hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
学校と美術館の連携による美術鑑賞教育モデルの開発

研究課題である、学校と美術館の連携による美術鑑賞教育モデルを開発するための実践的研究を行った。具体的には秋田県と大分県において、それぞれの地域の教育委員会、美術館、教員の協力を得て、以下のように授業実践ならびに考察を行った。・秋田県における学校と美術館の連携による美術鑑賞教育モデル(以下、秋田モデル)の作成10月20日(月)21日(火)の二日間にわたって秋田県立美術館において、秋田市立大住小学校(5年生)、潟上市立羽城中学校(3年生)、秋田県立西目高等学校(1年生)の授業をそれぞれ行った。題材(鑑賞作品)は藤田嗣治『秋田の行事』である。秋田モデルは、教育委員会が主導する美術館と学校との連携教育モデルである。また、同一作品を発達段階ごとの目標設定により授業を行う場合のモデルであり、地域が誇る作品を小学校、中学校、高等学校の各学校種ごとに鑑賞する場合の目標と授業のあり方を示すものである。・大分県における学校と美術館の連携による美術鑑賞教育モデル(以下、大分モデル)の作成10月28日(火)別府青山高校(1年生)、29日(水)臼杵市立北中学校(3年生)、11月6日(木大分市神崎中学校(3年生)、11月20日(木)大分市美術館にて大分県立芸術高校(2年生)、12月15日(月)由布市立西庄内小学校(3年生)の授業をそれぞれ行った。大分モデルは各学校種、授業者の必要に応じて美術館や作家などに働きかけ、学校と美術館の連携教育を行うモデルである。26年度が最終年度であるため、記入しない。研究期間に明らかにすることを、段階的に三つの究明課題に分け、年次計画を立てた。課題1;各地の主な美術鑑賞教育プログラムを分析し、その方法と理論背景を明らかにする課題2;所蔵作品を活用した美術鑑賞教育モデルを作成し、指導法や評価方法を明らかにする課題3;美術鑑賞教育モデルを教材化し、教材を活用した授業実践を通して有効性を確認する平成25年度は、課題1;に関した調査を行った。研究分担者は、それぞれの専門分野の観点から資料・調査内容について整理・分析を行った。●研究経過4月採択内定、研究協力依頼開始5月科研会議(研究計画:大分県大分市)、損保ジャパン美術館調査、資料収集「美術館連携の手引」⇒資料1(パワポ資料)6月資料整理⇒資料2(冊子)8月大原美術館、丸亀猪熊弦一郎現代美術館調査、資料収集⇒資料3(冊子)10月研究授業「日月山水図屏風」仲摩早矢香(大分県立豊南高等学校教諭)⇒資料科研会議(授業考察、大分県大分市)11月研究発表(第8回学び研大会別府大会:大分県別府市)発表者:岩佐まゆみ他⇒資料5(WEB公開中)科研会議(中間報告、東京国立近代美術館)12月科研会議(研究計画、島根県益田市)1月科研会議(研究計画、大分県大分市)2月科研会議(研究計画、長崎県長崎市)長崎県立美術館調査科研会議(研究計画、秋田県秋田市)秋田県美術館調査研究授業(北海道旭川市)庄子展弘(旭川市立北星中学校教諭)中原悌二朗彫刻美術館との連携授業科研会議(年度末報告、東京国立近代美術館)秋田県では秋田を代表する美術作品である藤田嗣治の『秋田の行事』を教材に授業モデルを作成することとなり、県教委、県立大学、高等学校、中学校、小学校の全面的な研究協力体制を構築し、授業研究の準備が整った。研究実績の概要に書いたとおり、年次計画に沿って研究は順調に進行している。年次計画に沿って課題

2および3に関する研究を行う。26年度が最終年度であるため、記入しない。年度当初に予定していた海外調査が本務との調整で中止となったため、その使用予定額が次年度使用額として生じた。26年度に海外調査を実施するため、現在フィレンツェ大学と企画中である。
濡れ性を利用した微小流路内の二相流の界面制御

サブミリ・ミリスケールの微小空間では、スケール効果により表面張力の影響が体積力よりも大きくなることが知られている。そこで本研究では、この表面張力の影響を積極的かつ効果的に利用することにより、微小流路における流体相界面の制御を行うことを目的した。流体と流路壁面の濡れ性をコントロールすることにより二つの相(気相と液相、あるいは液相と液相)から成る二相流れにおける相界面形状(気泡の長さ)の制御し、圧力損失の低減をできることを明らかにした。マイクロおよびミニ流路内の二相流の気液界面制御を目的として、本年度は流路代表径が0.25 mmのマイクロ流路と3 mmおよび5 mmのミニ流路の実験装置を作製した。そして、広範な文献調査を行ったところ、二相流の流動特性には液体の種類が影響を及ぼすことが分かった。特に、実用的な観点から非ニュートン流体の影響を知ることが必要とされるが、マイクロあるいはミニスケールにおける非ニュートン液体の二相流特性を調べた研究は僅かである。そこで、0.25 mmのマイクロ流路を用いた実験ではまず非ニュートン液体の特性が二相流動特性(気液界面形状、気泡の速度、気泡の長さ、気体の体積率、圧力損失等)を詳細に調べた。この実験では非ニュートン液体として、擬塑性を示す重量濃度が異なるポリアクリルアミド水溶液を用いた。実験の結果、ニュートン液体では見られない現象を観察した。そして、観察した流動特性を評価する式を検討した。また、3 mmのミニ流路内に設けた急縮小部を通過する非ニュートン液体二相流の流動特性を調査した。なお、現在は急拡大等の別な流路形状変化の検討および流動条件の拡充をしている。5mmのミニ流路では、直線部の下流端にY型分岐を設けた。そして、作動流体として空気と水を用いてY型分岐部での気体と液体の分離特性を調べた。分岐部上流部および下流部のそれぞれにおいて気泡の形状(長さ)、気泡速度、圧力損失等を測定した。そして、圧力の測定値から分岐部における分岐損失係数を評価した。そして、流動条件の拡充を行っているところである。幅5mm、高さ2.5mmの水平な矩形ミニ流路の実験装置を新規に作製した。そして、その装置を使用して流路の壁面の濡れ性が空気-水の気液二相流の流動特性(気泡長さ、液スラグ長さ、気泡速度(ボイド率)および摩擦圧力損失)へ及ぼす影響を調査した。流路の壁面(材質はアクリル樹脂)に撥水性のスプレー剤をコーティングすることにより濡れ性を変えた。濡れ性の指標である接触角を測定したところ、コーティングの無しの場合の接触角は80°、有りの場合のそれは115°であり、コーティング有の流路の濡れ性が悪いことが分かった。実験の結果次のことが明らかになった。・流路の壁面の濡れ性が悪くなる(撥水性のコーティングをした場合)と気泡の長さが長くなる。すなわち、同一の気・液流量条件にでも流路の壁面の濡れ性を変えることにより気液の界面の形状を変えることができることが分かった。・壁面の濡れ性が悪いと気泡の速度は遅くなり、気体の体積率であるボイド率は高くなることが分かった。気液間の反応を起こさせる場合、ボイド率が高くなることにより気液の接触界面が増加し、反応効率が上がることが期待される。・流路の壁面の濡れ性が悪くなると摩擦圧力損失が小さくなることが確認された。流路の代表径が小さくなるにつれて、圧力損失は大きくなり流体を装置に導入するための動力が大きくなる。したがって、流路の壁面の濡れ性を悪くすることにより圧力損失が低減でき、動力を削減できることが期待される。上記の研究に加えて、液体の種類が気液界面形状に影響を及ぼすことから、液体マイクロ流路内の非ニュートン液体と気体二相流の流動特性を実験的に調べた。当初の予定どおりミニ流路における壁面濡れ性が気液二相流に及ぼす影響を調査できたため。また、実績概要に示したとおり濡れ性を変えることにより二相流の界面形状や圧力損失をコントロールする可能性を見い出せたことによる。マイクロチャンネルおよびミニチャンネルにおける流路の壁面濡れ性が気液二相流の流動特性に及ぼす影響を調査した。本年度は水力学相当直径が1.00 mmの矩形マイクロチャンネルを用いた実験と解析を行った。流路は水平で、2枚のアクリル板の上下に重ね合わせて作られた。すなわち、その下板表面に矩形の溝を機械加工した。作動気体に空気、作動液体に水を用いた。流路の壁面の濡れ性を撥水剤のコーティングの有無により調整した。コーティング有の場合の壁面の接触角は80度、コーティング有の場合のそれは127度であった。すなわち、コーティング有の流路壁面の濡れ性が悪くなった。なお、試験流路にコーティングする際、流路の上板のみにコーティングした。また、予備試験により流路全長の壁面の濡れ性を悪くする場合と気液の混合部の付近の流路壁面の一部の濡れ性を悪くした場合で、流路に導入された2液の混合に及ぼす影響を調べた。その結果、気液混合部付近の濡れ性を変えるだけで、2液の混合を促進するのには十分であった。同一の気液条件において、濡れ性を悪くすると発生する気泡の長さが良い場合より長くなることが確認された。

それにともない流路の壁面の濡れ性を悪くした場合の気液二相流の摩擦圧力損失は濡れ性が良い場合のそれより小さくなることが分かった。これは気泡が長くなることにより発生する気泡の個数が減少し、その気泡の後流部にできる渦の頻度が減少したためと考えられる。そして、この圧力損失を予測する式を構築した。サブミリ・ミリスケールの微小空間では、スケール効果により表面張力の影響が体積力よりも大きくなることが知られている。そこで本研究では、この表面張力の影響を積極的かつ効果的に利用することにより、微小流路における流体相界面の制御を行うことを目的した。流体と流路壁面の濡れ性をコントロールすることにより二つの相(気相と液相、あるいは液相と液相)から成る二相流れにおける相界面形状(気泡の長さ)の制御し、圧力損失の低減をできることを明らかにした。文献調査を行ったところ気液界面の制御には液体の種類が大きく影響を及ぼすことが報告されている。そこで、従来あまり研究されていない非ニュートン液体がマイクロ流路内の二相流の流動特性に及ぼす影響を先に調べることにした。そのため、本年度に行う予定であった流路壁面の濡れ性の影響を調べる実験の開始が遅れたため、(3)と評価した。ただし、非ニュートン液体二相流の研究成果についてはIF付きの国際誌に掲載された。壁面の濡れ性の程度を変えた流路、濡れ性を局所的に変えた壁面を持つ流路を製作して、実験を行う。さらに、流路寸法をさらにダウンサイジングさせて流路を製作して実験を行う。そして、これらの実験から得られた成果をもとに液の混合への濡れのパターンや寸法効果の影響を総合的に明らかにする。流体工学壁面の濡れ性を変えた流路を数パターン作製し実験を行う。そして、濡れ性が二相流流動特性に及ぼす影響を明らかにしていく。マイクロ流路の製作を行わかなったため。壁面の濡れ性を変えた流路を作製しなかったため。マイクロ流路の製作に充てる。壁面の濡れ性を変えた流路を数パターン作製するのに使用する。研究成果・情報収集のため学会会議の出席するための旅費に使用する。
人工光合成色素蛋白超分子複合体の動作機構の解明

紅色光合成細菌の光合成初期過程における機能発現には,LH2,LH1と言う2つのアンテナと,光反応中心複合体(RC)の3つの色素蛋白複合体が関与している。本研究では,光合成初期過程の機能解明に資する事を目的として,精密有機合成化学技術を駆使して構造を改変した光合成色素カロテノイドを,天然由来のアポ蛋白系に再構築することにより,人工の色素蛋白複合体を創成し,その光機能を調査した。代表的な研究成果として,次に述べる6つを達成した。(1)アナログカロテノイドの大量全合成:天然カロテノイド(スフェロイデン,スピリロキサンチン,およびリコペン)と同一の炭化水素骨格を有するが,ポリエン共役鎖長の異なる一連のアナログ体大量全合成を行った。(2)アナログカロテノイドを再構築した人工RCの創成と単結晶X線構造解析:カロテノイド欠損光合成細菌から調製したRCに,アナログカロテノイドを再構築した人工のRCを創成し,単結晶X線構造解析により原子分解能での構造決定を行った。RCへのカロテノイドの結合様式・方法に関する重要な情報が蓄積できた。(3)LH2アンテナ色素蛋白複合体の電場変調吸収分光:2位相ロックインアンプを用いた,新たな電場変調吸収分光法を確立し,LH2アンテナ複合体に応用した。色素と蛋白の間の静電的相互作用の直接観測に成功した。(4)アナログカロテノイドを再構築した人工RCの電場変調吸収分光:RCに結合したカロテノイドが,他の光合成色素に与える静電場の影響を初めて定量した。(5)カロテノイドのサブ20フェムト秒時間分解吸収分光:時間分解能20フェムト秒を切る超高速レーザー分光法により,カロテノイドの光励起直後の緩和過程の実時間計測を行い,中間励起状態の検出に成功した。本研究成果は,アンテナ色素蛋白複合体におけるカロテノイドの補助集光作用の機構を解明するための本質的な情報を与えた。(6)LH1複合体の再構築とその電場変調吸収分光:単離精製したカロテノイドとカロテノイドを除去したLH1単量体サブユニットとを,自己会合し,人為的にLH1複合体を再構築した。電場変調吸収分光法を適用することで,色素周辺の静電的環境に関する知見を得た。天然カロテノイドの一種であるスフェロイデン(共役C=C結合数10)の共役二重結合数及び共役位置を改変した一連のアナログ体の大量全合成方法を確立し、一連のアナログ体試料の調製を行った。カロテノイド欠損光合成細菌Rb. sphaeroides R26.1株を大量培養し、そこからクロマトフォア膜、つづいて光反応中心複合体(RC)の大量調製を行い、シッティング・ドロップ法により単結晶成長を行った。一方、得られたRCに前述のアナログカロテノイドを再構築した人工光反応中心複合体の大量調製を行い、同様の手法を用いて単結晶成長を行った。作成した単結晶試料のX線構造解析を行い、天然及び人工RCの詳細な構造情報を得た。

カロテノイド周辺の電子密度分布に焦点をあてた場合、人工RCの場合においても天然と同様にアナログカロテノイドが15シス構造を取ってRCに結合すること、カロテノイドの有無でアミノ酸残基(フェニルアラニンM162)の位置がフリップすること、及びカロテノイドに存在するメトキシ基とアミノ酸残基(トリプトファンM75)とが水素結合していることが明らかになった。つまり、カロテノイドがRCに再構築するには一定の方向性が存在し、フェニルアラニンM162はカロテノイドが再構築される際に門番としてのトリプトファンM75は鍵としての役割を果たしている。アナログカロテノイドを再構築した人工RCの電場変調吸収スペクトルの測定を行い、アポ蛋白質にカロテノイド分子が取り込まれた際の光学非線形性の発現に関して調査したところ、トリプトファンM75との水素結合により共役ポリエン部分に電荷の偏りが生じることにより非線形性ふぁ増大することが分かった。これらの事に加え、カロテノイドのアンテナ色素としての機能発現に関して、10フェムト秒を切る超高速レーザー分光を適用することにより、従来から知られている一光子許容な^1B_u^+状態と禁制な2^1A_g^-状態の2つの一重項励起状態の間に別の一重項励起状態が存在し、励起状態の緩和に関与することを実時間で明らかにした。この結果を米科学誌サイエンスに発表した。天然カロテノイドの一種であるスフェロイデン(共役C=C結合数10)の共役二重結合数及び共役位置を改変した一連のアナログ体の大量全合成を行った。カロテノイド欠損光合成細菌Rb. sphaeroides R26.1株を大量培養し、そこからクロマトフォア膜、つづいて光反応中心複合体(RC)の大量調製を行い、シッティング・ドロップ法により単結晶成長を行った。一方、得られたRCに前述のアナログカロテノイドを再構築した人工光反応中心複合体の大量調製を行い、同様の手法を用いて単結晶成長を行った。作成した全ての単結晶試料のX線構造解析を完了した。これらの結果と半嫌気的に培養したRb. sphaeroides 2.4.1株(野生株)のRC(カロテノイドとしてスフェロイデノンを含有)の結果との比較を行った。本研究により、異なる蛋白調製におけるカロテノイドの構造、カロテノイドの結合サイトの特質、カロテノイドが再構成される機構に関する詳細が明らかになった。つまり、カロテノイドがRCに再構築するには一定の方向性が存在し、フェニルアラニンM162はカロテノイドが再構築される際に「門番」としてのトリプトファンM75は「鍵」としての役割を果たしている。これらの結果を取りまとめ、学術雑誌Structurcに論文投稿を行い採択が決定した。さらに、カカロテノイドとアポ蛋白質との静電的相互作用の影響に関して詳細に検討するために、2位相ロックインアンプを用いた電場変調吸収分光を、光合成細菌Rb. sphaeroides G1C株から調製した周辺集光性色素蛋白複合体(LH2複合体)の系に適用した。B850
肝細胞癌転移におけるファシンの役割解明と予後予測バイオマーカーとしての評価検討

【研究目的】病理組織を用いて免疫組織化学的にファシンを検出し、分化度や浸潤度との関連を詳細に検討し、ファシンの検出が肝細胞癌症例の予後を推察するバイオマーカーになるのかを解析する。また、肝癌細胞の遊走・浸潤能に与えるファシンタンパクの機能およびそのメカニズムを分子生物学的手法により解析する。【研究方法】1.ヒト肝癌組織のファシンタンパク発現と肝癌の浸潤度との関連性についての病理学的検討当大学附属病院の過去症例の肝針生検標本および手術摘出肝癌組織を材料として、ファシンタンパクを免疫組織化学法により検出し、その発現と脈管浸潤や転移について病理学的に検討。2.肝癌細胞株のファシン発現とその機能の解析ヒト肝癌細胞株(HLE、HLF、Hep3B、HePG2)の発現を調べ、遺伝子導入により、低発現株には、ファシンの強制発現、高発現株はファシンのノックダウンを行い、細胞増殖、細胞遊走・浸潤能について各アッセイ法を用いて解析する。また、細胞形態をアクチン染色および電子顕微鏡で観察する。3.遺伝子導入肝癌細胞のヌードマウスへの細胞移植実験遺伝子導入肝癌細胞をヌードマウスに移植し、腫瘍形成、転移能および転移様式について検討する。【結果および考察】肝生検材料では、ファシンの発現は限局的で、陽性症例はほとんど認められず、外科材料では、低分化および一部の中分化肝癌に陽性症例が認められ、分化度と陽性率に相関があった。また、ファシン陽性肝癌細胞は、E-cadherinの発現の消失が観察された。低分化・ファシン高発現HLE肝癌細胞株のファシンをノックダウンすると遊走・浸潤能が著明に低下した。一方、ファシンを強発現させた高分化・ファシン低発現株Huh-7の遊走能は亢進したが、浸潤能に著変は見られなかった。そこで、HLEとHuh-7の培養上清をザイモグラフィ法で比較検討したところ、プロナーゼであるMMP-2、9産生の有無が浸潤能に大きく関与している事が判明した。ヌードマウスへの移植実験は、増殖能および遊走能の高いHLE肝癌細胞のを皮下移植を試みたが、生着せず腫瘍形成マウスを作製できなかった。結果をまとめると、肝生検の肝癌部でのファシンの検出は困難であったが、ファシンは遊走能に主要な働きをするとともに、MMPと共同して浸潤能の亢進機能を有することがわかり、予後を推察するマーカーとなりえることが示唆された。
腫瘍内投与活性化樹状細胞の抗腫瘍効果と腫瘍内微小環境改変機構の解明

固形腫瘍に対する細胞性免疫療法(腫瘍抗原特異的T細胞を活性化あるいは移入する治療法)は、長期間続く腫瘍特異的メモリー免疫応答を誘導し、現在の手術療法、化学、放射線療法などの治療法との併用で、腫瘍の根絶が期待できる治療法であると考えられるが、その確固たる治療効果(実地の臨床試験でも報告されているように腫瘍抗原特異的T細胞応答が体内で誘導されても、腫瘍の縮小効果が必ずしも認められない)が得られていないため、悪性腫瘍の標準的治療への取り入れは未だ実現していない。強力な腫瘍特異的免疫応答を惹起し抗腫瘍効果を発揮する活性化樹状細胞腫瘍内投与療法(ITADT)における免疫学的機序解明並びに腫瘍内微小環境、特に腫瘍内樹状細胞と腫瘍内線維芽細胞に着目し、宿主免疫応答と腫瘍の免疫応答制御システムの交互作用解明を目的として、以下の点について明らかにした。1.血球系を野生型に置換したリンパ節欠損マウス(NIK^<aly/aly>)を用いたマウス悪性黒色腫皮下接種治療実験にて、ITADTの抗腫瘍効果はリンパ節に完全に依存すること、腫瘍再接種時の拒絶応答は脾臓に存在するメモリーT細胞ではなく、所属リンパ節に存在するメモリーT細胞が重要であることを見出し、腫瘍免疫療法における所属リンパ節の重要性が免疫応答の誘導期のみならず、メモリー応答時にも重要であることを見出した。本研究結果は、現在臨床で施行ざれている腫瘍免疫療法の所属リンパ節の重要性を立証する成果であり、有効な抗腫瘍効果の実現のために、腫瘍が存在する所属リンパ節を標的とすることが重要であることを示唆するものである。2.ITADTの樹状細胞のソース拡大を目的とし、大腸癌株及び悪性黒色腫株を用いたマウスモデルにおいて、MHCが完全に異なるfully allogenic DC及び半分が一致するsemiallogenicDCを用いた研究から、前者は抗腫瘍効果牽惹起できないが、後者は抗腫瘍効果を惹起できること、また、機能的Fas欠損マウス由来のDCに至っては、前者でも同系のマウスと同等の抗腫瘍効果を発揮できることを見出した。本知見は、特に汎血球減少症及び小児の坦癌患者に対するDCのソース拡大が可能であることを示唆するとともに、腫瘍内樹状細胞カミ所属リンパ節での適応免疫活性化における抗原提示細胞として重要であることを示唆するものである。3.CT26大腸癌モデルを用いた解析により、ITADTにより、腫瘍内へ宿主由来の樹状細胞並びにIFN-gamma陽性のT細胞の動員、それと伴に投与樹状細胞周囲の腫瘍並びに線維芽細胞にIP-10の発現を高度に誘導し、T細胞依存性の血管新生抑制が惹起されることを見出した。強力な腫瘍特異的免疫応答を惹起し抗腫瘍効果を発揮する活性化樹状細胞腫瘍内投与療法(ITADT)における免疫学的機序解明並びに腫瘍内微小環境に着目した宿主免疫応答と腫瘍免疫応答制御システムの交互作用解明を目的として、以下の点にっいて明らかにした。1.ITADTの機序として以下のことが明らかとなった。1)抗腫瘍効果には、リンパ節の存在が不可欠で、腫瘍抗原特異的T細胞応答のプライミングの場として重要。2)プライミングに必要な抗原提示細胞は、投与樹状細胞だけでなく、腫瘍内に存在する未熟樹状細胞(腫瘍内樹状細胞:Tumor associated DC)と思われる細胞も機能。3)投与樹状細胞は腫瘍抗原特異的T細胞の腫瘍内での再活性化に重要な機能を担う。よって、通常の樹状細胞療法より、多くの抗原特異的T細胞の活性化と局所のIFN-γの産生増強を惹起することが可能。3.ITADTにより、腫瘍内へ宿主由来の樹状細胞並びにIFN-γ陽性のT細胞の動員、それと伴に投与樹状細胞周囲の腫瘍並びに線維芽細胞様細胞にIP-10の発現を高度に誘導し、T細胞依存性の血管新生掬制を惹起。以上、ITADTは、樹状細胞の分化、成熟化に障害のある固形腫瘍微小環境における成熟化樹状細胞の供給療法として、腫瘍抗原特異的T細胞活性化と浸潤Tリンパ球の局所機能充進を惹起する治療法である。ITADTでは、局所のIFN-Y濃度の上昇並びに、腫瘍及び線維芽細胞様細胞のIP-10発現充進が惹起され、それが更なるT細胞遊走を促進するという微小環境構成細胞のTh-1タイプのポジティブフィードバック機構による交互作用によって優れた抗腫瘍効果を惹起する。
ハイブリッド型人工軟骨材料の開発及び評価

軟骨細胞を有する人工軟骨材料の開発を行い,摩擦特性について調査した.人工軟骨材料にはポリビニルアルコール(PVA)ハイドロゲルを用い,その表面に軟骨細胞を播種した後に培養してPVAハイドロゲルの表面に細胞外マトリックスを有するハイブリッド型人工軟骨を開発した.ハイブリッド型人工軟骨は培養日数に伴い摩擦係数が低下することを示し,細胞外マトリックスを有するハイブリッド型人工軟骨材料の開発が可能であることを示した.軟骨細胞を有する人工軟骨材料の開発を行い,摩擦特性について調査した.人工軟骨材料にはポリビニルアルコール(PVA)ハイドロゲルを用い,その表面に軟骨細胞を播種した後に培養してPVAハイドロゲルの表面に細胞外マトリックスを有するハイブリッド型人工軟骨を開発した.ハイブリッド型人工軟骨は培養日数に伴い摩擦係数が低下することを示し,細胞外マトリックスを有するハイブリッド型人工軟骨材料の開発が可能であることを示した.軟骨細胞から産生される細胞外基質をPVAハイドロゲル表面へ産生させることを目指し,第一段階として軟骨細胞をPVAハイドロゲル上へ接着するための方法を検討した.PVAハイドロゲルのみの表面では軟骨細胞の接着が難しいことがしられている.そこで各種蛋白質吸着膜をPVAハイドロゲル上へ形成し,軟骨細胞の接着挙動について評価した.ハイドロゲルへのマクロファージの接着量は表面の官能基により変化するという報告がある(K.Smetana, Biomaterials, 1993).PVAハイドロゲルの表面には, PVAの分子構造から考えると水酸基が露出していると考えられ,細胞接着は難しいことが十分に予想された.初期に行った研究代表者の予備試験においても軟骨細胞の接着は確認されなかった.PVAハイドロゲルを蛋白質溶液に浸して蛋白質の静的吸着によりPVAハイドロゲル表面へ蛋白質吸着膜を形成し,その上に軟骨細胞を播種したが,軟骨細胞の接着は確認されなかった.静的吸着では十分な蛋白質吸着膜が形成されなかったと考えられた.そこで,反復凍結法にてPVAハイドロゲルを作製する際に蛋白質溶液を表面のみに滴下して凍結・解凍することにより蛋白質をPVAハイドロゲル表面近傍に含ませることに成功した.そのPVAハイドロゲルに軟骨細胞を播種すると軟骨細胞の接着が観察され,コラーゲンの産生もみられたPVAハイドロゲルの低摩耗化には蛋白質吸着膜が重要であるため,軟骨細胞から産生された組織の潤滑特性とともに潤滑性に優れる蛋白質吸着膜の摩擦特性の長所を併せ持つPVAハイドロゲル表面を開発するために,蛋白質吸着膜の構造と詳細な検討を行った.2種の蛋白質を層状に吸着させることで摩擦が低減することを明らかにした.人工軟骨候補材料のポリビニルアルコール(PVA)ハイドロゲル上へ軟骨細胞を播種し細胞外基質を産生させたハイブリッド型人工軟骨の開発を行った.生体関節軟骨は軟骨細胞から産生されたコラーゲン線維から形成され,その表面にはゲル膜や蛋白質・脂質の吸着膜で覆われており,このような構造が長期にわたる低摩擦低摩耗を実現していると考えられる.そこで本研究では軟骨細胞と同様な表面構造を有するハイブリッド型人工関節の開発を行った.PVAハイドロゲルへ軟骨細胞を接着させるために各種蛋白質吸着膜を形成し,それぞれの蛋白質吸着膜上への軟骨細胞接着数の評価を行った.その結果,本研究で新しく開発した蛋白質凍結コーティング法によりフィブリノーゲンの吸着膜厚さが500μm程度になり,接着細胞数が生体関節軟骨と同等のレベルへ達することが明らかとなった.また,蛋白質吸着膜へ接着した軟骨細胞は脱分化していないため,生体関節軟骨細胞外基質のII型コラーゲンを多く産生する可能性を示した.培養により作製したハイブリッド型人工軟骨の摩擦試験を行い,その摩擦挙動について調査した.その結果,フィブリノーゲン吸着膜では摩擦の低減は見られないが,軟骨細胞を播種し14日間培養して細胞外基質を産生させた試料では摩擦の低減がみられた.しかし,摩擦試験途中で摩擦係数の急激な増加が見られる場合もあり,細胞外基質とPVAハイドロゲルの接着性を高める必要があることが明らかとなった.
fNIRSを用いたADHD治療薬無効例の病態メカニズムの解明

注意欠如・多動障害(ADHD)治療薬の塩酸メチルフェニデート徐放剤(MPH)内服歴のないADHD児に関して、自閉症スペクトラム(ASD)の併存の有無別に、MPHの効果を近赤外線光トポグラフィー(fNIRS)を用いた無作為二重盲検試験を抑制機能課題で行った。右前頭前野で、ASD併存なし群では、MPH内服前には活動がなかったが、内服後に見られた。ASD併存あり群では、内服前に有意傾向の活動があったが、内服後にはなかった。行動評価では、MPH内服前、内服1ヵ月後の比較で両群とも有意に改善があった。MPH有効例でASD併存の有無により病態が異なることが示唆された。今後はMPH無効例において検証を行う。本研究では、注意欠如・多動障害(ADHD)児の診断とADHD治療薬の有効・無効例を判別する事を目的の1つとしている。我々は、先行研究で、機能的近赤外線分光法(functional near-infrared spectroscopy; fNIRS)を用いて、抑制機能課題中の健常児は右前頭前野に活性があり、ADHD児は活性がないことを集団レベルで報告した1,2)。そこで2015年度は、健常児30名、ADHD児30名を対象に、個人レベルでの解析を行い、抑制機能課題中のfNIRS計測で、ADHDのスクリーニングが感度90%、特異度70%で判定可能であることを報告した3)。このことから、fNIRSを用いた我々の解析系が、ADHDの客観的診断の判定法に有用であることが示唆された。ADHD治療薬の有効・無効例を判別する事を目的に、ADHD治療薬内服の既往がないADHD児を対象に、ADHD治療薬である塩酸メチルフェニデート徐放剤(MPH)内服前後の抑制機能課題中のfNIRS計測による脳活性の変化量と質問紙によるMPH初回内服から内服1ヵ月後の行動の変化率の関連性の程度を個人レベルで評価した。16例の解析結果では、両者には中程度の負の相関が見られることが判明した。現在、50例ほどの計測が終了している。今後、対象者の内服1か月後および半年後の行動変化率とMPH内服前後の脳活性の変化量の関連性を解析し、報告予定である。また、リクルートもさらに進んでおり、大規模前向き臨床試験の実施が可能である。注意欠如・多動障害(ADHD)は、不注意、多動性、衝動性の中核症状により、家庭や学校において問題行動を引き起こし、度々の叱咤、いじめなどの困難な生育環境にさらされ、二次障害として行為障害、抑うつなどを合併する。二次障害を防ぐためにも、早期診断・早期治療が必要である。ADHD治療薬である塩酸メチルフェニデート徐放剤(MPH)は30%のADHD児に効果がないことが分かっている。しかし、行動観察で評価している現在は1か月以上内服しないと効果が判定できず、無効例の病態メカニズムは不明である。本研究では、脳機能イメージングを使用して、ADHD児の診断とADHD治療薬の有効・無効例を短期的に判別する事、MPHの有効例と無効例の病態メカニズムの差異を明らかにする事を目的としている。2016年度は、ADHD治療薬内服の既往がないADHD児を対象に、MPH内服前後の抑制機能課題中の機能的近赤外線分光法(functional near-infrared spectroscopy; fNIRS)計測による脳活性の変化量とMPH内服初回、1か月後、6か月後の質問紙による行動の変化率について計測を行った。MPH初回内服時の脳活性の変化量とMPH初回内服から内服1か月後の行動の変化率の関連性は、現時点で中程度の負の相関が見られている。2017年度中に、MPH初回内服時の脳活性の変化量とMPH内服6か月後の行動変化率との関連性、およびfNIRS計測でのMPH有効例と無効例の脳機能変化の違いを検証し、学会発表および査読付き学術誌への投稿を予定している。MPH初回内服前後の抑制機能課題中のfNIRS計測による脳活性の変化量と質問紙評価は70例ほど、内服1か月後の評価については45例ほど、6か月後の評価については15例ほど計測が終了している。リクルートもさらに進んでおり、6か月後の評価例も増加するため、解析および検証が可能である。注意欠如・多動障害(ADHD)は、中核症状である不注意、多動性、衝動性により、家庭や学校で問題行動を引き起こし、度々の叱咤、いじめなどの困難な生育環境にさらされ、行為障害、抑うつなどの二次障害を合併する。我々は、脳機能イメージングである近赤外線光トポグラフィー(fNIRS)を使用して、ADHD治療薬の有効・無効例を短期的に判別する事、MPHの有効例と無効例の病態メカニズムの差異を明らかにする事を目的として、研究を行った。ADHDは自閉症スペクトラム(ASD)と2080%の確率で併存する。

ASDは社会的コミュニケーションの苦手さ、常同行動、興味の範囲が限られるなどの症状を持つ。MPHの効果がASDを併存したADHDの方が低いと薬理学的研究で報告された。我々はこの点に着目し、ADHD治療薬内服歴のないADHD児に関して、ASDの併存の有無別に、MPHの効果を抑制機能課題施行中のfNIRS計測で無作為二重盲検試験を行った。右前頭前野において、ASD併存なしのADHD群ではMPH内服前には活動がなく、内服後に活動が見られた。ASD併存ありのADHD群では、内服前に有意傾向の活動がみられたが、内服後には活動がなかった。行動評価では、MPH内服前、内服1ヵ月後の比較で両群とも有意に改善がみられた。MPH有効例において、ASDの併存の有無により病態が異なることが示唆された。今後は、MPH無効例において、検証を行う予定である。注意欠如・多動障害(ADHD)治療薬の塩酸メチルフェニデート徐放剤(MPH)内服歴のないADHD児に関して、自閉症スペクトラム(ASD)の併存の有無別に、MPHの効果を近赤外線光トポグラフィー(fNIRS)を用いた無作為二重盲検試験を抑制機能課題で行った。右前頭前野で、ASD併存なし群では、MPH内服前には活動がなかったが、内服後に見られた。ASD併存あり群では、内服前に有意傾向の活動があったが、内服後にはなかった。行動評価では、MPH内服前、内服1ヵ月後の比較で両群とも有意に改善があった。MPH有効例でASD併存の有無により病態が異なることが示唆された。今後はMPH無効例において検証を行う。本研究の目的は、fNIRSを用いて、モノアミンアゴニストであるADHDの治療薬の無効例がモノアミンネットワークの機能不全に基づくのか否かを検証し、ADHDの治療反応性からみる、新しいADHD疾患分類を作成することである。また、fNIRS脳機能画像診断を用いた治療予後判定因子の確立を目指す。2016年度は、引き続き治療有効・無効例を判別する大規模前向き臨床試験を進める。その後、治療薬無効例に関与する脳機能学的特異性の抽出として、複数の認知課題を用いて、fNIRS脳機能画像検査と脳波検査を実施し、ADHD治療薬無効例の病態メカニズムを表す特徴的脳活動を探索する。本研究はMPH初回内服から6か月後までの縦断研究である。2017年7月までリクルートを行い、対象者を増加する。現時点までの計測結果を基に、1fNIRS計測による脳活性の変化量と行動の変化率の関連性について、2有効例と無効例のfNIRS計測での脳機能変化の差異について、適宜解析、学会発表を行う。対象者すべてが内服6か月後を迎える2018年1月から最終的な解析を行い、本研究に関する検証結果を査読付き学術誌へ投稿し、周知を目指している。発達神経学2015年度よりも2016年度の方が計測人数、解析量が増加する。このため、ポストドクターの雇用を2016年度から予定している。また、研究成果発表のため、国内外の発表、論文作成の機会が増加する。そのために、次年度への繰り越しが必要と判断した。次年度は計測人数、解析量がさらに増加するため、協力研究者を引き続き確保する予定である。また、研究成果発表、論文投稿掲載の機会が増加する。これらのことから、次年度への繰り越しが必要と判断した。実験に際して、被験者への刺激提示に必要な消耗品や、fNIRS関連機材(光プローブ、ホルダー等)の修理、NIRS画像処理ソフトウェア、統計ソフト、大容量データのバックアップのための記録メディアの購入に60万円程度を予定している。ポストドクターの人件費として、年間80万円程度を予定している。
c-Mycとその結合タンパク質による細胞周期調節機構と細胞癌化

1.MM-1 c-Mycの転写活性化/抑制化ドメインに結合し、c-Myc転写能を抑制する新規タンパク質MM-1は、白血病,リンパ腫、舌癌由来の培養癌細胞、癌患者組織においては157番目のアラニンがアルギニンに高頻度で変異しており、MM-1によるc-Mycの転写,癌化,細胞増殖能の抑制がこの変異により解除されることから、MM-1は新規癌抑制遺伝子と考えられる.更にもMM-1は転写コリプレッサーTIF1βと結合を介しhistonedeacetylase(HDAC)をc-Mycにリクルートする新規c-Myc転写抑制経路を形成した.このMM-1-TIF1βの解除細胞は高いc-Myc転写能と癌化能を有していた.また,MM-1はユビキチンを介さないc-Myc分解を促進し、MM-1アルギニン変異は分解促進機能を失っていた.更に,MM-1はヒト染色体12番由来のスプライシングの違いによるMM-1α,β,δ,γとN末13アミノ酸が14番染色体由来の融合MM-1が存在し,細胞内の局在が異なっていた.以上より,MM-1はc-Mycの転写抑制と分解の両面を司る因子であることが明らかとなった.2.AMY-1 AMY-1は細胞骨格重合促進因子WAVEと結合し細胞骨格制御に、また、A-kinaseタンパク質であるAKAP84と結合することで精子形成に関与する重要な因子であることが明らかとなった.3.MSSPMSSPはc-Mycと協調して転写、複製、癌化、アポトーシス誘導などを行なうが,MSSP欠損マウスは胎生致死を示し発生過程での重要性が明らかとなった.1.MM-1 c-Mycの転写活性化/抑制化ドメインに結合し、c-Myc転写能を抑制する新規タンパク質MM-1は、白血病,リンパ腫、舌癌由来の培養癌細胞、癌患者組織においては157番目のアラニンがアルギニンに高頻度で変異しており、MM-1によるc-Mycの転写,癌化,細胞増殖能の抑制がこの変異により解除されることから、MM-1は新規癌抑制遺伝子と考えられる.更にもMM-1は転写コリプレッサーTIF1βと結合を介しhistonedeacetylase(HDAC)をc-Mycにリクルートする新規c-Myc転写抑制経路を形成した.このMM-1-TIF1βの解除細胞は高いc-Myc転写能と癌化能を有していた.また,MM-1はユビキチンを介さないc-Myc分解を促進し、MM-1アルギニン変異は分解促進機能を失っていた.更に,MM-1はヒト染色体12番由来のスプライシングの違いによるMM-1α,β,δ,γとN末13アミノ酸が14番染色体由来の融合MM-1が存在し,細胞内の局在が異なっていた.以上より,MM-1はc-Mycの転写抑制と分解の両面を司る因子であることが明らかとなった.2.AMY-1 AMY-1は細胞骨格重合促進因子WAVEと結合し細胞骨格制御に、また、A-kinaseタンパク質であるAKAP84と結合することで精子形成に関与する重要な因子であることが明らかとなった.3.MSSPMSSPはc-Mycと協調して転写、複製、癌化、アポトーシス誘導などを行なうが,MSSP欠損マウスは胎生致死を示し発生過程での重要性が明らかとなった.A.癌抑制遺伝子機能を有するc-Myc結合タンパク質MM-1の機能解析c-Mycの転写活性化領域に結合し,転写抑制するタンパク質としてcDNAクローニングしたMM-1(Mori et al.,JBC,1988)は全長163アミノ酸を有する.リンパ腫,白血病,扁平上皮癌由来の培養細胞,癌患者由来のMM-1は157番目のアミノ酸が,癌細胞由来のMM-1の33%でAla→Thr,Argに変異していた.正常MM-1によるc-MycのRasとの協調的細胞癌化,細胞増殖能の抑制を,この変異MM-1は解除することから,MM-1はtumor suppressorの可能性が示唆された.更に,MM-1結合タンパク質として転写co-repressorであるTIF1βが同定された.MM-1-TIF1β複合体にはc-Mycに加え,HDAC1,mSin3が含まれており,MM-1のc-Mycの転写能抑制はHDAC1阻害剤であるTSAにより阻害された.また,TIF1βのMM-1結合領域のみはdominat negative体として作用し,MM-1のc-Mycの転写能抑制が解除されるばかりでなく,数十倍ものc-Mycの転写活性を示した.このことから,MM-1はc-MycとHDAC転写co-repressorを介在する因子であることが明らかとなった.次に,MM-1結合タンパク質としてユビキチン分解系のタンパク質であるelongin B,proteasome subuinitsが同定され,c-MycはMM-1導入により分解され,アルギニン変異体はその活性が低下していた.

さらに,c-Mycのユビキチン化に必要とされる58番目のスレオニンの変異体,及びMyc boxI欠損c-MycもMM-1により分解され,c-Mycのユビキチン化がMM-1により抑制されることより,MM-1はc-Mycのユビキチン非依存性分解系を活性化している可能性が考えられた.B.c-Myc結合タンパク質AMY-1の機能解析AMY-1結合タンパク質としては精子形成時に重要な機能を有するA-kinase Anchor protein 84(AKAP-84)がクローニングされ,AMY-1はAKAP-84と精子のミトコンドリアに局在した.更にAMY-1はアクチン重合に関与するWAVEに結合し,アクチン重合の場を変化させた.c-Mycの転写活性化/抑制化ドメインに結合し,c-Myc転写能を抑制する新規タンパク質MM-1は,白血病,リンパ腫,舌癌由来の培養癌細胞,癌患者組織においては157番目のアラニンがアルギニンに高頻度で変異しており,MM-1によるc-Mycの転写,癌化,細胞増殖能の抑制がこの変異により解除されることから、MM-1は新規癌抑制遺伝子と考えられる.更に、MM-1は転写コリプレッサーTIF1βと結合を介しhistonedeacetylase (HDAC)をc-Mycにリクルートする新規c-Myc転写抑制経路を形成した.このMM-1-TIF1βの解除細胞は高いc-Myc転写能と癌化能を有していた.また,MM-1はユビキチンを介さないc-Myc分解を促進し、MM-1アルギニン変異は分解促進機能を失っていた.更に,MM-1はヒト染色体12番由来のスプライシングの違いによるMM-1α,β,δ,γとN末13アミノ酸が14番染色体由来の融合MM-1が存在し,細胞内の局在が異なっていた.以上より、MM-1はc-Mycの転写抑制と分解の両面を司る因子であることが明らかとなった.AMY-1は細胞骨格重合促進因子WAVEと結合し細胞骨格制御に、また、A-kinaseアンカータンパク質であるAKAP84と結合することで精子形成に関与する重要な因子であることが明らかとなった.MSSPはc-Mycと協調して転写、複製、癌化、アポトーシス誘導などを行うが,MSSP欠損マウスは胎生致死を示し、発生過程での重要性が明らかとなった
錯体水素化物でのリチウム超イオン伝導-その機構解明と新材料創製

リチウム超(高速)イオン伝導特性を示すLiBH_4をベースとした水素化物群の合成やその伝導機構の解明、そして関連する新たな水素化物群の創製などを目的とした研究を進めている。今年度、[BH_4]-錯イオンに加えて、[NH_2]-錯イオンや[AlH_4]-錯イオンを含む新たな水素化物群を合成し、結晶構造・格子振動・融解などの諸特性やイオン伝導率の温度依存性などを系統的に評価したところ、以下の結果が得られた。(1)[NH_2]-錯イオンから形成されるLiNH_2の場合、それ自体のイオン伝導度は室温で10^<-9>/cmと低い(LiIも同様の低い伝導度を示す)が、I^-を用いて[NH_2]-錯イオンを部分的に置換することで特徴的な層状構造を有する新しい錯体水素化物Li_3(NH_2)_2Iが生成し、さらにそのイオン伝導特性を評価したところ出発原料であるLiNH_2やLiIより4桁も高い値(室温で10^<-5>S/cm)を示すことが明らかとなった。この特徴的な層状構造は、ラーベス相構造を示す金属水素化物との類似性も強く、錯体水素化物と金属水素化物を繋ぐ新たな水素化物の最初の合成例としての学術意的な意味も大きい。(2)[AlH_4]-錯イオンや[AlH_6]^<3->錯イオンから構成されるLiAlH_4やLi_3AlH_6などの錯体水素化物でも高いイオン伝導度を示すことが明らかとなった。これらの知見は、[BH_4]^-や[NH_2]^-、[AlH_4]^-や[AlH_6]^<3->などに加えて、[NiH_4]^<4->、[CoH_5]^<4->、[MnH_6]^<5->などの錯イオンも含めた多様な錯体水素化物群を次世代リチウムイオン電池電解質として機能化する上、さらにリチウムイオン伝導と水素の(または水素を含む錯イオンの)ダイナミクスとの相関を解明する上で、極めて重要である。今年度、[BH_4]^-錯イオンの部分置換によってLiBH_4をベースとした水素化物群を合成し、構造相転移温度(=超イオン伝導発現温度)・融解などの熱的特性やイオン伝導率の温度依存性などを系接的に評価したところ、以下の結果が得られた。(1)[BH_4]^-錯イオンをCl^-やI^-などのハロゲンイオンで部分置換することにより、構造相転移温度が低下するとともに室温でのイオン伝導度が101000倍増大した。粉末X線回折・示差走査熱量分析・第一原理計算などを用いた評価・解析の結果、特にI^-での部分置換により室温でも超イオン伝導相が安定化することが判明した。またこの安定化の起源が[BH_4]^-間距離の増大と密接に関連することも見出された。(2)[BH_4]^-錯イオンを他の錯イオン(例えば[NH_2]^-錯イオン)で置換した効果を評価した結果、Li_2(BH_4)(NH_2)およびLi_4(BH_4)(NH_2)_3では室温で顕著なイオン伝導度の向上が確認できた。さらに、Li_2(BH_4)(NH_2)を融点(365K)以上に加熱することでそのイオン伝導度は6×10^<-2>S/cmにまで上昇した。このイオン伝導度は、通常のリチウムイオン二次電池用の有機溶媒系電解液と同等またはそれ以上の値であり、LiBH_4をベースとした水素化物群を次世代リチウムイオン電池電解質として機能化する上での極めて重要な特性であると考えている。

これらの知見は、[BH_4]^-や[NH_2]^-、[AlH_4]^-や[AlH_6]^<3->などに加えて、[NiH_4]^<4->、[CoH_5]^<4->、[MnH_6]^<5->などの錯イオンも含めた多様な錯体水素化物群を次世代リチウムイオン電池電解質として機能化する上、さらにリチウムイオン伝導と水素の(または水素を含む錯イオンの)ダイナミクスとの相関を解明する上で、極めて重要である。
「異種自己抗原」に対する免疫応答を惹起したマウスモデルの構築

シアル酸は細胞の一番外側を占める糖であるが、このシアル酸の分子種がヒトと動物で異なる。このため、ヒトはN-グリコリルノイラミン酸という動物型のシアル酸に対して、異種抗原として免疫応答する。ところが、ヒトはN-グリコリルノイラミン酸があると、これを自己抗原として発現する。そこで、ヒトでは異種自己抗原免疫応答をおこすが、本研究ではこの慢性免疫状態をマウスモデルモデルで達成するための基盤となる知見を得た。マウスは非常に便利なモデル実験動物として幅広く使用されているが、病態モデル動物として考えると、必ずしもヒトの病態進行を模倣しておらず、ヒト病態を模倣できるモデル動物の開発はヒト医学研究でのボトルネックとなっている。本研究の研究目的は、マウスにおいてヒトに特徴的な、さらに言うと、ヒトにしか起こりえない特殊な自己免疫状態である、N-グリコリルノイラミン酸(Neu5Gc)に対する異種自己抗原応答状態を簡便に引き起こし、ヒトの動物実験モデルとして樹立することである。哺乳動物での主要なシアル酸分子種はC5位のアミノ基の修飾により、N-アセチルノイラミン酸(Neu5Ac)とNeu5Gcがあげられる。このため、研究計画として、ヒトと同様のNeu5Gc生合成酵素Cmah遺伝子欠損を起こしたマウスを用い、このCmah欠損マウス血管内皮細胞にヒトにとって異種シアル酸分子種であるNeu5Gcを発現させることが含まれる。また、Neu5Gcに対する免疫応答をマウス個体で惹起することで、これに対する抗体を作成し、マウスに投与することを考えているが、抗Neu5Gcを誘導する条件について検討することから始めた。シアル酸発現に関しては、ある特定の化合物を処理することで、目的の分子種のシアル酸を動脈血管特異的に発現誘導できることが明らかとなった。また、抗シアル酸分子種抗体の樹立に関しては、マウスにとっての異種細胞にNeu5Gcを強制発現させた細胞を免疫源に用いることで、目的のエピトープを持つと考えられる抗体産生を誘導できることを明らかにした。上述のようにマウスを含む哺乳動物での主要なシアル酸分子種はC5位のアミノ基の修飾により、Neu5AcとNeu5Gcがある。ヒトでは種特異的に上述のCmah遺伝子欠損しており、生合成経路上での前駆体となるNeu5Acしか持たないが、一方で、Neu5Gcを含む動物肉などを摂取しており異種抗原を自己抗原として発現する。ヒト免疫系はNeu5Gcを非自己の異種抗原として捉えるため、これに対する抗体応答を引き起こす。このコンビネーションで、ヒトでは、Neu5Gcに対して、異種自己抗原免疫応答が起こり、これによる慢性炎症が様々な疾患を改悪する。しかしながら、マウスを動物モデルとして使用すると、Neu5Gcは自己抗原であり、当然、これに対する応答も引き起こしていないため、ヒト医学に役に立つ動物モデル系とはいえない。本研究では、マウスにおいてヒトに特徴的な異種自己抗原応答状態を簡便に引き起こし、ヒトの病態動物モデルとして樹立することである。このためには、Neu5Gcを発現しないマウスに対して、人為的にNeu5Gcを発現させると言う点と、Neu5Gcに対して免疫応答を惹起すると言う2点をクリアしていかないといけない。これまでの研究の進捗により、Cmah欠損マウスに対して、化合物処理することで、血管内皮細胞に対してNeu5Gc発現を誘導出来ることを明らかにした。一方、シアル酸トランスポーターを介して、Neu5Gcを直接入れる方法に関しては、モデル細胞として、トランスポーター遺伝子を改変してヒト細胞に導入することで、シアル酸トランスポーターを形質膜に発現する細胞の樹立に成功した。また、抗Neu5Gc抗体応答についても、マウスにとって異種となる細胞株にCmah発現によりNeu5Gcを誘導した細胞を免疫源として免疫することで、比較的良好な抗Neu5Gc抗体産生を誘導できた。生化学上述のように、本研究ではマウスモデルを用いてヒトに特徴的な異種自己抗原応答状態を引き起こしたい。時間軸で考えると、ヒトでは、長い年月を経て、この状態に達することが考えられるが、一方でマウスの寿命は短く、また、実験モデルとしても、この状態を速やかに作り上げられないと、有効なモデルとしての意味をなさない。そこで、ヒトで特徴的な上記2点の状態を速やかにつくり出すことが重要となる。そこで、今後は、上記の化合物処理の条件を最適化する必要があるため、どのような週齢のマウスにどの程度の量の化合物処理を行うのがいいかなど、条件検討を進めていく。また、免疫応答状態を引き起こすためには、動物を免疫することが妥当ではあるが、この応答には個体差が生じやすい。そこで、これまで分かった免疫の条件を利用して、Cmah欠損マウスから抗Neu5Gc単クローン抗体を作成し、できた単クローン抗体をマウスに導入することで、炎症状態を引き起こすことで、再現性の良い慢性炎症状態を作ることが出来ると考える。このため、単クローン抗体樹立を急ぐ。単クローン抗体作成に用いるミエローマ細胞については、通常非常に高いNeu5Gc発現が見られるため、Neu5Gc不全

ミエローマ細胞を作成し、これと免疫動物のB細胞とを細胞融合させることで、反応性のよい単クローン抗体が作成出来ると考えており、これに取りかかる。さらに、自己免疫状態が引き起こすことが出来れば、これまで知られる疾患も出ると組み合わせて、マウスではなかなかヒトと近い病態引き起こせないもでるで、ヒト様の病態が引き起こされるかどうかの検証を行う。Neu5Gc発現におけるトランスポーター利用の系は、バックアッププランであるが、変異型形質膜局在トランスポーターのNeu5Gc取り込み活性を検証すると共に、血管新生時のシアル酸輸送能との関連も調べる。マウス飼育費用を多めに考えていたが、大学の施設が当初予想より使用でき、次年度での試薬購入などの費用に回した方が、費用対効果が優れると予想されたため。物品費として使用する。具体的には研究試薬・消耗品購入に使用する。