hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
京都府野田川流域のつつがむし病患者発生地における媒介種の分布構造の変動

京都府北部の野田川流域のつつがむし病患者発生地で、本年度もつつがむし病の媒介種の検索と地表面におけるツツガムシ未吸着幼虫の分布構造を調べた。今年度も、この地域からは本病患者は出なかったが、野鼠寄生ツツガムシ類、および地表面に生息している未吸着幼虫からリケッチアの検出と分離を試みた。媒介種の検索は、野田川流域のつつがむし病患者発生地でアカネズミ2頭、ハタネズミ3頭の合計5頭が捕獲された。このうちアカネズミ2頭とハタネズミ3頭からリケッチアの分離を試みた結果、すべてからリケッチが分離された。PCR法により、リケッチアの型別を判定したところ、すべてがGilliam型であった。一方、これらの野鼠に寄生していた5属5種1568個体のツツガムシからマウス接種法によりリケッチアの検出を行った結果、フトゲツツガムシを接種した群からのみリケッチアが検出された。このリケッチアの型別はPCRでの結果と同様にGilliam型であった。このことから、この地域でのツツガムシ病媒介種はフトゲツツガムシと考えらた。この地域では、この数年間はフトゲツツガムシ以外のツツガムシからはリケッチアは分離も検出もされていない。一方、リケッチア保有ツツガムシの微小浸淫地点の地表分布を調べた。土壌はあらかじめ選定された調査地点(1区域40地点(40cm間隔)で8区域、1回の調査で、およそ100kgを採取し、その中の未吸着幼虫をツルグレン装置を用いて採集した。今回の調査では、4属5種568個体が採集され、その大半はL.intermedium(62.6%)とL.pallidum(29.33%)が占めていた。リケッチアはL.pallidum9.3.6%(22/236)からのみ検出され、モノクローナル抗体での反応はGilliam型であった。以上のことから、この地域でのツツガムシ病媒介種はフトゲツツガムシと考えられた。昨年と比較してみると、患者は出なかったものの、リケッチアを保有するフトゲツツガムシは相変わらず高い割合で棲息していた。しかしツツガムシの種構成は昨年度もそうであったように、次第にアラトツツガムシが優占種になりつつあるように感じられた。これが事実であるなら、有毒地が無毒地に変化する要因が、経卵伝播率とあわせて、種構成の変遷に基ずくことも一つの理由に挙げることができよう。そして、必ずや1995年当時のようなネズミの異常発生と、それに付随するツツガムシの増加に呼応するように、つつがむし病患者発生の再興が不幸にして起こることが予想される。その意味で、今後も継続して調査する必要がある。

そして、必ずや1995年当時のようなネズミの異常発生と、それに付随するツツガムシの増加に呼応するように、つつがむし病患者発生の再興が不幸にして起こることが予想される。その意味で、今後も継続して調査する必要がある。
孵化酵素と孵化線細胞の発生進化学的研究

孵化酵素は卵膜を分解するプロテアーゼである。メダカとFundulus間では種特異的な卵膜分解を示す。これは、孵化酵素側4ヶ所と卵膜側1ヶ所(P2サイト)のアミノ酸残基の変異によってもたらされている。この酵素側4ヶ所の変異はP2サイトのアミノ酸残基に対する特異性を大きく変えていることをすでに明らかにしている。今年度はさらに、孵化酵素による卵膜分解系が正真骨類の進化過程でどのように変化したのかを考察した。まず、クローン化した種々の正真骨類の孵化酵素LCEと卵膜タンパク質遺伝子から、最尤法でそれぞれの祖先型遺伝子配列を推定した。この中から、新真骨類・棘鰭上目・ダツ目・メダカ属の祖先型の孵化酵素の組換えタンパク質を作成し、P2サイトに対する特異性を調べた。その結果、新真骨類では特異性が高かった。酵素側4ヶ所のアミノ酸残基はその後の進化過程で少しずつ変異したが特異性は維持されていた。一方、メダカ属の祖先で生じた変異により特異性が広くなった。正真骨類の進化過程におけるP2サイトの変異を見てみると、祖先型のアミノ酸残基は保存されていたが、メダカ属内での進化過程で変異したことが推定されている。これらの結果から、メダカ属の祖先でP2サイトに対する特異性が広くなり、その後メダカ属内で生じたP2サイトへの変異が許容されたと考えられる。本研究は、酵素と基質の共進化過程を示すことができた点で意義深い。本年度は上述の研究と平行して、トゲウオ目魚類に着目した孵化酵素と卵膜タンパク質の分子共進化の研究を進めた。トゲウオ科に属するイトヨはメダカなどと同様に1種類のLCEのみを持つが、同じトゲウオ科に属するトミヨでは2種類のLCEをもち、組換えタンパク質作成実験の結果、それぞれが機能分化していることがわかった。トゲウオ科に属するCulaea inconstans、Apeltes quadracus、Spinachia spinachiaも交えて解析したところ、トミヨとCulaea属の共通祖先で遺伝子重複が起きたことを示唆する結果を得た。Fundulusとメダカには2種類の孵化酵素HCEとLCEが存在し、HCEには種特異性がなく、どちらの種の卵膜も分解するが、LCEは魚種特異的な卵膜分解を示し、他種の卵膜を分解しない。その種特異性をもたらす卵膜側と酵素側のアミノ酸変異サイトを特定することを目的に、実験を行った。まず、卵膜タンパク質のLCE切断点のアミノ酸配列をFundulusとメダカで比較し、変異ペプチドを用いて原因アミノ酸残基を同定した。切断点から-2の位置にある1つのアミノ酸残基の変異(Leu⇔Pro)が種特異性に関与することがわかった。次に、酵素側の種特異性に関与する変異部位の決定も試みた。Fundulus LCE(FLCE)とメダカLCE(MLCE)のアミノ酸配列を比較すると、活性部位周辺に位置するアミノ酸50残基のうち、両者間で20残基の変異が見られる。この20残基に注目し、まず、FLCEを基に、その20残基をMLCE型に置き換えたミュータントリコンビナントタンパク質FLCE_mu20を作製した。FLCE_mu20の卵膜分解活性を調べた結果、MLCE様活性を示し、メダカの卵膜を分解した。この結果は種特異性を示すアミノ酸変異は活性部位周辺の20アミノ酸に存在することを示しており、さらに変異サイトの絞込みを行い、4箇所に絞り込むことに成功した。自然選択の検定を行うと、そのうちの1つである74番目のアミノ酸残基にのみ選択圧がかかっているという興味深い結果を得た。孵化酵素と卵膜タンパク質の分子共進化過程を考察することを目的に、孵化酵素LCEによる種研異的卵膜分解に寄与する卵膜タンパク質とLCEの領域を正真骨類に属する種々の魚からクローン化し、種間で配列を比較した。その結果、種特異性に重要であることがわかった卵膜側1箇所・酵素側4箇所のアミノ酸残基は多くの魚種間で保存されていたが、メダカが属するダツ目内の魚類では変異が生じていた。クローン化した配列を元に、最尤法により祖先配列を演繹してみると、ダツ目内の進化過程で先に酵素側に変異が挿入し、その後、メダカ属の進化過程で卵膜側に変異が挿入されたことがわかった。このため、正真骨類の祖先型の配列を保存しているFundulusは卵膜が変異したメダカの卵膜を分解できないと考えられる。一方、メダカでは祖先型の配列も変異した配列もどちらも分解する活性を持っているが、切断点近傍以外の領域にも酵素との相互作用する領域があると予想され、そのような領域の変異によってメダカのLCEはFundulusの卵膜を分解しないと考えられる。これがメダカとFundulus間で見られる種研異的卵膜分解をもたらしていると考えられる。その共進化機構を明らかにする目的で、ダツ目内での変異によって酵素の活性がどのように変化していったのかを調べた。ダツ目に属する魚種(サンマとジャワメダカ)のLCEのリコンビナントタンパク質を作成し、種特異性に寄与する1箇所のサイトを様々なアミノ酸で置換した変異ペプチドを用いて、特異性を調べてみると、Fundulusのものと比べ、LCEの特異性が広くなっていることが示唆された。

これらの結果から、酵素側が先に変異することによって基質特異性が変化し、変異した基質を分解するようになる、という酵素と基質の分子共進化の1例を示すことがでた本研究は意義深いものである。孵化酵素は卵膜を分解するプロテアーゼである。メダカとFundulus間では種特異的な卵膜分解を示す。これは、孵化酵素側4ヶ所と卵膜側1ヶ所(P2サイト)のアミノ酸残基の変異によってもたらされている。この酵素側4ヶ所の変異はP2サイトのアミノ酸残基に対する特異性を大きく変えていることをすでに明らかにしている。今年度はさらに、孵化酵素による卵膜分解系が正真骨類の進化過程でどのように変化したのかを考察した。まず、クローン化した種々の正真骨類の孵化酵素LCEと卵膜タンパク質遺伝子から、最尤法でそれぞれの祖先型遺伝子配列を推定した。この中から、新真骨類・棘鰭上目・ダツ目・メダカ属の祖先型の孵化酵素の組換えタンパク質を作成し、P2サイトに対する特異性を調べた。その結果、新真骨類では特異性が高かった。酵素側4ヶ所のアミノ酸残基はその後の進化過程で少しずつ変異したが特異性は維持されていた。一方、メダカ属の祖先で生じた変異により特異性が広くなった。正真骨類の進化過程におけるP2サイトの変異を見てみると、祖先型のアミノ酸残基は保存されていたが、メダカ属内での進化過程で変異したことが推定されている。これらの結果から、メダカ属の祖先でP2サイトに対する特異性が広くなり、その後メダカ属内で生じたP2サイトへの変異が許容されたと考えられる。本研究は、酵素と基質の共進化過程を示すことができた点で意義深い。本年度は上述の研究と平行して、トゲウオ目魚類に着目した孵化酵素と卵膜タンパク質の分子共進化の研究を進めた。トゲウオ科に属するイトヨはメダカなどと同様に1種類のLCEのみを持つが、同じトゲウオ科に属するトミヨでは2種類のLCEをもち、組換えタンパク質作成実験の結果、それぞれが機能分化していることがわかった。トゲウオ科に属するCulaea inconstans、Apeltes quadracus、Spinachia spinachiaも交えて解析したところ、トミヨとCulaea属の共通祖先で遺伝子重複が起きたことを示唆する結果を得た。
長尺配向カーボンナノチューブと熱可塑性樹脂による高電気・熱伝導材料の基礎研究

高配向カーボンナノチューブ(CNT)と樹脂の複合材料による高電気伝導・高熱伝導プラスティック材料開発の基盤技術を確立することを目的とし、研究を進めた。紡績CNTによる一方向配向CNTシートと樹脂シートをホットプレスにより複合化して一方向配向複合材料を作製した。ここで、紡績し得られるCNTウェブ積層数を変化させてCNTシート厚を制御し、複合化後のCNT濃度を制御した。従来の粉末状CNTによる複合材料では、均質な高濃度分散以外にも配向性やCNT結合性が乏しく、高伝導特性は得られていない。本研究で配列CNTシートプリフォームを用いている点が本研究の強みである。本研究を通して、CNT体積充填率やCNT直径などを変化させた複合材料を作製評価し、一方向配向CNT樹脂複合材料の電気伝導特性、および熱伝導特性を調べた。その結果、CNTを体積濃度50%という高濃度に含むCNTエポキシ樹脂複合材料の作製を達成した。また、その電気伝導率と熱伝導率を評価し、それぞれ最大で700S/cm及び80W/mKと、複合材料としては極めて高い電気伝導特性及び熱伝導特性を示すことを明らかにした。一方、直径が24nm及び36nmの二種類のCNTについて作成した複合材料では、引張強度、ヤング率ともに直径が小さいほど大きくなることがわかった。以上の研究から、細いCNTを高濃度に充填するほど、複合材料中で効果的に電気輸送及び熱輸送が生じることが分かった。また、CNT/樹脂界面によるキャリアの散乱が複合材料全体の伝導特性に大きな影響を与えることが明らかとなった。これまで申請者が開発した紡績CNTによる一方向配向CNTシートを基材とし、樹脂と複合化させて電気伝導特性および熱伝導特性がともに優れるCNT複合材料を新規に創出するための研究を実施した。まず、申請者が開発してきた塩化鉄を触媒とする塩化物介在CVD法により、CNTを一方向に配列したCNTウェブを引き出せる紡績性CNTアレイを作製した。ここで、複合材料の特性に直接的に作用するCNT直径を制御して合成するため、触媒供給方法を工夫した。それにより、CNT直径を10nmから40nm程度まで変化させることができた。次にCNTアレイから引き出したCNTウェブを積層し、一方向配向CNTシートを作製した。さらに、CNTシートと熱可塑性樹脂シートをホットプレスにより複合化した。ここで、ウェブ積層数を変化させてCNTシート厚を制御し、複合化後のCNT濃度を制御した。作製したCNT複合材料の複合化状況を調査するため、断面を観察した。CNT濃度によらず、均質な複合化が得られていることがわかった。そこで、次にCNT複合材料の直流電気伝導率を評価した。CNT濃度が増加するとともに、電気伝導率も大きくなり、従来のCNT複合材料と比較して飛躍的に高い特性が得られることが分かった。これは、樹脂中においてもCNT同士の連結が保存されており、CNT表面を介したキャリア輸送が支配的であるためと考えられる。CNT構造制御において、概ね当初目標のサイズの制御のための方法が確立しつつある。CNTと熱可塑性樹脂との複合化において、温度、圧力、時間などを制御して、ボイドのほとんどみられない良好な複合化が得られている。電気伝導性評価においては、これまで作製した熱可塑性及び熱硬化性樹脂との複合材料の電気伝導率データを取得している。材料は一方向配向性のため高い異方性が見られる。そのため、本試験ではCNT配向方向と直交方向について評価した。なお、高周波特性に関しては未実施である。

さらに薄膜複合材料の面内熱伝導率の評価準備を行った。熱伝導率評価には、試料の重量密度、比熱及び熱拡散係数を測定し乗することで熱伝導率を見積もった。前年度までにCNTを高濃度に含むCNTエポキシ樹脂複合材料において、ボイドを含まずCNTが均質に分散していることがわかってきた。そこで、CNT濃度を最大で50%程度まで高めた試料を作製し、直流電気伝導特性を調べた。電気伝導率においては、CNT配向方向に対して測定したところ、CNT濃度5%以下程度の領域で濃度増加とともに導電率が著しく増加した。その後、50%まで濃度が増加するとともに導電率はさらに単調増加し、最大で700S/cmに達した。CNT樹脂複合材料としてはこれまで報告されている結果と比較して極めて高い導電性である。さらに、CNTエポキシ樹脂複合材料の面内熱伝導率評価を進めた。そのために、複合材料フィルム面内の比熱測定と熱拡散率測定および重量密度を測定した後、熱伝導率を算出した。電気伝導率の場合とは異なり、CNT濃度の増加とともに線形的に熱伝導率は増加した。最大で80W/mKを超える極めて高い熱伝導率が得られた。CNTの高い濃度と配向性によるものである。高配向カーボンナノチューブ(CNT)と樹脂の複合材料による高電気伝導・高熱伝導プラスティック材料開発の基盤技術を確立することを目的とし、研究を進めた。紡績CNTによる一方向配向CNTシートと樹脂シートをホットプレスにより複合化して一方向配向複合材料を作製した。ここで、紡績し得られるCNTウェブ積層数を変化させてCNTシート厚を制御し、複合化後のCNT濃度を制御した。従来の粉末状CNTによる複合材料では、均質な高濃度分散以外にも配向性やCNT結合性が乏しく、高伝導特性は得られていない。本研究で配列CNTシートプリフォームを用いている点が本研究の強みである。本研究を通して、CNT体積充填率やCNT直径などを変化させた複合材料を作製評価し、一方向配向CNT樹脂複合材料の電気伝導特性、および熱伝導特性を調べた。その結果、CNTを体積濃度50%という高濃度に含むCNTエポキシ樹脂複合材料の作製を達成した。また、その電気伝導率と熱伝導率を評価し、それぞれ最大で700S/cm及び80W/mKと、複合材料としては極めて高い電気伝導特性及び熱伝導特性を示すことを明らかにした。一方、直径が24nm及び36nmの二種類のCNTについて作成した複合材料では、引張強度、ヤング率ともに直径が小さいほど大きくなることがわかった。以上の研究から、細いCNTを高濃度に充填するほど、複合材料中で効果的に電気輸送及び熱輸送が生じることが分かった。また、CNT/樹脂界面によるキャリアの散乱が複合材料全体の伝導特性に大きな影響を与えることが明らかとなった。引き続き複合材料の電気特性評価を進める。
炎症を標的とした糖尿病性腎症の新規治療薬のシーズ探索と創薬を目指した研究

本研究の目的は、糖尿病性腎症の発症・進展過程で起こる炎症の全体像を明らかにして、創薬のシーズを得るとともに、炎症を標的とした腎症の新しい治療薬を開発することである。1型および2型糖尿病モデルマウスの糸球体からRNAを抽出し、糖尿病マウスに共通して発現が増加する複数のmicroRNAを同定した。この中で発現レベルの高いmicroRNAの発現の機能解析を行った結果、当該microRNAは糖尿病発症早期から持続的に発現が増加しており、糸球体内皮細胞とメサンギウム細胞において、eNOSとSIRT-1の発現の減少、TGF-βの発現亢進を惹起することが明らかとなり、腎症の有望な治療標的であると考えられる。<研究方法>動物モデルとしてstreptozotocin誘発糖尿病マウスとdb/dbマウスを用いた。1)BL6マウスにstreptozotocin(STZ)を静脈内投与後、12週後に腎臓から糸球体を分離採取して、RNAを抽出し、対照には、クエン酸緩衝液を投与したBL6マウスを用いた。2)db/dbマウスとdb/mマウスを飼育し、生後12週に腎臓から糸球体を分離採取してmicro RNAを抽出した。3)Micro RNAアレイ:MicroRNAアレイを用いて、糖尿病マウスの糸球体に特異的に増加または低下するmicroRNAを検索するとともに、microRNAデータベースにアクセスして、糸球体における様々な炎症関連遺伝子の発現変化との関連を解析した。<結果>1)STZ糖尿病マウスではBL6マウスと比較して、糸球体内に発現が増加する9種類のmicroRNAと低下する22種類のmicroRNAが見出された。2)db/dbマウスではdb/mマウスと比較して、糸球体内に発現が増加する19種類のmicroRNAと低下する54種類のmicroRNAが見出された。3)両者に共通して発現が増加するmicroRNAは5種類、低下するmicroRNAは9種類であった。<研究方法>1型および2型糖尿病モデルとして、以下の動物を用いた。1)BL6マウスにstreptozotocin(STZ)を静脈内投与し、12週後に腎臓を摘出して糸球体を分離採取してRNAを抽出した。対照群として、BL6マウスにクエン酸緩衝液を静脈内投与し、12週後に腎臓を摘出して糸球体を分離採取してRNAを抽出した。2)2型糖尿病自然発症モデルとして、db/dbマウス、KKAyマウスを飼育して、生後12週で腎臓を摘出し、腎皮質と単離糸球体からRNAを採取した。対照群としてBL6マウスを飼育して、生後12週で腎臓を摘出し、腎皮質と単離糸球体からRNAを採取した。3)DNAマイクロアレイを用いて、腎組織における炎症関連遺伝子の発現を網羅的に比較検討した。さらにPCRを用いて、Micro RNAアレイで糖尿病マウスの糸球体で発現増加を認めたMicroRNAの発現を比較検討した。<結果>STZ誘発糖尿病マウス、db/dbマウス、KKAyマウスの腎皮質および糸球体に、炎症性サイトカイン、ケモカイン、接着分子の発現増加、さらにCaspase-1の発現増加が認められた。サンプル数を増やしてPCRで検討した結果、Micro RNAアレイで糖尿病マウスの糸球体に発現増加を認めたMicroRNAの中で、miR34aが糖尿病マウスの糸球体に強く発現しており、糖尿病状態では発現が増加していることが確認された。本研究において、これまでに、動物モデルとしてstreptozotocin誘発糖尿病マウスとdb/dbマウスを用いて、糸球体内におけるmicroRNAの発現変化を検討して、以下の結果を得た。1)STZ糖尿病マウスではBL6マウスと比較して、糸球体内に発現が増加する9種類のmicroRNAと低下する22種類のmicroRNAが見出された。そこで、昨年に引き続いて、上記の検討によって検出したmicroRNAのうち、発現量が多い2種類について、個体数を増やしてRT-PCRで発現変化を検討した。その結果、2種類のmicroRNAは糸球体内皮細胞で発現することを確認した。さらに、培養糸球体内皮細胞に上記microRNAの前駆体をtransfectionすることにより、このmicroRNAの発現増加によってeNOSとSIRT-1の発現が低下し、MCP-1とIV型コラーゲンの発現が増加することが明らかとなった。さらに、SIRT-1のsi-RNAをtransfectionした実験により、microRNAはSIRT-1とは独立した経路でMCP-1の発現を誘導することが示唆された。

これまでに発見した糖尿病マウスの腎臓に発現が増加するMicroRNAの発現量と増加率を2つの糖尿病モデルマウスの糸球体で検討することにより、miR34aが両モデルに共通して発現が増加し発現量も多いことが確認された。miR34aが糖尿病性腎症の新しい治療標的として有望であることが明らかとなった。さらに、DNAマイクロアレイによって、糖尿病マウスの腎組織に発現する炎症関連遺伝子が明らかにされた。糖尿病学、腎臓病学1.DNAマイクロアレイで糖尿病モデルマウスの腎臓で発現増加が認められた炎症関連遺伝子の発現を、サンプル数を増やしてPCRを用いて検討する。2.db/dbマウスとKKAyマウスを用いて、上記で確認された炎症関連分子の血液中および尿中濃度を継時的に測定することにより、糖尿病状態における炎症状態の経時的変化を明らかにする。3.miR34aを培養糸球体細胞で強制的に発現増加させて、その機能を解析する。当初の計画に従って、1型糖尿病および2型糖尿病モデルマウスを用いて、腎糸球体からRNAを採取して、microRNAアレイによって、microRNAの発現変化を解析した。この方法により、両モデルに共通して、糸球体内に発現が増加または低下する複数のmicroRNAを同定することができた。本年度はサンプル数を増やして定量PCRによる遺伝子発現の検討を行い、ほぼ予定額を支出したが、定量PCRによる解析の一部を次年度に行うこととしたため、プライマー等の試薬代が少なくなった。<1>上記の検討によって検出したmicroRNAに関して、1糸球体のどの細胞で発現が変化するのか、2発現が変化するメカニズムを検討し、3これらのmicroRNAの標的遺伝子と作用を解析する。1)MicroRNAアレイで検出したmicroRNAについて、サンプル数を増やして、MicroRNAアレイとPCRにて結果の確認を行う。2)糸球体上皮細胞、内皮細胞、メサンギウム細胞を高糖濃度条件下およびTNF-αなどの炎症性サイトカインを添加した条件下で培養して、PCRによって上記micro RNAの変化を検討する。3)腎症の発症・進展への関与が示唆されるmicro RNAを選択して、糸球体上皮細胞、内皮細胞、メサンギウム細胞にtransfectionし、細胞の形態変化、ケモカイン、サイトカインの発現、eNOSやSIRT-1の遺伝子および蛋白発現の変化を解析する。<2>PSGL-1が治療標的の有望な候補の一つであることから、抗PSGL-1抗体による糖尿病性腎症に対する効果を検討する。1)動物モデルとしてdb/dbマウスを用いる。2)既存の抗PSGL-1モノクローナル抗体の中から、PSGL-1阻害活性を持つ抗体を選択する。3)db/dbマウスに抗PSGL-1抗体またはコントロール抗体を投与する。腎組織を採取して、炎症関連分子の発現変化とアルブミン尿、腎組織の変化を解析する。定量PCR用のプライマーを購入して、本年度に行わなかった遺伝子の発現解析を行う予定である。
ホログラフィック光誘起メゾスコピック界面による液晶分子配向制御と記録素子への応用

本研究では、ネマティック液晶を用いた双安定表示素子のモードの1つであるZBD(Zenithal Bistable Display)モードを実現するための基礎研究について、2年計画に従って遂行した。はじめに、レーザー光干渉露光を用いた光誘起レリーフグレーティング(LRG)作製手法を確立した。現有備品並びに科研費補助によって新規に購入したHe-Cdレーザによって、再現性あるLRG界面の作製技術を確立した。レーザー光干渉露光を用いた光誘起LRG作製手法により、双安定配向界面を作成し、ZBD液晶セルをさまざまな条件で多数作製した。LRGの溝の深さ及びピッチを変えることによって、界面アンカリングエネルギーを連続的に変化させることが出来るため、発現するZBDセルにおける双安定性の違いを実験の上から検証出来た。実験と同時に、有限要素法による液晶配向シミュレーションを行い、ZBDセルの最適作製条件を探るため、デバイスパラメーターを振ることによって、実験する際の具体的な条件を明らかにした。次に、垂直配向のアンカリングエネルギー評価技術の確立に取り組んだ。エリプソメトリー法を用いた新規な垂直アンカリング測定手法を構築して、垂直配向膜を用いたホメオトロピック配向セルを使い、極角アンカリングエネルギーの測定を行った。また、ZBDモードの対向側一様配向は水平配向でも可なため、水平配向の方位角アンカリング測定技法の改良も行った。また、実用化に当たって、用いる液晶の相転移の違い(界面相転移/バルク相転移)が、アンカリングエネルギーに及ぼす影響について知見を得ておく必要性があることから、ラビング処理と残留リタデーションがアンカリングエネルギーに及ぼす影響を詳細に調べた。ZBDモードの研究に取り組む中で、表面幾何形状を用いずに、水平配向と垂直配向の周期的な構成による双安定モードを新規に見出し、素子の作製に成功した。本研究では、ネマティック液晶を用いた双安定表示素子のモードの1つであるZBD(Zenithal Bistable Display)モードを実現するための基礎研究を、研究計画に従って遂行した。現有備品並びに科研費補助によって新規に購入したHe-Cdレーザによって、再現性あるレリーフグレーティング界面の作製技術を確立した。有限要素法による液晶配向シミュレーションを行い、ZBDセルの最適作製条件を探るため、デバイスパラメーターを振ることによって、実験する際の具体的な条件を明らかにした(裏面論文1)。エリプソメトリー法を用いた新規な垂直アンカリング測定手法を構築して、垂直配向膜を用いたHANセルより極角アンカリングエネルギーの測定を行った(裏面論文2)。また、ZBDモードの対向側一様配向は水平配向でも可なため、水平配向の方位角アンカリング測定技法の改良も行い、SOITE法を考案した(裏面論文4)。また、実用化に当たって、用いる液晶の相転移の違い(界面相転移/バルク相転移)が、アンカリングエネルギーに及ぼす影響について知見を得ておく必要性があることから、ラビング処理と残留リタデーションがアンカリングエネルギーに及ぼす影響を詳細に調べた(裏面文献3)続いて、LRGを用いて作製されたグレーティング表面の方位角アンカリングエネルギーの測定を行った。有限要素法を用いたモデル検証からBerremanの溝モデルでは説明できなかった深い溝でのアンカリング飽和現象を説明できた(裏面文献1)。ZBDモードの研究に取り組む中で、表面幾何形状を用いずに、水平配向と垂直配向の周期的な構成による双安定モードを新規に見出した(裏面特許)。

本研究では、ネマティック液晶を用いた双安定表示素子のモードの1つであるZBD(Zenithal Bistable Display)モードを実現するための基礎研究について、最終年度としての研究を計画に従って遂行した。昨年度確立した、レーザー光干渉露光を用いた光誘起レリーフグレーティング(LRG)作製手法により、双安定配向界面を作成し、ZBD液晶セルをさまざまな条件で多数作製した。LRGの溝の深さ及びピッチを変えることによって、界面アンカリングエネルギーを連続的に変化させることが出来るため、発現するZBDセルにおける双安定性の違いを実験の上から検証出来た。実験と同時に、有限要素法による液晶配向シミュレーションを行い、ZBDセルの最適作製条件を探るため、デバイスパラメーターを振ることによって、実験する際の具体的な条件を明らかにした。次に、垂直配向のアンカリングエネルギー評価技術の確立に取り組んだ。エリプソメトリー法を用いた新規な垂直アンカリング測定手法を構築して、垂直配向膜を用いたホメオトロピック配向セルを使い、極角アンカリングエネルギーの測定を行った。また、ZBDモードの対向側一様配向は水平配向でも可なため、水平配向の方位角アンカリング測定技法の改良も行った。また、実用化に当たって、用いる液晶の相転移の違い(界面相転移/バルク相転移)が、アンカリングエネルギーに及ぼす影響について知見を得ておく必要性があることから、ラビング処理と残留リタデーションがアンカリングエネルギーに及ぼす影響を詳細に調べた。ZBDモードの研究に取り組む中で、表面幾何形状を用いずに、水平配向と垂直配向の周期的な構成による双安定モードを新規に見出し、素子の作製に成功した。
移植後免疫寛容の誘導における調節Ｔ細胞の役割の解明及び心臓乾燥保存法の開発

期間中全体の研究内容を主に下記二つつのテーマに絞って研究を行った:1.ALA/SFCの投与には虚血再還流障害によるマウスの生存率を著しく改善し、その効果はALA/SFCの濃度依存的であった。生存率の改善と同様に、腎障害の指標である血清クレアチニンおよび血中尿素窒素のALA/SFCの濃度依存的な改善が確認された。腎組織の病理学的検討によりALA/SFCが虚血再還流障害による腎組織障害)および脂質過酸化マーカーである血清中のチオバルビツール酸反応性物質の産生を有意に抑制する事が認められた。ALA/SFCの投与は虚血再還流障害による腎臓のTUNEL陽性細胞死およびF4/80陽性マクロファージの浸潤を有意に抑制した。また、ALA/SFCは虚血再還流障害時のHO-1発現を増強させた。この様に、我々の研究は投与されたALAが生体内にてHO-1を介してCOを産生する事により腎臓の虚血再還流障害を抑制する事を明らかにした。2.ラット小腸虚血再灌流障害モデルにおける水素保存液腸管内投与の効果:本研究は水素の持つ抗酸化作用に注目し、水素含有保存液のラット腸管内投与による虚血再灌流障害の有効性を検討した。腸間膜動静脈を90分間クランプし、再灌流直前に腸管内投与を行った。保存液注入の有無によりA群(注入なし)、B群(生食)、C群(水素保存液)に分類した。再灌流60分後に腸管組織を採取し、病理組織、炎症性サイトカイン、生存を検討した。病理組織(Park/Chiu分類)においてA群B群ではgrade2-4に対し、C群では全例grade2と良好であった。炎症性サイトカインでは、C群でTNF-α、IL-6、iNOSは有意に抑制された(p<0.05)。48時間生存率は、A群(25%)、B群(58.3%)、C群(66.7%)であり、A群とC群では有意差を認めた。以上の結果から、ラット小腸虚血再灌流モデルにおいて、水素含有保存液の腸管内投与の効果が示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。期間中主に下記の二つのテーマに絞って研究を行った:1.マウスiPS細胞から制御性DCへの分化誘導においては、iPS細胞から制御性DC (iPS-DCreg)への分化誘導およびその機能解析を行った。iPS-DCreg細胞の誘導は、IL-10、TGF-βの添加によって検討した。iPS-DCregでは、骨髄由来制御性DC (BM-DCreg)とほぼ同様で、Ia、CD80、CD86、CD40等表面分子の発現は顕著に減弱した。また、iPS-DCregは、BM-DCregと同様アロ刺激によるin vitroのT細胞増殖の抑制機能がiPS-DCregの用量に比例した。一方、iPS細胞からMDSCへの分化誘導においては、iPS-MDSCの抗原提示能および抑制機能について、未熟iPS-DCを追加して、詳細に比較検討した。BM-MDSC、未熟iPS-DCより、アロ刺激によるCD4、CD8T細胞増殖の抑制機能が顕著であり、iPS-MDSCの用量に比例していた。2.新規免疫抑制剤として、5-アミノレブリン酸(5-ALA)のヘムオキシゲナーゼ-1 (HO-1)発現増強効果について検討した。マウス細胞株RAW264において5-ALAとFe^<2+>を作用させることで細胞内ヘム量の上昇が確認でき、Bach1を標的とした免疫沈降により得られたサンプル中にもヘムが確認されたことから5-ALAの添加によってもBach1ヘム複合体の形成が起き、Bach1分解によるHO-1誘導の促進が起きていることが示唆された、同時に、5-ALAとFe^<2+>はHO-1転写因子Nrf2の核への移行を誘導した。これらの結果から5-ALAとFe^<2+>はRAW264においてヘムへの代謝を促進することでBach1の分解を誘導し、伺時にNrf2の活性化をもたらす2つの経路によってHO-1を誘導していることを明らかにした。

2.ラット小腸虚血再灌流障害モデルにおける水素保存液腸管内投与の効果:本研究は水素の持つ抗酸化作用に注目し、水素含有保存液のラット腸管内投与による虚血再灌流障害の有効性を検討した。腸間膜動静脈を90分間クランプし、再灌流直前に腸管内投与を行った。保存液注入の有無によりA群(注入なし)、B群(生食)、C群(水素保存液)に分類した。再灌流60分後に腸管組織を採取し、病理組織、炎症性サイトカイン、生存を検討した。病理組織(Park/Chiu分類)においてA群B群ではgrade2-4に対し、C群では全例grade2と良好であった。炎症性サイトカインでは、C群でTNF-α、IL-6、iNOSは有意に抑制された(p<0.05)。48時間生存率は、A群(25%)、B群(58.3%)、C群(66.7%)であり、A群とC群では有意差を認めた。以上の結果から、ラット小腸虚血再灌流モデルにおいて、水素含有保存液の腸管内投与の効果が示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度において、主にマウスiPS細胞から制御性DC、MDSCへの分化誘導および新規免疫抑制剤として、5-アミノレブリン酸(5-ALA)のヘムオキシゲナーゼ-1 (HO-1)発現増強効果について検討した。結果として、iPS由来の制御性DC、MDSCの分化誘導ができ、細胞の形態、細胞分子の発現および機能等は、骨髄由来細胞の比較検討で、ほぼ同様であることを明らかにした。一方、新規免疫抑制剤として、5-アミノレブリン酸(5-ALA)のヘムオキシゲナーゼ-1 (HO-1)発現増強効果について検討し、IUW264においてヘムへの代謝を促進することでBach1の分解を誘導し、同時にNrf2の活性化をもたらす2つの経路によってHO-1を誘導していることを明らかにした。マウスips細胞から制御性DC、MDSCへの分化誘導方法の確立およびin vivoでの検討するための大量生産方法を開発することを重点に置き、マウス心臓移植、GvHDモデルを用いた上記細胞の免疫抑制機能を検証して行きたい。また、5-ALAの免疫抑制剤としての機序をHO-1の発現増強の結果を生かして、ヘムの代謝産物である一酸化炭素(CO)、ビリベルジン、Fe^<2+>等の炎症・免疫反応の抑制効果について検討を進めたい。臓器保存の実験については、時間の関係で、今年度は余り進展がなかったが、来年度は時間的を有効に配分し、新規保存法、保存液の開発とその機序の解明でマウスモデルを用い、進めて行きたい。
ボーズアインシュタイン凝縮相の理論的研究

ボーズアインシュタイン凝縮(BEC)は、低温のボーズ粒子系に起こる相転移現象であり、自発的対称性の破れの典型例である。相互作用を持つボーズ粒子系に対する摂動論的な取扱いには、いくつかの困難や疑問点があった。それは以下のようにまとめられる。(i)通常の手続きで摂動展開すると、系の一粒子励起にエネルギーギャップを生じる。これはゴールドストーンの定理と矛盾する。また、このようなギャップを消す手続きを取ると、系が動的保存則を破る(ホーヘンバーグ、マーティン1965)。(ii)一粒子グリーン関数と二粒子グリーン関数の極は一致する(ガボレ、ノジェール1964)。これらの極はそれぞれ個別励起と集団励起に対応するもので、密度揺らぎを媒介とする集団励起と、局所的な粒子の励起である個別励起が同一であるというのは物理的な直観と反する。これらの困難に対して、(i)を解消する理論が報告された(北2009)。この理論によると一粒子グリーン関数と二粒子グリーン関数の極は一致しないことが示される。そこで、本研究においては、(ii)についての検証を非摂動論的な手法を用いて検証した。その手順を要約する。一粒子スペクトル関数と、動的構造因子に対して周波数に対するモーメントを取る。この手法を用いると、スペクトル関数の極および半値幅を、周波数の期待値として表現できる。その表式を変分モンテカルロ法により評価した。このような手法は、ファインマンら(1954,1956)やギルヴィンら(1986)などによって、動的構造因子のスペクトルを評価するために構成されており、本研究ではそれを高次のモーメントに拡張し、また一粒子スペクトル関数へと適用した。以上の手続きによる検証の結果、個別励起と集団励起は異なるという結論を得た。また、この作業で着想を得、正準集団における相関関数の構成法も併せて開発した。28年度が最終年度であるため、記入しない。相互作用を持つBEC系の理論的研究において、長年未解決であった``conserving vs. gapless dilemma"を解決する理論(conserving-gapless理論)が近年構成された。そこで、その理論の正当性を検証すべく研究を行った。先行研究と、conserving-gapless理論との主張の明確な違いは、系の準粒子励起の振る舞いにある。先行研究によると、系の個別励起および集団励起は同一の分散関係、寿命を持つとされるが、conserving-gapless理論では、それらは異なると主張されている。したがって、この対立する主張についてモンテカルロ法を用いて検証した。具体的な手法として、ファインマンらなどによって提案されたsingle-mode近似を高次へ拡張することを考える。この手法は、系のハミルトニアンの周波数に対する一次のモーメントをとり、分散関係を推定するというものである。この手法を二次のモーメントへ拡張すると、分散、つまり励起の寿命に対応する量を得ることができる。そこで相互作用を持つ、ボーズ粒子系のハミルトニアンから出発し、それに対する絶対零度におけるモーメントの表式を、個別励起、および集団励起について第一量子化の形式で書き下した。次に、量子モンテカルロ法を用いて、系のハミルトニアンのモーメントを評価し、系の個別励起、および集団励起の評価を行った。その結果、「系の個別励起と集団励起はそれぞれ異なる励起である」という、conserving-gapless理論の主張を定性的に指示する結果を得た。また、年次計画の1年目に記載した、先行研究の、希薄な斥力相互作用を仮定した物理量の計算の追試は、仮定する相互作用ポテンシャルに発散性があり、モーメントの評価に適さないことを踏まえ、実施していない。conserving-gapless理論において、先行研究と最も明確に異なる主張は、「系の個別励起と集団励起はそれぞれ異なる励起である」という点である。申請者は、先行研究と、conserving-gapless理論のどちらの主張がより正しくBEC相の振る舞いを記述するかを検証する目的で研究を行ってきた。そのために、摂動理論ではなく、第一原理的なモンテカルロシミュレーションを用いた。その手続きにより、「系の個別励起と集団励起はそれぞれ異なる励起である」という結論が得られたことによって、明らかになったと考える。残りの作業としては、より精度の高い試行関数の構成や、粒子数を増やした場合などの検討がある。そのため、上記区分を(2)とした。

この理論によると一粒子グリーン関数と二粒子グリーン関数の極は一致しないことが示される。そこで、本研究においては、(ii)についての検証を非摂動論的な手法を用いて検証した。その手順を要約する。一粒子スペクトル関数と、動的構造因子に対して周波数に対するモーメントを取る。この手法を用いると、スペクトル関数の極および半値幅を、周波数の期待値として表現できる。その表式を変分モンテカルロ法により評価した。このような手法は、ファインマンら(1954,1956)やギルヴィンら(1986)などによって、動的構造因子のスペクトルを評価するために構成されており、本研究ではそれを高次のモーメントに拡張し、また一粒子スペクトル関数へと適用した。以上の手続きによる検証の結果、個別励起と集団励起は異なるという結論を得た。また、この作業で着想を得、正準集団における相関関数の構成法も併せて開発した。上記の内容を踏まえ、今後の研究方針は、より精度の高いモンテカルロシミュレーションを行うことである。具体的には、より精度の高い試行関数の構成や、粒子数を増やした場合などの検討を行い、サイズ効果、およびモーメントの評価に必要な種々の物理量を検討し、より説得力のあるデータを得ることを目指す。28年度が最終年度であるため、記入しない。
Cell Healing:傷ついた細胞内小器官および細胞質の修復機構

1.研究の目的我々は,細胞膜修復は小胞を介して行われることを証明した(J.Cell Biol.,95,97).また,細胞膜損傷修復とアクチンフィラメントの関係を明らかにした(Faceb J.投稿中)。しかしながら,損傷した細胞内小器官の修復機構、膜修復後の長期の膜動態ついては全く不明である.本研究は,膜損傷修復後の細胞内および細胞膜動態を明らかにすることを目的としている。2.研究実施と結果(1)損傷修復によって引き起こされるオートファジー培養胃粘膜上皮細胞または培養線維芽細胞を蛍光デキストランまたは西洋ワサビペロキシダーゼ(HRP)中で損傷し,その後,経時的に固定し,蛍光顕微鏡および透過型電子顕微鏡で観察した.その結果,蛍光顕微鏡では損傷後6時間で,透過型電子顕微鏡では損傷後30分で,細胞質に蛍光デキストランまたはHRPの顆粒構造が確認された.この顆粒化は,損傷後7日までゆっくりとおこなわれた.さらに超微構造の解析によって,その顆粒は壊れた細胞内小器官を含んでおり,オートファゴゾームと考えられた.また,それらの顆粒内に酸性フォスファターゼ反応がみられ,pHも低かった.これらのことから細胞膜損傷後,細胞はオートファゴゾームを形成し,損傷した細胞内小器官や細胞質を取り除く機構をもつことが考えられた.(2)損傷修復に伴うエンドサイトーシスの膜回収機構細胞膜損傷後のエンドサイトーシスを観察した.受精膜を除去したウニ受精卵をシリンジ針で損傷し,カルセイン,HRPまたはFM4-64に浸積して,エンドサイトーシスを観察した.その結果,損傷後30分において,明瞭なエンドサイトーシスが観察された.このことは,膜損傷したする際のエクソサイトーシスによって細胞内から足された膜をエンドサイトーシスによって引き戻す反応であることが考えられた.(3)膜損傷修復による粘液分泌培養胃粘膜上皮細胞を用い膜損傷による粘液分泌を観察した。損傷細胞内の粘液をレクチンで染色し、細胞内粘液の分泌を観察したところ、Ca2+依存性のエクソサイトーシスと思われる粘液分泌が確認された。3.発表・報告本研究結果は米国細胞生物学会および解剖学会で報告した.また,本研究途上で発生した結果についても,Jornal of Cell Scienceに報告した.これらの得られた結果をさらに追求し、細胞生物学雑誌に投稿する予定である.1.研究の目的我々は、細胞膜修復が細胞内の小胞を介して行われることを証明した(J.CellBiol.,95,97).また、細胞膜損傷修復にかかわる細胞内アクチンフィラメントの動態を胃粘膜上皮由来細胞を用いて明らかにした(Nat.CellBiol.投稿中)。しかしながら,膜損傷によって損傷した細胞の細胞内小器官などの修復機構、修復後の長期の膜動態ついては全く不明てある.本研究では、膜損傷修復後の細胞内および細胞膜動態を形態学的に観察することを目的としている。2.研究実施と結果(1)損傷修復によって引き起こされるオートファジー胃粘膜上皮由来培養細胞(RGM1)はまたは線維芽細胞(NIH3T3)を蛍光デキストラン(Fdx/Txdx)または西洋ワサビペロキシダーゼ(HRP)中で損傷し,その後,経時的(15s,30m,1h,6h,24h,36h,7d)に固定し,蛍光顕微鏡および透過型電子顕微鏡で観察した.その結果,蛍光顕微鏡では損傷後6時間で,透過型電子顕微鏡では損傷後30分で,細胞質に蛍光デキストランまたはHRPの顆粒構造が確認された.この顆粒化は,損傷後7日までゆっくりとおこなわれた.さらに超微構造の解析によって,その顆粒は壊れた細胞内小器官を含んでおり,オートファゴゾームと考えられた.また、それらの顆粒内に酸性フォスファターゼ反応がみられ,pHも低かった.これらのことにより,細胞膜損傷後,細胞はオートファゴゾームを形成し,損傷した細胞内小器官や細胞質を取り除こうとすることが示唆された.(2)損傷修復によって引き起こされるエンドサイトーシスウニ受精卵を用い,細胞膜を損傷後のエンドサイトーシスを観察した.受精膜をグリシンによって除去し,22Gのシリンジ針で損傷し,その後カルセイン,HRPまたはFM4-64に浸積して,エンドサイトーシスを蛍光顕微鏡,共焦点レーザー蛍光顕微鏡,および透過型電子顕微鏡で観察した.その結果,損傷後30分において,明瞭なエンドサイトーシスが観察された.このことは,膜損傷したする際のエクソサイトーシスによって細胞内から足された膜をエンドサイトーシスによって引き戻す反応であることが考えられた.3.発表・報告本研究結果は米国細胞生物学会および解剖学会で報告した.また,本研究途上で発生した結果についても,Jornal of CellScienceに報告した.1.研究の目的我々は,細胞膜修復は小胞を介して行われることを証明した(J.Cell Biol.,95,97).また,細胞膜損傷修復とアクチンフィラメントの関係を明らかにした(Faceb J.投稿中)。2.研究実施と結果(1)損傷修復によって引き起こされるオートファジー培養胃粘膜上皮細胞または培養線維芽

細胞を蛍光デキストランまたは西洋ワサビペロキシダーゼ(HRP)中で損傷し,その後,経時的に固定し,蛍光顕微鏡および透過型電子顕微鏡で観察した.その結果,蛍光顕微鏡では損傷後6時間で,透過型電子顕微鏡では損傷後30分で,細胞質に蛍光デキストランまたはHRPの顆粒構造が確認された.この顆粒化は,損傷後7日までゆっくりとおこなわれた.さらに超微構造の解析によって,その顆粒は壊れた細胞内小器官を含んでおり,オートファゴゾームと考えられた.また,それらの顆粒内に酸性フォスファターゼ反応がみられ,pHも低かった.これらのことから細胞膜損傷後,細胞はオートファゴゾームを形成し,損傷した細胞内小器官や細胞質を取り除く機構をもつことが考えられた.(2)損傷修復に伴うエンドサイトーシスの膜回収機構細胞膜損傷後のエンドサイトーシスを観察した.受精膜を除去したウニ受精卵をシリンジ針で損傷し,カルセイン,HRPまたはFM4-64に浸積して,エンドサイトーシスを観察した.その結果,損傷後30分において,明瞭なエンドサイトーシスが観察された.このことは,膜損傷したする際のエクソサイトーシスによって細胞内から足された膜をエンドサイトーシスによって引き戻す反応であることが考えられた.(3)膜損傷修復による粘液分泌培養胃粘膜上皮細胞を用い膜損傷による粘液分泌を観察した。損傷細胞内の粘液をレクチンで染色し、細胞内粘液の分泌を観察したところ、Ca2+依存性のエクソサイトーシスと思われる粘液分泌が確認された。3.発表・報告本研究結果は米国細胞生物学会および解剖学会で報告した.また,本研究途上で発生した結果についても,Jornal of Cell Scienceに報告した.これらの得られた結果をさらに追求し、細胞生物学雑誌に投稿する予定である.
新しい脱細胞化技術による自己組織化する異種生体弁の開発

心臓血管外科領域で人口弁として使用される生体弁の欠点を克服するべく、近年組織工学を応用した脱細胞生体弁の研究が行われているが、いまだ問題点も多い。当研究では、組織侵襲の少ないdetergentを用いた脱細胞化処理により異種大動脈弁からscaffold(組織骨格)を作成した。組織学的・生化学的検討を行い、脱細胞化技術を評価、その安定化に成功した(2006 Int J Artif Organs)。ブタの大動脈基部を脱細胞化処理して得られた脱細胞弁は、組織学的・生化学的に細胞成分をほとんど認めないことが確認された。一方で細胞外マトリックスの保存状態は良好で、耐久性の面でも改善が期待された。ネズミ背部への皮下移植実験では、従来の弁と比較しても宿主による免疫応答が低く、石灰化の程度も軽かった。以上、良好な基礎的実験の結果を受け、in vivoでの評価を行うためイヌへの移植実験を行った。人工心肺を使用しての実験で、移植部位は肺動脈弁位とした。移植後2ヶ月、6ヶ月での超音波による評価で良好な弁機能が保たれていた。組織学的評価でも弁尖の肥厚、石灰化を認めず、弁尖を中心に宿主細胞による再細胞化を認めた。血流ストレスを受けることでin situでの再細胞化がすすむためと考えられた(2007 J Artif Organs)。またFibronectin-HGFを脱細胞弁に用いると、用いない群、HGFのみを用いた群に比べ、より内皮化が促進されることが分かった(2005 Ann Thorac Surg)。心臓血管外科領域で自己弁の代替として使用される生体弁の欠点を克服するべく,近年組織工学を応用した脱細胞化生体弁の研究が行われているが,耐久性などいまだ問題点も多い.本年度の研究では,異種大動脈弁を組織侵襲の少ないdetergentを用いた新たな脱細胞化処理によりscaffold(組織骨格)を作成,組織学的検討・生化学的検討を行い,脱細胞化技術を評価,その安定化に成功した.ブタの大動脈基部を脱細胞化処理し,得られた脱細胞弁は,組織学的には細胞成分をほとんど認めない.このことは生化学的検討でも確認され,ほぼ完全な脱細胞化を可能としている.一方でcollagenなどの細胞外マトリックスの保存状態は良好で,問題とされる耐久性の面でも改善が期待される.生体適合性をみるため行われたネズミ背部への皮下移植実験では,従来の弁と比較しても宿主による免疫応答が低く,石灰化の程度も軽かった.このような良好な基礎的実験の結果を受けて,in vivoでの評価を行うため,イヌへの移植実験を開始した.人工心肺を使用しての実験で,耐久性を考慮し移植部位は肺動脈弁位としている.移植後予定観察期間内で大きな合併症は認めなかった.移植後2ヶ月での組織所見では,弁尖を中心に炎症反応を含め,宿主細胞による再細胞化を認めた.血流ストレスを受けることで,in situでの再細胞化がすすむためと考える.ただしこの時点で,移植脱細胞弁の壁に関しては組織学的には細胞化の程度は低く,中・長期モデルでの検討が待たれる.来年度以降は,引き続き脱細胞化技術の向上に努め,理想的なscaffoldとなるよう改良を加えていくと同時に,移植実験では短期モデルで比較的良好な移植脱細胞弁の再細胞化が認められるので,より長期フォローアップしたモデルでの検討をすすめる.心臓血管外科領域で自己弁の代替として使用される生体弁の欠点を克服するべく、近年組織工学を応用した脱細胞化生体弁の研究が行われているが、'耐久性などいまだ問題点も多い。

本年度の研究では、異種大動脈弁を組織侵襲の少ないdetergentを用いた新たな脱細胞化処理によりscaffold(組織骨格)を作成、組織学的検討・生化学的検討を行い、脱細胞化技術を評価、その安定化に成功しこれを報告した(2006 The International Journal of Artificial Organs)。ブタの大動脈基部を脱細胞化処理し得られた脱細胞弁は、組織学的には細胞成分をほとんど認めない。このことは生化学的検討でも確認され、ほぼ完全な脱細胞化を可能としている。一方でcollagenなどの細胞外マトリックスの保存状態は良好で、問題とされる耐久性の面でも改善が期待される。生体適合性をみるため行われたネズミ背部への皮下移植実験では、従来の弁と比較しても宿主による免疫応答が低く、石灰化の程度も軽かった。このような良好な基礎的実験の結果を受けて、in vivoでの評価を行うため、イヌへの移植実験を行った。人工心肺を使用しての実験で、耐久性を考慮し移植部位は肺動脈弁位とした。移植後2ヶ月での組織所見では、弁尖を中心に宿主細胞による再細胞化を認めた。血流ストレスを受けることでin situでの再細胞化がすすむためと考えられた。移植後6ヶ月での超音波による評価でも逆流、狭窄など認めず、良好な弁機能が保たれていた。組織学的評価でも弁尖の弁尖の肥厚、石灰化を認めなかった(2007年3月J Artif Organs Publish予定)。またFibronectin-HGFを脱細胞弁に用いると、用いない群、HGFのみを用いた群に比べ、より内皮化が促進されることが分かった。(2005 AnnThorac Surgに報告)。