hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
破骨細胞および骨芽細胞における酒石酸耐性酸性ホスファターゼの発現と構造解析

1.ウズラ骨髄骨における酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP)の発現と構造解析TRAP種間共通プライマーを作製し、産卵ウズラ(LJQ)、エストロジェンを投与して骨髄骨形成を誘導させた雄ウズラ(EJQ)、および何も投与していない雄ウズラ(JQ)の骨髄および骨髄骨より全RNAを抽出しRT-PCRを行い増幅産物の定量的解析を行った。TRAPに相当する増幅産物は、EJQからもLJQよりは少ないがTRAP増幅産物を得ることができ、JQについてはわずかしか検出することができなかった。EJQについては骨髄骨形成期にあるので骨芽細胞が多く、従って今回の結果からウズラ骨髄骨においてTRAPは破骨細胞のみならず骨芽細胞においても発現されていると考えられた。さらに、LJQおよびEJQの増幅産物を構造解析したところ既存TRAPと非常に高いホモロジーが得られた。現在、組織学的にウズラ骨髄骨切片でのTRAP発現細胞を同定するため、TRAPcDNA断片をプローブとして用いin situハイブリダイゼーション法により解析を行っている。2.骨芽細胞株におけるTRAPの発現とDNA構造解析マウス骨芽細胞株MC3T3-E1におけるTRAPの発現について1同様RT-PCRにより解析を行ったところTRAPに相当する増幅産物を得ることはできなかった。しかし、最近リンパ系細胞においてTRAPの中に構造が異なる複数のグループが存在することを示唆する報告があり、MC3T3-E1細胞における同様の可能性について検討中である。
研究大学の産学共同研究履歴を用いた成果実用化の要因分析：計画性と柔軟性の効果

本研究は、産学共同研究における研究成果の実用化促進要因を明らかにすることを目指し、産側の計画性および産学双方の柔軟性に着目した分析を行うもので、研究開始から3年目の今年までの成果は下記のようなものである。1)産学協同研究の推進環境(専門人材の組織体制、関与の度合い)については、経年変化と現状把握、また統計解析に基づく外部資源獲得に対する正の効果を検証することができた。その結果について学会発表とともに内外有識者との意見交換も行い、計画2および3の課題検討の前提を確認することができた。2)組織的な連携、単一課題に閉じない連携の効果を把握するため、当初計画していた大規模データセットについて、事例候補の1大学をより詳細・長期に分析する方針とした。この方向性をふまえ、仮説検証のため申請時の計画より、質・量両面でデータ種を増強したデータセットを構築し、仮説検証を行なった。(計画2、および3関連)。本30(2018)年度の主たる成果は、この2)のテーマの仮説・検証の結果である。具体的には、産学共同研究関係における長期的なつながりを持つことの決定要因と、研究資金の量に対するつながりの影響について、構築したデータセットを用いて回帰分析による検証を行なった。その結果、技術的な知識を提供したり、共同で論文を発表したりすることが、相手方とのより強いつながりをもたらすことを見出しました。また、注目すべき点として、研究結果の存在、あるいは結果への満足が、長期的なつながりを促進するとは限らないということも明らかになった。このような関係が定まると、その後のプロジェクトでは研究費が多少高くなる傾向はあるものの、これらの関係のプラスの効果は永続的ではないことも明らかとなり、実務への示唆に富むものでもある。理由計画に基づき各人分担をすすめるとともに、得られた成果の国際学会発表を行なった(2018年10月)。この学会は、当該分野の研究者が集まる適切なセッションでの成果発表を行えたため、内外有識者と貴重な意見交換を行えた。その結果、2019年度に予定されている書籍への掲載候補となった。企業、大学の双方から、共同研究の難しさ、特に成果の実用化の困難さが指摘されていることに注目し、本研究では、産学共同研究における研究成果の実用化促進要因を明らかにすることを目指し、産側の計画性及び産学双方の柔軟性に着目した分析を行う。初年度は、産学共同研究履歴情報を基に、契約構造の計量経済学的分析を行うための、研究代表者、分担者及び関連する有識者により分析の枠組みの検討、先行研究調査、入手可能なデータセットをふまえた仮説について検討を行った(計7回のミーティングを含む)。具体的には、1)企業側の認識把握(計画2関連)、2)研究者の認識把握(計画3関連)のための関連調査分析を行った。また、それらの結果を踏まえて導出されたリサーチクエスチョンに基づく仮説を設定し、産学共同研究の推進環境(専門人材の関与を含む)に関するデータセットを用いた検証を行った(計画1関連)。計画に基づき、各人分担を進めるとともに、調査検討項目の詳細の打ち合わせを計7回行った。その結果データセットの全体枠組み設計はほぼ完了した。また予備的データ分析から興味深い結果を得、議論の結果、第一次分析結果としてH29年度に学会発表を行うに至った。主に計画1に関するメインデータセットは取り扱うデータ量が大量であることから、実際のデータセット構築の作業に入る前に、より効率的で正確なデータセット構築を優先し各種データ項目の整合性の検討に関する詳細な調整を進めている。本研究は、産学共同研究における研究成果の実用化促進要因を明らかにすることを目指し、産側の計画性および産学双方の柔軟性に着目した分析を行うもので、初年度に続き、産学協同研究履歴情報を基に、契約構造の計量経済学的分析を行うためのデータセットの整備、仮設・検証のための検討打ち合わせ、文献調査を続けている。本29年度の実績としては、大学の経営、ガバナンス改革の必要性も増す中、企業、大学の双方から共同研究の難しさ、特に成果の実用化の困難さが指摘され、その解決の一方策として、組織的な連携、単一の研究課題に閉じない幅広い連携の価値が改めて指摘されていることを踏まえ、具体的には、1)産学協同研究の推進環境(専門人材の組織体制、関与の度合い)について経年変化と現状把握、また統計解析に基づく外部資源獲得に対する効果について検証し、一部の知見を関連学会で発表した(計画1関連)。2)組織的な連携、単一課題に閉じない連携の効果を把握するため、事例候補の1大学をより詳細・長期に分析する方向性を強め、仮説検証のためより精緻なデータセットを構築しつつある(計画2、および3関連)計画に基づき各人分担をすすめるとともに、調査検討項目の詳細打ち合わせ、分析進捗の共有と適切な仮説設定のための勉強会を計9回行った。1)産学協同研究の推進環境(専門人材の組織体制、関与の度合い)については、経年変化と現状把握、また統計解析に基づく外部資源獲得に対する正の効果を検証することができ、その結果について内外有識者との意見交換も行い、計画2および3の課題検討の前提となる理解を確認することができた。2)組織的な連携、単一課題に閉じない連携の効果を把握するため、当初計画していた大規模データセットについて、事例候補の1大学をより詳細・長期に分析する方向性を強め、仮説検証のためより精緻なデータセットが必須であるが、的確なスキルをもった者への委託することができたため、初年度の計画遅延をある程度挽回することができた。

本研究は、産学共同研究における研究成果の実用化促進要因を明らかにすることを目指し、産側の計画性および産学双方の柔軟性に着目した分析を行うもので、研究開始から3年目の今年までの成果は下記のようなものである。1)産学協同研究の推進環境(専門人材の組織体制、関与の度合い)については、経年変化と現状把握、また統計解析に基づく外部資源獲得に対する正の効果を検証することができた。その結果について学会発表とともに内外有識者との意見交換も行い、計画2および3の課題検討の前提を確認することができた。2)組織的な連携、単一課題に閉じない連携の効果を把握するため、当初計画していた大規模データセットについて、事例候補の1大学をより詳細・長期に分析する方針とした。この方向性をふまえ、仮説検証のため申請時の計画より、質・量両面でデータ種を増強したデータセットを構築し、仮説検証を行なった。(計画2、および3関連)。本30(2018)年度の主たる成果は、この2)のテーマの仮説・検証の結果である。具体的には、産学共同研究関係における長期的なつながりを持つことの決定要因と、研究資金の量に対するつながりの影響について、構築したデータセットを用いて回帰分析による検証を行なった。その結果、技術的な知識を提供したり、共同で論文を発表したりすることが、相手方とのより強いつながりをもたらすことを見出しました。また、注目すべき点として、研究結果の存在、あるいは結果への満足が、長期的なつながりを促進するとは限らないということも明らかになった。このような関係が定まると、その後のプロジェクトでは研究費が多少高くなる傾向はあるものの、これらの関係のプラスの効果は永続的ではないことも明らかとなり、実務への示唆に富むものでもある。理由計画に基づき各人分担をすすめるとともに、得られた成果の国際学会発表を行なった(2018年10月)。この学会は、当該分野の研究者が集まる適切なセッションでの成果発表を行えたため、内外有識者と貴重な意見交換を行えた。その結果、2019年度に予定されている書籍への掲載候補となった。第一次の分析結果に基づく国内外の関係者と議論検討を進める。また、主たるデータセットの完成をめざす。1)産学協同研究の推進環境(専門人材の組織体制、関与の度合い)については、経年変化と現状把握、また統計解析に基づく外部資源獲得に対する正の効果検証をとりまとめ論文化する。2)組織的な連携、単一課題に閉じない連携の効果を把握するため、当初計画していた大規模データセットについて、事例候補の1大学をより詳細・長期に分析する方向性を強め、仮説検証のためより精緻なデータセットを構築することを目指す。企業側の情報整備も必要となるため、それに適したスキルをもつ適切な者への外部委託も含め計画を推進する。大規模データセット構築のため、事前の詳細な枠組み設計の検討に時間を充当することを優先した。このため一部初年度に予定していた外部への委託作業を次年度の活動へ変更したため。
微粒子化マトリックスを基盤とする立体的生体組織の再構築プロセス

本研究の最終年度に当たる平成30年度は,これまでに引き続き,特に肝細胞をターゲットとして,ECM微粒子を利用した3次元培養系の有用性の評価を目指した実験系の構築を目指した。コラーゲンからなる微粒子を用いた培養系については,非接着性コートを施したセルカルチャーインサートなど,数種類の培養基材をテストし,ラット由来初代肝細胞の組織形成と機能評価を行った。微粒子の混合割合によって細胞機能が有意に変化すること,安定な組織形成において微粒子の使用が有効であること,などの重要な知見が得られた。さらに,数10数100マイクロメートルの長さに断片化した直径1020マイクロメートルのコラーゲンファイバーを用いた,肝細胞のヘテロ細胞集塊の形成を行ったところ,ファイバーを導入した場合に細胞の生存率が飛躍的に向上し,また機能も上昇することが確認された。これらの結果は,微粒子あるいはファイバー状のECM材料を用いたボトムアップ組織工学の有用性を示していると考えられる。これらの結果については近日中に論文投稿を予定している。またコラーゲン以外にも,ゼラチン,エラスチンなどの材料を用いた微粒子・ファイバーを作製することも可能であったため,これらを用いた展開を今後行う予定である。さらに,薄膜状のコラーゲン材料の微細加工技術の確立を行い,かん流培養下での肝細胞の共培養を実証したほか,微細加工コラーゲンゲルを用いた肝細胞の毛細胆管形成の評価を行った。肝組織以外の生体組織モデルとして,血管組織モデルや筋肉組織モデルの構築を検討し,特に微細加工コラーゲン材料を用いた血管組織モデルについては,その詳細な作製プロセスの最適化と評価を行うことができた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。初年度に当たる平成28年度は,主にECM微粒子の効率的合成法の確立と,細胞の3次元培養系への適用を行った。まずECMタンパク質として,コラーゲンおよびマトリゲルからなる粒子の作製を試みたところ,膜乳化法によって濃縮型ECM粒子,バルクでの乳化法によって繊維化コラーゲン粒子の作製にそれぞれ成功した。また一方で,マイクロ流体デバイス技術を利用することで,ECMタンパク質からなる繊維状の材料を作製する手法の検討を行った。具体的には,流路内に形成される並行層流を利用することで,直径数μmの繊維状ECM材料を作製する手法を開発した。さらに,タンパク質の架橋方法についても検討したところ,これまでに報告したグルタルアルデヒド以外にも,ゲニピンなどによっても粒子の安定化が可能であった。また特に,膜乳化法を利用した場合に,比較的均一性の高い粒子を10の8乗個のオーダーで作製できることを明らかにしたほか,粒子サイズの精密な制御が可能であることを示した。また,マイクロ流路を用いた粒子形成において,粒子形態の制御も行った。次に,得られた粒子の応用として,3次元細胞培養系への応用を行った。細胞としては,肝細胞株であるHepG2細胞,線維芽細胞,および血管内皮細胞であるHUVECを主として用い,粒子と混合して3次元培養系を作製した。粒子と細胞を混合して厚みのある組織を形成し,ECM粒子の形状・組成・添加量が,組織の形態および細胞機能に与える影響を評価したところ,粒子を導入した場合に,細胞の生存率・増殖が促進することが確認された。さらに,肝細胞を用いた場合に,粒子の種類が細胞機能に与える影響を評価したところ,粒子の種類によって細胞機能の発現が変化することが示唆された。さらに,細胞を組織化するために,潅流培養を可能とするマイクロチャンバーの設計と作製を行い,その内部における流れの観察を行った。ECM成分からなる微粒子の合成手法について,異なる材料からなる粒子の大量作製法の確立を行うことができ,また化学的架橋方法の異なる粒子や,微小ファイバーの作製方法についても,有用な手法を開発することができた。さらに,特に肝細胞株を用いた3次元組織作製において,粒子のサイズや架橋の種類が細胞機能に与える影響を評価することができ,ECM微粒子を用いた3次元組織構築,という新しいプロセスの基盤技術の確立を行うことができた。以上の結果から、本年度は概ね当初の計画通り研究を遂行することができたものと考えられる。

さらに,薄膜状のコラーゲン材料の微細加工技術の確立を行い,かん流培養下での肝細胞の共培養を実証したほか,微細加工コラーゲンゲルを用いた肝細胞の毛細胆管形成の評価を行った。肝組織以外の生体組織モデルとして,血管組織モデルや筋肉組織モデルの構築を検討し,特に微細加工コラーゲン材料を用いた血管組織モデルについては,その詳細な作製プロセスの最適化と評価を行うことができた。本研究の2年目に当たる平成29年度は,初年度に引き続き,ECM質微粒子を利用した,新規3次元肝細胞培養系の有効性の実証を目指した。ECM微粒子の作製法としては,これまでに開発した非平衡状態の液滴を利用する手法に加え,マイクロ流路層流系を利用し,主にコラーゲンを用いて,断片化したファイバーをワンステップで作製する手法を開発した。ECM微粒子あるいは断片化ファイバーを,肝細胞と混合して培養することで,組織形状の維持,機能向上が可能であることを実証したほか,血管網を内包するヘテロ細胞集塊の形成条件の検討を行った。また,肝組織を集積化し潅流装置内において潅流培養を行うシステムについては,主に肝がん由来細胞を用い,マイクロファイバー内に細胞を集積化し,導入流量を制御しつつ培養することで,酸素濃度勾配存在下における肝機能発現(アルブミン,CYP等)の制御を行った。さらに,集塊状の細胞組織について,血管内皮細胞や間葉系幹細胞を導入することで,血管網の形成を可能とする条件の探索を行った。加えて,共連続水性2相分散系を利用することで,細胞を内部に導入可能な,多孔質の細胞培養基材の作製も実証したほか,ECM薄膜を組み込んだ細胞培養系の開発を行った。以上の検討では,主にヒト培養細胞を利用したが,それに加えて,ラットより単離した初代肝細胞の培養を試みた。粒子としてはI型コラーゲン微粒子を利用し,異なる化学架橋を施した数種類の粒子を調製した上で,初代肝細胞の3次元組織化を試みたところ,肉厚な組織をワンステップで形成できる条件を見出すことができた。今後は,特に初代肝細胞に対して,その機能を最大化・最適化するような条件を見出すとともに,かん流培養系への適用を図る予定である。ECMからなる微粒子のみならず,断片化したECMマイクロファイバーを作製する新規手法を確立するとともに,各材料を用いた新規3次元培養系の有効性を実証することができた。また初代肝細胞を用いた組織形成を行うことで,本手法の薬剤評価系への有用性を実証する第一歩となる条件を見出すことができた。以上を踏まえると,本研究はおおむね計画通り順調に進んでいると考えられる。特に肝細胞をターゲットとして研究を進めてきたが,今後は,(1)初代肝細胞を用いた3次元組織構築における細胞機能解析,(2)血管網を内包する組織の構築,(3)潅流培養における部位得的細胞機能の再現,の3点を目指した展開を行いたいと考えている。(1)については,本研究者の研究環境において細胞取得用設備を整備中であり,なるべく早急に実験を実施できる体制を整え,特に創薬などにおいて重要な初代細胞を利用した検討を行う予定としている。(2)については,血管内皮細胞を導入した3次元組織構築を行い,実際に導管として機能する組織を作製可能かどうか検証したい。
IgA腎症口蓋扁桃におけるBcl-2過剰発現と糖鎖不全IgA産生の関係について

口蓋扁桃サンプルを用いた検討の結果、IgA腎症の患者の口蓋扁桃の単核球におけるbcl-2の発現が著明に増加していた。また末梢血単核球においてもbcl-2の発現が著明に増加していることも明らかにした。これらの結果より糖鎖不全IgAの産生にはbcl-2が関与している可能性が示唆された。LPS、HP抗原で刺激をした末梢血単核球においてIgA産生が誘導されたがbclー2を抑制しても糖鎖不全IgAの産生抑制は認められなかった。しかしながらbclー2がIgA腎症の病態形成に関与する可能性は高く、bclー2の補体産生誘導などのメカニズムも考えられ今後更なる検討が必要である。IgA腎症の口蓋扁桃ではBcl-2蛋白の発現が亢進していることはすでに確認しているが、免疫組織化学染色で扁桃濾胞間隙での発現増強があるもののTリンパ球かBリンパ球かの区別は付いていなかった。まずBcl-2蛋白の発現増強細胞を同定する必要がある。口蓋扁桃を新規に購入した組織破砕装置を用いてホモジェナイズし、リンパ球をリンフォプレップを用いて分離した。次に磁気細胞分離法を用いてBリンパ球、CD4+T細胞、CD8+T細胞に分けた後に電気泳動法でBcl-2の発現を比較検討した。その結果IgA腎症口蓋扁桃由来のCD4+T細胞、CD8+T細胞ともに慢性扁桃炎口蓋扁桃よりもBcl-2蛋白の発現が増強していた。これはフローサイトメトリーでも同様な結果が確認された。また、real time PCRでも同様の結果であった。Bcl-2過剰発現とと糖鎖不全IgA産生との関係を調べるに当たり、慢性扁桃炎口蓋扁桃(非IgA腎症)から分離したTリンパ球にbclー2を遺伝子導入しBリンパ球と培養することで糖鎖不全IgAが産生されるかどうかの検討を行うこととした。しかし正常リンパ球に遺伝子導入を行うことが困難であり(遺伝子導入処置後の細胞生存が低率になるため)、逆にIgA腎症口蓋扁桃由来のTリンパ球にsiRNAを用いてbcl-2発現を抑制し、Bリンパ球との培養で糖鎖不全IgAの産生が抑制されるかどうかを検討することとした。用いるDahrmaconsiRNA(Thermo scientific社)を用いることでbclー2蛋白発現抑制が可能になるか検討中である。本研究の目的は、IgA腎症患者の口蓋扁桃において糖鎖不全IgAが産生されているどうかの検討である。IgA腎症患者の口蓋扁桃単核球におけるBcl-2の過剰発現は前年度に確認された。今年度は健常口蓋扁桃単核球にbcl-2を遺伝子導入した場合に糖鎖不全IgA産生がどのように変化するかを検討する予定であったが、単離した単核球に遺伝子導入をelectroporationで行うとやはり死滅する細胞が多く抗体産生量が十分に得られなかった。そこでもともとIgA腎症患者リンパ球では過剰にbcl-2が発現されているので、bcl-2に対するsiRNAを用いてIgA腎症患者リンパ球のbcl-2発現を抑制し糖鎖不全IgA産生が抑制されるかを検討することとした。IgA腎症患者の末梢血からFicoll-Paqueで分離した単核球を培養しThermo Scientific Dharmacon社のAccell siRNAを用いてBcl-2の発現を抑制した。次にLPS、H. parainfluenzae外膜抗原(HP抗原)で単核球を刺激し、上清中に産生されたIgA及び糖鎖不全IgAをELISAで測定した。糖鎖不全IgAの測定は特異的抗体が必要なため順天堂大学大学院医学研究科腎臓内科の鈴木仁先生にお願いした。その結果bcl-2発現を抑制していない単核球はLPS, HP抗原で刺激をするとIgA産生が十分に誘導されているが、bcl-2発現を抑制した単核球ではLPS, HP抗原刺激をしてもIgA産生が誘導されず、逆に抑制されていた。このためbcl-2発現抑制で糖鎖不全IgA産生が抑制されるかどうかの結論は得られなかった。単核球にbcl-2を抑制するとIgA産生が抑制される機序は不明であるが、今後siRNAによるbcl-2抑制の程度を検討することでIgA産生が確保されれば糖鎖不全IgAの検討が可能になると考えている。IgA腎症は、糸球体メサンギウム領域へのIgAの過剰な沈着によって生じる慢性糸球体腎炎である。口蓋扁桃の摘出、ステロイドのパルス療法が主な治療法であるが20年で40%前後が腎不全に至るとの報告もあり詳細な病態の解明と新たな治療法の開発が急務である。IgAは粘膜免疫の中心的な役割を担っているが分子内のヒンジ部に糖鎖が結合することにより安定化されておりこの糖鎖の異常はIgA分子全体の構造や性質に影響を与える。IgA腎症患者において糖鎖不全IgAが過剰に発現しておりこれがメサンギウム領域へのIgAの沈着に関与する。糖鎖不全IgA産生のメカニズムは不明であるが口蓋扁桃の摘出によって糖鎖不全IgAが減少することから糖鎖不全IgAの産生には口蓋扁桃が関与することが疑われる。

本研究の目的はIgA腎症患者における糖鎖不全IgAの産生に口蓋扁桃が関与しているかどうかを明らかにすることである。口蓋扁桃サンプルを用いた検討の結果、IgA腎症患者の口蓋扁桃の単核球におけるbcl-2の発現が著明に増加しており末梢血単核球においてもbcl-2の発現が著明に増加していることを明らかにした。これらの結果より糖鎖不全IgAの産生にはbcl-2が関与している可能性が示唆された。糖鎖不全IgA産生へのbcl-2の関与を検討した。LPS、H. Parainfluenzae外膜抗原(HP抗原)で末梢血単核球を刺激し上清中に産生されたIgA及び糖鎖不全IgAをELISAで測定した。その結果LPS, HP抗原で刺激をした末梢血単核球においてIgA産生が誘導されたがbcl-2を抑制することによって糖鎖不全IgA産生が抑制は確認できなかった。bcl-2による糖鎖不全IgA産生を証明することはできなかったが、bcl-2がIgA腎症の病態に関与する可能性は高く、bcl-2の補体産生誘導によるIgA腎症の病態形成への関与なども考えられる。口蓋扁桃サンプルを用いた検討の結果、IgA腎症の患者の口蓋扁桃の単核球におけるbcl-2の発現が著明に増加していた。また末梢血単核球においてもbcl-2の発現が著明に増加していることも明らかにした。LPS、HP抗原で刺激をした末梢血単核球においてIgA産生が誘導されたがbclー2を抑制しても糖鎖不全IgAの産生抑制は認められなかった。しかしながらbclー2がIgA腎症の病態形成に関与する可能性は高く、bclー2の補体産生誘導などのメカニズムも考えられ今後更なる検討が必要である。当初の実験計画では結果が得られないため一部変更したため。研究の目的である糖鎖不全igA産生の検討に向けて産生細胞の条件設定を詰めていけば結果が得られる見込みである。科学研究費により口蓋扁桃を確実に、効率よくホモジェナイズできる装置が購入でき、リンパ球単離の効率が飛躍的に向上し、順調に研究が推移しているため。扁桃から単離した単核球は長期間の培養が困難であり、実験に十分な量を採取する為に、なるべく新鮮な口蓋扁桃組織が必要である。当該年度は当院における手術症例が少なかったことにより十分に実験を進めることができなかったため、次年度使用額が生じた。リンパ球でBcl-2を過剰発現させる手法には困難を来しており、もっぱら過剰発現しているリンパ球に対しsi-RNAを用いた蛋白発現抑制のリンパ球を作成する試みを行っている。次年度に手術サンプルが採取でき次第、適宜進めていく予定である。
光子ビームを使ったηN散乱長の精密測定による核子共鳴N(1535)S11の研究

核子Nのカイラルパートナーの候補とされる核子共鳴N(1535)S11の構造を調べるためには、S11と強くするηNチャンネルの低エネルギー散乱の情報が欠かせない。本研究では、ηメソンと中性子nの散乱の寄与を露わに含む最適な運動学で、重陽子d標的でのηメソン光生成反応の微分断面積を測定し、ηN散乱の散乱長を精密に決定する。これにより自由空間でのS11の構造の解明を目指す。
神経内分泌系における一酸化窒素合成酵素遺伝子の発現調節因子についての検討

神経内分泌系の中でも、視床下部室傍核および視索上核はバゾプレッシンおよびオキシトシンの産生部位であり、自律神経系と内分泌系の統合部位のひとつとして重要である。これらの部位の神経分泌ニューロンの活動は種々の液性・神経性入力により調節されている。我々はこれまで、脱水、高張食塩水の飲水負荷および等張性容量減少刺激により室傍核および視索上核の神経型一酸化窒素(NO)合成酵素遺伝子の発現が増加することを明らかにしてきた。今回、食塩嗜好性により高血圧を発症する塩感受性高血圧ラット(Dahl-S)および塩抵抗性ラット(Dahl-R)の視床下細室傍核および視索上核における神経型NO合成酵素遺伝子の発現とNO合成酵素活性を調べた。Dahl-Sラット群およびDahl-Rラット群に8%食塩含有固形餌を与えて4週間飼育した。各ラットの血圧をテールカフ法により測定したところ、Dahl-Sラット群は、収縮期血圧が180mmHgを越える高血圧状態であった。一方、Dahl-Rラット群は塩負荷にもかかわらず正常血圧であった。各ラット群の室傍核および視索上核における神経型NO合成酵素遺伝子の発現をInsituハイブリダイゼーション法により検討したところ、Dahl-Sラット群で著明な増加を認めた。さらにNO合成酵素活性を示すNADPHジアホラーゼ活性染色を行なったところ、Dahl-Sラット群の室傍核および視索上核におけるNADPHジアホラーゼ活性も著明に増加していた。したがって、高血圧状態において視床下部室傍核および視索上核のNO合成が亢進していることが明らかとなった。今後、視床下部NOが高血圧発症および病態の進展にどのように係わっているか検討する必要がある。本研究は神経内分泌系における神経型NO合成酵素遺伝子の発現とNO合成酵素活性をIn situ hybridization法およびNADPH-ジアホラーゼ組織科学染色法を用いて調べることで、神経内分泌系のNOの役割について解明することを目的とする。高張食塩水負荷および脱水刺激によりNO合成系が亢進するが、糖尿病における高血糖、高浸透圧状態ではどうなるかを実験糖尿病モデルラットを用いて検討した。ウイスター系雄ラットを24時間絶食後、ストレプトゾトシン(80mg/kg体重)を腹腔内に投与して4週間後に断頭して視床下部室傍核及び視索上核における神経型NO合成酵素遺伝子発現及びNADPH-ジアホラーゼ染色を検討したところ、著明に増加していた。インシュリンを1週間皮下投与するとこれらの変化はコントロールレベルとなった。さらに、フロリジン投与により血糖値を正常化すると室傍核及び視索上核における神経型NO合成酵素遺伝子発現の著明な増加はコントロールレベルとなった。したがって、糖尿病モデルラットにおける高浸圧状態が室傍核及び視索上核における神経型NO合成酵素遺伝子発現を亢進させることが明らかとなた。次に、非浸透圧刺激であるHypovolemia時の場合について調べた。ポリエチレングリコールをラット腹腔内に投与して3時間後及び6時間後に断頭して室傍核及び視索上核における神経型NO合成酵遺伝子発現及びANDH-ジアホラーゼ染色を検討したところ、6時間後には有意に増加していた。したがって、非浸透圧刺激においては脳内上行経路を賦活することにより室傍核及び視索上核におけるNO合成を亢進させるものと思われる。
シャトルコック型フタロシアニン系タンデム逆型有機太陽電池の作製と物性評価

シャトルコック型フタロシアニン金属錯体や可溶性フタロシアニン錯体をホール輸送層に導入もしくは微量添加しながら有機・無機ハイブリッド系ペロブスカイト太陽電池を作製し、その導入効果について検討を行った。フタロシアニン錯体の種類や添加量を調節することによりペロブスカイト結晶成長のみならずバンド構造、輸送特性、光起電力特性、光電変換効率に影響を与えた。条件を最適化することによって従来のホール輸送層であるspiro-OMeTADよりも光起電力特性、光電変換効率、吸収特性、長期安定性が向上した。第一原理計算による電子構造に基づいて光起電力機構を明らかにした。本研究の課題では、シャトルコック型フタロシアニン金属錯体やフラーレン誘導体を電荷移動層として利用することにより吸収波長広域化と電荷輸送特性を向上させ、独創的かつ高性能な有機・無機複合型有機太陽電池を構築した。シャトルコック型フタロシアニン金属錯体をTiO2層やperovskite/TiO2層に蒸着法で製膜しながら有機活性層や電荷移動層として有機・無機複合型太陽電池を作製し、光起電力特性を向上した。フタロシアニン金属錯体の結晶構造や分子配向を蒸着の製膜条件、熱処理条件により制御し、電荷移動度の改善や吸収広域化により光起電力特性の向上を行った。シャトル型フタロシアニン金属錯体では光電変換効率4%を示した。光起電力特性の経時変化から長期安定性を検討したところ、従来のホール輸送層よりも2週間以上性能を保つことが分かった。走査型電子顕微鏡(SEM/EDX)やX線回折による薄膜の表面形態や組成成分、結晶構造を観測した。分子軌道計算法によりフタロシアニン金属錯体の電子構造や励起状態を検討した。吸収特性、光電変換効率IPCE、外部量子効率の波長特性、輸送特性、光起電力特性などの実験結果を考察することにより光起電力機構の違いを検討した。これらの成果は有機エレクトロニクス材料に関する国内外の学会において論文発表を行った。さらに海外の学術雑誌にて論文発表した。シャトルコック型フタロシアニン金属錯体を利用しながらペロブスカイト系太陽電池を作製し、光起電力特性を評価した。ホール輸送層としてフタロシアニン金属錯体を導入した独創的かつ高性能なペロブスカイト系太陽電池を作製し、吸収特性、光起電力特性を向上させた。特にシャトルコック型フタロシアニン金属錯体である鉛フタロシアニン錯体、バナジウムフタロシアニン錯体、バナジウムナフタロシアニン錯体、ゲルマニウムフタロシアニン錯体をホール輸送層に導入することにより吸収波長を広域化し、輸送特性、光起電力特性を向上させた。製膜条件によるホール輸送層や光活性層の結晶サイズの制御により輸送特性や光起電力特性の向上を行った。光起電力特性、外部量子効率からフタロシアニン錯体の分子構造の違いによる光電荷分離、電荷移動、光起電力特性への影響を検討した。SEM/EDX、X線回折の測定により光活性層の表面結晶形態や結晶成長を評価しながら構造最適化を行った。光起電力特性、吸収特性、外部量子効率の測定からホール輸送特性や吸収波長の影響を検討し、光起電力特性を明らかにした。量子化学計算法によるフタロシアニン金属錯体の電子構造や励起過程、吸収特性から分子構造の違いによる光起電力特性への影響を検討し、光起電力特性や作動安定性の向上を行った。得られた結果を取りまとめ、材料、有機エレクトロニクス材料に関する国際学会において口頭・ポスター発表を17件行った。学術雑誌や国際学会の特集号に論文を投稿し、6件掲載された。当初の計画通り、シャトルコック型フタロシアニン金属錯体を利用したペロブスカイト系太陽電池を作製し、特性評価することができた。光起電力特性、吸収、外部量子効率の測定から光電荷分離、電荷移動、光起電力機構を検討した。光起電力特性や光電変換効率、外部量子効率の測定からフタロシアニン金属錯体のホール輸送層としての役割や光起電力特性への影響を明らかにすることができた。ホール輸送層の調節により光活性層の表面形態やペロブスカイト結晶成長を促進し、光起電力特性、光電変換効率を向上させた。得られた結果を取りまとめ、材料、有機エレクトロニクス材料に関する国際学会において口頭・ポスター発表を行った。学術雑誌に論文を投稿することができた。有機・無機ハイブリッド系太陽電池は軽量で、安価であり、建築壁用、自動車用発電、アウトドアなどのスポーツ製品への応用などその用途が広がり始めている。高性能かつ高効率な太陽電池を開発・実用化するうえで吸収広域化、開放電圧、キャリア移動の向上が重要なポイントとなる。これまで本研究では、有機・無機ハイブリッド系太陽電池の光起電力特性、吸収波長広域化、輸送特性を向上させるために、P型有機半導体であるシャトル型フタロシアニン金属錯体を導入しながら独創的かつ高性能な有機・無機ハイブリッド系太陽電池を作製した。H28年度は、可溶性フタロシアニン金属錯体MPcやナフタロシアニン錯体Ncをホール輸送層に微量添加しながら有機・無機ハイブリッド系ペロブスカイト太陽電池を作製し、その導入効果について検討を行った。光起電力特性、吸収特性、ペロブスカイト結晶の表面形態、光電荷分離、電荷移動、光起電力機構との関連性を解明しながら性能向上を行った。製膜条件、熱処理条件、ホール輸送層へのMPc, Nc添加量、ペロブスカイト結晶のハロゲンやカチオンの組成比などを調節しながら開放電圧Voc、短絡電流密度Jscなど性能最適化を行った。

走査型電子顕微鏡(SEM)・エネルギー分散型X線分光法(EDX)、光学顕微鏡、X線回折からペロブスカイト結晶の表面形態、結晶構造への影響を明らかにした。添加するフタロシアニン錯体の種類や添加量を調節することによりペロブスカイト結晶成長のみならずバンド構造、輸送特性、光起電力特性、光電変換効率に影響を与えた。条件を最適化することによって従来のホール輸送層であるspiro-OMeTADを利用したときよりも光起電力特性、光電変換効率、吸収特性、長期安定性が向上した。第一原理計算による電子構造や電荷移動過程に基づいて光起電力機構を明らかにした。シャトルコック型フタロシアニン金属錯体や可溶性フタロシアニン錯体をホール輸送層に導入もしくは微量添加しながら有機・無機ハイブリッド系ペロブスカイト太陽電池を作製し、その導入効果について検討を行った。フタロシアニン錯体の種類や添加量を調節することによりペロブスカイト結晶成長のみならずバンド構造、輸送特性、光起電力特性、光電変換効率に影響を与えた。条件を最適化することによって従来のホール輸送層であるspiro-OMeTADよりも光起電力特性、光電変換効率、吸収特性、長期安定性が向上した。第一原理計算による電子構造に基づいて光起電力機構を明らかにした。シャトル型フタロシアニン金属錯体としてチタニアルフタロシアニン(TiOPc)、バナジルフタロシアニン(VOPc)、鉛フタロシアニン(PbPc)やフラーレン誘導体(PCBM)を利用した逆型有機薄膜太陽電池やペロブスカイト系太陽電池を作製した。蒸着法でホール輸送層の膜厚や分子配向、結晶構造を精密に制御しながら電子輸送層:酸化チタン(TiO2)/FTO基板上に製膜した。有機層のタンデム化や蒸着条件、熱処理、溶媒処理を調節しながら吸収領域、内部構造、結晶構造、分子配向を最適化し、光起電力機構を明らかにした。走査型電子顕微鏡(SEM/EDX)、X線回折などを用いて表面形態や組成成分、結晶構造を評価した。熱処理、溶媒処理による分子配向、結晶構造の相転移現象も検討を行った。分子構造や結晶構造や光起電力特性の関係について、実験的結果に基づいて検討を行った。これらの成果は材料、有機エレクトロニクス材料に関する国際学会において論文発表を行った。さらに海外の学術雑誌に論文を投稿した。フタロシアニン錯体を利用したペロブスカイト系太陽電池を作製し、光起電力特性の向上を目指す。光電変換効率の大幅な向上を目指すために様々な系のフタロシアニン金属錯体を導入することによりホール輸送特性、吸収特性、ペロブスカイト結晶成長を促進し、光起電力特性の向上を行う。さらにペロブスカイト結晶のハロゲンドープや組成成分を調節することにより電子構造、電荷分離、電荷移動を改善し、輸送特性、光起電力特性の向上を目指す。さらに量子化学計算法からフタロシアニン金属錯体の共役系や中心金属の影響を予測し、実験結果と比較検討しながらその効果を検討する。奥研究室ホームページ有機・無機太陽電池、有機半導体、スピンデバイス平成26年度に得られた結果を基にして高性能かつ長期安定性の有機・無機複合型太陽電池を作製する。
電動車いすの使用促進化を図るための設計要領の作成

・初年度の実験Iは、予備実験とし参考資料とした。なお、通過判定基準が実験IIのそれに比較し低かったため、実験IIの基準で見直した。・本年度の実験IIは、本実験とし、この結果を結論とした。通過判定基準として、衝突・切り返し無しを「通過容易」とし、衝突・切り返し20%以下を「通過可能」とした。(1)直進通路実験・結論として、「通過可能」寸法は780mm以上、「通過容易」寸法は850mm以上必要である。・結論として、L字通路に角切りをする場合、角切り寸法は300mmになると効果が急増する。「通過可能」寸法は、右折の場合990mm以上、左折の場合970mm以上で、統合すると990mm以上必要である。L字通路に300mmの角切りをする場合、「通過可能」寸法として、右折900mm以上、左折で890mm以上で、統合すると900mm以上必要である。(3)開口部実験・結論として、通路幅員850mmの場合、開口寸法を拡大してもその効果は殆どない。通路幅員を900mmまで拡大したとき、開口寸法1,000mm以上でほぼ「通行可能」となる。さらに通路幅員950mmの場合の「通行可能」寸法は、930mm以上必要である。通路幅員1,000mmの場合の「通行可能」寸法は、880mm以上必要である。現在、高齢者・障害者に配慮した設計要領・指針として、ハートビル法(対公共施設)及び長寿社会対応住宅設計指針(対住宅)がある。これらの基準は手動車いすによるもので、電動車いすは対象外である。本研究は今後高齢化及び障害者の社会参加に伴い、増加が予想される電動車いずに対応した公共施設・住宅の設計指針の基礎的資料を求めるためのものである。実験内容は、最も基本的な屋内通路のパターンとして、直進通路、L字通路、開口部前面通路での走行実験を行った。被験者は学生2人、電動車いす使用障害者4人の計6人で、1人あたり200回程度の実験を行った。今回の実験では衝突、切り返し回数からみた最小寸法、被験者の意識を含めた理想寸法を求めた。(1)直進通路実験-この実験では、通路側壁への衝突は1度も見られなかった。しかし、現在の指針による通路幅(=750mm以上)では、通過に対して困難と感じており、安心して通過するには少なくとも通路幅880mm以上必要であった。(2)L字通路実験-最小寸法は公共施設の場合では特に問題はなかったが、住宅における通路幅では通行不可能であり、推奨寸法(=850mm以上)の場合であっても通行は困難であった。衝突、切り返しせずに通過できる通路幅は900mm以上であった。また理想寸法は、安心して通過できるのは少なくとも通路幅940mm以上は必要であった。現在の指針による寸法で衝突、切り返しをせずに通過するには角を200mm以上落とす必要があり、楽に通過するには角を400mm以上落とす必要があった。(3)開口部実験-最小寸法は公共施設の場合では問題はなかったが、住宅の場合では通行不可能であった。1回程度の衝突、切り返しで通過できるのは通路幅850mmの場合開口幅860mm以上であり、開口幅800mm以上の場合通路幅1,000mm以上必要であった。また理想寸法は開口幅900mm以上、通路幅900mm以上必要であった。本年度は、昨年度の実験結果を踏まえ、最も基本的な屋内通路パターンである直進通路、L字通路、開口部前面通路について、被験者として電動車いす使用障害者8人に増やし、1ケースの走行回数を35回に増加した。測定資料としては、通過時間、衝突・切り返し回数、通過意識である。通過判定基準としては、衝突・切り返し無しを「通過容易」とし、衝突・切り返し20%以下を「通過可能」とした。

(1)直進通路実験・通路幅員の「通過可能」寸法は780mm以上であり、「通過容易」寸法は850mm以上であった。・L字通路の「通過可能」寸法は、右折の場合990mm以上、左折の場合970mm以上で、統合すると990mm以上となる。・L字通路に有効な300mmの角切りをする場合、「通過可能」寸法として、右折で900mm以上、左折で890mm以上で、統合すると900mm以上必要である。(3)開口部実験・前面通路幅員850mmの場合、開口部に入るための90度回転が困難で、開口寸法の拡大効果は殆どない。通路幅員850mmから900mmまで拡大したとき、開口寸法1,000mm以上で、ほぼ「通行可能」となった。さらに、通路幅員950mmの場合の「通行可能」寸法は、室内側から出るときは930mm以上、通路側から入るときは890mm以上必要で、統合すると930mm以上必要となる。通路幅員1,000mmの場合の「通行可能」寸法は、室内側から出るときは860mm以上、通路側から入るときは880mm以上で、統合すると880mm以上となる。
カルコーゲン元素の再生法の開発

高機能性材料の開発には、さまざまな元素の持つ特性の解明とその活用が1つの重要な鍵となり、その研究段階では今までほとんど利用されなかった多種類の元素が用いられている。しかしながら、その処理技術に関する研究は少なく、処理法はほとんど開発されていない。本研究では、最近電子材料に多用されつつあるセレン、テルル等のカルコゲン元素に注目し、特にこれらの研究、製造、廃棄過程で不用となり、適切な処理法がないまま放置されているセレン・テルルの混合物から、それぞれの元素を高純度で分離、回収する新しい方法を開発することを目的として行なった。本研究を推進するに当たっては、従来法でしばしば用いられる蒸留、昇華等の操作は用いず、セレンとテルルの化学的反応性の差異を利用する新しい分離法の開発をめざすとともに、実用化を考慮し、用いる試薬としては、安価かつ多量に供給される工業用試薬に限定した。これらの条件のもとに、セレンおよびテルルと種々の試薬との反応を詳細に検討した結果、一酸化炭素との反応においてセレンとテルルに大きな反応性の差異があることを見いだした。セレンは第1級および第2級アミン存在下、常温で一酸化炭素と容易に反応し、カルバモセレノアートとして溶媒に可溶となった。一方、テルルはこの条件下では全く反応せず、瀘別により回収された。次に、カルバモセレノアートからの単体セレンの回収法を検討した。第1級アミンの場合には、加熱によりセレン化水素に誘導し、その酸化または接触熱分解反応により単体セレンを得る方法が利用可能なことを明らかにした。また第2級アミンを用いる場合には、カルバモセレノアートを80度から100度で熱分解することにより、単体セレンをほぼ定量的に回収できることを見いだした。後者の方法は、一酸化炭素およびアミンを回収、再利用できることにより、前者の方法より有利と考えられる。
絹タンパク質セリシンのメタボリックシンドローム抑制作用の発見

本研究では,絹タンパク質セリシンが高脂肪食摂取下において,血中脂質低下作用,脂肪肝抑制作用,糖代謝改善作用を有することを明らかにし,これらの作用に血中アディポネクチンの増加が関与していることを新たに見出した。また,セリシンは腸管バリア機能の指標である糞中IgAおよびムチンを増加させることや,腸内発酵を促すことを明らかにした。これらの成果から,セリシンは,腸内環境を改善し,メタボリックシンドロームの発症を予防することが示唆された。シルクタンパク質セリシンが高脂肪食摂取ラットの脂質代謝に及ぼす影響について検討を加えた。SD系雄ラットに20%牛脂食,あるいは20%牛脂食に4%セリシンを添加した食餌を一定量の制限食とし摂取させた。成長量,食餌摂取量,肝臓重量および脂肪組織重量は,セリシン摂取による影響を受けなかった。血清トリグリセリドはセリシン添加食群において有意に減少し,この作用は,主にVLDLトリグリセリドの低下によるものであることが示された。血清コレステロール, VLDLコレステロールおよびLDLコレステロールもセリシン摂取により有意に減少することが明らかとなり,これらの結果からセリシンは高脂血症を抑制することが示された。肝臓脂質への影響について検討を行ったところ,食餌セリシンは,肝臓トリグリセリドと肝臓脂肪酸合成関連酵素であるリンゴ酸酵素活性およびグルコース6-リン酸脱水素酵素活性を有意に低下させることが明らかになった。一方,脂肪酸分解系酵素であるカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼの活性は,セリシン摂取による影響を受けなかった。そのため,セリシンによる肝臓脂質低下作用のメカニズムには,主に脂肪酸合成系の抑制が関与しており,脂肪酸分解系のメカニズムは関与していない可能性が示された。セリシンの血中アディポサイトカインへの影響について検討を加えた結果,メタボリックシンドロームの予防因子として注目されているアディポネクチンがセリシン摂取により顕著に増加していることが見出された。これらの結果より,セリシンは高脂肪食摂取下での脂質代謝の改善に有効である可能性が示された。1.セリシンが高脂肪食摂取ラットの脂質及び糖代謝に及ぼす影響について検討を加えた。その結果、肝臓と血清のトリグリセリド及び血清遊離脂肪酸は、セリシン摂取により有意に低下した。また、食餌セリシンは、血清レプチンとレジスチンに影響を与えることなく、血清アディポネクチンを顕著に増加させることが明らかになった。さらに、セリシン摂取は腹腔内グルコース注射後の血糖値とインスリンの上昇を有意に低下させた。これらの結果から、セリシンが高脂肪食摂取下での脂質代謝と糖代謝の改善に有効であることが示唆された。2.高脂肪食の摂取による脂質代謝の変動と大腸疾病との関連性が指摘されていることから、セリシンが高脂肪食摂取ラットの腸管免疫能に及ぼす影響について検討を加えた。その結果、セリシンの摂取は、腸管免疫能の指標である糞中IgA含量を著しく増加させることが明らかとなった。また、腸管バリア機能の指標である糞中ムチン含量もセリシン添加群で有意に増加しており、IgAの変動と一致していた。一方、血中IgAは高脂肪食摂取により有意に増加したが、このことに対する食餌セリシンの影響は認められなかった。血中IgE、IgG及び炎症性サイトカインであるTNF-αは、セリシン摂取による影響を受けなかった。大腸組織中のIgA量は、セリシン摂取により有意に増加することが認められた。これらの結果より、高脂肪食摂取下においてセリシンが腸管へのIgA及びムチン分泌を促進し、大腸内環境を改善する可能性が推察された。1.脂質の過剰摂取による腸内環境の変化が,脂質代謝異常や大腸疾病に関連していることが指摘されている。そのため,セリシンが高脂肪食摂取ラットの腸内環境に及ぼす影響について検討を加えた。その結果,セリシン摂取による盲腸重量の顕著な増加と盲腸内容物pHの低下が認められた。腸内の発酵産物である有機酸量について検討したところ,高脂肪摂取により盲腸内の酢酸,プロピオン酸,酪酸およびコハク酸量が減少した。一方食餌セリシンは,高脂肪食摂取条件下において,盲腸内の酢酸及び酪酸を有意に増加させることが明らかとなった。また,血清中性脂肪量と盲腸内の酢酸量との間に有意な逆相関関係が認められ,セリシンによる血中脂質低下作用に,腸内での酢酸発酵の増加が関与している可能性が示唆された。盲腸内容物の細菌叢と糞中の二次胆汁酸についてはセリシン摂取による影響は認められなかった。2.腸内環境改善が肝障害の防御につながる可能性があるため,肝障害に及ぼす影響についての検討を行った。高脂肪食摂取条件下でガラクトサミン肝障害を誘発させたラットにおいて,血清ALT,ASTおよびLDH活性は著しく増加した。食餌セリシンは,ガラクトサミン投与による血清ALT活性の増加を有意に低下させ,血中ASTおよびLDH活性を低下させる傾向を示した。

以上の結果より,セリシンは高脂肪食条件下で盲腸内の有機酸発酵を増加させることにより腸内環境を改善し,脂質代謝の改善や肝障害の抑制に関与する可能性が示された。
現行のポリクローナル抗体にかわる高中和性抗破傷風ヒトモノクローナル抗体の実用化

1.実用化に最も重要なハイブリドーマG2, G6株のマスターセルバンクを作製し,その3, 4代目培養上清について安全性試験を行い(1)in vivo :卵接種試験の結果,(i)羊膜腔内,(ii)漿尿膜上,(ii)卵黄嚢内,(iv)尿膜腔内接種試験において,胎児を死亡させたり,または血球凝集,血球吸着を起こす因子は検出されなかった.動物試験の結果,(i)乳のみマウス,(ii)成熟マウス,(iii)モルモット接種試験で,動物を死亡させたり,臨床症状に異常を起こす因子は検出されなかった.(2)in vitro:上記培養細胞の超音波処理上清について,(i)MRC-5, (ii)Vero, (iii)MDCK細胞接種試験,(iv)Co-cultivation試験の結果,細胞変性が認められず,また血球凝集,血球吸着も認められず,細胞中にRT(逆転写酵素)活性も認められなかったことからG2, G6のマスターセルバンクの細胞には,迷入ウイルスの混入はないと判定した.しかし,(3)誘発剤によるレトロウイルス検出試験でRT活性が陽性であり,電顕観察でIntercisternal-A型粒子が観察され,S+L-focus assayはG2株が陽性となった.Mouse antibody production assay, Extended XC plaque assayは陰性であった.2.品質管理のため,これらのモノクローナル抗体(MAb)の特性を明確にするために,毒素フラグメントを種々のプロテアーゼ処理した消化物を分画,免役染色により毒素分子上での対応するエピトープの局在を調べた.3.上述の安全試験の結果を考慮して,しかもハイブリドーマが高中和活性MAbを産生するという特性を活かして,免役グロブリンに共通して保存された遺伝子部分のオリゴヌクレオチドプライマー混合物を用いてcDNAをPCR法で増幅し,毒素の[C]ドメインに対応するMAb-G6の可変領域遺伝子部分をクローニングし,その塩基配列を確定、アミノ酸配列を推定した.ついで,毒素の[B], [C]ドメインに対応するMAb-G2, G4についてもクローニング,配列決定をし,より安全で,容易,安価に組み換え型ヒトモノクローナル抗毒素が作成できる道を開いた.1.(1)実用化に最も重要なハイブリドーマG2およびG6株をHy606培地で培養し,24日毎に継代し,それぞれ3,4代目の培養上清について安全試験を行った。卵接種試験の結果,胎児を死亡させたり,血球凝集を起こしたり,漿尿膜に異常を起こす因子は見出されなかった結果を得た。(2)動物試験(乳のみマウス,成熟マウス,モルモット)の結果,生死,臨床症状を観察,そのいずれにも異常を認めなかった。(3)in vitroで,上記培養細胞の超音波上清について調べた結果,VeroまたはMDCK細胞に変性を起こしたり,血球の凝集または吸着を起こす因子,各細胞に感染するRT活性をもつ因子は見出されなかった。(4)Co-cultivation(MRC-5細胞,Vero細胞)の結果,細胞変性を起こしたり,血球の凝集または吸着を起こす因子およびRT活性をもつ因子は見出されなかった。2.G2,G6株を大量連続細胞培養し,血清無添加培地での産生至適条件を決めた。3.ヒトモノクローナル抗体(MAb)G2,G6を高速液体クロマトグラフィー(Protein A-セルロファインカラム,FPLC-Mono S)を組み合わせ高度に精製する一方,毒素の各フラグメントをパパイン,V8プロテアーゼ,リジルエンドペプチダーゼ処理した消化物を逆相クロマトにかけ,各フラクションをドットブロッターでニトロセルローズ膜に吸着させ,各MAbを用いて免疫染色し,エピトープの毒素分子上での詳細な局在を決定しつつある。4.MAbの超可変領域のアミノ酸配列を決定するため,ハイブリドーマ株G2,G6より総RNAを抽出しcDNA第一鎖合成の鋳型とした。次にこれを鋳型としてPCR法を行い,超可変領域の遺伝子を増幅した。増幅した遺伝子断片をプラスミドに挿入し,得られた各クローンの塩基配列を決定しつつある。5.大量連続培養により産生したMAb-G2,G6について,中和活性の最高の相乗効果を示す条件を求め,in vivoでの受動免疫による予防効果をマウスを用いて調べた。1.実用化に最も重要なハイブリドーマG2, G6株のマスターセルバンクを作製し,その3, 4代目培養上清について安全性試験を行い(1)in vivo :卵接種試験の結果,(i)羊膜腔内,(ii)漿尿膜上,(ii)卵黄嚢内,(iv)尿膜腔内接種試験において,胎児を死亡させたり,または血球凝集,血球吸着を起こす因子は検出されなかった.動物試験の結果,(i)乳のみマウス,(ii)成熟マウス,(iii)モルモット接種試験で,動物を死亡させたり,臨床症状に異常を起こす因子は検出されなかった.(2)in vitro:上記培養細胞の超音波処理上清について,(i)MRC-5, (ii)Vero, (iii)MDCK細胞接種試験,(iv)Co-cultivation試験の結果,細胞変性が認められず,また血球凝集,血球吸着も認められず,細胞中にRT(逆転写酵素)