hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
燃焼のサイクル変動予測のための基礎実験

燃焼のサイクル変動因子を特定するために,平均流速や点火源のサイクル毎の変動は取り除いた状態で,乱れ特性と混合気の空間分布を変化させた状態の実験及び計算を行った.まず実験に関し2つの異なる濃度を有するプロパン-空気予混合気を層状に分布させた状態で燃焼実験が行える定容容器を使って,指圧計測,シュリーレン撮影,イオンプローブによる計測を行った.この結果1)平均当量比を一定として2つの予混合気の界面近傍で着火させたときの燃焼特性は,リッチ側混合気の影響が強く,均一混合気での燃焼に比べて急速な燃焼が行われること,2)層状燃焼させたときの急速な燃焼は,初期燃焼期間の短縮の影響が相対的に強いこと,3)この急速な燃焼の理由は,シュリーレン撮影及びイオンプローブ測定より,火炎面が徐々に広がるのではなく特異な形状で広がるためであること,などが明らかになった.一方計算に関し,層状化された予混合気の火炎伝播の様子を正確に予測できることが検証された燃焼モデルは存在しない.そこで,これまでに提案されている火炎暖波燃焼モデルの中から,火炎場の輸送方程式(G-Equation)と乱流燃焼速度はフラクタルモデルを組み合わせて用いて,一様混合場の計算を行った.火炎のストレッチング効果を考慮しなかったため,実際よりも大きな燃焼速度が示された.以上の結果をまとめると,混合気濃度が不連続的に変化すると燃焼速度は大きく変化し,その原因は火炎伝播の様子が異なるためと考えられるが,その詳細な現象は明らかではない.また計算に関しても,実験との比較によるモデルの評価・改良を行ってゆく必要がある.燃焼のサイクル変動因子を特定するために,平均流速や点火源のサイクル毎の変動は取り除いた状態で,乱れ特性と混合気の空間分布を変化させた状態の実験及び計算を行った.まず実験に関し2つの異なる濃度を有するプロパン-空気予混合気を層状に分布させた状態で燃焼実験が行える定容容器を使って,指圧計測,シュリーレン撮影,イオンプローブによる計測を行った.この結果1)平均当量比を一定として2つの予混合気の界面近傍で着火させたときの燃焼特性は,リッチ側混合気の影響が強く,均一混合気での燃焼に比べて急速な燃焼が行われること,2)層状燃焼させたときの急速な燃焼は,初期燃焼期間の短縮の影響が相対的に強いこと,3)この急速な燃焼の理由は,シュリーレン撮影及びイオンプローブ測定より,火炎面が徐々に広がるのではなく特異な形状で広がるためであること,などが明らかになった.一方計算に関し,層状化された予混合気の火炎伝播の様子を正確に予測できることが検証された燃焼モデルは存在しない.そこで,これまでに提案されている火炎暖波燃焼モデルの中から,火炎場の輸送方程式(G-Equation)と乱流燃焼速度はフラクタルモデルを組み合わせて用いて,一様混合場の計算を行った.火炎のストレッチング効果を考慮しなかったため,実際よりも大きな燃焼速度が示された.以上の結果をまとめると,混合気濃度が不連続的に変化すると燃焼速度は大きく変化し,その原因は火炎伝播の様子が異なるためと考えられるが,その詳細な現象は明らかではない.また計算に関しても,実験との比較によるモデルの評価・改良を行ってゆく必要がある.
カルシウムシグナリングにおける細胞内ナノシステムの統合

本研究では、カルシウムシグナリングに焦点を当て、生体を構成する分子からなる細胞内ナノシステムがどのように細胞機能を実現するかを解明するため、新しい分子イメージングプローブの開発を行った。開発されたプローブによって、分子の可視化を行うことに成功し、カルシウムシグナルがどのように制御されているかについてその実態を明らかにした。本研究においては、様々な生理機能の制御に役立っているカルシウムシグナリングについて解析し、どのように細胞内のカルシウムの時空間的特長が解釈され下流の分子群を制御するのかについて明らかにする。この目的のため、本年度においては今後の研究遂行に必要な予備的実験や材料の整備を中心に研究を遂行する計画であった。カルシウム依存性のシグナル分子の可視化法については、カルシウム・カルモジュリン依存性であるミオシン軽鎖キナーゼの活性をモニターすることができる実験系を目指した。ミオシン軽鎖はリン酸化依存性に構造変化を起こすと考えられ、その構造変化を蛍光によって検出することができれば、ミオシン軽鎖キナーゼの活性をリアルタイムにモニターすることができると考え、ミオシン軽鎖にGFPのバリアントであるECFPおよびCitrineを融合させた蛋白質であるCRCit(ECFP-RMLC-Citrine)を作製した。CRCitをラット血管平滑筋初代培養細胞に発現させ、分化を誘導すると、CRCitの蛍光が線維状に認められ、CRCitはミオシンに正しく取り込まれることが確認された。さらに、CRCit発現細胞をアゴニスト、イオノマイシンによって刺激するとCFPとcitrine間の蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)効率が変化することが観測された。これらのFRET変化はリン酸化を阻害することによって消失し、FRET変化が確かにリン酸化を反映することが示された。以上の結果からCRCitは生きた細胞内でミオシン軽鎖キナーゼの活性をリアルタイムでイメージングすることができるプローブであり、カルシウムシグナルによる制御様式を今後解明していく上で有用なツールとなると考えられる。本研究においては、様々な生理機能の制御に役立っているカルシウムシグナリングを中心としたナノシステムについて解析し、どのように細胞内のカルシウムの時空間的特長が解釈され下流の分子群を制御するのかについて明らかにすることを目的としている。平成17年度においては、特に中枢神経シナプスにおけるカルシウムシグナリングに焦点を当て、研究を行った。シナプス前終末に活動電位が伝わると膜電位依存性カルシウムチャネルが開口し、カルシウム濃度が上昇する。このカルシウム濃度上昇によって、シナプス伝達物質の放出や一酸化窒素の生産が誘発されることが知られている。そこで、これまでに開発した一酸化窒素(NO)の可視化蛍光プローブであるHBR-GFPを用いて、平行線維-プルキンエ細胞シナプスにおけるNO動態を解析した結果、NOの拡散は平行線維入力箇所のごく近傍の微小領域に限局していることが明らかとなった。また、平行線維刺激によるポストシナプスにおけるカルシウム応答とNO応答の空間的広がりについて比較解析することによって、NOシグナルはカルシウムシグナル同様の空間的広がりを持つことが明らかとなり、NOシグナルもシナプス特異性のある細胞内応答であることが示唆された。さらに、NOの空間限局性の意義についても解析を行った。一箇所でLTP誘導刺を与え、刺激部位から様々な距離離れた部位でLTP誘導の有無を調べた結果、わずか10μm離れるとLTPの誘導の程度は激減し、20μm以上の部位ではLTPはまったく起こらないことを見出した。さらに、わずかに離れた場所で誘発されるLTPは刺激される神経線維のオーバーラップによることが示された。これらの結果はNOの限局性がシナプス特異的なLTP誘発を制御するのにきわめて重要であることを示唆する。平成18年度は、1.中枢神経の細胞内カルシウムシグナリング機構のひとつであるシナプスの伝達物質放出機構に加えて、2.細胞間コミュニケーションにおけるカルシウムシグナリングの役割について研究を行なった。1.伝達物質放出機構については、伝達物質そのものの可視化の実現が重要であると考え、中枢神経で主要な神経伝達物質であるグルタミン酸の可視化を試みた。グルタミン酸可視化プローブの作成に当たり、グルタミン酸受容体のサブユニットであるGluR2の細胞外ドメインを利用した。このドメイン内のアミノ酸をシステインに置換した変異体をリコンビナント蛋白質として大腸菌内で発現・精製後、蛍光性物質であるオレゴングリーンマレイミドでラベルした。この蛍光ラベル体は、グルタミン酸結合によって蛍光強度の変化を呈し、グルタミン酸可視化プローブとして利用可能であることが分かった。2.細胞間コミュニケーションにおけるカルシウムシグナリングの役割については、細胞間の接触の際に一過性のカルシウム濃度上昇が見られること、このカルシウム濃度上昇がチロシンリン酸化酵素であるPYK2を介して細胞間のrepulsionを誘発することが明らかとなった。

本研究においては、様々な生理機能の制御に役立っているカルシウムシグナリングを中心としたナノシステムについて解析し、どのように細胞内のカルシウムの時空間的特長が解釈され下流の分子群を制御するのかについて明らかにすることを目的としている。この目的のため、平成19年度においては引き続き、カルシウムシグナリングのイメージング法と制御法の開発、有効なノックダウン法の確立など技術開発研究を推進しつつ、カルシウムシグナリングについて細胞レベルの機能解明を行った。特筆すべき成果としては、アストロサイトのカルシウムシグナリングと神経突起伸張の制御に関する結果が挙げられる。アストロサイトは神経細胞とともに中枢神経系を構成する重要な細胞であり、神経細胞機能の制御を行っていることが示唆されているが、その詳細には不明な点が多い。このアストロサイトでは、カルシウム振動やカルシウム波といった複雑なカルシウム動態が観測されることが知られているが、その役割は不明であった。アストロサイトにIP3の分解酵素であるIP3 5-phosphataseを発現させ、カルシウムシグナリングを人工的に止めたところ、アストロサイトのカルシウム振動が停止するとともに、共培養した神経の突起伸張が阻害された。カルシウム振動が抑制されたアストロサイトと抑制されていないアストロサイトが混在化した状態で調べると神経突起伸張の抑制はカルシウム振動が抑制されたアストロサイト上のみでみられた。このことから、神経突起伸張を制御する因子として、細胞膜上に発現している分子の関与が示唆された。さらに、この分子実体を探索し、Nカドヘリンであることが示唆された。以上の結果は、アストロサイトと神経細胞の機能的連関の理解に重要な知見を与えるものである。本研究では、分子イメージングプローブの開発と生細胞におけるイメージング実験を通じて、カルシウムシグナルを構成するナノシステムの構築と制御の問題にアプローチしている。本年度の分子イメーイングプローブ開発として、低分子・蛋白質融合型分子プローブの高効率作製技術の開発を目指した。具体的には、96穴プレートフォーマットを用いて多種類の候補プローブを同時に作製したうえでハイスループットに性能評価を行うことによって、短期間に目的の分子プローブを得ることを可能にする技術の開発を目指し、PCRによる変異導入、大腸菌の形質転換、蛋白質発現、蛍光色素ラベルといった各ステップにおいて最適な反応系の構築を試みた。特にボトルネックになっていたのは形質転換後蛋白質発現のプロセスであったが、半固体培地を用いて形質転換株をセレクションした後に半固体培地を融解し液状化した状態で蛋白質を発現させることによって解決を図った。その結果、23日で千種類程度のプローブの候補をスクリーニングする系の構築に成功し、実際にグルコース、アラビノース、グルタミン酸といった生体分子について高い性能を持つ蛍光プローブを得ることができた。さらに、用いる低分子蛍光色素を変えることによって、青赤といった様々な蛍光スペクトルを持つプローブを作製可能であることが示された。
ゼオライト触媒による炭化水素酸化における形状選択性の研究

チタンを含んだMFI構造のゼオライトTS-1を合成し、それを用いて、アルカン、アルケンの酸化反応を形状選択的に行わせることに成功した。ケイ酸およびチタン化合物を原料とし、水酸化テトラプロプルアンモニウムを細孔径調節剤として用い、オートクレーブ中、水熱合成により合成した、MFI構造を有するチタン含有ゼオライトのFT-IRでは960cm^<-3>にチタンの含有量に比例した強度の吸収が現れることを観察し、過酸化水素との反応で消失することから、Ti=Oの伸縮振動に帰属した。従来考えられていた構造よりも、Ti=Oを有し、Si-O-H基で囲まれた56配位の構造が有力であるものと結論した。また、3700cm^<-1>付近のO-H伸縮振動がシリカライトに比べて数倍の強度を有することが観察された。このチタノシリケートを触媒とし過酸化水素を酸化剤として、オレフィン、パラフィンの酸化を行った。オレフィン、パラフィンの形状によって反応性が大きくことなることが分かった。すなわち、このゼオライトは直鎖炭化水素は効率よく酸化し、分枝、環状の酸化はほとんど起こさない特異な形状選択性を有することを見いだした。この選択性は細孔径と基質の分子径の大小関係に起因するものと考えられるが、吸着特性もこれを裏付ける。また、アルカン、アレーンの水酸化活性とTi=OのIR吸収強度によい相関を見いだし、Ti=Oが活性点であるものと推定した。しかし、アルケンのエポキシ化との相関はなかった。MEL構造を有するゼオライトの合成にも成功した。反応性はMFI構造のものと類似した結果を示した。バナジウムを含むMFI,MEL構造のゼオライトの合成にも成功したが触媒活性は小さかった。ソーダライト型、Y型、モルデナイト型のゼオライトをつくることも試みたがアモルファスの生成物しか得られなかった。ゼオライトの有する分子オ-ダ-の細孔を持つという特性を利用して分子形状に基づいた特異な選択能を有するいわゆる形状選択的触媒の研究を行なった。従来の形状選択的反応はゼオライトが本来有する酸性を利用した反応にほとんど限られていたが、われわれはチタンを含んだZSMー5型ゼオライトであるチタノシリケ-トが直鎖炭化水素のみを酸化し、環状炭化水素を酸化しないという特異な形状選択性を示す酸化触媒であることを発見した。ケイ酸およびチタン化合物を原料とし、テトラプロピルアンモニウムヒドロキサイドならびにテトラブチルアンモニウムヒドロキサイドを細孔径調節剤として用い、オ-トクレ-ブ中、水熱合成によりチタン含有ゼオライトを合成する。合成したゼオライトはXRDにより同定し、ゼオライト構造を有することを確認し、IRによりTi=0構造を有することを確認した。これらのゼオライトを触媒とし過酸化水素を酸化剤として、オレフィン、パラフィンの酸化を行ったところ、活性はTi=0活性点の数とよい相関を示した。オレフィン、パラフィンの形状、炭素数の影響について検討し、細孔径と分子径により基質の吸着量が変化することで説明できることを見いだした。一方市販のゼオライト(シリカライト、ZSMー5、モルデナイト、Y)の水溶液中酸性条件下での反応、または塩化チタンを用いた高温気相反応により、チタンを導入したが、形状選択性が出現しなかったことから、チタンは外表面に存在しているものと考えた。また、チタンあたりの活性が低いことは、Ti=0の構造がIRでほとんど見られないことと対応しているものと推察した。

チタンを含んだMFI構造のゼオライトTS-1を合成し、それを用いて、アルカン、アルケンの酸化反応を形状選択的に行わせることに成功した。ケイ酸およびチタン化合物を原料とし、水酸化テトラプロプルアンモニウムを細孔径調節剤として用い、オートクレーブ中、水熱合成により合成した、MFI構造を有するチタン含有ゼオライトのFT-IRでは960cm^<-1>にチタンの含有量に比例した強度の吸収が現れることを観察し、過酸化水素との反応で消失することから、Ti=Oの伸縮振動に帰属した。従来考えられていた構造よりも、Ti=Oを有し、Si-O-H基で囲まれた56配位の構造が有力であるものと結論した。また、3700cm^<-1>付近の0-H伸縮振動がシリカライトに比べて数倍の強度を有することが観察された。このチタノシリケートを触媒とし過酸化水素を酸化剤として、オレフィン、パラフィンの酸化を行なった。オレフィン、パラフィンの形状によって反応性が大きくことなることが分かった。すなわち、このゼオライトは直鎖炭化水素は効率よく酸化し、分枝、環状の酸化はほとんど起こさない特異な形状選択性を有することを見いだした。この選択性は細孔径と基質の分子径の大小関係に起因するものと考えられるが、吸着特性もこれを裏付ける。また、アルカン、アレーンの水酸化活性とTi=OのIR吸収強度によい相関を見いだし、Ti=Oが活性点であるものと推定した。しかし、アルケンのエポキシ化との相関はなかった。MEL構造を有するゼオライトの合成にも成功した。反応性はMFI構造のものと類似した結果を示した。バナジウムを含むMFI、MEL構造のゼオライトの合成にも成功したが触媒活性は小さかった。ソーダライト型、Y型、モルデナイト型のゼオライトをつくることも試みたがアモルファスの生成物しか得られなかった。
遠隔臓器虚血プレコンディショニングによる脊髄虚血耐性効果の臨床的検討

マウスに対する虚血プレコンディショニングが施行されて24時間後の血液中のエクソソームに含有されているmicroRNAの発現レベルの変化が網羅的に解析された。胸部ステントグラフト内挿術を受ける患者に対して、術前に虚血プレコンディショニングが施行された患者と施行されなかった患者の術前と術後24時間におけるエクソソームに含有されているmicroRNAが網羅的に解析された。血管新生に関与するANGPT1を抑制することが報告されているmicroRNAは虚血プレコンディショニングが施行された患者で発現が下がっていることが観察された。遠隔臓器における虚血プレコンディショニングには2相性(Early Phase、Late Phase)があり、我々のグループは、Late Phaseにおける心筋の虚血耐性に、骨髄由来幹細胞の動員と集積が関与していることを報告してきた。本研究は脊髄の虚血耐性に、遠隔臓器における虚血プレコンディショニングが有効であるか、そして、骨髄由来幹細胞が関与するかを調べるものである。今年度はIRBに提出する書類に必要となる動物実験を行った。C57BL/6マウスの下肢に対して虚血プレコンディショニングを実施した後に、脊髄虚血を誘導して48時間後の血中の様々な炎症性サイトカインを測定したところ、虚血プレコンディショニングを実施した群では、実施しなかった群に対して、TNF-alphaが約20%減少したことから、虚血プレコンディショニングは炎症を抑える効果があることが示唆された。短時間の虚血と再灌流を数回実施する虚血プレコンディショニング法は、臓器保護効果があることが報告されている。虚血プレコンディショニング法を実施すると、その後の長時間の臓器虚血における組織の損傷が、何もしない状態から長時間の臓器虚血を行った時よりも、組織の損傷が軽減されることが報告されているが、そのメカニズムは完全には解明されていない。我々の研究グループはこれまでに、虚血プレコンディショニング法を行うと、末梢血中でCD34陽性骨髄細胞の割合が増加することを報告してきた。本年度、我々はCD34陽性骨髄細胞が生産する虚血状態から臓器保護作用を持つ因子の発現レベルを比較検討した。C57BL/6マウスの大腿骨から骨髄細胞を採取し、抗CD34抗体を用いて骨髄細胞の中でCD34陽性細胞の数を、フローサイトメトリーで確認すると、骨髄細胞の中で約11%の細胞がCD34陽性であった。次に、抗CD34抗体を用いて、CD34陽性骨髄細胞とCD34陰性骨髄細胞に分離し、total RNAを抽出し、cDNAを作製し、これまでに報告されている虚血状態から臓器保護作用を持つ因子8個の遺伝子のmRNAの発現をリアルタイムPCRで確認した。CD34陰性骨髄細胞と比較して、CD34陽性骨髄細胞の発現レベルが高いのは、GDF15が約45倍、Dkk1が約30倍、IL10とFGF9がそれぞれ約12倍であったことから、CD34陽性骨髄細胞は、虚血状態に対して臓器保護作用を持つ因子を生産している可能性が示唆された。今後は臨床試験において、健常人に対して虚血プレコンディショニング法を実施する前後で、末梢血中のCD34陽性細胞の割合が変化するかを、フローサイトメトリー等で確認する計画である。臨床試験を実施するために、本学の臨床研究センターに書類を提出し、審査を受けていたが、該当年度の年度末に我々が提出した臨床試験が承認された為に、臨床試験実施までには至っていないが、現在、臨床試験を実施するために、被験者をリクルートしている段階である。胸部大動脈瘤に対するステントグラフト内挿術を受けた一部の患者は、術後に一時的または永久的な下肢麻痺が生じる。この下肢麻痺を軽減させる方法として、本申請者は虚血プレコンディショニングに注目した。虚血プレコンディショニングは、臓器に対して予め短時間の虚血再灌流を繰り返し行うことで、その後の長時間の虚血状態からの再灌流による臓器障害を軽減させる方法として報告されている。臓器に対して直接、虚血プレコンディショニングを実施する方法と、間接的な方法として遠隔臓器に対して虚血プレコンディショニングを実施する方法があり、これまでに動物実験において、心臓、腎臓、脊髄などに対して直接または間接による虚血プレコンディショニングを実施することで臓器が保護されることが知られている。これまでの動物を用いた研究において、虚血プレコンディショニングが脊髄虚血による下肢麻痺を軽減させることを観察している。また、その機序として血液中の細胞外microRNAの発現変化が、血液中のVEGFの濃度を一過性に上昇させることで、脊髄保護に作用している可能性を見出している。平成28年度には、ステントグラフト内挿術を受けた患者の術前と術後24時間・48時間の血清中の細胞外microRNAをマイクロアレイ解析を用いて網羅的に解析し、microRNAの発現変化から脊髄保護に関与する候補遺伝子をバイオインフォマティクス解析により抽出した。

本年度は学内のIRBに提出する書類に必要となる動物実験データを集め、書類申請の準備を行っていたために、当初の予定より臨床研究の開始予定が遅れている。また、IRBの委員から臨床試験のプロトコルに対して指摘された箇所があり、当初予定していたプロトコルから変更して、臨床試験を実施する可能性がある。今後は臨床試験として、健常人に対して虚血プレコンディショニング法を実施し、虚血プレコンディショニング法の前後で、末梢血中のCD34陽性細胞の割合に変化があるかを検証する。また、虚血プレコンディショニング法の前後で、血液中のサイトカイン等を測定することで、抗炎症作用を有するサイトカインや血管新生作用を持つ因子がどのように変化するか観察する。心臓血管外科臨床試験において、虚血プレコンディショニングは大腿に血圧測定Cuffを巻くことで実施することにしていたが、血管の状態が悪い患者に対して下肢の血管に負荷をかけることに対してリスクが高いのではないかと、IRBの委員から指摘を受けたために、虚血プレコンディショニングは大腿ではなく、上腕に血圧測定Cuffを巻くことで実施する計画に変更する可能がある。また、健常人に対して、虚血プレコンディショニングの前後で骨髄由来幹細胞の動員に変化があるかをFACSで解析予定である。予定していた臨床試験の実施が遅れたため、未使用額が生じた。臨床試験実施が当初の開始予定より遅れているために、虚血プレコンディショニングの前後でFACSにより測定する骨髄由来幹細胞に対する抗体の購入を行わなかったために、その抗体の購入費用が次年度使用額として生じた。臨床試験において必要となる抗体とELISAキットの購入に使用する。ヒト骨髄由来幹細胞に対する抗体の購入に次年度使用額を使う計画である。
自己組織化を利用したデンドリマーの階層的高機能化によるナノリアクターの開発

1.サブナノパラジウム超微粒子の調製とアリル位置換反応ポリアミンデンドリマー内部に取り込むパラジウムイオンの数を制御することで、デンドリマー内部でサブナノサイズの超微粒子を調製することに成功した。これらのサブナノサイズの粒子の確認は極めて困難であるが、SPring8の放射光を用いたXAFS測定により、1nm以下のパラジウム粒子の生成が確認された。デンドリマーの世代数、パラジウムの取込数を変えることで、アリル位置換反応に高活性な触媒となる。通常、単核パラジウム錯体触媒を用いる系では、ボスフィンなどの配位子を必要とするが、本系では、サブナノサイズの配位不飽和なパラジウム粒子を安定化することで高活性が発現したと考えられる。2.アルキル化デンドロン内包貴金属ナノ粒子のサイズ制御と水素化触媒機能ピリジンをコアとするアミドアミンタイプのデンドロンの調製を行った。このデンドロンは、溶媒中で自己集合し球状集合体を形成する。アルコール、アミド、ハロゲン化アルキルなど溶媒の種類を変えることで、集合体のサイズを制御することができる。また、デンドロンの世代数や末端アルキル鎖の長さを変えることで集合体内部空孔サイズが制御でき、内部空孔サイズに応じた粒子径の金属超微粒子が得られ、およそ15nmまでのPd超微粒子のサイズを制御できた。得られたパラジウム粒子は、アミドアミンデンドロンで修飾された表面をもち、この保護デンドロンのもつ分子認識能にもとづく、基質選択的な水素化反応が可能である。例えば、水酸基をもつオレフィンと通常のオレフィンの競争水素化反応では、水酸基とデンドロンの水素結合に基づく、選択的水素化が進行し、それぞれの基質単独での水素化速度に比べ、高い速度比で水素化反応が進行する。アルキル化デンドロン内包貴金属ナノ粒子のサイズ制御法の開発ピリジンをコアとするアミドアミンタイプのデンドロンの調製を行った。また、デンドロンの世代数や末端アルキル鎖の長さを変えることで集合体内部空孔サイズが制御でき、内部空孔サイズに応じた粒子径の金属超微粒子が得られることを見出した。第1-3世代のアミドアミンデンドロン集合体溶液に[Pd(C_3H_5)Cl]_2などの金属錯体や金属塩溶液を加えた後、SuperHydride(トリエチル水素化ホウ素)で還元すると安定な金属超微粒子溶液が得られた。光散乱法より溶液中の集合体サイズを測定したところ、およそ15nm程度までの集合体の形成が確認された。この集合体がデンドロンの単分子膜から形成されると仮定したときの、集合体内部空孔のサイズ分布は、TEM観察から求めたPdやPt、Au粒子の粒子径分布と一致した。また、前駆体に白金錯体や塩化金酸を用いることで、同様にサイズ制御が可能である。超粒子調製時に、Pd錯体とPt錯体を混合するとPd-Ptバイメタル超微粒子を調製することができる。PdとPtの混合比は、任意に変えることが可能である。調製したPd-Pt超微粒子は共役ジエンの水素化反応に用いたところ、Pd/Pt=4付近で最も高い活性が得られた。アミドアミンデンドロンは、骨格内のアミノ基を利用した塩基触媒として機能することから、本デンドロン集合体内包Pd-Pt超微粒子は、アルドール反応、水素化反応、マイケル反応をワンポットで連続して行うことが可能であり、医薬品中間体として有用なグルタロニトリル誘導体が高収率で得られる。
食支援を受ける摂食嚥下機能障害高齢者の自己評価式QOL尺度の開発とNSTへの適用

初年度に実施した食支援の概念分析および食支援の専門家へのインタビュー調査から明らかとなった、食支援に関連するQOLの要素から評価尺度を作成する。また、食支援を受ける摂食嚥下機能障害を有する高齢者を対象とし、プレストを行い内容の精選後、本調査にて信頼性・妥当性の分析を行う。さらに、本尺度の臨床での適用可能性を評価するために、食支援介入事例で使用し、食支援チームにインタビュー調査を行う。
音韻的短期記憶の外国語習得への影響

本研究は、外国語習得効率の個人差を生み出す様々な要因から、記憶力の要素を構成する音韻的短期記憶力の外国語の能力への影響の大きさを調査することを主たる目的として実施された。具体的には、音韻的短期記憶力の外国語のリスニングと発音に与える影響の大きさを明らかにすることとした。また本研究では音韻的短期記憶力の中でこれまで研究されたことのない非言語的情報の記憶力の外国語の能力への大きさを明らかにすることにした。180名の日本人英語学習者を対象に実験したところ、音韻的短期記憶力の英語の発音及ひリスニングのスキルに影響を与えていることが明らかになった。今年度実施したこととして、前年度の実施したのパイロット実験結果を国際認知言語学学会、イギリス応用言語学学会、全国語学教育学会で発表をした。その学会で得られた情報・専門家によるアドバイスをもとに、本実験で使用するテストを修正し、約100名の被験者に協力してもらった。被験者には2種類の英語のリスニングテスト、英語の文法テスト、2種類の英語の発音テスト、2種類の母語による音韻的言語記憶テスト、2種類の非言語記憶力テストを実施した。そしてこれらのテスト結果をそれぞれの複数の専門家(英語の音声評価については英語母語話者、非言語記憶力テストについては声楽の専門家、それ以外についてはコンピュータによる採点)に依頼し評価を行なってもらい、その結果の分析を行った。本実験結果の論文については、今年度参加した学会参加や文献研究をもとに、先行研究のまとめ、本研究の実施方法、実験テストの妥当性・信頼性の検証、およびパイロット実験の結果をまとめて、専門家による査読を複数回受けた。データベースの検索や学会に出席して記憶力,リスニング、発音、語彙習得、音楽の言語獲得に与える影響に関する情報収集をおこない、本研究のための先行研究をまとめた。次に収集した先行研究を参考にして、本研究で使用するための各種能力テスト(言語的音韻記憶力テスト、非言語的音韻記憶力、リスニングテスト、発音テスト)を作成した。80名の被験者に協力してもらって、これらのテストの信頼性と本実験の方向性が妥当であるか調べた。試験結果を本実験と同様に発音についてはネイティブスピーカー、音楽的な記憶テストについては声楽の専門家に評価をしてもらった結果、作成した試験の信頼度は一部修正が必要であるが、概ね高いものであることが示された。このパイロット実験の結果をBritish Association for AppliedLinguisticsとPronunciation in Second Language Learning and Teachingの各学会主催の国際年次大会で発表し、他の研究者からアドバイスを受け、本実験に向けて準備を行った。具体的には、先行研究ではまだ十分に明らかにされていない音韻的短期記憶力の外国語のリスニング、発音、に与える影響の大きさを調査した。180名の被験者の協力を得て、実験をしたところ、音韻的短期記憶力は日本人の英語のリスニング及び発音のスキルに影響を与えていることが明らかにされた。また本研究では音韻的短期記憶力の中でこれまで研究されたことのない非言語的情報(音楽的情報)の記憶力の外国語の能力への大きさを明らかにする点が大きな特色であったが、言語的情報の記憶力だけでなく非言語的情報の記憶力も英語の発音及びリスニングスキルに影響があることが示唆された。本研究計画最終年度には本研究の成果を国際応用言語学学会で発表した。論文にもまとめた学会誌に投稿した。英語教育(第二言語習得)本研究の申請前から十分に準備をし、かつ申請した研究計画案のスケジュールをさらに細かく設定し、実行してきたからである。本研究の申請前から、十分準備を行なっていたこと、実験協力者も問題なく得られたこともあって計画通り進展している。本実験の分析結果を、国際応用言語学学会とアメリカ応用言語学学会で発表をおこなう。その発表した学会での他の研究者からの助言等を参考にして最終結果の論文を英語と日本語の両言語にまとめ、校閲者にチェックしてもらったうえで、学会誌(TESOL Quarterly, Language Learning)に発表する。1前年度に実施したパイロット実験の結果と、他の研究者からの助言をもとに各種能力テストと実験方法・能力テストの修正を行う。2本実験のためのデータ収集を行う。学生約200名に協力してもらい、実験に参加してもらう。3パイロット実験と同様に発音と音楽的記憶以外のテストはコンピュータ採点し、発音テストの評価についてはネイティブスピーカー、音楽的記憶テストについては声楽の専門家に評価をしてもらう。パイロット実験と同様の方法で各種テストのスコアを分析する。4本実験の分析結果を学会で発表した後に英語で論文にまとめる。

1本実験のために200名の被験者に協力してもらうためその謝金、2テスト評価者(ネイティブスピーカーと声楽の専門家)への謝金、3その結果を学会で発表するための旅費、4論文校正者への謝金が必要になると考えられる。
海洋質源環境と海鳥の相互作用:大型海鳥を用いた資源構造の把握

海鳥、特にカツオドリとアデリーペンギンを研究対象とし、大型海洋動物を利用して資源構造を把握することを目的としてきた。これまでの研究から、ペンギンやカツオドリは、大きく変動する餌環境に対して、行動的に対応し、採餌・索餌を行うことが解明されてきた。しかし、これらの高い採餌・索餌能力が獲得される過程については、全く分かっていない。そこで、本年度は、西表島のカツオドリの幼鳥を題材として、幼鳥の移動、採餌能力の獲得過程の解明を目的とした。まず、カツオドリの雛を刷り込みし、観察者を親と認識きせた。そして、巣立ち後に加速度データロガーを装着し、行動の発達を一秒単位で記録した。その結果、幼鳥は、エネルギー的に負荷の高い羽ばたきから、徐々に効率の良いグライディング飛翔を行うようになってきた。同時に、採餌技術も洗練され、その後、親から独立することが解明された。本研究の成果は、P.Roy.Soc.Lond.(Suppl)に発表した。また、海鳥の柔軟な行動的対応を知るために、南極のアデリーペンギンの上陸行動について研究した。ペンギンは、1m前後の氷壁にジャンプして上陸することがある。失敗すると、ヒョウアザラシに捕食される危険があるため、上陸を成功させるために、飛び出し速度や角度などを調節しなければならない。そこで、行動のビデオ撮影と、簡単な力学モデルの製作を行い、いかにペンギンが意思決定を行っているかを研究した。その結果、アデリーペンギンは、これらのパラメータを柔軟にコントロールしているごとが解明された。本研究の成果は、J.Zool.に発表した。海鳥類は,海洋を採餌場として利用し,その繁殖生態や行動は,海洋環境と密接に関係している.海洋の餌資源環境は時空間的に複雑に変化するため,海鳥はそれに行動的に対応する必要があるだろう.本研究では,西表島に隣接する仲ノ神島に生息するカツオドリと,南極アデリーランドに生息するアデリーペンギンを題材にして,変動する海洋資源環境に対する,海鳥の時々刻々の対応を明らかにし,高次捕食者と海洋環境の関係について考察することを目的とした.データロガーを用いて得られた行動データをもとに,海鳥の育雛戦略モデルを作成した.その結果,カツオドリやアデリーペンギンのように,胃に餌を貯めて子に運搬するような動物では,1)胃容量以上には餌を運搬できない,2)自分で消化吸収する採餌は,採餌トリップの前半に行い,後半は雛に餌を持ち帰るため,消化をストップする,という二つの形態的,行動的制約を受けていることが明らかになった.それらの制約を受けながら,変動する餌資源環境(時間あたり利用できる餌量)に対して,最適に振る舞っていることが明らかになった.これは,海鳥の行動から,餌環境の時々刻々の変動の予測を可能にする.海鳥、特にカツオドリとアデリーペンギンを研究対象とし、大型海洋動物を利用して資源構造を把握することを目的としてきた。
非アルコール性脂肪性肝疾患発症が摂食行動に及ぼす影響

非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)およびその重症型である非アルコール性脂肪肝炎(NASH)の治療は食生活の改善が重要である。しかしながら、食生活を改善することは非常に困難であり治療を難しくしている。病態発症が摂食調節機構に及ぼす影響を解明すれば、対象者の食行動を科学的に理解し、食事療法・栄養指導の戦略を立てることが可能となる。そこで、本研究ではNAFLD/NASH発症が末梢および中枢の摂食調節機構に及ぼす影響を明らかとし、さらには病態改善効果が期待される食品成分が摂食調節機構に及ぼす影響を解明することで、摂食行動を考慮した食事療法・栄養指導確立にむけての基礎的情報の構築を目指す。
住民の迅速な避難行動に資する土砂災害避難警報装置の開発

我が国は,急峻な山地が多く脆弱な地質で構成されている.近年,日本では集中豪雨や地震によって土砂災害が数多く発生している.本研究では,土砂災害のソフト対策の一環としてウェブカメラを用いた表層崩壊検知システムの開発を試みた.本システムは,OpenCVの環境下でリアルタイム処理を行うプログラムの作成を行った.その結果,ウェブカメラと斜面との距離が11m以内であれば,ターゲットの移動や落石を検知できることが判った.本研究の目的は,(1)衛星画像や各種の地理空間情報(オープンデータを含む)を用いて,地震や集中豪雨を誘因として発生した土砂災害の履歴を整理し,斜面災害(斜面崩壊,土石流)の危険箇所を絞り込むこと,(2)UAV(Unmanned Aerial Vehle:無人航空機)を用いて土砂災害発生箇所や危険箇所の空撮を行い,オルソモザイク画像やDSM(Digital Surface Model:数値表面モデル)を作成することで,山間部に住む住民の防災マップ作成に寄与する情報を提供すること,(3)危険箇所として絞り込んだ斜面にWebカメラを用いた土砂災害検知センサーを設置し,住民の迅速な避難行動に資するシステムを開発することである.平成27年度は,主として土砂災害検知センサーの開発に取り組んだ.土砂災害検知センサーには,Webカメラを用いるが,撮影した動画のリアルタイム差分(1フレーム前と現在のフレームとの差分)を行い,ターゲットの移動を把握するものである.Visual C++によるプログラミング環境を整備し,屋外や暗闇において模型斜面によるターゲットの移動把握に関する実験を行った.暗闇の中では,ターゲットにLED電球を取り付け,その移動を捉えられるか否かについてWebカメラとターゲットとの距離を変化させて実施した.その結果,Webカメラとターゲットとの距離が5m以内であれば,暗闇においてもターゲットの移動を把握できることが確認できた.さらに,OpenCVによるプログラミング環境を整備し,複数台(3台)のWebカメラにおけるリアルタイム差分を検討した.その結果,リアルタイムで動画を撮影するプログラムの動作確認を行うことができた.今後は,各Webカメラが捉えた動画のリアルタイム差分に関するプログラミングを行う.研究の全体構想として,(1)人工衛星画像(SARデータ)を用いた斜面崩壊の検出とDEM生成,(2)各種の地理空間情報を活用した土砂災害発生箇所の素因・誘因の特性の分析と考察,(3)土砂災害の特性分析結果に基づく危険斜面の絞りこみ,(4)斜面災害検知センサーの開発と危険斜面への設置という4つのステップを考えた.平成27年度は,研究実績の概要でも示した通り,主として土砂災害検知センサーの開発に取り組んだ.1台のWebカメラを用いてリアルタイム差分を試み,明るい場合は,Webカメラとターゲットとの距離が10m以内であれば,10mm程度のターゲットの移動が検知できることが確認できた.また,暗い場合はターゲットにLED電球を取り付け,その移動が確認できるかを実験した.その結果,Webカメラとターゲットとの距離が5m以内であれば,10mm程度のターゲットの移動が検知できることが確認できた.今後は,OpenCVのプログラミングにより,複数台のWebカメラによるリアルタイム差分を行う.また,福井県内で集中豪雨を誘因として発生した斜面崩壊の現場において,UAVを用いた空撮を行った.空撮画像より簡易オルソモザイク画像やDSMの生成ができることを確認している.DSMの誤差は実測値と比較すると平均で約10cmとなった.今回は飛行高度を80mとしたが,低空で飛行すること,オーバーラップを90%程度確保することで,さらに精度が向上することが期待される.今後も別の斜面崩壊現場を空撮する予定であり,人工衛星画像の解析と併せて斜面崩壊危険箇所の絞りこみを行っていく.本研究の目的は、(1)衛星画像や各種の地理空間情報(オープンデータを含む)を用いて、地震や集中豪雨を誘因として発生した土砂災害の履歴を整理し、斜面災害(斜面崩壊、土石流)の危険個所を絞り込むこと、(2)UAV(Unmanned Aerial Vehicle:無人航空機)を用いて土砂災害発生個所や危険個所の空撮を行い、オルソモザイク画像やDSM(Digital Surface Model:数値表面モデル)を生成することで、山間部に住む住民の防災マップづくりに寄与する情報を提供すること、(3)危険個所として絞り込んだ斜面にWebカメラを用いた土砂災害検知センサーを設置し、住民の迅速な避難行動に資するシステム開発を行うことである。平成27年度に引き続き、平成28年度においてもWebカメラを用いた土砂災害検知センサーの開発に取り組んだ。樹木などの不動点にターゲットを設置し、それをWebカメラで監視し続け、そのターゲットが移動した際に斜面災害が発生したとして警報を出すシステムである。本年度の実績として、ターゲットの移動を検知した際に、サーバーに移動後の画像をアップロードし、登録したメールアドレスに避難情報を出すことができた。なお、複数回の実験を試みた結果、アップロードには約10秒、移動を検知した後、約1分で警報メールが届けることができた。また、Webカメラが捉えている画郭全体ではなく、ターゲット付近のみに着目して移動の監視を行うことができるようになった。UAVを用いた空撮では、生成したDSMの精度が約±2cmであった。非常に細密なオルソモザイク画像やDSMが生成できることが判った。DSM生成の精度向上には,90%程度のオーバーラップ,1画素1cm程度の空撮,GNSS測量による基準点の設置が重要であることが判った.研究の全体構想として,(1)人工衛星画像(SARデータ)を用いた斜面崩壊の検出とDEM生成,

(2)各種の地理空間情報を活用した土砂災害発生箇所の素因・誘因の特性の分析と考察,(3)土砂災害の特性分析結果に基づく危険箇所の絞り込み,(4)斜面崩壊検知センサーの開発と危険斜面への設置という4つのステップを考えた.平成28年度は,研究実績にも示した通り,土砂災害検知センサーの開発の中で,とくにターゲットの移動を検知した際のサーバーへの画像のアップロードと登録したアドレスに対する警報メールの送信,Webカメラの画郭全体でなくターゲット付近のみに絞り込んで移動を検知すること,OpenCVの環境を用いて,移動した際に移動した箇所を明示すること,複数台のWebカメラでターゲットを監視すること等の検討を行った.その結果,ターゲット移動後のサーバーへの画像のアップロードは約10秒とほぼリアルタイムで行うことができた.また,警報メールは約1分で登録したアドレスに届けることができた.さらに,ターゲット付近のみに着目して移動の検知を行うことができるようになった.UAVを用いたオルソモザイク画像やDSMの生成では,平成27年度では平均の誤差が約±10cmであったが,オーバーラップや低空による空撮,GNSSによるRTK測位による基準点の設置によって平均の誤差が約±2cm程度となった.実斜面では電源の確保が必要であるがソーラーパネルを準備した.平成29年度は実斜面において実証実験を実施したい.我が国は,急峻な地形をなし,脆弱な地質で構成されている.また,地震が多く,台風や集中豪雨に見舞われやすいという気象条件を持つ.このような背景から毎年のように全国各地で1000件程度の土砂災害が発生しており,その対策に多くの力が注がれている.このような背景のもと,申請者は適切なタイミングと内容で避難勧告や避難指示を行うことで山間部に暮らす住民の被害軽減を図ることを目的としてウェブカメラを用いた土砂災害検知センサーの開発を試みた.斜面崩壊には前兆があると言われ,これらを把握することで避難行動を起こすことができる.もし,人間がその場にいたら,視覚(表層崩壊による斜面のずれや崩れる土砂,落石など),嗅覚(岩同士のぶつかり合いによる異臭や,崩れた土砂からの土や木の臭いなど),聴覚(木の根が切れる音や岩が転がる音など)などから危険を察知することができる.土砂災害発生前にその前兆を検知し,避難警報を発信できれば,被害を最小限に抑えることが可能である.そこで,本研究では,視覚に着目し,ウェブカメラを用いることにより,特殊な機械を必要としない安価な表層崩壊検知システムの開発を行った.なお,開発環境にはOpenCVを用いた.その結果,本研究で作成したプログラムは正常に機能し,リアルタイム差分により移動検知を行えることが確認できた.また,移動を検知した場合に登録したアドレスにメールが届くまでの時間は約1分であることを確認した.
植物ウイルスの複製機構を利用した新規酵母タンパク質発現系の開発に関する研究

前年度までに構築したメチルトランスフェラーゼ(MT)およびMTとヘリカーゼの中間領域にある22個のレアコドンを同義置換したベクターのサブゲノムプロモータ(SGP)下流に標的タンパク質をコードする配列を挿入した。このベクターでSaccharomyces Cerevisiae (S. Cerevisiae)を形質転換したが,標的タンパク質の発現は確認されなかった。そこで,ベクターをシングルコピー型からマルチコピー型に変更した。外被タンパク質(CP)のSGPの下流にヒスチジン合成酵素をコードする配列を挿入したベクターを構築しヒスチジン要求性S. Cerevisiaeを形質転換したところ,形質転換体はヒスチジン欠損培地で増殖した。一方,移行タンパク質(MP)のSGPの下流にヒスチジン合成酵素を挿入したベクターでは増殖しなかった。MPのSGPの特定の数箇所にランダム変異を導入したライブラリーを構築し,S. Cerevisiaeを形質転換したところ,ヒスチジン欠損培地で増殖するクローンが見出された。これらのクローンが保持するベクターの配列を確認したところ,全て同じ変異が導入されていた。次にヒスチジン合成酵素に換え蛍光タンパク質をコードする配列をそれぞれのSGPの下流に導入したベクターを構築した。これらでS. Cerevisiaeを形質転換し蛍光強度を測定したが,蛍光は観測されなかった。このことからSGP下流のタンパク質発現は極めて微量であることが示唆された。また,宿主の改善として3' poly A配列の無いmRNAに対して翻訳率の高いski2欠損株の構築を行った。しかし,ski2欠損株による標的タンパク質の発現量向上は確認できなかった。前年度に構築した改良型ベクターの評価を行ったが標的タンパク質の発現が確認できなかった。そのため,宿主およびベクターのさらなる改良を試みた。これらのうち,ベクターのマルチコピー化で標的とする外来タンパク質の発現が示唆された。しかし,その発現量は極めて微量と推測された。現在,細胞質スプライシング機構を利用した3' poly A除去を試みており,固体培地上では標的タンパク質の発現が示唆されるが液体培地に植えて培養すると発現が確認できない状況である。固体培地と液体培地における細胞質スプライシングによる3' poly A除去の効果を検証する。また,前年度に取得したski2欠損株やS. Cerevisiae deletion clonesを宿主として改良型ベクターや細胞質スプライシングによる標的タンパク質の発現を評価する。前年度に行うことができなかったRNAの転写量およびin vitroで合成した3' poly Aを持たないRNAの導入による標的タンパク質の発現についても評価を行う。タバコモザイクウイルス(TMV)のRNA複製機構を利用した酵母用RNA複製ベクターを構築するために、約450塩基長に分割した14種類のDNAを化学合成した。これらを元にオーバーラップPCRにより2つのDNA断片を連結し、約850塩基長の7種類のDNA断片を構築した。直鎖化したベクターと7種類のDNA断片を同時に酵母Saccharomyces Cerevisiae (S. Cerevisiae)へ導入し、相同組換えによる連結およびベクターへの組込みを試みた。形質転換したS. Cerevisiaeを選択培地に塗布し、得られたコロニーを用いてPCRを行い、インサートを確認した。目的の断片長が確認されたコロニーを培養し、ベクター(以後、基本ベクターとする)を抽出した。外来タンパク質(蛍光タンパク質)発現ベクターを構築するため、上記で抽出した基本ベクターを鋳型に5'非翻訳領域(5'-UTR)、TMVのRNA複製に係る酵素群(メチルトランスフェラーゼ、ヘリカーゼ、RNA依存性RNA合成酵素)、サブゲノムプロモーター部分および3'-UTRをPCRで増幅した。これらのDNA断片と蛍光タンパク質の遺伝子、直鎖化したベクターでS. Cerevisiaeを形質転換し、DNA断片の連結およびベクターへの組込みを行った。構築したこれらのベクターで大腸菌を形質転換し、ベクターの増幅・精製を行った。シーケンスにより、基本ベクターと外来タンパク質発現ベクターに正しい配列が導入されていることを確認した。次に、酵母内でRNA複製に係る酵素群を発現させ、サブゲノムプロモーター下流の蛍光タンパク質RNAの複製と翻訳を促進させるために、三種類の酵母用のプロモーターをそれぞれTMV由来遺伝子の上流に組込んだ。現在、蛍光タンパク質(EGFPとDsRed)の蛍光強度を指標に発現効率を検討している。当初、基本ベクターを制限酵素消化し蛍光タンパク質の遺伝子をライゲーションすることで外来タンパク質発現ベクターを構築する予定であった。しかし、酵母での基本ベクター構築は順調に進んだものの、大腸菌への導入、増幅・精製は予想以上に手間取った。酵母から回収できるベクター量は僅かであり、比較的長鎖(10 kb以上)のため大腸菌の形質転換効率も低い。また、形質転換に成功してもベクターが大腸菌で増幅され難く、遺伝子欠損が生じた。進捗の遅れを最小限にするために、外来タンパク質発現ベクターの構築も酵母の相同組換えを利用して基本ベクターと同時並行で進めた。さらに大腸菌株や培養条件の検討を行った。現在では目的のベクターを増幅・精製することが可能となっている。前年度に構築したタバコモザイクウイルス(TMV)のRNA複製機構を利用した酵母用発現ベクター(酵母用プロモーター(5種)ー5'非翻訳領域ーTMVのRNA複製に係る酵素(メチルトランスフェラーゼ,ヘリカーゼ,RNA依存性RNA合成機能を有する融合酵素)ーサブゲノムプロモーター領域ー蛍光タンパク質(EGFPまたはDsRed)ー3'非翻訳領域を導入したもの)で出芽酵母Saccharomyces Cerevisiae (S. Cerevisiae)を形質転換し蛍光強度を測定した。

しかし,使用する酵母用プロモーターの種類に関係なくどの形質転換体でも蛍光は検出できなかった。蛍光タンパク質の発現量が非常に低く蛍光を検出できていない可能性を考慮し,サブゲノムプロモーター下流に組込む外来タンパク質を蛍光タンパク質からヒスチジン合成酵素(栄養要求性選択マーカー)に変更したベクターを構築した。このベクターでヒスチジン要求性のS. Cerevisiaeを形質転換し,ヒスチジンを欠損した合成培地に塗布した。形成されたコロニーは数個であった。これらについてコロニーPCRでベクターの状態を確認したところ,ベクターの存在が確認できないもしくは一部が欠損したベクターを有していることが分かった。このことから,ヒスチジン合成酵素が発現されていない,すなわちサブゲノムプロモーターの下流に組込まれた外来タンパク質は発現されていないことが示唆された。また,RNA複製に係る酵素にHis6-tagを融合したベクターも構築した。このベクターでS. Cerevisiaeを形質転換し,総タンパク質をポリアクリルアミドゲルで電気泳動後,PVDF膜に転写し抗ヒスチジンタグ抗体を用いて酵素の検出を試みたが酵素の発現を確認できなかった。当初の設計に従ってベクターを構築したが,予想した通りには機能しなかった。その原因については確定できていないが,可能性として1) RNA複製にかかわる酵素のコドンに複数含まれるレアコドンの影響,2) mRNAのpoly(A)除去によるmRNAの分解促進あるいは翻訳効率の著しい低下,3) 3'非翻訳領域に挿入した自己切断型リボザイムの不活性,が考えられる。これらへの対策を進めており,現在,メチルトランスフェラーゼ(MT)およびMTとヘリカーゼの中間領域にある22個のレアコドンを同義置換したベクターの構築が終了している。前年度までに構築したメチルトランスフェラーゼ(MT)およびMTとヘリカーゼの中間領域にある22個のレアコドンを同義置換したベクターのサブゲノムプロモータ(SGP)下流に標的タンパク質をコードする配列を挿入した。このベクターでSaccharomyces Cerevisiae (S. Cerevisiae)を形質転換したが,標的タンパク質の発現は確認されなかった。そこで,ベクターをシングルコピー型からマルチコピー型に変更した。外被タンパク質(CP)のSGPの下流にヒスチジン合成酵素をコードする配列を挿入したベクターを構築しヒスチジン要求性S. Cerevisiaeを形質転換したところ,形質転換体はヒスチジン欠損培地で増殖した。一方,移行タンパク質(MP)のSGPの下流にヒスチジン合成酵素を挿入したベクターでは増殖しなかった。