hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大脳基底核の刺激が咀嚼筋トーヌスを亢進させるメカニズムの解析

筋運動の最終共通路である運動ニューロンに対して種々のレベルの情報が勝手気ままな出力を要請してくる。それを整理統括するためには、どこかで強力な抑制をかけるしか方法がない。大脳基底核はそのような抑制機構として出現したと考えられる。Hikosaka & wurtz(1985)は覚醒サルの黒質網様部へのGABA agonist、muscimolの微量注入により、反対側視野の特定領域に向かうサッケードが高頻度で起こることを示した。2年度にわたる本科研補助金交付期間に、筆者は軽麻酔ラットに組織学的同定法と組み合わせた連続微小電気刺激法を用いて、興奮性顎筋活動を誘発する大脳基底核領域の特定を試みた。その結果、Bregmaの後方0.33.3mm、外側2.53.5mmの範囲内のほぼ同じ深さに顎筋活動誘発部位が多数存在することが判明した。誘発される顎筋活動の性質および組織学的同定から、これらの部位は線条体、淡蒼球、脚内核、大脳脚(内包)に分かれた。つづいて、1本の電極で微小電気刺激と微小化学刺激の可能なelgiloy微小電極内蔵型微小ガラス管を軽麻酔ラットの脳内にstereotaxicに挿入し、微小電気刺激により顎筋に誘発される特徴的なEMG活動を指標に基底核出力部の脚内核に導いたのち、脚内核へのGABAまたはmuscimolの微量注入により、同側顎二腹筋に持続性burst活動、あるいは4050Hzの持続性motor unit発射活動が起こることを明らかにした。このメカニズムは、脚内核に局在するGABA作動性抑制性ニューロンのautoreceptorにGABA agonistが作用し、その高頻度自発性発射活動が抑制される結果、顎筋premotor neuronの持続性抑制の解除、つまり脱抑制(disinhibition)によると考えられる。誘発される顎筋活動が同側性優位であることから、上丘を経由することなく、脚内核から直接に網様体を経て顎筋に至る下行路の関与が推測された。頚髄を切断した成熟SDラットにおいて、Bregma付近の大脳皮質を露出後、ガラス被覆エルジロイ微小電極を大脳基底核内に降ろしてゆき、99μm毎に連続微小刺激(持続0.2ms,40μA,333Hzの40発パルス)を2.5秒おきに与え、刺激に同期した咀嚼筋EMG活動を誘発する部位を探索した。特徴的な部位には電極に直流通電してFe-markingを施し、実験後刺激部位を組織学的に固定した。同一ラットにおいて、Bregmaを基準に吻尾および内外方向に0.5mm間隔でmappingを行った結果、Bregmaの後方0.33.3mm、外側2.53.5mmの範囲内のほぼ同じ深さに顎筋活動誘発部位が多数見いだされた。誘発される顎筋活動の性質および組織学的同定から、これらの部位は線条体、淡蒼球、脚内核、内包の四つに分かれた。Hikosaka&Wurts(1985)は覚醒サルの黒質網様部へのGABA agonist、muscimolの微量注入により、反対側視野の特定領域に向かうサッケードが高頻度で起こることを示した。

今回、我々は1本の電極で微小電気刺激と微小化学刺激の可能なelgiloy微小電極内蔵型微小ガラス管を軽麻酔ラットの右側大脳にstereotaxicに挿入し、微小電気刺激により顎筋に誘発される特徴的なEMG活動を指標に脚内核に導いたのち、脚内核へのGABAまたはmuscimolの微量注入により、同側顎二腹筋に持続性burst活動、あるいは40-50Hzの持続性motor unit発射活動が起こることを明らかにした。このメカニズムは、脚内核に局在するGABA作動性抑制性ニューロンのautoreceptorにGABA agonistが作用し、その高頻度自発性発射活動が抑制される結果、顎筋premotor neuronの持続性抑制の解除、つまり脱抑制(disinhibition)によると考えられる。誘発される顎筋活動が同側性優位であることから、上丘を経由することなく、脚内核から直接に網様体を経て顎筋に至る下行路の関与が推測される。
MRI三次元データを用いた頭蓋内仮想内視鏡法の開発

まず平成11年度は、脳槽内仮想内視鏡に用いる撮像法の基礎的な検討と臨床応用の可能性について検討した。基礎的研究では、CISS法の特性を調べるためファントムを用いた検討を行い、単純および造影CISS法ともに60-70度のフリップ角が最適という結果を得た。CISS法により得られたデータをDICOM3.0でワークステーションに転送し、perspective volume-renderingalgorithmを用いてデータを処理することにより脳室、脳槽内の仮想内視鏡が実現した。この脳槽内仮想内視鏡では、後頭蓋窩内の脳神経や脳室などの複雑な構造をこれまでの画像で得ることのできなかった新しい三次元画像として表示することが可能であり、頭蓋内正常構造の理解を深めるための教育目的に応用可能であると考えられた。引き続き平成12年度は基礎的実験で得られた最適パラメータを有するシーケンスを用いて、神経血管圧迫やその他の様々な疾患、すなわち三叉神経痛、片側顔面神経痙攣、前庭神経鞘腫、鞍上部腫瘍、下垂体性小人症、側脳室壁の多発性病変例などに応用した。神経血管圧迫の症例では、複雑な神経と血管との関係を3次元的に描出する事が可能で、三叉神経や顔面神経を血管が圧迫している様子が明瞭に描出された。CISS画像を用いたため動脈による神経圧迫のみでなく、静脈による神経血管圧迫も描出できた。ほかの脳槽および脳室内の腫瘤性病変では、腫瘤と周囲の脳組織・脳神経などの構造との関係が遠近感を持った立体的3次元画像として描出された。そのほか、血管内仮想内視鏡の臨床応用も試み、正常血管内腔および動脈瘤などの異常な血管内腔の観察を行った。このような仮想内視鏡の画像は術前のシミュレーション、患者およびその家族への説明などに充分応用可能と考えられた。平成11年度は脳槽内仮想内視鏡に用いる撮像法の基礎的な検討と脳槽内仮想内視鏡の臨床応用の可能性について検討した。基礎的研究では、constructive interference in steady state(CISS)法の特性を調べるためファントムを用いた検討を行った。その結果、水の信号強度および造影剤に対する信号強度の変化から、単純および造影CISS法ともに60-70度のflip angleが最適と思われた。また、CISS法により得られたデータを外部コンピュータを用いてPACSnetからDICOM3.0に変換し、外部ワークステーションに転送した。このワークステーションに搭載されたperspectivevolume-rendering algorithmを用いてデータを処理することにより脳室、脳槽内の仮想内視鏡が実現しこれまでの画像で得ることのできなかった新しい3次元的な情報を得ることが可能となった。この脳槽内仮想内視鏡では、後頭蓋窩内の脳神経や脳室などの複雑な構造を三次元的に表示することが可能であった。動眼神経、顔面神経、聴神経、外転神経などが脳槽内を走行する様子が明瞭に描出され、脳幹からの神経の分岐部の状態や血管との関係が立体的に表現された。脳室系では脳室内からの観察が可能であり、Monro孔や第3脳室底の立体像が得られた。正常の生理的な位置関係を保ったままで、脳槽内の細かな構造物を観察することが可能であり、頭蓋内正常構造の理解を深めるための教育目的、術前のシミュレーションに応用可能であると考えられた。今後の問題点としては、CISS法において脳脊髄液の流れに伴うartifactが存在することと、元画像と比して分解能が低下していることがあげられる。

平成11年度において、脳槽内仮想内視鏡に用いる撮像法の基礎的な検討と脳槽内仮想内視鏡の臨床応用の可能性について検討し、constructive interference in steady state(CISS)法の特性を調べるためファントムを用いた検討を行ったが、平成12年度は基礎的実験で得られた最適パラメータを有するシーケンスを用いて、臨床例への応用を試みた。CISS法により得られたデータを外部コンピュータを用いてPACS netからDICOM3.0に変換し、外部ワークステーションに転送し、perspective volume-renderingalgorithmを用いてデータを処理することにより三次元的な仮想内視鏡像を得た。この脳槽内仮想内視鏡では、後頭蓋窩内の脳神経や脳室などの複雑な構造を三次元的に表示することが可能であり、神経血管圧迫やその他の様々な疾患、すなわち三叉神経痛、片側顔面神経痙攣、前庭神経鞘腫、鞍上部腫瘍、下垂体性小人症、側脳室壁の多発性病変例などに応用した。神経血管圧迫の症例では、複雑な神経と血管との関係を三次元的に描出する事が可能で、三叉神経や顔面神経を血管が圧迫している様子が明瞭に描出された。CISS画像を用いたため動脈による神経圧迫のみでなく、静脈による神経血管圧迫も描出できた。ほかの脳槽および脳室内の腫瘤性病変では、腫瘤と周囲の脳組織・脳神経などの構造との関係が遠近感を持った立体的三次元画像として描出された。そのほか、血管内仮想内視鏡の臨床応用も試み、正常血管内腔および動脈瘤などの異常な血管内腔の観察を行った。このような仮想内視鏡の画像は術前のシミュレーション、患者およびその家族への説明などに充分応用可能と考えられた。
硫黄化合物における硫黄原子の原子価拡張と電子密度分布の研究

硫黄原子の原子価拡張(Hypevalency,硫黄原子が電子吸引性のS,N,O,ハロゲンなどと単結合より長く、van der Waals距離より短い結合を示す)について、その結合の本質を明らかにするため、1.原子価拡張性に関連する有機硫黄化合物のX線結晶構造解析、2.低温X線回折実験によるHypervalentな硫黄化合物の電子密度分布の研究を行った。1.N,N ́-ジメチル-2,2 ́-ジチオジベンズアミド及びN-メチル-2-ベンジルスルフィニルベンズアミドのX線結晶構造解析を行ない、分子内S...O間の距離は2.890【A!°】,2.712【A!°】であった。これは0-ニトロフェニルチオ化合物のS...O距離より長いが、von der Waals距離より短かく、硫黄の原子価拡張に基く短かい分子内非結合S...O相互作用を持つことが明らかとなった。前者は分子間N-H...O=C水素結合(N...O2.813【A!°】)、後者は分子間N-H...O=S水素結合(2.845【A!°】)を形成しているが、分子内S...O相互作用が比較的弱いのは、このような分子間水素結合形成と関係があると思われる。2.原子価拡張性を示す硫黄原子の結合について検討するため、等距離S-N結合を持つチアチオフテン型化合物について173KのX線回折実験を行なった。解析の結果、分子平面内S-C,C-N間に結合による電子密度の歪みが観測された。原子価拡張性結合であるS-N間にはNに近い点で弱いピークが見られた。この他に硫黄原子の周辺に分子面内に4個、硫黄の上下に2個のピークが八面体型に存在する結果が得られ、硫黄原子のd電子との関連が考えられる。また硫黄や炭素原子の近傍では電子が不足している状態を示し、窒素の近くでは電子が過剰であることが得られ、この状況はCNDO/2で求めたnet chargeの計算結果と傾向が一致している。前記のジメチルジチオジベンズアミドについても低温実験を行ない、現在解析中である。
アユ冷水病の発生メカニズムの解明：生活史履歴解読からのアプローチ

アユ釣り解禁に伴う生息環境の変化がアユの冷水病発症に及ぼす影響を検討するため,多摩川水系においてアユの冷水病調査と生活史履歴の推定を行った.冷水病の原因菌は種苗放流アユから高い保菌率で検出されたことから,本研究の対象水域では種苗放流が冷水病の主要な感染経路になっていたことが示唆された.炭素・窒素安定同位体比分布に基づいて放流直後の種苗アユと推定された個体においても,冷水病の発症が認められたことから,冷水病に感染していた種苗アユは放流直後のストレスによって短期間に発症したことが示唆された.アユ釣り解禁に伴う生息環境の変化がアユの冷水病発症に及ぼす影響を検討するため,種苗アユの放流が行われている多摩川水系,及び放流が行われていない境川水系と引地川水系において,アユの冷水病保菌調査,耳石輪紋解析による日齢調査,胃内容物調査,および安定同位体比分析による採餌履歴の推定を行った.多摩川下流地点では5-6月のアユから原因菌が検出されなかったのに対し,アユ釣りの盛んな支流地点では,アユ釣り解禁前の5月に全検体の40%のアユから原因菌が検出され,さらに解禁後の6月上旬には保菌率が97.5%まで上昇した.6月中・下旬には,この流域でアユの大量死が確認されたことから,冷水病が蔓延していたことが示唆された.また,支流地点では種苗放流アユからも原因菌が検出されたことから,種苗放流が冷水病の感染経路になっていたことが示唆された.境川水系と引地川水系で採集されたアユでも少数個体から原因菌が検出されたが,発症個体は認められなかった.日齢査定では,どの水系でも上流側地点のアユで孵化日が早い傾向が認められた.胃内容物調査では,どの水系でも藍藻類のHomoeothrix属と珪藻類のNitzschia属が優占する傾向が認められた.多摩川支流地点では空胃率が多摩川下流地点や他河川より際だって高く,過密放流による餌料環境の悪化が示唆された.多摩川支流のアユでは安定同位体比分布も特徴的であり,種苗放流アユよりδ13C値が高くδ15N値が低い傾向が明瞭であった.多摩川支流での摂餌期間が長いアユほど,δ13C値が上昇しδ15N値が低下すると考えられる.冷水病を発症していた3個体のアユは,いずれもδ13C値が顕著に高くδ15N値が顕著に低かったことから,多摩川支流の餌料環境を長く経験したアユほど冷水病が発症しやすくなっていたことが示唆された.アユ釣り解禁に伴う生息環境の変化がアユの冷水病発症に及ぼす影響を検討するため,種苗アユの放流が行われている多摩川水系において冷水病の保菌調査と安定同位体比分析による採餌履歴の推定を行った.種苗放流アユの保菌検査を実施した結果,高い保菌率で原因菌が検出されたことから,種苗放流が冷水病の主要な感染経路になっていたことが示唆された.アユ釣りの盛んな支流地点では,アユ釣り解禁前の6月上旬に保菌率が37.5%,発症率が18.8%であったのに対し,解禁から一週間を経た6月中旬には保菌率が82.9%,発症率が43.9%まで上昇していた.この結果から,6月上・中旬の生息環境の変化により,冷水病の感染と発症が急激に進んだことが示唆された.多摩川水系で採集されたアユの安定同位体比分布は,3つのグループ(A・B・C)に分けられた.グループAはδ13C値が低くδ15N値が高い分布で特徴づけられたのに対し,グループCはδ13C値が高くδ15N値が低い分布で特徴づけられた.グループBの同位体比分布は,グループAとCの中間にあった.本流下流地点と本流中流地点で採集されたアユはどちらもグループAに含まれていたのに対し,アユ釣りの盛んな支流地点のアユは,グループBとCに明瞭に分かれた.グループBの同位体比分布は種苗放流アユの同位体比分布と重なっていたことから,グループBは放流直後の種苗アユであったと考えられる.2013年度の結果では,冷水病の発症はグループCのみで認められたが,2014年度の結果では,グループBとCで発症が認められた.2014年度には,冷水病に感染した種苗放流アユが,放流後間もなく環境変化によるストレスを受けて冷水病を発症していたと考えられる.アユ釣り解禁に伴う生息環境の変化がアユの冷水病発症に及ぼす影響を検討するため,種苗アユの放流が行われている多摩川水系において,冷水病の保菌調査,石面付着生物の種組成分析,および安定同位体比分析による摂餌履歴の推定を行った.種苗放流アユの保菌検査を実施した結果,高い保菌率で原因菌が検出されたことから,種苗放流が冷水病の主要な感染経路になっていたことが示唆された.アユ釣りの盛んな支流地点における採捕アユの保菌率と発症率は,アユ釣り解禁前の6月上旬から解禁後の6月中・下旬にかけて明瞭に上昇していた.アユ釣りの盛んな支流で採集されたアユは,本流中・下流域のアユの同位体比より高いδ13C値(-18.0-11.0‰)と低いδ15N値(4.215.1‰)で特徴付けられた.

このうち,δ13Cが-18.3-16.6‰,δ15Nが12.115.1‰のグループは種苗放流アユの同位体比分布とほぼ一致していたのに対し,δ13Cが-15.4-11.0‰,δ15Nが4.210.7‰のグループは支流の有機物と無脊椎動物の同位体比分布に近かった.前者は種苗施設の摂餌環境,後者は支流の摂餌環境を反映していたと考えられる.支流で採捕された冷水病発症アユには,どちらの同位体比分布のグループも含まれていたことから,種苗放流アユは放流後まもなく,支流の摂餌環境になじむ前の段階で既に罹患していたことが示唆された.また,アユの主要な餌生物と考えられている藍藻類のHomoeothrix janthinaは,6月上旬から8月上旬にかけて調査地点の石面付着有機物に豊富に含まれていたことから,アユの摂餌環境には際だった劣化は起きていなかったことが示唆された.冷水病菌を保菌した種苗アユは,生息場所の摂餌環境に関わらず,放流後まもない時期のストレスで発症していると考えられる.アユ釣り解禁に伴う生息環境の変化がアユの冷水病発症に及ぼす影響を検討するため,多摩川水系においてアユの冷水病調査と生活史履歴の推定を行った.冷水病の原因菌は種苗放流アユから高い保菌率で検出されたことから,本研究の対象水域では種苗放流が冷水病の主要な感染経路になっていたことが示唆された.炭素・窒素安定同位体比分布に基づいて放流直後の種苗アユと推定された個体においても,冷水病の発症が認められたことから,冷水病に感染していた種苗アユは放流直後のストレスによって短期間に発症したことが示唆された.2013-2014年度の活動により,冷水病保菌調査,耳石輪紋解析,胃内容物調査,および安定同位体比分析のいずれにおいても成果を得ることができたことから,おおむね順調に進展していると見なすことができる.特に多摩川水系では,安定同位体比分布に基づいて,生活史履歴の異なるグループを明瞭に分けることができたことから,冷水病が発症する過程についての考察が進んだ.多摩川支流では,冷水病に感染した種苗放流アユが,放流後間もなく環境変化によるストレスを受けて冷水病を発症していると考えられる.最終年度では,ストレスの原因となる環境要因として採餌環境に焦点を当て,採餌環境の経時変化と局所的差異を調べることにより,種苗放流アユが冷水病を発症する過程における採餌環境の関与について検討する予定である.生態学耳石輪紋解析と胃内容物調査については,昨年度の活動で既にまとまった結果が得られているので,今年度からは実施していない.今年度,多摩川水系に絞って冷水病保菌調査と安定同位体比分析を実施したことにより,種苗放流と冷水病発症の関係性について解明が進んだ.次年度は,石面付着物や底生無脊椎動物の種組成と安定同位体比分布を重点的に調べることにより,アユの採餌環境の経時変化と局所的差異を明らかにし,種苗放流アユが冷水病を発症する過程における採餌環境の関与について検討する予定である.冷水病保菌調査,耳石輪紋解析,胃内容物調査,および安定同位体比分析のいずれにおいても成果を得ることができたことから,おおむね順調に進展していると見なすことができる.特に多摩川では,支流地点の採集アユ,下流地点の採集アユ,および種苗放流アユの間で安定同位体比分布の特徴が顕著に異なっていたことから,アユの由来識別の指標になりうることが示唆された.今後,多摩川のアユの安定同位体比分布を詳細に検討することにより,冷水病発症個体の生活史履歴を解読できる可能性がある.分担者は,今年度の配分予算により,安定同位体比分析時の試料秤量に必要な電子天秤を購入した.次年度も高価な分析関連備品を購入する必要があるが,次年度の配分予算のみでは購入費が不足するため,今年度の残額の69.860円を次年度の予算として繰り越すことにした.耳石輪紋解析と胃内容物調査については既にまとまった結果が得られているので,今後は冷水病保菌調査と安定同位体比分析を重点的に実施していく.特に多摩川支流の発症個体と陰性個体(非感染個体)の差を詳細に検討することにより,発症個体の特性を明確にしていく.安定同位体比質量分析計の消耗部品を購入する予定である.
皮膚における共役リノレン酸の機能開発とメカニズム解明

本研究は、共役リノレン酸が皮下脂肪の蓄積を緩和するか否かを検証することを目的とした。共役リノレン酸はγ-リノレン酸油からアルカリ異性化法を用いて作製した。共役リノレン酸をラットに4週間自由摂取させ、皮膚中脂質量(総脂質、トリアシルグリセロール、総コレステロール、遊離脂肪酸および遊離コレステロール)を分析した。結果として、本検証で作成した共役リノレン酸は、皮膚中の脂質抑制効果は顕著にはみられなかった。共役リノレン酸摂取による皮下脂肪抑制の検証およびメカニズム解明共役リノレン酸(CLN)をマウスに長期摂取するために、アルカリ異性化(特許番号3017108号)による共役脂肪酸の作製に着手した。リノール酸高含有サフラワー油に、加熱したプロピレングリコールおよび水酸化カリウムの混合液を加えた。マントルヒーターにて2.5時間加熱しながら撹拌し、加熱終了後氷水で冷却すると急速に凝固してしまった。餌に混ぜるためには液体にしなければいけないため、油脂混合液を加熱後、瞬時に塩酸を加え水冷下で冷却しながら酸性にし、液体の状態を保った。ヘキサン抽出の後、食塩水および蒸留水で精製し、現在エバポレーターでヘキサンを留去し、ガスクロマトグラフィーにて組成分析を試みている。このアルカリ異性化の技術は、共役リノレン酸、共役リノール酸作製には必須であり、他の共役脂肪酸の作製にも応用できる。これらの作製法を修得した後、γ-リノレン酸をアルカリ異性化した油脂を用いて、マウス皮下脂肪への影響を検証する。共役リノレン酸摂取による皮下脂肪抑制の検証およびメカニズム解明リノール酸高含有サフラワー油をアルカリ異性化することにより、共役リノール酸(CLA)を合成し、この手法を応用して、γ-リノレン酸油から共役γ-リノレン酸油を作製した。本油脂の皮膚への効果を評価するため、ラットを用いて皮膚脂質代謝への影響を検証した。3週齢SD系雄ラット24匹を単飼ケージに入れ、1週間予備飼育後、AIN-93Gの一部を高リノール酸サフラワー油(LA群)、γ-リノレン酸油(GLA群)、共役リノール酸油(CLA群)および共役γ-リノレン酸油(CGLA群)にそれぞれ代替した餌を4週間自由摂取させた。飼育終了後、背部の皮膚を採取し、液体窒素にて瞬間凍結した後-80°Cで保存した。皮膚はFolch法にて脂質を抽出し、生化学的手法によりトリアシルグリセロール、総コレステロール、遊離脂肪酸および遊離コレステロール量をそれぞれ測定した。LA群、GLA群、CLA群およびCGLA群を一元配置の分散分析にて比較すると有意差は確認できず、トリアシルグリセロール量(p=0.48)、総コレステロール(p=0.98)、遊離脂肪酸(p=0.75)および遊離コレステロール量(p=0.37)という結果となった。これらの結果から、本研究で用いた共役γ-リノレン酸油は皮下脂肪抑制効果を示さなかった。ただし、LA群とCLA群とを比較するとCLA群においても減少傾向が確認されなかったことから、CLAへの感受性が低いラットを用いたことがCGLA群においても顕著な変化を及ぼさなかった要因であることを示唆した。今後、ラットに加えてラットより共役脂肪酸への感受性が高いマウスも用いて検証したいと考えている。
多機能型蛍光性色素の合成と外部刺激誘導による発光制御に関する研究

色素分子を多機能化すれば、外部からの刺激や環境の変化に対する新たな応答性の発現が期待できる。本研究では、蛍光性にさらに他の機能を付与した多機能型蛍光性色素を合成し、それらの外部刺激誘導による蛍光発光応答性について検討した。得られた結果を以下にまとめた。1.蛍光性と二色性を併せ持つ蛍光二色性色素の合成と分子配向の制御による発光強度ノ制御蛍光性と二色性を併せ持つ新規なジラクトンおよびラクトン-ラクタム系色素を合成し、その光学的特性を調べた。上記の色素は、分子配向の制御によって蛍光強度を大きく変化させることができ、蛍光スイッチング液晶用色素として有用であることがわかった。2.電荷移動(CT)制御型および光電子移動(PET)制御型蛍光性レセプターの設計とイオン認識発光機能蛍光発光母体である2-フェニルイミダゾアントラキノンに、イオン認識能を付与すべくアザクラウン(AC)環を共役的および非共役的に連結させたCT制御型とPET制御型の蛍光性レセプターを分子設計した。タイプによる相違はあるもののいずれにおいても、AC環での金属イオンの捕捉に伴い蛍光強度が劇的に増大し、蛍光性イオノフォアとしての優れた特性を示した。3.蛍光性と包接機能を併せ持つキノール系キラル蛍光性ホストの設計とゲスト情報発信機能クラスレート形成能を併せ持つ新規なキラル蛍光性ホストを分子設計した。このホストは、強い蛍光性を有し広範囲の溶媒分子を取り込んで結晶化する機能を有する。本蛍光性ホストのゲストを認識し、その情報を蛍光で発信する分子レポーターとしての機能を評価することが、今後の課題である。
RNAi法を用いた口腔癌に対するVEGF・同受容体を分子標的とした治療法の開発

我々は癌転移の成立過程,とりわけ癌細胞が基底膜や周囲の正常組織などへ浸潤していく際に必要となる運動能について着目し研究している。これまでの我々の研究で、口腔癌細胞において血管新生の重要な担い手である血管内皮増殖因子(VEGF)およびその受容体であるFlt-1(VEGFR1)およびKDR(VEGFR2)が発現していることを確認している。これらの結果は,VEGFは従来より研究されているパラクライン系を介した血管新生促進に加え,オートクライン機構を介して癌細胞自身の浸潤・増殖に関与している可能性を示唆している。そこで,我々は口腔癌細胞株のうち悪性黒色腫細胞株におけるVEGF・同受容体の浸潤・増殖における機能について解析した。1)口腔癌細胞の増殖能は、Flt-1アンチセンスオリゴ(ASO)により抑制された。一方、VEGFおよびKDRアンチセンスオリゴ(ASO)では影響を受けなかった。2)口腔癌細胞の運動能を解析したところ、VEGF165はケモタキシス及びケモキネシスを誘導することが明らかとなった。この活性はVEGF受容体のチロシンキナーゼ阻害剤およびFlt-1 ASOによって抑制されたが,KDR ASOでは明らかな影響を示さなかった。2)VEGF添加によりAktのリン酸化が亢進した。PI3K阻害剤で、Aktのリン酸化およびVEGFに依存した細胞遊走能は抑制された。以上の結果から,口腔癌細胞の浸潤・増殖は,Flt-1、PI3K/Akt経路を介したオートクライン機構により制御されている可能性が考えられた。今後さらに同受容体を分子標的とした治療の開発研究を行って行く予定である。我々は癌転移の成立過程,とりわけ癌細胞が基底膜や周囲の正常組織などへ浸潤していく際に必要となる運動能について着目し研究している.これまでの我々の研究で、口腔癌細胞において、血管新生の重要な担い手である血管内皮増殖因子(Vascular Endothelial Growth Factor : VEGF)およびその受容体であるFlt-1およびKDRが発現していることを確認している.これらの結果は,VEGFはパラクライン系を介した血管新生促進に加え,オートクライン機構を介して、癌細胞自身の浸潤・増殖に関与している可能性を示唆している。そこで,口腔癌細胞株が発現するVEGF受容体の浸潤・増殖における機能について解析した。口腔癌細胞の増殖能は、Flt-1アンチセンスオリゴ(ASO)により抑制された。一方、VEGFおよびKDRでは影響を受けなかった。また、Boyden Chamberの変法を用いて,VEGF165はケモタキシス及びケモキネシスを誘導することが明らかとなった。また,この活性はVEGF受容体のチロシンキナーゼ阻害剤およびFlt-1 ASOによって抑制されたが,KDR ASOは明らかな影響を示さなかった。さらに、VEGF添加によりAktのリン酸化が亢進した。PI3K阻害剤のウオルトマニンは、Aktのリン酸化およびVEGFに依存した細胞遊走能を抑制した。以上の結果から,ヒトメラノーマ細胞の浸潤・増殖は,Flt-1を介したオートクライン機構により制御されている可能性が考えられた。

そこで,我々は口腔癌細胞株におけるVEGF・同受容体の浸潤・増殖における機能について解析した。口腔癌細胞の増殖能は、Flt-1アンチセンスオリゴ(ASO)により抑制された。一方、VEGFおよびKDRアンチセンスオリゴ(ASO)では影響を受けなかった。また、Boyden Chamberの変法を用いて口腔癌細胞の運動能を解析したところ、VEGF165はケモタキシス及びケモキネシスを誘導することが明らかとなった。この活性はVEGF受容体のチロシンキナーゼ阻害剤およびFlt-1 ASOによって抑制されたが,KDR ASOでは明らかな影響を示さなかった。VEGF添加による口腔癌細胞の運動能における下流シグナルを解析したところ、Aktのリン酸化が亢進していた。さらに、PI3K阻害剤のウオルトマニンは、Aktのリン酸化およびVEGFに依存した細胞遊走能を抑制した。以上の結果から,口腔癌細胞の浸潤・増殖は,Flt-1、PI3K/Akt経路を介したオートクライン機構により制御されている可能性が考えられた。
性ホルモンに制御された厳格な繁殖サイクルとそれに対抗する繁殖戦術の進化

(1)ロウソクギンポ雄の繁殖サイクルを調節する性ホルモン・アンドロジェン(テストステロン:T)には免疫機能を低下させる効果はなかった。子の保護行動に関与するとされる脳下垂体ホルモン・プロラクチン(PRL)の塩基配列を決定した。(2)巣内の卵操作実験から、卵の存在が繁殖フェイズを切り替えるカギ刺激であることが強く示唆された。(3)体コンディションと卵食数の関係から、全卵食の目的が栄養摂取ではなく卵の存在を消すことにある可能性が示唆された。(4)全卵食行動と摂食行動を区別するために、脳内ペプチドホルモン・ニューロペプチド-Y(NPY)とオレキシン(ORX)の摂食活性への効果を検討した。ロウソクギンポ雄の非適応的に見える厳格な繁殖サイクルをもたらす内分泌システムの進化要因を明らかにするために、雄の求愛活性を促進するアンドロジェンが免疫機能を低下させるかを検証する長期アンドロジェン曝露水槽飼育実験を行った。雄の免疫機能の指標として、白血球数・体コンディション・活性酸素・リゾチウムを用いた。これまでに白血球数と体コンディションにはアンドロジェン曝露の効果が無いことが分かっており、アンドロジェンが免疫機能に影響しない可能性を示唆した。残りの2つの指標については現在測定中である。また、繁殖サイクルのメカニズムを解明する一環として、求愛活性を促すアンドロジェンに加えて、保護行動に関与すると考えられているプロラクチンの挙動を把握するために、その受容体の遺伝子(RNA)発現量を定量する手法の開発に着手した。次に、雄の全卵食行動が栄養摂取のためではなく、保護卵を除去するための行動であることを示すために、脳内に産生される摂食関連ホルモン・ニューロペプチドーY(NPY)とオレキシン(ORX)の挙動を室内及び野外実験で測定した。両ホルモンともに野外では摂食中と全卵食中の個体に差があるような傾向が見られたが、水槽内の予備実験では差が見られなかった。全卵食中の雄が、卵を食べるだけでなく巣外に吐き出す行動が確認され、保護卵を除去する目的で全卵食している可能性が強く示唆された。ロウソクギンポ雄の(1)非適応的に見える厳格な繁殖サイクルをもたらす内分泌システムの進化要因を明らかにするために、(1-a)雄の求愛活性を促進する11-KTが、一方で免疫機能を低下させる効果を持つかを検証した。野外で繁殖サイクルの求愛フェイズと保護フェイズの雄を採集し、魚類で免疫機能の指標とされる腎臓内のリゾチウム活性を調べた。その結果、両フェイズともに比較的高いリゾチウム値を示し、有意差はなかった。この結果は、11-KTが免疫機能に影響しないことを示唆する一方で、免疫機能がフェイズが移行する数日単位で変動するようなものではないことも示唆した。次に、雄の全卵食行動が(2)繁殖サイクルへの対抗戦術であることを検証するために、巣の中の卵の存在が繁殖サイクルをもたらすカギ刺激であることを検証した(2-a)。野外で人工巣を利用する雄に卵を追加・除去する操作実験を行ったところ、卵を除去した雄の11-KTとTレベルは上昇して求愛フェイズに戻り、卵を追加した雄のホルモンレベルは低下して保護フェイズに入るという予測通りの結果が得られた。この結果は、巣内の卵の存在かあるいは卵の存在によって始まる(または終わる)雄自身の卵保護行動がカギ刺激であることを強く示唆した。さらに、雄の全卵食行動が栄養摂取のためではなく、保護卵を除去するための行動であることを示すために(2-b)、野外で全卵食した雄と部分卵食した雄の体コンディションと実際に食べた卵数の関係を調べた。その結果、部分卵食した雄はコンディションが悪いほど多くの卵を食べていたが、全卵食した雄はコンディションにかかわらず全卵を食べていた。つまり、部分卵食する雄とは異なり、全卵食する雄は栄養摂取を目的とはしていないこと、すなわち産卵可能な求愛フェイズに速やかに移行するために卵を巣から消し去ることで自身のホルモンレベルを高めていると推察された。最終年度の成果:繁殖サイクルの形成メカニズムを解明する一環として、動物の子の保護行動に関与するとされる脳下垂体ホルモン・プロラクチンの塩基配列を決定した。これにより、プロラクチンのmRNA発現量を測定することで繁殖サイクルとプロラクチン動態の関係が調査可能になった。また、雄の全卵食行動と摂食行動の違いを示すために、摂食関連ホルモンであるニューロペプチドーY(NPY:免疫染色法)とオレキシン(ORX:時間分解蛍光免疫測定法)と本種の摂食行動との関係を調べた。ORXは無給餌条件で濃度が低下する摂食抑制効果が示唆されたが、一貫した傾向は認められなかった。

NPYは脳の免疫染色に有効な抗体の選定に時間を要し、測定には至らなかった。研究期間全体の成果:(1)繁殖サイクルを調節する性ホルモン・アンドロジェンの免疫機能への影響(免疫仮説)を解明する長期曝露実験から、免疫機能の指標である白血球数、肥満度、リゾチウム活性のいずれにおいても影響が無いことが示された。また、上述したように、保護行動に関与するホルモン・プロラクチンが繁殖サイクル形成に与える影響(保護仮説)を検討するためにプロラクチンの塩基配列を決定した。(2)雄の産卵巣に卵を追加・除去する野外操作実験を行い、卵の有無によって血中アンドロジェンレベルが変動することが示され、卵の存在がサイクル形成のカギ刺激であることが強く示唆された。(3)部分卵食雄が体コンディションが悪いほど多くの卵を食べる一方で、全卵食雄はコンディションにかかわらず全卵を食べていた。また、全卵食雄では卵を巣外に吐き出す行動がより高頻度で確認されたことから、全卵食の目的が栄養摂取ではなく、保護卵の存在を消すことにある可能性が強く示唆された。(4)上述したように、本種の摂食行動と摂食関連ホルモンであるNPYとORXとの関係を検討するために、両ホルモンの測定方法を確立した。行動生態学計画当初の仮説を検証するために、あと必要な研究項目はアンドロジェンが免疫機能に与える影響を示すことであり、26年度中には結果が出ると思われる。また、新たに着手した繁殖サイクル形成へのプロラクチンの関与については、下垂体内の微量なプロラクチンを測定する手法はほぼ開発済みである。脳内摂食関連ホルモンの挙動についても、新たに加わった研究分担者の協力を得て具体的なデータが出始めている。3ヶ年で4項目を実施する計画であったが、初年度で3項目に取り組み、そのうちの2項目で予測通りの結果が得られた。とりわけ、巣内の卵の存在によって、雄の血中アンドロジェンが変動する結果はクリアで仮説が正しいことが示された。また、雄の求愛活性を促進する性ホルモンが免疫機能の低下をもたらす影響は検出されなかったが、これも計画段階から想定しており、残るひとつの研究項目へと繋ぐ成果のひとつとみなすことができる。最終年度となる今年度は次の3つの研究項目を進める。(1)アンドロジェンが免疫機能に与える影響を明らかにする。昨年度の長期飼育実験の改善点を検討してより精度の高いデータ取得を目指す。(2)繁殖サイクル形成にプロラクチンが関与しているのかを受容体の遺伝子発現量で定量する。(3)全卵食行動に与える脳内摂食関連ホルモンの効果を検証する。昨年度の野外データを適用するには昨年度問題のあった水槽実験の再検証が不可欠である。水槽実験デザインの再検討と、NPYの免疫染色に最適な抗体の探索が最優先事項である。今後は繁殖サイクルの適応的意義を解明するための2つ目の研究項目に取り組む。すなわち繁殖サイクルを持つ雄と無い雄を、ホルモンを投与あるいは曝露することで人工的に作り、長期的に追跡して体コンディションや繁殖成功に与える影響を検出する。また、雄による全卵食行動が「食べているのに食べていない」ことを示すために、摂食行動が脳内活性に与える効果を調べる予定である。研究分担者が新たに2名追加され、その2名分の追加研究費配分(30万円)のために30万円を前倒し請求したが、最終的にはその半分程度の額は未使用のまま残った。
光ファイバを用いた空間選択的高速測定法による光硬化FRPの硬化進展モニタリング

本研究では、光ファイバ屈折率測定を用いた任意の微小領域での硬化度リアルタイム測定法を提案し、複数の光ファイバを用いたアレイ型センサを設計して、複数の位置における硬化度を同時にモニタリングする手法を開発した。開発されたアレイ型センサを用いて紫外線硬化樹脂の硬化進展の深さ分布の測定を行い、硬化度分布のリアルタイム測定が可能であることを示した。また、一点の測定結果からも任意位置の硬化進展が予測可能であることを示した。近年,紫外線硬化樹脂をマトリクスに用いたFRPが,省エネルギー,低い成形コスト,低い熱残留応力などの利点から注目されている。しかしながら,紫外線硬化樹脂は照射面から内部方向に分布を持って硬化が進展するため紫外線硬化FRPの成形条件の最適化は難しく,高品質なFRPを製造する上では問題となる。よって,紫外線硬化FRPの硬化状態を分布的に測定する手法は,成形条件の最適化という観点から非常に重要である。紫外線硬化樹脂の硬化モニタリング手法についてはさまざまな手法が提案・実用化されてきたが,硬化状態を分布的に測定する手法の開発は十分ではなかった。本研究では,樹脂硬化度の空間選択的高速測定法の開発を行った。提案した手法は,光ファイバ屈折率測定を用いた任意の位置の微小領域での硬化度リアルタイム測定法であり,複数の光ファイバを用いてアレイ型センサを開発することにより,複数の位置における硬化度を同時にモニタリングした。最初に,光ファイバを用いた微小領域硬化度分布測定のためのアレイ型屈折率センサを設計、製作し,その性能検証を行った。試験には,液体の屈折率測定にシリコンオイルを,硬化度測定にエポキシ樹脂をそれぞれ用いた。得られた実験結果では測定に用いた複数点から得られた屈折率値,そして硬化度の時間に対する変化曲線が全て一致し,開発されたセンサで正確な硬化度モニタリングが可能であることが分かった。次に,アレイ型センサを用いて紫外線硬化樹脂の硬化進展の深さ分布のモニタリングを行った。得られた結果より,表面からの位置が深いほど硬化開始が遅れることが分かった。さらに,硬化発熱による温度分布が存在したにもかかわらず,硬化進展速度は深さによらないことも明らかとなった。以上より,開発されたセンサによって,紫外線硬化樹脂の深さ方向の硬化度分布の測定がリアルタイムで可能であることが分かった。近年,成形コストが低く,残留応力も小さい紫外線(UV)硬化樹脂がFRPの母材として注目されている.しかしながら,紫外線硬化樹脂では照射面から硬化が始まり,照射面から離れると硬化が遅れることが知られている.その結果,位置によって硬化進展の度合いが異なるため, UV硬化FRPの最適な成形条件を探るのは難しかった.本研究では,光ファイバ屈折率測定法を用いることで, UV硬化樹脂の深さ方向における硬化進展モニタリング手法を提案した.光ファイバ屈折率測定法は微小な領域をモニタリングすることが可能であり,多点化によって分布的測定を期待することができる.本研究では3本の光ファイバを並べたマルチアレイ型センサを提案・製作し,任意深さにおける屈折率の測定を行った.最初に,アレイ型センサの開発を行い,硬化が一様に進展する熱硬化性樹脂の硬化度測定結果から,アレイ型センサで正確な硬化度モニタリングが可能であることを明らかにした.次に,これをUV硬化樹脂の硬化モニタリングに応用し,深さ方向によって硬化進展が異なるようすをモニタリングすることが可能であることを示した.実験結果より, UV硬化樹脂の硬化は表面から始まり,深い位置になればなるほどその硬化進展が遅れることが分かった.硬化進展の遅れが,光が樹脂中を伝播する際に生じる減衰によって有効な紫外線量が減少したためと考え,任意深さにおける透過紫外線量を実測によって求め,それを用いてそれぞれの測定位置での蓄積紫外線照射量を求めた.蓄積紫外線照射量によって硬化度曲線を整理したところ,完全には一致しなかった.これは,紫外線の減衰に波長依存性があるためであると仮定し,硬化反応に有効な波長の蓄積紫外線照射量を得る補正式を提案した.それを用いて実験結果を整理すると,実験結果と補正された硬化度曲線はよく一致した.以上の結果より,開発したアレイ型センサで深さ方向の分布をモニタリングし,その結果から任意位置での硬化度の進展を予想することが可能であることが示された.
作用素環の構造とその記号力学系の分類への応用

記号力学系の軌道同型と関連するC*環の研究を主として行い、結果を後述の3編の論文にまとめた。特に、位相的マルコフシフトの連続軌道同型類とカルタン部分環を保存するCuntz-Krieger環の同型類がきちんと対応することがわかった。また、記号力学系のC*-環への表現であるC*-記号力学系という新しい概念について、構成されるC*-環の単純性や、様々な例を調べた。ソフィックでない具体的な記号力学系からできるC*-環のK-群の計算も行った。また、温度が必ずしも実数値をとらない複素数に値をとるKMS条件をC*記号力学系に対して研究を開始した。本年度は本研究計画の初年度に当り.記号力学系の分類を作用素環の理論を用いて研究した.記号力学系の軌道同型に関しての分類は,本研究計画の大きな柱の1つであり,まづこれに着手した.位相的マルコフシフトや一般の記号力学系や,さらには記号学系の表現であるC^*-記号力学系の軌道同型による分類を対応する作用素環とそのカルタン部分環の同型類で完全に分類できることを示し,その結果をライデン大学(オランダ)で開催された作用素環論と力学系の国際会議で研究発表した。この結果は,この国際会議の講義録として出版されるように現在作成中である。また,W.Krieger教授(ドイツ,ハイデルベル大学応用数学研究所)との共同研究も継続中であり,one-counterコードと呼ばれるチューリング機械から構成される記号力学系を対応するC^*-環の構造により研究した。その結果自身とそのtransposeがflow eguivalentにならない記号力学系の例を発見し,3月に行なわれた日本数学会で発表した.また位相的マルコフシフトからできるCuntz-krieger環の生成元の組み合わせ論的性とその生成元達からできる記号力学系のゼータ関数についても研究を開始し,具体的なゼータ関数の計算が可能なことが明らかになった。この結果は,京都大学の作用素環の研究集会で発表し,講究録にも発表した。記号力学系の分類理論をC^*環の構造理論、K-理論を使って構築するために、記号力学系を表現しているラムダグラフシステムやC^*-記号力学系の構造を研究した。Markovシフトは、既に十分研究され、それをカバーにもつSoficシフトの構造も徐々に解明されてきたので、Soficでない記号力学系からできるC*-環が、本研究のターゲットとなる。One-Counterシフトの一般化されたクラスに、そのC^*-環が、Cuntz-Krieger環とは同型にならない記号力学系のクラスが存在することを発見し、論文
代数曲線の塔に付随するコホモロジー群と保型形式

代数曲線,特に楕円モジュラー曲線の塔に付随する"大きな"p-進エタール・コモホロジー群の研究を行った.素数pと正整数N(pXN)を固定し,モジュラー曲線の塔{X^1(Np^γ)}(γ=1、2、......)を考える.昨年迄の研究により、これに付随するパラボリック・コモホロジー群の通常部分が良いp-進ホッジ構造をもつ事がわかっていた.即ち,この群に自然なp-進ホッジfiltrationが入り,それをA-進カスプ形式の言葉で記述することができ,"特殊化社塑像による個々のレヴェル,重さをもつコモホロジ群のp-進ホッジ構造が取り出せる事を示した。この研究の自然な継続,発展として開曲線の族{X_11(Np^γ)-{cusps}(γ=1,2,......)のエタノール・コノホロジー群の通常部分のp-進ホッジ構造の研究を開始した.これは上記結果をアイゼンシュタイン級数のp-進族を含む形に拡張する事を目標にしており、応用としてはアーベル対上のアーベル体上のアーベル拡大の具体的構成が見込まれている。未だ理論の全体が構築された訳ではないが,今年度の研究により次の諸点が明らかになった:・上記コホモロジー群が∧-加群としてうまくcontrolできる事;・モジュラー形式に関する,異なった重さに対応する"大きな"p-進ヘッケ環の通常部分が重さによらない事:・モジュラー形式の射影系と∧-進モジュラー形式の間に,カスプ形式の場合と同様の対応がある事;・一般ヤコビ多様体を用いて,上記コホモロジー群を記述するp-divisible群が構成できる事;等である.この研究は来年以降も継続して行う.尚,A. WKilesによりフェルマ-の最終定理が証明されたが,それについての解説的仕事も行った.代数曲線,特に楕円モジュラー曲線の塔に付随する"大きな"p-進エタール・コモホロジー群の研究を行った.素数pと正整数N(pXN)を固定し,モジュラー曲線の塔{X^1(Np^γ)}(γ=1、2、......)を考える.昨年迄の研究により、これに付随するパラボリック・コモホロジー群の通常部分が良いp-進ホッジ構造をもつ事がわかっていた.即ち,この群に自然なp-進ホッジfiltrationが入り,それをA-進カスプ形式の言葉で記述することができ,"特殊化社塑像による個々のレヴェル,重さをもつコモホロジ群のp-進ホッジ構造が取り出せる事を示した。未だ理論の全体が構築された訳ではないが,今年度の研究により次の諸点が明らかになった:・上記コホモロジー群が∧-加群としてうまくcontrolできる事;・モジュラー形式に関する,異なった重さに対応する"大きな"p-進ヘッケ環の通常部分が重さによらない事:・モジュラー形式の射影系と∧-進モジュラー形式の間に,カスプ形式の場合と同様の対応がある事;・一般ヤコビ多様体を用いて,上記コホモロジー群を記述するp-divisible群が構成できる事;等である.この研究は来年以降も継続して行う.尚,A. WKilesによりフェルマ-の最終定理が証明されたが,それについての解説的仕事も行った.
旧社会主義諸国における民営化の法的形態にかんする比較研究

1:旧ソ連の国有企業民営化=私有化(以下私有化と略す)は、1994年6月で「バウチャーによる私有化」段階から「貨幣による私有化」段階へ移行した。本研究では、これに先行する諸段階を含めて過程全体を「体制転換」の視点からどうおさえるかに重点をおいた。2:これと並行しつつ、やや異なる様相で進行している土地改革(土地私有化、農業企業民営化)について中間的な研究のとりまとめを行った。-研究発表欄参照3:旧社会主義諸国における国有企業私有化の過程・形態の比較のポイントを検討した。(1)私有化の経済的前提条件の特殊性、例えば旧体制下における一定度の私的セクターの存在(ポーランドなど)、市場的社会主義路線による国有企業の「商事会社」化の進展(ハンガリー)、「自主管理」的システムの展開(ポーランドなど)、高度の集権的管理体制(旧ソ連、チェコスロヴァキア)の存続、などが私有化の過程の相違の要因となっていること。(2)政権の性格や安定度、国民の私的所有・企業家活動についての意識が、私有化のプログラム選択の方法をも規定しつつ、私有化の形態・テンポに影響している点。例えば旧ソ連末期の私有化プログラムにおける「集団企業化」構想、ロシアにおける「バウチャーによる私有化」、ポーランドにおける企業私有化の緩慢な過程とチェコスロヴァキアにおけるその急速な過程、再私有化政策の有無など。いわゆる「自然発生的」、「ノメンクラツ-ラ」私有化現象についても、同一にはみられない。4:旧ソ連諸国のうち、ロシア連邦以外の国およびロシア連邦内の各地域での私有化過程については、本年度は資料収集にとどまり、分析は次年度にまわされる。
脱細胞化、再細胞化技術を用いた再生型カバードステントの開発

先行実験として行っていた、再生型カバードステントのブタ腸骨動脈への端々吻合による同種動脈置換術の14日目の病理学的評価において、吻合部から連続する内皮細胞とともに、脱細胞化静脈壁内に多数の線維芽細胞を認めた。よって本年度の計画として、まずブタ脱細胞化静脈へのHUVEC(ヒト臍帯静脈内皮細胞)を用いた再細胞化を行う予定であったが、それに先行して、既存の検体の免疫組織学的染色を追加で行い、内皮細胞以外の細胞成分の検討を行うことにした。免疫組織学的染色で、脱細胞化静脈壁内にはDesmin陽性細胞を多数認め、移植後に内皮細胞だけでなく筋線維芽細胞が遊走することが判明した。この筋線維芽細胞は後に血管平滑筋細胞に分化すると予想される。内皮細胞は脱細胞化静脈内腔面のみ、筋線維芽細胞は静脈壁内のみに局在していることから、移植後に各細胞は自然と細胞外マトリックスの適所に遊走し、静脈壁を再生していく可能性が示唆された。また脱細胞化静脈への再細胞化をするにあたり、脱細胞化後の静脈壁の細胞外マトリックス構造がしっかり保持されていることをさらに詳細に確認することとした。これまでのHE染色やEVG染色に加え、走査型電子顕微鏡による検討を加え、脱細胞化処理後にも再細胞化の足場としての静脈壁構造を保持していることを確認した。カバードステントのデリバリーシステムに関しては、研究協力者の京都医療設計株式会社と意見交換を行い、スムースな挿入・展開が可能になるようなシステムの改良、調整を行った。実験計画の修正に伴い、既存の検体の組織学的評価などを先行させたことから、当初の計画からの遅れを生じている。再生型カバードステントをブタ腸骨動脈に血管内留置する実験に向けて、デリバリーシステムの考案と改良は同時進行で進めている。本年度の結果をふまえ、脱細胞化静脈への再細胞化を行うにあたり、内皮細胞だけでなく、線維芽細胞も共培養させるかなどを検討する。カバードステントの血管内留置実験に関しては、ブタ腸骨動脈へのカバードステント留置手技を安定化させるとともに、確実に標的部位に留置可能となるようなデリバリーシステムの改良を進める。そしてブタ腸骨動脈への留置後14日目の開存性評価や病理組織学的評価を行う。また、血管内留置後の遠隔期成績を評価する際に、カバードステント外壁を構成する生体吸収性ステントと、腸骨動脈の接触部における慢性的な炎症性変化や異物反応による内膜肥厚が生じることが懸念された。よって先述の計画に加え、生体吸収性ステント単独でブタ腸骨動脈内に留置して、遠隔期(6ヶ月程度)まで観察を行い、生体吸収性ステントが留置部動脈壁に与える影響を検討する実験の追加を予定している。
細胞内シグナル伝達経路の人為的制御による癌免疫療法の強化

TNF receptor-associated factor 6 (TRAF6)は細胞表面レセプターからのシグナルを伝達し、転写因子を活性化することで獲得免疫応答や自然免疫応答を制御する分子である。申請者はTRAF6に依存した細胞内シグナル伝達を人為的に制御することで癌免疫療法を強化することを目指している。本研究課題では樹状細胞の人為的活性化による癌免疫誘導の強化法の開発と制御性T細胞の人為的な抑制による宿主癌免疫応答の強化を目指した基礎的検討を行なった。ある種の癌の内部には制御性T細胞が多く集積しており、その結果癌免疫応答は制御性T細胞により抑制されることが知られている。すなわち制御性T細胞の分化を抑制することで、宿主の癌免疫応答が強化される可能性がある。そこで本年度は制御性T細胞の分化におけるTRAF6シグナルの役割解明を目指した。TRAF6欠損マウスでは胸腺内制御性T細胞の分化が大きく抑制される。その異常がT細胞やその前駆細胞に固有の異常であるかどうかを決定するために、TRAF6欠損マウスおよび野生型マウスから造血幹細胞を含む胎仔肝細胞を調製し、両者をX線照射したRAG2欠損マウスへ移入した。その結果、TRAF6欠損マウス由来造血幹細胞からの制御性T細胞分化は野生型に比べて大きく抑制された。すなわちTRAF6が関与するシグナルは制御性T細胞の前駆細胞で機能することで、制御性T細胞の分化を制御していることが証明できた。この結果は、T細胞やその前駆細胞において機能するTRAF6シグナルを抑制することにより、制御性T細胞の分化を抑制することが可能であることを示している。今後は、その機構を利用して癌免疫応答を強化する方法の開発へと展開したい。TNF receptor associated factor 6(TRAF6)は細胞表面レセプターからのシグナルを細胞内で伝達し、NF-kBやAP-1などの転写因子を活性化する分子である。TRAF6は樹状細胞の活性化に必要なToll様レセプターやCD40によるNF-kBやMAPKの活性化に必須であると伴に胸腺依存的な自己免疫寛容の誘導、制御性T細胞の分化あるいは生存に関与している。本研究は、TRAF6によるシグナル伝達メカニズムの情報を基に、TRAF6依存的な細胞内シグナル伝達を人為的に制御することで癌免疫療法を強化することを目的としている。本年度は樹状細胞の活性化を目的として、TRAF6を人工的に活性化するシステムを開発した。TRAF6のアミノ末端側領域を2量体形成可能なタンパク質であるGyrase Bに融合させたキメラタンパク質を発現する遺伝子を構築し、NF-kBの活性化能をIkBaのリン酸化を指標として確認した。さらにこの遺伝子を樹状細胞に効率的に導入するためにレンチウイルスベクターに組み入れた。現在、このキメラタンパク質による樹状細胞活性化能について検討中である。一方、制御性T細胞産生におけるTRAF6の役割を調べるために、TRAF6欠損造血幹細胞移植キメラマウスおよびTRAF6欠損胸腺ストローマ移植マウスを作製し、制御性T細胞の産生を検討した。その結果TRAF6は胸腺のストローマ細胞と造血幹細胞由来の細胞の両者で機能することが判明した。胸腺ストローマでは癌関連抗原が異所的に発現していることが知られており、TRAF6は癌関連抗原に特異的な制御性T細胞の産生を制御している可能性が示唆される。現在、胸腺ストローマ細胞でのTRAF6の欠損が癌に対する免疫監視を強化しているかどうか検討中である。