hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
薬毒物による細胞内空胞化を介した細胞毒性機序の研究

以前の研究で塩基性薬物ノルエフェドリンは、ヒトSH-SY5Y細胞に暴露することで顕著な空胞化と細胞毒性を引き起こすことを明らかにしている。本研究では、細胞内空胞化を伴う細胞毒性機構についてより詳細な検討を行った。薬物暴露後の遺伝子発現変動を解析したところ、コレステロール生合成に関する分子群の発現の増加が確認された。またSREBP2の活性化が誘導されており、結果細胞内にコレステロールの蓄積が認められた。誘導される細胞死は、ネクロトーシスおよびSREBP2の阻害剤で細胞死は顕著に抑えられた。以上の結果から塩基性薬物による細胞死は過剰なコレステロール蓄積によって引き起こされることが示唆された。本研究は、法医実務上扱われる薬毒物の中でも一般に使用されていることから、その毒性の検討が特に重要と考えられる塩基性薬物において散見される細胞内空胞化に着目し、これら薬物によって誘導される細胞内空胞化の詳細な誘導機序および毒性発現機序を明らかにすることを目的としている。そこで当該年度においてより詳細な空胞化誘導機序を検討するためにDNAマイクロアレイ法により塩基性薬物投与群の遺伝子発現の変化を検討したところ、脂質代謝に関する遺伝子群、特にコレステロール生合成に係わる分子の発現の顕著な増加が見られ、さらにリアルタイムPCR法により確認したところ、同様の結果が得られた。また細胞内のコレステロールの挙動を蛍光染色およびGC-MSにより検討したところ、塩基性薬物投与群ではLDLコレステロールの取り込みと、細胞内に顕著なコレステロールの蓄積が観察された。塩基性薬物の投与によりオートファジーが誘導され、その一方でリソソーム障害を引き起こすことでオートファジーを完了できなくなることが示唆されていたが(Funakoshi et al.Brain Research, 2013)、今回の結果から塩基性薬物の投与により、細胞内の脂質代謝に大きな変化が起こることが明らかとなった。神経細胞内におけるコレステロールの蓄積はアルツハイマーやニーマンピックC病などに見られ、神経細胞死の発生機序の一つと考えられており、そのことからも塩基性薬物の過剰投与における神経細胞死の一因として細胞内コレステロールの異常蓄積が関与していることが示唆された。本研究は、法医実務上扱われる薬毒物の中でも一般的に使用されていることから、その毒性の検討が特に重要と考えられている塩基性薬物において観察される細胞内空胞化に着目し、これら薬物によって誘導される細胞内空胞化の詳細な誘導機序と、それによって惹起される毒性機序を明らかにすることを目的としている。昨年度においては、塩基性薬物投与細胞でコレステロール生合成および細胞外コレステロール取り込みが誘導されており、結果細胞内に顕著なコレステロールの蓄積が観察されている。本年度は昨年度の結果を踏まえ、コレステロール蓄積後の細胞毒性の機序に関して検討を行った。その結果、塩基性薬物投与細胞においては、アポトーシス実行因子であるカスパーゼ群の活性化は起こっておらず、塩基性薬物による細胞死はアポトーシスではないことが示唆された。一方で、プログラムされたネクローシス様細胞死として知られるネクロトーシスのシグナル分子RIP1のインヒビター(Nec-1s)を投与したところ、塩基性薬物投与細胞における細胞死が抑制された。またsiRNAを用いてRIP1をノックダウンすると、塩基性薬物投与による細胞死が抑制された。これらの結果から塩基性薬物による細胞死はネクロトーシスであることが示唆された。さらにコレステロール蓄積と細胞死との関連を検討するため、細胞内コレステロール生合成系・取り込み系誘導のマスター遺伝子であるSREBP-2の非活性化型を恒常的に発現する細胞を作成、あるいは細胞内コレステロールを除去する実験系において検討したところ、コレステロールの蓄積を抑えることで、いずれも顕著に細胞死が抑制された。以上の結果から塩基性薬物による神経細胞死は、細胞内コレステロールの異常蓄積が誘導され、さらにネクロトーシスが誘導されることが要因であることが示唆された。医歯薬学当該年度に予定していた薬物暴露後の細胞内遺伝子・タンパク質発現パターンの解析、ウェスタンブロッティング法によるシグナル伝達物質活性化の検討により、薬物暴露群でのコレステロール生合成系分子の発現を確認でき、GC-MSによる解析から細胞内コレステロールの異常蓄積を明らかにできたことから、おおむね順調に進展していると思われる。塩基性薬物の投与により細胞内にコレステロールの異常蓄積が見られることが明らかとなったため、今後はコレステロールの異常蓄積からどのような細胞死を誘導するかを明らかにすることを計画している。具体的には、siRNAによる発現抑制あるいは阻害剤による機能抑制により塩基性薬物による細胞死経路の詳細および細胞死の形態を特定することである。またここまでの研究はすべて神経細胞のモデルとして培養細胞を用いて行っているが、一個体に対する影響を検討するために、マウスを用いた実験も計画している。当初測定を企業に測定依頼をする予定であった計測を当教室の機器で行うことが出来たため、その分の費用を次年度の実験に使用したいとの理由から。
マウスノロウイルス主要キャプシド蛋白Ｐドメインの機能解析と感染阻止効果

マウスノロウイルス(MNV)の組換えVP1タンパク質を用い、高感度かつ特異性の高いMNV抗体測定法を確立した。MNVはマウスに持続感染して1年以上も感染源となり、その間、常に高い血中抗体価の維持が観察された。VP1タンパク質の構造中で免疫原性に優れた領域を検討した結果、VP1-P2サブドメインが最も強力な抗体誘導能を有していることが明らかになった。しかし、VP1-P2サブドメインに対する血中抗体を誘導するだけでは、マウスへのMNV感染は阻止できず、粘膜局所IgAなどの腸管免疫の必要性が示唆された。1)MNV感染検出系の確立とバリデーション我々が分離したMNV株から組換えVP1抗原を作製し、ELISA法や蛍光マイクロビーズ(MFI)法による抗体測定系を構築した。また、MNV感染細胞を用いた間接蛍光抗体(IFA)法をMNV確定診断の目的で併用した。PCRでMNV陽性と判定された60検体を含む国内37施設に由来する310検体のマウス血清および同糞便サンプルを検査対象として各検査法を比較評価した結果、PCR検査はMNV感染初期の検出に優れ、PCR検査と各抗体検査は高い一致率を示した。一方、ウイルス排出が検出限界以下となった個体でも抗体検査は有効であり、その検出感度は9288%、特異性は9690%と推定され、特にMFIの検出感度の高さが実証された。2)MNV感染マウスでのウイルス動態と免疫応答の解析MNV感染マウスと同居させたBALB/cマウスでは、同居3週間後からMNV抗体陽性個体が出現し、6週間後に全個体が陽性と判定され、27週間後まで抗体価は上昇し続けた。糞便のPCR検査では、同居1週間後から27週間後まで全個体がMNV陽性と判定された。これらの成績から、本MNV株では持続感染が成立して糞便中へのウイルス排出が長期間続き、抗原刺激も持続して高い抗体価が維持されると推察された。MNVの組織分布や排出および抗体応答に影響を及ぼす宿主因子について比較解析中である。3)MNV-VP1タンパク質のPドメインを網羅する短鎖タンパク質ライブラリーの構築とエピトープ解析MNV-VP1のPドメインおよびP1-1、P1-2、P2サブドメインを組換え抗原として作製・解析し、P2サブドメインは抗MNV血清との反応性が強いことを示唆する結果が得られた。さらに、約50100アミノ酸配列からなるPドメインの部分重複ライブラリーを構築し、抗体認識エピトープをマッピング中である。マウスノロウイルス(MNV)の主要構造タンパク質であるカプシドタンパク質(VP1)の抗原性および免疫原性を解析し、VP1の各領域に対して誘導された抗体がノロウイルス感染阻止に有効であるかの解明を試みた。1)VP1の抗原性解析:His-tag化したVP1-full component、VP1-Pドメイン、VP1-P2サブドメインを組換えタンパク質として大腸菌を用いた発現系で作製した。MNV実験感染マウス血清の各組換え抗原に対する反応性をimmunoblot法で解析した結果、VP1-full componentとの反応性が強く、PおよびP2との反応性はVP1抗原よりも弱いことが明らかになった。2)VP1の免疫原性解析:PおよびP2の抗原性がimmunoblot解析に反映されない可能性も予想されるため、VP1-full component、Pドメイン、P2サブドメインをICRマウスに免疫し、各組換えタンパク質の免疫原性を解析した。免疫は40μgの各抗原をFreund's incomplete adjuvantとの乳剤とし、皮下接種を3回繰り返した。免疫後のマウスから採取した血清中抗体のMNVに対する反応性を、細胞培養系で増殖・精製したMNVを抗原とするELISA法で測定した。その結果、P2が最も強力な抗MNV抗体誘導能を有することが明らかになった。3)VP1による感染阻止効果の解析:MNV-UT株由来の組換えタンパク質を用いてICRマウスに抗体誘導し、MNV-JI10株に対する感染阻止効果を検討した。両株のVP-1タンパク質は97%のアミノ酸一致率であり、MNV分離株間では比較的一致率の高い関係にある。高力価の抗MNV抗体を産生したP2免疫群でMNV感染後のウイルス検出時期が遅延する傾向はみられたが、非免疫対照群と比較して有意な感染率低減効果は認められなかった。1)自然感染マウスにおけるMNV検査法の評価: MNV陽性8施設のマウス148匹を用いた解析の結果、各検査法の検出感度は、PCRが87%、IFAが90%、ELISAが88%、MFIが91%とほぼ同レベルであった。

一方、MNV陰性29施設のマウス162匹を用いて評価した特異性は、PCRとIFAが100%、ELISAが96%、MFIが90%であり、MFIは感度が高く、ELISAは特異性に優れていた。以上の結果、組換えVP1抗原を用いたELISAやMFIでスクリーニングし、IFAで確認するMNV血清検査法の実用性が明らかになった。2)実験感染マウスでのウイルス動態と免疫応答の解析: MNV同居感染マウスでは、同居1週目から1年後まで80%以上の個体でRT-PCR法でMNVが検出された。一方、MFI法による抗体検査では同居3週目から抗体陽性例が検出され始め、12週後に陽性率が100%に達し、1年後も全例で抗体価の持続がみられた。したがって、MNV感染マウスでは糞便中へのウイルス排出が1年以上続いて長期に感染源となり、その間も高い血中抗体価を持続することが確認された。3)MNV-VP1タンパク質のPドメインおよびPサブドメインの構築と機能解析: MNVのVP1タンパク質およびVP1のPドメイン、P1-1、P1-2、P2の各サブドメインをGST融合タンパク質として大腸菌で作製し、MNV感染マウス血清との反応性を解析した。PドメインとP2サブドメインで抗MNV抗体との反応性が認められるものの、VP1 full component抗原の反応性が強く、融合タンパク質での抗原性の立体障害や立体構造変化の影響が推察された。His-tag化したPドメインと各サブドメインの作製、ならびにマウスを用いたin vivoでの免疫原性、in vitroとin vivoでの感染阻止効果の解析を継続中である。MNV感染検出系の確立とバリデーションは予定どおり完了し、MNV感染症のモニタリング法としても実用化可能になった。MNV体内動態と免疫応答の解析については、持続感染の状況を含め経時的動態が明らかとなり、宿主因子(系統差、雌雄差、週齢差)の影響をさらに検討する段階にある。Pドメインおよびサブドメインの組換えタンパク質の構築と反応性の解析もほぼ順調に完了し、詳細なマッピングの段階に進んでいる。25年度が最終年度であるため、記入しない。MNV感染検査法は、組換え抗原でのスクリーニング系とIFAによる確認検査系を含めて整備を完了し、MNV感染症のモニタリング法として実用化に成功した。MNV体内動態と免疫応答の解析については、持続感染の成立を含め長期的動態が明らかとなり、血中抗体と局所抗体の役割を検討する段階にある。Pドメインおよびサブドメインの組換えタンパク質の構築は、発現ベクターやtagの影響を検討するために追加実験が必要となったが、最終年度に向けてin vitroとin vivoレベルで各ドメイン、サブドメインの機能解析が開始できる進捗状況となった。MNVのVP1タンパク質のPドメイン部分領域を用いたELISA系によって、MNV感染マウス血清との反応性クローンの選別を進めてマウス抗体が認識するエピトープの詳細なマッピングを行うことにより、Pドメイン中の免疫応答・感染防御上重要な抗原領域を同定する。さらに、完全長Pドメインのdimerからウイルス粒子様のP粒子を形成させ、P粒子のMNVレセプター結合能やin vitroでのMNV増殖抑制効果を調べることで、Pドメインの機能解析へと研究を展開させる計画である。MNV VP1タンパク質のPドメインおよびPサブドメインについて、MNV感染マウス血清との反応性マッピング、マウスに対するin vivoでの免疫原性の解析を継続して進め、免疫応答・感染防御上重要な抗原領域を同定する。
パーコレーション過程を考慮した複合材料の機能性とその普遍性

より現実的なパーコレーションモデルの構築のために、格子振動エネルギー、構成元素の組成依存性を、各々シミュレーションと実験により検討した。本年度は、はじめに格子モデルを用いたシミュレーションを行い、変態に対する格子振動エネルギーの効果について検討を行った。本計算は、従来行われてきた極めて均質性の高いモデル計算と比較して、より現実的な系に対するパーコレーションモデルを構築するために必要不可欠な検証である。そのため、これまでの一連の研究で開発した「ポテンシャル繰り込み法」により、有限温度における格子振動の自由エネルギーを考慮した計算状態図作製を行った。計算状態図のプロトタイプとしても知られているCu-Au系について、科学量論組成からはずれた組成範囲についても相変態温度を評価を行った。その結果、ポテンシャル繰り込みを行わない場合と比較して、変態温度が高精度で実験状態図と一致することを示した。つまり、従来の手法(古典分子動力学法)と比較しても短時間のシミュレーションで、高精度の結果が得られる事を示した。現在は、これを踏まえて、TiおよびTi合金系の無拡散変態(マルテンサイト変態)についてプログラムの拡張を行っているところであるが、最終的な結果が得られるまでには至っていない。一方、実験の立場からは、Ti-Nb、およびTi-Nb-Sn合金を取り上げ、無拡散変態の例としてマルテンサイト変態に注目し、その形態に及ぼす構成元素の組成依存性について検討を行った。添加元素であるNbについては517at.%まで、Snについては08at.%まで各々変化させた合金をアーク溶解炉を用いて作製した。適切な熱処理を施し圧延した試料を用いて、光学顕微鏡観察、結晶構造の同定、変態点の測定を行った。その結果、添加元素が比較的低濃度側においては、α'相、高濃度側においてはβ相を示し、その中間の濃度範囲において実用的と言われるα"相を生成する事が示された。これらの結果については、より高精度で評価する必要がある。現在はマルテンサイト変態の形態に及ぼす格子振動エネルギーの異方性について検討を行っている。本研究ではこれまでに、異なる二つの粒径が存在する場合のサイトパーコレーションモデルについていくつかの静的な臨界指数とフラクタル次元を詳細に求め、本モデルが「弱いユニバーサリティ」であることを示したが、本結果についての投稿論文を準備している最中である。また、本モデルについての動的な性質を評価するためのプログラムコードを開発中である。また今年度は、本モデルで使用する物性値を定量的に決定するための計算手法について考察を行った。実在する系の物性値を格子モデルシミュレーションで評価するためには、はじめに格子モデルの欠点(エントロピーの過小評価、歪みエネルギーの無視等の問題)を改善することが必要である。そのため今回は独自開発のポテンシャル繰り込み法を用いた。これは連続系で定義されている経験的ポテンシャルを、系の分配関数を変えずに離散系にマッピングする手法である。本研究では副格子分割の手法を用いて、格子モデルで使用するポテンシャルを評価した。はじめに本手法の妥当性を示すため、規則不規則変態を示す二元系合金のプロトタイプであるCuAu系について幾つかの物性値、および状態図を求めた。その結果、本手法が上述の格子モデルの欠点を改善し、実験値を再現するに妥当であるという結論を得た。本計算結果については3月末の日本金属学会春季大会において発表予定である。
大卒女性の教育効果とキャリア形成に関する実証分析

従来の転職研究は、「人的つながり」による転職が、いかに効果的な結果をもたらすかを解き明かすことが中心であった。しかしながら、「人的つながり」はavailabilityに限界があり、様々な属性を持つ転職希望者に対応するための政策変数とは考えにくい。そのため、公的機関としての役割が確立されている「公共職業安定所」、今後発展が期待される「民間職業紹介所」、さらに利用が極めて容易な「求人広告」の3種類の転職媒介機関を取り上げ、まず事例調査(10機関)を通じてそれぞれのマッチング機能を比較検討したところ、「民間職業紹介所」「公共職業安定所」「求人広告」の順に高い機能を持ち、さらに、昨年度実施した「阪神地区公立高等学校出身者のキャリア形成に関する調査」を通じて得た30歳代の転職経験者のデータから、「求人広告」による転職が他と比較して満足度を低めているものの、前二者による転職の満足度には顕著な差が見られないという結果を得た。これは、転職希望者の属性等による転職媒介機関の利用に、ある種の効率的な棲み分けがなされている実態を示唆するものであり、性別差が強く表出している。同じく昨年度より並行して進めている「創業者のキャリアと経営資源確保に関する調査」でも、転職の一形態である「創業」に着目した場合、創業者の属性やキャリアによって経営資源を確保できるか否かに無視できない格差が生じており、ここでも性別差を意識させられる。いずれも学会、研究会報告を終えつつあるため、学術論文として取り纏めることを急ぎたい。また、転職経験者だけでなく、より多様な転職希望者を対象に、転職経路、その成否、転職先の情報までを統合して扱うことを喫緊の課題として認識しており、今後の研究展開に一層の充実と広がりが見込まれる点にも期待できる。本年度は、申請者が平成1112年度科学研究費補助金奨励研究(A)「新卒労働市場における大学教育の効果に関する実証分析」(課題番号:11730037)を通じて得た知見に基づく雑誌論文を公表した。その内容を改めて吟味し、現時点ではサンプル数不足のために実態が把握できていない大卒女性の教育効果と社会におけるキャリア形成との関連性を明らかにするべく、先行調査・研究の整理を踏まえた上で、第一段階として共学大学出身女性を対象とする調査票調査実施に向けての準備を行った。1先行調査・研究に関するサーベイ女性の職業、キャリア意識、就業行動、あるいは教育効果に関する先行調査・研究を可能な限りサーベイし、論点の整理と課題設定に努めた。これらを調査票作成からモデルビルディング、分析手法に至るまでの検討材料としている。2共学大学出身女性に対する調査票調査に向けて大学入試の受験科目による効果を検証するために、私立大学文科系学部出身者を中心に調査対象者のサンプリングする。サンプル数は、1500サンプル×3大学=4500サンプルを予定しており、調査対象大学の選定と協力要請(同窓会等からの宛名ラベルの入手)を順次進めている。3パイロット調査上記の調査票調査に対するパイロット調査の一環として、就職活動を終えた私立大学(女子大学を含む)文科系学部4回生女子15名を対象とし、授けられる教育(特に共学校か女子校か)や親(特に母親)のあり方によって、子供(娘)の働くことに関する考え方に差異が生じているか否かという論点をを中心にヒアリング調査を実施した。また、ケーススタディとして、近年注目を集めているNPOセクターで働く高学歴女性を取り上げることを構想しており、NPOセクターをフィールドとする他調査を通じて、その可能性を模索している。本年度は、申請者が平成1112年度科学研究費補助金奨励研究(A)「新卒労働市場における大学教育の効果に関する実証分析」(課題番号:11730037)を通じて得た知見に基づく雑誌論文を継続的に公表すると共に、研究課題に基づく新たな調査票調査を実施した。「阪神地区公立高等学校出身者のキャリア形成に関する調査」は、学卒後一定期間を経過し、ある程度の就業経験を得て、キャリア形成を強く意識するようになった30歳代を対象に、個人のキャリアと転職時に利用した方法・媒体の現状、および今後の転職意識を明らかにすることを目的としている。その際、キャリアの多様化について、特に「雇用の受け皿」としての期待が高まっているNPOに注目し、NPOでの活動経験や保有するイメージを問うことで、一般に人々はNPOをどのようにとらえているのか、またNPO活動はキャリア形成の一貫として位置づけられ得るのかを検証することを試みた点が、本調査の貢献の一つとして挙げられる。その結果、転職に関しては、例えば子どもを持つ既婚女性は、「勤務地」や「労働時問・休日数」等を考慮し、無駄な費用をかけないために「新聞・チラシ」を利用することが多い等、個人の基本属性によって利用する方法・媒体、重視する項目に差異が生じていることが分かった。今後、誰が、どのような方法・媒体を通じてこれらの情報を入手し、それがどのような結果をもたらしているのかを計量的に分析することで、雇用流動化時代に対応した転職市場における最適なマッチングについて、特に方法・媒体面から考察したい。NPOに関しては、マスメディアからの広く浅い情報接触による特定のイメージ形成が懸念されることから、NPOに対するイメージやNPO活動への参加の意思を決定する要因をより厳密に検討するために、個人のキャリアの差異を加味したモデルを構築し、計量的に分析する必要がある。その推定を通じて、NPOに対する特定のイメージ形成要因や、それがNPO活動への参加の意思決定に結びついているかどうか、また、それは主に個人のキャリアと情報の入手経路・イメージのどちらに起因しているのか等を明らかにし、NPO、行政、教育機関等が、今後どのようなスタンスで、どのように働きかけていくべきかについて、一定の方向性を見出したい。

従来の転職研究は、「人的つながり」による転職が、いかに効果的な結果をもたらすかを解き明かすことが中心であった。しかしながら、「人的つながり」はavailabilityに限界があり、様々な属性を持つ転職希望者に対応するための政策変数とは考えにくい。そのため、公的機関としての役割が確立されている「公共職業安定所」、今後発展が期待される「民間職業紹介所」、さらに利用が極めて容易な「求人広告」の3種類の転職媒介機関を取り上げ、まず事例調査(10機関)を通じてそれぞれのマッチング機能を比較検討したところ、「民間職業紹介所」「公共職業安定所」「求人広告」の順に高い機能を持ち、さらに、昨年度実施した「阪神地区公立高等学校出身者のキャリア形成に関する調査」を通じて得た30歳代の転職経験者のデータから、「求人広告」による転職が他と比較して満足度を低めているものの、前二者による転職の満足度には顕著な差が見られないという結果を得た。これは、転職希望者の属性等による転職媒介機関の利用に、ある種の効率的な棲み分けがなされている実態を示唆するものであり、性別差が強く表出している。同じく昨年度より並行して進めている「創業者のキャリアと経営資源確保に関する調査」でも、転職の一形態である「創業」に着目した場合、創業者の属性やキャリアによって経営資源を確保できるか否かに無視できない格差が生じており、ここでも性別差を意識させられる。いずれも学会、研究会報告を終えつつあるため、学術論文として取り纏めることを急ぎたい。また、転職経験者だけでなく、より多様な転職希望者を対象に、転職経路、その成否、転職先の情報までを統合して扱うことを喫緊の課題として認識しており、今後の研究展開に一層の充実と広がりが見込まれる点にも期待できる。
腹膜播種における腹腔内癌幹細胞の同定

CD90陽性の腹腔内間葉系幹細胞は腹膜局所における線維化や免疫抑制を介して癌細胞の生育に好都合な微小環境を提供することによって腹膜播種の成立を促進する働きを有しており、この腹腔内間葉系幹細胞は、播種における環境因子として癌の幹性と密接な関連を有していることが推測された。また、フローサイトメトリーを用いた腹腔内遊離細胞中のCD326陽性細胞の算定は「生きた」状態の腹腔内遊離癌細胞量や播種病変の活動性を良く反映し、播種患者の予後や化療に対する効果を判定する上で極めて臨床的有用性の高いバイオマーカーになる。胃癌患者の癌性腹水/洗浄細胞液を採取、遊離細胞を回収し、Type I collagen-coated plate上で培養、付着細胞群の機能を解析した。胃癌患者腹腔内にはCD45(-)CD90(+)細胞が少数存在し、その比率は播種患者で高かった(0.010.45%,vs 0.046.81%, p=0.001)。このphenotypeを持つ細胞は高い運動能と増殖能を有し、23週間の培養にて大多数を占めるようになった。本細胞は通常培養では炎症性中皮細胞様の形態を示すが、至適培養条件下にて脂肪細胞、骨芽細胞などに分化し、T細胞の増殖を強く抑制することから、腹腔内に常在する間葉系幹細胞(Intraperitoneal mesenchymal stem cell,以下p-MSC)として機能している可能性が推測された。さらに、p-MSCはTGF-β刺激にてmyofibroblast様形態を示し、Collagen,α-SMA, FAP-αを強く発現、胃癌細胞株MKN45と共にnude mouse腹腔内に注入すると、播種の成立を増強した。組織所見では、蛍光標識した多数のp-MSCが播種巣内に取り込まれ、主に間質の線維組織に分布し、コラーゲンを産生する事が確認された。線維化阻害剤tranilast (>100μM)やTyrosine kinase Inhibitor, dasatinib (>10μM)はp-MSCの増殖を強く抑制し、MKN45は抑制しなかったが、In vivoで経口投与(dasatinib;25mg/Kg, 14日継続)すると、播種の成立を有意に抑制し、播種巣内線維成分は対照群と比べ明らかに減少していた。胃癌患者の腹水、腹腔洗浄液を回収し、細胞を白血球マーカーCD45,癌細胞に特異的なマーカーCD326に対するモノクローナル抗体で染色し、FACSを用いて、その個数を算定し、腹腔内遊離癌細胞の相対的頻度をCD326(+)細胞/ CD45(+)細胞の比率(tumor cell/leukocyte ratio:TLR)にてとして測定した。手術時の検体では、腹膜播種を有する38症例のTLRは腹膜播種のない場合(28例)と比べて有意に高値であった。(中央値=4.85 (0-751.37)vs 0 (0-2.14), p<0.001)。また、腹腔内化学療法を施行した患者においては、TLRは化学療法後で全例低下し、その変化は洗浄細胞診の結果よりも明らかの鋭敏であった。胃癌患者の腹水、腹腔洗浄液中の細胞から、MACSを用いてCD326(+)癌細胞分画を分離し、培養すると、12週間で繊維芽細胞状に形態変化し、CD326は消失したがcytokeratinは変化なく、間葉系マーカーのCD90が発現していた。この経過はCD14(+)マクロファージを除去すると認められなくなった。ヒト腹腔内、特に腹膜播種患者におけるの遊離細胞の同定が出来た。また、CD90が幹細胞のマーカーになりうる可能性が示唆された。前年度の継続。CD90陽性細胞の幹性を検証する。前年度の継続。CD90陽性細胞と陰性細胞を分離、In vivoで幹細胞性を検証する。
頭蓋底病変に対する至適な外科的アプローチ法と再建法の選択のための解剖学的研究

解剖学的検索と臨床例の積み重ねから,我々が開発してきた頭蓋底腫瘍に対する新しい術式である片側および両側Faicial dismasking法,さらにNasal downward swing法の術野展開の限界について明らかにし明確な手術適応を決定することができるようになった.一方,副咽頭間隙の解剖学的研究と副咽頭間隙腫瘍と咀嚼筋や内頸動脈の位置関係に関する画像所見の集積により,副咽頭間隙に発生した腫瘍の起源を推測することができ,さらに進展様式を予測できるようになった.これらの成果は,副咽頭間隙腫瘍の手術適応,術式の選択に有用な指針を与えるものと考える.解剖学的検索と臨床例の積み重ねから,我々が開発してきた頭蓋底腫瘍に対する新しい術式である片側および両側Faicial dismasking法,さらにNasal downward swing法の術野展開の限界について明らかにし明確な手術適応を決定することができるようになった.一方,副咽頭間隙の解剖学的研究と副咽頭間隙腫瘍と咀嚼筋や内頸動脈の位置関係に関する画像所見の集積により,副咽頭間隙に発生した腫瘍の起源を推測することができ,さらに進展様式を予測できるようになった.これらの成果は,副咽頭間隙腫瘍の手術適応,術式の選択に有用な指針を与えるものと考える.1.これまで解剖学的研究を基に、形態的・機能的障害の少ない頭蓋底への様々なアプローチ法を開発してきた。今年度も、以前に報告した新手術法であるFacial dismaskingflapアプローチに加え、さらに鼻骨を顔面皮膚から遊離せず血流を保ったまま下方に翻転するNasal downwardswing法を開発した。この術式により顔面皮膚に大きな切開を加えず、また鼻骨を犠牲にすることなく鼻腔を広く展開することができるようになった。この術式の大きな利点は顔面に大きな瘢痕を形成せずさらに顔面の変形もほとんど生じない上、従来の術式に比べ飛躍的に大きな術野を得ることができることである。この術式の適応は鼻腔全体を占めるような大きな腫瘍であり、さらに頭蓋底・眼窩進展例にも適用できる。今後さらに解剖学研究を進め、顔面皮膚を大きく切開せずに顔面全体を広く展開できる術式を開発していく予定である。2.3次元CT実体モデルを作成し、頭蓋底手術支援に応用した。これにより、術前の手術シミュレーション、本人および家族への説明、手術に携わる複数科の医師の手術情報の共有化さらに手術中の術野展開の再確認などが容易に行えるようになった。解剖学的検索と臨床例の積み重ねから、我々が開発してきた頭蓋底腫瘍に対する新しい術式である片側および両側Faicial dismasking法、さらにNasal downward swing法の術野展開の限界について明らかにし明確な手術適応を決定することができるようになった。さらに、従来は脳神経外科の術式であったOrbito-zygomatic approachおよびTranszygomaticapproachについても解剖学的検討から側頭下窩へのアプローチ法として臨床応用することができ、それらの術式の選択基準を設けることができるようになった。これらの新知見により、過剰な術野の展開を避けることができ手術の低侵襲化、様々な術後合併症の軽減を図ることができるようになった。今後これらの成果は頭蓋底手術の標準化に大きく貢献すると考えられる。一方、副咽頭間隙の解剖学的研究と副咽頭間隙腫瘍と咀嚼筋や内頸動脈の位置関係に関する画像所見の集積により、副咽頭間隙に発生した腫瘍の起源を推測することができ、さらに進展様式を予測できるようになった。これらの成果は、副咽頭間隙腫瘍の手術適応、術式の選択に有用な指針を与えるものと考える。さらに、頸動脈管の走行に関する側頭骨の解剖学的検討から、側頭骨悪性腫瘍に対する側頭骨亜全摘術のより安全な術式を確立することができた。これにより、予後の不良であった側頭骨悪性腫瘍に対する治療成績の向上が期待できると考える。
重症呼吸不全患者の気道および血液検体を用いた多角的病態解明および新規治療法開発

呼吸不全の原因となる微生物は、細菌、ウイルス、真菌など多岐に渡る。従来の培養検査などでは病原微生物の検出に至らない症例が多く認められる。また、嫌気性菌は培養困難であり、一定量の嫌気性菌が存在しても培養検査で検出できない可能性がある。次世代シークエンス手法を用いた解析では、培養検査では検出できない嫌気性菌を検出可能であった報告もあり、次世代シークエンス手法は病原体検出目的のため、有用な手段であることが示唆された。具体的な手法としては、細菌は16srRNA遺伝子内に可変領域が存在している。その部分の遺伝子配列を網羅的に解析することで細菌の特定が可能となる。ウイルスについてはDNA・RNAの遺伝子配列を解析する。本研究では次世代シークエンス技術を用いた、原因微生物の検索が目的であった。検体の集積については2017年度を通じて着実に集積することが可能であり、目標の検体数はほぼ達成された。2018年度では収集した血液、肺胞洗浄液検体を用い、細菌の次世代シークエンス法による網羅的解析を行う手法を確立した。一方で、ウイルスに関しては、固有領域がなく、次世代シークエンス法による網羅的解析を模索したが、方法の確立は困難であった。さらにARDS患者において、肺胞洗浄液中の細菌のメタゲノム解析を行ったが、病原微生物の特定は困難であった。細菌の次世代シークエンス法による網羅的解析を行う手法を確立した一方で、ウイルスに関しては、固有領域がなく、次世代シークエンス法による網羅的解析を模索したが、方法の確立は困難であったことが原因として考えられる。ウイルスの次世代シークエンス法による網羅的解析は困難であった。しかしARDS発症に消化管の細菌の関与が疑われているため、今後は肺胞洗浄液と便の細菌叢を解析し、ARDSと消化管細菌叢との関連性を検討していく。次世代シークエンス手法を用いた解析では、培養検査では検出できない嫌気性菌を検出可能であった報告もあり、次世代シークエンス手法は病原体検出目的のため、有用な手段であることが示唆される。具体的な手法としては、細菌は16s rRNA遺伝子内に可変領域が存在している。本研究では次世代シークエンス技術を用いた、原因微生物の検索を目的とする。検体の集積については、本年を通じて着実に集積することが可能であった。目標の検体数はほぼ達成された。現在までに、肺胞洗浄液からの細菌DNAの抽出、細菌DNAを用いた次世代シークエンス法による気道細菌の解析方法を確立した。患者の臨床データを参照に、喀痰培養検査結果と一致する結果が得られることを確認した。集積した全検体の解析は全て完了はしていないため、今後の継続した解析が必要である。また、ウイルスに関しては、ウイルスDNA・RNAの抽出することが可能であった。しかし、次世代シークエンスでの解析は可変領域がないため、その方法を条件検討している。細菌DNAを用いた次世代シークエンスでは、呼吸不全の原因となりうる、DNA量の多い細菌の特定はできていない。その理由として、検体の集積は可能であったが、集積した検体全てを解析できていないことによると考えられる。また、ウイルスの次世代シークエンスについては、核酸の抽出は可能であったが、メタゲノム解析方法は困難な点が多く、方法の確立はできていない.呼吸不全の原因となる微生物は、細菌、ウイルス、真菌など多岐に渡る。細菌DNAについては、前年度で集積した検体を用いて、細菌叢解析を継続して行う。

ウイルスのメタゲノム解析については、手法の確立を目指すべく条件検討を引き続き行う。ウイルスの次世代シークエンス法による網羅的解析は困難であった。しかしARDS発症に消化管の細菌の関与が疑われているため、今後は肺胞洗浄液と便の細菌叢を解析し、ARDSと消化管細菌叢との関連性を検討していく。集積した検体すべてを解析に回すことができなかったため、解析にかかると見込んでいた費用を、次年度に使用させていただき、残りの検体で次世代シークエンス解析を行う。ウイルスの次世代シークエンス法による網羅的解析は困難であり、ウイルス解析にかかると見込んでいた費用に余りが生じた。今後は肺胞洗浄液と便の細菌叢を解析し、ARDSと消化管細菌叢との関連性を検討していく予定であり、そちらの費用に使用させて頂きたい。
多角的視点で見る「顧客行動」と「時間」の関連性の研究

消費者の商品購買行動に対して「時間圧力」が顧客行動に与える影響について、多角視点から明らかにすること課題として、研究を行っている。本年度はこれらの課題を明らかにするため、2つの方向性で研究を実施し学会や研究会で論文化している。まず、消費者の購買行動に影響を与える時間要因の1つである「時間圧力」を扱った既存研究を詳細にレビューし、英語論文としてジャーナルに投稿し、採択されている。レビューを行った結果、ほとんどの既存研究では、A)既存研究では、限られた時間内で意思決定を行わなければならないとストレスである「時間圧力」と、何らかの主体が消費者に対して時間制限をかけていることを表す「時間制約」が多くの既存研究で明確に区分されず、混同されているというB)数秒から数分単位での「時間制約」の影響を論じており、数日数週間といった「時間制約」における「時間圧力」の影響について論じていないことの2点が問題点として明らかになった。2つ目の研究は、1つめのレビュー研究における問題点Aに着目した研究である。この研究では、時間制約の有無と強さを操作した上で、消費者に電気ケトルの品質を評価と感じた時間圧力を測定するという実験を通して、「時間制約」と「時間圧力」が消費者の商品の品質評価について与える影響について、定量分析から論じている。結果として、時間制約は消費者の品質評価に直接影響は与えておらず、時間圧力を介して間接的に影響を与えていることが明らかとなっている。この結果を纏め、研究ノートとしてジャーナルに投稿し、採用されている。現在は、1つ目の研究で明らかになった2つ目の問題点について、研究を進めている最中である。具体的には、「限定」のラベルが与える影響と「時間圧力」の影響の関連性について研究している。この研究に関しては、2018年6月に学会発表を行い、論文化する予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。消費者の商品購買行動に対して「時間圧力」を含めた複数の「時間」概念が顧客行動に与える影響について、顧客ごと、商品ごと、端末ごとの差異を明らかにすることを目的として、今年度3つの研究を実施し、学会や研究会で報告しています。まず1つ目の研究の前提として、過去に制限時間が課せられた状態の消費者の購買行動を分析し、消費者ごとの差異を明らかにする研究を行い、学会誌に投稿している。その結果、エディターから生存時間解析を用いた分析モデルを開発したほうが良いという指摘を受けました。この研究は顧客ごとの差異を考慮した生存時間解析モデルをスーパーマーケットの店舗で購買する消費者を分析対象とし、各消費者の「揚物惣菜」「牛乳」を含む8つの商品カテゴリにおける購買間隔を分析し、結果を日本マーケティング・サイエンス学会に報告しています。消費者ごと、商品ごとの差異を明らかにするに当たって、オンライン購買に関する消費者調査データを用いて、「該当商品カテゴリを購買するかどうか」と「該当商品カテゴリをオンライン購買するかどうか」という行動に対して、消費者属性と商品カテゴリ属性が与える影響をモデル化して、分析をおこなった。その結果、商品カテゴリ属性については、実物財かつ快楽的な商品であれば、オンライン購買を行いやすいということが明らかしている。最後に、「時間的距離」という概念に着目し、時間的距離の違いが選好の逆転が時系列の変化に併せてどのように変化するかに着目した研究である。インターネット調査を用いて収集した、当選金額は高いが当選確率は低いロトAと当選金額は低いが当選確率が高いロトBの選択問題の回答データを用いて分析を行った結果、時間割引率が双曲割引に従うと仮定したモデルが最も当てはまりが良いことが明らかし、日本マーケティング・サイエンス学会で報告しています。本研究課題に関して、進捗状況はやや遅れていると判断します。本研究課題は、時間の概念の中でも「時間圧力」と「時間的距離」の2つに着目して顧客ごとの差異、商品ごとの差異の影響を明らかにすることを目的としています。まず「時間圧力」に着目した研究については、制限時間が課せられた状態の消費者の購買記録を分析して結果を学会誌に投稿したが、分析モデルの再考を指摘されております。現段階では、分析モデルを再検討し、顧客ごとの差異を考慮した生存時間解析のモデルの構築が終わったばかりある。また「時間的距離」という概念に着目した研究を並行して進めている点も進捗が遅れている要因の1つである。「時間的距離」の概念は、「時間圧力」とはまた違った角度から、消費者の購買行動に影響を与えている要因である。こちらに関しては、受入研究員でもある東京大学阿部誠先生と、早稲田大学商学部助手の金子先生との共同研究として進めているものである。現段階では時間的距離の長さで消費者の選択の逆転が起こる現象が、時間割引率を導入した双曲割引型のモデルを使うことで最も説明しやすいことを明らかにして、日本マーケティング・サイエンス学会で報告させていただいている。

レビューを行った結果、ほとんどの既存研究では、A)既存研究では、限られた時間内で意思決定を行わなければならないとストレスである「時間圧力」と、何らかの主体が消費者に対して時間制限をかけていることを表す「時間制約」が多くの既存研究で明確に区分されず、混同されているというB)数秒から数分単位での「時間制約」の影響を論じており、数日数週間といった「時間制約」における「時間圧力」の影響について論じていないことの2点が問題点として明らかになった。2つ目の研究は、1つめのレビュー研究における問題点Aに着目した研究である。この研究では、時間制約の有無と強さを操作した上で、消費者に電気ケトルの品質を評価と感じた時間圧力を測定するという実験を通して、「時間制約」と「時間圧力」が消費者の商品の品質評価について与える影響について、定量分析から論じている。結果として、時間制約は消費者の品質評価に直接影響は与えておらず、時間圧力を介して間接的に影響を与えていることが明らかとなっている。この結果を纏め、研究ノートとしてジャーナルに投稿し、採用されている。現在は、1つ目の研究で明らかになった2つ目の問題点について、研究を進めている最中である。具体的には、「限定」のラベルが与える影響と「時間圧力」の影響の関連性について研究している。この研究に関しては、2018年6月に学会発表を行い、論文化する予定である。今後の研究の推進方策は2つある。1つ目は現在進めている、制限時間が課せられた状態の消費者の購買記録を分析して、消費者ごとの差異、商品ごとの差異を明らかにする研究を本年度中に学会誌投稿、採択まで進める点である。昨年度までに、この研究で用いる新たに分析モデルの構築は完了しているため、購買記録の分析を行い、消費者ごとの差異と商品ごとの差異をしっかりと明らかにしていきたいと考えている。2つ目は、端末ごとの差異を明らかにするという課題を取り下げ、「時間的距離」の概念を取り上げて顧客ごとの差異、商品ごとの差異を明らかにしていきたいと考えている。研究計画書には、本年度は「端末」と「時間」に関する統計的分析を実施することが盛り込まれており、データも収集済みである。しかしながら、基礎分析の段階で「端末」と「時間」の関連がほぼ見られていない。そのため計画を修正し、受入研究員でもある東京大学阿部誠先生らとの共同研究で進めている「時間的距離」に着目した研究で顧客ごとの差異、商品ごとの差異を明らかにしくように計画を変更していく予定である。こちらの進捗度合も50%ほどで、時間的距離の長さで消費者の選択の逆転が起こる現象が、時間割引率を導入した双曲割引型のモデルが最も当てはまりが良いことまでがわかっている。今後は、商品属性ごとの時間割引率が異なることを仮定したモデルを開発し、今年度中には学会報告と投稿を目指そうと考えている。29年度が最終年度であるため、記入しない。
CAD/CAMを応用し口腔内印象をせずにクラウンを製作する方法

○研究目的歯科医療で補綴物の製作には石膏模型が必須であり、石膏模型を製作するには口腔内を印象する必要がある。印象の多くには患者の唾液や血液が付着している場合が多く、滅菌操作を行っても印象から製作した模型にも唾液・血液が残存し、歯科技工士をはじめとする歯科医療従事者らに感染の危険性がある。また滅菌による印象や模型の変形も臨床的には無視できない。申請者は感染源と考えられる印象を用いない歯科技工方法として、マイクロCT画像から支台歯の3次元形状を抽出しCAD/CAMによってクラウンを製作する方法を開発した。本申請は、本方法の臨床応用を目指して、臨床形態支台歯への応用、クラウン精度の向上等を目指すものである。今回の研究期間では上記の問題点のうち、CT画像からデータ変換時に生じる誤差の原因と改良、臨床的形状を模した模型によ隆画像抽出方法論と適合制度について精査し、その対応方法を確立することにある。○研究方法上顎の左片側歯列を用いCT画像計測を行った。CT画像はコムスキャンテクノ社製のScan Xmate-A100S40を使用し、撮影したCT画像はSTLデータに変換した。STLデータをGC社製CAD/CAM・GN-1用のCADデータに変換し、同社GN-1を用いてコンポジット製クラウンを製作した。クラウンを支台歯に装着し断面の間隙を測定した.間隙測定は倒立型金属顕微鏡(PGM-3オリンパス社製)を使用した。○研究成果マイクロCT画像からCAD/CAM用データを製作し、CAD/CAMクラウンを製作できることが示された。データの変換における影響により大きな間隙が生じた部分もあるが、解像度とSTLデータの向上により十分に調整が可能である。また隣在歯接触点も口腔内の調整が可能な範囲であり、臨床で使用可能であることが示された。今後適切なセメントスペーサーの付与や、CT画像データの変換方法を改善により、高精度なクラウンが製作できる可能性が示された。
中心市街地における近隣型商店街の活性化:サンフランシスコ市の事例研究

本研究は、中心市街地の近隣型商店街が再生する条件について、アメリカのサンフランシスコ市の代表的な近隣型商店街に関する事例研究を行うことを通じて明らかにした。二次データの収集と分析に加えて、元サンフランシスコ市市長ArtAgnos氏を初めとする15名の利害関係者に対するインタビュー調査を行った。明らかになったのは、次の3つの条件である。すなわち、(1)商店街のみならず近隣住宅地を含む地区全体の再生を図ること、(2)不動産価格が高止まりせず革新的な商人が商店街に新規参入できること、および(3)不動産所有者は公的支援に依存せず商店街の環境改善のために積極的に投資することである。本研究の目的は、中心市街地における近隣型商店街の活性化メカニズムを明らかにすることにある。具体的には、アメリカのサンフランシスコ市に注目し、同市中心市街地を構成する5つの区すべてにおける代表的な近隣型商店街の再活性化に関する事例研究を行うことで、商店街の活性化プロセスを促進した主要な組織とその役割を明らかにすることを計画した。平成22年度は、5区のうちの3区について、代表的な商店街の事例研究を行った。(a)第5区のヘイト・アシュベリー(Haight Ashbury)、(b)第8区のカストロ(the Castro)、および(c)第9区のミッション(Mission)地域の3事例である。調査を通じて得られた結果は3点にまとめることができる。第1に、広域型商店街と異なり、近隣型商店街の場合、商店街の経営状況が近隣住宅地の変遷に左右される。それが故に、再活性化させるためには商店街のみならず地区全体の再生を図ることが不可欠である。第2に、衰退した近隣型商店街が再生するには、革新的な商人たちが商店街に進出し、従来と異なる店舗を構えることが不可欠である。商店街の高い不動産価格は新しい商人の参入を大きく阻害する。第3に、公的事業は呼び水の役割しか果たすことができない。地区の再生には、不動産所有者の投資と、彼らと彼らのコミュニティ組織の環境改善の努力が必要である。これらの知見は、アメリカだけではなく、日本の中心市街地近隣型商店街の再活性化にも重要な示唆を示したと考えられる。日本においては、中心市街地の割高な家賃と、一部の空き店舗所有者の低い賃貸・売却意欲は、近隣型商店街の再生を阻害する大きな要因となっている。また、商店街の再生において公的支援に対する過度の期待が商店主たちの間で抱かれている。これらの問題を解決する上で、サンフランシスコ市の再生事例から学ぶべきポイントは少なくないと思われる。本研究の目的は、中心市街地における近隣型商店街の活性化メカニズムを明らかにすることである。具体的には、活気あふれる近隣型商店街が中心市街地に数多く存在しているアメリカのサンフランシスコ市について、同市の代表的な近隣型商店街に関する事例研究を行った。二次データの収集と分析に加えて、元サンフランシスコ市市長Art Agnos氏を始め、サンフランシスコ都市計画局の職員、商店街のプロパティ・オーナー、商店主、市民活動家、サンフランシスコ州立大学の研究者など計15名の関係者に対するインタビュー調査を行った。事例研究を通じて、商店街の活性化プロセスおよび、活性化を促進した主要な組織について、次の2点を明らかにした。第1に、調査した近隣型商店街の再生では、類似したプロセスが観察された。まず、住宅街と近隣商店街の衰退により不動産価格が低下したため、安価な都市部住宅を求める人々が地区に引きつけられた。すると、こうした老朽住宅を購入した住民たちは、個人の資源を利用して住宅を修繕して、コミュニティ組織を通じて環境の改善と地区の宣伝に努めた。その結果、住宅街の環境改善と新しいタイプの住民の流入をきっかけとして、彼らを顧客とする新しいビジネスが近隣商店街に参入し、商店街は住宅街と共に再生した。第2に、再生プロセスで最も重要な役割を果たした個人・組織は、不動産所有者とそのコミュニティ組織である。一方、市当局が果たした主要な役割は、活性化事業に巨額な補助金を提供することではなく、むしろ、市の主要産業を製造業から金融・サービス業に転換させた、というマクロレベルでかつ間接的な役割である。同市の産業転換の成功によって、大量な若い専門職が市に移入した。彼らは商店街の再生を支えた主な顧客である。
軟骨形成異常疾患の病因の解明ーコラ-ゲン遺伝子異常の解析ー

1)軟骨型コラ-ゲンの1つであるIX型コラ-ゲンの合成異常を示すtransーgenic mouseの作製を試みてきた。これには軟骨組織中での特異的発現を司どることが確められているラットII型コラ-ゲン遺伝子のpromoter,enhancerを用い、これにラットIX型コラ-ゲンα1鎖、ヒトIX型コラ-ゲンα1鎖よりなるmini geneをつないだ。このmini geneは、5′側はヒト、3′側はラットのα1(IX)cDNAよりなり、中央部に欠損を有するhybrid geneで、in framcにつながっている。このconstructを約600個のマウス受精卵に注入し、43匹のF_0マウスを得た。このうち53匹が、2copy以上のtransgeneを有するtransgemic mouseであることが判明した。現在までにこれら3系統のうち2系統からF_1、F_2さらにF_3 miceを得ている。残る1系統は♀マウスであったが、不妊であったためovary transforを試みこれに成功し、現在F_1マウスを得ている。これら3系統のtransgemic mice及びその子孫において、明白な四肢短縮等の異常はない。しかしながら約15%のマウスに小眼球、角膜の脆弱性及び混濁が出現している。IX型コラ-ゲンをはじめとする軟骨型コラ-ゲンは、正常の眼でも発現することが知られており、導入したIX型コラ-ゲンα1鎖の異常発現が今回の眼の異常を引き越こしていることが強く示唆される。現在はそのメカニズム、殊に異常IX型コラ-ゲン3本鎖ヘリックス形成と、それに続く“protein suicide"による総IX型コラ-ゲン合成量低下の有無を検索中である。2)軟骨形成異常に関与しうる軟骨のminorコラ-ゲンのcDNAクロ-ニングを試みてきた。既に我々がクロ-ニングしたヒトのα1(IX)鎖、α1(XI)鎖α2(XI)鎖に続いて、V型コラ-ゲンα1鎖のcDNAクロ-ニングに初めて成功した。1.ヒト軟骨の未知のコラーゲンのcDNAクローン、続いてgenomiクローンを分離し、その構造を決定した。同時に、ヒト軟骨組織より各種コラーゲンを抽出し、そのtrypticpeptidesのアミノ酸配列との比較から、我々が分離したcDNA及びgenomicDNAが、IX型コラーゲンのα2鎖をコードすることが明らかとなった。さらにこのα2鎖の遺伝子が、先に分離したα1鎖の遺伝子と異り、軟骨でのみ発現していることを知り得た(投稿中)。2.IX型コラーゲンのcDNA及び上記XI型コラーゲンDNAプローブを用いた軟骨形成異常疾患患者のlinkageanalysisは現在続行中である。3.当初65年度に予定していたIX型コラーゲン遺伝子導入transgenicmouseの作成を既に開始した。この目的はIX型コラーゲンの合成異常を有するマウスを作成し、軟骨形成異常疾患のモデルとしようとするものである。異常IX型コラーゲン遺伝子(ラットα1(IX)cDNAの3′半分のもの)を高率よく発現させるために、ラットのII型コラーゲン遺伝子のプロモーター、エンハンサーを使用した。これらを組み合わせたDNA constructがin vitroでは高率よく発現することを確認した。さらにこのcDNAをマウス内で発現し易くするために、その上流にβーglobinのintron配列を付け加えた。現在このDNA constructのマウス受精卵へのmicroinjectionを開始している。4.ヒトIX型コラーゲンα1鎖をコードするcDNAより推測されたアミノ酸配列に従って、オリゴペプチドを合成、マウスに免疫し、15個のモノクローナル抗体クローンを得た。このうち14個のクローンはIX型コラーゲンを特異的に認識した。これらを用いて、まずヒト正常軟骨組織を染色し、その結果ヒト軟骨の細胞外マトリックスが一様に染色されることを知った。現在この抗体を用いて異常軟骨組織の検討を行っている。1.ヒト軟骨に存在するIX型コラ-ゲンα1鎖、XI型コラ-ゲンのα1鎖に続いて,XI型コラ-ゲンα2鎖をコ-ドするcDNA及びgenomicDNAを分離し、この構造を決定した(J.Biol,Chem.264:13910ー13916、1989)。現在このXI型コラ-ゲンは軟骨内でII型コラ-ゲン線維形成に関与する事が考えられるようになっており、このコラ-ゲン遺伝子の異常と軟骨形成異常との関係が、強く示唆される。2.種々の軟骨形成異常疾患々者から抽出したDNAを、我々が分離した上記の各DNAプロ-ブを用いてサザンブロット法を中心に分析してきた。軟骨形成異常疾患の1つであるSpondyloepphyseal dysplcsiaの発症がII型コラ-ゲン遺伝子の異常でおこり得ることが、つい最近明らかにされた。我々の分析でもこの疾患とII型コラ-ゲン遺伝子のlinkageが強く考えられた。しかし1つの家系列で、XI型コラ-ゲンα2鎖遺伝子が、他では見られないRFLPを示しており、これが欠失によるものか、さらにはこの疾患がII型コラ-ゲンのみならずXI型コラ-ゲンの異常でも発症しうるのかを現在検索中である。3.IX型コラ-ゲン合成異常を示すtransgenic mouseの作製を試みてきた。軟骨で発現する事が認められているratII型コラ-ゲンのpromoter,cnhancerにratIX型コラ-ゲンα1鎖cDNAの一部をつないだmini gene constructを導入した5匹のtransgenic mouseを既に得た。