hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
移動ロボットによる低精度センサを用いた大規模地図生成

移動ロボットのリアルタイム地図学習(SLAM)問題に対し,低精度センサに有効な手法群を開発し,実用的な低精度RFIDセンサを用いた大規模地図生成システムを実現した.具体的には,まず,(1)低精度センサに有効なコンパクト・高速なSLAM手法(LSH-PF手法)を開発した.また,(2)地図全体誤差を低減する平滑化手法(グラフィカルSLAM手法)を開発した.さらに,(3)低精度・小規模な地図群を位置合せ・統合して大規模・高精度な地図を生成する「低精度センサSLAM手法」を開発した.移動ロボットのリアルタイム地図学習(SLAM)問題に対し,低精度センサに有効な手法群を開発し,実用的な低精度RFIDセンサを用いた大規模地図生成システムを実現した.具体的には,まず,(1)低精度センサに有効なコンパクト・高速なSLAM手法(LSH-PF手法)を開発した.また,(2)地図全体誤差を低減する平滑化手法(グラフィカルSLAM手法)を開発した.さらに,(3)低精度・小規模な地図群を位置合せ・統合して大規模・高精度な地図を生成する「低精度センサSLAM手法」を開発した.本研究の主題は,移動ロボットのSLAM(自己位置と地図の同時推定)技術を拡張し,その応用可能性を低コスト・実用的な低精度センサ(RFIDセンサ等)にまで広げることを目的として,リアルタイム性に優れるSLAM手法と頑健性に優れる最適化(SGD)手法の開発および両者の融合を行うことにある.2007年度(初年度)は以下の研究開発を実施した.1 RFIDセンサの開発. RFIDソリューションEXPO(2007/5/16-5/18東京)に参加し最新のRFID技術に関する情報収集を行った.RFIDセンサを選定・購入し,ハードウェア・ソフトウエアを整備し,電波強度調節の仕組みを導入し,様々な精度域で使用可能なRFIDセンサを開発した.2センサモデルの開発.九州大学伊都キャンパスの大広間において,RFIDセンサの計測実験を行い,計測距離など観測特性を調べ,センサモデル(条件付確率密度)を構築した.予想通り,モデルと実際の乖離が大きく,自己位置推定実験(標準的なMCLアルゴリズム使用)において,大きな推定誤差が生じた(SICE九州支部にて報告).3オンライン学習手法の開発.2の結果から,完全なセンサモデルを事前に構築することが困難だと判断し,オンラインで獲得可能なセンサモデルを新規に開発した.このセンサモデルおよび地図最適化(SGD)手法を実装し両者を融合したところ,従来手法と比べて,規模拡張性・頑健性の面で大幅な改善がみられた(国際会議に投稿中).4オンライン地図作成手法の開発.低コストな地図作成・地図検索を特徴とするパーティクルフィルタ手法を開発した(国際会議ICRA2008にて発表予定).以上により,SLAM手法と最適化手法の両方の地図作成手法を整備できた.2008年度に両手法の融合を予定している.移動ロボットが安全・効率的なナビゲーションを行うためには周辺のランドマーク地図を生成するとともにこの地図上で自己位置を推定することが重要となる。特に未知環境においては地図と自己位置を同時並行に推定する必要があり、この推定問題をSLAM問題と呼ぶ。本研究では、特にRFIDセンサ等の低精度センサを対象とし、SLAM問題の研究開発を行った。得られた成果を以下に示す。(1)RFIDセンサ特有のセンサモデルを複数実装し性能比較を行い新しい有効なセンサモデルを開発した(論文準備中)。当初、標準的な距離方位モデルに基づくセンサモデルを試作した。しかし、低精度RFIDセンサの場合、大きなモデル化誤差が生じた。これを踏まえ、センサデータ対の整合性を判定し、信頼性の高い観測量を取得する方法を開発した。この方法は有効であった。(2)一般の低精度センサに有効な、新しい状態推定手法(LSHパーティクルフィルタ手法)を開発した。この成果は、ロボット分野の主要な国際会議icra2008にて発表した(論文準備中)。(3)複数の小規模地図を位置合せするのに有効な高速・軽快なマップマッチング方法を開発した(国際会議icra2009にて発表予定)。低精度センサのように、個々の小規模地図の信頼性が低い場合においても、本方法を用いて、多数の小規模地図を高速に位置合せすることで、信頼性の高い大規模地図を生成することが期待できる。(4)低精度センサの複雑な雑音分布を近似する新しいセンサモデルを考案した。このセンサモデルをRFIDセンサに適用し標準的なグラフィカルSLAM手法を用いて地図生成システムを構築し有効性を検証した(国際会議icpr2008にて発表)。
PCBによる脳発達障害におけるPCB反応性甲状腺ホルモン受容体結合蛋白の役割

#1近年我々は、PCBが甲状腺ホルモン(TH,T3)受容体(TR)を介する転写系に作用し、低濃度(10^<-10>M)でT3により活性化された転写を抑制することを報告し、その機序は標的遺伝子プロモーター領域からTRが部分的に解離することであることを明らかにした。従来、TRとDNAの結合はGel Shift法を使って証明されてきたが、放射性同位元素(RI)を使用する上、時間が48時間程度かかり、多検体のスクリーニング法として適さない。そこで非RI物質でDNAを標識した新たなスクリーニング法を考案した(Liquid Fluorescent DNA pull down assay ;LFDPD特許出願2006-064876)。この方法により結果が3-4時間で得られ、RIを使わずに、排出物を90%以上削減することができた。#2 PCBによる転写抑制はTHの1/1000という低濃度でも抑制するが、THの100倍程度の濃度でも抑制効果は有意差はなく、TRのリガンド結合領域(LBD)への競合的結合とは異なる機序が考えられた。そこで我々はPCBのTRへの作用部位を解明するために、TR及び、glucocorticoid受容体(GR)のN末端、DNA結合領域(DBD)、LBDを組み合わせて作成したキメラ受容体を用いて、レポーターアッセイを行った。転写が抑制されたのはGTT(N:GR、DBD:TR、LBD:TR)及び、GTG受容体のみであったことから、TRのDBDからLBDにかけての比較的広い領域にPCBが作用することが示唆された。このことをGel Shift法及び、LFDPDを用いて一致する結果を得た。#3 PCBより毒性が強いとされるダイオキシンについてTRの転写系に対する影響を調べたが、ほとんど認められなかった。また、代表的なPCB及び、PCDFを用いたがコンジェナーにより結果が異なることが明らかとなった。また、予備実験では転写を活性化するコンジェナーも存在するようであった。#4細胞によりPCBの転写抑制の程度が異なること、特に脳由来の細胞においてその抑制の程度が強いことから脳内に発現している蛋白が、転写抑制を強めている可能性が示唆された。そこで、酵母膜蛋白を用いた新たな同定法であるSos-Ras Yeast Two-hybrid法を用いて胎児脳cDNAライブラリーより新たな核内蛋白を同定した。この蛋白は、ノーザンプロット法により広範囲に発現しており、転写コリプレッサーとして機能することが明らかとなった。今後、脳特異的PCB反応性TR結合核内蛋白の同定、機能解析を試みたい。#5本申請で購入した倒立型顕微鏡の設定及び、予備実験が完了した。

#5本申請で購入した倒立型顕微鏡の設定及び、予備実験が完了した。#1近年我々は、PCBが甲状腺ホルモン(TH,T3)受容体(TR)を介する転写系に作用し、低濃度(10^<-10>M)でT3により活性化された転写を抑制することを報告し、その機序は標的遺伝子プロモーター領域からTRが部分的に解離することであることを明らかにした。従来、TRとDNAの結合はGel Shift法を使って証明されてきたが、放射性同位元素(RI)を使用する上、時間が48時間程度かかり、多検体のスクリーニング法として適さない。そこで非RI物質でDNAを標識した新たなスクリーニング法を考案した(特許出願)。#2 PCBによる転写抑制はTHの1/1000という低濃度でも抑制するが、THの100倍程度の濃度でも抑制効果はそれほど変わらず、TRのリガンド結合領域(LBD)への競合的結合とは異なる機序が考えられた。そこで我々はPCBのTRへの作用部位を解明するために、TR及び、glucocorticoid受容体(GR)のN末端、DNA結合領域(DBD)、LBDを組み合わせて作成したキメラ受容体を用いて、レポーターアッセイを行った。転写が抑制されたのはGTT(N:GR、DBD:TR、LBD:TR)及び、GTG受容体のみであったことから、TRのDBDからLBDにかけての比較的広い領域にPCBが作用することが示唆された。#3 PCBより毒性が強いとされるダイオキシンについてTRの転写系に対する影響を調べたが、ほとんど認められなかった。#4細胞によりPCBの転写抑制の程度が異なること、特に脳由来の細胞においてその抑制の程度が強いことから脳内に発現している蛋白が、転写抑制を強めている可能性が示唆された。そこで、酵母膜蛋白を用いた新たな同定法であるSos-Ras Yeast Two-hybrid法を用いて胎児脳cDNAライブラリーより新たな核内蛋白を同定した。この蛋白は、ノーザンプロット法により広範囲に発現しており、転写コリプレッサーとして機能することが明らかとなった。今後、脳特異的PCB反応性TR結合核内蛋白の同定、機能解析を試みたい。#1近年我々は、PCBが甲状腺ホルモン(TH,T3)受容体(TR)を介する転写系に作用し、低濃度(10^<-10>M)でT3により活性化された転写を抑制し、その機序は標的遺伝子プロモーター領域からTRが部分的に解離するためであることを明らかにした。従来、in vitroでのTRとDNAの結合はGel Shift法により証明されてきたが、放射性同位元素(RI)を使用する上、時間が48時間程度かかり、多検体のスクリーニング法として適さない。そこで非RI物質でDNAを標識した新たなスクリーニング法を考案した(Liquid nuorescent DNA pull down assay ; LFDPD特許出願2006-064876)。この方法により結果が3-4時間で得られ、RIを使わずに、排出物を90%以上削減することができた。
一次元型高スピン有機分子とその分子間スピン整列機構

研究実施計画の各項目について次の実績を得た。1.一次元型有機強磁性体のモデル分子:基底七重項分子3,3′-DPBPMのトポロジー異性体(3,4′置換体)について、トポロジー的対称性とスピン整列の関係をESRで調ベた。その結果前者と対照的に、この異性体は非常に低い励起五重項状態を持った基底三重項分子であることが分った。トポロジーによるこのスピン整列とエネルギー準位の大きな違いは、我々が確立したハイゼンベルグモデル計算によって良く説明されることが分った。さらにENDORでスピン分布を測定し、理論値と比較したところ、ハイゼンベルグモデルNでは、正、負スピン共に過大となり、分布に関してはむしろハバードの方が優れていることが分った。2.一次元型高スピンユニット間の架橋構造とスピン整列機構:架橋による高次元化の有用な官能基であるメチレン基とエーテル基について、合計6種類のトポロジー異性体の測定をほぼ終った。エーテル基については、4,4′置換は強磁性的に働らき、その原因はトポロジーと酸素原子を介する超交換機構であることが分った。残る3,3′置換は強磁性にも反強磁性にもなり複雑であるが、これは架橋位置3,3′のスピン密度が小さいために超交換が有効に働かないためである。またメチレン基の場合は、超共役が架橋の交換相互作用の原因であるが、他の機構との競合のために結果はやや複雑になった。3.フェリ磁性分子:上記の二つの官能基を用い、基底状態が三重項と五重項の高スピンユニット間に架橋して得られるフェリ磁性分子について総合的な研究を行った。その結果、トポロジーを考慮した分子設計を行えば、架橋によるスピン整列の制禦が可能であることが分った。また架橋位置のスピン密度が小さい3,3′の系については、量子混合を考慮することが必要となり、理論的な取扱いについて詳細に検討した。初年度は本研究計画の基礎となる二つの柱について研究を行った。第一は一次元型有機強磁性体の研究で、できるだけ大きなスピンを持つ鎖状の芳香族炭化水素ポリカルベンをモデル化合物としてつくり、その安定性と確実な検出方法を検討するものである。すでに最大のスピンを持つ有機化合物として知られている9重項分子まで得ているので、次の段階として11重項分子について研究した。この成果は、ジアゾ前駆体と光分解で生成するポリカルベンを共に単一のゲストとして安定に取込むホストとして、いかに適切な単結晶を得るかにかかっている。多数の化合物について試みた結果、m-ジベンゾイルベンゼンの単結晶が最も良好であることが判り、11重項分子の存在を示す電子スピン共鳴(ESR)を得ることができた。しかしスペクトルは極めて複雑なために解析が困難であり、9重項を越えると検出方法について再検討を要することが判明した。第二は一次元型有機強磁性体間に強磁性的相互作用をもたらす架橋の研究である。これは純一次元スピン配列はパイエルス転移により自発磁化を持ち得ないからである。モデル化合物として、ポリカルベンを構成する三重項ジフェニルメチレンユニット間にメチレン基あるいはエーテル基を架橋した異性体(各架橋につき3種類、合計6種類)を合成し、各々のスピン配列をベンゾフェノンをホストとする単結晶ESR法により測定した。その結果は、架橋の導入位置と立体配座によって強磁性的あるいは反強磁性的に働くという複雑な様相を呈した。この現象はπ系のトポロジーネットワークを考慮し、メチレン架橋では超共後機構が、またエーテル架橋では超交換相互作用機構がそれぞれ支配的であるとすれば統一的に説明できることが判った。したがって化学修飾として架橋の位置を選ぶことによって、一次元鎖間のスピン整列を制禦することが可能になり、有機強磁性体への道を開くことができた。研究実施計画(2年目)の各項目について,次の実積を得た.1.一次元型有機強磁性体のモデル分子として最大のスピンを持った11重項ポリカルベンを得ることができた.ホスト単結晶選択の問題は初年度に解決したが,本年度は検出条件について徹底的な検討を行った.その結果,9重項までのシリーズとは異なり,ジアゾ前駆体の光分解の光子エネルギーと,測定時のマイクロ波電力を十分大きくとる条件のもとで検出に成功した.この分子は,有機物・無機物を問わず,現在迄に知られている化合物の中で最大のスピン(S=5)を持っている.また,一次元型7重項分子のトポロジー異性体である新らしてタイプの高スピン有機分子を得ることもできた.2.従来のMO法あるいはVB法では,本研究の対象である高スピン有機分子を扱えないので,一般化したハバード・ハミルトニアンを用いてスピン状態を予測する方法を開拓した.種々のトポロジー異性体に適用した結果,この方法は基底状態のスピンと最大スピン状態については良い結果を与えるが,中間スピンの励起状態を正しく予測できないことが判った.現在,この欠点を克服する新しいアプローチによって成果をあげつつある.3.一次元型高スピン分子の鎖の間にメチレン基あるいはエーテル基を導入することによって,三次元的スピン整列をコントロールし得ることが明らかになった.特にESR910装置の稼動によッて,初年度の予備的成果を著しく改善・発展させることができた.また精密な測定が可能になったために,異るスピン間のスピン混合が見出され,次年度の研究が予定されている.

4.前項の研究から,特定のトポロジー的置換位置関係を満すエーテル結合の導入により,必ず反強磁性的スピン配列が得られることが判った.これを利用し,異るスピンを持つ高スピン分子間の架橋によって有機フェリ磁性体のモデル分子を検出することができた.研究実施計画の各項目について次の実績を得た。1.一次元型有機強磁性体のモデル分子:基底七重項分子3,3′-DPBPMのトポロジー異性体(3,4′置換体)について、トポロジー的対称性とスピン整列の関係をESRで調ベた。その結果前者と対照的に、この異性体は非常に低い励起五重項状態を持った基底三重項分子であることが分った。トポロジーによるこのスピン整列とエネルギー準位の大きな違いは、我々が確立したハイゼンベルグモデル計算によって良く説明されることが分った。さらにENDORでスピン分布を測定し、理論値と比較したところ、ハイゼンベルグモデルNでは、正、負スピン共に過大となり、分布に関してはむしろハバードの方が優れていることが分った。2.一次元型高スピンユニット間の架橋構造とスピン整列機構:架橋による高次元化の有用な官能基であるメチレン基とエーテル基について、合計6種類のトポロジー異性体の測定をほぼ終った。エーテル基については、4,4′置換は強磁性的に働らき、その原因はトポロジーと酸素原子を介する超交換機構であることが分った。残る3,3′置換は強磁性にも反強磁性にもなり複雑であるが、これは架橋位置3,3′のスピン密度が小さいために超交換が有効に働かないためである。またメチレン基の場合は、超共役が架橋の交換相互作用の原因であるが、他の機構との競合のために結果はやや複雑になった。3.フェリ磁性分子:上記の二つの官能基を用い、基底状態が三重項と五重項の高スピンユニット間に架橋して得られるフェリ磁性分子について総合的な研究を行った。その結果、トポロジーを考慮した分子設計を行えば、架橋によるスピン整列の制禦が可能であることが分った。また架橋位置のスピン密度が小さい3,3′の系については、量子混合を考慮することが必要となり、理論的な取扱いについて詳細に検討した。
中間レイノルズ数領域における物後流非定常放出渦の特異性乙側壁の影響

中間レイノルズ数領域(10^3<Re<10^4)正方形断面の角柱では,通常,レイノルズ数が減少するとき,ストローハル数が減少することが知られているが,アスペクト比が小さい角柱では主流の乱れが小さいとき逆に増加する場合がある.この現象は角柱前面からの剥離せん断層と側壁に発達する境界層の相互干渉に関係しているものと考えられる.このことを実験的に明らかにする目的で,可視化によってえられた測定部側壁の角柱設置位置前方に発生する首飾り渦の生成位置に,境界層厚さ程度までの高さのフエンスを入れることで側壁境界層を制御した.実験に用いた角柱はスパン長さ394mmで,前面高さ10,30,50mm,またフエンス高さは515mmである.得られた結果を以下に示す.1.前面高さ50mmの角柱の場合にのみレイノルズ数の減少にともなって,ストローハル数が減少する場合(パターンA)と増加する場合(パターンB)がみられた.2.後流の変動速度のスペクトルは,パターンBの方がパターンAに比して顕著な線スペクトルを示し,スパン方向への変化が小さい.3.フエンスの設置によって,Re<6x10^3でパターンBではストローハル数が減少するのに対して,パターンAと前面高さ10mmの角柱では変化がみられず,30mmの角柱でわずかな減少がある.4.スペクトル強度のスパン方向変化は,フエンスの設置によってストローハル数の減少するパターンでは側壁近傍と角柱中央部で強度が減少するが,変化がみられないときは強度のスパン方向変化も変化しない.5.角柱中央とスパン方向への速度相互相関をとるとき,パターンBでは側壁近くに位相の遅れがみられる.中間レイノルズ数領域(10^3<Re<10^4)正方形断面の角柱では,通常,レイノルズ数が減少するとき,ストローハル数が減少することが知られているが,アスペクト比が小さい角柱では主流の乱れが小さいとき逆に増加する場合がある.この現象は角柱前面からの剥離せん断層と側壁に発達する境界層の相互干渉に関係しているものと考えられる.このことを実験的に明らかにする目的で,可視化によってえられた測定部側壁の角柱設置位置前方に発生する首飾り渦の生成位置に,境界層厚さ程度までの高さのフエンスを入れることで側壁境界層を制御した.実験に用いた角柱はスパン長さ394mmで,前面高さ10,30,50mm,またフエンス高さは515mmである.得られた結果を以下に示す.1.前面高さ50mmの角柱の場合にのみレイノルズ数の減少にともなって,ストローハル数が減少する場合(パターンA)と増加する場合(パターンB)がみられた.2.後流の変動速度のスペクトルは,パターンBの方がパターンAに比して顕著な線スペクトルを示し,スパン方向への変化が小さい.3.フエンスの設置によって,Re<6x10^3でパターンBではストローハル数が減少するのに対して,パターンAと前面高さ10mmの角柱では変化がみられず,30mmの角柱でわずかな減少がある.4.スペクトル強度のスパン方向変化は,フエンスの設置によってストローハル数の減少するパターンでは側壁近傍と角柱中央部で強度が減少するが,変化がみられないときは強度のスパン方向変化も変化しない.5.角柱中央とスパン方向への速度相互相関をとるとき,パターンBでは側壁近くに位相の遅れがみられる.
電子線理工学による新機能材料創製の実用化

近年における材料開発は材料の機能性追及に加えて、微細加工による機能の高集積化が要求されてきている。高エネルギ-電子線の照射効果を利用した材料創製は非平衡状態を微小領域に生成することが可能であり、平衡相では得られないような特異な物性の出現が期待される。本研究ではこのような微小領域の非平衡相創製を実用化するために、高エネルギ-電子の照射効果を利用した異種原子の固体内強制注入、特にセラミックス基板中への金属原子の強制注入を取り上げた。具体的には超高圧電子顕微鏡(HVEM)用のシリコンカ-バイド(SiC)膜試料を作製し、その片側表面に白金(Pt)を真空蒸着して、非平衡相創製用の複合試料とした。この試料を日立HUー3000型HVEM内にセットして、金属を蒸着した側から電子照射し、強制注入領域を得ると同時に、照射領域の構造変化をその場観察した。照射終了後この注入試料をSAMに移送して、電子照射領域の状態分析を行った。得られた結果は以下のようにまとめられる。(1)Pt/αーSiC二層膜を高エネルギ-電子によって照射すると、まず基板のαーSiCがアモルファス化(aーSic)する。その結果、CおよびSiのダングリングボンドが形成される。(2)高エネルギ-電子との弾性衝突によってPt蒸着層からはじき出しを受けたPt原子は、このaーSiC中にたたき込まれる。(3)これらの孤立した原子として注入されたPt原子はダングリングボンドを有するSiと優先的に結合する。(4)aーSiC中にこのようにしてとり込まれたPt原子は引き続く照射中に高エネルギ-電子によって繰り返しはじき出しを受けるが、その都度新しいSiと結合し直して、次第次第に深部へと移動する。以上より、電子照射による強制注入の有無は基板構成原子が注入原子を化学的に受け入れるか否かによって決定されることが判明した。
多細胞体構築において階層間をつなぐ非典型的カドヘリンの機能解析

多細胞生物の体は器官、組織、細胞といった階層構造を持ち、発生過程においてはこらの階層が複雑に相互作用しながら全体を作り上げていく。例えば多くの発生の局面においては細胞が体軸に沿って集団的に移動していく。このような細胞の移動様式は集団的細胞移動と呼ばれ、正常な器官発生だけではなく癌細胞の浸潤といった病態の進行にも関与することが示唆されている。近年、ショウジョウバエ腹部のlarval epithelial cells (LECs)が変態期に示す集団的細胞移動においては、非典型的カドヘリンDachsous (Ds)がLECsの後側への移動を制御することが報告された。しかし、Dsがどのようなメカニズムで集団的細胞移動を制御するかはほとんどわかっていない。LECsの移動におけるDsの役割を調べるために、移動時のDsの局在を調べたところ、以下2つの不均一なDsの局在様式を見出した:1各体節において体の前後軸に沿って細胞膜上のDs量が変化する、2各LECにおいて前後方向の細胞境界にDsは多く局在し、背腹方向の細胞境界にはあまり局在しない。この2種類の不均一性がLECsの移動方向の制御に重要ではないかと考え、解析を進めた。その結果、体軸に沿ったDsの量の差がLECs細胞境界上のDsの偏った局在を生み出し、その偏りによって、LECsの後ろ側への移動が引き起こされることを示唆する結果を得た。移動する細胞集団自身が持つ非典型的カドヘリンの量差が集団の移動方向を決定することは今までに報告されていない。今後研究を進めることによって、新たな細胞集団移動方向の決定メカニズムを提唱できると考えている。(抄録なし)多細胞生物の体は器官、組織、細胞といった階層構造を持ち、発生過程においてはこれらの階層が複雑に相互作用しながら全体を作り上げていく。このような細胞の移動様式は集団的細胞移動と呼ばれ、正常な器官発生だけではなく、癌細胞の浸潤といった病態の進行にも関与することが示唆されている。近年、ショウジョウバエ腹部のlarval epithelial cells(LECs)が変態期に示す集団的細胞移動においては、非典型的カドヘリンDachsous(Ds)がLECsの後側への移動を制御することが報告された。まず、腹部におけるDsの発現パターンを確認した所、Dsの発現レベルが体軸に沿って変化することを見出した。このようなDsの発現レベルの変化がLECsの移動方向を決定づけるのではないかと考え、研究を進めている。また、LECsのライブイメージングでは、LECs移動開始後にDsの細胞内局在が変化することを見出した。具体的には、Dsが細胞質へ局在しなくなり、また、細胞膜上の局在の偏りが強くなる。現在、このようなDsの細胞内局在の変化とLECsの移動との機能関係を調べている。さらに、Dsが集団的細胞移動を制御する分子メカニズムを明らかにする目的で、免疫沈降と質量分析によるDsやDsと協調的に機能するFat(Ft)の新規結合分子の探索を行った。現在得られた結合分子候補の集団的細胞移動における機能解析を行っている。以上の解析を進めれば集団的細胞移動の新たな制御機構を明らかにできると期待される。ショウジョウバエ腹部においてDsが集団的細胞移動を制御するメカニズムの解析を進めた。その結果、Dsの発現レベルが体軸に沿って変化することと、LECs移動開始後にDsの細胞内局在が変化することを見出した。

また、免疫沈降と質量分析によるDsやFt結合分子の探索を予定通り終え、現在得られた結合分子候補の機能解析を進めている。以上のことから研究はおおむね順調に進展しているといえる。まずはDsを異所発現させてLECsの移動方向がどう変化するかを確認し、Dsの発現パターンとLECsの移動方向とを関連付ける。次に、Dsの細胞内局在の変化とLECsの移動との関係を調べる。具体的にはLECsの移動方向を変化させた際のDs細胞内局在やDsの細胞内局在を遺伝学的手法によって変化させた際のLECsの移動を確認する。さらに、Dsが集団的細胞移動を制御する分子メカニズムを明らかにするために、同定したDsやFt結合分子候補や、DsやFtが制御するHippo pathwayや平面内細胞極性に関連するタンパク質群のLECs移動における役割を調べる。以上の解析を通して、Dsが集団的細胞移動を制御する仕組みの全容を明らかにしていく。(抄録なし)
コヒーレント放射光を用いたテラヘルツ波電子線分光の研究

京都大学原子炉実験所のLバンドライナックを使用し、コヒーレント放射光をテラヘルツ光源として電子ビームと逆コンプトン散乱させ、理論と一致する逆コンプトン散乱光子スペクトルを得た。有機材料であるポリスチレンに対しコヒーレント放射光を利用したテラヘルツ波電子線分光を実施し、Martin-Puplett干渉計による分光結果と同様の結果を得た。我々の研究成果は同時刻分光の新しいツールを示しており、テラヘルツ科学の発展に寄与するであろう。京都大学原子炉実験所Lバンドライナックの放射光発生部に、小型の永久磁石型偏向磁石2台を設置し、その偏向磁石を通過する電子ビームによってコヒーレント放射光を発生させた。偏向磁石の間隔は、逆コンプトン散乱衝突点が磁場の影響を受けないように、Lバンドの電子ビームミクロパルスの間隔を考慮して約0.22mに設定した。光学素子を利用することでコヒーレント放射光を平行光束化して実験室まで輸送し、そのスペクトルを施設に設置されているMartin-Puplett型干渉計にて分光測定した。その結果、低エネルギー運転時には波長3mm付近で最大出力となることがわかった。逆コンプトン散乱によって発生する光子のスペクトルが可視域で最大強度を有するように、電子ビームエネルギーは19MeVに設定した。コヒーレント放射光を平行光束化した光路に中心20mmのみ蒸着していない反射鏡を挿入し、電子ビームとの逆コンプトン散乱を行い、非蒸着部分を通過した散乱光子のスペクトルを分光器と光電子増倍管を使用して計測した。そのスペクトル形状は、コヒーレント放射光スペクトルから予想される形状とほぼ一致した。また、逆コンプトン散乱光子数に対するバックグラウンド光子数の比率は、テラヘルツ光源としてコヒーレント遷移放射を使用した時よりも1/3以下に減少させることができた。反射鏡の前に有機薄膜を挿入し、得られた逆コンプトン散乱光子スペクトルを試料無しの場合と比較することで、テラヘルツ帯における有機薄膜の透過率測定を実施した。その測定結果は干渉計を利用して測定した透過率とほぼ一致し、コヒーレント放射光によるテラヘルツ波電子線分光の有用性を実証した。得られた知見については、自由電子レーザー国際会議などの国内外の研究会にて発表した。また、コヒーレント放射光開発について既に論文発表を実施し、分光測定についても論文発表を準備中である。京都大学原子炉実験所Lバンドライナックの放射光ビームラインにおいて、コヒーレント遷移放射源として使用しているアルミ薄膜の代わりに、小型の永久磁石型偏向磁石を2台設置した。その偏向磁石間を通過する電子ビームによってコヒーレント放射光を発生させ、加速器室に隣接している実験室までコヒーレント放射光の輸送を行った。電子ビームエネルギーが2532MeVの間の時に、コヒーレント遷移放射の約10%の強度を有するミリ波帯の放射を観測した。この放射は35mmの波長で最大強度となり、コヒーレント遷移放射に比べて長波長側へシフトしていることがわかった。資金不足のため大阪大学より譲渡された四重極電磁石をLバンドライナック終端部に挿入するため、架台及び真空チェンバーを作成し、新たな四重極電磁石ダブレットを設置した。コヒーレント放射光の発光点の約1m上流の位置にてQスキャン法によるエミッタンス測定を実施し、規格化エミッタンスが水平5.0×10-4 m rad、垂直3.5×10-4 m radであることを明らかにした。これにより、電子ビームエネルギーが1832MeVの場合は、コヒーレント放射光の発光点にてビームサイズを5mm以下にできることを確認した。また、コヒーレント放射光を利用したテラヘルツ波電子線分光のさらなる研究を推進するため、日本大学電子線利用研究施設のSバンドリニアックLEBRAにてコヒーレント放射光観測を行った。当施設では自由電子レーザー発振のために自由電子レーザービームラインの偏向部にて電子バンチが圧縮されるので、高強度のミリ波放射が期待されたが、1μJ級の放射があることを確認できた。新たな高強度テラヘルツ光源として利用可能であるため、コヒーレント放射光の特性を詳細に調べている。京都大学原子炉実験所Lバンドライナックを使用したコヒーレント放射光の開発、および新たに設置した四重極電磁石を用いたQスキャン法によるエミッタンス測定を行った。コヒーレント放射光スペクトルは京都大学原子炉実験所が所有する高輝度ミリ波テラヘルツ放射光分光装置を利用して測定し、コヒーレント遷移放射と比較して長波長側の35mmの波長にピークがあることがわかった。このため、コヒーレント放射光をテラヘルツ波電子線分光に利用する場合は、電子エネルギーは20MeVよりも高い設定で可視域の逆コンプトン散乱光子ビームが得られる。測定された規格化エミッタンスは、同様の電子銃を利用している大阪大学産業科学研究所のLバンドライナックのそれと同程度であることがわかった。

設置した四重極電磁石で電子ビームサイズを当初目標である5mm以下にすることが可能であるも確認できた。さらに、当初予定にはなかったが、日本大学電子線利用研究施設のSバンドリニアックLEBRAにてテラヘルツ波コヒーレント放射光源の開発に取り組んでいる。LEBRAでは高電荷・低繰り返しのバーストモードと低電荷・高繰り返しのフルバンチモードという二つの運転モードで自由電子レーザーを発生できるが、そのいずれの運転モードでも高出力なテラヘルツ波コヒーレント放射光が発生していることを観測した。LEBRAでテラヘルツ波電子線分光を行った場合、逆コンプトン散乱光子ビームのエネルギーは100eV付近になり、軟X線分光技術を利用することが可能である。このように、当初予定していた平成23年度研究実施計画を順調に実施しているのに加えて、新たなテラヘルツ波電子線分光技術の開拓も進展している。当初予定通り、2台の永久磁石型偏向磁石の間で電子ビームとテラヘルツ波コヒーレント放射光とを逆コンプトン散乱させるために、大部分のコヒーレント放射光を反射かつ逆コンプトン散乱光子を透過させる中空鏡システムを製作して、コヒーレント放射光輸送路に設置する。中空鏡システムの作成にあたっては、逆コンプトン散乱による高エネルギー光子と遷移放射等のバックグラウンドとの信号分離を行えるように、コヒーレント放射光を吸収できる機能を付加する。電子ビームエネルギーを増大させた方がライナックで輸送できる電荷量が増大するため、高強度コヒーレント放射光発生にとって有利である。しかし、逆コンプトン散乱光子エネルギーの中心波長が紫外域になるため、高輝度ミリ波テラヘルツ放射光分光装置で使用しているマイラー窓は透過できない。そこで逆コンプトン散乱光子を取り出す真空窓を石英に変えて、紫外域可視域の波長帯で散乱光子ビームのスペクトル測定を行い、コヒーレント放射光スペクトルとの関係を解明する。さらに、有機固体材料を中心とした試料を中空鏡の直前に挿入することでテラヘルツ波吸収スペクトル測定を実施する。京都大学原子炉実験所に既存の高輝度ミリ波テラヘルツ放射光分光装置を使用した試料の吸収スペクトルと比較し、コヒーレント放射光を用いたテラヘルツ波電子線分光の実効性を立証する。なお、日本大学電子線利用研究施設のSバンドリニアックLEBRAにて開発したテラヘルツ波コヒーレント放射源については、論文等で研究成果を公開する予定である。本研究課題にて当初要求した研究費は減額されて支給されたが、2台の四重極電磁石を大阪大学産業科学研究所より譲渡されたため、四重極電磁石関連の支出を架台及びボタン電極付き真空チェンバーに留めて、次年度使用額に25万円程度を計上できた。これらは主にテラヘルツ波コヒーレント放射光及び逆コンプトン散乱光子ビームを輸送するミラーなどの光学部品を調達するのに使用する予定である。また、平成24年度に本課題に支給される研究費についても要求額より減額されて支給されている。外国出張については国内で開催される国際会議に出席することで計上することを取りやめ、光学部品を中心とした消耗品については、昨年度より繰り越した経費を使用することで節約する。備品については予定通り、コヒーレント放射光によるテラヘルツ波電子線分光を実施するための中空鏡システム構築に使用する。
PET用核種を用いたがん治療:定量性に優れたがんのRI内用療法

現在PETで用いられている放射性核種(RI)はいずれも半減期が短く(^<18>F:110分、^<15>O:2分、^<13>N:10分、^<11>C:20分)、その利用にはサイクロトロンを必要とするなど汎用性の点で劣っている。これに対し^<76>Brは半減期16.2時間で臨床利用する上で適した半減期を有するポジトロン放出核種であり、^<18>Fや^<123>Iと同じハロゲンであることから低分子化合物を母体とする新しいPET用放射性薬剤の開発に適したRIとして期待される。さらに^<76>Brはエネルギーが高く、がんに選択的に集積させることができれば有効ながん治療薬になり得る。我々はこの^<76>Brの物理化学的性質に着目し、^<76>Br標識グルコース(^<76>BrDG)を合成してそのがん治療効果を基礎的に検討してきたが、^<76>BrDGは^<18>F-FDGに比べがんへの集積が低く、明らかな治療効果を認めなかった。そこで褐色細胞腫、カルチノイド腫瘍、神経芽細胞腫などへの高い集積が報告されているmeta-iodobenzylguanidine(MIBG)に着目し、MIBGの放射性ヨウ素を^<76>Brに置き換えた^<76>BrMBBGを合成し、その腫瘍集積性いついて検討した。その結果、^<76>Br-MBBGは培養細胞を用いたインビトロ実験系においてノルエピネフリントランスポーター(NET)陽性PC-12細胞に高い集積を示すとともに、インビボにおいてもヌードマウスに移植したNET陽性PC-12細胞に高く集積することが明らかとなった(約30%dose/g)。この結果をもとに、今後^<76>Br-MBBGのがん治療効果を明らかにしていく。現在PETで用いられている放射性核種(RI)はいずれも半減期が短く(18F:110分、150:2分、13N:10分、11C:20分)、その利用にはサイクロトロンを必要とするなど汎用性の点で劣っている。これに対し76Brは半減期16.2時間で臨床利用する上で適した半減期を有するポジトロン放出核種であり、18Fや123Iと同じハロゲンであることから低分子化合物を母体とする新しいPET用放射性薬剤の開発に適したRIとして期待される。我々はこの76Brの物理化学的性質に着目し、76Br標識グルコース(76BrDG)を合成してPET用がん診断薬剤としての有用性を基礎的に検討してきた。その結果、76BrDGはヌードマウスに移植したLL2がん細胞に高く集積し、がん診断に有効である可能性が示された。今回76BrDGのがん集積機序におけるグルコーストランスポーター(GLUT)の関与を明らかにする目的で培養細胞への76BrDGの取り込みを調べてみたが、76BrDGは顕著な取り込みを示さず、インビボとは異なる結果を得た。また細胞内滞留の機序としてヘキソキナーゼ(HK)による代謝の可能性を調べたが、HK活性も認められなかった。引き続き76BrDGの集積機序について調べるとともに今後は76BrDGを用いたがん治療の有効性について検討を進める。76Brはエネルギーが高く、がんに選択的に集めることができれば有効ながん治療薬になることが期待できるため、種々の担がんモデルマウスを用いて76BrDGのがん治療効果を明らかにしていく。我々はこの^<76>Brの物理化学的性質に着目し、^<76>Br標識グルコース(^<76>BrDG)を合成してPET用がん診断薬剤としての有用性を基礎的に検討してきた。^<76>BrDGはヌードマウスに移植したLL2がん細胞に高く集積し、がん診断に有効である可能性を示している。そこで今回LL2細胞移植ヌードマウスに^<76>BrDGを投与し、^<76>BrDGのがん治療効果について検討した。50500μCiの^<76>BrDGをマウスに投与し、経時的に腫瘍サイズを測定するとともに、PETを用いて^<76>BrDGのがん集積性について評価した。その結果、今回の検討ではいずれも投与早期に膀胱への速やかな排泄が認められ、^<76>BrDGのがん集積が低かったことより明らかな治療効果を認めなかった。今後は^<76>BrDGの投与量を増やすとともに、サンプル数を増やして再度治療効果を検討する。また、LL2以外の担がんモデルマウスについても^<76>BrDGのがん治療効果を明らかにしていく。現在PETで用いられている放射性核種(RI)はいずれも半減期が短く(^<18>F:110分、^<15>

O:2分、^<13>N:10分、^<11>C:20分)、その利用にはサイクロトロンを必要とするなど汎用性の点で劣っている。これに対し^<76>Brは半減期16.2時間で臨床利用する上で適した半減期を有するポジトロン放出核種であり、^<18>Fや^<123>Iと同じハロゲンであることから低分子化合物を母体とする新しいPET用放射性薬剤の開発に適したRIとして期待される。さらに^<76>Brはエネルギーが高く、がんに選択的に集積させることができれば有効ながん治療薬になり得る。我々はこの^<76>Brの物理化学的性質に着目し、^<76>Br標識グルコース(^<76>BrDG)を合成してそのがん治療効果を基礎的に検討してきたが、^<76>BrDGは^<18>F-FDGに比べがんへの集積が低く、明らかな治療効果を認めなかった。そこで褐色細胞腫、カルチノイド腫瘍、神経芽細胞腫などへの高い集積が報告されているmeta-iodobenzylguanidine(MIBG)に着目し、MIBGの放射性ヨウ素を^<76>Brに置き換えた^<76>BrMBBGを合成し、その腫瘍集積性いついて検討した。その結果、^<76>Br-MBBGは培養細胞を用いたインビトロ実験系においてノルエピネフリントランスポーター(NET)陽性PC-12細胞に高い集積を示すとともに、インビボにおいてもヌードマウスに移植したNET陽性PC-12細胞に高く集積することが明らかとなった(約30%dose/g)。この結果をもとに、今後^<76>Br-MBBGのがん治療効果を明らかにしていく。
視床ー視床網様核ー大脳皮質のループ回路が構成する感覚情報処理機構の解明

動物(麻酔したラット)実験を施行し、大脳皮質と視床が構成するループ回路網の感覚情報処理と伝達を制御する視床網様核で、聴覚、視覚、体性感覚入力が干渉することを解剖学的、電気生理学的に示した。干渉は異種感覚情報の統合に関与する高次視床核のみならず、特定種の感覚情報処理に関与すると考えられていた1次視床核に投射する2種類の視床網様核細胞で発生する。また、2種類の視床網様核細胞が特異なバースト活動特性で聴覚及び視覚の情報処理を制御する神経機構が存在すること、干渉を仲介する求心性連絡が存在することを示した。更に、機能が聴覚情報処理に特化する1次視床核細胞の聴覚反応に体性感覚が影響することを明らかにした。大脳皮質と視床が構成するループ回路で、視床網様核が異種感覚情報の選択と重み付け行い、様々な種類の感覚情報に対する注意の制御と異種感覚情報間の干渉と統合に関する神経機構の根幹を構成すると仮定する。大脳皮質と視床が構成するループ回路の感覚情報処理や意識の構成の神経メカニズムの解明を目的として、視床網様核の機能解剖に焦点を当て研究をすすめている。当該年度では、視覚の一次と高次視床核へ投射する視床網様核細胞の活動の特性に関する研究(ラットを結果をまとめた。視床網様核細胞は、情報の重み付けに深く関与するバースト活動を示すが、光反応と自発活動において、視覚の一次と高次視床核へ投射する視床網様核細胞群が特異なバースト活動を示すことを明らかにした。視床網様核が膝状体と非膝状体システムの視覚情報処理を異なる形で制御し、2つの視覚システムの機能を特徴づける神経機構が存在することを示した(Neuroscience 226: 208-226, 2012)。また、視覚、聴覚の刺激が、視床網様核細胞の音あるいは光反応を修飾する(Cross-modal interaction)ことを示す研究結果をまとめ、論文を投稿するところである。更に、視床網様核細胞における聴覚と体性感覚の相互干渉に関する実験を行い、その結果をまとめている。これまでの研究のまとめとして、視床と大脳皮質に展開する聴覚情報処理機構と、その情報機構における視床網様核の役割に関する研究知見を包括し学会で報告した(第89回日本生理学会大会、シンポジウム:聴皮質研究の最前線)。また、新たな研究展開のための視点から視床網様核に関する解剖と機能に関する研究知見を総論にまとめた(Clinical Neuroscience 30: 46-48)。視床網様核は、視床核と大脳皮質領域が出力した情報を基に視床核に抑制投射し、視床核の情報処理と視床核が大脳皮質領域に送る情報の伝達を制御する。視床網様核の機能に関する従来の見解では、視覚、聴覚、体性感覚の情報の処理と伝達をそれぞれ制御する機能解剖的に分離したセクターが視床網様核を構成すると考えられている。この見解に対し、本研究では、異種感覚情報が単一の視床網様核細胞に収束、干渉して、視床網様核が感覚種を越えて感覚情報の処理と伝達を制御する神経機構が存在することを仮定する。当該年度では、動物(麻酔したラット)実験において、視覚、聴覚の刺激(感覚入力)が、視床網様核細胞の音あるいは光反応を修飾することを明らかにし(European Journal of Neuroscience in press)、異種感覚情報が視床網様核細胞に収束し視床網様核を介して相互に情報の処理と伝達を制御する可能性(本研究の仮定)を示した。また、視床網様核細胞において聴覚と体性感覚入力が感覚反応を相互に修飾することを示す実験(前年度施行)のデータを当該年度で解析し、結果を学会で報告した。更に、当該年度で、視床網様核における視覚と体性感覚入力の干渉に関する実験を施行した。実験では、視覚と体性感覚入力も相互に感覚反応を修飾することが示唆された。研究結果から、視床網様核が、異種感覚情報の統合と競合及び注意制御、あるいは、感覚時間情報処理の制御に深く関与することを示すこと(本研究の目的)ができたと考える。加えて、当該年度では、視床網様核細胞の聴覚反応におけるバースト活動を調べる実験を新たに施行した。前年度論文にまとめた視覚反応と同様に、聴覚反応において1次あるいは高次視床核に投射する視床網様核細胞群が特異なバースト活動を示す結果が得られ、視床網様核に2つの特異な制御機構が存在する可能性を学会で報告した。異種感覚が大脳皮質1次感覚野で干渉することが判明し、感覚情報処理機構の階層性を見直す必要がある。大脳皮質と視床が構成するループ回路と、その情報伝達を制御する視床網様核が異種感覚の干渉に関与する可能性を仮定し、感覚情報処理の神経機構の解明をすすめている。当該年度では、ラットの視床網様核の聴覚領域には、音情報がトノトピーに基づいて入力する領域と、その辺縁に、視覚、体性感覚、内臓感覚を処理する皮質領野(2次視覚野、2次体性感覚野、島皮質)、視床核(外側膝状体、腹側基底核など)から異種感覚が入力する領域が存在することを明らかにした(J. Comp. Neurol. 520: 1457).更に、視覚、聴覚の刺激は、視床網様核細胞の音あるいは光反応を修飾する(Cross-modal interaction)ことを報告し、詳細なデータ解析を継続している。

視床網様核細胞は、情報の重み付けに関連するバースト活動を示すが、Cross-modal interactionは、バーストを含む感覚反応特性の変化として認められた。更に、LemniscalとNon-lemniscal systemの感覚情報処理を制御する視床網様核細胞の2群が、視覚および聴覚反応において特異なバースト活動を示すことを明らかにした。視覚反応のバーストに関する研究結果は、論文投稿中である。また、視床網様核に由来すると思われる視覚及び体性感覚刺激による音反応の修飾を、内側膝状体腹側亜核(聴覚情報のみを処理すると考えられている)の視床細胞において認めている(Neuroscience 174: 200)。以上の結果は、視床網様核が、その特異な神経活動に基づき、視床の感覚情報処理と大脳皮質への感覚情報伝達を制御して、注意(Cross-modal switching of attention)の神経機構を構成する可能性を示唆する。視床網様核は、視床核と大脳皮質領域が出力した情報を受け、視床核に抑制投射し、視床核の情報処理と視床核が大脳皮質領域に送る情報の伝達を制御する。本研究では、異種感覚情報が視床網様核細胞に収束、干渉して、異種感覚が視床網様核を介して相互に情報の処理と伝達を修飾し、注意、知覚、意識を制御することを仮定する。視床網様核における視覚と聴覚の相互干渉(European Journal of Neuroscience, 39, 1405-1418, 2014)に引き続き、当該年度では、動物(麻酔したラット)実験において、聴覚と体性感覚及び視覚と体性感覚が視床網様核で相互に干渉することを明らかにした。聴覚と体性感覚の相互干渉に関する研究結果は学会で報告し、視覚と体性感覚の相互干渉に関する研究結果とともに、現在論文にまとめている。本研究の仮定が、概ね検証されたと考える。加えて、視床網様核細胞の活動特性に関する研究を継続し、当該年度では、1次あるいは高次視床核に投射する視床網様核聴覚細胞群が特異なバースト活動を示す結果を論文にまとめ報告し(European Journal of Neuroscience in press)、既に報告した視覚細胞群の結果を踏まえ、バースト活動の特性に基づく2つの特異な感覚情報制御機構が視床網様核に存在することを示唆した。更に、視覚、聴覚に加え、体性感覚、運動、辺縁システムの制御に関わる視床網様核細胞の自発バースト活動の特性が神経前後軸に沿って変化することを学会で報告した。バースト活動は細胞間の情報伝達効率に影響し、異種感覚の相互干渉ではバースト活動の修飾を認める。研究は、視床網様核の機能解剖の基本要素(視床網様における異種感覚の相互干渉と解剖学的に構成されたバースト活動の特性)を明らかにした。動物(麻酔したラット)実験において、聴覚と体性感覚(当該年度で論文を作成、投稿中である)、視覚と体性感覚(当該年度の学会で報告し、現在論文を作成中である)入力が視床網様核で相互に干渉することを明らかにし、異種感覚が視床網様核を介して相互に情報の処理と伝達を修飾する可能性を示した。異種感覚入力の干渉は、1次あるいは高次視床核に投射する2種類の細胞で認めた。このことは、複数種の感覚入力を受ける高次視床核に加え、一種類の感覚
フコース転移酵素アンチセンスオリゴヌクレオタイドを用いた肝細胞癌治療

報告者らは肝細胞癌患者における各種血清糖蛋白においてフコシル化が亢進していることを報告し,この事象が腫瘍の悪性度の指標になることから,フコース転移酵素(α1-6FT)のmRNAに対するアンチセンスによる肝細胞癌治療の可能性に関する基礎的検討を行った.すなわち,5型グルコサミン転移酵素(Gnt-V)とα1-6FTに対するアンチセンスRNAを持続的に発現する系を確立しその生物学的特性の評価を試みた.テトラサイクリンの制御系に関してはClontech社(USA)のTet-off systemを用い,pTet-offベクターをHeLa細胞にトランスフェクトし,ネオマイシン耐性により持続安定発現株を選択,樹立した.次に,pTREベクターにNishikawa,A.ら(BBRC198,318-327,1994)によって報告されているGnt-VのmRNA配列と,Yanagidani,S.ら(J.Biochem.121,626-632,1997)によって報告されているα1-6FTのmRNAの配列に基づきプライマーを設定し,TR-PCRによってGnt-V(nt.54-495)とα1-6FT(nt.-20-693)のcDNAをHepG2より調製し,クローニングした.これらのクローニングされたベクターと,選択マーカーであるハイグロマイシン耐性遺伝子を持つpTK-Hygとをカチオニックリポソームを用いて,テトラサイクリンリプレッサー蛋白を持続発現しているHeLa細胞にコトランスフェクトし,ハイグロマイシンで選択した.約10^5のHeLa細胞を用いてリポフェクションを施行すると,50前後のハイグロマイシン耐性のクローンを選択する事が出来た.そして,やや不安定ながら,ドキシサイクリン存在下にセンス,あるいはアンチセンスRNAを発現する株を樹立し,現在その生物学的特性を評価中である.報告者らは肝細胞癌患者における各種血清糖蛋白においてフコシル化が亢進していることを報告し,この事象が腫瘍の悪性度の指標になることから,フコース転移酵素(α1-6FT)のmRNAに対するアンチセンスによる肝細胞癌治療の可能性に関する基礎的検討を行った.すなわち,5型グルコサミン転移酵素(Gnt-V)とα1-6FTに対するアンチセンスRNAを持続的に発現する系を確立しその生物学的特性の評価を試みた.テトラサイクリンの制御系に関してはClontech社(USA)のTet-off systemを用い,pTet-offベクターをHeLa細胞にトランスフェクトし,ネオマイシン耐性により持続安定発現株を選択,樹立した.次に,pTREベクターにNishikawa,A.ら(BBRC198,318-327,1994)によって報告されているGnt-VのmRNA配列と,Yanagidani,S.ら(J.Biochem.121,626-632,1997)によって報告されているα1-6FTのmRNAの配列に基づきプライマーを設定し,TR-PCRによってGnt-V(nt.54-495)とα1-6FT(nt.-20-693)のcDNAをHepG2より調製し,クローニングした.これらのクローニングされたベクターと,選択マーカーであるハイグロマイシン耐性遺伝子を持つpTK-Hygとをカチオニックリポソームを用いて,テトラサイクリンリプレッサー蛋白を持続発現しているHeLa細胞にコトランスフェクトし,ハイグロマイシンで選択した.約10^5のHeLa細胞を用いてリポフェクションを施行すると,50前後のハイグロマイシン耐性のクローンを選択する事が出来た.そして,やや不安定ながら,ドキシサイクリン存在下にセンス,あるいはアンチセンスRNAを発現する株を樹立し,現在その生物学的特性を評価中である.我々は本年度の研究課題としてα1-6フコース転移酵素に対するアンチセンスを用いた肝細胞癌の治療に関する基礎的検討を行った.1.α1-6フコース転移酵素に対するアンチセンスmRNAの安定発現細胞系列の樹立に関して,すでにUozumi N.ら(J.Biol.Chem.271(44):27810-7,1996)によって報告されている配列を基に,α-6フコース転移酵素のmRNA全長をHepG2より調製したcDNAを用いてクローニングした.さらにcDNAの5′側約600塩基をテトラサイクリンの有無でmRNAの発現制御が可能な系に,アンチセンスならびにセンス方向にクローニングした.現在これらのベクターをエレクトロポレーション法で各種細胞系列にトランスフェクトし,センスならびにアンチセンスmRNAの安定発現株を樹立中である.2.アンチセンスmRNAでα1-6フコース転移酵素の発現が抑制されていることを確認するため以下の系を用いトランスフェクト肝癌細胞系の酵素活性を測定中である.比較対照としてIII型N-アセチルグルコサミン転移酵素(GnT-III)活性も同時に測定する.α-1-6FT,GnT-III活性は蛍光標識したアシアロ・アガラクト2分岐型糖受容体に対し,糖供与体としてGDP-Fuc,UDP-GlcNAcを,また酵素源として培養組織抽出液を用いて反応後逆相系HPLCにて分離・定量する.今後,2の系で確認されたセンスならびアンチセンスmRNAの安定発現株を用いて,α1-6フコース転移酵素の癌細胞の浸潤性,転移能などへの関与に関し検討していく予定である.我々はα1-6フコシル化という現象が肝細胞の癌化に伴い生じること、さらにその程度が腫瘍の悪性度の指標になることから、A1-6FTのmRNAに対するアンチセンスによる肝細胞癌治療の可能性に関する基礎的検討を行っている。