hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
胎児期低栄養による成人病発症への幹細胞機能異常の関与

今回、デキサメタゾンおよびラパマイシンを妊娠ラット母体に投与することにより、胎盤機能を低下させ子宮内胎児発育遅延(IUGR)モデルを作成した。仔ラット成長後の骨髄細胞における遺伝子発現解析により、骨髄前駆細胞の維持や遊走に関与すると考えられているプロテアーゼ類およびその関連遺伝子が有意に変動していた。生活習慣病、特に心臓血管疾患では血管内皮機能の障害がその病態の一つと考えられているが、血管内皮を修復、維持する細胞源である骨髄細胞の機能が胎児期の低栄養により成長後も影響を受けていることが示された。胎児期の低栄養状態と生活習慣病発症に関連があることが明らかになっている。本研究では、胎児の器官形成期における低栄養が成体の組織幹細胞や前駆細胞に質的、量的障害を引き起こし、成人期におけるストレス等による障害時に十分な修復が出来ずに生活習慣病の発症の背景となるという仮説のもと検証を行なっている。本年度は胎児期低栄養の組織幹細胞に対する影響を検討するため、低体重出生児と正常体重出生児の臍帯血中血管内皮細胞(EPC)を用いアッセイをおこなった。EPC-CFUによるコロニーアッセイにおいて差は認められなかった。また、EPCの5代までの継代培養において老化細胞の指標であるβガラクトシダーゼ(SA-β-Gal)活性においても差は認められなかった。しかし、培養EPCの10日間TNFα(5ng/mL)持続暴露において低体重出生児臍帯血由来EPCにおいてβガラクトシダーゼ活性の増加が認められた。この結果は障害暴露による細胞老化誘導において胎児期の栄養状態が関与している可能性を示唆した。次年度はラットのIUGR(子宮内胎児発育遅延)モデルを使用し、生体幹細胞の質的、量的検討をおこなう予定である。本研究では、胎児の器官形成期における低栄養が成体の組織幹細胞や前駆細胞に質的、量的障害を引き起こし、成人期における心血管・腎臓等の障害時に十分な修復が出来ずに生活習慣病の発症の背景となるという仮説のもと検証を行なっている。本年度は胎児期低栄養と成体(成獣)組織幹細胞の質的、量的変化を検討するため、本研究室で飼育繁殖管理しているWisterラットによるIUGRモデルの検討をおこなった。従来より一般的に使用されている妊娠後期の子宮動脈結紮モデルは器官形成期の低栄養を反映しないと考え、初めに妊娠10日19日までの妊娠ラットに対する30%食餌制限によるIUGRモデルを検討した。食餌制限モデルにおいては出生仔の体重の減少は認められなかった。また、16週齢における骨髄EPCコロニーアッセイ、および骨髄細胞、腎臓組織における幹細胞マーカー(CD133、CD34)遺伝子発現、酸化ストレスアッセイにおいてコントロール群(非食餌制限群)との間に有意差が認められなかった。そのため、次に妊娠13日20日におけるデキサメタゾン200μg/kg/day持続投与によるIUGRモデルの検討を行った。従来の報告どおり、コントロール処置群と比較し出生体重の減少および16週齢における軽度の高血圧が認められた。このモデルは高血圧症を発症するため当該研究において有用なモデルが作成できたと考えられた。次年度は、このモデルラットを使用しEPC-CFUによるコロニーアッセイ、造血幹細胞コロニーアッセイ、骨髄細胞、腎臓組織におけるCD133、CD34、ネスチン等を指標とした前駆細胞の再検討、各組織における老化関連遺伝子の発現解析を予定している。今回我々は、ラット子宮内胎児発育遅延(IUGR)モデルに対する高食塩食負荷による骨髄における遺伝子発現の網羅的解析をおこなった。妊娠12日(母)ラットを2群に分け、浸透圧ポンプ(200μL/時)により生理食塩水、デキサメタゾン(200μg/kg/日)をそれぞれの群に1週間投与した。出生後4週目(1ヶ月齢)からそれぞれの群の仔ラットを2群に分け、正常食、8%NaCl食(メタボリック症候群誘導、内皮細胞傷害モデル)をそれぞれの群に1ヶ月間与え続けた。骨髄からトータルRNAを採取し、マイクロアレイ(Affymetrix GeneChip RatGene ST Array)による遺伝子発現の網羅的解析を行なった。結果:出生時体重生食投与群6.22±0.08グラム、デキサメタゾン投与群4.57±0.09グラム(平均±標準誤差)、仔血圧:1か月齢における両群の血圧には有意差は認められなかった。また、今回の検討ではデキサメタゾン投与群からの出生ラットの体重は、調査2ヶ月間を通じ、生理食塩水投与群からの出生ラットの体重と比較し有意に低く追いつくことはなかった(体重のcatchup認められなかった)。

遺伝子発現解析:デキサメタゾン投与群における遺伝子発現の顕著な特徴としてはcathepsin K、mast cell protease等の有意な発現上昇、hpocalin2の有意な発現減少および、高NaCl食負荷による前記増加遺伝子の発現減少および減少遺伝子の発現増加であった。骨髄における仔ラット遺伝子発現のプロファイルとして胎児期のデキサメタゾン暴露は成体骨髄からの幹細胞の易遊走傾向に遺伝子発現がプログラムされ、また、長期の高塩食負荷はこれをキャンセルすることが示唆された。今回の遺伝子発現解析は今後の低出生体重児のメタボリック症候群発症機序の解析に重要な示唆を与えたと考える。
非線形帯磁率による非可逆曲線の決定とその起源

高温超伝導体の混合状態におれる非可逆曲線の起源に関して研究を行った。磁束格子の隔解相転移・磁束グラスの隔解相転移・ピニング外しのクロスオーバーが提案されている。一方、実験的に見れば如何に非可逆曲線を決めるかにっいて問題が存在した。非可逆曲線の決定法として3次の非線形帯磁率の虚数部に表れる負けのピークを採用することを提案し、臨界状態モデルからの物理的意味付けを明確にした。平成4年度科研費で7次までの高調波の測定が出来るメックイン増幅機を購入、平成5年度は新たな5テラスの超伝導マグネット・デュアー、測定コイルの製作及びソフトウェアの開発をすすめ、非可逆曲線の磁場-温度の測定領域を広げた。ミュウヘン工科大学グループの協力によりスクリュウ型欠陥密度の異なる一連のYBCO蒸着薄膜の非可逆曲線の測定を行った。バーゼル大学での走査型トンネル顕微鏡による観察によりC軸方向に発達したスクリュウ型欠陥の密度を評価した。非可逆曲線に異常が現れる磁場がスクリュウ型欠陥の濃度とよく対応することがわかった。これはスクリュウ型欠陥が磁束系の振る舞いに有効な役割を果たすことを示す初めての明確な証拠である。次いで、スパッタイングで作成したかなり厚め(NTT通研、5000A)のC軸配向EuBco薄膜のC軸方向に230MeV金イオンを照射しカラム状の欠陥を導入し(原研東海と共同研究)、欠陥濃度を制御した。その結果欠陥密度の上昇とともに非可曲線が系統的に変化することを見いだした。さらにSQUIDによる磁気測定と比較し、非可逆曲線の決定にはその判定基準が重要であることを見いだした。
学校におけるアダプテッド・スポーツ教育の実施状況に関する調査研究

本年度の研究目的は,諸外国におけるアダプテッド・スポーツ教育の実態について,初等学校から大学まで調査を行ない,我が国の状況と比較検討することであった。対象とした国はドイツ・カナダ(大学におけるアダプテッド・スポーツ学教員養成課程および学校におけるアダプテッド・スポーツ教育実態)および韓国・台湾・インドネシア(小中学校におけるアダプテッドスポーツ教育の実態)であった。韓国では完全統合教育(インクルーシブ教育)の実現に向けた取り組みは,少しずつ広がっているものの,日本と同様に,地道な活動と制度の理解へ向けた普及活動を推し進めていく必要性があると考えられた。台湾では平成18年度に日本で行なったものと全く同じアンケート調査を体育教師に対して行なった。その結果,小中学校におけるアダプテッド・スポーツ教育はまだ十分ではなく,特にインクルーシブ教育が遅れていることがうかがわれた。ドイツでは教員養成にかかわる大学のアダプテッド体育指導者専門の養成コースについてはそれほど多くはなく、また大学の統合再編が進む中で、特殊教育教員の養成コースが削減される例なども見受けられるなど,アダプテッド・スポーツ関係の教員養成についても改革の影響が進んでいる様子が認められた。カナダでは障害のある子とない子をペアとして組ませ,インクルージョン教育を行なっていた。このアダプテッド・スポーツで培ったペアの関係は、他の授業でも効果的なものとなろう。またこのペアが体育以外のさまざまな授業に出ることにより他の教師に対してもペア・システムの有効性を示すことができると考えられた。アダプテッド・スポーツは各人に適応したスポーツのことであって,身体能力,身体障害,知的発達障害などにとらわれず,誰もが楽しむことができるスポーツと定義することができる。アダプテッド・スポーツを発展させるためには学校体育における障害者スポーツを中心とするアダプテッド・スポーツ教育が重要になってくる。本研究の目的は通常の小学校及び中学校において,低体力者,身体障害者,知的障害者などを対象としたアダプテッド・スポーツ実施状況についてアンケートを実施し,学校教育におけるアダプテッド・スポーツ教育の問題点を明らかにし,質の高いアダプテッド・スポーツ教育を行なうための提言を行なうことであった。日本全国を,北海道,東北,関東,東海,北陸・甲信越,関西,中国・四国及び九州の8地区に分け,それぞれの地域で調査を実施した。全体では小学校および中学校にそれぞれ2800校および1450校にアンケートを送付した。回収率は小学校および中学校でそれぞれ42.1%および45.2%であった。アンケート内容は障害内容,実施している授業内容(種目等),教員のアダプテッド・スポーツに関する授業歴(経験年数等),授業を行う上での問題点(施設,担当者等),アダプテッド・スポーツ実施に対する教育的意義,生徒の身体的特徴などであった。アダプテッド・スポーツ授業の実施形態は,地域によって多少の差はあるが小学校および中学校とも通常の学級で実施している場合が多かった。障害児の通常学級での授業については,健常児が障害を理解するのに有効であり,また障害児が他のこどもとの関係のとり方を学ぶのに有効であるという利点が指摘された。一方,少・中学校とも多くの教員が,障害者スポーツあるいはアダプテッド・スポーツに関する知識が不足していることを認めていた。今後,教員へのアダプテッド・スポーツに関する情報提供が必要である。本年度は,大学における教養教育課程および専門教育課程において,アダプテッド・スポーツに関する実習あるいは講義を開講しているかどうかを調査し,大学におけるアダプテッド・スポーツ教育の実態を明らかにすることを研究目的とした。調査方法は直接面接法,アンケートの郵送法,あるいは授業のシラバスからアダプテッド・スポーツ関連科目の実態を把握することとした。国公立大学の教養教育課程に従事している体育教員に対しては,障害のある学生のスポーツ実習科目をどのように実施しているかという質問を行なった。障害のある学生に対し個別に対応している(8.5%)および特別なクラスを設けて対応している(18.3%)という充実した指導体制がある一方で,実技にかえて見学およびレポート(15.9%),講義に振替える(2.4%),特別な対応をしない(7.3%)と,障害のある学生にとって体育実技科目を履修することが困難な状況にある大学も少なくなかった。一方,保健体育教員養成課程を有している大学において,アダプテッド・スポーツ教育に関する関連教科科目を開講している割合は,毎年開講,隔年開講,および教科の一部として開講を併せても35%にすぎなかった。また,短期大学の調査では,障害者スポーツ初級指導員を取得できる18の認定校を対象とした。これらの学校ではアダプテッド・スポーツ科目が充実しており,その成果はアダプテッド・スポーツを履修し習得しただけでなく,障害者を理解する上での教育効果が顕著であることが示された。大学教育におけるアダプテッド・スポーツ科目への対応は大学により大きな差が認められた。アダプテッド・スポーツ科目の開講をしていない大学では,対応できる教員がいないこと,教員自体の数が少なく個別の対応ができないことなどが,その主な理由であった。最終年度となる来年度は,アダプテッド・スポーツ教育が進んでいる諸外国の調査を通して,我が国におけるアダプテッド・スポーツ教育の問題点を明らかにしく予定である。

韓国では完全統合教育(インクルーシブ教育)の実現に向けた取り組みは,少しずつ広がっているものの,日本と同様に,地道な活動と制度の理解へ向けた普及活動を推し進めていく必要性があると考えられた。台湾では平成18年度に日本で行なったものと全く同じアンケート調査を体育教師に対して行なった。その結果,小中学校におけるアダプテッド・スポーツ教育はまだ十分ではなく,特にインクルーシブ教育が遅れていることがうかがわれた。ドイツでは教員養成にかかわる大学のアダプテッド体育指導者専門の養成コースについてはそれほど多くはなく、また大学の統合再編が進む中で、特殊教育教員の養成コースが削減される例なども見受けられるなど,アダプテッド・スポーツ関係の教員養成についても改革の影響が進んでいる様子が認められた。カナダでは障害のある子とない子をペアとして組ませ,インクルージョン教育を行なっていた。このアダプテッド・スポーツで培ったペアの関係は、他の授業でも効果的なものとなろう。またこのペアが体育以外のさまざまな授業に出ることにより他の教師に対してもペア・システムの有効性を示すことができると考えられた。
遷移金属化合物クラスターを包接したゼオライトの結晶構造及び磁気構造に関する研究

本研究ではゼオライト細孔内に遷移金属化合物クラスターを導入し、結晶構造や磁気構造について、X線・中性子構造解析及び高分解能電子顕微鏡法を用いて明らかにし、磁気的性質との関連を調べることを目的としている。本年度における成果は以下の三項目に要約される。1.粉末X線構造解析と磁化測定Niをイオン交換により導入したLTA型ゼオライト(Ni-LTA)は低温でスピングラス的振る舞いを示す。このNi-LTAの粉末X線構造解析を行い、細孔内のNi及び水分子の位置を明らかにした。その結果からNiの周囲には六個の酸素原子が近接して存在することがわかった。このことから、Niが細孔内において水溶液中に類似した六水和錯イオンを形成している可能性が高いことが明らかになった。このことはNi-LTAの光吸収スペクトルがNi(OH)_2水溶液のそれに極めて類似していることからも裏付けられた。また、FAU型ゼオライトについて同様な現象が現れることを見いだした。2.粉末中性子構造解析重水中でイオン交換処理を行ったNi-LTAについて、低温での磁気構造を解明することを目的として粉末中性子構造解析を行い細孔内イオンの位置を明らかにした。しかしながら細孔中の過剰の重水による散乱と考えられるバックグランドが非常に高く、低温での磁気散乱の寄与を検出するには至らなかった。試料作成法、測定方法などの改善を計画中である。3.高分解能電子顕微鏡観察スロースキャンCCDカメラを用いて、有機分子を導入したMFI型ゼオライトの電子回折パターン及び高分解能像を撮影し、電子回折強度のフーリエ変換により構造解析を行った。このことから、今後磁性クラスターを導入した系においても電子回折の定量評価による局所構造解析が可能であることが示された。
床の材料，構法ごとの諸性能と変形特性の関係の把握

日常の安全性や快適性の観点から床に要求される性能のうち、各種動作時に感じるかたさや足触り,転倒衝突時のかたさ,床衝撃音遮断性,キャスター・車椅子の走行性は、いずれも床の鉛直方向の変形に起因している点で共通している。これらの性能についてはそれぞれ妥当な評価方法が確立されており、建築物使用者や設計者が要求性能を満たす床を設計,選択する際に用いられている。一方、床の開発の際には、床の変形特性が各性能に影響するメカニズムの把握が有用であるが、これらは床の材料,構法により複雑に変化するため、開発者ごとに経験的な蓄積があるのみで、体系化されていない現状である。そこで本研究は、床の変形特性と各性能の関係を材料,構法ごとに定量的に検討し、よりよい床の開発に資する知見を体系的に提示することを目的として検討を行った。前年度は、床の材料,構法を直張り床に限定したうえで、住宅などの床に要求される各性能と床の変形特性の関係を定量的に検討し、変形特性が各性能に影響するメカニズムを明らかにした。具体的には、前述の諸性能について、既存の試験方法で得られる性能値と、簡便な方法で測定される変形特性の関係を検討し、どの程度の荷重領域におけるどの位置の変形が各性能に寄与しているかを明らかにした。すなわち、対象とする材料,構法を限定することにより、性能相互の関係を1つの物性を軸に体系的に整理できる可能性があることの一端を示した。今年度は、前年度に引き続き、直張り床ではなく、下地に組床やパネル床,乾式二重床を用いた床について同様の検討を行った。しかし、このような架構式床ではパネルの材質や剛性,根太や束のピッチなどで複雑に性状が異なるため、芳しい結果は得られなった。そこで、方針を変更し、建築物内の床に求められる新たな性能について検討することとした。申請時の計画では、今年度は対象とする床構法を組床,置床に変更して検討を進めていく予定であった。計画どおりに進行できなかった場合は、床の構法のみでなく、材料も限定するなどして分類を再構成し、検討を行うものとしていた。そこで、変形特性と諸性能の関係の検討は直張り床のみで完了とし、今年度は、床に求められる性能項目を新たに検討することとした。具体的には、高齢者施設などで介助動作を行う際の動作性や疲労の観点からみた床のかたさの評価方法について検討を行っている。今年度はまだ基礎的な検討までしか行えていないが、次年度はより詳細に検討を行っていく。介助動作時のかたさの評価方法については、これまで行ってきた研究方法と同様の検討で成果を得ることができると考えられる。ただし、介助動作は熟練したものが行う場合と初心者が行う場合では動作性状が大きく異なることが想定される。そこで、実際に介助を日常的に行っている熟練者複数名にヒヤリングおよび実際の動作を実施してもらい検討を行う。当該年度は、床の材料,構法を、現在住宅などで広く普及しており、かつ仕上げ材の変形特性が性能に直接的に反映される直張り床に限定したうえで、住宅などの床に要求される各性能と床の変形特性の関係を定量的に検討し、変形特性が各性能に影響するメカニズムを明らかにした。申請時の計画では、初年度にあたる当該年度に直貼り床を対象に検討を実施し、良好な結果が得られれば次年度には対象とする床構法を組床,置床に変更して検討を進めていく予定であった。当該年度に実際に実験,検討を進めた結果、直張り床を対象とした場合の諸性能の性能値と床の変形特性に明確な関係が得られることが明らかとなり、当該年度終了よりも早い段階でよい結果を得ることができた。そのため、当初の計画よりも早く、組床,置床を対象とした検討に進んでいる段階である。

日常の安全性や快適性の観点から床に要求される性能のうち、各種動作時に感じるかたさや足触り,転倒衝突時のかたさ,床衝撃音遮断性,キャスター・車椅子の走行性は、いずれも床の鉛直方向の変形に起因している点で共通している。これらの性能についてはそれぞれ妥当な評価方法が確立されており、建築物使用者や設計者が要求性能を満たす床を設計,選択する際に用いられている。一方、床の開発の際には、床の変形特性が各性能に影響するメカニズムの把握が有用であるが、これらは床の材料,構法により複雑に変化するため、開発者ごとに経験的な蓄積があるのみで、体系化されていない現状である。そこで本研究は、床の変形特性と各性能の関係を材料,構法ごとに定量的に検討し、よりよい床の開発に資する知見を体系的に提示することを目的として検討を行った。前年度は、床の材料,構法を直張り床に限定したうえで、住宅などの床に要求される各性能と床の変形特性の関係を定量的に検討し、変形特性が各性能に影響するメカニズムを明らかにした。具体的には、前述の諸性能について、既存の試験方法で得られる性能値と、簡便な方法で測定される変形特性の関係を検討し、どの程度の荷重領域におけるどの位置の変形が各性能に寄与しているかを明らかにした。すなわち、対象とする材料,構法を限定することにより、性能相互の関係を1つの物性を軸に体系的に整理できる可能性があることの一端を示した。今年度は、前年度に引き続き、直張り床ではなく、下地に組床やパネル床,乾式二重床を用いた床について同様の検討を行った。しかし、このような架構式床ではパネルの材質や剛性,根太や束のピッチなどで複雑に性状が異なるため、芳しい結果は得られなった。そこで、方針を変更し、建築物内の床に求められる新たな性能について検討することとした。申請時の計画では、今年度は対象とする床構法を組床,置床に変更して検討を進めていく予定であった。計画どおりに進行できなかった場合は、床の構法のみでなく、材料も限定するなどして分類を再構成し、検討を行うものとしていた。そこで、変形特性と諸性能の関係の検討は直張り床のみで完了とし、今年度は、床に求められる性能項目を新たに検討することとした。具体的には、高齢者施設などで介助動作を行う際の動作性や疲労の観点からみた床のかたさの評価方法について検討を行っている。今年度はまだ基礎的な検討までしか行えていないが、次年度はより詳細に検討を行っていく。当該年度の検討で、本研究の研究方法を体系化することができた。今後の検討についても、この研究方法を同様に実施することで問題なく研究を進めることが可能であると思われる。また、組床,置床を対象とした検討において、直張り床とは異なり床材料ごとに細分類する必要があることも推測されるが、研究方法自体に大きな変更はないため、計画通り推進可能と思われる。介助動作時のかたさの評価方法については、これまで行ってきた研究方法と同様の検討で成果を得ることができると考えられる。ただし、介助動作は熟練したものが行う場合と初心者が行う場合では動作性状が大きく異なることが想定される。そこで、実際に介助を日常的に行っている熟練者複数名にヒヤリングおよび実際の動作を実施してもらい検討を行う。
蝶類・シジミチョウ科のアリとの共生関係における系統進化学的研究

蝶類・シジミチョウ科の幼虫のアリとの共生関係の起源と発達過程を以下のように系統進化学的に解明した。1.問題点の解決(1)共生等の相互関係の把握全4亜科9族のうち,日本産を中心とした4亜科8族で構成される57属58種のシジミチョウ幼虫に関して,具体的な行動生態データを記録し,各種幼虫のアリとの関係について共存,相利共生,片利共生,寄生の段階分けを行なった。(2)好蟻性器官の機能と起源の解明幼虫が持つ代表的な3つの好蟻性器官を,走査電顕での形態学的研究および解剖学的研究により比較検討した。構造の相同性から1つは刺毛起源,2つは気門起源と考えられた。好蟻性器官とされる伸縮突起からの分泌物の有無を調べた。このうち1亜科の種からはアリの警報フェロモンに類似した揮発性物質,別の1亜科の種からは自然界ではほとんど生成されない機能不明な揮発性物質が検出された。残りの1亜科の種からは何も検出されなかったが,視覚的に外敵の攻撃を錯乱させる防御器官であることが明らかになった。(3)シジミチョウ科の系統関係の推定主に雌雄交尾器と幼虫の形態データによる系統解析とmtDNAのND5領域における分子データによる系統解析によって,整合性の高い系統関係を構築し,上位分類群の系統分類体系を確立した。2.アリとの関係の起源と発達過程の推定1の(1),(2)で明らかにした総合的な知見から導き出されたアリとの関係を,最節約復元により1の(3)で得られた系統体系を重ね合わせて,アリとの相互関係の進化を考察した。3.仮説の検証幼虫の食性からこれまで考えられたアリとの関係の発達における仮説の検証を行ない,次のような仮説が支持された。(1)葉食性からアリ関連物質の原料をより多く含む花蕾食性に転換したグループから好蟻性が出現した,(2)肉食性やアリの吐き戻し食性は,本科の系統枝において,より派生的なグループで独立に数回生じた,(3)アシナガシジミ亜科以外に見られるアリ幼虫捕食などの肉食性は相利共生を持つ祖先群から進化した,(4)アシナガシジミ亜科に見られる肉食性は地衣類食性から転換した。
新規転移促進因子コネキシン26と転移抑制因子プロテイン・フォスファターゼ2A

マウス・メラノーマ細胞株B16の亜株のうち、実験的転移能(静注後肺転移)と自然転移能(皮下注後肺転移)を有するBL6細胞と、実験的転移能のみを有するF10細胞との間でcDNAライブラリーのサブトラクションを行った。BL6細胞において高発現を示す遺伝子として、コネキシン26と、プロテイン・フォスファターゼ2A(PP2A)制御サブユニットB56γ変異型アイソフォームΔγ1を単離した。コネキシン26は表皮細胞、肝細胞のがん化過程においてはその発現が低下する。一方メラノサイト及びその良性・悪性腫瘍細胞においてコネキシン26の発現はまだ調べられていない。Δγ1はPP2AB56遺伝子におけるレトロトランスポゾン挿入がもたらす変異型アイソフォームで、B56γ1アイソフォームのN末の100アミノ酸が欠失している。PP2Aの阻害剤オカダ酸が発がん作用を持つことから、PP2Aは発がん抑制物質として期待される。実験結果:1)メラノーマ細胞はコネキシン26を介して血管内皮細胞とヘテロなギャップ結合を形成できる。2)F10及びBL6細胞においては、ギャップ結合形成能と自然転移能とはよく相関した。3)パキシリンとPP2Aとの接着斑における共局在を見つけた。4)PP2Aの細胞骨格再構成に対する抑制的な機能はパキシリンのリン酸化制御を介していた。5)Δγ1はPP2Aによるセリン脱リン酸化を抑制し、パキシリンの接着斑リクルートを亢進した。考察:1)自然転移能獲得、特に血管内侵入・血管外浸潤において、腫瘍細胞と血管内皮細胞との間のヘテロなギャップ結合形成が重要な役割を果たしている可能性が示された。2)Δγ1はPP2Aによるパキシリン機能制御を破壊し、細胞骨格再構成が迅速化した。発がん抑制におけるPP2Aの作用点の1つがパキシリンである可能性が示された。
マラリア伝搬阻止粘膜ワクチンの開発に関する研究

近年,粘膜を侵入門戸とする病原体に対しては,従来の注射接種型ワクチンよりも粘膜ワクチンの方が有効であることが報告されてきたが,代表者は,平成14年度から本年度までの研究期間中に,易接種型で非侵襲性の粘膜ワクチンの更なる汎用性を追及することを目的とし,粘膜感染症と無関係なマラリア原虫に対しても粘膜ワクチンが有効となりえるかを検討してきた.マラリアは,熱帯感染症として公衆衛生上極めて重要な節足動物媒介性の感染症であり,世界保健機構もその制圧に重点を置いた対策を進めてきたが,マラリア侵淫度の高い経済途上国で効果を発揮できる有効で安価なワクチンが未だ開発されていないことが対策の遅れの原因とされている.代表者は,本研究期間中に原虫のヒトから蚊への移行を阻止する伝搬阻止ワクチンの粘膜ワクチンとしての有効性を検討し,粘膜免疫法の高い有用性を示すことに成功した.即ち,マラリア伝搬阻止ワクチン抗原のマウスへの経鼻免疫は,注射接種以上の抗体価の誘導が可能であり,ネズミマラリア,ヒトマラリア(三日熱,熱帯熱)のいずれでも完全な防御免疫を賦与することに成功した.また,これまでの一連の実験から,1)組換えタンパクの直接の粘膜投与では免疫応答の誘導が極めて難しく,粘膜アジュバントが必須であること,2)コレラトキシンB鎖タンパク(CTB)などの粘膜キャリアー分子との融合化により効率よく免疫が可能であること,などが明らかとなった.以上の結果に基づき,CTB融合型ワクチン及びアジュバント分子作成を効率化できるヘテロ型CTB融合遺伝子の構築技術を提案し(特願2003-279156),この発現システムがマラリア以外の病原体由来抗原にも有効である可能性を示した.また,本年度は,コスト面で極めて有利といわれるDNAワクチンの実験を開始し,特に,新規性の高い粘膜投与可能なDNAアジュバントの開発に重点を置いた遺伝子構築の作業を行った.更に,経鼻投与よりも侵襲性の低い易摂取型ワクチンとして,経口投与型ワクチンの開発にも着手した.これら一連の研究業績は,将来的なマラリアワクチン開発のための基礎データとして重要であると考えている.酵母合成ネズミマラリア原虫(Plasmodium yoelii)伝搬阻止ワクチン抗原Pys25を強力な粘膜アジュバントであるコレラトキシン(CT)と混合し,PBSで希釈してマウスに3回(week 0,3,5)経鼻投与した.一回の投与にマウス1匹あたりワクチン抗原25μグラムとCT5μグラム投与した.その後血中の抗体価をELISA法により測定した.その結果,極めて高い抗原特異的血清IgGが誘導されていることが分かった.また,この抗体は,IgG1サブクラスのものでTh2型の免疫応答が有意に誘導されていることが分かった.次に,組換えPys25タンパク質とCTで経鼻免疫したマウスにP.Yoelii 17XLを感染させ,その後媒介蚊(Anopheles stephensi)に吸血させた.吸血した蚊を1週間飼育し,中腸内の原虫(オーシスト)数を測定した結果,全ての蚊で原虫の発育が完全に阻害されていた.さらに,このマウスの血清を非免疫のP.Yoelii 17XL感染させたマウスに移入し,移入前と移入後に蚊に吸血させ,前回同様,中腸内のオーシスト数を測定した.結果,受動免疫の場合と同様,原虫の完全な発育阻害が確認された.以上の結果から,ワクチン抗原の粘膜面(今回の場合は鼻腔内)への投与により,全身系の有効な免疫応答(特に血清IgG抗体)が誘導できることが示唆された.また,CTとの混合投与のみでの免疫が可能であったことから,粘膜アジュバント(今回の場合はCT)の重要性が示された.近年,粘膜ワクチンが従来の注射接種型ワクチンと比べ,粘膜侵入型病原体に対する感染防御ワクチンとして有効であることが示されている.したがって,幾つかの注射型ワクチンを粘膜投与型に改変しようという試みがあり,インフルエンザワクチンがその一例である.また,我々もブタ回虫に対する粘膜投与型感染防御ワクチンの有用性を示した.しかし,本研究では,粘膜ワクチンの更なる汎用性を追及することを目的とし,粘膜侵入型でない病原体に対する粘膜ワクチンの有用性を検討した.具体的には,熱帯・亜熱帯地域で公衆衛生上極めて重要な節足動物媒介性の感染症であるマラリアに対する新しいワクチン開発を視野に入れ,原虫のヒトから蚊への媒介を阻止する伝搬阻止ワクチンの粘膜ワクチンとしての有効性を検討した.これら一連の研究から粘膜面を進入門戸としない節足動物媒介性病原体に対しても粘膜免疫法が極めて有効であることを示した.即ち,マラリア伝搬阻止ワクチン抗原をマウスへ経鼻免疫することにより,ネズミマラリア,ヒトマラリア(三日熱,熱帯熱)のいずれでも完全な感染防御抗体の誘導が可能であることを示した.これらの経鼻免疫により誘導可能な免疫とその感染防御効果には幾つかの特色があることも分かった.まず,1)組換えタンパクの直接の経口投与では免疫応答の誘導が極めて難しいこと,2)注射接種より大量な投与量を必要とすること,3)アジュバントとの併用が不可欠であること,4)CTBなどの粘膜組織運搬体との融合化により効率よく免疫が可能であること,5)また,CTBとの融合により,高度精製の必要性が必ずしもないこと(ワクチン抗原選択的免疫の可能性),などである.以上の結果に基づき,粘膜投与型のアジュバント及びワクチン抗原の高効率発現が,経鼻免疫及び最終的には経口免疫法による感染防御ワクチン開発に重要な鍵を握ることが示唆された.

そして,CTB融合型ワクチン及びアジュバント分子作成を効率化できるヘテロ型CTB融合遺伝子の構築に成功した(特願2003-279156).現在,このシステムを利用して,粘膜投与型アジュバント及びワクチンの産生効率及び感染防御能の検討を行っている.また,CTB以外の分子を利用して,抗原提示細胞を標的とするアジュバント及びワクチン運搬分子の構築に関する実験を行っている。近年,粘膜を侵入門戸とする病原体に対しては,従来の注射接種型ワクチンよりも粘膜ワクチンの方が有効であることが報告されてきたが,代表者は,平成14年度から本年度までの研究期間中に,易接種型で非侵襲性の粘膜ワクチンの更なる汎用性を追及することを目的とし,粘膜感染症と無関係なマラリア原虫に対しても粘膜ワクチンが有効となりえるかを検討してきた.マラリアは,熱帯感染症として公衆衛生上極めて重要な節足動物媒介性の感染症であり,世界保健機構もその制圧に重点を置いた対策を進めてきたが,マラリア侵淫度の高い経済途上国で効果を発揮できる有効で安価なワクチンが未だ開発されていないことが対策の遅れの原因とされている.代表者は,本研究期間中に原虫のヒトから蚊への移行を阻止する伝搬阻止ワクチンの粘膜ワクチンとしての有効性を検討し,粘膜免疫法の高い有用性を示すことに成功した.即ち,マラリア伝搬阻止ワクチン抗原のマウスへの経鼻免疫は,注射接種以上の抗体価の誘導が可能であり,ネズミマラリア,ヒトマラリア(三日熱,熱帯熱)のいずれでも完全な防御免疫を賦与することに成功した.また,これまでの一連の実験から,1)組換えタンパクの直接の粘膜投与では免疫応答の誘導が極めて難しく,粘膜アジュバントが必須であること,2)コレラトキシンB鎖タンパク(CTB)などの粘膜キャリアー分子との融合化により効率よく免疫が可能であること,などが明らかとなった.以上の結果に基づき,CTB融合型ワクチン及びアジュバント分子作成を効率化できるヘテロ型CTB融合遺伝子の構築技術を提案し(特願2003-279156),この発現システムがマラリア以外の病原体由来抗原にも有効である可能性を示した.また,本年度は,コスト面で極めて有利といわれるDNAワクチンの実験を開始し,特に,新規性の高い粘膜投与可能なDNAアジュバントの開発に重点を置いた遺伝子構築の作業を行った.更に,経鼻投与よりも侵襲性の低い易摂取型ワクチンとして,経口投与型ワクチンの開発にも着手した.これら一連の研究業績は,将来的なマラリアワクチン開発のための基礎データとして重要であると考えている.
損傷や負荷に伴う深部筋腱の粘弾性変化を定量評価可能なMRエラストグラフィの開発

今年度の本研究の目的は1Open MRIを利用したmagnetic resonance elastography (MRE)システムの開発と2動物筋腱損傷モデルにおけるMREシステムの評価であったが、まずは深部筋である肩腱板筋に弾性波を効率よく発生させるための振動子を開発した。上腕骨大結節に付着し臨床上重要な腱板筋は棘上筋と棘下筋であるため、まずはこの2つの筋に対して2つの振動子を組み合わせて加振周波数を62.5 Hzで棘上筋、棘下筋の深部にまで弾性波を発生させ、弾性を計測する事が可能であった。また、静磁場強度が0.3 Tのオープン型MRIにより、弾性波を高い振幅対ノイズ比で画像化するためのパルスシーケンスを設計し、得られた弾性波画像から局所波長を抽出して適切な弾性算出法を用いることで、組織の弾性率を計測する事が可能となった。来年度はさらに、腱板筋は4つの筋で構成されているため4つ全ての筋に弾性波を発生させる振動子を開発し弾性計測が可能であるかの検討を行い、その後ボランティアの健常者を用いた研究へと進めていく予定である。2に関してはブタの肩関節6肩を用いて棘上筋腱損傷モデルを作製し、損傷前後にMREとすでに計測方法が確立されている超音波剪断波エラストグラフィ(SWE)を行い、損傷前後の棘上筋の硬さを計測した。MREの加振周波数は80Hzと62.5Hzでそれぞれ行った。80HzのMRE、62.5HzのMRE、SWE全てにおいて有意に損傷後は損傷前に比べ棘上筋の弾性率が低下していた。これは棘上筋の緊張が損傷後低下したことによって起こった事が推測され、その状態をMRE、SWE共に画像解析から定量する事が可能であった。今回の2の研究結果は2019年9月に開催される国際肩肘学会にて一般口演(開催地:ブエノスアイレス)で発表する事が予定されている。初年度の目的であったMRエラストグラフィシステムの開発とそれを用いた動物実験が予定どおり行なわれ、その結果も一部データ解析中ではあるものの、ほぼ仮説どおりの結果が得られたため順調に進行していると思われる。現在、上記2の動物実験のさらなるデータ解析と英語論文作成中であり、それを平成31年度中に論文掲載させることを第一の目的とする。さらに上記1のMRエラストグラフィシステムを用いた健常者での実験を予定通り平成31年度夏頃から開始する予定である。平成30年に購入予定であった高額機器であるQD肩用コイル(日立製作所)の購入(150万円)を現段階で必要かどうか検討している最中であり、差額が生じたと思われる。31年度の健常者の実験を開始し検討してから、再度それが必要かどうか決める予定である。
エリスロポエチン受容体系のリガンド親和力を支配する糖蛋白質

エリスロポエチン(EPO)は,赤血球産生を制御する最も重要な糖蛋白質である。EPOによるシグナル伝達は特異的なEPO受容体(EPO-R)を介して行われる。EPO-R遺伝子がクローン化された結果,EPO-Rはサイトカイン受容体スーパーファミリーに属することが明かとなった。一方赤血球系細胞上のEPO-Rには,高親和性部位(Kd=50pM)と低親和性部位(Kd=500pM)が存在する。EPO-Rに1ヶ所存在するN結合型糖鎖の有無が異なる親和力を示す原因であると考え,糖鎖結合部位を欠失させた変異型EPO-Rを作製し検討したが,糖鎖の存在と親和力とは無関係であった。しかし糖鎖合成阻害剤で野生型あるいは変異型EPO-Rを導入した細胞を処理すると,低親和性部位は消失し高親和性部位のみが存在するという事実を発見した。これはEPO-Rがクローン化された分子(α鎖)だけで形成されていると仮定すると,この現象を説明することはできない。すなわちこの現象は,EPO-Rには既知のα鎖と未知のサブユニット(β鎖)が存在し,β鎖の糖鎖がEPO-Rの親和力を支配することを示している。さらにEPOとEPO-Rを架橋剤で処理すると,EPOとα鎖の架橋ではなく,EPOとN結合型糖鎖を持つ未知タンパク質が架橋されることを見いだした。この結果はEPO-Rには,α鎖以外にもN結合型糖鎖を持つ未知タンパク質が存在することを示している。この未知タンパク質がβ鎖である可能性が高い。続いてEPO-Rα鎖が神経細胞にも発現していること,β鎖は赤血球系細胞と神経細胞では異なっていることを示す結果を得た。このことはEPO-Rが,β鎖の種類によりリガンドに対する親和力およびシグナル伝達の種類を変化させていることを示す。以上,EPO-Rの糖鎖が,リガンドに対する親和力およびシグナル形成に重大な役割を果たしていることを証明するために,β鎖の単離を試みている。
博物館収蔵資料活用と波及効果の研究

博物館収蔵資料のうち、実物である一次資料に対して、写真、図面などの二次資料が出版物などに使用されたものを三次資料と概念化し、地域アイデンティティ形成などへ寄与する状況を検討することを目的に、大衆消費文化の典型として商業出版物マンガの中に登場する考古資料を集成した。合わせて学校教育における社会科や芸術の教科書、歴史書や美術書などの商業出版物に使用された考古資料を集成した。結果、戦後に考古資料は歴史記述の標本として重視されるが、それに平行してあるいは戦前から原始美術として商業出版物に用いられていた。それらがマンガなどに描かれ、日本あるいは各地域のアイデンティティ形成などへ寄与した状況を把握した。博物館収蔵資料のうち、実物の一次資料と、複製、写真、図面などの二次資料に分類されることが一般的である。本研究では、歴史博物館における一次資料の派生物としての二次資料の多寡、あるいは二次資料の利用頻度として、学術刊行物以外の印刷刊行物その他の派生製作媒体を、博物館三次資料と概念化し、その利用件数を指標として、地域アイデンティティ形成への寄与度を測定する。そのための事例研究として、平成27年度は、博物館収蔵資料、主に考古資料が、大衆消費文化の典型として商業出版物マンガの中に登場する事例の集成を行った。合わせて、大衆消費文化に対比として、公的な出版物と位置付けられ得る学校教育における検定教科書に登場する、博物館収蔵資料、主に考古資料の事例の集成を行った。また、商業出版物のうち、学術書および関連書についてもあわせて事例の集成を進めた。これらの事例集成とともに、マンガや検定教科書に登場する考古資料の収蔵博物館の学芸員の一部に対して、使用申請や掲載実績の把握の有無を照会した。人文系、とりわけ歴史博物館収蔵の一次資料の多くは、標本として1点1点に固有の意義があり、展示等の手段で公開することで、それらの資料の有する意義をひろく周知できる。しかし、多くの場合に資料保存の観点から公開を制限せざるを得ず、資料公開の代替として出版物のような複製物の中で、二次資料の果たす役割は極めて大きい。これまでの調査では、マンガ等の大衆消費文化を構成する出版物に図像化された博物館収蔵資料は、検定教科書のみならず、学術書および関連の商業出版物に掲載れた二次資料を介しているらしいことが推定された。博物館収蔵資料について、その周知を図る媒体として商業出版部を三次資料と概念化して、その利用件数を指標として、地域アイデンティティ形成への寄与度を測定するため、資料集成を計画どおり進捗している。集成している資料から、具体的な寄与度の測定するために、それらをまとめるデータベースの設計を進める。そのための事例研究として、平成28年度は、前年度に引き続き、博物館収蔵資料、主に考古資料が大衆消費文化の典型として指標にあげた商業出版物マンガの中に登場する事例の集成を行った。これまでの調査では、マンガ等の大衆消費文化を構成する出版物に図像化された博物館収蔵資料は、博物館の展示を介してスケッチされたわけではなく、学校教育における検定教科書、学術書および関連の商業出版物に掲載れた二次資料を介していることがほぼ判明した。博物館収蔵資料について、その周知を図る媒体として商業出版部を三次資料と概念化して、その利用件数を指標として、地域アイデンティティ形成への寄与度を測定する。そのために、資料集成を計画どおり進捗している。集成している資料から、具体的な寄与度の測定するために、それらをまとめるデータベースの設計を進めた。最終年度、計画どおり、資料集成を進めながら、平成28年度に設計したデータベースについて、博物館収蔵の一次資料と二次資料と、その波及効果の指標となる三次資料と概念化した各種商業出版物の項目間の関連付けの調整を行い、博物館収蔵資料の活用と波及効果の測定に寄与するようにできると考える。博物館収蔵資料は、実物の一次資料と、複製、写真、図面などの二次資料に分類されることが一般的である。博物館における一次資料の派生物としての二次資料の多寡、あるいは二次資料の利用頻度として、学術刊行物以外の印刷刊行物その他の派生製作媒体を、博物館三次資料と概念化し、その利用件数を指標として、地域の社会的アイデンティティ形成への寄与度を測定する。そのための事例研究として、博物館収蔵資料、主に考古資料が大衆消費文化の典型として指標にあげた商業出版物マンガの中に登場する事例の集成を行った。

その対比として学校教育における検定教科書に登場する博物館収蔵資料、主に考古資料の事例の集成を前年度に続いて進めた。また商業出版物について関連書、特に美術書についても同様の集成を進めた。博物館収蔵の一次資料の多くは、標本として1点1点に固有の意義があり、展示等の手段で公開することで、それらの資料の有する意義をひろく周知されるが、資料保存の都合等で公開を制限せざるを得ず、その代替として出版物などで、二次資料の果たす役割は極めて大きい。マンガ等の大衆消費文化を構成する出版物に図像化された博物館収蔵資料は、博物館の展示を介して標本の実物をスケッチしたものはほとんどなく、美術書等の商業出版物に掲載れた二次資料を介していることをデータベースに整理した。現在、考古資料は戦後に日本史を記述する標本の役割を担っているが、それに平行するかたちで戦前から原始美術として商業出版物に取り上げられ、考古資料の周知化に寄与したことも関連して推測された。その波及効果として、美術作品として海外の博物館に収蔵されている考古資料がある。海外で出版された美術の商業出版物には、海外の博物館収蔵の日本出土の考古資料が掲載されており、それ自体の周知のみならず、日本への理解に寄与する波及効果が想定され、美術と関わる考古資料の追跡が必要である。博物館収蔵資料のうち、実物である一次資料に対して、写真、図面などの二次資料が出版物などに使用されたものを三次資料と概念化し、地域アイデンティティ形成などへ寄与する状況を検討することを目的に、大衆消費文化の典型として商業出版物マンガの中に登場する考古資料を集成した。合わせて学校教育における社会科や芸術の教科書、歴史書や美術書などの商業出版物に使用された考古資料を集成した。結果、戦後に考古資料は歴史記述の標本として重視されるが、それに平行してあるいは戦前から原始美術として商業出版物に用いられていた。それらがマンガなどに描かれ、日本あるいは各地域のアイデンティティ形成などへ寄与した状況を把握した。計画どおり、博物館収蔵資料、特に考古資料の商業出版物での利用状況調査を進める。特にこれまで、利用実績に加わっていないマンガ内で図像化された資料の集成に努める。合わせて出版物以外のあり方を把握する方策を検討する。合わせて出版物以外についても、データベースに登録しながら、博物館収蔵の一次資料と二次資料と、その波及効果の指標となる三次資料と概念化した各種商業出版物の項目間の関連付けの調整を行い、博物館収蔵資料の活用と波及効果の測定に寄与する。考古学平成27年度、研究代表者の所属する機関の他事業とともに調査を実施し、旅費、人件費・謝金、その他の科目で予定していた直接経費を平成28年度に繰り越した。平成28年度に、平成27年度から繰り越した直接経費を合算し、国内・海外調査の複数回実施にかかる旅費、集成した資料の整理にかかる人件費・謝金等、データベース設計にかかる委託経費として使用する予定。
中・高生の上肢・脚伸展パワーの発達、およびパワー発揮の際の速度要因の検討

前方への上肢伸展動作、および脚伸展動作でパワーを発揮する際の、力および速度要因を検討した。被検者は、健常な中学・高等学校男子生徒60名(年齢12歳17歳)、脚伸展パワー計測用に開発されたレッグパワー((株)竹井機器工業)を用い、6種類の上・下肢伸展速度(0.2m/秒1.2m/秒)で、速度ごとの上・下肢伸展パワーを測定した。各測定は、上肢伸展パワーでは、肩関節の最大伸展位および肘関節の最大屈曲位より上肢を最大努力で前方へ伸展させることで、また、脚伸展パワーでは、股関節および膝関節の最大屈曲位より下肢を最大努力で伸展させることで行った。測定の主旨を説明し、測定に慣れさせた後、15秒程度の休息をはさみながら、少なくとも45回本試行を繰り返させ、その最大値をその速度での上・下肢伸展パワーとした。得られた速度と上・下肢伸展パワーより、速度-上・下肢伸展パワー曲線を求め、上・下肢伸展パワーのピーク値、およびピーク値発揮の際の速度を2次回帰により算出し、ピーク値、およびピーク値発揮の際の速度を求めた。
消化管内視鏡を用いた生体内蛍光イメージングによる分子標的薬の治療効果予測

消化管腫瘍に対する抗がん剤である分子標的治療薬において、治療効果予測マーカーの探索が重要な課題である。今回、消化管内視鏡における画像強調観察法を用いた生体内蛍光イメージング法を開発し、消化管腫瘍の標的受容体を内視鏡下に可視化し、治療効果予測マーカーとしての有用性を検討することを目的に研究を実施した。臨床使用されている治療薬を目的抗体とし、理論上は内視鏡にて検出可能な蛍光物質を用いて、抗体を標識した。検出器では腫瘍細胞に作用する抗体を検出可できた。しかし、内視鏡では、視認性から特殊光以外に通常光も照射されており、研究期間内には、腫瘍細胞に作用した標識抗体のみを明確に検出するには至らなかった。消化管内視鏡における画像強調観察法を用いた生体内蛍光イメージング法を開発して、消化管腫瘍の増殖因子受容体を内視鏡下に可視化し、分子標的治療薬の治療効果予測マーカーとしての有用性を明らかにすることを目的として、実験を継続中である。臨床医療に汎用されている内視鏡システムとして、オリンパス社ならびに富士フィルムメディカル社製の内視鏡システムが当研究室では使用可能である。この2つの内視鏡に搭載されているシステムを用いて照射、検出できる波長を利用するため、405nmを励起波長とする蛍光標識物質を選択した。さらに、現在臨床医療にて、主に大腸癌治療における分子標的治療薬である抗上皮増殖因受容体(Epidermal Growth Factor Receptor:以下EGF-R)抗体である、セツキシマブを今回の研究にまず選択し、405nmを励起波長、420nmを蛍光波長として、標識を行った。EGF-R過剰発現細胞であるA431細胞株と標識抗体を反応させ、その検出感度を評価した。96wellプレートに培養したA431細胞株に対し、蛍光標識されたセツキシマブを50μg/mlの濃度で反応させ、plate readerにて、蛍光波長が検出できることを確認し、強度の測定、評価を行った。今後は、胃癌治療における分子標的薬である抗HER2抗体(トラスツズマブ)を、もう一つの抗体薬として使用予定としており、同様の蛍光標識を行い、in vitroでの検出を試みるべく準備中である。さらに、標識抗体を反応させた細胞株を実際に消化管内視鏡を用いて観察し、蛍光波長がCCDにて検出可能で、視認可能か評価を行うため、400420nmのレーザーが照射可能な富士フィルムメディカル社製の内視鏡システムの準備を整えている。臨床応用へ向け、必須の条件となる消化管内視鏡システムの技術的な仕組みと有効波長の検討に予期せず時間がかかり、蛍光標識物質の選別に時間がかかった。既存の内視鏡システムで照射可能な波長で、さらにシステム内のCCDにて検出が可能な蛍光波長を合わせて考慮が必要であった。そのため、抗体への蛍光物質標識実験の開始が遅れ、全体の進行が遅れた。検討の結果、励起波長405nm、蛍光波長420nmの蛍光標識物質で抗体を標識することで、実臨床医療で汎用されている内視鏡システムにて視認可能であると結論を得た。抗体への蛍光標識については、一般に市販されているキットにて問題なく実施可能であり、技術的な問題は発生しなかったため、予想通りの経過で進行することができた。しかし、一方で、検出感度をさらに改善するために、抗体溶媒から不要物質を除去する精製にさらなる行程が必要となっており、全体としては、遅れ気味である。臨床応用へ向けた内視鏡システムとして、我々が必要とする励起波長が照射可能な富士フィルム社製の内視鏡システムはすでに準備が完了しているため、本研究の要である蛍光標識された抗体薬の安定作成が実現できれば、残りの計画はほぼ予定通り進行できると考えている。現在感度のさらなる改善を行っているセツキシマブで安定作成ができれば、同じ手法を用いて、もう一つの使用抗体であるトラスツズマブへの標識も時間をかけずに行えるため、全体として予定通りに進行が可能と考える。消化管内視鏡における画像強調観察法を用いた生体内蛍光イメージング法を開発して、消化管腫瘍の増殖因子受容体を内視鏡下に可視化し、分子標的治療薬の治療効果予測マーカーとしての有用性を明らかにすることを目的として、本研究を実施した。さらに、現在臨床医療にて、主に大腸癌治療に対する分子標的治療薬である抗EGF-R抗体(セツキシマブ)を今回の研究に用いる抗体として選択し、405nmを励起波長、420nmを蛍光波長として、蛍光標識を行った。研究初年度には、目的抗体に蛍光標識を行う過程はほぼ終了し、EGF-R過剰発現細胞であるA431細胞と標識抗体を反応させ、Plate readerにて蛍光波長の検出を行うことに成功した。無標識の抗体と比して、2倍程度の感度での検出が可能であった。そこで、富士フィルムメディカル社製の内視鏡システムに搭載されている、400から420nmのレーザー光を照射可能なBlue Leaser Imaging機能を用いて、in vitro実験を施行した。Plate readerでの検出方法と同様に、A431細胞に対して、標識抗体反応群と、無標識抗体反応群とに分け、完全な暗室内にて、Blue Leaser Imagingにて検出を試みた。

結果、実臨床で用いる内視鏡では、消化管内腔構造の視認性向上のため、特定のレーザー光以外に、通常光が射出されており、本研究期間内には、2群間に明確なコントラストを得ることは不可能であった。通常光の遮断を行うことができれば、蛍光標識を検出することも可能と考えられた。消化管腫瘍に対する抗がん剤である分子標的治療薬において、治療効果予測マーカーの探索が重要な課題である。今回、消化管内視鏡における画像強調観察法を用いた生体内蛍光イメージング法を開発し、消化管腫瘍の標的受容体を内視鏡下に可視化し、治療効果予測マーカーとしての有用性を検討することを目的に研究を実施した。臨床使用されている治療薬を目的抗体とし、理論上は内視鏡にて検出可能な蛍光物質を用いて、抗体を標識した。検出器では腫瘍細胞に作用する抗体を検出可できた。しかし、内視鏡では、視認性から特殊光以外に通常光も照射されており、研究期間内には、腫瘍細胞に作用した標識抗体のみを明確に検出するには至らなかった。昨年度中に、目的抗体の一つであるセツキシマブに蛍光標識を行う過程はほぼ終了しており、現在蛍光標識された抗体の検出感度について、in vitroにて検討中である。標的受容体であるEGF-Rを過剰発現した癌細胞株と反応させることにより、標識抗体の検出感度をさらに高めるための標識工程の検討をさらに進める。セツキシマブで十分な検討を行った後、別の目的抗体である抗HER2抗体、トラスツズマブにおいても同様の手法にて蛍光標識を行い、早期に蛍光標識した2つの抗体の安定作成を目指す。次に、標的受容体が過剰発現した癌細胞株に標識抗体を反応させ、現在準備している内視鏡システムによる検出を行い、その感度を検討する。in vitroにて十分な視認能が確認できれば、その上で、in vivo実験として、免疫抑制ヌードマウス皮下に作成した標的受容体が発現している癌細胞によるXenograftを用いて、上記検討を行った標識抗体を投与して、生体内での投与量ならびに投与からイメージングまでの至適時間などの条件設定を行う。また、同時に、Xenograftモデルを用いて、非治療群をコントロールとし、経時的に腫瘍内標的受容体蛍光イメージングを行い、標的受容体発現量の変化を比較検討し、治療効果予測マーカーとしての有用性を評価する。in vivo実験で十分に検出、検討できれば、ヒト腫瘍内標的受容体に対したヒト臨床試験を予定している。すべての試薬、検査機器はすでに臨床応用がなされているものではあるが、標識抗体については、ヒト使用前に十分な安全確認を行う必要があり、その点には十分に時間をかける必要があると考える。28年度が最終年度であるため、記入しない。消化管悪性腫瘍28年度が最終年度であるため、記入しない。