hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
魚介類筋肉トロポミオシンの構造特性に関する分子動力学

筋肉トロポミオシン(以下、TMと略記)は単量体あたり、284アミノ酸残基よりなる二量体のタンパク質であり、脊椎動物横紋筋ではトロポニンとともに筋収縮調節を行う。TMの柔軟性および屈曲性は、アクチン結合能および筋収縮調節能に影響を与えるとされている。本研究では分子シミュレーションを用いて、TMの柔軟性及び屈曲性を評価することを目的とした。完全長TMを対象とすると情報量が多くなり、解析が困難になると予想されたので、TMのC末端側断片(190-284残基目)を対象とした。分子シミュレーションソフトはAMBER 10を用い、水分子を明示化する条件で、300Kにおいて20ns行った。本年度は、ウサギTMの一残基変異体であるS229T変異体(229残基目をウサギ型のSerからシログチ型のThrに変異)の分子シミュレーションを行った。S229T変異体の解析により、229残基目の変異によってウサギTM断片の屈曲性及び柔軟性は増大することが示された。さらに、モデリングによって、ウサギ、シログチおよびクルマエビTMの構造の評価を試みた。モデリングの鋳型となる結晶構造(PDB ID 1C1G)は解像度が7Åと低く、そのため二本のαヘリックス鎖間の距離が、TMの部分断片の結晶構造のそれと大きな差異を示した。従ってモデリングの結果から屈曲性や柔軟性を評価するのは不適切と判断した。筋肉トロポミオシンは284アミノ酸残基のサブユニットからなる二量体タンパク質であり、分子のほぼ全長でコイルドコイル構造を形成する。シログチTMをCysl90において2-ニトロ-5-チオシアナト安息香酸により特異的に切断して得られるC末端側断片(Cys190-Ile284)を比較し、ウサギTM由来のものに比べ高い熱安定性をもつことを既に示した。そこで本研究では、シログチおよびウサギTMのC末端側断片をAmber10による300Kにおける20nsの分子シミュレーションにより比較した。ウサギおよびシログチTM断片について、疎水性コア中断部位(Tyr214-Glu218-Tyr221)においてαヘリックス形成確率が低いことが示された。両TM断片は、この部位において屈曲していることが示されたが、ウサギTM断片では250残基付近においても屈曲が認められた。さらに、シログチTM断片の構造の安定性はウサギTM断片と比べて高く、とくに247および252番目のアミノ酸残墓の置換が両断片の安定性の差に大きな影響を及ぼしていることが示唆された。そこで、ウサギTM断片のT247A変異体およびS252T変異体について分子シミュレーションを行った。その結果、置換前の断片と比較して、T247Aではコイルドコイルの屈曲は小さくなり、S252TではArg244付近のαヘリックスを形成する水素結合長が減少することが分かった。今後は両置換がTMの構造安定性に及ぼす影響について検討する。最後に、疎水性コア中断部位の218残基目のグルタミン酸が構造に及ぼす影響を調べるため、E218V変異体を調製して分子シミュレーションを行った。その結果、置換前の断片と比較して、コイルドコイルの直径および屈曲角は小さくなることが示された。無脊椎動物TMに関する研究については、適切な分子シミュレーションの条件等に関して検討中である。
引き抜き損傷血管における血流回復パターンについて

一般に、引き抜き損傷を伴う切断手指再接着では、術後に血栓形成を生じ易く、再接着組織の生着率は極めて低いことが知られている。この原因には、内膜損傷の関与が示唆されてきたが詳細は不明であった。そこで、動脈の引き抜き損傷モデルを作製し、内膜の形態的変化を検討した。その結果、引き抜き損傷では、血管内膜に生ずる全周性の環状亀裂が特徴的に認められた。走査電子顕微鏡を用いた検討より、この亀裂は、内皮細胞層および内弾性板の断裂・剥離であった。さらに、血管形態的特徴よりみた血栓易形成性の原因は、中膜平滑筋層に及ぶ深い亀裂を伴う内膜の広範な弁状剥離である事が判明した(平成8年および9年度の研究結果)。一方、糖尿病による病的血管を対象とする切断手指再接着術では、血管壁の異常によって、術後血管開存率および再接着指の生着率は、さらに低下することが予測されるが詳細な検討は未だ行われていない。OLETFラットは、臨床的に95%以上を占めるインスリン非依存性糖尿病の自然発症モデル動物として近年注目を集めている。そこでわれわれは、このOLETFを動物モデルとした実験を行い、引き抜き損傷が、糖尿病状態における血管に及ぼす影響を検討した。その結果、OLETFを用いた血管引き抜き損傷モデルでは、血流遮断後の血管開存率が著明に低下していた。また、これには、血管壁の伸長性の異常による血栓形成の促進が関与していることが示唆された(平成10年度の研究結果)。微小血管外科の発展とともに切断肢再接着術や血管柄付遊離組織移植術は、広く進歩を遂げ臨床に応用され普及されているが、現在でも幾つかの問題点があり、特に血管吻合後の血栓形成が問題となっている。それに伴い、微小血管外科の臨床および基礎的研究もその問題に対し、研究が盛んに行われており、現在まで光学顕微鏡と電子顕微鏡による吻合後の血管に対する形態学的観察が多く報告され、ほとんどの場合血管壁の構造の変化や吻合部に生じる血栓形成の変化を観察したものである。しかし血栓形成の原因として1.血管壁の障害2.血流の障害3.血液成分の変化すなわちVirchowの3微の3要素が様々な要因で関与しており、これは微小血管吻合においても同様にあてはまるため、血管壁の構造だけでなく、血流の評価も必要なのは事実であるが、いままで血流計による詳細な報告例はなく、また血管壁との比較した報告例はない。そこでわれわれは、血流測定に着目し、超音波トランジット血流計で血流計測をした後すぐ血管を採取して、光学顕微鏡にて吻合部の血流の形態を検討し、各々の吻合部の病態に対し、どのような血流波形を示されるか、パワー・スペクトラルの解析も加えてデーターの解析を行っている。切断指再接着術において,引き抜き損傷が加わった動脈では,術後開存率が著しく低下する。その原因には,内膜損傷の関与が示唆させているが,詳細は未だ不明である。そこで今回,損傷後に生じた内膜の形態変化に着目し,どのような形態的変化が,動脈閉塞に影響を及ぼすか検討を行った。ラットの大腿動脈に,重りの落下力を利用した,血管牽引装置を用いて,無牽引,70g,80g,90g,100gの各5群の引き抜き損傷モデルを作成した。内膜の損傷状態は走査電顕及び光学顕微鏡を用いて観察し,さらに閉塞の有無はトランジットタイム血流計を用いて確認した。その結果,閉塞率は,無牽引群と70g牽引群では0%,80g牽引群は42.9%,90g牽引群で61.3%,100g牽引群では100%であった。形態的変化は,内膜に全周性の亀裂を認め,さらにこの亀裂部分を詳細に観察したところ,内膜の損傷は,断裂,剥離,弁状の3型に分類し得た。

この内膜の形態変化を各牽引群における発生頻度を検討した結果,弁状型の内膜損傷は,70g牽引群で0%,80g牽引群では1.74±1.74%,90g牽引群で1.48±0.48%,100g牽引群では14.55±2.64%で,100g牽引群における弁状型内膜損傷は,他の牽引群と比較して有意に増加していた。動脈の引き抜き損傷では,この弁状型内膜損傷が閉塞に深く関与することが明らかになった。糖尿病による病的血管を対象とする切断手指再接着術では、血管壁の異常によって、術後血管開存率および再接着指の生着率は、さらに低下することが予測されるが詳細な検討は未だ行われていない。OLETFラットは、臨床的に95%以上を占めるインスリン非依存性糖尿病の自然発症モデル動物として近年注目を集めている。そこでわれわれは、このOLETFを動物モデルとした実験を行い、引き抜き損傷が、糖尿病状態における血管に及ぼす影響を検討した。その結果、OLETFを用いた血管引き抜き損傷モデルでは、血流遮断後の血管開存率が著明に低下していた。また、これには、血管壁の伸長性の異常による血栓形成の促進が関与していることが示唆された(平成10年度の研究結果)。
ナノ電気化学顕微鏡を用いた膜輸送のリアルタイム計測

生細胞の界面で生じる膜輸送のメカニズムの解明は、生物学的な知見にとどまらず、ドラックデリバリーや遺伝子導入の高効率化への付与が期待できる。本研究では、ダイナミックに起こる膜輸送を、ナノ電極(半径10-100 nm)をセンサーとして、電流値の変化として捉えた。電気化学測定は、化学物質の拡散現象を定量的に捉えるため、固液界面の物質輸送の評価に大変有効であり、ナノ電極と電極の細胞表面でのポジショニングシステムの開発より、細胞膜界面の輸送過程の定量評価およびタイムラプスイメージングを行った。これまで走査型電気化学顕微鏡(SECM)による膜タンパク質の定量評価として、細胞内へ取り込まれにくい528抗体を利用して癌の増殖と密接なかかわりのある上皮成長因子受容体(EGFR)に酵素を標識してきたが、エンドサイトーシスによる膜表面のEGFRの変化を捉えるため、細胞内へ取り込まれやすい225抗体を利用する。また、これまでアルカリフォスファターゼ(ALP)を標識に用いたが、ALPの検出に利用する電気化学メディエータは細胞膜を透過するため、エンドサイトーシスをモニタリングする際の標識酵素として適切でない。そこでグルコースオキシダーゼ(GOx)を標識抗体に用いる。GOxが生成するH2O2を検出し、エンドサイトーシスに伴うEGFRの減少をモニタリングした。その結果、pH7.4かつメディエータを使用せずに膜タンパク質を電気化学的に計測可能となった。また、SICMに関して、解像度の向上と高速化を試みた。高解像度化に関しては、CO2レーザープラーによるナノピペットの作製条件の検討により、ピペット径の微細化を行い、光学顕微鏡では可視化が困難な直径120 nmのクラスリンピットの可視化に成功した。さらに、高速イメージングに関しては、ピエゾステージやプログラムの改良を行うことで128×128の測定点のイメージングに関して、約10分で測定が可能となった。本システムは、細胞上での局所的な化学物質の検出に大変有効であることがわかり、PC12から放出される神経伝達物質の局所検出にも成功した。本研究では、ダイナミックに起こる膜輸送を、ナノ電極(半径10-100 nm)をセンサーとして、電流値の変化として捉える。電気化学測定は、化学物質の拡散現象を定量的に捉えるため、固液界面の物質輸送の評価に大変有効である。ナノ電極と電極の細胞表面でのポジショニングシステムの開発より、細胞膜界面の輸送過程の定量評価およびタイムラプスイメージングを行っている。これまでの研究で、ブタンガスを利用したカーボンナノ電極と、イオン電流を利用した電極の細胞表面でのポジショニングシステムを搭載したナノ電気化学顕微鏡(nano-SECM)を開発した。カーボンナノ電極に関しては、先端半径が10 nmから6 umほどの電極を再現性高く作成することが可能となった。イオン電流を利用したポジショニングでは、生細胞において50 nmほどの精度での位置制御が可能となった。SECMを利用して、癌の増殖と関係の深い上皮成長因子受容体(EGFR)に関して、抗体を介して酵素を標識し、EGFRの発現状態を可視化した。さらに異なる細胞種に関して、EGFRフローサイトメトリーと同様の発現傾向が見られた。また、細胞の形状を非接触で測定可能な走査型イオンコンダクタンス顕微鏡(SICM)に関して、ピペットを微細化することで解像度を向上させ、細胞外物質を細胞内へ取り込む際に見られる80-120 nmほどの窪みを可視化することに成功した。このことから、光学顕微鏡の分解能を上回る解像度で細胞表面を可視化できた。SECMにより上皮成長因子受容体(EGFR)が細胞内へ取り込まれる様子を可視化するには、EGFRを標識した酵素の位置が細胞膜の内側であるか、外側であるかを明瞭に識別する必要がある。そのため、細胞内へ取り込まれ酵素による生成物の応答が全くなくなる測定系として、細胞膜を透過しないメディエータ(フェロシアン化カリウム)と酵素(グルコースオキシダーゼ)の組み合わせを検討した。標識酵素にグルコースオキシダーゼを利用すると、電極とグルコースオキシダーゼ間で酸化還元サイクルが生じることで電流が増幅され、この増幅度合いは、電極と細胞との距離に依存している。フェロシアン化カリウムをメディエータとして利用した場合、細胞膜を透過しないメディエータは、酵素との反応性が低く、標識酵素からの応答を検出できなかった。そのため、細胞膜を透過するメディエータであるフェロセンメタノールを利用することとした。この場合には、EGFRが細胞表面にある場合と、細胞内にある場合において、明瞭に識別することができた。エンドサイトーシスに伴う細胞表面の形状変化として、SICMによる形状測定を行った。先端開口径が20 nmほどのナノピペットを作成し、80-120 nmであるクラスリン依存型エンドサイトーシスを可視化することに成功した。

また、平成25年度予定していた高速スキャンに関してもソフトやハードに工夫をほどこすことで、従来の半分のイメージング時間5min(128×128ポイント)で行うことを可能とした。当初予定していたnanoSECMによるエンドサイトーシスの可視化に関しては、ほぼ実現することができた。しかし、細胞表面における膜タンパク質の局在化や、発現状態の変化を可視化には、空間分解能、時間分解能に関してさらなら向上が必要である。特にエンドサイトーシスに伴う形状変化に関しては、Imperial College LondonのKorchev教授らが実現した1イメージ8秒(32×32ポイント)を上回る高速走査システムの開発を行う。具体的には、プレスキャンや画像認識から細胞の形状、位置をあらかじめ予測し、測定時間を短縮する。また、EGFRをEGFにより刺激した際に、2量化することが知られているが、この変化を可視化するため、さらなる電極の微細化を行う。さらに、生じる過酸化水素の放出や、細胞内のフォスファターゼ活性の変化に関しても、1本の電極で評価を行う。このことで、細胞表面での形状だけでなく、化学物質の濃度変化をリアルタイムで測定する。初年度計画していたピエゾステージに関して、ソフトウェアの改良や、既存の装置を工夫して利用することで、支出を大幅に抑えることができた。具体的には、プローブをアプローチさせる際に使用するZ方向のピエゾの制御に関して、応答が遅い場合に試料にプローブが衝突してしまうという問題が起こっていた。そこで、これまで一定速度で行っていたアプローチ速度について、フィードバックシグナルを反映させるPI制御を導入した。このことで、比較的応答の遅いピエゾを利用しても、試料にプローブをぶつけることなく、アプローチさせることが可能となった。また、XY方向の移動の際の待ち時間に関しても、ピエゾのチューニングを行うことで高速化を行った。昨年度の繰り越しとなる予算では、SICMのさらなる高速化のためのピエゾシステムの開発や、SECMによるEGFRのエンドサイトーシスによる減少を捉えるための標識酵素、標識法、プローブの制御を行うプログラム、プログラムを実行するFPGAボードの選定に関してさらなる検討を行う。高速化のためのピエゾシステムとしては、Z方向の制御を行うピエゾステージ上に、ピエゾ素子を取り付け、プローブが試料表面に到達した際に、ピエゾ素子をプローブを上昇させる方向へ動かす。このシステムは、Imperial College LondonのKorchev教授らにより、すでにプロトタイプが開発されており、本研究にもこのシステムを導入する。
群上のMarkov-Zariski位相の構造とコンパクト型位相群の収束性質の研究

可換群のMarkov位相とZariski位相が一致することを証明し、可換群のMarkov-Zariski位相の構造を解明した。非可換群のMarkov位相とZariski位相が一致するための必要十分条件を得た。連続体濃度以下の濃度をもつ可換群Gの部分集合があるG上のHausdorff群位相で稠密であるための必要十分条件を得た。また、ねじれない可換群又はdivisible可換群の非可算部分集合についても同様な結果を得た。1.可換群Gの部分集合Aが与えられたとき、AのMarkov-Zariski閉包と位相TにおけるAの閉包は一致するようなG上のprecompact群位相Tを構成した。2.可換群Gの稠密可能な部分集合Aの性質を調べた。特に、Aは可算である場合、AはMarkov-Zariski位相で稠密になるための、必要十分条件を得た。可換群Gの可算部分集合AはGで稠密可能であるための必要十分条件はGの濃度は連続体濃度cのべき常の濃度以下でAのMarkov-Zariski閉包はGと一致することである。4.可換群のBohr位相を用いて、Sigma-コンパクトであるが1つのコンパクト部分集合で生成できない可換群の例を挙げた。1.群Gの部分集合からなる族Sを考える。族Sの濃度が連続体の濃度以下であるとき、Sに属する各集合Aに対して、AのMarkov-Zariski閉包と位相TにおけるAの閉包は一致するようなG上の群位相Tが存在することを証明した。また、(G,T)の完備化はコンパクト位相群になるようなTを構成した。特に、ねじれ群Gの場合、AはMarkov-Zariski位相で稠密になるための、必要十分条件を得た。3.群上のMarkov位相とZariski位相が一致するための、必要十分条件を得た。この条件を用いて、可換群の場合は、Markov位相とZariski位相が一致することを証明した。4.連続選択関数の存在定理(Michael定理)を用いて、局所コンパクト位相群のsuitable setを構成した。1.任意のminimal可換位相群のweightと濃度の関係明確にした。可換自由群上のminimal擬似コンパクト群位相が存在するための必要十分条件を得た。ねじれない可換群上のminimal局所連結な群位相が存在しないことを示した。2. Comfort, Hernandez, Macario, Raczkowski, Trigos-Arrieta氏の問題を解決し、可換コンパクト群GのWeightとGのdetermined部分群の最小の濃度が一致することを示した。この定理を用いて、「コンパクト群Gのすべての稠密な部分群がGをdetermineする場合は、Gは距離付け可能である」という知られている結果の簡単な証明を得た。3.与えられた位相空間Xと位相群Gに対し、XからGへの連続関数全体の集合上に点列収束位相(すなわち、チコノフ積位相)を導入したときの位相群C_p(X,G)の位相的及び代数的な性質を調べた。NSS群(単位群以外の部分群を含まない単位元の開近傍をもつ位相群)に関する概念(TAP群)を導入し、任位のNSS群Gに対し、「G-正規空間Xほ擬似コンパクトであるための必要十分条件はC_p(X,G)はTAP群であること」「G^<^*>-正規空間Xはコンパクトであるための必要十分条件はC_p(X,G)は加算tightnessをもつTAP群であること」を示された。特に、擬似コンパクト性質とコンパクト性質が(G^<^*>-正規空間における)G-同値関係で保たれていることを得た。4.可換群Gの非可算部分集合がG上のある群位相で稠密になるための条件を調べた。特に、Gはねじれない可換群又はdivisible可換群でるとき、必要十分条件を得た。
中枢神経系におけるペリオスチンの発現制御とその役割の解明

ペリオスチンは細胞外マトリックスの構成成分で、骨の分化・再生に関係することが知られている。しかし近年の研究により、ペリオスチンは梗塞などにより損傷を受けた細胞に対して強い増殖および保護作用を有していることが明らかにされてきている。そこで我々は、中枢神経系に対しても同様な保護作用があるのかを検討した。その結果ペリオスチンには、ある程度の神経保護作用があることが明らかになった。ペリオスチンは、損傷を受けた心筋細胞の保護、増殖に深く関わっていることが我々を含む内外のグループにより明らかになってきている。しかしながら、中枢神経系に対するペリオスチンの役割は未だ解明されていない。そこで、我々はラットにおける中大脳動脈閉塞モデルを用いて脳梗塞を作成し、ペリオスチンの発現パターンをin situhybridizationで検討した。その結果、正常脳においては大脳皮質神経細胞に特異的にペリオスチンの発現が認められるが、梗塞3時間後には虚血中心部と虚血周囲部における神経細胞のぺリオスチンの発現が低下し、梗塞24時間後からは虚血中心部においてペリオスチンの発現が徐々に上昇し、14日後にはその発現はピークに達することが分かった。この結果により、中枢神経系においても梗塞領域を中心にペリオスチンが強く発現していることが明らかとなった。心筋梗塞においては、繊維芽細胞がペリオスチンを発現していることが報告されている。しかし、脳組織には髄膜を除いて繊維芽細胞は存在していないことから、心臓とは異なる細胞種がペリオスチンを発現していると考えられる。そこで、脳梗塞後にペリオスチンを強く発現している細胞種の同定を試みた。様々な抗体を用いた検討を行った結果、CD68陽性細胞(マクロファージもしくはミクログリア細胞)が脳梗塞後にペリオスチンを発現していると思われるデータを得た。以上のデータを基にさらに検討を重ねていく予定である。妊娠ラットから胎生17日目の胎児を取り出した後、梗塞においてペリオスチンが強く発現している大脳皮質部分を切り出して酵素処理によって細胞をバラバラした後、培養を行った。その際シャーレには、何もコートなし、アルブミン(negative control)、ファイブロネクチン(positive control)、ペリオスチンをそれぞれコートしておいた。細胞培養開始から3日後に固定し、MAP2抗体で神経細胞を免疫染色し、NIHイメージで画像解析することによって、神経突起伸張作用への影響を検討した。その結果、ペリオスチンをコートしておいた神経細胞では、ある程度の神経突起伸張作用があることが確認できた。さらに、in vivoでの神経突起伸張作用を確認するために、遺伝子操作が簡単なアフリカツメガエルを用いて検討した。そこでまずアフリカツメガエルのペリオスチン遺伝子をクローニングし、ペリオスチンの強発現胚を作製し、神経の形成を観察した。その結果、ある程度の神経の過形成が確認できた。以上より、ペリオスチンは神経への神経突起伸張作用があることが明らかになった。
LSI用高寿命AL薄膜合金の研究

表面保護膜の効果を見積もるために最初に1.6%Mgを含有したAl-Si金属薄膜の表面に通常良く用いられるSiN、又は表面を大気に晒して強制的に酸化膜(MgOやAl_2O_3)を形成した合金膜についてボイドの時間変化と抵抗値変化の関連並びにエレクトロマイグレーション耐性について検討した。その結果、表面保護膜を施したMg含有膜は大きな活性化エネルギーを持つと同時に寿命時間の改善が図れる事が分かった。さらにボイドの増加と深さ方向への広がりが寿命試験中の抵抗値上昇と密接に結び付いている事を確認した。なお、保護膜としえLB膜を堆積した試料については通電試験屮の温度上昇によりLB膜が破壊され、十分な効果が観測出来なかった。Al-Mg-Siの三元合金膜の堆積においてはMg、Si等必要な含有量に対するスパッタ用ターゲットの用意が整い試料となる薄膜の堆積を行った。現在までに基準となるAl-Si膜を始めとして、1.6%、5.2%Mg含有膜の基礎評価を行い寿命時間として一桁以上のエレクトロマイグレーション耐性があることを確認した。またLB膜の堆積については平成6年9月末に搬入が終わった装置を用い、下地をSi基板として特性の評価を行った。その結果、絶縁膜の典型であるSiO_2膜に比べ誘電率はほぼ同等であるが絶縁耐圧は約1/2程度低い値となることが分かった。今後、パタン加工を行ったAl-Mg-Siの三元合金膜の上にLB膜ならびに窒化膜を堆積してより大きなエレクトロマイグレーション耐性の実現へ向けて実験を進める予定である。Al-Mg-Siの三元合金膜の堆積においては、基準となるAl-Si膜を始めとして、1.6%、5.2%Mg含有膜のエレクトロマイグレーション耐性の評価を行い寿命時間として一桁以上のエレクトロマイグレーション耐性があることを確認した。さらに表面保護膜の効果を見積もるために最初に1.6%Mgを含有したAl-Si金属薄膜の表面に通常良く用いられるSiN、又は表面を大気に晒して強制的に酸化膜(MgOやAl_2O_3)を形成した合金膜についてボイドの時間変化と抵抗値変化の関連並びにエレクトロマイグレーション耐性について検討した。なお、保護膜としてLB膜を堆積した試料については通電試験中の温度上昇によりLB膜が破壊され、十分な効果が観測出来なかった。
癌免疫治療におけるタンパク質間相互作用解析に基づいた創薬インターフェースの開発

がん免疫関連遺伝子のアミノ酸配列とその文献情報を網羅したデータベースCancer-related Immunological Gene Database(CIG-DB)を構築した。このデータベースにある論文文献情報を用いてテキストマイニングを行った結果、現在までに報告されているがんに関連する免疫遺伝子の文献は、免疫治療や抗体医薬関連の文献と血液がん関連の文献の二つに大別できることを発見した。この知見に基づいて、がん・免疫関連文献の自動分類アルゴリズムを開発しデータベースの品質を向上させることができた。本データベースは、ウェブ上で一般公開されている(http://www.scchr-cigdb.jp/)また、がん抗原エピトープペプチドを挟んだヒト白血球型抗原(HLA)とT細胞受容体の結合アフィニティを予測することを目的として、まず始めにHLAタンパク質に対するがん抗原エピトープの結合アフィニティおよび立体配座を計算機で推定する「インシリコアッセイ系」を開発した。がん胎児性抗原やメラノーマ抗原などのエピトープ候補に対して、インシリコアッセイ系は従来までの予測手法と比べて高い性能を示した。さらに、他の研究者が簡便に利用できることを目的として、HLAタンパク質に対して任意のエピトープ候補ペプチドの予測アフィニティを自動で取得することができるパイプラインを構築した。平成20年度は、抗体およびT細胞受容体の抗原エピトープ予測システムを構築する最初の段階として、十分な数の対象アミノ酸配列の学習セットを用意し、これをまずは当研究機関の内部で参照できるデータベースにするための作業を行った。具体的には、ヒトおよびマウスにおける免疫関連遺伝子のアノテーション情報を、世界中の主要な免疫学データベースから定期的に自動収集・整理するスクリプトの作成、さらにこれらをMySQLベースで速やかに検索・表示できるような統合データベースにするための種々のスクリプトを作成した。これらの一連のスクリプトをLinuxサーバ上で自動実行することにより、プロトタイプではあるが、免疫関連遺伝子のアミノ酸配列・文献情報および構造データについて、現在世界で最新かつ最大規模となるコレクションを構築することができた。その後、研究計画に記載した外部研究協力者との連携により、この統合データベースをブラウザ上からGUIインターフェースで操作できるように改善し、相同性検索プログラムBLASTや配列アラインメントプログラムCLUSTALWを実装した。さらに立体構造表示プログラムであるJmolをベースに抗体およびT細胞受容体の高次構造を可視化するシステムを搭載した。上記の作業を行う一方で、高性能計算機ワークステーションを用いて、免疫系分子間の相互作用をタンパク質ドッキングの手法によりシミュレーションするシステムの開発に着手した。平成20年度では、遺伝的アルゴリズムに基づいたフリーのドッキングソフトウェアであるAutoDockを抗原エピトープの座標計算のコアとして組み込み、抗体タンパク質とのドッキング精度の検討を行った。その結果、抗体タンパク質による抗原エピトープの認識反応をコンピュータ上で一部再現することに成功した。平成21年度では、前年度に構築したがん・免疫データベースによって収集された論文文献情報を用いて、テキストマイニングを行った。その結果、現在までに報告されているがんに関連する免疫遺伝子の文献は、免疫治療関連の文献と血液がん関連の文献の二つに大別できることを発見した。この知見に基づいて、単語ベクトル間のマハラノビス距離によるがん・免疫関連文献の自動分類アルゴリズムを開発した。分類感度を検証したところ文献全体の約95%が正しく分類され、これによりデータベースの品質を向上させることができた。本データベースは、インターネット上で独自ドメインにて試験的に一般公開されている(http://www.scchrcigdb.jp/)。上記と並行して、がんの免疫療法を見据えた免疫タンパク質のドッキングシミュレーションの検討を行った。がん抗原エピトープペプチドを挟んだヒト白血球型抗原(HLA)とT細胞受容体の結合アフィニティを予測することを目的として、まず始めにHLAタンパク質に対するがん抗原エピトープの結合アフィニティおよび立体配座を計算機で推定する「インシリコアッセイ系」を開発した。次に、日本人の約6割が持っているHLA-A2402アリルに着目し、アフィニティ既知のHLA-A2402拘束性抗原ペプチドセットを用いてインシリコアッセイの予測性能を検証した。検証にはROC解析を用い、米国国立衛生研究所で提供されている一般的なエピトープ予測プログラムBIMASと感度および特異度を比較した。その結果、HLA-A2402タンパク質においては、本課題で開発されたアッセイ手法はBIMASよりも優れていることが示された。

現在は、がん胎児性抗原のエピトープ候補ペプチドに対してインシリコアッセイを行い、臨床応用への可能性を検討している。平成22年度では、最終年度として成果の具体的な取りまとめを行った。がん免疫関連遺伝子のアミノ酸配列とその文献情報を網羅したデータベースCancer-related Immunological Gene Database(CIG-DB、http://www.scchr-cigdb.jp/)の完成版を構築し、国際オンライン学術誌BMC Bioinformaticsにその成果を発表した。また、がん胎児性抗原やメラノーマ抗原などのアミノ酸配列から、米国国立衛生研究所で提供されているエピトープ予測プログラムBIMASのスコアを参考に16ペプチドを選抜し、これらのペプチドに対して(i)HLA A24を発現している培養細胞を用いたMHC安定化アッセイ、および(ii)HLA A24+のがん患者から得られた末梢血単核球を用いたCTL誘導能の検査を行った。これら二つの結果と、前年度で開発されたHLAタンパク質に対するエピトープの結合アフィニティを計算する「インシリコアッセイ系」からの予測結果を比較したところ、インシリコアッセイ系の結果はBIMASのスコアに比べてCTL誘導能との相関は同程度であったが、MHC安定化能に関してはBIMASスコアよりも高い相関を示した。この成果はCancerScience誌に発表された。さらに、他の研究者が簡便に利用できることを目的として、HLA A24とHLA A2タンパク質に対して任意のエピトープ候補ペプチドの予測アフィニティを自動で取得することができるパイプラインを構築した。これにより本年度でインシリコアッセイ系のインターフェースのプロトタイプが完成し、静岡がんセンター研究所において試験的運用を開始した。
戦後日本のデザイン論における標準化への視座

本研究の目的は、「標準化」が戦後のデザイン論の文脈のなかでどのように語られたかを、勝見勝(1909-1983年)の特に1960年代までの言説を手がかりに明らかにすることである。本研究では、おもに二つの方法をとった。i)勝見勝の言説に基づくアプローチ、ii)「標準化」の概念史的アプローチ勝見による標準化の意味を明らかにするために、まず、i)に即し、研究をすすめた。資料として勝見勝の著作集、編著書および雑誌(『工芸ニュース』『芸術新潮』『アトリエ』『美術手帖』『美育文化』『リビング・デザイン』など)、新聞記事を収集し、それらをもとに、標準化が勝見のデザイン論全体にどのようなに位置づけられるかを考察した。本年は基礎研究として、特に勝見の「生活」、「様式」、「趣味」という言説に着目し、勝見のデザイン論におけるそれらの意味を整理した。その結果、勝見の標準化への視座が、それらの言説と密接に関わっており、今後さらに勝見のいう「総合」という視点から標準化について考察する必要があることがわかった。研究成果は論文としてまとめ、桑沢デザイン研究所の紀要である『研究レポートNo. 43』(2016年)に投稿した(論文標題「「生活」からみる勝見勝のデザイン論-戦後の民藝運動批判、デザイン批判を手がかりに-」)。次に、ii)に即し、戦後の標準化事業の流れやデザイン関連雑誌での標準化の扱われ方を照らし合わせ共時的に位置づけ、標準化が戦後のデザイン論、特に1950年代のデザイン批判の文脈で語られる際にどのような意味を持ち得たかを考察した。研究成果は、前述の論文「「生活」からみる勝見勝のデザイン論-戦後の民藝運動批判、デザイン批判を手がかりに-」の一部として発表した。
多値位相変調光信号の伝送制御と信号再生

1.信号の位相情報を乱さずに振幅揺らぎを除去する位相保持振幅制限器について、出力信号の位相雑音解析を行った。理論的な検討の結果、入力信号の振幅雑音がファイバ中の自己位相変調効果を介して出力信号の位相雑音を発生させる一方、ポンプ光の振幅雑音がファイバ中の相互位相変調効果を介して出力信号の位相雑音を発生させることを示した。これら効果により、出力信号の位相雑音を最小にする最適なポンプ光電力が存在することを明らかにした。また、波長が異なる2チャネルのDPSK信号に対して位相保持振幅制限と非線形位相雑音抑圧の実験を行い、多波長信号の同時処理の可能性について調べた。2.信号の位相揺らぎ(シンボル間の位相差の揺らぎ)を積極的に低減する位相情報再生の実験を行った。本信号再生器においては、入力位相変調信号を遅延干渉計により強度変調信号に変換してから雑音除去操作を行う。雑音除去は高非線形ファイバ中の自己位相変調効果を利用する方式を用いた。2スパン伝送系のほぼ中間点に信号再生器を挿入し、受信端におけるビット誤り率を毎秒10ギガビットの速度で測定する実験を行った。再生器に入力される前の信号が、伝送路の非線形効果により劣化する場合と、自然放出雑音の重畳により劣化する場合の2通りについて測定を行い、本再生器は前者の信号劣化に対してより大きな特性改善の効果をもつことを明らかにした。位相変調光信号の品質劣化を抑制する方法関して次の研究を行った。1.ファイバ中の四光波混合の飽和を利用した振幅制限器の振幅雑音除去特性を測定した。繰り返し周波数10GHz、パルス幅約7psのパルス列を用いた実験により、広い範囲の光信号対雑音比をもつ入力信号に対して振幅雑音除去が可能であることを確認した。2.シンボル速度が10GS/sの差動4値位相変調信号を生成し、上記の振幅制限器を通した後に40または56kmのファイバ伝送路を伝送させる実験を行った。その結果、振幅再生器を通した後に伝送せると、振幅揺らぎを原因とする位相雑音(非線形位相雑音)が大幅に低減され、ビット誤り率を下げることができる、または、伝送信号の電力を大きくすることができることを実証した。3.差動位相変調信号を遅延干渉計によりオンオフ信号に変換してから振幅再生を行い、再び位相変調信号に変換する再生方式の実験を行った。この方式の位相変調信号再生器においては、オンオフ信号の振幅雑音を強く低減する再生器の利用が必須になる。そのために、1本の高非線系ファイバを折返しで利用する双方向型信号再生方式を考案し、この振幅再生器を2段縦続に接続して振幅再生実験を行った。計4回の信号再生によりオンオフ信号の振幅雑音を大幅に除去することができた。また、この振幅再生器を用いて、RZ-DPSK信号からNRZ-DPSK信号への変換を行った。4.複数波長チャネルの光信号を1つの非線形媒体を用いて同時に信号再生する方式について考察を行った。四波混合の飽和の際のポンプ光デプレションが重ならないようにパルス例のタイミングを調節することにより、2波長信号の同時再生が可能であることを示した。
アルギン酸加熱分解物を利用した植物細胞による有用物質の高速度生産法の開発

オートクレーブ滅菌(加熱処理)によりアルギン酸から生成する加熱分解物が植物細胞の生理活性に及ぼす影響を調べた結果、細胞の増殖をわずかに阻害したが、種々の酵素の生産を促進した。加熱分解物を解析した結果、その中で、trans-4,5-dihydroxy-2 cyclopenten-1-one(DHCP)が高いエリシター活性を示すことが明らかとなった。また、加熱処理によるDHCPの生成効率は低分子のウロン酸(モノガラクチュロン酸など)ほど高かった。DHCPと活性酸素種の消去剤を混合して植物細胞に作用させた結果、細胞の増殖阻害なしに、酵素の生産を促進させることができた。また、DHCPはアルギン酸(内在性エリシター)と最適な濃度で組み合せて使用することにより、エリシター活性が相乗的に高まった。本研究でこれまでに得られた知見を基に、内在性エリシター(アルギン酸)、外来性エリシター(バクテリア,カビ,酵母など)および加熱分解物を組み合せた高活性エリシターの開発を試みた。外来性エリシターを種々検討した結果、アルギン酸分解菌(Alteromonas sp.)調整物が高いエリシター活性を示した。アルギン酸オリゴマーとAlteromonasを混合してニチニチ草細胞に作用させると、5'-Phosphodiesterase (5'-PDase)が相加的に増大し、コントロールの約18倍の生産性を示した。Alteromonasをアルギン酸を栄養源として培養することで、アルギン酸を低分子に分解し、この混合物をDHCPが効率的に生成する条件(121°C,pH2.0,2時間)で加熱処理を行い、アルギン酸混合エリシター(AMIX)を作製した。AMIXをニチニチ草細胞に作用させた結果、5'-PDaseの生産性はコントロールの約120倍に増大した。また、AMIXはブドウ細胞の色素生産に対しても促進効果を示した。最後に2年間の研究総括を行った。アルギン酸をニチニチ草細胞に作用させると、5′-Phosphodiesterase(5′-P Dase)などの抗菌酵素やアルカロイドの生産が促進された。アルギン酸とエリシター活性を有する種々の天然多糖類と比較検討した結果、アルギン酸はガラクチュロン酸と高い類似生を示し、内在性のエリシター様物質であることが明らかとなった。アルギン酸にはポリマーとオリゴマーがあり、約数百200万と広い分子量分布を有しており、アルギン酸をオートクレーブ滅菌するとポリマーが分解し、オリゴマーの量が増大すると伴にアルギン酸以外の加熱分解(分子量100以下)が新たに生成することが明かとなった。アルギン酸のオリゴマー(分子量1,0004,000)はポリマー(分子量4,000以上)に比べて高いエリシター活性を示した。また、ウロン酸であるアルギン酸に特有のカルボキシル基の電荷が、エリシター活性の発現に重要な役割を果たしていることを明かにした。蛍光標識したアルギン酸を作製し検討した結果、アルギン酸が植物細胞の細胞膜だけでなく原形質にまで到達していることが明かとなった。オートクレーブ滅菌によりアルギン酸から生じる加熱分解物の効果を調べた結果、植物細胞の酵素生産を促進させる効果があることを明かにした。分析の結果、加熱分解物の中で特に、(trans)-4,5-dihydroxy-2 cyclopenten-1-one(DHCP)が強い活性を有することが明かとなった。さらに、DHCPはウロン酸系の糖から生成することを明かにし、その最適生成条件として、pH2,121°C,2hを設定した。以上の結果よりアルギン酸ポリマー、オリゴマーおよび加熱分解物いずれもが植物細胞の有用物質生産促進効果を有することが明かとなった。得られた知見を基に、アルギン酸オリゴマーおよび加熱分解物を適切な濃度で組み合せてニチニチ草細胞に作用させた結果、無添加に比べ60倍高い5′-P Dase生産性を示した。

Alteromonasをアルギン酸を栄養源として培養することで、アルギン酸を低分子に分解し、この混合物をDHCPが効率的に生成する条件(121°C,pH2.0,2時間)で加熱処理を行い、アルギン酸混合エリシター(AMIX)を作製した。AMIXをニチニチ草細胞に作用させた結果、5'-PDaseの生産性はコントロールの約120倍に増大した。また、AMIXはブドウ細胞の色素生産に対しても促進効果を示した。最後に2年間の研究総括を行った。
鉛基合金/一酸化鉛/二酸化鉛固体電池の起電力発現に及ぼす合金元素の作用

PbOを電解質とした新型固体電池の可能性を探るため、熱処理法あるいは電解法によりPb-Me系合金(Me:Ag、Sn、BiおよびSb)上に固体電解質PbOを生成させた固体電池を構成し、起電力発現に及ぼす合金元素の影響を調査した。得られた結果は以下のように要約できる。1.正極活物質であるPbO_2とPb基合金を圧着し熱処理を施した電池の起電力は、最高でも数mV程度しかなく、実用電池としてはきわめて不充分であった。これに対し、電解によってPbO_2をPb基合金上に生成させて熱処理をした電池の起電力は、圧着法に比較して高い値を示した。特に、純Pbを負極材料とした電池を熱処理し、333Kに保持した際の起電力は670mVに達した。この電極では、電解生成物PbO_2と素地金属Pbとの界面に固体電解質PbO層が存在し、引き続く熱処理によってこの層が成長することが、交流インピーダンス法ならびにX線光電子分光法によって確認できた。ところが、Pb基合金中のAgおよびSnについては、固体電解質PbOの生成を阻害する傾向が認められ、電池起電力はこれらを合金化することで急激に低下した。2.電解法によって作製したPb-Bi系合金およびPb-Sb系合金電池の起電力は、Pb-Ag系合金およびPb-Sn系合金電池のそれよりも数オーダー高い値を示した。例えば、0.0023mass%Sb-Pb合金電池は、熱処理前室温の状態で既に150mVの起電力を示し、実用電池としての利用が期待できた。この現象は、固体電解質PbO中にPb^<2+>イオンとは原子価の異なるBi^<3+>イオンあるいはSb^<3+>イオンがドーピングされたために起こるものであり、O^<2->イオン空孔の増大に伴うイオン輸率の上昇と解釈できる。従って、起電力発現には、単に固体電解質PbOを生成させるだけではなく、そのイオン輸率を上昇させることがきわめて重要である。
腫瘍溶解能を増強した選択的抗腫瘍レオウイルスによる癌治療法の開発

哺乳類レオウイルス(MRV)は、腫瘍溶解性ウイルスとして、新規癌治療法への開発が期待されている。我々はMRV粒子表面に位置するSigma1タンパク質にインテグリン結合能を有するRGD配列を付加した遺伝子組換えMRVを作製したところ、野生型MRVに抵抗性を示す癌細胞への感染性が向上した。このRGD-MRVを用いて担癌マウスモデルにおける腫瘍溶解能を調べたが、野生型MRVと有意な差は得られなかった。すなわち、in vitroにおいて野生型MRVに抵抗性であった癌細胞が、マウス皮下に移植することで感受性を示すことが明らかとなり、今後の実験を進める上で、有用な知見が得られた。哺乳類オルソレオウイルス(以下MRV)は様々な癌に対して優れた殺腫瘍活性を示すことから、腫瘍溶解性ウイルスとして、癌治療への医薬品応用が有望視されている。本研究は、MRVの遺伝子改変技術を利用することで、より治療効果の高い腫瘍溶解性ウイルスベクターの開発研究を目的とする。我々はこれまでにMRV外層タンパクであるSigma1にインテグリン結合能を有するRGD配列を挿入した組換えMRVを作製し、一部の癌細胞において顕著な感染性の向上を認めていた。今年度はこのRGD-MRVを用いてさらに効果の認められる癌細胞を探索するため、60種類のヒト癌細胞について詳細に検討したところ、6種類のがん細胞に於いてRGDを付加することによる腫瘍溶解能の向上が認められた。さらにこれらのがん細胞を用いてRGD配列の挿入箇所の検討を行ったところ、sigma1の表面に位置する4か所のループ構造のうち2か所がRGDの挿入箇所として適切であることが明らかとなった。その他のループ構造へのRGD配列の挿入は、効果が弱いか、本来のsigma1が持つ細胞受容体への結合能を阻害することが明らかとなった。また、より強い腫瘍溶解能を得る目的で、複数のループ構造へのRGD配列の挿入を試みたが、いずれの組み合わせに於いてもRGDの挿入効果は認められず、組合せによっては本来の感染性を阻害することが明らかとなった。このRGD-MRVを用いたin vivoでの腫瘍溶解能を検討するため、in vitroでRGD-MRVに感受性を示したヒト癌細胞のヌードマウスへの定着能を検討したところ、定着能の高い癌細胞を見出した。現在マウスへの移植を行っており、今後in vivoでの実験を行う予定である。初年度の研究計画として1)RGD挿入箇所の検討、2)RGD-MRVのin vivoにおける抗腫瘍効果の検討、3)Sigma1タンパクにランダムペプチドライブラリーを挿入した組換えMRVの作製、4)抗腫瘍因子を搭載したMRVの作製を予定していた。(1)についてはRGDの挿入可能箇所としてsigma1タンパクの表面にある4か所のループ構造へRGDを挿入した組換えMRVを作製し、RGDペプチドの最適な挿入箇所の選定を行った。さらに複数個所へのRGD配列の挿入も試み、RGD効果の増強作用についての検討を行った結果、特定のループ構造への単数のRGD配列の挿入が最も高い抗腫瘍活性が得られることが明らかとなった。2)については、RGD-MRVに高い感受性を示したヒト癌細胞株を用いてヌードマウスへの定着能を検討し、グリオーマ由来癌細胞株がin vivoでの実験に適していることが明らかとなった。現在マウスへの移植を進めており、定着後、RGD-MRVで処置し、in vivoでの抗腫瘍活性を測定する。3)については、ウイルス作製のためのランダムペプチドを挿入したsigma1遺伝子ライブラリーを作製した。得られたライブラリーの配列を確認したところ、該当箇所にいずれも異なるランダムな塩基配列が挿入されていた。現在このライブラリーを用いたウイルス作製を行っており、MRV抵抗性のがん細胞で感染継代することで、癌細胞特異的に感染する組換えMRVを得る予定である。4)抗腫瘍因子として知られているマウスCSF2を発現するMRVの作製を行った。得られたウイルスMRV-CSF2は外来遺伝子としてL1遺伝子の上流に挿入したマウス由来CSF2遺伝を保持していたが、ウイルス感染細胞においてCSF2活性が認められなかった。現在挿入法の再検討を行っており、CSF2を十分に発現する組換えMRVの作製を試みている。昨年度はsigmaC表面露出部へのRGD配列挿入部位の最適化を行い、in vitroでの不死化がん細胞に対する殺腫瘍効果の検討を行った。今年度は癌細胞をマウス皮下に移植した担癌マウスモデルを用いてin vivoにおけるRGD付加配列の殺腫瘍効果に対する影響を調べたが、野生型MRVと有意な差は得られなかった。予想外ではあったが、in vitroにおいて野生型MRVに抵抗性であった癌細胞がマウス皮下に移植することで感受性を示した。癌細胞は2次元培養と3次元培養とで細胞の状態が変化し、抗癌剤に対する感受性が変化することが知られている。本研究結果は、癌細胞がin vitro(2次元)とin vivo(3次元)でMRVに対する感受性が異なることを示しており、今後の腫瘍溶解性MRVの研究に大きく影響することと思われる。

一方、MRVと同様に癌治療への応用研究がされているアデノウイルスにおいては、RGD配列を付加した組換えウイルスが担癌マウスおよびヒト自然発生癌に対して顕著な効果を挙げている事から、RGD付加MRVにおいても引き続き検討を行いたいと考えている。哺乳類レオウイルス(MRV)は、腫瘍溶解性ウイルスとして、新規癌治療法への開発が期待されている。我々はMRV粒子表面に位置するSigma1タンパク質にインテグリン結合能を有するRGD配列を付加した遺伝子組換えMRVを作製したところ、野生型MRVに抵抗性を示す癌細胞への感染性が向上した。このRGD-MRVを用いて担癌マウスモデルにおける腫瘍溶解能を調べたが、野生型MRVと有意な差は得られなかった。すなわち、in vitroにおいて野生型MRVに抵抗性であった癌細胞が、マウス皮下に移植することで感受性を示すことが明らかとなり、今後の実験を進める上で、有用な知見が得られた。今年度は腫瘍溶解能が向上したRGD-MRVの作製に成功した。これまでin vitroでは野生型MRVに抵抗性のがん細胞に対し非常に効果的に抗腫瘍活性を示していることから、次年度はヌードマウスへ癌細胞を移植した担癌マウスを用いたin vivoでの抗腫瘍効果についての検討を行う。またRGDがインテグリンに対し親和性を示すため、RGDを付加することによる非特異的な感染が懸念されることから、RGD-MRVのマウスに対する病原性の検討も同時に行う。またRGDの挿入箇所として顕著な効果を示したsigma1のループ構造にランダムなペプチドライブラリーを挿入したMRVライブラリーを作製し、野生型MRVに抵抗性の癌細胞で感染継代することで、抵抗性癌細胞特異的に感染性を示す組換えMRVの作製を行う。RGD感受性細胞を探索する過程で、多数のMRV抵抗性癌細胞を同定しており、複数の癌細胞種を使用することでそれぞれに特異的な親和性を示すペプチド配列が同定されると予想される。癌免疫の増強因子と知られるマウスCSF2(ヒトGM-CSFと同等)を挿入したMRV-CSF2を作製したものの、CSF2の発現が確認できなかった。同様の方法により外来遺伝子として挿入したNLucルシフェラーゼは高い発現が確認できていることから、何らかの理由(ウイルス遺伝子とCSF2の塩基配列の相互作用等)により外来遺伝子の発現が抑制されていることが予想された。今後外来遺伝子の前後にウイルス遺伝子をより多く配置するなどして、発現量の最適化を検討する予定である。同時にIL-12などその他の癌免疫増強因子についても挿入を試みる。ウイルス学平成28年度は、すでに得られていたレポーターRGDウイルスをもとに改良型のRGD-MRV作製を行った。すでに組換えウイルス作製法と癌細胞のスクリーニング法が確立されていたため、予定より予算の消化が少なくなった。またマウスでの実験では癌細胞の定着試験のみを行い、ウイルスを用いた本試験を行わなかったため、こちらも予定していた予算を次年度に繰り越すことになった。
水酸化カルシウムによる歯髄・歯周組織の治癒機転に関する研究

水酸化カルシウムCa(OH)^2は歯髄や歯周組織の病態に対する治療薬として用いられており、近年根管治療薬としての利用が注目されている。根管治療薬は、狭い根管内でも貼薬および除去操作が容易であることが望ましいが、Ca(OH)^2粉末を蒸留水や生理食塩水で練和したペーストは展延性に乏しく、貼薬操作が煩雑である。欧米ではセルロース等を添加し操作性を改良した既製品が市販されている。プロピレングリコールやグリセリンと練和したCa(OH)^2ペーストは、その操作性が良好であることが報告されている(LAWS 1962,RIVERA & WILLIAMS 1994)が、担体によりペーストの操作性や抗菌性がどのように変化するか比較検討されていない。臨床で、根尖周囲にX線透過像を有するものの自覚症状のない感染根管、および外傷により露髄、感染し、根尖部に歯周膿瘍を形成した根管を扱う機会に恵まれ、好気培養で5種の細菌を分離継代することに成功した。本研究ではこれらの細菌を用い、生理食塩水、プロピレングリコール、グリセリンを担体としたCa(OH)^2ペーストの抗菌性を寒天培地上の阻止円の大きさにより比較した。その結果、同一粉液比(Ca(OH)^2粉末1.0g:液0.6ml)で調製したペーストは、担体の種類によらず、全ての細菌に対しほぼ等しい直径の阻止円を形成した。各担体によりペーストの稠度が異なるため、操作性の良好な稠度における抗菌性を比較したり、嫌気性菌に対する抗菌性の有無など今後検討する必要がある。さらに、歯髄由来細胞や歯周組織由来細胞に対する影響など、細胞レベルでの組織の治癒機転の解明を図らなければならない。
脳回転状脈絡綱膜萎縮症の病態と治療に関する分子生物学的,生化学的研究

脳回転状脈絡綱膜萎縮症患者線維芽細胞を用い、本疾患の欠損酵素であるオルニチン・アミノトランスフェ-ラ-ゼ(以下OAT)の遺伝子異常を分子生物学的手法を用い解析した。まずヒトOATcDNAを分離し、その塩基配例を決定した。これをプロ-ブとして用い、患者DNAおよびRNAをサザン・ブロット法、ノ-ザンブロット法にて分析した。その結果、一例において、構造遺伝子の比較的大きな部分欠損が認められた。しかし、残りの例では正常と比較して差を認めることができず、点突然変異などの微細な遺伝子異常による酵素活性の低下の可能性が示された。このため次に、患者より異常OATcDNAを分離して、その塩基配例を決定してみたところ、コドン319のCAT(ヒスチジン)がTAT(チロシン)に変っている点突然変異が認められた。またこの点突然変異がOAT酵素の発現にどのような変化をもたらすかを検討したところ、転写と翻訳は正常に行われていたが、翻訳されたOAT蛋白質がミトコンドリア内に運ばれ成熟する過程が正常に働かず、酵素活性が発現しないことが判明した。さらにPCR法を用いコドン326(アスパラギンガリジンに変化)の点突然変異など他の点突然変異を明らかにしており、その機能異常を解析中である。また一方において免疫組織学的手法を用いてOATの正常眼における局在を検討した。抵体はヒトOATを精製し、ウザギを免疫作製した。これを用いてABC法にてOATの局在を検討した。その結果、綱膜では神経節細胞、一部のアマクリン細胞に反応が強く認められ、これら細胞におけるOATの重要性が示された。先ず脳回転状脈絡網膜萎縮症患者から、線維芽細胞を培養し、その細胞糸を維持して、のちの遺伝子の分析等に使用できるようにした。次にこれらの患者達の線維芽細胞を用い、本疾患の欠損酵素であるオルニチン・アミノトランスフェラ-ゼ(OAT)に対し、分子生物学的手法によりその分析を試みた。まずサザン・ブロットによるDNA,ノ-ザンブロットによるRNAの分析では、ほとんどの例で、正常ヒトとの比較において差が認められず、点異常などの微細な遺伝子の異常によるものではないかと思われた。しかし一例において構造遺伝子の比較的大きな部分欠損が認められ、遺伝子レベルでの本疾患の多様性を示すことができた。次に免疫組織学的手法を用いて欠損酵素であるOATの正常眼における局在を検討した。抗体はヒトOATを精製し、ウサギを用いて作製した。これを用いてABC法を行った。その結果、ヒト眼内におけるOATの局在は、網膜では神経節細胞、一部のアマクリン細胞に反応が認められ、他に水晶体上皮細胞、毛様体無色素上皮細胞に反応が認められた。色素のある脈絡膜、網膜色素上皮細胞、毛様体色素上皮細胞、虹彩では、色素のため判別困難であった。以上の結果は一部ラットを用いた結果と異なっており、ヒト眼における研究の重要性と、これら眼組織におけるOATの重要性が示された。OATを介してのオルニチン代謝の重要性を調べる目的で、グルタミン酸、プロリンに対する抗体を作製中である。脳回転状脈絡網膜萎縮症患者線維芽細胞を用い、本疾患の欠損酵素であるオルニチン・アミノトランスフェラ-ゼ(以下OAT)の遺伝子異常を分子生物学的手法を用い解析した。まずヒトOATCDNAを分離し、その塩基配例を決定した。これをプロ-ブとして用い、患者DNAおよびRNAをサザン・ブロット法,ノ-ザンブロット法にて分析した。その結果,一例において構造遺伝子の比較的大きな部分欠損が認められた。しかし残りの例では正常と比較して差を認めることができず、点突然変異などの微細な遺伝子異常による酵素活性の低下の可能性が示された。