hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
CdTe結晶の強磁場印加THM成長による高品質化

強磁場下でのCdTe系結晶育成中の溶液内での流体挙動を調べるために、実際の試料形状、物性値を考慮して有限要素法に基づいた数値流体力学的シミュレーションを行った。その計算の結果、6テスラの軸対称均一静磁場中では低重力相当の対流抑制効果が期待できるものの、それに伴うマクロな固液界面形状の変化はほとんど起こらないことを明らかにした。またCdTe結晶のTHM成長に対して赤外線顕微干渉計を用いた固液界面形態変化のその場観察を行い、既に導き出した界面形態安定性モデルを基に平坦界面形状を安定に保てる試料の引き下げ速度を決定した。この理論的解析および上記の数値シミュレーションの結果に基づいて、原料、溶媒、種結晶を入れた石英ガラス製試料アンプルの試作およびTHM成長装置の改良を行った。この改良した結晶育成装置を用いて、CdTeおよびCdZnTe結晶を成長温度750°C800°C、試料引き下げ速度410mm/day、磁束密度06テスラで長さ60mm程度の結晶を育成した。その結果、0テスラの場合はいずれの引き下げ速度でも界面形状が不安定化してセル状界面となり、またインクルージョン、多結晶の発生が見られた。これらの結果とは対照的に、3テスラ以上で育成した場合は界面形状が安定化し平坦となり、双晶、インクルージョンの発生が見られなかった。そして、得られた結晶の組成分布をEPMAで分析した結果、Cd、TeおよびZnのマクロ偏析は見られなかった。このように、強い均一静磁場を印加することで、速い引き下げ速度でもCdTeおよびCdZnTeの良質な結晶が育成出来ることを示した。研究代表者は超伝導マグネット(最大6テスラ)およびその装置への組み込み用THM成長装置を有している。そこで、磁場下でのCdTe系結晶育成中の溶液内での流体挙動を調べるために、有限要素法に基づいた数値流体力学的シミュレーションを行った。その計算の結果、Teではなく導電率の高いCdを溶媒として用いれば、5テスラ程度の静磁場で無人衛星ミッションでの残留重力レベルと同程度(10^<-5> g_0のオーダー)の対流抑制効果を得ることが出来ることを明らかにした。また、研究代表者が導き出した界面形態安定性モデルを基に、平坦界面形状を保てる試料の引き下げ速度を決定した。現在、これらの理論的解析の結果に基づいて、原料、溶媒、種結晶を入れた石英ガラス製試料アンプルの試作およびTHM成長装置の改良を行っている。それと並行して、磁場の無い条件でのCdTe結晶のTHM成長を行い、磁場での成長実験のための参照データを取得している最中である。今後は、磁場の無い条件での成長実験の成果を元に、最大6テスラの静磁場で同様の実験を行うとともに、磁場中で試料アンプルを回転させて層流を発生させ、マクロな固液界面形状の改善を図る予定である。そして、今まで報告された以上の光学的・電気的特性を有する赤外線、X線、ガンマ線検出用として使えるCdTe系バルク結晶の育成を試みる。また、赤外線顕微干渉計を用いてTHM成長中の固液界面形態変化のその場を行い、研究代表者が導き出した界面形態安定性モデルの妥当性を検証する。
小分子有機化合物を起爆剤とした細胞シグナル解析

本提案の目的は、二つの独特な小分子化合物(申請者らが発見・合成した合成化合物クロメセプチンと日本独自の海洋天然物オーリライド)を利用して、新しい細胞内シグナルを明らかにすることである。・目的1「クロメセプチン経路の解明」昨年度までの研究によって、クロメセプチン経路の最上流(MFP2)と最下流(STAT6)をつなぐ主要なタンパク質としてACC1タンパク質を同定した。クロメセプチンとMFP2が結合すると、その複合体はACC1に結合し、ACC1の活性が失われる。それによって、マロニルCoAの濃度が下がることによって、脂肪合成が抑制され、STAT6が活性化されると考えられる。これまでの結果をまとめた論文は投稿中。・目的2「オーリライドによる細胞死の解明」昨年度までの研究によって、オーリライドによる細胞死がプロヒビチンとOpa1タンパク質の働きによることを確定した。オーリライドはプロヒビチンに結合してOpa1のプロセシングを活性化する。今年度は、Opa1がプロセシングされることでミトコンドリアの膜構造が変化しチトクロームCの放出によって細胞死が誘導されることを示した。これらの結果をまとめた論文をChemistry & Biology誌に発表した。本提案の目的は、二つの独特な小分子化合物を利用して、新しい細胞内シグナルを明らかにすることである。申請者らが発見・合成した合成化合物クロメセプチンと日本独自の海洋天然物オーリライドを出発点として、脂質代謝、インスリン抵抗性、癌の増殖抑制、細胞死、ミトコンドリアの機能に関係する新しい細胞内シグナル経路を発見・理解する。・目的1「クロメセプチン経路の解明」クロメセプチン経路の最上流(MFP2)と最下流(STAT6)をつなぐ主要なタンパク質としてACC1というタンパク質を精製した。クロメセプチンとMFP2タンパク質が結合すると、この複合体はACC1タンパク質に結合し、その機能を阻害する。・目的2「オーリライドによる細胞死の解明」オーリライドによる細胞死はプロヒビチンとOpalタンパク質の働きによることを確定した。研究成果を論文にまとめ、投稿中である。
ヒストン脱アセチル化阻害剤を用いたヒト骨肉腫に対する免疫療法への応用

sodium valproate(VPA)単独およびHydralazine(Hy)との併用によるFasおよびNKG2Dを介するOSの感受性に及ぼす影響を検討した.VPAとHyの併用は膜結合型FasおよびMICの発現を亢進させ,sFas(10-40%)やsMIC(最大30%程度)を有意に減少させた.またこれらの結果よりFas抗体およびNKG2Dを介したOSの細胞死を有意に増加させた.更にMMP9がsMIC形成機構に関与していることを証明した.以上の結果より,DNAメチル化阻害剤とヒストン脱アセチル化阻害剤の併用はOSの抗腫瘍免疫細胞に対する感受性を増加させることが示された.VPAはすでに抗てんかん薬として,またHyは降圧剤として広く臨床応用され,安全性・至適濃度はすでに確認されている.今回使用した濃度はその範囲内であることから,人体への影響が少なく,かつ早期にOSの治療に応用可能であることが示唆された。以上の結果よりVPAはsMICsの形成を抑制し、NKG2D(NK細胞)に対する感受性を増加させ、OSの免疫細胞抵抗性を減弱させることがin vitroで示された。VPAはすでに抗てんかん薬として現在広く臨床応用されており、安全性・至適濃度はすでに確認されている。今回使用した濃度はその範囲内であることから、人体への影響が少なく、OSの治療に応用可能であることが示唆された。DNAのメチル化やヒストンのアセチル化等の異常はヒト悪性腫瘍において放射線・化学・免疫療法等に対する抵抗性をもたらすことが報告されており,このepigenetic eventを制御することがヒト悪性腫瘍に対する各種療法の奏効率を向上させることができると考える.ヒト骨肉腫細胞(OS)はFasやMHC class I chain-related molecules (MICs)を発現しており,NK細胞やCD8(+)T細胞等の抗腫瘍免疫細胞が発現するFas ligandやNKG2Dを介して殺腫瘍細胞作用を発揮する.しかしながら膜結合型FasやMICは,MMP等のproteaseの作用を受け遊離型(sFas,sMIC)となり,Fas/FasLおよびNKG2D/MICsの結合を阻害することにより,免疫細胞の殺腫瘍細胞作用を減弱させるといわれている.我々はsodium valproate (VPA)とHydralazille (Hy)併用によるFasおよびNKG2Dを介するOSの感受性に及ぼす影響を検討した.VPAとHyの併用は膜結合型FasおよびMICの発現を亢進させ,sFas(10-40%)やsMIC(最大30%程度)を有意に減少させた.またこれらの結果よりFas抗体およびNKG2Dを介したOSの細胞死を有意に増加させた.更にMMP9がsMIC形成機構に関与していることを証明した.以上の結果より,DNAメチル化阻害剤とヒストン脱アセチル化阻害剤の併用はOSの抗腫瘍免疫細胞に対する感受性を増加させることが示された.VPAはすでに抗てんかん薬として,またHyは降圧剤として広く臨床応用され,安全性・至適濃度はすでに確認されている.今回使用した濃度はその範囲内であることから,人体への影響が少なく,かつ早期にOSの治療に応用可能であることが示唆された。
応力勾配下での水素拡散に関する基礎的研究

水素をエネルギー源として利用するには,金属材料の強度信頼性確保が課題である.水素による金属材料強度の劣化(いわゆる水素脆化)は,1金属中への水素侵入,2破壊起点(き裂,格子欠陥)への水素の拡散・凝集,3水素による材料強度低下の3つのプロセスが考えられる.水素脆化を予測し未然に防ぐ為には,破壊起点への水素の拡散・凝集を高精度に予測する手法構築が重要である.金属中の水素拡散は濃度勾配と応力(静水圧)勾配を駆動力とした拡散方程式で表される.水素拡散シミュレータ等では濃度勾配項と応力勾配項に乗じる重み係数を無視した線形結合による一次近似拡散方程式を基礎式としており,高精度な拡散方程式の構築による解析結果の定量性向上が期待されている.本研究では,応力勾配の影響を適切に評価した拡散方程式の構築を目指した基礎的研究を行った.本年度は,まず大規模並列分子動力学シミュレータ(LAMMPS)を用いてα鉄完全結晶中の水素拡散係数を導出し,得られた結果が文献値と良く一致することを確認した.さらに,解析モデルに応力(静水圧)勾配を設けた解析モデルを作成し,見かけの水素拡散係数を算出した.本解析結果から,見かけの拡散係数は完全結晶中と一致しないことが示唆された.見かけの拡散係数に影響を及ぼす要因として(1)等方的格子ひずみ(2)水素原子に作用する外力の二つの要因を考え,それぞれの影響を評価した結果,(2)の影響はほとんどないことがわかった.水素をエネルギー源として利用するには,金属材料の強度信頼性確保が課題である.水素による金属材料強度の劣化(いわゆる水素脆化)は,1金属中への水素侵入,2破壊起点(き裂,格子欠陥)への水素の拡散・凝集,3水素による材料強度低下の3つのプロセスが考えられる.水素脆化を予測し未然に防ぐ為には,破壊起点への水素の拡散・凝集を高精度に予測する手法構築が重要である.金属中の水素拡散は濃度勾配と応力(静水圧)勾配を駆動力とした拡散方程式で表される.水素拡散シミュレータ等では濃度勾配項と応力勾配項に乗じる重み係数を無視した線形結合による一次近似拡散方程式を基礎式としており,高精度な拡散方程式の構築による解析結果の定量性向上が期待されている.本研究では,応力勾配の影響を適切に評価した拡散方程式の構築を目指した基礎的研究を行った.本年度は,まず大規模並列分子動力学シミュレータ(LAMMPS)を用いてα鉄完全結晶中の水素拡散係数を導出し,得られた結果が文献値と良く一致することを確認した.さらに,解析モデルに応力(静水圧)勾配を設けた解析モデルを作成し,見かけの水素拡散係数を算出した.本解析結果から,見かけの拡散係数は完全結晶中と一致しないことが示唆された.見かけの拡散係数に影響を及ぼす要因として(1)等方的格子ひずみ(2)水素原子に作用する外力の二つの要因を考え,それぞれの影響を評価した結果,(2)の影響はほとんどないことがわかった.
超伝導体の不可逆磁界と量子化磁束に関する研究

高温超伝導体の応用には低い不可逆磁界を高くする必要がある。ところが、この不可逆磁界はピンニング力の大きさで変化することが知られている。このような状況のもとで、試料の形状によって不可逆磁界に変化が生じることが予想される。すなわち、ピンポテンシャルの大きさが試料の形状で変化すると考えられるからである。一般に高温超伝導体中での量子化磁束線は、高温超伝導体特有の層状構造を反映してパンケーキ状に形成されていると考えられている。であれば、量子化磁束線の横方向や縦方向の相関距離から導かれるフラックスバンドル体積は、金属超伝導体中の量子化磁束線を想定した場合に比べて実質的に小さくなることが予想される。特に量子化磁束線が試料表面に対してノーマルな状態で存在して、長さ方向の量子化磁束線の相関距離がCuO2面間距離より短い場合は顕著に不可逆磁界は低くなることになる。昨年度から今年度にかけて作製した薄膜試料で計測された不可逆磁界は、試料作製条件がまだ完全に絞り込まれなかったこともあり100オングストロームオーダー以下の試料に関しては、はっきりとした不可逆磁界を磁化曲線や帯磁率から求めることができなかった。また、抵抗率の温度依存性に関しても非常にブロードな特性を示した。1000オングストローム以上の試料に関しては、完全に均一な試料とはなってないものの不可逆磁界を計測できた。その結果、2種類の超伝導体でオーダー的に違いはあるが厚さに関して同じ傾向の特性を得ることができた。これは詳細な検討が依然必要ではあるが、量子化磁束線は金属超伝導体中での挙動と変化が無いことを示唆している。ただし、高温超伝導体中での真の量子化磁束線の挙動に関しては議論の活発な分野でもあり、確実に再現性のある高温超伝導体の作が望まれるところである。不可逆磁界が低温超伝導体と高温超伝導体でどのように変わるのかを調べることを主な目的に、今年度はそのための試料作成および簡単な基礎データ計測を行い、次のような知見を得た。1、理論計算を行う際の基準に考える金属超伝導体のデータについて、塊(バルク)試料におけるピンニング力と不可逆磁界の間にはピンニング力が二桁以上変化しないと不可逆磁界には大きな変化が見られなかった。これは、ピンニング力が弱くなれば、上部臨界磁場も変化するため、この値で不可逆磁界を規格化してしまうためである。計測された磁化曲線に関しては大きな変化が認められた。2、薄膜試料は蒸着装置を用いて膜厚の異なる試料を作成した。500オングストロームを越えるような比較的厚い試料に関して、その超伝導性(臨界温度、均一性)に問題は無かったが、10オングストローム程度の比較的薄い試料については、特に均一性の問題が残った。すなわち、抵抗の温度計測を行う臨界温度付近でブロードな遷移曲線が観測された。これは、蒸着法の精度の問題であり、CVD膜のような1オングストロームの精度の膜は得にくいものの、実際ピンニング力の影響よりもそれを決定するピンニングポテンシャルが膜厚で制限されることがわかった。このことを裏付ける結果として、多芯線のフィラメント径の違いによって不可逆磁界が変化することからもこの結果が支持される。来年度は今年度得られた基礎データを基に計算による評価を行い実験値との比較を行う。ただ、薄膜試料の膜厚が比較的薄い試料については、引き続き作成を行う。
口唇口蓋裂におけるRdh10の変異遺伝子とアルコールの相互作用

顎顔面の発生には、様々な顔面突起の適切な成長及び癒合が必要不可欠である。異常な顔面突起の成長や癒合、骨形成の異常は顎顔面形成不全の原因となり、その中でも口唇口蓋裂は比較的高頻度で発生する疾患である。我が国における口唇口蓋裂の発生率は1/500と諸外国より高い事が知られており、患者は発音、咀嚼等の機能障害や審美障害を伴い著しいQuality of Life (QOL)の低下を来たす。そのため、口唇口蓋裂の発生機序の解明は臨床にとって非常に重要である。近年のヒトゲノム研究やスクリーニング等より、多くの骨形成に関する遺伝子変異が同口唇口蓋裂の患者においても同定されている。同時に、口唇口蓋裂は遺伝的要因と共にアルコールや喫煙等の環境的要因も影響する多因子疾患であることも証明されている。しかし多くの研究はそれぞれの要因を個別に解析しているものが多く、多因子疾患の特徴である各因子の相互作用については未だ不明な部分が多く存在する。そこで本研究では、口唇口蓋裂の遺伝的要因であるRdh10の変異と環境的要因であるアルコールの相互作用による顎顔面形成や骨形成における役割の解明を目的とした。その結果、Rdh10のノックアウトを胎生8.5日以前に行った場合や、アルコール投与を胎生12.5日付近で行った場合において、口蓋裂等の顎顔面形成不全の症状が重症となることを見出した。また、これらの条件を同時に作用させた場合は、単独条件よりも著しく症状が重篤となることも明らかになった。これらの結果は、胎生時期特異的なRdh10の低下とアルコール暴露が口蓋裂の発生に相互作用を起こしていることを示唆するものである。口唇口蓋裂をはじめとする顎顔面形成不全の原因の一つに、顎顔面発生時の骨形成異常が挙げられる。その骨形成異常に起因する遺伝子変異の多くは、近年のヒトゲノム研究やスクリーニング等より同定されている。しかし、これまではそれぞれの要因を個別に解析している報告が多く、各因子の相互作用については未だ不明な部分が存在する。そこで、本研究では、口唇口蓋裂の遺伝的要因であるRdh10の変異と環境的要因であるアルコールの相互作用による顎顔面形成や骨形成における役割の解明を目的としている。本年度の研究では胎生時期のマウスにおいてRdh10をノックアウトする時期とアルコールを投与する時期の条件を変えてそれぞれの因子が必要な時期の同定を試みた。その結果、Rdh10のノックアウトを胎生8.5日以前に行った場合や、アルコール投与を胎生12.5日付近で行った場合において、口蓋裂等の顎顔面形成不全の症状が重症となる事を見出した。また、これらの条件を同時に作用させた場合は、単独条件よりも著しく症状が重篤となる事を見出した。この事は胎生時期特異的なRdh10の低下とアルコール暴露は相互作用を起こしている事を示唆する結果である。更にレチノイン酸シグナルと顎顔面形成不全の相互関係を調査する一環として妊娠マウスにレチノイン酸を投与し口蓋裂を誘発する実験系を用いて細胞学的、分子生物学的な解析を進めている。現在までにレチノイン酸投与群では胎生9日胎児において頭部神経堤細胞の細胞増殖、細胞死共に減少する等の挙動の変化や二次口蓋の挙上などの動態に変化が認められる事を見出している。本年度までにRdh10の低下とアルコール暴露の胎生時期特異的な表現形を確認した。本年度までに遺伝子発現解析を行う予定であったが、Rdh10のノックアウト時期やアルコール暴露の時期の条件設定に想定より長期間を要した。

本年度までに胎生8.5日でRdh10をノックアウトし胎生12.5日にてアルコールを投与した個体がより強い顎顔面形成不全の表現形を示す事を見出したため、今後はそのサンプルを増やして組織学的、分子生物学的解析を行い、これらの相互作用の詳細なメカニズムを解明する予定である。研究計画において次年度に必要な経費が当初より増えたため
白血病細胞におけるオートファジーとアポトーシスの振り分け機構の解析

白血病細胞のアポトーシスとオートファジーの振り分け機構を解明するため,今回ビタミンK2(VK2)を中心に白血病細胞株HL-60に対する効果を検討した。以前より我々は,VK2はHL-60細胞のアポトーシスを効率よく誘導することを報告してきた。一方,BCL-2過剰発現株HL-60bc1-2では,アポトーシス耐性を獲得して単球系への分化が誘導されるものの,培養時間を延長することで,やがては細胞死が誘導される。また,HL-60bc1-2にVK2を作用させることで,原形質内の空胞形成,acidic vesicular organelles(AVO)の増加ならびに電顕(EM)上で細胞内小器官のautophagosome形成が観察された。また,一部では断裂化した核の自食胞が形成された後に,アポトーシス像に移行するものも観察された。一方,BCL-2低発現株HL-60neoではVK2添加培養48hr以内ではHL-60bc1-2を上回るAVOならびにEM上autophagosome形成が観察されたが,72hr以降ではアポトーシス誘導が顕著となった。3-MA添加によりHL-60neo,HL-60bcl-2ともにVK2添加後の細胞死が阻害され,AVO形成も抑制された。また,siRNA ATG7を用いたATG7のノックダウン,および,Tet-off ATG5 MEFの系でもVK2による細胞死が抑制された。以上よりオートファジーとアポトーシスは同時に並行して誘導され,個々に独立した現象ではないことが判明した。一方,HL-60bc1-2のようにBCL-2高発現によりミトコンドリア膜の安定化によりアポトーシスが回避される場合には,HL-60neoに比較に比較して相対的に"autophagic cell death"が顕在化することが示唆された。また,ここで誘導されるオートファジーは"autophagic cell death"として機能していることが明らかとなった。この現象を他の抗がん剤に拡大して検証していく予定である。従来,白血病細胞に抗がん剤を作用した場合には,アポトーシスを介してして細胞死か誘導されると考えられてきた。近年,オートファジーが,programmed cell dealh(PCD)type Iのアポトーシスとならびtype II PCDとして注目されている。しかし,アポトーシスとオートファジーの相互関係については依然不明である。我々はビタミンK2(以下VK2)が白血病細胞に作用させた場合に,アポトーシスが効率よく誘導されることを報告してきた。一方,Bcl-2の過剰発現株HL-60bcl-2では,アポトーシス耐性を獲得しGlarrestならびに一部の細胞は単球系への分化が誘導されるが,培養日間を延長することで,やがては細胞死が誘導される。今回,VK2により誘導される細胞死をHL-60bcl-2とBcl-2低発現株HL-60neoとで比較検討した。以上より1)白血病細胞のオートファジーとアポトーシスは並行して進行すること考えられ,独立した生物現象ではない。また,2)BCL-2高発現によるミトコンドリア膜の安定化によりアポトーシスによる細胞死が回避されることで,相対的に"autophagic cell death"が顕在化することが示唆された。今後は他の抗がん剤に関しても,上記の普遍性を検証していく予定である。

白血病細胞のアポトーシスとオートファジーの振り分け機構を解明するため,今回ビタミンK2(VK2)を中心に白血病細胞株HL-60に対する効果を検討した。以前より我々は,VK2はHL-60細胞のアポトーシスを効率よく誘導することを報告してきた。一方,BCL-2過剰発現株HL-60bcl-2では,アポト-シス耐性を獲得して単球系への分化が誘導されるものの,培養時間を延長することで,やがては細胞死が誘導される。また,HL-60bcl-2にVK2を作用させることで,原形質内の空胞形成,acidic vesicular organelles(AVO)の増加ならびに電顕(EM)上で細胞内小器官のautophagosome形成が観察された。また,一部では断裂化した核の自食胞が形成された後に,アポトーシス像に移行するものも観察された。一方,BCL-2低発現株HL-60neoではVK2添加培養48hr以内ではHL-60bcl-2を上回るAVOならびにEM上autophagosome形成が観察されたが,72hr以降ではアポトーシス誘導が顕著となった。3-MA添加によりHL-60neo,HL-60bcl-2ともにVK2添加後の細胞死が阻害され,AVO形成も抑制された。また,siRNA ATG7を用いたATG7のノックダウン,および,Tet-offATG5MEFの系でもVK2による細胞死が抑制された。以上よりオートファジーとアポトーシスは同時に並行して誘導され,個々に独立した現象ではないことが判明した。一方,HL-60bcl-2のようにBCL-2高発現によりミトコンドリア膜の安定化によりアポトーシスが回避される場合には,HL-60neoに比較に比較して相対的に"autophagic cell death"が顕在化することが示唆された。また,ここで誘導されるオートファジーは"autophagic cell death"として機能していることが明らかとなった。この現象を他の抗がん剤に拡大して検証していく予定である。
神経教育学的アプローチによる学校適応・学習促進プログラムの開発と評価

本研究は、発達障害児の適応と学習を促す教育支援プログラムの開発と評価の検討を目的に行われた。ADHDやASDなどの発達障害がある児童は、学校場面において様々な困難感を有していることが多い。たとえば、授業内容を理解するだけの能力や学習スキルを有しているにも関わらず、「授業に集中できない」「自分が気になることに集中してしまう」などの学校適応に関する困難感があり、結果的に学習に支障をきたしてしまうことが多い。本研究では、発達障害児の適応と学習を支援するための鍵となる認知機能として「注意制御」と「メタ認知」の機能に着目し、それらの機能促進が適応や学習に及ぼす影響について検討した。本研究の主要な取り組みの1つとしては、通級指導教室に通学する児童を対象に、注意制御を促進する課題を開発し、課題実施中における前頭前野背外側部(DLPFC;注意制御機能の責任部位)の脳血流をNIRSによって評価した研究があげられる。本研究における特徴的な結果は、継続的な注意制御訓練は発達障害児の注意制御機能を促進したことが課題成績とともに脳機能面からも把握できたことである。具体的には、支援開始時から支援8回目にかけて、課題成績が上昇しただけでなく、課題実施中のDLPFCが有意に上昇することが示された。また、注意制御機能が促進された児童においては、課題開始時における目標設定を高く設定する傾向が示された。本研究においては、注意制御機能を促す課題以外も実施されており、それらの課題においてポジティブなフィードバックが与えられていたことから、「注意制御能力」や「やり抜く力(Grit)」の理解(メタ認知)が促進されたことで、適応的な動機付けが涵養されたことも示唆された。研究実施初年度となった当年においては、研究実施場所となる小学校の通級指導教室と「研究実施にともなう調整」を行いつつ、データの収集を行いながら「研究内容に関する微調整」に焦点をあてた。発達障害のある児童が通級する小学校通級指導教室の管理職および現場教員と研究内容を確認し、脳血流装置(NIRS)の使用方法、測定方法、解析方法などについて、実験内容とともに共通理解を深めることができた。当年に実施した注意制御課題は、数字抹消課題をアレンジした課題(週1回10分程度)を用いた。発達障害のある児童と定型発達の児童において、課題実施時の前頭前野背外側部(DLPFC)の血流を測定し、左右差の優位性について分析を行った。その結果、定型発達の児童においては、課題開始時および8週間後の課題実施において、右DLPFCが優位に活動していることが示された。発達障害のある児童(特にADHDの診断を有している児童)においては、課題開始時においては左DLPFCが優位に活動していることが示され、8週間後の課題実施において、右DLPFCが優位に活動していることが示された。また、探索的ではあるが、衝動性制御に関する課題を実施している時のDLPFCのデータや、服薬を開始した児童の注意制御に関するデータについても収集することができた。以上のことから、本研究で実施される注意課題とそのプログラムが適切に選択的注意などの制御機能を促進していることが確認され、また、頑健なデータではないが、そのエビデンスが脳血流の測定から得た点は特徴的であるといえる。通級指導教室の現場教員がNIRSの実施手続きについて理解し、適切に実施することができるため、着実に研究が遂行できるようになった。本研究は発達障害のある児童に対する認知機能の向上が学習効率や適応に及ぼす影響を実証的に検討することである。研究は様々な認知機能ごとにいくつかの研究パートに分けられており、同時並行的に各研究パートが実施されている。特に重点的に実施している研究パートは、数字抹消課題に類した注意課題の効果性と機序の検証である。本研究は、通級指導教室において、初年度から同一課題を継続実施して研究知見を蓄積しており、発達障害の特性と注意機能の関連性を検討している。本研究の手続き的特徴としては、脳血流測定装置(NIRS)を用いて、課題実施中の前頭前野背外側部(DLPFC;能動的注意制御の責任部位)を測定し、課題成績では把握できない集中力に関するデータを蓄積していることである。本年度において得られたデータを解析した結果の概略としては、(1)発達障害児は定期発達児よりもDLPFCの左右差が大きく、左DLPFC優位で注意課題を実施していること、(2)定期的な注意課題を用いた指導により、発達障害児は定期発達児と同様に右DLPFC優位で注意課題を実施するようになること、(3)特に、ASD児よりもADHD児において、これらの変化が顕著であることが示された。これらの研究知見は、前年度までの結果と同様であることから、安定的な結果であることが示唆された。これらの結果は、注意課題の成績のみでは把握できない知見であり、発達障害の注意メカニズムに関する有用な知見であると言える。従来の発達障害と注意機能に関する知見は、症状を把握することを目的とされたものが多く、本研究のように介入に重点をおいた知見は少ないことら、本研究における注意の知見は教育臨床的にも意義がある。本研究が開始された時には1箇所の通級指導教室をメインにして実験が実施されていたが、現在は2箇所の通級指導教室において、研究が実施されるようになった。通級指導教室においては、研究課題の実施とそれに伴う脳血流測定が、教育研究プロトコル(研究計画)に従い、臨床心理士などの資格を有する6名の現場教員によって適切に行われている。

現場教員の支援を十分に受けられていることもあり、研究進捗は「おおむね順調」であると判断することができる。しかしながら、通級指導教室という研究環境においては、通級している児童の特徴は様々であり、本研究が対象としている特徴以外の児童らも多く通級しているため、本年度においては十分なデータが得られているとは言い難い状況である。ただ、複数年度に渡ってデータを蓄積してきているため、研究全体で評価すれば解析に耐えうるデータ量を本年度は確保できていると評価できる。本研究は、発達障害児の適応と学習を促す教育支援プログラムの開発と評価の検討を目的に行われた。ADHDやASDなどの発達障害がある児童は、学校場面において様々な困難感を有していることが多い。たとえば、授業内容を理解するだけの能力や学習スキルを有しているにも関わらず、「授業に集中できない」「自分が気になることに集中してしまう」などの学校適応に関する困難感があり、結果的に学習に支障をきたしてしまうことが多い。本研究では、発達障害児の適応と学習を支援するための鍵となる認知機能として「注意制御」と「メタ認知」の機能に着目し、それらの機能促進が適応や学習に及ぼす影響について検討した。本研究の主要な取り組みの1つとしては、通級指導教室に通学する児童を対象に、注意制御を促進する課題を開発し、課題実施中における前頭前野背外側部(DLPFC;注意制御機能の責任部位)の脳血流をNIRSによって評価した研究があげられる。本研究における特徴的な結果は、継続的な注意制御訓練は発達障害児の注意制御機能を促進したことが課題成績とともに脳機能面からも把握できたことである。具体的には、支援開始時から支援8回目にかけて、課題成績が上昇しただけでなく、課題実施中のDLPFCが有意に上昇することが示された。また、注意制御機能が促進された児童においては、課題開始時における目標設定を高く設定する傾向が示された。本研究においては、注意制御機能を促す課題以外も実施されており、それらの課題においてポジティブなフィードバックが与えられていたことから、「注意制御能力」や「やり抜く力(Grit)」の理解(メタ認知)が促進されたことで、適応的な動機付けが涵養されたことも示唆された。当年の段階では、児童の注意制御能力の促進に関する実験課題と測定に関する開発に焦点があてられた。2年目からは退級した児童の行動観察に関するあらたな評価基準を作成しつつ、支援の効果測定を総合的にと耐える取り組みについても実施していきたい。本研究は、2箇所の通級指導教室において6名の教員が子どもたちの指導をする体制で実施されている。各教室において、同一時間帯に複数の児童の指導が行われていることから、NIRSを用いた測定のタイミングを調整することを工夫することで、より多くのデータを確保しつつ、データ測定時期の厳密性も確保することができる。最終年度に行うデータ解析用に購入を検討していた統計ソフトやPC・ディスプレイなどの予算は別途確保できたことから、それらの予算でNIRSの本体ユニットを購入することを計画している。当年において実験に使用する備品などについては、購入が完了していたため。支出を予定していた物品などの価格が、計画時よりも安価になっていたため、次年度使用額が生じた。
MOZ/MLL融合遺伝子による急性骨髄性白血病発症機構の解明

本研究では、主にMOZ/MLL融合遺伝子による白血病発症における内在性のMOZや役割を中心に解析を行った。その結果、内在性のMOZはMOZ/MLL融合遺伝子の標的遺伝子のクロマチンを転写が起きやすい状態に維持することに必須であることを明らかにした。また下流遺伝子としてがん抑制遺伝子INK4Aの発現制御に関わっていることを明らかにした。以上の結果から、内在性のMOZは融合遺伝子による標的遺伝子の発現異常が生じ得るようなクロマチン状態を維持することで白血病発症に寄与していることが示唆された。本年度は昨年度に引き続き、MOZ/MLL融合遺伝子による白血病発症における内在性のMOZの役割を中心に解析を行った。最初にMOZ欠損MOZ融合遺伝子白血病細胞で発現が変化している遺伝子を探索した。その結果、細胞周期抑制遺伝子の一つであるp16/p19 INK4A遺伝子がMOZ欠損MOZ融合遺伝子白血病細胞で発現亢進していることを見出した。この結果はMOZ欠損MOZ融合遺伝子白血病細胞でコロニー形成が見られる条件においても依然として細胞増殖能が低い原因の一つであることが示唆された。さらにこれまでにMOZ欠損細胞にMOZ融合遺伝子を導入した細胞では不死化能は獲得されるが白血病発症能が失われていること、HoxA9の発現亢進は見られるがMeis1の発現亢進は起こらないことを報告してきた。そこでMOZ欠損細胞にMOZ融合遺伝子と同時にMeis1遺伝子を導入することで白血病発症能が回復するか解析を行った。その結果MOZヘテロ欠損細胞と比べて発症時期が遅れるが、MOZ欠損細胞においても白血病発症が誘導されることがわかった。この結果から白血病発症における内在性のMOZの作用点として、融合遺伝子によるHoxA9/Meis1遺伝子の発現亢進がその中心であることが示唆された。以上本研究から内在性のMOZは、ヒストン修飾などを制御することによってMOZ/MLL融合遺伝子の標的遺伝子であるHoxA9/Meis1遺伝子領域のクロマチン状態を活性化状態にすることで、MOZ/MLL融合遺伝子による転写の恒常的活性化に寄与し、さらに白血病発症に寄与していることが示唆された。またこれらの結果からMOZが、HoxA9/Meis1遺伝子の発現亢進が見られるような白血病で治療標的候補となりうることが示唆された。本年度は、MOZ/MLL融合遺伝子による標的遺伝子発現亢進における内在性のMOZの役割を中心に解析を行った。最初に正常のMOZとMeis1の発現との関係について、MOZ欠損造血幹細胞を分離してMeis1遺伝子の発現を解析した。その結果MOZ欠損造血幹細胞においてMeis1遺伝子の発現は顕著に減少していた。このことからMeis1についてもHoxA9と同様にMOZの標的遺伝子であることが示唆された。これまでの解析からMOZ欠損細胞においてもサイトカインの条件によって白血病細胞化、HoxA9遺伝子の発現亢進が誘導されることを報告してきたが、さらに解析を進めた結果、胎生13.5日といった胎齢がより若いMOZ欠損細胞では、サイトカインの条件に関わらずMOZ融合遺伝子を導入すると白血病細胞化が見られた。一方MLL融合遺伝子については、いずれの条件においてもMOZ欠損細胞では白血病細胞化は見られなかった。さらにMOZ融合遺伝子による標的遺伝子発現誘導と内在性のMOZとの関係について、クロマチン免疫沈降法を用いて標的遺伝子領域のヒストン修飾を解析した。MOZ融合遺伝子によってMOZ欠損細胞において白血病細胞化、HoxA9遺伝子の発現亢進が誘導される条件では、発現が誘導されるHoxA9領域の活性化ヒストン修飾は、MOZヘテロ欠損細胞と同程度かもしくはやや減少していたが、一方発現が誘導されないMeis1遺伝子領域では活性化ヒストン修飾がヘテロ欠損細胞と比べて顕著に減少していた。現在MOZ及びMLL遺伝子の局在についても解析を進めている。以上の結果から、MOZはMOZ/MLL融合遺伝子の標的遺伝子であるHoxA9/Meis1領域のクロマチン状態を制御することによって白血病発症に寄与していることが示唆された。またその制御機構は標的遺伝子及び融合遺伝子によって異なることが示唆された。本年度は、MOZ融合遺伝子を発現する白血病細胞において発現が亢進しているHoxA9/Meis1遺伝子領域のクロマチン制御における内在性のMOZの役割をMOZ欠損造血前駆細胞を用いてクロマチン免疫沈降法で解析を行った。その結果MOZ欠損白血病細胞では発現誘導が見られないMeis1遺伝子領域の活性化ヒストン修飾が顕著に減少していることを明らかにした。またMOZ/MLLの局在については現在解析中である。加えてMOZ/MLL融合遺伝子による白血病細胞化における内在性のMOZの必要性について、標的遺伝子及び融合遺伝子によって異なることを明らかにした。

本年度に行う予定であったMOZ融合遺伝子による白血病の各表現型と遺伝子発現との相関については次年度に遺伝子発現解析を行い、続けてMOZ/MLL融合遺伝子白血病における機能解析を行う予定である。次年度実施予定のMOZ/MLL融合遺伝子白血病細胞の維持における内在性のMOZの機能解析に用いる誘導型MOZ欠損マウスはES細胞のスクリーニングまでが終了していて、予定通り解析に使用可能であると考えられる。次年度もMOZ/MLL融合遺伝子による白血病の分子機構について解析を行う。本年度の解析から、MOZ欠損造血前駆細胞にMOZ融合遺伝子を導入した白血病細胞では、発現誘導が見られないMeis1遺伝子領域において遺伝子が活性化されているときに見られるようなヒストン修飾が顕著に低下していることが明らかとなった。この結果からこれらのヒストン修飾に関わるヒストン修飾酵素のMeis1遺伝子領域への局在の有無について、クロマチン免疫沈降法を用いて解析を行う。またMOZ欠損白血病細胞でMOZ融合遺伝子自体がHoxA9/Meis1領域に局在しているかについて、クロマチン免疫沈降法を用いて解析する。以上の解析からMOZ/MLL融合遺伝子によるHoxA9/Meis1発現誘導における内在性のMOZの役割について明らかにする。次にそれぞれ表現型が異なるMOZ融合遺伝子による白血病細胞において遺伝子発現解析を行い、MOZ/MLL融合遺伝子及び主な標的遺伝子であるHoxA9/Meis1遺伝子の下流遺伝子と考えられる遺伝子を明らかにする。さらにそれらの遺伝子について、クロマチン免疫沈降法による標的遺伝子領域への結合の有無やshRNA発現による遺伝子発現抑制もしくは過剰発現によって白血病発症及び維持における機能解析を行い、MOZ/MLL融合遺伝子による白血病の分子機構の解明を目指す。さらに現在作成中の誘導型MOZ欠損マウスやMOZ shRNAを用いてMOZ/MLL融合遺伝子による白血病細胞の維持における内在性のMOZの役割をクロマチン免疫沈降法などを用いて明らかにする。以上の結果をまとめて、学会発表及び論文発表を目指す。次年度の研究費は主に以下の解析に必要な試薬購入等に使用する予定である。本研究で用いるMOZ/MLL遺伝子欠損マウス及びMOZ/MLL融合遺伝子白血病モデルマウスの作製に必要なマウスの飼育管理費用に使用する。またIn vitroの解析において白血病細胞の培養に用いる細胞培養試薬の購入に使用する。さらに白血病細胞の解析を行うために各種の表面抗原を認識する蛍光標識抗体購入に使用する。また融合遺伝子導入用ウイルス作製、遺伝子発現抑制のためのshRNA導入用ウイルス作製、マイクロアレイ及びRT-PCR法によって遺伝子発現解析及びクロマチン免疫沈降法を行うために細胞培養試薬や核酸操作作用試薬購入に使用する。加えてクロマチン免疫沈降法及びウエスタンブロット解析を行うために、修飾ヒストンに対する抗体及び核酸/タンパク質作用試薬購入に使用する。
経頭蓋磁気刺激法を用いた神経因性疼痛治療法の開発

本研究では反復経頭蓋磁気刺激(rTMS)が神経因性疼痛に及ぼす影響を神経因性疼痛モデルマウスを用いて検討し低頻度rTMSがモデルマウスの機械的痛覚過敏には影響しないが熱痛覚過敏を軽減すること、その際前帯状回の興奮性を抑制することが明らかとなった。rTMSは神経因性疼痛治療法の一つとなることが示唆された。反復経頭蓋磁気刺激法(rTMS)が神経因性疼痛に及ぼす影響を解析するため,初年度はrTMSが機械的感覚刺激に及ぼす影響を、ddYマウスならびにてんかんモデルELマウスを用いて検討した.【方法】(1)ddYマウス群(n=20)をコントロール群(n=7)、rTMS群(n=7)、拘束群(n=6)に分けた。まず2週間各マウスの機械的非侵害刺激に対する反応をvon Freyフィラメント刺激に対する逃避反応で評価した。3-6週目では、週の前半2日間にrTMS群はrTMS(運動閾値の120%の強度、20Hz,1000発刺激/日)を、拘束群は10分間の身体拘束をおこなった。コントロール群はいずれの処置もしない。週の後半(処置後少なくとも2日おいて)にvon Freyフィラメント刺激に対する逃避反応閾値を評価した。(2)ELマウスはてんかん発作をきたすが、rTMSが発作を抑制することを我々はすでに確認している。そこでELマウスの機械的非侵害刺激に対する反応がrTMSによって変化するかを検討した。rTMS群(n=5)、拘束群(n=5)に対して、ddYマウスと同様のスケジュールで比較した。【結果・考察】(1)ddYマウスのコントロール群では、von Freyフィラメントの刺激強度0.4gまではまったく逃避反応はみられなかった。0.6gにて20%、以後強度が強くなるに従って反応個体数は増加し8gでは約100%となった。rTMS群、拘束群ともに同様の傾向であり、3群間での有意差はみられなかった。このことは、正常ddYマウスではrTMSは悪影響を及ぼさず安全であることを示している。(2)ELマウスでは、刺激強度0.07gから逃避反応を示す個体がみられ、0.16gでは50%、1.4gではすべての個体が反応していた。このことはELマウスの感覚過敏性を示唆する。3週目以降拘束やrTMSを開始したところ、拘束群では約20%ほど反応個体数が減少しているが、rTMS群では減少率は50-70%に達していた。拘束の影響を差し引いてもrTMSが感覚過敏を抑制したことを示している。初年度の研究によりELマウスのような中枢神経系の過剰興奮がみられる場合にはrTMSは感覚過敏状態を抑制できる可能性が明らかとなった。次年度は坐骨神経結紮モデル動物をもちいての検討を行っていく予定である。本年度は神経因性疼痛モデルマウスへの反復経頭蓋磁気刺激法(rTMS)の作用を検討した.【方法】(1)ddYマウス群(20週齢)の左坐骨神経を1/3-1/2結紮し神経因性疼痛モデル(Seltzer法)を作製した。まず4週間各マウスの機械的非侵害刺激に対する反応をvon Frey試験で、熱痛覚刺激に対する反応をplantar試験で評価した。5-13週目にrTMS群(n=8)は週の前半2日間にrTMS(運動閾値の120%の強度、20Hz,1000発刺激/日)を、コントロール群は10分間の身体拘束をおこなった。週の後半にvon Frey試験、plantar試験をおこなった。【結果】(1)von Frey試験:コントロール群、rTMS群ともに術後10週までは結紮側(左)の逃避閾値(0.5-0.9g)は有意差をもって健側(右:1.1-1.3g)よりも低下したが、13週目には有意差は消失した。rTMS群での結紮側の閾値はrTMS前が0.68±0.33g、rTMS刺激後が0.68±0.27gにて変化はなかった。健側はrTMS前後での変化はなかった(前1.53±0.63g、後1.18±0.35g)。コントロール群でも結紮側、健側ともに拘束前後での逃避閾値の変動はなかった。(2)Plantar試験:コントロール群、rTMS群ともに術後13週までは坐骨神経結紮側(左)の閾値(3.4-3.9秒)は有意差をもって健側(右:6.0-6.5秒)よりも短縮していた。rTMS群での結紮側の閾値はrTMS前が3.4±0.7秒、rTMS刺激後が3.4±0.4秒にて変化はなかった。

健側はrTMS前後での変化はなかった(前6.1±0.92秒、後6.0±0.6秒)。コントロール群でも結紮側、健側ともに拘束前後での逃避閾値の変動はなかった。【考察】今回のrTMSの刺激条件では、rTMSは神経因性疼痛に対しては影響を与えなかった。週2回の刺激回数が不十分であった可能性があること、刺激を人での検討を参考に20Hzの高頻度としたが低頻度での作用などにつき次年度は刺激条件を変更してrTMSによる神経因性疼痛抑制の可能性を検討する。本年度は反復経頭蓋磁気刺激法(rTMS)が神経因性疼痛モデルマウスの疼痛を抑制する刺激方法の確立とメカニズム解明を試みた.【方法】(1)5週齢のddYマウス群の左坐骨神経を1/3-1/2結紮し神経因性疼痛モデル(Seltzer法)を作製した。6週目に各マウスの機械的非侵害刺激に対する反応をvon Frey試験で、熱痛覚刺激に対する反応をPlantar試験で評価し左下肢の感覚過敏を確認した。7-10週にかけてrTMS群(n=10)は週5日間rTMS(運動〓値の120%の強度、1Hz,1000発刺激/日)を、コントロール群(n=10)は10分間の身体拘束をおこなった。11週目にvon Frey試験、plantar試験をおこなった。その後各5匹ずつ前帯状回のスライス標本を作成し電気刺激に対する集合膜電位を記録した。【結果】(1)Plantar試験:rTMS前の6週齢では熱刺激に対する逃避潜時は両群とも差がなく右下肢7.5±0.7秒に対して手術した左下肢では2.9±0.6秒と短縮していた。rTMS後の11週齢ではコントロール群の左下肢潜時3.7±1.0秒に対してrTMS群4.6±1.1秒と有意に(p<0.001)延長していた。(2)von Frey試験:フィラメントによる機械刺激からの逃避潜時は(3)前帯状回スライス標本での電気生理学的解析:rTMS群では電気刺激に対する集合膜電位の振幅がコントロール群に比較して減少していた。【考察】昨年度と異なりrTMSを行う時期を神経結紮後2週後より開始し、刺激条件も低頻度(1Hz),刺激回数の増加(5日/週)したところ、rTMSによる鎮痛効果が明らかとなった。rTMSの作用点としては前帯状回の興奮性抑制が関与することまで明らかとした。
大気粉塵の存在状態と雨水微量成分の存在状態、大気粉塵の洗浄効果に関する研究

1.雨水中のAlの状態別定量のための試料処理の検討:報告者らが開発した8-ヒドロキシキノリン-5-スルホン酸蛍光法による雨水中のAlの状態別定量を検討した。試料をそのまま定量した値を溶存Al濃度、フッ化水素酸、硝酸及び硫酸で加熱分解し定量した値を全Al濃度とし、雨水に取り込まれた大気粉塵中のAl量に相当する非溶存Al濃度をその差から求めた。Al溶液や実際試料を用いて試料処理条件を検討し、雨水試料を孔径0.45μmの膜フィルターで濾過して液、3000rpmで遠心分離した上澄液及び0.2M塩酸酸性にしたものを処理試料とした。保存の際のAl吸着損失を種々の材質の容器について調べ、ポリスチレン製容器が最も少なかったので、これを保存容器とした。2.雨水中のAlの状態別定量値の変化:雨水を時間経過とともに分けて採取し、分析した結果から、降雨量1mm以下の初期雨水には数十数百ppbの溶存Alが存在し、降雨量5mm以上の後続雨水では数ppbまで減少すること、全Alも溶存Alと同様の減少傾向を示すが、その濃度は1桁程度高いことなどが分かった。また、未処理試料や酸添加試料を保存すると溶存Alが増加し、アルミニウムを含む粉塵粒子からと思われる溶出が起った。初期雨水を濾過や遠心分離すると90%以上の非溶存Alが除かれ、3日間程度保存できたが、試料のpHが5以上の場合、濾過ではアルミニウム水酸化物の生成によると思われる溶存Alの低下が起こった。後続雨水では濾過や遠心分離で80%以下の非溶存Alしか除けず、保存するとAlの溶出や損失が起こった。ICP発光分光法によりAl、Feなどを定量した結果、未処理、処理試料とも溶存Al値は本蛍光法に比べて高くなり、溶存Alと全Alの中間の値を与え、Feの定量値の変化もAlに類似していた。従って、試料前処理を避け本蛍光法のような高感度な分析法で短時間に分析することが望ましいことが分かった。
ブルーベリーに発生するウイルスの病害防除に対する統合的研究

日本のブルーベリーから4種のウイルスを検出しその特性を解析した。その内の2種は、海外で発生しているブルーベリー赤色輪点ウイルスとブルーベリー潜在ウイルスであった。残りの2種は新種ウイルスで、ブルーベリー小球形潜在ウイルス(BLSV)とブルーベリーAウイルス(BVA)と名付けた。BLSVは、ネポウイルス属グループCの新規ウイルスであった。BVAは、クロステロウイルス科のどの属にも所属しない新規クロステロウイルスであることが系統樹解析により示された。本年度は、(1)ブルーベリー赤色輪点ウイルス(BRRV)によるブルーベリー赤色輪点病の検定法の開発、(2)日本のブルーベリーから検出される約3.5kbpの2本鎖RNA(dsRNA)の解析、(3)スパータンの黄化病からのウイルス検出を行った。(1)に関しては、ブルーベリー樹由来のPCR反応阻害物質のため、PCRを用いたBRRVの検出精度に問題があった.そこで、ブルーベリー樹からの全核酸抽出法および検定用プライマーの塩基配列を開発した。さらに、この方法を用い、岩手県・千葉県・宮城県を圃場調査し、3県全てでBRRVによるブルーベリー赤色輪点病が発生していることが明らかにした。(2)に関しては、約3.5kbpの二本鎖RNA(dsRNA)が、Blueberry fruitdrop associated virus (BFDaV)由来であることを明らかにした。BFDaVは、アメリカ・カナダで問題となっているBlueberry fruit drop disease (BFDD)の病原であると考えられていた。そこで、日本のBFDaVに感染しているブルーベリー樹の病徴を経時的に観察した。その結果、いずれの樹においてもBFDD症状は認められなかった。このことから、BFDaVはBFDDの病原ではない、あるいは単独で病気を引き起こすウイルスではないことが明らかとなった。さらに、BFDaVのゲノム解析から、BFDaVは、トチウイルス科に分類される新規なウイルスであると分かった。(3)に関しては、圃場調査により品種スパータンに黄化病が発生していることを突き止めた。本病気罹ったスパータンからdsRNAを抽出すると、9kbpのdsRNAが検出された。そこで、9kbp dsRNAのクローニングを行い、このdsRNA由来と考えられるクローンを得た。これまでの圃場調査で、黄化症状を示し衰弱したブルーベリー樹(品種スパータン)が多数観察された。本年度は、これら樹からウイルスの検出に成功した。本ウイルスゲノムの一部である約14kbを解析の結果、クロステロウイルス科に所属する世界未報告の新種ウイルスであることが示唆された。来年度、本ウイルスの病原性・伝搬を解析、さらに全長ウイルスゲノムを明らかにする。さらに、昨年度、海外でBlueberry fruit drop diseaseの病原であると考えられているBlueberry fruitdrop associated virus (BFDaV)が、日本では約3割の無病徴のブルーベリー樹から検出されることを明らかにした。しかし、BFDaVはブルーベリー葉から二本鎖RNA(dsRNA)を抽出するとdsRNAのウイルスゲノムが検出されるのみで、ブルーベリー細胞中にBFDaVが存在する証拠はなかった。また、BFDaVのゲノムを解析すると原生生物と糸状菌のウイルスから構成されるトチウイルス科のゲノムと類似していた。そのため、BFDaVはブルーベリーに感染するエンドファイトの様な糸状菌のウイルスである可能性があった。本年度の研究成果では、ウイルスRNAが柵状組織、海綿状組織、維管束組織の細胞に存在すること、BBLVゲノムの読み枠1は48kDaのタンパク質としてブルーベリー細胞中の細胞質内に不定形塊として局在することを明らかにした。このことから、BFDaVはブルーベリーの潜在性ウイルスであることを示唆した。本研究と同様に、Martinら(2011)によりBFDaVはBlue berry fruit drop diseaseの病原ではないとしBlueberrylatent virusと名称の変更があった。BBLVは、日本で未記載であるので和名をブルーベリー潜在ウイルスと日本植物病理学会で提案した。本年度、1.ブルーベリー樹から汁液接種により分離したウイルスの解析、2.黄化症状を呈するブルーベリー樹から検出された二本鎖RNAの解析を行った。1.本ウイルスはウイルス検定および接木試験から潜在感染性ウイルスであることが分かった。本ウイルスは直径30nmの球状粒子を持っていた。ウイルスゲノムは2成分(RNA1,RNA2)からなり、それぞれ全長7,960塩基と6,344塩基から構成されていた。RNA1とRNA2はネポウイルスと類似したモチーフおよび編成を持つポリタンパク質をコードしていた。RNA1とRNA2の3'非翻訳領域は1,379塩基と1,392塩基からなり,互いに97%の同一性を持っていた。BLSVのRNA依存RNAポリメラーゼとCPのアミノ酸配列を比較したところ、ネポウイルス属サブグループCに所属するウイルスとの間で最も高い類似性(57%,43%)が検出された。これらの特性および系統樹解析から,本ウイルスはネポウイルス属サブグループCの新種ウイルスであると示唆された.