hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
乱流渦キャビテーションに対するLES解析法の研究

研究代表者らが提案したLES(Large-Eddy Simulation)モデルに基づき、乱流中の微細な渦に伴うキャビテーション現象の発生、流体の弱圧縮性を考慮して、キャビテーションを伴う乱流の非定常解析法を発展させた。(1)LESモデリング:微細渦(乱流要素渦)の統計的性質に関する最近の知見をもとに、低圧力領域のスケールと数密度を推定することにより、乱流渦に起因するキャビテーションに対する解像度を格段に向上させるモデルを提案した。これを実機のキャビテーション流れ解析に拡張するため、(a)一般座標系への展開、(b)弱圧縮流れへの適用、(c)微細渦の統計的性質に基づく低圧力領域の推定、の3項目を実施した。(2)直接数値シミュレーション(DNS):剥離乱流の実験結果に対応する乱流場に対してDNSを実施し、渦中心とキャビテーションの対応関係を把握し、バーガース渦型の乱流要素渦はキャビテーションの発生原因となりうること、キャビテーションにより渦構造は強い影響を受けることを明らかにした。次に、乱流要素渦を模擬する単独のバーガース渦モデルにおけるキャビテーション流れの解析を行い、(1)のモデルに適合する可能性のあるパラメーターを示した。(3)低マッハ数弱圧縮流れに適した計算法:キャビテーション乱流のLESにおけるアルゴリズムの開発を行うため、圧力方程式(楕円型偏微分方程式)を基盤とした新しい弱圧縮流れ解法を提案し、NACA0012翼や温度成層乱流にも適用し、本研究の目的に合致した低マッハ数領域の弱圧縮流れ解法を整備した。さらに、TVDスキームを採用し、二次元解析の範囲内では、クラウドキャビテーションの放出を伴う非定常キャビテーション流れに関して、研究代表者らによる従来の解析よりも良好な結果を得た。乱流中のキャビテーション現象とキャビテーションに伴う乱流の変調を数値的にシミュレートするための非定常解析法の確立を目的として、本年度は次の3項目に関する研究を行った。1.キャビテーション乱流の一方程式型LESモデリングLESのサブグリッドスケールモデルを実機のキャビテーション流れ解析に拡張するためには、(a)一般座標系への展開、(b)弱圧縮流れへの適用、(c)微細渦の統計的性質に基づく低圧力領域の推定、の3項目が不可欠である。(a)と(b)に関しては、NACA0012翼周りの流れに適用し、既往解析例よりも良好な結果を得た。(c)に関しては、定式化を行っているが、検証には下記のDNSのデータベース作成が必要で、モデル定数の最適化は来年度の課題として残った。2.空間発展場での剥離乱流のLES剥離乱流の実験結果に対応する乱流のLES解析と検証を行う前段階として、直接数値シミュレーション(DNS)を実施し、圧力場や渦度変動など、実験的に得られていないデータの取得を行った。計算条件設定上の問題から、実験装置をやや簡略化した流路形状に関するDNSにより、三次元非定常剥離が良好に再現されていることを確認した。さらに渦中心とキャビテーションの対応関係を把握し、LEXモデリングの方針の妥当性を確認した。3.分散相のモデリングと連続相とのカプリング新たに圧力方程式を基盤とした圧縮・非圧縮統一解法のスキームを取り入れ、流れ場の広範な条件に対応できるように改良した。上述のNACA0012翼とともに成層乱流に適用し、本研究の目的に合致した低マッハ数領域の弱圧縮流れ解法を整備した。乱流中のキャビテーション現象とキャビテーションに伴う乱流の変調を数値的にシミュレートするための非定常解析法の確立と実用化を目的として、本年度は次の3項目に関する研究を行った。

1.キャビテーション乱流の一方程式型LESモデリングLESのサブグリッドスケールモデルを実機のキャビテーション流れ解析に拡張するためには、(a)一般座標系への展開、(b)弱圧縮流れへの適用、(c)微細渦の統計的性質に基づく低圧力領域の推定、の3項目が不可欠である。(a)と(b)に関して、本研究グループが提案している1方程式型ダイナミックモデルを弱圧縮流れに展開し、前年度から引き続いて翼周りの流れを扱い、本年度は新たに円柱周りおよび非対象ディフューザーにおける剥離乱流についても適用して有効性を検証した。2.乱流要素渦とキャビテーションの相互作用の解析上記の(c)に関連して、単独のバーガース渦モデルにおけるキャビテーション流れの解析を行い、消滅解・定在解のほか振動解を見いだし、要素渦の強度とキャビテーション数をパラメーターとしてキャビティの振る舞いを再現し、モデル化の指針となりうる物理現象を分類した。3.空間発展場での剥離乱流のLES剥離乱流の実験結果に対応する乱流のLES解析と検証を行う前段階として、直接数値シミュレーション(DNS)を継続し、圧力場や渦度変動など、実験的に得られていないデータの取得を行った。前年度には三次元非定常剥離を再現して渦中心と低圧分布の対応関係を把握したが、本年度はキャビテーション発生条件下での解析を行い、バーガース渦型の縦渦構造に伴うキャビテーションも再現して、乱流要素渦がキャビテーション生成に関与していることを確認した。研究代表者らが提案した一方程式型ダイナミックモデルによるラージエディシミュレーション(LES)に基づき、乱流中の微細な渦に伴うキャビテーション現象の発生を考慮して、キャビテーションを伴う乱流の非定常解析法を新たに構築することを目的として研究を実施し、下記のような成果を得た。(1)一方程式型LESのサブグリッドスケールのエネルギー散逸率をパラメーターとして、微細渦の統計的性質をもとに、低圧力領域のスケールと数密度を推定することによって乱流渦キャビテーション発生を表現するモデルの妥当性を検証した。(2)乱流中の散逸スケールにあるバーガース型の渦を数値的に再現し、キャビテーション発生条件を与え、渦の挙動を解析して散逸率およびその分布を算出し、(1)のモデルに適合する可能性のあるパラメーターを探索した。(3)二次元混合層乱流の直接数値シミュレーション(DNS)を実施し、空間発展する剪断層が妥当に再現されていること、微細渦の中心からキャビティが発生すること確認し、(1)で提案するモデルの検証のために利用可能なデータベースを構築できる見通しを得た。(4)キャビテーション乱流のLESにおけるアルゴリズムの高精度化、高効率化を行った。楕円型圧力方程式に基づく圧縮・非圧縮統一解法のスキームを改良し、流れ場の広範な条件に対応できるようにした。加えて、さらに進んだキャビテーションモデルのプログラミングに向けて、気液界面の再構成法を取り入れた高解像度化を実施した。
脂質輸送関連遺伝子のヒト病態における役割の解析

ABC蛋白質はヒトではこれまでに約50種類の遺伝子が単離され、一大ファミリーを形成している。これまでにも種々のABC蛋白質遺伝子と疾患との関連が明らかにされているが、機能や疾患との関連が不明な遺伝子が数多く残されており、これらのABC蛋白質の機能、生理的役割、病態における意義を明らかにすることは、その異常に基づくさまざまなヒト疾患の原因の解明や治療法の開発につながる。本研究では、ABC蛋白質遺伝子のなかでも特に脂質膜輸送に関連すると考えられるABC蛋白質に焦点を絞り、疾患における役割を解明することを目的とする。平成16年度は、1)ABCA2がヒトのシュワン細胞ならびに前庭神経鞘腫に発現することを明らかにした。2)ABCA3遺伝子異常により、先天性肺サーファクタント欠損が起こることが明らかになったが、これらの患者に認められる遺伝子異常の一部では、ABCA3蛋白の細胞内のソーティングに異常を来すことを明らかにした。(投稿準備中)また、日本人の肺胞蛋白症患者において初めてABCA3遺伝子異常の存在を明らかにした。3)ABCA3を過剰に発現させた哺乳動物細胞(HEK293)で、ラメラ体様のベジクルが細胞内に出現することを明らかにした。4)ABCA3のターゲティングベクターを用いてABCA3遺伝子に相同組み替えを起こしたES細胞が得られた。現在、キメラマウスを作製中である。5)精子特異的に発現するマウス並びにラットABCA17を新規に単離し、ABCA17を過剰発現する哺乳動物細胞では、細胞内コレステロールエステル、脂肪酸エステル、中性脂肪が有意に減少していることを明らかにした。(投稿中)6)葉状魚鱗癬の原因遺伝子として明らかにされているABCA12の発現ベクターを作製した。
詞章流動期狂言資料による複合辞形式の研究-近代語の分析的傾向

本研究課題にて特に重点的に研究を行ったのは、福岡市方言の「ゲナ」という形式である。「伝聞の助動詞からとりたて詞的用法へ」という文法化現象が主に福岡県筑前西北域の若年層に見られ、方言文法研究において興味深い事例であると考えられる。この研究に関する口頭発表を数回に亘って行い、学術論文にまとめた。また、これと並行して狂言資料による日本語文法史研究も行い、因由形式の階層構造に関する論文をまとめた。「複合辞形式による分析的傾向」は古代語から近代語へ至る流れの中での大きな変化である。現代語の「することができる」「ないつもりだ」など複合辞による表現形式は、いくつかの自立語がひとまとまりとなってモダリティ形式を形成している。このような複合形式による表現形式の形成過程の考察が本研究の全体構想である。本研究の中心課題である当為表現も、古代語の「べし」の担っていた意味範疇の一部が切り取られ、現代では「なければならない」などの形で表されるようになったものと考えられる。本研究の目的は、如上の複合辞形式が形成されて行くという近代語化への過程を中世期の資料を用いて探ることである。室町末江戸初期の台本の詞章は、即興劇として成立した狂言が台本の形で書き留められたごく初期であり、詞章としては流動的で当代の口語をよく反映しているものと考えられる。特に狂言資料に着目する所以である。このような見地に立ち、本年度は主に連体修飾節内部における当為表現の振る舞いを調査した。その結果、連体節内部において、当為表現は「客観的規制」と呼べそうな用法として専ら使用されていることが明らかとなった。この成果は、来年度中に学会誌に公表予定である。現在は、古狂言台本においても同様の傾向が見られるのかという点に関して調査中である。このような見地に立ち、今年度は天理図書館蔵『狂言六義』(近世初期筆録の和泉流台本)の原因理由を表す接続助詞(因由形式)を「因由形式間の包含関係」という側面から調査し、『文献探究』誌に公表した。また、上記の文献資料の調査と並行して、今年度は福岡市方言の「ゲナ」という形式に着目し、「伝聞の助動詞からとりたて詞的用法へ」という文法化現象が当該方言において生じていることを指摘した(「国語語彙史研究会」にて口頭発表)。この成果は次年度中に学術論文として公表予定である。今年度は福岡市方言の「ゲナ」という形式に着目し、「伝聞の助動詞からとりたて詞的用法へ」という文法化現象が当該方言において生じていることを指摘した。この成果は現在印刷中の『語文研究』誌(九州大学国語国文学会発行)に学術論文として公表予定である。この研究ではまずアンケート調査を行い、ゲナのとりたて詞用法の使用状況を調査した。ここでわかったことは、主に福岡県筑前西北域の若年層において、その使用が顕著であるということである。特に福岡市方言若年層話者の一部は、ゲナを伝聞用法では用いず、もっぱらとりたて詞として用いており、方言文法研究において興味深い事例であると考えられる。また、ゲナの取り立て詞用法成立のプロセスに関しても検討を加えた。その中で述べた変化モデルは、先行研究では様態用法から派生したとされていた取り立て用法が、引用マーカー的用法を仲立ちとして、伝聞用法から派生したというものである。九州方言、就中福岡県方言のゲナの使用状況、および各用法間の類似性からしてもこのように考えた方が妥当であるように思う。以上の研究と並行して、これまで私が主に研究テーマとして取り組んできた、狂言資料を用いた近代語文法の史的研究も行っている。このような複合形式による表現形式の形成過程の考察を近世期に筆録された狂言資料を用いて研究中である。
原始惑星系円盤におけるダスト沈殿・成長過程および系外惑星の形成問題への応用

惑星系は、星形成の副産物である原始惑星系円盤の中で生まれる。円盤は、9899重量%が水素・ヘリウムのガスで構成され、残りが固体成分(ダスト粒子)である。ダストは微惑星へ、微惑星は地球型惑星やガス惑星のコアへと集積する。本研究では、ダストから微惑星への過程の詳細を調べた。ダスト間の衝突の結果は常に合体になるわけではない。ダスト間の衝突の結果が合体か破壊かの条件を数値シミュレーションによって調べた(Wada et al.2007)。また、ダストが集積して自己重力不安定によってクランプ=微惑星が形成される様子を、円盤乱流がない場合についてN体シミュレーションによって調べた(Michikoshi et al.2007)。ダスト間の衝突の詳細を調べる一方で、完全合体を仮定した上で、ダストの赤道面への沈殿とそれに伴う成長を計算し、円盤の各半径、高さ毎のダストのサイズ分布の進化を求めて、ダストからの熱放射を計算し、観測と比べた(Tanaka et al.2005)。わかったことは、ダスト成長に従ってダストからの熱放射が減衰し、その時間スケールは100万年程度であることがわかった。電波観測により、100万1000万年の時間で円盤からの熱放射が減衰することがわかっており、従来、それは円盤自体が消失と解釈されていたが、実際はダストの成長によるもので、円盤自体は残存していてもいいことがわかった。観測への応用も行なった。このような円盤ダスト熱放射の理論モデルから、赤外線天文衛星「あかり」による円盤サーベイによって円盤ダスト成分を月質量程度まで追跡可能であることが分かり、それに基づいてサーベイ計画を確定した。また、星・惑星系形成研究専用データ処理パイプラインをIDLで開発した。さらに、ALMAの超高解像度イメージから、円盤内域と外域でのダスト粒子の成長の違いが検証可能であることを示した。1995年以来、約150個の系外惑星(太陽系外の恒星のまわりの惑星)が発見され、太陽近傍のG型、K型の孤立星においては、惑星系が存在する確率は少なくとも5%以上、もしかしたら数十%にも達するのではないかといわれている。したがって惑星形成は星形成に伴うかなり普遍的なプロセスである。惑星系は、恒星の形成の副産物である原始惑星系円盤の中で生まれる。円盤は、9899%の質量が水素・ヘリウムのガスで構成され、残りのごく一部が固体成分(ダスト粒子)である。ダストは微惑星へ、微惑星は地球型惑星、木星型惑星のコアへと集積する。大きなコアが形成されると、その強い重力で円盤ガスをひきつけ、木星型の巨大ガス惑星が形成される。円盤内でのダスト密度の空間分布の進化は惑星形成の初期条件を探る上で極めて重要である。ダスト密度の空間分布の進化はダストの赤道面への沈殿とそれに伴う合体成長である。本年度は、乱流のない円盤を考え、ダストのサイズ分布の進化を円盤の各半径、高さ毎に求め、各場所からの熱放射を計算し、それを足しあわせて円盤全体からの放射の準化を計算し、観測と比べた。電波観測により、100万1000万年の時間で円盤からの熱放射が減衰することがわかっており、従来、それは円盤自体が消失と解釈されていたが、本研究が明らかにしたことは、それはダストの成長によるもので、円盤自体は残存していてもいいということである。

本研究をまとめた論文は、米国天文学会誌"Astrophysical Journal"に受理された。今後、この解釈の妥当性を検証する電波観測の計画を立てて、プロポーザルを出していく予定である。この10年間に、約170個の系外惑星(太陽系外の恒星のまわりの惑星)が発見され、太陽型主系列星においては、観測限界以上の巨大ガス惑星を持つものだけでも、惑星系が存在する確率は5%以上であることがわかってきた。したがって、惑星形成は星形成に伴う普遍的プロセスだといえる。惑星系は、星形成の副産物である原始惑星系円盤の中で生まれる。円盤は、9899重量%が水素・ヘリウムのガスで構成され、残りが固体成分(ダスト粒子)である。ダストは微惑星へ、微惑星は地球型惑星、ガス惑星のコアへと集積する。コア質量がある値をこえると、その強い重力で円盤ガスをひきつけ、木星のような巨大ガス惑星が形成される。円盤内でのダスト密度の空間分布の進化は惑星形成の初期条件を探る上で極めて重要で、それはダストの赤道面への沈殿とそれに伴う合体成長である。前年度までに、乱流のない円盤でのダストのサイズ分布の進化を計算した。本年度は、円盤乱流の効果を多面的に調べた。乱流があると、それにひきずられて、ダスト間の相対速度は一般に増大する。ダストが衝突した場合に完全合体を仮定すると、大きな相対速度に対応して衝突頻度があがるため、ダストは急速に成長することになる。結果として、円盤からの熱放射の赤外部分は急速に減衰することが予測されるが、そのような減衰は観測されていない。そのため、ダストが衝突した際に破壊する効果、ダストが円盤表面付近の高温領域に巻き上げられた際に蒸発する効果を考えて、これらのことがダスト成長をかなり遅らせることが明らかになった。現在、観測との詳細な比較を行っている。一方で、微惑星が形成されたとして、乱流が引き起こす密度揺らぎが惑星集積にどのように影響するのかのN体計算も始め、原始惑星から惑星への最終段階において、密度揺らぎによる軌道変化が重要となることもわかった。現在、論文を執筆中である。この10年間に、200個以上の系外惑星(太陽系外の恒星のまわりの惑星)が発見され、太陽型主系列星においては、視線速度法の観測限界以上の巨大ガス惑星を持つものだけでも、惑星系が存在する確率は5%以上であることがわかってきた。このことから、惑星形成は星形成に伴う普遍的プロセスだといえる。円盤は、質量の9899%が水素・ヘリウムのガスで構成され、残りが重元素を中心としたダスト粒子として浮遊していると考えられている。μmサイズのダストはkmサイズの微惑星へ、微惑星は地球型惑星、ガス惑星のコアへと集積する。本年度は乱流のある場所とない場所(dead zone)があった場合の円盤の粘性拡散について調べ、観測データと比較すると、dead zoneは実際には存在しない可能性が強いことがわかった。また円盤に乱流があると、それにひきずられて、ダスト間の相対速度は一般に増大する。
好熱細菌堆肥を活用した環境に優しい緑地環境の創生及び維持

平成15年度に九州大学農学部附属農場において,乳牛糞尿主体の好熱細菌製の堆肥を作成した.その製造過程における発酵温度は通常堆肥製造時より高く約90°Cと確認され,それによって有機質の分解程度が高く砂状の良質堆肥を得た.このような良質堆肥をヒメコウライシバに施したところ,シバの地上部生育は化学肥料区より緩慢であったが,根の生育がよく排水による肥料成分の漏出は化学肥料に比較して極めて少なかった(日高ら,2004).平成16年度では,この堆肥の有効性をさらに確かめるために,圃場およびポット栽培のダイズに施与したところ,ダイズの開花期までの成長量はどの堆肥区においても化学肥料区と差はなく,子実収量は10倍堆肥(化学肥料に含まれる窒素の10倍相当量)区で化学肥料区よりは若干多かった.一方,排水中の養分偏出を測定したところ,排水中の窒素,燐酸および総塩分量は10倍堆肥区でも化学肥料区よりは少なく,ヒメコウライシバに施与した場合の結果と一致した(江頭ら,2004).以上のことから,好熱細菌製堆肥は緑地および作物栽培に使用した場合,肥料としての役割を果たすのみでなく,地下水汚染の原因となる栄養分漏出を抑えることもでき,環境保全上大変有効であることがわかった.今後の利用普及に当たっては,肥効性の向上や,病原菌および雑草種子混入の有無を確認する必要がある.九州大学附属農場に新設された超高温堆肥舎において、好熱細菌を含む既存堆肥に、九大附属農場の乳牛を主体とする糞尿を混合して、発酵させ、好熱細菌製の堆肥を得た。その過程において、通常の堆肥製造過程の温度より極めて高い、約90°Cが得られることを検証した。生成された堆肥は水分含有量20%を下回る、砂状の性状を示した。これを用いて、直径約5mmのペレットを、前押出型湿式造粒機(林鉄工所製;既存設備)で作製できた。次に、この堆肥の有効性を調査するために、化学肥料をコントロールとして、現物堆肥、そのペレットを用いて、ワグネルポットにヒメコウライシバ(Zoysia matrella (L.) Merr.)のソッドを生育させ、それらの反応を調べた。また、ポットから流出する溶液について、NH_4-N, NO_3-N, K^+イオン等について測定を行った。化学成分の測定には、主に、本研究で購入が認められた土壌・作物体総合分析計(SPCA-6210、島津製作所製)を用いた。地上部の生育は、堆肥区、ペレット区より化学肥料区が優っていたが、地下部の生育は変わらず、緑地用芝地としては、堆肥区・ペレット区の方が望ましい、と考えられた。また、ポットからの肥料養分の漏出は堆肥区・ペレット区-特にペレット区-がかなり少なく、環境保全上優れている、と判断された。平成15年度に九州大学農学部附属農場において,乳牛糞尿主体の好熱細菌製の堆肥を作成した.その製造過程における発酵温度は通常堆肥製造時より高く約90°Cと確認され,それによって有機質の分解程度が高く砂状の良質堆肥を得た.このような良質堆肥をヒメコウライシバに施したところ,シバの地上部生育は化学肥料区より緩慢であったが,根の生育がよく排水による肥料成分の漏出は化学肥料に比較して極めて少なかった(日高ら,2004).平成16年度では,この堆肥の有効性をさらに確かめるために,圃場およびポット栽培のダイズに施与したところ,ダイズの開花期までの成長量はどの堆肥区においても化学肥料区と差はなく,子実収量は10倍堆肥(化学肥料に含まれる窒素の10倍相当量)区で化学肥料区よりは若干多かった.一方,排水中の養分偏出を測定したところ,排水中の窒素,燐酸および総塩分量は10倍堆肥区でも化学肥料区よりは少なく,ヒメコウライシバに施与した場合の結果と一致した(江頭ら,2004).以上のことから,好熱細菌製堆肥は緑地および作物栽培に使用した場合,肥料としての役割を果たすのみでなく,地下水汚染の原因となる栄養分漏出を抑えることもでき,環境保全上大変有効であることがわかった.今後の利用普及に当たっては,肥効性の向上や,病原菌および雑草種子混入の有無を確認する必要がある.
精巣がんにおける幹細胞の形質変化の解明と新規細胞株を用いたエピゲノム創薬への応用

精巣における幹細胞である精子幹細胞は未分化性を維持しつつ自己複製を行い精子形成の供給源として働くが、近年、精子幹細胞の形質変化が精巣がんの発症に関わる可能性が示唆されている。精巣がんの発症原因の一つである停留精巣のモデル動物を用いて精子幹細胞の形質変化を解析した。その結果、ヒストン修飾酵素Kdm5aやマイクロRNAであるmiR-135aが有意に発現変化し、アンドロゲンが関与することを明らかにした。【研究目的】精巣がんの発生機序は不明であり、さまざまな組織型があるため適切な培養細胞株がなく、基礎研究の進展をさまたげている。私たちは、停留精巣における造精機能障害の病態解明のため研究を進めてきたが、その一因として精子幹細胞の分化異常を明らかにした。一方、複数のがんにおいて「がん幹細胞」の存在が注目されており、正常の幹細胞との違いが明らかになりつつある。そこで、これまでの研究成果をもとに、精巣のがん化に関わる幹細胞の形質変化を解明することを、本研究の目的とした。【本年度の研究実績の概要】精巣がん自然発症モデルから、がん細胞を分離する前段階として、精巣がん発症のリスクを持つ停留精巣モデル動物を用いた解析を行った。本モデル動物では精子幹細胞の分化傷害が起こるが、生後9日齢で正常と比べその差が顕著であることを明らかとした。そこで、生後9日齢の精巣組織を摘出し正常とモデル動物での遺伝子発現変化をマイクロアレイ法を用いて比較した。その結果、ヒストン修飾にかかわるKdm5a遺伝子や、miR-135aというマイクロRNAの変化が見られることを明らかにした。また、精巣組織の初代培養も行い、物理的な方法と酵素処理を組み合わせることで、細胞を分散できることを明らかにした。【研究の目的】精巣がんは、好発年齢が2030歳代と若年層であり社会的に影響の大きな疾患である。精子形成細胞を由来とする胚細胞腫瘍が多くを占め、様々な抗がん剤に抵抗性をもつ難治性症例も多い。精巣がんの発生機序は不明であり、さまざまな組織型があるため適切な培養細胞株がなく、基礎研究の進展をさまたげている。私たちはこれまで、停留精巣における造精機能障害の病態解明のため研究を進めてきたが、その一因として精子幹細胞の分化異常を明らかにした。【本年度の研究実績の概要】前年度に引き続き、精巣がんの原因疾患として重要である、停留精巣のモデル動物を用いて研究を進めた。生後9日齢のモデルラット精巣の詳細な解析から、精子幹細胞の分化に、ヒストン脱メチル化酵素であるKdm5aが関わることを明らかとした。さらに、マウスB型精原細胞由来である、GC-1細胞株にKdm5a強制発現ベクターを遺伝子導入し、ヒストンH3K4タンパクのメチル化の状態をWestern blotting法で確認したところ、H3K4me3タンパク質の発現低下を認めた。さらに、細胞分化に関わるOct3/4や、Thy1遺伝子の有意な発現亢進を認めた。当初計画では、細胞株への遺伝子導入・強制発現系の樹立、だけではなく、これらの樹立した新規培養細胞株を実験動物の精巣組織内へ移植する実験を立案していた。遺伝子導入効率の条件検討や、遺伝子導入した細胞の形質の解析に時間を要したためと考えられた。精巣がんの発生機序は不明であり、様々な組織型があるため適切な培養細胞株がなく、基礎研究の進展を妨げている。【本年度の研究実績の概要】精子幹細胞の形質変化に重要な役割を持つ、ヒストン修飾酵素Kdm5aの機能解析を進めるため、精原細胞株GC-1細胞にKdm5a強制発現ベクターを遺伝子導入したものとしていないサンプル間でマイクロアレイ解析を行った。Kdm5aを強制発現させた細胞では、精子形成細胞の分化に関わるScml2遺伝子が有意に発現亢進することを見出した。また、ChIP assayを行い、H3K4トリメチル状態ではKdm5a発現に伴いScml2遺伝子発言が上昇していることも明らかにすることができた。また、精巣組織から初代培養を行う系では、幼若精巣から精子幹細胞を分離・精製することができた。胎生期にアンドロゲン遮断を行った個体由来の細胞では、精子幹細胞の分化・未分化性維持に必要とされるc-Kit、Plzf遺伝子発現が有意に増加することを見出した。これらのことから、胎生期のアンドロゲンが精子幹細胞の形質変化に影響することが示唆された。

精巣における幹細胞である精子幹細胞は未分化性を維持しつつ自己複製を行い精子形成の供給源として働くが、近年、精子幹細胞の形質変化が精巣がんの発症に関わる可能性が示唆されている。精巣がんの発症原因の一つである停留精巣のモデル動物を用いて精子幹細胞の形質変化を解析した。その結果、ヒストン修飾酵素Kdm5aやマイクロRNAであるmiR-135aが有意に発現変化し、アンドロゲンが関与することを明らかにした。当初計画では、実験動物の精巣組織だけではなく、ヒト精巣がん組織においても、正常組織との比較を行うことを予定していたが、本年度は実験動物のみの解析にとどまった。ヒト精巣組織を扱うにあたり、十分な検体量が確保することが難しく、症例数も限られているためと考えられた。樹立した培養細胞株GC-1へのKdm5a遺伝子導入だけではなく、実験動物の精巣組織から分散した初代培養細胞へも遺伝子導入を行いたい。また、遺伝子導入した培養細胞において、精巣がん化にかかわる遺伝子発現変化が見られるかどうかや、実験動物の精巣への移植実験により、精巣がんの発生が認められるかどうかを確認していきたい。泌尿器科学実験動物で得られた知見をもとに、ヒト精巣がん組織での発現を正常組織と比較していきたい。本年度で同定できた、Kdm5aやmiR-135aなどの精巣組織における機能解析もあわせて行い、エピジェネティックな遺伝子発現制御メカニズムを解明していきたい。また、引き続き、実験動物の精巣組織から初代培養系を確立するために、細胞分散・培養条件などの最適化を進めていきたい。当該年度の研究においては、研究代表者および分担者によって効率的に実験が行われたため、実験助手への謝金が発生しなかった。そのため、他の消耗品費等を含めても実支出額が抑えられ、次年度使用額が生じた。研究の進捗状況がやや遅れているため、実験助手を効率的に活用しつつ研究を進めていきたい。次年度使用額はその一部に充当する予定である。
高エネルギー宇宙電子・ガンマ線観測による近傍加速源・暗黒物質の研究

銀河宇宙線の起源や加速・伝播機構の解明に向けて、国際宇宙ステーションにおける宇宙線観測実験CALETの装置開発を進めている。本研究では、シミュレーション計算や加速器ビーム実験を通じて装置性能の検証を進めてきた。またフライトモデルの製作に伴い、地上における各種動作試験や較正実験を行った。(1)シミュレーション計算による観測性能評価と軌道上における検出器較正手法の開発軌道上における検出器の出力較正のため、陽子やヘリウムを利用した較正手法を検討している。シミュレーション計算を基に、出力較正に利用可能な最小電離損失粒子の選別手法を開発し、またイベントレートを見積もることにより、軌道上において現実的な時間で較正可能であることを示した。(2)フライトモデルの地上較正試験CALETのフライト品の完成に伴い、検出器の組上げ試験、システム試験、熱真空試験等を実施した。各過程において、テストパルスやペデスタルのノイズレベルの評価、宇宙線ミューオンを利用した動作確認等を行ってきた。最終的なエネルギー較正に必要となる信号応答の基礎データの取得についても、紫外線パルスレーザー光を利用して全チャンネルの較正試験を実施した。(3) CERN-SPSにおける重粒子ビーム実験CALETのフライトモデルと同じ構造をもつ熱構造モデルを用いて、欧州原子核研究機構CERNのSPS加速器においてArの破砕核を利用した加速器実験を実施した。この実験では、初めてカロリメータによるシャワー粒子の出力応答を検証することができたため、後方散乱の影響を含む電荷測定性能、エネルギー測定性能の検証を行った。今後詳細な解析を進め、CALETに最適なハドロン相互作用モデルの検証も行う。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、高エネルギー宇宙線の観測から宇宙線近傍加速源や暗黒物質の探索を目指している。このため、国際宇宙ステーションに搭載する高エネルギー宇宙電子、ガンマ線観測装置(CALorimetric Electron Telescope : CALET)の開発を進めており、加速器実験やシミュレーションを通じて、検出性能の最適化を図っている。本年度は、検出器の性能検証のため、欧州原子核研究機構(CERN)のSPS加速器を用いて2度のビーム試験を実施した。2012年9月24日から10月15日にかけて行った実験では、CALETのフライトモデルと同じ構造を持つ熱構造モデルを用いて、μ粒子(150、180GeV)、電子(10-290GeV)、陽子(30-400GeV)の照射実験を実施した。μ粒子による最小電離粒子を基に各検出器を較正し、電子、陽子のシャワーイベントではエネルギー分解能や角度分解能などの観測性能について、シミュレーションデータが実験データをよく再現することが確認できた。2013年1月24日から2月4日に行った実験では、鉛の破砕核を用いた重イオン(30GeV/n)の照射実験を実施し、電荷測定性能に関する実験を行った。高統計のイベントを取得しており、詳細な解析を進めている。また、CALETの運用中に軌道上での検出器較正を行うため、シミュレーション計算を基に、トリガーイベントから較正に利用できる最小電離粒子イベントを選別する手法を開発した。軌道上の宇宙線が受ける地磁気による遮蔽効果や大気で生成されるアルベド粒子を考慮して検出レートを計算し、CALETの運用プランを見据えたシミュレーション研究を進めている。本研究は高エネルギー宇宙線電子、ガンマ線の観測を通じて、地球近傍の宇宙線加速源、及び暗黒物質の探索を行うことが目的である。このため、国際宇宙ステーションにおける高エネルギー宇宙線観測実験CALET (CALorimetric Electron Telescope)実験を進めており、本研究では特に、加速器実験やシミュレーション計算を通じて、検出器の性能最適化、精度検証を行っている。本年度は、ガンマ線に対する観測性能と、シミュレーション計算の精度検証を目的とした加速器ビーム実験のデータ解析を中心的に行った。ガンマ線は宇宙線の加速と密接な関係があり、加速現場の様子を反映したエネルギースペクトルを生成するほか、暗黒物質の対消滅・崩壊により生成される可能性が理論的に指摘されており、高エネルギー領域の観測が重要になっている。本研究では、CALETがガンマ線に対して有する有効面積や角度分解能といった基礎的な観測性能をシミュレーション計算から導出し、ガンマ線点源に対する観測期待値と、拡散成分に対する観測期待値をそれぞれ導出した。CALETはこれまでの観測(Fermi/LAT)に比べて、高エネルギー領域に感度があり、特に拡散成分に対して一桁高いエネルギー領域の観測感度があることを示した。また検出器の観測性能にシミュレーション計算を利用しているが、このシミュレーション計算自体の精度検証が検出器の性能評価に重要になる。そこで、CERN-SPSにおいて実施した加速器ビーム試験のデータ解析を行った。エネルギー分解能や角度分解能、検出効率等の項目について、シミュレーション計算が実験結果を精度よく再現することを確認することができた。

(2)フライトモデルの地上較正試験CALETのフライト品の完成に伴い、検出器の組上げ試験、システム試験、熱真空試験等を実施した。各過程において、テストパルスやペデスタルのノイズレベルの評価、宇宙線ミューオンを利用した動作確認等を行ってきた。最終的なエネルギー較正に必要となる信号応答の基礎データの取得についても、紫外線パルスレーザー光を利用して全チャンネルの較正試験を実施した。(3) CERN-SPSにおける重粒子ビーム実験CALETのフライトモデルと同じ構造をもつ熱構造モデルを用いて、欧州原子核研究機構CERNのSPS加速器においてArの破砕核を利用した加速器実験を実施した。この実験では、初めてカロリメータによるシャワー粒子の出力応答を検証することができたため、後方散乱の影響を含む電荷測定性能、エネルギー測定性能の検証を行った。今後詳細な解析を進め、CALETに最適なハドロン相互作用モデルの検証も行う。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、2014年度から運用を開始するCALETの実現に向けて加速器試験やシミュレーション計算を進めている。今回行った加速器実験はフライトモデルを模擬した検出器を用いて、高統計のデータを収集することができ、検出器性能の詳細な評価とシミュレーションモデルの最適化が進めることができた。また運用に向けた基礎資料となるシミュレーションデータも作成が進んでおり、今後の取得データの解析に向けた準備が順調に進行している。2014年度に控えるCALETの打ち上げに向けて、観測精度の検証を進めており、加速器実験で得られたデータの評価と、実験結果をよく再現するシミュレーション計算の最適化を達成することができた。これまでのシミュレーション計算や加速器実験で得られたデータを基に、引き続きシミュレーションモデルや解析手法の最適化を進める。特に加速器実験で得られた成果をシミュレーション計算に還元し、CALETの詳細な観測性能の評価を実施する。同時に、AMS-02などの最新の観測データを踏まえ、CALETによる観測予測の計算から期待される科学的成果について見積もる。また間近に控えるCALETの打ち上げに向けて、軌道上における最適なデータ較正が可能な運用プランを用意すると共に、科学目的に即したトリガーモードの運用プランをシミュレーション計算から最適化する。観測後のデータ解析のために、地上系の解析システムを構築し、所期の目的に沿った解析の実施に向けて準備を進める予定である。これまでに得られている成果を基に、最終的な観測性能の評価を実施する。
ローラガイドの反転時位置ずれの発生機構とその防止

本論文では,ローラガイドの反転時位置ずれ(往きと戻りの過程におけるキャリッジの変位または角変位の差)の発生機構を解明し,その低減法を得ることを目的としている.はじめに,実験を行い,反転時位置ずれは,ローラガイドで生じ,ボールガイドでは生じないことを見出した.次に,マルチボディ解析により,ローラガイドの反転時位置ずれはころのスキューにより発生することを明らかにした.最後に,ころのスキューを抑制するためにアンチスキューイングブレース(ASB)を提案した.本論文では,ローラガイドの反転時位置ずれ(往きと戻りの過程におけるキャリッジの変位または角変位の差)の発生機構を解明し,その低減法を得ることを目的としている.はじめに,実験を行い,反転時位置ずれは,ローラガイドで生じ,ボールガイドでは生じないことを見出した.次に,マルチボディ解析により,ローラガイドの反転時位置ずれはころのスキューにより発生することを明らかにした.最後に,ころのスキューを抑制するためにアンチスキューイングブレース(ASB)を提案した.ローラガイドでは,キャリッジの進行方向が変わるとキャリッジの重心が水平方向および鉛直方向にずれる現象,すわなち反転時位置ずれが生ずることが経験的に知られている.この反転時位置ずれは,ボールガイドでは発生しないことが知られているが,その発生機構はわかっていない.そこで,本研究では,ローラガイドの反転時位置ずれの発生機構を解明する第1地段階として,マルチボディ解析(MBA)ソフトウエアを用いて,ローラガイドの運動のシミュレーションを行うこととした.(1)はじめに,CADソフトウエアSolidWorksを用い,1個のレール,1個のキャリッジおよびローラ(1列あたりのローラ数:4個)で構成される非循環形のローラガイドのモデルを作成した.(2)ワークステーションおよびMBAソフトウエアRecurDynを用い,レール固定状態で,キャリッジを微小往復運動させたときの,キャリッジの運動およびローラの運動を調べた.(3)上の(2)の結果,運転開始時にローラにスキュー与えた(すなわち初期スキューを与えた)場合,キャリッジの進行方向が変わるとキャリッジの重心が水平方向および鉛直方向にずれるほか,ピッチング,ローリングおよびヨーイング方向にもずれが生ずることが判明した.このようなキャリッジの反転に伴うキャリッジの重心位置および姿勢のずれは,初期スキューを与えないと発生しないことが明らかとなった.また,ローラの初期スキュー角度の絶対値が大きいほど,反転時位置ずれが大きくなることも判明した.ローラガイドでは,キャリッジの進行方向が変わるとキャリッジの重心が水平方向および鉛直方向にずれる現象,すわなち反転時位置ずれが生ずることが経験的に知られているが,その詳細はわかっていない.そこで,実験で反転時位置ずれの発生を確認するとともに,マルチボディ解析(MBA)ソフトウエアを用いて,ローラガイドの運動のシミュレーションを行った.本年度に得られた成果は以下の通りである(1)はじめに,ローラガイドおよびボールガイドを往復運動させて,反転時位置ずれを測定する実験を行った.その結果,ローラガイドでは,水平,鉛直,ピッチングおよびヨーイシグ方向で反転時位置ずれが生ずるが,ボールガイドでは反転時位置ずれが生じないことを見出した.すなわち,反転時位置ずれは,ローラガイド特有の現象であることを確認した.(2)ローラガイドでは,ボールガイドでは発生しないころのスキューが生ずることに着目し,これが反転時位置ずれに関与していると推定した.(3)上の(2)の推定を確認するために,MBAを用いて,ローラガイドの反転時位置ずれに及ぼす初期スキュー角度の影響をMBAにより調べた.その結果,反転時位置ずれは,スキューを与えた場合,初期スキュー角度の絶対値が大きくなるほど増大することがわかった.(4)上の(3)のMBAの結果より,反転時位置ずれを低減するには,ころの初期スキューを極力小さくすることが有効であることが判明した.本研究は,ローラガイドの反転時位置ずれの発生機構を解明し,その低減法を得ることを目的としている.はじめに,スキュー対策をしていないローラガイドを対象とし,1個のころにのみ初期スキュー角を与えた場合,およびすべての初期スキュー角がゼロの場合の両方について,反転時位置ずれ,ころのスキュー角,およびころからキャリッジに作用する力をマルチボディ解析(MBA)で計算した.MBAの結果,以下のことが明らかになった.(1)ローラガイドの反転時位置ずれは,ころがスキューした場合に発生する.(2)スキュー防止対策をしていないローラガイドでは,ころのスュー角は,運転中,ほぼ初期スキュー角のままである.(3)ころに初期スキュー角を与えた場合には,ころからキャリッジに作用する力の大きさと方向が,往きと戻りで異なる.一方,すべてのころの初期スキュー角がゼロの場合には,このような変化は生じない.次に,これらのMBAの結果に基づいて,考察を行った.そして,ローラガイドの反転時位置ずれは以下の機構で発生することを示した.ころがスキューすると,ころとキャリッジの間でころの軸方向のすべりが生じ,摩擦力が発生する.すべりの方向は,往きと戻りで異なるため,摩擦力の方向も異なる.その結果,往きと戻りでころからキャリッジに作用する力(垂直接触力と摩擦力の合力)の方向と大きさが異なり,反転時位置ずれが発生する.最後に,ころのスキューを抑制するためにアンチスキューイングブレース(ASB)を提案し,ASBによるころのスキューの抑制効果および反転時位置ずれの低減について調べた.その結果,ASB付きローラガイドでは,ころの軸方向すきまが小さいほど,理論最大スキュー角が小さくなり,反転時位置ずれが低減されることを明らかにした.

平成23年度当初予定として,ローラガイドの反転時位置ずれの防止方法の検討を行うことをあげていたが,MBAの結果により,ころの初期スキューを極力小さくすることが反転時位置ずれに有効であることを示せたので,おおむね順調に進展していると判断した.24年度が最終年度であるため、記入しない。これまでの研究経過より,ローラガイドの反転時位置ずれの原因とその防止方法がほぼ解明できたので,それらの結果をまとめて,学会で公表する予定である.24年度が最終年度であるため、記入しない。
9系統の新規強皮症モデルマウスを活用した全身性強皮症の発症メカニズムの解析

本研究では9系統の遺伝子改変マウスにおいて強皮症関連遺伝子の発現様式を経時的に解析し、強皮症の発症初期・進行期に活性化される遺伝子プログラムを臓器別・細胞別に明らかにする。その最終目標は、ヒト検体を用いた研究では解析困難な発症初期の強皮症の病態を、動物モデルを活用して解明し、「強皮症の病態解明および早期治療戦略の基盤となる病態概念の確立」を実現することである。
SHBGによる乳癌発癌機構の解明に関する研究

肥満度をKaup Indexでみると乳癌群は平均24に対し正常婦人は平均21であり乳癌患者に肥満の傾向がみとめられた。肥満群に高LDH(低密度リポ蛋白)、高SHBG値(Sex Hormone Binding Globulinに対する17β-Estradiolの最大結合容量)の傾向を認めた。free Estradiolの血中濃度は総血中Estradiol濃度とSHBG値に対して正の相関を示した。従って、SHBGの肝細胞での合成がEstradiolによって誘導される事、ホルモン依存性乳癌のSHBG値が高い事等を考えるとホルモン依存性乳癌は高濃度の血中free Estradiolを有していると推定される。手術により切除された乳癌組織では、ras,myc,fos,の三種の癌遺伝子のRNA活性の上昇およびEGFレセプター遺伝子のRNA活性の上昇が認められたが、正常乳腺組織では認められなかった。一方、これらの組織の初代培養では、Estradiolは正常乳腺組織のras,fos,mycの各proto-oncogeneを活性化CmRNA活性)したのみならず、乳癌組織の、ras,fos,mycの各oncogeneおよびEGFレセプター遺伝子の各mRNA活性を上昇させた。MCF-7、人乳癌細胞でも同様の現象が認められた。この細胞の場合Estrogenレセプター遺伝子の活性誘導もEstradiolによってもたらされた。MCF-7人乳癌細胞におけるEstradiolのoncogeneおよびレセプター遺伝子の活性誘導は抗エストロージェンにより特異的に抑制された。これらの現象は細胞の増殖および抑制と一致して認められた。以上の成績より肥満,高LDH,高SHBGを伴うfree Estradiolの増加が細胞のEstrogenレセプターおよびEGFレセプター遺伝子の活性化をもたらし、これらのレセプター系をとうしてEstradiolやEGFの増殖因子がoncogeneを活性化するという発癌のメカニズムが考えられる。又ホルモン依存性乳癌ではEstradiolによるEGF Receptor遺伝子の活性化が認められたがホルモン非依存性と思われる一例ではこれを認めなかった。今後はこの面に関する研究を進める必要がある。
小動物のための超音波計測を融合した超高分解能血流解析手法の開発

動物実験に用いられる小動物の血管内の血流場を再現するため、超音波Bモード画像を用いたPIV計測と数値シミュレーションの間の速度情報の誤差をフィードバックしながら計算を行う超音波計測融合シミュレーション手法を開発した。モデル材料のPVAの音響特性の計測や調整を行って微小な直円管モデル流路を作成し、内部の流れを題材に超音波計測融合シミュレーションを実行して計算精度を評価し、本手法の有用性を確認した。動物実験による血管内皮の遺伝子発現の様子や病態の経時的変化と、血行力学の正確かつ詳細な情報を比較することができれば、循環器系疾患の機序が明らかになり、より高精度な診断方法や予防方法を確立できる。本研究では、小動物の血管内の血流場を再現するため、超音波計測結果と数値シミュレーション結果の間の誤差をフィードバックしながら計算を行う、小動物の血流の超音波計測融合シミュレーション手法を開発する。本年度は、本手法の妥当性の検証のための微小流路実験システムを構築した。特に、流路モデル材料に関し、PIV計測を行うことを考慮に入れ、透明性を有するポリビニルアルコールハイドロゲル(PVA-H)について検討を行った。PVA-Hは、含水率が高いため超音波を通し易く、生体組織を模擬するには、音響特性(音速および減衰率)を調整する必要があった。そこで、音響特性計測システムを構築し、PVA-HにおけるPVAの配合割合や、溶媒中の水とジメチルスルホキシド(DMSO)の比率を様々に変化させて音響特性を計測した。その結果、溶液に対するPVAの割合を10wt%、溶媒中のDMSOの割合を約98mol%とした場合に、音響特性を生体の値に近づけることができた。また、作動流体に関しても、粘度および粒子サイズが小動物の血液に近く、超音波計測時に実際の血液に類似した画像を提供できるものを選定した。さらに、超音波計測画像を解析して得られる断面内の速度ベクトルと、それに対応する計算結果を比較して得られる誤差をフィードバックする、超音波計測融合シミュレーションのプログラムを作成し、直円管内の層流の再現を題材に数値実験を行った。超音波計測融合シミュレーションでは、上流境界速度条件に誤差を含む場合でも、フィードバックの適用により、時間の進行に伴い計算結果を基準とする解に収束させ、計算精度が向上することを確認した。動物実験において、血管内皮上の遺伝子発現や病態の経時的変化と血行力学の情報を比較できれば、循環器系疾患の機序が明らかになり、より高度な診断方法や予防方法の確立に繋がる。本研究では、小動物の血管内の血流場を再現するため、超音波PIV計測結果と計算結果の間の誤差をフィードバックしながら計算を行う超音波計測融合シミュレーション手法を開発する。本年度は、本手法の有用性の検証を行うために、微小流路実験システムを用いて流動実験を行った。まず、前年度に引き続き、透明かつ生体軟組織に近い音響特性を有し、生体と同様の超音波Bモード画像を提供する流路の作成を行った。ポリビニルアルコール(PVA)ゲルにおいて、PVAの配合割合を10wt%、溶媒中のジメチルスルポキシド(DMSO)の割合を約98mol%とし、超音波散乱体としてガラスビーズを2.9wt%の割合で混合することにより、目的とする流路を作成することができた。流動実験では、第一段階として、通常の配合のPVAゲルを用いて直径2mmの直円管流路を作成し、内部に擬似血液の定常流を流して超音波Bモード計測を行った。得られた時系列の超音波Bモード画像を用いてPIV計測を実行し、計測断面上の2次元の速度場を算出した。さらに、複数断面上の計測結果を用いて超音波計測融合シミュレーションを実行した。それら超音波PIV計測結果や超音波計測融合シミュレーションの計算結果を直円管内流れの理論解と比較し、精度について検証した。超音波PIV計測は画像両端近傍において計測精度が悪かった。一方、超音波計測融合シミュレーションは、上流境界速度条件として一様平行流を与えた誤差を含む場合でも、フィードバック領域およびその下流域では良好な計算精度で発達層流を再現できた。ここで、通常の数値シミュレーションでも発達層流が得られたが、フィードバックの効果により流れ場はより早く発達した。
筋強直性ジストロフィーにおける選択的スプライシング異常とその分子機構の解明

本研究では、筋強直性ジストロフィー(DM)の選択的スプラシング異常に着目して研究を行い、特にABLIM1の選択的スプライシングの分子機構について培養細胞を用いて調べた。すると、PTBP1というスプライシング因子をマウス筋芽細胞C2C12に過剰発現させると、ABLIM1のスプライシングは、DM患者で見られる異常なスプライシングに変化した。逆にsiRNAでPTBP1の発現量をノックダウンさせると、ABLIM1のスプライシングは正常型へと発現が変化した。以上のことより、DM患者やDMモデルマウスの骨格筋ではPTBP1の発現量が通常の骨格筋より増加している可能性があると考え、PTBP1のタンパク質とmRNAの発現量を、それぞれウェスタンブロットとリアルタイムPCRで定量した。すると、PTBP1のタンパク質発現量は、DMモデルマウスでは、正常のマウスより有意に発現量の増加が見られ、同様にDM患者においても、PTBP1タンパク質発現量の増加傾向が見られた。しかし、PTBP1のmRNAの発現量は、DM患者、DMモデルマウスの両者において、正常の骨格筋と比べて発現量の増加は見られなかった。以上のことから、DM患者の骨格筋では、PTBP1の発現量がタンパク質レベル増加しており、それによってABLIM1など様々な遺伝子で選択的スプライシング異常が引き起こっている可能性がある。したがって、PTBP1のタンパク質発現量を減少させるような薬剤を見つけることができれば、スプライシングを正常化させる新規治療法の開発につながる。また、どのようにPTBP1のタンパク質発現量がDM患者で増加しているのか、その分子機構を調べることができれば、そこをターゲットとした薬物治療も可能になることから、本研究のスプライシング分子機構の研究は、治療法開発につながる意義のある研究である。26年度が最終年度であるため、記入しない。筋強直性ジストロフィー(DM)の患者において、PDLIM3とABLIM1のスプライシング異常を新たに検出し、これらのスプライシング異常が症状に関与しているかどうか、またどのようなスプライシング因子による異常によるものか調べた。PDLIM3は正常筋ではisoform aが主に検出されているが、DM筋ではisofom bが主に検出される。そこで異なるisofom間で結合するタンパク質や結合能に違いがあり、それが筋肉の症状に関与していると考えた。PDLIM3の持つ3つのisoformのタンパク質発現コンストラクトを作成して、結合するタンパク質をGSTプルダウンアッセイによって調べた。すると、PDLIM3との結合が報告されていたα-actinin2との結合は各isoform間で結合能の差は見られなかったが、isoformaとのみ結合するタンパク質の存在が確認できた。今後、そのタンパク質をマス解析する予定である。このタンパク質が同定されれば、PDLIM3と結合する新規タンパク質の検出だけでなく、このタンパク質とPDLIM3の結合がDMの症状に関与している可能性があり、治療のターゲットになる可能性もある。また、ABLIM1のミニジーンを利用して、LBNLやCELFといった従来から知られているスプライシング因子以外にRBM20に着目してスプライシングアッセイを行った。するとRBM20はCELF1と同様にexon11を脱落させる作用が見られた。RBM20は拡張型心筋症でも異常が報告されており、DMでも異常になっている可能性は高く、これがDM患者で見られる心筋症の原因である可能性もある点で、重要性は高いと思われる。筋強直性ジストロイーは様々な遺伝子で選択的スプライシングの異常を呈しており、いくつかの遺伝子のスプライシング異常は症状に関与することが明らかになっている。そこで、私たちは患者の筋肉で、ABLIMIエキソン11の選択的スプライシングが異常になっていることを明らかにし、その分子機構の解明を行うことを目的として、研究を進めた。今まで、ABLIMIのミニジーン(エキソン11の上流と下流のエキソン、イントロン構造を1つずつ保持したもの)を作製し、培養細胞に様々なスプライシング因子とともに遺伝子導入し、過剰発現することで、どのスプライシング因子がABLIM1のスプライシングを制御しているか調べてきた。すると、MBNL1、2、3、FOX1はエキソン11を挿入する方に、CELF1、2、6、PTBP1はエキソン11を脱落させる方に調節していることが分かり、それら因子をmiRNAをノックダウンさせた時に過剰発現と逆の結果が得られるかどうか、実験を行った。MBNL1、2、CELF1についてノックダウン実験を行ったところ、MBNL1、2は過剰発現とは逆の結果が得られたが、CELF1ではスプライシング変化を見られなかった。そこで、このmiRNAに利用した配列はすでに効くことが確認されているが、これらが正常に機能しているかどうか、ウェスタンブロットで確認したところ、MBNL、CELFのタンパク質レベル、RNAレベルいずれも発現が減少していないことが分かった。利用した培養細胞はマウス筋芽細胞C2C12であることから、遺伝子導入効率があまり良くないためだと考えられるが、蛍光観察よりミニジーンとmiRNAベクターが同じ細胞に入りやすいため、MBNLのノックダウンの実験は上手くいったと思われる。遺伝子導入の条件検討を行ったが、導入効率を今以上にすることができなかったため、siRNAを利用してノックダウンすることにした。すると、タンパク質レベルでMBNL1、CELF1をノックダウンすることができたため、この条件で現在、ノックダウン実験を行っているところである。