hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
磁界共鳴による人工衛星間無線エネルギー送電の実現

軌道上での有人・無人の宇宙活動は将来活発になると予測される一方で,その活動を支えるエネルギーに関しては,現状で宇宙船単体ごとの自給自足状態であり,集中的な発電衛星システムからのエネルギー供給や衛星間の余剰電力のやり取りが行われれば、活動範囲の広がりが期待できる。本研究では,無線電力伝送を利用して、宇宙空間における宇宙機や人工衛星間での無線送電技術の基礎研究を行う。本研究では衛星搭載可能な電力伝送システムについて提案する。宇宙空間におけるワイヤレスでの給電を実現するために,本研究では,磁界共鳴方式を採用し相対的な位置の変化に応じたインピーダンス整合や単一送電装置で複数負荷がある場合を想定した送電試験を行った.これまでに単一での相対位置変化に対するインピーダンス整合技術を確立し,コイル径程度の高さまで衛星に見立てたドローンを浮上させることに成功している。また負荷に対して一定電力で送電を行う技術を単一または複数台への受電を想定して開発を行っている。人工衛星の将来的な理工学ミッションの幅を広げるために,人工衛星単体で利用できる電力密度を高める必要がある。フォーメーション飛行等でより長距離での給電には電波を用いた無線電力伝送が適している.電波方式では電磁波を受信し直流に変換するために,アンテナと整流回路を併せ持つレクテナと呼ばれる素子が必要になる.また使用する周波数が高いほど回路の小型化が可能であること,ビームの拡散が小さいことなどの理由から,レクテナを小型化することができるため人工衛星への給電を想定した際に大きなメリットを有する.既存研究でも同周波数帯での研究はいくつか行われているが,レクテナの出力電力が低いもののみであり,人工衛星に十分な電力を送電した例はない.これは高い周波数帯では大電力を発振できる発振器が少ないことが主な理由である.宇宙空間における長距離人工衛星間給電を想定して、ミリ波型電力伝送システムの人工衛星への搭載を視野に,発信源としてジャイロトロンを利用した実験を筑波大学プラズマ研究センタ及び福井大学遠赤外線研究センタと共同で行った。高効率での送電を行うため,送電側にカセグレンアンテナを用いた実験を行った.出力電力,送電効率を測定し,理論値と比較することで評価を行った.送電効率は理論値とほぼ等しい値であり,ジャイロトロンを使用した実験が理論通りに行えたことが示された.より高効率での送電を行う場合は性能の良いアンテナを用いる必要がある.軌道上での有人・無人の宇宙活動は将来活発になると予測される一方で,その活動を支えるエネルギーに関しては,現状で宇宙船単体ごとの自給自足状態であり,集中的な発電衛星システムからのエネルギー供給や衛星間の余剰電力のやり取りが行われれば、活動範囲の広がりが期待できる。複数台に一定電力で給電するための受電回路の設計や要素となる技術の開発を行い,今後は反射電力の低減や整流回路の変換効率を上げてシステム全体としてのエネルギー伝送効率を上げることが課題であり、それぞれの要素技術課題を克服することが今後の方策である。航空宇宙工学当初の予定より電子部品が安く調達できたため消耗品(主に電子部品)購入に利用する
生理活性物質生産のためのバイオコンバージョンプロセスの開発

1.セファロスボリン誘導体セファロスポリン系抗生物質の工業的生産のための出発原料である7-アミノセファロスポリン酸(7-ACA)についてはすでにその生産プロセスが確立されているが、本研究では、その3位の側鎖について、選択的脱アシル化、脱アシル体のメトキシメチル化及び副産物として生成するラクトン体の水酸化と脱アシル化について検討を進めた。特に、新たに見いだした3位アセトキシメチル基の水解酵素によるデアセチル7-ACAのアセチル化について詳細に検討し、水解酵素生産のための培養条件の設定並びに7-ACA生産のための反応条件の設定に関する成果を上げることができた。2.トラネキサム酸合成プロセス止血剤としてその用途が急速に拡大されつつあるトラネキサム酸の工業的生産プロセスについて、1、4-ジシアノシクロヘキサンを原料とする新たに開発した酵素的プロセスについて更に検討を進め、ニトリルヒドラターゼ及びアミダーゼの性質に関する新たな知見を加えることにより、トランス-4-シアノシクロヘキサン-1-カルボン酸の生産効率を高めることができた。3.ビタミンK_3石油留分に含まれる2-メチルナフタレンを出発原料として、飼料添加用合成ビタミンKとして利用されるメナジオン(ビタミンK_3)を生産するプロセスを開発することを目的に、2-メチルナフタレン酸化能を持つ菌株のさらなるスクリーニングを行い、中間体である2-メチル-1-ナフトールを選択的に生産する培養条件、反応条件を設定することができた。更に、2-メチル-1-ナフトールがメナジオンに酸化される現象も明らかにすることができた。(1)セファロスポリン誘導体7-アミノセファロスポリン酸はすでにセファロスポリン誘導体合成の出発原料として生産プロセスが確立されているが、本研究では、その3位の側鎖について、選択的脱アシル化、脱アシル体のメトキシメチル化及び副産物として生成するラクトン体の水解と脱アシル化について検討を行った。それぞれの反応を触媒する酵素活性を広く微生物に求めスクリーニクグを行い、脱アシル化酵素及びラクトン水解酵素活性を示す微生物を得ることに成功した。それぞれの反応の特性を明らかにし、セファロスポリン誘導体合成プロセスを開発する計画である。(2)トラネキサム酸合成プロセストラネキサム酸は止血剤として汎用されつつある化学合成品であるが、本研究では、ジニトリル化合物の選択的水和、脱アミノより幾何異性をもつトラネキサム酸合成中間体を生産するプロセスについて検討した。1,4ージシアノシクロヘキサンを原料として、コリネバクテリウム属細菌のニトリルヒドラターゼを利用して立体選択的にトランスー4ーシアノシクロヘキサンー1ーアミドを、さらに、アミダーゼの作用により、トランスー4ーシアノミクロヘキサンー1ーカルボン酸に変換した。本物質は、化学的に容易にトラネキサム酸に尊くことができる。培養条件,反応条件を最適化することにより、40%濃度の基質から99.4%の収率で変換するプロセスを確立した。(3)ビタミンK_3飼料添加用合成ビタミンKとして需要が増大しているビタミンK_3を石油留分に含まれる2ーメチルナフタレンから生産するプロセスを開発するために、変換活性を微生物に求めスクリーニングを行い、2ーメチルー1ーナフトールを経由して変換する能力をもつ微生物を分離することに成功し、変換条件について検討している。
オンライン学習教材の共有環境の構築による教育改善の研究

教員は,教育のほか,研究,論文執筆,地域・国際貢献及び校務等の業務もあるので,従来の方法では対処不可能な状態になってきた.教育や校務の情報化(ICT活用)は,業務の軽減と効率化に繋がり,教育の質の改善が期待される.近年,大学教育において「単位の実質化」が重要視されてきている.単位の実質化の実現は, ICTを十分に活用した教育(eラーニング)を用いなければ困難と思われる.そこで本研究では,大学間で教材共有化を実現することにより, FD/ SDを目的として利用する教員を増やし,全学的な教育改善や卒業生の質の保証につながる,より高い学習効果の得られるeラーニングの実践を試みた.佐賀大学の2つのキャンパス(本庄,鍋島)間にLMS(学習管理システム)を稼動させ,さらに「大学コンソーシアム佐賀」に所属する大学をあわせた6つのキャンパス間で, LMSを利用してeラーニング教材の共有化の実証実験を行った.LMSにはオープンソースのMoodleを利用した. Moodleは全国の多くの大学で利用されており,本研究で得られた成果をいずれ全国の大学で活かすことができる.eラーニング教材は,佐賀大学eラーニングスタジオで開発した.教材は,中学レベル・高校レベルの教材も制作した.リメディアル教育や初年次教育等で長期的に使用することを目的として一度に多量のコンテンツを制作することを試みた.さらに,「大学コンソーシアム佐賀」における大学間連携の環境を使って, eラーニングを活性化させることを試みた.質の高い教材を共有化すれば,これまでにeラーニングが実施できなかった大学においても,対面授業にeラーニングを併用することができる. eラーニング教材を対面講義等の補習・補完教育に用いれば,より高い教育改善が得られる. LMSの学習履歴等を整理してデータ化すれば,学習カルテ(eポートフォリオ)の基礎データとすることもできる.このことはFD効果をもたらし,全学的な教育改善や大学卒業時の学生の質の保証を実現することに繋がると期待される教員は,教育のほか,研究,論文執筆,地域・国際貢献及び校務等の業務もあるので,従来の方法では対処不可能な状態になってきた.教育や校務の情報化(ICT活用)は,業務の軽減と効率化に繋がり,教育の質の改善が期待される.近年,大学教育において「単位の実質化」が重要視されてきている.単位の実質化の実現は, ICTを十分に活用した教育(eラーニング)を用いなければ困難と思われる.そこで本研究では,大学間で教材共有化を実現することにより, FD/ SDを目的として利用する教員を増やし,全学的な教育改善や卒業生の質の保証につながる,より高い学習効果の得られるeラーニングの実践を試みた.佐賀大学の2つのキャンパス(本庄,鍋島)間にLMS(学習管理システム)を稼動させ,さらに「大学コンソーシアム佐賀」に所属する大学をあわせた6つのキャンパス間で, LMSを利用してeラーニング教材の共有化の実証実験を行った.LMSにはオープンソースのMoodleを利用した. Moodleは全国の多くの大学で利用されており,本研究で得られた成果をいずれ全国の大学で活かすことができる.eラーニング教材は,佐賀大学eラーニングスタジオで開発した.教材は,中学レベル・高校レベルの教材も制作した.リメディアル教育や初年次教育等で長期的に使用することを目的として一度に多量のコンテンツを制作することを試みた.さらに,「大学コンソーシアム佐賀」における大学間連携の環境を使って, eラーニングを活性化させることを試みた.質の高い教材を共有化すれば,これまでにeラーニングが実施できなかった大学においても,対面授業にeラーニングを併用することができる. eラーニング教材を対面講義等の補習・補完教育に用いれば,より高い教育改善が得られる. LMSの学習履歴等を整理してデータ化すれば,学習カルテ(eポートフォリオ)の基礎データとすることもできる.このことはFD効果をもたらし,全学的な教育改善や大学卒業時の学生の質の保証を実現することに繋がると期待される複数の大学間を結び、eラーニング教材の共有を図るシステムを開発する。具体的なモデルとして、学内に数台のMoodleサーバを稼動させる。それらのサーバ間で、eラーニング教材の共有を実現できるシステムの開発と実証実験を行う。仮想教室となるLMS(学習管理システム)として、オープンソースのMoodleを利用する。Moodleは、全国の多くの大学で利用されており、本研究で得られた成果を全国の大学で活かすことができる。eラーニングは未だ発展途上にあり、各大学の教材は大学の環境に合わせて開発されているのが現状で、共有化を図りたくても簡単にはできない。そこで、教材を共有するために、教材の部品化およびその構成の標準化をおこなっておくべきである。評価システムを構築して、学習効果の高い教材及び講義の標準化を進める。これにより、より高い学習効果や改善効果の得られるeラーニング教材へと進化させることが可能である。さらに、eラーニング教材の共有化や標準化を実現することで、FD/SDを目的として利用する教員が増え、全学的な教育改善や大学卒業時の学生の質の保証を実現する。佐賀大学の2つのキャンパス(本庄、鍋島)間にLMS(学習管理システム)を稼動させ、さらに大学コンソーシアム佐賀に所属する大学をあわせて、6つのキャンパス間で、LMSを利用してeラーニング教材の共有を図るためのシステムを構築した。LMPはオープンソースのMoodleを利用した。Moodleは、全国の多くの大学で利用されており、本研究で得られた成果をいずれ全国の大学で活かすことができる。

eラーニングは未だ発展途上にあり、各大学の教材は大学の環境に合わせて開発されているのが現状で、共有化を図りたくても簡単にはできなかった。佐賀大学が制作していたeラーニング教材を、標準化された規格に基づいた教材への変換を行い、大学コンソーシアム佐賀での共有実験に提供した。さらに、中学レベル・高校レベルの教材も制作し、共有して利用できるようにした。大学コンソーシアム佐賀を繋ぐ大学間で、教材利用の実証実験を行った。質の高い教材を共有化すれば、これまでにeラーニングが実施できなかった大学においても、対面授業にeラーニングを併用することができる。eラーニング教材を対面講義等の補間学習として用いれば、より高い学習効果や教育改善が得られる。LMSの学習履歴等を収集・整理してデータ化すれば、学習カルテ(eポートフォリオ)の基礎データとすることができる。このことはFD効果をもたらし、全学的な教育改善や大学卒業時の学生の質の保証を実現することに繋がると期待される。教員は,教育のほか,研究,論文執筆,地域・国際貢献及び校務等の業務もあるので,従来の方法では対処不可能な状態になってきた.教育や校務の情報化(ICT活用)は,業務の軽減と効率化に繋がり,教育の質の改善が期待される.近年,大学教育において「単位の実質化」が重要視されてきている.単位の実質化の実現は,ICTを十分に活用した教育(eラーニング)を用いなければ困難と思われる.そこで本研究では,大学間で教材共有化を実現することにより,FD/SDを目的として利用する教員を増やし,全学的な教育改善や卒業生の質の保証につながる,より高い学習効果の得られるeラーニングの実践を試みた.佐賀大学の2つのキャンパス(本庄,鍋島)間にLMS(学習管理システム)を稼動させ,さらに「大学コンソーシアム佐賀」に所属する大学をあわせた6つのキャンパス間で,LMSを利用してeラーニング教材の共有化の実証実験を行った.LMSにはオープンソースのMoodleを利用した.Moodleは全国の多くの大学で利用されており,本研究で得られた成果をいずれ全国の大学で活かすことができる.eラーニング教材は,佐賀大学eラーニングスタジオで開発した.教材は,中学レベル・高校レベルの教材も制作した.リメディアル教育や初年次教育等で長期的に使用することを目的として一度に多量のコンテンツを制作することを試みた.さらに,「大学コンソーシアム佐賀」における大学間連携の環境を使って,eラーニングを活性化させることを試みた.質の高い教材を共有化すれば,これまでにeラーニングが実施できなかった大学においても,対面授業にeラーニングを併用することができる.eラーニング教材を対面講義等の補習・補完教育に用いれば,より高い教育改善が得られる.LMSの学習履歴等を整理してデータ化すれば,学習カルテ(eポートフォリオ)の基礎データとすることもできる.このことはFD効果をもたらし,全学的な教育改善や大学卒業時の学生の質の保証を実現することに繋がると期待される.
中国語のモダリティにおける接続詞・談話標識への転成：構文化と言語類型論の観点から

モダリティの文法化に関する従来の研究では、典型的なモーダル的意味(例:日本語の「かもしれない」が表す認識的可能性の意味)をめぐる諸変化の方向性やそれが物語る言語間の普遍性と多様性といった重要な問題が追究されてきた。しかし、典型的なモーダル的意味から逸脱したほかの文法機能(例:譲歩・条件などの節連結機能)、いわゆるポストモーダル機能への拡張については体系的な分析が遅れている。本研究は、中国語のモダリティにおける接続詞・談話標識への転成に焦点をあて、モダリティにおける典型的なモーダル領域から複文(節連結)・談話の領域への機能拡張を動機づける要因を明らかにすることを目的とする。
光スイッチング型ＲＥＳＯＬＦＴ超解像蛍光顕微鏡のための蛍光スイッチング分子の開発

光スイッチング型RESOLFT超解像蛍光イメージングのための最適な蛍光スイッチング分子を開発するために、本研究では、優れた光反応性と高い繰り返し耐久性を有するジアリールエテンに、(1)可視光に対する光応答性を付与し、(2)水溶液環境下においても高効率な蛍光スイッチングを示す蛍光スイッチングシステムの開発を目的とした。本研究において、可視光に対して光反応性を示す分子を開発するための一般的な分子設計指針を明らかとすることができた。また、ナノ粒子化することにより、水溶液中での安定な蛍光スイッチングを達成できるだけでなく、高効率な非線形蛍光スイッチングシステムを構築できることを明らかとした。本研究では、光スイッチング型RESOLFT顕微鏡のパフォーマンスを最大限に引き出すことが可能な蛍光スイッチング分子の開発と、それを用いた一分子サイズの空間分解能を有する究極的な超解像蛍光イメージングの実現を目的としている。その目的のために本年度は、水溶液中においても安定な光反応を示すスイッチング分子の開発に取り組んだ。様々な検討を行った結果、水溶性の蛍光色素であるローダミンに、光異性化に伴いトランス体とシス体の間で可逆的に分子構造を変化させるアゾベンゼン分子を、アミノ酸の一種であるリジン基をスペーサーとして結合させた分子を合成した。合成した分子は酸性条件下において、アゾベンゼンがトランス体の状態ではローダミン色素が非蛍光性の形をとっているのに対し、紫外光照射に伴いシス体へと変化するとローダミン色素の蛍光性状態に対応する強い吸収バンドが現れ、それに伴い強い蛍光が観測されるようになることが見出された。各異性体のpHに対する応答性をそれぞれ調べた結果、各異性体のpKaの値が有意に異なり、その違いにより可逆的な蛍光スイッチングが達成できていることが明らかとなった。一般的に蛍光スイッチングのメカニズムとして分子内エネルギー移動や分子内電子移動がよく用いられているが、それとは異なり、光異性化反応に伴う可逆的な酸解離定数の変化も水溶性の蛍光スイッチング分子を設計する上での蛍光スイッチング機構の一つとして利用できることを本年度の研究から明らかとすることができた。本研究では近年著しい発展を遂げている超解像蛍光イメージングの分野において特に注目されている『光スイッチング型RESOLFT顕微鏡』に要求される特性をすべて満足する新しい蛍光スイッチング分子の開発を目指している。平成25年度の研究では、より安定な蛍光スイッチングシステムを確立するために、ナノ粒子状態において優れた蛍光特性と高い耐久性を併せ持つ分子の設計・合成および機能の評価を行った。要求される条件を全て満足し得る分子として、ナノ粒子などの凝集状態においても高い蛍光特性を示すベンゾチアジアゾール色素とスイッチングユニットであるジアリールエテン分子を非共役なメチレン鎖でつないだ蛍光性のジアリールエテン誘導体を開発した。合成した分子は紫外光ー可視光照射に伴い、溶液中において可逆的なフォトクロミズムを示した。また、開環体の状態で強い蛍光が観測され、閉環体の生成に伴い線形的にその蛍光が消光することが認められた。続いて、この分子のナノ粒子を再沈殿法により作成し、ナノ粒子状態におけるフォトクロミック特性および蛍光特性を調べた。その結果、紫外光ー可視光照射に伴い溶液中と同様に可逆的なフォトクロミズムと開環体で溶液の時と同程度の強い蛍光性を示し、光閉環反応に伴い蛍光強度が減少することが認められた。さらに溶液状態の時とは異なり、その蛍光消光は線形的には起こらず、わずか数%の閉環体が生成しただけで完全に蛍光が消光する非線形的な蛍光消光現象が認められた。得られた結果は、一つのナノ粒子内のわずか数個の分子が反応するだけでナノ粒子全体の蛍光をスイッチできることを意味しており、非常に高効率な蛍光スイッチングシステムであると期待される。さらに必要とする照射光量を大幅に減らすことができるため、耐久性の向上も期待される。以上のことから、本研究目的に対して極めて有力な分子であると期待している。本研究では、H26年度のノーベル化学賞の受賞にも見られるように、近年著しい発展を遂げている超解像蛍光イメージングの分野において特に注目されている『光スイッチング型RESOLFT顕微鏡』に要求される特性をすべて満足する新しい蛍光スイッチングシステムの開発を目指している。平成26年度の研究では、顕微鏡下での効率のよい光スイッチングを達成するために、その蛍光スイッチングが光学部品を透過しにくい紫外光ではなく可視光のみで可逆的なスイッチングが可能な新しい蛍光スイッチング分子の開発を試みた。試行錯誤の結果、ジアリールエテンの反応点炭素に共役系が繋がる形で共役色素を導入し、ジアリールエテンと色素間のLUMOレベルと分子配向を適切に調整することで、可視光により可逆的な光閉環ー光開環反応を示す可視光応答性のジアリールエテンを開発することに成功した。開発した分子は両異性化反応ともに高い光反応転換率(>90%)を有しており、その分子設計指針は分子軌道計算を用いた理論解析により矛盾なく説明できた。本研究で明らかとなった分子設計に基づく事で、より長波長側の光で可逆的な蛍光スイッチングが可能な分子を設計することも可能であり、超解像蛍光顕微鏡に適したスイッチング分子を開発することができた。本研究では、平成26年度のノーベル化学賞の受賞に見られるように、近年著しい発展を遂げている超解像蛍光イメージングの分野において特に注目されている『光スイッチング型RESOLFT顕微鏡』に要求される特性を満足する新しい蛍光スイッチング分子を開発することを目的としている。

平成27年度の研究では、フォトクロミズムに伴う分子内エネルギー移動効率の光制御により、光可逆的に蛍光強度を変化させる蛍光スイッチング分子をナノ粒子化することで、僅か数%程度の光反応転換率で系全体の蛍光強度が完全にON/OFFスイッチする超高効率な蛍光スイッチングシステムを見出すことに成功した(Angew. Chem. Int. Ed., 2016, 55, 3662-3666:“Hot Paper"および“inside back cover"に選出)。開発した蛍光性フォトクロミックナノ粒子は、単一のナノ粒子でも顕著な非線形蛍光スイッチング挙動を示すことが認められ、系中の約2 %の分子が光反応すればひとつの粒子全体の蛍光が完全にON/OFFスイッチングすることが明らかとなった。実際に、『光スイッチング型RESOLFT顕微鏡』の応用の際に必要となる顕微鏡下での蛍光スイッチング特性を単一ナノ粒子のレベルで評価した結果、数百回の蛍光スイッチングを繰り返した後でも十分に蛍光強度が保持されることが認められた。このことは、蛍光のスイッチングに僅かな分子の光反応しか必要としないため、高効率な非線形蛍光スイッチング挙動が繰り返し耐久性の向上に大きく寄与していることを示唆している。これらの蛍光スイッチング特性は、目的とする『光スイッチング型RESOLFT顕微鏡』のための蛍光スイッチング分子として極めて有用であるものと期待される。光スイッチング型RESOLFT超解像蛍光イメージングのための最適な蛍光スイッチング分子を開発するために、本研究では、優れた光反応性と高い繰り返し耐久性を有するジアリールエテンに、(1)可視光に対する光応答性を付与し、(2)水溶液環境下においても高効率な蛍光スイッチングを示す蛍光スイッチングシステムの開発を目的とした。本研究において、可視光に対して光反応性を示す分子を開発するための一般的な分子設計指針を明らかとすることができた。また、ナノ粒子化することにより、水溶液中での安定な蛍光スイッチングを達成できるだけでなく、高効率な非線形蛍光スイッチングシステムを構築できることを明らかとした。本研究課題はH26年度中に完了する予定であったが、研究者自身の研究機関の異動が決まり、一定期間、研究を一時的に停止せざる得なかった。そのため、予定していた研究期間をH27年度まで延長せざる得ない状況となってしまったため、『やや遅れている』と判断した。しかしながら、研究内容自体は目的に向けて着実に前進しているため、H27年度で完了できるものと考えている。27年度が最終年度であるため、記入しない。光化学今後の研究では、これまでに明らかとしてきた非線形的な蛍光消光を示す蛍光性フォトクロミックナノ粒子に、H26年度に明らかとした可視光のみで可逆的なスイッチングが可能な分子設計指針を応用し、可視光のみで可逆的かつ効率よい蛍光スイッチングが可能な新しい蛍光性フォトクロミックナノ粒子の作成を試みる。得られた蛍光性フォトクロミックナノ粒子を用いた、蛍光顕微鏡下における単一粒子レベルでの蛍光スイッチング挙動および繰り返し耐久性の評価を行う。
プロポフォールの胎盤透過性に対するタンパク結合、P-Glycoproteinの影響

1.母体側におけるタンパク結合の影響:今までの研究によりプロポフォール(P)の胎盤透過性は胎児側のタンパク結合に大きく影響されるがわかった。そこで、Pの胎盤透過性は母体側潅流液中のアルブミン濃度にどのように影響されるかについて検討した。Pの胎盤透過性は母体側から胎児側への胎盤透過クリアランス(CL)により評価した。CLは母体側動脈中濃度(MA)、胎児側静脈中濃度(UV)、胎児側流量(Q_f)を用いて算出した(CL=UV×Q_f/MA)。胎児側還流液中のアルブミン濃度を44g/Lに維持し、母体側還流液中のアルブミン濃度を22,44g/Lと変えた条件下でPの胎盤透過性について調べた。その結果、アルブミン濃度22g/LにおけるPの胎盤透過クリアランスがアルブミン濃度44g/LにおけるCLの3倍程度の値となり、Pの胎盤透過性が母体側のタンパク結合にも大きく影響されることが明らかとなった。胎児側のタンパク結合がPの胎盤透過性を促進したのに対し、母体側のタンパク結合がその透過性を抑制する興味深い知見が得られた。妊産婦の血漿中のアルブミン濃度が大きく変動することが知られていることから、臨床におけるPの胎児への移行性は個体間変動が大きいと予測される。2.胎児側ならびに母体側の血流量の影響プロポフォールが速やかに胎盤を通過することは明らかとなったため、その胎盤透過性が胎児血流量ならびに母体の子宮血流量に影響されることが考えられる。帝王切開などの産科麻酔において母体・胎児の循環動態が変動することは多い。そこで、母体側の流量を15mL/minに維持した条件下で、胎児側の流量を0.5,1.0,2.0,3.0,4.0mL/minに変動させ、Pの胎盤透過性がどのように変動するかについて検討した。その結果、Pの胎盤透過クリアランスが胎児側の流量に依存して上昇し、元気な胎児ほどPの移行量が大きいことが示された。一方、興味深いことに胎児側のP濃度が胎児側の流量に全く影響されなかったことより、この増加したPの胎児移行が臨床で最も一般的に測定されるF/M比には反映されないことがった。従って、F/M比による胎盤透過性の評価に注意が必要であると考える。1.ヒト胎盤潅流系の確立:帝切時の娩出胎盤をただちに母体側と胎児側をM199組織培養液を用いて同時に潅流した。母体動・静脈および胎児側動・静脈より潅流液を採取し、グルコース、ラクテートおよび絨毛ホルモンHCGの濃度をそれぞれ測定した。胎盤のviabilityが維持されていることがこれらのマーカーにより証明された。2.プロポフォールの胎盤透過性に対するタンパク結合の影響:母体側潅流液中のアルブミン濃度を4.4mg/mLに維持し、胎児側潅流液中のアルブミン濃度を4.4,11,22,33,44mg/mLと変えた条件下で、プロポフォール(P)の胎盤透過について検討した。母体側潅流液中にPとアンチピリン(A)を添加し、母体側の動・静脈および胎児側静脈潅流液中のPとAの濃度はHPLCにて測定した。母体側から胎児側への胎盤透過クリアランス(CL)は母体側動脈中濃度(MA)、胎児側静脈中濃度(UV)、胎児側流量(Qr)を用いて算出した(CL=UVxQr/MA)。さらに、母体側潅流液中および種々のアルブミン濃度を含有する胎児側潅流液中でのPのタンパク非結合率を限外濾過法を用いて測定した。Pのタンパク非結合率が潅流液中のアルブミン濃度が増加するにつれて、著しく低下したことが明かとなった。AのCLが胎児側潅流液中のアルブミン濃度にまったく影響されなかったのに対し、PのCLは胎児側潅流液中のアルブミン濃度が増加するに連れて高くなり、AのCLを上回る結果となった。以上の結果より、Pのタンパク結合はアルブミン濃度に影響されることがわかった。さらに、その透過性は速やかであり、潅流液中のアルブミン濃度に大きく依存することが明かとなった。

妊産婦の血漿中のアルブミン濃度が大きく変動することが知られていることから、臨床におけるPの胎児への移行性は個体間変動が大きいと予測される。2.胎児側ならびに母体側の血流量の影響プロポフォールが速やかに胎盤を通過することは明らかとなったため、その胎盤透過性が胎児血流量ならびに母体の子宮血流量に影響されることが考えられる。帝王切開などの産科麻酔において母体・胎児の循環動態が変動することは多い。そこで、母体側の流量を15mL/minに維持した条件下で、胎児側の流量を0.5,1.0,2.0,3.0,4.0mL/minに変動させ、Pの胎盤透過性がどのように変動するかについて検討した。その結果、Pの胎盤透過クリアランスが胎児側の流量に依存して上昇し、元気な胎児ほどPの移行量が大きいことが示された。一方、興味深いことに胎児側のP濃度が胎児側の流量に全く影響されなかったことより、この増加したPの胎児移行が臨床で最も一般的に測定されるF/M比には反映されないことがった。従って、F/M比による胎盤透過性の評価に注意が必要であると考える。
リン脂質分解を介した内因性コリン産生経路の全容解明

本年度は以下の進展があった。(1)iPLA2δおよびiPLA2θに基質となるリゾホスファチジルコリンを供給する上流のホスホリパーゼA2分子種と、代謝産物のグリセロホスホコリンをコリンとグリセロール3-リン酸に加水分解する下流のグリセロホスホジエステルホスホジエステラーゼを同定し、それぞれの欠損マウスの解析を開始した。前者の欠損マウスはiPLA2θ欠損マウスと同様に肝臓のコリン・メチオニン代謝が乱れており、白色脂肪組織の喪失や背骨の彎曲、血糖値の低下などが見られ、後者の欠損マウスは胎生致死であった。(2)iPLA2δおよびiPLA2θのfloxマウスを組織的Creリコンビナーゼ発現マウスと交配し、肝臓特異的および神経特異的欠損マウスを作製した。さらに、iPLA2δとiPLA2θの両方を肝臓特異的に欠損させたマウスも作製した。(3)LC/MSを用いた水溶性低分子の網羅的解析系を確立し、全身性および組織特異的iPLA2θ欠損マウスと、メチオニン・コリン欠乏食を与えたマウスの比較を、主に肝臓を用いて行った。(4)メチル基を重水素標識したホスファチジルコリンを細胞に取り込ませ、標識化合物由来の各代謝物の変化を経時的に質量分析により測定することで、リン脂質由来のコリンの代謝フラックスを評価可能な系を構築し、株化細胞と初代培養細胞での条件検討を行った。(5)質量分析イメージングにより、脳切片におけるコリン含有代謝物の脳内分布を可視化し、グリセロホスホコリンが脳内で特徴的な分布を示すことを見出した。予定通り、必要な遺伝子改変マウスを作製して解析を進めたが、下流の代謝を担う酵素の全身性欠損マウスが胎生致死であったため、この遺伝子に関してはfloxマウスの導入に切り替えることとした。今後は以下の点に特に重点的に取り組む。(1)肝臓以外でのリン脂質分解を介した内因性コリン産生経路の役割を解析する。(2)同位体標識した化合物を活用して、代謝フラックス解析を行う。(3)各酵素の活性調節機構を明らかにする。(4)遺伝子改変マウスの神経変性とコリン代謝に相関があるか検討する。次世代シークエンスおよび導入する遺伝子改変マウスの費用計上が次年度となったため。
概日リズムの中枢である視交叉上核の位置決定と機能獲得のしくみ

バクテリアから植物、動物、地球上のほぼ全ての生物は、約24時間周期の体内時計を持っている。ほ乳類では、この概日リズムを作り出す生物時計の中枢は視交叉上核で、その機能はよくわかっている。しかしながら、視交叉上核の発生機構はほとんどわかっていない。本研究において、発生期の視交叉上核にホメオボックス型転写因子のLhx1、視交叉上核になる神経幹細胞にホメオボックス型転写因子Dbx1が発現していることを明らかにした。さらに、Dbx1ノックアウトマウスの解析より、Dbx1は視交叉上核のニューロンの形成に重要であることが明らかとなった。概日リズムの中枢である視交叉上核の発生機構を明らかにすることを目的とし、以下のことを明らかにした。1.視交叉上核を構成するニューロンを産生する神経幹細胞が位置する場所、2.Dbx1が視交叉上核ニューロンを産生する神経幹細胞に発現していること、3.Dbx1が視交叉上核の形成に関わっている事。本年は、Dbx1の役割を明らかにするためにノックアウトマウスの解析、Dbx1の強制発現実験を行った。視交叉上核のニューロンはマウスの胎生12日目から15日目に産生されることがわかっており、ホメオボックス型転写因子Dbx1は、間脳の最も腹側に位置する神経幹細胞において、この時期に一過的に発現している。前年度に、視交叉上核のニューロンの一部は少なくとも、Dbx1を発現する領域の神経幹細胞から産生されることを明らかにしている。Dbx1ノックアウトマウスの解析結果より、Dbx1陽性でみる視交叉上核の大きさが約10%減少しており、Rorα陽性のニューロンの数自体も減少していることが明らかとなった。一方、視交叉上核の一部のニューロンに発現しているホメオボックス型転写因子Lhx1は、若干ではあるが増えていることを示唆された。このことから、Dbx1は視交叉上核のRorα陽性ニューロンの運命を決定することに関わっているのかもしれない。Dbx1は運命決定に関わっているのかさらに検討するために、Dbx1を発生期の視交叉上核幹細胞に強制発現させ、解析を継続している。本年度は、1.視交叉上核を構成するニューロンを産生する神経幹細胞が位置する場所、2.Dbx1が視交叉上核ニューロンを産生する神経幹細胞に発現していること、を明らかにし、3.Dbx1ノックアウトマウスにおける視交叉上核の形成について解析を行った。Dbx1の遺伝子座にLacZを挿入したマウスのヘテロにおいて、Dbx1を発現したLacZ陽性細胞が胎生15日目にはLhx1陽性の視交叉上核になる領域に移動していた。このことから、Dbx1陽性の神経幹細胞は視交叉上核のニューロンを産生すること、視交叉上核のニューロンの一部は少なくとも、Dbx1を発現する領域の神経幹細胞から産生されることがわかった。次に、視交叉上核形成におけるDbx1の役割を調べるために、Dbx1ノックアウトマウスの解析を行った。視交叉上核が形成され、時計因子の発現が始まる頃の胎生18日目で解析を行った。その結果、視交叉上核のニューロンのうちRorα陽性のニューロンが少し減少していることを示唆するデータを得た。別のニューロン種は、大きな変化はなくむし増加している可能性を示唆するデータを得ている。Dbx1ノックアウトマウスの解析は標本数が充分でないので、今後、標本数を増やして検討していく。おおむね順調に進展しているが、申請書に元々書いていた因子についての解析が現時点では充分に行えていない。これは、解析実験の一部にトラブルが生じ、その解決に時間をとられたためである。その実験が遅れていた分、別の実験を並行して行った。トラブルに関してはほぼ解決したので、今後早急にその実験に取り組む。共同研究先においてDbx1ノックアウトマウス胚を充分数収集することができなかったため、今後、標本数を増やして検討していく。また、解析実験のトラブルのために実験が遅れていた以下の実験についても早急に行う。

Dbx1の強制発現、Lhx1やRorαの機能阻害と強制発現をエレクトロポーレション法にて行い、視交叉上核の形成のメカニズムについて明らかにしていく予定である。平成24年度分の繰り越し分に関しては、実験に使用する妊娠マウスに約50万円、解析実験の消耗品に約18万円使用する予定である。
動脈壁と周囲脂肪組織における慢性炎症の可視化と病態解明

慢性炎症の起点となるインフラマソームの活性化をCaspase1活性をでFRETを用いて評価する系の確立を試みたが困難を極めた。また他のグループから、当初の計画では低強度の慢性炎症を可視化することが不可能であることが報告された。そこで、慢性炎症の機序を明らかにすることにした。肥大化によって変性した脂肪細胞から遊離したDNA断片が病原体センサーを活性化することで、無菌的慢性炎症の契機となるという仮説を、遺伝子改変マウスやオリゴヌクレオチドを用いた実験で証明した。変性脂肪細胞から遊離するDNA断片が、TLR9を介してマクロファージを活性化することで脂肪組織の慢性炎症を引き起こすことが明らかとなった。この血管壁と血管周囲脂肪組織における慢性炎症の起点となるインフラマソームの活性化を可視化する手段の開発を開始した。インフラマソームが活性化すると、Caspase1 (ICE, Interleukin-1β変換酵素)が活性化する。このCaspase1活性をFRET(fluorescence energy transfer)現象を用いて可視化することを図った。青色蛍光タンパクCFPと黄色蛍光タンパクYFPをICE認識配列であるY E V D G Wというアミノ酸配列を含んだリンカーによって結合したFRETコンストラクトを作成し、その感度、特異度を培養細胞を用いて確認した。Caspase1によって認識されるYEVDGWをCFP(青色蛍光タンパク)とYFP(黄色蛍光タンパク)間に挟んだFRETタンパクを発現するコンストラクトをpcDNA3発現ベクターに組み込んだ。蛍光タンパクとして、CFPΔC11とcp173Venusの組み合わせがFRET効果が最大であった。YEVDGW配列を一個ならびに、二個、三個含む組み換え型タンパク質をCasepase1で一時間処理すると、YEVDGW配列を二個ならびに三個含むコンストラクトにおいて、発光スペクトラムが変化し、FRET効果を反映して、蛍光が黄色から青色に変化することを確認した。次に、YEVDGW配列を三個含むタンパクを発現するプラスミドSCAT1.43をRAW264.7細胞にNucleofectionを用いてトランスフェクションした。そののち、stable lineを6株樹立した。1 ng/mlのLPS2時間刺激後に、1mMのATPを負荷した。425nmのレーザー光で励起した時の放出光を解析したところ、わずか30分でCFP/YFPの上昇が認められ、Caspase1の活性化を可視化することに成功した。慢性炎症の起点となるインフラマソームの活性化をCaspase1活性で評価する系の確立を目指している。青色蛍光タンパクCFPと黄色蛍光タンパクYFPをCaspase1の認識配列であるYEVDGWというアミノ酸配列を含んだリンカーによって結合したFRETコンストラクトを作成し、大腸菌に発現させた遺伝子組み換えタンパクを用いて、in vitroの実験を繰り返した。YEVDGW配列を三個含むコンストラクトが感度が最も良かったが、特異度に問題があった。そこで、リンカーをYVADGPに変更したところ、Caspase1のみで切断されることを確認した。次に、このコンストラクトSCATva 1.43を発現するStable cell lineをRAW264.7,THP-1, J774.1で得た。PMA,LPS, Nigericinで刺激するとIL-1βは培地中に大量に分泌されたが、コンストラクトタンパクは切断されていないことが判明した。そこで、方針を一大転換して、proIL-1βをセンサーにして、切断をうけると蛍光物質cp173Venusが核に移行するようなコンストラクトを作製した。しかし、このコントラストを強制発現させるだけで、無刺激下においても細胞毒性があることが判明した。そのため、pro-IL1βの生理活性を欠損させて、インフラマソーム結合能だけあるコンストラクトを各種作製したところ、N27-N116までに毒性部位があることが判明した。そこで、この毒性部位を欠如したコンストラクトを作製したが、毒性部分にCaspase1によって切断される部位があるため、このコンストラクトではセンサーに使用できないことが判明した。そこで、doxycyclineにより発現を誘導することが可能なpTetOne Vectorにコンストラクトをサブクローニングして、RAW264.7細胞にトランスフェクションして、stable cell lineを樹立している。慢性炎症の起点となるインフラマソームの活性化をCaspase1活性でFRETを用いて評価する系の確立を目指しているが、平成26年度実績報告書で報告したとおり研究遂行中に諸々の問題点が明らかとなり解決策を模索した。また、同時期に、同じ系を用いて、他のグループから、細胞レベルでCaspase-1が活性化すると細胞にはすぐさま細胞死が生じるという論文が出版された(Liu et al. Cell Rep. 2014;8:974-982.)。当初、計画していた低強度の慢性炎症をin vivoで可視化することが困難なことが明らかとなった。そこで、方向転換して、肥満によって脂肪組織と血管壁で無菌的慢性炎症が惹起されるメカニズムの解明に取り組むことにした。ヒトとマウスの両方で、肥満個体は、痩せた個体に比べて、脂肪細胞の変性に関連した血液中の遊離DNA断片の濃度が多く、血液中の遊離DNA断片の量がインスリン抵抗性の指標と相関した。また、変性脂肪細胞から遊離するDNA断片が、本来は細菌由来のDNA断片を認識するToll様受容体9(TLR9)によって認識され、マクロファージを活性化した。

実際に、肥満マウスの脂肪組織内では、DNA断片を貪食しているマクロファージを免疫電子顕微鏡で捉えることができた。そして、TLR9欠損マウスでは、野生型マウスと同様の肥満を誘導しても、脂肪組織における炎症が軽度であり、インスリン感受性が保たれていた。骨髄移植により作出した骨髄由来細胞にのみTLR9を発現するマウスでは、脂肪組織の炎症とインスリン抵抗性が高度であった。また、マウスにTLR9の阻害オリゴヌクレオチドを投与することで、肥満に伴う脂肪組織の炎症とインスリン抵抗性の発症を抑えることができた。これらの結果から、肥満によって変性した脂肪細胞から遊離するDNA断片が、TLR9を介してマクロファージを活性化することで脂肪組織の慢性炎症とインスリン抵抗性を引き起こすことが明らかとなった。慢性炎症の起点となるインフラマソームの活性化をCaspase1活性をでFRETを用いて評価する系の確立を試みたが困難を極めた。また他のグループから、当初の計画では低強度の慢性炎症を可視化することが不可能であることが報告された。そこで、慢性炎症の機序を明らかにすることにした。肥大化によって変性した脂肪細胞から遊離したDNA断片が病原体センサーを活性化することで、無菌的慢性炎症の契機となるという仮説を、遺伝子改変マウスやオリゴヌクレオチドを用いた実験で証明した。変性脂肪細胞から遊離するDNA断片が、TLR9を介してマクロファージを活性化することで脂肪組織の慢性炎症を引き起こすことが明らかとなった。順調に計画は進行して、DNAコンストラクトの作製に成功し、その特異性を確認することができた。コンストラクトの作製ならびに細胞にトランスフェクションしての感度、特異度に関する検討は順調にいった。各種予備実験ののち、十分な特異度を得るため、proIL-1βをセンサーにすることにしたが、このコントラストは強制発現させるだけで、無刺激下においても細胞毒性があることが判明した。そのため、pro-IL1βの生理活性を欠損させて、インフラマソーム結合能だけあるコンストラクトを各種作製したところ、N27-N116までに毒性部位があることが判明した。切断部位はN27とN116であるため、毒性を欠如したコンストラクトでは、pro-IL1βをセンサーに使用できないことが判明した。そこで、doxycyclineにより発現を誘導することが可能なpTetOne Vectorにコンストラクトをサブクローニングして、実験繰り返している。27年度が最終年度であるため、記入しない。循環器内科学細胞レベルにおいて、提案した手法が有効であることを確認できた。今後は、インフラマソーム活性を効率的に可視化するトランスジェニックマウスのラインを樹立、増殖して、疾患モデルにおける慢性炎症の病態解明に応用する。1)pTetOne-NLS-iSCAT1.7-2NESがdoxycyclineで発現を誘導されたのち、炎症活性化刺激で切断され、蛍光物質が核内に移行することを確認する。
放射免疫治療薬剤への利用を目指した部分的アミノ化セルロース・セロオリゴ糖の調製

β-1,4-グルカン鎖であるキトサンの1糖残基おきに2-N-アミノ基と2-N-アセタミド基が交互に繰り返される多糖およびオリゴ糖の最適合成方法を確立した。これらの成果を3報の学術論文に取りまとめていずれも学術誌に投稿した。繰り返し単位となる二糖を合成するため、D-グルコサミンを原料としてt-butyldimethyl silyl (4-0-acetyl-2-azido-3, 6-di-0-benzyl-2-deoxy-β-D-glycopyranosyl)-3,6-di-0-benzyl-2-deoxy-2- phthalimido-β-D-glycopyranoside (1))を合成した。グリコシル化の最適条件を見出すため、反応溶媒について検討を行った。その結果、アセトニトリルよりクロロフォルムでより大きな収率を与えること見出した。オジゴ糖をボトムアップ構築するために、二糖1からt-butyldimethylsilyl基を脱離して二糖供与体2、および二糖1からアセチル基を脱離して二糖受容体3へと変換した。二糖供与体2と二糖受容体3をイミデート法(Schmidt法)によりグリコシル化反応を行い、四糖誘導体を合成した。このグリコシル化反応についても、クロロフォルム溶媒が最適であることを確認した。多糖を構築するために、二糖1からt-butyldimethylsilyl基とアセチル基を脱離させた1,4'-ジオール4へと変換し、さらに1位にトリクロロアセチミド基(脱離基)を導入して、重合単独出発原料5を合成した。二糖5の重合反応について、アセトニトリル、クロロフォルムよりも、より低温(-78°C)での反応が可能となる塩化メチレンを反応溶媒とすれば、より大きな反応収量、到達重合度が得られることを明かにした。同じ位置の水産基に対して規則的に1残基おきに特定の置換基を導入せしめて「表・裏」を区別出来るβ-1,4-グルカン鎖の調製を達成するため、先ず繰り返し単位二糖の合成経路を確立した。同じ位置の水酸基に対して規則的に1残基おきに特定の置換基を導入せしめて「表・裏」を区別出来るβ-1,4-グルカン鎖の調製を達成するため、重合法による多糖合成に成功した。前年度に合成法を確立できた繰り返し単位セロビオース誘導体(2位フタルイミド基、2'位O-ベンジル基)から、脱アセチル化(4'位)と脱t-ブチルジメチルシリル化(1位)の後トリクロロアセトイミド化を行い、4'-OH基遊離、1-トリクロロアセトイミド基を導入した糖受容体兼供与体を導いた。この際、反応条件(過剰な試薬量、あるいは長過ぎる反応時間)によっては、1,4'-ジイミデート誘導体が生成するので、反応条件の最適化を行った。これを単独原料としてイミデート法による重合反応を試みた(回収率81%)。重合生成物をゲルパーミエーションクロマトグラフィーおよびTOF型質量分析計により重合度を測定した結果、数平均重合度4.5、分子量分散(Mw/Mn)1.96、最高重合度は14糖であった。13C-NMRによる分析結果より、重合様式は主にβ-1,4結合であることが確認できたが、なお、未同定のシグナルがありβ-特異的な重合反応であるか否かについて結論を出すにはさらに検討を要する。本研究で開発した新規多糖材料は、放射免疫治療薬の放射性元素を担持するキレート部基材として用いることが目的であるが、ガン細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体に対する放射性元素の担持可能個数と重合度は比例関係にある。本法により、一挙に高重合体の調整が可能となったため、本研究の主目的はほぼ達成された。さらに、今回開発した重合法は、本来配糖体の合成法として認知されているイミデート法を重合反応に適用した最初の合成例であり、新規重合法としての意義も大きい。

多糖を構築するために、二糖1からt-butyldimethylsilyl基とアセチル基を脱離させた1,4'-ジオール4へと変換し、さらに1位にトリクロロアセチミド基(脱離基)を導入して、重合単独出発原料5を合成した。二糖5の重合反応について、アセトニトリル、クロロフォルムよりも、より低温(-78°C)での反応が可能となる塩化メチレンを反応溶媒とすれば、より大きな反応収量、到達重合度が得られることを明かにした。
水棲型嗅覚受容体巨大遺伝子クラスターを支配する発現制御領域の解析

マウスゲノム最大の遺伝子ファミリーを形成する嗅覚受容体は、系統学的に、魚類まで保存されたファミリーを含むClass I(水棲型)と、陸棲生物特異的なClass II(陸棲型)に分類される。Class II遺伝子がほぼすべての染色体上に散在しているのに対して、Class I遺伝子は約300万塩基対の単一の巨大遺伝子クラスターを形成する特徴的なファミリーである。嗅神経細胞における「1細胞1受容体」ルールから、Class I遺伝子クラスターを支配する共通の発現制御領域の存在が推定されているが、同定には至っていなかった。本研究課題では、発現制御領域を同定し、さらにその機能を明らかにすることで、他に類を見ない巨大遺伝子クラスターを形成するClass I嗅覚受容体遺伝子の発現制御機構を解明することを目的とする。昨年度までに、Class I遺伝子クラスターを制御する新たな嗅覚受容体遺伝子発現制御領域「Jエレメント」の同定に成功し、エンハンサーを介した嗅覚受容体遺伝子の発現制御モデルを提唱した。Jエレメントはこれまでに例のない長距離作用性エンハンサーであるため、本年度はその制御機構の解明を目指し、Jエレメントならびにその他推定制御因子の機能解析を実施した。嗅覚受容体遺伝子の網羅的遺伝子発現解析やトランスジェニックマウスを用いたレポーターアッセイにより、Jエレメント内の機能領域と他の制御因子を明らかにしつつある。関連学会において発表をおこなったが、論文投稿には至っていないため、研究課題の実施期間を翌年度まで延長することとした。本研究課題では(1)Class I嗅覚受容体発現制御領域の同定、(2)発現制御領域の機能解析、(3)転写因子によるClass I嗅覚受容体遺伝子発現への寄与、の3つの小課題を計画している。本年度までに、申請者が同定したJエレメントがClass I遺伝子のエンハンサーとして機能していることを見出し、一連の成果を発表している。Jエレメント内に種間で高度に保存されたモチーフ配列が見出されたことから、本年度はトランスジェニックマウスを用いたJエレメントの機能解析に取り組み、その機能単位を同定しつつある。また、Jエレメントの制御に関わることが予想された転写因子の嗅覚系特異的欠損マウスについては、網羅的遺伝子発現解析や組織学的解析を実施し知見が得られつつある。一方、これまで考えられていたモデルに反し、Class I嗅覚受容体遺伝子クラスターには複数のエンハンサーが存在することが明らかとなったため、Class I嗅覚受容体遺伝子発現制御機構の全容解明に向けて、Jエレメント以外のエンハンサー領域の同定が新たな課題となっている。そこで、新たなClass I遺伝子エンハンサーについても候補を探索し、見出した配列についてノックアウトマウスの作出と遺伝子発現解析をおこなったが、新たなClass Iエンハンサーを同定することはできなかった。以上の点から、当初の研究計画はおよそ達成しつつあるが、Class I遺伝子発現制御機構の解明のため研究課題の実施期間を翌年度まで延長することとし、Jエレメントのさらなる機能解析を進める予定である。本年度に取り組んでいたJエレメントの機能解析を継続し、Jエレメントの機能発現に必要な領域やモチーフ配列を同定する。他方、着目した転写因子の嗅覚系特異的遺伝子欠失マウスについては、主にClass I嗅覚受容体遺伝子の発現に着目して解析を進め、Jエレメントとの関係を明らかにする。近年、嗅覚系のエピゲノムデータが集積してきていることから、適宜これらを活用し、Class I遺伝子クラスターにおけるエピジェネティック修飾状態を解析する。以上の解析を通して、Class I嗅覚受容体遺伝子クラスターの発現制御機構の解明を目指し、得られた成果を取りまとめ発表する予定である。Class II遺伝子がほぼすべての染色体上に散在しているのに対して、Class I遺伝子は約3Mbの単一の巨大遺伝子クラスターを形成する特徴的なファミリーである。当該年度までに研究代表者らは、塩基配列の保存性を基にした情報学的解析と種々のトランスジェニックマウスによる解析から、新たな発現制御領域「Jエレメント」を同定した。ゲノム編集技術(CRISPR-Cas9)を用いて作出したJエレメント欠失マウスを用いて、DNAマイクロアレイ解析やin situ hybridization法による遺伝子発現解析により、JエレメントがClass I嗅覚受容体遺伝子クラスター全体に作用する、長距離作用性エンハンサーであることを明らかにした。また、Jエレメントの機能解析から、嗅覚受容体遺伝子の発現メカニズムについてエンハンサーの選択が先行するというモデルを提案した。得られた成果は、国際科学雑誌への論文投稿、プレスリリースおよび学会において発表した。今後は、Class I遺伝子発現制御機構の全容解明を目指し、計画を継続する。