hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Adipokinetic Hormoneとその受容体の哺乳類での存在とその作用

このAKHが節足動物でエネルギー産生に関与する事より、哺乳類での作用を検討する為、膵灌流系へ添加し膵ホルモンへの影響の有無を検討した。基礎灌流への添加でインスリン及びグルカゴン分泌の軽度の抑制傾向が認められた事から、分泌刺激下での影響について検討した。両ホルモンの分泌刺激としてアルギニンを用いAKH10^<-10>M10^<-6>Mの範囲で添加した。AKH10^<-9>M10^<-6>Mの範囲で容量依存性に両ホルモンの分泌抑制を認めた。ラット脳、膵、肝、腎組織から超遠心法に依って得られた粗製膜分画を用いて^<125>lーtry-AKHとの間に特異的結合が認められるか否か検討した。脳、肝、腎組織で特異的結合を認めた。今後更に膵組織での検討が必要と考えられる。又ラット組織にAKH免疫活性を認めた事からヒト組織についての検討及び脳脊髄液、血液中のAKH免疫活性の有無についても検討を加えたい。AKH受容体自体についても検討を加えたい。前年度に作成した抗体で構築したradioimmunoassay系を用いてヒトおよびラットでの組織分布、ヒト体液中での存否について検討した。ラット組織では脳下垂体、膵臓、副腎等内分泌臓器で比較的高値を認めた。ヒト消化管外科手術時の摘出標本での検討では小腸各部位、大腸で免疫活性を認めたが部位別で著しい差異はなかった。ヒト体液中での検討では脳腫瘍患者、脳血管障害患者(蜘蛛膜下出血、脳出血、硬膜下出血および脳硬塞)、正常者の脳脊髄液中に免疫活性を認めた。血漿での検討も行ったが正常者、糖尿病患者、甲状腺機能異常症患者、肝疾患患者等では免疫活性を認めなかった。慢性腎不全患者血漿では免疫活性を認めadipokinetic hormone(AKH)の血漿よりの除去に腎が重要な役割を果たしていると考えられた。逆相高速液体クロマトグラフィ-、ゲルクロマトグラフィ-によるこれら免疫活性の検討では脳脊髄液および腎不全患者血漿の免疫活性は単峰性でAKHとほぼ同一と考えられたが組織中の免疫活性は多峰性を示しAKHより大分子型の占める割合が多いと考えられた。又、脳下垂体、膵臓、副腎でのAKHの作用について検討を行なった。ラット摘出膵灌流標本を用いて10mMアルギニンおよび18.5mMトルブタマイドを刺激物質としてインスリン、グルカゴン分泌の変化を検討した。両刺激下でAKH10^<-10>Mから10^<-6>Mの濃度で用量依存性に分泌抑制作用を認めた。雑種成犬を用いたin vitroの検討ではAKH50pmol/kg/minの投与でACTHの有意の変動を認めた。5pmol/kg/min以下の投与での有意の血中ホルモンの変動は認められず無脊髄動物に認められる脂質動員作用は認められなかった。レセプタ-の検討は超遠心法によって得られる粗製膜分画を用い、脳、肝、腎組織で特異的結合が存在すると考えられたが安定した結果が得られずアッセイ法の変更も必要と考えられた。
細胞内シグナルフローの可視化解析

本研究では、重要なシグナル分子についてそれらを可視化するプローブの開発を推し進め、それを用いてシグナル分子の局在と機能の時間変化を生きた細胞でシグナル・カスケードをリアルタイムに可視化し、細胞機能の調節機構の解析を進める。これによって、シグナル分子が細胞機能を制御する機構を、全く新しい観点から明らかにすることを研究の目的としている。今年度の研究により以下の成果を得た。1)中枢シナプスにおけるIP_3シグナル機構の可視化解析:二光子励起顕微鏡法による細胞内IP_3濃度イメージングにより、シナプスにおいて、イオンチャネル型グルタミン酸受容体と代謝型グルタミン酸受容体が協同して下流のシグナル(IP_3産生)を誘導することを明らかにした。これによりシナプス後膜に2種のグルタミン酸受容体が共存する生理的意義を明らかにした。2)ミオシン軽鎖リン酸化インジケーターの開発:ミオシン軽鎖のリン酸化状態を経時的に測定するインジケーターを開発した。このインジケーターは、血管平滑筋の異常収縮などに関与すると考えられるRhoキナーゼ系作用薬の評価にも応用できる。3)中枢シナプスにおける一酸化窒素(NO)シグナルの可視化解析:神経終末から放出されるNOをシナプスにおいて初めて可視化した。これにより、従来の予想とは異なり、NOシグナルは高いシナプス特異性を有することを明らかにした。また、小脳の平行線維・プルキンエ細胞シナプスにおいて、NOシグナルが神経活動の頻度に二相性に依存していることを発見し、これに依存したシナプス可塑性を発見した(投稿中)。4)細胞周期と細胞死:アポトーシス関連分子BADと14-3-3分子の結合解離を生きた細胞内で経時的に観測することにより、増殖因子の除去と細胞周期の一致がアポトーシスを強く誘導することを明確にした(投稿中)。1)可視化プローブの開発一酸化窒素(NO)可視化のためのプローブについては、NOとの結合が十分強い蛋白質ドメインのより詳細な情報を得る実験に成功し、蛍光物質とのコンジュゲートが完成した。また、リン酸化プローブ作製に向けた基礎的実験成果を得た。具体的には、セリンスレオニンキナーゼによるリン酸化を認識するドメインであるWWドメインを単離し、リン酸化ペプチドとの結合様式を評価した。さらに、NFATの核内移行をモニターするプローブが完成し、その活性化因子である細胞内カルシウムとの詳細な時間的関係を明らかにしつつある。可視化プローブの生細胞への導入法としてシンドビスウイルスを用いる方法を確立した。2)血管収縮制御機構解明へのアプローチ血管系をできるだけインタクトな状態で摘出して、細胞内蛍光イメージングを行える実験システムの確立に着手した。3)神経系におけるシグナル分子の可視化解析マウス胎児小脳由来のプルキンエ細胞の培養系を確立した。現在、この培養ニューロンに対して可視化プローブを導入し、測定を試みている。さらに、培養系で得られた結果をもとに、生体内の構造が保たれた状態で、生理的条件下におけるシグナル分子の動態を明らかにするため、スライスパッチクランプ用の実験系を立ち上げ、マウス小脳スライス標本を用いた解析にも着手している。4)カルシウムシグナル系の解析ツールカルシウムシグナル系で重要な役割を果たすIP3受容体のカルシウム感受性に関わるアミノ酸を分子上に同定した。この結果は、今後カルシウムシグナルフローを解析するうえで重要なツールになる。本研究では、重要なシグナル分子についてそれらを可視化するプローブの開発を推し進め、それを用いてシグナル分子の局在と機能の時間変化を生きた細胞で解析する。これによって、シグナル分子がどのように細胞機能を制御するのかを明らかにすることを研究の目的としている。可視化解析という点で最も進んでいるCa^<2+>シグナル系を研究の軸とするが、関連する分子群に対象を拡大し、生きた細胞においてシグナル・カスケードをリアルタイムに可視化し、細胞機能の調節機構を明らかにしたいと考えている。今年度の研究により以下の成果を得ることができた。1)培養神経細胞に対して確立したDNA導入法を用い、イノシトール三リン酸(IP_3)インジケーター分子を培養神経細胞あるいは脳スライス標本中の神経細胞に発現させ、種々のアゴニスト刺激あるいはシナプス入力刺激に対応する細胞内IP_3濃度測定を進めた。その結果、小脳プルキンエ細胞においてシナプス入力に伴う脱分極によって、IP_3が産生されるという新しいシグナル伝達機構を発見した。2)IP_3受容体のカルシウムセンサー部位を同定することに成功し、このセンサー部位にアミノ酸変異を導入することによって、カルシウムシグナルが変化することを突き止めた。これによって、IP_3受容体機能とCa^<2+>シグナルの関係を追究するための有力な道具を手中にした。3)これらに加えて、一酸化窒素プローブ、リン酸化酵素活性のインジケーターおよびミオシン軽鎖リン酸化可視化プローブについても、現在順調に開発を進めている。

1)カルシウムシグナル形成に重要なIP_3受容体の構造と機能の関連について解析を進めた。IP_3受容体の欠失ミュータントの機能解析により、アデニンヌクレオチドによるIP_3受容体機能調節部位の分子メカニズムを明らかにした。2)IP_3受容体のカルモジュリン結合部位に点突然変異を導入することによって、カルモジュリン結合がIP_3受容体機能調節には関与しないことを、従来の見解を覆して明確にした。3)Ca^<2+>シグナルに関連して、一酸化窒素プローブ、リン酸化酵素活性のインジケーター、およびミオシン軽鎖リン酸化可視化プローブについても開発を進め、一部については良好な結果が得られているので論文を準備中である。また、NFATによる転写は、Ca^<2+>オシレーションよって制御されるが、その分子機構に迫る成果が得られた。4)小脳プルキンエ細胞に、長期抑圧として良く知られるシナプス可塑性において、Ca^<2+>のターゲットとなる分子候補を明らかにした。5)シミュレーション計算と網羅的な遺伝子発現定量技術を応用して、概日リズムのシステム論的解析を行った。これにより、視交叉上核および肝において周期的に発現量が変化する遺伝子群を同定し、概日リズムで変動する転写機構の一つを明らかにした。本研究では、重要なシグナル分子についてそれらを可視化するプローブの開発を推し進め、それを用いてシグナル分子の局在と機能の時間変化を生きた細胞で解析する。可視化解析という点で最も進んでいるCa^<2+>シグナル系を研究の軸とするが、関連する分子群に対象を拡大し、生きた細胞においてシグナル・カスケードをリアルタイムに可視化し、細胞機能の調節機構の解析を進める。これによって、シグナル分子が細胞機能を制御する機構を、全く新しい観点から明らかにすることを研究の目的としている。今年度の研究により以下の成果を得た。1)Ca^<2+>依存性転写因子NFATの核移行とCa^<2+>濃度変化の関係を解析した結果、NFATはCa^<2+>濃度上昇シグナルを一時的に記憶する分子メカニズムを持つことを明らかにした。この機構により、NFATの核移行はCa^<2+>オシレーションの頻度に依存し、さらに、Ca^<2+>オシレーションがシグナル伝達の高効率化に寄与することを明らかにした。これによって、Ca^<2+>オシレーションの意味と意義について明らかにした。2)標的とするcDNAから、効果の高いsiRNAライブラリーを酵素的に生成する方法を開発した。これにより、Ca^<2+>シグナル機構に関わる分子の同定を行う新しい方法論を獲存した。3)Ca^<2+>シグナルに関連して、一酸化窒素プローブおよびミオシン軽鎖リン酸化可視化プローブについて開発を進め、基本的な開発は完成したので論文を投稿中である。4)Ca^<2+>依存性チロシン
動学的ミクロ経済学による乗数理論と裁量的マクロ経済政策の厚生的意義

本研究により,(1)市場均衡を保証する伸縮的価格,(2)経済主体の動学的最適化行動,(3)合理的期待形成仮説を前提に,ケインズ理論を再構築することに成功した.加えて当該研究はマクロ経済理論研究に対して,次のような貢献があったと考えられる.近代経済学は一般にミクロ・マクロの二分野に分けて論じられる.しかし二分野間にいかなる理論的関連が存在するかは,今まできわめて不分明である.当該研究により,マクロのケインズ理論は,貨幣経済における無限期間の動学理論として,ミクロ経済学の一部として位置づけられることになった.すなわち従来のマクロ・ミクロの二分法を不要とする一般的理論の開発に成功した.本研究により,(1)市場均衡を保証する伸縮的価格,(2)経済主体の動学的最適化行動,(3)合理的期待形成仮説を前提に,ケインズ理論を再構築することに成功した.加えて当該研究はマクロ経済理論研究に対して,次のような貢献があったと考えられる.近代経済学は一般にミクロ・マクロの二分野に分けて論じられる.しかし二分野間にいかなる理論的関連が存在するかは,今まできわめて不分明である.当該研究により,マクロのケインズ理論は,貨幣経済における無限期間の動学理論として,ミクロ経済学の一部として位置づけられることになった.すなわち従来のマクロ・ミクロの二分法を不要とする一般的理論の開発に成功した.
新しいエピゲノムとしてのDNAの2次構造による転写調節

ANXA5遺伝子のプロモーターにある遺伝子多型によるハプロタイプが習慣流産と関連し、女性が高リスクのM2ハプロタイプを持つと流産のリスクが増加する。M2からのANXA5遺伝子の発現量は少なく、プロモーター活性は低い。ANXA5遺伝子のプロモーター領域の多型の位置にはG4形成のコンセンサス配列がある。野生型とM2のヘテロ接合体の胎盤由来のゲノムをバイサルファイト処理後、PCR産物を次世代シーケンサーで解析した。C>T変換パターンから、M2はG4の形成しやすさに影響し、その結果、ANXA5のプロモーター活性や発現量が低下し、胎盤内過凝固をひきおこし、流産のリスクが増加する可能性が示唆された。DNA2次構造の解析は、ゲノム配列情報に付加的機能を媒介する新しいエピゲノムとして重要である。G-quadruplex (G4)と呼ばれる四重鎖DNAもそのひとつであり、転写、複製、組換えの調節に関係するといわれている。胎盤性抗凝固因子ANXA5遺伝子のプロモーター領域には習慣流産と関連する多型が存在するが、この多型はプロモーター領域にあるG4のコンセンサス配列を変化させる。従って、この多型が四重鎖DNAのできやすさに影響し、ANXA5の発現量が変化した結果としておこる胎盤での凝固亢進状態が習慣流産の原因であるという仮説が成り立つ。本研究では、2年間で、ANXA5のプロモーター多型と四重鎖DNA、遺伝子の発現量との関連を統合的に検討することで、習慣流産の原因を解明しようとするものである。本年度は、生体内で実際にG4構造をとっていることを証明するために、抽出したゲノムDNAに対し、熱変性をさせないでバイサルファイト法をおこない、変換される塩基の割合を調べた。その結果、ANXA5遺伝子のプロモーター領域は、他の場所と比較して、変換率が高かった。この結果から、ANXA5遺伝子のプロモーター領域は、生体内で1本鎖などの2次構造をとっている可能性が示唆された。本年度は、生体内で実際にG4構造をとっていることを証明するために、抽出したゲノムDNAに対して、熱変性をさせないバイサルファイト法をおこない、変換される塩基の割合を調べた。その結果、ANXA5遺伝子のプロモーター領域は、多の場所と比較して、変換率が高かった。また、変換されるDNA鎖とそうでない鎖が明確に分かれた。その割合がこの領域の多型と連動した。この結果から、ANXA5遺伝子のプロモーター領域は、生体内で1本鎖などの2次構造をとり、プロモーター領域の多型による遺伝子発現の多寡は、この多型の四重鎖DNAのできやすさへの影響を介している可能性が示唆された。研究計画では多くをin vitroでの2次構造を証明することに費やす予定であったが、生体内での2次構造を証明することにバイサルファイト法が応用できるという新たな試みが成功し、期待通りの結果が出た。臨床遺伝学バイサルファイト法によって、ANXA5遺伝子のプロモーター領域の多型、とくに習慣流産と関係があり、アネキシンVの発現を低下させるM2ハプロタイプと、野生型ハプロタイプとの間に、グアニン四重鎖構造のとりやすさに差があるのかどうかを検討したい。ANXA5遺伝子のプロモーター領域の2次構造がANXA5遺伝子の発現を調節しているとした場合、おそらく、2次構造は空間的、時間的制御を受けていると予想される。実際に、組織としてゲノムDNAを抽出した時に、実際にANXA5遺伝子が発現するという作業をしている細胞を含む割合が小さい場合は、期待している、多型によるグアニン四重鎖構造のとりやすさの違いを検出するのは難しいかもしれない。細胞種によって分画してから検討する必要があるかもしれない。研究計画の変更により、in vitroでのグアニン四重鎖の証明ではなく、in vivoでの証明を中心に解析を行った。

そのため、パイロット的な実験が多くなったため。in vivoでのグアニン四重鎖の証明を中心に解析を進めていくが、同じバイサルファイト法を用いて、種々の細胞や組織、種々の条件によって検討を進める。また、in vivoでの1本鎖DNAを証明する別の実験系を試行してゆく(薬物による切断など)。
本研究では、潜行深度が2000mとなるArgoフロート観測網に導入が可能となるWATの開発を行うために、1)WATの運動制御の検討、2)WATによる波浪解析手法の検討、3)実海域における実証試験を実施する。そのために、水槽実験によるフロートの制御手法の検討、相模湾係留実験による解析手法の検討、台風通過時の波浪・海洋変動の測定を実施する。海面付近でフロートの中性浮力を確保し、圧力計では不可能な方向スペクトルを含めた波浪観測を慣性計測装置(IMU)にて実施する。海洋表層の乱流下でフロートは鉛直方向に移動すると考えられるので、フーリエ解析ではなく、ウェーブレット変換による解析を行う。
昆虫の遺伝子機能解析を飛躍的に進展させる効率的なプロモーター探索と効果の実証

効果的な昆虫の遺伝子機能解析に必要となる、遺伝子の時空間的な制御を可能にするシステムの開発とプロモーターの探索を行った。カイコでは部位特異的組換えが機能し、クローン解析やプロモーター探索に有効であることを示した。さらに、人工ヌクレアーゼによるゲノム編集の可能性も見出した。また、バキュロウイルスの初期遺伝子プロモーターは、程度の差はあるものの昆虫目を超えて機能し、汎用できる可能性を示した。トランスジェニック昆虫を用いた遺伝子機能解析では、遺伝子発現を制御できる適切なプロモーターが必要である。そこで本研究では、効率的かつ汎用的なプロモーター探索システムを開発するとともに、ゲノム情報を用いて汎用性の高いプロモーターの開発を行う。本年度は、Ga14/UAS系とFLP-FRT系を組み合わせた汎用的なクローン解析の系をカイコで構築し、遺伝子機能解析の効率を検討するため、ベクタープラスミドを作製した。すなわち、細胞質アクチンA3遺伝子のプロモーターの下流にFRTで挟まれたGFP遺伝子、さらに下流にGa14遺伝子の結合したものを、piggyBac由来のベクターに挿入した(pBac[A3-GFP(FRT)Ga14])。これにより、通常は全身でGFPを発現し、組換え酵素FLPの作用により体細胞の一部でGAL4を発現する実験系を構築することができる。カブラハバチでは、効果的エンハンサートラップを行なうための、piggyBac転移酵素遺伝子をゲノム中で安定に保持し、転移酵素を構成的に産出する系統を確立した。これにより、部位特異的組換え用のターゲット遺伝子を、交配により任意のゲノム領域に転移させることができる。ナミテントウでは、汎用性のある高い発現を示すプロモーターの候補として、バキュロウイルスの初期遺伝子immediate eraly 1(ie1)プロモーターに着目した。その有効性を検証するため、ショウジョウバエおよびカイコにおける形質転換体を用いたBmNPVie1プロモーターのレポーターアッセイを詳細に行った。その結果、胚、幼虫、蛹を通した全身での発現および幼虫における前胸腺、腸での発現が両昆虫間で保存されていることが明らかとなった。したがって、BmNPVie1プロモーターが様々な昆虫において高い発現を誘導する汎用性プロモーターとして有効であることが示唆された。昆虫各種において効率的かつ汎用的なプロモーター探索システムおよび汎用性の高いプロモーターを開発するために、本年度は、部位特異的組換えの条件設定、改良エンハンサートラップ用のベクター構築、各種ベクターを導入した遺伝子組換え系統の作出、プロモーター探索を進めた。カイコでは、Gal4/UAS系とFLP-FRT系を組み合わせた汎用的な解析系を構築するために、[カイコ細胞質アクチンA3遺伝子プロモーター-FRT-EGFP-FRT-Gal4]をpiggyBacベクターに導入したプラスミドをカイコ卵に注入し遺伝子組換えカイコ系統を4系統作製した。各系統において、14コピーのベクターの挿入が認められ、幼虫脂肪体でのEGFPの発現が強く認められた。また、共同研究によってカイコでホーミングヌクレアーゼが機能することを初めて示した。さらに、FRTおよびattP配列を組み込んだ改良エンハンサートラップ用のベクター構築を行った。その他、チョウ目昆虫ゲノムを比較し、論文を発表した。カブラハバチでは、piggyBac転移酵素を産生する系統とテトラサイクリントランスアクティベーターとEGFPのキメラタンパク質を産出する系統を交配してエンハンサートラップを試みたが、いまのところ有用なプロモーターの検出には至っていない。ナミテントウでは、汎用性のある熱ショック誘導性プロモーターの候補として、キイロショウジョウバエのheat shock protein 70(hsp70)プロモーターに着目した。その有効性を検証するため、形質転換ナミテントウを作出し、蛹期において発現解析を詳細に行った。その結果、hsp70プロモーター活性は、25°Cにおいて検出されるものの40°C付近で最も高い活性を示すこと、熱ショック時間に応じて増加すること、熱ショック後速やかに減少すること、組織特異性を有しないことが明らかとなった。昆虫各種において効率的かつ汎用的なプロモーター探索システムおよび汎用性の高いプロモーターを開発するために、前年度に引き続き、部位特異的組換えの条件設定、改良エンハンサートラップ用のベクター構築、ベクターを導入した遺伝子組換え系統の作出、プロモーター探索等を行なった。カイコでは、部位特異的遺伝子導入系を組み込んだ改良エンハンサートラップベクターの構築と組換え体作出を開始した。また、pBac[A3-GFP(FRT)Gal4]を導入したカイコ系統について、様々な組織でのクローン解析に用いることができるように、piggyBac転移酵素を発現する系統と交配して挿入配列を転移きせ、脂肪体以外に皮膚や筋肉など、異なる組織でGFPの発現が観察される系統を樹立した。カブラハバチでは、piggyBac転移因子とtTAとEGFPのキメラタンパク質を産出する系統を交配してエンハンサートラップを実施中である。また、リポフェクション法によって、あるプロモーターが機能する可能性を見出した。ナミテントウでは、ナミテントウのcytoplasmic actin

遺伝子のプロモーターの有効性をTet-Offシステムを利用して検証するためのベクターを作製した。プロモーター探索では、幅広い昆虫種で利用可能と思われるプロモーターと新規マーカー遺伝子の候補を用いたベクターを構築した。このベクターをカイコに導入したところ、このプロモーターとマーカー遺伝子がワークすることがわかった。そこで次に、このベクターが昆虫各種でワークするかを検証するために、キイロショウジョウバエ、カブラハバチ、ナミテントウ各種において遺伝子組換え個体の作出を開始した。また、別のプロモーターの改良のために、これまで活性が低かったプロモーター候補配列を3回繰り返すことによって活性増強が可能かを検証するためのベクターを構築した。各昆虫種(カイコ:瀬筒、河本、冨田、キイロショウジョウバエ:冨田、新美、カブラハバチ:畠山、ナミテントウ:新美)において、部位特異的組換えの条件設定、改良エンハンサートラップ用のベクター構築および組換え系統の作出、プロモーター探索等を行なった。カイコでは、インテグラーゼの標的配列を導入した改良エンハンサートラップ系統の開発を行い、エンハンサーを検出している系統が得られた。FLP-FRT系を利用したクローン解析実験系では、組換え酵素FLPの発現を誘導する熱ショックの条件と体細胞クローンのパターンとの関係を各種組織について明らかにして有効性を示し、論文発表を行った。カブラハバチでは、tTAとEGFPのキメラタンパク質を産出するような系統を用いたエンハンサートラップを実施した。これまで再転移により致死となる場合は見られたが、明らかな表現型としてエンハンサーを検出できるまでには至っていない。ナミテントウでは、汎用性の高い強力な発現誘導プロモーターの候補としてナミテントウからクローニングしたcytoplasmicactin遺伝子のプロモーターの有効性を検証したところ、ショウジョウバエにおいて有効であることが示唆された。人工プロモーターの開発にむけては、ie1プロモーター等およびカイコの体表黒色を薄くするBmaaNAT遺伝子を用いて、カイコ、カブラハバチ、テントウムシ、キイロショウジョウバエで機能するかを検証したところ、カブラハバチ以外の昆虫種の黒色色素を薄くできた。カブラハバチではie1プロモーターによる発現誘導のみ確認できた。また、プロモーター領域の迅速な特定のために、バキュロウイルス系よりも扱いやすいと思われるエレクトロポレーションを利用した一過性の遺伝子導入発現系の開発に着手し、カイコではこの方法が有効であることが示唆された。部位特異的組換えがカイコ等で機能することが示され、次世代型の組換えベクターに利用可能であることが示される等、予想を上回る成果を上げている。キイロショウジョウバエ以外の昆虫では遺伝子組換え昆虫を作出・飼育するのに手間と時間がかかるという難点があるにも関わらず、それぞれの昆虫種で実験が進みつつある。
幼小接続期における源数学の理論に基づく教科書的な図書「小学校0年生の算数」の開発

5歳児を対象とした就学前準備教育「小学0学年」を独自に設置し「数学的な見方・考え方」に焦点をあてた教科書的な図書「小学校0年生の算数」を創造する研究である。その基盤は、オーストラリア就学前準備教育「PREP」制度と「源数学」の理論にある。「PREP」の施設や実践の視察を通した教育システムの構築と「源数学」の理論に基づいたカリキュラム研究に取り組む。次にこの図書の開発と、「小学0学年」を想定した環境で、この図書を用いた実践に取り組む。その結果、この図書の開発・実践を通して、就学前準備教育「小学0学年」における「数学的な見方・考え方」の育成と、小学校算数科との連続性・一貫性の確保を明らかにしたい。
磁性ナノ粒子を用いた複合磁性材料作製に関する研究

本研究は、電気化学的手法による高性能ナノコンポジット磁石膜の実現を目的とし、磁性ナノ粒子の電気泳動堆積(EPD)法と金属磁性膜の電析法(電気めっき)を組み合わせ、磁性ナノ粒子をナノメートルオーダーで内包した新規複合磁石膜の開発を行うものである。昨年度までに、本研究で提案している手法によりFe-Coナノ粒子(平均粒径:15 nm)とL10 Fe-Pt電析膜からなる複合磁性膜の形成を達成したが、試作した膜の磁気特性は改善の余地が大きい状況であった。このため本年度は、膜の形成プロセスや熱処理条件を検討し、膜の磁気特性を改善することに注力した。これまでの複合膜は、1. Fe-Coナノ粒子電気泳動堆積、2.表面修飾剤除去を目的としたFe-Coナノ粒子電気泳動堆積膜の水素ガス中熱処理、3. Fe-Pt電析膜との複合化、4. Fe-Ptの規則化を目的とした複合膜の真空中熱処理の手順により試作を行っていた。このプロセスでは表面修飾剤が除去された分散性の悪いFe-Coナノ粒子をFe-Pt電析膜中へ複合化しているため、複合膜中にFe-Coナノ粒子の凝集領域が形成され、試作した膜の磁化曲線はFe-CoとFe-Ptの磁気特性が分離した振舞いを示した。複合膜中のFe-Coナノ粒子の分散性を改善するために1. Fe-Coナノ粒子電気泳動堆積、2. Fe-Pt電析膜との複合化、3.表面修飾剤除去およびFe-Ptの規則化を目的とした複合膜の水素ガス中熱処理の手順により複合膜の試作を行った。新たなプロセスは表面修飾剤により被覆されたFe-Coナノ粒子をFe-Pt電析膜中へ複合化するものであるため、試作した複合膜ではFe-Coナノ粒子の分散性の向上が確認された。また、Fe-CoとL10Fe-Ptの微細な複合組織の形成により、磁化曲線がFe-CoとFe-Ptの特性が分離した振舞いではなく、ナノコンポジット磁石のように単相材料のような振舞いを示す複合磁性膜の実現が達成された。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、電気化学的手法による高性能ナノコンポジット磁石膜の実現を目的とし、磁性ナノ粒子の電気泳動堆積法(EPD法)と金属磁性膜の電析法(電気めっき)を組み合わせ、磁性ナノ粒子をナノメートルオーダーで内包した新規複合磁石膜の開発を行うものである。本年度は、以下の点について検討を行った。1.金属磁性ナノ粒子の電気泳動堆積技術および電析膜との複合化に関する検討熱分解法により合成したFe-Coナノ粒子(平均粒径:15 nm)をエタノール中に分散させ電気泳動堆積を行った。合成後のFe-Coナノ粒子は堆積基板への良好な堆積が確認されなかったが、Fe-Coナノ粒子をカチオン性表面修飾剤であるポリエチレンイミンにより表面修飾することで良好に堆積することを確認した。また、Fe-Coナノ粒子堆積膜とL10 Fe-Pt電析膜との複合化の検討を行った。作製した膜の構造解析から、L10 Fe-Ptマトリックス中にFe-Coナノ粒子が複合された複合構造を確認した。これにより、本研究で提案している電気化学的手法を用いて金属磁性ナノ粒子を内包した複合体が形成可能であることを実証した。2.単分散ナノ粒子の3次元規則的堆積技術に関する検討平均粒径300nm、40nmの単分散ポリスチレンナノ粒子を用いて検討を行った。平均粒径300nmのポリスチレンナノ粒子を用いた検討では、電気泳動堆積法による規則的な堆積構造を確認した。一方、平均粒径40nmのポリスチレンナノ粒子を用いた検討では、規則的な堆積構造を確認できなかった。これは、ポリスチレンナノ粒子の粒径分散が大きいためと考えられる。本研究で応用を考える平均粒径10nm程度の磁性ナノ粒子を用いて規則的な堆積構造を実現するためには、粒径分散がきわめて小さいものを用いる必要があると考えられ、そのような磁性ナノ粒子合成技術の確立が必要である。

複合膜中のFe-Coナノ粒子の分散性を改善するために1. Fe-Coナノ粒子電気泳動堆積、2. Fe-Pt電析膜との複合化、3.表面修飾剤除去およびFe-Ptの規則化を目的とした複合膜の水素ガス中熱処理の手順により複合膜の試作を行った。新たなプロセスは表面修飾剤により被覆されたFe-Coナノ粒子をFe-Pt電析膜中へ複合化するものであるため、試作した複合膜ではFe-Coナノ粒子の分散性の向上が確認された。また、Fe-CoとL10Fe-Ptの微細な複合組織の形成により、磁化曲線がFe-CoとFe-Ptの特性が分離した振舞いではなく、ナノコンポジット磁石のように単相材料のような振舞いを示す複合磁性膜の実現が達成された。帯電性表面修飾剤を応用した金属磁性(Fe-Co)ナノ粒子の電気泳動堆積技術の確立、金属磁性(Fe-Co)ナノ粒子堆積膜と電析(L10 Fe-Pt)電析膜との複合化を達成したため、本研究はおおむね順調に進展している。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度、金属磁性ナノ粒子を内包した複合磁性膜を実現したが、膜中にFe-Coナノ粒子の凝集部が存在することや熱処理時の元素拡散の問題などから、膜の磁気特性は改善の余地が大きい状態である。今後は、作製プロセスや熱処理条件の最適化を行うことで上記の問題を改善し、磁気特性向上を目指し研究を推進する予定である。
高圧法による分子内励起錯体状態の双極子モーメントの決定

N,N-ジメチルアミノベンゾニトリル(DMABN)と3,5-ジメチル4-N,N-ジメチルアミノベンゾニトリル(TMABN)の蛍光のスペクトルは極性溶媒中で、通常のπ-π^*バンド以外に、60007000cm^<-1>長波長側に振動構造を持たない幅広い蛍光が観測される。このバンドは、溶媒温度、圧力などの媒体条件によって、大きな影響を受ける。それに対して、N-エチル-5-シアノインドール(EIN)とそのカルボン酸エチルエステル(EICEE)では、この長波長側のバンドは観測されない。今回、これら4種の化合物について、極性溶媒(アセトニトリル)と非極性溶媒(n-ヘキサン)中で、蛍光スペクトルの温度効果と圧力効果を測定した。その結果、DMABNとTMABNの長波長側の蛍光は、分子内でのN,N-ジメチル基とフェニル基との間でのねじれ回転を伴う、コンフォメーションの変化によって生じる電荷移動状態、すなわち“TICT(twisted intramolecular charge-transfer)状態“からの発光であることが結論できた。さらに、圧力効果の測定結果を用いて、DMABMとTMABNのTICT状態の双極子モーメント(MTICT)を決定した。その結果、DMABNではMTICT=27.7Dであり、TMABNではMTICT=22.5Dであった。いずれも非常に大きな電荷分離をしていることが分る。また、TMABNの方が、約5D小さな値である。これはメチル基の導入に伴って、電荷分布の非局在化に起因するものと考えられる。
照葉樹林域における不確実性を考慮した確率的評価に基づく天然更新完了基準の提示

針葉樹人工林伐採後における広葉樹の天然更新に及ぼす前生樹広葉樹の影響を明らかにするため、宮崎大学田野演習林内の前生広葉樹が発達しシイ・カシ類などが生育する高齢ヒノキ人工林に、伐採時の前生広葉樹を伐採する区(伐採区)と保残する区(保残区)を設け、伐採後12年後の更新状況の調査を行った。個体数は伐採区および保残区ともに大きく減少したが、その多くは伐採後に埋土種子から更新したアカメガシワなどの先駆性木本種であった。一方、両区とも前生樹由来の更新個体は、伐採後の個体数減少が小さく、安定的に更新していた。さらに、サイズ構造(階層構造)を比較した。伐採1年後において、伐採区では樹高2m未満の個体が占め単純な構造であったが、保残区では樹高15m程度まで個体がばらついて存在し多様なサイズ構造であった。しかしながら、伐採12年後の段階では、伐採区と保残区でサイズ構造に大きな違いはみられなくなった。これには、伐採後に切株から萌芽更新した個体の成長速度が速いことが影響していると考えられた。したがって、短期的(幼齢段階)には前生広葉樹の保残処理は、サイズ構造の多様さを高める有効な手段であるが、実生で更新した先駆性木本種が淘汰される若齢段階への移行期になると、その効果は限定的であると考えられた。また、伐採後に新たに発生した実生のなかには、先駆性樹種以外にもクスノキ、チシャノキおよびタブノキなどの高木性樹種の発生も観察された。しかしながら、それらの個体の8割以上が12年後の段階では枯死しており、実生で発生した個体は更新の不確実性が高く、1年目の実生更新の多寡で更新の判断は難しいと考えられた。平成30年度は伐採時に前生広葉樹を伐採した試験区のモニタリングを終え、前生樹広葉樹の伐採区と保残区における更新状況を比較し、前生樹広葉樹の保残処理の中期的効果を評価することができた。また、実生で更新した個体についても種別に生残率を算出し、更新の可能性の不確実性の高さを確認した。また、次年度測定予定の試験地の復元作業も終えた。固定試験地での調査を継続するともに、これまでに取得した全試験地のデータを取りまとめ、樹木の更新予測モデルの構築と更新完了基準の提示を行う。針葉樹人工林の多くが主伐期を迎えるなか、一部の人工林では広葉樹林化が試行されている。我々はこれまで、針葉樹人工林内の前生広葉樹が天然生林の再生と生物多様性の回復に重要な役割を果たすことを明らかにしてきた。しかし、これらの知見は伐採直後の短期的な評価に基づくものであり、長中期的な森林動態における前生樹の貢献度は評価されていない。そこで、針葉樹人工林伐採後の天然更新に与える前生樹の影響を中期的に明らかにするため、宮崎大学田野演習林内に設置した伐採後12年が経過した試験地において、更新状況の調査を行った。本試験地は植栽木であるヒノキを伐採する際に、伐採前に通常行う下層木の刈り払いを省略(保残処理)し、可能な限り前生樹を保残した林分である。伐採前の前生樹の個体数(樹高50cm以上)は約9100個体/haで、カシ類やシイ類が生育する下層植生が発達した林分であった。伐採後1生育期を経過した段階では、前生樹の54%が生残し、26%が萌芽によって再生した。また、約47000個体/haが実生として更新していた。これらの保残、萌芽および実生の伐採12年後の個体数は、それぞれ約3200、1500および10000個体/haで、保残および萌芽個体の約3割、実生個体の約8割が枯死しており、個体の生死の面で前生樹の重要性が明らかとなった。また、保残および萌芽によって再生した個体について、伐採前の樹高に着目し生残率を計算すると、伐採前の樹高が2mを超えると生残率が高い傾向にあり、樹高2m程度以上の前生樹が重要であると考えられた。さらに、保残、萌芽および実生個体間で、現在の樹高分布を比較すると、実生由来の更新個体が低い傾向にあり、保残個体と萌芽個体では大きな違いはなかった。つまり、成長の面でも実生より前生樹由来(保残および萌芽)の更新個体の方が有利であった。研究計画で予定した通り、固定試験地の復元および針葉樹人工林伐採後10年以上が経過した林分での生残状況や成長量のデータを取得することができた。また、伐採時に前生広葉樹の保残処理を行った試験地において、林分レベルでの更新状況の解析を行い、人工林の広葉樹林化における前生広葉樹の中期的な役割について評価した。

一方、両区とも前生樹由来の更新個体は、伐採後の個体数減少が小さく、安定的に更新していた。さらに、サイズ構造(階層構造)を比較した。伐採1年後において、伐採区では樹高2m未満の個体が占め単純な構造であったが、保残区では樹高15m程度まで個体がばらついて存在し多様なサイズ構造であった。しかしながら、伐採12年後の段階では、伐採区と保残区でサイズ構造に大きな違いはみられなくなった。これには、伐採後に切株から萌芽更新した個体の成長速度が速いことが影響していると考えられた。したがって、短期的(幼齢段階)には前生広葉樹の保残処理は、サイズ構造の多様さを高める有効な手段であるが、実生で更新した先駆性木本種が淘汰される若齢段階への移行期になると、その効果は限定的であると考えられた。また、伐採後に新たに発生した実生のなかには、先駆性樹種以外にもクスノキ、チシャノキおよびタブノキなどの高木性樹種の発生も観察された。しかしながら、それらの個体の8割以上が12年後の段階では枯死しており、実生で発生した個体は更新の不確実性が高く、1年目の実生更新の多寡で更新の判断は難しいと考えられた。平成30年度は伐採時に前生広葉樹を伐採した試験区のモニタリングを終え、前生樹広葉樹の伐採区と保残区における更新状況を比較し、前生樹広葉樹の保残処理の中期的効果を評価することができた。また、実生で更新した個体についても種別に生残率を算出し、更新の可能性の不確実性の高さを確認した。また、次年度測定予定の試験地の復元作業も終えた。固定試験地の復元および樹木の更新および成長状況の調査を継続し、伐採前の前生樹量の異なる林分でのデータを取得する。また、林分レベルでのデータ解析に加え、個体レベルでの解析を行い、針葉樹人工林伐採後の樹木の更新予測モデルへのパラメータの調整を開始する。固定試験地での調査を継続するともに、これまでに取得した全試験地のデータを取りまとめ、樹木の更新予測モデルの構築と更新完了基準の提示を行う。当初の計画より現地調査が効率よく進行し出張回数が少なくなったため、その分で次年度使用額が生じた。次年度は現地調査の回数が増える予定であり、旅費として使用する。次年度は成果取りまとめのため共同研究者との打ち合わせ回数が増加する予定であり旅費として使用する。
16世紀及び17世紀イタリアにおける建築と音楽の変化に関する研究

建築は一般に空間芸術の非再現芸術或いは形式芸術に分類され、通常は絵画や彫刻のように具体的な物を再現することはない為、人間の持つ空間観をあらわに映し出してきた歴史遺産と考えられる。音楽もまた同様に時間芸術の形式芸術に分類され、数多く残された音楽作品にはそれぞれの時代の人々の時間観が映し出されているが、本研究は、同時代の建築と音楽を比較する上で、空間観と時間観の変化の並行性により、建築と音楽の変化に何らかの並行性を見いだそうというものである。本年度は、昨年度に引き続き建築が音楽に与えた影響について、16世紀後期ヴェネツィアを中心に栄えた分割合唱について文献資料をもとに研究し、これについては、2000年9月の日本建築学会大会で発表した。また、並行してバロック期の建築の設計において、実際の寸法をどのように図面に書き表すかという問題について、特にイタリアバロックの代表的建築家ボッロミーニの図面において調査研究した。なお、この研究のための渡航費、書籍、演奏を聴くためのCD類、研究に際し必要となった消耗品(文房具類)は本年度の補助金によりまかなった。本年度は、建築が音楽に与えた影響について、16世紀後期ヴェネツィアを中心に栄えた分割合唱の実態を調査した。従来分割合唱はサン・マルコの建築的特性から生み出された演奏方法とされていたが、実際には周辺都市のトレヴィーゾ、パドヴァ、ベルガモでも演奏されていた。そこで、実際に現地でそれぞれの都市の建築を調査し、この演奏方法と建築物との関連性について研究を進めた。これについては、2000年9月の日本建築学会大会で発表する予定。また、17世紀の建築にみられる空間観と音楽にみられる時間観の並行性についてのこれまでの研究成果を「ExMusica」で発表。(2000年6月頃刊行予定)なお、この研究のための渡航費、書籍、演奏を聴くためのCD類、研究に際し必要となった消耗品(文房具類)は本年度の補助金によりまかなった。
アポトーシス促進Bcl-2分子Baxのミトコンドリア移行制御機構の解明

哺乳動物細胞におけるアポトーシス決定機構と考えられるアポトーシス促進Bcl-2ファミリー分子Baxのミトコンドリア移行制御の分子機構は未だ明確になっていない。申請者は、Baxをミトコンドリアから恒常的に隔離する分子機構の存在,および各種アポトーシス誘導時における、これを解除するそれぞれに独自の分子機構の存在を想定し、本研究でこの2点の分子機構の同定を試み、哺乳動物細胞におけるアポトーシス決定機構を解明することを目指した。本年度、申請者はアポトーシス誘導刺激に依存せず人工的にBaxのミトコンドリア移行を制御するシステム(coumermycin・YFP-GyrB-Baxシステム)を構築することに成功した。本システムは以下の4点を特徴としている。1培養細胞に導入された改変型Baxは内在性Baxと同様に細胞質に局在し細胞毒性を発揮しない、2培養細胞に導入された改変型Baxはストレス刺激によるアポトーシスの感受性に影響を与えない、3細胞質に局在する改変型Baxは抗生物質coumermycin添加によりミトコンドリアへの移行が誘導される、4改変型Baxはミトコンドリア移行後も、細胞毒性を発揮しない。このシステムを用いることにより、申請者はBaxのミトコンドリア移行制御に必須と従来考えられていた疎水領域は移行に関与せず、従来想定されていなかったミトコンドリアと細胞質間の移行の可逆的な制御が存在することを明らかにした。さらに、このBaxのミトコンドリアと細胞質間のシャトリングにBaxの構造変化がともなうことを発見し、可逆的構造変化がBaxをミトコンドリアから恒常的に隔離する分子機構であると同時に解除する分子機構であることが強く示唆された。哺乳動物細胞におけるアポトーシス決定機構と考えられるアポトーシス促進Bcl-2ファミリー分子Baxのミトコンドリア移行制御の分子機構は未だ明確になうていない。申請者は、Baxをミトコンドリアから恒常的に隔離する分子機構の存在・および各種アポトーシス誘導時における、これを解除するそれぞれに独自の分子機構の存在を想定し、本研究でこの2点の分子機構の同定を試み、哺乳動物細胞におけるアポトーシス決定機構を解明することを目指している。本年度、申請者はBH3-onlyタンパク分子によりBaxのミトコンドリア移行を伴うアポトーシスを誘発する実験系を用いて、Baxに結合するタンパクの質的、量的変化の経時的網羅を試みた。この結果、予想外にBH3-onlyタンパク分子は、抗アポトーシスBcl-2ファミリー分子Mcl-1に対しても細胞質からミトコンドリアへの移行を強く誘導するいう知見を得た。さらに紫外線照射によるアポトーシス誘導時にMcl-1はミトコンドリア移行と同時に強くデグラデーションを誘発されることを見いだし、デグラデーションが優位となった細胞においてBaxのミトコンドリア移行-活性化が起きることをが示唆された。以上の知見より申請者の想定するBaxのミトコンドリア移行制御機構が実際に存在し、その相反する機能にもかかわらず、非常に構造が似通っている抗アポトーシスBcl-2ファミリー分子に対してもこのミトコンドリア移行制御機構が働くことが強く示唆された。
四環性ジテルペン骨格の多様性をもたらす生合成メカニズムの分子生物学的解明

本研究の目的は「植物が産生する多彩な四環性ジテルペン骨格を構築するための重要な因子である一連のチトクロームP450 (P450)及び環化酵素遺伝子を単離し、同じカテゴリーに分類されながらも化学構造上異なる基本骨格を持つ天然物が、一つの細胞の中でどのように作り分けられるかを分子生物学的レベルで理解すること」である。この目的のために、ジテルペン生合成酵素をコードする一連の遺伝子群がジャスモン酸(JA)等の外部刺激に対して大きく異なる応答性を示すことを利用し、それぞれのP450遺伝子がどのジテルペン骨格の天然物生合成に関与するホモログであるかを解明すること試みた。我々が最近見出した67個のP450フラグメントのうち、高発現していた14種について、MJ処理による発現誘導の再現性をRT-PCRで確認したところ、7種のcDNAクローンでエリシター処理による発現増加が観察できた。このうち、機能未解明の2種(7-15、8-5)について、全長cDNAクローン(SdCYP5、SdCYP6)を得た。SdCYP5およびSdCYP6の推定アミノ酸配列は、様々な高等植物の二次代謝に関与しているCYP71Dファミリーと高い相同性を示すことが明らかになった。さらに、SdCYP5のアイソフォームSdCYP7とSdCYP8の単離にも成功した。次に、今回単離した単離したSdCYPの遺伝子発現とSDB生合成の関係について解析をした。その結果、SdCYP5、SdCYP8ではSDB生産が最も高い若い葉において発現増加が観察された。一方、スコパリアでの酵母エキス(YE)によるエリシター誘導性があるかを解析したところ、SDBの急速な増加が見られた。このことから、スコパリアのSDB生合成には、YEによるエリシター誘導性が存在することが明らかになった。本研究において、薬用植物スコパリアのジテルペン類(SDB)生合成経路の制御機構を解明することを目的としてcytochrome P450(P450)分子種に着目し、すでに単離されているエリシター誘導性のP450分子種の詳細な解析を行った。エリシター誘導性のP450候補遺伝子として単離したSdCYP5およびSdCYP6は、CYP71ファミリーに分類された。続いて、SdCYP5のアイソフォームの単離も行い、SdCYP7およびSdCYP8を得た。SdCYP5およびSdCYP8の遺伝子発現はスコパリア葉におけるSDB生合成活性と密接な関係を有していた。さらに、ジテルペン環化酵素群のクローニングを行ったところ、ent-kaurene synthase(SdKS)やent-kaureneoxidase (CYP701Aファミリーに属するP450)をコードする遺伝子(SdKO1)の単離にも成功した。次いで、SdKO1のアイソフォーム(SdKO2)も同時に取得した。得られたP450や環化酵素群を大腸菌で組み換えタンパク質を発現させるため、得られたクローンのORF部位を大腸菌発現ベクターに導入し、発現誘導を行ったところ、予想サイズの各組み換えタンパク質を得ることが出来た。今後は、触媒反応機構を詳細に解析していく予定である。本研究で実施した生合成遺伝子のクローニングおよびエリシター添加による変動の解析は、エリシター制御機構の解明には必要不可欠であり、総合的な解析の基礎となる知見である。植物P450酵素の機能を化学物質を使って可逆的選択的に制御できれば、種や生育ステージ、期間や強度を選ばずに、生長分化やストレス応答、有用物質の生産等の制御を自在に行えるようになる。本研究は、その試みの一例であり、新たな創薬ターゲットとしての植物P450の可能性を提示するものである。植物生理学本研究において、SDB生合成経路の制御機構を解明することを目的としてP450分子種に着目し、エリシター誘導性のP450クローニングとその解析を行った。エリシター誘導性のP450候補遺伝子として単離したSdCYP5、SdCYP6、SdCYP7およびSdCYP8は、CYP71ファミリーに分類された。これらのクローンのうち、SdCYP5およびSdCYP8はスコパリア葉におけるSDB生合成活性と密接な関係を有していた。さらに、ジテルペン環化酵素のクローニングを行ったところ、ent-kaurene synthaseやent-kaureneoxidase (CYP701Aファミリーに属するP450)をコードする遺伝子の単離にも成功した。以上の結果から、本研究の目的は順調に達成しており、今後も生合成遺伝子のクローニングおよびエリシター添加による変動の解析はエリシター制御機構の解明には必要不可欠であり、総合的な解析の基礎となる知見である。前年度の遺伝子からのアプローチに引き続き、得られたP450や環化酵素を微生物で高発現させた組み換えタンパク質を用いることにより、触媒反応機構を詳細に調べる。1組換えP450の基質特異性前年度にクローニングしたS. dulcisのP450とP450 reductase遺伝子(当研究室ですでに単離)のORF部分をそれぞれ大腸菌発現ベクターに組み込み、発現用大腸菌株に導入する。両酵素遺伝子を共発現させ、対応するタンパク質の蓄積を確認する。その後、酵素タンパクを精製して基質と反応させ、生成物をGC-MSで解析する。反応産物のピークが観察された場合、酵素量や反応時間依存的な挙動も観察する。

また、反応経路の中間体以外にも類似構造をもつ化合物等を用いて基質特異性を調べる。また、クローニングの際に同時に単離できるホモログの中でのアミノ酸配列の違いがP450分子種の基質認識におよぼす影響(基質親和性など)も観察する。2組換え環化酵素タンパク質の酵素活性まず、単離した環化酵素クローンのORF部分を大腸菌発現ベクターに組み込み、発現用大腸菌株に導入する。発現を誘導した大腸菌から可溶性画分を調製し、タンパク質発現を確認した後、必要であればカラムを用いて精製する。基質と組換えタンパク質とを反応させ、反応産物をGC-MSで解析する。反応産物のピーク(GC-MS用検索ライブラリーで特定可能)が観察された場合、酵素量や反応時間依存的な挙動も観察する。基質以外にも類似構造をもつ化合物等を用いて基質特異性を調べる。次いで、モチーフ欠損、アミノ酸置換にも着手し、同様に基質と反応させ、酵素活性を検出する。残額が生じてしまったが、本計画は順調に進んでおり今年度の計画遂行には影響はない。残額は物品費(消耗品等)として使用する予定である。
熱帯亜熱帯「境界」の大気熱力学：水蒸気場の動態から迫る熱帯気候の新描像

スコールに代表される多雨地域の熱帯に比べ、グアムやハワイが位置する亜熱帯は比較的穏やかな気候に恵まれる。その背後には熱帯と亜熱帯をつなぐ壮大な大気循環(ハドレー循環)が知られる。本研究課題では、従来考えられてきたような地理的に固定された循環場の描像に代わり、日々の気象場に応じ動的にゆらぐ熱帯と亜熱帯の境界の動態に着目し、衛星観測や数値シミュレーション解析を通じてそのメカニズム理解に迫る。