hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
小川未明の総合的再考：詩業と思想展開を中心として

作家・小川未明は、「日本児童文学の父」と敬称される児童文学界の大家だが、これまでその研究は、「赤い蝋燭と人魚」や「野薔薇」等の代表作が煌めく、大正期のロマンチシズム童話を中心として展開されるのが常だった。申請者は、従来の未明研究史における、かかる傾向(偏向)を「大正童話中心主義」と名付けた上で、本研究ではその克服を目指している。すなわち、大正童話以外の童話や、漢詩・口語自由詩・小説・評論・随筆といった童話以外の文業を積極的に論の対象に据えることで、従来の未明=童話作家という単一的な措定を破砕し、もって、明治・大正・昭和という三代を生きた文人の埋もれた横顔を照射したいと考えているのである。
冠動脈プラークの進展や不安定化における睡眠呼吸障害の関与を解明する

今年度は睡眠呼吸障害を合併した冠動脈疾患患者における責任病変のプラーク解析の論文報告をした。(J Am Heart Assoc. 2018Oct 2;7(19):e009826.)本研究は冠動脈疾患を有する患者、289例を対象に、冠動脈責任病変のプラークをIVUS(血管内超音波)で評価した研究である。睡眠呼吸障害の定義は簡易検査で、3%ODI(oxygen desaturation index)が15イベント以上とした。結果的に、睡眠呼吸障害を合併した患者のプラークは非合併の患者と比較して、プラーク容量が多い傾向にあり、減衰角度が有意に大きかった。多変量解析でもプラークの不安定性と睡眠呼吸障害は有意に関連していた。これらより、睡眠呼吸障害の存在がプラークの進展や不安定化に関与している可能性が示唆された。これらの結果は日本循環器学会学術集会でも口演発表している。上記の横断的調査と同時に我々は睡眠呼吸障害合併冠動脈疾患患者への介入試験を計画し、実施を開始した。研究の目的は睡眠呼吸障害を合併する冠動脈疾患患者に対し、CPAP治療12ヶ月後の非責任病変冠動脈プラークの進展( [脂質性プラークの変化ならびにプラーク容積])に対する効果をCPAP治療群と標準治療群の間で比較することである。研究のアウトラインは冠動脈硬化症の診断にて待機的に経皮的カテーテル冠動脈形成術(PCI)を行う睡眠呼吸障害合併患者において、PCI治療成功後にランダム化を行い、CPAP治療群(適切薬物治療+CPAP治療)と標準治療群(適切薬物治療のみ)の1:1割り付けを行い、12ヶ月後の責任血管・非責任病変冠動脈プラークの進展度を比較検討する。本研究の目標症例は100例であり、登録を開始している状況である。また、本研究のプロトコール論文も執筆済みである(J Cardiol. 2019 Jan;73(1):89-93.)。当院でこれまでに冠動脈疾患に対して経皮的カテーテル治療を施行し、睡眠呼吸障害を評価した約3年分の患者のデータベースの構築が完了している。睡眠呼吸障害を評価した患者の後ろ向き予後調査も終了している。それら患者の冠動脈疾患治療時における責任病変冠動脈プラークに対する血管内超音波での評価・解析のための画像解析システムの構築が完了している。現時点で一部の画像解析が終了しており、睡眠検査データとの統合を行っている。これにより本研究目的である睡眠呼吸障害と冠動脈プラークの関連性についての評価が可能になると思われる。当院冠動脈疾患データベースにおいて栄養状態の評価に関しても注目している。平時からの栄養不良が睡眠障害にも影響するのではないかとの仮説に対してまずは栄養状態と長期予後との関連性について検討した。対象は2000年から2011年にかけて初回の冠動脈疾患治療を施行した患者,2853名であり,治療時のGeriatric nutritional risk index (GNRI)で3分位に分けた.主要エンドポイントは,心臓死,非致死性心筋梗塞を含むmajor adverse cardiac events (MACE)とした.GNRIの中央値は101。フォローアップ期間の中央値は7.4年で,146のイベントが生じた(7.2%).カプランマイヤー曲線ではGNRIの低下とイベントの発症の関連が認められた.多変量解析ではGNRIが高い群に対して,最も低い群の心血管イベントのリスクが有意に高い結果となった。低栄養状態が冠動脈疾患患者の長期予後と関連していることが明らかとなった。それにより、栄養状態の評価も睡眠呼吸障害の評価と同様に重要であると考えている。当院で冠動脈疾患に対して経皮的カテーテル治療を施行し、睡眠呼吸障害を評価した患者の後ろ向きデータベースの構築が完了している状況であり、現在データクリーニングを行っている。各セクションからのデータで再確認が必要な事項も有り、慎重に対応している。画像解析に関してはシステム構築が終了し、解析方法論を決定後にパイロット解析を行った。その後に連続的に画像解析を行っている状況である。また、前向き介入研究の準備もすすめている。睡眠呼吸障害に対する治療介入が冠動脈疾患イベントの抑制につながるとの仮説をもとに、代替エンドポイントを冠動脈プラークとしての研究計画を立案している。治療介入の方法や研究デザインに関して準備をしている。2014年8月2016年8月にかけて順天堂医院にて経皮的カテーテル冠動脈形成術(PCI)を施行した患者のうち、酸素飽和度モニター(PULSOX; Minolta, Osaka, Japan)を用いて睡眠呼吸障害(sleep disorder breathing: SDB)に対する簡易検査を323症例で施行し、そのうち、IVUSによる責任病変冠プラーク解析を300症例で実施した。解析手法としては病変の形態や減衰角度・石灰化角度などの質的解析、ならびにプラークの容量や最小血管径などの量的解析を行った。その結果、睡眠呼吸障害を合併した患者では合併していない患者と比較して責任病変における冠動脈プラー容量が有意に大きかった。(224.5mm3 vs. 190.8mm3, p=0.05)また、プラークの不安定性と関連するとされているエコー減衰角度が高値である傾向と共に、減衰角度中央値以上(maximum attenuation angle >140°)の頻度が有意に高率であった。従ってこれらの結果より、睡眠呼吸障害を合併する冠動脈疾患患者は不安定性が高く、容量の大きい冠動脈病変を有する可能性があることを示唆した。今後はこれらの睡眠呼吸障害に対しての治療介入試験を検討していく方針である。

当院で冠動脈疾患治療を施行した患者で睡眠呼吸障害の評価が出来た患者の血管内超音波検査(IVUS)で得られた画像解析が終了している。これらの画像解析データを臨床データと共に統計解析を行い、論文作成中である。また、睡眠呼吸障害を合併した冠動脈疾患患者に対する治療介入による冠動脈プラークに対する効果を判定するために前向き臨床研究を計画している。今年度は睡眠呼吸障害を合併した冠動脈疾患患者における責任病変のプラーク解析の論文報告をした。(J Am Heart Assoc. 2018Oct 2;7(19):e009826.)本研究は冠動脈疾患を有する患者、289例を対象に、冠動脈責任病変のプラークをIVUS(血管内超音波)で評価した研究である。睡眠呼吸障害の定義は簡易検査で、3%ODI(oxygen desaturation index)が15イベント以上とした。結果的に、睡眠呼吸障害を合併した患者のプラークは非合併の患者と比較して、プラーク容量が多い傾向にあり、減衰角度が有意に大きかった。多変量解析でもプラークの不安定性と睡眠呼吸障害は有意に関連していた。これらより、睡眠呼吸障害の存在がプラークの進展や不安定化に関与している可能性が示唆された。これらの結果は日本循環器学会学術集会でも口演発表している。上記の横断的調査と同時に我々は睡眠呼吸障害合併冠動脈疾患患者への介入試験を計画し、実施を開始した。研究の目的は睡眠呼吸障害を合併する冠動脈疾患患者に対し、CPAP治療12ヶ月後の非責任病変冠動脈プラークの進展( [脂質性プラークの変化ならびにプラーク容積])に対する効果をCPAP治療群と標準治療群の間で比較することである。研究のアウトラインは冠動脈硬化症の診断にて待機的に経皮的カテーテル冠動脈形成術(PCI)を行う睡眠呼吸障害合併患者において、PCI治療成功後にランダム化を行い、CPAP治療群(適切薬物治療+CPAP治療)と標準治療群(適切薬物治療のみ)の1:1割り付けを行い、12ヶ月後の責任血管・非責任病変冠動脈プラークの進展度を比較検討する。本研究の目標症例は100例であり、登録を開始している状況である。また、本研究のプロトコール論文も執筆済みである(J Cardiol. 2019 Jan;73(1):89-93.)。睡眠呼吸障害が冠動脈疾患に与える影響に関しては様々な因子が関与していると考えている。具体的には患者の栄養状態や食生活などのライフスタイルである。睡眠もライフスタイルで重要であるが、それらと共に栄養状態についても注目していきたいと考えている。本研究目的は睡眠呼吸障害が冠動脈粥腫いわゆるプラークの進展、更にはその不安定化にどのように影響するかを明らかにすることである。本研究では、冠動脈プラーク病変に対して血管内イメージングモダリティを駆使して様々な角度から冠動脈プラークを評価し、睡眠呼吸障害との関連性を詳細に検討する予定である。
河川植生の水理に関する総合的研究

1.植生群落調査:河道内植物群落調査においては植物種,そのサイズ,密度に加えて,河道の微地形をしっかり把握し植物群落との相対的位置関係を明らかにすることが重要で,こうした観点からの調作法を確率,手取川で実地調査を行い,扇状地河川の植物群落性状が明らかにされた.また北海道では鵡川において洪水後の樹木の倒伏状況が詳細に調査され,樹木倒伏が河道微地形に支配されていることを明らかにした.さらに河川・貯水地の水辺の潅木の生長過程が観察され,潅木林の経年変化予測の手掛かりが得られた.2.植生層上の流れ:植物が剛な場合については最近研究が進んできたので,本研究では柔軟な植生が注目された.可橈性を有する沈水性植物を対象に植生層協会近傍の組織渦が画像解析とマスコン法で調べられ,楕円形の渦構造が運動量混合をになっていることが明らかにされた.一方,植物の揺動と植性層境界近傍の流れの変化の相互作用系の不安定解析から穂波の発生の説明も試みられた.3.植生帯を伴う流れと流砂:植生帯を伴う流れが水平組織渦の存在で特徴づけられることが明らかにされ,その発生の線形不安定解析による説明が試みられた.また,これに起因する低周波変動が掃流過程にも影響し,植生近傍での掃流砂の横断方向フラッスの交番,ネットのフラックスの出現を解析的に導き,植生帯境界近傍の縦筋地形,分級縦筋の形成が説明された.一方,応力代数モデルによる流れの数値計算によって,植生帯を伴う流れ,複断面河道流れの計算を行って比較すること,高水敷・植生帯の並存する場の流れの予測が試みられた.4.植生と河川の土砂動態:地理情報システムを利用して植生の繁茂分布をも考慮した流域特性にもとづいた水系全体の土砂動態モデルを試作し,特に中上流部の河川植生繁茂機会と出水頻度・流送土砂条件との関係について考察された.1.植生群落調査:河道内植物群落調査においては植物種,そのサイズ,密度に加えて,河道の微地形をしっかり把握し植物群落との相対的位置関係を明らかにすることが重要で,こうした観点からの調作法を確率,手取川で実地調査を行い,扇状地河川の植物群落性状が明らかにされた.また北海道では鵡川において洪水後の樹木の倒伏状況が詳細に調査され,樹木倒伏が河道微地形に支配されていることを明らかにした.さらに河川・貯水地の水辺の潅木の生長過程が観察され,潅木林の経年変化予測の手掛かりが得られた.2.植生層上の流れ:植物が剛な場合については最近研究が進んできたので,本研究では柔軟な植生が注目された.可橈性を有する沈水性植物を対象に植生層協会近傍の組織渦が画像解析とマスコン法で調べられ,楕円形の渦構造が運動量混合をになっていることが明らかにされた.一方,植物の揺動と植性層境界近傍の流れの変化の相互作用系の不安定解析から穂波の発生の説明も試みられた.3.植生帯を伴う流れと流砂:植生帯を伴う流れが水平組織渦の存在で特徴づけられることが明らかにされ,その発生の線形不安定解析による説明が試みられた.また,これに起因する低周波変動が掃流過程にも影響し,植生近傍での掃流砂の横断方向フラッスの交番,ネットのフラックスの出現を解析的に導き,植生帯境界近傍の縦筋地形,分級縦筋の形成が説明された.一方,応力代数モデルによる流れの数値計算によって,植生帯を伴う流れ,複断面河道流れの計算を行って比較すること,高水敷・植生帯の並存する場の流れの予測が試みられた.4.植生と河川の土砂動態:地理情報システムを利用して植生の繁茂分布をも考慮した流域特性にもとづいた水系全体の土砂動態モデルを試作し,特に中上流部の河川植生繁茂機会と出水頻度・流送土砂条件との関係について考察された.模型植生上の3次元乱流構造を可視化実験により調べた。マルチスリット光源装置を作製し、複数の鉛直断面内のトレーサ移動パターンから組織渦の3次元構造を推定することを試みた。現段階では渦構造の断辺的なイメージは抽出できたが、改良すべき点も多数存在することが明らかになった。(池田,渡辺)手取川での植生群落調査、実河川敷の植生上の流れの野外計測,揺動する植生モデル上の乱流構造についての研究に加えて、植生帯を伴う流路で植生近傍の横断方向流砂とそれによる河床変動について研究を行った。(辻本)カワヤナギの成長の様子を観察し、流水抵抗を支配する葉の量の季節変化を明らかにした。また、葉1枚の流水抵抗を明らかにすることともに成長に伴う葉の量の経験式を作成し、カワヤナギの流水抵抗の時間変化の算定方法を導いた。(石川)富士川支川笛吹川において流況を観測し、その解析をした。ブロック抵水護岸と植生を含む自然側岸との不連続部で水理量を解析し、流速分布形等から、河床、ブロック護岸、自然測岸でのそれぞれの粗度評価を行った。(砂田)水路全断面あるいは半断面の路床に模擬植生を設置し、乱流場の詳細測定をLADを用いて実施した。また、これらの流れ場を抵抗項を加えたK-εモデル,代数応力モデルヲ用いて数値解析し、平均流特性を明らかにした。(清水)

1.植生群落調査:扇状地河川の代表例である手取川河川敷において河道内植物群落分布についての調査を行ない,特に縦断方向に帯状の群落を形成するカワヤナギ,アキグミ,ツルヨシなどの群落形成特性を基準流量時水位からの比高に着目して明らかにした。北海道・鵡川においては洪水後の樹木の倒伏状況の詳細な調査から,樹木倒伏が河道微地形に支配されていることが明らかにされた。また,樹木群の影響を考慮した2次元浅水流モデルで当該洪水の再現が試みられた。さらに河川・貯水池の水辺の潅木の生長過程を幹・枝の接合状況に着目して調査され,水辺の潅木林の経年変化予測の手掛かりが得られた。2.植生層上の流れ:可橈性を有する沈水性植物を対象に植生層協会近傍の組織渦が画像解析とマスコン法で調べられ,組織渦がローラーとリブ構造からなる三次元構造を持っていることが明らかにされた。一方,組織的に変動している柱状植生層では,植生密度の空間分布がどのように不均一化するかが調べられ,このような非均質植生層上の流れについての検討が行なわれた。3.植生帯を伴う流れと流砂:植生帯を伴う流れの流速分布が導かれ,それをもとにした線形不安定解析によって,水平組織渦の発生が説明が試みられた。これに起因する低周波変動のため,植生近傍で掃流砂の横断方向フラッスが交番する過程を非平衡掃流砂モデルで表現し植生帯境界近傍の縦筋地形,分級縦筋の形成が説明された。また,応力代数モデルによる流れの数値計算によって,高水敷・植生帯の並存する場の流れの予測が試みられた。4.植生と河川の土砂動態:地理情報システムを利用して植生の繁茂分布をも考慮した流域特性にもとづいた試作された水系全体の土砂動態モデルを用いて,中上流部の河川植生繁茂機会と出水頻度・流送土砂条件との関係について考察された。
社会性の発達を促す子育て支援における行動コンサルテーションの効果

本研究では、自閉症スペクトラム障害を含む社会性の発達に偏りのある子どもの「子育て支援」の方法として、保護者ならびに子どもに関わる支援者(学生セラピストや学校教員等)に対して「行動コンサルテーション」を行い、その効果を客観的、科学的に評価した。その結果、子どもの問題行動が減少し、保護者の精神健康度とストレスが改善し、学生セラピストの技術と知識が向上し、学校教員の児童に対する分析の視点が変容した。平成24年度では、公立小学校の情緒障害学級(通級)に通う発達障害児の保護者を対象に、保護者のストレスを調べる質問紙とConners3の2種類の検査を行い、保護者のストレスと子どもの行動特徴の関係を明らかにすることを目的とした。保護者のストレスを調べる質問紙としては、稲浪・小椋・ロジャーズ・西(1994)が障害のある子どもを育てる親のストレスについて、多角的に測定することを目的に開発したQuestionnaire onResourcesandStress(QRS)簡易版を用い、子どもの行動特徴を詳細に分析するための比較的新しい質問紙としてConners3TM日本語版を用いた。その結果、保護者のストレスととても高い相関が見られたのは子どもの多動性・衝動性という特性であり、ある程度の相関があったのは実行機能、攻撃性、友人関係であった。一方、相関が見られなかった特性は不注意と学習の問題であった。結果からは、保護者のストレスと子どもの多動性・衝動性に相関があるということが分かっただけで、因果関係まで明らかになったわけではないが、子どもの多動性・衝動性が保護者ストレスを高めた可能性や、逆に保護者ストレスが子どもの多動性・衝動性を高めた可能性が示唆された。今後の課題として、さらにデータを蓄積し、相関関係だけでなく保護者のストレスに影響する子どもの行動特徴について因果関係の検討をする必要があるだろう。また、そうした分析からストレスの原因別に子育てを支援する方法を提案する必要があるだろう。平成25年度の研究では、A県B市の発達に偏りのある子どもの不適応行動に悩む保護者10名を対象に、メンタルヘルスの問題を改善するため、以下の内容から構成されるペアレントトレーニングプログラムを8回実施した。なお、参加者に対しては、研究の目的や得られたデータの公開方法及び個人情報の保護に関して説明し、文書による同意を得ている。1子どもの行動の機能的アセスメントと標的行動の選定、2三項随伴性に基づいた対応の方法(非両立行動、代替行動、他行動の分化強化)、3自己モニタリング、4指示やルール、約束を効果的に示す。尺度として、GHQ(精神健康度)、QRS(障害児の保護者用のストレス尺度)、Conners3(ADHDおよびその関連障害の尺度)の3種類の質問紙を用いた。質問紙は、第1回目と第7回目のプログラム時に行なった。その結果、GHQ得点、QRS得点、Conners3得点が下がり、標的行動の頻度が下がった。プログラムが母子両方にポジティブな効果をもたらしたことが明らかとなった。また、参加者はプログラムの後半になるにしたがって、子どもへの対応の工夫や過去の自分の養育の問題点について、積極的に意見を述べるようになり、参加者間での情報交換も活発に行なわれるようになった。グループでプログラムを行なうことにより、参加者の各家庭でのポジティブな効果が生まれただけではなく、参加者間でのポジティブな関係も生まれたことが考えられる。平成23年度の6月から12月までは、準備期間として、コンサルテーションの教材としてテキストと動画(応用行動分析学に基づいた支援技法であるディスクリートトライアルティーチング及びピボタルレスポンストレーニングについての解説を含む)を作成し、ネット上から教材動画を閲覧できるように準備を行った。そして、大学生および大学院生と対象に、早期発達支援(共同注意、喃語、模倣、言語理解、言語表出、機能的言語、学習支援)のスキルを指導するプログラムを実施し、発達障害児に対する指導法の改善についてその効果を検証した。また、並行して、通常学級に在籍する発達障害児を対象に、問題行動を低減するためのセルフマネージメント法の指導を行い、一定の効果が得られたため、その結果を学会にて発表した。発達障害児の家庭においても、余暇活動の支援およびコミュニケーションの指導について実践的検証を行い一定の成果を得た。こうした問題行動の対応や余暇活動支援、コミュニケーション指導についての知見を支援プログラムに組み込む予定である。平成26年度は、特別支援学校の小学部教員を対象として、応用行動分析学に基づいた行動コンサルテーションを実施し、その効果を検討した。研究参加者として、特別支援学校小学部教員(1学年6学年)20名程度を対象とした。平成26年5月平成27年3月の間に、応用行動分析学を専門とする2名の専門家がのべ24回訪問し、各学年の教員に対して、特に対応の難しい障害児の行動問題改善についてのコンサルテーションを行った。

1回のコンサルテーションの流れは、1午前中2時間程度、専門家が対象児童の授業中の様子をビデオ撮影しながら行動観察を行い、2午後に90分程度、専門家が撮影した動画を教員に見せながら、対象児童の問題となっている行動を分析した後、専門家と教員が協働で今後の対処について検討するというものであった。コンサルテーションは各学年に対して4回ずつ実施された。そうしたコンサルテーションの結果、対象児童および担当教員の行動に変化が見られた。また、教員の問題行動に関する分析観点にも変化が見られた。この一連のコンサルテーション活動に対する教員の満足度は非常に高いものであった。特別支援学校において深刻な問題行動のある児童への対応は、学校教員の試行錯誤だけでは困難な場合があり、そうした場合には専門家によるコンサルテーションが有効であることがわかった。特に、撮影した動画を用いてのビデオフィードバックに基づいた実践的な助言と教員との双方向的な話し合いが、効果的かつ満足度の高い方法であることが明らかとなった。応用行動分析学いわゆる親のストレスは子どもの発達的要因だけでなく社会的環境やサポート資源とも関係が深いことが示唆されているが、具体的にどのような子どもの行動特徴が親のストレスに関連しているのかを詳細に検討した研究は少ない。発達障害と言っても、個々の子どもが示す行動特徴は多様であり、一概に親のストレスが高いということはできないと思われる。親のストレスの原因を子どもの障害に帰属させるのではなく、子どもの示す特定の行動特徴に求めなければ、親のストレスに対しての焦点の定まった支援を検討することができない可能性がある。こうした問題を受け、24年度には、発達障害児の保護者を対象とした調査研究を行い、保護者のストレスと子どもの行動特徴の関係を検証することができたため、おおむね順調に進展しているといえる。保護者だけではなく、学校教員などの子育てに関わる専門家を対象とした研究を実施する予定であったが、十分に得られていないため。23年度には、大学生および大学院生を対象に必要な教材と技法の開発と検証を行うことができたため、おおむね順調に進展しているといえる。25年度は、発達障害児の保護者グループを対象に、開発した支援プログラム研修を行い、その効果を検証する予定である。今後、研究期間を延長し、学校教員を対象とした研究を実施する予定である。また、保護者を対象とした研究についても、研究参加者を増やしてデータを得る予定である。24年度以降は、発達障害児の保護者グループを対象に、開発した支援プログラム研修を行い、その効果を検証する予定である。24年度の成果について国際学会での発表を行うための旅費として研究費を使用する。また、保護者対象の実践研究を実施するため、参加者への謝金、研究協力者への謝金として主に使用する。本研究の対象者は障害のある子どもとその保護者であるため、参加に同意してくれる対象者を短期間に多数集めるのは困難である。そのため、平成25年度にデータを収集できた対象者は予定よりも少なく、リサーチアシスタントにデータの分析を依頼する必要がなかった。以上により平成25年度の未使用額が発生した。現在のデータ量では一般性のある結論を導き出すのに不十分という問題が生じる可能性がある。
クロマチン修飾を介したブロモドメインタンパク質による発生制御機構

1、BETドメインファミリー遺伝子は、アセチル化ピストンに特異的に結合するプロモドメインを持つ遺伝子群である。アミノ酸一次構造から、主に体細胞で発現するBrd2,Brd3,Brd4と生殖系列特異的に発現するBrdtとに大別されている。今年度は、マウスの神経上皮形成過程における、Brd2遺伝子の機能を明らかにするため、遺伝子欠損マウス及び過剰発現マウスを作製し、その表現型を解析した。Brd2遺伝子欠損変異体としては、当研究室で同定された、Brd2遺伝子座を完全に欠失したトランスジーン挿入null変異体及び英国サンガーセンターのBrd2遺伝子トラップ変異体を用いて解析を進めた。また、過剰発現マウスについては、CAGプロモーター下にBrd2 cDNAを連結したトランスジーンを用いて、トランスジェニックマウスを作製した。Brd2欠損変異胚では、どちらの変異alleleでも神経管閉鎖不全、顔面頭蓋形成不全、矮小等を示し、胚性1215日目までに致死となった。一方、Brd2過剰発現マウスは、一見したところ正常であり、遺伝子欠損マウスで見られる矮小や神経管閉鎖不全などの形態的異常を回復させることができた。2.次に神経上皮における細胞レベルでの異常を明らかにするため、細胞増殖マーカーとしてリン酸化ヒストンH3、細胞死マーカーとして活性化型Caspase-3等について組織免疫染色を行った。その結果、前脳領域の神経上皮細胞は、胚性10日目では、ほとんど細胞分裂像が観察されず、細胞死に至ることが明らかになった。また、9日目では、アピカル側以外のより基底膜側においても、異所的な細胞分裂が観察された。以上の解析から、細胞増殖異常及び異所的な細胞死が主たる原因で神経管閉鎖不全や矮小などの異常に至ったことが示唆された。1、BETドメインファミリー遺伝子は、アセチル化ヒストンに特異的に結合するプロモドメインを持つ遺伝子群である。アミノ酸一次構造から、主に体細胞で発現するBrd2, Brd3, Brd4と生殖系列特異的に発現するBrdtとに大別されている。マウスの初期旋発生過程において、Brd2,3,4遺伝子がどのように発現しているかその詳細は示されていない。そこで、これら3種類のBrd遺伝子の発現様式をin situ hybridization法により検討した。結果、3種類とも胚性6日目から既に発現を開始し、10日目まで、ほぼユビキタスに発現していることが分かった。更に、特異的な抗体を用いた発現から、Brd2タンパク質は分裂中でも核内に局在することが分かった。2、Brd2遺伝子欠失マウスの表現型を解析したところ、ホモ変異胚では、頭部神経管閉鎖不全、顔面頭蓋形成不全、矮小等を示し、胚性12日目までに致死となることが分かった。形態的な解析及び分子マーカーレベルでの発現解析から、前後軸や背腹軸に沿った領域形成は正常に進行するが、細胞が正常に増殖できず、10日目までに細胞死に至っていた。3、発生過程におけるBrd2遺伝子産物の発現をライブで解析するため、内在性Brd2遺伝子との融合蛍光タンパク質を持つトランスジェニックマウスをBACベクターを用いて樹立した。観察された蛍光タンパク質の発現は、in situ hybridization法によるBrd2遺伝子の発現パターンと良く一致していた。実際、本トラスジーンによって、Brd2欠損マウスの表現型が完全に回復したことから、本融合蛍光タンパク質が、内在性のBrd2遺伝子の発現と機能を再現できていることが示唆された。
薬剤耐性菌感染症を克服する光線免疫殺菌療法の開発

黄色ブドウ球菌の主要細胞壁構成成分であるペプチドグリカンを特異的に認識するモノクローナル抗体と光感受性物質を結合させた化合物および近赤外光の照射によって、モノクローナル抗体が標的特異的に結合する細菌(黄色ブドウ球菌)のみを選択的に殺菌することが可能であった。MRSAやVISAのような薬剤耐性黄色ブドウ球菌に対しても、抗ペプチドグリカンモノクローナル抗体の特異的な結合によって殺菌効果が誘導可能であった。標的特異的な感染症治療として今後臨床応用できる可能性が示唆された。ペニシリンが実用化され暫くして薬剤耐性菌が確認されて以来、細菌感染症に対する治療は抗菌薬の進歩と耐性菌の出現を繰り返している。薬剤耐性のメカニズムとして薬剤の酵素分解や修飾、細胞膜透過性の低下、薬剤排出機構、作用点変異などが広く知られている。近年になり、多剤耐性緑膿菌のような複数の耐性メカニズムを発現する細菌も検出されるようになり、耐性菌に対する感染症治療は全世界的な問題となっており、新規抗菌薬の開発とならび、新たな治療法の出現が望まれている。申請者らが開発してきたがんに対する新しい治療法であるphotoimmunotherapy(PIT)は、がん分子標的モノクローナル抗体に近赤外光を吸収し蛍光や熱などを産生する蛍光プローブを結合させ、正常細胞に障害を与えずにがん細胞のみを近赤外光にて破壊する方法である。本研究では、がんに対するPITの方法論を感染症治療へ応用することを目的とした。つまり、細菌細胞膜や細胞壁に発現する分子に対するモノクローナル抗体に光感受性蛍光プローブを結合させた新規化合物を合成した。新規化合物を細菌に添加し、近赤外光を照射することで、光線殺菌治療可能となることをin vitroにおいて証明した。細菌感染症における薬剤耐性菌の問題は、ペニシリンが実用化されて以来現在においても、大きな問題であり、抗菌薬の開発と耐性菌の出現を繰り返している。薬剤耐性のメカニズムとして薬剤の酵素分解や細胞膜透過性低下など複数知られているが、近年になり多剤耐性緑膿菌のような複数の耐性メカニズムをもつ細菌も検出されるようになり、感染症治療における耐性菌の克服は全世界的な問題である。研究代表者らが開発してきたがんに対する分子標的特異的な光線治療法であるphotoimmunotherapy(PIT)は、がん分子標的モノクローナル抗体に近赤外光を吸収し蛍光や熱を発する光感受性物質を結合させ、正常細胞に障害を与えずにがん細胞のみを近赤外光によって破壊する治療法である。本研究課題では、がんに対するPITの方法論を感染症治療へ応用させることを目的とした。黄色ブドウ球菌の細胞壁(ペプチドグリカン)を認識するモノクローナル抗体と光感受性物質を結合させた化合物、および、近赤外光の照射によって各種黄色ブドウ球菌(MSSA,MRSA,VISA)に対する光線殺菌効果を抗体の細胞壁特異的結合の程度に依存して誘導可能であった。細菌の細胞壁および細胞膜を構成する分子に対するモノクローナル抗体を検索し、黄色ブドウ球菌の細胞壁に存在する分子を特異的に認識するモノクローナル抗体を本課題では選択した。この抗体に光感受性蛍光プローブIRDye700DXを結合させた化合物を作成し、細菌に投与することで、蛍光プローブの細菌細胞壁への局在を顕微鏡レベルで確認した。この状態において近赤外光を照射することで、MSSA(メシチリン感受性黄色ブドウ球菌)、MRSA(メシチリン耐性黄色ブドウ球菌)、VISA(バンコマイシン軽度耐性黄色ブドウ球菌)に対して近赤外光のエネルギーに依存した光線殺菌の効果をin vitroの条件において確認できた。消化器内科学がんに対するPITの方法論が薬剤耐性菌の治療法として応用可能であることがin vitroレベルで示せたため、今後ex vivoおよびin vivoの条件実現可能であるか検討を進めていく予定である。PITを実現させる標的分子の選択のため、モノクローナル抗体購入に多額の費用が必要と見込まれたが、計画よりも早く標的とするモノクローナル抗体が決定できたため、初年度の使用計画に若干の変更が生じた。in vivoの検討においては、多量のモノクローナル抗体と多数の実験動物が必要と見込まれ、その購入費用に充てる予定である。
中国の都市高温化緩和を目的とした都市環境気候地図のあり方に関する研究

今年度は、昨年度作成した都市環境気候地図(クリマアトラス)の実用化、及び都市計画や社会状況が異なる他国に適合した都市環境気候地図作成を目標に、以下に示す内容を実施した。1都市環境気候地図(クリマアトラス)の実用化に向けたワークショップへの参加2017年3月24日に開催された「ドイツの環境都市づくり近年の事例から学ぶ温暖化適応都市」にて、広島市の都市環境気候地図を用いて、プランナー、行政関係者との意見交換を行った。このワークショップでは、まずドイツ・シュツットガルト大学、およびカールスルーエ市、ベルリン市それぞれの地方自治体担当部局者より、温暖化適応のための諸対策(暑熱対策、水害対策等)に関する紹介があり、次に都市環境気候地図を用いて、広島の温暖化適応都市づくりに関する意見交換を行った。ここでは、温暖化適応都市作りを行う上で、プランナー、行政関係者が都市環境気候地図に示してほしいこと、またドイツの取り組みを日本の都市計画制度下で行うためには何をすべきかに関する議論が活発に行われた。2都市計画や社会状況が異なる他国に適合した都市環境気候地図の作成中国の諸都市の都市環境気候地図作成前の予備的研究として、アメリカ合衆国・カリフォルニア州・サンディエゴとその周辺域を対象に都市環境気候地図作成を行った。作成手順は以下のとおりである。(1)メソ気象モデルの入力境界条件の作成・収集(2)メソ気象モデルを用いた、対象都市における夏季の気候の再現数値シミュレーション(3)数値シミュレーションの精度検証(4)数値シミュレーション結果を用いた気候の現況分析(5)計画指針地図(試作版)、及び都市環境気候地図(試作版)の作成28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は以下に示す内容を実施し、都市環境気候地図(クリマアトラス)作成方法を確立した。1都市環境気候地図(クリマアトラス)に関する既往研究の整理:都市環境気候地図に関する既往研究の整理を行い、今後作成されるべき都市環境気候地図の条件を3つ示した。I.都市環境気候地図には大きく3つのタイプ(タイプA、タイプB、タイプC)があり、都市内の気候は、その場所の地表面の状況と周囲の状況(風の吹き方)の影響を受け成立しているため、タイプBとタイプCの複合型のクリマアトラスが望ましい。II.タイプCでは数値シミュレーションの利用が有効と考えられるが、社会的にシミュレーション技術に対する信頼度が絶対的でないことをふまえると、都市環境気候地図は気温観測データをもとに作成し、その根拠としてメカニズムを示すために数値シミュレーション結果を併用することが望ましい。III.都市環境気候地図では各ゾーンにおける都市高温化対策に関する計画時の配慮事項、活用可能な気候資源等を示す必要があるため、高温化する場所それぞれの高温化要因を把握することが望ましい。2気温観測データを用いた都市内の気温分布形成要因の総合的評価:各気温分布形成要因を説明変数、気温観測データを目的変数とした重回帰分析を行い、これらの要因の影響度合いを総合的に評価した。3メソ気象モデルWRFを用いた対象都市の夏季気候の再現数値シミュレーション、および気候の現況分析:再現数値シミュレーションには、メソ気象モデルWRF version 3.2.1 ARWを用いた。次に数値計算結果を用いて昼間の気温分布の主要形成要因の1つである海風方向海岸距離が気温分布に影響を及ぼすメカニズムを明らかにした。4都市環境気候地図の作成:2、3の結果をもとに、昼間・夜間別に地域区分を行い、その地域区分結果をもとに都市環境気候地図を作成した。研究計画書に示した本年度の目的である都市環境気候地図(国内版)の作成を行ったが、一部行っていない調査があるため、「(2)おおむね順調に進展している。」を選択した。(1)メソ気象モデルの入力境界条件の作成・収集(2)メソ気象モデルを用いた、対象都市における夏季の気候の再現数値シミュレーション(3)数値シミュレーションの精度検証(4)数値シミュレーション結果を用いた気候の現況分析(5)計画指針地図(試作版)、及び都市環境気候地図(試作版)の作成主に、27年度の成果をベースに、中国の都市における都市環境気候地図の作成を行う。なお手順は以下のとおりとする。1数値シミュレーション(WRF)の入力

境界条件である、土地利用/土地被覆データ等の収集・作成を行う。21で収集・作成した入力境界条件を用いて、WRFによる夏季の気候の再現シミュレーションを行う。3対象地の気象観測所の観測データ等を入手し、それらを用いて2の結果の精度検証を行う。4現状の再現数値シミュレーション結果より、対象都市の気候の現況分析を行い、気候分析地図を作成する。54の分析結果にもとづき、対象都市内のゾーニングを行った後、各ゾーンに対する具体的な指針、配慮事項を検討し、その後それらを地図にまとめた計画指針地図を作成する。6現地の都市計画関係者に対するヒアリング調査を行う。7国内外の学会やその論文集等を通じて6までの成果の公表を行う。86と7の意見等を反映させた中国版都市環境気候地図を作成する。28年度が最終年度であるため、記入しない。
ウシにおけるレプチンのアッセイ系確立と泌乳との関係

昨年度に引き続き、組み替え型ウシレプチンの合成を行った。昨年度中にGST融合型ウシレプチンと思われるタンパク質の発現は確認していたものの、そのほとんどが不溶性分画に存在した。本年度、様々な培養・発現条件の検討を行ったが、可溶性を向上させることが出来なかった。そこで発現ベクターと大腸菌を共に変更したところ、良好な発現と、可溶性の向上を認めるに至った。現在、組み替え型タンパク質の抽出・精製条件を検討中である。37°C、0.7mM lPTGにて発現を確認していたので、培養温度の低下(26°C)、lPTG濃度の減少(0.1mM,0.3mM)、エアロレーションの改善等により可溶性の向上を試みた。また超音波による大腸菌の破砕やプロテアーゼインヒビターの濃度にも注意し、発現・抽出を行ったが、改善は認められなかった.。そこで、GSTよりも一般に可溶性が高いと言われるMBP融合型の発現ベクター(pMAL-cRl)に変更し、宿主大腸菌も、チオレドキシンを発現している株(BL21(DE3))に変更した。そして、26°C、0.3mM IPTG、230rpmにて発現誘導を試みたところ、良好なMBP融合型タンパク質の発現を認めた。依然不溶性分画にも存在するものの、MBP融合型ウシレプチンと思われるタンパク質が、可溶性分画に多量に存在する事をSDS-PAGEにて確認した。今後、アミロースレジンやファクターXaを用いて、組み替え型ウシレプチンを抽出・精製し、ウシ特異的レプチン抗体の作成等行っていく予定である。平成12年度に予定していた組替え型ウシレプチンの合成とともに、作成されるウシ特異的抗体により平成13年度に行う予定であった、乳腺組織の免疫組織化学的検索を、市販のポリクローナル抗体にて行った。1.組替え型ウシレプチンの合成シークエンシングに用いたベクターより、成熟型ウシレプチンの遺伝子配列部位を制限酵素(BamHI,EcoRI)にて切り出し、発現用ベクターpGEX-4T-1に組み込み、BL21大腸菌にトランスフォームした。形質転換された大腸菌をスモールスケールにて37°Cで培養し、0.7mM IPTGにて誘導したところ、GST融合型ウシレプチンと思われる蛋白質の発現を、SDS-PAGEにて確認した。しかしながら、そのほとんどが不溶性分画に存在することが分かったため、培養温度の低下(25°C)、IPTG濃度の減少(0.1mM,0.4mM)、エアロレーションの改善などにより、目的とする蛋白質の可溶性の向上を試みている。2.ウシ乳腺組織におけるレプチン蛋白質の免疫組織化学的検索当初、平成13年度において、今年度中に作成されるウシ特異的抗体で行うはずであった、ウシ乳腺組織の免疫組織化学的検索を、市販のポリクローナル抗体(rabbit anti-mouse leptin,PA1-051,AFFINITY BIOREAGENTS,INC)にて行った。レプチン遺伝子の発現の有無を確認したウシ乳腺組織について、検索を行なったところ、泌乳期で、かつレプチン遺伝子の発現している組織では、乳腺上皮細胞に陽性と考えられる染色像が認められるものの、各種処理においても非特異反応を十分に取り除くことは出来なかった。条件の検討は今後も継続するものの、ウシ特異的抗体の作成も早期に必要であると思われた。
高齢臓器提供者からの肝移植および高齢肝の再若年化の可能性

肝移植の普及によるドナー肝不足に伴い、高齢ドナー肝の利用が増加してきた。生体肝移植においても高齢ドナー肝を使用せざるをえない機会に遭遇する。高齢肝を移植するにあたり、これまで危惧されていた点は、1)若年肝に比し高齢肝の保存時間耐性、及び再潅流による障害の程度、2)高齢肝の加齢によるレシビエントへの影響であった。1)については、すでに我々は、高齢肝も若年肝と同様の保存時間耐性があり、再潅流障害も少ないことを明らかにしている。今回は2)の点を明らかにするために、ラット肝移植モデルにて検討した。加齢による動脈血流減少に伴う肝機能変化を考慮し、肝移植モデルは肝動脈再建を伴うものとした。高齢肝(ヒト年齢6070歳に相当)は若年肝(ヒト年齢20歳に相当)と比較して、組織学的にはその約20%に加齢変化を認めるものの、ほぼ100%の加齢変化を認める心、腎に比較すると、明らかに加齢変化を受けない臓器と考えられた。高齢肝、若年肝を移植された群ともに長期にわたる生存率、蛋白合成能、レシビエント体重変化には、有意な差は認めなかった。術後早期死亡の原因は両群ともに、胆道再建に用いたチューブによる胆道閉塞や膵炎によるものであった。晩期死亡の原因のほとんどは加齢に伴う心不全であり、高齢肝のさらなる加齢によると考えられる肝不全死は認めていない。長期生存例の組織学的検索により、高齢肝移植群の肝で約50%に、若年肝移植群のそれで約20%に加齢変化を認めたことは、生理学的には機能低下を認めないものの、組織学的加齢変化は進行していることを示唆する。注目すべきは、高齢肝移植群の晩期死因のなかで、腫瘍死(肝外)が若年肝移植群より高率に認められたことである。加齢に伴い肝実質細胞機能より肝間質細胞(網内系細胞)の機能低下が、レシピエントの全身における免疫サーベイランスの低下を惹起している可能性があり、移植後の免疫抑制剤の使用と合わせ、高齢肝移植後の発癌は今後の解決すべき問題と考えられた。
細菌によるリグニン関連物の分解に関する研究

リグノセルロ-スからの脱リグニンのためにPseudomonas属細菌TMY1009諸性質を使うことを考え、今年度は酵素の単離、性質の究明、酵素を使っての天然リグニン関連物分解を追究した。Cγ脱離酵素についてリグニン関連化合物の一つ、erythro-1,2-bis(4'-hydroxy-3'-methoxy-phenyl)-1,3-propanediol(β-1型化合物)のγ位炭素脱離を行う酵素を菌体から精製し、活性を459.6倍向上させ、最終精製酵素の純粋性を電気泳動法により示した。さらに、精製した酵素について、分子量、性状、基質特異性、β-1型リグランモデル化合物の分解機構などを究明した。リグノスチルベン-α,β-ジオキシゲナ-ゼ(LSD)について菌体の抽出物を各種クロマトグラフィ-にかけLSD-1を分取した。精製により活性は100倍向上し最終段階で得られた酵素は電気泳動法で純粋性を示した。精製した酵素を用いての研究により、分子量、各種性状及び本酵素がグアヤコキシスチルベン型化合物に特異的に働く酸素添加酵素であることなどを明かにした。またLSD-1が含む鉄の性状も追究し、これが非ヘムの2価鉄で、失活しても添加二価鉄によって再活性化するのを示した。本研究で見いだしたリグニン分解の手法の、天然リグニン関連化合物分解への適用可能性を追究した。爆砕リグニンは生菌で一部が分解し、またアルカリ処理した木粉の分解に酵素LSDは明確な促進効果を与えた。しかしバガスの糖化効率に菌体、粗酵素による前処理は何の効果も生まなかった。ブナ爆砕リグニン、エゾマツアルカリ蒸解リグニン(可溶部)及びチオリグニンへの粗酵素による前処理は何の効果も生なかった。ブナ爆砕リグニン、エゾマツアルカリ蒸解リグニン(可溶部)及びチオリグニンへの粗酵素の作用ではアルカリ蒸解リグニンで効果が認められた。サ-モメカニカルパルプには粗酵素は何の変化も起こさなかった。
紡錘体の形態的評価による高い受精能・発生能をもつ体外成熟卵子の選抜法の確立

哺乳動物の卵子は、体外で培養し操作することが可能になっているが、効率的に発生能力の高い胚を生産し、個体作出に繋げるためには、質の高い成熟卵子を選別して利用する必要がある。本研究では、成熟卵子の紡錘体に着目し、質の高い卵子の特徴を明らかにした。さらに、これに関わる因子を同定し、分子レベルでの解析結果に基づいて、卵子の質の評価につながる指標を確立した。体外培養技術の改良により、体外成熟培養で受精・発生可能な成熟卵子を得ることが可能となったが、体外培養により成熟させた卵子は、体内成熟卵子に比べて受精・発生能が低いことが問題であり、体外で成熟させた卵子の「質」を評価する方法の確立が必要である。本年度は、当初の計画通り、マウスの体内成熟卵子の紡錘体の特徴を捉え、さらに体外成熟卵子との比較を行い、以下のことを明らかにした。1)紡錘体形成に必須である、中心小体周辺物質(PCM)の2点は、極体放出直後のMII期卵子で離れているが、時間経過に伴い2点が寄り、再び離れるという特徴的な動きを捕らえることができた。2)PCMは、卵細胞質中の微小管形成中心(MTOC)によって構成されるが、細胞質のMTOCの蛍光輝度を調べたところ、高い蛍光輝度を示すMTOC数の割合は、体内成熟卵子とゴナドトロピン成熟卵子では、50%程度であったが、自発的成熟卵子においては高い蛍光輝度を示すMTOCは観察されなかった。3)PCMが一時的に寄るタイミングで、高い蛍光輝度を示すMTOC数の割合が最も高くなった。4)受精・発生への影響を調べるため、体外受精・体外培養を行ったところ、PCMが一時的に寄るタイミングが受精・発生能の高いポイントであることが明らかとなった。5)受精能と相関のあるIntegrin mRNA発現解析の結果も4)の結果と一致した。以上の結果から、PCMおよびMTOCに着目した紡錘体形態の評価が、卵子の成熟能評価に有効であることが示された。卵成熟過程における紡錘体形成・維持の分子メカニズムについて解析を行い、以下のことを明らかにした。1)Aktの活性は、減数分裂再開に伴って低下することが明らかとなった。2)Aktは微小管と結合していることが明らかとなり、Aktが紡錘体の形成・維持に直接的に関与している可能性が示された。体外培養技術の改良により、体外成熟培養で受精・発生可能な成熟卵子を得ることが可能となったが、効果的に質の高い胚を生産し、個体作出に繋げるためには、質の高い成熟卵子を選別する必要がある。そのために卵子の「質」を評価する方法の確立が求められている。本年度は予定に沿った研究を進め、以下のことを明らかにした。1)体外成熟卵子の紡錘体形態を体内成熟卵子に近づける培養条件を検討し、FSHを含むWaymouth's培地で18時間培養することで最も効果的に得られることが明らかとなった。また、この条件で受精・発生率が最も高いことを確認した。2)培養条件の違いによる微小管形成能力を調べた結果、微小管形成中心(MTOC)の発現量について変化は認められなかったが、昨年度の研究結果に基づいた受精適期(Phase II)でMTOCの活性が最も高くなることが明らかとなった。特に、1)で示した培養条件において高い活性が認められた。3)微小管の安定性・不安定性に関与する因子(それぞれ、CLIP-170、MCAK)に着目し、微小管形成能力を比較したところ、培養条件の違いにより局在が異なった。すなわち、体内成熟卵子や1)で示した条件では、CLIP-170の紡錘体紡錘体周辺の局在が強く、微小管の安定性が高いことが明らかとなった。この結果は、2)に一致するものである。4)受精に大きく関与する卵成熟促進因子(MPF)の活性を調べたところ、これまでの結果に一致した。以上の結果から、卵子の質と紡錘体の形態には相関があり、微小管の安定性に深く関与することが明らかとなった。そのために卵子の「質」を評価するための方法の確立が求められている。この卵子の質を評価する指標として、顕微鏡下で観察が可能な紡錘体の形態に着目し、本年度は卵成熟過程における紡錘体形成・維持の分子メカニズムの解析を進め、以下のことを明らかにした。

成熟卵子において、受精・発生能が最も高いのは、紡錘体極に存在する2点の中心小体周辺物質が近接するポイントであり、このタイミングでは、微小管の安定性を制御する因子(CLIP-170)の発現が高く、細胞質中には微小管形成中心(MTOC)が大きなクラスターを形成して機能していることを明らかにした。すなわち、微小管が十分束ねられていることが精子侵入前に必要であることが言える。受精後の第二極体放出により減数分裂が完了するが、受精適期に精子侵入が起こらなければ、染色体の不分離にも繋がるため、受精適期の正確な判定が必要である。また、同じタイミングで、AktとmTORおよびその結合パートナーであるRaptorが紡錘体上で共局在し、一時的に微小管と結合している可能性を示した。Aktの阻害は、紡錘体の維持機構に影響を与えたことから、受精・発生能の高い卵子でみられる紡錘体形態の維持には、AktやmTORが積極的に関与しており、これらの因子が卵子の質(受精能力)を判定するひとつの指標になり得ると考えられた。24年度が最終年度であるため、記入しない。
初期リンパ球の発生と分化

ヒトリンパ球の初期発生と分化のメカニズムを研究する目的で、ヒトリンパ性白血病の膜抗原であり、リンパ球分化の極めて初期の段階で発現されるCommon ALL抗原の生化学的特徴の解析(秦順一)や、これらの分化抗原を発現する未熟B前駆細胞型白血病におけるイムノグロブリン重鎖遺伝子(IgH)の遺伝子再構成の研究(水谷修紀)を行なった。また、ヒトTリンパ球の初期分化のメカニズムを研究する目的で、ヒト胸腺上皮細胞を単離し(水谷修紀)、その免疫学的特徴について解析した(水谷修紀、中山雅之)。CALLA抗原はリンパ球の初期分化過程で発現される分子量100kdの糖蛋白である。この抗原はリンパ球の他に顆粒球、線維芽細胞、腎上皮細胞などにおいても発現されることから、これらの異同を生化学的に解析し、蛋白レベルでは共通である事を明らかにし、シアル酸の構成に違いのある事を明らかにした。CALLA抗原陽性リンパ性白血病を、リンパ球の初期分化過程にある細胞のモデルとして用い、IgH遺伝子の再構成について解析した。まずIgH遺伝子5′側に遺伝的多型の存在することを明らかにした。詳細な解析の結果、IgH遺伝子胎児型を示すもの、DQ_<52>とIgJの結合を示すもの、より上流のDとJの結合を示すものを発見した。これらの結果、胎児型、DQ_<52>J結合型、より上流のDとJの結合型の順でBリンパ球が分化して行くものであると推量した。そしてこのことを支持する研究が最近F.Altのグループによっても報告された。ヒトTリンパ球は、胸腺上皮細胞との相互関係によって機能する成熟Tリンパ球に分化する。これらのメカニズムを明らかにする目的で、胎児胸腺より被膜下上皮細胞をSV40遺伝子によって不死化し、その膜抗原の特徴を解析した。また、初期培養系の上皮細胞を用いて、Tリンパ球との接着に関与する膜抗原についても解析した。リンパ球の初期分化過程に関する細胞生物学的,分子生物学的研究の重要性が広く認識されつつあるが,このような命題に答える為には多くの困難な課題を克服しなければならない.我々は小児期造血器腫瘍が,リンパ造血系幹細胞のある分化段階でクローナルに増殖したものとしての材料を提供するとの立場より,これらの白血病の遺伝子解析を行ってきた.プローブとして免疫ブロブリン重鎖(Ig)遺伝子, T細胞抗原受容体遺伝子(TCR)β,γを用い,それぞれの白血病にみられる表現形質との対比を行った.対象はリンパ系32検体,リンパ系,骨髄系の両方の抗原を発現するいわゆるMixed Lineage Leutemia(MLL)7検体, Natural Killer Cell型1検体である.リンパ性のものはT型16検体, B型3検体,未熟B型13検体を含んでいる.T型の14例においてはTCRB.γの再構成がみられたが, 2例においてはβγ鎖の再構成はみられなかった.このことはこれらTCRの再構成がTリンパ球への化分を決定された後引起されることを物語る.従来よりB4抗原陽性のリンパ球は既にBリンパ球への分化を開始したものと考えられてきたが,我々はIg遺伝子胎児型のB4陽性リンパ性白血病を3例発見した.このことはB4抗原の発現がIg遺伝子の再構成に先立つ現象であることを物語っており, B4陽性細胞の中にはリンパ球幹細胞とも呼ぶべき一群が存在することを示唆している.

一方で我々はBリンパ球抗原と骨髄球抗原を同時に発現するMLLの中にIg遺伝子の胎児型の群と再構成のみられる群が存在することからB4抗原の発現が必ずしもリンパ系細胞に限定されず,骨髄芽球の1部において発現されること,又ある種のT型腫瘍ではMy9等の骨髄球抗原が発現されることなどを発見した.これらの現象は幹細胞における抗原発現様式にある種のPromiscuityが存在する,あるいはそういう時期が存在することを示唆しており,今後の研究の方向を示している.リンパ球初期分化過程に関する研究を目的に小児急性リンパ性白血病を用いて細胞生物学的、分子生物学的研究を行った。Bリンパ球の初期分化過程研究の指標としてイムノグロブリン重鎖遺伝子の構造解析を行った。従来の分化抗原による分類とは異り、Bリンパ球の本来的使命であるイムノグロブリン産生をつかさどる同遺伝子の構造が最もよくBリンパ球の分化レベルを反映していると考えられたからである。その結果分化抗原による分類でstageII、IIIを示すものの中にIg遺伝子の胎児型と示すものを2例発見し、さらにIg遺伝子J_H領域が欠損するabortiveB前駆細胞型とも呼ぶべきグループを発見した。未熟B細胞型白血病(Comman ALL)12例について抗リン酸チロシンモノクローナル抗体を用いてリン酸化チロシンの有無について検討した。その結果5例に本抗原の陽性所見を得た。これらは染色所見により2種に分類された。即ち主として細胞膜に陽性となる症例(2例)と細胞室に陽性となる症例(3例)である。これらの結果は異なる作用機序をもつチロシンキナーゼの存在を示唆しているが、このような解析を通して通常B前駆細胞の増殖、分化に関連するチロシンキナーゼを同定できるものと期待している。In vivoでT細胞と複合体で構成するThymic NurseCellとマクロファージを分離し、結合するTリンパ球の分化抗原を検索した。TNC内に存在するTリンパ球はL_3T_4、Lyt_2 double positiveが主体で、double negative cellも認めた。マクロファージとロゼットを形成するTリンパ球はL_3T_4single positiveでdouble positiveが主体を占めた。これらの結果、間質細胞の種類によって結合する胸腺Tリンパ球の分布に差が認められることが明らかになった。