hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
キラー細胞類の自己防御能に関する研究

本研究の最終的な目的は、キラー細胞類が標的細胞を攻撃する際、その顆粒内より放出されるパ-フォリンに対し、自己防御のためにキラー細胞類が保有していると考えられている仮想タンパク質Lプロテクチンの存在を明らかにすることにある。今年度の目標は、Lプロテクチンに対するモノクローナル抗体あるいはパ-フォリンをリガンドとするアフィニティーカラムを作製することであった。以下、現時点での成果を順を追って概説する。1、株化されたキラー細胞株CTLL-R8細胞(R8)の二種類の変異株をクローニングすることに成功した。一方は、パ-フォリンの非産生変異株CTLL-R8^-細胞(R8^-)であり、他方は、パ-フォリンの高産生変異株(CTLL-R8.6細胞(R8.6)である。2、R8^-は、パ-フォリンに対する自己防御能を有しており、キラー細胞の対パ-フォリン防御能は、キラー細胞自身が有するパ-フォリンとは、なんら関係ないことが明らかにされた。この結果は、パ-フォリン遺伝子欠損マウス由来LAK細胞を用いた前年度の研究結果(J.Immunol,1995,155,602-608)と一致するものであった。3、R8.6を用いることにより、当初予定していたR8を原料にするよりも、遙かに効率よくパ-フォリンを精製することが出来た。しかし、パ-フォリンをリガンドとしたアフィニティーカラムを作製するには不十分であった。4、そこで、既にクローニング済みのパ-フォリンcDNAをGST融合タンパク法によりコンビナントパ-フォリンを得ることに成功した。しかし、活性は全く保持されておらず、タンパク質の巻き戻しを試みる必要が考えられた。5、一方、Lプロテクチンは、キラー細胞表面に発現していると考えられたので、R8^-全体を抗原とし、抗体の取得を試みた。免疫マウスの抗血清をウエスタンブロッティングにより確認した結果、リファレンスとして使用したパ-フォリンに対して感受性の高いマウス肥満細胞株P815細胞のライゼ-トには認められないバンドがR8^-のライゼ-トに特有のバンドとして検出された。そこでマウス型モノクローナル抗体の作製を試みたが、現在のところ取得するに至っていない。6、免疫動物種をヒトに変更し、IL2,IL4,ムラミルペプチドの存在下で体外免疫を行った。この実験は現在進行中である。
経カテ-テル法による末梢臓器温存近位動脈閉塞術に関する研究

(1)autoperfusion balloon catheter(以下APBC)の有用性に関する実験的検討(1)ーa)血管模型及び血液透析用ポンプを用いてグリセリン水溶液を還流させ,APBCの側孔を1分間に通過する液量を測定した。その結果,側孔の大きさは直径0.81.3mm,数は35個であれば十分な流量がとれ,かつフラッシュが有効でカテ-テルもキンクしにくいと考えられた。7F.APBC(径1.3mm側孔3個)の流量は129ml/分であった。(1)ーb)前年度に引き続きAPBCを成犬の上腸間膜動脈に挿入して根部をバル-ンにて閉塞し,近位の側孔を介する末梢血流の温存の程度を検索しようとしたが,短時間でAPBCが血栓にて閉塞する例が続いたため,上腸間膜動脈は本研究の実験系には不適当と判断した。(1)ーc)成犬7頭の腎動脈根部にAPBCを約2時間半留置後,復部大動脈造影を施行,直後に屠殺して肉眼的,組織学的変化を検討した。腹部大動脈造影では側孔を介して閉塞腎が比較的良く造影された。肉眼的及び組織学的に異常所見を認めたものはなかった。一方対照として通常のバル-ンカテ-テルにて腎動脈根部を2時間閉塞した例では対側腎と比較して肉眼的に明らかに色調の変化を認め,組織学的にも尿細管上皮に虚血性変化が確認された。APBC内腔の血栓形成はいずれも軽度であった。以上の結果よりAPBCは比較的短時間の緊急止血法(末梢臓器温存近位動脈閉塞術)として有用な手段であり,臨床応用可能と考えられた。(2)酸素化人工血液の有用性に関する実験的検討:成犬5頭の腎動脈根部をバル-ンカテ-テルにて閉塞し,酸素化人工血液(perfluorochemical emulsion)を体外より血液ポンプにより2時間にわたり種種の速度で注入した。直後に屠殺し閉塞腎の変化を肉眼的及び組織学的に検索した。その結果20ml/時間/kg(7.5kgの犬で150ml/時間)以上の速度で注入すると肉眼的及び組織学的に異常を認めず,腎動脈における末梢臓器温存近位動脈閉塞術に必要な注入速度と考えられた。(1)腹部領域の基幹動脈の血行を根部にて遮断したときに生ずる末梢臓器障害の程度を知るために以下の検討を行った。(1)ウサギを静脈麻酔下に開腹し,上腸間膜動脈根部を結紮後,種々の時間をおいて(1時間・3時間・6時間後)腸管を切りだし,固定標本を作成して,腸管の壊死・梗塞の有無・程度を組織学的に検討した。その結果回腸領域では,1時間後では明確な組織学的変化は認められなかった。3時間後では,軽度の浮腫及び出血を認めたが,粘膜面は比較的良く保たれていた。6時間後では明らかな出血及び浮腫を認め,粘膜面の破壊像を広範囲に認めた。

空腸(近位小腸)領域及び結腸領域では何れの時間においても明瞭な組織学的変化は認められなかった。以上の結果よりウサギ上腸間膜動脈根部の血行遮断により回腸(遠位小腸)領域に3時間前後で軽度の,6時間前後でかなり強度の梗塞性変化が生じるものと考えられた。(2)同様に開腹したウサギの賢動脈根部を結紮し,3時間後に切りだして組織学的変化を検討した。(2)成犬を対象として麻酔下に大腿動脈より,既に試作したautoperfusion balloon catheterを上腸間膜動脈根部に挿入し,balloonをdilateさせた状態で血管造影施行,末梢の腸管枝は比較的明瞭に描出された。又2時間後に切りだした小腸にも組織学的変化は認めなかった。以上の結果より本カテ-テルの有用性(末梢臓器を温存しながら基幹動脈根部をブロックする)が示唆された。(1)autoperfusion balloon catheter(以下APBC)の有用性に関する実験的検討(1)ーa)血管模型及び血液透析用ポンプを用いてグリセリン水溶液を還流させ,APBCの側孔を1分間に通過する液量を測定した。その結果,側孔の大きさは直径0.81.3mm,数は35個であれば十分な流量がとれ,かつフラッシュが有効でカテ-テルもキンクしにくいと考えられた。7F.APBC(径1.3mm側孔3個)の流量は129ml/分であった。(1)ーb)前年度に引き続きAPBCを成犬の上腸間膜動脈に挿入して根部をバル-ンにて閉塞し,近位の側孔を介する末梢血流の温存の程度を検索しようとしたが,短時間でAPBCが血栓にて閉塞する例が続いたため,上腸間膜動脈は本研究の実験系には不適当と判断した。(1)ーc)成犬7頭の腎動脈根部にAPBCを約2時間半留置後,腹部大動脈造影を施行,直後に屠殺して肉眼的,組織学的変化を検討した。腹部大動脈造影では側孔を介して閉塞腎が比較的良く造影された。肉眼的及び組織学的に異常所見を認めたものはなかった。一方対照として通常のバル-ンカテ-テルにて腎動脈根部を2時間閉塞した例では対側腎と比較して肉眼的に明らかに色調の変化を認め,組織学的にも尿細管上皮に虚血性変化が確認された。APBC内腔の血栓形成はいずれも軽度であった。以上の結果よりAPBCは比較的短時間の緊急止血法(末梢臓器温存近位動脈閉塞術)として有用な手段であり,臨床応用可能と考えられた。(2)酸素化人工血液の有用性に関する実験的検討:成犬5頭の腎動脈根部をバル-ンカテ-テルにて閉塞し,酸素化人工血液(Perfluorochemical emulsion)を体外より血液ポンプにより2時間にわたり種種の速度で注入した。直後に屠殺し閉塞腎の変化を肉眼的及び組織学的に検索した。その結果20ml/時間/kg(7.5kgの犬で150ml/時間)以上の速度で注入すると肉眼的及び組織学的に異常を認めず,腎動脈における末梢臓器温存近位動脈閉塞術に必要な注入速度と考えられた。
EPAを基盤とした段階的若手指導医養成プログラム開発研究

本研究では、Entrastable Professional Activity(EPA)に着目して、体系的若手指導医養成プログラムに応用させる研究を行う。本プログラムの受講生が受講後に臨床教育現場において、受講時に得られた教育技法を実践できているかを探索し、受講生にフィードバックを行うことで、受講生の評価を行うと同時に教育効果の増大をねらう。またプログラム評価・効果検証を行い、汎用性の高いプログラムを目指す。日本や世界に普及することができれば、臨床医学教育のレベルアップが期待できる。本研究は3つのプロジェクトに分けて実施することとした。第1プロジェクトはEPA-Clinical Teacher's Competency Frameworkの作成とClinical Teaching EPAのマトリックス作成、第2プロジェクトは若手指導医養成モデルプログラム開発、第3プロジェクトはEPA評価法開発である。第1プロジェクトについて、EPAの記述作成を試みたが、更に洗練することが求められた。第2プロジェクトはコホート研究のための協力病院、協力者の確保を行った。第3プロジェクトは第2プロジェクトの後に始動する予定である。平成29年10月、EPA開発者に本研究の相談をしたところ、EPAの記述を綿密にすることの重要性を指摘された。この指摘を踏まえEPAの綿密な記述を研究班内で検討を行う必要が生じた。また、当初の予想に反し、参加する研修医の数や指導医の確保ができる協力病院の選定が、受け入れ側の会場確保や対象者の時間確保の点で難航した。結果、来年4月からシリーズでパイロットを実施できる病院の目途がたったが、結果として6ヶ月の遅れが生じた。第1プロジェクトについては研究参加者と議論し、内容を精緻化する。第2プロジェクトを始動し、モデルプログラム完成をめざす。その知見を元に第3プロジェクトを進めていく。
アストロサイトを侵すタウオパチー：タウの病理多様性とアストロサイト多様性の関係

PSPとCBDはアストロサイト胞体内に4-リピートリン酸化タウ蓄積による封入体を認める疾患であるが、両疾患間でその封入体の形状や封入体含有アストロサイトの脳内分布が異なる。PSPではtufted astrocyte、CBDではastrocytic plaqueを示し、前者は明るく、やや大きい核の周辺から放射状にくねくね伸びる表面の滑らかな線状構造であるが、後者は太く、短い、表面がギザギザしてみえる構造物である。また、PSPでは主に皮質、特に皮質深部に分布するのに対し、CBDでは皮質から白質まで広汎に認められる。それ故、これらの疾患では、その病的なアストロサイトの種類が異なると推察した。近年、アストロサイトは極めて複雑な、機能的に多様性に富む細胞であることが示唆されている。しかし、その分子マーカーは明らかとはなっていないため、免疫組織化学的にこれらを区別することは困難であった。我々は、両疾患においてリン酸化タウの蓄積を認めるアストロサイトの特性を解析する。今までに、PSPとCBD剖検脳を対象とし、両疾患で高頻度に異常アストロサイトを認める運動野を含む大脳のフォルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織を用い、抗リン酸化タウ抗体(clone AT8 , Innogenetics)を用いて免疫染色を行い,特徴的な封入体を持つアストロサイトを皮質にて同定し、Laser Capture Microdissection System(Leica LMD 7000:Leica社)にて、1例につき100細胞を目安とし選択的回収を行うことを試みた。しかし、細胞範囲を同定することが困難であり、同定手法を再考する必要があることが判明した。よって、当該領域の組織を用いて解析を試み、得られた結果からクラスター解析を行い、PSPとCBDの皮質のアストロサイト間の差の検討を開始した。今までにPSPとCBD剖検脳を対象とし、両疾患で高頻度に異常アストロサイトを認める運動野を含む大脳のフォルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織を用い、抗リン酸化タウ抗体(clone AT8 , Innogenetics)を用いて免疫染色を行い、特徴的な封入体を持つアストロサイトを皮質にて同定し、Laser Capture Microdissection System(Leica LMD 7000:Leica社)にて、1例につき100細胞を目安とし選択的回収を行うことを試みた。しかし、個々のリン酸化タウ陽性のアストロサイトにおいて、その細胞範囲を同定することが困難であり、同定手法を再考する必要があることが判明した。よって、当該領域(運動野)の組織を用いて解析を試み、得られた結果からクラスター解析を行い、PSPとCBDの皮質のアストロサイト間の差の検討を開始した。これまでに、罹患部位の同定には成功しており、またパラフィン包埋切片からのRNA及びタンパクの解析については、試験的に可能であることを見出している。また、その解析結果のクラスター解析の手法にも精通している。PSPとCBD剖検脳(各々5症例)を対象とし、両疾患で高頻度に異常アストロサイトを認める運動野を含む大脳のフォルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織を用いる。我々は10μm厚に切り出した標本を抗リン酸化タウ抗体(clone AT8 , Innogenetics)を用いて免疫染色を行い、特徴的な封入体を持つアストロサイトを運動野皮質にて同定し、Laser Capture Microdissection System(Leica LMD 7000:Leica社)にて、当該領域の組織を集積し解析を試みる。得られた結果から、クラスター解析を行い、PSPとCBDの運動野皮質のアストロサイト間の差をみる方針とした。最終年度は、これを推し進め、FFPE切片から抽出した資料を用い蛋白質を質量分析法により解析し、罹患アストロサイトの分子署名の相異を検討する。同時に、すでに判明しているアストロサイトの種ごとの特異的核酸プローブ、抗体を用い、両疾患間のアストロサイトの相異を明確にする。タウオパチーではタウ蛋白質の特定のスプライシング多様体が蓄積する。4-リピートタウがアストロサイトの胞体内に蓄積するprogressive supranuclear palsy (PSP)とcorticobasal degeneration (CBD)は蓄積したタウの形状により区別される(前者はtufted astrocytes、後者はastrocytic plaquesと呼ばれる)。前者は明るく、やや大きい核の周辺から放射状にくねくね伸びる表面滑らかな線状構造が特徴である。一方、後者は太く、短い、表面がギザギザしてみえる構造物である。また脳内分布では、PSPでは主に皮質に特に皮質深部に認めるのに対して、CBDでは皮質から白質まで広汎に認められる。それ故、これらの疾患では、その病的なアストロサイトの種類自体が異なるのではないかと推察した。我々は、この病理像の違いはアストロサイトの多様性に関連していると仮定し、両疾患においてリン酸化タウの蓄積を認めるアストロサイトのみを回収し、RNAプロファイルを解析する。具体的には、PSP、CBD剖検脳(各々5症例)を対象とし、両疾患で高頻度に異常アストロサイトを認める運動野を含む大脳のフォルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織を用いた。標本を抗リン酸化タウ抗体(clone AT8, Innogenetics)を用いて免疫染色を行い。特徴的な封入体を持つアストロサイトを皮質にて同定し、Laser Capture Microdissection (LCM)System(Leica LMD 7000:Leica社)にて、1例につき100細胞を目安とし選択的回収を行うことを試みた。

当初の計画通りに一細胞解析をすることが困難であり、他の細胞成分を含んだ解析に変更せざるを得ないため。PSPとCBDはアストロサイト胞体内に4-リピートリン酸化タウ蓄積による封入体を認める疾患であるが、両疾患間でその封入体の形状や封入体含有アストロサイトの脳内分布が異なる。PSPではtufted astrocyte、CBDではastrocytic plaqueを示し、前者は明るく、やや大きい核の周辺から放射状にくねくね伸びる表面の滑らかな線状構造であるが、後者は太く、短い、表面がギザギザしてみえる構造物である。また、PSPでは主に皮質、特に皮質深部に分布するのに対し、CBDでは皮質から白質まで広汎に認められる。それ故、これらの疾患では、その病的なアストロサイトの種類が異なると推察した。近年、アストロサイトは極めて複雑な、機能的に多様性に富む細胞であることが示唆されている。しかし、その分子マーカーは明らかとはなっていないため、免疫組織化学的にこれらを区別することは困難であった。我々は、両疾患においてリン酸化タウの蓄積を認めるアストロサイトの特性を解析する。今までに、PSPとCBD剖検脳を対象とし、両疾患で高頻度に異常アストロサイトを認める運動野を含む大脳のフォルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織を用い、抗リン酸化タウ抗体(clone AT8 , Innogenetics)を用いて免疫染色を行い,特徴的な封入体を持つアストロサイトを皮質にて同定し、Laser Capture Microdissection System(Leica LMD 7000:Leica社)にて、1例につき100細胞を目安とし選択的回収を行うことを試みた。しかし、細胞範囲を同定することが困難であり、同定手法を再考する必要があることが判明した。よって、当該領域の組織を用いて解析を試み、得られた結果からクラスター解析を行い、PSPとCBDの皮質のアストロサイト間の差の検討を開始した。今までにPSPとCBD剖検脳を対象とし、両疾患で高頻度に異常アストロサイトを認める運動野を含む大脳のフォルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織を用い、抗リン酸化タウ抗体(clone AT8 , Innogenetics)を用いて免疫染色を行い、特徴的な封入体を持つアストロサイトを皮質にて同定し、Laser Capture Microdissection System(Leica LMD 7000:Leica社)にて、1例につき100細胞を目安とし選択的回収を行うことを試みた。しかし、個々のリン酸化タウ陽性のアストロサイトにおいて、その細胞範囲を同定することが困難であり、同定手法を再考する必要があることが判明した。よって、当該領域(運動野)の組織を用いて解析を試み、得られた結果からクラスター解析を行い、PSPとCBDの皮質のアストロサイト間の差の検討を開始した。
DNA組換えにおけるRuvA,B,Cタンパクの機能解析

遺伝学的研究によって、大腸菌のruvA,ruvB,ruvC遺伝子の産物は相同的DNA組換えの後期温程に関与すると考えられている。私達は前年度迄の研究の結果、RuvAとRuvBタンパクは複合体を形成して組換え中間体であるHolliday構造の移動を促進する機能をもつという仮説をたて、本年度の研究によってこの仮説を証明した。又RuvCはHolliday構造を切断して組換え体を分離する特異的なエンドヌクレアーゼであることを前年度に証明したが、本年度は更にRuvCの性質を化学的に解析した。1.RuvAとRuvBタンパクは各々4量体と2量体を形成し、この比率で、両者は安定な複合体を水溶液中で形成することを証明した。2.合成DNAを用いて、Holliday構造のアナログである十字型DNAを作成し、RuvAがHolliday構造に特異的に結合する性質をもつ、RuvBはこの結合能を促進することを証明した。3.RuvA-RuvB複合体は十字型DNAに結合して、ATPの存在下で二重鋭DNAを巻きもどして分離する活性(Holliday構造特異的ヘリケス)をもつことを発見した。4.RuvA-RuvB複合体は、RecAタンパクによって形成されたHolliday構造に作用して、ATP分解のエネルギーを利用してHollidy junctianの移動させる(branch migration)活性をもつことを証明した。5.種々の構造をもつDNAを作成して、RubCは十字型およびY型DNAに特異的に結合するが、切断するためには中央のコア部分にホモロジーが存有することが必要であることが示された。6.RuvCのエンドヌクレアーゼ活性の至適pHは69で、2価金属イオンが活性に必須で、高濃度の1価の金属塩は阻害的であることを明らかにした。
Ｎ，Ｎ－アミナール四級不斉炭素の構築を基盤としたパラウアミンの合成研究

本研究ではピロール-イミダゾールアルカロイド(PIA)の一種であるpalau'amineの全合成と生物活性発現機構の解明を目的とし、PIAに共通して存在するN,N'-アミナール四級不斉炭素の構築を基盤としたpalau'amineの合成研究を行った。その構造はN,N'-アミナール炭素を含む7連続不斉中心、2つの環状グアニジン構造を有するなど高度に官能基化されており、合成化学上解決すべき課題を多く含んでいる。またpalau'amineは、強力な免疫抑制活性を示し、かつ毒性が低いため新規免疫抑制剤としての開発が期待されている。本研究では、N,N'-アミナール四級不斉炭素の強力な合成手法であるエナミン型のOverman転位反応を応用することで、高収率、完全な立体選択性でC10位N,N'-アミナール構造の構築に成功し、palau'amineのC環部のグアニジン、ウレア、イソウレアでの合成法を確立した。また、本研究で得られたN,N'-アミナール四級不斉炭素に関する知見を応用することで、類縁化合物であるcylindradine Bの不斉全合成を達成した。今回開発した手法を基盤にE環部不斉点の構築を行うことでpalau'amineの全合成が期待できる。また今後は、C環部のグアニジン、ウレア、イソウレアでの合成法を応用することで様々なpalau'amine誘導体を合成し、生物活性発現機構解明のための基盤構築を展開していく。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
日本における子どもの貧困と健康状態

本研究は,金銭的な豊かさと健康の因果関係の解明と,子どもの貧困と健康状態に関する基礎統計の整理を行っている.異なる種類の個票データおよびマクロデータを用いた9つの分析により,2000年代の日本において,非正規労働者の増加がとくに子供のいる世帯の厚生を低下させた可能性や,生まれてくる子供の健康状態を悪化させた可能性があることが示された.また,分析者には観察できない家計間の異質性を計量経済学の様々な手法を駆使して取除いても,豊かな者ほど健康状態は良く,貧しい者ほど健康状態は悪いことが示された.今年度は,第一に,経済的な豊かさと健康状態の因果関係を分析した.具体的には以下の2本の論文を投稿した.一つ目の論文は,リーマンショック前後における資産分布と健康状態の分布の変化をRIF推定に基づいた分布の描写によって求めたものである.分析の結果,2006年から2009年の景気悪化時期において,BMIで計測される健康状態を分析したところ,痩身の者がさらに痩せ,肥満の者がさらに肥満となる形で健康状態は悪化していることが分かった.この要因を分解したところ,少なくとも肥満度の高い者において平均的な資産保有額が減少したことで肥満の増加につながったことが分かった.2009年から2011年の回復期にも,痩身においては資産が高くなるほどBMIが増加し,肥満においては資産が高くなるほどBMIが減少するという具合に,豊かであるほど健康状態が良くなる関係が確認された.二つ目の論文は,日本の家計パネルデータを用いて,資産額が主観的健康状態に与える影響を分析したものである.分析の結果,パネルデータを利用することで初期時点の個人の異質性を捉え見せかけの相関を取り除き,かつ,健康状態の時間連続性を考慮してもなお,金銭的な豊かさと健康状態の両者の間に因果関係が存在することが明らかにされた.今年度は,第二に,親の失業が新生児の健康状態に与える影響についてすでに雑誌に発表した研究を発展させた分析も行った.分析の結果,親の失業が新生児の健康状態を悪化させる影響は,2000年代以降小さくなっていることが分かった.しかしながら,非正規労働者といった雇用の不安定な者の増加が新生児の健康状態を悪化させている可能性は2000年代以降も確認されており,親の経済状況やその不安定性は子供の健康状態を低下させることが示された.本研究は,金銭的な豊かさと健康の因果関係の解明と,子どもの貧困と健康状態に関する基礎統計の整理を行っている.異なる種類の個票データおよびマクロデータを用いた9つの分析により,2000年代の日本において,非正規労働者の増加がとくに子供のいる世帯の厚生を低下させた可能性や,生まれてくる子供の健康状態を悪化させた可能性があることが示された.また,分析者には観察できない家計間の異質性を計量経済学の様々な手法を駆使して取除いても,豊かな者ほど健康状態は良く,貧しい者ほど健康状態は悪いことが示された.今年度は分析を行うための個票データの申請と,別のデータセットで行った研究成果の論文執筆,研究会等での発表を行った.まず,親の経済環境が子どもの健康状態に与える影響を分析するため,厚生労働省に『国民生活基礎調査』の目的外申請を行い使用許可を得た.データクリーニングを行った後,「傷病数」と「症状数」を使って,1986年2007年にわたる健康状態の分布の変化を追跡した.分析では,第一に,標本期間中に景気後退期(とくに1998年のアジア金融ショック)があることを利用して,家族世帯員の健康状態の分布が外生的な経済状況の変化でどう変わるかに注目している.第二に,親が直面する経済状況の変化が子供の健康状態の分布にどう影響するかを見ている.これらより,健康状態の分布の変化が何により生じているかについて現在文章にまとめている.なお,分析を進めるにあたり,そもそも豊かさと健康状態に因果関係があるのかを検証することも重要だと感じた.そこで,大阪大学GCOE調査データおよび慶應義塾家計パネル調査(JHPS)の利用許可を得て,豊かな者ほど健康状態がよいという関係が本当に存在しているのかについて分析を進めている.家計の貧困と子供の健康状態に関して複数の日本のマイクロデータを用いた分析を行った.第一に,各家計の日次消費データを用いて,母親が働くことで健康によいと考えられる財の消費量が減少すること,この効果は貧しい家計であるほど大きいことを明らかにした(結果は“Maternal Employment and Food Production at Home"としてReview of Economics of the Householdに近刊).第四に,大阪府下で合計7つの調査(失業者や求職者,就業者に対するアンケート調査,大学生に対するアンケート調査,企業人事課に対するインタビューおよびアンケート調査,派遣元企業に対するインタビュー調査,大学卒業生に対する1年間の追跡調査)を行うことで,劣悪な雇用環境や失業経験が個人の健康を悪化させることや,貧困家計の子供が労働や健康に対して不安を持つ様子を明らかにした(「若年女性の労働供給」2015年3月,未公刊).社会科学これまでの達成度は以下のようにまとめられる.第一に,政府による大規模個票データ(国民生活帰途調査)を申請し,親の経済状況と子供の健康状態の因果関係を分析する許可を得た.このデータを用いた初期の分析は終了している.分析についてさらに修正が必要なので,再度使用許可を申請する予定である.第二に,複数のパネルデータを用いて,リーマンショック前後の経済状況と健康状態の関係について分析を終了し2本の論文としてまとめた.現在投稿中である.第三に,県別パネルデータを用いて,親の失業が新生児の健康状態に与える因果関係を分析した(すでに行った研究を発展させてものである).

2000年代以前と以後の変化に注目し,何が新生児の健康状態に影響を与えているのかを明らかにした.現在論文に執筆中である.第四として,回顧調査を使って,親の労働と子供の成長に関する論文を2つの国際学会で報告しコメントを得た.現在修正をして投稿中である.データの申請,入手,基礎分析については予定通り進んでいる.すなわち,必要なデータを入手するために必要な先行研究のサーベイを行い分析計画を立てたこと,データ申請を完了させたこと,データを入手後に基礎分析を行い結果を概観したことの3点を達成できた.また,これまで分析を行ってきた関連テーマの論文については,セミナーなどで発表し学術研究者からコメントをもらうこと,それに基づき文章として完成させること,投稿することの3点を達成できた.さらに,分析を進めるにあたり必要だと分かった点について新たな分析も開始できた.ただし,利用許可を得たデータを用いて行った研究について,いくつかの点ですでに追加分析が必要だと感じている.すでに利用申請は終わっているので,次年度で再申請して分析を再開する必要がある.親の経済環境が子供の健康状態に与える影響について,より直接的な分析を進める.具体的には,大規模個票データを用いて(すでに入手し初期分析は終了しているので必要であれば今年度の追加申請をする予定),親の失業や所得の減少が子供の健康状態ー健康に関する自覚症状や客観的な治療件数ーに与える影響を分析する.その際,リーマンショック前後といった外生的な経済ショックを利用することでその前後での健康状態の変化を分析する.また,居住地域の医療サービスの充実度が,親の経済状況と子供の健康状態の関係に与えた影響についても分析する.分析には,市区町村別の医療データを使い,地域差と時点差を用いることで外生的な制度の影響を捉えたい.過去30年間の市区町村別データについてはすでにまとめ,いくつかの医療サービス指標を作成済みである.なお,これまでに分析してきた論文については,引き続き投稿を続け,雑誌に掲載したいと考えている.これまでの分析内容を踏まえて,今後の分析テーマは,(1)親の直面する経済環境の変化が子どもの健康状態に与える影響の検証,(2)豊さが健康状態に与える影響の検証,(3)1および2が社会政策の影響を受けるかどうかの検証の3点に要約される.
歯科領域の求心路遮断性疼痛の早期診断システムの構築

難治性疼痛疾患の中でも極めて難治性の求心路遮断性疼痛(DEAFFERENTATION PAIN)に関して早期診断エキスパートシステムの構築を行った。まず、求心路遮断性疼痛の特徴である(1)PAINFULDYSESTHSIAの有無。(2)DELAYED ONSET.の有無。(3)疼痛部の知覚障害。(4)麻酔薬による末梢神経ブロックの一時的な有効性。(5)神経遮断の無効。(6)サイオペンタールの静注の有効性の5項目について(1)(4)までのチャートを本院・医学部附属病院の患者総計175名について、アルゴリズムを逐次作成・改変しながら検討した。その結果、特徴(1)(3)までは本疾患の可能性が濃厚な患者では全て共通していたが、(2)のトリガー時期の判断と、(3)の症状が多様であることから、その判別が問題となった。ここまでは一般歯科開業医で本疾患を念頭におけばクリーニングが可能である事がわかったものの、一時的に疼痛の消失を見ている時期もある事から、場合を数を増加する事とした。また(4)に関しては、伝達麻酔を確実に奏効可能な術者で有れば可能である事がわかったが、(5)の奏効の確実性の確認と、(6)の施行が重要な問題となり、(3)の症状の増悪・軽減自体を一つの特徴とする必要があった。また、麻薬の無効性(時に有効ではあったが)を加味しフローチャートを作成した。その結果、求心路遮断性疼痛は,関連痛・反射性交感神経萎縮症・心因性疼痛・神経病等との鑑別は可能となり、NEC9801系パソコンでの診断システムは完成した。これは当初考案していたよりも簡易なアルゴリズムで作成できたが、現在医療用として汎用されている最終目的であった、マッキントッシュへの移植は研究期間の製薬から時間がなく、完遂できず、現在作業進行中である。
狭窄根管に対する非拡大・非根充の新しい根管治療法-生体接着材料の応用-

本研究は、歯の寿命の延長に伴い増加傾向にある狭窄根管に対して、従来の根管治療法とは異なり、浸透性の高い固定剤(生体接着材料シアノアクリレート:DC)で処置する新しい根管治療法の可能性を探究するものである。推定年齢20歳以上のアカゲザル2頭を用い、歯科用X線写真で根管の走行が確認できないか、狭小化の明らかな根管を有する全歯種を用いた。全身麻酔下で本来の髄角が点状に見える位置まで切削し、半導体レーザー組織血流計で、組織血流量、血液量、血流速度を測定した。実験群は、6%NaClOと3%H_2O_2で交互洗浄、乾燥後、以下の4群に設定した。(1)DCを0.2μml滴下する群。(2)EDTA処理、水洗、乾燥後、DCを0.2μml滴下する群。(3)Nd-YAGレーザー10pps、1sec照射、DCを0.2μml滴下する群。(4)EDTA処理、水洗、乾燥後、Nd-YAGレーザー10pps、1sec照射、DCを0.2μml滴下する群。術1週間と3か月後にsacrificeし、非脱灰で樹脂包埋した。X線写真撮影後、根管の縦断面を含む厚さ約80μmの研摩切片を作製し、光顕観察した。さらに約20μmまで研摩し、H-E染色を施して光顕観察した。その結果、歯科用X線像で狭小化の著しい根管でも組織学的には完全に閉鎖することはなく、歯科用X線像での根管狭小化程度と歯髄の血流動態は必ずしも相関しないことが判った。DCは浸透性に優れ、狭小根管に対しても根管深部まで浸透することが明らかとなり、根尖歯周組織に異常所見を認めず、概ね良好な結果が得られた。しかし、X線像で狭小化と判断したが、組織像では狭小化が著明ではなかった2例において本剤の根尖孔外溢出を認め、根尖病巣と歯根の一部吸収が認められた。レーザー併用群では良好な結果が得られた。今後、本剤の安全性、物性、使用量、適応歯の確定方法等について追究する必要がある。本研究は、歯の寿命の延長により増加傾向にある狭小根管に対して、従来の抜髄処置とは全く異なり、浸透性の高い固定剤で処置する新しい根管治療法の可能性を探るものである。まず基礎的研究として、歯科用X線写真で髄室および根管の狭小化の著しいヒト抜去下顎切歯の組織構造を検索した結果、根管壁には構造の不規則な象牙細管を有する第二象牙質(不整象牙質)が厚く添加し、根管は複雑に狭小化してきわめて細いが、光顕では幅径の小さいものでも50μmほどの細小根管が存在し、象牙質基質中に象牙芽細胞などの封入がみられ、根管が石灰化により完全に閉鎖することはないと推察した。さらに、歯科用X線写真で根管の狭小化のみられる歯の歯髄血流動態を調べて検討した。

高齢のアカゲザル2頭の歯科用X線写真撮影を頬舌投影法と咬合撮影法で上下左右各8歯、計32歯について行い、根管の走行を確認できないか、明らかに狭小化が疑われる10根管について半導体レーザー組織血流計を用いて組織血流量、血液量、血流速度を測定した。その結果、歯科用X線写真で狭小化がみられる根管では血流量、血液量、血流速度の平均値は低い値を示すものが多く、波形の上下的振幅も減少する傾向がみられた。冷・温熱刺激に対する反応は鋭敏ではなかった。X線写真での根管の狭小化と血液量の相対的な関係は明らかではなかった。これは狭小化の状況と関連するものと思われ、血流量、血流速度の低下傾向から血液循環が低下している可能性が考えられた。現在、狭小化した根管内に存在する生活組織や硬組織に対する生体接着材料の作用を考究するため、NaClOとH_2O_2の交互洗浄、EDTA処理、Nd-YAGレーザーを組み合わせた4群にシアノアクリレートを作用させ、5分、24時間、1週間、3か月後の非脱灰組織標本を作製し、同材料の有用性について検討中である。本研究は、歯の寿命の延長に伴い増加傾向にある狭窄根管に対して、従来の根管治療法とは異なり、浸透性の高い固定剤(生体接着材料シアノアクリレート:DC)で処置する新しい根管治療法の可能性を探究するものである。推定年齢20歳以上のアカゲザル2頭を用い、歯科用X線写真で根管の走行が確認できないか、狭小化の明らかな根管を有する全歯種を用いた。全身麻酔下で本来の髄角が点状に見える位置まで切削し、半導体レーザー組織血流計で、組織血流量、血液量、血流速度を測定した。実験群は、6%NaClOと3%H_2O_2で交互洗浄、乾燥後、以下の4群に設定した。(1)DCを0.2μml滴下する群。(2)EDTA処理、水洗、乾燥後、DCを0.2μml滴下する群。(3)Nd-YAGレーザー10pps、1sec照射、DCを0.2μml滴下する群。(4)EDTA処理、水洗、乾燥後、Nd-YAGレーザー10pps、1sec照射、DCを0.2μml滴下する群。術1週間と3か月後にsacrificeし、非脱灰で樹脂包埋した。X線写真撮影後、根管の縦断面を含む厚さ約80μmの研摩切片を作製し、光顕観察した。さらに約20μmまで研摩し、H-E染色を施して光顕観察した。その結果、歯科用X線像で狭小化の著しい根管でも組織学的には完全に閉鎖することはなく、歯科用X線像での根管狭小化程度と歯髄の血流動態は必ずしも相関しないことが判った。DCは浸透性に優れ、狭小根管に対しても根管深部まで浸透することが明らかとなったが、根尖歯周組織に異常所見を認めず、概ね良好な結果が得られた。しかし、X線像で狭小化と判断したが、組織像では狭小化が著明ではなかった2例において本剤の根尖孔外溢出を認め、根尖病巣と歯根の一部吸収が認められた。レーザー併用群では良好な結果が得られた。今後、本剤の安全性、物性、使用適正量、適応歯の確定方法等についてさらに追究する必要がある。
皮質階層構造における情報処理様式の普遍性と多様性

本研究では哺乳類大脳皮質における情報処理過程の普遍性および多様性を明らかにすることを目指している。特に大脳皮質における階層的な情報処理過程に注目し、機能的神経回路の領野間での差異を明らかにすることを目指す。本年度は、大脳皮質層構造が比較的単純であるラット大脳皮質第一次視覚野(V1)と第一次体性感覚野(S1)バレル領域を対象として、大脳皮質第4層と3層間での単シナプス性興奮結合に焦点を絞って研究を実施した。計測には、麻酔(ウレタン)動物を用いた。32個の計測点が直列に配置したマルチプローブ電極を皮質表面に対して垂直に刺入し、4層、3層を含む領域から同時に複数神経細胞より活動を計測した。電流源密度解析と組織学的手法により、計測細胞の層を同定した。V1からの計測においては、グレーティング刺激を眼前に設置したディスプレーより提示した。S1バレル領域からの計測においては、触覚刺激を最適ヒゲとその周辺のヒゲを含むようにピエゾ素子により提示した。この結果、V1とS1では単シナプス性興奮結合を反映すると考えられる時間遅れを伴ったスパイク発火相関の出現頻度に差異があることをが明らかになった。すなわち、S1では解剖学的構造から予想されるように、大脳皮質4層細胞のスパイク発火に対して、2ms後に3層細胞が発火する様子が観察された。一方、V1では多くの4層ー3層ペアで、時間遅れを伴わない、同期的発火が観察された。この結果は、各皮質領野において、固有の機能的神経回路が存在することを示唆しており、領野固有の様式で感覚情報が階層的に処理されている可能性を示唆している。昨年度新規に導入した多細胞計測システムとスパイクソーティング手法を用いた計測・解析の処理過程を確立した。この新規システムを用いて、神経活動データ計測をラット第一次視覚野、体性感覚野より実施した。得られたデータを用いて、各領野における単シナプス性結合を反映した時間遅れを伴った神経活動の特性について明らかにした。さらに、各領野の細胞の感覚応答依存性について、定量的な解析を実施した(neuro2019において発表予定)。また、サル皮質領野間で、情報表現様式に差異があることを明らかにした(電子情報通信学会ニューロコンピューティング研究会・MEとバイオサイバネティックス研究会合同研究会、信学技報, vol. 118, no. 470, NC2018-71, pp. 145-150, 2019年3月)。さらに、サル皮質領野間で、情報処理のダイナミクスに領野間差異が存在することも見いだした(neuro2019において発表予定)。以上のように当初計画に従って研究を進めることができたと同時に、学会発表および投稿を行うことができた。しかしながら、これら実験では昨年度から問題となっていたように、単シナプス性の直列結合を反映した結合はごく少数観察されただけであった。そこで、当初方針を変更して、単シナプス性の直列結合における情報の収束ー発散過程の領野間比較を、視床ー大脳皮質結合に注目して実施する予定である。このための予備的な計測実験・解析を実施中である。申請書の計画に基づいて、実験・解析を進める。大脳皮質層構造が比較的単純であるラット大脳皮質第一次視覚野(V1)と第一次体性感覚野(S1)を対象とした実験でも、多くの細胞間で時間遅れを伴わない神経活動相関(同期的発火)が観察され、単シナプス性の直列結合を反映した時間遅れを伴った神経活動相関は、少数しか観察できなかった。そこで、時間遅れを伴った神経活動相関が確実に観察される視床ー皮質経路をモデルとして、単シナプス性の直列結合における情報の収束ー発散過程を検討する。具体的には、視覚系(外側膝状体ー第一次視覚野)と体性感覚系(後内側腹側核ー第一次体性感覚野)で計測実験を実施し、比較する。本研究では、階層的に配置した皮質領野による情報処理に注目し、機能的神経回路の領野間での差異を明らかにすることを目指す。マカク属サル大脳皮質視覚野(初期視覚野、V1;中次視覚野、V4;高次視覚野、IT)より、複数神経細胞活動をマルチプローブ電極を用いて計測した。得られた神経活動にスパイクソーティングを適用して、複数単一神経細胞活動を得た。これら活動に相互相関解析を適用して、機能的神経結合の解析を行った。この結果、サル大脳皮質視覚関連領野において、スパイク発火の相関活動の性質が変化することを明らかにした。すなわち、同期発火の出現頻度、同期発火の時間構造などの指標が階層構造に従って変化した。このような変化は、各領野において、固有の機能的神経回路が存在することを示唆しており、情報処理様式が階層構造に伴って変化している可能性を示唆している(Tamura, bioRxiv, 2017)。また、予備的な解析より、機能的に推定された単シナプス性の抑制性結合が、近傍よりも水平方向に少し離れた細胞間で顕著に観察される様子が明らかになった。また、多数の細胞と同期発火する神経細胞群を見出した。これら実験では、同時計測される細胞数が限られていたため、単シナプス性の直列結合を反映した時間遅れを伴った相関発火はごく少数観察されただけであった。そこでより多数の神経細胞からの同時計測を目指したシステムを構築し、検出数を上昇させることを目指した。新しいスパイクソーティングソフトウェアを導入し、予備的な解析を実施した。

多領野大規模並列神経活動データ計測をマカク属サル第一次視覚野、中次視覚野V4野、そして下側頭葉皮質IT野に適用して、複数神経細胞活動データを取得することができた。得られた神経活動データからオフラインでスパイクソーティングを実施し、すべてのデータについて複数神経細胞活動を得た。各領野における単シナプス性共通入力を反映した同期的神経活動の特性について明らかにすることができた(Tamura, bioRxiv,2017)。以上のように当初計画に従って研究を進めると同時に、予備的データ解析から得られた知見について、論文発表・学会発表を行うことができた。さらに、予備的な解析より、機能的に推定された単シナプス性の抑制性結合が、近傍よりも水平方向に少し離れた細胞間で顕著に観察される様子が明らかになった。また、多数の細胞と同期発火する神経細胞群を見出した。このように、新しい知見が多数得られており、現在慎重に解析を進めているところである。これら実験では、同時計測される細胞数が限られていたため、単シナプス性の直列結合を反映した時間遅れを伴った相関発火はごく少数観察されただけであった。そこでより多数の神経細胞からの同時計測を目指したシステムを構築した。これに伴い、新しいスパイクソーティングソフトウェアを導入した。現在、予備的な解析を実施中である。本研究では哺乳類大脳皮質における情報処理過程の普遍性および多様性を明らかにすることを目指している。特に大脳皮質における階層的な情報処理過程に注目し、機能的神経回路の領野間での差異を明らかにすることを目指す。本年度は、大脳皮質層構造が比較的単純であるラット大脳皮質第一次視覚野(V1)と第一次体性感覚野(S1)バレル領域を対象として、大脳皮質第4層と3層間での単シナプス性興奮結合に焦点を絞って研究を実施した。計測には、麻酔(ウレタン)動物を用いた。32個の計測点が直列に配置したマルチプローブ電極を皮質表面に対して垂直に刺入し、4層、3層を含む領域から同時に複数神経細胞より活動を計測した。電流源密度解析と組織学的手法により、計測細胞の層を同定した。V1からの計測においては、グレーティング刺激を眼前に設置したディスプレーより提示した。S1バレル領域からの計測においては、触覚刺激を最適ヒゲとその周辺のヒゲを含むようにピエゾ素子により提示した。この結果、V1とS1では単シナプス性興奮結合を反映すると考えられる時間遅れを伴ったスパイク発火相関の出現頻度に差異があることをが明らかになった。すなわち、S1では解剖学的構造から予想されるように、大脳皮質4層細胞のスパイク発火に対して、2ms後に3層細胞が発火する様子が観察された。一方、V1では多くの4層ー3層ペアで、時間遅れを伴わない、同期的発火が観察された。この結果は、各皮質領野において、固有の機能的神経回路が存在することを示唆しており、領野固有の様式で感覚情報が階層的に処理されている可能性を示唆している。昨年度新規に導入した多細胞計測システムとスパイクソーティング手法を用いた計測・解析の処理過程を確立した。この新規システムを用いて、神経活動データ計測をラット第一次視覚野、体性感覚野より実施した。得られたデータを用いて、各領野における単シナプス性結合を反映した時間遅れを伴った神経活動の特性について明らかにした。
多色カルシウム指示遺伝子を用いたグリア・神経細胞活動相関の可視化

最近の知見により、従来は活動が乏しいとされてきたグリア細胞にて、神経活動と連動した、電気的活動やカルシウム応答が生じる可能性が示唆されている。しかし、神経活動とグリア活動の同時可視化は、技術的困難からまだ十分検討されていない。平成28年度においては、緑、赤の高速カルシウムインディケーターと同等のスパイク検出脳を有する黄色、青色のカルシウムインディケーターを創出することに成功した。この成果に基づき、平成29年度には、神経活動のプレ・ポスト同時活動測定をin vivoで試みた。また、青色などの第3色のインディケーターをGFAPプロモーター下でグリア細胞に発現させる技術を構築し、アストロサイトCa2+変動を可視化した。さらに、可塑性刺激を付加し、シナプス伝達の変容とともに、グリア活動がどのように変わるか、また、グリア活動を抑制することに伴う、シナプス可塑性の変化を検討した。平成29年6月30日付けで平成29年度新学術領域研究(研究領域提案型)が採択されたため、本研究は廃止された。29年度が最終年度であるため、記入しない。グリア細胞では、従来は、活動が乏しいとされてきたが、最近の知見により、神経活動と連動した、電気的活動やカルシウム応答があることが示唆されている。本研究では、これまでに開発を進めてきた多色Ca2+インディケーターを活用し、異なる色のCa2+インディケーターを神経細胞終末・ポストシナプス・グリア細胞などに特異的に発現させる技術の確立を試みる。平成28年度には、まず、多色・高速・線形Ca2+インディケーター各種を、アストロサイト特異的GFAPプロモータを含む、様々なプロモータの下流で発現するAAVウィルスベクター等を開発し、その実用性を検証した。つづいて、シナプス前・後における2重活動測定を実現するための予備的検討を実施した。緑・赤色、黄・赤色、緑・黄色の2重イメージングについて、1光子・2光子でのイメージングにおける最適化を進めた。プレ・ポストの同時イメージング条件を確立した上で、さらに、3色目のインディケーターをシナプス周辺のアストロサイトに発現するための技術的検討を実施した。これに加え、シナプス酵素反応をYellow-to-Red FRETインディケーターにより可視化し、グリア細胞の活動動態を基底時蛍光の高い青色Ca2+インディケーターを指標に計測する、などの新規イメージング法についても、検討を進めているところである。当初研究計画に基づき、グリア細胞における新規カルシウムセンサーの発現条件検討や同時可視化が順調に進んでいる。最終年度において、研究計画に従い、グリア活動と神経活動の同時可視化法の確立を進めて行く。
HTLV-I associated uveitisにおける接着分子についての検討

human T-cell lymphotropic virus typel(HTLV-I)感染に関連してぶどう膜炎が発症することが疫学的に証明され、HTLV-I associated uveitis(HAU)という疾患概念が確立された。症例研究を主体とする臨床研究の結果、網膜血管表面の白色の顆粒付着が、他のぶどう膜炎でみられないHAUに特徴的な臨床所見として浮かび上がってきた。この白色顆粒付着は、HTLV-I感染リンパ球が網膜血管外に遊走して、血管表面で何らかの増殖反応をおこしているものではないかと推定し、この仮説を検証するひとつの手段として、リンパ球の血管外遊走の第一段階である血管内皮接着に関与する血中の接着分子とその発現を修飾するサイトカインについて検索した。HTLV-I感染者の原因不明のぶどう膜炎20例(HAU群)を対象とし、HTLV-I感染者で既知のぶどう膜炎を発症した6例(HTLV-I(+)ぶどう膜炎(+)群とぶどう膜炎を発症していない8例(HTLV-I(+)ぶどう膜炎(-)群)、HTLV-I非感染者のぶどう膜炎8例(HTLV-I(-)ぶどう膜炎(+)群)をコントロールとし、それぞれ血漿のsICAM-1、IL-6、TNF-αを測定して比較した。
ウシルーメン上皮崩壊の予防に向けたルーメン上皮バリア機能の調節機序の解明

濃厚飼料といった易発酵性の飼料の多給は、乳牛や肉牛の生産効率を高めたが、エネルギー産生・吸収の場であるルーメン(第一胃:ミノ)に負荷を掛け、亜急性ルーメンアシドーシス(SARA)といった生産病を招くことがある。このSARAを罹患すると、採食量の低下や下痢を引き起こす上に、ルーメンの表面の上皮を崩壊させ、ルーメン微生物などの宿主への侵入を許し、全身で炎症が起きる。本研究の目的は、ウシルーメン上皮の崩壊機序の解明とバリア機能調節因子を探索することである。本研究が上手くいった場合、SARAで苦しむウシを救うことができ、また、農家の生産効率も向上することが考えられる。
細胞運動制御の新展開：筋収縮調節タンパク質トロポニンによる細胞運動の制御

クマムシでは咽頭以外の全身の非横紋運動細胞のアクチン線維ネットワークにトロポニン(Tn)の存在を免疫染色法により明らかにし、アクチン線維を分離しイムノブロット法によりTnIバンドを同定した。次に、最も原始的な後口動物である棘皮動物有柄ウミユリ及び半索動物ギボシムシの平滑筋でTnの有無を検討、いずれの筋でもTnを欠損するがパラミオシン(PM)の存在を見いだした。棘皮動物ウニ、ナマコ筋での知見と併せ、後口動物の進化過程では、PMを保持しながらTnを欠損するグループ(棘皮動物と半索動物)とTnを保持しながらPMを欠損するグループ(原索動物脊椎動物)とに分かれたであろうことを提起した。1)棘皮動物ナマコ筋のアクチン線維の構成蛋白質の解析(前年度から継続):ナマコの体壁筋(非横紋筋)から分離条件を修正して天然アクチン線維を分離し、SDS-PAGEで解析した。このアクチン線維にトロポミオシン(TM)相当のバンドは検出されるが、トロポニン(TN)相当のバンドは検出されない。TMと思われるバンドは尿素存在下で特異的に移動度が低下するというTMの特性ももつことが確認された。分離アクチン線維はミオシンATPaseを活性化させるが、Caイオンの存在の有無により影響されないので、機能面からもTNの存在は否定された。ナマコの筋にはトロポニンがないと見なされる。棘皮動物の中で最も原始的位置にあるウミユリ(トリノアシ)の筋(構造的には平滑筋)からアクチン線維を分離し解析した。この場合も、TMは検出されたがTN相当バンドは検出されず、機能特性の面からもTNの存在は否定された。ウニ平滑筋がトロポニンを欠くことは既にわかっている(Obinata et al, 1974)。従って、棘皮動物全般にTNが欠損しているとの結論に至った。2)線虫のカルポニン様タンパク質(UNC-87)の機能特性:無脊椎動物でのトロポニンによる収縮運動(アクチン-ミオシン相互作用)の制御に影響を与える可能性があるので、前年度に続き、UNC-87の機能特性を解析した。今年度は線虫ミオシンを調製し調べた。その結果、UNC-87はアクチンおよびミオシンに結合し両者を架橋、アクチン-ミオシン相互作用に抑制的に制御するという特異な機能を確認した。3)コフィリン(CF)と運動装置の形成:トロポニンをアクチン線維を局在化させるトロポミオシンはCFと競合する作用があるので、運動装置の形成でのコフィリンの役割を検討、CFが必須の役割を果たすことを解明した。CFのアクチン線維への局在はUNC-87とは競合しない。棘皮動物と半索動物の非横紋筋の収縮制御蛋白質トロポニンの検討:後口動物に属する棘皮動物のウニ、ナマコの筋では、他の後口動物(原索動物、脊椎動物)の筋とは異なり、トロポニンによる制御系を欠損、しかしパラミオシンをもつことがわかっている。そこで、最も原始的な棘皮動物である有柄ウミユリ類•トリノアシの筋、及び半索動物•ギボシムシの筋ではどうか、後口動物の筋収縮の制御系の進化の観点から検討した。それぞれの動物に存在する微小な筋肉を採取、天然アクチン線維を分離し、そこにトロポニンがあるか否かをSDS-PAGEで解析するとともに、天然アクチン線維がミオシンMg2+-ATPアーゼをCa2+依存的に活性化するか否かを解析、その結果、トリノアシの筋、ギボシムシの筋のいずれでもトロポミオシンは存在するがトロポニンを欠損することを明らかにした。一方、既に作成されていたウニパラミオシンに対する抗体を用いてイムノブロット法で解析の結果、トリノアシ及びギボシムシの筋のいずれでもパラミオシンの存在が確認された。そのサイズは約100 kDa、ミオシンより多量に存在することがわかった。トリノアシとギボシムシの筋の特徴は他の後口動物の筋よりも前口動物群の筋に類似している。これまでの研究成果を総合して考察、後口動物の進化の過程で、パラミオシンを保持しながらトロポニンを欠損するグループ(棘皮動物と半索動物)とトロポニンを保持しながらパラミオシンを欠損するグループ(原索動物脊椎動物)とに分かれたであろうと推測するに至った。プラナリアのトロポニンについて:ゲノム情報から示唆されるトロポニン成分(TnT, TnI, TnC)の非横紋筋での発現実態をRT-PCR法で解明、更にTnCを組み替え体蛋白質として作成、TnCとしての機能特性をもつ事を確認した。