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プラズモニック・メタ表面における増強光工学の研究

プラズモニック・メタ表面という人工ナノ構造において、分子内の光励起過程を経て生じる光信号を増強して観測する研究を実施し、増強効果のない参照信号と比較するとプラズモニック・メタ表面上では光信号強度が2000倍以上増強された。今回、均一で大きな増強効果が得られたことは極低濃度分子の光検出法の実用化に向けて大きな進歩である。プラズモニック・メタ表面(人工ナノ構造表面)において実現される共鳴的な電磁場(光波)を活用して、物質内の電子遷移過程を人工的に促進する増強光(ひかり)工学の開拓と確立を最終的・将来的な目的として本研究を遂行してきた。平成26年度においては、新規なメタ表面構造として、プラズモン共鳴とフォトニック導波路モードが混合(ハイブリダイゼーション)して生じるプラズモ・フォトニックメタ表面のハイブリッド共鳴状態の研究を中心的に実施してきた。具体的には、ハイブリッド共鳴自体の特性を解明する詳細な電磁場解析を行い、プラズモ・フォトニック共鳴を系統的に解明した。プラズモン共鳴と大きな状態密度をもつフォトニック導波路モードの混合状態は先行例のない研究対象で今回初めて解明に成功した(Nano Lett. 2015)。また、このプラズモ・フォトニック共鳴状態を活用して、蛍光有機分子の蛍光増強実験を実施した。プラズモン共鳴による蛍光増強はこれまでに多数の研究報告例があるが、それらと比較しても顕著な蛍光増強効果を実験的に見出した。極微量の蛍光分子が互いに離散的に分散する濃度でメタ表面上に配置された条件下で、汎用的な平坦シリコン基板と比べて、450倍を超える蛍光増強を観測した。この蛍光増強効果は均一性が高く、いわゆるホットスポット利用の従来の蛍光増強に欠けていた均一性、データの再現性が高い(J. Nanomater. 2015)。このほか、シリコンフォトニック結晶スラブにおいても、200倍を超える蛍光増強を観測し、実用に資する有望なメタ表面構造を複数発見できた(Appl. Phys. Lett. 2015)。なお、プラズモ・フォトニックメタ表面などはナノインプリント法を用いて高精度かつ高速に作製する工程も確立した(J. Micro/Nanolith. MEMS MOEMS 2014)。平成27年度までにおいてはとくに次の成果があった。・ナノインプリント法は基本的に垂直方向の加工技術であるが、不可避の残膜処理工程に注目して、水平方向の加工自由度を導入することに成功した。これにより、単一モールドによって多種類のメタ表面基板の作製が可能となり、低コスト化と実用度の向上を実現できた。・SC構造のメタ表面は完全放射率も可能であり、その高い放射率は蛍光分子の蛍光強度増強に非常に有用であることを実証した。平坦なシリコン基板と比べて、最大2500倍を超える蛍光強度増強を観測した。この大きな蛍光強度増強においては金属最表面と分子の界面制御が重要であり、自己組織化単分子膜(SAM)を用いることで先述の強度増強を実現した。・さらに、SAMなしのSC構造メタ表面においてラマン散乱を著しく増強できることを実験的に見出した。予想外の結果であり、実験データを手広く収集して、この現象が可能となるメカニズムについて考察を進めた。この内容については論文投稿の準備を進めた。上記の結果についてこれまでに発表論文5報(いずれも研究代表者が対応著者)、招待講演5件(登壇のみ)、特許出願1件を通じて成果を発信した。増強光工学の開拓を目指す本課題において、メタ表面という人工環境における物質内電子遷移の光による選択的な操作が中心的な課題である。これまでに蛍光分子における光学遷移過程をメタ表面上で促進すること及び無輻射遷移に励起状態が流出する過程を人工的に抑制することには前年度までに成功していた。さらに複数の光学遷移過程が競合する場合に、それらを人工的に選択できることを実験的に明らかにした。蛍光やラマン散乱に関して、多数のプラズモン増強を報告した論文があるが、これらの人工的な選択は初めて成功したと認識している。この結果は光学遷移過程をメタ表面上で人工的に操作したことによって生じたものであり、物質の人工的な光操作の多面性を示唆する結果である。人工的に作製されたメタ表面において、光と物質の相互作用を選択的(意図的)に増強することによって光機能を高めることを目指して研究に取り組んだ。一連の研究を通じて、増強光(ひかり)工学と呼ぶに値する研究分野の創出を念頭にこの若手研究を実施した。物質や材料の特性に応じて多様な増強効果が期待されるが、本研究ではとくに蛍光を発する分子からの光信号(蛍光またはラマン散乱)を顕著に増強することに集中的に取り組んだ。具体的には、まず100%に近い光放射率を有するメタ表面を独自に考案、実証した。このメタ表面はプラズモン共鳴とフォトニック導波路共鳴のハイブリッド共鳴を固有モードとして有する特徴があることを見出した[Nano Lett. (2015)]。このメタ表面はナノ構造からなるが、量産可能なナノインプリント法によってセンチメートル平方級の大面積で多数作製し、蛍光分子の実験に用いた[JM3 (2014); J. Nanomater. (2015)]。メタ表面上の蛍光分子からの蛍光強度を増強効果のないシリコン基板上と同等な条件下で比較すると、最大2600倍を超える大きな増強効果があることを見出した。この際には、金属と分子の直接接触を避ける自己組織化単分子膜(SAM)を用いることで金属への励起移動を抑制することが重要であった[Chem. Commun. (2015)]。

さらに蛍光分子内において競合する蛍光過程と分子振動過程を人工環境によって選択することに成功した[Nanoscale (2016)]。この時にも大きな光信号の増強効果があり、なおかつ観測された信号は位置依存性がほとんどなく均一であった。これら一連の研究を通じて、今回のメタ表面は分子検出基板として極めて有望であることを示した。また、プラズモン増強効果全般を包括的に述べた英文単著書を出版した。プラズモニック・メタ表面という人工ナノ構造において、分子内の光励起過程を経て生じる光信号を増強して観測する研究を実施し、増強効果のない参照信号と比較するとプラズモニック・メタ表面上では光信号強度が2000倍以上増強された。今回、均一で大きな増強効果が得られたことは極低濃度分子の光検出法の実用化に向けて大きな進歩である。増強光工学を開拓するうえで特徴ある新規メタ表面構造の開発は必須であるが、平成26年度においてはプラズモ・フォトニックメタ表面を見出すことができた。プラズモ・フォトニックメタ表面を蛍光増強に活用して、顕著な蛍光増強効果を観測できたため、増強光工学の明示的な成功例を1つ示すことができた。ナノインプリント法の活用によるメタ表面の大量作製を可能にした点も本研究の手法を展開するうえで重要であると考えている。また、構造としては既知であったが、顕著は蛍光増強特性のあるメタ表面の1つとしてシリコンフォトニック結晶スラブを再発見できたことも達成度を高めたと考えている。今後はこれまでの成果を発展させる一方で、増強光工学の多様性を示す研究を推進していく方針である。(1)分子の光学遷移過程から生じる競合信号(蛍光やラマン散乱)のメタ表面上での選択可能性に関して、その普遍性を検証すべく、これまで対象としてこなかった分子種について実験研究を行う。(2)半導体における光学遷移過程の人工的な促進や選択は新規の半導体光デバイス開発につながる重要な基礎研究である。したがって、半導体を対象とする増強光工学を推進する方針である。半導体の光励起に伴う電子過程は発光のみならず、無輻射遷移と結びついた光伝導などもあり、競合過程に注意を払いながら、予断なく研究を進める。28年度が最終年度であるため、記入しない。人工ナノ構造環境下における光と物質の相互作用蛍光増強効果を素過程としてみれば、観測できたのは電子双極子遷移の増強であった。現実の物質内では蛍光に寄与する電子双極子遷移よりも非輻射遷移のほうがほとんどの場合支配的である。したがって、非輻射遷移の原因となる電子遷移過程を抑制する人工的なメタ表面の改質がつぎの重要なステップであり、平成27年度にはその具体化を進めたいと考えている。人工的に増強することが期待されている電子遷移過程は多数ある。蛍光を生じる電子双極子過程のほかに電子励起状態から電子と正孔が分離することによって生じる光触媒や光学非線形過程などがそれらの例として挙げられる。増強光工学としての展開に多様性も重要であるから、電子双極子遷移以外の電子過程にも研究を進めていく方針である。
不妊症診断・治療のための迅速簡便なホルモン一斉分析システムの開発

1000分の1ミリメートルの精度で微細加工するための技術(MEMS)を利用して化学分析マイクロチップを設計・作成し、多項目の内分泌検査を一つの装置内で一斉、迅速、簡便、高感度かつ高精度で行うことができる実用分析システムを構築した。これまで不妊症治療の臨床現場で1週間程度かかっていた内分泌検査がわずか数分間のうちに完結できる分析システムの開発に成功した。本研究の目的は、高感度検出試薬固定化マイクロチップ技術を用いて、多項目の性ホルモン検査を一つの装置内で行える一斉分析システムを開発することである。本分析システムの原理は、複数の抗体試薬を一つのマイクロチャンネル内にあらかじめ固定化し、微量の試料がチャンネル内を通過する際に複数の抗体とわずか数分の間に反応完結し、高感度蛍光検出系によって検出するというものである。これに基づいて、研究計画を以下の6項目に分類した。(1)分離・発色系の検討(抗原抗体反応、酵素反応、蛍光反応、感度・精度・再現性)(2)蛍光検出技術の検討(光源・レンズ・フィルター・CCDなど光学系の選択、データ処理法)(3)マイクロチャンネル設計・作製(材質、サイズ、エッチング、固定化技術、インターフェイス)(4)試料導入方法(採取チップ、前処理、送液)(5)試作機の作製(モジュール結合、小型化の試み)(6)実証実験・評価(従来機との比較、実際試料への応用)1000分の1ミリメートルの精度で微細加工するための技術(MEMS)を利用して化学分析マイクロチップを設計・作成し、多項目の内分泌検査を一つの装置内で一斉、迅速、簡便、高感度かつ高精度で行うことができる実用分析システムを構築した。本年度は、1.分離・発色系の検討、2.蛍光検出技術の検討、ならびに3.マイクロチャネルの設計・作製に着手した。1.分離・発色系の検討種々のホルモンの分離検出系の構築を目指して、生体成分の高感度かつ簡便な分離法であるELISAを用いた分離検出系の原理検証を行った。高感度検出を視野において、発色試薬にはAmplex RedやFluorescein Diphophateなどの蛍光試薬を扱った。原理検証のためのモデル物質としては、研究に汎用されかつ取り扱いの容易な数種類のホルモンを選択した。発色試薬の種類や濃度、および溶液のpHなど反応効率を左右する諸条件を最適化し、ホルモンを蛍光検出によって高感度に分離定量できることを確かめた。2.蛍光検出技術の検討マイクロチャネル内で生じた蛍光試薬からの発光を効率・精度良く捕捉するための測定技術について検討した。マイクロチャネル内で生じた蛍光試薬からの発光を効率・精度良く捕捉するために、倒立型蛍光顕微鏡と高感度CCDカメラを組み合わせた測定系を構築し、チャネルの蛍光画像を精度良く撮影するための諸条件を決定できた。3.マイクロチャネルの設計・作製マイクロチャネルの材質や形状を設計し、マイクロチャネルを組み込んだチップを試作した。チップ作成のしやすさから、ガラスとPDMSとの複合チップを設計・作製した。チップの大きさは、扱いやすさを考慮して2x4cmのサイズとした。マイクロチャネルの作成にはフォトリソグラフィーによるウェットエッチング法を採用した。エッチングの諸条件を最適化し、任意の流路径のマイクロチャネルを作成できた。本年度は、(1)蛍光検出、(2)マイクロチャネルの設計・作製、および(3)試料導入方法の3点について実験を遂行した。(1)蛍光検出蛍光標識したタンパク質をモデル化合物として用い、マイクロチャネル内に固定された蛍光標識試薬を精度良く検出できることを確認した。倒立型蛍光顕微鏡と高感度CCDカメラを組み合わせて撮影したマイクロチャンネル内の蛍光画像をパーソナルコンピュータに取り込み、蛍光スポットの強度を定量的に読み取る手法を確立した。(2)マイクロチャネルの設計・作製マイクロチャネルを組み込んだガラスとPDMSとの複合チップに試料溶液、反応試薬溶液、洗浄液を送液するためのインターフェイスについて検討した。送液部には、ポンプあるいは電気浸透流の利用が考えられたが、ガラスとPDMSとの複合チップではその構造上流路内における電気浸透流が不均一となるため、再現性の良いデータを得ることは困難であった。そこで、高精度のマイクロシリンジポンプを用いて送液を行うこととし、最適な送液条件について明らかにした。さらに、すでに開発済みの反応試薬固定化手法によって、マイクロチャネル内表面の任意の位置に抗体試薬を固定化したチップを試作できた。(3)試料導入方法多項目検査チップとのインターフェイスの容易な唾液採取法について検討した。その結果、綿による吸収の後に遠心分離にて試料を回収する方法が最も簡便であることが分かった。しかしながら、綿へのタンパク質の吸着により回収率が落ちることも同時に分かったので、今後回収率改善のための検討の必要性が明らかになった。本年度は、(1)マイクロチャネルの設計・作製、(2)試料導入方法、および(3)試作機の作製に取り組んた。(1)マイクロチャネルの設計・作製:マイクロチャネルを組み込んだガラスとPDMSとの複合チップに試料溶液、反応試薬溶液、洗浄液を送液するためのインターフェイスについて、引き続き検討した。特に、安定した送液のためには、マイクロチャネル内壁の疎水性・親水性を制御する必要があることが分かった。そこで、前処理として適当なタンパク質を内壁表面にあらかじめ吸着させておくと、送液が円滑に行えることが分かった。

ただし、吸着したタンパク質が蛍光検出や抗原抗体反応を妨害する現象が見られたため、タンパク質の種類や濃度など最適な条件についてはさらに引き続き検討が必要であることが分かった。(2)試料導入方法:唾液採取法について昨年度から引き続き検討した。唾液中の目的高分子成分が唾液採取用器具の素材に吸着して回収率が落ちてしまうという問題について、唾液採取用器具の種類を検討した結果、回収率を向上することに成功した。唾液試料をマイクロチャンネルへ導入する際に問題となる、試料そのものの粘度や気泡の影響については取り除くことが困難であった。引き続き次年度への検討課題とする。(3)試作機の作製:個々に開発したマイクロチャンネルチップ、試料採取チップ、光学系、送液系などの機能モジュールを組み合わせた分析システムの試作を目指し、構造や材料などの設計に着手した。始めは、個々のモジュールを組み合わせることができるかどうかの検証を行い、その後、サイズや形状などの最適化に結び付けることを計画した。本年度は、(1)試作機の作製ならびに(2)実証実験・評価に取り組んだ。(1)試作機の作製:個々に開発したマイクロチャンネルチップ、試料採取チップ、光学系、送液系などの機能モジュールを組み合わせた分析システムを試作した。唾液試料を検出部に導いて高感度に蛍光検出を行うための流路条件を確立できた。ヒューマンインターフェイスを意識したシステム化について検討したが、実際の製品化を念頭に置いた試作化までには、データの電子処理装置の設計・作成、得られた数値データに関する評価方法の確立、試料の粘度や気泡の蛍光検出・定量に及ぼす影響の除去など、解決すべき残された課題が多いことが分かり、計画当初の予想をはるかに上回る労力と時間がかかることが判明したため、本項目の完全な達成までには至らなかったが、次のモデル実験を実施できた。(2)実証実験・評価:作成した試作機を用いたモデル検証実験を実施できた。内分泌物質モデルとしてprolactinなど数種類を取り上げ、ヒト試料への応用について検討した。比較検証にはELISA法を用いた。その結果、唾液および血清中に含まれる内分泌物質の検出・定量が可能であることを明らかにした。例として、prolactinの検量線を作成し、1050ng/mLの定量範囲(r=0.999)を得た。検出感度は5.2ng/mLであった。したがって、本モデルはプロラクチンをはじめとする内分泌物質を含む実際試料の迅速かつ高感度な定量に有用であることが示唆された。
タンパク質の固有振動特性とマイクロセンサへの適用可能性

本研究では動物細胞の膜上に存在するタンパク質を有限要素法によりモデル化し,固有振動解析を行うことでセンサとなるタンパク質の固有振動数と固有モードを求めることを試みた.タンパク質を失点系に置き換えて有限要素法により解析するために,質量の位置および大きさ,質点同士をつなぐ合成をデータとして与える必要がある.各原子の位置座標はタンパク質のデータバンクで講評されているのでそれを用いた.原子同士をつなぐ剛性については,分光分析による吸収スペクトルを参考に決定した.その結果,タンパク質の固有振動数と対応する固有モードを求めることができた.本研究では動物細胞の膜上に存在するタンパク質を有限要素法によりモデル化し,固有振動解析を行うことでセンサとなるタンパク質の固有振動数と固有モードを求めることを試みた.タンパク質を失点系に置き換えて有限要素法により解析するために,質量の位置および大きさ,質点同士をつなぐ合成をデータとして与える必要がある.各原子の位置座標はタンパク質のデータバンクで講評されているのでそれを用いた.原子同士をつなぐ剛性については,分光分析による吸収スペクトルを参考に決定した.その結果,タンパク質の固有振動数と対応する固有モードを求めることができた.本研究では動物細胞の膜上に存在するタンパク質を有限要素法によりモデル化を行い,固有値解析を行うことでセンサタンパク質の固有振動数と固有モードを求めることを目的としていた.並行して行う細胞培養実験によりその動的特性の整合性について検討した.タンパク質を質点系に置き換えて有限要素法により解析を行うために,質量の位置および大きさ,質点同士をつなぐ剛性をデータとして与える必要がある.タンパク質としては,細胞膜上にあるタンパク質のひとつであるインテグリンを対象とした.インテグリンの分子量は8000を超えるが,各原子の位置座標はタンパク質のデータバンクで公表されている.質量は原子量を用いた.問題は原子同士をつなぐ剛性であるが,これは分光分析による吸収スペクトルを参考に剛性を決定した.これにより固有値を求めることは理論的に可能であるが,質量行列と剛性行列の各要素の値のオーダーが大きく異なっているために,計算してもすべて誤差の中に結果が埋もれてしまう.これを回避するために,各特性行列のオーダーをあわせて計算し,その後の固有値を導出する段階で補正することとした.さらに,分子に含まれる原子数が大きいために各特性行列の大きさが膨大になる.現時点でこのような大きな行列の固有値を全て精度良く計算できるスキームは存在しないために,ランチョス法を用いて,中心となる固有振動数を変化させながら固有振動数の同定を行った.分光分析では固有モードを得ることはできないが,有限要素法では固有モードも得ることができた.並行して行った実験では分光分析の吸収スペクトルから推定できる固有振動数より遙かに小さな値に固有振動数があることが推定できるが,今回の計算ではまだ分光分析による結果との一致に留まっている.今後さらに検討したい.
3次元光集積回路網に関する基礎研究

本研究では、3次元光集積回路網の実現可能性を探るため、導波路の多積層化、導波路間機能的結合、等を理論的・実験的に検討することを目的としている。本研究で得られた主な具体的成果は以下のとおりである。1.グレーティングカップラによる2階積層導波路の結合特性を、理論解析により明らかにした。2.2階積層導波路を逆方向に伝搬する光波を、グレーティングカップラにより波長選択結合させる素子を、提案、設計、作製し、その波長フィルタ特性を実験的に確認した。3.誘電体ガラス薄膜導波路を2階に積層させ、1階の導波路にビーム出射用、2階の導波路に入射ビーム偏光回転検出用のグレーティングカップラを開口を一致させて集積する光集積デバイスを提案し、その設計・作製・特性評価を行い、機能別導波路の積層およびそのデバイスへの応用における有用性・可能性を示した。4.無機誘電体薄膜と光機能性高分子薄膜との積層化として、高分子薄膜のスピン塗布・微細加工とガラス薄膜のスパッタ・微細加工を併用して多層導波路を作製し、導波の確認を行った。5.LiNbO3薄膜をサファイア基板上にレーザアブレーションにより堆積させることを試み、得られた薄膜の膜質、結晶性、光学特性を評価し、良好な導波路を得るための知見を得た。6.グレーティングカップラ結合の機能化をはかるために、3次回折によるDBR条件を制御して、1次回折による出力光のスイッチングを行うことを提案、設計、作製し、その動作原理を実証した。7.高屈折率半導体導波路にグレーティングカップラを含むグレーティング素子群の集積化および半導体レーザとの集積化に成功した。本研究では、回路網デバイスの実現可能性を探るために、導波路の多重積層化、およびそれら導波路間の機能的結合を理論的・実線的に検討することを目的としており、本年度は、導波路積層化の基礎検討を行った。具体的な成果は以下のとおりである。1.LiNbO3薄膜の堆積・特性評価LiNbO_3薄膜をサファイア基板上にレーザアブレーションにより堆積させることを試み、得られた薄膜の膜質、結晶性、光学特性を評価し、良好な導波路を得るための知見を得た。2.高精細グレーティングの作製高屈折率半導体導波路にグレーティングカップラを含むグレーティング素子群の集積化および半導体レーザとの集積化に成功した。3.高分子の積層化特性の異なる高分子薄膜のスピンコートによる多重積層化の可能性を探るために、側鎖導入型電気光学高分子、光バッファ層用低屈折率高分子、化学バッファ層用高分子等のコーティング条件を調べ、問題点を明らかにした。4.高次回折を利用するグレーティングカップラの検討積層反射膜の集積化により3次回折を利用する高効率グレーティングカップラを提案・設計し、その可能性を明らかにした。5.光集積センサデバイスの考案Si基板上にガラス導波路を2階に集積し、センサビームを形成するのための導波路と戻ってきた信号光を処理/検出するための導波路とを分離して構成する回転検出光集積デバイスを考案し、設計した。3次元光集積回路網の概念の確立および基礎技術の蓄積のため、スラブ導波路の積層化、積層導波路間の結合、ならびに積層導波路構造を用いた光集積デバイスの実現に重点をおき、理論的・実験的検討を行った。本研究で得られた主な成果は以下のとおりである。

1.光集積偏光回転検出デバイス薄膜導波路を2階に積層させ、1階の導波路にビーム出射用、2階の導波路に入射ビーム偏光回転検出用のグレーティングカップラを開口を一致させて集積する光集積デバイスを提案し、その設計・作製・特性評価を行い、機能別導波路の蓄積およびそのデバイスへの応用における有用性・可能性を示した。2.積層導波路間のグレーティングカップラによる結合の理論解析積層させた多階層導波路を伝搬する光波を結合する素子として、グレーティングカップラは、導波路間隔が離れていても適用でき、また、光波の選択的結合が可能であるという利点を有している。今回、理論解析により、その結合特性を明らかにした。3.積層導波路間逆方向結合を用いた波長フィルタ2階積層導波路を逆方向に伝搬する光波を、グレーティングカップラにより波長選択結合させる素子を、提案、設計、作製し、その波長フィルタ特性を実験的に確認した。4.スイッチング機能付グレーティングカップラグレーティングカップラ結合の機能化をはかるために、3次回折によるDBR条件を制御して、1次回折による出力光のスイッチングを行うことを提案、設計、作製し、その動作原理を実証した。高分子薄膜と誘電体薄膜の積層化導波路間の機能的結合を達成するためには、無機誘電体薄膜と光機能性高分子薄膜との積層化が有望である。今回、高分子薄膜のスピン塗布・微細加工とガラス薄膜のスパッタ・微細加工を併用して多層導波路を作製し、導波の確認を行った。
ランダム媒質の中の確率過程の研究

直線上で(ー∞,0]上で連続かつ[0,∞)で恒等的にゼロとなる関数空間w上にウィーナー測度をいれる。この空間をランダム媒質とする確率過程{X(t),t>0}を∫^x_0e^<-w(y)>dy(W∈w)をスケール関数、2e^<-w(x)>dxを速度速度とする拡散過程とするとき、次のことが成り立つ。但し、ーMは1/2から出発した一次元ブラウン運動の区間[0,2]からの脱出時間の法則に一致する。一次元空間で左半直線上(-∞,0]に{B(t),t≦0}ブラウン運動を、右半直線上[0,∞)に恒等的に0であるポテンシャル(ランダム媒質)が配置されている時にその空間上を動く拡散過程についての極限定理及びその拡散過程の最小過程についての極限定理を得ることが出来た。Sinaiのモデルの拡散モデルをBroxが得ていたが、今回の研究でランダム媒質を変化させることによって、今までは予想されていなかった現象を解明したことになる。特に最小過程の規準化極限の分布がl一次Brown運動の1/2を出発して区間[0,2]を脱する最初時間の分布に一致することは新しい現象の一つと言える。直線上で(-∞、0]上で連続かつ[0、∞)で恒等的に零となる関数空間W上にウィーナー測度を入れる。この空間をランダム媒質とする確率過程{X(t),t≧0}を∫^x_0e^<W(g)>(W∈W)をスケール関数2e^<-W(x)>dnを測度速度とする拡散過程とする時次のことが成り立つ。(3)【numerical formula】は極限分布{M、P}に収束する。但し、-Mは1/2から出発した一次元ブラウン運動の区間[0、2]からの脱出時間の法則に一致する。
連想形記憶を用いた画像情報の類似性の評価とその利用に関する研究

本研究により得られた成果は、次の五項目にまとめられる。1.連想形記憶の連想処理能力の向上に関する研究成果連想形記憶における連想能力の向上は画像情報の類似性判定能力の向上につながる。そこでここでは、不完全画像が入力された場合でも安定で、高い連想処理能力をもつ連想形記憶の構成方法を提案した。この方法はウィナ-フィルタ-の構成理論に基づくもので、不完全画像に対しても平均二乗誤差最小の最適な類瞭性判定処理を行うことができる。2.大規模な連想処理システムの構成に関する研究成果連想形記憶を用いた大規模な画像の類似性判定システムを構成するための方法を提案した。この方法は、異なった時間・異なった場所で個別に構成された小規模なシステムを複数個統合して大規模なシステムを構成するもので、この方法で実際に有効に機能することを確かめている。3.ニョ-ラルネットを用いた画像情報の類似性評価に関する研究成果連想形記憶は二層のニュ-ロン回路である。ここでは更に高い連想処理能力を得るため、より複雑なニュ-ロン回路(ホップフィ-ルド回路,多層ニュ-ロン回路)について研究を行った。その結果、回路の解析手法、回路定数の決定法,初期値決定法に関して有用な結果を得た。4.画像情報の類似性判定のための特徴量に関する研究成果画像情報の類似の判定に、従来からいくつかの特徴量が用いられている。ここではこの中で特に重要で基本的と思われる9種類の特徴量について類似性判定実験を行い、これらの特徴量の性質を検討した。5.画像情報の情報圧縮に関する研究成果連想形記憶に与える画像情報の情報圧縮に関して新しい方法を提案した。提案した方法は、多値ディザ法とPA法を用いるもので、大幅な情報圧縮を行っても高品質の画像を再生できるという特徴をもつ。複数の画像情報の間に存在する類似性を連想形記憶を用いて評価する方法を確立するため、各種の連想形記憶に対してその連想動作を理論的に解析し、その並列処理機能、記憶事項参照能力、画像情報の類似性の評価能力等を比較・検討した。また計算機械シミュレーションによりその結果を確認した。検討を行った連想形記憶は、従来の連想形記憶の中で最も代表的な相関行列型、ベイズ型、一般逆行列型の3種、新たに本研究で提案した連想形記憶、Hopfield型の連想形記憶の合計5種類である。その結果、以下のことが明らかとなった。1.相関行列型の連想形記憶はシステムの設計・構成は最も容易であるが、連想の機構に相関行列を用いているため、画像情報の類似性の評価結果は従来の「内積に基づく方法」とほとんど変わらない。2.ベイズ型の連想形記憶は、これまでパターン識別(認識)等に用いられてきた平均誤り率最小規範に基づく連想・識別を行うため、画像情報の類似性の評価には適している。3.一般逆行列型の連想形記憶は高い連想能力・記憶事項参照能力を示すが、画像情報の変形に対して連想動作が不安定になることがある。4.新たに提案した連想形記憶は、一般逆行列型の連想形記憶の持つ高い連想能力・記憶事項参照能力を保持し、かつ安定な連想動作を実現するため、画像情報の類似性の評価には最も適している(発表論文参照)。5.14で検討した連想形記憶一層のフィードフォワード型であり、その連想能力には一定の限界があるのに対し、Hopfield型の連想形記憶はフィードバック型であり、その連想能力は高い。また、画像間の類似の状況をエネルギー関数として表現できるため、類似性の評価には有利である。しかし、画像の類似性を拘束条件として回路定数に反映させる必要があるため、システムの設計・構築・動作解析はかなり困難である。本年度は,大規模な連想処理システムの構成法,ホップフィ-ルドモデルの利用,画像情報の情報圧縮に関して以下の成果を得た。

1.大規模な連想処理システムの構成に関する研究成果連想形記憶を用いた大規模な画像の類似性判定システムを構成するための方法を提案した。この方法は,異なった時間・異なった場所で個別に構成された小規模なシステムを複数個統合して大規模なシステムを構成するもので,この方法が実際に有効に機能することを確かめている。2.ニュ-ラルネットを用いた画像情報の類似性評価に関する研究成果フィ-ドバック型のニュ-ロン回路であるホップフィ-ルドモデルでは、記憶画像を回路のエネルギ-最小安定点とするように回路定数を決めることで,入力画像に最も類似した記憶画像を出力することができる。ここでは,この利用に関して以下の成果を得た。(1)エネルギ-関数の標準形を提案した。この標準形を用いれば,ニュ-ロン回路の結合係数により与えられる行列(結合行列)の固有値から回路のエネルギ-最小安定点についての性質が容易に導かれる。(2)エネルギ-関数における制約条件を制御することで,解の収束速度および収束点の妥当性を向上させる方法を求めた。(3)エネルギ-関数の概略形状(凹凸方向)から,適切な初期値を設定する方向を導いた。3.画像情報の情報圧縮に関する研究成果連想形記憶に与える画像情報の情報圧縮に関して新しい方法を提案した。提案の方法は,先ず多値ディザ法を用いて原画像から中間的な画像に情報圧縮し,更にこの画像に対してPA法(Popularity Algorithm)を用いて情報圧縮を行うもので,大幅な情報圧縮を行っても高品質の画像を再生できるという特徴をもつ。
ダイニン組換え体と、その構造・動態に基づくエネルギー変換機構の解明

細胞内で物質輸送を駆動したり細胞分裂時の染色体分離を担ったりする細胞質ダイニンがどのようにしてATPの加水分解エネルギーを力学的仕事に変換するか、その分子機構をあきらかにすることが本研究の目的である.本研究の成果としてはつぎのことがあげられる.(1)遺伝子操作を駆使してダイニンの最小モータードメインを同定し、電子顕微鏡法でその構造をあきらかにした.(2)ATP加水分解キネティックスをもとに、1個のダイニンモータードメインは3か所のATP加水分解部位と1か所のADP結合部位をもつことをあきらかにした.そして、このうち1個の主要なATP加水分解部位がダイニンのモーター機能を駆動しており、残りのATP加水分解部位は、この主要部位を制御する部位であることもあきらかにした.(3)主要ATP加水分解部位での反応ステップをストップトフロー法で詳細に解析した.(4)主要ATP加水分解部位の反応ステップに呼応して、モータードメインから突き出ているリンカーが大きくスイングし、レバーアームとして機能することをFRET法や電子顕微鏡法であきらかにした(5)主要ATP加水分解部位の加水分解ステップに呼応して、ダイニン上の微小管結合部位に構造変化がおこり、微小管とダイニンが会合と解離を繰り返すことをあきらかにした.このような成果に基づいて、ダイニンの作動機構のモデルを作り上げた.細胞内で物質輸送を駆動したり細胞分裂時の染色体分離を担ったりする細胞質ダイニンがどのようにしてATPの加水分解エネルギーを力学的仕事に変換するか、その分子機構をあきらかにすることが本研究の目的である.本研究の成果としてはつぎのことがあげられる.(1)遺伝子操作を駆使してダイニンの最小モータードメインを同定し、電子顕微鏡法でその構造をあきらかにした.(2)ATP加水分解キネティックスをもとに、1個のダイニンモータードメインは3か所のATP加水分解部位と1か所のADP結合部位をもつことをあきらかにした.そして、このうち1個の主要なATP加水分解部位がダイニンのモーター機能を駆動しており、残りのATP加水分解部位は、この主要部位を制御する部位であることもあきらかにした.(3)主要ATP加水分解部位での反応ステップをストップトフロー法で詳細に解析した.(4)主要ATP加水分解部位の反応ステップに呼応して、モータードメインから突き出ているリンカーが大きくスイングし、レバーアームとして機能することをFRET法や電子顕微鏡法であきらかにした(5)主要ATP加水分解部位の加水分解ステップに呼応して、ダイニン上の微小管結合部位に構造変化がおこり、微小管とダイニンが会合と解離を繰り返すことをあきらかにした.このような成果に基づいて、ダイニンの作動機構のモデルを作り上げた.本研究では、我々が世界に先駆けて開発した細胞質ダイニン重鎖発現システムを用い、種々の組換えダイニンを作成することで、ダイニン滑り運動の分子機構を明らかにすることが目的である。ダイニン重鎖にはモータードメイン当たり複数のATP加水分解部位が存在しており、ただひとつの加水分解部位しかもたないミオシンやキネシンといったモータータンパク質とその作動機構が大きく違っていると予想される。本年度は、この複数の加水分解部位が微小管滑り運動にどのように関わりあっているかを、GFP-BFP系を基礎にした蛍光エネルギー遷移(FRET)法で明らかにした。尾部末端にGFPを融合させ、BFPをダイニンモータードメインのAAAリングに挿入したコンストラクトは、ATP加水分解にともない大きなFRET変化を示し、これは尾部のスイングに対応する。そこで、これを光学プローブとし、AAAリング内の複数のAAAモジュールひとつひとつのWakerBモチーフにトラップ変異を導入したコンストラクトを用いて、AAA1、AAA3そしてAAA4モジュールがATP加水分解を担い、AAA2モジュールはADP結合部位であることを明らかにした。さらに、AAA1モジュールでのATP加水分解が尾部のスイングを引き起こし、微小管滑り運動に直接関わっていることも明らかにした。AAA1,AAA3そしてAAA4のATP加水分解部位は互いに強く共役しており、AAA3とAAA4の加水分解が滑り運動に果たす役割を解明することが次の課題となっている。(1)クライオ電子顕微鏡像3次元再構成によりMD-微小管複合体の3次元クライオ電子顕微鏡像を得ることに成功した(分担者,吉川との共同研究).(2)負染色電子顕微鏡法により,MD中のリンカーの位置を同定した.リンカーはATP加水分解にともないレバーアーム様の動きをすると考えられている.リンカーはちょうどAAAリング構造を横切るように位置しており,その先端はストーク基部に位置していた(Leeds大,Burgessらとの共同研究).(3)ダイニンモータードメイン(MD)の大量発現系の構築,結晶化スクリーニングをおこなっているが,その特異な形態のために容易には結晶化しないことを覚悟している.(6)MDと微小管はATP加水分解にともない解離会合を繰り返している.これとパワーストロークの位相があうことが微小管滑り運動には必須である.そこでMDと微小管の相互作用を定量的に測定し,これがATP加水分解サイクルでどのように調節されているかを検討した.その結果,パワーストローク前には微小管に弱く(解離定数50μM)結合していたMDがパワーストローク後には強く結合する(解離定数0.2μM)ことが分かった.またこの結合の強さの変化はリンカーの動きと同様にAAA1モジュールのATP加水分解と共役していることがあきらかとなった.(7)微小管結合部位はAAAリング構造と12nmにもなるコイルドコイルで隔てられている.

コイルドコイルを構成する2本のαらせんにCys残基を導入し,ジスルフィド結合で2本のらせんを固定するという実験をおこなった.この結果,2本のらせんは1ヘプタドリピート分(7残基)揺らいでおり,この揺らぎを共有結合で抑えると,ATP加水分解部位と微小管結合部位のコミュニケーションが断ち切られることがあきらかとなった.つまりダイニンでは,コイルドコイルでのらせんどうしの滑りがATP加水分解部位と微小管結合部位間のコミュニケーションに利用されていることがあきらかとなった.クライオ3次元電子顕微鏡法でダイニンモータードメイン(MD),微小管複合体の構造を明らかにした(Mizunoら,PNAS2007)。この結果,MDのATPase部位をふくむリング構造と微小管結合部位をつなぐ10-14nmもの長大なストーク,コイルドコイルが,棒と考えればよいほど硬いことがあきらかとなった。これはパワーストロークを支える構造としてストークに期待される性質である。一方,このコイルドコイルは,動的揺らぎを介して,ATPase部位と微小管結合部位が情報交換をしていることが期待されるが,実際に組換え体のジスルフィド架橋から,こうした動的揺らぎが存在し,これが情報伝達を担っていることを明らかした(Konら,投稿準備中)。つまり,ダイニンMDから突き出しているストーク構造は,パワーストロークを支えるには十分なほどの硬さをもっが,一方で動的揺らぎによって情報伝達をおこなっているという興味深い結果がえられたことになる。また,生化学的機能解析では,ATP加水分解にともない,3か所存在しているMD中のATPase部位のうち,AAA1モジュールのATPaseサイクルに共役して,レバーアームスイングと微小管との解離,会合が生じることを明らかにした(Imamulaら,PNAS2007;Mogamiら,J。Bio。Chem。2007)。つまり,ストップトフローを用いたキネティックス解析から,ATPが微小管,ダイニン複合体に結合するとまず微小管とダイニンの解離がおこり,次いでレバーアームがスイングする(recoverystroke)。ATPが加水分解されるとまず微小管にダイニンが結合し,次いでレバーアームが再び元の位置にスイングする(powerstroke)。このような時間差のある共役の結果,ダイニンは微小管上を滑り運動できることを初めて明らかにした。本年度は、1)SNAPタグで蛍光標識したダイニンモータードメインのヘテロダイマーを用い、1分子TIRF計測によって、片足を完全に不活性化してATP存在下でも微小管(MT)から離れないようししたモータードメインダイマーでも野生型のほぼ三分の一の速度でMT上をプロセシブに滑り運動することを発見した.死んだ足にQDを結合させてTIRF計測したところ、16nmでステップしていることが明らかとなった.これは、ダイニンダイマーのプロセシブ歩行機構を考えるうえで重要である.2)Cys-
『菊池風土記』の註釈的研究

本研究の対象は、『菊池風土記』という江戸時代の地誌資料で、菊池地方の伝承・風俗・記録など多様な話題を盛り込んだ書物である。一般には、時代背景をふまえないと理解困難な箇所などが多く、そのため註釈に取り組んだ。研究期間内に巻一のみではあるが註釈を付し、これをネット公開により発信した。また、註釈に付随して、同書に収録されている「菊池万句発句」についても研究を進めた。これまで歴史学からも言及のある資料だが、もう一度テキストそのものから見直す必要があることを明らかにした。1.菊池市の協力を得て、菊池風土記の巻一、巻二に記載された社寺・史跡等をいくつかピックアップし、そこを実地に探訪することで、記事との対応や現状の確認を行った。このことは、記載内容の具体的裏付けの確認という意味だけではなく、今後、本研究を社会的に還元していくうえで、どのような手法がありうるのかを考えるという意味をもつ。また菊池市と提携した今後の事業展開の可能性をさぐり、そのために必要な顔つなぎという意義もある。おそらく本研究をさらに進めていく上では、菊池市に残されている典籍類の調査が重要になってくるものと思われ、そうした新たな展開のためにも菊池市の協力は不可欠である。2.学生をアルバイト雇用し、菊池風土記の関連資料(嶋屋日記など)から菊池風土記にかかわる記事の抽出を行った。今後、その内容を註釈に反映させていく作業に移ることとなる。3.菊池風土記巻一の註釈作業を8割程度まで終了させた。註釈の作業により、一般読者にとって甚だ難解な序文について、もちいられている用語の典拠を含めて明らかにしえた。また地誌としての菊池風土記が利用している先行資料の種類が、一定程度明らかとなり、菊池風土記の生成過程が浮かび上がってきた。また、菊池風土記がその中に納めている資料の性格と、文献学的にみた場合の問題についても、この註釈作業により明らかとなってきた。ことに、これまで専門としてきた連歌研究にかかわるものとして、菊池万句の資料批判を行う必要性が明らかとなったことは大きな意義がある。『菊池風土記』研究のための基礎資料の収集、整備を行い、註釈作業の準備段階に入った。これまで一般に提供されている『菊池風土記』テキストは、『肥後文献叢書』所収のものであったが、これはその底本についての情報が明示されておらず、テキストの信頼性については、検討の余地を残していた。そこで、まずは伝来奥書を有する本学蔵本について、学生アルバイトを用い巻一の翻刻を行った。なお、本学蔵本以外のテキストとしては、東洋文庫蔵本の複写を入手した。なお、収集すべきテキストは残っているが、活字テキストを相対化するための準備段階としては、一定の写本テキストを集めることができた。また、菊池市の協力を得て、同市公民館所蔵の和本調査を実施した。これには、本学の学生有志、同僚も参加することで、地域研究と教育とが緊密に連携した研究スタイルを模索できたのではないかと思われる。また、同様の試みを水俣市立図書館の淇水文庫においても実施し、学生の書誌調査能力の育成の一助とした。最後に、註釈作業に入るための資料整備として、『肥後国志』『肥後国絵図』『鎮西菊池軍記』等の郷土史関連資料の収集を行った。これと並行し、先行研究の確認をすすめたが、その調査の過程において、『菊池風土記』に先行する地誌資料、『菊池温故』が重要な位置を占めることが判明した。ただし、これも伝本調査から徹底する必要があり、改めて資料収集にとりかかったところである。本研究は人文学分野における地域課題の解決を念頭に、近世熊本の地誌資料の一つである『菊池風土記』をテキストから見直し、通行の活字本を批判的に乗り越え、信頼すべきテキストを紹介し、さらには難解な記述については註釈を加えることで、広く一般を含めた学問成果の還元をはかることにある。研究期間を通じて、東洋文庫本、太宰府市公文書館寄託大江田家資料本、そして「肥後文献叢書本」など幾つかのテキストを収集し、比較検討しながら、比較的善本と考えられる熊本県立大学蔵中嶋真親写本をベースに翻刻を行い、そこに諸本比較を加えながら註釈を付す作業を行った。註釈は、相当に多方面にわたる話題を扱うことから、研究期間内では全七巻のうち巻一について、ひとまず註釈を終えた。また、研究期間内には、地域連携の観点から菊池市当局の協力を得、『菊池風土記』中に記される主要な社寺、遺跡を見て回ることができた。期間内の研究成果をふまえながら、最終年度には三冊本の熊本県立大学蔵中嶋真親写本の第一分冊(巻一・巻二)を、熊本文化研究叢書第9輯として影印刊行した。また新たにホームページを立ち上げ、インターネットを利用して巻一の註釈を公開した。

なお、『菊池風土記』巻一の註釈の過程で、特に同巻に収録される『菊池万句発句』についての研究を深め、その成果を平成26年度熊本県立大学日本語日本文学会において「「菊池万句」をめぐる基礎的問題」と題して研究発表を行った。これは学生の地域理解促進と研究成果の教育的還元を意図したものである。特に菊池市在住の方や、菊池市ゆかりの方々からの問い合わせも数件あり、原文のままでは難解な内容も、研究の成果をふまえながら広く読まれるものとしていくことが、郷土にかかわる文献に求められていることを示している。その点に、本研究の意義は明確に窺われることと思われる。日本文学当初計画においては、巻二までの註釈を予定していた。その意味においては、現在、巻一の註釈を八割程度終えているという進展状況は、やや遅れているともいえるかもしれないが、註釈を進める過程で相当に詳細な内容の註釈へと、質的に変化を遂げてきている。むしろ、質的水準を維持した註釈を続けることに重きを置くならば、順調な進展と考えられる。当初の予定では、本学蔵本の翻刻作業が終了し次第、学生の自主研究を組織することで註釈作業を進める予定でいたところ、学生の組織化が必ずしも順調に進まず、かつ一年生ばかりの組織となってしまい、上級生の参加が得られなかった。そのため、24年度末時点では、底本と予定しているテキストの一巻分の電子入力を終えたに留まっている。初年度で註釈作業に多少なりとも着手する予定からすれば、やや遅れていると言わざるをえないため。達成度の欄にふれたように、単に地誌として「読める」ものにする註釈という水準ではなく、歴史・文学・芸能等にまたがる諸領域の研究成果の集約をはかり、それを反映させた詳細な註釈をめざす。当面は巻一の註釈を完成させ、冊子その他の形として公開へともっていくことに力を注ぎ、巻二からは順次、紀要類を用いての発表としていくことで、責任を果たしたいと考える。まず学生の自主研究と連動した形で、巻一の註釈の具体的作業に入る。それとあわせて、『菊池風土記』とかかわりの深い地誌資料である『菊池温故』についても調査を進める必要がある。まずは、『菊池温故』の最善本かと推測される東京大学史料編纂所の謄写本を入手し、内容の点検を行う必要がある。同時に、簡易に複写の入手できるものについては、他の諸本も収集しつつ、史料編纂所本の位置づけを考えていく。『菊池温故』のテキスト批判を進めながら、同時にその成果を『菊池風土記』註釈に活かし、両者の関係について見通しを立てていく。翌年度が研究計画の最終年度となるため、その成果発表を書冊の形では公にすることを念頭においていたが、原テキストの写真、本文そして註釈を合わせると、かなりの印刷経費を要することが想定されるため、最終年度の予算に余裕をもたせる必要があった。最終年度は成果公開のための経費が、主たる支出費目となる。これを印刷物として刊行するか、あるいはホームページにより発信するか、現在ふたつの選択肢を考慮に入れて検討している。後者の場合にはホームページの作成経費が支出の大きな部分を占めることとなる。なお、作成した註釈の校正作業が公開までには必要であり、そのためのアルバイト経費も支出の予定である。新たに『菊池温故』など、関連した地誌資料の重要性が明らかとなってきたため、それらの複写代金が必要である。また、図書館等への調査の必要性も出てくる可能性が高い。
膜蛋白質のトポロジー形成機構と構造予測

小胞体での膜タンパク質の立体構造形成に関して以下のことを明らかにした。1、I-型(Nlumen/Ccytoplasm)シグナルアンカー配列の機能が、疎水性セグメントが長いことと、そのセグメントのアミノ末端に正電荷を持つアミノ酸がないという特性により規定されていることを明らかにした。すなわち、アミノ末端に正電荷を導入すること、および疎水セグメントを短くすることにより、小胞体型チトクロームP450のI-型シグナルアンカー配列が逆の配向を示すシグナル配列に変換されることを実証した。さらに、一連のモデル配列を用いた実験から、シグナル配列の機能は疎水セグメントとそのアミノ末端側の正電荷のバランスで決まることを確認した。2、小胞体膜での新生ペプチド鎖の膜透過を停止する機能は、主にセグメントの疎水性で規定されていることを明らかにした。また、疎水性セグメントのカルボキシル末端側に高頻度で見られる正電荷をもつアミノ酸残基が、膜透過を抑制し、膜貫通型のトポロジーを形成するために積極的に機能することを実証した。3、複数の膜貫通セグメントを有するタンパク質のトポロジー形成に関わる“膜透過再開配列"の基本特性を明らかにした。即ち、膜透過停止の後、膜への組み込みを再開してこのようなトポロジーを形成する機能は、疎水性セグメントの長さに依存しており、N-末端のシグナル配列に認められている疎水セグメントのアミノ末端側の正電荷の要求性は認められないことを明らかにした。今後、疎水性セグメント間の相互作用や、疎水セグメントの前後関係のトポロジーへの影響を詳細に解析する。
在日朝鮮人の機関紙における北朝鮮文学と韓国文学の様相

朝鮮半島が日本から解放され、南北への分裂から朝鮮戦争へと続く激動の時代に国境越えを経験したいわゆる「越北」「越南」作家や朝鮮戦争を経験した作家の作品と、日本在住の朝鮮人により組織された総連系や民団系の機関紙(1950年代半ばから1960年代半ば)を中心に資料調査及び比較分析を行うことで、在日朝鮮人文学の特徴や様相を明確にすることができると考える。
トランスジェニックマウスを用いた心筋小胞体カルセクエストリンの生理機能の解析

ナトリウム/水素交換担体(Sodium/Proton Antiporter)は細胞内pHの維持を担う細胞膜蛋白であるが、細胞増殖作用を持ち、この遺伝子の過剰発現マウス(トランスジェニックマウス)では塩分負荷により、心臓肥大が形成される。この肥大心形成に伴う心筋小胞体のカルシウム貯蔵能の変動について検討し、カルセクエストリンの生理機能を解析した。1.高血圧性心肥大形成に伴う心機能の変化、すなわち、心拍数の減少(陰性変時作用)や、収縮弛緩速度の減少には、心筋小胞体Ca2+-ATPaseによるCa2+汲み上げ速度の減少だけでなく、カルセクエストリンによるカルシウム貯蔵能の低下が大きく寄与していることが明らかになった。2.著者は圧負荷肥大心では、圧負荷の程度によらず、カルセクエストリンmRNA発現量が変動しないことを既に報告している(J Moll Cell Cardiol 28:1583-1590:1996 Arai M.et.al.)。本研究により、カルセクエストリンは遺伝子転写レベルではdown-regulationがみられないものの、機能レベルでは低下がみられ、mRNAと機能の間に解離があることが判明した。3.本研究の肥大心では、Ca2+輸送能の変動は心機能(心拍数)の変動とよく相関した。肥大に伴うカルセクエストリシを介した細胞内Ca2+貯蔵能の変化やSRCa2+-ATPaseを介したCa2+汲み上げ能の変化は、心筋細胞肥大刺激としてではなく、心機能の調節因子としてのみ作用する。最近、カルセクエストリンはCa2+放出を行うリアノジン受容体と介在蛋白を介して機能的複合体を形成するとの報告がある。今後、Ca2+放出能との同時測定や、カルセクエストリンの転写、翻訳時の遺伝子制御機構についての研究を計画している。ナトリウム/水素交換担体(Sodium/Proton Antiporter)遺伝子のトランスジェニックマウス(Na/H過剰発現マウス)において、心筋小胞体のカルシウム貯蔵蛋白であるカルセクエストリンのカルシウム貯蔵能について検討した。8週令の雌Na/H過剰発現マウスに8%の塩化ナトリウム負荷食を8週間経口摂取させ、容量負荷心を作製した。対照は同週令のNa/H過剰発現マウスに0.3%の塩化ナトリウムを負荷したものを用いた。マウスは体重、血圧、心拍数、心電図変化を計測の後、屠殺し、心筋重量を測定した。摘出心筋をホモジェナイズし、粗心筋小胞体分画をレムリ-法により電気泳動した。これをニトロセルロース膜にブロッティングした後、カルシウムオーバーレイ法により^<45>CaCl2と反応させ、カルセクエストリンによるカルシウム貯蔵量をオートラジオグラム上で半定量した。容量負荷心筋のカルシウム貯蔵量(92±13%)は実験群のそれと有意差を認めなかった。また、同じサンプルにより、心筋小胞体のカルシウムポンプ(SR Ca2_<+->ATPase)のカルシウム汲み上げ能についても検討しているが、現在までの計測では実験群は55±14nmol Ca2_+/mg protein/5 minに対して、対照群では74±14nmol Ca2_+/mg protein/5 minと容量負荷心で減少を認めた。すなわち、容量負荷心では心筋小胞体へのカルシウム汲み上げ速度は減少しているものの、心筋小胞体でのカルシウム保持能には変化が見られないことが判明した。現在、検体数を増やして、上記の検討を重ねている。また、ノーザンブロット法でカルシウムポンプとカルセクエストリンのmRNA発現量の検討も行う予定である。ナトリウム/水素交換担体(Sodium/Proton Antiporter)は細胞内pHの維持を担う細胞膜蛋白であるが、細胞増殖作用を持ち、実験的肥大心筋では、そのmRNA

発現量が増加しているとの報告がある。この遺伝子のトランスジェニックマウス(Na/H過剰発現マウス)に塩分負荷を行い、心臓肥大を作製し、肥大心形成に伴う心筋小胞体のカルシウム貯蔵能の変動について検討し、カルセクエストリンの生理機能を検討した。8週令の雌Na/H過剰発現マウスに8%の塩化ナトリウム負荷食を8週間経口摂取させ、肥大心を作製した。対照は同週令のNa/H過剰発現マウスに0.3%の塩化ナトリウムを負荷したもの、および、野生型マウスに8%ならびに0.3%塩化ナトリウム食を負荷したものを用いた。マウスは体重、血圧、心拍数、心電図変化を計測の後、屠殺し、心筋重量、心室壁厚を測定した。摘出心筋をホモジェナイズし、粗心筋小胞体分画をレムリ-法により電気泳動した。これをニトロセルロース膜にブロッティングした後、カルシウムオーバーレイ法により^<45>CaCl2と反応させ、カルセクエストリンによるカルシウム貯蔵量をオートラジオグラム上で半定量した。また、心筋小胞体Ca^<2+>-ATPaseによるCa^<2+>汲み上げ能も測定した。Na/H過剰発現マウスに8%の塩化ナトリウム負荷を加えた群では、ほかの3種に比し有意に、血圧の上昇(収縮期圧123mmHg)、脈拍数の減少(568bpm)、両心室重量/体重比の増加(4.04mg/g),心室中隔厚の増加(1.21mm)、左室自由壁厚の増加(1.08mm)を認め、肥大心が形成されたことが確認された。この心筋では、カルシウム汲み上げ能の有意な減少(21.0nmol Ca/mg protein min)はあるものの、心筋小胞体カルシウム貯蔵量には変動がみられなかった(野生型低塩群の92【plus-minus】13%以上より、肥大心筋では心筋小胞体へのカルシウム汲み上げ速度は減少しているものの、心筋小胞体でのカルシウム貯蔵能、保持能には変化が見られないことが判明した。