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学部教育における文化を反映した看護倫理教育プログラムの開発と受講生の縦断調査

看護倫理教育プログラムを受講した看護学生の実習および卒業後の実践について縦断調査した。学生時代には医療現場での問題を倫理的推論にそって整理しており、プログラムの効果が示唆された。しかし卒業後の医療現場では、他職種との価値観の相違や現場の組織文化が影響要因となる葛藤に悩んでいた。以上より、基礎教育課程と卒後教育との連携や、医療現場での専門職種連携教育の必要性が示唆された。研究者らは,21世紀CDEプログラム「日本文化型看護字の創出、国際発信拠点-実践知に基づく看護学の確立と展開」の助成を受け開発した看護倫理教育プログラムを,千葉大学看護学部で平成17年から実施しており,本研究はこのプログラムの受講生の看護実習および卒業後の5年間にわたる倫理的推論能力の推移の実態調査と報告および,看護倫理教育に関する東アジアの拠点づくりと交流をめざす。平成19年度は,平成17年度自由科目「看護倫理」受講生7名と,18年度受講生6名のうち研究承諾が得られた学生または卒業生の計11名に対し,受講12年後の倫理的推論能力を明らかにするための調査を計画した。画接調査実施前に,改めて調査依頼を行い,承諾が得られた計7名の画接を行った。調査の結果,対象者全員に倫理的葛藤が体験されており,対象者はそれを倫理的推論にそって整理しており,プログラムの効果が示唆された。また調査で得られた倫理的葛藤の内容には,他職種との価値観の相違や現場の組織文化が影響要因として考えられるもが多かった。そして対象者からは。本調査をきっかけに葛藤が整理されたとの感想があった。以上より,本研究では,学生の倫理的推論能力の縦断的変化の実態のみならず,基礎教育課程と卒後教育との連携や,医療現場に携わる多職種の連携教育の必要性を示唆する資料が得られた。看護倫理プログラムの実際は,平成17年度、平成18年度の自由科目「看護倫理」の授業内容とその実際署をまとめ,千葉大学看護学部に報告した。平成19年度からは本プログラムは必修科目となり,80名の学生への授業科目として開始した。看護倫理教育アジアの拠点づくりと交流については,台湾で開催された第11回東アジア看護学研究フォ-ラムに研究代表者ら参加し,台湾、韓国湾の看護倫理教育カリキュラムについて意見交換を行い,今後の研究交流を企画することとなった。平成17・18年度にかけて開発した看護倫理教育プログラム暫定版にもとついて実施した授業を受講した卒業生のうち3名から、卒業後1年目の臨床現場で体験する倫理的ジレンマと、倫理的感受性に関する縦断調査についての研究協力を得た。協力が得られた卒業生に対する面接時間は60分70分間であった。3名が所属する医療施設はすべて異なるが、いずれも200床以上の大規模病院に所属していた。臨床現場で体験する倫理的ジレンマに関する語りを抽出するとともに、現時点での倫理的感受性について考察し、以下の特徴を明らかにした。・卒業後1年目といえども倫理的価値を反映して行動し、倫理的ジレンマを感じつつも、日々の実践のなかで看護を実現しようとしていた。・倫理的ジレンマの焦点とそれが動いていくありようが、倫理的感受性の発達段階を示し、発達途上にあることを示唆すると考えられた。・卒業後1年目で経験する倫理的ジレンマは、身近にいる医師や上司となった看護師の行動や判断から、受講生自身がとらえたそれらの人々の倫理的感受性に影響されていた。以上より、本プログラム受講生は周囲の医療者の倫理的感受性に影響を受けており、1年目でありながら、受講生自身の倫理的価値を反映して看護を実現しようとしていることが明らかとなり、それがジレンマを助長することも懸念された。本プログラムの教育効果をより慎重に検討する必要性が明らかとなった。またこのことは、看護学教育のコアカリキュラムとして看護倫理教育のあり方そのものを、医療組織文化との関連で検討すベきことを示唆するものである。本研究の目的は、平成17・18年度にかけて開発した看護倫理教育プログラム暫定版にもとづき授業を実施し、これら受講生の看護実習および卒業後の5年間にわたる倫理的推論能力の推移の実態調査を行い、並行して東アジア諸国でも共同調査研究を行って学部レベルにおける各国文化を反映した効果的な看護倫理教育プログラムを確立し、看護学教育に従事する教員との間で共有することである。受講生のうち本研究への参加に同意した延べ12名の看護実習および卒業後の3年間の実態を追跡するため、面接調査を行った。その結果、対象者は、卒業後の臨床現場で、その医療組織における価値に戸惑いながらも自己の倫理的判断をもつがゆえに葛藤状況にあるという実態が浮き彫りになった。また並行して、東アジアにおける看護基礎教育に関する意見交換を行い、プログラムの交流に向けて英語冊子刊行の準備をした。
脊髄損傷再生医療における神経栄養因子を用いた内・外因性神経幹細胞の分化制御

筋肉内から軸索流にのり、逆行性に脊髄内へ神経栄養因子を導入する損傷脊髄に非侵襲的な手法を用い、神経保護効果、賦活化効果について検討を行った。本導入方法は、直接導入と遜色ない導入効率を示し、障害高位に応じてtarget organ(筋)を選択することが可能であった。また、脊髄損傷下では前角細胞のみならずグリア系細胞への導入も可能であることが示唆され、逆行性神経栄養因子遺伝子導入を用いた障害脊髄内の微小環境の改善が、脊髄神経グリア系細胞の神経保護効果、再生能力の賦活化効果、分化誘導などを介して、さらなる脊髄再生、機能回復に繋がるものと予想された。機械的圧迫・損傷を受けた脊髄再生には、神経栄養因子関連物質の補充とそれによる内因性神経幹細胞の活性化が必須である。これらを損傷部位に非侵襲的に達成するために、我々は、髄内への直接投与ではなく、target organからの逆行性神経栄養因子遺伝子導入を行い、残存ニューロンの生存維持、再生能力の賦活化効果、神経幹細胞の分化制御について解析することを目的として研究を行った。β-galactosidase,mouse BDNF,Nr-3,GDNF遺伝子を組み込んだ非増殖型adenovirus vector(AdV-LacZ,BDNF,NT-3,GDNF)を作製した。実験動物には、(1)急性脊髄損傷:頚髄圧挫損傷モデル、(2)慢性脊髄圧迫モデル:twy mouseを用いた。急性脊髄損傷モデルに対し、胸骨乳突筋からAdV-BDNFを導入した研究では、主に前角細胞の神経保護効果が確認され、またapoptosis抑制効果も確認された。慢性脊髄圧迫モデルに対しても、AdV-BDNF、AdV-NT-3の逆行性導入により前角細胞の神経保護効果、軸索伸長を確認した。逆行性導入は、障害脊髄に対して非侵襲的であり、直接導入と遜色ない導入効率を示し、持続するneurotrophic supportのため前角細胞に対して有用な保護効果が得られると考えられ、急性脊髄損傷のみならず、脊髄圧迫障害にも応用可能であることが示唆された。上記研究では、胸骨乳突筋をtarget organとしたが、損傷高位に応じてtarget organの選択が可能(胸髄は頚腰髄と比較して導入効率が低下するが)であることを確認した。内因性神経幹細胞発現は少なく、十分な機能回復にはつながらないため、外因性神経幹細胞移植と共に、逆行性神経栄養因子遺伝子導入を併用することでさらなる効果が期待され得ると思われる。脊髄損傷では、内因性神経栄養因子の欠乏による微小環境の変化が、neuronの細胞死、軸索変性、大部分の幹細胞のastrocyteへの分化誘導など、損傷を助長させ再生を困難にしている大きな要因の背景となっていると考えられている。このことから、神経栄養因子を外因性に投与することは合理的と考えられる。投与方法としては、髄内直接投与、クモ膜下腔投与、経静脈的投与などが報告されているが、それぞれ侵襲性や効率、他臓器への影響などの問題点を抱えている。我々はこれまで、脊髄に(1)非侵襲的(2)目的部位に効率的に導入(3)他臓器に影響を与えない、などの点で有利と考えられるmuscle(target organ)からの逆行性導入の手法を用い研究を行ってきた。逆行性に導入された神経栄養因子は理論的には軸索流を介し前角細胞に導入され、autocrine, paracrine機構を介し、周囲の神経グリア系細胞にも賦活化効果をもたらすものと考えられる。逆行性導入は軸索流を介したアプローチであるため、直接導入は前角細胞のみと考えていたが、今回の研究の結果からは、興味深いことに脊髄損傷の環境下ではグリア系細胞への直接的な導入も確認された。mechanismについてはさらなる検討を要すが、軸索の破綻、astorocyte, microghaの遊走、貪食作用など損傷後の脊髄内環境が関与している可能性が考えられる。神経栄養因子遺伝子逆行性導入により、neuron, oligodendrocyteのapoptosis抑制および、oligodendrocyteの前駆体のmakerであるNG2の発現上昇が確認された。逆行性導入では、neuronからautocrine、paracrine機構を介したtorophic effectsが神経保護効果の主なmechanismと考えられるが、グリア系細胞によるtorophic effectsの助長の可能性も示唆され、neuronやoligodendrocyteのapoptosis抑制、分化誘導をひとつの機序として、神経保護効果、再生能力賦活化効果をもたらすと考えられた。
数理物理にあらわれる非線形偏微分方程式の数値解析的研究

数理物理系によくあらわれる偏微分方程式の数値解を求める有力な手法としての有限要素法は、数理科学の分野では現在最も多く利用されている。しかし、非線形問題に対しては十分統一的な体系ができあがっていない。そのため今回の研究では、特に非線形境界条件を伴った放射冷却問題を中心テーマとしてとりあげて、有限要素近似におけるアルゴリズムの開発、誤差評価収束性など数値解析上の問題点を明らかにした。さらに関数解析、微分方程式論、作用素論などの結果を応用して数値解の数学的構造や性質について明らかにした。同時に大型電子計算機による数値実験も行ない理論の有効性を示した。次に個々の研究成果を列挙する。1.有限要素解が正則な鋭角型の三角形分割の下で真の解に一様収束する。2.非線形方程式を解くために、上と下から収束する単調陽型反復法を提案し、そのアルゴリズムが収束することを証明した。3.勾配平均化にもとずいて最適収束率を通常知られているオーダーより1だけ上まわる優収束する解も構成できた。4.非保存力学系の力学的対称性に注目すれば保存則も得られて、場の理論においても例証できた。5.ヒルベルト空間上の縮小作用素がバナッハ空間に拡張されて平均エルゴード定理も得られた。6.内積空間における中線定理がより一般化できることも示した。7.局所有限な微分作用素での不変となる条件をリー代数によって求めた。今後はさらに、差分法,ガレルキン法,有限要素法などの近似解法の長所や短所を精密に評価する数学的基準を求めて数値解析上の問題点を明らかにしていきたい。あわせてコンピューターによる数値実験も行ない理論と実際との統一を考えていきたい。
ガスセンサーヘム蛋白質の特異的リガンド識別と検出情報伝達機構の構造化学

O_2分子センサーであるEc DOSとHemAT-Bsを詳しく調べた。これらの蛋白では、N末端側にあるFe(II)ヘムにO_2,CO,或はNO等の2原子分子が結合するが,ターゲット分子が結合した時のみC末端側で機能(Ec DOSではリン酸ジエステル化活性、HemAT-Bsでは次の蛋白に情報伝達)を発揮する。蛋白の構造変化を紫外共鳴ラマン法で,ヘムの構造変化を可視共鳴ラマン法で検出し、蛋白の識別法と情報伝達の構造化学を解明した。呼吸酵素のプロトンポンプ機構についても調べたO_2分子センサーであるEc DOSとHemAT-Bsを詳しく調べた。呼吸酵素のプロトンポンプ機構についても調べた本年度は0_2センサー蛋白に焦点を合わせ、細菌(B.subtilis)のHemAT-BsとE.coliの、EcDOSを調べた。これらはN末端側で0_2を検出すると、C末端側で生化学機能を発現する。N末端側にはヘムがあり、ヘムに0_2が結合するとその周りにコンフォメーション変化が起こり、C末端側に構造変化を引き起こして、HemAT-Bs、では次の蛋白へ情報伝達して最終的にはその生物の走光性を変え、EcDOSではリン酸エステル化の酵素反応速度を高める。COやNOもヘムに結合するが機能発現は起こらない。大きさのよく似た2原子分子を蛋白質が識別して、シグナルを生み出すメカニズムを解明する事が本研究の目的である。ヘムに0_2,CO,NOと云った環境因子が結合した時のヘムの構造変化を可視光共鳴ラマン分光で,その時の蛋白部分の構造変化を紫外光共鳴ラマン分光で検出した。また,遺伝子操作で特定のアミノ酸残基(HemAT-BsではTyr13,49,70,133,148,184,Trp132,Thr95,His86、EcDOSではTyr55,Tyr80,Tyrl25,Tyr126,Trp53,Trp101)を部位特異的に置換した変異蛋白を作り,どの残基が変化するかを帰属した。どちらの結果も,国際的に評価の高いJ.Biol.Chem.にフルペーパーとして受理された。HemAT-Bsについて詳述すると、Fe-0_2伸縮振動から,0_2結合体に3つの構造があり,0_2と1番強い水素結合を作るものがシグナル伝達の活性種であった。COは水素結合を作らない。0_2の結合による水素結合状態の変化は,蛋白の全体構造に影響を与え,その大きさはCOやNOの場合とは異なっていた。換言すると,蛋白はその構造変化として、0_2,CO,NOの結合を識別している事が明らかになった。本年度は大腸菌のO_2分子センサーで、3'.5'-cyclic diguanylic acidのリン酸ジエステル化酵素活性を持つDOS蛋白(Ec DOS)を調べた。この蛋白では、N末端側にあるFe(II)ヘムにO_2,CO,或はNOと云った2原子分子が結合すると,C末端側にある触媒部位での活性は高くなるが,高くなり方は結合する分子種により異なる。EcDOS蛋白がどのようにして2原子分子を識別し、その検出を触媒部位に伝達しているかについて,リガンド結合によるヘムの構造変化を可視共鳴ラマン分光法で、蛋白部分の構造変化を紫外共鳴ラマン分光法で検出した.具体的な戦略として,活性のある野生株蛋白と,重要と思われるアミノ酸残基を1つずつ別のアミノ酸に置換した変異蛋白のラマンスペクトルを比較し,一方でその蛋白の酵素活性を見るという方法をとった。ラマンスペクトルの測定には,ヘム含有ドメイン(147残基、DOSHと略す)を用い,活性測定には全長の蛋白を用いた.DOSHには2個のTrpと5個のTyr残基が含まれ,部位特異的アミノ酸置換でそれらのラマンバンドの帰属をした。紫外共鳴ラマンスペクトルより明らかになった事は、2原子分子の種類によりDOSH蛋白部の構造変化が異なる事である.例えば,2-ビニル基の近くにあるTrp53はO_2結合でより疎水環境に移るが,CO結合では親水的環境に移る.そして、W53F変異体のリガンド結合形は野生型より活性が低かった。ヘムにO_2が結合するとTyr126とAsn84間に強い水素結合ができ、ヘム側鎖プロピオン酸基の構造変化がそのAsn84との水素結合を通じてTyr126にO_2結合を伝達する事がわかった.CO結合形のCO光乖離による蛋白構造変化のダイナミクスを時間分解ラマン法で調べた.Arg97とPhe113の変異体はCO光乖離後のMet95のヘムへの過度的配位に強い影響を与えた。此の事からArg97側鎖の静電相互作用とPhe113側鎖の立体障害がCO光乖離後のMet95とCOの競争的再結合を制御している事が想像された.これらの観測から,ヘムから蛋白への情報伝達に対するモデルを提案した.
ゲノム情報を利用したハイブリッドライス生産性の生理生態学的解析

稲はジャポニカ(ssp. japonica)とインディカ(ssp. indica)の2つの亜種を含む。これら亜種間の交配は稲の育種には滅多に用いられてこなかったものの、バイオマスやストレス耐性など多くの農業形質において顕著な雑種強勢が現れることはよく知られてきた。こうした機構の解明は、稲の育種に大きく資するものと考えられる。本研究では、高い雑種強勢を示すジャポニカ×インディカ交配組合せによる分離集団において、各種の農業形質が遺伝的にどのように制御されているかを、DNAマーカーを利用した量的遺伝子座解析法(QTL解析法)によって解析した。解析にあたっては、研究代表者によって独自に育成された集団である熱研2号(ジャポニカ型改良水稲品種)×伽椰(インディカ型改良水稲品種)組換え近交系、亀の尾(ジャポニカ型在来水稲品種)xDular(インディカ型在来水陸稲品種)組換え近交系およびIR36(インディカ型改良水稲品種)xGenjahWangkal(ジャポニカ型在来水稲品種)組換え近交系を用いた。解析の結果、これまで遺伝的制御様式が未知であった多くの形質(出葉間隔、穎花退化など)についてQTLが明らかとなるとともに、多くの形質において、ジャポニカ由来の遺伝子とインディカ由来の遺伝子の間の遺伝子間相互作用(エピスタシス)が超越分離に密接に関わっていることが明らかとなった。なお、ある形質(例・分げつ数)のQTLが、積の形で働く2形質(分げつ休眠と出葉間隔)の、連鎖した微少なQTLの複合体であるケースなども見いだされたが、このことは、エピスタシスが必ずしも遺伝子間の分子的な相互作用だけでなく、こうした形態レベルでの形質の成り立ちに関わっている可能性を示唆しており、興味深い。本計画は、イネの生理生態学的研究にゲノム学の手法を援用する試みの1つとして、ハイブリッドライスの生産性に関する諸特性を対象としたQTL解析を行おうとするものである。今年度は、ハイブリッドライスの示す雑種強勢は分げつ数に最も強く現れることを考慮し、強いヘテロシスを生じるインディカx熱帯ジャポニカの組み合わせを対象に、分げつ数のQTL解析を行った。IR36(インディカ)とG.Wangkal(熱帯ジャポニカ)の組み合わせによる組み換え自殖集団を用いて分げつ数のQTL解析を行ったところ、分げつ数のQTLが数個検出されたが、個々の作用は特定の節位・次位の分げつに限られていることがわかった。理論上、1次の分げつに関与する遺伝子と2次の分げつに関与する遺伝子が異なる場合、両者の間には、積の関係にある遺伝子間相互作用(multiplicative epistasis)が検出されることになる。このことより、従来より報告されてきた分げつ数QTLの間の相互作用(雑種強勢の機構の1つと考えられてきた)の多くは、こうした視点から説明できるものと考えられた。また、分げつ数のQTLと同定された染色体領域は、実際には、分げつ芽の休眠に関わる小さなQTLと、かたや出葉間隔に関わる小さなQTLの連鎖が見られる場合があった。分げつ休眠と出葉間隔もまた積の関係にある遺伝子間相互作用を示すことになる。このように、従来より雑種強勢の主要な機構と考えられてきた遺伝子間相互作用の実態は、遺伝子間のクロストークよりもむしろ形態レベルのインテグレーションに起因する可能性が高いものと判断された。

本計画は、イネの生理生態学的研究にゲノム学の手法を援用する試みの1つとして、ハイブリッドライスの生産性に関する諸特性を対象としたQTL解析を行おうとするものである。今年度は、ハイブリッドライスの示す雑種強勢が分げつ数に最も強く現れることを考慮し、分げつ数に強いヘテロシスを生じるインディカxジャポニカの組み合わせを対象に分げつ数のQTL解析を行った。まず、伽耶(インディカ)と熱研2号(ジャポニカ)の組み合わせによるF1ハイブリッドを対象に分げつ発育を解析したところ、F1における分げつ数のヘテロシスは前葉節(それぞれの分げつの最基部の節)における分げつ芽の休眠解除によっていることが判明した。そのため、これら2品種の組み換え自殖集団を用いて前葉節分げつのQTL解析を行ったところ、前葉節分げつの休眠解除はいくつかのエピスタシスQTLの対によって制御されていることが判明した。それらはいずれも、伽耶の対立遺伝子と熱研2号の対立遺伝子の組み合わせによって前葉節分げつの休眠解除が促進される型のエピスタシスであった。また、これらQTLの1つは、トウモロコシの分げつ性遺伝子であるteosinte branched 1のイネ相同遺伝子の座位とほぼ一致した。なお、インディカとジャポニカの交配においてはしばしば後代に著しい少げつ個体が分離する。こうした現象はヘテロシスの裏返しと説明される場合があるが、この少げつは別な座位でのエピスタシスが関与する現象であることが判明し、前葉節分げつの休眠との関連は否定された。以上のように、イネのヘテロシスは多数のエピスタシスが関与して生じるものと推測された。とくに、ハイブリッドライスの示す雑種強勢が分げつ数に最も強く現れることを考慮し、分げつ数に強いヘテロシスを生じるインディカ×ジャポニカの組み合わせを対象に分げつ数のQTL解析を行ってきた。昨年は、伽耶(インディカ)×熱研2号(ジャポニカ)組み換え自殖集団を用いて分げつのQTL解析を行い、エピスタシスの関与の重要性を明らかにしたが、今年は、バイオマス生産を対象として同様の検討を行なうとともに、別の交配組み合わせによる組み換え自殖集団を用いて、昨年の結果の普遍妥当性を確認した。熱研2号×伽耶の組み換え自殖系統を用いてバイオマス生産に関わるQTLを同定したところ、半数近くのQTLが昨年同定した分げつ数のQTLと同座であったが、それ以外のQTLも含め、バイオマスの超越分離にはエピスタシスの関与が大であった。全表現型分散に占めるエピスタシスの累積寄与率は、多い場合で40%を上まわった。また、熱研2号×伽耶の組み合わせと並んで大きなヘテロシスを示す組み合わせである亀の尾(ジャポニカ)×Dular(インディカ)の組み合わせで組み換え自殖系統を作成し、同様の解析を行った。F5集団183系統を対象として、111個のSSRマーカーを用いて総長1447cMの連鎖地図を作製し、分げつ数を対象にQTL解析を行った。Dularと伽耶とは、同じインディカではあるが系統類縁関係はきわめて遠いものである。にも関わらず、結果は前年の熱研2号×伽耶の組み合わせときわめて類似しており、日印交配のもとで生じるエピスタシスのネットワークは非常に保存性の高いものであることが推察された。
老人性円板状黄斑変性症のレーザー光凝固成績向上のためのビデオ赤外螢光造影の応用

1.老人性円板状黄斑変性症の螢光眼底造影(FA)とビデオ赤外螢光造影(IA)で認められる脈絡膜新生血管(CNV)を光凝固し、光凝固成績とIAの有用性を検討した。(1)IAは大量の網膜下出血や滲出性色素上皮剥離を有する場合のCNVの検出に特にすぐれていた。(2)IAのみでCNVが明らかな場合、光凝固によるCNVを閉塞できる場合もあった。(3)典型的なCNVの造影パターンをFAで認めた場合、IAでは(1)同様の典型的な所見を示す場合(2)早期には充盈遅延による低螢光を示す場合(3)後期には全くあるいはほとんど色素の漏れを示さない場合(4)全く過螢光を示さない場合があった。(4)FAとIAの所見が異なる場合。凝固成績を上げるためにはIA所見について詳細な検討が必要である。2.IAで認められるCNVの栄養血管凝固の有用性を検討した。栄養血管の凝固によってCNV全体が退縮したものが8眼中5眼あり、栄養血管の凝固が有用であることが明らかになった。しかし大部分の症列で再疎通が頻回に生じ、栄養血管に対する数会の凝固が必要であった。栄養血管の凝固によって視力の悪化したものはなかった。以上のことから、中心窩CNVを有する例ではIAで栄養血管が造影された場合、CNV全体を光凝固する前に栄養血管に対する光凝固を試してよいと考えた。1.老人性円板状黄斑変性症が疑われた168症例178眼に対して、蛍光眼底造影(FA)とビデオ赤外蛍光眼底造影(IA)を行い、比較検討し、以下の結果を得た。1)FAで脈絡膜新生血管(CNV)の検出ができない場合(Poorly-defined CNV)にはIAが有用である場合の多いことが再確認できた。前年度には検討できなかった、FAでoozingを示すPoorly-defined CNVに対しても、IAではCNVが明らかになる場合の多いことがわかった。2)FAでWell-definedを示すCNVは、IAではFAと同様の典型造影所見を示す場合、初期にのみCNVの所見を示す場合、後期にのみ色素の漏れを示す場合、蛍光漏出を示さない場合の4通りがあることが明らかになった。3)IA初期にはCNVが低蛍光部を示す場合のあることが明らかになった。これは、CNVからの出血、滲出による蛍光のプロックである可能性と充盈遅延の可能性があると考えられた。2.カメラを交換し、IAの造影像の画質の改良が得られた結果、CNVの栄養動脈の造影像が明瞭にみとめられるようになった。その結果、中心窩に大型の脈絡膜新生血管板があり、CNV全体に対する光凝固によって視機能が障害されると考えられる場合に、この栄養動脈を凝固閉塞するという新しいレーザー治療の手技が可能になった。現在5例に試み、経過観察中である。3.IAとFA、FAのみを指針として従来の方法でレーザー光凝固を行った症例の治療成績の比較については前者の経過観察期間が不十分なため、次年度にもちこした。1.老人性円板状黄斑変性症80症例で蛍光眼底造影(FA)とビデオ赤外蛍光造影(IA)で、認められる脈絡膜新生血管をレーザー光凝固し、光凝固成績とIAの有用性を検討した。FAとIAで同一部位に同型の脈絡膜新生血管が造影されている場合には凝固成功率は高く、凝固回数も少なくてすむが、FAとIAで、同一部位に異なる型の新生血管が造影されている場合、および新生血管の部位も形も異なる場合では凝固回数は増え、凝固成功率は悪化した。IAでのみ認められる脈絡膜新生血管をレーザー光凝固し、約60%で新生血管を閉塞できた。

このことからレーザー光凝固成績を上げるためにはIAの脈絡膜新生血管造影像の解釈についてさらに検討が必要であると考えられた。2.IAで認められる脈絡膜新生血管の栄養血管凝固の有用性を検討した。栄養血管の凝固によって脈絡膜新生血管全体が退縮したものが8眼中5眼あり、栄養血管の凝固が有用であることが明らかになった。しかし大部分の症例で再疎通が頻回に生じ、栄養血管に対する数回の凝固が必要であった。栄養血管の凝固によって視力の悪化したものはなかった。以上のことから、中心〓脈絡膜新生血管を有する例ではIAで栄養血管が造影された場合、新生血管全体を光凝固する前に栄養血管に対する光凝固を試みてよいと考えた。現在使用中のIA装置では栄養血管の造影されるものは少数であり、Scanning Laser Ophthalmoscope、デジタルカメラの使用によって栄養血管の検出率を上げる必要があると考えた。色素上皮離は老人性円板状黄斑変性症の前段階になる可能性が高い。一方、老人性円板状黄斑変性症の初期病巣では色素上皮剥離を伴う場合がある。しかし、フルオレセイン蛍光造影では脈絡膜新生血管を検出できないことが多かった。筆者は100個の色素上皮剥離のフルオイセイン蛍光造影所見とインドシアニングリーン蛍光造影所見と比較した。インドシアニングリーン蛍光造影で脈絡膜新生血管が認められた39個の色素上皮剥離のうち、フルオレセイン蛍光造影で脈絡膜新生血管が認められたものは4個にすぎなかった。色素上皮下の脈絡膜新生血管はフルオレセインによる蛍光造影では発見が困難であり、従来は光凝固の適応になる場合が少なく、光凝固成績は不良であった。インドシアニングリーン蛍光造影により脈絡膜新生血管の検出率が上昇すると、レーザー光凝固の適応が増え、本病型を有する患者の視力予後は今後改善するものと考えられる。また、インドシアニングリーン蛍光造影で脈絡膜新生血管を認める色素上皮剥離では、インドシアニングリーン蛍光造影で後期に色素上皮剥離を示す過蛍光部内に低蛍光部がみられる場合に、脈絡膜新生血管が発生する可能性のあることがわかった。したがってこのような蛍光造影パターンを示す色素上皮剥離には注意深い経過観察が必要であると思われる。
摩擦係数のコントロールによる免震装置の相対変立の低減の実用化

本研究の目的は、免震構造において、応答加速度を大きくすることなく、摩擦係数、摩擦力をコントロールすることによって、相対変位を低減させることを解析モデルで明らかにし、摩擦係数、摩擦斜面の角度を設計し,実験装置を製作して、福井大学地震波再現装置を利用して,実地震波を入力して、免震効果を実験的に明らかにする。さらに,実験装置の解析モデルを構築して,シミュレーション解析により、実験結果を検証することである。免震装置は,ばねと質量との関係で、0.5Hzになるように,実験装置の質量と装置を支えるばね定数を決める。摩擦係数の変化の方法は,摩擦面の表面のあらさを2段階(μ=0.03と0.08)に変えていくことにより、応答変位を低減する実験を行っている。シミュレーション解析を行い、実験結果との比較を行っている。本解析モデルの有効性を検討している。解析モデルにより,実地震波での免震性能に,検証を行っている.さらに,摩擦斜面を利用するにより,相対変位の大きさに伴って,摩擦力を変化させる免震装署を製作して,免震性能を検証している.新たに,解析モデルを構築して,実験結果との検証を行っている.解析モデルによって,実地震波による免震性能の検証を行っている.本免震装置の応答変位低減効果についての有効性を示すことができた.実用化を進める大きな結果を得ることができた.本研究の目的は、免震構造において、応答加速度を大きくすることなく、摩擦係数、摩擦力をコントロールすることによって、相対変位を低減させることを解析モデルで明らかにし、摩擦係数、摩擦斜面の角度を設計し,実験装置を製作して、福井大学地震波再現装置を利用して,実地震波を入力して、免震効果を実験的に明らかにする。解析モデルにより,実地震波での免震性能に,検証を行っている.さらに,摩擦斜面を利用するにより,相対変位の大きさに伴って,摩擦力を変化させる免震装署を製作して,免震性能を検証している.新たに,解析モデルを構築して,実験結果との検証を行っている.解析モデルによって,実地震波による免震性能の検証を行っている.本免震装置の応答変位低減効果についての有効性を示すことができた.実用化を進める大きな結果を得ることができた.1.摩擦係数のコントロールによる免震装置の相対変位の低減について(1)摩擦係数をコントロールによる免震装置の相対変位の低減に有効であることを検討するための解析モデルを作成した。(2)免震装置の構造は摩擦面を下に向けて、可動部の下に取り付けて、地面(構造物)から摩擦面に対して、圧縮ばねを取り付けた支承棒で押しつけて、摩擦力を発生させるようになっている。(3)相対変位の大きさによって、摩擦係数を変えるシミュレーション解析を行い、免震装置の相対変位の低減に有効であることを確認した。(4)相対変位の大きさによって、摩擦係数を変えるモデルは実用的であると考えられる。さらに、実用的にするために、摩擦係数を2段階に変えるシミュレーション解析を行い、免震装置の相対変位の低減に有効であることを確認した。(5)摩擦係数を2段階に変えた摩擦面を製作した。(6)福井大学工学部建築建設工学科の地震波再現装置を用いて、実地震波を入力した免震装置の実験を行い、免震装置の相対変位の低減に有効であることを確認した。2.摩擦力をコントロールすることによる免震装置の相対変位の低減について(1)摩擦力のコントロールによる免震装置について、新しい解析モデルを作成した。(2)摩擦面を斜面にすることによって、摩擦係数が一定でも、摩擦力をコントロールすることができることがわかった。免震装置の構造は摩擦斜面を下に向けて、可動部の下に取り付けて、地面(構造物)から摩擦面に対して、圧縮ばねを取り付けた支承棒で押しつけて、摩擦力を発生させるようになっている。相対変位によって、支承棒のばねの変位が斜面への押しつけ力を変化させることによって、摩擦力がコントロールすることができる。(3)斜面の角度、斜面の摩擦係数、斜面の長さ等をパラメータとして、免震効果が有効になるパラメータをシミュレーション解析によって検討を行っている。解析モデルにより,実地震波での免震性能に,検証を行っている.

さらに,摩擦斜面を利用するにより,相対変位の大きさに伴って,摩擦力を変化させる免震装置を製作して,免震性能を検証している.新たに,解析モデルを構築して,実験結果との検証を行っている.解析モデルによって,実地震波による免震性能の検証を行っている.本免震装置の応答変位低減効果についての有効性を示すことができた.実用化を進める大きな結果を得ることができた.
子宮内膜の増殖と分化および癌化における性ステロイド受容体転写供役因子の関与

2次に子宮内膜増殖症(36例)、子宮内膜癌(55例)におけるこれら性ステロイド受容体転写供役因子の発現を免疫染色によって観察・検討した。増殖症ではCBPとSRC-1の発現は正常内膜増殖期とほぼ同等であったが、corepressorであるN-CoRの発現も増強しており、これが増殖症におけるKi-67が増殖期内膜より低値であった一因となっている可能性が示唆された。内膜癌では各因子の陽性例がCBP;49例(89%)、SRC-1;48例(87%)、N-CoR;13例(24%)、SMRT 15例(27%)であり、SRC-1陽性例は有意に高分化型癌に多く、SMRT陽性は有意に低分化型癌に多かった。しかしながらこれらの共役因子の発現とER/PR、Ki-67の発現には明らかな相関は見られず、また、予後因子としての意義もみられなかったことから、内膜癌においては共役因子がステロイドの効果発現に強く関与している可能性は低いと思われ、これがER/PR陽性の子宮内膜癌の増殖がしばしば性ステロイドに反応しない原因の一つである可能性が示唆された。現在これらの所見を投稿準備中である。2次に子宮内膜癌(55例)におけるこれら性ステロイド受容体転写供役因子の発現を免疫染色によって観察し、その意義を検討した。内膜癌では各因子の陽性例がCBP;49例(89%)、SRC-1;48例(87%)、N-CoR;13例(24%)、SMRT15例(27%)であり、SRC-1陽性例は有意に高分化型癌に多く、SMRT陽性は有意に低分化型癌に多かった。
Tenascin-Cによる歯髄幹細胞の活性を期待する機能性マトリックスの開発

本研究の目的は(Tenascin-C)TN-C添加をしたCollagen spongeを作製した細胞外マトリックスからなる機能性マトリックスをラット大臼歯の露髄部に填入封鎖した後に断髄面下で第三象牙質形成を誘導するかを分析し、覆罩材として有効かを検討することである。In Vivoの結果より5日後では機能性マトリックスと歯髄が結合し、1週間後では象牙芽細胞様細胞の配列が見られた。1か月後では第三象牙質の形成が認められた。このことからTN-C添加したCollagen spongeは生体親和性の高い覆罩材になりうると考えられた。今後、さらに硬組織形成能の評価を検討する予定である。歯科治療において可能な限り歯髄を残すことが望まれており、歯科臨床では歯髄を効果的に治癒させる新しい覆罩材が期待されている。覆罩材は生体親和性が高く、血液・滲出液を吸収かつ止血効果を有し、さらに歯髄幹細胞の増殖・分化する場を提供し、歯髄の石灰化を促すことが歯髄保護の成功率を上昇するものと考えられる。一方で細胞外基質の一つであるTenascin-C (TN-C)は創傷治癒時に種々なる組織で発現することが報告されており、歯髄の断髄面においてもTN-Cが発現していることが明らかになっている。申請者らはTN-Cを塗布した培養皿を作成した後に、その上に培養歯髄細胞を播種し、動態を解析した。その結果、TN-Cは効率的に象牙芽細胞様細胞の分化へ誘導できる環境を与える細胞外基質であることを示した。本研究の目的は歯髄覆罩材としてTN-Cをコートしたcollagen spongeが歯髄幹細胞の動態および硬組織形成細胞への分化、第三象牙質形成にどのような影響を与えるかを分析し、機能性マトリックスとしての有効性を評価することである。平成25年度の予定は、In vitro実験により、TN-Cをコートさせたcollagen spongeを作製し、その上にラット培養歯髄細胞を播種後の細胞増殖能と骨形成関連蛋白の発現を免疫組織化学染色法、RT-PCR法により検索する。TN-Cをコートさせたcollagen spongeを実験群、非コートcollagen spongeを対照群として比較し検証する。In vivo実験としてはラット臼歯の生活歯髄切断部にTN-Cをコートしたcollagen spongeと非コートcollagen spongeを充填・封鎖後に一定期間経過後、組織標本を作製し、H-E染色および骨形成関連蛋白の発現を免疫組織化学染色法にて分析する。申請者はin vitro研究結果からTenascin-C(TN-C)が歯髄幹細胞の分化及び増殖を促進し、硬組織形成能を有する細胞へと分化が亢進されることを明らかにし報告した。そこでin vivo研究によりTN-Cが歯髄断髄面で硬組織形成に作用するかを明らかにするため、ラット両側第一臼歯部を露髄させ、Recombinant TN-C(15μg/ml)をコートしたCollagen spongeを左側に填入した方を実験群とし、対照群は右側に非コートしたものを填入し、ラット術後の直後、1日、5日、1週間、1か月後に屠殺した後、上顎骨を摘出し組織標本を作製し分析した。また屠殺直前にはμCTで上顎第一大臼歯部を撮影した。1週間後では対照群において窩洞直下に肉芽組織と好中球の著明な浸潤がみられるのに対し実験群では窩洞下の象牙芽細胞様細胞の配列と線維の増生が認められ、1か月後では対照群では窩洞周囲に第三象牙質の形成がみられ実験群では窩洞周囲の第三象牙質の形成と髄壁内の石灰化の亢進が観察された。免疫組織化学染色法では1週間後で実験群の窩洞直下にNestin陽性細胞の出現および髄壁周囲の歯髄にOsteocalcinの陽性が観察された。μCT画像では1か月後に対照群と実験群において窩洞周囲に石灰化像が観察された。またIn vitro実験ではTN-CをコートしたCollagen spongeを実験群、非コートしたものを対照群として、それぞれに培養歯髄細胞を播種し1週間後の分化を定量的RT-PCR法で検索した結果、Notch1は実験群が対照群に比べて高く発現し、ALPは実験群と対照群で同等の発現を示した。これらの結果からTN-Cは歯髄の硬組織能を促進し、TN-CコートしたCollagen spongeは生体親和性の高い覆罩材になりうると考えられた。

保存治療系歯学In vitro実験では使用する培養歯髄細胞の細胞数が十分に得られず、そのため免疫組織化学染色法を中心した実験となり遺伝子の検索の進行に遅れが生じてしまった。D系雄性ラットの切歯より歯髄組織を採取し57継代し培養歯髄細胞を得た。Recombinant human TN-Cを10μg/mlの濃度に調整した溶液を培養皿に塗布した後2時間37°Cでインキュベートした。その後、PBSで2回洗浄後、冷蔵庫(4°C)で自然乾燥させた。この培養皿に細胞を播種し24時間後にホルマリンにて固定した後に免疫組織化学染色法にて細胞の硬組織関連タンパク発現を観察した。実験群としてTN-Cをコートした培養皿の培養歯髄細胞は対照群とした非コート培養皿の細胞と比較して硬組織関連タンパクであるAlkaline phosphataseとOsteocalcinの強い陽性を示した。次に機能性マトリックスを作製するためcollagen sponge (Atelo Cell)を96well中に静置した後にTN-Cを10μg/mlの濃度に調整した溶液を100μl添加した2時間37°Cでインキュベートした後、PBSにて洗浄し冷蔵庫(4°C)で自然乾燥させてTN-Cをコートしたcollagen spongeを作製した。Collagen sponge上に培養歯髄細胞数を2.5 ×104 cells/mlの密度で播種し3、7日後にホルマリン液にて固定した。その後、パラフィン浸透し、ブロックを作成後、薄切し標本を作製した。現在、HE染色法および免疫組織化学染色法にて検索中である。In vivo実験としてはSD系雄性ラットの上顎第一臼歯の咬合面にラウンドバーを用いて低速回転で窩洞を形成した後、μCTを用いて窩洞の直径と深度を確認しており生活歯髄切断したラットモデルを作製している。In vitro実験ではTN-Cコートしたcollagen sponge上の細胞を検索するにあたりパラフィン切片から得られた標本を用いた免疫組織化学染色法だけではなく免疫蛍光染色法により共晶点レーザー顕微鏡による観察も行う予定である。細胞数を充分に得たため、これと並行する形でcollagen sponge上の細胞からmRNAを抽出しcDNAに変換しRT-PCR法にて遺伝子発現を調べる予定である。In vivo実験では生活歯髄切断したラットモデルが確立してきたため、実験群としてTN-Cをコートしたcollagen sponge、対照群として非コートcollagen spongeを充填して、封鎖し、術後ラットを3、5、7、14、21日後に屠殺後、上顎第一臼歯を含んだ上顎骨を摘出し、ホルマリンにて固定した後、脱灰処理する。標本作製は通法に従い、採取したサンプルをパラフィン浸透し、ブロックとし、その後薄切して標本を作製していく。免疫組織化学染色法では、一次抗体として、細胞外基質の指標として(抗TN-C抗体)、歯髄幹細胞のマーカーとして(抗Stro-1抗体、抗CD44抗体、抗Notch1抗体)、象牙芽細胞の指標として(抗Nestin抗体)、硬組織形成能の指標として(抗Alkaline phosphsatase抗体、抗Osteocalcin抗体、抗Osteopontin抗体)を施行する予定である。実験補助およびデータ分析として使用する予定であった謝金の支出が予定より少なくなり、次年度使用額が生じた。
小児慢性疾患患者の「生活力」支援プログラムの作成および実施と評価

研究計画では、「体験型学習シナリオ」「教育ツール」「自己管理ツール」を作成する予定であったが、患者会などで、実際の患者さんとの交流も経て、「生活力」を育むプログラムとして、どのような形がよいのかを検討してきた、まず、私が行った先行研究の結果を参考にして、「体験型学習シナリオ」と「自己管理ツール」をあわせたツールを作成する方法に変更し、実際のツール案まで作成した。ツールは、マジック折りのリーフレットの形式で、ツール案を作成し、現在、専門家に質問紙調査を計画し、大学の研究倫理審査委員会に提出中である。この調査により、患者さんに合った表現のツールにできると考えている。先行研究の結果は、投稿予定であり、現在執筆中である。専門家への質問紙調査は、成人領域、小児領域の専門家に意見を聞く予定である。これは、成人移行期つまり、学童後期、思春期の患者への支援のひとつとして、小児だけでなく、成人の患者さんと関わっている専門家の意見についても、両方聞くためでもある。以上が、現在の研究の実績である。質問紙調査の後、マジック折りリーフレットの案の調整を図り、印刷してゆく予定で、見積もりはすでに取って準備状態である。実際に小児IBD患者が通院する病棟や患者会での実施ができるように調整中である。また、作成したツールは、ホームページを開設して、利用者や医療者が利用しやすくする計画である。方法が適切であるかを検討するのに時間をかけてしまったが、、「体験型学習シナリオ」と「自己管理ツール」をあわせたツールを作成することに変更して、検討し、ようやく、専門家への質問紙調査まで研究を進めることができた。当初計画していた「IBD教室」についても、実際に行うことが可能かどうかを検討し、対象者が、学童後期、思春期の患者であるために、「IBD教室」よりも、個別に関われる方法が適していると考える。まずは、「体験型学習シナリオ」と「自己管理ツール」をあわせたツールの実施を行って、修正もしつつ、完成したら、紹介機関などの活用場所を検討してゆく。ホームページで、利用しやすくする計画も考えている。当初の計画の、「その人らしく自立する」ための援助の重要性は、確認できた。「生活力」に着目し、今回作成したツールにおいて、まず、小児IBD患者での実施を行い、他の小児慢性疾患患者へ使用するための変更点や、共通な面を確認してゆく方向である。また、作成したツールは、ホームページを作成して、利用者や、医療者がダウンロードできるようにしてゆく予定である。1.「生活力」ニーズの質問紙調査は行えていないが、現時点では、自身の先行研究から導き出された「生活力」の2種類の分析結果を、小児看護学会や日本小児IBD学会、患者会等でポスター、口演で発表した。小児看護学会では、炎症性腸疾患(IBD)の研究経験のある人と検討し、小児IBD研究会は全員がIBDに関する専門家に報告できた。雑誌(CCJAPAN)で研究の一部が紹介され、子どものIBD患者会では「生活力」の表記への意見を頂いて修正した。IBD特に小児IBD患者が少ない中で、関係者に先行研究の結果を報告する機会としては、これらの発表は全国版であり有益であった。今後は計画通り「自己管理力」や「治療への参加」「自分の病気を知る力」「助けを依頼できる力」の視点で療養中の自分の持つ力を育成することの重要性が確認できた。成人患者が述べた「学力」についても、今後、患者が自立して診療を受けるには重要で「学力」は周囲の人々がいうよりも、実際の患者さんが述べている点で重要性が確認できた。計画の2年目は、全国版での質問紙調査で確認していく予定である。2.SSTを参考にした体験型学習シナリオで「自己管理力」の実践を育む計画だが、患者会では、思春期児が参加するか?といった疑問点などの検討もいただいた。ただ、Face To Faceの関わりのあと「メル友」になりたいという思春期患者さんもいて、少人数でもまたは個人でも、両用の実施も考えた学習シナリオの「実践版」や「冊子版」など、「疾患教育」以外の検討が必要である。3.患者会で、消化器症状の質問を「痛みのコンテンツ」が適切か、について尋ねた。「痛み」が出た時点では遅い、という意見があり、再考中である。症状悪化の兆しで「トイレ時間が次第に長くなって」と観察した親の意見など、便秘型、下痢型の人もいて、自分で症状を選んで記録するコンテンツの検討中である。計画自体は、予定していた質問紙調査の実施などはできていないが、シナリオやツールを考えていくにあたって、実際の患者さんや小児IBD研究をしている人たちに結果を公表して、意見をいただいた。これは、ツール作成にはいたっていないが、実践に使用できるように内容を検討するといった点で、おおむね進んでいると考えられる。作成したら変更がしづらいツールを作成するので、作成前には有効な活動だったと考える。今後は、全国調査などの情報の収集方法も行っていく必要がある。29年度は、炎症性腸疾患(IBD)の現状・実態について、再度把握し、今後の具体的な研究方法の実施について再考する1年となった。炎症性腸疾患については、成人が参加する患者会などで、学習会や患者同士の交流、意見交換をしたり、ホームページでは、患者の語りが掲載されている会もあり、成人の炎症性腸疾患患者の活動は、少しずつ拡大、共有されている現状がわかった。

都市Oの子どものIBDの会と、都市NのIBD(成人が対象)の両方の患者会への参加を継続し、会に出てくる患者さんの現状や実態を把握した。小児期発症の炎症性腸疾患患者では、高校生以上だと、患者会に出てくる方もいるが、多くは家族が患者会で情報収集をしていることがわかった。小児科から成人科に移行する移行期支援の情報収集も継続した。移行期支援においては、子どもの支援だけでなく、家族を支援することに関して、家族支援CNSを活用していこうとする施設など、小児慢性疾患の家族への援助に関する医療者の関わりも増えている現状がわかった。私が研究の対象とする、思春期(=成人移行期)への炎症性腸疾患の患者は、思春期に、病気を持ちつつ、学校に通いつつ、将来を模索する時期である。患者会など外の会には出る人、出ない人、考え方は様々あり、まず、自分で自分のからだに関心を持ち、自分の病気について知り、周りの助けも借りながら成長していく時期で、研究課題の自己管理を促すツール、人間関係をよりよくするツール等を作成し、「生活力」育成を提供する実施の必要性を大きく感じた。母親というよりも、家族に視点をもって家族支援も行っていくことの重要性も再認識した。30年度は思春期の患者で、その時は無関心でも、気になった時にひとりでも活用できる前述のツールを作成し、自立心を育む「生活力」育成の計画を実施する。家族支援へのツールも検討していく。先行研究結果から作成した質問紙調査の実施ができていないが、思春期の患者を対象に行うという点において、実施の具体的方法について、現状を把握し、検討できた。現状に合わせた実施が重要である。現状を検討している時期が長くなり、質問紙調査の実施が予定より遅れている。質問紙調査では、医療関係者、炎症性腸疾患の成人患者や、教諭、成人患者の家族を対象にして、思春期の子どもの生活力育成に役立つかを質問する予定である。質問紙調査により内容の妥当性を把握してから、実際のツールの作成をするので、ツールも作成が予定より遅れている。30年度は、1「生活力」の育成等の意見を聞く質問紙調査を、早急に実施し、2ツールを作成し、患者の意見、評価、家族の意見、評価を得る。研究計画では、「体験型学習シナリオ」「教育ツール」「自己管理ツール」を作成する予定であったが、患者会などで、実際の患者さんとの交流も経て、「生活力」を育むプログラムとして、どのような形がよいのかを検討してきた、まず、私が行った先行研究の結果を参考にして、「体験型学習シナリオ」と「自己管理ツール」をあわせたツールを作成する方法に変更し、実際のツール案まで作成した。ツールは、マジック折りのリーフレットの形式で、ツール案を作成し、現在、専門家に質問紙調査を計画し、大学の研究倫理審査委員会に提出中である。この調査により、患者さんに合った表現のツールにできると考えている。先行研究の結果は、投稿予定であり、現在執筆中である。専門家への質問紙調査は、成人領域、小児領域の専門家に意見を聞く予定である。これは、成人移行期つまり、学童後期、思春期の患者への支援のひとつとして、小児だけでなく、成人の患者さんと関わっている専門家の意見についても、両方聞くためでもある。以上が、現在の研究の実績である。質問紙調査の後、マジック折りリーフレットの案の調整を図り、印刷してゆく予定で、見積もりはすでに取って準備状態である。
神経膠腫アルキル化剤治療後の高度点変異誘導機序解明による個別化療法の開発

神経膠腫に対する標準治療薬はアルキル化剤であるテモゾロミド(TMZ)である。その主たる殺腫瘍効果であるO6-メチルグアニン(O6-MG)形成は、DNA複製の際にC:T transitionによる点突然変異が生じる源泉となる。経過が相対的に長い低悪性度神経膠腫でTMZ治療後に腫瘍が再発時に悪性転化し、点突然変異数が著しく多いhypermutator形質を獲得することから、このような神経膠腫に対するTMZ療法の是非が問われている。本研究では、TMZ及び他のアルキル化剤(特にニトロソウレア薬であるACNUなど)による神経膠腫細胞に対するhypermutator形質の発生度、その分子機序を解析し、薬剤の種類や腫瘍細胞の背景形質や遺伝子異常のパターンによる相違を明らかにすることで、TMZ治療におけるhypermutator化の危険因子を探索し、神経膠腫治療の基盤となるTMZ治療の良好な対象群を解明することを目的とする。我々の研究室で保有するヒト・グリオーマ細胞株、TMZおよびニトロソウレア薬(ACNU)への耐性の主因であるMGMTを強制発現した細胞株を用いて、TMZならびにACNUへの感受性をMTSアッセイを中心に実施し評価した。その結果、各薬剤への感受性が高い細胞株に対して、TMZあるいはACNUをsublethalな低濃度で持続暴露し、生存した細胞を引き続き同濃度濃度を増加して、再培養することで、各薬剤に対する耐性株の作成を試みた。それらの細胞株における治療耐性因子、特にMGMTおよびミスマッチ修復機構(MMR)に関与する遺伝子の発現状況をWestern blot法を用いて評価検討した。現時点では、MGMTの発現亢進がみられた細胞株は得られているものの、MGMT発現の増加なく、MMR関連蛋白の有意な変化を来した株は得られておらず、引き続きの耐性株作成、検討を行っている。TMZによるhypermutationの分子機序解明と、その克服法の開発が目的となる。我々の研究室で保有するヒト・グリオーマ細胞株、TMZ耐性グリオーマ株などを使用し、TMZ及びACNU等による治療をin vitroならびにin vivoで行い、治療後の生存細胞及び再発腫瘍を用いて、その遺伝子異常の変化につき解析を行うことを計画した。今年度は、グリオーマ細胞株のうち、既に先行研究でTMZおよびニトロソウレア薬であるACNUに感受性を示す細胞株、U251を主として用い、これら薬剤治療におけるIC50値を求めた。U251細胞株には、TMZおよびACNU耐性の主因と考えられているMGMTの遺伝子プロモーター領域のメチル化があることが知られており、そのためMGMT蛋白が発現していないことをWestern blot法で確認した。一方、U251にMGMT遺伝子を強制発現させたMGMT陽性U251株もこれまでの研究の中で作成しており、その株がTMZおよびACNUに耐性となるかを同様にMTSアッセイならびにWestern blot法で検討した。この基礎実験結果を基に、TMZ治療およびACNU治療がhypermutation形質、あるいはその前駆状態をもたらす可能性があるか検討するため、低用量の薬剤による持続治療を行い、治療後も生存する耐性細胞を収集し、薬剤耐性関連因子の発現状況を調べたところ、多くの場合、MGMTの発現が誘導されていることが明らかとなった。しかし、一部の細胞においては、MGMT発現の誘導は認められなかったため、引き続きミスマッチ修復機構(MMR)関連因子の発現変化を解析した。現時点まで、安定したMMR蛋白の変動は検証できておらず、引き続き治療-耐性細胞収集-因子解析を行っていく。また他の細胞株も使用する予定である。当研究室に保管するヒト悪性グリオーマ細胞株から、U251株以外の細胞株も用いて、治療感受性に関与が予想される分子の遺伝子異常や発現状況について検討する。特にTMZ、ACNU感受性に関与する遺伝子・因子(MGMT, MSH1, MSH6, MLH1, PMS2など)に加えて、hypermutatorに関連しえる遺伝子異常(TP53, IDH1/2, Rad51, Chk1/2など)、神経膠腫におけるdriver mutationなどをCancer Panel等を用いて検索し、それら遺伝子異常とTMZ治療後のhypermutationの有無の相関を検討する。遺伝子異常や蛋白発現異常を検出し、細胞の治療に対するcharacterizationを行う。これらの細胞をTMZ及びACNUで治療する。最終的に初年度に開始したTMZ及びACNU耐性株を作成を成功させたい。親株⇔耐性株間におけるMGMT statusとMMR機能・発現・遺伝子変異の変化の有無を解析する。樹立した細胞及び各親株のペアに対し、遺伝子変異の解析を行う。その上で、ヌードマウス脳腫瘍モデル(Nagane M, et al. Cancer Res 56: 5079-5086, 1996など)を用いて、遺伝子異常背景が明らかとなっているTP53野生型、TP53変異型の双方の細胞株の移植後、TMZあるいはACNUでマウスを治療し、治療後の再発腫瘍を摘出し、移植した親細胞と遺伝子変異にどのような差が生じているか、解析、比較評価する。これらの実験結果から、グリオーマ細胞において、hypermutationを惹起する因子として、MGMT、MMR、使用薬剤(TMZ/ACNU)の組み合わせ、その他有意な因子を総合解析する。