hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
医療訴訟における専門的知見活用策の比較法的研究―書面鑑定と交互尋問を超えて

なお,海外でも台湾,アメリカで研究報告を行い,英語論文も2018年6月に公表予定である。医療訴訟において,専門家(医師)に知見を提供してもらう方法として,従来の書面鑑定や証人尋問に代えて,当事者双方がそれぞれ独立に選任した専門家と,裁判所が選任した専門家が,ラウンド・テーブル法廷で裁判官,弁護士と一緒に議論をする「カンファレンス尋問」という新たな方法を考案し,提言を行った。カンファレンス尋問では,当事者が選任する専門家は証人として参加し,裁判所が選任した専門家は鑑定人として参加する。カンファレンス尋問の長所は,複数の良質な専門家の参加,証拠の質の向上,判断の質の向上,専門家共同体へのフィードバック,手続の対等性,公正性,公開性の担保,時間と費用の節約などである。コンカレント・エヴィデンスについてはシンガポールでも採用されているとのことであるので,シンガポール調査を行うとともに,シンガポールで開催される東アジア法社会学会で本テーマに関する報告を行うことを応募している。ほかにも日本医事法学会等での報告や論文執筆を予定している。学会報告の結果を学会誌に発表するとともに,法学者,法律実務家,医療関係者の集まる研究会での報告・意見交換を行うなどして,カンファレンス尋問を具体的に実務に浸透させるための改善案を検討するとともに,普及を図りたい。医事法,民事訴訟法今年度実施した海外調査について研究分担者として参加している他の科研費からの支出でまかなえたために残額が生じた。当該年度に英語論文を発表するための翻訳料を見込んでいたが,論文の執筆・発表を次年度に延期することにしたため,その費用を繰り越すことになった。次年度は,海外での調査および学会参加を複数予定しているため,それに当てる。また,論文の翻訳料の支出も予定している。英語論文の翻訳料として使用する予定である。
カラーインクジェットプリンターによる成長因子アレイの作製

成長因子アレイを作製する際、細胞がアレイの大きさや形状により増殖や分化に影響を受ける可能性が考えられる。そこで、カラーインクジェットプリンターを用い細胞接着成分であるゲラチンを線状にプリントし、その上で骨格筋細胞C2C12を培養し、細胞増殖率、形成された筋管細胞とゲラチン線とのなす角度、分化制御因子マイオジェニンの発現率、分化指標である横紋筋型ミオシン重鎖の発現率、休眠期にある筋衛星細胞の出現率等について検討した。分化制御因子マイオジェニンの発現率および分化指標である横紋筋型ミオシン重鎖の発現率は、抗マイオジェニン抗体(F5D)あるいは抗横紋筋型ミオシン重鎖抗体(MF20)を用い、Hoechst33258による全細胞数あたりの陽性細胞数を傾向顕微鏡により求めた。休眠期にある筋衛星細胞の出現率は、Nagataら(2005)の方法にしたがい、ライセニン&抗ライセニン抗体を用い、蛍光抗体により求めた。その結果、ゲラチン線の幅が50ミクロン、線同士の間隔が80ミクロン以上の場合において、プリントしたゲラチン線の方向に筋管細胞の形成が認められた。しかし、細胞の増殖率には有意な差は認められなかった。分化指標である横紋筋型ミオシン重鎖と分化制御因子マイオジェニンの発現率は線上の細胞の方がゲラチン全面塗りした対照実験のものより有意に低下していた。それと対照的に、休眠期にある筋衛星細胞の出現率は増加していた。これは、細胞の分化制御が成長因子や細胞数などだけでなく、細胞が生育する領域の形状によっても影響を受けることを示唆している。今後、この観点を重視しながら、さらに成長因子アレイの官製を目指して行きたい。本斫究は2004年12月にサンフランシスコにて開催された第44回米国細胞生物学会にて注目発表"HotPick"に選ばれた。さらに本研究は、インクジェットプリンターによる細胞生物学の新しい展開として、Science 305:1895(2004)において紹介され、2005年3月に米国サウスカロライナ大学医学部で開催された「第2回バイオプリンティング・バイオパターニングワークショップ」においても高い評価を得た。6種類の溶液をピコリットルの精度で射出し、任意のパターンでプリントできるカラーインクジェットプリンターの機能を応用し、6種類の成長因子を任意の濃度組み合わせで培養基質上にマトリクス状にプリントし、成長因子アレイの作成を目指すことが本研究の目的である。この成長因子アレイをもちいて、多分化能をもった幹細胞の分化運命を人為的に制御できれば、再生工学上、重要な貢献をすることが期待される。本年度は、清澄因子アレイを作製するための作業条件の確立をおこなった。その内容は以下の通りである。1)射出した液体を着弾点上で混合し、かつ基質上で固相化するため、グリセリン、活性化デキストランの濃度と反応条件の検討を行った。その結果、グリセリン濃度1.3-1%の範囲で、良好な混合と固相化が起きることがわかった。2)成長因子アレイの各セル内の細胞の個数をイメージアナライザー上で定量化するため、各種のDNA結合性傾向色素を用い、700nmで傾向料を測定し、細胞数との相関を検討した所、TOTO-3という傾向色素が最も高い定量制をもつことが分かった。3)細胞接着因子としてブタ皮膚ゲラチンを用い、カラーインクジェットプリンターにより、様々な太さの直線を任意の間隔で培養基質上にプリンターし、その上に筋細胞C2C12を培養し、筋分化および形成された筋管細胞の形態を比較した所、太さ50ミクロン、感覚100ミクロンにおいて最も太く、分化が進んだ筋管細胞が形成された。1)本研究の目的である固定化した成長因子を用いたアレイの作製のためには、成長因子を固定化しても細胞に対し効果を持つことが前提となる。しかし、一部の成長因子において、細胞表面の受容体に結合後、成長因子-受容体の複合体が細胞膜上で集合し、細胞内に取り込まれ、細胞内に情報伝達をおこすことが知られている。もし、成長因子の固定化により、このような成長因子-受容体の複合体のダイナミズムが阻害されると情報伝達に支障をきたす可能性がある。そこで、各種成長因子の細胞に対する効果を培養液に溶解状態にある場合と培養基質に固定化された場合で比較検討した。その結果、インスリン、インスリン様成長因子1および塩基性繊維芽細胞成長因子は固定化しても効果を保持したが、骨形成因子-2は固定化すると効果を発揮しないことが明かとなった。2)成長因子を固定化したアレイ上で細胞を培養し、そのDNA良、分化マーカーの発現量を近赤外の画像解析装置を用いて定量するための条件設定をおこなった。現段階に使用している画像解析装置は700と800nmの二波長であるため、一旦結合した抗体を測定後、アルカリ処理で解離させ、新たに別の抗体を反応させても定量性が確保できる系を確立した。3)成長因子細胞外基質成分を固定化する培養基質の検討を行った結果、高吸収性OHPシートが有効であることが分かった。これを用いて細胞外基質をパタン化してプリントし、その上で細胞を培養した所、プリントしたパタン通りに細胞が配置された。

そこで、カラーインクジェットプリンターを用い細胞接着成分であるゲラチンを線状にプリントし、その上で骨格筋細胞C2C12を培養し、細胞増殖率、形成された筋管細胞とゲラチン線とのなす角度、分化制御因子マイオジェニンの発現率、分化指標である横紋筋型ミオシン重鎖の発現率、休眠期にある筋衛星細胞の出現率等について検討した。分化制御因子マイオジェニンの発現率および分化指標である横紋筋型ミオシン重鎖の発現率は、抗マイオジェニン抗体(F5D)あるいは抗横紋筋型ミオシン重鎖抗体(MF20)を用い、Hoechst33258による全細胞数あたりの陽性細胞数を傾向顕微鏡により求めた。休眠期にある筋衛星細胞の出現率は、Nagataら(2005)の方法にしたがい、ライセニン&抗ライセニン抗体を用い、蛍光抗体により求めた。その結果、ゲラチン線の幅が50ミクロン、線同士の間隔が80ミクロン以上の場合において、プリントしたゲラチン線の方向に筋管細胞の形成が認められた。しかし、細胞の増殖率には有意な差は認められなかった。分化指標である横紋筋型ミオシン重鎖と分化制御因子マイオジェニンの発現率は線上の細胞の方がゲラチン全面塗りした対照実験のものより有意に低下していた。それと対照的に、休眠期にある筋衛星細胞の出現率は増加していた。これは、細胞の分化制御が成長因子や細胞数などだけでなく、細胞が生育する領域の形状によっても影響を受けることを示唆している。今後、この観点を重視しながら、さらに成長因子アレイの官製を目指して行きたい。本斫究は2004年12月にサンフランシスコにて開催された第44回米国細胞生物学会にて注目発表"HotPick"に選ばれた。さらに本研究は、インクジェットプリンターによる細胞生物学の新しい展開として、Science 305:1895(2004)において紹介され、2005年3月に米国サウスカロライナ大学医学部で開催された「第2回バイオプリンティング・バイオパターニングワークショップ」においても高い評価を得た。
花ハス成長相転換の生理・遺伝学的解析と次世代型育種・栽培法の開発

花ハスの開花期・花型を決定する分子機構を明らかにするため、花芽・花器官形成関連遺伝子を単離し、発現動態を解析した。フロリゲン/アンチフロリゲンをコードするFT/TFL1ファミリー遺伝子を14種類同定した。このうち、FTグループ4種類、TFL1グループ4種類について開花特性の異なる2品種において遺伝子構造と発現パターンを比較した結果、NnFT2がフロリゲンとして機能する可能性、およびNnTFL1が抑制因子として機能する可能性が示唆された。花器官形成に関与するABCEクラス遺伝子(全12種類)の発現解析の結果、ハスの八重咲きはNnAG (Cクラス)の発現低下が原因である可能性が考えられた。花ハスの開花期および花型を決定する遺伝要因を明らかにするため、H27年度は花成・花器官形成関連遺伝子の単離および発現解析をおこなった。NCBIのデータベースに登録されている中国古代蓮の全ゲノム配列およびLOTUS-DBに登録されているRNA-seqデータに対しフロリゲン/アンチフロリゲンをコードするPEBPファミリー遺伝子のblast検索をおこなった結果、少なくとも14種類の遺伝子がハスゲノム中に存在することが明らかとなった。このうち、FTフループは6種類、TFL1/CENグループは4種類、MFTグループは4種類であった。紅・一重咲きで連続開花性を示す品種"毎葉蓮"をモデル系統と位置づけ、器官別の発現解析をおこなった結果、NnFT1, NnFT2は植物体全体で発現が見られたのに対し、NnFT3は地上部、NnFT4は花器官と地下部で高く発現していた。また、NnTFL1は茎頂および根で、NnAFT, NnBFT, NnCENは花器官で高く発現していた。花器官形成関連遺伝子としてAGAMOUS (AG)およびAPETALA2 (AP2)遺伝子ホモログを単離し、発現解析をおこなった。一重咲き品種の毎葉蓮および八重咲き品種の重台蓮の花器官から抽出したRNAをもとにcDNAを合成し、全長配列の取得を試みた結果、2種類のAG (NnAG1, NnAG2)と3種類のAP2 (NnAP2, NnAP2a, NnAP2b)を単離・同定した。花器官における発現解析の結果、NnAG1/2は雄蕊、雌蕊、花托で発現が高く、一方でNnAP2a/bは花弁、雄蕊で発現が高かった。NnAP2に関しては花器官全体で発現が見られた。上記の遺伝子構造解析および発現解析から、ハスで機能する花成・花器官形成関連遺伝子の絞り込みを進行中である。当初の計画通り、H27年度は花成・花器官形成関連遺伝子の単離をおこなった。一部遺伝子については計画を前倒しし、Q-PCRによる発現解析を進行中である。開花期を決める環境要因の解明については、生理実験に適した品種の選定および人工気象器での自殖種子の実生栽培実験に取り組み、人工光源下での生育・開花を確認した。現在のところ、本研究を進めるにあたって支障となるようなの想定外の結果は得られていない。花ハスの開花期および花型を決定する遺伝要因を明らかにするため、H28年度は前年度までに単離した花成・花器官形成関連遺伝子の詳細な発現解析を行った。FT様遺伝子4種類、およびTFL1様遺伝子4種類に着目し、連続開花性品種の`毎葉蓮'と難開花性品種の`桜蓮'において遺伝子の全長配列および発現パターンを比較した。全長遺伝子配列の比較解析の結果,4種類のTFL1様遺伝子においては正常な転写産物に加え、300800 bpのイントロン領域が残存したスプライシング多型を発現していた。正常な転写産物の塩基配列から想定されるアミノ酸配列はいずれも175 aa程度であり、中でもNnFT1,NnFT2,NnTFL1,NnAFTでFT/TFL1活性に重要とされる5アミノ酸が高度に保存されていた.器官別発現解析の結果,NnFT2は植物体全体で高く発現していたのに対し,NnFT1はいずれの器官においても低い発現量を示した。NnTFL1は根および茎頂で特異的に発現しており、NnAFTの発現は発達中の花器官で高かった。また、葉におけるNnCENの発現量は`桜蓮'で相対的に高かった.これらの結果から,TFL1様遺伝子のスプライシング異常と発現量とが開花特性の違いに関与している可能性,およびNnFT2がハスにおいてフロリゲンとして機能している可能性が示唆された.花器官形成関連遺伝子としてABCEクラス遺伝子に着目し、一重咲きと八重咲き品種の花器官における詳細な発現解析を行った。Cクラス遺伝子であるNnAGの発現は八重咲き品種の雄ずいにおいて発現が低下していた。また、八重咲き品種ではBクラス遺伝子であるNnAP3の発現領域の拡大が見られた。以上の結果から、ハスの八重咲き性はCクラスおよびBクラス遺伝子の発現制御機構の違いによって引き起こされる可能性が示唆された。

花器官形成に関与するABCEクラス遺伝子(全12種類)の発現解析の結果、ハスの八重咲きはNnAG (Cクラス)の発現低下が原因である可能性が考えられた。花成関連遺伝子については昨年度に用いた連続開花性の品種"毎葉蓮"に加え、鉢栽培ではほとんど開花しない不開花性品種の"桜蓮"および"妙蓮"を加え、より詳細な発現解析に取り組む予定である。また、昨年度採取した毎葉蓮の自殖種子の実生栽培系を用い、発生初期からの時空間的な発現解析を行うことにより、ハスの花芽分化・発達制御におけるマーカー遺伝子を特定する。花器官形成関連遺伝子に関してはAGおよびAP2の発現解析を他の八重咲き品種へ拡大するほか、主要なMADS-box遺伝子についての単離と発現解析に取り組み、ハスの花器官形成に関与する主要な遺伝子を特定する。また、ゲノムワイドなSNP情報と表現型データとのアソシエーション解析をおこない、表現型とリンクする遺伝子座の特定を試みる予定である。画期的な栽培法の確立に向けた取り組みとしては、昨年度予備的に取り組んだ人工気象器での実生栽培実験について規模を拡大し、開花促進的な光周期・光質および温度条件について検討する。園芸科学シークエンス解析(外注)のサンプル数が当初計画より大幅に少なかった事と、旅費として計上していた分を使用しなかったため。昨年度未実施分のシークエンス解析、および研究打合せのための旅費として使用する予定である。
生体肝移植と脳死肝移植の適応ならびに施行時期に関する研究

臓器移植医療にはドナーからの臓器提供が欠かせない。肝移植では脳死ないし生体ドナーからの提供が可能である。しかしながら脳死下の提供は限られ生体ドナーは健康体である親族の犠牲を必要とする。本研究では法改正後の臓器提供の増加を期待し、レシピエントの予後改善に寄与しつつ生体ドナーの負担を軽減し脳死ドナーの有効活用を図る上で最適な適応と施行時期の検討を行うことを目標としたが、研究期間中に期待された臓器提供の増加はなく、むしろ全体では減少した。生体肝移植が可能であれば直ちに施行を考慮するのが最も個別の患者の生存率を向上させる確かな選択肢であると考えられる。今後、脳死下臓器提供を推進する研究が必要である。脳死下の提供による移植施行の時間的予測は得られず、待機中死亡は深刻な問題であることに変化はない。そして、健康な生体に侵襲を加えざるを得ない生体肝移植が依然として時間的予測は正確に得られる手段であることにも変わりはない。本研究の目的は、国民の理解と信頼の下に肝移植医療が発展するために、現在までの経験症例を基に、客観的な尺度を用いて最適な脳死肝移植待機、生体肝移植の施行の選択肢を示すことのできる指針を提案すること、である。平成24年度26年度の3年間での進展を念頭に、研究には大きく三段階を設けた。1.当施設の肝移植症例の解析:当施設に於いて施行した肝移植患者の生存率、移植片生着率解析、原病の再発率に加え、時系列解析を行う。2.得られた知見を生体肝移植ならびに脳死肝移植の別に整理の上比較検討し特に生存利益に主眼を置いた考察を加え、治療選択指針の原案を作成する。3.当施設の解析で得られた治療選択指針の原案を、本邦の生体肝移植症例ならびに脳死肝移植症例の全国データに適用した解析を行い、妥当性を評価する。平成25年度は、一年目の平成24年度に引き続き主に1.の段階において、C型肝炎、肝細胞癌、胆汁鬱滞性肝硬変を来たす疾患、の3疾患領域を対象に解析を行った。以下、年度内の研究実績の概要を記す。C型肝炎肝硬変:当科の経験にIL28遺伝子変異の新知見を加えて解析し英文論文として発表した。肝細胞癌:当科の経験と本邦の現状について学会発表を行った。また、移植後の予後因子について詳細な検討を加え、英文論文として発表した。胆汁鬱滞性肝硬変について:本邦での移植症例を参考に時代による治療背景の変遷を検討し、成果を英文論文として発表した。平成24年度は、主に1.の段階において、劇症肝炎、C型肝炎、肝細胞癌、胆汁鬱滞性肝硬変を来たす疾患、の4疾患領域を対象に解析を行った。劇症肝炎:当科の成績に全国集計データを併せ、本邦の劇症肝炎に対する肝移植の成績を英文論文として発表した。C型肝炎肝硬変:当科の経験と本邦の現状を英文論文として発表した。肝細胞癌:当科の経験と本邦の現状について論文を投稿中である。胆汁鬱滞性肝硬変について:全国的なGenome-wide association studyに参加し、日本人における重要な遺伝的背景の解析に寄与しえた。また、成果が英文論文として発表された。本研究を立案していた段階より現時点に至るまで予想に反して脳死下提供は伸び悩み心停止下

臓器提供は昨年度の段階で4割減じるという事態が昨年顕在化した。研究期間を通じてこの傾向の大きな改善はなく、平成25年中の全国脳死下提供数47例、心停止下提供数37例の計84例という数字は、平成26年度に至って脳死下提供数50例、心停止下提供数27例の計77例と更に減少した。研究の主たる対象である肝移植では改正法案の施行に伴い大きな期待が寄せられていたものの実症例の増加は上記の全体の数字から明らかなように、微増に留まった。平成2226年の間の年間脳死肝移植数(肝腎同時含)は、それぞれ30例、41例、41例、39例、45例であった。日本臓器移植ネットワークの待機リストには常時400人程度の待機患者がリストアップされている事態に変わりはなく、欧米諸国はもとより隣国韓国に大きく後塵を拝している状況に変わりはない。本研究ではC型肝炎や肝細胞癌を背景に有する肝硬変を含め肝移植の適応について研究を進め、脳死肝移植と生体肝移植の比較解析により生体肝移植を選択すべきか脳死肝移植を待つべきか客観的な尺度を用いて最適な選択肢を示すことのできる指針を提案すること目標としていた。現状についてはC型肝炎に対する新たな抗ウイルス治療の経験や肝細胞癌に対する拡大適応について等を自施設の経験も加え、詳細に検討し発表した。しかしながら現状では改正以前と同様、本質的に初回移植では劇症肝炎以外の症例に脳死下提供臓器が得られる機会は小さく、緊急度の高い再移植症例と併せて考慮した場合、本邦で大きな課題であるC型肝炎や肝細胞癌を背景に有する肝硬変等、慢性に経過する疾患では未だ移植に至る可能性は極めて小さいことに変化はない。現状の提供数にて課題の解析の継続は困難である。今後の発展には、まず、脳死下臓器提供を推進する研究が必要である。移植医療本研究を立案していた段階より現時点に至るまで諸家の予想は大きく裏切られ、脳死下提供は伸び悩み、心停止下の臓器提供に至っては4割以上減じるという事態となった。改正脳死法案の施行に伴い、脳死下の提供は増加すると考えられ、生体移植の停滞も相俟って大きな期待が寄せられた。事実、米国の年間6000例超には遠く及ばないものの、脳死下肝移植は年間平均5例程度であったものが、ようやく、年間40例程度に増加した。しかし、残念ながら、欧米諸国はもとより、年間360例以上脳死下肝移植を施行している隣国韓国に大きく後塵を拝している現状に変わりはない。臓器提供に対する社会全体の受け入れの指標として、脳死下提供に加え、心停止下の提供数が挙げられるが、後者は4割減じており、内閣府の国民の意識調査による移植医療をサポートする国民の一般意識と相いれない結果となっている。常時日本臓器移植ネットワークの待機リストには400人以上の待機患者がリストアップされている事態に変わりはない。現状では改正以前と同様、本質的に劇症肝炎以外の症例に臓器が提供される機会は小さく、解析データ蓄積のために症例の収集を継続する必要があるといえる。また、肝移植は本来、周術期合併症等で失う症例もあり、生存解析で様々な因子を得るきっかけとなるが、当科の21例の経験では、生体肝移植の経験が有効であるためか、いまだ一例も失っておらず、5年生存率100%を維持しており、予後解析自体を施行する時期に至っていない状態である。脳死移植と生体移植の比較解析により、意義ある指針を見出すには、今後の経験のさらなる蓄積が必要である。本研究を立案していた段階での予想と異なり、脳死下提供が伸び悩んでいる。平成22年度の改正脳死法案の施行に伴い、脳死下の提供は増加すると考えられ、生体移植の停滞も相俟って大きな期待が寄せられた。
ストレッチングがもたらす糖尿病と動脈硬化症の予防効果の解明

食後にストレッチングあるいは歩行運動を行い,血糖値低下作用に違いがあるか検討することを目的とした.運動習慣のない健常成人女性16名を対象とし,食後30分にストレッチングを10分実施する条件,トレッドミル歩行(5km/h)を10分実施する条件,座位安静を保持する条件の計3条件の実験を実施した.血糖値の測定を空腹時,食後30分,60分,90分および120分に実施した.試験食として,カツ丼およびうどん(エネルギー580 kcal,炭水化物80 g)を摂取させた.疲労感,腹痛,吐き気をVAS検査法により評価した.ストレッチングおよび歩行条件の血糖値は,食後30分の値と比較して食後60分,90分および120分に有意な低値を示した(p<0.01).一方,安静条件の血糖値は,食後30分と食後60分の間に有意な差を認めなかった.食後60分の時点の血糖値は,歩行条件が他の2条件に比べて有意に低値を示した(p<0.01).安静条件で食後2時間の血糖値が140 mg/dl以上の食後高血糖を示した者3名は,ストレッチング条件で3人中2人が,歩行条件では全員が140 mg/dl未満に改善した.ストレッチングおよび歩行前後の疲労感,腹痛,吐き気のVASに有意な変化は認めなかった.以上のことから,食後に行う10分間のストレッチングと歩行運動は,ともに食後の血糖上昇を抑制すること,さらに,歩行運動の方がストレッチングと比較して,血糖値の低下作用は大きいことが示唆された.食後10分間のストレッチングは歩行運動と同様に吐き気や腹痛を引き起こさずに実施できることが示された.血糖値の上昇抑制に有効な一過性の静的ストレッチングの処方条件について検討した.健常成人女性12名を対象に,糖負荷試験後にストレッチングを15分間実施する条件,30分間実施する条件,座位安静を保持する条件の計3条件を順序無作為に実施した.空腹時から糖負荷120後までの血糖値を測定し,血糖値の変動曲線から血糖上昇曲線下面積を求めた.ストレッチング条件では糖負荷試験30分経過後から,受動的な静的ストレッチングを行った.両方のストレッチング条件の血糖値は,糖負荷試験30分後の血糖値と比較して60分,90分,および120分において有意な低下を認めた(p<0.01).一方,安静条件においては,糖負荷試験90分および120分後においてのみ血糖値が有意な低下を認めた(p<0.01).血糖上昇曲線下面積は,15分間および30分間のストレッチング条件が安静条件と比較して有意に低値を示した(p<0.05).これらの結果から,糖負荷試験後に上昇した血糖値が受動的な静的ストレッチングよって降下することが示唆され,ストレッチによる伸長刺激が骨格筋の糖の取込み作用を促進させたものと考えられた.また,15分間といった短時間のストレッチ運動でも食後の血糖値上昇の抑制に効果があることが示唆された.さらに,静的ストレッチングが伸長部位の代謝と血管径に及ぼす急性効果について検討した.健常成人女性10名を対象に,10秒および30秒の静的ストレッチングを実施した結果,伸長部位の筋代謝が安静時の1.4倍まで上昇し(p<0.05),さらに静的ストレッチング後に上腕動脈血管径が安静時よりも13%増大した(p<0.01).これらの結果から,静的ストレッチングは伸長部位局所の代謝を亢進させるとともに,血管拡張作用を有することを明らかにした.静的ストレッチングが食後の血糖値に及ぼす一過性の影響について,血糖値の降下に有効な静的ストレッチングの処方条件を探る研究に取り組み,順調に研究計画を遂行できている.また,静的ストレッチングが伸長部位局所の代謝と循環に及ぼす急性効果についての研究を遂行することができ,研究計画はおおむね順調に進展している.ストレッチングが血糖値の上昇を抑制するか調べるとともに酸化ストレスに及ぼす影響について検討した.運動習慣のない健常成人女性10名を対象に,糖負荷試験前にストレッチ運動を30分間実施する条件,糖負荷試験後にストレッチ運動を30分間実施する条件,座位安静を保持する条件の計3条件を順序無作為に実施した.ストレッチングはパートナーによる受動的な静的ストレッチングとし,大筋群を対象とした12種目を実施した.血糖値の測定を摂取前,摂取後30,60,90および120分に,酸化ストレス度(d-ROMs),抗酸化力(BAP)の測定を摂取前,摂取後30,60および120分に実施した.その結果,血糖値は糖負荷後60分時点において安静条件と比較していずれのストレッチ条件においても有意に低値を示した.そのほかの時点の血糖値は各条件間で有意な差がなかった.血糖上昇曲線下面積は安静条件と比較して糖負荷後のストレッチ条件で有意に低値を示した.d-ROMsおよびBAPは,すべての条件において糖負荷試験の時間経過に伴う変化に有意な差がなく,さらに,各条件間においても有意な差がなかった.これらの結果から,ストレッチングは酸化ストレスを上昇させることなく,糖負荷後の血糖値上昇を抑制することが示唆された.

また,食後および食前のタイミングで実施するストレッチングは,食後の血糖値管理のための運動として有効であるものと考えられた.本年度は,ストレッチングが酸化ストレスを上昇させることなく,血糖値上昇抑制作用があること,食前および食後のタイミングで行うストレッチングには食後の血糖値管理のために有用であることを明らかにすることができ、研究計画はおおむね順調に進展している.食後に行う10分間の座位による静的ストレッチングが血糖値を降下させる作用があるかどうか検討した.運動習慣のない健常成人女性11名を対象とし,食後30分の時点から座位によるストレッチングを10分間実施する条件,あるいは座位安静を保持する条件を順序無作為に実施した.試験食として,おにぎり2個を摂取した.血糖値の測定を空腹時,摂取後30分,60分,90分,120分に実施した.ストレッチングは座位で実施可能な8種目とし,ストレッチングの前後に吐き気と疲労感をVAS検査法を用いて評価した.ストレッチング条件では,食後30分の血糖値と比較して食後60分,90分および120分の血糖値が有意な低値を示した.一方,安静条件の血糖値は,食後30分と60分との間に有意差がなく,食後90分および120分において食後30分よりも有意に低値を示した.ストレッチング条件における食後30分から60分までの血糖値降下量は安静条件よりも有意に高い値を示した.食後高血糖を呈した1名の食後120分後の血糖値は,ストレッチング条件において改善を示した.ストレッチング前後の疲労感と吐き気のVASに有意な変化は認めなかった.以上のことから、食後に行う短時間の座位ストレッチングには,血糖値を降下させる急性の作用があることが示唆された.この短時間のストレッチングは,吐き気と疲労感を伴うことなく実施できたことから,食後の血糖値管理のための運動として活用できるものと考えられた.当初予定通り,食後のストレッチング運動の実用化に向けて,短時間の座位によるストレッチングが血糖値を降下させる作用があることが示すことができた.さらに,この食後のストレッチングは吐気や疲労感を伴うことなく実施できることを示すことができ,おおむね研究は順調に進行している.また,現在までにストレッチングが心臓足首血管指数(CAVI)に及ぼす効果について検討を進めている.食後にストレッチングあるいは歩行運動を行い,血糖値低下作用に違いがあるか検討することを目的とした.運動習慣のない健常成人女性16名を対象とし,食後30分にストレッチングを10分実施する条件,トレッドミル歩行(5km/h)を10分実施する条件,座位安静を保持する条件の計3条件の実験を実施した.血糖値の測定を空腹時,食後30分,60分,90分および120分に実施した.試験食として,カツ丼およびうどん(エネルギー580 kcal,炭水化物80 g)を摂取させた.疲労感,腹痛,吐き気をVAS検査法により評価した.ストレッチングおよび歩行条件の血糖値は,食後30分の値と比較して食後60分,90分および120分に有意な低値を示した(p<0.01).一方,安静条件の血糖値は,食後30分と食後60分の間に有意な差を認めなかった.食後60分の時点の血糖値は,歩行条件が他の2条件に比べて有意に低値を示した(p<0.01).安静条件で食後2時間の血糖値が140 mg/dl以上の食後高血糖を示した者3名は,ストレッチング条件で3人中2人が,歩行条件では全員が140 mg/dl未満に改善した.ストレッチングおよび歩行前後の疲労感,腹痛,吐き気のVASに有意な変化は認めなかった.以上のことから,食後に行う10分間のストレッチングと歩行運動は,ともに食後の血糖上昇を抑制すること,さらに,歩行運動の方がストレッチングと比較して,血糖値の低下作用は大きいことが示唆された.食後10分間のストレッチングは歩行運動と同様に吐き気や腹痛を引き起こさずに実施できることが示された.
天然力を利用した自然林再生技術の開発

本研究は、針葉樹人工林伐採後の森林再生メカニズムを林分レベルとランドスケープレベルの両面から明らかにし、生態学知見に基づいた天然更新による森林再生の可否判断および更新技術の開発を目的としている。本年度は、森林再生に及ぼすシカの影響、および伐採後の更新個体の発生および成長に及ぼす伐採前の個体サイズおよび光環境の影響を明らかにし、既報の成果と併せて、人工林が卓越する森林空間(集水域)での自然林再生の候補地の選定方法について解析を行った。伐採後の再生植生に及ぼすシカの影響はシカ生息密度と対応しており、高密度で生息する林地では更新個体が少なく、ほとんどが食害を受けていた。また、シカ生息エリアの境界付近での伐採による餌資源の増加は、シカ生息エリアの拡大を引き起こす要因のひとつであると示唆された。伐採後の更新個体のなかで、埋土種子由来の先駆性木本種は光環境によって発生および成長が規定され、Gap Light Indexが20-40%以下でそれらが抑制されていた。一方、前生樹由来の常緑性木本種の発生および成長に対する光環境の影響はなく、樹種および伐採前の個体サイズによって決まっていた。したがって、前生樹からの更新については、伐採前の林分状態から伐採後の更新個体を比較的確実に予測することが可能と考えられた。最後に、これまでの研究成果を総合し、集水域内で自然林に戻すべき場所の抽出を行った。評価軸には、生物多様性保全機能の高い場所および木材の生産性が低い場所を用いた。その結果、再生候補地は抽出されたが、集水域内にパッチ状に点在していたため、各パッチ間の距離が近い箇所から結合し、パッチの連続性を確保した。その際に、集水域内の人工林率を計算し、木材生産も考慮した最適な候補地の抽出を行った。この結果は、今後自然環境に配慮した木材生産を実現していく上で重要な基礎データを提示することができた。本年度は、自然林再生へ影響を及ぼす要因の抽出として、シードソースとなりうる伐採跡地に隣接する照葉樹林の効果(残存する天然生林の役割)について解析を行い、自然林再生におけるこれらの効果について重要な知見を示すことができた。伐採跡地に散布される種子は、周辺の照葉樹林やスギ人工林と比較して、明らかに少なかった。また、伐採跡地に散布される種子は、隣接する照葉樹林との林縁から20m以内であり、種子の散布が狭い範囲に限られていることが分かった。さらに、これらの種子散布は、種子生産の豊凶や母樹の有無、伐採跡地の環境などによって時空間的にバラツキが大きいことが示された。したがって、伐採後に散布される種子からの実生更新は、短期的には更新の不確実性が非常に高いことが分かった。また、これまでの成果で得られている、自然林再生における前生樹の重要性(極相林構成種を比較的多く含む、伐採しても萌芽などによって更新の確実性が高い)と上記の伐採後の種子散布由来の実生更新の結果を合わせることで、自然林再生における更親材料(前生樹および散布種子)の長期的および短期的な役割を示すことができた。自然林再生において、短期的には、更新確実性の高い前生樹の有無が更新の指標となる。一方、伐採後に散布される種子からの更新は、林分としての多様度の増進など長期的な更新の指標とすることが妥当であると考えられた。また、この成果とこれらの更新材料の多寡を左右する因子を整理することで、針葉樹人工林伐採後の更新予測の基礎を構築することができた。
心筋細胞の分化に関わる遺伝子の同定と分化誘導への応用

心筋細胞の早期マーカーであるNkx2.5遺伝子座にGFPをノックインしたマウスES細胞株に対して我々の作成したポリAトラップレトロウイルスベクターを用いて遺伝子を破壊した。分化誘導後GFPを発現しない細胞クローン、すなわち心筋細胞への分化効率が減少するクローンを選別した。このレトロウイルスベクターのLTRにはloxP配列を挿入しているので、Cre recombinaseを発現させることで、挿入されたレトロウイルス遺伝子を除去した後にGFPの発現が再上昇するクローンをさらに選別した。その後、薬剤耐性遺伝子とポリA配列から作成したプライマーを用いて3'RACE法を行うことにより、挿入変異を受けた遺伝子を同定した。現在48個の遺伝子について、その上流、下流の遺伝子を含めて詳細な検討を続けている。そのうちの1つであるtryptophan hydroxylase 1(TPH1)においては、ノックアクトマウスにおいて拡張型心筋症様の心筋病変が生じることが報告されている。しかしながら、そのような病変を呈しないノックアウトマウスの系統もあり、神経系で発現の認められるTPH2が代償的な役割を果たしている可能性もある。現在、後者のノックアウトマウスの分与を受け、TPH1の役割について検討を始めた。一方、マウスES細胞で胚葉体形成後6日目にヒストン脱アセチル化酵素阻害薬トリコスタチンAで刺激すると、心筋細胞分化効率は約4%から8%へと有意に増加した。さらに上記で得られた遺伝子の過剰発現とトリコスタチンAの刺激で心筋細胞分化効率が上がるかどうかについても検討中である。また、白色脂肪細胞から分離されるstromal vascular fractionには間葉系の幹細胞が含まれる。この幹細胞からの血管系への分化効率についても上記の実験で得られた遺伝子をもとに検討している。本研究の目的は、心筋細胞分化に必要な遺伝子の同定とその遺伝子の役割の解明、さらに効率的な分化誘導法の開発をめざすことである。申請者は、レトロウイルスを用いてランダムに遺伝子を変異させ、その遺伝子変異によって生じた細胞の機能変化をもとに遺伝子クローニングを行う方法を開発した。レトロウイルスはゲノムに対してほぼランダムに遺伝子挿入を起こすが、我々はレトロウイルスベクターを改良することで、高率に内在性遺伝子の存在する部位に薬剤耐性遺伝子が挿入されたクローンを選択することを可能とした。まず、ES細胞(h17)に、このレトロウイルスに感染させ、ランダムに遺伝子を破壊し、その結果、hanging dropによってembryoid bodyの形成率の低いクローンを選別した。機能が未知の遺伝子を含めて、8つの遭伝子が得られた。これらの遺伝子の中で、遺伝子を破壊した細胞に導入した結果、embryoid bodyの形成率が上昇した遺伝子の1つはMAD(mothers against decapentaplegic homolog interacting protein)であった。今後上記で得られた遺伝子の詳細な機能を明らかにする。さらに候補となる遺伝子数を増やすとともに、心筋細胞に分化誘導できるP19CL6細胞や他の細胞系に対する遺伝子導入の効果も検討する。
二段階脱保護法による実用的リン酸化ペプチド・タンパク質の合成法の開発に関する研究

蛋白質のチロシン、セリン、スレオニン残基のリン酸化、脱リン酸化が生体内情報伝達系において重要な役割を果たしていることが明らかになるにつれ、近年リン酸化ペプチド・タンパク質の需要が高まっている。このような観点より『二段階脱保護法による実用的リン酸化ペプチド・タンパク質の合成法の開発に関する研究』を遂行し以下のような実績をあげることができた。2.長鎖リン酸化ペプチドの合成に必要とされるリン酸化フラグメントの合成については、ジメチル保護リン酸化アミノ酸とLys(ClZ)を含有する保護ペプチドフラグメントをトリフルオロメタンスルホン酸(TFMSA)-TFA-m-cresol(1:9:1)からなる系で脱保護するとLysとリン酸化アミノ酸側鎖が完全に保護されたチオエステルペプチドフラグメントが効率的に合成できることを見出した。現在、得られたフラグメントを用いる長鎖リン酸化ペプチドの合成について検討中である。1.まず合成ストラテジィーとしては保護リン酸化アミノ酸を縮合し、合成の最終段階においてリン酸の保護基を含む全保護基の除去を行うプレリン酸化法を採用することとした。そこで保護リン酸化アミノ酸としてジメチルホスフェート含有アミノ酸[Boc-Ser/Thr/Tyr-(OPO_3Me_2)-OH]を用いることとし、これらアミノ酸誘導体を通常のBoc型固相ペプチド合成法に適用可能であることを確認した。さらに本メチル基の脱保護並びにペプチド合成への適応性という点に注意をはらい新規最終脱保護系の開発を行った。その結果High Acidic[1 M TMSOTf-thioanisole/TFA,m-cresol,EDT(ethanedithiol)]-Low Acidic[1 M TMSOTf-thioanisole/TFA,m-cresol,EDT+TMSOTf+DMS(dimethyl sulfide)]からなる二段階脱保護法がリン酸化ペプチドの脱保護法に非常に有効であることを見出した。2.長鎖リン酸化ペプチドの合成にはフラグメント縮合を用いることが必要不可欠であると判断し、チオエステルリン酸化ペプチドフラグメントの合成に焦点を当て研究を展開した。その結果、トリフルオロメタンスルホン酸(TFMSA)-TFA-m-cresol(1:9:1)からなる系をフラグメントの脱保護系として用いるとLysとリン酸化アミノ酸側鎖が完全に保護されたチオエステルペプチドフラグメントが効率的に合成できることを見出した。
物理的根拠に基づく表層崩壊発生限界雨量の検討

表層崩壊(崖崩れ)を引き起こす降雨強度・量の閾値を,物理的なメカニズムに基づいて検討する為に,自然斜面土層内部に発達した通水経路網(水みち)の探査手法を開発し,通水経路網を介した地下水の流動プロセスを解明した。土壌の硬さを計測するための貫入試験機に水分計を取り付けた土壌水分計付貫入計を開発・改良し,これを用いた計測と,高密度電気探査を組合わせることにより,通水経路網を効率良く探査できることが示された。山地斜面の表層崩壊発生限界雨量を物理的に評価する為に,(1)土層内に「水みち」が自然に形成されるプロセスを室内実験により解明すること,(2)自然斜面内部の「水みち」を探査する手法を確立すること,(3)自然斜面の「水みち」の発達具合とその排水能力を解明すること,(4)人工降雨実験により自然斜面を崩壊させ「水みち」が与える影響を解明すること,を計画した。山地斜面土層内の土壌水分空間分布を知ることは,崩壊に対する斜面の安全性の評価や,斜面緑化の為の土壌環境評価を行う上で,極めて重要となる。特定の斜面における土壌水分分布の時系列を知るためには,テンシオメータや土壌水分計を設置すれば良いが,利用できるセンサーの数によって空間的な分解能が規定されてしまう上,測器の設置に時間と手間がかかることから,機動性を重視した使用には適さない。一方,最も標準的な秤量法による土壌水分計測では,不撹乱土壌を土壌断面掘削やオーガーを用いて採取せねばならず,効率が悪い。これに代わる手法として,電気探査等による地表面からの非接触計測技術の向上が望まれるが,非接触であるがために土壌水分以外の要因が計測値に大きく影響してしまい,キャリブレーション方法の確立が容易でない。このような背景のもと,本年度の研究では,主に水分計付貫入計(以下,CPMPと呼ぶ)を開発し,精度の検証を行った。その結果,従来の長谷川式土壌貫入計とCPMPを用いて計測された貫入抵抗値Nc(10cmの貫入深を得るのに必要な打撃数)の鉛直分布は,互いに良好な一致を示した。このことから,水分センサーを取り付けたことによる貫入抵抗値への影響は,無視できる程度のものであると結論付けられた。また,CPMPで計測された体積含水率の鉛直分布が,市販のTDRプローブ(CS605)による計測値と非常に良い対応を示すことがわかった。また両測器で計測された体積含水率は,秤量法により得られた含水率と一致した。この様に,CPMPを用いることによって,土壌水分量の鉛直分布を迅速かつ精度良く求めることができることが示された。さらに,含水率と貫入抵抗の両方を同時に計測できるCPMPは,土性の違いや地下水位といった水文現象を解析する上で重要な情報を得ることができるため,従来の貫入計に比べて山地斜面の特性を調査する上でより有効な測器であることがわかった。斜面の表層崩壊発生に関して,斜面土壌内の水分挙動に関する情報が重要であることが指摘されている。これまで地盤内の水分挙動を把握するために,埋設型の土壌水分計が用いられてきたが,センサーの空間的な分解能が低くセンサー数によって計測範囲が限定されるという問題がある。このため,間接的な計測方法である電気探査を用いて,広範囲を対象とした土壌内水分挙動を探査することができれば,情報量が飛躍的に増加する。そこでH20年度の研究では,特に,山地斜面の同一測線上で,電気探査と高密度に配置した土壌水分計による経時観測を行い,その観測結果を比較した。勾配約28度の斜面において,縦断方向に電気探査と水分計の測線を10cmほど離して並列に設置した。電気探査に用いた装置はE60CN MERS(GeoPen社製)で,電極間隔は水平距離で50cmとし,計11か所に電極を設置した。一方,土壌水分計にはキャパシタンスメーターを用い,水平距離で約50cm間隔,計10か所(上流側より,No.110)埋設し,全長約4.7mの測線を設定した。電気探査は1時間ごとで自動計測を,水分計は1か所につき深度10cmから50cmまでの10cmごとの計50点について,5分間隔で自動計測を行った。測線端にあるNo.1地点では降雨と無関係な比抵抗値の変動が見られ,降雨に対する比抵抗値の変動が体積含水率の変動と必ずしも対応しない結果となった。また,下層の比抵抗計測値が上層の比抵抗値変動の影響を大きく受けることがわかった。それに対し,測線中央のNo.6地点では良好な対応関係が見られた。特に,異なる深度における比抵抗計測値が,それぞれの深度の含水率変化と良好な対応を示すことが分かった。

各地点・深度ごとに体積含水率と比抵抗値の相関をとった結果,側線の中央部分では相関が高い一方で,測線端では相関が低くなった。これらの結果から,測線長を解析領域よりも十分大きく設定することにより,電気探査によって山地斜面表層の水分挙動が把握できることが明らかとなった。崩壊発生限界雨量を解析する為に,A:土層内に「水みち」が形成されるプロセスを室内実験により解明すること,B:自然斜面内部の水みちを探査する手法を確立すること,C:自然斜面の水みちの発達具合と排水能力を解明すること,D:人工降雨実験により自然斜面を崩壊させ「水みち」の影響を解明すること,を計画していた。Aでは,水路に充填した土層に1ヶ月にわたって給水して,水みちが発達する課程をモデル化した。Bでは,水分計付貫入計と高密度電気探査と組み合わせることで新たな探査手法を開発し,土層内に存在する基岩からの湧水点と,そこから発達した水みちの形状を探査することに成功した。Cでは,この湧水点を有する斜面において詳細な水文観測を実施し,「水みち」が雨水の排水経路として機能する様子を解明した。項目A,B,Cの結果,土層内に発達した水みちが,降雨流出に支配的な影響を及ぼしていることが判明した。よって,水みちが崩壊に与える影響を解明すること(項目D)が,崩壊予測において重要であることが明確となった。ただし同時に,項目Dで計画していた人工降雨実験では,不十分であることも明らかとなった。その理由は,水みちの発達と浸透水の挙動に重要な影響を持つ基岩湧水は,数ヶ月にわたる先行雨量の影響を受ける上,その集水域が表面地形の集水域とは異なる為,人工降雨では正確に再現できないからである。さらに,林地斜面の降雨は樹木により林内雨と樹幹流に分離され,大きな空間不均質性を示す為,地表面に直接人工降雨を散布しても自然状態を再現できないことも問題である。このようなことから,自然斜面の崩壊機構を解明するには,自然降雨によって崩壊が起きる時の土層内部の状況を克明に計測する必要があるとの認識に至った。以上の結果に基づきH22年度には,当初の研究計画の一部を見直していく予定である。
砂地盤の三次元支持力に関する基礎的研究

小型容器(30cm径×高さ20cm)、中型(150cm径×165cm)、遠心装置(30、60、90G)を使った稲城砂の表面載荷試験により、(1)係数Sγは1ー0.4B/Lとde Beerに近いものを得た。(2)L/B>5では支持力はほぼ定値になる。(3)支持力係数がBの増大とともに低下する度合はL/Bに依存し、L/Bの小さい程低下度合が大きいが、寸法効果に比べると差異は小さい。(4)稲城砂のφが応力及び異方性を受けるとして塑性計算を円、帯基礎について行ったところ、(3)の実験特性を説明することが出来た。(5)長方形基礎の塑性域の範囲は理論に比べ約1/2と小さいが、これは進行性破壊に因ると思われる。小型容器(60cm巾×10cm長×25cm高;30×30cm巾×35cm高)に豊浦砂を入れ、根入れ巾比を014に変え二、三次元実験を行った。その結果(6)係数Sγは1ー0.5B/L、係数Sqは1.5(L=B)と求められSq=1+tanφが確かめられた。(7)解析により係数dq=1+0.25tanφ・tan^<-1>(D/B)を得たが、二次元ではこれと良く一致し、三次元ではdq=1+0.16tan^<-1>(D/B)(L=B)が得られた。三次元分割法を支持力計算に適用するプログラムを開発した。これにより、(8)C、φを変え試算した結果、三次元支持力q_3と二次元支持力q_2の間にq_3=(1+0.8B/L)q_2が成立つことがわかった。(9)宝木ロ-ムで作った斜面(傾角30、45、60°)上の長方形基礎の載荷試験を行い、崩壊荷重と分割法による計算を比べたところ、実用的にほぼ一致することが確かめられた。山口は気乾標準砂を用い小型土槽(直径34cm、高さ30cm)で2,3次元支持力実験を行った。根入れ/巾比は014と変え、間隙比e=0.650.73である。その結果、(1)D=0のテストから得られたS_2は約0.4となり、日下部の整理結果に比べてかなり小さくなっており、再検討の必要が認められた。(2)D≠0のテストからSgを求めたところeに抱らずSg〓1.55となったが、これはde Beerの提案値に近い。また2,3次元の支持力を比べて求めたSgは1.67であった。また2、3次元の支持圧力が等しいようなD/B=1.1となり、これはMeyerhofの求めた0.25と大巾に異なっている。(3)2次元実験から求めたdgはD/B<4では1+(D/(4B))・tanφで、D/B>4では1+1/4tanφ、tan^<-1>(D/B)で近似出来ることがわかった。

日下部は気乾稲城砂を用い小型土槽(直径30m、高さ20cm)および中型土槽(直径1.5m、高さ2.0m)で支持力実験を行った。L/B=19に変え、Dr〓80%であった。その結果、(4)荷重沈下曲線はL/Bの値により変化し、D/Bが大きい程、平面ひずみ効果のためgp(ピーク)が大きく、gr(残留)が減少するがL/B>5では一定になることが確かめられた。(5)地表面で観測した破壊域の範囲もL/B>5でほぼ一定となるが、その範囲は塑性理論で知られてるものに比べ約1/2と小さい。理由の一つとして進行性破壊が考えられる。(6)載荷時の土盤内土圧を測定したところL/Bの増大とともに、垂直土圧と水平土圧は長辺側に集中する傾向がみられた。これは砂地盤内の応力伝達特性に起因するものと考えられる。小型容器(30cm径×20cm)、中型(150cm×165cm)、遠心載荷装置(30、60、90G)を使って稲城砂の表面載荷試験を行った。そして、(1)形状係数はほぼDe Beerのものと一致した。(2)支持力係数は巾Bが増すと下り寸法効果が認められるが、L/Bが小さい程、低下の度合が大きくなった。(3)稲城砂ではφ=41.8-2.5logσf(σfは破壊時の平均圧力でkgf/cm^2の数値)として、他に異方性を考慮してkotter解析を行った。軸対象、二次元解析の結果を比べたところ、(2)の実験特性を良く説明し得ることがわかった。豊浦砂を小型容器(60cm巾×10cm長×25cm、30×30cm巾×35cm)にセットし根入れ/巾比を014に変えて二、三次元の載荷実験を行った。(4)解析により深さ係数dq=1+0.2tanφ・D/Bまたは1+0.25tanφ・tan^<-1>(D/B)と推論された。(5)tan^<-1>を用いる必要性は二次元載荷実験から確かめられた。(6)三次元載荷デ-タからdq=1+0.16D/Bが推論されたが、理論に比べ低く出たのは根入れ増大にともなう局所せん断の発生によるものと思われる。三次元分割法を支持力計算に適用するプログラムを開発した。(7)解析のデ-タを整理した結果、三次元支持力q_3と二次元支持力q_2の間には平地盤の場合にq_3=(1+0.8B/L)q_2の関係が成り立つとみてよい。(8)宝木ロ-ムから成る斜面(傾角30、45、60°)上の長方形基礎の載荷試験を行い崩壊荷重と分割法による計算を比べたところ実用的にほぼ一致することが確かめられた。
腎臓発生開始を司る液性因子の探索

腎臓の発生は尿管芽が後腎問葉に侵入し、その相互作用によって始まる。本研究では尿管芽を引き寄せる過程に関与する液性因子あるいは細胞表面因子を同定することを目的とした。1.Sall1ノックアウトマウスでの既知因子の発現観察後腎間葉と尿管芽の相互作用の関与が新たに報告された細胞外基質や接着因子の発現を検討したが、細胞外基質integrinα-8の発現の差は認められなかった。今後接着因子Robo2やFrem1の発現解析を行う予定である。2.後腎間葉で発現する遺伝子の網羅的探索Sall1は腎臓の大部分のもととなる後腎間葉で発現している。我々は胎齢11.5の後腎のSall1高発現分画に、複数の上皮細胞種へと分化しうる前駆細胞が含まれることを明らかにしており、ここで発現する遺伝子の探索は腎臓の発生、再生研究に有効であると考えられる。しかしながら胎齢11.5の後腎間葉は小さく採取できたRNA量は非常に少なかった。一方胎齢17.5の後腎間葉の大きさは十分であるが、Sall1が分化した広範囲の細胞集団で発現するため、後腎問葉細胞のみを単離することが難しい。そこで後腎間葉においてSall1よりも未分化な細胞群に発現が限局している別の転写因子遺伝子座にGFPを組み込んだES細胞を単離し、さらにそれからマウスを作成したところ、期待通りに後腎問葉でのみ蛍光が強く発色した。現在このマウスの胎齢17.5の後腎間葉からGFP陽性細胞をFACSにより取り出し、マイクロアレイ解析を行っているところである。18年度は後腎間葉で発現する既知因子についての解析を中心に研究を進めた。1. Sall1ノックアウトマウス後腎(胎齢10.5日)の切片を用いて既知因子の発現を検索これまでに後腎間葉と尿管芽の相互作用への関与が報告されているPax2、Six1、Eya1、Gdnf、Wt1などの発現をin situ hybridizationで検討したところ、いずれの因子にも差を認めなかった。後腎間葉と尿管芽の相互作用において最も重要と考えられるGdnfは、Pax2、Six1、Eya1により制御されていると考えられ、Sall1はこの制御に直接の関与がないことが示唆された。またSall1ノックアウトマウスで見られる腎臓欠損の表現型はGdnfの変化を介していないことが考えられる。相互作用には細胞外基質や接着因子の作用も知られている。今後これらの因子についての解析を行う予定である。2.後腎間葉で発現する遺伝子の網羅的検索Sall1は腎臓の大部分のもととなる後腎間葉で高発現している。当研究室では胎齢11.5日の後腎におけるSall1高発現分画に、腎臓実質のいくつかの細胞腫へと分化しうる能力を持った細胞が含まれていることを明らかにしており、ここで発現する遺伝子の検索は腎層の発生、再生研究に有用であろうと考えられる。今回同様に後腎間葉で発現する遺伝子を探索する方法の一つとして、凍結切片上で後腎間葉を目視しながら採取できるレーザーキャプチャーマイクロダイセクション法の条件検討を行った。しかし採取できたRNA量は非常に少ないものであり、膨大なサンプル数が必要ということで別の方法を検討することになった。シグナルシークエンス・トラップ法を組み合わせた網羅的解析を今後行う予定である。