hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
恒常性の破綻に起因するEP4受容体が担う大腸癌発症と2型免疫による改善機構の解明

ホメオスタシス維持のため正常な大腸上皮細胞は、細胞増殖を繰り返し3日から5日後に頭頂部にて脱落するターンオーバーを繰り返す。このサイクルが破綻し、過剰な細胞増殖が繰り返されると、発癌へとつながることが考えられる。平成29年度には腸内細菌叢が産生する酪酸が、初期大腸癌に関るEP4受容体自身の発現をエピジェネティクに制御している可能性を見いだした。平成30年度の研究では、以下の結果を得た。(1)ヒト初期大腸癌HCA-7細胞において、酪酸の濃度依存的にEP4受容体が減少するが、それに伴い、プロスタグランジンE2(PGE2)刺激により誘導されるシクロオキシゲナーゼー2(COX-2)発現量も減少すること。(2)この酪酸の取込みは、Na+依存性モノカルボン酸トランスポーター(SMCT)ー1を介していること。(3)Cancer Genome Atlasdatabaseを用いてin silico解析を行ったところ、大腸癌組織のほうが対応する正常組織に比べてSMCT-1 mRNAの発現が低いこと。またアレルギー疾患罹患時に、作用機序の不明確な大腸癌改善効果が報告されている。アレルギー疾患などには、一般的にインターロイキン4(IL-4)や、ヒスタミンの関与が知られている。そこでHCA-7細胞を用いて、IL-4やヒスタミンの存在下で、PGE2刺激によるEP4受容体情報伝達系への影響を検討した。その結果、(4)IL-4の存在化では、PGE2刺激により誘導されるCOX-2発現量が減少すること、(5)ヒスタミン存在化においてもPGE2刺激により引き起こされる細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK)のリン酸化が抑制されることも見いだした。以上の結果は、酪酸、IL-4、そしてヒスタミンは、EP4受容体、あるいはその情報伝達系を抑制することで、HCA-7細胞の癌悪性化シグナルを抑制する可能性を示唆している。平成30年度の研究において、酪酸によるエピジェネティックなEP4受容体の発現抑制により、初期大腸癌マーカーであるCOX-2の発現も抑制することを明らかにできた。また酪酸のCOX-2発現抑制作用は、SMCT-1を介していることも明らかにした。さらにin silico解析により実際の大腸癌患者ではSMCT-1の発現が減少していることも見いだすことができた。クリプト基底部における短鎖脂肪酸の濃度は、管腔部と比べて1/10倍程度低いことが報告されていることから、クリプト基底部から管腔部へと大腸上皮細胞が移動するにつれて、上皮細胞は、より高濃度の短鎖脂肪酸に暴露されることが予想される。つまり正常細胞における細胞増殖活性を抑制する要因の一つは、短鎖脂肪酸の濃度上昇が考えられる。本来であれば途中で抑制される細胞増殖が、何らかの原因で活性化したままの状態が、大腸癌発症の第一歩であると推測される。すなわち、食物繊維の摂取不足などの食の欧米化により大腸上皮細胞周辺の短鎖脂肪酸量が減少することでEP4受容体情報伝達系が過活性化し、細胞増殖機構を活性化し続けることが、発癌の一つの要因である可能性を示唆することができたと考えている。またアレルギー疾患と大腸癌との関連性を解明するため、IL-4やヒスタミンと、それら受容体シグナルがEP4受容体情報伝達系に与える影響についても着手し始めたことから、研究は概ね順調に伸展していると考えられる。平成31年度には、着手し始めたIL-4やヒスタミンなど、アレルギー関連因子が大腸癌に与える影響についてEP4受容体情報伝達系を中心に展開して行きたい。特にIL-4によるCOX-2発現・PGE2産生への影響の解析について、EP4受容体発現それ自体や、その活性化状態などを、レポーター・ルシフェラーゼ・アッセイ、ウェスタン・ブロット法、qRT-PCR法などを用い明らかにして行きたい。またIL-13は、アラキドン酸代謝経路への作用が報告されていることから、そのEP4受容体情報伝達系への影響や、IL-4との役割の違いなども明らかにして行きたいと考えている。ところでアレルギー・アトピー・喘息の罹患者では、大腸粘膜層で増加したマスト細胞由来のヒスタミンそれ自体によるβカテニン系の活性化を介した癌化への関与が示唆されていることから、大腸癌改善への直接の関与は少ない可能性が高いと考えていた。しかしながらヒスタミン存在化においてもEP4受容体刺激により引き起こされる細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK)のリン酸化が抑制されることも見いだせたことから、EP4受容体情報伝達系を制御することで癌悪性化改善効果があり得る可能性が示唆された。そのため、ヒスタミン系がEP4受容体系に与える影響や、そのメカニズムも明らかにして行きたいと考えている。さらに、酪酸によるEP4受容体発現制御機構を推進したことで、食物繊維の摂取不足などにより大腸上皮細胞周辺の短鎖脂肪酸量が減少することと発癌との関係性の一端を明らかにできたことから、それらの内容に関して学会での発表および論文化を進め、日本および海外の研究者や学生などへの理解を促す社会への還元を行って行きたいと考えている。ホメオスタシスの破綻が発癌へと繋がる一つの要因であるとすると、その発端は腸内環境の変化である可能性が考えられる。平成29年度には、腸内細菌フローラが産生する短鎖脂肪酸である酪酸(C4)を主に用いて、EP4プロスタノイド受容体および、その情報伝達系への効果をメカニズムと共に分子薬理学的手法を用いて以下の結果を得た。

正常大腸上皮細胞の形質や形態を維持している数少ない細胞であるヒト大腸癌細胞株HCA-7細胞に、酢酸(C2)からカプロン酸(C6)までの種々の短鎖脂肪酸を24時間処理した時のヒトEP4受容体の発現を検討した結果、酪酸(C4)のみが有意にEP4受容体の発現を50%程度抑制した。またHCA-7細胞における酪酸(C4)の効果は濃度依存的であり、生理的な濃度に近い0.1 mMを用いた時に細胞障害性もなく、かつ有意にEP4受容体発現量を減少させることを見出せた。さらに、酪酸(C4)の濃度依存的なプロスタグランジンE2 (PGE2)刺激によるcAMP産生量の減少がみられたことから、酪酸(C4)はEP4受容体の発現を減少させることで、PGE2による生理的作用も減弱させることも明らかにできた。一方で、酪酸(C4)処理により、時間依存的なヒストンH3のアセチル化を、ヒストンアセチル基転移酵素(HAT)であるCBP/p300を介して引き起こすことも明らかにできた。このCBP/p300は転写因子のコアクティベーターとして遺伝子プロモーター上の応答エレメント周辺のヒストンをアセチル化し、クロマチン構造を解放することで転写活性を調節することが知られている。そのため酪酸(C4)によるエピジェネティックな調節が、EP4受容体の発現を制御している可能性が見出された。さらに酪酸(C4)はNa+依存性モノカルボン酸トランスポーターを介してHCA-7細胞内に取り込まれている可能性も見出すことができた。平成29年度の研究において腸内細菌フローラが産生する酪酸(C4)が、EP4受容体の発現をエピジェネティックに制御している可能性を見出せた。これまでの我々の研究から、EP4受容体の過活性が、初期大腸癌マーカーであるシクロオキシゲナーゼー2(COX-2)発現や、それによって産生されるPGE2がEP4受容体を介したポジティブ・フィードバック機構を形成し、それが大腸癌発症への鍵となることを示唆し、報告してきた。また近年増加している大腸癌の発症理由として、食生活の変化が言われているが、この食生活の変化により腸内細菌フローラそれ自体の構成菌や産生産物が変化することも言われている。さらに大腸癌患者の便中では短鎖脂肪酸濃度が減少していることが報告されていることから、食生活の変化により大腸内での酪酸(C4)を含む短鎖脂肪酸の量が減少することが大腸癌発症の引き金となる可能性が極めて高い。すなわち我々が平成29年度に明らかにした酪酸(C4)によるEP4受容体の発現減少が意味することは、大腸内の酪酸(C4)量が減少することで、発現量が制御されていたEP4受容体数が亢進し、それに続くCOX-2発現の亢進と、その産生物であるPGE2の増加により、EP4受容体が過活性化することで大腸癌が発症するとした我々の提案しているメカニズムを裏打ちする成果であると考えられる。さらに酪酸(C4)によるEP4受容体の発現制御はエピジェネティックに調整されている可能性があることから、最初期の段階でのEP4受容体の発現亢進は、酪酸(C4)を処置することで抑制される可能性を示唆しており、初期大腸癌の治療に関しても非常に重要な成果であると考えられる。ホメオスタシス維持のため正常な大腸上皮細胞は、細胞増殖を繰り返し3日から5日後に頭頂部にて脱落するターンオーバーを繰り返す。このサイクルが破綻し、過剰な細胞増殖が繰り返されると、発癌へとつながることが考えられる。
肢芽におけるホメオボックス遺伝子発現制御機構の解析

Hox遺伝子群は転写因子をコードし、遺伝子情報カスケードの下流にある遺伝子群の転写制御を通じて形態形成を制御しているが、これら標的遺伝子の実体、制御方式については未解明である。肢芽においてはAbdBファミリーに属する遺伝子群がパターン形成を行っているが、予定自脚領域でHoxa-13遺伝子の発現が開始するとその領域で発現していたHoxa-11のmRNA量が顕著に低下、消失し、二者の発現は相補的なものになる。この事実から"Hoxa-11遺伝子はHoxa-13の標的遺伝子のひとつである"という相互作用を想定し、この仮説の証明する実験を行っている。Hoxa-11プロモーターと未分化な細胞状態を反映するマウス奇形種細胞P19細胞を用いたトランジェントトランスフェクション法により制御領域の同定を行った。この系にエフェクターとしてHoxa-13強制発現構築とともにトランスフェクトすると、Hoxa-13依存性のHoxa-11レポーターの転写抑制が観察された。P19細胞がこの転写抑制のアッセイ系として使用できることが判明した。この系を用いてさらに応答領域を狭めていったところ、翻訳開始コドンの上流約600塩基以内にHOXA-13応答性エレメントが同定された。マウス肢芽でもHoxa-13とHoxa-11の排他的な発現が報告されており、ニワトリと同じ機構で転写制御が行われていると考えられる。この応答系に関与する転写制御領域は二者で進化的に保存されていると考えられ、機能及び塩基配列の比較を行った。プロモーター領域には二者で部分的に塩基配列の類似性が観察され、制御エレメントの特定化に利用しているマウスのプロモーターを用いたトランスフェクションの実験においてもHoxa-13応答エレメントはこのプロモーター領域にあることが判った。
顎関節滑膜の増殖メカニズムとサイトカインの作用

本研究の目的は、顎関節滑膜由来の細胞を培養し、滑膜の細胞増殖に関わるサイトカインの作用を解明し、顎関節疾患特有の病態を明らかにすることである。今回は、培養滑膜細胞の産生するサイトカイン(TGF-β、IL-1β、IL-6)およびTIMP-1について、培養上清中の産生量を測定した。研究方法)予備実験を含めて13例の標本から滑膜細胞の培養を試みたが、その中で実験に使用可能な程度まで細胞増殖を示したものは6例であった。滑膜培養手法は通法に従って行い、実験に必要な細胞数が得られた5例を今回用いた。5例の臨床診断は、顎関節内障4例、習慣性顎関節脱臼1例であった。各細胞株は測定に必要な数、すなわち約1x10^7個程度まで増殖させ、その後1x10^5個および1x10^6を無血清培地でインキュベートし2日目および7日目に上清をとり実験に使用した。TGF-β、IL-1β、IL-6、およびTIMP-1の産生量の測定はELISAで測定した。結果)今回樹立した細胞株ではTGF-β、IL-1βの産生は見られなかったが、IL-6、TIMP-1の産生が見られた。産生されたIL-6、TIMP-1は時間依存性に、また細胞数依存的に産生量の増加を認めた。考察)培養細胞株は、継代することによって本来の細胞の性格が変化することが知られているが、結果に示した様にIL-6、TIMP-1の産生が見られた。IL-1βはおもにA型細胞から産生され、IL-6はB型細胞から産生される報告されているが、今回用いた細胞株は細胞形態からもB型細胞であると思われた。また今回用いた細胞株すべてにIL-6の産生が見られたことから、顎関節疾患の滑膜でIL-6が関与していることが示唆された。TIMP-1の産生では、滑膜炎の著明な症例に産生量が多い傾向が見られた。
自己組織化テンプレートを用いたプラズモニック・メタマテリアルの作製とその機能創発

本研究では、可視光に応答するプラズモニック・メタマテリアルの創製を目的とし、分割リング共振器として銀ナノ粒子が球状に集積した構造体の作製を目指した。作製手法には、ブロック共重合体のミクロ相分離構造を自己組織化テンプレートとするボトムアップ技術と、金属を直接三次元的に析出させることができるフェムト秒レーザーを用いた二光子還元法のトップダウン技術を融合する新規作製手法を提案した。まず、ポリエチレンオキサイドとポリメチルメタクリレートからなるブロック共重合体薄膜を作製した。その薄膜を硝酸銀水溶液に浸漬し、銀イオンを導入した。その後、フェムト秒レーザーで描画を施し、二光子還元による銀イオンの金属化を行った。レーザー描画後、ブロック共重合体薄膜中に直径約10nmの銀ナノ粒子が析出していることを透過型電子顕微鏡観察と元素分析によって明らかにした。レーザー描画後の薄膜の表面構造を調べるために、原子間力顕微鏡観察を行った。得られた高さ像より、描画した部分の基板表面が一部露出し、その周りのブロック共重合体薄膜の膜厚が厚くなっていることがわかった。この結果については、レーザー照射の際に発生した熱によってブロック共重合体が融解したと考察した。この融解は、テンプレートとして機能させるべきブロック共重合体のミクロ相分離構造を乱すため、大きな問題となった。そこで、薄膜が融解しない微弱なレーザー照射で銀イオンの二光子還元を起こすために、増感剤の添加を検討した。増感剤には、色素のクマリン440と界面活性剤のN-デカノイルサルコシンナトリウムを用いた。レーザー強度を変化させながら、必要な添加量、ブロック共重合体の融解の有無、及び、銀イオンの金属化の有無を検討した。本研究課題は平成26年度が最終年度のため、記入しない。本年度は、トップダウン技術であるフェムト秒レーザーを用いた二光子還元法と、ボトムアップ技術であるブロック共重合体テンプレートを融合することによって、ナノスケールの金属微粒子の作製が可能であることを示し、新しいメタマテリアル作製技術の土台を構築した。本研究では、量産性に優れた自己組織化材料を用いて、メタマテリアルの素子となる金属ナノ構造体を作製する方法を開発するために、金属を三次元に析出させることが可能なフェムト秒レーザーを用いた二光子還元法と、百ナノメートル以下の周期構造を自己組織的に形成するブロック共重合体テンプレートを組み合わせた。親水性ポリマーと疎水性ポリマーからなる3種類の異なるブロック共重合体を用いて、カバーガラス上に薄膜を作製した。熱処理または溶媒アニールによって親水性ポリマーと疎水性ポリマーのミクロ相分離を促し、50-100nm程度の周期構造を得た。薄膜の上に金イオンまたは銀イオンを含む水溶液を滴下し、親水性ポリマーに金属イオンを導入した。金属イオンが導入されたブロック共重合体薄膜に、集光したフェムト秒レーザーを照射した後、走査型電子顕微鏡でナノ構造を確認した。ブロック共重合体薄膜がフェムト秒レーザーに対して十分に吸収をもたないとき、集光点内で金属イオンの還元反応が起き、大きさ約30nmの金属の微粒子を与えることが示唆された。一方で、光子密度が非常に高くなるフェムト秒レーザー集光点で発生する熱が、ブロック共重合体薄膜を融解する現象が確認され、金属ナノ構造への融解の影響については、今後の検討が必要であることがわかった。本研究では、自己組織化材料を用いてメタマテリアルの素子となる金属ナノ構造体を量産性高く作製する方法を開発する。金属ナノ粒子が集積した構造体が可視光に応答するリング共振器として振る舞うと考え、金属を三次元的に析出させることが可能なフェムト秒レーザーを用いた二光子還元法と、百ナノメートル以下の周期構造を自己組織的に形成するブロック共重合体テンプレートを組み合わせ、金属ナノ粒子集積体を得ることを目指した。疎水部をポリメチルメタクリレート、親水部をポリエチレンオキサイドとする両親媒性ブロック共重合体をスピンコートによってカバーガラス上に製膜した。次いで、熱処理によってブロック共重合体のミクロ相分離構造を誘起させた。その後、銀イオンを含む水溶液にブロック共重合体薄膜を浸漬し、ポリエチレンオキサイドに銀イオンを導入した。銀イオンが導入されたブロック共重合体薄膜に、集光したフェムト秒レーザーを用いて描画パターンを作製した。作製したパターンを原子間力顕微鏡で観察したところ、パターンは線幅300ナノメートル程度であることがわかった。また、パターン内において、数十ナノメートルの粒子が集積している様子が確認された。さらに、同じ試料の走査型電子顕微鏡観察を行い、原子番号依存性のある反射電子像を確認したところ、描画したパターン部のみが高輝度に示されていた。この結果より、描画したパターン部でのみフェムト秒レーザーによる二光子還元反応が生じ、銀イオンが還元されて銀ナノ粒子の析出が起こったと考えた。分子量の異なるブロック共重合体についても同様の実験を行い、形成される銀ナノ粒子のサイズ制御について検討した。以上のように、本年度は、自己組織化材料とフェムト秒レーザーを用いた銀ナノ粒子集積構造の作製法とナノ構造評価法について、新しい知見を得ることに成功した。本研究では、自己組織化テンプレートを用いてメタマテリアルの素子となる金属ナノ構造体を作製する方法を開発する。球状や棒状に集積した金属ナノ粒子は、可視光の磁場成分に応答するメタマテリアルの素子として振る舞うと考えられている。

金属を三次元的に析出させることが可能なフェムト秒レーザーを用いた二光子還元法と、百ナノメートル以下の周期構造を自己組織的に形成するブロック共重合体テンプレートを組み合わせ、金属ナノ粒子の集積体を得ることを目指した。本年度は、集光したフェムト秒レーザーによって還元された結果得られるブロック共重合体テンプレート中の銀ナノ粒子の分析を行った。まず、ポリメチルメタクリレートとポリエチレンオキサイドからなる両親媒性ブロック共重合体をスピンコートによってマイカ基板上に製膜した。次いで、熱処理によってブロック共重合体のミクロ相分離構造を誘起した。マイカ基板上のブロック共重合体薄膜を、水中に浸漬することによって剥離し、水面に展開した。この水面上のブロック共重合体薄膜を透過型電子顕微鏡観察用の金グリッドに転写し、硝酸銀水溶液で処理することによって銀イオンをポリエチレンオキサイドに導入した。銀イオンを導入したブロック共重合体薄膜に集光したフェムト秒レーザーを照射し、銀ナノ粒子を析出させた。得られた試料の透過型電子顕微鏡観察によって、析出した銀ナノ粒子は直径約10nm程度であり、レーザーが照射された部位のエッジ付近に多く存在していることがわかった。また、これらのナノ粒子が銀であることをエネルギー分散型X線分析によって同定した。以上のように、本年度は、二光子還元法によって生成されたブロック共重合体テンプレート中の銀ナノ粒子のナノ構造を確認することがきた。この成果は、本研究におけるメタマテリアルの素子の形と光学特性の関係を調べるための重要な分析プロセスの確立といえる。本研究では、可視光に応答するプラズモニック・メタマテリアルの創製を目的とし、分割リング共振器として銀ナノ粒子が球状に集積した構造体の作製を目指した。作製手法には、ブロック共重合体のミクロ相分離構造を自己組織化テンプレートとするボトムアップ技術と、金属を直接三次元的に析出させることができるフェムト秒レーザーを用いた二光子還元法のトップダウン技術を融合する新規作製手法を提案した。まず、ポリエチレンオキサイドとポリメチルメタクリレートからなるブロック共重合体薄膜を作製した。その薄膜を硝酸銀水溶液に浸漬し、銀イオンを導入した。その後、フェムト秒レーザーで描画を施し、二光子還元による銀イオンの金属化を行った。レーザー描画後、ブロック共重合体薄膜中に直径約10nmの銀ナノ粒子が析出していることを透過型電子顕微鏡観察と元素分析によって明らかにした。レーザー描画後の薄膜の表面構造を調べるために、原子間力顕微鏡観察を行った。得られた高さ像より、描画した部分の基板表面が一部露出し、その周りのブロック共重合体薄膜の膜厚が厚くなっていることがわかった。この結果については、レーザー照射の際に発生した熱によってブロック共重合体が融解したと考察した。この融解は、テンプレートとして機能させるべきブロック共重合体のミクロ相分離構造を乱すため、大きな問題となった。そこで、薄膜が融解しない微弱なレーザー照射で銀イオンの二光子還元を起こすために、増感剤の添加を検討した。増感剤には、色素のクマリン440と界面活性剤のN-デカノイルサルコシンナトリウムを用いた。
ショウジョウバエ以外の昆虫種における液性免疫応答の機序の解明

昆虫の免疫系の研究は、学術的な意義に加え、昆虫病原微生物の害虫管理への応用などといった側面からも重要であるが、免疫系、特に感染時の液性免疫応答が包括的に理解されているのはモデル生物・ショウジョウバエのみであった。そこで我々はゲノムが明らかでRNA干渉も効きやすいコクヌストモドキを用いてショウジョウバエ以外の昆虫種での液性免疫応答の全体像の解明に取り組み、研究期間内にほぼそれを明らかにした。その結果、これら2種では液性免疫応答惹起の微生物種特異性が大いに異なっており、さらに感染シグナル伝達の種々の階層で異なった分子種を用いていることが明らかとなった。昆虫に微生物が感染するとさまざまな免疫応答が起こるが、このうち微生物を殺す活性をもつ抗微生物ペプチド(AMP)の脂肪体(昆虫の肝臓の相同器官)での産生応答機構については、ショウジョウバエでの膨大な研究があり、グラム陽性菌と真菌が感染した場合にはToll経路、グラム陰性菌感染ではIMD経路と呼ばれる免疫経路が特異性を持って活性化され、それぞれの経路の末端に位置するAMP遺伝子のセットが活性化されることが知られている。我々はショウジョウバエモデルとは別の昆虫種の液性免疫応答経路のリファレンスを提供することをひとつの目的として、全ゲノム配列が明らかでありRNA干渉法に適した貯穀害虫・コクヌストモドキを用いて研究を行っている。我々は既にコクヌストモドキではショウジョウバエとは異なり、上記の二つの免疫経路の感染微生物種に特異的な活性化が起こらないことを明らかにしていたので、平成25年度はこの現象の分子的背景を探るために二つの経路で細胞内へ感染シグナルの入力を行う膜タンパク質に着目し、IMD経路ではペプチドグリカン認識タンパク質(PGRP)遺伝子群、Toll経路ではToll受容体遺伝子群をノックダウンし、AMP産生応答への影響を調べた。詳細な検討の結果、まずコクヌストモドキのIMD経路ではショウジョウバエとは違ったPGRPバリアントが中心的なレセプターとして機能し、様々な微生物種の感染シグナルを伝えることが分かった。Toll経路についても同様であり、ショウジョウバエとは異なった分子種が中心的なレセプターであり、同じく多くの微生物種の感染に応答することが示され、コクヌストモドキの特徴である感染微生物種に対する特異性の低い免疫経路の活性化の背景になっていることが強く示唆された。これらはいずれも新規な知見であり、学術的価値も高いと思われる。昆虫の微生物感染時の防御応答のうち最も特徴的であるのは、抗微生物活性を示す一群のペプチドの高レベル発現が肝臓の相同器官である脂肪体を中心に誘導され、体液中に分泌された成熟ペプチドが高濃度で体中を循環するという全身性の応答を示す点である。この過程はショウジョウバエに於いて詳しく検討され、グラム陰性菌感染時には主としてIMD経路、グラム陽性菌と真菌の感染時には主としてToll経路と呼ばれる免疫シグナル伝達経路が活性化され、それぞれが異なったセットの標的遺伝子群を活性化することが知られている。我々はこの感染微生物種特異的な免疫経路の活性化がショウジョウバエ以外の昆虫種に於いても起こるのかに興味を持ち、RNA干渉が効きやすく、全ゲノム情報が利用できるコクヌストモドキを材料として研究を進め、これまで1)コクヌストモドキではショウジョウバエで見られるような感染微生物種特異的なIMDあるいはToll経路の活性化は起こらないこと、2)この微生物感染時の特異性の低い両経路の活性化は、それぞれの経路の最上流に位置するパターン認識レセプターの持つ幅広い認識特異性に起因するであろうことを明らかにしてきた。26年度はまず、これまで手を付けていなかった、両経路での感染シグナルを細胞内に入力する膜レセプターの細胞内ドメインの分子集合に関わるTube、Pelle、IAPの各遺伝子群についての解析を行った。さらに、これまで微量注入をもちいて感染させていたモデル病原体に加え、自然感染を起こす2種類の昆虫病原性糸状菌を実験系に組み込み、これらの感染動態および昆虫側の応答についての解析を進め、コクヌストモドキではショウジョウバエと異なり、昆虫病原性糸状菌の感染防御にToll経路がほとんど無力であるという驚くべき結果を得ている。昆虫の液性免疫機序のうち、微生物感染時の抗微生物ペプチド(AMP)産生応答は、昆虫の生体防御に大きな役割を果たしている。AMP産生応答の機序は、ショウジョウバエでたいへん詳しく記述されており、Toll経路およびIMD経路と呼ばれる免疫シグナル伝達経路があり、前者はグラム陽性菌と真菌、後者はグラム陽性菌の感染時にそれぞれの制御下にあるAMP遺伝子群が活性化するという特異性の高い応答をすることが示されている。他の昆虫種を用いた包括的な報告がなかったことにより、このショウジョウバエモデルは広く受け入れられていたが、我々はコクヌストモドキを用いた研究により、この種ではいずれの微生物種の感染時にもToll経路とIMD経路が同時に活性化されることを見出した。本研究ではこの知見をベースに、コクヌストモドキの免疫シグナル伝達経路を構成する種々の階層の遺伝子群を対象にRNA干渉を利用した網羅的な機能解析を行った。これによりコクヌストモドキのAMP産生応答の系をほぼ解明し、また、ショウジョウバエとは異なった幅広いスペクトラムの微生物特異性を持つ分子種をそれぞれの経路が微生物の検知に利用していることが、コクヌストモドキの、感染微生物種に関わらない経路の同時活性化の基盤であることを明らかにした。

また当初研究計画にはなかったが、フェノール酸化酵素、さらに生物農薬としても期待される昆虫病原糸状菌を研究対象に組み入れ、最終年度では特に昆虫病原糸状菌について、その感染によりToll経路およびIMD経路がともに活性化されるが、感染防御にはIMD経路がずっと重要であるという、ショウジョウバエでの知見とは反対の結果を得た。さらにこの研究の過程で、バリア上皮の健全性が糸状菌の感染防御にはより重要であるという、これら生物的防除資材を実際に利用する場合に有用となる知見を得た。昆虫の免疫系の研究は、学術的な意義に加え、昆虫病原微生物の害虫管理への応用などといった側面からも重要であるが、免疫系、特に感染時の液性免疫応答が包括的に理解されているのはモデル生物・ショウジョウバエのみであった。そこで我々はゲノムが明らかでRNA干渉も効きやすいコクヌストモドキを用いてショウジョウバエ以外の昆虫種での液性免疫応答の全体像の解明に取り組み、研究期間内にほぼそれを明らかにした。その結果、これら2種では液性免疫応答惹起の微生物種特異性が大いに異なっており、さらに感染シグナル伝達の種々の階層で異なった分子種を用いていることが明らかとなった。平成26年度には、上の項に記した通りの複数の新知見を得ている。このうち特に、当初の研究計画になかった昆虫病原性糸状菌に対するコクヌストモドキの免疫応答の解析結果については、1)Toll経路の重要構成要素をコードする遺伝子をノックダウンしても、せいぜい死亡時期をやや早める程度の効果がなく、昆虫病原性糸状菌に対する防御応答に大きな役割を果たすことで免疫系でのはたらきが認知されるようになったショウジョウバエのToll経路とは大きな差があり、2)種々の感染方法と昆虫側の応答を精査することにより、コクヌストモドキの抗糸状菌防御では、体腔内に侵入されてからの応答機序よりもむしろ強固なバリア性上皮での防御応答が重要であることを示唆する結果を得ている。このように必ずしも当初計画に沿って研究が進んでいるわけではないものの、コクヌストモドキとショウジョウバエの免疫系の重要な差異が順調に明らかになっていることから、達成度については「おおむね順調に進展している」とした次第である。昆虫生理生化学2年間のコクヌストモドキを用いた研究を通じ、当初研究計画になかった研究結果による補完も含めて、研究目的である「主としてショウジョウバエでの知見をもとに構築された昆虫の免疫システム像の相対化」をある程度達成することができた。計画最終年度となる27年度は、これまで抜け落ちている部分を的確に補いつつ、次につながる成果である昆虫病原性糸状菌のコクヌストモドキ感染系での知見を集積するとともに、これまで得た結果に基づいて論文の執筆を進めていきたいと考えている。平成25年度には、まず上の項に記した通り、複数の新しい知見を得ている。また当初の計画にはなかったが、Toll受容体のリガンドであるspaetzleというサイトカインの遺伝子群についても詳細な解析を行って、こちらも1)ショウジョウバエとは異なる分子種が機能していること、さらに2)spaetzleに依存しないTollへの入力経路の存在を示唆するデータを得ている。
アトロポス重合：自発的停止反応制御による精密重合

重合化学の発展により,分子量や末端基を制御した高分子合成が実現しているが,従来の制御重合(リビング重合)では,モノマー消費後に停止剤を加える必要があった.本研究では重合開始時に停止剤を含めたすべての試薬を混合する,新しい重合(アトロポス重合)を開発した.すなわち,(メタ)アクリレートのアニオン重合において,モノマーに比べて極端に反応性の低い停止剤を用いることにより,停止剤存在下でも選択的にモノマーが反応した後に,停止剤が成長アニオンと反応して末端機能化ポリマーが生成する新規な制御重合系を確立した.さらに,ブロック共重合体やグラフト共重合体の自動合成にも展開し,簡便な操作での精密重合を達成した.リビング重合に基づく高分子合成により,分子量や立体規則性,末端構造を精密に制御した高分子の精密合成が実現している.しかしながら,従来のリビング重合では開始剤/助剤(添加剤),モノマー,停止剤を適切な順序,タイミングで逐次投入する必要があり,重合の実験操作を煩雑化するとともに,反応設計を制約する遠因にもなっていた.これに対し,本研究では反応剤を同時投入するだけで,開始剤,モノマー,停止剤が予めプログラム化された順序で理路整然と反応し,分子量・立体規則性・末端構造を制御した高分子を自発的に与える重合(アトロポス重合)を開発する.一般に開始剤と停止剤を混合すると,これらの直接的な反応により,単に開始剤が失活して重合が開始しない.また,前述の副反応を経ずに無事に重合が開始できた場合も,活性種が共存する停止剤とすぐに反応するため,高分子が成長しない.このため,全ての試薬を同時投入し,分子量・末端構造の同時制御を目指すアトロポス重合は非常にチャレンジングな課題であると言えるが,同重合では用いる試薬を反応開始時に混合するだけで精密高分子合成が達成できるため,実験プロセスの大幅な簡略化が可能であり,工業的にも重要な基幹技術となり得る.アトロポス重合の実現には,開始剤/成長種に対してモノマーよりも圧倒的に穏やかな反応性を示す停止剤が有効である.この場合,重合初期終期まではモノマーが選択的に反応し,モノマーがほぼ完全に消費された後に,より低活性な停止剤が反応すると期待される.そこで,本研究の初年度では,研究代表者らがこれまで精力的に研究を進めてきたメタクリル酸メチルのアニオン重合を題材に,アトロポス重合を実現する適切な停止剤を開発することを目的とする.本年度の研究は,モノマー担持型停止剤を利用した分岐高分子の合成など,次年度以降に展開する応用研究の基礎としての役割も担う.リビング重合は分子量や末端構造を精密制御した高分子を提供するが,停止剤をモノマー消費後に逐次添加する必要があり,実験操作を煩雑にしていた.本研究では停止剤を含む必要試薬を反応開始時に同時添加しても,開始剤,モノマー,停止剤が予めプログラム化された順序で反応し,分子量,末端構造を制御した高分子を自発的に与える重合(アトロポス重合)を開発する.初年度はメタクリル酸メチル(MMA)のシンジオタクチック特異性リビングアニオン重合において,MMAより十分に反応性が低く,かつ停止反応を起こすのに十分な求電子性を有する停止剤を検討し,α-(ブロモメチル)-β-メチルアクリル酸メチル(T1)がアトロポス重合を実現することを見出した.2年目に当たる本年度は,T1を用いたアトロポス重合の条件を精査し,温度一定の条件で分子量が3万以上のポリマーを狭い分子量分散度,約60%の末端導入率で合成することに成功した.また,アクリル酸ブチル(BA)とMMA, T1を開始剤と混合すると,BAの選択的な重合,MMAの重合を経てT1が反応し,末端機能化ブロック共重合体が得られた.すなわち,分子量,末端構造に加えモノマー配列の制御をも達成するアトロポス重合に成功した.また,BAとα-(クロロモメチル)アクリル酸エチル(T2)の組合せでも,アトロポス重合が達成されることを見出し,反応性差を利用した重合設計の普遍性が示唆された.翌年度にアトロポス重合を分岐ポリマーの合成に応用することを視野に,メタクリロイル(M)基とα-(クロロモメチル)アクリロイル(T)基を有するモノマー担持型停止剤(M-T)を合成した.1モル等量未満のM-Tを加えてMMAのリビングアニオン重合を部分的に停止すると,残存した成長アニオンをマクロ開始剤,生成した末端機能化ポリマーをマクロ開始剤とする重合が進行し,グラフトポリマーが得られた.(1)停止剤T1を用いるMMAのアトロポス重合では,停止反応促進のため重合温度をー78 °Cから0 °Cに昇温する必要があった.反応条件を精査した結果,ー40 °Cないし0 °Cで重合開始した場合,昇温を必要としない,より理想的なアトロポス重合が達成された.また,分子量が10万を超え反応系がゲル化する場合でも,停止剤を開始段階で添加するアトロポス重合では,停止剤の混合などの技術的限界なく,有効に停止反応が進行する.

(2) BA, MMA, T1をー40 °Cで重合すると,BA選択的な重合を経てMMAが重合し,末端機能化ブロックコポリマーが得られ,モノマー配列をも制御可能なアトロポス重合が実現した. (3) BAの重合では,モノマー消費後に徐々にアニオン失活の兆候が見られ,実際にT2を逐次添加しても末端導入率は最大で80%程度であった.他方,アトロポス重合では,成長種の失活より早く停止反応が進行し,末端導入率は90%以上に達した.(4) MMAの重合系に開始剤に対して1当量未満のM-Tを逐次添加すると,残存した成長アニオンをマクロ開始剤,生成した末端機能化ポリマーをマクロモノマーとする重合が進行し,グラフトポリマーがone-potで得られた.(5)メタクリル酸アンモニウム塩をAl助剤と組合わせると,アクリル酸エチルの重合がリビング的に進行し,末端にメタクリロイル基を有するポリマーが生成した.さらに,時間経過とともに末端メタクリロイル基が消費され,環化もしくは多量化反応が進行した.(1), (2)は計画通り,(3)は(1)の成果から派生した計画外の発展研究, (4)は次年度計画の前半部分(予備実験)に相当し,当初の計画を凌駕するペースで成果が挙がっている.加えて,本年度当初計画では停止剤担持型モノマーを用いたアトロポス重合による環状ポリマーの合成を予定したが,モノマー担持型開始剤を用いた(5)の発見で同等の目的が達成されたため,本成果を持って当初計画案の代替とする.嵩高いアルミニウムLewis酸を助剤とするアクリル酸ブチル(BA)のリビングアニオン重合を,停止剤であるα-(クロロメチル)アクリル酸エチル(ECMA)の存在下で開始すると,選択的な成長反応によりモノマーがほぼ完全に消費した後,停止反応が進行し末端機能化ポリマーを与える.この重合系にメタクリル酸メチル(MMA)を共存させても,求電子性に勝る停止剤が選択的に反応し,MMAはほとんど消費されないことがわかった.そこで,メタクリロイル基を修飾した停止剤を設計し,これを開始剤に対して1モル等量未満用いてBA, MMAとのアトロポス共重合を行ったところ,BAの選択的な重合に続く停止反応により,メタクリロイル基を末端に有するマクロモノマーが生成した.さらに,未反応のリビングアニオンをマクロ開始剤とするMMAとマクロモノマーの共重合が続き,グラフトポリマーを与えた.すなわち,必要な試薬を同時に混合するだけで,ポリアクリル酸エステルをグラフト鎖に,ポリメタクリル酸メチルを幹鎖に有するグラフト共重合体が自発的に生成する重合系を見出した.以上の重合系では開始反応と停止反応の選択性はやや低く,開始剤と停止剤が直接反応したオリゴマーが生じて,分子量分布を広幅化した.そこで,これまでのリチウムエステルエノラート開始剤に替えて,より穏和な求核性を有するアンモニウムアジド,アンモニウムカルボキシラートを開始剤に用いた重合を新たに開発した.このうち,テトラブチルアンモニウムベンゾエートを開始剤に用いて,ECMAを停止剤とするアクリル酸エチル(EA)のアトロポス重合を行うと,開始反応における選択性が向上し,非常に分子量分布の狭いポリマーが生成した.さらに,この開始剤を前述の自発的グラフトポリマー生成に応用した.重合化学の発展により,分子量や末端基を制御した高分子合成が実現しているが,従来の制御重合(リビング重合)では,モノマー消費後に停止剤を加える必要があった.本研究では重合開始時に停止剤を含めたすべての試薬を混合する,新しい重合(アトロポス重合)を開発した.すなわち,(メタ)アクリレートのアニオン重合において,モノマーに比べて極端に反応性の低い停止剤を用いることにより,停止剤存在下でも選択的にモノマーが反応した後に,停止剤が成長アニオンと反応して末端機能化ポリマーが生成する新規な制御重合系を確立した.さらに,ブロック共重合体やグラフト共重合体の自動合成にも展開し,簡便な操作での精密重合を達成した.
浸水に伴う体積変化を考慮した不飽和土の強度評価に関する研究

本研究は「浸水時の不飽和土の強度低下」はコラプスと,それに伴う間隙圧の発生・消散に関連し、採用すべき強度定数の試験法の選択指針を究明する意図である。不飽和なシルト質土(サクションが小さい)の浸水時の間隙圧が発生することを確認したが,微少な間隙圧を無視したCU試験法により「浸水時の強度評価法」を検討した結果は次のようである。(1)成層土模型では上載荷重に匹敵する間隙圧が計測された。しかし、圧密容器での浸水時のコラプスに伴う間隙圧は約30分の1の微少値に過ぎなかった。これは、試料へ浸水させるには間隙空気の脱出を許容する必要があり、メニスカスの形成とコラプス発生時の人為的な空気閉塞タイミングが難しいことに起因すると考えられる。(2)一面せん断試験とリングせん断試験により、前者はひずみ制御のみで後者は応力制御によっても非浸水試料と浸水試料のせん断試験挙動を試験した。特に「非浸水試料」と「その強度の6割までせん断動員した時点で浸水した浸水試料」に対して、定圧試験と定体積試験を垂直応力50kPaまでの範囲でせん断試験した成果は、(1)浸水時直後にせん断応力は消失してゼロになるが、ひずみの増加につれて若干回復すること、(2)浸水後のせん断強度は非浸水試料に較べて内部摩擦角で27.1度から20.4度まで低下すること、(3)定体積試験では、土試料の密度に依存するが、緩い土試料では体積を一定に保っために垂直応力(平均応力)を著しく小さく制御せねばならないため、せん断強度は低下する。しかし、強度定数(粘着力c、内部摩擦角Φ,CU試験・全応力表示)は定圧試験結果とほぼ同じ値が得られた。(4)「せん断強度は、せん断中の内部応力変化と体積変化に大きく依存する」ことに注目する必要がある。(3)前項で推論された結果を、実験室内で模型の小型斜面で検証するべく、数値シミュレーション計算モデルの構築に努めたが、計算結果が得られるほどに完成せず断念した。従って、結論でなくこれからの見通しを以下に略述して参考に供する。(1)密度の高い土質ではコラプスが起こり難いため浸水の影響は少ない。緩い土質ではコラプスが起こりやすい。(2)両者に通用し易いせん断試験は、浸水に伴う応力変化に追随できる「定体積試験」が推奨されると考える。不飽和な土質が浸水を受けたときの強度評価は,対象土構造物に関して圧縮時の排気・排水条件設定法に課題が残っているため,「等体積せん断試験」を奨める堤防設計ケースがあるが,確立されていない。本研究は,サクション効果が大きくないシルトや砂を対象として,(1)「非浸水」と「浸水」の各土試料の強度評価法,(2)浸水過程で状態変化に伴う強度変化評価法,について研究する目的である。

第一に,既往の室内せん断試験データ等を再整理してコラプスに伴う間隙圧を推定する一方,間隙圧(空気圧と水圧)が計測できる圧密試験を実施して,コラプス発生時の間隙圧の発生・消散を確認する。第二に,リングせん断試験中のコラプスと間隙圧の発生消散を計測するために,既往のリングせん断装置に間隙圧計測部を付加する改造や成層の緩い砂質土層の体積変化(コラプス)と間隙圧も計測する実験を行う計画とした。成果概要は次のようである。1.浸水に伴う強度低下の原因は間隙水圧の発生ではなく「平均主応力主応力差間隙比」(pqe)関係の応力経路の消散・再現過程のずれに起因する模様であると推定されるに至った.(根拠)1)せん断試験データの分析(「歪み制御」リングせん断試験と「応力制御」試験の結果を比較した結果,浸水時の土構造は崩壊により一時的に強度低下するが歪の増大にっれて強度が回復する),2)不飽和土試料の圧密試験中の浸水過程における間隙水圧は,不正確であるが,計測した結果微小な圧力であることが判明。3)水槽に充填した「弱部が水平な地層で接する土層弱部」への浸水コラプス時における発生間隙水圧は微小であった.2.リングせん断試験機の改造に基づく「浸水時の有効応力経路」の推定的検討1)リングせん断試験機の改造は,間隙圧計測を可能にする改造が上記1.の結果により期待薄く中止して,応力制御システムの不調部分の改造に変更した。2)浸水時の有効応力経路降伏曲面を移動する経路を解明する検討斜面模型に対する有限要素法解析により,有効応力経路降伏曲面を移動する経路設定による出水時の斜面変形解析プログラムを作成して,次年度に強度評価法の指針究明に活用する。第1に不飽和なシルト質土(サクションが小さい)の浸水時の間隙圧が発生することを確認したが,第2の主題である、微少な間隙圧を無視したCU試験法により「浸水時の強度評価法」を検討した。(1)成層土模型では上載荷重に匹敵する間隙圧が計測された。しかし、圧密容器での浸水時のコラプスに伴う間隙圧は約30分の1の微少値に過ぎなかった。これは、試料へ浸水させるには間隙空気の脱出を許容する必要があり、メニスカスの形成とコラプス発生時の人為的な空気閉塞タイミングが難しいことに起因すると考えられる。(2)一面せん断試験とリングせん断試験により、前者はひずみ制御のみで後者は応力制御によっても非浸水試料と浸水試料のせん断試験挙動を試験した。特に「非浸水試料」と「その強度の6割までせん断動員した時点で浸水した浸水試料」に対して、定圧試験と定体積試験を垂直応力50kPaまでの範囲でせん断試験した成果は、(1)浸水時直後にせん断応力は消失してゼロになるが、ひずみの増加につれて若干回復すること、(2)浸水後のせん断強度は非浸水試料に較べて内部摩擦角で27.1度から20.4度まで低下すること、(3)定体積試験では、土試料の密度に依存するが、緩い土試料では体積を一定に保つために垂直応力(平均応力)を著しく小さく制御せねばならないため、せん断強度は低下する。しかし、強度定数(粘着力c、内部摩擦角Φ,CU試験・全応力表示)は定圧試験結果とほぼ同じ値が得られた。(4)「せん断強度は、せん断中の内部応力変化と体積変化に大きく依存する」ことに注目する必要がある。(3)前項で推論された結果を、実験室内で模型の小型斜面で検証するべく、数値シミュレーション計算モデルの構築に努めたが、計算結果が得られるほどに完成せず断念した。従って、結論でなくこれからの見通しを以下に略述して参考に供する。(1)密度の高い土質ではコラプスが起こり難いため浸水の影響は少ない。緩い土質ではコラプスが起こりやすい。(2)両者に通用し易いせん断試験は、浸水に伴う応力変化に追随できる「定体積試験」が推奨されると考える。
プラズマ励起有機金属気相法による酸化物高温超伝導薄膜形成

本研究においては酸化物超伝導薄膜を作製するための新しいプロセス装置を開発した。このプラズマ励起有機金属化学気相堆積法(PEーMOCVD法)は超伝導元素を含む有機金属錯体の蒸気をプラズマ分解し、基板上に均質な、大面積薄膜を高速に作製できる特徴を有する。本年度は高周波プラズマ励起法によるMOCVD装置の試作とYBaCuO薄膜の作製を行い以下の成果を得た。(1)平行電極間にAr/O_3プラズマを生成し、Y(DPM)_3,Ba(DPM)_2、Cu(DPM)_2の原料気体を分解し、基板上に薄膜を堆積するための装置を開発し、YBaCuO膜を析出するための条件を調べた。(2)析出されたasーgrown膜はアモルファス状であり、導伝導伝性を示すが、超伝導遷移は示さなかった。(3)880°Cにおいてアニ-リングをした結果、超伝導特性を示した。4端子測定によると。Tc(onset)=90K、Tc(zero)=87Kであった。(4)X線回折法の結果、(OOL)面方位の結晶構造を有し、c軸配向していた。(5)膜厚は約5μmであり、堆積速度は約100nm/minであった。(6)プロセスプラズマを分光計測し、Y,Ba,Cu各元素の原子、イオンからのスペクトルおよび酸化物からのスペクトルを確認した。(7)再現性良く薄膜を堆積することを及びプロセスの操作性を向上することが次の課題である。4端子測定によると。
カテキンによる上皮増殖因子受容体蛋白分解の分子機構解明と口腔癌増殖抑制作用の検討

上皮増殖因子受容体(EGFR)は頭頸部癌の治療における有用な分子標的である.我々は以下の2点について検討した.1. EGCGによるEGFR分解作用の有用性の分子レベルでの評価.血管平滑筋細胞を用い,EGCGの添加によるEGFRへの影響を評価した.EGCGはEGFRを蛋白質レベルにて減少させこれは生理的蛋白質分解機構であるユビキチンープロテアソーム経路の活性化によることが示唆された.2.マウス腫瘍移植モデルにおけるEGCGによる腫瘍増殖抑制効果の判定.口腔扁平上皮癌細胞株であるHSC-3をヌードマウス背部皮下に移植した.今後腫瘍体積,アポトーシス,EGFRの発現,リン酸化について評価する.上皮増殖因子受容体(EGFR)は頭頸部癌などの腫瘍にて発現や活性の変化が報告されており,癌治療における分子標的として位置づけられ,現在治療薬の開発と臨床応用が行われている.緑茶成分に含まれるカテキンには抗腫瘍効果を含めた様々な生理学的有用性が報告されており,中でもエピガロカテキン-3-ガレート(EGCG)は,in vitroにおいて腫瘍細胞の増殖抑制やEGFRのキナーゼ阻害作用が報告されている.今回我々はEGCGのEGFR蛋白質への影響を検討した.EGFRを発現しているラット血管平滑筋細胞を用い,EGCGの添加によるEGFRへの影響をウエスタンブロットにて評価した.また蛋白質合成阻害剤,プロテアソーム阻害剤,ライソソーム阻害剤を用いて蛋白質分解におけるEGCGの作用をウエスタンブロットにて評価した.またEGFRのユビキチン化についてウエスタンブロットにて評価した.EGCG処理によるPDGFRの細胞膜から細胞質への移行と処理2時間後でのEGFR蛋白質の減少を認めた.蛋白質合成阻害剤によりその減少は促進され,プロテアソームやライソソーム阻害剤によりその減少は抑制されるか検証中である.またプロテアソーム阻害剤添加後のEGFRの免疫沈降にてEGFRのポリユビキチン化が認められるか検証中である.EGCGはEGFRを蛋白質レベルにて減少させ,これは生理的蛋白質分解機構であるユビキチンープロテアソーム分解経路の活性化によることが示唆されており,これを検証中である.上皮増殖因子受容体(EGFR)は頭頸部癌の治療における有用な分子標的である.我々は以下の2点について検討した.1. EGCGによるEGFR分解作用の有用性の分子レベルでの評価.血管平滑筋細胞を用い,EGCGの添加によるEGFRへの影響を評価した.EGCGはEGFRを蛋白質レベルにて減少させこれは生理的蛋白質分解機構であるユビキチンープロテアソーム経路の活性化によることが示唆された.2.マウス腫瘍移植モデルにおけるEGCGによる腫瘍増殖抑制効果の判定.口腔扁平上皮癌細胞株であるHSC-3をヌードマウス背部皮下に移植した.今後腫瘍体積,アポトーシス,EGFRの発現,リン酸化について評価する.【目的】上皮増殖因子受容体(EGFR)は頭頸部癌などの腫瘍にて発現や活性の変化が報告されており,癌治療における分子標的として位置づけられ,現在治療薬の開発と臨床応用が行われている.緑茶成分に含まれるカテキンには抗腫瘍効果を含めた様々な生理学的有用性が報告されており,中でもエピガロカテキン-3-ガレート(EGCG)は,in vitroにおいて腫瘍細胞の増殖抑制やEGFRのキナーゼ阻害作用が報告されている.今回我々はEGCGのEGFR蛋白質への影響を検討した.【材料及び方法】EGFRを発現しているラット血管平滑筋細胞を用い,EGCGの添加によるEGFRへの影響をウエスタンブロットにて評価した.また蛋白質合成阻害剤,プロテアソーム阻害剤,ライソソーム阻害剤を用いて蛋白質分解におけるEGCGの作用をウエスタンブロットにて評価した.またEGFRのユビキチン化についてウエスタンブロットにて評価した.【結果】EGCG処理によるPDGFRの細胞膜から細胞質への移行と処理2時間後でのEGFR蛋白質の減少を認めた.蛋白質合成阻害剤によりその減少は促進され,プロテアソームやライソソーム阻害剤によりその減少は抑制されるか検証中である.またプロテアソーム阻害剤添加後のEGFRの免疫沈降にてEGFRのポリユビキチン化が認められるか検証中である.【結論】EGCGはEGFRを蛋白質レベルにて減少させ,これは生理的蛋白質分解機構であるユビキチンープロテアソーム分解経路の活性化によることが示唆されており,これを検証中である.上皮増殖因子受容体(EGFR)は頭頸部癌にて治療の有用な分子標的とされている.エピガロカテキン-3-ガレート(EGCG)は,腫瘍細胞の増殖抑制やEGFRのキナーゼ阻害作用が報告されており,我々は今回以下の2点について検討した.A.分子標的薬のEGFRシグナル抑制作用におけるEGCGによるEGFR分解作用の有用性の分子レベルでの評価.EGFRを高度に発現している血管平滑筋細胞を用い,EGCGの添加によるEGFRへの影響をウエスタンブロット(WB)にて評価した.また蛋白質合成・プロテアソーム・ライソソームの阻害剤を用いて蛋白質分解におけるEGCGの作用をWBにて評価した.またEGFRのユビキチン化についてWBにて評価した.EGCG処理によるEGFRの細胞膜から細胞質への移行と処理2時間後でのEGFR蛋白質の減少を認めた.蛋白質合成阻害剤によりその減少は促進され,プロテアソームやライソソーム阻害剤によりその減少は抑制された.

EGCGとまたプロテアソーム阻害剤添加後のEGFRの免疫沈降にてEGFRのポリユビキチン化が認められた.EGCGはEGFRを蛋白質レベルにて減少させこれは生理的蛋白質分解機構であるユビキチン-プロテアソーム分解経路の活性化によることが示唆された.今後この結果ついて発表予定である.B.分子標的薬の口腔扁平上皮癌細胞株およびマウス腫瘍移植モデルの腫瘍増殖抑制効果におけるEGCGによる作用増強効果の判定.口腔扁平上皮癌細胞株であるHSC-3をヌードマウス背部皮下に移植した.今後コントロール群とカテキン投与群に分け,癌組織を取り出し腫瘍体積を評価し,また免疫染色にてEGFRの発現およびリン酸化,下流のシグナル分子とのリン酸化について評価する.この研究は進行中であり,結果を待って発表する予定である.口腔癌EGFRを発現しているラット血管平滑筋細胞を用い,EGCGの添加によるEGFRへの影響をウエスタンブロットにて評価したしたところEG CG処理によるPDGFRの細胞膜から細胞質への移行と処理2時間後でのEGFR蛋白質の減少を認めた.この条件にて実験を進めていく予定である.平成25年7月に米国留学が決定しその準備と留学のため研究が中断している.平成26年6月に帰国予定であり,研究期間延長を申請しており,その後の研究を継続する予定である.EGFRを発現しているラット血管平滑筋細胞を用い,EGCGの添加によるEGFRへの影響をウエスタンブロットにて評価したしたところEGCG処理によるPDGFRの細胞膜から細胞質への移行と処理2時間後でのEGFR蛋白質の減少を認めた.この条件にて実験を進めていく予定である.学会に参加し情報収集に努める.学会に参加し情報収集に努める.平成25年7月に米国留学が決定しその準備と留学のため研究が中断した.平成26年6月に帰国予定であり,研究期間延長を申請しており,その後の研究を継続する予定である.正常細胞を用いたウエスタンブロットによる詳細な検討,および腫瘍細胞を用いた実験に使用指せて頂く予定である.さらなるデーターの蓄積を図る.