hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
呼気相での換気補助が可能な人工呼吸法の開発

人工呼吸法は広く普及しているが人工呼吸で用いられる気管チューブ、人工鼻、呼吸回路、また人工呼吸器そのものにも気道抵抗が存在する。人工呼吸器は吸気相では吸気陽圧によって呼吸仕事量を軽減し呼吸を補助できたが、呼気相に関しては顧みられてこなかった。集中治療部に入室し気管挿管下で人工呼吸を受けた患者において呼気相に患者に負荷される呼吸仕事量を測定し、呼気補助システムの必要性を示した。とくに呼吸不全患者では呼気相の呼吸に要する仕事量が大きく呼吸補助システムが必要であった。次に人工呼吸器の呼吸回路に接続した電磁弁と呼気相に駆動するピストンシリンジを用いて呼気補助して呼吸仕事量を軽減するシステムを開発した。前年度までに計測、記録した集中治療で人工呼吸受けた患者での人工呼吸中の気道内圧と流量波形データを元に気管チューブ先端部での患者の気管内圧を連続的に算出し、呼気相に患者に負荷される呼気仕事量を算出した。呼気仕事量は今までほとんど測定されておらず、実際の患者データに基づくものでは我々の研究がほとんど唯一のものである。呼気相の仕事量を気管チューブサイズと人工呼吸モード別に分析し、従来考えられてきたよりも、呼気相に負荷される患者の仕事量は大きく、特に必要な換気量が増大している呼吸不全患者においては著明に大きくなっている可能性が示唆された。このことはわれわれが目指す呼気補助の可能な人工換気システムの必要性とその問題点を分析するのに大きく参考になった。この研究結果は米国の呼吸管理専門誌Respiratory Careに投稿し、採択されH24中に掲載予定である。また、同時に人工呼吸器モードの影響をみるために自発呼吸がある患者においてプレッシャーサポート換気モード、オートマチックチューブコンペンセーションモードとプロポーショナルアシスト換気モードにおける相違点の分析研究も行い現在、外国誌に投稿中である。これらの研究結果を踏まえ、人工呼吸器の呼吸器回路に接続する形で呼吸器回路内に設置した電磁弁と呼気相に連動したステッピングモータ駆動のピストンで呼気補助を行うシステムを作成中である。H23年度中にハードウェアシステムの構築はほぼ完成しており、機器計測制御ソフトウェアLabView上でハードウェアをコントロールするソフトウェアを開発、作成中である。集中治療部に入室し、人工呼吸を受けた患者において気管チューブ先端圧の推計と呼気相における患者に負荷される呼吸仕事量を算出する検討を前年度より引き続き行い、本年度は結果発表に必要なデータの計算を行った上、医学雑誌上に論文として発表した。対象は調節、補助換気assist/contorol(A/C)モードの28人、人工呼吸器から離脱を考慮する自発呼吸テストSpontaneous breathing trial(SBT)として用いるContinuous Positive Airway Pressure (CPAP) + Pressure Support Ventilation (PSV)モードの29人を対象とした。気管チューブの太さは内径7もしくは8mm、A/Cモードでの換気条件設定は担当医師の決定にしたがい、SBTではCPAP 5 cmH2O、PSV 5 cmH2Oの換気条件とした。呼気相の呼吸仕事量を負荷するのは気管チューブ、人工鼻Heat moisture exchanger (HME)の3つであり、両モードともに気管チューブサイズが小さいほど、患者の分時換気量が増大するほど、指数関数的に患者に負荷される仕事量が増大した。また、A/Cモードでは不適切な吸気時間の設定が付加呼気仕事量を増大させた。呼吸不全患者では死腔量の増大によって必要となる分時換気量は増大することが多いが、そのような場合には呼気相に患者に負荷される仕事量が大きくなり問題となることが多い。また、内因性PEEPの発生の原因にもなる。上記のように人工呼吸器による呼気補助を考慮する必要性がある。この問題に対し、ステッピングモータで駆動するピストンシリンジを患者呼吸の呼気相に同期して駆動し呼気補助を行うシステム引き続き開発した。人工呼吸器回路への接続は電磁弁によって行い、電磁弁とステッピングモータの駆動はLabView上で作成したソフトウェアで行うシステムとした。本年度において従来の人工呼吸器に接続して呼気補助を行うプロトタイプを作成した。集中治療部に入室し人工呼吸管理を受けた患者32名において調節呼吸中と自発呼吸離脱テスト中に測定した呼吸回路内圧と呼吸流速の波形データを解析した。測定データから気管チューブと人工鼻の気流抵抗値から気管チューブ先端部での気管内圧波形を推定し、それをもちいて気管チューブ、人工鼻と人工呼吸器本体から人工呼吸中の呼吸相に負荷される抵抗値や負荷される呼吸仕事量を算出した。これまで実際の人工呼吸中の患者で気管内圧を評価した報告は非常に少ない。

この解析結果から呼気相においても気管チューブ、人工鼻と人工呼吸器によって患者へ呼吸負荷がかかっており、とくに1分間あたりの換気量が増加した場合に呼吸負荷が大きくなることが判明した。人工呼吸を必要とするような患者においては肺機能の低下と全身酸素消費の亢進によって必要な1分間あたりの換気量が増加していることが知られており、集中治療部に入室するような患者においては人工呼吸管理中の呼気補助法の必要性が示唆された。患者での気管内圧波形データは今後の呼気補助法の開発に役立てる予定である。呼気補助法の開発には人工呼吸回路と呼気補助のための陰圧発生装置との接続を行う回路弁を呼吸サイクルに同調して駆動させるシステムが必要である。患者の呼吸サイクルの測定は呼吸回路内圧と呼吸流速を測定することによって行う。また、陰圧による呼気補助レベルの設定には呼吸回路内圧と呼吸流速のデータをPCに取り込み、気管チューブと人工鼻の抵抗値から気管内圧を推定する方法と先端に圧トランスデューサを持つ細いカテーテルを使用して実際に気管内圧を測定する方法の両者を併用する方法を検討開発中である。回路弁を制御するソフトウェアは開発用ソフトウェアLabViewを用いての作成を進めている。来年度中には呼気補助システムのモデル肺を用いたテストを行う予定としている。人工呼吸中の患者に負荷される呼気仕事量を計算をおこなったが、計算式が複雑なため患者データの解析に時間がかかり、投稿論文の掲載がおくれた。呼気補助システムの構築には患者の呼吸に合わせてステッピングモーターを駆動し、電磁弁を開閉するソフトウェアの開発が必要である。その前段階としてコントロールシステムと機器の接続に種々の問題点が発生したため、それを克服するために時間がとられた。患者のデータの解析から呼気補助の必要性と目標の評価ができた。呼気補助システムの開発もソフトウェアの開発を進めており、来年度中にはテスト肺の実験を行える予定である。これまでの研究結果を踏まえ、人工呼吸器の呼吸器回路に接続する形で呼吸器回路内に設置した電磁弁と呼気相に連動したステッピングモータ駆動のピストンで呼気補助を行うシステムを作成中である。H23年度中にハードウェアシステムの構築はほぼ完成しており、機器計測制御ソフトウェアLabView上でハードウェアをコントロールするソフトウェアを開発、作成中である。H24年度早期にシステム完成させ、モデル肺を用いた実験を行いたい。陰圧による呼気補助レベルの設定には呼吸回路内圧と呼吸流速のデータから気管内圧を推定する方法と先端圧トランスデューサ付細径カテーテルを使用して実際に気管内圧を測定する方法の両者を併用する方法を検討開発中である。LabView上でソフトウェア開発を行くための経費として使用予定である。
芳香族有機銅錯体とビニルオキシランの反応における位置選択性発現機構の研究

有機銅錯体はアルキルハライドやアルキルスルホネートに対して置換反応を行うことが知られている。またエポキシドも置換反応のよい基質となることが報告されている。特に二重結合と共役したエポキシド(以下ビニルオキシランと称す)は有機銅錯体との反応でS_N2型とS_N2′型が競争的に進行することから、位置選択性を支配する要因を明らかにすることが重要な課題となっている。一方、錯体の有機基による反応性あるいは選択性への影響は十分には行われていない。特に有機基が芳香族の場合、その環上の置換基効果が影響するという報告例は全くない。今回申請者はエステル基と隣接したビニルオキシランであるMethyl4,5-epoxy-2-pentenoateと各種芳香族有機銅錯体との反応を行った結果、以下のことが明らかとなった。(1)臭化銅から調整した錯体を用いた場合、BF_3・Et_2Oを添加すると位置選択性の逆転が起こる。すなわち、添加しない場合は4位で優先的に反応するのに対し、添加した場合は2位で優先的に反応する。(2)BF_3・Et_2Oを添加した場合の選択性逆転は、Methyl4-bromo-5-hydroxy-2-pentenoateを経由する二段階機構で反応が進行することに起因する。このことはBF_3・Et_2Oが銅錯体と新たな活性種を形成するのでなく、単独のルイス酸としてエポキシドに配位していることを示唆する。(3)また興味ある芳香環上の置換基効果が見いだされた。両オルト位がメトキシル基あるいはメチル基によって置換されていると、他の芳香族銅錯体よりもはるかに反応性が高く、またBF_3・Et_2Oを添加してもほぼ完全な選択性で4位に反応する。これらの錯体は他の芳香族銅錯体と異なる錯体型ではないかと現在考えている。
ルネサンス教皇の即位儀礼に関する美術史学的研究

本研究では、ローマの教皇宮廷において執り行われたスペクタクル、とりわけ新たに就任した教皇がおこなう、ヴァチカンからラテラノ聖堂へのポッセッソの行列において、どのように美術要素が機能したのかについて解明することを目指した。教皇庁の公式記録、同時代人の日記、書簡ほかの各種記録を収集整理することにより、ポッセッソの際の沿道の装飾、凱旋門をはじめとする各種アッパラート(仮設建造物)やタブロー・ヴィヴァン(活人画)の実態を明らかにした。今年度は、ポッセッソにおけるアッパラートの使用に関する調査研究を中心におこなった。ポッセッソにおいて中心的なアッパラートであったのは仮設凱旋門である。ルネサンス期のポッセッソにおいては、教皇毎に非常に特徴的な凱旋門が建造され、それはそれぞれ立場を異にする諸集団が新教皇との関係を取り結ぶ場でもあった。その様子について、とりわけ図像プログラム解析の観点から研究をおこない、ポッセッソにおける仮設凱旋門の役割を検討した。とりわけ、多くの記録の残るアレクサンデル6世、ユリウス2世、レオ10世等のポッセッソの際の仮設凱旋門について、中心的に取り扱った。次いでポッセッソにおけるタブロー・ヴィヴァン(活人画)の使用に関する調査研究としては、とりわけユリウス2世およびレオ10世のポッセッソの際の事例について調査研究をおこなった。それらは厳密なタブロー・ヴィヴァンとはいえないものではあるが、機械仕掛けのアッパラートにタブロー・ヴィヴァン的な趣向が凝らされたことが明らかとなった。同時に、アルプス以北の君主の入市式でしばしば用いられたページェントのタブロー・ヴィヴァンとの比較検討もおこなった。また近代市民社会におけるポッセッソの構成要素の受容に関する調査研究としては、ポッセッソで用いられた仮設凱旋門やタブロー・ヴィヴァンが、近代以降の市民社会においていかに受容されていったかについての事例の収集につとめた。以上の研究遂行のために、海外調査としてはイタリア、ヴェネツィアのマルチァーナ図書館、フェッラーラのアリオステア図書館、ローマのヴァチカン図書館、ヘルツィアーナ図書館等で資料収集を行い、また日本国内においても、早稲田大学演劇博物館や阪急池田文庫等において、アッパラートの近代日本への伝搬に関する資料の収集につとめた。平成25年度は研究計画に従い、ポッセッソと関連事項との比較研究、すなわち宗教行列、古代ローマの凱旋入城式、世俗君主がローマで執り行った入市式との関係について資料収集および考察をおこなった。ポッセッソは行列と装飾、仮設建造物、演劇的儀礼等からなる複合的なスペクタクルであるが、まずキリスト教の文脈において、聖体行列、イコン行列などの宗教行列との影響関係を調査した。また古代文献に語られ、また遺跡として残存する凱旋門等にも浮き彫り彫刻のかたちで刻まれた古代の凱旋入城式とポッセッソの関係について、とりわけ美術的な側面からの検討をおこなった。ルネサンス期にはカール5世を始め世俗君主がローマで入市式を執り行ったことが記録に残るが、それとの関係についても分析をおこなった。またポッセッソはルネサンス期のみに限られるものではなく、バロック期も引き続き壮麗なポッセッソがとりおこなわれ、近代に至る。今年度はバロック期や近代のポッセッソについても調査を実施し、今後の研究発展への基礎作りとした。ポッセッソ研究の基本文献たるFrancesco Cancellieri, Storia de'solenni possessi de' sommi pontefici(Roma, 1802)を道しるべとし、劇場祝祭の観点からポゼッソに関する情報に富む、Cruciani,Teatro nelRinascimentoRoma 1450-1550, Romaも用いながら、ルネサンス期の教皇のポッセッソについての、テクストと図像双方の一次資料の収集と整理をおこなった。教皇庁の公式の記録はもとより、ポッセッソの式次第の準備・実行に大きな役割を果たした教皇庁式部官ヨハンネス・ブルクハルトの日記、同時代のローマの祝祭・式典についての情報に富むステファノ・デッリンフェッスーラの日記、その他同時代人の書簡などの資料収集をおこなった。ついで、ポッセッソの沿道の装飾に関する調査研究として、15、16世紀当時のローマ地図を利用し、上記の調査結果と照らし合わせ、ポッセッソの行程を確認した。その上で、その沿道の各種装飾とその装飾がなされた場所との関係について、装飾の注文主、装飾形態などから総合的に考察をおこなった。また比較事例として、ヴェネツィア共和国における総督と祝祭の関係についても調査をおこなった。

さらに、近代市民社会におけるポッセッソの構成要素の受容に関する調査研究として、ポッセッソで用いられた仮設凱旋門やタブロー・ヴィヴァンが、近代以降の市民社会においていかに受容されていったかについての事例も収集した。上記研究実績の概要に記したように、当初の研究計画に従い、おおむね順調に研究目的が達成された。ポッセッソにおけるアッパラートおよびタブロー・ヴィヴァン、およびその近代への伝搬について、海外および国内調査の図書館および諸研究機関において調査をおこない、資料収集は予定通りに達成された。またそれら資料の分析にも時間をかけ、成果が上がったと考えている。ただし、それを論文として仕上げ、外部発信するには至らなかったため、これは次年度の課題として残された。上記研究実績の概要に示したように、当初の研究計画に従い、おおむね順調に研究目的が達成された。ポッセッソに関する基本的な資料に基づき、テクストと図像双方の一次資料の収集と整理が進行した。ただし、健康上の理由のため、今年度は当初予定した海外調査をすることが叶わず、資料調査に関しては、国内の図書館や研究機関等に所蔵されるものを中心に行うこととなった。平成25年度の研究計画に従い、ポッセッソと関連事項との比較研究、すなわち古代の凱旋入城式とポッセッソの関係や世俗君主がローマで執り行った入市式とポッセッソの関係についての考察、およびバロック期のポッセッソに関する基礎資料収集を、海外の図書館における調査や国内研究機関の調査等により推進する。当初の研究計画に記載した、ポッセッソにおけるタブロー・ヴィヴァン(活人画)の使用に関する調査研究、ポッセッソと関連事項との比較研究(宗教行列との関わり、古代の凱旋行列との関わり、世俗君主の凱旋入城との関わり、カンピドーリオの劇場(1513)との関係)、バロック以降のポッセッソに関する調査研究、近代市民社会におけるポッセッソ構成要素の受容に関する調査研究等を、海外の図書館における調査や国内研究機関の調査等により推進する。ヨーロッパ主要図書館調査のための外国調査旅費、日本国内の研究機関所蔵の資料を調査するための国内調査旅費、および研究関連の書籍購入のための図書費等を予定している。
糖鎖の分子置換による新規抗ウイルス薬の設計手法の開発

インフルエンザウイルスは感染する初期過程で細胞表面の糖鎖と相互作用する。本課題では糖鎖リガンドをペプチド分子に「置換」し、感染過程を阻害する新しい作用機序を持つインフルエンザの治療薬の分子設計の手法を開発した。糖鎖構造を模倣したペプチド分子は複数の亜型に阻害活性を示した。また化学修飾によって高い阻害活性を示すことが明らかとなった。このように複雑な構造を持つ糖鎖を「置換」する方法論は、迅速な治療薬の開発に貢献できる可能性が示された。インフルエンザウイルスはヘマグルチニン(HA)が受容体糖鎖であるシアル酸含有糖鎖に結合することで感染する。この結合を阻害する分子は感染阻害剤として作用する可能性がある。本課題では糖鎖リガンドをペプチドに分子置換し、既存にはない新しい作用を持つインフルエンザの治療薬の分子設計を行っている。これまでにペプチドライブラリーから単離されたHA結合ペプチドの1つである15残基のペプチドD1の中央7残基目のセリン(Ser)にα-GalNAcを修飾すると、脂質修飾したペプチドと同レベルの高い感染阻害活性があることがわかっている。H22年度ではこの阻害メカニズム解析について検討した。まず、α-GalNAcを修飾したペプチドD1(GalNAc)が阻害活性を有する理由を解明するために、糖の位置および種類を変えた糖ペプチドを化学合成した。GalNAc以外に、GlcやLac(=Gal-Glc)などの糖を含むペプチド、およびビオチン化糖ペプチドをFmoc化学による固相合成で合成した。ペプチド自動合成機(島津製作所)で固相樹脂に順次アミノ酸を連結させ、最後にペプチドを樹脂から切断した。糖アミノ酸のアセチル基はナトリウムメトキシドで加水分解を行ない、最後に高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で精製して凍結乾燥後、HPLCおよび質量分析で純度および目的物の同定を行なった。次にビオチン化D1を用いた阻害実験によって、糖ペプチドのHAとの相互作用で評価した。その結果、糖ペプチドのHAとの相互作用の強さに比例してウイルスの感染阻害活性が高くなり、高い相関性を示した。また蛍光標識したペプチドおよびウイルスをMDCK細胞と相互作用させ、共焦点レーザー顕微鏡およびフローサイトメトリーを用いて評価したところ、直接細胞と相互作用しないことがわかった。糖ペプチドによる阻害活性は、ウイルス表面のHAに結合することでウイルスの感染を阻害することが示唆された。H22年度まではインフルエンザウイルスのヘマグルチニン(HA)結合ペプチドを化学修飾し、季節性ウイルスである弱毒性H1型およびH3型ウイルスに効果があることを示してきた。しかし近年、高い致死性の強毒性H5型ウイルスの流行が危惧されている。そこでH23年度はH5型HAに対するペプチドの結合評価の方法を検討し、既存のHA結合性ペプチドとの相互作用評価を行った。H5型HAはサンプル入手が困難であるため、少量のHAでも相互作用解析が行える表面プラズモン共鳴法での実験系を構築した。HA結合性ペプチドは、H1型およびH3型ウイルスに効果のある15残基のD1配列を化学合成した。D1ペプチドもしくはH5のいずれかを表面プラズモン共鳴装置のセンサーチップに固定化し、もう片方の分子を流路系に流すことで条件検討を行った。その結果、HAをチップに固定化し、ビオチン化ペプチドとアビジンとの複合体を添加する手法が最も確実に相互作用解析を行うことが可能であった。決定された固定化の条件を用いて、H1,H3およびH5型HAをそれぞれ固定化し、D1および2つのD1変異体のビオチン化ペプチドとの相互作用解析を行った。その結果、D1配列のHAへの結合は濃度依存的に増加し、Langmuirプロット解析で得られた解離定数の値はどのHAでも数十μMの値を示した。D1変異体も解離定数はHAが異なってもほぼ同じ値を示した。これらの結合親和性の順序は、ファージELISAでの結合活性の順序に対応していた。ファージ上でも合成ペプチドでもD1配列および変異体は異なる亜型に対しても近い結合親和性を持っていたことから、設計通り糖鎖受容体のリガンドを模倣していることが示された。
学習集団づくりの組織方法論による授業規律形成のための指導評価表の開発研究

学習集団づくりによる授業改善に取り組む授業実践事例と組織方法論を検討することで、授業規律の形成を図るための指導と評価の具体的なあり方を開発していく回路が2つあり、それらを交差して指導と評価のあり方を開発していくことが必要である。つまり、教科内容や教材といった教科指導の特性が要請する学習方法や学び方のスタイルとして指導される授業規律形成の回路と、学級づくりのなかで培われた自主性や協同性と連動して授業のなかでコミュニケーション・スキルや応答関係のスタイルとして評価される授業規律形成の回路である。戦後の学習集団づくりによる授業規律形成に関する知見の蓄積と交流に寄与してきた長崎県および高知県における小学校での授業実践に関するフィールドワークをすることで、歴史的な教育方法遺産と今日的な教育実践課題についての基礎資料を収集するとともに、情報交換を行うことができた。とくに、長崎では、8月に行われた伝統的な合宿型の授業研究会に参加することで、教育現揚の生の声を聞くことができたし、3学期に実施した授業研究フィールドワークの打ち合わせを十分に行うことができて、また実施後にビデオ等を活用して研究室で振り返りの研究活動ができ、学習集団づくりの授業研究に固有な視点を明らかにするための基礎資料を作成することができた。また、高知県での授業研究においては、大阪教育大学の久田教授との連携、長崎県では長崎県立大学の宮原講師らとの連携をすることができ、学習集団研究の視点を拡大することもできた。そうした研究の発端となる広島県での学習集団づくりによる授業研究については、本年度現地調査を実施した群馬県の島小校長であった斎藤喜博や次年度に現地調査を実施する予定である岩手県杜陵小学校との比較を志向する基礎的研究作業を行い、中国四国教育学会で発表し、今後の研究に向けての示唆を得た。1960年代の全国授研究協議会(全授研)の潮流の一つである学習集団づくりの組織方法論の一つとして定式化された授業における「発言形式」のあり方について、今日の教育課程改革の言語論的展開の動向の一つでもあり、さらに新しい学習指導要にも示された「言語活動の充実」とも関連するところの「言語技術」のあり方として教室で展開していることと連動させて、言語技術と学習規律の関連を歴史的かつ実践的に検討した。授業規律の問題が、授業のコミュニケーションと関連していることから、「言語技術」の指導が、学習規律の指導に置き換えられやすい実態のあることを調査研究に基づき検証するとともに、授業研究等を通して教科内容習得の点から言語技術や学習規律が形式化しやすい課題をかかえていることを明らかにした。ドイツでの調査においては,ブエブ(Bueb)の提唱する『規律の賛美』(Lobder Diszilin)をめぐる争点について、ハンブルグでのGudjonsとの面談等を通して基本文献を入手するとともに、「教室の前に立つ教師」という視点から、「一斉授業」(Frontalunterricht)の捉え直しの必要性について検討し、わが国の授業規律の指導評価にとって有効な観点をえるための基礎資料を収集することができた。授業規律の指導評価表の作成に当たっては、学習集団の発展段階に関する構造表を、わが国の教育実践のなかから、いくつか発掘するとともに、今日的視点から評価を行うさいの観点について検討し、最終年度に向けての基礎資料を収集した。本年度は3ヶ年計画の最終年度にあたり、前年度までに実施した授業研究の総括を、とりわけ学習規律形成の視点から行った。そのさい、いくつかの授業を比較検討することで、教科内容へのアプローチのし方が自主的な学習のスタイルを要請し、それが一定の習慣化していくことで授業規律が形成される回路と、学級づくりで培われた自主共同の学習規律形成が話し合いや討論のある授業の展開とそれを支える教材研究を要請する回路との、二つの回路が実践的な仮説として想定されることが明らかになった。さらに学習集団づくりの組織方法論の一つとして普及している「指導的評価活動」について、授業者が授業のどの場面で使用しているかの分析を行い、授業規律形成のための指導評価表を開発するための条件的な基礎資料を得ることができた。また実施した授業研究の関係者への聞き取り調査を個別に実施することで、授業記録に表れている言動を支えている教師の教育観や授業規律観についての知見を深めることができ、指導評価表を支える教師の理念や構えの重要性を再認識した。また昨年度に調査を行ったドイツ教育学における規律をめぐる言説について、アメリカの規律をめぐる言説と対比することで、わが国の規律指導の言説の動向を国際的な観点から見直すことができ、その点について中国四国教育学会で発表した。最後に3月に全体を振り返る総括的な研究会を開催し、今回達成できなかった「有効性の検証」のための実証的研究にむけての枠組みの検討を行った。
グリオーマ幹細胞と樹状細胞の融合細胞を用いた活性型グリオーマワクチンの開発

検体提供者に対するインフォームドコンセントを徹底したうえで、手術摘出組織および血液を研究用検体として入手した。これまでの研究に基づき、悪性グリオーマ患者の摘出腫瘍組織からグリオーマ幹細胞の誘導を試みた。23週間腫瘍組織を培養すると、培養用フラスコ底面に付着する細胞群に交じって、球形を形成する浮遊細胞塊の出現が確認された。この球形細胞塊から、磁気ビーズ細胞分離法を用いてCD133+細胞とCD133-細胞の分離・濃縮を行った。平成22年度の研究において、悪性神経膠腫患者8症例のCD133+グリオーマ幹細胞の濃縮および継代培養に成功した。血清添加培地やVEGF等の成長因子添加培地を用いて、誘導されたグリオーマ幹細胞の分化誘導を試み、誘導された細胞の形態を観察した。CD133+グリオーマ幹細胞からは、血管内皮細胞への分化を思わせる管腔様形態を形成するような細胞群や、腫瘍細胞への分化を思わせるシート状に増殖する細胞群への分化を認めた。また、血管内皮様細胞や腫瘍様細胞に分化した細胞群をグリオーマ幹細胞用調節培養液で培養すると、再び球形細胞塊を形成し、グリオーマ幹細胞の自己複製能が確認された。CD133+グリオーマ幹細胞やそこから分化した細胞と樹状細胞との融合細胞を作成し、FACSにより融合効率を解析した。融合効率は、2050%であった。得られた融合細胞にIL-10-siRNAおよびdouble-stranded RNAを細胞内導入し、定量的PCRとELISAにより、融合細胞のIFNβ・IL-10およびIL-12等の分泌能を解析した。解析の結果、低IL-10分泌性・高IL-12分泌性・高IFNβ分泌性融合細胞の誘導が確認された。悪性グリオーマ患者の摘出腫瘍組織からCD133+グリオーマ幹細胞を誘導した。平成22・23年度の研究において、悪性神経膠腫患者12症例のCD133+グリオーマ幹細胞の濃縮および継代培養に成功した。血清添加培地やVEGF等の成長因子添加培地を用いて、CD133+グリオーマ幹細胞の分化誘導を試みたのち、誘導された細胞の形態を観察した。CD133+グリオーマ幹細胞からは、血管内皮細胞への分化を思わせる管腔様形態を形成する細胞群や、腫瘍細胞への分化を思わせるシート状に増殖する細胞群への分化を認め、グリオーマ幹細胞としての多分化能が確認された。また、血管内皮様細胞や腫瘍様細胞に分化した細胞群をグリオーマ幹細胞用調節培養液で培養すると、再び球形細胞塊の形成が確認され、グリオーマ幹細胞としての自己複製能が確認された。次に、CD133+グリオーマ幹細胞やそこから分化した細胞からcDNAおよびタンパクを抽出し、real time PCRおよびwestern blotにてWT-1のmRNAおよびタンパクの発現を確認した。グリオーマ幹細胞cell lineとして知られるU87MGおよび当施設で確立した4症例のCD133+グリオーマ幹細胞における検討では、IVT-1の発現はすべてのグリオーマ幹細胞においてmRNA、タンパク共に低かった。次に、CD133+グリオーマ幹細胞と樹状細胞との融合細胞を作成し、FACSにより融合効率を解析した。得られた融合細胞にIL-10-siRNAおよびdouble-stranded RNAを細胞内導入し、ELISAにて融合細胞のIFN-beta・IL-10およびIL-12の分泌能を解析した。解析の結果、低IL-10分泌性・高IL-12分泌性・高IFN-beta分泌性融合細胞の誘導が確認された。平成23年度までの研究で、複数の悪性神経膠腫患者症例におけるCD133+グリオーマ幹細胞(glioma stem cell; GSC)の濃縮および継代培養に成功した。これらのGSCを用いて、血清添加培地、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)等の成長因子やインターフェロン(IFN)等のサイトカインを添加した培地によるGSCの形態、細胞表面マーカーや免疫学的抗原性の変化を観察した。血清添加培地で培養したCD133+ GSCからは、血管内皮細胞への分化を思わせる管腔様形態を形成するような細胞群や、腫瘍細胞への分化を思わせるシート状に増殖する細胞群への分化を認めた。また、血管内皮様細胞や腫瘍様細胞に分化した細胞群をGSC用培養液で培養すると、再び球形細胞塊を形成し、GSCの自己複製能が確認された。無血清培地にVEGFを添加したものでは、GSCの明らかな形態変化は認めなかったが、血清添加培地にVEGFを添加した培地では、血管内皮様細胞の出現が顕著になった。無血清培地にIFNを添加してGSCの培養を行ったところ、細胞表面のHLA classIIの発現が顕著に増加し、マイクログリア系への分化が示唆された。また、血清添加培地によってGSCから分化した腫瘍細胞と親株GSCとの抗原性の変化に関しては、TRP2, SOX2, SOX4の発現が親株GSCで高い傾向を認めた。次にCD133+ GSCと樹状細胞との融合細胞を作成し、IL-10-siRNAおよびdouble-stranded RNAにて刺激したのち自家リンパ球との混合培養を行ったところ、CD4+ T cellを用いたELISPOTにおいてGSCに対する免疫反応の誘導が確認された。

以上の結果から、GSCと樹状細胞との融合細胞を用いた免疫療法は、GSCに対する抗腫瘍免疫を誘導する治療としてその有用性の高さが示唆された。想定よりも多くのグリオーマ症例においてCD133+グリオーマ幹細胞を誘導することができた。グリオーマ幹細胞は増殖が極めて緩徐なことが知られており、そのことが本研究の律速段階になることが予想されていたが、誘導したCD133+グリオーマ幹細胞のうち、より実験に都合の良い増殖の速い細胞を選んで研究に用いることが出来たことが、効率よく研究を遂行できた要因と考える。24年度が最終年度であるため、記入しない。まずグリオーマ幹細胞と同一患者から誘導した樹状い細胞との融合細胞を作製し、in vitroにおいて融合細胞による自家リンハ球に対する抗原提示能、すなわちCTLやTh1反応の誘導能を確認する。同時に、real time PCRやwestern blotにてグリオーマ幹細胞の有する腫瘍特異抗原を同定し、テトラマーを用いて誘導されたCTLにおける抗原特異性を確認する。既知の腫瘍抗原に関する検討においては、問題なく研究を遂行できると思われるが、既知の腫瘍抗原の発現が認められない場合は、テトラマーを用いた検討において困難が予想される。新たな腫瘍抗原の発見に関しては、今後の検討課題と考える。
骨髄血投与による肝臓リモデリングの基礎的検討

平成13年度までの研究にてGreen Fluorescent Protein (GFP)トランスジェニックマウスを用い骨髄細胞からの肝細胞への分化増殖のin vivo評価モデルを世界に先駆け開発した(GFP/CCl4モデル)。このモデルにおいては,持続的な四塩化炭素(CCl4)投与による肝障害時に,骨髄細胞から肝細胞への分化・増殖が確認され,骨髄細胞投与後,肝臓内の骨髄細胞は25%まで増加し,肝細胞索構造を構築した(特願2001-271240号)。この研究成果については2年1回開かれる2002 FASEB Summer Research Conference"Mechanism of liver growth, differentiation and molecular pathogenesis of hepatic diseaseにて招待講演を行った。さらにこのモデルの解析の結果、骨髄細胞投与により、血清アルブミン値の回復、生存率も有意に骨髄細胞の非投与群に比べ有意差を持って改善していた。最近問題になっている、この分化転換において細胞融合の関与は少ないと考えられた。また肝線維化も有意に改善していた(この結果については2002年度アメリカ肝臓病学会総会プレナリーセッション口頭発表)。これらの結果より考え、自己骨髄細胞を用いた肝臓再生療法は臨床応用可能な次世代の移植医療になりえると考えられた。さらに東京大学薬学系研究科生理化学教室の仁科博史博士との共同研究にて、胎児肝特異的な分子マーカーを単離する目的で、胎生期11.5日(E11.5)のマウス肝を抗原にして複数のモノクローナル抗体を作製して解析してきた。このうち抗Liv2と命名した抗体は、マウス発生期に出現する肝幹細胞である肝芽細胞を特異的に認識する。このLiv2陽性細胞は骨髄差wartの肝細胞への分化過程にて出現する。また抗Liv2抗体作成時、同時に作成した抗Liv8抗体は、大動脈・生殖隆起・中腎(AGM)領域の血管内皮細胞や胎児肝領域に流入する血液幹細胞に加え、成体骨髄中の細胞も認識することから、胎児肝における二次(成体型)造血や成体の造血の場である骨髄を解析する有用なツールになることが期待されている(第25回日本分生物学会ワークショップにて口頭発表)。我々は骨髄中に存在する肝幹細胞の同定のため、あらたに作成したLiv8抗体を解析した。この結果Liv8陽性、陰性細胞の移植では、陰性群において高率に肝細胞への分化転換が確認でき、この結果より骨髄中のLiv8陰性細胞群が再生療法に有用な細胞群と考えられた。平成13年度までの研究経過[骨髄細胞から肝細胞へに分化評価モデルの開発の経過](方法)GFPトランスジェニックマウスより全骨髄血を採取し同種同系のマウスに尾静脈より投与する。四塩化炭素CCL4の持続投与により持続的な肝障害を起こらせた群と,正常群にそれぞれのGFP標識された全骨髄細胞を採取し,各群のマウスに標識蛋白陽性の肝細胞あるいは胆管細胞が存在するかどうかを骨髄細胞を投与後,1週間,2週間,3週間,4週間と経過に従い観察し,GFP陽性細胞の肝臓への遊走の有無を,蛍光顕微鏡および免疫染色にて確認する。さらに肝細胞系表面分化マーカー(アルファフェトプロテイン,アルブミン),胆管細胞系分化マーカー(サイトケラチン7・19)を使用し,肝細胞・胆管細胞への骨髄細胞の分化の有無について検討した。(結果)GFP陽性細胞が持続肝障害群においては,肝臓に遊走され,GFP陽性細胞が,肝細胞および胆管細胞の分化マーカーを併せて発現していることが明らかに。このモデルは骨髄から肝細胞・胆管細胞への新しいin vivo modelの開発に成功したと考えられた。

また抗Liv2抗体作成時、同時に作成した抗Liv8抗体は、大動脈・生殖隆起・中腎(AGM)領域の血管内皮細胞や胎児肝領域に流入する血液幹細胞に加え、成体骨髄中の細胞も認識することから、胎児肝における二次(成体型)造血や成体の造血の場である骨髄を解析する有用なツールになることが期待されている(第25回日本分生物学会ワークショップにて口頭発表)。我々は骨髄中に存在する肝幹細胞の同定のため、あらたに作成したLiv8抗体を解析した。この結果Liv8陽性、陰性細胞の移植では、陰性群において高率に肝細胞への分化転換が確認でき、この結果より骨髄中のLiv8陰性細胞群が再生療法に有用な細胞群と考えられた。
植民地朝鮮近代詩の日本の表象研究 - 鄭芝溶を中心に

この研究は、植民地朝鮮の詩人は日本をどのように表象しては分ける、1930年代の代表的な詩人鄭芝溶の詩を通じて考察する。鄭芝溶(チョン・ジヨン)は、1930年代の植民地朝鮮で最も影響力があった詩人であり、同時に、今日の古典の班列に上がった代表的な詩人だ。彼は他の多くの植民地,朝鮮の詩人のように日本に留学した。にもかかわらず,彼の日本の表象はなかなか表れないが,この研究は,彼の西欧や朝鮮の表象の中に隠されている日本の表象を探求しようとする。
掃流砂流および土石流に関する力学の統一化

本研究は,水と砂礫の混合物の流れに関する構成則,土石流・掃流砂流の流速分布と粒子濃度分布および掃流砂量式と浮遊砂基準点濃度の予測法を統一的な視点から議論しようとするものである.本研究において申請者らが提案した構成則において,粒子径,粒子間摩擦および粒子密度が主要な役割を果たす.そこで,前年度に引き続いて,内部摩擦の演ずる役割を実験値と計算値とを用いて考察した.前年度において,ビーズ粒子を含む流れにおいて,河床近傍で,流速の小さい領域が鉛直下方に伸びる現象,すなわちクリーピング現象が認められ,流動深の測定が困難になったため,今年度においては,その現象が発生しにくいような領域においても水路実験を行っている.これらのデータおよび計算値とともに,固定床上の流れにおいては,内部摩擦係数の増加に伴い流れの抵抗が増加し,移動床流れにおいては,逆の傾向を示すことが分かった.土石流から掃流砂流にまたがる領域において,粒子径の異なる砂礫粒子を用いて実験を行い,これらの結果と構成則を適用して得られる流速や粒子濃度の鉛直分布とを比較して,粒子径の流れに及ぼす影響を検討した.さらに,輸送土砂量(流砂量)に関する検討も行った.前々年度の理論的検討によって,無次元流砂量は無次元掃流力の5/2乗に比例し,流砂量は粒子径に依存する結果が得られている.そこで,水路実験によって得られた実験データおよび多くの研究者によって行われた実験データを用いて検討したところ,流砂量は掃流力の大きい領域から小さい領域にわたって,粒子径の影響を受け,粒子径が大きくなるに従って流砂量が小さくなる結果が得られた.これらの実験データと構成則を適用して得られる掃流砂量式とを比較したところ,両者はよく一致した.申請者らが提案した構成則に基づき,掃流砂層の粒子濃度および水流相のレイノルズ応力の鉛直分布に着目して,浮遊砂基準面濃度を予測する手法を2層モデルを用いて提案した.これによれば,粒子径が小さくなるほど,基準面濃度は小さくなるという結果が得られた.以上,いくつかの貴重な成果が得られたが,今後,構成則の物理的な合理性を検討するため,水流相の乱れ構造を直接的に測る必要がある.本研究は,水と砂礫の混合物の流れに関する構成則,土石流・掃流砂流の流速分布と粒子濃度分布および掃流砂量式と浮遊砂基準点濃度の予測法を統一的な視点から議論しようとするものである.本研究において申請者らが提案した構成則において,粒子径,粒子間摩擦および粒子密度が主要な役割を果たす.そこで,前年度に引き続いて,内部摩擦の演ずる役割を実験値と計算値とを用いて考察した.前年度において,ビーズ粒子を含む流れにおいて,河床近傍で,流速の小さい領域が鉛直下方に伸びる現象,すなわちクリーピング現象が認められ,流動深の測定が困難になったため,今年度においては,その現象が発生しにくいような領域においても水路実験を行っている.これらのデータおよび計算値とともに,固定床上の流れにおいては,内部摩擦係数の増加に伴い流れの抵抗が増加し,移動床流れにおいては,逆の傾向を示すことが分かった.土石流から掃流砂流にまたがる領域において,粒子径の異なる砂礫粒子を用いて実験を行い,これらの結果と構成則を適用して得られる流速や粒子濃度の鉛直分布とを比較して,粒子径の流れに及ぼす影響を検討した.さらに,輸送土砂量(流砂量)に関する検討も行った.前々年度の理論的検討によって,無次元流砂量は無次元掃流力の5/2乗に比例し,流砂量は粒子径に依存する結果が得られている.そこで,水路実験によって得られた実験データおよび多くの研究者によって行われた実験データを用いて検討したところ,流砂量は掃流力の大きい領域から小さい領域にわたって,粒子径の影響を受け,粒子径が大きくなるに従って流砂量が小さくなる結果が得られた.これらの実験データと構成則を適用して得られる掃流砂量式とを比較したところ,両者はよく一致した.申請者らが提案した構成則に基づき,掃流砂層の粒子濃度および水流相のレイノルズ応力の鉛直分布に着目して,浮遊砂基準面濃度を予測する手法を2層モデルを用いて提案した.これによれば,粒子径が小さくなるほど,基準面濃度は小さくなるという結果が得られた.以上,いくつかの貴重な成果が得られたが,今後,構成則の物理的な合理性を検討するため,水流相の乱れ構造を直接的に測る必要がある.本研究は、水と砂礫の混合物の流れに関する構成則、土石流・掃流砂流の流速分布と粒子濃度分布および掃流砂量式と浮遊砂基準点濃度の予測法を統一的な視点から議論しようとするものである。まず、構成則について、代表的ないくつかの研究を比較検討し、新たな知見を用いて静的粒子間応力の表示式を提案した。これを従来の江頭らの構成則に加えることによって、流速分布と粒子濃度分布とを同時に議論できる構成則が準備された。これを検証するため、固定床上の土石流から移動床上の土石流への遷移機構を調べるための水路実験を行い、流速分布と濃度分布に関する詳細なデータを得た。これらのデータは、他の研究では説明できないが、新たに提案した構成則によってかなり適切に評価されることが明らかにされている。ついで、土石流および土砂流の領域の流れを対象として、上述の構成則を適用し、流速分布と粒子濃度分布を解析した。また、多くの研究者によって行われた実験データを集め、これらと解析結果とを比較検討した。

それによれば新しい構成則は、土石流の領域ばかりでなく、土砂流の領域においても流速・粒子濃度分布を極めてよく再現できることが明らかになった。さらに、新しい構成則は土石流や土砂流の抵抗および輸送土砂量(流砂量)もかなり適切に評価できることが分かったので、現在、一般に見られる掃流砂の領域への適用を図っている。なお、この方法によれば、流砂量無次元掃流力の5/2乗に比例し、流砂量は粒径に依存する形になる。そこで、掃流砂量に関する評価実験を行うとともに、多くの研究者の実験データの収集に努めている。本研究は,水と砂礫の混合物の流れに関する構成則を確立し,これに基づいて,土石流・掃流砂流の流速分布と濃度分布および浮遊砂基準点濃度について統一的に議論しようとするものである。前年度に提案された構成則において,粒子径,粒子間摩擦および粒子密度が主要な役割を果たす。このうち,粒子間摩擦係数の流れに対して演ずる役割について理論的に検討を行った。固定床における混合物の流れにおいては,粒子間摩擦係数の増加に伴って,流れの抵抗が増加する。一方,移動床上における流れにおいては,固定床上のものと逆の結果,すなわち,粒子間摩擦係数の増加に伴って,流れの抵抗が減少する結果が得られた。これを検証するために,内部摩擦係数の異なる材料として砂粒子とガラスビーズ粒子を用いて,固定床および移動床上の流れを調べるための水路実験を行い,流速分布と粒子濃度に関する詳細なデータを得た。因みに,内部摩擦係数は,砂粒子よりもガラスビーズ粒子の方が小さい。これらのデータは,先に述べた理論的に得られた結果と同様の傾向を示した。土石流および土砂流の領域を対象として,砂粒子とビーズ粒子を用いた実験を行い,これらの結果と構成則を適用して求められる流速分布や濃度分布の結果を比較検討することにより,構成則の一般化を図った。それによれば,砂およびガラスといった材料特性の異なる材料によりそれぞれ構成される混合物の流れの諸量を,新しい構成則を用いて概ね説明できることが示唆された。さらに,砂粒子およびビーズ粒子を含む流れおよび流砂量に関する実験データと多くの研究者によって行われた実験データを集め,それらと新しい構成則を適用して求められる掃流砂量式と比較検討した。これによれば,砂粒子ばかりかビーズ粒子を含む流れの流砂量をもかなり適切に評価できることが明らかになった。新しい構成則に基づき,現在,掃流砂層の粒子濃度の鉛直分布および水流相のレイノルズ応力の鉛直分布に着目し,浮遊砂基準点濃度の予測法について検討を深めている。本研究は,水と砂礫の混合物の流れに関する構成則,土石流・掃流砂流の流速分布と粒子濃度分布および掃流砂量式と浮遊砂基準点濃度の予測法を統一的な視点から議論しようとするものである.本研究において申請者らが提案した構成則において,粒子径,粒子間摩擦および粒子密度が主要な役割を果たす.そこで,前年度に引き続いて,内部摩擦の演ずる役割を実験値と計算値とを用いて考察した.前年度において,ビーズ粒子を含む流れにおいて,河床近傍で,流速の小さい領域が鉛直下方に伸びる現象,すなわちクリーピング現象が認められ,流動深の測定が困難になったため,今年度においては,その現象が発生しにくいような領域においても水路実験を行っている.これらのデータおよび計算値とともに,固定床上の流れにおいては,内部摩擦係数の増加に伴い流れの抵抗が増加し,移動床流れにおいては,逆の傾向を示すことが分かった.
新しい抗ウイルス戦略をめざしたヘルペスウイルス遺伝子発現制御因子の解析

本研究の目的は、HSVおよびEBV感染直後に発現する制御因子およびウイルス特異プロテインキナーゼ(PK)の機能発現機構を解析し、新たな抗ウイルス剤開発や抗ウイルス戦略構築に向けての基礎的な知見を蓄積することにある。本年度の成果は以下の通りである。(i)EBVがコードするPKであるBGLF4の新規標的因子としてEBV制御因子EBNA-LPを同定し、そのリン酸化部位がEBNA-LPの主要機能を制御するSer-35であることを明らかにした。また、Ser-35が宿主のPKであるcdc2によってももリン酸化されることが明らかになった。以上の結果は、EBNA-LPの機能発現が宿主およびウイルスのプロテインキナーゼによって制御されていることを示している。(ii)野生体の性状(培養細胞での増殖性や動物モデルでの病原性)を保持した完全長の感染性HSVクローンの構築に成功し、あらゆる目的に利用可能なHSV組み換え系を確立した。我々が確立したHSVのリバースジェネティックス法は、HSVの増殖機構、病原性発現機構といった基礎研究から、新規HSVベクターの開発まで幅広く利用可能であると考えられる。(iii)完全長のHSV遺伝子を保持し、かつ、GFPを発現する組み換えHSVを作製した(YK333)。YK333は、GFPを効率よく発現し、培養細胞においては野生株と同等な増殖能を示した。YK333を用いて、大量サンプルの簡便・迅速スクリーニング目的とした抗ウイルス活性解析系(fluorescence-based anti-viral assay)を確立した。本系は、96-well microplateを用いるので、大量サンプルの処理が可能である。行程は、細胞にウイルスYK333および薬剤を添加・培養後、GFPの発現をfluorometerでそのまま計るといった単純なものであり、全行程は2日間で完了する。感度は、抗ヘルペスウィルス剤ガンシクロビルを用いた場合、plaque reduction assayとほぼ同等なIC_<50>が得られた。YK333はHSV動態追跡に有用であるだけでなく、抗HSV剤の大量・迅速スクリーニングにも応用可能であると考えられる。
再生医療用における腎臓組織の新規構築培養法および機能評価

Tissue Engieering技術が開発されてから、細胞、細胞の足場となるECM(細胞外マトリックス)、細胞増殖活性因子の相互的な作用により、通常の生体では起こりえない再生現象を作り出すことができた。しかし、生物の再生能力は動物種によっても、其々の組織によっても異なっている。皮膚、心筋シート等の展開が著しくするんでいるが、腎臓細胞のような再生能力の低い細胞から濾過機能を持つ糸球体組織のTissue engineering技術はまだ樹立されていない。本研究は、腎疾患患者の腎糸球体の修復と再生を目指し、特に、ネフローゼ症候群に糖尿病やFinnish病の糸球体上皮細胞の極性消失により糸球体濾過機能の低下を着目し、in vitroの細胞培養系で上皮細胞の極性復元に重点を置いた。糖尿病由来ネフローゼ症候群やFinnish病の典型的な特徴は糸球体上皮細胞の足突起癒合.(foot process fusion)により、細胞間のslit diaphragmが消失し、細胞極性が欠乏し、細胞の形態が扁平呈する。本研究は、糸球体細胞の足場を着目し、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲンを基材として、コラーゲン薄膜とガーゼゲル薄膜を設計した。また、上皮細胞だけの単独培養ではなく、薄膜の両側に、糸球体メサンギウム細胞、内皮細胞を植え付け、異なる細胞と上皮細胞の共培養方法を開発した。1)メッシュシービン法(mesh sieving method)と細かいミンス(fine mince method)の併用により、腎糸球体のボウマン嚢上皮細胞、内皮細胞、メサンギウム細胞、足細胞を迅速に単離する培養技術を確立した。2)コラーゲンゲル薄膜の作成により、腎糸球体構成細胞の共培養系を樹立した。上皮細胞とメサンギウム細胞の共培養系では、上皮細胞の極性を復元できた。メサンギウム細胞が細胞足場の基質であるfibronectinの分泌を増強するため、上皮細胞がゲル薄膜に対する接着斑.(focal contact)が強化され、細胞と細胞の相互作用により、上皮細胞の極性が形成された。3)In vitroの研究を進みながら、研究分担者がin vivoの移植条件の探求を進んでいた。中空糸モジュールの中空糸内面にコンフルエントな上皮細胞を単層に生者させ、急性腎不全患者に用い、治療効果の促進を確認した。4)今後の研究方向は発生腎をin vitroで培養する条件、発生腎の尿管芽分枝および糸球体の複雑な血管形成に着目すべきである。本研究は複雑な腎臓組織を再生するため、最も実現可能な対策を考え、従来の細胞材料から出発するティシュッ・エンジニアリング技術を超えて、未来型の腎組織化を目指し、in vitroでの構築技術の開発を目的とする。平成15年11月6日に15年度の研究補助金交付の追加決定通知を受けてから、短期間で実験装置の作成と実験必要な材料を調達した。

実験装置において、当初自作予定したDisposable振盪式膜培養装置は、学内の工作センターが科学研究費を受け付けできないため、学内工作センターの自作したブループリントを持参して、NASDA宇宙センターの装置開発部門まで相談しに行った。そこで自作の代わりに、シンセコン社(トミ社輸入)の3次元細胞培養システムを勧められ、この微小重力を調整できる装置を発注し、平成16年3月に納品した。同時に、実験材料としては、胎生期11.5日から21日の妊娠マウスを飼育した。1001000倍拡大倍率の実体顕微鏡を用いて、マウス腎臓発生過程に最も重要な後腎、すなわち将来複雑な尿管、腎孟、腎杯、集合細胞を形成する尿管芽、ならびに将来ボーマン嚢、糸球体を形成する間質細胞を含む組織を、顕微鏡下で分離した。分離した組織を、タイプI,IV,Vコラーゲンのコートした培養プレートおよびtranswell上で培養し、コラーゲンナーゼの処理により、尿管芽の伸展および分枝が顕微鏡に観察されたため、初期の実験が成功した。また、平成15年12月にアメリカの細胞生物学会に参加し、本研究に関連する培養装置、培養条件と技術手法の情報を収集し、今後研究の進みに新たなヒントを得た。本研究は補助金交付の通知を受け取ってから今まで、4ヶ月しか過ぎていないので、研究発表はまだない。高齢化社会において、ガン疾患や腎炎、ネフローゼの患者数が著しく増加しており、医療費が上回っている。一方、新たな生体組織工学やES細胞の操作技術が確立されており、皮膚、神経、心筋、軟骨細胞を分化再生することが実現されつつある。しかし、この両者の技術は複雑な血管網に包まれる腎臓器官を再生するのは、現段階では無理である。これらの問題点を踏まえ、もっとも実現可能な対策を考え、発生期の後腎尿管芽ならびに周りの間質細胞を出発材料とし、流動性環境と擬微小重力状態を加え、腎組織の基本単位であるネフロンの構成を目指す。今年度は以下の点を明らかにした。(1)前年度はマウス胚形成11.520.5日の後腎の摘出に成功したので、樹立された技術により、胎生期初期の後腎を24wellの培養皿および上皮、内皮培地で培養した。上皮培地は尿管芽のbranchingを促進したが、血管形成を逆に抑制したので、内皮培地を添加した。その結果、後腎組織は赤血球細胞を保ちながら、尿管芽のbranchinも形成された。また、持続培養して35日の間、S字体管腔の形成ができた。さらに血管新生因子のVEGF、HGF, b-FBFを投与した結果、VEGFの血管新生効果が他の因子より強いことが分かった。(2)上記(1)で確立された方法を用い、形成された後腎をdisposable膜培養器及び平面旋回培養器に移し、時間軸に沿って培養した。その結果、平面旋回培養法に比べ、disposable膜培養器では、多くの後腎組織が凝集した。また、凍結切片でHE染色した結果、腎糸球体と尿集合管の形成が観察された。さらに継続培養すると、永久腎に類似する尿細管が観察された。2重抗体染色法で染色した結果、糸球体の3種類構成細胞のマーカが陽性であり、糸球体の分化を実証した。以上の成果により、我々が開発したin vitroでの後腎培養系では後腎の分化に促進し、後腎の組織化に有効であることを示す。