hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
枯草菌の分泌・代謝機能を改変する変異の探索とその活用

三重破壊株で同様の実験を行なったところ、この株ではzwf破壊株と同様に増殖能は低下したままであり、zwf glcP二重破壊株で観察された代謝産物量の変化も観察できなかった。以上のことから、glcP遺伝子破壊によるzwf破壊株の増殖回復効果はNTD合成を活性化することによりTCAサイクルの代謝中間体が蓄積し、TCAサイクルを通して細胞内NADPH量を増加させたことによるものと考えられた。物質生産向上に寄与する新たな変異株のスクリーニングでは、現時点では有望な変異株の単離までには至っていないが、枯草菌においてアミラーゼ生産を高めるバシトラシン耐性変異の同定には成功しており、当初の計画が順調に進展している。24年度が最終年度であるため、記入しない。物質生産向上に寄与する新たな変異株のスクリーニングが容易でないことは当初から予想されていたことである。スクリーニングに用いる薬剤を可能な限り試験するほか、選択濃度も種々変更してスクリーニングを継続することが重要である。
In vivo, in situ突然変異検出系を用いた環境および放射線リスク評価

個体内で起こる体細胞や生殖細胞の突然変異を、生体内の組織構築の「場」を壊すことなく検出する事をモデル動物にて実現した。これにより、放射線や環境変異原の暴露により生じる細胞の突然変異リスクについて、被ばく後の時間と組織内の三次元的情報を加えて計測することが可能となった。本システムは、組織をすりつぶしてDNAを抽出するといった従来法に対しては革命的である。我々の方法は、体内で起こる細胞の突然変異を生きたまま観察することを可能とし、組織幹細胞の突然変異とその増殖動態を明らかとした。今回作製したHPRTdupGFPマウスは公的バンクにも登録され、世界中に配布される。商業的利用に関しては特許も取得した。本研究は、放射線や環境変異原の暴露によりモデル動物体内で生じる突然変異細胞をライブでとらえて観察し、個体レベルでのリスク評価に用いることを目標としている。突然変異細胞が組織の中で生きたまま光る(GFP蛍光等を発する)システムを遺伝子組換え(knock-inとtransgenic)で作製する作業をマウスで行った。特定遺伝子座の変異指標として、X染色体上のHPRT遺伝子の部分重複からの復帰変異(reversion)にて細胞がGFP陽性になるマウス系統をES細胞のknock-inにより作製した。このマウス(HPRTdupGFP)を用いて、放射線被ばくによる各種臓器(肝臓や膵臓、小腸など)内での体細胞突然変異誘発リスクについて評価実験を行った。胎児被ばくの影響実験も開始した。メダカでも同様なシステム構築を開始した。体内で生じる突然変異細胞のゲノム変異解析、変異発生率に影響を与える遺伝的要因を明らかにする目的で、メダカにて特定遺伝子破壊系統を複数作製し、変異検出モデルメダカとの交配の準備段階に入った。培養幹細胞、組織幹細胞の突然変異特性を解析するシステムを構築した。さらに、前進性突然変異(forward mutation)やがん遺伝子のLOHにより細胞が光るモデル動物の作製も開始した。これら全体の研究を統括して、個体レベルでの体細胞突然変異の発生をマクロおよびミクロでとらえる本グループ研究の全体像が定まってきた。第一段階の研究成果を論文としてまとめる作業に入った。突然変異細胞が組織の中で生きたまま光る(GFP蛍光等を発する)システムをマウスとメダカで作製し、さらにはその発展型として、体細胞でのLOHにて起こる発がんをライブでとらえるシステムをメダカでつくることを目指している。マウスにおいては復帰突然変異にて細胞がGFP陽性になる系(HPRTdupGFPマウス)が確立し、次のステップとしてがん抑制遺伝子に変異が起こると体細胞が生きたまま光る(GFP陽性となる)マウスシステム開発も行った。これについては候補マウスが誕生し始めている段階である。以上の結果から、個体レベルにおいて、組織・器官の構造を完全に把握しつつ、体細胞突然変異の発生と変異細胞の広がり(増殖)を観察できる(つまり本研究の主題であるin vivo, in situで突然変異細胞を見る)システムが達成されつつある。このシステムを用いて、組織幹細胞の突然変異頻度を見ること、変異細胞の全ゲノム解析を行うこと、さらには組織幹細胞と機能分化細胞の突然変異頻度・発生様式の違いを解析する実験段階に入った。全体の研究を統括して、個体レベルでの体細胞突然変異の発生をマクロおよびミクロでとらえる本グループ研究の全体像が定まってきた。年度末に班会議を行い、今後の共同研究体制について意見を交換した。第一段階の研究成果を論文として投稿した。本研究は、放射線や環境変異原による体細胞や生殖幹細胞の突然変異リスクを、組織細胞の「場」、つまり組織の構築を壊すことなく生きたままの状態で測定するマウスおよびメダカシステムを作製することを第一の目標としている。具体的には、(1)突然変異が生じると細胞が生きたまま光る(GFP陽性となる)システムを個体レベルで達成する。(2)これを用いて、既存の系とは全く異なり、より直接的に体細胞突然変異リスクを評価することが可能な実験システムを確立する。最終的には、組織の再構築の場である組織幹細胞と、それから派生する分化して機能する細胞に対する環境・放射線リスク評価を個体を構成する全ての細胞についてin vivo、in situで可能とし、内在する分子メカニズムや遺伝的背景の影響研究へと踏み込む。(3)世界共通のin vivoリスク評価系としてのモデル動物を確立し、実用化レベルまで検査法を整えた後、広く配布する。本年度はモデルマウスシステムの完成と評価結果について論文を発表した。また、モデルメダカシステムの実行性も検証した。同時に、モデル動物の遺伝的背景を改変する目的でのTALEN-CRISPRシステムの導入もマウス、メダカで行い、いくつかの修復遺伝子変異系統を作製した。生体組織内で生じる突然変異細胞の全ゲノム解析のシステムをメダカで準備した。体内で生じる突然変異を生きたまま、ライブでとらえる(突然変異細胞が光る)事が可能なマウス系統(HPRTdupGFPマウス)の作製に成功した。このマウスでは少なくとも、肝臓、膵臓、小腸、肺、脾臓リンパ球、甲状腺上皮、精原細胞などで生じた突然変異細胞が蛍光顕微鏡下と凍結組織切片で観察できることが確認された。また、フローサイトメーター解析では、組織由来の変異細胞を生きたまま検出、分離が可能であった。マウス系統の確立を報告する論文をPlosOne誌にて発表した。マウスの商業的用途としては、日本国内特許を取得した。

研究用途としては広く配布する事を目的として公共の変異マウス資源バンク(例えば国立医薬基盤研究所バンク、理化学研究所生物資源バンク、アメリカジャクソン研究所マウス資源バンク)に寄託する計画を立てた。第二世代ノックインマウスとして、がん抑制遺伝子p53に変異が生じると細胞が光るマウス作製もほぼ最終段階であり、有効性を検証するところまで到達した。メダカでは、p53のLOH発生に依存した癌の発生をモニターするシステム(Mit-xmrk/p53(+/-))が実用段階に入った。体の中で生じる突然変異細胞の全ゲノム解析のシステム構築も引き続き行った。分化した体細胞と、未分化組織幹細胞の突然変異成立過程の相違について、in vitro, in vivoでの実験システムを構築しつつある。突然変異細胞のみならず、被ばく細胞集団の同定を目的としたバイオマーカー探索作業も引き続き行い、候補遺伝子(蛋白質)の絞り込みを行った。本研究は、放射線や環境変異原による体細胞や生殖幹細胞の突然変異リスクを、組織細胞の「場」、つまり組織の構築を壊すことなく生きたままの状態で測定するマウスおよびメダカシステムを作製することを第一の目標としている。具体的には、(1)突然変異が生じると細胞が生きたまま光る(GFP陽性となる)システムを個体レベルで達成する。(2)これを用いて、既存の系とは全く異なり、より直接的に体細胞突然変異リスクを評価することが可能な実験システムを確立する。最終的には、組織の再構築の場である組織幹細胞と、それから派生する分化して機能する細胞に対する環境・放射線リスク評価を個体を構成する全ての細胞についてin vivo、in situで可能とし、内在する分子メカニズムや遺伝的背景の影響研究へと踏み込む。(3)世界共通のin vivoリスク評価系としてのモデル動物を確立し、実用化レベルまで検査法を整えた後、広く配布する。本年度は、作製したモデルマウスシステムの応用のひとつの可能性として、生殖幹細胞のin vivoおよびin vitro放射線誘発突然変異検出のシステム構築を始めた。また、モデルメダカシステムも完成し、放射線の影響の有無を検証する実験に着手した。少なくとも、体細胞のモザイシズムは発生の段階から観察できることを確認した。同時に、モデル動物の遺伝的背景を改変する目的でのTALEN-CRISPRシステムの導入もマウス、メダカで行い、いくつかの修復遺伝子変異系統を作製した。組織幹細胞における突然変異成立メカニズム研究の材料は揃った。体内で生じる突然変異を生きたまま、ライブでとらえる(突然変異細胞が光る)事が可能なマウス系統(HPRTdupGFPマウス)の作製に成功した。このマウスでは少なくとも、肝臓、膵臓、小腸、肺、脾臓リンパ球、甲状腺上皮、精原細胞などで生じた突然変異細胞が蛍光顕微鏡下と凍結組織切片で観察できることが確認された。また、フローサイトメーター解析では、組織由来の変異細胞を生きたまま検出、分離が可能であった。
タケ亜科植物における推定雑種検出を可能とするDNAバーコーディングの検討

ササ類は容易に雑種を形成し、外部形態による同定が非常に困難である。本研究は、葉緑体および核遺伝子マーカーがササ類の雑種を検出するのに有効か否か検討した。東京大学秩父演習林と同北海道演習林において、2種のササ類の分布が重複する領域を含むようにそれぞれ37、16個体を採集した。外部形態による同定の結果、それぞれ属間および種間雑種が確認された。遺伝解析の結果、核遺伝子・花成促進遺伝子FLOWERING LOCUST(FT)が雑種の推定に有効な可能性を示した。本研究は、日本列島固有植物であるタケ亜科植物において、葉緑体遺伝子マーカーに加え、核遺伝子である花成遺伝子をターゲットとして雑種性の有無と両親種の推定を検討することを目的とする。今年度は以下の内容を実施した。1.サンプリング:東京大学大学院農学生命科学研究科附属演習林の北海道演習林および秩父演習林においてササ類の分布を確認した。北海道演習林では、高標高域にチシマザサが、低標高域にクマイザサが分布しており、秩父演習林では、高標高域にミヤコザサが、低標高域にスズダケが分布する。両演習林において2種のササ類の分布域が重複する場所を調査地とし、種間雑種と考えられる個体群を探索した。推定雑種個体群を含む高標高から低標高域の範囲において一定間隔に約30個体を根際より採集した。採集場所の位置情報はGPSによって取得し、証拠標本は押し葉標本にして東京大学千葉演習林内で保管した。2.DNA抽出:証拠標本の葉から1cm四方の断片を切り取り、破砕機により粉砕した。粉末をバッファーに懸濁後、FTA Plant Cardに滴下し、風乾させて葉に含まれる全DNAを抽出精製した。3.PCR法:葉緑体ゲノムマーカーrbcLおよびmatKに加え、核遺伝子マーカーとして花成遺伝子PmFT遺伝子のプライマーを設計し、PCR増幅を行ない、プライマーの有効性を検討した。来年度は証拠標本の詳細な同定を行なうとともに、候補遺伝子の塩基配列情報を獲得し、標本の同定結果と照らし合わせ、ターゲット領域の有効性を検討する。本研究により、推定雑種起原の限りない中間形や複合体によって同定が極めて困難なタケ亜科植物において、誰にでも同定可能な簡明な検索システムを構築することが可能となる。日本列島準固有植物であるササ類は冷温帯林床優占種として森林施業においても重要な分類群であるが、浸透性交雑により生じた限りない中間形や複合体が存在し、外部形態による同定が非常に困難である。本研究は、DNAバーコーディングの手法に基づき、推定雑種分類群を含むササ類において葉緑体および核遺伝子を解析し、雑種およびその両親種を検出可能なマーカーとしての有効性を検討することを目的とした。東京大学秩父演習林において標高920m1910mに分布するササ類37個体を、同北海道演習林において標高530m1200mに分布するササ類16個体を採集した。外部形態による同定結果から、秩父演習林では高標高域にミヤコザサが、低標高域にスズダケが分布し、標高1800m付近にササ属とメダケ属の推定雑種ヒシュウザサが確認された。北海道演習林では1200m地点にチシマザサが、530m地点にクマイザサが確認された以外はチシマザサ-チマキサザ複合体のオクヤマザサであった。遺伝子解析の結果、rbcL配列ではスズダケ属に特異的な1塩基置換が検出された。花芽運命決定遺伝子LFY配列では変異は検出されなかった。花成促進遺伝子FT配列では複数の1塩基置換と336bpの挿入欠失が検出された。FTとrbcLの系統解析を比較した結果、FT配列は属間雑種の推定には利用できないが、浸透交雑した種間雑種の推定には有効な可能性が示された。本研究により有用な核遺伝子マーカーが開発されれば、推定雑種起原のササ類において、誰にでも同定可能な簡明な検索システムを構築することが可能となり、生物多様性の保全のみならず林業などの産業分野においても応用可能な技術となると期待される。
変動する社会における刑罰の実態分析とその改革のマスタープラン

(1)全国の刑事施設および更生保護関連機関等に関する実態調査およびデータベース作成:統一的な調査を実施するため、「施設調査票」を作成し、全国的に施設参観を実施した。その他、元矯正施設職員、施設関係での訴訟を提起している当事者、弁護士等から、日本または海外の矯正施設の現状や新たな立法動向等についての聴き取りを行った。これらの調査から、刑事施設が現在抱えている最大の問題は過剰収容であり、それによって、施設運営も保安的観点が重視され、処遇面がおろそかにされるおそれがある等の状況が把握された。日本の刑罰システムに関する総合的なデータベース作成については、国内外のインターネット上で提供されている情報を利用しやすい形態にまとめた。その他、海外については、NGOの発行した年次活動報告書、欧州人権裁判所の重要判例関する資料を収集した。日本については、近代監獄改革関連事項に関する年表を2001年度分まで完成させた。(2)現行制度および運用に関する評価・分析、ならびに「対案の」提示:かつて本研究会が、拘禁二法案への対案として作成した『刑事拘禁法要綱案』(1996年)につき、改訂作業を行った(「改訂・刑事拘禁法要綱案」)。改訂に際しては、近年、日本においてもNGO活動が盛んとなりつつあることや、行政機関の情報公開に対する意識が高まっていること等、新しい社会の動向にも注目した。主な改訂のポイントは、施設内処遇に市民が協力するという形態を積極的に採用したこと、施設処遇に対する第三者機関としての市民の監視を充実させたことにある。刑事施設の抱える問題点に対する一つの回答でもあり、施設だけで処遇を担うのではなく、一般社会と連携しながら、また一般社会に対しアカウンタビリティを果たしながら施設を運営していくべきであるとの方向性を示したものである。改訂作業に加え、改訂要綱案に基づく施設運営の実現可能性についても検討を行った。そのために、数名の被収容者を想定し、入所時から出所時までのシミュレーションを作成した。(3)研究成果の公表およびシンポジウムの開催:以上の研究成果を広く公表するために、研究会のホームページを立ち挙げた。2002年3月9日には、法政大学において、「21世紀の刑事施設-グローバル・スタンダードと市民参加」と題するシンポジウムを開催した。本年度は、まず、日本の刑罰システムに関する総合的なデータベース作成に関して、データ入力用のデータベースソフトの作成に着手した。資料については、公刊物に登載されている文献だけでなく、インターネット上で提供されている資料や一般には入手しにくいニュース等の収集に努めた。今後は、一層の資料収集を実施していく一方、収集した資料の分析を進めていく予定である。次に、刑事施設および更正保護関連機関等の実態調査ならびに刑事施設および更正保護関連機関等のハード面ソフト面に関する統計的調査に関して、まず全国規模での調査を統一的に行うために、調査・質問すべき事項を一覧にした「施設調査票」を作成した。これにより、各施設の実態についての的確で効率的な調査を行えるものと考えている。この調査票に基づく本格的調査と予備的な調査を含めて、全国28施設の調査を実施した。

具体的には、黒羽刑務所・喜連川少年院・宮城刑務所・府中刑務所・小田原少年院・栃木刑務所・福岡少年院・山形刑務所・笠松刑務所・多摩少年院・愛光女子学園・和歌山刑務所・宇治少年院・京都医療少年院・京都刑務所・奈良少年院・奈良刑務所・奈良少年鑑別所・交野少年院・浪速少年院・大阪拘置所・大阪刑務所・瀬戸少年院・熊本刑務所・札幌刑務支所・静岡勧善会・駿府学園・静岡少年鑑別所の各施設である。なお、この調査には、合宿時に多数の研究分担者で行ったもの、地域別に数人の研究分担者が集合して行ったもの、大学のゼミナールでの施設参観の機会に研究分担者が単独で行ったものが含まれている。予備的な調査については、再度本格的調査を行う予定である。また、元矯正施設職員や施設関係での訴訟を提起している当事者等からの聞き取り調査を行い、刑事施設の実態・問題点についての把握に努めた。あわせて国連などの国際的な動向についても参照しながら、現行法・現行制度の問題点について検討を行った。本年度は、まず日本の刑罰システムに関する総合的なデータベース作成作業の一環として、公刊されておらず一般にはアクセスの困難な資料の収集に努めた。国内に関しては、受刑者が刑務所職員を相手取って起こした損害賠償請求訴訟等、行刑関係の末公刊判例や訴訟資料を収集した。また海外に関しては、National Association for the Care and Resettlement of OffendersやPenal Reform lnternational等のNGOの発行した年次活動報告書、European Court of Human Rightsの出した重要判例、更には欧米の行刑関連施設に関する資料を収集した。これらについては、データベース化して今後の研究に活用していく予定である。刑事施設および更生保護関連機関等の実態調査ならびに刑事施般および更生保護関連機関等のハード面ソフト面に関する統計的調査に開しては、昨年度に引き続いて施設調査表に基づく統一的な調査を行った。本年度調査を行った施設として、刑務所等として姫路少年刑務所・名古屋刑務所・名古屋拘置所・旭川刑務所・函館少年刑務所・札幌刑務所・札幌刑務支所・八王子医療刑務所・横須賀刑務所、少年院として駿府学園・播磨学園・和泉学園、更生保護会として勧善会・和衷会・宝珠園・盟親がある。また、前年度調査した施設と併せ、調査結果の中間的総括を行った。本年度はまた元矯正施設職員、弁護士、ジャーナリスト等からわが国ならびに海外の矯正施設の現状や新たな立法動向等についての聞き取りを行った。以上収集した知見については、全て次年度以降に作成する「監獄改革マスタープラン」に活かしていく予定である。本年度は、まず日本の刑罰システムに関する総合的なデータベース作成作業の一環として、公刊されていないために、アクセスが困難な資料の収集を引き続き行った。近代監獄改革関連事項に関する年表については1996年までは完成させた。これらの成果を公表するために、ホームページも立ち上げた。刑務作業や刑務所内での教育に関する英語文献の翻訳も併せて行った。
慢性関節リウマチの病因、病態におけるサブスタンスPを中心とする神経系の関与の解明

我々は、本期間中に慢性関節リウマチの病態においてSubstanceP(SP)を中心とした神経系の関与について研究をすすめてきた。慢性関節リウマチの関節液中には変形性膝関節症の関節液中に比べて有意に高濃度のSPが存在しその濃度はIL-1濃度および関節液中の白血球数と相関すること、そのSPの由来として関節腔内に存在する知覚神経終末の他に、滑膜中に侵潤した細胞がSPを産生している可能性のあること、これらの細胞にSPの前駆体であるpreprotachykininのmRNAの発現すること、リウマチ滑膜培養細胞において、初代培養の種々の細胞が混在している状態では細胞からのSP産生をみとめることなどを報告してきた。これらのことより、慢性関節リウマチの病態には免疫系と神経系の二方向性を持つ密接な関係が存在しており、リウマチ滑膜からのSP産生には種々の免疫細胞やこれらの細胞の産生するサイトカインの働きが重要であると考えられる。我々はリウマチ滑膜細胞におけるサイトカイン産生に対するSPの影響や、反対に滑膜細胞のSP産生に対するサイトカインの影響についてリウマチ滑膜培養細胞を用いた培養液中のサイトカインやSPの濃度測定やRT-PCRをもちいmRNAレベルでの検討を行なったが、今回は一定の結果を得ることができなかった。今後サイトカインの種類、濃度について再検討し、また他のニューロペプタイドやオピオイドペプチドについて又、これらのレセプターの存在についても検討を加える必要がある。Substancep(SP)は神経伝達物質としての働きの他に炎症におけるメディエーターとしても知られている。我々はSPが慢性関節リウマチ(RA)の関節液中に変形性膝関節症(OA)関節液中に比し有意に高濃度に存在する事を認めた。関節液中SP濃度は同関節液中の白血球数、IL-1濃度と有意な正の相関関係を示し炎症の重症度と相関するものと考えられた。関節液中SP放出源として、滑膜、関節包等に存在する知覚神経終末と、滑膜中の細胞が考えられる。我々は滑膜深層の血管周囲に豊富なSP陽性神経線維と滑膜表層下領域間質に存在するSP陽性細胞の存在を免疫組織学的手法を用いて認めた。又、滑膜中の細胞によるSP産生を確かめる目的でSPの前駆体であるpreprotachykinin(PPT)のoligonucletideDNAprobeを用いたin situhybridization法によりRA滑膜中のPPTmRNAの発現を検討した。ISH法ではRA滑膜の滑膜表層下領域間質における細胞にPPTのmRNAの発現を認め、これらの細胞によるSP産生を確認した。正常滑膜、OA滑膜中ではPPTmRNAは認められなかった。これらの事より、RAにおいて、SPは知覚神経終末より放出され、関節内に浸潤する多くの細胞を活性化させ炎症を増悪化させると共にこれらの細胞の一部は自らSPを産生し、さらに炎症の増悪化、持続化に関与しているものと考えられる。前年までに慢性関節リウマチ(RA)の関節液中に変形性関節症(OA)に比べて有意に高濃度のSubstance P(SP)が存在し、その濃度は関節内の炎症の重症度と相関すること、さらに、その由来として関節腔内に存在する知覚神経終末のほかに、滑膜中の浸潤細胞がSPを産生している可能性について報告した。このことを証明するために、SPの前駆体である、preprotachykininのmRNAのRA滑膜における発現をin situ hybridization法により確認したが、今年度はRA、OA滑膜培養細胞を用いて実験を行った。滑膜組織は手術時採取し培養実験に使用した。実験開始後、1週間-10日間で細胞はconfluentに達したが、初代培養細胞は、マクロファージ様細胞、樹状様細胞、線維芽様細胞等の種々の細胞が混在していた。しかし、その後、継代培養を続けると、ほとんどの細胞が線維芽様細胞に置き換わってしまった。新鮮な培養液に変換し、48時間後、これら培養上清中のSPをラジオイムノアッセイを用いて測定した。

その結果、RA初代培養上清からは、SP様免疫活性が検出されたものの、RA6代培養上清、OA培養上清からはSP様活性は検出されなかった。このことより、RA滑膜中細胞におけるSP産生にはマクロファージ等の種々の細胞の存在が重要であることが示唆された。今後、このSP産生細胞のさらなる特徴の解明と種々のサイトカインやニューロペプタイドとの関連について研究を進めていく方針である。前年度までに慢性関節リウマチの病態においてSubstancep(SP)を中心とした神経系の関与について研究をすすめてきた。慢性関節リウマチの関節液中には変形性膝関節症の関節液中に比べて有意に高濃度のSPが存在しその濃度IL-1濃度および関節液中の白血球と相関すること、そのSPの由来として関節腔内に存在する知覚神経終末の他に、滑膜中に浸潤した細胞がSPを産生している可能性のあること、これらの細胞にSPの前駆体であるpreprotachykininのmRNAの発現すること、リウマチ滑膜培養細胞において、初代培養の種々の細胞が混在している状態では細胞からのSP産生をみとめることなどを報告してきた。これらのことより、慢性関節リウマチの病態には免疫系と神経系の二方向性を持つ密接な関係が不足しており、リウマチ滑膜からのSP産生には種々の免疫細胞やこれらの細胞の産生するサイトカインの働きが重要であると考えられる。今年度はリウマチ滑膜細胞におけるサイトカイン産生に対するSPの影響や、反対に滑膜細胞のSP産生に対するサイトカインの影響についてリウマチ滑膜培養細胞を用いた培養液中のサイトカインやSPの濃度測定やRT-PCRをもちいmRNAレベルでの検討を行なったが、今回は一定の結果を得ることができなかった。今後サイトカインの種類、濃度について再検討し、また他のニューロペプタイドやオピオイドペプチドについて又、これらのレセプターの存在についても検討を加える必要がある。
生体膜共役輸送系の進化と生理-海産藻類はNa+を必須とするか

生体膜共役輸送系は、栄養の取り込みや老廃物の排出に働き、細胞存続の基盤となる輸送系である。H+共役型とNa+共役型が知られていて、植物と動物を区別する大きな要素である。我々は陸上植物の祖先種とされるシャジクモのリン酸輸送系はNa+共役型であることを報告し、細胞膜型リン酸輸送体遺伝子を単離し、それが高等植物の細胞膜リン酸輸送体全ての祖先型であることを見出した。本研究では、この共役輸送系の進化を明らかにするために、シャジクモ類のさらなる祖先種として、海水から汽水までの多様な環境で生育できる緑藻類の一つアオサ類の栄養塩輸送機構に着目し、遺伝子解析と膜輸送生理解析を組み合わせ、海藻の生体膜共役輸送系の分子基盤と進化を明らかにすることで、海水環境→淡水環境→陸上という、光合成生物の生態の進化を、生体膜共役輸送系という分子の言葉で記述することを目指した。本年度は、昨年度の最後の実験に引続き、実験材料Ulva compressa(ヒラアオノリ)の、Na+欠乏条件の生育下において、これまで多くの植物で知られていた膨圧によるイオン調節機構とは異なる機構が存在することを見いだし、その解析を検討した。また、シャジクモのリン酸輸送系として単離した遺伝子CbPht1が、本当にNa+共役輸送系かどうかの機能解析を、アフリカツメガエルの未受精卵を用いて、放射性同位体によるフラックス測定と電気生理学的解析の二つの方面からNa+依存性の確定実験を行った。本年度は、実験材料Ulva compressa(ヒラアオノリ)が、Na+欠乏条件でも成長速度は落ちるが生育できることを見いだし、放射性リンを用いた取り込み実験から、必須栄養塩としてのリン酸の輸送には、H+共役型とNa+共役型であることを明らかにした。さらにアオサ属のリン酸輸送体の解析から、陸上植物の葉緑体包膜に存在する輸送体のホモログが、アオサでは細胞膜に存在する可能性を見いだし、その解析を進めている。また、Na+欠乏条件の生育下において、これまで多くの植物で知られていた膨圧によるイオン調節機構とは異なる機構が存在することを見いだした。それがどのような機構かの解析も行っている。本研究では、リン酸輸送機構の進化を中心に解析を進めており、その目的については、生理レベルの解析、遺伝子レベルの解析について、当初の予定通りの研究が進んでいる。さらに、その解析過程で、異なるNa+欠乏条件下で藻体を生育させた際に、細胞内Na+濃度の調節が細胞の膨圧とリンクしないことを見いだした。これは、これまで植物生理学の常識であった、細胞の膨圧変化が、細胞内のイオン調節のトリガーとなるということと大きく異なっているため、現在その現象の追試を進めている段階である。細胞内Na+濃度の調節過程は、Na+共役型イオン輸送機構の進化を探る研究目的そのものとも密接に関わることがらであり、現在、その解析をも視野に入れつつ研究を進めているところである。本年度は、昨年度に引続き実験材料Ulva compressa(ヒラアオノリ)が、Na+欠乏条件でどのような生理応答をするかを検討し、海水環境からNa+欠乏環境に移した時に、極めて迅速に細胞内Na+のみを選択的に減少させること明らかにした。また、この時外液の浸透圧をSorbitolによって海水と同じ値に保っておくと、外液Sorbitolの流入によって浸透圧は維持されるが、Na+は選択的に減少することが明らかになった。これは、これまで植物細胞で知られていたイオンや浸透圧調節とは全く異なる機構である。

また、アオサ類のRNA-seq解析から、リン酸輸送体と想定される遺伝子を二つ見つけた。さらに、シャジクモ細胞膜リン酸輸送体をクローニングし、そのcRNAをアフリカツメガエルの未受精卵に導入することで、生理機能と分子構造の関係の解明を進めている。アオサ属のリン酸輸送体がシャジクモの物とどのように異なるかの検討も行った。本研究では、リン酸輸送機構の進化を中心に解析を進めており、その目的については、生理レベルの解析、遺伝子レベルの解析について、当初の予定通りの研究が進んでいる。さらに、その解析過程で、異なるNa+欠乏条件下で藻体を生育させた際に、細胞内Na+濃度の調節が細胞の膨圧とリンクしないことを見いだし、それが外液浸透圧調節物質の流入とリンクすることを明らかにした。これは、これまで植物生理学の常識であった、細胞の膨圧変化が、細胞内のイオン調節のトリガーとなるということと大きく異なっているため、現在その現象の解析を進めている段階である。細胞内Na+濃度の調節過程は、Na+共役型イオン輸送機構の進化を探る研究目的そのものとも密接に関わることがらであり、現在、その解析をも視野に入れつつ研究を進めている。さらに、シャジクモPht1型リン酸輸送体の生理機能と分子構造の関係の解明を進め、現在予備実験段階ではあるが、これまでH+共役とされていたPht1型リン酸輸送体がシャジクモの場合はNa+共役である可能性が示唆されている。生体膜共役輸送系は、栄養の取り込みや老廃物の排出に働き、細胞存続の基盤となる輸送系である。H+共役型とNa+共役型が知られていて、植物と動物を区別する大きな要素である。我々は陸上植物の祖先種とされるシャジクモのリン酸輸送系はNa+共役型であることを報告し、細胞膜型リン酸輸送体遺伝子を単離し、それが高等植物の細胞膜リン酸輸送体全ての祖先型であることを見出した。本研究では、この共役輸送系の進化を明らかにするために、シャジクモ類のさらなる祖先種として、海水から汽水までの多様な環境で生育できる緑藻類の一つアオサ類の栄養塩輸送機構に着目し、遺伝子解析と膜輸送生理解析を組み合わせ、海藻の生体膜共役輸送系の分子基盤と進化を明らかにすることで、海水環境→淡水環境→陸上という、光合成生物の生態の進化を、生体膜共役輸送系という分子の言葉で記述することを目指した。本年度は、昨年度の最後の実験に引続き、実験材料Ulva compressa(ヒラアオノリ)の、Na+欠乏条件の生育下において、これまで多くの植物で知られていた膨圧によるイオン調節機構とは異なる機構が存在することを見いだし、その解析を検討した。また、シャジクモのリン酸輸送系として単離した遺伝子CbPht1が、本当にNa+共役輸送系かどうかの機能解析を、アフリカツメガエルの未受精卵を用いて、放射性同位体によるフラックス測定と電気生理学的解析の二つの方面からNa+依存性の確定実験を行った。今後の研究として、1.アオサ類におけるリン酸輸送体遺伝子の推定:現在、アオサ類のRNA-seqを進めており、リン酸輸送体と想定される遺伝子が見つかった場合は、その配列構造をこれまでの系と比較することで、Na+共役輸送かH+共役輸送かを推定するとともに、酵母などの異種遺伝子発現系を用いて、実際の輸送能を明らかにする。2.リン酸環境とNa+環境の認識:
16・17世紀中国北部辺境における多元社会の形成と発展

16世紀の中国辺境社会の変化は,二つの領域において顕著であった。海上の辺境たる中国東南沿岸の港湾,島嶼から日本および東南アジア方面では,華夷混合の居留地や海賊集団が形成された。北辺の長城ライン内外および遼東地域では,越境した華人集団が形成され,モンゴルやジュシェンも積極的にかれらを保護し利用した。「北虜南倭」の危機は,上記のような辺境における華夷混合社会の形成を背景とするものであった。このような華夷混合社会の出現は,中国の絹製品,木綿製品,各種瓷器などにたいする需要のたかまりによる交易の活発化を主たる要因としていた。辺境の商業ブームは,16世紀40年代にはじまる大量の日本銀の流入とも深いつながりをもつ。辺境の華夷混合の集団は,しばしば軍事商業集団として活動した。こうした性格は,密輸をおこなったり交易の管理権を握ったりすることで利益をえた辺境の軍隊にも現れた。つまり境界をはさんでその両側に類似した性格の集団があらわれるという対称的な構造がみられたわけである。遼東におけるモンゴル・ジュシェン諸集団と明朝との関係は,おおむね辺境交易の利害を軸として変動していたことが明かとなった。貢敕制度による交易の規制と特権の分与は,覊縻政策によって地域の安定化をはかる明当局にとって重要な手段であり,モンゴル・ジュシェン諸集団相互の勢力関係も,対明交易にどのようにかかわり,そこからいかに大きな利益を上げるかという点によって左右されていた。やがてヌルハチのもと,ジュルチン・モンゴル・漢人の三重帝国として発展していった満洲集団には、海の上の南倭=倭冦とおなじく、言語や種族を乗りこえて形成されたマージナルマンの姿がつよく表れている。中心と辺縁とのあいだを動いた銀と商品、辺境の経済ブームのなかに生じた武装-商業集団の活動。この二つの事態が、十六世紀の半ばからおよそ百年にわたる東アジア全域の動乱と再編の底流をなしていたと評価することが可能である。1.「庚戌の変」すなわちアルタンによる北京包囲(1550)の翌年,嘉靖帝の寵臣仇鸞の提案によって,明朝はモンゴルとの馬市を許可した。この馬市は1年間のみおこなわれ,絶貢政策への復帰と仇鸞一派の没落をもって終結したため,その経緯や意義についてはこれまで深く追究されなかった。当該時期の諸資料を精査することによって,下記のような点を明らかにした。(1)アルタンの連年の進攻が、モンゴルと漢人との間に生じたさまざまな結合を背景としていた。(2)これが、1540年代前半からモンゴルとの交易の必要性を主張していた總督翁萬達,総兵官周尚文ら大同の当局者と、北京の政治姿勢との亀裂を生じさせた。(3)1年限りで決裂した1551年の馬市は,20年後に「北虜問題」を終息させることとなるアルタン封貢の雛形をなしていた。(4)モンゴル側は,馬牛羊と絹,棉布の交易のみならず穀物の売却を明側に要求し,大同における明側の馬市責任者であった史道もこれを求めたが,朝廷中枢が猜疑によってこれを否定し馬市をうち切った。辺境における人や物資の交流の深化と,このあらたな事態に対応できなかった明朝の政策との軋轢が,1570年までつづく北虜問題を底通していた。

この評価は,本研究によって重要な立脚点を得た。2.北辺における多元社会の形成の焦点をなす遼東地区については,1610年代以降の最重要資料である熊廷弼の奏議・書簡類を,明代刊本にもとづいて整理する作業をすすめている。北辺における多元社会の形成の焦点をなす遼東地区について,1610年代以降の最重要資料である熊廷弼の奏議・書簡類を,明代刊本にもとづいて整理する作業をすすめた。目録をデータベース化するとともに,明代刊本の画像をスキャンし,Hyper Text Mark-up Languageをもちいて目録と画像とのあいだにリンク付けをおこなって,当該資料のオンライン化を試みた。遼東における「馬市」制度の形成と変遷についての資料を収集した。これを分析した結果,遼東におけるモンゴル・ジュシェン諸集団と明朝との関係は,おおむね辺境交易の利害を軸として変動していたことが明かとなった。貢敕制度による交易の規制と特権の分与は,覇縻政策によって地域の安定化をはかる明当局にとって重要な手段であり,モンゴル・ジュシェン諸集団相互の勢力関係も,対明交易にどのようにかかわり,そこからいかに大きな利益を上げるかという点によって左右されていた。また遼東における漢地と夷地との経済的交流の拡大は,遼東にも「板升」すなわちモンゴルやジュシェンの支配化のもと農耕などに従事する漢人の集落を生みだした。やがてヌルハチのもと,ジュルチン・モンゴル・漢人の三重帝国として発展していった満洲集団には、海の上の南倭=倭冠とおなじく、言語や種疾を乗りこえて形成されたマージナルマンの姿がつよく表れている。中心と辺縁とのあいだを動いた銀と商品、辺境の経済ブームのなかに生じた武装-商業集団の活動。この二つの事態が、十六世紀の半ばからおよそ百年にわたる東アジア全域の動乱と再編の底流をなしていたと評価することが可能である。
IκB-ζ欠損マウスが自然発症する自己免疫疾患の病因の解明

転写制御因子IκB-ζを上皮細胞特異的に欠損するマウスはシェーグレン症候群に類似した自己免疫疾患を発症する。シェーグレン症候群は、女性優位に発症する自己免疫疾患であり、潜在的なケースを含めると国内に数十万人の患者がいると推定されている。また、その標的組織は外分泌腺など上皮組織であることがその特徴であり、上皮におけるIκB-ζの働きを解明することは、autoimmune epithelitis(自己免疫性上皮炎)とも呼ばれるシェーグレン症候群の病因の根本を解き明かすカギとなると考えられる。今回、IκB-ζ欠失に伴う上皮組織の異常として、IκB-ζ欠損マウスの涙腺における過剰なアポトーシスがシェーグレン症候群様の涙腺炎を引き起こしていることを証明した。また、本年度は、涙腺におけるIκB-ζの発現維持機構と涙腺腺房細胞の潜在的なアポトーシス傾向について解析を行った。その結果から、涙腺腺房細胞はERストレスによりアポトーシスの機器に曝されている可能性があり、STAT3-IκB-ζに依存した経路が正常に機能することでアポトーシスを防いでいるのではないかと考えられる。加えて、予てからシェーグレン症候群との関与が指摘されていたepidemal growthfactorがSTAT3を介したIκB-ζの発現に関係している可能性についても示した。本研究によって、涙腺における恒常性維持メカニズムの一端を解明したとともに、シェーグレン症候群の新たな発症メカニズムを提唱し、その治療法開発に大きく貢献すると考えられる。IκB-ζ欠損マウスにおけるシェーグレン症候群の発症機序を明らかにするとともに、正常な涙腺における恒常性維持機構を示した。IκB-ζがアポトーシスを抑制しているmolecular mechanismに着目した研究を進めることが必要である。微生物感染などにより惹起される炎症応答において、転写因子Nuclear Factor(NF)-κBは炎症性サイトカインなどの発現に中心的な役割を果たしている。筆者らのグループによって同定された、グラム陰性菌のリボ多糖(LPS)刺激時に発現誘導され、核内でNF-κBと結合する新規因子IκB-ζ、この1κB-ζ欠損マウスはシェーグレン症候群に類似した自己免疫疾患を発症することを示した。さらに、1κB-ζ欠損マウスが発症するこの自己免疫疾患は、リンパ球の異常ではなく、上皮組織における1κB-ζ欠失に伴う異常が原因であることを明らかにした。また、その標的組織は外分泌腺など上皮組織であることがその特徴であり、上皮における1κB-ζの働きを解明することは、autoimmune epithelitis(自己免疫性上皮炎)とも呼ばれるシェーグレン症候群の病因の根本を解き明かすカギとなると考えられる。今回、1κB-ζ欠失に伴う上皮組織の異常として、1κB-ζ欠損マウスの涙腺における過剰なアポトーシスがシェーグレン症候群様の涙腺炎を引き起こしていることを証明した。研究計画に沿って、シェーグレン症候群とアポトーシスの関連性をIκB-ζ欠損マウスをモデルとして示すことに成功した。今後は、IκB-ζがどのようにアポトーシスを抑制しているのか、涙腺におけるIκB-ζの発現維持機構の解明を目指す。
ケニアの初等教育における学校間格差の研究－地域・文化間の就学動機の違いに注目して

本研究の目的は、ケニアの初等教育における学校間の成績格差がどのような要因で生じるのか検証することにある。上記の目的を達成するため、当該年度に実施した研究の成果は新たな仮説の可能性である。それによって、分析の枠組みが再考する必要がでてきた。当初、現地での調査を予定していた。しかし、二次データの組み合わせによって、分析をおこなえる可能性がでてきた。分析の枠組みや全体の構成を修正する必要が生じたものの、自分でデータ収集するよりも、より精度の高い大規模のデータが入手できたことは大きな進展といえる。今後の推進方策として、データの組み合わせについて、問題が無いか検討する。家計調査のパネルデータおよび、学校調査のパネルデータが組み合わせを検討しているものである。複数年の調査が、それぞれのデータの収集時期と合致している。問題は、各家計が所属する地域と、その地域にある学校が合致するかという点にある。該当する村や地域のコードの照合を行い、分析を行うに十分な数のサンプル数を確保できるならば、具体的にモデル構築に移ることができる。学習動機と成績の関係を、地域や学校、そして個人レベルでの特徴を考慮して推計するにあたって、教育生産関数分析を行うことを予定している。それには、高度な計量経済学的な手法の導入が不可欠であり、その手法の妥当性を確保するには、推定をするパラメーターに起こりうる様々なバイアスを排除する必要がある。教育の内生バイアス、セレクション・バイアス等を排除するには、精度の高いデータセットが不可欠である。もし、そのデータが利用可能であるならば、これまでの先行研究から、適用可能なモデルとその応用を考え、分析を行うという手筈になる。上記の目的を達成するため、当該年度に実施した研究の成果は新たな仮説の発見である。その仮説とは、「成績格差は学校の設立経緯から生じる銘柄力(プランド性)による」というものである。当初の仮説は「出身階層の違いによって生じる文化資本の蓄積量の違いが成績格差を生み出している」としてきた。しかし、それだけで説明できないことが文献調査やデータ分析、現地での予備調査結果からわかってきた。当該年度の成果を総合して、独立以前から西欧人の通う「名門私立校」、独立初期段階で「有名公立校」として認知された学校と、「その他の学校」の二極化された成績格差であることが見えてきた。このように、より具体的な仮説に洗練されたという成果が、今後の研究に大きな意義を持つ。まず、分析の枠組みが固まったことである。実証分析のモデル構築や、現地での本調査で用いる社会調査手法の設計の役に立つ。次に、最終的な研究成果の意義が向上することである。興味深い仮説によってこそ、より質の高い分析結果や重要な結論を導くにいたる。このような成果を得られた概ね研究実施計画にもとづいて研究を進めることができたからであると考えている。まず、各種学会や研究会での成果報告を通じて、様々なコメントをいただいたおかげである。それによって、研究の方向性を修正することができた。また、文献調査を通じて背景となる理論や焦点となる理論の理解が深まったおかげでもある。その一方で、データ分析を行うにあたっては分析手法の習熟や、データの整理が必要であることもわかった。その点は今後の課題である。また、仮説が洗練されたことで予定していた本調査の設計を変更する必要がでてきた。以上のように、当該年度に実施した研究の成果は新たな仮説の発見という具体的な進展がみられたといえる。1、予定していた本調査を実施できなかったこと。より精緻な設計が必要となり、延期するにいたった。2、第一稿を仕上げる予定が遅れていること。分析の枠組みや全体の構成を修正したため。

3、分析手法の習得とデータの整理が終わっていない。分析の枠組みの修正が必要であるため。今後の推進方策として、上記の達成度の評価から浮かび上がった課題を解決する必要がある。まず、本調査の設計に合わせて分析の枠組みをさらに固めていくことである。次に、これまでに書き溜めた文章を整理し、第一稿を早い段階で書き終えることである。最後に、分析手法の研鑽とデータの整理を最優先して予備分析結果を導くことである。以上のように、上記の課題は互いに連動しており、新たな仮説をもとに分析の枠組みを構成し直すことが一番優先すべきことだと考える。
老化マーカー蛋白質SMP30欠損マウス作製による生理機能の解明

我々は、加齢に伴って肝臓で減少してくる新しいカルシウム結合性肝臓蛋白質を発見しSMP30と命名し研究を進めている。その生理機能として細胞内カルシウム濃度のホメオスターシスやカルシウムシグナリングに関与することが示唆されている。本年度は昨年度構築できたターゲテイングベクターをES細胞へ導入し選別を行った(他研究機関で行った)。ES細胞の選別はまず第一にPCR法でスクリーニングし次にサザン解析で確認する方法をとった。しかしフォールスポジテイブを多く拾う結果になったので戦略を変更し直接サザン解析を行った。そのために効率のよいと考えられるよりホモロ-ガス部位の長いターゲテイングベクターをES細胞へ導入し選別を行なった。517クローンをサザン解析した結果3コのポジテイブクローンが得られた。現在、このES細胞を胚盤胞に注入し仮親の子宮で発生生育させ順調にキメラマウスが誕生している(他研究機関で行っている)。SMP30遺伝子の発現調節機構の解析のために本年度はマウスSMP30遺伝子の転写開始位置の決定をプライマー・エクステンション法によって転写開始位置を決定した。さらに5'-フランキング領域の遺伝子配列の決定し推定プロモタ-、エンハンサー配列、転写調節因子結合配列を特徴ずけることができた。SMP30は高い相同性をもってヒトをも含めた高等動物のみに保存されていて、その生理機能として細胞内カルシウム濃度のホメオスターシスやカルシム依存性酵素活性の制御などが示唆されている。本研究はSMP30の生理機能を解明するするためにジーン・ターゲッテイング法によるSMP30遺伝子を破壊したマウス(ノックアウトマウス)の作製を行なう。本年度はマウス129SMP30ゲノミック遺伝子をクローニングしターゲッテイングベクターの構築まで行なうことができた。1.前年度クローニングしたB6マウスSMP30遺伝子(pgM5)は全mRNAをカバーしていると考えられたのでSMP30遺伝子の全ゲノム構造を決定した。2.用いるES細胞がマウス129由来のため、マウス129ゲノミックライブリーよりホモロ-ガスコンビネーションに必要な部位のSMP30遺伝子をB6マウスSMP30遺伝子構造を参考にしてクローニングし構造決定した。3.マウス129ゲノミックSMP30遺伝子のゲノム構造ならびに制限酵素地図、塩基配列を基にしてターゲッテイングベクター作製のためのストラテジーをデザインした。ポジテイブ選別にneo耐性遺伝子、ネガテイブ選別にはジフテリア毒素Aフラグメント(DT-A/A+Tpau)遺伝子を用い、ターゲッテイングベクターならびにコントロールベクターのコンストラクトを構築することができた。
一過性除神経期の運動がラット骨格筋および神経筋接合部形態に及ぼす影響

筋損傷は一過性除神経を引きこす。運神経終末と筋の再接合期に、筋線維は多重神経支配を受ける。その後、余剰神経が排除されて単一神経支配の状態に戻る。筋損傷から再生過程に起こる余剰神経排除の選択はその後の筋線維タイプの決定を左右するだろう。一方、余剰神経の選択的排除には運動が大きく関与し、筋線維から運動神経終末へ何らかの情報が発信されている可能性が考えられる。筋の情報としてミオシン重鎖mRNAの発現量があげられる。そこで本研究では、一過性除神経期の神経筋接合部形態と運動がミオシン重鎖mRNA発現量に及ぼす影響から仮説を検討した。結果、運動に伴うミオシン重鎖mRNA発現量の増加、筋線維タイプ移行が示された。一過性除神経期の運動は、筋から神経への情報伝達に関与し、余剰神経の排除に影響を及ぼす可能性が示唆された。<研究目的>神経筋相互作用に関して、筋活動が如何にしてシナプス形成を調節するのか、除神経筋に関する神経筋再接合を何が調節するのかは明らかにされていない。そこで、筋損傷に伴う一過性除神経後のシナプス再形成において、筋原性の調節が起こるか否かを検討した。筋活動量の変化に伴うミオシン重鎖(MHC) mRNAの量的変化、骨格筋筋線維タイプ構成比、神経筋接合部形態変化の関係にから明らかにした。<研究方法>Fischer344系雌ラットに持久走トレーニング(活動量+)と下り走トレーニング(活動量0)を行わせた。実験群は、コントロール、2週間トレーニング群(E)、2週間走トレーニング+下り走群(ED)、2週間走トレーニング+下り走+2週間走トレーニング群(EDE)の4群とした。被験筋は足底筋(PLA)、長指伸筋(EDL)とした。MHCmRNAの量的変化は、Real-Time-PCR法を用いてMHCmRNA Type I、Type II A、Type II Bを調べた。凍結筋縦断切片を作成し、コリンエステラーゼ染色と鍍銀染色を施し、神経筋接合部の形態観察も行った。<結果>ED群で、筋損傷、神経筋接合部の損傷が観察された。EDE群では筋再生の指標が観察された。一部の神経筋接合部では、多重神経支配像が観察された。よって、下り走後、筋損傷、脱神経が起こり、時間の経過とともに筋の再生、シナプス再形成が起こることが示唆された。E郡、EDE群で、持久能力の高いMHCm RNA Type I、Type II Aの増加が起こった。また、骨格筋筋線維タイプ構成比ではType II Aの増加が起こった。一過性除神経から神経再接合期に筋活動に適したMHCm RNAの増加、筋線維タイプの移行が起こったことは、筋から運動神経への情報を与えている可能性を示唆している。<研究方法>一過性除神経から神経終末再接合期における神経栄養因子およびMHCmRNAの発現と量的変化及び筋の機能特性、神経筋接合部の形態変化に関する検討をおこなう。実験動物は、生後10週齢のFischer344雄ラットを18匹用いる。被験筋は、PLA、EDL、SOLとする。餌、及び飲水は自由摂取とする。一過性除神経モデルラットは、麻酔科にて坐骨神経に液体窒素で冷却したステンレスロッド(径3.5mm)を5秒間押し当て、神経を凍結させる。神経凍結後1日,2日,3日,5日,7日,14日,28日後にラットを安楽死させ物理的刺激を可能な限り与えないよう注意して筋を摘出する。ラットから被験筋を摘出し、筋発揮張力測定及び神経成長因子、神経栄養因子、MHCmRNA発現と量的変化の測定、NMJ超微細構造の形態変化の観察を行う。遺伝子発現量は、骨格筋よりRNAを抽出し、RT-PCR法にて定量した。<結果>神経凍結後の筋におけるNMJでは、時間経過に伴い、脱神経が起こることが確認された。

神経凍結7日以降、NMJの構造は再接合の兆候が観察された。筋発揮張力は、神経凍結2日後まで張力が発揮されなかった。神経凍結7日以降は値が回復し、21日後には、神経凍結前の値まで回復がみられた。遺伝子発現量は変化が現れなかっため、条件を検討し22年度に継続する。<目的>運動神経終末や骨格筋は特異的にその形態を変化させ、シナプス部である神経筋接合部(NMJ)の形態も特異的に変化する。神経筋相互作用に関して、神経系の調節性、骨格筋筋線維の調節性の多くが明らかにされているが、筋活動が如何にしてシナプス形成を調節するのか、除神経筋に対する神経再接合を何が調節するのか、は明らかにされていない。一方、筋損傷およびNMJ構造が再生する過程では、サイトカインとして神経成長因子等が神経細胞の発生、分化、再生に働くことが明らかにされている。これらが、運動によって増加した場合、速やかな神経筋再接合、筋機能回復が予測される。そこで本研究では、神経筋再接合の再形成機序について、筋活動によって何らかの情報(mRNA、神経栄養因子、神経成長因子)を運動神経に発信するといった筋原性調節が起こるか否かを検討してきた。今年度は老化に伴うNMJ形態変化と筋活動の関係について検討した。<方法>今回は加齢変化をみるために老化促進マウス(SAM)を用い、SAM群(A)とSAM+トレーニング群(ST)を設けた。トレーニングは自発性走運動を行わせた.生後54週齢時に、筋発揮張力を測定した。凍結切片を作成し、ATPase染色を行った。また、神経終末の形態変化を光学顕微鏡より観察した。老化、筋活動によるNMJ形態の変化と機能的特性について検討した。<結果および考察>最大張力においてST群はA群より高値を示した。NMJ形態では、A群では加齢時にみられる形態特徴が観察されたが、ST群では観察されなかった。しかし、除神経は認められず、多重神経支配によるタイプグルーピングなどの像は観察されなかった。また、筋線維タイプ別構成比においては、2群間の差は認められなかった。加齢初期においては、運動により神経終末形態の老化が抑制する傾向があり、筋発揮張力に影響を及ぼしていることが示唆された。