hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ＫＣＮＱ１－ＫＣＮＥ１イオンチャネル複合体の結合状態と電流キネティクスの関係

心臓の電位依存性カリウムチャネルKCNQ1チャネルについて、その修飾サブユニットのKCNE1がKCNQ1電流へ与える影響について検討した。KCNE1の結合数が増えるほどチャネルが開きにくくなることが明らかとなり、またKCNE1をKCNQ1から遠ざけるほどKCNQ1電流の活性化が遅くなることもわかった。別の電位依存性カリウムチャネルであるKv4チャネルについても、KCNQ1と同様に、修飾サブユニットKChIPおよびDPP10の発現量依存的にKv4電流の性質が変化することを明らかにした。以上の結果により、心臓などにおいて、イオンチャネル修飾サブユニットの発現量が重要である可能性を示した。KCNQ1の性質はKNCE1が結合することによって、大きく変化する。そしてKCNE1の結合数は、KCNQ1とKCNE1の発現密度に依存して変化することから、細胞膜上での結合解離の可能性が示唆され、それを明らかにすることが本研究の目的である。昨年度までに作成したタンデムコンストラクトを使用することでFRET解析を行う予定であった。しかしながら、FRETがおきるようなタンデムコンストラクトはこれまでのところできていない。全反射蛍光顕微鏡下でかつ膜電位固定時にFRETと電流を同時測定することが、KCNE1の結合解離を測定するためにはもっとも直接的な証明にはなるが、今後はこれまでに当研究室で実績のある一分子イメージング法なども併用することで、KCNQ1とKCNE1の間のダイナミクスを検討していく予定である。そのためのコンストラクトはすでに作成済みである。またKCNQ1はKCNE1が結合することにより、電位依存性が脱分極側に大きくシフトし、非常に開きにくいチャネルに機能修飾される。本研究によって、KCNQ1のS4セグメント上とS5セグメント上に存在する2つのフェニルアラニン残基が、KCNE1によるKCNQ1の電位依存性のシフトに大きな役割を果たしていることを見出した。これらのアミノ酸あるいは近傍のアミノ酸がKCNE1と直接相互作用している可能性が高く、来年度以降検討していきたいと考えている。心臓のカリウムチャネルKCNQ1とそのサブユニットであるKCNE1のタンデムコンストラクトを作成し、ストイキオメトリーをコントロールした上で電流キネティクスの解析を行った。4:4(KCNQ1四分子に対してKCNE1四分子の複合体)のストイキオメトリーが生じるKCNE1-KCNQ1のタンデムコンストラクトは、4:2(KCNQ1四分子に対してKCNE1二分子の複合体)あるいは4:1のストイキオメトリーを生じるコンストラクトのチャネルに比べ活性化キネティクスに遅延が認められ、また電位依存性も脱分極側にシフトしており、4:4のチャネルが4:2のチャネルなどに比べ、より開きにくいチャネルであることが明らかになった。KCNQ1-KCNE1チャネルの活性化のコンポーネントは3秒程度と20秒程度の主に2つが存在し、4:4チャネルの活性化が遅いことは主に20秒のコンポーネントが増大しているからであると考えられる結果を得た。また4:4と4:2のコンストラクトのKCNE1とKCNQ1の間をつないでいるアミノ酸リンカーの長さを変えることで、KCNQ1とKCNE1の間にダイナミックな結合解離が起こっているかを検討した。4:2のチャネルにおいてはリンカーの長さに依存した変化は認められなかったが、4:4のチャネルにおいてはリンカーの長さを34アミノ酸、100アミノ酸、300アミノ酸と長くするにつれて、電位依存性カーブが過分極側にシフトしていき、4:2チャネルの性質に近づいていった。2分子までのKCNE1は強固にKCNQ1分子に結合しているが、抑制的に働く3分子目、4分子目のKCNE1はKCNQ1にゆるく結合しており、ダイナミックな結合解離の存在が示唆される結果を得た。電位依存性カリウムチャネルKCNQ1とその修飾サブユニットKCNE1は、発現密度依存的にその分子構成(ストイキオメトリー)と電流のキネティクスを変化させることがわかっている。本研究においては、発現密度に依存して変化するサブユニット間の結合解離状態を評価、解析することが目的であった。KCNQ1とKCNE1のタンデムコンストラクトを作成し、KCNQ1とKCNE1のストイキオメトリーを4:4、4:2、4:1と固定することで、電流の性質を比較検討した。4:4チャネルは、4:2や4:1チャネルに比べて、活性化のキネティクスが遅く、かつ電位依存性がより脱分極側にシフトしており、KCNE1分子が結合するほど開きにくいチャネルになることがわかった。

一方、両分子間のリンカーの長さをさまざまに変え(34268アミノ酸長)、擬似的に発現密度を変化させることで、それらのタンデムコンストラクトの電流を解析した。この場合は、リンカーの長さが長いほど、活性化のキネティクスが遅くなるという現象を見出した。以上の結果は、細胞膜上でKCNE1がKCNQ1に対して結合・解離する可能性を示唆していると考えられた。同じ電位依存性カリウムチャネルであるKv4についても、KChIPおよびDPP6/10と呼ばれる2種類の修飾サブユニットが知られている。これらについても、一分子イメージングによるサブユニットカウンティング法と電気生理学的解析を適用することで、発現依存的なストイキオメトリーの変化と、それに伴う電流キネティクスの変化を確認した。発現密度依存的なイオンチャネル複合体のストイキオメトリー変化とキネティクスの変化は、KCNQ1チャネルのみならず、より広い種類のイオンチャネルでも起こりうることが示唆され、心筋細胞等の膜興奮性を検討する上で重要な知見を得た。イオンチャネルの分子生理学・生物物理学計画していたFRETの実験に関しては、コンストラクトの作成などの点から、若干の遅れが生じているが、その一方で、KCNE1の機能修飾に重要なKCNQ1上のアミノ酸残基を発見するという、非常に新しい知見を得ることに成功した。総合的にはおおむね順調に進展していると考えている。タンデムコンストラクトの作成とその機能解析が初年度の主な計画であったが、その2点において、おおむね計画通り進行していると考えている。リンカーの長さに依存した活性化キネティクスの変化が、4:2と4:4のチャネルで異なる結果を得たことは意外な結果であった。KCNE1が結合している場所、あるいは数によってその結合の強さが異なることを示唆しており、来年度以降の光生理学実験などにより明らかにしていきたい。計画に従って全反射蛍光顕微鏡下でのFRET実験を引き続き実施していく。FRETを効率よく起こすコンストラクトの作成が課題になる。その一方で、当初の計画にはなかったが、全反射蛍光顕微鏡を用いた一分子イメージング法を適用する予定である。一分子レベルでのKCNQ1とKCNE1の挙動を解析することで、両者の結合解離に関する情報が得られると期待される。タンデムコンストラクトを用い、全反射蛍光顕微鏡を用いた蛍光エネルギー共鳴移動(FRET)法などを用いて、KCNE1とKCNQ1の間のダイナミクスの解析を進めていく。特に24年度に明らかとなった4:4チャネルのみで観察されたリンカー長依存的な電位依存性のシフトから予想される、KCNE1の結合場所、あるいは結合数に依存した結合強度の変化を、光生理学的解析により明らかにすることを目的として、研究を推進していく。FRETコンストラクトが順調に作成された場合、440 nmのダイレクトダイオードレーザーを購入する予定であったが、コンストラクトの完成が次年度に持ち越されたため、レーザーの購入も1年遅らせることとした。FRETコンストラクトが完成すれば、440 nmのダイレクトダイオードレーザーを購入する。そのほかその光生理学実験の試薬、一分子イメージング用の部品、消耗品等を購入する予定である。
新規肝線維化マーカー糖蛋白WFA-M2BPの肝再生促進効果による革新的治療の開発

われわれは新規の肝線維化血清マーカーであるM2BPGiが生体肝移植ドナーの術後速やかに上昇し、CTで算出される肝再生率と相関することを見出した。われわれの以前のin vitroでの検討で、M2BPGiは肝星細胞の活性化に伴い分泌される糖蛋白で、肝Kupffer細胞に作用してKupffer細胞を活性化することを見出していたため(Bekki Y, Shirabe K, et al. J Gastroenterol Hepatol 2017)、M2BPGi自体が肝再生因子であるとの仮説を立て、研究を開始した。まず、M2BPGiをヒト肝細胞の培養系に添加したが、肝細胞の分裂はおこらなかった。そこで、M2BPGiをヒトKupffer細胞の培養系に添加し、その後の培養上清をヒト肝細胞培養系に添加したところ、BrdUの肝細胞への取り込みが増加し、肝細胞は分裂を開始した。すなわちM2BPGiによって活性化されたKuppfer細胞が肝再生因子を産生したと考えられた。そこでその因子を同定する目的で質量分析計を用いたところ、いくつかの分子が認められたが、そのうち肝細胞の分裂を促進する蛋白が同定された。この分子は既知の分子ではあったが、いままで肝細胞の分裂を促進する効果は報告されていなかった。したがってわれわれは肝星細胞とKupffer細胞の連関から肝再生が促進される全く新たな分子機序を解明した可能性があると考えている。このような革新的な結果をもって、新規肝再生因子のマウス肝切除モデルにおける動態や再生促進効果などを明らかにする目的で、本研究は共同研究者の播本憲史講師(群馬大学)を筆頭研究者として「肝星細胞をターゲットとした新たな肝再生機序解明と革新的治療法の開発」(研究課題/領域番号19K09189 )に引き継がれた。このWFA-M2BPを生体肝移植ドナーの周術期にて経時的に測定したところ、血清WFA-M2BP値は術後早期に上昇し、術後3日目の血清値は術前後に計測した肝臓の容積を用いて算出された肝再生率と有意に相関した(R2: 0.3512, p=0.0023)。すなわち、血清WFA-M2BP値が高いほど、肝再生率が大きいことがわかった。そこでわれわれはWFA-M2BPが新たな肝再生因子である可能性を明らかにする目的で、以下の研究を行った。ヒト肝細胞培養系での肝細胞の分裂に与える影響を検討した。ついで、ヒトKupffer細胞培養系のmediumにWAF-M2BPを添加し、培養を行った。培養48時間目に培養液を回収し、ヒト肝細胞培養系に添加した。その結果、WFA-M2BPは肝細胞への直接分裂促進作用を示さないこと、ヒトKupffer細胞の上清はWFA-M2BPを添加しない対照群でも軽度の肝細胞分裂作用を示したが、WFA-M2BP添加後の上清では有意に肝細胞分裂を促進した。この肝細胞分裂促進作用は既知のEGFの作用とほぼ同等であった。したがって、WFA-M2BPはKupffer細胞を介した肝細胞の分裂を促進することが明らかになった。われわれは新たなWFA-M2BPは肝再生因子であるとの仮説をたて、以下の研究を行った。その結果、WFA-M2BPは肝細胞への直接分裂促進作用は見られないこと、ヒトKupffer細胞の上清はWFA-M2BPを添加しない対照群でも軽度の肝細胞分裂作用を示したが、WFA-M2BP添加後の上清では有意に肝細胞分裂を促進した。われわれは当初、WFA-M2BPが肝細胞に直接作用し、肝細胞の分裂を促進するのではないかとの仮説をたて、実験したが、極めて正常ヒト肝細胞に近いと考えられているフェニックスバイオ社のヒト肝細胞に対しては明らかな分裂促進作用はなかった。しかしながら、ヒトKupffer細胞からWFA-M2BPによって産生が促進される液性因子が肝細胞の分裂が促進している可能性が明らかになった。本年度はサイトカインアレイや質量分析計を用いて、WFA-M2BPが産生を促すヒトKupffer細胞の液性因子を同定する予定である。この結果、新たな肝再生の機序が明らかになるとともに、肝再生を促進するといった肝不全に対する新たな治療戦略が構築が可能となる可能性がある。われわれは、以前よりWFA-M2BPが肝線維化の有用なサロゲート・マーカーであることを報告してきた(Toshima T, Shirabe K, et al. J Gastroenterol. 2015Jan;50(1):76-84)。さらにその機序として、肝星細胞が産生する糖蛋白であることを示した(J Gastroente高いほど、肝再生率が大きいことがわかった。WFA-M2BPが肝再生因子であることを明らかにする目的で、ヒト肝細胞培養系での肝細胞の分裂に与える影響を検討した。

ついで、ヒトKupffer細胞培養系のmediumにWAF-M2BPを添加し、培養を行った。培養48時間目に培養液を回収し、ヒト肝細胞培養系に添加した。WFA-M2BPは肝細胞への直接分裂促進作用を示さないこと、ヒトKupffer細胞の上清は、WFA-M2BP添加後の上清では有意に肝細胞分裂を促進した。したがって、WFA-M2BPはKupffer細胞を介して肝細胞の分裂を促進することが明らかになった。WFA-M2BPを添加したKupffer細胞の上清を質量分析計を用いて蛋白を同定した。Protein Xをヒト肝細胞培養に添加したところ、肝細胞の分裂が確認された。Protein Xは今まで肝再生促進因子としては全く報告されておらず、新規の因子であると考えられる。今回われわれは全く未知の肝再生因子を発見することとなった。このことは本研究の目的を達成した結果である。さらには本研究により、肝再生の肝星細胞からKupffer細胞、肝細胞へとの全く新たな連関が明らかになった。本年度はin vivoモデル(70%肝切除マウス)で、このProtein Xの動態を明らかにし、正常の肝再生における役割を明らかにするとと共にProtein Xを前投与することで肝切除後の肝再生が促進するか否かを明らかにする。われわれは新規の肝線維化血清マーカーであるM2BPGiが生体肝移植ドナーの術後速やかに上昇し、CTで算出される肝再生率と相関することを見出した。われわれの以前のin vitroでの検討で、M2BPGiは肝星細胞の活性化に伴い分泌される糖蛋白で、肝Kupffer細胞に作用してKupffer細胞を活性化することを見出していたため(Bekki Y, Shirabe K, et al. J Gastroenterol Hepatol 2017)、M2BPGi自体が肝再生因子であるとの仮説を立て、研究を開始した。まず、M2BPGiをヒト肝細胞の培養系に添加したが、肝細胞の分裂はおこらなかった。そこで、M2BPGiをヒトKupffer細胞の培養系に添加し、その後の培養上清をヒト肝細胞培養系に添加したところ、BrdUの肝細胞への取り込みが増加し、肝細胞は分裂を開始した。すなわちM2BPGiによって活性化されたKuppfer細胞が肝再生因子を産生したと考えられた。そこでその因子を同定する目的で質量分析計を用いたところ、いくつかの分子が認められたが、そのうち肝細胞の分裂を促進する蛋白が同定された。この分子は既知の分子ではあったが、いままで肝細胞の分裂を促進する効果は報告されていなかった。したがってわれわれは肝星細胞とKupffer細胞の連関から肝再生が促進される全く新たな分子機序を解明した可能性があると考えている。このような革新的な結果をもって、新規肝再生因子のマウス肝切除モデルにおける動態や再生促進効果などを明らかにする目的で、本研究は共同研究者の播本憲史講師(群馬大学)を筆頭研究者として「肝星細胞をターゲットとした新たな肝再生機序解明と革新的治療法の開発」(研究課題/領域番号19K09189 )に引き継がれた。本年度はサイトカインアレイや質量分析計を用いて、WFA-M2BPが産生を促しているヒトKupffer細胞の液性因子を同定する予定である。
透明度により生息水深の異なる「中深度」サンゴ群集間のコネクティヴィティの解明

水深30150mに存在するとされている中深度サンゴ類であるが、懸濁物が多いために暗い内湾環境では、水深1520mの比較的浅い場所でも生息していることが分かってきた。湾口から湾奥まで5kmある西表島船浮湾に調査区を4区設置し、野外調査を行なっている。平成30年度に集中サンプリングを計画していたが、研究施設の小型船舶のエンジンに修理不能な故障が生じ、購入までに時間を要し、また、申請者が利き腕の指に怪我を負い、手術・療養をする必要があり、その間潜水による環境測定調査を実施できなかったため十分にサンプリングを行えなかったことから、対象サンゴの分布種の把握・分類の整理が遅れている。各調査区では、中深度サンゴ類の生息環境において、濁度と水深、及び光合成有効放射量の関係より、中深度サンゴ類の暗所への適応について検証するため、環境計測を行なっている。これについては継続的にデータを得ており、今年度も計器の電池交換等を数回行う予定である。透明度が高く深い場所の群集と、透明度が低く浅い場所の群集の種構成と遺伝的な交流の有無について調べることにより、環境間における幼生供給の可能性について検証し、中深度サンゴ類の保全に有効なユニットを探っている。これに関しては、すでに得られている標本を元に解析を進めているが、研究室メンバーの異動等により担当者が複数回変わることになったことと、サンプリングの遅れもあり、若干遅れているため、今年度重点的に進める必要がある。中深度サンゴ類各種が環境によって保有する共生藻に変異については、まだ限られたサンプル数であるが多様な遺伝子型が見つかってきている。平成29年度までには各調査区でのセンベイサンゴ類のサンプル採集を終える予定であったが、水深の深い場所で作業を行うことができるダイバーの数に限りがあり、想定していたよりも時間がかかり、まだ終えられていない。さらに、平成30年度に研究施設の小型船舶のエンジンに修理不能な故障が生じ、購入までに時間を要し、また、申請者が利き腕の指に怪我を負い、手術・療養をする必要があり、対象サンゴの分布種の把握・分類の整理が遅れている。今年度は、調査員の安全を第一に考慮し、より時間をかけて調査を実施することにより、遅れを取り戻す予定である。これについては継続的にデータを得ており、順調に進んでいる。分子実験についても、研究室メンバーの異動等により担当者が複数回変わることになったことと、サンプリングの遅れもあり、こちらの作業にもウェートを割いて遅れを取り戻す必要がある。今年度は、まず各調査区でのセンベイサンゴ類のサンプル採集を重点的に行い、対象サンゴの分布種の把握・分類の整理を進めるのと同時に分子実験を行うことにより、遅れを取り戻すことになる。サンプリングには当初予定していた施設のボートは使えないが、代わりにゴムボート、あるいは傭船をして効率的に調査を行う。ただし、深場での作業になるため、調査員の安全を第一に考慮し、より時間をかけて調査を実施することにより、遅れを取り戻す予定である。分子実験については、研究協力者のライマー准教授が中心に推進できる体制を整えており、サンプリングの後にすぐに作業をはじめて、遅れを取り戻す予定である。中深度サンゴ類の生息環境において、濁度と水深、及び光合成有効放射量の関係より、中深度サンゴ類の暗所への適応について検証する。また、透明度が高く深い場所の群集と、透明度が低く浅い場所の群集の種構成と遺伝的な交流の有無について調べることにより、環境間における幼生供給の可能性について検証し、中深度サンゴ類の保全に有効なユニットを探る。さらに、中深度サンゴ類各種が環境によって保有する共生藻に変異があるかを調べ、濁度と水深が共生藻の選択に与えうる影響についても考察する。調査初年度となる平成28年度は、調査区の設定を終え、その調査区に生息するセンベイサンゴ類相の調査のために形態分類用及び分子実験用のサンプリング、また各調査区の環境測定の開始を予定しており、それぞれ無事着手することができた。平成29年には各調査区でのセンベイサンゴ類のサンプル採集を終える予定であったが、水深の深い場所で作業を行うことができるダイバーの数に限りがあり、想定していたよりも時間がかかり、まだ終えられていない。調査員の安全を考慮し、今年度もすでに調査を始めており、より時間をかけて行うことにより、遅れを取り戻す予定である。平成29年度に集中サンプリングを計画していたが、研究代表者が所属する施設のボートが故障し十分にサンプリングを行えなかったことから、対象サンゴの分布種の把握・分類の整理が遅れている。

各調査区では、中深度サンゴ類の生息環境において、濁度と水深、及び光合成有効放射量の関係より、中深度サンゴ類の暗所への適応について検証するため、環境計測を行なっている。これについては継続的にデータを得ており、今年度も計器の電池交換等を数回行う予定である。透明度が高く深い場所の群集と、透明度が低く浅い場所の群集の種構成と遺伝的な交流の有無について調べることにより、環境間における幼生供給の可能性について検証し、中深度サンゴ類の保全に有効なユニットを探っている。これに関しては、すでに得られている標本を元に解析を進めているが、研究室メンバーの異動等により担当者が複数回変わることになったことと、サンプリングの遅れもあり、若干遅れているため、今年度重点的に進める必要がある。中深度サンゴ類各種が環境によって保有する共生藻に変異については、まだ限られたサンプル数であるが多様な遺伝子型が見つかってきている。平成29年度までには各調査区でのセンベイサンゴ類のサンプル採集を終える予定であったが、水深の深い場所で作業を行うことができるダイバーの数に限りがあり、想定していたよりも時間がかかり、まだ終えられていない。さらに、研究代表者が所属する施設のボートが故障し十分にサンプリングを行えなかったことから、対象サンゴの分布種の把握・分類の整理が遅れている。今年度は、施設のボート以外の船舶の調達をしつつ、調査員の安全を第一に考慮し、より時間をかけて調査を実施することにより、遅れを取り戻す予定である。これについては継続的にデータを得ており、順調に進んでいる。分子実験についても、研究室メンバーの異動等により担当者が複数回変わることになったことと、サンプリングの遅れもあり、こちらの作業にもウェートを割いて遅れを取り戻す必要がある。水深30150mに存在するとされている中深度サンゴ類であるが、懸濁物が多いために暗い内湾環境では、水深1520mの比較的浅い場所でも生息していることが分かってきた。湾口から湾奥まで5kmある西表島船浮湾に調査区を4区設置し、野外調査を行なっている。平成30年度に集中サンプリングを計画していたが、研究施設の小型船舶のエンジンに修理不能な故障が生じ、購入までに時間を要し、また、申請者が利き腕の指に怪我を負い、手術・療養をする必要があり、その間潜水による環境測定調査を実施できなかったため十分にサンプリングを行えなかったことから、対象サンゴの分布種の把握・分類の整理が遅れている。
魚類病原ノダウイルスの感染防御に関与するタンパク質の抗原構造解析について

ウイルス性神経壊死症の原因ウイルスである魚類病原ノダウイルスは、分子進化学的に4つの遺伝子型(SJNNV、TPNNV、BFNNVおよびRGNNV型)に分類されるが、これらの血清学的関係および感染防御抗原に関する解析はほとんど成されていない。本研究では、遺伝子型の異なるノダウイルスの血清学的関係を明らかにするとともに、本ウイルスの感染防御に関与する抗原の構造解析を行った。昨年度は、SJNNV外被タンパク質遺伝子の塩基配列を基に、遺伝子型の異なるウイルスの外被タンパク質遺伝子を部分的に発現させる系を確立した。本年度は、各遺伝子型ウイルスの発現外被タンパク質を用い、以下の成果を得た。1)まず、各遺伝子型ウイルスの発現タンパク質を精製し、抗SJNNV血清との反応性について検討した。その結果、抗SJNNV血清は遺伝子型の異なるウイルスの発現タンパク質とも交差反応を示したが、その反応強度に明らかな差が認められた。したがって、遺伝子型の異なるウイルスは多数の共通抗原を有するが、血清学的には同一でないことが明らかになった。2)SJNNVの中和活性を有する単クローン抗体を用いた解析では、SJNNVと他の遺伝子型ウイルスとは明らかに異なることが示された。さらに、同単クローン抗体はSJNNV外被タンパク質のアミノ酸配列(aa)254-256に存在するPro-Ala-Ansを認識していることが示唆され、本アミノ酸配列がSJNNVの感染防御に関与する抗原の一つであると考えられた。3)他の遺伝子型ウイルスにおける(aa)254-256は、各々Pro-Pro-Gly,Pro-Glu-GlyおよびPro-Asp-Glyで、各アミノ酸配列はTPNNV、BFNNVおよびRGNNV型ごとに保存されており、遺伝子型の異なるウイルスは血清学的にも異なると考えられた。4)また、本実験過程においてSJNNV非構造タンパク質遺伝子(RNA1)の全塩基配列を決定し、RNA1にコードされているタンパク質がRNA-依存RNAポリメラーゼであることが明らかになった。ウイルス性神経壊死症(VNN)の原因ウイルスである魚類病原ノダウイルスは分子進化学的に独立した4つの遺伝子型に分類される。本研究では4つの遺伝子型に分類される魚類病原ノダウイルスの血清学的関係の解明および魚類ノダウイルスの感染に関与する外被タンパク質の抗原構造解析を目的に以下の研究を行った。1)魚類ノダウイルスのひとつであるSJNNV(striped jack nervous necrosis virus)の外被タンパク質遺伝子の塩基配列をもとに、同遺伝子のT2領域(塩基番号1551030)およびT4領域(塩基番号6041030)を増幅し遺伝子発現用ベクターに組み込むためのPCR用プライマー、Flexp(5`-aaac-atatgGGATTTGGACGTGCGACCAA-3')、F2exp(5`-aaacatatgGTGTCAGTCATGTGTCGCTG-3')およびR3exp(5`-gctaagcttcaC-GAGTCAACACGGGTGAAGA-3')を設計した。2)上記プライマーを用いて異なる遺伝子型ウイルス(SJ,TP,BFおよびRGタイプ)の外被タンパク質遺伝子を各々増幅し、遺伝子発現用プラスミドベクター(pET-25b)に組み込み大腸菌(BL21-DE3)を形質転換させた。3)その結果、形質転換した大腸菌から異なる4遺伝子型ノダウイルスのT2およびT4領域にコードされているタンパク質が各々発現されていることをSDS-PAGE解析により確認した。4)本実験過程に於いて、4つの遺伝子型ウイルスをドットハイブリダイゼイションにより迅速かつ簡便に区別する方法を確立した。

なお、本実験過程で得られた遺伝子ライブラリーおよびウイルス外皮タンパク質発現大腸菌株は全て液体窒素保存容器内で保存されている。5)平成11年度は、これらの発現タンパク質を用いてウイルスの血清学的関係および感染に関与するタンパク質の抗原構造を解明する。ウイルス性神経壊死症の原因ウイルスである魚類病原ノダウイルスは、分子進化学的に4つの遺伝子型(SJNNV、TPNNV、BFNNVおよびRGNNV型)に分類されるが、これらの血清学的関係および感染防御抗原に関する解析はほとんど成されていない。本研究では、遺伝子型の異なるノダウイルスの血清学的関係を明らかにするとともに、本ウイルスの感染防御に関与する抗原の構造解析を行った。昨年度は、SJNNV外被タンパク質遺伝子の塩基配列を基に、遺伝子型の異なるウイルスの外被タンパク質遺伝子を部分的に発現させる系を確立した。本年度は、各遺伝子型ウイルスの発現外被タンパク質を用い、以下の成果を得た。1)まず、各遺伝子型ウイルスの発現タンパク質を精製し、抗SJNNV血清との反応性について検討した。その結果、抗SJNNV血清は遺伝子型の異なるウイルスの発現タンパク質とも交差反応を示したが、その反応強度に明らかな差が認められた。したがって、遺伝子型の異なるウイルスは多数の共通抗原を有するが、血清学的には同一でないことが明らかになった。2)SJNNVの中和活性を有する単クローン抗体を用いた解析では、SJNNVと他の遺伝子型ウイルスとは明らかに異なることが示された。さらに、同単クローン抗体はSJNNV外被タンパク質のアミノ酸配列(aa)254-256に存在するPro-Ala-Ansを認識していることが示唆され、本アミノ酸配列がSJNNVの感染防御に関与する抗原の一つであると考えられた。3)他の遺伝子型ウイルスにおける(aa)254-256は、各々Pro-Pro-Gly、Pro-Glu-GlyおよびPro-Asp-Glyで、各アミノ酸配列はTPNNV、BFNNVおよびRGNNV型ごとに保存されており、遺伝子型の異なるウイルスは血清学的にも異なると考えられた。4)また、本実験過程においてSJNNV非構造タンパク質遺伝子(RNA1)の全塩基配列を決定し、RNA1にコードされているタンパク質がRNA-依存RNAポリメラーゼであることが明らかになった。
ナミハダニ種群の寄生性の変化に関する研究

1.カ-ネ-ションにおける黄緑色型ナミハダニの発生状況を熊本県と鳥取県の生産団地に赴いて実態調査を行った。熊本県では6生産団地のうち2団地において,鳥取県では5生産団地のうち2団地で赤色型ナミハダニとともに黄緑色型ナミハダニの発生していることが認められた。黄緑色型ナミハダニの発生由来については考察するだけの資料は得られなかったが,鳥取県では周囲のハウスに裁哉されているバラやカスミソウからの移動や種苗による持ち込みの可能性が示唆された。2.カ-ネ-ションのスタンダ-ドタイプとスプレ-タイプの両方を含む10品種について赤色型(2個体群)と黄緑色型(5個体群)ナミハダニの発育状況を調査した。その結果,特定の品種で特に発育が良いとか悪いとかという傾向は認められなかった。3.ナミハダニの黄緑色型5個体群,赤色型2個体群についてカ-ネ-ション上における発育率を調査したところ,黄緑色型は赤色型に比べ発育率が明らかに低いことが分かった。しかし,カ-ネ-ション以外から採集した黄緑色型個体群でも卵を接種してやればカ-ネ-ション上でも発育することが明らかとなった。今後はカ-ネ-ション上での成虫之定着率と産卵数についても検討していく必要がある。4.黄緑色型ナミハダニ5個体群をカ-ネ-ション上で飼育し,飼育前の個体群と飼育後生き残った個体群をインゲンマメで増殖させたものについて,18°C,9時間明期15時間暗期の条件下で休眠率を調査したところ,これらの間にほとんど変化がみられなかった。このことから,カ-ネ-ション寄生性と休眠性の間にはそれほど強い関係はないものと考えられる。
単核軟骨吸収細胞septoclastにおける脂肪酸・レチノイン酸代謝の意義

平成30年度は、n-3系不飽和脂肪酸過剰摂取および欠乏餌摂食マウスの作成を行い、septoclastの局在および形態学的解析、septoclastの核内レセプターの解析を行った。具体的な実験としては、これらのマウスおよびコントロールマウスの膝関節の凍結組織切片を作成し、骨端板軟骨の組織学的検討、表皮型脂肪酸結合タンパク(E-FABP)の免疫組織化学的染色の解析を行った。それらの結果から、n-3系不飽和脂肪酸摂取がseptoclastに及ぼす影響と骨端板軟骨吸収の関係を検討したが今のところ有意な結果が得られていないので、引き続き、走査型共焦点レーザー顕微鏡による3D再構築画像の解析、透過型電子顕微鏡による観察、E-FABP遺伝子発現の解析を行い、n-3系不飽和脂肪酸摂取がseptoclastに及ぼす影響と骨端板軟骨吸収の関係を検討していく予定である。また、septoclastにおけるE-FABPの脂肪酸・レチノイン酸摂取の影響を発生過程において解析する一環として、正常マウス胎仔におけるseptoclastの発生を解析した。その結果、E-FABP陽性septoclastはマウス脛骨原基軟骨中央部の軟骨膜付近に出現し、軟骨内へ侵入する血管とともに軟骨表面に移動し、一次骨化中心完成時には、骨端板直下の骨軟骨境界に局在した。E-FABP陽性septoclastには発生最初から生後に至るまで、常にPDGFRbetaまたはNG2の免疫活性が共在した。このことから、septoclastはpericyteから分化してE-FABPを発現することが分かった。septoclastは一次骨化中心の形成の際、血管の侵入に関与していることが示唆された。以上の成果をHistochem Cell Biol (2018) 149:645-654において報告した。septoclastにおけるレチノイン酸摂取が軟骨吸収に及ぼす影響1. septoclastの局在および形態学的解析まずレチノイン酸(RA)過剰投与マウス、ビタミンA(VA)欠損餌摂食マウス及びコントロールマウスの作成を行った。これらのマウスの脛骨骨端板軟骨の組織学的検討を行った後、膝関節の凍結組織切片に対して表皮型脂肪酸結合タンパク(E-FABP)の免疫組織化学染色を行い、骨端板軟骨吸収細胞と考えられているE-FABP陽性septoclastの骨端板領域における分布、数や形態を光学顕微鏡、走査型共焦点レーザー顕微鏡による3D画像再構築、透過型電子顕微鏡による観察で解析した。その結果、RA過剰、VA欠乏両栄養状態で、軟骨吸収低下を示唆する骨端板の組織像と、E-FABP陽性septoclastの数の有意な減少、突起の短縮や減少、微絨毛の喪失などの形態不全が認められた。2. septoclastの核内レセプターの解析、分化増殖機構、アポトーシス誘導の解析RA過剰、VA欠乏におけるseptoclastの細胞数減少、形態変化の原因を探るため、E-FABP陽性septoclastにおける、細胞増殖・抑制の核内レセプターの局在とアポトーシス誘導の解析を二重染色法により行った。その結果RA過剰マウスでseptoclastに細胞増殖を介する核内レセプターPPARbeta/deltaの発現抑制が認められた。今後は、RA過剰マウスおよびVA欠乏マウスにおいて、E-FABP陽性septoclastに対する形態学的解析、E-FABP遺伝子発現の解析、核内レセプター発現の解析、細胞分化・細胞増殖・アポトーシス誘導の解析を行ってゆく予定である。1.septoclastにおけるレチノイン酸摂取が軟骨吸収に及ぼす影響研究計画では2016年度にレチノイン酸(RA)過剰投与マウス、ビタミンA(VA)欠損餌摂食マウスの作成とこれらの栄養条件下におけるE-FABP陽性septoclastに対する形態学的解析、E-FABP遺伝子発現の解析を行い、n-3系不飽和脂肪酸過剰摂取および欠損餌摂食マウスの作成を行う予定であった。2016年度はこれまでにレチノイン酸(RA)過剰投与マウス、ビタミンA(VA)欠損餌摂食マウスの作成を行い、これらの栄養条件下におけるE-FABP陽性septoclastに対する形態学的解析を予定通り行った。また、2017年度以降に行う予定であった核内レセプターPPARbeta/deltaの解析に2016年度中に着手した。E-FABP遺伝子発現の解析は2016年度行う予定であったが、2017年度以降に行う予定である。2. septoclastにおける脂肪酸摂取が軟骨吸収に及ぼす影響2016年度にn-3系不飽和脂肪酸過剰摂取および欠乏餌摂食マウスの作成を行う予定であった。n-3系不飽和脂肪酸欠損餌摂食マウスの作成は2016年度中に予定通り行った。n-3系不飽和脂肪酸過剰摂取マウスの作成に関しては、2016年度行う予定であったが、2017年度以降に行う予定である。また、E-FABP陽性septoclastに対する形態学的解析、E-FABP遺伝子発現の解析、核内レセプター発現の解析、細胞分化・細胞増殖・アポトーシス誘導の解析は、予定通り2017年度以降に行う予定である。平成28年度に、レチノイン酸(RA)過剰投与マウス、ビタミンA(VA)欠損餌摂食マウス及びコントロールマウスの作成を行い、E-FABP陽性septoclastの分布、数や形態を脛骨近位端で組織学的に解析した結果、RA過剰、VA欠乏両栄養状態で、septoclastの数の有意な減少、突起の短縮や減少、微絨毛の喪失などの形態不全が認められた。

平成29年度は、RA過剰、VA欠乏におけるseptoclastの細胞数減少、形態変化の原因を探るため、E-FABP陽性septoclastにおける、細胞増殖・抑制の核内レセプターの局在とアポトーシス誘導の解析を二重染色法により行った。その結果RA過剰マウスでseptoclastに細胞増殖を介する核内レセプターPPARbeta/deltaの発現抑制と、アポトーシスのマーカーのTUNEL陽性反応、アポトーシス誘導を介する核内レセプターRARbetaの局在が認められた。VA欠乏マウスでは、septoclastに細胞増殖抑制と形態変化を誘導するCD-RAPが局在した。以上の結果から、RA過剰マウスではRARbetaを介するアポトーシス誘導により、VA欠乏マウスではCD-RAPの発現を介してseptoclastの細胞数減少、形態変化が引き起こされていることが示唆された。1.septoclastにおけるレチノイン酸摂取が軟骨吸収に及ぼす影響平成28年度にレチノイン酸(RA)過剰投与マウス、ビタミンA(VA)欠損餌摂食マウス及びコントロールマウスの作成とこれらの栄養条件下におけるE-FABP陽性septoclastに対する形態学的解析、E-FABP遺伝子発現の解析を行い、n-3系不飽和脂肪酸過剰摂取および欠損餌摂食マウスの作成を行う予定であった。平成28年度はレチノイン酸(RA)過剰投与マウス、ビタミンA(VA)欠損餌摂食マウスの作成を行い、これらの栄養条件下におけるE-FABP陽性septoclastに対する形態学的解析を予定通り行った。平成29年度に、核内レセプターPPARbeta/deltaの解析、細胞増殖・抑制、アポトーシス誘導に関する解析を予定通り行った。2. septoclastにおける脂肪酸摂取が軟骨吸収に及ぼす影響平成28年度にn-3系不飽和脂肪酸過剰摂取および欠乏餌摂食マウスの作成を行う予定であった。n-3系不飽和脂肪酸欠損餌摂食マウスの作成は平成28年度中に予定通り行った。n-3系不飽和脂肪酸過剰摂取マウスの作成に関しては、平成28年度行う予定であったが、平成30年度に行う。また、E-FABP陽性septoclastに対する形態学的解析、E-FABP遺伝子発現の解析、核内レセプター発現の解析、細胞分化・細胞増殖・アポトーシス誘導の解析は、平成29年度に着手する予定であったが遅れており、平成30年度に行う。平成30年度は、n-3系不飽和脂肪酸過剰摂取および欠乏餌摂食マウスの作成を行い、septoclastの局在および形態学的解析、septoclastの核内レセプターの解析を行った。具体的な実験としては、これらのマウスおよびコントロールマウスの膝関節の凍結組織切片を作成し、骨端板軟骨の組織学的検討、表皮型脂肪酸結合タンパク(E-FABP)の免疫組織化学的染色の解析を行った。それらの結果から、n-3系不飽和脂肪酸摂取がseptoclastに及ぼす影響と骨端板軟骨吸収の関係を検討したが今のところ有意な結果が得られていないので、引き続き、走査型共焦点レーザー顕微鏡による3D再構築画像の解析、透過型電子顕微鏡による観察、E-FABP
膵癌細胞-癌間質線維芽細胞クロストーク制御による膵癌オーダーメイド治療法の開発

膵癌間質組織の膵星細胞は、癌細胞の分泌する成長因子で活性化し、癌細胞の増殖・浸潤を促す。このクロストークを捉えることは、膵癌オーダーメイド治療戦略を確立する一助になる。初代培養膵星細胞の培養上清は、膵癌細胞の増殖を促進したが、液性因子の網羅的解析は再現性の観点から困難であった。そこで、手術時に採取された切除標本から、顕微鏡的に癌細胞・膵星細胞を分離採取して液体クロマトグラフィータンデム質量分析を用いたショットガンプロテオミクスによる網羅的発現解析を行った。3000種以上の蛋白質を同定し、転移・浸潤に綿密に関連する臨床徴候であるリンパ節転移に着目し、リンパ節転移陽性症例群と陰性症例群で発現に有意差を認める、490種の蛋白に絞り込みを行った。最終的に発現多寡による統計解析で、リンパ節転移陽性症例に群間差2倍以上の高発現する5種の蛋白質及び陰性症例に群間差2倍以上で高発現する4種の蛋白質を同定した。組織免疫染色による再現確認で、膵癌細胞及び膵星細胞にヘモペキシン及びフェリチン軽鎖の発現を確認した。ヘモペキシンは、解析した切除膵癌の80%以上に発現を認めたが、年齢・性別・腫瘍径・癌遺残度・組織学的異型度には関連していなかった。ヘモペキシン陽性は、リンパ節転移、転移陽性比率、静脈侵襲、リンパ管侵襲と有意に関連していた。膵癌細胞及び膵癌関連間質膵星細胞に存在するリンパ節転移関連蛋白質が、膵癌の浸潤・増殖に関連することが明らかにされた。膵癌間質膵星細胞発現蛋白質を治療標的として、膵癌-膵星細胞クロストークを制御することで、膵癌オーダーメイド治療戦略が確立する可能性が示唆された。膵癌の間質組織には膵星細胞が存在し、膵癌細胞の分泌する成長因子で活性化して膵癌細胞の増殖、遊走、転移を促す。癌細胞-膵星細胞クロストークを捉えることにより、膵癌オーダーメイド治療戦略を確立することを目的とした。手術切除標本を用いて、膵星細胞の初代培養を行い、3系統の初代培養を樹立した。樹立した星細胞を癌細胞とともに、免疫不全マウスに共移植したモデルを作成した。同モデルに種々のシグナル伝達を阻害するリン酸化阻害剤を投与して、共移植された腫瘍の微小環境の変化を検討するための基礎実験を行っている。過去の多くの報告では、初代培養の膵星細胞を用いた検討は少なく、不死化された膵星細胞が用いられているため、不死化の過程で生じる細胞の性質変化の影響が除外できない。初代培養の膵星細胞により種々の検討を行うことができれば、不死化の影響が除外され、更に膵癌細胞との共移植により、癌細胞ー膵星細胞のクロストークが解析できると考えられた。共移植された腫瘍の解析はまだ充分に行えていない。初代培養膵星細胞の培養上清を回収して作成した調整培地を、培養膵癌細胞に添加したところ、予想通り、膵星細胞培養上清添加により、膵癌細胞の生育は促進された。生態環境に近い初代培養膵星細胞(不死化ではない)が産生する何らかの液性因子が膵癌細胞の増殖を促す可能性が示された。そこで、液性因子の網羅的解析のために、初代培養膵星細胞の培養上清を充分量調整・採取しており、解析を進める予定である。必要とされる初代培養膵癌細胞ー膵星細胞の共移植モデルにおいては、細胞数を充分に確保する必要がある。しかし、初代培養膵星細胞では、生育条件が不死化細胞と異なり、細胞増殖にばらつきがあり、再現性のある実験の反復がやや困難な面がる。初代培養の膵星細胞の生育が充分でないため、解析に必要な培養上清が反復実験に耐える量得られていない。また、充分な細胞数が準備された場合でも、移植条件により移植腫瘍の生育にばらつきが生じることがあるため、モデルの確立がまだ安定していない可能性がある。樹立した星細胞を癌細胞とともに、免疫不全マウスに共移植したモデルを作成したが、初代培養膵星細胞では、生育条件が不死化細胞と異なり、細胞増殖にばらつきがあり、再現性のある実験の反復が困難であった。そこで、手術時に採取された膵癌切除標本のホルマリン固定標本から、切片を作成し、顕微鏡的に癌細胞・癌関連膵星細胞を分離採取して、液体クロマトグラトグラフィータンデム質量分析(LC-MS/MS)を行った。LC-MS/MS測定の結果、間質で1067種類、癌細胞で2938種類、合計で3054種類のタンパク質を同定した。同定したタンパク質を、スペクトラルカウント法:存在比(Abundance ratio)及びG-検定により、間質及び癌細胞にで、それぞれリンパ節転移陽性群と転移陰性群の群間比較を行った。全体のうち5サンプル中3サンプル以上で発現を認め、存在比-1未満もしくは、存在比1以上かつG-testにてp値0.05未満を満たす条件でタンパク質を限定した。その結果、間質で67種類、癌細胞で205種類までの候補タンパク質の絞り込みが可能であった。

初代培養膵星細胞では、細胞増殖にばらつきがあり、再現性のある実験の反復が困難であったため、方法をホルマリン固定標本からの癌細胞・癌関連膵星細胞を分離・液体クロマトグラトグラフィータンデム質量分析(LC-MS/MS)に修正したことで、進捗している。膵癌間質組織の膵星細胞は、癌細胞の分泌する成長因子で活性化し、癌細胞の増殖・浸潤を促す。このクロストークを捉えることは、膵癌オーダーメイド治療戦略を確立する一助になる。初代培養膵星細胞の培養上清は、膵癌細胞の増殖を促進したが、液性因子の網羅的解析は再現性の観点から困難であった。そこで、手術時に採取された切除標本から、顕微鏡的に癌細胞・膵星細胞を分離採取して液体クロマトグラフィータンデム質量分析を用いたショットガンプロテオミクスによる網羅的発現解析を行った。3000種以上の蛋白質を同定し、転移・浸潤に綿密に関連する臨床徴候であるリンパ節転移に着目し、リンパ節転移陽性症例群と陰性症例群で発現に有意差を認める、490種の蛋白に絞り込みを行った。最終的に発現多寡による統計解析で、リンパ節転移陽性症例に群間差2倍以上の高発現する5種の蛋白質及び陰性症例に群間差2倍以上で高発現する4種の蛋白質を同定した。組織免疫染色による再現確認で、膵癌細胞及び膵星細胞にヘモペキシン及びフェリチン軽鎖の発現を確認した。ヘモペキシンは、解析した切除膵癌の80%以上に発現を認めたが、年齢・性別・腫瘍径・癌遺残度・組織学的異型度には関連していなかった。ヘモペキシン陽性は、リンパ節転移、転移陽性比率、静脈侵襲、リンパ管侵襲と有意に関連していた。膵癌細胞及び膵癌関連間質膵星細胞に存在するリンパ節転移関連蛋白質が、膵癌の浸潤・増殖に関連することが明らかにされた。膵癌間質膵星細胞発現蛋白質を治療標的として、膵癌-膵星細胞クロストークを制御することで、膵癌オーダーメイド治療戦略が確立する可能性が示唆された。初代培養膵星細胞及び膵癌細胞が充分に得られない、あるいは充分な増殖が確立されない場合、実験の再現性に影響を及ぼし、のちの解析に困難を伴うことが予想される。そこで、手術時に採取された膵癌切除標本のホルマリン固定標本から、切片を作成し、顕微鏡的に癌細胞・癌関連膵星細胞を分離採取して、液体クロマトグラトグラフィータンデム質量分析を行うことも検討する。また、分離採取が充分な制度で行われない場合には液体クロマトグラトグラフィータンデム質量分析で成果が出ない可能性あるため、切除切片を用いた免疫組織染色を行うことも検討する。当施設では、膵癌切除症例が年間40-50例あるため、化学療法・化学放射線療法後の切除例と未治療切除例の切除標本がある。それらの標本から、治療介入別に膵癌ー膵星細胞の関連を検討していく方向性も検討している候補タンパク質を最終的に10種類程度に選定する予定である。LC-MS/MS測定を行なった10症例で免疫組織化学を行いタンパク質発現の局在を確認したのち、多数の膵癌切除症例(術前治療介入未施行膵癌症例)で免疫組織化学を行い、臨床病理学的因子との関係を検証する。
超音波診断装置を活用した母親準備教育プログラムの確立に向けて

今回はこれまでの研究結果(荒木,2007)から胎児の腕の動きを指標にし、妊婦の音楽聴取時の胎動(腕の動き)の変化と、妊婦の腹部を介して胎児に音楽をきかせた時の胎動の変化を明らかにすることを研究目的とした。対象:妊娠3536週の妊婦32人、方法:妊婦にヘッドホンを装着し音楽を聴取してもらった。胎児には妊婦の腹部にヘッドホンを装着し音楽を聴取してもらった(この際、音がもれないよう妊婦に防音用のヘッドホンを装着した)。音楽のボリュームは、妊婦に平均70db、胎児に平均105dbとなるようDVDプレイヤーにアンプを接続し、調整した(B.S. Kisilevsky,2004)。胎動の回数および持続時間を音楽聴取前5分間、音楽聴取時5分間、音楽聴取後5分間、計15分間を超音波診断装置にて観察し、録画再生し分析した。また、妊婦には心電計および分娩監視装置を装着した。音楽はモーツアルト(二長調K448)を用いた。モーツアルトは一般的に胎教の目的で使用されることが多く、その中でもこの曲は活性的な気分が高まることが報告されている(Thompson, Schellenberg, & Husain,2001)。また、音楽聴取前後の情動の変化を測定するために心理テストProfile of Mood States (POMS)にて6種類の情動(緊張-不安、抑うつ-落ち込み、怒り-敵意、活気、疲労、混乱)を測定した。音楽聴取前の6種類の情動の平均値および中央値を算出し、中央値からの高低で2群に分け分析した。」その結果、妊婦音楽聴取群15人では情動の高低で胎動に変化はなかった。一方、胎児音楽聴取群17人では緊張、不安が低い妊婦は高い妊婦に比べ胎動が減少した(P<0.05)。また活気が低い妊婦は活気が高い妊婦に比べ胎動が減少し(P<0.05)、疲労が高い妊婦は疲労が低い妊婦に比べ胎動が減少した(P<0.05)。妊婦は、20週前後になると直接的に胎動というかたちで胎児から働きかけを受け、その働きかけに反応することでより胎児への愛着を深めている。このように妊娠中から妊婦と胎児との関係が良好に形成されていくことは、出産後の母子関係確立を援助するための有効な方法だと考えられる。これまでに我々は、妊婦に情動を喚起する方法を確立し、妊婦と胎児30組を対象に妊婦の情動に反応する胎児の胎動および表情の変化を解析した。その結果、妊婦の情動の変化は胎児の各身体部位の動きに影響を与えることがわかった。本年度は、妊婦の胎児に対する愛着形成を促す一つの援助法として妊婦の五感の中でも特に視覚に注目し、3Dエコー(3次元型超音波診断装置)により胎児の顔の表出を試みた。つまり妊婦が三次元型胎児の顔をみることは胎児に対する愛着に有効かどうか解明することを本研究の目的とした。胎児愛着の測定には高橋らによる10の質問からなる簡易化胎児愛着テストを用い測定した。その結果、妊婦28人中、胎児の顔をみた妊婦16人はエコー前41.9±1.08点、エコー後45.5±1.02/50点満点、胎児の顔をみなかった妊婦12人はエコー前43.8±0.87点、エコー後44.8±0.78点であった。エコー前後の胎児愛着尺度の変化については、顔を見た妊婦は3.56±0.59点、顔をみなかった妊婦は1.0±0.59点増加しており、胎児の顔を見た妊婦のほうが胎児の顔をみなかった妊婦に比べ、胎児愛着尺度が有意に増加していた(P<0.05)。つまり3Dエコーによって胎児の顔を視覚的にみること妊婦の胎児に対する愛着が増加することがわかった。」

その結果、妊婦音楽聴取群15人では情動の高低で胎動に変化はなかった。一方、胎児音楽聴取群17人では緊張、不安が低い妊婦は高い妊婦に比べ胎動が減少した(P<0.05)。また活気が低い妊婦は活気が高い妊婦に比べ胎動が減少し(P<0.05)、疲労が高い妊婦は疲労が低い妊婦に比べ胎動が減少した(P<0.05)。
良タンパク質米の育種

昭和63年度ー平成2年度の3年間に亙る「良タンパク質米の育成」に関する本研究期間中以下の成果を得た。(1)九州大学に保存する国内外の稲約1、400品種およびMNU受精卵処理によって誘発した突然変異900系統の種子貯蔵タンパク質をグラジエントゲルを用いたSDSーPAGEによって分析した。既報の4タイプの突然変異に加え、グルテリンに関する変異体や、グロブリンに関する変異体等を得た。(2)新たに等電点電気泳動法(IEF)を導入し、種子貯蔵タンパク質に関する構造遺伝子変異探索を行った。IEF分析ではグルテリン酸性サブユニットは等電点の異なる13種のタンパク質から構成され、塩基性サブユニットは9種のタンパク質から構成されていた。しかし、構成タンパク質の数やその等電点は品種間で大きな差異が認められた。一方、PBーIの主構成タンパク質であるプロラミンは等電点の異なる9ー12種のタンパク質から構成されるが、グルテリン同様プロラミンについても構成タンパク質の等電点や数に大きな品種間差異が認められた。(3)得られた変異体について、遺伝様式の解明、同座性検定、三染色体分析による座乗染色体の決定を行った。espー1-espー6(t)の6遺伝子について座乗染色体を決定できた。IEF分析の結果、品種中に見いだされた変異は大部分がそれぞれのペプチドをコ-ドする構造遺伝子の変異であると推察された。(4)良タンパク質米育成に対する突然変異体遺伝子の遺伝子資源としての評価を行った。変異系統は優良品種と交配し劣悪形質を取り除くことにより、これらの突然変異遺伝子を良タンパク質米育成の遺伝子資源として利用することが可能であると判断された。本研究で得た突然変異系統及び品種内に見いだした変異系統を奨励品種と交配し、良タンパク質米育成の中間母本育成に取り組んでいる。良タンパク質米の育成に関し、本年度実施項目について検討し以下の結果を得た。(1)既知の4遺伝子espー1,ー2,ー3およびー4間の相互交配を行い、多数のF_1種子を得た。またIsogenic Lines作成のため原品種「金南風」との交配を行った。(2)espー1およびespー2の連鎖分析を行い、espー1は染色体10上にd_6ーgーRcーSpl_5ーV_<11>ーrfsーespー2で配列し、一方、espー2はZ_2ーdtーdrp_7ーlaーV_4ーSpーespー2ーV_9の配列で染色体9に座乗すると推定された。(3)トリソミック分析の結果、espー3はG型トリソミックとのF_2でトリソミック分離を示し、espー2同様染色体9に座乗すると推定される。(4)1986処理M_3系統について貯蔵タンパク質に関する変異体の探索を行ったところ、新たに57ーH変異体12系統、13bーL変異体2系統、10/13aーL変異体1系統、10/16ーH変異体2系統を得た。加えて、これまで未知のPBーIIグルテリンに関する変異体3系統、26および16KDaグロブリンが顕著に減少する変異体7系統を得た。さらに九大保存系統中に多数の13bーL系統およびグルテリンαー3サブユニット欠損系統が存在することを確認した。(5)1987処理M_1植物を育成し、多数のM_2系統を得た。さらに新たにニシホマレ、台中65号およびIR36の3品種についてMNU受精卵処理を行い、多くのM_1種子を得た。