hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中小企業の新規事業開発　－ネットワーク形成と協働の観点から－

文献レビューを行った(経費:小売関連書籍・資料費)。文献レビューは,ネットワーク形成と協働に関わる文献を整理し,同時に,説明のための理論枠組みである,資源依存パースペクティブ,ネットワークケイパビリティ,起業家志向性にかんする文献の整理を行った。2次データによる対象企業の絞り込みを行い,複数事例研究のための調査を実施した(経費:調査旅費・インタビュー起稿費)。調査データは,企業や組織に関する資料や文献を用いた文献調査と,調査対象となる新規事業開発に関わる中小企業事業者へのインタビュー調査によって収集した。しかし,調査の問題意識としていた点からすると、対象企業の規模が小さいことから,企業行動が想定しがたい部分があり,論文という形にするには難しいという調査結果となった。このことから,資源依存パースペクティブ,ネットワークケイパビリティ,起業家志向性にかんする文献の整理を行い、アンケート調査についても検討を行ったが,研究代表者妊娠のため,研究が進まなかった。研究が遅れている理由として2点あげられる。1点目は,対象企業が中小企業であることから、調査が難航している。2点目は,研究代表者の妊娠である。1.事例調査研究と分析事例の本調査をおこなう。事後的にデータの不足が発見された場合には,追加調査をおこなう(経費:調査旅費・インタビュー起稿費)。また,事例の比較分析を行い,事例間の差異を分析するとともに,新規事業開発を進展させる要因を特定化する。2.学会発表と成果のとりまとめ国内の学会において研究報告をおこなう(経費:成果発表旅費)。想定される学会は日本経営学会や組織学会,日本商業学会である。最終的には,そこでのディスカッションを踏まえて研究をとりまとめ,論文を作成し,上記学会の学会誌である「日本経営学会誌」や「組織科学」「流通研究」等でのアクセプトを目指す。文献レビューと分析枠組の構築文献レビューの焦点は,以下の2点である。第1は,現象理解の焦点となるネットワーク形成と協働に関わる文献を整理し,同時に,説明のための理論枠組みとなる資源依存パースペクティブとその関係文献の整理をおこなった。さらには,中小企業のネットワーク研究における文献の整理を行った。中小企業のネットワークに関して近年は、「異業種交流」「産学連携」「新連携」「農商工連携」など、戦略的な中小企業が関係性を構築する志向がされるようになっている。中小企業ネットワーク研究においては、ネットワークの意義を論じているものの、個別の中小企業が他企業との関係をいかにマネジメントするか、といったミクロ・レベルでの経営的視点からの議論が十分にはされていない。さらに「異業種交流」「産学連携」「農商工連携」に関する研究は多くあるものの「中小企業の新事業開発におけるネットワークについての研究は多くないことが明らかとなった。第2は,方法論の整理である。研究チームは過去に複数事例研究を主要な方法とした経験があるが,最新の研究動向にも配慮し,適切な方法で調査に臨むための方法論の整理を行った。ケーススタディは、一般化や客観性の問題、データ収集、分析の過程などが厳密性に欠けるとの指摘もある。よって、ケース・スタディにおいては、リサーチ設計を行い、質の確保を行うことが重要であることが明らかとなった。調査項目が多岐に渡るため、事例研究の調査対象となる企業やパートナー企業・機関にも,ある程度の負荷がかかることから,調査に協力してくれる企業の確保に時間がかかったためである。文献レビューは,現象理解の焦点となるネットワーク形成と協働に関わる文献を整理し,同時に,説明のための理論枠組みである,資源依存パースペクティブとその関係文献の整理を行った。また,予備調査対象企業が,地域資源のブランディングを行う事業者であったため「地域資源」「地域ブランド」「地域ブランドのマネジメントの議論」などについての文献レビューも行った。複数事例研究のための予備調査を実施した(経費:調査旅費・インタビュー起稿費)。予備調査データは、企業や組織に関する資料や文献を用いた文献調査と、調査対象となる新規事業開発に関わる中小企業事業者へのインタビュー調査によって収集し、分析と考察を行った。事例として選択したのは、4事例である。その他、事例対象企業の選定のため、数社に対して資料収集・調査を行った。予備調査から,本調査前のための「調査プロトコル(計画)」(Yin,2009)を作成し,研究グループで共有を行った。本研究の研究方法としてはインタビュー調査を中心とした複数事例研究(multiple-case study)を採用するが,予備調査の結果,アンケート調査による1時点での現象の理解と合わせた考察を行うことによって中小企業の新規事業開発におけるネットワーク形成と協働の進展に影響を与える要因を特定化し,そのマネジメントにおける重要性を明らかにすることができると考えられた。項目が多岐にわたるため、予備的調査の対象となる企業やパートナー企業・機関にも負担がかかることから、調査に協力してくれる企業の確保に時間がかかったため。

しかし,調査の問題意識としていた点からすると、対象企業の規模が小さいことから,企業行動が想定しがたい部分があり,論文という形にするには難しいという調査結果となった。このことから,資源依存パースペクティブ,ネットワークケイパビリティ,起業家志向性にかんする文献の整理を行い、アンケート調査についても検討を行ったが,研究代表者妊娠のため,研究が進まなかった。研究が遅れている理由として2点あげられる。1点目は,対象企業が中小企業であることから、調査が難航している。2点目は,研究代表者の妊娠である。29年度前半に複数事例研究のための予備調査を行う(経費:調査旅費・インタビュー起稿費)。調査の中心は半構造化インタビューである。予備調査から,本調査前のための「調査プロトコル(計画)」(Yin,2009)を作成し,研究グループで共有する。29年度後半より,事例研究の本調査と分析を行う予定である。予備調査および調査プロトコルに基づいて本調査を行う(経費:調査旅費・インタビュー起稿費)。基本的には,焦点企業を中心とした事例を最低2事例,グループによる新規事業を最低2事例調査することを目標とする。それぞれの事例調査においては,焦点企業とそれに協力したパートナー企業・機関の双方に対してインタビューをおこなう。また,複数事例研究の方法論に基づき,まずは個別の事例についての分析をおこない,その後,各事例の比較研究をおこなう。分析に際しては,質的分析のソフトウェア(NVivo)を用いて,効率的な分析を行う(経費:ソフトウェア購入費)さらには,アンケート調査・考察も行う。1.事例調査研究と分析事例の本調査をおこなう。事後的にデータの不足が発見された場合には,追加調査をおこなう(経費:調査旅費・インタビュー起稿費)。また,事例の比較分析を行い,事例間の差異を分析するとともに,新規事業開発を進展させる要因を特定化する。2.学会発表と成果のとりまとめ国内の学会において研究報告をおこなう(経費:成果発表旅費)。想定される学会は日本経営学会や組織学会,日本商業学会である。最終的には,そこでのディスカッションを踏まえて研究をとりまとめ,論文を作成し,上記学会の学会誌である「日本経営学会誌」や「組織科学」「流通研究」等でのアクセプトを目指す。予備調査や本調査を行うため。予備調査に協力してくれる企業の確保に時間がかかったため,予備調査と本調査が思うように進まず,次年度使用額が生じた。今年度は,調査対象企業に調査を行うと同時にアンケート調査も行い,研究の精緻化を行う予定である。研究を中断・延長したため引き続き、文献レビューをおこなう(経費:関連書籍費)。予備調査および調査プロトコルに基づいて本調査をおこなう(経費:調査旅費・インタビュー起稿費)。
活性酸素産生酵素のアレルギー疾患への関与の解明

I型アレルギーや炎症に重要な役割を果たすマスト細胞において、活性酸素産生酵素NOX1が果たす役割を解明することを試みた。マスト細胞の成熟や機能への関与を示唆するデータは得られなかったが、NOX1は顆粒膜上に局在し、無刺激時には顆粒内に活性酸素を放出しているが、脱顆粒に伴い細胞外に放出するようになると考えられた。NOX1により産生される活性酸素がマスト細胞のメディエーターのひとつであることが示唆された。マスト細胞はI型アレルギーや炎症に重要な役割を果たす細胞であり,ヒスタミンやエイコサノイドといったアレルギー・炎症のメディエーターを顆粒中に貯蔵している。外部からの刺激に誘発された脱顆粒によりメディエーターが放出されるが,その脱顆粒に活性酸素が関与することが以前から報告されている。活性酸素産生酵素であるNADPHオキシダーゼの触媒サブユニット・NOXには5種類のアイソフォームが存在するが,申請者はマスト細胞株においてNOX1のみが発現することを見出した。このことはマスト細胞における活性酸素の産生にはNOX1が必須であることを示唆している。まずNOX1の脱顆粒への関与の有無について検討した。野生型およびNOX1遺伝子欠損(NOX1-KO)マウスの骨髄由来マスト細胞(BMMC)を培養し,抗原刺激による脱顆粒をβ-ヘキソサミニダーゼ活性を指標に計測したが,両者の脱穎粒の程度に有意な差は認められなかった。次にBMMCのヒスタミン含量を測定したが,野生型とNOX1-KOで有意な差は認められなかった。そこで成熟型のマスト細胞とされる腹腔マスト細胞を腹水から回収し,マスト細胞プロテアーゼであるキマーゼ,トリプターゼ,およびカルボキシペプチダーゼAの活性を測定した。しかしどの酵素の活性についても,野生型とNOX1-KOで有意な差は認められなかった。これまでマスト細胞の成熟とアレルギー疾患への関与を中心にNOX1の役割を検討してきたが,今後はNOX1の細胞内局在と活性酸素産生部位を検討し,活性酸素の放出そのものの意義について検討を加えたい。マスト細胞はI型アレルギーや炎症に重要な役割を果たす細胞であり、ヒスタミンやエイコサノイドといったアレルギー・炎症のメディエーターを顆粒中に貯蔵している。外部からの刺激に誘発された脱顆粒によりメディエーターが放出されるが、その脱顆粒に活性酸素が関与することが以前から報告されている。活性酸素産生酵素であるNADPHオキシダーゼの触媒サブユニット.NOXには5種類のアイソフォームが存在するが、申請者はマスト細胞においてNOX1のみが発現することを見出した。しかし野生型およびNOX1遺伝子欠損(NOX1-KO)マウスの骨髄由来マスト細胞(BMMC)、および腹腔マスト細胞を用いた検討では、脱顆粒の程度、ヒスタミン含量、プロテアーゼ活性、染色像のいずれについても、野生型とNOX1-KOで差異は認められなかった。BMMCの活性酸素産生量を、膜非透過型プローブであるルシゲニンの化学発光を指標として測定したところ、野生型とNOX1,KOで差が認められなかった。しかし細胞をポッターホモジナイザーで処理した後測定すると、NOX1-KOでは有意に活1生酸素産生量が少なかった。このことから、NOX1は顆粒膜上に局在し、無刺激時には顆粒内に活性酸素を放出しているが、脱顆粒に伴い細胞外に放出するようになると考えられた。
マイコプラズマ滑走運動装置の構造とその変化

もっとも速い速度で運動する,マイコプラズマ=モービレ(Mycoplasma mobile)と,ヒト病原菌であるマイコプラズマ=ニューモニエ(Mycoplasma pneumoniae),トリ病原菌であるマイコプラズマ=ガリセプティカムMycoplasma gallisepticum)の3つを用いて研究を行い,以下の成果を得た(それぞれ(1-3)(4,5)(6))。(1)滑走のギアとして働いているタンパク質,Gli521の構造解析を進めた。分子は3つのドメインからなり,3本の長さ約120ナノメートルの腕から構成されていた。(2)昨年度に見つけた,滑走装置の深部構造にかんする解析を進めた。画像処理により詳細な構造とその大きさを明らかにし,質量分析により構成タンパク質を特定した。(3)滑走装置の進化的由来を議論するため,滑走装置以外の細胞表面に存在して抗原性変化を引き起こしているタンパク質,Mvsplの構造解析を進めた。片側が膜にアンカーされた繊維状の構造があきらかになった。(4)滑走の足のタンパク質である,P1アドヘジンタンパク質の精製方法を改善し,その活性と構造の解析を進めた。(5)滑走装置を支える細胞骨格である「ロッド構造」を観察する方法を再検討した。その結果,構成要素と考えられるタンパク質のそれぞれがロッド構造のどの部分を構成しているのかを調べることが可能になった。(6)トライトンで細胞を処理した後に電子顕微鏡で詳細に観察することで,細胞骨格構造が存在することを明らかにした。また,画像の平均化,マイコプラズマ=ニューモニエとの比較などを用いた解析を行い,細胞骨格構造の概要を明らかにした。もっとも速い速度で運動する、マイコプラズマ=モービレ(Mycoplasma mobile)と、ヒトの病原菌であるマイコプラズマ・=ニューモニエ(Mycoplasma pneumoniae)の両方を用いて研究を行い以下の成果を得た(それぞれ(1-4)と(5-6))。(1)滑走の・ギアとして働いているタンパク質、Gli521を単離精製し、構造を解析した。分子は3つのドメインから成り、3本の長い腕から構成されていることが明らかになった。(2)滑走装置の深部構造を明らかにするため、細胞膜を界面活性剤で少しずつ取りのぞき、電子顕微鏡で観察した。そこには全く新しい、細胞骨格様の構造が存在していた。その構造の形態をトモグラフィーで詳細に解析すると共に、構成する数個のタンパク質を同定した。(3)滑走装置の進化的由来を議論するため、滑走装置以外の細胞表面に存在して抗原性変化を引き起こしているタンパク質、MvspIを単離精製し、その構造を解析した。球状および繊維状の2ドメインから構成されている構造は、滑走装置を思い起こさせるものであった。(4)上記の構造が細胞中でどのように構成されているかを調べるために細胞のクライオトモグラフィー解析を行った。(5)滑走の足のタンパク質である、P1アドヘジンタンパク質を単離精製し、構造を解析した。分子が2つのドメインからなり、1ヶ所の膜貫通セグメントを持っていること、全体としては球状の形態であること、などが明らかになった。(6)滑走装置を支える細胞骨格である「ロッド」を観察する方法を再検討した。その結果、ロッドの片側にモップの様な回転対称体が存在すること、回転対称体が細胞の基部側に位置していること、などが明らかになった。
非線型楕円型方程式の大域理論の比較研究を通じた統一的理解の研究

物理現象を記述するモデル方程式として、場の古典論、流体力学、プラズマ物理をはじめ様々な分野に現れる重要な非線型楕円型偏微分方程式について、今まで個別に用いられることの多かった変分解析、非線型常微分方程式、粘性解理論の手法を総合的に駆使することにより、定在波の安定性や爆発現象を深く説明する方法論を確立し、さまざまな応用を見出した。本年度は、楕円型評価とソボレフ型埋蔵不等式について研究した。楕円型評価については、基礎となるユークリッド空間内の内部領域の伸張パラメタ(例えば原点を中心とする球の半径)に関する依存性を明らかにし、楕円型評価における伸張パラメタに関する〓状依存項と伸張パラメタに依存しない因子とを分離して記述する事に成功した。これにより、全ユークリッド空間における問題と内部領域における問題との関連が、伸張パラメタを通じて具体的に把握する事が可能となった。さらには非線型楕円型方程式系や非線型放物型方程式系への応用も見出し新たな知見を得た。ソボレフ型埋蔵不等式については、動径対称な函数の満たすストラウスの不等式とニイの不等式を、一径数で補間することの出来る一般的な不等式を見出した。これにより、ストラウスの不等式とニイの不等式の統一的な理解が可能となった。さらには動径対称性の仮定が成立しない一般の場合への拡張も研究し、球面方向への若干の滑らかさを仮定すれば同様の不等式が成立する事を証明した。これは同時に全ユークリッド空間では破綻するソボレフのコンパクト埋蔵が、球面方向への滑らかさの仮定の下で回復する事実を主張するものであり、空間的に非均質性をもつ非線型楕円型方程式への応用が期待される。また、有界領域におけるボワンカレの不等式を、全ユークリッド空間におけるスケール不変な不等式に書き換え、その本質が空間伸張に対応する運動群で特徽付けられる事も明らかにした。本年度は、昨年度に引き続き、領域上での楕円型偏微分作用素系についての楕円型評価とユークリッド空間上のガリアルド・ニーレンバーグ型の補間不等式について研究した。楕円型評価については、Reifenberg平坦条件を満たす境界を持つ領域における勾配評価を、分布函数や再配分函数などの実解析的手法により研究した。これにより、昨年度発表した論文"Elliptic estimates independent of domain expansion", Calculus of variations and PDE, 34(2009) 321-339の主定理の内の勾配評価に関する内容を著しく改善する事が出来た。特に、楕円型評価に於ける領域の伸長パラメタに関する依存性を、より精密に記述する事が出来た。同時に、弾性体のラメ方程式系や非線型放物型方程式系への有効な応用も見出した。ガリアルド・ニーレンバーグ型の補間不等式については、ベゾフ系列とトリーベル・リゾルキン系列及びそれらの斉次型不等式を、現在迄知られている場合を全て含むように拡張した。その一連の不等式に於いて現れる、微分可能性・可積分性・総和可能性を示す三種類のパラメタの成すスケール不変な等式が、斉次型では必要充分条件である事も明らかにした。また、新しく見出された補間不等式の新たな応用を、ハートリー型の変分問題とナビエ・ストークス方程式の解の特異性・正則性の問題に対し研究した。粘性解理論においては、未知函数の導函数について優線型の項を持つ完全非線型方程式の弱ハルナック不等式を導いた。本年度は二次相互作用を持つシュレディンガー方程式の連立系、三次の自己相互作用をもつクライン・ゴルドン方程式、微分形相互作用をもつ退化楕円型方程式を主な研究対象として研究した。シュレディンガー連立系については、質量共鳴と解の長時間的挙動との関係について研究した。空間4次元以上ではソボレフ空間の枠組のみで小さなデータによる散乱理論が構築できることが分かった。空間3次元はストラウスの意味で臨界となるが、質量共鳴条件が本質的であることを明らかにし、ガリレイ変換の生成作用素による解の時間減衰に基づいた散乱理論を構築した。これにより、質量非共鳴の条件下でしか知られていなかった解の大域的構造の研究に新たな道を拓いた。クライン・ゴルドン方程式については、空間二次元において成立しない末端ストリッカーズ評価の修正版を、円周方向への可積分性と滑らかさを課す事によって考案し、停留位相の方法を双曲線座標に書きなおすことにより証明を与え、三次の自己相互作用モデルに応用した。微分形相互作用を通じた非局所ハートリー方程式については、動径対称ストリッカーズ評価と、その球面調和函数展開を用いる事により、微分の損失を恢復する手続きを記述し、小さなデータによる散乱理論を構築した。微分形自己相互作用をもつ退化楕円型方程式については、非有界粘性解に対する比較原理の理論を構築し、外力項の可積分性と空間次元との関係について臨界冪の場合も扱えるように一般化した。本年度は主要部がラプラシアンの分数冪となっている非線型シュレディンガー方程式を研究した。

これは無質量の半相対論的古典場のモデル方程式であり、フレーリッヒ・レンズマンのボゾン星の崩壊理論で取り上げられた事もあって、最近特に研究が盛んになっている方程式である。本研究では、非線型楕円型方程式の大域理論の観点から、分数冪シュレディンガー方程式の定在波の存在とその安定性を中心に考察を深めた。その研究過程に於いてCazenave-Lionsの方法論を分数冪の場合に拡張した理論を構築した。また、基底状態の遠方での指数函数的減衰を、動径方向の重みと球面方向の滑らかさを考慮した函数空間において、動径方向の減衰度がもたらすコンパクト性を駆使した変分解析的手法と動径変数に基づいた常微分方程式論的手法を組み合わせる事により、最良の評価を導出した。シュレディンガー方程式の連立系に対しては、新たにラグランジアンを定義する事により、質量共鳴条件と変分構造との関係を見出した。これにより、質量共鳴の新たな役割の記述が可能となり、二次相互作用における波動函数の複素共軛を通じた寄与の意義が、ラグランジュ形式の立場から明確になった。また、関連する函数空間論や調和解析学においてはローレンツ空間や球体上のハーディーの不等式について新たな知見を得た。特に球面上の境界条件が決定的な役割を果たす事を示す反例を構成する事が出来た。これにより、ルレイやラジゼンスカヤが定式化した流体力学の基礎的定式化において零ディリクレ条件が本質的である事が説明可能となった。本年度は二次の相互作用を持つシュレディンガー方程式の連立系とクライン・ゴルドン方程式の連立系を主な対象として研究した。シュレディンガー方程式の連立系については、質量共鳴条件と結合定数条件が解の大域的存在にどのように影響を及ぼすのか研究した。また、小さなデータに対しても解が爆発するような相互作用を見出した。更に定在波解の満たす非線型楕円型方程式系を変分問題として研究し質量共鳴との関連を議論した。クライン・ゴルドン方程式の連立系については、質量共鳴条件下での相互作用の零構造の代数的特徴付けを与えるとともに、小さなデータによる散乱理論をエネルギークラスで構築した。上記研究実績に加え、非線型楕円型方程式系における質量共鳴と云う全く新しい展開を見出し、当初の計画以上の進展に繋がっているため。25年度が最終年度であるため、記入しない。シュレディンガー系の質量共鳴を、定在波の基底状態の解析を通じて非線型楕円型方程式の見地から研究する。シュレディンガー系の質量共鳴を、定在波の基底状態の解析を通じて非線型楕円型方程式の見地から研究し、擬共形構造の下で爆発解の具体的構成に応用する。
リプログラミング関連ｍｉＲＮＡによる肝細胞癌への影響および治療への応用

肝癌細胞株に対してmiR-302を導入し、培養することでiPS細胞と形態学的に類似した細胞塊の出現を認めた。これらは未分化マーカーの発現上昇を認め、分化誘導によって、三胚葉の分化マーカーが上昇していた。そしてこれらの細胞塊は親株と比較し、細胞増殖の抑制、間葉上皮移行の誘導、複数の薬剤に対する感受性の改善、アポトーシス細胞の増加を認めた。miR-302を導入した細胞塊においては、c-Mycの発現が低いことが特徴であり、miR-302の標的遺伝子のなかで、c-Mycの発現に影響のあるヒストン脱メチル化酵素AOF2の関与を認めた。教室においてmiRNAを用いた体細胞のリプログラミングに成功したことから、同じプロトコールを用いた場合の肝細胞癌における影響について検討した。まず、導入すべきmiRNAの肝細胞癌株における発現状況を検討したところ、体細胞のリプログラミングで導入したmiR-302、miR-369、miR-200cのうち、miR-302のみが低発現であったことから、これを中心に導入することとした。体細胞のリプログラミングに準じて同miRNAを導入したところ、iPS細胞と形態学的に類似した細胞塊の出現を認め、アルカリフォスターゼ染色が陽性であった。この細胞塊においては、Nanog、Oct3/4等の未分化マーカーの発現が上昇しており、分化誘導によって、三胚葉の分化マーカーが上昇していた。また、親株と比較し、細胞増殖の抑制、間葉上皮移行の誘導、複数の薬剤に対する感受性の改善、アポトーシス細胞の増加を認めた。続いてメカニズム解析を行った。miR-302の標的遺伝子としては、AOF2, NR2F2, TGFBR2, CDK2などが報告されている。miR-302を導入した細胞塊においては、転写4因子(Oct3/4・Sox2・Klf4・c-Myc)を導入した細胞と異なり、c-Mycの発現が低いことが特徴であった。そのため、上記miR-302の標的遺伝子のうち、c-Mycとの関連が報告されていたヒストン脱メチル化酵素AOF2に着目した。細胞塊ではAOF2の発現低下およびヒストンH3のリジン残基(H3K4)のメチル化を認めた。AOF2の抑制実験では、同様にH3K4のメチル化を認め、さらにアポトーシス、薬剤感受性において、細胞塊と同様の変化を確認した。以上の結果をAnnals of surgical oncologyへ投稿し受理された。今後はヒストン脱アセチル化酵素の影響についての検討および動物実験等による評価が必要と考えている。教室では転写因子を用いたリプログラミング手法を大腸癌細胞株に応用することによって悪性度が低下することを報告した(Miyoshi N, et al. PNAS 2010)。この手法においては転写因子に癌遺伝子であるc-Mycを含むこと、ベクター等により導入する必要があることから、技術的に閾値が高く、この問題点を解決する方法としてmiRNAに着目し、ES細胞とiPS細胞のmiRNAの発現の網羅的解析を通じて、共通に発現するmiRNA(miR-302, miR-369, miR-200c)を導入することで体細胞のリプログラミングに成功したことを報告した(Miyoshi N, et al. Cell Stem Cell 2011)。本年度の研究実績の概要としては、まず肝癌細胞株においてこれらリプログラミング関連miRNA(miR-302, miR-369, miR-200c)の発現を確認した。参考値としてヒト多能性胎生期癌(N-TERA2)を用いた。いずれのmiRNAの発現においても細胞株間で差異を認めた。miR-302においては他のmiRNAとは異なり、N-TERA2と比べ、肝癌細胞株では著明に発現が低値であった。体細胞のリプログラミングにおけるmiRNAの導入プロトコールに添って、肝癌細胞株にトランスフェクション試薬を用いてmiR-302の導入を行ったところ、iPS細胞と形態的に類似したALP活性陽性の細胞塊の出現を認めた。これらの細胞塊においてNanog, Oct3/4などの未分化マーカーの発現上昇を認めた。分化誘導を行うと3胚葉への分化する傾向を認めた。これらの細胞塊は親株と比べ、緩徐な発育、薬剤感受性の改善(5-FU、IFN-α)、アポトーシス細胞の増加を認め、悪性度の低下が示唆された。当初の計画通り、miR-302の導入によりsphereの形成を認め、これらの回収に成功した。これらのsphereにおいて緩徐な発育、薬剤感受性の改善(5-FU、IFN-α)、アポトーシス細胞の増加を認め、悪性度の低下が示唆された。

今までの検討からmiR-302を導入したsphereにおいて悪性度の低下が示唆されており、この機序の解明を行うことにしている。miR-302を導入して形成したsphereにおいてはc-Mycの発現が低下していることも一因の可能性があると考えている。悪性度の低下にはmiR-302のターゲットの中に関与している因子があると思われ、その中から因子の選定を行う。またリプログラミング手法を用いることにより薬剤感受性の改善をもたらすことがわかってきた。教室では肝細胞癌のIFN耐性株を保有しており、今後は耐性株での同様の検討を行うことにしている。癌細胞のリプログラミングにおけるHDAC阻害剤の影響について検討する。これまでのリプログラミングの殆どはES培地を使用しており、その組成はあきらかでない。バルプロ酸(VPA)はリプログラミングの効率をあげたと報告(Huangfu D, et al. Nat Biotechnol 2008;26:795)(Anokye-DansoF, et al. Cell Stem Cell 2011)されており、この培地に代わるものとしてバルプロ酸(VPA)をはじめとした複数のHDAC阻害剤(Vorinostat, Belinostat)を利用する。動物実験においてもリプログラミング関連miRNAの導入による治療効果を検討する。まず、細胞レベルで同リプログラミングを行った肝細胞癌株を用いて異種移植モデル(皮下)での細胞変化に関する検討を行う。続いて、肝細胞癌異種移植モデル(皮下/肝)に対してリプログラミング関連miRNAとHDAC阻害剤を投与する。投与経路としては局注あるいは超音波下に門注を考えている。投与後の腫瘍の増大速度、生存期間などについて比較検討する。1)悪性度低下の機能解明悪性度が低下した機序の解明を行うことにしている。miR-302を導入して形成したsphereにおいてはc-Mycの発現が低下していた。2)耐性株での検討リプログラミング手法を用いることにより薬剤感受性の改善をもたらすことがわかってきた。教室では肝細胞癌のIFN耐性株を保有しており、今後は耐性株での同様の検討を行う。1)HDAC阻害剤のリプログラミングへの影響これまでのリプログラミングの殆どはES培地を使用しており、その組成はあきらかでない。2)リプログラミング関連miRNAの導入による治療効果(動物実験)まず、細胞レベルで同リプログラミングを行った肝細胞癌株を用いて異種移植モデル(皮下)での細胞変化に関する検討を行う。
水中のアニオンを高選択に認識する超分子センサーの開発

ジピリジルカリックス[4]ピロールを合成し、そのシス体、トランス体を単離した。シス体をパラジウム試薬(Pd(II)(OTf)2(PEt3)2)と反応させることで超分子的に籠状分子を形成させることに成功した。籠状分子はオクタン二酸アニオンを1対1で認識することを1H NMRスペクトルの化学シフトの変化から確認した。選択性の高いオクタン二酸アニオンは籠を保持したまま籠の内部の二量体間のNHプロトンに認識され、酢酸アニオンはパラジウムと相互作用して籠を分解することが分かった。このことから籠状分子のサイズにフィットした二酸アニオン(炭素数= 8)を認識することで籠状分子が安定化することが示唆された。本研究では、水中に存在するアニオン(陰イオン)を高選択且つ強力に認識するセンサーを開発するため、アニオン認識部位をアニオンのサイズや形を考慮し、三次元的(カプセル状または籠状)に組織化させた分子の合成を行っている。平成22年度は、アニオン認識部位としてハロゲン化物イオン(F^-,Cl^-,Br^-,I^-)やリン酸イオン等のアニオンを認識することが可能なカリックス[4]ピロールにピリジンを置換した新規分子を合成し、ピリジン部位のパラジウムへの配位を用いた自己組織化により、カプセル状分子の形成が可能か検討した。合成は、トリフルオロ酢酸を触媒として、ジクロロメタン中でピロールとアセチルピリジンを24時間攪拌し、前駆体である1-ピリジル-1-ジピロエタンを得、ボロントリフルオロエーテラートを触媒に1-ピリジル-1-ジピロエタンをアセトンで環化させて5,15-ジピリジル-5^',10,10^',15^',20,20^'-ヘキサメチルカリックス[4]ピロールを合成し、ピリジン置換基から成るシスートランス異性体をカラムクロマトグラフィーで分離した。このピリジン置換カリックス[4]ピロールのシス体にパラジウム試薬(Pd(OTf)_2(PEt_3)_2)を加え、パラジウム錯体を形成した。^1H NMRスペクトルにおいて、ピリジン部位のパラジウムへの配位によるシフトを確認した。またESIマススペクトルにおいて、カプセル状分子(ピリジン置換カリックス[4]ピロールのパラジウム錯体から成る二量体)とこの分子からトリフルオロホスフィンがとれたフラグメントのピークを確認した。以上のことから、ピリジン置換カリックス[4]ピロールのカプセル状分子の形成が示唆された。このカプセル状分子を用いて、認識部位のサイズにフィットした比較的大きなアニオン(Br^-,I^-,リン酸イオン等)についての認識を現在検討している。アニオンに対して高選択性を有する新規な超分子アニオン認識場として、カリックス[4]ピロールにピリジンを置換した分子のPd錯体による籠状分子のアニオン結合性について検討した。アニオンの滴定実験において、籠状分子がHSAB則に基づいて保持または解離することを^1H NMRの化学シフトの変化から確認した。例えばソフトな塩基であるヨウ化物アニオンはパラジウムと相互作用して籠を解離させ、ハードな塩基であるフッ化物アニオン(F^-)は籠を保持したまま籠の内部のNHプロトンとの水素結合により包摂されることが示唆された。また、色素としてアントラキノンを用い、アニオン認識部位として2つのウレア基、ZnO電極へのアンカー部位として2つのカルボン酸を有するアントラキノン誘導体を合成し、ZnO電極に吸着させ、色素増感太陽電池を作製した。この色素は^1H NMRスペクトル(DMSO-d_6中)と吸収スペクトル(DMSO中)を用いたアニオン滴定実験により、F及びMalonateと強く結合することが分かり、吸収スペクトルの長波長シフトを起こすことで色が変化した(F^-:赤→青)、また、ZnO電極上(固体基盤)においても色の変化が見られた。そのため色素をZnO電極に吸着させ、色素増感太陽電池を作製し、性能を評価したところ、アニオン(F^-)を認識させたものは、IPCEの大きな長波長シフトと電流値の増加が見られた。以上の結果より、固体基盤を用いたアニオンの肉眼検出(可視化)と色素増感太陽電池を用いた新規な電気化学的アニオンセンサーの開発に成功した。特定のアニオンに対して高選択性を有する超分子認識場の形成をジピリジルカリックス[4]ピロールを用いて行い、重アセトニトリル、重ジクロロメタン中でのアニオン認識の挙動を検討した。また、アニオンレセプター部のカリックス[4]ピロールの結晶構造をとることで、アニオン認識を三次元的に解析することも検討した。シスジピリジルカリックス

[4]ピロールのPd錯体はジクロロメタンに難溶であること、アニオン溶液を滴下した後は溶解度が上がったことを確認した。これはアニオンによる超分子認識場の安定化、アニオンとの相互作用によるものだと考えられる。1H NMRによるピークシフトよりアニオン認識を確認した。錯体分子はアセトニトリルにジクロロメタンよりは可溶であることを確認した。またアセトニトリル中ではアニオン滴定後コンホメーション変化が起こり安定化し1H NMRによるピークシフトを確認した。アニオンレセプター部である、シスジピリジルカリックス[4]ピロールを酢酸エチル:メタノール=2 : 1の混合溶媒を冷蔵条件下で蒸発させ、プレート型の結晶が形成することを確認した。またこの結晶化の方法で高純度のシス体を精製した。なお、トランスジピリジルカリックス[4]ピロールについては、超分子ポリマー状の結晶構造が得られた。特定のアニオンを高選択に認識させるため、カリックス[4]ピロールにピリジンを置換したアニオンレセプターを合成し、Pd(II)と配位結合させ、約10オングストロームの籠状分子からなる超分子アニオン認識場を形成させた。この籠状分子のサイズにフィットしたアニオンの選択性を検討するため、炭素鎖の長さが10オングストローム付近の二酸アニオン(TBA塩)の滴定実験を1H NMRを用いて行ったところ、炭素数8、炭素数9の二酸アニオンではNHプロトンのシグナルが低磁場シフトしたことから、籠状分子にアニオンが認識されることが示された。特に炭素数8の二酸アニオンに対してはホスト:ゲスト=1:1で強く結合することがJob plotより確認された。炭素数9の二酸アニオンに対しては、ホスト:ゲスト=2:1とホスト:ゲスト=1:1の平衡が示唆された。一方、長さが短い炭素数6、炭素数7の二酸アニオンおよび酢酸アニオンでは籠が分解することが分かった。このことから籠状分子のサイズにフィットした二酸アニオンを認識することで籠状分子が安定化していることが見出された。ジピリジルカリックス[4]ピロールの2つの構造異性体(シス体、トランス体)をカラムクロマトグラフィーで分離することに成功し、Rf 0.33とRf 0.23の成分を得た。この2つの成分は1H NMRにおいて同様のスペクトルを与えるため、シス体、トランス体の判別が困難であった。そこで、それぞれの成分で結晶を作成し、X線構造解析を行った。まず、Rf 0.33の成分をクロロホルム、酢酸エチルを用いた混合溶媒に溶かし、蒸発法で結晶を得、X線構造解析を行ったところ、水を介した水素結合で組織化し、パッキングしている結晶構造をとっていることがわかった。1,2-オルタネイト型の二つのピロールのNHと水分子の酸素原子の間で水素結合し、ピリジンの窒素原子と水分子の水素原子の間で水素結合をした超分子ポリマー構造が得られた。一方、Rf 0.23の成分を用いて結晶を作成し、X線構造解析を行ったところ、同様に水を介した水素結合で組織化した二量体を形成していることが明らかとなった。またシス体にPd試薬を反応させ合成した籠状分子をジクロロメタンに溶解させ、ESI-Massスペクトルを測定したところ、m/z=2656の親ピークが得られた。
東アジア地域における越境型大気汚染（黄砂）の短期・長期曝露による健康への影響評価

本年度は、1対象とする都市部の選択、2解析データの入手とデータセット作成、3データ解析作業を実施した。まず、1対象とする都市部は、日本全国を対象とするなか、まずは黄砂のライダー測定局がある10都府県(宮城、茨城、東京、新潟、富山、大阪、島根、福岡、長崎、沖縄)をサンプル地域として選択した。次に2解析データの入手は、曝露データの入手を試みた。結果として、大気汚染時間値データを上述の10都府県の入手を国立環境研究所及び、各自治体より入手し、データセットの作成が完了した。次に、黄砂の長期影響評価を実施すべく、サンプルの10都府県以外の地域の黄砂データ入手について、調査を行った。その結果、気象庁気象研究所のエーロゾル再解析データの利用が可能であることがわかり、同研究処理データの入手を行った。また、健康アウトカムのデータを同年に目的外申請を行い入手予定であったが、2017年データまでの入手を行うため、次年度(2019年度)へ作業を持ち越した。また、本年度設定したサンプリング10県において、黄砂の長期影響評価を実施すべく、ライダーで測定した黄砂濃度を用いて、健康影響評価(Health impacts assessment)を実施した。同研究内容は、韓国ソウル大学で開催された「Workshop and Symposium for Health Impact and Exposure Assessment of Transboundary Air Pollution in Asia」で、発表を行った。また、同会議において、越境型大気汚染の曝露濃度についても日本の知見について発表を行い、アジアの越境型大気汚染について、アジアの研究者と情報交換を行った。また、同研究内容は、2019年に開催予定である、国際会議でも発表予定である。対象地域の設定及び、曝露データについてはデータセット作成が完了し、順調に進行している。当初の計画予定であった健康アウトカムについては、厚生労働省へ申請予定の年度を曝露データとそろえるために、2017年度までのデータを予定したため、申請を2019年度へ持ち越したため、健康アウトカムのデータセット作成は少し遅れが生じている。一方で、長期影響評価を実施するための黄砂データセットの入手が完了し、動作確認等も完了した。また、サンプリング10県においては、一部解析を前倒しして実施することができ、国際会議での発表も行うことができた点は、2020年度予定の一部を前倒して実施することができた。2018年度から持ち越した、健康アウトカムデータセット作成のために、厚生労働省へ目的外申請を行いデータセットの作成を行う。次に、2018年度に入手した曝露データとの連結を行い、長期影響評価を引き続き実施する。また、同研究内容を、2019年国際環境疫学学会(ユトレヒト)で発表を行う予定である。

健康アウトカムデータの入手予定を、2019年度に持ち越したため、一部解析作業が2019年度へ持ち越した。これにより2018年度購入予定であった、解析のためのソフトとハードウェアの購入を、最新バージョンを解析時に利用するために、2019年度へ、その購入を持ち越した。
微細加工エカンチレバ-を用いた近接光学プローブによる機能性有機薄膜の評価

分子配向制御された有機強誘電体分子(P(VDF/TrFE)薄膜を原子的平坦さで堆積する技術を確立することを目的として、スピンコート法によるグラファイト基板上でのP(VDF/TrFE)薄膜形成過程を原子間力顕微鏡(AFM)で観察し、最適成膜条件を調べた。スピンコート法で作製した薄膜は、その熱処理温度・時間に依存して全体的な表面形状が大きく変化する。熱処理初期過程では基板上に分子鎖が凝集して成長核が形成され、その後3次元成長が始まる。さらに熱処理を続けると、高さ1020nm、長さ100500nmの棒状のアイランドになる。基板が単層の棒状構造で覆われる場合、基板面内の特定方位に揃う棒状構造がしばしば見られた。これらの方位はグラファイト基板面の結晶方位に一致していることから、棒状結晶がエピタキシャル的に成長していると考えられる。2層目の棒状構造においては、配列は無秩序になる。棒状結晶中の分子鎖が、どのような配向するかは、これまでの文献では報告されていないが、本実験による超高真空AFMによる表面形状像には、棒状結晶内部に約20nm幅の細かな縞状構造が存在することが確認され、高分子結晶に特有の高分子鎖の折り返し構造であることが示唆された。熱処理した薄膜試料のX線回折プロファイルは、(200),(110)の結合ピークを示し、β型の結晶であることが確認された。PowderのX線回析プロファイルと比べて、薄膜の(200),(110)のピークは0.5°ほどシフトしており、面間隔が小さくなっていると考えられる。さらに、AFM探針にパルス電圧(-8V10秒あるいは+8V10秒)を加えて局所的な分極反転領域を形成し、その圧電振動応答を観察した。得られた分極領域の半径は100nm程度であり、測定された局所領域の圧電定数は10pm/Vであった。
微生物集団の代謝活動における半導体鉱物材料の役割

電流産生菌の一種であるShewanella loihica PV-4が酸化鉄を豊富に含む深海底から採取されたことに着想を得て、電気化学系に半導体特性を有する酸化鉄のナノコロイドを添加した。すると、微生物がナノコロイドの半導体特性を利用した長距離電子伝達経路を自己構築し、その結果、電流生成能が50倍と飛躍的に増大する現象を見出した。これは、深海底における微生物と鉱物が作り出す新しい生体電子伝達経路の存在を示していると同時に、微生物燃料電池の高効率化に向けて新しい方法論を提供するものである。鉄還元微生物の一種であるShewanellaは、自然界に豊富に存在する酸化鉄を電子受容体として利用し、これらを還元することで生命活動に必要なエネルギーを獲得している。本研究では、Shewanellaが鉄鉱物の多い海底に生息していることに着想を得て、電気化学系に酸化鉄のナノコロイドを添加したところ、電流密度が50倍から300倍も増加する現象を見出した。天然に豊富に存在する鉄酸化物を用い、自然界に近い環境を作るだけで著しく電力生産能が上昇したことは、微生物燃料電池の実用化に向けて興味深い結果であると考えられる。自然界にはFe2O3以外にも、多種多様な機能材料がナノ鉱物という形で存在している。たとえば、FeSは金属、Fe3O4は半金属、そしてFeOOH、Fe2O3、FeS2は半導体としての特性を有する。本研究では、Fe2O3の発見に着想を得て、電気化学セル内部で硫化鉄ナノコロイドの生合成を試みた。細胞を塩化鉄ならびにチオ硫酸ナトリウム存在下で培養すると、細胞懸濁液の色は1時間ほどで変わり始め、約3時間後には黒色の沈澱物が生成した。黒色沈澱物のXPSならびにXRD測定より、微生物の代謝活動によって鉄と硫黄の両方が還元され、準安定相であるmackinawiteナノコロイドが選択的に形成することを明らかにした。さらに、細胞がFeSナノコロイドを介して3次元ネットワーク体を形成することで、微生物からの電流生成は100倍以上に飛躍的に向上した。ここで、mackinawite相が金属伝導を示すことを考慮に入れると、電流の大幅な増大は細胞ネットワーク内部において効率的な電子伝達経路が自発的に構築されたことを示唆している。深海などの太陽光が届かない環境においては、地球内部に貯蔵された還元力が第一次エネルギーとなり多様な生態系を支えている。H2SやH2といった高エネルギー物質を放出するブラックスモーカーと呼ばれる熱水噴出孔では、これらを利用した化学合成細菌によるバイオマス生産が進行し、熱水環境における食物連鎖の底辺を支えている。ブラックスモーカーチムニーについては鉱物学的、構造学的な研究は広く行われてきたが、電気伝導性や電気触媒性については全く着目されて来なかった。本研究では、ブラックスモーカーチムニーの電気化学的な特性の解析を行った。チムニー塊から小片をいくつか切り出し個々の電気伝導性を測定したところ、全ての小片が金属のような高い電気伝導性を有することを見出した。さらに、チムニーの触媒特性を測定した。その結果、チムニー内壁表面による触媒活性により硫化水素が元素状硫黄に酸化され、一方、外壁表面では触媒活性によって酸素分子の還元反応が観察された。以上の結果から、チムニーの内外で最大700mVの電位差を持つ化学反応が進みチムニー壁を横断する電流が流れること示している。しかも、この反応によるエネルギー損失は極めて小さく、チムニーが触媒として優秀であることも確かめられた。チムニー壁は空間的に隔離された熱水と海水のエネルギー差を高効率に電気エネルギーに変換する天然の電池としての機能を持つことになる。これらの結果は、地球の内部エネルギーが海底に放出される際に電気エネルギーに変換されることを世界で最初に実験的に証明したものである。この「熱水チムニー電池」とも言うべき現象は深海熱水活動域の生命活動や物質循環、更には生命の起源を説明する新たなメカニズムとして注目されるであろう。深海底における電気エネルギーに依存した微生物生態系が発見されれば、地球における生命活動の存在可能領域についての理解が大きく変わることが期待される。
超音波ガイド下穿刺吸引細胞診を応用した頸部リンパ節転移の診断

口腔癌の頚部リンパ節転移の精査のために長崎大学医学部歯学部附属病院診断管理料X線検査診断室を受診した患者に対して、当科に設置されている超音波診断装置(Logiq 9 unit, General Electric Yokogawa Medical Systems)を用い、頚部の超音波検査を以下のように実施してきた。I.1)gray-scal法、2)パワードプラ法の画像を収集する。これらの画像所見と部位を統合したいわゆる頚部リンパ節マッピングを作成した。II.これらの患者のなかから特にパワードプラ法において無信号を示すリンパ節を収集した。III.手術により摘出され、病理組織学的所見の得られたリンパ節を上記の超音波画像と対比させた。IV.以上から得られたデータをもとに解析を行い、以下のような結果を得た。1)パワードプラ法において無信号を示すリンパ節の出現頻度は約20%程度であった。2)その中で病理学的に頚部リンパ節転移と診断されたのは45%あった。3)これらのリンパ節に対して、穿刺吸引細胞診は有効であった。口腔癌の頚部リンパ節転移の精査のために長崎大学歯学部附属病院歯科放射線科を受診した患者に対して、当科に設置されている超音波診断装置(Logiq 700 unitおよびLogiq 9 unit, General Electric Yokogawa Medical Systems)を用い、頚部の超音波検査を実施している。現在のところ以下のような進捗状況である。I.1)gray-scale法、2)パワードプラ法の画像を収集する。これらの画像所見と部位を統合したいわゆる頚部リンパ節マッピングを作成する。II.これらの患者のなかから特にパワードプラ法において無信号を示すリンパ節を収集し、穿刺吸引細胞診を実施しようとしているところである。III.これらの患者のなかから手術により摘出され、病理組織学的所見の得られたリンパ節を上記の超音波画像および穿刺吸引細胞診の結果と対比させる。IV.以上から得られたデータをもとにレトロスペクティブな解析を行い、特にパワードプラ法において無信号を示すリンパ節に対しての穿刺吸引細胞診有用性を検討し、頚部リンパ節転移の新しい診断基準を作成することを目指している。次年度は超音波診断学的に困難なリンパ節に対して、新しく導入された最新式MR検査を実施し、各種パラメータにおけるリンパ節像を詳細に検討し、超音波、穿刺吸引細胞診との結果にMRの結果を組み合わせることで、頚部リンパ節転移の診断精度を高めていきたい。口腔癌の頚部リンパ節転移の精査のために長崎大学医学部歯学部附属病院診断管理科X線検査診断室を受診した患者に対して、当科に設置されている超音波診断装置(Logiq 9 unit, General Electric Yokogawa Medical Systems)を用い、頚部の超音波検査を以下のように実施してきた。I.1)gray-scale法、2)パワー・ドプラ法の画像を収集する。
沖縄県におけるヒト免疫不全ウイルスおよびB型肝炎ウイルス重複感染の現状調査

本研究課題は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)およびB型肝炎ウイルス(HBV)に重複感染している患者検体を対象とし、分離されたHIVについては分子系統樹を、HBVについてはゲノタイプ判定を行い、それらの情報を総合的に解析することで、沖縄県におけるHIV感染状況の特徴を明確にし、感染防止対策に貢献することを目的とした。2008年から2015年の期間に当院においてHIV陽性であった686検体のうち、HBsAg陽性の重複感染検体8件(1.02%)の患者血漿を用いて解析を行った。HBVゲノタイプはEIA法による4種類のPreS2抗原エピトープの検出パターンにより判定を行った。またHIVの遺伝子解析には、血漿よりRNAを抽出し逆転写、増幅後にnestedPCRを行って得られたDNAサンプルを使用した。精製したDNAサンプルの塩基配列をダイレクトシークエンス法にて解析し、MEGA6解析ソフトにおいてロスアラモスのHIVデータベースよりリファレンスを得て分子系統樹を作成した。解析した8検体のHBVゲノタイプは6件がゲノタイプA、1件がゲノタイプD、1件はHBs抗原量が低値のため判定保留となった。HIVのシークエンスデータより分子系統樹を、最尤法(MJ法)ならびに近隣接合法(NJ法)にて作成したところ、HBVゲノタイプがAと判定された6件と判定保留であった1件はすべての分離株においてHIVサブタイプBグループに属していた。さらに、これらのうち4件はBグループの中で独自のクラスターを形成しており、HBVゲノタイプもA型と共通していたことから、同一人物由来の遺伝子または亜型の可能性が示唆された。HBVゲノタイプDの1検体についてはPCRにおけるDNA増幅不良のため今回はシークエンスデータを得ることができなかった。今後は、今回HIVシークエンスデータが得られなかったHBVゲノタイプD症例の再解析を含め、より多くの症例のデータを蓄積し解析していくことにより沖縄県における感染状況の特徴を明らかにすることが必要と考えられた。
二様の下垂体幹・前駆細胞ニッチを制御するｅｐｈｒｉｎ／Ｅｐｈシグナリングの解明

本研究では、ホルモン分泌を担う下垂体前葉の機能調節機構を幹細胞という観点から解明することを目的に、下垂体幹細胞ニッチ(微小環境)の制御機構解析を目指す。具体的には1.幹細胞ニッチにおけるephrin-B2/Eph Receptorの解析、2.幹細胞ニッチの単離と制御因子の同定、を行う。本年度の研究成果は以下の通りである。2.下垂体幹細胞ニッチの単離と制御分子の同定:下垂体幹細胞ニッチの存在割合は全下垂体前葉細胞の1%以下と非常に低い。そのため,ニッチの性質、ならびにそこで機能する分子を同定するために、ニッチの単離方法の確立が必須である。前年度までに,ニッチの単離方法、ならびに、それら幹細胞ニッチ由来幹・前駆細胞を用いたホルモン産生細胞へのin vitro分化誘導に成功している。本年度は、胚葉を超えた分化能を有するかに関して解析を行った。結果、2次元培養を行うことにより、外胚葉系以外に、中胚葉系ならびに内胚葉系への分化能を有することを確認した。この結果に関して、筆頭著者として原著論文を投稿し、PLOS ONEに受理された。また、前年度に引き続き、単離したニッチを用いた網羅的遺伝子発現解析を展開している。問題となっていた細胞溶解液の組成を再検討することで、微量サンプルからのcDNA Libraryの作製に成功した。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、ホルモン分泌を担う下垂体前葉の機能調節機構を幹細胞という観点から解明することを目標に、下垂体幹細胞ニッチ(微小環境)の制御機構解析を目指す。1.下垂体幹細胞におけるephrin-B2/Eph Receptorの解析:これまでに我々は、ephrin-B2が下垂体の幹細胞ニッチに発現していることを見出している。そこで、ephrin-B2のパートナー分子の同定を試みた。結果、ephrin-B2と結合が知られる6種類のEph分子のうち、EphB3が下垂体の幹細胞ニッチに局在することを同定した。さらに、ニッチと隣接する細胞においてEphB2が発現することを見出し、EphB3ならびにEphB2が下垂体幹細胞で発現するephrin-B2と相互作用する可能性が示唆された。また、EphB1, B2, B3, B6-quadrupleノックアウトマウス、ならびにEphB1, B3, B6-tripleノックアウトマウスを用いた解析から、ノックアウトマウスで幹細胞の増殖が低下していることを見出した。2.下垂体幹細胞ニッチの単離と制御分子の同定:下垂体幹細胞ニッチで機能する分子の同定を目的に、ラット下垂体組織からニッチの単離を試みた。コラゲナーゼとトリプシンを用いた方法により、10-20程度の細胞で構成される細胞塊として、下垂体幹細胞ニッチの単離に成功した。また、網羅的な遺伝子発現解析を行うために、単離した幹細胞塊を材料としたSAGE解析用cDNALibraryの作製に成功した。現在、次世代シークエンサーを用いた網羅的な遺伝発現解析を実施している。下垂体組織から幹細胞ニッチを単離する方法の構築、また、それら幹細胞塊を用いた網羅的遺伝子発現解析を実施できたことから、下垂体幹細胞ニッチの制御機構解明に向けて、概ね順調に進展していると判断した。1.下垂体幹細胞におけるephrin-B2/Eph Receptorの解析: ephrin-B2が下垂体の幹細胞ニッチに発現していることに注目し、前年度、パートナー分子の同定に成功した。本年度は本研究結果を原著論文にまとめ、投稿し、現在Minor Revision中である。前年度,ニッチを単離することに成功しており、本年度は、それら幹細胞ニッチ由来幹・前駆細胞を用いたin vitro分化誘導を行った。結果、Wnt signalingのアゴニストを添加することで,下垂体ホルモン産生細胞への分化誘導が可能であることを見出した。この結果に関して、筆頭著者として原著論文を投稿し,Stem Cell Researchに受理された。前年度に行った発現解析では、cDNA Libraryの作製過程に問題があり、バイアスがかかっていることが判明した。この問題点に関しては、細胞溶解液の検討を行い、解決した。2つの主要テーマに関して、論文投稿または受理まで到達した。一方で、単離した幹細胞塊を用いた網羅的遺伝子発現解析では、cDNA Library作製過程に問題が生じていることが確認されたが、実験系の改良により、解決済みである。これらのことから、概ね順調に進展していると判断した。