hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
浮遊微粒子の時空間密度分布計測装置の開発

本研究では、微粒子の粒径・密度計測方法の基礎的研究と実用化へ向けての計測装置の開発を行うことを目的に、三つの方法を研究し成果を上げてきた。以下に、それらの概略を述べる。1.レ-ザ-ビ-ム走査方式による微粒子計測法この方法は、レ-ザ-ビ-ム走査系と高倍率の結像系からなる光学系を用いて、探測領域を特定し、この領域を浮遊する微粒子からの散乱光を高感度の撮像管によって検出し、特定の時間でビデオ画像を積算することで時間と空間に関する微粒子密度の情報を、散乱光の強度から粒径を同時に求めるものである。実際には、(1)レ-ザ-ビ-ム走査光学系と検出系の最適設計を作製・改良、(2)時間積分散乱光空間分体の表示法と密度・粒径解析、(3)可測粒子の評定と総合評価を行ない、この成果を基礎に実用装置の製作を行った。2.透過型移動格子を用いた光学的微粒子計測法この方法は、微粒子からの散乱光を光学的にとらまえ、その微粒子の像を一定間隔に配列したスリット列の格子を透して観察すると、格子が一種の狭帯域空間フィルタ-の作用をし、光栓出器で得られた電気信号の中心周波数から物体の速度と粒径・密度を測定する研究である。実際には、(1)測定法の原理と基礎理論、(2)二つの回転格子を用いた2次元速度測定、(3)イメ-ジファイバ-の応用、(4)格子状室間フィルタ-速度計における粒子の密度、粒径の測定の研究を行ない、種々の速度計の開発を行った。3.スペックル相関法を用いた微粉体粒径計測法この方法では、粉体層表面のレ-ザ-光散乱により生じるスペックルパタ-ンの相互相関を用いて、微粒体層の平均粒径を計測する。本方法の予備的な研究を行ない、オンライン計測への応用の可能性を探った。本研究では、レーザー光散乱を用いて、高度に清浄化された気体や液体中(例えば、クリーンルームや超純水中)に残留する低密度浮遊微粒子の時空間密度分布を測定するダストカウンターを試作した。この装置は、レーザービーム走査系と高倍率の結像系からなる光学系を用いて、深測領域を特定し、この領域を浮遊する微粒子からの散乱光を高感度の撮像管によって検出し、特定の時間でビデオ画像を積算することで時間と空間に関する微粒子密度の情報を同時に得るものである。このような電子光学的方法によって、気体や液体中に残留する浮遊微粒子を、対象の空間を乱すことなく実時間的に監視・計測することは、半導体集積回路などに代表される高密度・高性能の素子や新素材の開発・製作にとって極めて重要であり、この装置の実用化は高清浄度化が要求される多くの分野で有用である。具体的には、以下の研究が実施された。(1)レーザービーム走査系と検出系の最適設計と作製:テスト用クリーンルーム内及び超純水内に浮遊する低密度の粒子群をレーザービームを二次元的に走査して、散乱光を効率的に検出する光学系を設計・作製した。散乱光を倍率の高い結像系を用い、CCDカメラ装置で撮像し、画像入出力装置を介して計算機に取り込んだ。(2)時間積分散乱光空間分布の表示法と密度解析:微粒子密度に応じて積算時間を設定し、時間積算散乱光分布を表示する処理方法を確立した。合わせて、散乱光強度分布に閾値を設定して計数する統計解析法によって、微粒子密度を求めた。

この際、レーザービーム径、ビデオ走査、微粒子の運動特定との関係を数量的に明らかにした。(3)可測粒子の評定:計測可能な粒子からの散乱光強度は、微粒子サイズに依存すると共に、レーザー光強度や撮像条件にも依存する。これらの要素を考慮に入れて、検出できる微粒子サイズの下限を求めた。前年度に引続きレ-ザ-ビ-ム走査方式による微粒子計測法の研究が行われ、更に本年度は透過型移動格子を用いた光学的微粒子計測法とスペックル相関法を用いた微粉体粒径計測法の研究が実施された。1.レ-ザ-ビ-ム走査方式による微粒子計測法(1)レ-ザ-ビ-ム走査光学系の改良:試作したレ-ザ-ビ-ム走査法に基づく微粒子計測装置の問題点、レ-ザ-ビ-ムの光強度分布の変化による散乱光強度の変動の補正、観測可能な粒子サイズを広げるための散乱光検出の光学系改良、粒子サイズ低下に伴なう光子計数検出法の導入を研究した。(2)時間積分散乱光空間分布の表示法と密度解析:試作した計数装置において微粒子密度に応じて積分時間を設定し、時間積分散乱光分布を表示する処理方法を確立した。(3)可測粒子の評定と綜合評価:本計測装置の測定可能な粒子サイズを、レ-ザ-光強度や検出条件との関係で明らかにし、検出できる微粒子のサイズの下限を求め、かつ環境との関係で本装置の綜合評価を行った。2.透過型移動格子を用いた光学的微粒子計測法(1)二つの回転格子を用いた微小領域における2次元流速測定:現在まで研究したベクトル速度測定法を、実際に微小領域の流速測定に応用するための研究が行なわれ、実際の実験を通して応用の可能性を確認した。(2)イメ-ジファイバ-と二つの回転格子を用いた2次元ベクトル速度測定:二つの格子をもつ回転円盤を用いた速度測定法による微小域用の2次元ベクトル速度計へのイメ-ジファイバ-の利用に関する研究を行なった。(3)格子状空間フィルタ-速度測定における出力信号特性:格子状空間フィルタ-速度測定における出力信号を解析することで、粒子径と密度の情報が得られることを研究した。3.スペックル相関法を用いた微粉体粒径計測法を研究した。
ミオシン・ホスファターゼレギュレーターを介した管腔臓器機能制御

ミオシンのリン酸化は、平滑筋細胞や多くの非筋細胞の収縮、細胞運動、遊走、物質透過性、および細胞内物質輸送などに関与する。ミオシンのリン酸化はミオシン軽鎖キナーゼとミオシンホスファターゼ(MPPase)の活性バランスにより調節される。MPPase活性はPKC/CPI-17経路とROCK/MYPT1経路という二つの負の制御経路の調節を受けるが、これらの経路の生体内での生理・病態生理学的役割は依然不明である。本研究では、CPI-17に着目し、CPI-17変異体導入マウスと同欠損マウスを作出し、各管腔臓器の運動生理機能や疾患モデルでの病態発現におけるCPI-17の役割を解明する。
地盤材料のせん断破壊現象を対象とした高精度AE測定による微視的メカニズムの解明

粒状体である地盤材料が固結力を有していない場合には、微視的な「粒子間でのすべり」と「粒子自体の破砕」により、巨視的なせん断破壊が生じると考えられているが、これらの相互関係は十分には解明されていない。そこで、固結力のない地盤材料に対する室内せん断試験において、「近年になって格段に高精度化されたAE測定技術」を用いた非破壊計測を適用する研究を実施した結果、微視的な「粒子間すべり」と「粒子破砕」の発生状況と、巨視的なせん断層の形成過程を、非破壊で評価できることを明らかにした。粒状体である地盤材料では、微視的な「粒子間でのすべり」と「粒子自体の破砕」、および「粒子間結合部が固結力を有する場合にはその消失」により、巨視的なせん断破壊が生じると考えられているが、これらの相互関係は十分には解明されていない。そこで、固結力の有無が異なる2種類の地盤材料に対する室内せん断試験において、「近年になって格段に高精度化されたAE測定技術」を用いた非破壊計測を適用することにより、以下の点を明らかにすることを目的とした検討を実施した。a.「粒子間すべり」と「粒子破砕」が、せん断試験中のどのタイミングにどの位置で生じるのか?b.これらの発生状況は、固結力のない地盤材料のせん断層形成過程とどのように関係するのか?c.固結力を有する地盤材料に対してAE測定を実施することで、「固結力消失」も判別できるか?初年度である本年度は、AE測定を併用した未固結地盤材料の室内せん断試験を実施した。未固結な地盤材料として硅砂を用いて円柱形の密な供試体を作成し、その側面8箇所に高感度AEセンサーを設置して圧密排水三軸圧縮試験を行った。試験では、水平可動ペデスタルを装着した装置を用いて、せん断層が形成され横ずれが始まっても載荷軸に過大な曲げモーメントが作用しないようにした。試験中に計測したAE波形を分析し、その発生頻度と試験で得られた応力ひずみ関係の相関性を明らかにした。さらに、AE波源の発生位置を算定し、その分布がせん断中にどのように変化するかについて検討した。AE測定を併用した未固結地盤材料の室内せん断試験では、AE波源の発生位置の分布状況として、当初予期していた状況とは異なる結果が得られた。そのため、本年度後半は当初の研究計画を見直して、AE波源の発生位置の推定手法の高精度化に関する検討を、基礎的な試験も含めて集中的に実施した。そこで、固結力のない地盤材料に対する室内せん断試験において、「近年になって格段に高精度化されたAE測定技術」を用いた非破壊計測を適用することにより、以下の点を明らかにすることを目的とした検討を実施した。a.「粒子間すべり」と「粒子破砕」が、せん断試験中のどのタイミングにどの位置で生じるのか?b.これらの発生状況は、地盤材料のせん断層形成過程とどのように関係するのか?最終年度である本年度は、AE測定を併用した未固結地盤材料の室内せん断試験を実施した。水平可動ペデスタルを装着した装置を用いて、せん断層が形成され横ずれが始まっても載荷軸に過大な曲げモーメントが作用しないようにしつつ、せん断時の拘束圧や供試体密度および飽和状態を変えた試験を系統的に実施した。固定波源を用いて別途実施したキャリブレーション試験結果を参照しながら、試験中に計測したAE波形を分析した。AE波源の発生位置を精度よく推定するための分析手法の改善を行い、改善後の推定結果が各種試験条件の影響をどのように受けるかを明らかにした。平成29年度は、AE波源の発生位置の推定手法の高精度化に関する検討を継続して行うとともに、当初予定していた以下の研究も実施する。1) AE測定を併用した未固結地盤材料の室内せん断試験:せん断時の拘束圧や供試体密度を変えた系統的な試験を実施する。さらに、単調載荷だけでなく、せん断の途中で繰返し載荷履歴を与える試験も実施して、これらの条件の違いが微視的現象の発生状況に及ぼす影響を明らかにする。2) AE測定を併用した固結地盤材料の室内せん断試験:まず、セメントや石膏を添加して土粒子間で固結力が発揮されるようにした状態で、固結部分を強制的に破壊させる予備試験を行い、その際のAE波形を測定する。

この周波数特性を「粒子間すべり」と「粒子破砕」の発生時と比較することで、微視的な「固結力消失」もAE測定で判別できるか否かを明らかにする。次に、このような固結地盤材料で作成した供試体に対して、1)と同様にAE測定を併用したせん断試験を実施する。AE波形の分析結果に基づいて、固結地盤材料の巨視的なせん断破壊過程における微視的現象の発生位置とその頻度の変化状況を明らかにする。3)画像解析結果との比較分析:試験中に記録した供試体側面の変形状況の画像解析を行う。これらの結果を総合的に分析し、微視的現象の発生状況と巨視的なせん断破壊挙動との相互関係が、地盤材料の固結力の有無や密度,拘束圧等の条件の違いに応じてどのように変化するかを明らかにする。地盤工学当初は直方体と円柱形の供試体の間で試験結果を比較することで、より高精度なAE測定ができる供試体形状とAEセンサーの配置・設置方法を明らかにする予定であったが、この検討に着手することができなかった。そのため、直方体で試験を行うための各種消耗品の購入費用として予定していた71,772円が、次年度使用額となった。当初の予算使用計画に追加して、次年度使用額71,772円を直方体供試体用のメンブレン等の消耗品購入費用として使用する。
脊髄虚血再灌流障害を軽減させる細胞外microRNAの探索

C57BL/6マウスの下肢に対する虚血プレコンディショニングは、エクソソームに含有されているmicroRNAの中で、VEGFを標的遺伝子とするmiR-762とmiR-3072-5pの発現を減少させて、血液中のVEGF濃度を一時的に上昇させた。虚血プレコンディショニングはCD34陽性骨髄細胞におけるmiR-762とmiR-3072-5pの発現を減少させた。これらの結果から、虚血プレコンディショニングが、CD34陽性骨髄細胞におけるmiR-762とmiR-3072-5pの減少による血液中のVEGF濃度上昇が、脊髄虚血再灌流障害を軽減させている可能性が示唆された。虚血プレコンディショニングの方法としては、C57BL/6マウスの腹部大動脈に対して、クリップにより5分間の虚血と再灌流の1サイクルを、合計3サイクル実施した。虚血プレコンディショニングと開腹のみ(sham)をして24時間後のマウスから採血して血漿を作製し、血漿中のエクソソームを回収後に、エクソソームに含まれるmicroRNAが抽出された。そのmicroRNAsはmicroRNAmicroarray解析に用いられ、虚血プレコンディショニングによりshamと比較して、発現レベルの変化が大きかったmicroRNAを同定した。虚血プレコンディショニングして1、2、3日後の血漿中のVEGF濃度をELISAで測定すると、虚血プレコンディショニングして1日後の血漿中のVEGF濃度はshamと比較して有意に高かったが、虚血プレコンディショニングして2日後と3日後の血漿中のVEGF濃度はshamと同程度であった。虚血プレコンディショニングして1日後のマウスの大腿骨から単離された骨髄細胞が、MACSによる抗CD34抗体を用いた技術により、CD34陽性細胞とCD34陰性細胞に分け、CD34陽性骨髄細胞とCD34陰性骨髄細胞からそれぞれ、microRNAを抽出した。microRNAmicroarray解析から虚血プレコンディショニングによりshamよりも発現レベルが下がった8つのmicroRNAに対するプライマーを用いて、虚血プレコンディショニング後のCD34陽性骨髄細胞とCD34陰性骨髄細胞でのmicroRNAの発現レベルの違いをqPCRにより比較した。虚血プレコンディショニングによりshamと比較してエクソソーム内で発現が低下した8つのmicroRNAは全て、shamのCD34陽性骨髄細胞よりも、虚血プレコンディショニング後のCD34陽性骨髄細胞において、発現レベルが低下していた。エクソソームに含まれるmicroRNAの発現レベルをmicroRNAmicroarrayにより網羅的に解析したことにより、虚血プレコンディショニングによる血液中のエクソソーム内で変化するmicroRNAを同定することが出来た。また、そのmicroRNAの中には、データベースを用いたバイオインフォマティクス解析から、VEGF mRNAの3' UTRに結合する可能性があるmicroRNAが3つあることが予想された。虚血プレコンディショニング(Ischemic preconditioning : IPC)として、C57BL/6マウスの腹部大動脈をtapingし、IPCは腹部大動脈遮断による5分間虚血と5分間灌流を3サイクル行った。対照群として開腹したマウスをShamとした。IPCをして24時間後のマウス5匹の血漿中の平均VEGFの濃度は41pg/ml、Shamマウス5匹の平均VEGF濃度は34pg/mlであった(p = 0.0408)が、IPCをして48時間後と72時間後における血漿中のVEGF濃度は、sham群における血漿中のVEGF濃度と差はなかった。CD34陽性骨髄細胞にmiR-762とmiR-3072-5pのinhibitorをCD34陽性骨髄細胞に導入して24時間後の培養上清中のVEGFを測定したところ、CD34陽性骨髄細胞の培養上清中のVEGF濃度は、コントロールでは6.9 pg/mlであったが、miR-762とmiR-3072-5pのinhibitorを導入したCD34陽性骨髄細胞の培養上清中のVEGF濃度は、12.6 pg/mlと12.5 pg/mlであり、CD34陽性骨髄細胞のmiR-762とmiR-3072-5pをノックダウンすると、VEGFの分泌量が高い結果が得られた。虚血プレコンディショニングにより血液中のVEGF濃度が上がったメカニズム解明の一環として、虚血プレコンディショニングにより発現レベルが下がった8つのmicroRNAのなかで、VEGF mRNAの3' UTRに結合するものがあるか否か解析していく予定である。microRNAinhibitorをCD34陽性骨髄細胞に導入し、CD34陽性骨髄細胞が分泌するVEGF濃度を測定する予定である。

qPCRには当初、予定したメーカーの試薬とプライマーよりも安いメーカーの試薬とプライマーを用いた為に、次年度使用額が生じた。新たなmicroRNAmicroarray解析と学会発表の旅費に使用予定である。
ミドリムシのゲノムDNA量の減少と正常レベルへの複帰過程とに影響する要因の検索

ミドリムシ(Euglena gracilis)は2倍体生物であるが単相と複相の世体交番を示唆する現象は観察されていない。この生物を栄養源を欠いた生育条件に移すとDNA量が半減するという減数分裂類似過程が誘導される。この減数分裂類似過程を解明することが本研究の目的である。完全培地で対数的に増殖中のミドリムシは細胞当り3.7ngのDNAを含有している。この細胞集団を栄養源(燐酸又は炭素)を欠いた栄養条件下に移し、培養を続けると最終的に、細胞当たりのDNA量は、燐酸源欠乏下では1.9ngに,炭素源欠乏下では2.3ngのレベルに減少した。これらの値は、それぞれ、ゲノムの半数体化が起こってランダムに増殖している細胞集団と細胞分裂直後の二倍体細胞集団が含有すると推定されるDNA含量に相当している。エチオニン(アミノ酸メチオニンのアナログ)加えると、炭素源欠乏条件下では、DNA量の減少はゆるやかに進行したが、燐酸源欠乏条件下ではDNA量の減少は起こらなかった。これらの事実は、2つの栄養源欠乏条件下では、DNA量減少の過程が異なっていることを示唆する。燐酸又は炭素源欠乏条件下でDNA量の減少した細胞集団に燐酸又は炭素源を加えるとDNA量は正常レベルに復帰した。この復帰過程はエチオニンによって阻害されなかった。エチオニンはDNA量減少過程では半数体化を抑える作用を持つが、復帰過程では倍数体化を促進する作用を持つと結論できる。これらのエチオニンの効果はメチオニンによって抑えられた。なお、エチオニンは正常な生育条件下では細胞の増殖をおさえるが、DNA量には影響を持たなかった。ミドリムシゲノム編成は真核細胞ゲノムに普遍的にみられる高度反復配列、中程度反復配列、ユニーク配列からなっている。生育条件に伴うDNA量の減少・正常レベルへの復帰とゲノム編成の特性との関連を明らかにするため、DNA再会合の速度論的解析(cot解析)を行った。燐酸源を欠いた培地に移してDNA量を減少差せると、3つの塩基配列クラスの内、中程度配列クラスにDNA減少の影響が最も顕著にあらわれ、DNA削減が大きなゲノム再編を伴っているることが明らかになった。飢餓状態にある細胞で合成されたDNAは、その時点で存在している鋳型DNAの編成と同じパターンであったが、正常な生育条件へ移した初期に合成されるDNAの多くは、中程度反復配列クラスに属するものであった。これらの事実から、DNAの正常レベルの復帰は中程度反復配列の選択的増幅によって起こることが示唆される。
進行性腎癌に対するチロシンキナーゼ阻害薬における腎障害予測バイオマーカーの検討

蛋白尿は、進行性腎癌の分子標的治療薬で用いられるチロシンキナーゼ阻害薬(TKI)の有害事象の一つである。尿中バイオマーカーの測定により蛋白尿の出現を早期に予測する事が可能か検討した。新鮮尿半定量を用いて腎尿細管障害の指標であるβ2-microglobulin、NAG、L-FABPと糸球体上皮細胞障害の指標である尿中ネフリンを測定したが、蛋白尿の増悪を有意に事前予測できるマーカーは認められなかった。しかし、今まで蛋白尿の出現は、糸球体蛋白濾過障壁でのVEGF作用阻害が原因と考えられていたが、糸球体障害マーカーだけではなく、尿細管障害マーカーも顕著な増加がみられ、尿細管障害の関与を同定できた。「研究目的」進行性腎癌患者に対する分子標的治療、とくにチロシンキナーゼ阻害薬(Tyrosine Kinase Inhibitor, TKI)の有害事象である蛋白尿を予測するバイオマーカーは未だ発見されていない。従って、蛋白尿出現を早期に予測するバイオマーカーの確立を目指すことが本研究の目的である。「研究実施計画」バイオマーカー採尿(尿中ネフリン、β2-MG、NAG、L-FABP)を(1.TKI治療前、2.TKI投与14日目、3.TKI投与28日目、4.以降、28日間隔)で実施する。外来にて検尿、尿沈渣、尿蛋白、尿クレアチニン、β2-MG、NAG、L-FABPを新鮮尿半定量で測定する。また、尿の余剰検体を用いて、尿中ネフリンをELISAキットにて比色定量する。「実施状況」平成26年度は12月に1例、2月に2例の症例登録があった。現在総検体数が10検体であり、検体数が20となった時点で尿中ネフリンの比色定量を行う予定である。「研究意義」糸球体上皮細胞障害マーカー、尿細管障害マーカーを測定することにより進行性腎癌患者のTKIによる腎障害が、初期の可逆的な蛋白尿のみの段階から、不可逆的な糸球体上皮細胞の脱落、分節性硬化、尿細管間質病変を惹起する時点を予測できる可能性がある。TKIによる蛋白尿は臨床上多く認められるが、未だそのメカニズムは解明されておらず、その研究も殆ど実施されていない。アキシチニブにおいて蛋白尿発現時の投薬量漸減の指標はあるものの、エビデンスに基づくものではない。本研究において尿中ネフリンをモニターし解析することで蛋白尿発現ならびに増悪をいち早く予測し得ると期待している。さらに本研究のデータに基づいて、尿蛋白量によるTKIの漸減指標を既存のものより精確に設定できるものと期待している。「研究意義」糸球体上皮細胞障害マーカー、尿細管障害マーカーを測定することにより進行性腎癌患者のTKIによる腎障害が、初期の可逆的な蛋白尿のみの段階から、不可逆的な糸球体上皮細胞の脱落、分節性硬化、尿細管間質病変を惹起する時点をバイオマーカーの推移から予測できる可能性がある。また有害事象としての蛋白尿が出現する前に尿中ネフリンの間歇測定により、蛋白尿の出現または障害のグレードを予測し得る可能性もある。「研究目的」進行性腎癌患者に対する分子標的治療、とくにチロシンキナーゼ阻害薬(Tyrosine Kinase Inhibitor, TKI)には有害事象として蛋白尿があるが、蛋白尿を予測するバイオマーカーは同定されていない。従って、蛋白尿出現を早期に予測するバイオマーカーの確立が本研究の目的である。外来にて検尿、尿沈渣、尿蛋白、尿クレアチニン、β2-MG、NAG、L-FABPを新鮮尿半定量で測定し、余剰検体を一旦4°C保存した後、-80°Cにて凍結保存する。尿中ネフリンはネフリンELISAキットにて比色定量する。「実施状況」現在エントリー症例数は22例であり、順次尿中ネフリンの比色定量を実施中である。症例数としては当初の目標を下回っているが、着実に患者尿検体の保存、検査は行われており、尿中ネフリンの比色定量も予定通り実施されている。2016年3月時点でのエントリー症例数は22例であるが、全症例とも採尿検査、ネフリン比色定量が実施できている。進行性腎癌患者に対する分子標的治療、とくにチロシンキナーゼ阻害薬(Tyrosine Kinase Inhibitor, TKI)の有害事象の一つには蛋白尿がある。TKIに伴う蛋白尿に関しては、初期の段階では可逆的であるが、一方で進行すると不可逆的な糸球体上皮細胞の脱落、分節性硬化、尿細管間質病変を惹起する事がある。このため蛋白尿の増悪は治療継続を困難にする事がある。

本研究では、尿中バイオマーカーとして糸球体上皮細胞障害マーカーである尿中ネフリン及び、尿細管障害マーカーである尿中β2-MG、NAG、L-FABPを測定し、その推移から早期に蛋白尿の増悪が予測可能かどうかを検討した。尿検体は、外来で検尿、尿沈渣、尿蛋白、尿クレアチニン、β2-MG、NAG、L-FABPを新鮮尿半定量で測定し、余剰検体を一旦4°C保存した後、-80°Cにて凍結保存し、尿中ネフリンはネフリンELISAキットにて比色定量した。採尿は、1.TKI治療前、2.TKI投与14日目、3.TKI投与28日目、4.以降28日間隔で実施した。最終的なエントリー検体数は25例であった。受診日の尿蛋白定量の相関関係をその前回受診日に採取した各種尿中バイオマーカーと比較しその相関性を解析検討した。研究結果としては、尿中バイオマーカーと尿蛋白定量における相関関係は得られたが、早期に蛋白尿の増悪が予測可能になる事や投薬量の減量の指標となるような有効な尿中バイオマーカーの検出には至らなかった。しかし、TKIによる蛋白尿の出現は、糸球体濾過障壁でのVEGF作用阻害によって蛋白尿が生じられると考えられているが、糸球体障害マーカーだけでなく、尿細管障害のマーカーも顕著な増加が認められており、蛋白尿の成因にはそれらの関与があることが示唆された。蛋白尿は、進行性腎癌の分子標的治療薬で用いられるチロシンキナーゼ阻害薬(TKI)の有害事象の一つである。尿中バイオマーカーの測定により蛋白尿の出現を早期に予測する事が可能か検討した。新鮮尿半定量を用いて腎尿細管障害の指標であるβ2-microglobulin、NAG、L-FABPと糸球体上皮細胞障害の指標である尿中ネフリンを測定したが、蛋白尿の増悪を有意に事前予測できるマーカーは認められなかった。しかし、今まで蛋白尿の出現は、糸球体蛋白濾過障壁でのVEGF作用阻害が原因と考えられていたが、糸球体障害マーカーだけではなく、尿細管障害マーカーも顕著な増加がみられ、尿細管障害の関与を同定できた。平成26年度の当院症例登録目標が16例であったが、実際には3例であり、約19%の登録率であった。実際に進行性腎癌患者が新規で当院へ受診され、尚且つTKIが治療に使用されなければならないため、患者次第という不確定要素がある。引き続き、進行性腎癌患者を積極的に診療してゆくつもりである。研究計画の変更予定はない。本年度はこれまで収集したデータを解析して、蛋白尿を予測するバイオマーカーが同定できるかを検討する。解析結果は腎臓学会、泌尿器科学会総会、または海外の泌尿器科学会などで発表する予定である。医学これまでは進行性腎癌患者の1次治療を登録症例の優先候補としていたが、2次治療、3次治療でTKIが投与される症例も積極的に登録してゆく。臨床試験参加の同意取得に関しては、これまで承諾が得られず症例登録できなかった患者さんもいることから、さらにインフォームドコンセントに力を注ぎ、臨床試験への参加を呼びかけてゆく所存である。平成28年3月に出席した国際関連学会の参加費を平成27年度分の科研費で支出する予定だったが、学会参加申請書類提出が受理されたのが平成28年4月となったため、平成28年度分の科研費で支出されることになったため。他には、購入予定ELISAキット、検体採取チューブ、検体収容ボックスの購入が遅れたため。平成26年度の臨床試験への登録症例数が少なかったため中間解析を平成27年度にすることにした。
手術侵襲が及ぼす唾液分泌型IgAの変化

手術侵襲は免疫システムにさまざまな変化を及ぼすことが示されており、末梢リンパ球数の減少、ナチュラルキラー活性の減少、免疫グロブリンの変化などが報告されている.本研究の目的は、手術侵襲が及ぼす粘膜免疫への影響であり、唾液中分泌型IgAの量的変化と唾液腺組織中のIgA産生量の変化ならびにそのメカニズムを検討した.【方法】(1)外科侵襲と唾液ならびに唾液腺組織の採取:ICR雄性マウスを用い、ネンブタール全身麻酔下に行った.腹部正中に皮膚切開を加え、皮下組織を剥離し皮弁を形成した後、ナイロン糸にて皮膚を縫合した.唾液の採取はピロカルピン(ムスカリン受容体刺激)を投与し分泌唾液を口腔内よりマイクロピペットにて採取した.コントロール群はネンブタール全身麻酔のみ施し、外科侵襲を与えない動物から唾液ならびに唾液腺組織を採取した.(2)唾液中IgA濃度の測定:ELISAによって測定した.(3)顎下腺組織中のIgA mRNAの測定:RT-PCRにより行った.【結果】唾液中IgA濃度は外科侵襲直後に上昇し、翌日以降正常の値に戻った.この上昇は唾液タンパクあたりのIgA濃度としてみると、侵襲翌日に高い傾向であり、生体防御に関連して働いている可能性が示唆された.顎下腺組織中のIgA mRNA量も唾液中IgA濃度と同様に外科侵襲直後に上昇しでおり、IgAは外科侵襲によって分泌が促進されるとともに産生も促進されていた.【結論】アドレナリン受容体刺激によって、唾液IgA濃度が上昇すること、外科侵襲によるIgAの分泌と産生は術直後のみに起こり、翌日以降は正常値に戻ることから、IgA上昇は外科侵襲によって交感神経優位になった結果に生じる一時的な唾液分泌細胞の交感神経受容体への刺激のためと推察された.手術侵襲は免疫システムにさまざまな変化を及ぼすことが示されており、末梢リンパ球数の減少、ナチュラルキラー活性の減少、免疫グロブリンの変化などが報告されている.本研究の目的は、手術侵襲が及ぼす粘膜免疫への影響であり、唾液中分泌型IgAの量的変化と唾液腺組織中のIgA産生量の変化ならびにそのメカニズムを検討した.【方法】(1)外科侵襲と唾液ならびに唾液腺組織の採取:ICR雄性マウスを用い、ネンブタール全身麻酔下に行った.腹部正中に皮膚切開を加え、皮下組織を剥離し皮弁を形成した後、ナイロン糸にて皮膚を縫合した.唾液の採取はピロカルピン(ムスカリン受容体刺激)を投与し分泌唾液を口腔内よりマイクロピペットにて採取した.コントロール群はネンブタール全身麻酔のみ施し、外科侵襲を与えない動物から唾液ならびに唾液腺組織を採取した.(2)唾液中IgA濃度の測定:ELISAによって測定した.(3)顎下腺組織中のIgA mRNAの測定:RT-PCRにより行った.【結果】唾液中IgA濃度は外科侵襲直後に上昇し、翌日以降正常の値に戻った.この上昇は唾液タンパクあたりのIgA濃度としてみると、侵襲翌日に高い傾向であり、生体防御に関連して働いている可能性が示唆された.顎下腺組織中のIgA mRNA量も唾液中IgA濃度と同様に外科侵襲直後に上昇しでおり、IgAは外科侵襲によって分泌が促進されるとともに産生も促進されていた.【結論】アドレナリン受容体刺激によって、唾液IgA濃度が上昇すること、外科侵襲によるIgAの分泌と産生は術直後のみに起こり、翌日以降は正常値に戻ることから、IgA上昇は外科侵襲によって交感神経優位になった結果に生じる一時的な唾液分泌細胞の交感神経受容体への刺激のためと推察された.本研究の目的は、手術侵襲が及ぼす唾液中分泌型IgAの量的変化を検討することである.手術侵襲によって分泌唾液量は減少し、唾液タンパク濃度が著明に上昇し、この変化はα-アドレナリン受容体が刺激されるために起こる変化であることが示唆されている.一方、局所免疫に関連する唾液の分泌型IgAは、抑圧されたストレス下ではその濃度が低いことが報告されている.また、手術侵襲は免疫システムにさまざまな変化を及ぼすことが示されており、末梢リンパ球数の減少、ナチュラルキラー活性の減少、免疫グロブリン濃度の減少などが報告されている.平成14年度は、外科侵襲直後の唾液中IgA濃度の測定をELISAにより測定した(平成14年度研究費にてマイクロプレート吸光度リーダーを備品として購入).外科侵襲は、ICR雄性マウスを用い、ネンブタール全身麻酔下に、腹部正中に皮膚切開を加え、皮下組織を剥離し皮弁を形成した後、ナイロン糸にて皮膚縫合を行った.唾液の採取は術直後にピロカルピン(ムスカリン受容体刺激)を投与し分泌唾液を口腔内よりマイクロピペットにて採取した.コントロール群はネンブタール全身麻酔のみ施し、外科侵襲を与えない動物から唾液を採取した.その結果、IgA濃度はコントロール群(ピロカルピンのみ投与)2497.2±695.0(n=4)、外科侵襲群30207.0±7845.6(n=4)であり、外科侵襲直後にIgA濃度の上昇を認めた.正常マウスにフェニレフリン(α-アドレナリン受容体刺激)を投与した場合もIgA濃度の上昇を認めた{26249.9±3548.6(n=6)}.したがって、外科侵襲直後のIgA上昇は外科侵襲によって交感神経優位になった結果、唾液腺が交感神経によって刺激されたためと推察された.

現在外科侵襲後のIgAの経時的変化を検討している.手術侵襲は免疫システムにさまざまな変化を及ぼすことが示されており、末梢リンパ球数の減少、ナチュラルキラー活性の減少、免疫グロブリンの変化などが報告されている.本研究の目的は、手術侵襲が及ぼす粘膜免疫への影響であり、唾液中分泌理IgAの量的変化と唾液腺組織中のIgA産生量の変化ならびにそのメカニズムを検討した.【方法】1.外科侵襲と唾液ならびに唾液腺組織の採取:ICR雄性マウスを用い、ネンブタール全身麻酔下に行った.腹部正中に皮膚切開を加え、皮下組織を剥離して皮弁を形成した後、ナイロン糸にて皮膚を縫合した.唾液の採取はピロカルピン(ムスカリン受容体刺激)を投与し、分泌唾液を口腔内からマイクロピペットにて採取した.コントロール群はネンブタール全身麻酔のみ施し、外科侵襲を与えない動物から唾液ならびに唾液腺組織を採取した.2.唾液中IgA濃度の測定:ELISAによって測定した(平成14年度研究費にてマイクロプレート吸光度リーダーを備品として購入).3.顎下腺組織中のIgA mRNAの測定:RT-PCR(現有段備を使用)により行った.【結果】唾液IgA濃度は外科侵襲直後に上昇し、翌日以降正帯の値に戻った.顎下腺細織中のIgA mRNA量も唾液中IgA濃度と同様に外科侵襲直後に上昇し、翌日以降正常の値に戻った.正常マウスにフェニレフリンを投与した場合、ピロカルピンやイソプロテレノールを投与したときに比べてIgA濃度の上昇が大きかった.【結論】アドレナリン受容体刺激によって、唾液IgA濃度が上昇すること、外科侵襲によるIgAの分泌と虚生は術直後のみに起こり、翌日以降は正常値に戻ることから、IgA上昇は外科侵襲によって交感神経優位になった結果に生じる一時的な唾液分泌細胞の交感神経受容体への刺激のためと推察された.
演劇のインター・カルチャー的総合研究

本研究は既存の国や文化の枠を超えてますますクロスオーバー化する現代の演劇の諸相を歴史的淵源にさかのぼって分析するとともに、近年著しい成果をあげているインターディシプリナリーな分析装置を手がかりに多角的に演劇の表象システムを再検討することを目指したものである。年度ごとの研究成果を記せば、以下の通りである。平成9年度においては、まず研究の端緒として広くヨーロッパ近代演劇の成立にかかわる各国の演劇理論を再検討し、個々の演劇理論が具体的にどのような舞台表象とつながりの中で発展してきたかを解明した。平成10年度には、「身体論」と「空間論」の観点から演劇の表象システムを考究した。おのおの文化に固有な身体観や空間意識がいかなる形式を演劇に与えるか、また逆に演劇という表象システムが演劇固有の身体や空間を形作ってきたか、その相互のダイナミズムを理論化した。平成11年度には、精神分析の立場から演劇に分析を加えた。たんに戯曲というテクストを精神分析的に解剖するのではなく、演劇と精神分析がきわめて類似した表象システムであることを分析し、演劇の中でヒステリー的身体がいかに抑圧され、また解放されてきたを歴史的に解明した。最終年の平成12年度には、これまでの研究成果の取りまとめの段階として、演劇という表象システムの歴史的変遷を総括した上で、演劇と他のメディアの相互作用、個別身体論や空間論との交叉から演劇のインター・カルチャー的本質を抽出し、演劇理論の新しいパラダイムを構築した。本研究は既存の文化の枠を越え、ますますインター・カルチャー化する時代にあって演劇がどのような変貌を遂げつつあるのかを総合的に分析・考察することを目的としている。本年度はその前提としてできる限り内外の近・現代演劇に関わる資料を収集し、それらを電子メディアとして整理するための基礎的な作業を行った。具体的には、それらの資料を基にヨーロッパ近代演劇の成立を演劇理論、劇場、舞台表象の視点から分析し、統合的な理論的枠組みの構築に努力した。また、こうした理論的考察と平行して、研究で得られた知見を社会に還元することをめざして、本研究の分担者が関わって講演会やビデオ上映を試みた。そのひとつ、平成9年5月13日東京大学教養学部視聴覚ホールで開催された「京劇の現在」では、北京京劇院院長であり演出家でもある石宏図氏が京劇の実演を交えて講演を行い、西洋演劇とも日本演劇とも異なる身体表現と演劇性を浮き彫りにした。また同年5月16日に開かれた世界的に著名な電子映像作家デヴィット・ブレア氏のビデオ上映は、電子時代における表象・映像がはらむ問題の所在を多角的に掘り下げるものとなった。これらは緒についたばかりの本研究の問題意識を広く社会にフィードバックする重要な試みであったと自負している。ただ、本研究は日本、アメリカ、イギリス、フランス、ドイツ、ロシアと幅広い地域を対象とし、時代的にも17世紀から現代までをカバーするものであるため、テーマが拡散しかねないことも明らかになった。今後はこれら地域と時代を通底するよりふさわしいトピックの絞り込みを行うと同時に、相互に有機的な関連を持った研究体制の整備が必要であることが痛感された。既存の文化や国の枠を超えてクロスオーバー化する現代の演劇の淵源を探り、その方向性を総合的に解明しようとする本研究では、平成10年度にはまず前年度に引き続き、近・現代演劇に関わる文献資料の収集と整理を行った。同時にヨーロッパから日本にわたる広範な地域と17世紀から現代まで長い歴史を対象に、舞台芸術研究の基礎となるビデオ・LD資料の収集・整理、それらの資料の電子メディア化にも力を注いだ。それと平行して、今年度は研究分担者のあいだで身体論や空間論の観点から議論を積み重ね、舞台表象に関するより広い文化横断的な理論構築をめざした。当然のことながら、身体論・空間論という新たな視角の導入は、演劇および舞台表象をたんなるパフォーマンス芸術の枠に押し込めるのではなく、それらをより広い文化的コンテクストのなかに位置づけることを可能にした。

こうした研究の過程で得られた新たな視点と知見は教育の現場や一般公開の公演や講演にフィードバックさせ、その中でさらに緻密な理論に鍛造し直さなければならない。今年度もアメリカ・ドキュメンタリー映画の上映と講演、能役者による実演と講演などさまざまな企画を試みた。なかでも教養学部キャンパスプラザ新ホールの完成を記念して、平成10年7月2日に行われた朗読ハフォーマンス『「書物」ー精神の楽器としての』(作・松浦寿輝、演出・パトリック・ドゥヴォス)は特筆に価する。これは表象文化論の学生を中心に事前にワークショップを行うなど、研究と実践を結ぶ貴重な経験であると同時に一個の芸術作品としてきわめて刺激的なパフォーマンスとして高く評価された。ただし、資料の電子メディア化はそれを扱う電子メディア・リテラシーの未熟さゆえに十分に機能しているとはいえない。本研究が対象とするテーマの多様さをいかに束ねるかという問題と並んで、今後の課題として残された問題である。本研究は既存の国や文化の枠を超えてクロスオーバー化する現代演劇の淵源とその方向性の解明を目指すものであるが、平成11年度はこれまで行ってきた一次資科、ビデオや近年登場したDVDソフトの収集・整理の継続に努めると同時に、それらの資料の電子メディア化の作業を行った。理論的研究の面では、精神分析学の観点からヒステリー的身体のあり方に着目し、ヒステリー的身体が舞踊や演劇の場でいかに表象され、また歴史的過程のなかでいかなる変質を蒙ってきたかを分析した。併せてパフォーマンス芸術の分析装置として精神分析学が持つ可能性と有効性についても検討した。また、映像論の観点から、おもに映画に見られる映像表現と舞台における表象のあり方を比較し、その本質的差異を探ると同時に、表象システムがそれぞれのジャンルでいかなる機能を担っているかを理論的に考察した。こうした理論的考察と平行して、本年度も引き続き研究の成果を広く一般に還元した。平成11年7月の公演ならびに講演「舞台芸術の伝統と現在」、平成12年1月フランスのクリスティーヌ・ビュシ=グリュックスマン氏を迎えて開催されたシンポジウム「Penser le virtuelen art」はそのほんの一例である。前者は京劇と狂言の二夜連続の公演で、アジアの身体表現を浮き彫りにするものであった。後者はデュシャンからコンピュータ・アートまで芸術におけるヴァーチャルなものを現代思想の観点から多角的に分析した。このほか平成11年6月にはシンポジウム「ラブレー・ことばの発明工房」、10月にはシンポジウム「中国ドキュメンタリー映画の現状」を開催した。本研究は、歴史横断的・分野横断的な性格を有する研究である。それをいかに統合的な理論にまとめ上げるかが今後に残された課題である。本研究は既存の国や文化の枠を超えてますますクロスオーバー化する現代の演劇の諸相を歴史的淵源にさかのぼって分析するとともに、近年著しい成果をあげているインターディシプリナリーな知見を基に多角的に演劇の表象システムを再検討することを目指したものである。
厚みのある細胞－リン酸カルシウム複合組織体作製と骨再生治療への応用

生体外での三次元細胞組織体において、酸素供給は細胞の生存や機能を維持するための重要な因子である。酸素供給が不足すると組織体内部で壊死が起こることが問題点である。本研究はこの内部壊死を抑制するための酸素透過性三次元細胞培養器とリン酸カルシウム担体材料を基盤として、材料と間葉系幹細胞の複合組織体構築と骨再生治療応用を目的とした。培養デバイスにより幹細胞の骨芽細胞分化の促進と材料との複合組織体構築に成功した。また、複合化により幹細胞の骨芽細胞分化が大幅に促進されることを見いだした。以上より、当該培養デバイスは応用性、汎用性が高く、骨再生医療への貢献が期待できる結果を得ることができた。生体外における三次元細胞組織体構築は、組織再生工学における重要課題のひとつである。しかし、通常細胞を生体外で100マイクロメートル以上の厚みに積層すると内部酸素不足により壊死が起こることが問題点である。本研究は、独自開発した酸素透過性培養器を基盤とし、細胞塊中の壊死抑制と細胞・リン酸カルシウム材料複合化を行う。すなわち、生体外で「活きが良く、骨再生材料と複合化された細胞組織体」を構築する技術を提案し、骨再生治療へと応用を図る。当該培養器を用いることで肝癌細胞の場合、直径600マイクロメートルの細胞塊でも壊死がほとんど起こらないことを見出している。26年度は酸素透過性培養器に間葉系幹細胞(MSC)株を播種し、培養器および培養条件の最適化を図った。骨芽細胞分化を培養器を用いて最適化した後、リン酸カルシウム材料OCPとの複合化を行った。OCPは細胞と同等の大きさ(約50マイクロメートル)に整粒して用いた。MSCを培養器を用いて三次元培養することで通常の平面培養に比べて骨芽細胞分化が促進する知見が得られた。また、細胞とOCPの混合比を変化させて培養器に播種し、MSCとOCPが自己組織的に複合化する条件を検討した結果、MSCとOCPが複合組織体を形成し、OCPにより骨芽細胞分化が促進する傾向がみられた。以上の結果より、本培養器は間葉系幹細胞の骨芽細胞分化を促進し、骨代替材料であるリン酸カルシウムと細胞との複合組織体形成に有効であることが確認できた。本研究で開発する培養器の最大の特徴は酸素透過性である。この酸素透過性細胞培養器は、細胞組織体スフェロイドに安定に酸素を供給することができる。本培養器は、従来のスフェロイド培養の問題点を解決し、再生医療を含めた広範な応用が可能な基盤技術であることを見出した。一方、自家骨に代わる人工骨再生担体材料、治療法の開発に対するニーズは非常に高い。既存人工材料は吸収が遅く、自家骨に比べて骨再生能、吸収速度の点で劣っているのが問題点である。これまでに我々のグループは、リン酸オクタカルシウム(OCP)が骨芽細胞分化を促進することや優れた骨再生能を有することを報告している。本研究は独自開発した培養器を基盤とすることで、生体外で骨再生材料OCPと細胞から成る三次元組織体を構築し、骨再生医療へ応用することを目的としている。当該年度には、培養器の最適化を行い、OCPやその他のリン酸カルシウム材料を微粒子化し、細胞との複合化条件について検討した。これまでに培養器による複合化が間葉系幹細胞の骨芽細胞分化に有効であることを証明することができており、新規骨再生治療法として本研究の優位性を示すことができた。当初の計画において、まずは主にin vitro細胞培養実験によって本研究の優位性を示すことを計画していたが、細胞培養デバイスの改良と培養条件の最適化に想定以上の時間を要した。しかし、遅延が生じたが、細胞培養実験については一定の結果を出すことができており、論文投稿し、受理された。生体外における三次元細胞組織体構築は、組織再生工学における最重要課題のひとつである。しかし、通常細胞を生体外で100マイクロメートル以上の厚みに積層すると内部への酸素供給が不足し、組織体内部で壊死が起こることが問題点である。本研究は独自開発した酸素透過性培養器を基盤とし、細胞組織体中の壊死抑制と細胞・リン酸カルシウム材料複合体の作製を行うことを目的とした。すなわち、生体外で「活きが良く、骨再生材料と複合化された細胞組織体」を構築する技術を提案し、骨再生治療へと応用を図った。当該培養器を用いることで肝がん細胞の場合直径600マイクロメートルの細胞塊の細胞塊においても壊死がほとんど起こらないことを見いだしている。最終年度は、酸素透過性培養器に間葉系幹細胞(MSC)を播種し、ここに種々のリン酸カルシウム材料を加えることで細胞・リン酸カルシウム材料複合組織体を作製し、その細胞分化に与える影響について検討した。リン酸カルシウム材料は細胞に近い大きさ(50マイクロメートル)に整粒して用いた。

この結果、リン酸カルシウム材料を複合化することでMSCの骨芽細胞分化が大幅に促進することをお見いだした。さらに、in vivo移植実験のためにこの複合組織体をさらに凝集させ、骨欠損領域と同じ大きさになるようにディスク化するための培養デバイスを作製し、直径4ミリメートルのディスク状複合組織体を作製した。このディスク状複合組織体をマウス頭蓋冠に作製した規格化骨欠損に移植することで骨再生が起こることを確かめることができた。これらの結果より、本研究で開発した酸素透過性培養器による細胞・リン酸カルシウム複合組織体の骨再生治療における優位性を確認することができた。生体外での三次元細胞組織体において、酸素供給は細胞の生存や機能を維持するための重要な因子である。酸素供給が不足すると組織体内部で壊死が起こることが問題点である。本研究はこの内部壊死を抑制するための酸素透過性三次元細胞培養器とリン酸カルシウム担体材料を基盤として、材料と間葉系幹細胞の複合組織体構築と骨再生治療応用を目的とした。培養デバイスにより幹細胞の骨芽細胞分化の促進と材料との複合組織体構築に成功した。また、複合化により幹細胞の骨芽細胞分化が大幅に促進されることを見いだした。以上より、当該培養デバイスは応用性、汎用性が高く、骨再生医療への貢献が期待できる結果を得ることができた。当初の研究計画に対しておおむね順調に進んでいる。細胞培養実験後に計画していた、より大きな細胞組織体の培養とそのin vivo移植実験について検討を行っていく。再生医工学培養デバイスを用いることに寄る骨芽細胞分化への影響についてより詳細に検討を行う。また、酸素供給による代謝経路の変化などについても検討を行い、骨芽細胞分化に対するリン酸カルシウムの影響及び酸素濃度の影響について検討していく。当初の計画においてまずは主にin vitro細胞実験によって本研究の優位性を示すことを計画していたが、細胞培養デバイスの改良と培養条件の最適化に想定以上の時間を要したため。細胞培養の種々の条件設定に時間を要したため。細胞培養実験後に計画していたin vivo移植実験を行う。移植のための細胞組織体の作製とその培養条件の最適化を行い、その後、マウスに細胞組織体を移植することで生体内における骨再生について検討を行う。26年度に購入した細胞培養用インキュベーターに低酸素培養ユニットを付け、新たな条件設定を検討する。
エンドソーム系ロジスティクスのユビキチンによる制御と癌研究

細胞膜タンパク質は、ユビキチン化依存的に細胞表面からエンドサイトーシスされ、リソソームに輸送されて分解される。本研究では、このユビキチン化依存的エンドサイトーシスにおける機能未知のユビキチン結合タンパク質ファミリーANKRD 13A, 13B, 13Dの役割を解析しており、前年度までにANKRD13が上皮細胞増殖因子EGFの刺激依存的にユビキチン化されたEGF受容体と結合し、その過剰発現によりEGF受容体の細胞膜からのインターナリゼーションが阻害されることを見出している。本年度は、引き続きEGF受容体のエンドサイトーシスにおれるANKRD13の機能解析を進め、以下の結果を得た。1.ANKRD13自身がユビキチン化されること、それにはユビキチン結合モチーフUIMが必要であること、そしてユビキチン化によりANKRD13とユビキテン化されたEGF受容体の結合が抑制されることを見出した。したがって、ANKRD13がユビキチン化による負の活性制御を受けることが示唆された。2.ANKRD13A,13B,13Dそれぞれのノックダウン・ベクターを作製し、HeLa細胞においてトリプル・ノックダウンを行った。しかし、ANKRD13A,13B,13Dがすべて効率よくノックダウンされているかどうかを判断できておらず、この実験から結論を導くことはできなかった。3.ANKRD13Aと13Dをれぞれのノックアウトマウス(どちらも外見上は正常)を交配し、ANKRD13A、13Dダブル・ノックアウトマウスを作製した。しかしながら、外見上の異常は見られなかった。そこで、胚から13A,13Dダブル・ノックアウト細胞株を作製し、この細胞におけるEGF受容体のエンドサイトーシスを解析した。その結果、ダブル・ノックアウト細胞では野生型細胞に比べ、EGF刺激後のEGF受容体の細胞表面からのインターナリゼーションが促進されていることが明らかとなった。この結果は、前年度のANKRD13の過剰発現がEGF受容体のインターナリゼーションを阻害するという結果と合わせ、ANKRD13がEGF受容体のエンドサイトーシスを負に制御する因子であることを示唆している。そして、エンドソームにおいて脱ユビキチン酵素UBPYとAMSHがユビキチン化された細胞膜タンパク質を脱ユビキチン化し、そのリソソームでの分解を負に調節していることが明らかになっている。我々は、酵母two-hybrid法によりAMSH結合タンパク質をスクリーニングし、N末端にアンキリンリピート、C夫端にユビキチン結合モチーフUIMをもつ機能未知のタンパク質Ankrd13AをAMSH結合タンパク質として同定した。そこで上皮細胞増殖因子EGFの受容体のエンドサイトーシスにおけるその機能解析を行い、以下の結果を得た(未発表)。1. Ankrd13Aは、EGF刺激依存的に、刺激後5分をピークとしてEGF受容体と結合した。そして、その結合にはアンキリンリピートは不要であったが、UIMが必要であった。また、in vitroのプルダウン実験により、Ankrd13AはUIMを介してLys63結合型ポリユビキチン鎖と特異的に結合した。このことは、EGF受容体がLys63結合型ポリユビキチン化を受けるというこれまでの報告と合致した。したがって、Ankrd13Aが活性化されユビキチン化されたEGF受容体のユビキチン鎖に結合することが示唆された。2. Ankrd13A過剰発現細胞において、EGF刺激510分後におきるEGF受容体の細胞膜からのインターナリゼーションが阻害された。この阻害効果は、Ankrd13AのUIM欠失変異体、アンキリンリピート欠失変異体のいずれにおいても見られたが、両方を同時に欠失させると失われた。したがって、UIM、アンキリンリピートのいずれもがEGF受容体のインターナリゼーションに関与することが示唆された。以上、Ankrd13Aが細胞膜上で活性化されたEGF受容体にユビキチン化を目印として結合し、そのインターナリゼーションを制御している可能性が示唆された。

2.ANKRD13A,13B,13Dそれぞれのノックダウン・ベクターを作製し、HeLa細胞においてトリプル・ノックダウンを行った。しかし、ANKRD13A,13B,13Dがすべて効率よくノックダウンされているかどうかを判断できておらず、この実験から結論を導くことはできなかった。3.ANKRD13Aと13Dをれぞれのノックアウトマウス(どちらも外見上は正常)を交配し、ANKRD13A、13Dダブル・ノックアウトマウスを作製した。しかしながら、外見上の異常は見られなかった。そこで、胚から13A,13Dダブル・ノックアウト細胞株を作製し、この細胞におけるEGF受容体のエンドサイトーシスを解析した。その結果、ダブル・ノックアウト細胞では野生型細胞に比べ、EGF刺激後のEGF受容体の細胞表面からのインターナリゼーションが促進されていることが明らかとなった。この結果は、前年度のANKRD13の過剰発現がEGF受容体のインターナリゼーションを阻害するという結果と合わせ、ANKRD13がEGF受容体のエンドサイトーシスを負に制御する因子であることを示唆している。