hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
まばたき、まばたかれるロボットの目：まばたきを通じた情動の表現と認識

人間同士のインタラクションでは表情、視線、身振りなどの非言語行動が重要な役割を果たしている。そこで、人間とロボットのインタラクションにおいても非言語行動を有効に利用しようという研究が行われている。しかし、これまでは、人間が目で見て、意識的に解釈できる非言語行動しか対象にしていなかった。しかし、人間には無意識のうちに行動し、また他者のその行動に対して無意識のうちに反応したり、感覚的な情報を得たりするものがある。このような無意識の行動は、その人の本当の気持ちを表すものであり、それを利用すれば人間と適切に対応できるロボットが実現できると期待される。本研究では、そのような行動として「まばたき」を検討する。人間のまばたきから感情状況を推定し、適切にまばたきを行い対話を活性化するロボットを開発する。また、その応用として会話時のまばたきから認知症者の感情表出の指標が得られないか検討する。平成30年度は、前年度に引き続き、ロボットのまばたきに対して人間のまばたきが人間同士の場合と同様に同期して生じるか、また、ロボットが人間に同期してまばたきをするのと等間隔でまばたきするのでは、ロボットに対して印象の違いがあるかを、被験者を増やして実験を行った。前者の同期現象は確認されたが、後者については明確な結論は得られなかった。また、これも前年度に引き続き、高齢者介護施設でロボットと対話するときの高齢者の顔画像を収集した。感情状況をまばたきだけから推定するのではなく、心拍数や表情と組合せた方がより確実に推定できると考え、画像からそれらの情報を得る方法を検討した。相手のまばたきを検出して、それに応じてまばたきをするロボットの開発などシステム開発の面では順調に進んでいる。しかし、まばたきの効果に対する検証については、被験者を増やし、条件設定もいろいろと検討して実験を進めているが、やはりまばたきのような無意識的な行動に対する反応は微妙であり、論文として発表できるような統計的に有意な結果はあまり得られていない。このように、得られた学術的成果という点では、順調とは言えない面もあるが、研究への取り組みや実験システムの開発は計画に沿って進められているので、おおむね順調に進展していると評価する。研究課題の提案のときには、1適切にまばたきをするロボットの開発、2人のまばたきからの感情状況の推定とそれを利用したインタラクションの活性化、3認知症者の感情表出の指標の基礎検討、の3つを研究目的としてあげた。1については、ロボットのまばたきにより人間同士と同様のまばたきの反応が得られることは確認できた。ただし、人間のようにまばたきするロボットが好印象という結果は得られていない。これについては実験法を検討して引き続き実験を行う。2については、研究課題の提案のときにも心拍数や表情との併用を検討するとしたが、やはりまばたきだけでは困難ということが分かってきたので、すでに前年度から検討を始めているが、画像から得られる複数の情報を利用して、目的を達成することを検討する。3については高齢者介護施設でロボットとの会話の際の画像データはすでに収集しているが、1、2について確定した成果がまだまとまっていない状況なので、本研究課題の期間では、感情表出の指標の提案までは行かず、収集したデータに処理法を適用し、可能性を検討するところまで進めることを目指す。平成29年度は、初期の実験用として、指示したタイミングだけではなく、ビデオカメラの画像から対話の相手のまばたきを検出し、それに応じてまばたきをすることもできる液晶ディスプレイ上のエージェントを開発した。これを用いて、エージェントに従来研究で分かっている人間のまばたきするタイミングでまばたきをさせたとき、それを見た人間が、人間の話者の場合と同様に、エージェントのまばたきに同期してまばたきを行う引き込みが起こることを確認した。逆に、人間にエージェントに話をしてもらい、そのときにエージェントが一定間隔でまばたきする場合と、話し手のまばたきを検出してそれに同期してまばたきを行う場合の2つについて人間の受ける印象を比較する実験を行った。後者の方が人間に好印象を与えることを期待したが、本年度の少数の実験では差は見られなかった。また、今後の実験用のデータとして高齢者介護施設で対話をしている場合の顔画像データを収集した。

当初の計画では、平成29年度にレーザプロジェクタでCGの目を投影する機構を製作し、高速にまばたきを行うことのできる目を持つロボット頭部を開発する予定であったが、まばたきについての各種の予備的実験を早く始めた方がよいと考えたので、ロボットではなく液晶ディスプレイ上にCGでエージェントを表示する実験システムをまず開発することにした。これを用いて、いろいろな場合について実験を行った。しかし、これは予想していたことだが、まばたきのような無意識的な行動に対する反応は微妙であり、実験の設定などいろいろと試したが、明確な結果が得られていない部分も多い。このように、得られた学術的成果という点では、十分ではない点もあるが、研究への取り組みや実験システムの開発は順調に進められたので、おおむね順調に進展していると評価する。人間同士のインタラクションでは表情、視線、身振りなどの非言語行動が重要な役割を果たしている。そこで、人間とロボットのインタラクションにおいても非言語行動を有効に利用しようという研究が行われている。しかし、これまでは、人間が目で見て、意識的に解釈できる非言語行動しか対象にしていなかった。しかし、人間には無意識のうちに行動し、また他者のその行動に対して無意識のうちに反応したり、感覚的な情報を得たりするものがある。このような無意識の行動は、その人の本当の気持ちを表すものであり、それを利用すれば人間と適切に対応できるロボットが実現できると期待される。本研究では、そのような行動として「まばたき」を検討する。人間のまばたきから感情状況を推定し、適切にまばたきを行い対話を活性化するロボットを開発する。また、その応用として会話時のまばたきから認知症者の感情表出の指標が得られないか検討する。平成30年度は、前年度に引き続き、ロボットのまばたきに対して人間のまばたきが人間同士の場合と同様に同期して生じるか、また、ロボットが人間に同期してまばたきをするのと等間隔でまばたきするのでは、ロボットに対して印象の違いがあるかを、被験者を増やして実験を行った。前者の同期現象は確認されたが、後者については明確な結論は得られなかった。また、これも前年度に引き続き、高齢者介護施設でロボットと対話するときの高齢者の顔画像を収集した。感情状況をまばたきだけから推定するのではなく、心拍数や表情と組合せた方がより確実に推定できると考え、画像からそれらの情報を得る方法を検討した。相手のまばたきを検出して、それに応じてまばたきをするロボットの開発などシステム開発の面では順調に進んでいる。しかし、まばたきの効果に対する検証については、被験者を増やし、条件設定もいろいろと検討して実験を進めているが、やはりまばたきのような無意識的な行動に対する反応は微妙であり、論文として発表できるような統計的に有意な結果はあまり得られていない。このように、得られた学術的成果という点では、順調とは言えない面もあるが、研究への取り組みや実験システムの開発は計画に沿って進められているので、おおむね順調に進展していると評価する。前年度にできなかったレーザプロジェクタでCGの目を投影することにより、高速にまばたきを行うことのできる目を持つロボット頭部を開発する。これについては問題ない。そして、エージェント、およびこのロボット頭部を用いて、ロボットのまばたきに対する人間の反応を調べる。ロボットのまばたきとしては、ロボットが話し手になる場合と、聞き手になる場合がある。また、対話では、その両者が頻繁に切り替わる。
有機-無機ナノハイブリッドのコーティングによる医用材料の高機能化

医療現場で栄養補給や血液浄化などに使われているチューブ,カテーテルの材料として,ポリ塩化ビニル(PVC),ポリウレタンなどがある。しかし,一般にこれら有機高分子は硬度に乏しいため表面に傷がつきやすく,体内で長期にわたり安定に用いることが困難である。従って,時として患者の体内深部に挿入されたチューブ,カテーテルの交換を余儀なくされる。これは患者に多大な肉体的,精神的負担を強いるものであり,患者の生活の質(QOL)を著しく低下させる。そこで,機械的性質に優れた薄膜を有機高分子表面にコーティングできれば,これらの問題点が改善される。本年度の研究では,機械的性質に優れた酸化チタンを有機高分子(ポリメチルメタクリレート(PMMA)またはPVC)マトリックスにナノレベルで分散した有機-無機ナノハイブリッドの薄膜をゾルーゲル法により有機高分子基板にコーティングし,その機械的特性が改善されるか否かを調べた。酸化チタンの前駆体であるチタンテトライソプロポキシド(TTiP)と有機高分子(PMMAまたはPVC)を種々の割合でテトラヒドロフラン(THF)に溶解してゾル溶液を調製した。PMMAまたはPVCを含むゾル溶液をPMMAまたはPVC基板にそれぞれコーティングした。これら試料の引掻に対する抵抗を引掻抵抗測定機より,剥離に対する抵抗をScotch Tapeを用いた剥離試験により調べた。ゾル溶液のTTiP/PMMAまたはTTiP/PVC質量比が2.5以下の場合,引掻および剥離に対する抵抗は,ハイブリッド薄膜をコーティングしない場合に比べて向上した。従って,酸化チタンを含む有機-無機ナノハイブリッド薄膜のコーティングにより,有機高分子の硬度を向上できることが明らかになった。本年度は,機械的性質に優れた酸化チタンを有機高分子(ポリメチルメタクリレート(PMMA)またはPVC)マトリックスにナノレベルで分散した有機-無機ナノハイブリッドの薄膜をゾルーゲル法により合成する条件を調べた。これら試料の表面構造を走査型電子顕微鏡(SEM)観察,エネルギー分散型X線(EDX)分光分析ならびに薄膜X線回折(TF-XRD)により調べた。ゾル溶液のTTiP/PMMAまたはTTiP/PVC質量比が2.5以下の場合,表面にクラックのない厚さ約lOμmの均一な薄膜がコーティングできた。TF-XRD測定によれば,いずれの組成においても得られた薄膜は非晶質であった。さらに薄膜表面におけるチタンの分布をSEM及びEDXにより調べると,マイクロメートルサイズのドメインは観察されなかった。従って,酸化チタンが均一に分散された有機-無機ナノハイブリッド薄膜を有機高分子表面にコーティングできることが明らかになった。
ニンニク祖先種の解明

2001年、2002年の夏、トルコ東部及び中部でネギ属野生種Allium tuncelianum収集した。この種は1996年にイギリス、キュー植物園のDr.B.Mathewがニンニク(A.sativum)の祖先種の可能性を示唆した新種で、トルコ固有種である。2001年より2002年で多くの球根を収集できた。まず、ニンニクと正逆交雑した。子房は多少肥大したものの、結実には至らなかった。なお、A.tuncelianumの自家受粉では種子も得られ、種子発芽も見られた。この結果、A.tuncelianumはニンニクと非常に近い種ではないことが推定された。次に、RAPDで系統樹を作成した。収集したA.tuncelianum、ニンニク、その他の近縁種を用いて、RAPDマーカーにより多型を検出し、系統樹を作成した。大きくは2つのクラスターが形成された。問題のA.tuncelianumはA.macrochaetumに近く、A.atroviolaceumにはやや遠かったが、これらで1つのクラスターを形成した。ニンニクを含むその他の種でもう1つのクラスターを形成し、A.longicuspisに非常に近く、A.ampeloprasumに含まれるGreat-headedgarlicに近いことが推察された。従って、A.tuncelianumとニンニクはRAPD分析でもそれ程近くないことが示唆された。A.tuncelianumは同じくトルコで収集した野生種A.macrochaetumから新たに分けられた新種であるが、両者は核型も近かった。一方、ニンニクとは染色体数(16)は同じだが、2種類の付随体染色体の数その他がニンニクと異なり、ニンニクは独特の短い次中部動原体染色体2本を持ち、やや核型が異なった。これらの結果からA.tuncelianumはニンニクの直接の祖先種ではないと推定された。ニンニクの祖先種解明のため、トルコで最近発見された野生種Allium tuncelianumをトルコ東部で2001年夏に探索・収集した。11カ所でA. tuncelianumと思われる植物を収集したが、うち3カ所収集した植物のみがA. tuncelianumと、イスタンブール大学のOzhatay教授によって同定された。収集植物は開花期直後で、同定困難な面がありたが、他の2カ所の植物がA. tuncelianumである可能性が残った。他は異種と判断された。収集した植物は球根の形で日本に持ち帰り、鹿児島大学で2001年秋に植え付け、生育させ、詳細を調査している。3ヵ所で収集されたA. tuncelianumの染色体を先ず調査した。ニンニクは染色体を16本持つが、2ヵ所で収集されたA. tuncelianumが16本、残り1カ所で収集されたのが32本の染色体を有していた。従って、後者は倍数体であった。A. tuncelianumである可能性が残った2ヵ所の植物は、一方が16本、他方が32本であった。ニンニクの染色体の核型は特徴があり、10本が長い中部動原体染色体、4本が特徴ある付随体染色体、2本が短い次中部染色体である。収集した植物の核型は変異が見られたが、いずれもニンニクの付随体染色体に似た染色体を有し、ニンニクとの関連が推定された。収集した植物の形態・生態については現在調査中であるが、いずれも寒さに敏感な寒地型ニンニクに似た生態を示す。

ニンニクの野生種或いはニンニクの中で最も原始的とされる系統は同じ生態を示す事を合わせて考えれば、興味深い。DNAマーカーによるニンニクとの比較を試みつつあるが、植物体の生育が冬季で不十分なため、まだ詳しいデータは得られていない。次年度に行う予定である。トルコで最近、新種と同定されたAllium tuncelianumはニンニク(A. sativumの祖先種かもしれないと、イギリス、キュー植物園のDr. Mathewが示唆している。ニンニクの種の起源と進化に永年関わってきた本研究代表者は、この問題を解明するため、2001,2002の両年、トルコ東部及び中部地域で本種を収集し、ニンニクとの関係について解析を進めた。本年度は、昨年度、調査・収集できなかった地域、本種の最も多く分布するTunceli地方奥地での調査・収集を最重点として試みた。幸運にも、調査・収集行の直前にトルコで同地方の軍隊規制が緩和された。更に、イスタンブール大学のOzhatay教授、現地でAli Kaya氏などの協力があり、TunceliからMunzur川を遡り、川の水源地、Ziyaretまで調査・収集の道を進めることが出来た。そこでは、本種を野生のヤマニンニクとして栽培し、土産物として販売さえしていたので、非常に幸運な収集が出来た。収集した材料は球根であったが、鹿児島に持ち帰り、栽培し、植物体を実験に供した。昨年度は球根の発芽に非常に日数がかかり、本種は寒冷な地域に分布していることから冬を越して発芽する生態的特徴を有するものと推測された。そのため、本年度は夏の終わりに球根の低温処理を行った上で、植え付けたところ、無処理より3ヶ月も早く10月下旬には発芽した。形態はニンニクに似ていて、花軸は発達の途中、ニンニクと同じように丸く輪を作った。花器はまだ形成中で詳細な構造は不明である。ニンニクの臭い成分、アリシンを定性的に調べたところ、存在は認められたが、ニンニクほど多量には存在しなかった。ニンニクその他の種と本種をRAPDによりDNA分析しているが、まだ3種のプライマーしか使用していないので、ニンニクと共通のバンドも観察されたものの、はっきりした結果は未だ得られていない。2001年、2002年の夏、トルコ東部及び中部でネギ属野生種Allium tuncelianumを収集した。この種は1996年にイギリス、キュー植物園のDr.B.Mathewらがニンニク(A.sativum)の祖先種の可能性を示唆した新種で、トルコ固有種である。本年度はキュー植物園を訪問し、2カ年にわたって収集した材料の同定をDr.B.Mathewに依頼し、更に、ニンニクの祖先に関して討議、意見交換を行った。その結果、収集材料のうち、ニンニク染色体数16本と異なり32本と倍数性で、しかも花色が紫の2系統はA.tuncelianumと異なるA.atroviolaceumであることが判明した。残りの収集系統はいずれもA.tuncelianumと同定された。収集したA.tuncelianumは球根の発芽が非常に遅く、冬季の低温を経過して後、成長を開始する寒地型の生態を持つものと推定された。そのため、発芽前の球根を低温処理したところ、無処理より3ヶ月早く発芽した。この処理個体は花粉稔性を有するニンニクより時期的に非常に早く開花した。
ラミニン-5の活性部位由来の合成ペプチドを用いた角膜創傷治癒薬の開発

ラミニンは、基底膜におもに存在し、上皮と問質の結合を支持するとともに種々の細胞生物学的機能を有している。我々はラミニン-503鎖のLG4ドメインが、表皮細胞の遊走活性を持つことを示した。皮膚の基底膜を構成するラミニン-5が表皮-細胞間結合のみならず、ラミニン-5が皮膚の創傷治癒に重要な役割を果たしていることを示した。本研究で、角膜の基底膜を構成するラミニンが角膜の創傷治癒に寄与しているという報告からラミニンが有する創傷治癒促進作用を調べた。我々のグループの研究結果において、ラミニンのC末端のLG4ドメインに表皮細胞の細胞接着活性と細胞遊走活性を有することから、ラミニン-1における同部位をコードするAG73ペプチドを用いて角膜創傷におけるラミニンの生物学的活性と創傷治癒促進する新規薬剤の可能性を検討した。ヒトの角膜上皮細胞の細胞株に用いたIn vitroでのAG73ペプチドに対して化学走性を示した。また、その化学走性はp38MAPK依存性であった。In vivoでは、n-heptanolによるアルカリ創傷で作成した角膜潰瘍モデルにおいて、潰瘍作成後12時間で有意な創部の縮小が認められた。本実験で明らかになったように、ラミニン-1・1鎖C末端のLG4ドメインの生理活性部位をコードするAG73ペプチドがin vitroとin vivo誘導するという事実は、創傷治癒における、ラミニン-1の生物学的な意義を示唆し、AG73ペプチドがEvidence Based Medicineに合致する創傷治癒促進する新規薬剤の可能性を示すことができた。1.角膜上皮細胞に生理活性機能のあるラミニン-5分子内の活性ドメインの解析:ラミニンα3鎖のC末端にあるGドメインにはLG1LG5の5つのモジュールが存在し、生体内ではLG4-5モジュールが切り離されており、その意義が注目されている。本年度は、これまで明らかにされてきた各subtypeのLG4の活性配列を用いて、角膜上皮細胞における細胞遊走活性が生じるのか検討した。具体的には、ラミニンα1鎖LG4由来の活性ペプチドであるAG73の角膜上皮細胞に対する接着活性がヘパリン依存性なのを、インテグリンとの結合はEDTAとを用いて行い、ヘパリンとの結合活性はヘパリンの添加による阻害実験により確認した。そして、AG73ペプチドを30mg/mgの濃度で培養液に添加し金コロイドアッセイを行った。また、正常角膜上皮細胞のモデルとして、ウサギ角膜上皮由来の不死化Cell LineであるRCE cellと、同じくヒト角膜上皮由来のHCE cellをアッセイに用いた。2.合成ペプチドによる網羅的スクリーニングにより活性アミノ酸配列の同定:約200アミノ酸の活性ドメインをカバーする12アミノ酸から成る合成ペプチドは準備した。各ペプチドをウェルに固定し、培養角膜上皮細胞の接着活性を評価した。そのなかで、ヘパリン接着活性部位であることをすでに証明済みであるA3G76が、培養角膜細胞においても生理活性ペプチドであることを同定した。3.活性Gドメインの活性部位の合成ペプチドを用いて、培養角膜上皮の細胞遊走活性とその遊走機構の評価:細胞遊走は角膜上皮化に必須の生理機能であることから、培養角膜上皮細胞の細胞遊走活性は金コロイド・アッセイとボイデン・チャンバー法による評価とマトリックス・メタロプロテアーゼ産生の評価、および相関性を検討を現在行っている。1.活性Gドメインの活性部位の合成ペプチドを用いて、培養角膜上皮の細胞遊走活性とその遊走機構の評価:ラミニンα1鎖LG4由来の活性ペプチドであるAG73の角膜上皮細胞に対する接着活性がヘパリン依存性なのを、インテグリンとの結合はEDTAとを用いて行い、ヘパリンとの結合活性はヘパリンの添加による阻害実験により確認した。

そして、AG73ペプチドを30μg/mgの濃度で培養液に添加し金コロイドアッセイを行った。細胞遊走は角膜上皮化に必須の生理機能であることから、培養角膜上皮細胞遊走活性はボイデン・チャンバー法による評価とマトリックス・メタロプロテアーゼ(MMP)産生の評価、および相関性を検討を現在行った。現時点、MMP-2と-9に関してAG73ペプチドの添加によるHCTcellsからの産生は増加させておらず、表皮細胞との相関性は認めていない。今後、角膜上皮のprimary cellsを用いるか、他のMMP産生を評価する予定である。2.ラミニンー5生理活性部位の情報伝達機構の解明:細胞遊走とMMP誘導に関わるシグナル因子としてMAPキナーゼをターゲットとした角膜上皮再生に関わる細胞内シグナル伝達の解析を行う。MAPキナーゼのリン酸化を検出するアッセイとMAPキナーゼ特異的阻害剤による阻害実験は確立している。ラミニンα1鎖LG4ドメインのAG73ペプチドからのシグナル伝達にp38MAPキナーゼの関与を明らかにした。活性ペプチド点眼がおよぼす角膜の創傷治癒促進に対する治療効果を評価:マウスの両目に創を作り、コントロールと活性ペプチド投与を各角膜に行う。各活性ペプチド・その配列の長短による治療効果を検証した。潰瘍の作製は以下の方法で行った。全身麻酔下で眼球には局所麻酔を処置し、0.5NのNaOHを吸収させた直径2mmフィルターディスクを角膜中央に2分間静置し、アルカリ火傷を創る。活性ペプチドとコントロールペプチドを点眼し、12時間から48時間後に創部を評価した。その結果は12時間後にペプチド群で創部の閉鎖が促進された。このことから、ラミニンα1鎖・LG4ドメイン全体をカバーする合成ペプチドによる網羅的スクリーニングにより決定したAG73活性ペプチドがラットの角膜に作成した潰瘍の治癒促進に働くことを証明した。in vitroで角膜上皮細胞がp38MAPキナーゼという細胞内シグナル依存性に細胞遊走することを前年度証明した。このメカニズムの明確な活性ペプチドはEvidence Based Medicineに合致する新規治療薬・医用生体材料となるものと期待される。
顎運動制御システムの恒常性維持に対する歯根膜受容器の役割を再生医療の観点から探る

咀嚼システムの発達と恒常性維持における歯根膜入力の基本的役割を明確にするために、生後20日に片側の臼歯を抜去したICR系マウスと未処置マウスを用いて、生後30日から360日まで、経日的にhorseradish-peroxidase-wheat germ agglutinin(HRP-WGA)を下歯槽神経(IAN)に注入して、逆行性に三叉神経中脳路核(Me5)、および三叉神経節(TG)におけるニューロンを標識することによって、ニューロン数の経日的変化と三叉神経感覚核群(TSNC)において標識されるターミナルの変動についても解析した。その結果、歯の喪失がそれらの減少を引き起こすことが明らかになった。さらに、様々な神経栄養因子、とくにaFGFとbFGFが末梢と中枢神経系の再生に関与している可能性があるため、生後20日で片側臼歯を抜去した直後、下顎の抜歯窩それぞれに0.25μgのaFGFを注入し,その効果を解析した。その結果、生後60日においてMe5とTGにおけるニューロン数とTSNCにおけるターミナルを反対側のレベルまで回復することが明らかになった。これらの事実から、投与されたaFGFは抜歯によって破壊された歯根膜以外の部分に神経終末の再形成を速やかに引き起こす役割を果していると考えられる。以上のように、マウスを用いた動物実験の結果、歯の喪失は口腔における食物摂取機能の低下をもたらすだけではなく、咀嚼運動制御システムそのものにダメージを与えることが明らかになったが、aFGFの適切な使用によってそのようなダメージを最小限に抑えることが可能になることが示唆された。口腔が栄養摂取のための極めて重要な窓口であるという認識に基づけば、現代社会における咀嚼システムの脆弱化傾向から子供達を守るための基礎的研究を展開することは急務である。同時に、老化に伴う咀嚼システムの崩壊は個人の健康を著しく損なう原因となる。そこで、本年度は、これまでの実績を踏まえて咀嚼システムの発達と老化に対する歯根膜の知覚神経からの入力の重要性をメインに研究を展開してきた。その結果、以下のような研究成果が得られた。マウスの上下の臼歯の萌出直前、あるいは直後に一側性の抜歯を行い、抜歯側と非抜歯側において咬筋を支配する三叉神経運動核と三叉神経中脳路核のニューロン数を比較した。その結果、未処置のマウスにおいて、咬筋を支配する三叉神経運動核ニューロンと三叉神経中脳路核のニューロンの数は生後180日から減少し始め、生後360日以後には60日齢マウスと比べると、有意に減少することが明かになった。さらに、マウスの臼歯萌出直後(20日齢)に抜歯すると、三叉神経運動核ニューロン数の早期の減少が引き起こされた。さらに、抜歯時期を徐々にずらし、歯根膜喪失による抹消からの入力の低下が咀嚼制御中枢に最大の影響を与える臨界期が存在するかどうかを明らかにする実験を行ったところ、生後30日以後の抜歯処置は、三叉神経運動核のニューロン数に影響を与えないという、この研究分野において極めて貴重な知見が得られた。一方、咬筋に存在する筋紡錘の伸展知覚を支配する三叉神経中脳核のニューロン数においても抜歯による歯根膜入力欠除の影響を調べたところ、三叉神経運動核ニューロンとは異なり、抜歯の影響を全く受けないという極めて興味深い結果を得た。以上のような研究結果は、将来における咀嚼システムの再生医療に重要な指針を与えると考えられる。咀嚼システムの正常な発達と恒常性維持はヒトの健康維持のために極めて重要である。

本研究では、以下のように咀嚼制御システムの発達と恒常性維持における歯根膜入力の基本的役割を明確にした。生後20日に片側の臼歯を抜去したICR系マウスと未処置マウスを用いて、生後30日から360日まで、経日的にhorseradish-peroxidase-wheat germagglutinin(HRP-WGA)を下歯槽神経(IAN)に注入して、逆行性に三叉神経中脳路核(Me5)、および三叉神経節(TG)におけるニューロンを標織することによって、ニューロン数の経日的変化と三叉神経感覚核群(TSNC)において標織されるターミナルの変動についても解析した。その結果、歯の喪失がそれらの減少を引き起こすことが明らかになった。さらに、様々な神経栄養因子、とくにaFGFとbFGFが末梢と中枢神経系の再生に関与している可能性があるため、生後20日で片側臼歯を抜去した直後、下顎の抜歯窩それぞれに0.25μgのaFGFを注入し,その効果を解析した。その結果、生後60日においてMe5とTGにおけるニューロン数とTSNCにおけるターミナルを反対側のレベルまで回復することが明らかになった。これらの事実から、投与されたaFGFは抜歯によって破壊された歯根膜以外の部分に神経終末の再形成を速やかに引き起こす役割を果していると考えられる。以上のように、マウスを用いた動物実験の結果、歯の喪失は口腔における食物摂取機能の低下をもたらすだけではなく、脳における咀嚼運動制御システムそのものにダメージを与えることが明らかになったが、aFGFの適切な使用によってそのようなダメージを最小限に抑えることが可能になることが示唆された。
有機シリカ粒子技術による革新的マルチモーダルイメージングプローブの開発

本研究では、申請者が世界に先駆けて開発した有機シリカ粒子技術を駆使して新規なイメージングプローブの開発を行った。in vitro並びにin vivo蛍光イメージング、X線CT、MRIなどに応用可能な新規なプローブの作製に成功した。さらに一つのプローブで蛍光観察とMRI観察など複数観察が可能なマルチモーダルイメージングプローブの作製にも成功した。マウスを用いた生体イメージングにおいても腫瘍組織の検出など有用な所見を得ることができた。生物医学研究に有用な革新的マルチモーダルイメージングプローブの開発に成功した。近年、生体内の分子や細胞を可視化し、生体機能を観察するイメージング技術の発展が期待されている。イメージング技術の発展において、対象物の可視化を可能とするプローブ開発は極めて重要である。本研究は有機シリカ粒子技術を応用して多様なモダリティーに対応可能なイメージングプローブ・ナノ粒子の開発を目標とする。具体的なプローブのモダリティーとしてはA)近赤外線蛍光、B) X線、C)MRI、D)PETであり、本年度はこれらの各モダリティーにてシグナル検出が可能なシングルモーダルプローブ・ナノ粒子の作製を検討した。A)近赤外線蛍光においてはドーピング法、組込み法、層状被覆法などを用いて蛍光波長が650nm以上の蛍光を持つナノ粒子を2種類作製することに成功した。また粒子サイズは約50nmから200nmの粒子の作製を行うことができた。B) X線においてはドーピング法並びに層状被覆法等を用いてヨード化合物を含有する粒子の作製を検討した。今後、シグナル評価を進めていく予定である。C)MRIにおいてはドーピング法並びに層状被覆法等を用いて陽性造影剤を含有する粒子の作製を検討した。作製した粒子を1テスラの小動物用MRIにて評価を行ったところ陽性シグナルが確認できた。粒子サイズも約50nmから200nmの粒子の作製が可能であった。D)PETにおいては粒子表面に核種を結合させるためのキレート剤の結合を検討した。有機シリカ粒子に対して表面修飾法等を用いて検討した。粒子表面にてキレート剤の結合並びにその結合機能を示唆する結果が得られた。これらの知見に基づき次年度はより多様なシングルモーダルプローブ・ナノ粒子の作製を進めると共に、マルチモーダルプローブの作製に有用な知見を深めていくことを計画している。生体内の分子や細胞を可視化し、生体機能を観察するイメージング技術の発展が期待されている。イメージングにおいて対象物を可視化するためのプローブは極めて重要である。本研究では有機シリカ粒子技術を応用して多様なモダリティーに対応可能なマルチモーダルイメージングプローブ・ナノ粒子の開発を目標とする。開発するプローブはA)近赤外線蛍光、B)X線、C)MRI、D)PETと4つのモダリティを対象とする。本年度は昨年より研究を進めているシングルモーダルプローブ・ナノ粒子の作製研究がさらに発展できた。さらに得られた成果をもとにマルチモーダルイメージングプローブ・ナノ粒子の作製へと展開することができた。A)近赤外線蛍光を持つナノ粒子を2種類作製することに成功しており、それらを用いてマウス生体内での粒子の蛍光が確認できた。生体機能の可視化に向けた検討も進めている。B)X線においてはヨード化合物を含有する粒子の作製に成功した。また近赤外線蛍光とのマルチモーダル化を検討し、良好な結果が得られつつある。また金ナノ粒子を被覆した有機シリカ層に蛍光機能を付加させることにも成功した。C)MRIにおいてはT1強調において陽性シグナルを持つ粒子の作製を検討した。作製した粒子を3テスラのMRIにて評価を行ったところ陽性シグナルが確認できた。また酸化鉄を被覆した有機シリカ層に蛍光機能を付加させることにも成功した。粒子サイズも200nm以下の粒子の作製も可能であった。マウスを用いた動物実験において蛍光とMRIによるマルチモーダル検出が可能であった。D)PETにおいては粒子表面に核種を結合させるためのキレート剤の検討を進めている。粒子表面にキレート剤が得られた粒子に対してPET検出の準備を進めている。次年度はこれら成果をもとに、より多様なシングルモーダルプローブ・ナノ粒子の検討を進める。さらにマルチモーダルプローブの作製を進めていきたい。作製したナノ粒子にてマウスを用いて各モダリティーによるin vivoイメージングを行い生体内でのシグナル検出の検討を進めていく予定である。開発するプローブはA)

近赤外線蛍光、B)X線、C)MRI、D)PETと4つのモダリティを対象とする。本年度は初年度より研究を進めているシングルモーダルプローブ・ナノ粒子の作製研究がさらに発展できた。さらに得られた成果をもとに複数の装置で観察が可能なマルチモーダルイメージングプローブ・ナノ粒子の作製へと展開し成果を得ることができた。作製したマルチモーダルイメージングプローブ・ナノ粒子による動物を用いた実験において有意な所見を得ることができた。A)近赤外線蛍光を持つナノ粒子を2種類作製に成功していたが、新たにより長波長な近赤外線蛍光を持つ粒子の作製に成功した。作製に成功した粒子を用いてマウス生体内での粒子の蛍光が確認できた。体外からの腸管の蠕動運動の観察などの生体機能の可視化に成功した。また腫瘍を移植したマウスにおいて粒子の集積を確認することができた。B)X線においては金ナノ粒子を被覆した有機シリカ層に多様な蛍光機能を付加させることにも成功すると共に、ヨード化合物を含有する粒子の作製に成功した。また近赤外線蛍光とのマルチモーダル化に成功した。粒子の生体内での分布の変化をX線CTにて観察することができた。C)MRIにおいては蛍光観察のための多機能化とT1強調において陽性シグナルを持つ粒子を検討した。酸化鉄を被覆した有機シリカ層に多様な蛍光機能を付加させることにも成功した。マウスを用いた動物実験において蛍光とMRIのT2強調によるマルチモーダル検出が可能であった。T1強調において陽性シグナルを持つ粒子の作製に成功した。作製した粒子を3テスラのMRIにて評価を行ったところ陽性シグナルがin vitroとin vivoで確認できた。さらに蛍光とMRIのT1強調によるマルチモーダル検出が可能であった。MRIのT1強調とT2強調にて検出可能な粒子の作製と蛍光とのマルチモーダル化に成功した。D)PETにおいては粒子表面に核種を結合させるための多種のキレート剤の検討を進ることができた。粒子表面にてキレート剤の結合並びにその結合機能を示唆する結果が得られた。
DNA高次構造と遺伝子活性のON/OFFスイッチング：実験・理論・計算による探求

本研究では、ゲノムサイズDNAを用いて、その高次構造が遺伝子発現にどのように寄与しているかを明らかにすることを目的とする。本研究では、カチオンである生体ポリアミンを添加することによって、DNAの高次構造を制御し、蛍光顕微鏡および原子間力顕微鏡を用いてDNA高次構造観察を実施している。遺伝子発現については、ルシフェラーゼアッセイを用いて、定量的な評価を行っている。これまでの研究結果から、固く凝縮する直前のDNAセグメントが平行配列している構造が最も遺伝子発現が促進され、固く凝縮すると遺伝子発現が完全に阻害されることを明らかにした。現在は、ポリアミンの価数、炭素鎖数、構造の違いが、DNAの高次構造にどのように作用し、遺伝子発現に寄与するのかについて、研究を展開している。遺伝子発現の炭素鎖数依存性については、これまでの実験結果から、炭素鎖数が3のものが、遺伝子促進作用が最も顕著であることを明らかにした。この場合のDNAは、ゆるくねじれた環状構造をもっている。最も遺伝子発現の促進作用が弱いのは、炭素鎖数6のもので、この場合、DNAセグメントが固く平行配列したバンドル構造をもつことを明らかにした。また、DNA高次構造に関するポリアミン価数の寄与については、対イオン凝縮理論に、イオン交換過程と取り入れた物理モデルを構築しつつあり、実験で観測される、2価と3価のカチオンが共存する環境における、カチオン競合効果について、実験結果を適切に再現できることを示した。今後は、モンテカルロおよび分子動力学シミュレーションも取り入れ、DNA高次構造転移に関して、より詳細な調査を進める予定である。炭素鎖数の異なる2価のポリアミンである、1,3-ジアミノプロパン(C3)、カダベリン(C4)、プトレシン(C5)、1,6-ジアミノヘキサン(C6)を用いて、ポリアミンの炭素鎖数の違いがDNAの遺伝子発現にどのように寄与を調査した。さらに,原子間力顕微鏡によりDNA微細構造の観察し、DNA高次構造と遺伝子発現の関係性を評価した。ルシフェラーゼアッセイを用いた遺伝子発現評価実験では、炭素鎖数に関係なく、ポリアミンの添加が、遺伝子発現活性に関して、ポリアミンが低濃度の場案、発現が促進され、高濃度の場合、阻害されることを明らかにした。実験結果から、C3が最も促進作用が強く、C4、C5という順番となり、ポリアミンがない場合に比べて、912倍程度の遺伝子発現の促進を観測した。一方、最も炭素鎖数の多いC6については、3倍程度の促進作用を示した。原子間力顕微鏡を用いた、DNAの高次構造観測結果から、C3,C4,C5存在下では,濃度に関係なくDNAの高次構造変化は見られず,環状のDNAがゆるくねじれた構造が観察された。一方、C6存在下では、DNAのセグメントが平行配列したバンドル構造が観察された。遺伝子発現活性の促進度合いが最も小さいC6存在下では、DNAがバンドル構造をとることを明らかにした。この結果は、DNA鎖が固く集合したバンドル構造では、RNAポリメラーゼによる転写翻訳が阻害されることを意味する。ポリアミンは真核生物,原核生物に共通して存在する生体分子であり、これまでも細胞活性との関連で数多くの研究が行われているが、電荷が同じで異なる炭素鎖数のポリアミンンがDNAの高次構造にどのように作用し、遺伝子発現にどのように寄与しているのかについては、本研究によって、初めて明らかにされた知見であるこれまでの研究では、ゲノムサイズの長鎖DNAの高次構造に関して、蛍光顕微鏡および原子間力顕微鏡(AFM)を用いて、実験的に評価してきた。また、カチオンによるDNA高次構造転移について、対イオン凝縮理論にイオン交換過程を取り入れた物理モデルを構築し、理論的なアプローチも展開している。遺伝子発現については、ルシフェラーゼアッセイを用いて、定量的に評価している。これまでの研究結果から、DNAが固く凝縮する直前のDNAセグメントが平行配列している構造が、RNAポリメラーゼによる遺伝子読み取りを容易にし、遺伝子発現を促進することを明らかにした。DNAの高次構造についての微細構造は、AFMを用いて観察を行っているが、AFM観察では、DNAを基盤上に貼り付けて観察を行うため、溶液中をブラウン運動する3次元構造をもつDNAとは、直接対応していないという課題がある。今後は、溶液中のDNAの3次元構造を詳細に評価するために、モンテカルロおよび分子動力学シミュレーション解析を実施する。シミュレーションコードは、本研究グループが開発したものを基にして、対イオンの併進エントロピーの効果を取り入れた解析を進める。シミュレーション結果とAFM観察による微細構造とを比較検討することによって、遺伝子発現のON/OFFスイッチングに、DNAの高次構造がどのように寄与しているのかについて明らかにする。本研究は,ゲノムサイズの長鎖DNAの高次構造と遺伝子発現との関係を明らかにすることを目的としている.遺伝子発現について,これまでのところ,鍵と鍵穴的な特異的な制御因子の作用により遺伝子発現の自己調節が行われているとの考えに基づいて説明しようとする研究が多数を占めていたが,2万個余りの遺伝子について,細胞分化にみられるようなロバストなON/OFFのスイッチングについて,細胞内に各特定の遺伝子はほぼ全てが単一であり,制御因子の数ゆらぎを考慮すると,このような従来の考えでは説明が困難である.本研究は,DNAの高次構造転移が,遺伝子発現のロバストなON/OFFを引き起している可能性について, DNA一分子計測と遺伝子発現実験を軸に,構造と機能の両面から計測を進める検証を行った.

本研究では,長鎖DNAとして,166キロ塩基対をもつT4 DNAを用い,溶液中で正の電荷をもつ生体ポリアミンの添加濃度を調節することで,凝縮・非凝縮といったDNAの高次構造を制御し,DNAの構造および状態は,蛍光顕微鏡鏡によるDNA一分子計測と原子間力顕微鏡による計測を実施することで確認した.また,ルシフェラーゼアッセイを用いた遺伝子発現実験を実施した.実験結果から,DNAが凝縮する直前で,最も遺伝子発現量が多くなり,ポリアミンがない場合と比べて5倍程度,遺伝子発現が促進されることを明らかにした.一方,DNAが完全に凝縮した場合は,遺伝子発現が完全に阻害されることも明らかにしている.原子間力顕微鏡観察結果から,遺伝子発現量が最大値の場合,DNAの高次構造はセグメント同士の平行配列が増加し,RNAメッセンジャーによる遺伝子読込が容易な構造なっていること,また,完全に凝縮した場合は,RNAメッセンジャーがDNAに作用できない構造になることが明らかにされた.生命体に広く存在するポリアミンは,癌や細胞分裂などの生命現象と密接に関連しており、例えば癌患者ではその濃度が高くなることが知られている.しかしながら,ポリアミンの生体での役割については不明な点が多く残されていた.本研究では,ポリアミンの濃度の上昇に伴い,DNAから作り出されるタンパク質(遺伝子発現)の生成速度が5倍程度に増強されること,そして,更なるポリアミン濃度の増大に伴い,この生成速度がゼロ(遺伝子発現が阻止される)ことを明らかにした.このようなタンパク質合成の促進と阻害が,ポリアミンによって調節されるメカニズムの解明にも成功した.すなわち,ひも状のDNA分子の3次元的な広がり(高次構造)が,たんぱく質生成に対しての促進・阻害をもたらしていることを解明した.従来は,DNAと生体内因子との“鍵と鍵穴"的な作用が,DNAからのタンパク質生成のスイッチング制御を担っていると考えられていたが,本研究によって,DNAとポリアミンとの電気的・幾何学的相互作用に基づく遺伝子発現のON/OFFスイッチング機構を新たに見出した.本研究は、ポリアミンンの濃度によってDNA分子の3次元的な広がりが変化し,この構造変化がタンパク質生成のON/OFFのスイッチングの働きをすることを明らかにしたもので,癌などの病気のメカニズム解明やiPS, ES細胞などによる再生医療分野にも,今回の知見は重要な貢献をするものと期待される.本研究では、ゲノムサイズDNAを用いて、その高次構造が遺伝子発現にどのように寄与しているかを明らかにすることを目的とする。本研究では、カチオンである生体ポリアミンを添加することによって、DNAの高次構造を制御し、蛍光顕微鏡および原子間力顕微鏡を用いてDNA高次構造観察を実施している。遺伝子発現については、ルシフェラーゼアッセイを用いて、定量的な評価を行っている。これまでの研究結果から、固く凝縮する直前のDNAセグメントが平行配列している構造が最も遺伝子発現が促進され、固く凝縮すると遺伝子発現が完全に阻害されることを明らかにした。現在は、ポリアミンの価数、炭素鎖数、構造の違いが、DNAの高次構造にどのように作用し、遺伝子発現に寄与するのかについて、研究を展開している。
口腔顔面癌モデルラットに対する中枢疼痛抑制の検討

我々の口腔顔面癌モデルの初期段階においては、末梢性ではなく中枢性のグリア細胞の活性化が、自発痛の拡大や異痛症そして過敏症の発生に関与していることが判明した。またこの段階において、活性化する中枢グリア細胞にはミクログリアとアストロサイトがあり、後期にはアストロサイトが主に関与していることが示唆された。末梢性や中枢性のグリア細胞の活性は、炎症や神経障害により発生する痛覚過敏において重要な役割を果たす。しかし癌性疼痛におけるグリア細胞の役割はよく解っていなかった。よって本研究では、末梢性ならびに中枢性のグリア細胞の評価と、そのグリア細胞の活性を抑制するプロペントフィリンが、Walker256B細胞を片側の鼻毛部に注入した口腔癌モデルラット(34日後)の痛覚関連行動にどのような作用を及ぼすのかを評価した。結果、我々のモデルはsham群と比較し、顔面グルーミング時間は延長し、癌細胞注入部における輻射熱刺激に対する逃避潜時は短縮、von Frey hair刺激に対する逃避閾値は減少した。これらは自発痛ならびに温度痛覚過敏症ならび機械的異痛症が出現した事を示唆している。Ibal(ミクログリアの抗体)とGFAP(アストロサイトの抗体)に対する免疫染色に関しては、三叉神経節においては変化はなかったが、三叉神経脊髄路核尾側亜核においては強い陽性像を示した。しかし連日のプロペントフィリン腹腔内投与により、腫瘍サイズは変化しないものの、2日目より中枢性グリア細胞の活性は減弱し、痛覚関連行動は抑制された。結果、我々のモデルの初期段階においては、末梢性ではなく中枢性のグリア細胞の活性化が、自発痛の拡大や異痛症そして過敏症の発生に関与していることが判明した。次に我々は血管内皮細胞由来のペプチドで強力な血管収縮作用を示すエンドセリンが、近年神経因性疼痛発生に大きく関与していると報告されていることに着目した。複数の研究において、エンドセリンが中枢性グリア細胞を活性化することで神経因性疼痛を発生させているとの報告がある。よって我々は当モデルを用いて、エンドセリンの末梢投与による自発痛出現の有無、ならびに中枢におけるグリア細胞の変化を調査しているところである。この機序が解明できれば我々が当初の目的としていた中枢性疼痛抑制を解析することが期待される。最近の報告では、中枢グリア細胞の過剰活性化が癌による持続性疼痛に関わると言われているが、この過剰活性の時間的変化とグリア細胞の痛覚過敏への寄与は未だに解明されていない。よって、今回の研究では顔面癌モデルで、三叉神経脊髄路核尾側亜核(MDH)や頚椎後角(UCDH)などを含む三叉神経入力領域におけるミクログリアとアストロサイトの過剰活性の時間的変化と痛覚関連行動を調査した。本モデルでは、MDHへ感覚神経が投射される鼻毛部付近で腫瘍が増大したが、UCDHへ感覚神経が投射される眼窩下領域へは広がっていなかった。それにもかかわらず、機械的異痛症や温度痛覚過敏症は鼻毛部だけでなく眼窩下領域においても観察された。ウェスタンブロッティング法や免疫染色法では、癌接種4日目では三叉神経入力領域においてミクログリアの広範囲の活性化が認められ、11日目にかけて次第に不活化していった。対照的に、アストロサイトは4日目においてMDHのみ活性化が認められ、過剰活性は遅れてUCDHへ広がっていった。4日目から開始したグリア細胞活性の抑制剤であるプロペントフィリンの毎日の投与は、その後のグリアの過剰活性を抑制した。プロペントフィリン投与は5日目に始まる眼窩下領域の異痛症や過敏症をほとんど予防するが、鼻毛部においてはあまり効果がなかった。これらの結果から、本モデルでは、一過性のミクログリアの過剰活性や持続的なアストロサイトの過剰活性など中枢のグリア細胞の過剰活性は、痛みの維持ではなく、痛覚過敏の発生に寄与すると考えられる。
高濃度グルコース曝露に対する膵β細肪の応答反応におけるTRPチャネルの役割

本研究は、高濃度グルコースに対するβ細胞の応答反応がTRPチャネルを介して引き起こされる、という仮説を立て、高濃度グルコース曝露による(1)細胞膨張を介したインスリン分泌反応、および(2)アポトーシスへのTRPチャネルの関与について検討を行った。まず、ラットおよびマウスβ細胞において、低浸透圧刺激による細胞膨張を介したインスリン分泌反応とカチオンチャネルとの関係を調べた。そして、低浸透圧刺激による[Ca^<2+>]_iの上昇、細胞膜の脱分極、およびインスリン分泌がカチオンチャネル阻害薬により抑制されること、さらに低浸透圧刺激によりカチオン電流が活性化されることを示した。すなわち、細胞膨張の際に細胞膜に加わる伸展刺激により伸展活性化カチオンチャネルが活性化され、細胞膜が脱分極してインスリン分泌が惹起される、という新たなK_<ATP>チャネル非依存性インスリン分泌機序を示唆した。また、β細胞株INS-1細胞を用いた検討により、H_2O_2誘導アポトーシスがカチオンチャネル阻害薬およびIP_3受容体阻害薬により抑制されることを示し、酸化ストレスにより誘導されるβ細胞アポトーシスに小胞体からのIP_3作動性Ca^<2+>遊離およびカチオンチャネルを介したCa^<2+>流入が関与することを示唆した。以上の結果から、β細胞においてTRPチャネルは高濃度グルコースによるインスリン分泌およびアポトーシス誘導に関与することが示唆され、2型糖尿病治療薬の新たなターゲットとして魅力的な分子であると考えられた。Wistar系雄性ラットからコラゲナーゼ消化法により単離したβ細胞の低浸透圧刺激に対する[Ca^<2+>]_i変化をCa^<2+>蛍光指示薬であるfura-2を用いて測定した。低浸透圧刺激は、灌流液の浸透圧を296mOsmから190mOsmへと減少させることにより行った。また、単離した膵ラ氏島およびβ細胞株であるINS-1細胞におけるTRPチャネルの発現をRT-PCR法により解析した。低浸透圧刺激によるβ細胞の[Ca^<2+>]_i上昇反応は、Gd^<3+>と同様に、他のカチオンチャネル阻害薬であるamilorideや2-APBによっても有意に抑制された。また、プロテインキナーゼC阻害薬であるRO 31-8220も低浸透圧刺激に対する[Ca^<2+>]_i上昇反応を有意に抑制することが示された。以上の結果から、低浸透圧刺激によるβ細胞[Ca^<2+>]_i上昇反応にカチオンチャネルが関与していることがさらに強く示唆された。また、その活性化にはプロテインキナーゼCが関与している可能性が示された。神経細胞、平滑筋細胞など多くの細胞において、TRPチャネルのひとつであるTRPV4が低浸透圧感受性を示し、低浸透圧刺激による[Ca^<2+>]_i上昇反応に関与していることが報告されている。そこで、β細胞における低浸透圧感受性カチオンチャネルがTRPV4である可能性について検討を行った。しかし、低浸透圧刺激による[Ca^<2+>]_i上昇反応は、TRPVチャネルの選択的阻害薬であるruthenium redでは抑制されず、また、選択的TRPV4活性化薬である4α-PDDは[Ca^<2+>]_i上昇反応を惹起しなかった。さらに、RT-PCRにより、ラット膵ラ氏島およびINS-1細胞におけるTRPV4の発現は確認されなかった。以上の結果から、ラット膵β細胞における低浸透圧感受性カチオンチャネルがTRPV4である可能性は低いことが示された。高濃度グルコース曝露がβ細胞アポトーシスに及ぼす影響を調べた。Wistar系雄性ラットから単離したβ細胞を33.3mMグルコース含有培地で6日間培養し、TUNEL法により解析したところ、明らかなアポトーシス細胞の増加が認められた。そこで、より定量的な解析を行うために、フローサイトメトリーを利用した測定を行った。

解析にはラット由来β細胞株であるINS-1細胞を用い、アポトーシスの評価には、ヨウ化プロピジウム染色によるsub-G_1測定法、およびAnnexin V法を用いた。33.3mMグルコースへの6日間の曝露により、アポトーシス細胞の割合は有意に増加した。この高濃度グルコースによるアポトーシスへのiNOS誘導の関与をiNOS選択的阻害薬1400WとNOS非選択的阻害薬L-NNAを用いて検討したところ、1400Wでは抑制が認められたが、L-NNAでは効果にバラツキがあった。一方、NOドナーDETA/NOは、0.3mMまでの濃度ではアポトーシスを抑制し、1mMでは促進することが示され、NOがβ細胞のアポトーシスに対して2面性の作用を示すことを明らかにした。今後、このNOの作用とTRPチャネルとの関連について検討していく。また、高濃度グルコース曝露による細胞膨張に対する応答反応とTRPチャネルとの関連についても検討した。ddy系雄性マウスから単離したβ細胞を用いて、低浸透圧誘発細胞膨張によるβ細胞の[Ca^<2+>]_i上昇およびインスリン分泌について薬理学的解析を行った。いずれの反応もカチオンチャネル阻害薬Gd^<3+>により一部抑制されたものの、ラットβ細胞とは異なり、プロテインキナーゼC阻害薬RO31-8220による抑制は認められなかった。今後、さらに薬理学的解析や遺伝子欠損動物を用いた解析等を行うことにより、この応答反応に関与するTRPチャネルの同定をめざす。まず、マウスおよびラット膵ランゲルハンス氏島を単離し、発現しているTRP mRNAをRT-PCRにより解析した。その結果、いずれにおいても、TRPCl,V2,M4が高発現していることを確認した。次に、マウス単離膵島を用いて、低浸透圧刺激により細胞膨張を誘発した際に活性化されるカチオンチャネルの性質を調べた。低浸透圧刺激によるインスリン分泌量の増大は、TRPVチャネル阻害薬ruthenium redにより顕著に抑制された。さらに、カチオンチャネル阻害薬Gd^<3+>、PKC阻害薬Ro31-8220、PLC阻害薬U73122もこの反応を有意に抑制した。以上の結果から、マウスβ細胞における細胞膨張によるインスリン分泌に伸展活性化カチオンチャネルが関与することが示唆され、その分子実体がTRPV2である可能性が推察された。また、PLCおよびPKCの活性化がこの反応に寄与していることが示唆された。また、酸化ストレスにより誘発されるβ細胞アポトーシスに関わるカチオンチャネルの性質についても検討した。ラット由来β細胞株INS-1において、100μMという比較的低濃度のH_2O_2により誘導されるアポトーシスは、細胞内Ca^<2+>キレート剤であるBAPTA/AMや、IP_3作動性Ca^<2+>遊離チャネルおよびカチオンチャネルの阻害薬である2-APBにより、ほぼ完全に抑制された。すなわち、H_2O_2誘導アポトーシスに小胞体からのIP_3作動性Ca^<2+>遊離とカチオンチャネルを介したCa^<2+>流入の両方が関与することが示唆された。
新しいタイプのミオシン様蛋白質と平滑筋収縮弛緩調節

一般にミオシンと言えば骨格筋ミオシンに代表されるように、双頭・短尾の形態をとり、生理的イオン強度で尾部から集合しフィラメントを形成する性質を示すものを意味し、分子量は500K台のものである。この分子はその起源により多少の差異はあれ、200K台の重鎖と20K10Kの2種の軽鎖、それぞれ二つづつ合計6つのポリペプチドより成り立っている。現在では、このミオシンはミオシンIIはたは通常ミオシン(conventional myosin)と呼ばれる。ミオシンIまたはミニ・ミオシン(mini-myosin)と呼ばれるものはこれとは性質を異にするもので新しいタイプのミオシン様蛋白質であり、単頭・短尾で集合性を示さないのが特色である。このミオシンI類似タンパク質は、脊椎動物より次々と得られる可能性があり、ニワトリ砂のう平滑筋粗抽出物より次のようにして新しいタイプのミオシン様タンパク質の候補として、130kDa蛋白質を得た。ニワトリ砂のう高イオン強度抽出物をHPLCゲルロカ・カラム、ハイドロオキシアパタイト、つづいてDEAEセルロ-スを用いたカラムにより、SDS-PAGE上ほぼ単一蛋白質にまで精製した。ATPase活性を種々の条件下で測定したところ、Ca^<2+>-ATPase活性、K-EDTA ATPase活性、Mg^<2+>-ATPase活性及びactin活性化Mg^<2+>-ATPase活性はそれぞれ、4.0,13.8,3.1及び9.5nmol/min/mg proteinであった。ミオシンの特色であるMg^<2+>-ATPaseのactinによる活性化が認められた。ここで強調すべき事は、ATPase活性が極端に低いことである。今後、i)必要なサブユニットが精製過程で失われたかどうか、ii)リン酸化又は脱リン酸化処理が必要であるかどうかにつき充分な検討を加え、130kDa蛋白質がミオシン様蛋白質であると決定したい。