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アンチセンス核酸工学によるリンゴ果実の完熟抑制に関する研究

遺伝子工学による過熟防止を施したリンゴの作出を行うための基礎的研究として、リンゴ-1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸合成酵素(ACS;EC4.4.1.14)遺伝子族の構成とその構造について解析を行った。1.リンゴ栽培品種'ゴールデンデリシャス'のゲノミックDNAからライプニング時に特異的に発現するACS遺伝子の一部をPCRにより増幅し、これをプローブとした。2.リンゴ栽培種14品種および野性種1種のゲノミックサザン解析によって、ライプニング型ACS遺伝子のRFLP分析を行ったところ、これらは4つのタイプに分類されることが明らかにされた。3.複数の制限酵素を用いたサザン解析から、ACS遺伝子は少なくとも4つの遺伝子からなる遺伝子族を構成していた。4.栽培品種'ゴールデンデリシャス'のゲノミックDNAライブラリーを作製し、そのスクリーニング実験から、ライプニング型ACS遺伝子の6つのゲノム領域をクローン化することが出来た。5.ライプニング型ACS遺伝子の塩基配列を決定した結果、3つのエキソンと4つのイントロンからなること、'ゴールデンデリシャス'にはその対立遺伝子が存在していた。6.対立遺伝子のプロモーター領域には162bpのトランスポゾン様配列が挿入されており、このことが栽培品種間で観察されたRFLPの原因であることが判明した。今年度は先ず、リンゴへの遺伝子導入を行うにあたり大きな要因となる、再分化系の確立を図った。栽培品種`王林'を材料として、再分化のための培養条件を検討した。無菌的に培養したシュートの葉身から再分化を試みた結果、1/2MSにBAP7mg/l、NAA0.2mg/lの条件で34.4%の再分化率が得られた。また、葉身を葉柄側から葉頂にかけて24群の葉切片に分け、それぞれの再分化率を検討したところ、1.11.5cmの葉身の中央部が最も高い再分化率(75%)を示すことが明らかにされた。さらに、抗生物質の濃度の検討から形質転換体の選抜には、カナマイシン25mg/l、除菌にはセフォタキシン300mg/lが最適であることを見い出した。次に、リンゴ果実の過熟を抑制するため1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸(ACC)合成酵素(S-adenosyl-L-methionine methylthioadnosine-lyase,EC4.4.1.14)のcDNAを用いて、これをアンチセンスで導入し、エチレン合成系を制御出来る可能性に着目し、ACC合成酵素遺伝子のcDNAの作成を試みた。収穫期のリンゴ`ゴールデンデリシャス'の果実から全RNAを抽出し、これを鋳型としてRT-PCRを行ったところ、約1,200bpの増幅産物を得、これがACC合成酵素遺伝子のcDNAであることを確認した。今後はこのcDNAをバイナリーベクターに挿入し、リンゴ栽培種に導入する実験を開始するとともに、既にクローニングされているACC合成酵素遺伝子のゲノミッククローンの塩基配列の決定を進める予定である。絵遺伝子工学による過熱防止を施したリンゴの作出を行うための基礎的研究として、リンゴ-1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸合成酵素(ACS;EC4.4.1.14)遺伝子族の構成とその構造について解析を行った。1.リンゴ栽培品種`ゴールデンデリシャス'のゲノミックDNAからライブニング特に特異的に発現するACS遺伝子の一部をPCRにより増幅し、これをブローブとした。2.リンゴ栽培種14品種および野性種1種のゲノミックサザン解析によって、ライブニング型ACS遺伝子のRFLP分析を行ったところ、これらは4つのタイプに分類されることが明らかにされた。4.栽培品種`ゴールデンデリシャス'のゲノミックDNAライブラリーを作製し、そのスクリーニング実験から、ライプニング型ACS遺伝子の6つのゲノム領域をクローン化することが出来た。5.ライプニング型ACS遺伝子の塩基配列を決定した結果、3つのエキソンと4つのイントロンからなること、`ゴールデンデリシャス'にはその対立遺伝子が存在していた。6.対立
ミトコンドリア膜アスパラギン酸ーリンゴ酸キャリヤー蛋白の同定と機能発現

アスパラギン酸・リンゴ酸シャトルの構成要素、キャリヤー蛋白(トラシスロケーター)の研究は、動力学的性質の解明を中心課題として進められてきた。そのためキャリヤー蛋白の単離法、アスパラキン酸・リンゴ酸シャトル系を再構成系する試みが模索されてきた。この重要なシャトル系の代謝過程での役割を明らかにするためには、個々のキャリヤー蛋白のもつ動力学的性質を明らかにすることも必要である。しかし、キャリヤー蛋白の構造情報を得ることができなければ、有効な再構成系の構築ならびに動力学的性質についての明解な解釈を得ることはできない。一次構造の決定によって得られる情報から推定される、膜貫通部分や親水性部分、二次構造情報を基に考察を加えることで、キャリヤー蛋白のミトコンドリア膜上での存在様式と反応機構に関する解析が進めることが可能となる。本研究では、この点に着目しキャリヤー蛋白に関する構造情報を得ることを目的として、キャリヤー蛋白の単離を行なった。(1)心筋に最も多くのキャリヤー蛋白が含まれ、精製材料として、マウスやラットよりブタ心筋が優れていることを見いだした。(2)リポソームの作成法とキャリヤー活性の測定法を確立した。(3)ケトグルタル酸キャリヤー蛋白を精製し、特異抗体を作成した。(4)アスパラギン酸キャリヤー蛋白は安定性に乏しく、大量精製を行うためには、より有効な安定化剤を見つけることや、アフィニティーカラムによる精製のための担体の開発が必要であることを確認した。上記のような研究成果が得られたが、当初にかかげた目標のためには、まだ解決すべき問題点も数多く残されている。一つは出発材料であるミトコンドリア粒子の心筋からの大量精製法を、さらに簡便かつ効果的にすることである。第二にキャリヤー蛋白の迅速な分離精製法の確立、とりわけアフィニティークロマトグラフィーの導入が必須とすることが予想された。ラット肝,心筋,ブタ心筋より,それぞれミトコンドリア粒子を分画し,各種可溶化剤で処理し,キャリヤー蛋白を抽出しリポソームに組み込み活性を測定したところ,ブタ心筋がキャリヤー蛋白の抽出精製材料として最も適していることがわかったが,心筋からのミトコンドリア粒子の分画収率が悪いため大量精製にまだ至っていない.ブタ心筋ミトコンドリア粒子をトリトンX144で処理し,オキソグルタル酸-リンゴ酸キャリヤー蛋白を抽出し,ヒドロキシアパタイト及びDEAEカラムを用いて部分精製した.部分精製物を,さらにSDS電気泳動法に供し,抗体作製を目的としてSDSゲルより切り出し抽出することにより純化したが,さらに必要十分量を得るため他の効率の良い精製法(アフィニティクロマトグラフィー)の検討を進めている.家兎にて抗体を作成し,イムノブロット法により抗体価の上昇を認めた.グルタミン酸-アスパラギン酸キャリヤーはオキソグルタル酸-リンゴ酸キャリヤーに比べて安定性に劣り,ヒドロキシアパタイトHPLCやDEAEカラムを用いた精製法では,必要量の精製物を得ることが出来なかった.グルタミン酸-アスパラギン酸キャリヤーの迅速な抽出分離のため,アフィニティクロマトグラフィーの導入をめざした.グルタミン酸あるいはアスパラギン酸を結合した担体を合成して,キャリヤー蛋白との結合条件を検討したが,特異的な結合は観察出来なかった.アフィニティ担体となりうる基質以外の構造類似物を,キャリヤー活性の阻害実験により検索している.また,高濃度の酢酸アンモニアをグルタミン酸-アスパラギン

酸キャリヤーの安定化のために使用しているが,カラム操作の簡素化のためにも,さらに効率の良い他の安定化剤に変更することを検討している.ラット肝、心筋、ブタ心筋などより、それぞれミトコンドリア粒子を分画し、各種可溶化剤で処理し、キャリヤー蛋白を抽出し、リポソームに組み込み活性を測定したところ、ブタ心筋がキャリヤー蛋白の抽出精製材料として最も適していることがわかった。心筋からのミトコンドリア粒子の分画精製法を確立した。ブタ心筋ミトコンドリア粒子をトリトンX1114で処理し、オキソグルタル酸-リンゴ酸キャリヤー蛋白を抽出し、ヒドロキシアパタイト及びイオン交換樹脂カラムを用いて部分精製した。部分精製物を、さらにSDS電気泳動法に供し、抗体作製を目的としてSDSゲルより切り出し抽出することにより純化したが、さらに必要十分量を得るため他の効率の良い精製法(アフィニティクロマトグラフィー)の検討を進めた。家兎にて抗体を作成し、イムノブロット法により抗体価の上昇を認めた。グルタミン酸-アスパラギン酸キャリヤーはオキソグルタル酸-リンゴ酸キャリアーに比べて安定性に劣り、ヒドロキシアパタイトHPLCやイオン交換樹脂を用いた精製法では、当初の目的を達成するために必要な量の精製物を得ることが出来なかった。現在使用しているC12E8より効率がよく、安定性も損なわない界面活性化剤の利用について検討した。グルタミン酸-アスパラギン酸キャリヤーの迅速な抽出分離のため、アフィニティクロマトグラフィーの導入をめざした。グルタミン酸あるいはアスパラギン酸を結合した担体を合成して、キャリヤー蛋白との結合条件を検討したが、特異的な結合は観察出来なかった。アフィニティ担体となりうる基質以外の構造類似物を、キャリヤー活性の阻害実験により検索したが、有効な化合物を発見できなかった。さらに検索を進めるために、より効率的な活性測定法の構築が必要となった。
ウォータージェット加工法の実用化研究

ウォータージェット技術は、高速でビーム状の水噴流によって金属材料ないし非金属材料の特殊加工や高圧洗浄、建築物の切断・解体などを行う技術である。本研究の目的は、この新しい技術を高能率、高精度なものとして確立し、実用技術として広く産業界に普及させるため、応用の予想される各種の金属材料および非金属材料について、ウォータージェットによる加工特性を測定し、それらの基礎研究と所要データを積み上げ広く実用化できるウォータージェット加工法を確立することである。得られた研究成果をまとめると次のとおりとなる。1.アブレシブジェット加工実験を各種固体材料について行い、それらの切断面に発生するビーム加工特有の縞模様粗さについて波形解析を行い、縞模様の特性を明らかにした。次に、その縞模様の発生は加工精度と直接係わりをもつため、様々の実験条件のもとで系統的実験を行い、縞模様粗さを僅少に止どめるための最適の加工条件を見出した。2.水噴流により加速される砥粒の飛行速度を2組のカメラを用いた二重露光影写真法により実測することに成功した。その結果、砥粒の速度は水噴流速度の80%ないしそれ以上に達していることが判明した。またその理論的背景を明らかにした。3.ノズルヘッド内の圧力が実験条件に応じていかに変化しているかを系統的に解明した。4.アブレシブノズルの直径はウォーターノズル直径の3倍のとき、砥粒の加速特性が最も良好であること、またそのとき加工能力も最大になることを示した。5.アブレシブノズルの内部において砥粒は著しく崩壊していることを明らかにした。6.ウォータージェットによる加工面に現れる縞模様粗さについて、これを数値シミュレーションによって再現することに成功した。7.水産物、野菜類などの軟質材料について、ウォータージェット加工の実験を行い、その効果と問題点の検討を行った。本研究の目的は、この新しい技術を高能率、高精度なものとして確立し、実用技術として広く産業界に普及させるため、応用の予想される各種の金属材料および非金属材料について、ウォータージェットによる加工特性を測定し、最適加工条件を決定することである。さらに本研究では、それらの基礎研究と所要データを積み上げ広く実用化できるウォータージェット加工法を確立することを目的としている。本年度に得られた研究成果は次のとおりである。(1)ノズル圧力が100MPaから300MPa、ノズルのトラバーハ速度が5mm/minから100mm/minの範囲で、250μmのガーネットを用いたアブレシブジェット加工実験をアルミニウムと中炭素鋼について行い、その切断面に生ずる縞模様状のあらさを表面あらさ測定器により詳細に測定し、その波形解析をコンピュータを用いて行うことにより縞模様の特性を明らかにした。(2)次に、その縞模様の発生は加工精度に直接係わりをもつため、種々の実験条件のもとで系統的実験を行った結果、同じ加工能力のもとでは、ノズル圧力が低く、しかしトラバース速度を小にすると加工精度として最適の加工条件が得られることを見出した。(3)アブレシブジェットの構造を究明するため、閃光時間が0.8μsのストロボスコープを2台使用し、シャドーグラフ法により噴流を写真撮影し、画像処理によって固体粒子の挙動を調べた。その結果、固体粒子は水噴流によって300m/sまで加速されていることが分かり、その速度はウォータージェットの80%に達していることを明らかにした。(4)ノズルヘッド内の圧力が実験条件に応じていかに変化するかを系統的に解明した。

ウォータージェット技術は、高速でビーム状の水噴流によって金属材料ないし非金属材料の特殊加工や高圧洗浄、建築物の切断・解体などを行う技術である。本研究の目的は、この新しい技術を高能率、高精度なものとして確立し、実用技術として広く産業界に普及させるため、応用の予想される各種の金属材料および非金属材料について、ウォータージェットによる加工特性を測定し、それらの基礎研究と所要データを積み上げ広く実用化できるウォータージェット加工法を確立することである。本年度に得られた研究成果は次のとおりである。(1)ノズル圧力が70MPaから125MPaの範囲で、約300μmおよび140μmのガーネットを用いたアブレシブジェット加工実験を行い、水噴流により加速される砥粒の速度を2組のカメラを用いた二重露光影写真法により測定した。その結果、砥粒の半径位置を立体的に決定することができ、その飛行速度は水噴流速度の80%ないしそれ以上になっていることを明らかにした。またその理論的背景を明らかにした。(2)アブレシブノズルの直径はウォーターノズル直径の3倍のとき、砥粒の加速特性が最も良好であること、またそのとき加工能力も最大になることを示した。(3)アブレシブノズルの内部において砥粒は著しく崩壊していることを明らかにした。(4)ウォータージェットによる加工面に現れる縞模様粗さについて、これを数値シミュレーションによって再現することに成功した。(5)水産物,野菜類などの軟質材料について、ウォータージェット加工の実験を行い、その効果と問題点の検討を行った。
σ-π共役により安定化された大環状π電子系の合成と性質

当初の実験計画にしたがって研究を行ない、以下に記す結果を得た。1.ビシクロ[2.2.2]オクテンの縮環したデヒドロアヌレン類の合成と酸化還元挙動ビシクロ[2.2.2]オクテン(以下BCOと略記)の縮環したデヒドロアヌレン類をBCOのジェチニル体およびモノエチニルモノブロモ体の環化カップリング反応により合成し、ジェチニル体からは25量体を得、モノエチニルモノブロモ体からは3、4量体を得た。このうちデヒドロ[16]アヌレン、およびデヒドロ[18]アヌレンについてX線結晶解析を行った。またこれらデヒドロアヌレンの酸化還元挙動について、サイクリックボルタメトリーにより測定し、理論計算の結果とあわせて考察した。2.ビシクロ[2.2.2]オクテンの縮環したデヒドロアヌレン類の金属イオン錯体の合成1で合成したデヒドロアヌレン類の錯体形成について検討した.特にデヒドロ[16]アヌレンの各種銀イオンの錯体を新たに合成・単離し、X線結晶解析によりそれらの精密構造を明らかにした。
プラズマホログラムによる高強度レーザーシンセシス

本研究は、10-100GW程度のレーザー(光強度はTW/cm^2)を二光束干渉させることで生成できるプラズマの周期的空間密度分布を過渡的なダイナミックホログラム(「プラズマホログラム」)として記録し、1TWを超える高強度レーザーパルスで再生することで、高強度レーザーパルスの波面、スペクトル時間発展、パルス波形という時空間にわたるあらゆるパラメーターを高効率にかっ自在に制御する革新的な研究分野「プラズマホログラムによる高強度レーザーシンセシス」を開拓しようとする挑戦的研究である。コヒーレントな二光束をシリカガラス板表面に集光させると、「プラズマホログラム」と同時にアブレーションされたガラス表面にも静的な回折格子が刻まれるため、二重の回折格子が生じると考えられる。この二つの寄与を分離するため、前方縮退四光波混合配置によるポンプ-プローブを用いてレーザー強度に対する「プラズマホログラム」の回折効率および緩和時間を測定した。回折光は閾値フルエンス(1J/cm^2)以上で発生し、回折効率はステップ関数状に上昇する。このことから回折光はシリカガラスの3次非線形光学効果によるものではなく、「プラズマホログラム」によるものであると考えられる。また、回折効率は5-10psの時間スケールで急速に低下することがわかった。この時間スケールはプラズマ拡散時間と一致することから「プラズマホログラム」の緩和時間であると考えられる。観測された回折効率は約3%であったが、電子生成のアバランシェモデルとプラズマの誘電率を示すドルーデモデルを用いて解析した値とオーダーが一致した。本研究は、10-100GW程度のレーザー(光強度はTW/cm^2)を二光束干渉させることで生成できるプラズマの周期的空間密度分布を過渡的なダイナミックホログラム(「プラズマホログラム」)として記録し、1TWを超える高強度レーザーパルスで再生することで、高強度レーザーパルスの波面、スペクトル時間発展、パルス波形という時空間にわたるあらゆるパラメーターを高効率にかつ自在に制御する革新的な研究分野「プラズマホログラムによる高強度レーザーシンセシス」を開拓しようとする挑戦的研究である。平成21年度は、高エネルギーピコ秒パルスレーザー(10ps、5-10mJ、1064nm)を用いてガラス基板ターゲットに集光し「プラズマホログラム」を記録した。この時、プラズマ密度の空間変調度とその緩和時間を測定するためのプローブ光を同時に入射し、プローブ光の「プラズマホログラム」による回折光の強度を測定した。ホログラムの回折効率は数%であった。レート方程式によりアブレーション時に発生するプラズマ密度を計算し、ドルーデモデルと結合波方程式から回折効率を計算したところ実験と良く整合した。また、高エネルギーナノ秒パルスレーザーを光渦に変調し、光渦によるレーザーアブレーションを行った。アブレーション加工された金属表面のデブリが軌道角運動量の効果により低減することがわかった。これは軌道角運動量を受けたプラズマが光渦の位相特異点近傍に閉じ込められ、効率よく金属ターゲットから離脱することによると考えられる。
前胃神経系の構築形成

反芻動物の前胃における神経系の発達を明らかにすべく牛で検索した。胎児、子牛、成牛の前胃各所から材料を採取し燐酸緩衝10%ホルマリン液で固定した。通常はマイクロスライサ-で100μm厚の切片として浮遊染色した。子牛および胎児のいくつかの材料は伸展した後に固定した。また小さい胎児のいくつかの標本は胃全体をまのごと固定した。いずれの材料もABC法により免疫染色した。neurofilament protein(NFP)やprotein gene product(PGP)により神経細胞体および神経線維が認められ、筋層間神経叢や粘膜下神経叢が豊富に観察された。両神経叢間の連絡束ばかりでなく、両神経叢からそれぞれ粘膜へ向かう神経束も認められた。伸展標本やまるごとで染色した材料では筋層間神経叢の網工を見事にとらえることができた。第三胃、第二胃、第一胃の順で筋層間神経叢の網目の密度が高く成長とともにその密度は低くなるが前胃間の密度順には変わりないようであった。迷走神経を付着させたままで染色した標本では迷走神経が筋層間神経節に連絡し筋層間神経叢の神経束に融合していく様が確認できた。tyrosine hydroxylase(TH)やdopamine β-hydroxylase(DBH)によるカテコラミン神経は初期から認められたが前胃各所による分布差はあまり大きくないようであった。THおよびDBHともに陽性の神経細胞体が認められたことは特徴的である。胎児および新生児の上皮中にはTH陽性細胞が多数認められ周産期には非常に長い細胞質突起を伸ばしていた。ペプチド神経の代表的なものとして検索したsubstance P(SP)神経は初期の胎児から既に存在していたがNFPやPGPによる神経一般の分布に比べると神経細胞体と神経線維ともに遥かに少数であった。その差は胎児の発達とともに縮まるようであった。SP神経は中期から特に後期にかけて分布が豊富になり、周産期から哺乳期にかけて最高になるものと思われる。
生活空間に及ぼす調理臭気の化学的研究

近年生活環境における匂いに関して人々は非常に敏感になっており、特に住空間に放出される不快な匂いは環境汚染の問題でもある。一般に、家庭では毎日調理を行い、食品から様々な臭気が蒸気や煙となって室内に充満し、一方換気装置により外に排気されることが繰り返されている。調理の種類により、比較的揮散し易いもの、あるいは残存してもあまり気にならないものもあるが、不快臭として長時間残存するものもある。本研究は、生活という面から臭気を捕え、代表的な献立の調理中に生活空間に発散される臭気成分について分析し、快適な生活空間形成のための基礎データを得ることを目的として行った。家庭料理で人気の高い献立で且つ臭気が問題となる天プラ、焼き魚、野菜炒め、カレーを研究対象とし、モデルキッチンで実際に調理した直後に室内空気をダクト方式で悪臭にたいする環境分析法に基き袋に収集した。その中の臭気成分を一部は官能検査に供し、一部は種々検討した結果、最適であったポーラスポリマー(TenaxGC)に吸着捕集した。これをヘッドスペースガス脱着システムを装置したGCおよびGD-MSで分析した。焼き魚については研究続行中であるが、その他の調理について分析した結果、天ぷらは室内に長く不快臭が残るが、それは油の分解物であるヘキサナール、ヘプタジエナール、デカジエナール等の閾値の低いアルデヒド類および油の代表的もどり臭成分である2-ペンチルフランが煙成分として揮散されるためと推測された。一方、カレーや野菜炒めは油を使うが上記化合物は殆ど検出されず、野菜炒めでは代表的煙成分である脂肪族および芳香族炭化水素が多く検出されたが臭気としてはあまり強いものではなかった。カレーの残存臭気は官能的には不快ではないと判定されたが、これは香辛料由来のリモネン、m-シメン、サビネンなどのモノテルペン炭化水素及びクミンアルデヒドの芳香によると考察された。
「スポーツ・健康サービスラーニング」による中山間地域の活性化に関する研究

「スポーツ・健康サービスラーニング」プログラムの開発を行い,吾川郡仁淀川町において「サービスラーニング演習(スポーツ)」の授業を実施した。同プログラムは,事前指導,「健康づくり教室」の企画立案及び支援実習,事後指導(振り返り)で構成。参加者アンケートでは,学生のサービスについて「良かった」が100%,効果の内容については「健康づくり」(100%),「ストレス発散」(86%),「知識の拡がり」(79%)であった。(1)吾川郡仁淀川町において当該地域の関係者と連携・協力し,「スポーツ・健康サービスラーニング」プログラムの開発を行い,25年度の本学共通教育の教養科目の授業として「サービスラーニング演習(スポーツ)」(集中形式)を実施した。授業は,事前事後指導と地域住民が行う健康体操(計5回の「健康づくり教室」を実施)の支援を学生が行う実習で構成。受講学生は8名,地域住民の参加者は15名(平均)であった。(2)高齢者対象のトレーニングプログラムの運営および実施方法についてヒアリング(広島県北広島町「一般財団法人ドングリ財団」)を行った。同財団では、三重県いなべ市で取り組まれている取組を参考に、地区ごとに住民主体で運動教室を行う仕組みづくりを行っていた。地域実習の内容及び地域への効果に関してヒアリング(北九州大学)を行い,地域ボランティア養成コースのスポーツ・健康分野の実習について調査した。(3)仁淀川町における「健康づくり教室」参加者のアンケートによると,「参加の満足度」は「良かった」(89.5%),「楽しさ」「有益性」「今後の開催希望」はいずれも「はい」(100%)であった。効果については,「健康づくり」(100%),「ストレス発散」(86%)「知識の拡がり」(79%)であった。学生の参加については「良かった」(100%)であった。(4)学生への教育効果については,少人数であったこともあり,直接学生にヒアリングを行い,「振り返りシート」は活用しなかった。主な意見としては,「普段接することのない人たちの交流による自分への気付き」,「自分たちが受け入れられていることへの喜びや充実感」「中山間地域での人々やその生活に一部に触れることによる新しい社会認識の獲得」などがあった。(1)高知県長岡郡大豊町と吾川郡仁淀川町において、地域住民のスポーツ・健康活動及び意識の実態に関するアンケート調査とヒアリングを行う予定であったが,大豊町での実施は当該地域の協力が得られず実施できなかった。仁淀川町のアンケートでは、施設・用具や指導者等の客観的条件の未整備よりも、住民自身の生活スタイルやスポーツに対する優先度やモティベーションなどの主体的条件のほうが,スポーツ・健康活動の阻害要因になっていることが明らかになった。このモティベーションの掘り起こしと向上が今後の鍵になると思われる。(2)「スポーツ・健康サービスラーニング」を実施している大学の訪問調査では,立命館大学・スポーツ健康科学部を訪問、桐蔭横浜大学・スポーツ健康政策学部については,訪問先の事情により,関連資料の送付に基づき担当者への電話インタビューを行った。立命館大学では,地域パートナーの開発が行き詰っており,大津市教育委員会との連携プログラムを中心に実施されていて,今後のスポーツ・健康サービスラーニングの拡がりに大きな課題を抱えていた。また,桐蔭横浜大学については,ボランティア的なスポーツサービスは実施されていたが,授業としての実質的な開発が途上であった。(3)吾川郡仁淀川町において、「スポーツ・健康サービスラーニング」プログラムの開発として,当該地域の関係者と連携・協力し、「スポーツ・健康サービスラーニング」プログラム(授業)の開発を行い,25年度の本学共通教育の教養科目の授業として「スポーツサービスラーニング演習」を実施することになった。高知県長岡郡大豊町と吾川郡仁淀川町において,地域住民のスポーツ・健康活動及び意識の実態に関するアンケート調査とヒアリング,「スポーツ・健康サービスラーニング」プログラムの開発を行う予定であったが,吾川郡仁淀川町のみを対象として集中的に取組むことになった。その理由は,当初予定していた大豊町から諸般の事情により協力が得られなかったこともあるが,一つに的を絞って実施した方が効率的であり,実験的な試みとしては十分であると判断したからである。研究(研究成果)上は,支障がないと判断している。なぜなら,この二つの地域は非常に似通った環境にある中山間地域であり,仁淀川町で得られる知見や成果だけでも十分に当初の研究目的・計画の達成は可能だからである。また全面協力を確約してくれている仁淀川町に研究を集中することによって,より充実した研究成果を上げることができると考えている。実際に,「スポーツ・健康サービスラーニング」プログラム(授業)の開発は,仁淀川町地域住民の協力の下,順調に推移しており,実施に関わる日程もほぼ確定している。他大学の訪問調査については,立命館大学だけになったが,このことはスポーツサービスラーニングの日本で実績が,まだまだ不十分であることを証明したかたちとなった。そのことで,本研究が重要であるという認識がより深まることになった。(1)高知県吾川郡

仁淀川町において、「スポーツ・健康サービスラーニング」プログラムの中核である「スポーツ・健康サービスラーニング」プログラム(授業)=「スポーツサービスラーニング演習」を本学の共通教育科目として実施する。(2)スポーツによる地域活性化の取組を行っている中山間地域またはそれに関連する地域について,訪問調査を実施し、そこでの成果と課題や可能性を明らかにすることによって、本研究における「スポーツ・健康サービスラーニング」プログラム及び「大学教育の地域貢献検証プログラム」の開発・試行に資する。(3)高知県吾川郡仁淀川町における「スポーツ・健康サービスラーニング」プログラムの地域活性化に対する効果の評価・検証を実施する。「大学教育の地域貢献検証プログラム」の開発・試行を通じて、「スポーツ・健康サービスラーニング」プログラムの地域貢献面での効果の評価・検証を行う。その方法は、同プログラムに関わった当該地域の自治体関係者並びにスポーツ・健康団体関係者に対するヒアリングや住民アンケートによるものが中心となる。(4)高知県吾川郡仁淀川町における「スポーツ・健康サービスラーニング」プログラムの学生に対する教育効果の評価・検証を実施する。「サービスラーニング」本来の目的としての学生の学びの成長や能力の向上の評価・検証を行う。評価・検証の方法としては、学生アンケートによるものとし、本学のサービスラーニングの授業で開発・実施し実績のある「振り返りシート」を改善し活用する。教育面での評価・検証を行うことは、同プログラムが果たした地域活性化(社会的効果)についての検証の際の不可欠の要素となる。(5)研究総括として、2年間の研究の成果をまとめ、報告書を作成する。平成24年度において実施する予定であった計画のうち,「スポーツ・健康サービスラーニングを実施している大学の訪問調査の実施」に関して,立命館大学・スポーツ健康科学部に関しては訪問調査を実施したが,予定していたもう1つの大学については,実施状況の問題などから訪問調査を行うことができなかったため,それに関連する研究費の残が生じることとなった。ただし,実施した訪問調査の結果から,サービスラーニングの受け皿となる地域パートナーの開発と役割がより重要であることが判明したため,平成25年度に行うスポーツによる地域活性化の取組を行っている中山間地域またはそれに関連する地域についての訪問調査によって,研究目的の達成は可能であると考えている。このことも踏まえて、平成25年度の研究費と合わせる形で,研究対象となる中山間地域への訪問調査を行う。また,平成25年度分の研究費については,先の訪問調査と合わせて当初の予定通りに執行する。
NiTi系形状記憶合金の精密鋳造に関する研究

NiTi合金は、形状記憶効果や超弾性といったユニークな特性を示すことで、工業用はもちろんのこと歯科用から医療用い至るまで幅広い応用が期待されている。しかし、この合金は加工が難しく、また歯科や医科の分野では寸法精度や複雑な形状のものが要求され、精密鋳造が必要不可欠である。ところが、この合金はTiを多量に含むため鋳造が非常に難しかった。この研究では、歯科用のみならず一般工業用部品まで、NiTi合金の精密鋳造の実用化に向けて精密鋳造の研究を行い、これまでほとんど知られていない鋳造したNiTi系合金の諸特性および組織学的研究を系統的に行った。まず、NiTi合金は我々が開発した鋳造機を用いると、鋳型材との焼き付きもなく、重要な機械的特性を失うことなく鋳造することが可能であることが判った。つぎに各種の歯科鋳造とその実用化に向けて、試験を行なったが、歯科鋳造に用いられているリン酸塩系埋没材を鋳型材として直接使用しても性質の良い鋳造体が得られるようになり、十分実用化できることがわかった。また、生体中での安全性の高いNiTi合金の開発するため、Auの添加によるNiTi合金の耐食性の影響について調べた。その結果この合金にAuを添加することにより安全性の高いNiTi系合金が得られることが判った。NiTi合金は耐摩耗性非常にすぐれ、人工関節用の材料としても可能性があることが判った。精密鋳造したNiTi合金の耐食性試験、長期間浸漬によるイオンの溶出試験を行なった結果この合金は歯科用としての十分耐食性があることが判った。精密鋳造したNiTi合金の熱処理についても検討したが、この合金は熱処理によって特性がいろいろ変化することがわかった。この研究成果はNiTi合金の応用範囲を広げるだけでなく、歯学や医学それに一般工業界にとっても重要であると考えられる。NiTi合金の鋳造は難しいとされていたが,新しい鋳造機の開発によりこの合金の鋳造に成功し,実用化のために諸特性を測定した.鋳造による性質の劣下はほとんどなく,実用的に問題が無いことがわかった.また,ステンレスやコバルトクロム合金に比べて,ポテンショスタット測定,浸漬試験の結果,腐食電流やNiイオン溶出量が少ないなど,優れた耐食性が得られた.組織学的には,鋳造組織の写真撮影などによりその組織が均一で,しかも酸化された組織が少ないなど合金の優れた性質,鋳造機の精密さなどを証明できた.NiTi合金の精密鋳造ができることにより応用の範囲が広がったといえる.さらに我々は,合金側からのアプローチとしてCr,Mp,Pd,Au,Cuの添加について検討し,合金の諸性質改良を行った.合金添加と性質の変化は,合金の変態点に関係が深く,熱分析による正確な変態点測定が必要となる. Cr,Mo,Pdの添加は,主に耐食性の向上に効果があり腐食電流, Niイオンの溶出量ともにさらに減少させることができた.また, Au,Cuの添加は,機械的性質の向上に効果があり,形状記憶効果しか得られなかった組成で超弾性が得られるようになり,超弾性の範囲が広がった.これらの性質の変化は変態点,特に二次的な変態点の影響が大きく,熱分析においてもごく小さな変化が重要になってくる.示差走査熱量計の導入により正確に小さな変化を捕えることができるようになり,機械的性質の変化について的確な考察が下せるようになった.NiTi合金には,以上のような性質の他に,耐振合金としての振動減衰性,衝撃吸収性がありこれらの測定も行った.これらの特性も機械的性質と変態点の影響が大きく,機械的性質の測定,組織学的な考察,熱分析による変態点の正確な測定により実現された研究である.今後は,熱処理の影響などについても研究を進めて行くつもりである.NiTi合金は、形状記憶効果や超弾性といったユニークな特性を示すことで、工業用はもちろんのこと歯科用から医療用い至るまで幅広い応用が期待されている。

この研究成果はNiTi合金の応用範囲を広げるだけでなく、歯学や医学それに一般工業界にとっても重要であると考えられる。今年度は以下のような研究を行なった。1.NiTi合金の人工関節への応用人工関節は耐摩耗性を必要とするが、NiTi合金を用いて骨頭部のみを作製し、耐摩耗性試験を行なった。その結果NiTi合金は従来の人工関節よりもはるかに耐摩耗性がすぐれ、人工関節用の材料としても可能性があることが判った。2.耐食性試験、長期間浸漬によるイオンの溶出試験生体中で使用する材料は、耐食性に優れ、長期間使用しても金属イオンが溶出しないことが必要である。ポテンショスタットを用いてアノード分極曲線を求め、各種溶液を用いた長期間の浸漬による金属イオンの溶出試験を行った。その結果この合金は歯科用としての十分耐食性があることが判った。3.NiTi合金の熱処理条件の検討。NiTi合金は、NiとTiの割合を変えることにより、変態点や特性を変化させることができるが、熱処理によっても特性が変化する。精密鋳造したNiTi合金の熱処理についても検討したが、この合金は熱処理の温度や時間によって特性がいろいろ変化することが判った。とくに500°C付近の熱処理と、440°C付近の熱処理とでは機械的性質かかなり変化し、熱処理温度を変えることにより機械的性質が可逆的に変化するという結果が得られた。この現象は金属学的にも興味深い現象であると思われる。これらの研究成果はNiTi合金の応用範囲を広げるだけでなく、歯学や医学それに一般工業界にとっても重要であると考えられる。
多発性硬化症を統制する多能的特異的制御性Ｔ細胞による自己免疫ワクチンと慢性期治療

中枢神経症状の再発・寛解を反復しやがて慢性に進行するという経過を特徴とする多発性硬化症(MS)の動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)において長期の寛解維持を担う要因として、脳炎惹起性ペプチドのヒエラルキーの中で最上位の優位ペプチドで感作すると抗原特異性の高いCD69CD103共陽性のCD4+CD25high制御性T細胞(=DP-Treg)が誘導・維持されること、DP-Tregが炎症性T細胞と表現型を共有するhybrid Tregを含有し炎症環境下でも安定して疾患制御能を発揮できることがこれまでの研究で明らかになった。本研究では、このDP-Tregが炎症性T細胞と入れ替わりに発症ピーク以降に誘導・維持される機構と、組織選択的に炎症抑制能を発揮し、さらに組織障害の修復に関与しうる機構とを解明し、疾患を統制する自己免疫ワクチンの適正化と慢性病態に対する治療へ応用を目標とした。すなわち(A) DP-Tregの誘導・維持機構(規定因子);(B) DP-Tregの作用機構(疾患抑制効果);(C)ペプチドワクチンへの応用の3つの観点から解明した。本年度は(A)に関連して、DP-Tregの中で最も他のサブセットとの差が大きく発現量も高い遺伝子として同定したpreproenkephalinをsiRNAで除去すると確かにDP-Tregは減少し、EAEの再発・再誘導への感受性が惹起されることが確認できた。さらに感作ペプチドのN末端とC末端の長さを調節すると、DP-Tregの誘導能と相関してこの感受性が変化し、MHCとのペプチド結合度が変化することが判明した。また(C)に関連して、ペプチドを経口的に投与した場合のみならず不完全フロイントアジュバントと混合して感作した場合もEAEが惹起されないが、後者ではDP-Tregが誘導されて組織関連抗原特異的に抑制できることが判明した。中枢神経症状の再発・寛解を反復する時期を経て慢性に進行する時期に移行するという経過を特徴とする多発性硬化症(MS)の動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)において長期の寛解維持を担う要因として、が高値で維持されること、脳炎惹起性ペプチドのヒエラルキーの中で最上位の優位ペプチドで感作すると抗原特異性の高いCD69CD103共陽性のCD4+CD25high制御性T細胞(=DP-Treg)が誘導・維持されること、DP-Tregが炎症性T細胞と表現型を共有するhybrid Tregを含有し炎症環境下でも安定して疾患制御能を発揮できることがこれまでの研究で明らかになった。本研究では、このDP-Tregが炎症性T細胞と入れ替わりには発症ピーク以降に誘導・維持される機構と、組織選択的に炎症抑制能を発揮し、さらに組織障害の修復に関与しうる機構とを解明し、疾患を統制する自己免疫ワクチンの適正化と慢性病態に対する治療へ応用を目標とした。すなわち(A) DP-Tregの誘導・維持機構(規定因子);(B) DP-Tregの作用機構(疾患抑制効果);(C)ペプチドワクチンへの応用の3つの観点から解明することとした。本年度は(A)に関連して、EAEの臨床経過においては急性期・再発期・慢性期で主に関与する炎症性T細胞の種類が異なり(ぞれぞれRORγt陽性, Tbet陽性Eomes陽性)、DP-Tregの中でそれぞれの炎症性T細胞に対応するhybrid Tregがそれらの惹起に遅れて誘導されること、抗原特異性を有するのはhybrid Tregと炎症性T細胞のみであり、さらにhybrid Tregの誘導と維持には抗原特異性が重要であることが判明した。また(B)に関連して、最上位の優位ペプチドで惹起される進行性病態を伴わない単相型EAEでは、それ以外のペプチドで惹起される進行性病態を伴う再発寛解型EAEに比べ、中枢神経細胞が維持され、ミクログリアが組織修復に働く表現型にシフトしていることが明らかになった。DP-Tregの誘導・維持機構のうち一部の項目(誘導機構)については、抗体入手の関係で遺伝子発現の修飾ができなかったため解析を延期した。その代わり、DP-Tregの誘導・維持機構のうち平成29年度で施行する予定だった一部の項目(維持機構、炎症性細胞との相関関係)については解析でき、さらに中枢神経細胞の分離が簡便に施行できる装置が研究部の意向で研究室に早めに搬入されたことから、平成30年度で行う予定だった中枢神経細胞との相互作用を検討する実験を先に施行した。世間の趨勢としてEAE/MSの慢性化病態については、炎症機転が明確な急性期病態に比べてかなり遅れているものの昨今注目されている領域であり、先に解析を行うべきかと考えた。中枢神経症状の再発・寛解の時期を経て慢性に進行するという経過を特徴とする多発性硬化症(MS)の動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)において、長期の寛解維持を担う要因として脳炎惹起性ペプチドのヒエラルキーの中で最上位の優位ペプチドで感作すると抗原特異性の高いCD69CD103共陽性のCD4+CD25high制御性T細胞(=DP-Treg)が誘導・維持されること、DP-Tregが炎症性T細胞と表現型を共有するhybrid Tregを含有し炎症環境下でも安定して疾患制御能を発揮できることがこれまでの研究で明らかになった。

本研究では、このDP-Tregが炎症性T細胞と入れ替わりには発症ピーク以降に誘導・維持される機構と、組織選択的に炎症抑制能を発揮し、さらに組織障害の修復に関与しうる機構とを解明し、疾患を統制する自己免疫ワクチンの適正化と慢性病態に対する治療へ応用を目標とした。すなわち(A) DP-Tregの誘導・維持機構(規定因子);(B) DP-Tregの作用機構(疾患抑制効果);(C)ペプチドワクチンへの応用の3つの観点から解明することとした。本年度は(A)に関連して、DP-Tregの中で最も他のサブセットとの差が大きく発現量も高い遺伝子がpreproenkephalin (PENK)であることがmicroarrayでの解析により判明した。siRNAを用いてPENKを除去したところ、最上位の優位ペプチドで惹起される進行性病態を伴わない単相型EAEでも、それ以外のペプチドで惹起される進行性病態を伴う再発型EAEに匹敵する再発・再誘導への感受性が惹起されることが確認できた。また(C)に関連して、ペプチドを不完全フロイントアジュバント(IFA)と混合した場合にはEAEが惹起されないことを利用し、EAEを惹起せずに最上位の優位ペプチドを感作することでその後の追加免疫によるEAEの発症や再発・進行性病態を抑制できることが確認できた。DP-Tregの誘導・維持機構(規定因子)のうち一部の項目(誘導機構)について、生体内での発現量を調べることを試みたが、フローサイトメーター用の試薬がなく他の染色法で用いられる試薬を工夫して使用し染色を試みたがうまくいかなかった。その代わりDP-Tregに最も重要であると推定される遺伝子が明らかになり、siRNAを用いたその発現修飾により作用機序の解析ができた。先送りになったDP-Tregの誘導・維持機構の残りの部分に関しては、当初の予定にはなかった手法で感作ペプチドと抗原提示細胞との結合度の関与が推定される結果が得られた。またペプチドワクチンへの応用に関しても、従来EAEを発症しない条件としてペプチド寛容化条件以外に、ペプチドを不完全フロイントアジュバント(IFA)と混合して感作する方法でも可能であり、ペプチド特異的な抑制しか得られないペプチド寛容化条件とことなり脳炎惹起性ペプチドに対し普遍的に抑制が可能であることが示せた。中枢神経症状の再発・寛解を反復しやがて慢性に進行するという経過を特徴とする多発性硬化症(MS)の動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)において長期の寛解維持を担う要因として、脳炎惹起性ペプチドのヒエラルキーの中で最上位の優位ペプチドで感作すると抗原特異性の高いCD69CD103共陽性のCD4+CD25high制御性T細胞(=DP-Treg)が誘導・維持されること、DP-Tregが炎症性T細胞と表現型を共有するhybrid Tregを含有し炎症環境下でも安定して疾患制御能を発揮できることがこれまでの研究で明らかになった。本研究では、このDP-Tregが炎症性T細胞と入れ替わりに発症ピーク以降に誘導・維持される機構と、組織選択的に炎症抑制能を発揮し、さらに組織障害の修復に関与しうる機構とを解明し、疾患を統制する自己免疫ワクチンの適正化と慢性病態に対する治療へ応用を目標とした。すなわち(A) DP-Tregの誘導・維持機構(規定因子);(B) DP-Tregの作用機構(疾患抑制効果);(C)ペプチドワクチンへの応用の3つの観点から解明した。
癌細胞膜上のMMP9前躯体新規活性化機構の発見と癌細胞浸潤機序の解析

炎症性細胞の浸潤を伴う癌組織では、マトリックスメタロプロテアーゼのMTI-MMP,MMP-1,MMP-9前駆体に対する極めて強い活性化プロテアーゼの存在することを見出し、これを精製して一次構造を決定することに成功した。その結果このプロテアーゼは、従来人工的に作り得ることが知られていたが、体内での生理的意義の解明されていなかったミニプラスミンであり、同時にアンギオスタチンが形成されている事を見出した。本研究では疎水性と酵素活性の高まった膜結合型ミニプラスミンの、細胞膜上でのMMP-9前駆体の活性化機序と特異阻害剤の解析を行った。Pro-MMP-9過剰発現細胞を用いてPro-MMP-9の成熟型への変換を検定した。従来試験管内でPro-MMP-9を活性化するプロテアーゼとして、トリプシン、プラスミン、MMP-3などが挙げられていたが、これまでで最も強い活性化作用を示すと言われていたトリプシンよりもミニプラスミンはさらに強い前駆体型MMP-9の活性化作用を示すことが判明した。さらに興味深いことはプラスミンの生体内での強力な阻害剤と言われているアンチプラスミンの阻害を、ミニプラスミンは受けにくいことである。以上のようにプラスミンがミニプラスミンに変換されることにより、1.分子量の減少に伴う基質特異性の拡大。2.親水性のアンギオスタチンの除去に伴う疎水性と膜結合性の獲得。3.リジン結合領域の除去によりアンチプラスミンへの親和性の消失といった新たな酵素学的特性が出現した。今後癌細胞の転移に、ミニプラスミンが直接どのようにかかわっているかを検討してゆく。
スリランカにおける牛ピロプラズマ症の制圧に向けた実践研究

申請者が行ってきた“スリランカにおける牛原虫感染症の疫学調査"から、スリランカの牛と水牛は高度に牛ピロプラズマ(バベシア及びタイレリアの総称)に感染している実態が明らかとなった。そこで、スリランカで発生している牛ピロプラズマ症の被害を軽減するために、これまで申請者らが開発してきた技術シーズを駆使して、1)スリランカに適した簡易診断法の確立、2)スリランカで牛ピロプラズマを媒介しているマダニの同定、及び3)予防ワクチン及び治療薬の効果検証を行ってきた。最終年度では以下の研究成果を得た。牛バベシア(Babesia bovis)のBOV57は、牛タイレリア(Theileria parva)のワクチン候補抗原として知られているP67のホモログで、バベシア寄生サイクルのマダニ期及び牛血液期の両方で発現する原虫抗原である。しかし、BOV57抗原のワクチンとしての潜在能力はこれまで調べられてこなかった。そこで本研究では、まず組換えBOV57(rBOV57)を作製し、マウス及びウサギにおいてrBOV57に対するポリクローナル抗体を作製した。マウス抗rBOV57抗体を用いた間接蛍光抗体法では、BOV57が血液寄生期メロゾイトの先端付近の原虫膜に局在していることが観察された。さらに、試験管内原虫侵入阻害試験において、ウサギ抗rBOV57抗体は、B. bovisメロゾイトの赤血球侵入を有意に阻害することが分かった。本BOV57遺伝子の多型性をスリランカ、モンゴル、及びベトナムの分離株間で比較した結果、よく保存されていることが判明した。これらの知見は、B. bovisのBOV57がメロゾイトの赤血球侵入に重要な役割を果たし、牛バベシア病に対する新たなサブユニットワクチンの候補抗原として活用できる可能性が示唆された。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。平成26年度において、以下の研究成果を得た。1)日本、フィリピン、及びベトナムのピロプラズマ病に関する疫学調査を実施し、疫学調査に必要な遺伝子診断法及び血清診断法の有用性を評価し、また新たな遺伝子多型解析法を確立した。2)スリランカの水牛におけるピロプラズマ(バベシア、タイレリア)の感染状況を調査し、その実態を解明した。3)スリランカを含めた、世界に分布するタイレリア原虫の系統進化の推測と遺伝子多型の事態を取りまとめ、総説論文として学術発信した。4)ピロプラズマ病に対する薬剤探索スクリーニングに有効な新たな培養系を確立し、かつその薬剤候補のいくつかを同定した。5)タイレリア感染に必要な宿主赤血球の感染受容体を同定した。スリランカで実装可能な牛ピロプラズマ症に対する遺伝子診断法や血清診断法を確立し、かつそれらの技術を活用して、水牛におけるピロプラズマの感染実態を明らかにできたことから、本研究はおおむね順調に進展していると考える。平成27年度では主に以下の研究成果を得た。トリパノソーマ(Trypanosoma theileri)は、様々な反芻動物に感染する血液内寄生性原虫である。本年度は、原虫のCATL遺伝子を標的とした診断PCR法を活用して、スリランカで飼育されていた牛および水牛の集団におけるこのトリパノソーマの分布調査を行った。その結果、すべての採取地域で本原虫が検出され、全体の陽性率は、牛(7.6%)よりも水牛(15.9%)の方が高かった。続いて、PCR増幅断片の塩基配列を決定し系統樹解析を実施した。その結果、スリランカのCATL遺伝子配列は2つの主要な群(TthIとTthII)に分けられ、その両方に他国のCATL配列も多く含まれていた。スリランカの牛と水牛のCATL配列の大部分は独立して集団化していたが、2つの水牛由来の配列はスリランカ牛のものとほぼ同一であることが判明した。さらに、スリランカ水牛由来の塩基配列は、ブラジルの水牛およびタイの牛のCATL遺伝子配列と同じクラスターに属していた。本研究では、スリランカの牛と水牛に対する最初のPCR調査となった。さらに、水牛由来のCATL遺伝子断片のいくつかは同国の牛から決定されたものと類似していることが判明した。平成27年度では、スリランカ国の家畜動物にとって重要な住血性原虫種であるトリパノソーマの分子疫学調査を完了し、トリパノソーマが牛及び水牛に分布していることと、その一部が両種間で行き来している可能性が明らかとなった。この成果より、本研究はおおむね順調に進展していると考える。平成28年度では、以下の研究成果を得た。1)牛バベシア(Babesia ovata)の起原や疫学的分布について、総論としてとりまとめた。また、スリランカ、タイ、ベトナムに分布する牛バベシア(Babesia bovis)の遺伝子多型を明らかにした。さらに、スリランカ国の牛ピロプラズマ病(Babesia及びTheileria)発生の季節変動について明らかにした。3)牛バベシア(Babesia bovis)の試験管内の赤血球侵入評価系を確立し、さらに牛バベシア病に対するワクチン候補抗原(Profilin抗原、Methionine aminopeptidase抗原)を同定した。

スリランカ国を含めて世界の疫学調査を実施し、牛ピロプラズマの遺伝子多型や進化を明らかにできたこと、スリランカ国の牛ピロプラズマ病発生の季節動態を明らかにできたこと、牛ピロプラズマ病に対する治療薬やワクチンの候補を同定できたことから、スリランカ国で実装するための制圧戦略の学術基盤が構築できた。当初の計画以上に進展している。申請者が行ってきた“スリランカにおける牛原虫感染症の疫学調査"から、スリランカの牛と水牛は高度に牛ピロプラズマ(バベシア及びタイレリアの総称)に感染している実態が明らかとなった。そこで、スリランカで発生している牛ピロプラズマ症の被害を軽減するために、これまで申請者らが開発してきた技術シーズを駆使して、1)スリランカに適した簡易診断法の確立、2)スリランカで牛ピロプラズマを媒介しているマダニの同定、及び3)予防ワクチン及び治療薬の効果検証を行ってきた。最終年度では以下の研究成果を得た。牛バベシア(Babesia bovis)のBOV57は、牛タイレリア(Theileria parva)のワクチン候補抗原として知られているP67のホモログで、バベシア寄生サイクルのマダニ期及び牛血液期の両方で発現する原虫抗原である。しかし、BOV57抗原のワクチンとしての潜在能力はこれまで調べられてこなかった。そこで本研究では、まず組換えBOV57(rBOV57)を作製し、マウス及びウサギにおいてrBOV57に対するポリクローナル抗体を作製した。マウス抗rBOV57抗体を用いた間接蛍光抗体法では、BOV57が血液寄生期メロゾイトの先端付近の原虫膜に局在していることが観察された。さらに、試験管内原虫侵入阻害試験において、ウサギ抗rBOV57抗体は、B. bovisメロゾイトの赤血球侵入を有意に阻害することが分かった。本BOV57遺伝子の多型性をスリランカ、モンゴル、及びベトナムの分離株間で比較した結果、よく保存されていることが判明した。これらの知見は、B. bovisのBOV57がメロゾイトの赤血球侵入に重要な役割を果たし、牛バベシア病に対する新たなサブユニットワクチンの候補抗原として活用できる可能性が示唆された。平成27年度以降も、確立した遺伝子診断法及び血清診断法を用いてスリランカの牛、水牛、マダニの分子疫学調査を実施するとともに、得られた成果よりスリランカに適した媒介マダニ駆除プログラムの策定を試みる。平成28年度以降も、確立した遺伝子診断法及び血清診断法を用いてスリランカの牛、水牛、及びマダニに対する病原性原虫の分子疫学調査を実施するとともに、得られた成果よりスリランカに適した制圧プログラムの策定を試みる。平成29年度では、牛ピロプラズマの媒介マダニの同定と、そのマダニの吸血活性に適したマダニ駆除プログラムを策定する。さらに、牛を用いた感染実験を実施し、ワクチン候補分子や治療薬候補の効果について予備的に検証し、スリランカ国で実装できる制圧戦略を取りまとめる。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。