hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
好熱性絶対共生細菌における微生物間共生の分子機構とその生態学的解析

これまでにSTは16SrDNAによる分類でグラム陽性細菌に含まれる全く新しい属を形成する一方、草食獣の消化管に一般的に生存していることが明らかであるが、本年度新たに行ったスクリーニングにより、草食獣以外の動物の糞便中にも高い割合で検出されること、また固形食餌や飼い葉サンプル中にも存在していることが明らかとなり、動物腸管内-肥料-食餌の環境サイクルに分布することが強く示唆された。また、生育因子の同定を目的として実験で、透析培養装置を用いてSTとBSを透析膜で隔てて培養することでSTの単独培養が可能であること、培地のpHを7.5に調整することで僅かなSTの単独生育が見られること、さらにBS培養上清を培地に添加するとSTの生育が促進されることを見いだした。次に、BS培養上清中に含まれている生育促進因子の耐熱性を検討したところ、1分間の処理で活性が1/2以下に減少することがわかった。また、透析膜を用いてBS培養上清を高分子部分と低分子部分に分離したところ、そのどちらにも活性があること、高分子部分をSTと透析膜を隔てて添加しても活性が得られることが明らかになった。また、BS培養上清の硫安塩析を行うと40-60%の分画に活性が回収できることがわかった。これらの結果から、ST生育因子は透析培養装置のBS側に存在する高分子物質と、透析性の低分子物質の二成分からなると推測される、現在BS培養上清からの生育促進因子の分離精製を、培地pHの効果と併せて詳細に検討している。耐熱性トリプトファナーゼ生産菌Symbiobacterium thermophilum(ST)は、好熱性Bacillus S株(BS)との共存下で生育する好熱性共生細菌である。本年度、まずBSが生産するST生育支持物質について、それが低分子画分と高分子画分に分かれること、低分子については揮発性画分にST生育促進活性があることがわかった。加えて、BS培養上清から硫安塩析を行い取得した高分子活性画分について、イオン交換カラム・ゲル濾過を用いての部分精製により活性画分を分画できることがわかった。以上のことから、BS培養上清に見られるST生育促進活性は性質の異なる複数の因子が関与していることを示唆している。一方、培地成分の一つである酵母エキスに明らかなST生育支持活性があることが判明し、それを除いた培地において新たにST生育支持活性を追跡する実験系が確立できることがわかった。次に、STおよびその類縁菌の生態分布について、動物園に飼育される動物の糞便を調査した結果、きわめて高い頻度でSTが存在していることが明らかになった。また、動物園で使用されている配合飼料ならびに家畜用の種々の飼料について同様な検討を行ったところ、同様に高頻度でSTおよび類縁菌が分離された。これまでに得られた16S rDNAの塩基配列に基づく系統樹は、いずれの配列も従来のグラム陽性グループの外側にSTが新たに形成する系統枝に含まれるとともに、分岐を形成する種の多様性を示した。さらに、探索により得られた16S rDNA増幅断片のDGGE法による解析は、Symbiobacterium属細菌が複数種存在することを支持する結果を与えた。透析培養法を用いた2槽式のジャーファーメンターを設計し、それによるSTの大量培養ならびに培養経過追跡システムを確立した。
感圧塗料を用いた回転物体表面上における非接触・非侵襲圧力分布計測

ある種の色素から放射されるリン光の酸素消光現象を利用すると,物体表面上の空気の圧力変化を光学的に計測することができる.「感圧塗料」と呼ばれる塗料は,この原理を利用して空気中の物体表面の圧力を計測するために開発された一種の機能性塗料である.感圧塗料を用いることで,スリップ・リングやテレメトリを使用することなく,非接触・非侵襲的に,空気中で回転している物体表面の圧力情報を得ることができる.本研究では,感圧塗料を用いた表面圧力計測法の,小型回転機械上における圧力分布計測への適用を試み,その実用化に向けて克服すべき問題点を明らかにすることを目的とした.本年度は,昨年度整備した,物体の回転に同期した短パルス光を照射することができる青色LED励起光源システムを用い,最大2000rpm程度の速度で回転する物体(模型用プロペラ)表面の圧力分布計測を試みた.色素には耐光劣化性に優れたメソテトラペンタフロロフェニルポルフィリンを用い,薄層クロマトグラフィ用シリカゲルプレートをバインダとして作製した多孔性感圧塗料を用いて実験を行った.実験は大気圧下で行い,プロペラの回転に同期して動作する励起光源システムとCCDカメラを用いて,ノズルから噴射される噴流が回転するプロペラ表面に衝突することで生じる圧力分布を計測した.その結果,回転する翼面上の圧力変化を明確に捉えることができた.さらに,物体の変形が圧力計測結果に及ぼす影響が非常に大きいことを明らかにした.ある種の色素から放射されるリン光の酸素消光現象を利用すると,物体表面上の空気の圧力変化を光学的に計測することができる.「感圧塗料」と呼ばれる塗料は,この原理を利用して空気中におかれた物体表面の圧力を非接触・非侵襲で計測するために開発された機能性塗料である.本研究では,この感圧塗料を用いた表面圧力計測法の小型回転機械上における圧力分布計測への適用を試み,その実用化に向けて克服すべき問題点を明らかにすることを目的としている.今年度得られた主な成果は以下の通りである.1.物体の回転に同期した短パルス光を照射することが可能な励起光源システムを構築した.光源には高輝度青色発光ダイオードを1台当たり342個配したものを複数台用い,発光パルス幅を無段階に調整できる制御電源と組み合わせることで,使用目的にかなうシステムとした.2.高速回転する物体の位置を高い精度で検知するためレーザダイオードと高速応答フォトダイオードを対向させた光センサーを作製し,その性能を確認した.3.光計測を行う現有のデジタルCCDカメラの制御法を確立し,上記励起光源システムと同期した撮影を可能とした.4.研究代表者らによって数キロヘルツの圧力変動に追従することが確認された多孔質感圧コーティングを用いて、上記励起光源およびCCDカメラから構成される計測システムの有効性を確認した.その結果,キロヘルツオーダの高速現象を捕らえることが可能であることを示すことはできたが、単一の画像からでは十分な信号対ノイズ比を得ることができず,両像データのノイズ除去処理が今後取り組むべき重要な課題であることが明らかになった.ある種の色素から放射されるリン光の酸素消光現象を利用すると,物体表面上の空気の圧力変化を光学的に計測することができる.「感圧塗料」と呼ばれる塗料は,この原理を利用して空気中の物体表面の圧力を計測するために開発された一種の機能性塗料である.感圧塗料を用いることで,スリップ・リングやテレメトリを使用することなく,非接触・非侵襲的に,空気中で回転している物体表面の圧力情報を得ることができる.本研究では,感圧塗料を用いた表面圧力計測法の,小型回転機械上における圧力分布計測への適用を試み,その実用化に向けて克服すべき問題点を明らかにすることを目的とした.本年度は,昨年度整備した,物体の回転に同期した短パルス光を照射することができる青色LED励起光源システムを用い,最大2000rpm程度の速度で回転する物体(模型用プロペラ)表面の圧力分布計測を試みた.色素には耐光劣化性に優れたメソテトラペンタフロロフェニルポルフィリンを用い,薄層クロマトグラフィ用シリカゲルプレートをバインダとして作製した多孔性感圧塗料を用いて実験を行った.実験は大気圧下で行い,プロペラの回転に同期して動作する励起光源システムとCCDカメラを用いて,ノズルから噴射される噴流が回転するプロペラ表面に衝突することで生じる圧力分布を計測した.その結果,回転する翼面上の圧力変化を明確に捉えることができた.さらに,物体の変形が圧力計測結果に及ぼす影響が非常に大きいことを明らかにした.
イオン化金属配合による高熱電気伝導性樹脂接合法

Cuフィラーを用いた導電性接着剤の熱抵抗及び電気抵抗の低減のため,フィラー間ギャップが熱特性に与える影響及び低融点金属含有による金属架橋構造形成の影響を解析及び実験により明らかにした.低融点金属フィラー含有による熱抵抗及び電気抵抗の低減を実現し,低融点金属フィラー径を小さくすることによる分散性の向上が,熱・電気伝導率向上につながることを示した.導電性接着剤は低温で接合可能でありながら,実装温度以上の耐熱特性を持つ実装材料であるが,鉛フリーはんだよりも機械的特性,熱伝導性,電気伝導性が低く,これらの特性向上が課題となっている.電気・熱伝導特性が劣る原因としては金属間の接触抵抗や樹脂層による抵抗により金属間の導通パスが小さくなるためであると考えられる.そこで,フィラー含有率を向上させ,金属フィラー間ギャップを短縮し導通パスが増加すること,および低融点金属を金属フィラー間に添加し,金属架橋構造を形成することによる熱伝導特性の改善効果を検証するために,接着剤中のフィラー間ギャップが熱伝導特性へ与える影響と金属フィラー架橋構造形成が熱伝導特性へ与える影響について明らかにした.熱伝導解析においては,Cuフィラー含有導電性接着剤のフィラー間ギャップと熱伝導率の関係を明らかにした.また, Cuフィラー含有導電性接着剤のフィラー間をSnBiの架橋が形成した場合の熱伝導率特性の改善効果を検証し,有効であることが明らかになった.実験的には,Cuフィラー含有導電性接着剤の銅板接合体を作製して熱伝導率の測定を行った.Cuフィラー含有率を変化させた場合の熱伝導率を測定した.また,SnBiフィラーを添加した場合の断面観察によって架橋構造が形成していることを確認するとともに,その添加量増加に伴う熱伝導率の変化を測定した.さらに,添加するSnBiフィラーのサイズを小さくすると,その分散性が向上し,熱伝導率向上に有効であることを確認した.熱伝導解析により,Cuフィラー含有導電性接着剤の熱伝導率がフィラー間ギャップの短縮によって増加し,ギャップが2μmから0.1μmに短縮することで約3倍の熱伝導率増加が得られることが明らかになった.実験的にもフィラー含有接着剤の熱伝導率測定により,フィラー含有率の増加により熱伝導率が増加する傾向が得られ,60vol%で約8W/mKを示した.金属架橋構造が熱伝導特性に与える影響を評価するために金属架橋モデルについて伝熱解析を行った.SnBiぬれ幅の増加・Cuフィラー間のSnBi高さの低下により熱伝導率が向上する傾向が得られ,Cuフィラー間距離が0.8μm,SnBiぬれ幅が10μmのとき,Cuフィラーのみのモデルと比較すると熱伝導率が約20倍の増加が見込まれた.実験的には,導電性接着剤に添加するSnBiフィラー粒径を変化させたとき,Cu50vol%にφ20μmのSnBiを20vol%添加したサンプルは,17W/mKの熱伝導率となり,Cu50vol%サンプルと比較して3倍以上の値を示した.以上の結果より,解析による見積ほどの効果は得られなかったが,金属架橋構造の形成による伝導パスの増加が熱伝導特性の改善に有効であることが明らかになっており,おおむね順調に進んでいる.導電性接着剤は低温で接合可能でありながら,実装温度以上の耐熱特性を持つ実装材料であるが,鉛フリーはんだよりも機械的特性,熱伝導性,電気伝導性が低く,これらの特性向上が課題となっている.電気・熱伝導特性が劣る原因としては金属間の接触抵抗や樹脂層による抵抗により金属間の導通パスが小さくなるためであると考えられる.そこで,フィラー含有率を向上させ,金属フィラー間ギャップを短縮し導通パスが増加すること,および低融点金属を金属フィラー間に添加し,金属架橋構造を形成することによる熱伝導特性の改善効果を検証するために,接着剤中のフィラー間ギャップが熱伝導特性および電気伝導率へ与える影響と金属フィラー架橋構造形成が熱伝導特性および電気伝導特性へ与える影響について明らかにした.熱伝導解析においては,Cuフィラー含有導電性接着剤のフィラー間ギャップと熱伝導率の関係を明らかにした.また, Cuフィラー含有導電性接着剤のフィラー間をSnBiの架橋が形成した場合の熱伝導率特性の改善効果を検証し,有効であることが明らかになった.実験的には,Cuフィラー含有導電性接着剤の銅板接合体を作製して熱伝導率の測定を行った.Cuフィラー含有率を変化させた場合の熱伝導率を測定した.また,SnBiフィラーを添加した場合の断面観察によって架橋構造が形成していることを確認するとともに,その添加量増加に伴う熱伝導率の変化を測定した.さらに,添加するSnBiフィラーのサイズを小さくすると,その分散性が向上し,熱伝導率向上に有効であることを確認した.

電気伝導特性についても,50vol%までCuフィラー含有率の上昇とともに電気抵抗率が低下すること,SnBiフィラー含有により23桁の電気抵抗率低減が実験により明らかになった.Cuフィラーを用いた導電性接着剤の熱抵抗及び電気抵抗の低減のため,フィラー間ギャップが熱特性に与える影響及び低融点金属含有による金属架橋構造形成の影響を解析及び実験により明らかにした.低融点金属フィラー含有による熱抵抗及び電気抵抗の低減を実現し,低融点金属フィラー径を小さくすることによる分散性の向上が,熱・電気伝導率向上につながることを示した.低融点金属含有による導電性接着剤の界面抵抗の低減が熱抵抗の向上に効果的であることが明らかになったが,解析による見積りからは乖離があったため,解析との相違点を明らかにするとともに,樹脂自体の抵抗低減を目的に,酢酸銀または硝酸銀を用いて樹脂中にイオン化金属を分散させた材料開発を行い,熱伝導率以外に電気伝導率とせん断試験による接着強度の測定を行う予定である.電子デバイス実装,微細接合実験材料の手配を行う前に解析的な検討を十分実施すべきとの判断から,本年度は解析を中心に検討し,実験検証を熱伝導率のみに絞ったため,その他の評価実験を次年度に延期することとした.したがって,実験用の一部の消耗品は次年度の実験の進捗に応じて手配するために,26,284円を次年度の研究費として繰り越した.平成27年度より繰り越した研究費は,前年度実施予定であった強度試験や導電性試験における金属表面処理用の薬剤や樹脂材料の購入に充てる予定である.
海産多酸素化合物の立体制御合成と活性

海洋天然物の中には、食品(いわゆるシーフード)として人の健康に影響を与えるものが少なくなく、食品衛生学的にも分子科学的にも研究を深めなければならないものが多い。本研究では、いまだに達成されていない光学活性な(-)-テトロドトキシン(TTX)とシガテラ毒の本体であるシガトキシン(CTX)などの多酸素化合物の化学合成を目的としたものである。まず、前者については水酸基が少ない類縁体2種類の合成を完成させた。フグの肝臓から取り出したテトロドトキシンの結晶化精製母液について、イオン交換カラムによるLC-MSを軽水・重水中で測定し、交換プロトン数の差から、類縁体の欠損酸素原子の結合位置が炭素原子か窒素原子かを特定する新しい手法を確立した。ここで化学合成した5,11デオキシTTXなどは天然には見つかっていない。一方、CTXの化学合成は多くの研究者が試みているものの手法として独創的な研究グループはわずかである。本研究では糖質アセチレンを増炭反応やビスコバルトカルボニル錯体としてエーテル環形成反応に活用する手法、さらにこの閉環エンド錯体をビニルシランに変換して官能基変換する手法、これを繰り返して梯子状の分子を構築するという方針で臨んだ。すでに、各部分部分の合成を終了して80%の合成を終えた。最終年度では、これらを実際に全合成するために、左右2分割した分子を中央でカップリングする方針でモデル実験に成功し、ほぼ当初の予定を達成することができた。これらの活性物質合成が完成したら、これとは別に進めているタンパク質の部位特異的修飾法とそのピコフェムトモルにおける超微量解析法をあわせて、研究の大きな段階を越えることができた。多く見受けられる多酸素化天然有機化合物には、重要な生理活性を持つものが多い。例えば、フグ毒のテトロドトキシンやシガテラ毒のシガトキシンはきわめて微量で効果を示すことで有名である。この研究では、食品衛生学的に重要なこのクラスの化合物を化学的により深く理解するために、その物質の立体制御合成を目指すものである。これまで確立してきた糖質を出発原料として、その炭素源および光学活性を確保する手法を展開した。糖質にシリルアセチレンを付加して選択的にアルファ型の糖アセチレンとしたあと、必要に応じてベーター型に異性化する方法、アセチレンから炭素鎖を伸延する方法、コバルトやパラジウム触媒を用いて、立体選択的に官能基化する方法を開発した。これらを実際に、テトロドトキシン母核合成と、水酸基あるいは窒素原子の立体選択的導入に活用し、最終的には環状グアニジニウムとラクトンを含むデオキシ型テトロドトキシンの合成に成功した。また、糖アセチレンから炭素鎖を伸ばした後アセチレンコバルト錯体として、その後7、8、9という中員環のエーテル結合合成に発展させ、これをシガトキシンのABC環、DEFG環、HIJK環などの合成を完成させた。特に、K環の合成ではLM環に必要な炭素原子や官能基を一気に持ち込む手法を立体選択的に確立することができた。これらの手法をまとめると、エーテル環の形成反応が終了したときには、次の合成段階の準備ができ上がるような手順を考案して、syn/transという立体化学を高選択的に合成することができるようになった。コンフォーメーションの予想も計算機化学を用いて論理的にできるようになった。来年度は、天然物の全合成を目指す。

まず、前者については水酸基が少ない類縁体2種類の合成を完成させた。フグの肝臓から取り出したテトロドトキシンの結晶化精製母液について、イオン交換カラムによるLC-MSを軽水・重水中で測定し、交換プロトン数の差から、類縁体の欠損酸素原子の結合位置が炭素原子か窒素原子かを特定する新しい手法を確立した。ここで化学合成した5,11デオキシTTXなどは天然には見つかっていない。一方、CTXの化学合成は多くの研究者が試みているものの手法として独創的な研究グループはわずかである。本研究では糖質アセチレンを増炭反応やビスコバルトカルボニル錯体としてエーテル環形成反応に活用する手法、さらにこの閉環エンド錯体をビニルシランに変換して官能基変換する手法、これを繰り返して梯子状の分子を構築するという方針で臨んだ。すでに、各部分部分の合成を終了して80%の合成を終えた。最終年度では、これらを実際に全合成するために、左右2分割した分子を中央でカップリングする方針でモデル実験に成功し、ほぼ当初の予定を達成することができた。これらの活性物質合成が完成したら、これとは別に進めているタンパク質の部位特異的修飾法とそのピコフェムトモルにおける超微量解析法をあわせて、研究の大きな段階を超えることができた。
マルコス計画法を応用した年金リスク管理モデルの構築

本研究では、年金数理計算の本質に回帰し、年金数理計算の外生変数(基礎率等)がALMにたいしていかに影響を及ぼしているかを実験的に解明した。そしてその結果を用い、実用的な多期間最適化モデルに挿入できる簡便的な負債モデルを構築することを目的とした。具体的には以下の成果を達成した。(1)年金ALMの負債モデルの外生変数の性質について、ALMに対する影響の視点から分析・整理を行った。(2)資産モデルを構築するため、年金ALMの特徴をより正確に反映するよう、従来の時系列モデルに修正を加えた。(3)資産・負債モデルを結合し、モンデカルロシミュレーションを行った。その結果負債モデルの外生変数と掛け金率の関係について把握することができた。また、この結果について解析的分析と比較を行った。(4)以上の結果を踏まえ、年金ALMモデルの修正・簡略化を行い、多期間最適ポートフォリオ政策の作成モデルを提案した。その過程において、従来の方法であるDPやシナリオアプローチのもつ問題点を指摘し、それぞれの長短を比較した。その後、上記の問題を解決する手段として、MDP (Markov Decision Process)の適用を試みた。(5)モデルの評価方法としては掛金率の増減に着目したリスク評価を採用したモデルを作成し、実用性を検討した。モデル評価によると従来の方法より、リスク管理の多様化が達成され、実用に耐えうることが判明した。その結果、来年度より、一部の年金基金のリスク管理に実際に使われる予定である。
視文叉上核の可塑性に対する光とがん原遺伝子の関与の生化学的解析

1.視文叉上核(SCN)の機能的可塑性。眼球摘出(後天的)盲目動物(ラット)では摘出後46週目にはSCN破壊時と同様に2-deoxy-D-glucose(2DG)脳内投与やSCN電気刺激による高血糖及び高グルカゴン血症反応が消失しているが,12週目までにはこれらの反応が回復すること,及びこれらと平行して食餌中の蛋白質の摂取が変化することなどを見出した。これらの事実はSCNが食質選択を含むエネルギー代謝調節に関与し,この機能が網膜からの神経連絡によって維持されていることを示唆している。また,健常動物の眼球を光照射すると,SCN腹側部にc-Fosの発現が認められるのと共に交感神経が興奮し,副交感神経の活動が低下するが,これらの変化はSCN破壊動物では認められないことも観察しており,上記の考えを支持している。2.CSNの形態学的可塑性。上記の後天的盲目動物では機能異常の出現する眼球摘出5週目にはSCNの細胞が「たが」のはずれたように広がって存在するが,機能の回復する摘出10週目にはそれらの細胞が再び「たが」のはめられたごとくに密度高く存在するようになる。また,同様のSCNの機能異常が認められる先天的盲目動物である遺伝子小眼球症ラットでもSCNの容積と細胞数が著しく減少し,形能異常が認められた。3.SCNでのがん原遺伝子産物。明暗情報を網膜から伝達する神経路が到達するSCNの腹側部のc-Fos発現には日周変動が認められ,12時間毎の明暗周期下では明期開始前に最低値を,暗期開始前に最高値を示す。しかしながら,この様な変化は盲目動物では認められなかった。高血糖を引き起こす2DG投与や低血糖を引き起こすインスリン投与によりSCNにc-Fosの発現が認められたので,現在,上記盲目動物でのSCNでのこれらc-Fosの発現について検討している。SCNにはBDNF受容体であるTrkBが認められた。1.視交叉上核(SCN)の機能的可塑性。眼球摘出盲目動物では摘出後4週目にはSCN破壊時と同様に2ーデオキシ-Dーグルコ-ス(2DG)脳内投与時の高グルカゴン血症反応が消失しているが、12週目には回復すること、及びこの様なグルカゴン濃度の反応性と平行して4週目には蛋白質の摂取が減少するが、9週目には対照動物と同様のレベルに戻ることを見出した。2.SCNの形態学的可塑性。SCNのVIP含有ニュ-ロンは眼球摘出後5週目には「たが」の外れた様な形態を一時的にとり細胞密度が低下するが10週目には回復する。3.SCNでの癌原遺伝子産物の発現。(1)FOS。明暗情報を網膜から伝達する網膜視床下部路が投射するSCNの腹側部にCーFOSが存在することはその抗体を用いる免疫組織化学的方法で確認している。そこで、今後この部分のCーFOSの発現が盲目動物で認められるか否かなどについて検討する。(2)TRK。SCNに存在する神経成長因子(NGF)に低親和性受容体が盲目動物のSCNには存在しないこと及び^<125>IーNGFをSCNに投与すると網膜に達することを見出した。

以上の事実は低親和性NGF受容体がSCNに投射する網膜神経節細胞の軸策終末に存在することを示す。NGFに構造の類似したBDNFやNTー3もこの低親和性受容体と結合し得るが、これらNGFファミリ-の高親和性受容体の構成成分は癌原遺伝子産物のTRK、TRKーB、TRKーCであることが明かとなっている。そこで、現在クロ-ニングを行って、TRKーBの相補性DNAの部分断片を得たので、この発現産物の抗体を作成して、SCNでの発現を検討し、どの神経栄養因子が実際に作動しているかを明らかにしたい。4。VGF。成熟動物ではSCNに特異的に存在し、NGFで迅速に誘導されるVGFは新生児の視床下部の初代培養細胞ではNGFでなくbFGFによって誘導されることを見出した。1.視交叉上核(SCN)におけるc-Fosの発現。12時間毎の明暗周期下に飼育する健常対照動物(ラット)においては体内時計の同調に関与する網膜からの神経連絡が到達するSCNの腹外側部で、c-Fosには明期開始前に最低値を暗期開始前に最高値を示す日周変動が認められたが、これと同様の変動は眼球摘出盲目動物では認められなかった。高血糖を引き起こす2DGを脳内及び腹腔内に投与するとSCNにc-Fosの発現が認められた。このc-Fosの発現は細胞核に限局していたが、バゾプレッシン(VP)陽性神経細胞との共存は認められなかった。2DGの投与によりSCNの他に、室傍核(PVN)、視索上核(SON)や室周囲核などの視床下部諸核にc-Fosの発現が認められた。低血糖をもたらすインスリンの腹腔内投与はSCNの前方では腹側に後方では外側にc-Fosの発現が認められた。血糖調節能に異常のある先天的及び後天的盲目動物でこれらの健常動物でのc-Fosの発現が認められるか否かについて現在検討中である。2.先天的盲目動物でのc-Fos発現。エネルギー代謝調節とc-Fosの関連を検討する過程で筆者らは24時間脱水時に認められるVP分泌増加の指標となる、PVN及びSONのc-Fos発現に関して検討してみた。その結果、24時間脱水時には健常動物では、PVN及びSONのバゾプレッシン陽性細胞にc-FOSの発現が認められたが、先天的盲目動物である遺伝性小眼球症ラットでは24時間脱水後の血中バゾプレッシン濃度の上昇反応の消失と平行してPVN及びSONのバゾプレッシン陽性細胞でのc-Fosの発現反応もまた認められなかった。この遺伝性小眼球症ラットはSCNの形態が異常であることから、以上の事実はSCNが体内時計やエネルギー代謝調節以外に体水分量の調節に関与することを示唆している。SCNには更にJunBやFynが存在した。
家族性乳癌の原因遺伝子BRCA2の相同DNA組換えにおける機能の解析

(1)BRCA2遺伝子と他の遺伝子の遺伝学的相互作用本研究ではBRCA2と、相同DNA組換えに関与する(1)XRCC3、(2)RAD52、(3)BRCA1、(4)FANC-C遺伝子との二重破壊株を作製し、表現型の解析を行った。まず、自然発生する染色体断裂は、XRCC3、RAD52、BRCA1遺伝子を破壊してもBRCA2ナル細胞より増えることはなかった。一方、FANC-C遺伝子を破壊すると、より多くの染色体断裂が生じた。このことより、自然発生するDNA損傷に対しては、XRCC3、RAD52、BRCA1遺伝子はBRCA2と同じ経路で働くが、FANC-C遺伝子は別の経路で働いていることがわかった。またシスプラチンに対する感受性は、どの二重破壊株もBRCA2遺伝子単独破壊株と一致し、DNA架橋剤後の修復には、これら4つの遺伝子がBRCA2と共同して働いていると結論した。一方、カンプトテシン(DNAトポイソメラーゼIの阻害によってDNA複製をブロックする)に対しては、BRCA1破壊株の方がBRCA2破壊株より感受性が高く、BRCA1はDNA損傷の種類によってはBRCA2と独立して働くことがわかった。(2)表現型解析技術の開発BRCA2破壊細胞に高エネルギーのレーザーを照射して、核内に高密度の二本鎖切断を導入した。BRCA2破壊細胞でも効率は低いが、RAD51蛋白が損傷部位に集合し、BRCA2に依存しないRAD51蛋白の働きを明らかにすることができた。(ii)クロマチン免疫沈降法によるDNA修復過程の解析染色体DNAを切断しない制限酵素の認識部位を、特定の染色体部位に導入した。酵素を一過性発現させ、ゲノムDNAの一カ所にDNA二本鎖切断を導入すると、切断部位周辺のヒストンH2AXがリン酸化されている現場をとらえることができた。1.BRCA2と他の遺伝子の二重変異株の作製本年度は、(1)XRCC3、(2)Rad52、(3)FANC-C遺伝子とBRCA2の二重変異株を作製した。BRCA2ナルのバックグラウンドでXRCC3遺伝子やRad52遺伝子を破壊しても、自然発生する染色体断裂は、それ以上増えることは無かった。一方FANC-C遺伝子を破壊すると、各遺伝子の単独破壊細胞より多くの染色体断裂が生じた。このことより、自然発生するDNA損傷に対しては、XRCC3、Rad52遺伝子はBRCA2と同じ経路で働くが、FANC-C遺伝子は別の経路で働いていることがわかった。またこれらの二重変異株のシスプラチンに対する感受性は、BRCA2遺伝子単独破壊株と一致し、シスプラチンによって誘導される染色体断裂の数も、BRCA2遺伝子単独破壊株と同じであった。つまり、DNAクロスリンカーによるDNA損傷の修復に関しては、これら3つの遺伝子はBRCA2遺伝子と共同して働いていると結論した。現在BRCA1遺伝子(実施計画ではBRCA1遺伝子のパートナーであるBARD1)とBRCA2遺伝子の二重変異株の作製に取り組んでいる。2.表現型解析技術の開発(I)DNA損傷後のBRCA2蛋白の細胞内局在C端末に蛍光蛋白GFPや短いタグ(HA、FLAGなど)が付いたBRCA2蛋白を発現する細胞を作製した。この細胞に高エネルギーレーザーを照射して、高密度のDNA二本鎖切断を導入したが、BRCA2蛋白の損傷部位への集積は捉えることが出来なかった。レーザー照射実験から、BRCA2蛋白が存在しない状態でも、効率は落ちるが、Rad51蛋白は損傷部位に集合できることが明らかになった。

1.BRCA2とBRCA1遺伝子の二重変異株の解析本年度は、家族性乳癌原因遺伝子で相同組換えに関与する2つの遺伝子、BRCA1遺伝子とBRCA2遺伝子の相互作用を遺伝学的に解析した。まず制限酵素によって染色体DNAの特定箇所に二本鎖切断を起こし、二本鎖切断が修復される効率から、相同組換え能力を評価した。その結果、二重欠損株の方がBRCA1またはBRCA2単独欠損株より相同組換え能力が低下していたことから、BRCA1はBRCA2とは独立した経路で、相同組換えを促進しうることがわかった。またカンプトテシン(DNAトポイソメラーゼIを阻害してDNA複製をブロックする)に対する感受性は、BRCA2欠損細胞よりBRCA1欠損細胞の方が高く、シスプラチン(DNAを架橋してDNA複製をブロックする)や紫外線に対する感受性は、逆にBRCA2欠損細胞の方がBRCA1欠損細胞より高かった。以上の結果から、BRCA1とBRCA2はDNA損傷の種類によって、お互いに独立して働いていると結論した。2.部位特異的なDNA二本鎖切断基質を用いたDNA修復過程の解析(クロマチン免疫沈降法)染色体DNAを切断しない制限酵素I-SceIの認識部位を、卵白アルブミン遺伝子座に人工的に導入した細胞株で条件検討を行った。I-SceIを一過性発現させ、ゲノムDNAの一カ所に二本鎖DNA切断を導入すると、切断部位周辺のヒストンH2AXがリン酸化されている現場をとらえることができた。しかし相同組換えの初期段階で切断部位に集合するはずのRAD51蛋白は、検出することができなかった。これは前者が特異性の高いモノクローナル抗体を使用しているのに対して、後者は特異性に劣るポリクローナル抗体を使用しているためであると考えられた。今後、ニワトリRAD51蛋白に対する高力価のモノクローナル抗体の作製が必要であると考えられた。
眼科学の領域における脳幹電位の臨床応用の開発

聴性脳幹電位は約15年前より脳幹部の機能検査法として臨床に広く応用されている.しかるに視機能性の脳幹電位は私共の研究以前には微々たるもので,臨床応用は全くなかった.この発達の遅れの原因は視覚性脳幹電位は網膜から4種類の速度の異なる反応が投射されることや,瞳孔の対光反射を発生する脳幹電位も発生することなどから,著しい複雑性が分析のさまたげとなっていた.私共は動的脳電図法を基礎テクニックとして,従来の波形による電気生理では検出できなかった視覚性脳幹電位を短潜時視覚誘発反応の中に確認した.すなわち光刺激後40msec時に出現する網膜律動様小波は陰性帯電として後方に投射し44msec頃脳幹部に到達し陰性電位の焦点を形成する.この反応は視神経から連続的に発生する.しかるに50msecにいたって脳幹電位の特徴である遠隔電場電位の帯電を示す陽性電位が脳幹部から湧くように出現する.加算平均法ではこの反応は連続的にみえるが,加算しない単一試行では34回の脳幹部の発火を認め,対光反射発動の神経核群の電位が示唆された.このP_<50>電位は瞳孔の対光反射の消失した脳幹部変性症の症例では欠損を示した.今一つの視機能性脳幹電位には眼球運動準備電位がある.各種の眼球運動中脳幹電位が正確に検出できるのは,衝動性眼球運動に先行するスパイク陽性電位である.これは脳幹部の眼球運動神経核群のバーストニューロンの発火と考えられ,衝動性眼球運動発動前8msecにはじまり,運動中も5msecずれこむ.単一試行ではこの14msecの間に5回の短発射を認める.外転神経核出血をCTで認める外転神経麻痺の症例ではこれに相応する脳幹性スパイク陽性電位の欠損が明瞭に検出された.本研究により,従来研究が停滞していた視機能性(感覚と運動)脳幹電位の臨床応用が確立された.本研究は日本を代表する独創的研究とすることができる.聴性脳幹電位は約15年前より脳幹部の機能検査法として臨床に広く応用されている.しかるに視機能性の脳幹電位は私共の研究以前には微々たるもので,臨床応用は全くなかった.この発達の遅れの原因は視覚性脳幹電位は網膜から4種類の速度の異なる反応が投射されることや,瞳孔の対光反射を発生する脳幹電位も発生することなどから,著しい複雑性が分析のさまたげとなっていた.私共は動的脳電図法を基礎テクニックとして,従来の波形による電気生理では検出できなかった視覚性脳幹電位を短潜時視覚誘発反応の中に確認した.すなわち光刺激後40msec時に出現する網膜律動様小波は陰性帯電として後方に投射し44msec頃脳幹部に到達し陰性電位の焦点を形成する.この反応は視神経から連続的に発生する.しかるに50msecにいたって脳幹電位の特徴である遠隔電場電位の帯電を示す陽性電位が脳幹部から湧くように出現する.加算平均法ではこの反応は連続的にみえるが,加算しない単一試行では34回の脳幹部の発火を認め,対光反射発動の神経核群の電位が示唆された.このP_<50>電位は瞳孔の対光反射の消失した脳幹部変性症の症例では欠損を示した.今一つの視機能性脳幹電位には眼球運動準備電位がある.各種の眼球運動中脳幹電位が正確に検出できるのは,衝動性眼球運動に先行するスパイク陽性電位である.これは脳幹部の眼球運動神経核群のバーストニューロンの発火と考えられ,衝動性眼球運動発動前8msecにはじまり,運動中も5msecずれこむ.単一試行ではこの14msecの間に5回の短発射を認める.外転神経核出血をCTで認める外転神経麻痺の症例ではこれに相応する脳幹性スパイク陽性電位の欠損が明瞭に検出された.本研究により,従来研究が停滞していた視機能性(感覚と運動)脳幹電位の臨床応用が確立された.本研究は日本を代表する独創的研究とすることができる.1.視性脳幹電位の脳電位図の確定聴性の脳幹電位は頭皮上から特徴ある帯電地図として捉えることができる。この事実を再確認して未知の視機能性脳幹電位を同定するため、断頭した豚脳の植込電極実験を行って、脳幹部発射電流の頭皮上分布の特徴を動的脳電位図法で確定した。さらに現在臨床に応用されている聴性脳幹反応についてヒトにおける脳幹電位図の特徴を求めて、視機能性脳幹電位の同定の対照とした。その結果視機能性においても遠隔野電位の脳図を認めた。2.短潜時視覚誘発反応眼から視中枢までの視路伝導を測定する方法を確立し、この中に含まれる視路脳幹電位の要素を分析した。脳幹電位と思われるものは26msec頃から陰性帯電として出現をはじめ40msecで最大に達する。その後50msec-60msecにかけて脳幹由来と思われる陽性焦点が出現する。さらにこれらの陰性陽性反応には、それぞれ数回の発射電位が含まれ、視覚伝導の中継核群の放電と考えられる。3.眼球運動に先行する脳幹電位衝動性眼球運動の直前1520msecより運動初期にかけて頭頂部から出現する電位を脳幹電位としての同定を完了した。

さらにこの電位には数回の発射があることを発見したが、中脳附近に散在する眼球運動の発生源である神経核群の放電であろうと考えられる。これらの電位は視運動眼振や自発眼振の急速相の直前にも認められた。4.簡易測定法の開発13の実験はすべて頭皮上に設置した12または16個の電極から誘導されたものであるが、臨床的な実用法として4チャンネルシグナルプロセッサーでの分析を開発した。頭皮上電極は4個を1組として脳幹用,後頭用,全中心線用の3種のモンタージュを使い分けすることにより、短潜時誘発反応の診断を可能にすることができた。
新規HLA-A2402拘束性扁平上皮癌拒絶抗原(SART-2)の解析

我々は扁平上皮癌患者の末梢血リンパ球よりリンパ球腫瘍混合培養法にてHLA-A2601拘束性CTL株の樹立及び大量培養に成功した。さらに樹立したCTL株よりHLA-A2402拘束性に癌細胞を認識するCTLサブラインを樹立を試み、大量培養に成功した。このCTLサブラインを用いて扁平上皮癌における新しい癌拒絶抗原遺伝子(SART-2)をクローニングした。SART-2遺伝子は全長約4000塩基であり、第6染色体の長腕(6q22)に位置し6個のエクソンから構成されている。この遺伝子は一部の腺癌には発現していないものの扁平上皮癌に広く発現していた。また正常組織においては普遍的に発現していた。さらにこの遺伝子は958アミノ酸からなる蛋白をコードしており、3個の疎水性領域を持っていることから膜蛋白である可能性が示唆された。SART-2蛋白内に存在するHLA-A2402結合性ペプチドを作製し、これらのペプチドに対するCTLサポラインの感受性を検討したところ、9個のペプチドに対して感受性を示した。さらにこれらのペプチドの中で2個のペプチドに対してCTLサプラインは用量依存性を示した。これらの2個のペプチドにてHLA-A24陽性の健康人末梢血単核球(PBMC)を刺激した。刺激したPBMCはHLA-A2402陽性及びSART-2陽性の癌細胞を特異的に認識し、細胞傷害活性を示した。現在、食道癌、頭頚部癌、肺癌などの扁平上皮癌患者のPBMCを用いて健康人と同様に抗原特異的細胞傷害性リンパ球を誘導することができるかどうか検討中である。
国会議員の経歴特性からみた日本的政治風土の社会学的研究

本研究は、日本の権力構造をドムホフらのエリート論的な視角から経験的に解明しようとする試みである。このためにわれわれは、二つの調査を行った。一つは、第38回総選挙回の衆議院議員512名の経歴についての調査であり、今一つは、同議員を対象とした議員職へのアスピレーション形成過程と政治的諸アクターに関する評価を尋ねるためのアンケート調査である。後者は128名(25.0%)の有効回答を得ることができた。この二つの調査の分析から、議員が各党ごとにみて、いくつかの経歴パターンをもつ集団に分類可能であること、しかもそれらが日本の権力エリートの一つである国会議員を補充するためのかなり閉鎖的なシステムであることが分った。議員は出身階層→学歴→職業と移動するプロセスで議員就位にとってより有効な資源となるようなキャリア形成に努めるが、最近回の選挙ごとに増加する世襲議員はきわめて閉鎖的なエリート補充システムであり、達成的なキャリアが無意味である点で特異な移動パターンをもつこともわかった。議員へのアスピレーション形成には周囲の「重要な他者」が、モデルあるいはディファイナーとしての影響を及ぼすことが判明した。また役割評価の点では、政党間に差違が見られ、自民党は政党優位論であり、野党は官僚優位論的であったが、総じて国会議員自身も日本の政策決定過程をエリート論的に考えていることが理解された。本研究の詳しい内容については、「国会議員のキャリア形成と役割評価」と題する報告書を作成したので参照していただきたい。
超臨界流体プラズマ生成・診断、および、それを用いた環境調和型材料プロセスの創製

本研究は、「超臨界流体プラズマ生成・診断・および、それを用いた環境調和型材料プロセスの創製」を目的とする。本年度の研究においては、この新規プラズマ状態、さらにはプラズマプロセスの更なる理解・制御のために"時間的・空間的な疎密混合状態のプラズマ反応場"のモデル反応場として、超臨界流体の密度揺らぎと比較し、時間的・空間的にマクロな系で揺らぎが生じている、バブルを含む液中におけるプラズマ反応場の生成・解析を行い、本プラズマ反応場制御に関する新たな知見を獲得した。具体的には、生理食塩水中において100μm程度の微小電極にAC電圧(10-100kHz)を印加し、主としてジュール加熱による、ガス注入無しでのバブル生成を行い、バブル中でのプラズマを形成した。印加電圧波形の制御のみで、電極上に10分以上安定に存在させた単一バブルと、電極近傍で生成されたバブルクラウドとの2つのバブルモードにおける安定なプラズマ形成、制御に成功している。さらに電気的特性、プラズマ中の励起種等を診断すると共に、計算機モデリングにより、バブルクラウド形成時に見られるバブル流が、主に誘電泳動力により駆動されていることを示唆した。誘電泳動力は、電界勾配と周囲媒質との誘電率の差により生じ、超臨界流体プラズマ反応場においても、疎密による誘電率の分子レベルでの空間的不均一性により、この力が働くことが考えられることから、誘電泳動力が、超臨界状態も含めた、疎密混合状態のプラズマ反応場の効率的輸送、さらにはプラズマ処理の空間的制御に効果的であることが期待される。また生体環境調和型プロセスとして、バブルクラウドモードでの液中プラズマ殺菌を行い、180sで99.5%の殺菌を実現した。本手法は、微小プラズマを用いることによる利便性と共に、高速処理能を有しており、次世代殺菌技術に大きく貢献しうるものである。本研究は「超臨界流体プラズマ生成・診断・および、それを用いた環境調和型材料プロセスの創製」を目的とし、I.プラズマの発生、II.プラズマの診断、III.材料プロセスへの応用を総合的に行うものである。本年度は、1.超臨界流体中でのプラズマ発生時における電子-クラスタ相互作用の電子増強誘導ラマン散乱分光法を用いた診断、2.プラズマ反応場中における、超臨界流体特有のミクロな流体構造の存在の実証、3.DCナノパルス放電を用いたカーボンナノマテリアルの合成を行った。1.電子-クラスタ相互作用は、電子付着によるラマン散乱断面積の増強効果を用いて調査し、臨界点付近の超臨界水中におけるレーザー誘起プラズマの発生過程においては、(H_2O)_3-が主要な負イオンクラスターとなることを明らかとした。2.クラスタリングは、超臨界流体の高溶解度を始めとする優れた溶媒特性の起源であり、特に、臨界点付近においては、分子間力と熱運動の拮抗により促進されるため、"密度揺らぎ"が生じ、物理量の劇的な変化が起こる。本研究では、CO_2のラマンスペクトルから、バリア放電プラズマの適用により、温度上昇が0.1K以下に抑えられたプラズマ反応場の形成を可能とすることを示し、プラズマ反応場中の分子クラスタリングの存在を明らかにするとともに、臨界点付近において、プラズマ非発生時と比較し、25%程度の"密度揺らぎ"が、プラズマ反応場中においても存在していることを実証した。この結果と臨界点近傍がカーボンナノマテリアル合成に優位な条件であることを合わせ、密度揺らぎの増大に伴う臨界点近傍の超臨界流体の特性が、カーボンナノマテリアル合成の促進に寄与したことを示唆し、超臨界流体のミクロな流体構造の共存したプラズマ反応場の特異性を提示した。3.プラズマ電流、発生時間の能動的制御が可能なDCナノパルス放電を用い、CO2を原料としたカーボンナノマテリアルの合成を行った。
集積反応場の機能設計

生体系に見られる各種の集積場のモデル研究に焦点をあて,昨年につづき機能設計原理の確立およびその展開を目的とする研究を遂行した.まず包接化合物を高分子の反応場として利用し,特異な構造をもつ高分子の合成を目的として,天然物のデオキシコール酸などをホスト分子とする重合反応を研究した.その結果,包接系内で生長ラジカルが長寿命であること,かさ高いブタジエン誘導体でもうまく重合が進行することなどを見出し,包接空間とモノマーの重合性との関係をさらに明確にすることができた.また新らしい型の人工細胞として,反応制御機能をもつ人工細胞の設計のため,卵黄のレシチンによる人工リン脂質二重膜を合成した.その膜内に設計されたフラボ脂質が極めて高い電子輸送能を示す触媒となること,またこれを利用して膜輸送電子流束の制御が有効に達成された.またキラルな分子より構成される二分子膜は適当な条件下で,らせん超構造体を形成することも確立された.さらに金属錯体系を触媒とするシクロペンテンの酸素酸化反応で銅の酸素活性化とパラジウムのオレフィン活性化の両機能が集積されて進行すると考えられる,高効率の酸素酸化系を設計することに成功した.これはチトクロムP-450の人工モデル系として興味がある.また酵素機能の発現因子の化学的解析を目的としてモデル化合物の研究を行う一方,酵素の活性部位の解析によって新らしいドラッグデザインへの展望を開くことができた.また細胞のもつ機能を理想的に発現させるために,これを包括固定化して有用物質の生産に応用する試みについては,微生物および植物細胞の化学的固定化の方法をさらに一歩押し進め,複数の酵素の固定化によるペルオキシソームモデルの構築の可能性を得ることができた.これらの研究に関連して,人工タンパク質合成のモデル系としてのミトコンドリアの特徴を明らかにし,セリンt-RNAの単離法をも確立した.生体系に見られる各種の集積場のモデル研究に焦点をあて,昨年につづき機能設計原理の確立およびその展開を目的とする研究を遂行した.まず包接化合物を高分子の反応場として利用し,特異な構造をもつ高分子の合成を目的として,天然物のデオキシコール酸などをホスト分子とする重合反応を研究した.その結果,包接系内で生長ラジカルが長寿命であること,かさ高いブタジエン誘導体でもうまく重合が進行することなどを見出し,包接空間とモノマーの重合性との関係をさらに明確にすることができた.また新らしい型の人工細胞として,反応制御機能をもつ人工細胞の設計のため,卵黄のレシチンによる人工リン脂質二重膜を合成した.その膜内に設計されたフラボ脂質が極めて高い電子輸送能を示す触媒となること,またこれを利用して膜輸送電子流束の制御が有効に達成された.またキラルな分子より構成される二分子膜は適当な条件下で,らせん超構造体を形成することも確立された.さらに金属錯体系を触媒とするシクロペンテンの酸素酸化反応で銅の酸素活性化とパラジウムのオレフィン活性化の両機能が集積されて進行すると考えられる,高効率の酸素酸化系を設計することに成功した.これはチトクロムP-450の人工モデル系として興味がある.また酵素機能の発現因子の化学的解析を目的としてモデル化合物の研究を行う一方,酵素の活性部位の解析によって新らしいドラッグデザインへの展望を開くことができた.また細胞のもつ機能を理想的に発現させるために,これを包括固定化して有用物質の生産に応用する試みについては,微生物および植物細胞の化学的固定化の方法をさらに一歩押し進め,複数の酵素の固定化によるペルオキシソームモデルの構築の可能性を得ることができた.これらの研究に関連して,人工タンパク質合成のモデル系としてのミトコンドリアの特徴を明らかにし,セリンt-RNAの単離法をも確立した.
耳下腺腺房細胞における受容体刺激に伴う細胞内イオン動態の画像解析

1.ムスカリン受容体刺激によって惹起される細胞内Ca^<2+>ウエーブのイメージング。Ca^<2+>蛍光指示薬Fura-2を取り込ませた腺房細胞をカルバコール(CCh)で刺激したところ[Ca^<2+>]_1の上昇は腺腔の近傍で始まりCa^<2+>ウェーブとして速やかに細胞全体に広がった。2. caged IP_3の光分解によって惹起される膜透過性細胞のCa^<2+>ウエーブ。サポニン処理した腺房細胞を膜結合性蛍光色素(Calcium Green C_<18>)でラベルし、caged IP_3の光分解によって惹起されるCa^<2+>動員のパターンをモニターした。IP_3の解離は腺腔膜の近傍からから広がるCa^<2+>ウエーブ様の反応を起こした。3.膜透過性細胞における細胞内ストアからのCa^<2+>放出のイメージング。細胞内ストアからのCa^<2+>放出をMag-fura-2およびCalcium Green C_<18>を用いてモニターした。IP_3は速やかなCa^<2+>放出を起こしたが、cyclic ADP-ribose,カフェイン、リアノジンはCa^<2+>放出を刺激しなかった。4.細胞内Ca^<2+>分布に対するイソプロテレノール(ISO)の効果。アミラーゼの最大分泌を起こす1μM ISOは細胞内Ca^<2+>分布に全く影響を与えなかった。5.細胞内Cl^-濃度に対するCChの効果。CChは細胞内Cl^-濃度の速やかな低下を起こした。この反応は[Ca^<2+>]_1の上昇とよく相関していた。1.Ca^<2+>蛍光指示薬Fura-2を取り込ませた耳下腺細胞を10μMカルバコール(CCh)で刺激したところ細胞内Ca^<2+>濃度([Ca^<2+>]_1)の上昇は刺激後約0.4秒で腺腔の近傍からから始まり速やかに細胞全体に広がった。この[Ca^<2+>]_1の変化は腺腔側から基底側に広がるCa^<2+>の波(ウエーブ)のように見えた。Ca^<2+>ウエーブは細胞外のCa^<2+>を除いても見られたことからこの現象は細胞内Ca^<2+>ストアからのCa^<2+>の遊離によるものと思われる。腺腔から基底側へと伝搬するCa^<2+>ウエーブの速度はCChの濃度の低下とともに遅くなった。低濃度のCCh (<0.5μM)で刺激した時[Ca^<2+>]_1は主に腺腔側領域で上昇し、基底側領域での[Ca^<2+>]_1上昇は小さかった。タプシガ-ジンやイオノマイシンを細胞に作用させるとCa^<2+>遊離は細胞全体でほぼ同時に惹起された。これらの結果はイノシトール1,4,5-三燐酸(IP_3)がCa^<2+>ウエーブを惹起する必須の細胞内シグナルであること、Ca^<2+>ウエーブの発生はCa^<2+>ストアのIP_3感受性の部域差が関係していることを示唆している。2.耳下腺細胞をサポニンで処理し、膜透過性細胞を作成した。細胞内ストアからのCa^<2+>遊離を低感受性Ca^<2+>蛍光指示薬Mag-fura-2及び膜結合性Ca^<2+>蛍光指示約CalciumGreenC_<18>を用いてモニターした。IP_3は速やかなCa^

<2+>遊離を起こした。この反応はIP_3拮抗薬であるヘパリンで抑制された。リアノジン受容体を活性化するcyclic ADP-ribose,カフェイン、リアノジンはCa^<2+>遊離を刺激しなかった。リアノジン受容体は耳下腺腺房におけるCa^<2+>シグナルの生成に関与していないものと思われる。1.膜透過性細胞を膜結合性Ca^<2+>蛍光色素(Calcium Green C_<18>)でラベルし、Caged IP_3の光分解によって惹起されるストアからのCa^<2+>放出パターンを画像解析装置を用いて観察した。低濃度のIP_3(0.2μM)の解離は腺腔膜の近傍から細胞全体に広がるCa^<2+>ウエーブ様の反応を起こした。このcaged IP_3による反応はタプシガージンでCa^<2+>ポンプを抑制した細胞でも観察された。一方、高濃度のIP3(4μM)の解離は細胞全体で同時にCa^<2+>放出反応を起こした。以上の結果から、腺腔膜近傍のCa^<2+>ストアは基底側よりもIP3に対する感受性が高いことが示唆された。2.耳下腺腺房細胞のCa^<2+>分布に対するイソプロテレノール(ISO)の効果を調べた。アミラーゼの最大分泌を刺激する0.1-10μM ISOは細胞内Ca^<2+>の分布に全く影響を与えなかった。高濃度(100μM)のISOは有意な[Ca^<2+>]iの上昇を引き起こした。この反応はβ遮断薬であるブロプラノロールでは全く影響を受けず、α遮断薬であるフェントラミンによって強く抑制された。この結果から、β受容体の活性化は腺房細胞のCa^<2+>動員を刺激しないことが示唆された。3.耳下腺腺房細胞にCl^-蛍光指示薬SPQを取り込ませ、受容体刺激による細胞内Cl^-の分布変化をモニターした。Ca^<2+>動員性アゴニストであるカルバコールやサブスタンスPは細胞内Cl^-濃度の速やかな低下、すなわち細胞外へのCl^-の放出を起こした。しかし、Cl^-分布の変化は細胞全体で同時に惹起され、ウエーブ様の反応は認められなかった。SPQの蛍光変化はβ受容体刺激によってもしばしば惹起され、Cl^-分布の変化とCa^<2+>動員との関係についてはさらなる検討が必要である。
角化細胞辺縁帯形成機構の細胞生物学的検討

1)ロリクリン角皮症と辺縁帯形成ロリクリンは辺縁帯の主成分である。我々は本蛋白の遺伝子変異による角化異常症を世界で始めて発見しこれをロリクリン角皮症と命名した。我々はロリクリン角皮症患者におきている遺伝子変異から予想される変異蛋白を特異的に検出できる抗体の作成に成功し、その蛋白局在をあきらかにした(J Invest Dermatol,115:1095-1103,2000)。その結果、変異蛋白は顆粒細胞、角質細胞の核に集積していることが明らかになった。意外なことに辺縁帯にはほとんど移行しないことかが判明し、辺縁帯の形成が直接障害される可能性は否定的となった。変異ロリクリンはとりわけ初期には核小体に局在することから、我々は変異ロリクリンは角化細胞の核、核小体機能を障害することにより表皮細胞の分化過程をちょうどDNA断片化が起きる時点で停止させると推定した。ロリクリン遺伝子異常が見られた紅斑角皮症と共通する臨床症状を呈するあらたな紅斑角皮症患者1名を検討し、本例ではロリクリン変異蛋白の発現がみられず、別の疾患であることが確認された(Br J Dermatol 143:1283-1287,2000)。2)シスタチンAの遺伝子発現調節機構辺縁帯の成分であるシスタチンAの遺伝子発現が転写因子AP-2gにより増強することを明らかにした(BBRC278:719-723,2000)。2)ケラチンの脱イミノ化辺縁帯に架橋されるケラチンであるK1はヒト表皮角層で脱イミノ化による翻訳後修飾をうけるが、尋常性乾癬表皮ではK1は発現しても脱イミノ化されないことがわかった(J Invest Dermatol 114:701-705,2000)。辺縁帯の成分であるインボルクリンとシスタチンAの遺伝子発現調節機構の一端を明らかにした(Takahashi H,Ishida-Yamamoto A,他J InVest Dermatol 110:218-223,1998、J Biol Chem 273:17375-17380,1998)。辺縁帯の成分の1つとなると考えられていたプロフィラグリンのアミノ末端ドメインが辺縁帯ではなくむしろ核内に移行することを示し、全く別の機能をもったペプチドである可能性を指摘した(Ishida-Yamamoto A他Lab Invest 78:1245-1253,1998)。角化細胞辺縁帯の主成分であるロリクリンの遺伝子変異を日本人Vohwinkel症候群患者で初めて同定した(Takahashi H,Ishida-Yamamoto A,他J Dermatol Sci 19:44-47,1999)。辺縁帯形成は角化細胞の終末分化の過程でおきるが、これがアポトーシスの反応の一部であることを示すことのできる、免疫電顕とTUNEL法を同一切片上で行うことを可能にした新しい手法を開発した(Ishida-Yamamoto A,他J Histochem Cytochem in press)。辺縁帯形成過程においてロリクリンの抗原エピトープはデスモゾーム部分においてはデスモグレインなどによりマスクされることを抗原の再活性化により証明した(Ishida-Yamamoto A,他Exp Dermatol inpress)。本研究において我々は表皮の生体防御機構である辺縁帯の形成機構を細胞生物学的アプローチにより明らかにする。