hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
T 型カルシウムチャネルによる神経新生調節機構の解明 と創薬研究

うつ様行動を懸垂尾試験および強制水泳試験を用い評価したところ、Cav3.1欠損マウスではうつ様行動はみられなかった。一方、海馬歯状回の脆弱性と相関が見られる社会性行動がCav3.1欠損マウスでは低下していた。Cav3.1欠損マウスと野生型マウスでは行動量に変化はみられなかった。ストレスホルモンを投与したうつ様モデルマウスに対するST101およびSAK3の作用を検討したところ、改善効果はみられなかった。現在、例数の追加と再現性について検討している。また、ストレスホルモンをCav3.1欠損マウスに投与し、同様にうつ様行動について評価している。野生型およびCav3.1欠損マウスの海馬歯状回サンプルをマイクロアレイ解析にかけ、遺伝子変化について解析を行った。その結果、昨年度に報告した細胞内シグナル伝達の低下と相関し、BDNF遺伝子発現が低下しているのがわかった。その他、興味深い遺伝子を数種見出すことが出来た。低下した遺伝子群において標的を絞り、標的分子の活性化または発現増強を薬理学および遺伝学的に行い、Cav3.1欠損マウスにみられる神経新生低下が改善されるか検討する予定である。さらに、新生細胞には主にCav3.2-3.3ではなく、主にCav3.1チャネルが発現していることがわかった。今後、Cav3.2-3.3の未成熟細胞における発現について免疫染色法により確認する。また、SAK3投与により、グルタミン酸およびGABA遊離が促進されることを見出した。本研究ではT型カルシウムチャネル賦活薬SAK3の抗うつ作用・神経新生のメカニズムおよびT型カルシウムチャネルのうつ様行動・神経新生における生理機能を明らかにすることを目的とし、研究をおこなった。Cav3.1 T型カルシウムチャネル欠損マウス海馬歯状回において神経新生が低下していることを見出した。また、Cav3.1 T-型カルシウムチャネル欠損マウスでは新生細胞の増殖および生存能どちらも低下していた。Cav3.1の海馬歯状回における局在について検討したところ、神経幹細胞のマーカーであるnestinおよび未成熟細胞のマーカーであるDCXと共局在を示した。これらのことはCav3.1から流入するカルシウムイオンが神経新生に直接影響を与えている可能性がある。実際に細胞増殖・生存に重要なプロテインキナーゼであるAktリン酸化反応は低下していた。一方、T型カルシウムチャネル賦活薬SAK3投与により、モノアミン遊離が促進した。SAK3の作用はT型カルシウムチャネル阻害薬NNC 55-0396 (1 μM)処置により抑制された。SAK3はアセチルコリン遊離を促進するが、モノアミン遊離促進作用はニコチン性アセチルコリン受容体拮抗薬でも阻害された。以上の結果は、T型カルシウムチャネルは直接および間接的に新生細胞の増殖・生存に関与していることを示唆している。また、研究成果を3つの国内学会にて報告した。計画通り実験が進んでいる。SAK3の抗うつ作用に関する論文は現在投稿中である。Cav3.1欠損マウスにおける解析は遺伝子レベルでの解析を行い、本年度中に論文を作成し、投稿予定である。Cav3.1のうつ様行動および社会性行動などの行動薬理試験による解析を行う。難治性うつ病モデルマウスを用い、SAK3の抗うつ作用について検討する。In vivoマイクロダイアリシスを用い、興奮性神経伝達物質グルタミン酸および抑制性神経伝達物質GABA遊離に対するSAK3の作用を検討する。また、Cav3.1 T型カルシウムチャネル欠損マウスの神経新生低下のメカニズムについてより詳細な検討を行う。
複数結合同時構築法の一般化とその生理活性天然物合成の応用

先ず分子内二重ミカエル反応の一般化を計るため、基質と反応条件の関連性を解明し、基質の分子環境と反応条件が本反応の立体,配向および位置選択性に大きく関与することを明らかにした。このことにより分子内二重ミカエル反応の持つ大きな特徴をより明確にすることができた。これらの事実に基ずき、シテルペン系アルカロイドの一種デヌダチン合成の鍵中関係となりうる五環性化合物を高効率下に立体選択的に不斉合成することに成功した。次いで複数結合同時構築法の発展・拡大を目的として検討を加え,β-チオエノン系での分子内二重ミカエル反応を開発することができた。なお本反応(硫黄媒介型分子内二重ミカエル反応)は極めて高い立体選択性のもとに進行し、上記の分子内二重ミカエル反応では進行しえない系へ適用しうる応用範囲の広い新化学反応どある。さらにこの新反応の機構について検討し、硫黄原子が反応に際し極めて重要な役割を果していることを明らかにすることができた。さらに従来、不可能とされてきた酸ハライド類のミカエる反応も、反応系を分子内反応として改変することにより、極めてスム-ズに反応が進行することを発見し、ミカエル反応の適用範囲を大きく拡大することができた。なお新反応,連続的酸無水物形成・分子内ミカエル反応は、基質にキラル補助剤を組込むと極めて高い光学純度で目的の得られることも見出した。最後に基質の修蝕により新化学反応、連続的分子内ミカエル・アルド-ル反応を開発し,シクルブタン系の新構築法の開拓に成功した。上記のごとく、著者は(1)分子内二重水ミカエル反応の一般化,(2)硫黄媒介型二重付加反応の開発,(3)連続的酸無水物形成・分子内ミカエル反応,(4)連続的ミカエル・アルド-ル反応の開発に成功した。
結晶組織的に複雑な系中の水素の移動機構の解明

金属板中の水素の透過能を低圧力領域、中間温度領域で測定する超高真空系の装置を作成し、純Pd、Fe、Ni板中の水素の透過能の水素圧力依存および温度依存をガス透過法で調べた。この装置では表面汚染が抑制される分、より低水素圧、より薄い試料板での測定が可能になる。真空中で焼鈍したPd試料板の水素の透過能のアレニュウス・プロットは種々の温度で折れ曲がり非常に複雑な様相を示した。これらの結果は水素の透過能がPd板の表面状態に大きく影響されるためである。この表面汚染は空気中、低温での焼鈍で取り除かれることが判明した。汚染の除去によって水素透過量は増加し、その量のアレニュウス・プロットは直線を示すようになった。この結果から、作成した装置および測定方法は多層膜試料での水素透過測定に適していることが判明したのでPd基板上のPd-Fe系、Pd-Ni系の多層膜について水素の透過能測定実験を行った。Pd-Fe系多層膜ではPd基板表面の汚染物を取り除く表面処理を行えば水素透過量のアレニュウス・プロットは直線を示したが、Pd-Ni系多層膜でのアレニュウス・プロットは低温領域で上方に折れまがり、直線状にはならなかった。これらの実験結果と多層膜の水素透過のモデル計算とより、Pd-Ni系多層膜ではPd中間膜および境界層は水素透過には全く影響しないことが明らかになった。Niのバルクの物性値を用いたモデル計算と比べて異常に高い透過能は薄膜層の結晶粒が小さいため粒界拡散の寄与が大きくなるとして理解出来る。一方、Pd-Fe系についての結果は複雑であり、更に詳しく調べる必要がある。水素透過量はPd-Fe系多層膜では減少し、前記のPd-Ni系多層膜と逆に、Feの薄膜層は結晶粒が小さいと水素透過を抑制することを示唆している。また、AESでPd表面を調べ、この水素透過を抑制する表面汚染物が炭素の化合物であることを明らかにした。この装置では従来の装置と比べて表面汚染が抑制される分、より低水素圧、より薄い試料板での測定が可能になる。真空中で焼鈍したPd試料の透過能のアレニウス・プロットは種々の温度範囲で折れ曲がり非常に複雑な様相を示した。このらの結果は透過能がPd板の表面状態(汚染)に大きく影響されるためであることが判明した。また、この汚染は空気中、低温での焼鈍で取り除かれることが分かった。汚染の除去によって水素透過量は増加し、アレニュウス・プロットは直線を示すようになった。また、汚染の除去と共に、水素の圧力と透過量のlog-logプロットの傾きは減少し、ジーバーツ則が成立するようになる。一方、水素ガス中で焼鈍したFe板、Ni板では透過能のアレニウス・プロットは非常によく直線に載り、表面汚染の影響はなかった。また、ジーバーツ則も清浄表面Pd板の場合と同様に成立した。清浄表面Pd板およびFe板、Ni板の透過能の測定データは各々の元素に対する文献値と非常によく一致することがわかった。この結果、我々の作成した装置および測定方法は良好であることが判明したので再度Pd-Fe系の多層膜についての水素の透過実験を開始した。

Pd基板の表面処理を行えばPd-Fe系の多層膜についても水素透過量のはアレニュウス・プロットは直線を示すようになった。この直線の傾きから求められる水素の透過エネルギーはFe膜の厚さ、Pd中間層膜、Pd基板の厚さ、層間の境界層などに依存している。次の13年度、14年度でこれら多層膜境界層などがおよぼす影響を明確にする。前年度は金属板中の水素の透過能を低圧力領域、中間温度領域で測定する超高真空系め装置を作成し、この装置が純Pd、Fe、Ni薄板の水素の透過能を測定するのに有効であることを示した。今年度はPd-Fe系、Pd-Ni系の多層膜についての水素の透過実験を行った。両多層膜の水素透過量はFe、Niの水素透過能がPdのそれと比べて格段に少ないためPd基板のみの試料と比べて非常に少ない。前年度の研究で明らかになったPd基板表面の汚染を除去する清浄化処理を行えばPd-Fe系の多層膜についても水素透過量のアレニュウス・プロットは直線を示すようになった。この直線の傾きから求められる水素の透過エネルギーはFe膜のトータルの厚さの増加と共に、Fe薄板のそれに近づく。一方、Pd-Ni系の多層膜では水素透過量のアレニュウス・プロットは直線を示さなかった。勿論、水素の圧力と透過量のlog-logプロットはPd-Fe系、Pd-Ni系両多層膜について、ジーバーツ則が成立するようになった。水素の透過量はPd-Fe系多層膜についてはPdとFeのバルク値から期待される値よりも小さい値を示した。すなわち、多層膜の境界層は水素透過の抵抗に明らかになっている。一方、Pd-Ni系の多層膜については、まだ測定試料数が少ないけれども、水素透過量はPdとNiのバルク値から期待される値よりも常に大きい値を示した。特にそれは低温で顕著であった。この余分の水素透過量はアレニュウス・プロットすると直線状になる。しかもこの量は現在のところ原因はまだ解明されていないがNi膜の厚さに比例している。この状況はPdやNiでの水素濃度、水素の拡散係数のバルク値からのずれによっては説明できない。金属板中の水素の透過能を低圧力領域、中間温度領域で測定する超高真空系の装置を作成し、純Pd、Fe、Ni板中の水素の透過能の水素圧力依存および温度依存をガス透過法で調べた。この装置では表面汚染が抑制される分、より低水素圧、より薄い試料板での測定が可能になる。真空中で焼鈍したPd試料板の水素の透過能のアレニュウス・プロットは種々の温度で折れ曲がり非常に複難な様相を示した。これらの結果は水素の透過能がPd板の表面状態に大きく影響されるためである。この表面汚染は空気中、低温での焼鈍で取り除かれることが判明した。汚染の除去によって水素透過量は増加し、その量のアレニュウス・プロットは直線を示すようになった。この結果から、作成した装置および測定方法は多層膜試料での水素透過測定に適していることが判明したのでPd基板上のPd-Fp系、Pd-Ni系の多層膜について水素の透過能測定実験を行った。Pd-Fe系多層膜ではPd基板表面の汚染物を取り除く表面処理を行えば水素透過量のアレニュウス・プロットは直線を示したが、Pd-Ni系多層膜でのアレニュウス・プロットは低温領域で上方に折れまがり、直線状にはならなかった。これらの実験結果と多層膜の水素透過のモデル計算とより、Pd-Ni系多層膜ではPd中間膜および境界層は水素透過には全く影響しないことが明らかになった。
閉鎖生態系実験装置(ミニ地球)を用いた環境-生命系の動態研究

生命の創り出す系であるリビング・システムと閉鎖生態系(CES)の動態を研究するため、1)大気圏の酸素濃度測定、2)同じくCO2濃度測定、3)水圏の溶存酸素濃度測定、4)ATP濃度測定、5)pH測定などを長期間継続した。1から3は24時間連続観測された。また、リビング・システムの不安定性を調べる実験、開放系と閉鎖系に対する性質の知見を得るための実験を行った。それらの知見は次の通りである。CESはそれ特有のダイナミズムと振動状態を有している。例えばそれは、微小擾乱によって突如変化する可能性を持っている。しかし、また、強力な復元力をも持っている。これらの性質の中で、水圏で起こる突然の無酸素状態の出現がもっとも注目すべき現象である。これらの事態は、CESの見かけ上の安定性にも関わらず、ある種の不安定性がCESに存在するということを示しているのである。また、このようなリビングシステムの性質を理論的に研究するために、我々がやっているオートポイエ-シス論のような新しい生命論の展開がどうしても必要である。それは「共生」とか「環境」といった事柄に対して新しい概念を与えるだろう。リビング・システムとしてのCESの安定性や擾乱への動態研究が、巨大な一閉鎖生態系を成す地球の性質理解のためにさらに必要である。CESの結果を地球に当てはめるなら、生命と環境とは共進化する系を成しているといえる。それらは決して切り離されてはいない。ところが、現行の気候変動理論は皆、地球をCESとして考えていないものになっている。リビング・システムと閉鎖生態系(CES)の動態を研究するため、2号機、3号機を使って、ATP濃度測定、酸素濃度測定、CO_2濃度測定、pH測定などを長時間継続した。その間に、系に対する不安定性を調べる実験、開放系と閉鎖系に対する性質の知見を得るための実験を行った。1.先ず、CESを維持することは難しいことではないし、それはダメ-ジに対して永続的復元動作をする。このようにCESはその環境の創発と調整に対し力動的に振る舞う。2.CESには固有の振動的動作があり、それゆえ、巨大CESとしての地球に、外因なしでの固有振動が存在することになり、地球の気候変化の解明にそのCES的動態は欠かせないものとなる。3.CESは極小擾乱に対し、系の性質を突如変更するという、とても重要な性質がある(不安定性)。4.しかし、そのような突如の変動後には執拗に元へ戻すという性質を持つ(安定性)。この様な不安定性と安定性の混在がCESの現象である。また、次のような新学説を提出した。特に微小擾乱に対しての、水圏での突如とした無酸素状態の顕現はもっとも注目すべきところである。このことは見かけの安定さにも関わらず、CESには不安定さが同居していることを示す。古生代から中生代、中生代から新生代といった大変換期に海洋に突如とした大規模無酸素状態が存在したことが発見されているが、巨大CESとしての地球の、微小擾乱への閉鎖生態系的動態のゆえであろうと考えられる。生命の創り出す系であるリビング・システムと閉鎖生態系(CES)の動態を研究するため、おもに2号機、3号機を使って、前年度に引き続き、ATP濃度測定、酸素濃度測定、CO2濃度測定、pH測定などを長期間継続した。1.CESはダメ-ジに対しての永続的復元動作をする。CESはその環境の創発と調整に対し、常に力動的に振る舞う。

2.CESは2日、4日、1週間といった短期間暗期設定の突如の擾乱に対し、敏感に酸素濃度などの激減反応を引き起こすが、再度まったく以前の状態に復することが出来る。つまり一時的にまったく別の状態へ遷移するにも関わらず、以前の状態を再現しうるという安定さを示す。3.CESには固有の振動的動作がある。それゆえ、巨大CESとしての地球にも外因なしでの固有振動が存在することになり、地球の気候変化の解明にそのCES的動態は欠かせない。4.CESは2.のように極小擾乱に対し、系の性質を突如変更するという、とても不安定な性質がある。しかし、そのような突如の変動後にも系は破壊されることなく、執拗に元へ戻すという性質を持つ(安定性)。この様な不安定性と安定性の混在がCESに内在する固有の現象である。以上のことから、CESの動態研究はリビング・システムとしての地球の性質を明かすための重要な研究となる。見かけの安定さにも関わらず、CESには不安定さが同居している。古生代から中生代、中生代から新生代といった大変換期に海洋に突如、大規模無酸素状態が存在したことが発見されているが、巨大CESとしての地球の、微小擾乱への閉鎖生態系的動態を考えなければならない。生命の創り出す系であるリビング・システムと閉鎖生態系(CES)の動態を研究するため、前年度に引き続き、1)大気圏の酸素濃度測定、2)同じくCO2濃度測定、3)水圏の溶存酸素濃度測定、4)ATP濃度測定、5)pH測定などを長期間継続した。1から3は24時間連続観測された。また、リビング・システムの不安定性を調べる実験、開放系と閉鎖系に対する性質の知見を得るための実験を行った。それらの知見は次の通りである。1.完全暗的条件でも、CESは内部の構成要素の組み換えによって、ダイナミックな環境改変を行うことができる。すなわち何らの外因なしでも、生命圏はその内的動作のみによって、環境とシステムそれ自体の動的性を保持する。この事態は、巨大CESとしての地球も、外因なしで、気候変化を引き起こしうることを意味し、気候変化解明に地球自体のCES的動態の探索が欠かせないことを意味している。つまり一時的にまったく別の状態へ遷移するにも関わらず、再度、以前の状態を再現しうるという強固な安定さを示す。3.微小擾乱に対する不安定性と、強靱な復元性が、CESに内在する固有な特徴である。これは〈複雑系〉としてのCESの性質の一端であろう。4.オートポイエ-シス論の展開から、「共生」の論理、「環境」とは何かなど、新しい生命システム論の展開が進んだ。これらの論考は出版物の中で公表した。古生代から中生代、中生代から新生代とった地球史の大変換期に、大規模無酸素海洋状態が存在したことが発見されているが、巨大CESとしての地球の、微小擾乱への閉鎖生態系的動態が似た様相を呈する。以上のことから、CESの動態研究は、リビング・システムとしての地球の動態を明かすための重要な研究でありその継続的研究が望まれる。
免疫チェックポイントを阻害したiPS細胞由来樹状細胞による新規癌免疫療法の開発

癌細胞は、免疫チェックポイントを活性化することにより宿主の免疫逃避機構を働かせ、腫瘍増殖を来す。我々は、以前より癌特異的ワクチン療法として、樹状細胞療法の有用性を報告してきた。そこで、本研究は、免疫逃避に重要な役割を担うPD-1およびCD47の二つの免疫チェックポイント分子を阻害させるために、iPS(induced pluripotent stem cell)細胞から誘導した樹状細胞(DC)にPD-1のリガンドであるPD-L1、PD-L2のsiRNA (small interfering RNA)およびCD47のリガンドであるSIRPαのsiRNAを導入することにより、二つのアプローチから免疫抑制状態を破壊することで免疫環境を改善し、さらに効率で強力な細胞傷害性T細胞(CTL)を誘導し、腫瘍特異的抗腫瘍効果を増強する癌免疫療法を構築することを目的にしている。本年度は、PD-L1siRNA,PD-L2siRNAを組み込んだadenovirus vectorを用いて、DCにPD-L1siRNA、PD-L2siRNAを導入し、そのDCからのPD-L1、PD-L2およびSIRPαの発現実験を行った。しかし、その発現解析が進まず(抑制効果が不十分かつ不安定)、adenovirus vectorによる遺伝子導入からelectroporation法に変更し、遺伝子導入の改善およびその条件設定の検討を行っている。現在、iPS由来DCにelectroporation法を用いてCEA遺伝子を導入する実験系を施行し、結果、導入効率は良好で、そのDCの機能(遊走能、細胞傷害活性)が担保されていることを確認している。マウスiPS細胞由来DCにPD-L1siRNAおよびPD-L2siRNA発現adenovirus vector、SIRPαsiRNA発現adenovirus vectorを感染させ、それぞれの細胞からのPD-L1、PD-L2およびSIRPαの発現実験を試みているが、その過程が進まない状況であり、PD-L1、PD-L2およびSIRPαが抑制される至適条件が定まっていない。遺伝子導入法、およびその至適条件の設定に時間を要し、siRNA導入iPSDCにおける抗腫瘍効果の実験系が行えていない。siRNAの導入方法を改良し、種々の条件で検討を進め、PD-L1siRNA、PD-L2siRNA、SIRPαsiRNAをそれぞれ導入したCEA発現iPSDCの作製を早急に遂行し、至適なPD-L1、PD-L2およびSIRPαの抑制条件を決定する予定である。それが判明すれば、siRNA導入iPSDCにおける抗腫瘍効果の実験系が順調に進むことができると考える。また、同時に臨床応用に向けたヒトにおける抗腫瘍免疫応答を検討するため、ヒトiPS細胞由来DCを用いた実験系を行う予定である。癌細胞は、免疫チェックポイントと呼ばれる分子を活性化することにより宿主の免疫逃避機構を働かせ、腫瘍増殖を来す。我々は,以前より癌特異的ワクチン療法として、樹状細胞療法の有用性を報告してきた。そこで、本研究は、免疫逃避に重要な役割を担うPD-1およびCD47の二つの免疫チェックポイント分子を阻害させるために、樹状細胞(dendritic cell;DC)(iPS細胞から誘導)にPD-1のリガンドであるPD-L1、PD-L2のsiRNAおよびCD47のリガンドであるSIRPαのsiRNAを導入することにより、効率的で強力な癌細胞に対する免疫療法を確立することを目的にしている。

siRNAの導入方法を改良し、種々の条件で検討を進め、PD-L1siRNA、PD-L2siRNA、SIRPαsiRNAをそれぞれ導入したCEA発現iPSDCの作製を早急に遂行し、至適なPD-L1、PD-L2およびSIRPαの抑制条件を決定する予定である。それが判明すれば、siRNA導入iPSDCにおける抗腫瘍効果の実験系が順調に進むことができると考える。また、同時に臨床応用に向けたヒトにおける抗腫瘍免疫応答を検討するため、ヒトiPS細胞由来DCを用いた実験系を行う予定である。本年度は、実験試薬、遺伝子操作用試薬・酵素および抗体の一部が当教室の在庫で代用でき、また、国内外の学会出張を抑えたため、次年度使用額が発生した。次年度は抗腫瘍効果の検討に入るため、実験動物やラジオアイソトープ等に費用がかかると考える。また、次年度が最終年度のため、研究結果発表のための学会出張費および論文投稿費が大きく必要になると考える。
誤差拡散法による計算機ホログラムの新しい像改善手法

本研究では,計算機ホログラムの再生像改善である誤差拡散法について,(1)エッジ強調誤差拡散法を適用した場合の効果の検討,(2)3次元像再生シミュレーションの実現,(3)光学系の特性を考慮した再生像の改善手法についての検討を行った.まず,(1)について,しきい値が入力データによって変化するエッジ強調誤差拡散法を適用した.この方法は,ハーフトーン処理において前処理を行うことなく像のエッジを強調できるものである.ところが,計算機ホログラムに適用すると,従来の誤差拡散法と比較して,パターンが明るく再生され,しかも再生像の評価指数である平均2乗誤差を小さくすることができることが明らかとなった.次に,(2)について,計算機ホログラムからの3次元像再生をシミュレーションによって実現した.シミュレーションは離散フーリエ変換を用いた計算によって可能であることを示し,シミュレーションによる再生像と光学再生像はよく一致することを確認した.更に,(3)について,組合せ最適化問題を解くという考えのもとでの再生像の改善方式について検討した.すなわち,CCDカメラで再生像を取り込み,その再生像を良質にするという想定で数値シミュレーションを行った.その解法として,シミュレーテッドアニーリングを適用し,優れた再生像となる計算機ホログラムを構築し,断層タイプの計算機ホログラムの再生像改善を行った.その結果,すべての面で再生像の改善効果が現れ,コスト関数の設定を変えることで再生像の画質が異なってくることが明らかとなった.以上のことから,更に良質な3次元像再生の可能性を明らかにすることができた.本研究では,計算機ホログラムの再生像改善である誤差拡散法について,(1)エッジ強調誤差拡散法を適用した場合の効果の検討,(2)3次元像再生シミュレーションの実現,(3)光学系の特性を考慮した再生像の改善手法についての検討を行った.まず,(1)について,しきい値が入力データによって変化するエッジ強調誤差拡散法を適用した.この方法は,ハーフトーン処理において前処理を行うことなく像のエッジを強調できるものである.ところが,計算機ホログラムに適用すると,従来の誤差拡散法と比較して,パターンが明るく再生され,しかも再生像の評価指数である平均2乗誤差を小さくすることができることが明らかとなった.次に,(2)について,計算機ホログラムからの3次元像再生をシミュレーションによって実現した.シミュレーションは離散フーリエ変換を用いた計算によって可能であることを示し,シミュレーションによる再生像と光学再生像はよく一致することを確認した.更に,(3)について,組合せ最適化問題を解くという考えのもとでの再生像の改善方式について検討した.すなわち,CCDカメラで再生像を取り込み,その再生像を良質にするという想定で数値シミュレーションを行った.その解法として,シミュレーテッドアニーリングを適用し,優れた再生像となる計算機ホログラムを構築し,断層タイプの計算機ホログラムの再生像改善を行った.その結果,すべての面で再生像の改善効果が現れ,コスト関数の設定を変えることで再生像の画質が異なってくることが明らかとなった.以上のことから,更に良質な3次元像再生の可能性を明らかにすることができた.本研究では、計算機ホログラムの再生像改善法である誤差拡散法について(1)エッジ強調誤差拡散法を適用した場合の効果の検討(2)3次元像再生シミュレーションの実現を行った。まず、(1)について、しきい値が入力データによって変化するエッジ強調誤差拡散法を適用した。この方法は、ハーフトーン処理において前処理を行うことなくハーフトーン処理が像にエッジが強調されることが知られているものである。計算機ホログラムにエッジ強調誤差拡散法を適用した場合について、走査ならびに強調係数に対する効果を検討した。エッジ強調誤差拡散法を適用する走査としてはペアノ走査が再生像の改善に優れた効果を与えることと、エッジ強調誤差拡散法における強調係数を大きくするに従って再生像が改善される傾向にあることとを明らかにした。次に、(2)について、計算機ホログラムからの3次元像再生を計算機シミュレーションによって実現した。ここで用いた計算機ホログラムは断層タイプとした。回折理論により再生像の解析を行ったところ、3次元像再生シミュレーションは離散フーリエ変換を用いた計算によって可能であることを示した。シミュレーションによって得られた再生像は光学再生像とよく一致することを確認した。既存の表示方式に対する再生像の比較から、3次元像再生における再生像の画質は2次元像再生の場合と同様な傾向となることを明らかにした。以上のことから、計算機ホログラム再生像の更なる改善と、3次元像再生への研究展開の可能性とを明らかにした。本研究では,計算機ホログラムの再生像改善である誤差拡散法について,(1)エッジ強調誤差拡散法を適用した場合の効果の検討,(2)3次元像再生シミュレーションの実現,(3)光学系の特性を考慮した再生像の改善手法についての検討を行った.まず,(1)について,しきい値が入力データによって変化するエッジ強調誤差拡散法を適用した.この方法は,ハーフトーン処理において前処理を行うことなく像のエッジを強調できるものである.ところが,計算機ホログラムに適用すると,従来の誤差拡散法と比較して,パターンが明るく再生され,しかも再生像の評価指数である平均2乗誤差を小さくすることができることが明らかとなった.

次に,(2)について,計算機ホログラムからの3次元像再生をシミュレーションによって実現した.シミュレーションは離散フーリエ変換を用いた計算によって可能であることを示し,シミュレーションによる再生像と光学再生像はよく一致することを確認した.更に,(3)について,組合せ最適化問題を解くという考えのもとでの再生像の改善方式について検討した.すあわち,CCDカメラで再生像を取り込み,その再生像を良質にするという想定で数値シミュレーションを行った.その解法として,シミュレーテッドアニーリングを適用し,優れた再生像となる計算機ホログラムを構築し,断層タイプの計算機ホログラムの再生像改善を行った.その結果,すべての面で再生像の改善効果が現れ,コスト関数の設定を変えることで再生像の画質が異なってくることが明らかとなった.以上のことから,更に良質な3次元像再生の可能性を明らかにすることができた.
出芽酵母のエタノールストレス応答はエピジェネティクス制御を受け るか?

出芽酵母の持つエタノールストレス応答とエピジェネティクス制御との関連を解析し、環境応答に関わる遺伝子発現制御機構の解明を目指した。ストレス下におけるヒストンアセチル化レベルを解析した結果、野生株ではアセチル化レベルの上昇が見られた。エタノール感受性が見られるエピジェネティクス関連遺伝子欠損株においてはアセチル化レベルが上昇しない株が存在した。本応答に関わるエピジェネティクス関連因子は存在し、複合的に寄与していると推測される。本研究では、出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeの持つエタノールストレス応答に着目し、近年重要性が明らかにされつつあるエピジェネティクス制御との関連を解析し、酵母の環境応答に関わる遺伝子発現制御機構の解明を目指した。エピジェネティクスに重要なヒストンアセチル化レベルの制御には、ヒストンアセチル基転移酵素(HAT)とヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)が関わる。そこでHDAC阻害剤を用い、エタノールストレス応答に及ぼす影響を検討した。その結果、SAHAにより野生株の生育に抑制傾向が見られ、HDACの阻害は本応答に影響を与えることが示唆された。次に、野生株、HAT関連遺伝子欠損株およびエタノール耐性傾向が見られたHDAC関連遺伝子欠損株Δsir3株とΔsir4株について本応答とヒストンアセチル化の関係を解析した。エタノール存在下での野生株のアセチル化レベルは顕著に上昇しており、一方で、HAT関連遺伝子欠損株Δada2株、Δhfi1株、Δngg1株においては、アセチル化レベルに大きな差異は見られなかった。以上より、エタノールストレス応答には、HAT関連遺伝子ADA2、HFI1、NGG1が重要であることが示唆された。また、Δsir3株、Δsir4株では野生株と比べて差異はやや小さいもののアセチル化レベルの上昇が見られた。両株は、エタノールに耐性傾向がみられるが、エタノール存在下では野生株よりもアセチル化レベルは低く、さらに、ノンストレス時では高い可能性が示された。本研究では、エタノールストレス応答に関わるエピジェネティクス関連因子は多数存在することを見出した。また、それぞれの因子は、複合的に作用していることが推測され、さらにストレス適応と耐性ではその機構が異なる可能性が示され、ストレス応答に対してエピジェネティクス制御が深く関与していると考えられる。出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeが持つアルコール発酵能力は古くから人々が利用し、醸造産業やバイオエタノールなどその需要は高まるばかりである。酵母はアルコール発酵の際、自らもエタノールストレスを受けるため、いかにエタノールストレスに耐えるかということが最も重要である。そこで本研究では酵母のエタノールストレスに対抗する仕組みについて明らかにすることを目的とした。また、S.cerevisiaeは単細胞真核生物であり、ヒトを含む真核細胞の生命現象を解明するためのモデル生物としての役割を果たしていることから、エタノールストレス適応機構の解明により真核生物に普遍に存在する環境応答機構を見出せると考え、エピジェネティクスによる遺伝子発現制御に着目した。エピジェネティクスとはDNAの変異を伴わない状態で遺伝する表現型の変化として定義され、クロマチンの構造が変化することがポイントとなる。このクロマチンに対し、ヒストン脱アセチル化酵素(HDACまたはSirtuin)やヒストンアセチル化酵素(HAT)が作用することでDNA発現調節を行っていると考えられている。エピジェネティクスによる制御は、酵母のエタノールストレス適応にも何らかの関わりを持つことが推測され、H23年度は以下の通り解析を進めた。クロマチン構造の変化とエタノール応答の関係について明らかにするため、エタノールストレス存在下、非存在下でのヒストンアセチル化レベルの比較を行った。その結果、野性株においてエタノールストレス存在下ではヒストンのアセチル化レベルが上昇することが明らかになった。また、エタノール感受性を示したHAT関連欠損株のうち、エタノール存在下においてもアセチル化レベルの上昇が見られない株が存在した。これより、エタノールストレス応答にクロマチンの構造変換が関与する可能性が示唆された。当初の実験計画にあるクロマチンの構造変化とエタノールストレス応答との関連性について、種々のエピジェネティクス関連遺伝子欠損株でのアセチル化レベルの比較などから、複雑な制御系の存在が推測されそれらに関わる遺伝子を明らかにできる一端となったと考えている。広範な遺伝子が対象となるため、解析対象の精査に時間を要したと考えている。エピジェネティクス関連遺伝子の欠損とエタノール感受性および耐性となる機構の関連性について、解析を進める。エタノールに対し、感受性および耐性が見られる欠損株を中心にエピジェネティクス制御のターゲットとなる可能性のある遺伝子群を推測する。クロマチンの構造変化について野生株、感受性株および耐性株での差異を比較検討し、エピジェネティクス制御と連動して起こるエタノールストレス関連遺伝子発現を精査する。次年度は、遺伝子欠損株解析において遺伝子改変、発現解析などのため多くの物品費が必要と考えている。また、成果発表のため国内外での報告を予定しており、旅費の支出等も予定している。
骨髄性白血病細胞の分化と細胞内刺激伝達機構

骨髄性白血病の分化と細胞内刺激伝達機構に関して、主にヒト骨髄性白血病細胞株HL-60を用いて検討した。機能の分化は活性酸素産生能を指標として用い、機能蛋白の発現と蛋白チロシンリン酸化はそれぞれの特異的抗体を用いたイムノブロッティングにより解析した。HL-60細胞はジメチルスルホキシド(DMSO)やレチノイン酸(ATRA)に反応して顆粒球に分化し、ホルボールエステル(PMA)に反応してマクロファージに分化する。これらの分化の課程で活性酸素産生能が獲得され発達してくるが、その際の分化誘導能はDMSO>ATRA>PMAの順であり、培養開始後3-5日でほぼ最大の機能発現が観察された。DMSOで分化誘導したHL-60の活性酸素産生能は正常人好中球のそれに匹敵していた。活性酸素産生に必須の膜蛋白(gp91、p22)および細胞質因子(p67、p47)の発現は、蛋白によって大きく異なっていた。すなわち、膜蛋白(特にgp91)の発現は正常好中球に比べて著明に低く、p67の発現は分化誘導剤によって様々であり、p47の発現は常に安定して高かった。これらの蛋白の発現の多様性と活性酸素産生能との間に相関はなく、(正常好中球と比較して)きわめて少量のgp91でも十分に機能することが示された。次に、活性酸素産生のみならずやサイトカインの細胞内刺激伝達においても重要な役割を果たすvav癌遺伝子産物の発現をHL-60を用いて検討したところ、いずれの分化誘導剤による分化においても発現が誘導されることが明らかになり、機能獲得との関係が示唆された。ところが、正常好中球においてはvav産物の含有量は検出限界以下ときわめて少なく、今後は正常血球を用いた分化課程の解析をさらに進めてゆく必要があると考えられた。
日本列島の最終間氷期以降の海況変化にともなう植生の時空間変化と拡散モデル

日本列島の最終間氷期以降の植生変遷をとくに海況変化との関連でとらえ,植生および植生を構成する種群の拡散モデルを構築するために,照葉樹林の発達過程に着目し,主に太平洋に面する海岸低地および内陸域の低地の花粉分析をおこなった。その結果次のことが明らかになった。1.関東以西の低地部では,後氷期を通じて照葉樹林が拡大,成立するが,照葉樹林を形作る要素や拡大時期,発達の様式には地域によって差異がある。2.照葉樹林の成立時期と樹種構成やその発達過程は,日本列島の南西部から北東部へ,そして,沿岸域から内陸域へと温度勾配にしたがって連続している。3.日本列島太平洋沿岸部は,10000年前にはすでに黒潮の影響下にあり,照葉樹林構成要素は潜在的に分布していた。中でも,伊豆半島松崎低地は日本列島の中央より東に位置するが,早くから黒潮の影響を受け温暖であったため,シイ林の発達が著しく,カシ類やナラ類を随伴しない(松下,1990)。また房総半島太東崎での後氷期初期に堆積したと思われるピ-ト(年代測定中)からも落葉広葉樹花粉とともにシイノキ属,アカガシ亜属,エノキ-ムクノキ属などの照葉樹林構成要素が検出された。こられのことから,照葉樹林は九州南部から北方へ拡大するとともに,黒潮の影響を受けてきた室戸半島や紀伊半島をはじめ,伊豆半島,房総半島の南端から一斉に拡大したことが推定される。4.照葉樹林の拡大期は後氷期の前半を通じて3回認められた。これらの拡大期は海水準の変動と大きくかかわっている。8500年前の拡大期は,海水準の急速な上昇開始期におおむね一致し,7500年前の拡大期は海水準の停滞あるいは小変動期に一致する。そして6000年前の拡大期は最高海水準期に一致する。これらの拡大期では,海水準の状態がそれぞれの地域で,照葉樹林の拡大を促進する効果をもたらした。
分子ナノワイヤーを用いた多値論理デバイスの開発

本研究の目的は一次元的に加工した分子ワイヤを用いて多値論理素子を開発することにある。ここでは閾値電圧の異なる複数の分子ワイヤをトランジスタチャネルとして、これらを共通の電極に接合した多チャンネル分子ワイヤトランジスタとなっている。有機半導体としては液晶性を示すポリフルオレン系の高分子半導体を用い、これをナノインプリント法でワイヤ状に加工した。トランジスタ特性を評価したところ、閾値電圧を制御しつつ移動度を向上できることを明らかにした。一次元構造に加工した分子ワイヤを用いて多値論理素子を開発することを本課題の目的とする。そのためまず閾値電圧の異なる複数の分子ワイヤトランジスタを共通のソース・ドレイン電極に並列接合する。次にそれぞれの分子ワイヤに個別にゲート電極を接合させた素子構造がこの特長となっている。ここでは分子ナノワイヤの形状加工とそこへの正確な電極配線が最も重要かつ困難な課題となることが予想される。そこで平成25年度にこれら要素技術の確立に注力した。基板は平坦性に優れなおかつ有機材料との密着性が高いことが必須となるため、熱酸化膜(SiO_2)付きSi基板を用いた。高分子半導体はトランジスタ材料として機能することが知られているポリチエフェンやポリアニリンを取り上げた。ナノインプリントを用いた一次元構造加工ではモールドの設計と作製が重要となる。これはNIMSにある電子線リソグラフ装置などの共通設備を活用して依頼作製した。具体的には直径100nm、長さ40μmの分子ワイヤについて、単一ワイヤ、複数ワイヤ、枝分かれ構造ワイヤ、幅広ワイヤなど様々な構造を持った分子ワイヤを作製できるようSi基板にモールド構造を加工した。このモールドを用いてナノインプリントか好条件の最適化を進めた。具体的にはプレス圧.温度・プレス時間の最適化が重要となる。いくつかの実験条件を変えながら加工実験を実施したところ、いずれの高分子材料でもワイヤ状に加工できることは確認した。今後はその後のエッチング条件を最適化して残留物の除去を進める必要がある。平成26年度以降はこれら分子ワイヤと電極との接合技術を確立してデバイス動作の探索に移行する。本研究の目的は一次元構造に加工した分子ワイヤを用いて多値論理素子を開発することにある。そのためまず閾値電圧の異なる複数の分子ワイヤトランジスタを共通のソース・ドレイン電極に並列接合し、次にそれぞれの分子ワイヤに個別にゲート電極を接合させた素子構造がこの特長となっている。ここで各ゲート電極から電圧を印加して、それぞれのワイヤに流れる電流量を独立にスイッチする。これにより総電流量を多段階に制御できる多値論理素子とする。有機材料が容易に加工できることを利用して「分子ならでは」のワイヤトランジスタ作製技術を確立し、これを多値論理素子という機能へ発展させて「ワイヤならでは」の新しい動作原理を実証する。これまでナノインプリント法による分子ワイヤ作製条件の最適化を進めてきた。材料はポリチオフェンやポリフルオレンなどのπ共役系高分子材料を対象としてきた。その結果、直径50nm以下のナノワイヤ構造に加工するとπ共役系高分子の配向性(結晶性)が向上することが確認された。ただし材料系により配向方向が異なることも見出された。いずれの場合も導電性の向上が期待できる。今後やこれら分子ワイヤとソース・ドレイン電極との接合、ゲート絶縁膜の成膜とゲート電極の配線に取り組み、多値デバイス動作の実証に注力する。本研究の目的は一次元構造に加工した分子ワイヤを用いて多値理素子を開発することにある。ここでは閾値電圧の異なる複数の分子ワイヤをトランジスタチャネルとしてこらを共通のソース・ドレイン電極に接合した多チャンネル分子ワイヤトランジスタとなっていることを特長とする。この目的を達成するための基礎技術としてワイヤ構造の加工技術の確立とトランジスタの特性評価に注力した。有機半導体材料としては液晶性を示すポリフルオレン系の有機半導体(F8T2)から取りかかり、これをナノインプリント法で一次元ワイヤ状に加工した。加工する際の温度や圧力、加工時間を最適化した結果、ワイヤ径の狭線化に伴い高分子鎖の配向が向上することを見出した。これは誘導自己組織化と呼ばれる高分子材料の配向現象が半導体系の材料にも適用されることを初めて示した成果と言える。さらに高分子鎖の高配向化の結果としてトランジスタの電荷移動度を30%向上させることに成功した。さらに高分子鎖の精密制御を目指して高分子半導体材料を結晶性の高いポリチオフェン系(P3HT)に変更して同様の実験を実施した。ここでは特に高分子鎖長を系統的に変化させたものを合成し、ワイヤ径と高分子鎖長の相関関係の明確化と高結晶化へ向けた条件最適化に取り組んだ。その結果、ワイヤ径と高分子鎖長が同程度になると高配向化が促進されることを見出した。特にワイヤ径が50nm以下となるとその傾向が顕著となることも分かった。これらの成果は当課題の基礎的知見と技術を与えるだけでなく、高分子材料を使ったナノスケール電子素子の作製の可能性を示すものとなっている。26年度が最終年度であるため、記入しない。

有機半導体工学26年度が最終年度であるため、記入しない。分子ワイヤの加工技術についてはおおむね目処が立ち、当初の予定通り進んでいると言える。しかしその後のエッチング条件の最適化が未達成であり、翌年度以降の課題となっている。既にナノインプリント法による分子ワイヤ作製方法は確立できた。さらにこの手法で作製された分子ナノワイヤにおける高分子鎖の配向性が向上することも確認できた。最終目標のデバイス動作を実証するためには電極との接合技術が必要とされる。これまでの進捗を元に今後は電極との配線技術の確立に取り組みデバイス動作の実証まで進める。26年度が最終年度であるため、記入しない。ナノインプリント加工後のエッチング条件の最適化を達成し、ワイヤと電極の接合技術の確立に移行する。今後やこれら分子ワイヤとソース・ドレイン電極との接合、ゲート絶縁膜の成膜とゲート電極の配線に取り組み、多値デバイス動作の実証に注力する。これらの実験のためマスク法による電極作製やマイクロコンタクト法による接合・配線技術に取り組む予定。ナノワイヤ構造加工条件の最適化に予想以上の時間を要したため、研究補助員の雇用を見送った。その後の経緯から当初の予定通りの進捗となったため改めて研究補助員を雇用して研究の促進を図る。
血清中シアリル遊離糖鎖の生成機構の解明と肝疾患マーカーとしての応用

血清中に新たに同定されたシアリル遊離糖鎖の解析を行った。様々な哺乳動物由来の血清中の主要の糖鎖構造を決定し、ウシ血清に関しては様々な成育ステージにおける糖鎖構造の変化を解析した。その結果、血清遊離糖鎖は肝臓から分泌され、肝臓での発現遺伝子の差異によって構造が規定されている可能性が示唆された。更に肝がん患者由来の血清シアリル糖鎖と健常人のそれを比較したところ、主要な2本鎖ジシアロ糖鎖の量が肝がん患者血清で有意に上昇しており、血清遊離糖鎖が肝臓の病的状態を検知するバイオマーカーとしての役割を果たす可能性が示された。血清中に新たに同定された遊離糖鎖について解析を行った。10種の哺乳動物の血清を調べたところ、どの種にも還元末端にGlcNAcbeta1-4GlcNAc構造を持ち、非還元末端にシアル酸を持つ遊離糖鎖が観察された。その主要構造は種ごとに異なり、それぞれの種の血清中の糖タンパク質上の主要な糖鎖と構造が同じであった。また、同一種の血清において胎児、幼児期、成体における血清遊離糖鎖を解析したところ、成長のステージによって特徴的な糖鎖が観察された。殆どの血清糖タンパク質は肝臓で生成されることから、血清遊離糖鎖は肝臓から分泌され、肝臓にステージ毎で発現されている糖鎖合成に関わる遺伝子の差異によって構造の違いが生まれると推測出来た。興味深いことにニワトリの血清遊離糖鎖にも遊離糖鎖は確認できたものの、非還元末端にシアル酸を持たない糖鎖が多く存在し、遊離糖鎖の代謝機構が哺乳動物と鳥類で異なっている可能性が示唆された。これらの違いは血清糖タンパク質上の糖鎖の違いともよく対応していることが明らかとなった。また本遊離糖鎖はサケの血清にも存在しており、脊椎動物に広く血清の遊離糖鎖が存在することが明らかとなった。更に肝がん患者由来の血清糖鎖と健常人の遊離糖鎖を比較したところ、主要な2本鎖ジシアロ糖鎖の量が肝がん患者で有意に上昇しており、血清遊離糖鎖が肝臓の病的状態を検知するバイオマーカーとしての役割を果たす可能性が示された。本研究の目的の一つは疾患バイオマーカーとして血清遊離糖鎖が機能しえるかどうかの検討を行うことであったが、肝がん患者の遊離糖鎖量が健常人の遊離糖鎖量と違う可能性があることを明確に示すことが出来た。血清中のシアリル遊離糖鎖について、ラットの肝臓から分泌されている可能性を検討するために、ラットの初代肝細胞の培地に分泌される糖鎖の解析を試みた。無血清培地での培養条件について検討を行い、遊離糖鎖の分泌が観測されたが、糖鎖の蛍光検出の際に糖鎖以外の蛍光成分が観察されており、定量的な解析はまだ出来ていない。今後更なる方法の改善の検討が必要である。今後同一個体の血清中のシアリル遊離糖鎖との構造比較を行い、シアリル遊離糖鎖生成のメカニズムについてさらに検討を進める予定である。また、C57BL/6マウスの血清シアリル遊離糖鎖の詳細な構造を解析中である。詳細構造を決定次第、これらの構造を肝臓のアシアロ糖タンパク質受容体のKOマウスの血清シアリル遊離糖鎖との構造の比較を行う予定である(UC Santa Barbara Jamey Marth教授との共同研究)。また、血清シアリル遊離糖鎖がどのくらい生物に保存されているかを調べるために魚類(サケ)の血清についても調べてみたところ、構造は異なるもののシアリル糖鎖の存在を確認できたことから、哺乳動物、鳥類以外にも血清シアリル糖鎖が存在することが明らかになった。遊離糖鎖の代謝機構について、その非還元末端の殆どがシアル酸で覆われていることから、肝臓におけるアシアロ糖タンパク質受容体によってシアル酸を持たない糖鎖が吸収されていることが考えられた。この仮説を検証するためにアシアロ糖タンパク質受容体のKOマウスを使用する予定であるが、遊離糖鎖の構造を比較するためにはまず野生型のマウス血清における遊離糖鎖の詳細な構造解析が必要である。そこで今後は実験マウスとしてよく用いられているC57BL/6マウスの遊離糖鎖の解析を行う。糖鎖生化学予定していたアセトニトリルの購入を次年度に持ち越すことになった。今年度購入予定にしていたアセトニトリルを次年度に購入する。
蛋白尿発症に関わる腎上皮細胞の運動能の解析

ポドサイトと腫瘍細胞の運動能の制御における分子機構には共通性が指摘され、腫瘍細胞の運動能の亢進は浸潤に至る。また、近年腫瘍細胞内の小胞輸送が細胞骨格と協調して浸潤に深く関わることが報告されている。そこで腫瘍細胞の浸潤に必須な低分子量Gタンパク質Rabファミリーの同定を行った。昨年度までにヒト乳腺癌由来の細胞を用いスクリーニングを実施しデータベースを用いた解析を加え、浸潤制御に関わる因子としてRabXを同定し、更にRabXの過剰発現とレスキューによる細胞外基質の分解の変化を解析した。3年目である本年は、3次元の浸潤における影響の評価を行い、RabXが浸潤に関与する分子機構の解析を開始した。腫瘍細胞を細胞外基質内で培養すると、3次元における周囲への浸潤の様子が観察できる。細胞外基質を混合して調製した2種類の3次元培養系において、薬剤誘導依存的にRabXの発現を抑制する2種類の乳腺癌細胞を事前に作製し培養すると、薬剤誘導依存的に周囲への浸潤が抑制された。また、Rabファミリーはエフェクター蛋白が結合し小胞輸送を促進することから、RabXが浸潤に関与する機序を検討するために、RabXのエフェクターの発現低下時の細胞外基質の分解能を測定した。その結果RabXのエフェクター因子AおよびBの発現低下により、乳腺癌細胞のゼラチンの分解能は低下した。RabXの発現低下は因子Aの発現低下時と同様に細胞内小器官の形態を変化させ、過剰発現により回復した。以上より、RabXが乳腺癌細胞の3次元への浸潤を制御し、RabXのエフェクターも乳腺癌細胞の細胞外基質の分解を制御することが分かった。RabXは腎臓糸球体での発現が認められ、RabXの結合蛋白の腎臓特異的ノックアウトマウスは蛋白尿を来す。今後腎臓におけるRabXの機能の解析が望まれる。27年度が最終年度であるため、記入しない。1年目である本年は、培養細胞を用いた運動能の評価系の構築を試みた。当初はラット培養ポドサイトを使用しスクリーニングを行う予定であったが、多数のサンプルを評価する系の構築が困難であった。これまで腫瘍細胞とポドサイトの運動能の分子機構の共通性から腫瘍細胞の浸潤における先行研究がポドサイトでの研究に応用されてきたこと、さらに細胞内の小胞輸送が浸潤に関わることが近年報告されていることから、RabファミリーのsiRNAライブラリーを用いて腫瘍細胞の浸潤に必須な因子を同定し、次いでその因子のポドサイトでの機能解析を行うこととした。浸潤能を持つ乳癌由来細胞MDA-MB-231細胞を用い、蛍光ゼラチンの分解能を有する細胞の割合を定量した。1次スクリーニングとして、3つの異なる配列がプールされている全Rabファミリーに対するsiRNAをMDA-MB-231細胞に導入し、ゼラチン分解能を有する細胞をコントロールに比べ大幅に減少させる因子を選出した。続いて2次スクリーニングを行い、1次スクリーニングを通過した候補因子に対し、3つの異なる配列のsiRNAを単独で導入し、どのsiRNAを導入してもゼラチン分解能を減少させる因子を選出した。3次スクリーニングとして、細胞外基質であるマトリゲルへの浸潤能を評価した。2次スクリーニングで選出した候補因子のsiRNAを用い、マトリゲル中を閾値以上の高さまで上行したMDA-MB-231細胞数を計測したところ、複数の候補因子のsiRNAでは細胞数が大幅に減少していた。なお、標的因子のmRNAの減少はqPCR法にて確認した。以上の実験により、MDA-MB-231細胞において浸潤能に必須なRabファミリーを同定することができた。腫瘍細胞とポドサイトの運動能の制御における分子機構には共通性が指摘され、かつ近年腫瘍細胞内の小胞輸送が細胞骨格と協調して浸潤に深く関わることが報告されている。そのためまず腫瘍細胞の浸潤に必須な低分子量Gタンパク質Rabファミリーの同定を目指し、昨年度3次スクリーニングまで実施した。2年目である本年は、他の腫瘍細胞での浸潤能を解析し候補因子を更に絞り込み、3次元の浸潤における影響を評価した。昨年度のMDA-MB-231細胞でのスクリーニングに続けて、本年は浸潤能を持つ乳癌由来細胞であるMCF10A DCIS.com(Ductal carcinoma in situ)細胞を用い、蛍光ゼラチンの分解能を有する細胞の割合を定量した。3次スクリーニングを通過した候補因子に対するsiRNAを導入し、ゼラチン分解能を減少させる因子を選出した。その後公開されているデータベースを解析し、それらの候補因子のうち乳癌患者での遺伝子増幅が最も高い因子RabXを選出し、RabXによる浸潤の分子機構の解析を行った。マウス由来のRabXがドキシサイクリンにより発現誘導されるMDA-MB-231細胞ならびにMCF10A DCIS.com細胞株を樹立し、これを用いて基質分解能を評価したところRabXの誘導依存的に蛍光ゼラチン分解能が上昇した。更に、RabXの発現減少による基質分解能の低下がRabXの発現によりレスキューできるかを検討し、siRNAの導入により低下したゼラチン分解能がRabXの過剰発現により回復することを確認した。