hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
建築物に作用する津波荷重の定量化とその耐津波性能の向上に関する総合的研究

本研究の成果は下記の通りである。1)津波漂流物の衝突外力並びに衝突外力が作用した際の応答を実験・解析を通して評価し,その簡便な評価法を提案した。2)津波漂流物の衝突により柱に局所的な破壊が生じた状況を想定し,破壊された柱の軸力(自重)保持能力評価法を提案した。3)津波外力により生じるひび割れの抑制とそれによる劣化の防止を目的として,既存の縮小部材実験における損傷量データを実大部材のそれへと換算するための損傷量換算評価手法を提案した本研究の成果は下記の通りである。3)津波外力により生じるひび割れの抑制とそれによる劣化の防止を目的として,既存の縮小部材実験における損傷量データを実大部材のそれへと換算するための損傷量換算評価手法を提案した平成24年度の本研究課題で実施した研究は、主として下記の2点である。1小型水槽を用いた津波漂流物の衝突実験及び解析アクリル製の小型水槽を用いて、6階建て津波避難ビルを模した鋼製試験体を津波漂流物を模した模型へと衝突させる衝突実験を実施し、衝突力、衝突時間及びそれらによる建物の応答を検討した。その結果、衝突時間は衝突速度に因らないこと、衝突速度および漂流物質量が増大し、衝突力の力積が増大すると、建物の衝突による変位も増大すること、および衝突時間などの条件が変化しても衝突力の力積が一定である限り、応答変形も一定であることが確認された。また、本実験に類似の状況を想定した衝突解析では、浸水深および水深係数が増大すると、建物の応答塑性率が1階部分において大きくなること、さらにその状態において300t程度の漂流物の衝突を受けると1階及び高層階において応答塑性率が1を超え、降伏する場合があることを確認した。2津波漂流物の衝突により破壊した鉄筋コンクリート造柱の残存軸耐力評価実験上記の衝突実験及び衝突解析に基づき、漂流物の衝突により破壊が生じた柱の軸力支持能力が、津波避難ビルの安全性検討のためには不可欠であるとの認識に至った。津波波力および漂流物の衝突に対しては、建物全体の水平抵抗力により抵抗可能であったとしても、柱等に局所的な破壊が生じた場合にはその軸耐力が維持できることは最低限保証されるべきである。以上の認識に基づき、破壊した鉄筋コンクリート造柱を想定した柱試験体の残存軸耐力評価実験を行った。試験体は漂流物の衝突により柱内部のコンクリートが破壊されかつ津波により流失した状態(柱の軸力支持能力を検討する上では最悪の状態)を想定し、露出した主筋のみの試験体を作成した。試験体に軸力に相当する錘を設置し水平変形を与えたところ、早期に軸崩壊した試験体が見られた。今年度は,津波漂流物の衝突が津波避難ビルへ与える影響を調査した。具体的な研究内容を下記に示す。1津波漂流物の衝突を模擬した衝突実験ならびに同解析衝突実験を行う際に想定した衝突物は排水量300tの鋼製船舶で,これを相似則に従い1/40に縮小した鋼棒を,津波避難ビルを模擬した鉄筋コンクリート(RC)スタブへ衝突させた。本実験では,主に最大衝突力,衝突時間,力積の特性及び反発係数を把握することを目的として実施し,また,それを補完する解析を行った結果,下記を明らかにした。(1)鋼製船舶と建築物の間の反発係数は衝突速度によらず一定となるが,質量と材長(船の長さ)により変化し,単位長さあたりの質量を変数にとることにより反発係数の変動を評価できる。(2)実大スケールで衝突力および力積の評価に必要な衝突力波形の形状と衝突時間及び反発係数は,船舶排水量と船長から評価が可能である。(3)津波荷重に対して構造耐力上満足するもののその余裕度が低い6階建てRC造津波避難ビルの場合,排水量300tの40m船舶が衝突すると,衝突速度が1.0m/sであっても建物が降伏する恐れがある。2津波避難ビルに漂流物が衝突した際の崩壊安全性検討「津波防災地域づくりに関する法律」の技術基準である「津波避難ビル等の構造上の要件に係る暫定指針」には,津波漂流物の衝突により建築物に局所的な破壊が生じたとしても,崩壊に至らないことを設計段階で確認することが要求されているが,その具体的な確認方法は提示されていない。そこで本研究では,津波漂流物がRC造柱に衝突することにより柱内部のコンクリートが完全に流出した状況を想定した試験体を製作し,避難ビルの自重に相当する鉛直荷重作用下での加力実験を行った。その結果,(1)柱が崩壊するときには主筋が全塑性状態となること,(2)主筋が露出した柱の軸力保持能力は主筋端部での力の釣合い式により評価可能であること,を明らかにした。平成26年度は,津波漂流物が建築物に衝突した際の応答の理論解を簡略化することによりその推定式を提案し、動的解析との比較によりその妥当性を検証した。本研究ではまず,衝撃外力が作用する多質点系モデルの応答の理論解を弾性理論に基づいて導出した。

続いて,平成25年度での解析的検討により,津波漂流物が建築物に衝突すると,衝突階より上の階と下の階ではその応答性状が大きく異なることが明らかとなったことを利用し,理論式を衝突階より上の階と下の階で分けて簡略化することにより,簡易な応答の評価式を提案した。本研究で提案した応答の評価式を用いて,津波避難ビルを想定した6質点系モデルの応答解析結果と比較したところ,評価式は解析結果を包絡する傾向が見られた。しかしながら,下階に荷重が作用した時の上階の応答評価には,簡略化の際に高次モードの影響が加味されていないため,やや過小評価となった。以上より,高次モードの影響の評価に課題は残るものの,本研究で提案した応答評価式を用いることで,概ね妥当な応答(外力)評価がなされる。加えて,津波避難ビルの総合的な耐津波性能向上のために欠かせない,ひび割れからの海水の侵入を防ぎ劣化を防止することを図ることを目的とした鉄筋コンクリート造部材の損傷評価実験を行った。具体的には,これまで行われてきた多種多様な部材の縮小試験体による損傷評価実験で得られた部材損傷データを実大の津波避難ビルにも適用可能とすべく,縮小試験体と実大試験体の寸法の差異がひび割れ幅・長さ等の損傷量に与える影響を検討した。その結果,縮小試験体に生じた損傷量を用いて,部材の幾何学的変形モデルを介することにより,実大建物の損傷を精度よく評価することができた。26年度が最終年度であるため、記入しない。予定していた衝突実験ならびに衝突解析,および漂流物が衝突した際の軸力保持能力を検証する実験を実施し,津波漂流物の衝突による建築物の応答及びそれに対する建築物の安全性が明らかとなってきたため,おおむね順調に進展していると評価した。防災H26年度には,H25年度の研究結果を利用して,津波避難ビルの設計に用いる津波漂流物衝突外力評価法の検討を行う。H25年度に行った衝突解析においては,漂流物衝突階の上下でその応答性状が異なる傾向が見られた。具体的には,荷重作用階より上階では建物の一次固有周期程度の周期で応答し,荷重作用階以下での応答波形は荷重波形と同様の波形形状となった。このため,衝突階上下の応答性状を理論的に検討したのち,衝突階上下で異なる外力・応答評価法を提案する予定である。加えて,津波避難ビルの総合的な対津波性能向上を目的として,津波波力により鉄筋コンクリート部材に生じるひび割れ幅等の損傷量を評価する手法を開発し,ひび割れからの海水の侵入を防ぎ劣化を防止するための検討を行う。具体的には,これまで行われてきた縮小試験体を用いた部材実験結果を利用しこれらの実験で得られたひび割れ幅等の実験結果を設計時に参照可能なものとするため,縮小試験体ー実大試験体間のひび割れ損傷量の差異を検討し,両者を容易に変換可能にする評価手法を開発する。本研究では建築物に作用する津波荷重だけでなく、建築物の耐津波性能の向上に関する総合的研究を行うことを主旨としているため、検討が必要な課題が多岐に渡っており、また、研究実績の概要の欄で述べた柱の残存軸耐力評価実験のように、研究の進捗に伴い新たな課題が生じることもあった。これらの、申請当初には予期しえなかったが目的達成のためには必要となる課題の解決に時間を費やす必要があったため、現段階の達成度としてはやや遅れている。今後は、アクリル製水路(幅1m程度)および1/30スケールの建物模型ならびに漂流物模型を用いた、より実大に近い状況を模擬した衝突実験を行う。実験は漂流物質量や流速等をパラメータとした複数ケースについて行う予定であるが、それでも不足する条件下での衝突評価は解析により補完する予定である。
エンドセリン変換酵素の調節機構ならびに病態モデルでのその発現の変化

エンドセリン変換酵素(以下ECE-1)は、エンドセリンの産生過程において、Prepro-ET-1より産生された中間体Big-ET-1をET-1に変換される役割を有する酵素である。私達はエンドセリン変換酵素の発現調節に関し検討し、以下の実験結果を得た。ウシ大動脈培養内皮細胞、ならびにラット大動脈培養平滑筋細胞において、それぞれの細胞におけるECE-1mRNA発現を、ウシECE-1 cDNAより作成したプローブを用い、Northern blotting法により検討した。実験においては、各培養細胞がcpnfluentな状態で、無刺激無血清培養下24時間における発現量をコントロールとして、種々の因子による刺激後の発現量の変化を検討した。(2)各種循環器疾患の病態モデルにおける心血管系でのECD蛋白発現の変化家兎免疫抗ウシECE polyclonal抗体を用い免疫組織化学を行なった。1。ラット頚動脈balloon傷害内膜剥離、血管壁肥厚モデル:内膜肥厚部に一致し、内皮細胞のみならず増殖平滑筋細胞においてもECE-1蛋白発現を認めた。2。モノクロタリンによるラット肺高血圧、右心不全モデル:Western blotting法による検討において、心室におけるET-1蛋白の発現は右心不全ラットではコントロールラットに比べて増加していたが、ECE-1蛋白の発現もやや増大の傾向を認めた。以上よりECE-1は各細胞においてconstitutiveに発現しており、その遺伝子発現は比較的安定であるが、生体内においては病態により発現量が変化する可能性があると考えられた。1。2。
大断層変位を想定した超免震橋梁構造物の一提案

1999年8月のトルコ・コジャエリ地震と同年9月の台湾・集集地震では,数mの大断層変位による社会基盤施設の被害が多数生じ,特に,集集地震では橋台や橋脚の倒壊,単純桁の落下が8橋の橋梁で報告されている.本研究では,1)このような地盤の大変位による橋台や橋脚の倒壊,および桁の落橋メカニズムを数値シミュレーションによって解明し,2)数mに及ぶ大断層変位が生じても橋梁としての機能を保持できる新構造形式ならびに大断層変位を想定した橋梁構造物の耐震設計法の模索を試みた.平成13年度には上記2)について,大断層変位に対応できる構造形式として可能性のあるマルチヒンジ免震構造に対する検討を行った.マルチヒンジ免震構造とは,橋梁全体系を構成する構造要素の塑性ヒンジ化によって地盤で生じた断層変位を分散させようという発想である.もともと,免震橋梁では免震支承でのみ塑性化を図り,上下部構造の地震応答の低減を目指す構造形式であるが,地盤上の大変位に対応するためには免震支承の塑性化のみならず,上部構造を支える橋脚や基礎においても塑性ヒンジ化を許容しなければならない.以上より,免震橋梁において免震支承と下部構造が同時に塑性化した場合の非線形地震応答の相互作用による影響について,別途行った繰り返し載荷実験とハイブリッド地震応答実験による実験データを活用し,解析的に検討を行い,地震入力において大変位が生じた場合の構造要素間の変形の分担を平均相互作用係数という指標で評価し,マルチヒンジ免震構造を達成するために必要な免震支承-下部構造間の塑性ヒンジ化の度合いについて明らかにした.同時に,現行の免震設計においてはこれらの構造要素間の非線形応答の相互作用による影響を評価できていないため,この点について前述した平均相互作用係数と関連づける方法について提案した.1999年に発生したトルコ・コジャエリ地震,トルコ・デュッゼ地震,台湾・集集地震では,数mの大断層変位による構造物の被害が多数生じた.日本においても2000箇所以上の断層が現時点で確認されており,これらの地震で見られたような断層変位による構造物の被害が生じない保証はない.以上を踏まえ,本研究の目的としては,1)大変位地震入力下における橋梁の落橋メカニズムを解明すると同時に,2)数mに及ぶ大断層変位が生じても橋梁としての機能を保持できる新構造形式を模索することである.本年度は上記1)について検討を行った.第一に,トルコおよび台湾地震における橋梁の被害を断層変位量や断層線の方向と関連づけることによって解析的に分析した.特に,台湾における卑豊橋,烏渓橋の落橋メカニズムに着目し,周辺地盤において水平方向,上下方向ともに3m4m程度の断層変位が生じたことを明らかにすると同時に,断層の上下方向変位によって生じた隣接桁間の段差ではなく断層の水平方向変位によって生じた隣接桁間の相対変位によって落橋したことを明らかにした.第二に,単純桁橋を模擬した模型供試体を製作し,大変位地震入力下における隣接桁の運動の相互作用,特に隣接桁間の衝突現象について実験的に再現し,桁間衝突のメカニズムの解明および衝突を緩和するための落橋防止構造の有効性に関する実験的検討を行った.その結果,隣接桁の圧縮・引張方向の相対変位の増大を防止するためにはゴム製緩衝装置が有効であることを明らかにした.次年度においてはこれらのゴム製の緩衝材料を地盤に設置し,橋梁-地盤全体系に対する免震構造について検討していくつもりである.1999年8月のトルコ・コジャエリ地震と同年9月の台湾・集集地震では,数mの大断層変位による社会基盤施設の被害が多数生じ,特に,集集地震では橋台や橋脚の倒壊,単純桁の落下が8橋の橋梁で報告されている.本研究では,1)このような地盤の大変位による橋台や橋脚の倒壊,および桁の落橋メカニズムを数値シミュレーションによって解明し,2)数mに及ぶ大断層変位が生じても橋梁としての機能を保持できる新構造形式ならびに大断層変位を想定した橋梁構造物の耐震設計法の模索を試みた.平成13年度には上記2)について,大断層変位に対応できる構造形式として可能性のあるマルチヒンジ免震構造に対する検討を行った.マルチヒンジ免震構造とは,橋梁全体系を構成する構造要素の塑性ヒンジ化によって地盤で生じた断層変位を分散させようという発想である.もともと,免震橋梁では免震支承でのみ塑性化を図り,上下部構造の地震応答の低減を目指す構造形式であるが,地盤上の大変位に対応するためには免震支承の塑性化のみならず,上部構造を支える橋脚や基礎においても塑性ヒンジ化を許容しなければならない.以上より,免震橋梁において免震支承と下部構造が同時に塑性化した場合の非線形地震応答の相互作用による影響について,別途行った繰り返し載荷実験とハイブリッド地震応答実験による実験データを活用し,解析的に検討を行い,地震入力において大変位が生じた場合の構造要素間の変形の分担を平均相互作用係数という指標で評価し,マルチヒンジ免震構造を達成するために必要な免震支承-下部構造間の塑性ヒンジ化の度合いについて明らかにした.同時に,現行の免震設計においてはこれらの構造要素間の非線形応答の相互作用による影響を評価できていないため,この点について前述した平均相互作用係数と関連づける方法について提案した.
海溝近傍での海洋プレート変形に伴う水・熱の流動過程とその沈み込み帯への影響の解明

1.2018年9月の「白鳳丸」KH-18-5航海により、北海道沖千島海溝海側のアウターライズにおいて地殻熱流量の測定を行った。一部の点のみにおいて、沈み込む太平洋プレートの年齢に対して有意に高い熱流量が測定され、熱流量分布の特徴が日本海溝とは異なることが判明した。この航海では、熱流量測定用温度プローブの改良に向けての機器動作試験も行った。また水晶温度計・恒温槽を購入し、温度センサの特性試験の精度を高めた。2.2018年8月の「新青丸」KS-18-9航海において、日本海溝海側の太平洋プレート上で活動するプチスポット火山の岩石採取を行った。特異な化学組成を示す、極めて若い溶岩試料が得られた。また複数薄片作成装置を導入し、岩石試料の処理を効率化した。3.メタン,水素,二酸化炭素等の濃度を高精度で測定するためのガス分析システムを整備し、海底下深部から移動してくるガスの検出感度を向上させた。陸上火山地帯において水・ガス試料の採取・分析を実践し、海域での流体試料採取法、ヘリウム同位体などの測定手法を検討した。4.宮城沖日本海溝を横切る測線で過去に取得された反射法地震探査データの再解析を行い、海溝海側に発達する正断層による地塁・地溝構造の詳細イメージングやP波速度モデル構築に成功した。既存の海底電磁気観測データを新たな手法を用いて解析し、岩手沖日本海溝アウターライズ下の海洋プレート内の比抵抗構造を求めた。5.室内実験により、海洋地殻・マントルを構成する岩石の浸透率、間隙のサイズを測定し、海洋プレート上部における流体移動について考察した。6.既存の地殻熱流量データに基づき、1つのプチスポット火山を通る水循環の流量と熱輸送量を見積もった。堆積物から突き出た複数の山体における水循環・熱輸送の数値計算を行い、熱流量観測値は、水が1つの山から流入し他から流出することで概ね説明できることを示した。千島海溝海域における熱流量測定、日本海溝海域における岩石採取とも、航海中の台風の影響により計画の一部が実施できなかったものの、これまで未調査であった地域でデータ・試料を得ることに成功し、アウターライズにおける流体循環・火成活動について重要な知見を加えることができた。温度センサの特性試験、ガス試料分析等のシステムの整備を進めることにより、今後実施する熱流量測定、間隙水分析等の観測調査において、より高精度のデータを得る体制を整えることができた。熱流量測定用温度プローブ改良のための海中試験により、測定機器への衝撃が計測に影響することが判明したが、この問題点を解決する方法の検討を行った結果、既に設計変更を終え、次年度に再度の試験を行う準備を進めている。次年度に実施すべき観測調査について議論した上で、アウターライズ上のプチスポット火山が海洋地殻内の流体循環に及ぼす影響を調べる調査航海の提案を行い、採択された。千島海溝海側の熱流量分布が日本海溝と異なる特徴を示すことが判明し、既存の地震波速度構造の情報と合わせて、両海溝の間の違いが明らかになってきた。この違いを調べることは、海溝海側で海洋プレートに水が入る過程を解明するために非常に重要である。今後、本研究における重点課題として、千島海溝海域での電磁気探査等も含めた調査観測を計画する一方、他の研究計画による地殻構造探査等とも密接に連携する。また、両海溝の構造の違いを取り入れ、熱流量分布の差を説明する流体循環と熱輸送のモデルの構築を試みる。海溝海側において沈み込むプレートに生じる過程、それが沈み込み帯に及ぼす影響について、本研究が対象とする流体と熱の移動にとどまらず、より総合的な研究を推進する。このために、沈み込み帯へのインプットをテーマとした学会セッションや研究集会を開催し、沈み込んだプレートに関する研究も含めて、幅広い分野の研究者との情報交換・議論を進める。また、日本海溝アウターライズを対象とした2つの掘削調査提案との協力も深めていく。

既存の海底電磁気観測データを新たな手法を用いて解析し、岩手沖日本海溝アウターライズ下の海洋プレート内の比抵抗構造を求めた。5.室内実験により、海洋地殻・マントルを構成する岩石の浸透率、間隙のサイズを測定し、海洋プレート上部における流体移動について考察した。6.既存の地殻熱流量データに基づき、1つのプチスポット火山を通る水循環の流量と熱輸送量を見積もった。堆積物から突き出た複数の山体における水循環・熱輸送の数値計算を行い、熱流量観測値は、水が1つの山から流入し他から流出することで概ね説明できることを示した。千島海溝海域における熱流量測定、日本海溝海域における岩石採取とも、航海中の台風の影響により計画の一部が実施できなかったものの、これまで未調査であった地域でデータ・試料を得ることに成功し、アウターライズにおける流体循環・火成活動について重要な知見を加えることができた。温度センサの特性試験、ガス試料分析等のシステムの整備を進めることにより、今後実施する熱流量測定、間隙水分析等の観測調査において、より高精度のデータを得る体制を整えることができた。熱流量測定用温度プローブ改良のための海中試験により、測定機器への衝撃が計測に影響することが判明したが、この問題点を解決する方法の検討を行った結果、既に設計変更を終え、次年度に再度の試験を行う準備を進めている。次年度に実施すべき観測調査について議論した上で、アウターライズ上のプチスポット火山が海洋地殻内の流体循環に及ぼす影響を調べる調査航海の提案を行い、採択された。千島海溝海側の熱流量分布が日本海溝と異なる特徴を示すことが判明し、既存の地震波速度構造の情報と合わせて、両海溝の間の違いが明らかになってきた。この違いを調べることは、海溝海側で海洋プレートに水が入る過程を解明するために非常に重要である。今後、本研究における重点課題として、千島海溝海域での電磁気探査等も含めた調査観測を計画する一方、他の研究計画による地殻構造探査等とも密接に連携する。また、両海溝の構造の違いを取り入れ、熱流量分布の差を説明する流体循環と熱輸送のモデルの構築を試みる。海溝海側において沈み込むプレートに生じる過程、それが沈み込み帯に及ぼす影響について、本研究が対象とする流体と熱の移動にとどまらず、より総合的な研究を推進する。このために、沈み込み帯へのインプットをテーマとした学会セッションや研究集会を開催し、沈み込んだプレートに関する研究も含めて、幅広い分野の研究者との情報交換・議論を進める。また、日本海溝アウターライズを対象とした2つの掘削調査提案との協力も深めていく。
Sirt1が関節炎発症に及ぼす影響

関節リウマチは特に治療しなければ経過で関節破壊の可能性が生じる炎症性疾患である。関節リウマチでみられる関節破壊に重要な役割を果たしているのは破骨細胞で破骨細胞は生体内で唯一骨吸収を担う細胞である。関節リウマチでは関節局所で破骨細胞による骨吸収が正常より亢進している状態と考えられ破骨細胞の分化誘導を抑制することは関節リウマチの関節破壊の進行を抑制する治療につながると考えられる。そこで我々はSirt1ni着目した。実験の結果、Sirt1は関節炎による関節破壊で重要な役割を果たす破骨細胞の分化誘導に関して抑制的に働く可能性が示唆された。現在野生型マウスの骨髄マクロファージ(BMM)を用いて破骨細胞の分化誘導に関する実験を進めている。具体的にはScl-ddyマウス2匹を使用し、同マウスの両側大腿骨、脛骨を分離しそれぞれの骨先端から25G針を刺しMEM-α液を注射シリンジを用いて骨髄内に流すことにより対側先端より骨髄細胞を分離した。分離した骨髄細胞を10cmシャーレに細胞密度2.0×100万個となるように播き10%FCS含有MEMα、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)10ng/ml、37°C、5%CO2の条件下で培養し、培養液中に浮遊している非接着細胞をBMMとして採取し、得られたBMMを96穴プレートに1穴当たり細胞密度1.0×10万個となるように播き可溶性RANKリガンド(RANKL)50ng/ml、M-CSF10ng/ml、37°C、5%CO2の条件下で培養し現在培養による経過観察中である。関節リウマチは関節の骨破壊を伴う慢性炎症性疾患でこの骨破壊に破骨細胞が重要な役割を果たす。また破骨細胞はM-CSF,RANKLの存在下でマクロファージから分化誘導されることも知られている。今回、関節リウマチの骨破壊におけるマクロファージのSirt1の役割を調べるため、マクロファージのSirt1遺伝子がノックアウトされたマウス(ノックアウトマウス)と野生型マウスを使用した。ノックアウトマウスと野生型マウスのそれぞれから骨髄マクロファージを分離精製し、破骨細胞の分化誘導に必要なM-CSF,RANKLを用いて同じ条件で骨髄マクロファージを破骨細胞に分化誘導した。分化誘導された細胞をTRAP染色し赤く染色された多核巨細胞を破骨細胞とした。分化誘導された破骨細胞数をカウントし、ノックアウトマウスと野生型マウスの両者由来の破骨細胞数の平均値を比較したところノックアウトマウス由来の破骨細胞数の平均値は野生型マウスのそれよりも多い傾向にあった。次にノックアウトマウスと野生型マウスの間で破骨細胞の分化誘導に関する細胞内蛋白の発現の程度に違いがあるかを評価した。破骨細胞の分化誘導に関するマスター転写因子のNFATc1に着目し、Western blot法を用いてノックアウトマウスと野生型マウス間でのNFATc1の発現を蛋白レベルで評価したところノックアウトマウスの方が野生型マウスに比べNFATc1の発現が亢進しておりTRAP染色の結果と矛盾しないと考えられた。これらのことから関節炎におけるマクロファージのSirt1の機能は破骨細胞の分化誘導を抑制し関節炎の発症を抑制する方向に作用する可能性が示唆された。リウマチ・膠原病理由として本学での動物実験施設での実験許可が下りるまでに約半年要したため。今後は次の2点を目標とする。1つ目は野生型のマウスのみならず、Sirt1ノックアウトマウスのBMMを用いた破骨細胞分化誘導実験を行い野生型の場合と何が異なるか検証していくことで2つ目は野生型マウスとSirt1ノックアウトマウスに関節炎を人工的に発症させ、こうしてできた2種類の関節リウマチモデルマウスを比較することでSirt1の関節リウマチにおける役割を検証していく。上記の実験のために必要である。研究に必要な物品(培養液、抗菌薬、M-CSF、RANKL、蛋白検出用の各種抗体、RNA検出用のプライマーなど)の購入費やマウス購入費・飼育費などに充てる。
パリスターホール症候群の臨床像の確立

パリスターホール症候群は多指、視床下部過誤腫などを主徴とする先天奇形症候群である。本邦におけるパリスターホール症候群の分子遺伝学的、臨床的検討を行い、臨床像確立を目指した。原因遺伝子GLI3遺伝子変異陽性の患者では、泌尿生殖器異常の合併を認めた。汎下垂体機能低下症を持たない、女児例にも認めた。パリスターホール症候群での泌尿生殖器異常は汎下垂体機能低下症と関連して起こる異常ではないと考えられた。本研究結果からはパリスターホール症候群では下垂体機能異常の有無にかかわらず、泌尿生殖器の精査が重要であるという医療管理方針の確立と、泌尿生殖器の発生段階でのGLI3遺伝子関与についての基礎的知見が示唆された。国内におけるパリスターホール症候群(以下PHS)患者の自然歴や臨床像の確立を行うため、本年度は国内のPHS患者の実数把握と試料収集を行った。研究協力が得られた患者はその後分子遺伝学的解析と臨床症状解析を行った。まず、国内でPHSとして報告された症例について検索した。1983年から2011年の期間に計18回報告され、そのうち、年齢や性別、症状の情報から同一患者と推察される報告を除き、9症例が確認された。次に、責任著者に宛て、報告患者の研究協力を依頼し、計6人から回答を得た。そのうち、患者の死亡、所在不明などの理由で研究協力が得られなかったのが4例、研究協力希望は2例、無回答は3例であった。また、日本小児遺伝学会を通じて、国内の小児病院に勤務する遺伝科医に問い合わせたところ、現在患者をフォロー中は2施設で、計2例が確認された。そのうち、患者からの研究協力が得られたのは1例であった。今年度は計7人の患者についてGLI3遺伝子変異の検索を行った。7例中2例でGLI3遺伝子変異が同定された。変異陰性患者は、さらにMLPA法によるGLI3遺伝子コピー数解析を行ったが、これらの検査で明らかな変異が同定された患者はなかった。GLI3遺伝子変異が同定された2例について詳細な臨床症状を解析したところPHSに特徴的とされる二分喉頭蓋裂、心臓、腎臓などの合併症状を認めず、頻度が少ないとされる外性器奇形や精神発達遅滞が明らかとなり、これらについて学会および論文報告を行った。国内におけるパリスターホール症候群(以下PHS)患者の自然歴や臨床像の確立を行うため、国内のPHS患者の実数把握と試料収集を行った。研究協力に同意が得られた患者については続いて分子遺伝学的解析と臨床症状解析を行った。前年度に引き続いて、国内患者の実数把握を目的として、全国の医療施設を対象に調査をおこなった。対象は日本小児総合医療施設協議会に加盟している小児専門病院24施設で、PHSの特徴的臨床症状の診療と関係する小児科、内分泌科、形成外科、脳神経外科を主とする71診療科を調査対象とした。各診療科に宛て、PHS患者の受診状況について郵送にて問い合わせを行った。全71診療科のうち回答が得られたのは34診療科であった。施設問における患者の重複は除外し、計4施設でPHS患者の受診が確認されたが、患者が現在も診療を継続しており、遺伝学的解析への協力が得られたのは1施設1名であった。主治医を通してGLI3遺伝子解析協力への説明を行い、同意が得られた患者の血液由来のDNAを用いてGLI3遺伝子解析を行った。その結果、exon15にナンセンス変異が同定された。この変異は前年度に解析を行った別の家系で同定された変異と同じ塩基置換を伴う変異であり、海外ではこれまでに報告されていない変異であった。前年度までの解析と合わせて、国内GLI3遺伝子変異陽性例は全てナンセンス変異で、エキソン13-15内に集積が見られた。GLI3変異陽性例では男女比が1:2であり、PHSに特徴的とされる二分喉頭蓋裂、心臓などの合併症は全例認めなかった。しかし、腎合併症は3例中1例(腎低形成)、外性器異常を認めたのは3人中2人であり、GLI3における泌尿生殖器発生過程への影響が推察された。
過酸化脂質を含有するカイロミクロンと人工脂肪粒子のAtherogenecity

新生児未熟児医療で使用される静注用脂肪乳剤は、中性脂肪のhydroperoxi-des(TG-OOH)が含まれている。酸化された脂肪乳剤がCMと同様な代謝をするかについての報告はない。そこで、今回はTG-OOHを含有する脂肪乳剤の諸臓器への分布について検討した。【方法】1)酸化油: 2時間光酸化を行った大豆油から、TG-mono-OOHと=C triolein(TO)で標識された中性脂肪、遊離型とエステル型コレステロール、リン脂質からなる脂肪乳剤を作成し、添加する酸化油の量により、非酸化、低酸化、高酸化の3種類の脂肪乳剤を作成し、脂肪乳剤中のTG-OOH量は、科学発光高速液体クロマトグラフィーで確認した。3)代謝実験:ラットに標識した脂肪乳剤を投与し、諸臓器(肝臓、腎臓、脾臓、肺、脳、脂肪組織、筋組織)の取り込み率を調べた。【結果・考察】1)非酸化、低酸化、高酸化群におけるTG-OOH/TGモル比はそれぞれ0.0、0.051、0.24であった。2)COの肝像への取り込みは非酸化群の71.4%に比べ、低酸化群: 62.9%、高酸化群: 46.7%と、酸化が進むほど低下した。腎臓の取り込みも同様の傾向を認た。TG/COでみると、酸化が進むほど比は大きいことより、remnant粒子は取り込まれにくいが、取り込まれた粒子はまだTG含量の多い粒子であることを示唆した。3)逆にCOの脾臓への取り込みは、酸化されるほど取り込みが上昇しており、網内系の除去機構もは働らいていると推測された。4)COの肺への取り込みは、酸化群が有意に高かったが、酸化の程度による差は認めなかった。1.OxEMの3H-COで表されるEM remnantの血漿消失曲線は、2相性の曲線を描く。即ち、最初の3分で急速に消失したのちは、血中に停滞する経過をとり、この傾向はTG-OOH含量が多いEM程顕著であった。fractional clearance rate (FCR)でみると、正常EMのFCRが0.134±0.0047/minであるのに対し、TG-OOH/TG ratioが0.031のOxEMでは0.1184±0.0101であり、0.052のOxEMでは、0.0941±0.0152/min、0.120のOxEMでは0.060+0.0373/minであった。2.投与30分後の肝臓への取り込みを見ても、TG-OOHを多く含むOxEM程取り込みは低下していた(76%vs66%)。3.lipolytic indexは正常EMも、OxEMも有意差なかった。なお、現在EMに結合するapo蛋白を検出中であり、TG-OOH含有EMを初期急速にに取り込む組織を検索中である。以上より、TG-OOH含有EMとは明らかに異なる代謝をとることより、臨床ににおいてはTG-OOHの混入または発生を防ぐ方策をとることが望まれる。新生児未熟児医療で使用される静注用脂肪乳剤はカイロミクロン(CM)と同様な代謝を受けるが、実際の脂肪乳剤にはCMとは異なり、中性脂肪のhydroperoxides(TG-OOH)が含まれている。酸化された脂肪乳剤がCMと同様な代謝をするかについては報告がない。そこで、TG-OOHを含有する脂肪乳剤の代謝について検討した。【方法】1)酸化油:2時間光酸化を行った大豆油から、TG-mono-OOH部分のみを抽出し実験に供した。

2)脂肪乳剤の作成:^3H cholesteryloleate(CO)と^<14>C triolein(TO)で標識された中性脂肪、遊離型とエステル型コレステロール、リン脂質からなる脂肪乳剤を作成した。また、添加する酸化油の量により、非酸化、軽度、中等度、高度酸化の4種類の脂肪乳剤を作成した。3)作成した脂肪乳剤の組成:脂質を抽出後、TLCで分離し測定し、脂肪乳剤中のTG-OOHは、抽出後化学発光高速液体クロマトグラフィーで測定した。4)代謝実験:頚動静脈にカテーテルを留置したラットに標識した脂肪乳剤を投与し、臓器の取り込み率と血漿消失率(fractional clearance rate : FCR)を調べた。【結果・考察】1)脂質組成:各群間の差は認められなかった。軽度、中等度、高度酸化群におけるTG-OOHTGモル比はそれぞれ0.027、0.051、0.24であった。2)脂肪粒子は血中に入るとアポ蛋白が付加され、リポ蛋白リパーゼ(LPL)によりTGは分解され、肝臓に取り込まれていく。よって、3H-COのFCRは肝臓の取り込みのみを、14C-TOのFCRはLPLによる代謝と肝臓の取り込みの両方を反映する。今回の実験でCOのFCR(分)は、軽度、中等度、高度酸化の順に0.118、0.094、0.061であり、中・高度群で非酸化群(0.134)に比して有意に低値であった。また、COの肝臓への取り込みも高度酸化群では56.3%と非酸化群(76.1%)に比して有意に低下した。以上より、強く酸化された粒子程、肝臓に取り込まれにくく、血中に停滞しやすいと考えられた。3)COの脾臓への取り込みは、高度酸化群で1.45%と非酸化群(0.94%)に比して有意に増加したことより、網内系の除去機構も働いていると推測された。(1)ラット腸管における過酸化脂質吸収について腸管における過酸化脂質の吸収をみるために、2時間光酸化を行った大豆油を腸管膜リンパ漏ラットに投与した。投与開始後、1時間毎にリンパカイロミクロンを採取し、TG-OOHを抽出した後、化学発光高速液体クロマトグラフィーにて測定した。その結果、投与後8時間にわたり、リンパカイロミクロン中のTG-OOHを測定したが、いずれも検出限界以下であった。以上のことより、ラット腸管においては、腸管腔内での抗酸化防御系でhydroperoxideは除去されるか、あるいは粘膜細胞へは吸収されない可能性が考えられた。(2)ラットリンパ液中の抗酸化防御系次にラットリンパ液中では酸化作用に対し、どのような防御系を持つのかについて、in vitroの実験を行った。新鮮な腸管膜リンパ液に最終濃度が10mMとなるようにAAPHを添加し、37°Cでincubationし、抗酸化物質とTG-OOHの変化を経時的に測定した。その結果、抗酸化物質ではアスコルビン酸が急速に、ついでCoQ_<10>が消費され、尿酸、α-トコフェロールの順に消費されていった。30分後にアスコルビン酸とCoQ_<10>はそれぞれもとの量の20%と30%まで低下し、CoQ_<10>を切った頃より、TG-OOHが産生されはじめた。以上より、リンパ液中ではカイロミクロンは容易に酸化されにくい状態で存在することが判明した。
マントル400・670km不連続は物質境界か相転移か

1、この研究の発端は、マントル400km不連続の成因と考えられているオリビン・スピネル転移に関連して、オリビンとスピネルの弾性波速度を、高圧下で測定した事に始まる。この測定によればオリビン・スピネル転移に伴う縦波速度の増加は約10%であった。一方、地震学的研究によれば、400km不連続点における縦波速度の増加は約5%である。2、この不一致を説明するためには、上部マントルの主要構成鉱物と考えられているオリビンだけでなく、副成分である輝石やざくろ石の弾性波速度について、400km付近の圧力に対応する圧力下で、測定する必要がある。3、この測定のために、高性能パルス発生器を購入し、成功裏に使用しつつある。4、輝石とざくろ石の混合物は400km不連続の付近でざくろ石型固溶体(メージャライト)をつくる。この固溶体化にともないやや不連続的に密度も増加する。したがって、弾性波速度のやや不連続的な増加も期待できる。5、このメージャライトを合成し弾性波速度の測定を行うことに成功した。6、670km不連続については、この不連続に関して最も重要なペロボスカイトについて、現存する微小試料を用いて、その弾性波速度の測定を試みつつあるがまだ初歩的な段階にとどまっている。7、現在までの研究の成果を基に考えると、400km不連続の成因については、現在広く受け入れられている「オリビン・スピネル転移」ではなく、物質境界を示唆するものである。670km不連続については、現在利用可能なペロボスカイトの試料の大きさが不足のため、意味あるデータがとれていない。残念である。残念である。
DNA相同組換えにおけるDNAクランプの酵素反応制御機構の解明

DNA複製や修復時には、様々な酵素が次々と順序良くDNAに作用することで一連の酵素反応が実施されている。ここで、酵素反応の足場となり、円滑な反応を進行させる重要な因子としてDNAクランプの存在が注目されている。本研究は、DNA相同組換え機構において、ホリデイ構造の移動から切断に至る一連の酵素反応が、四量体型DNAクランプによって制御される仕組みを明らかにすることを目的にしている。そして、これらの反応を担当するDNAヘリカーゼ(Hjm) -ホリデイ構造複合体、リゾルバーゼ(Hjc) -四量体型DNAクランプ-ホリデイ構造複合体といった超分子複合体についてX線結晶構造解析を用いた立体構造の解明を目指している。本年度は、Hjc -四量体型DNAクランプ-ホリデイ構造複合体の結晶化条件の最適化、X線回折実験に重点を置いて研究を実施した。その結果、Hjc -四量体型DNAクランプ-ホリデイ構造複合体でホリデイ構造を形成するDNA鎖の長さを検討したたことで、X線回折実験可能な大きさの単結晶が得られるようになった。この得られた単結晶を用いて、放射光実験施設でのX線回折実験を実施した結果、最大分解能3.0オングストロームのX線回折データセットの収集に成功した。現在、分子置換法を用いた構造解析を実施しているが、構造決定には至っていない。今後、重原子を用いた構造決定を行う予定である。本年度は、Hjc -四量体型DNAクランプ複合体について結晶化条件の最適化に取り組み、得られた結晶を用いて放射光実験施設でのX線回折実験を実施した。結果、構造解析には至らなかったが、得られた回折像はタンパク質結晶に観察される格子の大きな結晶であることを示していた。結晶を溶かしたサンプルをSDS-PAGEで分離した結果も踏まえ、得られている結晶は意図としたタンパク質複合体の結晶であると判断し、現在さらなる結晶化条件、X線回折実験条件の最適化を進めている。また、Hjmについては収量の向上を目指し精製条件を再検討している際にタンパク質の分解が疑われるような結果が得られるようになった。現在、このタンパク質分解を防ぐ手段を検討している。Hjmでは収量の向上を目指して精製条件の最適化を行ったところ、これまでは観察されなかったタンパク質の分解が認められるようになった。このタンパク質の分解は従来の手順に戻しても観察されるため、分解を防ぐ方法を検討項目に追加することになった。また、Hjc -四量体型DNAクランプ複合体について結晶化条件を最適化したところ針状の単結晶が得られるようになった。この結晶を用いて所属機関に設置されたX線回折実験装置で回折実験を実施したが回折像は観察されず、X線回折実験条件の最適化を放射光実験施設で実施することになった。しかし、放射光実験施設での実験時間が確保できず研究の進行が遅れている。そして、これらの反応を担当するDNAヘリカーゼ(Hjm) -ホリデイ構造複合体、リゾルバーゼ(Hjc)-四量体型DNAクランプ-ホリデイ構造複合体といった超分子複合体についてX線結晶構造解析を用いた立体構造の解明を目指している。結果、昨年度までに得られていた結晶の最大分解能は10オングストローム程度であったが、本年度は4.3オングストロームまで改善した。また、Hjc-四量体型DNAクランプ複合体についてSEC-SAXS解析を実施し、濃度依存的な会合状態が存在することを示唆する結果が得られた。Hjmについては精製方法を改良し、昨年度までに観察されていた分解を可能な限り抑えることに成功した。さらにこのサンプルを用いて結晶化条件を検討したところ微結晶が得られるような条件がいくつかみつかった。熊本地震の影響で、研究環境の復旧に時間が必要になったことに加え、それまでに得られていた結晶はすべて割れ、結晶化条件の最適化していたサンプルについても再検討することになった。

本研究は、DNA相同組換え機構において、ホリデイ構造の移動から切断に至る一連の酵素反応が、四量体型DNAクランプによって制御される仕組みを明らかにすることを目的にしている。そして、これらの反応を担当するDNAヘリカーゼ(Hjm) -ホリデイ構造複合体、リゾルバーゼ(Hjc) -四量体型DNAクランプ-ホリデイ構造複合体といった超分子複合体についてX線結晶構造解析を用いた立体構造の解明を目指している。本年度は、Hjc -四量体型DNAクランプ複合体、Hjc -四量体型DNAクランプ-ホリデイ構造複合体の結晶化条件の検討に重点を置いて研究を実施した。その結果、これまでに結晶が得られていなかったHjc -四量体型DNAクランプ-ホリデイ構造複合体で、結晶化条件が見つかった。そこで、その条件を最適化したところ、X線回折実験可能な大きさの結晶が得られた。得られた結晶を用いて、放射光実験施設でのX線回折実験を実施した結果、タンパク質の結晶であることを示唆する格子の大きな回折像が得られた。しかし、回折点が観察される面とほとんど回折点が観察されない面が混在しており、構造解析が行える回折データセットは収集できなかった。これまでに結晶の得られていなかったHjc -四量体型DNAクランプ-ホリデイ構造複合体の結晶が得られた。この結晶は構造解析には至らなかったものの、この条件を最適化することで構造解析可能な結晶が得られると期待している。DNA複製や修復時には、様々な酵素が次々と順序良くDNAに作用することで一連の酵素反応が実施されている。ここで、酵素反応の足場となり、円滑な反応を進行させる重要な因子としてDNAクランプの存在が注目されている。本年度は、Hjc -四量体型DNAクランプ-ホリデイ構造複合体の結晶化条件の最適化、X線回折実験に重点を置いて研究を実施した。その結果、Hjc -四量体型DNAクランプ-ホリデイ構造複合体でホリデイ構造を形成するDNA鎖の長さを検討したたことで、X線回折実験可能な大きさの単結晶が得られるようになった。この得られた単結晶を用いて、放射光実験施設でのX線回折実験を実施した結果、最大分解能3.0オングストロームのX線回折データセットの収集に成功した。現在、分子置換法を用いた構造解析を実施しているが、構造決定には至っていない。今後、重原子を用いた構造決定を行う予定である。Hjmについては早期にタンパク質分解を防ぐのに有効なプロテアーゼ阻害剤や緩衝液の条件を見出し、結晶化条件の検討を実施する。また、Hjc -四量体型DNAクランプ複合体については、現在結晶が得られている条件を基に、より厚みのある結晶が得られるような結晶化条件の最適化を進める。そして、得られた結晶は放射光実験施設で凍結条件の検討を実施する。
不変性をもった拡散テンソルファントムの開発

本研究では拡散テンソル画像から得られるFA値を絶対評価として活用するための基準となる、任意のFA値を不変的に維持できるファントムの開発を目的としている。本年度は昨年度に引き続きファントムに用いる糸の太さと性状について検討を行い、最も適した組み合わせを明らかにし、ファントムに用いる糸を決定した。この成果については国内学会1件において報告を行った。水の腐敗については防腐剤を導入し、室温にて1年間の保存を行い変化を観察した。その結果、防腐剤導入以前のような、水の腐敗を示す変色等の変化は見られなかった。また測定値への影響がないことを確認した。加速劣化試験として恒温槽を用いて80°C環境下で1週間及び2週間の加熱ののちに測定したところ、測定値への影響は見られず、ファントムの外観にも変化は見られなかった。以上より、本研究課題の主な課題の一つである不変性については達成することができたと考えている。一方で、長期間の保管を行ったファントムの一部にはファントム内部にわずかな気泡が発生しているものが認められた。これはファントム作成中の脱気操作が不十分であったためだと考えられる。しかし、気泡はファントム内壁外周部に発生しており、測定値には影響を及ぼさない。念のため、より確実な脱気操作やより高性能な脱気装置の導入を検討している。次年度は当初の計画にもどりMR装置間の再現性評価と校正曲線の取得を行う予定である。ファントムに適した素材の決定とファントムの不変性・安定性が確認できたことでファントムの作成自体は概ね完了したと考える。残る再現性試験と校正曲線によるMR機種間の比較については次年度内で達成できると考えている。本年度までに確立されたファントムの作成法により作成したファントムを用いて再現性試験を行う。また複数のMR装置間でのFA値の比較を目的として校正曲線を作成し補正FA値を算出する。また、拡散テンソルトラクトグラフィの描出能についても検討を行う予定である。これらの成果は学会及び論文として報告する予定である。初年度はこれまでの研究成果から判明していた改善点(大きさ、材質、形状等)について改善を行った。まず、部分容積効果による影響を減少させるためにガラス管径を従来よりも大きなものへと変更し、より安定したFA値の取得を目指した。結果としてより大きな関心領域を用いたFA値測定が可能となり、測定値の信頼性が向上した。しかし、ガラス管径の拡大により圧入作業中における糸の切断等が起こりやすくなり、ファントム作成の難易度が上がったため、この問題に対する解決策を検討している。また、糸の素材については不変性に優れていると考えられる無機物質を用いた合成糸を中心に様々な太さ、性状の糸について検討を行い、適切な素材についての目途をたてることができた。この検討については初年度中に完了する予定であったが、糸の太さ・性状の組み合わせが多くなったため、今後も目的とするFA値ごとの太さと性状の組み合わせについて詳細な検討を続ける予定である。また、過去に作成したファントムにおいて水の腐敗によるものと考えられる変色等の変化が表れ始めたため、当初計画していたMR装置間の再現性評価と校正曲線の取得は保留とし、防腐剤の導入とその影響についての検討を行ったうえで不変性評価を先行して行うこととした。検討対象とした合成糸の太さ、性状を予定よりも増やし、より詳細な検討を行ったため、初年度中に完了予定であった改良ファントムの開発については現在も進行中である。また、過去に作成したファントムにおいて水の腐敗によるものと考えられる変色等の変化が見られたため、防腐処理に関する検討を追加したため、当初計画よりも後ろ倒しされている。昨年度から継続している糸の検討については早期に完了させる。

また防腐処理による経時的影響の評価も必要であるため、当初計画とは異なるが、校正曲線の作成よりも不変性評価を先に行う予定である。また本年度中に学会や論文にてこれまでの成果を報告する予定である。本年度までに確立されたファントムの作成法により作成したファントムを用いて再現性試験を行う。また複数のMR装置間でのFA値の比較を目的として校正曲線を作成し補正FA値を算出する。また、拡散テンソルトラクトグラフィの描出能についても検討を行う予定である。これらの成果は学会及び論文として報告する予定である。初年度に国際学会での発表を予定していたが研究の遅れにより見送ったため次年度使用額が発生した。この分の予算については加速劣化試験の外注もしくは恒温装置の購入に使用する予定である。子の養育のため本年度の国際学会参加を見送り、国内学会での発表としたため。次年度使用予算については脱気装置等のファントム作成に必要となる装置の購入と学会発表に用いる予定である。
蛋白質高次構造の解析と機能

1.蛋白質の精密な構造解析、我国で結晶解析がされたSSI(ストレプトマイセスサブチリシンインヒビター)のX線結晶解析の分解能が1.85Aまで上げられた。その結果が1各原子の温度因子の信頼できる数値が得られた。SSIがサブチリシンと複合体を生じると変形を起すが、その変形を記述する方法が考案された。NMRでも精密な構造解析が試みられている。リプレッサー蛋白質croは溶液中で2重体で存在するが、これにオペレーターDNAが結合すると予想に反して2重体構造がゆるむ。上記の2つの結果は分子間相互作用が個々の構造変化を引き起していることを示している。2.巨大な蛋白質の構造解析の手法の開発、巨大な蛋白質には上記のような解析方法は適用し難い。X線小角散乱法がHRPに適用され分子サイズや水和層の厚さが決められた、ミオシン頭部にATPがいかに結合するかという問題があるが、その位置が重原子を含だ特別のATP類似アナログを化学的に結合させ電子顕微鏡で決定された。従来NMRが不得意とする巨大蛋白質の解析にもNMRによるアプローチがされ、IgGとProteinAとの相互作用位量の検出、およびリゾチームモノクローナル抗体とリゾチームの結合様式が実験的に試みられ、静電的パターンによる相互認識機構が提唱された。3.蛋白質の構造の動きと、視覚的にとらえる方法、荷電を帯びた蛋白質分子はどういう因子で結合様式して規則的なクラスターを作るか論じられた。実験的にはピコ??パルスで励走したトリプトファンの蛍光のピーク位量がシフトする。その拡がりの時間依存性を解析して、分子のゆらぎの速い成分、おそい成分に分離して?すことに成功した。蛋白質の構造が解析されても結果を数値やグラフで見ていたのでイフイメージがわか??。それを手軽にパソコンを用いてグラフィック表示する方法が解析されている。手軽で高度なソフトが開発された。
制御性T細胞による新規慢性GVHD治療法の開発

本研究の目的は、マウスで発見されたTreg機能を持つCD8^+/CD122^+細胞分画が、ヒトにおいても同様にTreg機能を示すかを、造血幹細胞移植後の臨床検体を用いて検討することである。1)第3者健常人末梢血単核球(5×10^4)を用いて、リンパ球混合培養(MLR)をおこない、この系に同種幹細胞移植後にCD8^+/CD122^+細胞分画の著増(CD8分画中の89.9%)がみられた患者由来末梢血単核球を添加してMLRを抑制するかを検討した。CD8^+分画(1×10^4)を添加した場合は、MLRを顕著に抑制したが、CD8^-分画ではMLRの抑制が見られなかったことよりCD8^+分画にTreg機能を持つ細胞分画が存在する可能性が示された。2)同種骨髄移植を施行した26例を対象に移植後、day20,40,60,80,100と継時的にフローサイトメトリーを用いてリンパ球分画におけるCD8^+/CD122^+細胞分画の割合を解析した。Day40,60,80におけるCD8^+/CD122^+分画(%)は、非血縁あるいは肌A不一致血縁ドナー間移植後(n=22)は47.2±33.6%,37.4±28.1%,41.9±31.8%で、HLA一致血縁者間移植(n=4)の12.3±12.4%,22.8±15.2%,13.5±12.3%と比較して、高い傾向がみられた。同様に慢性GVHDが発症した10例と発症がみられない17例とでCD8^+/CD122^+分画の割合をday60,day80とで検討したが、47.3±26.1%vs33.9±24/1%,58.2±34.3%vs30.5±26.3%と慢性GVHDの発症群で高い傾向がみられた。移植後のCD8^+/CD122^+分画の割合は個人差が著しく、今後は多数例においてはCD8^+/CD122^+分画細胞のin vitroにおけるTreg機能を中心にした検討が必要である。これまで、IL2-IL-15レセプターβ鎖(CD122)欠損マウスを用いた研究から、マウスにおいてはCD8^+ CD25^+細胞分画に制御性T細胞(Treg)が存在することが判明している。われわれは、同種骨髄移植後の患者の免疫能の再構築をモニタリングする過程で、慢性GVHDの発症とCD8^+ CD122^+細胞分画の割合とに一定の傾向があることを見い出した。本研究では、平成17年度に当科で同種骨髄移植をおこなった15例の同種骨髄移植症例について、継時的に移植後のCD8^+ CD122^+細胞とCD8^+ CD122^-細胞の比率を、FACS caliburを用いて測定した。同時にCD4^+ CD25^+細胞の動態についても解析した。健常人ではCD8^+ CD122^+細胞/CD8^+ CD122^-細胞の比率は1.0以下であり、HLA一致同胞間移植においても、移植後全期間を通じて0.18.0に分布し、その中央値は1.0であった。一方、非血縁者間あるいはHLA不一致血縁者間移植症例では、慢性GVHDの発症がみられる移植後day60からday80におけるCD8^+ CD122^+細胞/CD8^+ CD122^-細胞比は0.5から100.0(中央値10.0)で、HLA一致同胞間移植症例と比較して高い傾向を示した。非血縁者間あるいはHLA不一致血縁者間移植症例で、慢性GVHDを発症した3例では、慢性GVHDを発症する直前のCD8^+ CD122^+細胞/CD8^+ CD122^-細胞比は1.0以下であった。慢性GVHDの発症がみられなかった症例では、CD8^+ CD122^+細胞/CD8^+ CD122^-細胞比はその中央値が8.0であった。一方、急性GVHDの発症とCD8^+CD122^+細胞の動態とは一定の傾向はみられなかった。またCD4^+ CD25^+細胞についても継時的に検討したが、GVHDの発症との関連はみられなかった。以上の検討から、同種骨髄移植後のCD8^+ CD122^+細胞は、慢性GVHDの発症を制御している可能性が示された。今後単離したCD8^+ CD122^+細胞のin vitroにおけるMLRに対する制御能の検討を予定している。