hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
う蝕・歯周病予防ワクチン開発に向けての新たな戦略

う蝕や歯周病は口腔局所のみの疾患にとどまらず,全身の健康状態にも大きく影響を及ぼすことが明らかとなった。現在,いかにう蝕や歯周病を予防するかその効果的な手段が模索されている。なかでもう蝕や歯周病の病因細菌に対する免疫療法や予防ワクチンの開発研究の推進が急がれる。本研究ではう蝕や歯周病の発症を予防する免疫療法やワクチン開発についてその最新の技術や戦略について企画調査を行い,国内外の研究機関との共同研究へと発展させることを目的とし,以下のような成果を得た。1)ワクチン抗原候補:S.mutansでは菌体表層抗原(Pac),グルカン合成酵素(GTase)がP.gingivalisでは線毛蛋白(FimA),外膜蛋白(Pga53とPga67),赤血球凝集素(HagA),各種蛋白分解酵素(KGP,RGP等)が,またA.actinomycetemcomitansでは線毛蛋白(FapA)等がワクチン抗原候補として有力視されている。2)免疫方法:病因細菌のワクチン抗原を用いた能動免疫はサル等に対する動物実験では,感染防御効果が確認されているが,ヒトに対しての投与は安全性や副作用等が問題である。その実用化までにはまだ時間を要するが,経口粘膜免疫による新しい抗原投与方法での成果に期待が寄せられている。一方,ウシやニワトリ等の動物に病因細菌の抗原を免疫して得た抗体またはそれらの抗原に対して作製したモノクロナール抗体,組換え抗体あるいはヒト型抗体を口腔内に含ソウや塗布する受動免疫は現実性が高いが,有用抗体の量産化がカギとなっている。3)新型ワクチン:う蝕や歯周病病因細菌の全塩基配列決定が目前となり,その情報をもとに遺伝子工学手法を駆使したリコンビナントワクチンやDNAワクチン等が有望である。4)共同研究:本企画調査の成果をふまえて,国内外の研究者との共同研究へと発展させる体制が整った。
コラーゲンビーズカラムを用いた抗血小板剤モニター・臨床応用における有用性の検討

血栓性疾患患者検体に対する薬効判定や薬剤不応症症例の検出,消化管内視鏡症例など抗血小板剤を投与されている症例における休薬時の薬効の変化に対して,血小板機能と抗血小板剤の薬効評価,出血性副作用が示唆できるか2種類のカラムを用い,検査法の有用性を検討した.コラーゲンビーズカラムを測定し,血小板機能を測定するだけでは,個人によって測定結果が大きく異なり,基準値を設定した上での測定値が正常範囲内もしくは異常値であると判定を単純に行うことは困難であることは確認できた.薬効に関しては,服薬による測定値の変化は認められる傾向はあるが,測定時の誤差や薬物動態などの個人差などによるばらつきは認められた.全血をフィルターに通して測定する吸引法(screen filtration pressure法)では,2種類の抗血小板薬を使用しても,その効果判定が明らかとなりその有用性が示された.これら抗血小板薬の薬効モニタリングに関しては,測定結果に個人差が認められること,また検査方法の差により抗血小板薬効判定に与える影響が大きいことから,投与前後での測定を行うことがその効果判定に重要であることが示唆された.本研究により,抗血小板薬のモニタリングには適した検査を用いることが重要であること,また血小板機能の評価は複雑であることが示され,今後も引き続き検討が行われる必要があると思われた.血栓性疾患患者検体に対する薬効判定や薬剤不応症症例の検出,消化管内視鏡症例など抗血小板剤を投与されている症例における休薬時の薬効の変化に対して,血小板機能と抗血小板剤の薬効評価,出血性副作用が示唆できるか2種類のカラムを用い,検査法の有用性を検討した.コラーゲンビーズカラムを測定し,血小板機能を測定するだけでは,個人によって測定結果が大きく異なり,基準値を設定した上での測定値が正常範囲内もしくは異常値であると判定を単純に行うことは困難であることは確認できた.薬効に関しては,服薬による測定値の変化は認められる傾向はあるが,測定時の誤差や薬物動態などの個人差などによるばらつきは認められた.全血をフィルターに通して測定する吸引法(screen filtration pressure法)では,2種類の抗血小板薬を使用しても,その効果判定が明らかとなりその有用性が示された.これら抗血小板薬の薬効モニタリングに関しては,測定結果に個人差が認められること,また検査方法の差により抗血小板薬効判定に与える影響が大きいことから,投与前後での測定を行うことがその効果判定に重要であることが示唆された.本研究により,抗血小板薬のモニタリングには適した検査を用いることが重要であること,また血小板機能の評価は複雑であることが示され,今後も引き続き検討が行われる必要があると思われた.血栓性疾患患者検体に対する薬効判定や薬剤不応症症例の検出,消化管内視鏡症例など抗血小板剤を投与されている症例における休薬時の薬効の変化に対して,血小板機能と抗血小板剤の薬効評価,出血性副作用が示唆できるか2種類のカラムを用い,検査法の有用性を検討した.凝集能の測定結果に関しては,個人によって大きく異なることが明らかとなり,基準値を設定した上での測定値が正常範囲内もしくは異常値であると判定を行うことは困難であった.薬効の変化に関する血小板凝集能の変化では,薬物動態などの個人差があるが服薬による測定値の変化は認められる傾向があった.ただし,この検討に関しても測定値のばらつきなどがあり,はっきりと測定結果が有用であるか判断するには症例数を重ねる必要があると思われた.この方法に加え,全血をフィルターに通して測定する吸引法(SFP法)を比較検討方法として加えた.この方法でも,全血では血小板以外にも血球成分などが検体の取り扱いに与える影響が大きいと考えられ,測定結果に大きく変動が認められることから,非特異反応を示す可能性が示唆された.これら検査の実施に関して,全血を用いて操作が簡便となる点においては有用性が認められるものの,その結果の解釈に関しては判定が難しい面もあり,今後も引き続き検討が行われる必要があると思われた.血栓性疾患患者検体に対する薬効判定や薬剤不応症症例の検出,消化管内視鏡症例など抗血小板剤を投与されている症例における休薬時の薬効の変化に対して,血小板機能と抗血小板剤の薬効評価,出血性副作用が示唆できるか2種類のカラムを用い,検査法の有用性を平成21年度に引き続き検討した.コラーゲンビーズカラムを測定し,血小板機能を測定するだけでは,個人によって測定結果が大きく異なり,基準値を設定した上での測定値が正常範囲内もしくは異常値であると判定を行うことは困難であることは確認できた.薬効に関しては,服薬による測定値の変化は認められる傾向はあるが,測定時の誤差や薬物動態などの個人差などによるばらつきは認められた.全血をフィルターに通して測定する吸引法(SFP法)では,2種類の抗血小板薬を内服していても,その効果判定が明らかとなりその有用性が示された.ただし,薬効に関しては,測定結果に個人差が認められることから,投与前後での測定を行うことがその効果判定に重要であることが示唆された.これら検査の実施に関して,抗血小板薬のモニタリングの重要性が示され,今後も引き続き検討が行われる必要があると思われた.
バレット上皮の癌化とその制御に関する基礎的研究

十二指腸食道逆流による逆流性食道炎-Barrett食道-食道腺癌の発生とcyclooxygenase 2 (COX2)の発現との関係を調べるとともに、選択的COX2阻害薬によるBarrett食道、食道腺癌のchemopreventionの可能性を調べる目的で、7週齢のF334雄性ラットを用いて以下のモデルを作成した。選択的COX2阻害薬としてはcelecoxibを使用した。ラット80頭を用いて、十二指腸食道逆流モデルを作成した。すなわち、胃全摘術後、十二指腸断端を閉鎖し、空腸を挙上しTreitz靱帯より4cm肛門側部位で、端側で食道空腸吻合を行った。ラット80頭を用いてGroup Iと全く同じモデルを作成し、術後1週目からcelecoxibを500ppmの濃度で経口投与を開始した。手術を行わずcelecoxibも投与しない群で10頭とした。手術10,20,30,40週間後に犠牲死させて、Barrett食道・食道腺癌の発生率を比較するとともに、COX2 mRNA発現、PGE2産生量などを検討した。その結果、DGR群ではBarrett食道と食道腺癌の頻度は継時的に高くなり、40週目には89%,47%と高率に認められたのに対して、DGR+CLX群ではともに0%と有意に低率であった。COX2 mRNAの発現はDGR群では10週及び20週の時点でcontrol群に比較して有意に上昇しており、DGR+CLX群でも同様であった。しかしPGE2はDGR群では10週の時点でcontrol群に比較して有意に上昇しているものの、DGR+CLX群では有意に低下しておりcelecoxibの効果が示唆された。十二指腸食道逆流による逆流生食道炎-Barrett食道-食道腺癌の発生及び、選択的cyclooxygenase2(COX2)阻害薬によるchemopreventionを調べる目的で、今年度は7週齢のF334雄性ラットを用いて以下のモデルを作成した。ラット80頭を用いて、エーテル麻酔下に十二指腸食道逆流モデルを作成した。すなわち、胃全摘術後、十二指腸断端を閉鎖し、空腸を挙上しTreitz靭帯より4cm肛門側部位で、端側で食道空腸吻合を行った。ラット80頭を用いてGroupIと全く同じモデルを作成し、術後1週目からCOX2阻害剤のひとつであるcelecoxibを750ppmの濃度で投与を開始した。ラット80頭を用いてGroupIと全く同じモデルを作成し、術後1週目からcelecoxibを1500ppmの濃度で投与を開始した。手術を行わずcelecoxibを1500ppmの濃度で投与する群であり、20頭に行った。全ての群において、発癌剤の投与は一切行わず飼育中で、定期的に体重・摂食量を計測している。これらのラットは手術50週間後に犠牲死させて以下の検討を行う予定である。すなわちBarrett食道発生率、腫瘍発生率・腫瘍多発率・腫瘍総発生量を比較するとともに、COX2mRNA・タンパク発現の検討、PGE2産生量の検討などを行う。
酸性雪の長距離輸送とそれが流出過程に及ぼす影響に関する研究

わが国でも春先の融雪期にアシッドショックなる酸性度の低い流出水が観測されつつあることを考え,冬季の酸性雪,とりわけ琵琶湖北部域でのそれに焦点をあてて,以下の研究を行ってきた.まず,化学反応を含む酸性雪の輸送・反応・沈着過程をモデル化するとともに,長距離輸送され到達した酸性雪が降水の微物理過程モデルを介して降下するモデルを作成し,そこでの降水の水質観測からこれらモデルの検証をはかった.また,この酸性雪が降下してからの流出諸過程,すなわち降雪・積雪・融雪・浸透・流出過程の水量・水質観測とモデル化をおこない,観測データとあわせ解析を行った.具体的な研究結果を以下に示す.1.酸性雪数値モデルの開発:大石らの開発した詳細な雲物理過程を含んだ雲物理モデルに琵琶湖北部域の二次元斜面地形を組み入れて大気水象場を形成し,さらにRutlegeらの開発したSo^<2->_4,No^-_3の生成・沈着モデルを一部改良して診断的に,すなわち化学物質の輸送過程を考慮しない形で結合した結果,So^<2->_4,No^-_3の混合比が観測値に比べて幾分大きな値を示した.そこで,化学物質の輸送過程なども予報変数に組み込んでプログノスティックに化学物質の移動・輸送・生成・沈着過程をモデル化しなくていけないという結論に達し,モデル化を行った.本モデルは降水粒子の分布をも計算できるモデルと化学物質の降水粒子への沈着を考慮した世界で最も現象に忠実なモデルである.2.酸性雪の流出諸過程のモデル化とその流域規模への拡張:酸性雪の流出諸過程をモデル化するにあたって流域面積約5.4Km^2の小流域における連続あるいは集中観測によるデータ取得をはかるとともに,水量・水質個々のモデルとその結合,さらには多層メッシュモデルによる面的拡張を展開することによって,融雪水量の日内変動,融雪時のアシッドショックによる河川水PHの低下,河川水PHの日内変動をかなり再現できることが見い出された.わが国でも春先の融雪期にアシッドショックなる酸性度の低い流出水が観測されつつあることを考え,冬季の酸性雪,とりわけ琵琶湖北部域でのそれに焦点をあてて,以下の研究を行ってきた.まず,化学反応を含む酸性雪の輸送・反応・沈着過程をモデル化するとともに,長距離輸送され到達した酸性雪が降水の微物理過程モデルを介して降下するモデルを作成し,そこでの降水の水質観測からこれらモデルの検証をはかった.また,この酸性雪が降下してからの流出諸過程,すなわち降雪・積雪・融雪・浸透・流出過程の水量・水質観測とモデル化をおこない,観測データとあわせ解析を行った.具体的な研究結果を以下に示す.1.酸性雪数値モデルの開発:大石らの開発した詳細な雲物理過程を含んだ雲物理モデルに琵琶湖北部域の二次元斜面地形を組み入れて大気水象場を形成し,さらにRutlegeらの開発したSo^<2->_4,No^-_3の生成・沈着モデルを一部改良して診断的に,すなわち化学物質の輸送過程を考慮しない形で結合した結果,So^<2->_4,No^-_3の混合比が観測値に比べて幾分大きな値を示した.そこで,化学物質の輸送過程なども予報変数に組み込んでプログノスティックに化学物質の移動・輸送・生成・沈着過程をモデル化しなくていけないという結論に達し,モデル化を行った.本モデルは降水粒子の分布をも計算できるモデルと化学物質の降水粒子への沈着を考慮した世界で最も現象に忠実なモデルである.2.酸性雪の流出諸過程のモデル化とその流域規模への拡張:酸性雪の流出諸過程をモデル化するにあたって流域面積約5.4Km^2の小流域における連続あるいは集中観測によるデータ取得をはかるとともに,水量・水質個々のモデルとその結合,さらには多層メッシュモデルによる面的拡張を展開することによって,融雪水量の日内変動,融雪時のアシッドショックによる河川水PHの低下,河川水PHの日内変動をかなり再現できることが見い出された.酸性雪数値モデルの開発;大石らの開発した詳細な雲物理過程を含んだ雲物理モデルに二次元斜面地形を組み入れて雲水,雨,雪,雲氷,霰の大気水象場を形成するとともに,Rutledgeらの開発した酸性物質のSO_4^<2->およびNO_3^-の移動・輸送・沈着モデルを一部改良して結合し,SO_4^<2->,NO_3^-の物質収支を追跡計算できるモデルを展開した.琵琶湖北部域を対象にして大気中での化学物質の鉛直成分分布,風速等を与件として計算したところ,降雪の地形分布形態が再現できること,SO_4^<2->,NO_3^-の高い混合比が山頂付近に出現すること,地上での降水中のSO_4^<2->,NO_3^-混合比が観測値に比べて幾分大きな値になること,などがわかった.酸性雪の流出諸過程の観測とモデル化;滋賀県伊香郡

余呉町の丹生ダム流域を流れる妙理川洞寿院地点(流域面積約5.4Km^2)で95年,96年の冬季,流量,河川水PHを連続測定してきたが,本年度は1月と3月の数日間集中して河川水,土壌内浸透水をサンプル採水し,陽イオン,陰イオンを含む8つのイオン濃度を分析・測定した.また種々の地形特性が考慮できるように,流域を多層メッシュに分割し,そこにおける水量計算部分では積雪・融雪過程を詳細に表現した池淵らの積雪・融雪モデルと多層メッシュモデルの地中内流出部分をベースに用い,水質計算部分ではILWASモデルをベースにした土壌内化学反応モデルの中から6つの陽イオン交換反応を組み込んだ.メッシュ間を合流流下させることによって河道流が構成され,河道内にあってはさらに水中藻類の光合成活動によるCO^2減少量を観測日射量の関数として表現した.こうしたモデル展開により,融雪水量の日内変動,融雪時のアシッドショックによる河川水PHの低下,河川水PHの日内変動がかなり再現できることがわかった.わが国でも春先の融雪期にアシッドショックなる酸性度の低い流出水が観測されつつあることを考え,冬季の酸性雪,とりわけ琵琶湖北部域でのそれに焦点をあてて,以下の研究を行ってきた.まず,化学反応を含む酸性雪の輸送・反応・沈着過程をモデル化するとともに,長距離輸送され到着した酸性雪が降水の微物理過程モデルを介して降下するモデルを作成し,そこでの降水の水質観測からこれらモデルの検証をはかった.また,この酸性雪が降下してからの流出諸過程,すなわち降雪,積雪・融雪・浸透・流出過程の水量・水質観測とモデル化をおこない,観測データとあわせ解析を行った.具体的な研究結果を以下に示す.1.酸性雪数値モデルの開発:大石らの開発した詳細な雲物理過程を含んだ雲物理モデルに琵琶湖北部域の二次元斜面地形を組み入れて大気水象場を形成し,さらにRutlegeらの開発したSo^<2->_4,No3^-_3の生成・沈着モデルを一部改良して診断的に,すなわち化学物質の輸送過程を考慮しない形で結合した結果,So^<2->_4,No3^-_3の混合比が観測値に比べて幾分大きな値を示した.そこで,化学物質の輸送過程なども予報変数に組み込んでプログノスティックに化学物質の移動・輸送・生成・沈着過程をモデル化しなくてはいけないという結論に達し,モデル化を行った.本モデルは降水粒子の分布をも計算できるモデルと化学物質の降水粒子への沈着を考慮した世界で最も現象に忠実なモデルである.2.酸性雪の流出諸過程のモデル化とその流域規模への拡張:酸性雪の流出諸過程をモデル化するにあたって流域面積約5.4Km^2の小流域における連続あるいは集中観測によるデータ取得をはかるとともに,水量・水質個々のモデルとその結合,さらには多層メッシュモデルによる面的拡張を展開することによって,融雪水量の日内変動,融雪時のアシッドショックによる河川水PHの低下,河川水PHの日内変動をかなり再現できることが見い出された.
グリオーマ発生過程における神経幹細胞の役割の解析

(目的)神経幹細胞あるいは神経前駆細胞が、gliomaの発生基盤となる細胞であるという仮説を検証する事を目的とした。(方法)パラフィン包埋したgliomaの臨床標本を免疫組織学的に検討した。神経幹細胞もしくは神経前駆細胞由来ではないかと考えられているependymomaやmedulloblastoma培養細胞株の多分化能の有無について検討した。(結果及び考察)(1)Glioblastoma組織内にGFAP陰性の小型腫瘍細胞が存在することが知られており、増殖能が高く、治療抵抗性であり、この細胞群がMusashi1を強く発現しており神経幹細胞の特性をもつと考えられた。(2)Pure oligodendrogliomaはGFAP陽性細胞が見られたが、Musashi1は陰性であった。一方oligoastrocytomaではMusashi1陽性細胞を認め、未分化神経細胞のマーカーと考えられるHu陽性細胞が混在した。Oligoastrocytomaはより未分化で多分化能を有する細胞から発生した腫瘍と考えらた。(3)Ependymoma培養細胞株はMusashi1,nestin, A2B5, GFAP陽性となり上衣細胞及び神経幹細胞のマーカーが陽性と考えられた。長期継代培養を行なうことにより、培養細胞は長い突起を伸ばすように変化し、神経細胞のマーカーが陽性になった。Medulloblastoma細胞株はMusashi1,nestin, synaptophysin陽性でGFAPの発現を免疫細胞染色で認めなかったが、神経幹細胞のin vitroでの分化培養条件に従って培養したところGFAP陽性細胞を認めることができた。以上(1)(2)(3)よりある種のgliomaは、神経幹細胞あるいは神経前駆細胞が発生起源ではないかと推測された。OG以外のグリオーマについても、解析を進めている。神経幹細胞あるいはグリア前駆細胞が、グリオーマの発生基盤となる細胞ではないかという仮説を検証するための解析を行うことが目的である。(1)グリオーマ組織におけるMusashi 1の発現:現時点で神経幹細胞に最も選択性の高いマーカーと考えられるMusashi 1に関する研究で、グリオーマと神経幹細胞を結びつける興味深い結果が得られた(Kanemura Y, Arita N, et al.:Differentiation,2001)。従来、膠芽腫組織内にGFAP陰性の小型腫瘍細胞が存在することは知られており、増殖能が高く、治療抵抗性が強いとされてきた。私達の解析では、この細胞群がMusashi 1を強く発現している。したがって、膠芽腫組織中には神経幹細胞の特性をもつ細胞群が存在する。(2)上衣腫細胞株の樹立:臨床サンプルからの膠芽腫あるいは退形成性星細胞腫の細胞株樹立は、多数報告がある。しかし上衣腫細胞株の報告は文献上認めない。私達は大脳半球原発退形成性上衣腫サンプルから、上衣腫細胞株の培養、株化に成功した。本株の解析は現在進行中で、免疫染色でGFAP、Musashi 1陽性、主要組織適合抗原クラスIIを発現し、電顕でmicrovilliおよびadherent junctionを認める。またdibutyryl cAMP添加により、敷石状形態から突起を持つ星細胞様形態に変化を示す。哺乳類adult brainで、上衣細胞あるいは上衣下星細胞自体が神経幹細胞であるという報告も見られる。本細胞株は本研究推進に当たり、極めて有益な研究材料であると考えている。神経幹細胞あるいはグリア前駆細胞がグリオーマの発生基盤となる細胞ではないかという仮説を検証するための解析を引き続き行なった。膠芽腫組織中に神経幹細胞マーカーの一つであるMusashi1を強発現している細胞群が存在することを既に示したが、今回はグリオーマの中でもより神経幹細胞に近いと考えられる腫瘍から培養細胞株を樹立し、多分化能の有無について検討した。

(1)哺乳類のadult brainにも神経幹細胞が存在し、上衣細胞もしくは上衣下細胞が神経幹細胞そのものであるという報告がなされている。私達は上衣細胞より発生したと考えられる上衣腫より培養細胞株を樹立した。免疫細胞染色では同細胞はMusashi1, Nestin, A2B5, GFAP陽性、O4陰性となり上衣腫及び神経幹細胞のマーカーが陽性と考えられた。長期継代培養を行なうことにより、培養細胞は敷石状の形態から長い突起を伸ばすように変化し、突起はTuj1, MAP2及びsynaptophysin陽性であったため神経細胞の性格を示しうる可能性が考えられた。(2)一方小児に多い悪性脳腫瘍である髄芽腫は、小脳虫部外顆粒細胞層のグリアへもニューロンへも、分化可能な神経前駆細胞から発生すると考えられている。私達が樹立したONS76髄芽腫培養細胞株はMusashi1, Nestin, synaptophysin陽性でGFAPの発現を免疫細胞染色で認めなかったが、神経幹細胞のin-vitroでの分化培養条件に従って培養し、LIF及びBMP-2を添加したところGFAP陽性細胞を認めることができた。またレチノイン酸を添加した場合も同じくGFAP陽性細胞を認め、紡錘状の形態から突起を伸ばした星細胞様の形態変化を示した。今後種々の培養条件を試み、乏突起膠細胞や膠芽腫細胞などへの分化誘導の可能性について検討していく予定である。
エンドセリンが神経系の前駆細胞の分化・増殖能に及ぼす作用

今年度の研究では主として中枢神経系(CNS)の前駆細胞に対するETの作用について検討を行うため、(前駆細胞の採取が可能であることから)胎生13日目の脳よりPercoll gradient法およびdifferential a ttachment法により前駆細胞を分離し培養を行った。その結果、CNSの前駆細胞ではET_BRがdominantに発現しており、^<12>5I-ET-1を用いた受容体結合実験から1細胞当たりの受容体数は1900sites、結合親和定数は0.76nMであることが認められた。また、10μM以上の濃度のET-1によってPIturnoverの亢進が認められ、さらに微弱ながらMAP kinaseの活性化が生じることが認められた。従って、ETによってCNSの前駆細胞での細胞内シグナル伝達系が活性化することが認められた。しかしながら、顕著な^3H-thymidine incorporationの上昇が認められなかったことから、ETはCNSの前駆細胞に対してmitogenとして作用しないことが示唆された。さらに、前駆細胞からneuronsおよびglial cells(主にastrocytes)への分化に関して、それぞれMAP-2ならびにGFAPに対する抗体を用いて検討を行った結果、両者への分化の割合に対するETの直接的な作用は認められなかったが、一旦glial cellsに分化した後の細胞に対してETのmitogenicな作用が認められ、glial cellsの相対的な割合が増加することが確認された。従って、CNS構築におけるETの作用はgliaにcommitmentされた細胞に対して発現され、glial cellsのmaturationの過程に影響を及ぼす可能性が示唆された。今後はglial cellsのmaturationの過程におけるETの役割に焦点を当て検討を行って行く予定である。
iPS創薬・再生医療のための糖鎖分化マーカー探索と分化評価法の開発

本研究の目的は、iPS細胞由来神経細胞や心筋細胞に特徴的な糖タンパク質を見出し、分化評価法を開発することである。iPS細胞研究の進展に伴い、iPS創薬や再生医療実現への期待が高まっている。iPS創薬の実用化と再生医療の有効性・安全性確保には、iPS細胞由来臓器細胞の品質評価・管理法の開発は必須である。現在のところ、臓器に分化した細胞の評価には、分化後の機能から予想される核内分子などが用いられているが、特異性・定量性・応用性などに課題がある。すなわち、評価マーカーの種類が限られており、細胞の多様性を十分評価できていない可能性が否定できないこと、細胞の固定化が必要であり、定量性に問題があること、細胞の選別に利用できないことなどである。細胞表面には多数の糖タンパク質が存在し、糖鎖は分化、成熟、がん悪性化に伴い変化することが知られている。分化細胞に特異的な細胞表面糖鎖を複数同定し、分化評価マーカーとして利用できれば、これらの問題を解決できる。本研究では、LC/MS/MSを用いたグライコプロテオミクス技術により、iPS細胞から神経・心筋細胞に分化する過程の細胞膜糖タンパク質を時系列的・体系的・網羅的に解析し、機能解析やパスウェイ解析と組み合わせ、分化関連糖タンパク質を見つけ出す。2018年度は、iPS細胞を神経幹細胞、神経前駆細胞、ドパミン作動性神経様細胞に分化させ、グライコプロテオミクスを行うための各種分析条件の検討を行った。その結果、細胞溶解液から効率的に糖ペプチドを濃縮するための条件を設定することができた。また、糖ペプチド解析のためのプログラム作成に着手した。予備的結果ではあるが、神経分化に伴って、接着関連タンパク質の糖鎖が変化する傾向が認められた。まず、iPS細胞を神経幹細胞、神経前駆細胞、ドパミン作動性神経様細胞に分化させ、免疫学的評価により、目的とした細胞に分化していることが示唆された。さらに、各細胞から膜タンパク質を抽出し、還元アルキル化とトリプシン消化を行い、LC/MS/MSによるタンパク質の網羅的解析を行い、同定されたタンパク質群から、意図した細胞に分化していることを確認した。つぎに、グライコプロテオミクスのための試料調製の最適化を行った。iPS細胞、神経幹細胞、神経前駆細胞、ドパミン様細胞の膜フラクションを還元アルキル化し、トリプシンで消化した。このままLC/MS/MSを行うと、共存するペプチドによるイオン化抑制が生じ、糖ペプチドのMSデータを取得すること困難であることから、糖ペプチドを濃縮する必要がある。我々はすでに、N-結合型糖鎖修飾ペプチド濃縮のための固相抽出用チップを開発しているが、タンパク質量が豊富な細胞抽出液への対応は難しいことから、バッチ法による濃縮を検討した。複数のモデル糖タンパク質を用いて検討し、N-結合型糖鎖修飾ペプチドを高効率で濃縮できる方法を見出した。濃縮した糖ペプチドをnano-ESI-LC/MS/MSにより解析した。まだ予備的段階ではあるが、網羅的な解析結果を統計的に処理し、GO解析やパスウェイ解析を実施したところ、複数の接着関連タンパク質の糖鎖が変化していることが示唆された。実際、マススペクトルを確認したところ、インテグリン類の糖鎖が変化していることが確認された。また、次年度に向けて、O結合型糖鎖修飾ペプチドの濃縮法の開発に着手した。以上のように、N-結合型糖鎖だけでなく、O-結合型糖鎖修飾タンパク質の解析にも着手していることから、当初の計画以上に進展しているといえる。2019年度はまず、分化関連N-結合型糖鎖修飾タンパク質の詳細解析を目的として、前年度とは異なる種類のiPS細胞株(7種以上)を用いて、神経細胞や心筋細胞への分化条件を検討する。免疫学的評価やプロテオミクスにより、適切に分化したと判断される細胞株を選び、グライコプロテオミクスのための細胞数を確保する。前年度最適化した方法を用いて、前年度とは異なるiPS細胞に由来する神経分化細胞、及び心筋細胞のグライコプロテオミクスを行い、分化ステージに特徴的な糖鎖の変化を見出す。前年度の結果と合わせて、分化評価マーカーとしての妥当性を総合的に評価する。つぎに、O-GlcNAc修飾タンパク質の網羅的解析に向けて、細胞全タンパク質を回収する方法を検討する。トリプシン消化の最適化を行い、O-結合型糖鎖修飾ペプチド、O-GlcNAc化ペプチドに加え、O-GlcNAc化と競合するといわれているリン酸化ペプチドを濃縮する方法を検討する。LC/MS/MSによるO-結合型糖鎖修飾ペプチド、O-GlcNAc化ペプチド、及びリン酸化ペプチドの網羅的解析を行い、分化ステージごとに特徴的なO-結合型糖鎖修飾、O-GlcNAc化、およびリン酸化を明らかにする。またGO解析やKEGGパスウェイ解析を行い、神経や心筋分化に関係のある修飾を絞り込む。2020年度は絞り込んだ糖鎖修飾を用いて、分化評価方法を開発する。

現在のところ、臓器に分化した細胞の評価には、分化後の機能から予想される核内分子などが用いられているが、特異性・定量性・応用性などに課題がある。すなわち、評価マーカーの種類が限られており、細胞の多様性を十分評価できていない可能性が否定できないこと、細胞の固定化が必要であり、定量性に問題があること、細胞の選別に利用できないことなどである。細胞表面には多数の糖タンパク質が存在し、糖鎖は分化、成熟、がん悪性化に伴い変化することが知られている。分化細胞に特異的な細胞表面糖鎖を複数同定し、分化評価マーカーとして利用できれば、これらの問題を解決できる。本研究では、LC/MS/MSを用いたグライコプロテオミクス技術により、iPS細胞から神経・心筋細胞に分化する過程の細胞膜糖タンパク質を時系列的・体系的・網羅的に解析し、機能解析やパスウェイ解析と組み合わせ、分化関連糖タンパク質を見つけ出す。2018年度は、iPS細胞を神経幹細胞、神経前駆細胞、ドパミン作動性神経様細胞に分化させ、グライコプロテオミクスを行うための各種分析条件の検討を行った。その結果、細胞溶解液から効率的に糖ペプチドを濃縮するための条件を設定することができた。また、糖ペプチド解析のためのプログラム作成に着手した。予備的結果ではあるが、神経分化に伴って、接着関連タンパク質の糖鎖が変化する傾向が認められた。まず、iPS細胞を神経幹細胞、神経前駆細胞、ドパミン作動性神経様細胞に分化させ、免疫学的評価により、目的とした細胞に分化していることが示唆された。さらに、各細胞から膜タンパク質を抽出し、還元アルキル化とトリプシン消化を行い、LC/MS/MSによるタンパク質の網羅的解析を行い、同定されたタンパク質群から、意図した細胞に分化していることを確認した。つぎに、グライコプロテオミクスのための試料調製の最適化を行った。iPS細胞、神経幹細胞、神経前駆細胞、ドパミン様細胞の膜フラクションを還元アルキル化し、トリプシンで消化した。このままLC/MS/MSを行うと、共存するペプチドによるイオン化抑制が生じ、糖ペプチドのMSデータを取得すること困難であることから、糖ペプチドを濃縮する必要がある。我々はすでに、N-結合型糖鎖修飾ペプチド濃縮のための固相抽出用チップを開発しているが、タンパク質量が豊富な細胞抽出液への対応は難しいことから、バッチ法による濃縮を検討した。複数のモデル糖タンパク質を用いて検討し、N-結合型糖鎖修飾ペプチドを高効率で濃縮できる方法を見出した。濃縮した糖ペプチドをnano-ESI-LC/MS/MSにより解析した。まだ予備的段階ではあるが、網羅的な解析結果を統計的に処理し、GO解析やパスウェイ解析を実施したところ、複数の接着関連タンパク質の糖鎖が変化していることが示唆された。実際、マススペクトルを確認したところ、インテグリン類の糖鎖が変化していることが確認された。また、次年度に向けて、O結合型糖鎖修飾ペプチドの濃縮法の開発に着手した。以上のように、N-結合型糖鎖だけでなく、O-結合型糖鎖修飾タンパク質の解析にも着手していることから、当初の計画以上に進展しているといえる。2019年度はまず、分化関連N-結合型糖鎖修飾タンパク質の詳細解析を目的として、前年度とは異なる種類のiPS細胞株(7種以上)を用いて、神経細胞や心筋細胞への分化条件を検討する。免疫学的評価やプロテオミクスにより、適切に分化したと判断される細胞株を選び、グライコプロテオミクスのための細胞数を確保する。
密度勾配遠心法を用いた海洋環境試料の構成成分分離技術の高度化及び汎用化

複数成分が混在する海洋環境試料において、構成成分ごとにアミノ酸組成等を分析するための前処理技術の高度化を目的とした。今回は、造礁サンゴの構成成分の一つである共生藻をその他の成分から取り除き精製する技術の改良を目指した。サンゴの共生藻を取り出そうとすると、どうしても宿主細胞のサンゴ組織とサンゴ骨格が混ざってしまう。この状態から共生藻だけを取り出すため、他の成分から分散させることを試みた。サンゴ組織、共生藻、サンゴ骨格が混ざった混液を遠心分離すると、サンゴ組織画分(上澄み成分)は他の成分から取り出せるが、共生藻画分(沈殿部分)はサンゴ組織とサンゴ骨格が混ざった状態となる。共生藻画分に分散剤のピロリン酸ナトリウム溶液に再懸濁させてから振盪し遠心分離することを繰り返すことにより、構成成分が絡みついた状態から、ある程度分散された状態にすることができた。その後、コロイダルシリカを用いた密度勾配遠心法により、共生藻とサンゴ骨格を分離することができた。ただし、一部の共生藻画分については、精製の過程で壊れたり、残留サンゴ組織によってサンゴ骨格が絡みついて分散させられなかったために、最終的な共生藻画分の回収率は17%と低かったが、顕微鏡観察(400倍)によって他の成分が取り除かれていることが確認できた。共生藻の精製段階が進んでも、全体的にはアミノ酸組成に大きな変化は見られなかったが、アミノ酸の種類によっては比率の増加または減少傾向が見られた。これは來雑物の影響が少なくなってきたためであると考えられる。今回はアミノ酸態窒素同位体比分析まで行うことができなかったが、同位体比分析の場合は、アミノ酸組成以上に夾雑物の影響を受けるので、顕微鏡観察で成分の混在が確認できない程度に精製されている必要がある。今回の方法は同位体比分析にも有用であると考えられる。
最適複合文字列パターン発見アルゴリズムに関する研究

本年度の主な成果は以下の3点である.1)昨年度に引き続き,最適複合文字列パターン発見を行う際に不必要なパターン候補を減らす手法について研究を行った.部分文字列パターンの候補を減らすために,テキストにおける出現箇所に関する部分文字列上の同値関係を定義し,部分文字列を同値類に分解することが考えられる.この部分文字列の同値類分解問題は接尾辞木やCDAWGなどのデータ構造を用いることで,テキスト長に関して線形時間でできることが知られてはいたものの,大きな記憶容量を要した.これに対し,本研究ではこの同値類分解を接尾辞配列と二つの補助配列のみを用いて線形時間で行うアルゴリズムを考案した.また,接尾辞木などを用いた従来アルゴリズムと比べ,計算速度と記憶容量の両面で優れていることを様々なデータに対する計算機実験で示した.2)上述の部分文字列上の同値類分解アルゴリズムを利用することで,インターネット上の掲示板データから特徴的な部分文字列同値類を複数抽出し,それを基に掲示板におけるスパム投稿を検出する効率の良い教師無し学習アルゴリズムを提案した.また計算機実験によりその有効性を確認した.3)様々なパターンクラスに対して最適パターン発見アルゴリズムの実装を行う際に必要な,パターンクラスに依存しない共通点を明確にし,実装作業を簡易化するためのソフトウェア基盤開発に取り組んだ.C++言語のテンプレートを利用したライブラリの基礎設計を行い,プロトタイプを作成した.最適複合文字列パターン発見について、本年度の主な成果は以下の2点である.1)最適な部分文字列の複合パターンの探索において,組み合わせる文字列がお互いに部分文字列の関係にあると,意味をなさない場合がある.このような無駄な組み合わせの候補を効率よく検出して除去するために,接尾辞木上の任意の節点の組の対応する文字列が部分文字列の関係にあるかどうかを判定する必要がある.本研究ではこの問題が接尾辞木グラフ上の到達可能性問題に帰着できることを示し,長さNの文字列に対して平均で0(NlogN)時間の前処理を行うことで,任意の節点の組が部分文字列の関係にあるかどうかを0((logN)時間で判定できるアルゴリズムを考案した(通常は0(N).また,厳密な証明はできなかったものの,計算機実験から,前処理時間の最悪計算量に関しては0(N√<N>)であることを示唆する結果が得られた.2)最長共通部分文字列長,最長共通部分列長,窓付き最長共通部分列長など,パターンとテキストとの間の局所類似性指標に基づいた新しい文字列パターンクラスの系列を考案した。このパターンクラスは従来の単一のパターンクラスを拡張したものとなっており,複数のパターンの局所的な類似性を複合したパターンと解釈することができる.窓付き最長共通部分列長の計算は通常,長さがそれぞれmとn(m>n)の文字列と窓幅dに対して動的計画法を用いて0(mnd)時間で計算できるが,本研究では0(md)時間で計算するアルゴリズムを提案した.このパターンクラスに対して最適なパターンを発見する問題はNP困難であったが,前述の局所類似性を効率よく計算するアルゴリズムとパターン候補の枝刈りを組み合わせることで,ある程度実用的な時間で計算できることを示した.本年度の主な成果は以下の3点である.1)昨年度に引き続き,最適複合文字列パターン発見を行う際に不必要なパターン候補を減らす手法について研究を行った.部分文字列パターンの候補を減らすために,テキストにおける出現箇所に関する部分文字列上の同値関係を定義し,部分文字列を同値類に分解することが考えられる.この部分文字列の同値類分解問題は接尾辞木やCDAWGなどのデータ構造を用いることで,テキスト長に関して線形時間でできることが知られてはいたものの,大きな記憶容量を要した.これに対し,本研究ではこの同値類分解を接尾辞配列と二つの補助配列のみを用いて線形時間で行うアルゴリズムを考案した.また,接尾辞木などを用いた従来アルゴリズムと比べ,計算速度と記憶容量の両面で優れていることを様々なデータに対する計算機実験で示した.2)上述の部分文字列上の同値類分解アルゴリズムを利用することで,インターネット上の掲示板データから特徴的な部分文字列同値類を複数抽出し,それを基に掲示板におけるスパム投稿を検出する効率の良い教師無し学習アルゴリズムを提案した.また計算機実験によりその有効性を確認した.3)様々なパターンクラスに対して最適パターン発見アルゴリズムの実装を行う際に必要な,パターンクラスに依存しない共通点を明確にし,実装作業を簡易化するためのソフトウェア基盤開発に取り組んだ.C++言語のテンプレートを利用したライブラリの基礎設計を行い,プロトタイプを作成した.
核内構造体形成及び転写制御におけるタンパク質SUMO化の役割

細胞核内では遺伝子の転写、複製、修復など多くの重要な事象が複雑な制御のもとで起こる。核内は均一ではなく、高度に組織化され、ゲノムを含む染色体領域に加え、様々な構造体がダイナミックに変動しながら存在することで、効率的な反応を可能にしていると考えられる。本研究では核内構造体の形成機構、特にユビキチン様タンパク質であるSUMOによる翻訳後修飾の関わりを明らかとすることを目的に、下記のように実験を計画し、遂行した。核内構造体形成に関わるRanBP2のSUMO化活性:細胞内のSUMO化活性を可視化するために独自に開発した、in situ SUMOylationアッセイ法を用いて、核膜孔でRanBP2がSUMO E3活性を発揮していることを明らかとした。siRNAを用いたRanBP2の減弱により、核膜孔におけるSUMO化活性が消失するとともに、PMLボディーの数が減少、核スペックルが形成不全になるなど核内構造体に様々な変化が観察された。タンパク質が核膜孔を通過する際にRanBP2によりSUMO化され、核内で適切な場にリクルートされることに重要である、という新たな可能性が示された。核スペックルの機能と形成機構の解明:核スペックルは転写、RNAプロセッシング、輸送に関わる多くの蛋白質とpoly(A^+)RNAを含む、遺伝子発現制御に重要な核内構造体である。RanBP2の減弱により核スペックルの不全を呈する細胞に着目し、遺伝子発現様式の変化や、核スペックル構成因子群の挙動を半網羅的に調べ、核スペックルの形成機構を分子レベルで追跡することを可能とした。以上のように本研究においては、核内構造体の形成機構に関わるタンパク質SUMO化修飾の多くの知見を得、細胞核の機能とダイナミクスの解明に大きな進展があったと考えられる。1.RanBP2によるSUMO化活性と核内構造体形成の関係独自に開発したin situ SUMOylationアッセイ法により、核膜孔タンパク質RanBP2は核膜孔でSUMO E3活性を発揮していることが明らかとなった。siRNAによりRanBP2をノックダウンすると、核膜孔におけるSUMO化活性が消失するとともに、PMLボディーの数が減少、核スペックルが形成不全、カハールボディーが核スペックル様に分布、傍核小体の形態が変化するなど様々な変化が観察された。よって、細胞質で合成されたタンパク質が核膜孔を通過する際に少なくとも一過的にRanBP2によりSUMO化され、それが核内で適切な場にターゲットされることに重要である可能性が示唆された。核小体、核膜、クロマチンなどには変化がなくRanBP2の欠損による変化は特異的なものである。2.核スペックルの形成機構の解明核スペックルは転写、RNAスプライシング、プロセッシング、輸送に関わる多くの蛋白質とpoly(A^+)RNAから成る複合体であるが、細胞内でどのように形成されているかは明らかでない。RanBP2を欠いたHeLa細胞においては、核スペックルの主要構成蛋白質であるSC35が核内から消失し、細胞質に斑状構造を形成していることがわかった。hnRNPA1、リン酸化型RNAポリメラーゼIIを含む、他の核スペックル蛋白質も同様に細胞質の斑状構造に局在するものの、poly(A^+)、ASF/SFII、hnRNPC1/C2、Y14などは通常通りに核スペックル様の分布をしている。よって、核スペックル構成因子が異なる機構で構造体に相互作用していることがわかり、今後、形成機構を解明する糸口となることが期待される。1. SUMO化活性と核スペックルの形成機構の解明

核スペックルは転写、RNAスプライシング、プロセッシング、輸送に関わる多くの蛋白質とpoly(A^+)RNAを含む、遺伝子発現制御に重要な核内構造体である。しかし、細胞内でどのように形成されているかは明らかでない。本研究により、核膜孔タンパク質RanBP2は核膜孔でSUMO E3活性を発揮していることを明らかとしてきた。さらに、siRNAを用いたRanBP2の減弱による種々の核内構造体への影響を網羅的に調べたところ、核膜、核膜孔複合体、核小体などは不変である一方、PMLボディーの数が減少、核スペックルが形成不全、カハールボディーが核スペックル様に分布、傍核小体の形態が変化するなど複数の特異的変化を確認した。RanBP2の減弱により核スペックルの不全を呈する細胞に着目し、核スペックル構成因子群の挙動を調べた。また、本細胞にRanBP2のSUMO活性部位を再導入することにより、核スペックルの形成効率が回復することを見いだし、核スペックルの形成機構を分子レベルで追跡することを可能とした。2.マウス初期胚の染色体と細胞核内構造の解析生物の発生過程は、細胞の増殖と特定の細胞系譜への分化から成るが、いずれの場合も核内構造が大きく変動し、それに伴い特定遺伝子の発現はダイナミックに変動する。マウス初期胚の蛍光免疫染色法を確立し、PMLボディー、核膜、核小体、ヒストン修飾、抑制クロマチン因子など、発生初期における様々な核内構造体と染色体のダイナミクスを可視化した。
細胞増殖と分化に関与するキネトコアタンパクKLIP1の解析

今回の科学研究費基盤研究(C)(平成17-18年度)(研究費3,500千円)において、我々は、細胞の分裂および分化に重要な新規遺伝子MgcRacGAP (Kawashima et al.,Blood,2000: Hirose et al, J.Biol.Chem.,2001: Minoshima et al.,Dev.Cell,2003: Tonozuka et al.,Blood 2004: Kawashima et al.,J.Cell.Biol.,2006.)をbaitにyeast two-hybrid法にて同定したKLIP1の機能解析をおこなった。当初、KLIP1は他のグループから転写抑制因子であるとの報告(Pan et al. J Virol.2003)がなされていたが、我々はこの分子が恒常的にセントロメア領域に局在することを明らかとした。そしてこの分子は、セントロメアタンパクの慣例にならい、また分子量が50kDaだったことからCENP-50(Centoromere protein 50kDa)と改名されることとなった。さらに我々は、ニワトリDT40細胞を用いてCENP-50の遺伝子破壊細胞を樹立した。すると、この遺伝子破壊細胞の増殖速度は著しく遅く、分裂期の染色体分配には分配異常が認められた。また興味深いことに、CENP-50はスピンドルチェックポイントからの回復に極めて重要な分子であることが判明した。この結果は論文発表している(Minoshima et al., Mol.Cell.Biol.,2005)。さらに我々はCENP-50がセントロメアに局在するのに必要な領域を同定し、この領域がもつ機能を明らかとしており、現在論文投稿の準備を進めている。今回の科学研究費基盤研究(C)(平成17-18年度)(研究費3,500千円)において、我々は、細胞の分裂および分化に重要な新規遺伝子MgcRacGAP (Kawashima et al.,Blood,2000: Hirose etal, J.Biol.Chem.,2001: Minoshima et al.,Dev.Cell,2003: Tonozuka et al.,Blood 2004: Kawashima et al.,J.Cell.Biol.,2006.)をbaitにyeast two-hybrid法にて同定したKLIP1の機能解析をおこなった。我々はこれまでにMgcRacGAPが細胞質分裂において必須な役割を担うことを明らかにしてきた(Hirose et al., J.Biol.Chem.,2001 ; Minoshima et al., Dev. Cell, 2003)。また、2005年には染色体分配においてもMgcRacGAPが機能を有するという報告がなされた。我々は酵母を利用したツーハイブリッド法によりMgcRacGAP結合蛋白質としてKLIP1という分子を単離した。局在を検討した結果、KLIP1はヒト子宮頸がん細胞株であるHeLa細胞およびニワトリB細胞株であるDT40細胞において、細胞周期を通じてCENP-AやCENP-Hと共局在を示すキネトコア(動原体)蛋白質であることが判明した(Minoshima et al., Mol Cell Biol, 2005)。そこで我々はKLIP1をCENP-50と命名した。CENP-50/KLIP1の機能解析のためDT40細胞において遺伝子破壊細胞を樹立した。このCENP-50遺伝子破壊細胞は致死ではないものの、野生型に比べ増殖速度の低下が認められた。この増殖速度の低下が細胞分裂の遅延によることも明らかとなった。共免疫沈降の実験からCENP-50は恒常的動原体局在分子であるCENP-H/CENP-Iと複合体を形成していることが明らかとなった。また、CENP-HおよびCENP-Iを欠損した細胞においてはCENP-50の動原体への局在が消失していた。さらに、CENP-50遺伝子破壊細胞は細胞分裂期に微小管重合阻害剤でスピンドルチェックポイントを活性化させると、阻害剤を除去しても正常に分裂を終了できないことが明らかとなった。その際、姉妹染色分体が分離していたことから、CENP-50はスピンドルチェックポイントが活性化している際の姉妹染色分体の接着に役割を持つことが示唆された。今回の科学研究費基盤研究(C)(2)(平成17-18年度)(研究費

3,500千円)において、我々は、細胞の分裂および分化に重要な新規遺伝子MgcRacGAP(Kawashima et al.,Blood,2000:Hirose et al.,J.Biol.Chem.,2001:Minoshima et al.,Dev.Cell,2003:Tonozuka et al.,Blood 2004:Kawashima et al.,J.Cell.Biol.,2006,)をbaitにyeast-two-hybrid法にて同定したKLIP1の機能解析をおこなった。当初、KLIP1は他のグループから転写抑制因子で.あるとの報告(Pan et al.J Virol.2003)がなされていたが、我々はこの分子が恒常的にセントロメア領域に局在することを明らかとした。そしてこの分子は、セントロメアタンパクの慣例にならい、また分子量が50kDaだったことからCENP-50(Centoromere protein 50kDa)と改名されることとなった。さらに我々は、ニワトリDT40細胞を用いてCENP-50の遺伝子破壊細胞を樹立した。すると、この遺伝子破壊細胞の増殖速度は著しく遅く、分裂期の染色体分配には分配異常が認められた。また興味深いことに、CENP-50はスピンドルチェックポイントからの回復に極めて重要な分子であることが判明した。この結果は論文発表している(Minoshima et al.,Mol.Cell.Biol.,2005)。さらに我々はCENP-50がセントロメアに局在するのに必要な領域を同定し、この領域がもつ機能を明らかとしており、現在論文投稿の準備を進めている。