hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
染色体機能形成の階層性とゲノム反復DNA上のクロマチン構造の解明

染色体分配機能に必須なセントロメアでは、反復DNA(アルフォイドDNA)からなる巨大領域にヒストンH3バリアントであるCENP-Aを含んだクロマチンが集合し、これを足場に多様な因子群が集積し、キネトコア構造体が形成される。キネトコアでは微小管との相互作用により染色体の動きを調節する。一方、セントロメア内部ではヘテロクロマチンが集合し姉妹染色分体の接着・分離を調節する。しかし、同一反復DNAからなる巨大領域にどのようにこれらの異なるクロマチンが集合し、機能統合体としてのオーケストレーションを保つのかは不明なままである。そこで本研究では、セントロメアの階層的集合メカニズムを解明し、ヘテロクロマチンとの集合バランスとその変動が引き起こす影響について明らかにすることを目的とし、ヒト人工染色体(HAC)やChIP-seqによる方法を用いて(1)染色体機能形成の階層性とヘテロクロマチンの解析、(2)ゲノム反復DNA上のクロマチン構造の解析、に取り組む計画である。H29年度は以下の成果を得た。(1)染色体機能形成の階層性とヘテロクロマチンの解析:HACや合成反復DNAと各種融合タンパクを用いた構成生物学的手法を駆使して、KAT7とSuv39h1がお互いに拮抗的にセントロメアクロマチンとヘテロクロマチンの集合と抑制バランスに関わり、ゲノム機能の維持にも強い影響を与えることを明らかにした。(2)ゲノム反復DNA上のクロマチン構造の解析:ChIP Seq法により、ゲノム反復DNA上のクロマチン構造の解析を進め、CENP-Aクロマチン、CENP-B、ヘテロクロマチン(H3K9me3)、オープンクロマチン(H3K36me2/3)等の詳細な分布を明らかにした。29年度が最終年度であるため、記入しない。本代表者らはこれまでに、合成反復DNAを細胞へ導入して、セントロメア機能を獲得したヒト人工染色体(HAC)の構築に成功している。そこで本研究では、セントロメアの階層的集合メカニズムを解明し、ヘテロクロマチンとの集合バランスとその変動が引き起こす影響について明らかにすることを目的とし、HACやChIP-seqによる方法を用いて(1)染色体機能形成の階層性とヘテロクロマチンの解析、(2)ゲノム反復DNA上のクロマチン構造の解析、に取り組む計画である。H28年度は以下の成果を得た。(1)染色体機能形成の階層性とヘテロクロマチンの解析:合成反復DNAと各種融合タンパクを用いた構成生物学的手法を駆使して、KAT7とSuv39h1がお互いに拮抗的にセントロメアクロマチンとヘテロクロマチンの集合と抑制のバランス制御に関わることを明らかにした。(2)ゲノム反復DNA上のクロマチン構造の解析:ChIP Seq法により、ゲノム反復DNA上のクロマチン構造の解析を進め、CENP-Aクロマチン、CENP-B、ヘテロクロマチン(H3K9me3)の詳細な分布を明らかにした。(1)染色体機能形成の階層性とヘテロクロマチンの解析:tetO配列挿入反復DNAからなる人工染色体(tetO-HAC)とtetO-反復DNAの染色体挿入部を用い、tetR-各種融合タンパクを結合させる構成生物学的手法を駆使しながら、セントロメア・キネトコア因子群の階層的集合機構を解析した。その結果、セントロメアを決定するCENP-Aクロマチンの集合に必須なMis18複合体とヒストンアセチル化酵素KAT7(MYST2)が相互作用し、更にKAT7のアセチル化によりリモデリング因子のRSF1が集合することを発見した(Ohzeki et al DevCell 2016)。Mis18複合体の下流でのKAT7とRSF1の集合は、ヘテロクロマチン様に修飾されたヒストンでも交換反応を促進することで、その侵食をくい止め、同時に新しいCENP-Aクロマチンの補充を促進する反応にも関わっていることを明らかにした。(2)ゲノム反復DNA上のクロマチン構造の解析:セントロメアの巨大反復DNA領域のゲノム構造の解明は反復DNA解析の困難さに阻まれ遅れていた。CENP-Aクロマチン、CENP-B、ヘテロクロマチン(H3K9me3)がゲノム反復DNA領域上で実際どのように分布しているのかChIP Seq法により解析を進めた。各種解析ツールの組み合わせと実行パラメーターを反復配列用に最適化し、最新のヒトゲノム(バージョンhg38)と独自に作製した解析スクリプトを駆使して、ゲノム反復DNA上の詳細なクロマチン構造を明らかにした。これまでにヒト染色体セントロメア領域に同一の反復DNAファミリーに属するサブドメインを見つけ出し、これらサブドメイへのCENP-Aクロマチン、CENP-B、ヘテロクロマチン(H3K9me3)の分布にそれぞれ違いがあることを発見した。以上の成果に示した通り、計画は予定通り進展した。

染色体分配機能に必須なセントロメアでは、反復DNA(アルフォイドDNA)からなる巨大領域にヒストンH3バリアントであるCENP-Aを含んだクロマチンが集合し、これを足場に多様な因子群が集積し、キネトコア構造体が形成される。キネトコアでは微小管との相互作用により染色体の動きを調節する。一方、セントロメア内部ではヘテロクロマチンが集合し姉妹染色分体の接着・分離を調節する。しかし、同一反復DNAからなる巨大領域にどのようにこれらの異なるクロマチンが集合し、機能統合体としてのオーケストレーションを保つのかは不明なままである。そこで本研究では、セントロメアの階層的集合メカニズムを解明し、ヘテロクロマチンとの集合バランスとその変動が引き起こす影響について明らかにすることを目的とし、ヒト人工染色体(HAC)やChIP-seqによる方法を用いて(1)染色体機能形成の階層性とヘテロクロマチンの解析、(2)ゲノム反復DNA上のクロマチン構造の解析、に取り組む計画である。H29年度は以下の成果を得た。(1)染色体機能形成の階層性とヘテロクロマチンの解析:HACや合成反復DNAと各種融合タンパクを用いた構成生物学的手法を駆使して、KAT7とSuv39h1がお互いに拮抗的にセントロメアクロマチンとヘテロクロマチンの集合と抑制バランスに関わり、ゲノム機能の維持にも強い影響を与えることを明らかにした。(2)ゲノム反復DNA上のクロマチン構造の解析:ChIP Seq法により、ゲノム反復DNA上のクロマチン構造の解析を進め、CENP-Aクロマチン、CENP-B、ヘテロクロマチン(H3K9me3)、オープンクロマチン(H3K36me2/3)等の詳細な分布を明らかにした。(1)染色体機能形成の階層性とヘテロクロマチンの解析:tetO反復DNAとtetR-各種融合タンパクを結合させる構成生物学的手法を駆使しながら、セントロメア・キネトコア因子群の階層的集合機構の全容を解明する。一方、同じ反復DNA上にはCENP-Aクロマチンとは拮抗するヘテロクロマチンも集合する。細胞分化や老化に伴ってヘテロクロマチン(H3k9me3修飾)の強度が変化し、これがセントロメア機能に影響を与える可能性が示唆されている。そこで今後の研究では、セントロメアクロマチンとヘテロクロマチンの集合バランスと細胞老化等の制御機構との関連について明らかにする。セントロメアのCENP-A集合量を制御するヒストンアセチル化酵素KAT7(MYST2)をRNAiで減少させた場合にも、ヘテロクロマチンが増加して正常細胞で細胞老化が誘導されるかどうかについて検証する。また、多様なセントロメア因子群のノックダウンを行い、p53に依存する細胞老化誘導が起こるかどうかについても解析する。(2)ゲノム反復DNA上のクロマチン構造の解析:セントロメアの巨大反復DNA領域のゲノム及びクロマチン構造の解明を目的として、CENP-Aクロマチン、CENP-B、ヘテロクロマチン(H3K9me3)が実際どのように分布しているのかChIP Seq法による解析を進める。
患者由来iPS細胞を用いた骨髄異形成症候群における骨髄微小環境の役割に関する解析

骨髄異形成症候群の病態における骨髄微小環境細胞の役割について解析するため、患者骨髄細胞よりiPS細胞を樹立した。iPS細胞から造血幹細胞と間葉系幹細胞にそれぞれ分化させ、共培養により造血細胞の分化や形態に及ぼす影響を検討した。7-染色体異常を持つ造血細胞は、骨髄球系細胞の分化と増殖が阻害されていた。また、骨髄造血細胞と間葉系幹細胞を共培養し、造血細胞の分化について検討したところ、7-を有する骨髄造血細胞の形態異常を認めたが、正常造血細胞においても7-を有するMSCとの共培養において成熟異常を認めた。骨髄異形成症候群においては、異常クローンの骨髄間葉系幹細胞からの影響もあり得ることが示唆された。我々は、本研究において、骨髄異形成症候群(MDS)における造血幹細胞と骨髄微小環境との関係を明らかにしたい。特にMDS患者では、造血幹細胞に異常があると考えられているが、微小環境側の異常の有無についても明らかにしたいと考えている。MDS患者骨髄細胞由来のiPS細胞を作成することにより、そこから骨芽細胞を含む骨髄間葉系細胞に分化させることによって、その造血細胞に及ぼす影響について解析したいと考え、研究を計画した。大阪大学大学院医学系研究科血液・腫瘍内科学教室において保管されている骨髄異形成症候群(MDS)患者I症例の骨髄細胞を用いてiPS細胞株を樹立した。MDSの疾患細胞を区別するために、7(-)を持つ患者の骨髄細胞を用いた。MDS患者骨髄細胞からのiPS細胞の樹立は困難であったが、CD34陽性細胞を選択し、遺伝子導入を行うことによってiPS細胞株を樹立することができた。さらにそれぞれのクローンをFISHを用いて7(-)染色体異常の有無を検索し、数個の7(-)染色体異常をもつ細胞株を獲得することができた。これまでMDSの患者特異的iPS細胞を樹立することは困難であると言われているが、改良を重ね少数ではあるが疾患由来のiPS細胞を樹立できた。一方、正常臍帯血CD34陽性細胞からiPS細胞を樹立し、骨芽細胞、筋芽細胞、脂肪細胞への分化を確認するとともに、間葉系細胞への分化を試み、CD105、CD90の発現を確認した。iPS細胞の間葉系細胞への分化の系を確立した、当初、iPS細胞からシャーレ上で間葉系幹細胞に分化させる方法で健常人、及び患者由来の間葉系幹細胞を得る方法を予定していたが、健常人で安定した細胞を得ることができなかった。一方、近畿大学福田寛二教授らは、iPS細胞を投与したNODSCIDマウスのテラトーマから間葉系幹細胞を分離する方法を樹立したと発表され、その方法で間葉系幹細胞を得る方法を試行し、実験系を確立した。患者由来のiPS細胞については、1例で試行したが、うまくいっていない。骨髄異形成症候群(MDS)は、造血幹細胞に異常が生じ、成熟障害が起こることで発症するが、骨髄における造血環境もその病態に大きく寄与していることが報告されている。これまで、骨髄支持細胞において造血細胞と同様の染色体異常は報告されていないが、in vitroの培養や、造血幹細胞の移植によって同様の病態を再現することはできていない。本研究は、骨髄異形成症候群の遺伝子異常を有する骨髄支持細胞が造血に及ぼす影響について解析することを目的とし、研究を実施した。MDS患者の骨髄細胞よりiPS細胞を樹立した。7番染色体異常を持つMDS患者3名よりiPS細胞樹立を試行したが、1例のみ樹立できた。本iPS細胞より7番染色体異常を持つコロニーを3つ選択し、増殖させた。また、同iPS細胞株から間葉系幹細胞への分化を行い、間葉系幹細胞としての性質の確認を行ったが、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞への分化は確認できなかった。複数回の試行において分化が確認できなかったことより、本iPS細胞由来の間葉系幹細胞には分化異常があることが示唆された。一方、1本間葉系幹細胞と患者由来の造血幹細胞、2正常間葉系幹細胞と患者由来の造血幹細胞、3本間葉系幹細胞と正常造血幹細胞の共培養をそれぞれ行った。1および2において造血細胞の形態異常を認めたが、3についても形態異常を認めた。我々は、すでに健康人からのiPS細胞の樹立の方法は習得し、準備を進めていたが、骨髄異形成症候群の患者由来のiPS細胞樹立に難渋しているところである。疾患において何らかのエピジェネティックな修飾が入っているため、初期化することが困難と考えられる。情報の収集と改善方法の検討が必要である。血液内科学患者からのiPS細胞の樹立については、現在、1例で試行したが成功していない。

血液細胞からiPS細胞を作成する方法は、現在T細胞で行われているが、目的からは骨髄造血幹細胞からの樹立が必要である。患者由来のiPS細胞については、バンクからの供給の方法も考慮している。交付申請書における研究の目的では、疾患特異的iPS細胞から樹立した骨髄間葉系細胞や骨芽細胞と、正常造血幹細胞、正常骨髄微小環境細胞と疾患造血幹細胞との共培養を行うことにより、MDSの病態形成において骨髄微小環境の役割について明らかにすることを明記している。本研究において、共培養の系における細胞の観察や遺伝子解析は比較的スムースに行えると考えているが、iPS細胞の樹立やiPS細胞からの骨髄環境細胞への分化系の確立に時間を要することが当初より予想された。これまで、ほとんど実験系の確立に時間を要しているが、極めて困難な過程はおおむね通過したと考え、上記の評価を行った。さらに数例の症例についてiPS細胞の樹立を行う。樹立した疾患iPS細胞を用いて骨芽細胞、骨髄間葉系幹細胞への分化を試み、正常の骨芽細胞、骨髄間葉系幹細胞との違いを形態、遺伝子発現などにつき検討する。本研究における我々の主な目的は、患者由来の骨髄間葉系細胞が造血に及ぼす影響を解析することである。正常間葉系細胞と患者造血細胞、患者間葉系細胞と患者造血細胞、正常間葉系細胞と正常造血細胞とのそれぞれ共培養を行う。その上で、造血細胞の分化や増殖、アポトーシスに及ぼす影響を解析する。造血細胞と骨髄微小環境との関係は、決して一方的ではなく、相互作用が存在すると思われる。これらの培養系に於いて造血細胞における変化についての解析も極めて重要である。この培養系において有意なアポトーシスや形態異常が認められた場合、造血幹細胞を共培養することで各系統分化過程のどの段階でアポトーシスが誘導されるのか、それに呼応して誘導される分子についても解析を行いたい。
両棲類における内臓自律機能調節の発達

今回のプロジェクトでは、両性類における内臓自律機能調節とその発達について、嘔吐、消化管運動、および内臓自律機能調節中枢の三点をとりあげ、脊椎動物内臓調節機能の基本的メカニズムを考察するよう研究を企画・実施した。1.嘔吐について:アフリカツメガエル、トノサマガエルほか無尾類8種、およびカスミサンショウウオとニホンイモリの有尾類2種を用いて、ホ乳類で有効な吐剤である塩酸アポモルフィンと硫酸銅に対する反応、および嘔吐抑制剤メトクロプラミドの効果を生理・薬理学的、行動学的に詳細に調べ、両性類り嘔吐における一般的反応様式を明らかにした。これまでの研究で私ども(Hukuhara et al.,Jpn.J.Smooth Muscle Res.,9:1ー8,1973;Naitoh et al.,Mem.Fac.Sci.Shimane Univ.,15:57ー63,1981;Naitoh et al.,Physiol.Zool.,62:819ー843,1989)は、カエルの嘔吐メカニズムは基本的にはホ乳類と同様であると述べてきた。今回の研究はこれをさらに進め、カエルの嘔吐機能は系統発生上劣ると言われてきたこれまでの通説を否定するとともに、無尾両性類の嘔吐研究への有用性を示した(Naitoh et al.,Comp.Biochem.Physiol.,1991,in press)。なお、嘔吐は本来摂食と密接に結びついているであろうという作業仮説のもとに、摂食調節に係わると言われるCCKが嘔吐に関与するかどうかを、CCKを注射投与したカエルの嘔吐行動の観察と脳内CCK結合部位についての免疫組織化学的手法により調べた。しかし、CCKの嘔吐への関与の有無について明確な結論は得られなかった。2.消化管運動の発達について:オタマジャクシの成長に伴う消化管構造の変化には、部位なよって遅速がみられる。大腸では、変態開始以前に繊毛が消失する一方でカエル型の消化管運動(Hukuhara et al.,Jpn.J.Smooth.Muscle.Res.,8:85ー98,1972)が獲得されており、構造、機能ともに、成長途上大腸が最もはやく成体型に達すると思われる(Naitoh et al.,Comp.Biochem.Physiol.,97C:201ー207,1990)。また、カエル、オタマジャクシともに、大腸においては、消化管壁を構成する縦走筋および輪走筋が異なるリズム運動しており、両者が同期期して運動するホ乳類の場合と異なっている。メチレンブル-を用いた生体染色によると、ホ乳類に比べて無尾類の大腸壁内神経叢の網目構造は粗雑でかつ神経細胞数も少なくまた散在している。壁内神経叢が消化管運動の調節に深く係わることから考え、私どもは消化管を構成する縦走筋と輪走筋の協調運動は、壁内神経叢の発達と対であるという仮説を提唱した(Naitoh et al.,Comparative.Biochem.Physiol.,97C:201ー207,1990)。他方、胃および小腸は、形態、運動ともに変態期をとおしてカエル型に急速に移行・完成される。なお、オタマジャクシの胃、いわゆるマニコト、は変態後カエルの胃の中・下部に移行する。3.内臓自律機能調節中枢の発達について:迷走神経核にもっぱら焦点をあてて組織化学的研究を進めた。カエルおよびオタマジャクシの迷走神経切断枝からHRPをとりこませ、HRPーDAB法を用いて迷走神経核の神経細胞を染めだしたところ、大・小様々な神経細胞が観察された。核内の神経細胞数は、カエルのほうで少ない。特に顕著な点として、オタマジャクシで前方に位置する神経細胞群がカエルでは欠けている。核内の神経細胞と消化管各部との対応関係については結論を得るに至っていない。現在、変態後消失する器官をめじるしとしてこの対応関係を継続研究している。HRPによる染色以外に、DiIおよびtetramethylrhodamineによる染色を試みた。しかし、DiIについてはおもに色素移動に要する時間が長いために十分の検索ができるまでに至らず、結論が得られていない。また、tetramethylrhodamineを用いた染色では迷走神経核と消化管を結びつける結果は得られなかった。これら両者の方法についてはさらに検討を加え研究を継続したい。

今回の研究はこれをさらに進め、カエルの嘔吐機能は系統発生上劣ると言われてきたこれまでの通説を否定するとともに、無尾両性類の嘔吐研究への有用性を示した(Naitoh et al.,Comp.Biochem.Physiol.,1991,in press)。なお、嘔吐は本来摂食と密接に結びついているであろうという作業仮説のもとに、摂食調節に係わると言われるCCKが嘔吐に関与するかどうかを、CCKを注射投与したカエルの嘔吐行動の観察と脳内CCK結合部位についての免疫組織化学的手法により調べた。しかし、CCKの嘔吐への関与の有無について明確な結論は得られなかった。2.消化管運動の発達について:オタマジャクシの成長に伴う消化管構造の変化には、部位なよって遅速がみられる。大腸では、変態開始以前に繊毛が消失する一方でカエル型の消化管運動(Hukuhara et al.,Jpn.J.Smooth.Muscle.Res.,8:85ー98,1972)が獲得されており、構造、機能ともに、成長途上大腸が最もはやく成体型に達すると思われる(Naitoh et al.,Comp.Biochem.Physiol.,97C:201ー207,1990)。また、カエル、オタマジャクシともに、大腸においては、消化管壁を構成する縦走筋および輪走筋が異なるリズム運動しており、両者が同期期して運動するホ乳類の場合と異なっている。メチレンブル-を用いた生体染色によると、ホ乳類に比べて無尾類の大腸壁内神経叢の網目構造は粗雑でかつ神経細胞数も少なくまた散在している。壁内神経叢が消化管運動の調節に深く係わることから考え、私どもは消化管を構成する縦走筋と輪走筋の協調運動は、壁内神経叢の発達と対であるという仮説を提唱した(Naitoh et al.,Comparative.Biochem.Physiol.,97C:201ー207,1990)。他方、胃および小腸は、形態、運動ともに変態期をとおしてカエル型に急速に移行・完成される。なお、オタマジャクシの胃、いわゆるマニコト、は変態後カエルの胃の中・下部に移行する。3.内臓自律機能調節中枢の発達について:迷走神経核にもっぱら焦点をあてて組織化学的研究を進めた。カエルおよびオタマジャクシの迷走神経切断枝からHRPをとりこませ、HRPーDAB法を用いて迷走神経核の神経細胞を染めだしたところ、大・小様々な神経細胞が観察された。核内の神経細胞数は、カエルのほうで少ない。特に顕著な点として、オタマジャクシで前方に位置する神経細胞群がカエルでは欠けている。核内の神経細胞と消化管各部との対応関係については結論を得るに至っていない。現在、変態後消失する器官をめじるしとしてこの対応関係を継続研究している。HRPによる染色以外に、DiIおよびtetramethylrhodamineによる染色を試みた。しかし、DiIについてはおもに色素移動に要する時間が長いために十分の検索ができるまでに至らず、結論が得られていない。また、tetramethylrhodamineを用いた染色では迷走神経核と消化管を結びつける結果は得られなかった。これら両者の方法についてはさらに検討を加え研究を継続したい。
オニヒトデ新規ステロイド配糖体の構造多様性、神経突起誘導機構および薬理作用

沖縄で駆除の対象になっているオニヒトデから発見されたAcanthasteroside B3は、神経モデル細胞PC12に対し神経突起伸長活性を示す。その作用機構およびマウスに対する記憶改善効果について引き続き検討し、興味深い結果を得た。(1)作用機構:これまでに、acanthasteroside B3による神経突起伸長作用にはNGF受容体TrkAの活性化は必要ではなく、MEK-ERK経路、PI3K-Akt経路、Cdc42-p38 MAPキナーゼ経路の活性化が起こっていることが判明している。そこで、マウス脳内でのこれらキナーゼの活性化を調べるため、マウス脳内にacanthasteroside B3を注入したのち、脳を取り出し調べた結果、ERKが有意に活性化していた。(2)記憶改善効果:Acanthasteroside B3の記憶改善効果について加齢マウス(約10ヶ月齢)や老化促進モデルマウスSAMP8をもちいて調べた。これらの実験は前年度に行っているが、19年度は再現性を確認する実験をおこなった。その結果、同様の記憶改善効果が見られた。以上のことから、オニヒトデの神経突起伸長活性ステロイド配糖体は、神経疾患治療薬のシーズとして有望であることが判った。本結果と前項の結果を総合すると、マウスに投与されたacanthasteroside B3は、脳内に移行しMAPキナーゼ系を活性化し神経細胞ネットワークを修復している可能性が示唆される。今後、本物質の体内動態の解析が待たれる。神経疾患治療薬のシーズ開拓を目的として、ラット由来PC12細胞に神経成長因子(NGF)様の突起伸長作用を示す物質の探索を行った結果、沖縄で駆除の対象になっているオニヒトデから活性を示す新規ステロイド配糖体Acanthasteroside類を発見した。これらの中で最も高い活性を示したacanthasteroside B3の突起伸張活性の作用機構を調べた。まず、シグナル伝達経路上の各酵素の特異的阻害剤を用いた化学遺伝学的実験により、NGF受容体TrkAの活性化は必要ではなく、PI3キナーゼ、MEK(ERKキナーゼ)、p38 MAPキナーゼの活性化を通して突起伸張を誘導していることがわかった。中でもp38 MAPKの活性化が突起伸張に最も重要と考えられた。次に、シグナル伝達酵素の活性化をWestern blot法により調べた結果、TrkAのリン酸化は起こらず、MEK-ERK経路、PI3K-Akt経路、p38 MAPキナーゼのリン酸化が観測された。活性化が顕著なp38 MAPKの上流ではCdc42が活性化(GTP型)されていた。NGF様神経突起伸長活性を示すacanthasteroside B3が個体レベルで記憶や学習に何らかの効果を示すかどうかを、加齢マウス(約10ヶ月齢)を用いて評価した結果、Y迷路、新規物質認知テスト、受動的回避試験において一定の効果が見られた。さらに、老化促進モデルマウスSAMをもちいて同様の記憶学習実験を行った結果、同様の記憶改善効果が見られた。
英語焦点構文の非焦点的分析

It was Marythat you spoke to. What John did was wash himself.などの「焦点」構文に関しては、その焦点要素を特別な位置に配置し、その位置で焦点の意味機能を付与するという分析法が主流となっている。一般的に、この位置に配置された要素のさらなる語順変更は不可能であることが観察されているが、上記構文ではこの語順変更操作が実際には可能であるので、上記分析法を維持することは困難である。そこで、焦点以外の要素を「前提」位置に配置しその意味機能を付与し、その結果としてデフォルト的に焦点要素を焦点と解釈する分析法の妥当性を検証した。平成25年度の研究では、24年度に引き続き、当該の焦点構文の焦点要素に関する調査研究を進めた。特に、焦点要素とその周辺部の要素の考察に集中して取り組んだ。作業仮説として提示した具体的分析法の妥当性を検証すべく、従来の分析法と異なり、当該焦点構文の「前提部分」を除く部分、つまり主語場所句倒置文の動詞・焦点主語要素の連鎖、分裂文の虚辞・連辞・焦点要素の連鎖、疑似分裂文の連辞・焦点要素の連鎖を、「非前提的」もしくは「新情報的」と想定することが可能であることを示し、その裏付け作業をさらに行った。次に、当該焦点構文の二次的な焦点解釈は通常文の焦点解釈メカニズムによってなされるという次の段階への研究に着手した。この作業と同時並行的に、当該焦点構文の「前提部分」の談話機能特性の考察も進めた。現在のところ、この談話機能を「旧情報的話題」と考える可能性を念頭に置いているが、この妥当性を検証すべく「前提」「旧情報的話題」という二つの談話機能概念の実証的な比較検討作業も行った。「話題要素」の特性に関しては、統語的、談話機能的、音韻的研究が十分に進められているので、これらの研究を基礎にして検証作業を進めた。「移動要素凍結性」、「移動の島」、「音調の切れ目」などの他に、「否定作用域」、「文末追加表現(afterthought)」などの項目についても考察を加えた。今後は、「前提部分」の実証的研究をさらに進めて「前提部分」が担う談話機能の本質を明らかにしたい。平成24年度の研究では、焦点構文の焦点要素の諸特性に関する実証的な考察を行った。まず、先行研究の資料収集を進め、これまで明らかにされてきた焦点要素の統語的、談話機能的、音韻的特性に関して如何なる事実観察がなされてきたか、またどのような考察・分析が提示されてきたかを丹念に調査した。その上で、「焦点に特有であると考えられてきた特性が、それぞれの焦点構文において本当に観察されるのか」という問題意識を常に念頭において、焦点構文の諸特性を綿密に考察した。この際に着目したのは、主に、次のような項目である。1焦点要素が「移動要素凍結性」を示すのか否か2焦点要素が「別の談話機能付与に関わる移動」を受けるのか否か3焦点要素を含む焦点構文が「移動の島」を形成するのか否か4焦点要素が「焦点強勢」を担うのか否か5焦点要素が「音調の切れ目」を伴うのか否かこのような作業を通して、焦点としての条件を完全に満たす焦点要素と、そうでない焦点要素を峻別し、後者の焦点要素を持ち「焦点構文の非焦点的分析」の対象なる焦点構文を特定することに努めた。さらに、当該の焦点構文の焦点要素に関する調査研究を進めた。そして、従来の分析法と異なり、当該焦点構文の「前提部分」を除く部分、つまり、主語場所句倒置文の動詞・焦点主語要素の連鎖、分裂文の虚辞・連辞・焦点要素の連鎖、疑似分裂文の連辞・焦点要素の連鎖を、「非前提的」もしくは「新情報的」と想定することが可能であることを示した。本年度(最終年度)の研究においては、昨年度と並行的に、当該焦点構文の「前提部分」の談話機能特性の考察も行い、この談話機能を「旧情報的話題」と考えることの妥当性を検証するために、「前提」「旧情報的話題」という二つの談話機能概念の実証的な比較検討作業を進めた。「話題要素」の統語、談話機能、音韻に関わる従来の研究をもとにして、「移動要素凍結性」、「移動の島」、「音調の切れ目」などの他に、「文頭譲歩表現」、「文末追加表現」などの項目についても考察した。具体的には、非副詞的な「文頭譲歩表現」、「文末追加表現」の特性を明らかにし、ReinhartやNakajimaの構造分析に依拠することによって、例外的規定を設けることなくこれらの特性を理論的に説明できることを明らかにした。さらに、これらの表現が持つ情報構造特性を明らかにし、当該焦点構文の一つである主語場所句倒置構文との類似性の説明方式を探る試みをした。

また、「前提部分」の実証的研究をさらに進めて「前提部分」が担う談話機能の性質を明らかにする取り組みを行い、加えて、当該の焦点構文の派生に関わるメカニズムの解明を目指し、分裂CP仮説を想定した理論的研究を進めた。この際、「前提部分」の移動に加え、「非前提部分」の語順派生の仕組みの解明を進めた。他の焦点構文に比べて、より複雑な語順を持つこれらの「非前提部分」の派生のメカニズムを解明することができれば、当該焦点構文の本質を捉えることが出来ると考えたからである。これらの研究成果は、27年度と28年度に出版される研究論文集に収録される予定である。英語学、生成文法、統語論、意味論、音韻論平成25年度の研究計画のうち、80%の計画を達成することができたと判断している。また、当初の予想と矛盾しない研究成果をあげることができたと考えている。当初の計画で24年度に行う予定であった「焦点構文の焦点要素の諸特性に関する実証的な考察」をほぼ完了することができた。また、25年度に着手する予定であった「焦点要素とその周辺部の要素の考察」を24年度に着手することができた。今後は、当該の焦点構文の派生に関わるメカニズムの解明を目指し、分裂CP仮説を想定した理論的研究を行う予定である。この際、「前提部分」の移動に加え、「非前提部分」の語順派生の仕組みを明らかにしたいと考えている。これは、他の焦点構文に比べて、より複雑な語順を持つこれらの「非前提部分」の派生のメカニズムを解明できて初めて、当該焦点構文の本質を捉えることが出来ると考えているからである。平成25年度の研究では、引き続き、当該の焦点構文の焦点要素に関する調査研究を進めたい。当該焦点構文の「前提部分」を除く部分を、「非前提的」もしくは「新情報的」と想定することを裏付ける作業を行いたい。そして、当該焦点構文の二次的な焦点解釈は通常文の焦点解釈メカニズムによってなされるという次の段階への研究を進めたい。このような作業と同時並行的に、当該焦点構文の「前提部分」の談話機能特性の考察も進めていきたい。現在のところ、本研究代表者は、この談話機能を「旧情報的話題」と考える可能性を念頭に置いているが、この妥当性を検証すべく「前提」「旧情報的話題」という二つの談話機能概念の実証的な比較検討作業を行いたいと考えている。「話題要素」の特性に関しては、統語的、談話機能的、音韻的研究が十分に進められているので、これらの研究を基礎にした作業が可能であろう。2月に行った出張の旅費の支払いが、25年度中に終了していないことによる次年度繰越である。26年度中に支払いがなされる。24年度の研究においては、研究が順調に進み、思いの外、備品・旅費に計上していた予算が少なくて済んだ。そこで、本年度は、計画どおり、東北大学及び静岡大学への研究調査・資料収集のための出張を行い、新たな研究書・文献の入手、他の研究者との意見交換、母語話者への言語知識提供の依頼などが必要となるので、関連予算を計上するが、新たに学会などで意見交換を行った研究者との間で研究成果を検討すために必要となる旅費を計上することにする。
特許権行使に対する制約原理の総合的研究

特許権行使を制限する様々な法理、たとえば、審査経過禁反言、無効の抗弁、消尽法理などの正当化根拠と判断基準を総合的に検討した。特許権行使の制限については、特許権者の利益と公衆の利益をいかに調和させるのかという観点が重視されてきた。本研究では、この両者の適切なバランスという観点をより具体化し、考慮要素を明確にしたモデルを構築した。本研究は、情報保護と情報利用の調和という見地から、特許権行使を制限する種々の法理の理論的根拠とその機能、限界を再検証するとともに、制限法理相互間の関係を体系的に整理することを目的とする。平成27年度は、特許法に明文の規定を持たず、主として裁判例・学説により形成された不文の法理について、その理論的根拠と機能・限界を再検証した。具体的には、まず、クレームの「限定解釈」という手法について改めて検討した。実務上、この手法は、純粋な「クレーム解釈」ではなく、特許権侵害を否定し権利行使を退けるという結論が先にあり、これを実現する便法として用いられてきた側面があり、このような手法で侵害を否定することがどこまで正当化されるのかを理論的に再検証した。次に、審査経過禁反言について、アメリカ法、特にフェスト連邦最高裁判決後のFederal Circuitの判断を対象として、その具体的な判断基準を整理したうえで、我が国における審査経過禁反言の適用要件・効果を考察し、出願時同効材に対する均等論適用の可否についても併せて検討した。さらに、間接侵害の場面における消尽法理の適用のあり方を分析した。物の発明、方法の発明それぞれについて、特許法101条1号・4号の専用品や2号・5号の多機能品を特許権者等が自ら譲渡した場合、いかなる要件のもと、いかなる行為について、消尽法理が適用され、権利行使が否定されるのかを明らかにした。以上の研究の成果は全て論文として公表している。また、これらの議論を踏まえて、不文の特許権行使の制限法理全般について検討を加え、単著を公表した。今年度は、不文の特許権行使制限法理について、個々の法理の理論的根拠を明らかにし、それに裏打ちされた判断枠組みを定立するという当初の目的をおおよそ達成することができ、単著を含めた成果の公表を行うことができた。平成28年度は、まず、知財高判平成28年3月25日判時2306号87頁[マキサカルシトール知財高裁大合議判決]を契機として、出願時同効材(出願時における当業者を基準に置換可能性・容易想到性を充足する部材等)がクレームに記載されなかったという一事をもって、直ちに第5要件不充足として均等論適用を否定することができるかという問題について再検討を行った。その結果、大合議判決の理論的根拠の脆弱性、及び、大合議判決が例外的に第5要件充足を否定する事情について、それが法的安定性の見地から大きな問題を残すことを明らかにした。なお、同事件については最高裁判決(最判平成29年3月24日平成28年(受)第1242号)が下されており、知財高裁大合議判決との差異を中心に検討を行う予定である。さらに、クレームの「限定解釈」あるいは審査経過禁反言に関連して、最判平成27年6月5日民集69巻4号700頁・同904頁[プラバスタチンナトリウム事件最高裁判決]を契機に大きな注目が集まったプロダクト・バイ・プロセス・クレームについて、最高裁判決後の平成28年中に下されたいくつかの知財高裁判決も参照しつつ、検討を行った。その結果、物の発明であっても、特定の製法で製造される物に限定する趣旨が、明細書や審査経過を参酌しつつ、当業者の通常の理解を基にクレームから明確に読み取れる場合には、不可能・非実際的事情の存否を問わず、明確性要件を充足すると考えるべきであるが、権利範囲は製法限定された範囲にとどまる(侵害訴訟において物同一の範囲にまでクレームを広げることは審査経過禁反言等により許されない)との立場を明らかにした。以上の研究の成果を論文等で公表した。今年度は、前年度に引き続き、特許権行使制限法理の理論的根拠の解明と判断枠組みの定立をさらに進め、その成果を公表するという当初の目的をおおよそ達成することができた。平成29年度は研究期間の最終年度として、まずは平成27年度・平成28年度に行った分析検討を補充する個別研究を行った。具体的には、出願時同効材と均等論について平成29年3月に下された最高裁判決(最判平成29年3月24日民集71巻3号359頁[マキサカルシトール])について、控訴審である知財高判平成28年3月25日判時2306号87頁(この大合議判決の分析は平成28年度に行っており、成果公表済みである)と対比しつつ、その判旨を検討した。その結果、あえて大合議判決の判示内容との差異を強調するのであれば、出願同効材に対して均等論適用が排斥される例外的ケースの範囲が異なっている(論文公表ケースに対する均等論排斥を明言していない)ことを指摘することができる旨を明らかにし、判例評釈にて成果を公表した。また、無効の抗弁に関連して、訂正の再抗弁における訂正請求・訂正審判請求の要否について考察し、訂正請求等を要しない例外的なケースを過度に限定する必要はない旨を論じた判例評釈を公表した。

さらに、延長特許権の効力範囲の制限(特許法68条の2)についても検討し、これも判例評釈の形で成果を発表している。研究期間全体を通して行ってきた、クレームの「限定解釈」、審査経過禁反言の法理(出願時同効材に対する均等論の排斥)、無効の抗弁、消尽理論、差止請求権の制限など特許権行使の制限法理の網羅的な研究を総括し、それらの理論的根拠と判断枠組みを明らかにすることができた。特許権行使を制限する様々な法理、たとえば、審査経過禁反言、無効の抗弁、消尽法理などの正当化根拠と判断基準を総合的に検討した。特許権行使の制限については、特許権者の利益と公衆の利益をいかに調和させるのかという観点が重視されてきた。本研究では、この両者の適切なバランスという観点をより具体化し、考慮要素を明確にしたモデルを構築した。今後も引き続き特許権行使を制限する個別法理の理論的根拠・機能・限界の再検証を進めるとともに、制限法理相互間の関係についての総合的研究に着手する。来年度は研究期間最終年度として、これまで行ってきた特許権行使制限法理の個別的検討を基礎に、制限法理相互の関係を体系的に整理する研究を進める。知的財産法今年度予定していた国内出張のうち、調整が付かず断念したものがあった。今年度予定していた出張のうち、調整が付かず断念したものがあった。今年度に引き続き、本研究課題に関連する文献・資料の購入を進める。また、本研究目的を達成するためには、実務的知見を獲得することが必要となる。そこで、学会や研究会等に参加し実務家と交流することで、実務的知見を獲得するとともに、研究成果の報告や意見交換を通して、本研究課題に関する議論を深める。そのための旅費を支出する。また、学会・研究会等に参加し、研究成果の報告や意見交換を通して本研究課題に関する議論を深める。
戦後日本の産業政策と資金配分調整-鉄鋼業のケース

戦後日本の高度経済成長期における資金配分の仕組みを鉄鋼業のケースを中心に検討した。明らかになった主要な論点は以下通りである。鉄鋼第二次合理化計画の期間にあたる1950年代後半には、主要な鉄鋼企業は巨額の設備投資資金を主として外部資金によって調達したが、これを可能にしたのは次のような日本経済に固有の仕組みであった。第一に、通産省産業合理化審議会産業資金部会、大蔵省金融機関資金審議会と全国銀行協会連合会の資金調整委員会を主体とする産業資金配分調整に関する機構が、「不要不急」産業への資金供給の抑制、財政投融資資金の重点的配分などを通じて、第二次合理化のピークと重なった1957-58年の金融引き締め期に鉄鋼業への資金供給を確保する役割を果たした。この時期、国際収支の悪化に対処するため、産業合理化審議会産業資金部会における審議やこれに基づく通産省の行政指導などを通じて全体的な設備資金供給の圧縮が行われる一方、鉄鋼業に対しては海運業とともに、金融機関資金審議会の決定に基づいて、金融債の引き受けを通じた財政投融資資金の投入が実施され、合理化計画の遂行が金融面から支えられた。第二に、日本開発銀行は、直接的な資金供給と単純な民間金融機関に対する誘導効果だけでなく、メインバンクないし世界銀行の融資を誘導することを通じて間接的にも鉄鋼業に対するその他民間金融機関の融資を促進する役割を果たした。間接的な誘導効果は、開銀融資、メインバンク融資、非メイン金融機関融資の3変数VARモデルに基づく因果制テストによって確認された。
ヒト腫瘍ウイルスの伝播と発症の時空的変化とそれに及ぼす物理的環境要因の検索と影響

1.成人T細胞白血病ウイルス(ATLV)の伝播は母乳感染で、生後早期に感染が成立し、その後水平感染による感染のない事から、各年令層の感染率は、出生年当時の感染状況を反映している事が判明した。一方ATLVキャリア母親の末梢リンパ球中にウイルス抗原発現のある者の児に感染が集中しており(50%)キャリア母親に高リスク群の存在が明らかとなった。2.長崎県大島町の隣接2カ所(O地区,S地区)の新たなフィールド調査の結果、B型肝炎ウイルス(HBV)感染率は両地区差はないが、ATLV感染率はO地区9%,S地区22%と有意の差が見出された。O地区は地元出生者が90%、第一次産業従事者60%、仏教徒97%で、S地区はそれぞれ、60%、40%、66%である。S地区は第二、三次産業従事者が多く、キリスト教徒27%で、仏教徒にも元来キリスト教徒が含まれる。分析結果、他地区出生者にATLV感染が集中、S地区のATLV高感染率が他地区出生者(特にキリスト教徒)の移動に伴うものと考えられた。3.五島地区の過去80年間の両ウイルス感染率の推移から、個人的要因として栄養摂取,経済状態の向上,家庭内出産の減少が、環境的要因として母子センター,血液センター開設,学校給食等特に衛生環境の整備が感染率減少に有効に作用している事が明らかとなった。4.以上の結果、HBV感染は地域により濃淡はあるが、広く分布し、その背景の上に個人的要因が重って感染率の高低が生ずると考えられる。一方ATLV感染は特定の家系に集中し、それらの移動状況が主に地域の感染率の高低に反映していると考えられる。同じ感染者でも個人要因によりリスクの大小が影響して蓄積して来る事になる。しかし両ウイルス共母児感染である為、地域社会における衛生環境により新たな感染者の増減が大きく影響される事も明らかとなった。
中枢循環血圧調節機構の統合的解析

延髄孤束核(NTS)において,染色された上行性大動脈弓由来降圧神経(ADN)は孤束を介してmedial NTSの樹状突起と細胞体に投射していた.ADNからの入力を受ける細胞は,ADNから単シナプス性入力を受けない細胞よりもカイニン酸応答が約2倍に増強していた.また,ADNからの神経伝達物質はグルタミン酸であり,後シナプスNTS細胞におけるグルタミン酸受容体はnon-NMDA受容体であった.また,後根神経節などの感覚器受容細胞にはVR-1(バニロイド配糖体)受容体が高密度に発現しているが,ADN神経終末にもVR-1受容体が存在しグルタミン酸放出が増強することが明らかとなった.しかしVR-1受容体のアゴニストのカブサイシン頻回投与ではむしろグルタミン酸放出量が減少したことから,後シナプスNTSニューロン上のnon-NMDA受容体が脱感作するか,もしくはグルタミン酸放出が枯渇する可能性が考えられた.さらに,VR-1受容体が高密度に発現している部位にはATP受容体の一つであるP2X3受容体が共存していることが1997年にCaterinaらによってNature誌に報告されており,medial NTSより得たシナプスブートン標本においても,P2X1,3,2/3受容体アゴニストのαβ-metATPならびにカプサイシンともに,後シナプス細胞に影響することなくグルタミン酸の放出のみを増強した.以上の結果から,VR-1受容体とP2X受容体はグルタミン酸作動性興奮性神経終末部に共存してグルタミン酸の放出を促進し,その結果NTSニューロンの興奮を惹起して降圧効果を示すことが初めて明らかとなった.延髄孤束核(NTS)において,染色された上行性大動脈弓由来降圧神経(ADN)は孤束を介してmedial NTSの樹状突起と細胞体に投射していた.ADNからの入力を受ける細胞は,ADNから単シナプス性入力を受けない細胞よりもカイニン酸応答が約2倍に増強していた.また,ADNからの神経伝達物質はグルタミン酸であり,後シナプスNTS細胞におけるグルタミン酸受容体はnon-NMDA受容体であった.また,後根神経節などの感覚器受容細胞にはVR-1(バニロイド配糖体)受容体が高密度に発現しているが,ADN神経終末にもVR-1受容体が存在しグルタミン酸放出が増強することが明らかとなった.しかしVR-1受容体のアゴニストのカブサイシン頻回投与ではむしろグルタミン酸放出量が減少したことから,後シナプスNTSニューロン上のnon-NMDA受容体が脱感作するか,もしくはグルタミン酸放出が枯渇する可能性が考えられた.さらに,VR-1受容体が高密度に発現している部位にはATP受容体の一つであるP2X3受容体が共存していることが1997年にCaterinaらによってNature誌に報告されており,medial NTSより得たシナプスブートン標本においても,P2X1,3,2/3受容体アゴニストのαβ-metATPならびにカプサイシンともに,後シナプス細胞に影響することなくグルタミン酸の放出のみを増強した.以上の結果から,VR-1受容体とP2X受容体はグルタミン酸作動性興奮性神経終末部に共存してグルタミン酸の放出を促進し,その結果NTSニューロンの興奮を惹起して降圧効果を示すことが初めて明らかとなった.本研究の目的は中枢性循環血圧調節機構に関するin vivoおよびin vitroにおける実験結果が必ずしも一致していないことを受けて、この差を埋めるために新しい実験系の開発およびそれを利用した研究を行なうことにある。初年度は以下の2点について計画をたてた。1)心房圧受容器からの情報が入力する延髄孤束核神経細胞の同定、および同細胞の急性単離標本の作成。麻酔下のラットにおいて生体内でatrial depressantnerve(ADN)に親脂質性蛍光トレーサーであるDi-Iを投与し、1-2週間後に延髄脳薄切片を作成した。孤束核神経細胞を機械的に急性単離し、Di-Iで順行性に染色されているADN神経終末が付着している細胞の選択に成功した。これによって孤束核において心房からの情報を直接受けている細胞の同定および電気生理学検討の適用が可能となった。2)孤束核細胞の機能的分類。ADN入力を受ける神経細胞の機能的特徴の決定を行なうために、本年度は孤束核細胞全体における機能的特徴特に各種伝達物質に対する応答および発達による変化に関して分類を行なった。その結果、ATPおよびニコチンに対する応答の有無によって分類することが可能であった。またカイニン酸およびニコチンに対する反応が発達に従って著しく増大する細胞群が存在することも明らかになった。延髄孤束核(NTS)は末梢からの循環に関する情報収集と上位中枢からの反射調節を担う重要な部位である.n vivoやin vitroの実験において,興奮性アミノ酸をNTSに注入すると血圧低下や徐脈が生じる.一方で興奮性アミノ酸拮抗薬や抑制性アミノ酸を注入すると血圧上昇や頻脈が生じることが報告されている.これらは大動脈弓圧受容体からの抑制性神経線維(aortic depressor nerve;ADN)が投射するNTSニューロンの活動が投与物質によって変化した結果であることが示唆され,血圧調整に関するNTSの役割が解明されつつある.しかし,ADNから直接投射を受けているニューロン(mono-synaptic neuron)自身の生理学的特性は不明である.

そこでADNが投射されているNTSニューロンを同定するために,生体においてADNにDiーIを注入し,その後作製したスライス標本においてDi-I染色陽性神経終末付着神経細胞を確認後,同細胞の電気生理学的特性を検討した.NTSにおけるADNの神経終末は殆どmedial NTSの樹状突起に付着しており,一部に細胞体に投射しているものが確認された.そこで,NTSにおいて1)細胞体に直接投射されているもの,2)樹状突起に投射されているもの,および3)ADNの投射を受けないものの3群に分類し,カイニン酸,GABA,グリシン,ATPやニコチンの作用を比較検討した.その結果,細胞体または樹状突起のADNからの投射を受けるものは投射を受けないものと比較し,カイニン酸の応答が有意に増強していた.以上から,求心性ADNを介して大動脈弓圧受容器からの情報を受けるmedial NTSニューロンはnon-NMDA型グルタミン酸受容体が多く存在していることが明らかとになった.延髄孤束核(NTS)において,染色された上行性大動脈弓由来降圧神経(ADN)は孤束を介してmedial NTSの樹状突起と細胞体に投射していた.ADNからの入力を受ける細胞は,ADNから単シナプス性入力を受けない細胞よりもカイニン酸応答が約2倍に増強していた.また,ADNからの神経伝達物質はグルタミン酸であり,後シナプスNTS細胞におけるグルタミン酸受容体はnon-NMDA受容体であった.また,後根神経節などの感覚器受容細胞にはVR-1(パニロイド配糖体)受容体が高密度に発現しているが,ADN神経終末にもVR-1受容体が存在しグルタミン酸放出が増強することが明らかとなった.しかしVR-1受容体のアゴニストのカブサイシン頻回投与ではむしろグルタミン酸放出量が減少したことから,後シナプスNTSニューロン上のnon-NMDA受容体が脱感作するか,もしくはグルタミン酸放出が枯渇する可能性が考えられた.さらに,VR-1受容体が高密度に発現している部位にはATP受容体の一つであるP2X3受容体が共存していることが1997年にCaterinaらによってNature誌に報告されており,medial NTSより得たシナプスプートン標本においても,P2X1,3,2/3受容体アゴニストのαβ-metATPならびにカプサイシンともに,後シナプス細胞に影響することなくグルタミン酸の放出のみを増強した.以上の結果から,VR-1受容体とP2X受容体はグルタミン酸作動性興奮性神経終末部に共存してグルタミン酸の放出を促進し,その結果NTSニューロンの興奮を惹起して降圧効果を示すことが初めて明らかとなった.
カイコにおける多細胞体制の初期構築とその遺伝的制御機構

昆虫における多細胞体制の初期構築は,成熟分裂から接合核形成までの過程と発生運命の決定から体制構築までの過程からなる.前者では,多核発生を防ぐための遺伝的制御機構が不可欠であり,後者では体節構造や発生時期を制御する遺伝的機構が不可欠である.本研究では各過程においる突然変異遺伝子を用いてカイコの多細胞体制の初期構築を解析し以下の知見を得た.1.カイコの卵では受精膜の形成などによる多精拒否が起こらず多数の精子が卵内に侵入するため, 1個の卵核を残し他の3個を極核として不活性化する機構が多核発生防止の前段の機構であり,この機構を人為的に崩壊すると多核発生が起こりキメラ個体を生ずる.この機構が遺伝的に崩壊しているのがmo系統であり,本系統では卵形成がやや遅延し卵核の位置などに異常がみられた.また,カイコの成熟分裂が前還元型であることも判明した.2.多核発生防止の後段の機構としては,接合核形成後に残存する精核の発生を抑制する機構が不可欠で,この機構が欠落した突然変異系統がmo-l系統である.mo-l遺伝子はホモの雌個体の次代卵期において遅発発現しモザイク卵を形成とするが,雄核の異常発生が高い致死性を示していた.3.発生運命の決定機構についてはE突然変異群と正常系統のモザイク個体の発生パターンの解析から,ショウジョウバエのホメオボックスに相当する機構が存在し,体節分化の方向に腹部第8節を中心にする変極性がみられた.4.体制構築の過程に関しては, Bu,pndなどのモザイクの解析から,背面閉鎖の際に位置情報とその相互認識の機構が機能することと,発生時期の制御が単純な遺伝子的支配を受けていることなどが明らかになった.5.多細胞体制の初期構築に異常を示すものは致死性が高く生殖不能なものが多い.そこで致死遺伝子をもつ精細胞を正常蚕に移植し,遺伝的解析を行う系を開発した.昆虫における多細胞体制の初期構築は,成熟分裂から接合核形成までの過程と発生運命の決定から体制構築までの過程からなる.前者では,多核発生を防ぐための遺伝的制御機構が不可欠であり,後者では体節構造や発生時期を制御する遺伝的機構が不可欠である.本研究では各過程においる突然変異遺伝子を用いてカイコの多細胞体制の初期構築を解析し以下の知見を得た.1.カイコの卵では受精膜の形成などによる多精拒否が起こらず多数の精子が卵内に侵入するため, 1個の卵核を残し他の3個を極核として不活性化する機構が多核発生防止の前段の機構であり,この機構を人為的に崩壊すると多核発生が起こりキメラ個体を生ずる.この機構が遺伝的に崩壊しているのがmo系統であり,本系統では卵形成がやや遅延し卵核の位置などに異常がみられた.また,カイコの成熟分裂が前還元型であることも判明した.2.多核発生防止の後段の機構としては,接合核形成後に残存する精核の発生を抑制する機構が不可欠で,この機構が欠落した突然変異系統がmo-l系統である.mo-l遺伝子はホモの雌個体の次代卵期において遅発発現しモザイク卵を形成とするが,雄核の異常発生が高い致死性を示していた.3.発生運命の決定機構についてはE突然変異群と正常系統のモザイク個体の発生パターンの解析から,ショウジョウバエのホメオボックスに相当する機構が存在し,体節分化の方向に腹部第8節を中心にする変極性がみられた.4.体制構築の過程に関しては, Bu,pndなどのモザイクの解析から,背面閉鎖の際に位置情報とその相互認識の機構が機能することと,発生時期の制御が単純な遺伝子的支配を受けていることなどが明らかになった.5.多細胞体制の初期構築に異常を示すものは致死性が高く生殖不能なものが多い.そこで致死遺伝子をもつ精細胞を正常蚕に移植し,遺伝的解析を行う系を開発した.1.昆虫のような決定卵における受精核形成過程には、多受精を拒否する機構と多核の発生を拒否する機構が存在し重要な役割を果していることが、これまでの研究で明確になってきた。そこで本年度はこれらの機構について解析した結果、1)多受精拒否機構については、(1)カイコの卵では受精膜の形成などによる多精拒否が起こらず多数の精子が卵内に侵入するため、多受精拒否機構の中心は卵核を1個にし他の3核を極核として不活性化する機構であり、この機構が崩壊すると多核発生が起こりキメラ個体が出現する。(2)極核を不活性化する機構が遺伝的に崩壊しているものがmo系統であり、この系統では卵形成が遅延し、初期発生における卵核の位置等に異常がみられた。2)多核発生拒否機構については、(1)受精(核合体)後は残存する精核の発生を抑制する機構が重要な働きをし、この機構にはゲイムの倍性も関与していることが明らかになった。(2)mo-l系統は、この精核の発生を抑制する機構が欠落した突然変異で、初期発生の異常が極めて高い致死性を示すこと、および(3)mo-lホモの雌個体の次代卵においてmo-l遺伝子は遅発発現しモザイク卵を形成するが、雄個体の生殖にも影響し受精率を低下させていることが伺われた。2.モザイク卵における多細胞体制の構築異常については(1)Bu,l-n,l-nlなどの致死遺伝子による異常の解析と、温度による精細胞の不活性化と発生異常について人工受精法による解析系を開発した。

(2)pnd1,2などの休眠性異常についてモザイク個体による解析から、pnd2に関するモザイク個体の胚は発生後期に致死する場合があることが明らかになった。3.発生運命の決定機構の解析はE突然変異群を用いて行ない、【E^(NK)】【E^(IW)】の発生異常からショウジョウバエのホメオボックスに類似する機構が存在することを明らかにした。