hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
コヒーレント領域における電子・光子相互作用

本研究では、ナノ構造における光子と電子の相互作用を明らかにすることを目的として、ナノ構造の作製技術の開拓、電子と光子の相互作用の微小空間分解評価、および微小共振器効果について研究を進めている。本年度は、量子ドットの新しい作製法として、選択成長を用い2次元V溝構造を形成しその中に量子ドットを成長させる手法およびSpinodal相分離による量子ドットの自己成形法を開拓した。特に、前者においては垂直量子細線も形成可能である。また、量子ドットの局所的評価手法として、近接場光学顕微鏡による量子ドットからの発光の観測を行うとともに量子細線における量子閉じこめシュタルク効果を実験的に明らかにした。さらに、微小共振器型量子ドットレーザの発振に成功する一方、量子井戸における磁気励起子効果の観測や2次元フォトニック結晶における新欠陥構造の提案など、共振器効果についても重要な知見を得ることができた。さらに微小共振器面発光レーザの基礎設計と形成技術のテーマで微小共振器中の光波の挙動を実験的に解明して、高性能面発光半導体レーザを実現することを目的として研究を進めた。96年度は、微小共振器による極低しきい値レーザを実現するために、AlAsの選択酸化膜構造を用いて光と電子を同時に閉じ込める微小光共振器構造のモデリングを行い、極低しきい値動作の可能性を示すとともに、長波長帯面発光レーザへ適用しうる酸化膜強窄構造を提案し、その製作プロセスを確立した。さらに、高指数面方位歪み量子井戸構造を用いた面発光レーザの低しきい値動作と安定な偏波面動作を初めて実現した。また、相互作用するメゾスコピック系の電子の輸送について、メソスコピック伝導体の理論で、久保公式を用いた理論と、ランダウア-流の方法を多体相互作用のある系に拡張した理論とを、比較して議論した。本計画班では、量子光学と半導体のメンスコピック系の物理という二つの学問領域に立脚しつつ、半導体中の電子と光の量子相互作用について研究を推進し、新概念を有する半導体光デバイスの実現をはかる。さらに、従来制御不能と思われていた自然放出などの光の量子現象を微小共振器により、また、電子波を量子細線・量子ドット構造および多重量子障壁(Multi Quantum Barrier:MQB)により、それぞれ積極的に制御することにより、新たな量子相互作用を人工的に創り出しかつ制御を積極的に行う。また、量子系をそのコヒーレンス性を保ったまま相互作用をうまく制御することにより外部系と結合させるための新しい手法を探索する。本年度は、まず半導体量子ドットの作製技術について研究をすすめた。特にMOCVD法を用いた幅15nmのInGaAsドットの作製に成功した。また、単一量子ドットの電子と光子の相互作用をマイクロフォトルミネッセンス法を用いて究明し、単一量子ドットからの発光を観測した。さらに単一量子ドットからの時間分解スペクトルの観測も行うことに成功した。これらの結果はナノスケール電子-光相互作用の解明に有用である。可視光および通信用の半導体レーザは、二重ヘテロ構造における電子の閉じ込めが十分でないため、高温・高出力動作時や大規模な集積化の際に十分な電気・光変換効率が得られない。これらの問題を解決するため、伊賀らは電子の波動性を利用した電子の反射鏡、多重量子障壁(Multi-Quantum Barrier:MQB CXC)を提案し、MQBの電子波反射現象の理論的基礎の確立、MQBの試作・評価によりその効果についての基礎的な検討を行った。いわゆる仮想励起過程において、光子数が保存されながらも波長が赤方変位する場合があることを見い出した。また、光励起された擬2次元系の電子スペクトルを考察し、多体エネルギーの凍結現象を発見した。さらに、「ひねられた真空」からの光子放出を考察した。また、電子回路理論のミクロな基礎付けを行った。以上述べた本年度の成果は電子光コヒーレント相互作用の物理の理解に大きな進展をもたらすとともに、次世代の光量子デバイスの新しい展開を実現できるものとして期待できる。本年度の成果をふまえてさらに第2年度において研究を遂行していきたいと考える。7年度は次のような研究成果を得た。まず,量子ドット構造の形成技術について,形成の初期過程の観察,自然配列化,新しい作製法の開拓,微小共振器量子ドットレーザ作製,劈開面上への量子細線の選択成長について成果を挙げるとともに,ナノメートルスケールの光・電子相互作用の解明として,近接場光顕微鏡による量子ドットの光学評価,マイクロフォトルミネッセンスによる2次元電子ガスとポイントコンタクト構造における電子の噴出現象の可視化を進めた。さらに,共振器ポラリトンにおける励起子-励起子散乱の効果の解明(9)微小共振器中の量子井戸における磁気励起子効果の観測,2次元フォトニック結晶における新欠陥構造の提案など,共振器効果についても重要な知見を得ることができた。さらに歪量子井戸を含むウエハに加工とパッシベーションを施すことで電子・光子相互作用を確かめるための発光特性観測および偏波依存性を確認した。また,多重量子障壁に歪み補償構造を導入した多重量子障壁の電子波障壁の増大効果を明かにするとともに、それを化学ビーム成長法により製作し、良質な結晶と界面特性を実現するための製作条件を確立した。また、微小共振器による極低しきい値レーザを実現するために、AlAsの選択酸化構造を用いて光と電子を同時に閉じ込める微小光共振器構造を提案し、しきい値電流70μAの極低しきい値レーザを実現するとともにそのレーザ特性を明かにした。

さらに,理論的検討として,半導体発光素子の弱励起領域における光子統計を、量子ランジェバン方程式を用いて解析し、光子のファノ因子の新しい公式を導くとともに、物質が連続吸収スペクトルを持つ場合の共振器量子電気力学のミクロな定式化を行い、その簡単な応用例として、吸収性媒質よりなるcavityの中に置かれた原子による光子の自然放出確率を計算した。本研究では、ナノ構造における光子と電子の相互作用を明らかにすることを目的として、ナノ構造の作製技術の開拓、電子と光子の相互作用の微小空間分解評価、および微小共振器効果について研究を進めている。本年度は、量子ドットの新しい作製法として、選択成長を用い2次元V溝構造を形成しその中に量子ドットを成長させる手法およびSpinodal相分離による量子ドットの自己成形法を開拓した。特に、前者においては垂直量子細線も形成可能である。また、量子ドットの局所的評価手法として、近接場光学顕微鏡による量子ドットからの発光の観測を行うとともに量子細線における量子閉じこめシュタルク効果を実験的に明らかにした。さらに、微小共振器型量子ドットレーザの発振に成功する一方、量子井戸における磁気励起子効果の観測や2次元フォトニック結晶における新欠陥構造の提案など、共振器効果についても重要な知見を得ることができた。さらに微小共振器面発光レーザの基礎設計と形成技術のテーマで微小共振器中の光波の挙動を実験的に解明して、高性能面発光半導体レーザを実現することを目的として研究を進めた。96年度は、微小共振器による極低しきい値レーザを実現するために、AlAsの選択酸化膜構造を用いて光と電子を同時に閉じ込める微小光共振器構造のモデリングを行い、極低しきい値動作の可能性を示すとともに、長波長帯面発光レーザへ適用しうる酸化膜強窄構造を提案し、その製作プロセスを確立した。さらに、高指数面方位歪み量子井戸構造を用いた面発光レーザの低しきい値動作と安定な偏波面動作を初めて実現した。また、相互作用するメゾスコピック系の電子の輸送について、メソスコピック伝導体の理論で、久保公式を用いた理論と、ランダウア-流の方法を多体相互作用のある系に拡張した理論とを、比較して議論した。
アミノ酸作動性チャネルによる細胞外マトリックス制御機構の解明

生体内のアミノ酸は蛋白質の構成成分としてだけでなく、細胞内シグナル伝達経路を活性化する細胞外の栄養リガンドとしても働いている。生体内のアミノ酸バランスの破綻と様々な疾患との関連が示唆されているものの、両者を直接結びつけるアミノ酸の標的センサー分子は見つかっていなかった。我々は、プロリン、ヒドロキシプロリンなどの細胞外基質の構成アミノ酸によって直接活性化されるカチオンチャネル(Proline-activated Channel: PRAC)を同定した。心筋細胞・心線維芽細胞においては、ジアシルグリセロール活性型のTRPCカチオンチャネル(TRPC3とTRPC6)がPRACの構成サブユニットとして関わることが明らかとなり、TRPC3またはTRPC6を欠損させることでアミノ酸刺激によるカチオン流入とそれに付随して起こる細胞内Ca2+濃度上昇が完全に抑制された。また、TRPC3またはTRPC6を欠損させたマウスの心臓においてオートファジーの強い誘導が観察された。初代培養ラット新生児心筋細胞や心線維芽細胞のTRPC3/6を阻害した際にもオートファジーの誘導が観察されたことから、これらのシグナルは蛋白質のリサイクリングと密接に関わる可能性が示された。逆に、プロリン感受性を示さない細胞にTRPC3とTRPC6を共発現させることでプロリン感受性が確認できたことから、TRPC3/6ヘテロ4量体チャネルがPRACの分子実体あるいは構成サブユニットとして機能する可能性が初めて示された。生体内のアミノ酸は蛋白質の構成成分としてだけでなく,細胞内シグナル伝達経路を活性化する細胞外の栄養リガンドとしても働いている.生体内のアミノ酸バランスの破綻と様々な疾患との関連が示唆されているものの,両者を直接結びつけるアミノ酸の標的センサー分子は見つかっていない.我々は最近,プロリン,ヒドロキシプロリンなどの細胞外基質の構成アミノ酸によって直接活性化されるカチオンチャネル(Proline-activated Channel: PRAC)を同定した.驚くべきことに,受容体作動性チャネル(TRPC3とTRPC6)がPRACの構成サブユニットとして関わることが明らかとなり,TRPC3またはTRPC6を欠損させることでアミノ酸刺激によるカチオン流入とそれに伴って起こる細胞内Ca2+濃度上昇が完全に抑制された.TRPC3またはTRPC6を欠損させたマウスの組織を用いて,アミノ酸シグナルにより負に制御される自己貪食(オートファジー)を調べたところ,心臓においてのみTRPC3欠損またはTRPC6欠損によってオートファジーが強く誘導されることを見出した.初代培養ラット新生児心筋細胞や心線維芽細胞のTRPC3/6を阻害した際にもオートファジーの誘導が観察されたことから,これらのシグナルは蛋白質リサイクリングと密接に関わる可能性が示された.逆に,プロリン感受性を示さない細胞にTRPC3とTRPC6を共発現させることでプロリン感受性が確認できたところから,TRPC3/6ヘテロ4量体チャネルがPRACの分子実体あるいは構成サブユニットとして機能する可能性が示された.生体内のアミノ酸は蛋白質の構成成分としてだけでなく、細胞内シグナル伝達経路を活性化する細胞外の栄養リガンドとしても働いている。生体内のアミノ酸は,蛋白質の構成成分としてだけでなく,細胞内シグナル伝達経路を活性化する細胞外リガンドとしても働いている.生体内のアミノ酸バランスの破綻と様々な疾患との関連が示唆されているものの,両者を直接結びつけるアミノ酸の標的分子は見つかっていない.我々は最近,プロリンなど特定のアミノ酸で活性化されるカチオンチャネル(Proline-Activated Channel:PRAC)を同定した.ラット心線維芽細胞にL-プロリンを処置すると,濃度依存的なCa2+濃度上昇が観察され,この応答はPI代謝回転阻害薬では抑制されなかった.薬理学的解析および電気生理学的解析の検討結果から,PRACは電位非依存性の直線に近いI-V曲線を示し,既知のチャネル(TRP)と複合体を形成する可能性が示された.全アミノ酸(D体も含む)に対するCa2+応答性を調べた結果,プロリン以外にもL-ハイドロキシプロリンやアラニンによっても活性化されることがわかった.

さらに,PRACを過剰発現させた心線維芽細胞ではコラーゲンやフィブロネクチンなどのマトリックスmRNA量が低下していること,カルシニューリン阻害剤処置によりコラーゲンmRNA量の低下がキャンセルされることが明らかになった.以上の結果は,PRACが細胞外マトリックス代謝制御において重要な役割を果たす可能性を示している.アミノ酸作動性チャネルの分子実体を同定し,その生理的意義として細胞外マトリックス代謝制御に関与することを見出したのは大きな進歩である.しかし,PRACのアミノ酸感知機構については未だ解明できておらず,特にパートナー蛋白質との複合体形成がアミノ酸感受性を獲得するのに必要であるかどうかについて今後より詳細に解析していく必要がある.次年度予定していた病態との関連よりも,PRACのアミノ酸感知機構解明に力点を置いて検討を行う.具体的には,他のカチオンチャネルとの相同性検索などからPRACのアミノ酸感知ポア領域を同定し,アミノ酸の点変異による影響を観察する.また,PRAC特異的な抗体を作成し,内因性PRACの発現分布などについても確認する.さらには,PRAC遺伝子欠損マウスを作成し,特に心血管系における表現型の比較観察を行う.野生型マウスとの間に有意な差が認められた場合は,病態モデル(圧負荷や心筋梗塞・アンジオテンシンII持続投与など)との掛け合わせを行い,病態生理学的意義も明らかにしていく.研究費は90%を消耗品費として使用し,残りの10%を共同研究打ち合わせ(電気生理解析など)に用いることにする.消耗品の主な項目としては,実験動物費,細胞培養器具類,酵素類,抗体・キット類が含まれる.
燃料噴射率への周期的変動付加による舶用重質油の微粒化特性改善に関する研究

高粘度燃料の微粒化促進と,空間的分散の制御を可能にするような燃料噴射技術の基礎を確立することを目的として研究を進めた.まず前年度に引き続いて軽油を対象とした噴射率変動付加実験を行い,それと共に,高粘度油の燃料噴射実験,噴霧燃焼実験,さらに噴射率変動付加実験を実施した.(1)噴射率変動付加実験軽油を燃料として7kHzまでの噴射率変動を付加して,非蒸発噴霧の可視化実験を行った.ノズルを変更した実験においても,特定周波数より高周波数側で噴霧の空間的な広がりが改善されること,その周波数は噴射率変動の振幅と平均噴射率の比(相対噴射率変動振幅)に影響を受けること,また相対噴射率変動振幅が等しければノズルが異なっても同じ周波数から噴霧の空間的分散が改善されることなどを明らかにした.これらにより,この現象は相対噴射率変動振幅が支配する現象であることを明らかにした.(2)高粘度油の噴霧・燃焼実験重油を模擬する高粘度油としてパーム油を採用し,軽油と混合させたものについて燃料噴射および燃焼実験を行った.混合率を100%までと,昨年度に比べて大きく変化させて検討した結果,混合率の増加に伴い噴射率形状の立ち上がりが緩くなること,またこれは燃料の粘度の影響であることが明らかになった.このために噴霧の進行が遅れ,また噴霧の広がりも悪化することを確認した.一方燃焼特性については,パーム油混合により着火が早くなると共に燃焼期間も短縮することが明らかになった.パーム油独自の燃焼特性が現れたものと判断され,重油の噴霧特性を模擬する上では問題ないものの,燃焼特性を模擬する燃料としては不適当であることが分かった.なお噴射率変動を付加した実験を行った結果,軽油単体の場合と定性的には同様に,噴霧の空間的分散が改善されることが確認され,本手法による重質油の微粒化促進,空間的分散の制御が可能であることが確認された.高粘度燃料の微粒化促進と,空間的分散の制御を可能にするような燃料噴射技術の基礎を確立することを目的として研究を進め,本年度はまず燃料噴射システムの改良試作を行い,その後に通常の燃料(軽油)を対象とした噴射率変動付加実験と,高粘度燃料の燃焼実験を並行して行った.1)燃料噴射システムの改良試作:ピエゾアクチュエータを更新すると共に,同アクチュエータ制御用の電流増幅回路を改良して,10KHz以上の電圧・電流変動を付加できるようなシステムに改善した.2)噴射率変動付加実験:軽油を燃料として,7kHzまでの噴射率変動を付加して,非蒸発噴霧の可視化実験を行った.特定周波数より高周波数側で燃料噴霧の空間的な広がりが改善されること,その周波数は噴射率変動の振幅と平均噴射率の比(相対噴射率変動振幅)に支配され,相対噴射率変動振幅が大きいほど低周波数から噴霧の空間的分散が改善されることを明らかにした.またこれには,燃料噴霧内での燃料の追い付き・追い越しと,燃料の空間的集中による相互作用が影響しているものと考えられた.3)高粘度油の噴霧燃焼実験:重油を模擬する高粘度油としてパーム油を採用し,軽油と混合させたものについて燃焼実験を行った.装置としては,高温・高圧の燃焼容器を用い,高温・高圧の雰囲気条件は,希薄水素予混合気の燃焼によって作成した.噴霧燃焼実験の結果,軽油中への混合率20%程度までであれば,特に大きな影響無く,安定して噴霧燃焼させられることを確認した.高粘度燃料の微粒化促進と,空間的分散の制御を可能にするような燃料噴射技術の基礎を確立することを目的として研究を進めた.まず前年度に引き続いて軽油を対象とした噴射率変動付加実験を行い,それと共に,高粘度油の燃料噴射実験,噴霧燃焼実験,さらに噴射率変動付加実験を実施した.(1)噴射率変動付加実験軽油を燃料として7kHzまでの噴射率変動を付加して,非蒸発噴霧の可視化実験を行った.ノズルを変更した実験においても,特定周波数より高周波数側で噴霧の空間的な広がりが改善されること,その周波数は噴射率変動の振幅と平均噴射率の比(相対噴射率変動振幅)に影響を受けること,また相対噴射率変動振幅が等しければノズルが異なっても同じ周波数から噴霧の空間的分散が改善されることなどを明らかにした.これらにより,この現象は相対噴射率変動振幅が支配する現象であることを明らかにした.(2)高粘度油の噴霧・燃焼実験重油を模擬する高粘度油としてパーム油を採用し,軽油と混合させたものについて燃料噴射および燃焼実験を行った.混合率を100%までと,昨年度に比べて大きく変化させて検討した結果,混合率の増加に伴い噴射率形状の立ち上がりが緩くなること,またこれは燃料の粘度の影響であることが明らかになった.このために噴霧の進行が遅れ,また噴霧の広がりも悪化することを確認した.一方燃焼特性については,パーム油混合により着火が早くなると共に燃焼期間も短縮することが明らかになった.パーム油独自の燃焼特性が現れたものと判断され,重油の噴霧特性を模擬する上では問題ないものの,燃焼特性を模擬する燃料としては不適当であることが分かった.なお噴射率変動を付加した実験を行った結果,軽油単体の場合と定性的には同様に,噴霧の空間的分散が改善されることが確認され,本手法による重質油の微粒化促進,空間的分散の制御が可能であることが確認された.
末梢神経損傷による骨破壊現象の物質基盤の解明

脳由来神経栄養因子(BDNF)は損傷した神経の治癒を促進する効果を有するが、その一方で周囲の骨硬化をもたらす可能性があることが知られている。私たちは今までに末梢神経損傷が局所にBDNFの産生をもたらすことを報告してきた。そこで本研究では、局所のBDNFが骨形成に対しての影響を検討した。その結果、BDNFは前骨芽細胞株において、細胞増殖をさせずOsteocalcinとOsteopontinのmRNAの発現させた。この分化促進はtrkBを介していた。新生骨では破骨細胞、骨細胞や骨芽細胞が関与したリモデリングが進行していた。したがって下歯槽神経損傷は下顎骨内での骨硬化をもたらすことが認められた。下顎骨内部の下歯槽神経が損傷されると、神経種が形成されると同時に下顎管は損傷部位において拡大することが臨床的には認められている。すなわちこの骨の変形には神経損傷が何らかの関与をしていると考えた。そこで初めに培養した前骨芽細胞に対する神経栄養因子の影響を検討した。1.培養前骨芽細胞(MC3T3-E1)に様々な濃度のBDNFまたはNGFを添加したところ、細胞増殖にはほとんど影響を及ぼさなかった。2.骨芽細胞の分化マーカーとして、アルカリフォスファターゼ、osteocalcin、osteopontin、cyclin D1をRT-PCRで検討を行った。その結果、これらすべてにおいて有意な変化は認められなかった。3.走化試験においては、NGFにより優位に細胞遊走性が促進された。以上の結果からは現段階では、損傷部位おいて生じた神経栄養因子が骨形成に対して明らかな変化をもたらすに至る証拠は得られていない。ラットの下顎骨表面にドリルで小孔を開けて、そこにBDNF1μgを投与し、それを骨蝋で覆った。コントロール群には代わりに生理食塩水を入れたものとした。これらは周囲へ漏れないようにして覆い2-3週間生存させた。その後の骨変化を形態学的に観察した。形態学的観察には破骨細胞に特異的なCathepsinK、神経栄養因子BDNFの受容体TrkB、アルカリフォスファターゼ、骨基質に特異的であるオステオポンチンの存在を検討した。術後7日目のBDNF群では、骨切削面に不規則な吸収面が観察される一方、骨の新生が認められた。骨髄腔は狭小化している傾向があった。またコントロール群と比べて破骨細胞が多く遊走されているのが観察された。術後14日のBDNF群ではCathepsinK陽性の破骨細胞が散見された。これはコントロール群ではほとんど認められていなかった。またコントロール群ではアルカリフォスファターゼまたはオステオポンチン陽性の新生骨が確認され、骨芽細胞が骨表面に配列していたのに対し、BDNF群にはこれらはほとんど認められなかった。術後28日のコントロール群ではCathepsinK陽性の破骨細胞が出現し、アルカリフォスファターゼまたはオステオポンチン陽性の骨組織新生が認められたことから骨のリモデリングが活発であることが示唆された。それに対してBDNF群ではアルカリフォスファターゼまたはオステオポンチン陽性の新生骨梁が少ない傾向が認められた。以上から、局所のBDNFの存在は、破骨細胞の遊走を促し骨吸収を促す一方で、新生骨組織造成を抑制する可能性があることが示唆された。前骨芽細胞の培養液にBDNFを加えて、細胞分化が促進される可能性について生化学的に検討した。その結果、オステオポンチン、オステオカルシンのmRNAレベルは有意に増加した。細胞増殖および走化性には変化が無かった。また免疫細胞化学的検討でも、BDNF添加により前骨芽細胞のTrkBの発現上昇とオステオポンチンの沈着亢進が観察された。さらにBDNFが細胞内シグナルのリン酸化を促進しているかに関しての検討をウエスタンブロット法で行った。その結果、BDNFは前骨芽細胞においてセリン/スレオニンキナーゼ(Akt)を増加させることが判明した。さらにin vivoで局所に投与したBDNFの効果を再度検討した。マイクロCTで下顎管部分を切断後28日で観察したところ、BDNFを投与した群では骨新生による骨形態の明らかな変化を認めた。免疫組織学的観察では、投与されたBDNFによりALP陽性の活動性の骨芽細胞の存在が認められ、オステオポンチン陽性の新生骨の有意な添加が確認された。これらの骨造成は骨小腔内および骨髄腔側でも生じていることが観察された。これらより、BDNFは骨芽細胞に作用して骨の新生を促進する効果を有すると考えられた。顎骨内局所に投与したDBNFが及ぼす破骨細胞への効果を検討できた。

以上により、骨芽細胞(平成25年度)とあわせて骨吸収と再生の両面からの影響を検討することができた。歯科麻酔学破骨細胞遊走に関しての統計的分析を行い、さらに骨造成の変化についても定量化して検討を行っている途中である。培養骨芽細胞における神経栄養因子への効果の概要が把握できているため。研究計画は概ね順調に進んでいたが、時間的制約のために実験実施を新年度にわたって行う必要が出たため。骨芽細胞分化の促進傾向が認められているため、これについてはさらに検討を重ねる。また今後は破骨細胞における影響に関しても検討を行う必要があると考える。一方、in vivoの実験において、神経損傷に依って誘導される骨形成への抑制効果を、形態学的に検討する方針である。定量的変化の検討のため、動物購入費の補助として補填する予定である。培養細胞の購入・維持費が必要である。またin vivoの研究においても、動物の購入費または免疫染色に関する薬品・試薬が必要になってくる。動物または細胞の購入費、染色にかかわる試薬が必要となる。また本研究成果の発表のためまたは資料収集のために、旅費が必要となる。
幾何学における代数的,解析的並びに情報論的方法

幾何学の重要な研究対象である多様体に対し,代数的側面,解析的側面ならびに情報論的側面から多面的にアプローチを行い,多様体の新しい研究方法の開発をめざすことがこの研究の目的でありました。本年度はまず,多様体の重要な不変量である基本群の構造の研究を第一の研究課題にあげ,垣水が,群のHNN分解に対し,その共役類の間の関係を記述するものとして,共役類の間の距離関数を定ギし,そのさまざまな性質を研究しました。これは今後多様体の幾何学的な性質を研究していくうえで重要な基礎研究となるものであります。さらに垣水はもっとも基本的な多様体である円周に対し,その上の分布関係に関する基礎的な性質を,幾何学的な関点にたって,新しいアプローチの方法を研究いたしました。一方,古谷は,解析的側面からの研究として、近似性をもたない類列空間Coの部分空間を使って自明でないある種のテンソル積を構成し,この結果を用いてよく知られている定理の適用限界を示しました。また古谷は,p-hyponornnal作用業の点スペクトルと近似スペクトルの特徴付けを与え,Aluthgeの結果を拡張しました。さらに高野は,情報論的数学基礎論的側面からの研究として,様相論理における部分特性をもつ体系について一般的な形でに考察を行ない,lesniewshi存在論の命題論理部分を特徴付ける三性質にとって定まる様相論理に対し,部分式特性をもつ体系を与えることに成功しました。
地域電子技術者と学内の共同利用半導体集積回路機能デバイス試作研究システムの開発

半導体素子の共同製作実験という内容の公開講座を2回にわたり実施し、クサビ型ソース・ドレインMOS FETの開発および温度センサ組込み型シリコン拡散抵抗ヒーターの製作等の共同研究を行なった。公開講座は昭和62年7月28日より8月6日および昭和63年7月26日より8月4日の2回にわたり開催した。第1回目は講師6名、実験補助者7名、受講者6名で行ない、第2回目は講師8名、実験補助者7名、受講者6名で行なった。受講者は地域電子技術者のリーダー養成ということで企業から社命で派遣された優秀な人材に限られた。それ故受講者のレベルは高く、研究熱心であり、半導体素子の製作にも成功した。また試作研究の入門テキスト『P-MOS ICの製作』および『半導体センサの製作』を出版した。後者には、・試作研究におけるコンピュータ利用技術、および・研究発表の手法もまとめられている。半導体機能デバイスの研究開発の具体的な課題として、一、シリコンに一体化された半導体加重計測デバイスおよび二、シリコンに一体化組込み用半導体温度センサを取上げた。これらの素子半導体物性からセンシングシステムまで考慮し、数種類設計製作された。製作した素子の特性測定については、加重センサの保持、電気接続が困難で改良が重ねられた。他方温度センサは温度特性の測定が容易で研究の進行が早かった。それらの研究の成果は別紙一覧の如く発表されている。本研究は、教えるために準備したスタッフのみならず、関係した電子技術者あるいは、高専学生を通して地域の研究開発の気運を高め、工業振興にも寄与した。63年度は、半導体センサ素子の製作を中心とした公開講座を実施し、温度センサ組込み型シリコン拡散抵抗ヒーターの開発等の共同研究を行なった。まず公開講座は、第1回目と同様にして昭和63年7月26日より8月4日までの9日間にわたり開催した。第2回目は講師8名、実験補助者7名。受講者6名で第1回目より盛大であった。試作素子は応力集中型拡散抵抗加重センサと応力集中型MOS-FET加重センサであった。試作した拡散抵抗ならびにMOS型トランジスタの電気的特性は直ち測定された。しかし加重特性は試験装置の試作が重ねられていた事情で、研究としては温度制御機能素子の開発の分野でいくつかの成果が得られた。それらは別紙の4編の研究論文にまとめられた。研究技術教科書としては、次の項目がまとめられた。1.半導体制御機能素子1.1半導体温度センサ1.2半導体ストレインゲージ2.試作研究におけるコンピュータ利用技術2.1プロッターのコンピュータ制御2.2測定器のコンピュータ制御3.研究発表の手法3.1研究発表の目的3.2研究発表の実際本企画によって得られた成果は別紙の研究発表一覧のみならず、波及効果として学生の学会講演件数の増加、あるいは卒業研究論文の質の向上に貢献した。本研究はスタッフのみならず、受講された電子技術者あるいは波及効果として地域に研究心の振興にも寄与した。
3種抗体、および、レンチウイルスを用いた移植腎生着延長の試み

「研究の目的」"CTLA4-IgとAnti-ICOS-IgおよびAnti-CD28-Igの併用投与による、強力な免疫学的寛容の導入により、異種移植を成功させることを目的としている。異種移植モデル(Ginea pig-Rat)における免疫学的寛容導入、およびMF-1遺伝子治療のin vivoにおける効果の検討MF-1遺伝子を導入したGinea pigドナー腎をRatに腎移植する。レシピエントの固有腎は術当日に摘除。移植手術はすでに確立している。尿管のサイズが著明に異なるので尿管吻合にはステントカテーテルを用いる。無治療コントロール群の生存日数は4-7日である。実験群:上記モデルを用いて次の4つの実験群を作成c)効果判定:3)で示したと同様に検索i)移植腎機能の評価、ii)移植腎生着延長効果の検討、病理組織学的検索、iv)免疫組織化学的検索、v)Molecular assay「結果」上記の全ての条件において、明らかな生着延長効果は得られず、また、摘出した移植腎は、組織学的に高度のvascular rejectionを呈する所見であり、新たな方法の検討が必要と考えられた。「研究の目的」"CTLA4-IgとAnti-ICOS-IgおよびAnti-CD28-Igの併用投与による、強力な免疫学的寛容の導入により、免疫抑制剤を全く使用することなく移植腎を生着させ、また、HGFとMacrophage stimulating Factor (MSP)のキメラであるMF-1遺伝子を、超音波照射用造影剤(オプチゾン)を併用した超音波照射遺伝子導入法によって移植腎組織に局所的に導入し、移植腎に生じる様々な組織障害因子から移植腎を長期的に保護することによって、永久生着させることを目的としている。「研究成果」2)アデノウイルス並みの使いやすさ、高い導入効率、そして目的の遺伝子を標的組織内に入れることで長期的な遺伝子発現を可能にする“超音波照射用造影剤(オプチゾン)を併用した超音波照射遺伝子導入法によって腎組織への遺伝子導入に成功した:これまで、腎組織における遺伝子導入においては確立された手法は未だ報告されていなかったが、アデノウイルス並みの使いやすさ、および導入効率を持ち、また、長期的な遺伝子発現、および蛋白合成を可能にする新しい遺伝子導入法である、“超音波照射用造影剤併用、超音波照射遺伝子導入法を確立し、腎組織への遺伝子導入に成功した。3)HGF,およびMacrophage stimulating Factor(MSP)の持つ“アポトーシス抑制作用"をHGF、MSPそれぞれのfactorに比較して有意に強く認めるが、悪性腫瘍を誘発させる作用はほとんど認めないHGFとMSPのキメラであるMetron factor 1 (MF-1)をレンチウイルスベクターを用いて腎組織に導入した。
東京・大阪方言の談話展開にみる接続詞の役割についての対照社会言語学的研究

本研究は、現代東京方言と現代大阪方言の若年層生え抜き女子二人の会話を対照させて、そこに表れる接続詞について考察しようとしたものであ。接続詞については次のようなことが分かった。まず、調査対象とした摂津方言生え抜き女子大学生話者の談話には、ほとんど方言特有語が観察できなかった。また、先行研究で久木田は、接続詞「それで」「そして」が大阪方言談話を特徴づけているとしたが、今回の大阪方言談話資料には「そして」は、ほとんど出現しなかった。ちなみに「そして」は、東京方言談話においても出現していない。また、「それで」は若干みられたものの、「それで」自体は東京方言談話にも出現している。収集した談話資料を観察すると、出現度数に差はあるものの、東京、大阪、両談話でともによく使用されている接続詞は、「けど」「だけど」「でも」「だって」「だから」であり、使用形式そのものからみれば両方旨の差はなかった。以上の結果は、若年層の談話を収集したからであるともいえる。ただし、本資料のねらいはむしろ、こうした若年層の共通語化した資料を収集することにあった。共通語化した若年層談話において、形式は共通語化していても意味・用法に差異を有する「気づかれにくい方言」がみられるかどうかについて、詳細に観察するための資料となるからである。本成果を得て、今後は、これらの接続詞の意味・用法を詳細に分析することが課題である。また、個人差や世代差についても収集し、今回の定性的研究結果を位置づけていく必要がある。本年度は、年度当初の実施計画に基づき、以下のような調査・研究を行った。(1)東京23区内に生育し、少なくとも両親のいずれかも同様である生え抜きの話者2組の自然談話を、次に述べる方法でDATおよびDVDに収録した。(2)話者は、お互いに親しい関係にある女子大学生2人と、お互いに知己の関係にある男子大学生2人である。約1ヶ月ほどの間をおいて、それぞれの組を2回にわたって調査した。1回の調査時間は約3時間。文体差を考慮して、同じゲームを初回は友人同士で、2回目は外来の年長者である調査者とともに、実行してもらった。(3)上記の資料のすべてを、文字化した。これらの調査および資料作成には、科研費の設備備品費、旅費、謝金を活用した。(4)また、上記の調査・文字化に入る前に予備的な知見を得ておくため、謝金で手持ちの談話調査を文字化していった。(5)文字化の過程でさまざまな知見を得ることができた。とくに、談話の最小単位は「文」ではなく、「句」という一種のイントネーション単位であることを発見した。「句」はもともと川上秦が発見した音調の単位であるが、これが談話の最小単位として機能していることを示したことが新たな知見である。また、談話は実時間に沿った不可逆的な展開をもち、異質な他者との交代によって進むという談話観を得、そうした談話の姿を明確に示しうる文字化の方法について具体化することができた。(6)以上の成果をもとに、いくつかの学術論文を発表した。(1)大阪摂津方言域に生育し、少なくとも両親のいずれかも同様である生え抜きの話者2組の自然談話を、次に述べる方法でDATおよびDVに収録した。(2)話者は、お互いに親しい関係にある女子大学生二人である。約1ヶ月ほどの間をおき、初回は<同輩・親>の関係にある女子大学生同士、2回目は<目上・疎>の関係にある調査者で、それぞれ同じゲームをしてもらい、その際の談話を収録した。収録時間は1回約3時間である。(3)上記の資料のすべてを文字化した。

文字化の際には、昨年度の研究によって得られた文字化方式である「楽譜方式」を用いた。「楽譜方式」とは、実時間に添って展開する談話の姿をよくとらえ、話者交替が明確に視覚化される方式である。(4)昨年度に同様の調査方法で行った東京方言談話と、今年度行った大阪方言談話については、全談話を文字化し、研究成果報告書として若干部数刊行した。両地域の談話分析から、次のことを明らかにした。(5)いずれの方言においても、対人場面によって句の長さは変化をみせた。<同輩・親>の方が、<目上・疎>よりも、一句は短く発話される傾向にある。(6)大阪方言談話の接続詞についていえば、方言特有語はほとんど出現せず、接続詞自体は共通語化していた。(7)大阪方言において使用される共通語化した接続詞が、意味・機能的変異(気づかれにくい方言)を有しているかどうかは、まだ結論を得る段階にはない。それは、使用の個人差が、予想より大きかったことと関係している。(8)よく使用される接続詞には、個人差がみられ、地域差については必ずしも明確に表れなかった。今後は、地域ごとに、同一調査表にもとづいた一定量の自然談話を採集することが必須の課題である。
タンパク質の0-グリコシル化亢進にもとづく2型糖尿病発症機構の解明と改善薬の開発

今世紀最大の生活習慣病と位置づけられ糖尿病は、わが国では治療中および潜在患者を含めると1600万人に達すると言われており、新たな治療薬の開発が強く要望されている。高血糖状態が続くとインスリンシグナル伝達系にある細胞内タンパク質のO-グリコシル化修飾(O-GlcNAc化)が促進されるため、インスリン抵抗性が惹起して2型糖尿病の発症につながる機構が最近支持されてきている。我々は、実験モデル動物を用いた検討から、生体関連元素を含有する金属錯体の中に2型糖尿病の改善作用があることを見出した。今回の研究では、(1)糖尿病改善の作用機構について、金属錯体とO-linked β-N-acetylglucosaminetransferase(OGT)との相互作用の点から解明すること、さらに(2)インスリンまたは従来の合成薬剤に代わる臨床応用可能な新しいバナジウム、亜鉛、およびマンガンを含む生体関連元素含有錯体を開発することを目的として2年間の研究を計画した。昨年度(平成18年4月平成19年3月)は、以下の1-4を中心に検討を行い、培養細胞系における細胞内タンパク質の糖化修飾およびインスリン抵抗性の測定・評価方法を確立した。1.配位子の合成:バナジウムおよび亜鉛錯体合成のためのマルトール誘導体の合成、マンガン錯体合成のためのサレン関連配位子の合成2.各種金属錯体の合成:バナジル(IV)、亜鉛(II)、マンガン(III)4.培養細胞系を用いるインスリン抵抗性改善作用の評価:脂肪細胞(3T3-L1)引き続き、今年度(平成19年4月平成20年3月)は、各種金属錯体による抑制効果を検討した。その結果、亜鉛錯体が細胞内タンパク質のO-グリコシル化修飾を抑制することを初めて見出した。その抑制機構について検討したところ、OGT活性に対する阻害作用ではなく、むしろO-GlcNAcase活性に対する促進作用であることを見出した。今回の研究では、(1)糖尿病改善の作用機構について、金属錯体とO-linkedβ-A^acetylglucOsaminetransferase(OGT)との相互作用の点から解明すること、さらに(2)インスリンまたは従来の合成薬剤に代わる臨床応用可能な新しいバナジウム、亜鉛、およびマンガンを含む生体関連元素含有錯体を開発することを目的として2年間の研究を計画した。今年度(平成18年4月平成19年3月)は、研究実施計画として、以下の1-4を中心に検討を行い、培養細胞系における細胞内タンバク質の糖化修飾およびインスリン抵抗性の測定・評価方法を確立した。引き続き、現在は各種金属錯体による抑制効果を検討中である。1.配位子の合成:バナジウムおよび亜鉛錯体合成のためのマルトール誘導体の合成、マンガン錯体合成のためのサレン関連配位子の合成2.各種金属錯体の合成:バナジル(IV)、亜鉛(II)、マンガン(II、III)

4.培養細胞系を用いるインスリン抵抗性改善作用の評価:脂肪細胞、筋細胞、肝細胞など今世紀最大の生活習慣病と位置づけられ糖尿病は、わが国では治療中および潜在患者を含めると1600万人に達すると言われており、新たな治療薬の開発が強く要望されている。高血糖状態が続くとインスリンシグナル伝達系にある細胞内タンパク質のO-グリコシル化修飾(0-GlcNAc化)が促進されるため、インスリン抵抗性が惹起して2型糖尿病の発症につながる機構が最近支持されてきている。我々は、実験モデル動物を用いた検討から、生体関連元素を含有する金属錯体の中に2型糖尿病の改善作用があることを見出した。今回の研究では、(1)糖尿病改善の作用機構について、金属錯体とO-linked β-N-acetylglucosaminetransferase (OGT)との相互作用の点から解明すること、さらに(2)インスリンまたは従来の合成薬剤に代わる臨床応用可能な新しいバナジウム、亜鉛、およびマンガンを含む生体関連元素含有錯体を開発することを目的として2年間の研究を計画した。昨年度(平成18年4月平成19年3月)は、以下の1-4を中心に検討を行い、培養細胞系における細胞内タンパク質の糖化修飾およびインスリン抵抗性の測定・評価方法を確立した。1.配位子の合成:バナジウムおよび亜鉛錯体合成のためのマルトール誘導体の合成、マンガン錯体合成のためのサレン関連配位子の合成2.各種金属錯体の合成:バナジル(IV)、亜鉛(II)、マンガン(III)4.培養細胞系を用いるインスリン抵抗性改善作用の評価:脂肪細胞(3T3-L1)引き続き、今年度(平成19年4月平成20年3月)は、各種金属錯体による抑制効果を検討した。その結果、亜鉛錯体が細胞内タンパク質の0-グリコシル化修飾を抑制することを初めて見出した。その抑制機構について、さらに現在、検討中である。
歯胚の形態形成におけるＰＰ２Ａインヒビターの細胞内シグナル伝達制御機構の解明

歯の形態形成は上皮間葉相互作用により行われる。我々は、マウス歯胚形成初期に強発現を示す遺伝子をcDNAサブトラクション法によりいくつか検出した。今回、それらの因子の中でPP2Aインヒビター2(I2PP2A)およびFRG1について、マウス歯胚組織を用いてタンパクやmRNAの局在を形態学的に検索し、歯の形態形成において特異的な発現していることを見出した。併せて、マウス歯原性上皮細胞内でのFRG1発現および局在を検索し、I2PP2AおよびFRG1がマウス歯胚形態形成において重要な役割を担っていることが示唆された。我々は、歯の再生医療を見据えた人工的な歯胚再生法の確立を目指した研究を推進しており、既に歯原性上皮幹細胞の作製に着手しているところである。歯原性幹細胞を分化誘導するシステムの確立には、上皮間葉相互作用に重要な歯胚形成因子の分子ネットワークを捉えることが必要である。我々は、マウス歯胚形成初期に強発現を示す遺伝子をcDNAサブトラクション法により検索し、歯胚の形態形成への関与について報告されていない因子をいくつか検出した。I2PP2A(protein phosphatase 2A inhibitor 2/SETα)はそのうちの1つである。本研究の目的は、歯胚形成過程に重要とされる細胞内シグナリング分子ネットワークであるWnt、TGFβ/Bmp、MAPKシグナル伝達系に着目し、それらのシグナル伝達を調節している因子としてI2PP2Aの制御機構を捉え、その機能的役割を解明することである。歯の再生医療を見据えた人工的な歯胚再生法の確立を目指した研究を推進しており、既に歯原性幹細胞の作製に着手した。我々は、マウス歯胚形成初期に強発現を示す遺伝子を検索し、歯胚の形態形成への関与について報告されていない因子をいくつか検出した。本研究は、歯胚形成過程に重要とされる細胞内シグナリング分子ネットワークであるWnt、TGFβ/Bmp、MAPKシグナル伝達系に着目し、それらのシグナル伝達を調節しているprotein phosphatase 2Aの阻害因子であるI2PP2Aの制御機構を捉え、その機能的役割を解明しようとするものである。我々は、マウス歯胚形成初期に強発現を示す遺伝子をcDNAサブトラクション法にて検索し、歯胚の形態形成への関与について報告されていない因子をいくつか検出した。I2PP2A (protein phosphatase 2A inhibitor 2/SETα)はそのうちの1つである。本研究は、歯胚形成過程に重要とされる細胞内シグナル伝達を調節しているprotein phosphatase 2Aを阻害する因子であるI2PP2Aに着目し、その機能的役割を解明することを目的とした。平成25年度は、胎齢11日の下顎および胎齢15日歯胚組織を器官培養下で、I2PP2A siRNAによるI2PP2Aノックダウンを行い、通法により組織標本を作製し、歯胚形態の変化を組織学的に解析した。平成26年度、I2PP2Aの機能解明に必要とするI2PP2A発現制御ベクターの作製に時間を要し、機能解析を行うまでには至らなかった。そこで平成27年度は、I2PP2A同様に歯胚形成初期に強発現を示す遺伝子として検出されたFRG1(facioscapulohumeral muscular dystrophy region gene 1)について、歯原性細胞や歯胚組織を用いた局在や機能に関する実験を行い、若干の知見を得た。平成26年度には胎齢11日マウス下顎および胎齢15日の歯胚組織を用いた器官培養実験を主に行った。いずれの胎齢においても、培養開始から1日毎に3日間I2PP2A siRNAを培地に添加することでノックダウンを行い、実験終了後、通法により組織標本を作製し、形態学的な解析を行った。同時に、タンパクおよびmRNAを回収し歯胚形態形成の変化を機能的に解析するための試料を作製した。I2PP2Aノックダウンにより、I2PP2A mRNAの合成阻害および歯胚形態形成阻害を確認できた、サンプル数を増やしている。また、I2PP2Aシグナリングネットワークを調べる上で、歯原性上皮細胞株を用いて、SmadとAktのシグナリング経路を確認できた。しかし、ProteoTunerシステムを用いたI2PP2Aの発現制御ベクターが作製途中の段階にある。口腔病理学2) ProteoTuner (Clontech社)システムを用いたI2PP2Aの発現制御ベクターを作成する。

まず始めに、歯髄細胞株にI2PP2A発現制御ベクターをエレクトロポレーション法により導入し、I2PP2Aの発現制御を行い、Wnt、TGFβ/Bmp、MAPKシグナル伝達系のタンパク質のリン酸化をWestern blotting法で、シグナル伝達系の標的遺伝子および歯原性因子の定量解析をリアルタイムPCR法で行う。次に、歯原性上皮細胞株でも、同様の実験を行う。3)胎齢10日、全胚培養下にて、神経管に近接した神経堤細胞に対してI2PP2A発現制御ベクターをエレクトロポレーション法により導入する。歯胚上皮が肥厚し始める時期まで、3日間培養、その後I2PP2Aの発現制御を行い、Wnt、TGFβ/Bmp、MAPKシグナル伝達系のタンパク質のリン酸化をWestern blotting法で、シグナル伝達系の標的遺伝子および歯原性因子の定量解析をリアルタイムPCR法で行う。平成25年度には胎齢11日マウス下顎および胎齢15日の歯胚組織を用いた器官培養実験を主に行った。培養開始から毎日1回、3日間I2PP2AsiRNAを培地に添加、I2PP2Aの発現阻害を行った。阻害実験終了後、通法により組織標本を作製し、形態学的な解析を行った。同時に、タンパクおよびmRNAを回収し、歯胚形態形成の変化を機能的に解析するための試料を作製した。胎齢11日または胎齢15日から3日間のI2PP2A発現阻害により、I2PP2AmRNA発現量の減少をリアルタイムPCR法にて確認できたこと、および歯胚形態形成が阻害されたことから、I2PP2Aは歯胚形成因子の分子ネットワークに重要な役割を有していることが示唆された。2) ProteoTunerシステム(Clontech社)を用いたI2PP2Aの発現制御が可能なベクターを作成し、歯胚上皮細胞株・歯髄細胞株にI2PP2A発現制御ベクターをエレクトロポレーション法により導入し、I2PP2Aの発現制御を行い、Wnt、TGFβ/Bmp、MAPKシグナル伝達系のタンパク質のリン酸化をWestern blotting法で、シグナル伝達系の標的遺伝子および歯原性因子の定量解析をリアルタイムPCR法で行う。3)胎齢10日、全胚培養下にて、I2PP2A発現制御ベクターを神経管に近接した神経堤細胞に導入後、歯胚上皮が肥厚し始める時に、ProteoTunerシステムによりI2PP2Aタンパク質発現を制御して、歯胚形成におけるI2PP2Aの機能の解析を行う。
レセプター遺伝子導入モデルを用いたウマヘルペスウイルス1型潜伏感染機構の解明

ウマヘルペスウイルス1型(EHV-1)レセプターであるウマMHCクラスI分子を発現する小動物モデルを使用し、EHV-1潜伏感染の分子機構を明らかにする目的で、平成30年度は以下の実験を行った。EHV-1潜伏感染を再現する神経細胞モデルとして、RN33B-A68B2M細胞(ウマMHCクラスI重鎖遺伝子クローンを安定発現させたラット中脳縫線核神経細胞株)を作製した。本細胞株は温度感受性SV40ラージT抗原の導入によって不死化されており、33°Cにおいては増殖が認められるが、培養温度を37°Cに上昇させることによって分化し、神経細胞の形質を示すようになる。未分化RN33B-A68B2M細胞、分化RN33B-A6B2M8細胞にそれぞれEHV-1を感染させたところ、前者においてはウイルスの増殖感染が生じ、培養上清中に感染性ウイルス粒子が産生されたのに対し、後者ではウイルスの増殖が認められなかった。細胞内ウイルス遺伝子転写産物をRT-PCR法により比較定量したところ、分化RN33B-A68B2M細胞は未分化RN33B-A68B2M細胞に比較して著しく低い発現レベルを示した。EHV-1感受性マウスT細胞モデルとして作製したCTLL2-A68細胞(A68を安定発現させたマウスの細胞傷害性T細胞由来細胞株)にTGF-β存在下でウイルス持続感染を成立させ、デキサメタゾン等の薬剤処理ならびにTGF-βの除去を行ったが、ウイルスの再活性化は認められなかった。細胞表面にA68を高発現するクローンを選別した場合でも、in vitroにおけるウイルス感染率は0.97%と非常に低く、受身移入による潜伏感染の解析は困難と考えられた。以上に加え、ウマMHCクラスI分子を全身臓器に発現する遺伝子導入マウスの肺は野生型マウスの肺に比較してより高いEHV-1感受性を示すことを報告した。In vivoモデルとして当初計画していたCTLL2-A68細胞の受身移入による潜伏感染モデルは、細胞のウイルス感受性の低さにより、マウス体内でのトレースが困難であると考えられた。一方、平成30年度にin vitroモデルとして新たに作成したRN33B-A68B2M細胞は、本研究の目的であるEHV-1の潜伏感染の背景にある分子機構の解明に有用であると考えられ、順調に解析を行なっている。EHV-1は神経細胞に潜伏感染することが示唆されているが、その一方で他のアルファヘルペスウイルスとは異なり、神経細胞におけるウイルス増殖は通常認められない。RN33B-A68B2M細胞は神経分化状態においてこの性質を模倣していることから、ウイルス感染時、再活性化誘導時に特異的に発現するノンコーディングRNAの解析を未分化RN33B-A68B2M細胞、分化RN33B-A68B2M細胞の双方に対して行い、ウイルスー神経細胞間の相互作用を明らかにする。ウマヘルペスウイルス1型(EHV-1)レセプターであるウマMHCクラスI分子を発現するマウスモデルを使用し、EHV-1潜伏感染の分子機構を明らかにする目的で、平成28年度は以下の実験を行った。EHV-1感染馬においてウイルスはT細胞もしくは三叉神経節に潜伏感染する。しかしながら、馬のリンパ球、神経細胞由来株化細胞は存在しない。そこでEHV-1潜伏感染を再現し得るin vitroモデルを作製する目的で、CTLL2(マウスの細胞傷害性T細胞由来細胞株)とPC12(ラットの副腎褐色細胞腫由来細胞株)にレンチウイルスベクターを用いてウマMHCクラスI重鎖遺伝子クローンA68を安定発現させ、EHV-1感受性を付与した(CTLL2-A68細胞およびPC12-A68細胞と命名)。PC12-A68細胞は神経成長因子(NGF)存在下で神経細胞様に分化した。この分化PC12-A68細胞にEHV-1を感染させ、ウイルス前初期遺伝子、後期遺伝子の発現ならびにウイルスゲノムの有無をRT-PCR法およびPCR法によって感染後11日目まで継時的に検索した。その結果、ウイルス遺伝子(mRNA)の発現は感染後3日目以降に検出限界以下となったが、ウイルスゲノム(DNA)は実験期間を通じて細胞中に検出された。従って、EHV-1は分化PC12-A68細胞に持続感染を成立することが示唆された。一方、CTLL2-A68細胞ではEHV-1感染後早期にウイルスゲノムが検出限界以下となり、これは活発な細胞増殖によってウイルス感染細胞が希釈されたためと推察された。本研究ではCre-loxP部位特異的組換えによってT細胞特異的にウマMHCクラスI分子の発現を誘導したLck/A68-B2Mマウスをin vivoモデルとして主に用いる予定であるが、その繁殖に時間を要している。そのためin vivoモデルの解析に遅れが生じているが、in vitroモデルについては概ね順調に進展している。ウマヘルペスウイルス1型(EHV-1)レセプターであるウマMHCクラスI分子を発現するマウスモデルを使用し、EHV-1潜伏感染の分子機構を明らかにする目的で、平成29年度は以下の実験を行った。EHV-1潜伏感染を再現する神経細胞モデルとして平成28年度に作製したPC12-A68細胞(ウマMHCクラスI重鎖遺伝子クローンA68を安定発現させたラットの副腎褐色細胞腫

由来細胞株)を神経成長因子下で7日間培養することにより、神経細胞様に分化させた。この細胞にEHV-1を感染させ、アシクロビル存在下で培養することにより、持続感染を成立させた。ヒト単純ヘルペスウイルスではデキサメサゾン(DEX)がウイルス前初期遺伝子プロモーターに作用し、ウイルス再活性化を誘導することが知られている。そこでEHV-1持続感染細胞をDEX存在下で7日間培養し、培養上清中の感染性ウイルス粒子の有無および細胞内ウイルス遺伝子転写産物の検出を試みた。その結果、DEX添加群・非添加群ともに培養上清中に感染性ウイルスは認められなかったが、DEX添加群において33.3%、DEX非添加群において3.33%の割合でウイルスICP0遺伝子転写産物が検出され、両者には有意差が認められた。以上の結果より、DEXにより誘導されたウイルス遺伝子発現誘導は、ウイルス再活性化を模倣している可能性が示唆された。EHV-1感受性マウスT細胞モデルとして作製したCTLL2-A68細胞(A68を安定発現させたマウスの細胞傷害性T細胞由来細胞株)は細胞増殖が活発なためウイルス持続感染の成立が困難であったが、TGF-β処理によって生細胞数を維持しながら細胞増殖の遅延を誘導することが可能となった。in vivoモデルとして当初用いたLck/A68-B2Mマウスは目的とする表現型の産仔を一定数得ることが難しいため、CTLL2-A68細胞の受身移入による潜伏感染モデルの解析を検討している。in vitroモデルについては順調に進展している。ウマヘルペスウイルス1型(EHV-1)レセプターであるウマMHCクラスI分子を発現する小動物モデルを使用し、EHV-1潜伏感染の分子機構を明らかにする目的で、平成30年度は以下の実験を行った。EHV-1潜伏感染を再現する神経細胞モデルとして、RN33B-A68B2M細胞(ウマMHCクラスI重鎖遺伝子クローンを安定発現させたラット中脳縫線核神経細胞株)を作製した。本細胞株は温度感受性SV40ラージT抗原の導入によって不死化されており、33°Cにおいては増殖が認められるが、培養温度を37°Cに上昇させることによって分化し、神経細胞の形質を示すようになる。未分化RN33B-A68B2M細胞、分化RN33B-A6B2M8細胞にそれぞれEHV-1を感染させたところ、前者においてはウイルスの増殖感染が生じ、培養上清中に感染性ウイルス粒子が産生されたのに対し、後者ではウイルスの増殖が認められなかった。細胞内ウイルス遺伝子転写産物をRT-PCR法により比較定量したところ、分化RN33B-A68B2M細胞は未分化RN33B-A68B2M細胞に比較して著しく低い発現レベルを示した。EHV-1感受性マウスT細胞モデルとして作製したCTLL2-A68細胞(A68を安定発現させたマウスの細胞傷害性T細胞由来細胞株)に