hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生体吸収性高分子材料を用いたハイブリッドペプチドの徐放性注射製剤の開発

EGFR2R-lyticハイブリッドペプチドを全身投与後血中で長時間安定に存在させ抗腫瘍効果を増強させるために、生体吸収性高分子材料を用いハイブリッドペプチドの徐放性製剤を作製した。in vitroにおいてペプチドが時間経過とともに複合体から徐々に放出されることが確認され、in vivoにおいてペプチド単体と比べ、複合体ではペプチドの腫瘍組織への到達量増加並びに抗腫瘍効果増強が認められ、さらにペプチドの血中濃度ー時間曲線下面積(AUC)の増大及び半減期(T1/2)の延長が確認された。我々の研究グループで発明されたEGFR2R-lyticハイブリッドペプチドはin vitroとin vivoレベルで癌細胞特異的に殺細胞効果と抗腫瘍効果を示し、新規抗がん剤としての有用性が確認された。しかし、臨床応用に向けては全身投与による血中安定性の向上が必要である。本研究では、生体吸収性高分子材料を用いて、EGFR2R-lyticハイブリッドペプチドの血中での放出を制御することにより血中動態を安定化させ、薬効を高めることを目的としている。平成25年度は、主に下記の研究内容を行った。(1)生体吸収性高分子材料ゼラチンハイドロゲルを用いた徐放性ペプチド複合体製剤の作製。アニオン化ゼラチンPI 5(等電点5.0)との静電的相互作用を利用し、小さい粒径の安定した徐放性ペプチド複合体を作製した。(2)in vitroにおける徐放試験。ウシ胎児血清を用いた生体内を考慮した環境でペプチドが徐放性ペプチド複合体から時間依存的に徐々に放出されるかどうかを確認した。(3)in vivoにおける徐放試験。EGFR高発現癌細胞を皮下移植した担癌マウスモデルを用い、ペプチド単体と比べ、複合体処置ではペプチドの血中半減期の延長、ペプチドの腫瘍内送達の向上並びに抗腫瘍効果が増強されるかどうかを確認した。我々の研究グループで開発されたEGFR2R-lyticハイブリッドペプチドは癌細胞特異的に殺細胞効果と抗腫瘍効果を示し、新規分子標的抗がん剤としての有用性が確認された。しかしながら、臨床応用に向けては全身投与による血中安定性の向上が必要である。本研究では、生体吸収性高分子材料を用いハイブリッドペプチドの血中での放出を制御することにより血中動態を安定化させ、薬効を高めることを目的とした。平成25年度には、ゼラチンハイドロゲルを用い静電的相互作用によりペプチド/ゼラチン複合体を作製し、ウシ胎児血清を用いたin vitroにおける徐放試験並びにEGFR高発現癌細胞を皮下移植した担癌マウスモデルを用いてin vivoにおける徐放試験を行った。引き続き、平成26年度には、新たな高分子材料であるチオール化カルボキシメチルデキストラン(CMD-Cys)を用い、予めシステイン残基を導入したEGFR2R-lytic-Cysのシステイン同士のS-S結合による複合体(CMD-s-s-Peptide)を作製し、ペプチド/ゼラチン複合体と同様にin vitro及びin vivoにおける徐放試験を行った。その結果、in vitroにおいてグルタチオン(GSH)存在下状態ではペプチドが複合体から徐々に放出され、in vivoにおいてペプチド単体と比べ複合体ではペプチドの血中半減期の延長、ペプチドの腫瘍内送達の向上及び抗腫瘍効果が増強された。以上の結果から、ハイブリッドペプチドを高分子材料と組み合わせることにより、ペプチドの血中での放出を制御しその結果ペプチドの血中内の安定性及び薬効を改善出来ることが確認された。医歯薬学H25年度の研究計画の内容に関して、予定していた生体吸収性高分子材料ゼラチンハイドロゲルを用いたハイブリッドペプチドの徐放性注射製剤の作製ならびに、in vitro及びin vivoにおいてペプチドが複合体から時間経過とともに放出され、ペプチド単体よりも優れていることが確認できているために、おおむね順調に進展している。今後は、臨床実績のある新たな高分子材料チオール化カルボキシルメチルデキストランを用い、予めシステインを導入したEGFR2R-lyticハイブリッドペプチドのS-S結合によるペプチド複合体を作製し、ゼラチンハイドロゲルと同様にペプチドの体内動態を改善できるかどうかを確認する。H25年度には生体吸収性高分子材料ゼラチンハイドロゲルとハイブリッドペプチドの静電的相互作用により作製した徐放性ペプチド複合体がペプチド単体よりも優れていることが確認された。引き続き、次年度には新たな高分子材料であるチオール化カルボキシルメチルデキストランを用い、予めシステインを導入したハイブリッドペプチドのS-S結合による徐放性ペプチド複合体を作製し、ゼラチンハイドロゲルを用いた実験と同様な検討を行う。H26年度の研究費の使用計画としては、次の項目で使用予定である。EGFR2R-lyticハイブリッドペプチドの薬理作用を最大に発揮させる理想の徐放性ペプチド複合体製剤調製するために、導入率の高いチオール化カルボキシルメチルデキストラン合成実験の試薬類とシステイン導入したペプチドの購入等。IVIS分子イメージングを用いたペプチド血中動態実験を行うために、蛍光色素の購入等。動物実験のための動物購入、保守費用等。

細胞培養を行う上で必要な細胞培養用プラスチック及びガラス器具類等。その他、実験で必要となる試薬類等。また、研究成果発表のための費用等である。
圧縮センシングのための画像辞書への確率分布アプローチ

本研究は,圧縮センシングによる画像処理の為の辞書行列(画像辞書)の従う確率分布の表式を明らかにし,それを応用して,普遍的かつ実用上重要な“画像の複雑さ等に対する画像辞書サイズのスケーリング則"を導出すると共に,画像辞書を高速に生成可能にすることを目的としている.具体的には,今年度は特に“確率分布からの画像辞書の高速生成"というテーマの研究を計画していた.しかし,昨年度から継続中の“画像辞書サイズの従うスケーリング則の解析的評価"という,より重要な課題が解決していないため解析を継続した.今年度も,画像生成モデルとして“最近接近傍相互作用を有するガウスモデル"を仮定し,統計物理学のレプリカ法を応用した解析的性能評価を実行した.画像サイズと画像辞書内の基底ベクトル数の比を一定に固定して,両者が共に非常に大きい漸近的な状況の下で,画像処理性能を決定するパラメータ群を同定した.また,それらの満たす非線形連立方程式を導出した.今年度は特に,以前は数値的にしか得られなかった解を解析的に得ることに成功し,昨年度得られた結果の一部修正が必要なことが判明した.その結果,“画像の複雑さ等に対する画像辞書サイズのスケーリング則"について,疎性パラメータの1次の摂動レベルまで導出に成功した.圧縮センシングによる画像処理の解析的性能評価を,統計物理学のレプリカ法を応用して実行した.画像サイズと画像辞書内の基底ベクトル数の比を一定に固定して,両者が共に非常に大きい漸近的な状況の下で,画像処理性能を決定するパラメータ群を同定し,それらの満たす非線形連立方程式を導出した.これら非線形連立方程式の解析解の,漸近形の導出は大変困難であったが,ようやく解決に至った.上記に時間を要したため,現状では,他の課題への着手が若干遅れている.昨年度の未解決課題である(1)“エッジを生成可能な画像辞書の従う確率分布"の作成については,画像生成モデルとしてガウスマルコフ確率場モデルを採用して解析を行う.また,今年度の課題である(3)“確率分布からの画像辞書の高速生成"については,再生性を有する多変量確率分布関数を中心に,どのモデルが画像生成モデルとして適しているかを数値的に調査する.本研究は,圧縮センシングによる画像処理の為の辞書行列(画像辞書)の従う確率分布の表式を明らかにし,それを応用して,普遍的かつ実用上重要な“画像の複雑さに対する画像辞書サイズのスケーリング則"を導出すると共に,画像辞書を高速に生成可能にすることを目的としている.具体的には,今年度は特に,次の2テーマを計画していた.(1)(特に,エッジを生成可能な)画像辞書の従う確率分布の解析的導出(2)画像辞書サイズの従うスケーリング則の解析的評価(1)については,画像生成モデルが“最近接近傍相互作用を有するガウスモデル"のとき,画像辞書の従う確率分布と,その有限な共分散行列の表式の解析的導出を行った.“エッジを生成可能な画像辞書の従う確率分布"については,複数のモデルが候補として考えられるため,画像処理に有効かつ圧縮センシングに適したモデルを検討中である.(2)については,画像生成モデルが“最近接近傍相互作用を有するガウスモデル"のとき,統計物理学のレプリカ法を応用した解析的性能評価を行った.画像サイズと画像辞書内の基底ベクトル数の比を一定に固定して,両者が共に非常に大きい漸近的な状況の下で,画像処理性能を決定するパラメータ群を同定し,それらの満たす非線形連立方程式を導出した.“画像の複雑さに対する画像辞書サイズのスケーリング則"については,未だ解析中である.上記の研究成果は,物理学会の秋季大会と年次大会を中心に発表した.画像生成モデルが“最近接近傍相互作用を有するガウスモデル"のとき,画像辞書の従う確率分布の有限な共分散行列の表式の解析的導出は,非常に困難であると当初予想されたが,既にそれを完了することが出来た.その一方で,“エッジを生成可能な画像辞書の従う確率分布"については,複数のモデルが候補として考えられるため,画像処理に有効かつ圧縮センシングに適したモデルを未だ検討中である.また,圧縮センシングによる画像処理の解析的性能評価を,統計物理学のレプリカ法を応用して実行した.画像サイズと画像辞書内の基底ベクトル数の比を一定に固定して,両者が共に非常に大きい漸近的な状況の下で,画像処理性能を決定するパラメータ群を同定し,それらの満たす非線形連立方程式を導出した.“画像の複雑さに対する画像辞書サイズのスケーリング則"の導出が,残された課題である.本研究は,圧縮センシングによる画像処理の為の辞書行列(画像辞書)の従う確率分布の表式を明らかにし,それを応用して,普遍的かつ実用上重要な“画像の複雑さ等に対する画像辞書サイズのスケーリング則"を導出すると共に,画像辞書を高速に生成可能にすることを目的としている.具体的には,今年度は特に“確率分布からの画像辞書の高速生成"というテーマの研究を計画していた.

しかし,昨年度から継続中の“画像辞書サイズの従うスケーリング則の解析的評価"という,より重要な課題が解決していないため解析を継続した.今年度も,画像生成モデルとして“最近接近傍相互作用を有するガウスモデル"を仮定し,統計物理学のレプリカ法を応用した解析的性能評価を実行した.画像サイズと画像辞書内の基底ベクトル数の比を一定に固定して,両者が共に非常に大きい漸近的な状況の下で,画像処理性能を決定するパラメータ群を同定した.また,それらの満たす非線形連立方程式を導出した.今年度は特に,以前は数値的にしか得られなかった解を解析的に得ることに成功し,昨年度得られた結果の一部修正が必要なことが判明した.その結果,“画像の複雑さ等に対する画像辞書サイズのスケーリング則"について,疎性パラメータの1次の摂動レベルまで導出に成功した.圧縮センシングによる画像処理の解析的性能評価を,統計物理学のレプリカ法を応用して実行した.画像サイズと画像辞書内の基底ベクトル数の比を一定に固定して,両者が共に非常に大きい漸近的な状況の下で,画像処理性能を決定するパラメータ群を同定し,それらの満たす非線形連立方程式を導出した.これら非線形連立方程式の解析解の,漸近形の導出は大変困難であったが,ようやく解決に至った.上記に時間を要したため,現状では,他の課題への着手が若干遅れている.“画像の複雑さに対する画像辞書サイズのスケーリング則"の解明は非常に重要なテーマであるので,最優先課題として取り組む予定である.しかし,画像処理性能を決定するパラメータ群の満たす方程式は,複雑な非線形連立方程式であるため,先ずはそれらを数値的に解いて,上記スケーリング則の解明にアプローチする.その後,数値的なアプローチで得られた所見を生かして,解析的なアプローチに着手する.他方,“エッジを生成可能な画像辞書の従う確率分布"の作成については,解析的取り扱いの可能性や数値シミュレーションによる性能評価に基づいて,画像処理に有効かつ圧縮センシングに適したモデルを決定する.昨年度の未解決課題である(1)“エッジを生成可能な画像辞書の従う確率分布"の作成については,画像生成モデルとしてガウスマルコフ確率場モデルを採用して解析を行う.また,今年度の課題である(3)“確率分布からの画像辞書の高速生成"については,再生性を有する多変量確率分布関数を中心に,どのモデルが画像生成モデルとして適しているかを数値的に調査する.学会の開催地および参加日数により,旅費の支出額は計画時より多少増減するため,今年度は助成金に剰余が生じた.上記の剰余は,次年度以降の同様の事情による旅費の増減に対応するために使用する.3月に物理学会と国際会議へ合わせて出張し,学会への行きの交通費と1泊分の宿泊費のみを科研費から支出したため,旅費の支出額が予定よりも少なくなりました.この剰余は,来年度の研究成果発表のための,旅費として使用致します.
懸濁性物質が水環境中の微量化学物質輸送に果たす役割に関する調査研究

1.富山県の和田川ダム貯水池ならびに流入河川・水路水中の農薬と変異原物質の季節変化特性を週1回定時の調査により解明した。あわせてSS,E_<260>,COD,窒素,リンなど基本的な水質項目も分析した。調査地点は貯水池内に1地点(表層ならびに下層),流入河川・水路で3地点とした。農薬はシマジン,チオベンカルブ等について分析したが,1993年9月以降検出されなかった。変異原性はAmes Test(TA98,TA100;S9mix添加,無添加)により分析したが,いずれのサンプルも陰性であった。農薬使用量の増加する1994年4月以降,降雨時の詳細調査を含めて,調査を継続する予定である。2.降水中の農薬,変異原物質,基本的水質について調査し,季節変化特性を明らかにした。月1回程度の頻度で主要な降水について調査した。1993年9月以降農薬は検出されなかったが,Ames Testによる変異原性はTA98,TA100いずれの菌株についてもS9mix添加,無添加にかかわらず陽性であった。変異原性発現物質は自動車排ガスや固定発生源からの汚染物質と考えられるが,今後検討していく予定である。3.底質中の有機物,農薬,変異原物質の含有量を分析し,懸濁性物質への吸着量との関係について検討するため,予備的な試験を実施した。今年度は変異原試験のための底質の試料量,抽出方法等について検討した。
ラット肝科学発癌系での癌細胞の発生と増殖を抑制する因子の解析

本研究では、ラット実験肝化学発癌系を使い、肝癌発生過程で新たに出現してくる遺伝子をスクリーニング、その中から実際に癌化の引き金や癌細胞の成長に関連する遺伝子を単離し、さらにヒトの遺伝子ホモログを同定することにより、ヒト肝臓癌における発癌過程やその成長過程における遺伝子発現調節機構を明らかにする事を目的としている。また、種々の癌マーカー遺伝子も同定できると考えられ、肝癌診断の新しい検出プローブの開発も可能である。実際にサブトラクション法、ならびにPCR法を併用することで、肝臓癌特異的に発現の上昇している遺伝子を116個同定した。これらの遺伝子の塩基配列を一部決定したところ、31種類の独立した遺伝子を確認し、正常肝臓と比較して肝臓癌で発現量が著しく増加している2種類のクローンを選択、全塩基配列を決定した。ホモロジー検索の結果、一つのクローンはCysteine Sulfinic Acid Decarboxylase(CASD)であることが判明した。本酵素はタウリンの前駆体となるヒポタウリンを合成する。興味深いことにこの酵素はγ-アミノ酪酸(GABA)の合成酵素であるグルタミン酸デカルボキシラーゼ(GAD)の配列と全長にわたって80%以上の高い相同性を示した。GADはインシュリン依存性糖尿病や神経系の疾患であるステイフマン症候群における自己抗原として報告されている。われわれも同様にラット化学発癌系で癌の発生にともない血液中に自己抗体(抗CSAD抗体)が出現することを確認しており、臨床的見地からみてきわめて興味深いタンパク質である(平成7年度生化学会、癌学会、分子生物学会で発表、J.B.C.に投稿中)、現在、ヒトの肝臓癌と抗CSAD抗体との関係について解析を進めている。また、もう一つのクローン(CRT1)は、転写因子であるヒトXBP1(X-box Binding Protein 1)/TREB5(Tax Responsive Element Binding Protein 5)とアミノ酸レベルで80%以上の相同性を示した。TREB5は成人T細胞白血病ウイルス(HTLV-1)由来の転写活性化因子Taxにより活性化されるHTLV-1のLTRに結合する因子として発見されている。TaxはLTR上に結合したTREB5と相互作用すると考えられることから、CRT1は細胞の癌化に積極的に関与することが示唆される(平成7年度癌学会、分子生物学会)、また、Taxに結合する細胞内因子はウイルスによる細胞の癌化だけでなく、化学発癌の過程においても重要な役割を有すると考えられる。癌化の過程を転写レベルで解析していく上で、たいへん興味深い転写因子である。今後、さらにこれら二つの因子について細胞の癌化との関わりを詳細に検討していく予定である。
若年雇用者における健康状態・自殺の背景要因に関する研究

わが国における代表サンプルを用い、職種を考慮しつつ、若年雇用者の労働時間や援助希求行動(help-seeking behavior)などと身体的・精神的健康状態との関連を検討するため、「国民生活基礎調査」の二次利用によるデータセットを構築し、予備的解析を行った。本年度では、国内外における、年齢層別・業種・職種別の健康状態と、労働時間および援助希求行動を中心としたその背景要因に関連する先行研究の文献レビューを実施した。その結果、メンタルヘルスに関する労働者の援助希求行動については、軍隊、医療専門職、救急、警察官、消防士など特定の業種・職種のみを対象とした研究が主であった。上記のレビューを踏まえ、本研究では、多様な職種の労働者を対象とし、援助希求行動とメンタルヘルスの双方を調査項目に含み、かつ、代表性のある標本調査として「国民生活基礎調査」を活用することとした。統計法第33条に基づき、厚生労働省に対して「国民生活基礎調査」の調査票情報の目的外使用を申請した。厚生労働省から、2016年「国民生活基礎調査」のうち、世帯票および健康票の調査票情報の提供を受けた。対象は、全国から層化無作為抽出された224,208世帯の世帯員568,426人であった。このうち、主に仕事をしている2059歳の雇用者で、日常生活における悩み・ストレスを報告した者について、年齢層別に労働時間や援助希求行動の有無と精神的健康との関連を検討するためのデータセットを構築した。今後、上記データセットの分析を継続し、その結果を疫学系の国際誌に原著として投稿するとともに、産業保健系の国際学会にて発表する。交付申請書に記載した計画のとおりに進捗しているため。本年度の研究で構築したデータセットをもとに、引き続き若年雇用者の労働時間や援助希求行動と身体的・精神的健康状態との関連を検討する。近年、わが国において長時間労働や職務ストレスによる精神障害・自殺が深刻な問題になっている。本研究では、既存統計資料を活用して勤務問題による若年被雇用者の自殺死亡の特徴の分析を行った。2014年2016年におけるA県の警察自殺統計の提供を受け分析を実施した。3年間の自殺死亡者のうち、被雇用者1,200人を本研究の分析対象とした。被雇用者の自殺死亡者のうち、約35%が39歳以下であった。残差分析の結果、職業については、「サービス業従事者」で39歳以下が多かった。自殺の原因・動機のひとつに「勤務問題」が報告されていた被雇用者は全体の20%であり、39歳以下で多い傾向がみられた。39歳以下の被雇用者の23%で「勤務問題」が自殺の原因・動機のひとつとして挙げられており、原因・動機として最も多かった。また、「勤務問題」がみとめられた事例の半数以上は「勤務問題」のみが報告されていた。原因・動機として「勤務問題」が報告されていた事例を年齢層別に分析した結果、「勤務問題」以外の原因・動機としては、年齢層を問わず「健康問題」が多かった。「勤務問題」の詳細について見ると、39歳以下、40歳以上ともに「仕事疲れ」が最も多かったが、40歳以上では「職場環境の変化」が多いのに対し、39歳以下では「職場の人間関係」が多い傾向がうかがえた。本研究の結果は、若年被雇用者における、長時間労働による過労や職場の人間関係などの勤務問題に関連する自殺予防対策の重要性を示唆するものと考えられた。わが国における代表サンプルを用い、業種・職種を考慮しつつ、若年労働者の労働時間・雇用形態などの要因と健康状態との関連を検討するためのデータセット構築および予備解析を実施予定である。

本年度の研究で構築したデータセットをもとに、引き続き若年雇用者の労働時間や援助希求行動と身体的・精神的健康状態との関連を検討する。年度途中で所属研究機関を変更し、学会出張などを他の経費でまかなうことができたため。次年度は学会出張などの経費は本研究費から支出する。専門的知識の提供などにかかる人件費等が見込みと異なり不要であったため。次年度使用額については、国際誌に投稿中の論文の出版料、別途投稿を予定している論文の投稿料・英文校正費などが見込まれるため、これらに充当させる。
局所的ゲノム編集とウイルストレーシング法を用いた細胞種特異的な視覚情報処理の解明

網膜からの視覚情報は、視床外側膝状体(LGN)を経由し、6層からなる大脳皮質一次視覚野(V1)に送られる。この際、マウスでは異なる2つのフィードフォワード経路が並列階層的な情報処理を行い、図形特徴をV1で検出する。一方V1第6層の細胞は、LGNへフィードバック投射する。本フィードバック経路の理解は、初期視覚情報処理の重要な基盤にも関わらず、フィードフォワード経路に比べ大きく遅れている。我々は、ウイルストレーシング法およびCRISPR/Cas9システム法を解剖・生理学的実験に適用し、技術的に解析が困難であった、V1第6層からLGNへのフィードバック経路の様式・機能を細胞種レベルで明らかにする。
海洋酸性化の評価に関連したサンゴ骨格のホウ素同位体比分析(海洋pH変動解析)

本研究では,近年の人為的な大気中二酸化炭素濃度の上昇に伴って,海洋へ吸収された炭酸イオン濃度の上昇により懸念される「海洋酸性化」の影響を評価することを目的とした。具体的には,太平洋北半球のグアム島沖のサンゴの骨格に記録されている「サンゴ年輪」のホウ素同位体比の分析から過去約200年間の海洋のpHの変動の様子を読み解くことを目指した。海水中には,B(OH)3とB(OH)4-の2種のホウ素溶存種があり,それぞれの溶存種はpHの変化にあわせて同位体比が変化し,特にpHが7.59.5の範囲で変化程度が大きいことが知られている。サンゴ骨格にはB(OH)4-のみが取り込まれることから,その同位体比組成から骨格形成時の周辺海水のpHを推定することができる。本研究期間では,グアム島沖のサンゴ骨格柱状コア試料を用いて、1940年1999年までの1年分毎の試料のホウ素同位体比を測定し、過去60年間の同海域の表層海水のpH変動の復元を試みた。本コア試料は1787年1999年までの記録を保持していると考えられるが,1940年以前の部分については,現在5年毎でのサンプリングを終了し,分析を行っている途中である。約20mgの試料を酸分解し,この一部を本研究で開発したマイクロ昇華法を用いてホウ素の分離を行った。測定には台湾・成功大学のマルチコレクター型誘導結合プラズマ質量分析計(MC-ICP-MS)を使用した。分析精度はサンゴ骨格標準試料ICp-1の再現性でみると±0.25‰(2σ,n=20であり、pH値に換算すると約±0.03に相当する。復元されたpHは0.25の変動幅を持ち、不規則な変動パターンを示す。この変動幅はグレートバリアリーフのサンゴ骨格から報告されているホウ素同位体データと比べると約半分である。グアムのホウ素同位体比(δ11B)の変動は,Pacific Decadal Oscillation(PDO)やWestern Pacificindex(WP)との強い相関は認められず,この点もグレートバリアリーフのパターンと異なっている。グアムのδ11Bから,本地域では1940年1999年にかけて約0.4‰の減少(pHで0.05の減少)が推定される。1)サンゴ骨格等の炭酸塩試料に特化した効率的なホウ素の分離・抽出技術を検討した。イオン交換樹脂や特殊抽出樹脂を使用したカラム分離法を用いず,ホウ素を昇華させる方法(マイクロ昇華法)を検討し,スタンタード試料に関しては回収率が100%に近い良好な結果を得た。2)極微量のホウ素のTIMSによる高精度同位体比分析の手法を検討した。微量のホウ素のイオン化に適した陰イオン法を使用するNegative-TIMS法を検討した。5ngのホウ素をホウ素抜きの海水を使用して,フィラメントへ添加することで安定したイオンビームを得ることができた。イオン化の際の同位体分別をどのように一定にするか,今後の課題である。3)サンゴ骨格試料の微小領域を正確に採取するための技術改良を行った。高精度マイクロミルを用いて,薄片試料上の目的箇所のサンプリングを試みた。結果は良好であった。今後は実サンプルに適用する予定である。グアムのホウ素同位体比(δ11B)の変動は,Pacific Decadal Oscillation(PDO)やWestern Pacific

index(WP)との強い相関は認められず,この点もグレートバリアリーフのパターンと異なっている。グアムのδ11Bから,本地域では1940年1999年にかけて約0.4‰の減少(pHで0.05の減少)が推定される。
低利用資源植物アマランサスの非栄養成分の分析と生理作用

アマランサスの種子(Amaranthus hypochondriacus K-343)1.4kgを乳鉢で粉砕し、塩化メチレンにて浸漬後、吸引濾過し、エバポレーターで濃縮を行なった。この操作を4回繰り返して塩化メチレン抽出物を得た。続いてアセトン、メタノールにおいて同様にして抽出を行ない各抽出物を得た。塩化メチレン抽出物に関しては、シリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー(ヘキサン-塩化メチレン-酢酸エチル系)を行い、25のフラクションを得た。このうちの7つのフラクション(ヘキサン-塩化メチレン[1:1]溶出区分2フラクション、酢酸エチル5%溶出区分1フラクション、酢酸エチル10%溶手区分1フラクション、酢酸エチル20%溶出区分1フラクション、酢酸エチル30%溶出区分2フラクション)と各抽出物(塩化メチレン抽出物、アセトン抽出物、メタノール抽出物)について、リノール酸を基質とした水-アルコール系で抗酸化活性を測定した。7つのフラクションのうちの2フラクション(酢酸エチル20%、30%溶出区分)とアセトン抽出物には天然の抗酸化化合物α-トコフェロールよりも強い抗酸化活性がみられ、また塩化メチレン抽出物と2フラクション(ヘキサン-塩化メチレン溶出区分、酢酸エチル30%溶出区分)にも酸化の開始を遅らせる効果があることがわかった。これら活性を有するフラクションについて補助金により購入したHPLCを用いて分析を行なったところ、多数のピークが検出され、抗酸化活性を有する成分の存在が確認できた。現在、各フラクションについて精製を行なっており、今後さらに、オープンカラム、分取HPLCを組み合わせて精製を行ない、単離した成分について、各種機器分析による構造解析と各単離成分の抗酸化活性を測定する予定である。
局所K-Ar年代法による隕石衝撃変成年代測定の試み

隕石衝撃年代決定に必要な極微量のArとK濃度測定を行うため、ArはパルスNd:YAGレーザーにて抽出し質量分析計で、Kはレーザー照射の際に発生するプリューム光の分光(LIBS)によって測定するシステムを開発した。抽出される40Ar量は微量であるため、装置のバックグラウンド低減を行い、従来の約1/10 (108atoms)にすることが出来た。また、LIBSシステムを設計・開発し、地球岩石試料からのK検出に成功した。昨年度に引き続き、希ガス分析装置の開発・製作を行った。レーザー照射および分光のための光学設計・作成が終了し、テスト試料をもちいたレーザーアブレーションによる発光分光に成功した。本研究で作成したレーザー照射・分光光学系は、Nd:YAGパルスレーザーの基本波(1064nm)を試料表面に導入しつつ、同一光路上に分光光学系を置くというこれまでに存在しない新しい光学系である。この光学系は、1)薄片試料観察が容易、2)任意の局所領域にレーザーアブレーションが可能、3)分光用光学的に明るい(元素定量分光感度が高い)、という優れた点を持つ。また、レーザー照射と分光で共通の対物レンズを用いているためシステムが簡便であり、試料交換に伴う光学系の再現性に優れる。従って、レーザー発光分光(LIBS)による元素の定量においての再現性向上が期待できる。また、希ガス同位体質量分析部の改良においては、40Arのバックグラウンド低減が重要であったが、装置全体での40Arバックグラウンドを<5E-12 cm3STPという極微量にまで下げることが出来た。これは始原隕石にふくまれる直径50マイクロメートルの斜長石でも年代測定が可能となる条件に相当する。これらの成果の一部は、学会及び研究会等において報告した。一方、今年度は真空配管部品に度重なる不具合が発生したため、研究計画に若干の遅れが生じ、実際の試料分析までは到達していない。しかし、数ヶ月中には標準試料および岩石試料の分析を行えるめどがついたため、今後は早急に実際の試料分析を行う予定である。放射性同位体40Kの娘核種である40Arを用いた局所K-Ar年代測定法を確立し、隕石衝撃変成年代を測定することが本研究の目標である。そのためには、パルスNd:YAGレーザーをもちいて隕石試料薄片の局所(直径数十ミクロン)から希ガスを抽出する必要があるが、抽出されるガス量はきわめて微量であり、装置に起因するバックグラウンドガスが無視できないことが予想される。このため、レーザーガス抽出専用の真空ラインの設計・開発を行った。これに加え、既存の真空ラインも改良を加え、質量分析装置全体としての低バックグラウンド化を行った。イオン源の低バックグラウンド化のため、イオン源に使用されているステンレス部をタンタルあるいはモリブデンで置き換えることを予定している。そのため、既存のイオン源の採寸を行った。次年度において新たなイオン源を製作し、テストする予定である。パルスレーザー照射の際に発生するプリューム光の分光によって試料中カリウム濃度測定を行うことを目標としているが、そのために必用な紫外・可視域用の分光器および冷却CCD検出器を選定した。選定基準として、目的波長領域において高感度であること、パルスレーザーと同期して分光測定が行えることとした。選定・購入した分光装置を用いて、地球岩石試料(アンデサイト)薄片に大気中にてパルスレーザー照射した際に発生したプリューム光の分光テストを行い、先行研究と同等のスペクトルを取得することに成功した。また、局所領域のレーザー照射・分光を可能にすべく、専用の光学系も設計中である。次年度は真空中においた試料での分光テストを地球および隕石試料に対して行っていき、実際の試料の年代測定を行う予定である。希ガス分析装置の開発はほぼ予定通りに進んでいる。一方、局所領域へのレーザー照射・分光のための光学設計も進めている。ダイクロイックミラーの設計において適当なコーティング選定に多少時間がかかっているが、研究計画を大きく遅らせるようなことは無い。LIBSのテスト分析も予想より良い成果が得られたので、設計した装置の制作・組立が終われば、次年度も研究計画通りに進むと思われる。今年度設計・作成した真空装置の実用に向けた試験を行う。また、カリウム定量のための分光装置測定条件の最適化、プリューム発生条件の検討・試験などを行っていく。数%のカリウムを含む鉱物が存在する地球および隕石試料の薄片を作成し、局所K-Ar年代測定をおこなう。希ガス質量分析および分光用光学系に必要な消耗品を購入。隕石試料の購入。研究成果発表に伴う旅費。
周期ナノフォーカシングアレイによるプラズモニックラマンセンサーの開発

表面プラズモン共鳴を用いたバイオセンサーは、分子の結合反応をリアルタイムで高感度に検出できることから注目されている。しかしながら、1分子検出には至っておらず、より大きな光増強やラマン増強が要求されている。光をナノ領域にフォーカシングすると、ナノ空間に光エネルギーを閉じ込め、表面増強ラマン散乱で局所場増強の高い制御が可能となる。本論文では、ホール作製時におけるアスペクト比を利用したナノフォーカシングアレイを作製し、その光学特性を評価した。また、より大きな増強を得るために周期ナノフォーカシングアレイ構造の最適条件を検討したので報告する。本研究の目的は、プラズモンナノフォーカシング構造と表面増強ラマン散乱(Surface Enhanced Raman Scattering:以下、SERS)との融合を図った単一分子ラマンセンサーの開発である。本センサーを実現するにあたり、これまで困難とされていた1分子の結合反応がリアルタイムで高感度に検出することが可能となる。平成22年度の研究実施計画には、数値計算による最適構造の模索とその試料作製、試料評価の3つに大別される。第1に、有限差分時間領域法を用いた数値計算においては、周期ナノフォーカシングアレイの原理確認を行った。また、フォーカシングホール径やホール間隔、膜厚におけるそれぞれの最適値を検討した上で、最適構造を決定した。さらに、アレイ化による光学特性の変化を明らかにした。第2に、所定の基板にスパッタ法による金薄膜を成膜し、集束イオンビームリソグラフィ法により周期ナノフォーカシングアレイを作製した。ここでは、数値計算により得られた最適構造の作製に成功した。第3に、作製した試料評価においては、顕微鏡下で透過や散乱光による線形光学特性を測定可能な光学系を構築した。そこで、作製した試料の透過ならびに散乱光スペクトルを測定した結果、計算結果と定性的によく一致した。さらに、当初の予定を大幅に推進し、顕微鏡下におけるSERS測定系を自らの光学系においても構築した。これらの研究成果ならびにその関連発表としては、論文7報と学会発表15件(内、国際会議7件、国内会議8件)である。以上のことから、平成22年度の研究実施計画を着実に遂行したと考えられる。本研究の目的は、表面プラズモンをナノ領域にフォーカシングさせる構造を作製し、表面増強ラマン散乱効果の増加を図った単一分子ラマンセンサの開発である。平成23年度の研究実施計画には、昨年に引き続き、数値計算による最適構造の最適化とその試料作製、試料評価の3つに大別される。第1に、有限差分時間領域法を用いた数値計算により、これまでの最適構造条件(フォーカシングホール径やホール間隔、膜厚)に加え、さらにホールの周期性依存電界強度特性や光の入射方向依存光学特性について検討し、最適な構造条件を決定した。第2に、所定の基板に真空蒸着法による金薄膜を成膜し、集束イオンビームを用い、周期ナノフォーカシングアレイを作製した。第3に、作製した試料評価の線形光学特性より、数値計算結果との定性的な一致を示した。これらの結果より、最適構造では大きな電場増強を示すことから、表面増強ラマン散乱による測定ではある特定分子の高感度検出が可能であると考えられる。その他、本研究成果を発展させ、多岐に渡る応用が可能なプラズモンチップを提案し、その基本原理を確認した上で、特許を申請した。これらの研究成果ならびにその関連発表としては、論文4報と学会等発表19件(内、国際会議10件、国内会議8件、展示会1件)、特許1件である。以上のことから、平成23年度の研究実施計画を当初の計画以上に遂行したと考えられる。
分子マーカーを用いた保全のための調査法のマニュアル作成

生物多様性の保全は、生物多様性国家戦略で指摘されているように、自然環境保全の大きな柱の一つである。生物多様性の保全のためには、絶滅の恐れがある種の生育地を改変せず、現状のまま維持すべきである。しかし、人間の経済活動は、必ず自然環境の破壊を伴う。やむを得ず開発を行う場合、その種に対する影響を最小限にとどめるためには、個体群の遺伝的特性をもとに定量的な影響評価を行う必要がある。そこで申請者らは、秋の七草の一つに数えられ、河川敷の植生の基本的構成種でありながら近年その数が激減し絶滅危惧種にあげられるフジバカマと,愛知県を中心に局所的に分布しているシデコブシ,更に普通種であるタンポポを対象とし,現代用いられている一般的な分子マーカーによる集団構造解析法を用いて調査し、各種植物の集団の遺伝子多様度を明らかにするとともに、得られた分子データと申請者の行った過去の調査から保全のための共通分子集団解析マニュアルの創生を目指している。14年度フジバカマは中部地方,北陸地方,関東地方で,サンプリングを行った。シデコブシについては,以前サンプリングしたものを用いた。基本的に,植物材料は20個体から一枚ずつ葉を採集して研究室に持ち帰り、10程度の酵素種についてアロザイム多型解析を行った。その結果,シデコブシは集団内および集団間の分化が大きかった。それに対して,フジバカマは,集団内の変異が小さかった。15年度は,新たにタンポポの採集を行った。また,14年度までに抽出しておいた全DNAサンプルをもちいて,特定領域のダイレクトシークエンス,マイクロサテライト、RAPD法などの解析をし,その結果から分子マニュアルの作成を行った。生物多様性の保全のためには、基本的には各種レッドリストに掲載されているような絶滅の恐れがある種の生育地を改変せず、現状のまま維持すべきである。しかし、人間の経済活動は、多かれ少なかれ、必ず自然環境の破壊を伴う。それを行う際,対象とされる植物集団の遺伝的状況を明らかにする必要がある。そこで申請者らは、秋の七草の一つに数えられ、河川敷の植生の基本的構成種でありながら近年その数が激減し絶滅危惧種にあげられるフジバカマと,愛知県を中心に局所的に分布しているシデコブシとその近縁種を対象とし,現代用いられている一般的な分子マーカーによる集団構造解析法をすべて用いて調査し、日本国内のフジバカマ集団の遺伝子多様度を明らかにするとともに、得られた分子データと申請者の行った過去の調査から保全のための共通分子集団解析マニュアルの創生を目指している。14年度フジバカマは中部地方では愛知県木曽川流域,北陸地方では富山県付近,関東地方では,渡良瀬遊水池およびその周辺でサンプリングを行った。基本的に植物材料は20個体から一枚ずつ葉を採集して研究室に持ち帰り、10程度の酵素種についてアロザイム多型解析を行った。シデコブシは,15年度に近縁種であるコブシおよびキタコブシのサンプリングを行う予定である。また、各集団から採集したうちの1枚の葉から15年度の解析に備えてDNA抽出も行った。15年度は,14年度までに抽出しておいた全DNAサンプルをもちいて,マイクロサテライト、DNAマーカーを用いたシーケンス,RAPD、AFLPなどの解析をおこなう予定である。

生物多様性の保全は、生物多様性国家戦略で指摘されているように、自然環境保全の大きな柱の一つである。生物多様性の保全のためには、絶滅の恐れがある種の生育地を改変せず、現状のまま維持すべきである。しかし、人間の経済活動は、必ず自然環境の破壊を伴う。やむを得ず開発を行う場合、その種に対する影響を最小限にとどめるためには、個体群の遺伝的特性をもとに定量的な影響評価を行う必要がある。そこで申請者らは、秋の七草の一つに数えられ、河川敷の植生の基本的構成種でありながら近年その数が激減し絶滅危惧種にあげられるフジバカマと,愛知県を中心に局所的に分布しているシデコブシ,更に普通種であるタンポポを対象とし,現代用いられている一般的な分子マーカーによる集団構造解析法を用いて調査し、各種植物の集団の遺伝子多様度を明らかにするとともに、得られた分子データと申請者の行った過去の調査から保全のための共通分子集団解析マニュアルの創生を目指している。14年度フジバカマは中部地方,北陸地方,関東地方で,サンプリングを行った。シデコブシについては,以前サンプリングしたものを用いた。基本的に,植物材料は20個体から一枚ずつ葉を採集して研究室に持ち帰り、10程度の酵素種についてアロザイム多型解析を行った。その結果,シデコブシは集団内および集団間の分化が大きかった。それに対して,フジバカマは,集団内の変異が小さかった。15年度は,新たにタンポポの採集を行った。また,14年度までに抽出しておいた全DNAサンプルをもちいて,特定領域のダイレクトシークエンス,マイクロサテライト、RAPD法などの解析をし,その結果から分子マニュアルの作成を行った。
神経終末に存在するボツリヌス神経毒素標的蛋白の検出とシナプス機能に於ける役割の解明

ボツリヌス毒素は、脳神経系に働き神経伝達物質の拡出抑制や神経細胞壊死などの特異作用を惹起する。我々は既にボツリヌス毒素中C_1とDにADPリボシル化酵素が存在し、脳神経組織において分子量21Kの特異蛋白を修飾することを見出してきた。本年度は、この反応の毒素作用発現に占める役割と基質蛋白の神経細胞における役割を解明するため、まずこの基質蛋白の精製と同定を行った。1.基質蛋白の精製はADPリボシル化基質活性を指標としてウシ副腎を材料に行った。この結果、基質蛋白を細胞上清より収率2%で1800倍精製した。最終標品はSDS-PAGE上分子22Kに単一蛋白バンドを呈し、ADPリボシル化基質活性の他に、GTP結合活性、GTPase活性を示した。このことから、ボツリヌス毒素のADPリボシル化基質蛋白は、低分子量のGTP結合蛋白の一種であることが明らかとなり、我々はこれをGbと名付けた。また、ラット各組織においてこの蛋白の分布を検討した結果、これが脳神経系に極めて高含量に存在することが明らかとなった。2.この蛋白の正体を更に明らかにするため、精製蛋白の部分アミノ酸の配列を解析し、既知蛋白・遺伝子のアミノ酸及び塩基配列との相同性を検討した。この結果、Gbがアメフラン神経節より単離されていたrho遺伝子の推定アミノ酸配列と高い相同性(88%)を示すことが明らかとなった。これによりGbはrho遺伝子産物であると推論された。以上、本年度の研究は、ボツリヌス毒素がrho遺伝子の産物である低分子量のGTP結合蛋白質をADPリボシル化していることを示したものである。rho遺伝子はrasがん遺伝子の類似性より細胞の生存や分化に関わっているものとされている。今後、この蛋白の神経細胞での機能を解明し毒素作用との関連を明らかにする予定である。
BOLD-fMRI法による固形腫瘍低酸素領域に対する新規抗癌剤の非侵襲的薬効評価

固形腫瘍内には酸素濃度の低い低酸素細胞が存在し、医療のみならず獣医療において放射線治療後のがんの再発の原因となっている。本研究では制がん剤エチニルシチジン(ECyd)が、この低酸素細胞に抗腫瘍作用を示すか否かを検討した。まず、大気条件下および低酸素条件下で培養された腫瘍細胞に対して、ECydがX線による細胞死を増強するかを検討したところ、酸素濃度に依存せずアポトーシスおよび増殖死を増強することを明らかにした。次に低酸素細胞の放射線抵抗性の原因となっているとされるsurvivin、c-IAP2,HIF-1・に対するECydの効果を検討したところ、分子生物学的手法によりこれらの蛋白質は転写調節を受け発現が抑制されていた。以上の結果に加え、マウスに移植した固形腫瘍を用いてECydの放射線増感作用を検討したところ、細胞培養系と同様にECydによるHIF-1・発現の抑制と低酸素細胞に対するアポトーシス誘導が観察された。加えて、低酸素マーカーpimonidazoleを用いた免疫染色を行ったところ、X線照射とECyd投与の併用により低酸素領域の有意な縮小が起こることを示した。以上の結果は、ECydが低酸素細胞に対しても細胞死を誘導できる点で有望な放射線増感剤となりうる可能性を示したものであり、その成果は国際誌British Journal of Cancer誌に掲載受理された。またマウスに移植した固形腫瘍内の酸素濃度pO2を経時的かつ非侵襲的に計測する手法として、ESRオキシメトリー法を確立した。具体的には、L-band ESR装置にサーフェスコイル型共振器を取り付けることで動物の皮膚表面に移植した腫瘍の酸素濃度を測定できるようにした。また酸素感受性プローブとして、生体内で安定かつESRスペクトル線幅の狭いlithium octa-n-butoxy-2,3-naphthalo-cyanine(LiNc-BuO)を用いた。移植固形腫瘍にLiNc-BuO懸濁液を埋め込み、pO2を計測したところ腫瘍成長に伴って低酸素化が進んでいることが明らかとなった。この実験系が確立したことで、今後、薬剤や放射線による腫瘍内酸素濃度の変動を同一個体で評価することが可能となり、その意義は大きいと考えられる。新規制がん剤エチニルシチジン(ECyd)の低酸素腫瘍細胞に対する増殖抑制作用についてin vitroおよびin vivo実験系両面から検討を行った。まず低酸素マーカーであるpimonidazoleに対する免疫染色によりヒト胃癌由来MKN45腫瘍内の低酸素領域を描出することが可能となった。この手法を用いることにより、単独では抑制効果を示さない低線量のX線照射とECyd投与との併用で低酸素領域の有意な縮小が起こり、その結果腫瘍全体の成長遅延を引き起こすことを明らかにした。またcleaved caspase-3との多重染色により、併用処理された低酸素細胞にアポトーシスが誘導されていることが明らかとなり、この事は培養細胞を用いた実験においても証明された。またウェスタンブロット法により、ECyd処置で放射線抵抗因子である低酸素誘導性HIF-1α発現およびその転写制御を受けるアポトーシス抵抗因子cIAP-2やsurvivinの発現が抑制されていたことから、ECydによるHIF-1αの発現抑制が放射線誘発アポトーシスの増強作用の原因であることが示唆された。以上の結果は固形腫瘍に対する放射線治療においてECydが低線量のX線照射と併用してもその抗腫瘍効果を効率的に高め、低酸素細胞にも細胞死を誘導できる点で有望な放射線増感剤となりうる可能性を示したものであると考えられ、現在、国際誌に投稿準備中である。また酸素感受性ラジカルプローブlithium octa-n-butoxy-2,3-naphthalo-cyanine(LiNc-BuO)を用いたEPRスペクトロメトリー法で実際のMKN45移植腫瘍内の酸素濃度を非侵襲的にモニターすることが予備実験段階ではあるが可能となった。この手法が確立することで動物を犠牲にすることなく、薬剤や放射線による腫瘍内酸素濃度の変動を経時的に観察する事が可能となり、その意義は大きいと考えられる。

またマウスに移植した固形腫瘍内の酸素濃度pO2を経時的かつ非侵襲的に計測する手法として、ESRオキシメトリー法を確立した。具体的には、L-band ESR装置にサーフェスコイル型共振器を取り付けることで動物の皮膚表面に移植した腫瘍の酸素濃度を測定できるようにした。また酸素感受性プローブとして、生体内で安定かつESRスペクトル線幅の狭いlithium octa-n-butoxy-2,3-naphthalo-cyanine(LiNc-BuO)を用いた。移植固形腫瘍にLiNc-BuO懸濁液を埋め込み、pO2を計測したところ腫瘍成長に伴って低酸素化が進んでいることが明らかとなった。この実験系が確立したことで、今後、薬剤や放射線による腫瘍内酸素濃度の変動を同一個体で評価することが可能となり、その意義は大きいと考えられる。
固液界面における潤滑油分子の並進運動計測：単一蛍光分子追跡

全反射照明が可能な蛍光顕微鏡を用いて、バルク潤滑油に溶解した蛍光分子が発する蛍光の寄与を抑え、添加剤層に取り込まれた蛍光分子を画像計測した。ヘキサデカン(C16H34)基油のみ、およびこれにパルミチン酸(C15H31COOH,濃度0.1 mass%)を添加したモデル潤滑油に蛍光分子を加えて測定に用いた。ピラニア溶液に浸漬して、親水化したガラス基板とモデル潤滑油の界面に波長532 nmの励起光を照射して、界面に捕捉された蛍光分子が発する蛍光像を毎秒30画面の撮像速度で記録した。親油性が高くしかも532 nm光励起で強い蛍光を発する化合物としてboron-dipyrromethene系の蛍光分子(略称BODIPY)が有望である。これまでに商業的に入手できる5種類の蛍光分子(BODIPY 581/591・R6G・530/550・558/568・TMR-X)を用いて試験測定をおこなった。これらのうちTMR-Xは潤滑油中で著しく大きさの異なる二種類の形態(単一分子と凝集体)を与えるために本測定に適さないことがわかった。残る4種類の蛍光分子を用いた測定では、ほぼ均一な大きさの光点が現れたので、界面に捕捉された単一蛍光分子に帰属した。潤滑油-ガラス界面に励起光を照射し続けると、蛍光分子は一定の確率で焼尽破壊されてゆく。このため一画面内に存在する蛍光分子の数は照射時間とともに減少するが、10秒程度の時間が経過すると一定数となり0までは減少しなかった。液中からの捕捉・励起光による焼尽・液中への脱離の速度が釣りあった定常状態に達した時点でのBODIPY 581/591の数密度を、純ヘキサデカン中とパルミチン酸添加ヘキサデカン中で比較すると、パルミチン酸添加によって数密度は減少した。パルミチン酸添加剤層の形成によってBODIPY 581/591の吸着が妨げられたと解釈できる。研究計画に沿ってBODIPY系蛍光化合物5種類を試用し、うち4種類が潤滑油-ガラス界面の単一分子蛍光追跡に適していることを確認できた。これによって、2019年度に現有する実験装置をもちいて潤滑油界面の分子運動計測に挑戦する基盤を構築できたため。蛍光分子を添加した潤滑油-ガラス界面で記録した単一分子蛍光動画像の目視観察から、界面に捕捉された単一蛍光分子のなかに、連続画像のなかで位置を変えない分子と、界面に捕捉されたまま面内方向に運動する分子が存在することがわかった。測定条件(蛍光分子の種類・濃度・測定温度など)を最適化することで面内運動の定量的評価を実現していく。

(1)当初計画では市販のBODIPY蛍光化合物群に加えて新たな蛍光化合物を合成することを想定して費用を計上しや。市販化合物5種類を試用したところうち4種類が良好な成績をあげたために新規化合物の合成が不要となったため。(2)当初計画では蛍光励起に試用するYAGレーザーランプの更新を予定していたが、定格寿命を越してもランプの光出力は低下しなかったため、本年度中のランプ更新を見送ったため。
化学物質の腎毒性発現に関与する生体内レドックス変化の非侵襲的測定法の確立

高血圧モデルマウスや敗血症モデルマウスを作成し、in vivo ESR法を用いた非侵襲的な方法でこれらモデルマウスの体内が健常マウスに比べて酸化に傾いていることを示した。グルタチオン抱合ハイドロキノンを投与した腎障害モデルラットの腎臓における局所的な測定法の確立を試みた。本研究では、電子スピン共鳴(ESR)を用いて腎臓におけるレドックス変化を非侵襲的に測定するため、ニトロキシルプローブのレドックス(ニトロキシル/ヒドロキシルアミン)を利用する。生体内は還元状態に維持されているため、ヒドロキシルアミン型プローブを用いて酸化状態に傾いた時に現れるESRシグナルを検出したほうが有利と考えられるが、ヒドロキシルアミンは容易に空気酸化されるため、そのままでは投与に適さない。そこで、生体内での還元反応に耐性があるニトロキシルプローブcarbamoyl-PROXYL(CP)に、投与までのヒドロキシルアミンの空気酸化を抑えるためにアシル保護を施したプローブ(ACP)を合成した。ACPの収率は41%であり、常磁性種(CP)の混入は0.01%以下であることをESRで確認した。ACP投与後の腎臓におけるESRシグナルの測定条件の検討のため、健常マウスの背部右側の一部を切開し、右腎を露出させた後、尾静脈よりACPを投与した。サーフェイスコイル型共振器を、露出させた腎蔵に接触させてESR測定を経時的に行ったところ、ESRシグナルが小さい、測定中のマウス体温が著しく低下するなど、そのままの条件では病態マウスとの比較が困難であることが判明したため、使用するプローブの選定、測定中の体温維持の方法等について検討を重ねることとした。腎毒性を発現させる化学物質としてハイドロキノンのグルタチオン抱合体(HQ-GSH)の合成を行った。ベンゾキノン水溶液とグルタチオン水溶液を混和して反応させ、HQ-GSH抱合体粗画分を得た。HPLC(逆相カラム使用)によりHQ-GSH抱合体粗画分を1置換抱合体、2置換抱合体、3置換抱合体に分離・精製した。細胞毒性、過酸化水素生成量は3置換抱合体が高いことから、マウスには3置換体を投与し、腎障害病態マウスを作成することとした。今回の合成で3置換体の収率は16.4%だった。本研究では、生体内のレドックスバランスの変化をESRを用いて非侵襲的に測定する方法の確立を目的としており、腎臓での局所的測定法の検討とともに、腎障害を伴う疾患について全身的なレドックス変化の測定を試みた。1.アンギオテンシンII投与により作成した高血圧モデルマウスは、健常マウスと比較して血清中尿素窒素(BUN)の上昇が認められ腎障害が起こっていることが示唆された。アシル保護ニトロキシルアミンプローブ(ACP)を用いたL-band ESRで生体内レドックスを測定したところ高血圧モデルマウスではESRシグナルが持続したことから健常マウスに比べて体内レドックスが酸化に傾いていることが示唆された。また、鉄キレート剤投与によりシグナルの持続が抑制されたことから、レドックスの変動に鉄の沈着が関与していることが示唆された。2.LPSを投与した敗血症モデルマウスでもBUNの上昇が認められた。ACPを用いたL-band ESR測定により敗血症モデルマウスの体内が酸化に傾いていることが判明した。また、SODとカタラーゼの投与によりESRシグナルの持続が抑制されたことからレドックス変化にO2-生成が関与していることが示唆された。3.合成、分離、生成したグルタチオン抱合ハイドロキノンをラットに投与し、血清クレアチニンの上昇が認められた。体外に露出させた腎において充分なESR感度を得るためにニトロキシルラジカルプローブを用いて測定を行ったが、体内への分布と還元が同時におこり、シグナルの減衰が一次反応によらないために解析が困難となった。全身的な測定では今回の方法でレドックス変化の測定が可能であることが示された。局所的測定を行うにはプローブ等についてさらに工夫、検討が必要である。