hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
メダカを用いた小胞体ストレスに起因するアポトーシス分子機構の解析

本研究は細胞内の小胞体ストレス応答機構において小胞体ストレスに起因するアポトーシスの分子メカニズムを明らかにすることを目標とする。細胞を用いたin vitroレベルでの実験系は薬剤を処理し小胞体ストレスを引き起こすが、その場合細胞内の様々な経路が同時に誘導されるため解析が混乱である。この問題点を解決するため生理的に生じる小胞体ストレスに着目しメダカをモデル動物として用いたin vivoレベルでの解析にアプローチし研究を行なっている。現在メダカの発生段階に生じる生理的小胞体ストレスとアポトーシスの誘導、また持続的小胞体ストレスにより異常な表現型が生じるメダカであるmeigo遺伝子欠損メダカを用いて小胞体ストレス応答機構の誘導とそれに起因するアポトーシスの関係性を調べている。今年度はアポトーシスの可視化のため4種類の蛍光タンパク質それぞれを用いたアポトーシス可視化メダカを作出し、発生段階で生じる生理的アポトーシスの観察に成功した。次にmeigo遺伝子欠損メダカと掛け合わせ異常な表現型におけるアポトーシスの誘導の観察を行った。その結果、レンズや心臓など組織特異的にアポトーシスが誘導されることが観察され、さらに小胞体ストレス応答機構の誘導も組織特異的に異なることがわかった。また小胞体ストレス応答機構の中アポトーシスの誘導に関与していると考えられているPERK経路が欠損されたメダカと掛け合わせを行い解析した。その結果、PERKとmeigoのダブルノックアウトの場合、より強いアポトーシスの誘導と重篤な表現型が観察され、PERKが直接アポトーシスの誘導と表現型に関与している可能性は低いと考えられた。本研究で重要である発生段階におけるアポトーシスのライブイメージングに成功し、研究は予定通り進んでいると考えられる。また、持続的小胞体ストレスが誘導されるmeigo遺伝子欠損メダカにおいて小胞体ストレス応答機構の回復経路であるXBP1(S)を過剰発現させた結果、全身のアポトーシスの誘導が減少し、さらに心臓の異常な表現型も回復する結果が得られた。この回復実験結果によりmeigo遺伝子欠損メダカにおいて持続的小胞体ストレスがアポトーシスの誘導と異常な表現型に関与していることが強く示唆された。これらの結果から今年度本研究は順調に進展していると考えられる。1小胞体ストレス応答機構からアポトーシスにつながる他の経路や因子(IRE1, CHOP)の欠損メダカとmeigo遺伝子欠損メダカと掛け合わせアポトーシスと表現型解析を行う。2アポトーシスと小胞体ストレスを同時に可視化できるメダカを作出し観察を行う。3アポトーシスの下流因子であるCaspase3の欠損メダカを作出し、小胞体ストレスに起因するアポトーシスの解析を行う。4meigo遺伝子欠損メダカから培養細胞を樹立し、meigoの欠損による小胞体ストレス誘導の原因をタンパク質レベルで調べる。
候補遺伝子DISC1の機能解析を通じた精神疾患の病態理解

スコットランドの精神疾患多発家系の遺伝学的研究で発見されたdisrupted in schizophrenia 1 (DISC1)は、その後の解析の結果、脳の形成に関わる可能性が示唆され、世界的な注目を集めている。本研究では、脳内皮質構造の発生過程において、どのような組織構築の異常がDISC1の機能欠失によって起こるのかを明らかにすることを試みた。DISC1のsiRNA発現ベクターおよび変異体遺伝子発現ベクターを作成し、子宮内電気穿孔法を用いて発生中の中枢神経系に導入した。その結果、DISC1が発生中の大脳皮質興奮性神経細胞のみならず、海馬皮質の発生にも重要な役割を果たしていることが判明した。さらに、DISC1結合分子である、やはり統合失調症および双極性感情障害に連鎖を示すpericentriolar material-1 protein (PCM1)、さらにBardet-Biedl syndromeの原因遺伝子であるBardet-Biedl syndrome-4 protein (BBS4)が、DISC1とともに発生中の大脳皮質形成に重要な役割を持つことを明らかにした。スコットランドの精神疾患多発家系の遺伝学的研究で発見されたdisrupted in schizophrenia 1 (DISC1)は、その後の解析の結果、コードする蛋白質が大脳皮質構造形成に関わる可能性が示唆され、世界的な注目を集めている。本研究では、脳内皮質構造の中でも大脳以外の皮質構造を中心に、発生のそれぞれの過程において、どのような組織構築の異常がDISC1の機能欠失によって起こるのかを明らかにすることを試みた。siRNA発現ベクターおよびDISC1の変異体遺伝子発現ベクターを作成し、子宮内電気穿孔法を用いてこれらを発生中の中枢神経系に導入した。その結果、脳内皮質構造の発生過程に置いて、DISC1が重要な役割を持っている事が判明した。統合失調症の成因についての仮説として、発達段階での脳の異常が、その後の統合失調症ならびに関連した精神疾患に罹患する危険性を増すとする発達障害仮説があるが、これまではどのような分子異常に基づいて形態・組織構築の異常が起こるのか不明であった。本研究においてDISC1のsiRNA発現ベクターを発生中脳内皮質に導入すると、siRNA発現ベクターの強さに応じた神経細胞移動の遅れを認めた。また、dominant negative効果を持つDISC1変異体の導入によっても、同様の神経細胞移動の遅れを認めた。本研究の結果を考え併せると、DISC1などの発生段階で重要な役割を果たす遺伝子の変異や発現量の異常により微細な構造異常が発生し、それがその後の発症の基盤となる可能性が考えられた。スコットランドの精神疾患多発家系の遺伝学的研究で発見されたdisrupted in schrzophrenia 1 (DISC1)は、その後の解析の結果、コードする蛋白質が大脳皮質構造形成に関わる可能性が示唆され、世界的な注目を集めている。さらに、DISC1結合分子である、やはり統合失調症および双極性感情障害に連鎖を示すpericentriolar material-1 protein (PCMI)、さらにBardet-Biedl syndromeの原因遺伝子であるBardet-Biedl syndrome-4 protein (BBS4)が、DISC1とともに発生中の大脳皮質形成に重要な役割を持つことを明らかにした。また、GABA作動性抑制性神経細胞におけるDISC1の機能解析を行うために,発生期マウス脳の大脳基底核原基特異的なプラスミドベクターの導入を試みた。その結果、DISC1が大脳皮質抑制性神経細胞の発生にも重要な役割を果たしていることが判明した。これらの研究の結果、脳の発生段階における分子的な異常が神経細胞の発生・発達に障害を及ぼし、成熟後の統合失調症発症をもたらす可能性が示唆された。
リゾチーム1-,2-,3-SS体コレクションの作製と構造・機能解析

ニワトリリゾチームの8個のシステイン残基を色々の組み合わせでセリン残基に置換した3-SS体4種(SS結合の欠損に応じて△1、△2、△3、△4と命名)、ならびにアラニン置換体2種(△2Ala、△4Ala)を、人工合成遺伝子の大腸菌内での発現により作製した。封入体中に得られた発現産物は2段階のカラムクロマトグラフィにより精製した。還元および酸化型グルタチオンならびにグリセロール存在下、低温条件にてそれらの再生を行った。各3-SS体の再生の至適温度は円二色性の温度依存から知られる個々の改変蛋白のfolded状態の熱安定性と相関している事、またこれらの再生反応はグリセロール濃度に依存した至適温度を持ち、それはグリセロールによるfolded状態の安定化と相関している事がわかった。3-SS体4種の安定性は、△4△3>△2>△1の順で、SS架橋ループサイズからの予想通りであった。試験的なカロリメトリ測定によれば、天然状態と変性状態の間の比熱の差は4-SS体の場合と同定度であった。測定pH点を増やし、正確な比熱差ならびにエントロピー差を求めるのは今後の課題である。△4は天然リゾチームより溶菌活性が高いが、その活性の温度依存性を調べた所、天然型に比べて低温側での活性が相対的に高くなっている事がわかった。△1、△2、△3の再生効率はほぼ同様の温度プロフィルを示し、グリセロールによる再生促進効果を受けやすい。他方、△2Ala、△4、△4Alaはそれよりも再生効率が二倍以上高く、グリセロールによる促進効果を受けにくい。さらに再生のキネティクスにおいては、SS結合30-115を欠いた△2が最も再生速度が遅く、構造形成におけるこのSS結合の重要性が示唆された。また、2-SS体6種、ならびに1SS体4種の遺伝子も合成し、その発現ならびに産物の精製をおこなった。ニワトリリゾチームの全部で8個のシステイン残基を色々の組み合わせでセリン残基に置換した2SS体6種、ならびに1SS体4種、併せて10種の遺伝子を合成した。発現は我々が以前開発した直接発現ベクターを用いて大腸菌内で行った。その結果2SS体としては、#1+2(SS結合の#1と#2とが存在し得るの意)、#3+4,#1+3,#1+4,#2+3,#2+4、また1SS体については#1,#2,#3,#4を蛋白質分子として得る事ができた。それぞれの収量には約5倍の開きがあった。3SS体のうち、△2と△4についてはシステイン残基をアラニン残基に置換した改変体も作製した。これらのうち3SS体4種について数10mgスケールでの大量精製を行った。発現物はいわゆる封入体中に得られ、2段階のカラムクロマトグラフィにより単一のポリペプチドに精製できた。還元および酸化型グルタチオンならびにグリセロール存在下、低温条件にてそれらの再生を行い、再生物の溶菌活性や逆相HPLC溶出プロフィルによって再生効率を検討した所、これらの再生反応はグリセロール濃度に依存した至適温度を持つ事、そしてその至適温度は円二色性の温度依存から知られる蛋白のネイティヴ立体構造の物理的安定性と一定の関係にある事がわかった。

一方、3SS体のひとつ△4は天然リゾチームより溶菌活性が高いという特性を持っているが、その活性の温度依存性を調べた所、天然型に比べて至適温度が低下するとともに低温側での活性が相対的に高くなっている事がわかった。また、円二色性測定により3SS体4種の熱力学的安定性を比較した所、△4△3>△2>△1の順に高く、SS架橋のループサイズからの予想通りであったが、熱変性転移温度の天然体との差の絶対値はループ・エントロピーの効果のみでは説明できないという結果が得られた。ニワトリリゾチームの全部で8個のシステイン残基を色々の組み合わせでセリンあるいはアラニン残基に置換した3-SS体6種について、2.5mgから10mgスケールでの大量の再生反応のための改良を行った。再生後の濃縮については、MWCO値5,000から10,000の膜をもちいた限外濾過法が有効であった。疎水性担体をもちいたクロマトによる濃縮の有効性についてはまだ結論が得られていない。精製については、大口径の逆相カラムの使用が有効で、一度にmgスケールの再生精製物を得ることが可能となった。ただし、△4ならびに△4Alaについては、他の3-SS体と比べて蛋白の物性の変化があるらしく、C4カラムをもちいての他と同一のクロマト条件では精製物の収量が一桁近く低いという問題が見いだされた。。試験的なカロリメトリ測定の結果は、昨年度の遠紫外部円二色性測定によって推定した各3-SS体の熱力学的安定性の序列と一致するものであった。天然状態と変性状態の間の比熱の差は4-SS体と同定度であり、3SS-体の天然状態はいわゆるmolten globule状態ではない事がさらに確認された。しかし、測定pH点を増やし、より正確な比熱差ならびにエントロピー差を求めるのは今後の課題である。一方、各3-SS体の再生の最適条件を検討したところ、その最適温度は個々のfolded状態の熱安定性と綺麗に相関している事が明らかになった。この事は、種々の改変蛋白質の再生条件の最適化における基本原則となるであろう。また、△1、△2、△3の再生効率はほぼ同様の温度プロフィルを示し、グリセロールによる再生促進効果を受けやすい。他方、△2Ala、△4、△4Alaはそれよりも再生効率が二倍以上高く、グリセロールによる促進効果を受けにくい事が示された。さらに再生のキネティクスにおいては、SS結合30-115を欠いた△2が最も再生速度が遅く、構造形成におけるこのSS結合の重要性が示唆された。
ペルオキシソーム酵素異常疾患の分子生物学的研究

最近新しいタイプのペルオキシソーム異常疾患が認知された.これらの疾患の特徴は極長鎖脂肪酸が体液や各組織に蓄積することである.極長鎖脂肪酸の分解は主としてペルオキシソーム局在性の脂肪酸β-酸化系によっておこなわれる.本研究においては患者検体(剖検肝,培養線維芽細胞など)を用い,ペルオキシソームβ-酸化系の3つの酵素(アシルー(CoAオキシダーゼ, 2頭酵素, 3-ケトアシルーCoAチオラーゼ)についてイムノブロット解析,パルスーチェイス実験をおこなった.ペルオキシソーム構造が欠損しているZellweger症候群や乳幼児型レフサム病ではこれら酵素は生合成されるが,急速に分解するためすべての酵素が欠失することがわかった.また別の疾患で1つの酵素が欠失していることが明らかにされたものがあり,これらはアシルーCoAオキシダーゼ欠損症とか3-ケトアシルーCoAチオラーゼ欠損症と呼ばれることになった.副腎白質ジストロフィーでは3つの酵素とも存在していることがわかった.現在本疾患の病因はペルオキシソームにおける極長鎖脂肪酸のCoA誘導体への活性化に異常であると考えられている.新生児型副腎白質ジストロフィーなどではまたそれぞれ特徴的な酵素欠失のパターンを示すことがわかった.以上の研究は国内外の多数の研究グループとの共同研究でおこなわれた.またこれら疾患の遺伝子解析の準備としてラット酵素のcDNAと遺伝子を単離し,構造決定をした.最近新しいタイプのペルオキシソーム異常疾患が認知された.これらの疾患の特徴は極長鎖脂肪酸が体液や各組織に蓄積することである.極長鎖脂肪酸の分解は主としてペルオキシソーム局在性の脂肪酸β-酸化系によっておこなわれる.本研究においては患者検体(剖検肝,培養線維芽細胞など)を用い,ペルオキシソームβ-酸化系の3つの酵素(アシルー(CoAオキシダーゼ, 2頭酵素, 3-ケトアシルーCoAチオラーゼ)についてイムノブロット解析,パルスーチェイス実験をおこなった.ペルオキシソーム構造が欠損しているZellweger症候群や乳幼児型レフサム病ではこれら酵素は生合成されるが,急速に分解するためすべての酵素が欠失することがわかった.また別の疾患で1つの酵素が欠失していることが明らかにされたものがあり,これらはアシルーCoAオキシダーゼ欠損症とか3-ケトアシルーCoAチオラーゼ欠損症と呼ばれることになった.副腎白質ジストロフィーでは3つの酵素とも存在していることがわかった.現在本疾患の病因はペルオキシソームにおける極長鎖脂肪酸のCoA誘導体への活性化に異常であると考えられている.新生児型副腎白質ジストロフィーなどではまたそれぞれ特徴的な酵素欠失のパターンを示すことがわかった.以上の研究は国内外の多数の研究グループとの共同研究でおこなわれた.またこれら疾患の遺伝子解析の準備としてラット酵素のcDNAと遺伝子を単離し,構造決定をした.Zellweger症候群(ZS)はペルオキシソーム異常疾患のプロトタイプとして注目されている。本症候群はペルオキシソームが欠損し、このオルガネラ局在の脂肪酸酸化系が欠失する重篤な遺伝疾患である。ZSおよび関連疾患について研究し以下の成果を得た。1.脂肪酸酸化系諸酵素の欠損。(1),今回あらたにZSと診断された日本症例3例についてインムノブロット法で検索し、2例について酵素欠損を認めたが、他の1例では酵素欠損が認められなかった。この症例については今後詳細な検討が必要である。(2),日本症例線維茅細胞を用い、パルス-チェース実験をおこない、脂胞酸酸化系諸酵素の酵素発現を認めた。(3),米国で発見された偽ZSと名付けられた症例についてインムノブロット法で検索したところ3-ケトアシル-CoAチオラーゼが特異的に欠失していることがわかった。2.ペルオキシソーム膜タンパク質の解析。(1),日本症例剖検肝で膜タンパク質の欠失を確認した。(2),今後の研究方針を確立するため、ラット肝臓ポリソームを用いて翻訳実験をおこなった。これら膜タンパク質は遊離ポリソームで生合成され、プロテオリティックプロセシングをうけることなく膜に局在化されることを示唆する結果を得た。(3),膜タンパク質に対するcDNAをクローニング中である。
琉球列島海域におけるサンゴ礁の保全・回復技術に関する生理学的研究

世界各地のサンゴ礁生態系がサンゴの白化現象により衰退の危機に瀕している。琉球列島海域のさんご礁も例外ではない。本研究はサンゴの白化抑制に関する基礎研究をおこない、回復・保全技術の指針を得ることを目的としている。本年(平成16年度)は前年度の研究によって得られた海流(または潮流)によるサンゴ白化の緩和効果という知見をもとに多種の造礁サンゴを対象とした生理学的研究をおこなった。この研究では、人為的に水流環境をコントロールした屋内・屋外水槽実験系を利用し、そのサンゴ白化の生理的メカニズムである光合成阻害過程についてPAMクロロフィル蛍光測定装置を用いて調べた。その結果、白化耐性が一般的に低いと言われているサンゴ種では、適度な潮流を与えた場合では流れを制限された環境に比べて光阻害の緩和がみられる事が分った。加えて、対象となるサンゴ種によってはその効果がまったく見られないものがあることが明らかにされた。また、水流による長期の白化抑制効果により、サンゴの成長量・生存性が飛躍的に高まる事を明らかにした。これらの結果を総合する事でサンゴ礁域における人為的な海流・潮流の変更(埋め立て・港湾開発)が近接する造礁サンゴの群集に多大なストレスを与えうることを示唆した。本研究はサンゴ白化抑制に関する基礎研究をおこない、回復・保全技術の指針を得ることを目的としている。研究の初年度である本年(平成15年度)は、サンゴを長期(年単位)にわたって人工飼育する試みと同時に屋内・屋外両方でのサンゴ実験系の確立をおこなった。また、サンゴの光合成機能が強光によるストレスでどのような傷害を受けるのかについて実験をおこなった。その結果、サンゴの白化と強光によっておこる光合成のストレス反応との相関性が高いことが判明し、強光のみによってサンゴを人為的に白化させる手法を得ることができた。また、サンゴ白化が野外で観察される高水温条件においてサンゴの光合成ストレス反応を解析した研究では、高水温(30°C以上)によって光合成機能修復に不可欠なたんぱく質合成系に顕著な阻害が起こることが明らかとなった。これらの知見をもとにサンゴ白化を緩和する方策として海流(または潮流)の効果に着目した研究をおこなった。この研究では、人為的に白化させたサンゴを用いて延べ9週間にわたる屋外水槽実験をおこない、その回復過程を調べた。サンゴに適度な潮流を与えた場合では潮流を受けないものに比べて速やかに白化状態からの回復がおこなわれ、生存性が高まる事が明らかになった。さらに、潮流によって環境ストレスによる光合成機能低下が緩和され、白化が抑制されることも明らかになった。平成16年度の研究ではサンゴの生理的ストレスに潮流がどのように関与するかを詳細に調べる予定である。
療養者にとって快適な介護方法とその力学的解析手法の開発

療養者にとって快適な介護方法を探るために、寝返りの援助における介護者の手のふれ方と動作の関連を力学的に解析した。従来は、心地よさや快適さは主観的感覚によって評価されていたが、本研究では、介護者の手指圧力と3次元動作解析によりデータを数値化し、客観的な評価方法を得ることができた。快適な手のふれ方には、介護者自身の身体の動かし方が関連しており、力学的視点で示唆を得ることができた。研究実施計画に基づき、2010年6月8月に実験を行った。対象は、女子看護大学生11名(1820歳)および、女性看護教員3名(3565歳)。方法は、仰臥位から右側臥位への体位変換時の看護者の手指および手掌にかかる圧力を測定した。測定用具は、圧力測定フィルム;プレスケール(富士フィルム)極超低圧用LLLWを用いた。フィルムは圧力が加わると赤く発色するしくみで、これを看護者役の右手に貼付した。採取した発色フィルムは専用のスキャナで読み取り、圧力画像解析システム(FPD-9270)で圧力値を得た。動作分析にはDARTFISH(VIDEO SOFTWARE SOLUTIONS)を用い、手指、手掌への圧力分布の違いによる重心の高さや体幹・肘の屈曲角度への影響、患者役の主観的反応を分析した。圧力分布から看護学生と看護教員の手のふれ方の特徴について検討した。倫理的配慮として、久留米大学倫理委員会で承認を得て行った。結果、看護技術教育に携わっている教員は、体位変換を手掌外側に力を加えて行っていたのに対し、初学者の看護学生は、指先に力を入れて行う傾向を認めた。手の圧力と看護者の動作の関係については、今回の2次元的な解析を元に、3次元的解析へと進める必要がある。そして、患者役の主観的反応も観察し、対象者数を増やして検討したい。本研究成果については、第22回バイオメカニズム・シンポジウム(2011.7開催)、ならびに第37回日本看護研究学会学術集会(2011.8開催)にて発表予定である。研究実施計画に基づき、平成23年4月末5月に実験を行った。対象は、女子看護大学生13名(1820歳)および、女性看護教員6名(3565歳)。採取した発色フィルムは圧力画像解析システム(FPD-9270)で圧力値を得た。動作分析には3次元動作解析(光学式動作分析装置VICONカメラ、解析ソフト:workstation)装置を用い、看護者の全身35か所に赤外線反射マーカーを貼りつけ、体位変換時の看護者の体幹および、肘、膝等の各関節の屈曲角度、重心の高さ、基底面積等について測定した。分析は、看護者の手指、手掌への圧力分布と体幹屈曲角度、肘屈曲角度、膝屈曲角度との関連を中心に、プレスケールのデータと3次元データを現在、解析中である。本研究は、久留米大学倫理委員会で承認を得て進行中である。昨年実施した2次元動作解析結果を踏まえ、3次元動作解析に発展することができた。3次元動作解析は、介護分野では物理的にも技術的にも難易であったが、既存の装置の活用ならびに、交付金による解析サポートプログラムによって進めることができた。解析結果によっては、今後の快適な介護動作に示唆を与えるものと思われる。療養者にとって快適な介護方法を探るために、日常生活で頻繁に行われる援助である体位変換(寝返り)の援助に着目し、介護者の手のふれ方と動作の関連を解析した。対象である看護学生13名と看護教員7名の実験結果を解析した。手のふれ方は、圧力測定システムを、身体の動かし方は、3次元動作解析システムを用いた。被介護者役からは、体位変換の援助に対する安定感、快適感、安心感に関する主観的評価を得て、集計した。対象者はいずれも環指(薬指)、小指および手掌(てのひら)で被介護者の身体にふれ、体位変換していた。指のうち、圧力分布が高かったのは、指の付け根付近であった。手の広い面積を患者にあて体位変換していた。しかし、対象者の中には、指先が食い込むような指の先端付近に圧力が分布している者もいた。このような介護者の身体の動かし方には、肘、腰、膝の屈曲角度および足幅が関連しており、看護者の足幅が狭い方が指先部分の圧力が高く、安心や快適の度合いが低くなっていた。看護者が環指・小指に圧をかけて患者を包み込むようにふれたとき、看護者は腰部を屈曲させず、肘と膝を同時に屈曲させ、いわゆる重心を下げる動作で体位変換していた。

これは、医療現場で推奨されているボディメカニクスの活用と一致していた。以上より、手指圧力の数値化と3次元動作解析により、看護ケアや介護場面における快適な手のふれ方について、力学的視点で示唆を得ることができ、療養者にとって快適な介護方法を探る一助となった。達成目標は、実験データの分析ならびに論文作成であったが、分析作業が遅れている。複雑な3次元データの解析については、解析サポートプログラムを活用し分析を再開することができた。このように、当初計画よりやや遅れていると評価できる。24年度が最終年度であるため、記入しない。3次元動作解析サポートプログラムで得た解析方法をもとに、膨大なデータの解析を進める。本研究の目的である介護動作である体位変換時の介護者の手の接触圧と動作の関係を明らかにする。その結果を受け、介護を受ける療養者側の身体の動きおよび主観的反応について更なる調査を進める。
プロセッサ階層に関する研究

本研究では,プロセッサ-メモリ間転送路に焦点を絞って,それがプロセッサとメモリとの機能分担によって受ける影響を見直し,プロセッサ-転送路-メモリのアーキテクチャ上の関係を改良した.まず,処理機能を1点集中させているプロセッサ機能を「メモリや転送路の利用」という観点から実験的に解析した.このとき,プロセッサ機能を性能(動作速度)だけで評価するのではなく,メモリや転送路からの情報(命令やデータ)供給量(「アクセススループット」といってもよい)も定量的に評価して考察した.これは,プロセッサ機能を「動作速度」と「メモリや転送路とのアクセススループット」の両者によって評価することである.この2つの指標がトレードオフ関係になることを考えると,プロセッサも超高機能なものを唯一コンピュータシステム中に置くのではなく,処理機能をこの2つの指標で評価し,適切な性能(動作速度とアクセススループット)のプロセッサ機能に分割設定して,それを別々のプロセッサに分担させるのが望ましいことが分かった.このように,動作速度と対メモリのアクセススループットの性能が異なる数種のプロセッサ(及びその機能レベル)を本研究では「プロセッサ階層」と呼んでいる.本研究では,プロセッサ階層の具体的なアーキテクチャを提案した.具体的には,i)プロセッサ階層を評価(定義)する指標である動作速度と対メモリのアクセススループットによってプロセッサ機能を3種類程度に分割する;ii)それぞれのプロセッサアーキテクチャについて,それと整合するメモリアーキテクチャ(メモリ階層)を含めて,設計する;iii)設計したプロセッサ階層とメモリ階層との整合性について定量的に評価する;を行った.本研究では,プロセッサ-メモリ間転送路に焦点を絞って,それがプロセッサとメモリとの機能分担によって受ける影響を見直し,プロセッサ-転送路-メモリのアーキテクチャ上の関係を改良した.まず,処理機能を1点集中させているプロセッサ機能を「メモリや転送路の利用」という観点から実験的に解析した.このとき,プロセッサ機能を性能(動作速度)だけで評価するのではなく,メモリや転送路からの情報(命令やデータ)供給量(「アクセススループット」といってもよい)も定量的に評価して考察した.これは,プロセッサ機能を「動作速度」と「メモリや転送路とのアクセススループット」の両者によって評価することである.この2つの指標がトレードオフ関係になることを考えると,プロセッサも超高機能なものを唯一コンピュータシステム中に置くのではなく,処理機能をこの2つの指標で評価し,適切な性能(動作速度とアクセススループット)のプロセッサ機能に分割設定して,それを別々のプロセッサに分担させるのが望ましいことが分かった.このように,動作速度と対メモリのアクセススループットの性能が異なる数種のプロセッサ(及びその機能レベル)を本研究では「プロセッサ階層」と呼んでいる.本研究では,プロセッサ階層の具体的なアーキテクチャを提案した.具体的には,i)プロセッサ階層を評価(定義)する指標である動作速度と対メモリのアクセススループットによってプロセッサ機能を3種類程度に分割する;ii)それぞれのプロセッサアーキテクチャについて,それと整合するメモリアーキテクチャ(メモリ階層)を含めて,設計する;iii)設計したプロセッサ階層とメモリ階層との整合性について定量的に評価する;を行った.1,対メモリ関係によるプロセッサ機能の実証的解析と分割コンピュータにおけるプロセッサ機能をメモリアクセスやプロセッサ(コンピュータ)間通信の観点から定性的かつ定量的に評価した.現在までの研究によって得られた知見によると,プロセッサ機能は,(1)純粋な演算やデータ処理機能;(2)OS機能;(3)ネットワークを介するメッセージ通信機能;の3種類に大別でき,それらはそれぞれ対メモリ関係すなわちプロセッサによるアクセス機能の性質がかなり異なることが分かった.これについて具体的に種々の応用プログラムによって定量的アクセススループットを計測し実証している.2,プロセッサ階層とそのアーキテクチャの設計1,での成果をもとに,3種類のプロセッサ機能の個々について,その具体的なハードウェア/ソフトウェア・トレードオフについて考察している.具体的には,機能分割することによって特化できる処理機能だけをハードウェア機構として装備するプロセッサ階層アーキテクチャを設計している.また,分割したプロセッサ階層ごとに独立して設計するのではなく,それらプロセッサ階層間の「メッセージ」の流れについても十分に配慮している.(1)プロセッサ階層に適合するメモリアーキテクチャの設計昨年度に設計した3種類のプロセッサ階層に適合するメモリ階層を選定し,それぞれのメモリ機能を設計した.その際,当該プロセッサ階層に適合するメモリ階層との整合性に注意し,そのプロセッサ階層が分担する機能に特化したプロセッサ-メモリアーキテクチャとした.具体的には,レジスタやキャッシュメモリの(撤廃を含む)見直し,メモリ(アドレス)空間の統合か分割かの決定など,プロセッサ階層に整合するメモリアーキテクチャを設計する必要があるとの知見を得た.(2)プロセッサ階層とメモリ階層との整合性に関する評価(1)で設計したメモリアーキテクチャについてシミュレーション及びエミュレーションによって評価した.すなわち,3種類のプロセッサ-メモリ対に対して,そのプロセッサ階層とメモリ階層との整合性,すなわち,ボトルネックがないかどうか,を定量的に評価した.そして,(1)の研究過程にフィードバックし,プロセッサ階層アーキテクチャの再設計を行っている.本研究では,プロセッサ-メモリ間転送路に焦点を絞って,それがプロセッサとメモリとの機能分担によって受ける影響を見直し,プロセッサ-転送路-メモリのアーキテクチャ上の関係を改良した.まず,処理機能を1点集中させているプロセッサ機能を「メモリや転送路の利用」という観点から実験的に解析した.このとき,プロセッサ機能を性能(動作速度)だけで評価するのではなく,メモリや転送路からの情報(命令やデータ)供給量(「アクセススループット」といってもよい)も定量的に評価して考察した.これは,プロセッサ機能を「動作速度」と「メモリや転送路とのアクセススループット」の両者によって評価することである.

この2つの指標がトレードオフ関係になることを考えると,プロセッサも超高機能なものを唯一コンピュータシステム中に置くのではなく,処理機能をこの2つの指標で評価し,適切な性能(動作速度とアクセススループット)のプロセッサ機能に分割設定して,それを別々のプロセッサに分担させるのが望ましいことが分かった.このように,動作速度と対メモリのアクセススループットの性能が異なる数種のプロセッサ(及びその機能レベル)を本研究では「プロセッサ階層」と呼んでいる.本研究では,プロセッサ階層の具体的なアーキテクチャを提案した.具体的には,i)プロセッサ階層を評価(定義)する指標である動作速度と対メモリのアクセススループットによってプロセッサ機能を3種類程度に分割する;ii)それぞれのプロセッサアーキテクチャについて,それと整合するメモリアーキテクチャ(メモリ階層)を含めて,設計する;iii)設計したプロセッサ階層とメモリ階層との整合性について定量的に評価する;を行った.
視覚バリアフリーのためのWebセーフカラー視覚分光輝度データベースの構築

Webセーフカラー216色の輝度、色度、及び分光放射輝度を精密に測定し、データベース化した。このデータベースによって、Webセーフカラーの輝度コントラスト比を多角的に計算することが可能になった。また、年代別分光視感効率に基づきWCAG2. 0を評価した結果、WCAG2. 0達成基準は加齢による感度低下を考慮した場合でも、適切な輝度コントラスト比を確保しているが、青近傍の領域の色を使用する場合は輝度コントラストの減少に注意が必要であることが明らかとなった。本研究は、Webセーフカラー216色の輝度、色度、及び分光輝度を精密に測定することによって、高齢者に配慮した色覚コントラストに関する規格を詳細に検証するとともに、Web画面の作成者に対して、候補色やコントラスト適合性をリアルタイムに判定できるシステムを提供することを目的としている。今年度は研究の初年度として分光放射輝度計を導入し、実験用ソフトウェア作成と併行して液晶ディスプレイ装置の較正を行い、呈示光に対する分光放射輝度の測定を実施した。実験成果の概要は以下の通りである。(1)暗室、および昼光色蛍光灯を点灯した状態で、sRGB規格に準拠したWebセーフカラー216色の分光放射輝度を測定し、データを収集することができた。現状では、データはCSV形式のファイルとしてPCに蓄積されているが、オンラインRDBによるデータベース化によって、データの検索・利用を容易にするシステムを構築する予定である。(2)(1)で得られたデータに基づき、WCAG2.0の有効性について検討した。その結果、JIS S 0031年代別分光視感効率が加齢に伴い短波長側で減少しているため、447nmにピークがある青色光に対する感度が低下し、年代別相対輝度の大幅な減少が見られた。従って、若年者であればWCAG2.0クラスAAAを満たすコントラスト比の2色が高齢者には適合しなくなるケースが、特にHSV色相240°を中心とする青系統の領域で多く見受けられた。今年度は前年度の測定によって得られた分光放射輝度データに基づき、WCAG2.0輝度コントラスト比達成基準に関する詳細な検証を実施するとともに、輝度コントラスト比適合性を判定するシステムについて検討した。成果の概要は以下の通りである。(1)測定値および年代別分光視感効率より年代別輝度を計算した結果、WCAG2.0理論値との輝度比は、加齢により緑・青系統のHSV色相領域では減少し、特に50歳代以降において青(HSV色相240°)近傍における低下が顕著であった。また黒に対する年代別輝度コントラスト比を求めた結果、輝度コントラスト比増減率の分布は加齢により分散傾向を示し、70歳代では140色中47色が10%以上の減少率となった。WCAG2.0は加齢による感度低下を考慮した場合でも、適合条件が変化する色が少ないことから、概ね適切な輝度コントラスト比を確保していると考えられるが、青近傍の領域の色を使用する場合は輝度コントラストの減少に注意が必要であることが明らかとなった。(2)輝度コントラスト比適合性を判定するシステムに関しては、当初PHPおよびデータベースによるWebアプリケーションの開発を予定していたが、判定結果および候補色の動的な表示には、ActionScript3.0によるFlash形式での開発がより適切であることが分かった。来年度の高齢被験者を対象とした応答実験の結果を踏まえ、システムを完成させる予定である。本研究は、Webセーフカラー216色の輝度、色度、及び分光放射輝度を精密に測定することによって、高齢者に配慮した色覚コントラストに関する規格を詳細に検証するとともに、Web画面の作成者に対して、コントラスト適合性をリアルタイムに判定できるシステムを提供することを目的としている。今年度は、前年度までの研究成果として得られた、分光放射輝度と年代別視感効率によるWCAG2.0輝度コントラスト比達成基準の評価結果を検証するため、若年被験者と高齢者分光透過率再現メガネを用いた応答実験を実施した。また、分光放射輝度データベースに基づく輝度コントラスト比適合性を判定するシステムを開発した。(1)カラーマッチング法による応答実験の結果、高齢者視環境下においては特にHSV色相216°264°、HSV彩度204以上の青系統の色度領域における大幅な感度低下が見られた。この実験結果は、WCAG輝度コントラスト比達成基準に関する評価によって得られた結果と一致した。結論として、WCAG2.0達成基準1.4.3,1.4.6は加齢による感度低下を考慮したとしても、適切な規格であると考えられる。ただし黒を背景としてHSV色相240°近傍の色度領域を使用する場合、年代別輝度コントラスト比の絶対値が低く、かつ加齢による減少率が大きいため注意が必要である。

また、70歳代以降の高齢者に対して情報提示を行う場合は黒背景に対してHSV輝度024以上の前景色の使用が適切であることが明らかとなった。(2)分光放射輝度データベースによって、Webセーフカラーの輝度コントラスト比を、sRGBによる理論値、分光放射輝度計による年代別コントラスト、およびL^*明度指数の比として多角的に計算することが可能になった。
果実がコルクで覆われるリンゴ「ふじ」変異体を用いたサビ形成を制御する遺伝子の解明

リンゴにおいて果面のサビは,光沢や色彩のある果面の外観品質を損なうことから,劣悪形質とされており,その制御が課題となっている.しかし現在までにサビ形成を制御する原因遺伝子は明らかになっていない.そこで本研究ではリンゴ`ふじ'の枝変わりにより果皮が銹褐色となった品種`ゴールドファーム'を材料として,リンゴの公開ゲノム情報を利用して果実のトランスクリプトーム解析を行い,サビの原因遺伝子の推定を目指している.本年度は,茨城大学農学部国際フィールド農学センター内の果樹園に植栽されているリンゴ`ふじ'果実および`ゴールドファーム'の葉からゲノムDNAを抽出し,ニホンナシ由来のSSRマーカー13種類を用いて,原品種と枝変わり品種の関係とされている両品種の同一性を確認した.その結果,6箇所のSSR遺伝子座が増幅され,その全ての遺伝子型が`ふじ'と`ゴールドファーム'で同一であった.この結果からこれまで報告されている両品種の関係性が再確認できた.さらに両品種の果実を適期に採取し,RNA-seq解析に用いるためのRNAの抽出を試みた.果実の採取時期としては,原品種である`ふじ'と比較して果皮の構造に違いが生じる開花40日後およびその前後1週間程度とした.採取した果実試料について,表皮組織からRNA抽出を試みたがRNA-seq解析に必要なRNAの品質と収量を得ることができなかった.原因としては採取した試料が微少であることがあげられる.来年度以降は,プロトコルを改良することで抽出を完了し,早急にRNA-seq解析へ移行したい.RNA-seq解析に必要なRNAの品質と収量を得ることができなかったため,本年度内に解析を行うことができなかった.次年度は,プロトコルを改良することで抽出を完了し,早急にRNA-seq解析に移行する予定である.当初の計画通り,枝変わり品種および原品種の果皮組織からの果面サビ発生開始前後の全RNAを抽出し,トランスクリプトーム解析を実施する.さらに,その結果に基づいてサビ形成の原因候補遺伝子の第一次選抜を実施する.リンゴにおいて果面のサビは,光沢や色彩のある果面の外観品質を損なうことから,劣悪形質とされており,その制御が課題となっている.しかし現在までにサビ形成を制御する原因遺伝子は明らかになっていない.そこで本研究ではリンゴ`ふじ'の枝変わりにより果皮が銹褐色となった品種`ゴールドファーム'を材料として,リンゴの公開ゲノム情報を利用して果実のトランスクリプトーム解析を行い,サビの原因遺伝子の推定を目指している.本年度は,茨城大学農学部国際フィールド農学センター内の果樹園に植栽されているリンゴ`ふじ'果実および`ゴールドファーム'の葉からゲノムDNAを抽出し,ニホンナシ由来のSSRマーカー13種類を用いて,原品種と枝変わり品種の関係とされている両品種の同一性を確認した.その結果,6箇所のSSR遺伝子座が増幅され,その全ての遺伝子型が`ふじ'と`ゴールドファーム'で同一であった.この結果からこれまで報告されている両品種の関係性が再確認できた.さらに両品種の果実を適期に採取し,RNA-seq解析に用いるためのRNAの抽出を試みた.果実の採取時期としては,原品種である`ふじ'と比較して果皮の構造に違いが生じる開花40日後およびその前後1週間程度とした.採取した果実試料について,表皮組織からRNA抽出を試みたがRNA-seq解析に必要なRNAの品質と収量を得ることができなかった.原因としては採取した試料が微少であることがあげられる.来年度以降は,プロトコルを改良することで抽出を完了し,早急にRNA-seq解析へ移行したい.RNA-seq解析に必要なRNAの品質と収量を得ることができなかったため,本年度内に解析を行うことができなかった.次年度は,プロトコルを改良することで抽出を完了し,早急にRNA-seq解析に移行する予定である.当初の計画通り,枝変わり品種および原品種の果皮組織からの果面サビ発生開始前後の全RNAを抽出し,トランスクリプトーム解析を実施する.さらに,その結果に基づいてサビ形成の原因候補遺伝子の第一次選抜を実施する.本年度は,RNA-seq解析に必要なRNAの品質と収量が得られなかったため計画していた解析を行うことができなかった.このため次年度使用額が発生した.本年度予定していた研究内容は次年度に問題を解決次第,実施する予定である.
長鎖ncRNA MALAT1を標的とした慢性腎臓病治療戦略開発に向けた研究

慢性腎臓病の病態発症機構の解明を目指し,長鎖ncRNA MALAT1の腎臓における役割について検討した.MALAT1は,腎疾患病態モデル動物で発現上昇したが,P2X7R欠損マウスでは抑制された.この時,腎傷害の抑制も認められた.培養ポドサイトを用いた検討から,P2X7RのリガンドであるLL-37はMALAT1の発現を上昇させ,また細胞死も誘導した.腎臓において,MALAT1はLL-37/P2X7Rの下流シグナルとして,細胞死に関連する可能性が示唆された.CKDモデルの一つとして,マウス一側尿管結紮(UUO)モデルを用いた.本モデルでは重度の腎線維化が惹起される.UUOモデルを作製し,MALAT1の発現変動を経時的に検討した.その結果,傷害惹起後,経時的にMALAT1が発現上昇することが明らかとなった.この発現変動パターンは筋線維芽細胞マーカーであるα-SMAの発現変動と同様であった.そこで,本モデルにおいて発現上昇するMALAT1の機能を解析する上で,腎線維芽細胞に着目した.マウスの腎臓より線維芽細胞を単離,培養し,二度の継代後,実験に用いた.PCR法を用いた予備的な検討から,腎線維芽細胞にMALAT1が発現していることを見出した.今後は,腎線維芽細胞におけるMALAT1の発現誘導機構の解明及びその機能解析を行う予定である.他方,加齢はCKDのリスクファクターの一つである.そこで若齢マウスと老齢マウスの腎臓におけるMALAT1の発現を比較したところ,老齢マウスにおいてMALAT1の発現が上昇していることを見出した.上記UUOモデルとは異なり,加齢のみでは重度の線維化は形成されないことから,線維芽細胞以外の細胞における機能も検討する予定である.腎線維化の進展にMALAT1が関与する可能性を示してきた.UUOモデルにおいて上昇するMALAT1がどの細胞に由来するかをin situ hybridization法により確認する予定であったが,評価系が未確立である.しかしながら,MALAT1がUUO傷害に寄与する腎線維芽細胞に発現している可能性を示すことができ,おおむね計画通り遂行している.加えて,加齢による腎臓の質的変化においてもMALAT1が関与する可能性を示すことができている.慢性腎臓病(CKD)の病態発症メカニズムや治療法の開発を目指し,長鎖ncRNAであるMALAT1に着目し,検討を行っている.本年度の検討により,マウス一側尿管結紮(UUO)モデル腎においてMALAT1が経時的に発現上昇することを見出した.また,本モデルでは重度の線維化及び炎症が惹起されるが,MALAT1の発現上昇パターンは筋線維芽細胞マーカーであるα-SMAや炎症マーカーであるTNF-αと同様であることを明らかとした.MALAT1と線維化,炎症の観点から検討を進めた.腎臓から単離した線維芽細胞を解析した結果,MALAT1が線維芽細胞に発現することを見出した.そこで,線維芽細胞におけるMALAT1の発現誘導機構を探索した.予備的検討ではあるが,TGF-βを用いて線維芽細胞を活性化させたところ,MALAT1が発現上昇することを見出しつつある.一方,炎症に着目したLPSの処置,糖尿病性腎症を模倣した高血糖刺激を試みたが,明確なMALAT1の発現変動は認められなかった.他方,リガンド開口型イオンチャネルであるP2X7受容体のノックアウトマウス(KO)では,UUOによる腎障害が抑制されることが報告されている.そこで,UUO手術を施したP2X7RKOの検討を端緒に,MALAT1と腎傷害との関連を評価した.その結果,P2X7KOではUUOによるMALAT1の発現上昇が抑制されることを見出した.またこの時,P2X7KOマウスとWTマウスとの間で線維化マーカーであるTGF-βの発現に違いがないこと,TNF-αはP2X7KOマウスで有意に抑制されることを明らかにした.以上の結果より,MALAT1は線維化より炎症に関与する可能性が考えられる.現在,培養血管内皮細胞を用いて,P2X7シグナル-MALAT1-炎症の観点から検討を進めている.腎線維化モデルを用いて,MALAT1の機能に関する検討を進めている.当初,腎組織サンプルを用いたin situ hybridization法を用いて,MALAT1が発現上昇する細胞の同定を試みる予定であったが,明確に同定することができていない.しかしながら,培養線維芽細胞での発現誘導機構に関する検討や遺伝子改変マウスを用いた検討から,MALAT1の炎症との関連性及び分子ネットワークにおけるMALAT1の位置づけを見出しつつあり,おおむね計画通りに遂行している.慢性腎臓病(CKD)の病態発症メカニズムや治療法の開発を目指し,長鎖ncRNAであるMALAT1に着目し,検討を行ってきた。これまでの検討から,マウス一側尿管結紮(UUO)モデルや加齢モデルの腎臓において,MALAT1の発現が上昇することを見出した.次に,MALAT1の発現上昇メカニズムやUUOモデルの病態形成におけるMALAT1の関与を評価するため,イオンチャネル型ATP感受性プリン受容体P2X7Rに着目した.P2X7R KOマウスにUUO手術を施し解析した結果,P2X7R KOマウスでは有意なMALAT1の発現低下が認められた.MALAT1の発現局在をin situ hybridizationにより評価したが,MALAT1はユビキタスに発現していた.

そのため,腎疾患(UUO)時の腎病態形成に関与するMALAT1発現細胞を同定することはできなかった.そこで,MALAT1の発現細胞として,腎線維芽細胞とポドサイトに着目し検討を行った.培養線維芽細胞においては,P2X7RのリガンドであるLL-37によりMALAT1の発現は上昇しなかったが,培養ポドサイトではLL-37添加後1時間において,有意なMALAT1発現の上昇が認められた.また,培養ポドサイトではLL-37添加6時間後において顕著な細胞死が観察され,細胞死関連因子の発現上昇も認められた.よって,MALAT1は,ポドサイトにおいてLL-37/P2X7Rの下流シグナルとして,細胞死に関連する可能性が示唆された.今後は,MALAT1のsiRNAやshRNA発現レンチウイルスを用いた発現抑制系を構築し,その機能を解析する予定である.慢性腎臓病の病態発症機構の解明を目指し,長鎖ncRNA MALAT1の腎臓における役割について検討した.MALAT1は,腎疾患病態モデル動物で発現上昇したが,P2X7R欠損マウスでは抑制された.この時,腎傷害の抑制も認められた.培養ポドサイトを用いた検討から,P2X7RのリガンドであるLL-37はMALAT1の発現を上昇させ,また細胞死も誘導した.腎臓において,MALAT1はLL-37/P2X7Rの下流シグナルとして,細胞死に関連する可能性が示唆された.今後は,腎線維芽細胞におけるMALAT1の発現誘導機構を解明する.その後,MALAT1のノックダウン評価系を立ち上げ,MALAT1の機能解析を行う予定である.今後,培養細胞を用いて,P2X7シグナルや炎症とMALAT1との関連性を中心に検討を進める.すなわち,P2X7活性化ペプチドであるLL-37の処置により,MALAT1の発現が上昇するかどうか及び炎症が誘導されるかどうかを検討する.これらが認められれば,MALAT1のsiRNAを用いたノックダウン系を構築し,その機能を評価する.腎循環病態学
有機金属化合物の選択的酸化による新規合成手法の開発

遷移金属錯体の一電子レドックスプロセスを用い、有機金属化合物を一電子酸化または一電子還元すれば、有機金属上の電子状態を変化に基づく新規な反応挙動が予想され、従来にない新規合成反応が可能になる。金属交換が起こる場合には、導入した金属の特性に基づいた反応性が可能となり、有機金属化合物を中間体とする合成手法が拡大される。本研究では、有機金属化合物に対してレドックス相互作用できる金属として、一電子酸化能力を有するオキソバナジウム化合物に焦点をあて、有機金属化合物の酸化的変換反応に関する研究を展開し、従来にない選択的炭素-炭素結合形成手法を開発した。1)アルケニルアルミニウム化合物をアルキニルリチウムでアート化することで得られた有機アルミニウム化合物をオキソバナジウム酸化剤で酸化したところ、酸化的カップリング反応が効率的に進行し、エンインが収率よく得られた。本手法は一般性のある骨格形成法であることが判明した。2)アルケニルアルミニウム化合物の代わりにアリールアルミニウム化合物を用いても、対応するアート錯体の酸化的カップリング反応が同様に進行することが明らかになった。3)アリールアルミニウム化合物をアート錯体に変換せず、オキソバナジウム化合物で基化したところ。アルキル酸が導入された。オキソバナジウム化合物の立体的崇高さやレドックスポテンシャルの違いが、結合形成に大きく反映することが判明した。有機金属化合物を単離することなく、one potで酸化的カップリング反応を行うことができ、有用な合成手法として位置づけられた。オキソバナジウム化合物により有機金属化合物の電子状態が変化することで、このような酸化反応挙動が可能になったと推測される。形式的には、有機典型金属化合物において還元的脱離が誘起されたと考えられる。遷移金属錯体の一電子レドックスプロセスを用い、有機金属化合物を一電子酸化または一電子還元すれば、金属上の電子状態を変えることにより新規な反応挙動が予想され、従来にない新規合成反応が可能になる。本研究では、有機金属化合物に対してレドックス相互作用できる金属として、一電子酸化能力を有するオキソバナジウム化合物に焦点をあて、有機金属化合物の酸化的変換反応に関する研究を展開し、以下のような結論を得た。1)ヒドロジルコニウム化により合成した有機ジルコニウム化合物をオキソバナジウム酸化剤で酸化したところ、酸化的カップリング反応が効率的に進行することが明らかになった。2)ヒドロアルミニウム化で得られる有機アルミニウム化合物に対しても、オキソバナジウム化合物による酸化反応を検討したところ、同様な酸化的カップリング反応が起こることが判明した。さらに、有機アルミニウム化合物をアート錯体に変換することで、より高い反応性が見られた。3)オキソバナジウム化合物により有機金属化合物の電子状態を変えることで、このような酸化反応挙動が可能になったと推測される。4)有機金属化合物を単離することなく、one potで酸化的カップリング反応を行うことができ、有用な合成手法として位置づけられた。遷移金属錯体の一電子レドックスプロセスを用い、有機金属化合物を一電子酸化または一電子還元すれば、金属上の電子状態の変化に基づいた反応挙動が予想され、従来にない新規合成反応が可能になる。本年度は、前年度までの結果をふまえ、一電子酸化能力を有するオキソバナジウム(V)化合物による有機アルミニウム化合物の酸化に焦点をあて、選択的炭素-炭素結合形成手法を開発した。

1)アルケニルアルミニウム化合物をアルキニルリチウムでアート化することで得られた有機アルミニウム化合物をオキソバナジウム酸化剤で酸化したところ、酸化的カップリング反応が効率的に進行し、エンインが収率よく得られた。本手法は一般性のある骨格形成法であることが判明した。2)アルケニルアルミニウム化合物の代わりにアリールアルミニウム化合物を用いたところ、対応するアート錯体の酸化的カップリング反応も同様に進行することが観測された。3)アリールアルミニウム化合物をアート錯体に変換せず、オキソバナジウム化合物で酸化したところ。アルキル基が導入されることが明らかになった。オキソバナジウム化合物の立体的嵩高さやレドックスポテンシャルの違いが、結合形成に大きく反映することが判明した。反応機構の詳細は必ずしも解明されたわけではないが、上記の反応はいずれもレドックスで制御されている。形式的に有機典型金属化合物における還元的脱離が誘起されたと考えられる。有機合成化学的にも非常に有用な手法である。
癌転移の骨破壊に対するIL-18の抑制作用の検討および臨床応用

癌の骨転移に対するIL-18の抑制効果について、以下の成果を報告する。1.IL-18受容体の骨芽細胞、破骨細胞での発現と、IL-18が破骨細胞の活性に及ぼす影響:マウス骨芽細胞、破骨細胞共にIL-18受容体の発現を免疫組織学的手法で、mRNAの発現をRT-PCR法で証明した。IL-18が破骨細胞の骨融解活性を抑制することを、マウスの破骨細胞とIL-18を象牙薄切片上での培養から証明した。2.悪性腫瘍の骨転モデルの作成と、IL-18の影響:乳癌、肺癌、多発性骨髄腫の細胞株をマウス左心室に注射し骨転移を作成した。このモデルを用いて、IL-18が骨転移を抑制することをin vivoで証明した。3.IL-18による破骨細胞活性を抑制する機序:IL-18はIL-12と協調して破骨細胞活性を抑制した。その機序に関しては、IFN-γと未同定の因子の協調が関与する事を証明した。さらに、変形性関節症(OA)や慢性関節リウマチ(RA)による骨破壊や軟骨変性に対して、IL-18の作用を検討した。1.OAの病態におけるIL-18の役割:OAの病態でPGE2は関節軟骨の変性や骨棘形成を引き起こす。OA関節液中に存在するPGE2は、IL-18によって産生されたものであることを証明した。2.RAのIL-18の産生機序と役割:IL-18は関節炎の増悪因子である。研究分担者は、Kupffer細胞での活性型IL-18産生に、Fas ligand(FasL)刺激とcaspase3の関与を発見した。一方、RA滑膜細胞でのIL-18のプロセシングは、Kupffer細胞内と異なるものと推測している。すでにRAにおけるIL-18の産生経路は、sFasL刺激下のCD14陽性細胞によることを確認した。現在、細胞内のシグナリングを解明中である。今後申請者らは、骨破壊や軟骨変性を来す疾患に対して、IL-18をターゲットとした治療を考えている。1)IL-18受容体の骨芽細胞、破骨細胞での発現とIL-18の破骨細胞の活性に及ぼす作用マウスから骨芽細胞、破骨細胞を採取し、そのIL-18受容体の発現を坑IL-18受容体抗体を用いて免疫組織学的に検討した。またRT-RCR法を用いてIL-18受容体のmRNAの発現を検討した。その結果、骨芽細胞、破骨細胞ともにIL-18の受容体を持つ事が明らかになった。次ぎに、マウスから得られた破骨細胞(骨芽細胞や血液細胞の混入がある)を象牙薄切片上でIL-18と培養すると、破骨細胞による象牙の融解が抑制された。この事から、IL-18破骨細胞の骨融解活性を抑制することが明らかになった。現在IL-18による破骨細胞骨融解活性の抑制が破骨細胞への直接作用か、混入した他の細胞を介する作用かについて検討中である。2)悪性腫瘍の骨転移モデルの確立とIL-18の骨転移に及ぼす影響乳癌、肺癌、多発性骨髄腫の細胞株をマウス左心室内に注射し骨破壊性骨転移をおこさせる系の確立に成功した。