hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
酵素による難分解性ポリマーの分解・除去・加工技術の開発

(3)Tk-SPの高活性化と安定化:Tk-SPのCa2サイトにAsp474→Alaの変異を導入することにより、Tk-SPの活性は変化しないがEDTA存在下における安定性が大きく向上することを明らかにした。(4)Tk-subtilisinによる異常プリオン分解機構の解析:プリオン病に感染したマウス脳ホモジネートをプロテアーゼで処理し、その培養細胞(N2aC24 cell)感染性を調べることにより、プロテイナーゼKで処理するよりTk-subtilisinで処理する方が感染性は低下することを明らかいした。(5)コンポスト由来新規セルラーゼの構造と機能の解析:枝葉コンポストからメタゲノム法により単離した10種類の新規セルラーゼのうち、N末端にflexible loop(FL)をもつLC-CelAとIg-likeドメインをもつLC-CelGの結晶構造を決定した。また、FLが安定性に寄与すること、Ig-likeドメインが安定性、活性、フォールディングに寄与することを明らかにした。26年度が最終年度であるため、記入しない。生化学26年度が最終年度であるため、記入しない。今年度の目標としていた、1)LC-cutinaseの結晶構造解析、2)LC-cutinaseの大腸菌菌体外漏出領域の同定、3)Tk-subtilisinの成熟化速度の向上、4)Tk-SPの大量生産、5)Tk-SPによる異常プリオンの分解、のうち、1)、3)、5)についてはほぼ完全に目的を達成したため。また、2)と4)についても、来年度中に目的を達成できる目途がついたため。目標としていた、1)LC-cutinaseの高活性化、2)LC-cutinaseの安定化、3)LC-cutinaseの大腸菌菌体外漏出機構の解明、4)Tk-subtilisinとTk-SPの高機能化、5)Tk-subtilisinとTk-SPの大量生産、6)Tk-subtilisinとTk-SPによる異常プリオン分解機構の解明、のうち、2)、3)、5)についてはほぼ完全に目的を達成したため。また、1)、4)、6)についても、来年度中に目的を達成できる目途がついたため。当初の予定通り、LC-cutinaseの高活性化と安定化、漏出シグナルの同定(限定化)、Tk-subtilisinの高機能化を検討する。Tk-SPの大量生産に関しては、プロペプチドの可溶性タンパク質としての発現とPro-Tk-SPとの共発現不溶性融合タンパク質としての発現と再構成、などを検討する。また新たに、Tk-SPのキレート剤に対する安定〓や、Tk-subtilisinやTk-SPによる異常プリオンタンパク質分解機構の解析に取り組む。LC-cutinaseの漏出シグナルの同定に関する研究は今年度で終了する。LC-cutinaseの高活性化と安定化、Tk-subtilisinの高機能化、Tk-SPのキレート剤に対する安定化と高活性化、Tk-subtilisinやTk-SPによる異常プリオンタンパク質分解機構の解析に関する研究は今後も引き続き取り組む。また、新たに、メタゲノム法により単離した新規セルラーゼの構造と機能の研究に取り組む。本研究を推進するために基金助成金で特任研究員を1名雇用している。
三次元LDVによる矩形管内乱流統計量の高精度測定とそのデータベース化に関する研究

本研究は,十分に発達した正方形断面管路内乱流の乱流統計量の高精度測定を行い,その結果をデータベース化することによって,従来から行われていたDNS(直接数値シミュレーション)を検証することを目的として行われた.本研究により,以下の知見が得られた.1.実験結果のデータベース化実験より得られた管路の1/4断面における乱れ強さ,歪度,平坦度,およびレイノルズ応力等の乱流統計量をグラフィックスワ-スクテーションに入力し,可視化用ソフトウエアAVSを用いて種々の乱流統計量の空間構造を示すデータベースを作成した.その結果,正方形管内乱流においては,管壁面付近で生成されたイジェクションが壁面から上昇するとともに管路角部に向かって曲がる現象によって乱れが生じていることが明らかになった.また,管路角部では,二つの壁面で生じた上記の現象が互いに干渉し合い,特異な流動が現れることを示した.2.DNSの検証本データベースに基づいて従来から報告されていたDNSの結果を検証した結果,DNSによって信頼性のある結果を得るためには,レイノルズ数が4000程度の場合,格子点数が800×128^2程度必要であることがわかった.本研究は,十分に発達した正方形断面管路内乱流の乱流統計量の高精度測定を行い,その結果をデータベース化することによって,従来から行われていたDNS(直接数値シミュレーション)を検証することを目的として行われた.本研究により,以下の知見が得られた.1.実験結果のデータベース化実験より得られた管路の1/4断面における乱れ強さ,歪度,平坦度,およびレイノルズ応力等の乱流統計量をグラフィックスワ-スクテーションに入力し,可視化用ソフトウエアAVSを用いて種々の乱流統計量の空間構造を示すデータベースを作成した.その結果,正方形管内乱流においては,管壁面付近で生成されたイジェクションが壁面から上昇するとともに管路角部に向かって曲がる現象によって乱れが生じていることが明らかになった.また,管路角部では,二つの壁面で生じた上記の現象が互いに干渉し合い,特異な流動が現れることを示した.2.DNSの検証本データベースに基づいて従来から報告されていたDNSの結果を検証した結果,DNSによって信頼性のある結果を得るためには,レイノルズ数が4000程度の場合,格子点数が800×128^2程度必要であることがわかった.
選択的核内受容体分解誘導剤の開発

エストロゲン受容体(ER)は全乳がんのおよそ70%で過剰発現しているタンパク質であり,ER陽性乳がん治療薬としてERアンタゴニストが有効である.申請者は,ERアンタゴニストの副作用を抑え,かつより強力な乳がん治療薬を開発するには,化合物によってERを分解することが有効であると考え,これまでに選択的エストロゲン受容体分解薬(Selective Estrogen Receptor Down-regulator,SERD)の開発研究を行ってきた.本研究では,SERD開発を効率的に行うための化合物デザイン法の確立と経口投与可能な薬剤の開発および他の核内受容体への応用可能性の検討を行う.エストロゲン受容体(ER)は全乳がんのおよそ70%で過剰発現しているタンパク質であり,ER陽性乳がん治療薬としてERアンタゴニストが有効である.申請者は,ERアンタゴニストの副作用を抑え,かつより強力な乳がん治療薬を開発するには,化合物によってERを分解することが有効であると考え,これまでに選択的エストロゲン受容体分解薬(Selective Estrogen Receptor Down-regulator,SERD)の開発研究を行ってきた.本研究では,SERD開発を効率的に行うための化合物デザイン法の確立と経口投与可能な薬剤の開発および他の核内受容体への応用可能性の検討を行う.
階層構造制御による複合導電性高分子の電気伝導機構の解明

本研究では導電性高分子ポリ(3,4-エチレンジオキシチオフェン)/ポリ(4-スチレンスルホン酸)(PEDOT/PSS)の電気伝導機構の解明を目的としている.本年度は昨年度見出した2次元的な電子状態を反映した磁気抵抗効果の起源について,微小角入射広角X線散乱(GIWAXS)測定や走査型トンネル顕微鏡(STM)観察を用いることで,固体構造の視点からの解明を試みた.GIWAXS測定では4nm程度の周期性を有する構造由来の散乱ピークが観測された.その起源としては,扁平楕円体型のPEDOT/PSSのコアシェル構造が短軸を基板に垂直に向けて非周期的に積層したものが考えられる.こうして推測した構造をSTM測定により検証したところ,膜断面のSTM像では実際にコアシェル構造が積層する様子が確認された.また,膜際表面のSTM測定では,コアシェル構造が連なっている様子が観測された.このような構造情報と磁気抵抗効果の結果を併せると, PEDOTナノ結晶の伝導層がPSSシェルによって上下を挟み込まれた状態にあることで,低温で位相緩和長が長くなった際に,シェルによる散乱の影響が顕在化し,2次元的な磁気抵抗効果が観測されたと考えられる.これらの電気伝導の律速となっているキャリアドーピングに寄与しないPSS層を除去することにより,現状では数nm程度である位相緩和長を伸ばし,高電気伝導化を実現することが可能となる.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は,導電性高分子ポリ(3,4-エチレンジオキシチオフェン)/ポリ(4-スチレンスルホン酸)(PEDOT/PSS)におけるPEDOTナノ結晶の配向制御手法を確立し,配向膜の高次構造/異方的特性を明らかにした.また,膜の強酸液浸処理による高電気伝導化の起源となる高次構造変化の詳細を明らかにした.PEDOTナノ結晶の配向制御は,薄膜の乾燥析出方向を制御するエッジキャスト法により実現した.配向膜の広角エックス線回折(WAXD)測定により,PEDOT鎖が成膜時の固液界面に対し平行に配向することを明らかにした.疎水性のPEDOT鎖が固液界面にトラップされた状態で析出するためであると考えられる.また,成膜温度の上昇に伴い配向度が向上し,水分散液の沸点近傍温度での成膜により最も高い配向度が得られた.膜面内の電気伝導度や赤外反射スペクトルに異方性が観測され,配向度と同様,成膜温度の上昇に伴い異方性が増大した.薄膜のPEDOT鎖平行方向における電気伝導度やプラズマ周波数が高く,ナノ結晶の配向を反映した異方性が得られていることが裏付けられた.また,キャスト法で作製した無配向PEDOT/PSS薄膜に濃硫酸液浸処理を施し,面内配向に依らない純粋な液浸処理効果を検証した.WAXD測定により,PSS非晶質量が液浸時間の増加と共に減少すること,また,微小角入射広角エックス線回折(GIWAXD)測定により,膜面直方向に関してコアシェル構造の積層集合体からPEDOTとPSSの交互積層構造へと変化することを明らかにした.これらの結果は,構造秩序化による高電気伝導化を示唆しており,今後の成膜指針を決定するのに重要な知見である.本研究は,複素環共役系高分子ポリ(3,4-エチレンジオキシチオフェン)(PEDOT)に対し,ポリ(4-スチレンスルホン酸)(PSS)をドープしたPEDOT/PSSの電気伝導機構を解明することを目的としている.そのために,高分子固体構造の理解と制御を通じて,PEDOT/PSSの構造と電気伝導特性との相関を明らかにする.本年度は,エッジキャスト法を用いて作製したPEDOT/PSS配向膜の極低温強磁場中の電気抵抗測定を行い,詳細な電気伝導機構を調べた.PEDOT/PSS水分散液PH1000に対して質量比3%のエチレングリコールを添加した試料について,室温における伝導度は鎖配向方向とその垂直方向で2倍程度の異方性を示した.その温度依存性はどちらの方向も弱局在で説明されたが,異方性は低温まで保たれていた.より詳細な情報を得るために磁気抵抗の測定を行ったところ,100 Kから10 K程度の中低温では,異方的な弱局在による負の磁気抵抗が観測された.ここで見積もられた異方性は,膜面直と膜面内が有効質量比で90倍程度と大きく,一方の膜面内の異方性は2倍程度と小さかった.面内配向の影響よりも,面直方向におけるPEDOT/PSSの積層由来の異方性の方が大きな影響をもたらす結果となった.また,より低温領域では正の磁気抵抗が観測され,乱れた2次元系における電子間相互作用モデルで説明された.PEDOTナノ結晶の2次元的な電子状態を反映していると考えられる.本年度は,導電性高分子PEDOT/PSS配向膜における,詳細な電気伝導機構を明らかにすることを目的とした.磁気抵抗効果の解析結果は固体構造から推測される異方性と整合しており,固体構造と伝導機構の相関が明らかになりつつあることから,おおむね順調に進展していると判断した.本研究では導電性高分子ポリ(3,4-エチレンジオキシチオフェン)/ポリ(4-スチレンスルホン酸)(PEDOT/PSS)の電気伝導機構の解明を目的としている.

本年度は昨年度見出した2次元的な電子状態を反映した磁気抵抗効果の起源について,微小角入射広角X線散乱(GIWAXS)測定や走査型トンネル顕微鏡(STM)観察を用いることで,固体構造の視点からの解明を試みた.GIWAXS測定では4nm程度の周期性を有する構造由来の散乱ピークが観測された.その起源としては,扁平楕円体型のPEDOT/PSSのコアシェル構造が短軸を基板に垂直に向けて非周期的に積層したものが考えられる.こうして推測した構造をSTM測定により検証したところ,膜断面のSTM像では実際にコアシェル構造が積層する様子が確認された.また,膜際表面のSTM測定では,コアシェル構造が連なっている様子が観測された.このような構造情報と磁気抵抗効果の結果を併せると, PEDOTナノ結晶の伝導層がPSSシェルによって上下を挟み込まれた状態にあることで,低温で位相緩和長が長くなった際に,シェルによる散乱の影響が顕在化し,2次元的な磁気抵抗効果が観測されたと考えられる.これらの電気伝導の律速となっているキャリアドーピングに寄与しないPSS層を除去することにより,現状では数nm程度である位相緩和長を伸ばし,高電気伝導化を実現することが可能となる.本年度の目標は,導電性高分子PEDOT/PSSの配向制御手法の確立であった.初期構想とは異なる手法となったが,比較的容易にPEDOTナノ結晶の配向が可能となり,異方的な物性を観測し始めているという点から,おおむね順調に進展していると判断した.今後は,原子間力顕微鏡・走査型トンネル顕微鏡観測により,電気伝導に多大な影響を及ぼすナノ構造の詳細を実空間視点で明らかにする.SPring-8を利用した構造解析と組み合わせることにより,幅広いスケールに渡る構造と電気伝導特性の相関を明らかにする.28年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は,配向制御と強酸液浸処理を独立に行うことで各々の効果を明らかにした.今後は,最適条件で配向制御と強酸液浸処理を組み合わせることで高電気伝導化を達成する.極低温・強磁場中の電気抵抗測定を行い,高次構造秩序化とキャリア輸送特性の相関を明らかにする.28年度が最終年度であるため、記入しない。
群が作用する組合せ構造

群が作用する組合せ構造のうちで、有限群Gがlatticeに作用するときをまず研究した。熊本大学の吉田氏は次のような注目すべき問題を数理研講究録671の中にあげている。即ち、群作用をもつ符号について、MacWilliamsの恒等式が一般化されたように、群作用をもつlatticeについてもtheta関数を拡張出来ないか?この問題を次のような形で解決した。定理1Λを群作用をもつlatticeとしΔ_0={reΛ1rθeΛ}とする。そのとき、(Λ_0)^L_G=Λ^L_0θただし、θ=Σgこの定理からtheta関数が拡張出来る。この定理の証明には群Gが作用する符号についてのHaydenの命題をlatticeの場合に翻訳し、(ここでΛ_0というG-部分加群を見つけたことが成功の理由である)この命題を使って、上の結果を証明した。次に、この結果をよく考えたら、これは群Gの整数表現であるということに気ずき、これをmodPで計算すればGの作用がモジュラーの場合、即ち、(p,IGI)キI、ただしpは体の標数である。このとき、G-符号についてもMacWilliamsの恒等式が拡張出来るのでは思った。これはうまくゆき次の定理を得た。定理2 π((C^G)1/G=π((Δ1/0θ)MnΛ^G)、ただしπはmodpをとる自然写像である。この定理2よりMocWilliamsの恒等式の拡張はすぐに従う。定理2の証明には、やはりΔ_0というG-部分加群が重要な役割を演ずる。残念なことであるが、今のところこの定理2を使用して具体的な計算が出来ない。これらの結果の一部は平成4年10月、名古屋大学で開かれた日本数学会の代数学分科会で発表した。
婦人科領域悪性腫瘍におけるDNAコピー数異常とその臨床病理学的意義の検討

パラフィン包埋切片を用いたCGH法にについてII同手法をより安定した実験系として確立するための検討を加えた。また,遺伝子コピー数減少の検出についてLOHの検出との比較検討を行った.DNAは20%緩衝ホルマリン固定パラフィン包埋切片(10μm)2030枚をキシレンにより脱パラフィン処理し、25mlのPK(20mg/ml)を加えたdigestion bufferを用い55°Cで適宜PKを追加し72時間incubation行った後PCI法によりDNAを抽出した。回収されたDNAのfragment sizeは新鮮標本から抽出されたものに比べ短い傾向を認めたが、症例によっては新鮮標本と同等のfragment sizeのDNAを抽出することも可能であった。Nick-translationにより腫瘍DNAの標識を行うにあたっては、反応時間を新鮮標本を用いる場合に比較して短時間で行うことがポイントであった。作成されたプローブの標識率は新鮮標本を用いる場合に比較して若干劣る場合もあるが、hybridizationに際して腫瘍DNA(FITCにて標識)と正常DNA(Texas Redにて標識)の比率を4:1と設定することにより、遺伝子コピー数の減少の検出についての検出率を低下することなくCGH解析に際して新鮮標本を用いた場合と同等のデータを得ることが出来た。LOHとCGH法により検出された遺伝子コピー数の減少は検討をおこなった6箇所の領域において約8割の一致を示し、この点でも新鮮標本を用いた場合と同様の結果を得た。パラフィン包埋切片を用いたCGH法についてDNAは20%緩衝ホルマリン固定パラフィン包埋切片(10μm)20から30枚をキシレンにより脱パラフィン処理し,25mlのPK(20mg/ml)を加えたdigestion bufferを用い55°Cでincubation(適宜Pkを追加)を行い、PCI法を用いてDNAを抽出し,エタノール沈殿法により回収した.回収されたDNAは新鮮標本より抽出されたものに比べfragment sizeは短いものの,CGH解析においてはNick-translationの条件をコントロールすることにより新鮮標本を用いた場合と同等のクオリティのデータを得ることが可能であった.プローブの標識率の検討についてパラフィン包埋切片を用いたCGH法にについてII同手法をより安定した実験系として確立するための検討を加えた。
Galectin-1による筋萎縮性側索硬化症の発症と進行の二面的制御

ヒトALS患者の脊髄運動神経の軸索腫大病変にガレクチン1が蓄積することが知られている。本研究では、ガレクチン1がALSの病態にどのように関与するのかを明らかにするためにマウスモデルを用いた解析を行った。変異SOD1トランスジェニック(SOD1G93A)マウスの脊髄におけるガレクチン1の発現を病理学的解析、リアルタイムRT-PCR、ウエスタンブロッティングにて解析した。さらにガレクチン1欠損(Lgals1-/- )マウスと交配し、SOD1G93Aマウスにおける内因性ガレクチン1欠損の効果を検討した。SOD1G93A/Lgals+/+マウスでは、ALS様症状が出現する以前に、腫大した運動神経軸索内に凝集するニューロフィラメントと一致して、強いガレクチン1の免疫反応性を認めた。電子顕微鏡観察により、SOD1G93A/Lgals1-/-マウスではSOD1G93A/Lgals+/+マウスに比べ、腫大した運動神経軸索の内径が顕著に小さくなり、さらに変性ミトコンドリアと思われる空胞の蓄積が減少していることが明らかとなった。摘出した坐骨神経のタイムラプスイメージングによりSOD1G93A/Lgals1-/-マウスでは、SOD1G93A/Lgals1+/+マウスと比べ部分的ではあるが、少なくとも逆行性の軸索輸送が改善している事がわかった。一方、症候期のSOD1G93A/Lgals+/+マウスでは、軸索周囲のアストロサイトにガレクチン1の高い発現を認めた。ヒトALS患者同様に、SOD1G93Aマウスでも軸索腫大病変にガレクチン1が蓄積することが明らかになった。ガレクチン1はALS様症状の出現以前に運動神経軸索に蓄積し、その蓄積はSOD1G93Aマウスにおける軸索変性の初期過程に関与すると考えられる。一方、アストロサイトで発現するガレクチン1は、症状が出現する後期の軸索変性に関与する可能性がある。26年度が最終年度であるため、記入しない。筋萎縮性側索硬化症(ALS)患者の剖検例において,脊髄運動神経の腫大部にニューロフィラメントの凝集体とともにガレクチン-1の過剰な蓄積が報告されている。ガレクチン-1は還元的な環境下ではホモダイマーとして細胞増殖、細胞接着、腫瘍転移、T細胞のアポトーシス誘導に関わるが、酸化的な環境下ではシステイン残基の酸化によりモノマーの酸化型ガレクチン-1に変換される。酸化型ガレクチン-1は神経の軸索再生を促進する活性を有し、ALSモデルマウスへの長期投与により運動神経変性を抑制することが報告されているが、内在性のガレクチン-1がALSの発症にどのように関わるのかこれまで全く報告がない。今回我々は、ALSの発症におけるガレクチン-1の関与を明らかにする目的で、SOD1[G93A]トランスジェニックマウスにおけるガレクチン-1の発現と局在を解析し、以下の事実を見出した。SOD1[G93A]トランスジェニックマウスでは、運動機能失調の発症以前より脊髄運動神経軸索の腫大部にガレクチン-1がニューロフィラメントとともに過剰に蓄積した凝集体からなるニューロスフェロイドが確認された。この知見は、ALS患者の脊髄運動神経のニューロスフェロイドに認められるガレクチン-1の過剰蓄積が、SOD1G93AトランスジェニックALSモデルマウスで再現されるALSに普遍的な病理変化であることを世界で初めて明らかにしたものである。運動神経変性の進行期には軸索周囲に増生したアストロサイトにガレクチン-1の高発現を認めた。現在、SOD1[G93A]トランスジェニックマウスにおけるガレクチン-1欠損の影響に注目し、運動機能失調発症に至る期間と発症後の生存期間、脊髄運動神経のニューロスフェロイドに蓄積しているガレクチン-1に関してタンパク質化学的な解析、脊髄運動神経の軸索輸送障害の解析な計画に従った解析を継続している。

一方、症候期のSOD1G93A/Lgals+/+マウスでは、軸索周囲のアストロサイトにガレクチン1の高い発現を認めた。ヒトALS患者同様に、SOD1G93Aマウスでも軸索腫大病変にガレクチン1が蓄積することが明らかになった。ガレクチン1はALS様症状の出現以前に運動神経軸索に蓄積し、その蓄積はSOD1G93Aマウスにおける軸索変性の初期過程に関与すると考えられる。一方、アストロサイトで発現するガレクチン1は、症状が出現する後期の軸索変性に関与する可能性がある。26年度が最終年度であるため、記入しない。以下の5つの実験を計画していたが、1から4につについてほぼ計画どおりに遂行できたが、5については、組換えタンパク質の調製まで終了した。1SOD1[G93A]トランスジェニック・ガレクチン-1欠損マウスの運動機能失調発症に至る期間と発症後の生存期間についてSOD1[G93A]トランスジェニックマウスと統計学的に十分な匹数のマウスを用いて比較検討する。2SOD1[G93A]トランスジェニックマウスの脊髄運動神経のニューロスフェロイドに蓄積しているガレクチン-1に関してタンパク質化学的な解析を行う。3SOD1[G93A]トランスジェニックとSOD1[G93A]トランスジェニック・ガレクチン-1欠損マウスの脊髄運動神経の軸索輸送障害の程度を比較解析する。4SOD1[G93A]トランスジェニックマウスの運動神経軸索周囲に増生したアストロサイトが発現するガレクチン-1に関してタンパク質化学的な解析を行う。5組換えガレクチン-1βあるいは酸化型ガレクチン-1αタンパク質をSOD1[G93A]トランスジェニック・ガレクチン-1欠損マウスに長期投与し、運動機能失調発症に至る期間と発症後の生存期間への影響を解析する。当初の計画どおりに実験を遂行する予定であるが、平成25年度の研究から今回用いたSOD1[G93A]トランスジェニックマウスのSOD1[G93A]トランスジーンのコピー数が少ない事から、ALS様の運動機能障害を発症するまでに35週を要することが明らかになり、長期観察が必要となる。そこで、現在最もよく使用されているSOD1[G93A]トランスジーンのコピー数が多い系統のマウスを入手したので、この系統を用いた解析も追加で予定している。また、運動神経とアストロサイトの2つの細胞種に異なる時期にガレクチン-1が発現する事から、細胞特異的にガレクチンー1を欠損するようにFloxアリルを持つマウス胚性幹細胞を樹立したので、Floxアリルを持つマウス系統を樹立する予定である。このマウスが樹立できると、神経細胞選択的なガレクチン-欠損の解析が可能となる。
宇宙用マニピュレ-タの知的自動化に関する研究

宇宙用マニピュレ-タの知的自動化について、弾性を考慮したマニピュレ-タの動力学と、マニピュレ-タを含む環境の幾何学モデルをコンピュ-タ上にインプリメントした。具体的には、動力学について、宇宙で利用が計画されている実際のマニピュレ-タは、すでにわれわれが指摘したような静的なたわみのみによって十分モデル化できるものであることを実験によって再確認した。また、このような系では歪みのフィ-ドバック制御が有効であることも再確認できた。次に、宇宙でマニピュレ-タが扱うものは全て人工物で、マニピュレ-タに都合のよいように設計できる点に着目して、マニピュレ-タを含む環境のモデル化を考えた。このモデル化についてはCADで用いられる幾何学モデルを計算機上にSmalltalkを使ってインプリメントした。この際、Smalltalk自体の構造がPascal言語の持つデ-タ型と知識表現方法としてのFrameの特徴を合わせ持つオブジェクト指向言語で知識構造のプロトタイプをつくるのに最適の言語であった。現在計画されている宇宙用ロボットは第一世代と呼ばれ、マスタ・スレ-ブ方式のものであるが、第二世代の宇宙用ロボットはテレロボティクスという言葉に代表されるようにある程度の自律性を持ったものになる。本研究は今後この方向に向かってさらに発展するものである。
バゾヒビンファミリーと腫瘍血管・がん幹細胞連関

バゾヒビンファミリーメンバーにはバゾヒビン1(vasohibin-1:VASH1)とバゾヒビン2(vasohibin-2:VASH2)がある。VASH1は、血管内皮細胞が血管新生刺激に反応して誘導性に発現する血管新生抑制因子である。これまでの研究で、内因性VASH1は血管新生抑制作用を介して原発性腫瘍の発育を制御することを明らかにしてきたが、今回の研究において、血管内皮細胞が発現する内因性VASH1は、がんの血行性転移やリンパ行性転移を制御していることを明らかにした。一方、VASH2はVASH1とは拮抗的に血管新生を促進する因子であるが、今回の研究において、がん組織ではがん細胞がVASH2を主に発現し、血管新生促進作用を介して腫瘍の発育を促進することを明らかにした。以上より、がん組織におけるVASH1とVASH2のバランスは、がんの進展を規定する1つの要因と考えられた。VASH1は、VEGFのみならず他の多くの血管新生促進因子に対して広いスペクトルムで血管新生を抑制できることを確認している。そこでVEGF依存性に発育することが確認されている腫瘍細胞とFGF-2依存性に発育することが確認されている腫瘍細胞をマウス皮下に移植して解析した結果、VEGF阻害剤はVEGF依存性腫瘍の発育は阻害するが、FGF-2依存性腫瘍の発育は阻害できないのに対し、VASH1はいずれの腫瘍細胞においても血管新生を抑制して腫瘍の発育を阻害できることを確認した。VASH1とVASH2の癌組織における発現について、自然発癌の動物モデルであるMinマウスを用いて解析した。その結果、VASH1は発癌後に癌間質の血管内皮に発現するに対し、VASH2は、間質の血管にVASH1が発現するようになる前の前癌状態の腸ポリープにおいて、異形成を示す上皮部分に限局して発現していること、しかもその発現はVEGFとは一部重複したが、大部分はVEGFとは重複せず、VEGFとは独立した分子である可能性を明らかにした。ヒトVASH2とマウスVASH2の共通アミノ酸配列を合成して抗原とし、抗VASH2モノクローナル抗体の作成を開始し、その第一段階として、免疫マウス血清のELISAアッセイから抗体産生を確認されるマウスを選別した。血管内皮細胞に発現する内因性Vasohibin-1(VASH1)の癌転移(血行性転移、リンパ行性転移)における意義について、野生型マウスとVASH1(-/-)マウスにルイス肺癌(LLC)細胞を移植して比較検討した。マウスの足底部にLLC細胞を皮下移植し、一定サイズに発育した後、足を切断、その後一定期間を置いてマウスを犠牲死させ、肺とソケイリンパ節への癌転移の程度を比較検討した。足底部の腫瘍は、VASH1(-/-)マウスにおいて大きく発育し、以前の結果が再現された。癌転移については、VASH1(-/-)マウスにおいて肺転移と鼠径リンパ節転移の程度が顕著に増加していた。原発巣の腫瘍血管とリンパ管を比較すると、VASH1(-/-)マウスにおいてリンパ管は顕著に増加していた。また血管については、壁細胞による被覆の程度が有意に低下していた。癌細胞が発現する内因性Vasohibin-2(VASH2)は、前年度の研究から、VASH1とは拮抗的に腫瘍血管新生を促進し、腫瘍発育を促進することが判明したので、VASH2のがん細胞における遺伝子発現調節について検討した。ヒト卵巣癌を用いた検討から、VASH2の癌細胞における発現は構成的であり、種々の刺激によっても発現誘導は認められなかった。そこでこのVASH2の構成的な発現上昇の機序について検討した結果、VASH2 mRNAの3'非翻訳領域にはmicroRNA mir-200の結合配列が存在しており、このmir-200によって発現は通常サイレンシングされているが、癌細胞においてはmir-200の発現が低下することによりVASH2の発現が増加することが判明した。研究代表者は、血管内皮細胞が産生する血管新生のnegative feedback調節因子VASH1と、そのホモログでVASH1とは拮抗的に血管新生を促進するVASH2という2つの新規分子を単離・同定している。これまでの研究では、VASH1は血管内皮細胞が発現して血管新生を終息させるのに対し、VASH2は骨髄から血管新生部位に動員される単核球に発現して血管新生を促進することが示されている。そこで本研究では、特に血管新生を促進するVASH2のがんにおける意義に関する研究を進めた。

その結果、ヒトの卵巣がんや肝臓がんの病理標本や培養細胞を用いた解析からがん細胞がVASH2を発現していることを見出した。また、このVASH2の癌細胞における発現調節は、代表的な血管新生促進因子であり低酸素で誘導されるVEGFとは異なっていることが判明した。すなわち、ヒトVASH2 mRNAの3'UTRにはmicroRNAのmir-200ファミリーの結合配列がclusterしており、特にmir-200bによってその発現は負に制御されていること、mir-200bの発現が低下した癌細胞において恒常的にVASH2の発現は上昇することを明らかにした。さらに、VASH2のがん細胞における発現をshRNAによってノックダウンすることにより移植腫瘍の腫瘍血管新生は阻止され、腫瘍の発育が顕著に制御できることをマウスモデルで証明した。以上より、VASH2はがん細胞に発現し、VEGFとはindependentに腫瘍血管新生を促進することを明らかにした。VASH1が、血行性およびリンパ行性のいずれにおいても癌転移抑制的に機能していることが客観的に証明された。VASH2の癌細胞における発現調節機構が明らかとなった。24年度が最終年度であるため、記入しない。VASH1が、血行性およびリンパ行性のいずれにおいても癌転移を抑制することを、癌細胞の種類を換えて再現性を確認するとともに、そのメカニズムについて、腫瘍血管・リンパ管の構造の面から検討する。VASH2の発現をサイレンスするmir-200は、癌の上皮間葉転換にも関与している。予備的な研究から癌細胞におけるVASH2の発現をノックダウンすると上皮間葉転換が抑制されるデータが得られていることから、VASH2の上皮間葉転換に対する効果を検証し、パラクリン的な血管新生促進以外に癌細胞自身に対してオートクリン的に作動している可能性を検証する。
An Alphabet of Talesにおけるラテン語原典語彙・文法の受容

本研究では、15世紀にラテン語から英訳されたAn Alphabet of Talesにおける語彙や文法が原典での語彙や文法にどのような影響を受けているのかを、両者の詳細な比較・分析を通して実証的に調査する。本研究を通して、いまだデータの少ない15世紀イングランドにおけるラテン語の受容の一端を明らかにしつつ、中英語期における言語接触に関する最新の学説を検証し、新たな見解をもたらすことも目指す。
ニューロイメージングによる職業性ストレス理論モデルの脳内機序の解明

平成18年度は、PETを使用した実験的研究によるコントロール可能性の記憶部位の探索と、光トポグラフィー(NIRS)を使用した確率学習課題によるコントロール可能性可能性の操作に対する脳機能の解明を行った。1. PETを使用した確率学習課題による実験により、コントロール可能性の責任部位を同定し、これらの部位と生理的ストレス反応指標との間の相関を確認した。内側前頭前野(BA32)他の部位が、コントロール可能性が低いとの認知と関連しており、またこの部位の活動が血圧・心拍・免疫・心理反応などのストレス反応と正の相関をしていた。2.光トポグラフィーを用いた研究について日立基礎研究所と共同研究契約を締結し、光トポグラフィー測定系に、確率学習課題による心理学的実験システムの組み込みを行い、光トポグラフィーを用いた職業性ストレス理論モデルの脳内機序の解明のための汎用実験系を確立した。3.本研究の解析方法について、国際行動医学会(タイ)の場を利用して、関連する専門家から助言を受けるとともに、研究成果の一部を発表した。以上から、コントロール可能性の記憶担当部位が前頭前野内側にあることがほぼ明らかとなり、この部位の機能が仕事の要求度や急性ストレスに対する血圧・心拍・免疫・心理反応を修飾していることが示された。職業性ストレスモデルである要求度-コントロールモデルの神経基盤を明確にし、また光トポグラフィーを用いた汎用実験系を確立し、今後の本領域の研究の進展に寄与した。平成17年度は、実験的研究によるコントロール可能性の記憶部位の探索とストレス反応の修飾効果評価を検討した。1.平成17年6月には第1回ラテンアメリカ行動医学会(メキシコ)の機会を利用してこの分野の専門家により研究計画のレビューを受けた。研究計画に対する高い評価を受けるとともに、いくつか重要な指摘を受け、研究計画を見直した。2.fMRIよりも測定の自由度が高い光トポグラフィーを本研究に応用する可能性について、日立基礎研究所の研究者にヒアリングを行った。光トポグラフィーは測定可能部位が大脳皮質など表層に限定され、また時間解像度があたり高くないという欠点はあるが、被験者への放射線曝露がないこと、電気生理学的測定の同時実施が容易などの利点があることが判明した。3.文献レビュー、これまでの実験経験などから本研究における有効なストレス刺激課題を検討した。この刺激課題を使用して被験者数名に対して予備実験を実施し、コントロール可能性を操作する範囲(3段階)の最適値を検討した。この結果、最適の刺激課題を決定することができた。4.fMRIを実際に使用して、上記刺激課題を用いた実験および各種心理・生理学的測定が実際に実施可能であることを確認するための予備実験を行った。予備実験の結果、本刺激課題を使用して実験を実行する上でいくつかの問題点が抽出された。この点については次年度研究において改善する予定である。
砂質土及び礫質土地盤の原位置静止土圧係数(Ko)測定法の開発

本研究は構造物の基礎設計にとって重要な地盤の強度や変形特性の評価に不可欠な地盤の原位置の応力状態を明らかにしようとしたものである。具体的には、測定する方法がほとんどない砂質や礫質地盤の原位置での水平方向応力を測定できる装置の開発が目的である。研究者達が既に開発した高品質の不撹乱試料を採取できる原位置地盤凍結サンプリング法により不撹乱試料を採取した後にできる凍結孔の中に開発した測定器を挿入し、凍結した地盤が融解するのを待つ。地盤が完全に融解したときに、挿入した測定器の外周に設置した土圧計で計測される圧力が原地盤の水平方向土圧である。測定器は120°の円弧状の3枚の金属板からなる。凍結孔に設置された後、地上より空気圧でこれら3枚の円弧状の金属板は開き、凍結孔に固定される。土圧計は地盤の温度変化及び地盤中の水圧の影響を補償できるようになっている。実験は東京湾に位置する埋立砂地盤において実施した。まず、開発した装置を未改良地盤について予備実験を実施した。その後、装置の問題点を改良して、SCP工法により締固めた埋立砂地盤で本実験として実施した。その結果、本装置により、締固めた埋立地盤のKo値として0.41-0.98の値を得た。測定値のバラツキは地盤のバラツキによるものと考えられる。この測定値は、研究者達が提案しているKo値を半理論的に推定できる「Vs等価法」を用いて、原位置地盤凍結サンプリング法で採取した不撹乱試料について求めた値(0.92-1.06)とほぼ対応している。独立した2つの方法で得られたKo値がほぼ対応したことは本研究で開発した原位置測定方法が有用であることを示唆しているものと考えられる。なお、締固め前の埋立地盤について、不撹乱試料を用いて、排水三軸試験で求めた内部摩擦角により、実務で使われているヤーキの式で推定したKo値(0.38)に比べて、締固めた地盤のKo値が大きく増大したことも明らかになった。締固めにより、地盤の水平方向応力の増大が測定されたのは本研究がはじめてである。平成14年度では、研究代表者たちが既往に開発した原位置地盤凍結サンプリング法により凍結試料を採取した凍結孔を利用した砂質及び礫質地盤の原位置静止土圧係数測定装置の問題点を確認し、(1)土圧測定法の改善、(2)操作性の改善、(3)測定結果評価法の改善等を行った新しい装置の設計及び試作を行った。(1)については、既往装置が水の入ったゴム製バルーンを装着しているため、凍結地盤に挿入したときのバルーン内水の温度変化や凍結に伴う様々な問題を解決するため、ゴム製バルーンの代わりにステンレス製の剛版に直接土圧計を装着した。(2)については、現場での装置の操作性をよくするため、重量を既往装置の1/3程度に軽量化した。(3)については、6つの土圧計の結果が独立して求められるようにすることにより、本装置の一部が凍結孔との接触不良があっても、他の部分の測定値に影響がないようにした。

そして、試作器を用いて室内模型地盤(乾燥・飽和・凍結)や原位置凍結地盤での試摘用を行い、新しい装置の性能確認を実施した。その結果、装置の基本的な性能が地盤の凍結・融解の履歴には影響されず、操作性もよく、有効であることが確認された。これにより、今まで信頼できる測定結果がほとんどない砂質や礫質地盤の静止士圧係数が評価出来ることになり、砂質や礫質地盤の原位置力学特性の正確な評価が可能になり、地盤や基礎の合理的な設計が大きく前進するものと考えられる。本装置の基本概念についてはすでに研究代表者が旧職((株)竹中工務店技術研究所)に在職したときに特許出願しており、一部国際特許も含めて登録されているが、本研究ではさらに、その実用性と有効性を高めたものである。なお、この内容については本年7月に開催される地盤工学研究発表会(秋田市)に論文発表し、そして、それまでに特許を申請する予定にしております。
自然体験療法における発達障害児の社会性支援プログラムの構築

本年度は、発達障害児が自然体験療法プログラムにおいて社会性を獲得してゆくプロセスを明らかにすることを目的とした。研究の対象とした自然体験療法プログラムは、社会教育施設が主催する平成30年に実施した1泊2日の事前キャンプ(7月)と縦走登山をメインプログラムとする12泊13日の本キャンプ(8月)であった。調査対象者は、当該プログラムに参加した小学5年生から中学2年生の発達障害児5名(男子4名、女子1名)であった。また、キャンプには15名の定型発達児も含まれていた。調査の方法は、事前キャンプン及び本キャンプにおいて対象児5名の参与観察を実施した。参与観察からは、対象児5名がそれぞれの体験をしながら社会性を得てキャンプに適応していく過程が観察された。すなわち、プログラムの適応に随伴して社会性が獲得されることが明らかになった。また、事例の分析からプログラムにおける社会性を伴う適応のプロセスモデルが生成された。発達障害児童生徒は、まず、プログラムにおいて日常的に表出している問題行動をプログラムにおいても反復的に示した。すなわち、「不適応的な自己」の段階である。さらに、プログラムの進行と共に、問題行動をめぐる集団内の葛藤が生じることによって、自己と他者への意識が高まる。これは、「自己への注目」の段階である。そして、他者との関係や対処の方法を模索するような「自己の模索」の段階へと移行する。そしてこの段階においてプログラムを通じて起こるエピソードを繰り返しながら、集団内の他者との折り合いをつけるようになる。すなわち、「前適応的自己」の段階を経て、さらに他者との相互浸透的なコミュニケーションが見られるような「適応的な自己」の段階へ進展することが明らかにされた。平成30年度は、当初の計画通りプログラムを実施しデータを収集することができた。したがって、研究の目的とした社会性獲得のプロセスについて、データ分析も順調に進めることができた。今後は、平成31年度が最終年度であるため、発達障害児の社会性獲得プログラム構築のためのこれまでの研究知見を総括したい。したがって、そのための研究協力者を確保し、不測の事態にも対応できるように準備する。本年度は、自然体験療法プログラムにおける発達障害児の社会性に及ぼす効果について検討することが目的であった。平成28年7月8月に発達障害児3名と定型発達児15名を含む自然体験療法プログラム(1泊2日及び12泊13日)を実施し、社会性に及ぼす効果について検討した。まず、量的研究として戸ヶ崎・坂野が作成した社会的スキル尺度をプログラムの行動に適したものに修正した質問紙を用いてプログラム前後、及び1ヶ月後にデータを収集し比較検討した。その結果、発達障害群及び定型群に違いは認められなかった。いずれも、プログラム前に比較して、プログラム後、1ヶ月後は有意に得点が高く、プログラムの効果が維持されていた。したがって、プログラムによって発達障害児の社会性スキルが向上することが明らかになった。また、社会性スキルは、「関係参加行動」「関係向上行動」「関係維持行動」の3因子から構成されているが、発達障害群においては、3因子いずれもプログラムの効果が認められた。自然体験療法プログラムは、グループ活動であり、おのずから人間関係を円滑に営むことが求められる。起床後、就寝までの多くの時間において、他者と折り合いをつけて活動を進めていかなければならなかった。グループにおいて、自分の意見を述べ、相手の意見を聴き、そしてお互いに合意を形成するという経験を繰り返すことによって社会性を獲得したと考えられる。また、プログラムは、80Kmのロングトレイル(登山道)を踏破するという大きな目標のあるプログラムであった。目標達成に向かってグループで挑戦するという設定が、参加者の社会性を向上させる契機になっていたと考えられる。さらに、発達障害群の事例を抽出し、プログラムの効果について質的に検討した。その結果、社会性に関して成長が認められ、事例固有のプログラムの意義が見出された。平成28年度は、当初の計画通り、自然体験療法プログラムを実践し、データを収集することができた。また、自然体験療法における発達障害児の社会性獲得に関する分析においても概ね計画通り実施できている。本年度の研究目的は、自然体験療法の社会性の障害に対する効果及びその治療的要因について検討することであった。平成29年8月に、発達障害児5名と定型発達児13名を含む自然体験療法プログラム(事前プログラム:1泊2日、メインプログラム:12泊13日)を実施し、社会性に及ぼす効果の検討及び、その治療的要因について3名の発達障害児の事例研究から検討を行った。まず、プログラムの社会性の効果に関する研究では、戸ヶ崎・坂野が作成した社会的スキル尺度をプログラムの社会的行動に適したものに修正した質問紙を用いて、プログラム前後、プログラム1か月後にデータを収集し比較検討した。その結果、社会的スキル尺度の下位尺度の関係参加行動得点において、発達障害群と定型群の間に交互作用が認められ、発達障害群は、キャンプ前に比べてキャンプ後、キャンプ1か月後において有意に高い値を示した。関係向上行動、関係維持行動については、プログラムの効果は認められなかった。したがって、発達障害群は、プログラムにおいて、社会的スキルのうち、人間関係に参加し、関係形成するスキルを向上させたと言える。また、発達障害児の事例検討から、社会的障害に対する治療的要因について検討した。その結果、1集団活動における対人行動、2スタッフのカウンセリングマインド、3自然の帰結、4充分な身体活動、5遊戯性、6達成感、7称賛の要因が明らかにされた。

事例では、プログラムにおいて、対人葛藤などの不適応的な自己を体験することを繰り返しながら、受容される自己を体験し、集団への適応を果たしてゆくプロセスが観察された。平成29年度は、当初の計画通り自然体験療法プログラムを実施し、データを収集することができた。また、自然体験療法プログラムにおける発達障害児の社会性の障害の治療的要因やプログラムにおけるそのプロセスに関して知見を得ることができ、概ね予定通り進めることができている。本年度は、発達障害児が自然体験療法プログラムにおいて社会性を獲得してゆくプロセスを明らかにすることを目的とした。研究の対象とした自然体験療法プログラムは、社会教育施設が主催する平成30年に実施した1泊2日の事前キャンプ(7月)と縦走登山をメインプログラムとする12泊13日の本キャンプ(8月)であった。調査対象者は、当該プログラムに参加した小学5年生から中学2年生の発達障害児5名(男子4名、女子1名)であった。また、キャンプには15名の定型発達児も含まれていた。調査の方法は、事前キャンプン及び本キャンプにおいて対象児5名の参与観察を実施した。参与観察からは、対象児5名がそれぞれの体験をしながら社会性を得てキャンプに適応していく過程が観察された。すなわち、プログラムの適応に随伴して社会性が獲得されることが明らかになった。また、事例の分析からプログラムにおける社会性を伴う適応のプロセスモデルが生成された。発達障害児童生徒は、まず、プログラムにおいて日常的に表出している問題行動をプログラムにおいても反復的に示した。すなわち、「不適応的な自己」の段階である。さらに、プログラムの進行と共に、問題行動をめぐる集団内の葛藤が生じることによって、自己と他者への意識が高まる。これは、「自己への注目」の段階である。そして、他者との関係や対処の方法を模索するような「自己の模索」の段階へと移行する。そしてこの段階においてプログラムを通じて起こるエピソードを繰り返しながら、集団内の他者との折り合いをつけるようになる。すなわち、「前適応的自己」の段階を経て、さらに他者との相互浸透的なコミュニケーションが見られるような「適応的な自己」の段階へ進展することが明らかにされた。平成30年度は、当初の計画通りプログラムを実施しデータを収集することができた。したがって、研究の目的とした社会性獲得のプロセスについて、データ分析も順調に進めることができた。平成29年度においても、平成28年度と同様に自然体験療法プログラムを実践し、発達障害児の社会性に関する効果を検証する。しかしながら、社会性獲得の要因の検討という点で平成28年度と課題が異なるため、平成29年度当初より、研究分担者及び研究協力者との研究打ち合わせを実施し、研究計画に関して遺漏のないように努める。また、研究協力者については、人数を確保して不測の事態にも対応できるようにしておく。平成30年度は、これまでの知見をまとめ、発達障害児の社会性の獲得に関するプロセスについて検証する。
長鎖DNA断片導入による、汎用実験動物に感染する百日咳菌の作出

ヒトのみを自然宿主とする百日咳菌に広い宿主域を持つ気管支敗血症菌の長鎖ゲノム断片を導入することによって、実験動物に感染する組換え百日咳菌を作製することを目的に、当研究課題を実施した。この成果によって得られる百日咳菌は感染動物モデルの作製を通じて、百日咳症発症の解析に寄与すると考えられる。この目的のために、申請者らはファージの組換え機構と大腸菌人工染色体(BAC)を組み合わせた新規のゲノム組換え系(BBI法を開発した。本法により、50 kb前後の長鎖DNA断片を百日咳菌に導入することに成功したが、実験動物に安定的に感染する百日咳菌を得ることはできなかった。申請者らは、ファージの組換え機構と大腸菌人工染色体(BAC)を組み合わせた新規のゲノム組換え系(BBIシステム:BAC-based integrationシステム)を開発した。本年度はこの手法の有用性の検討(1)と、気管支敗血症菌ゲノムの長鎖DNA断片を百日咳菌ゲノムに安定導入した百日咳菌の気管支敗血症菌ゲノム相補ライブラリー(BbBAC/Bpライブラリー)を用いた予備的感染実験(2)を行った。(1)BBIシステムを用いて、LPSにO抗原を持たない百日咳菌に気管支敗血症菌のO抗原合成遺伝子領域(wbm領域:約32 kb)を導入し、その性状を検討した。wbm領域を導入された百日咳菌は、気管支敗血症菌と同等のO抗原を安定的に発現することを確認した。このことはBBIシステムによって機能的な遺伝子領域を百日咳菌に導入することが十分可能であることを示している。(2)BBIシステムを用いて、589クローンからなるBbBAC/Bpライブラリーを作製した。ライブラリーに導入された気管支敗血症菌ゲノムDNA断片の平均長は30 kb程度であった。ここから、589 x 30 kb = 17670 kbと概算して、5.3 Mbの気管支敗血症菌ゲノムを約三倍の冗長性でカバーしていると考え、予備実験としてこのライブラリーをラットに経鼻感染させた。感染16日後にラット鼻腔から菌を回収して再度感染実験に供し、感染23日後に再び菌を回収した。このサンプルからゲノムを回収し、挿入DNA断片塩基配列を決定したところ、挿入断片には鉄輸送関連遺伝子xが高い頻度で回収されていることがわかった。しかし、クローン化した遺伝子xのみを導入した百日咳菌のラット感染・定着能は野生型親株のそれと変わらなかった。当初の計画通り、気管支敗血症菌ゲノムDNA断片を百日咳菌に導入したライブラリーの作製を行い、さらに予備実験レベルながらライブラリーのラット感染、菌の回収および導入断片の遺伝子の同定までを実施することができた。28年度は予備実験として実施したため、ラット感染性を百日咳菌に付与する、有望な遺伝子の同定には至らなかったが、BBIシステムを用いたO抗原発現百日咳菌の作製とその性状を確認し、機能的な遺伝子領域が安定的に百日咳菌に導入されることを確認できた意義は大きい。申請者らは、ファージの組換え機構と大腸菌人工染色体(BAC)を組み合わせた新規のゲノム組換え系(BBIシステム:BAC-based integ rationシステム)を開発した。28年度においてはこの手法の有用性の検討を、LPSのO抗原を生成する気管支敗血症菌の遺伝子領域をO抗原を持たない百日咳菌に導入し、O抗原のあるLPSを発現させることに成功した。29年度においては当初の目的の達成を目指して、気管支敗血症菌ゲノムの長鎖DNA断片を百日咳菌ゲノムに安定導入した百日咳菌の気管支敗血症菌ゲノム相補ライブラリー(BbBAC/Bpライブラリー)を用いて、ラットに感染する百日咳菌の作製とその責任遺伝子の同定を試みた。前年度の予備実験においては、ゲノム長5.3 Mbpの気管支敗血症菌に対して3倍の冗長性で全ゲノムをカバーするライブラリーを作製したが、ラット感染性を百日咳菌に付与する遺伝子は同定できなかった。そこで今年度は平均長15 kbpの気管支敗血症菌ゲノム断片を持つ6641クローンを分離して実験に供した。このライブラリーは気管支敗血症菌ゲノムを約20倍の冗長性でカバーする。このライブラリーの断片をBBIシステムで百日咳菌に導入して回収できた百日咳菌932クローンをラットに感染させたが、野生型百日咳菌と比較して有意に定着の安定したクローンを得ることはできなかった。一方、前年度にBBIシステムを用いて作製したO抗原のあるLPSを発現する百日咳菌の血清抵抗性を検討したところ、野生型に比べて血清抵抗性が向上していることがわかった。以上の結果から、本研究で開発したBBIシステムは任意の長鎖遺伝子を受容菌に導入する目的には有用であることはわかったが、本研究課題の目標であったランダムにゲノム断片を導入して百日咳菌の宿主特異性を変更させるまでには至らなかった。

本法により、50 kb前後の長鎖DNA断片を百日咳菌に導入することに成功したが、実験動物に安定的に感染する百日咳菌を得ることはできなかった。28年度の予備試験により、ライブラリー作製からラット感染実験、さらに菌の回収と挿入遺伝子断片の同定までに必要な仕事量や期間が想定できるようになり、一年間で充分余裕のあることがわかった。そこで、29年度は、BBIシステムのプロトコールをさらに整備して、さらに大きなDNA断片を導入する条件、ライブラリーの回収を高効率にする条件、感染条件(感染ルート、菌の接種方法、感染期間、菌の回収組織)などを検討し、当初の目的通り、百日咳菌にラット感染性を付与する遺伝子(群)の同定に迫る予定である。細菌学初年度は、当初計画になかったBBIシステムの確認実験を行い、その影響で期間的な余裕がなく、ライブラリーの作製から動物実験、遺伝子の塩基配列決定による同定など多額の費用が要求される実験を予備的試験にとどめた。そのため表記の次年度使用額が発生した。次年度は初年度の残額と併せた予算を費消して、多数回のライブラリー作製とそのチェック、大規模な動物実験と回収された遺伝子の塩基配列決定と同定を集中的に行い、本研究課題の目的を達成する予定である。