hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
粒子状環境試料分析のための３次元全元素分析システムの開発

分析システムの感度向上については、これまでの検出器の約10倍の有感面積を持つ検出器の導入しテストを行った。その結果、本検出器は分解能はX線分席に十分であり、感度を10倍程度向上させることが可能となった。マルチモーダル分析システムの一部として有効であることが分かった。現在、マイクロビームシステムに取り付けを行っており、実際の分析に利用する予定である。平成23年度に目標とした大部分は達成済みだが、一部達成がおくれているが、解決策はすでに見いだしており、平成24年度の早いうちに達成が可能と考えており、今年度の計画には何も影響しない。25年度が最終年度であるため、記入しない。計画を実施するのに必要な要素がほぼそろい、問題点も解決方法を見いだしている。最終調整中であり、早い時期にナノビーム分析システムの構築し実試料への応用する予定である。。ナノビームシステムの調整を進め、高強度のナノビームの達成を目指す。同時に、実環境試料の収集し、ナノビームシステムで分析する。エネルギー差分法とキャピラリー法の比較検討を行い、3次元分析手法の確立を図る。そしてこれらを組み合わせて、最終的にナノビームを用いた3次元全元素分析システムの構築を図る。ナノビームシステムの調整を進め、高強度のナノビームの達成とマルチモーダル分析システムを完成させ、ナノビームを用いた3次元全元素分析システムの構築し、ナノビームでの分析を目指す。現在、実環境試料の収集を行っており、ナノビーム分析システムが完成後に、ナノビームシステムで分析する。
中耳真珠腫組織における水素イオン濃度と水素イオンセンサー蛋白からみた骨吸収機序

手術時に採取した真珠腫組織のpHを測定したところ弱酸性であった。リン脂質結合pH指示薬を用いて基底膜近傍のpHを測定した結果、乳突洞粘膜よりも真珠腫上皮のほうが低かった。ランタンを細胞間隙トレーサーとして用い電顕で観察すると、真珠腫上皮の全層にランタンが侵入していた。真珠腫上皮ではバリア機能が障害されており、内部の酸性pHが上皮を透過して隣接する骨組織を脱灰・吸収する機序が考えられた。1)手術時に採取した真珠腫debrisを生理食塩水に懸濁させ、微量測定用pHメーターを用いてpHを測定した。その結果、pHは4.97.7の範囲に分布しており、平均6.46±0.71(mean±SD)の値が得られた。2)真珠腫マトリックスのケラチノサイト細胞間隙の透過性について検討した。摘出した真珠腫塊を、2%塩化ランタンを加えた2.5%グルタールアルデヒド溶液中に2時間浸し、1%四酸化オスミウム溶液で後固定後、エポン包埋して超薄切片を作成し透過型電子顕微鏡で観察した。その結果、表皮細胞間隙に侵入したランタンが確認された。現在、コントロールとして耳後部から採取した正常皮膚を用い、同様の検討を行っている。3)リン脂質を結合させたpH蛍光指示分子プローブfluoresceinDHPE(Invitrogen, F-362)を生理食塩水に浸した真珠腫に負荷し、共焦点レーザー走査顕微鏡を使ってマトリックスケラチノサイト細胞膜近傍のpHを測定した。脂肪酸の尾部が細胞膜に入り込み、細胞外に突き出した親水性の頭部がpHの変化により蛍光を発するため、細胞膜に非常に近接した領域のみのpHを測定することが可能となる。488nmと458nmのアルゴンレーザーを励起光に用いたdual excitation ratio法によりpHの絶対値を計算した。その結果、5.05.5の値が得られた。さらに症例数を増やして、引き続き検討中である。4)以上より真珠腫debris内部の酸性側に傾いたpHがマトリックスを透過して、隣接する骨組織が脱灰・吸収される可能性が考えられた。1)手術時に採取した真珠腫組織にトレーサーとして塩化ランタン(2%)を一定時間負荷しながら2.5%グルタールアルデヒドで固定し、洗浄後に透過型電顕によって細胞間隙に侵入する塩化ランタンを観察した。その結果、角質層、顆粒層、有棘層、基底層に侵入したランタンが確認された。これに対し対照試料として同様の処理を行った正常な頸部皮膚ではランタンの侵入は認められなかった。2)真珠腫上皮基底層のpHを、リン脂質結合pH指示分子プローブ(fluorescein DHPE;Invitrogen,F-362)を用いて測定した。真珠腫組織および対照試料として真珠腫を伴わない慢性中耳炎の乳突洞粘膜を、25μM fluoresceinDHPE中に60分間浸し、共焦点レーザー走査顕微鏡観察下に488nm/458nmにて二重励起を行い、dual excitation ratio法により検量線に照らし合わせてpHを決定した。その結果、真珠腫のpH(6.17±0.54)は乳突洞粘膜のpH(6.67±0.59)に比べて有意に低値であることが分かった(p<0.05)。4)pH指示薬を付加した真珠腫上皮のケラチノサイトを酸性溶液で刺激し、細胞内Ca2+濃度の変化を共焦点レーザー走査顕微鏡下で観察したが、変化はみられなかった。5)真珠腫組織および対照試料として正常皮膚におけるフィラグリンの発現を、免疫組織学的に、さらに定量的RT-PCR法により検討した。フィラグリンはどちらの組織においても角質層に発現していたが、発現パターンと発現量に相違がみられた。6)以上より、真珠腫上皮ではバリア機能が障害されており、内部の酸性に傾いたpH(水素イオン)が上皮を透過して、隣接する骨組織を脱灰・吸収する機序が考えられた。またバリア機能の障害の原因としてフィラグリンの発現異常が考えられた。1)真珠腫上皮と耳後部正常皮膚におけるフィラグリンの発現を、引き続き症例を増やして、免疫組織染色と定量的RT-PCRにより検索した。フィラグリンはどちらの組織においても角質層に発現していた。定量的RT-PCRでは真珠腫上皮における発現が耳後部皮膚に比べて有意に低下していた。2)アトピー性皮膚炎など皮膚のバリア機能が障害される疾患で報告されている変異型フィラグリンについてPCR法により検索したが、真珠腫上皮、耳後部皮膚のどちらにも発現は認められなかった。3)次に真珠腫上皮と耳後部正常皮膚におけるタイト結合蛋白(claudin-1, claudin-3, tricellulin)の発現を、免疫組織染色と定量的RT-PCRにより検索した。免疫組織染色の所見では、これらのタイト結合蛋白はどちらの組織でも基底層有棘層顆粒層に発現し、特に顆粒層において強く発現していた。

さらにこれらの発現を定量的RT-PCRで検討したが、真珠腫上皮と皮膚との間で差は認められなかった。4)さらに真珠腫上皮の透過性亢進を実際の生体内で確認するため、中耳手術中に電気的インピーダンスを測定した。インピーダンス測定器は皮膚科領域の臨床検査で使用されている角層膜厚水分計(ASAHI BIOMED・ASA-M2)を用いた。その結果、真珠腫上皮では耳後部皮膚に比べてインピーダンスが低下していた。これにより真珠腫上皮の透過性亢進が実際に生体内で確認された。5)以上の結果、および平成2223年に得られた結果より、真珠腫内容物の酸性pHが透過性の亢進した上皮を通過し、隣接する骨組織が脱灰・侵食されるという機序が考えられた。さらにこうした真珠腫上皮の透過性亢進はフィラグリンの発現低下に起因する可能性が推定された。塩化ランタンをトレーサーとして用いた透過性の検討と、リン脂質結合pH指示分子プローブを用いた真珠腫上皮基底層のpH測定では、ほぼ予想通りの結果が得られた。これに対し予想に反して、水素イオンセンサー蛋白の発現は確認できず、真珠腫上皮細胞の酸に対する反応も確認できなかった。しかし当初の計画になかったフィラグリンの発現について調べたところ、真珠腫と皮膚の間に相違が認められた。24年度が最終年度であるため、記入しない。真珠腫の病態において、酸性に傾いたpHが骨吸収に関与している可能性は高いが、このpHの変化は真珠腫上皮細胞からの水素イオンの産生/分泌に依存するものではないと考えられる。酸性を帯びた真珠腫内容物の水素イオンが、透過性の亢進した真珠腫上皮を透過して、隣接する骨組織の脱灰を引き起こすと考えたほうが妥当である。皮膚においてそのバリア機能を担っていると報告されているフィラグリンの発現の結果からもこのことが裏付けられる。今後は真珠腫上皮の透過性/バリア機能を中心に検討していくという方針に切り替える。具体的にはフィラグリンの発現についての追試、claudinやtricellulinなどのタイト結合蛋白の発現の検索、in vivoにおける真珠腫上皮のバリア機能の測定、などの方向で研究を展開していくのが良いと考えられる。
下痢原性大腸菌感染症の予防に役立つ粘膜ワクチンの開発に関する基礎的研究

安全性の高い「組換えコレラ毒素Bサブユニット(rCTB)」を粘膜アジュバントとした粘膜ワクチン開発の一環として、依然発展途上国で高い乳児死亡率を示す毒素原性大腸菌感染症やわが国でも問題となっている腸管出血性大腸菌感染症(特に、溶血性尿毒症症候群や脳症)の予防に役立つワクチン候補の作製を目的とした。感染・発症予防には、菌の定着を阻止する腸管分泌型IgAおよび毒素の中和抗体(腸管および血清中)を誘導することが重要である。以下、有カワクチン候補として「アドヘシン」、「ホルマリン不活化菌体」、「Stx1B」を示した。1.毒素原性大腸菌(1)定着因子としての精製線毛(CFA/III)標品をマウスに経鼻投与すると、血清IgGと腸管IgA産生が誘導された。これらの抗体には菌体凝集活性があり、定着阻止能をもつ可能性が高い。(2)線毛標品はCaco-2細胞へ付着するが、実際に付着に関わる成分は微量のアドヘシンタンパクであることが欠失変異株の実験から明らかになった。(3)組換えアドヘシンはCaco-2細胞に結合し、そのIgG (Fab)抗体は野生株の付着を濃度依存的に阻害した。(4)組換えアドヘシンをワクチン候補としてrCTBと共にマウスに粘膜投与する実験を計画中である。2.腸管出血性大腸菌O157(1)ホルマリン不活化菌体をrCTBと共にマウスに経鼻および経口投与すると、血清IgGが誘導された。特に、経鼻投与では経口投与に比べ1/1000の菌量でより高い抗体価が得られたことから、「全菌体の経鼻投与」の有効性が示された。他の病原体への応用も期待される。(2)組換え志賀毒素Bサブユニット(rStx1B、rStx2B)の分泌産生系を作製し、精製標品を得た。(3)rStx1BをrCTBと共に経鼻投与すると、rCTBの有無に関わらず血清IgGが誘導された。(4)rStx1Bの粘膜アジュバント活性が判明した。(5)rStx2Bの経鼻投与実験は進行中である。全菌体、Stx1Bに対する粘膜IgA誘導が少なかった点は、ワクチン組成に工夫が必要であろう。感染症の予防は治療に勝る。新興・再興感染症を含め多くの感染症では広い粘膜面が病原体の侵入門戸となっており、粘膜系での効果的な感染防御が重要である。われわれは、新しいワクチンとして「粘膜ワクチン」の開発を目指し、安全性の高い粘膜アジュバント「組換えコレラ毒素Bサブユニット(rCTB)」を独自に作製した。これまでに現行ワクチンを抗原として用い、rCTBと共に点鼻することで、粘膜上および全身性の免疫応答が誘導され、ワクチンとしての有効性を証明してきた。

本研究では、rCTBアジュバントをさらに種々の感染防御抗原に応用する一環として、下痢原性大腸菌感染症の予防を目的として、まず、線毛を抗原とした場合の全身および粘膜免疫応答の誘導を調べ、次の結果を得た。BALB/cマウスに毒素原性大腸菌(ETEC)の線毛性定着因子(CFA/III)を経鼻投与すると、rCTBの有無にかかわらず全身性免疫応答(血清IgG、IgA)が誘導された。血清IgGサブクラスは、IgG1、IgG2a、IgG2b抗体価がほぼ同程度上昇し、Th1、Th2の両応答が示唆された。粘膜免疫応答(分泌型IgA)は、唾液、鼻腔、肺、膣、小腸、糞便で認められ、rCTBの有無にかかわらず、特に肺と膣で高い抗体価が得られた。ETEC菌体凝集反応は、すべての血清と高い抗体価を示した一部の小腸洗浄液で認められた。今回の実験ではrCTBアジュバント非存在下でも全身と粘膜免疫応答が誘導されたことから、CFA/IIIは鼻粘膜上皮より取り込まれやすい性質があると考えられる。CFA/IIIの経鼻投与により腸管においてIgA応答がみられたことは、腸管感染症の予防に経口投与でなくても「経鼻投与」により線毛ワクチンを利用できる可能性を示唆している。なお、rCTB添加ワクチンの場合は、得られる抗CTB抗体がETEC易熱性腸管毒(LT)と交差反応することから毒素に対する防御効果が加わることになる。安全性の高い「組換えコレラ毒素Bサブユニット(rCTB)」を粘膜アジュバントとした粘膜ワクチン開発の一環として、依然発展途上国で高い乳児死亡率を示す毒素原性大腸菌感染症やわが国でも問題となっている腸管出血性大腸菌感染症(特に、溶血性尿毒症症候群や脳症)の予防に役立つワクチン候補を作製することを目的とした。感染・発症予防には、菌の定着を阻止する腸管分泌型IgAおよび毒素の中和抗体(腸管および血清中)を誘導することが重要である。毒素原性大腸菌(1)定着因子としての精製線毛(CFA/III)標品をマウスに経鼻投与すると、血清IgGと腸管IgA産生が誘導された。これらの抗体には菌体凝集活性があり、定着阻止能をもつ可能性が高い。(2)線毛標品はCaco-2細胞へ付着するが、実際に付着に関わる成分は微量のアドヘシンタンパクであることが欠失変異株の実験から明らかになった。(3)組換えアドヘシンはCaco-2細胞に結合し、そのIgG(Fab)抗体は野生株の付着を濃度依存的に阻害した。(4)組換えアドヘシンをワクチン候補としてrCTBと共にマウスに粘膜投与する実験を計画中である。腸管出血性大腸菌O157(1)ホルマリン不活化菌体をrCTBと共にマウスに経鼻および経口投与すると、血清IgGが誘導された。特に、経鼻投与では経口投与に比べ1/1000の菌量でより高い抗体価が得られたことから、「全菌体の経鼻投与」の有効性が示された。他の病原体への応用も期待される。(2)組換え志賀毒素Bサブユニット(rStx1B、rStx2B)の分泌産生系を作製し、精製標品を得た。(3)Stx1BをrCTBと共に経鼻投与すると、rCTBの有無に関わらず血清IgGが誘導された。(4)rStx1Bの粘膜アジュバント活性が判明した。(5)rStx2Bの経鼻投与実験は進行中である。全菌体、Stx1Bに対する粘膜IgA誘導がわずかしか見られなかった点は、ワクチン組成に工夫が必要であろう。
薄膜によるジルコニアアロイの状態図および相変態の研究

純ZrO_2は高温から低温にかけて立方晶、正方晶、単斜晶の多形があるが、CaO、MgO、Y_2O_3を添加すると、酸素欠損が結晶中に形成されて、高温相が低温でも安定化される。これらを安定化ジルコニア、あるいは部分安定化ジルコニアという。CeはZrと同様に4価の金属であるが、CeO_2を添加してもジルコニアは安定化される。著者はこれまでZrO_2基2元系アロイセラミックスの状態図と組織および機械的性質の関係を調べてきた。今回の研究はその延長線上にあるものであるが、その第一はZrO_2ーCeO_2系の状態図と組織の関係を明らかにして、これまで最も詳細に研究してきたZrO_2ーY_2O_3系アロイと比較すること、第二は、高周波スパッタ装置を用いて、種々の組成のZrO_2ーY_2O_3アロイ薄膜をつくり、その組織及び相変態挙動をバルク試料のそれと比較することである。得られた結果は次のとおりである。(1)ZrO_2ーCeO_2系平衡状態図を決定した。15mol%以下のCeO_2を含むアーク溶解試料は安定な立方晶であり、CaF_2型格子の2倍の周期をもつ規則格子をもつ。これを焼きなますと双晶やドメインをもつ正方晶になるが、さらに長時間焼きなますと、核発生・成長型の析出が起って2相組織となる。ZrO_2ーY_2O_3アロイに見られたようなスピノーダル分解は起らなかった。(2)2、2.5、3、4、8mol%Y_2O_3を含むジルコニアを焼結してターゲットをつくり、これを用いて薄膜をKCl、MgO単結晶{100}面上につくった。その組成はターゲットの組成に一致し、また粒径が20nm程度の強い配向性をもつ多結晶体であった。2および2.5%Y_2O_3試料中の正方晶相は単斜晶相に変態したが、立方晶相は安定であった。ジルコニア(Zr O_2)には立方晶,正方晶,単斜晶の多形がある.適当な酸化物を添加して,室温で準安定正方晶としたものを部分安定化ジルコニア(PSZ)という. Y_2 O_3を添加したもの(Y-PSZ)は破壊のさいに単斜晶に変態し,このために極めて高い靭性を示す.しかしこれを300°C付近に加熱すると,単斜晶が生成され,靭性が低下する.このようにPSZの性貭には相変化が大きな影響を及ぼすが,これを正しく理解するには状態図を明らかにすることがまず大切である.本研究は薄膜組織観察法を主要な主段として,ジルコニアアロイの状態図と組織を明らかにすることを目的としている.まず採り上げたアロイはCeO_2添加部分安定化ジルコニア(CeーPSZ)である.アーク溶解によって種々の組成のボタン状試料をつくり,熱処理を行い,これより薄片を切り出し,透過電顕,電子回折,分析電顕を用いて組織と構造を調べた.

この結果得られた状態図は従来の推定状態図と大筋において一致した.なお,アーク溶解したままの試料は酸素欠陥を多く含む.このために立方晶が著しく安定となっているが,その酸素イオンの配置は, Ca F_2型といわれるZr O_2と異なり,単位胞の大きさが2倍の規則構造をもつことが分った.また12mol%Y_2 O_3を含むアロイは熱的には極めて安定であるが,粉砕すれぱ70%が単斜晶に変態し,変態誘起靭性を示すことが明らかになった.本研究費補助金でRFスパッタリング装置を設置することができた.調整は完了し,現在バッキングプレートに種々の組成のジルコニアアロイのターゲットの接合を行っている.純ジルコニアには高温から低温にかけて立方晶、正方晶、単斜晶の多形があり、Y_2O_3、CaO、MgOなどを添加することにより、高温相が低温でも得られるようになる。この種のいわゆる部分安定化ジルコニアは強靱材料として、また、安定化ジルコニアは耐火物やセンサーなどとして利用されている。著者はこれまでZrO_2ーY_2O_3系の状態図と組織、および相変態について、アーク溶解試料および焼結試料を用いて研究を行ってきた。本年度は高周波スパッタリング法により薄膜をつくり、これを加熱した場合の組織変化を調べることとした。まず、種々のY_2O_3濃度の共沈ジルコニア粉末を用い、ホットプレート法により直径50mmのターゲットをつくった。この裏面を超音波加工機を用いて凹所をつくってから、Inを用いてバッキングプレートに貼りつけた。スパッタ装置は本補助金によって購入した日本真空技術(株)製の高周波スパッタ装置である。基板には単結晶のKClおよびMgOの(100)面を用いた。蒸着したままの膜は20mm程度の平均粒径の多結晶体であり、膜面に平行に(110)と(100)が優先的に配向しており、8mol%Y_2O_3試料は立方晶単相であったが、2.5、3、4%Y_2O_3試料では正方晶相が混在していた。これを473Kで720ks加熱したが、単斜晶相の生成を確認できなかった。しかし、2%試料では単斜晶相が生成した。この試料でもなお立方晶のみの部分もあり、立方晶→単斜晶の遷移が困難であることを示している。また、予め873Kで90ks時効処理をしてから473Kで3.6ks加熱した2%Y_2O_3試料には多量の単斜晶相が存在していた。これは、正方晶→単斜晶の遷移が容易に起ることを示している。
可積分量子系および近可積分量子系に対する新しい準位統計理論の構築

本研究によって量子系のエネルギー準位に新しい法則が見出される可能性を示すことができた。ある種の対称性を持つ量子系(古典系が積分可能である量子系)には、エネルギー準位に異常な揺らぎが発生することが過去の研究によって証明されている。本研究はこの揺らぎを準位数分散やスペクトル硬度などの統計量よって特徴づける新しい理論を考案し、大きく分けて3種類の揺らぎが生じることを明らかにしている。今年度は当初の計画に沿って、可積分量子系のスペクトル硬度・準位数分散・2準位相関関数などを、準位成分の数を無限大にとる極限として導出し、得られた極限分布関数の性質を評価することで、量子系のエネルギー準位に生じる揺らぎの性質を明らかにする理論を構築した。ベリーとロブニックが考案した準位統計の半古典理論を、パンディによって構築されたエネルギー準位の重ね合わせ理論に適用し、さらにリュービル・アーノルドの定理を考慮にいれ、可積分量子系の無限個の相空間構造を想定したある仮定のものでスペクトル硬度・準位数分散などの理論公式を準位成分の数を無限大にとる極限として導くことに成功した。得られた理論公式の性質をパラメータ関数を用いて評価し、可積分量子系の長距離準位相関にみられる揺らぎの性質をいくつかのクラスに分類した。またエネルギー準位列がポアソン統計を示す条件、外れる条件を示すことができた。われわれの構築した理論は、量子系の長距離準位相関に従来から知られている統計則(ポアソン統計)とは異なる新しい統計則が生じる可能性を示唆するもので、ポアソン統計から外れる条件として、系に内在する対称性を起源にエネルギー準位に強い集積が起こる必要があるという結論を与えている。量子化された矩形ビリアード系を用いたコンピュータシミュレーションによって、ポアソン統計に一致する事例や外れる事例を集め、構築した理論との整合性を明らかにすることができた。次年度は、いよいよ、長距離スペクトル相関と短距離スペクトル相関の関係を明らかにするつもりである。今年度は、2003年の研究論文で発表した極限準位間隔分布の公式を高次の相関モーメントを含む一般的な公式に書き換え、次数に対して無限和をとることにより、2点相関関数などの長距離スペクトル統計の新しい分布関数を導出した。得られた分布関数と平成18年度の研究計画で導出した理論公式と比較し、両者の関係をつなぐ新しい理論を構築した。両者の関係を結ぶパラメータ関数の関係式を詳しく分析したところ、ポアソン統計が得られるケース、ポアソン統計から外れるケース、サポボアソン統計が得られるケースに対する長距離スペクトル統計の振る舞いを明らかにすることに成功した。これら3つのケースのうち後者の2つのケースは本研究代表者らが2003年の研究論文で短距離スペクトル統計の分析の際に報じたケースと同一であり、後者の2つのケースが長距離スペクトル統計においても観測可能であることが初めて明らかになった。本年度の研究により、強い準位集積を示す可積分量子系の長距離スペクトル統計の性質について、かなりのことが明らかにできた。特に、量子系の分析においてよく用いられる準位間隔分布などの短距離スペクトル統計と、今回の研究対象としている長距離スペクトル統計の間の対応関係に対する理解が初めて明らかになったことは、大きな成果といえる。今後はコンピュータシミュレーションを行い、理論が示す新しい法則の存在が現実系で確認できるかどうか検証作業をおこなってみる予定である。今年度は平成19年度に実施したの研究の成果をスペクトル硬度や準位数分散の理論に応用し、これらの量の振る舞いに関する詳しい分析をおこなった。平成19年度の研究によって可積分量子系のエネルギー準位統計には3つのクラス(ポアソン統計/漸近ポアソン統計/サブポアソン統計)が存在することが理論的に示唆されたが、今年度は、これら3つのクラスの差異が準位数分散(あるいはスペクトル硬度)の傾きに表れることを理論的に示すことに成功した。傾きの値はポアソン統計では1、漸近ポアソン統計では1以上、サブポアソン統計では3以上になる事が明らかになった。さらに、矩形量子箱系に対する数値計算を行い、3つのクラス全ての証拠を実際の物理系で確認することにも成功した。これら3種の結果はグッツウィラーの周期軌道理論による結果とも矛盾していない。特に2番目に挙げた漸近ポアソン統計と3番目に挙げたサブポアソン統計が生じるケースについては、スペクトル硬度や準位数分散の理論において報告事例が全く無く、対称性を起源とするエネルギースペクトルの異常集積がもたらす量子系の新しい統計則である。矩形量子箱は単電子メモリなど、量子ドット系としての工学的な応用にも用いられており、最もポピュラーな量子系の一つとして量子論の教科書にも多数とりあげられている。このような模範的な量子系において新しい性質を解明することができた。本研究は量子化された可積分系に対し、これまで知られていた統計則の導出に関する新しいアプローチ法を提案するとともに、新しいアプローチ法を採用した際に得られる新しい統計則の可能性を示した。量子系の性質を深く理解するための学術的な知見を与えている。
Crm1複合体の解析による肝細胞癌発癌機構およびその治療法の解明

肝細胞癌は肝臓にできる悪性腫瘍である原発性肝癌の約95%を占める疾患であり,原因としてB型肝炎,C型肝炎ウイルスが関係すると考えられている.世界的には、アジアとアフリカを中心として3億5千万人も持続感染しているB型肝炎ウイルスが原因となる肝細胞癌の患者数の方が,C型肝炎ウイルスよりまだ圧倒的に多いのが現状である.その原因として,B型肝炎ウィルスによる肝細胞癌発癌機構に最も関与することが報告されているタンパク質であるHepatitis B virus X proteinその機序としてタンパク質を核から細胞質へ輸送するという重要な機序に関わる核外輸送因子Crm1複合体がHBxを細胞質に輸送し,中心体分裂に不安定性を引き起こし発癌することが報告されている.ヌクレオフォスミン(NPM/B23)は5量体(オリゴマー)を形成する非常に安定したタンパク質であり,核と細胞質を往復し正常細胞では核内で見られる頻度が最も高い.以前より中心体分裂に関与することが知られていたが,最近になりNPMの細胞質への輸送能はCrm1複合体によってコントロールされていることが報告された.以上より,Crm1複合体に関わる二つのタンパク質がcomplexを形成することにより肝細胞癌発癌機構制御に大きく関わり,治療に応用される可能性が示唆される.HBxとNPMの接合部位の同定:pcDNA3myc3NPMとpcDNA3flag3HBxを作成し,この両タンパク質が結合する可能性があることが示唆された.現在,NPMとHBxの接合部位の同定のため,NPMの変異体を作成し細胞にpcDNA3flag3HBxと共発現させ,抗Flag抗体にて免疫沈降し,HBxとNPMに対する抗体でWestern blotting法を用いて接合部位の同定を行っている.肝細胞癌は肝臓にできる悪性腫瘍である原発性肝癌の約95%を占める疾患であり,原因としてB型肝炎,C型肝炎ウイルスが関係すると考えられている.世界的には、アジアとアフリカを中心として3億5千万人も持続感染しているB型肝炎ウイルスが原因となる肝細胞癌の患者数の方が,C型肝炎ウイルスよりまだ圧倒的に多いのが現状である.その原因として,B型肝炎ウィルスによる肝細胞癌発癌機構に最も関与することが報告されているタンパク質であるHepatitis B virus X proteinその機序としてタンパク質を核から細胞質へ輸送するという重要な機序に関わる核外輸送因子Crm1複合体がHBxを細胞質に輸送し,中心体分裂に不安定性を引き起こし発癌することが報告されている.ヌクレオフォスミン(NPM/B23)は5量体(オリゴマー)を形成する非常に安定したタンパク質であり,核と細胞質を往復し正常細胞では核内で見られる頻度が最も高い.以前より中心体分裂に関与することが知られていたが,最近になりNPMの細胞質への輸送能はCrm1複合体によってコントロールされていることが報告された.以上より,Crm1複合体に関わる二つのタンパク質がcomplexを形成することにより肝細胞癌発癌機構制御に大きく関わり,治療に応用される可能性が示唆される.HBxとNPMの接合部位の同定:pcDNA3myc3NPMとpcDNA3flag3HBxを作成し,この両タンパク質が結合する可能性があることが示唆された.現在,NPMとHBxの接合部位の同定のため,NPMの変異体を作成し細胞にpcDNA3flag3HBxと共発現させ,抗Flag抗体にて免疫沈降し,HBxとNPMに対する抗体でWestern blotting法を用いて接合部位の同定を行っている.
核融合プラズマ中の高Z不純物に関する電荷変換断面積測定とデータサーバ構築

国際熱核融合実験炉の第一壁構成材に決定しているベリリウム,同じくダイバータに採用されるタングステンおよび、通常の核融合プラズマ装置において第一壁のホウ素化に使用されるホウ素,次世代の核融合炉において重要な役割を期待されるステンレス合金構成元素である鉄とニッケルから発生する高Z不純物イオンが核融合プラズマ中で及ぼす作用を検討するための電荷変換断面積の絶対値測定ならびに、学術雑誌に発表された電荷変換断面積の収集とデータベース構築を実施した。測定においては、衝突エネルギー0.532keVでのタングステン1価正イオン,ニッケル1価2価正イオン,鉄1価正イオン,ホウ素1価2価正イオンならびにベリリウム1価2価正イオンの、各種希ガスならびに分子ガス(He, Ne, Ar, Kr, H2, CO, CO2, N2, CH4, C2H6, C3H8)に対する電荷変換(1電子捕獲ならびに2電子捕獲)全断面積を絶対値測定した。電荷変換断面積データ公開サニーバ構築に関しては、平成18年9月よりデータベースを公開し、逐次20042006年に学術雑誌に発表された電荷変換断面積の実験測定値の衝突系,エネルギー,断面積と測定誤差および実験手法を、論文書誌情報(題名,掲載誌,巻号頁,著者,著者所属)ならびにコメントと共に収録した。現在、486衝突系に関する1766レコードに及ぶ電荷変換断面積を公開中である。断面積測定に関して、論文1編が発表済、1編が投稿済(平成20年3月)であり、今後さらに2編の論文を投稿する予定である。また断面積測定およびデータベースに関し、平成19,20両年で計4つの国際会議・ワークショップで発表を行った。平成19年7月の国際会議にて、国際原子力機関(IAEA)からの出席者と協議し、本データベースを平成20年にIAEAのGenie統合インターネットサーチエンジンシステムに組み込むことで合意しており、平成20年6月に最初の作業のための会合をウィーンで開催する。電荷変換断面積測定に関して、現有の装置を改良し、イオン発生部真空槽の真空排気系とターゲットガス圧力記録計を更新した。イオン発生部真空槽の真空排気系をターボ分子ポンプを使用したものに更新したことにより、従来の油拡散ポンプによる真空排気系では(ポンプ油による汚染のため)得られなかった高Z元素イオンビームを得ることに成功し、衝突エネルギー510keVでのタングステン元素1価正イオンの、各種希ガス(He, Ne, Ar, Kr)ならびに水素(H2,D2),窒素ガスターゲットに対する電荷変換(電子捕獲)全断面積を絶対値測定した。本測定データは、下記の電荷変換断面積データ公開サーバの詳細と共に、平成19年7月にドイツ・フライブルクにて開催される第25回光・電子・原子衝突国際会議にて発表を行う。(報告概要受理済)電荷変換断面積データ公開サーバ構築に関しては、既に設計を完了してあったデータベース仕様を若干改善し、平成18年8月に導入したサーバ計算機上に、合計10のデータテーブルから構成されるデータベースを構築した。このデータベース上に、20O4,2005両年に学術雑誌に発表された電荷変換断面積の実験測定値(443種衝突系に関する1492レコード)の衝突系,衝突エネルギー,断面積と測定誤差データおよび実験手法を、論文書誌情報(題名,掲載誌,巻号頁,著者,著者所属)ならびに検索用キーワードと共に収録し、平成18年9月よりインターネット上で公開開始した。

本データベースの仕様,データテーブル構成,実際の検索手順等につき、平成18年10月にフランス・パリで開催された第5回原子分子データとその応用に関する国際会議ならびに平成19年2月に韓国・大田で開催された第3回日韓原子分子データ共同ワークショップにて発表を行った。衝突エネルギー510keVでのタングステン1価正イオンの、各種分子ガス(N2, CH4, C2H6, CO)に対する電荷変換(1電子捕獲)全断面積を絶対値測定した。18年度中の測定データとあわせ、各種希ガス(He, Ne, Ar, Kr)ならびに分子ガス(H2, D2, N2, CH4, C2H6, CO)に対する電荷変換全断面積が得られたこととなる。また、国際熱核融合実験炉の第一壁構成材に決定しているベリリウム元素につき、衝突エネルギー1520keVでのベリリウム2価正イオンの、COガスに対する電荷変換(1および2電子捕獲)全断面積を絶対値測定し、平成20年3月に論文投稿した。電荷変換断面積データ公開サーバ構築に関しては、平成18年9月より公開開始したデータベースの仕様を一部見直し、原子衝突実験研究者の視点から収録データにコメントを加えるよう変更を施した。このデータベース上に2006年に学術雑誌に発表された電荷変換断面積の実験測定値の衝突系,エネルギー,断面積と測定誤差および実験手法を、論文書誌情報(題名,掲載誌,巻号頁,著者,著者所属)ならびにコメントと共に収録し、平成18年中に収録した2004,2005両年に発表された実験測定値とあわせ、486衝突系に関する1766レコードに及ぶ電荷変換断面積を公開中である。タングステンイオンに関する実験結果と電荷変換断面積サーバにつき、平成19年7月にドイツ・フライブルクにて開催された第25回光・電子・原子衝突国際会議ならびに11月に韓国・大田にて開催されたコアユニバーシティワークショップにて発表を行った。会議にて、国際原子力機関(IAEA)からの出席者と協議し、本データベースを平成20年にIAEAのGenie統合インターネットサーチエンジンシステムに組み込むことで合意した。
CaMKIアイソフォームの特異的活性化による樹状突起・軸索伸展の選択的制御

神経細胞は、樹状突起と軸索を発達させ神経回路を形成するが、神経細胞の突起伸展機構解明は神経科学の大きな課題である。神経活動依存的なカルシウム流入は、樹状突起・軸索の伸展に密接に関わるが、カルシウムの下流の分子機構や機能制御に関して不明な点は多い。カルシウム流入によって、活性化するカルシウム/カルモデュリン依存性蛋白リン酸化酵素(CaMK)群の内、大脳皮質神経細胞培養の実験系から、CaMKIに属す、CaMKIγとCaMKIαが、樹状突起と軸索を選択的に制御することを明らかにした。CaMKIγとCaMKIαの下流基質分子を同定し、樹状突起・軸索伸展の選択的な制御を目指す。本年度は、以下の項目について研究を遂行した。1、ペプチドアレイから同定したリン酸化モチーフに基づいたCaMKIγとCaMKIαの基質ペプチドを作成し、Ca^<2+>/CaM依存性や基質特異性を検討した。2、CaMKIγ-KOマウス由来の培養神経細胞を用いて、リン酸化プロテオミクスを行い、CaMKIγ-KOでリン酸化が低下する基質候補を探索した。3、リン酸化プロテオミクスの結果やリン酸化モチーフから推測されたCaMKIγの基質候補について、基質候補由来のペプチドを作成し、よくリン酸化しうる分子を同定した。以上の研究成果を、第26回神経組織の成長・再生・移植研究会学術集会、第34回日本神経科学会、第41回北米神経科学学会にて発表した。カルシウム流入によって、活性化するカルシウム/カルモジュリン依存性蛋白リン酸化酵素(CaMK)群の内、大脳皮質神経細胞培養の実験系から、CaMKIに属す、CaMKIγとCaMKIαが、樹状突起と軸索を選択的に制御することを明らかにした。平成22年度は、生化学的な解析を中心に、下記の項目について研究を遂行した。1、in vitro酵素活性特性を明らかにするため、Sf9細胞を用いた、リコンビナント酵素の発現・精製法を最適化した。精製酵素を用いて、酵素活性を測定し、Ca^<2+>/CaMの依存性を検討した。3、基質特異性を酵素学的視点から検証するため、ペプチドアレイを用いて、CaMKIγとCaMKIαのリン酸化モチーフを同定した。同定配列を基に、データベースから基質候補分子を探索した。4、CaMKIγノックアウトマウスを用いたリン酸化プロテオミクスによる、基質分子の探索を開始した。5、In vivoの表現型を解析するため、遺伝子導入可能なrAAVベクターの精製法を樹立し、最適化を行った。以上の研究成果を、第83回日本生化学会大会、第84回日本薬理学会年会にて発表した。
健康相談活動に関する養護教諭のための自己研修方法の工夫

1.生徒が抱く保健室のイメージ子どもたちが保健室へ抱くイメージはおおむね良好ではあるが、「心や体の悩み」を十分に相談できずにいる事実もあることがアンケートにより明らかになり、より生徒理解の必要を感じた。2.教育相談活動と健康相談活動の違い「健康相談活動」は保健室の重要な機能の一つであり、「教育相談」とはちがった役割を担っていると考えている。そのため、この研究において二つの「相談機能」の差別化をはかり、より「健康相談活動」の内容の明確化をはかりたいと考えたが、「教育相談」の一部分に「健康相談活動」を位置付けることがより実態に合っていると考える。3.健康相談活動の自己研修方法養護教諭は、ほとんどが一人で保健室の執務に携わる。ただ、「健康相談活動」の分野は、一人では執務を遂行できない場合が多い。子どもの相談に関わる問題の解決については、子どもを取り巻く教師集団が「いかにしなやかに相互に関わり合っていくか」ということが、子どもと教師との関わりと同じくらい重要になってくる。したがって、対子ども、対教師との関係の中で随所に自己研修の要素がある。つまり、対教師、対子どもとの関わりの事実を詳細に記録し、ケース会議を持ち意見を交換していく中で資質を高めていくことが十分可能である。ケース会議を開催するにあたっては、教員はもちろんのこと「相談活動」の専門家にも意見をもらうようにし、より専門的な力量を高めていけるようにする。また、「関わり」と平行して記録をとっていくことはむずかしいため、「効果的な記録の方法」についてもこれから研究を深めていく。4.健康相談活動の課題とは個人情報の管理を慎重にした上で「健康相談活動」を「開かれた相談活動」にしていく必要がある。つまり「教育相談」の機能にうまく連動させていくことが、これからの「健康相談活動」に重要である。
光合成細菌 Phodespirillum rubrumのプレスミドに関する研究

光合成細菌の紅色無硫黄細菌の1種であるR.rubrumを用いて、下記の研究を行った。当菌は、嫌気的明所で光合成を行い、好気的条件下では酸素呼吸により従属栄養的に生長する。また、嫌気的暗所では発酵により従属栄養的に生長する。すなわち当菌は、環境条件に応じて代謝をよく使いわけ、生長、生存することができるので、代謝進化の研究にはきわめて適した生物であるといえる。R.rubrumの野生型株をアクラフラビンで処理すると、非紅色の各種の変異体がえられることを発見した。そこで本研究では、野生株と白色変異株を用いて次のような研究を行った。1.白色変異株はバクテリオクロロフィル合成能とクロアトホア形成能を欠くことを発見した。2.野生株に大型のプラスミドが含まれることをKuhlらの研究とは独立に発見したが、白色変異株はこのプラスミドを欠いている。3.このプラスミドを野生株から分離、調整し、白色変異株に形質転換すると、紅色に変わり、バクテリオクロロフィル合成能とクロマトホア形成能とを回復する。4.このことから、プラスミド上に、両機能を発現する遺伝子が含まれることは明らかである。5.プラスミドを取り出し、各種の制限酵素を用いて物理的染色体地図を作成した。全長は50キロベースと、プラスミドとしてはかなり大きいものであることが、わかった。6.大腸菌の基本的ベクターであるPBR322を用いて当光合成細菌に形質転換を試みた。このベクター自身は転換能をもつが、これにプラスミドの一部を組み入れた雑種プラスミドを用いて同様なテストを繰返しているが、現在のところ成功していない。現在は、この雑種プラスミドに対する光合成細菌特異な制限酵素によって、細胞内で制限分離を受けている可能性もあり検討中である。DNA量、カルシウム濃度、時間等をパラメーターとする実験はすでに終わっている。光合成細菌Rhodospir llumruhrumは,嫌気的明所で光合成により,好気的条件下で従属的な呼吸代謝により,また嫌気的暗所では醗酵により生活エネルギーを生産するという非常に興味のある細菌である.報告者らはこの菌を用いて代謝進化を知るべく研究していたところ,塩基性色素のアクリフラビンによって,光合成色素形成能を喪失した変異菌がえられることを発見した.これは,おそらくプラスミドの消失に由るとの仮説を立てて,その再現性と真実性を確めるべく数多くの実験を重ねていたところ,アメリカのKuhnらがR.rubrum細胞にプラスミドの存在を示す論文を発表した(1983).しかし彼らは,アクリフラビンによるのではなくDNA分離中に,サティライトDNAの存在することを発見したことによる.われわれがえた50kbpプラスミドは,アクリフラビンにより光合成能を失った,いわゆる白色変異株(野生株は朱色)に形質転換したところ,転換体は光合成能を取り戻したこと,また光合成色素吸収を再生すること,など発見した.その他,バクテリオクロロフィル合成能をもたないが,カロチノイド合成能をもつ,いわゆる黄色変異株の出現することを発見した.分離した50kbpの物理的染色体地図を数種の制限酵素について決定した.アクリフラビン処理によってえられた白色変異株の細胞には,バクテリオクロロフィル吸収やカロチノイド吸収がみられない.

また野生株から分離されるプラスミドは,この白色変異株からは分離されないこと,また野生株プラスミドを32Pでラベルし,分離した後,これをプローブとして白色変異株についてハイブリダイズしたが,まったく雑種シグナルが得られないが,野生株細胞では十分な雑種形成がみられることなどから,白色変異株に50kbpプラスミドは含まれていないことは明らかであるといえる.現在この問題をさらに深く追求中である.光合成細菌Rhodospirillum rubrumは紅色無硫黄細菌の一種である。嫌気的明条件で光合成を行ない。好気的条件では従属的な吸収によって成長する。また嫌気的暗条件では発酵によって成長することができる。またこの光合成細菌は、同一の電子伝達系を光合成にも呼吸代謝にも用いているという著しい特徴がある。したがって、光合成代謝が停止すると、この菌種は従属的な酸素呼吸細菌になる。われわれの研究室では、R.rubrumの野性株をアクリフラビンで処理すると、非紅色、すなわち白色、黄色、肉色などを呈する突然変異菌が出現することを発見した。これらの変異菌は、バクテリオクロロフィルまたはカロチノイド、あるいは両色素の合成能を失っており、これらは光合成能を欠いている。本年度の研究実績は次の通りである。1.この菌種は野性株に50キロベース大のプラスミドが含まれることを各種の制限酵素を用いて明らかにした。白色変異菌にこのプラスミドが含まれていないことを、あらゆる方面から検討し確認した。この成果は近く論文として公表する予定である。2.単離したプラスミドDNAを用いて白色変異菌に形頂転換すると紅色転換体が得られ、バクテリオクロロフィル合成能、カロチノイド合成能およびクロマトホア形成能を回復する。もちろん合成能も回復している。3.現在は、このプラスミドを制限酵素で分断し、大腸菌ベクターのPBR322を用いて当光合成菌の白色変異菌に形頂転換しているが、なかなかコンピーテント細胞条件がつくり出せないので、奮斗中である。4.将来は、このプラスミド上の各種の遺伝子座をあきらかにすつるとともに、その膜結合機構についても明らかにしていきたい。
血管発生分化過程における内分泌因子の働きのヒトES/iPS細胞を用いた解析

本研究では、ヒトES/iPS細胞からの血管細胞分化誘導技術の改良、血管細胞分化誘導過程におけるBNPの機能的意義の検討を行った。我々の血管細胞誘導系は、血管内皮細胞(EC)と壁細胞(MC)の双方を簡便に誘導できることを特徴、利点として持つ。中大血管でMCは血管平滑筋の形態をとるが、DNAマイクロアレイ法による遺伝子網羅的解析データベースを作成し検討した結果、我々の誘導したMCとヒト成熟血管平滑筋では異なる点が多く見られた。そこで、より成熟したMCを誘導するための技術改良に取り組み、TGFβ刺激の必要性を見出した。これにより、疾患特異的iPS細胞を用いた他施設共同研究で、これまでのEC誘導の解析だけでなく、今回、遺伝性脳動脈症(CADASIL)でMC誘導の解析を実施できた。また、StemFitを用いて未分化維持培養の継代状態を小細胞塊から単細胞に変更することで、血管細胞誘導も単細胞から開始可能となり、その後の解析や定量が容易となった。一方、血管細胞誘導過程において、特にFlk1(+)VE-cadherin(-)分画の細胞がBNPを強発現・産生していることの意義を追求した。この分画の細胞は、中胚葉系幹細胞、心筋幹細胞とは異なる遺伝子発現を示し既存の複数の誘導法にて心筋、脂肪、軟骨、骨への分化を認めなかったことより、血管幹細胞として機能し、血管細胞分化にBNPが深く関与することが示唆された。この細胞分画に対するsiRNA実験で、BNP発現を60%ほど低下させることに成功したが、誘導される血管細胞の性質に明らかな変化は認めなかった。今後は、未分化iPS細胞へのsiRNA実験、BNPノックダウンiPS細胞株の作成による解析も予定している。また、培養液へのBNP添加実験では、一定濃度のBNP添加によりMCの増殖率が増加したが、濃度依存性は明らかではなく、今後さらなる検討を要する。当年度は本研究計画に従い、ヒトES/iPS細胞からの血管細胞分化誘導技術の改良および血管細胞分化における心血管ホルモンおよびその受容体発現の意義についての解析を進めた。Flk1(+)TRA1-60(ー)分画から血管壁細胞を分化誘導する系に関して、より成熟した壁細胞を誘導するため、各種液性因子の添加による効果検討を継続した。誘導効果判定は後期血管平滑筋マーカーであるSM22を用いて行った結果、TGFβを誘導初期に使用することで、より成熟した壁細胞を選択的に誘導する系を確立できた。次に、改良した血管細胞分化誘導の系において、各分化誘導過程での心血管ホルモンおよびその受容体の発現につき再検討した結果、BNPは分化誘導過程で得られるFlk1(+)TRA1-60(ー)細胞分画では強発現しており、さらにこれらの細胞が培養液中にBNPを産生することが同様に確認できたが、壁細胞に分化するに従い、BNP発現量は減少した。また、BNPが主に作用する受容体であるGC-Aは壁細胞ではなく血管内皮細胞に強く発現していた。未熟な中胚葉の細胞と考えられるFlk1(+)TRA1-60(ー)分画は、形態的にも多様な細胞集団であるため、これらがどのような性質をもつ細胞であるかを確認した。血管、心筋、軟骨などへの分化が可能であるかを既報の誘導法に従い実施したところ、血管内皮細胞へのみVEGF高濃度添加で一部分化が確認できたが、他中胚葉への分化は確認できなかった。Flk1(+)TRA1-60(ー)細胞におけるBNP発現の生理的意義の解明のために、現在siRNAを用いてBNP発現を低下させる実験系を確立中である。同時に、我々の血管細胞分化誘導系においてBNPを添加することで分化誘導に影響を与え得るかを検討したところ、壁細胞の増殖能に関与している可能性も示唆される結果が得られた。生体の血管は、おもに内面を覆う血管内皮細胞(EC)とその外側を裏打ちする壁細胞(MC)からなるが、申請者らの研究室では、本研究申請時までに既にヒトES/iPS細胞からEC、MCのいずれも分化誘導することに成功している。ECの分化誘導に関しては、これまでに、GSK3β阻害剤やRock inhibitorの導入による誘導技術の改良によりどのES/iPS細胞株からも安定して分化誘導できる高い技術レベルを確立できている。MCは細小血管ではpericyte、中等度以上の血管では血管平滑筋(SMC)の形態をとるが、MCの分化誘導に関して、pericyteとSMCとの両者を分けて考え、双方を分化誘導できる技術の開発は不十分であった。今回、MC分化に影響を与えると報告されている各液性因子や細胞外基質について検討し技術改良を加えることで、MCの分化誘導法を整備することが出来た。分化誘導法を整備した上で、各種心血管ホルモンが、ヒトにおける血管分化誘導に何らかの影響を与え得るかどうかについて、これまでに得られているデータを元に解析中である。特にヒトES/iPS細胞からの血管細胞誘導過程で得られるFlk1(+)細胞でANP、CNPなどの発現は観察されずBNPのみが強発現し、さらにFlk1(+)細胞が培養液中にBNPを産生することは興味深い現象だと考えている。その生理的意義、作用機序の解明のために、血管細胞分化誘導過程でのBNP添加による影響の検討、Flk1(+)細胞への遺伝子導入(siRNA)によるBNP発現低下状態での血管分化の評価を実施中であり、研究計画に沿って進行していると考えている。

本研究では、ヒトES/iPS細胞からの血管細胞分化誘導技術の改良、血管細胞分化誘導過程におけるBNPの機能的意義の検討を行った。我々の血管細胞誘導系は、血管内皮細胞(EC)と壁細胞(MC)の双方を簡便に誘導できることを特徴、利点として持つ。中大血管でMCは血管平滑筋の形態をとるが、DNAマイクロアレイ法による遺伝子網羅的解析データベースを作成し検討した結果、我々の誘導したMCとヒト成熟血管平滑筋では異なる点が多く見られた。そこで、より成熟したMCを誘導するための技術改良に取り組み、TGFβ刺激の必要性を見出した。これにより、疾患特異的iPS細胞を用いた他施設共同研究で、これまでのEC誘導の解析だけでなく、今回、遺伝性脳動脈症(CADASIL)でMC誘導の解析を実施できた。また、StemFitを用いて未分化維持培養の継代状態を小細胞塊から単細胞に変更することで、血管細胞誘導も単細胞から開始可能となり、その後の解析や定量が容易となった。一方、血管細胞誘導過程において、特にFlk1(+)VE-cadherin(-)分画の細胞がBNPを強発現・産生していることの意義を追求した。この分画の細胞は、中胚葉系幹細胞、心筋幹細胞とは異なる遺伝子発現を示し既存の複数の誘導法にて心筋、脂肪、軟骨、骨への分化を認めなかったことより、血管幹細胞として機能し、血管細胞分化にBNPが深く関与することが示唆された。この細胞分画に対するsiRNA実験で、BNP発現を60%ほど低下させることに成功したが、誘導される血管細胞の性質に明らかな変化は認めなかった。今後は、未分化iPS細胞へのsiRNA実験、BNPノックダウンiPS細胞株の作成による解析も予定している。また、培養液へのBNP添加実験では、一定濃度のBNP添加によりMCの増殖率が増加したが、濃度依存性は明らかではなく、今後さらなる検討を要する。我々はこれまでにヒトES/iPS細胞からの血管構成細胞(血管内皮細胞、壁細胞)への分化誘導システムの構築において着実な成果を上げている。また、心血管ホルモンの血管障害や血管再生に与える影響についても検討してきた。本研究の特色は、ヒトES/iPS細胞からの血管構成細胞分化誘導技術と心血管ホルモンに関する研究の知見から、実験動物ではなく、ヒトの血管の発生分化過程における内分泌因子(特に心血管ホルモン)の働きの解析を行うという点である。ヒトES/iPS細胞を用いて同定した血管構成細胞分化誘導におけるkey factorを血管新生・再生を促進する因子として臨床応用し、動脈硬化の進展・心血管イベント発症を抑制するべく血管保護・再生・修復を促す非侵襲で根治的な新規治療法の開発を目指す。本研究では主にBNPに着眼し、BNPのヒト血管の発生分化へ与える影響を追究することで、血管障害の予防・治療に関して新たな知見を広めていく。我々の分化誘導系を用いた解析において、BNPが主に作用する受容体であるGC-Aは壁細胞ではなく血管内皮細胞に強く発現していたため、血管分化におけるBNPの意義を検討するために、Flk1(+)細胞または壁細胞と血管内皮細胞の共培養実験を行う予定である。さらに、上述したFlk1(+)細胞へのsiRNA導入によるBNP発現低下モデル実験を進めるとともに、未分化ヒトES/iPS細胞自体への遺伝子導入アプローチも行い、同じくBNP発現低下モデルおよび亢進モデルを作成することで、血管誘導初期段階におけるBNPの意義についても検討したいと考えている。