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イネYAC(酵母人工染色体)ライブラリーの構築と染色体マッピング

平成3年度以降イネ染色体構造を明らかにする目的でYACライブラリーの構築を進めている。しかしながら最近キメラ遺伝子の形成が問題化してきたため、平成4年度、平成5年度にかけて挿入断片がやや小型化するものの、キメラ遺伝子形成の割合が少ないP1ライブラリーの構築も進め、YACライブラリーの弱点を補足する試みを行ってきた。P1ライブラリー構築の手法そのものは昨年度末YACライブラリー構築に用いた方法と基本的に同一である。即ち、イネ幼葉より得た高分子量DNAを制限酵素MboI切断した後、パルスフィールド電気泳動(CHEF 170V、15r、パルスタイム3→50秒)を行い80100Kb部分を切り出した。beta-アガラーゼによりゲルを分解後、P1ベクターpAd10sacBIIをSacI、BamHI切断して作成したアームにライゲーションした。Pacase,Head/Tailをそれぞれ調節してパケージングした後NS3529株にinfectionしKanamycin入培地上でスクリーニングした。2000ケのP1クローンから得られたDNAについて、プロラミン(RM4、PR10、PR16)およびグルテリン(RG21)に対応するプライマーを設計し、Polymerase Chain Reaction(PCR)により挿入配列の増幅を試みた。その結果予定された長さのDNA断片がアガロース電気泳動で確認できた。また、電気泳動にPCR産物をニトロセルローズ膜へブロティングした後、cDNAをプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った結果、RM4(13kDaプロラミン)、PR10(10kDaプロラミン)についてそれぞれ複数グループについてシグナルが確認できた。この結果、イネプロラミン遺伝子を含む長鎖DNA(90Kb)が得られたことになる。今後、プロラミン遺伝子の遺伝子マッピングや、発現機構を染色体レベルで研究するための足がかりとなる。また、YACライブラリーと対応させるための貴重な材料となる。組織形態学的概念である染色体を分子遺伝学的概念であるDNA塩基配列として理解する目的でYAC(酵母人口染色体)法が開発されているが、本年は、この方法をイネに応用するための基本的手法の調査を行なった。イネ胚芽、あるいはイネ若葉から調整したプロトプラストを0.8%低融点アガロ-スゲルに包埋しProteinaseK処理した後、パルスフィ-ルドゲル電気泳動法(PFGE)を行なったところ10Mb以上の巨大DNAが分離できた。一方、アガロ-スに包埋した巨大DNAをレア-カッタ-であるNot I、Pac I、Sse 8387Iで切断し、PFGEで分離した。その結果それぞれのレア-カッタ-に対応した数十数百kbにわたるDNAの分布がアガロ-スゲル上に認められた。これらのDNAをnylon membraneヘブロッティングすることを試みたところ不完全ながら、数百kb程度の巨大DNAでもブロット可能であることが判った。このブロッティングの効率化は今後の課題であるが、現時点で使用可能な方法を用いてブロッティングしたnylon membraneに対し、プロラミン、グルテリン等の主として貯蔵タンパク質のcDNAを放射性リンー32Pで標識したプロ-ブを用いてサザンハイブリダイゼ-ションを行なった。その結果、それぞれのプロ-ブに対し、アガロ-スゲル上の特定領域にプロ-ブがハイブリダイズすることが認められた。貯蔵タンパク質遺伝子はプロラミン、グルテリンについて多重遺伝子族を構成していることが知られているが、本研究で得られた結果は、これら遺伝子はイネゲノム上の限定された領域に集まっていることを想像させる。得られたサザンハイブリッドの結果は不鮮明であるため、明確に結論するためには更に詳細な検討を要する。平成3年度以降、イネ染色体構造を明らかにする目的でYACライブラリーの構築を進めている。しかしながら、最近キメラ遺伝子の形成が問題化してきたため、平成4年度は挿入断片は小さくなるが、キメラ遺伝子形成の割合が少ないといわれるP1ライブラリーも作成しYACライブラリーの弱点を補足する試みを行った。イネ幼葉を液体窒素中でホモジナイズし、ナイロンメッシュ(50μm)処理、分画遠心(6,000×g)処理することにより挟雑物を除去した試料を低融点アガロースに埋め込んだ。アガロース包埋の状態でプロテイネースK処理し、その後、アガロース包埋のまま制限酵素MboIでDNAの部分分解処理を行った。その後、パルスフィールド電気泳動(CHEF,170V,15hr,パルスタイム3→50秒)を行い80100kb部分を切り出した。β-アガラーゼによりゲルを分解後、P1ベクターpAd10SacBIIをSacI、BamHI切断して作成したアームにライゲーションした。NS3208、NS3210株からPacase、Head/Tailをそれぞれ調製してパッケージングした後、NS3529株にinfectionしkanamycin入り培地上でスクリーニングした。これまでに、約10,000個のライブラリーを作成した。イネ全ゲノムをカバーするためにはまだ不十分であるが、現在までに得ている手持ちの遺伝子を含むクローンを得ることは比較的簡単であり、現在までに得られているライブラリーをスクリーニングすることにより、イネ遺伝子構造を、これまでのλファージを用いては解析不可能な範囲にわたって解析することが可能となった。なお、現在までに、YACライブラリーで観察されたキメラ遺伝子形成はみられず、YACの弱点を十分にカバーしており、この点も特筆すべき成果と考えている。

しかしながら最近キメラ遺伝子の形成が問題化してきたため、平成4年度、平成5年度にかけて挿入断片がやや小型化するものの、キメラ遺伝子形成の割合が少ないP1ライブラリーの構築も進め、YACライブラリーの弱点を補足する試みを行ってきた。P1ライブラリー構築の手法そのものは昨年度末YACライブラリー構築に用いた方法と基本的に同一である。即ち、イネ幼葉より得た高分子量DNAを制限酵素MboI切断した後、パルスフィールド電気泳動(CHEF 170V、15r、パルスタイム3→50秒)を行い80100Kb部分を切り出した。beta-アガラーゼによりゲルを分解後、P1ベクターpAd10sacBIIをSacI、BamHI切断して作成したアームにライゲーションした。Pacase,Head/Tailをそれぞれ調節してパケージングした後NS3529株にinfectionしKanamycin入培地上でスクリーニングした。2000ケのP1クローンから得られたDNAについて、プロラミン(RM4、PR10、PR16)およびグルテリン(RG21)に対応するプライマーを設計し、Polymerase Chain Reaction(PCR)により挿入配列の増幅を試みた。その結果予定された長さのDNA断片がアガロース電気泳動で確認できた。また、電気泳動にPCR産物をニトロセルローズ膜へブロティングした後、cDNAをプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った結果、RM4(13kDaプロラミン)、PR10(10kDaプロラミン)についてそれぞれ複数グループについてシグナルが確認できた。この結果、イネプロラミン遺伝子を含む長鎖DNA(90Kb)が得られたことになる。今後、プロラミン遺伝子の遺伝子マッピングや、発現機構を染色体レベルで研究するための足がかりとなる。また、YACライブラリーと対応させるための貴重な材料となる。
準粒子注入型高出力超伝導超格子トランジスタの開発

本研究は、Bi_2Sr_2CaCu_2O_y単結晶に内在する自然超格子を用いた準粒子注入型高出力型超伝導超格子トランジスタの開発を目的として、(i)同単結晶のデバイス加工技術の確立、(ii)同単結晶に内在する自然超格子の電気特性の解明、(iii)準粒子注入型超伝導トランジスタの作製等を行った結果、以下の成果を得た。(i)同単結晶のデバイス加工技術の確立薄膜作製技術ならびにフォトエッチング技術を用いてBi_2Sr_2CaCu_2O_y単結晶上に50μm□から300μm□、50μm×500μmの大きさのメサを作製することにより、再現性のよい固有ジョセフソン接合特性を得ることができた。(ii)同単結晶に内在する自然超格子の電気特性の解明(i)の技術を用いて作製したメサの抵抗-温度特性の測定から、常伝導状態において、ab面方向は2次元的導電性を反映した金属的伝導であり、c軸方向は熱励起型のホッピング伝導であることがわかった。また、固有ジョセフソン接合特性から、(1)バリアとして考えられているBiO層に弱い超伝導性が誘起されている、(2)大きいメサにおいては準粒子注入による非平衡効果が存在することがわかった。(iii)準粒子注入型超伝導トランジスタの作製上記で得られた成果を踏まえ、準粒子注入型超伝導トランジスタを作製したが、ゲート電極用絶縁層の厚さならびに材料選択の問題から有効な準粒子注入効果は確認できなかった。しかし、固有ジョセフソン接合においては強い準粒子注入効果が見られることから、ゲート電極用絶縁層の厚さならびに材料選択の問題を解決すれば準粒子注入型超伝導トランジスタが実現できるものと思われる。本研究で得られた成果は、Bi_2Sr_2CaCu_2O_y単結晶自身の準粒子注入型超伝導トランジスタ応用への可能性を示すものであり、本分野の今後の進展が期待される。
破骨細胞の分化あるいは細胞融合を選択的に阻害する活性天然物の探索と作用機構の解明

骨は一見、静止した器官のように見えるが、骨が溶かされ壊れること(骨吸収)と骨が新たに作られること(骨形成)を絶えず繰り返している。正常な状態では骨吸収と骨形成のバランスは保たれているが、骨粗鬆症患者では骨吸収の方が優位になっているので、骨の量が次第に低下する。骨吸収を担うのは破骨細胞なので、その細胞の形成を阻害し、骨吸収を抑制することができる化合物は骨粗鬆症治療薬の候補化合物となる。一方、破骨細胞が形成されるためには、破骨細胞の(1)分化と(2)細胞融合の2つの段階を踏む必要がある。したがって、(1)と(2)のどちらかの段階を阻害することができれば、破骨細胞による骨吸収を阻害することができる。なお、(1)分化を阻害する骨粗鬆症の治療薬はすでに開発されているが、(2)細胞融合を阻害する薬は未だ存在しない。そのため、(2)細胞融合を阻害する化合物は新たな骨粗鬆症の治療薬として期待できる。当研究室では、独自の薬用資源(約4,500種)を保有しており、それらの資源から、破骨細胞による骨吸収を阻害する化合物を探索している。2018年度は、破骨細胞の(1)分化あるいは(2)細胞融合を阻害する化合物を探索し、3つの阻害物質(化合物A、B、C)を発見した。そのうちの2つ(化合物A、B)は本研究で初めて発見された化合物(新規化合物)であった。さらに、化合物Aは破骨細胞の(1)分化は阻害せず、(2)細胞融合を阻害することから、骨粗鬆症の治療薬の候補として期待できる。2018年度は、当研究室で保有する薬用資源ライブラリー(約4,500種)を用い、多核破骨細胞の分化・細胞融合を阻害する低分子化合物を探索した。そして、2種の新規化合物を含む合計3種の阻害物質を見出した。さらに、そのうちの1種は破骨細胞の細胞融合を特異的に阻害することが明らかになった。現在、細胞融合の阻害メカニズムについて調べているところであり、本研究課題はおおむね順調に進展している。引き続き、当研究室で保有する薬用資源ライブラリー(約4,500種)を用い、多核破骨細胞の分化・細胞融合を阻害する低分子化合物を探索する。見出した阻害剤については、遺伝子レベルで阻害メカニズムを調べる。また、破骨細胞の融合機構については未だ明らかになっていないことが多いが、最近、脂質二重膜を構成しているリン脂質の動的変化が細胞融合に深く関わっていることが明らかになった。本研究課題では、阻害剤がリン脂質の動的変化に及ぼす影響についても調べる予定である。
「ライフ・スキルを高める心理学の授業」の開発

平成22年度は、カリキュラム案(学習面、心理・社会面、進路面)および講義ノート(教科書)を用いて、茨城県立鹿島灘高校、結城二高において、高校のカウンセリング・コーディネーターの教員が「心理学」の授業を、年間30コマ行った。研究代表者(石隈)が、両校における授業のスーパービジョンを行った。さらに、筑波大学附属坂戸高校の生徒を対象に7月29日8月4日に5日間の「心理学入門」集中授業(例:自己主張、学習スタイル、進路、障害の理解)を研究代表者・分担者と高校教員が共同で行った。さらに鹿島灘高校(午前部、午後部)にて、「心理学」を受講した1年生(54名)対象に、「学校生活スキル尺度」を実施した。「勉強」19項目、「進路」11項目、「コミュニケーション」23項目、「健康」10項目と4つに分けて、それぞれ4件法にてライフ・スキルの分析をした。その結果、午前と午後の部において、また男女においても得点に有意差は見られなかった。個人の平均値は「勉強」2.40(すべて4点が最高値)、「進路」2.77、「コミュニケーション」2.72、「健康」2.81という結果が得られた。「勉強」以外の項目に関して、やや高い結果が得られた。この授業において「進路」「コミュニケーション」「健康」へのライフ・スキルが高まったと示唆される。心理学授業の成果を「学校生活スキル尺度」で評価できることがわかった。本研究から「心理学」授業の実践・観察、質問紙調査等から、高校生のライフ・スキルを高めることの重要性と可能性が改めて示された。今回の科研費による研究を『ライフスキルを高める心理学』としてまとめ、心理学授業の内容および授業成果の評価方法について新たな提案を行う。「生徒のライフ・スキル」(自己学習スキル、対人コミュニケーションスキル、集団適応スキル、意志決定スキル、健康維持スキル)に関する質問紙について、茨城県立結城第二高校の「心理学」担当教員とともに、項目の修正を行い、学力が低い生徒でも応えやすいようにした。最終的に、「勉強について」10項目、「進路について」14項目、「集団活動について」6項目、「人とのコミュニケーションについて」13項目、「健康について」6項目、合計49項目の質問紙(4件法)ができた。結城二高の生徒(1年生・2年生)計111名を対象に調査を行った。その結果、平均点は学習面が2.4、進路面2.6、集団活動3.0、コミュニケーション2.7、健康2.5であり、学習面、健康面、進路面、コミュニケーションの側面で、スキルを高めるニーズがあると言える。項目別に見ると、「自分で探して勉強することができる」が1.9であり、特にニーズが高い。高校のカウンセリング・コーディネーターの教員が「心理学」の授業を、年間30コマ行った。研究代表者(石隈)が、授業のスーパービジョンを行った。研究代表者等の授業観察では、教員の「心理学」授業における工夫、および生徒のスキルの向上が確認された。また日本LD学会等で、研究成果の発表や高校生の特別支援教育に関する情報交換を行った。とくに、高校における「ライフ・スキルを高める心理学」の授業は、発達障害などで苦戦する生徒の成長に有用であることが考察される。平成21年度は、まず「生徒のライフ・スキル」(自己学習スキル、対人コミュニケーションスキル、集団適応スキル、意志決定スキル、健康維持スキル)に関する質問紙について、茨城県立結城第二高校の「心理学」担当教員とともに、項目の修正を行い、学力が低い生徒でも応えやすいようにした。平成20年度(研究1)において作成されたカリキュラム案(学習面、心理・社会面、進路面)および講義ノート(教科書)を用いて、茨城県立鹿島灘高校、結城二高において、高校のカウンセリング・コーディネーターの教員が「心理学」の授業を、年間30コマ行った。さらに、筑波大学附属坂戸高校の生徒を対象に7月に4日間の「心理学」集中授業を、筑波大学聴党特別支援学校の生徒を対象に11月にキャリアについての授業を研究代表者・分担者と高校教員が共同で行った。質問紙調査、授業の観察等から、ライフ・スキルを高めることの重要性が改めて示され、授業内容について新たな示唆が得られた。また研究代表者と研究分担者(熊谷)が、香港・台北におけるガイダンスの授業について、調査旅行を行った。香港・台北では生徒指導が包括的カウンセリングの方針のもとに行われており、我が国における生徒のライフ・スキルを高める心理学の授業の学校教育における位置づけの検討に示唆を与えた。同時に、授業内容でも「いじめ防止」におけるレジリエンスをめざす教育など参考になった。

「勉強」19項目、「進路」11項目、「コミュニケーション」23項目、「健康」10項目と4つに分けて、それぞれ4件法にてライフ・スキルの分析をした。その結果、午前と午後の部において、また男女においても得点に有意差は見られなかった。個人の平均値は「勉強」2.40(すべて4点が最高値)、「進路」2.77、「コミュニケーション」2.72、「健康」2.81という結果が得られた。「勉強」以外の項目に関して、やや高い結果が得られた。この授業において「進路」「コミュニケーション」「健康」へのライフ・スキルが高まったと示唆される。心理学授業の成果を「学校生活スキル尺度」で評価できることがわかった。本研究から「心理学」授業の実践・観察、質問紙調査等から、高校生のライフ・スキルを高めることの重要性と可能性が改めて示された。今回の科研費による研究を『ライフスキルを高める心理学』としてまとめ、心理学授業の内容および授業成果の評価方法について新たな提案を行う。
有機溶媒中での酵素反応に適した酵素固定化用両親媒性粒子の開発

本研究は,有機溶媒中で安定かつ高活性な固定化酵素を作製するための担体,すなわち機能性両親媒性粒子の開発手法を確立することを目的とした。申請者は,これまでに,メタクリル酸を2-[(p-1,1,3,3-テトラブチル)フェノキシポリエトキシ]エタノールによりエステル化することによって,ポリエトキシ基の重合度nが1.5から70.5の2-[(p-1,1,3,3-テトラブチル)フェノキシポリエトキシ]エチル基(tert-C_8ΦE_n基)を有するモノマー(MAX-n)を合成するとともに,クロロホルム中の溶液重合におけるMAX-nの重合特性を調べた。さらに,MAX-nを用いたシード重合における官能基の導入量を制御するため,シード粒子中におけるマクロモノマーと低分子量モノマーのシード共重合を相関できるモデルを構築した。その結果MAX-nの側鎖の立体障害のため粒子への導入量が制限されることが明らかになった。そこで本年度は,MAX-nの側鎖の立体障害の影響が少ないとされるグラフト重合により,グラフト状にtert-C_8ΦE_n基を有する粒子の合成および両親媒性粒子へのリパーゼの固定化を検討した。アゾ系重合開始剤2、2'-アゾビス[N-(2-プロペニル)-2-メチルプロピオンアミド]のビニル基を用いて、シード共重合により、アゾ基を有する高分子粒子(アゾ粒子)を合成するとともに、アゾ粒子のアゾ基を開始剤末端としてtert-C_8ΦE_n基を有するモノマーのグラフト重合を行い、グラフト状にtert-C_8ΦE_n基を有する両親媒性粒子を合成した。シード共重合により得られるアゾ粒子中のアゾ基のモル分率は、モノマー液中のアゾ基のモル分率の約0.9倍であった。また、両親媒性粒子は重合度58のグラフト鎖を有していた。この両親媒性粒子を用いて作製した固定化リパーゼのヘキサン中における活性の半減期は823時間と極めて長かった。また、ヘキサン中でのエステル交換比活性は粉末リパーゼのものと比べて約75倍高かった。本研究は、有機溶媒中で安定かつ高活性な固定化酵素を作製するための担体、すなわち機能性両親媒性粒子の開発手法を確立することを目的とした。申請者は、これまでに、メタクリル酸を2-[(p-1,1,3,3-テトラブチル)フェノキシポリエトキシ]エタノールによりエステル化することによって、ポリエトキシ基の重合度ηが1.5から70.5の2-[(p-1,1,3,3-テトラブチル)フェノキシポリエトキシ]エチル基(tert-C_8ΦE_n基)を有するモノマー(MAX-n)を合成するとともに、クロロホルム中の溶液重合におけるMAX-nの重合特性を調べた。さらに、MAX-nのシード共重合により、tert-C_8ΦE_n基を有する両親媒性粒子を合成したところ、粒子にはモノマー中のMAX-nのモル分率の約0.6倍のMAX-nが導入されること、ならびに導入量はMAX-nのnの影響を受けないこと、を明らかにした。本年度は、両親媒性粒子への官能基の導入量を制御するため、シード粒子中におけるマクロモノマーと低分子量モノマーのシード共重合の反応機構の解明を目的として、マクロモノマーと低分子量モノマーとのシード共重合の動力学を解析した。シード粒子中では、ラジカルの伸長速度定数がラジカルの分子量に比例する、停止反応速度定数が生成ラジカル分子の分子量により変化する、高分子の質量分率がある値に達すると伸長速度定数が急激に低下する、という仮定に基づいて、マクロモノマーとスチレンまたはメタクリル酸メチルのシード共重合のシミュレーションを行い、実験値と比較した。その結果、いずれの共重合においても、本モデルにより各モノマーの反応速度の実測値をほぼ相関することができた。本年度は,スチレン,ジビニルベンゼンおよびMAX-nのシード共重合を行い,両親媒性粒子を合成し,リパーゼの固定化を検討した。MAX-nを用いて合成した両親媒性粒子であるSDMX-n粒子(nはポリエトキシ基の重合度)のnの値が1.3から16までは,nの値が大きくなるにつれ,粒子に導入されるMAX-n量は増加する傾向にあり.最もMAX-nの導入量の多かったSDMX-16粒子については,モノマー中のMAX-n量に対して約1.2倍のMAX-nが粒子に導入されていることがわかった。

一方,nの値が16以上では,nの値の増加とともに粒子に導入されるMAX-n量は減少することがわかった。次に,MAX-nのポリエトキシ基の重合度nが固定化リパーゼの加水分解活性に及ぼす影響を調べた。ポリエトキシ基の重合度が1.3から16までは,ポリエトキシ基の重合度が大きくなるにつれ固定化リパーゼの加水分解活性は増加する傾向か見られたが,nの値が16のSDMX-16粒子を用いて作製した固定化リパーゼの加水分解活性が最も高いことがわかった。しかしながら,ポリエトキシ基の重合度が16以上では,重合度の増加とともに加水分解活性が減少した。本研究は,有機溶媒中で安定かつ高活性な固定化酵素を作製するための担体,すなわち機能性両親媒性粒子の開発手法を確立することを目的とした。申請者は,これまでに,メタクリル酸を2-[(p-1,1,3,3-テトラブチル)フェノキシポリエトキシ]エタノールによりエステル化することによって,ポリエトキシ基の重合度nが1.5から70.5の2-[(p-1,1,3,3-テトラブチル)フェノキシポリエトキシ]エチル基(tert-C_8ΦE_n基)を有するモノマー(MAX-n)を合成するとともに,クロロホルム中の溶液重合におけるMAX-nの重合特性を調べた。さらに,MAX-nを用いたシード重合における官能基の導入量を制御するため,シード粒子中におけるマクロモノマーと低分子量モノマーのシード共重合を相関できるモデルを構築した。その結果MAX-nの側鎖の立体障害のため粒子への導入量が制限されることが明らかになった。そこで本年度は,MAX-nの側鎖の立体障害の影響が少ないとされるグラフト重合により,グラフト状にtert-C_8ΦE_n基を有する粒子の合成および両親媒性粒子へのリパーゼの固定化を検討した。アゾ系重合開始剤2、2'-アゾビス[N-(2-プロペニル)-2-メチルプロピオンアミド]のビニル基を用いて、シード共重合により、アゾ基を有する高分子粒子(アゾ粒子)を合成するとともに、アゾ粒子のアゾ基を開始剤末端としてtert-C_8ΦE_n基を有するモノマーのグラフト重合を行い、グラフト状にtert-C_8ΦE_n基を有する両親媒性粒子を合成した。シード共重合により得られるアゾ粒子中のアゾ基のモル分率は、モノマー液中のアゾ基のモル分率の約0.9倍であった。また、両親媒性粒子は重合度58のグラフト鎖を有していた。この両親媒性粒子を用いて作製した固定化リパーゼのヘキサン中における活性の半減期は823時間と極めて長かった。また、ヘキサン中でのエステル交換比活性は粉末リパーゼのものと比べて約75倍高かった。
フィラーゲル層に着目した耐高圧ガス環境用ゴムの開発

ゴムの破壊現象に強く影響を及ぼすガス透過特性はガス浸入量(溶解量)と拡散係数によって決定される。補強目的でゴム材料にカーボンブラック[CB]を配合した際、ポリマー鎖とCB間に形成されるフィラーゲル層におけるガス特性の把握が重要となる。フィラーゲル層を有するCB粒子の新規単離精製法を提案し、ガス特性を評価した。CBと高分子鎖の密度差を利用した超遠心分離法を探索し、高純度でフィラーゲル層を有するCB粒子を単離精製する事に成功した。ガス特性を評価した結果、フィラーゲル層へのガス侵入挙動が確認され、重要な知見を得ることが出来た。今後各種耐ガス機器用材料等の設計において有用な指針となることが期待される。カーボンブラックやシリカに代表されるフィラーとゴムマトリックス界面に形成されるフィラーゲル層が、各種ガスや溶媒および添加剤の溶解・拡散挙動に及ぼす影響の把握を目的としている。未加硫ゴム中からゲル層を含むフィラーを単離精製し、ガスに対する特性評価を行いフィラーゲル層の溶解・拡散挙動解明を試みた。未加硫ゴム中には混練り過程でゴムゲル層とフィラーと結合したフィラーゲル層が形成されており、フィラーとゴムマトリックスの比重差を利用した超遠心分離法にて、フィラーを含むフィラーゲル層の単離精製を行った。効率的かつ正確なフィラーゲル層の単離精製に最適な条件を探索すため、1THF、クロロホルム、トルエン溶媒中でのフィラー単体の粒度分布測定を行った。合わせて、使用するフィラーの比表面積の実測を行った。2粒径が異なるカーボンブラックを配合したNBR未加硫ゴム6種をTHF、クロロホルム、トルエンに溶解させ動的散乱方による粒度分布測定を行った。その結果・超音波による分散時間は5分程度で分散が完了した。・一次粒子径に対し10から15倍の平均粒径が2400nmの凝集体を確認した。・トルエン中で数百μスケールの2次粒子の混在を確認した。・クロロホルム中の凝集粒径はTHFおよびトルエン中に比較して大きい。・クロロホルム中の凝集体サイズと一次粒子径サイズは相関関係を示した。一方、トルエンおよびTHF中では粒径の小さいフィラーほど凝集サイズと粒径サイズの相関が逆転する。以上の結果より、超遠心分離用未加硫ゴム溶液の作成条件はクロロホルムを主溶剤として使用することが最適であることを確認し、適正な希釈率、攪拌条件、超音波分散条件を決定することが出来た。年度の後半で超遠心機を導入し、上記実験にて得られた最適条件で準備した未加硫ゴムのクロロホルム溶液の遠心分離を進めた。遠心分析装置導入のタイミングが年度の後半になったが、装置導入に先行して年度の前半で種々フィラーゲル層の効率的かつ正確な遠心分離作業に必要な未加硫ゴムの溶液作成条件の探索を終えることができた。さらに、熱重量分析によりフィラーゲル量の定量法の探索も順調に進んでいるので総合的には研究の遅延はない。補強目的でゴム材料に添加されるカーボンブラック[CB]やシリカ等のフィラーとゴムマトリックスの界面に形成されるフィラーゲル層が、各種ガスや溶媒および添加剤の溶解・拡散挙動に及ぼす影響を把握する事を目的としている。1昨年度の研究で確認できた溶液作成の条件に従い、年度後半に導入した超遠心分離機を利用して、未加硫混練り後の原料ゴムにおいて、フィラーゲル層を含むフィラーとゴムマトリックス相の分離を行った。1.遠心スピード・遠心時間を検証し合計20条件で分離条件を探索した。最高回転数(120K)で分離を試みたが二相分離に至らなかった。特にクロロホルムへの原料ゴムの溶解性が悪く、濾過作業を試みたところ、マトリックスゲル由来と考えられる物質が多く回収された。そこで、フィラーの配合部数は変更せず、混練りスケールを再調整し、小スケール化することでマトリックスゲルを含まない原料ゴム分離を試みた。2.再調整したN330+NBRニトリル量33.5%の原料ゴムのクロロホルム溶液を、同様に20条件で再度単離生成したのち単離度を評価した。2TG/DTAによる単離生成度の評価を行った。120K/1時間の条件で分離洗浄を繰り返し下層成分をTG/DTA測定した。洗浄回数を重ねる事で、ゴム成分由来の重量減少率が小さくなり、単離生成が順調に進んでいる事が確認された。4回目-5回目でほぼ同じTGプロファイルが得られたため、単離の為の洗浄が完了したと判断した。3単離精製したフィラーゲル相を含むフィラーの水素ガス吸着量を評価した。結果の解析を進めているが回収できたサンプル量が少なかったため明確な結論を導くには至っていない。また、合わせてフィラー単体への20MPa水素ガス曝露環境下でのガス吸着量評価を始めた。今年度おおよその単離条件を決定することが出来たのでサンプル回収量を今後増やし、特性評価を行う。当初、原料サンプルの保管による時間経過が原因で架橋が進行したと考えられる不容成分が回収され、単離精製に時間を要したが、原因が判明し対策を講じることで下期は順調に実験が進捗した。単離条件もおおよそ決定することが出来ており、今後評価対象サンプル回収を迅速に進めることが可能となった。

補強目的でゴムに添加されるフィラーとゴムマトリックスの界面に形成されるフィラーゲル層が、各種ガスや溶媒および添加剤の溶解・拡散挙動に及ぼす影響を把握する事を目的とし、遠心分離機を用いたフィラーゲル層の単離精製法を昨年まで試みてきた。昨年度見いだした条件で大量精製を試みたが、TGA測定を行った結果、精製度が大スケールでは不十分であることが判明した。平行して溶液粘度測定値とストークスの式を用いて遠心時間を計算し、最良な沈降時間内で高純度に単離精製可能なおおよその溶液濃度を算出した。濃度/粘度0.15wt/%(3cp)・0.5(8)・1.0(20)の3条件とし、回転数10krpm、1.92x108[cm/s2]の条件で遠心分離を試みた。遠心時間は5分・10分・1時間の3条件で実施した。10分でほぼ1時間遠心分離した結果と目視で同等の結果が得られ、上記計算の信頼性が確認された。TGA測定の結果、微量のゴムマトリックス単離不純分物が確認されたが、3回洗浄と遠心を行い目的の純度を得る事に成功した。粒径の大きいフィラーほど、フィラーゲル層の重量比は少なく、メッシュ法により単離されるバウンドラバー量の関係と酷似する。しかし、その量はメッシュ法に比べ大幅に少なく、特に粒径の小さいフィラーではその差が大きい。本手法がフィラーゲル層の単離精製を行うのに優れた手法である事が証明された。回収物のガス吸着性を評価した。合わせて、同配合のゴム試験片のガス吸着性・透過性を評価した。フィラー配合ゴム1・フィラー単体2・フィラー未配合ゴム3・精製回収したフィラーゲル層を含むフィラー4の収着量は3=1+2では成り立たなく、1<4であった。これまで比表面積が大きい、つまりガス吸着量が多いフィラー配合ゴムほどガス溶解量が大きいとされているが、フィラーゲル層の浸入量が全体のガス溶解性に寄与している可能性が確認された。ゴムの破壊現象に強く影響を及ぼすガス透過特性はガス浸入量(溶解量)と拡散係数によって決定される。補強目的でゴム材料にカーボンブラック[CB]を配合した際、ポリマー鎖とCB間に形成されるフィラーゲル層におけるガス特性の把握が重要となる。フィラーゲル層を有するCB粒子の新規単離精製法を提案し、ガス特性を評価した。CBと高分子鎖の密度差を利用した超遠心分離法を探索し、高純度でフィラーゲル層を有するCB粒子を単離精製する事に成功した。ガス特性を評価した結果、フィラーゲル層へのガス侵入挙動が確認され、重要な知見を得ることが出来た。今後各種耐ガス機器用材料等の設計において有用な指針となることが期待される。当初計画に変更はなく、遠心分離条件の最適化と熱重量分析によりフィラーゲル量の定量法の確立を引き続き行う。単離物の回収後各種ガス特性評価を実施する予定である。当初計画に変更はなく、単離物の回収量を増やし各種ガス特性評価を実施する予定である。高分子化学実験の結果、消耗品であるサンプルチューブの形状が分離特性と、その後の精製作業性に影響が出ることが分かった。当初の発注個数を減らし今年度の実験結果を基に最適なサンプルチューブを選択し直すこととした。現状の実験速度に影響が出ないレベルのなので次年度の発注費用と合わせて購入することで単価を下げることが可能であり、効率の良い予算執行を目指したため。得られた研究結果から、次年度予定していたサンプルと本年度予定していたサンプルの種類を入れ替え研究の効率をはかったため。
新規腫瘍検査法評価と未知なるバイオマーカー因子同定

悪性腫瘍に対する医学検査の革新を意図し、独自に開発してきた腫瘍バイオマーカーRB1CC1, p62/SQSTM1、他の臨床医学的検証を行った。とともに、ゲノム変異モデルマウスを用いた未知の悪性腫瘍バイオマーカーの探索、同定を併行して行ってきた。一方で、正常細胞系列と癌細胞系列との比較に於いて発現解析、主成分分析を施行し、がん細胞、がん幹細胞に特異的発現を示す新規の分子群を同定し、革新的な標的治療分子として特許申請を行い、更に、これらの解析を進めた。腫瘍検査学の更なる革新を意図し、我々がこれまで独自に開発してきた腫瘍マーカー因子の臨床医学的検証を行った。とともに、ゲノム変異モデルマウスを用いた未知の腫瘍検査バイオマーカー因子の探索・同定を、併行して行っている。腫瘍バイオマーカーの検証として、口腔扁平上皮の癌化におけるp62/SQSTM1の役割とその臨床的意義を検討した。口腔扁平上皮癌、異形成上皮、正常上皮においてp62の免疫組織化学的評価を行い、ヒト口腔扁平上皮癌細胞株を用いたp62の生物学的機能解析も行った。細胞生物学的な解析より、p62は癌細胞のグルタチオン誘導に寄与し、放射線治療抵抗性と関連することが示唆された。組織評価において口腔扁平上皮癌でp62の過剰発現を示す症例は予後不良であった。p62/SQSTM1の過剰発現、蓄積は口腔扁平上皮の癌化に寄与し治療抵抗性、予後不良のバイオマーカーになり得ることが実証し得た。本内容は論文として報告したが、2013年8-9月に新聞各紙でも報道された。一方で、腎癌に於ける飢餓細胞死のバイオマーカーとしてN-GlcNAc2蛋白の蓄積を発見し得た。本内容はがん細胞に於ける特異的代謝と治療抵抗性を関連づけるマーカーとして、注目されつつある。ゲノム変異モデルマウスを用いた未知の腫瘍検査バイオマーカー因子の探索・同定については、その責任遺伝子領域を<50Mbにまで狭めることができた。今後、本責任領域の更なる解析を進め、未知のバイオマーカー、長寿因子同定に至る計画である。とともに、ゲノム変異モデルマウスを用いた未知の腫瘍検査バイオマーカー因子の探索、同定を、併行して行ってきた。一方で、正常細胞系列と癌細胞系列とに於いて、比較発現解析、主成分分析を行い、癌細胞に特異的発現を示す発現分子10種を同定した。1.独自開発の腫瘍バイオマーカーについてのcohort studies:腫瘍バイオマーカーの検証として、口腔扁平上皮の癌化におけるp62/SQSTM1の役割とその臨床的意義を検討した。本内容は既に2013年度に発表し得た。本内容はがん細胞に於ける特異的代謝と放射線治療抵抗性を関連づけるマーカーとして、注目されつつある。本内容は2014年度に発表した。2.RB1CC1 K0変異マウスに於ける胎生致死を救済する長寿因子Sの探索、同定:ゲノム変異モデルマウスを用いた未知の腫瘍検査バイオマーカー因子の探索、同定については、今後、責任領域の更なる解析を進め、未知のバイオマーカー、長寿因子同定に至る計画である。3.癌細胞特異的発現分子を標的とする新規腫瘍検査法、治療法の開発:骨肉腫、乳癌細胞系列と正常線維芽細胞、間葉系幹細胞系列を比較解析し、主成分分析を行うことによって、癌細胞系列に特異的発現を示す分子10種を同定した。これら癌細胞特異的発現分子は新規性が高く、特許申請を進める。とともに、今後、これら分子を応用した分子診断法、標的分子治療法を開発して行く予定である。腫瘍検査医学の更なる革新を意図し、これまで独自に開発してきた腫瘍マーカー因子の臨床医学的検証を行った。一方で、正常細胞系列と癌細胞系列とに於いて、比較発現解析、主成分分析を行い、癌細胞に特異的発現を示す発現分子10種を同定、特許申請を行った。また、下咽頭癌におけるp62/SQSTM1の過剰が放射線治療抵抗性と関与し、治療選択の際の良い指標となることを実証した。それぞれ、2013、2016年度に論文にて発表した。2. RB1CC1 K0変異マウスに於ける胎生致死を救済する長寿因子Sの探索、同定:ゲノム変異モデルマウスを用いた未知の腫瘍検査バイオマーカー因子の探索、同定については、今後、責任領域の更なる解析を進め、未知のバイオマーカー、長寿因子同定に至る計画である。3.癌細胞

特異的発現分子を標的とする新規腫瘍検査法、治療法の開発:骨肉腫、乳癌細胞系列と正常線維芽細胞、間葉系幹細胞系列を比較解析し、主成分分析を行うことによって、癌細胞系列に特異的発現を示す分子10種を同定した。これら癌細胞に特異的な発現分子については、標的化実証実験の上、特許申請を行った。これら分子のうち、特に、RAB39Aに対する標的治療有用性のproof of conceptを積み上げ、論文発表を準備し、更に、本分子標的治療の創生に向かって研究を継続している。悪性腫瘍に対する医学検査の革新を意図し、独自に開発してきた腫瘍バイオマーカーRB1CC1, p62/SQSTM1、他の臨床医学的検証を行った。とともに、ゲノム変異モデルマウスを用いた未知の悪性腫瘍バイオマーカーの探索、同定を併行して行ってきた。一方で、正常細胞系列と癌細胞系列との比較に於いて発現解析、主成分分析を施行し、がん細胞、がん幹細胞に特異的発現を示す新規の分子群を同定し、革新的な標的治療分子として特許申請を行い、更に、これらの解析を進めた。腫瘍バイオマーカーの検証として、頭頸部癌に於けるp62/SQSTM1の検証を行い得、社会的にも大きな注目を浴びた。また、腎癌に於ける細胞死の新しいバイオマーカーとしてN-GlcNAc2蛋白の蓄積を発見し、報告し得た。一方、RB1CC1 K0変異モデルマウスを用いた未知の腫瘍検査バイオマ一カー因子の探索、同定については、その責任遺伝子領域を絞りつつ、解析を進めている。他方、正常細胞系列と癌細胞系列とに於いて、比較発現解析、主成分分析を行い、癌細胞に特異的発現を示す発現分子10種を同定し、これらについて、特許申請を進めている。研究計画の2つの柱である、バイオマ一カーのcohort検証、変異マウスを使った未知の長寿因子同定、は、多少の振幅はあるものの、両者ともに概ね計画に沿って進行しているものと考える。これらとは別に、新たな癌細胞特異的発現分子を同定し、これら分子を基にした癌に対する新規診断法、標的治療法を開発しようとしており、全く新たな展開も生みつつある。27年度が最終年度であるため、記入しない。遺伝子診療各種腫瘍バイオマーカーのcohort studiesについては、一旦目処を付けて、もう一つの柱である、未知の長寿因子同定に傾重して計画を更に進行させる。また、新たに同定した癌細胞特異的発現分子10種を基に、癌に対する全く新規の分子診断法、標的治療法を開発して行く。また、腎癌に於ける細胞死の新しいバイオマーカーとしてN-GlcNAc2蛋白の蓄積を発見し得た。一方、RB1CC1 KO変異モデルマウスを用いた未知の腫瘍検査バイオマーカー因子の探索・同定については、その責任遺伝子領域を<50Mbにまで狭めることができた。研究計画の2つの柱である、バイオマーカーのcohort検証、変異マウスを使った未知の長寿因子同定、多少の振幅はあるものの、両者ともに概ね計画に沿って進行しているものと考える。年度内の予算執行に際し、研究消耗物品を購入するにあたり、端数として発生した。
昭和戦前期における高等師範学校附属小学校の歴史教育実践に関する実証的研究

本研究では,歴史教育の戦前と戦後の教育論や授業論レベルでの「継承」と「断絶」とはどのようなものであったのかという問題意識のもとに,昭和戦前期の歴史教育の理論と実践を初等教育段階の歴史授業を対象に,歴史教育雑誌の教育実践に基づく実証的な分析を行った。それによって,高等師範学校附属小学校の歴史教育論を「説話主義」「理会主義」「作業主義」「合科主義」の4つに類型化し,その歴史教育実践に見られる特質と限界を明らかにすることができた。本研究の目的は,初等教育段階での授業諭に焦点を当て,歴史教育改革の代表的実践校であった東京高等師範学校附属小学校,広島高等師範学校附属小学校,東京女子高等師範学校附属小学校,奈良女子高等師範学校附属小学校での4つの歴史教育実践を教科教育学的なアプローチから考察するこである。昭和戦前期における4つの高等師範学校附属小学校の実践は,大正自由教育期の理諭と実践を生かしながら,多くの小学校教師の理諭と実践に影響を及ぼしたものの,歴史教育については,教科教育学的なアプローチよる分析は十分になされていない。そこで,初等教育研究会『教育研究』(東京高等師範学校附属小学校),学校教育研究会『学校教育』(広島高等師範学校附属小学校),児童教育研究会『児童教育』(東京女子高等師範学校附属小学校),学習研究会『学習研究』(奈良女子高等師範学校附属小学校)の4つの機関誌から高等師範学校附属小学校の歴史教育実践を実証的に明らかにした。平成20年度の研究成果は以下の2点である。第一に,奈良女子高等師範学校附属小学校の合科主義歴史教育諭について,大松庄太郎の理諭と実践を手がかりに,大正末期から昭和初期までの大松の歴史教育に関する著作及び『学習研究』『伸びて行く』などの諭考を分析対象にして明らかにした。第二に,広島高等師範学校附属小学校の理解主義歴史教育諭について,大久保馨を中心にしながら,その理諭と実践の特質を明らかにした。広島高等師範学校附属小学校の学校教育研究会が発行した『学校教育』に大久保が諭考を発表するのは,1921年2月号(第92号)が初出で,以後,1939年9月号(第324号)まで継続的に諭考を発表している。そこで,『学校教育』に発表された大久保の歴史教育に関する諭考と著作を主な対象として分析を行った。次年度は,残った高等師範学校附属小学校の歴史教育論の分析を行う計画である。本研究の目的は,初等教育段階での歴史授業論に焦点を当て,歴史教育改革の代表的実践校であった東京高等師範学校附属小学校,広島高等師範学校附属小学校,東京女子高等師範学校附属小学校,奈良女子高等師範学校附属小学校での4つの歴史教育実践を教科教育学的なアプローチから考察することである。平成21年度の研究成果は以下の3点である。第一に,広島高等師範学校附属小学校の理会主義歴史教育論について,大久保馨を中心にしながら,その理論と実践の特質を明らかにした。広島高等師範学校附属小学校の学校教育研究会が発行した『学校教育』に大久保が論考を発表するのは,1921年2月号(第92号)が初出で,以後,1939年9月号(第324号)まで継続的に論考を発表している。そこで,『学校教育』に発表された大久保の歴史教育に関する論考と著作を主な対象として分析を行った。第二に,東京高等師範学校附属小学校の説話主義歴史教育論について,山田義直を中心にしながら,その理論と実践の特質を明らかにした。同校の国史科の訓導であった山田は,東京高等師範学校附属小学校の初等教育研究会が発行した『教育研究』に第125号(1914年)から第367号(1931年)まで継続的に論稿を投稿している。そこで,『教育研究』に発表された山田の歴史教育に関する論考と著作を主な対象として分析を行った。第三に,4つの高等師範学校附属小学校の歴史教育論の類型化を行い,その歴史教育実践の特色を明らかにした。
言語遺伝子の同定および変異解析と臨床病型に関する研究

発達性言語障害を有する患者におけるFOXP2遺伝子の解析を行った。非言語性IQが比較的正常に近い41症例を臨床的に分類した上で、末梢血からゲノムDNAを抽出し、全エクソン領域(17エクソン)をPCR-SSCP法で解析し、変異の有無を検討した。自閉症18例、表出性言語障害15例、受容-表出混合性障害5例、注意欠陥/多動性障害1例、学習障害(読字障害)1例、上記の何れにも当てはまらない軽度精神遅滞患者1例およびその家族と、正常対照として80例(男性42例、女性38例)の解析を行った。疾患群のうち家族歴を有するものは4例であった(兄弟3例、従兄弟1例)。解析の結果、エクソン5のポリグルタミンストレッチにおける3塩基(CAA)欠損が疾患群に4例と正常対照に4例、15エクソンのイントロン/エクソン境界部分における1塩基(T)挿入が疾患群に3例と正常対照に9例見つかった。この2つの変異の保有率に関して、疾患群と正常対照の間に統計学的有意差は認めなかった。またエクソン5のポリグルタミンストレッチにおける3塩基(CAG)挿入が正常対照にのみ2例存在した。既存のR553H変異(KE family : Lai CS, et al. Nature 413:519・523,2001)は検出されなかった。家族歴のある症例に変異は検出されなかった。変異を有する症例について、さらなる発達検査や言語評価を行い詳細に検討していく予定であるが、現時点では、日本語を第1言語に有する本邦においてFOXP2遺伝子が発達性言語障害患者の言語発達に直接影響を及ぼしている可能性は少ないと考えられる。平成15年度は自閉症を含む発達性言語障害患者におけるFOXP2遺伝子の解析を行った。小児自閉症、その他の発達性言語障害例(非言語性IQが正常に近い症例)を臨床的に分類した上で、末梢血からゲノムDNAを抽出し、全エクソン領域(17エクソン)をPCR-SSCP法で解析し、変異の有無を検討した。これまでのところ、22例(小児自閉症9例、特異的言語障害例13例)の患者およびその家族の解析を行った。このうち家族歴を有するものは3例であった(兄弟2例、従兄弟1例)。解析の結果、エクソン5のポリグルタミンストレッチにおける3塩基(CAA)欠損と15エクソンのイントロン/エクソン境界部分における1塩基挿入がそれぞれ2例ずつ見つかった。既存のR553H変異(KE family : Lai CS, et al.Nature 413:519-523,2001)は検出されなかった。FOXP2遺伝子のエクソン5および6にはポリグルタミンストレッチ、エクソン1214にはフォークヘッドDNA結合ドメインがあり、今回発見された変異はこれらの領域内や近傍に存在するため、FOXP2遺伝子の機能に影響をきたす可能性が高いと思われる。変異のみつかった症例に関しては、今後、家族および正常対照を増やして比較し、遺伝子変異が疾患と関連するものか否かを検討する。また、同じ変異を有する2例ずつについて、臨床病型の相違を種々の発達検査や言語評価を行い詳しく検討する必要がある。
新しい日本人特異的DNAマーカー(SNP)の開発と個人識別への応用

個人識別は法医学の重要な鑑定項目であり、本研究では従来あまり研究されてこなかった死体あるいは斑痕等の帰属民族・集団の同定、とくに日本人であることの証明を可能にするDNAマーカー(SNP)を、主にミトコンドリアDNA、Y染色体DNAを用いて検討した。日本人、韓国人、中国人(漢民族)、モンゴル人(ハルハ族)、ドイツ人からなる計7002000人を調査した。mtDNAではわれわれの開発したAPLP法を利用して、コード領域の変異20種を同時にタイピングした。ハプロタイプB2はドイツ人や中国人ではまったく観察されず、韓国人では3%であったが、沖縄では22%を示し、沖縄から青森に向かって頻度が減少する勾配が認められた。また、Y染色体上の非組換え領域にある二対立遺伝子多型からなるハプログループは、主にRFLPによって分析した。YAP、RPS4Y、M9などの東アジアの集団に特徴的な29多型部位を調査したところ、24種類のハプログループに分類された。東アジアの集団は上記3種の多型から派生したC、D、O系統が大多数を占めた。漢民族は圧倒的にO系統が優勢で、日本人、韓国人、ハルハ族とは分布が異なっていた。漢民族はかなり均一な集団と考えられた。SRY遺伝子にみられたC-Tトランジションは日本人と韓国人に比較的高い頻度で出現していることが示された。その日本人には、YAP系統のhg4、hg5やRPS4Y系統のhg8が比較的高頻度に検出された。韓国人にもわずかに観察されたが、ほぼ日本人特異的であった。これらのハプロタイプが検出されたときは日本人である可能性が高いことが示された。その他、AHSG、PI、C1Rなどの常染色体の遺伝子も検討した。われわれは、国際化にともなって日本の国内に住む外国人が犯罪や事故、あるいは、船舶事故や遺棄による解剖体や生物試料の個人識別において、日本人と他の外国人とを識別することができる新しい遺伝的マーカーの発見と実務への応用をめざしている。本年は多型性が高く、コピー数の多いミトコンドリアDNA(mtDNA)内の塩基置換に着目して検討をおこなった。日本人、韓国人、中国人、ドイツ人からの得たmtDNAの6ヶ所の多型部位(nt3010、4386、5178、8794、10398および9bpのコピー数)についてタイピングしたところ、ハプロタイプとして、18種が観察された。そのうち、主要なハプロタイプは10種あった。A1、A2、B2、B3、C2はアジア系の人々に、B5とC5はドイツ1人に限定しており、相違が認められた。A2は日本人では26-44%であったのに対して、17%であった。B2に関しては、日本人は高い頻度を示し、なかでも沖縄の人々が22%と最も高かった。ソウルと光州の韓国人は3%であり、シェンヤンの中国人やドイツ人では観察されなかった。このように、ハプロタイプB2を持っているヒトは日本人に多く観察されており、日本人である可能性を示すものである。このような遺伝子変異を多数見つけることによって、遺伝学的にきわめて類似性の高い日本人と韓国人の識別も可能になってくると思われる。さらに、Y染色体のSNPであるM55、M174もその可能性が高いことが示唆された。

国際化に伴って増加している日本国内に居住する外国人の犯罪や事故への関与、あるいは、周辺海域における船舶事故や遺棄によって発生する遺体やその一部に対する個人識別が重要となってきており、われわれは、日本人と外国人の異同識別のための新しいマーカーの検索を行なっている。本年度は男性特有のY染色体上の二対立遺伝子多型(SNPs)からなるハプログループの分布を調査した。DNAは日本人(鳥取,沖縄)、韓国人(ソウル),漢民族(西安,長沙,福州,恵州),ハルハ族(モンゴル),ドイツ人(ミュンヘン)の9集団785人から得た。DNA多型はUnderhill et al.(2001)のプライマーデータベースを一部改変して,主に,RFLPによって解析した。YAP(M1),RPS4Y(M130),M9などの東アジアの集団に特徴的な29多型を調査したところ,24種類のハプログループに分類された。東アジアの集団は上記3種の多型から派生したD,C,O系統が大多数を占めた。鳥取ではそれぞれ25.6,21.4,52.1%であり、沖縄では特にD系統が高かった。韓国人ではD系統は少なく、O系統のSRY465やDXYS5Yが日本人と共通して高かった。一方、漢民族ではO系統が圧倒的に優勢で,ハルハ族ではC系統が50%以上を示した。ハプログループ頻度を基にCavalli-Sforzaの遺伝距離(Dc)を算出し、近隣結合(NJ)法で得られた系統樹は,日本人・韓国人,中国4集団,ハルハ族がそれぞれ異なるクラスターを形成した。日本人で高頻度に出現するD系統のうち、M125陽性グループなどが実務に応用可能であった。法医学の個人識別はSTR多型の開発にともなって大いに発展したが、いまだに死体や法医学的生物試料の民族的由来を証明することは困難であるために、主にミトコンドリアDNA(mtDNA)やY染色体DNAについて新しい日本人マーカーを検索した。DNAサンプルは700-2000人の日本人、韓国人、中国漢民族、モンゴル人、ドイツ人のほかに、新しく中国無錫の集団を加えた。マーカーもmtDNAでは約20種に、Y染色体DNAでは約30に増やした。mtDNAでは多くの集団において大きな頻度の相違を示すと共に、幾つかのハプロタイプは日本国内でもかなり顕著な勾配を示すことから、ミトコンドリアハプロタイプ分析は日本人の起源の問題に関するよいマーカーとなることが期待された。また、Y染色体上の非組換え領域にあるbinary多型からなるハプログループ頻度を調査すると、東アジアの集団はC、D、Oの系統からなるハプログループが大多数を占めたが、集団ごとに大きく分布が異なっていた。漢民族では圧倒的にO系統が優勢であることが無錫の集団データからも支持された。Karafetら(2001)のデータをくわえて解析した系統樹分析でも日本人と韓国人の親和性が高く、共通の対立遺伝子を共有していた。にもかかわらず、D系統のhg4(M55座)、hg5(M125座)、C系統のhg8(M131)は韓国人ではほとんど検出されず、ほぼ日本人特異的であった。mtDNAやY染色体DNAのこれらのハプログループが検出された場合は日本人である可能性が高く、また、SRY遺伝子のC→T変異が見られた場合は日本人もしくは韓国人である可能性が高い。他に、補体第一成分R因子(C1R)遺伝子やエステラーゼD遺伝子などについても調べた。