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下行性疼痛調節系の脳―脊髄連関の機序解明

脳から脊髄に投射している下行性抑制系は生体での内因性鎮痛の中でも非常に重要な役割を果たしている。通常はこの系が賦活化されると痛みが抑えられると考えられているが、神経障害性疼痛ではこの系の賦活化により痛みが強くなる、すなわち下行性促進系になっているとも言われている。しかし、脳と脊髄の神経ネットワークを保持した状態での下行性調節系(抑制系・促進系)の詳細な機序は解明されていないだけでなく、促進系の真偽さえも議論の分かれるところである。加えて、下行性抑制系を賦活化すると言われている薬剤が本当に脊髄で痛みの伝達を抑制しているのかは証明されていない。これらの疑問を解決するために、脳ー脊髄ネットワークが保たれている生体動物を用い、下行性調節系の脳ー脊髄連関の機序を明らかにする。実験のセットアップに時間がかかり、思うように研究が進んでいない。in vivo脊髄標本を用いた脊髄後角ニューロンからのパッチクランプ記録:ラットの椎弓切除を行い、脊髄を露出する。腰膨大部のクモ膜を剥離し、記録電極がアプローチし易いように処置しておく。電極を顕微鏡下に目的とする細胞に誘導する。細胞膜を破りパッチクランプ記録を行う。得られた電流を記録後、解析する。青斑核または延髄の吻側延髄腹内側部ニューロン刺激により、後角ニューロンでの興奮性または抑制性シナプス伝達が変化するか、またその関与する受容体を同定する。実験のセットアップが完成しつつあるので、今後薬品を購入していく予定である。
ピロール/PVDFブレンドフィルムの内部起電力による自己改質に関する研究

圧電性及び焦電性を示すポリフッ化ビニリデン(PVDF)に電気化学的重合により導電性高分子となるピロールをブレンドし,外部からの負荷により材料中に生じる熱,ラジカル及びPVDFの内部起電力をピロールの重合により消費すると共に,生じたポリピロールによって,材料自身が補強される,自己改質特性を示す材料の開発を試みた。実験計画にもとづき、フィルムをキャスト法により成膜したもの、表面にドーパントとして第二塩化鉄を含浸させたもの、さらに、延伸したものを用いた。[結晶構造と物性]ブレンドフィルムはピロールの濃度の増加に伴い高い圧電性を示すPVDFのβ型結晶が増加し,自発分極がほとんどないα型結晶はサイズが小さくなり減少した。超音波照射負荷後ではβ型結晶がさらに増加傾向にあり、フィルムの表面の電気伝導度は57桁程度高くなり、ポリピロールの生成が確認された。また、曲げ弾性率は、ピロールのブレンドにより高濃度では2倍以上高くなり、超音波の照射により、さらに1.21.4倍高くなった。[ドーパントの効果]第二塩化鉄はピロールを重合し、また、ドーパントとしての効果が期待できる。第二塩化鉄を含浸したブレンドフィルムは、超音波負荷によって初めてピロールが重合し、黒色に変化した。自己改質特性も塩鉄を含まない場合に比べ優れている。[β型結晶の効果]延伸したブレンドフィルムは、他のブレンドフィルムに比べβ型結晶がよく成長し,分子配向性も高い。超音波負荷による引張弾性率の上昇が最も大きく、高い自己改質特性を示した。この自己改質特性は振動性負荷の集中に対し効果的であり、材料の信頼性の向上に寄与するインテリジェントマテリアルとして、さらに、性能向上が望まれる。
HRF20遺伝子の塩基欠落による遺伝的発作性夜間血色素尿症に関する研究

自己補体の自己細胞に対する障害反応を防ぐ役割を果たしている種特異的補体制御膜因子である20kDa homologous restriction factor(HRF20)の遺伝子の塩基に欠落を来している患者を発見した。この遺伝子の2本の内の一つ異常を来しているheterologous異常の両親から異常遺伝子を受け継ぎ、当該患者ではhomologous遺伝子異常となり、HRF20の産生ができなくなった患者であった。同様な遺伝子異常を持った患者の存在を想定して検討を行ったが、現在までのところ同様な塩基欠落を認める患者を発見できていない。当該患者の異常について病理組織学的検討を行ったところ、免疫組織染色法で正常組織では強く発現の認められる抹消神経のシュワン氏鞘にも全く発現が認められなかった。これに対し、正常組織のシュワン氏鞘ではほとんど発現の認められないdecay accelerating factor(DAF)が強く発現していた。DAFは補体活性化を制御する腫特異的補体制御膜因子であるが、HRF20を欠落した当該患者に於いては、補体反応を防ぐためにDAFが代償的に高発現になっていると考えられる。一方、HRF20の研究を展開する過程に於いて、その特徴を利用して遺伝子導入細胞の選択マーカーにHRF20の遺伝子を応用できることを明らかにする事ができた。すなわち、HRF20cDNAをトランスフェクトして細胞表面にHRF20を発現させるとヒト補体に対して抵抗性になるので、ヒト補体で処理することにより遺伝子導入した細胞のみを選択的に残して、遺伝子導入されなかった細胞を補体反応で傷害して取り除くことができることを立証できた。従来の薬剤耐性遺伝子を用いるよりも迅速に選別できるので、応用範囲の広い方法である。特に遺伝子治療を施工する時に有用に活用できる方法論が開発できたと考えている。
被熱を受けた金属検体からの新たな指紋検出法の開発

【研究目的】拳銃の薬莢、爆発物等の金属に付着した潜在指紋が高熱の被熱を受けた際、指紋中の有機物が揮発するなどして指紋検出が難しい場合がある。また、アイロン(200°C)による接触加熱は、DNA定量値を低下させるという報告があり、被熱を受けた潜在指紋検体からのDNA型鑑定も難しいものとなる。このことから、金属が熱を受けた際に、唯一、指紋のみが被疑者特定のカギとなる。本法を確立するため、次の3点を検討した。1通常の指紋検出法がどのくらいの被熱温度で検出できなくなるのか。次に、再加熱法と腐食液法による検討2様々な金属検体の潜在指紋を段階的に加熱することでの蛍光強度の増加の検討3顕在化システムの確立について、である。上述の検討により、被熱を受けた一部の金属検体からの指紋検出が可能となった。【研究計画及び結果】真鍮、ステンレス、アルミニウム、スチール製空き缶の検体に、指紋を押捺後、一昼夜乾燥させたものを検体とした。1指紋を押捺した金属検体について、電気炉内で300°Cを超える被熱5分程度により、通常の指紋検出法では検出できないことが明らかとなった。また、本検体を電気炉内で温度と時間を変化させる実験を行い、上記被熱を受けた金属検体について、再加熱(650°C、520分)することで指紋を顕在化できることも確認できた。アルミニウムについては、融点660°Cに近く顕在化には至らなかった。スチール製の塗装部分については、塗装が変色炭化に至り、指紋隆線を確認することはできなかった。腐食液による検出法においては、スーパーブルー、パーマーブルー、塩酸、硫酸等の酸を使用し、濃度を変え検討した結果、最も効率よく潜在指紋の検出ができたものは2%スーパーブルー溶液であった。しかし、放置しておれば検体全体も酸化してしまうことにより、潜在指紋が消失してしまうため、注意を要する。2200°Cに加熱された潜在指紋は、メイラード反応等により蛍光強度が増加することを実験により確認しており、上質紙で試験を行った結果、532nmの5wレーザーにより蛍光指紋として確認できた。同様の実験を温度と時間を変えながら、各種金属検体に対して行ったが、上質紙のように蛍光指紋としてとらえることはできなかった。スチール製空き缶については、塗装のバック蛍光を炭化させることにより消失させ、潜在指紋の蛍光化の可能性が考えられ、更なる検討を行う。3平面の検体では通常の写真撮影による検出法で行えるが、筒状の撃ち柄薬莢の顕在指紋については、プリズム、ミラー等を配置して3次元を2次元として撮像し、画像処理によりひずみ等の除去の更なる検討を行い、今後、H28年法科学技術学会に発表予定である。

3平面の検体では通常の写真撮影による検出法で行えるが、筒状の撃ち柄薬莢の顕在指紋については、プリズム、ミラー等を配置して3次元を2次元として撮像し、画像処理によりひずみ等の除去の更なる検討を行い、今後、H28年法科学技術学会に発表予定である。
日本語力検査の標準化に関する研究

今回の調査の目的は日本語力を構成する8要素(語彙、助詞、文型、漢字、作文、文章理解など)について、小学校1年生から中学3年生までの発達状況の基準を作成することである。問題の作成から調査の依頼、実施、調査結果の統計処理までいずれも予想を超える規模になったが、北は北海道の札幌、釧路から南は九州、沖縄県まで24都道府県28地域の165校以上の学校で調査を実施し、統計処理によって発達基準を作成した。さらに、各テスト項目間の相互相関を求める目的から小、中学校各2校について8種類の全てのテストを同じ子供について実施し、各テスト項目間の相関が高いことを確かめた。現在、これらの処理結果を参考に問題の整理を行っており、語彙、漢字については等化処理を行ない適応型テストを作成し、他のテスト項目と合せて今後、海外在住及び帰国児童・生徒や障害児言語理解の指標としたいと考えている。適応型テストは、従来のテスト形式より少ない問題で、精度の良い能力推定が可能であり、被験者の能力がどの程度かわからなくても、被験者にとって問題がむつかしすぎたり、やさしすぎたりしないため、帰国子女などの客観的な能力を知るのに最も適したテスト方法と考えられる。さらに、今後、特定の問題について幼稚園から高校までの発達状況を調べるため、幼稚園児を対象としたテープを使っての語彙及び文型の調査及び高校生に対する語彙と漢字の調査の実施を予定しており、今回の結果と合わせ幼稚園から高校生までの日本語力の発達の基準としてまとめる計画である。1.日本語力の標準化について:日本語を構成する語彙、助詞、漢字(ふりがな)、文章理解、作文、指示代名詞などの要素について、独立した評価を行なうための問題作りを行った。出来上った学年別の問題について、プリテストとして12校(3001000人)のテストを行ない、その結果の計算機を用いた統計処理により、標準化テストとしての問題の適性化、改善を行った。さらに、標準化テスト(62年7月実施)の実施方法を検討し、その規模として、各項目、各学年(小1中3)各1000人とし、教育委員会、学校等とその準備をした。標準化テストの結果にもとずき、適応型テストを作成するソフトを作成した。2.システムの開発:パソコンを用いた適応型テストのモデル(語彙)を作り、普通の小,中学生,帰国子女,留学生など約100人にパソコンを用いた適応型テストを実施した。その際、テストの妥当性について、キーボードの操作,問題の提示方法,回答方法,テスト時間,システム構成などについて検討し、現在開発されつつある、コンピュータ及びその周辺装置、ビデオフロッピーなどについて、実際に各種のシステムを構成し、子供達がテストが受けやすく、小型でかつ安価なシステムを検討した。3.日本語力の評価のための検査の実施と追跡:普通児,海外帰国子女などについて問題作成の終った項目からテストを実施し、併せて教育歴や海外での生活形態、親の教育に対する意見などのアンケート調査を実施し、データベースを作成中である。本研究の研究期間は3年間であり、昭和61年度は主として調査項目の選択問題の作成、予備調査の実施、その評価および問題の改良を行ない、昨年度は全国調査の依頼と調査の実施期間にあてた。さらに、今年度は日本語力を構成する要素のうち語彙、助詞、文型、漢字作文、指示語、前提、含意の8要素について全国の北は北海道の札幌、釧路から南は九州、沖繩県まで24都道府県28地域の165校以上の学校で実施した約19万人のデータの統計処理によって、小学校1年生から中学3年生までの発達状況の基準を作成することである。そのための作業として全国調査を行なった大量データの入力、統計処理、各学校の分析結果の報告、全体のまとめとして、調査結果にもとづき、各テスト項目の問題の整理などが今年度の主とした研究内容となった。また、各テスト項目間の相互相関を求める目的から小、中学校各2校について8類種の全てのテストを同じ子供について実施し、各テスト項目間の相関が高いことを確かめた。

基礎的な統計処理として学校別、学年別、男女別の最高得点、最低得点、平均得点、標準偏差、平均正答率、問題別正答率、などの算出を行なった。計算機にはすべての生データが圧縮して入力されており、必要に応じて学校別、或いは全国平均データを出力できるようになっている。語彙、漢字の項目については小学校1年にとって、1番やさしい問題から中学3年生にとって1番難しい問題までを1つの尺度で表わし、適応型テストを作成するための、項目応答理論にもとずいた、IRT分析を行ない、現在我々のテスト問題により適応型テストを作成中である。
触媒の動的構造制御に基づくタンデム型反応と効率的有用物質合成への展開

構造的に自由度の高いグアニジンー(チオ)ウレア型有機分子触媒を用い、テトラロン構造を有するβケトエステルの不斉酸化反応、β位置換基に対する速度論的光学分割反応の開発に成功した。本反応を応用することで、抗腫瘍剤ダウノルビシン及びカンプトテシン、また天然物リノキセピン、リシリジドの全合成に成功した。一方、エントロピー支配型触媒的フリーデルークラフツ反応を開発し、本反応を基盤として、抗腫瘍活性を有するジヒドロリコリシジンの効率的全合成を行った。これまでに様々な有機化合物を、高い立体選択性で合成する手法が数多く開発されてきた。またこれらを活用して複雑な骨格を有する生理活性天然物の合成研究も盛んに行われてきた。近年これらの研究に加え、創薬リードとなりうる有用な有機化合物を、より効率的に多様性を持たせて合成する手法開発が求められている。その1つのアプローチとして、複数の分子変換工程を単一フラスコで連続的に行うタンデム型反応開発がある。本研究では、有機分子触媒を用いたタンデム型反応を基盤とする有用有機化合物の合成法開発を目的としている。本年度は、我々がこれまで開発してきたグアニジン官能基を中心とする官能基複合型触媒を用い、タンデム型反応を実現するための基本反応の開拓を行った。その結果、グアニジン-チオウレア官能基複合型触媒を用い、ニトロアルケンに対するβ-ケトエステルの不斉マイケル反応が高い選択性で収率よく進行することを見いだした。このとき、グアニジン-チオウレア間のキラルスペーサー長は、炭素数3であることが必要であり、グアニジン上の置換基は環状アミン誘導体を用いることで選択性が向上することがわかった。また、これまでに見いだされた反応を応用したタンデム型反応についても検討を行った。グアニジン-チオウレア有機触媒存在下フェノール誘導体とニトロアルケンを作用させたところ、フリーデルクラフツ反応に続き反応過程で発生したニトロソ化合物へのニトロアルドール反応が連続して進行し、ジヒドロフラン二量体が高選択的かつ高収率で得られることを見いだした。我々が開発した鎖状グアニジン/ビスウレア触媒を用い、テトラロン骨格を有するβ-ケトエステルに対するα位の不斉酸化反応(水酸基化反応)について検討を行った。その結果、酸化剤としてクメンハイロドロパーオキサイド(CHP)を用いることで、高い不斉収率、化学収率で対応する酸化物を得ることに成功した。そこで本反応を基盤に、現在がん化学療法で用いられているダウノマイシンの触媒的不斉合成について検討を行った。その結果、高い光学純度かつ短工程で合成鍵中間体の合成に成功した。さらに開発した不斉酸化反応を基盤に抗腫瘍活性物質カンプトテシン(CPT)の触媒的不斉合成法について検討を行った。CPTはA環からE環までの5環性化合物であり、これまでに、CPTがE環ラクトン上20位に有するS配置の不斉第三級水酸基が活性の発現に必須である事が明らかとなっている。20位への直接的酸化反応は、内在するビニロガスジカルボニル化合物の性質により、不斉酸化反応の条件が適用できると考え、種々検討した結果、10 mol%のグアニジンーウレア触媒存在下、トルエン中、CHPを1.5当量、炭酸カリウム1当量を0 °Cにて24時間作用させる事により、目的とする化合物を収率95%、84% eeで得られることを見出した。本反応の基質一般性について確認したところ、±位の置換基がメチル基やブチル基、ベンジル基においても高エナンチオ選択的に酸化反応が進行し、光学活性なCPT鍵中間体へと誘導できることを見出した。また、本手法を用いることで20位置換基にベンジル基を有する新規CPT誘導体の合成にも成功した。これまでに我々が開発した鎖状グアニジン/ビスウレア触媒を用い、テトラロン骨格を有するβーケトエステルに対するα位の不斉酸化反応(水酸基化反応)を開発している。そこで今回、β位に置換基を有するテトラロン型βケトエステルに対して本反応を適応することを検討した。これにより、β位の立体化学により水酸化反応の速度が変われば、β位の不斉点について速度論的光学分割反応が進行すると考えた。実際に鎖状グアニジン/ビスウレア触媒存在下、酸化反応を検討した結果、非常に効率よく酸化的光学分割反応が進行し、テトラロンのβ位に不斉炭素を有するテトラロン誘導体が高い不斉収率で得られることがわかった。なお本化合物は、通常よく用いられる不斉1,4付加型の反応では得ることができないため、当該骨格を持つ化合物の非常に効率的な合成法が開発できたことになる。そこで本手法を基盤として、リグナン系アルカロイドであるリノキセピンの不斉合成を検討した。その結果、今回開発したβ置換型テトラロン誘導体に対する酸化的光学分割法を基盤に、光学活性リノキセピンの合成に成功した。(1)鎖状グアニジン/ビスウレア触媒を用い、テトラロン骨格を有するβ-ケトエステルに対するα位の不斉酸化反応(水酸基化反応)を開発した。さらにβ位に置換基を有するテトラロン型βケトエステルに対して本反応を適応することで、β位の不斉炭素に関する速度論的光学分割反応を見いだすことができ、非常に効率よくテトラロンのβ位に不斉炭素を有するテトラロン誘導体を高い不斉収率で得ることに成功した。

なお本化合物は、通常よく用いられる不斉1,4付加型の反応では得ることができないため、当該骨格を持つ化合物の非常に効率的な合成法が開発できたことになる。これらの開発した二つの有機触媒的不斉反応を基盤として、抗がん剤として知られるカンプトテシンおよびダウノマイシンの効率的不斉合成を達成した。また速度論的光学分割反応を基盤として、リグナン系アルカロイドであるリノキセピンおよびリシリジドBの不斉全合成にも成功した。(2)鎖状グアニジン/ビスチオウレア触媒を用いたエントロピー支配型不斉反応の開発を行った。その結果、イミン類に対するフェノール類の不斉フリーデルークラフツ型反応において-30°Cから20°Cの温度範囲において顕著なエントロピー効果を見いだすことができた。本反応を基盤として、グラシラミンの基本骨格の合成に成功した。一方、これまでにフェノール類とニトロアルケン類のエントロピー支配型不斉フリーデルークラフツ型反応を開発している。本不斉反応を基盤として、ジヒドロリコリシジンの不斉合成を達成することができた。構造的に自由度の高いグアニジンー(チオ)ウレア型有機分子触媒を用い、テトラロン構造を有するβケトエステルの不斉酸化反応、β位置換基に対する速度論的光学分割反応の開発に成功した。本反応を応用することで、抗腫瘍剤ダウノルビシン及びカンプトテシン、また天然物リノキセピン、リシリジドの全合成に成功した。一方、エントロピー支配型触媒的フリーデルークラフツ反応を開発し、本反応を基盤として、抗腫瘍活性を有するジヒドロリコリシジンの効率的全合成を行った。我々はこれまでに、構造自由度の大きい鎖状グアニジン/ビスチオウレア触媒を用い、溶媒依存的なエナンチオ多様性マンニッヒ型反応の開発しており、単一有機触媒を用いて、二つの異なる立体選択性が制御可能であることを報告している。本研究では、本反応のメカニズム解析、可逆性の検討を行い、更に高度な触媒的スイッチング反応の開発を目指した。反応機能の解析の結果、m-キシレンを用いる(S)-選択的反応及びアセトニトリルを用いる(R)-選択的反応いずれにおいても、立体選択性は単一触媒活性種により制御され、グアニジン官能基とチオウレア官能基の協調効果が重要であることを明らかにした。次に、m-キシレン/アセトニトリル混合溶媒を用いて反応を検討した結果、混合溶媒の比率に依存してエナンチオ選択性が変化することを見出した。これらの知見をもとに、1つ目の終了後に、エバポレーターを用いて溶媒を留去した後、2つ目の反応を同一行う連続エナンチオスイッチング反応を開発した。新たに開発したこの反応系は、i) (S)-選択性から(R)-選択性、ii) (R)-選択性から(S)-選択性へのいずれのスイッチング反応にも適用することが可能である。反応条件を適切に選択することで、鎖状グアニジン/ビスチオウレア触媒は、可逆的に立体選択性を制御できることを示すことができた。また本触媒を用い、生理活性物質を合成するための新たな不斉反応の開発を行った。カルボニルアルファ位に水酸基を持つ生理活性天然物は、カンプトテシン、ダウノマイシン等の抗腫瘍活性化合物に多く存在し、その立体化学が活性発現に重要な役割を果たすことが知られる。鎖状グアニジン/ウレア触媒を用い、CHPを酸化剤として1,3-ジカルボニル化合物に対する酸化反応を検討した結果、テトラロン誘導体に対して、高立体選択的に水酸基を導入することに成功した。
椎間板変性の抑制に関する基礎的研究(髄核再挿入モデルにおける長期的経過観察)

椎間の可動性を犠牲とする椎間固定術にかわり、その椎間板の変性過程を時間的に遅らせる方法としての髄核再挿入術を考案し、実験動物モデルにおいて、それが可能であることを示してきた。wistar系ラット40匹と日本白色家兎20羽に作成された今回の椎間板変性モデルでは、同一個体での長期間の経過観察においても、非再挿入群ではその変性変化進行は著明であった。一方、髄核の再挿入群では、その変性進行を時間的に遅らす効果が持続することが示された。変性椎間板の線維輪内層部におけるchondrocyte様細胞の出現の意義に関しては、椎間板変性の作成法や実験動物種によって異なった見解が示されている。慢性の椎間板変性過程をよく示しているこのモデルにおいて、線維輪内層に出現するchondrocyte様細胞は、髄核を再挿入しない変性進行椎間板に多くみられ、その出現後に、椎間板全体の変性がさらに進行することが特徴である。すなわち、chondrocyte様細胞の出現が変性に対するregenerative reactionとする他家の報告とは、全く異なっている。細胞の合理的な死と考えられるアポトーシスが、線維輪内層部にみられたのは、髄核を再挿入した軽度変性椎間板切片であり、著明な進行椎間板では線維輪内層細胞にアポトーシスは認められなかった。すなわち、線維輪内層のchondrocyte様細胞の出現は、regenerative processではなく、また出現したこの細胞がアポトーシスによって処理されていく過程が、椎間板全体の変性変化が時間的に遅延される過程と相関する可能性が考えられた。また、椎間板変性過程におけるII型collagenの線維輪内層での出現は、椎間板変性の進行と相関し、光顕所見におけるchondrocyte様細胞の出現とも相関していた。従って、II型collagenの椎間板線維輪内層部での分布の大小が、各個体における椎間板変性度の重要な指標の一つになると考えられる。8週齢wistar系ラット40匹(各群20匹で2群)の第6から第9尾椎間に45度の捻転を加えた自己考案脊椎固定器を装着し、椎間板ヘルニアモデルを作成した。2週間後に尾椎6/7、7/8、8/9椎間板より髄核を経皮的に摘出し、更に2週間、長軸方向の負荷を加えた。髄核摘出後4週間で各椎間に、尾椎4/5、5/6から経皮的に摘出した髄核を再挿入した。髄核再挿入後4週間で尾椎8以下を、10週で尾椎7以下を、16週で尾椎6以下を断尾し、尾椎8/9、7/8、6/7の椎間板を経時的に採取した。20匹(第1群)の60椎間板について、10%ホルマリン液固定後、Plank-Rychlo液で脱灰、パラフィン5μm切片とし、HE,Safranin O,Von Gieson,TBM染色を行った。西村考案による分類で線維輪、軟骨透明帯の変性度を評価し、髄核と線維輪内層部ではchondrocyte様細胞とfibroblast様細胞の数と分布について、同一個体内の経時的変化を比較検討した。残り20匹(第2群)60椎間板については、5μmの切片を作成し、TUNEL法で脱パラフィン後、ProteinkinaseKで反応後、Apoptag peroxidase kitで処理し、DAB-H2O2で発色させた。

再挿入後10、16週においても4週群と比し、その線維輪、軟骨透明帯の変性進行はなく、西村により示された髄核再挿入による変性過程抑制効果が長期間持続していることが示された。10週群、16週群でも線維輪内層部のchondrocyte様細胞とfibroblast様細胞はみられたが、合胞体様の細胞集族の傾向はむしろ経時的に減少していた。アポトーシス細胞は4、10、16週群で共に線維輪中間層、外層に認められただけではなく、線維輪内層の髄核との移行部において、多数ではないが観察された。各椎間板ごとの標本のばらつきは否定されないが、10週群、16週群で線維輪内層部のアポトーシス細胞が多く観察される傾向であった。椎間板変性促進因子と考えられる細胞集族が髄核再挿入によって抑制されている可能性が示された。体重1.3kgの日本白色家兎20羽の腰椎前方を経腹膜外経路で展開し、腰椎4/5、5/6、6/7椎間板前側方に21ゲージ針を刺入し、髄核を吸引する。髄核摘出後4週間で、腰椎4/5にメディウム+髄核(腰椎2/3及び3/4から採取)を、腰椎5/6にメディウムを挿入し、腰椎6/7椎間板には27ゲージ針で穿刺のみを行う。再挿入後、2、4、8、24週で標本を摘出、腰椎1/2を無処置群、4/5をメディウム群、5/6を髄核再挿入群、6/7を髄核非再挿入群とする。光顕的観察には5μm切片を作成し、HE染色、safranin O染色を行う。また、椎間板各部におけるII型collagenの分布をcarl Zeus社製共焦点レーザー走査顕微鏡により観察するために、200μmの椎間板正中部矢状断切片を作成する。髄核非再挿入群では再穿刺後2週間で髄核細胞の減少が始まり、4週で線維輪内層が蛇行し、8週ではさらに進行し、髄核細胞に一部集簇化が認められた。24週では線維輪内層の断裂と走行の逆転がみられ、同部にchondrocyte様の細胞が集簇していた。一方、髄核再挿入群では、髄核のhalo構造が保たれ、線維輪の蛇行や部分的断裂もごく軽度であった。再挿入後別週では髄核のhalo構造が明らかでない部分が増加し、髄核細胞集簇化も一部で見られた。線維輪は一部蛇行する部分がみられた。II型collagenの蛍光強度の分布では、髄核非再挿入群では、再穿刺後24週では、線維輪中層、内層にかけて蛍光強度が高くなり、光顕観察における蛇行した線維輪部に集簇するchondrocyte様細胞の分布部分とほぼ一致していた。一方、髄核再挿入群ではいずれの時期においても、線維輪外層から内層にかけて小山状の蛍光強度増強を示す椎間板と、線維輪全層の蛍光強度が低く平坦な椎間板に大別された。このモデルでは、同種椎間板での長期的経過観察における髄核再挿入の変性抑制効果が観察された。II型collagenの線維輪内層での出現は、椎間板変性の進行と相関し、光顕所見におけるchondrocyte様細胞の出現とも相関していた。
低温核整列を用いた核構造の研究

強磁性体中に原子核を埋め込み、超低温にすると核スピンは整列する。この整列核からのガンマ線を測定することにより核構造の研究をより精密に行なうことができる。加速器と質量分析器と超低温装置を直結したやり方で(Onーline Nuclear Orientation)安定核から遠くはなれた領域までの原子核の研究が可能となる。この方法で核構造を研究することと、これに伴う超微細相互作用の問題を解くことがこの国際共同研究の目的である。onーlineのNuclear Orientationの研究では最初埋め込まれた原子核が次々と崩壊するためにどの核からの崩壊によるガンマ線であるか同定するのに因難を伴うことが多い。このため、埋め込まれた最初の時間と同時測定を行なうTimeーresolved Nuclear Orientationの新しい方法を行なった。現在詳しい解析は進行中であるが下記にスピンと核磁気モ-メントを中心に、結果と問題点を示す。これらはスイスにあるCERN研究所のISOLDEとNICOLの^3He/ ^4He Onーline希釈冷凍機を用いた。^<181>Au; ^<181>Hgを最初に埋め込みガンマ線を測定したが、^<181>Auと^<181>Hgの半減期が近い上に、^<181>Hgのガンマ線が強いため^<181>の核整列の測定は難しく、ISOLDEから^<181>Au自身を直接分離して埋め込む必要があることが判明した。^<184>Au; ^<184>Auには69keVのところに53sの半減期をもつ高スピンのアイソマ-が存在することが判明した。基底状態の半減期は12sである。このアイソマ-遷移はその内部転換電子を測定してM3遷移であることを決定した。これによりこれらのスピンは、(2^+,3^+)と(5^+,6^+)が考うられる。次にHg崩壊からHgーAuーPtーIrの崩壊を研究した。これは、CERN研究所のISOLDEで^<180,181,182,183,184>Hgのビ-ムを分離して^3He/^4He希釈冷凍機に導きFe箔に中に埋め込みを行なった。この測定では^<192>Irを温度計として使用として20ー200mKの温度を決定した。また、Timeーresolved Nuclear Orientationの方法でHg,Au,Ptからのガンマ線を除くことに成功した。^<183>Ir,^<182>Ir,^<180>Ir,^<179>Ir(^<183>Hgからのα崩壊による)及び^<176>Ir(^<180>Hgからのα崩壊による)の核種について核整列の測定を行ないその温度変化を得た。強い超微細相互作用による核スピンの整列を得た。詳しい解析は現在進行中である。新潟大学の^3He/^4希釈冷凍機を用いオックスフォ-ド大と共同で平成3年3月に東大の原子核研究所のSFサイクロトロンを用いて試料をつくり、^<124>Iのニッケル中でのOffーlineのNMRーONの実験を新潟大で行なった。タ-ゲットは^<123>Sbを用いて、αビ-ケで照射してRecoilーImplantationの方法でニッケル箔(1μm)中に^<124>I(半減期は4.15d)を埋め込んだ。試料はその後、新潟大へ搬入し、500°Cで真空中で30分間熱処理を行なった。7mkに試料を冷却して、603kevのガンマ線の角分布の測定で0度方向における非等方性1.13を得た。NMRーONの方法により共鳴周波数を外部磁場0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.8Tで得た。これにより外部磁場による共鳴周波数シフトからν_0(B_0=0)=165.79(4)MHzを得た。既に知られている^<124>I磁気モ-メントμ=1.446(4)n.m.を用いることにより^<124>Iのニッケル中での内部磁場はB_<HF>(INi)=30.08(8)Tと決定した。この値は今までにJamesらによって報告されているB_<HF>(INi)=28.93(4)Tと違いを示している。この理由については現在検討中である。また緩和時間の測定を行なった。その結果、外部磁場0.2T,温度8mkでT_1=3.7(7)sを得た。これは^<124>Iの鉄中での緩和時間と比べると、コリンハンコンスタントを条件にすると一桁位遅いことになる。以上、オックスフォ-ド大学スト-ングル-プと新潟大理のグル-プとの、スイスCERN研究所でのISOLDEとNICOLを用いたAu,Ir領域での核種の研究と、新潟大でのI核の超微細相互作用の研究が共同で行なわれてきた。単年度のため、結果の解析が最終にまで行なわれていないが、いずれこの結果は他紙面で発表される。

加速器と質量分析器と超低温装置を直結したやり方で(Onーline Nuclear Orientation)安定核から遠くはなれた領域までの原子核の研究が可能となる。この方法で核構造を研究することと、これに伴う超微細相互作用の問題を解くことがこの国際共同研究の目的である。onーlineのNuclear Orientationの研究では最初埋め込まれた原子核が次々と崩壊するためにどの核からの崩壊によるガンマ線であるか同定するのに因難を伴うことが多い。このため、埋め込まれた最初の時間と同時測定を行なうTimeーresolved Nuclear Orientationの新しい方法を行なった。現在詳しい解析は進行中であるが下記にスピンと核磁気モ-メントを中心に、結果と問題点を示す。これらはスイスにあるCERN研究所のISOLDEとNICOLの^3He/ ^4He Onーline希釈冷凍機を用いた。^<181>Au; ^<181>Hgを最初に埋め込みガンマ線を測定したが、^<181>Auと^<181>Hgの半減期が近い上に、^<181>Hgのガンマ線が強いため^<181>の核整列の測定は難しく、ISOLDEから^<181>Au自身を直接分離して埋め込む必要があることが判明した。^<184>Au; ^<184>Auには69keVのところに53sの半減期をもつ高スピンのアイソマ-が存在することが判明した。基底状態の半減期は12sである。このアイソマ-遷移はその内部転換電子を測定してM3遷移であることを決定した。これによりこれらのスピンは、(2^+,3^+)と(5^+,6^+)が考うられる。次にHg崩壊からHgーAuーPtーIrの崩壊を研究した。これは、CERN研究所のISOLDEで^<180,181,182,183,184>Hgのビ-ムを分離して^3He/^4He希釈冷凍機に導きFe箔に中に埋め込みを行なった。この測定では^<192>Irを温度計として使用として20ー200mKの温度を決定した。また、Timeーresolved Nuclear Orientationの方法でHg,Au,Ptからのガンマ線を除くことに成功した。^<183>Ir,^<182>Ir,^<180>Ir,^<179>Ir(^<183>Hgからのα崩壊による)及び^<176>Ir(^<180>Hgからのα崩壊による)の核種について核整列の測定を行ないその温度変化を得た。強い超微細相互作用による核スピンの整列を得た。詳しい解析は現在進行中である。新潟大学の^3He/^4希釈冷凍機を用いオックスフォ-ド大と共同で平成3年3月に東大の原子核研究所のSFサイクロトロンを用いて試料をつくり、^<124>Iのニッケル中でのOffーlineのNMRーONの実験を新潟大で行なった。タ-ゲットは^<123>Sbを用いて、αビ-ケで照射してRecoilーImplantationの方法でニッケル箔(1μm)中に^<124>I(半減期は4.15d)を埋め込んだ。試料はその後、新潟大へ搬入し、500°Cで真空中で30分間熱処理を行なった。7mkに試料を冷却して、603kevのガンマ線の角分布の測定で0度方向における非等方性1.13を得た。NMRーONの方法により共鳴周波数を外部磁場0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.8Tで得た。これにより外部磁場による共鳴周波数シフトからν_0(B_0=0)=165.79(4)MHzを得た。
一酸化窒素代謝系が各種内在性調節因子による胃粘膜防御機構の制御に果たす役割

各種内在性調節因子による胃粘膜防御能の制御機構の解明を目指して、胃粘液代謝の指標となり得るムチン生合成活性の変化に焦点を絞りラット胃粘膜器官培養系を用いて、各種酸分泌刺激物質(ガストリン、ヒスタミン、カルバコール)のムチン生合成亢進作用におけるNitric Oxide(NO,一酸化窒素)の関与を比較検討し以下のような結果を得た。1.NO合成酵素阻害薬であるN^C-nitro-L-arginine(L-NNA)単独培地内添加について検討したところ、10^4MまでのL-NNA単独では胃体部・前庭部共にムチン生合成活性(^3H-glucosamineの取り込み)は対照と同程度の値を示し有意差を認めなかった。2.次に、ガストリンの胃体部ムチン生合成亢進作用に対するNO代謝系の関与を検討するため、L-NNAを10^5M併用添加したところ、ガストリンの作用が完全に抑制されることが明らかとなった。このL-NNAによる抑制作用はL-arginine5x10^3Mの投与により消失し、D-arginineでは変化がないことが確認された。3.ガストリンの作用におけるNOそのものの役割を明らかにするため、さらにNOのみを消去できる新しいタイプのNO消去薬Carboxy-PTIOを用いて同様の検討を行ったところ、10^4Mガストリンの作用は10^5Mの濃度のCarboxy-PTIOで完全抑制された。4.ガストリンとは対照的に、ヒスタミン及びカルバコールによるムチン生合成亢進作用はL-NNAにより全く影響を受けなかった。5.以上の結果より、胃ムチン生合成に調節因子として作用する酸分泌刺激物質のうち、ガストリンはヒスタミン、カルバコールとは異なりその制御過程の一部に一酸化窒素代謝系の関与があることが示された。
脳における細胞膜骨格蛋白質とアネキシンとの相互作用に関する研究

本研究では、神経細胞におけるアネキシンVIの機能を明らかにすることを目的としてアネキシンVI結合蛋白質の検索を行い、その同定を試みると共に結合の性質の解析を行った。このためまずアネキシンVI結合解析法の確立を行い、ラット脳において約14種類の蛋白質と結合することが明らかとなった。アネキシンVIとこれらの蛋白質との結合は、カルシウム依存性で燐脂質の存在が必須であった。燐脂質では、フォスファチジルセリンあるいはフォスファチジン酸に特異的であった。また、アネキシンVIとこれらの結合蛋白質との結合は、直接の蛋白質同志の結合であった。これらの蛋白質のうち分子量80Kの蛋白質がシナプス小胞蛋白質シナプシンI、240Kの蛋白質が細胞膜骨格蛋白質カルスペクチンであることを同定した。シナプシンIとの結合では、アネキシンVIはシナプシンIa,bの両者に結合し、NTCBフラグメントへの結合実験からシナプシンIのN末端頭部に結合することが判明した。アネキシンVIのシナプシンIへの結合は、シナプシンIのcAMPキナーゼ或いはCaMキナーゼIIによる燐酸化により著明に阻害された。シナプシンIは、シナプス前部におけるシナプス小胞のアクチンネットワークへの貯留に重要な役割を果たす。アネキシンVIのシナプシンIへの結合は、そのカルシウム感受性から考えてシナプス小胞のアクチンネットワークへの貯留に関与しているとは考え難く、むしろシナプス前膜直下で細胞膜とシナプス小胞の相互作用に関与している可能性が考えられる。アネキシンVIのカルスペクチンへの結合では、アネキシンVIのカルシウム/燐脂質依存性のカルスペクチンへの結合がカルスペクチンからF-アクチンを解離させることが明かとなった。さらに、カルスペクチンのアネキシンVI結合部位を検討した結果、アネキシンVIはカルスペクチンのbサブユニットのN末端側のアクチン結合部位近傍に結合することが明かとなった。以上の結果は、アネキシンVIがカルシウム/燐脂質依存性にカルスペクチン-アクチン相互作用を調節し、細胞膜骨格を制御している可能性を示唆する。神経細胞におけるアネキシンVIの機能を明かにすることを目的として、ラット脳におけるアネキシンVIの標的蛋白質の検索を行った。このためまずアネキシンVI結合解析法の確立を行った。これは、蛋白質をニトロセルロース膜に固定し、^<125>IでラベルしたアネキシンVIを用いてアネキシンVI結合蛋白質を検出あるいは解析するものである。本法を用いてラット脳のホモジネートを検索した結果、450K、350K、240K、180K、120-140K、105K、80K、63K、48K、40K、32K、27K、23K、16Kの約14種類の蛋白質と結合することが明らかとなった。アネキシンVIとこれらの蛋白質との結合は、Ca依存性で燐脂質の存在が必須であった。燐脂質では、フォスファチジルセリンあるいはフォスファチジン酸に特異的で、フォスファチジルコリン、フォスファチジルエタノルアミンでは結合は認められなかった。

また、アネキシンVIとこれらの結合蛋白質との結合は、直接の蛋白質同志の結合であった。これらの蛋白質のうち80Kは、P2分画さらにシナプス小胞分画に、240KはP2分画さらにTritonX-100で処理した細胞骨格分画に豊富に存在し、抽出条件および精製蛋白質との比較からそれぞれシナプシンIとカルスペクチンであることを同定した。さらにアネキシンVIとシナプシンIとの結合を詳細に検討した結果、アネキシンVIは、シナプシンIa,bの両者に結合し、NTCBフラグメントへの結合実験からシナプシンIのN末端頭部に結合することが判明した。アネキシンVIのシナプシンIへの結合を非変性条件下で調べた結果、フォスファチジルセリン存在下でのCa感受性は12.6μMで、Kdは270nMであった。アネキシンVIのシナプシンIへの結合は、シナプシンIのcAMPキナーゼ或いはCaMキナーゼIIによる燐酸化により著明に阻害された。シナプシンIは、シナプス前部におけるシナプス小胞のアクチンネットワークへの貯留に重要な役割を果たす。アネキシンVIのシナプシンIへの結合の生理機能は、現時点では不明であるが、そのCa感受性から考えてシナプス小胞のアクチンネットワークへの貯留に関与しているとは考え難く、むしろシナプス前膜直下で細胞膜とシナプス小胞の相互作用に関与している可能性が考えられる。神経細胞におけるアネキシンVIの機能を明かにすることを目的として、ラット脳におけるアネキシンVIの標的蛋白質の検索を行った。その結果、ラット脳のにおいて約14種類の蛋白質とカルシウム/燐脂質依存性に結合することが明らかとなった。これらの蛋白質のうち240kDaの蛋白質はP2分画さらにTritonX-100で処理した細胞骨格分画に豊富に存在し、抽出条件および精製蛋白質との比較からカルスペクチンであることを同定した。アネキシンVIのカルスペクチンへの結合は、カルシウム依存性でホスファチジルセリン及びホスファチジン酸に特異的であった。カルスペクチンはF-アクチン架橋能を有している。そこでアネキシンVIのカルスペクチン-アクチン相互作用への効果を落下球法による粘度測定及び遠心法による結合実験により解析した。その結果、アネキシンVIは、1)カルシウム/燐脂質共存下においてのみ粘度を著名に低下させること、2)同様の条件下でF-アクチンからカルスペクチンを解離させることが明かとなった。さらに、カルスペクチンのアネキシンVI結合部位を検討した結果、アネキシンVIはカルスペクチンのβサブユニットのN末端側のアクチン結合部位近傍に結合することが明かとなった。以上の結果は、アネキシンVIがカルシウム/燐脂質依存性にカルスペクチン-アクチン相互作用を調節し、細胞膜骨格を制御している可能性を示唆する。
細胞内輸送系を支える液胞選別輸送レセプターのリサイクルのための分子機構の解明

高等生物は個体レベルでは様々な器官を進化させ,周囲の環境の多様性に対応しており,細胞レベルでは多数の細胞内小器官(オルガネラ)を含み複雑化している.それぞれの器官は分化した細胞から構成される.細胞の分化状態はそれぞれのオルガネラの機能によって決定されている.オルガネラが正常に機能するためには,個々のオルガネラに局在する物質が適切に配置されることが重要である.よって高等生物が正常に生きていくためには細胞内輸送が必須である.一方,細胞内輸送の分子実態およびその機能については明らかにされていないことが多い.私は液胞への選別輸送に注目し細胞内輸送の分子実態について解明することを目的として研究を進めている.これまでの成果として,以下の2点を明らかにした.(1)細胞内レベルの解析:高等植物において液胞選別輸送にレトロマー複合体が関与する.(2)植物体レベルの解析:レトロマー変異体は高等植物の成長,老化,胚発生,病害応答にも不具合を示す.これまでに知られている高等植物の液胞の輸送に異常を持つ変異体は植物体レベルでは特に野生型と差がないものが多い.したがって(2)の表現型は液胞への輸送以外にもレトロマーが機能することを示唆しており,高等植物においてレトロマーの機能が多様化していると考えられる.酵母のレトロマー変異体は液胞の形態異常を示すが,個体としての生存や分裂活性は正常である.レトロマー構成因子は酵母から脊椎動物,高等植物まで広く真核生物に保存されており,哺乳類の初期発生に重要であることも指摘されている。このことから生物が進化の過程で複雑化し,細胞内輸送の役割が多様化するなかでレトロマーの機能も多様化したのではないかと考えられる.以上の成果は投稿論文として2008年2月に報告した(雑誌論文参考).高等植物の種子は次世代の芽生えに必要な栄養源として,大量の貯蔵タンパク質を登熟期に蓄える.貯蔵タンパク質は小胞体でプロ型前駆体として合成され,小胞輸送によりタンパク質貯蔵型液胞に運ばれた後,プロセシングを受けて成熟型になる.最近,私たちはシロイヌナズナにおいて貯蔵タンパク質の液胞選別輸送レセプターAtVSR1を明らかにした.AtVSR1はゴルジ体から液胞前区画へと貯蔵タンパク質の前駆体を輸送する.AtVSR1欠損株では貯蔵タンパク質前駆体が大量に蓄積し,貯蔵タンパク質が細胞外に分泌していた.酵母において,液胞選別輸送レセプター(Vps10p)は液胞前区画からゴルジ体へとリサイクルされる.このリサイクルにはレトロマー複合体が必要である.私達はシロイヌナズナのゲノム中にレトロマー複合体をコードする思われる遺伝子群を見出した.これらの遺伝子群が液胞選別輸送レセプターAtVSR1のリサイクルに関与するかどうかを調べるため,T-DNA挿入変異株を取得して解析した.その結果,レトロマー複合体不全変異体は,AtVSR1欠損株と同様に,貯蔵タンパク質の前駆体を蓄積していた.Vps10p-AtVSR1間には相同性が認められないにも関わらず,シロイヌナズナにおいても液胞選別輸送レセプターのリサイクルはレトロマー複合体に依存している可能性が高い.面白いことにレトロマー複合体不全変異体ではタンパク質貯蔵型液胞が小型化し数が増加していた.AtVSR1欠損株ではこのような表現型は観察されないため,レトロマー複合体は種子貯蔵タンパク質の輸送のみならず,他の機能も担うと考えられる.これらの結果より,レトロマー複合体が液胞選別輸送に重要な役割を果たしていることが明らかになった.高等植物の種子は次世代の芽生えに必要な栄養源として,大量の貯蔵タンパク質を登熟期に蓄える.貯蔵タンパク質は小胞体でプロ型前駆体として合成され,小胞輸送によりタンパク質貯蔵型液胞に運ばれた後,ブロセシングを受けて成熟型になる.細胞内の輸送機構に関する分子レベルでの知見は不足しているが,所属研究室では貯蔵タンパク質の液胞選別輸送機構の解析を通じ,新たな知見を集めることに成功している.液胞選別輸送レセプターAtVSR1はその代表例である.私はこの液胞選別輸送機構にレトロマー複合体が関与することを明らかにした.現在その成果について論文を執筆中である.また,レトロマー複合体欠損変異体は,貯蔵タンパク質の輸送異常だけでは説明のつかない表現型を示した.レトロマー複合体を欠損した植物体は生育に異常をきたす.これはレトロマー複合体による標的タンパク質のリサイクル(再利用)が適切に行われていないからだと考えられる.現在はこの原因となる標的タンパク質の候補として,オーキシンの排出トランスポーターであるPINが有力であると注目し,解析を続けている.具体的には架橋剤を用いた共免疫沈降による解析や,GFPにより可視化したPINタンパク質の細胞内局在の蛍光顕微鏡解析などである.高等生物は個体レベルでは様々な器官を進化させ,周囲の環境の多様性に対応しており,細胞レベルでは多数の細胞内小器官(オルガネラ)を含み複雑化している.それぞれの器官は分化した細胞から構成される.細胞の分化状態はそれぞれのオルガネラの機能によって決定されている.オルガネラが正常に機能するためには,個々のオルガネラに局在する物質が適切に配置されることが重要である.よって高等生物が正常に生きていくためには細胞内輸送が必須である.一方,細胞内輸送の分子実態およびその機能については明らかにされていないことが多い.私は液胞への選別輸送に注目し細胞内輸送の分子実態について解明することを目的として研究を進めている.これまでの成果として,以下の2点を明らかにした.

(1)細胞内レベルの解析:高等植物において液胞選別輸送にレトロマー複合体が関与する.(2)植物体レベルの解析:レトロマー変異体は高等植物の成長,老化,胚発生,病害応答にも不具合を示す.これまでに知られている高等植物の液胞の輸送に異常を持つ変異体は植物体レベルでは特に野生型と差がないものが多い.したがって(2)の表現型は液胞への輸送以外にもレトロマーが機能することを示唆しており,高等植物においてレトロマーの機能が多様化していると考えられる.酵母のレトロマー変異体は液胞の形態異常を示すが,個体としての生存や分裂活性は正常である.レトロマー構成因子は酵母から脊椎動物,高等植物まで広く真核生物に保存されており,哺乳類の初期発生に重要であることも指摘されている。このことから生物が進化の過程で複雑化し,細胞内輸送の役割が多様化するなかでレトロマーの機能も多様化したのではないかと考えられる.以上の成果は投稿論文として2008年2月に報告した(雑誌論文参考).
RI標識コバルトブレオマイシンの研究

コバルトと結合したブレオマイシン(以下Co-ブレオマイシンと略す)が強い悪性腫瘍集積性を持つことは周知の事実である。そこで、Co-ブレオマイシンの生物学的性質を変化させることなく、Co-ブレオマイシンを放射性同位元素(以下RIと略す)を結合させて悪性腫瘍に集積させ、悪性腫瘍の診断及び治療を行なおうとするものである。Co-ブレオマイシンをRIで標識する方法として、放射性ヨウ素イオン(^<131>I^-)、^<125>I-Bolton-Hunter試薬、^<125>I-PIB試薬を使用する方法を検討した。標識の実際的方法として第1の方法はブレオマイシンをこれらRI(又はその試薬)で標識したRI標識ブレオマイシンにCoを結合させる方法と第2の方法はCo-ブレオマイシンを前もって製造しておいてこれにRI(又はその試薬)を結合させることで、RI標識コバルトブレオマイシンを製造する方法である。まず第1の方法において、ブレオマイシンを^<131>I^-)、^<125>I-Bolton-Hunter試薬、^<125>I-PIB試薬で各々標識したところ、この3種類のRIともに高収率でブレオマイシンに結合し、RI標識ブレオマイシンを製造できた。このRI標識ブレオマイシンにCoCl_2を作用させ、RI標識コバルトブレオマイシンの製造を試みたが、この3種のいずれにもCoは結合しなかった。Co-ブレオマイシンをこれら3種のRIで標識を試みたところ、^<131>I^-では標識できなかった。^<125>I-Bolton-Hunter試薬、^<125>I-PIB試薬では低い収率ながら、Co-ブレオマイシンを標識することができた。少量ながら得られた^<125>I-Bolton-Hunter標識Co-ブレオマイシンをエールリッヒ癌皮下移植マウスで悪性腫瘍集積性を調べたが、強い悪集積性は認められなかった。今後はブレオマイシンの側鎖のアミンをRIで標識する方法を検討する予定である。はじめに:コバルトと結合したブレオマイシン(以下Co-BLMと略す)が強い癌親和性を持つことは周知の事実である。そこで、Co-BLMの生物学的性質を変化させないような状態で、Co-BLMに放射性同位元素(以下RIと略す)を結合させて癌に集積させ、癌の診断及び治療を行うとするものである。実験:まずBLMに塩化コバルトを作用させて、Co-BLMを製造した。次にCo-BLMにRIを結合させる方法であるが、アミノ基に放射性ヨウ素を導入する場合に使用される^<125>l-Bolton-Hunter試薬を用いて^<125>lでの標識を行った。すなわち、Co-BLMの水溶液(pH 8.0)に^<125>l-Bolton-Hunter試薬を加えて2時間撹拌し、Co-BLMを放射性ヨオウ素化して、Co-BLM-^<125>lを製した。ついでエーテルを加えて撹拌し、エーテル層を除去することで、未反応の^<125>l-Bolton-Hunter試薬を除去した。Co-BLM-^<125>lの中には幾種類かの化学形の異なる^<125>

l標識物が含まれているので、これを分離することとした。そこで、上記のCo-BLM-^<125>lを、CM-セファロースカラムに添加して、ギ酸アンモニウム(pH6.5)0.05M及び1.0M溶液を溶出液として濃度勾配をつけて溶出分離した。その結果、Co-BLM-^<125>lは8種類の^<125>lに分離されたので、各々をエールリッヒ癌を皮下移植したマウスに投与して、その癌集積性を調べた。この動物実験により、Co-BLM-^<125>lの中に癌に強い集積性を持つものや、癌集積性をほとんど示さないものがあることが明らかとなった。おわりに:Co-BLMは^<125>l-Bolton-Hunter試薬で標識できることがわかったので、この中で強い癌集積性を示すものを純粋に分離すること及びその標識物を効率よく多量に製造する方法を今後検討する予定である。コバルトと結合したブレオマイシンが強い悪性腫瘍集積性を持つことが知られている。そこで、昨年は非放射性Co-ブレオマイシンを^<125>l-Bolton-Hunter試薬等で標識し、悪性腫瘍へ集積させる方法を試みたが、成功しなかった。今回は^<125>I-PIB試薬を用いて標識する方法を検討した。第1の方法として、ホウ酸緩衝液(pH8.0)に溶かしたブレオマイシンに^<125>I-PIB試薬を加えpH8.0pH8.5に調整後、1時間攪拌してブレオマイシン-PIB-^<125>Iを製造した。ここで製造したブレオマイシン-PIB-^<125>IにCoCl_2を加えて^<125>I-PIB標識後のブレオマイシンにCoを結合させる試みを行った。第2の方法として、昨年述べた方法で非放射性のCo-ブレオマイシンを製造し、これに^<125>I-PIB試薬を作用させてCo-ブレオマイシン-PIB-^<125>Iを製造するための実験も行った。その結果、^<125>I-PIB試薬によるブレオマイシンの標識では高収率でブレオマイシン-PIB-^<125>Iが得られた。この標識物にCoを作用させてもCoはブレオマイシンに結合しなかった。他方、Co-ブレオマイシンの^<125>I-PIB試薬による標識の試みは成功しなかった。ブレオマイシンに^<125>I-PIB試薬は結合するが、Coが結合したブレオマイシンには^<125>I-PIB試薬は結合しなかった。ブレオマイシンにCoか、^<125>I-PIB試薬の一方を結合させることは可能であるが、両者を一つのブレオマイシンに結合させることは不可能であった。一方、上記の方法で得られたブレオマイシン-PIB-^<125>Iをエールリッヒ癌皮下移植マウスを使用して、悪性腫瘍集積性を調べたが強い悪性腫瘍集積性は認められなかった。今後はブレオマイシンの側鎖のアミンをRIで標識する方法を検討する予定である。