hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ナノトライボロジ-の基礎研究

これは,材料力学における,応力ーひずみ曲線に対応するナノメ-タ・オ-ダでの初めての変形曲線である.この類の曲線は,ナノメ-タ・オ-ダでの摩擦,加工を論ずる上で,必ず重要となるものと考えられる.萌芽的研究としてSTMーTribologyの研究が行われた.これは,STM(走査型トンネル顕微鏡)をトライボロジ-の基礎研究に導入することにより,これまで未開拓だったナノメ-タオ-ダのトライボロジ-の基礎を確立することを目的とするものである.トライボロジ-とは二物体間の接触に関する総合科学として位置づけられ、接触特における材料の変形挙動は,トライボロジ-の基礎として非常に興味深く重要な問題である.これに対し,昨年度接触面における微小変形量に対し興味深い結果を得た.そこで本年度は,さらに剛性を考慮し精度を向上させた装置への改良を行い,探針としてダイヤモンドを用い,これを直接試料表面に押し込む方法によりナノメ-タオ-ダの材料の変形挙動を明らかにする実験が行われた.以下に,本研究で得られた興味深い知見を示す.1.ナノメ-タオ-ダにおける塑性変形挙動10nm以上の押し込み量と塑性変形量の間に比例関係が成立することが確認された.さらに26nm以上の塑性変形が生じる場合,押し込み圧子の形が転写されることが確認された.これらの結果は,ナノメ-タオ-ダにおける塑性変形挙動に対し一般的塑性力学の応用を考える事が可能であることを示唆するものであると考えられる.2.ナノメ-タオ-ダにおける弾性変形挙動装置の変位吸収量を除いた総押し込み量と塑性変形量の不一致が確認された.さらに総押し込み量が8.6nm以下の繰り返し押し込みに対し塑性変形量がゼロであることが確認された.これらの結果は,ナノメ-タオ-ダにおける弾性変形挙動に対し一般的弾性力学の応用を考える事が可能であることを示唆するものであると考えられる.
古墳時代墓制の終焉過程からみた律令国家形成期の北部九州

本研究では、北部九州各地の古墳時代墓制の終焉過程から、律令国家形成期の北部九州の社会について考察した。墓制の衰退に向かう諸変化は7世紀前半代にもみられるが、特に7世紀中頃以降は急速に墳丘や墓室規模が縮小し、副葬品も簡素になるなど、墓制の衰退が顕著となる。それは造墓における政治・社会的意義の減退を示し、律令国家形成に向かう社会の成長と発展が北部九州でも確実に進んでいることが明らかになった。本研究は、北部九州を対象に、古墳時代墓制の終焉過程を検討することで、律令国家形成に向けた政治的・社会的変化を地方の視点から考察することを目的としている。前年度は、筑前・筑後・豊前地域を中心に資料の収集と整理作業を実施した。2ヵ年目にあたる平成25年度は、豊前地域の一部と肥前地域について資料の収集等を行った。研究は途上であるが、中間的に得られた成果を論文として発表した。まず、資料集成作業の過程で、北部九州では豊前地域の終末期古墳から偏在的に出土する頸基部突帯付須恵器壺・瓶類に注目し、畿内以西の分布傾向を検討し、瀬戸内海の西端に位置する豊前地域が、その立地環境から瀬戸内地方との文化的な接触や交流が色濃いことを改めて確認した(『福岡大学考古学論文集2』2013年)。この検討により、墓制の構造的な側面との検討が必要であるが、豊前地域と東方地域との文化的な近縁性は、北部九州における墓制を分析する上で不可欠な視点であることを再認識できた。さらに、昨年度遺物の検討会を行った手光波切不動古墳の調査成果に基づき、北部九州における横口式石槨墓制の影響について考察を行い、畿内主導の墓制の統制とは関係なく、北部九州の側の主体的かつ限定的な墓制受容であったことが判明した(『九州歴史資料館論集』39 2014年)。このことは地方の墓制にまで中央集権的な解釈を行う傾向にあった従来の見解に対し、地方の主体性を軽視できない点を改めて確認するものである。一方で、中央における墓制の情報がさほど時期差もなく地方に到達していることも確認した。以上の諸様相は、王権と地方との文化交流の側面と、地方間の文化交流の側面とが表出したもので、なおかつ諸要素が斑状に分布する状況は、王権による地方支配が単一の方式によっていないことを物語る。今後、墓制に対する検討を深めることで、実態がより明確になることが期待できる。本研究は、北部九州全域を対象に古墳時代の終末期墓制を整理・検討することで、当時の地方社会の実像に迫ることを目的としている。しかし、対象地域が広いため、初年度は筑前・筑後・豊前地域を対象に、資料の収集・整理作業を実施した。あわせて、必要に応じて出土土器を中心に実見し、一部資料については再実測を行った。その中で、筑前・観音山古墳群に関しては、以前に検討した段階からさらに調査古墳数が増加し、資料的な充実が顕著であることから、改めて検討を行い、その成果を講座で発表するとともに、さらに分析を重ねて『九州歴史資料館論集』に論文を掲載した。また、畿内の横口式石槨の影響が指摘される手光波切不動古墳の出土遺物検討会や、別府大学が発掘調査を進める終末期方墳・鷹塚古墳の現地検討会などに、それぞれ調査機関の配慮を得て参加した。両古墳とも最新の調査状況や出土遺物、年代観についての知見を得られたことは大きな成果であった。なお、筑後地域の資料検討のため、大牟田市・甘木山古墳群の現地踏査も実施した。一方で、先学による研究成果の整理も重要であることから、改めて北部九州における研究の現状と課題について整理を行った。作業は途上にあるが、その成果については今後、研究雑誌への投稿を予定している。また、九州以外の地域における終末期古墳研究の現状を把握するため、平成25年1月に開催された播磨考古学研究集会に参加した。播磨は当然にして北部九州と異なる歴史的・地理的背景を有するが、資料を通覧すると畿内に隣接しながら畿内とは異なる地域性・独自性が顕著に見受けられる。そのため、当該地域の研究者による資料解釈の視点は、北部九州の資料解釈にとっても大いに参考となった。本年度は、北部九州地域における古墳文化終焉を考察する上で欠くことのできない古墳出土資料について資料調査を実施するともに、肥前や豊後地域の墓制についての資料を収集し、壱岐・対馬・五島列島などの墓制についても資料収集を行った。資料調査では、近年発掘調査報告書が相次いで刊行された豊前地域の古墳の様相を整理するため、ヒメコ塚古墳や渡築紫古墳群などの資料調査を実施した。いずれも地域の主要な首長墳や終末期群集墳の事例で、河川(水系)などを単位とする首長系譜の様相が明確になったとともに、墓制の推移について重要な情報が得られた。豊後においても九州では特異な横口式石槨を内蔵する古宮古墳の出土資料や、近隣の長谷横穴墓や城南遺跡方形周溝遺構(火葬墓と推定される)などの出土資料の調査を実施するともに、大分国造の奥津城とみられる横穴式石室墳の現地踏査も行った。横穴墓が卓越する地域における墓制の推移を考察する資料を得ることができた。その一方で、豊前・豊後などの東部九州の墓制の理解には、地理的に接する西部瀬戸内地域の墓制を整理・検討する必要があることを再認識し、関連資料の収集等を行った。

また、肥前東部地域の墓制について検討を進めていたところ、ちょうど長崎県考古学会が古墳時代墓制についての研究大会を開催した。学会では、近年の最新の調査成果が網羅されており、石棺墓の卓越と、石室墓の点在性を理解する上で多くの情報を得ることができた。現在、こうした点についても成果報告書に向けて整理・検討を行っている。なお、これまでの研究成果等をもとに九州歴史資料館において、第26回企画展「古墳から火葬墓へー北部九州における古墳の終焉ー」を開催し、筑前・豊前・豊後・肥前の古墳出土資料をもとに、古墳文化終焉の様相を紹介した。併せて解説シートの作成やギャラリートークを行い、成果の公開と理解促進に努めた。本研究では、北部九州の7世紀代を中心に高塚石室墳や横穴墓の他、石棺墓や土壙墓など、各種古墳時代墓制の終焉過程を分析することで、律令国家形成期における地域の様相を明らかにした。北部九州各地の墓制の在り方から、7世紀中頃を境にした墓制の大きな変革が確認できた。7世紀前半代までは明確な首長墓が各地で確認できるのに対して、7世紀後半代にはほとんどの地域で首長墓が見出し難くなる。また、墳丘規模も急速に小型化するとともに、横穴墓も含めて墓室規模が小型化し、副葬品も被葬者が生前に身に付けていた装身具が伴う程度に簡素化する。こうした諸変化は、古墳(や横穴墓)の造墓における政治的・社会的な意義が後退していることを意味し、政治的・社会的な身分表徴としての「古墳」から、一個の埋葬施設である「墓」への変化と考えた。その背景には、律令国家の形成に向けた様々な社会制度の展開や、列島を取り巻く東アジア世界情勢の変化などが大きく影響しているとみられ、当時の社会が完成された律令国家に向かって確実に成長し、発展していることを示している。ただし、筑前地域などでは階層分化が顕著であるのに対して、肥前西部や対馬などではやや分化の程度が弱いなど、地域によって社会構造や規模に違いがある。また、筑前東部や豊後では高塚石室墳よりも横穴墓が卓越しているなど墓制の内容に差異が存在するものの、古墳時代墓制の終焉に向かう過程は概ね共通する点などから、地域社会の構造や規模に即した墓制の展開が認められており、地域の実態に即した支配体制の構築・強化が図られたことが明らかとなった。本研究では、北部九州各地の古墳時代墓制の終焉過程から、律令国家形成期の北部九州の社会について考察した。墓制の衰退に向かう諸変化は7世紀前半代にもみられるが、特に7世紀中頃以降は急速に墳丘や墓室規模が縮小し、副葬品も簡素になるなど、墓制の衰退が顕著となる。それは造墓における政治・社会的意義の減退を示し、律令国家形成に向かう社会の成長と発展が北部九州でも確実に進んでいることが明らかになった。今年度は、壱岐・対馬を含めた肥前地域や豊後などの地域についての資料収集を進めたが、とくに肥前地域の墓制については、筑前・筑後・肥後といった隣接地域の墓制の影響を受けることで、非常に複雑な様相を呈していることが明らかとなり、それぞれの古墳資料の系譜的な検討を十分に進めなければ、誤った見解に落ちいってしまう可能性があった。長崎県考古学会による古墳時代墓制を主題とした研究会においても、その系譜観や造墓主体の認識には様々な意見が出されるなど、改めて周辺地域の墓制を含めた鳥瞰的な視座からの検討の必要性を認識した。また、豊前地域については、九州内よりも西部瀬戸内地域における墓制との比較検討が不可欠であることが明らかとなり、先行研究の収集・検討や主要資料の収集等をはじめている。
ビタミンEによる脂質アルキルラジカル捕捉反応の解析

ビタミンEの生体内脂質過酸化抑制作用を明らかにする目的で、脂質アルキルラジカル捕捉反応を解析した。まず、ヒト血漿脂質を構成するコレステロールエステルとリン脂質由来のアルキルラジカルとビタミンEとの反応生成物として付加体を分離してそれらの構造を決定した。さらに、ビタミンE付加体の高感度分析法として、高速液体クロマトグラフィーで分離した後、還元カラムを通して蛍光検出する方法を開発した。本分析法を使用して、LDLモデル溶液の脂質過酸化反応に対するビタミンEの作用を検討しところ、低酸素条件下で脂質アルキルラジカルを捕捉した付加体の生成を確認した。脂質過酸化反応に対するビタミンEの作用機構を明らかにする目的で、ビタミンEと脂質ラジカルとの反応生成物を検討した。まず、リン脂質(1-パルミトイル-2-リノレオイル-3-sn-ホスファチジルコリン、PLPC)あるいはリノール酸コレステロールエステルから調製したヒドロペルオキシドを熱分解または窒素気流下で鉄触媒分解させることによって脂質ラジカルを発生させた。これらの脂質ラジカルをビタミンE (α-TH)と反応させたところ、α-THの6位水酸基に脂質ヒドロペルオキシドの分解で生じたアルキルラジカルとエポキシアルキルラジカルが結合した6-O-アルキル-α-THおよび6-O-エポキシアルキル-α-THが生成した。これらの6-O-脂質-α-TH付加体は、ビタミンEの脂質ラジカル捕捉反応解析のための標品として利用できるものである。次に、ビタミンE-脂質ラジカル捕捉反応モデルとして、UV-A照射による脂質過酸化に対するα-THの作用を検討した。その結果、α-THを添加したリノール酸メチルを37°CでUV-A照射すると、反応生成物としてα-THと脂質ペルオキシルラジカルとの付加体とともに脂質アルキルラジカルとの付加体が検出された。しかしながら、α-THを添加したPLPCリポソームに対してUV-Aを照射したところ、反応生成物はα-THとPLPCペルオキシルラジカルとの付加体であり、この場合にはビタミンEは脂質ペルオキシルラジカルを優先的に捕捉している可能性が示唆された。従って、今後のビタミンEによる脂質ラジカル捕捉反応の解析には、酸素濃度を考慮した反応系の確立が必要である。まず、血漿脂質の主成分であるコレステロールリノール酸エステルから調製したヒドロペルオキシド(ChL-OOH)を熱分解させることによって脂質ラジカルを発生させてビタミンE(α-TH)と反応させた。その結果、α-THの6位水酸基にChL-OOHの分解で生じたアルキルラジカルとエポキシアルキルラジカルが結合した6-O-アルキル-α-THおよび6-O-エポキシアルキル-α-THが生成した。これらの付加体は、HPLCによって分離して構造決定し、今後、血漿モデルの脂質過酸化反応におけるα-THの抗酸化機構の検討に標品として使用する予定である。一方、生体膜脂質過酸化反応で重要な標品となる主要膜リン脂質の1-パルミトイル-2-リノレオイル-3-sn-ボスファチジルコリン由来のアルキルラジカル種とα-THとの付加体は、その調製法が未だ確立できておらず、さらに反応条件等を検討する必要がある。また、ビタミンE-脂質ラジカル捕捉反応モデルとして、酸化二次生成物である4-オキソ-2-ノネナールとの反応についても検討した。その結果、酸化二次生成物はα-THによって捕捉されず、別のビタミンE同族体であるγ-THよって効果的に捕捉され、5-置換体を生成することを明らかにした。すなわち、ビタミンEの同族体によって脂質過酸化反応の捕捉分子種が異なることが示された。従って、ビタミンEによる脂質ラジカル捕捉反応の解析には、生成するフリーラジカル種を考慮した反応系で検討していく必要がある。脂質過酸化反応に対するビタミンE(α-TH)の作用機構を明らかにする目的で、脂質アルキルラジカルとの反応生成物を検討した。まず、ヒト血漿脂質の主成分であるコレステロールリノール酸エステル(ChL)由来のアルキルラジカルとα-THとの反応生成物として、α-THの6位水酸基にChLアルキルラジカルあるいはepoxyChLアルキルラジカルが結合した6-ο-ChL-α-THと6-ο-epoxyChL-α-THを分離し、それらの構造を決定した。さらに、生体膜を構成するリン脂質である1-パルミトイル-2-リノレオイル-3-sn-ホスファチジルコリン(PLPC)由来のアルキルラジカルとα-THとの反応生成物として、6-ο-epoxyPLPC-α-THの構造を決定した。次に、生体系におけるこれらビタミンE付加体の生成を高感度に検出するための分析法を検討した。6-ο-

脂質-α-THは高速液体クロマトグラフィーで分離した後、プラチナ還元カラムを通すとα-THに変換できたので、これを蛍光検出することによって高感度分析が可能となった。本分析法を使用して、ChLとPLPCから調製したヒト血漿低密度リポタンパク質モデル溶液の脂質過酸化反応におけるα-THの抑制作用を検討した。その結果、酸素を十分に供給した脂質過酸化系で、α-THは脂質ペルオキシルラジカルを捕捉してα-TH-脂質ペルオキシルラジカル付加体を形成したが、酸素供給が不十分な反応系ではアルキルラジカルも捕捉してα-TH-脂質アルキルラジカル付加体を生成できることが示された。従って、脂質過酸化抑制において、ビタミンEは脂質ペルオキシルラジカルだけでなく、低酸素条件下では脂質アルキルラジカルを捕捉できることが明らかとなった。
IT技術を用いた中国語多重母音の発音教育システムの開発

本研究はIT技術を用いて,中国語の多重母音の発音教育システムの開発を目的として,まず,中国語の「有気音」と「無気音」の多重母音の発話の音節を解析し,それらの発話のVOTの長さと相対平均パワーを測定することにより有気音と無気音のVOT,パワーなどから特徴を引き出す。様々な中国語の発音に対する多様なモデルを開発し,IT技術を用いた中国語多重母音の発音教育システムの開発を目指す。
前立腺の発育および肥大、炎症誘発におけるプロラクチンの作用機構-プロラクチンノックアウトマウスを用いた解析-

雄マウスにおいて、幼弱期におけるエストロゲンの作用による持続的な高プロラクチン血症が前立腺の炎症誘発の一因となることが示唆されている。そこでプロラクチンのノックアウトマウスおよび野生型マウスの幼弱期に、エストロゲン作用を有する内分泌攪乱化学物質として知られるビスフェノールAを投与し、前立腺における炎症発症度をミエロパーオキシダーゼ活性を指標として測定したところ、ノックアウトマウスでは野生型マウスに比べて炎症度が大きく軽減されており、ビスフェノールによる前立腺の炎症誘発はそのエストロゲン作用により発現誘導されたプロラクチンによるものであることが明らかになった。ついでこうしたプロラクチンの前立腺における作用機構を明らかにするため、プロラクチン受容体(PRL-R)遺伝子の発現調節機構の解析を行った。ラットのPRL-R遺伝子にはこれまで3種類の第一エクソンEl-1、El-2、El-3の存在が知られていたが、PRL-R遺伝子の5'領域の解析により、El-4とEl-5の2種類の新規の第一エクソンの存在することを明らかにした。これらの各第一エクソンは組織特異的な発現を担っている。ラットの前立腺において発現している第一エクソンをRT-PCRにより調べたところ、El-3エクソンの発現していることが明らかになった。すなわち、前立腺におけるPRL-R遺伝子の発現はEl-5第一エクソンに働く因子により調節されている。El-3第一エクソンは広範囲の組織で発現しているが、その発現調節には転写因子のSP-1およびC/EBPβが関与していることが知られており、前立腺でのPRL-R遺伝子の発現もこれらの転写因子により調節を受けていると考えられる。1.ビスフェノールAによる前立腺の炎症誘発におけるプロラクチンの関与の検討雄マウスの血中プロラクチン濃度は4週齢頃に顕著に上昇するが、プロラクチン上昇期におけるエストロゲンの作用による持続的な高プロラクチン血症が前立腺の炎症誘発の一因であることが示唆されている。そこでプロラクチンノックアウトマウスおよび野生型マウスの幼若期にエストロゲン用作用を有する内分泌攪乱化学物質ビスフェノールAを投与し、前立腺炎症誘発に対するプロラクチンの影響を検討した。Myeloperoxidase活性を指標として前立腺の炎症度を測定したところ、プロラクチンノックアウトマウスでは野生型マウスに比べて前立腺炎症度が40%以下であり、プロラクチンにより前立腺の炎症が促進されることが示された。2.プロラクチン受容体遺伝子の発現調節機構の解析前立腺におけるプロラクチンの作用機構を解明するためには、プロラクチン受容体の組織発現の調節機構を明らかにすることが必要である。そこでマウスのプロラクチン受容体遺伝子の第一エクソンとその上流域をクローニングし構造解析を行った。その結果、マウスプロラクチン受容体遺伝子には5種類の第一エクソンが存在し、各第一エクソン上流のプロモーター領域により、肝臓、脳、卵巣等の各組織における発現調節がなされていることが明らかになった。今後さらに、前立腺で発現する第一エクソンを同定し、前立腺におけるプロラクチン受容体遺伝子の発現調節機構を解明していく。前年度の本研究において、エストロゲン作用を有する内分泌攪乱化学物質として知られるビスフェノールを幼少期の正常マウスに投与すると前立腺に炎症を誘発するが、プロラクチンノックアウトマウスでは炎症誘発が生じないことから、ビスフェノールによる前立腺の炎症誘発はそのエストロゲン作用により発現誘導されたプロラクチンによるものであることを明らかにした。こうしたプロラクチンの前立腺における作用機構を明らかにするため本年度においては、プロラクチン受容体(PRL-R)遺伝子の発現調節機構の解析を行った。ラットのPRL-R遺伝子にはこれまで3種類の第一エクソンE1-1、El-2、E1-3の存在が知られていたが、PRL-R遺伝子の5'領域の解析により、El-4とEl-5の2種類の新規の第一エクソンの存在することを明らかにした。これらの各第一エクソンは組織特異的な発現を担っており、El-4は脳特異的に発現し、また、El-5は主に肝臓と腎臓で発現している第一エクソンであった。

ラットの前立腺において発現している第一エクソンをRT-PCRにより調べたところ、El-3エクソンの発現していることが明らかになった。すなわち、前立腺におけるPRL-R遺伝子の発現はE1-5第一エクソンに働く因子により調節されている。E1-3第一エクソンは広範囲の組織で発現しているが、その発現調節には転写因子のSP-1およびC/EBPβが関与していることが知られており、前立腺でのPRL-R遺伝子の発現もこれらの転写因子により調節を受けていることが考えられる。プロラクチンによる前立腺の炎症誘発におけるPRL-Rの情報伝達経路の解明が今後の課題である。
基底状態および励起状態における選択的電子移動複合体を経る反応の表発と応用

ドナ-・アクセプタ-としての適当な分子ペアの基底状態および励起状態における選択的電子移動を経る複合体形成を利用し,新しい高選択的な官能基変換,合成反応を開発し,これを医薬・農薬などとして有用な天然有機化合物などの合成に応用し,現代有機化学への貢献と創薬のための基礎研究に寄与することを目的になされた本研究の成果の中,マクロリド・ポリエ-テルの合成につき報告する。I.セコ酸のコンホメ-ション制御によるエリスロノリドAなどの合成エリスロノリドAセコ酸の保護基の違いによるコンホメ-ション変化をNMR解析とMMP2計算により明らかにし,マクロラクトン化に最も適したセコ酸誘導体を予測,合成した。これは超効率で閉環し(室温数分,定量的),対応する14員環ラクトンがえられ,常法によりエリスロノリドAに誘導された。この方法は,オレアンドノリド,ランカノリド合成にも応用され,現在フラグメントの合成が進行中であり,エリスロノリドAと同様の結果が期待される。II.マクロリングのコンホメ-ション制御によるマリドノリド類の合成・カルボノリドBの各種誘導体につきNMR解析とMMP2計算によりマクロリングのコンホメ-ションを予想し,制御し,選択的還元,エポキシ化の組合せにより,カルボノリド類,ロイコノリド類,マリドノリド類の完全立体選択的合成に成功した。III.新テトラヒドロフラン形成反応によるイソラサロシドAなどの合成熱力学的条件下のキレ-ション制御反応により,置換テトラヒドロフランの立体選択的合成法を確立し,これを鍵反応として,ラサロシドケトン,イソラサロシドケトンを合成し,アルデヒドとのアルド-ル反応により,ラサロシドA,イソラサロシドAの合成に成功した。
小型魚類を利用した眼形成遺伝子の挿入突然変異法による探索

眼は、複雑な組織間相互作用を通して形成され、その背後には多くの未知の遺伝子の働きがあると考えられる。ゼブラフィッシュは、胚発生の過程でレポーター遺伝子の発現が観察しやすいなど、挿入突然変異法が適用しやすい条件を備えている。本研究は、(1)ゼブラフィッシュにおいて、Sleeping Beauty(SB)トランスポゾンとGAL4/UASシステムを利用した挿入突然変異法(エンハンサートラップ法等)を確立、(2)眼形成過程で機能する遺伝子あるいはエンハンサーをトラップしたと予想される系統を多数見いだし、眼形成の発生システム過程で働く遺伝子の隠された役割を探り出すことを目的に実施した。まず、GAL4結合部位が種々の蛍光タンパク質遺伝子の上流に配置されたUASレポーター遺伝子を持つトランスジェニックフィッシュ系統を確立した。次に、ゼブラフィッシュ胚での使用に適したGAL4活性化因子を見出すため、様々な転写活性化ドメインを持つGAL4活性化因子を作製した。エンハンサートラップのコンストラクトは、SBトランスポゾンのinverted repeat(IR)の間にプロモーターおよびGAL4活性化因子の配列を挿入して作製した。エンハンサートラップ用のDNAを、SBトランスポーゼースmRNAとともに1細胞期の受精卵に顕微注入し、成魚になるまで飼育したところ、トランスポゾンをF1胚に伝えるファウンダーが、2040%の効率で得られた。これらのF0魚を、UASレポーターフィッシュと掛け合わせたところ、特異的な蛍光タンパク質の発現を示すF1胚が、約50%のファウンダーから得られた。以上の結果より、GAL4活性化因子とプロモーターの組み合わせを最適化することで、GAL4/UASシステムを利用したエンハンサートラップがゼブラフィッシュで実現可能であることが分かった。挿入突然変異法は、遺伝子の隠された役割を探り出すうえで非常に優れた方法であるが、脊椎動物においてはひろく利用されるには至っていない。ゼブラフィッシュは、胚発生の過程においてレポーター遺伝子の発現が観察しやすいなど、挿入突然変異法が適用しやすい条件を備えている。本研究は、(1)ゼブラフィッシュにおいて、Sleeping Beauty(SB)トランスポゾンとGAL4/UASシステムを利用した挿入突然変異法(遺伝子トラップ法およびエンハンサートラップ法)を確立、(2)眼形成過程で機能する遺伝子あるいはエンハンサーをトラップしたと予想される系統を多数見いだし、眼形成の発生システムの研究に新たな展開をもたらす、を目的に実施している。まず、UASレポーター遺伝子として、GAL4結合部位を、種々の蛍光タンパク質遺伝子の上流に配置したコンストラクトを作製し、さらにこれらのレポーター遺伝子を持つトランスジェニックフィッシュ系統を確立した。遺伝子トラップおよびエンハンサートラップのためのDNAコンストラクトは、SBトランスポゾンのinverted repeat(IR)の間にGAL4-VP16を含むトラップに必要な配列を挿入して作製した。作製した遺伝子トラップ用およびエンハンサートラップ用のトランスポゾンベクターを、SBトランスポーゼースmRNAとともに1細胞期の受精卵に顕微注入した。成魚になるまで飼育したところ、トランスポゾンDNAをF1胚に伝えるファウンダーが、2040%の効率で得られた。これらのF0魚を、UASレポーターフィッシュと掛け合わせたところ、特異的な蛍光タンパク質の発現を示すF1胚が、遺伝子トラップでは約10%、エンハンサートラップでは約50%のファウンダーから得られた。
植物群落における熱・水・炭素循環過程と群落の成長・衰退過程の統合モデル化

熱・水・炭素循環過程と群落の成長・衰退過程との相互関係を明らかにすることを目的とし、様々な植生において環境応答特性を明らかにするための観測・モデル化の双方を行った。個葉の光合成・蒸散過程をもとにした群落熱・水・炭素循環モデルを改良し、芝地用の群落成長・衰退モデルを開発した。このモデルにより、芝群落の生長・衰退の予測を可能にしたが、森林群落への適用に当たっては植物生長戦略・生物季節の違いを考慮する必要があった。本研究は植物群落における熱・水・炭素循環過程と群落の成長・衰退過程との相互関係を明らかにすることを目的として行われており、様々な植生において、その環境応答特性を明らかにするために観測・モデル化の双方を行っている。対象群落は熱帯雨林、温帯常緑針葉樹林、温帯落葉広葉樹林、温帯寒地芝群落であるが、本年度は主に担当している熱帯雨林樹冠上でのフラックス観測および微気象観測を継続して行い、芝群落での観測結果をもとにモデル化を行った。また、対象群落として冷温帯常緑針葉樹林を追加し、同様の観測を行っている。以下に主要な成果を概説する。熱帯雨林群落である半島マレーシア低地フタバガキ林における樹冠上フラックスの観測結果から群落全体としての環境応答特性を解析し、本群落では乾期においても大気飽差に対する蒸散特性が変化しないこと、一年を通して午前と比較して、午後には二酸化炭素吸収量が低下することなどを明らかにした。芝群落に於いては、生態系呼吸量を葉・根・土壌の各コンパートメントに分離して測定した。各コンパートメントの呼吸量の温度依存特性を解析し、これまでに取得されている各コンパートメントの生長量・枯死脱落量のデータを併せて、成長・衰退モデルを新たに開発し、光合成・蒸散モデルとの結合を行った。モデルによる試算を行った結果、芝群落に於いては一年の間に植物のバイオマスが大きく変化し、単なる温度依存式では生態系呼吸量が推定できず、熱・水・炭素循環過程と群落の成長・衰退過程とのモデルによる結合がより正確な年間純生態系生産量の推定を可能とすることを明らかにした。本研究は植物群落における熱・水・炭素循環過程と群落の生長・衰退過程との相互関係を明らかにすることを目的として行われており、様々な植生において、その環境応答特性を明らかにするために観測・モデル化の双方を行っている。対象群落は熱帯雨林、温帯常緑針葉樹林、温帯落葉広葉樹林、温帯寒地芝群落、冷温帯常緑針葉樹林である。熱帯フタバガキ群落における樹冠上フラックスの観測結果から群落全体としての環境応答特性を解析し、本群落では乾期においても大気飽差に対する蒸散特性が変化しないこと、一年を通して午前と比較して、午後には二酸化炭素吸収量が低下することなどを明らかにした。各コンパートメントの呼吸量の温度依存特性を解析し、これまでに取得されている各コンパートメントの生長量・枯死脱落量のデータを併せて、生長・衰退モデルを新たに開発し、光合成・蒸散モデルとの結合を行った。改良された生長・衰退モデルにより、芝群落における地温の上昇・光条件の変化・芝の張り替え等の影響を定量的に評価し、芝群落の生長・衰退の予測を可能とした。またこのモデルを植生タイプの違う森林群落に適用し、再現性・一般性を検討した。芝群落においては光合成産物をあまり貯蔵せず、生長・衰退に直結するため、ある程度うまく予測することができたが、ライフサイクルが長く、多様な植物が存在する森林群落においては時間的・空間的な生長戦略・生物季節の違いを考慮する必要があった。
コリオリカの壁組織構造に及ぼす影響

乱流の壁構造へのコリオリカの効果を調べるため,始めに平均流速に及ぼすコリオリの効果を明らかにした.その結果,流れを規定するパラメ-タは,R^*_e=u_*D/ν,Ων/u^2_*,ΩD/U_*の三つであることが分った.R^*_e,Ων/u^2_*,y/Dを軸とする三次の元流れ状態空間を用いれば,流れの分類を幾何学的に表現できる.壁法則や速度欠損法則へのコリオリカの効果はこれらのパラメ-タで整理できる.具体的には,Van Driest係数A,カルマン定数κ,積分定数CがR^*_e,Ων/u^2_*の関数として表わされる.コリオリカのみが支配的となるコリオリ領域の存在が確認され,その速度分布則が与えられた.レイノルズ応力<uv>^^^ーは,圧力側と負圧側でそれぞれイジェクションの寄与の増大あるいは減少に伴ない大きく叉は小さくなる.<uv>^^^ーへのスイ-プやインタ-アクションの寄与の変化は比較的小さい.負圧側において流れが層流化する場合には,イジェクション,スイ-プともに低下して<uv>^^^ー【similar or equal】0となる.相関係数は,負圧側で低下し,圧力側で増大し,コリオリカによる乱れ構造変化が生じている.スペクトル分布では,特に負圧側でv成分のスペクトルの低周波成分の低下が顕著にあらわれる.またR_Ω=±140においては,y^+=80(コア領域)でのv成分スペクトルに無次元波数kD【similar or equal】0.3に不連続な分布があらわれる.この波数は,乱れの速度スケ-ルをu_*ととると,時間スケ-ルがπ/Ωの渦に対応する.すなわちチャネル回転の周期の半分である.バ-ストの検出にVITA法を適用したが,得られたバ-スト周期には矛盾した傾向があらわれ,この流れには使えないことが分った.uv法を含め新しい手法を開発中である.乱流の壁構造へのコリオリカの効果を調べるため,始めに平均流速に及ぼすコリオリの効果を明らかにした.その結果,流れを規定するパラメ-タは,R^*_e=u_*D/ν,Ων/u^2_*,ΩD/U_*の三つであることが分った.R^*_e,Ων/u^2_*,y/Dを軸とする三次の元流れ状態空間を用いれば,流れの分類を幾何学的に表現できる.壁法則や速度欠損法則へのコリオリカの効果はこれらのパラメ-タで整理できる.具体的には,Van Driest係数A,カルマン定数κ,積分定数CがR^*_e,Ων/u^2_*の関数として表わされる.コリオリカのみが支配的となるコリオリ領域の存在が確認され,その速度分布則が与えられた.レイノルズ応力<uv>^^^ーは,圧力側と負圧側でそれぞれイジェクションの寄与の増大あるいは減少に伴ない大きく叉は小さくなる.<uv>^^^ーへのスイ-プやインタ-アクションの寄与の変化は比較的小さい.負圧側において流れが層流化する場合には,イジェクション,スイ-プともに低下して<uv>^^^ー【similar or equal】0となる.相関係数は,負圧側で低下し,圧力側で増大し,コリオリカによる乱れ構造変化が生じている.スペクトル分布では,特に負圧側でv成分のスペクトルの低周波成分の低下が顕著にあらわれる.またR_Ω=±140においては,y^+=80(コア領域)でのv成分スペクトルに無次元波数kD【similar or equal】0.3に不連続な分布があらわれる.この波数は,乱れの速度スケ-ルをu_*ととると,時間スケ-ルがπ/Ωの渦に対応する.すなわちチャネル回転の周期の半分である.バ-ストの検出にVITA法を適用したが,得られたバ-スト周期には矛盾した傾向があらわれ,この流れには使えないことが分った.uv法を含め新しい手法を開発中である.流れの乱れ壁組織構造に及ぼすコリオリカの効果を調べるため,初めにチャネル内の平均流速度分布の特性を考察した。従来コリオリカの安定化・不安定化作用のため,平均速度分布が影響を受けることは知られていたが,定量的に詳しい考察はされていない。本研究では次元解析の結果から,壁近くの流れの支配パラメ-タがΩν/u_*^2(Ω;回転角速度,u_*;摩擦速度)であることを示し,実験結果からカルマン定数化,摩擦係数Cfがこのパラメ-タで良く整理できることを確認した。又Van・Driestの係数Aは圧力側ではΩν/u_*^2のみに依存するが,負圧側ではレイノルズ数にも依存し,静止流路に近い性質の流れとなる。乱流コア部では,コリオリカが作用する流れ場での新しい欠損則を提案し,その妥当性を実験により確めた。乱流統計量は,小型のX型熱線で,主流成分uはy^+>10,垂直成分vはy^+>30で正しい測定ができることを確認した。チャネル内のせん断応力分布は,静止流路の場合のように直線分布とならず,ロ-ルセル発生による慣性効果のため曲線分布となる。乱れ強さは,静止チャネルに比らべ圧力側での増大は少ないが,負圧側での低下が著しい。

乱れu,v成分の4象現分解法による解析により,圧力側ではスィ-プの発生頻度が増加し,イジェクトのそれは静止流路と同程度であるが,レイノルズ応力への寄与はイジェクションが著しく大きくなる。負圧側では,いずれの象現も発生頻度に著しい差がみられなくなる。高次統計量であるひずみ度は,u成分では静止流路からのずれは小さいが,v成分は圧力側で著しく大きくなり,平担度はv成分の負圧側で大きくなる。u,vの相関係数は,負圧側で低下し,圧力側で増大する。バ-ス発生率の変化は,現在計算途中である。前年度に引く続き,平均流速分布へのコリオン力効果を解析した結果対数領域に相当する場所において,コリオリ力のみが支配的になる新たなコリオリ領域の存在を示し,その速度分布を求め,これを実験により正しいことを確認した.また乱れ構造については,R_e=3700,4500,5500について詳細な実験を行い,以下の結果を得た.レイノルズ応力uvの圧力側,負圧側へのコリオリ力の効果は,いずれのレイノルズ数においても,圧力側ではイジェクションの寄与の増大負圧側ではイジェクションの寄与の低下に伴い,それぞれuvの増大あるいは減少が生じる,スィ-プやインタ-アクションの寄与の変化は比較的小さい,R_e=3700でRΩ=-140では,流れは層流化しており,この場合イジェクション,スィ-プともに低下しておりuv0となる.相関係数は,負圧側で低下し,圧力側で増大し,コリオン力による乱れ構造変化が生じている.u変動のひずみ度は壁近傍を除き圧力側で負の値が大きくなり,負圧側では逆の傾向になる.一方v変動では,負圧側で零に近づき,圧力側では負の値が大きくなる.偏平度については,u成分は大きい変化はないがv成分の負圧側で大きい値となる.スペクトル分布では,特に圧力側でv成分のスペクトルの低周波成分の低下が顕著にあらわれる.またRΩ=±140においては,y^+=80の位置(コア領域)でのv成分スペクトルに,無次元波数KD【similar or equal】0.3に不連続的な分布がみられる.この波数は,回転に伴う代表的な乱れのスケ-ルから計算される値(ΩD/u_*)に対応する値である.バ-ストの検出は,VITA法づく方法では精度よく求められないため,uv法を含め現在新しい手法を開発中である.
経験尤度法による条件付モーメント制約を持つジャンプ型拡散過程の推定

平成19年度において、前年度の研究成果をもとにジャンプ型拡散過程モデルを含んだ連続時間モデルの条件付特性関数を利用した経験尤度推定法の漸近効率性、すなわち操作変数の数と条件付モーメント制約の数がサンプル数にしたがって、無限大に近づく場合、経験尤度推定量は最尤推定量の効率性を達成することの証明に取り組んできました。この研究課題に関して共同研究者と証明方法を検討し論文を作成する途中です。もう一つ、条件付特性関数を利用する推定法の一つの共通的な課題に関する問題にも取り組んできました。特性関数または条件付特性関数でモーメント制約を構築した場合、特性関数のどの点の関数値を使うのかは問題となります。特性関数の点の数を固定して、異なった点を選んだ場合、得られた推定量の漸近的性質が異なります。これに関して、平成19年度において新しい手法を開発しました。この手法は特性関数で構築したモーメント制約を直交列展開して、特性関数の点の選び方と関係ない新たなモーメント制約を構築します。それで特性関数の点の選択を回避することができました。今まで既にこの手法で得られた推定量の漸近的性質を調べました、引き続き、その推定量の漸近効率性を調べてから論文にまとめて投稿する予定です。以上の二つの研究の結果により連続時間モデルの条件付特性関数を利用した経験尤度推定法の推論を完結し、さらにそれをより実用的なものにすることができます。研究成果を拡張することで、特性関数を利用する他の推定法の改良にも繋がります。平成18年度において、経験尤度法による条件付モーメント制約を持つジャンプ型拡散過程の推定という課題を中心に研究を展開してきました。研究の中でまず経験尤度法の既存研究に関して概観しました。特に条件付モーメント制約に関わる既存研究に関して詳しく考察しました。さらに、参考のために、条件付き特性関数を利用して条件付モーメント条件を構築する方法を考案した論文を詳しく分析しました。以上の準備の下で、先行論文の拡張として、ジャンプ型拡散過程モデルを含んだ連続時間モデルの推定法として条件付特性関数を利用した経験尤度法を考案しました。その研究成果を共著者と論文にまとめて投稿し掲載の承諾をいただきました。論文の中で具体的にはまず条件付特性関数を利用した経験尤度法の仕組みを説明し、そして、既存な代替的な推定法についても説明しました。その上で、われわれの方法と既存の方法の短所と長所について論じました。そして、比較のために特定の連続時間モデルのシミュレーション推定を行いました。シミュレーションのモデルとして金融工学で金利モデルとしてよく利用されているCox-Ingersoll-Rossモデルとジャンプ付きVasicekモデルを選びました。この二つのモデルでデータを発生して推定を行いました。推定において私たちの方法以外に既存の最尤法とモーメント条件の連続体を利用した一般化モーメント法を利用しました。結果としてわれわれの方法が幾つかの点において優れたパフォーマンスを示しました。この研究の一つの次なる課題として考案された推定法の漸近効率性の証明が残されています。
ヒト膵癌幹細胞と微小環境の相互作用機構の解明に関する研究

治療法の進歩にも関わらず、膵臓がんは依然として予後が見込めない「21世紀に残された難治性腫瘍」である。本研究では既存の抗がん剤耐性を示した進行膵癌患者から新たに癌幹細胞株を樹立するという新規性・独創性の高い研究をおこなった。その結果、腫瘍とその周囲の微小環境を構築する間質細胞との相互作用により、腫瘍の増殖や形態維持が制御されていることが明らかになった。癌幹細胞を標的とする新たな分子標的薬につながる重要な知見が得られた。膵癌はわが国で癌死亡率の第5位にあり、早期診断が困難で極めて予後不良の疾患で、発見時には既に多くの症例で遠隔転移や癌性腹膜炎を伴っている。「21世紀に残された難治性癌」とも呼ばれる所以である。既存の抗がん剤にも反応するが、長期投与により抵抗性を獲得するため、新規治療法の開発は喫緊の課題である。本研究の全体構想は膵癌幹細胞とその微小環境を標的とした新規治療法の開発を目指すことである。われわれはこれまで、正常膵臓組織細胞や膵癌組織内の一部の細胞が汎幹細胞マーカー(CD133)を発現していることを明らかにした(Hori et al. Stem Cells, 2008)(Shimizu et al. Pancreas, 2009)(Hashimoto et al. Pathobiology, 2011)。また、既存の抗がん剤に対して耐性を示した進行膵癌患者から20種類のCD133陽性膵癌幹細胞株の樹立にも成功している(Shmizu et al. PLOS ONE, 2013)。本研究ではわれわれが樹立した膵癌幹細胞株を用いて、ニッチと考えられる間質細胞(マウス由来細胞あるいは膵癌患者由来細胞)との相互作用に着目した培養系を確立し、癌幹細胞の増殖機構や転移能獲得機構を分子レベルで明らかにし、癌幹細胞を標的とする新規治療法の開発をめざす。具体的には間質細胞とCD133陽性膵癌幹細胞の接着が(1)膵癌に特徴的な間質反応を起こすメカニズムを明らかにする。また、その担当細胞を明らかにする。(2)ニッチを形成する機序を明らかにする。ことによって新たな治療標的を探索する。膵癌はわが国で癌死亡率の第5位にあり、早期診断が困難で極めて予後不良の疾患で、発見時には多くの症例で遠隔転移や癌性胸腹膜炎を伴っている。「21世紀に残された難治性癌」とも呼ばれる。われわれはこれまで、マウス正常膵臓組織細胞やヒト膵癌組織内の一部の細胞が汎幹細胞マーカー(CD133)を発現していることを明らかにした(Hori et al. Stem Cells, 2008)(Shimizu et al. Pancreas, 2009)(Hashimoto et al. Pathobiology, 2011)。さらに、既存の抗がん剤に対して耐性を示した進行膵癌患者から20種類のCD133陽性膵癌幹細胞株の樹立にも成功している(投稿中)。本研究ではわれわれが樹立した初代膵癌幹細胞株を用いて、ニッチと考えられる間質細胞(マウス由来細胞あるいは膵癌患者由来細胞)との相互作用に着目した培養系を確立し、癌幹細胞の増殖機構や転移能獲得機構を分子レベルで明らかにし、癌幹細胞を標的とする新規治療法の開発をめざす。具体的には間質細胞とCD133陽性膵癌幹細胞の接着が、(1)癌幹細胞の細胞周期をどのように調節するのか、(2)ニッチの構成細胞は癌幹細胞により、どのような作用を受けてニッチを形成するのかを、分子レベルで解明する予定である。さらに、この結果をもとに、ヒト膵癌患者由来feeder細胞の樹立にも着手し、癌患者自身の生体内で起こる微小環境を再構築し、創薬につなげたい。膵癌はわが国で癌死亡率の第5位にあり、早期診断が困難で極めて予後不良の疾患で、「21世紀に残された難治性癌」とも呼ばれる。

本研究においては、既存の抗がん剤に対して耐性を示した進行膵癌患者から20種類のCD133陽性膵癌幹細胞株の樹立に成功した(Shmizu et al. PLOS ONE, 2013)。本研究ではわれわれが樹立した膵癌幹細胞株を用いて、ニッチと考えられる間質細胞との相互作用に着目した培養系を確立し、癌幹細胞の増殖機構や転移能獲得機構を分子レベルで明らかにし、癌幹細胞を標的とする新規治療法の開発をめざす。具体的には(1)間質細胞とCD133陽性膵癌幹細胞の接着がどのような因子により調節されているのか。(2)そのシグナル経路についても明らかにする。(3)in vivoでの解析をするためにはマウス膵癌細胞が必要であり、その樹立にも着手する。これらのデータから新たな治療標的を探索することを目的として研究計画を進める。膵臓がん1.初代CD133陽性膵癌幹細胞株とfeeder細胞の接着により発現調節をうける因子の同定マウスのstroma細胞やヒトの間葉細胞との共培養により、樹立したCD133陽性膵癌幹細胞株は膵管状腺癌に類似したコロニーを形成することを確認した(CD133陽性腺管の形成、粘液産生能、コロニー内の不均一性など)。また、予備実験の結果、膵癌幹細胞株とfeeder細胞の接着により基底膜の主成分であるラミニンの発現誘導を遺伝子発現や蛋白発現で確認している。2. CD133陽性膵癌幹細胞株とfeeder細胞の接着により分泌される増殖因子の同定CD133陽性膵癌幹細胞株とマウスstroma細胞あるいはヒト間葉細胞との共培養により得られた培養液中に膵癌幹細胞株を増殖させる因子が分泌されることを認めた。また、候補分子としてGCSFの存在を同定した。1. CD133陽性膵癌幹細胞株とfeeder細胞の接着により発現調節をうける因子の同定マウスのstroma細胞やヒトの間葉細胞との共培養により、樹立したCD133陽性膵癌幹細胞株は膵管状腺癌に類似したコロニーを形成することを確認した(CD133陽性腺管の形成、粘液産生能、コロニー内の不均一性など)。2. CD133陽性膵癌幹細胞株とfeeder細胞の接着により分泌される増殖因子の同定CD133陽性膵癌幹細胞株とマウスstroma細胞あるいはヒト間葉細胞との共培養により培養液中に膵癌幹細胞株を増殖させる因子が分泌されることを認めた。これまでの研究成果から、今後の研究推進方策として、1. CD133陽性膵癌幹細胞株とfeeder細胞の接着により発現調節をうける因子の同定われわれが樹立した膵癌幹細胞株は、in vitroやin vivoにおいて依然として抗がん剤に対する反応を呈することが明らかになっている。抗がん剤投与により変化する遺伝子を網羅的に解析するため、DNA chipをおこなう。その結果、同定された因子について、免疫染色、RT-PCR、in situ hybridizationにより、発現を確認する。2. CD133陽性膵癌幹細胞株とfeeder細胞の接着により分泌される増殖因子の同定培養により得られた培養液内の分泌因子を同定するため、ELISA法により、同定する。候補因子が明らかになれば、免疫染色やウェスタンブロット法により確認する。また、中和抗体やshRNA導入によって阻害効果を検討する。
圧電材料を用いた神経ネットワーク再生用三次元力学・電磁場刺激バイオリアクタの開発

本研究では,交流電圧磁場刺激および圧電薄膜設置と繰り返しひずみ負荷による力学・電場刺激の重合による神経細胞活性が可能な三次元力学・電磁場刺激バイオリアクタの開発を目指す.本年度の研究では,交流磁場,直流電場,繰返し引張りひずみ場の個別の負荷による軸索伸展効果の確認を行った.生体適合圧電材料MSOによるひずみ・電磁場刺激の軸索伸展促進効果が非常に低いことから,新たに圧電ポリマーPVDFを採用し,繰返し引張りひずみおよび電界刺激を負荷する装置の設計と製作を行った.再生用足場材料として,コラーゲンゲル,ポリマーゲルおよび生体由来の低分子アミノゲルを採用し,三次元チャンバー内に播種したPC12,N1細胞,マウス由来の大脳皮質初代細胞に対する磁場,電場,力学場刺激の単独効果の検討を行った.以下に,主要5課題の研究成果を示す.(1)三次元神経ネットワーク形成予測のために,細胞外環境の影響を考慮可能なCA法と有限要素法によるハイブリッドコンピュータシミュレーションプログラムの開発を行った.(2)コラーゲンゲルに加えて低分子アミノ構造ゲルを導入し,軸索促進効果の最適化を図った.また,接着誘引要素としてラミニンおよびレジンの添加を行うことで細胞死を防ぎ,接着強度の増加,さらには軸索伸展の加速を可能にした.(3)本年度は高圧電特性を有する生体適合圧電ポリマーであるPVDFを採用し,圧電効果をによる軸索伸展促進の評価を行った.(4)完成した三次元磁場負荷装置を用い,神経ネットワーク形成のための最適磁場刺激条件の探索を行い,磁場強度と細胞間距離の軸索伸展への影響に関して,細胞間距離に関しては閾値(100μm)があることを見出した.(5)本申請研究の統合としての三次元力学・電磁場刺激バイオリアクタ構築によるマウス由来の海馬大脳神経細胞を用いた神経ネットワーク再生の検証実験の予備実験を行った主要5課題の研究成果を示し,研究が予定通り進んでいることを示す.(1)本年度は,細胞が一様配置された場合の細胞間距離の相違による細胞外基質および細胞に生じるひずみ・応力場を求め,細胞の活性に寄与する力学刺激の定量化を行った.(2)本年度はコラーゲンゲルに加えて低分子アミノ構造ゲルを導入し,軸索促進効果の最適化を図った.また,接着誘引要素としてラミニンおよびレジンの添加を行うことで細胞死を防ぎ,接着強度の増加,さらには軸索伸展の加速を可能にした.(3)昨年度に製作した力学刺激および電場刺激が可能な三次元バイオリアクタによる軸索伸展促進効果のための最適条件探索のための実験を進めた.細胞はPC12に加えN1細胞を採用した.しかし,新規圧電材料MSOの電界強度が非常に小さいために,本年度は高圧電特性を有する生体適合圧電ポリマーであるPVDFを採用し,コラーゲンおよびラミニンコーティングによる軸索伸展の加速を目指し,本圧電ポリマーが有効であることを確認した.(4)本年度は,完成した三次元磁場負荷装置を用い,神経ネットワーク形成のための最適磁場刺激条件の探索を行い,磁場強度と細胞間距離の軸索伸展への影響に関して,細胞間距離に関しては閾値(100μm)があることを見出し,それ以上の距離においては磁場(4μT)刺激に伴い軸索伸展が加速することを見出した.(5)本申請研究の統合としての三次元力学・電磁場刺激バイオリアクタ構築によるマウス由来の海馬大脳神経細胞を用いた神経ネットワーク再生の検証実験の予備実験を行った:磁場および力学場刺激において,初期の細胞播種による細胞配置が軸索伸展に大きな影響を及ぼすことが判明した.さらに,磁場刺激による軸索配向の制御が困難であることを見出した.以上のことを考慮し本年度は電極を三次元バイオリアクタ内に設置する直流電場刺激装置の設計製作を行った.本申請の主要な研究5課題の研究計画を示す.(1)三次元神経ネットワーク形成予測シミュレーションプログラムの開発:力学刺激下での神経軸索伸展の大規模シミュレーションが可能なCA法と有限要素法による解析手法の開発を行う.(2)三次元バイオリアクタ足場としてコラーゲンゲルおよび低分子アミノ構造ゲルを採用し,軸索促進効果の最適化を図る.また,接着誘引要素としてラミニンおよびレジンの添加を行うことで細胞死を防ぎ,接着強度の増加,さらには軸索伸展の加速を可能にする実験法の確立を図る.(3)高圧電特性を有する生体適合圧電ポリマーであるPVDFを採用し,足場・接着誘引剤の選定およびPC12を主に用いて軸索促進効果の評価を行う.(4)三次元磁場負荷装置を用い,神経ネットワーク形成のための最適磁場刺激条件探索およびMPM観察による細胞体配置と軸索伸展の関係を定量評価する.(5)本申請研究の統合としての三次元力学・電磁場刺激バイオリアクタ構築によるマウス由来の海馬大脳神経細胞を用いた神経ネットワーク再生の検証実験を行う:最終目標は,電磁場・力学の融合刺激が可能な三次元バイオリアクタの設計製作と刺激効果の評価である.昨年度までの研究を考慮し,本年度は電極を三次元バイオリアクタ内に設置する直流電場刺激装置の設計製作を主目標に設定する.中枢神経のex-vivo形成過程において,直流電場刺激による軸索ネットワークの形態制御が可能であること,さらに軸索伸展促進が可能であることを確認する.

個別の課題として,細胞の均一細胞間距離の配置が可能な播種用デバイスの開発,および三次元力学刺激における,細胞間距離と力学刺激の関係を明らかにすることで最適な細胞初期配置と力学刺激量を探索することも目指す.最終的には,力学・電場刺激の融合負荷を可能にすることで任意配向制御が可能な三次元バイオリアクタの完成を目指す.本研究では,生体適合圧電材料を設置し,交流磁場・直流電場・力学刺激を行うことで神経軸索伸展および神経ネットワーク形成・再生の促進が可能な三次元力学・電磁場刺激バイオリアクタの開発を目指す.まず,軸索伸展および神経ネットワーク形成過程を細胞体内および細胞周辺環境の状態因子の影響をシミュレート可能なセルラーオートマトン(CA)および有限要素法を採用したハイブリッド数値解析手法の開発を行った.幾何学的な分解能に限界があるものの神経ネットワーク形成過程の予測が可能であることを示した.再生用足場材料として,コラーゲンゲルを採用し,三次元直方体チャンバー内に神経細胞を混入した足場材料を注入・硬化させ,電場・磁場・力学場刺激のための繰り返し刺激負荷が可能な三次元バイオリアクタを設計製作した.神経細胞としてラット由来の疑似神経細胞であるPC12を採用し,力学・磁場・電場刺激負荷に対する軸索伸展促進効果を多光子顕微鏡(MPM)による500μm立方領域の形態変化観察により計測し定量評価を行った.実験数が不十分ではあるが,それぞれの刺激による軸索促進効果を確認できた.圧電材料を用いた実験では負荷ひずみ量が脆性材料であることから非常に小さく発生する電界も想定以下となりひずみ・電界同時負荷刺激装置については検討することが必要であると考える.次年度以降は刺激効果が顕著である直流電場刺激を採用することにした.神経細胞としてマウス由来の海馬大脳神経細胞を採用した予備実験を行った.一様磁場刺激に対する軸索伸展促進効果を確認したが,軸索がPC12に比較して細いことから鮮明な画像取得技術の開発も同時に行うことにした.次年度以降は,力学・電場・磁場刺激における軸索伸展速度の最大化および神経ネットワーク形成速度の最大化を目的とした最適な細胞周辺環境創生が可能な三次元バイオリアクタの開発を行う.本研究は,以下に示す5課題により遂行された.(1)三次元神経ネットワーク形成予測シミュレーションプログラムの開発:細胞体から,樹状突起の伸展と選択的な軸索伸展によるネットワーク形成をシミュレート可能なセルラーオートマトン(CA)法と細胞外周辺環境としての力学・電磁場刺激の影響を評価可能な有限要素(FE)法を融合したCA・FEハイブリッド法シミュレーションコードの開発に成功した.PC12による実験結果およびマウス大脳皮質の各層における細胞体の配置解析結果を用いてシミュレーションを行うことで神経ネットワーク形成過程の予測が可能であることを示した.(2)三次元バイオリアクタ足場用コラーゲンゲルおよび生体適合ポリマーゲルの選択: PC12および海馬大脳神経細胞による神経ネットワーク形成用バイオリアクタに使用する足場材料の検討を行った.