生型と欠損型でその治癒過程を比較した。さらに、生後2日目のマウスの表皮を培養し、ケラチノサイトの移動速度とその形態学的変化について野生型と欠損型の比較検討も行なった。【結果】欠損型マウスは野生型と同様に正常に生まれ、成長し、各組織のHE標本では野生型と欠損型では明らかな差は認められなかった。マウスの背部に皮膚欠損を作成し、その治癒過程を比較したところ、欠損型マウスの方がやや早い上皮化を認めた。生後2日目のマウスの表皮を使用した培養においても欠損型マウスのケラチノサイトが野生型に比べて有意に早い移動速度を示した。マイトマイシンC処理した表皮を使用した培養においても欠損型マウスは有意に早い移動速度を示した。さらに遊走ケラチノサイトをケラチン6及びエピプラキンの抗体で染色し共焦点レーザー顕微鏡で観察したところ、野生型では一部の細胞でケラチン6とエピプラキンとが同一の染色パターンをとっていた。しかし、欠損型ではケラチン6が伸展し染色性が低下している細胞が多く認められた。【考察】エピプラキンは、細胞内に存在し中間径線維と結合し、それらを束ねる役割をしていると考えられている。今回、エピプラキンが欠損することによってケラチン6の性状が変化し、それがケラチノサイトの移動に影響を与えることが示唆された。
多視点映像の幾何変換技術の発展とスポーツ教示システムへの応用

研究課題「カメラと注視点の位置関係が未知な場合の自由視点映像生成」については、従来、注視画像を作成するためには撮影した画像間のカメラ運動を推定してその3次元情報を利用して注視画像を作成するためのカメラ姿勢を計算し、注視画像を作成する方法が用いられてきた。それに対して我々は、注視画像を作成するために必要な3次元情報をパラメータとした射影変換行列を定式化して、画像のマッチング技術によって3次元情報を用いることなくそれらのパラメータを推定する手法を提案した。これは、注視画像の作成に必要な注視点の3次元位置、カメラの光軸回りの回転、焦点距離の調整といった情報をそれぞれ、注視点の画像中での位置、画像面の回転、画像の拡大縮小パラメータといった画像上から得られるパラメータに置き換え、基準とする画像との画像の一致度を最大にするパラメータを推定するものである。提案手法方の有効性を示すために実画像実験を行い、パラメータの初期値の与え方などの改善が残るものの、手法の有効性を確認した。そして国際会議に投稿しポスター発表として発表する予定である。研究課題「カメラと注視点の位置関係を正確かつ安定に求める技術の開発」については、手法の理論部分を検討している段階である。研究課題「スポーツシーンを自由な視点から自由な時間軸で再現可能な教示システムの開発」については、スポーツシーンを撮影対象にするため、フレームレートの高い撮影が行えるカメラを購入して、システムを構成する準備を進めている。研究課題のうち、「カメラと注視点の位置関係が未知な場合の自由視点映像生成」に関しては、当初計画した通り、その理論設計を行い、実画像実験によりその理論妥当性と実用性を確認した。その内容について国際会議に投稿してポスター発表として発表する予定である。そのため、今年度予定していた提案手法の有効性検証まで進められていると考えられる。一方、「カメラと注視点の位置関係を正確かつ安定に求める技術の開発」では、第1の研究課題で得られた成果をもとに本来の3次元情報を推定する理論の構築を進めているところであり、おおむね計画通りに進んでいる。最後に、「スポーツシーンを自由な視点から自由な時間軸で再現可能な教示システムの開発」では、予算内で購入できるフレームレートの高いカメラを選定することに難航し、昨年度中には研究目的に使用できると考えられるカメラを試験的に購入してその性能を確認するにとどまった。そのため全体的なシステム構成についても今年度に使用するカメラに基づいて検討していく必要がある。そのため、この課題については当初の計画から少し遅れていると判断する。上記より、総合的にはおおむね順調に進展していると判断した。全体的には計画通りス進んでいると考えられるので、基本的には計画通り進めていく。ただし、システム構築に関しては早急に使用するカメラを決定して、実験に必要なカメラ台数をそろえて環境を構築していくつもりである。残りの研究課題については計画にそって進め、研究成果を発表していく。

ただし、システム構築に関しては早急に使用するカメラを決定して、実験に必要なカメラ台数をそろえて環境を構築していくつもりである。残りの研究課題については計画にそって進め、研究成果を発表していく。昨年度購入を予定していた高速度カメラは1台の価格が高価であり予算内で研究に必要な台数を用意できないと判断し、代わりのカメラを探したが昨年度中に決定することができずに次年度に持ち越したため。
腹腔内マクロファージで被覆した小口径人工血管の術后抗凝固能及び開存性に関する検討

1.腹腔内埋め込み日数と開存性との関連についての検討雑種成犬(15-18kg)を用い、preclotting(Sauvageの方法に準じた)した小口径人工血管(Golaski社製、径3.5mmニットダクロン)を腹腔内に埋め込み、2日、4日、1週後腹腔内より取り出し、ヘパリン1000U/20mlPBS内に浸水し、同犬の頚動脈に端々吻合で移植した。術後5週で犠牲死させ、開存性を肉眼的に観察した。人工血管の開存率は、腹腔内埋め込み2日のものが1/3、4日のものが3/4、1週間のものが1/4であった。腹腔内埋め込み日数は、4日が良好と考えられた。その理由として、埋め込み日数が少ない(2日)と、移植時人工血管壁から出血し、止血操作中に血栓が内腔に付着するためで、埋め込み日数が長い(1週間)と、グラフト内面に結合織成分の付着が多く、血栓形成を促進するためと考えられた。2.コントロールグラフトとの開存性及び、内腔面の走査電顕での比較検討コントロール(以下C群)として、腹腔内に埋め込みをしていないものを、preclotting、ヘパリン浸水(上記の方法)し、犬頚動脈に移植した。腹腔内埋め込み後4日のもの(以下T群)を、上記1.の如く対側頚動脈に移植し、術後1週、5-10週で犠牲死させ、開存性及び内腔面の走査電顕での性状をC群と比較した。人工血管の開存率は、術後1週ではC群2/2、T群2/2で、術後5-10週ではC群2/4、T群3/4であった。開存したグラフトの走査電顕での比較では、術後1週において、C、T群とも、内面に血球成分が付着したダクロン繊維が露出し、術後5-10週においては、T群に内皮細胞による被覆が多くみられる傾向にあった。ヘパリン浸水により、移植後急性期の閉塞はコントロールにおいても減少するが、腹腔内埋め込みによりグラフト内腔面の早期内皮化が促進すると考えられた。本研究は、腹腔内に埋め込みハイブリット化した小口径人工血管の、血管移植術后抗凝固能及び開存性に関し、動物実験にて検討する事を目的とした。1.腹腔内埋め込み日数の決定;麻酔した日本白ウサギ(33.5kg)の腹腔内に、宇部興産社製ウーブンダクロン人工血管、径3.5mm(年度途中より、同径のGolaski社製ニットダクロンに変更)を埋め込み、術后4、7、14日目に取り出し、光顕にて内腔面を観察した。術后7日目には、腹腔内マクロファージ、線維芽細胞と考えられる細胞層及び、結合織により内腔面は完全に被覆されていた。フィブリン平板法により、埋め込み人工血管内腔面に線溶活性を認めたため、埋め込み日数は7日間と決定した。2.人工血管移植;ウサギ腹部大動脈に、腹腔内に7日間埋め込んだ人工血管を移植した(埋め込み群、4例)。処置をしていない人工血管をコントロールとして移植した(コントロール群、6例)。移植術中、埋め込み群2例、コントロール群2例が死亡。死亡原因は、吻合部出血、大動脈遮断によるAcidosisの進行であった。3.手術后経過と開存性;移植術后生存例全例が両下肢麻卑をきたした。コントロー群手術生存例全例が術后3日目以内に死亡。人工血管は、全例充満した凝血塊により閉塞していた。埋め込み群生存例2例中1例は、術后7日目まで生存したため、同日犠牲死させた。人工血管内腔面への血栓付着は極めて少なく、開存していた。本年度は、実験動物にウサギを選択したため、手術操作中の死亡率が高く、実験系の確立に至らなかったため、年度途中より、次年度予定であったイヌの大腿動脈への移植に変更し、イヌにおける上記実験を施行中である。1.実験モデルの確立平成4年度は、対象を日本白ウサギとし、その腹部大動脈に人工血管を移植したが、移植手術中および術後早期に、高率に死亡するため、平成5年度から対象動物を雑種成犬に変更した。又、5年度当初は、移植部位を犬の大腿動脈としたが、約1cmのグラフト長しか得られず、開存性の評価には不適と考え、移植部位を両側頚動脈に変更した。2.グラフト開存性の評価雑種成犬(15-18kg)の腹腔内に、小口径人工血管(Golaski社製、径3.5mmニットダクロングラフト)を1週間埋め込み、腹腔内より取り出した後、頚動脈に端々吻合で移植した。他側の頚動脈には、コントロールグラフト(腹腔内に埋め込みをしていないもの、Sauvageの方法に準じてpreclottingした)を移植した。計5匹に対して行い、術後3週で犠牲死させ、開存状況を肉眼的に観察したところ、両者とも1/5の開存率であった。腹腔内埋め込みグラフトが、開存性の低かった理由として、グラフト内面に付着した結合織成分特にコラーゲンの強い血栓性により、移植早期に閉塞(ドップラー血流計により確認)したものと考えられた。3.今後の展開現在、グラフト内面への結合織成分の付着を最小限に抑えるため、腹腔内埋め込み日数を2-3日としている。

またこれとは別に、preclottingしたグラフト内面に、腹腔内洗浄液中の細胞をseedingしたものの抗凝固能と開存性を検討中である。1.腹腔内埋め込み日数と開存性との関連についての検討雑種成犬(15-18kg)を用い、preclotting(Sauvageの方法に準じた)した小口径人工血管(Golaski社製、径3.5mmニットダクロン)を腹腔内に埋め込み、2日、4日、1週後腹腔内より取り出し、ヘパリン1000U/20mlPBS内に浸水し、同犬の頚動脈に端々吻合で移植した。術後5週で犠牲死させ、開存性を肉眼的に観察した。人工血管の開存率は、腹腔内埋め込み2日のものが1/3、4日のものが3/4、1週間のものが1/4であった。腹腔内埋め込み日数は、4日が良好と考えられた。その理由として、埋め込み日数が少ない(2日)と、移植時人工血管壁から出血し、止血操作中に血栓が内腔に付着するためで、埋め込み日数が長い(1週間)と、グラフト内面に結合織成分の付着が多く、血栓形成を促進するためと考えられた。2.コントロールグラフトとの開存性及び、内腔面の走査電顕での比較検討コントロール(以下C群)として、腹腔内に埋め込みをしていないものを、preclotting、ヘパリン浸水(上記の方法)し、犬頚動脈に移植した。腹腔内埋め込み後4日のもの(以下T群)を、上記1.の如く対側頚動脈に移植し、術後1週、5-10週で犠牲死させ、開存性及び内腔面の走査電顕での性状をC群と比較した。人工血管の開存率は、術後1週ではC群2/2、T群2/2で、術後5-10週ではC群2/4、T群3/4であった。開存したグラフトの走査電顕での比較では、術後1週において、C、T群とも、内面に血球成分が付着したダクロン繊維が露出し、術後5-10週においては、T群に内皮細胞による被覆が多くみられる傾向にあった。ヘパリン浸水により、移植後急性期の閉塞はコントロールにおいても減少するが、腹腔内埋め込みによりグラフト内腔面の早期内皮化が促進すると考えられた。
特異的免疫学的寛容状態の誘導:胸腺外T細胞分化とCD8細胞のフェノタイプの解析.

ラット肝移植モデルを用いて移植前ドナー抗原投与による特異的免疫学的寛容状態を誘導した。移植肝内の浸潤細胞、特にCD8+T細胞について白血球共通抗原のアイソフォームの一つであるCD45RCの発現状態についてFACS解析を行った。CD8+細胞にはCD45RC-CD8+細胞とCD45RC+CD8+T細胞の2種類のフェノタイプが存在し、寛容状態の移植肝ではCD45RC-CD8+T細胞/CD45RC+CD8+T細胞数比が拒絶群に比較して有意に増加していた。cell sortingによりそれぞれの細胞群を単離し、PCR法にて各種サイトカインの発現を検索した。CD45RC+CD8+T細胞とCD45RC-CD8+T細胞では、それぞれIL-2とIFN-γ及びIL-4とIL-10が強く発現していた。従って、これらの細胞群はそれぞれTc1及びTc2であることが判明した。ドナーであるACIラット(RT1a)とclassIMHC抗原(RT1Aa)だけが遺伝的に同一であるPVG.r1ラットのヘパリン加新鮮血血液1mlを移植7日前にレシピエントの投与すると、ドナー抗原投与群と同様に、移植肝は生着延長した。このことより、寛容状態の誘導にはドナーのclassIMHC抗原が重要な役割を演じていることが推察された。このモデルを用いて、移植肝内のCD8+T細胞のフェノタイプについて解析した結果、寛容状態の移植肝ではCD45RC-CD8+T細胞/CD45RC+CD8+T細胞数比が拒絶群に比較して有意に増加していた。移植肝における各種サイトカインの発現をNorthern blot法にて検索した。拒絶群では、TNF-α、IFN-γ、IL-12、IL-18、寛容群ではTGF-β、IL-10が強く発現していた。正常のラットの脾臓から単離したCD8+T細胞を用いて、これらのサイトカインがCD45RCの発現に及ぼす効果について検討した。その結果、TGF-βでCD45RCの発現が有意に抑制された。拒絶群ではc-kit protooncogene mRNAが発現し、これはIL-12によって増強されることが判明した。以上より、移植前ドナー抗原投与による特異的免疫学的寛容状態の誘導時には、TGF-βが産生され、CD8+T細胞におけるCD45RCの発現を抑制し、坑炎症性サイトカインであるIL-4やIL-10を産生するTc2が誘導されることが判明した。

cell sortingによりそれぞれの細胞群を単離し、PCR法にて各種サイトカインの発現を検索した。CD45RC+CD8十T細胞とCD45RC-CD8+T細胞では、それぞれIL-2とIFN-γ及びIL4とIL-10が強く発現していた。従って、これらの細胞群はそれぞれTcl及びTc2であることが判明した。ドナーであるACIラット(RTla)とclass I MHC抗原(RT1Aa)だけが遺伝的に同一であるPVG.r1ラットのヘパリン加新鮮血血液1mlを移植7日前にレシピエントの投与すると、ドナー抗原投与群と同様に、移植肝は生着延長した。このことより、寛容状態の誘導にはドナーのclass I MHC抗原が重要な役割を演じていることが推察された。このモデルを用いて、移植肝内のCD8+T細胞のフェノタイプについて解析した結果、寛容状態の移植肝ではCD45RC-CD8+T細胞/CD45RC+CD8+T細胞数比が拒絶群に比較して有意に増加していた。移植肝における各種サイトカインの発現をNorthen blot法にて検索した。拒絶群では、TNF-α、IFN-γ、IL-12、IL-18、寛容群ではTGF-β、IL-10が強く発現していた。正常のラットの脾臓から単離したCD8+T細胞を用いて、これらのサイトカインがCD45RCの発現に及ぼす効果について検討した。その結果、TGF-βでCD45RCの発現が有意に抑制された。拒絶群ではc-kit protooncogene mRNAが発現し、これはIL-12によって増強されることが判明した。以上より、移植前ドナ-抗原投与による特異的免疫学的寛容状態の誘導時には、TGF-βが産生され、CD8+T細胞におけるCD45RCの発現を抑制し、坑炎症性サイトカインであるIL-4やIL-10を産生するTc2が誘導されることが判明した。