hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
異常タンパク伝播阻止に立脚した神経変性疾患の進行予防治療開発

リクルートメント異常が起こっていることを明らかにした(※現在投稿中)。もう一つの課題として、aS細胞間伝播のメカニズム解析を進めた。この過程で細胞外aSは細胞膜上のドパミントランスポーター(DAT)パーティションを変調させるとともに、エンドサイトーシスによる同分子の内在化・不活性化を誘導し、ドパミン神経機能に影響を与えていることを確認した。また、一部の細胞外aSはDATエンドサイトーシスに伴って細胞内へ取り込まれていることが確認された。(投稿準備中)。また、安定した線維化aS脳内接種を可能とする超音波印加装置を用いた改良型マウスモデルを作出し、先行実験で線維化aS細胞内取込阻害効果が確認されたセルトラリンの治療効果検証を進めている。(1)神経細胞におけるαS吸収・分泌・分解メカニズム解明:細胞モデルを用いて、SSRIなどの既存薬におけるαSYNの細胞内への取り込み抑制効果を検討し、候補薬剤種とその有効濃度を推定する。細胞モデルの結果に基づいて選定された候補薬をin vivoモデルにて検討する。具体的には線維化精製マウスαSYNをマウス脳へ超音波印加型convection-enhanced delivery装置を用い、一側の線条体へ局所注入する。接種1ヶ月後に対側大脳皮質におけるリン酸化αSYN病理に基づき、SSRIによる伝播阻害効果について定量評価を行う。(2)家族性PD・ALS病態下における異常タンパク伝播への影響:PDやALSなどの神経変性疾患に関連する原因遺伝子の多くが、小胞輸送機構を制御していることが近年明らかとなってきている。換言すればこれらの遺伝子異常により小胞輸送機構が破綻を来すと、異常タンパクの分解障害・細胞外分泌が誘導されることが予想される。本研究では家族性ALS・PD遺伝子異常による凝集タンパク分解・分泌プロセスおよび伝播へ影響について、細胞・ショウジョウバエモデルを駆使した病態解析を実施する。(3)細胞外核酸特にエキソソーム中miRNAを介した伝播現象の可能性:miRNAによる伝播性タンパクの細胞毒性修飾の可能性を念頭に、AD、PD、MSA、ALS患者髄液エキソソーム中に含まれるmiRNAのアレイ解析を行い、疾患特異的に増加しているmiRNAを同定する。さらに、同miRNAを介した凝集性タンパクの発現制御、リン酸化などの翻訳後修飾、分解・分泌制御の可能性について、培養細胞系を用いた解析を試みる。28年度が最終年度であるため、記入しない。東北大学大学院医学系研究科神経内科学分野長谷川隆文講師、青木正志教授らのグループは、宮城県立がんセンター研究所田中伸幸教授との共同研究により、神経変性疾患の脳内にみられる異常凝集タンパク蓄積と神経細胞死のプロセスに、小胞輸送
患者の病態運動を再現するアームロボットを用いたリハビリ臨床技能教育プログラム開発

本研究は開発した患者の上肢運動病態を再現できるアームロボットを用い,運動療法熟練者がロボットに与えた上肢運動療法を定量化し,標準的な評価値を算出する.また,算出した評価値は臨床技能を検定するための評価アルゴリズムとしてアームロボットに実装し,学生を対象に運動療法の技術講習を実験的に行い,その教育効果を検証することを目的としている.本年度は,昨年度に得られた内容に関する論文を投稿し,掲載予定となった.データ取得に関しては,対象者数を増やし,熟練者と初学者の運動療法技術の比較を引き続き行った.その結果,熟練者に比べ初学者は,肘関節最大屈曲角まで動かすことができていないこと,動かす最大速度が速くなってしまうこと,最大速度に達するまでの時間も短いこと,運動療法の時間が短くなってしまうことが明らかとなり,熟練者に比べ初学者の方が,運動療法技術が不十分であり,回数を重ねた際の再現性も低いことが明らかとなった.この内容に関して,学会発表を行った.現在は,この取得したデータを用いて,熟練者と初学者の運動療法技術を判別するための評価アルゴリズムを作成中であり,その内容に関する論文を作成している.また現在は,昨年度改良したアームロボットを用いて,学生を対象に,アームロボットを用いた運動療法の技術練習前後での学習効果について検討している.今後は,アームロボットを用いた運動療法練習の効果を検証するためのデータを引き続き取得すると同時に,改良したアームロボットで使用可能な評価アルゴリズムも作成する予定である.平成30年度の計画では,教育実験を行う予定としていた.現在までのところ,アームロボットを用いた練習前後の学習効果について,初学者を対象にデータ取得中である.平成31年度は,アームロボットに運動療法の技能判定プログラムを搭載し,初学者の教育効果について,引き続き検証する予定である.本研究は開発した患者の上肢運動病態を再現できるアームロボットを用い,運動療法熟練者がロボットに与えた上肢運動療法を定量化し,標準的な評価値を算出する.また,算出した評価値は臨床技能を検定するための評価アルゴリズムとしてアームロボットに実装し,学生を対象に運動療法の技術講習を実験的に行い,その教育効果を検証することを目的としている.試作したアームロボットを動かした際に,モーター特有のコギング現象(コリコリと動く)が認められており,人体の関節を動かした感触とは大きく異なっていた.具体的には,改良前の設計では,モーター軸1回転あたり50回(アームを約7.2度曲げるたびに)コギング現象が生じていた.そこで,関節部のモーター軸上のプーリとの間に減速機(減速比:1/10)を組み込むことで,アームを約0.72度曲げるたびに脈動が可能となり,コギング現象を目立たなくする改良を加えた.その結果,人体の関節を動かした感触に近づけることが可能となった.アームロボットの実証実験として,熟練者と初学者の運動療法データを取得し比較を行った.その結果,熟練者に比べ初学者の方が運動療法の再現性が不正確であることが明らかとなった.現在は,アームロボットに施術者が与えた運動を点数化するためのアルゴリズム作成の調査として,アームロボットに対して,熟練した施術者が行う用手運動療法データを取得中である.また,取得したデータから熟練者の運動療法を定量化するためのアルゴリズムを検討中である.さらに,このアームロボットの開発論文を作成し,投稿中である.今後は,取得したデータを熟練者の運動として定量化し,標準的な上肢運動療法の評価値と算出アルゴリズムを作成する.その後,学生を対象にしてアームロボットを用いた運動療法の技術講習を実施し,学生の技能を解析する.平成29年度の計画では,アームロボットに対して熟練した施術者が行う用手運動療法の定量化および初学者と熟練者との運動療法の違いの調査を予定していた.現在までのところ,初学者と熟練者との運動療法の違いを明らかにすることができた.また,熟練者の運動療法の定量化に向けて,運動療法データを取得中である.本研究は開発した患者の上肢運動病態を再現できるアームロボットを用い,運動療法熟練者がロボットに与えた上肢運動療法を定量化し,標準的な評価値を算出する.また,算出した評価値は臨床技能を検定するための評価アルゴリズムとしてアームロボットに実装し,学生を対象に運動療法の技術講習を実験的に行い,その教育効果を検証することを目的としている.本年度は,昨年度に得られた内容に関する論文を投稿し,掲載予定となった.データ取得に関しては,対象者数を増やし,熟練者と初学者の運動療法技術の比較を引き続き行った.その結果,熟練者に比べ初学者は,肘関節最大屈曲角まで動かすことができていないこと,動かす最大速度が速くなってしまうこと,最大速度に達するまでの時間も短いこと,運動療法の時間が短くなってしまうことが明らかとなり,熟練者に比べ初学者の方が,運動療法技術が不十分であり,回数を重ねた際の再現性も低いことが明らかとなった.この内容に関して,学会発表を行った.現在は,この取得したデータを用いて,熟練者と初学者の運動療法技術を判別するための評価アルゴリズムを作成中であり,その内容に関する論文を作成している.また現在は,昨年度改良したアームロボットを用いて,学生を対象に,アームロボットを用いた運動療法の技術練習前後での学習効果について検討している.今後は,アームロボットを用いた運動療法練習の効果を検証するためのデータを引き続き取得すると同時に,改良したアームロボットで使用可能な評価アルゴリズムも作成する予定である.平成30年度の計画では,教育実験を行う予定としていた.現在までのところ,アームロボットを用いた練習前後の学習効果について,初学者を対象にデータ取得中である.

平成30年度は,アームロボットに運動療法の技能判定プログラムを搭載し,初学者の教育効果を検証する予定である.平成31年度は,アームロボットに運動療法の技能判定プログラムを搭載し,初学者の教育効果について,引き続き検証する予定である.コギング現象の改善策として,ステッピングモータからサーボモータへの変更を検討し,サーボモータの購入を予定していたが,モータは変更せず,サーボモータより安価な減速機で対応することができたため,余剰金が生じた.平成29年度で余剰となった資金を使用して,平成30年の効果検証に必要な物品の購入等を検討したい.ステッピングモータからサーボモータへの変更を検討し,サーボモータの購入を予定していたが,モータは変更せず,サーボモータより安価な減速機で対応することができたため,余剰金が生じている.平成30年度で余剰となった資金を使用して,平成31年度の効果検証に必要な物品の購入等を検討したい.
膵beta細胞の細胞内ATP濃度に対するグルカゴンの作用

膵beta細胞においては細胞外グルコース濃度が11.1mM以上である場合、spike-burstが繰り返し発生する。spike-burstとspike-burstとの間のsilentphaseがどの様な機構で発生するのかを解明するために、スパイクが発生するあるいは発生しない条件下で細胞内ATP濃度を測定することは重要であると考えられる。本実験ではマウスよりランゲルハンス島を単離し、低Ca^<2+>および低Na^+などの条件下でATP濃度を測定した。Ca^<2+>-freeHanks溶液中でランゲルハンス島を30min間incubateした場合では、正常Ca^<2+>濃度のコントロールに比較して細胞内ATP濃度は約2.6倍に上昇していた。N-methyl-D-glucamineでNaClを置換した25mM Na^+Hanks溶液でincubateした場合では、コントロールに比較して細胞内ATP濃度は約4倍に上昇していた。Na^+/H^+交換輸送の抑制剤である。amilorideの投与により、細胞内へのNa^+の流入を抑制した条件下で実験を行った。amilorideを作用させた細胞では細胞内ATP濃度は約4倍に上昇していた。一方、Na^+/H^+交換輸送体であるmonensinの投与により、細胞内へのNa^+の流入を促進した条件下で実験を行った結果、細胞内ATP濃度はコントロールに比較して1/2以下に低下していた。これらのことはspike-burst発生中細胞内Ca^<2+>濃度が急速に上昇し、Na^+/Ca^<2+>濃度が上昇すると共にNa^+K^+-pumpが活発に働き細胞内ATP濃度が低下するという予想を完全に支持するものである。従って、spike-burstに引き続いて起こる再分極は細胞内ATPの低下の結果であると考えることができる。glucagonの作用については、細胞外からglucagonを作用するとspike-burstのdurationが長くなり、細胞内Ca^<2+>濃度が上昇した。これらのことから、glucagonは細胞内ATP濃度を上昇させる作用があると推測された。
バネ分子コネクチンによる心臓メカニクス制御機構解明と心不全治療への展開

横紋筋細胞(心筋・骨格筋)の伸展性を規定するバネ分子コネクチンは生体内最大のタンパク質であり、バネとしての弾性特性発現や機械的刺激に対する心筋細胞応答を担うことが報告されているが、その大きさ故に分子機能や心不全の病態生理における役割の解析は困難である。心筋細胞のコネクチンは胎児・新生児期のN2BAアイソフォームから成人型のN2Bアイソフォームに成長に伴って変換することが知られているが、高血圧などの圧負荷に対してN2BAの増加の有無について相反する報告がなされている。本研究では4週齢Wisterラットにモノクロタリンを投与して肺高血圧を発症させ、右心室に対する圧負荷への応答を検討した。右心室への圧負荷は左心室へのものとは異なり、動脈圧が低下していることと心室壁が薄いために冠循環が障害され易いという特徴がある。コネクチンアイソフォーム発現は心エコー評価では右室圧の上昇が軽度であるモノクロタリン投与2週後でも対照と比較してN2BAの発現が増加していた。N2BAはN2Bに比べ分子内のバネ領域が長いため、圧負荷に対応して伸展性を増加させた応答と考えられた。コネクチンによる心臓機能・構造調節のメカニズムとして、胎児期には核に高発現し、出生後発現が著減するnovex-3(コネクチンのアイソフォーム、分子量62.5万)に注目し、心筋細胞の分裂に関与することを明らかにした。そしてnovex-3高発現マウスを作成し、X線位相差CTによる微細構造評価を行った。X線位相差CTでは、心停止液により弛緩した状態で心室内腔にアガロースゲルを一定圧で充填し、心室内の乳頭筋や房室弁、肉柱構造などを固定することなく可視化することが出来た。今後、心筋の細胞周期に関する研究を進めていく上で生体レベルでの臓器形態制御システムを解析する有用なツールとして活用できる。ラットを用いたモノクロタリン誘導肺高血圧モデルによる右心室のコネクチンアイソフォーム発現変化と心臓メカニクスの検討や、出生児の酸素分圧変化で発現量や局在が著明に変化するnovex-3(コネクチンアイソフォームの一つ)高発現マウスのマクロ心機能・心筋細胞・分子レベルでの機能解析や心臓微細構造の検討に関しては、心不全におけるバネ分子コネクチンの心臓メカニクス制御機構の解明に向けて概ね順調に進んでいる。これまで圧力負荷による心不全では心筋細胞で発現するコネクチンアイソフォームN2BとN2BAの変化は報告により異なっていたが、酸素環境や力学的状況によって応答が異なることがわかってきた。また、断面が円形に近い心外膜側心室壁に対し入り組んだ肉柱構造をもつ心内膜側心室壁の構造を組織固定することなく生体に近い状態で評価するために、放射光施設SPring-8にてX線位相差CTによる心室微細構造の撮影を行った。この手法は、高い分解能で生体組織を観察できると共に、炭素・酸素・水素などの軽元素で構成される心筋組織の比重を画像上で可視化できる特徴があり、分裂能を持つ心筋細胞が幼若化して細胞内の収縮タンパク量が現象していることが予想されることを合わせて考えると、心臓を構成する心筋細胞の分化度を部位別に評価するユニークな評価法となり得る。一方で、本研究の主要テーマの一つであるコネクチン分子I帯の弾性特性を光ピンセットで評価する課題に関しては、これまでに原子間力顕微鏡を用いた結果が報告されていたmiddle Igドメインの一部分(540アミノ酸)にGST抗体とアビジンをコーティングした検体で実験を進め、長さ-張力関係を計測しているものの再現性の高いデータを得られていない状況である。ラット肺高血圧モデルを用いた力学的負荷に対するバネ分子コネクチンの生理的応答と心不全への進行機序に関しては、モノクロタリン投与量を変えて病期進行の異なるモデルを作成し、Hif-1などの低酸素誘導因子などとの関連や大動脈縮窄モデルにおける左心室との違いを検討する。圧負荷に対する心肥大応答において、胎児期タンパクが発現してくることは良く知られており、胎児期・新生児期型のコネクチンN2BAアイソフォームの発現が増加することは同様の応答であるが、その生理的意義についてマクロ機能である心臓力学的知見やミクロレベルでの分子生物学的な知見をマルチスケールで統合していく。また、novex-3を始め出生時の心筋分裂停止に関与する因子の遺伝子改変マウスを作成しており、正常では出生後に分裂を止め肥大のみによって成長する哺乳類の心臓が付加的に細胞分裂が維持された時にどのような結果を招くのかを明らかにして、高いポンプ機能を発揮し続けねばならない成体心臓において心筋細胞分裂の起こす結果についての知見を得る。我々の心筋細胞が心筋梗塞などの疾病にあたっても二度と分裂しない終末分化細胞であることの意味とメカニズムを知ることは再生医療にとっても重要な情報である。また、現在進捗が遅れているコネクチン分子の光ピンセットによる分子弾性評価法の確立についてもビーズの修飾や実験溶液の改良で再現性の高いデータが得られるよう検討を続ける。X線位相差CTによる心室微細構造評価に関しても、現在は拡張期の形態を撮影しているが、非固定標本で実験している利点を生かして同一標本で収縮期形態を撮影して、複雑な心室内腔の肉柱構造が収縮・弛緩においてどのような役割を果たしているか、また、付加的な心筋分裂がどのような影響を与えるかについて検討する。心臓は収縮と拡張を繰り返す血液ポンプであり、様々な疾患によって引き起こされる収縮障害性の心不全に関して多くの治療法が開発されてきた。

一方、拡張障害性心不全の臨床的重要性が近年になり認識されてきたが、その病態生理は不明な点も多く、治療法も限られている。本研究は心機能評価フレームワーク:可変弾性モデルによる心臓レベルでの機能評価を基盤とし、生体医工学的な手法を駆使した細胞レベルの機械特性の評価、更に分子レベルでの制御メカニズムを検討して心不全の病態解明へと繋げる事を目的としている。具体的な標的分子は心臓の拡張性を規定する巨大バネ分子:コネクチン(別名タイチン、3万アミノ酸)であるが、生体内最大の大きさに起因する技術的制限から過去には数百アミノ酸生成による局所の機能解析が報告されているのみである。このような現状に対し、2万塩基対以上(約7000アミノ酸)の導入が可能なバキュロウイルスを用いた遺伝子導入法を用いてコネクチン分子内でバネとしての機能を果たしているI帯領域(アクチン・ミオシン非重複部で、弾性領域を含む)を発現させ、光ピンセットによる分子丸ごとの力学的機能評価法の確立に取り組みたいと考えている。これらの研究により、コネクチンの各領域が有する力学特性を明らかにし、病態モデルマウスを用いてコネクチンのアミノ酸配列変化や、メカノトランスダクションによる分子・細胞レベルでの応答を解明する。また、過度の拡張性は心臓への血液供給(冠循環)を障害するため、心臓拡張性と冠循環についても検討してコネクチンが心臓メカニクスを制御する機構を分子・細胞・臓器レベルで解明する。コネクチンは拡張型心筋症の重要な原因遺伝子としても注目されており、本研究ではその多彩な機能を明らかにすることにより心不全の病態生理解明・新規治療法開発に貢献したいと考えている。コネクチン分子の機械特性計測について光ピンセットによる計測系を立ち上げ研究を進めている。計測分子に関しては、コネクチンのアイソフォームであるNovex3(分子量62.5万)のクローニングに成功し、N末端にGSTタグ、C末端にビオチン化BDTCタグを持つポリペプチドとして大腸菌内で発現させて精製した。GST抗体、アビジンをコーティングしたビーズに接着して検体を作成した。現在はこの検体を用いて光ピンセットによる計測の最適条件を検討している。クローニング出来たNovex3はBacmid化して昆虫細胞内で増殖させたバキュロウイルスをマウス単離心筋細胞に感染させ、過剰発現させることに成功した。コネクチン分子PEVK領域はバネとしての弾性を発揮する以外に、細胞内での力学的情報伝達(メカノトランスダクション)を担う分子としても注目されており、心筋細胞に発現するN2BAアイソフォームのPEVK領域に結合するタンパク質を酵母2-ハイブリッド法にて網羅的にスクリーニングして2種類の候補分子を同定した。また、これらのコネクチン分子の生化学的・力学的特性の解析と並行して、レーザーによるリン光系有機色素の光化学反応を利用した生体の酸素濃度計測技術を用いて心臓の局所酸素分圧評価法の確立に取り組んでおり、Nd:YAGレーザーによる励起によるリン光の減衰を計測・解析するシステムを立ち上げておりin vivo実験系にて微小循環の酸素計測を可能にする。
未熟肺血管に於ける酸素感受性カリウムチャンネル発現に関する分子生物学的研究

本研究では未熟な胚血管平滑筋細胞における膜電位依存性Kチャンネルの遺伝子の発現をあきらかにし、酸素感受性の膜電位依存性Kチャンネルの発達に伴う変化を明らかにした。肺動脈のうち、主肺動脈と抵抗血管を用いて、パッチクランプ法を用いて胎仔、新生仔,成獣家兎の肺動脈平滑筋細胞で膜電位依存性(酸素感受性)K電流を測定した。実験動物:生後5日の新生仔家兎と生後6-12カ月の成獣家兎を用いた。実験標本:主肺動脈および径100-200ミクロンの肺動脈より単離した平滑節細胞をもちいてパッチクランプを行った。膜電依存性(酸素感受性)K電流は主肺動脈にはほとんど存在しないことがわかった。抵抗血管には膜電位依存性(酸素感受性)K電流は存在し、新生仔では成獣に比べ有意に大きいことがわかった。PCR法、ノーザンブロット法、In situ hybridization法を用い、肺動脈平滑筋細胞における膜電位依存性Kチャンネル遺伝子の発現を調べた。膜電位依存性K電流Kv 1.5,2.1は主肺動脈にはほとんど存在しないことがわかった。抵抗血管には膜電位依存性Kチャンネルは発現しており、その発現は新生仔では成獣に比べ有意に大きいことがわかった。卵母細胞:アフリカツメガエルの卵母細胞にKチャンネルのmRNAを注入し、灌流液の酸素濃度を変化させた。卵母細胞に発現した膜電位依存性K電流Kv 1.5,2.1は酸素感受性を持っていることがわかった。本研究では、未熟な肺血管平滑筋細胞におけるATP感受性Kチャンネルを測定し、ATP感受性Kチャンネルの発達に伴う変化を明らかにした.実験動物:生後5日の新生仔家兎と生後6-12カ月の成獣家兎を用いた.実験標本:主肺動脈および径100-200ミクロンの肺動脈より単離した平滑筋細胞を用いた.各年齢群の肺動脈よりコラゲナーゼを用い細胞を単離した.単離平滑筋細胞をもちいてパッチクランプを行った.パッチクランプ法:ガラス微小電極を用いwhole-cell voltage clampをおこなった.膜電位を-60mVの保持電位から、-80mVから+40mVの間で変え、K電流を記録した.ピペット内ATP濃度は1mMとし、pinacidilで活性化され、glybenclamideで阻害されるK電流をATP感受性K電流とした.各年齢群とも主肺動脈にはATP感受性Kチャンネルはほとんど存在しないことがわかった.末梢肺動脈にはATP感受性Kチャンネルは存在し、ATP感受性Kチャンネルは新生仔では成獣に比べ有意に大きいことがわかった.ATP感受性Kチャンネルは低酸素状態で細胞内ATP濃度が減少すると開口し、血管弛緩の方向に働く.低酸素状態では肺動脈は収縮するが、新生児でATP感受性Kチャンネルが多いことは、周産期の低酸素状態に於ける肺血管収縮を軽減する方向に働くのに有利かもしれない.本研究では未熟な胚血管平滑筋細胞における膜電位依存性Kチャンネルの遺伝子の発現をあきらかにし、酸素感受性の膜電位依存性Kチャンネルの発達に伴う変化を明らかにした。
鉄硫黄蛋白質の窒素固定に関する量子化学的研究

生態系が行う窒素循環において、ニトロゲナーゼが行う空気中の窒素分子をアンモニアに変換する窒素固定は、最も重要な生物反応である。ナイトロゲナーゼは、反強磁性状態にある{Fe_7MoS_9}及び{Fe_8S_7}を骨格中心にもち、電子伝達反応を行いながら常温・常圧条件下で窒素固定を行っている。本研究では、密度汎関数法および多配置関数法(RASSCF法)を用いて、ニトロゲナーゼ骨格中心の{Fe_7MoS_9}及び{Fe_8S_7}クラスターの電荷移動反応と窒素固定反応を理論的に明らかにした。電荷移動反応の過程で、いずれのクラスターもその骨格を保持する。{Fe_7MoS_9}および{Fe_8S_7}のいずれにおいても-1価の電荷で最安定構造であった。モリブデン挿入された{Fe_7MoS_9}の特徴は、{Fe_8S_7}より小さなエネルギー差で電荷移動可能であり、各電荷状態に低い励起状態が存在し、容易に電荷移動が可能であることである。2つのクラスターは電荷移動に関与する金属が全く異なり、{Fe_8S_7}ではクラスター中心の四つの鉄に存在するFe(3d)軌道の電子密度が変化するに対して、{Fe_7MoS_9}ではMo(3d)軌道の電子密度の変化が大きく、窒素固定反応の初状態にFeMocoのモリブデンが大きく関わってくる。窒素分子の挿入反応では、{Fe_8S_7}には窒素分子が全く挿入されないのに対し、{Fe_7MoS_9}では窒素分子の挿入により窒素分子の分子間距離も伸張する。これらの窒素分子の挿入反応では、窒素分子のπ^*軌道が電子受容体となるが、それぞれのクラスターの電子供与に関わる軌道(SOMO)の軌道エネルギーが異なり、窒素分子のπ^*軌道と、{Fe_8S_7}^<1->では全く相互作用をしないのに対し、{Fe_7MoS_9}^1では大きな相互作用を行う。これらの結果は、ニトロゲナーゼの窒素固定反応を解析する大きな足がかりとなった。ナイトロゲナーゼは常温常圧の条件下で窒素固定を容易に行い、その骨格中心に{Fe_7MoS_8}を持つ。また、フェレドキシン{Fe_4S_4}は高温高圧で窒素固定を行う。好熱菌のフェレドキシンは電子伝達機能蛋白質であり、鉄が二個から四個までの鉄-硫黄クラスター骨格中心が存在する。古細菌のルブレドキシン{FeS_4}も電子伝達機能蛋白質として知られている。これら自発的自己集合型鉄硫黄蛋白質の電子伝達機能と窒素固定反応について、分子軌道法を用いて研究を行った。鉄硫黄蛋白質の特徴は、Fe(III)(酸化型)とFe(II)(還元型)で電荷移動を行うことである。ルブレドキシンの全蛋白質分子軌道計算により、7つのβシートは配位子場効果により、効率良い一電子電荷移動を行うことを明らかにした。またこれらのβシートは双極子モーメントを形成し、{FeS_4}骨格中心への長距離電荷移動を行う。フェレドキシンの特徴は、{Fe_2S_2}および{Fe_3S_4}で全ての鉄が酸化型Fe(III)で最安定状態となり、{Fe_4S_4}ではFe(III)とFe(II)の混合原子価状態が最安定状態であり分子間電荷移動による一電子移動が容易となる。ナイトロゲナーゼでは、Fe(II)とFe(III)の混合原子価状態が最安定状態であった。この最安定状態ではモリブデンはMo(V)の電荷となっている。この最安定状態からMo(VI)の電子供与型またはMo(IV)の電子受容型へと分子内電荷移動が可能である。また、分子間電荷移動による電子供与型状態および電子受容型状態からも、モリブデンの電荷移動による分子内電荷移動が可能である。つまり、ナイトロゲナーゼでは分子間電荷移動と分子内電荷移動の協奏反応により、三電子移動反応が可能である。多電子電荷移動反応を引き起こすナイトロゲナーゼでは、窒素分子とのσ供与とπ逆供与が容易となり、窒素固定を行う。

2つのクラスターは電荷移動に関与する金属が全く異なり、{Fe_8S_7}ではクラスター中心の四つの鉄に存在するFe(3d)軌道の電子密度が変化するに対して、{Fe_7MoS_9}ではMo(3d)軌道の電子密度の変化が大きく、窒素固定反応の初状態にFeMocoのモリブデンが大きく関わってくる。窒素分子の挿入反応では、{Fe_8S_7}には窒素分子が全く挿入されないのに対し、{Fe_7MoS_9}では窒素分子の挿入により窒素分子の分子間距離も伸張する。これらの窒素分子の挿入反応では、窒素分子のπ^*軌道が電子受容体となるが、それぞれのクラスターの電子供与に関わる軌道(SOMO)の軌道エネルギーが異なり、窒素分子のπ^*軌道と、{Fe_8S_7}^<1->では全く相互作用をしないのに対し、{Fe_7MoS_9}^1では大きな相互作用を行う。これらの結果は、ニトロゲナーゼの窒素固定反応を解析する大きな足がかりとなった。
言語における「音と意味の対応関係」の学習を支える認知科学的な仕組みとその神経基盤

当該年度は、言語獲得前後の生後9か月、12か月、15か月の乳幼児を対象にした音と意味の結びつきの獲得過程を評価する実験に対する実験を行った。乳幼児は馴染みのあるものや好ましいと感じるものに対して視線を向ける傾向があることが知られており、本研究では視線計測機器を用いて視線の動きや停留時間を計測し比較した。被験者である乳幼児は母親の膝の上で抱きかかえられ、モニターに視線を向けるよう求められた。モニターに視覚刺激が呈示され、併せて音刺激がスピーカーから呈示された。視覚刺激は図形の輪郭(とげとげしいあるいは丸みを帯びている)が異なる図形(Shape条件)と大きさの異なるボールの絵(Size条件)とした。音刺激には、大きい/丸みと結びついていると報告されている日本語単音節“a"と低周波数のトーンバースト(100Hz)および小さい/とげとげしさと結びついていると報告されている日本語単音節“i"と高周波数のトーンバースト(400Hz)を用いた。結果として、どちらの条件においても音刺激がトーンバーストの場合は低周波数のトーンバーストの方が視覚刺激への注視時間が長くなった。このことから、トーンバーストの場合は視覚刺激と音刺激それぞれから想起される印象が一致しない方への選好性が高く、それは月齢に依存しないことが示唆された。一方で、音刺激が日本語単音節の場合は9か月では印象が一致する方への注視時間が長く15か月は印象が一致しない方への注視時間が長くなった。その傾向は、どちらでの条件でも確認された。このことから、日本語単音節の場合は月齢が変化するにつれて親近性の高い方への選好性から新奇性の高い方への選好性へと変化することが示唆された。乳幼児の関心が親近性から新奇性へと変化することは他の実験からも報告されており、言語においても同様の変化することが示唆された。当該年度では、言語獲得前後の乳幼児として生後9カ月、12か月、15か月の3つの月齢を対象に実験を実施した。実験では乳幼児にモニターに視線を向けてもらい、呈示刺激に対する視線の停留時間を計測し評価した。この乳幼児を対象にした視線計測実験の実施を通して、集中力の維持等が困難な乳幼児に合わせた刺激の提示方法などを確立した。この実験の結果、乳幼児の月齢が変化するにつれて呈示刺激への視線の停留の傾向が親近性のある刺激から新奇性のある刺激へと変化することが確認された。これまでに複数の月齢を対象に同一パラメータで検証している実験はなく、今回初めて言語獲得と音と意味の結びつきを検証することができた。以上のように、当該年度において期待通りの成果が得られたと考えられる。次年度は乳幼児を対象に新たな行動評価実験を実施する。具体的には、輪郭の異なる玩具を作成しその玩具の動きに合わせて音を呈示する。乳幼児は好ましいと思う対象に対して手を伸ばすリーチングという動作をすることが知られている。このリーチング動作を利用し、輪郭の異なる2種類の玩具を同時に呈示して実験者が玩具を動かすことで音を呈示した際にどちらの玩具に対してリーチング動作を行うのかをビデオカメラで記録し計測する。この実験により、より乳幼児が積極的に選択する環境が構築できると考えられる。昨年度の実験と本年度の実験を併せて検討することで乳幼児の言語発達と音象徴の関係を多角的に捉えられることが期待される。本研究の目的は、音象徴が形成される過程や語彙力との関係を検討することで、音象徴が言語の獲得に与える影響を明らかにすることである。音象徴とは、音そのものが特定の印象を有する現象のことである。報告者は、音象徴は語音と意味の関係性を支える心理学的基盤であると考えており、言語の中でも語彙の学習を支える基盤になると考えている。当該年度では、2つの実験を行った。1つ目の実験では、成人の被験者を対象に日本語の各音素が図形の輪郭(鋭さや丸さ)に対して有する印象を調べた。被験者は視覚刺激である図形の輪郭が鋭いのか、あるいは丸いのかを回答した。音刺激は視覚刺激と同時に呈示され、被験者が視覚刺激の判断に要した時間(反応時間)を評価した。ここで、音刺激と視覚刺激から想起される印象が一致している場合は一致していない場合よりも反応時間が短くなると仮定し、その場合は音象徴が生じていると定義した。これらの結果から日本語の各音素が図形の輪郭に対して有する印象がわかる。そして、それらの結びつきから、それぞれの音象徴が生じやすい擬似単語や生じにくい擬似単語を作成することが可能となる。音象徴と新たな語彙の結びつきの学習を評価する実験を行う上で、音象徴と学習効果を評価するためには擬似単語の設定が極めて重要な役割を果たす。2つ目の実験では、乳幼児を対象に図形の輪郭や大きさに関する音象徴が生じるかを調べた。視線計測機器によって計測された被験者の各視覚刺激に対する視線の動きや停留時間を評価した。視覚刺激の提示と同時に音刺激が呈示され、音刺激には純音および日本語の音素を用いた。これらの結果から乳幼児を対象にした実験における刺激の最適な呈示方法や課題の難易度の設定方法がわかる。音象徴と言語獲得過程の関係を調べる上で、乳幼児を対象にした実験は欠かすことができず、本実験の果たす役割は極めて重要である。当該年度では、2つの実験に取り組んだ。

1つ目の実験より情報量の少ない日本語の音素でも図形の輪郭や大きさに関して特定の印象に結び付くものがあることが確認された。これは、音象徴と新たな語彙の結びつきの学習実験を実施する上で呈示刺激の擬似単語をより効果的に作成する指標となり得るものであった。さらに、2つ目の実験である言語獲得前後の乳幼児を対象にした視線計測実験の実施を通して、集中力の維持等が困難な乳幼児に合わせた刺激の提示方法などを確立した。これらの結果を踏まえて実施される次年度以降の実験において、言語獲得や言語発達に対して音象徴が果たす役割が解明されることが期待される。以上のように、当該年度において期待通りの成果が得られたと考えられる。当該年度は、言語獲得前後の生後9か月、12か月、15か月の乳幼児を対象にした音と意味の結びつきの獲得過程を評価する実験に対する実験を行った。乳幼児は馴染みのあるものや好ましいと感じるものに対して視線を向ける傾向があることが知られており、本研究では視線計測機器を用いて視線の動きや停留時間を計測し比較した。被験者である乳幼児は母親の膝の上で抱きかかえられ、モニターに視線を向けるよう求められた。モニターに視覚刺激が呈示され、併せて音刺激がスピーカーから呈示された。視覚刺激は図形の輪郭(とげとげしいあるいは丸みを帯びている)が異なる図形(Shape条件)と大きさの異なるボールの絵(Size条件)とした。音刺激には、大きい/丸みと結びついていると報告されている日本語単音節“a"と低周波数のトーンバースト(100Hz)および小さい/とげとげしさと結びついていると報告されている日本語単音節“i"と高周波数のトーンバースト(400Hz)を用いた。結果として、どちらの条件においても音刺激がトーンバーストの場合は低周波数のトーンバーストの方が視覚刺激への注視時間が長くなった。このことから、トーンバーストの場合は視覚刺激と音刺激それぞれから想起される印象が一致しない方への選好性が高く、それは月齢に依存しないことが示唆された。一方で、音刺激が日本語単音節の場合は9か月では印象が一致する方への注視時間が長く15か月は印象が一致しない方への注視時間が長くなった。その傾向は、どちらでの条件でも確認された。このことから、日本語単音節の場合は月齢が変化するにつれて親近性の高い方への選好性から新奇性の高い方への選好性へと変化することが示唆された。乳幼児の関心が親近性から新奇性へと変化することは他の実験からも報告されており、言語においても同様の変化することが示唆された。当該年度では、言語獲得前後の乳幼児として生後9カ月、12か月、15か月の3つの月齢を対象に実験を実施した。実験では乳幼児にモニターに視線を向けてもらい、呈示刺激に対する視線の停留時間を計測し評価した。この乳幼児を対象にした視線計測実験の実施を通して、集中力の維持等が困難な乳幼児に合わせた刺激の提示方法などを確立した。この実験の結果、乳幼児の月齢が変化するにつれて呈示刺激への視線の停留の傾向が親近性のある刺激から新奇性のある刺激へと変化することが確認された。これまでに複数の月齢を対象に同一パラメータで検証している実験はなく、今回初めて言語獲得と音と意味の結びつきを検証することができた。次年度以降は、まず言語獲得前後の月齢の乳幼児を対象に音象徴と言語獲得過程の関係を調べる。
難生産性蛋白質分泌発現系のリバースエンジニアリング

難生産性蛋白質の活性型発現に関わる遺伝子群の同定・解析・応用を目的として研究を行った。遺伝子の調節因子としてAdr1、Ygr067Cを同定した。両者は非常に類似したDNA結合領域をもち、同一の標的遺伝子群を競合的に発現調節している可能性が示唆された。両遺伝子欠損株を作製し、下流遺伝子の発現に与える影響を定量的に調べた。また発現蛋白質の過剰糖鎖付加に着目し、予想糖鎖付加部位の多重置換体を作製した。これらの結果、Ygr067Cが難生産性蛋白質の生産に関係していた。一方、アミノ酸置換を伴わない、低使用頻度コドンへのサイレント変異が蛋白質の発現量を増大させることを明らかにした。高密度系でのみ生産が可能なラッカーゼをモデル組換え酵素として用い、種々の解析および工学的検討を行った。ホスト因子同定のため、網羅的転写産物解析により絞り込んだ候補遺伝子を選定した。広域転写因子ならびにその下流の転写因子群が候補に挙がっている。これらの遺伝子を欠失した酵母宿主株をそれぞれ作製し、菌体高密度化に伴う遺伝子発現量の変動を解析している(計画1、2)。この目的を達成するため、本予算措置で購入予定であったリアルタイムPCR装置を別予算で導入し、さらに本予算措置で導入したHPLCシステムを活用し解析を勧めている。一方、ゲスト因子同定のため、モデル酵素遺伝子にランダム変異を導入し、分泌ストレス低減型変異体の取得を試みている(計画3)。同定されたホスト因子、またはAdr1の恒常発現株を作成し、モデル酵素の発現特性を解析する(計画4、平成28年度着手予定)。野生型酵母株を変異原処理し、モデル酵素を生育連動的に発現する変異株を取得する(計画5)。取得できた菌株を用い、組換え酵素生産プロセスの最適化を行う(計画6、平成28年度着手予定)。これらを連携研究者とともに推進する。本研究で得られた研究成果の一部を学会で発表した(鈴木ら、日本生物学会平成27年度大会、(鹿児島))。また関連した別の研究課題で得られた成果についても学会で公表した(河原崎ら、日本農芸化学会平成28年度大会(札幌))。難生産性蛋白質の発現を容易化している責任遺伝子の候補は、小胞体シャペロンやゴルジ体蛋白質など、蛋白質の分泌生産に直接関与しているものではないため、容易化機構の推定は容易ではない。繰り返し解析結果を吟味し、実験間誤差による遺伝子発現の変動を排除しており、時間を要している。活性型組換え蛋白質生産量を最大化するゲスト因子について進化工学的な手法を用いて解析をすすめており、これについては新規な知見が得られている。特に、コドン使用頻度の偏りと蛋白質生産量との関連について研究が進み、この点において当初予定を超える研究成果が得られつつある。新たな発現制御系を用いた難生産性蛋白質発現系の構築に着手し、新たな発現プロモーターによる発現誘導システムを当初予定よりも早く構築できた。以上より、宿主因子の解析はやや困難に直面しているものの、研究全体としては順調に進行しているものと判断される。宿主酵母株を高菌体密度としたときにのみ生産が可能になる組換えラッカーゼをモデル組み換え酵素とし、種々の解析および工学的検討を行った。ホスト因子を同定するため、網羅的転写産物解析により絞り込んだAdr1、Ime1、Ygr067Cの3種の転写因子遺伝子の発現量をモニターし、さらにそれぞれの欠損株における各種菌体密度応答性遺伝子の発現パターンの変動を調べた。転写産物の定量には、リアルタイムPCR装置を用いた。この結果、広域転写因子であるAdr1は菌体密度に応答した難生産性蛋白質の発現にほぼ無関係であり、Ygr067Cが高菌体密度時に一定の役割を果たしていることがわかった。Ime1は組換え蛋白質の生産というよりも、菌体内の代謝フラックスに広範に影響を与えていた。一方、ゲスト因子を同定するため、N-結合型糖鎖付加部位(-N-X-T/S-)を予測し、ラッカーゼの酵素活性に影響を与えぬよう、N(アスパラギン)を別のアミノ酸(アスパラギン酸やグルタミン)に置換することを試みた。計4カ所の糖鎖付加部位が検出され、それぞれのアミノ酸置換体を作出した。作出されたアミノ酸置換体発現株のうち、N242D置換体は生育連動的発現系において良好な発現量を示し、また発現に伴う宿主の生育阻害が改善される傾向にあった。ただし生産されたラッカーゼは、N242Dを含む多重置換体であっても依然として高度に糖鎖修飾されており、高度糖鎖修飾と難生産性の間の強い因果関係を立証することはできなかった。本研究で得られた研究成果の一部を学会で発表した(河原崎ら、日本農芸化学会29年度大会;大橋ら、静岡ライフサイエンスシンポジウム平成28年度大会;)菌体の密度に応答して難生産性蛋白質の発現を容易化している責任遺伝子は、小胞体シャペロンやゴルジ体蛋白質など、タンパク質の分泌生産に直接関与しているものではないため、容易化機構の推定は容易ではない。菌体密度の変化にともなう候補遺伝子の発現量変動を繰り返し測定し、実験間誤差を排除するため、時間を要している。また、当初推定していた難生産性蛋白質と高度糖鎖付加の関連性についても、予想糖鎖付加部位を多重置換しても糖鎖付加は依然としておこるため、因果関係を導き出すことが困難であった。以上より、「やや遅れている」と自己評価した。

組換え出芽酵母を高密度に懸濁することによってのみ生産が可能となる一群の難生産性蛋白質がある。菌体の高密度化に伴って引き起こされる酵母遺伝子発現の変動より、難生産性蛋白質の活性型発現を可能にしている遺伝子群を同定し、これを解析・応用することで、酵母を用いた組換え蛋白質の生産量増大、生産量の安定化を達成することを目的として研究を行った。高密度系でのみ生産が可能なラッカーゼ(シイタケ由来Lcc4)をモデル組み換え酵素として用い、菌体高密度化にともない発現量が変動する遺伝子群をDNAマイクロアレイ解析により検出した。複数の候補遺伝子が得られ、これらの多くは出芽酵母の広域転写因子であるAdr1pの推定結合領域下流に存在していた。また、Adr1pとほぼ同一の配列を認識すると考えられる機能未知遺伝子Ygr067Cの発現量も増大していた。このため、Adr1、Ygr067Cの遺伝子破壊株を作製し、リアルタイムPCRやラッカーゼの分泌生産量、菌体の生育等を指標として種々の解析を行った。同発現系で発現したラッカーゼを精製・解析したところ、高度に糖鎖修飾されていることが分かり、また、高密度系でのみ発現可能な他の組換え蛋白質についても、同様な糖鎖修飾が見られた。このため、組換え蛋白質の過剰発現にともなう糖鎖修飾が、宿主酵母の細胞壁合成および糖蛋白質の合成と競合するとの仮説をたて、組換えラッカーゼの予想糖鎖修飾部位に変異を導入し、糖鎖付加が起こらない変異体を作製し、強制発現時の宿主に与える影響を調べた。これらの研究成果は学会(日本生物工学会平成27年度大会、29年度大会等)で発表し、また、本研究から派生して得られた研究成果についても、学会発表を行った(日本農芸化学会平成28年度大会等)。現在投稿論文を作成中である。難生産性蛋白質の活性型発現に関わる遺伝子群の同定・解析・応用を目的として研究を行った。遺伝子の調節因子としてAdr1、Ygr067Cを同定した。両者は非常に類似したDNA結合領域をもち、同一の標的遺伝子群を競合的に発現調節している可能性が示唆された。両遺伝子欠損株を作製し、下流遺伝子の発現に与える影響を定量的に調べた。また発現蛋白質の過剰糖鎖付加に着目し、予想糖鎖付加部位の多重置換体を作製した。これらの結果、Ygr067Cが難生産性蛋白質の生産に関係していた。一方、アミノ酸置換を伴わない、低使用頻度コドンへのサイレント変異が蛋白質の発現量を増大させることを明らかにした。平成28年度以降は、以下のような予定で研究を進める(当初予定どおり)。(計画1)網羅的転写産物解析・遺伝学的解析によるホスト因子同定(継続):Adr1p下流遺伝子等、各遺伝子欠損株を調製し、生育速度およびモデル酵素生産能を比較する(継続)。必要に応じ、ホスト因子欠損株(必須遺伝子等の理由により欠損できない場合はAdr1欠損株等)の高菌体密度時の転写産物の網羅的解析を行い、野性株と比較する。計画6の進捗状況に応じ、高密度系誘導48時間後以降の生産速度の低下について、ホスト因子との関連性を調べる。(計画2)ホスト因子候補群の発現変動の定量的解析(継続):平成27年度に引き続き、菌体密度に応答する遺伝子群を同定し、発現量の経時変化をリアルタイムPCRにより調べる。(計画4)ホスト因子候補の恒常
ケアワークによる統合的援助に関する研究

介護保険下のホームヘルプ業務は、介護報酬上の派遣区分により身体介護と家事援助に二分され、相談援助は基本サービスとして取り扱われている。また、家事援助を家事代行としてとらえる考え方があり、身体介護に比べ家事援助が介護報酬上低く評価されている。ホームヘルプ実践が身体介護・家事援助・相談援助の統合的援助であることを実証するためには、第1にホームヘルプにおける相談援助が身体介護や家事援助と統合的に提供されていること、第2に家事援助が利用者の生活を支える過程において、身体介護や相談援助と統合的に提供されていること、第3に身体介護が家事援助や相談援助と不可分の関係にあることを示す必要がある。昨年度は前二者の視点から研究を進め、今年度はそれらを分析し、ホームヘルプ実践の統合的援助として対応困難な場合が多いと予測できる身体介護を要する事例について、第1第3の視点でインタビューを実施した。(1)相談援助が身体介護や家事援助と統合的に提供されていることを示すための研究援助過程におけるホームヘルパーの働きかけと利用者との相互変化について、ホームヘルパー実践に関するインタビュー内容を修正版グラウンデッド・セオリー・アプローチにより分析し、(2)と関連させて検討した。(2)家事援助が身体介護や相談援助と統合的に提供されていることを示す研究家事援助効果が顕著にみられた事例における統合的援助についての検討結果を踏まえ、予防的側面においても分析を加え、統合的援助の意義を深めた。さらに、家事援助が有効である事例について、ホームヘルパーへのインタビューを実施し、詳細な統合的援助の過程をまとめた。(3)対応困難な身体介護を中心とした事例について、統合的援助が有効であったことを示す研究対応困難事例として挙げられることの多い内部障害者への事例について、利用者及びホームヘルパーにインタビューを実施し、統合的援助の意味と援助過程を示した。ホームヘルプ実践が身体介護・家事援助・相談援助の統合的援助であることを実証するためには、第1にホームヘルプにおける相談援助が身体介護や家事援助と統合的に提供されていること、第2に家事援助が利用者の生活を支える過程において、身体介護や相談援助と統合的に提供されていること、第3に身体介護が家事援助や相談援助と不可分の関係にあることを示す必要があるが、ここでは前二者の視点から研究を進めた。(1)相談援助が身体介護や家事援助と統合的に提供されていることを示すための研究援助過程におけるホームヘルパーの働きかけと利用者との相互変化を示した。具体的には、ホームヘルパーの実践に関するインタビュー内容(7名に実施)を修正版グラウンデッド・セオリー・アプローチにより分析し、相談援助が身体介護や家事援助と統合的に提供された結果、利用者の生活全体に変化をもたらしていく過程を明らかにした。(2)家事援助が身体介護や相談援助と統合的に提供されていることを示す研究家事援助を中心としたホームヘルプ実践を展開している生活協同組合において、家事援助が有効であると判断できた事例(20例)についてヒアリングを行い、そのうち効果が顕著にみられた10例を分析対象として、統合的援助の効果について検討した。その結果、どのような視点によりホームヘルプ実践が提供され、利用者の生活に効果がみられたのかなどについて明らかにした。
精子形成期精巣特異的発現遺伝子の機能解析と精子形成障害への関与

本研究は、精子形成に特異的に発現している遺伝子の特定と精子形成障害に関与する遺伝子を発見することを目的としている。本年度は精子形成期ラット精巣に特異的に発現する遺伝子の検索と無精子症患者遺伝子のスクリーニングを行った.2.無精子症患者の遺伝子で、これらの精子形成関連遺伝子の異常の有無を検索しているが、現在迄は見つかっていない。本研究は、精子形成期に特異的に発現している遺伝子の特定と発現時期、発現部位を検討し、さらにこれらの遺伝子が精子形成障害に関与しているか否かを明らかにすることを目的としている。この研究の中である種の癌抗原遺伝子が精巣でのみ特異的に発現していることが明らかとなった。精巣癌はきわめて稀であり、精巣内では正常に機能している遺伝子が癌組織で発現している事は、癌発生・進行の機構を解明する上で興味深い。これらは癌精巣抗原と総称され、癌の免疫療法への応用の研究が行われているが、精巣内での機能はほとんど明らかになっていない。22年度は、結腸癌抗原遺伝子(CCA8)の精巣発現を下垂体摘出ラットにhCG、hFSHを投与して、ゴナドトロピンの関与を検討した。CCA8のペプチドを合成し、免疫染色により精巣内の蛋白発現を検討した。「結果」CCA8 mRNAは精母細胞に特異的に発現し、CCA8蛋白は精母細胞と精子細胞に発現を認めた。この遺伝子は細胞増殖に関与している可能性があると推測している。下垂体摘出ラットへのゴナドトロピン投与では,hCG-Testosteroneには依存せず、FSH投与により発現が増加した。以上の結果から、CCA8発現にはセルトリ細胞が関与している可能性がある。この遺伝子の癌細胞での機能は不明だが、精細管内で減数分裂期に特異的に発現していること、セルトリ細胞が発現に関与していることから、精子細胞の分裂・増加に関与している可能性が高く、癌組織においても細胞増殖に関与していると推測している。現在ヒト癌組織での機能を解析している。本研究は、精子形成期精巣に特異的に発現している遺伝子の特定と精子形成障害に関与する遺伝子を発見することを目的としている。23年度は、Ttc29(NYD-SP14)の発現調節とAMH,AMHR2、アンドロゲン受容体(AR)の性成熟期精巣での発現の検討を行った。1.3週齢下垂体摘出ラットにhCG、rhFSHを2週間投与し,Ttc29発現へのゴナドトロピン、テストステロンの関与を検討した。hCG投与でテストステロン分泌は著明に増加するが,精子形成は精粗細胞に留まっており,Ttc29発現は増加しなかった。rhFSH投与では,テストステロン分泌は軽度増加し,精子形成はパキテン期精母細胞まで進行し、Ttc29発現は有意に増加した。正常ラットの精母細胞でのTtc29発現は,初期から後期にかけて増加した。Ttc29は精子鞭毛運動に関与していると推測され、FSH依存性にセルトリ細胞を介して精母細胞で発現すると考えられる。2.抗ミュラー管ホルモン(AMH)とその受容体(AMHR2),ARは精子形成の開始に関与している可能性がある。5日齢から50日齢のラット精巣での発現、下垂体摘出ラットでの発現を検討した。AMHは新生仔期に強発現しており、21日齢から50日齢にかけて1/10に減少する。AMHR2は6日齢ではほとんど発現せず,10日齢から増加し21日齢では50日齢と同等となる。AR発現は変動しなかった。7週齢下垂体摘出ラット精巣ではAMH発現が著明に増加し、LH/FSH投与で発現は減少した。AMHR2はFSH投与で発現が軽度増加した。AMHは精子形成の抑制に関与していると推測しており,今後ARを含めて精巣内発現部位の加齢変化を検討していく必要がある。3.15日齢と50日齢のラット精巣の発現遺伝子の比較をマイクロアレイ法で行っており,精子形成に関連する新たな遺伝子を検索している。