hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
次世代電子顕微鏡を用いたオメガ変態の実次元マルチスケール解析

β-Ti, Zr合金におけるω変態について以下の項目を調査した.1.焼入,時効ω相の結晶学的特徴.2.焼入,時効ω相の実次元解析.3. ω相の結晶学的特徴と形態に及ぼす材料学的諸因子の検討.4. ω変態の機構解明.5. ω変態と熱弾性マルテンサイト変態の前駆現象との関連性.特筆すべき成果として,収差補正HAADF-STEM法によりω相を単位胞内のダンベル構造の可視化に成功した.また,ダンベル構造の原子変位uの測定を行い,βマトリックス近傍から内部に向かって0.5から0.67の間で緩やかに変動することを示した.さらに,3Dトモグラフィーの結果に基づきω相の形態と生成機構の関係を考察した.β-Ti, Zr合金におけるω変態について以下の項目を調査した.1.焼入,時効ω相の結晶学的特徴.2.焼入,時効ω相の実次元解析.3. ω相の結晶学的特徴と形態に及ぼす材料学的諸因子の検討.4. ω変態の機構解明.5. ω変態と熱弾性マルテンサイト変態の前駆現象との関連性.特筆すべき成果として,収差補正HAADF-STEM法によりω相を単位胞内のダンベル構造の可視化に成功した.また,ダンベル構造の原子変位uの測定を行い,βマトリックス近傍から内部に向かって0.5から0.67の間で緩やかに変動することを示した.さらに,3Dトモグラフィーの結果に基づきω相の形態と生成機構の関係を考察した.金属物性分野の主要な研究課題である相変態現象の中でも多様な特徴を持つβ-Ti,Zr合金におけるω変態の本質を3Dトモグラフィー,収差補正HAADF-STEM等の次世代電子顕微鏡法よって結晶学と材料組織学の観点から多次元的に解明し,さらに,得られた結果に基づきω変態の制御による材料機能創出の可能性を探ることを目的として,当該年度では基礎的事項にあたる以下の項目について実験的研究を行った.1.焼入,時効,応力誘起ω相の結晶学的特徴.各ω相の観察に最適な試料組成を探索し,焼入整合ω相の解析にはTi-15Nb-3Mo合金,焼入不整合ω相についてはTi-21Nb-3Mo合金,時効ω相については上記2合金に加えてTi-24Nb-3Moを用いることを決定した.また,応力誘起ω相の研究にはTi-34Nb-3Mo合金を作製した.さらに,Ti-Nb系合金とは異なる形状の時効ω相が形成するTi-6.25Fe合金,β-Zr合金としてZr-7.5Nb合金を作製しTi-6.25Fe合金,β-Zr合金としてZr-7.5Nb合金を作製した.通常透過電顕観察により全ての合金において目的とするω相が存在していることを確認した.Ti-Fe合金においてはβ,ω,αの3相共存状態と相互の方位関係を原子レベルで捉えることに成功した.2.焼入,時効,応力誘起ω相の実次元解析.上記の合金について焼入および時効ω相の3Dトモグラフィーによる形態観察,収差補正HAADF-STEM観察による原子配列の直接観察を行った.いずれの合金においても焼入ω相は不規則形状であったが,時効ω相は各々の合金系に特有の形状が観察された.Ti-Nb系合金では紡錘形,Ti-Fe合金では立方体,Zr-Nb合金では不定形塊状であった.また,後者2つのω相においてはβ母相の{112}面に沿った分裂が観察されたこのことはω相の形状と形成機構(収縮型とせん断型)が密接に関連していると考えられ,解析を進めている.金属物性分野の主要な研究課題である相変態現象の中でも多様な特徴を持つβ-Ti, Zr合金におけるω変態の本質を次世代電子顕微鏡法よって結晶学と材料組織学の観点から多次元的に解析することを目的として,前年度までに実施した1.焼入,時効,応力誘起ω相の結晶学的特徴,2.焼入,時効,応力誘起ω相の実次元解析,3. ω相の結晶学的特徴と形態に及ぼす材料学的諸因子の検討と形態制御,4. ω変態の機構解明について,引き続き精査した.項目1については,Ti-15Nb-3Mo (原子%)合金の焼き入れ材,焼き入れ後の時効材をHAADF-STEMによって観察しω単位胞内における原子変位量(u)を系統的に調査した.焼入れω相と時効ω相のいずれにおいても中央部のダンベル構造は一様であり,時効処理がω相内部の原子位置に及ぼす熱処理条件の影響は少ないと判断された.一方,ω/β界面においては,uはω相内部から界面にかけて0.500(AlB2型六方晶)から0.667(体心立方晶)へとなだらか,かつ,連続的に変位していた.

さらに,焼入れω相と時効ω相のいずれにおいても原子位置が連続的に変位している領域の大きさに違いは見られなかった.すなわち,ω相は全体が同じuを有しておらず,ω相とβマトリックス相との間に存在するひずみや応力を緩和するために,その構造を徐々に変化させβ相に近づくことが示唆された.項目2については,チャネリングコントラストを活用することにより走査電子顕微鏡によってもω相を可視化できることを見出した.項目3, 4については,電子線トモグラフィーとHAADF-STEM観察よりω相の形態が紡錘状の場合,β相の{111}面の<111>へのCollapse,塊状の場合,β相の{111}面の<112>へのせん断によって生成することを支持する結果が得られた.金属物性分野の主要な研究課題である相変態現象の中でも多様な特徴を持つβ-Ti, Zr合金におけるω変態の本質を3Dトモグラフィー,収差補正HAADF-STEM等の次世代電子顕微鏡法よって結晶学と材料組織学の観点から多次元的に解明し,さらに,得られた結果に基づきω変態の制御による材料機能創出の可能性を探ることを目的として,当該年度では基礎的事項にあたる「1.焼入,時効,応力誘起ω相の結晶学的特徴」,「2.焼入,時効,応力誘起ω相の実次元解析」に加えて「3. ω相の結晶学的特徴と形態に及ぼす材料学的諸因子の検討と形態制御」,「4. ω変態の機構解明」について実験的研究を行った.項目1についてはHAADF-STEM観察よりω相に特徴的なダンベル構造の原子変位uの測定を行った.まず,マルチスライスシミュレーションを用いて,u = 0.5(1/2):hcp構造から0.6667(2/3):bcc構造まで変化させたuに対するHAADF像の計算を行い,uの変動が0.01程度であれば測定できることを示した.その結果uはβマトリックス近傍から内部に向かって緩やかに変動することが知られた.また,ω相中にω相の構造からは想定できない特異なコントラストを持つ部分が存在することを発見した.マルチスライスシミュレーションの結果,このコントラストは試料方位のずれや別の相の重なりなどから起こりうるアーティファクトではなく,この位置に原子がない状態では現れず,ω相の原子位置とは異なる新たな結晶構造が存在する可能性があることを示す興味深い結果が得られた.項目24については電子線トモグラフィーとHAADF-STEM観察より,ω相の形態(紡錘状,回転楕円体,塊状,立方体等)と変態機構に関連があることを示唆する結果を得た.研究対象とするω相が生成する合金試料の作製を全て終了し,それらの結晶学的特徴を解析するためのHAADF-STEM観察も順調に進行している.Ti-Fe合金においてはβ,ω,αの3相共存状態と相互の方位関係を原子レベルで捉えることに成功し,Zr-Nb合金の焼入および時効ω相の結晶学的特徴については学術誌への論文掲載が決定した.実次元形態については各々の合金系に特有な3次元形態が存在することを確認し,それらがω相の形成機構と密接に関連することを示唆する結果を得ており,研究はおおむね順調に進展している.25年度が最終年度であるため、記入しない。研究実績の概要に記載したように,ω相に特徴的なダンベル構造の原子変位uの定量的評価によってマトリックス界面から内部にかけてuが連続的変化することを明らかにし,さらに,ω相内に従来とは異なる結晶構造を有する相の存在を示唆する興味深い結果が得られた.この2つの成果はいずれもω相変態の研究において学術的価値の高いものであると自負している.しかし,24年度はこれらの解析に多くの時間を費やしたため,当初予定していた拡散対を利用した実(多)次元解析や,ω/β界面の歪分布の測定が実施できなかった.
日本・ノルウェーにおける介護保障と福祉行政システムに関する国際比較

研究の背景-ノルウェーと日本比較福祉国家研究では、ノルウェーは北欧福祉国家モデルに分類され、高齢者介護では公的セクターが大きな役割を果たしていることが特徴とされる。日本とノルウェーでは、高齢者介護へのアプローチが異なるものの、類似点も見られる。ノルウェーは北欧諸国の中では、比較的、家族の役割が期待され、またNPOの活動も見られ、日本の高齢者介護との共通点もみられる。その意味で北欧諸国の中でもノルウェーは日本に身近な存在のようにみえる。研究の目的本研究の目的は、ノルウェーと日本の高齢者介護システムについて、特に家族の役割やサービス供給のしくみに重点を置いて、比較検討を行うことにより、それぞれの国の特徴を明らかにすることであった。研究計画と実施方法本研究は3つのパートで構成された。第一にノルウェーと日本の福祉国家比較研究を行った(岡沢、久塚)。第二に、両国の高齢者介護サービスの供給システムについての分析を行った(クリステンセン、エドヴァードセン、斉藤)。第三に、家族、ジェンダーの視点から両国の高齢者介護を比較した(ウエルネス、安倍)。本研究の特徴はノルウェー研究者との共同研究であり、東京、オスロ、ベルゲン、トロンハイムにおいて、現地調査および研究会を共同で実施してきた。研究の成果研究成果は各研究者が論文としてまとめた。本研究では、両国の介護サービス発展の歴史を見ると、伝統的なスタイルから専門化という同じプロセスをたどっていること、グローバル化の中で競争原理が強調され、介護サービス供給スタイルが大きく変わっていることなどが、共通点として明らかとなった。研究成果については、今後、出版を計画している。本年度の研究実績は以下の通りである。研究代表者・斉藤弥生は(1)ノルウェー研究者を訪問し(2006年3月)、来年度に予定する現地調査ならびに研究会の打ち合わせを行い、(2)ノルウェーの介護事情についての資料整理を行った。(1)ノルウェー側研究者の訪問と打ち合わせ(1)安倍オースタッド玲子氏(オスロ大学教授)にはノルウェー側研究者への連絡を依頼しているが、日本で計画している研究会の開催について打ち合わせをし、また日本とノルウェーの介護事情について情報交換を行った。(2)K.クリステンセン氏(ベルゲン大学教授)は現在、ロンドンにて海外研修中。メールで情報交換を継続しており、ノルウェーの介護保障制度の整理に必要な基本文献リストを作成してもらった。(3)U.エドヴァードセン氏(トロンヘイム大学研究員)とは論文の交換をし、お互いの研究テーマについて理解を深めた。またトロンヘイム市役所、ナーシングホームを訪問し、共同研究についての議論を深めた。(4)K.ウェルネス氏(ベルゲン大学教授)には、日本とノルウェーの介護保障の比較研究の視点についてのアドバイスを受け、基本文献の紹介を受けた。また日本での研究会と現地調査についての検討を行った。(2)ノルウェーの介護事情についての資料調査M.Szebehery(ed.)Hemtjanst I Norden.(北欧のホームヘルプ)のレヴューを作成し、日本の研究者で情報を共有した。同書によれば、スウェーデン、デンマークに比べて、ノルウェーの介護保障の歴史は後発である。また介護の担い手としての家族の役割への期待が他の北欧諸国に比べて大きい等、ノルウェーの特色を整理することができた。またノルウェー側研究者により紹介された文献についても、現在、レヴューを作成している。研究分担者の岡沢憲芙は、北欧型福祉国家レジームの中でのノルウェーの社会保障の特徴と現状を明らかにする作業を継続している。2006年3月にオスロ大学において資料研究と関係機関でのヒアリング調査を実施した。研究分担者の久塚純一は、主に日本国内のNPOの介護事業者に対するヒアリング調査し、介護保険制度のもとでの新たな介護事業者の動向に関する研究を精力的に継続している。

研究代表者ならびに研究分担者は、本年度2回にわたり、意見交換を実施し、これ以外にもメールなどで随時、情報交換を行っている。以上のような経過であり、本年度の研究実施計画はほぼ達成することができた。平成18年度の研究実績は以下の通りである。最も大きな研究成果は12月に実施した合同研究会である。ノルウェーの共同研究者である安倍オースタッド玲子氏(オスロ大学教授)、K.ウェルネス氏(ベルゲン大学教授)、K.クリステンセン氏(ベルゲン大学准教授)、U.エドヴァードセン氏(ノルウェー工科科学大学研究員)の4名とともに、研究会(早稲田大学)ならびに現地調査(西東京市など)を実施した。研究会では各メンバーが各自の研究成果を発表し、意見交換を行った。また来年度の最終報告書の作成に向けた打ち合わせも行なった。現地調査では厚生労働省、連合、連合総合研究所、西東京市役所高齢者福祉部で日本の介護政策に関するヒアリングを実施した。さらに西東京市で介護サービス事業を展開するNPO法人「年輪」を訪問し、法人代表者と家族介護者のヒアリングも行なった。ノルウェーの共同研究者らは日本の介護事情の知識を深めることができ、さらに議論を深めることができた。来年度はベルゲン市における高齢者介護の現状について、共同で調査する計画を立てている。以下に、研究代表者ならびに研究分担者の本年度の研究実績を記す。研究代表者・斉藤弥生は(1)日本社会福祉学会第54回研究大会(2006年10月7日立教大学)で研究発表を行ない、(2)「北欧諸国間の介護政策比較研究-ノルウェー・スウェーデンの比較を一例として」という題目で、研究発表を行なった。同年3月に本研究費補助金により実施したノルウェーにおける現地調査を踏まえ、北欧におけるノルウェーの福祉施策の特徴とその要因について分析した。(3)ノルウェーの介護事情についての資料整理を行い、特に「Aldreomsorgsforskning i Norden-En kunskapsoversikt(北欧における高齢者介護研究一研究の概観)」は、北欧5カ国ではどのような高齢者介護に関する研究が行なわれているか、また最新の研究をレビューしたものである。この資料を読むことにより、北欧における研究の概観をつかむことができ、また北欧諸国の比較資料を得ることができた。研究分担者・岡澤憲芙はストックホルム大学、ルンド大学、オスロ大学においてヒアリング調査を実施し、研究分担者・久塚純一は日本国内では東北地方のNPO法人による介護事業者に対するヒアリングを実施し、またヨーロッパの状況を調査するためにフランスでの資料収集およびヒアリングを実施した。(1)研究会(オスロ大学、ベルゲン大学・ノルウェー工科大学にて、各研究者と進捗状況の確認)(1)研究代表者の斉藤は、5月22日6月3日にオスロにて、海外研究協力者の安倍オースタッド玲子氏(オスロ大学教授)、岡沢憲芙氏(早稲田大学教授/スウェーデン在外研究中)と研究会を持った。
抗腫瘍免疫応答を抑制する制御性T細胞の新規特異的分子の同定

がんに対する治療方法として、体内に備わっている免疫機能を利用したがん免疫療法が注目されている。本研究では、胃がん患者体内の免疫応答を解析し、新規がん免疫療法の開発につながる知見を得ることを目的とした。胃がん患者の血液あるいは腫瘍組織中の免疫細胞を解析したところ、血液に比べ腫瘍組織中では免疫応答を抑制する制御性T細胞の割合が多く、それらがICOSまたはCTLA-4といった細胞表面分子を強く発現していた。これらの結果から、ICOSやCTLA-4を標的とした制御性T細胞の除去によるがん免疫応答の向上効果が期待できる可能性が示唆された。新規がん治療法の開発が進むにつれ、難治性・再発性悪性腫瘍患者に効果的な治療法として免疫療法が注目されている。その中で免疫チェックポイント阻害剤の開発が急速に進み、メラノーマ・肺がん患者に対する治療薬として承認されている。一方で、その効果は限定的であり、すべてのがん患者に効果的な免疫療法が切望されている。がん免疫療法を向上するためには、がんを殺傷するエフェクター機能を強化することと、そのエフェクター機能を抑制する機構を解除することが望ましい。本研究では、この免疫抑制解除に焦点を当て、がん患者検体を用いた研究をおこなう。胃がん患者由来の腫瘍組織からリンパ球を採取し、免疫抑制系に重要な役割を果たす制御性T細胞(Tregs)の動態をフローサイトメーターにて解析した。ヒトTregsは、その特異的マーカーの一つである転写因子FOXP3および細胞表面分子CD45RAの発現差異により、3つの細胞画分に分類できる。その中で抑制活性の最も強いエフェクター型Tregsを解析したところ、末梢血中にはエフェクターTregsの割合が25%程度であったが、胃がん局所には2030%の割合で存在するという結果を得た。次に、このがん局所浸潤エフェクター型TregsとCD8陽性T細胞に発現する免疫チェックポイント分子を解析した。その結果、エフェクターTregsには共刺激分子であるICOSが高発現していた。一方で、CD8陽性T細胞ではICOS発現が見られず、末梢血中のCD8陽性T細胞およびエフェクターTregsにおけるICOS発現も低い状態であった。これらの結果から、胃がん局所のエフェクターTregsの選択的マーカーの一つであることを見出した。今年度の研究では、胃がん患者検体を用いたフローサイトメーターを用い、末梢血および腫瘍局所に存在するリンパ球の解析をおこなった。免疫細胞解析では、末梢血中に比べ腫瘍局所においてCD4陽性FOXP3強陽性CD45RA陰性のエフェクター型Tregsの割合が多く、2030%であった。また、分子発現解析では免疫チェックポイント分子であるCTLA-4, PD-1, LAG-3等を解析し、CTLA-4の発現が腫瘍局所エフェクターTregsにおいて高い傾向を示した。一方で、T細胞に発現する共刺激分子を解析したところ、ICOSの発現がエフェクターTregsで高く、とりわけ腫瘍局所エフェクターTregsで高いがCD8陽性T細胞をはじめとした他の免疫細胞では低発現であった。このことから、本研究の目標である腫瘍局所エフェクターTregsに選択的発現を示す分子の同定に向け、ICOSがその候補分子であることを見出した。当初の計画では、今年度は腫瘍局所エフェクターTregsを採取し、その機能解析および網羅的解析により、末梢と比較し腫瘍局所エフェクターTregsのみで発現する分子の同定を試みる予定であった。この計画が遂行できなかったため、現在では本研究課題の進捗は遅れており、来年度で本研究を完了できるよう研究を進める。新規がん免疫療法の急速な開発が進む中、がん患者の生体内免疫応答を解明することが重要となっている。本研究では消化管がん患者、とりわけ胃がん患者の末梢血および腫瘍組織に存在する免疫細胞の解析を実施してきた。昨年度では、胃がん患者末梢血中に比べ、腫瘍組織中のCD4陽性FOXP3強陽性CD45RA陰性で表されるエフェクター型制御性T細胞の割合が高く、これら腫瘍組織中の制御性T細胞では免疫チェックポイント分子であるCTLA-4および共刺激分子であるICOSの発現が高いことを示した。本年度ではこの制御性T細胞の解析を進め、胃がん患者の腫瘍組織中のエフェクター型制御性T細胞においてICOS強陽性と弱陽性の2パターンが存在することを見出した。これらの2パターンについて、それぞれの腫瘍組織RNAを用いリアルタイムPCRによる免疫関連遺伝子の発現を解析した。その結果、ICOS強陽性を示す患者腫瘍組織においてIl-22やIL-8といったサイトカイン遺伝子の発現が上昇していた。これらの結果から、ICOS強発現のエフェクター型制御性T細胞の腫瘍組織浸潤にIL-22、IL-8などの免疫関連サイトカインが関与していることが示唆された。一方で、腫瘍組織に浸潤する免疫担当細胞ごとの遺伝子発現解析を実施するため、腫瘍組織浸潤リンパ球からCD4陽性T細胞、CD8陽性T細胞を回収し、RNA抽出をおこなった。抽出したRNAの品質をチェックしたところ、RNAシークエンス解析に耐えうる品質であった。このことから、腫瘍組織浸潤リンパ球を用いたRNAシークエンス解析が実施可能であることが示唆された。

胃がん患者の血液あるいは腫瘍組織中の免疫細胞を解析したところ、血液に比べ腫瘍組織中では免疫応答を抑制する制御性T細胞の割合が多く、それらがICOSまたはCTLA-4といった細胞表面分子を強く発現していた。これらの結果から、ICOSやCTLA-4を標的とした制御性T細胞の除去によるがん免疫応答の向上効果が期待できる可能性が示唆された。今年度の研究進捗が遅れていることから、来年度で研究を完了できるよう調整する。今年度の研究において胃がん局所エフェクターTregsの選択的分子マーカーとしてICOSが候補であることを見出したため、来年度ではICOSを標的としたTreg機能解除の検討をおこなう。ただし、それと平行し、腫瘍局所エフェクターTregsの網羅的遺伝子解析も実施しICOS以外の候補分子の探索も続ける。ICOSを標的とした研究では、ヒトPBMCを使用し、ICOSに対するモノクローナル抗体を用い、エフェクターTregsを除去できるか否かを検討する。その後、エフェクターTreg除去による抗原特異的CD8陽性T細胞の機能向上を見出し、臨床応用に向けた基盤データを得る。また、上記網羅的遺伝子解析により探索した新たな選択的分子に対する抗体あるいは機能阻害化合物を作成し、それらを用いたTreg機能解除効果を検討する。これらの結果から、新規Treg解除による免疫療法の向上効果を実証する。28年度が最終年度であるため、記入しない。腫瘍免疫28年度が最終年度であるため、記入しない。
細管内流動特性を生かした半導体レーザー検出/超精密流量フロー分析装置の開発

半導体レーザーと細く長い光路長をもつフローセルを組み合わせることにより,フローインジェクション分析法(FIA)や高速液体クロマトグラフ法(HPLC)などのフロー分析装置全般に適した高感度なフロー分析用検出器を開発した。この高感度検出システムは,ポリテトラフロオルエチレン製円筒に細く,長い光路(内経1.4mm,長さ100mm)を設けたフロー吸収セルと,発光波長780nmのGaAIAs半導体レーザーを光源として構成され,あらゆるフロー検出系に適用可能な機能を有する。このようなレーザー分光検出システムを使用すれば,通常のFIA-吸光光度法は(10mmセル使用)に比べ10倍高感度となる。既存のレーザー分光フロー分析法関連研究の経過を踏まえ,この検出器システムの適用例の一つとして,全リンのモリブデン青-吸光光度法への応用について検討した。相対標準偏差は1.0%(n=10,20μgP/l),検出限界濃度と検量線直線範囲はそれぞれ0.6(3σ)及び(1.050)μgP/lであった。環境水試料測定への応用結果は,公定法とほぼ相関関係にあることがわかった。同様に,この高感度検出システムは各種水試料中の溶存状の超微量シリカ高感度分析にも適用例が示され,好結果が得られることを明らかにした。さらに,将来はHPLCを含んだフロー法分祈システム全般に広く応用研究され,実用面で有益な成果をもたらすことが期待される。(1)フローインジェクション法(FIA)や液体クロマトグラフィー(LC)などのフロー分析流路系に,超微量から通常流量(2μl/min2 ml/min)までの3オーダーの広い流量範囲で,精密かつ安定した送液の可能なコンピュータ制御のパルス吐出マイクロポンプ,およびこの種の流動系での過渡応答検出に最適と考えられる半導体レーザーと長光路フローセルを組み合わせた超高感度検出システムを適用し,最高性能を引き出せるような装置・要素技術の開発を目指した結果,半導体レーザー分光法は超精密流量ポンプを備えたフロー分析流路系に長光路フローセルを設置することにより超高感度検出が可能になることが明らかになった。(2)四連のシリンジを正確に動作させるには,コンピュータによる精密制御を要し吐出はコンピュータからのパルス信号に従い1μ1ずつをパルス状に左右交互に押し出す必要があった。パルス時間分割制御により,超精密かつ広範囲な流量調整ができると考えられたので,このポンプを用い毛細管内流動と溶質分散にかかる数値解析と実験検証に関するこれまでの研究成果を背景に,超微量の流量域から通常流量域まで広範囲の実験を行うことにより,分析装置設計に分子化学工学的アプローチを導入する試みを行い,性能評価と操作因子の数式化を試みる特性評価研究を行った。(3)キャピラリー・フロー系で起こる対流分布と分子拡散とによる溶質分散挙動解析に基づき,FIA反応場の最適化と分析反応の操作条件をリン,シリカの半導体レーザー/長光路フローセル超高感度検出システムの応用研究を通じて解明できた。物理的因子のみならず化学的因子をも考慮して,超精密流量で高分解能分析を可能にするLCやFIA開発で,パルス吐出方式マイクロポンプを用いて設計した。この高感度検出システムは,ポリテトラフロオルエチレン製円筒に細く,長い光路(内径1.4mm,長さ100mm)を設けたフロー吸収セルと,発光波長780nmのGaAlAs半導体レーザーを光源として構成され,あらゆるフロー検出系に適用可能な機能を有する。このようなレーザー分光検出システムを使用すれば,通常のFIA-吸光光度法(10mmセル使用)に比べ10倍高感度となる。

相対標準偏差は1.0%(n=10,20μg P/l),検出限界濃度と検量線直線範囲はそれぞれ0.6(3σ)及び(1.050)μgP/lであった。環境水試料測定への応用結果は,公定法とほぼ相関関係にあることがわかった。同様に,この高感度検出システムは各種水試料中の溶存状の超微量シリカ高感度分析にも適用例が示され,好結果が得られることを明らかにした。さらに,将来はHPLCを含んだフロー法分析システム全般に広く応用研究され,実用面で有益な成果をもたらすことが期待される。
新しい実験技術を用いた平滑筋収縮調節の分子機構の研究

筆者は、平滑筋に特有な線維状蛋白質カルデスモン(CaD)の分子内機能分担に関して、そのC・端部がF-アクチン(FA)及びトロポミオシン(TM)にまたN-端部がミオシン・サブフラグメント-2(S2)に特異的に結合すること、そして低イオン強度の溶液内ではCaDは半分の長さに折れたたまることなどを報告している。このような性質が実際の分子構築にどのように反映されているかを調べるために、精製した蛋白質から再構成した細いフィラメント(FA、TM、CaDを含む)および天然の細いフィラメントを軽度に科学固定後、ネガティブ染色またはマイカ細片急速凍結フリーズレプリカ法を用いて電子顕微鏡観察した。その結果、再構成系においては、TMと同じ周期でFAから突出する線維状分子が観察された。また、脱燐酸化重メロミオシン(DP-HMM)頭部はATP存在下ではFAと結合しないはずであるが再構成フィラメントにDP-HMMを加えると、CaDの突出と同一周期で(恐らく複数の)HMMが結合しているのが見られた。類似の条件で脱燐酸下ミオシンも結合する。天然の細いフィラメントを生理的イオン強度に近い条件で固定観察すると線維状分子の突出は見られないがFA表面の螺旋が不明瞭であり何らかの分子が結合していると推定される。一方、やや低イオン強度で固定すると、ところどころに線維状分子の突出が見られ再構成フィラメントと同様の像が観察された。これらの結果は上記の生化学的データと良く符号する。脱燐酸化ミオシンにより形成されるフィラメントはin vitroでは不安定で溶液にATPを加えると溶解する。しかし、CaD存在下ではフィラメントは安定化し、また、アクチンを加えると周期的に係留されることが判明した。以前から、平滑筋では弛緩時にも脱燐酸化ミオシン・フィラメントが存在し、in vitroの結果と矛盾するとの指摘があったが、CaDのこの様な性質により生理的状態が良く理解できるようになった。カルデスモン(CaD)は平滑筋の細いフィラメントの構成成分のひとつであり、ラッチ収縮(ミオシン軽鎖の低レベルの燐酸化状態における収縮)に関与する可能性が議論されている線維状蛋白質である。筆者はこれまでにその分子のC末端側がFーアクチン(FA)及びトロポミオシン(TM)にまたN末端側が重メロミオシン(HMM)に特異的に結合すること、そして溶液中で約半分の長さに折れたたまり易いことなどを既に報告している。今年度はCaDとFAおよびHMMとの結合様式を電子顕微鏡的に探ることを試みた。平滑筋の天然の細いフィラメントとほとんど同一組成であるKI抽出アクチン(FA、TM、CaDを含む)を軽度に化学固定した後ネガティブ染色するとアクチンフィラメントに沿ってTMと同周期(約38nm)の突出物が認められた。次にシステイン残基にビオチンを導入したCaDを含む同一組成のアクチンフィラメントをアビジンで標識するとやはり同じ周期が観察された。マイカ細片急速凍結レプリカ法で見られるKI抽出アクチンの像はTMと同じ周期でアクチンフィラメントから生え出す長い線維を示した。FAーTMのみではそのような構造は見られなかったことからこれらの結果は、CaDがそのC末端付近でFAーTMと周期的に結合しN末端部分はアクチンフィラメントから遊離していると解釈される。これはネガティブ染色像のみのデ-タからCaDの全長に渡ってFAに結合していると考えられる従来の仮説と矛盾する。

一方、低蛋白質濃度、ATP存在下ではHMMはFAーTMとはほとんど結合しないが、CaDを含むKI抽出アクチンは同じ条件でHMMを弱く結合する。この試料にネガティブ染色を施して観察するとHMMがその尾部でアクチンフィラメントと結合している様子が示された。細胞内ではアクチン、ミオシンともに高濃度で存在していることから、太いフィラメント内のミオシンはその頭部とは別の部分でもアクチンフィラメントと相互作用している可能性が考えられる。平滑筋の細いフィラメントはその構成成分のひとつとして線維状蛋白質カルデスモン(CaD)を含む点で特徴的であり、これがラッチ状態(ミオシン軽鎖の低レベル燐酸化状態における収縮)を引き起こす可能性が議論されている。著者はこれまでにその分子のCー末端部位がFーアクチン(FA)及びトロポミオシン(TM)にまたNー末端部位がミオシン・サブフラグメントー2(S2)に特異的に結合すること、そして低イオン強度中ではCaDは半分の長さに折れたたまることなどを報告している。昨年度は再構成した細いフィラメント(FA、TM、CaD、場合により2個のシステイン残基にビオチンを導入したCaDを含む)を用いてCaDとFAおよび重メロミオシン(HMM)との結合様式を電子顕微鏡的に探ることを試みた結果、CaDがそのCー末端付近でFAーTMと周期的に結合し、Nー末端部分はFAから離れて突出しHMMのS2部分と結合していると解釈される像が得られた。今年度は平滑筋組織から直接単離した天然の細いフィラメントの構造を調べた。アクチンからのCaDやTMの解離を防ぐために、軽く化学固定し電子顕微鏡観察したところ生理的に近いイオン強度ではアクチンの螺旋周期は不明瞭であり表面に何らかの別の分子が結合していることが推定されるものの線維状分子の突出は見られなかった。しかしやや低いイオン強度では長い線維状分子の周期的な突出が認められ基本的構造は再構成フィラメントと同様であることが確認された。脱燐酸化ミオシンの構成するフィラメントは不安定でありATPを加えると溶解してしまうことが知られているが、最近、アクチン結合CaDがこのようなミオシン・フィラメントを安定化させる作用をもつことを見いだした。弛緩した平滑筋細胞内ではミオシンは脱燐酸化しているにもかかわらずフィラメントが安定に存在することが報告されておりin vitroの結果との矛盾点が指摘されているがCaDのこのような性質により問題が解決される可能性が出てきた。
大腸がん新規薬物療法を目指したＡｈＲリガンドの探索

大腸がん発生に重要な役割を持つβカテニンが、AhRによってリガンド依存的に分解されることが報告された。様々な大腸癌細胞株を用いてこれを検証したところ、AhRリガンド処理によるβカテニンの分解は再現できなかった。AhRとβカテニン、およびCUL4Bの結合はレポーターアッセイやツーハイブリッドアッセイによって確認できなかった。一方、動物実験ではAhR-KOマウス盲腸での自然発がんは再現され、何らかのリガンドがAhRを活性化して発がんを抑制していると考えられた。改良酵母アッセイ系により、野生型マウスの盲腸内容物からAhRリガンド様活性が検出され、HPLCによる分析では複数の画分に活性が見出された。AhRはリガンド依存的にCUL4Bと結合し、標的タンパクをユビキチン化し分解促進すると考えられている。マウス盲腸においてはAhRがβ-カテニンを分解することによって発がんを抑制することが報告された。そこで、核内のβ-カテニンの分解を測定しうるレポーターアッセイ系構築を試みた。しかし、10種のヒト大腸がん由来細胞および20種以上のAhRリガンドを用い、考えられ得る条件を試行したが、レポーター活性の低下は確認できなかった。β-カテニンタンパクの分解は高濃度のDIM(ジインドールメタン)処理でのみ認めらたが、この反応はAhRやプロテオソーム依存的な反応ではなく、細胞接着性の低下によるものであった。また、酵母two-hybrid法によるCUL4BとAhRおよびβ-カテニン結合を指標としたアッセイ系構築を試みたが修飾介在因子を含め様々な組み合わせを試行したものの、これらタンパクの酵母内での結合は認められなかった。このため、AhRリガンドの活性評価についてはXRE依存的な酵母レポーターアッセイを高感度化することで行うこととした。本研究の最終目標は腸での発がんを予防する安全なAhRリガンドの探索である。マウス盲腸には何らかのAhRリガンドが存在し、AhRを活性化することで発がんを抑制していると考えられるため、盲腸内容物(CC)中に含まれるAhRリガンド様物質の探索を行なった。C18カートリッジにてCCの簡易精製を行い、AhRリガンドの有無を高感度化酵母アッセイにより調べたところ、水抽出画分に活性を認めた。そこで大阪府立大学分子細胞遺伝学研究室(八木孝司教授)に研究協力を求め、簡易精製物をHPLCで分離し、活性画分の同定を行った。その結果、盲腸内容物中のAhRリガンド様活性は複数の画分に認められた。現在、ヒト細胞を用いた活性の確認と対象分画の絞り込みを行っている。Wntシグナル伝達因子であるβカテニンの蓄積は、標的遺伝子の転写活性化を介して大腸がんに至る腺腫形成を起こす。AhRはリガンド依存的に薬物代謝酵素等の発現調節を行う転写因子であるが、AhR欠損(KO)マウスの盲腸がんの発症と、その原因としてAhRがβカテニンをリガンド依存的に分解することが報告された(Kawajiri et al., 2009. PNAS)。そこでAhR依存的なβカテニン分解を測定し得る系の作成と、大腸がん発症に抑制的に働くAhRリガンドの探索を試みた。既報に従いDLD-1細胞でのβカテニンの変化をwestern blot、TOPflash assayで測定したところ、AhRリガンドによる分解は観察されなかった。βカテニン分解に先立って起こるAhRとCUL4Bおよびβカテニンの結合をYeastおよびMammalian two-hybrid法、免疫共沈法により検討したが、いずれの方法でもこれらタンパクの結合は認められなかった。複数ロットのDLD-1細胞にてAhRの応答性をXRE依存的レポーターアッセイで検証したが、誘導にはAhRの強制発現を要したため、本細胞はAhRを発現していないと考えられた。以上の結果よりこの現象を再現することは不可能であると考えられる。一方、AhR-KOマウス盲腸での自然発がんは既報どおりに再現された。そこで腸内細菌代謝物を対象にマウス盲腸内容物からAhRリガンドを単離することを試みた。通常飼育マウスおよびオメプラゾール(OME)を含む抗生物質投与マウスの盲腸内容物を固相抽出し、高感度化酵母AhRレポーターアッセイにより活性を測定した。盲腸内容物のリガンド活性は通常マウスおよびオメプラゾール投与動物に認められ、HPLCによる分画では、通常動物盲腸内容物には複数の画分に活性が、OME投与動物盲腸からはOME代謝物に起因する活性が認められた。AhRはダイオキシンを始めとした化学物質をリガンドとして認識し、遺伝子発現を調節する転写因子であると共に、E3ユビキチンリガーゼの構成因子としてタンパク分解に関与している。

近年、AhRがβ-catenin分解を介して大腸がんを抑制することが報告された。この経路はAhRリガンドに依存的なため薬物制御が可能と考えられ、大腸がんの新規薬物療法または予防法が開発できることが期待できる。本研究では生体内または天然物由来の「安全な」物質から、臨床応用可能なAhRリガンドを探索することを目的とした。23年度はまず、AhRリガンドによる転写調節活性とタンパク分解活性の評価に用いる細胞株の検討を行った。大腸由来細胞(DLD1、Caco-2)および陽性対象として肝臓由来細胞(HepG2)を用いて実験を行った結果、DLD1細胞では転写活性化作用がHepG2に比べて著しく低く、アッセイには不向きであった。Caco-2では高い転写活性化を示したが、実験系として非常に不安定であったため、安定形質転換株の作成を行っている。一方、β-catenin分解の指標となるTOPFLASHアッセイを十数種の大腸がん由来細胞を用いて行ったが、AhRリガンドによる抑制作用はいずれの細胞においても認められなかった。この結果は既報とは異なるため、実験条件の検討ならびにタンパクレベルでのβ-cateninの定量化を行っている。また、簡便なAhRリガンド活性の測定のため、ヒトAhRを発現するレポーターアッセイ酵母株を作成した。ホスト酵母の細胞透過性や薬物排出機能を改変したところ、極めて高感度のアッセイ酵母株を作成することに成功した。臨床応用可能なAhRリガンドの探索のため、トリプトファン代謝物のアッセイを行った結果、内因性リガンド候補とされるキヌレニンにはリガンド活性はみられず、キヌレン酸に活性が見られた。大腸がん由来細胞でのAhRリガンド処理によるβ-カテニンの分解については、現在のところ再現することができない。この現象は本研究の立案時における重要な実験的根拠の一つであることから、結果を再現するべく、考えられ得るあらゆる条件を試行した。このために研究期間のおよそ半分を費やしたが、実験結果の再現には至らなかった。さらに、この現象について論文発表およびデータを提供した研究室は、昨年4月に研究主催者の辞任により解散した。このため、適切な情報やアドバイスを得ることができなくなり、研究期間内での実験結果の再現は非常に困難な状況になった。また、CUL4BとAhRのリガンド依存的な結合の有無については、酵母two-hybrid法以外にも、免疫共沈法、mammalian two-hybrid法を試行したが、今のところこれらタンパクの結合を示すデータは全く得られていない。一方、個体レベルでの表現型であるAhR欠損マウスでの盲腸発がんについても本研究の根幹であることから動物を入手、繁殖させて追試したところ、既報通り回盲部での病変が確認された。このことから、マウス盲腸においてAhRを介した発がん抑制機構が存在していることは確実であり、その分子メカニズムとして盲腸での何らかのAhRリガンドの関与が示唆される。そこでマウス盲腸内容物からのAhRリガンドの探索を本年度より開始した。しかし、所属研究機関ではHPLC等の分離精製機器を保有していないこと、また高感度化した酵母レポーターアッセイについては特許およびライセンスの制約があり、大阪府立大学で機器、実験設備を借用して実験を行った。
ワーク‐ファミリー関係論の組織心理学的発展

既存研究によると、仕事生活に対する態度と家庭生活に対する態度の間の関係について3つの競合モデルが存在する。スピルオーバー(流出)、コンペイセイション(補償)、そしてセグメンテーション(分離)の3つである。これらのモデルは、両生活領域における態度の間にはそれぞれ正相関、負相関、無相関的な関係が存在すると主張している。我々は、これら3つのモデルのどれが正しいかを問うべきはなく、個人の価値観とかパーソナリティー等の個人差要因、及び雇用条件、家族状況、社会的歴史的なコンテクスト等の環境要因を考慮した場合、上記のいずれのモデルも妥当であることを主張し得る調査結果を得た。仕事生活領域と家庭生活領域に対する個人の態度や行動の相互作用の過程と結果について考察するのが本研究の目的である。両生活領域間の態度の関係については、全体的仕事生活満足、全体的家庭生活満足といった広義な態度だけでなく、各領域の具体的な下位次元(仕事内容、給与、家庭内人間関係、家族の凝集性)に対する態度に着目する。さらに態度間の関係に影響を与える第3の変数として、心理学的個人差変数(性格特性や欲求等)や状況要因(職場環境、文化)等を考慮する点が本研究の主な特徴と言える。さらに、平成20年度はここまでの理論研究を実証的にテストする段階へと入れそうである。平成20年度は、平成21年度に行う本調査に向けてプリテストを行った。約100名のサンプルを対象とし、理論にもとついて作成した尺度を盛り込んだ質問紙を配布、回収し、尺度の信頼性と妥当性を検証した。具体的には、(1)パーソナリティ特性、欲求、価値観等の心理学的個人差尺度こ(2)職場風土が達成志向的なのか、或いは親和志向的なのか等を測定ずる職場環境尺度、(3)家庭風土を測定するたあに必要な夫婦の性役割意識、達成志両性(親和志向性等の家庭環境尺度、及び(4)仕事と家庭生活に対する足度、転職意思、家庭内和、家庭内暴力といった成果変数を測定するための尺度、等の開発に努力を傾倒した。原文が英語の既存尺度を用いた一場合には、まず当該尺度を我々が邦訳し、さらにバイリンガルな一般成人にバックトランスレーションをしてもらった。この作業は、バックトランスレーションが原文と同義となるまで、繰り返し行われた。このような過程を経て完成させたAlpha版尺度の信頼性と妥当性をテストした結果、ほぼすべての尺度の信頼性係数が0.8°Cを超えた。また第1回目の調査から1ヶ月ほど経過した後に、同一の質問票を同一の被検査者に施行し、テストリテスト間の信頼性を検証した結果、統計的に有意な水準に到達できた。さらに、種々の個人差変数・環境変数と成果変数の間の基準連関妥当性も両時点において、また時点問において有意であった。以上より、昨年度の目的は達成されたと言える。本年度は信頼性と妥当性に裏打ちされたこれらの尺度を用いて、本調査を開始するつもりである。平成21年度は、このプロジェクトの3年目である。当初の予定では、データ収集を行い、分析を開始する年度である。昨年までの2年間度に行った理論研究、および予備調査を経て作製してきたさまざまな尺度(Big-5性格特性、事生活満足度尺度、家庭生活満足度尺度、ワーク・ファミリー・コンフリクト尺度、その他)を使用し、大量のデータを収集した。そして、新尺度の信頼性を高めるために、構成概念のインディケータの等質性を再吟味し、異質と判定されるアイテムが削除された。次に、本研究最大の目的であるワーク・ファミリー研究に取り掛かる前に、尺度の最大の難所である性格特性尺度の妥当性に関する研究に取り掛かった。尺度の妥当性を検証するためには、作製した新尺度が別概念(例えば、職務満足、ワーク・モティベーション等)の既存尺度との間に期待される連関を有しているかについて実証しなけばならない。それを検証するために、3つの研究を行い、開発した性格特性尺度の妥当性を確認することができた。具体的には、各性格特性尺度を転職意思、内発動機、継続学習行動等の既存の確立された尺度と関連付け、所期の連関が存在するかを検定した。その結果、尺度の妥当性が確認された。また、これら3つの研究内容は単に妥当性検定だけのために行われたのではなく、組織行動論分野に対する理論的貢献、及び実社会に対する実際的貢献を付加し得るような内容とした。3つの論文はすべて査読付学術に投稿され、受理されるに至った。性役割構造の平等化が進むにつれ、家庭での役割が職場での役割にあたえる影響(または、その逆の影響)を考慮せずして働く人々の行動を理解することは非常に困難となっている。組織における人間行動の原因を説明する際に考慮する環境要因を種々の組織変数だけにもとめる

従来のフレームワークを脱皮し、仕事生活と家庭生活の相互影響過程に目を向ける必要がある。本研究はこのような社会背景に鑑みて開始された。既存研究においては、仕事生活に対する態度と家庭生活に対する態度の間の関係について3つの競合モデルが存在してきた。スピルオーバー(流出)、コンペイセイション(補償)、そしてセグメンテーション(分離)の3つである。これらのモデルは、両生活領域における態度の間にはそれぞれ正相関、負相関、無相関的な関係が存在すると主張している。我々は、これら3つのモデルのどれが正しいかを問うべきはなく、個人の価値観とかパーソナリティー等の個人差要因、及び雇用条件、家族状況、社会的歴史的なコンテクスト等の環境要因を考慮した場合、上記のいずれのモデルも妥当であることを主張し得る調査結果を得た。文献に対する理論的貢献は極めて高いと評価されよう。今後は、仕事生活と家庭生活における具体的な諸要因が、両生活領域における具体的な行動(例えば、職場での業績、自発的欠勤・退職、仕事コミットメント等、及び家庭での人間関係、レジャー、暴力、離婚等)とどのように結びついているかを明らかにしていきたい。
二酸化炭素中毒での中枢性の呼吸障害に関する基礎的研究

10%以上の高濃度二酸化炭素の吸入による病態を幼弱ラットと成熟ラットで比較した。二酸化炭素30%で幼弱ラットの生存時間はより長く,海馬CA1の好酸性化率はより上昇した。次に呼吸中枢とされる延髄腹側中央部の遺伝子発現をマイクロアレイとリアルタイムPCRで調べた。高濃度二酸化炭素によってノルアドレナリンおよびセロトニンに特異的に関連する遺伝子の発現増加は明らかにはならなかったが,MAPKシグナルパスウェイやサイトカインのシグナルパスウェイとの関連が報告されている最初期遺伝子の発現増加が認められた。これらの発現増加は,低酸素では認められず,高濃度二酸化炭素による呼吸抑制と関連する可能性が考えられた。目的:呼吸調節の中枢は延髄に分布する。セロトニン神経の細胞体のほとんどは脳幹の縫線核にあって神経線維は中枢神経系全体に分布し,ノルアドレナリン神経の細胞体の多数は橋背側の青斑核にあり,いずれも呼吸調節に関連する可能性が示されている。本研究では両者を含む延髄中央部での二酸化炭素によるmRNAの発現をマイクロアレイ法で測定し,二酸化炭素による呼吸抑制との関連を調べた。方法:ラットとマウスは二酸化炭素に対する反応が類似するが,遺伝子改変実験などによってマウスの情報がより充実していることから実験動物にはマウスを用いた。動物を麻酔後,高濃度二酸化炭素(二酸化炭素30%,酸素21%,窒素バランス)を3時間吸入させてCO2群とし,二酸化炭素30%の空気は低酸素となるので低酸素(酸素14.7%(21%×0.7),窒素バランス)を吸入させたHypoxia群,大気を吸入させた対照群(酸素21%,窒素バランス),さらに遺伝子発現までの所要時間を考慮して高濃度二酸化炭素を8時間吸入させたCO2長時間群に分けた。ガス吸入後に断頭し,第4脳室下の延髄中央部を採取し直ちに凍結した。アッセイは冷却下にホモジナイズし,mRNAをQIA shredderおよびRNeasy Mini Kitで抽出し,DNaseとエタノール沈澱操作で精製した。バイオアナライザーでRNAの性能を確認し,定法に従ってアレイを含む試薬(1色法対応In-situオリゴDNAマイクロアレイキット,4×44K)を用いてマイクロアレイを行い,GeneSpringで解析した。結果:対照群に比べてHypoxia群の変動はわずかであったが,CO2群では前初期遺伝子を含む複数の転写遺伝子の有意な発現増加がみられ,CO2長時間群ではこれらの遺伝子の数および程度はさらに顕著となった。CO2群で発現増加を示した遺伝子を解析したところ,いくつかのシグナル経路との関連が示唆された。一方,ノルアドレナリンおよびセロトニンに関連する特異的な発現遺伝子の変動は明らかにならなかった。目的:二酸化炭素による中枢性の呼吸障害に対する加齢の影響を検討する。方法: Wistar雄の幼弱ラット(生後7日から14日)と成熟ラット(体重400gから500g)を麻酔した後,容量約2リットルの暴露容器に入れ,空気動圧センサーを用いて呼吸運動を記録した。30 - 50%の高濃度二酸化炭素(CO2)(酸素21%,窒素バランス)混合ガスを吸入させ,呼吸停止までの生存時間を測定した。次に幼弱ラットと成熟ラットを40%CO2(酸素21%,窒素バランス)に3時暴露したCO2群と大気に暴露した対照群(CO2 0%,酸素21%,窒素バランス)に分け,脳切片をHE染色した。海馬CA1領域に分布する錐体細胞は虚血に脆弱であることから,CA1の好酸性化細胞および壊死細胞数の正常細胞数に対する出現率を算出した。統計上,群間の危険率5%未満を有意差あり,10%未満を有意差の傾向があるとした。結果:幼弱ラットの生存時間はCO2 30%では成熟ラットより有意に長かった。CO2 40%および50%での生存時間の有意差は認められなかった。次に海馬CA1の錐体細胞をみると,対照群の好酸性化率と壊死率は成熟ラットのほうが幼弱ラットよりも有意に高かった。また成熟ラットではCO2群の錐体細胞の好酸性化は対照群と差はなかったが,壊死率は高い傾向を示した。一方,幼弱ラットではCO2群の好酸性化率は対照群よりも有意に高く,壊死率は対照群よりも高い傾向を示した。すなはち,海馬CA1の錐体細胞は,高濃度CO2によって好酸性化が幼弱ラットでより出現し,壊死細胞の出現傾向は成熟ラットと幼弱ラットに認められた。結論:成熟ラットと幼弱ラットでは高濃度CO2暴露下での生存時間や海馬CA1の好酸性化率といった中枢での呼吸障害の病態像に差異が認められた。

目的:二酸化炭素による呼吸抑制の機序を調べるために,前年度は高濃度二酸化炭素吸入下での延髄腹側中央部のmRNAの発現をマイクロアレイで網羅的に調べ,変動が顕著なバイオマーカーを得た。本年度はこれらについてReal time PCRで定量を行い,変動の有意差の有無を確認した。方法:マウスに高濃度二酸化炭素(二酸化炭素30%,酸素21%,窒素バランス)混合ガスを0時間,3時間および8時間吸入させてCO2群とした。同様に低酸素(酸素14.7%(21%×0.7),窒素バランス)を0時間,3時間および8時間吸入させた群をHypoxia群とした。ガス吸入終了後,すみやかに第4脳室下延髄中央部を分割・採取しmRNAを抽出した。ターゲット遺伝子として転写調節因子FOS,FosB,JUN,JunB,ATF3およびサイトカインおよび免疫関連遺伝子Ccl2,CD14,成長因子Cyr61,アポトーシス関連因子Nr4a1を用いた。変動の少なかったATP5bを内在性コントロールとし,TaqManプローブを用いてThreshold cycle(Ct値)を算出し,ATP5bのCtで除した値ΔCtを分散分析および多重比較法により検定した。なお発現量が増加すればΔCtは減少することから,ΔCtの減少は発現量の増加を表し,ΔCtの増加は発現量の減少を示す。結果:Hypoxia群では有意なΔCtの変化は認められなかった。一方,CO2群では転写調節因子のうちATF3はCO2-3hr群およびCO2-8hr群で有意に減少し,FOS,FosB,JUN,JunBのΔCtはCO2-8hr群で有意に減少した。またCcl2,Cyr61,Nr4a1のΔCtは,CO2-3hr群およびCO2-8hr群で有意に減少し,CD14のΔCtはCO2-8hr群で有意に減少した。これらはいずれも同時間帯のHypoxia群よりも有意に低値であった。ΔCtの減少すなはち発現増加を示したこれらのターゲット遺伝子は,MAPKシグナルパスウェイやサイトカイン類のシグナルパスウェイなどとの関連も報告されており,高濃度二酸化炭素の吸入によって生じる呼吸抑制と関連する可能性が考えられた。法医病理1.本年度の主眼であったマイクロアレイの実施にあたって試薬や操作法などの不備が生じ,再実験を行うこととなった。原因の究明ならびに再度の試料収集と試薬の入手に時間を要した。2.データ解析にあたって,一部ソフトの不具合があり解決に時間を要した。本年度の研究の目的は,二酸化炭素による中枢性の呼吸障害が加齢によって影響を受けるかどうかを検討することであった。上記の研究実績の概要に示したとおり,目的は達成できたものと考える。今回の結果を参考にして,Real time PCR装置(学内共同利用施設現有)を用いて発現物質を同定を行う。これを幼弱と成熟において比較検討する。病態像が確立した各群の脳を採取し,各部位を前処理したのち,DNAマイクロアレイ装置(学内共同利用施設現有)を用いて5-HTおよびNAなどの脳内伝達物質の発現を調べる。さらにマイクロアレイの結果を参考にして,Real time PCR装置(学内共同利用施設現有)を用いて発現物質を同定する。さらに,発現物質をELIZA法などでキットを用いて定量する。血中の二酸化炭素濃度を測定するための血液ガス分析装置(現有)の電極を年度末に注文した。
ヘテロクムレンユニットを含む有機ケイ素試薬を用いる高選択反応の研究

1目的有機炭素資源の有効利用をはかり、高い機能性と付加価値をもつ物質への変換を効率よく達成するためには新しい反応原理に基づく有機合成反応の開発がまたれる。本研究ではヘテロクムレンユニットを官能基として含む有機ケイ素化合物を合成試薬として用いる高選択的反応を開発することを目指す。60年度は官能基としてアジド基に着目し、同一分子内にケイ素原子とアジド基を含むシリルアジドとしてトリメチルシリルアジド(TMSA)およびトリメチルシリルメチルアジド(TMSMA)を選びその反応性を研究した。2方法・結果(1)カルボニル化合物をgem-ジアジドアルカンへの変換。種々のケトンやアルデヒドと2等量のTMSA、触媒量の塩化亜鉛と反応させた所gem-ジアジドを高物率で得た。(2)テトラゾール誘導体への変換。上記で得たgem-ジアジドを当量の塩化亜鉛と処理したところテトラゾール誘導体を与えることが分った。ケトンは1.5-二量換テトラゾールに、アルデヒドでは一量換テトラゾールおよび第二のアルデヒドが反応した二量換テトラゾールに変換できることが分った。(3)ニトリルへの変換芳香族アルデヒドとTMSAとの反応により、芳香族ニトリルが高物率で合成できることが分った。(4)トリメチルシリルメチルアジド(TMSMA)の反応。TMSMAはメチルアジドのシリル誘導体であり、更に多変反応試薬と考えらける。芳香族金属化合物との反応では、アジンを生成することが分った。また酵塩化物、酵無化物との反応によってトリアジン誘導体写、特色のある化合物を生成することが分った。以上、これらのケイ素試薬はいずれも合成化学上右用であり、ユニットプにセスに用いることが出語ることが明らかとなった。