hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多量の色素沈着のみられる病理組織標本における蛍光抗体法を利用した診断法の検討

【研究目的】悪性黒色腫の病理診断における免疫染色は、過剰なメラニン色素沈着により評価が困難な場合がある。通常行われるDAB発色ではメラニンとの鑑別が困難なため、赤色系基質を用いたり、ギムザ後染色により区別する方法等があるが過剰な沈着に対しては有効とは言えないため、我々は短時間処理が可能で抗原の保存性にも優れた加温過酸化水素漂白法を開発した。また、進行期メラノーマの温熱免疫療法の免疫組織学的評価の妨げとなるマグネタイトの沈着の除去法についても検討しハイドロサルファイトを用いた方法が有用であることを発表した。本研究では、蛍光抗体法を色素沈着のある組織に適応することで、色素除去処理によらず抗原局在の明瞭な観察が可能かどうか検討を行った。【研究方法】ホルマリン固定-パラフィン包埋されたメラニン沈着の強い悪性黒色腫5例、温熱免疫療法後に採取されたマグネタイト沈着の強い組織3例を用いた。何れの症例も3μmに薄切を行い検討した。1(1)メラニン沈着の強い悪性黒色腫に対しては、1次抗体にHMB45,MART-1,S100抗体を用い室温1時間反応を行い、2次抗体にAlexa Flor488標識抗体を用い室温1時間反応を行った。(2)対照として加温過酸化水素漂白法(3%過酸化水素・0.03MPB(pH7.4),55°C)を行い蛍光抗体法を実施したものと比較した。2(1)マグネタイト沈着組織に対しても、1(1)と同様の反応を行い(2)対照としてハイドロサルファイト処理を行い蛍光抗体法を実施したものと比較した。3蛍光抗体法標本は共焦点レーザースキャン顕微鏡にて蛍光画像の取り込みを行い、観察した。【研究成果】メラニン漂白処理、マグネタイト除去処理を行わない標本と比較し、色素除去後の標本において蛍光量が何れの標本も著しく増加した。微分干渉像をみると色素除去を行わない組織切片ではメラニン顆粒或いはマグネタイトが抗原抗体反応を阻害していることが色素除去を行った切片の微分干渉像との比較により確認できた。以上より、蛍光抗体法を用いた場合でも、メラニンやマグネタイトなどの色素沈着物の除去をせずに正確な抗原局在を把握することは困難であることが分かった。
地震災害廃棄物管理における共助ネットワークシステムの構造分析

本研究の目的は、地震災害廃棄物管理における1共助の活動ポテンシャルを明らかにする2共助ネットワークの構造を明らかにする3SCの経年変化に伴う共助ネットワークの変容を推計することである。2018年度は、2共助ネットワークの構造を明らかにした。2017年度の成果から、共助ネットワークは、Bonding SC、Bridging SC、Linking SCから分析できることが明らかにされている。本研究では、コミュニティにおける災害からの復旧には、コミュニティのレジリエンス(回復力)が必要である点に着目し、コミュニティレジリエンスは、Capacity(変化へのポテンシャル能力)とCapital(現在の能力)から構成されるものとした。コミュニティにおけるBonding SC、Bridging SC、Linking SCネットワークと災害フェーズ別の災害廃棄物管理それぞれについて、CapitalとCapacityの空間特性を分析した。第1の成果として、Capitalは地理的なクラスターを形成する傾向が高いことを明らかにした。第2の成果として、Bonding capitalやBridging capitalがコミュニティレジリエンスの推進要因であることを明らかにした。第3の成果として、コミュニティレジリエンスを育成するには、Linking capacityが有用であることを明らかにした。2018年度は、目的2:共助ネットワークの構造分析を達成した。2019年度は、目的3:SCの経年変化に伴う共助ネットワークの変容を明らかにする。平成29年度は、1共助の活動ポテンシャルを明らかにした。本研究では、AldrichによるSCを基盤とした3種のネットワーク概念を用いて、共助ネットワークを分析した。これらのネットワークは構造的SCともいわれ、Bonding SCは、同一コミュニティメンバー間のネットワークを示す。Bridging SCは、地域を超えたグループのメンバー間のネットワークを示す。Linking SCは、一般市民と公式及び制度化した権力や社会の中の権限者との間の信頼関係のネットワークを示す。災害復旧時における共助行動は、市民のもつSCネットワークを介して行われる点に着目し、地震災害廃棄物管理における共助の活動ポテンシャルを明らかにした。第一の成果として、構造的SCを用いた共助は、新たなSCネットワークを構築し、市民の認知的SCに影響するメカニズムを明らかにした。一方で、地震災害時に新たに構築されたSCネットワークは、その後の復旧期や復興期に減少することも指摘した。第二の成果として、SCが低い地域では、構造的SCを用いた共助によって、地震災害廃棄物管理のレジリエンスが向上することを明らかにした。第三の成果として、災害初動期及び応急復旧時には、Linking SCを用いた共助の効率性が最も高くなることを明らかにした。平成29年度は、目的1:地震災害廃棄物管理における共助の活動ポテンシャルの分析を達成した。平成30年度は、目的2:共助ネットワークの構造を明らかにする。平成31年度は、目的3:SCの経年変化に伴う共助ネットワークの変容を明らかにする。(理由)計測手法に関する改善が必要になったため。(使用計画)海外研究機関における研究渡航費及び研究滞在費として使用。ハワイ大学において、Dr. Karl Kimより指導を受ける。また、WEB調査へ反映させる(理由)評価手法に関する改善が必要になったため。また、WEB調査へ反映させる
多変量推定論と計算機統計学

正規分布の分散に対するStern推定量およびBrewster-zidek推定量の最良アフイン共変推定量に対するPrtman近接度を評価し平均の局外母数が1より多いときBrewster-zidek推定量の近接度が悪いことを示した。多変量正規性の適合度検定について漸近分布の近似のよさについて検討しデータ解析を行った。シミュレーションが有効であることを示した。
小児期特有のランパントカリエスにおける遺伝的要因の探索とその機能解明

本研究では、エナメル質形成に重要な二つのタンパク質、アメロジェニン(AMELX)とエナメリン(ENAM)の遺伝的要因に着目した。AMELX+287、+522の部位とENAM+2452の部位の1塩基置換(SNPs)の出現率を検討したところ、コントロール群がそれぞれ12.2、0.0、11.9%、重度齲蝕群はそれぞれ2.5、0.0、5.0%であった。AMELX+287の部位とENAM+2452の部位の統計学的解析の結果(P値)は、それぞれ0.142、0.143で有意差は認められなかった。今回の結果はAMEXおよびENAMのSNPsと齲蝕との関連は認められなかったが、日本人小児での解析は初めてであり、非常に有意義であるものと考えられる。ヒトゲノム研究は著しい進歩を遂げ医療やバイオインフォマティクス分野への発展をもたらした。特に-塩基多型(Single nucleotide Polymorphisms; SNPs)解析は、疾患疫罹患性や薬剤感受性などの研究に用いられ、アルコール代謝酵素ALDHや慢性気管支喘息におけるCYP1A2などの解析が行われ病因の追求に一石を投じている。歯科領域では、歯周病発症に関する遺伝子研究は行われているが、齲蝕に関する宿主の遺伝子研究は行われていない。小児期特有のランパントカリエスにおける研究はS.mutansやS.sanguisなどの齲蝕原因菌の遺伝子解析や地域流行性やリスクファクターの要因分析が主で、宿主の内的・遺伝的要因を探求した報告は国内外問わずごくわずかである。そこで本研究は小児期特有のランパントカリエスにおける遺伝的要因の探索と機能解明を目的とする。現在、ランパントカリエス患者及び健常児80名以上よりインフォームドコンセントを行った後、我々の確立した歯ブラシを用いる細胞回収方法にて舌上皮剥離細胞を採取し、ゲノムDNAを回収・精製した。標的となるエナメリンの+2452部位遺伝子に対し、PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)法用のプライマーをデザインした。被験者より採取したゲノムDNAを鋳型としてPCR法にて特定部位を増幅した。PCR産物を制限酵素にて消化しSNPs解析を行った。その結果、現時点ではランパントカリエスとその関連性はなかった。今後、サンプル数を増やして同様に解析すると同時に、新たな標的となるアメロゲニン遺伝子について検討を行っていく予定である。齲蝕と歯周病は広汎性の重大な口腔疾患である。齲蝕は生活習慣要因だけではなく、遺伝的な要因も原因で引き起こされると考えられている。しかしながら、齲蝕と遺伝的要因との関わりはほとんど知られていない。本研究では齲蝕感受性において、エナメル質の質と量が直接的な役目を果たし、その中でもエナメル質形成に重要な二つのタンパク質、アメロジェニンとエナメリンの遺伝的要因に着目し、検討した。健常児と患児の舌細胞からDNAを抽出し、アメロジェニン遺伝子+287、+522の部位(CからTへの1塩基置換)とエナメリン遺伝子+2452の部位(CからTへの1塩基置換)に着目し、Polymerase Chaln Reaction-Restrlction Fragment LengthPolymorphysm(PCR-RFLP)法により、1塩基多型(Single Nucleotide Polymorphisms : SNPs)頻度を調べた。被験者は全て日本人で、コントロール群は67名、重度齲蝕群は80名を対象に行った。その結果、アメロジェニン遺伝子+287、+522の部位とエナメリン遺伝子+2452の部位の1塩基置換の出現率は、コントロール群がそれぞれ122、0.0、11.9%、重度齲蝕群はそれぞれ2.5、0.0、5%であった。アメロジェニン遺伝子+287の部位とエナメリン遺伝子+2452の部位の統計学的結果(P値)はそれぞれ0.142、0.143で有意差は認められなかった。今回の結果はアメロジェニンおよびエナメリン遺伝子のSNPsと齲蝕との関連は認められなかったが、日本人小児での解析は初めてであり、非常に有意義であるものと考えられる。
網羅的メチル化解析法を用いたヒトインプリンティング異常症発症機序の解明

研究初年度である平成27年度は集積済みのインプリンティング異常症エピ変異症例においてビーズアレイによる網羅的メチル化解析を施行した。親由来でメチル化状態が異なるDifferential Methylated Region (DMR)と同定されている約750プローブ、49DMRについてメチル化状態を検討した。疾患責任DMR以外の複数のDMRのメチル化異常を示すMultiple Methylation Defects (MMD)はSilever-Russell症候群や新生児一過性糖尿病などで報告されているが、14番染色体インプリンティング異常症であるTemple症候群(TS14)やKagami-Ogata症候群(KOS)では報告がない。我々は4例のTS14および5例のKOSエピ変異症例でアレイを用いた49DMRに対するメチル化解析を行いTS14において2例のMMDを同定した(現在投稿中)。MMDの既知の原因遺伝子には変異を認めず、新規原因遺伝子、もしくは受精後早期のエピジェネティックな事象により生じたと推測している。また、Beckwith-Widemann症候群、偽性副甲状腺機能低下症両疾患の臨床像を示しし、DMRのメチル化異常も示すMMDの症例も同定し報告した(Sano et al, 2016, J Hum Genet)。そして、メチル化異常を示す症例における組織間でのメチル化の違いについてアレイを用いてTS14エピ変異症例の白血球由来DNAと頬粘膜由来DNAで比較したが、両者のメチル化状態に大きな違いはなかった。研究初年度に成果を二編の論文に発表することができた。そのほか数十例のアレイを用いたアレイを用いたメチル化解析データを得た。研究2年目の本年度は、これまでのInfinium HumanMethylation450BeadChip (Illumina)でのデータ解析に加え、新製品であるEPICを用いての網羅的メチル化解析も開始した。EPICは85万プローブが掲載されており、これまでの45万に比べより多くの領域の解析が可能となった。本年度は研究初年度から継続してInfinium HumanMethylation450BeadChipによるデータ取得および、得られたデータの解析、論文化を進めた。先行研究と合わせて150名以上のインプリンティング異常症検体のデータが得られた。そのうち我々がこれまで研究を進めてきた14番染色体インプリンティング異常症であるTemple症候群およびKagami-Ogata症候群のエピ変異症例において網羅的メチル化解析結果について論文化した。これらの解析では、血液に加え頬粘膜からのDNAを用いて、750のDifferentially methylated region (DMR:親由来にCpG配列のメチル化修飾状態が異なる領域)のメチル化状態を検討し、Temple症候群症例で責任DMR以外のメチル化異常を示すMutilocus imprinting disturbance: MLID)を世界で初めて同定し、報告した(Kagami et al.Genetics in Medicine, 2017)。これはインプリンティング異常症の頬粘膜と血液由来のメチル化状態を比較するビーズアレイを用いた初めての検討である。さらに、分担研究者の松原が、ビーズアレイを用いた効果的ね解析プログラムを開発した。加えて、解析用のコントロールのEPICでのデータ取得も進め、来年度はこれを用いて、取得済みのアレイデータ(Infinium HumanMethylation450 BeadChipおよびEPIC)について全ゲノム領域を対象とした解析を進める。これまで当研究室で集積したさまざまなインプリンティング異常症症例の検体を用いたメチル化アレイデータの取得を多いに行った。さらに、これらの効率的な解析用のプログラムも開発できた。希少疾患である14番染色体インプリンティング異常症(Temple症候群、Kagami-Ogata症候群)のエピ変異症例の初めてのメチル化解析結果を論文化することもでき、成果も十分にでていると考えている。本研究は包括的および網羅的メチル化解析により、8インプリンティング異常症において複数のメチル化異常を示すMultiple Imprintinf Disturbance (MLID)の頻度を明らかとすること、インプリンティング異常症発症機構を明らかにすることを目的とした研究である。我々はこれまでに集積した8インプリンティング異常症約1300名に対し、8インプリンティング異常症責任Differential methylatedregion (DMR)に対する包括的メチル化解析を行い、38名のMLID症例を同定した。これら、全MLID症例に対し、Infinium Human Methylation 450KBeadChip kit (イルミナ社)を用いた網羅的メチル化解析を施行し、そのうちメチル化可変領域に存在する約750のプローブについてメチル化状態を検討した。14番染色体インプリンティング異常症であるKagami-Ogata症候群(KOS)とTemple症候群(TS14)についての網羅的メチル化解析の報告はこれまでになかった。我々はエピ変異で生じたKOS 5症例、TS14 4症例の網羅的メチル化解析を施行し、世界で初めてTS14においてMLIDを同定し、報告した(Kagami et al. Genet Med. 2016)。これらのMLID症例において、既知のMLID責任遺伝子には変異を認めず、epigeneticな原因もしくは未知のgeneticな原因により生じたと予想された。また、同定されたさまざまなMLID症例の中には、構造異常である片親性ダイソミー症例や欠失症例も含まれ、インプリンティング領域間の相互作用の破たんがMLID発症に関連することを示唆した。さまざまなインプリンティング異常症におけるDMRのメチル化状態の検討に加え、今後はDMR以外のメチル化状態を検討する。

インプリンティング異常症表現型がどのように生じるかを明らかにするうえで、異常発現を示すインプリンティング遺伝子の下流に存在する遺伝子のプロモーター領域などもメチル化の異常が生じている可能性を考え、約45万か所のプローブについてメチル化解析を進め、インプリンティング異常症症例でメチル化比率が大きく変動している遺伝子を明らかし、インプリンティング異常症の表現型発症機序を明らかとしていく。今後は我々が開発した解析プログラムを用いて、インプリンティング領域以外のメチル化状態を明らかとしていく。特に構造異常を伴ったインプリンティング異常症症例で、インプリンティング領域以外のメチル化が異常を示している症例を同定しおり、インプリンティング領域と相互作用する遺伝子群の同定を目指す。人類遺伝学、小児科学研究初年度のため網羅的メチル化解析のためのアレイ購入のための費用を多く算定していたが、別の研究費で購入してたアレイが残っていたことから購入する必要がなくなったため。学会が東京であったことから旅費が不要であった。beadchip methylation arrayが異なった研究費で以前に購入していたものでまかなうことができた。アレイ解析で同定された結果の確認のための実験に使う試薬の購入などを予定している。余剰分は、次年度は論文化予定であることから、投稿料にあてたい。遺伝子解析を依頼され、解析結果について論文にまとめた
メダカ孵化酵素遺伝子の解析

本研究課題において目的とした以下の3つの点に関して述べる。(1)孵化酵素遺伝子の発現と腺細胞の分化:申請者らはメダカ孵化酵素の2成分、HCEとLCE、に特異的な抗体を用いて発生過程における酵素タンパク質の形成をしらべ、両成分ならびにそのプロ酵素のタンパク質が発生第2日目に検出できることを確かめた。これらは同一分泌顆粒中に含まれる。さらにHCEとLCEのcDNAのクローニングを行い、その断片をプローブとして発生過程における胚からのRNA抽出物のノザン分析を行った。その結果、遺伝子発現は発生第2日(レンズ形成初期)に起り第3日にかけて急激に活発化することが判明した。すなわち、遺伝子発現後たゞちに翻訳されることが判った。(2)HCE及びLCEの比較分子生物学的研究:両者のcDNAクローンの分析を行い、LCEとHCEはともに20アミノ酸のシグナルペプチドをもち、51および50のアミノ酸から成るプロペプチドを有し、ともに200アミノ酸の成熟ペプチドから成るプレプロ酵素として合成されることが判った。両成熟酵素のアミノ酸配列のホモロジーは55%である。両酵素ともにその活性中心と考えられる共通配列の構造は酷似しており、Znを配位するヒスチジンを含む5残基はコラゲナーゼなどの細胞間質分解金属プロティナーゼの共通配列と同一である。さらにこの5残基を含む12アミノ酸残基はアスタシン族と呼ばれるZn-プロテアーゼの活性中心の構造と同じである。なお、孵化腺細胞内にあるプロ酵素から分泌時に成熟型酵素に活性化されるが、この過程はEDTAにより粗害されるので、おそらく自己触媒的に起ると考えられる。(3)ゲノムDNAの構造解析:cDNA断片をプローブとしてHCE、LCEのゲノムDNAをクローン化した。LCEは7つのイントロンをもつ構造であるがHCEはイントロンがなく、複数の遺伝子が縦列している。
C型肝炎ウイルスNS2蛋白質が感染性粒子形成に関与するメカニズムの解明

分割ユビキチン法を利用した酵母Two-Hybridスクリーニング系を用い、C型肝炎ウイルス(HCV)のNS2蛋白質と相互作用を示す宿主因子を探索し、ヒト肝臓ライブラリーより37種類の候補遺伝子を同定した。これらの宿主蛋白質の発現レベルの低下がHCV増殖に及ぼす影響を調べ、ウイルス産生を顕著に抑制する新規宿主因子を見いだした。この宿主因子のノックダウンはウイルスの感染およびゲノム複製には影響しない事から、粒子形成に関与すると考えられた。さらにこの宿主因子のノックダウンはHCVのNS2とE2の相互作用を減弱させる事を見いだし、HCV NS2が感染性粒子形成に関与するメカニズムの一端を明らかした。HCV(JFH-1株)のcoreからp7領域のcDNA、およびNS2領域のcDNAをpCAGGSに組み込んだpCAGC-p7およびpCAGNS2を作製した。またJFH-1株のレプリコン(構造蛋白質領域を欠損し、EMCV-IRESおよびFluc遺伝子を挿入したもの)cDNAをpolI promoter/terminater間に挿入し、pHH JFH1 SGR-Flucを作製した。これらの3つのプラスミドをHuh7.5.1細胞ヘトランスフェクションし、その培養上清をさらにnaiveなHuh7.5.1細胞に感染させ、3日後の細胞のルシフェラーゼ活性を測定する事により、上清中の感染価をLuciferase活性で定量的に評価出来る系を構築した。この系により、NS2をトランスに発現させて、HCVの感染性粒子形成を評価できるようになった。次に、NS2蛋白質のプロテアーゼ活性中心残基の変異体、およびN末あるいはC末欠損変異体発現プラスミドを作製した。それらを上記の系を用いて感染性粒子の産生へ及ぼす影響を評価した。その結果、NS2のプロテアーゼ活性中心や、リン酸化部位と推定されるセリン残基をアラニンに置換した変異体は粒子形成能に影響しなかったが、NS2のN末端側の膜貫通領域やC末端のアミノ酸を欠損させると、感染性粒子の産生は認められなかった。さらに膜蛋白質同士の蛋白質相互作用を解析する事が可能な分割ユビキチン法を利用した酵母Two-Hybridスクリーニング系を用いて、3回膜貫通蛋白質であると考えられているHCV NS2蛋白質と相互作用を示す宿主因子を、ヒト肝臓ライブラリーより探索し、複数同定した。C型肝炎ウイルス(HCV)のNS2蛋白質は3回膜貫通蛋白質であると考えられており、従来の酵母Two-Hybridスクリーニング法では結合蛋白質のスクリーニングが困難である。その為、膜蛋白質の蛋白質相互作用を解析する事が可能な分割ユビキチン法を利用した酵母Two-Hybridスクリーニング系を用い、HCVのNS2蛋白質と相互作用を示す宿主因子を探索した。ヒト肝臓ライブラリーよりJFH-1株のNS2蛋白質をbaitとしてスクリーニングした結果、17種類のNS2結合蛋白質候補遺伝子を同定した。これらの遺伝子中には、膜に親和性の高い蛋白質や、分泌蛋白質が多く含まれていた。同定された遺伝子について、それぞれのsiRNAをHuh細胞に導入し、細胞内の宿主蛋白質の発現レベルの低下がHCVの増殖にどう影響するかについて、培養細胞由来HCVを感染させてから3日後の培養上清中のコア蛋白質量およびウイルス力価を測定する事により評価した。その結果、siRNAの導入により顕著にウイルス産生を抑制する宿主因子を見いだした。この遺伝子についてターゲット配列の異なる複数のsiRNAを用いたところ、ウイルスの産生量は細胞内での発現レベルと逆相関する事も確認できた。そこでこの宿主因子の遺伝子をPCR法によりクローニングし、発現プラスミドを構築した。これを用い、哺乳動物細胞内での宿主因子とHCV NS2蛋白質の結合を免疫沈降法により確認した。さらに宿主因子の過剰発現がHCVの増殖に及ぼす影響についても解析を行った。C型肝炎ウイルス(HCV)のNS2蛋白質は、ウイルスのポリプロテインを切断するプロテアーゼであるが、近年、感染性粒子形成に重要な役割を果たしている事が明らかになりつつある。本研究では、HCVのNS2蛋白質がどのようなメカニズムで感染性粒子形成に関わっているのかを明らかにするために、NS2蛋白質と相互作用を示し、感染性粒子の形成に関与する宿主因子の同定を試みた。昨年度までに、分割ユビキチン法を利用した酵母Two-Hybridスクリーニングにより同定したHCVNS2蛋白質結合因子の中から、さらにsiRNAによるノックダウンにより、HCVの増殖に関わる事を強く示唆する宿主因子を同定した。本年度はこの宿主因子のshRNA発現プラスミドを構築し、HCVの感染、複製を許容するヒト肝臓由来培養細胞から、この宿主因子が恒常的にノックダウンされている細胞株を樹立した。この細胞株ではHCVの増殖は顕著に抑制されていたが、shRNAのターゲット領域に変異を持つ宿主因子の遺伝子を用いてその発現を回復させると、HCVの増殖能も回復した。

また、HCVのNS2蛋白質は他のウイルス蛋白質と相互作用する事により、ウイルスの粒子形成に関わると考えられている為、この宿主因子のノックダウンがHCV蛋白質同士の相互作用に及ぼす影響を解析したところ、宿主因子のノックダウンはHCVのNS2とE2の相互作用を減弱させる事が明らかとなった。以上の結果から、HCVNS2に結合し、さらに感染性粒子形成に関与する新規宿主因子の同定に成功すると伴に、そのメカニズムの一端を明らかにする事が出来た。
精度保証付き数値計算ライブラリの開発

1.定常Navier-Stokes方程式の解析解を数学的に厳密に評価する定式化に基づき,解の存在検証条件を有限操作(計算機演算)の問題に帰着させた.さらに,前年度の成果によって得られた有限要素近似解の周りで解析的な解の存在検証条件を満足するアルゴリズムを構成し,あわせて検証アルゴリズムの高速化,並列化の検討を行なった.2.具体的な問題に対する計算機実験を行い,その原理的有効性を確認した.あわせて, Navier-Stokesの数値解を入力することによって,その近傍にもとの方程式の厳密解の存在を数学的に計算機内で立証するとともに,数値解の誤差限界を与える数値計算ライブラリのプロトタイプを作成した.また,近似解の形状および行列の固有値の分布や近似解の存在範囲の表示など,数値のみでは直観的に把握しにくい情報の可視化についても検討した.3.今後の研究の展開としては,強度の非線形性のため解析的取り扱いが著しく困難であることが知られている高レイノルズ数の問題,解の複雑な分岐をともなう熱対流問題に対する精度保証付き数値計算を行ない,厳密解・分岐点の存在検証を理論面から,また,アルゴリズムの効率化・並列化を実用面から追求し,汎用性を持つ数値計算ライブラリを開発することを計画している.1.Navier-Stokes方程式の離散近似解を数値的に求めるアルゴリズムを開発し,プログラム開発を行なった.離散化手法は有限要素法とNewton-likeな手法とを組み合わせ,あわせて乱流,分岐に対応した数値的安定性の議論,および特異性を持つ領域に対する要素再分割手法,並列計算機に適した手法とされる領域分割法などについても理論面,数値シミュレーションの両面から考察した.2.Navier-Stokes方程式の線形化問題であるStokes方程式の有限要素近似解に対する厳密な誤差評価を行なった.数値計算のため,区間演算に関する精度保証付きシステムをFortran,C++のモジュール機能,ビット操作機能を基礎として開発し,ライブラリ化した.ライブラリは,基本的線形計算である行列の積,連立1次方程式の解法,一般化固有値問題を含み,それらすべてについて,丸め誤差を考慮した厳密な数値的評価が可能となった.3.Navier-Stokes方程式に対する解析的な解の存在を保証する条件を不動点問題に定式化し,この段階で2.で行った線形化問題に対する誤差評価を近似解の改良および逆作用素のノルム評価に適用した.今後は,目的とする非圧縮性粘性流体の基礎方程式であるNavier-Stokes方程式に対する数学的な厳密解を含む集合を計算機内で自動的に構成する手法,アルゴリズムを与え,あわせて汎用性のあるライブラリを開発する.1.定常Navier-Stokes方程式の解析解を数学的に厳密に評価する定式化に基づき,解の存在検証条件を有限操作(計算機演算)の問題に帰着させた.さらに,前年度の成果によって得られた有限要素近似解の周りで解析的な解の存在検証条件を満足するアルゴリズムを構成し,あわせて検証アルゴリズムの高速化,並列化の検討を行なった.2.具体的な問題に対する計算機実験を行い,その原理的有効性を確認した.あわせて, Navier-Stokesの数値解を入力することによって,その近傍にもとの方程式の厳密解の存在を数学的に計算機内で立証するとともに,数値解の誤差限界を与える数値計算ライブラリのプロトタイプを作成した.また,近似解の形状および行列の固有値の分布や近似解の存在範囲の表示など,数値のみでは直観的に把握しにくい情報の可視化についても検討した.3.今後の研究の展開としては,強度の非線形性のため解析的取り扱いが著しく困難であることが知られている高レイノルズ数の問題,解の複雑な分岐をともなう熱対流問題に対する精度保証付き数値計算を行ない,厳密解・分岐点の存在検証を理論面から,また,アルゴリズムの効率化・並列化を実用面から追求し,汎用性を持つ数値計算ライブラリを開発することを計画している.
山辺景域の敷地計画とデザイン手法に関する研究

本研究は、近代以降市街地の急速な拡大にもかかわらず、自然と市街地とが一体化した良質な景域が形成された京都の山辺の丘陵地形を対象にして、CGを援用した地形・敷地の空間デザイン分析、および文献資料調査、ヒアリング調査などにより、自然環境と密接に関連した景域の敷地計画と景観設計に関する新たな知見を得ることを目的とした。1.複数の丘陵地を利用した住居群・街路網・広域庭園の景観設計京都の神楽岡界隈の景域を対象とした。近代以前の敷地構成、特に吉田神社・真如堂・金戒光明寺境内との接続によって形成された街路網と土地造成を明らかにした。次に近代における吉田山斜面の広大な茶室庭園と計画的住宅群開発や、その周辺に発達した街路網に着目し、大文字山への眺望特性を地形データに基づくCGから分析し、斜面建築と庭園の統合的な敷地造成と広域な景観設計法を評価した。2.「野」の緩傾斜地形に展開する疏水と沿線都市の景観設計浄土寺・鹿ヶ谷の景域および南禅寺周辺の景域を対象とした。測量データに基づくCGを用いて敷地構成の原形を分析し、複数寺院の境内と建設された琵琶湖疏水分線を軸として「哲学の道」と文人が居住した住居地域界隈の、地形断面などに基づき敷地構成および景観特性を明らかにし、広域でまとまる景観形成の手法を評価した。3.山裾の広域傾斜を利用した広域公園の景観設計円山公園の界隈を対象とした。近世における複数の時宗寺院の塔頭群が複合して名所界隈を形成した景域を絵画史料や現地形に基づく再現CGにより解析し、急傾斜地形の眺望性に特化した懸崖建築と一体的造成による回遊庭園の統合的な景観設計を評価した。次に、近代公園の庭園敷地において微地形を考慮した敷地造成と疏水利用による景観の展開を調査し、広域的な景観設計の解明を行った。本研究は、近代以降市街地の急速な拡大のなかで、自然と市街地とが一体化した良質な景観領域<景域>が形成されてきた京都の山辺の丘陵地形を対象に、それらの景域の成り立ちを明らかにし、さらに自然環境と密接に関連する仕組みを構造的に把握することを目的としている。本年度は、2地域におけるサンプルを選定してケーススタディを行った。1.複数の丘陵地を利用した住居群・街路網・広域庭園の景観設計吉田山と紫雲山の二独立丘陵地形から形成される京都の神楽岡界隈の景域を対象とした。次に近代における吉田山斜面の広大な茶室庭園と計画的住宅群開発や、その周辺に発達した街路網に着目し、大文字山への眺望特性を地形データに基づくCGから分析し、斜面建築と庭園の統合的な敷地造成と広域な景観設計の手法を評価した。2.「扇状地」と「野」の緩傾斜地形に展開する疏水と沿線都市の景観設計緩傾斜から隆起する地形あるいは谷と扇状地の接触する地形の山裾に複数の社寺が位置する。かつて西側の広い野に田園地帯が形成されていた浄土寺・鹿ヶ谷・若王子・南禅寺の景域を対象とした。測量データに基づくCGを用いて敷地構成の原形を分析し、複数寺院の境内と建設された琵琶湖疏水分線を軸として形成された「哲学の道」と文人が居住した住居地域界隈や、近代において別荘地が集中的に造営された界隈の、地形断面などに基づく敷地構成および景観特性を明らかにし、広域でまとまる景観形成の手法を評価した。

本研究は、近代以降市街地の急速な拡大のなかで、自然と市街地とが一体化した良質な景観領域<景域>が形成されてきた京都の山辺の丘陵地形を対象に、それらの景域の成り立ちを明らかにし、さらに自然環境と密接に関連する仕組みを構造的に把握することを目的としている。本年度は、2地域におけるサンプルを選定してケーススタディを行った。1.「野」の緩傾斜地形に展開する疏水と沿線都市の景観設計昨年度後半に引き続き、複数の社寺が位置する扇状地における景域として、浄土寺・鹿ヶ谷地域、さらに南禅寺周辺地域を対象とした。緩傾斜から隆起する地形あるいは谷と扇状地の接触する地形の山裾であり、かつて西側の広い野に田園地帯が形成された景域における、近代前後の敷地計画とデザイン手法を分析した。測量データに基づくCGを用いて敷地構成の原形を分析し、複数寺院の境内と建設された琵琶湖疏水分線を軸として発達した住居地域・別荘群地域界隈の、地形断面などに基づき敷地構成および景観特性を明らかにし、広域でまとまる景観形成の手法を評価した。2.山裾の広域傾斜を利用した広域公園の景観設計山際の急傾斜から緩傾斜にいたる広域的な地形上に敷地形成された円山公園の界隈を対象とした。近世における複数の時宗寺院の塔頭群が複合して名所界隈を形成した景域を絵画史料や現地形に基づく再現CGにより解析し、急傾斜地形の眺望性に特化した懸崖建築と一体的造成による回遊庭園の統合的な景観設計を評価した。次に、近代公園の庭園敷地において微地形を考慮した敷地造成と疏水利用による景観の展開を調査し、広域的な景観設計の解明を行った。山裾の広域傾斜を利用した広域公園の景観設計(平成17年度に引き続き)1.敷地デザインと景観解析a.近世における社寺群の建築と庭園の名所の景観解析急傾斜地形の眺望性に特化した懸崖建築と回遊庭園の統合的な敷地構成を絵画史料より再現し、地形モデル上にオーバーレイし景観のモデル化を行い、一体的造成デザインの手法を評価した。現在も残されている部分については測量などの調査を補完してデータ化した。b.近代における円山公園の景観設計評価山辺から祇園社までの広域な微地形を考慮した敷地造成と疏水利用を展開して、近代公園として整備した景観設計の図面の収集を行い、デザイン調査により景観要素の特定を行ない、地形的な分析に基づいてデザイン手法を評価した。c.祇園社から祇園町へのつながりの景観評価祇園社の境内の敷地分析と造成計画を、絵画・文献史料の調査により、地形表現モデル上に表示した。さらに祇園町へのつながり部分についても同様に分析した。2.景観デザイン手法の評価広域な公園としてデザインされた現在の景観が成立するまでの壮大なプロセスを明らかにした。上記の分析により明らかにされた過去と現在の敷地利用を比較する事により、現在に得られた新たな手法と、失われた微地形利用を把握し、変化した景観を基盤の構造から評価した。研究のとりまとめ以上の研究の成果をとりまとめ、研究全体の体系的整理を行ない、報告書を作成した。
異物薬物排出ポンプの構造機能と多剤耐性

院内感染の主要な起因菌である緑膿菌は複数の抗生物質に対し耐性を示す。その主たる原因はこの菌がMexAB-OprMなどの抗生物質排出蛋白を発現することにある。この問題を解決に向けた年度内の研究から得られた成果は主として次のような事柄である。1、MexAB-OprMポンプのMexA及びOprMサブユニットの膜トポロジーを決定する実験を行った。その結果、MexAは内膜に結合したリポプロテインで蛋白部分はペリプラズムに露出しているという結果を得た,またOprMは外膜に脂肪酸で結合し,蛋白部分はペリプラズムに露出しているものと結論した。2、MexBサブユニットの膜貫通領域(TMS)に存在する荷電を有するアミノ酸の役割を場所特異的変異を挿入することによって解析した。その結果TMS-4のAsp407,Asp408とTMS-10のLys939の間でイオン結合をし、一方のAspにプロトンが結合してエネルギー変換をしているものと解釈できた。3、MexAB-OprMの発現制御を調べるために,制御因子であるMexRとMexOP-DNAの結合実験を行った。その結果MexRはmexRとmexAの間のMexR寄りに結合しmexRとmexAB-oprMの転写を同時に制御していることが明らかとなった。4、MexEF-OprNポンプの集合体形成の機序を解析した。その結果、トランスポート機能を有したMexFが存在することによってMexEの部分分解が起きその部分分解が起きたMexEの存在下においてOprNがアッセンブルされることが明らかとなった。5、MexB/MexYトランスポーターの基質認識部位を決定する実験をこれらの蛋白のドメインを交換することによって行った。その結果これらのトランスポーターは内膜からペリプラズムに突出した大きなドメインで基質認識をしておりTMS領域は直接関係がないという結果を得た。これによって今まで知られていない新しい能動輸送のモデルが構築できた。院内感染多剤耐性菌として問題を残している緑膿菌は、薬物及び異物排出ポンプを発現することによって多剤耐性を示す。本研究では、中でも最も重要な役割を果たすMexABMポンプサブユニットの膜上トポロジーと二次元構造の解析を行った。ポンプの本体をなすと考えられるMexBサブユニットについては、内膜を12回貫通するポリトピック型排出ポンプであることをすでに明らかとして来た。内膜に結合したMexAは、そのシグナル配列の中に脂肪酸修飾配列に共通に見られるLSGCを有する。そこで〔^3H〕-パルミテン酸存在下に生育した菌のMexAを調べてみると、脂肪酸による修飾が見られたことからMexAはリポ蛋白であることが明らかとなった。次に、MexAの脂肪酸修飾部位と考えられるN-末端のシステイン残基をフェニルアラニンもしくはトリプトファンに置換したところ、これらの変異体はペリプラズム可溶性蛋白となった。従ってMexAは脂質によって内膜に結合し、蛋白部分はペリプラズムに存在していた。次にOprMに関しても同様の実験を行ったところ、OprMもまたリポ蛋白であることが明らかとなった。そこでOprMのシグナル配列をペリプラズム蛋白の一つであるAzurinのシグナル配列と置換した。その結果、OprMはペリプラズム可溶性蛋白となった。またOprMのシグナル配列を、内膜貫通蛋白の一つであるMexFの第一膜貫通ドメインと置換した。

その結果OprMは内膜貫通蛋白となったが、この雑種蛋白はポンプサブユニットとして正常に機能した。これらの結果から、OprMは主としてペリプラズムに突出した外膜リポ蛋白であることが明らかとなった。以上述べてきたように緑膿菌排出ポンプMexABMのサブユニットトポロジー構造の全ては当研究室で明らかとすることができた。薬剤排出ポンプMexAB-OprMは三成分からなる異物・薬物排出蛋白である。このトランスポーターはプロトンの濃度勾配をエネルギー源として構造の異なる複数の抗生物質を排出する。そのトランスポーターの主たる役割を果たすのはMexBサブユニットである。MexBの膜貫通領域(TMS)には5ケの荷電を有するアミノ酸が配置されているがその役割については不明である。そこで本実験ではTMS-2に存在するLys342及びGlu346に場所特異的変異を導入し、これらの座を中性、逆の荷電及び同じ荷電を有する別のアミノ酸に変えたところポンプの機能には影響を及ぼさなかった。従ってこれらの残基は荷電を有することの意味は少ないものと考えられた。次にTMS-4に存在するAsp407、Asp408及びTMS-10に存在するLys-939に変異を導入した。その結果、Asp408及びLys939に関しては同じ荷電を有するアミノ酸に変換した場合にのみポンプは機能した。またこの二つのアミノ酸残基は膜中にあって同じ高さで向かい合って存在すると考えられることから、膜中でイオン結合をすることによって安定化しているものと考えられる。Asp407に関してはどの変異株においてもポンプ活性が消失したかもしくはAsp407Gluの時のみわずかに活性を残した。このことからこのAsp407を介してプロトンが移動するものと解釈できた。Asp407に結合したプロトンは基質がMexBに結合すると同時にAsp408に移り、その時Lys939はAsp407と結合することにより安定化し、やがてプロトンは細胞質に移動するという仮説を築くことができた。このプロセスの進行と同時に基質である抗生物質はMexA/OprMに移されるものと解釈できた。緑膿菌の抗生物質多剤耐性は、この菌が発現するMexAB-OprM異物・抗生物質排出ポンプによるところが大である。このポンプの三つのサブユニットの内、MexB蛋白は内膜を12回貫通するポリトピック型トランスポーターである。このMexBサブユニットが基質を認識しエネルギーを消費して基質を認識するものと考えられている。(i)そこで先ず行った実験は、MexBの基質認識ドメインを決定する実験であった。MexBとその類似体であるMexYは、各々にβラクタムとアミノグリコシドを認識する。そこでこれらのトランスポーターの基質認識部位を明らかとするため、MexBのペリプラズム側膜外ドメインをMexYの膜貫通領域につないだ雑種蛋白を構築した。この雑種蛋白の基質特異性はMexB型でβラクタムを効率よく排出した。このことはRND-型排出ポンプがペリプラズムに突出したドメインによって基質を認識していることを示している。更に膜貫通領域が基質認識に係っている可能性を検証するため、MexBの膜貫通領域を一本一本MexYのそれと置換した。
高速クリーンアーク溶接プロセス実現のための熱と力の分離制御技術の創成

ものづくりにおける国際競争力の向上のため、GTA溶接と同等の溶接部が得られる高速クリーンGMA溶接プロセスの開発が待ち望まれている。その実現を目指して、本研究では、2台の電源と電極ワイヤへの2カ所の給電により、溶接として必要な熱の制御と、アークの安定化として必要な力の制御を分離するための科学を明らかにするとともに、高速クリーンGMA溶接プロセスを実現するための、熱と力の分離制御技術を創成した本研究では、2台の電源と電極ワイヤへの2カ所の給電により、溶接として必要な熱の制御と、アークの安定化として必要な力の制御を分離するための科学を明らかにするとともに、高速クリーンGMA(ガスメタルアーク)溶接プロセスを実現するための、熱と力の分離制御技術の創成を目的とする。前年度に構築した2段給電可能なGMA溶接システムを用いて、各種パラメータが溶接アーク現象に及ぼす影響について調査した。溶接アーク現象は、高速度デジタルビデオカメラによって観察するとともに、溶接電流、プラズマジェット誘起電流、およびアーク電圧の測定を行った。特に、電極ワイヤ先端部の揺動と溶滴の形成・離脱に与えるプラズマジェット誘起電流および給電点の位置の影響を実験的に調査した。その結果、1段目と2段目の給電点の位置が離れるほど、かつ、溶接電流を抑えてプラズマジェット誘起電流を高く確保する条件において、2段給電の効果が大きく出現した。従来のGMA溶接と比較した場合、同じ合計電流でありながら溶接部の溶込みが約2倍に増加することが明らかになった。さらに、多段給電を考慮に加えたGMAの数値解析モデルを構築した。電極ワイヤ突出し部でのジュール加熱や高温プラズマの発生など熱に寄与する溶接電流の割合と、電磁ピンチ力に寄与するプラズマジェット誘起電流の割合を定量的に出力し、熱の制御と力の制御を分離するための科学を解明した。その結果、2点の給電点間におけるジュール加熱が2段給電の効果の重要なファクターであり、それは双方の給電点における電流配分によって制御されていることが定量的に明らかになった。以上により、溶接電流とプラズマジェット誘起電流の最適バランス、および給電点の最適位置が存在することを確認し、高速クリーンGMA溶接プロセスを実現するための,熱と力の分離制御技術の創成に成功した。平成23年度では、まず、実験装置を構築した。具体的には、熱の発生を担当する溶接電源と、力の発生を担当するプラズマジェット誘起電源の2台から構成される。次に,2段給電可能なGMA溶接トーチの試作を行った。具体的には、従来の自動機用GMA溶接トーチを改造し、プラズマジェット誘起用給電チップを内蔵させた。特に、耐摩耗性に優れ、電極ワイヤの送給安定性が良好なように、溶接用給電チップの下流域に位置するプラズマジェット誘起用給電チップの材質、形状、穴径等を工夫した。実験観察では、ビード・オン・プレート溶接を行い,プラズマジェット誘起電流を変化させ、2段給電式と従来式の溶接アーク現象を比較検討した。現象の観察には、高速度デジタルビデオカメラを用いるとともに、溶接電流、プラズマジェット誘起電流、およびアーク電圧の測定を行った。その結果、同じ電極ワイヤの送給速度でありながら、従来式に比べて2段給電式では、明らかに余盛角の小さい、ぬれ性の良い溶接ビードが得られた。これに対して、高速度デジタルビデオカメラを利用した二色放射温度測定により電極ワイヤ先端部の表面温度を測定した結果、従来式に比べて2段給電式では、表面温度が明らかに上昇していることがわかった。以上の知見により、2台の電源と電極ワイヤへの2カ所の給電により、熱と力の分離制御が実現されていることが確認された。当初の計画どおり、熱の発生を担当する溶接電源と、力の発生を担当するプラズマジェット誘起電源の2台から構成される実験装置を構築した。加えて、2段給電可能なGMA溶接トーチの試作を行った。本試作にあたって、当初計画にはなかったが、溶接用給電チップの下流域に位置するプラズマジェット誘起用給電チップの材質、形状、穴径等を工夫した。その結果、電極ワイヤの送給安定性が良好で耐摩耗性に優れた、2段給電可能なGMA溶接トーチの試作を達成した。一方、実験観察では、同じ電極ワイヤの送給速度でありながら、従来式に比べて2段給電式では、明らかに余盛角の小さい、ぬれ性の良い溶接ビードが得られた。これに対して、当初の計画にはなかったが、高速度デジタルビデオカメラを利用した二色放射温度測定により電極ワイヤ先端部の表面温度を測定した。その結果、従来式に比べて2段給電式では、表面温度が明らかに上昇していることを定量的に把握できた。

以上の知見により、当初計画よりも一歩進んで、2台の電源と電極ワイヤへの2カ所の給電により、熱と力の分離制御が実現されていることが確認された。平成24年度では、まず、我々の研究グループのオリジナルで実績があるGMAの数値解析モデルに2段給電を考慮に加えるよう拡張する。本モデルは「電極ワイヤ-アークプラズマ-溶融プール」を同時に一体化して計算する軸対称2次元の電磁熱流体モデルである。電極ワイヤ突出し部でのジュール加熱や高温プラズマの発生など熱に寄与する溶接電流の割合と、電磁ピンチ力に寄与するプラズマジェット誘起電流の割合を定量的に出力し、熱の制御と力の制御を分離するための科学を解明する。数値計算の結果と平成23年度の実験観察の成果を比較検討し、さらに、母材として純アルゴン雰囲気下での溶接を必要とするステンレス鋼での実験観察を加えることにより、様々な溶接電流に対する最適なプラズマジェット誘起電流および給電点の普遍的条件を見出し、高速クリーンGMA溶接プロセスを実現するための、熱と力の分離制御技術を創成する。最後に、得られた結果を取り纏め、成果の発表を行う。平成24年度の研究費は、平成23年度に得られた研究成果発表のための旅費に充てるとともに、数値計算シミュレーションの妥当性評価ならびに追加実験観察のため、試験片、シールドガス、給電チップ、電極ワイヤ等の消耗品を購入するための物品費に充てる。
唾液腺の傍細胞経路による唾液分泌調節機構の解明とその活性化

唾液腺の分泌にともなうタイト結合(TJ)の構造と構成蛋白質の局在変化を検討し、腺房細胞間の傍細胞経路における選択的な透過性調節機序を明らかにする目的で研究を行なった。ラット灌流顎下腺のcarbachol(CCh)とisoproterenol(IPR)刺激後の、未固定新鮮組織の急速凍結ディープエッチングレプリカの透過電顕観察において、細胞間分泌細管のTJ部から腺腔側膜直下のアクチン細胞骨格が分泌にともなって改変され、TJを介した水やイオン、低分子量の分子等の傍細胞輸送を増大させることが示唆された。唾液腺の腺房細胞内および腺房細胞間を様々な修飾を受けながら結合組織側から腺腔内へと輸送・分泌される唾液分子および水の透過経路(細胞内経路/trans-cellular pathwayと傍細胞経路/para-cellular pathway)とがある。本研究では、唾液腺の分泌にともなう唾液腺腺房細胞におけるタイト結合の構造と、構成蛋白質の局在変化の検討を通して、腺房細胞間の傍細胞経路における選択的な透過性の調節を明らかにすると共に、細胞内経路による唾液分泌に関して、腺房細胞の分泌顆粒における、アクアポリンAquaporin/AQPの局在と機能について研究を行なっている。平成20年度は、唾液分泌にともなうタイト結合による傍細胞経路における選択的調節機構およびその三次元的構造変化を、主として共焦点レーザー顕微鏡および、新鮮組織の液体ヘリウム急速凍結レプリカ法を中心として、学外の研究機関と共同で研究を遂行している。1)岡崎国立共同研究機構における共同研究で、同・生理学研究所に設置された金属圧着急速凍結固定装置をもちいて、液体ヘリウムにより未固定新鮮組織の急速凍結固定を行い、生きたままの状態の構造を瞬間的に凍結固定し、レプリカ上で、細胞間分泌細管のタイト結合の接着部位の膜内粒子と直下の細胞骨格を透過電子顕微鏡にて観察し、タイト結合とアクチンタイト結合部から腺腔側膜直下のアクチン細胞骨格が分泌にともなって改変されて、タイト結合を介した水やイオン、低分子量の分子等の傍細胞輸送経路の透過性を増大させることが明らかとなった(投稿準備中)。また、2)AQPの検討では、AQP5のみならず、AQP6が同様に分泌顆粒膜に存在することを明らかにし、AQP6がタイト結合部の細胞膜と分泌穎粒膜で、水と陰イオンの輸送に密接に関与していることを示した(Sugiya H.et.al., J Cell Mol Med.,:2008.Matsuki-Fukushima M., et.al., Cell and Tissue Research,:2008)。唾液腺の腺房細胞内および腺房細胞間を様々な修飾を受けながら結合組織側から腺腔内へと輸送・分泌される唾液分子および水の透過経路すなわち、細胞内経路と傍細胞経路とがある。本研究では、唾液腺の分泌にともなうタイト結合(TJ)の構造と、構成蛋白質の局在変化の検討を通して、腺房細胞間の傍細胞経路における選択的な透過性の調節を明らかにすると共に、Aquaporin(AQP)の局在と機能について研究を行なっている。1)分泌刺激に伴うTJと細胞骨格の超微構造変化を、新鮮組織を用いたディープエッチングレプリカ法により三次元的に解析するため、ラット顎下腺を摘出し灌流下に、carbachol(CCh)と、isoproterenol(IPR)により刺激し、液体ヘリウム下に金属圧着法により未固定新鮮組織の急速凍結固定を行いレプリカを作成した。3D-TEM観察において、細胞間分泌細管のタイト結合の接着部位の膜内粒子と直下の細胞骨格を透過電子顕微鏡にて観察し、CCh後にIPR刺激を加えたものでは、TJ部から腺腔側膜直下のアクチン細胞骨格が分泌にともなって改変されて、TJを介した水やイオン、低分子量の分子等の傍細胞輸送を増大させることが明らかとなった(J.Medical Investigation, 2009)。2)AQPの検討では、AQP 6が腺腔膜と共に分泌顆粒膜に存在することを明らかにし、AQP 6がタイト結合部の細胞膜と分泌顆粒膜で、水と陰イオンの輸送に密接に関与していることを示した。3)傍細胞経路における選択的輸送調節機構の解析のために、ラット灌流唾液腺を用いて傍細胞経路を通過するトレーサー分子を、分光共焦点レーザー顕微鏡観察と高速スキャンヘッド(Zeiss社製・5-Live)による高時間分解能の4D解析を行ない、トレーサー基質の分子サイズ・荷電・形の関係を検討しており、速やかな細胞間から傍細胞経由の腺腔側へのトレーサー分子の移行を観察している。

本研究では、唾液腺の分泌にともなうタイト結合(TJ)の構造と、構成蛋白質の局在変化の検討を通して、腺房細胞間の傍細胞経路における選択的な透過性調節機序について研究を行なっている。1)TJと細胞骨格の超微構造変化を三次元的に解析するため、ラット灌流顎下腺をcarbachol(CCh)と、isoproterenol(IPR)により刺激し、液体ヘリウム下に金属圧着法による未固定新鮮組織の急速凍結固定後、ディープエッチングレプリカを作成した。3D-TEM観察において、細胞間分泌細管のタイト結合の接着部位の膜内粒子と直下の細胞骨格を透過電子顕微鏡にて観察し、CCh後にIPR刺激を加えたものでは、TJ部から腺腔側膜直下のアクチン細胞骨格が分泌にともなって改変され、TJを介した水やイオン、低分子量の分子等の傍細胞輸送を増大させることが示唆された(Hashimoto, S. & Murakami, M., et. al., J.Medical Investigation, 2009)。2)傍細胞経路における選択的輸送調節機構の解析のために、ラット灌流唾液腺を用いて傍細胞経路を通過するトレーサー分子を、分光共焦点レーザー顕微鏡観察と高速スキャンヘッド(Zeiss社製・5-Live)による高時間分解能の4D解析を試みた。1/secの3D画像のタイムシリーズ解析では、IPRによるβアドレナリン受容体への分泌刺激により、腺房細胞の容積の減少が経時的に記録できたと共に、血管灌流したLucifer YellowおよびRhodaminは、非刺激時には腺房細胞周囲の細胞間隙にとどまるが、IPR投与後には、細胞間分泌細管内へと移行する像が観察されたことから、β受容体刺激によりTJを介した傍細胞輸送経路が開くことが示唆された。(Hashimoto, S.& Murakami, M., XXIth ISMS, Taormina, 2010)