hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
mtDNA-HV1領域の万能プライマーによる動物種と個人・個体の同時識別

本研究では、ミトコンドリアDNA(mtDNA)のHV1の周辺領域に、万能プライマーmt-U1・mt-U2を、HV2/3領域の周辺領域にヒト特異的プライマーmt-HV2F・mt-HV2Fを設定し、D-ループ領域を増幅すると、PCR産物の増幅長の差異により哺乳類の動物種の識別とヒトの証明が容易に可能となった。さらに、この産物の塩基配列を決定すると、いずれの動物でも高変異部位であるため、種内の変異を同定でき、個体(個人)識別が可能であった。HV1領域に哺乳類のみではなく、鳥類や魚類の動物種決定のためのプライマーを作成し、蛍光プライマーと法医学で汎用されているフラグメントアナライザーを用いた自動化解析法を確立した。最近、ニホンザルの出没報道があるため、チンパンジー、ゴリラ、ニホンザルの霊長類について、本法について検討したところ、系統的には近親な関係にあるが、容易に識別が可能であった。さらに、サンプル数を増加させるとともに、実務資料への応用をはかり、問題点を解決し、方法を確立した。成果を総説として、市販の一般誌『臨床検査』にて、実務例を紹介しながら、本法の有用性について詳細にかつ平易に解説した。共同研究者の梅津は同じく、mtDNAの12rRNAと16rRNA領域を増幅するユニバーサルプライマーを用いた方法を開発した。この方法は上記の方法のような断片長の相違はないので、塩基配列の決定が必須であり、簡便なスクリーニング法としては使えないが、脊椎動物全般に適用できる方法であり、有用である。場合に応じて、これら二つの方法を選択しておこなうか、組み合わせて、相互に補完しながら使用するのが良い。愛玩用動物として広く飼育されているイヌやネコ等や家畜等の動物毛は、犯罪鑑識においてしばしば異同識別の対象となるが、従来の形態学的検査ではその識別が困難であることも少なくない。われわれは、mtDNAのhypervariable region(HV1)の塩基配列に着目したところ、すなわち、動物種間において共通な配列と職別可能な配列とが認められ、共通部分に、どの動物のmtDNAも増幅させえる万能プライマー(mt-U1,mt-U2)を設定することが可能であることがわかった。そこで、種々の動物の被毛や筋肉組織等から得たDNAをこの万能プライマーを用いて増幅させると、イヌ398bp、ラット433bp、ウマ444bp、ブタ492bp、ウシ543bp、ヒト545bp、ウサギ564bpネコ692bp、ヒツジ799bpの増幅断片が得られ、増幅断片長の相違から容易に動物種の識別が可能であった。さらに、イヌ20個体のDNAをこの方法にて増幅すると、期待通りのDNA断片が得られた。この二つの万能プライマー間の塩基配列内にさらに新しくイヌ特異的プライマーを設定し、増幅させると、イヌのみ増幅が認められ、引き続いて、塩基配列を決定すると、計174個の塩基のうち、17箇所で置換が観察され、個体識別も可能であることがわかり、実務例に応用し事件の解決に利用できた。また、ヒトとウシの増幅断片長がきわめて類似しているため、ヒト特異的プライマーを使用して同時に増幅させる方法を確立した。このように、法医学的に有用なプライマーであるので、蛍光標識化して、Genetic Analyzerで分析可能な条件を詳細に検討している。法医鑑定において生物試料からの人獣鑑別は重要な検査項目のひとつであり、われわれはミトコンドリアDNA(mtDNA)に存在する相同性の高い塩基配列部位に設定したプライマー(mt-U1、mt-U2)を用いて超可変領域(mtDNA-HV1)を増幅し、その増幅断片長の相違によって判定する新たな人獣鑑別法の検討を行ってきた。

さらに、ヒトとウシでは増幅サイズが543bpと545bpであるために、ヒト特異的断片をmtDNA-HV2から多重増幅することにより、簡便かつ正確な判定法を確立してきた。このシステムに使用している万能プライマーとヒト特異的プライマーを6FAMにより、蛍光標識化して、Genetic Analyzerを用いた自動判定法の検討を行った。とくに、Genetic Analyzerによる分析は、ヒトの個人識別に繁用されているSTR多型の市販キット「Profiler」や「Identifiler」等の条件にしたがって行い、汎用性、簡便性を高めた。蛍光プライマーでも、当然ながら、ヒトの場合は2本、動物の場合は1本のピークが出現し、それぞれのピークのサイズは期待通りであった。アガロースゲルを用いた分離においては、サイズマーカーに加えて、対照サンプルと同一ゲルで電気泳動して比較する必要があるが、蛍光プライマー法においては、ピークサイズの絶対値を対照サンプルのものと比較するだけで充分であり、貴重な対照資料の浪費も防ぐことができた。現場資料からは、われわれのデータベースにないサイズのピークが検出されたが、増幅産物の塩基配列を決定し、さらにBLASTすることにより、タヌキ、イタチ等の動物種の決定を行うことができた。ミトコンドリアDNA(mtDNA)のHV1の周辺領域に、万能プライマーmt-U1・mt-U2を、Hv2/3領域の周辺領域にヒト特異的プライマーmt-HV2F・mt-HV2Fを設定し、D-ループ領域を増幅すると、PCR産物の増幅長の差異により哺乳類の動物種の識別とヒトの証明が容易に可能となった。さらに、この産物の塩基配列を決定すると、いずれの動物でも高変異部位であるため、種内の変異を同定でき、個体(個人)識別が可能であった。今年度は、HV1領域に哺乳類のみではなく、鳥類や魚類の動物種決定のためのプライマーを作成し、蛍光プライマーと法医学で汎用されているフラグメントアナライザーを用いた自動化解析法を確立した。最近、ニホンザルの出没報道があるため、チンパンジー、ゴリラ、ニホンザルの霊長類について、本法について検討したところ、系統的には近親な関係にあるが、容易に識別が可能であった。さらに、サンプル数を増加させるとともに、実務資料への応用をはかり、問題点を解決し、方法を確立した。成果を総説として、市販の一般誌『臨床検査』にて、実務例を紹介しながら、本法の有用性について詳細にかつ平易に解説した。共同研究者の梅津は同じく、mtDNAの12rRNAと16rRNA領域を増幅するユニバーサルプライマーを用いた方法を開発した。この方法は上記の方法のような断片長の相違はないので、塩基配列の決定が必須であり、簡便なスクリーニング法としては使えないが、脊椎動物全般に適用できる方法であり、有用である。場合に応じて、これら二つの方法を選択しておこなうか、組み合わせて、相互に補完しながら使用するのが良い。
バングラデシュの河岸浸食と共に生きる人々―在来知と近代技術の融合による救済策

今年度は、前年度までに収集したデータと資料に対して必要な分析を加え、学術論文として完成し、学会等で発表するとともに、学術雑誌に投稿し採択されるまでの一連の作業に専念した。またそれらを博士論文として集大成し、2012年3月、京都大学から博士(地域研究)の学位を取得した。学会等での成果発表の主なものは、以下のとおり。学術雑誌に投稿し掲載または受理されたものは、以下のとおり。2012年3月、博士(地域研究)の学位を京都大学から授与された博士論文は、以下のとおり。研究は順調に進展し、終了した。本国バングラデシュに帰国し、研究職の仕事を探す。研究職に就いたら、中洲の住民に対する政策的枠組みをさらに発展する方向に研究を進める。バングラデシュにおける大河川(ポッダ川)の侵食されやすい河岸や中洲に居住する人々の生業や生存戦略についての既存研究文献を広く渉猟し、とりわけ関連する2冊の本を丹念に読み、これまで明らかになっていること、今後の研究課題を確認した。また、ポッダ川沿いの調査地に赴き、1)河岸侵食のため村ぐるみで移動を余儀なくされた村、2)河岸に近い中州上の村、3)河岸から非常に遠い中州上の村の3つの村を調査村として選定し、まず各村の全世帯の悉皆調査を実施した(合計で242世帯)。そこでは、世帯員構成、主な職業、副業、教育水準、家屋の状況、農地所有、小作、農産物の生産と販売、家畜保有、飲料水用井戸の保有、ボートの保有、その他耐久消費財の保有、金融事情といった基礎的情報を収集した。全世帯のデータをコンピュータ入力し、簡単な集計を行った。さらに、村でグループ・ディスカッションの場をいくつか設営し、住民の直面する問題などを直接、把握した。さらにダッカにおいては、バングラデシュ工科大学、地理情報センター、バングラデシュ統計局などを訪問し、必要な統計、地図、ポッダ川の水文データなどを入手した。以上の一連の作業を通じて、侵食されやすい河岸や中洲といった特殊な地域に居住する人々の生業および社会経済状況を把握し、またその生存戦略を理解するための基礎作業が終わったことになる。今後は、以上の基礎データをもとに、やや詳細な分析を加えるとともに、彼らの生存戦略により密接した仮説を導出し、それを現地調査によって検証していく予定である。今年度は、必要な追加調査(主に、3ヵ村242世帯すべてについて、その屋敷地の盛り土の高さや家屋の構造を詳細に調べあげ、洪水に対する脆弱度を測定する調査)を現地で実施するとともに、これまで収集した資料・データに本格的分析を加え、2本の異なるテーマの論文にまとめ、それを学会の場で積極的に発表し、論文の質の向上に努めた。ただし、学術誌への投稿が可能なレベルまで引き上げるため、今年度いっぱいは、論文の書き直しに費やした。論文の1本は、毎年(79月にピークに達する)の洪水に対する各世帯の脆弱性、およびそれに対する備えについて、各世帯の生業構造、農地所有と貸借、労働力賦存、教育レベル、家屋の構造、家畜保有、ボートその他輸送手段の所有状況、社会的ネットワークの有無などと関連させつつ論じたもの、もう1本は、全面的な河川侵食で村全体が移住を余儀なくされた過去の経験、および移住プロセスとそこでの問題点などを詳細に論じたものである。チョールと呼ばれる砂州上や侵食の激しい河岸沿いに住む人々にとっては、前者が毎年のように襲われる災害、後者が数年に一度襲われるカタストロフィーであり、両者への対応様式を考察してはじめて彼らの生存戦略が明らかになるという意味で、非常に重要な2つの柱であるということができる。また今年度行った追加的調査で得たデータは、まだ本格的に利用してはおらず、今後、もう1つの重要な研究成果としてまとめていく予定である。これは、世帯単位で洪水への脆弱度を数量化し、指数を作成することによって、災害防止や災害時の支援の必要などを行政やNGOが把握しやすくするための試みであり、これも非常に重要な成果となる可能性を秘めている。
ヒト腫瘍における癌抑制遺伝子Lats1変異の解析

ショウジョウバエの癌抑制遺伝子として最近見い出されたWarts/LATS1遺伝子の欠損マウスでは高率に軟部肉腫や卵巣腫瘍を発生することが報告されているが、ヒト腫瘍におけるこの遺伝子ホモログ(h-Warts/LATS)の変異を調査した研究は乏しい。本研究ではヒト軟部肉腫を対象とし、種々の分子生物学的手法を用いてこの遺伝子変異の有無を検索した。初年度にはそれまで未確定であったh-Warts/LATS1遺伝子の構造をより明らかにするとともに、reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)法によって50例のヒト軟部肉腫を検索し、7例において遺伝子発現の低下ないし消失を認めた。次年度には、この7例についてh-Warts/LATS1遺伝子が局在する6q24-25.1のマイクロサテライトマーカーを用いて遺伝子欠失の有無を検討し、遺伝子発現が低下していた1例において欠失を見い出した。次にPCR-single strand conformation polymorphism(SSCP)によってこの遺伝子の翻訳領域における点突然変異の有無を検索し、7例中2例においてミスセンス変異を見い出した。さらに最終年度にはこの遺伝子の5'プロモーター領域におけるCpG配列のメチル化の有無をメチル化配列特異的なPCR法によって検索し、遺伝子発現の消失していた6例においてCpG配列のメチル化を認めた。以上の結果から、遺伝子欠失や点突然変異を含む種々のh-Warts/LATS1遺伝子変異がヒト軟部肉腫の一部の例で認められ、特に5'プロモター領域におけるCpG配列のメチル化に基づく遺伝子発現の消失が、それらの変異の中では高頻度に認められることが示された。したがってh-Warts/LATS1遺伝子がヒトにおける癌抑制遺伝子の一つであることを本研究で示すことができた。本研究結果も含めh-Warts/LATS1遺伝子に関して得られる情報が、今後ヒト腫瘍、特に軟部肉腫の診断や遺伝子治療等に臨床応用されることが期待される。平成12年度は卵巣莢膜細胞腫2例と種々の組織型の軟部肉腫29例を対象に、それらの凍結腫瘍組織から核酸を抽出し、RNAについては逆転写反応によりcDNAを合成した。まずLATS1遺伝子のkinase domain(約0.9kbp)に着目し、合成したcDNAを用いて同部のPCRを行い、その発現状況を内在性コントロールのGAPDH遺伝子転写産物と比較したところ、2例の卵巣莢膜細胞腫及び平滑筋肉腫などの軟部肉腫5例においてLATS1遺伝子転写産物の発現現象または消失が示唆された。現在それらの腫瘍のgenomic DNAを用いて同部の遺伝子突然変異の有無を調査するため、PCR-SSCP解折を進めている。なおこの過程で同部の遺伝子構造をより明らかにする必要が生じたため、genomic DNAのPCR産物の塩基配列を自動シークエンサーによって解析した。既報告のcDNAの塩基配列との比較により、エクソン-イントロン境界領域を明らかにでき、このkinase domainは4つのエクソンから構成されていることが判明した。さらにRT-PCRで発現異常が示唆された腫瘍のうち検討に十分な量のgenomic DNAが得られた腫瘍3例(卵巣莢膜細胞腫1例、軟部平滑筋肉腫1例、粘液型脂肪肉腫1例)についてはサザンブロット法による遺伝子構造の異常の検出を試みたが、明らかな遺伝子再構成の所見は得られなかった。本年度はさらに症例を追加して上記の検索を継続すると共に、LATS1遺伝子の局在する染色体の欠失の有無を検討するため、サテライトマーカーを用いたLOH解折を予定している。癌抑制遺伝子の候補として最近見い出されたh-Warts/LATS

1遺伝子の変異の有無を種々のヒト軟部肉腫50例を対象として検索した。昨年度に明らかにしたh-Warts/LATS1遺伝子の翻訳領域における構造を基に、reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)によってh-Warts/LATS1遺伝子の発現状況を調査したところ、7例(14%)において発現の現弱ないし消失が認められた。この7例にっいてh-Warts/LATS1遺伝子が局在する6q24-25.1に対するマイクロサテライトマーカーを用いて遺伝子欠失の有無を検討したところ、遺伝子発現が現弱していた1例において欠失が見い出された。次にPCR-single strand conformation polymorphism(SSCP)によってこの遺伝子の翻訳領域における点突然変異の有無を検索し、7例中2例においてミスセンス変異を見い出した。一方遺伝子発現に異常のなかった例では、それらの遺伝子変異は認められなかった。なおサザンブロット法による解析では、明らかなh-Warts/LATS1遺伝子の再構成は検出されなかった。以上の結果から、ヒト軟部肉腫のあるものはh-Warts/LATS1遺伝子の変異を伴っており、それらの例における腫瘍発生にこの遺伝子異常が関与している可能性が示唆された。平成14年度はh-Warts/LATS1遺伝子発現異常の機序をより明らかにするため、特にプロモーター領域の構造を詳しく調査し、CpG配列のメチル化などの同部における異常について検討する予定である。本研究では、癌抑制遺伝子の候補として最近見い出されたh-Warts/LATS1遺伝子の変異の有無を種々のヒト軟部肉腫50例を対象として検索を行ってきた。今年度は、一昨年度に明らかにしたh-Warts/LATS1遺伝子の構造と遺伝子バンクに登録されている遺伝子配列の情報を基に、インターネットオンライン上で利用可能な遺伝子プロモーター検索プログラムを用いてこの遺伝子の5'プロモーター領域の候補を推定した。同部がCpG配列に富む領域であることを確認した後に、この領域におけるCpG配列のメチル化の有無を、遺伝子発現が現弱ないし消失していた7例と遺伝子発現を確認できた6例を対象としてメチル化配列特異的なpolymerase chain reaction (PCR)法を用いて検索した。その結果、遺伝子発現の消失していた6例ではCpG配列のメチル化を認めたが、発現減弱例を含む遺伝子発現の見られた7例においてはメチル化は見い出されなかった。以上のデータを含むこれまでの結果から、遺伝子欠失や点突然変異を含む種々のh-Warts/LATS1
不飽和脂肪酸による細胞機能調節

1.脂肪酸縮合反応の活性化脂肪酸伸長系は4つの部分反応:縮合、還元、脱水、還元に分かれるが、調節点と考えられている縮合反応は動脈では伸長反応に対する比率が2.6%と非常に低く測定が不可能であった。本年度は、この縮合反応が煮沸したミクロソ-ムあるいは牛血清アルブミン(BSA)を添加することにより、添加しない場合に比べ約7倍活性上昇することを見出した。2.脂肪酸縮合反応のパルミトレイン酸による阻害機構パルミチン酸ーCoA(16:0ーCoA)伸長反応がパルミトレイン酸ーCoA(16:1ーCoA)によって抑制される機構を解析するため、16:0ーCoA縮合反応のキネティックスを測定した。16:0ーCoAに対する縮合酵素のKmは23.3μMであり、先に測定したオ-バ-オ-ルの脂肪酸伸長反応のKm22.6μMにほぼ一致した。これに基質と等量の16:1ーCoAを加えたところ、16:0ーCoA縮合反応の阻害を示し、その阻害様式は非拮抗阻害であった。この結果は16:1ーCoAが16:0ーCoA縮合酵素の活性中心とは異なった部位に結合して反応を阻害していることを示す。3.種々の不飽和脂肪酸による縮合反応の阻害16:0ーCoA縮合反応に対する不飽和脂肪酸の阻害の程度は20:1ーCoA>16:1ーCoA>18:1ーCoA>18:2ーCoA>14:1ーCoAの順であった。この順序は脂肪酸伸長に対する不飽和脂肪酸ーCoAの抑制とほぼ同じであった。脳卒中易発症高血圧自然発症ラット(SHRSP)に対し、16:1が延命効果を示したが、20:1について効果があるかどうかは興味がある。また低酸素状態における高血圧自然発症ラット(SHR)頚動脈内壁異常を16:1が回復したが、20:1についても調べてみる必要がある。16:1ーCoAは脂肪酸伸長反応の変換を介して血管壁細胞膜流動性の変化を修飾している可能性が考えられる。
葉緑体NAD(P)Hデヒドロゲナーゼに依存した電子伝達経路の解明

1精製当初は、葉緑体の単離が容易なホウレンソウを用い、予備的精製を行ったが、粗抽出液中のNDH量が予想に比べかなり低いことが判明したため、十分な精製標品を得ることが難しいと判断した。そこで、NDH活性の高い植物をスクリーニングするため、クロロフィル蛍光法による簡便なNDH活性測定法を開発し、実際に200種弱の植物種をスクリーニングした結果、一部のC4植物において、非常に高いNDH活性を見出した。入手しやすいC4種を材料として精製を行った。精製には、葉緑体の単離、チラコイド膜の可溶化、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過を用いた。活性測定にはNADPH/フェリシアン化カリウムの酸化還元測定を、タンパク質の同定にはNDH-H抗体によるウェスタン解析を利用した。2抗体の作成大腸菌で大量発現させたNDH-Kサブユニットを用いてウサギ抗体を作成した。3Hisタグ付加コンストラクトの作成NDH-KおよびKサブユニットのN末端、C末端にアフィニティー精製のためのHisタグを付加したコンストラクトを作成した。葉緑体形質転換法にてそれらをタバコに導入した。これまでに、抗生物質耐性植物ラインを多数再分化させることに成功した。これらの植物の成長を待って、遺伝子解析、NDH精製を行う予定である。4生理的機能の解明新たにNDH-KJおよびNDH-CJKを欠損した葉緑体形質転換体を作成し、強光ストレスによる過還元状態の回避にNDHに依存する循環的電子伝達系が重要な役割を果たしていることを明らかにした1精製当初は、葉緑体の単離が容易なホウレンソウを用い、予備的精製を行ったが、粗抽出液中のNDH量が予想に比べかなり低いことが判明したため、十分な精製標品を得ることが難しいと判断した。4生理的機能の解明新たにNDH-KJおよびNDH-CJKを欠損した葉緑体形質転換体を作成し、強光ストレスによる過還元状態の回避にNDHに依存する循環的電子伝達系が重要な役割を果たしていることを明らかにした1.ホウレンソウ葉緑体からのNAD(P)Hデヒドロゲナーゼ(NDH)の粗精製無傷葉緑体をホウレンソウ葉から単離し、チラコイド膜を含む粗抽出液を各種の界面活性剤で処理した。これらの標品についてBlue-Native PAGEを行い、ニトロブルーテトラゾリウムを電子受容体とした活性染色により、NDH活性を検出した。400kDaおよび200kDaに複合体の活性バンドが見出され、それぞれ、NDH複合体全体および親水性サブ複合体に対応している可能性が示唆された。これら高分子量の酵素はNADHは基質とせずNADPHに特異的であった。現在これら2つの酵素の精製を進めている。2.抗体の作成NDHタンパク質の同定のため、特異的抗体の作成を行った。親水性サブユニットであるNDH-H, I, JおよびK遺伝子を大腸菌で発現させたところ、NDH-Kが最も大量に発現していた。インクリュージョンボディーを形成していたため、尿素により可溶化した後、陽イオン交換クロマトグラフィーにて精製し、ウサギ抗体を作成した。水溶性サブコンプレックスを効率よく単離するため、その構成成分であるNDH-KとJのN末、C末にHis-tagを付加したコンストラクトを作成を行っている。これまでにKのC末とJのN末にタグを付加したコンストラクトを作成し終えている。現在、これらを用いてタバコ葉緑体形質転換を行っている。当初は、葉緑体の単離が容易なホウレンソウを用い、予備的精製を行ったが、粗抽出液中のNDH量が予想に比べかなり低いことが判明したため、十分な精製標品を得ることが難しいと判断した。

現在のところ、単一タンパク質までの精製は達成しておらず、さらに1段階の精製ステップを経た後、各サブユニットのN末アミノ酸配列を決定する予定である。2抗体の作成大腸菌で大量発現させたNDH-Kサブユニットを用いてウサギ抗体を作成した。3 Hisタグ付加コンストラクトの作成NDH-KおよびKサブユニットのN末端、C末端にアフィニティー精製のためのHisタグを付加したコンストラクトを作成した。葉緑体形質転換法にてそれらをタバコに導入した。これまでに、抗生物質耐性植物ラインを多数再分化させることに成功した。これらの植物の成長を待って、遺伝子解析、NDH精製を行う予定である。
発がんにおける突然変異と染色体再構成

本研究はヒト癌を対象に発癌における原因突然変異と染色体再構の実態を追求してきた.網膜芽細胞腫の発生に関係する遺伝子のcDNAを用いて骨肉腫のDNAをサザン法で分析した結果,網膜芽細胞腫も骨肉腫も同じ突然変異によるが,染色体のホモ接合化は両者で異っている.多内分泌腺腫瘍症MEN2Aの原因遺伝子は#10染色体に座位するが,随伴腫瘍の甲状腺髄様癌化現象は必ずしも原因突然変異の指標とならず癌の増殖など続発変異としても重要であることがわかった.横紋筋肉腫および子宮頚癌の細胞に#11染色体を導入すると造腫瘍性が抑えられ,発癌における欠失突然変異を実験的に検討できるようになった.神経芽細胞腫には染色体数が3n領域にある一群の腫瘍があり,これらにはNーmycの増幅や染色体の構造異常がなく,また治療の予後も格段に良好であることがわかった.造血系腫瘍では,前白血病変に高率に#5,#7染色体の全部あるいは一部の欠失が認められ,骨髄幹細胞の増殖制御の変化を示唆している.成人T細胞白血病の発症初期のT細胞にも14gllが関与する異常が特異的変化として認められ,悪性化への重要な要因となっていることを示唆する.濾胞性リンパ腫でbclー2遺伝子の構造変化を調べた結果,日本人患者における14;18転座の切断点は本症の流行地である米国の患者の場合とかなり異なることがわかった.また, 9;14転座を持つリンパ腫細胞株KIS株で切断点の#9染色体側のDNAの単離に成功した.このDNAは他のリンパ腫でも発現されているが, KIS株では異常なサイズのmRNAとして発現されている.新しい癌関連遺伝子としてその全構造の解明が待たれる.その他,すでに単離されている癌遺伝子7種をin situ分子雑種法により染色体上にマップした.いずれもその位置は癌に見られる特異的染色体異常の切断点に一致する.本研究はヒト癌を対象に発癌における原因突然変異と染色体再構の実態を追求してきた.網膜芽細胞腫の発生に関係する遺伝子のcDNAを用いて骨肉腫のDNAをサザン法で分析した結果,網膜芽細胞腫も骨肉腫も同じ突然変異によるが,染色体のホモ接合化は両者で異っている.多内分泌腺腫瘍症MEN2Aの原因遺伝子は#10染色体に座位するが,随伴腫瘍の甲状腺髄様癌化現象は必ずしも原因突然変異の指標とならず癌の増殖など続発変異としても重要であることがわかった.横紋筋肉腫および子宮頚癌の細胞に#11染色体を導入すると造腫瘍性が抑えられ,発癌における欠失突然変異を実験的に検討できるようになった.神経芽細胞腫には染色体数が3n領域にある一群の腫瘍があり,これらにはNーmycの増幅や染色体の構造異常がなく,また治療の予後も格段に良好であることがわかった.造血系腫瘍では,前白血病変に高率に#5,#7染色体の全部あるいは一部の欠失が認められ,骨髄幹細胞の増殖制御の変化を示唆している.成人T細胞白血病の発症初期のT細胞にも14gllが関与する異常が特異的変化として認められ,悪性化への重要な要因となっていることを示唆する.濾胞性リンパ腫でbclー2遺伝子の構造変化を調べた結果,日本人患者における14;18転座の切断点は本症の流行地である米国の患者の場合とかなり異なることがわかった.また, 9;14転座を持つリンパ腫細胞株KIS株で切断点の#9染色体側のDNAの単離に成功した.このDNAは他のリンパ腫でも発現されているが, KIS株では異常なサイズのmRNAとして発現されている.新しい癌関連遺伝子としてその全構造の解明が待たれる.その他,すでに単離されている癌遺伝子7種をin situ分子雑種法により染色体上にマップした.いずれもその位置は癌に見られる特異的染色体異常の切断点に一致する.
助産外来を活用した妊娠糖尿病女性への妊娠分娩産褥期の継続的な支援の介入評価研究

本研究では、妊娠糖尿病(以下GDM)女性への支援において、妊娠糖尿病療養支援助産師(GDM助産師)が主導する助産外来を活用し、妊娠分娩産褥期の継続的な支援の介入を実施し評価する。GDM助産師についてはこれに先立つ科研「妊娠糖尿病女性への妊娠糖尿病認定助産師による産後継続支援に関する多施設共同研究」(平成2628年度、研究代表者)において育成プログラムを開発しその育成を進めてきたが、2016年度より2日間開催で妊娠分娩産褥期の継続的な支援を範疇に入れたものに修正し、2017年度より日本母性看護学会開催のプログラムとし、本科研メンバーがその開催を支援している。科研開催で75名、母性看護学会セミナーで約150名が修了し各医療機関で活躍している。この育成は日本母性看護学会主催で継続する予定である。また、前の科研において産後介入のプロトコール開発および介入時に使用する「妊娠糖尿病を経験されたあなたへ」のパンフレットを作成し、すでに2施設において介入研究を実施している。2017年度の報告において、不十分となっている糖尿病外来の医療スタッフ、周産期医療スタッフ間の連携体制づくりに取り組むことを報告したが、その方策として、診療報酬「在宅妊娠糖尿病指導管理料」の妊娠中の支援職種に助産師を追加すること、産褥12週までの内科受診の際の助産師による保健指導を加えるという要件拡大に向けた検討を科研メンバーで重ねてきた。この申請は、日本母性看護学会、日本助産学会、日本糖尿病・妊娠学会、日本糖尿病学会という多職種が参加する学会共同での提案をめざしており、2018年度に各学会主要メンバーに対して調整を重ね、2019年度6月に申請の予定となっている。介入を実施していたうち1施設において介入期間が終了した。今後データを分析し、日本母性看護学会で報告予定である。年1回の開催では、受講可能な助産師に限りがあるために、研修会内容の出版を検討している。GDM助産師についてはこれに先立つ科研「妊娠糖尿病女性への妊娠糖尿病認定助産師による産後継続支援に関する多施設共同研究」(平成2628年度、研究代表者)において育成プログラムを開発しその育成を進めてきたが、平成28年度より2日間開催で妊娠分娩産褥期の継続的な支援を範疇に入れたものに修正し、日本母性看護学会開催のプログラムとし、本科研メンバーがその開催を支援している。科研開催で75名、母性看護学会セミナーで約100名が修了し各医療機関で活躍している。2018年度には富山大学においてミニセミナーを開催したが、ミニセミナーであったため、修了証書は発行していない。2018年度末に、前科研において実施した周産期医療施設に対する聞き取り調査の結果を公表したが、GDMの診療・看護に先駆的と評価されている医療機関であっても、糖尿病外来の医療スタッフ、周産期医療スタッフ間の連携体制づくりは不十分であった。今回の科研では、これまでその体制づくりに取り組む。GDM妊婦については、診療報酬上、内分泌科と産科の共同での診療・指導に対して、加算措置が取られているが、助産師が関わることは明記されていない。そこで、現在は、GDM妊産婦に対する診療報酬上の対応の状況について情報収集を進め、産婦人科医、内分泌科医、糖尿病外来の医療スタッフとGDM助産師の共同について検討を進めているところである。GDM助産師の育成プログラムについては、2017年度にも日本母性看護学会開催のプログラムとして開催するに当たり、本科研メンバーがその開催を支援した。また、前の科研において作成した産後介入のプロトコール開発および介入時に使用する「妊娠糖尿病を経験されたあなたへ」のパンフレットについて修正作業を開始している。すでに介入研究を実施している2施設の介入研究を支援してきた。また介入プロトコールを妊娠期・分娩期にも適用できるように検討を進めている。

GDM助産師についてはこれに先立つ科研「妊娠糖尿病女性への妊娠糖尿病認定助産師による産後継続支援に関する多施設共同研究」(平成2628年度、研究代表者)において育成プログラムを開発しその育成を進めてきたが、2016年度より2日間開催で妊娠分娩産褥期の継続的な支援を範疇に入れたものに修正し、2017年度より日本母性看護学会開催のプログラムとし、本科研メンバーがその開催を支援している。科研開催で75名、母性看護学会セミナーで約150名が修了し各医療機関で活躍している。この育成は日本母性看護学会主催で継続する予定である。また、前の科研において産後介入のプロトコール開発および介入時に使用する「妊娠糖尿病を経験されたあなたへ」のパンフレットを作成し、すでに2施設において介入研究を実施している。2017年度の報告において、不十分となっている糖尿病外来の医療スタッフ、周産期医療スタッフ間の連携体制づくりに取り組むことを報告したが、その方策として、診療報酬「在宅妊娠糖尿病指導管理料」の妊娠中の支援職種に助産師を追加すること、産褥12週までの内科受診の際の助産師による保健指導を加えるという要件拡大に向けた検討を科研メンバーで重ねてきた。この申請は、日本母性看護学会、日本助産学会、日本糖尿病・妊娠学会、日本糖尿病学会という多職種が参加する学会共同での提案をめざしており、2018年度に各学会主要メンバーに対して調整を重ね、2019年度6月に申請の予定となっている。介入を実施していたうち1施設において介入期間が終了した。今後データを分析し、日本母性看護学会で報告予定である。今回の科研では、糖尿病外来の医療スタッフ、周産期医療スタッフ間の連携体制づくりに取り組む。GDM妊婦については、診療報酬上、内分泌科と産科の共同での診療・指導に対して、加算措置が取られているが、助産師が関わることは明記されていない。そこで、現在は、GDM妊産婦に対する診療報酬上の対応の状況について情報収集を進め、産婦人科医、内分泌科医、糖尿病外来の医療スタッフとGDM助産師の共同について検討を進めているところである。年1回の開催では、受講可能な助産師に限りがあるために、研修会内容の出版を検討している。2017年度の科研主催のGDMセミナーについては、ミニセミナーの開催にとどまったこと、介入プロトコールの修正が途中であるため、新規の介入研究の開始がなかったことから、次年度使用額が生じている。2018年度には、科研主催のセミナーを研究協力を期待できる愛媛大学を中心として開催できるように、調整予定である。研修会開催が科研での開催から日本母性看護学会での開催となったため、開催に関わる経費等が削減された。削減分については、成果の発表に関わったメンバーが参加できるように旅費や学会参加費として補助すること、また、セミナー開催では受講できる人数に限りがあるため、これまでの成果をまとめ、出版物の形で提供できるように考えており、そのとりまとめ作業に用いる予定である。
中近世移行期における大名権力と地域社会

史料調査に必要な基本的な撮影機材(カメラ・レンズ・三脚等)の整備を進めるとともに、東京方面では東京大学史料編纂所・内閣文庫、福岡方面では福岡県立図書館・福岡県地域史研究所、山口方面では山口県文書館・毛利博物館に出張し、戦国期および豊臣期関係の史料の写真撮影、影写本・謄写本・写真帳の閲覧、マイクロリーダーによる影写本複写等の方法で史料収集を行なった。収集した史料については、翻刻作業を進めるとともに、データベースソフトを利用して地域別および編年別の整理に着手した。今年度に進めた研究内容としては、筑前国に対する豊臣政権の支配強化の過程を、主として地域の視座から一国規模で考察した最近の成果をふまえ、地域の独自性をより明確にするために、一郡規模での検討を試みた。具体的には、古代より幅広い信仰をあつめる宗像社の鎮座する筑前国宗像郡を素材とし、大内市滅亡後の北部九州において領主的発展を遂げた大宮司宗像氏貞が没した後の宗像郡の状況について、特に宗像社および宗像社領を中心に、その史的展開を明らかにした。その結果、豊臣期、宗像郡には豊臣政権の支配が深く浸透して行き、宗像社においても社家衆の衰退や社領の減少・消失が進むなか、社領の直接支配という中世的な社領経営から領国主による年貢米給付という近世的な財政運営の形態に移行したことを明らかにした。今後は、収集した史料をもとに、中国地方に北部九州地方を研究対象とし、豊臣政権下の大名権力(毛利氏・小早川氏)の領国支配や村落社会の実態について、太閤検地の実施や近世的石高の成立、さらにはそれらと知行制・軍役・年貢収納の関係について解明して行く予定である。
ゲノム科学による南西諸島全域のサンゴ個体群の全容解明

生物多様性豊かなサンゴ礁が存在する南西諸島のサンゴの遺伝的集団構造を、ゲノム科学的手法を用いて明らかにすることを目的とした。南西諸島で普通に見られ、種の多様性が高いミドリイシ属サンゴの仲間で、全ゲノムが解読されている種の沖縄周辺の詳細な集団構造を、ゲノムワイドなSNP情報により明らかにした。さらにゲノム情報と次世代シーケンサーから得られる膨大なDNA情報を活用して、多様なサンゴ種の集団構造を解析可能な汎用性の高い遺伝子マーカーの開発、それを使用した天然のサンゴの集団構造や養殖サンゴの遺伝的多様性の調査を行った。この方法は、他の海洋生物の遺伝子マーカーの開発や集団構造の解析にも応用された。地球規模での環境変動によりサンゴ礁が壊滅的な打撃を受けており、早急な対策と保護が求められる。本研究はサンゴの全ゲノム情報を駆使し、豊かな生物多様性を支える南西諸島のサンゴ個体群の全容を、1000kmもの広範囲に渡って明らかにする。ゲノム科学・生態学・集団遺伝学のスペシャリストが集い、南西諸島のサンゴ礁の遺伝的多様性や、島々のサンゴ礁がどのような遺伝的つながりがあるか(コネクティビティ)といったサンゴの動態を、全ゲノムSNPデータを用いた最高精度の解析を行う。本研究は、全ゲノムが解読されているコユビミドリイシ(Acropora digitifera)を主な対象種としている。南西諸島全域のサンゴ個体群の詳細な遺伝的背景が明らかになり、どの海域を優先して保護すべきか、そして荒廃したサンゴ礁の回復は望めるのか予測する事が可能になる。このように本研究は、南西諸島のサンゴ礁保護に大きく貢献することが期待される。本年度は1000kmにもまたがる南西諸島の全域で、コユビミドリイシの採集をほぼ予定通り行うことが出来た。ゲノム・リシークエンスによる全ゲノムSNPデータを獲得するための解析にも着手した。南西諸島には400種以上の造礁サンゴが生息している。南西諸島のサンゴ礁の全容を把握するためには、様々な種を調べることも重要である。Acropora属サンゴに汎用性があるマイクロサテライトマーカーの開発を行い、実際に多様な種において使用できることを確かめた。このマーカーを用いて、コユビミドリイシ以外のミドリイシサンゴについても、南西諸島全域での集団遺伝学的解析を進めている。ミドリイシサンゴ以外の造礁サンゴについてもマイクロサテライトマーカーを開発しており、多様な種を用いたサンゴの集団遺伝解析を行う基盤を整えつつある。本研究はサンゴの全ゲノム情報を駆使し、豊かな生物多様性を誇る南西諸島のサンゴ個体群の全容を、超高精度に明らかにすることを目的とする。本研究は、全ゲノムが解読されており、膨大な量のDNA上の一塩基多型、SNP(Single Nucleotide Polymorphism)情報が利用可能で、ゲノムレベルでの詳細な集団解析が可能なコユビミドリイシ(Acropora digitifera)を主な対象種としている。沖縄県周辺のコユビミドリイシの詳細な155個体を採捕し、それぞれの全ゲノムをGA IIx、HiSeq(Illumina)を用いてリシークエンスを行った。得られた塩基配列データを参照ゲノムにマッピングし、個々のサンゴ個体から約90万ヶ所のSNPを特定し、集団解析を行った。全地点間での遺伝的距離(Fst)はとても小さく、ほぼ同一集団と推定された。その一方で、主成分分析では沖縄本島・慶良間諸島・八重山諸島北・八重山諸島南の4つのクラスタが確認され、島嶼間での移動は頻繁には起こっていない可能性が示唆された。過去のサンゴの加入パターンを推定したところ、八重山から沖縄本島への過去の加入の痕跡が検出され、沖縄本島のサンゴの集団形成には八重山地方のサンゴが過去に大きな役割を果たしたことが示唆された。これらの結果は学術論文として公表した。ミドリイシサンゴは南西諸島域で最も普通に見られるサンゴであるが、これまでに次世代シークエンサーとバイオインフォマティクス解析により、ミドリイシサンゴ以外の造礁サンゴ、アザミサンゴ(Galaxea fascicularis)についてもマイクロサテライトマーカーを開発し、南西諸島周辺の集団解析を行った。沖縄周辺のコユビミドリイシの詳細な集団構造を、全ゲノムSNP解析により明らかにし、学術論文として公開できた。ミドリイシ以外のサンゴについても遺伝子マーカーの開発と集団解析について学術論文として公開することが出来た。本研究はサンゴの全ゲノム情報を駆使し、豊かな生物多様性を誇る南西諸島のサンゴ個体群の全容を明らかにすることを目的とする。当該年度は南西諸島に広く見られるミドリイシ属サンゴ、ウスエダミドリイシ(Acropora tenuis)を対象に、南西諸島全域の集団遺伝学的解析を行った。我々が開発したミドリイシ属サンゴに広く使用可能なマイクロサテライトマーカーを用いて、南西諸島全域から15地点、298のサンゴ群体を調査した。その結果、自然界では主に有性生殖によってこのサンゴは繁殖していることが明らかになった。

そして地理的な境界は存在しないにもかかわらず、南西諸島には少なくとも二つの遺伝的由来の異なる集団が存在することが分かった。その境界は曖昧で、グラデーションのような構造を取っており、従来考えられているよりも複雑な集団構造を取っている可能性が明らかになった。さらに沖縄県で行われているサンゴ養殖の、養殖場での大規模一斉産卵についても報告することができた。ゲノムが解読されているコユビミドリイシに加え、他のミドリイシ属サンゴ種についても集団構造解析を行い、南西諸島全域のサンゴの集団構造についてより知見が深まった。この結果は学術論文として公開することができた。地球規模での環境変動によりサンゴ礁が壊滅的な打撃を受けており、早急な対策と保護が求められる。本研究はサンゴの全ゲノム情報を駆使し、豊かな生物多様性を誇る南西諸島のサンゴ個体群の全容を、超高精度に明らかにすることを目的とする。南西諸島には400種以上の造礁サンゴが生息している。南西諸島のサンゴ礁の全容を把握するためには、様々な種の集団構造の情報も必要になる。これまでにミドリイシ属サンゴに汎用性があるマイクロサテライトマーカーの開発を行い、実際に多数の種において使用できることを確認した。そしてこのマーカーを用いて、南西諸島の代表的なサンゴの一つであるミドリイシ属サンゴの一種、ウスエダミドリイシ(Acropora tenuis)の南西諸島全域での集団遺伝学的解析を行った。当該年度は、沖縄県恩納村漁協で養殖されているウスエダミドリイシを、開発したマイクロサテライトマーカーを用いて、遺伝的多様性を調べた。前兼久と恩納の両養殖場のウスエダミドリイシは、これまでに我々が調べた南西諸島の天然の集団と比較して、遜色ないレベルの遺伝的多様性を保っており、近隣の天然の集団と同じ遺伝的集団に属することを明らかにした。さらに、2016年の白化現象の被害が特に顕著だった石西礁湖にて、白化から生き残ったサンゴのサンプルも採集した。今後これらを白化の前のサンゴ集団と比較を行うことで、サンゴ礁生態系の変遷について解析を進めていきたいと考えている。生物多様性豊かなサンゴ礁が存在する南西諸島のサンゴの遺伝的集団構造を、ゲノム科学的手法を用いて明らかにすることを目的とした。南西諸島で普通に見られ、種の多様性が高いミドリイシ属サンゴの仲間で、全ゲノムが解読されている種の沖縄周辺の詳細な集団構造を、ゲノムワイドなSNP情報により明らかにした。さらにゲノム情報と次世代シーケンサーから得られる膨大なDNA情報を活用して、多様なサンゴ種の集団構造を解析可能な汎用性の高い遺伝子マーカーの開発、それを使用した天然のサンゴの集団構造や養殖サンゴの遺伝的多様性の調査を行った。この方法は、他の海洋生物の遺伝子マーカーの開発や集団構造の解析にも応用された。南西諸島の主要な島々(沖縄本島、宮古、石垣、奄美、種子島)でのサンゴの採集を行い、ラージスケール(1000 km)でのサンプルの採集を、ほぼ予定通りに完了することが出来た。いくつかのサンプルについては次世代シーケンサーによるゲノム解読にも着手した。
新しい2重共鳴分光法を用いた含金属炭素鎖分子の分子構造及び電子構造の研究

本研究課題で開発した新しい2重共鳴分光装置を用いて、炭素鎖分子の分子構造や電子構造におけるハロゲン置換効果を見出した。さらに、本装置を用いてこれまで知られていなかった酸素原子からなる鎖状分子の検出に成功し、その分子構造を始めて決定した。これらの業績について以下に概説する。研究実績[1]ハロゲン原子(塩素原子)のような電子親和性の強い原子が結合することで、炭素鎖分子の電子構造や炭素骨格の幾何学構造が大きく変化することを見出した。更にこの傾向は炭素骨格が長くなる事で増長されることも新たに確認した。最も単純なCCClでは2つの電子状態が塩素原子の強い電子親和力で近接することが、我々の以前の研究で明らかになっていたが、今年度新たに炭素骨格が伸びたCCCCClのマイクロ波分光を行い、電子状態の混合がより促進され、電子基底状態の近傍でConical intersectionを起こしていることを明らかにした。研究実績[2]これまで全く知られていなかった、酸素原子を基本とする鎖状分子の検出に成功し、初めて分子構造に関する知見を得た。これまで知られている酸素鎖分子は酸素原子2個から成るHOOHやHOOなどのような2酸化物のみであった。今年度の研究でより長い酸素鎖からなるHOOOHやHOOO分子の同定に成功した。これら酸素鎖分子の鎖骨格は、これまでによく知られている炭素鎖分子の結合様式とは全く異なり、通常の共有結合よりもかなり結合エネルギーの小さな、特異な結合を形成していること等を見出した。本年度でフーリエ変換型マイクロ波分光装置とミリ波帯のGunn発振器を組み合わせた新しい2重共鳴分光装置の開発を行った。本装置を用いて化学的に興味あるいくつかの短寿命分子種の分光研究をおこなった。以下に代表的なものを記す。1.クロム金属原子とハロゲン原子からなるCrF及びCrClのマイクロ波分光を行った。遷移金属原子を含むラジカル分子は、電子状態が近接して存在するため、それらの間で強い相互作用が存在し、特殊な化学結合を形成してると考えられる興味深い系であるが、分光研究はこれまでほとんど行われていなかった。本研究ではCrF及びCrClについて回転スペクトル中に現れる超微細構造を観測し、近接する電子状態間で強い相互作用が存存し、基底電子状態においても他の状態との混合が起こっていることを実験的に初めて明らかにした。2.成層圏におけるオゾン分子破壊の原因となるCl原子の供給源としてその存在が注目されてきた過酸化ラジカル、Cl00の分光研究をおこなった。新しい2重共鳴分光装置を用いることで、多くの回転遷移を観測し、より詳細な分子定数を決定することができた。これらをもとに、はじめて分子構造を決定した。さちにCl-00間の結合が通常の化学結合よりも極めて弱い事を明らかにし、この分子がCl原子の供給源としての重要性な役割をはたしうることを実験的にも証明した。
神経栄養院子の局所投与による歯髄・歯根膜神経線維の再生促進の可能性の探求

咀嚼運動に重要な役割を果たしている歯根膜機械受容器であるルフィニー神経終末は激しく分枝した軸索終末とそれに付随する特殊なシュワン細胞である終末シュワン細胞から成り立っている。この歯根膜ルフィニー神経終末の発生や維持、再生には多くの細胞増殖因子などが関わっていることが知られている。以前の研究において、神経栄養因子の一つである脳内来神経栄養因子(brain-derived neurotrophic factor;BDNF)の高親和性受容体であるTrkBが歯根膜ルフィニー神経終末の軸索や終末シュワン細胞のいずれにも発現するが、その分布様式は個々のルフィニー神経終末で異なっていることを明らかにしている。神経栄養因子の機能から、BDNFが歯根膜ルフィニー神経終末の発生、維持、再生に深く関わっていることが考えられ、BDNFの局所投与による神経再生の促進を検討する目的で、本年度はBDNF遺伝子欠損マウスを用い歯根膜ルフィニー神経終末の発生および支配神経損傷後の再生過程を検索した。その結果BDNF遺伝子欠損マウスでは歯根膜ルフィニー神経終末の分布密度が低いこと、またこれらのマウスにおいては歯根膜ルフィニー神経終末の発生、再生のいずれもがワイルドタイプと比較して遅れることが分かった。このときの終末シユワン細胞の動態変化を検索したところ、ワイルドタイプでの動態とBDNF遺伝子欠損マウスでの動態に明らかな差は認められなかったが、遺伝子欠損マウスでは終末シュワン細胞の数が低下していた。BDNFの高親和性受容体であるTrkBは歯根膜ルフィニー神経終末の発生早期から認められた。以上の所見から支配神経損傷後の歯髄・歯根膜神経線維の再生促進にBDNFの局所投与が有用である可能性が示唆された。以前の研究において、神経栄養因子の一つである脳由来神経栄養因子(brain-derived neurotrophic factor ; BDNF)の高親和性受容体であるTrkBが歯根膜ルフィニー神経終末の軸索や終末シュワン細胞のいずれにも発現するが、その分布様式は個々のルフィニー神経終末で異なっていることを明らかにしている。現在BDNFの高親和性受容体であるTrkBの歯根膜ルフィニー神経終末の発生および再生での動態変化について検索中である。
動脈ステントの屈曲・伸展による影響に関する研究

末梢動脈屈曲部に留置したステントの開存性と耐久性を検討するために,総腸骨動脈から外腸骨動脈にかけて留置したステントの変形と体位変換に伴うステントの作る角度の変化について検討したが、ステントの変形と体位変換に伴うステント角度の変化が血行動態的に影響を及ぼすか否かをDSAを用いて検討した。骨盤単純X線写真正面および側面像でステントの変形の有・無を確認した100例136病変中にステントの変形は11病変(8%)に認められた。ステントをオーバーラップさせ,2個以上留置した52病変中8病変(15%)でステント間のgapがみられた。次に,下肢を伸展した状態で骨盤側面の単純X線を撮像し,下肢を最大屈曲させた側面の単純X線を撮像し,伸展時の側面像を比べ、ステントの作る角度の変化を外腸骨動脈において測定し、バルーン拡張型と自己拡張型で比較検討し、自己拡張型が有意により屈曲,伸展することが示され,屈曲した動脈の走行に追従することが示唆された。DSAを行った30例について下肢伸展位と下肢屈曲位で撮影した側面DSAではステントの変形部、gap、屈曲部にも明らかな狭窄や造影剤のpoolingは認められず、腸骨動脈の血流は良好であった.腸骨動脈にステントを留置する場合は,変形やgapを生じることがあるため、動脈の走行に追従するステントの選択と十分なオーバーラップが必要であると考えられるが、変形や屈曲があっても血行動態的に影響を及ぼす可能性は少ないと考えられた。末梢動脈屈曲部に留置したステントの開存性と耐久性を検討するために,総腸骨動脈から外腸骨動脈にかけて留置したステントの変形と体位変換に伴うステントの作る角度の変化について検討した。骨盤正面と側面の単純X線を撮像し,ステントの変形の有・無を確認した。ステントの変形は100例136病変中11病変(8%)に認められた。次に,下肢を伸展した状態で骨盤側面の単純X線を撮像し,下肢を最大屈曲させた側面の単純X線を撮像し,伸展時の側面像を比べ、ステントの作る角度の変化を外腸骨動脈において測定し、バルーン拡張型と自己拡張型で比較検討した。ステントの作る角度の変化はバルーン拡張型で18.0°±19.6、自己拡張型では40.6°±22.5であり,自己拡張型が有意により屈曲,伸展することが示され,屈曲した動脈の走行に追従することが示唆された。以上より腸骨動脈にステントを留置する場合は,変形やgapを生じることがあるため、動脈の走行に追従するステントの選択と十分なオーバーラップが必要であるとの知見が得られた。この内容は2000年7月,弘前で行われた第17回日本メタリックステント研究会ならびに2001年2月,鹿児島で行われた第18回日本メタリックステント研究会において報告した。
蛍光バイオイメージング法による炎症性滑膜組織内のエストロゲンレセプター動態解析

慢性関節リウマチの滑膜細胞におけるエストロゲンレセプターの発現量を定量的に評価し、細胞内の活性酸素(ROS)産生、NO産生、過酸化脂質反応およびアポトーシスに対するエストロゲンの効果について検討した。RA患者の膝関節から摘出した新鮮滑膜組織8症例を用い、蛍光免疫組織染色およびウェスタンブロット法にてエストロゲンレセプターαの発現の多い2症例と発現の少ない2症例を選択した。これらの滑膜細胞にエストロゲンによる処理を行い、サイトカイン(IL-1β,IFN-γ,TNF-α)刺激ならびに無刺激下で培養した。細胞内のROS産生はHPF蛍光試薬を用い、NO産生はDAF蛍光試薬を用いてレーザー顕微鏡で観察を行った。過酸化脂質はHNE染色法にて、またアポトーシスはHoechst 33342染色法にて検出した。3個以上の核断片化をアポトーシスと判定した。NOS mRNAの発現量は、定量PCR法で解析を行った。エストロゲンレセプター発現の多い滑膜細胞では、エストロゲン処理とサイトカイン刺激により、ROS産生、NO産生および過酸化脂質の発現は有意に抑制され(P<.01)、またアポトーシスの割合も有意に減少した(P<.05)定量PCR法の解析結果から、NO産生が抑制されたのは、iNOS mRNA発現が抑制されたためであることが確認された。エストロゲンレセプター発現の少ない滑膜細胞では、エストロゲンによる効果は本質的に認められなかった。結論として、エストロゲンはROSやNO産生および過酸化脂質の発現を抑制することにより、細胞死に対する予防効果に重要な役割を果たしていることが示唆された。炎症関節の滑膜組織において、エストロゲンレセプターの分布やエストロゲン効果の細胞内でのpathwayについて言及した報告は全く見当たらない。本研究では、慢性リウマチ性関節炎(RA)患者の滑膜細胞内におけるエストロゲンレセプターの局在と分布量を蛍光バイオイメージング法により定性的、定量的に評価した。また、細胞内の活性酸素(ROS)産生、NO産生および過酸化脂質反応に対するエストロゲンの応答性を検討した。滑膜サンプル間で、エストロゲンレセプターの発現量に違いがみられた。滑膜細胞内のROS産生、iNOS発現、NO産生および脂質過酸化物質の発現は、サイトカイン刺激により有意に高く、17βエストラジオールのpretreatmentにより、それらの発現は抑制された。また、エストロゲン効果は、細胞内のエストロゲンレセプターの発現量と密接に関係していた。慢性関節リウマチ(RA)患者の滑膜細胞内におけるエストロゲンレセプターの発現量を定量的に評価し、また細胞内の活性酸素(ROS)産生、NO産生、過酸化脂質反応およびアポトーシスに対するエストロゲンの効果を検討した。実験には、RA患者の膝関節から摘出した新鮮滑膜組織9症例を用い、蛍光免疫組織染色およびウェスタンブロット法にてエストロゲンレセプターαの発現の多い2症例ならびに発現の少ない2症例を選択した。コントロール群としてPWS-Y、MCF-7細胞を用いた。細胞内のROS産生はHPF試薬を用い、NO産生はDAF蛍光試薬を用いてレーザー顕微鏡(波長488nm)下で観察を行った。過酸化脂質はモノクロナール抗体によるHNE染色法にて、またアポトーシスはHoechst 33342染色法にて検出した。3個以上の核断片化がみられたらアポトーシスと判定した。エストロゲン

レセプター発現の多い滑膜細胞では、エストロゲン処理とサイトカイン刺激により、ROS産生、NO産生および過酸化脂質の発現は有意に抑制され(p<0.01)またアポトーシスの割合も有意に減少した(p<0.05)。定量PCR法の解析結果から、NO産生が抑制されたのは、iNOS mRNA発現が抑制されたためであることが確認された。エストロゲンレセプター発現の少ない滑膜細胞では、エストロゲン効果は本質的に認められなかった。結果的、エストロゲンはROSやNO産生および過酸化脂質の発現を抑制することにより、細胞死に対する予防効果に重要な役割を果たしていることが示唆された。