hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
地球環境化学・数理解析手法の統合による残留性有害物質の濃縮挙動解明とリスク評価

日本近海およびカリフォルニア沖の多様な栄養段階の海洋生物を対象に、PCBsや臭素系難燃剤(PBDEs・HBCDs)、微量元素等による汚染実態と生態影響、海洋食物網における濃縮動態について評価した。汚染実態に関しては瀬戸内海や宮城沖におけるHBCDs汚染の進行が示唆された。また、瀬戸内海のスナメリにおいて、寄生虫感染個体で有意に高値のPCBs蓄積が認められ、免疫抑制等の影響が推察された。食物連鎖による濃縮動態に関しては、炭素・窒素安定同位体比やその他物理化学的・生物学的パラメーターの解析から、生物の栄養段階以外に海域固有の栄養塩循環や食物網構造、異性体特異的な代謝・排泄特性が食物網を介した濃縮動態に影響を与える主要因子となることが示唆された。既存の残留性有機汚染物質(POPs)に関する分析法を改良し、複数の臭素系難燃剤と一斉分析する手法を確立した。また日本沿岸(瀬戸内海・東北沖)、東シナ海、米国西海岸沖などから採取した動物プランクトンや魚介類および生物環境試料バンクに保管されている海棲哺乳動物等を対象に窒素・炭素安定同位体比(δ^<15>N・δ^<13>C)を測定した。各海域の食物網構造を解析した結果、海域ごとに食物連鎖長が大きく異なっており、とくに沿岸湧昇流の影響を受ける米国西海岸沖では他海域よりも食物連鎖長が短いことが示された。さらに東北沖や米国西海岸沖から採取した動物プランクトンや魚介類について微量元素およびPCBs・臭素系難燃剤を測定した。その結果、東北沖の海洋食物網では水銀や主要PCBs異性体、臭素系難燃剤の一部PBDEs異性体について、栄養段階に伴う明らかな残留濃度の上昇傾向が観測された。一方、相対的に食物連鎖長の短い米国西海岸沖の生態系では、ほとんどの物質で明瞭な濃縮傾向が認められなかった。以上の結果は、海洋生態系の食物網構造によって微量元素やPOPs等の濃縮傾向が大きく異なることを示しており、食物網構造の解析と併せた有害物質の動態予測や影響評価の重要性が改めて示唆された。また本年度はPOPsの生物濃縮過程について、海水-植物プランクトン-溶存有機炭素系の数理モデルを構築した。海水中のPOPs濃度を別途開発した全球レベルのPOPs動態解析モデルと統合し、低次栄養段階におけるPOPsの生物濃縮過程を全球レベルで予測する手法を確立した。また,このモデルにベイズ不確実性解析を適応し,植物プランクトン機能(円石藻1種と珪藻3種)に依存するパラメーターの不確実性を定量化した.瀬戸内海および東シナ海から採取した底泥堆積物、動物プランクトン、魚介類および生物環境試料バンクに保管されている海棲哺乳類を対象に窒素・炭素安定同位体比(δ^<15>N・δ^<13>C)を測定し、各海域の食物網構造の概要を明らかにした。また、瀬戸内海海域と外洋(黒潮域)での食物網構造の比較を窒素・炭素安定同位体比分析により行い、沿岸域と外洋域の食物網間における相互作用を検討した。さらにそれら瀬戸内海および東シナ海の動物プランクトンや魚介類の一部、海棲哺乳類のスナメリについて、PCBsなどの既存POPsや臭素系難燃剤のPBDEs・HBCDsを測定した。各生物のδ^<15>N値と動物プランクトンのδ^<15>N値の差を元に定量的な栄養段階(TLs)を算出し、POPs・臭素系難燃剤濃度との相関を解析した結果、PCBsおよびPBDEsの濃度はTLsとの間に有意な正の相関が認められた。また、それら相関の傾きから、食物連鎖による生物濃縮係数(TMF)を各物質の異性体ごとに求め、脂溶性の指標であるオクタノール・水分配係数(Kow)と比較・解析した。その結果、PCBsやPBDEsの異性体は脂溶性依存的にTMFが増加するが、log Kowが7を超えるような高分子異性体ではTMFが相対的に低下すること、一部低臭素化PBDEs異性体については高臭素化異性体の脱臭素によってlog Kowから予測される値よりもTMFが上昇する傾向がみられた。また、POPsの生物濃縮過程について、海水-植物プランクトン-溶存有機炭素系の数理モデルと、別途開発した全球レベルのPOPs動態解析モデルを統合したものを改良した。加えて、その統合モデルに対する、ベイズ不確実性解析のプログラムを開発した。これにより、低次栄養段階におけるPOPsの生物濃縮過程を全球レベルで予測し、その不確実性を解析する手法を確立した。

PCB等の残留性有機汚染物質(POPs)やその候補物質として注目されているポリ臭素化ジフェールエーテル(PBDEs)、ヘキサブロモシクロドデカン(HBCDs)等の臭素系難燃剤に関して、東シナ海や瀬戸内海、日本海から採取した多様な栄養段階の生物種を対象に調査を実施し、その汚染実態や生物濃縮の特徴を解明した。また、生態系の動物プランクトン・底生生物から鯨類含む高次捕食者まで炭素・窒素安定同位体比(δ^<13>C・δ^<15>N)を測定し、各海域の食物網構造と物質の濃縮動態について解析した。汚染実態に関しては、瀬戸内海東部や日本海の富山湾沿岸ではHBCDsによる汚染がPCBsと同程度かそれを上回るレベルに享で顕在化していることが示された。一方、東シナ海ではHBCDsよりもPBDEsによる汚染が顕著であった。食物連鎖による生物濃縮に関しては、瀬戸内海の生態系においてPBDEsやHBCDsの蓄積濃度がPCBs等の既存POPsと同様にδ^<15>Nに基づく栄養段階指標(TLs)と有意な正の相関を示すことが確認された。一方、東シナ海では食物連鎖による生物濃縮傾向が不明瞭であった。その要因として、PBDEsやHBCDsの一部異性体が生体内で代謝されやすいこと、東シナ海における汚染物質の起源が複雑であること、などが推察された。さらに生態系に蓄積している汚染物質の起源を推定するため、代表的な底生および表層性食物網のδ^<13>C・δ^<15>Nに基づき、底生および表層性由来の有機物寄与や汚染物質起源について解析した。また、各生物種の実測濃度データ、BCFs・BAFs、TMFs等を既報の文献値等と比較・検証を進め、昨年度までに開発したPOPsの生物濃縮モデルと統合して、食物連鎖によるPOPs生物濃縮過程の数理解析と検証を行った。とくにPCBsについては、環境動態モデルから得られた植物プランクトン体内の濃度を、生物濃縮モデルの入力データに応用した。また、ベイズ不確実性・感度解析のプログラムを改良し、動態解析モデルや生物濃縮モデルの各種パラメーターの不確実性が、高次消費者の生物濃縮予測の不確実性に現れる規模を明らかにした。
ガス分子依存性脳血流代謝カップリング機構の解明：代謝解剖学的アプローチを用いて

ガス分子は、高分子の構造内に比較的容易に浸透し、金属原子や鉄-硫黄クラスターを有する補欠分子族への結合や、低分子の官能基に特異的に結合することにより生物活性を発揮する。ガス分子の作用は、可逆的・即効的でかつ複数の標的をもつことを特徴とするが、それ故に、複数のガス分子とその受容蛋白質が時空的に複雑な相互作用を形成する生体内において、ガス分子の生成・受容及び情報伝達機構と生理作用との因果関係は十分に立証されていない。本研究は、脳で恒常的に産生される一酸化炭素(CO)の役割を、二光子励起顕微鏡を用いin vivoで解析した。野生型(WT)とCOの量が半分に減弱したHO-2KOマウスを用い、異なる微小血管レベル(e.g.毛細血管、前毛細血管、細動脈)で惹起される虚血応答をreal-timeで精査した。低酸素性血管拡張は、基質(O2、グルコース)の要求が最も高い神経細胞の近傍の血管から拡張シグナルが伝播し、十分のCOが存在する野生型マウスでは顕著に増幅されると予測した。血管径測定に加えて、赤血球速度を計測し血流量を算定した。毛細血管径は、野生型とHO-2KOマウスの間で差が認められないのに対し、赤血球速度はHO-2KOで顕著に早いこと、つまりCOがないと基底状態で血流量が増加することが示された。CNSで恒常的に産生されるCOの役割は、基底状態で統合的な抑制因子として働くことのみならず、持続的抑制によりストレス応答に必要な予備能を担保し、neuron発振型のfail-safe regulationの根幹を担うガスであるという一つの証左を得るに至った。ガス分子の作用は、可逆的・即効的でかつ複数の標的をもつことを特徴とする。それ故に、複数のガス分子とその受容蛋白質が時空的に複雑な相互作用を形成する生体内において、ガス分子の生成・受容及び情報伝達機構と生理作用との因果関係は十分に立証されていない。本研究は、脳組織で産生されるガスの生成・受容機構を探究し、ガス分子によるエネルギー代謝と血流調節のカップリング機構を解明することを目的とした。CO2は脳血管の強力な拡張物質であることが古くから知られていながらも、拡張の機序・センサー分子の実体は未解明である。正常酸素下でのCO産生量がwild-type(WT)の約半分に低下したHO-2 knockout(KO)マウスの脳では、基底状態のATPが、WTに比べて高値を示すこと、さらにWTでは殆ど影響のない短時間のhypoxia(10% O2,1 min)に対しても、HO-2KOではATPが半減するという興味深い結果を得た・さらに、脳組織のメタボローム解析により、HO-2KOの糖代謝を詳細に解析した。特に、COの標的として脳エネルギー代謝の根幹をなすグルコース代謝に着目し、グルコースの酸化によって産生される二酸化炭素(CO2)の産生量を内因性のCOが制御する可能性の検証を試みた。以下の仮説を検証することを第一目標とした。仮説:正常酸素下で産生される内因性COは、糖代謝酵素を制御しCO2産生を恒常的に抑制することで過剰な血流増加を防ぐglucose sparingのmaster regulatorである。研究初年度はGC-MSを用いて脳組織中の内因性のCO2量を定量するための実験系を構築した。具体的には、少量(20 mg)の脳組織sonicateに酸を添加して気相に追い出したCO2をガスクロマトグラフ質量分析機(GCMS-QP-Ultra)で測定することに成功した。HO2-KOマウスを用いた検証に持ち込むところまで準備が整った。おおむね順調に進展していると判断する。ガス分子は,高分子の構造内に比較的容易に浸透し,金属原子や鉄-硫黄クラスターを有する補欠分子族への結合や,低分子の官能基に特異的に結合することにより生物活性を発揮する.ガス分子の作用は,可逆的・即効的でかつ複数の標的をもつことを特徴とするが,それ故に,複数のガス分子とその受容蛋白質が時空的に複雑な相互作用を形成する生体内において,ガス分子の生成・受容及び情報伝達機構と生理作用との因果関係は十分に立証されていない.本研究は,脳組織で産生されるガスの生成・受容機構を探究し,ガス分子によるエネルギー代謝と血流調節のカップリング機構を解明することを目的とした. COによる代謝制御の鍵分子を洗い出すため,左中大脳動脈閉塞(MCAO)モデルを作製し,虚血の度合いに呼答して領域特異的(e.g.,虚血コアvsペナンブラ,皮質vs海馬など)に惹起される代謝リモデリングを,野生型(WT)とHO-2KO(COが半分に減弱)マウスの両群で比較した.具体的には,定量的質量分析イメージング法を武器に,皮質,海馬,基底核などの解剖学的な領域,あるいは,コア,ペナンブラといった血流低下に伴った虚血病態に特異的に形成される領域で惹起される代謝リモデリングを,複数の代謝物の組織内分布及び量的・質的な変化を解析した.野生型のマウスでは,「虚血コア」のATPが完全に消失しているのに対し,「ペナンブラ」では,健常側の同一領域に比して増加しているhyperactive regionの存在が確認された.

さらにHO-2KOのマウスのペナンブラでは,虚血による顕著なlactate増加(嫌気的解糖の亢進)がみられたのに対し,野生型のマウスではlactateの上昇が抑制されることが判明した.内因性のCOが存在することで,ペナンブラ領域では虚血時でも酸化的リン酸化が担保されることを示唆する結果である.COは緊急時に予備能を担保し, neuron発振型のfail-safe regulationを担うガスである証左となった.平成29年度は以下の仮説の検証を試みた.仮説:正常酸素下で産生される内因性COは,糖代謝酵素を制御しCO2産生を恒常的に抑制することで過剰な血流増加を防ぐglucose sparingのmaster regulatorである.概要で記したように,野生型とCO産生の減弱が認められたHO2-KOマウスを用い,中大脳動脈閉塞モデルを作製し,偏在性虚血によって惹起される領域特異的な代謝物の組織内分布・量的変動を解析した.虚血時に亢進する解糖系の最終代謝物であるlactateの増加を, COが抑制することが解剖学的なユニットを勘案した実験系で示されたことは一つの成果である.一方, COが糖代謝系のどの酵素を標的とするのかは未解明であり,次年度への継続目標である.ガス分子は、高分子の構造内に比較的容易に浸透し、金属原子や鉄-硫黄クラスターを有する補欠分子族への結合や、低分子の官能基に特異的に結合することにより生物活性を発揮する。ガス分子の作用は、可逆的・即効的でかつ複数の標的をもつことを特徴とするが、それ故に、複数のガス分子とその受容蛋白質が時空的に複雑な相互作用を形成する生体内において、ガス分子の生成・受容及び情報伝達機構と生理作用との因果関係は十分に立証されていない。本研究は、脳で恒常的に産生される一酸化炭素(CO)の役割を、二光子励起顕微鏡を用いin vivoで解析した。野生型(WT)とCOの量が半分に減弱したHO-2KOマウスを用い、異なる微小血管レベル(e.g.毛細血管、前毛細血管、細動脈)で惹起される虚血応答をreal-timeで精査した。低酸素性血管拡張は、基質(O2、グルコース)の要求が最も高い神経細胞の近傍の血管から拡張シグナルが伝播し、十分のCOが存在する野生型マウスでは顕著に増幅されると予測した。血管径測定に加えて、赤血球速度を計測し血流量を算定した。毛細血管径は、野生型とHO-2KOマウスの間で差が認められないのに対し、赤血球速度はHO-2KOで顕著に早いこと、つまりCOがないと基底状態で血流量が増加することが示された。CNSで恒常的に産生されるCOの役割は、基底状態で統合的な抑制因子として働くことのみならず、持続的抑制によりストレス応答に必要な予備能を担保し、neuron発振型のfail-safe regulationの根幹を担うガスであるという一つの証左を得るに至った。上述したCO2の微量測定系の構築に加えて、O2-CO-CO2系が低酸素時の脳血流のリスクマネジメントの一機序となりうるかをin vivoで検証する。二光子励起顕微鏡を用い異なる微小血管レベル(e.g.毛細血管、前毛細血管、細動脈)で惹起される低酸素応答をreal-timeで精査する。低酸素性血管拡張は、基質(O2,グルコース)の要求が最も高い神経細胞の近傍の血管から拡張シグナルが伝播し、十分のCOが存在する野生型マウスでは顕著に増幅されると予測する。血管径測定に加えて、赤血球速度を計測し血流量を算定する。
PNHにおけるペプチドワクチンによる免疫療法の可能性

我々は発作性夜間ヘモグロビン尿症(PNH)に対するペプチドワクチンを用いた免疫療法を開発にむけて以下の基礎的研究を行った。1)マイクロアレイ法によるPNHクローンの増殖・拡大に関与する遺伝子(群)を検討した。2)PNH由来骨髄造血幹細胞をNOGマウスに移植し、モデル動物の作成に努めた。今後は、WT1ペプチドワクチンを用いて、PNHのワクチン療法の可能性を検討する予定である。本年度の研究およびデータは、PNHではPIG-A遺伝子変異を有するPNHクローンがGPIアンカー膜蛋白を複合欠損するため様々な病態を引き起こすが、PIG-A遺伝子のknocked-out mouseではPNHの病態を再現できず、PNHクローン拡大には造血幹細胞レベルでのPIG-A遺伝子以外の異常が必要であることが明らかになった。現在までPNHクローンの増殖・拡大に関与する候補遺伝子としてWT1、EGR-1、TAXREB107、抗アポトーシス関連遺伝子、HMGA2が報告されているが、PNHクローンにおける遺伝子を網羅的に検討してはおらず、これらの遺伝子がPNHクローンの拡大につながるかは未だに結論がついていない。我々はこのデータのさらに集積する予定であると伴に、これらを参考に、次年度以降に行うペプチドワクチンの対象遺伝子を絞り込む予定である。1)現在まで、我々はPNH症例の骨髄細胞よりCD59^+AC133^+細胞およびCD59^-AC133^+細胞の分離を行った。これらの細胞よりTotal RNAを抽出し、>14,000 human genesに相当する>22,000プローブセットを用いた、Mano Hら(Blood,98,422-427,2001)がMPSと急性白血病症例を対象として行ったAC133細胞でのDNAマイクロアレイ法を用いて、遺伝子(RNA)発現のプロファイルを検討した。現在はデータの解析中である。今後、論文作成予定。2)ACC133^+細胞のNOGマウスへの移植:これまでの検討から、移植後のマウス末梢血におけるヒト由来造血細胞の評価に関して、(1)PNH型血球の評価に当初予定していたCD48モノクローナル抗体(mAb)およびCD59 mAbが採取可能な検体量の関係により、また、(2)各種造血細胞のlineage markerとして通常用いられているmAbがGPIアンカー膜蛋白のために、使用できないことが判明した。このため、健常人およびPNH症例において今回の検討に適切なmAbを検討した。赤血球以外の造血細胞においてCD48 mAbおよびCD59 mAbとFLAERによる評価が正の相関を認めた(Takahashi H, et al.第73回日本血液学会学術集会)ことから、これらの細胞の検討にはFLAERを用いることとした。lineage markerに関しては、現在、検討を加えている。今後、PNH症例および健常人の骨髄由来ACC133^+細胞をNOGマウスへ移植実験を予定している。現在まで、我々はPNH11症例の骨髄細胞よりCD59+AC133+細胞およびCD59- AC133+細胞の分離を行った。これらの細胞よりTotal RNAを抽出し、>14,000 human genesに相当する>22,000プローべセットを用いた、Mano Hら(Blood, 98, 422-427, 2001)がMDSと急性白血病症例を対象として行ったAC133細胞でのDNAマイクロアレイ法にて遺伝子発現の異常性を検索した。昨年の東日本大震災後に、実験機部の破損、実験系の再構築を強いられた。また、当初、今回の検討に予定していた抗体での評価が難しいことが判明し、これらに関しても再検討が必要になった。24年度が最終年度であるため、記入しない。健常人およびPNH骨髄由来ACC133^+細胞をNOGマウスへ移植する。生着後よりマウス末梢血において、CD45mAb、各種lineage markerに対するmAb、およびFLEARを用いた3重免疫染色を行い、フローサイトメトリー法よりphenotypeを検討し、PNHモデルマウスを作成する。その後、WT1ワクチンのPNHクローンに対する効果を検討する。
発光観測と質量スペクトルを併用した反応性プラズマ中のラジカルの検出

プラズマエッチングのメカニズムを明らかにするためには、プロセスガスの初期解離過程および気体中のラジカルを含む反応素過程を調べることが重要である。1.電子衝突による三塩化ホウ素の解離過程:電子衝突による紫外可視発光スペクトルを観測し、励起状態にある生成物の生成過程を調べた。(1)まずスペクトルの観測からB原子とB^+イオンからの発光およびBCl(A-X)バンドを同定し、さらにBCl_2からと思われる250-380と400-530nmのバンドを観測した。(2)各発光種の励起スペクトルは25eV付近にピークを示す。発光のしきい値を測定しB原子の生成には2つの過程があることがわかり、またBCl(A)状態の生成としてはBCl(A)+2Clのみの過程が観測された。(3)B原子の^2D状態は直接生成しているのに対し、^2S状態は直接生成せず、より高い状態からのカスケードによることが、発光寿命の測定からわかった。またBCl(A)状態の発光寿命は文献値と一致した。BCl_2の寿命は光分解による値と矛盾しない値を得た。2.プラズマ中でのラジカルの検出と生成過程:放電プラズマ中でのラジカルやイオンの濃度および減衰を調べるため、Arガス中のハロメタン類のホローカソード放電中での発光スペクトルと質量スペクトルを観測する装置を製作した。CCl_4を用いて、ClやCClの発光を観測した。注目していたCl_2やCCl_2からの発光はブロードなため未だ確認していない。一方、Ar^+やCCl^+の質量スペクトルを観測したが、CCl^+の強度が弱く、反応定数の測定等は行えなかった。今後は、放電をRFあるいはMWにして、装置の改良を行う予定である。
事前情報に基づく統計的推測方式の研究

統計的推測問題において、事前情報を活用する推測方式を導出することは重要な課題の一つである。研究代表者はデータ解析学的立場から、区間で与えられる事前情報のもとでの推測方式を提唱し、それによって得られるMDI(Minimum Discrimination Information)推定量の特性についての研究を行った。平成9年度の研究では、区間事前情報に基づく二項分布を含む指数分布族での母数のMDI推定量と収縮MDI推定量の提案と有効性の研究を行った。つまり区間事前情報に基づくこの推測方式は、Kullback-Leiblerの判別情報関数の条件付き最適化として定式化され、それは区間事前情報の条件の下で判別情報関数を最小にする推定量を求めることである。この推定量の有効性を実証するために平均2乗誤差に基づく効率を計算し、従来の推定量との比較を行った。その結果MDI推定量の有効性が示され、また多くの興味深い知見を得ることができた。また、区間事前情報に基づく2次元正規母集団の母平均ベクトルのMDI推定量の提案と有効性の研究を行った。この研究成果は、1997年12月5日6日に韓国の済州大学で開催された第9回日韓統計会議で発表した。平成10年度の研究では、上記の研究成果をふまえ、収縮技法を取り入れた収縮MDI推定量について研究を行った。これらの研究成果は、1998年12月2日4日にフィリピンのマニラで開催された「The 3rd Conference on Statistical Computing of the Asian Regional Section」において発表した。また、平成10年度より同じ問題に対する2回標本抽出法に基づく推測方式の研究にも取り組んでおり、11年度以降にも継続して研究を行う予定である。研究代表者はデータ解析学の立場から、区間で与えられる事前情報のもとでの推測方式の研究を行った。平成9年度の研究では、区間事前情報に基づく2次元正規母集団の母平均ベクトルのMDI(Minimum discrimination Information)推定量を求めた。つまり区間事前情報に基づく母平均ベクトルの推測方式は、Kullback-Leiblerの判別情報関数の条件付き最適化として定式化され、それは区間事前情報の条件の下で判別情報関数を最小にする推定量を求めることである。その結果MDI推定量の有効性が示された。またこの研究成果をまとめた論文は現在「Bulletin of Informatics and Cybernetics」に投稿中である。平成9年度の研究では、区間事前情報に基づく2次元正規母集団の母平均ベクトルのMDI(Minimum Discrimination Information)推定量を求めた。

またこの研究成果をまとめた論文は「Journal of the Japanese Society of Computational Statistics」に採択され現在印刷中である。平成10年度の研究では、上記の研究成果をふまえ、収縮技法を取り入れた収縮MDI推定量について研究を行った。これらの研究成果は、1998年12月2日4日にフィリピンのマニラで開催された「The 3rd Conference on Statistical Computing of the Asian Regional Section」において発表した。この研究成果をまとめた論文は「Communications in Statistics:Theory and Methods」に現在投稿中である。
テラヘルツ時間分解STMの開発

本研究で開発した時間分解THz-STMはTHzパルスをSTMのトンネル接合に照射し、THzパルスによって誘起された過渡的なトンネル電流を用いて試料の超高速ダイナミクスをピコ秒時間分解能で計測する手法である。これまでの実験結果より、微弱なTHz誘起トンネル電流を高精度に計測するためにはシステム全体の安定化・低ノイズ化を行う必要性が明らかになり、以下の対策を行った。(1)防音ブースを導入しSTMとレーザー光学系を実験室の騒音、空調から隔離することによって光学系の安定化、STMの低ノイズ化を行った。(2) STM探針先端へ照射するレーザースポット位置をリアルタイム制御するシステムを開発。常にレーザースポットの中心を探針先端に来るようにフィードバックすることでレーザースポット位置揺らぎに伴う信号強度の揺らぎを低減した。(3)低ノイズ電流プリアンプの導入これらの対策の結果、安定な時間分解計測が可能になった。セレン化ビスマスを対象とした実験では、赤外パルスによって励起されたホットエレクトロンのダイナミクスの計測に成功した。THz電場強度を連続的に変化させながらTHz誘起トンネル電流を計測することで光誘起された過渡的な電子状態の変化を捉えることに成功した。また2H-テルル化モリブデンとした実験では、赤外パルスによって励起された光キャリアの緩和過程を計測することに成功した。次に、さらなるS/N比向上のためにレーザーの繰り返し周波数の上限を1MHzから50MHzへと引き上げるためにレーザー装置のアップグレードを行った。これまでのシステムの開発・改良によって実際にピコ秒時間分解能で様々な試料の高速ダイナミクスが計測可能になってきており、十分な装置性能を実証することができた。本研究計画の目標としていた装置の開発はほぼ完了しており、順調と判断できる。レーザーの繰り返し周波数の上限を1MHzから50MHzへ高繰り返し化したことに合わせて光学系の最適化を進める。THz発生用の結晶をレーザーによる損傷から守るために結晶冷却装置を開発し、これまでより高強度のパルス光によるTHz発生を可能にし、時間分解THz-STMに適した高強度、高繰り返しのTHzパルス光源が実現する。開発した装置を用いて、2硫化タンタルなどの電荷密度波絶縁体における光誘起相転移ダイナミクスの時間分解イメージングを行い、原子分解能とピコ秒時間分解能を両立した計測の実現を目指す。研究初年度の28年度は新しくフェムト秒レーザーを導入し、LiNbO3結晶を用いたパルス面傾斜法THz発生方式によって、10kV/cmのTHzパルス強度、帯域1THz、1MHzの高い繰り返し周波数のTHzパルス光を作成することに成功した。このようにして発生させた高強度THzパルスと現有の低温超高真空STMを組み合わせることでTHz-STMを開発した。開発した装置を用いて、THzパルス誘起でトンネル電流が増大することが確認できた。またトンネル電圧を印加しない状態でTHz光を照射し、THz誘起電流のみをフィードバック信号としてSTM動作させることによりいグラファイト表面の観察を行った。その結果、通常のSTM像と同様の原子分解能でグラファイト表面の格子像を観察することに成功した。このTHz誘起トンネル電流は、THzパルス電場がトンネル接合に印加されている1ps秒以下の時間スケールでのみ流れることから、超高速領域での試料の電子状態変化を捉えることが可能であり、この結果は、開発した装置がサブピコ秒の時間分解能と原子レベルの空間分解能を両立することを示している。次に光ポンプ-THzプローブ光学系を構築し時間分解計測を行った。InAsやWSe2などの半導体試料を用いて光ポンプにより生成したキャリアのダイナミクスの計測を試みたが、現時点では時間分解信号よりも大きいノイズがトンネル電流に乗っていることが原因で計測はうまくいかなかった。問題となったトンネル電流のノイズは、THz光を照射することで発生することが分かった。ノイズ低減のためには低いTHz強度での実験が必要であり、そのための装置改良対策を検討した。当初の計画では、平成2829年度の2年間で装置開発を行う予定であったが、現時点ですでに装置は完成しており、当初の計画以上に進展しているといえる。完成した装置を用いてすでに測定を開始しているが、最終目標の時間分解計測を実現するために解決しなければならない問題点が明らかとなり、現在装置の改良を進めている。前年度に問題となっていたトンネル電流ノイズとシステムの不安定性を改善するため、平成29年度前半期にシステムの大幅な改定を行った。下記に詳細を示す。1.トンネル電流ノイズの低減THz-STMではTHzパルス照射によって生じる瞬間的なトンネル電流を用いて時間分解計測をするものであるが、この電流量が大きいとSTMトンネル接合が不安定になり試料表面や探針の破壊されるという問題があった。この問題を回避するための対策として、トンネル電流検出回路の低ノイズ化を行い低いトンネル電流条件での測定を可能にした。その結果、長時間安定にTHz電流を検出することが可能になった2.光学システムの最適化時間分解計測では、光パルスをポンプ光、THzパルスをプローブ光として用いる。これまでの光学系では光パルスとTHzパルスをそれぞれ別の角度からSTMトンネル接合に集光し測定を行っていたが、両パルスを同軸にそろえて同じレンズを使用して集光する方式に変えることで、光軸にアライメントを容易にした。これによって精度の高い光軸、スポット位置の調整が可能になった。

上記改善に加えて、探針先端のTHz近接場を光電子を用いて計測する方法を開発し、実際に測定に用いるSTM探針の先端に生じるTHz近接場の計測を行った。さらに時間分解STMを用いた、試料の光励起ダイナミクスにも成功した。Bi2Se3表面では、光励起されたホットエレクトロンのダイナミクスの観察に成功し、1T-TaS2表面では、光誘起相転移のダイナミクスをピコ秒の時間分解能で計測することに成功した。現時点で装置の開発はほぼ完了し、当初目的とした実験に部分的に成功してきており、順調に進展していると判断できる。本研究で開発した時間分解THz-STMはTHzパルスをSTMのトンネル接合に照射し、THzパルスによって誘起された過渡的なトンネル電流を用いて試料の超高速ダイナミクスをピコ秒時間分解能で計測する手法である。これまでの実験結果より、微弱なTHz誘起トンネル電流を高精度に計測するためにはシステム全体の安定化・低ノイズ化を行う必要性が明らかになり、以下の対策を行った。(1)防音ブースを導入しSTMとレーザー光学系を実験室の騒音、空調から隔離することによって光学系の安定化、STMの低ノイズ化を行った。(2) STM探針先端へ照射するレーザースポット位置をリアルタイム制御するシステムを開発。常にレーザースポットの中心を探針先端に来るようにフィードバックすることでレーザースポット位置揺らぎに伴う信号強度の揺らぎを低減した。(3)低ノイズ電流プリアンプの導入これらの対策の結果、安定な時間分解計測が可能になった。セレン化ビスマスを対象とした実験では、赤外パルスによって励起されたホットエレクトロンのダイナミクスの計測に成功した。THz電場強度を連続的に変化させながらTHz誘起トンネル電流を計測することで光誘起された過渡的な電子状態の変化を捉えることに成功した。また2H-テルル化モリブデンとした実験では、赤外パルスによって励起された光キャリアの緩和過程を計測することに成功した。次に、さらなるS/N比向上のためにレーザーの繰り返し周波数の上限を1MHzから50MHzへと引き上げるためにレーザー装置のアップグレードを行った。これまでのシステムの開発・改良によって実際にピコ秒時間分解能で様々な試料の高速ダイナミクスが計測可能になってきており、十分な装置性能を実証することができた。本研究計画の目標としていた装置の開発はほぼ完了しており、順調と判断できる。平成28年度の研究成果より、THzパルス誘起のトンネル電流を観測することができたが、THzパルス強度を強くしていくとトンネル電流にノイズが現れてしまい安定な測定が難しくなることがわかった。さらに、1kV/cmを超える強度のTHzパルスを照射するとSTM探針または試料表面の破壊が起きることが分かった。これらの現象が起こる理由としては、THzパルス印加時にトンネル接合に印加される実効的なTHz電圧が大きく、瞬間的にμAを超える大きなトンネル電流が流れてしまうことが考えられる。そのため、トンネル電流の不安定化や破壊が起きない弱いTHz強度での測定を可能にする必要がある。
マウス胎仔皮膚再生モデルを用いた、皮膚再生遺伝子群の機能解析

皮膚が再生する時期と再生しなくなる時期のマウス胎仔皮膚から、マイクロアレイにより得ることができた、皮膚を再生させる候補遺伝子をin vitro及びin vivoで胎仔皮膚創傷面から消失させることで、これら候補遺伝子の皮溝、皮丘、真皮の癒痕の形成与える影響につき検討した。siRNAを用いた機能解析のスクリーニングのため、マウス胎仔皮膚を用いたin vitroのスクリーニングモデルを開発した。Genechipを用いた皮膚再生を引き起こす候補遺伝子の中で、in vitroおよびin vivoの胎子創傷治癒モデルで、皮膚再生に機能的に作用のあった遺伝子はtwist, fbn1であった。これらをsiRNAにより、成獣マウス創傷部位からノックダウンを行って、癒痕形成、皮溝、皮丘の形成に与える影響を観察した。遺伝子導入は、リポフェクション試薬を用いて行ったが、創傷部位で効果的にノックダウンを行うことが可能であった。その後、成獣の創傷部位でtwist, fbn1のノックダウンを行い、効率的に創傷部位でのノックダウンは行えたが、療痕形成、皮溝、皮丘の形成に作用を及ぼさなかった。また、スキッドマウスの背部での胎仔皮膚再構築モデルを用いて、マウス胎仔真皮間葉系細胞のshh, twist, fbn1のノックダウンを行い、再構築された皮膚の組織学的構造の変化、皮溝、皮丘の形成に与える影響を検討した。その結果、shhのノックダウンで毛包の再構築が抑制され、twistのノックダウンできめの再構築が乱された。胎生期のある時期までは哺乳類の胎仔の皮膚に実験的に傷をつけても、傷は素早くそして瘢痕を残すことなく治癒し、皮膚は完全に元通りに再生する。われわれはこれまでの研究で、胎生13日までのマウス胎仔に傷をつけると皮膚は完全に再生するが、胎生14日以降の胎仔に傷をつけても、皮膚は再生せず傷跡を残すことを発見し、またマウス胎生13日と胎生14日の胎仔につけた創から採取した組織から、DNAマイクロアレイで異なった発現パターンを示す遺伝子を特定した。また、胎仔創傷治癒過程でのこれらの遺伝子が創周囲で過剰発現していることを明らかにした。これらの遺伝子はマウス胎生13日と胎生14日の創傷治癒過程で、同じ発生段階の健常皮膚と比べても発現パターンが急速に切り替わるので、皮膚の完全再生に関与する遺伝子の候補と考えられる(以下、候補遺伝子とする)。本研究では、これら候補遺伝子をin vitro及びin vivoで胎仔皮膚創傷面からsiRNAを用いて発現を減少させることで、これら候補遺伝子の皮溝、皮丘、真皮の瘢痕の形成に与える影響につき検討した。さらに、効果のあった遺伝子に対して、成獣創傷治癒過程で創周囲に過剰発現、または消失させることで、成獣の瘢痕形成にどのような効果を与えるか、皮溝、皮丘の形成に与える影響を含めて検討した。その結果、胎生14日で発現している遺伝子をノックダウンすることで、創傷治癒の遅延が見られ、胎生13日の創傷部位で発現している遺伝子をノックダウンすることで、皮溝、皮丘の乱れが見られたが、現在のところ成獣の急性創傷には明らかな変化はみられないので、検討中である。皮膚が再生する時期と再生しなくなる時期のマウス胎仔皮膚から、マイクロアレイにより得ることができた、皮膚を再生させる候補遺伝子をin vitro及びin vivoで胎仔皮膚創傷面から消失させることで、これら候補遺伝子の皮溝、皮丘、真皮の瘢痕の形成与える影響につき検討した。Genechipを用いた皮膚再生を引き起こす候補遺伝子の中で、in vitroおよびin vivoの胎仔創傷治癒モデルで、皮膚再生に機能的に作用のあった遺伝子はtwist, clu, mmp14であった。平成18年度はこれらをsiRNAにより、成獣マウス創傷部位からノックダウンを行って、瘢痕形成、皮溝、皮丘の形成に与える影響を観察した。

遺伝子導入は、リポフェクション試薬を用いて行ったが、創傷部位で効果的にノックダウンを行うことが可能であった。その後、成獣の創傷部位でtwist, clu, mmp14のノックダウンを行い、効率的に創傷部位でのノックダウンは行えたが、瘢痕形成、皮溝、皮丘の形成に作用を及ぼさなかった。また、スキッドマウスの背部での胎仔皮膚再構築モデルを用いて、マウス胎仔真皮間葉系細胞のshh, twist, clu, mmp14のノックダウンを行い、再構築された皮膚の組織学的構造の変化、皮溝、皮丘の形成に与える影響を検討した。その結果、shhのノックダウンで毛包の再構築が抑制され、twistのノックダウンできめの再構築が乱された。
資産価格を通じた金融危機の伝染・拡大

本研究では、複数の銀行が預金取り付けにあい尚且つ同時にソブリン債がデフォルトに陥る理論的枠組みを構築した。銀行は預金をソブリン債に投資する。預金取り付けが起これば銀行はソブリン債を売却するため、政府がデフォルトに陥る可能性が高まる。これがさらに銀行危機を悪化させる。このような悪循環が存在する中で政府による最後の貸し手(LLR)機能は、支払い可能であるが非流動的な銀行における預金取り付けを防ぐことはできず、むしろ支払い可能であり流動的な銀行までをも預金取り付けに陥らせてしまうことを示した。これらの結果は、国内の政府によるLLRではなく国際的なLLRが必要となることを示唆する。近年における金融危機の重要な一つの側面は、銀行危機と公的債務危機が同時に起こることである。特に、欧州において銀行危機と公的債務危機の間に悪循環が生じていることが、いくつかの実証研究によって指摘されている。本研究では、公的債務危機のもとで複数の銀行が預金取り付けに合う理論的枠組みを構築し、銀行危機と公的債務危機がどのようにして互いに影響しているのかを分析した。より具体的には、すべての銀行がその預金をソブリン債に投資しているモデルを構築し、次のような結果を得た。もし、ある銀行において預金取り付けが起これば、当該の銀行は預金の引き出しに対応するべくソブリン債を政府のもとへ行き換金する。もし政府が十分な税収を得ることができなければ、ソブリン債の償還に伴って政府がデフォルトを起こす危険が高まる。結果として、同じソブリン債に投資している別の銀行において、政府がデフォルトを起こすと預金者に対して返済される額が少なくなり得る。従って、ある銀行で預金が引き出されれば政府がデフォルトを起こす見込みが高まり、その結果、同じ国における別の銀行においても預金が早々に引き出され得る。この別の銀行における引き出しは、ソブリン債の償還をさらにもたらし、政府がデフォルトに陥る危険はますます高まる。これらの過程は延々と続く。さらに、このような理論的枠組みの中で政府による最後の貸し手(LLR)機能の効果について検証した。LLRを実行したところで、返済能力はあるが当面の資金を持ち合わせていない銀行における預金取り付けを防ぐことができない可能性がある。さらに悪いことに、そのような銀行に対する公的資金の注入によって、返済能力があり尚且つ当面の資金を持ち合わせている銀行までをも預金取り付けに陥れさせてしまうことがあることを示した。本研究では、公的債務危機のもとで複数の銀行が預金取り付けにあう理論的枠組みを構築し、銀行危機と公的債務危機がどのようにして互いに影響しているのか、更にいかにして銀行危機が伝染するのかを分析した。より具体的には、すべての銀行がその預金をソブリン債に投資しているモデルを構築した。従って、ある銀行で預金が引き出されれば政府がデフォルトを起こす見込みが高まり、その結果、別の銀行においても預金が早々に引き出され得る。このような枠組みの中で政府による最後の貸し手(LLR)機能の効果について検証した。LLRは、支払い可能であるが非流動的な銀行における預金取り付けを防ぐことができない可能性がある。さらに悪いことに、そのような支払い可能であるが非流動的な銀行に対する公的資金の注入は、支払い可能であり尚且つ流動的な銀行までをも預金取り付けに陥れさせてしまうことがあることを示した。これらの結果は、近年のヨーロッパにおいてみられるような金融危機を考察するにあって有益な示唆を与えるものと考えられる。資産価格を通じた金融危機のモデルを構築し、政策を導き出すという目的は達成された。また、その研究成果は論文にまとめられ、予定よりも早く学会において発表された。public informationを導入するという分析手法は採用しなかったという点において計画が変更されたものの、得られた結果は当初に期待されていたものから大きく乖離することはなかった。政策含意についてより深く考察する。より具体的には、他国への金融危機の伝染を扱い、国際間の資金の融通が危機を防止できるかについての分析をより詳細に行う。今年度は、まとめた論文をEconometric Societyの欧州会合において発表する(発表予定論文は審査に通過している)。最終的には、学術誌へ投稿する。関連する知見を得るために研究会におもむく。次年度の研究費の一部は、そのための旅費にあてる。また、関連書籍・資料を購入するためにも使用する。
ゲノム情報学アプリケーションの自己適応的並列化/最適化に関する研究

ゲノム情報アプリケーションを対象として,PCクラスタ群などの分散システム環境,メタコンピューティング環境上で,ユーザに使い勝手のよいプログラミング環境を提供するとともに,対象計算機システムにあわせて自己適応的に並列/分散化,最適化する手法,ならびに汎用性に優れたソフトウェア基盤を構築し,ゲノム情報アプリケーションの高速化を図ることを目的とする.上記の目的を遂行するために,進め方としては,以下の項目を遂行する.・分散環境におけるプログラミングスタイルとして,共有メモリとメッセージパッシングによるものがある.各々利点/欠点があり,アプリケーションの実行形態に依存する.ゲノム情報アプリケーションにおけるプログラミングスタイル,高速実行などのトレードオフを検討し,ゲノム情報アプリケーションに適したプログラミングスタイルを研究するとともに,その実行環境を構築する.・分散/並列ハードウェア環境にゲノム情報アプリケーションを自己適応させて,ハードウェア能力を最大限に引き出し,かつ,異なる並列/分散ハードウェア環境にも容易に移植できる機構を研究/開発する.今年度は,初年度ということで,下記の研究を行った.(1)ゲノム情報学アプリケーションの分析:分析の結果,並列処理としては,データベースとのマッチングをとるデータ並列処理が基本であることが分かった.(2)共通並列プログラミングモデルの設計:共通プログラミングモデルの一つである分散共有メモリシステムの設計を行った.(3)自己適応的並列化/最適化手法の研究・開発:HMMerを対象として,ヘテロな環境において,ノード性能,ネットワーク性能などを考慮したスケジューリング手法を研究し,その基本的スケジューリング手法の有効性を小規模ヘテロ環境において示した.(4)分散共有メモリの研究開発:分散メモリシステムを開発した.ゲノム情報アプリケーションを対象として,PCクラスタ群などの分散システム環境,メタコンピューティング環境上で,ユーザに使い勝手のよいプログラミング環境を提供するとともに,対象計算機システムにあわせて自己適応的に並列/分散化,最適化する手法,ならびに汎用性に優れたソフトウェア基盤を構築し,ゲノム情報アプリケーションの高速化を図ることを目的とする.上記の目的を遂行するために,進め方としては,以下の項目を遂行する.・分散環境におけるプログラミングスタイルとして,共有メモリとメッセージパッシングによるものがある.各々利点/欠点があり,アプリケーションの実行形態に依存する.ゲノム情報アプリケーションにおけるプログラミングスタイル,高速実行などのトレードオフを検討し,ゲノム情報アプリケーションに適したプログラミングスタイルを研究するとともに,その実行環境を構築する.・分散/並列ハードウェア環境にゲノム情報アプリケーションを自己適応させて,ハードウェア能力を最大限に引き出し,かつ,異なる並列/分散ハードウェア環境にも容易に移植できる機構を研究/開発する.今年度は,初年度ということで,下記の研究を行った.(1)ゲノム情報学アプリケーションの分析:分析の結果,並列処理としては,データベースとのマッチングをとるデータ並列処理が基本であることが分かった.(2)共通並列プログラミングモデルの設計:共通プログラミングモデルの一つである分散共有メモリシステムの設計を行った.(3)自己適応的並列化/最適化手法の研究・開発:HMMerを対象として,ヘテロな環境において,ノード性能,ネットワーク性能などを考慮したスケジューリング手法を研究し,その基本的スケジューリング手法の有効性を小規模ヘテロ環境において示した.(4)分散共有メモリの研究開発:分散メモリシステムを開発した.
概日時計の基本特性「入力・発振・出力」を分子レベルで解き明かす

我々はこれまで、時計タンパク質CLOCKが結合しているゲノム領域をChIP-Seq解析により決定した。本研究では、新しいバイオインフォマティクス技術MOCCSを開発し、時計シスエレメントE-boxの配列モチーフを網羅的に抽出した。このE-boxからのリズミックな出力遺伝子として、Nrf2とNfatc2を報告した。また、時計タンパク質DBPの抗体を作製してChIP-Seq解析を行い、時計シスエレメントD-boxの配列を正確に決定した。さらに、時計因子との相互作用解析から、CLOCKリン酸化酵素CaMKII、BMAL1ユビキチン化酵素UBE3A、CRY脱ユビキチン化酵素USP7などを同定した。CLOCK-BMAL1複合体は時計シスエレメントE-boxに結合して転写リズムを生み出すことにより、時計発振の中心的な役割を担っている。申請者はこれまで、この複合体に着目した研究を展開してCLOCKのリズミックなリン酸化がDNA結合能を低下させるという転写抑制モデルを報告した(MCB, 2009)。さらに、このCLOCK-BMAL1複合体のリン酸化責任キナーゼとしてJNKが概日時計の重要な鍵分子であることを見出した(EMBO Rep, 2012)。本研究では、自作CLOCK抗体を駆使したChIP-Seq解析を行い、CLOCKが結合している約8,000のゲノム領域を網羅的に決定するとともに、RNA-Seq解析により全転写産物の発現プロファイルを正確に記述した。さらにBmal1欠損マウスにおいて、CLOCKのDNA結合は一日を通して低いレベルで維持され、リズミックな転写産物はそのリズム性を失うことを明らかにした。以上の解析により、E-boxの機能的な破綻がCLOCK標的遺伝子のダイナミックな転写産物リズムに与える影響を浮き彫りにし、サーカディアンリズムにおけるE-boxの重要性を示すことができた。本研究ではさらに、新しいバイオインフォマティクス技術MOCCSを開発し、CLOCK-ChIP-SeqのデータをもとにCLOCKが認識するDNAモチーフを網羅的に抽出した。これをもとにルシフェラーゼレポーター解析を行った結果、CLOCKは典型的なE-box配列(CACGTG)に加えて非典型的な配列(CACGNG、CACGTT、CATG[T/C]G)を認識していることが判明した。以上の成果は、英語原著論文としてMol. Cell. Biol.誌に掲載された(Yoshitane et al., 2014)。一方で、E-boxとは異なる時刻に転写産物のピークを作り出す時計シスエレメントとしてD-boxが知られており、bZIP型の転写因子であるDBP(活性化分子)とE4BP4(抑制分子)により転写活性が制御されている。本年度には、D-boxを介した転写の生理的意義に迫るために、E4BP4-KOマウスを用いた解析を展開した。具体的には、この変異マウスを12時間明:12時間暗の明暗サイクルに同調させ、6時間おきにマウス肝臓を単離した。抽出したtoal RNAを超並列型シーケンサーに供してRNA-Seq解析を行い、全転写産物の発現プロファイルを正確に記述した。この結果を同時にサンプリングした野生型マウスの結果を比較することにより、E4bp4欠損によって実際に転写レベルが大きく変化している因子をリストアップした。これと並行して、DBPに対する抗体を新たに自作して定量的なChIP条件を決定した。DBPの発現量が高い夕方と発現量が低い明け方にDBPが結合しているDNA領域を濃縮し、超並列型シーケンサーを駆使したゲノムワイドな解析を展開した。こうして得られたChIP-Seqデータを詳細に解析し、実際に生体内でDBPが結合している2,725のゲノム領域を決定した。このDBP結合領域の情報もとに、R-GADEM法によってDBPが認識するDNA配列を決定した。さらに得られた結果を初年度に開発した新しいバイオインフォマティクス技術MOCCSを用いて、妥当な結果であることを評価した。さらには、初年度に解析を進めたE-boxのChIP-Seqデータとの比較解析により、E-boxとD-boxの2つのシスエレメントの相互連関を明らかにすることができた。本研究費の支援を受けてこれまで、DBPに対する抗体を新たに自作し、DBPの発現量が高い夕方と発現量が低い明け方にChIP-Seq解析を行った。実際に生体内でDBPが結合している2,725のゲノム領域の情報をE4BP4の結合領域の情報と統合し、機能的なD-box配列の決定を試みた。具体的には、初年度に開発したバイオインフォマティクス技術MOCCSをさらに改良することにより目的を達成することができた。これまでのMOCCS解析では、CLOCKが認識する6bpのDNA配列を解析したが、単純にMOCCS解析を8bpのD-boxに適応することはできなかった。そこで、新たに出現頻度をスコアーに組み込むことにより、長い認識配列にも対応できるようになり、DBPとE4BP4によりリズミックに転写制御されるDNA配列を正確に記述することができた。

また本研究では、培養細胞に発現させた時計タンパク質DBPを質量分析に供し、そのリン酸化部位とユビキチン化部位を同定した。また、新たに同定したDBP相互作用分子の中には、リン酸化酵素やE3リガーゼが含まれていた。これと並行して、時計タンパク質CRYの相互作用分子として、脱ユビキチン化酵素USP7とALSの原因因子TDP-43を同定した。TDP-43の過剰発現はCRYを安定化したが、この安定化作用は同時にFBXL3を機能阻害することにより観察されなくなった。これに対してUSP7によるCRYの安定化はFBXL3の機能阻害下でも観察されたため、複数のE3リガーゼによるユビキチン化の全てをリセットする強力な機能を持つと考えられた。我々はこれまで、時計タンパク質CLOCKが結合しているゲノム領域をChIP-Seq解析により決定した。本研究では、新しいバイオインフォマティクス技術MOCCSを開発し、時計シスエレメントE-boxの配列モチーフを網羅的に抽出した。このE-boxからのリズミックな出力遺伝子として、Nrf2とNfatc2を報告した。また、時計タンパク質DBPの抗体を作製してChIP-Seq解析を行い、時計シスエレメントD-boxの配列を正確に決定した。さらに、時計因子との相互作用解析から、CLOCKリン酸化酵素CaMKII、BMAL1ユビキチン化酵素UBE3A、CRY脱ユビキチン化酵素USP7などを同定した。上述したように本年度には計画した全ての実験を実施し、順調に成果を上げることができた。さらに、CLOCKをリン酸化する時計キナーゼとしてCaMKIIを同定し、SCN内の細胞間カップリングが行動リズムを制御する機構を報告した(Genes Dev, 2014a)。また、BMAL1をユビキチン化して分解に導くE3リガーゼとしてUBE3A/E6APを同定した。ヒトパピローマウイルスの感染により異常活性化するこの酵素は、BMAL1を異常分解して体内時計の振動を停止させ、癌の悪性化に寄与する可能性を提唱した(NAR, 2014)。さらに、CLOCKによるリズミックな転写制御を受ける遺伝子のなかでも、酸化ストレスに応答する転写因子Nrf2に着目し、肺の繊維化リスクの時刻依存性を見出した(Genes Dev, 2014b)。このように、当初の計画以上に多くの成果を上げることができた。分子生物学/生化学/時間生物学概日時計の基本特性として、自律的な「振動」を機能的に「出力」することに加えて、その振動位相を外部環境に同調するための「入力」機構が知られている。睡眠覚醒リズムなどを制御する中枢時計は光刺激により強く位相同調し、肝臓などに機能リズムを生み出す末梢時計は食事のタイミングにより強い入力を受ける。申請者は最近、JNKが光刺激により活性化して、外界の明暗情報をダイレクトにCLOCK-BMAL1複合体へと伝達するという時計入力経路を明らかにした(EMBO Rep., 2012)。