hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
MRI・MTC画像による卵巣病変の良悪性診断の基礎的・応用的研究

1)まず、PVAゲル封入型MRIファントムを用いた物理的検討では、1.周波数off-set量はSNRを考慮し500-1000Hz、2.MTCパルスの印加時間は、印加時間を短くしslice数を増やしMTC pulse数を増やす、3.muti-slice数は最大、4.MTCパルスの印加強度も最大、5.TRは息止めの長さSNRやpulse数を考慮し150-200msec、5.Interleavingはoff、6.slice厚/gap率は、slice厚をSNRを考慮し5-8mm、Gapは信号強度を考慮しslice厚の2-12%が最適なシークエンスと結論し、平成12年9月の日本磁気共鳴学会で結果の報告を行った。2)これらの結果を踏まえ、MTCパルス(Gaussian-like shape pulse)の印可時間を2msec、印加強度を500度、TR/TE/FAを170msec/5msec/70度、off set周波数を500Hz、multi-slice数は、MTCパルスonで6 slices、offで3 slices、slice厚/gapは6-8mm/1mm、Matrixは224x256、加算回数1回、撮像時間39秒とし、種々の女性骨盤内病変のMRI画像を撮像し得られた信号強度からMTRを算出した。得られた平均MTRは、皮下脂肪が2.21、膀胱が-7.13、骨格筋が28.84、子宮筋層が22.92で、筋腫結節は25.46、子宮頸癌は24.35、卵巣嚢胞性病変は0.07、卵巣類皮嚢胞腫が1.56、子宮内膜症性嚢胞が6.15という結果を得、平成12年9月の日本磁気共鳴学会で結果の報告を行った。3)更に本研究の最終目的である種々の卵巣腫瘍に対し、前述した撮像法を用いてMTRを算出した。良性病変のMTRは嚢胞腺腫で0.61、shadingを有する子宮内膜症性嚢胞で6.40、有さないもので6.04と一桁の価であったのに対し、卵巣腫瘍の充実部は20.16と高い価を呈し両者の鑑別が可能と思われ平成12年11月の北米放射線学会で報告した。ポリ塩化ビニールによる実験モデルの作成を急ぎ、種々のT1緩和時間を有するファントムに対しファーストスピンエコー法を基杢とするMRI、MTC画像の撮像を行った。ファントムは、水成分だけでなく今後は生体軟部組織に似た環境を作り撮像を続ける必要がある。ファントム実験に加え、T1強調画像で高信号を呈する卵巣嚢胞性腫瘍患者に対してMRI、MTC画像の撮像法の確立のために種々の撮像条件でMRI撮像を施行した。撮像条件については、現時点ではMTCパルスにより周囲軟部組織の信号抑制は可能で、骨盤内周囲組織と卵巣病変の境界は明瞭になった。造影剤投与時の周囲とのコントラストも明瞭となった。しかし、T1強調画像で高信号を呈する卵巣嚢胞性病変における造影剤投与後の増強効果の判定には、嚢胞部の信号の十分な信号の抑制が必要であるが、現時点では良好な信号低下が得られておらず、今後の課題である。さらに脂肪や粘液、血液などT1強調画像で高信号を呈する病変の信号を選択的に抑制するために、インバージョンパルスを用いた撮像法も検討し、種々のインバージョンタイムを使用し撮像中である。しかし、臨床応用に関しては、脂肪や粘液、血腫のT1緩和時間は個々の病変により異なるため、また同一病変内でも均一でないため、画一的なインバージョンパルスを使用しても対応できないことが明らかになった。そのため、今後は種々の病変に対しMRIを撮像し、T1緩和時間を実際に測定して、それに合ったインバージョンパルスを使用することにした。MTCを用いたMRI画像を実際に卵巣腫瘍患者に対し撮像を行った。具体的には卵巣嚢胞腺腫、嚢胞腺癌、その他の悪性腫瘍、子宮内膜症性嚢胞、類皮様嚢腫、貯留嚢胞が対象疾患である。現時点では、それらの病変のMTC付加後の画像で、期待された充実部における信号の視覚的な低下が少ないため、充実性病変と嚢胞性病変の鑑別は困難なことが多く、卵巣腫瘍の良悪性の診断で重要な充実部の有無の鑑別は、今後MTCパルスの条件を変化させていく事で改善していく予定である。また、造影剤投与によるT1短縮効果は、MTC効果とは異なった機転であるため併用により充実部と嚢胞部の鑑別をより容易にするべく検討中である。MTCパルスはパルスの形、印加時間、強度、off-resonance周波数などいくつもの要素の組み合わせがある。問題点はSARが高値となるのでFDAの指針である平均SARが2W/kg以下、ピークSARが8W/kg以下に収めなければならず、MTC効果を最大限に引き出せない点であるが、制限値内での最も効果的な組み合わせについても検討中である。特にMTCパルス波形に関してはpulsed off-resonance irradiationとpulsed on-resonance irradiationの比較を行っている。また、類皮様嚢腫のような脂肪を含む病変に対しては、前年度に引き続いてインバージョンパルスを併用して撮像し、MTC効果との相乗効果を引きだしていく予定である。

1)まず、PVAゲル封入型MRIファントムを用いた物理的検討では、1.周波数off-set量はSNRを考慮し500-1000Hz、2.MTCパルスの印加時間は、印加時間を短くしslice数を増やしMTC pulse数を増やす、3.muti-slice数は最大、4.MTCパルスの印加強度も最大、5.TRは息止めの長さSNRやpulse数を考慮し150-200msec、5.Interleavingはoff、6.slice厚/gap率は、slice厚をSNRを考慮し5-8mm、Gapは信号強度を考慮しslice厚の2-12%が最適なシークエンスと結論し、平成12年9月の日本磁気共鳴学会で結果の報告を行った。2)これらの結果を踏まえ、MTCパルス(Gaussian-like shape pulse)の印可時間を2msec、印加強度を500度、TR/TE/FAを170msec/5msec/70度、off set周波数を500Hz、multi-slice数は、MTCパルスonで6 slices、offで3 slices、slice厚/gapは6-8mm/1mm、Matrixは224x256、加算回数1回、撮像時間39秒とし、種々の女性骨盤内病変のMRI画像を撮像し得られた信号強度からMTRを算出した。得られた平均MTRは、皮下脂肪が2.21、膀胱が-7.13、骨格筋が28.84、子宮筋層が22.92で、筋腫結節は25.46、子宮頸癌は24.35、卵巣嚢胞性病変は0.07、卵巣類皮嚢胞腫が1.56、子宮内膜症性嚢胞が6.15という結果を得、平成12年9月の日本磁気共鳴学会で結果の報告を行った。3)更に本研究の最終目的である種々の卵巣腫瘍に対し、前述した撮像法を用いてMTRを算出した。良性病変のMTRは嚢胞腺腫で0.61、shadingを有する子宮内膜症性嚢胞で6.40、有さないもので6.04と一桁の価であったのに対し、卵巣腫瘍の充実部は20.16と高い価を呈し両者の鑑別が可能と思われ平成12年11月の北米放射線学会で報告した。
藻類の生理に関与する活性物質の単離と構造

オキナワモズクが生育している周囲の海水中に放出する他感性の活性物質を単離するために、最初に生物検定法を確立した。自然界の海藻は四季を通じて形態が変化するので実験室でバイオアッセイの材料にすることはできない。しかしながら生活史の全ての段階をいつでも作り出すことの出来るスサビノリについて検討したところこの他感性物質はコンコセリススポアが着床する前に胞子を殺してしまうことが明らかになり、これを利用して生物検定法を確立した。短日条件下においたコンコセリスから放出される胞子を海水中に浮かべた筏に付着させた後一週間生育させて胞子数を測定できるようにし、同一条件で海水中にオキナワモズクの抽出物を加えて胞子数を測定して他感作用の活性をしらべた。これによりオキナワモズクの他感性物質の作用する段階は明らかになったが、生物検定に日数がかかり精製に不便であった。このためさらに他の生物について検討した結果植物性のプランクトン・ヘテロシグマアカシオを急速に死滅させることが明らかになったためこれを用いて精製の際の生物検定とした。各種のクロマトグラフィイ-を用いて精製を行いC18H28O2の組成を持つ活性物質を単離し、各種のスペクトルにより6Z,9Z,12Z,15Z-octadecatetraenoic acid(ODTA)と決定した。この構造は標品と比較することにより確認した。この他感性活性物質はスサビノリだけでなくワカメなどの褐藻の生育も阻害することが明らかになった。ODTAがヘテロシグマにたいして強い活性を示すことから、そのほかの微細藻、とくに赤潮プランクトンに対する作用にも興味がもたれた。ODTAは約30種の植物性プランクトンに対して強い活性を示し3ppmの濃度で数分以内に死滅させた。さらにこのようなプランクトンに対してODTAだけでなくてアラキドン酸、エイコサペンタエン酸のような高度不飽和脂肪酸も同程度の強い作用を示すことが明らかになった。海藻類の発生・分化・生長などの基本的な過程は陸上植物とは著しく異なっているが,これらの過程を支配している活性物質の研究は殆んどなされていなかった.代表的な褐藻オキナワモズクは生活史のうち微小な枝状体世代において周囲に他感作用を示す物質を放出し,他の海藻類の遊走子および胞子の活動を低下させることが考えられていた.このような作用をもつ活性物質を純粋に単離するために最初に生物検定法の確立を試みた.多くの海藻類は一年間に一回しか胞子とか遊走子を放出しないため天然の海藻を被検体とすることは実行を進める上で著しく不利である.このため実験室で常時藻類の生活史の各段階を制御することのできるスサビノリを被検体に選んだ.最初,オキナワモズクの盤状体を保存しておいた海水について活性物質の検出を試みたが検出することは出来なかった.ついでこの褐藻の成熟葉状体のメタノール抽出物について試験したところ,スサビノリの生活史のうちコンコセリス胞子に作用し,放出された胞子が海水中を遊泳し着床するまでの間に死滅させることが明らかになった.活性物質の純度(活性度)を定量的に明らかにするために着床した胞子を計測する方法を確立した.しかしこの方法ではなお検定に2週間近くの日数を要し単離・精製に日数を要すという不利の点があった.

ついでスサビノリの胞子と近緑のプランクトン・ヘテロシグマに対しても同様な作用を示することが明らかになり容易に(数時間以内)検定する方法が確立され,活性物質を純粋に単離することが出来た.陸上植物の他感作用については大分くわしく研究され、この作用に関与する物質も多数単離されそれらの化学構造も解明されている。しかし海洋性の藻類についてはこのような現象は知られていなかった。本研究者らは昨年褐藻オキナワモズクから他感性物質を単離した。本年度はこの他感性物質について更らにくわしく検討した。この物質の化学的本体は、メチルエステルの質量スペクトルが290にM^+のピークを示すこと、H-NMRスペクトルでδ0.99にメチル(t)のシグナル、2.89にビスビニルメチレン(6H)のシグナル、5.40(8H)にビニルプロトンのシグナル等を示すことなどから、オクタデカテトラエン酸であると決定した。また別の方法で同一物質を調製し生物検定を行ったが、天然物と全く同一の生理作用を示し活性物質の構造を確認することが出来た。生物検定はスザビノリおよびヘテロシグマを用いて行っていたが、ワカメなどの褐藻の遊走子に対しても全く同一の作用を示すことがわかった。また微細藻に対する作用も検討した処、有毒赤潮鞭毛藻であるシャトネラおよびギムノジニウムに対して1ppmの濃度で数秒以内にすべての細胞を破壊させることが明らかになった。ついでオクタデカテトラエン酸のような高度不飽和脂肪酸はオクタデカテトラエン酸と同一の生理作用を示したが、オレイン酸とかリノール酸のように不飽和度の低い脂肪酸は活性が十分の一程度に低下することが明らかになった。藍藻の一種であるMicrocystisviridisから著者らは毒性を示す物質cyanoviridin RRを単離したが、この物質は7個のアミノ酸からなるペプタイドであり、そのアミノ酸の一つは3-amino-9-methoxy-2,6,8,-trimethyl-10-phenyldeca-4,6-dienoic acidであった。このアミノ酸の2-および3-位の立体配置は明らかになっているが、8-および9-位のキラリティ-は不明であった。本年度は合成によってこの立体配置を決定するための実験を行った。絶対配置のRであるmethyul3-hydroxy-2-methylpropionateをハイドライド試薬で還元して相当するアルコ-ルに変えたのち、酸化してRアルデヒドとした。S-型のアルデヒドもアルコ-ルの保護基の変換によって調製した。R-アルデヒドを臭化ベンジルから作ったグリニヤ-ル試薬と反応させ二種のジアステレオマ-を1:6の比で得た。それらの立体配置はNMRスペクトルの解析によって決定したところ、主生成物はβ-アルコキシレ-ト制御によって生成した立体配置を有していた。S-アルデヒドからも同様にして光学活性のジアステレオマ-2種を得た。これら4種の立体異性体をそれぞれメチル化してメトキシアルコ-ルとしたのち、ウレタン誘導体にした。これとは別にCyanoviridin RRをオゾン分解したのち、ハイドライド試薬で還元し、ついでフェニルイソシアナ-トによってウレタンとした。このようにして得られた天然のウレタンは8-S,9-Sの合成品と一致したのでこれによりアミノ酸の立体配置が決定した。
口腔粘膜遺伝子異常解析による肺がん発生高リスク群検出システムの構築

早期肺がんにおける特徴的なエピジェネティクス異常検出をめざした肺がん組織を用いた検討で、DLX4, PCDH10, MDFIのメチル化異常が、完全切除されたリンパ節転移陰性肺がんにおける予後関連因子である事を発見した。喫煙など有害環境因子の暴露は肺組織のみならず気道全域に及ぶと考え、口腔粘膜のエピジェネティクス異常解析を行い、肺がん発生高リスク群同定に繋がるマーカーの検出を試みた。早期肺がん患者で高頻度にエピジェネティクス異常を呈した遺伝子群の口腔粘膜プロファイルを作成したところ、肺がん患者でGDNF, RARB, HS3ST2, HOXD11が有意に高頻度のメチル化異常を呈していた。肺がん発生高リスク群を効率的に選定できれば、CT検診やPET検診などと連動し、社会全体として低コストでの早期肺がん患者発見に繋がると考え、本研究は、肺がん組織だけではなく容易に採取可能な口腔粘膜を用いた解析を通して、肺がん発生高リスク群の同定に繋がる分子生物学的マーカーの確立を目的としている。肺がん発生の主因である喫煙・大気汚染などの環境要因は、肺組織のみならず口腔内を含めた気道全域に直接影響をあたえるとの仮説から口腔粘膜に注目し、環境要因に影響を強く受けるとされるDNAメチル化やmicroRNAを指標とした検討を行うことを計画した。平成26年度は、まず切除した肺がん組織を用いてDNAメチル化異常と臨床病理学的因子についてその関連性を評価した。過去に報告がほとんどない遺伝子を中心に解析を進め、DNAメチル化異常が肺がんにおいて効率に発現する遺伝子、予後と関連する遺伝子、進行度と関連がある遺伝子、併存疾患との関連など幅広い検討を行い、遺伝子プロファイルの作成をすすめた。これまでの検討より、本研究からの派生的結果ではあるが、完全切除された病理病期1期肺がんにおいての術後予後因子となりうるDNAメチル化異常を複数個発見し、国際ジャーナルならびに国際学会で報告した。口腔粘膜におけるDNAメチル化異常の解析も進めており、肺がん組織の結果(プロファイル)を考慮し、肺がん組織と口腔粘膜との遺伝子異常の関連性などについて検討をすすめている。また環境因子を総合的に表す指標として酸化ストレスに注目し、DNAメチル化異常との関連についても解析を進めており、平成26年度に得られた基盤的な解析結果をもとにした多面的な解析を進めている。肺がん発生の主因である喫煙・大気汚染などの環境要因は、肺組織のみならず口腔内も含めた気道全域に直接影響を及ぼすと考えられる。肺がん組織以外の気道上皮における遺伝子異常については十分に解明されていないため、口腔粘膜の遺伝子異常解析が肺がん発生高リスク群の選定に有用な分子生物学的マーカーとなりうるか検討することが本研究の目的である。昨年度から継続して切除した肺がん組織における遺伝子メチル化異常について広く検討を行い、早期肺がんでも多くはメチル化異常の発現を認める遺伝子をいくつか検出した。これらの中で、早期肺がんの術後予後因子となりうる遺伝子メチル化異常を分子生物学的マーカーとして同定し、国際学会での発表(2編)および国際ジャーナルでの掲載にいたった。比較的早期の肺がんでも多く検出されている遺伝子メチル化異常について、口腔粘膜における解析も進め、国際学会において発表(2編)を行い、現在論文作成中である。また環境因子の総合的指標である酸化ストレスや血中アディポネクチン値などとの関連についても検討が進んでおり、2016年度は学会発表を予定している。自施設での検体(手術標本・口腔粘膜)を用いた解析はおおむね順調に進んでおり、国際での学会発表や国際ジャーナルへの掲載も達成できている。本年度はさらに血液を用いた解析もすすめてきた。また肺がん以外の慢性呼吸器疾患(COPDなど)を対象とした検体採取も進めており、2016年度は解析段階にはいる予定である。しかしながら連携協力者施設との多施設共同での研究は進捗状況が思わしくなく、今後の進展にむけて努力が必要な状況である。最終年度に実施した研究成果1)早期肺がんにおいて予後因子となりうる遺伝子エピジェネティクス異常について、これまでに報告されていない複数の遺伝子について検討を行い、MDFIが分子生物学的マーカーとなる可能性を発見した。国際学会での発表に続いて現在論文作成中であり、近日投稿予定である。2)肺がん発生リスクと関連する口腔粘膜遺伝子異常について、遺伝子メチル化異常が分子生物学的マーカーとなりうる新規遺伝子を複数発見し、現在論文作成中である。また昨年までに検出・発表・報告してきた複数遺伝子メチル化異常について統合解析を行うことで、肺がん発生リスク群同定における正確度の向上につながる可能性について発表予定である。3)がん発生に関する環境因子として酸化ストレスと肺がん組織メチル化異常の関連性について遺伝子異常のプロファイル作成を進めており、今後発表予定である。研究機関全体を通して、早期肺がんにおいて予後因子となりうる遺伝子エピジェネティクス異常について、複数の新規遺伝子が分子生物学的マーカーとなりうることを発見できた。中でも2014年のSociety of Thoracic Surgeryでの発表は優秀ポスターに選定され、また複数の英文原書ならびに英文総説を発表した。肺がん発生リスクと関連する口腔粘膜遺伝子異常についても、新規遺伝子を複数発見し、国内外での学会発表をならびに英論文による発表を行った。今後は多施設・多数症例での批准・検討を計画しており、現在調整中である。早期肺がんにおける特徴的なエピジェネティクス異常検出をめざした肺がん組織を用いた検討で、DLX4, PCDH

10, MDFIのメチル化異常が、完全切除されたリンパ節転移陰性肺がんにおける予後関連因子である事を発見した。喫煙など有害環境因子の暴露は肺組織のみならず気道全域に及ぶと考え、口腔粘膜のエピジェネティクス異常解析を行い、肺がん発生高リスク群同定に繋がるマーカーの検出を試みた。早期肺がん患者で高頻度にエピジェネティクス異常を呈した遺伝子群の口腔粘膜プロファイルを作成したところ、肺がん患者でGDNF, RARB, HS3ST2, HOXD11が有意に高頻度のメチル化異常を呈していた。過去の手術検体である肺がん組織を用いて、エピジェネティクス(DNAメチル化)異常の解析を、過去に検討が為されていない遺伝子を中心に実施し、これまでに複数個の遺伝子について肺がんの予後因子となる可能性について発見した。これらの成果を国際学会で発表並びに国際ジャーナルに投稿し、一部でacceptとなった。口腔粘膜を用いた解析も進めており、肺がん発生高リスク群の同定に繋がるDNAメチル化異常について、国際学会での発表を予定している。酸化ストレスについても測定を進めており、肺がんにおけるDNAメチル化異常と酸化ストレスの関連についても、検討を開始した。当初の予定より進んだ部分と、遅れている部分があるため、全体としてはおおむね順調と評価している。引き続き手術検体を用いた分子生物学的マーカーの検出を進めていく。本年度は研究補助員のサポートが得られる体制になったため、進捗状況の改善が期待される。連携研究者との連携を強化し、なんとか多施設での解析につなげたい。呼吸器外科連携研究者の施設からサンプル採取を含めた手続きを進めなければならない。また非がん患者のサンプル数が少ないため、本年度に呼吸器内科患者からも口腔粘膜のサンプル採取を行う必要があると考えており、現在施設IRBへの申請を行う段取り中である。口腔粘膜を用いた解析で、肺がん発生高リスク群の同定につながる遺伝子異常を発見できない場合でも、COPDなど気道の慢性炎症などとDNAメチル化異常の関連性について解析を進めることができると考えている。国際学会での発表を2回計画していたが1回のみとなったことが最大の理由である。一部サンプルでまかなってきた研究関連消耗品(器具や薬品)に関して本年度は出費が増加すると考えており、繰り越し分を使用する予定である。
レンサ球菌用改良選択培地の開発

病変部や生体試料からレンサ球菌を分離する選択分離培地には、市販の合剤を添加した血液寒天培地が利用されるが、この培地には他の多くの菌も発育する。一方、人獣共通感染症の原因菌である豚レンサ球菌は、ブタだ液中に最も優位に存在することが明らかにされた。しかし、選択培地で分離を試みた場合、分離率は良くて5%、悪い時には200コロニー拾っても検出できない。これは、現状の選択培地の選択性が弱いだけでなく、レンサ球菌の発育をも阻害していることを示す。本研究では、近年実用化されたオムニログシステムを利用し、レンサ球菌選択の最適条件を見つけ、信頼できる新たなレンサ球菌用選択培地を開発し、この分野の発展に資する。
ゲノム編集技術を応用した新規胃癌肝転移関連分子LAMP5の機能解析

予後不良な胃癌肝転移の診断・治療を進歩させるためには、胃癌肝転移関連分子の同定、及び機能の解析が不可欠である。本研究では胃癌肝転移症例から得た肝転移巣、原発巣、正常胃粘膜組織を対象に実施したTranscriptome解析から同定した候補分子LAMP5の機能を調べる。すでにLAMP高発現胃癌細胞株に対してゲノム編集を行い安定的LAMP5ノックアウト胃癌細胞株を樹立した。このLAMP5ノックアウト胃癌細胞株を活用し、LAMP5の胃癌細胞機能と肝転移巣形成能への影響を調べるとともに、その外科切除標本や血液における発現と転移・予後との相関を明らかにする。
ヌマエラビルにおける凍結耐性機構の解明とその利用に関する包括的研究

本研究ではヌマエラビルの飼育繁殖法が確立された大きな成果があった。しかし、これまでの研究からヌマエラビル抽出物(カルノシンも含めて)には氷結晶成長を抑制する効果が無いこと、また凍結したヒルの組織内細胞は多数ダメージを受けているにも関わらず高い復元性を示すことからヌマエラビルは凍結のダメージを抑制するのではなく、凍結ダメージから復元する高い能力を持っている可能性が示唆される。それにはメタボローム解析から見出された抗酸化能を有するカルノシンが関与している可能性も否定できない。カルノシンが乳酸菌の凍結乾燥耐性を向上させるなどの応用効果もそれを裏付ける一つの側面かもしれない。本研究は、ヌマエラビル(Ozobranchus jantseanus)の凍結耐性機構の解明、および体内に存在する保護物質を特定し、その利用性を明らかにすることを目的とする。H27年度は、ヌマエラビルの育種技術確立を目指し、宿主であるカメの飼育施設の設置を計画したが、設置場所の制約から、サイズ仕様の変更を行ったため、年度内に達成されなかった。引き続き、カメの飼育と当該寄生をする手法の確立をダウンスケールして検討する。一方で、近隣の池から採取できたヌマエラビルを用いて、凍結前後での細胞組織の構造変化の顕微観察を行ったところ、凍結条件によって一部、細胞核の損傷が観察された。細胞核の損傷と個体の生死について、手がかりとなる情報を得た。また、遺伝子からの予備情報としてゲノムサイズ決定、paired-endゲノムライブラリの作成等、トランスクリプトーム解析への準備が整った。上記と関連したメタボローム解析より、凍結前後で物質A(特許申請中)の体内濃度が優位に上昇することが明らかとされたため、物質A(特許申請中)の生物に対する凍結乾燥保護効果につき、確認試験を行ったところ、優位な効果が認められた。一方、凍結貯蔵したヌマエラビル体液を含む溶液中で生成した氷結晶成長の速度論的解析を行う手法の確立を行った。その結果、凍結貯蔵時間2時間以内で氷結晶成長を定量的に評価する方法を確立し、既往の方法と比較して、凍結貯蔵時間の短縮に成功した。1.ヌマエラビルの飼育技術の確立(鈴木大):当初予定していた実験施設(東京海洋大学吉田ステーション)の利用が困難となったため、新たに東京海洋大学品川キャンパス内に飼育設備を設置し、準備を進めている。2.ヌマエラビルの凍結耐性機構の解明<2.1.ヌマエラビルの凍結組織の静的形態評価・分光学的評価(代表者)>:現有DSCを用いて凍結・解凍を繰り返した個体の凍結状態・解凍後の状態の作成に成功した。さらに、蛍光顕微鏡で観察を行い損傷部位特定と氷結晶の局在状態の把握を行った。その結果、凍結は細胞内凍結、あるいは消化器官内容物の凍結であること、損傷を受けて一部の核の崩壊に関係していることが明らかにされた。<2.2.ヌマエラビルの遺伝子発現解析(黄川田)>:ヌマエラビルの凍結耐性の本質を解明すべく、ゲノム解析に着手した。フローサイトメーターを用いた解析から、ヌマエラビルのゲノムサイズは190 Mbであることが分かった。また、ゲノムDNAを単離し、1.5kbインサートサイズのpaired-endゲノムライブラリの作製、網羅的な塩基配列解析(PE100)を行った。<2.3.ヌマエラビルおよび体内成分の氷結晶成長に関する速度論的評価(萩原)>:凍結貯蔵したヌマエラビル体液添加溶液中で生成した氷結晶成長の速度論的解析を行う手法を検討し、2hr以内で氷結晶成長を定量的に評価する方法を確立した。<2.4.ヌマエラビルおよび体内成分のガラス転移特性評価(川井)>:黄川田Gによるメタボローム解析より、凍結前後で物質A(特許申請中)の体内濃度が優位に上昇することが明らかとされたため、生物に対する凍結乾燥保護効果の解明を前倒しで検討し、常温保存中に死滅する乾燥乳酸菌に物質A(特許申請中)を加えておくと、保存性が飛躍的に向上することが明らかとなった。本研究は、クサガメに寄生する"ヌマエラビル"の特異的な凍結復元性のメカニズム解明とその機能の応用を狙った研究である。昨年度までに宿主クサガメと共にヒルを飼育するための環境条件を検討し、ほぼ屋内飼育槽内での飼育法の見通しが得られた。一方、天然採取ヒルのメタボローム解析に続きゲノム解析を行なったものの、微生物のコンタミネーションが解析を困難にしていることが判明し、飼育法と合わせて対策をとることで最終年度にはゲノムの解析をまとめ、クサガメの特異性を明確にする。組織蛍光染色評価からは、ヒルが緩慢な凍結によってダメージを受けると核崩壊した細胞が増大することが明らかとなった。また、発生初期の卵には凍結耐性が無いことが示され、成体の凍結耐性メカニズム理解へのヒントが得られた。最終年度は、細胞ダメージと組織全体のダメージの定量的相関を明確にする。また、機能の応用として、現在のところ成分として唯一多く含有することが分かったカルノシンの氷結晶成長抑制、また乾燥耐性を評価したところ、氷結晶成長阻害効果は見られず、抗酸化能による保護効果が期待される結果が得られた。最終年度には、カルノシンまたはヒル体液のタンパク質凝集抑制、および膜機能健全化効果についても検討する。そして、最終年度として全成果から得られて知見を総合し、当初の目標に近づけるとともに、成果の公表を進める。

1.ヌマエラビルの飼育技術の確立(鈴木大):ヌマエラビルの分子系統解析を行った結果、種内の遺伝的変異が小さく、ホストの外来種クサガメとともに日本に侵入したと考えられた。また、飼育方法の確立に向けホストのカメとの飼育を継続し、水質記録とともに、ヒルの寄生率や成長段階について記録を続けた。2.ヌマエラビルの遺伝子発現解析(黄川田):既知のAFP (antifreeze protein)のホモログは少なくともトランスクリプトームデータ上には見当たらなかった。すなわち既知の凍結耐性因子のホモログでは無い新規の凍結耐性関連遺伝子が存在する事で、ヌマエラビルは凍っても死なない可能性がある。3.ヌマエラビルの凍結耐性機構の解明3. 1ヌマエラビルの凍結組織の静的形態評価・分光学的評価(代表者鈴木):組織学的にヌマエラビルは、超緩慢凍結では凍結によるダメージを受けることが判明。ダメージを受けた個体の組織染色観察の結果、細胞内の核構造が崩壊した細胞が組織内に多数派生することがわかった。3. 2ヌマエラビルおよび体内成分の氷結晶成長に関する速度論的評価(萩原):研究分担者黄川田氏によるメタボローム解析より体内濃度が有意に上昇したカルノシンについて、氷結晶の再結晶化抑制効果、タンパク質変性抑制効果を調べた結果、カルノシンには、有意な氷結晶再結晶化抑制能は認められないこと、同一重量濃度のスクロースと同程度のタンパク質加熱変性抑制能を有することが分かった。3. 3ヌマエラビルおよび体内成分のガラス転移特性評価(川井):ヌマエラビルから見出されたジぺプチドであるカルノシンが、凍結乾燥乳酸菌に対して、他の酸化防止剤と比較して高い保護効果を有し、保護効果は水分活性の高い領域において有効であることを明らかにした。一方、カルノシンの熱分析の結果、明確なガラス転移を捉えることができなかった。ヌマエラビルが個体として極端な耐凍結復元性を示すメカニズムに関して、氷結晶の生成以外に与える影響を調べ凍結体制に対する新たな視点の創生を目指した。1.飼育技術確立(鈴木大、鈴木徹):ヌマエラビルの育種に関して種々の条件設定を行いカメを使った継続寄生手法が完全に確立された。ヒルは34ヶ月周期で卵から成体への循環を繰り返し現在4世代まで育成確認した。しかし、ヒル単独繁殖には成功しなかった。2.ヌマエラビルの遺伝子発現機構(黄川田):ゲノム配列のアッセンブリスからトレス前後での遺伝子発現変動の解析を試みるも、個体数の不足から十分な結果が得られなかった。3.ヌマエラビル成分と耐凍結保護機能物質の機能評価3. 1組織切片を用いた保護効果の動的観察(代表者):種々染色法による組織学的なダメージ評価結果の結果、凍結により半数以上の細胞が崩壊しているにもかかわらず生体として復元する能力を持つことが示された。また頭部神経系除去試料も凍結耐性を示すことが判明した。3. 2凍結保護効果(萩原):ヒル生体に比較的多く含まれるカルノシンは氷結晶生成に与える影響は小さく、むしろ種々の酵素の活性を増大させる効果が見出された。これがヒルの凍結復元性に影響を与えていることが示唆された。造変化を抑制するか否かの検討を行う。3. 3乾燥保護効果(川井):前述カルノシンの乾燥保護効果について、乳酸菌を一モデルとして検討しカルノシン保護効果を確認し抗酸化能との関連性が示唆される結果が得られた。
スペイン・フランス神秘思想の研究

1.研究費申請の主たる目的であった必要な文献資料、とくに十字架のヨハネ(Juan de ia Cruz)を中心とするキリスト教神秘主義関連の原典および研究書類の入手に関しては、十全とは言えないがほぼ所期の目的が達せられた。ただし、購入に予定以上の費用がかかり、交付された研究費は全額が図書購入費に充てられた。2.それら文献を咀嚼しつつ並行して進められている神秘家テクストの読解・分析は、とくに筆者の中心的研究課題である十字架のヨハネに関して、これもほぼ予定範囲の進捗を見た。すなわち、一般にキリスト教神秘主義の頂点をなすとされる「神秘的合一(unio mystica)」なる事態を、彼がいかに語っているかに関する研究を、彼の最後の主著『愛の生ける炎(Llama de Amor Viva)』を題材に綿密に検討し、これを語る際に重要な役割を果たしている「中心(centro)」、「接触(toque)」、「かげ(obumbracion)」、「目覚め(recuerdo)」という四つのイメージをテクストから抽出し、それぞれの含みもつ「イメージの論理」を解明する論文を作成した。うち公刊できた論文は「中心」を主題とする一編のみだが、他に二編がほぼ成稿を見、一編が作成中である。これらと、既発表の成果を再編して、近年中に一冊の研究書として刊行を期している。3.また西洋神秘主義全般に関する研究としては、筆者の研究の重要な方法論的背景をなす現代フランスの代表的神秘主義研究者ミシェル・ド・セルト-(Michel de Certeau)の業績について、その全体像および学問的・思想的意義を明確にする研究を行った。その一端は学会発表し、部分的に短論文として発表した。他に、近世西欧の神秘主義言語の重要な構成要素をなす「女性的」および「性的」言語の性格に関する系譜学的研究も行い、これといわゆる宗教心理学の成立原理との関連を探るかたちで、その成果の一部を発表した。
アクチンダイナミクスに基づく非筋細胞運動の突出形成メカニズム解明

アクチンダイナミクスの動的再構築に関する数値解析と,細胞運動における突出端形成の定量的計測を融合させることにより,細胞運動における突出形成メカニズム解明を目指した.数値解析の結果,細胞内の多彩なアクチン構造形成には,アクチン濃度,および重合核形成に関する反応速度が関わることが示唆された.また,光応答性細胞培養基板を用い細胞を非対称に形状制御し,引き続き細胞運動を誘起した結果,細胞運動の開始には形状極性が重要であり,かつ核ー中心体ベクトルがそれに影響を及ぼすことがわかった.また,細胞内の焦点接着斑とストレスファイバの時空間形成ダイナミクスが,運動の方向性を決定する一つの要因であることが示された.本研究では,アクチンダイナミクスの動的再構築に関する数値解析と,細胞運動における突出端形成の定量的計測を融合させることにより,非筋細胞の運動駆動源である「突出」形成メカニズムを解明することを目指す.平成25年度は,物質・材料研究機構中西淳独立研究者から提供の光応答性細胞培養基板を用い,統一的細胞運動制御実験を実施した.細胞が運動を開始する際,その形状極性,すなわち形状の非対称性は,運動方向を決める重要な要因の一つであることが知られている.特に,核ー中心体ベクトルの向きは形状極性の指標であり,これもまた運動方向の決定要因の一つと考えられている.そこで,細胞の形状極性,あるいは核ー中心体ベクトルの向きのどちらが,細胞運動を開始する際の突出形成により重要であるかを明らかにすることを試みた.実験では,紫外光の一次照射により初期細胞形状を統一するためのパターニングを行った後,細胞を播種し,その形状を三角形に制約した.さらに,核ー中心体ベクトルが三角形の底辺側を向く場合と頂点側を向く場合のそれぞれにおいて,紫外光の二次照射により,細胞運動が可能となる基板の接着領域を拡張した.そして,細胞運動に伴う核および中心体の位置を観察した.二次照射後のタイムラプス観察の結果,三角形に形状を制約された細胞において,底辺側に運動方向を拡張した場合,核の移動を伴い大きく運動するのに対し,頂点側に拡張した場合は運動がみられなかった.また,大きく運動を開始した底辺側拡張だけに着目した場合,核ー中心体ベクトルの向きの違いにより,細胞の運動性に違いが見られた.以上より本研究結果,細胞が運動を開始する突出形成の際に,その方向を決める主因は細胞の形状極性であることが明らかとなった.アクチンダイナミクスの動的再構築に関する数値解析と,細胞運動における突出端形成の定量的計測を融合させることにより,細胞運動における突出形成メカニズム解明を目指した.数値解析の結果,細胞内の多彩なアクチン構造形成には,アクチン濃度,および重合核形成に関する反応速度が関わることが示唆された.また,光応答性細胞培養基板を用い細胞を非対称に形状制御し,引き続き細胞運動を誘起した結果,細胞運動の開始には形状極性が重要であり,かつ核ー中心体ベクトルがそれに影響を及ぼすことがわかった.また,細胞内の焦点接着斑とストレスファイバの時空間形成ダイナミクスが,運動の方向性を決定する一つの要因であることが示された.本研究では,アクチンダイナミクスの動的再構築に関する数値解析と,細胞運動における突出端形成の定量的計測を融合させることにより,非筋細胞の運動駆動源である「突出」形成メカニズムを解明することを目指す.研究初年度である平成24年度は,物質・材料研究機構中西淳独立研究者から提供の光応答性細胞培養基板を用い,細胞運動が統一的に制御された状況において,形状の時空間変化を観察し定量計測することを試みた.2008年から2009年にかけて,この光応答性培養基版を用いた統一的細胞運動制御実験の実験系を一度立ち上げ,その成果を論文に発表しており,今回も同様の手法を用いる予定で実験を開始した.しかし当時から実験室を移動したこと(理研から千葉大),また用いる光応答性培養基板が改良された新しい基板となったこともあり,再度実験系の立ち上げから行うこととなった.その結果,紫外光の一次照射により初期細胞形状を統一するためのパターニングが可能であることまでは確認できたものの,実際の細胞形状の統一実験,さらに紫外光の二次照射による細胞運動の統一的制御までには至らなかった.一方,細胞内に存在すると予想されるタンパク質の化学反応を考慮した,アクチンダイナミクスの動的再構築に関する数値解析については,これまで構築してきたモデルにはじめてArp2/3複合体によるアクチンフィラメントの分岐機構を導入した.これにより,予想されるすべてのタンパク質の反応を考慮したモデルが完成した.現在,モデル構築およびタンパク質の化学反応に基づくアクチンネットワーク形成像の特徴に関して,論文投稿準備中である.現在までの達成度は,実験面においてやや遅れているものの,数値解析面においては順調に達成されている状況である.物質・材料研究機構の中西淳研究者から提供された光応答性培養基板は,以前と比較しその性能が改良されたものであるが,一方で本実験室にて2009年までに構築した実験系をそのまま利用できるかについては不明点があり,その確認を兼ねた実験系の立ち上げから再度開始することとなった.実験への慣れに時間がかかったこと,紫外光照射に用いる光学系の一部が紫外光による劣化により機能しなかったことなどにより,紫外光の一次照射により初期細胞形状を統一するためのパターニングが可能であることを確認するまでに時間がかかった.一方,数値解析モデルの構築については,予定どおりこれまでのモデルにArp2/3複合体によるアクチンフィラメントの分岐機構を組み込むことができた.

これにより,細胞運動に伴い「突出」部位において形成されるアクチンダイナミクスに含まれると予想されるすべてのタンパク質の反応を考慮したモデルが完成した.平成24年度に引き続き,まずは光応答性培養基板を用い,紫外光の一次照射による細胞形状の統一的制御,および二次照射による細胞運動の統一的制御を可能とする実験系構築を急ぐ.構築でき次第,細胞運動が統一的に制御された状況において,その形状の時空間変化を観察し定量計測する.一方,数値解析の面では,平成24年度に構築したモデルを大規模な場にも適応できるよう,モデルの拡張を行い,濃度勾配が存在する細胞膜近傍の変形が解析可能となるモデルを構築する.そして,実験による細胞膜変形の定量計測結果を,シミュレーションモデルによる膜変形解析結果と比較することにより,マクロな細胞膜の変形とミクロな細胞内部のタンパク質ダイナミクスの関連を明らかにし,細胞運動の突出メカニズムの解明を目指す.平成25年度は,実験および数値解析に必要な消耗品,および実験補助者を雇用することによる謝金,さらには研究成果発表のための旅費等に研究費を使用する予定である.
病原体が持つ抗原変異多コピー遺伝子ファミリーのメタゲノム解析

本研究の目的は、病原微生物が抗原変異性を獲得してきたメカニズムを遺伝子配列の計算機解析によって解明することである。抗原変異は多くの病原微生物がホストの免疫系を逃れるために獲得してきた仕組みであり、ある種の病原微生物に対するワクチン開発が困難な理由の一つとなっている。そこで本研究では抗原変異に関わる遺伝子ファミリーを収集し、その配列を比較することにより抗原性獲得、特に配列多様性の獲得メカニズムについて明らかにする。このような解析は個々の遺伝子ファミリーではこれまでも進められてきたが、複数の遺伝子ファミリー、複数の生物種で解析するためのリソースはなかった。そのため、本研究ではデータベースをはじめとする計算機リソースを開発し、世界中の研究者がワクチン開発などに応用できるような解析環境も整備する。平成24年度は、ブロード研究所がシーケンシングしたデータのうち、抗原変異遺伝子群の一つであるrif遺伝子ファミリーのデータを公開前に解析する許可を得たので、解析を開始することができた。まず、得られたデータから抗原変異部位を抽出する方法を開発した。抗原変異部位は、定義からも分かるように多くの変異が入った部位であるため、よく保存された配列領域を使って抽出する従来手法はそのまま適用できない。そこで、今回は、ゲノム領域の中からよく保存された領域を除外する方法を取った。この方法が適用出来るかどうかを判定するために、リファレンスとして公開されているマラリア原虫ゲノムをランダムに抽出したデータを用いてテスト行ったところ良好な結果を得たので、今後引き続きrif遺伝子の抽出を進める予定である。平成24年度は、抗原変異遺伝子のデータベースvarDBの改良も平成23年度に引続き行った。抗原変異は多くの病原微生物がホストの免疫系を逃れるために獲得してきた機構であり、ある種の病原微生物に対するワクチン開発が困難な理由の一つとなっている。そのため、本研究ではデータベースをはじめとする計算機リソースを開発し、他の研究者がワクチン開発などに応用できるような解析環境も整備する。本年度は当初、米国ブロード研究所が進めている75個体のマラリア原虫Piasmodium falciparumから得られるrifin遺伝子ファミリーの系統解析をする予定だったが、解析に使えるだけのデータが公開されなかったため、データベースの開発に重点を置いて研究を進めた。まず、我々が既に公開している抗原変異遺伝子ファミリーのデータベースvarDBを改良するために、新規に導入する遺伝子ファミリーの検討を行い、ライム病の病原バクテリアBorreliaの遺伝子ファミリーを2種類追加した。また、既存の遺伝子ファミリーについても新たに配列検索をすることによって、約6,000の配列を追加した。varDBのインタフェースや配列更新の方法などについても検討した。本年度も、米国ブロード研究所からのデータ公開が遅れているため、データベース開発に重点を置き、解析はvarDBに登録しているデータで行った。varDBの更新は4ヶ月ごとに計4回実施し、遺伝子配列数で約2,000、タンパク質配列数で約1,300のデータを追加した。データ管理方法や検索・解析インタフェースの改良も検討し、リファレンスゲノム情報だけでなくサンプル、菌株、個体の情報を管理する枠組みを設計した。具体的にはPlasmoDBなど多くの病原微生物ゲノムデータベースで採用されているGUS(Genome Unified Schema)を利用したデータの管理とインタフェースの改良を進めている。ゲノムから抗原変異遺伝子ファミリーを検出する方法については、ファミリーサイズの大きさに着目し、パラロググループから候補を検出する方法を検討した。また、サブファミリーへの分類についてはpir(Plasmodium interspersed repeat)ファミリーに着目し、霊長類とげっ歯類のマラリア原虫で分類した。

まず、得られたデータから抗原変異部位を抽出する方法を開発した。抗原変異部位は、定義からも分かるように多くの変異が入った部位であるため、よく保存された配列領域を使って抽出する従来手法はそのまま適用できない。そこで、今回は、ゲノム領域の中からよく保存された領域を除外する方法を取った。この方法が適用出来るかどうかを判定するために、リファレンスとして公開されているマラリア原虫ゲノムをランダムに抽出したデータを用いてテスト行ったところ良好な結果を得たので、今後引き続きrif遺伝子の抽出を進める予定である。平成24年度は、抗原変異遺伝子のデータベースvarDBの改良も平成23年度に引続き行った。データ解析について、提供元からのデータの公開が遅れているため、もともと予定していたデータセットを用いた解析は進んでいない。しかし、それ以外のデータを用いた解析で代用しているため方法論の開発やデータベースの開発部分については順調に進展している。今後もメタゲノムデータが公開されないようであれば、別の共同研究先で出している実験室株のマラリア原虫と、その200世代子孫のゲノムデータを用いた比較解析で代用する予定である。varDBの改良については、本研究での設計に基づくバージョンを11月までに公開する。
口腔癌細胞の増殖を制御する圧受容チャネル分子機構の解明

本研究の目的は、口腔扁平上皮癌細胞の増殖に重要な役割を果たすと考えられる容積感受性Cl-チャネル(VRAC)の分子実体および増殖制御機構を解明すること、さらに、VRACと陽イオンチャネル(TRPチャネル)や水チャネルとの相互作用の全容解明を目指ことである。これらの分子機序を解明することにより、新たな分子標的を発見し、確実で安全な癌治療(薬)の開発を目指す。これまで、TMEM16A、LRRC8A及びbestrophin1(BEST1)が容積感受性クロライドチャネルの分子実体の候補と考えられてきたが、口腔扁平上皮癌細胞(HST-1及びHSC3)においては、TMEM16AとLRRC8Aの相互作用により容積感受性クロライド電流を制御していること、この容積感受性クロライドチャネルが細胞増殖に関与していること、容積感受性クロライドチャネルの選択的阻害薬であるDCPIBの投与により、アポトーシスが引き起こされること、本現象に対しBEST1は関与していないことを各種実験方法(パッチクランプ法、RT-PCR法、ウエスタンブロット、免疫沈降、In situ Proximity Ligation Assay(PLA)システム、フローサイトメトリー、WST-8を用いたセルカウント等)により明らかにしてきた。一方、TMEM16Aと各種TRPチャネル複合体形成についての実験については、RT-PCRにより、TMEM16Aと複合体を形成すると考えらえているTRPC1, V4, M7, P1, P2のいずれの遺伝子の発現が認められたものの、免疫沈降やPLAシステムにより複合体形成は確認できなかった。さらに、DNAアレイによる各種頭頸部癌における遺伝子の発現(TMEM16A、LRRC8Aおよびbestrophin 1)についての調査については、現在遂行中である。口腔癌細胞を用いたin vitroの実験について(電気生理、生化学、分子生物学的実験)はほとんど終了し、現在、in vivo実験を行っている最中である。DNAアレイによる各種頭頸部癌における遺伝子の発現(TMEM16A、LRRC8Aおよびbestrophin 1)についての調査についても、現在、解析中である。in vivo実験およびDNAアレイ実験の結果を分析し、今後、専門科学雑誌への投稿を行う。平成28年度の研究計画としては、in vitro実験における浸透圧受容による細胞増殖機構の解明として、1)BEST1の役割の検討、2)TMEM16Aと相互作関係の解明、3)非浸潤・非転移性口腔癌細胞や正常角化細胞へのTMEM16A挑んし導入による効果の検討であった。結果として、パッチクランプ法、RNAi、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー、セルカウント、In situ Proximity Ligation Assay(PLA)システム等を用いて、口腔癌細胞(HST-1及びHSC-3)と対照として非浸潤・非転移性口腔癌細胞(HSC-2)および正常角化細胞(HST-1)を用いて浸透圧変化によるTMEM16A、LRRC8AおよびBEST1の電流量や発現の変化、RNAiや阻害薬による影響、細胞増殖への関与、さらには各種遺伝子の浸透圧刺激による相互作用についての実験・検討を行った。結果として、口腔癌細胞では浸透圧変化(腫瘍周囲の慢性炎症に伴う浸透圧変化)がTMEM16AとLRRC8Aの相互作用によると考えられる容積感受性クロライドチャネルの活性化を介して細胞増殖が制御されていること、またこの容積感受性クロライドチャネルの活性化にはBEST1は関与していないことが強く示唆される結果を得た。遺伝子導入実験に関しては、TMEM16Aの遺伝子クローニングはすでに終えているが、現在、シークエンス依頼をしているところで、それが完了次第、発現ベクターに載せかえ、HSC-2およびHaCaT細胞への遺伝子導入による実験を行う予定である。なお、これまでの実験成果は国際歯科研究学会(2017年3月22-25日、於:米国カリフォルニア州サンフランシスコ)にて成果発表を行った。現在まで、予定していた各種実験は概ね順調に進行している。しかし、遺伝子導入実験に関しては、本年度行う予定であるが、遺伝子クローニングまで終了しているので、大幅な遅れにはなっていない。一方で、TRPチャネルの発現状況についての実験も併行して行なっているので、全体的には概ね順調に進行していると考えている。さらに今年度は、1)口腔扁平上皮癌細胞(HST-1及びHSC3)におけるTMEM16Aと各種TRPチャネル・水チャネル複合体形成及び機能解析と2)TMEM16AとLRRC8Aの相互作用をFRETにて観察することを目標として実験を行った。その結果、口腔扁平上皮癌細胞では、RT-PCRにより、TMEM16Aと複合体を形成すると考えらえているTRPC1, V4, M7, P1, P2のいずれの遺伝子の発現が認められたものの、免疫沈降やPLAシステムにより複合体形成は確認できなかった。さらに、FRETに関しては、TMEM16A及びLRRC8Aのいずれの遺伝子のクローニングは行ったものの、はっきりとした結果は得られなかった。

しかしながら、共同研究者及び連携研修者と相談し、PLAシステムにて結果が出ているので、FRETによる実験結果を示すことができなくとも本研究の遂行には影響がないことを確認した。今年度は、1)口腔扁平上皮癌細胞(HST-1及びHSC3)におけるTMEM16Aと各種TRPチャネル・水チャネル複合体形成及び機能解析と2)TMEM16AとLRRC8Aの相互作用をFRETにて観察すること、3)マイクロアレイ実験によるTMEM16A及びLRRC8Aの各種癌細胞における発現検索を目標として実験を行った。その結果、口腔扁平上皮癌細胞では、RT-PCRにより、TMEM16Aと複合体を形成すると考えらえているTRPC1, V4, M7, P1, P2のいずれの遺伝子の発現が認められたものの、免疫沈降やPLAシステムにより複合体形成は確認できなかった。さらに、FRETに関しては、TMEM16A及びLRRC8Aのいずれの遺伝子のクローニングは行ったものの、プローブのデザインによるものかわからないが、はっきりとした結果は得られなかった。一方で、マイクロアレイによる実験に関しては、研究費の関係上、遂行できなかった。本研究の目的は、口腔扁平上皮癌細胞の増殖に重要な役割を果たすと考えられる容積感受性Cl-チャネル(VRAC)の分子実体および増殖制御機構を解明すること、さらに、VRACと陽イオンチャネル(TRPチャネル)や水チャネルとの相互作用の全容解明を目指ことである。これらの分子機序を解明することにより、新たな分子標的を発見し、確実で安全な癌治療(薬)の開発を目指す。これまで、TMEM16A、LRRC8A及びbestrophin1(BEST1)が容積感受性クロライドチャネルの分子実体の候補と考えられてきたが、口腔扁平上皮癌細胞(HST-1及びHSC3)においては、TMEM16AとLRRC8Aの相互作用により容積感受性クロライド電流を制御していること、この容積感受性クロライドチャネルが細胞増殖に関与していること、容積感受性クロライドチャネルの選択的阻害薬であるDCPIBの投与により、アポトーシスが引き起こされること、本現象に対しBEST1は関与していないことを各種実験方法(パッチクランプ法、RT-PCR法、ウエスタンブロット、免疫沈降、In situ Proximity Ligation Assay(PLA)システム、フローサイトメトリー、WST-8を用いたセルカウント等)により明らかにしてきた。一方、TMEM16Aと各種TRPチャネル複合体形成についての実験については、RT-PCRにより、TMEM16Aと複合体を形成すると考えらえているTRPC1, V4, M7, P1, P2のいずれの遺伝子の発現が認められたものの、免疫沈降やPLAシステムにより複合体形成は確認できなかった。