hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
白血病における骨髄微小環境誘導性ガレクチンー３の機能解析と新規分子標的治療の開発

骨髄環境特異的に慢性骨髄性白血病(CML)細胞に発現が誘導されるGalectin-3(Gal-3)の分子細胞生物学的効果と制御法について研究した。Gal-3発現はERK,AKT活性化の誘導、細胞外環境におけるSERPINA1-アルブミン複合体の抑制によってCML細胞の細胞増殖を亢進したほか、分子標的薬や抗癌剤によるアポトーシス誘導をMCL-1発現亢進により抑制した。また、Gal-3発現は骨髄内でのCML細胞の安定的棲息を促進した。こうしたメカニズムの克服には既存の分子標的薬にくわえ、Protein phosphatase 2A活性化薬の併用が有用であることが明らかになった。本研究では骨髄間質細胞、細胞外マトリクスとの相互作用によって白血病細胞内に発言誘導されるGalectin-3(Gal-3)の白血病細胞における細胞増殖、治療抵抗性、細胞遊走など病態形成における機能を明らかにし、その制御法開発による新規分子標的治療法の確立を目指してきた。研究2年目にである平成24年度は、Gal-3過剰発現による白血病細胞内での分子制御異常、Gal-3過剰発現によるparacrineな白血病細胞増殖促進のメカニズム、ならびにGal-3によるアポトーシス抵抗性の解除をもたらす薬剤の探索研究を行なった。白血病細胞ではGal-3発現によりアポトーシス抵抗性分子であるMCL-1の過剰発現が誘導されること、PI3K-AKT、RAS-MAPK経路などの活性化が誘導されることが確認され、それらによるアポトーシス抵抗性の解除には、現在の治療薬であるチロシンキナーゼ阻害剤に加え、従来、多発性硬化症の治療薬として使用されているFTY720が有効であることを見出した。FTY720はAKTやERKの活性化を阻害するほか、BIM, BIDなどのアポトーシス誘導分子を白血病細胞内に誘導し、MCL-1過剰発現によるアポトーシス抵抗性を解除する。一方、Gal-3過剰発現によって腫瘍環境内におけるSERPINA1の安定性が阻害され、これによって白血病増殖が促進することが見出された。遺伝子導入によりGal-3を安定的に過剰発現したCML細胞株亜株は親株に比して分子標的薬剤であるチロシンキナーゼ阻害剤(TKIs)やdoxorubicin、cytarabineなど抗がん剤によるアポトーシス誘導に対して抵抗性を示した。また、Gal-3過剰発現によりアポトーシス抵抗性BCL-2ファミリー分子であるMCL-1の発現誘導が認められた。従前、われわれはTKIのBCR-ABL阻害によるCML細胞のアポトーシス誘導において、アポトーシス誘導性BH3-only protein (BIM、BAD、BID、PUMA、BIK、HRK、NOXA、BMF)のうち、BIMの誘導が必須であることを明らかにしてきた。Gal-3により発現亢進するMCL-1は、BIMに結合し、そのアポトーシス誘導作用を中和してしまうため、細胞死誘導効果が減弱すると想定される。これらの結果から、骨髄微小環境内ではCML細胞に対してTKIによってBCR-ABLシグナルを阻害しても、CML細胞を完全に駆逐することは困難となるものと推定される。そこで、BIMと同時にBIM以外のBH-3 only proteinを誘導・活性化しうる薬剤を探索的にスクリーニングしたところ、protein phosphatase 2A活性化剤であるFTY720がBCR-ABL非依存的にBIMならびにBIDを誘導・活性化することでTKIとの併用によりGal-3によるアポトーシス抵抗性を克服しうることを見出した。FTY720は多発性硬化症に対する免疫抑制剤として、現在、すでに日常診療に活用されている薬剤である。既存薬の新たな活用法が見出されたものと期待できる。BCR-ABLチロシンキナーゼ(TK)に対する特異的阻害剤の開発により慢性骨髄性白血病(CML)の治療予後は劇的に改善したが、完治はいまだに困難である。白血病細胞は生体内では骨髄環境構成因子の支持・庇護のもとに生存・増殖している。本研究ではCML細胞における治療抵抗性を促進する骨髄環境特異的な分子メカニズムを網羅的に探索・解明し、その制御法の探索による新規の分子標的治療法の確立を目指す。CML由来細胞株ではfibronectin(FN)や骨髄間質細胞HS-5との共培養によりTKIや抗ガン剤に対する感受性低下が誘導た。この培養条件におけるCML細胞株での遺伝子発現変化をAffymetrix Gene Chip arrays、Ingenuity pathway analysissoftwareにてシグナル経路を解析したところ、Galectin-3(Gal-3)の発現亢進が同定された。

CML細胞株MYL、K562、BV173,MYLにGal-3を遺伝子導入したところ、Gal-3過剰発現細胞は親株に比べてより高い細胞増殖能を有した。また、Gal-3過剰発現によりDOX、Ara-C、VP-16、VCRのほか、BCR-ABL TKIであるimatinib、dasatinibによるアポトーシス誘導効果が明らかに減弱した。これはGal-3強制発現状態ではAkt, Erkのリン酸化による活性化、Mcl-1の高発現が誘導されたこととの関連が推測される。Gal-3過剰発現MYL細胞はより、高度の細胞遊走能を有することも明らかになった。Gal-3のin vivo機能を検討したところ、Gal-3はCML細胞の骨髄環境への安定的生着と持続的棲息を促進し、CML慢性期類似の病態形成に促進的に関与するものと考えられた。従前の研究目標であったGal-3過剰発現による白血病細胞の分子制御異常の一端を解明し、それらを制御しうる新規治療戦略、ならびにその理論的背景を特定することができた。当初、3年計画であった本研究において2年終了時点で、これらの研究結果を得ることができたうえ、それぞれについて2編の論文執筆、ならびに投稿(いずれも審査中)に至ることができたことは当初の計画以上の進展と考える。CML細胞株において骨髄微小環境の疑似モデルである骨髄間質細胞との共培養によってGal-3が特異的に発現誘導されること、Gal-3発現によって細胞増殖、ならびに細胞死抵抗性の亢進による薬剤耐性が誘導されることが明らかになった。さらに本研究によりGal-3がCML細胞の骨髄腫瘍環境における安定的棲息、病態の維持を正に促進することが明らかになった。CMLに対する更なる新規分子標的治療戦略開発において重要と考えられる。同時にGal-3の発現誘導における分子メカニズム、Gal-3により支配される下流のエフェクター分子についてはいまだに不明点が多く、現在も研究を継続中である。白血病マウスモデルによるGal-3のin vivo病態形成における機能の検討、すなわち、Gal-3がin vivoにおいて白血病増殖を促進する可能性を検討するため、以下を検討する(i) Gal-3過剰発現白血病細胞亜株、ならびに親株を2Gyの放射線照射をおこなった免疫不全マウスNOD/SCIDマウスに経静脈的に移植し、白血病モデルマウスを作製する。(ii)ヒト白血病細胞の生着、ならびに増殖について尾静脈からの少量採血によって検討する。同時に体重変化について検討する。白血病細胞の増加が高度となるか、体重減少が高度となった時点で内臓病変について安楽死のもと検討する。(iii)白血病モデルを作成ののち、化学療法剤による治療効果を検討し、in vivoにおけるGal-3過剰発現の治療的意義を明らかにする。Gal-3を標的とした分子標的薬の探索研究Gal-
Ａ群レンサ球菌感染症におけるＲａｂ　ＧＴＰａｓｅを介した細胞内動態の解明

本研究では、A群レンサ球菌をモデルとして用い、膜輸送制御に関わるタンパク質群である低分子量Gタンパク質Rab GTPaseおよび、その負の調節因子として働くTBC/RabGAPに着目することで、選択的オートファジーの制御機構を明らかにすることを目的とした。今回、Rab35とそのRabGAPであるTBC1D10Aを選択的オートファジーの新規制御因子として同定した。Rab35は、A群レンサ球菌感染細胞だけでなく、ミトコンドリアの分解に関わるマイトファジー、細胞内で異常に蓄積したタンパク質の凝集体の除去に関与するアグリファジー、非選択的オートファジーである栄養飢餓誘導時のオートファジー等の制御にもにおいてオートファジーのアダプタータンパク質であるNDP52を制御していることを明らかにした。マイトファジーにおけるNDP52のミトコンドリアへのリクルートには、TBK1キナーゼが重要であること、またTBK1はNDP52をリン酸化することが報告されている。実際、TBK1の阻害剤を処理、もしくはTBK1をノックアウトしたところ、Rab35の菌へのリクルートに影響を与えず、NDP52のリクルートを阻害した。この結果から、ゼノファジーにおいてもTBK1はNDP52の局在化に関与することが明らかとなった。さらにRab35を介したNDP52のリクルートへの関与を検証した結果、TBK1ノックアウト細胞では、Rab35とNDP52の結合が阻害された。すなわち、TBK1はRab35とNDP52の結合を促進することでNDP52のリクルートを制御することが示唆された。28年度が最終年度であるため、記入しない。まず、13種のTBC/RabGAPのEmGFP融合発現体を作製し、A群レンサ球菌感染時におけるオートファジーの形成に関与するTBC/RabGAPのスクリーニングを行った。その結果から、未だオートファジーへの関与について報告がされていないTBC1D10Aに着目し、その機能解析を行った。TBC1D10AおよびTBC1D10Aの酵素活性を欠損させた変異体(R160KまたはD157A)を強発現させた細胞にて解析を行ったところ、TBC1D10Aはその酵素活性依存的にアダプタータンパク質であるNDP52のGASへのリクルートおよびオートファゴソーム形成に関与することが明らかになった。TBC1D10AはRab27Aおよび35の特異的GAP活性を持つことが報告されている。これより、Rab27AとRab35をノックダウンさせた細胞にて解析を行ったところ、Rab35がオートファゴソームの形成に関与することが明らかになった。さらに、Rab35のノックアウト(KO)細胞を作製、解析を行ったところ、Rab35はNDP52のGASへのリクルートおよび、その後のオートファゴソーム形成に関与することが明らかになった。また、免疫沈降による解析より、Rab35とNDP52は複合体を形成することが明らかになった今回の結果は、選択的オートファジーの制御機構の一端をを明らかにしており、学術的な観点だけでなく臨床応用に向けたオートファジー制御の観点からも非常に重要な知見であると考えられる。当該年度は、A群レンサ球菌(Group A streptococcus, GAS)をモデルとして用い、膜輸送制御に関わるタンパク質群である低分子量Gタンパク質であるRab GTPaseおよびにその負の調節因子として働くTBC/RabGAPに着目することで、選択的オートファジーの制御機構を明らかにすることを目的に解析を行った。採用1年目にA群レンサ球菌感染細胞においてオートファジーのアダプタータンパク質であるNDP52がRab35によって制御を受けていることが明らかになったことから、採用2年目の前年度においてはミトコンドリアの分解に関わるマイトファジー、細胞内で異常に蓄積したタンパク質の凝集体の除去に関与するアグリファジー、非選択的オートファジーである栄養飢餓誘導時のオートファジー等の制御にもRab35がNDP52の制御に関与する可能性が示唆されたため、その検証を行った。その結果、マイトファジーおよび、アグリファジー、栄養飢餓誘導時のオートファジー等の制御にもRab35およびNDP52が関与していることが明らかにした。具体的には、CRISPR/Casシステムを用いたゲノム編集法によりHaLa細胞のRab35およびNDP52ノックアウト細胞を作製してマイトファジーおよび、アグリファジー、栄養飢餓誘導時のオートファジーを誘導することによってRab35の機能を明らかにした。今回の結果は、免疫機構として働く細菌感染時のオートファジーだけでなく、より広義なオートファジーの制御機構の一端を明らかにしたことから、学術的観点だけでなく臨床応用に向けたオートファジー制御の観点からも非常に重要な知見であると考えられる。本研究は、A群レンサ球菌感染時のオートファジー制御に限らず、ミトコンドリアの分解に関わるマイトファジー、細胞内で異常に蓄積したタンパク質の凝集体の除去に関与するアグリファジー、非選択的オートファジーである栄養飢餓誘導時のオートファジー等の制御にもRab35およびNDP52が関与していることが明らかになり、学術的意義の大きな知見であると考えられる。当初は、来年度に同定されたRabタンパク質のエフェクタータンパク質のスクリーニングを行う予定であったが、Rab35のエフェクタータンパク質としてNDP52が同定できている。また、この研究に関しては学会発表を行い、現在、論文投稿中である。ことからも当初の計画以上に進展していると判断した。

本研究では、A群レンサ球菌をモデルとして用い、膜輸送制御に関わるタンパク質群である低分子量Gタンパク質Rab GTPaseおよび、その負の調節因子として働くTBC/RabGAPに着目することで、選択的オートファジーの制御機構を明らかにすることを目的とした。今回、Rab35とそのRabGAPであるTBC1D10Aを選択的オートファジーの新規制御因子として同定した。Rab35は、A群レンサ球菌感染細胞だけでなく、ミトコンドリアの分解に関わるマイトファジー、細胞内で異常に蓄積したタンパク質の凝集体の除去に関与するアグリファジー、非選択的オートファジーである栄養飢餓誘導時のオートファジー等の制御にもにおいてオートファジーのアダプタータンパク質であるNDP52を制御していることを明らかにした。マイトファジーにおけるNDP52のミトコンドリアへのリクルートには、TBK1キナーゼが重要であること、またTBK1はNDP52をリン酸化することが報告されている。実際、TBK1の阻害剤を処理、もしくはTBK1をノックアウトしたところ、Rab35の菌へのリクルートに影響を与えず、NDP52のリクルートを阻害した。この結果から、ゼノファジーにおいてもTBK1はNDP52の局在化に関与することが明らかとなった。さらにRab35を介したNDP52のリクルートへの関与を検証した結果、TBK1ノックアウト細胞では、Rab35とNDP52の結合が阻害された。すなわち、TBK1はRab35とNDP52の結合を促進することでNDP52のリクルートを制御することが示唆された。本研究はA群レンサ球菌感染時においてRab35が選択的オートファジーのアダプタータンパク質であるNDP52と細胞内で相互作用し、この局在を制御するという全く新しい発見であり、細菌感染時のオートファジーだけでなく、選択的オートプァジーである傷害を受けたミトコンドリアの分解に関与するマイトファジーや非選択的オートプァジーである栄養飢餓が誘導するオートファジー等の制御にも関与する可能性を示唆する学術的意義の大きい重要な知見であると考えられる。当初予定していた、1年目でのRabタンパクのスクリーニングとその機能解析は予定通り終了し、学会発表を行ったことに加え、2年目に予定していた、Rabタンパク質の相互作用因子の同定にも成功していることから、当初の計画以上に進展していると判断した。今後は、新たにRab GTPaseの負の調節因子として働くTBC/RabGAPの一つであるTBC1D18について詳細な解析を行う予定である。上記に記した研究結果とは別に、これまでに、TBC1D18はそのGAP活性依存的にA群レンサ球菌感染時のオートファゴソーム形成を著しく抑制することが明らかになっている。このことから、TBC1D18に焦点を当て、A群レンサ球菌の細胞間移動を含めた細胞内動態の解明を目指す。具体的には既に構築済みであるTBC1D18強発現細胞およびにノックアウト細胞を用いてその詳細な機能解析に着手する予定である。また、細胞間移動経路に関しても解析に着手する。まず、リアルタイムイメージングを用いてA群レンサ球菌が感染細胞間を移動しうることを観察する。次に、菌の細胞間移動に関与するRabの同定を行う。
低出生体重児特有の感覚特性を伴う発達障害の病態解明とその治療戦略

今回の研究では早産児において以下の点を明らかにし、早産児の特異的な発達過程の病態解明に繋げる予定である。それぞれ、修正1歳半、3歳、6歳を目安に行う。1質問紙(感覚プロファイル)による感覚特性の評価2味覚に関する調査(3歳、6歳)3重心動揺計による前庭覚の調査(6歳)4新版K式発達検査による発達調査(3歳、6歳)今回の研究期間内ではまずは現時点での感覚特性の評価を行い、今後の治療方針へとつなぐ。
ロメフロキサシン経口投与後の歯根肉芽腫への移行について

歯根肉芽腫を摘出した患者10人を対象し、術前に、Lomefloxacin 100mgを1回投与し、1-4時間に歯根肉芽腫を採取した。また、14人には、Lomefloxacinを600mg/1日(200mgを1日3回)の容量にて1日投与し、最終投与後、2、2.5あるいは3時間に歯根肉芽腫を採取した。歯根肉芽腫の採取時間にあわせて、血液を肘正中皮静脈より採血して、血清を得て試料とした。血清、歯根肉芽腫中のLomefloxacin濃度は、paper disk法にて測定した。1回投与では、血清濃度;0-1.46mug/ml、歯根肉芽腫濃度;0-6.12mug/mlであった。連続投与では、血清濃度;1.51-3.91mug/ml、歯根肉芽腫濃度;1.30-6.43mug/gであった。連続投与後の血清、歯根肉芽腫中Lomefloxacin濃度は、1回投与と比較して、高い濃度が認められ症例間のバラツキが小さい傾向がみられた。ロメフロキサシンの口腔感染症より分離したalpha-hemolyitc streptococci、Staphylococcus aureus、Neisseriaspp.に対するMIC_<80>は、それぞれ2、0.5、0.12mug/mlであった。1回投与後の歯根肉芽腫中ロメフロキサシン濃度は、10症例中4例が3種類の細菌のMIC_<80>以上であった。また、連続投与では、14症例中12例がMIC_<80>以上であった。口腔外科臨床で用いられているロメフロキサシンの優れた臨床成績(68-77%)を裏ずける結果であった。
光合成細菌の反応中心における電荷分布と電子伝達反応

光合成細菌を材料に,光化学反応中心の電子伝達における電荷分布の変化に関する研究を行った.また,その電子伝達をひきおこすところの,光エネルギ-の吸収と移動に関する研究をあわせ行った.これらの研究により,生体構造内を電子や励起エネルギ-が移動してゆく際の,電場やタンパク質の役割を中心とする局所環境の影響について以下のような新しい知見を得た.1.紅色光合成細菌Rhodopseudomonas molischiaumを用いて,チトクロムの光酸化反応の速度論的解析を行い,高い酸化還元電位を持つチトクロムも低い酸化還元電位を持つチトクロムも共に1マイクロ秒前後のほぼ等しい光酸化速度を持つことがわかった.2.上記の(1)の結果と,カロチノイドスペクトルシフトによる膜電位測定の結果から,電子の移動距離と膜電位の形成の大きさは,一次近似的予想に反して比例的関係にないことがはっきりした.それを説明するために,タンパク質内やまわりの溶液環境に影響されて電位分布が複雑化しているとする仮説を提唱した.3.好熱性緑色光合成細菌を用いて,光化学系I型の反応中心を持つ種でも,反応中心結合型チトクロムの性質は,紅色細菌のものと良く似ていることを示し,生物進化の過程で局所環境が反応の最適化にはたしてきた役割を明らかにしていく良い系を見つけた.4.電子移動と多くの共通点を持つ励起エネルギ-移動について,緑色光合成細菌をもちいて解析を進め,タンパク質がほとんど関与しない励起エネルギ-移動系があること,人工的な色素集合構造が自己集合的に形成されそれが生体内の構造とたいへん良く似ていることを明らかにした.光合成細菌を材料に,光化学反応中心の電子伝達における電荷分布の変化に関する研究を行った.また,その電子伝達をひきおこすところの,光エネルギ-の吸収と移動に関する研究をあわせ行った.これらの研究により,生体構造内を電子や励起エネルギ-が移動してゆく際の,電場やタンパク質の役割を中心とする局所環境の影響について以下のような新しい知見を得た.1.紅色光合成細菌Rhodopseudomonas molischiaumを用いて,チトクロムの光酸化反応の速度論的解析を行い,高い酸化還元電位を持つチトクロムも低い酸化還元電位を持つチトクロムも共に1マイクロ秒前後のほぼ等しい光酸化速度を持つことがわかった.2.上記の(1)の結果と,カロチノイドスペクトルシフトによる膜電位測定の結果から,電子の移動距離と膜電位の形成の大きさは,一次近似的予想に反して比例的関係にないことがはっきりした.それを説明するために,タンパク質内やまわりの溶液環境に影響されて電位分布が複雑化しているとする仮説を提唱した.3.好熱性緑色光合成細菌を用いて,光化学系I型の反応中心を持つ種でも,反応中心結合型チトクロムの性質は,紅色細菌のものと良く似ていることを示し,生物進化の過程で局所環境が反応の最適化にはたしてきた役割を明らかにしていく良い系を見つけた.4.電子移動と多くの共通点を持つ励起エネルギ-移動について,緑色光合成細菌をもちいて解析を進め,タンパク質がほとんど関与しない励起エネルギ-移動系があること,人工的な色素集合構造が自己集合的に形成されそれが生体内の構造とたいへん良く似ていることを明らかにした.
甲状披裂筋の収縮と粘膜移動性に関する研究

犬の喉頭を用いて甲状披裂筋(内筋)の声帯振動に対する影響について検討した。実験には5個の成犬の喉頭を用いた。まず内筋収縮時および非収縮時の声帯の粘膜移動性(移動性)を測定した。その後、喉頭を摘出し移動性の測定条件と同様の条件下で吹鳴を行い、気管側からみた声帯振動をストロボ光および連続光下に観察し、標識点との位置関係からヒダ状粘膜隆起(ヒダ状隆起)の形成部位を推定した。吹鳴終了後、喉頭の前額断面の薄切切片を作成し、ヒダ状隆起の形成部位を組織学的に検討した。その結果、内筋非収縮時には、移動性は遊離縁より下方1mmの部位から下方に向かって次第に小さくなり、遊離縁より23mm下方の部位で極小となった。その後、移動性は一旦大きくなった後再び小さくなった。ヒダ状隆起の形成部位は移動性が極小となった部位とほぼ一致した。内筋収縮時には、移動性が極小となる部位は非収縮時に比べ下方へと移動した。ヒダ状隆起の形成部位も非収縮時に比べ下方へと移動し、移動性が極小となる部位とヒダ状隆起の形成部位はほぼ一致した。なお以上の結果は5例全例で同様であった。組織学的検討の結果、内筋非収縮時に移動性が極小となった部位の周辺で、粘膜固有層(固有層)が薄く上皮下に筋層が最も近接していた。以上の結果より、内筋非収縮時には固有層が薄く上皮下に筋層が最も近接する部位の周辺で移動性が極小となり、移動性が極小となった部位にヒダ状隆起が形成されると考えられた。内筋収縮時には固有層が薄く上皮下に筋層が最も近接する部位よりも下方で移動性が極小となり、移動性が極小となった部位にヒダ状隆起が形成されると考えられた。これらのことより、内筋による声帯振動の調節は、その収縮の移動性に影響がヒダ状隆起の形成部位を変化させることにより行われていると考えられた。
がんの病勢制御と健康寿命延長に寄与する統合的分子病態診断システムの開発

癌は予後不良な重篤疾患の一つであり、我が国と世界において年々患者数は増加している。標準的な癌治療で効果が得られる場合はいまだ限られており、完全に治癒できる早期の段階で癌を発見できる診断マーカーは実用化されていない。本研究においては、新しい癌の診断バイオマーカーの開発に利用可能な癌関連分子を複数発見した。これらのバイオマーカーは、早期癌の発見、治療効果の確認、治療法の選択のみならず、癌の新薬の開発に貢献するものと考えられる。本研究では我が国の癌の3分の2を占める5大癌(胃癌、大腸癌、肝臓癌、肺癌、乳癌)等の組織・血清試料とこれまで培ってきた網羅的ゲノム・プロテオーム解析技術を基盤として、癌の発症リスクから未病状態および疾患発症・増悪を早期に感知する統合的病態診断系を開発し、その迅速な癌予防・診断・治療への展開による癌年齢層の健康寿命の延長をめざし、当該年度は、以下の通り解析基盤(技術・試料)の確立と血清バイオマーカー候補分子の同定を行った。1.5大癌(胃癌、大腸癌、肝臓癌、肺癌、乳癌)等の臨床試料収集と迅速多検体解析:それぞれの癌種につき各種サンプルセット(早期癌診断時、進行期癌診断時、根治的外科手術前後、健常者)の臨床試料(組織・血清等)の蓄積を行い、解析可能な試料を用いて網羅的遺伝子発現情報解析等で独自に同定した癌バイオマーカー候補の血清解析や免疫組織化学染色を行った。2.5大癌(胃癌、大腸癌、肝臓癌、肺癌、乳癌)のゲノム・プロテオーム解析情報と臨床情報の統合化:得られた血清、癌組織検体の臨床情報の収集を進めるとともに、これまで同定した癌バイオマーカー候補につき、正常臓器組織やがん組織におけるゲノム解析情報、予後相関情報を各種データベースならびに独自解析により集積し、癌特異的バイオマーカー開発の情報基盤の構築を開始した。また、これまでに同定・確認された日本人集団においてゲノムワイド水準で有意な再現性を示す発癌リスク遺伝子多型の基盤情報の収集を進めた。本研究では我が国の癌の3分の2を占める5大癌(胃癌、大腸癌、肝臓癌、肺癌、乳癌)等の組織・血清試料とこれまで培ってきた網羅的ゲノム・プロテオーム解析技術を基盤として、癌の発症リスクから未病状態および疾患発症・増悪を早期に感知する統合的病態診断系を開発し、その迅速な癌予防・診断・治療への展開による癌年齢層の健康寿命の延長をめざし、当該年度は、前年度に引き続き以下の通り解析基盤(技術・試料)の充実と各種バイオマーカー候補分子の同定を行った。(1)5大癌等の臨床試料収集と迅速多検体解析:各癌種につき各種サンプルセットの臨床試料(組織・血清等)の集積を引き続き行い、解析可能な試料から網羅的遺伝子発現情報解析等で同定した癌バイオマーカー候補の血清解析や遺伝子発現解析を行った。(2)5大癌等のゲノム・プロテオーム解析情報と臨床情報の統合化:集積試料の臨床情報を取得するとともに、これまで同定した癌バイオマーカー候補につき、正常臓器組織や癌組織におけるゲノム解析情報、予後相関情報を各種データベースならびに独自解析により集積し、癌特異的バイオマーカー開発の情報基盤の構築と拡充を行った。(3)5大癌組織マイクロアレイによる臨床病理学的評価:これまでに選出された血清バイオマーカーおよび網羅的発現情報解析で癌組織における高レベルの遺伝子発現が確認されたバイオマーカーの抗体を入手して、独自に作製した各種癌組織および同一患者由来の各種正常臓器由来組織をスポットした詳細な臨床情報を備えた5大癌の組織マイクロアレイを使用し免疫組織染色を行い、蛋白発現レベルが各癌種の患者の生命予後の短縮やリンパ節・遠隔転移等の臨床的な癌の悪性度に相関する組織染色バイオマーカーを抽出した。以上、解析基盤の拡充とヒト腫瘍の診断・治療の標的分子となる候補バイオマーカー群を同定して、成果を学会・論文発表した。本研究では我が国の癌の3分の2を占める5大癌(胃癌、大腸癌、肝臓癌、肺癌、乳癌)等の組織・血清試料とこれまで培ってきた網羅的ゲノム・プロテオーム解析技術を基盤として、癌の発症リスクから未病状態および疾患発症・増悪を早期に感知する統合的病態診断系を開発し、その迅速な癌予防・診断・治療への展開による癌年齢層の健康寿命の延長をめざした。当該年度は、これまでの研究成果を踏まえ、臨床応用を含む社会還元を念頭に置き、ヒト腫瘍の診断・治療の標的分子となる候補バイオマーカー群の同定と解析を行い、成果を学会・論文発表した。(1)血清バイオマーカーによる癌の診断法構築:同定した血清バイオマーカー候補に対する抗体を用いたELISA法やPCR法等による肺癌の早期血清診断システムの構築を行った。また、これまでに構築した複数の血清診断アッセイ系を組み合わせた診断系の可能性を検討した。(2)免疫組織学的マーカーによる癌の迅速悪性度診断:同定した免疫組織学的マーカー候補につき、肺癌、大腸癌、乳癌等の組織

マイクロアレイを用いて発現を確認後、臨床病理・予後情報との相関を検討し、癌の悪性度予測に基づいた治療方針の決定や再発の早期発見、病勢制御を目的とした早期からの集学的治療選択に応用可能な組織標本を用いた癌の悪性度診断法の構築を行った。(3)癌の迅速病態診断系の検討:上記のマーカー候補を各臨床診断段階で有機的に使い分ける低コスト・簡易・迅速解析の可能な癌の迅速診断系の構築に向けたアッセイ系の検討を行った。(4)適用拡大と検証研究への取り組み:上記のマーカー候補の各種のがん種への適用拡大や検証試験に向けた試料収集を行った。26年度が最終年度であるため、記入しない。病態検査学26年度が最終年度であるため、記入しない。5大癌の臨床試料と情報の集積を進め、利用可能な試料と独自に同定したバイオマーカーについて解析を実施するとともに、得られた情報を統合した癌特異的バイオマーカー診断の情報基盤の構築を開始できたため。5大癌の臨床試料と情報の集積と拡充を進め、独自に同定したバイオマーカーについて解析を実施するとともに、得られた情報を統合した癌特異的バイオマーカー診断の情報基盤の構築・拡充と多数検体を用いた癌の悪性度に相関する組織染色バイオマーカーの抽出を開始できたため。平成24年度に得られた結果を基にして、第2段階として、引き続き選出された血清バイオマーカー候補および網羅的発現情報解析で癌組織における高レベルの遺伝子発現が確認されたバイオマーカー候補の抗体やプライマー等を入手・作製して、多数の癌患者群での発現分布と臨床病理学的評価(疫学因子、組織型、分化度、病期、予後との相関)を進め、癌組織バイオマーカー分子の同定を行う。平成25年度に得られた結果を基にして、第3段階として、引き続き各種の癌バイオマーカー分子の同定を行うとともに、これらを組み合わせた最小のマーカー数で癌を早期に検出する、もしくは定量的に悪性度を予測し、治療方針の決定や集学的治療選択に応用可能な癌の早期診断および悪性度診断法の基盤情報を取得する。
19世紀オスマン帝国における中央-辺境関係の研究-司法制度を中心に

司法制度に着目して19世紀オスマン帝国の中央-辺境関係の解明を図る本研究の最終年度にあたる平成19年度には、以下の研究を行った。1.前年度のリビアの文書館・研究所の調査をもとに、これらの研究機関の所蔵状況などを紹介する学界動向を発表した。この論文ではリビア国立文書館にオスマン帝国時代のシャリーア法廷文書のみならず、19世紀末以降の制定法裁判所の資料も豊富に存在することを指摘した。2.これまで収集した資料をもとに、19世紀前半のオスマン帝国の司法改革とその地方社会への適用・波及に関するトルコ語の論文を発表した。この論文では従来知られていなかった1840年の裁判官訓令を利用し、その現代トルコ語転写を掲載した。3.平成19年8月25日9月3日、9月10日17日の期間にトルコ、イスタンブルに出張し、前年度に引き続きイスタンブル・ムフティー局附属文書館、総理府オスマン文書館、イスラーム研究センター図書館などで調査を行った。とくにオスマン帝国末期の辺境域の司法制度に関する資料(帳簿類約十冊、文書数十点)を閲覧し複写及びデジタル画像を入手した。今回の調査では、リビアにおける「ハナフィー化」政策を示す重要な文書を入手することができた。4.平成19年12月及び平成20年1月にそれぞれ「アジア・ロシア」とコーカサスをテーマとした国際シンポジウムに司会として参加し、帝政ロシア及びその支配下の中央アジア・コーカサスに関する新しい知見を得るとともに、これら地域とオスマン帝国との比較に関して内外の研究者と意見を交換した。5.これまで行ってきた研究から、オスマン帝国の辺境地域、とくにリビアとイエメンにおける司法制度改革のプロセス及び現地社会に与えた影響を解明し、シャリーア法廷の重視や、ハナフィー派法学と現地の慣行との相克などの特徴を明らかにすることができた。また、帝国権力によるシャリーア施行の奨励・監督、「現地人法廷」の設置、「ハナフィー」化といった問題において、イギリス、フランス、とくにロシアの対ムスリム政策や植民地法制一般と一定の共通性が見いだされ、帝国間の比較の方向性を探ることができた。これらの成果は論文として発表する予定である。2006年8月16日8月30日及び9月4日25日の期間、トルコ・イスタンブルに出張し、調査を行った。イスタンブル・ムフティー局文書館及び総理府オスマン文書館において、オスマン帝国の文書史料を調査・収集した。とくに、イエメンやリビアなどにおける司法組織に関する公文書について大きな収穫をえた。ベヤズット国立図書館、スレイマニエ図書館、イスラム研究センター図書館、イスタンブル大学附属貴重書図書館では、本研究課題にかかわる刊行資料、研究支献の調査・複写を行った。とくに、法令集、アラブ地域の州年鑑、アラブ地域に関する同時代のオスマン語刊行物の収集ができたことに大きな成果があった。また、9月19日に科学芸術財団のトルコ研究センターにおいて、「末期オスマン帝国のカーディー制度」という題目で講演(トルコ語)を行い、現地の若手研究者と意見交換した。2006年8月30日から9月4日にかけてマケドニアのスコピエ及びテトヴォに出張した。スコピエでは国立歴史研究アカデミーを訪問し、アカデミーと国立文書館の出版物を収集したほか、アカデミーのオスマン史研究者と意見交換を行った。テトヴォでは、市の文書館を訪問し、郷土史研究者と交流を深めたほか、モスク、神秘主義教団の修道場、墓地、民家などのオスマン時代の史跡の見学を行った。そのほか、本研究をさらに深化させるための基礎的作業として、論文「西アジア・北アフリカ(近現代)」において2004年の日本における中東研究を批判的に検討し、共著書所収「日露戦争とイエメン」では、オスマン帝国のイエメン支配を近代日本との比較の中で考察することを試みた。以上の調査、収集等を踏まえ、来年度開催される第6回アジア中東学会連合大会及び第2回中東学会世界大会で報告するために、オスマン帝国末期の中央-辺境関係の事例研究となる報告要旨及び報告原稿(英語)を執筆した。6月11-16日、第2回世界中東学会大会(於アンマン)に参加して報告(Judicial Reforms in the Ottoman Borderlands)を行い、末期オスマン帝国による辺境地域の統合過程を裁判官の任命に着目して分析した。1月13、14日、国際ワークショップ「19世紀中東・バルカンへの新しいアプローチ-オスマン帝国における近代国家の形成」(於千葉大学)にて報告(Administration of Justice in the Ottoman Arab Frontiers)し、リビアとイエメンにおけるオスマン帝国の司法行政を政策決定過程に注目して分析した。2月27日3月8日、トルコ・イスタンブル(2/2728、3/57)及びリビア・トリポリ(2/283/5)に出張し、トルコでは、総理府オスマン文書館及びイスタンブル・ムフティー局附属文書館にてオスマン帝国末期の中央-辺境関係に関係する文書資料を調査、収集し、リビアでは、国立歴史文書館でオスマン帝国支配期に関する文書資料の所蔵状況を調査した。また、リビア歴史研究ジハード・センターを訪問し、研究者と意見交換を行った。また、ムフティー局附属文書館所蔵の資料から、オスマン帝国末期イスラーム法廷裁判官のデータベースの基礎部分を作成した。

2.これまで収集した資料をもとに、19世紀前半のオスマン帝国の司法改革とその地方社会への適用・波及に関するトルコ語の論文を発表した。この論文では従来知られていなかった1840年の裁判官訓令を利用し、その現代トルコ語転写を掲載した。3.平成19年8月25日9月3日、9月10日17日の期間にトルコ、イスタンブルに出張し、前年度に引き続きイスタンブル・ムフティー局附属文書館、総理府オスマン文書館、イスラーム研究センター図書館などで調査を行った。とくにオスマン帝国末期の辺境域の司法制度に関する資料(帳簿類約十冊、文書数十点)を閲覧し複写及びデジタル画像を入手した。今回の調査では、リビアにおける「ハナフィー化」政策を示す重要な文書を入手することができた。4.平成19年12月及び平成20年1月にそれぞれ「アジア・ロシア」とコーカサスをテーマとした国際シンポジウムに司会として参加し、帝政ロシア及びその支配下の中央アジア・コーカサスに関する新しい知見を得るとともに、これら地域とオスマン帝国との比較に関して内外の研究者と意見を交換した。5.これまで行ってきた研究から、オスマン帝国の辺境地域、とくにリビアとイエメンにおける司法制度改革のプロセス及び現地社会に与えた影響を解明し、シャリーア法廷の重視や、ハナフィー派法学と現地の慣行との相克などの特徴を明らかにすることができた。また、帝国権力によるシャリーア施行の奨励・監督、「現地人法廷」の設置、「ハナフィー」化といった問題において、イギリス、フランス、とくにロシアの対ムスリム政策や植民地法制一般と一定の共通性が見いだされ、帝国間の比較の方向性を探ることができた。これらの成果は論文として発表する予定である。
エフェクターT細胞と制御性T細胞の皮膚への遊走を調節する因子の解析

本研究において、皮膚病変部へ浸潤するエフェクターT細胞(Teff)と制御性T細胞(Treg)の間のバランスが何によって制御されているかを明らかにしようと考えた。自然治癒傾向のある固定薬疹(FDE)の病変部ではIL-16を強く発現する肥満細胞を多数認め、それがTregを局所に遊走させるのに対し、重症薬疹であるStevens-Johnson症候群(SJS)/中毒性表皮壊死症(TEN)病変部ではこのような肥満細胞は減少しており、それがTregの遊走を阻害する結果、病変が重篤化することが分かった。しかし、このような肥満細胞の増加によるTregの増加は腫瘍の退縮には好ましくない。イミキモドはTLR7/8を刺激するが、繰り返しボーエン病に外用することにより、IL-17を産生する肥満細胞が増加する結果、局所のTregを減少させることにより、腫瘍を退縮させることが出来ることが分かった。このように、肥満細胞がIL-16かIL-17を産生するかにより、Tregの遊走を促したり阻害したりすることにより皮膚の炎症は巧妙に調節されている。当該年度の研究において以下の成果が得られた。2. DIHSの急性期に増大しているTregはfucosyltransferase VII (Fuc-TVII)の発現が強く認められた。それに対しSJS/TENではTregにおけるFuc-TVIIの発現は著明に低下していた。3.これらの薬疹が起こりやすくなる原因としてのウイルス感染やマイコプラズマ感染の影響を検討した。殆どのウイルス感染やマイコプラズマ感染の急性期にはTregの数は変わりないものの機能の著明な低下を認めた。しかもFuc-TVIIの発現も低下を認めた。他のウイルス感染ではTregの機能低下は感染の軽快とともに回復したが、マイコプラズマ感染では一年後も機能低下が認められた。4.一方、マイコプラズマ感染ではエフェクターT細胞(Teff)のTregに対する感受性も低下していることが明らかになった。1.重症薬疹と感染症(マイコプラズマ、水痘、麻疹)患者の様々な時期から末梢血リンパ球(PBMC)を採取し、Treg、Th1、Th2、Th17の頻度とその機能について検討した。重症薬疹のSJS/TENでは急性期にはTreg機能の著明な低下とTh17の頻度の上昇を認めたのに対し、DIHSでは急性期にTregの頻度の著明な増加を認めた。感染症では全ての例でTregの頻度の減少と機能の低下を認めた。Th1、Th2に関しては一定の傾向は見出せなかった。TregのFucT-VII発現について検討したが、Treg機能の低下はFucT-VII発現の低下と一致していた。2.マウス皮膚の角層水分量を変化させ、その水分量が局所へのTregの遊走とどのように関連しているかを検討した。低湿度環境において角層水分量を低下させると、ハプテン塗布部へのTregの遊走は低下するのに対し、高湿度環境で水分量を上昇させるとTregの遊走は亢進した。水分量とTregの局所への遊走は密接に関係していると考えられる。本年度の研究では主に薬疹患者の末梢血から、ヘルペスウイルス(HSV)特異的に反応するT細胞を分離し、その分画においてTeffとTregのバランスがどのように調節されているかの検討を行った。Teffは主にHSV特異的CD8T細胞分画に存在しているのに対し、Tregは主にHSV特異的CD4T細胞分画に存在していた。重症薬疹のうちStevens-Johnson症候群(SJS)やToxic epidermal necrolysis(TEN)では、HSV特異的CD8Teffのサイトカイン産生が亢進しているが、それはHSV特異的Tregの機能が低下していることを反映していた。それに対し、drug-induced hypersensitivity syndrome(DiHS)ではHSV特異的Tregが著明に増加しており、そのためHSV特異的CD8Teffのサイトカイン産生やキラー活性が抑制されていることが明らかになった。DiHSではこのため単球内に潜伏感染しているHSVの再活性化が起こり、それがまたHSVに特異的でないbystander Tregを増やし、それが他のヘルペス科ウイルスの再活性化をきたすという連鎖が起こることが明らかになった。

このようなHSV特異的Tregは他の疾患(例えば天疱瘡)でも見られ、これの増加がウイルスを再活性化させるとともに、この機能異常が自己免疫疾患につながっていく可能性が示された。このようにあるヘルペス科ウイルスに特異的なTregとTeffのバランスが、様々な疾患における皮膚傷害の程度を決めているとともに、潜伏ウイルスの再活性化、ひいては自己免疫疾患の発症につながることが明らかになった。
物性物理に発する非可換幾何学モデルの提案

物質のもつ性質を、そのミクロな構造と物性の関係をあきらかにすることにより研究することは、物性物理におけるもっとも基本的な課題である。周期的な結晶構造をもつ物質に関しては、局所的なデータから大域的な構造が記述できるため、原理的には詳細な物性を計算することができる。しかし様々な物理的な理由により、周期性が壊れた場合に物性がどのように変化するかは難しい課題である。これに非可換幾何学の手法で挑戦し、準周期構造や、磁場のある場合、境界のある場合などに対して、数学的な手法を確立した。結晶のミクロ構造の単純化した数理モデルとして、周期性をもつ無限グラフを考え、これを結晶格子という。結晶格子の幾何とランダムウォークの長時間挙動の研究をシステマティックに行ってきた。これを物性物理に発する非可換な設定に、非可換幾何学の手法を用いて拡張することを目指し、具体的には「分数量子ホール効果と非可換統計」「準結晶と結晶の統一的取り扱いと代数幾何学」「格子欠陥と曲率・トーションの取り扱い」について、連携研究者小田忠雄氏、赤間陽二氏とともに、研究を行っている。平成24年度は、物性物理の平山祥郎氏との分数量子ホール効果と非可換統計に関する定期的なワーキングセミナー、川勝年洋氏および赤間氏との格子欠陥と曲率・トーションの取り扱いに関する定期的なワーキングセミナー及び、海外の研究者との情報交換を行った。特に、米国ジョージア工科大学からJ.Bellissard氏、R.Parada氏、テキサス大学C.Radin氏を招聘し、準結晶と結晶の統一的取り扱いと代数幾何学に関係して、国際研究集会を開催し、disorder系の物質の非可換幾何学的アプローチについて議論した。また、英国J.Coates氏を招聘し、準結晶に関する母関数の特異点に関して整数論からの知見を得た。小田氏は、準結晶格子を記述するカット&プロジェクション方法により結晶格子を記述することに成功した。赤間氏は、molecular sphereの構造予想に向けて、合同な球面四角形による球面タイリングの分類を行った。また、準結晶に,確率的に独立でない統計的擾乱が道理にかなった組合せ的条件を満たすと,準結晶の回折測度は,純点成分と絶対連続成分が計算できることを示した。これを物性物理に発する非可換な設定に、非可換幾何学の手法を用いて拡張することを目指し、具体的には「スピン量子ホール効果の非可換幾何学による定式化」「準結晶と結晶の統一的取り扱いと代数幾何学」「格子欠陥と曲率・トーションの取り扱い」について、研究協力者小田忠雄氏、赤間陽二氏とともに、研究を行っている。平成25年度は、現在の固体物理における中心的話題である「スピン量子ホール効果・トポロジカル絶縁体」に関する勉強会、セミナー、国際ワークショップを行った。H.Schultz-Baldes、E.Prodan、P.Kuchment、古田幹雄、森吉仁志、村上修一を招聘した2月の国際ワークショップでは、非可換機科学のK理論によって、バルクーエッジ対応を定式化できることを見出し、界面への応用への道筋を検討した。赤間氏とともに、準結晶の格子欠陥に関し研究を進めた。また、材料科学研究者とともに格子欠陥と曲率・トーションの取り扱いに関して、定期的なセミナーを行い、特に2つの結晶の出会う粒界における安定性を測る数学的指標を見出した。小田氏は引き続き準結晶と結晶の統一的取り扱いと代数幾何学の研究を推進した。ルーマニアの研究者が興味を示し、AMS-ルーマニア集会に招かれ、講演および討論をおこなった。結晶格子およびその上のランダム・ウォークに関する申請者のこれまでの研究では、周期構造と作用素の可換性が重要であった。本萌芽研究では、これを物性物理に発する非可換な設定に、非可換幾何学の手法を用いて拡張することを目指し、以下の課題に取り組む。1.分数量子ホール効果と非可換統計、2.準結晶と結晶の統一的取り扱いと代数幾何学、3.格子欠陥と曲率・トーションの取り扱い。これらを研究するために平成23年度は以下の研究をおこなった。初年度であるので、文献収集および物性物理学者も交えたワーキングセミナーを行い、問題の理解に努めた。また、赤間陽二氏を京都大学に派遣、近藤剛史氏、能川知昭氏を東北大学招聘し、議論を深めた。準結晶の数理的研究についてはドイツ・ビレフェルド大学のM.Baake氏と、格子欠陥についてはイギリス・ケンブリッジ大学の時枝正氏と、情報交換および研究討論を進めるため、それぞれを訪問した。分子ホール効果の研究については、東北大学の物理学者と研究討論を行うほか、ジョージア工科大学のJean Bellissard氏、パリ大学のDe Nittis氏を招聘し情報交換を行なった。

世界の研究動向について、全般的な助言をもらうために、Weizmann研究所Uzy Smilansky氏を招聘した。準結晶と結晶の統一的取り扱いと代数幾何学については、小田忠雄氏が、二重点を持つ代数曲線の一般ヤコビ多様体のコンパクト化に関するSeshadri教授との30年以上前の共同研究が、結晶に関する小谷・砂田の結果、更には準結晶にも思いがけず関連することを発見した。2論文に纏めて投稿中である。格子欠陥と曲率・トーションの取り扱いについては、近藤、甘利、長谷部の論文をスタディグループで詳読している。結晶のミクロ構造を単純化した数理モデルとして結晶格子を考え、その標準的実現により原子配置が定まる物質の物性と幾何構造の関係を調べるという研究目的に沿って、下記の項目に関して研究を行い、成果を得た。トポロジカル絶縁体に物質の幾何構造がどのように反映するかを様々な幾何を用いて解析するという研究目的に基づき、固体物理で注目されているバルクーエッジ対応の理解に努めた。1)Schultz-Baldes, Villegas-Blasとの共同研究をおこない、非可換幾何学を用いてランダムポテンシャルがある場合に理論を拡張し、2つの物質の界面に流れる界面流を、物質のチャーン数(C*環の)の差で表した、2)古田、林、窪田、松尾、佐藤との共同研究を行い、より一般的な設定でバルクーエッジ対応が成立する背景となる上位概念であるギャップインデックスを発見し、バルク指数、エッジ指数がそのGysin写像による押し出しであることを解明、3)内藤、田上との共同研究を行い、3重周期、Octahedral対称性をもつ負曲率カーボン材料の安定構造を分類し、その電気伝導性を調べた。3月に海外から研究者を招へいし、トポロジカル相に関する勉強会を開催し、理解を深めることができた。赤間氏が中心となり物理化学の福村研と相分離の初期段階の観測と数理モデルの検証を行った。構造化照明によって、解像度限界を超える微細構造の観測に成功し、初期段階の相分離が通常の数学モデルに沿わないことを解析した。その現象を説明するモデルをシミュレーションで確認した。幾何学、離散幾何解析学情報交換のための国際研究集会を開催し、またいくつかの成果発表の論文と講演を行っている。研究推進のための方針が定まり、順調に進めている。情報交換のための国際研究集会を開催し、またいくつかの成果発表の論文と講演を行っている。スピン量子ホール効果や、破壊、準結晶の物性などに関して、非可換幾何学を用いた定式化に成功し、これからの進展の方向を見出すことができた。また、物性物理や材料科学の研究集会に招聘され、好評をいただいた。数学に閉じず、これらの分野に対しても大きな貢献をできる展望が開けた。初年度なので、情報収集を中心に行った。震災の影響があり、海外との情報交換が難しいと予測していたが、イスラエルからSmilansky氏を、アメリカからBellissard氏を、フランスからDe Nittis氏を招聘し、十分な研究討論ができた。研究協力者の赤間氏、小田氏も活発に情報収集を行った。
パラコート中毒の分子メカニズムの解析

パラコート(PQ)の中毒発現機序を解明する目的で遺伝子発現変化を中心に検討し,以下の結果を得た。1)ラット肺での抗酸化酵素及びグルタチオン(GSH)に対する影響を検討した結果,GSH合成酵素の発現が誘導されてGSHが増加してもGSH peroxidaseが変化しないためGSHがOH radical scavengerとして真に機能しないことを示した。3)腹腔内投与の腎でも同様な遺伝子発現の変化が観察され,とくにmetallothionein 1,HO-1の発現は強く,免疫組織学的検査所見とも一致した。しかし,この上昇レベルは24h以内に消失し,続く2回目投与では1回目に比べて上昇効果は遺伝子発現も蛋白レベルでも有意に低いことが分かった。この結果は,PQ障害に対する抵抗蛋白の産生が弱まり毒性が発現することを示唆した。4)マウスにPQ溶液を点鼻投与し肺に直接PQを曝露することで,ヒトPQ中毒の病態に酷似するモデルを作製した。5)PQ肺モデルを用いて,中毒初期"destructivephase"における遺伝子発現の変化を45遺伝子について検討した結果,炎症やapoptosisに関連する遺伝子の多くが1日以内にmaxを示し,他方fibrosisに関連する遺伝子は曝露5日目でmaxを示した。また肺サーファクタントや細胞外SODなどは曝露初期からその発現が低下することが分かった。活性酸素による障害を分子レベルから解明することを目的に,活性酸素産生剤であるパラコート(PQ)を用いて遺伝子発現レベルの変化を肺・腎について検討した。PQ 20mg/kgを腹腔内投与し,投与後3h,24hさらに48h後に再度PQを投与して3hに肺および腎を摘出し,対照群を含む4群についてRNAを抽出してmRNAの発現変化を比較検討した。一部肺での発現が強い遺伝子については免疫染色によってタンパク発現の局在を調べた。まず肺については,昨年からの継続でthioredoxin, glutathione S-transferaseなどの他hemeoxigenase(HO 1),NADPH-oxidoreductase(NQO 1)を追加して検討した。その結果,いずれも経時的に促進効果が観察されたが,とくにHO 1,NQO 1について強い誘導がみられた。それぞれの特異的な抗体で肺組織切片を染色すると,いずれも気管上皮細胞(クララ細胞とも一致して)に陽性反応が得られた。除草剤パラコート(PQ)によるヒトでの肺線維症はよく知られているが,実験動物では個体差が大きくその線維化モデルは未だ報告がない。今年度は,PQを直接マウス肺に暴露し,マウス肺線維化モデルの作製について検討した。方法:PQ溶液(20μL;0.01,0.02,0.04mg個体)を雄性C57BL/6Jマウスに麻酔下で点鼻投与した。その後経日的に体重の変動を測定し,実験最終日に肺を摘出して切片を作製,hematoxylin & eosin(HE), Masson's Trichrome(M-T)およびElastica VanGiesoon(E-Van-G)染色などを行い組織学的に評価した。結果と考察:生理食塩水投与群(コントロール群)に比較し,PQを投与した群はすべていったん体重低下を示した。PQ投与3日で,肺は肉眼的にも炎症が強く,組織学的にもリンパ球浸潤を中心とした強い炎症反応が観察された。その後,体重が増加に転じる個体は生存を維持したが,増加に転じない個体の多くは投与11日以内に死亡し,PQの用量-反応性が認められた。死亡したマウスの肺は強い水腫様変性と出血が全体的に認められた。一方,生存した個体では23週間で肺重量/体重(比率)がPQの用量と相関して有意に増加した。肺の萎縮は観察されず,炎症性細胞やfibroblastが観察され,M-T染色,E-Van-G染色による肺の線維化を認めた。高用量(0.04mg)を投与され長期間生存した個体では,肺の線維化が顕著で,肺胞の融合や間質の肥厚がみられ,肉眼的にhoneycomb状を示す個体も観察された。

また肺細気管支に多数の細胞片がPQ投与後1224時間で観察され,PQによる生体の反応がかなり早い時期に起こっていることが示唆された。この細胞片は抗urine protein 1抗体(クララ細胞に対する抗体)によって特異的な陽性像を示した。