hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
頭頸部癌の神経周囲浸潤における細胞外マトリックス、接着因子の意義に関する研究

また、同じ切片内にみられた神経周囲基底膜にもIV型コラーゲンの発現がみられ、腺様嚢胞癌が神経周囲に接着、浸潤している場合、癌細胞周囲のIV型こコラーゲンと神経周囲のIV型コラーゲンが接触しており、細胞外マトリックス同士の相互作用により神経周囲浸潤が生じているのではないかと推測された。引き続いて、基底膜のもう一つの主要構成蛋白であるラミニンの発現とその生物学的意義について検討中である。1.舌扁平上皮癌におけるラミニン発現手術にて切除した患者舌扁平上皮癌組織におけるラミニンγ2鎖の発現を免疫組織化学的に検討した。その結果、癌細胞どうしが密に接着しながら増殖している場合(胞巣状増殖)、ラミニンγ2鎖が胞巣の辺縁細胞に発現していた(辺縁性発現)。一方、癌細胞がばらばらに分散し、舌筋層や結合組織内に深く浸潤している場合(分散性浸潤)、癌細胞一つ一つが強くラミニンγ2鎖を発現していた(びまん性発現)。また、分散性浸潤を呈しラミニンγ2鎖をびまん性に発現した癌細胞は高率に神経周囲浸潤や脈管浸潤をきたしていた。予後に関しても、ラミニンγ2鎖びまん性発現群は辺縁性発現群より予後不良であることが分かった。すなわち、舌扁平上皮癌において、細胞同士が密着した胞巣状増殖は正常扁平上皮の形質をある程度保持した状態であり、ラミニン発現は正常上皮の基底層に相当する辺縁細胞にのみみられているのではないかと考えられる。一方、分散性浸潤をきたしびまん性にラミニンを発現した細胞はより悪性度が高い状態とと思われ、今後はそのメカニズムの解析が必要である。2.腺様嚢胞癌におけるラミニン、コラーゲンの発現手術切除した患者腺様嚢胞癌組織におけるラミニン、コラーゲンの発現を検討した。扁平上皮癌と異なり、癌細胞には発現を確認できず、大きな癌胞巣の周囲に発現を認めた。比較的分化度を維持した発現と考えられる。しかし、癌胞巣が結合組織や神経周囲に浸潤する場合、癌胞巣は小さくなり細く伸長しており、その周囲にラミニン、コラーゲンの発現がみられた。すなわち、腺様嚢胞癌は分化度を維持しているため増殖が緩除であるが、細胞外マトリックスを利用しながら神経周囲や間質に深く浸潤しており、これが腺様嚢胞癌を特徴づけているのではないかと考えられた。1.舌扁平上皮癌におけるラミニン発現レトロスペクティブな検討から舌扁平上皮癌組織におけるラミニンγ2鎖の発現様式が辺縁性発現とびまん性発現型の二つに分類され,、ラミニンγ2鎖びまん性発現型は辺縁性発現型より予後不良であることが分かった。そこで舌癌症例の手術切除後に切除マージンの検討とともにラミニンγ2鎖の発現を検討し、以下のような追加治療の方針とした。マージン(-)辺縁性発現型;追加治療なし。マージン(-)びまん性発現型;術後化学療法。マージン(+)辺縁性発現型;術後照射。マージン(+)びまん性発現型;術後照射化学同時併用療法。今後はこの治療法による治療成績について検討する予定である。2.腺様嚢胞癌におけるラミニンγ2鎖、IV型コラーゲンの発現腺様嚢胞癌組織におけるラミニンγ2鎖、IV型コラーゲンの発現を検討した。Cribriform typeでは大きな癌胞巣の周辺に加え、pseudocyst内腔に沿った発現がみられた。一方tubular typeでは癌胞巣周辺にのみ発現がみられた。間質や神経周囲への浸潤部では癌胞巣が小さくなり伸長しているが、その小さな癌胞巣でも周辺とpseudocyst内腔に沿って発現がみられた。
建設技術者の生きがいの向上方策

1.日本の建設技術者・技能者の生きがい構造を表現できる理論の検討ー文献調査、並びに、建設コンサルタント、地方建設会社の技術者と技能者に聞き取り調査を行った。今回の調査の範囲内では、ブルームの期待理論とデシの内発的動機付け理論が有力である。期待理論では、動機付けは「E:期待ーこの仕事できる?」と「V:誘意性ー意味がある?」との積で表される。例えば、復興事業CMRが意欲的に仕事をするためには、「仕事の目的は住民満足」との価値観を発注者と共有してVを高め、関係者との密な情報交換によって事業不確実性を減少させEを高めることが重要である。内発的動機付けは、「自分にとって有意なことを発見し(関係性)、進んで実践し(自律性)、その有意性・自分の存在を確かめる(有能感)」状態と捉えた。地方建設会社では、経営者がICT(情報通信技術)に投資し、中堅社員が実装し、若手社員が喜々として活用し仕事に励む姿が複数社で観察された。これは「自律にはその支援が必要」とのデシの説を裏付けるものである。2.近年の米欧公共建設事業における特徴と動向の調査・整理ースイス地方公共建設事業の施工現場状況を調査した。安定した事業量を持つ環境の中で、1資本主義精神(利潤追求原理、勤勉)、2市場制度(市場単価(特に労働者賃金協定)確立、生産性把握(工事日報)、総価単価契約)、3会社経営方針と施工計画(自前施工、クレーン設置が最重要課題)等がシステム化されている。日本も独自のシステム化が必要である。3.新時代公共建設事業の一例ー国土交通省四国整備局が佐賀橋下部工事で、一つの橋台では従来型(油圧クレーン)を、もう一つは新方式(定置式水平ジブクレーン)を用いて施工し、両者の施工性を評価する試行工事を行った。研究代表者も技術検討会一員として調査に加わり、新方式では、技能者の安心感・やりがいが向上する可能性があるとの結果を得た。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。初年度は、第一に、種々の動機付け理論を概括した。日本の建設技術者の動機付けを論じる上で、デシの内発的動機付けも有力な理論であるとの結論を得た。第二に、指名競争入札制度時代と入札制度改革後の、技術者の動機付け水準の変化を考察し、次の四つの仮説ー1健全な指名競争入札制下では、a)民間技術者は高い内発的動機付けを持ち、b)内発的動機付けと外的動機付けとの間に好循環が存在、2一般競争入札制度導入後、民間技術者の内発的動機付けが低下、3発注者技術者の内発的動機付けも低下、4日本の公共建設事業と建設業界のパフォーマンスが低下ーを設定した。第三に、動機付けの問題をリスクマネジメントの視点から考察する独自の発想を得た。その結果として、1現在の公共調達改革では、非公正な調達リスクの回避に主眼が置かれているが、このリスクの回避の姿勢・施策こそ、技術者の動機付け低下の根源である、2発注者責任とは、リスクの最適化、すなわち、「公正さ・品質・経済性・時間の目的未達成リスクを最適にマネジメントすることによって、公共事業の価値最大化を図る責任」と捉えることが出来る、との結論を得た。第四に、中国東北部のバイオマス発電事業の分析から、階層意思決定構造を有する問題では、全体最適を実現するためには、その「底辺」を支える主体の不安(認知リスク)と動機付けを解明・改善することが不可欠であるとの知見を得た。バイオマス発電事業には、発電者ー仲介者ー農夫、という階層意思決定構造が存在する。公共事業でも、例えば、公共発注者ー民間会社経営者ー民間技術者、という階層意思決定構造が存在する。技術者の動機付けを高めることが、階層意思決定構造の全体最適を実現するためには不可欠である。当初の研究計画では、初年度は、1公共建設事業における建設技術者の生きがいの分析枠組みの検討、2公共事業主要主体の特性分析、3近年の米欧公共建設事業における特徴と動向の調査・整理、4行政者・発注者責任の体系化と行政者・発注者責任達成行為の価値計測、を実施する予定であった。実際には、1、2、4の一部の実施に留まった。この主な理由は、既往研究の中で、日本の建設技術者の生きがい・動機付けを表す上で参考となる研究が皆無であったため、1の生きがいの枠組みの構築が極めて困難であったことによる。まず、建設分野では、独自の動機付け理論は存在しない。既往の研究では、二要因理論(ハーツバーグ)、期待理論(ブルーム)、欲求階層説(マズロー)等の適用性を分析する実証的研究が大部分である。しかし、様々な方々にヒアリングを行う中で、日本人の技術者には、「仕事自体が楽しい」、或いは「一種の使命感」を感じながら、業務に携わっている方々が少なくないことに気付いた。これらの人々の動機付けは、上記の理論では充分に表現できない。デシの内発的動機付けは有力な理論であると考えられるが、その大部分の適用例は教育現場であり、労働者・ホワイトカラーの動機付けに関する具体的分析例は限定的である。このため、建設技術者の生きがいの分析枠組みの検討に長い時間を要した。第二年度は、当初の研究計画テーマ遂行と同時に、それを実施するための方法論の深化にも力を入れた。

研究計画テーマ遂行に関しては、まず、業務にICTを主体的に導入することによって,飛躍的な業務生産性の向上と社員の動機付け向上を実現している徳島県の小規模建設会社を選び、技術者だけでなく技能者にも焦点を当て、動機付け向上の要因を調査・分析した。その結果、1多くの社員が高い内発的動機付けを感じ、2インセンティブにも動機付けられて仕事を行っていること、3経営者陣は「リスクマネジメントの目的は価値の創造と維持」との原則を実践していること、4経営陣の動機付けの根源の一つは「自分たちは地域に育てられたので、人財を育てることによって地域に恩返しをしたい」との思いであることが明らかとなった。これらの結果は、初年度に得た視点・アイディアと符合するものである。その他に、CM業務の価値分析、米国建設事業のインセンティブ制度の分析、英国地質リスクマネジメントの現状調査、建設事業組織の文化が事業パフォーマンスに与える影響も分析を行い、組織マネジメントが動機付けと生産性に与える影響を定量的に分析した。方法論の深化に関しては、1)日本の森林管理に関する制度分析、2a)ベトナム公共水域の内分泌攪乱物質に対する住民のリスク認知、2b)中国東北部バイオマス発電関係者の信頼意識を分析し、制度分析とリスク認知分析手法の活用法に関する知見を深めた。さらに1)の研究では、「現場の森林管理リスクを正確に把握・評価し、森林所有者と行政とを仲介する専門家が必要である」、2a)の研究では、「専門家と非専門家の間ではリスク認知構造に大きな差がある」との結論を得た。これらは、「公共発注者ー民間会社経営者ー民間技術者・技能者」という階層意思決定構造の中で、特に公共発注者と経営者の正確なリスクマネジメントが重要であることを示唆している。第二年度の研究計画は、初年度の研究計画テーマである1公共建設事業における建設技術者の生きがいの分析枠組みの検討、2公共事業主要主体の特性分析、3近年の米欧公共建設事業における特徴と動向の調査・整理、4行政者・発注者責任の体系化と行政者・発注者責任達成行為の価値計測、の継続と5今後の公共事業における官民の責任・リスク分担論試案提案と建設技術者の生きがい評価、6新時代の公共建設事業の構想、の着手である。1については、研究実績でも述べたように、地方建設会社員の動機付け要因の調査・分析を通して、日本人の建設実務者の動機付けモデルの方向性を明らかにしつつあると感じている。2についても、地方建設会社の調査・分析から「経営者と社員間の動機付け相互作用」という結果を得ることが出来た。3では、米国建設事業のインセンティブ制度、英国の地質リスクマネジメントの実態を調査しその特徴を明らかにした。4については、CM業務の価値分析を進めた。5については、2の「経営者陣は『リスクマネジメントの目的は価値の創造と維持』との原則を実践」という調査結果を得た。これは、今後5のサブテーマの本質の一つになるものと考えられる。6は、四国地方整備局の協力で地方公共事業の未来を先取りする試行事業の検討に着手した。また、これらのサブテーマを研究していくための重要な手法である制度分析とリスク認知論の活用法に関する知見を深めることが出来た。1.日本の建設技術者・技能者の生きがい構造を表現できる理論の検討ー文献調査、並びに、建設コンサルタント、地方建設会社の技術者と技能者に聞き取り調査を行った。今回の調査の範囲内では、ブルームの期待理論とデシの内発的動機付け理論が有力である。期待理論では、動機付けは「E:期待ーこの仕事できる?」と「V:誘意性ー意味がある?」との積で表される。
DNA・薬剤結合の幾何学を知るためのラマンセルの開発

二つの研究の目的は水溶液中でDNAに結合する薬剤分子がどのような方位で配置するかを知ることのできる方法の開発である。その一方法は薬剤分子の与えるいくつかのラマンバンドのおのおのの散乱テンソルがDNA二重らせんの軸に対してどのように配置するかを知ることである。そのためには、DNA二重らせんを水溶液中で一定方向に配向させ、他方薬剤分子だけが共鳴するレ-ザ-光を用いてラマン散乱光の偏光状況を調べればよい。DNA分子の配向は流動速度勾配形成によった。ここで開発した装置の中心部は、内外一対のガラス製共軸円筒から成る。外筒は内径12mmの中空底付円柱容器であり、内筒は外径10mmの円柱ブロックである。内柱と外筒内壁との間に1mmの間隙があり、この部分にDNA水溶液を入れる。内柱を2500回転/分の速度で回転すると、この1mmの間隙に平均1300秒^<-1>の速度勾配が生じる。これによってDNA分子が流れの方向に長さ方向を揃えて配向する。この溶液に薬剤を入れ、その分子がDNA分子とじゅうぶん強く結合すれば、この薬剤分子も配向する。この間隙にレ-ザ-光を入射して、試料溶液からのラマン散乱(または螢光)を測定する。そしてその偏光特性から、DNA・薬剤結合の幾何学について情報が得られる。ここで開発したセルを使ってアクラシノマイシンとDNAとの水溶液中における相互作用の研究を行なった。上記の流動速度勾配によってDNA分子が配向することは、そのラマン散乱テンソルの異方性から確認された。ここに更にアクラシノマイシンを添加してAγ^+レ-ザ-の514.5nm線を入射(試料点での出力30mW)し、その発光スペクトルならびにラマンスペクトルを、溶媒の水のラマン散乱を標準として用いつつ調査した。その結果、この装置は所期の目的を達成していることを知った。1.前年度に程発した流動速度勾配セルの試作品を完成した。この装置の中心は、軸を共通にする内径12mmのガラス製同筒容器と外径10mmのガラス製円柱とであるが、この両者の軸を合わせて且つその位置ならびに方向を入射レーザー光(両者の間隙に入れる)と合致させるための微調装置がついている。この微調装置は外円筒と内円柱とを互いに独立に、三方向の平行移動ならびに傾斜変更することが可能であるようにつくられている。また、内円柱は歯のついたベルトによって直流モーターと連結され、これによって回転する。回転速度はモーターにかける電圧を調節することによって可変となっている。本装置は所期の目的であるDNA+薬剤溶液のラマン.散乱や蛍光の異方性を検出する性能を有するのみでなく、糸状ミセルを形成する系の分子配置幾何学を知る上にも応用できることが知られた。ただし、後者の場合にはモーターの低速回転を安定に保つため、定電圧発生装置にもう一工夫が必要であることが判明した。2.次に、微量DNA溶液に電場をかけてラマンスペクトルを測定できる装置の開発を開始した。まずラマン顕微鏡用の液体試料は、ガラス板の中央に高さ26mm径26mmの山高帽子状のふくらみをつけた容器の内側に付着させ、ここに上部からレーザーを入射集光するのが適当であることを発見した。この発見に基き。

ガラス山高帽の内側空間を小さいゴム栓等によって密閉し、その天井に向って一対の白金電極が突出している形のセルを数種試作した。これは光学的には所期の目的を達し得ることが判明したので、これに連結すべきゲート付き矩形定電圧発生装置の製作を開始した。3.上記の開発と平行して、DNA+薬剤(アクラシノマイシン,アドリアマイシン,ポルフィリンの金属錯体)系の分光学的調査を行ない、成果を一部公表した。1.電場配向セルの試作を行こなった。山高帽子形の小さいガラス容器に小さいゴム栓様の底をつけて中の空間を密閉し、この空間の天井に接して0.3ミリメ-トルのギャップを持つ白金電極を設置し、ここに少量の試料溶液を置き、電極に100ボルト(つまり3000Volt/cm)の矩形直流電圧をかけるのがよいことを知った。2.上記の装置をラマン顕微鏡に設置して試料の異方性を偏光子を用いて測定する場合の誤差について検討した。その結果、市販の良質の偏光板は殆ど誤差の原因をつくらないこと、しかしビ-ムスプリッタ-は反射面に垂直の偏光面を持つ光を平行の偏光面を持つ光よりも余計に透過させることを知った。後者に対する補正方法を確立した。3.アクラシノマイシン・DNA結合の幾何学と、アドリアマイシン・DNA結合の幾何学がどう違うかをラマン分光学的に追究し、これをこの両薬剤の塩基配列選択性を結びつけることに成功した。その結果を第三回ヨ-ロッパ生体分子分光学会議(平成元年9月)で発表し、詳細をJ.Raman Spectroscopyに投稿した。また、アクラシノマイシンとオリゴDNAのd(CGTACG)_2との結合、および同薬剤とd(CCTAGG)_2との結合を核磁気共鳴法によって調査した。その結果、この薬剤はどちらの塩基配列でもTpA部位に挿入されるらしいことを知った。また、Cu(TMpyーP_4)と称する扁平ポルフィリン分子はDNA二重らせんのGpC部位に挿入されるが、波長426nmのレ-ザ-光で励起されるとこれがApT部位に結合することを知った。これについての詳細な報文はPhotochem.Photobiol.に投稿した。なお、ディスタマイシンとDNAの結合についても調査し、この結合に当ってディスタマイシン分子のねじれが起ることを明らかにした。
商品別貿易マトリックスの推定の多国籍・多部門計量モデルによる世界経済の実証研究

本研究は19871990年に行われた日・米2ケ国の多部門計量モデルの開発と両国間の貿易フロ-による両モデルのリンクによる各種の分析的研究の成果にもとづき、さらに拡大した先進国諸国と東アジア諸国などを対象とする36ケ国・地域の多部門世界モデルの構築と分析を目的としている。このためこれまで最も隘路とされてきた商品グル-プ別の貿易マトリックベ-タの時系列のデ-タ開発をまず行い、つぎにこれらを基礎とする部門別輸入関数を主要国について推定した。一方上記の主要諸国のマクロ経済については、旧筑波大・FAIS世界モデルを基礎に今回全面的改訂を行い、この結果得られる36ケ国・地域のマクロ計量モデルを上記の貿易デ-タによる4部門の輸入関数を通じて結合し、一体的モデルとして完成した。ただしこの場合、先進国7ケ国(G7)についてはそのマクロモデルの工業生産をさらに多部門化し(21部門)、一方上記の輸入関数についても類似の多部門化を行い、生産と輸入に関する多部門分析上の斉合性を図ることとした。上記36ケ国・地域(正確には29ケ国と7つの大陸別のその他地域)のマクロ計量モデルについては、先進国9ケ国(豪州とNZを含む)は生産能力と貨幣供給の二つの制約下での需給均衝型マクロモデルで、一方20ケ国の非先進国モデルは、生産関数による供給制約型ではあるが伸縮的需給調整を含むマクロモデルとなっている。これら諸国の主要パラメ-タ-については、共通のスペシフィケ-ションで推定されているため、生産、消費、投資、賃金、価格行動などについて興味ある比較計量分析が行われた。また、政策シミュレ-ションについては、通常の財政、金融政策のほか、エネルギ-価格、為替レ-ト調整、関税率、自主規制など多部門モデル個有の産業構造上の分析が行われ、興味ある政策的インプリケ-ションが得られている。本研究の目的は.(1)過去3ヶ年に行われた日・米両国の多部門計量モデルの開発と二国間貿易フロ-による両国経済の相互依存性の分析の成果を基礎に、その他の主要先進国とアジアNIESを中心とする品目別貿易マトリックスのデ-タベ-ス構築と輸入関数の推定を行うとともに.(2)日・米両国と比較可能な分類体系のもとで.その他の主要国(日米以外の先進国とアジアNIES等)のマクロモデルについても生産部門の多部門化(ただし主要部門のみ)を行い、これに上記の商品別貿易マトリックスを結合させて世界モデルとしての完成を図り、(3)このモデルのシミュレ-ション分析を通じて世界経済の構造変化の分析等を行うことにある。初年度の作業としては、まず品目別の貿易マトリックスの時系列デ-タベ-ス構築が行われ、特に国連の貿易統計デ-タを基礎に推計作業が行われた。周知の通り国連貿易統計はしばしば分類の変更があり、また一部欠落した時系列も存在するので、これらの部分についての調整ないし推計にかなりの時間と労力を必要とした。一方、名古屋大学木下研究分担者においてはこれら品目別貿易マトリックスに対応する各国別の輸出価格指数の推計が行われ.ほぼその大半が完成した。国連貿易デ-タに基づく品目別輸入関数の推計については、アジアNIESとアセアン諸国について行われた。主要先進国の品目別輸入関数は平成3年度前半に予定している。マクロベ-スの世界モデルである筑波大ーFAISモデルについては、デ-タの更新と国の追加が行われた。上記の生産と貿易の多部門サブモデルとの結合は平成3年度前半に行い、同年度後半にシミュレ-ション分析が行われる予定である。
溶融合金を溶媒に用いたシリコンカーバイド半導体の低温結晶成長

本研究では、次世代半導体材料として注目されるSiCの新規製造法を開発するため、溶融合金を溶媒に用いたSiCの溶液成長法に関する基礎検討を行っている。溶媒の溶融合金については高いSiC溶解度を有することが予想されたFe-Si合金を用いている。SiCの結晶成長を得る上でFe-Si-C系状態図中のSiC飽和液相領域の把握が不可欠であるため、同系の熱力学的再評価を行いそれに基づき状態図の推算を行った。その結果、従来SiCの溶液成長を行う上で注目されなかった金属成分(Fe)富化組成でSiCの飽和液相が存在し、また同液相が高いSiC溶解度を有することが予測された。そこで、Fe富化液相とSiCの平衡実験を15231723Kにて実施し、同液相中のSiC溶解度を調査した。SiCの溶解度はいずれの液相、温度においても0.1mol%以上であり、通常用いられるSi富化溶液と比較し2オーダーほど高値であったことから、溶融Fe-Si合金がSiCの溶液中高速成長を行ううえで好適な液相合金であることを明らかにした。また得られた溶解度と上述した熱力学推算結果との間に良い一致が見られたことから、本研究で再評価を行った熱力学的諸量の妥当性を検証した。さらに温度差法によるFe-Si合金を溶媒に用いたSiCの結晶成長を試みたところ、結晶成長用基板に用いたグラファイト相上にSiCの成長層が確認されたことから、溶融Fe-Si合金を用いたSiCの溶液成長法の可能性を見出した。SiCは高熱伝導率・絶縁破壊電圧を有しており、パワー半導体デバイス等への応用が期待されている。従来SiC結晶は2000K以上の高温下での気相成長法が行われてきたが、その普及促進には低コスト製造法が不可欠である。本研究では低温(1500K程度)での液相成長法による低コストSiC結晶成長を目標とする。ここでの着眼点は高SiC溶解度を有する溶媒の適用であり、SiへCとの溶解性の高いFeを加えたFe-Si合金溶媒を用いたSiC結晶成長を検討する。Fe-Si系合金溶媒からのSiC結晶成長において高成長速度を得るためには溶媒が高SiC濃度を有することが望ましいため、Fe-Si-C系状態図、特にSiCの液相面について熱力学的推算を行った。本研究で再評価したSi-C系熱力学データならびにFe-Si、Fe-C系熱力学データを用いて計算状態図を作成した結果、Fe富化Fe-Si融液(30at%)にSiC初晶領域が存在することが明らかとなり、同領域の液相は従来SiC液相成長が試みられてきた溶融SiあるいはSi基溶融合金中のSiC溶解度と比較すると、3桁ほど高い溶解度であることから、同系合金はSiC結晶成長用溶媒に好適であることが示唆された。上記Fe富化Fe-Si融液を用いた温度差法によるSiC結晶成長を試みた結果、グラファイト製の結晶成長用基板上へのSiCの晶出が確認され、金属富化溶媒を用いたSiC結晶成長の可能性を見出した。また溶媒中のSiC溶解度がより大きい場合、あるいは溶媒中温度勾配が大きい場合SiC結晶の分布量、結晶粒サイズともに大きい傾向を示したことから、溶液成長過程では溶媒中溶解度と温度場が重要因子となることが明らかとなった。現時点では用いた基板が多結晶グラファイト製であったため成長結晶は多結晶であるが、今後SiC結晶を成長用基板に用いることでエピタキシャル成長を目指す予定である。
胚体外細胞系列への細胞運命決定機構とヒト胎盤由来幹細胞の樹立

胎盤は受精後、胚体細胞系列と胚体外細胞系列に最初の分化が起こる組織である。胎盤組織へと分化する栄養外胚葉は、胚盤胞期にCdx2の発現亢進とOct3/4の発現低下により、胚体組織より分化し、細胞運命が決定する。本研究では、トロホブラスト幹細胞(TS細胞)を用い、Cdx2の発現調節する分子機構として、DNAメチル化及びヒストン修飾に着目した。その結果、TS細胞への分化にはエピジェネティックな分子機構が作用する事を明らかにした。胎盤は受精後、胚体細胞系列(内部細胞塊: ICM)と胚体外細胞系列(栄養外胚葉: TE)に最初の分化(細胞運命決定)が起こる。胎盤組織へと分化するTEは、胚盤胞期にCdx2の発現亢進とOct3/4の発現低下により、胚体組織より分化し、細胞運命が決定する。本研究では、胎盤幹(TS)細胞を用い、Cdx2遺伝子のエピジェネティックな分子機構と分子間相互作用について解析する事を目的とした。本年度は、まず一過性に遺伝子発現を抑制するCdx2遺伝子のノックダウンTS細胞(3株)を用いて、未分化TSマーカー遺伝子(ErrB, Eomes)の発現解析を行なった。その結果、いずれも発現量は20%以下に減少した。両遺伝子のプロモーター領域について、メチル化の解析を行ったところ、TS細胞に比べ高メチル化状態を示した(平均値:78.2%)。ノックダウン効率は約40%であったが、細胞形態に大きな変化はみられなかった。次に、永続性に遺伝子発現を抑制するCdx2遺伝子のノックダウンTS細胞株(3株)を樹立した。2種類の未分化TSマーカー遺伝子の発現量は減弱し、ヒストン修飾も活性型(抗ヒストンH3-K(リジン)9とH3-K14のアセチル化および抗H3-K4のジメチル化抗体)で有為な変化を認めた。一方、非活性型ヒストン修飾には、ほとんど変化はみられなかった。さらに、Oct3/4遺伝子強制発現TS細胞株(2株)でも同様な傾向を示した。これらの結果より、TSの分化過程には、Cdx2遺伝子のエピジェネティックな分子機構を介した遺伝子発現が作用する事が示唆された。動物の種により胎盤組織構築は多様性を有するが、その機能、発生機序は共通である。すなわち、胎盤は母体と胎児間で栄養交換を司る器官であり、受精後、胚盤胞では、胚体細胞系列(内部細胞塊: ICM)と胚体外細胞系列(栄養外胚葉: TE)に最初の分化(細胞運命決定)が起こる。両者は、同じゲノム配列を持つにも関わらず、全く異なる細胞系譜を辿る。胎盤組織へと分化する胚体外組織(TE)は、胚盤胞期にCdx2の発現亢進とOct3/4の発現低下により、胚体組織より分化し、細胞運命が決定する。胎盤幹(TS)細胞は、胚体外細胞系列から樹立した未分化細胞で、容易に胎盤構成細胞への分化が可能な細胞である。本研究では、TS細胞を用い、Cdx2遺伝子のエピジェネティックな分子機構と分子間相互作用について解析する事を目的とした。均一な細胞集団で未分化なTS細胞を用いて、Cdx2遺伝子プロモーター領域のDNAメチル化とヒストン修飾について解析を行なった。DNAメチル化の解析はBisulphite-PCR法を用いて解析し、PCR領域内の全てのメチル化部位について解析した。その結果、Cdx2遺伝子のプロモーター領域のDNAメチル化を解析したところ、低メチル化状態でヒストン修飾も活性型で有為な変化を認めた。反対に胎児性幹細胞(ES)では、高メチル化状態とヒストンの不活化を維持していた。この結果はメチル化阻害剤やヒストン阻害剤を添加して、再確認した。この結果より、ESとTSの分化過程には、Cdx2遺伝子のエピジェネティックな分子機構が作用する事が示唆された。上記の如く、平成23年度の研究実施計画であるin vitroにおける「胚体外細胞系列分化へのCdx2遺伝子の分子機構の解明」はほぼ予定通り終了した。一過性および永続性に、遺伝子発現を抑制するCdx2遺伝子のノックダウンTS細胞とOct3/4遺伝子強制発現TS細胞株を樹立し、「TS細胞におけるCdx2遺伝子の機能解析と分子間相互作用」を明らかにしていく計画である。TS細胞におけるOct3/4遺伝子とCdx2遺伝子の分子間相互作用:(1)Oct3/4強制発現用ベクターの作製とTS細胞への遺伝子導入:Oct3/4遺伝子cDNAをRT-PCRで合成し、強制発現用ベクター(pcDNA)にクローニング。Electropolation法を用い、TS細胞株にトランスフェクションし、強制発現細胞株を樹立。Oct3/4蛋白の発現はウェスタンブロッティングによって確認。(2)Oct3/4強制発現TS細胞株の細胞特性:Oct3/4強制発現TS細胞株の細胞形態変化とコロニー形成能の解析。

また、TS特異的未分化遺伝子マーカー(Eomes, Id2, ErrB)の発現量を解析。(3)Cdx2遺伝子の発現およびエピゲノム解析:複数のOct3/4強制発現TS細胞株を用い、Cdx2遺伝子の発現およびエピゲノム解析、DNAメチル化とヒストン修飾を行なう。また、このTS細胞株は分化誘導し、細胞形態、巨細胞の出現の有無とTS特異的分化遺伝子マーカー(4311,mash2,Pl-1)の発現量の比較を行なう。(1)ヒト未分化胎盤絨毛細胞へヒトCDX2遺伝子の導入:これまでの研究成果より、FACSを用い、ヒト未分化胎盤絨毛細胞(SP細胞)の分離に成功。至適培養条件を確立するため、ヒトCDX2遺伝子を遺伝子導入。これまでの予備実験より、このSP細胞は、遺伝子導入効率は極端に悪く、細胞数も少ないため、胚体外細胞系列に特異的に遺伝子導入可能なレンチウイルスベクターを用いる(2)ヒトTS細胞樹立の確認:ヒトTS細胞株でGATA2,CBFBの発現がみられ、TAL1, Klk-1の発現がないことにより、組織特異性に関しても確認。染色体異常についてはG-band法にて解析。また胎盤ホルモン(ヒト胎盤性ゴナドトロピン、ラクトーゲン)の産生をELISA法にて測定。
白血球のNADPH(O_2^-生成)酵素の研究

白血球は細胞膜にNADPHを基質としてスーパーオキサイド(O_2^-)を生成する一種の電子伝達系が存在する。この膜内電子伝達因子には諸説がある。この点を明らかにするために、無損傷の活性中心(フラビン及びヘム蛋白)をもつ標品を分離し、電子伝達反応のKinetics及び物理化学的性質を明らかにする必要がある。この状件を満す標品を、粒状ゲルを用いた。調製用平板等電点電気泳動法に改良を加えて分離した。(1)フラビン酵素(pl5)の分離と電子伝達反応:NADPHの電子受容体と考えられるフラビン酵素がpl5.0に集まり、分子量が約70KDaであることを確認した。このフラビン酵素は、チトクロムCに直接電子を渡し酵素との反応性は低く、チトクロムCペルオキシダーゼ(CCP)とH_2O_2との複合体生成反応で測定したKmO_2は、70134MMとなり、膜レベルのNADPH(O_2^-生成)酵素のKmO_2の67MMの10倍高い値を示した。従って、膜内ではフラビン酵素は、酸素とは直接反応しないと考えられる。(2)チトクロムb558の分離及びESRスペクトル:等電点電気泳動のアンホラインの状件を変えることにより、チトクロムb558のヘム部位の変性なしに、分離できる状件を見出した。このチトクロムb分画を濃縮し、ESRスペクトルを液体ヘリウム温度可変装置を用いて測定した。そのスペクトルは、以前に報告したHigh Spinのシグナルは見られず、またヘム変性に伴って生ずるg=4のシグナルを極力小さく抑えることにより、近接するg=3領域のLow Spinのヘムのシグナルの検出に成功した。以上の結果、白血球膜内のNADPH(O_2^-生成)酵素系に存在するチトクムロb558は、ミエロペルオキシダーゼやヘモグロビンなどのHigh Spin型とは異なるLow Spin型ヘムであり、この酵素系がシアンや一酸化炭素で阻害されない特徴と、理論的には一致することが明らかとなった。白血球の活性酸素生成酵素(NADPH oxidase)は,その活性基種について諸説があるが,膜のNADPHoxidaseを可溶化し,等電点電気泳動より分離したpI5.0分画が, NADPHoxidase固有の諸性質を示すFAD酵素であることを明らかにした.本年は,このFAD酵素のNADPH及びO_2との反応を明らかにするために, pI5.0分画の大量分離法を確立した.方法は,粒状ゲルの調整用平板等電点電気泳動(LKBマルチフォーII)を用いた. FAD酵素の収率を上げるために,泳動中のゲル内温度を低温(1.5°C)に維持し,そのために低温下でもCMC値の変化しない界面活性剤を用いて,泳動方法に諸改良を行って分離した.白血球は細胞膜にNADPHを基質としてスーパーオキサイド(O^-_2)を生成する一種の電子伝達系が存在する。

この状件を満す標品を、粒状ゲルを用いた、調整用平板等電点電気泳動法に改良を加えて分離した。(1)フラビン酵素(Pl5)の分離と電子伝達反応:NADPHの電子受容体と考えられるフラビン酵素がPl5.0に集まり、分子量が約70KDaであることを確認した。このフラビン酵素は、チトクロムCに直接電子を渡し酵素との反応性は低く、チトクロムCペルオキシダーゼ(CCP)とH_2O_2との複合体生成反応で測定したKmO_2は、70134μMとなり、膜レベルのNADPH(O^-_2生成)酵素のKmO_2の67μMの10倍高い値を示した。従って、膜内ではフラビン酵素は、酵素とは直接反応しないと考えられる。(2)チトクロムb_<558>の分離及びESRスペクトル:等電点電気泳動のアンホラインの状件を変えることにより、チトクロムb_<558>のヘム部位の変性なしに、分離できる状件を見出した。このチトクロムb分画を濃緒し、ESRスペクトルを液体ヘリウム温度可変装置を用いて測定した。そのスペクトルは、以前に報告したHigh Spinのシグナルは見られず、またヘム変性に伴って生ずるg=4のシグナルを極力小さく抑えることにより、近接するg=3領域のLow Spinのヘムのシグナルの検出に成功した。以上の結果、白血球膜内のNADPH(O^-_2生成)酵素系に存在するチトクロムb_<558>は、ミエロペルオキシダーゼやヘムグロビンなどのHigh Spin型とは異なるLow Spin型ヘムであり、この酵素系がシアンや一酸化炭素で阻害されない特徴と、理論的にも一致することが明らかとなった。
金属錯体の酸化状態評価に関する共鳴ラマンスペクトルの応用

本研究では、混合原子価複核錯体における混合原子価状態中での電子の非局在化の過程を調べる方法を確立することを目的とし、β-ジケトナルテニウム単核錯体の電解共鳴ラマンスペクトルを測定し、ルテニウムの酸化状態とルテニウム-酸素(β-ジケトナト)の伸縮振動との関係を検討した。1.β-ジケトンとしてアセチルアセトン(2,4-pentanedione;Hacac)及びジピバロイルメタン(2,2,6,6-tetramethyl-3,5-heptanedione;Hdpm)を選び、電解共鳴ラマンスペクトル測定用試料として[Ru(acac)_n-(dpm)_<3-n>]の一連の錯体を合成した。又、比較として、鉄錯体の系列の合成を行った。2.電解しながら電子スペクトルを測定するための電解セルを作製し、各錯体の電子スペクトルを測定して共鳴ラマンスペクトルの共鳴条件の検討を行った。その結果、アルゴンイオンレーザーによる励起波長(514.5nm)を用いれば、Ru^<II>,Ru^<III>,Ru^<IV>の何れの錯体においても前期共鳴ラマン散乱することがわかった。3.電解しながら共鳴ラマンスペクトルを測定するための電解ラマンセルを作製し、各錯体の共鳴ラマンスペクトルの測定を行った。その結果、金属-配位酸素原子の伸縮振動はRu^<II>→Ru^<III>→Ru^<IV>と変化するに従って、高波数側にシフトすることを見いだし、これを指標とした金属の酸化状態を知るための尺度を完成した。この結果は、現在論文投稿準備中である。現在、複核錯体の単結晶の調製、電解電子スペクトル及び電解ラマンスペクトル測定を継続中である。
ムチランス型慢性関節リウマチの滑膜細胞内破骨細胞活性化因子の解析

ムチランス部位より採取した滑膜組織中より破骨細胞活性化作用を有し、約1kDの分子量を持つ活性蛋白質の存在を強く疑う研究結果を得たため、第41回日本リウマチ学会、および第61回アメリカリウマチ学会にてすでに報告した。本研究では上記因子が全く未知の蛋白である場合は精製し構造を決定することを目的とし研究を開始した。この因子はムチランス変形を呈する関節より採取した滑膜細胞の培養過程上で一過性に出現した蛋白であり、この蛋白の分子量、および生化学的特性を上記の学会において報告したところ大きな反響を得た。その後、ムチランス型慢性関節リウマチ患者膝関節から全人工膝関節置換術施行時に滑膜組織を採取し培養した。培養開始一週後、培養上清を採取し濃縮後セファデックスG-15カラムにてゲル濾過し、分子量勾配に従って再び採取したサンプルを準備した。このサンプルを象牙片上に培養した破骨細胞に添加し、非添加の破骨細胞と吸収孔形成能を比較検討した結果、添加した破骨細胞は非添加の平均で約3倍の吸収孔を形成した。次に吸収孔形成の促進作用が認められるサンプルチューブを電気泳動法にかけ、含有する物質の分子量を確認したが、0.5kDから12kDまで約6種類のピークを示した。それぞれのピークからフラクションを採取し、先ほどと同様に破骨細胞の吸収孔形成能に及ぼす影響を確認したところ、分子量が約1kDの蛋白を含むフラクションは吸収孔形成能を他のフラクションやコントロールと比較し有意に促進させた。そこでこのフラクション中の蛋白をDE52カラムを用いて、電気極性にてさらに細分化したサンプルを破骨細胞に投与し、再度吸収孔形成能を確認した結果、この活性化因子の蛋白を含むと考えられるフラクションを抽出することができた。加えて、逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて抽出したフラクションから蛋白を分離し、得られた3つのピーク部分の蛋白をそれぞれ再度破骨細胞に添加した結果、その内の1つに破骨細胞に対する吸収孔形成能活性化作用が確認できた。最後にこのピーク部分から得られた蛋白をgas-phaseプロテインシークエンサーを用いてアミノ酸配列を決定することを試みたが、蛋白構造の確定には至らなかった。申請者のグループは、当研究室における一連のムチランス型リウマチの発生機序に関する研究成果を詳細に検討し、且つ、研究の予備段階から抱いていた以下についての疑問、すなわち、(1)ムチランス変形の速度は急速に進行する時期と緩徐な時期があり一定の速度で推移するものではないのではないか。(2)ムチランス変形を呈する患者であっても全ての関節が一様の変化を示すのではなく、骨硬化像を呈する場合もあり得るのではないか。(3)ムチランス変形の発生機序を局所のサイトカイン濃度が高いというだけで説明することは不可能ではないか。以上の3点を更に考慮し、現在も研究は進行中である。そして、我々は本期間中に以下の結果を得た。(a)ムチランス部位より採取した滑膜細胞の培養開始一週後、培養上清を採取し濃縮後セファデックスG-15カラムにてゲル濾過し、分子量勾配に従って再び採取したサンプルを準備した。象牙片上に培養した破骨細胞に準備したサンプルを添加し、吸収孔形成への影響を測定したところ、コントロールと比較し有意に骨吸収が亢進した。

(b)吸収孔形成の促進作用が認められるサンプルチューブを電気泳動法にかけ、含有する物質の分子量を確認したところ、1kDの破骨細胞活性化機能を有する活性蛋白質を確認した。(c)DE52カラムを用い、電気極性にてさらに含有蛋白を細分化し精製した後再度破滑細胞培養系に添加し、破骨細胞活性化作用を確認した。以上の結果、我々は、ムチランス部位より採取した滑膜組織中より破骨細胞活性化作用を有し、約1kDの分子量を持つ活性蛋白質の分離に成功し、この因子の作用はIL・1RAや抗GP130中和抗体等の破骨細胞活性化サイトカインの阻害薬で抑制を受けなかった。これらの事実より、ムチランス型急速骨吸収はこの活性蛋白質の発現による破骨細胞活性化を介して発生する可能性が示唆された。ムチランス型リウマチの発生機序に関して当教室における現在までの研究成果と今回の本研究の結果を詳細に検討した結果、研究の予備段階から抱いていた以下についての疑問、すなわち、(1)ムチランス変形の速度は急速に進行する時期と緩除な時期があり一定の速度で推移するものではないのではないか。(2)ムチランス変形を呈する患者であっても全ての関節が一様の変化を示すのではなく、骨硬化像を呈する場合もあり得るのではないか。(3)ムチランス変形の発生機序を局所のサイトカイン濃度が高いというだけで説明することは不可能ではないか。以上の3点について若干の方向性を見いだすことができたが、研究は現在も進行中である。前期および本期間中に以下のような結果を得た。(a)ムチランス部位より採取した滑膜細胞の培養開始一週後、培養上清を採取し濃縮後セファデックスG・15カラムにてゲル濾過し、分子量勾配に従って再び採取したサンプルを準備した。象牙片上に培養した破骨細胞に準備したサンプルを添加し、吸収孔形成への影響を測定したところ、コントロールと比較し有意に骨吸収が亢進した。(c)DE52カラムを用い、電気極性にてさらに含有蛋白を細分化し精製した後、再度破滑細胞培養系に添加し、破骨細胞活性化作用を確認した。
分子磁性体における双安定性の構築とその制御

無機物と有機物の中間に位置するような環状チアジルラジカルを研究対象に選び、新規物性開拓に努めた。その結果、誘導体TTTAにおいて常磁性-反磁性双安定性の光および圧力制御に成功し、高い転移温度をもつ有機強磁性体BBDTA塩を得ることができた。研究期間の後半には、局在と非局在電子系の狭間で見られるような、BDTA塩において配位子-対イオン変換を伴う電荷移動相転移の発見し、NT塩では電荷秩序状態における非線形電気伝導の発現を見出した。そのほか、チアジアゾール環をもつポルフィラジン化合物において、自己集積薄膜の作製に成功し、電気化学ドーピングによってエレクトロクロミズムや電気伝導度の著しい上昇を見出した。一方、単分子磁石の研究では、Mn12の化学修飾によってその磁気異方性の起源に対して分子論的な洞察を与えたほか、研究を大きく展開し、このようなクラスター錯体が2次電池の活物質となることを実証した。さらに、サブミクロン中空球殻磁性体の合成に挑戦し、500nm程度のポリスチレン・ビーズをテンプレートとし金属水酸化物を表面に均一沈殿させ、その後水素下あるいは空気中でか焼することによって、hcp-およびccp-Co、α-Fe、α-Fe_2O_3(ヘマタイト)、Fe_3O_4(マグネタイト)など、様々な磁性体においてこの構造を実現した。温度に著しく依存する保磁力など、特異な磁性を見出すことができた。磁性素材とは無縁のものと思われていた有機物質に強磁性的性質を付加しようとする分子磁性研究が、我が国で独創的な進歩を遂げた。このような静的な強磁性を追い求めた研究が一段落した今、分子磁性体の最大の特異である動的特性を突詰め、次世代の分子メモリーやスイッチへの展開を模索すべき段階に到達している。環状チオアミルラジカルの磁性と構造、光物性を検討した。これまでの研究により、TTTAと呼ばれる議導体が、常磁性高温相と反磁性低温相の間で相転移し、しかも室温を含む大きなヒステリシスループをもつことを既に報告している。室温で両相を安定に単離することができ、磁気的双安定性をもつ。本研究では、470nmのパルスレーザー光照射によって、室温で低温相から高温相への相転移が誘起されることを見出した。このような光誘起相転移は、遷移金属錯体などにおいて観測例はあるものの、TTTAのような有機ラジカル結晶で見出されたのはこれが初めてである。ナノスケールの物質開拓が盛んに行われている。強磁性体の場合、その性質は磁性体の形状に著しく依存することが知られており、したがって、サブミクロンスケールで磁性体の形状を制御する研究が、基礎としても応用としても大変重要である。硝酸銅水溶液を尿素で塩基性にすることによって、ポリスチレンビーズの表面を、塩基性炭酸銅で均一にコートできることが報告されている。本研究では、この手法を用いることによりナノ球穀磁性体を合成した。中心金属としてコバルトを選び、塩基性炭酸コバルトを均一沈殿させた。これを水素気流下でか焼することによって、直径500 nm、厚み40 nm程度のナノ球殻形状のコバルト金属磁石をつくることができた。粉末X線回折を測定したところ、fcc相であることが分かった。得られた試料は室温で強磁性を示し、その温度以下で磁化曲線の温度変化はほとんどなかった。分子磁性体とナノ磁性研究の橋渡しをする目的で、以下の研究を遂行した。単分子磁石研究においては、Mn12の磁気特性や量子効果の起源を探るため、Mn11Crを合成し、磁気特性を調べた。構造解析やX線吸収スペクトルによってCrサイトを特定し、磁性との相関を調べたところ、Mn12と非常に近い磁気構造を持つことが分かった。Mn12/Mn11Cr混晶を用いることにより、両者の磁化の個別制御や、トンネル効果にバイアスされた量子磁化トンネリングを見出した。

分子磁性体が溶媒中で合成されるという利点を生かし、ポリスチレン・ビーズの表面に、均一に球状のナノ球殻分子磁性体を沈殿させ、さらにそれを〓焼させてナノ球殻磁石の合成した。硝酸コバルトを原料にして、加水分解反応によって塩基性炭酸コバルトをポリスチレン(直径500nm)表面に沈殿させた。電子顕微鏡で確認したところ、厚みが40nm程度でほぼ均一にコーティングが成されていた。これを、空気中あるいは水素気流下で〓焼することによって、それぞれナノ球殻形状の酸化コバルト(Co_3O_4)とfcc金属コバルトをつくることができた。バルクのCo_3O_4は反強磁性体として知られているが、得られたナノ形状磁性体の場合、転移温度以下で格子欠陥上のスピンに起因すると考えられる、大きな自発磁化が観測された。今年度は、環状チアジルラジカルの物性探索を中心に研究を進めた。その結果、電子移動が関与するいくつかの興味深い特性を見出すことができた。チアジルラジカルBDTAについて、BDTA_2[Co(mnt)_2]なる2:1塩を合成した。室温ではBoTA^+と[Co(mnt)_2]^<2->のような状態に近いが、温度を減少とともに、230KでBDTAから[Co(mnt)_2]へ1電子移動する一次相転移を見出した。両分子のg値の違いにより、磁化率の温度依存性は顕著な飛びを見せる。両相の結晶構造解析を行ったところ、低温相では、電荷移動が生じる分子間で配位結合が形成されることが分かった。これは、BDTAのカウンターカチオンおよび配位子としての相反性を反映したもので、どちらの特性が優先されるかはBDTA上の電荷によって規定されることを示している。電荷移動相転移はこれまでもいくつかの系で見出されてきたが、このような配位結合形成を伴う現象は初めてのことである。ナフタレン環の両側にジチアゾール環を有するNTは、NT_3[GaCl_4]なる3:1塩をつくる。室温で結晶構造解析を行ったところ、多次元的は分子ネットワークの中で顕著な電荷の不均化が見出された。さらにパルス電源を用いて電流-電圧曲線を測定したところ、著しい非線形性を見せ、大きな負性抵抗現象が出現した。室温で、このような特性が観測される有機系はきわめて特異で、しかもその閾値は、既存の物質に比べて一桁近く低かった。将来の有機エレクトロニクスへの展開に向け、きわめて有益な系を得ることができた。その他、チアジアゾール環をもつポルフィラジン誘導体の薄膜作成についても成功した。強い電子相関と電子-格子相互作用を持ち合わせる強相関強結合系として知られている環状チアジルラジカルについて、錯体合成ならびに物性開拓を行った。NTと呼ばれる分子についてNT_3(GaCl_4)なる3:1錯体の合成に成功し、その結晶構造解析を行ったところ、電荷の異なる4つのNT分子が2次元正方格子をつくり、それが強くπスタックした構造が見られた。これは、強相関系に特徴的な電荷秩序状態の形成を意味しており、このため室温で半導体特性を示した。この状態にパルス電場を印加して電流-電圧曲線を測定したところ、電圧増にともなう爆発的な電流増加を意味する負性抵抗現象を観測することができた。てれは、電荷秩序状態の部分融解に起因すると考えられるが、室温、低電場で現れるという新規性があり、有機エレクトロニクスへの展開を大いに期待させる。さらに電場下のEPR測定を実施したところ、電場印加とともに、線幅の増加なく吸収強度は著しく減少することが分かった。
ポリマー・アーキテクチャにもとづく高選択性抗菌剤の開発

本研究課題では、耐性菌の発生を誘導しにくい天然の抗菌ペプチドの構造及び作用機構にヒントを得てポリマー分子を設計し、ポリマー骨格構造を厳密にチューニングすることで、高抗菌活性かつ低毒性な抗菌ポリマーの開発を行った。その結果、ポリマーの有する分子構造の違いにより、細胞膜との相互作用様式が変わることがわかった。また、細胞膜との相互作用を制御することで抗菌活性および生体毒性を最適化できることを明らかにした。本研究課題では、耐性菌の発生を誘導しにくい天然の抗菌ペプチドの構造及び作用機構にヒントを得てポリマー分子を設計し、ポリマー骨格構造を厳密にチューニングすることで、高抗菌活性かつ低毒性な抗菌ポリマーの開発を行うことを目的とした。本年度は、具体的に以下の研究を実施し、成果を得た。q)抗菌ポリマーライブラリの作成アミノ基をはじめとするカチオン性側鎖を有する各種両親媒性ポリマーの設計を行った。はじめに側鎖構造にバリエーションを付与するため、新規なモノマーとして各種メタクリレート誘導体を合成した。得られたモノマーを元にポリマーを合成し、ライブラリ化を行った。(2)抗菌活性及び溶血毒性の評価得られたポリマーの生物活性として、抗菌活性及びほ乳類細胞に対する毒性を評価した。具体的には、大腸菌を用いた最小発育素子濃度(MIC)の測定及び全血を用いた溶血毒性試験を行った。抗菌ポリマーの生体活性は、カチオン性側鎖の構造のみならず、ポリマーの分子量や親疎水性に依存することがわかった。(3)作用メカニズムに関する物理化学的検討モデル細胞膜として、リン脂質ベシクル(リポソーム)を用いて物理化学的観点から作用機構の検討を行った。具体的には、蛍光色素内包リポソームを用いた膜破壊試験のほか、細胞サイズベシクル(ジャイアントベシクル)の形態変化についても観察することで、抗菌ポリマーと脂質膜の相互作用に関して多角的に評価を行った。モデル細胞膜との相互作用機構は、実際の生物活性とよい対応関係がみられ、適切な評価システムであることが明らかになった。(1)抗菌活性の有効範囲評価と新規モデル系の構築細菌の種類に応じて細胞膜の有する脂質組成が異なることが知られている。そこで、本研究で開発する抗菌ポリマーの有効範囲と作用機構を検討するため、異なる種類の細胞膜を模倣したリポソームを用いて評価を行った。また、より詳細に作用機構を検討するためのモデル系として、脂質ナノディスクを新規に開発し、ポリマーとの相互作用評価を行い、有効性を検証した。(2)細胞毒性に関する詳細な検討細胞毒性に関する検討として、これまでの溶血試験に加えて、ジャイアントベシクルを用いたモデル系による検討を重点的に行った。赤血球を模倣した脂質組成を有するジャイアントベシクルを用いて評価したところ、高い溶血毒性を示すポリマーは膜構造を破壊したのに対して、低毒性なポリマーは膜の概乱効果が極めて低いことが明らかになった。これらの知見から、毒性低減を行うためのポリマー分子の設計指針を得た。(3)ポリマー構造の最適化前年度までに得られた成果をもとにポリマー構造の最適化をおこなった。具体的には、細胞膜と相互作用することで、脂質膜の超分子構造である脂質ドメインの形成を誘導するポリマーの設計・合成を行った。結果、従来の抗菌性材料や天然の抗菌ペプチドと比較して極めて高い抗菌活性を有するものの、溶血毒性を全く示さない抗菌性ポリマーの開発に成功した。
MHCクラスIIによるフリーMHCクラスIの発現制御機構と機能の解明

私どもはMHCクラスII(HLA-DRαβ)がβ2-microglobulinに会合していないFree-MHCクラスI(HLA-A,B,C)の発現を制御していることを、NKレセプターによる認識機構の解析中に発見した。多くのMHCクラスIはβ2-microglobulinに会合して細胞表面に発現しているが、β2-microglobulin欠損マウスの解析や、β2-microglobulin free MHCクラスI特異的抗体などにより、ある種の細胞には、β2-microglobulinに会合していないMHCクラスIがかなりの量で発現し、そのようなFree MHCクラスIに対するCTLが誘導されることも報告されている。また、HLA-B27は多発生硬化症の原因遺伝子として知られているが、HLA-B27もFree MHCクラスIとして発現したものが多発生硬化症の発症に関与していると考えられている。従って、私どもの発見したMHCクラスIIによるFree MHCクラスIの発現機構は、今までに知られていない全く新たな免疫制御機構として重要であると考えられる。そこで、本研究では、MHCクラスIIによるFreeMHCクラスIの発現誘導の分子機構の解明、さらにMHCクラスIIによって誘導されたFree MHCクラスIの免疫応答における機能の解析を行った。その結果、MHCクラスIIによって発現が誘導されたクラスIにも抗原提示能があること、さらに、通常のMHCクラスIとは異なる抗原を提示している可能性等が明らかになった。