hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脂肪細胞における新規形質転換メカニズムの組織学的解析

代表者は同マウスに対して短期間(40日)高脂肪食給餌を行うと、野生型に比較して顕著な脂肪沈着を伴う体重増加や耐糖能異常が生じることを報告しているが、今年度の実験結果により、長期間の高脂肪食給餌はDGKε欠損および野生型マウスの体重増加や白色脂肪量の差が減少すること、さらにDGKε欠損マウスでは耐糖能異常が改善されることが明らかとなった。よってDGKε欠損は短期間の高脂肪食給餌では肥満を惹起するが、長期間給餌では肥満に抵抗性を示すよう表現型が変化することが明らかになった。これらの現象が白色脂肪組織で認められる“褐色化"に起因する可能性が示唆され、次年度以降の実験遂行に備えている。平成29年度の実験計画は脂質代謝酵素DGKεの遺伝子欠損マウスを高脂肪食で長期間(90日および120日)給餌し、その表現型を詳細に解析することであった。既報の通り(Nakano et al. 2018, FASEB J)、短期間(40日)の高脂肪食給餌においては、同マウスは野生型マウスと比較して急激な脂肪沈着を伴う体重増加と耐糖能異常という生活習慣病の表現型を呈する。平成29年度の研究結果から、長期間給餌条件では短期間の結果と大きく異なる表現型が認められるようになった。すなわち、野生型マウスでは精巣上体周囲白色脂肪の沈着亢進および耐糖能異常のさらなる増悪が認められるのに対し、DGKε欠損マウスにおいては脂肪沈着の減少および耐糖能の改善が認められた。免疫組織化学的解析の結果、長期間給餌のDGKε欠損マウスの精巣上体周囲白色脂肪組織中に、DGKεと同様に小胞体に局在し、アラキドン酸代謝に関与するサイクロオキシゲナーゼ(COX)-2の発現が検出された。文献的に、COX-2により産生されるプロスタグランジンが褐色化に関与することが知られていることから、前述の平成29年度に得られたデータは、DGKεがCOX-2発現を調整し、褐色化に関連することを示唆する。よって、高脂肪負荷条件下において、DGKεの欠損は褐色化を通して脂肪沈着量の減少を惹起する可能性が考えられ、このメカニズムの詳細を次年度以降に解析していく予定である。ジアシルグリセロール(DG)は中性脂質(TG)合成の中間産物であり、かつ細胞内二次伝達物質としても機能する脂質である。よって、DGの代謝はTG合成と細胞内情報伝達系の両方を制御すると考えられる。研究代表者はDGをリン酸化してフォスファチジン酸を産生する酵素、DGキナーゼ(DGK)の機能解析を行ってきた。最近、epsilon型DGK(DGKe)遺伝子欠損(KO)マウスを高脂肪食(HFD)で40日間給餌すると、精巣上体周囲白色脂肪において脂肪細胞の大型化や脂肪沈着が亢進し、肥満が生じることを報告した(科研#26460265、Nakano et al. 2018)。当該プロジェクトを遂行する過程で、HFDで長期間給餌すると白色脂肪組織中に褐色脂肪様細胞が出現することを見出し、DGKe-KOマウスで“褐色化"が促進する可能性を考え、本研究プロジェクトを立案した。これまでの報告により、褐色化惹起因子として、1長期間の高エネルギー摂取、2寒冷暴露、3交感神経刺激が知られている。本研究プロジェクトの計画初年度(平成29年度)においては1に関する詳細な解析を行った。その結果、高脂肪食給餌40日で増悪したDGKe-KOマウスの耐糖能は90日以上の長期間の高脂肪食給餌条件では改善され、組織学的にも脂肪細胞のサイズが小型化することを見出し、学会で報告した(第64回日本解剖学会支部会)。計画2年目である平成30年度は、前述の「2寒冷暴露による褐色化」に着目した実験を行った。
分子性導体の新規物質、新奇物性の理論的研究

本年度は、1/4充填の伝導バンドを持つ電荷移動型の分子性導体に対する数値的理論研究、および新規分子性導体に対するモデル化およびその解析を行った。1.前年度に引き続き擬1次元分子性導体の有限温度物性と相図の数値的研究を行った。その結果、TMTTF_2XやDCNQI_2Xなどの擬1次元系における電子相関および電子格子相互作用が絡んだ相転移現象を、有限温度における数値計算によって再現することにより重要なパラメータを同定し、臨界温度領域での熱力学的物理量の振舞を計算することによって相転移の性質を明らかにした。また、低温領域で有効となる数値的手法であるモンテカルロシミュレーションを用いた計算も行うことにより、実際の物質での観測される物理量の温度依存性や実験相図との1対1の対応が付けられる段階まで到達した。また、これらの数値的手法と相補的に用いている、ボゾン化法および繰り込み郡の手法による解析的アプローチによって電荷秩序転移やダイマーモット絶縁体の有限温度物性の物理的解釈を与えることに成功した。2.単一成分分子性金属M(tmdt)_2(M=Ni,Au)の電子状態を理解するため、第一原理計算および分子軌道計算を元に、有効モデルを構築しその解析を行った。このモデルは分子内の"仮想"分子軌道、すなわち両tmdt配位子中のTTF骨格上の軌道と、金属原子および周りのS原子の反結合軌道、を基底とした3バンドハバードモデルである。これら2種の軌道は、Ni系では金属化自体に、Au系では磁性発現において、重要な寄与を果たすことがわかり、この新物質系が「多バンドπ-d系」であることを示した。本年度は1/4充填の伝導バンドを持つ電荷移動型の分子性導体に対する数値的理論研究を中心に遂行した。また、分子性導体における電荷秩序現象に関するレビュー論文をJournal of the Physical Society of Japan誌上のSpecial Topicsにおいて発表した。上記の数値的理論研究については:(A)θ-ET_2Xやα-ET_2Xなどの擬2次元系や、PrBa_2Cu_4O_8などの擬1次元系における電荷秩序や関連の現象において、サイト間クーロン力における幾何学的フラストレーション効果が重要であるという以前の我々の提案を元に、フラストレーションによって電荷秩序が量子融解を起こした結果実現する金属状態において低エネルギーの集団電荷励起が顕著に残る異常な振舞を見出した。これらの問題に対しては競合する異なる電荷秩序パターンを安定化させるサイト間クーロン相互作用を含んだ1次元および2次元拡張ハバードモデルに対して数値的厳密対角化(ランチョス法)を用いた。(B)TMTTF_2XやDCNQI_2Xなどの擬1次元分子性導体における強い電子相関および電子格子相互作用が絡んだ複合相転移現象を調べるため、擬1次元の拡張ハバードモデルに電子格子相互作用も考慮し、これに対して数値的量子転送法を用いて有限温度物性を相転移前後において計算した。その結果、ウィグナー結晶型の電荷秩序転移、ダイマーモット転移(格子2量体化)、およびスピンパイエルス転移(格子4量体化)を有限温度における数値的量子転送行列法によって再現し重要なパラメータを同定し、臨界温度領域での熱力学的物理量の振舞を直接計算して求めることによって相転移の性質を明らかにした。
MR画像から計算したconductivity値に基づく直腸がん悪性度評価法確立

平成30年3月9日に札幌医科大学附属病院臨床研究倫理審査委員会に対し、本研究の申請を行い、平成30年4月12日に札幌医科大学附属病院病院長の承認を得た後、本研究を開始した。現時点までで26例の登録を行い、5例(1例は上手くconductivityを計算できていない)のconductivity計算用のMRI画像の解析を行った。この時点では結果についての解析を行うには十分なデータ量は集まっていないが、直腸病変は空気と接しているためにsusceptibilittyの影響を強く受けるためなのか、データ自体のばらつきが当初の予想以上に大きい印象であり、今後この点の克服に注力する必要があると感じている。札幌医科大学附属病院臨床研究倫理審査委員会に研究許可申請を提出し、平成30年4月12日付で研究承認を得た後、本臨床研究を開始した。直腸病変の精査のために当院にて3T MRI装置で骨盤部のMRI検査を行う患者のうち、同意書に署名頂いた患者に対し、IVIM法のためのDWI画像を2回、conductivity計算用の3DSSFP画像も2回撮像し、Fujifilm Medical社製のVINCENTを用いて病変領域のregion of interest (ROI)を設定しD・f・D*の計算を行った。Conductivity値に関しては、匿名化したDICOMformat画像を研究協力者であるDr. Ulrichに送ってconductivity画像を作成していただき、再度VINCENTを使って病変部のconductivityの解析を行った。現時点で26例の画像を取得しているが、conductivityに関しては4例、IVIMに関しては5例の解析を行った。Conductivityに関して、症例1(1st/2nd)では1150/3508 mS/m、症例2では-168 /-177、症例3では1111 /381、症例4では938/659と値が非常にばらついており、改善の必要性を感じている。IVIMに関しては、症例1のDおよびf(1st/2nd)は1.37 /1.52 mm2/s、0.054/0.030、症例2は0.97 /0.96、0.092 /0.108、症例3は0.73 /0.71、0.072 /0.082、症例4は0.72/0.75、0.084 /0.129、症例5は0.86/0.96、-0.012/0.074であった。fについてはマイナスの値を取るケースもあり計算方法に改善の余地があるが、Dは値のばらつきも少なく高い再現性を示し信頼性が高いと考えられる。Echo-planner法を用いるDWIの場合、直腸のように空気が近接しておりsusceptivility artifactが生じやすい臓器では歪みが生じてしまう。しかし、再現性確認のために2回連続して撮像したDWIでは、両者に同様の歪みが生じているためであろうと思われるが予想以上に再現性は高く、画像が歪むことによるROI設定の難しさは残るがデータ自体の信頼性は十分高いと考えられた。ただし、D*に関しては、低b値での信号強度のばらつきが大きいためvoxelごとの値を計算することはほぼ不可能と考えられる。Conductivity計算の元画像である3D SSFPは歪みのない画像であるので、conductivity値自体も高い再現性を期待したが、現在までの解析の範囲では当初の予想に反してIVIMのmetricsよりも明らかに低い再現性となった。この点を改善する必要があると考えDr. Ulrichとも議論したが、彼のデータではphantomや頭部領域のconductivityの再現性は高かったとのことであったので直腸領域の特殊性に主原因があると推定される。試みとして隣接する前立腺のconductivityも計測してみた。詳細な検討は行っていないが直腸に比してデータの再現性はかなり高い印象であったので上記の可能性は高いのではないかと考えている。まず考えられる対処法としては元画像である3D SSFPの繰り返し回数を上げることである。しかし、臨床検査にこの撮像を加えているので繰り返し回数を増加させることによる撮像時間自体の延長は病院の検査スケジュール上、難しい。データを詳細に観察してみると、比較的病変が大きい症例では再現性が高い傾向にあるのでこういった症例に絞ってconductivityを活用する方法も検討する必要があるかもしれないと考えている。直腸病変の精査のために当院にて3T MRI装置で骨盤部のMRI検査を行う患者のうち、同意書に署名頂いた患者に対し、IVIM法のためのDWI画像を2回、conductivity計算用の3DSSFP

画像も2回撮像し、Fujifilm Medical社製のVINCENTを用いて病変領域のregion of interest (ROI)を設定しD・f・D*の計算を行った。Conductivity値に関しては、匿名化したDICOMformat画像を研究協力者であるDr. Ulrichに送ってconductivity画像を作成していただき、再度VINCENTを使って病変部のconductivityの解析を行った。現時点で26例の画像を取得しているが、conductivityに関しては4例、IVIMに関しては5例の解析を行った。Conductivityに関して、症例1(1st/2nd)では1150/3508 mS/m、症例2では-168 /-177、症例3では1111 /381、症例4では938/659と値が非常にばらついており、改善の必要性を感じている。IVIMに関しては、症例1のDおよびf(1st/2nd)は1.37 /1.52 mm2/s、0.054/0.030、症例2は0.97 /0.96、0.092 /0.108、症例3は0.73 /0.71、0.072 /0.082、症例4は0.72/0.75、0.084 /0.129、症例5は0.86/0.96、-0.012/0.074であった。fについてはマイナスの値を取るケースもあり計算方法に改善の余地があるが、Dは値のばらつきも少なく高い再現性を示し信頼性が高いと考えられる。Echo-planner法を用いるDWIの場合、直腸のように空気が近接しておりsusceptivility artifactが生じやすい臓器では歪みが生じてしまう。しかし、再現性確認のために2回連続して撮像したDWIでは、両者に同様の歪みが生じているためであろうと思われるが予想以上に再現性は高く、画像が歪むことによるROI設定の難しさは残るがデータ自体の信頼性は十分高いと考えられた。ただし、D*に関しては、低b値での信号強度のばらつきが大きいためvoxelごとの値を計算することはほぼ不可能と考えられる。Conductivity計算の元画像である3D SSFPは歪みのない画像であるので、conductivity値自体も高い再現性を期待したが、現在までの解析の範囲では当初の予想に反してIVIMのmetricsよりも明らかに低い再現性となった。この点を改善する必要があると考えDr. Ulrichとも議論したが、彼のデータではphantomや頭部領域のconductivityの再現性は高かったとのことであったので直腸領域の特殊性に主原因があると推定される。試みとして隣接する前立腺のconductivityも計測してみた。詳細な検討は行っていないが直腸に比してデータの再現性はかなり高い印象であったので上記の可能性は高いのではないかと考えている。まず考えられる対処法としては元画像である3D SSFPの繰り返し回数を上げることである。しかし、臨床検査にこの撮像を加えているので繰り返し回数を増加させることによる撮像時間自体の延長は病院の検査スケジュール上、難しい。データを詳細に観察してみると、比較的病変が大きい症例では再現性が高い傾向にあるのでこういった症例に絞ってconductivityを活用する方法も検討する必要があるかもしれないと考えている。
サイトメガロウイルス臨床分離株の感染細胞指向性の違いによる迅速型判別方法の開発

感染細胞指向性(トロピズム)の違いにより異なる疾患を引き起こすと想定されるサイトメガロウイルス(CMV)臨床分離株に対する型判別法の開発を目指し、全ゲノムシークエンシングを行った。計10の臨床分離株の85 %前後の塩基配列を決定したが、違いは認められなかった。感染細胞指向性の違いがゲノムのメチル化などのエピジェネティックな制御によるものと考え研究を継続しており、その成果はCMVのトロピズムとCMVが原因とされている疾患との関連性について明らかにするとともに、病気の進行を正しく判断して発症の予防にも結び付く先制的な治療を可能にすると期待している。本研究では先天性サイトメガロウイルス感染症児の尿中のウイルスをヒト線維芽細胞およびヒト網膜色素上皮細胞に感染させることで細胞指向性の異なる臨床分離株を分離し、その全ゲノムシークエンスを行い、細胞指向性を決定する責任遺伝子を特定し、その領域について型判別可能な迅速診断法を開発することを目的としている。これまでに、同一個人から分離され細胞指向性の異なるウイルス株5セット計10株について次世代シークエンサーとPCRダイレクトシークエンスによってシークエンスの決定を試みてきた結果、各株6080%ほどシークエンスが決定出来た。しかしながら、同一個人から分離されたウイルス株間でのシークエンスに相違点は現時点で見つかっていない。業室株を用いた細胞指向性を決定する領域に関する報告ではULb'領域に違いが見られるとのことだが、この領域についても現在のところ違いは見つかっていない。本研究開始前にも想像していたが、ここまでの結果からは業室株で起こっている現象が生体で起こっていることや病態を正しく反映していないと言える。まだシークエンスが決定できていない領域について解析を進め相違点を明らかにすることでサイトメガロウイルスの細胞指向性や臓器特異性と本ウイルスの多様な疾患との関連性を明らかに出来るものと考えている。本学に設置しているロシュ社の次世代シークエンサーでウイルスゲノムのシークエンスの決定を試みたが、リードの精度と深さのバラつきが見られること、また想像していた以上にギャップが多いことで当初の予定より難航している。加えて、ロシュ社は次世代シークエンサー用の試薬の販売を中止したことで、現在PCRダイレクトシークエンスによってシークエンスの決定を余儀なくされているが、あらたにイルミナ社の次世代シークエンサーが設置されたので本機器を併用することで改善ができると思われる。本研究では先天性サイトメガロウイルス感染児の尿中のウイルスをヒト線維芽細胞およびヒト網膜色素上皮細胞に感染させることで細胞指向性の異なる臨床分離株を分離し、その全ゲノムシークエンスを行い、細胞指向性を決定する責任遺伝子を特定し、その領域について型判別可能な迅速診断法を開発することを目的としている。我々はこれまでに、同一個人から分離され細胞指向性の異なるウイルス株5セット計10株を保持しており、これらの株について次世代シークエンサーとPCRダイレクトシークエンスによってシークエンスを試み、各株とも全ゲノムの85%のシークエンスを決定できた。サイトメガロウイルスは株間で多型を示す遺伝子が複数存在するが、同一個人から分離された株間でそれらの遺伝子には違いはなく、また塩基配列が決定できた領域についても同様に違いはなく、細胞指向性を決定する遺伝子の特定にはいまだ至っていない状況である。これまでに決定できた領域には、研究室株では細胞指向性に関与していると報告のあった遺伝子やULb'領域も含まれているが、我々が分離した株ではこれらの遺伝子、および領域にも違いは認められていない。このことは臨床分離株ではこれまで報告のあった細胞指向性に関与する遺伝子以外にその責任遺伝子が存在することを示唆している。サイトメガロウイルス臨床分離株の全ゲノム塩基配列は順調に決定できているが、次世代シークエンサーだけでは決定出来ない領域があることで細胞指向性が異なるウイルス間の違いがいまだ確認できていない。そのため当初予定していた株間での細胞指向性を決定する遺伝子の特定につながる組み換えウイルスの作成に着手できていない。PCRダイレクトシークエンスを組み合わせることで全ゲノム塩基配列の決定は継続し、速やかに株間の違いを特定したいと思っているが、全ゲノムの塩基配列の85%を決定した現時点で株間の違いが確認できていないので、細胞指向性の違いは単にウイルスゲノムの変異だけで説明できない可能性も考えなくてはならないかもしれない。サイトメガロウイルス(CMV)はCD34陽性造血幹細胞やマクロファージなど様々な細胞に感染する。その細胞指向性は免疫不全患者や臓器移植後の患者での網膜炎や肺炎、骨髄炎、先天性CMV感染における網脈絡膜炎、聴覚障害、精神未発達、肝炎などの様々な疾患と関連すると考えられる。我々は、先天性CMV感染児の尿から複数の細胞株を用いてCMVの分離培養を継続的に行ってきたが、同一個人から上皮・内皮系細胞への感染効率が異なるCMV株を分離することができた。本研究ではこうして分離したCMV株の全ゲノムシークエンスにより細胞指向性を決定する責任遺伝子を特定し、その領域について型判別可能な迅速診断法の開発を試みた。細胞指向性の異なるウイルス株5セット計10株について次世代シークエンサーとPCRダイレクトシークエンスによってシークエンスを行い、各株とも全ゲノムの85%前後のシークエンスを決定できた。サイトメガロウイルスは株間で多型を示す遺伝子が複数存在するが、同一個人から分離された株間でそれらの遺伝子に違いはなく、同一個人に感染していた細胞指向性の異なるウイルス株は同一株からの派生型であることが示された。

塩基配列が決定できた領域、特に研究室株で細胞指向性に関与していると報告のある遺伝子およびULb'領域(UL133-UL138)について、我々が分離した株では違いは認められなかった。このことは臨床分離株ではこれまで報告のあった細胞指向性に関与する遺伝子以外にその責任遺伝子が存在することを示唆している。一方で、ウイルスゲノムのメチル化などのエピジェネティックな制御をウイルスが受けることも徐々に明らかになってきており、CMVの潜伏感染にヒストンが関与することも報告されている。今後は、CMVゲノムのエピジェネティクスと細胞指向性との関係について調べ、CMVが原因とされている疾患との関連性について明らかにしたい。感染細胞指向性(トロピズム)の違いにより異なる疾患を引き起こすと想定されるサイトメガロウイルス(CMV)臨床分離株に対する型判別法の開発を目指し、全ゲノムシークエンシングを行った。計10の臨床分離株の85 %前後の塩基配列を決定したが、違いは認められなかった。感染細胞指向性の違いがゲノムのメチル化などのエピジェネティックな制御によるものと考え研究を継続しており、その成果はCMVのトロピズムとCMVが原因とされている疾患との関連性について明らかにするとともに、病気の進行を正しく判断して発症の予防にも結び付く先制的な治療を可能にすると期待している。ウイルス株の全ゲノムシークエンスについては、あらたに導入された次世代シークエンサーとPCRダイレクトシークエンスにより早急に決定をし、5セット10株のシークエンスを比較することで細胞指向性を決定する領域の候補を絞ったのち、実際にその領域を変更することで細胞指向性が変わるか確認をする。またこの領域に対して型判別、すなわち細胞指向性を検出可能なリアルタイムPCR系を構築し、同一個人に感染しているウイルスを型別に経時的に定量することを可能にしたい。塩基配列がまだ決定できていない領域(ゲノム全体の約15%)についての塩基配列を決定し、線維芽細胞でのみ増殖できる株と網膜色素上皮細胞でも増殖できる株との相違点を明らかにし、組み換えウイルスを作成して細胞指向性を確認する。仮に違いがない場合はウイルスゲノムが宿主細胞においてエピジェネティックな修飾を受けている可能性も視野に入れてメチル化部位の違いについて検討してみたい。ウイルス学ロシュ社次世代シークエンサー用の試薬を購入予定であったが、当該試薬の生産中止と機器の使用を中止したため。次世代シークエンサーで決定しきれなかった領域があり、追加でPCRダイレクトシークエンスの必要性が出たことと、細胞指向性を決定する遺伝子の特定が出来ていないためその領域に対する抗原の作成と実験動物を用いた抗体の作成が未着手である点からPCRダイレクトシークエンスと実験動物購入のための経費を一部次年度で使用することにした。繰り越し金はあらたに設置したイルミナ社次世代シークエンサー用の試薬に充てる。PCRダイレクトシークエンスと次世代シークエンサーを組み合わせウイルス株の全ゲノムシークエンスを行い、速やかに塩基配列の異なる遺伝子を特定し、細胞指向性を決定するであろう遺伝子の候補として組み換えウイルスを作成したのちにその細胞指向性を確認する。
トポロジカル超伝導体へのスピン流注入と逆スピンホール効果

今年度は、昨年度に確立した試料作製技術や測定技術を用いて、トポロジカル超伝導体へのスピン流注入を達成することを目標にして幾つかの実験に取り組んだ。まず第一に、昨年度から取り組んできた、s波超伝導体/磁性絶縁体接合試料に対する熱的スピン流注入の実験について、超伝導転移点直下でコヒーレンス因子によるスピン流-電流変換効果の増大を観測した(論文投稿中)。これは最近報告された理論提案とも整合する結果であり、超伝導スピンカロリトロニクスにおける新しい成果として注目を集めることが期待される。次に、d波超伝導体である銅酸化物YBCOとフェリ磁性絶縁体LiFe5O8の接合系において、非自明な超伝導ボルテックスネルンスト効果を観測した(出版済み)。磁気界面の影響で、ネルンスト電圧が磁場に対して振動的な振る舞いを示すことを特徴とし、トポロジカルな性質を有する超伝導ボルテックスと磁性が関係した新しい熱輸送現象である。さらに、p波超伝導体の有望な系として、本新学術領域のメンバーからの試料提供により準備した幾つかの空間反転の破れた原子層超伝導体に対してスピン注入実験を行った。まず、室温の常伝導状態でスピン流注入によるスピン流-電流変換効果を測定したところ、明瞭な信号が得られた(論文準備中)。この結果はこれらの原子層物質で効率的なスピン流-電流変換が可能なことを意味する。一方で、これらの試料で温度を下げて抵抗率を測定したところ、報告された超伝導転移点では超伝導を示さないことがわかった。超伝導転移が消失した原因として金属膜をつけたことによるバンド変調が疑われる。今後は、上記実験と並行して試料作製条件を検討してきた空間反転対称性を人工的に破った超伝導体試料に対して引き続きスピン注入実験研究を行う予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、超伝導試料の作製と極低温スピンポンピング実験系の構築が主な目的であった。試料作製については、以下に述べる通りいくつかのs波超伝導体やd波銅酸化物超伝導体を作製した。既に強磁性絶縁体との良質な接合膜が得られており、スピントロニクス実験を開始している。また、2K以下で安定的にスピン流注入実験を行う測定系も無事に構築された。比較的高い超伝導転移点をもつs波超伝導試料として選んだNbN薄膜は、基板を選ばない成膜のために室温スパッタ成膜条件を割り出した。既に強磁性絶縁体基板上でも10K以上の超伝導転移点をもつNbN薄膜が作製でき、予備実験を開始している。超伝導転移と絡んだ新スピン流現象やトポロジカル欠陥である超伝導ボルテックスが関係した新規輸送現象が見え始めており、論文としてまとめるために結果の解釈を議論している。また、PLD法によって銅酸化物超伝導体YBCO薄膜を強磁性絶縁体上に作製し、熱的スピン注入実験を行った。YBCOはスピン軌道相互作用が弱いために効率的なスピン流検出はできなかったが、超伝導ボルテックスが絡んだ新しいタイプのネルンスト効果が見られた。既に学会発表を行い論文を投稿中である。極低温スピンポンピング実験の測定系は、超伝導マグネットにおいてサンプルロッドを自作することで構築した。当初はマイクロ波ケーブルの熱流入により温度が下がらない問題があったが、改良を加えることで現在は2K以下で安定的にスピンポンピング実験が可能な測定系が構築された。既に別の実験で動作を確認済みであり、トポロジカル超伝導体試料が用意でき次第実験が可能な状態にある。今年度の研究計画に記載した内容は達成された。また、計画になかった超伝導体試料を作製し様々なスピン流現象測定を行うことで、計画以上の成果が出始めている。

今後は、これまでに構築した試料作製条件や測定系を用いてトポロジカル超伝導体へのスピン流注入実験に取り組む。いくつかのトポロジカル超伝導体試料を準備中であり、それらの試料を用いてスピン流注入の証拠を得る。また、並行して今年度得られた超伝導ボルテックスが絡んだ新規物理現象について引き続き調べる。超伝導ボルテックスはトポロジカル欠陥であり、その新規物性の探求により包括的に超伝導体におけるトポロジカル量子現象の研究が達成される。29年度が最終年度であるため、記入しない。
ゲノム解析に基づくバラ科植物(リンゴ、バラ)の遺伝的多様度と育種

リンゴ自家・交雑不和合性に関わるS遺伝子解析とリンゴとバラのSSRマーカー解析については、1.国内ならびに外国のリンゴ栽培種、栽培種の起源種とされている品種、野生種計96種のS遺伝子型を同定した。2.S遺伝子型を同定した栽培種の中で記載されている両親との間に矛盾を生じたものについて、交配試験と後代解析によりS遺伝子型を確認した。3.交配試験と後代実生のS遺伝子型解析により、類似性の高いS_3とS_<10>-allele間に認識のゆらぎのないことを明らかにした。また'Makamik'のS_<1,20,24-like>RNasealleleのゲノム解析を行い、S_1、S_<20>、S<24>との類似性を明らかにするとともに交配試験によりこれらのalleleとの問に機能的な差異のないことを明らかにした。さらに、S_<16a>-とS_<16b>-RNase alleleも機能的に同じalleleであることを確認し、S_<6b>-とS_<21>-RNase allele同定法を新たに確立した。4.花粉親不明種と、両親とも、もしくは両親のいずれかの記載に誤りのあるリンゴ栽培種についてSSRマーカー解析を行い、17種の来歴・系図を明らかにした。5.SSRマーカー解析により日本のリンゴ栽培種を中心に42栽培種の遺伝的多様度を明らかにするとともに、リンゴ赤果皮および赤果肉形質に関わるMYB遺伝子群のゲノム解析を行った。6.バラの遺伝的多様度を解明するために、野生バラおよび野性バラ間の種間交雑種を中心にSSRマーカー解析を行い、種間交雑種の来歴を確認するとともに、遺伝的多様度について明らかにした。7.Rosa rugosaとRosa multifloraのF1集団は、いずれの個体も稔性が低く十分な戻し交雑集団を確保することが困難であることが判明した。そこで、新たにRosa rugosa x Rosa'WKS82'ならびにRosa rugosa x 'Lavande'の交雑集団を作製し、SSR解析を行った。リンゴの自家・交雑不和合性に関わるS遺伝子解析とリンゴとバラのSSRマーカー解析を行い、以下の成果をあげた。1.国内ならびに外国のリンゴ栽培種計17種のS遺伝子型を同定した。2.リンゴ野生種14種のS遺伝子型を同定し、国内の栽培種成立の基となった品種について一部特定した。3.同定したS遺伝子型が、記載されている両親との間で矛盾を生じたリンゴ栽培種について、交配によりS遺伝子型を確認した。4.交配試験と後代解析により類似性の高いリンゴS-RNase allele間に認識の揺らぎの無いことを明らかにした。また、Malus domastica `Makamic'のS-RNase alleleのゲノム解析を行い、S1、S20、S24との類似性を明らかにするとともに交配試験によりこれらalleleの機能的な差異を明らかにした。5.花粉親不明種と、両親とも、もしくは両親のいずれかの記載に誤りのあるリンゴ栽培種についてSSRマーカー解析を行い、9種の来歴・系図を明らかにした。6.SSRマーカー解析により日本のリンゴ栽培種を中心に42栽培種の遺伝的多様度を明らかにした。7.現代バラ成立の基となった野生バラおよび野生バラ間の種間交雑種を中心にSSRマーカー解析を行った。

8.Rosa rugosaとRosa multifloraのF1集団のSSRマーカー解析を行うとともに、R.rugosaとF1の戻し交雑を行った。リンゴ自家・交雑不和合性に関わるS遺伝子解析とリンゴとバラのSSRマーカー解析を行い、下記成果をあげた。1.PCR-digestion法により、前年度に引き続き`Delicious'等の枝変わり、`Delicious'を両親のいずれかに持つ品種等を含む国内リンゴ栽培種、栽培種の起源種とされている品種、野生種計35種のS遺伝子型を同定した。2.リンゴ品種`こうみつ'の来歴について、S遺伝子、SSR解析および交配試験により胚珠親が`紅玉'、花粉親が`スターキングデリシャス'であることを明らかにした。3.推定アミノ酸配列が同じであるS16a-とS16b-RNase alleleが機能的に同じalleleであることを交配試験と後代のS遺伝子型解析により明らかにした。4.S6b-とS21-RNase allele同定法を新たに確立した。5.リンゴ赤果皮および赤果肉形質に関わるMYB遺伝子群のゲノム解析を行った。6.バラの遺伝的多様度を解明するために、野生バラを中心にSSRマーカー解析を進めた。7.Rosa rugosaとRosa multifloraのF1集団は、いずれの個体も稔性が低く十分な戻し交雑集団を確保することが困難であることが判明した。そこで、新たにRosa rugosa x Rosa`WKS82'ならびにRosa rugosa x`Lavande'の交雑集団を作製し、SSR解析を行った。
市街地の安全性・利便性に関する実証研究-小売り店舗と犯罪の分布をもとにして-

新潟市の人口集中地区において、犯罪の起こった地点の分布と、鉄道駅・商店・諸施設等への近接性から定められる地区の利便性との関連性について分析・考察した。犯罪のデータとしては、新潟県警により提供をうけた1988、89年の新潟中央署・東署・西署管内の犯罪リスト(罪種、犯罪発生地点、発生時刻を記入したもの)を元本とし、これを地理情報システムソフト・ATLAS*GISに地点および属性情報を入力、整理したものを用いた。一方、地区の利便性を示すものとして、主要鉄道駅の分布、並びに食料品・日用品を扱う小売店舗及び銀行・医院等の施設の分布をとった。後者については、1990年版の電話帳(タウン・ページ)から店舗の地点を抽出し、適宜住宅地図等を用いての補正した。この作業についても同様に地理情報システムを用いた。これらの基礎データをもとに、以下の方法で分析を行った。(1)対象地区の主要駅を中心とする半径125m,250m,500m,1Kmの距離帯別に罪種別犯罪数密度とそれ以外での密度とを算出、比較分析した。(2)食料品および日用品を扱う小売店舗および銀行・医院等の施設から250m以内の範囲をその利用圏として設定し、各利用圏の内外での罪種別犯罪数密度の比較並びに、いくつかの利用圏が重なった地区の内外での同様の比較を行う。以上の分析により、以下のことが明らかとなった。(1)主要駅の付近では、自動車・自転車・バイク盗のように駅に隣接する駐輪場の存在そのものが誘因となる犯罪は確かに増加するが、それ以外にはあまり有意差が見られない。(2)各店舗・施設の利用圏内での犯罪は、確かにその外より多い傾向にあるが、利用圏が重なるエリアほどその傾向は薄らいでくる。これらの結果は、都市空間における「不特定多数の目」の微妙な働きを示唆するものと考えられる。
光空間エンコード化に基づくレーザドップラー3次元空間速度ベクトル分布計測法の開発

申請者は,光を用いた非接触な速度分布計測技術として,精密な位置情報取得を可能とする光空間エンコード化と,高精度かつ空間分解能の高い計測が可能な差動型レーザドップラー速度計測技術を利用した手法を提案してきた.本研究では,提案手法を発展させ,高精度で扱いやすい新たな3次元空間速度ベクトル分布計測方法を確立するための技術開発を行い,使い勝手の良い装置を実現するための道筋を模索する.申請者は,光を用いた非接触な速度分布計測技術として,精密な位置情報取得を可能とする光空間エンコード化と,高精度かつ空間分解能の高い計測が可能な差動型レーザドップラー速度計測技術を利用した手法を提案してきた.本研究では,提案手法を発展させ,高精度で扱いやすい新たな3次元空間速度ベクトル分布計測方法を確立するための技術開発を行い,使い勝手の良い装置を実現するための道筋を模索する.
青色殺虫光の作用部位の解明

ショウジョウバエの視覚系突然変異系統のwhite(白色眼)、sepia(セピア色眼)、Bar(棒状眼)、eye missing(複眼欠損)、norpA(ホスホリパーゼC酵素活性欠損)および体色系突然変異系統のebony(黒体色)、視覚系以外の光受容突然変異系統のCry(クリプトクロム欠損)の突然変異7系統と、比較としてCanton-S、住化テクノサービス系統(FBrf0227020)の野生型2系統について、成虫に対する各種青色波長光(405、420、435、450、470 nm)の殺虫効果を調査した。複眼色素異常のwhite、複眼が棒状で野生型よりも顕著に小さいBar、複眼欠損のeye missingは、野性型2系統に比べて青色光耐性が明らかに低かった。一方、whiteと同じく複眼色素異常のsepiaは野性型2系統とほぼ同じかやや高い耐性を示した。このことから、複眼における光吸収は、ショウジョウバエ成虫に対する青色光の殺虫効果にあまり関与していないと考えられた。また、視覚系突然変異のうちホスホリパーゼC酵素活性欠損により複眼での光受容ができないnorpAの青色光耐性も野生型と同程度であった。このことから、複眼はショウジョウバエ成虫に対する青色殺虫光の作用部位ではないと考えられた。さらに、視覚系以外の光受容突然変異であるCryの青色光耐性も野性型と同程度であった。一方、黒体色のebonyは野性型に比べて青色光耐性が顕著に高かった。したがって、青色光は複眼からではなく、体表を透過して体内に吸収され、殺虫効果を発揮するものと考えられた。また、ebonyの体表の吸収スペクトルを野生型と比較したところ、ebonyは明らかに体表での光の吸収率が高いことがわかった。このことから、ebonyでは体表で青色光が吸収され内部に透過しにくいため、殺虫効果が低くなったものと考えられた。作用部位の解明(成虫)における視覚入力遮断による解析で、ショウジョウバエ複眼からの光入力の物理的遮断を試みたが、非常に困難であったため実施計画を変更することとした。代わりに、視覚系突然変異系統を用いた解析において,供試系統数を当初計画よりも増やして実施した。この計画変更により、作用部位の解明(蛹)における視覚系突然変異系統を用いた解析を本年度実施できず、来年度実施することとした。したがって、進捗は計画よりもやや遅れていると自己評価した。・青色殺虫光の作用部位の解明(幼虫):ショウジョウバエ幼虫における青色殺虫光の作用部位の解明のため、幼虫の光受容器として重要な役割をしているBolwig organ切除個体と無切除個体で効果的波長・有効光強度を比較する。これにより、青色殺虫光の作用部位にBolwig organが関与しているか明らかにする。・青色殺虫光の作用部位の解明(蛹):ショウジョウバエ蛹における青色殺虫光の作用部位の解明のため、今年度未実施となった視覚系突然変異系統の蛹に対する青色光の殺虫効果を調査し、青色光耐性および効果的波長を系統間で比較する。これにより蛹における作用部位と成虫における作用部位とで違いがあるか明らかにする。・虫体の光吸収特性と効果的波長の関係解明:虫体の光吸収特性を調べることで効果的波長を推定できるか明らかにするため、ホモジナイズした卵および幼虫の吸収スペクトルを解析し、効果的波長とスペクトルの関係を調査する。吸収波長と効果的波長の間に類似性が認められれば、吸収波長を調べることで効果的波長を推定することが可能か検討する。成虫における作用部位の解明では、視覚系突然変異系統や体色の異なる突然変異系統間で青色光の殺虫効果を比較し、作用部位を推測するための知見を得る計画である。本年度はsepia(複眼がセピア色)、white(複眼が白色)、Bar(複眼が棒状)、eye missing(複眼が欠失または点状)、norpA(複眼活動電位が消失)の視覚系突然変異系統5系統とクリプトクロム機能消失変異体のCryおよび体色が黒色のebonyの7系統を入手、比較として用いる野生型のCanton-Sと合わせて8系統の累代飼育を確立した。成虫に対して470あるいは435 nmの青色光を照射し、系統間で殺虫効果を比較しているが、いずれの系統でも両波長による殺虫効果は雄のほうが高いことが明らかになった。またこれまでのところ、470 nmでは、殺虫効果の高い順に、white>sepia>ebonyとなり、435 nmでは、white>norp>sepia>ebonyという結果を得た。ebonyの次に高い青色光耐性がみられたsepiaでは、470 nmで約8割、435 nmで約7割の個体が死亡したが、ebonyではいずれの波長でも12割程度の個体しか死亡せず、非常に高い青色光耐性がみられた。このことから、青色光の体内への入力経路として体表が重要である可能性が高いと考えられた。卵における作用部位の解明では、ショウジョウバエ胚由来培養細胞と卵との間で、効果的波長に類似性がみられた。したがって、卵においては、卵殻を通った青色光が細胞に直接吸収され、活性酸素が生じることで細胞が傷害を受けている可能性が高いと考えられた。蛹における作用部位の解明では、効果的波長は前蛹段階ですでに成虫と類似してくることがわかった。したがって、蛹における作用部位は成虫と類似している可能性が高いと考えられた。

卵および蛹における作用部位の解明に関しては、申請書に記載した本年度の研究実施計画のすべてを終了することができた。成虫における作用部位の解明に関しては、申請書作成時は、体色の異なる系統を用いた解析だけを本年度の研究実施計画としていた。しかし実際には、視覚系突然変異系統のいくつかについてもすでに解析に着手し、視覚よりも体表の方が殺虫に関与する青色光の入力経路として重要である可能性をすでに見出すことができた。このことから、おおむね順調に進展していると自己評価した。ショウジョウバエの視覚系突然変異系統のwhite(白色眼)、sepia(セピア色眼)、Bar(棒状眼)、eye missing(複眼欠損)、norpA(ホスホリパーゼC酵素活性欠損)および体色系突然変異系統のebony(黒体色)、視覚系以外の光受容突然変異系統のCry(クリプトクロム欠損)の突然変異7系統と、比較としてCanton-S、住化テクノサービス系統(FBrf0227020)の野生型2系統について、成虫に対する各種青色波長光(405、420、435、450、470 nm)の殺虫効果を調査した。複眼色素異常のwhite、複眼が棒状で野生型よりも顕著に小さいBar、複眼欠損のeye missingは、野性型2系統に比べて青色光耐性が明らかに低かった。一方、whiteと同じく複眼色素異常のsepiaは野性型2系統とほぼ同じかやや高い耐性を示した。このことから、複眼における光吸収は、ショウジョウバエ成虫に対する青色光の殺虫効果にあまり関与していないと考えられた。また、視覚系突然変異のうちホスホリパーゼC酵素活性欠損により複眼での光受容ができないnorpAの青色光耐性も野生型と同程度であった。このことから、複眼はショウジョウバエ成虫に対する青色殺虫光の作用部位ではないと考えられた。さらに、視覚系以外の光受容突然変異であるCryの青色光耐性も野性型と同程度であった。一方、黒体色のebonyは野性型に比べて青色光耐性が顕著に高かった。したがって、青色光は複眼からではなく、体表を透過して体内に吸収され、殺虫効果を発揮するものと考えられた。また、ebonyの体表の吸収スペクトルを野生型と比較したところ、ebonyは明らかに体表での光の吸収率が高いことがわかった。このことから、ebonyでは体表で青色光が吸収され内部に透過しにくいため、殺虫効果が低くなったものと考えられた。作用部位の解明(成虫)における視覚入力遮断による解析で、ショウジョウバエ複眼からの光入力の物理的遮断を試みたが、非常に困難であったため実施計画を変更することとした。代わりに、視覚系突然変異系統を用いた解析において,供試系統数を当初計画よりも増やして実施した。この計画変更により、作用部位の解明(蛹)における視覚系突然変異系統を用いた解析を本年度実施できず、来年度実施することとした。したがって、進捗は計画よりもやや遅れていると自己評価した。現在入手済みの突然変異系統すべてにおいて、成虫の青色光耐性を比較する。また、視覚入力遮断を行うことにより、青色光の殺虫効果が変化するか調査する。これらの調査により、殺虫に関与する青色光の入力経路として、視覚系の光受容部が重要であるのか、体表を通しての体内への青色光の侵入が重要であるのか明らかにしていく。
ポリエーテルによる包摂とイオン会合との相乗効果に基づく水系分離分析法の開発

本研究では環状ポリエーテル及びポリエーテル系の非イオン界面活性剤を用い,ポリエーテルの分子認識能,疎水性の双方の機能を水系溶媒中でのイオン会合反応と相乗的に活用した.擬均一系水溶液で分離分析を行うためにキャピラリー電気泳動法を活用し,フェニルアルキルアンモニウムの包摂反応,アルキルピリジニウム,アルキルイミダゾリウムのミセル結合反応を解析した.また,環状ポリエーテルの包摂によるアルカリ金属イオンの疎水性増加をテトラフェニルボレート系イオンとの水溶液内イオン会合反応で実証した.本研究では環状ポリエーテル及びポリエーテル系の非イオン界面活性剤を用い,ポリエーテルの分子認識能,疎水性の双方の機能を水系溶媒中でのイオン会合反応と相乗的に活用した.擬均一系水溶液で分離分析を行うためにキャピラリー電気泳動法を活用し,フェニルアルキルアンモニウムの包摂反応,アルキルピリジニウム,アルキルイミダゾリウムのミセル結合反応を解析した.また,環状ポリエーテルの包摂によるアルカリ金属イオンの疎水性増加をテトラフェニルボレート系イオンとの水溶液内イオン会合反応で実証した.本研究は,水系溶媒中におけるポリエーテルの分子認識能に焦点をあて,単分子系ポリエーテルと分子集合体系ポリエーテルによる包接現象を対象として,キャピラリーゾーン電気泳動における分離選択性の発現因子の解明を目的とする.分子間相互作用である包接現象は,キャピラリー電気泳動法での電気泳動移動度の変化を用いて,その反応平衡を解析した.本年度の研究では,基本的な反応である環状ポリエーテルによるアミノ基の包接反応から着手した.環状ポリエーテルには18-クラウン-6-エーテルを用い,o-,m-,p-フェニレンジアンモニウムの包接平衡を解析した.三種類のフェニレンジアンモニウムの中では,p-フェニレンジアンモニウムで大きな包接定数が得られた.o-フェニレンジアンモニウムでは,隣接するアンモニウム基によりクラウンエーテルの包接は立体障害をうけると予想され,本法では解析できないほど小さな包接定数であった,また,フェニルアルキルアンモニウムの包接では,アルキル鎖長の伸長とともに包接定数が大きくなり,水溶媒中における疎水性相互作用が示唆された.分離分析の観点からは,環状ポリエーテルを用いることで,キャピラリー内壁への吸着を抑制することができた.また,ポリエーテル部位を有する非イオン界面活性剤のBrij 58を用い,分子集合体ミセルとしての結合反応選択性を検討した.陽イオンであるアルキルピリジニウムイオン,アルキルイミダゾリウムイオンの結合定数は,同程度の分子サイズを有する陰イオンよりも小さいことがわかった.ミセル中のポリエーテル部位が泳動液中のナトリウムイオンを包接しているため,陽イオンの結合反応は実際にはイオン交換反応であり,陰イオンの結合とは反応機構が異なるために結合定数に差異が出ることを明らかにした.本研究は,水系溶媒中におけるポリエーテルの分子認識能に焦点をあて,単分子系ポリエーテルと分子集合体系ポリエーテルによる包接現象を対象として,キャピラリーゾーン電気泳動における分離選択性の発現因子の解明を目的とするものである.これまでに,ポリエーテル系非イオン界面活性剤ミセルへの陽イオン種の結合反応について,結合定数の値,メチレン鎖長に起因する疎水性増加の効果とも,陰イオン種と比較して弱いことを明らかにしている.本年度の砺究では,イオセ会合試薬として用いられるテトラフェニルボレート系陰イオンに関して,ポリエーテルであるクラウンエーテルによる包接も含めたアルカリ金属イオンとのイオン会合平衡を検討した.クラウンエーテルによるアルカリ金属イオンの包接現象に基づく疎水性増加により,テトラフェニルボレート系陰イオンめイオン会合性は増加した.この研究の過程において,テトラフェニルボレート類が水溶液内でのイオン会合反応に伴い分解する現象を見出し,疎水性の高い陽イオンで特に分解が促進された.これまでに酸性領域でのテトラフェニルボレート類の分解は報告されているが,イオン会合反応に伴う分解現象は新たな発見である.また,キャピラリー電気泳動法による分離分析の特徴を活用した平衡反応解析では,酸性領域で徐々に分解する酸塩基指示薬の酸塩基平衡においても,副反応である分解反応が共存する中で,主反応である酸解離平衡の解析が可能であることを見出し,テトラブロモフェノールフタレイン,テトラブロモフェノールフタレインエチルエステルの酸解離定数の決定に成功している.本年度は,ポリエーテルが存在する系での水溶液内イオン会合反応として,陰イオンのジピクリルアミネートイオンとアルカリ金属ークラウンエーテル錯体との反応に関して検討を進めた.ジピクリルアミンはイオン対抽出系で高いイオン会合性を示す陰イオンとして知られていたが,キャピラリー電気泳動法に基づく本法により水溶液内でのイオン会合性を解析したところ,Li+,Na+,K+,Cs+,及び第四級アンモニウムイオンとのイオン会合性に劇的な変化はなく,K+の沈殿選択性,抽出選択性には水溶液内イオン会合性以外の因子が作用していることが推察された.対陽イオンとしてのアルカリ金属イオンを,18-クラウン-6によりクラウンエーテル錯体としてイオン会合試薬として用いたところ,Na+,K+,Cs+錯体でジピクリルアミネートイオンとのイオン会合性が高まり,ポリエーテルによる錯形成の効果が確認された.なお,クラウンエーテルの錯形成能は弱いので水溶液中には遊離のアルカリ金属イオンとクラウンエーテル錯体との2種類の陽イオン種が存在するが,本研究で二種類の陽イオンが混在する系での解析に初めて成功した.

また,二次元構造を有するグラフェンの分離分析を目的として,ドデシルベンゼンスルホン酸を疎水性ミセル媒体として用いるミセル動電クロマトグラフィーにより,グラフェンと欠損を有する酸化グラフェンとの分離分析に成功した.通常用いられるSDSミセルではグラフェンの凝集を防げなかったことから,ドデシルベンゼンスルホン酸とグラフェンとの間の芳香環相互作用がミセル溶液中でのグラフェンの単分子分散に寄与していると考察した.測定装置の経年劣化による故障と修理,年度の途中での大学間の異動,の不測の事態が生じたが,ポリエーテル系界面活性剤ミセルの分配反応場としてのイオン性物質に対する選択律の解明,クラウンエーテル包接錯体によるイオン会合反応に関する研究は順調に進展している.24年度が最終年度であるため、記入しない。テトラフェニルボレート類のイオン会合反応を取り扱う研究の過程で,徐々に進行する速度論的反応が共存する平衡反応系においても,キャピラリー電気泳動法の均一溶液系での分離分析の特長を活用して,速度論反応の影響を受けずに主反応である平衡解析が可能であることを見出した.速度論的反応の促進/抑制に及ぼすポリエーテルの効果,主平衡反応への影響に関して研究を推進する予定である.対象とする反応系としては,酸解離平衡,イオン会合平衡を主平衡とし,分解反応が速度論的な副反応となる反応系を予定している.24年度が最終年度であるため、記入しない。
Ｉｎ　ｖｉｖｏイメージングによる唾液腺機能の可視化と神経制御システムの解明

ウイルスベクターを使って唾液腺にCa2+センサーを発現させ、生きたラットの唾液腺におけるCa2+応答の可視化に成功した。この技術により、アセチルコリン刺激で起こる唾液腺組織全体で同期したCa2+オシレーションや、舌神経刺激を介する反射的副交感神経刺激でおこる局所的Ca2+応答が明らかになった。また唾液分泌のリアルタイム解析と血流イメージングによって、唾液分泌の調節におけるCa2+シグナルと血流変化の関係が明らかになった。さらに従来のFRET型IP3センサーの約5倍の大きなFRETシグナルが得られるCFLA法を開発し、これを利用したIP3定量法を確立した。In vivoイメージングに使用するFRET型のCa2+センサー、cAMPセンサー、IP3センサー発現用ウイルスベクターを作成し、培養耳下腺細胞(HSY細胞)を使ってそれらの反応性を確認した。また、新規購入した共焦点レーザー顕微鏡システムで、これらの反応が解析できる事を確認した。さらに、これらのウイルスをラット顎下腺の導管から注入し、顎下腺腺房細胞に発現させる事に成功した。Ca2+センサー遺伝子を使ったin vivo Ca2+イメージング解析の予備実験として、Ca2+蛍光色素fura-2を取り込ませた顎下腺のCa2+応答を低倍レンズを用いた落射蛍光照明イメージングで解析した。この実験では蛍光色素fura2を耳下腺および顎下腺に取り込ませ、カルバーコル刺激による細胞内Ca2+濃度の上昇を確認した。遺伝子発現型Ca2+センサーYC-nano50やG-GECOを使ったイメージング解析では、刺激薬の滴下、腹腔内投与、および静脈投与によるCa2+応答が確認された。さらに今後の研究で実施する、神経刺激によるCa2+応答に関する研究の予備実験として、舌神経刺激による唾液分泌を確認した。導管のCa2+応答に関する研究の予備実験として、単離耳下腺導管および顎下腺組織を用たイメージング解析で、導管細胞の自発的Ca2+オシレーションと形態変化を共焦点レーザー顕微鏡を用いて解析した。cAMP動態に関する研究では、FRET型cAMPセンサーを発現させた細胞で、反応性が認められなかった。従って、新たに発光型cAMPセンサーの使用を試みた。この発光センサーを発現させた細胞をイソプロテレノールで刺激すると、細胞内cAMP濃度の上昇による発光の増加を確認できた。そこで、この発光型cAMPセンサー遺伝子を組みこんだウイルスベクターを作成し、顎下腺に導入し、この発光cAMPセンサーの発現を確認した。1、アデノウイルスベクターを使って蛍光Ca2+センサー遺伝子を導入し、生きた動物の顎下腺細胞のCa2+応答を定量的に解析することに成功した。さらにCa2+応答と同時に、唾液分泌や血流変化をリアルタイムで解析できる実験系の確立によって、Ca2+応答と唾液分泌の関係が初めて明らかになった。また、α受容体刺激による腺房細胞の持続的Ca2+応答と一過性の唾液分泌から、唾液分泌と血管収縮反応の関係が明らかになった。さらに、舌神経の電気刺激によって、反射性に副交感神経を興奮させた場合は、唾液腺に小さなCa2+応答や唾液分泌が起こることが確認された。神経刺激によるCa2+応答は、薬物刺激と比較して局所的で小さな反応であるにも関わらず、薬物刺激に匹敵する唾液分泌が観察されたことから、Ca2+以外の細胞応答あるいは腺房細胞以外の細胞(例えば導管)が、分泌に関与する可能性が示唆された。2、新しい発光センサー(Nano Lanthern Ca2+やNano Lanthern cAMP)を使った発光イメージング解析を実施した。培養唾液腺細胞を使ったCa2+やcAMPの発光イメージング解析に加え、アデノウイルスベクターによる顎下腺腺房細胞への遺伝子導入によって腺房細胞のCa2+およびcAMPシグナルの発光イメージングに成功した。3、IP3センサーの開発従来の一分子FRETを使った蛍光IP3センサーの蛍光変化率を大きく上回るIP3センサーの開発を行った。この新しい蛍光センサーは蛍光タンパク質(CFP)あるいはシステイン結合性蛍光物質(DACM)でラベルしたIP3受容体のリガンド結合ドメインと蛍光リガンドの間のFRETを利用するもので、これまで最大15%程度であった従来のIP3センサーの蛍光変化率の10-20倍の変化率を示した。今後、このセンサーを細胞内に導入する方法を検討する。Ca2+応答による唾液分泌の調節機構:唾液腺のCa2+応答と唾液分泌の関係を明らかにするために、遊離顎下腺細胞を用いたCa2+動態の解析と、麻酔下のラットへのムスカリン受容体作動薬投与による唾液分泌を解析した。その結果、最大反応の約30%という小さなCa2+応答を起こす濃度の作動薬によって、ほぼ最大の唾液分泌が起こる事が明らかになった。