hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アリ植物と共生アリの共種分化関係における種特異性を維持する化学的機構の解明

調査地であるマレーシア・サラワク州のランビルヒルズ国立公園に滞在し、現地に生育するマカランガ属アリ植物および共生するシリアゲアリについて野外調査と化学成分のサンプリングを行った。共生アリは、宿主のマカランガに食物と居住空間の提供を受ける代わりに、宿主の植食者や宿主にまきつく蔓植物を排除する防衛サービスを提供している。この防衛サービスに関して、働きアリの攻撃行動を類型化し、防衛強度の評価を行い、これをアリの種間で比較した。その結果、共生するアリは、宿主自体が傷つけられていなくても、他株のマカランガの加害葉一片を近づけるだけで、攻撃行動を誘発されることが明らかとなった。さらに、他株の加害葉の種を変えて実験を行ったところ、宿主と同種の加害葉を与えたときの方が、宿主以外の種の加害葉を与えたときよりも、攻撃行動に参加する個体数が多くなった。また、この攻撃行動を誘導するシグナルとして、加害葉から放出されるにおい成分を分析したところ、マカランガの種間でその成分組成に違いが見られた。以上のことから、共生アリはまず、種に関係なくマカランガの加害そのものに対して反応し、攻撃行動を開始することで来るべき宿主の外敵に備え迅速な防衛を行うとともに、宿主の加害に対してはより攻撃力を増すことで、効率的な防衛を行っているものと考えられた。このことは、同所的に複数種が生育するにも関わらず、高度に種特異的な共生関係を築いている両者の共生系を維持する至近的要因の一つであると考えられる。以上の成果は、現在論文にまとめ、化学生態学系の学術誌に投稿中である。マレーシア国のサラワク州にあるランビルヒルズ国立公園内の熱帯雨林に赴き、現地に生育するオオバギ属(Macaranga)アリ植物の調査にあたった。国立公園内にてオオバギ属7種について共生するアリの創巣女王アリが未侵入の実生を野外で採集し、苗畑内にて栽培した。これらの実生を、創巣女王アリが侵入する段階にまで成長させたのち、化学成分のサンプリングに用いた。揮発性成分のサンプリングのために、吸着剤TENAXによるヘッドスペース法および有機溶媒抽出法を用いた。得られたサンプルは日本に持ち帰り、GC-MS分析に供した。その結果、溶媒抽出のサンプルから、テルペン類などの複数の揮発性成分が得られ、これらはオオバギ属の種によって異なることが分かった。現在これらの成分の同定と詳細な解析を進行中である。また、アリ類が巣仲間認識に用いることが知られている体表炭化水素について調査するために、野外にて成長したアリのコロニーを擁する成木のオオバギから働き蟻を採集し、溶媒を用いて体表に存在する炭化水素の抽出を行った。現在これらの成分について化学分析を進行中である。また、共生するアリ類は宿主であるオオバギの木の外敵に対して攻撃をすることで宿主を防衛するが、攻撃行動と動員を誘発する化学的シグナルの存在を確認するために、野外にて加害葉の葉辺を未加害の葉の上に置き、アリ類の行動観察を行った。この結果、宿主の種のオオバギの葉辺に対してより迅速で多数の動員が観察された。これは薬の加害部から放出される成分が種に特異的であることを示唆している。一方、日本の木本植物で、葉の揮発性成分と昆虫群集構造の関係を調査する研究も併せて行い、植物の葉の揮発性成分が昆虫の入植プロセスに関わることで群集の形成に寄与していることを示唆した。オオバギにおいても、アリの入植に葉由来の化学的情報が深く関わっている可能性が高いことが考えられる。マレーシア・サラワク州のランビルヒルズ国立公園の熱帯雨林にある研究調査地に、2004年は2度渡航し、現地にてマカランガ属のアリ植物調査活動を行った。●アリ植物の実生の揮発性成分マカランガ実生を野外で採集して苗畑で栽培し、溶媒抽出法および固相マイクロ吸着法(SPME)や吸着剤TENAX-TAを使用したヘッドスペース法により、揮発性の成分の採取を試みた。その結果、溶媒抽出法により揮発性成分を検出でき、その組成が種間で異なることが分かった。実際に空気中に放出される成分を直接トラップするためには、ヘッドスペース法が有効だが、実生からの成分は非常に微量であるため検出されにくく、現在採集方法の改良を進行中である。また、野外にで定点デジタルビデオカメラ撮影装置を設け、実生に創巣女王アリが侵入する過程の撮影を試みたが、成功には至っていない。●アリによる防衛行動とアリ植物の揮発性成分マカランガ稚樹の葉を野外で採集し、固相マイクロ吸着法(SPME)や吸着剤TENAX-TAを使用したヘッドスペース法により、揮発性の成分の採取を試みた。その結果、TENAX-TAにより、揮発性成分を検出でき、その組成が種間で異なることが分かった。また、稚樹の葉片の匂いに対する共生アリの攻撃反応を比較する野外実験を行ったところ、共生アリは宿主マカランガの葉片の匂いに対して、特に高い攻撃行動を示すことが分かった。このことより、マカランガの葉が食害されたときなどに、そこから放出される種特異的な匂い、すなわち揮発性成分をシグナルとして、共生アリが宿主を防衛するために攻撃行動を起こすと考えられる。現在この結果を論文にまとめ、投稿中である。

共生アリは、宿主のマカランガに食物と居住空間の提供を受ける代わりに、宿主の植食者や宿主にまきつく蔓植物を排除する防衛サービスを提供している。この防衛サービスに関して、働きアリの攻撃行動を類型化し、防衛強度の評価を行い、これをアリの種間で比較した。その結果、共生するアリは、宿主自体が傷つけられていなくても、他株のマカランガの加害葉一片を近づけるだけで、攻撃行動を誘発されることが明らかとなった。さらに、他株の加害葉の種を変えて実験を行ったところ、宿主と同種の加害葉を与えたときの方が、宿主以外の種の加害葉を与えたときよりも、攻撃行動に参加する個体数が多くなった。また、この攻撃行動を誘導するシグナルとして、加害葉から放出されるにおい成分を分析したところ、マカランガの種間でその成分組成に違いが見られた。以上のことから、共生アリはまず、種に関係なくマカランガの加害そのものに対して反応し、攻撃行動を開始することで来るべき宿主の外敵に備え迅速な防衛を行うとともに、宿主の加害に対してはより攻撃力を増すことで、効率的な防衛を行っているものと考えられた。このことは、同所的に複数種が生育するにも関わらず、高度に種特異的な共生関係を築いている両者の共生系を維持する至近的要因の一つであると考えられる。以上の成果は、現在論文にまとめ、化学生態学系の学術誌に投稿中である。
介護保険出来高報酬制度の可否と変更する場合の諸要件の研究

介護保険法は製成12年から実施され、社会に馴染んできている。しかし、厚生労働省においてその制度維持が課題になっており、多方面から検討が行われてきている.今回の調査は介護保険を出来高報酬制度に変更する要件として、機能の再獲得に関する意識を探り、問題点を洗い出すことが目的である。全国の介護老人保健施設2000ヶ所、理学療法士養成校184校に質問紙を送付した.さらにインターネットアンケートを試みた。内容は介護保険制度、要介護度改善、成功報酬、機能訓練に関するものなど64項目である。有効回答数は計549件が得られた。男女はほぼ同数で、職種は多岐に分かれている。結果、費用負担の相関と介護費用支出のあり方からは、要介護度改善による介護経費の軽減を認識すると共に、重度者への一層の経費投入を容認している。さらに高齢者介護は社会責任との回答が多く、社会保障経費として介護経費は今後拡大せざるをえないとの認識を持っているように思われる。成功報酬については必要と認めているが、成功報酬の具体的な考えは明確ではない。報酬が支払われる先も自分たちの関わっている職種、職場へとする考えと、要介護者本人へ支とする考えが多かった。成功報酬を期待はしつつも、それを具現化するほどの意識は低いのではないかと推察された。要介護状態の改善は本人や家族の生き方および経済的にも良い結果をもたらすと考えているものの、改善に対する本人の意欲の欠乏を訴え、さらに改善により転倒・骨折の可能性が増大することに懸念を示している事が伺われる。直接要介護高齢者に接している職種や事業所ほど、介護度改善の可能性を感じているが、それを阻害するものとして高齢者本人の意欲の問題があげられている。高齢者への意欲の持たせ方などについては今後の研究が必要となろう。また、要介護高齢者の在宅自主トレーニングの可能性についても調査した。介護保険を出来高報酬制度に変更することの可否と変更する場合の諸要件を明らかにすること,機能改善のための機能訓練普及に必要な要件の抽出と施設および一般の出来高制に対する意識調査を課題に本研究を実施した.ドイツ介護保険の実態調査と問題点の把握を課題に研究する計画となっていたが,本研究が10月採択となったため,本研究費による研究としては実施しなかった.機能改善のための機能訓練普及に必要な要件の抽出の研究のため,佐渡市在宅介護支援センター真野の里の研究協力を得た.在宅におけるタキザワ式実施の効果,機能改善の状況を探るため,当該施設通所者の家庭に器具を配置し,実施状況の自己申告を求め,実施前の身体状況の変化を評価した.この研究には11月25日研究協力者バイオフィリア研究所滝沢茂男氏と同行し,導入説明を行い,12月22日,23日研究室生北原奈緒子、高津和子、内山芳恵を伴い,導入時評価を行った.施設および一般の出来高制に対する意識調査に関し,12月11日産能大学において、研究協力者として,木村哲彦国際医療福祉大学教授,渡部一郎青森県立保健大学教授,高田一横浜国立大学,牛澤賢二産能大学及び滝沢氏の参加を得て,委員会を組織し開催した,そこでアンケート内容について,討議し,原案を決定した.その後,牛澤,高田,滝沢各氏と討議を進め,内容を決定し,3月31日介護老人保健施設2000箇所及び理学療法士養成校184箇所にアンケート調査表を送付した.インターネットにおける調査とFAXにおけるアンケート参加要請のための準備を行った.FAX専用回線を準備し,FAX番号調査の準備を依頼した.WEBはバイオフィリアリハビリテーション学会のアドレスを利用できることとなり,WEB調査票作成を依頼した.介護保険法は製成12年から実施され、社会に馴染んできている。
イモリにおけるレンズの再生を虹彩上縁部に限定する分子の解析

(1)2NIー36抗原が認識する抗原の精製:これまでに、この抗原分子はウエスタンブロットによって80kD以上の不溶性タンパク質として検出されていたが、その生化学的実体は不明瞭のままであった。そこで、我々はイモリからこの抗原分子を精製し生化学的性質を明らかにすることを計画した。現在、以下に示すような精製方法を確立し、この抗原分子の生化学的性質を解析中である。我々の確立した精製方法は(1)イモリから不溶性膜分画を調整した後、TritonXー100によって抗原分子を可溶化する。(2)可溶化された抗原分子をDEAEーSepharose chromatography及びRCA120Ag arose chromatographyにかける。(3)2NIー36抗原を固定化したSepharose chromatographyにかける。(4)透析後、TritonXー100を除去する。(5)超遠心後沈澱した抗原分子を50%アセトニトリルで可溶化した後、粉末化する。この方法で抗原分子をほぼ精製できたと思われる。この精製標品のウエスタンブロットにより、この抗原分子は分子量80kD、100kD、120kD、180kDの大きさをもつ大溶性糖タンパク質であることが明かとなった。(2)抗原分子の遺伝子のクロ-ニング:精製標品を用いて作成したポリクロ-ナル抗体を使用して、λgt11発現ベクタ-で作製したイモリcDNAライブラリ-をスクリ-ニングしたところ、3個のポジティブクロ-ンが得られた。現在各クロ-ンの塩基配列決定の作業が進行中である。(3)生体内分布と正常発生における発現時期の解析:免疫組織化学的手法を用いてこの抗原分子の生体内分布を調べたところ、この抗原分子は色素上皮細胞特異的ではなく真皮、血管、中腎など各組織を広く分布していることが判明した。また、同様な手法を用いて発生段階における発現時期を調べた結果、眼球内では色素上皮細胞の分化に伴って初めて発現することも明かとなった。そのほか血管の形成とともに発現することもわかった。
ナノ流体ネットワーク構造の光操作と光ニューロン回路に関する研究

本研究は,光により変形するアゾベンゼン・ポリマー微粒子を用いて,ナノ流体の自己組織化過程を制御する手法を開発し,ナノ流体ネットワーク構造の光操作と物質移動型光ニューロン回路への応用を検討することを目的としている。アゾ微粒子による流体の捕捉と,局所的な光異性化による形状変形により,流体の空間分布を制御する。ナノ流体における物質の流れの光制御について調べ,物質流による光学応答変化と流路の光変形を用いた,光ニューロン回路の基本機能を開拓する。
固体高分解能二次元NMR装置の試作研究

1.円筒形ガスベアリング試料回転システム、回転軸のスイッチングシステム、温度変化CPMASプローブ、回転速度の安定化装置を含む固体高分解能二次元NMR装置を試作し、固体SASS二次元NMRの実行およびデータ処理のためのコンピュータープログラムを作製した。ローターの外径は10mmで容量は600μl、最高回転速度は5KHzである。回転軸のスイッチング速度は10°程度の角度に対し約50msである。2.化学シフトSASS二次元NMRによる化学シフト異方性の分離測定法をβキノール-メタノール包接化合物に対して実行し、各【^(13)C】の化学シフトテンソルの値を決定した。得られたテンソル値は以前に単結晶で決定したものと極めて良い精度で一致し、この方法の有用性を確認した。3.一般的な固体において2D-J二次元スペクトルを得る方法を開発し、βキノール-メタノール包接化合物、Pジメトキシベンゼンにおいて結合定数を測定した。4.Dipolar Spinning sidepa tternを解析し、化学シフトテンソルと双極子テンソルの間の方向の決定に役立つことを示した。5.ギ酸カルシウムにおいて双極子SASS二次元NMRを実行し、CH結合距離を高精度に決定した。また、結合定数の値を求めるとともにその絶対符号が正であることを確認した。6.βキノール-メタノール包接化合物、尿素-トランス-4-オクテン包接化合物、尿素-オクタン包接化合物、尿素-ヘプタン包接化合物において双極子SASS二次元NMRを実行し、包接されている分子の動的構造を明らかにした。
FSHの分泌を調節する新しい生理活性物盾の作用機構に関する分子生物学的解析

1,顆粒膜細胞のゴナドトロピンレセプターの発現に対するアクチビンの作用をmRNAレベルで検討した。幼若の雌ラットにDESを投与しその卵巣から末分化の顆粒膜細胞を採取しin vitroで培養した。アクチビンを添加すると顆粒膜細胞に結合するFSHの量が用量反応的に増加した。これは細胞膜に存在するFSHレセプター(FSHR)の発現がアクチビンによって促進されたことを示唆している。そこでFSHRのcRNAをプローブとしてノーザンブロットを行い培養細胞のFSHRのmRNAの変動について検討した。100ngのアクチビンを添加するとFSHRのmRNAは経時的に増加し24時間後に頂値を示しコントロールの4倍に達した。48時間後に減少しコントロール群と同じレベルまで減少した。この様なFSHの結合能の増加はスキャチャード解析の結果レセプターの増加によることが判った。アクチビンによるFSHRの増加は、ノーザンブロットの結果、FSHのmRNAの発現の増加によることが明かとなった。アクチビンによって細胞内のcAMPの上昇が見られなかったことから、アクチビンはおもにFSHRの転写レベルを刺激することが示唆された。LHレセプターの発現は、アクチビン単独では増強されないが、FSHによるLHレセプターとそのmRNAの誘導を促進し、顆粒膜細胞の黄体化を刺激した。2.前述のようにアクチビンは卵胞の機能の調節に重要な役割を果たしている。そこでアクチビンの作用機序を明らかにするためにアクチビンのレセプターの構造を明らかにすることを試みた。ラットの顆粒膜細胞からIIAタイプのアクチビンレセプターのcDNAを得ることができた。このレセプターは、細胞内にセリン/スレオニンキナーゼ構造を持ち細胞膜を1回貫通するタイプのレセプター構造であった。アクチビンのmRNAの発現はFSIとLHによって刺激され、特に黄体に多いことが明かとなった。本研究はFSHの分泌を調節する新たな物質として卵胞液中より発見されたインヒビン,アクチビンおよびアクチビン結合蛋白質の作用機序を明らかにすることを目的とした。本年度においては以下の結果を得た。1.先ず本研究に使用する卵胞液中のインヒビン,アクチビン,アクチビン結合蛋白質を大量に精製する必要がある。ウシのインヒビンのモノクロ-ナル抗体により免疫吸着クロマトグラフィ-を開発し,短時間で大量のウシインヒビンを精製するシステムを完成させた。2.精製したウシインヒビンの抗体を山羊を用いて大量に作成し,ヒトおよびラットのインヒビンの精製システムも開発した。3.インヒビンの免疫吸着クロマトに吸着しない分画からアクチビンとアクチビン結合蛋白質の精製を試みた。アクチビンとアクチビン結合蛋白質の複合体は硫酸基に結合することから,硫酸セルロファインやヘパリンセファロ-スによって効率的に精製されることを明らかにした。現在さらにアクチビン結合蛋白質とアクチビンA,AB,Bの4つの蛋白質を分離するシステムを検討中である。4.ウシインヒビンをを樹脂に結合させ,インヒビンのレセプタ-を精製するためにアフィニティ-カラムを作成した。5.マウスの精巣のcDNAライブラリ-よりアクチビンレセプタ-のcDNAをクロ-ニングした。6.私共は既にラットとヒトのゴナドトロピンレセプタ-のcDNAクロ-ニングに成功し,それらの発現機序について検討中である。

ラットのFSHのレセプタ-はアクチビンにより上昇するが,レセプタ-の増加に先立ちそのmRNAもアクチビンにより上昇することを明らかにした。1.顆粒膜細胞のゴナドトロピンレセプターの発現に対するアクチビンの作用をmRNAレベルで検討した。幼若の雌ラットにDESを投与しその卵巣から未分化の顆粒膜細胞を採取しin vitroで培養した。アクチビンを添加すると顆粒膜細胞に結合するFSHの量が用量反応的に増加した。これは細胞膜に存在するFSHレセプター(FSHR)の発現がアクチビンによって促進されたことを示唆している。そこでFSHRのcRNAをプローブとしてノーザンブロットを行い培養細胞のFSHRのmRNAの変動について検討した。100ngのアクチビンを添加するとFSHRのmRNAは経時的に増加し24時間後に頂値を示しコントロールの4倍に達した。48時間後に減少しコントロール群と同じレベルまで減少した。この様なFSHの結合能の増加はスキャチャード解析の結果レセプターの増加によることが判った。アクチビンによるFSHRの増加は、ノーザンブロットの結果、FSHのmRNAの発現の増加によることが明かとなった。アクチビンによって細胞内のcAMPの上昇が見られなかったことから、アクチビンはおもにFSHRの転写レベルを刺激することが示唆された。LHレセプターの発現は、アクチビン単独では増強されないが、FSHによるLHレセプターとそのmRNAの誘導を促進し、顆粒膜細胞の黄体化を刺激した。2.前述のようにアクチビンは卵胞の機能の調節に重要な役割を果たしている。そこでアクチビンの作用機序を明らかにするためにアクチビンのレセプターの構造を明らかにすることを試みた。ラットの顆粒膜細胞からIIAタイプのアクチビンレセプターのcDNAを得ることができた。このレセプターは、細胞内にセリン/スレオニンキナーゼ構造を持ち細胞膜を1回貫通するタイプのレセプター構造であった。アクチビンのmRNAの発現はFSHとLHによって刺激され、特に黄体に多いことが明かとなった。
マウス二次口蓋形成を支配する遺伝子群と口蓋裂発症の分子機構

本年度の実験では、マウス二次口蓋形成のin vivoと器官培養系におけるMEE細胞のアポトーシス・移住・形質転換に関する組織観察に基づき、上皮索消失に至る細胞レベルでの形態形成モデルについて検討した。Trowell器官培養システムを用いた培養実験では、in vivoでの上皮索形成から断裂期を経て間葉合流に至る形態形成過程を組織形態ならびに進行速度のうえで再現しうることと、MEE細胞の消失機序として提唱されているアポトーシス、移住、形質転換がいずれも培養系で起こりうることが確認できた。三次元空間でのアポトーシスの発現頻度の計測から、上皮索では早期にアポトーシスが誘発されており、組織容積当りでの出現頻度は上皮索形成期から間葉合流期までほぼ一定に保たれていることも確かめられた。カスパーゼ抑制因子を添加した培養実験では、MEE細胞の消失は遅れるが完全抑制には至らないことが判明し、カスパーゼ依存性と非依存性の経路が働くと推測された。MEE細胞の運動能に関して、CCFSE標識した口蓋突起培養試料のin situ観察により、上皮索周辺に位置して個々に分離したMEE脚胞が1時間に直線距離として10μm前後、MEE細胞の大きさとして1個程度の距離を移動しうることを確かめた。単独標識細胞の動きとして、上皮索内部での移動と上皮索より離脱する方向での移動が同じ観察視野で認められ、三次元空間での移動方向は一定していなかった。このMEE細胞の空間移動については、細胞自体が獲得した運動能による能動的な動きと、組織構造の改築に伴う受動的な動きとが考えられる。前者の高い細胞運動能は、を示す細胞の獲得には、アポトーシス細胞の貧食と関連すると考えられた。この貧食能を高めたMEE細胞が単独あるいは数個の細胞集団として間葉組織内に移住、サイトケラチン発現の停止を指標とした形質転換をきたすことも確かめられた。二次口蓋形成は上顎突起から一対の口蓋突起の発生を起点として、舌側面に沿った下方伸長、舌上方への挙上から水平方向への伸長、左右突起間での接着と癒合、上皮索の消失と間葉組織の合流の段階を経て完了する。口蓋突起の挙上現象は左右突起MEE細胞の接着・癒合・消失とともに口蓋形成を特徴づける表現型であり、口蓋突起の構成成分(上皮・間葉細胞、細胞外基質)のダイナミックな変動とともに、舌をはじめとする周囲組織との相互作用が複雑に働いていることが想定される。本研究においては、挙上現象と上皮索の消失(細胞死、移住、上皮間葉転換)の分子機構に注目し、野生型およびδEF1欠損、endothelin-1(ET1)欠損の各マウスモデルにおいて、免疫染色、in situ hybridizationにより、MEE細胞、予定口腔上皮、予定鼻腔上皮に現われる細胞表現型について調べている。本年度においては、当初の計画に従い、異なる胎生時期(E13-E18)のマウス(野生型、δEF1欠損、ET1欠損)を対象として、顎顔面の前頭断連続標本を作製、突起構成成分の変動と口蓋形成の進行(その障害)について観察した。さらに、これらの動物モデルから採取した口蓋突起を器官培養し、MEE細胞の接着癒合能について検討した。δEF1欠損マウスは100%の発症率で口蓋裂を発症するが、MEE細胞自体は接着癒合に向けた分化の方向付けを受けており、この口蓋裂の原因として、メッケル軟骨の形成不全と関連した口蓋突起の挙上不全が示唆された。次年度においては、下方伸長期から間葉融合に至る時間枠での突起構成成分の変動(細胞増殖、基質産生量とその局在変化)について定量的な解析を継続し、確立した培養系において救助機能を発揮しうる因子の探索をすすめる。

この貧食能を高めたMEE細胞が単独あるいは数個の細胞集団として間葉組織内に移住、サイトケラチン発現の停止を指標とした形質転換をきたすことも確かめられた。
多層薄膜への超微小圧子押し込み/引き抜き過程におけるエネルギー散逸の物理的評価

基板/Al/TiN二層構造膜において,塑性変形に使われるエネルギーおよび弾性変形に使われるエネルギーを,押し込み硬さ試験により得られる荷重-変位曲線より評価した.塑性変形に使われるエネルギーがAl層厚みに比例し増加すること,弾性変形に使われるエネルギーはAl層厚みには依存しないことを見いだした.この結果は,塑性変形が主に降伏応力が小さい金属層において起こるため塑性変形エネルギーがAl層厚みに依存し,弾性変形のために消費されるエネルギーは金属Al層とTiN層の間のヤング率あるいは剛性率の差が大きいことによりAl層厚みに依存しないことを示すと考えられる.2.基板/(Al/TiN)多層構造薄膜におけるエネルギー散逸基板/(Al/TiN)多層構造薄膜におけるエネルギー散逸を評価し,薄膜における全Al厚みが同じ場合においても薄膜を多層構造化すること,すなわち,一層あたりのAl厚みを小さくし,界面の数を増やすことにより塑性変形に使われるエネルギーが少なくなることを明らかにした.この結果は,界面を形成することにより,薄膜が何らかの要因でより弾性的になることを示唆する.金属,あるいは金属窒化物と軟材料であるポリテトラフルオルエチレン(以下PTFEと略す)を多層化し,PTFE層厚みが多層薄膜の硬さおよび超微小押し込み硬さ測定時のエネルギー散逸に与える影響を検討した.TiN/PTFE多層構造薄膜においては,PTFE層の厚みを7nmまで薄くしていくことにより,超微小押し込み硬さ試験により測定される動的硬さが大きくなった.また,このとき,超微小押し込み硬さ試験中に散逸されるエネルギーは小さくなり,逆に弾性的エネルギーとして膜内に一旦蓄えられるエネルギーは大きくなった.これは,薄いPTFEを挟むことにより多層構造化された薄膜が塑性変形しにくくなると同時に弾性率が向上することを示す.4.まとめ金属と金属窒化物,あるいは有機高分子膜と金属膜を組み合わせた多層構造膜に対する超微小押し込み硬さ試験におけるエネルギー散逸の評価が,多層薄膜の物理的性質を明らかにする上で有効であることを示した.基板/Al/TiN二層構造膜において,塑性変形に使われるエネルギーおよび弾性変形に使われるエネルギーを,押し込み硬さ試験により得られる荷重-変位曲線より評価した.塑性変形に使われるエネルギーがAl層厚みに比例し増加すること,弾性変形に使われるエネルギーはAl層厚みには依存しないことを見いだした.この結果は,塑性変形が主に降伏応力が小さい金属層において起こるため塑性変形エネルギーがAl層厚みに依存し,弾性変形のために消費されるエネルギーは金属Al層とTiN層の間のヤング率あるいは剛性率の差が大きいことによりAl層厚みに依存しないことを示すと考えられる.2.基板/(Al/TiN)多層構造薄膜におけるエネルギー散逸基板/(Al/TiN)多層構造薄膜におけるエネルギー散逸を評価し,薄膜における全Al厚みが同じ場合においても薄膜を多層構造化すること,すなわち,一層あたりのAl厚みを小さくし,界面の数を増やすことにより塑性変形に使われるエネルギーが少なくなることを明らかにした.この結果は,界面を形成することにより,薄膜が何らかの要因でより弾性的になることを示唆する.金属,あるいは金属窒化物と軟材料であるポリテトラフルオルエチレン(以下PTFEと略す)を多層化し,PTFE層厚みが多層薄膜の硬さおよび超微小押し込み硬さ測定時のエネルギー散逸に与える影響を検討した.TiN/PTFE多層構造薄膜においては,PTFE層の厚みを7nmまで薄くしていくことにより,超微小押し込み硬さ試験により測定される動的硬さが大きくなった.また,このとき,超微小押し込み硬さ試験中に散逸されるエネルギーは小さくなり,逆に弾性的エネルギーとして膜内に一旦蓄えられるエネルギーは大きくなった.これは,薄いPTFEを挟むことにより多層構造化された薄膜が塑性変形しにくくなると同時に弾性率が向上することを示す.4.まとめ金属と金属窒化物,あるいは有機高分子膜と金属膜を組み合わせた多層構造膜に対する超微小押し込み硬さ試験におけるエネルギー散逸の評価が,多層薄膜の物理的性質を明らかにする上で有効であることを示した.押し込み硬さ試験により得られる荷重ー変位曲線より,圧子押し込み過程において薄膜試料に与えられた全エネルギー,圧子引き抜き過程において薄膜試料から圧子に戻されたエネルギー,そしてこれらのエネルギーの差,すなわち薄膜試料において散逸されたエネルギーを算出する手法を確立した.この手法を用いて,組成変調した金属チタニウム/窒化チタニウム多層構造薄膜において,散逸したエネルギーの比率,すなわちエネルギー散逸率を組成変調周期に対して求め,その変化の機構を解析した.実験結果より,エネルギー散逸率が,変調周期に依存するとともに.周期が10nm程度と短い領域において,窒化チタニウムにおいて得られた値よりもさらに小さな値を示すという特異な挙動を見いだした.同様の結果を,金属バナジウム/窒化バナジウムの系においても確認した.ここで得られた結果は,薄膜が多層構造化によって弾性的になることを示す.さらに,剛性率の大きく異なる材料の組み合わせに着目し,基板/Al/TiNという構造からなる多層膜において,塑性変形に使われるエネルギーがAl層厚みに依存し,弾性変形に使われるエネルギーはAl層厚みに依存しないことを示した.以上の結果より,圧子押し込み過程におけるエネルギーの散逸に着目することにより.多層構造薄膜材料の塑性的・弾性的挙動を評価できることを示した.基板/Al/TiNという構造からなる二層構造膜において,塑性変形に使われるエネルギーおよび弾性変形に使われるエネルギーを,押し込み硬さ試験により得られる荷重-変位曲線より評価した。

塑性変形に使われるエネルギーがAl層厚みに比例し増加すること,弾性変形に使われるエネルギーはAl層厚みには依存しないことを見いだした。この結果は,塑性変形が主に降状応力が小さい金属層において起こるため塑性変形エネルギーがAl層厚みに依存し,弾性変形のために消費されるエネルギーは金属Al層とTiN層の間のヤング率あるいは剛性率の差が大きいことによりAl層厚みに依存しないことを示すと考えられる。さらに,この結果を確認するため,Al層を降状応力のより大きなCu層に置き換え,同様の実験をおこなった。その結果,圧子によりAl/TiN薄膜と同荷重を加えた場合には,塑性変形に使われるエネルギーの割合は降状応力の比率に比例して減少することが明らかとなり,前記の考察が正しいことが明らかとなった。さらに,二層構造薄膜において得られた結果をもとに,Al/TiN系多層構造薄膜におけるエネルギー散逸を評価し,薄膜における全Al厚みが同じ場合においても薄膜を多層構造化すること,すなわち,一層あたりのAl厚みを小さくし,界面の数を増やすことにより塑性変形に使われるエネルギーが少なくなることを明らかにした。この結果は,界面を形成することにより,薄膜が何らかの要因でより弾性的になることを示唆する。今後さらに多層構造薄膜における界面の役割について検討を加えていく。金属,あるいは金属窒化物と軟質材料であるポリテトラフルオルエチレン(以下PTFEと略す)を多層化し,PTFE層厚みが多層薄膜の硬さおよび超微小押し込み硬さ測定時のエネルギー散逸に与える影響を検討した.TiN/PTFE多層構造薄膜においては,PTFE層の厚みを7nmまで薄くしていくことにより,超微小押し込み硬さ試験により測定される動的硬さが大きくなった.また,このとき,超微小押し込み硬さ試験中に散逸されるエネルギーは小さくなり,逆に弾性的エネルギーとして膜内に一旦蓄えられるエネルギーは大きくなった.これは,薄いPTFEを挟むことにより多層構造化された薄膜が塑性変形しにくくなると同時に弾性率が向上することを示す.TiN/PTFE,Al/PTFEおよびTi/PTFE多層構造を比較すると,それぞれ周期長さを5nmまで小さくするとともに硬さが向上し,また,膜が弾性的になるという傾向は同じであった.しかし,その硬さおよび弾性率の変化の割合はTiN/PTFE,Ti/PTFE,そしてAl/PTFEの順になった.我々は,この差は多層薄膜を形成した材料の表面自由エネルギーの差により多層構造薄膜内に発生する界面自由エネルギーの大きさの違いに起因するのではないかと考察している.多層薄膜への超微小硬さ試験において,エネルギー的考察をおこなうことにより多層構造化による薄膜の硬さ向上,弾性化についての新規な知見を得ることができた.
腎細胞癌の増殖様式とその抑制に関する研究

1.腎細胞癌の発育に関する臨床的検討過去15年間にincidentalomaとして発見され、経過観察されていた腎細胞癌21例のdoubling time (DT)を計測した。21例のDTは40日から6.4年で平均1.6年であった。初診時の腫瘍径を3群(<15mm=7例,1625mm=7例,2650mm=7例)に分けてDTを検討したが、各群(<15mm=2.1±1.8年,1625mm=0.8±0.5年,2650mm=2.1±1.8)でDTに有意差は認めなかった。またDTをGrade別(G1=2.6±2.5年,G2.3=1.2±1.1年)に検討したがGrade 1で成長速度が遅い傾向が認められたが有意差は認めなかった。2.腎細胞癌の細胞増殖動態の研究病理組織学的に証明された腎細胞癌の原発巣(18例)と転移巣(27例)でのDTは前者で40-1893日、後者で10-1932日と多様であったが、原発巣の増殖率は転移巣と比較して有意に低かった。原発巣におけるDTは腫瘍径、組織学的異型度、Ki-67 Labeling Index (Li)、apoptosis LIのそれぞれとは直接関係しなかったが、Ki-67 LIとapoptosis LIの比をとると相関が認められた。一方、転移巣におけるDTは組織学的異型度とKi-67 LIとapoptosis LIの比に相関した。このことより腎細胞癌の原発巣と転移巣の増殖は、癌細胞の増殖とアポトーシスのバランスによって決定されていると考えられた。3.VEGFの免疫機構への影響VEGFは腎細胞癌より産生されるが、血管内皮細胞をVEGFで処理するとFSCAcanではVCAM-1の軽度の発現とICAM-1の強い発現が認められた。VCAM-1は腎細胞癌表面に発現しているVLA-4のリガンドである。一方、ICAm-1はANK細胞に発現しているLFA-1のリガンドである。このことよりVEGFは血管内皮細胞に作用した場合、血管内皮細胞と腎癌細胞の接着を促す一方、リンパ球と血管内皮細胞の接着を促進し、腎癌細胞の増殖、転移に対して抑制的に働く可能性も考えられた。(1)腎細胞癌の発育に関する臨床的検討過去15年間にincidentaomaとして発見され、経過観察されていた腎細胞癌21例のdoubling time(DT)を計測した。初診時の腫瘍径を3群(<15mm=7例,1625mm 7例,2650mm=7例)に分けてDTを検討したが各群(<15mm=2.1±1.8年,1625mm=0.8±0.5年,2650mm=2.1±1.8年)でDTに有意差は認めなかった。

またDTをGrade別(Grade 1=2.6±2.5年,Grade 2,3=1.2±1.1年)に検討したがGrade 1で成長速度が遅い傾向が認められたが有意差は認めなかった。なお21例中4例はDTが3年以上で残りの17例は全例2年以下であった。このためいわゆるslow growing typeと考えられるこれら4例を除外し、17例で腫瘍発生推定年齢を算出してみた。これら17例の初診時の平均年齢は51歳、平均腫瘍径は23mm、手術時の平均年齢54歳、平均腫瘍径は45mmであった。17例の平均DTである305日より逆算したところ腫瘍発生推定年齢は41歳と推定された。(2)腎細胞癌の増殖様式に関する生物学的検討(3)血管新生因子による血管内皮細胞上の接着分子の発現に関する検討HUVECをVEGFで処理した場合にICAM-1の発現増強は認められたがVCAM-1の発現は認められなかった。1.腎細胞癌の細胞増殖動態の研究病理組織学的に証明された腎細胞癌の原発巣(18例)と転移巣(27例)でのdoubling time(DT)は前者で40-1893日、後者で10-1932日と多様であったが、原発巣の増殖率は転移巣と比較して有意に低かった(p=0.0015Mann-Whiteney U test)。原発巣におけるDTは腫瘍径、組織学的異型度、Ki-67 Labeling Index(LI)、apoptosis LIのそれぞれとは直接関係しなかったが、Ki-67 LIとapoptosis LIの比をとると、相関が認められた。一方、転移巣におけるDTは組織学的異型度とKi-67 LIとapoptosis LIの比に相関した。このことより腎細胞癌の原発巣と転移巣の増殖は、癌細胞の増殖とアポトーシスのバランスによって決定されていると考えられた。2. VEGFの免疫機構への影響VEGFは腎細胞癌より産生されるが、血管内皮細胞(HUVEC)をVEGFで処理するとFACScanではVCAM-1の軽度の発現とICAM-1の強い発現が認められた。VCAM-1は腎細胞癌表面に発現しているVLA-4のリガンドである。一方、ICAM-1はIL-2-activated natural killer cells(ANK ce11s)に発現しているLFA-1のリガンドである。このことよりVEGFは血管内皮細胞に作用した場合、血管内皮細胞と腎細胞癌細胞の接着を促す一方、リンパ球と血管内皮細胞の接着を促進し、腎癌細胞の増殖、転移に対して抑制的に働く可能性も考えられた。(1)ANK細胞(LAK cells)の血管内皮細胞(HUVEC)に対する接着能測定実験。HUVECに対してVEGF処理をした場合に無処理の場合と比較してLAK細胞のHUVECに対する接着能の増加が認められた。(2)抗体処理によるANK細胞の血管内皮細胞に対する接着阻止実験。以上のことよりVEGFは血管内皮細胞に作用した場合、ANK細胞と血管内皮細胞との接着を促進し、腎癌細胞の増殖、転移に対して抑制的に働く可能性も考えられた。
高感度・低暗電流撮像素子素子用CCDレジスタの研究

VOD(Vertical Overflow Drain:縦型オーバーフロードレイン)つきダイオードを上下反転したCCD(Charge Coupled Device)レジスタを提案し、これをフレーム転送方式CCDイメージセンサに応用した場合の特性を3次元デバイスシミュレータにより解析した。本方式では、暗電流を電極側に排出することが可能となるため、ホールピンニングデバイスと同様に低暗電流化が可能である。さらに原理的に、ホールピンニングデバイスよりも転送電荷量を増やすことが可能である。またこのレジスタを埋め込みホトダイオードと組み合わせてインタライン方式CCDセンサを構成する方法を提案し、その特性を同じくデバイスシミュレータにより解析した。主要な結果はつぎの通りである。2.インタライン方式CCDセンサにおいては、電極を分離するSi-SiO_2界面が完全に空乏化している場合には大きなg-r電流が発生し、界面近傍に正孔が注入される場合には極めで小さなg-r電流しか発生しない。3.1.2のg-r電流はこの部分で発生する電流がチャネルに入ると暗電流に成るが、構造を工夫することにより、その大半を電極側へ排出することができ、低暗電流化が可能となった。これにより、電極に流れ込むため暗電流は極めて小さくなる。4.上に述べた2つの方式のCCDイメージセンサでは、CCDレジスタは本質的に低暗電流であるので、4相駆動によって小さな暗電流で大きな信号電荷を扱える。裏面入射方式Full-FT CCDはデイジタルスチールカメラの理想型と考えられる。しかし、現状では改良すべき多くの点がある。本研究者は新しいCCDレジスタ(DTB-CCB)を提案し、三次元数値解析によって特性を明らにした。その結果は上記CCDの特性改善にきわめて有効であると考えられるD、TB CCDは縦型オーバーフロードレインつきのホトダイオードを上下反転し,ドレイン部をSiO_2膜で分離して電極としたものである。シミュレーションの結果1.暗電流はきわめて小さくなる2.セルサイズ12×4.5μm^2,駆動電圧振幅5Vの場合,高い転送効率で転送できる電子数は7×10^4以上である3.ブルーミングを完全に防止できる4.転送可能電子数は,低・暗電流化のために2相駆動CCDをホールピンニングモードで使用した場合より数倍大きいVOD (Vertical Overflow Drain:縦型オーバーフロードレイン)つきダイオードを上下反転したCCD(Charge Coupled Device)レジスタを提案し、これをフレーム転送方式CCDイメージセンサに応用した場合の特性を3次元デバイスシミュレータにより解析した。2.インタライン方式CCDセンサにおいては、電極を分離するSi-SiO_2界面が完全に空乏化している場合には大きなg-r電流が発生し、界面近傍に正孔が注入される場合には極めて小さなg-r電流しか発生しない。3.1. 2のg-r電流の大半は電極に流れ込むため暗電流は極めて小さくなる。
プラズマで生成された生体内フリーラジカルの実時間計測とプラズマ滅菌処理の研究

プラズマ滅菌では理想的には薬品を不要とし,電力供給だけで医療行為を行える.しかしながら放電プラズマにより生成する化学活性なイオン,ラジカル,光などによる放電プラズマの作用は未解明であった。モデル生物としてミドリカビ胞子の生体フリーラジカル観察を行い,殺菌中の実時間その場検出し,そのフリーラジカル信号の同定を行った.さらに,プラズマと相互作用により代謝される生体物質の質量分析法による測定を行い、放電プラズマのイオン,ラジカル,光というような個々の作用とそれらの相乗効果について解明した.新たなプラズマ源を創成し,プラズマ滅菌の装置の要求仕様を示した.細菌の殺滅を目的とした放電プラズマ滅菌は、薬品不要で電源のみで稼働するために、いつでもどこでも生物学・農学的な作用を得られているが、バイオプラズマ応用全般においてもいえることであるが、プラズマと生体との相互作用で未知な部分が多くある。また、完全な滅菌を得るためにも、その解析が強く求められているため、本研究では、プラズマ滅菌過程において、生体内フリーラジカルの挙動が多くの知見を与えるのではないかとの考えから、フリーラジカル解析を軸に、プラズマ生成するイオン・ラジカル・光といった個々の反応種の滅菌作用の発現機構を、プラズマ殺菌中その場で実時間に観察可能な方法によって詳細に解明することを進めている。本年度は、実時間その場電子スピン共鳴装置に生体解析のための装置を取り付けた。生体のフリーラジカル検出を行い、プラズマとの相互作用の解析しはじめた。放電プラズマで生成される酸化性化学種やプラズマ発光の過剰な照射は、生体試料の抗酸化機能を破壊する。生体試料としてカビ胞子の粉砕・超遠心分画により行って成分分析した.その結果、プラズマと相互作用により代謝される生体物質の観測しはじめることができた。今後、信号の同定作業に進める。殺菌の殺滅を目的とした放電プラズマ殺菌は、薬品不要で、電源のみで稼働するために、いつでもどこでも生物学・農学的な作用を得られているが、バイオプラズマ応用全般に於いてもいえることであるが、プラズマと生体の相互作用で未知な部分がおおくある。また、完全な殺菌をえるためにも、その解析がつよく求められているため、本研究では、プラズマ滅菌過程において、生体内フリーラジカルの挙動が多くの知見を与えるのではないかとの考えから、フリーラジカル解析を軸に、プラズマ生成するイオン・ラジカル・光といった個々の反応種の滅菌作用の発現機構を、プラズマ殺菌中そのばで実時間に観察可能な方法によって詳細に解明することを継続して進めている。本年度は、生体のフリーラジカル検出を行い、プラズマの相互作用の解析を進め、放電プラズマで生成される酸化性化学種が生体の代謝に与える影響を生体内の代謝物の網羅計測を行い、グルコースをエネルギー源としてピルビン酸、乳酸を経て、クエン酸回路でのシュウ酸、コハク酸、リンゴ酸などの代謝物量の亢進がプラズマ照射で見られる可能性を得ることができた。今後、代謝機構にプラズマが与える影響について解明を進める。本年度内計画通り、生体のフリーラジカル検出と代謝物の網羅解析を進めることができたため殺菌に放電プラズマが活用できれば、薬品不要で、電源のみで稼動できるために、いつでもどこでも生物学・農学的な作用を得ることが期待される。このようなバイオプラズマ全般において課題となっているプラズマと生体の相互作用の理解の乏しさである。完全な殺菌を得るためには、プラズマと生体の相互作用の解明が不可欠である。本研究では、プラズマ滅菌過程における生体内フリーラジカルの解析をはじめ、生体に係わる液体に発生する化学活性種の解析を進めてきた。プラズマで生成するイオン・ラジカル・光といった個々の反応種の滅菌作用の発現機構を、プラズマ殺菌中その場で実時間に観測可能な方法によって詳細に解明することを継続している。昨年度から引き続き、放電プラズマで生成される生体のフリーラジカル検出をおこない、活性酸化種の生成機構について解析を進めた。膜で囲まれる生体をさらに取り囲む液体中に発生する酸化窒素活性種との係わりについてに解明を進め、放電プラズマの生体作用の機構について解明してきた。本年度はメタボロミクス解析に注力し、生体内の代謝物のダイナミクスについて解析してきた。ラジカルの関わる反応経路モデルを立てて、プラズマと生体の相互作用の理論構築を導いた。モデル生物としてミドリカビ胞子の生体フリーラジカル観察を行い,殺菌中の実時間その場検出し,そのフリーラジカル信号の同定を行った.さらに,プラズマと相互作用により代謝される生体物質の質量分析法による測定を行い、放電プラズマのイオン,ラジカル,光というような個々の作用とそれらの相乗効果について解明した.新たなプラズマ源を創成し,プラズマ滅菌の装置の要求仕様を示した.本年度内計画通り、実時間その場電子スピン共鳴装置に生体解析のための装置を取り付け、生体のフリーラジカル検出ができるところまで進捗したため引き続き種々多様な調査対象に拡張してプラズマとの相互作用の解明を目指す。プラズマ省により発現する代謝経路とその機構を解明しつつあるが、継続して生体内フリーラジカルが生体物質に与える影響を分析し、その影響が生体反応に及ぶメカニズムを体系化する。28年度が最終年度であるため、記入しない。プラズマエレクトロニクス引き続き種々多様なモデル生物に調査対象を拡張してプラズマとの相互作用の解明を目指す。放電プラズマからイオン,ラジカル,光というような個々の反応種と作用やそれらの相乗効果について解析を進め、プラズマ照射により発現される代謝経路とその機構を解明していく。新たなプラズマ源の作成をはじめ、イオンのみやラジカルのみ、また光照射だけといった装置を構築し、完全滅菌を目指す。

プラズマと相互作用前後での生体内フリーラジカルを含む物質系の総括的に集合として捉えて解析していき、プラズマ作用を受けた分子集合の挙動を解明することにより、生体反応を体系化するため、構築している実験系ではプラズマからのイオン,ラジカル,光という個々の反応種の個別効果・相乗効果について質量分析によるメタボロミクス解析との対応関係で詳細に踏み込んだ機構解明を進める。生体用実時間その場解析の拡張装置の改造予定が順調に進んだため、代謝解析に重点をおくように来年度に持ち越して、まとめて解析を行うために繰り越した。28年度が最終年度であるため、記入しない。生体用実時間その場解析の生体材料向けに拡張した解析装置とするための改造を予定していたが、試験・設計段階で仕様が不十分であったため、来年度に持ち越して、まとめて拡張改造を行うために繰り越した。プラズマ照射したときに生じる代謝活性の解析を重点的に実施する予定をしている。生体用実時間その場解析の生体材料向けに拡張した解析装置とするための改造を予定している。
血中アミノ酸組成及びアミノ酸摂取量が糖代謝障害の進展に及ぼす影響に関する疫学研究

近年、糖尿病の予防におけるアミノ酸の効果に関心が高まっているものの、アミノ酸の組成が早期の糖代謝障害の進展にどのような影響を与えるかは明らかでない。そこで本研究では、職域前向きコホート研究の成績を用いて糖代謝障害の進展に関連するアミノ酸(血中アミノ酸および食事アミノ酸摂取量)を特定することを目的とする。本研究の成果は、糖代謝障害の形成におけるアミノ酸の寄与について病態生理学的機序の理解につながるほか、栄養改善を通じた糖尿病予防のための公衆衛生指針の基礎的な知見となり得る。
神経変性疾患の新規原因蛋白ｐ６２とユビキリン２の関連と治療的蛋白分解亢進

本研究は、筋萎縮性側索硬化症[ALS]の原因蛋白ubiquilin2やp62/SQSTM1に関する研究であり、ALS患者と対照者iPS細胞由来の神経細胞を用いた。免疫染色の結果、p62遺伝子変異のある患者細胞の細胞質内に、p62の凝集が認められた。このような細胞質内凝集はALS病理像に特徴的所見である。一方、遺伝子変異のないALS患者細胞には軽度のみ、対照細胞には認められなかった。凝集に、ubiquilin2や他のALS原因蛋白は共局在しなかった。iPS細胞由来神経細胞において、オートファジー促進剤や抗酸化剤の一部により、凝集の形成抑制が見られた。1.患者iPS細胞の確立と神経への分化誘導すでに、予備実験で一部患者由来iPS細胞を確立していたが、本研究では、種々の異なる原因で生じる孤発性のALSや認知症も対象としており、できるだけ多くの患者のiPS細胞を樹立し、数種のiPS細胞で確認された知見を他の患者で確認する作業が必要である。このため、引き続き患者由来の線維芽細胞をiPS細胞に誘導し、新たに2例のiPS細胞を確立した。ALS患者から確立したiPS細胞を神経幹細胞さらに神経細胞へ分化誘導を行った。患者細胞では、神経突起伸展が阻害されていることが想定されていたが、実際には、明らかな伸展阻害は見られなかった。しかし、細胞内に凝集体が形成されていることが観察された。2.iPSから神経誘導におけるubiquilin2, p62の発現様式まず、基礎的情報収集のため行ったubiquilin2やp62発現に関して確認したが、iPS細胞においても、これら蛋白やそのmRNAは発現していることが証明された。また、凝集体はALS患者細胞でのみ観察された。前年度までに患者および対照由来のiPS細胞を神経幹細胞さらに神経細胞へ分化誘導を行った。細胞内にALSの病理標本でみられるユビキチン陽性の凝集体などが形成されるかを免疫染色で検討した結果、p62の凝集が、ALS患者由来細胞のみにみられた。今年度は、さらに、凝集を他のALSに関連する蛋白に対する抗体で染色したが、残念ながら、p62と同様オートファジーとプロテアゾームに関連するALS原因蛋白Ubiquilin2は共局在していなかった。p62凝集をマーカーとして、オートファジーや酸化ストレスの改善薬により、凝集の形成抑制が可能かを検討した。その結果、オートファジーの促進薬である薬剤Xや抗酸化作用を有する薬剤Yを培養液に添加することで、p62の凝集は減少した。それらの薬剤の毒性については、少なくとも細胞の形態などへの影響は無いようであった。また、これまで予備実験で一部患者ではiPS細胞を確立していたが、本研究ではALSや認知症は種々の異なる原因で生じている孤発性疾患も対象としており、できるだけ多くの患者のiPS細胞を樹立し、数種のiPS細胞で確認された知見を他のiPS細胞で確認する作業が必要であると考えられた。このため、引き続き、皮膚切開を伴う処置・検査をうける患者を対象に皮膚の採取と線維芽細胞の樹立を試み、7例の樹立をおこなうことができた。現在iPS細胞を作製中である。本研究は筋萎縮性側索硬化症(ALS)の病態を、原因蛋白p62/SQSTM1やUbiquilin2に注目してiPS細胞を用いて解明、さらに、ALS病理像に出現するような蛋白凝集を減少させることを目的とした。これまでに患者および対照由来のiPS細胞を神経幹細胞さらに神経細胞へ分化誘導を行った。ユビキチン陽性の凝集体などが形成されるかを免疫染色で検討した結果、p62の凝集が、p62遺伝子変異陽性ALS患者由来細胞にみられた。一方孤発例では、凝集は見られるが少量であった。凝集を他のALS関連蛋白に対する抗体で染色したが、残念ながら、p62と同様オートファジーとプロテアゾームに関連するALS原因蛋白Ubiquilin2は共局在していなかった。また、最終年にはp62と関連するストレスマーカーであるNrf2やKeap1も検討したが凝集への共局在は見られなかった。一方、本年度行った、抗酸化作用のあるレチノイン酸には効果がなく、オートファジー促進作用のあるバルプロ酸では細胞形態の変化などを来し、凝集の評価が困難であった。本研究ではALSや認知症は種々の異なる原因で生じている孤発性疾患も対象としており、できるだけ多くの患者のiPS細胞を樹立し、数種のiPS細胞で確認された知見を他のiPSで確認する作業が必要であると考えられたため、引き続き、皮膚切開を伴う処置・検査をうける患者を対象に皮膚の採取と線維芽細胞の樹立を試み、7例の樹立をおこなうことができiPS作製中である。また、iPS細胞も新たに2例分(別のALS遺伝子陽性例を含む)を樹立でき、公的バンクへの供与が可能となった。

免疫染色の結果、p62遺伝子変異のある患者細胞の細胞質内に、p62の凝集が認められた。このような細胞質内凝集はALS病理像に特徴的所見である。一方、遺伝子変異のないALS患者細胞には軽度のみ、対照細胞には認められなかった。凝集に、ubiquilin2や他のALS原因蛋白は共局在しなかった。iPS細胞由来神経細胞において、オートファジー促進剤や抗酸化剤の一部により、凝集の形成抑制が見られた。患者iPS細胞の樹立から、神経細胞への誘導、さらに試験的な治療まで進んでいるので、概ね順調であると考えられる。神経内科様々なオートファジーの促進剤(amiodarone, perhexiline, rottlerin, niclosamide,valproate, minoxidil)などを用いて、神経突起伸展や細胞生存率への影響や凝集体の変化を検討する。また、飢餓(低栄養)という最も普遍的なオートファジーの賦活法も試す。反対に、プロテアソーム阻害剤(lactacystin, MG132)やオートファジーの阻害剤(chloroquine)で、促進効果の逆が生じるかを確認する。また、抗酸化剤がp62凝集抑制効果のあることを本研究で明らかにしたので、様々な抗酸化物質について凝集抑制効果が出現するか、あるいはその逆に酸化促進剤が凝集促進を行うかを検証し、オートファジー促進剤との併用によりその抑制効果が促進されるかも検討する。p62と同様に認知症とALSの原因蛋白であるVCPやこの蛋白およびp62自身が関与するNF-kB経路は酸化ストレスへの関与が指摘されているがそういったカスケード上の蛋白発現・局在について免疫染色を用いて観察する。新たなiPS細胞の確立も進んでおり、iPS細胞から神経への誘導、患者細胞の特徴も観察できたため。遺伝子導入によるubiquilin2あるいはp62の発現亢進・抑制で細胞の機能障害が改善されるかを観察する。最近、ALSと認知症に関係する遺伝子としてVCP遺伝子の重要性が指摘されているので、本研究でも、患者情報の蓄積、検体の入手、あるいは遺伝子・蛋白機能解析について研究する。また、プロテアソームの活性化剤であるIU1、あるいはオートファジー促進作用のあるラパマイシンなどを用いて、蛋白凝集への影響やubiquilin2・その他蓄積蛋白の発現(ウエスタンブロットや免疫染色)を検討する。反対に、プロテアソーム阻害剤やオートファジーの阻害剤で、促進効果の逆が生じるかを確認する。本研究におけるToll-like receptor 3-Trifシグナルの状態を調べ、シグナルが抑制されている場合にはmicrotubule assembly阻害作用を持つ薬剤などの効果も調べる。