hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
オートファジーは歯周病菌が撹乱した細胞内秩序を再び律するのか？

エンドサイトーシスの評価系の開発が難航し、LYSTのノックダウンの効果の評価が遅れた。またエンドサイトーシスのプロセスに新たにRabタンパク質が関与することが明らかとなり、その効果の解析にも時間が必要とされた。歯周病は歯周病菌とよばれるPorpyormonus gingivalisをはじめとした細菌群の定着感染により惹起される歯肉および歯槽骨での上皮細胞、マクロファージ、破骨細胞などでの過剰な免疫反応がその病因である。特にP.gingivalisは歯肉細胞内にエンドサイトーシスを介して侵入すること、および一部が細胞内の構造を特殊な膜構造により包み込み分解する現象オートファジーにより包まれることが近年観察されているが、しかしその生理的重要性はほぼ未解明のままであった。そこで本研究では、上皮細胞、マクロファージ、破骨細胞でのエンドサイトーシスおよびオートファジーの活性の詳細な検討を行った。その結果、しばしば重篤な歯周病をともなうチャディアックヒガシ症候群の原因遺伝子であるLYSTの機能がP.gingivalisのエンドサイトーシス活性に重要な影響を与えることを見出した。さらにマクロファージおよび破骨細胞に特異的に発現することで、エンドサイトーシスに関与する細胞内輸送因子の同定にも成功した。これらは同時に通常のオートファジーとは異なる様式で進行するミクロオートファジー現象に関わり、細胞内の他のオルガネラの貪食分解を通じて、マクロファージおよび破骨細胞の機能を制御することが示唆された。このようにエンドサイトーシスおよびオートファジーは歯周病発症に関わる重要な細胞内現象であることが示唆され、今後歯周病治癒へ向けたあらたな創薬ターゲットとして検討する必要があると考えられる。歯周病は歯周病菌とよばれるPorphyromonus gingivalisをはじめとした細菌群の定着感染に惹起される歯肉および歯槽骨での上皮、マクロファージ、破骨細胞などの可能な免疫反応がその病因である。この発症過程においてエンドサイトーシスおよびオートファジーがどのように関与するのかはほぼ不明であった。本研究により、Porphyromonus gingivalisの感染にLYSTを介したエンドサイトーシス、および破骨細胞で特異的に発現するタンパク質を介したミクロオートファジーが発見され、それらが歯周病発症に関与する可能性が示唆された。チェディアック東シンドロームの責任遺伝子のノックアウトを計画しているが、進行が遅滞しているため、ノックダウンへと切り替えたためLystのノックダウン、およびオートファジー関連遺伝子のノックダウン、また新たに同定されたRabタンパク質のノックダウンを行い、エンドサイトーシスおよびオートファジーが歯周病菌Pgの生存戦略に与える影響を解析する。28年度が最終年度であるため、記入しない。細胞生物学チェディアック東シンドロームの責任遺伝子のノックダウンを行い、その影響を調べる分担研究者として予定してた研究者が退職をしてしまい、その研究者が予定してた実験系の構築の部分が遅滞が見られた。当初予定したLYST遺伝子ノックダウンの効果の解析のためのエンドサイトーシス解析系の確立が難攻したため、研究におくれが生じた。
生殖細胞のエピゲノムダイナミクスとその制御

本領域は1)生殖系列細胞の発生過程においてエピジェネティックネットワークがどのように形成・維持されるのかを明らかにし、2)エピゲノムの乱れによる生殖細胞の遺伝子発現異常をエピゲノム操作により正常化・機能改善を行うという二つの目標を掲げて5年間研究を行った。その結果、生殖細胞の性決定因子同定、精子幹細胞からの多能性細胞誘導、精子の妊孕性に必須な遺伝子の同定、ヒストンシャペロンの着床における役割の解明、多能性幹細胞からの始原生殖細胞誘導におけるエピゲノム解析などの優れた研究成果が得られ、領域内共著論文は30.6%に及び計画は概ね順調に進んで来た。若手研究者も4名が教授へと昇進した。平成25年度は領域の発足と共に以下の活動を行った。1)領域研究の推進体制の構築:3つの研究計画グループからなる計画研究の方針を確認した。11月に第一回公開シンポジウム(班会議)を大阪大学微生物病研究所で二日に渡り開催し、領域研究の方向付けを確認した。領域研究者間の情報交換、研究リソースの共有などを通じて連携体制の構築を強化する。その際に論文、学会発表、特許公開などで開示されていない情報(最新データやネガティブデータ)に関しても共有できるよう便宜を図った(次の広報の項目参照)。2)研究の広報:広報担当係を決定し、領域ホームページを開設した。研究体制と計画班員のメンバーの陣容を発表すると共に、領域の目的とその成果を、領域内外の研究者、専門家へ広く周知させた。また、ここには班員外のメンバーもアクセスが可能となる領域研究者間の情報交換のための情報交換サイトも作成している。3)研究リソース:遺伝子改変マウスの共有や作製支援、エピゲノム解析支援、顕微授精・クローン作製支援などの研究支援事業についての具体的な実施方法を協議し、その計画を決定した。各計画班員からの情報収集も終え、実際の支援の開始もスタートしたこともあり、支援グループには研究代表者から消耗品についての支援を行った。4)公募研究の決定:平成26年2月28日に新学術領域研究専門委員会が行われた。この場で計画班員3名に加えて、外部委員が参加し、公募研究の方針について協議し決定を行った。5)若手勉強会の開催:本年度は公開シンポジウムの前日より若手勉強会を開催した。口頭発表、ポスター発表を行い、最優秀者1名にはベストプレゼンター賞を授与した。次回の若手勉強会については、最優秀者が中心となって企画し、それを計画班員メンバー1-2名がサポートして行うこととなった。平成26年度においては以下の活動を行った。1)領域研究の推進体制の構築:各計画班を総括班研究代表者がサイトビジットを行い、個々の研究者が行っている研究の進捗状況や公募班を含めた共同研究状況についての確認を行った。また11月には公募研究班も交えた公開シンポジウムを九州大学で開催した。2)研究の広報:領域ホームページにおいて各研究班が発表した特筆すべき業績について別の班員が紹介するという形式で論文発表を行った。またプレスリリースも行っており、その成果は幅広く新聞やテレビにおいて報道された。これに加えて、関連研究分野の研究会の支援も行った。3)研究リソース:これまでに予定していた支援(遺伝子改変マウスの共有や作成支援、エピゲノム解析支援、顕微授精・クローン作成支援など)を公募班も含めて行った。支援グループには研究代表者から消耗品についての支援を行った。4)若手育成:7月につくばにおいて若手勉強会を二泊三日で行った。口頭発表、ポスター発表を行い、最優秀者2名を参加者全員の投票により決定しベストプレゼンター賞を授与した。昨年度と同様に次回の若手勉強会については、最優秀者が中心となって企画し、その研究者が所属する計画班が準備を行いつつある。本年度は主な活動として研究室へのサイトビジット、若手勉強会、中間評価、国際シンポジウムを行った。以下にそれぞれについて説明する。研究室へのサイトビジットは一昨年より開始し、本年度に全て終了した。個々の研究室の実験進捗状況の確認と研究目的の再確認を行い、若手研究者については論文執筆や研究遂行についての助言をするとともに、共同研究支援についての説明も行った。若手勉強会は2015年7月22-23日にかけて伊豆の修善寺で行われた。2014年度のベストプレゼンテイター賞を受賞した慶応大学の大学院生が主催し、各研究室の若手メンバーを中心として合計50名の参加があった。中間評価には10月16日にヒアリングが行われ、本領域は「A]判定と判定された。概ね計画通り、あるいは計画以上の成果が得られているとの評価があった一方で、改善点もいくつか指摘されており、翌年度以降への課題となった。国際シンポジウムは2016年2月17日19日に京大で開かれ、海外7カ国の参加者を含めて合計255名の参加があった。このシンポジウムでは生殖細胞とエピゲノム研究の最先端の研究者を国内外から招聘し、生殖細胞を専門とする研究者とエピゲノムを研究する研究者の融合による、既存のコミュニティーの枠を超えた共同研究や議論を行った。特に我が国の若手研究者が多く参加したことにより、両分野を開拓してきたパイオニアと直接ふれあうことは人材育成の観点からも有意義であったと考えている。本領域では領域設定時に設置した技術支援グループによる班員の支援が功を奏し、計画班員の平均では29.2%、公募班では25.9%が領域内連携による共著論文を作成している。

また現在進行中の領域内共同研究は59件にのぼり、22班のうち17班が領域内で共同研究を行っている。これは当初予測したよりも高い数字であり、このために当初の計画以上に進展しているとした。昨年度行われた中間評価において、「概ね計画通り、あるいは計画以上の成果が挙げられている」と評価を受けた一方で、研究分野が近い他の新学術領域研究との連携を期待したいとのコメントがあったことから、本年度は特にこの点に重点をおいて活動を強化した。具体的には、まずは総括班活動として若手合宿を2016年7月27日から29日まで大分県別府で行った際に「ステムセルエイジングから解明する疾患原理」(幹細胞エイジング班)班と共催を行った。若手合宿では63名が参加し、2名の研究者がベストプレゼンテーター賞を受賞した。これに引き続き、同年11月16-17日にも静岡県三島においての公開シンポジウムも幹細胞エイジング班と共同で行った。シンポジウム参加者は79名であった。両方の会議においても、二つの領域の合同となったために、これまでとは異なった角度からでの意見交換がなされたのみならず、幹細胞エイジング班の領域代表の岩間厚先生とは領域の運営や方向性について意見を交わすことができた。さらにこれに加えて本領域の国際支援班で海外より来日したDr. John R. McCarrey博士と共同で「動物における配偶子産生システムの制御」班と交流を行い、とくに精子形成を研究対象とするメンバー3名と研究打ち合わせを行った。3週間あまりの滞在期間で既存のコミュニティーの枠を超えた共同研究の打ち合わせや議論は双方の研究領域の進展に大きく寄与するものであった。中間評価でいただいたコメントの中でもう一つ問題となった若手研究者の論文の取りまとめや融合研究の促進については、三島で行われた総括班メンバーとの会議の際にも取り上げられ、班外の総括班メンバーからのアドバイスを受け、議論を行った。シニアメンバーからのサポートについては引き続き行っていく予定である。中間審査で指摘いただいたコメントに予想よりも早く対応できた。一昨年度に行われた中間評価において研究分野が近い他の新学術領域研究との連携を期待したいとのコメントを受け、本年度は「ステムセルエイジングから解明する疾患原理」(幹細胞エイジング班)班に加えて、「動的クロマチン構造と機能」(クロマチン動構造班)班も合わせた3つの新学術領域合同の若手勉強会を開催した。2017年6月7日から9日まで和歌山県白浜温泉にて行われた。若手合宿には3領域の代表が全員参加し、合計93名の参加があった。2領域だけの合同班会議だった昨年よりもさらにトピックが幅広い会議であったが、関連している領域であるため非常に活発な議論が行われた。参加者全員による投票で選ばれるベストプレゼン賞は例年より1名多い3名に授与された。合宿での会議に加えて、国際支援班の支援のもと海外からも7名の研究者が訪れた。中でもDirk de Rooij博士(オランダUtrecht大)は、研究内容が近い「動物における配偶子生産システムの制御」(配偶子産生制御班)班の中の特に精子形成を研究対象とするメンバーとも研究打ち合わせを行い、領域間の交流に貢献した。
寺院組織と史料管理システム解明のための書誌学的研究－日本中世寺誌論の構築に基づく

本年度は、本研究課題が対象とする真言密教聖教の生成と集積の意義について、史料集積の大きな流れと個別的な聖教の検討を中心に考察を加えた。まず、中世鎌倉における密教の流入と展開に大きな役割を果たした、鎌倉幕府の有力御家人である安達氏について研究を進め、その成果は「特別展安達一族と鎌倉幕府ーもうひとつの鎌倉時代史ー」の開催(於神奈川県立金沢文庫、2018年7月9月)および同図録の刊行に結実させ、広く一般に成果を公開した。追って研究成果を発表する予定である。「歴史学からみた千字文説草」(仏教文学会12月例会、2018年12月)では、中世寺院に集積された聖教が、教化の過程で説草の形態で流布していくありようを、歴史学の観点からとらえようと試み、中世聖教の裾野の拡がりに言及している。また「特別展顕われた神々ー中世の霊場と唱導」(2018年11月2019年1月)において、そうした多種多様にわたる聖教史料を形態・内容の両面から体系的にとらえ、広く一般に成果を公開した。「室町期における東寺と『東宝記』」(国際日本文化研究センター共同研究:応永・永享期文化論研究会、2018年12月)では、本研究課題が主たる対象とする中世東寺における史料集積の流れとその画期性について考察している。本研究課題の主たる対象である中世東寺について、聖教の集積過程と寺誌の関わりを論究したが、今後得られた課題を克服して、論文として成稿していく予定である。本年度は最終年度として、得られた課題について取り組み、これまでの成果を公開していきたいと思う。適宜補足調査等を実施する必要がある。寺院社会をはじめとする宗教は、日本の古代・中世において政治的・社会的に重要な位置を占めていたことは言を俟たない。本研究は、寺院に集積された膨大な史料を題材として、従来の寺院組織論および寺院史料論の成果をふまえ、近年の文庫研究および宗教テクストにおいて蓄積されてきた「目録」研究を寺誌の検討に生かし、寺院史料調査の成果を積極的に取り入れて、新たな寺院史像を再構築することを目的としている。本年度は、東寺・東大寺・醍醐寺といった中世の有力権門寺院の寺院史料を素材として、寺院史料のなりたちと寺院内部の構造との関係を明らかにしていった。南北朝期に編纂された東寺寺誌『東宝記』や鎌倉中期に編纂された東大寺寺誌『東大寺続要録』を取り上げた。とくに寺院史料のうち寺誌に注目し、寺院の蔵する財物を仏・法・僧の区分をもって捉える思考の構造を、寺誌の編纂過程の解明のなかから析出した。ひとつの寺誌が生成されるに至る多くの寺院史料と、その大成としての寺誌を構造的に読み解くことで、寺院史料の集積と利用について究明した。今後は、寺院史料それぞれが連関して編纂される営為が、真言宗寺院内外においてどのような意味を持つのかについて深めていきたい。中世東寺における寺誌を事例として、寺誌が寺院組織や寺院運営に担った役割について、これまで注目してきたところであるが、寺内にとどまらず、真言宗内あるいは社会全体に与えた影響について、宗教的・社会的な観点から捉え直していきたいと考えている。おおむね順調に進んでいるが、京都での原本調査回数は、当初想定していた回数を下回ったため、その点においてやや遅れている。その分、他箇所での必要な調査を実施できたが、今年度は京都での調査回数を増やして、翻刻等基礎作業に邁進したい。古代・中世の東寺において、さまざまな法会や記録の作成に従事してきた東寺執行家について、分析を進める。東寺執行家に関わる研究は、これまでまとまった翻刻がなく、このことが研究を後らせていると考えられる。

本研究課題では、執行家に伝来した古文書・古記録を積極的に活用することで、東寺執行家の職務全般、とりわけ寺院史料の集積にもたらした影響を中心に明らかにしたい。そのうえで、これまでの東寺研究の中核を成してきた寺僧集団の研究を相対化していく。本年度は最終年度として、得られた課題について取り組み、これまでの成果を公開していきたいと思う。適宜補足調査等を実施する必要がある。次年度当初に必要とする機材の購入にあたり、購入予定物品の追加をしたため、予算が不足したことから、次年度の予算の振り込みがあり次第購入することとした。これにより繰り越しが生じた。次年度に当該物品を購入し、活用することにより、より詳細な調査が可能となり、研究への効果が期待できる。研究の進捗状況および調査先の事情等により、次年度に調査出張する必要が生じたため。次年度執行予定である。
高効率プラズモニック光・電子デバイスの基盤技術開発

表面プラズモン(SP)共鳴を用いた高効率プラズモニックLEDを開発し、プラズモニクスの光・電子デバイス応用のための基盤技術の確立に取り組んだ。主な成果は次の通り。(1)電磁波解析計算により、金属ナノ構造とデバイス構造を最適化できた。(2)超薄P層を持つ高品質InGaN/GaN量子井戸LEDを作製した。(3)様々な金属種を用いたナノ微粒子の作製に成功し、紫外可視の広い波長域でフレキシブルなSP共鳴波長制御に成功した。(4)顕微PLや近接場顕微分光を構築し、発光機構の空間分解評価に成功した。(5)プラズモニックLEDデバイスの作製に成功し、電流注入においても高効率化できることを実証した。本研究の目標である、InGaN系量子井戸を用いた実用化レベルにおける電流駆動の高効率プラズモニックLEDの開発にむけて、初年度は以下の項目について研究を進めた。(1).もともと高い発光効率を有する最高品質のInGaN/GaNにおいて、表面プラズモン(SP)共鳴による高効率化を試みた。研究分担者の山口大学のグループが、GaNの半極性基板上に成長した高品質InGaN/GaN試料を作製し、九州大学においてSP共鳴の効果を測定した。評価方法としては、光励起による発光スペクトルの測定、その温度依存性によるIQEの測定、時間分解発光測定によるPurcell増強ファクターの測定を行った。(2).電磁波解析シミュレーションによる金属ナノ構想の最適化を行った。SPの共鳴波長域と電場増強度は、金属ナノ構造のサイズ・形状等によって変わり、例えばAgナノ微粒子の直径を変化させることにより、SPーフォトン共鳴スペクトルを全可視光域にわたって変調でき、さらに微粒子対や2次元配列構造においては、微粒子間のナノギャップに特に強い増強電場が生じ、距離や配列によって共鳴波長・強度が大きく変わる。よって高効率化したい発光材料に合わせて、金属ナノ構造を最適化することは本目標を達成するためには必要不可欠である。(3).電流注入においてもSP共鳴の効果が有効に得られるように、極薄のP+GaN層を備えたInGaN/GaN系LED構造を作製し、その上に熱処理によって銀ナノ微粒子を作製することによって、電流注入による発光の高効率化を実証できた。(4). SP共鳴を提供する金属としては、多くの場合銀が用いられているが、新たな試みとして銀の代わりにアルミニウムを用いた。それによって予想以上の著しい発光増強効果を得ることに成功した。(1).これまでにP+GaN層のドーピング量、膜厚を最適化することによって、電流注入によっても表面プラズモン(SP)増強効果を示すプラズモニックLEDの試作に成功した。しかし発光の増強度が予想より低かったため、金属ナノ構造の最適化に取り組んだ。クラスター計算の環境を整え、電磁場解析計算をより大規模に効率よく行った。その結果、金属に銀を、透明電極にITOを用いている限り、これ以上の高効率化は困難であり、新たな金属種、デバイス構造を検討する必要があることがわかった。(2).光取り出し構造を最前するためのサファイア加工基板(PSS)を用いて、更なる増強が得られた。このことは、SP共鳴の効果が光取り出し効率の改善に加え、内部量子効率の改善に寄与していることを示している。そこで発光機構解明のため時間分解発光測定を行った。その結果、励起子とプラズモンの相互作用によるPurcell効果によって発光寿命が短縮され、Purcell増強因子は3に達していることがわかった。(3).さらに短波長領域でSP共鳴を示す可能性のあるアルミニウム、インジウム、タンタルを用いて、ナノ微粒子構造を作製した。どの金属種においても粒径数十nmのナノ微粒子が形成され、紫外波長域に局在SP共鳴に起因すると考えられるピークが確認できた。中でもタンタル微粒子は最短波長の200 nmにピークを持ち、新しい深紫外プラズモニクス材料として非常に有望であることがわかった。また青色発光増強には銀の代わりにアルミニウム、インジウムのナノ微粒子を用いることが有効である可能性を示した。本研究の目標であるプラズモニックLEDの試作にはすでに成功している。あとは実用性に耐えうるデバイスに改良するために、金属ナノ構造、デバイス構造の最適化を行い、さらなる高効率化を達成することが肝心である。銀ナノ微粒子構造については、作製条件によって粒径100300nm、波長450750nmの範囲で調整することに成功し、発光増強効果の最適化にも成功した。さらに短波長側でSP共鳴を達成するために、アルミニウム、インジウム、タンタルを用いて、薄膜蒸着と熱処理だけの簡単な方法によって、大面積にナノ微粒子を高密度に作製することにも成功した。特にインジウムナノ微粒子が他の金属よりも短波長領域でSP共鳴を示すことを初めて明らかにした(国内会議で発表。論文準備中)。試作したプラズモニックLEDは、光取り出し効率と内部量子効率の両方が改善されていることを明らかにした。それにより、SP共鳴による効果はもともと発光特性に乏しい材料だけでなく、ある程度高い発光特性を持つ材料をさらに高効率化するのに有益であることを示した(未公開)。これまでInGaN系材料で観測されてきたのは励起子ープラズモン間の弱結合によるPurcell効果であるが、二硫化モリブデン等の単原子層構造に発生する振動子強度の強い励起子と金属ナノ構造を用いれば、励起子とプラズモンが強結合したプレキシトンが観測されることを発見した(Advanced Materialsで発表)。

今後これを利用した新たな光学素子の開発が期待される。前年度までの成果により、P層のMgドーピング量を調節することにより、20nmの膜厚においてもPN接合を形成し、電流注入においても銀ナノ微粒子の表面プラズモン(SP)増強効果を得ることに成功している。しかし得られた増強度は予想よりも小さいものであり、銀ナノ微粒子をITO透明電極で覆った際に、ITOの屈折率が空気よりも大きいため、SP共鳴波長が長波長側にずれることをクラスター計算による電磁場解析計算で明らかにした。これを解決するために、九州大学ではより短波長域にSP共鳴をチューニングする方法を、山口大学ではより長波長で発光する極薄P+GaN層をもつLEDの作製を試みた。アルミニウム、インジウム、ガリウム、タンタルを用いて、ナノ微粒子構造の作製に成功し、紫外波長域においてSP共鳴が得られた。しかしアルミニウムは熱処理では高密度にナノ微粒子を作成することが困難で、インジウムは強いSP共鳴スペクトルをもつがやや長波長で損失が大きいブロードなスペクトルになり、ガリウムはシャープで強いスペクトルを深紫外波長域にもつが融点が30度と低いためにデバイスに使いにくく、最も短波長域に強くシャープなスペクトルが得られたタンタルは不安定で大部分が酸化されている可能性がることなど、様々な問題が明らかになった。そこで新たな方法として、SPモードの結合による共鳴波長チューニングの方法を考案した。金属基板の上に金属ナノ微粒子の多層積層膜を置いたところ、微粒子内の電場振動と、金属基板内に発生したその鏡像による電場振動が干渉し、共鳴スペクトルが2つに分裂し、非常にシャープで強いスペクトルが得られることを見出した。同様に金属基板上にSiO2スペーサーを蒸着し、その上に熱処理で金属ナノ構造を作成したところ、同様の効果が得られ、さらにスペーサー膜厚で広い波長域でフレキシブルに共鳴波長を制御することに成功した。本研究の目標であるプラズモニックLEDの試作にはすでに成功している。あとは実用性に耐えうるデバイスに改良するために、金属ナノ構造、デバイス構造の最適化を行い、さらなる高効率化を達成する必要がある。そこで昨年の研究成果により、従来よりも遥かに強い増強効果をフレキシブルな波長域で得られる可能性が高い方法を発見した。すなわち、金属基板上にSiO2等の薄膜スペーサーを介して金属ナノ構造を作成することにより、SP共鳴モード結合によって非常に強く急峻なスペクトルがえられ、スペーサー膜厚によって広い波頭域で制御することに成功した。例えばアルミニウムで同様の構造を作製すれば、これまでに例のない200nmよりも短波長な深紫外域においても強い共鳴ピークが得られる。また従来の銀ナノ微粒子を用いた際には、300nm800nmの紫外域から近赤外領域において強い共鳴が得られ、その増強度の線幅から従来の10倍以上の増強効果(Purcell効果)が期待できることが分かった。逆に金を用いると1000nmよリも長波長の赤外域において共鳴を制御できる。さらにナノ構造を最適化することにより、より一層の増強効果が得られる可能性があり、今後の展開が期待できる。
PTP4A1の抗癌剤耐性分子メカニズムの解明と新たな内因性耐性遺伝子の同定

我々は、口腔癌によく用いられる抗癌剤シスプラチンの効果を事前に予測するため、耐性遺伝子の検索を行ってきた。今回新たに樹立したシスプラチン耐性株と感受性株を用いて以下の実験を行った。PTP4A1は以前に同定した耐性遺伝子であるが、今回樹立した耐性株および感受性株のPTP4A1 mRNAの発現に有意な差は認められなかった。またJNK阻害剤は耐性株特異的に殺細胞効果を示し、耐性株では感受性株に比べJNKの活性が非常に高かった。このことからJNKの活性化が、シスプラチン耐性に関与している可能性が考えられ、またJNK阻害剤を併用すると耐性癌でも効果を期待できる可能性が示唆された。我々は、シングルセルクローニング法を応用した独自の方法で、これまでにシスプラチン耐性遺伝子を同定してきた。多くの抗癌剤耐性遺伝子の研究で用いられる方法は、耐性株を抗癌剤によって選択的に樹立し、親株との遺伝子発現をマイクロアレイによって検索する方法である。これは主に薬剤によって誘導される外因性耐性遺伝子の検索の方法に適しているとかんがえられる。我々の方法はこれとは異なり内因性のシスプラチン耐性遺伝子に注目したものである。我々はこれまでに内因性耐性遺伝子の一つとしてPTP4A1遺伝子に注目してきた。これまでにPTP4A1を遺伝子導入した細胞はシスプラチンに耐性に働くことを示してきたが、さらに細胞の増殖能が亢進することも明らかとなり、PTP4A1高発現腫瘍が多角的に悪性化に関与していることが示唆された。またPTP4A1発現とシスプラチン抵抗性の関連性を調べるため、実際の患者サンプルを用いて実験を行った。対象とした腫瘍サンプルを、シスプラチンが奏功し再発を認めなかった群(CR群)、シスプラチンが奏功しなかったまたは再発を認めた群(non CR群)の2群に分け、生検時の組織を用いて免疫染色を行った。non CR群ではCR群に比べやや強く染色される傾向がみられたものの、その染色性は弱く判定は非常に困難であった。そのため生検組織からmRNAを採取しPTP4A1の発現量について比較した。non CR群ではCR群に比べ、PTP4A1 mRNAの発現が有意に発現量が高かった。これらのことからPTP4A1はシスプラチン抵抗性と関連性があるだけでなく、臨床応用できる可能性を示唆していた。我々は、口腔癌の生検時に、その癌のシスプラチン耐性あるいは感受性の程度を予測するために、シスプラチン耐性遺伝子の同定を行ってきた。同様の研究はこれまで長く行われてきたが、我々が行っている方法とは大きく異なる。抗癌剤耐性遺伝子には2種類あることが知られている。ひとつは獲得性(外因性)耐性遺伝子で、抗癌剤によって誘導される遺伝子群のうち抗癌剤耐性に働くものを示す。それに対して内因性耐性遺伝子は、抗癌剤によって誘導されるものではなく、癌が本来持っている抗癌剤耐性遺伝子である。これまでのほとんどの研究は耐性細胞を低濃度抗癌剤処理に寄って樹立し、親株との遺伝子発現パターンを比較検討することで耐性遺伝子を同定してきた。しかしこの方法は、獲得性耐性遺伝子をターゲットにした研究である。実際の癌患者が来て、生検を行い免疫染色でその癌の耐性有無を予測する場合には、内因性耐性遺伝子の同定が必要となる。そこで、我々はシングルセルクローニング法を用いて口腔癌細胞株から数種の細胞株を樹立し、それぞれの細胞株の遺伝子発現パターンを比較検討することで、数種の耐性遺伝子を見出してきた。しかし、これら遺伝子群は一種類の細胞株から見つかったもので、口腔癌に普遍的な耐性遺伝子を同定するためには、数種類の口腔癌細胞株を用いて同様の実験を行い、共通する遺伝子群を検索する必要がある。そこで、我々はHSC-3細胞の他にSAS細胞、HSC-4細胞を用いてシングルセルクローニングを行って数種類の細胞株をそれぞれ樹立した。それらのシスプラチン抵抗性をMTS assayを用いけ調べ、シスプラチン耐性細胞および感受性細胞を樹立した。我々は、これまでにシングルセルクローニング法を用いた独自の方法でシスプラチン耐性遺伝子を同定してきた。このうちの一つであるPTP4A1は、強制発現させるとシスプラチンに抵抗性を示すこと、逆にsiRNAでその発現を減弱させるとシスプラチンに対して感受性が高まることを我々は明らかにしてきた。また、PTP4A1が細胞の増殖能を上昇されることから、PTP4A1がシスプラチン耐性能だけでなく、多角的に癌の悪性化に関与していることも示された。しかし、PTP4A1のシスプラチン耐性の機序についてはこれまで不明であった。我々は、RNA結合タンパクであるHuRに注目した。HuRは3'UTR領域にAU rich element(ARE)という特別な配列を持つmRNA(ARE-mRNA)に特異的に結合するタンパクで、HuRと結合したmRNAは安定化しその後翻訳される。PTP4A1はARE-mRNAであることから、シスプラチンによるHuRの細胞内での移動について研究を行いPTP4A1の抗シスプラチン効果の機序について検討を行った。HuRは核内でmRNAに結合した後に細胞質内へ移動し、翻訳の場であるリボソームにmRNAを運ぶ。我々はHuRの細胞内の局在移行にシスプラチンがどのように関与するか調べた。我々の期待どおり、口腔癌細胞株SAS細胞をシスプラチン処理すると、HuRは核から細胞質へその局在を変化させることがわかった。

その結果、ARE-mRNAの一つであるPTP4A1 mRNAは安定化して翻訳され、シスプラチン耐性に関与する可能性が考えられた。我々はPTP4A1を内因性シスプラチン耐性遺伝子と考えてきたが、シスプラチンに反応性に発現量が上昇する獲得性シスプラチン耐性遺伝子でもある可能性が示唆された。我々は、口腔癌に対する抗癌剤であるシスプラチンの耐性遺伝子の検索を行ってきた。これまでの多くの耐性遺伝子の研究は獲得性耐性遺伝子の検索がほとんどで、実際に臨床応用するには内因性耐性遺伝子の同定が必須であるにも関わらずその研究はあまり行われていない。我々は、これまでシングルセル・クローニング法を用い、口腔癌細胞株SAS細胞からシスプラチンに対する感受性が異なる20種以上の細胞株を樹立した。それぞれのシスプラチン抵抗性をMTS assayにて測定しシスプラチン耐性株2種類と感受性株2種類、計4種の細胞株を選択し以下の実験を行った。まず、シスプラチン耐性株および感受性株のPTP4A1 mRNAをリアルタイムPCRにて調べたところ、4つの細胞においてPTP4A1 mRNAの発現に有意な差は認められなかった。次に、JNK, MEL, NF-kB, EGFR, AKT, mTORの各阻害剤を使用してシスプラチンとの併用効果について検討したところ、JNK阻害剤はシスプラチン耐性株および感受性株に対して同程度の殺細胞効果を示し、シスプラチンJNK阻害剤とを併用した実験でも高い併用効果を認めた。耐性株2種類ではJNKの活性が上昇している可能性が考えられたことから、ウェスタンブロッティングにてリン酸化JNKの活性を測定した。予想通り、耐性株2種類では感受性株2種類に比べJNKの活性が非常に高く、シスプラチンで処理した後でもその活性は高く維持されていた。このことからJNKの活性化が、シスプラチン耐性に関与している可能性が考えられ、またJNK阻害剤を併用するとシスプラチン耐性癌でも効果を期待できる可能性が示唆された。我々は、口腔癌によく用いられる抗癌剤シスプラチンの効果を事前に予測するため、耐性遺伝子の検索を行ってきた。今回新たに樹立したシスプラチン耐性株と感受性株を用いて以下の実験を行った。PTP4A1は以前に同定した耐性遺伝子であるが、今回樹立した耐性株および感受性株のPTP4A1 mRNAの発現に有意な差は認められなかった。またJNK阻害剤は耐性株特異的に殺細胞効果を示し、耐性株では感受性株に比べJNKの活性が非常に高かった。このことからJNKの活性化が、シスプラチン耐性に関与している可能性が考えられ、またJNK阻害剤を併用すると耐性癌でも効果を期待できる可能性が示唆された。口腔癌細胞株HSC-3細胞を用いてシングルセルクローニングを行い、数種の耐性遺伝子を同定した。それらは実際にシスプラチン抵抗性と相関関係があった。しかし、臨床検体を用いて免疫染色を行ったところ、それら遺伝子を発現している扁平上皮癌ではシスプラチン抵抗性を示す傾向がみられたものの、その差は十分とは言えなかった。さらに有用な耐性遺伝子を同定するためには、数種の細胞株を用いて同様の実験を行い、それらに共通する遺伝子群を同定する必要がある。
大腸菌DNAポリメラーゼI機能ドメインのゲノム安定性維持機構の研究

ゲノムの安定性を維持し,細胞のがん化を抑制する意味でも,DNA複製は極めて正確に行われなければならなくこの時に起こる自然突然変異を抑制するメカニズムを解明する事は,進化や細胞のがん化の原因の研究にも非常に重要な事である。そこで,本研究では大腸菌の突然変異抑制因子の欠損株を作成し,大腸菌のDNA複製に起因する,自然突然変異のメカニズムを解明する事を目的としている。1つめとして,『大腸菌DNAポリメラーゼI(PolI)の各機能部位における突然変異解析』を行った。DNAポリメラーゼI(PolI)が持っている,3つの機能部位を個々に変異させ,遺伝的な解析を行ったところ,次の様な結果が得られた。(1)5'→3'エキソヌクレアーゼ欠損株は塩基が増加するような変異を抑制していた。(2)3'→5'エキソヌクレーゼ欠損株はトランスバージョン型変異を抑制していた。(3)5'→3'ポリメラーゼ活性欠損株は塩基が減少するような変異を抑制していた。(1)(2)(3)より,Poll単独の突然変異抑制に関する詳細な知見を得ることが出来た。2つめとして,『大腸菌PolIのミスマッチ修復機構』について研究を行った。以前の結果より,PolIは新たにミスマッチ修復系にも関わっていることを示した。そこで,本研究では,PolIのどの部位がミスマッチ修復系に関わっているかを調べ,以下のことが分かった。(1)ミスマッチ修復系遺伝子MutSとPolIエキソヌクレアーゼ活性多重欠損株はトランジション型変異が増えた。(2)MutSとPolIポリメラーゼ活性2重欠損株は塩基が減少する変異の増加を示した。(1)(2)の結果より,PolIのエキソヌクレアーゼ活性はミスマッチ修復系に関わっていることが示唆された。これらの結果は,ポリメラーゼという重要かつ基本的な酵素についての知見を増やし,高等生物への応用に繋がると期待される。
サンスクリット翻訳文献群としてのチベット大蔵経の研究

本計画研究(平成13・14年度)が目指した成果は、チベットへの仏教前期伝播期におけるサンスクリット原典からの翻訳文献(特に、経典と論書)から知り得る、個々のテキストの翻訳者/翻訳グループによる翻訳技術・翻訳用語の特性を個別的に明らかにすることにあった。平成11年秋、高野山大学所蔵デルゲ版チベット大蔵経の完全デジタル資料が完成し、世界で初めて、チベット大蔵経の一つの版全体がPC上の研究分析対象資料として活用できるようになったこと、当該大蔵経収蔵テキストのサンスクリット原典が現存し、校訂テキスト並びに写本のマイクロフィシュ版が公開されていること、などを前提として、ヴァスバンドゥ(世親)に帰せられるチベット翻訳文献群をすべて整理し検討を加えた。世親の諸著作を取り上げたのは、彼が西暦400年頃の聖典伝承を取り上げ、仏教史上初めて、その聖典の用語/表現を解釈(vyakhya)するための軌範(yukti)を提起して、仏教学匠としては、言わばインド古典文献として残る最古の古典解釈学を今に伝えているからである。その作業・吟味の結果、サンスクリット翻訳文献群としてのチベット大蔵経の研究遂行に資すると思われる今後の留意点として、世親が解釈対象とする経本文の文言は、現存のチベット大蔵経カンギュルともサンスクリット写本とも異なる可能性があること、グループによる翻訳手順として、本文翻訳に先行してその注釈書が翻訳されたという作業過程が確認でき、必ずしも本文作者の著述意図通りには翻訳されていない可能性があること、などを明らかにし得た。なお、デルゲ版CD-ROMの画像情報と、The Asian Classics Input Projectで入力されている文字情報とをリンクさせ、語彙検索がPC上で可能となるような試作ソフトを、宮崎泉(京都大学文学部非常勤講師)氏の協力を得て開発することができた。この宮崎ソフトの活用とその公開に向けて、今後とも研究を継続する予定である。本研究において目指す成果は、チベットへの仏教前期伝播期の翻訳文献(特に、経典と論書)から知り得る、個々の翻訳者による翻訳技術・翻訳用語の特性を個別的に明らかにすることである。この研究遂行に当たっては、チベット大蔵経の一つの版全体がPC上で分析可能な資料としてデジタル化されていること、並びに、収蔵テキストのサンスクリット原典が現存し、校訂テキストが公刊されていることの2点を前提として考えている。その内、第1の点は、現在のところ、デルゲ版のみが活用可能である。第2点目については、近年、本邦のインド学・仏教学の研究分野において、貴重なサンスクリット原典がマイクロフイシュ版で公開されている事情を鑑み、従来、世界のインド古典文献研究者たちが拠所としてして来た校訂テキストをも、写本と照合して批判的に吟味しながら取り扱うべき状況となって来ているため、本研究においてもまず第1に、マイクロフィシュ版で公開され、かつ、校訂テキストのあるサンスクリット文献を研究分析対象資料とすることとした。さらに、デルゲ版チベット大蔵経に収蔵されている翻訳文献の内、経典とその注釈書、あるいは、論書とその注釈書というように、一つのセットとして翻訳されている文献に焦点を絞り、少なくとも2つのテキスト資料において確認され得る翻訳事例に検討を加えることとした。このような方針のもと、本年度は、初期大乗経典の代表作品の一つ、ヴァスバンドゥ(西暦400年頃)が注釈を残す『十地経』を取り上げ、その中心テーマの一つである「三界唯心」の経文と、その表明をなすに到る菩薩にとっての「大悲」について、それぞれの表現/用語に対して文脈を重視した分析を行なった。なお、デルゲ版CD-ROMの画像情報と、The Asian Classics Input Projectのもと入力されている文字情報とをリンクさせて、語彙検索がPC上で可能となるソフトについても、目下、検討・開発中である。
歯小嚢特異的発現遺伝子F-spondinの機能解析による歯周組織再生療法への展望

歯小嚢特異的発現遺伝子の機能を検討することで、歯小嚢から歯周組織が形成される分子メカニズムの解明を試みた。本研究結果より、鐘状期の歯小嚢に強く発現するF-spondinはTGF-βシグナルを阻害することにより歯根膜細胞分化を抑制し、歯根膜細胞を未分化な状態に保持させることが示唆された。一方、歯根膜の成熟が必要となる部位・時期にはF-spondinの発現は低下し、歯根膜細胞の分化を進めると推測される。F-spondinがTGF-βシグナルを抑制する分子メカニズムは、TGF-βとの直接結合による作用と細胞膜タンパク質との結合により活性化される細胞内シグナルを介した間接的作用の二つが考えられる。本研究では,歯根膜細胞への分化能を有する初代培養歯原性間葉系細胞(DMC)を実験に供し,歯胚形成において帽状期,鐘状期の限られた期間に発現が認められる歯小嚢特異的発現遺伝子F-spondinのTGF-βシグナルに対する作用の検討を行った.はじめに,TGF-βによる歯根膜細胞分化誘導に対するF-spondinの効果を検討した.DMC,マウス由来歯根膜細胞株MPDL22,およびC3H10Tl/2細胞をTGF-β1で刺激して培養した後,歯根膜関連遺伝子であるペリオスチン,テネイシンNおよびI型コラーゲンの発現を,特異的プライマーを用いて定量的PCR法により検討した結果,ペリオスチンならびにテネンシンNの発現が有意に増加した.さらに,DMC,MPDL22,およびC3H10Tl/2細胞に対して,アデノウイルスを用いてF-spondinの遺伝子導入を行い,TGF-β刺激で刺激して培養した後,前述と同様にして,歯根膜関連遺伝子の発現を特異的プライマーを用いて定量的PCR法により検討した結果,TGF-β依存性のペリオスチン,テネンシンNおよびI型コラーゲンの発現を抑制した.これらの結果はF-spondinはTGF-βシグナルを阻害することにより,歯根膜細胞分化を抑制している可能性を示唆している.次に,F-spondinの効果がTGF-βシグナルに関与しているものか否かを検討する目的で,TGF-βシグナルの伝達分子であるSmad3のリン酸化に対するF-spondinの効果を,蛍光細胞免疫染色により調べたところ,DMCにおけるTGF-β刺激はSmad2/3のリン酸化を著明に誘導すること,またその発現部位は核内に認められることが確認された.現在,F-spondinが過剰発現されたDMCにおけるSmad2/3のリン酸化をウェスタンブロッティング法により検討中である.本研究では,歯根膜細胞への分化能を有する初代培養歯原性間葉系細胞(DMC)を実験に供し,歯胚形成において帽状期,鐘状期の限られた期間に発現が認められる歯小嚢特異的発現遺伝子F-spondinの効果がTGF-βシグナルに関与しているものか否かを検討する目的で,TGF-βシグナルの伝達分子であるSmad3のリン酸化に対するF-spondinの効果を,蛍光細胞免疫染色により調べたところ,DMCにおけるTGF-β刺激はSmad2/3のリン酸化を著明に誘導すること,またその発現部位は核内に認められることが確認された.また,TGF-β誘導性Smadシグナル活性化に対するF-spondinの効果をウェスタンブロッティング法により検討した結果,F-spondinの過剰発現はTGF-βによって誘導されるSmad3のリン酸化を阻害することが明らかになった.次に,TGF-βシグナルに対するF-spondinの転写レベルでの効果を未分化間葉系細胞株C3H10T1/2を用いて検討したところ,DMCと同様に,C3H10T1/2細胞においてもF-spondinの過剰発現はTGF-βによるSmad3のリン酸化を抑制した.また,Smad結合配列(CAGA)を用いたレポーターアッセイを行ったところ,F-spondinはTGF-β刺激によるSmadシグナルの活性化を有意に阻害した.さらに,F-spondinはTGF-βI型受容体ALK5の恒常的活性型変異受容体ALK5 T204D導入により誘導されるSmadシグナルの活性化に対しても抑制的に作用した.本研究では,歯根膜細胞への分化能を有する初代培養歯原性間葉系細胞(DMC)を実験に供し,歯胚形成において帽状期,鐘状期の限られた期間に発現が認められる歯小嚢特異的発現遺伝子F-spondinのTGF-βシグナルに対する作用の検討を行ってきた.これまでの成果により,F-spondinはTGF-β刺激によるSmad3のリン酸化を阻害し,またSmadシグナルを転写レベルでも阻害したことから,F-spondinが歯胚形成過程におけるTGF-βシグナルの制御因子の一つであることが明らかになった.次に,F-spondinの発現に影響を及ぼす因子を検討する目的で,歯胚形成に関与する因子の中であるWnt3a,IhhおよびTGF-βがF-spondin発現に及ぼす効果を調べた.DMCを用いて各因子による刺激を行いF-spondinの発現を検討した結果,DMCにおけるF-spondinの発現は,Wnt3aおよびIhhによって明らかな影響を受けなかった.一方,興味深いことに,F-spondinによって歯根膜細胞分化促進作用が阻害されるTGF-βはDMCにおけるF-spondinの発現を有意に減少させた.したがって,TGF-βはSmadシグナル活性化を抑制するF-spondinの発現を抑制することによりその阻害効果を消失させ,歯根膜細胞分化を促進すると推測された.

つまり,鐘状期の歯小嚢に強く発現するF-spondinはTGF-βシグナルを阻害することにより歯根膜細胞分化に対して抑制的に作用し,歯根膜細胞を未分化な状態に保つと考えられる.一方,歯根膜成熟に伴ってTGF-βは歯小嚢におけるF-spondinの発現を低下させることにより,歯根膜細胞分化を進行させると考えられる.本研究により,歯根膜の分化はTGF-βとF-spondinとの間に存在する連環によって巧妙に制御されていることが示唆された.歯小嚢特異的発現遺伝子の機能を検討することで、歯小嚢から歯周組織が形成される分子メカニズムの解明を試みた。本研究結果より、鐘状期の歯小嚢に強く発現するF-spondinはTGF-βシグナルを阻害することにより歯根膜細胞分化を抑制し、歯根膜細胞を未分化な状態に保持させることが示唆された。一方、歯根膜の成熟が必要となる部位・時期にはF-spondinの発現は低下し、歯根膜細胞の分化を進めると推測される。F-spondinがTGF-βシグナルを抑制する分子メカニズムは、TGF-βとの直接結合による作用と細胞膜タンパク質との結合により活性化される細胞内シグナルを介した間接的作用の二つが考えられる。歯根膜細胞への分化能を有する初代培養歯原性間葉系細胞(DMC)を用いて,TGF-βによる歯根膜細胞分化誘導に対するF-spondinの効果を,TGF-βシグナルに対する転写レベルで検討したところ,F-spondinはTGF-β誘導性の歯根膜細胞分化に対して抑制的に作用することが明らかとなった.次に,TGF-βシグナルに対するF-spondinの転写レベルでの効果を検討したところ,DMCと同様に,C3H10T1/2細胞においてもF-spondinの過剰発現はTGF-βによるSmad3のリン酸化を抑制した.また,Smad結合配列(CAGA)を用いたレポーターアッセイを行ったところ,F-spondinはTGF-β刺激によるSmadシグナルの活性化を有意に阻害した.さらに,F-spondinはTGF-βI型受容体ALK5の恒常的活性型変異受容体ALK5 T204D導入により誘導されるSmadシグナルの活性化に対しても抑制的に作用することがわかっている.現在,F-spondinの発現制御の検討を進めており,当初策定した研究計画書どおりおおむね順調に進展している.小児歯科現在,F-spondinの発現に影響を及ぼす因子を明らかにするために,DMCを用いて歯胚形成に関与するWnt3a,IhhおよびTGF-β1刺激を行い,F-spondinの発現の変化を検討したいと考えている.これまでの成果により,歯根膜細胞分化を負に制御することが明らかになりつつあるF-spondinの発現に影響を及ぼす因子を検討する予定である.歯胚形成に関与する因子は数多く知られているが,その中で特に注目されているWnt3a,Ihh,そしてTGF-βがF-spondin発現に及ぼす効果を検討し,F-spondinの発現制御機構の解析をさらに進めることにより,歯根膜,さらには歯根,そして最終的には歯やその歯周組織の形成の分子メカニズムの解明をめざしたいと考えている.歯根膜細胞への分化能を有する初代培養歯原性間葉系細胞(DMC)を用いて,TGF-βによる歯根膜細胞分化誘導に対するF-spondinの効果を検討したところ,F-spondinはTGF-β誘導性の歯根膜細胞分化に対して抑制的に作用することが明らかとなった.
サンゴ礁群集の造る帯状分布パターンの形成機構の解明と群集遷移モデルの構築

サンゴ礁には様々な生物群集が生息し、それらは海岸とほぼ平行に帯状に分布している。この帯状分布は、岸から沖にかけての様々な物理・化学的な環境パラメータの勾配によって形成されていると考えられるが、その詳しい成因やメカニズムについてはまだ良く分かっていない。この環境勾配に伴ったこの空間的な群集の遷移メカニズムを理解することは、環境変動による時間的な群集遷移を理解する上でも重要である。そこで、本研究の目的は、サンゴ礁群集の帯状分布が、どのような物理・化学条件によって形成されるかを明らかにすることである。前年度は、今回サンゴ礁群集の分布がどのような環境パラメータによって規定されるかを検討するため、石垣島白保サンゴ礁域で礁を横断しながら海岸から50m1000mまでを50m間隔で計6回採水を行い、温度、塩分、pH、アルカリ度および栄養塩類(全窒素、全リン、硝酸、亜硝酸、リン酸など)を測定した。また、平衡計算によりその他の炭酸系パラメータ(全炭酸、アラゴナイト飽和度、CO_2フガシティーなど)も求めた。本年度では、前年度に加えて、人為的な汚染が進んでいる轟川河口域にも測線を追加し、両測線のベルトトランゼクト法による群集調査と、両測線上50m間隔での採水を夏季4回、冬季4回行った。それらの結果、サンゴ礁生物群集は岸から沖に向かって帯状構造が確認されると供に、水温・塩分・栄養塩濃度等の環境パラメータは岸沖方向に明らかな勾配が生じていることが確認された。そこで、それらのデータを基に群集被度と環境パラメータとの関係を比較し、一般化線形モデルを用いて群集被度を環境パラメータの関数としてモデル化した。モデルにより再現された群集被度分布は、実際の被度の分布パターンを概ね良く再現することが確認された。そこで今回サンゴ礁群集の分布がどのような環境パラメータによって規定されるかを検討するため、石垣島白保サンゴ礁域で礁を横断しながら海岸から50m1000mまでを50m間隔で計6回採水を行い、温度、塩分、pH、アルカリ度および栄養塩類(全窒素、全リン、硝酸、亜硝酸、リン酸)を測定した。さらに、白保サンゴ礁に流入する河川水や流域の湧水や井戸水などの陸水も採取し、同様の項目を測定した。その結果、陸水はアルカリ度、全炭酸、栄養塩類ともに海水よりも高ことが分かった。また、海岸付近の海水は、外洋よりも低塩分かつアルカリ度や全炭酸、栄養塩濃度が高いことが分かり、陸水の影響を受けていることが示唆された。さらに、以前に同測線上の調査によって得られているサンゴ礁群集の被度データと海水の化学成分のデータを比較した。その結果、陸側に見られるアマモ群集の分布域は栄養塩の高い陸水の影響のある範囲に限られること、サンゴ群集は陸水の影響の及ぶ範囲にはほとんど生息しないことなどが明らかとなった。
分泌マイクロRNAの分泌様式と機能による分類

がんの発生・悪性化の過程では、複雑でダイナミックな周囲の環境変化が生じており、がん細胞の増殖や浸潤・転移能の維持に必須である。所謂、がん微小環境の維持には、がん細胞から分泌されるサイトカインや成長因子などが重要であるが、細胞外小胞(Extracellular vesicles: EVs)や分泌マイクロRNA(miRNAs)の機能も極めて重要であることが解ってきた。がん細胞から分泌されるmiRNAsは、受け手細胞の遺伝子発現プロファイルのリプログラミングを可能とし、細胞特性を大きく変化させることに貢献している。しかしながら、がん細胞が如何にして特定miRNAを選別し、どのような分泌様式で細胞外へと分泌しているのかその詳細は不明な点が多い。エクソソームを含むEVsは、miRNAの細胞外分泌の主要な担体であると考えられている。当研究グループは、特定miRNAのエクソソームへの取り込み機構に関する研究を行ってきた。肺がん、膵臓がん、大腸がん細胞株のエクソソーム画分に濃縮されるmiRNAプロファイルを取得し、これらの細胞内発現量の相関を検討すると、2種類のメカニズムでmiRNAが分泌されている可能性が考えられた。一つは、細胞内発現量と正の相関を示す細胞外miRNAであり、内在性の発現量が分泌量を規定していると推察される。一方、細胞内での発現が低いのにもかかわらず、細胞外の存在量が多いmiRNも存在する。我々の結果から、このタイプの細胞外miRNAは、エクソソームに内包されておらず、タンパク質複合体として存在していることを見出した。本研究では、様々ながん種の細胞外miRNAの存在様式を詳細に、且つ、網羅的に解析し分類する。また、それらの機能を検討し、細胞外miRNAをカタログ化する。さらに、新規のmiRNA分泌に関与するタンパク質複合体を同定する。肺がん細胞株および肉腫細胞株の細胞外miRNAの解析から、複数のmiRNAががん細胞の培養条件によって分泌される量が変化することがわかった。超遠心法によりエクソソーム濃縮画分を調整し、さらにショ糖密度勾配遠心法で分離し、栄養状態によって変動する画分の検討を実施した。低栄養状況でがん細胞を培養した際に、上昇する特定のフラクションが存在することがわかった。ここには、miRNAとともに当研究室で同定した細胞膜タンパク質も増加することから、この膜タンパク質が局在・介在する細胞外小胞を利用して分泌が亢進している可能性が考えられた。当該膜タンパク質にタグを導入し、さらにドキシサイクリンで誘導可能な安定細胞株を作出した。この細胞にドキシサイクリンを添加し、タグに対する抗体で蛍光免疫染色を行うと、細胞内に小胞状の局在を認めた。興味深いことに、細胞膜近傍ではアクチンファイバーと共局在することから、Microvesicle様の小胞、もしくは様式で分泌されていることが強く示唆された。事実、密度勾配遠心法でも、典型的なエクソソームマーカーとは局在が完全には一致していない。これらの知見から、がん細胞は栄養状態に依存した、細胞内メカニズムを利用して特定のmiRNAを細胞外へと放出していることが示唆された。一方、この画分に局在するタンパク質分子を網羅的に解析する必要性も強く示唆された。本年度の研究から、miRNAの分泌様式、特にがん細胞が晒された環境状況に応じて、特異的なmiRNAを分泌することが強く示唆された。これは、微小環境への適応を考える上では極めて重要な知見である。本研究の細胞外miRNAのカタログ化に向けて、まずはこの画分に濃縮されるmiRNAとタンパク質分子を同定することが必要となる。方法としては、密度勾配遠心法によって濃縮した当該画分(各々を異なる培養条件下で調整)を用いて、miRNAマイクロアレイ、および質量分析によりタンパク質の同定を試みる。質量分析に関しては、膜タンパク質がメインとなるために、その調製方法に注意が必要だと考える。通常の濃縮を経て全量を質量分析に資すると、膜局在のマーカータンパク質が検出しにくいという問題が生じる。実際に、イッムノブロッティングで強く検出できるマーカータンパク質が、質量分析では、そのフラグメントがほとんど検出できないことが多い。したがって、脂質二重膜を除去し、タンパク質を濃縮したのちに質量分析に資する必要がある。来年度は、タンパク質の調製法の検討を加えて、膜タンパク質を十分に検出できる実験系を用いて質量分析を実施し、当該画分に培養栄養状態に依存して濃縮される分子を網羅的に解析する。また、当研究室で同定している膜タンパク質についても、免疫沈降等により複合体を濃縮し質量分析によりその構成成分を解析する。当該分子は、細胞内で膜小胞に局在することが示唆されており、細胞分画法でも、膜局在が強くしさされる。したがって、上記と同様に免疫沈降を実施する際の条件検討を実施し、適切な条件で複合体を濃縮し、質量分析による網羅的解析を実施する。