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ナノバブルと超音波を用いた新し遺伝子治療による悪性唾液腺腫瘍の攻略

本研究の目的は、高悪性度唾液腺腫瘍を対象としたナノバブルと超音波を用いた画像診断法と遺伝子治療法を開発することである。本研究では、腫瘍モデルを対象として、ナノバブルと高周波超音波解析装置による高解像度の画像診断システムモデルを開発した。さらに、ナノバブルと超音波を用いた抗腫瘍遺伝子発現プラスミドDNAの遺伝子導入による新たな遺伝子治療法の可能性を提示することができた。唾液腺悪性腫瘍は、病理組織の悪性度によって予後が大きく異なる。中でも唾液腺導管癌は術後の再発率が高く、予後はきわめて不良である。その理由として神経や血管に沿って浸潤する進展様式などがあげられる。本研究では、ナノバブルと高周波超音波を用いた四次元画像システムを完成させ、「超悪性唾液腺腫瘍」の腫瘍血管新生を観察するとともに、腫瘍血管の新生を抑制する治療・標的ナノバブルを用いて、新たな遺伝子治療法の開発を目指す。本年度においては、「超悪性唾液腺腫瘍」の疾患モデルの開発を試みた。本研究課題における疾患モデルの条件としては、1)遺伝子治療を想定した研究に対応できること、2)in vivo生体発光イメージングシステムによる腫瘍の増殖、転移の状況を把握できること、3)ナノバブルを用いた高周波超音波画像解析装置による画像解析が可能であること、4)腫瘍が転移性でび慢性の浸潤様式を示し、臨床的観点から高悪性度腫瘍の生物学的性状を示すこと、5)病理組織像が「超悪性唾液腺腫瘍」に類似していること、などを想定した。以上の観点から、実験モデル動物としてマウスを用い、腫瘍細胞は、我々が開発してきた、マウスに生着し、ルシフェラーゼ遺伝子を恒常的に発現し、in vivo生体発光イメージングシステムによる腫瘍の増殖、転移の状況を把握できる実験腫瘍細胞株の中から選択することにした。唾液腺導管癌の組織像は、乳腺の乳管癌に類似していることが知られていることから、我々が開発したルシフェラーゼ遺伝子を恒常的に発現する乳癌細胞株であるEMT6-luc細胞を用いて、転移能の検証実験を行っった。その結果、EMT6-luc細胞は、び慢性に浸潤し、細胞の接種部位によっては、効率に肝転移を起こすことがin vivo生体発光イメージングシステムにより確認でき、この実験腫瘍モデルが本研究を遂行する上で極めて有用と思われた。本研究では、ナノバブルと超音波を用いた四次元画像システムを構築し、「超悪性唾液腺腫瘍」の腫瘍血管新生を観察するとともに、ナノバブルと超音波を用いた遺伝子導入法と抗腫瘍遺伝子長期発現プラスミドDNAを用いて、腫瘍血管の新生を抑制する新たな遺伝子治療法を開発し、「超悪性唾液腺腫瘍」の患者救済を目指すことを目的とする。これまで我々は、遺伝子治療を想定した研究に対応できること、in vivo生体発光イメージングシステムによる腫瘍の増殖、転移の状況を把握できること、ナノバブルを用いた高周波超音波画像解析装置による画像解析が可能であること、腫瘍が転移性でび慢性の浸潤様式を示し、臨床的観点から高悪性度腫瘍の生物学的性状を示すこと、病理組織像が「超悪性唾液腺腫瘍」に類似していることなどの条件を満たした実験腫瘍モデルを開発した。この腫瘍モデルにおいては、ルシフェラーゼ発現腫瘍細胞が、マウス組織内でび慢性に浸潤し、細胞の接種部位によっては、効率に腫瘍細胞がび慢性に肝転移を起こすことがin vivo生体発光イメージングシステムにより確認できた。平成22年度においては、この転移病巣の超音波画像による診断法の開発を試みた。その結果、従来の臨床用超音波診断装置と超音波造影剤を用いた超音波画像では、腫瘍細胞がび慢性に浸潤し、一塊としての転移病巣を形成しない上記実験腫瘍の診断は困難であったが、高周波超音波画像診断と超音波造影剤を用いて取得した超音波画像を基に腫瘍血管密度を解析することにより、腫瘍塊を形成せず、び慢性に浸潤する高悪性腫瘍の転移病巣を早期に診断できる可能性が示された。本研究では、ナノバブルと超音波を用いた画像解析システムを開発し、「超悪性唾液腺腫瘍」の腫瘍血管新生を観察するとともに、ナノバブルと超音波を用いた遺伝子導入法と抗腫瘍遺伝子発現プラスミドDNAを用いて、腫瘍の増殖を抑制する新たな遺伝子治療法の開発を目指すことを目的とする。これまで我々は、ルシフェラーゼ発現腫瘍細胞が、マウス組織内でび慢性に浸潤し、細胞の接種部位によっては、腫瘍細胞がび慢性に高率に肝転移を起こすことがin vivo生体発光イメージングシステムにより確認できる実験腫瘍モデルを開発した。この腫瘍モデルを用い、転移病巣の超音波画像による診断法の開発を試みた。その結果、従来の臨床用超音波診断装置と超音波造影剤を用いた超音波画像では、腫瘍細胞がび慢性に浸潤し、一塊としての転移病巣を形成しない腫瘍の診断は困難であったが、高周波超音波と超音波造影剤を用いて取得した超音波画像を基に腫瘍血管密度を解析することにより、腫瘍塊を形成せず、び慢性に浸潤する高悪性腫瘍の転移病巣を早期に診断できる可能性が示された。

平成23年度においては、TNF-α発現プラスミドDNAを作製し、ナノバブルと超音波を用いた分子導入法を用いて、ルシフェラーゼ発現腫瘍細胞を移植したマウス実験腫瘍にTNF-α発現プラスミドDNAを導入し、遺伝子治療実験を行った。その結果、腫瘍の縮小と腫瘍血管の密度の減少が、in vivo生体発光イメージングシステムおよびナノバブルと高周波超音波を用いたイメージングシステムにより確認できた。
高レイノルズ数円管流れにおける摩擦損失係数の定式化と普遍速度分布に関する研究

高レイノルズ数円管乱流における管摩擦係数と流速分布に対する普遍性に関する研究を行った。本研究は高レイノルズ数実流試験設備を用い、流量を高精度に計測することによる摩擦速度やレイノルズ数を高精度に求めることができる点が最大の特徴である。流速分布をLDVを用いて行い、その計測結果の妥当性の検証を詳細に行った。特に、流速分布から求められる管摩擦係数と圧力勾配から実測された値が非常に良い一致を示した。この結果を元に、流速分布を対数則により現した場合の傾き(カルマン定数)を精度良く算出し、その値は0.384であった。他の壁乱流における値と非常に良い一致を示しており、壁乱流における普遍性を示すことができた。H27年度においては、口径100mmの配管において、最大1,000,000の管レイノルズ数における流速分布計測を実施し、その速度分布と管摩擦係数との整合性および平均流速分布型、さらに空間情報に対する補正方法について検討を行った。主要な結果は以下の通り。流速分布計測にはLDVを用いた。産業技術総合研究所における高精度流量校正設備を用い、安定した流量及び水温条件のもと、流速分布および乱流強度計測を粘性低層から後流にかけて精密に実施した。流速分布計測部の上流において、管摩擦係数の計測を同時に行い、ここから得られる壁面せん断応力から摩擦速度を算出した。平均流速分布において、対数則による整理を行うと、レイノルズ数が300,000以上において、カルマン定数や切片定数Bが一定となることが分かった。本研究においてカルマン定数は、0.3820.383の値を取る。この平均流速分布から得られたカルマン定数は、300,000より大きいレイノルズ数に対する管摩擦係数の実験結果から得られる値と良く整合し、Superpipeにおける結果と大きな差があることが明らかになった。本研究で求められたカルマン定数は、平板境界層やチャネル流ときわめて近い値となっており、壁乱流における相似性を明確に示す結果を得ることができた。乱流強度分布においては、PDFの不変性を用いた空間分解能に対する補正方法を検討したうえで、特にAttached Eddyモデルに対する検証を行った。このモデルの-1乗スペクトルについて検証したところ、低レイノルズ数において確認されるものの、高レイノルズ数領域では確認できないことが分かった。このモデルが乱流強度における対数直線性に関連性がないことを明らかにした。H27年度においては1,000,000までのレイノルズ数における流速分布の計測を行うことができ、この結果から数多くの知見を得ることができている。特に、Superpipeとは異なる管摩擦係数の結果に対して、流速分布との整合性を非常に高い精度にて確認することができたこと、カルマン定数が他の壁乱流との相似的な値を得ることができたことは非常に重要な情報である。この他、PDFの不変性を用いた空間分解能の補正方法について提案し、壁乱流におけるLDV計測の乱流強度の精度良い計測方法を確立することができた。管摩擦係数に関する再試験に関しては、その粗さの影響について検討するとともに、Colebrook-Whiteの式を適用し、その影響を明確にすることができた。低レイノルズ数と高レイノルズ数領域における特性変化については、平均流速分布からも一致した傾向が得られることも明らかにできた。さらに、H28年度以降の大口径配管における10,000,000オーダーの高レイノルズ数試験のためのウィンドーチャンバーの準備を終え、予備試験を実施した。以上がH27年度に計画されていた研究計画に対する結果であり、当初予定されていた内容については、十分に実施された。さらに、乱流強度解析を行いAttached Eddyモデルの非成立を明らかにしたこと等については、当初H28年度計画に盛り込まれていたものであり、当初の計画以上に研究は進行していると言える。H28年度においては、H27年度において計測された実験結果をさらに高度に検証するためのデータ解析をまず実施した。カルマン定数、切片定数に関するレイノルズ数特性を明確化するとともに、流速分布から得られるこれらの定数と、管摩擦係数の計測結果から得られるこれらの定数の一致について検討した。その結果として、バルクのレイノルズ数が5x10^5より小さい領域では定数にレイノルズ数依存性がある一方で、これより大きいレイノルズ数においては普遍的な値、すなわちカルマン定数が0.383、切片定数が4.335をとなることを示すことができた。これらの定数は、流速分布と管摩擦係数のそれぞれ独立した計測結果から得られたものであり、両者の高い一致性から、妥当性が非常に高い結果であると結論づけられる。これらの結果は近年の議論の対象となっている、Superpipeの結果とは一致しない(カルマン定数が0.41)一方で、他の壁乱流、すなわち、平板境界層やっチャネル流れにおける定数と高レイノルズ数領域において、極めて良い一致を示しており、普遍的な流速分布形状となる可能性を示唆する結果となった。一方、上記の結果は100mmの口径における結果であり、レイノルズ数もSuperpipe等に比較し十分には大きくなく、また、粗さの影響を考慮した場合には大口径でさらに高レイノルズ数での実験が必要であった。H28年度においては内径が387mmの大口径の配管に対して、十分に長い直管長さを持つ滑管を準備した。

当初においては発達に十分な長さを有しない可能性があったことから、配管を追加したものである。また、LDV計測における空間分解能を向上するための手法等についての検討も実施した。H28年度までの研究において、これまでに広範囲なレイノルズ数域における管摩擦係数および小口径(100mm)の流速分布および乱れ強度分布の計測を行ってきた。すでにこれらの実験結果の解析を行っており、普遍的流速分布の可能性、それらの定数、また、乱れ共同分布のスケーリングやAttached Eddy Modelの検証等を行ってきており、高レイノルズ数円管流れにおける、多くの新しい知見を得ることができている。このような観点から、当研究はおおむね順調に進展していると言える。H29年度においては、大口径(387mm)配管を用いて平均流速分布および乱れ強度分布の計測実験を行った。この試験は異なる口径(異なる流動条件)におけるカルマン定数をはじめとする定数の比較および、レイノルズ数をRet=5x10^5まで拡張することによる普遍性に対する議論を追求するためのものである。H27, H28年度に実施した小口径配管と本年度の実験結果は、カルマン定数において非常に良い一致を示した。また、レイノルズ数を拡張することにより、カルマン定数が0.384に漸近することが明らかになった。この成果は、他の壁乱流におけるカルマン定数に極めて良く一致しており、流動場が異なっても一定の勾配を持つ流速分布となることを示している。一方、付加定数については両者において差が観測される。付加定数は他の壁乱流とも異なる値を示しているように、場に依存した値となることが分かった。H29年度は、さらに空間分解能が平均流速分布や乱れ強度分布に与える影響についても、詳しく実験的に調査した。実験は、配管へのレーザーの入射角度を変更することにより、流動場における空間分解能(測定体積)をパラメトリックに変化させることにより行った。その結果、乱れ強度分布の壁面近傍第一ピークにおいては、測定体積の影響が大きいことが明らかになり、精度の高い計測のためにはL+<10程度の測定体積とする必要があることが明らかになった。また、y+>100においては、測定体積の影響をほぼ受けないことも明らかにすることができた。この他、壁面垂直成分の計測も行った。その乱れ強度分布はDNSと非常に良い一致を示しており、今後のレイノルズ応力計測におけるバックデータの取得に成功した。高レイノルズ数円管乱流における管摩擦係数と流速分布に対する普遍性に関する研究を行った。本研究は高レイノルズ数実流試験設備を用い、流量を高精度に計測することによる摩擦速度やレイノルズ数を高精度に求めることができる点が最大の特徴である。流速分布をLDVを用いて行い、その計測結果の妥当性の検証を詳細に行った。特に、流速分布から求められる管摩擦係数と圧力勾配から実測された値が非常に良い一致を示した。この結果を元に、流速分布を対数則により現した場合の傾き(カルマン定数)を精度良く算出し、その値は0.384であった。他の壁乱流における値と非常に良い一致を示しており、壁乱流における普遍性を示すことができた。H28年度においては、大口径配管における流速分布計測試験を実施する。
カンラン岩の系における高圧型含水マグネシウム珪酸塩の安定関係

2.高輝度放射光施設SPring-8(兵庫県)のビームラインBL10XUへ設置した抵抗加熱(外熱)式ダイアモンドアンビルセル(DAC)を用いて、含水D相の高温高圧下における安定性を調べた。抵抗加熱式DACは、一昨年度のバイロイト大学(ドイツ連邦共和国)滞在中に習得したものである。含水D相は100GPa,1000Kまで分解しない可能性があり、非常に冷たいスラブであれば、核-マントル境界まで地球表層の水が運搬されうることが明らかになった。実験では同時に、含水D相の高温下(900K)の圧縮率のデータを得た。1.2002年9月12日2003年3月5日の間、ドイツ連邦共和国、バイロイト大学、バイエルン地球科学研究所に滞在した。滞在期間中、Dubrovinsky博士(バイロイト大学)と共同で、抵抗加熱式ダイアモンドアンビルセル(外熱DAC)装置を用いて、高圧含水相である含水D相の高圧相平衡実験を行なった。その結果、含水D相は67GPa(深さ1600km)、550°Cまでは安定であることが分かった。また、実験と平行して外熱DACの技術を習得した。帰国後、Dubrovinsky博士協力の元、外熱DACの東京工業大学への設置を開始した。2.沈み込む含水カンラン岩を代表する蛇紋石鉱物アンティゴライトの高圧相平衡X線その場観察(大型放射光施設SPring-8(兵庫県)にて行なった)の結果を、Journal of Geophysical Research誌に投稿した。沈み込み帯で観測される二重深発地震面(アンティゴライトの脱水反応起源と考えられている)と放射光実験により精密決定したアンティゴライトの状態図を比較することにより、世界中の沈み込み帯のうち、東北日本、アリューシャン、カムチャッカでは、沈み込むプレートにより、マントル深部(410km以深)に水が運び込まれている可能性があることを示した。3.「30GPa(深さ800km)、1600°Cまでの沈み込む含水カンラン岩に対する岩石成因論的グリッド」を国内(地球惑星科学合同大会、5月、代々木、口頭)、海外(米国地球物理学連合(AGU)、12月、米国サンフランシスコ、ポスター)それぞれの学会で発表した。高圧下での含水カンラン岩に対する、含水鉱物(高圧型含水マグネシウムケイ酸塩)を含む内部矛盾のない反応曲線網(グリッド)を世界で初めて構築した。そのグリッドを基に、沈み込むカンラン岩による水輸送の機構を論じた。2.昨年度のバイロイト大学(ドイツ連邦共和国)滞在中に習得した抵抗加熱(外熱)式ダイアモンドアンビルセル(DAC)を、高輝度放射光施設SPring-8(兵庫県)のビームラインBL10XUへ設置した。実験はすでにルーチンに乗っており、高温高圧X線その場観察が可能である。現在までに、70GPa,1050Kを達成した。含水D相の高温高圧安定性、高温下(900K)の圧縮率のデータを得ている。3.東工大のマルチアンビルプレスを用いたクエンチ実験により、深さ410-km(14GPa)付近でのDHMSの相平衡を調べた。従来報告されている実験と異なり、水に不飽和なバルクの出発物質を用い、遊離フルイドの組成に影響されない相平衡実験をおこなった。構築した相平衡図に基づき、マントル遷移層への水の出入りについて議論した。この実験結果は上記1.で論文発表したグリッドに新たな制約を与え、マントル内部の水のダイナミクスの理解に重要な寄与となる。この成果を国際学会(米国地球物理学連合(AGU)、12月、米国サンフランシスコ、ポスター)で発表した。
膿胸関連リンパ腫における遺伝子変異の特徴と放射線被ばくの関与

これは、PAL以外のリンパ腫、肉腫、基底細胞癌等で報告されているp53遺伝子の変異のパターン(CpG site変異が多く、dipyrimidine siteの変異が少ない)や変異のスペクトラムと大きく異なっている。また、ウラン鉱鉱夫や原爆に被爆した人に発生した肺癌や、トロトラスト注入後に発生した肝癌等におけるp53遺伝子の変異のパターン(G:C→T:A transversionの頻度>G:C→A:T transitionの頻度)とも大きく異なっている。今後、長期にわたる放射線(X線)あるいは化学物質(抗結核剤等)による被曝がp53遺伝子に変異を引き起こした可能性についてさらに検討していきたい。
植物由来生理活性物質による糖代謝調節とその応用

肥満や糖尿病などの予防・治療を目的として、生薬や食品として利用されてきた植物の有効成分を検索し、それらの中から効力の強いものを選択し、ドラッグデザイン技術の導入により、新たな予防・治療のための機能性食品あるいは薬品への応用を目的とし、糖吸収の最終段階である膜消化酵素の阻害物質、細胞レベルの糖吸収糖阻害物質、そして糖尿病合併症を抑制する化合物を植物から見いだし、その基本骨格を決定し、ドラッグデザイン技術に活かせるまでの研究を行う。本研究は、その目的を達するため、植物に含まれる有効成分の同定および生理効果を解明することとした。ギムネマ・シルベスタ乾燥葉よりコンズリトール-Aおよび青シソ葉よりペリロシドAがインスリン依存1型糖尿病ラットの血糖値を低下させること、また糖尿病合併症の鍵酵素アルドースレダクターゼを阻害した。そこで、その化合物と生理活性との構造相関、作用発現に必要な基本骨格を求めた。その成果の一部は、各種学会での口頭発表および論文に掲載あるいは投稿中である。本年度は、その目的を達するため、植物に含まれる有効成分の同定および生理効果を解明することとした。苦参乾燥根より、湯浴抽出、さらに酢酸エチルエステル-水抽出、シリカゲルクロマトなどにより、数種のイソフラボン配糖体を単離した。これらの化合物はラットの小腸二糖類水解酵素を阻害した。その濃度は、IC_<50>は10μgであった。インスリン依存1型糖尿病ラットの血糖値を低下させた。そこで、その化合物と生理活性との構造相関について検討している。
一次元応力（メガ重力）を利用するナノ傾斜構造化の実現

本研究課題は、新奇反応の開拓や機能材料を創造する新しい手法の開発・確立を目的として、極限環境場としてのメガGレベルの超重力場に着目し、各種モデル反応をデザインしながら有機反応やナノ傾斜構造化を実施した。本報告では下記の三つの研究課題について成果報告を集録した。(1)高分子電解質中でのアルカリ金属の選択的輸送現象の誘起と傾斜構造化の実現(2)有機半導体の傾斜複合化(3)ラジカル付加反応おける新奇立体選択の発掘本研究課題は、新奇反応の開拓や機能材料を創造する新しい手法の開発・確立を目的として、極限環境場としてのメガGレベルの超重力場に着目し、各種モデル反応をデザインしながら有機反応やナノ傾斜構造化を実施した。(1)高分子電解質中でのアルカリ金属の選択的輸送現象の誘起と傾斜構造化の実現(2)有機半導体の傾斜複合化(3)ラジカル付加反応おける新奇立体選択の発掘本研究課題では、新奇機能材料を創製する新しい手法を開発・確立することを目的として、超重力場中での有機反応の実施、およびソフト材料とハード材料から継ぎ目なく組成傾斜させることによって生成する機能傾斜材料の作製を試みた。この目標を達成するために、以下のような課題を設定し、実施した。1、桂皮酸メチルとトリクロロブロモメタンとの付加反応を超重力場で実施した。一般に1Gの条件下では、クロロおよびトリクロロメチル基がそれぞれ付加した物質が生成するが、20万G以上の重力場においては、1G条件下では生成しないクロロおよびトリクロロメチル基が付加した物質の生成が確認されるとともに、立体選択性が逆になった物質の生成が生じることを確認した。反応種の濃度効果や温度効果、重力場などを詳細に調査するとともに、桂皮酸アルキルのアルキル基をエチル基やブチル基に変えて詳細に調査し、いずれの場合も特異性は発現したが、残念ながらその要因については特定することができなかった。おそらく超重力場において反応種の濃度勾配が誘起されたり、また反応の遷移状態においてひずみが生じたりしていることが推測される。2、アクリル酸とアルカリ金属によるイオン交換体の混合当量物を作製し、粉末レベルで十分に均質に混ぜた後、ステンレス反応管の中に封じ込め、所定時間、所定の重力場にさらした。得られたサンプルに対して反応管の断面をEPMA測定を行うと、重力方向に対して重い元素であるアルカリ金属イオンが選択的に沈降(移動)していることが認められ、傾斜構造化が生じていることを確認した。傾斜構造化はカリウムイオン/水素イオンの間でもっとも顕著に確認され、またカリウムイオン/ナトリウムイオンやセシウムイオン/水素イオンにおいても観察された。本研究課題は、新奇機能材料を創製する新しい手法を開発・確立することを目的として、超重力場中での有機反応や重合反応を実施し、またソフト材料とハード材料から継ぎ目なく組成傾斜させることによって生成する機能傾斜材料を作製することを目的としている。(1)前年度では、アクリル酸とアルカリ金属によるイオン交換体の混合当量物を作製し、傾斜構造化がカリウムイオン/水素イオンの間でもっとも顕著に確認されることを報告したが、初期段階で含まれる水分量が傾斜構造化に大きく寄与していることが判明した。そこで水分量を精密に調整し、各種のアルカリ金属イオンについて調査したところ、これまで傾斜構造化の進みにくかったカリウム/ナトリウム混合系(より原子量差が小さな混合系)においても傾斜構造化が促進できることを確認された。おそらく、水含量によるイオンの拡散速度の変化が大きく寄与しているものと考えられる。(2)前年度では、桂皮酸メチルとトリクロロブロモメタンとの付加反応を超重力場で実施し、20万G以上の重力場においては、1G条件下では生成しないクロロおよびトリクロロメチル基が付加した物質の生成が確認された。反応メカニズムを調査するため、桂皮酸メチルに変えてエチルやブチル、オクチル化合物に対して同様な反応を実施した結果、モノマーの分子比重が小さくなるほど、立体選択性が変化することが明らかになった。一方で、桂皮酸メチルにおいて、ラジカル種の生成量の効果について検討したところ(トリクロロブロモメタンの割合を増加させたところ)、同様に立体選択性が変化することが確認された。以上の結果は、反応の遷移状態においてひずみが生じたりしていることが推測されるものの、超重力場において反応種の濃度勾配が形成されている可能性が示唆された。次年度はこの知見を活かしたさらなる新奇反応の検出にチャレンジする予定である。本研究課題は、新奇反応の開拓や機能材料を創製する新しい手法を開発・確立することを目的として、極限環境場としての超重力場に着目し、各種モデル反応をデザインしながら有機反応や重合反応を実施している。前年度までに、当初目標であったアクリル酸の重合ならびに重合に伴うアルカリイオン濃度の傾斜化について検討し、アルカリイオンの種類によって組成傾斜化が起こることを確認しているので、本年度は、組成傾斜化の駆動力の一つとなる拡散速度との相関性について調査した。1.組成傾斜化に及ぼす水含量の影響についてポリメタクリル酸を高分子電解質として選択し、そのカリウム塩との等量混合物に対して重力場を作用させたところ、カリウムイオンに関して明瞭な組成傾斜が生じることを確認した。一方、同様な実験を、添加水量を0-50重量%の範囲で変化させて調査したところ、傾斜組成の逆転が生じる含有量が存在することが確認された。これについては現在、引き続き調査中である。2.有機反応のカオス化へのチャレンジ

組成の傾斜化は、重力方向に対して不均質な反応ミクロ環境の形成を示唆しているので、この状態は、むしろ反応性のカオス化(新奇な副反応を誘発・多発)を導く可能性があると推測し、当初計画にはない、有機反応(低分子有機反応系および重合反応系)におけるカオス化を探求した。具体的には、2種類のアミノ酸を固体状態で重力揚に曝し、生成物を分析する手法を採用した。ロイシンとフェニルアラニンにおいて実施したところ、1G条件下ではほとんど生じないペプチド生成が比較的低温で生じること、また生成するペプチドに重合度分布が生じることを確認し、有機反応場としての超重力場の新たな展開に繋げることができた。
新しい描画調査の開発とその画像解析による社会心理学的応用

本研究では、描画から社会心理学的解釈を行う方法論と研究知見を見出すことを目的とした。具体的には、まず第1に、調査から得られた描画を幾つかの領域に分割し、各領域で濃度ヒストグラムによる空間レベル依存法を用いた定量的特徴の分析、及び色彩の配色に関する定量的分析を行う。本年は、国内での精神病院、大学でのデータ収集、ロシア、スウェーデンでの描画収集を行った。第2に、描画調査と質問紙調査を併用し、描画の特徴次元と、評価者の印象用語との関係構造を、多変量解析によって明らかにした。また第3に、分析から得られた描画の基本的特徴の心理的効果を計量的手法により明らかにし、描画の心理的解釈の妥当性を検討した。本研究では、日本人大学生、日本人成人、ロシア人大学生、スウェーデン人学生に、それぞれ「日本人」、「ロシア人」、「スウェーデン人」、「精神疾患患者」の人物画を描かせ、描画の統計的解析からステレオタイプや偏見の社会的態度や判断の測定可能性の検討を目的とした。画像解析の特徴量として画像濃度を用いて、濃度平均、濃度重心、重心点を視点とした濃度分散を用いた描画の大きさ指標を提案した。第2に描画項目を数量化することで描画内容の定量的分析を実施した。あらかじめ描画の評価基準を定め、描画項目を数量化してコレスポンデンス分析を実施した。スウェーデン人のデータはまだ解析中であるが、画像解析による特徴量からロシア人大学生は自国民を他のものより大きく濃く描き、日本人はロシア人を大きく描いていた。また、描画評価指標を用いた描画の内容の統計分析からは描画者の属性や、描かれた人物画の属性による特徴が認められ、特に日本人は描画対象に対する特徴付けが大きい事が示唆された。本研究の結果から、描画の統計的解析手法が、描き手のステレオタイプや偏見についての社会的態度や判断の測定に有効である可能性が示唆された。本研究では、調査研究で得られた描画を画像解析的手法で解析する心理学的方法を提唱することを第一の目的とした。この目的の実現のため、画像をいくつかの領域に分割し、その濃淡の濃度ヒストグラムによる頻度分布、空間濃度レベル依存法や濃度レベル差分法による描画の定量的特徴、さらに色の配色に関する定量的分析する方法を提案した。またこの方法を用いて、学生を対象としてリスク認知調査や調査および学生および精神病院外来患者を対象にした樹木画テストなどを行い、これらの画像解析を行った。次に、本研究では、質問紙調査を併用することによって、画像の特徴次元と評価者の質問紙評定との関連性構造を多変量解析によって明らかにすることを第二の目的としたが、これについては、リスク認知調査および樹木画テストにおていて、これらの関係を分析し、画像と質問紙評定との関係性を確認している。さらに、これらの分析によって得られた基本的特徴の心理的効果と描画の心理的解釈の妥当性を明らかにすることを第三の目的としたが、臨床心理学者らの協力を得て質的解釈も行った。最後に、この研究で提唱された方法をもとに実際的な問題解決のための画像解析の活用法を明らかにすることを第四の目的としたが、これについては、精神医学者、行動生物学者、臨床心理学者、社会心理学者にヒアリングや検討会を行い、現在、検討している。社会調査では、通常、評定法や自由回答法などの評価用語や自然言語での反応をもとに人々の心理傾向を検討しているが、リスク認知調査のように、調査対象者が標準言語も充分に話せないといった、調査者と共通の言語を持たない状況では、描画が重要な判断材料になる。本研究では、昨年度の研究の成果をもとに、描画から社会心理的解釈を行うことができるような方法論をさらに発展させるための研究を行った。具体的には、2004年の長岡での地震を経験した人々に震災において怖かったことについての描画を求め、また、購買状況での商品選択状況、精神病院での患者と大学生のバウムテストの実施などを行い、描画の計量的分析の手法をさらに検討した。具体的には、これらの描画の定量的特徴分析を行うために、得られた描画像をスキャナによって計算機に画像データとして取り込み、画像をいくつかに分割し、分割された画像を画像解析ソフトウェアにより、濃度解析し、濃度ヒストグラムから、平均、分散、歪度、尖度などを求める。さらに、分割された画像に対して、空間濃度レベル依存法などによって、エネルギー、エントロピー、相関、局所-様性、慣性、角度別二次モーメント、平均などを求めた。また、精神病院のデータについては、精神医、臨床心理学者による質的解釈の知見を併用して、データの解釈を行った。本研究の結果については、国内外の学会で研究発表を行った。

本研究では、日本人大学生、日本人成人、ロシア人大学生、スウェーデン人学生に、それぞれ「日本人」、「ロシア人」、「スウェーデン人」、「精神疾患患者」の人物画を描かせ、描画の統計的解析からステレオタイプや偏見の社会的態度や判断の測定可能性の検討を目的とした。画像解析の特徴量として画像濃度を用いて、濃度平均、濃度重心、重心点を視点とした濃度分散を用いた描画の大きさ指標を提案した。第2に描画項目を数量化することで描画内容の定量的分析を実施した。あらかじめ描画の評価基準を定め、描画項目を数量化してコレスポンデンス分析を実施した。スウェーデン人のデータはまだ解析中であるが、画像解析による特徴量からロシア人大学生は自国民を他のものより大きく濃く描き、日本人はロシア人を大きく描いていた。また、描画評価指標を用いた描画の内容の統計分析からは描画者の属性や、描かれた人物画の属性による特徴が認められ、特に日本人は描画対象に対する特徴付けが大きい事が示唆された。本研究の結果から、描画の統計的解析手法が、描き手のステレオタイプや偏見についての社会的態度や判断の測定に有効である可能性が示唆された。
知的財産権の国際的執行に関する法的諸問題の研究

目的:知的財産権には属地主義が妥当し、一国で成立した権利は他国で主張できない、それゆえ一国で訴訟の対象となりうるのはその国の知的財産権だけであり、外国の知的財産権は権利として認められない以上渉外訴訟も発生しない、したがって知的財産権には国際私法問題は存在しない。これが近年までの知的財産権を巡る一般的な意識であり、かかる理解が学説においても支配的であったと言えよう。ところがビジネスにおいて知的財産のもつ戦略的意味が高まるにつれ、知的財産を国際戦略に用いる局面は増え続けている。概要:本研究では、知的財産権をめぐる国際民事訴訟を想定し、国際裁判管轄、準拠法、外国判決承認執行の3つの問題群に分け、その問題群をさらに多くの仮説事例を用いて細分化し、それを各国の専門家に送付して回答を求め、その回答をもとに比較法分析を進める、という手法をとった。一例をとると、米国およびカナダにおいては、対人管轄と事物管轄の双方が肯定される必要があるところ、対人管轄とは別に、外国の知的財産権に関する訴訟に対しては事物管轄権がない、という結論をとっている。これは日本の最高裁が、カードリーダー事件において、アメリカ特許侵害を理由とする管轄を日本の裁判所に肯定したことと対照的である。EUでも、一般裁判管轄権のある被告常居所所在地国においては外国知的財産権についても問題にすることができるのが一般的見解である。もっともEUにおいてもブリュッセル規則2条により、外国知的財産権の登録または有効性の問題に関しては、かかる知的財産権を付与した国の専属管轄に属するとされる。なお、これは日本の改正民事訴訟法によって採用された立場と同じである。International Law Associationの中に知的財産権と国際私法に関する委員会が設立され、その委員会の活動スケジュールに合わせる形で研究を進める。すでに平成24年3月16-17日に一回目会合が開催され、今後の方向性を取り決めた。平成22年度は、平成22年8月に開催された第18回国際比較法アカデミー研究大会(ワシントンDC)において、河野が担当した、知的財産権と国際私法に関する総括報告とそのために寄せられたナショナルレポートの取り纏めを共同で行った。その過程において、いくつかの興味深い傾向を読み取れた。知的財産権をめぐる国際裁判管轄に関する学界の動向は、効率性の観点から訴訟地を一か所に集中させることを目指す見解が増えつつあるように思われる。しかし各国の裁判実務は、逆に自国の知財に射程を限定する方向へ向かいつつあるように思われる。国際裁判管轄権に関しては、知的財産権の有効・無効に関する国際裁判管轄の専属管轄の問題がある。アメリカ、イギリス、カナダといったコモンロー諸国では、外国知財権の有効性の問題に関する事物管轄を否定することで自国裁判所の管轄権を認めないとの結論を出すのに対し、EU諸国では、土地管轄の専属性を根拠にする。これを定めるブリュッセル規則の規定は、欧州司法裁判所により、この理は抗弁として主張される場合にも当てはまると解釈されたことから、専属管轄の範囲は広範に及ぶこととなっている。比較的リベラルな対応を見せてきたのが日本の裁判例であったが、審議中の民事訴訟法改正案は、専属管轄を志向する規定ぶりとなっている。しかも登録を要する権利、としてより広い規定ぶりになっている。同国民間の訴訟であっても、外国知財が問題になる限り、自国裁判所では争えないという結論になるが、果たしてそれでよいのか議論が必要であろう。このことはカードリーダー事件最高裁判決にも関連する問題である。こうして取りまとめた報告書は、2011年中にイギリスのHart社から出版される予定である。
各国間の所得の不平等に影響を及ぼす因子の特定化に関する理論的・実証的研究

各国の所得に影響を及ぼす因子としてIT化の進展による経済環境の変化を反映するパラメータを導入して新しいモデルを構築し、不平等を測る指標であるジニ係数を導出した。この結果から、経済環境のパラメータが所得の不平等に大きく影響を及ぼすことが確認できた。また、新しいモデルの整合性を実証面から4ヶ国を対象に分析し、韓国を除く国々に関してはある程度理論モデルで示唆された結果(所得の不平等に影響を及ぼす因子としてIT化の進展があげられること)が支持された。●昨年度の目的と手法:急激に変化する経済環境を考慮して、IT化の進展等に関する包括的因子や研究開発部門の外部効果に関する因子をシステムに導入することによって、新しい内生的経済成長モデルを構築すること、およびこのモデルのもとで、所得の不平等に関する分析をすることである。具体的には、まず、内生的経済成長モデルにおいて、経済環境を反映するパラメータを中間財生産に導入した。その経済環境を体化するパラメータは、ITの進展などの経済環境が各国毎に異なるために、豊かな国から貧しい国まで異なる値をとり、一様分布するものとした。さらに、研究開発部門の生産関数に外部効果の因子も組み込ませて、従来のモデルよりもより現実的なモデルへと発展させた。この新しいモデルのもと、所得の不平等を図る指標としてジニ係数を扱い、経済的環境のパラメータ等がジニ係数にどのような影響を及ぼすのかを分析した。●結果:新しいモデルのもと、経済環境のパラメータがジニ係数に大きく影響を及ぼすことが以下のように確認できた。(1)一旦、中間財の生産において、先進工業国と発展途上国との間で経済環境の相対的な変化(パラメータの比)が拡大すれば、両国間の所得格差は大きく拡大し、それに関連するジニ係数も大きくなる。(2)経済環境の格差がより一層拡大すれば、ジニ係数は緩やかに拡大する。最後に、経済環境と製品のライフサイクルに変化がないとすれば、技術革新の程度が大きければ大きいほど、ジニ係数は大きくなり、所得の不平等も拡大するという結果も得られた。●意義・重要性:経済的な環境を変化させるグローバル化が所得の不平等の拡大要因である可能性を理論的に示したこと、したがって、平等の観点から、IT化等の進展が無条件に好ましいことではなく、物的および人的資本と同様に、その所得の分配に関しては大きな影響を及ぼす可能性を示唆している点で意義がありかつ重要である。本年度の研究目的は、前年度に構築したモデルをもとに導出された一般均衡体系の均衡式について回帰分析を行い、モデルの整合性を検討し、所得の不平等に影響を及ぼす因子のひとつがICTの進展であることを確認することである。具体的には、OECDやPenn-Worldの統計資料をもとに、中間財(ICT)や効率性などの説明変数と被説明変数の収集を行い、計量ソフト(TSP)を用いて回帰分析を行った。実証分析の対象国は、日本、アメリカ合衆国、イタリア、韓国、およびインドの5カ国とした。その結果は以下の通りである。(1)イタリアは、回帰分析の統計量の検定結果、分析対象外の扱いになり、韓国を除く国々に関してはある程度理論モデルで示唆された結果が支持された。特に、日本とアメリカ合衆国との所得格差は、本理論から得られる2005年度の所得格差は1.28であるが、実際の所得格差は1.35で、その誤差は7ポイントであった。(2)韓国とアメリカ合衆国との所得格差に関しては、その大小関係が逆転する結果となり、この原因は韓国の急激な研究開発部門の変質が関係していると考えられ、研究開発部門の急激な構造変化を示す国に対しては、その部門の生産関数の定式化の改善が必要とされる可能性がある。(3)かなりの制約がある中での本結果を考慮すれば、グローバル的なICTの進展が経済環境の変化を引き起こし、その結果、経済格差が生じる、つまりICTの進展の程度が所得格差を引き起こす要因のひとつとであると考えられ、前年度で行ったモデル構築が支持される結果を得た。
周期加熱環境下におけるスマート熱制御手法に関する研究

本研究の目的は,月面等の周期加熱環境下に曝される宇宙機に有効な新しい熱制御手法を提案し,その実現性の検証を行うことである.熱輸送を担う小型高機能ループヒートパイプを新たに製作し,大気環境及び宇宙模擬環境での熱負荷変動および外部熱環境変化に対する制御性評価を行った.また,月面模擬環境システムを新たに製作するとともに,レゴリスシュミラントの熱物性評価に基づく周期熱環境モデルを新たに構築した.本研究の目的は,月面等の周期加熱環境下に曝される宇宙機に有効な新しい熱制御手法を提案し,その実現性の検証を行うことである.熱輸送を担う小型高機能ループヒートパイプを新たに製作し,大気環境及び宇宙模擬環境での熱負荷変動および外部熱環境変化に対する制御性評価を行った.また,月面模擬環境システムを新たに製作するとともに,レゴリスシュミラントの熱物性評価に基づく周期熱環境モデルを新たに構築した.本研究は,これまで有効な解決策が無かった月・惑星着陸機の夜間保温方法に対し,太陽光周期加熱環境を利用したスマートかつ現実的な熱制御手法を提案,実証することを目的とする。初年度は,本提案を実現させるために高性能マルチエバポレータ型ループヒートパイプ(LHP)の要素研究を中心に行った。以下に本年度成果を記す。●LHPの熱輸送能力を向上させるために,新規ウィックの研究開発を行った。具体的には,重量と熱伝導性,耐熱性,耐宇宙環境性の観点からウィック多孔質の材料選定を行い,選定結果に基づいてウィックの試作および特性評価を行った。その結果,平均気孔径の整ったミクロ細孔を有する高性能ウィックを実現することができた。●次に,試作ウィックを具備したLHPの性能を確認するため,シングルエバポレータ型LHPを新たに設計,製作した。また,試作したLHPの性能を評価するための特性評価システムを構築し,基本性能を実験的に明らかにした。具体的には,エバポレータの熱負荷量とコンデンサ温度をパラメータとしたスタートアップ特性,定常・過渡特性評価,作動流体封入量依存性に関して詳細な特性評価を行った。●月面着陸機に適用可能なマルチエバポレータ型LHPの形状およびリザーバ容積をそれぞれ数値計算により求め,計算結果に基づいてリザーバー体型エバポレータを設計,製作した。また,実用型LHPの作動流体の選定を行い,想定温度範囲(-180°C+120°C)において凍結せず,また高い評価関数を有する低凝固点冷媒を選定した。本研究は,これまで有効な解決策が無かった月・惑星着陸機の夜間保温方法に対し,太陽光周期加熱環境を利用したスマートかつ現実的な熱制御手法を提案,実証することを目的とする。本年度は,昨年度開発したループヒートパイプの高性能化と月面・地下環境を模擬した実験システムの構築,ならびにレゴリスシュミラントの熱物性計測を中心に行った。以下に本年度成果を示す。●ループヒートパイプにベヨネット管を設け,動作信頼性の向上を図った。またウィックとエバポレータのシール性を向上し,良好な動作特性を得た。また,マルチエバポレータに向けた課題抽出ならびにリザーバ設計を行った。●現有の熱真空試験チャンバーに温度コントロールパネルを新たに設置し,アポロデータに基づいて月表面環境(-180°C+120°C)を模擬可能な実験システムを製作した。月面では昼と夜が30日周期で訪れる。最終的には実時間スケールでの実験を行うが,機能検証実験においては熱物性値を調整し,数時間周期での特性評価が行えるよう,周期加熱条件ならびにレゴリス代替物を調整した。●擬似レゴリスの熱物性値を恒温槽を用いて詳細に評価し,熱伝導率,比熱,密度の温度依存性を同定するとともに,月表面および地下の熱環境を予測可能な物理モデルを構築した。●昨年度までに構築した月面・地下環境模擬システムにおいて,良好な真空度を得ることができなかった。スヌープ検査およびリーク検査により,原因が熱電対および電源ケーブルからのリークおよび真空ポンプの汚染であることを同定し,改修を図った。●宇宙環境用ループヒートパイプを試作した。コンデンサを展開ラジエータによるふく射放熱方式とし,蒸気管,液管にフレキシブルパイプを導入した。次に,模擬実験システムにより性能評価を行い,熱輸送性,熱応答特性を明らかにした。また,リザーバ制御による温度制御性の確認を行い,安定した動作温度制御が可能であることが示された。●月面模擬環境を実現するために,レゴリスの熱物性データと加熱周期からレゴリス内部の温度変化,温度分布を予測した。また,アポロ15での温度実測データとの比較を行い,概ね良好な一致を得た。また,レゴリスシュミラントの放射率を明らかにするため,熱電対とサーモグラフィとの温度を一致させることで放射率の温度依存性を計測した。その結果,放射率は0.8程度であることが明らかとなった。また,得られた熱物性データをもとに加熱周期,温度振幅を見積もり,最終的な実験条件を決定した。
骨治療に資するポリリン酸エステルの構造最適化と作用機序の解明

超高齢社会における健全かつ持続的な社会活動の確保は我が国が取り組むべき最重要課題のひとつとして位置付けられている。そこで本研究では,骨に高い親和性を示すポリリン酸エステル(PPE)が骨系細胞の分化や機能におよぼす影響を生化学的手法によって明らかにすること,また,同ポリマーによる骨疾病モデル動物の健全化を試み,骨治療に資するポリマーの創出するこを目指す。
抗菌性および分子識別能を有する高機能性配糖高分子錯体の開発

1.本研究は当研究室で世界に先駆けて切り拓いてきた糖質の配位化学を基盤にし、錯体の構造と機能の相関を明らかにしながら抗癌性、抗菌性配糖錯体および高分子錯体という新物質領域を開拓して行くことを目的としている。本年度は1)DNAに対してより選択的に結合するインターカレート部分を有するシスプラチン型Pt(II)錯体の開発を行った。2)配糖錯体の高分子化のための準備研究としてN-メチルエチレンジアミンとD-リボースのNi(II)配糖錯体の合成を行った。またモノマー官能基をもつN-置換ジアミン開発した。さらに、3)糖質を有する新規キレート配位子の開発とその金属錯体の合成を行った。2.1)インターカレート部位を有するシスプラチン型錯体の合成と性質:インターカレートとしてアクリジンを有するジアミン配位子ACCH_2enを新しく合成し、その白金錯体[PtCl_2(ACCH_2en)]の結晶構造を明らかにした。さらにマウス白血病P388による制ガン効果の検定を行ったところ、dose 50mg/kgでT/C値が113となり、わずかではあるが延命効果が見られた。2)N-メチルエチレンジアミンとD-リボースのNi(II)配糖錯体の合成とキャラクタリゼーション7)モノマー官能基をもつN-置換ジアミン開発:良好な結晶が得られた[Ni(D-Rib-N-Meen)_2]Br_2のX線結晶構造解析のを行い立体構造とCDスペクトルとの相関を明らかにした。3)糖質を有する新規キレート配位子とその金属錯体の開発:糖質を含む金属錯体の新機能開発を目指し、糖とアミンの組み合わせとして、アミノ糖に代わり新規配位子2-β-O-D-glc-pnの合成法を確立した。本化合物は他の糖に、あるいは他のジアミンに対しても広く拡張でき、きわめて有用である。3.現在新機能材料の開発を目指して配糖錯体の高分子化を進めている。
高等植物小胞体チューブ形成におけるリン酸化を介した調節機構の解明

植物小胞体膜融合に関与するRHD3の調節機構の解明を試みた。シロイヌナズナの植物体や培養細胞から単離した小胞体の膜融合や、RHD3の会合体形成は、プロテインキナーゼで処理することにより促進された。RHD3のC端部に存在するセリン残基のクラスター部位がリン酸化されており、その部位を変異させたRHD3を発現させた植物体から単離した小胞体の膜融合は、キナーゼ感受性が欠如していた。これらの結果から、RHD3のリン酸化により小胞体膜融合が調節されていることが明らかになった。1.小胞体膜融合におよぼすキナーゼの効果前年度は、シロイヌナズナ培養細胞MM2dから調製した小胞体(ER)のチューブ形成におけるキナーゼ(市販されているA-kinaseの触媒サブユニットなど)の効果について解析を行った。今年度はまず、ER膜融合におよぼすキナーゼの効果について調べた。融合活性は、膜融合時に放出されるカルシウムイオンによるエクオリン蛍光強度変化をルミノメーターで測定することにより評価した。その結果、キナーゼ処理により膜融合が促進されることが明らかになった。そして、昨年度作製しておいたRHD3のC端部に存在するセリン残基クラスター配列に対するペプチド抗体でERを処理することにより、膜融合促進・チューブ形成促進といったキナーゼの効果が消失した。質量分析法により、この部位のセリン残基がリン酸化されている結果を既に得ている。今回得られた結果から、キナーゼによるER膜融合・チューブ形成促進は、RHD3のリン酸化による活性化を介して起こっていることが強く示唆された。2.細胞内で機能しているキナーゼの同定細胞内でRHD3をターゲットとする、つまりERネットワーク形成に関与しているキナーゼの同定を試みた。GFPでラベルされたERが発現しているタバコ培養細胞をCa-A23187で処理すると、表層ERネットワークは袋状構造に変化するが、試薬を除くことによりネットワークは回復する。この回復を抑制する、つまりネットワーク形成を阻害する、ある種のキナーゼ特異的な阻害剤を検索した。その結果、いくつかのキナーゼ阻害剤が回復を抑制した。更にこれらのキナーゼがER膜融合過程に関与していることを明確にするために、それらの阻害剤が表層ERチューブ融合におよぼす効果を解析しているところである。1小胞体チューブ形成におけるキナーゼやフォスファターゼの効果シロイヌナズナ培養細胞MM2dから調製した小胞体画分を用いたin vitroチューブ形成系により、市販されているキナーゼやフォスファターゼの効果を調べた。その結果、A-キナーゼやカゼインキナーゼIIによってチューブ形成が促進されることがわかった。また処理後2次元電気泳動によって、レティキュロン(AtRTNLB)やRHD3の等電点を解析したところ、キナーゼ処理により酸性側にシフトする、つまりリン酸化されていることが確認された。そして化学架橋剤EGSによるRHD3の架橋産物が、キナーゼ処理により増加することが明らかになった。従って、小胞体膜融合に寄与しているRHD3の複合体形成をキナーゼが促進することにより、小胞体チューブ形成が起りやすくなると考えられた。一方フォスファターゼ処理では全く変化が見られなかった。この結果から、小胞体画分中に既にフォスファターゼが存在しており、これによってチューブ形成が常に抑制されているという仮説を立てた。そして、Caイオンのキレート剤であるEGTAあるいはCa/CaM依存性フォスファターゼであるカルシニウリンの阻害剤によリチューブ形成が促進されたことから、カルシニウリンがターゲットとするフォスファターゼの一つである可能性が示唆された。2RHD3のリン酸化部位の同定GFP-RHD3が発現しているシロイヌナズナ植物体から、抗GFP抗体を用いた免疫沈降法によりGFP-RHD3を多量に調製し、質量分析によるリン酸化部位の同定を京都大・工学研、桑田啓子博士に依頼した。本研究で着目しているRHD3のC端に存在するセリン残基のクラスター内のいくつかのセリン残基のリン酸化が認められた。とりあえず、リン酸化されていないセリン残基クラスター部位を含む合成ペプチドに対する抗体を作製した。前年度までに明らかにした、RHD3のリン酸化部位であり、シロイヌナズナ培養細胞の単離小胞体(ER)膜の融合やチューブ形成の促進に関与するC端部セリン残基クラスター部位の役割について、シロイヌナズナRHD3変異体を解析することにより詳細に解明することを試みた。

共同研究を行っている京都大学西村いくこ教授・上田晴子研究員が作製したRHD3C端部セリン残基クラスターを除去したRHD3変異体、あるいはセリン残基をアラニン残基に置換したRHD3変異体を発現させたシロイヌナズナ株のER形態と動態や成長などを解析したところ、野生種とほとんど違いがなく、顕著な表現型は検出されなかった。しかしそれらの変異体から調製したER膜は、キナーゼ感受性が消失していた。つまり変異体ER膜融合やチューブ形成は、野生種から単離したER膜とは異なり、A-キナーゼ触媒サブユニットなどのキナーゼ処理により促進されなかった。これらの結果は、キナーゼによるER膜融合促進に必要な部位は、確かにRHD3C端部のセリン残基クラスターであることを強く示している。またその部位のリン酸化はER膜融合に必要不可欠ではなく、何らかの調節機構に関与している可能性が示唆された。今後細胞内におけるこの調節機構の役割を明らかにしていく必要がある。本研究を通して、RHD3のリン酸化によりER膜融合やチューブ形成が促進されること。MS解析や変異体解析などにより、これらの促進と共役するリン酸化部位がC端部セリン残基クラスターに存在すること。そしてその部位のリン酸化によってRHD3会合体形成も促進されることなどが明らかになった。これらの結果から、リン酸化RHD3がER膜上でより多くの会合体を形成することで融合が促進されるというモデルを提案し、現在論文を投稿中である。植物生理学RHD3による小胞体(ER)膜融合過程が、キナーゼによるリン酸化によって促進されている、つまりキナーゼのターゲットがRHD3であることが明らかになった。しかし、大腸菌で発現させたリコンビナントRHD3をリポゾームに組み込んだ系を用いて、より直接的にRHD3のリン酸化の膜融合促進への関与を示すには至らなかった。来年度引き続きこの系の確立を試みたい。表層ERネットワークの回復を抑制するキナーゼ阻害剤を探索することにより、ネットワーク形成に関与すると思われるキナーゼを絞り込むことができた。ただ、ネットワーク全体の回復を指標として探索を行ったため、実際にこれらのキナーゼが本当にRHD3によるER膜融合に関与しているのかを明確にする必要がある。現在研究を進めているところである。in vitro小胞体チューブ形成系を用いて、キナーゼやフォスファターゼの効果を解析することができ、RHD3に関しては複合体形成変化まで明らかにすることが出来た。またフォスファターゼに関しては、カルシニウリンが細胞内で作用するフォスファターゼの一つであることも示唆された。しかし、リン酸化部位、特にRHD3のセリン残基クラスター内のどのセリン残基がリン酸化されているかまでは、解明できなかった。より直接的にRHD3がキナーゼのターゲットであることを示すために、大腸菌で発現させたリコンビナントRHD3をリポゾームに組み込んだ系を用いてキナーゼの影響を解析していく。またRHD3のC端部に存在するセリン残基のクラスターが重要なリン酸化部位であり、活性調節に関与していることを明らかにするために、この部位を欠損させた、あるいはセリン残基を他のアミノ酸で置換した変異RHD3をリポソームに組み込んだ系を用いて解析を行っていく。細胞内で機能しているキナーゼの同定を引き続き行っていく。候補として考えられたキナーゼに関して、ペプチド抗体による蛍光抗体法、あるいは蛍光タンパク質を連結されたキナーゼを発現させることにより、細胞内局在や表層小胞体との関連を調べていく。研究計画通り推進していく予定である。しかし、上述したようにセリン残基クラスター内のリン酸化されているセリン残基の同定は困難である。