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海外直接投資が発展途上国の生産性向上に与えるスピルオーバー効果

本論文では、「同一産業内の多国籍企業は地場企業にとって生産における競争相手であるため、地場企業がそれらの多国籍企業から新しい知識を吸収するには、時間等の生産活動にとっての機会費用が増大するのではないか」という仮説をたて、モデル化した。本研究の理論モデルにより、FDIのスピルオーバー効果は短期的にはないが、長期的には投資を受け入れた途上国の生産性成長によい影響を与えることが示された。2016年度の研究では既に中国の産業別データを利用し、モデルを実証している。しかし、産業レベルのデータのようなマクロデータには内生性問題等の弱みがある。そのため、昨年(2017年)の4月から7月にかけて、頑健性チェックとして様々な実証方法を試し、実証部分をより繊細化した。そして昨年度5月から7月にかけての3か月間、垂直的なスピルオーバー効果についての分析も始めた。垂直的なスピルオーバー効果とは、川上産業・川下産業における地場企業に与えるスピルオーバー効果である。多くの経済学者は、川下産業における多国籍企業には生産コストを下げるために、生産戦略の一つとして、自発的に川上産業における投資受容国の現地企業に新技術などを移転するインセンティブがあると議論している。つまり、FDIの垂直的なスピルオーバー効果は正であると考えられる。この観点に基づき、川上産業・川下産業というバーティカルな技術移転のチャンネルをモデル化し、多国籍企業がこのチャンネルを通じて地場企業の生産性に与える効果を分析し、川下産業における多国籍企業が現地企業の生産性成長にポジティブな影響を与えるということを明らかにした。29年度が最終年度であるため、記入しない。海外直接投資(Foreign Direct Investment,以下、FDIと省略)は過去20年間における世界経済の主要な特徴の一つである。特に発展途上国へのFDIフロー額が急上昇していることから、途上国の政策担当者の間では、自国の持続可能な発展にFDIが果たす役割について関心が高まっている。受け入れた海外直接投資が発展途上国の生産性向上に有益なのか有害なのかを明らかにするために、本研究はFDIのスピルオーバー効果を水平的なスピルオーバー効果(同産業における現地企業に与えるスピルオーバー効果)と垂直的なスピルオーバー効果(川上産業・川下産業における現地企業に与えるスピルオーバー効果)に分けて分析を行う。今年度は、主にFDIの水平的なスピルオーバー効果に注目し、分析を行ってきた。最近の多くの実証研究は発展途上国におけるFDI水平的なスピルオーバー効果は負であることを示している。FDIの水平的なスピルオーバー効果は何故負なのかを明らかにすることが本研究の目的である。本研究では、海外直接投資の受容国は多国籍企業からコストなく新しい技術を得られるのではなく、物質の面や時間の面など学習投資をする必要があると仮定する。具体的に言うと、例えばL人の労働者の中でIの割合の人が新技術開発セクターに投入された。ここのIはいわゆる「学習投資」である。その場合、実際に実物生産を行う人数はLではなく、L×(1-I)である。そのため、生産性(TFP)を計算するために、総生産量YをLではなく、L×(1-I)で割る必要がある。しかし今までの実証研究はFDI受入国の現地企業のTFPを計算した際に、学習投資Iという項目を考慮に入れていないために、IはそのままTFPの式に残っている。そのため、多国籍企業は学習投資のチャンネルを通じて、同産業の現地企業の生産性にネガティブな影響をもたらすことが示されてきた。昨年度の研究計画では、海外直接投資が毎期に一定の増加率で増えていくという現実の世界と乖離している仮定条件を緩め、不確実性・確率を理論モデルに導入し、理論研究を行うことを目的としていた。昨年度には、予定通りに理論研究を行い、多国籍企業は学習投資のチャンネルを通じて、同産業の現地企業の生産性にネガティブな影響をもたらすことが示された。確率動的計画という手法を用いることにより、海外直接投資の水平的なスピルオーバー効果に注目する本研究の理論部分をより精緻に証明できた。そして、実証分析にも着手している。この一年間の研究成果を取りまとめた上、論文に仕上げたので、今年論文投稿が可能になる。

つまり、FDIの垂直的なスピルオーバー効果は正であると考えられる。この観点に基づき、川上産業・川下産業というバーティカルな技術移転のチャンネルをモデル化し、多国籍企業がこのチャンネルを通じて地場企業の生産性に与える効果を分析し、川下産業における多国籍企業が現地企業の生産性成長にポジティブな影響を与えるということを明らかにした。1.本研究では既に産業レベルのデータを用いて実証分析を行っている。しかし、産業レベルのデータのようなマクロデータには内生性問題が起こりやすいという特有の弱みがある。そのため、昨年度の研究計画では、今年度にはGMMなどの計量手法を用いて、内生性問題を解決する予定であった。しかし、昨年度には、この実証部分の補正をすでに行ったため、これからの一年間には頑健性チェックとして手に入れたばかりの企業レベルのミクロデータを用い、もう一度実証推定を行う。2.垂直的なスピルオーバー効果を分析する。多くの経済学者は、川下産業における多国籍企業には生産コストを下げるために、生産戦略の一つとして、自発的に川上産業における投資受容国の現地企業に新技術などを移転するインセンティブがあると議論している。この観点に基づき、垂直的なスピルオーバー効果に対して分析しようと考えている。29年度が最終年度であるため、記入しない。
戦後期における音楽教育改革に関する研究

平成13年度は前年度に続き、資料収集とその分析によって、次のように研究を総括した。1.終戦直後における音楽教科書取扱いの実態を分析するとともに、文部省著作音楽教科書と戦時期音楽教科書の比較分析を行った。(1)その結果、「墨塗り」措置の中で特徴的なことは「儀式唱歌」が全国的に残存されていたことであり、しかしながら暫定教科書には不掲載となった経緯を確認した。同様の教材が他教科では修正削除されていることからすれば、このことは当時の天皇制に対する曖昧な姿勢を反映するとともに、儀式の場で一斉唱する活動が、集団統合、思想教化の場として特化した機能を有していたことを示すものであった。(2)また二つの教科書は芸術性の追求、あるいは児童の自己表現や人格形成といった理念に対して対照的な立場にたつものの、双方ともに児童の発達段階への配慮や音楽的内容の深化において相応の発展があったことが検証した。政策理念が異なっても、教材や日々の指導は一定の普遍的原理があり、そのことが変革時の実践に対する自己批判、社会的意味づけを困難にする土壌形成の一因をなしていることを実証的に明らかにした。2.1940年代後半から1950年代半ばまでの音楽科を中心としたカリキュラム編成及び学習指導構成の変遷を資料や聞き取りをもとに検証した。その結果、1950年前後にいくつかのバリエーションをもったコア・カリキュラムプランが多く作成され、1951年以降は次第に教科カリキュラムヘと変移していったこと、また音楽科内の学習指導構成においても1950年前後に「単元学習」として単元を用いた学習指導構成が積極的に試みられたものの、1952年以降その形骸化が批判され、次第に消失していった経緯を確認することができた。学習指導構成の単位は楽曲教材であり、「正しく歌唱」するという原理に基づくものであった。「正しく歌唱」するということは礼法、朕、,集団統合、音楽表現の礎といった理念を裏付けとする歌唱教育の基本原理であり、日本の音楽文化変容の過程における学校音楽教育の関わり方を示す鍵概念としての意味をもつことを明らかにした。本研究の目的は、戦後期の音楽教育改革を制度・思想、実践の各視点から検討し、その歴史像を明らかにすることである。平成12年度は、主として音楽科の教育実践定形化の過程とその特質を明らかにするとともに、カリキュラム・プランの個別事例の検討を通してカリキュラム改革全体の中での音楽教育実践の位置づけを明確化する作業を開始した。(1)音楽科のカリキュラムや実践の定形化の過程を辿る作業として、これまでに『教育音楽』、『音楽手帖』の雑誌の体系的収集をすすめ、さらに今年度は器楽教育振興の実態を把握するために、上記の雑誌の他『楽器商法』、『器楽教育』の資料収集を行い考察を行っている。(2)カリキュラムの個別事例の検討を補強する作業としては、音楽独自の実践を行った栃木師範学校女子部附属小学校、神奈川師範学校附属鎌倉小学校、京都市音楽教育関係者、コア・カリキュラムを実践した明石女子師範附属小学校、奈良師範学校女子部附属小学校の関係者へのインタビューを行い、その資料整理を行っている。(3)戦後期の音楽教育内容の変化とその特質を把握するために、国民学校期国定教科書、墨塗り教科書、暫定教科書、戦後期国定教科書の資料を収集し、それらの比較分析を進めている。(4)国民学校期と戦後の音楽の教材構成及び教師の音楽教育観を比較を行うために、戦前、戦中期の『学校音楽』、『教育音楽』等の収集を行い考察を行っている。また、芸能科の成立経緯については教育審議会議事録及び関係資料に基づき考察を行っている。(5)今年度は、上記の資料と考察をもとに作業を具体的に進めている。

「正しく歌唱」するということは礼法、朕、,集団統合、音楽表現の礎といった理念を裏付けとする歌唱教育の基本原理であり、日本の音楽文化変容の過程における学校音楽教育の関わり方を示す鍵概念としての意味をもつことを明らかにした。
ボールエンドミルによる硬脆材料の切削加工に関する研究

光学ガラスに対しボールエンドミルによる曲面切削において切れ刃稜線形状が被削材の脆性破壊に及ぼす影響について試験研究を行った。供試する単結晶ダイヤモンド製工具の切れ刃稜線にミクロンオーダの周期的な波状構造を生成して切削試験を行い、仕上げ面の脆性破壊特性を検証した結果1.三角波状の稜線構造の場合波形状の頂角に依存して脆性破壊特性が変化し、エンドミル加工において特定の頂角の場合脆性破壊の消失が確認できること、2.被削材構成成分によりき裂の形態が変化すること、などを明らかにした。・単結晶ダイヤモンド製バイトの切れ刃稜線粗さにおける山頂間隔、および傾斜切削時における傾斜角による脆性破壊への影響を切削試験により検証した。切れ刃稜線に粗さが存在する工具で切削を行う場合、稜線粗さの各山頂が接近するとこれらに近接する材料内部で発生する応力が互いに干渉し、この分布が変化することで切削中に発生する脆性破壊の特性が変化すると考えられる。一方、傾斜角はエンドミル切削における工具の捩れ角に対応し、その特性を明らかにすることでエンドミル切削の実験に先立ち捩れ角の影響について検討を行うことができる。以上挙げた影響を明らかにする目的で、稜線形状の各山頂間隔を変化させた数種の単結晶ダイヤモンド平バイトを用いてソーダライムガラスに対し形削りにより傾斜切削を実施した。その結果、山頂間隔の接近とともに延性モード切削の限界切込量が減少すること、また傾斜角の変化に応じてき裂が切削溝の片側端部に集中して発生することが明らかになった。今回の実験結果について原因究明のためには今後詳細に検討を加える必要があるが、山頂間隔による影響については前述した応力の干渉によるもの、また傾斜角による影響については切削時に先行する山頂が生成した仕上げ面上に残留応力または脆性破壊が発生し、その近傍で後続の山頂が材料を除去する際にこれらと干渉して1次もしくは2次的に発生した亀裂の進展が応力干渉に応じて変化したためと推測される。・前年度開発した切削厚さ解析プログラムについて改良を施した。前年度に開発したプログラムでは、送りに対し工具の姿勢を固定した状態で切削中の材料除去過程を計算していた。本年度は、工具経路とともに工具姿勢が変化する場合の除去過程を計算しうるものに変更している。計算の結果、各時刻ごとに工具経路に応じて工具姿勢を算出し切れ刃各点の切削厚さを算出できた。・単結晶ダイヤモンド製円バイトの切れ刃稜線粗さがガラス切削における脆性破壊に及ぼす影響について切削試験により検証した。ノーズ曲率半径R0(平バイト)、0.025および0.05の円バイト切れ刃稜線上に三角波状の粗さ形状を振幅および周期を変化させながら集束イオンビーム加工機(FIB)により生成し、バイトの曲率半径および粗さ形状の形状特性が脆性破壊に及ぼす影響について観察した。その結果、1.脆性破壊の進展方向と規模が三角波形状の配置(個数)および形状特性(振幅および周期)により変化する、2.しかし、バイトのノーズ曲率半径には影響を受けないことが明らかになった。・ボールエンドミル切削によるガラス切削において切れ刃稜線粗さが脆性破壊に及ぼす影響について切削試験により検証した。工具傾斜角45度、軸方向切込み20ミクロンの条件で溝切削をすることを前提として、ノーズ曲率半径R0.5の単結晶ダイヤモンド製ボールエンドミルの切れ刃稜線上に三角波状の粗さ形状を加工位置を変化させながらFIBにより生成し、粗さ形状の形状特性および一刃送りなどの切削条件が脆性破壊に及ぼす影響について観察した。その結果、1.粗さ形状を切れ刃の実切削領域のうち材料除去のみに寄与し仕上げ面生成に影響を与えない領域に加工した場合、加工により生成される仕上げ面には稜線粗さによる脆性破壊の影響は確認されないこと、2.しかし、仕上げ面生成に寄与する領域に粗さ形状を加工した場合は脆性破壊の影響が観察された。平成23年度は、主に以下の2点について成果が得られた。・単結晶ダイヤモンド平バイトを用いて、切れ刃稜形状が脆性破壊に及ぼす影響について基礎的な切削試験を実施した結果、振幅が増加するにつれ脆性破壊が促進されることが明らかになった。試験では、平バイトの主切れ刃稜に正弦波状の切れ刃を成型し、切れ刃の振幅が脆性破壊に及ぼす影響について観察した。工具は幅10ミクロンの主切れ刃稜に、周期2.2ミクロン、振幅0.5、1.0ミクロンの正弦波形状をFIB(集束イオンビーム加工機)を用いて成形した。試験では、被削材としてソーダライムガラス基板を用いて型削り切削を実施した。使用加工機のリニアステージ上に被削材を工具送りに対して0.5°傾斜させることで、工具の連続的な切込みを実現した。また、試験は切れ刃稜形状による影響のみを観察することを目的として乾式で切削を行っている。

試験後、FIBおよびSEM(走査型電子顕微鏡)を用いて各工具による仕上げ面の表面性状および断面を観察した。試験結果から、切れ刃稜の振幅が増加する場合、これに伴い切れ刃稜先端すなわち正弦波の頂点における曲率が増加し局所的な切込量の増減により切れ刃近傍の材料内部の応力分布が局所的に大きく変化し脆性破壊が促進されることが考察される。・次年度で実施する切削試験の条件設定および実験結果の評価を目的として、ボールエンドミル切削における切削厚さの数値計算手法の確立した。開発した手法は、任意の切れ刃形状を有するボールエンドミルについて切削過程における切れ刃稜線各点の移動軌跡を時系列に計算し、材料除去に寄与する前後の切れ刃稜点の位置から切削厚さを求めている。工具径、刃数、リード、捩れ角、および切れ刃稜形状などの工具形状を問わず、工具姿勢を含めた任意の切削条件における切削厚さの時間変化を求めることができる。・単結晶ダイヤモンド製ボールエンドミルによりソーダライムガラスに対し切削試験を実施した。ボールエンドミル切れ刃稜線上に周期2ミクロン、振幅0.58ミクロン、1ミクロンおよびそれぞれを交互に変化させた三角波状微細構造を生成し、各工具で傾斜角45度として、一定の軸方向切込みを与えて溝切削を実施した。試験の結果1.微細構造の振幅により脆性破壊特性が変化する、2.振幅1ミクロンの三角波微細構造の例で(微細構造を生成していない例も含めて)脆性破壊がもっとも抑制されることが確認された。これは1.ボールエンドミル切削において切れ刃に微細構造が存在する場合、材料除去が微細構造先端に集中して行われること、2.微細構造直下の内部応力が形状に依存して変化し、今回の試験では、三角波状微細構造の頂角が90度の場合で亀裂の材料内部への進展が抑制される応力状態となったことが原因と推測される。また、同一試験を石英ガラスについても実施した結果、ソーダライムガラスと異なり切れ刃稜線形状に拠らずサブミクロンレベルの微細な脆性破壊が仕上げ面全体に発生した。両者の破壊特性の違いを生む要因としてガラスを構成するシリカの架橋構造の変形挙動が考えられる。・上記のボールエンドミルを用いた切削試験において、工具の送りに並行した方向への傾斜角による脆性破壊への影響についても検証を行った。光学顕微鏡により仕上げ面を観察した結果からは工具傾斜による脆性破壊の変化は観察されなかった。ただし、時間的制約のため仕上げ面断面の観察を行っていないこと、工具送りに対し垂直方向への傾斜角については検討を行っていないことから、試験結果の詳細な考察は上記の実施も含めて今後の課題として残す。現在、本課題の研究成果に基づく加工技術について特許申請を準備中である。機械工学申請時に立案した研究計画の内本年度分の課題についてはほぼ実施できており、本試験研究はおおむね順調に推移しているものと思われる。遅延の理由:ダイヤモンド工具の納入時期の大幅な遅延による。経緯:・年度当初(4月)に研究計画の修正により工具購入計画の見直しを行った。当初はボールエンドミルの購入し9月末までの切削試験の終了を予定していたが、国際会議などで聞かれた意見を参考にバイト切削による基礎実験(切れ刃稜線の曲率半径などによる影響)について再検討した。
情報システムのソーシング戦略と企業間アライアンスに関する理論的・実証的研究

本研究は、企業における情報システム(IS)のアウトソーシング形態の多様化が進みつつある現状をふまえ、ISソーシング戦略におけるIS子会社や企業間アライアンスの役割を理論的・実証的に明らかにすることを目的として実施した。その結果、ISアウトソーシングの形態別差異にもとづく特徴の違いを析出するとともに、アウトソーシングマネジメントの今後の方向性について統計解析を行い、プロフィットセンタ化の推進とIS子会社のアレンジメントとの相関関係の存在を指摘した。また、ISアウトソーシングの形態選択に影響する諸因子の検討を行い、別会社方式の採用に有意な影響を与える変数を抽出した。さらに、ISソーシング戦略に対するTCE(取引コスト経済学)とRBV(資源ベース企業観)の複合的なフレームワークの有効性をサーベイデータにもとづいて検証した。本研究の目的は、企業における情報システム(IS)のアウトソーシングの現状分析をふまえ、ISソーシング戦略の立案や実行時における課題を検討し、とくに、ISソーシング戦略におけるIS子会社や企業間アライアンスの役割を理論的・実証的に明らかにすることにある。ここで、典型的なISソーシング戦略とは、IS業務を自社内でインソーシング(内製)するか、それともアウトソーシング(外注)するかという内外製(メイク・オア・バイ)に関する意思決定とそれにもとづく具体的なマネジメントの構想を意味する。本研究課題実施の1年目となる平成20年度は、企業におけるISアウトソーシングの取組みの現状と動向に関して、その実態を把握し、とくにIS子会社のマネジメントの多様化現象について考察した。その結果、以下のことが明らかとなった。1、ISアウトソーシングに関する理論的なアプローチとして代表的なのは、取引コスト理論(TCE)と資源ベース理論(RBV)である。前者に立脚すれば、資産特定性に起因する機会主義の脅威を低減し、取引コストの増大を抑制する必要がある場合には、インソーシングや別会社方式によるISアウトソーシングが選好されると考えられる。また、後者の観点では、IS業務に関する独自の資源や能力自体が他社によって模倣や代替されにくいコア・コンピタンスとして位置づけられる場合などにはインソーシングや別会社方式が選好されると考えられる。2、形態別差異に起因するISアウトソーシングの効果や問題点などを比較論的に分析する先行研究では、外注方式と別会社方式の2形態に注目する分析がなされている。ただし、複数の研究によって異なる知見が得られているケースも存在する。また、ISアウトソーシング形態の今日的な多様化現象の要因や背景についての分析・検討は十分とはいえない。本研究の目的は、企業における情報システム(IS)のアウトソーシングの現状分析をふまえて、ISソニシング戦略の立案や実行時における課題を検討し、とくに、ISソーシング戦略におけるIS子会社や企業間アライアンスの役割を理論的・実証的に明らかにすることにある。平成21年度は、とくにIS子会社のマネジメントの多様化現象を中心に企業におけるISアウトソーシングの取組みの現状を考察した。ISソーシング戦略の実際を理論的に検討すると、取引コスト経済学(TCE)と資源ベース企業観(RBV)の視座が補完的に機能するケースと相反するケースの存在が示唆された。そこで、企業におけるISソーシング戦略を規定する要因をより詳細かつ厳密に分析するために、質問票調査の実施を計画した。しかしながら、質問票調査の企画段階にて質問項目の内容の妥当性や明確性、測定尺度の精度などをプレビューした結果、見直しを要する項目がいくつか見出されたために、拙速を避ける観点から当初の研究計画を変更し、繰越(翌債)を申請することとした。したがって、質問票調査の実施とそこで得られるデータの統計解析・考察などの作業は平成22年度に行うことになった。本研究の目的は、企業における情報システム(IS)のアウトソーシングの現状分析をふまえて、ISソーシング戦略の立案や実行時における課題を検討し、とくに、ISソーシング戦略におけるIS子会社や企業間アライアンスの役割を理論的・実証的に明らかにすることにある。ここで、典型的なISソーシング戦略とは、IS業務を自社内でインソーシング(内製)するか、それともアウトソーシング(外注)するかという内外製に関する意思決定とそれにもとづく具体的なマネジメントの構想を意味する。本年度は、企業におけるISソーシング戦略を規定する要因をより詳細かつ厳密に分析するために質問票調査データの統計解析を実施した。その結果、ISアウトソーシングの形態別差異にもとづく特徴の違いを析出するとともに、アウトソーシングマネジメントの今後の方向性に関して、プロフィットセンタ化の推進とIS子会社のアレンジメントとの間に有意な正の相関関係が存在することを明らかにした。

また、ISソーシング戦略に対する取引コスト経済学(TCE)と資源ベース企業観(RBV)の複合的なフレームワークの有効性を検証し、両視座が補完的に機能するケースと相反するケースの存在を確認した。そして後者の場合には、企業は機会主義の脅威とそれに起因する取引コストの増大を回避あるいは抑制することを相対的に重視する傾向が存在することを見出した。すなわち、資源ポジションが優れている(劣っている)にもかかわらず,機会主義の可能性が低い(高い)場合にはアウトソーシング(インソーシング)が選好される傾向があるといえる。
炭疽菌毒素を介した生理活性物質の細胞内移入方法に関する基礎研究

炭疽菌の主要な病原因子の一つ,毒素は防御抗原(PA)、浮腫因子(EF)、致死因子(LF)から成り、PAがまず宿主細胞に結合し、その後、EFもしくはLFが細胞結合性のPAを介して、細胞内に取り込まれ、初めて毒素を発揮する。LFのN-末から255アミノ酸残基(LF255)領域がPAへの結合部位である。そこで、LF255と外来遺伝子産物の融合タンパクを作成すれば、PA存在下で融合タンパクは真核細胞内に取り込まれる。最近、LF255とリステリアのT細胞エピトープとの融合タンパクによる防御効果が報告された。この結果、種々の感染症に応用可能で、非常に安全かつ簡便にワクチンが精製可能となった。また、PAは多くの細胞に結合するので、生理活性物質を細胞内に移入することも可能となる。そこで、融合タンパクを作り出すための発現ベクターの開発を目的として、以下の実験を企画した。LF255との融合タンパクを産生するための発現ベクターの構築、融合タンパクを細胞内に取り込ませるためのPAタンパクの精製、細菌感染症ワクチンの試作。昨年度構築した発現ベクターLF255融合蛋白の発現を調べたところ、6xHisモノクローナル抗体およびコマシーブルー染色により目的の蛋白が確認できた。そこに、細菌や原虫でT細胞エピトープを持つと報告されているタンパク質の遺伝子を挿入した。しかし、塩基配列から融合蛋白の発現可能なように構築されていたにもかかわらず、融合蛋白は確認できず、6xHisモノクローナル抗体と反応したのは、もとのLF255融合蛋白がメジャーで、目的とする融合蛋白はごく微量であった。さらに蛋白精製後の菌体から分離したプラスミドには変化がなかった。以上の結果から、蛋白発現の過程で目的とする融合蛋白は、LF255と融合蛋白との融合部位で何らかの作用で切断されたとしか考えられなかった。LF255との融合蛋白を作成する際に、問題があったと考えている。現在は、この発現プラスミドに変わる新たなプラスミドの構築を行っており、より安定な形への改良を行っている。炭疽菌の主要な病原因子の一つ,毒素は防御抗原(PA)、浮腫因子(EF)、致死因子(LF)から成り、PAが先ず宿主細胞に結合し、その後、EFもしくはLFが細胞結合性のPAを介して、細胞内に取り込まれ、初めて毒性を発揮する。本年度は、発現ベクターをまず構築した。LFの全塩基配列は既に報告されているので、PCR法により遺伝子を単離した。さらには、融合タンパクをワンステップで精製可能にするために、"6 x His"をN末にインフレームになるように挿入し、さらにLF255の直後に外来遺伝子断片を挿入するための制限酵素切断部位が付加されるようにプライマーを設計し、PCRを行った。実際に構築されたベクターはLF255を産生していた。翌年度は、実際に外来の遺伝子を組み込んで発現を調べる。

以上の結果から、蛋白発現の過程で目的とする融合蛋白は、LF255と融合蛋白との融合部位で何らかの作用で切断されたとしか考えられなかった。LF255との融合蛋白を作成する際に、問題があったと考えている。現在は、この発現プラスミドに変わる新たなプラスミドの構築を行っており、より安定な形への改良を行っている。
高等学校数学における授業構成枠組みとしての２軸過程モデルの具体化に関する研究

(1)研究協力校において数学科教員の意識と高校生の数学理解についての実態調査を行い、その結果を分析し、数学科教員の意識の変容と生徒の数学理解の深化を評価することによって、数学科教員の数学科授業構成に対する意識が向上するとともに、生徒の数学理解が深まることが明らかになった。(2)数学科授業構成枠組みとしての2軸過程モデルの具体化の改良案の有効性についての検証を行い、それを踏まえて高等学校における数学科授業の質的改善が可能となるような2軸過程モデルの具体化を策定することができた。そして、数学科教員の授業力と生徒の数学理解度の向上にとって有効な具体的示唆を導出することができた。本研究の目的は、研究代表者が算数・数学科の授業構成枠組みとして構築した「数学理解の2軸過程モデル」を具体化することによって、高等学校における数学科授業の質的改善を図ることである。そのため、本年度は、高等学校における数学科カリキュラム、授業構成及び授業実践の課題を明らかにし、2軸過程モデルの具体化の第1次案を作成することを具体的な目的として、1高等学校数学科のカリキュラムと授業構成の課題の明確化、2高等学校数学科の授業実践の課題の明確化、32軸過程モデルの具体化の第1次案作成という3つの事柄に取り組んだ。その結果、以下のような大きく3つの研究成果が得られた。1.数学科カリキュラムや数学理解、授業研究に関する研究文献を分析したり、先端的研究を行っている国内外の大学や研究機関を訪問して研究資料を収集し分析したりすることによって、わが国の高等学校の数学科カリキュラム、数学科の授業構成及び授業実践の具体的な課題を明確にすることができた。2.高等学校数学における授業実践の課題を解決するために、2軸過程モデルの構成要素(思考水準と学習段階)及び授業構成の原理と方法を踏まえた理論的研究と実践的研究を行うことによって、数学的一般化の機能を明確にし、数学科固有の言語活動の枠組みを構築することができた。3.こうした理論的研究と実践的研究の研究成果を基に、2軸過程モデルの構成要素(思考水準と学習段階)及び授業構成の原理と方法を再検討し、高等学校における数学科授業の質的改善に寄与すると考えられる2軸過程モデルの具体化の第1次案を作成することができた。そのため、第2年次の平成27年度は、前年度に立案した2軸過程モデルの具体化の第1次案の検討を行うことを具体的な目的として、1具体化の第1次案に基づく数学科授業の実践、2具体化の第1次案の有効性の検討、3具体化の改良案作成という3つの事柄に取り組んだ。1.2軸過程モデルの具体化の第1次案に基づいて、研究協力校で学習指導内容に応じた単元構成や学習指導展開にそって1単元分の数学科授業を実践することができた。2.1単元分の数学科授業の記録と生徒の数学理解度の実態調査を分析することによって、2軸過程モデルの具体化の第1次案の有効性が明らかになった。3.こうした実践的研究の研究成果と国内外で収集した最新の研究文献や資料を参考にして、2軸過程モデルの構成要素(思考水準と学習段階)及び授業構成の原理と方法を見直し、高等学校数学における授業構成枠組みとして具体化の改良案を作成することができた。以上の第2年次の研究成果を、数学教育関連の国際会議(ICMI-EARCOME7国際会議)等で発表し、数学教育関連の学術誌に論文として掲載した。それによって、第3年次の平成28年度における研究推進と研究発表のための準備をすることができた。本年度の具体的な研究目的は、2軸過程モデルの具体化の第1次案に基づく数学科授業の実践、第1次案の有効性の検討、具体化の改良案を作成することであった。本年度末までに実施した研究の成果として、2軸過程モデルの具体化の第1次案に基づいて、研究協力校で学習指導内容に応じた単元構成や学習指導展開にそって1単元分の数学科授業を実践し、1単元分の数学科授業の記録と生徒の数学理解度の実態調査を分析することによって、2軸過程モデルの具体化の第1次案の有効性を明らかにするとともに、2軸過程モデルの構成要素(思考水準と学習段階)及び授業構成の原理と方法を見直し、高等学校数学における授業構成枠組みとして具体化の改良案を作成することができた。また、その研究成果を国外の数学教育関連国際会議で研究発表した。さらに、次年度の研究発表の準備と研究の推進のための準備ができたから。本研究の目的は、研究代表者が算数・数学科の授業構成枠組みとして構築した「数学理解の2軸過程モデル」(以下、2軸過程モデル)を具体化することによって、高等学校における数学科授業の質的改善を図ることである。そのため、本年度は、前年度に作成した具体化の改良案の有効性を検証することを主な目的とし、1具体化の改良案に基づく数学科授業の実践、2数学科教員の意識と高校生の数学理解についての実態調査、32軸過程モデルの具体化の改良案の有効性についての検証と具体的示唆の導出、43年間の本研究の研究成果のまとめに取り組んだ。その結果、以下のような3つの研究成果が得られた。

1.2軸過程モデルの具体化の改良案に基づいて、研究協力校で前年度と同じ学習指導内容に応じた単元構成や学習指導展開にそって数学科授業を実践することができた。2.研究協力校において数学科教員の意識と高校生の数学理解についての実態調査を行い、その結果を分析し、数学科教員の意識の変容と生徒の数学理解の深化を評価することによって、数学科教員の数学科授業構成に対する意識が向上するとともに、生徒の数学理解が深まることが明らかになった。3.数学科授業構成枠組みとしての2軸過程モデルの具体化の改良案の有効性についての検証を行い、それを踏まえて高等学校における数学科授業の質的改善が可能となるような2軸過程モデルの具体化を策定することができた。そして、数学科教員の授業力と生徒の数学理解度の向上にとって有効な具体的示唆を導出することができた。以上の3年間の本研究の研究成果をまとめ、その研究成果を、平成28年7月ドイツ・ハンブルクで開催された数学教育国際会議ICME13および平成28年8月ハンガリー・セゲドで開催された国際数学教育心理研究学会PME40で招待講演として発表した。(1)研究協力校において数学科教員の意識と高校生の数学理解についての実態調査を行い、その結果を分析し、数学科教員の意識の変容と生徒の数学理解の深化を評価することによって、数学科教員の数学科授業構成に対する意識が向上するとともに、生徒の数学理解が深まることが明らかになった。(2)数学科授業構成枠組みとしての2軸過程モデルの具体化の改良案の有効性についての検証を行い、それを踏まえて高等学校における数学科授業の質的改善が可能となるような2軸過程モデルの具体化を策定することができた。本年度の具体的な研究目的は、高等学校における数学科カリキュラム、授業構成及び授業実践の課題を明らかにし、2軸過程モデルの具体化の第1次案を作成することであった。本年度末までに実施した研究の成果として、高等学校における数学科カリキュラム及び数学科の授業構成と授業実践の課題を明確にし、これらの課題を解決するために、理論的研究と実践的研究の両方の方法による研究を行い、2軸過程モデルの構成要素(思考水準と学習段階)及び授業構成の原理と方法を再検討し、高等学校における数学科授業の質的改善に寄与すると考えられる2軸過程モデルの具体化の第1次案を作成することができた。また、その研究成果を国内外の数学教育関連学会で研究発表した。さらに、次年度の研究発表の準備と研究の推進のための準備ができたから。次年度は、本年度に作成した具体化の改良案の有効性を検証することを具体的な目的として、以下のような研究計画に基づいて本研究課題の研究を推進する。1.具体化の改良案に基づく数学科授業の実践:2軸過程モデルの具体化の改良案に基づいて、研究協力校で第2年次と同じ学習指導内容に応じた単元構成や学習指導展開にそって数学科授業を実践する。2.数学科教員の意識と高校生の数学理解についての実態調査:研究協力校において数学科教員の意識と高校生の数学理解についての実態調査を行い、その結果を分析し、数学科教員の意識の変容と生徒の数学理解の深化を評価する。3.数学科授業構成枠組みとしての2軸過程モデルの具体化の策定:上記1、2を踏まえて、具体化の改良案の有効性についての検証を行い、高等学校における数学科授業の質的改善が可能となるような2軸過程モデルの具体化を策定する。そして、数学科教員の授業力と生徒の数学理解度の向上にとって有効な具体的示唆を導出する。
マウス疾患特異的iPS細胞を用いた遺伝性中枢性尿崩症in vitro実験系の確立

本研究課題では、家族性中枢性尿崩症モデルマウスから疾患特異的iPS細胞を樹立、既存培養法を改良することでAVPニューロンへの分化を行った。疾患特異的iPS細胞由来AVPニューロンの、細胞質内に存在する変異タンパクを経時的に観察した結果、家族性中枢性尿崩症の特徴的な所見である小胞体内封入体様構造物をin vitroで再現出来ていることが判明した。この封入体様構造物が、培養時間の経過と共に変化し、生体での変化と似た経過を辿ることを確認した。これらの成果は、ヒト疾患特異的iPS細胞への応用に際して基盤技術になると考えられる。家族性中枢性尿崩症モデルマウス(FNDIマウス)としては、実際にヒトの疾患で存在する変異と同じものを導入したCys98stopマウス(既に樹立済)を用いた。iPS細胞樹立の為の遺伝子導入ベクター(具体的には、エピゾーマルベクター、レトロウイルスベクター、センダイウイルスベクター)や、マウス由来細胞(リンパ球もしくは線維芽細胞)を実際に樹立作業に用いることで検討し、Cys98stop変異をもつマウスiPS細胞株を10株樹立した。染色体変異など、iPS化作業に伴う異常を生じていないことを確認した。今後、バゾプレシン(AVP)ニューロンへの分化能の善し悪しを、それぞれの株にて検討していく。また、従来用いられてきたマウスES細胞からのAVP細胞分化培養法では、視床下部前駆細胞にて特異的に発現するRax遺伝子に蛍光蛋白をノックインした細胞を樹立してcell sortを行う必要があった。蛍光蛋白ノックインを行わなくともAVP細胞を誘導できる分化法が必要と考え、培養方法を改変した。その結果、表面抗原を利用するだけで視床下部前駆細胞濃度を上げる方法を確立した。これにより、マウスiPS細胞でも、Rax遺伝子にノックイン作業を行う必要がなくなるものと考えられる。加えて、FNDIマウスへの薬剤投与による検討で、AVPニューロン保護作用を持つ可能性を示す候補を発見した。今後、マウスiPS細胞由来のAVPニューロンをモデルとして用いて、薬剤の効果発現機序を検討する。平成26年度に樹立した疾患特異的iPS細胞(mFNDIiPS細胞)を用いて、長期維持培養を行った。これまでのFNDIマウスの検討で、マウス生体では、1ヶ月齢から電子顕微鏡で、2ヶ月齢から光学顕微鏡で小胞体内の封入体が観察され、時間経過と共に封入体が増大することが判明している。この特徴的な封入体がin vitroでも再現できるかどうかが重要なポイントと考えられる。従って、mFNDIiPS細胞からAVP細胞を分化させ(mFNDIiPS-AVP細胞)、mFNDIiPS-AVP細胞の長期培養でin vivo同様の封入体形成が観察できるかを検討した。FNDIマウスでは脱水条件負荷によりAVP合成を亢進させる状態を3ヶ月間維持すると、多飲多尿の表現型が進行する。mFNDIiPS-AVP細胞の長期培養で、もし、封入体などの特徴的な構造が出現しない場合は、cAMPでAVP合成を亢進させたり、tunicamycinやthapsigarginで小胞体ストレスを亢進させることで、FNDIマウスの脱水条件と同じ状況を負荷し、AVP細胞への影響を検討する予定とした。当初、mFNDIiPS細胞の維持培養に、従来我々が用いていたマウスES細胞とは異なる性質があったため、mFNDIiPS細胞用に最適化した方法を開発する必要があった。従来の接着培養による維持を、浮遊による立体的な維持に変更することで、mFNDIiPS細胞でも良好に維持培養が可能になった。そこからAVP細胞への分化(mFNDIiPS-AVP細胞)にも成功した。別にあらかじめ検討しておいた長期培養法と組み合わせることで、mFNDIiPS-AVP細胞の中に封入体が時間経過と共に形成されることを確認した。人為的に小胞体ストレスを亢進させなくとも、疾患特異的iPS細胞から誘導したAVP細胞は自ずと封入体を形成することが判明し、疾患モデルとして優れた性質を示していると考えられる。小胞体ストレスに伴う封入体をin vitroで再現するには、AVP産生細胞へ分化したニューロンを、長期に維持培養する必要がある。従来の、マウスES細胞からAVPニューロンへの分化法では、AVPへの分化は得られるものの、intactに観察できる期間が1週間程度という限界があった。本年はまず、この観察可能期間を長期化する技術開発を行った。3次元培養から平面培養への展開や、使用する細胞外マトリクス、あるいは培地組成の工夫により、従来1週間しか観察できなかった期間を、4週間以上へ延長することに成功した。この成果を平成28年度に発表する予定である。次に、平成26年度に樹立した疾患特異的iPS細胞を用いて、AVPニューロンへの分化を行った。従来の分化法ではAVP産生細胞まで分化しなかったが、分化法を改良することで、マウスES細胞から従来法でAVPニューロンを分化させた場合とほぼ同じ効率で、疾患特異的iPS細胞から遺伝子変異AVPニューロンへの分化を達成した。加えて、先に達成した長期培養法と組合せ、光学顕微鏡で小胞体内の封入体が観察されることを確認した。この小胞体内封入体は、FNDIモデルマウスの視床下部でも特徴的に見られる所見であり、なおかつ、小胞体ストレスの証拠である。今後、詳細な観察と、薬剤負荷などによる変化を観察していく。

家族性中枢性尿崩症(FNDI)は、常染色体優性遺伝でバゾプレシン(AVP)ニューロンの変性によりAVPの分泌が継時的に低下する疾患である。大部分がニューロフィジンII(NPII)の変異により小胞体内に変異タンパクが蓄積されることがモデルマウスによる実験で報告されている。しかし、AVPニューロンは生体内に少量しか存在しないため、よいin vitroのモデルが存在しなかった。FNDIマウスiPS細胞からAVPニューロンを分化誘導した。FNDIマウスiPS細胞に対して、既存の無血清凝集浮遊培養法(SFEBq/gfCDM法)を改良することでAVPニューロンへの分化を行った。昨年度までは分化効率の低さが問題であったが、分化培養中にシグナルXを加えることで、有意に分化効率が上昇することが判明した。また、成熟度の問題なのか、従来法では本来同一ニューロン内に同居すべきAVPとNPIIとが共染色しない問題点が存在したが、改良後は共染色するようになり、生体と同じ性質を示すようになった。こうして成熟を達成した疾患特異的iPS細胞由来AVPニューロンの、細胞質内に存在する変異タンパクを経時的に観察するため、分化後長期にニューロンを維持する方法を確立した。一部は分散培養法を併用することで長期間の維持培養を行い、細胞内の観察を行った。その結果、FNDIの特徴的な所見である小胞体内凝集体(ERAC)様構造物をin vitroで再現した。現在、電子顕微鏡にて詳細を確認中である。このERAC様構造物が、培養時間の経過と共に変化し、生体での変化と似た経過を辿ることを確認した。現在、in vitroでの浸透圧刺激や小胞体ストレス亢進剤を用いて、影響を検討中である。このようにして疾患モデルとしての妥当性を確認できれば、薬剤スクリーニングのツールとしての疾患細胞が出来上がったと言える。本研究課題では、家族性中枢性尿崩症モデルマウスから疾患特異的iPS細胞を樹立、既存培養法を改良することでAVPニューロンへの分化を行った。疾患特異的iPS細胞由来AVPニューロンの、細胞質内に存在する変異タンパクを経時的に観察した結果、家族性中枢性尿崩症の特徴的な所見である小胞体内封入体様構造物をin vitroで再現出来ていることが判明した。この封入体様構造物が、培養時間の経過と共に変化し、生体での変化と似た経過を辿ることを確認した。これらの成果は、ヒト疾患特異的iPS細胞への応用に際して基盤技術になると考えられる。本年度は、Cys98stopマウスから疾患特異的iPS細胞を樹立することを主目的としていた。未分化性や増殖能に問題がなく、また樹立作業に伴う染色体異常などを起こしていない株を多数樹立出来たことで、主目的は達成しているものと考える。また、今後の利用に際して、従来の分化法で抱えていた問題点を解決する改良方法を先回りして確立することにも成功した。以上から、おおむね順調に進展しているものと判断する。FNDIマウスモデルではこれまでに、小胞体ストレスやオートファジーが表現型進行に関与していることが示唆されてきた。しかしながら、オートファジーと細胞死との関連、あるいはAVPニューロンが細胞死する経過など、細胞レベルでの詳細な検討は今後の課題である。
食道癌に関与する未知なる遺伝子の同定とその構造及び機能の解明

食道癌(扁平上皮癌)の遺伝子変化を、ゲノムDNAを2次元電気泳動して解析するRestrictionlandmark genomic scanning法(RLGS法)を用いて、検討している。食道癌の新鮮手術材料(5症例)の癌部、非癌部組織を採取し、ゲノムDNAを抽出後、RLGS法を施行した。オートラジオグラフィーで得られたprofileをデジタル化し、約1000のスポット化されたDNA断片を癌部、非癌部間で比較した。症例数がまだ少ないものの、癌部のみに出現するスポット変化を2箇所みとめた。これらのスポット変化と,臨床病理学所見との関連性を様々な角度から解析,検討している段階である。スポット変化のうち,1箇所に対しては,既にクローニングを施行済みである。その際、制限酵素NotI切除断端のみを描出し,他の切除断端からなる遺伝子断片を除去するNot I trapper methodを用いている。クローニングは、trapper施行後のprofileから、目的とするスポットを直接打抜き、DNAを抽出した。DNA量の確保のため、プラスミドに挿入し、大腸菌を用いて形質転換を行い、増幅させた。さらにダイデオキシ法にて、塩基配列を決定した。本遺伝子断片と他遺伝子との相同性の検索では、特記すべき相同性は認めなかったものの、本遺伝子断片をプローブとして、さらなる解折が可能と思われた。さらに,本遺伝子断片の塩基配列よりプライマーを作成し,PCRによる脱メチル化の変化を微小病変やパラフィン切片からも検出し得るため,これを計画している。この方法にて,検索症例数を増加させれば,臨床病理学的所見との関連性が明らかになる可能性が考えられる。また,今後はRLGS profi1e数とスポットクローニング数の増加も目標にしたいと考えている。これらのスポット変化と臨床病理学所見との関連性は、まだ現時点では認めていない。そのうちの1箇所に対して、クローニングを施行した。その際には、制限酵素Not I siteのみを抽出するtrapper methodを用いた。クローニングは、trapper施行後のprofileから、目的とするスポットを直接打抜きDNAを抽出した。本遺伝子断片と他遺伝子との相同性の検索では、特記すべき相同性は認めなかったものの、木遺伝子断片をプローブとして、さらなる解析が可能と思われた。また、今後は症例数の増加に伴って、新しい共通変化スポットの出現や、既知のスポットと臨床病理学的所見との関連性が明らかになる可能性が考えられる。食道癌(扁平上皮癌)の遺伝子変化を、ゲノムDNAを2次元電気泳動して解析するRestriction landmark genomic scanning法(RLGS法)を用いて、検討している。
発声障碍者音声の明瞭化フィルタリングに関する研究

喉頭摘出患者の食道発声音声、老化や脳性麻痺にともなう不明瞭音声を、発声原理に基づいて明瞭化するフィルタを構成することが本研究の目的である。最終年度は、これら不明瞭音声の特徴抽出、および音声の個人性を保持した明瞭化フィルタの構築をおこなった。更にここで得られた音声の特徴と発声器官の動作の関係をもとに、発声された音声の特徴から口内の動きを推定して提示することにより、発声障碍患者が自律的に発声訓練をおこなえるシステムに関する研究をおこなった。喉頭発声音声との比較・分析から、食道発声音声については、雑音性が高い、基本周波数が低い、倍音構造が不明瞭、スペクトル包絡が平坦、発声が不安定であるといった特徴がみられた。一方の脳性麻痺患者の音声は、基本周波数が高く(男女共に300400Hz)、パワースペクトルのエネルギーが2kHzまでの低域に集中しており、フォルマントが不明瞭かつ独特の共鳴特性を持ち、更に発声が不安定であることがわかった。これらをもとに発声原理に基づいたリアルタイム明瞭化フィルタを構成した。マイクからの入力音声に対してまず母音/子音の判別を行う。母音であれば基本周波数を抽出し、ピッチを喉頭発声音声の帯域へシフトした上で、櫛形フィルタにより倍音構造を明瞭化する。一方、子音に対しては振幅の増幅をおこなう。更に時間軸上では、子音の立ち上がりおよび母音発声時の定常状態を安定化させるための包絡処理をおこない、出力音声を生成する。本手法の有効性を調べるため、アンケートによる聴取実験を行った。フィルタリング前後の音声の対を合計12対作成し、ランダムな順でスピーカーから呈示した。成人健聴者に対し、11の評価項目について5段階評価でアンケートに答えてもらった結果、本提案フィルタの有効性が示された。今後は、基本周波数の高精度抽出と音声の自然性、個人性保持に関する検討を更に進めるとともに、発声障碍音声フィルタリング機器の実用化を目指していく。喉頭摘出後に食道を使って発声をおこなう食道発声者の音声、および老化や脳性麻痺にともなう発声障碍者の音声を、発声原理に基づいて明瞭化するフィルタリングの実現が本研究の目的である。本年度は、食道発声音声の明瞭化に関する研究をおこなった。喉頭摘出者の食道発声の習得には半年以上に渡る訓練が必要とされ、また呼気圧と呼気量の不足から、獲得される音声についても明瞭なものとは言い難い。喉頭発声音声との比較・分析から、雑音性が高い、基本周波数が低い、倍音構造が不明瞭、スペクトル包絡が平坦、発声が不安定であるといった特徴が見られ、これらをもとに発声原理に基づいたフィルタを構成した。ここでは、倍音処理に適している櫛形フィルタリングと雑音制御処理により、声質改善と明瞭化を試みた。母音であれば基本周波数を抽出して実時間で櫛形フィルタを構成し、明瞭化フィルタリングを行う。一方、子音に対しては振幅の増幅を行い、出力音声を生成する。フィルタリング前後の食道発声音声の対を合計12対作成し、ランダムな順でスピーカーから呈示した。成人健聴者に対し、11の評価項目について5段階評価でアンケートに答えてもらった。フィルタリングを行った食道発声音声は全体的に、澄んでいる、滑らかである、はっきりしている、という評価が得られ、また子音の立ち上がりの良さ、母音の明瞭度においても有効性が示された。これは、呼気の少ない食道発声音声において子音部分を増幅し、また母音部分においては櫛形フィルタリングによる雑音制御、ピーク部分の強調を行った効果が出ているためと考えられる。今後は、基本周波数の高精度抽出と音声の自然性に関する検討を進めるとともに、脳性麻痺患者の音声のように発話器官の自律的制御に障碍を持つ音声の明瞭化について検討をおこなっていく。

本手法の有効性を調べるため、アンケートによる聴取実験を行った。フィルタリング前後の音声の対を合計12対作成し、ランダムな順でスピーカーから呈示した。成人健聴者に対し、11の評価項目について5段階評価でアンケートに答えてもらった結果、本提案フィルタの有効性が示された。今後は、基本周波数の高精度抽出と音声の自然性、個人性保持に関する検討を更に進めるとともに、発声障碍音声フィルタリング機器の実用化を目指していく。
臨床分離腸球菌が産生するバクテリオシンBac41の抗菌作用機序と耐性機構の解析

Bac41の溶菌実効タンパク質の一つであるBacL1は、E. faecalisの細胞壁を分解する酵素活性を有しており、標的細胞表面における細胞分裂に関連する構造体に結合することを明らかにした。一方、増殖を停止したE. faecalis細胞の表面にはBacL1が結合せず、溶菌活性も認められなかった。BacL1の結合は、L-Ala-L-Ala型の架橋構造を有する細胞壁に特異的であり、Bac41の狭域な抗菌スペクトルの一因であることが推察された。腸球菌Enterococcusfaecalis(E. faecalis)は、ヒトや動物の腸管常在菌である一方、尿路感染症や心内膜炎を始めとした様々な日和見感染症の原因菌として分離される。新規バクテリオシンBac41は臨床から分離されるE. faecalis株の約半数が産生するバクテリオシンであり、抗E. faecalis活性を示すことから、同菌種間における拮抗現象に深く関与すると考えられている。本研究では、腸球菌感染症における細菌間相互作用を理解するために、Bac41の殺菌機構の解析を行なった。Bac41の殺菌活性の実体であると思われる2種類の遺伝子の産物BacL1(595 a.a.)とBacA(726 a.a.)の組換え体を、大腸菌を用いた発現系により調製した。組換えBacL1とBacAを用いて、E. faecalisに対する殺菌活性の検討を行なったところ、BacL1とBacAはE. faecalisの殺菌に必要十分な因子であることを確認した。また、BacL1とBacAは協調的にE. faecalisに対する殺菌活性を示し、それぞれ単独では殺菌活性を全く認めなかった。BacL1とBacAはともに共に既知のペプチドグリカン加水分解酵素と高い相同性を示すことから、両者の標的は細菌の細胞壁を構成するペプチドグリカンであることを推定した。そこで、E. faecalis由来の精製ペプチドグリカンにBacL1あるいはBacAを作用させたところ、BacL1単独でペプチドグリカン分解活性を認めた。一方、BacAには全くペプチドグリカン分解活性を認めなかった。以上の結果から、本研究ではこれまでに、(1)BacL1はペプチドグリカン分解酵素であること、ならびに、(2)生菌に対する殺菌活性にはBacL1だけでなくBacAが同時に必要であることを明らかにした。腸球菌(Enterococcus faecalis)は、健康なヒトや動物の腸管内に存在する常在菌である、尿路感染症、心内膜炎、菌血症などの日和見感染症の起因菌としても分離される。このようなE. faecalis臨床分離株から単離されたプラスミド上に抗菌活性を示す領域が見出され、バクテリオシンBac41と命名された。興味深いことに、抗菌スペクトルは産生菌と同菌種であるE. faecalisに高度に限定されていた。遺伝学的解析の結果、抗菌活性の発現にはbacL1、bacAと名づけた2つのORFが必要であることが既に明らかにされていた。前年度までに、BacL1ならびにBacAの組換え体タンパク質を構築し、in vitroでの機能解析を行なった結果、BacL1がエンドペプチダーゼ活性を有する細胞壁分化酵素であることを明らかにした。最終年度では、BacL1の標的細胞上における実際の動態を解析するために、蛍光標識したBacL1タンパク質と腸球菌を混合し、蛍光顕微鏡下で観察した。この結果、BacL1は、赤道面や分裂面などの細胞分裂に関連した構造体に局在することを明らかにした。この特異的局在は、前年度に同定したBacL1のC末端に存在する細胞壁結合領域に依存していた。さらに、増殖を停止した細胞ではBacL1とBacAによる溶菌感受性、ならびにBacL1の細胞表面への局在が消失した。以上の結果から、BacL1が細胞分裂に関連した領域を標的とすることにより、BacL1/BacAは分裂中の細胞を特異的に溶菌することが示唆された。また、BacL1がE. faecalisのペプチドグリカンに特有な構造であるL-Ala-L-Ala架橋を識別することを明らかにし、本酵素が狭域な抗菌スペクトルを示す一因であると考えられた。以上の研究結果は、Journal of Bacteriology誌に発表した。分子細菌学バクテリオシンBac41の殺菌活性の実体である2種類のタンパク質BacL1とBacAについて解析を行った。平成23年度では、主にBacL1の機能解析において進展があった。BacL1の酵素活性がペプチドグリカン分解であること、およびBacL1分子内の機能ドメインの局在を明らかにした。本研究の目的であるBac41の殺菌機序を理解に至るためには、BacAの分子機能を明らかにすることが不可欠であり、今後の課題である。

BacL1に関する解析の成果においては一定の成果を得られていることから、総合的にはおおむね順調に進展していると考えている。BacL1とBacAによる殺菌機序と各因子の役割をさらに明らかにするために、両タンパク質の標的因子を同定する。具体的には、標的細胞の細胞壁表面における局在を明らかにするために、蛍光標識体のシグナルを蛍光顕微鏡下で観察する。さらに、BacL1ならびにBacA特異的抗体を用いた免疫電子顕微鏡により両タンパク質の局在を観察する。また、細胞壁あるいは細胞膜に局在するタンパク質との相互作用を検討するために、プルダウン法、ならびに2ハイブリッド法による標的タンパク質の検索を行う。また、Bac41による殺菌に関わる標的細胞側因子を同定するために、Bac41耐性トランスポゾン変異体を解析を行う。