hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
DNAの構造と反応性に関するケミカルバイオロジー研究

申請者のグループではブロモウラシルに置換したDNAの光照射を用いてDNAの構造と反応性について分子レベルで研究を進めてきた。検討の結果、DNAの局所構造と光照射によって生成したウラシルラジカルによる水素引き抜きの相関を明らかにすることができ、この手法を用いたDNA構造の検出が可能であることを示した。本研究によって、特定の遺伝子発現に連動したDNAのダイナミックな構造変化とその制御法への道が拓けた。申請者のグループでは光の細胞透過性に着目し、細胞内のチミンを5-ハロウラシルで置換し、その光反応性を用いてDNAの構造解析を行なうことを目指し基礎研究を進めてきた。本研究では、DNAの構造と機能の制御に関する化学的研究を推進することによって、遺伝子発現に連動したDNAのダイナミックな構造変化を解明し、特定遺伝子の一般的な発現制御法の開拓を目的としている申請者のグループではブロモウラシルに置換したDNAの光照射を用いてDNAの構造と反応性について分子レベルで研究を進めてきた。本研究では、DNAの構造と機能の制御に関する化学的研究を推進することによって、遺伝子発現に連動したDNAのダイナミックな構造変化を解明し、特定遺伝子の一般的な発現制御法の開拓を目的としている。特に、グアニンに富むDNA配列が形成する特異的な立体構造、Z型や4本鎖構造はDNA結合性タンパクの認識モチーフとして興味深い。従って、細胞内DNA中で形成している高次構造の状態を解析するための方法論の開発は細胞生物学的にも重要な研究である。当初の計画ではZ型DNAや染色体末端のテロメアが形成する4本鎖領域に選択的に結合する新規機能分子を設計・合成し、プレートリーダーを用いて構造特異的な結合特性評価を網羅的にすすめることとしていた。誘導体の合成と機能評価進めていたが、研究開発初期段階で発見した機能分子を超える新規機能分子を見出すことができないという結果となった。そのため、今年度は異なった候補化合物からの誘導体合成に努めた。また、細胞内ゲノム中での特異的な遺伝子発現制御に関する研究の一環として、現有のFmoc固相合成法によりPy-Imポリアミド合成の効率化を行ない、新規機能性ポリアミドの合成と機能評価を行った。その結果、10塩基対の認識塩基配列を有する機能分子設計の改善が進み詳細を論文に報告した。現在、転写開始領域で観察されるグアニン連続配列や、染色体末端のテロメア配列で形成される4本鎖構造を研究対象として、構造特異的な機能評価を詳細に進めている。本年度は、転写開始領域で観察されるグアニン連続配列や、染色体末端のテロメア配列で形成される4本鎖領域を対象として、有機化学と光化学の両側面から構造特異的な特性評価を網羅的に進めた。特に、ヒトテロメア配列の4本鎖形成能が生体内の安定なラリアット構造の形成に関与していることをDNAフラグメントのPAGE解析に基づいて確認し、論文として報告した。また、申請者が開発を進めている光反応によるDNA解析法は,5-ハロウラシル(XU)を光プローブとして用いることにより,大きく変化するDNAの局所構造をモニタリングできる点が大きな特徴である。実際に,DNA合成機を用いてDNA中のチミンはXUに容易に置換することは可能である。中でも、XUで特定位置のチミンを置換したピレンラベルしたDNAフラグメントに対する光反応について詳細に解析を行なった結果、配列特異的なウラシルラジカルによる水素引き抜き反応とリボノラクトンの形成が起きていたことを確認した。DNA末端に存在するペリレンからの電荷移動が,XUの光反応によるDNA損傷機構において重要な役割を果していることが示唆された。現在、細胞DNA中でのG-カルテット構造の検出等の応用を目指して、XUの光反応や単分子FRET測定技術の有用性の確認を行なっている。本年度も、転写開始領域近傍で観察されるグアニンに富む連続配列や、ヒト染色体末端のテロメア配列、GGGTTA繰返配列で形成されるG-4本鎖構造と機能に関して研究を進めた。単分子FRET測定技術を4本鎖構造の確認に応用することにも成功し、これまでの研究成果を活かして、光化学から遺伝子有機化学全般に関わる構造特異的な機能評価を実施した。特に、ヒトテロメア配列の主な4本鎖構造を、DNAフラグメントのNMR解析に基づいて詳細に解析し、論文として報告した。加えて、申請者が研究を進めている光反応によるDNA構造解析法は,5-ハロウラシル(XU)を光プローブとして用いることにより,大きく変化するDNAの局所構造を推定することができる。DNA中のチミンをXUに置換することは可能であり、今年度は、5-ハロシトシン(XC)の光プローブとしての可能性を新たに探索した。XUの代わりにXCを用いることが可能になれば、細胞内へ適用可能な塩基配列の範囲が広がり、構造解析技術としての汎用性が高まると考える。

実際に、特定位置のシトシンをXCに置換したDNAフラグメントに対する光反応について詳細に解析を行なった結果、構造特異的なシトシンラジカルによる水素引き抜き反応とリボノラクトンの形成が起きていることを確認した。現在、最終年度での細胞生物学的な応用を目指してXUとXCの構造に起因した基礎的な光反応性の確認、及び大腸菌DNA内におけるG-カルテット構造の光反応を活用した検出技術の検討を進めている。申請者のグループではこれまで光の細胞透過性に着目し、細胞内のチミンを5-ハロウラシル(XU)で置換し、その光反応性を用いてDNAの構造解析を行なうことを目指し基礎研究を進めてきた。本研究では、DNAの構造と機能の制御に関する化学的研究を推進することによって、遺伝子発現に連動したDNAのダイナミックな構造変化を解明し、特定遺伝子の一般的な発現制御法の開拓を目的としている。本年度は、転写開始領域近傍で観察されるグアニンに富む連続配列や、ヒト染色体末端のテロメア配列、GGGTTA繰返配列で形成されるG-4本鎖構造と機能に関する解析研究が進展した。中でも原子間力顕微鏡(AFM)を用いる単分子測定技術をヒトテロメア配列が形成する4本鎖構造の熱力学的な解析技術として応用することに成功した。加えて、申請者のグループのこれまでのDNA化学で培った研究手法を駆使して、ヒトテロメア配列が形成する4本鎖構造に特異的に結合する新規機能分子、キラルウェッジの結合特性や生物活性を詳細に評価・解析した結果をまとめ、論文として報告した。5-ハロシトシン(XC)の光プローブとしての可能性の探索も進んでいる。XUの代わりにXCを用いることが可能になれば、細胞内へ適用可能な塩基配列の範囲が広がり、構造解析技術としての汎用性が高まると考える。現在、細胞生物学的な応用が重要な課題であり、XUとXCの構造に起因した基礎的な光反応性の確認、及び、大腸菌DNA内に対する光反応を活用した構造検出技術の開発を目指している。
発見的数値解析利用を実現する並列分離型連成フレームワークの創成

本研究課題では、分散メモリ型並列計算機による大規模解析を前提とし、広い分野の様々な連成問題に対応できる汎用的なカプラーを開発することで、高度な大規模連成解析を可能とする解析フレームワークを創成し、数値解析を未知の現象や危険の発見的予測が可能なレベルにまで昇華させることを目指す。そのために、各現象の解析間の空間・時間離散化の違いによる時空間不整合性を、力学的・数理的妥当性を保持した形で扱うことができる一般化連成手法と連成アルゴリズムの開発を行う。また、それぞれに異なる連成形態をもつ三つの実問題をターゲットとし、大規模並列連成解析の精度および妥当性を検証する。未知の現象の解析や発見的予測を目指して、汎用的なカプラーを開発することで、複数の現象とそれらの相互作用を考慮し数値解析を行う「連成解析」を、より高度な大規模連成解析フレームワークとして創成することを目的とした研究である。時空間不整合性を含む広範囲の連成問題の一般化、連成問題の定量的評価、複雑・複合的連成問題について大規模解析を行う枠組みの構築という学術的問題について、実問題への応用を見据え、より広範囲の工学的分野に通用する大規模解析法の開発が期待される。
バリスティックトレーニングにおける安全な負荷重量とその効果

異なる負荷重量におけるバリスティック動作(BM)の力発揮と筋電図活動および血圧値の変化を明らかにし,バリスティックトレーニング時の負荷設定について検討を加えた。実験1.課題はスミスマシンを用いた仰臥位でのレッグプレスとし,15回の反復動作を行なわせた。負荷重量は30%,40%,50%,60%,70%1RMとした。動作は通常動作(NM)とBMの2種類とした。重量物の重心変位,速度,加速度を計測し,ばね力,ダンパ力,ジャッキ力を算出した。外側広筋,内側広筋,大腿二頭筋,大殿筋より表面筋電図を導出記録した。実験2.実験課題,負荷重量,動作は実験Iと同様の条件で血圧値の測定を行なった。NMでは常にばね力,ジャッキ力が働き,負荷の増大と共にばね力,ジャッキ力も増大した。BMでは,ばね力,ジャッキ力の発揮は切り返し期に集中した。負荷の増大と共に切り返し期のばね力,ジャッキ力は増大し,さらに下降期においてダンパ力が出現した。60%1RMになると,切り返し期および上昇期のジャッキ力が増大し,70%1RMでは上昇期途中にさらに突発的なジャッキ力を発揮する傾向がみられた。30%50%1RMにおけるBMの筋電図活動は,動作最終局面で筋活動の休止がみられたが.60%1RM以上になると動作の最後まで筋活動がみられた。血圧値の変化は,最高血圧値において30%50%1RMでBMの方が有意に低い値を示した。これらの結果から,筋の弾性エネルギーを利用しで慣性を生み出し,スムーズな挙上が実現できる負荷重量は60%1RM程度以下であることが示唆され,スミスマシンによるレッグプレスでは60%1RMを越えない負荷重量で行なうのが望ましいと考えられた。平成17年度の実績の一部は第60回日本体力医学会で発表された。動作速度と力発揮の関係を検討するため,以下の2点を目的とした.(1)スクワット動作における身体機能を「ばね」「ダンパ」「ジャッキ」の3種類の機械要素にモデル化し,スクワットの動作速度と力発揮パターンの特徴をとらえる.(2)スクワット動作中の外側広筋(VL)および大腿二頭筋(BF)の筋電図活動を観察し,力発揮パターンと筋の活動動態の関係を把握する.被験者は健康な男子7名(17-18歳)であった,スミスマシーンを用いたハーフスクワットを課題とし,負荷重量は15%,30%,60%RM,動作速度は低速(約2秒に1回)および高速(初動負荷法・約1秒に1回)とし,それぞれの組み合わせによる6条件とした.スクワット動作中の床反力と重量物の変位から,身体の力発揮機構を「ばね力」「ダンパ力」「ジャッキ力」として算出した.重量物の移動が下降から上昇に変化する局面におけるばね力またはジャッキ力の最高値は低速の場合,負荷の増加に伴って大きな値を示した.高速の場合,負荷の増大に関係なく約1500kNであった.低速,高速ともに負荷の増大に伴い,重量物の下降期におけるダンパ力の働きが大きくなった.これらの結果より,15%RMの負荷であっても高速であれば,短時間ではあるが60%RMと同等の力発揮を行なっていると考えられた.また,負荷の上昇に伴って下降期にダンパ力を発揮し,速度調節を行なうことによって切り返し期の力発揮を1500kN程度に調節している可能性が考えられた.VLおよびBFの筋電図活動はいくつかの条件で,高速と低速の間に有意な差がみられたが,力発揮パターンにおける高速と低速の差を考慮すると,速度の違いによる筋活動の差は小さいものと考えられた.これはスクワット動作が多関節運動であり他の筋活動の影響が大きいこと,また高速動作の場合,多くの筋活動の同期性により力発揮が実現している可能性が推察された.スクワット動作では,15%1RMといった低負荷であっても高速動作であれば60%1RMと同等のばね力が観察された。負荷の増大に伴って重量物下降期にダンパ力を発揮し、速度調節を行なうことによって切り返し期のばね力を一定に調節している可能性が考えられた(平成15年度実績,平成16年度論文集「高専教育」で一部発表)。今年度は単関節運動である足関節底屈動作に着目し,動作速度と力発揮パターン(ばね,ダンパ,ジャッキ)の様相を観察した。その結果,足関節運動における力発揮はばね力およびジャッキ力で構成されており,ダンパ力はみられなかった。高速動作におけるばね力およびジャッキ力の最大値はスクワット動作と同様,動作の切り返し期(背屈から底屈)にみられたが,この値は低負荷で小さく,高負荷で大きな値を示した。足関節運動では可動範囲が小さいため,ばね力を引き出すだけの十分な速度が得られず,ダンパ力による動作速度の調節も不要であったと考えられた。以上のことから単関節運動では低負荷で十分なばね力を引き出すことは難しいと推察され,ウェイトトレーニングにおいてばね力の強化を目的とする場合,多関節運動種目を選択することが望ましいと考えられた。また安全性の観点から考えると,多関節運動種目では高速であれば低負荷でも大きなばね力が発揮され得ることから,低負荷であってもその動作速度には特に注意が必要であると考えられた。

現在,動作速度と生体反応(血圧,心拍数,酸素摂取量,血中乳酸濃度等)の関係,動作速度とそのトレーニング効果についての実験を進行させている。異なる負荷重量におけるバリスティック動作(BM)の力発揮と筋電図活動および血圧値の変化を明らかにし,バリスティックトレーニング時の負荷設定について検討を加えた。実験1.課題はスミスマシンを用いた仰臥位でのレッグプレスとし,15回の反復動作を行なわせた。負荷重量は30%,40%,50%,60%,70%1RMとした。動作は通常動作(NM)とBMの2種類とした。重量物の重心変位,速度,加速度を計測し,ばね力,ダンパ力,ジャッキ力を算出した。外側広筋,内側広筋,大腿二頭筋,大殿筋より表面筋電図を導出記録した。実験2.実験課題,負荷重量,動作は実験Iと同様の条件で血圧値の測定を行なった。NMでは常にばね力,ジャッキ力が働き,負荷の増大と共にばね力,ジャッキ力も増大した。BMでは,ばね力,ジャッキ力の発揮は切り返し期に集中した。負荷の増大と共に切り返し期のばね力,ジャッキ力は増大し,さらに下降期においてダンパ力が出現した。60%1RMになると,切り返し期および上昇期のジャッキ力が増大し,70%1RMでは上昇期途中にさらに突発的なジャッキ力を発揮する傾向がみられた。30%50%1RMにおけるBMの筋電図活動は,動作最終局面で筋活動の休止がみられたが.60%1RM以上になると動作の最後まで筋活動がみられた。血圧値の変化は,最高血圧値において30%50%1RMでBMの方が有意に低い値を示した。これらの結果から,筋の弾性エネルギーを利用しで慣性を生み出し,スムーズな挙上が実現できる負荷重量は60%1RM程度以下であることが示唆され,スミスマシンによるレッグプレスでは60%1RMを越えない負荷重量で行なうのが望ましいと考えられた。平成17年度の実績の一部は第60回日本体力医学会で発表された。
「看護師の自律性」と社会的関連要因に関する研究ー日米比較ー

本研究の目的は、「看護師の自律性」と社会的要因(特に職場環境)との関連を明らかにすることであり、「看護師の自律性」尺度(KNAS)による日米での実態調査を試みた。日本側調査では、これまでの調査結果(専門看護師、認定看護師、特定機能病院勤務の臨床看護師)に加え、日本の「看護の質向上を目指す」4施設の看護師102名、「院内助産に取り組んでいる」6施設の助産師75名を対象に調査を実施した。その結果、後者2対象は、下位尺度での差はあったものの臨床看護師との有意な差はなかった。米国側調査では、予備調査を実施したが本調査の実施に至らず、改めて英語翻訳版尺度で実施する予定である。本研究は、看護師が臨床でどのように「看護師としての自律性」を発揮しているのか、特に受けた教育課程との関連、また職場環境との関連から解明しようとするものである。今回の取り組みは、これまでの調査(日本の「看護師の自律性」の実態、米国在住日本人看護師との比較)を元に、同一尺度(英語翻訳版)で米国人の「看護師の自律性」の実態調査をすることで、「看護師の自律性」関連要因のうち社会的要因(特に職場環境に焦点を当てる)を探り、日本の看護管理・看護教育への示唆を得ることを目的としている。平成25年度は、来年度に米国でMagnet hospitalとして認可されているMedical Center勤務の「看護師の自律性」の実態調査を行うため、1日本における比較対象施設を選定し、該当施設に勤務する「看護師の自律性」調査、2日本の保健師助産師看護師法の範囲内で高い自律性発揮が考えられる看護職種(助産師)を対象とした「助産師の自律性」調査を実施し、3「看護師の自律性」測定尺度の英語翻訳版作成を行った。その結果、1「看護の質向上」に継続的に取り組むJCI(Joint Commission International)認証取得施設に勤務する臨床看護師323名を対象に調査し、140名から回答を得た(回収率43.3%)。2助産外来・院内助産を実践している全国6施設に勤務する助産師147名(日本看護協会webサイト, 2012年)を対象に調査し、79名から回答を得た(回収率53.7%)。3英語翻訳版尺度を作成し、英語版暫定尺度としての妥当性を検討中である。平成26年度は、日本・米国で予備調査を行い、米国人看護師の「看護師の自律性」とその関連要因の本調を実施する。この結果を用いて、暫定版尺度の信頼性・妥当性を検討するとともに、米国人「看護師の自律性」の実態把握とその関連要因を検討する。本研究は、看護師が臨床でどのように「看護師の自律性」を発揮しているのか、特に受けた教育課程との関連、また職場環境との関連から解明しようとするものである。その結果、Medical Centerでの調査は可能だが、申請の窓口については、Medical CenterではなくUCSFから申請することとなり、平成27年度調査に向けて準備を整えることとなった。現在、英語翻訳版尺度を作成し、英語版暫定尺度としてのプレテストを米国APNとRNに対し実施中である。平成27年度は、プレテストを基に、UCSFに勤務する米国人看護師の「看護師の自律性」とその関連要因の調査を実施する。この結果を用いて、暫定版尺度の信頼性・妥当性を検討すると共に、米国人「看護師の自律性」の実態把握とその関連要因を検討し、日本での調査結果と比較検討する。これまで研究者が実施した調査(日本の「看護師の自律性」の実態、米国在住日本人看護師との比較)を元に、同一尺度(英語翻訳版)で米国人の「看護師の自律性」の実態調査をすることで、「看護師の自律性」関連要因のうち社会的要因(特に今回はMagnet hospitalとしての職場環境に焦点を当てる)を探り、日本の看護管理・看護教育への示唆を得ることを目的としている。平成25年度は、米国のMagnet hospitalに対応する日本の「看護の質向上を目指す施設」に勤務する看護師の調査および日米の助産師の比較をするため日本の「院内助産に取り組んでいる施設」勤務の助産師を対象にした調査を実施した。平成27年度は、英語翻訳版尺度を作成し、英語版暫定尺度としての予備調査を米国APNとRNに対し実施したが、予備調査の有効回答数が少なく、本調査の実施に至らなかった。そのため、平成28年度に改めて英語翻訳版尺度の予備調査を実施した後に、本調査を実施する予定である。平成27年度の予定していた英語翻訳版の予備調査(米国内で実施)の有効回答数が少なかったため、本調査の実施に至らなかった。平成28年度前半に早急に実施する必要がある。

本研究は、看護師が臨床でどのように「看護師の自律性」を発揮しているのか、特に受けた教育課程との関連、また職場環境との関連から解明しようとするものである。これまで研究者が実施した調査(日本の「看護師の自律性」の実態、米国在住日本人看護師との比較)を元に、同一尺度(英語翻訳版)で米国人の「看護師の自律性」の実態調査をすることで、日本の看護管理・看護教育への示唆を得ることを目的としている。平成25年度は、米国のMagnet hospitalに対応する日本の「看護の質向上を目指す施設」に勤務する看護師の調査および日米の助産師の比較をするため日本の「院内助産に取り組んでいる施設」勤務の助産師を対象にした調査を実施した。平成27年度は、英語翻訳版尺度を作成し、英語版暫定尺度としての予備調査を米国APNとRNに対し実施したが、予備調査の有効回答数が少なく課題が残った。また、UCSFが大規模改修工事と病棟移転と重なったことにより調査受け入れ困難となり、本調査の実施に至らなかった。平成28年度に改めて、英語翻訳版尺度の信頼性・妥当性検討のための米国内研究フィールド開発に努めた。また、英語・日本語バイリンガルによるバックトランスレーションおよびAPNとRNへの予備調査実施とともに、現在調査対象組織への倫理申請準備中である。本研究の目的は、「看護師の自律性」と社会的要因(特に職場環境)との関連を明らかにすることであり、「看護師の自律性」尺度(KNAS)による日米での実態調査を試みた。日本側調査では、これまでの調査結果(専門看護師、認定看護師、特定機能病院勤務の臨床看護師)に加え、日本の「看護の質向上を目指す」4施設の看護師102名、「院内助産に取り組んでいる」6施設の助産師75名を対象に調査を実施した。その結果、後者2対象は、下位尺度での差はあったものの臨床看護師との有意な差はなかった。米国側調査では、予備調査を実施したが本調査の実施に至らず、改めて英語翻訳版尺度で実施する予定である。米国調査の窓口の決定に時間を要し、準備が遅れている。米国在住の研究協力者(UCSF大学院博士課程在籍者)との連絡・連携を強化し、米国における予備調査の有効回答数確保の手段を検討する。同時に、平成28年度中に本調査を実施するための検討を行い、準備を整え実施する。医歯薬学平成27年5月2日5月7日に米国に赴き、今年度の計画について、UCSFの研究協力者(大学院博士課程在籍中)と共に具体化する予定。平成25年度に予定していた日本における調査はおおむね実施できたが、英語翻訳版の妥当性検討については、日本では現在検討中、米国での検討は予定より遅れている。暫定尺度作成を平成26年度前半で行う必要がある。米国内で実施した英語翻訳版尺度の信頼性・妥当性検討のための予備調査の有効回答数が少なく、平成28年度に再度米国内で実施することとした。そのため、本調査が実施できず、旅費および人件費・謝金の支払いがなかった。研究計画の遅れにより米国出張の予定変更のため。英語翻訳版尺度の妥当性検討を、平成28年度前半に実施し、平成28年度内に本調査を実施する。平成26年度実施予定の米国の「看護師の自律性」とその関連要因の本調査(質問紙調査)は、平成25年度予定であった英語翻訳版(暫定版)作成と妥当性の検討、日・米予備調査の結果を踏まえて実施する。米国在住の研究協力者との連絡・連携を強化し実施する。平成26年度の計画は平成27年度に実施する。
統計熱力学計算に基づくロドプシンの熱安定化アミノ酸置換体の創出

昨年度の研究で改良した膜タンパク質用の独自の自由エネルギー関数(FEF)を用いてサーモフィリックロドプシン(TR)とキサントロドプシン(XR)の極めて大きな熱安定性の違いを解析した。我々のFEFは脂質二重膜を構成する炭化水素基を溶媒とみなした時の並進運動に伴うエントロピー利得に着目している点に特徴がある。膜内(TM)領域と水中(WI)領域はTRとXRの結晶構造に対して全原子の分子動力学(MD)シミュレーションを行うことで決定した。解析の結果以下のことが判明した。TRはXRと比較して、TM領域がより大きく、かつ、WI領域の極性・荷電性アミノ酸が少ないという特徴があった。これらの結果、エネルギーの観点でTRはTM領域でのタンパク質の分子内水素結合のエネルギー利得を大きくしつつ、かつWI領域での脱水和のペナルティー(水-タンパク質間の分子間水素結合の損失)を小さくできる構造である。さらに、エントロピーの観点でも、TRはXRと比較してより密に主鎖と側鎖を充填することにより、大きな溶媒のエントロピー利得を獲得していることが分かった。さらに、上記の研究で得られた知見に基づいて、TRをさらに熱安定化させるアミノ酸変異体の創出を行った。結晶構造から側鎖を上手く充填できていないと考えられるアミノ酸残基に対して他の19アミノ酸への置換体を計算機内で作成し、その置換に伴うエントロピー変化、エネルギー変化をFEFにより計算した。その結果から、熱安定化すると予測されるものを選出した。TM・WI領域は上記のMDシミュレーションで決定されたものを用いた。それらの変異体の熱安定性を実験により検証した結果、野生型と比較して熱変性温度が約3度向上した変異体が得られた。また、変異体の活性測定を行なった結果、プロトンポンプとしての機能を保持していることが確認された。当初の計画通り、昨年度改良した我々の自由エネルギー関数を用いて、TRの非常に高い熱安定性の物理起源を明らかにした。さらに、TRの耐熱化変異体の創出に成功した。このため予定通り順調に進展していると考えている。当初計画に従って、研究項目を継続する。今年度発見されたTRを熱安定化させるアミノ酸変異体に他の熱安定化アミノ酸変異を加えることで、さらに熱安定化したTRの創出に取り組む。極めて高い熱安定性を有する膜タンパク質であるサーモフィリックロドプシンに関して、その安定性の物理起源を膜タンパク質用に開発した我々独自の自由エネルギー関数(FEF)を用いて詳細に解析した。FEFはタンパク質内の静電相互作用エネルギー及び、細胞膜を構成する炭化水素基を溶媒と見なしたときの溶媒の並進配置エントロピーに着目している点に特徴がある。以下の手順で研究を遂行した。(1)エネルギー項の改良。いくつかの膜タンパク質に対してFEFのエネルギー項Λを計算し、それをCHARMM力場で計算される静電相互作用エネルギーEと比較することでΛの計算パラメータの改良を行った。(2)TRの高い熱安定性の物理起源の解析。(1)で改良されたΛを組み込んだFEFを用いて、TRの熱安定性の物理起源をTRと非常によく似た立体構造とアミノ酸配列をもつキサントロドプシン(XR)と比較することで解析した。その結果以下のことが判明した。膜内領域のみでは、TRもXRもエントロピーの観点では安定性に違いはない。また、エネルギーの観点ではXRの方が安定である。従って、膜内領域を見る限り、TRよりむしろXRの方が安定である。一方で、TRは水中領域でエントロピーSの観点で有利な構造となっている。同時にエネルギーΛの観点でも安定である。すなわち、TRは水中領域での側鎖の密な充填に伴う大幅な溶媒のエントロピー利得と、効率的な分子内及び水ータンパク質間水素結合形成により非常に高い熱安定性を獲得していることが判明した。本研究の成果は、他の多くの不安定な膜タンパク質の安定化への有力な指針を与えるものと期待される。当初の計画通り、我々の自由エネルギー関数を改良し、TRの非常に高い熱安定性の物理起源を明らかにすることができた。

結晶構造から側鎖を上手く充填できていないと考えられるアミノ酸残基に対して他の19アミノ酸への置換体を計算機内で作成し、その置換に伴うエントロピー変化、エネルギー変化をFEFにより計算した。その結果から、熱安定化すると予測されるものを選出した。TM・WI領域は上記のMDシミュレーションで決定されたものを用いた。それらの変異体の熱安定性を実験により検証した結果、野生型と比較して熱変性温度が約3度向上した変異体が得られた。また、変異体の活性測定を行なった結果、プロトンポンプとしての機能を保持していることが確認された。当初の計画通り、昨年度改良した我々の自由エネルギー関数を用いて、TRの非常に高い熱安定性の物理起源を明らかにした。さらに、TRの耐熱化変異体の創出に成功した。このため予定通り順調に進展していると考えている。当初計画に従って、研究項目を継続する。我々がこれまで開発してき膜タンパク質の熱安定化変異体の理論的予測手法に、今年度得られたTRの熱安定性起源の知見を融合することにより、TRの熱安定化変異体の創出を行う。今年度発見されたTRを熱安定化させるアミノ酸変異体に他の熱安定化アミノ酸変異を加えることで、さらに熱安定化したTRの創出に取り組む。研究を進めていく上で必要に応じて研究費を執行したため当初の見込み額と支出額は僅かに異なった。研究計画に変更はなく、前年度の研究費も含め、当初予定通りの計画を進めていく。日程の都合の問題で、参加を予定していた海外学会への渡航を取りやめたため、予定していた使用額と異なった。残額は次年度使用分と合わせて、新たな計算機(Dell Precision)の購入に利用する。
非線形進行波解に基づく矩形ダクト乱流二次流れの解明と制御

本研究では,ニュートン法によるプログラムを用いて,正方形ダクトにおける非線形定常進行波解の解析を行った.乱流二次流れと同様の8つの渦を有するパターンをもつ定常進行波解を求めることに成功した.この解の流れ方向平均された速度場は,乱流二次流れの時間及び流れ方向平均された平均二次流れの速度と同程度の強さを持ち,低レイノルズ数域(Re=1400-2500)での乱流二次流れの性質を定性的にも,定量的にも再現できていることがわかった.さらに,矩形ダクト流における非線形定常進行波解の解析も行った.正方形ダクトにおける乱流二次流れと同様の8つの渦を有するパターンをもつ定常進行波解を,ダクト断面のアスペクト比を変化させながら追跡した.レイノルズ数が1200の場合には,8つの渦を有する定常進行波は,2.4より小さいアスペクトに対してのみ存在することが明らかとなった.アスペクト比が大きくなると,定常進行波に見られる渦構造はスパン中央に局在化することが判明した.また,高レイノルズ数域(Re=3500,5480)で正方形ダクト乱流の直接数値シミュレーションを行い,平均二次流れと関連性が示唆されるダクト横断面での大規模循環流を,クレプシュポテンシャルを導入することにより同定し,大小様々なスケールを有する大規模循環流が平均二次流れを生成することを明らかにした.本研究では,ニュートン法によるプログラムを用いて,正方形ダクトにおける非線形定常進行波解の解析を行った.乱流二次流れと同様の8つの渦を有するパターンをもつ定常進行波解を求めることに成功した.この解の流れ方向平均された速度場は,乱流二次流れの時間及び流れ方向平均された平均二次流れの速度と同程度の強さを持ち,低レイノルズ数域(Re=1400-2500)での乱流二次流れの性質を定性的にも,定量的にも再現できていることがわかった.さらに,矩形ダクト流における非線形定常進行波解の解析も行った.正方形ダクトにおける乱流二次流れと同様の8つの渦を有するパターンをもつ定常進行波解を,ダクト断面のアスペクト比を変化させながら追跡した.レイノルズ数が1200の場合には,8つの渦を有する定常進行波は,2.4より小さいアスペクトに対してのみ存在することが明らかとなった.アスペクト比が大きくなると,定常進行波に見られる渦構造はスパン中央に局在化することが判明した.また,高レイノルズ数域(Re=3500,5480)で正方形ダクト乱流の直接数値シミュレーションを行い,平均二次流れと関連性が示唆されるダクト横断面での大規模循環流を,クレプシュポテンシャルを導入することにより同定し,大小様々なスケールを有する大規模循環流が平均二次流れを生成することを明らかにした.本研究では,4名の海外研究協力者:J.Jimenez教授(UPM), A.Pinelli博士(CIEMAT), M.Uhlmann教授(Karlsruhe工科大),L.van Veen博士(Ontario工科大)と学生の協力を得て以下の研究計画を実施した正方形ダクト流については,既に開発済みのニュートン法によるプログラムを用いて,非線形定常進行波解の解析を進めた.その結果,乱流二次流れと同様の8つの渦を有するパターンをもつ定常進行波解を求めることに成功した.この解の流れ方向平均された速度場は,乱流二次流れの時間及び流れ方向平均された平均二次流れの速度と同程度の強さを持ち,低レイノルズ数域(Re=1400-2500)、での乱流二次流れの性質を定性的にも,定量的にも再現できていることがわかった.また,高レイノルズ数域(Re=3500)で乱流の直接数値シミュレーションを行うことにより,乱流二次流れと関連性が示唆される大規模ストリークのダクト断面内での存在分布を調べ,ストリークがダクトの特定の位置に存在しやすいことを示した矩形ダクト乱流については,様々なアスペクト比に対して乱流遷移域での乱流の直接数値シミュレーションを行い,臨界レイノルズ数や乱流パフ,乱流斑点といった局在構造がアスペクト比の影響を大きく受けることを明らかにした.レイノルズ数については,正方形ダクトでは比較的高い遷移レイノルズ数となるが,アスペクト比の増加とともにレイノルズ数は減少し,アスペクト比が4程度において二次元チャネル(アスペクト比無限大)の遷移レイノルズ数と同程度となる.一方,乱流構造については,正方形ダクトでは乱流パフが現れるが,アスペクト比が4を超えると乱流斑点が現れ,乱れは流路スパン方向にも局在し始める.以上のシミュレーションに加え,本科研費により,矩形ダクトの実験装置を設計製作し,導入したレーザードップラー流速計による.流速計測及び可視化の実験の準備を進め,予備実験を開始した本研究では,4名の海外研究協力者:J.Jimenez教授(UPM),A.Pinelli博士(CIEMAT),M.Uhlmann教授(Karlsruhe工科大),L.van Veen博士(Ontario工科大),1名の研究協力者:清水雅樹助教と学生の協力を得て以下の研究計画を実施した.既に開発済みのニュートン法によるプログラムを用いて,矩形ダクト流における非線形定常進行波解の解析を進めた.平成22年度に求めた正方形ダクトにおける乱流二次流れと同様の8つの渦を有するパターンをもつ定常進行波解を,ダクト断面のアスペクト比を変化させながら追跡した.

その結果,レイノルズ数が1200の場合には,8つの渦を有する定常進行波は,2.4より小さいアスペクトに対してのみ存在することが明らかとなった.アスペクト比が大きくなると,定常進行波に見られる渦構造はスパン中央に局在化することが判明した.また,高レイノルズ数域(Re=5480)で正方形ダクト乱流の直接数値シミュレーションを行い,平均二次流れと関連性が示唆されるダクト横断面での大規模循環流を,クレプシュポテンシャルを導入することにより同定し,大小様々なスケールを有する大規模循環流が平均二次流れを生成することを明らかにした.さらに,様々なアスペクト比に対して乱流遷移域での乱流の直接数値シミュレーションを行い,アスペクト比が4を超えると乱れは,乱流パフといわれる流れ方向にのみに局在した状態から,流れ方向だけでなくスパン方向にも局在する,いわゆる乱流斑点の状態に移行することが明らかとなったが,このスパン方向の乱れの局在化は,上述の定常進行波の渦構造の局在化と関連性を有す得るものと考えられる.以上の理論,シミュレーションに加え,アスペクト比3の矩形ダクトの実験装置を設計製作し,レーザードップラー流速計による流速計測及び可視化の実験を行った.その結果,アスペクト比3の矩形ダクトの乱流遷移がシミュレーションとほぼ同一のレイノルズ数で生じることが確認され,上記シミュレーションの妥当性が検証された.様々なアスペクト比の矩形ダクトに対して乱流遷移域での流れの直接数値シミュレーションを行い,アスペクト比が4を超えると側壁近傍に乱れの存在しない静穏な領域が現れ,乱れ構造は,乱流パフといわれる流れ方向にのみに局在した状態から,流れ方向だけでなくスパン方向にも局在する,いわゆる乱流斑点の状態に移行することが明らかとなった.理論的には,このスパン方向の乱れの局在化は,これまで明らかにしてきた定常進行波の渦構造のスパン方向局在化により説明できるものと思われる.現象論的には,アスペクト比が4を超えると,側壁面上での剪断率が減少し,流路高さが摩擦長の100倍以下となり,壁近傍の低速ストリークや縦渦が側壁上に存在できなくなるため,乱れの自己再生サイクルが維持されず,乱れのスパン方向局在化が生じるものと解釈される.また,安定温度成層下における水平正方形ダクトの乱流遷移に関する直接数値シミュレーションを行い,乱流遷移レイノルズ数付近では,安定成層下でも,等温流と同様の乱流パフが発生することが明らかとなった.ただし,この安定成層下でのパフの上流側には,等温パフとは異なる4つ渦構造が現れることも判明した.さらに,前年度に引き続き,高レイノルズ数域(Re=3500,5480)で正方形ダクト乱流の直接数値シミュレーションを行い,平均二次流れと関連性が示唆されるダクト横断面での大規模循環流を,クレプシュポテンシャルを導入することにより同定し,大小様々なスケールを有する大規模循環流が平均二次流れを生成することを明らかにした.以上のシミュレーションに加え,アスペクト比3の矩形ダクトの実験装置を製作し,レーザードップラー流速計による流速計測及び可視化の実験を行った.その結果,アスペクト比3の矩形ダクトの遷移時には,円管と同様な乱流パフが現れ,その寿命の確率分布が指数分布になることが明らかとなった.ニュートン法による矩形ダクト流の定常進行波解の計算,直接数値シミュレーションによる矩形ダクト乱流の大規模構造の解析,及びレーザー流速計,流れの可視化による矩形ダクト乱流の実験のいずれも順調に進展しており,本研究の目的が達成されていると判断する.24年度が最終年度であるため、記入しない。
遺伝子型に基づく細胞分離法

本研究では、「生細胞内の遺伝子シグナルを釣り針として望みの細胞を単離する」前例のない新しい技術を開発することを目指した。長波長領域にシグナルを発生する赤色プローブを作成した。つづいて、未分化細胞で高発現しているmiRNAを標的にRETFプローブを作成し、フローサイトメーターで検出実験をおこなったところ、優位なシグナルを観測できた。そこで、現在、標的シグナルを指標にした細胞分離を検討している。本研究では、「生細胞内の遺伝子シグナルを釣り針として望みの細胞を単離する」前例のない新しい技術を開発する。これまでの細胞単離法は細胞表現型(例えばタンパク質マーカー)を識別することで分離する技術がほとんどである。一方、近年、DNAチップなどの網羅的遺伝子解析技術の発展により細胞種を見分けるための遺伝子マーカーの探索が容易となった。そこで、申請者は自身がこれまでに開発してきた「生細胞内RNA検出プローブ」を適用することで遺伝子型に基づいた細胞単離技術を確立する。本年度はプローブの高感度化を検討した。まず、微量RNAシグナルを観測する場合、細胞の自家蛍光が問題となる。その低減のために、長波長領域にシグナルを発生する赤色蛍光化合物(660nm)を設計した。ナフソローダミンを基本骨格として、その両アミノ基をアジド基に変換することで赤色領域に蛍光を発生する新規化合物を合成した。この化合物をDNA鎖に導入することでRETF(Reduction Triggered Fluorescence)プローブを作成できた。続いて、RETFプローブの特徴である化学反応によるシグナル増幅について最適化を行った。DNAプローブの長さを種々検討したところ、DNAの融解温度に近い反応温度で検出反応を行うと効率のよいシグナル増幅効果を観察できた。例えば、10塩基のプローブを用いた場合は25□Cでもっともよいシグナル増幅が可能となった。本プローブを細胞内に導入したところ、生細胞内RNAをイメージングすることが可能であった。また、フローサイトメーターを用いた解析でもRNAシグナルを観測することが可能であった。本年度は、細胞内RNA検出を検討した。細胞分離を可能にするためには、ほとんどすべての細胞にダメージ少なくRETFプローブを導入する必要がある。そこで、まず、最適な細胞内プローブ導入法を検討した。市販のリボソームを用いた導入をおこなったが、バックグラウンド蛍光が高くなるため、不向きであった。つづいて、エレクトロポレーションを用いたが、プローブがその条件で分解することがわかった。そこで、ストレプトラインシンO(SLO)を用いて細胞膜に穴を開けてプローブを導入したところ、ほとんどの細胞にプローブを導入できることがわかった。また、細胞の生存率は10%程度と完全ではないが、細胞分離の実験に用いることができるレベルであった。
グレリンの消化管運動に与える影響

本研究でghrelinがmolitinと同様、消化管の空腹期運動を誘発する事がわかった。Motilinとの違いは、ghrelinは脳室内投与でも静脈内投与でも上部消化管の空腹期運動を誘発するのに対して、motilinは静脈内投与でのみ空腹期運動を誘発する事である。Ghrelinのほうがmotilinより脳内メカニズムとより密接に関連する事が示唆される。ghrelinが胃十二指腸の空腹期運動を引き起こすメカニズムに関して興味深い結果を得た。Ghrelinの脳室内投与または静脈内投与で誘発される空腹期運動は、NPYの中和抗体を脳室内に前投与する事で完全にブロックされた。またghrelinの静脈内投与で起こる空腹期運動はghrelin受容体(GHS-R)アンタゴニストの脳室内投与ではブロックされず、静脈内投与でブロックされた。以上の実験結果より、ghrelinが上部消化管の空腹期運動を誘発する反応は視床下部のNPYニューロンを介している事がわかる。弓状核のNPYニューロンの細胞体にはGHS-Rの存在が報告されているが、我々の実験結果は、胃から分泌されるghrelinは消化管壁内の迷走神経知覚線維終末に作用し、神経性に脳内に情報が伝わり、孤束核、弓状核(NPYニューロン)、迷走神経背側運動核のルートで最終的に消化管の空腹期運動を誘発する事がわかった。さらに胃内pHとghrelinの作用に関して興味深い結果を得た。食後0-30分間は胃内pHが2.5に下がり食後期運動がおこるが、Ghrelinによる空腹期運動の誘発は胃内pHが5以上にならないと起こらない事がわかった。この実験結果は、胃酸分泌の異常と上部消化管運動の異常が連動している事を示すもので、胃酸分泌が亢進または遅延している患者では空腹期運動が起こらないことが種々の症状の原因になっていると考えられる。グレリンは新しく発見されたペクチドで胃体部の内分泌細胞から分泌され摂食を亢進させることで知られている。我々は従来より、摂食をコントロールするペコチドが同時に、消化管運動にも影響を与え、特に消化管の空腹期運動は、摂食行動を密接に関連することを報告して来た。(M. Fujimiya et al. Am. J. Physiol 27g,932-938,2000, N. Kihara et al. Am. J. Physiol. 280.G406-G419,2001)今回は、グレリンを脳室内投与または、静脈内投与し、無麻酔ラットの実験系でグレリンの消化運動に与える影響を調べた。グレリンを脳室内投与すると、食後期の運動パターンが消失し、胃では運動の亢進、十二指腸では空腹期運動の誘発が観察された。静脈内投与によっても基本的には同様の効果が観察されたが作用出現まで30分のtime lagがあった。グレリン受容体の拮抗薬であるGHS-R an tagonistとグレリン複合投与実験でグレリンの作用機序を調べた。その結果、末梢投与したグレリンの効果は、末消のGHS-Rantagonistでブロックされたが中枢投与のGHS-R antagnistでは影響を受けなかった。このことよりグレリンは末梢のグレリンレセノターに作用して消化管運動に影響を与えることがわかった。このことは迷走神経切除術を行ったラットにおける実験でも証明され、迷切動物で中枢からの影響をブロックした状態でもクレリンの末梢投与で空腹期運動が誘発された。

我々は無麻酔ラットの脳室内または静脈内に各種ペプチドを投与し、リアルタイムで消化管運動を測定する方法を開発し興味深い結果を得た。NPYやPYYなど摂食行動を刺激する事で知られるペプチドを脳室内投与すると、十二指腸の空腹運動が誘発され、逆にCRFやウロコルチンなど摂食行動を抑制する事で知られるペプチドを脳室内投与すると、胃十二指腸の空腹運動が抑制されることがわかった。一方、グレリンは、近年ラット胃より同定された28個のアミノ酸配列を有するGHS-Rのリガンドで、末梢(胃)に含まれ視床下部の受容体に作用して摂食行動を刺激する事で知られている。我々の研究で、グレリンの中枢および末梢投与で、胃の食後期運動の亢進と十二指腸の空腹期運動の誘発が観察され、この作用は弓状核のNPYニューロンを介した反応であることがわかった。本研究で、視床下部のペプチドが消化管運動に影響与えるという、脳→腸のルートだけでなく、胃から放出されるペプチドが脳の受容体に作用して消化管運動を支配するという、腸→脳→腸のルートで消化管運動が制御されることが明らかになった。脳が消化管の運動をコントロールし、消化管の運動が脳の機能をコントロールするという脳腸相関のダイナミズムを実験的に証明することで、NUDやIBSなど脳が原因で起こる消化管機能異常症や、拒食症や過食症の病態の解明に貢献できると考える。
BMP2による骨芽細胞分化誘導におけるOsterixとCbfa1の相互関係の解明

1.骨芽細胞分化に対するOsterixの役割Osterixの過剰発現により未分化問葉系幹細胞から骨芽細胞への分化誘導が、認められた。Microarray解析の結果、Osterixの過剰発現により誘導される遺伝子群とRunx2(Cbfa1)過剰発現により誘導される遺伝子群に相違を認めた。したがって、Osterixは、Runx2の下流として機能するだけでなく、Runx2に非依存的に骨芽細胞分化を調節している可能性が強く、示唆された。2.Ruxn2非依存性的なosterixの発現調節機構Runx2遺伝子欠損マウス由来の未分化間葉系幹細胞にBMP2を作用させることにSmadシグナルを介して、Osterixの発現が誘導されるメカニズムを探索した結果、Smadシグナルにより活性化されるホメオボックス遺伝子群により、Osterixの発現がコントロールされていることを見出した。3.Osterixの標的遺伝子の探索Microarray解析の結果、Osterixの過剰発現誘導される標的遺伝子の解析を順次、行った。その結果、RRMモチーフを有する転写制御因子が、骨芽細胞の分化に関与していることが示唆された。4.Ihhによる骨芽細胞分化に対するOsterixとRunx2の関与Ihhによる骨芽細胞分化に対するOsterixおよびRunx2の関与を検討した結果、Ihhにより活性化されるGli2が、Runx2の発現ならびに機能を促進し、骨芽細胞分化を誘導する一方で、Osterixは、Ihhによる骨芽細胞分化に対しては効果をほとんど示さないことが明らかとなった。1.Osterixの発現調節メカニズムの解明1)SmadファミリーによるOsterixの発現制御Osterixの発現誘導に対するBMP2シグナル、特にBMP2シグナルにおいて中心的役割を担うSmad1,Smad4,Smad5の関与について検討を行った。その結果、Osterixの発現は、Smadの活性化に依存していた。2)Osterixの発現に対するCbfa1の関与C2C12細胞に、Cbfa1を過剰発現させても、Osterixの発現は誘導されなかった。さらに、Cbfa1欠損マウス由来の骨芽細胞様細胞にBMP-2処理を行うと、Osterixの発現が誘導された。2.骨芽細胞分化におけるOsterixの機能的役割の検討1)Osterixの過剰発現の骨芽細胞分化に対する効果の検討骨芽細胞分化におけるOsterixの役割を明らかにするために、アデノウイルスを用いてC2C12細胞あるいは他の未分化間葉系細胞にOsterixを過剰発現させ、その効果を検討した。骨芽細胞への分化は、を指標にした。Osterixの過剰発現によっては、アルカリホスファターゼ(ALP)、オステオカルシンの発現は変動を受けなかった。2)骨芽細胞マーカー遺伝子の転写制御に対するOsterixの役割の検討分子レベルでOsterixの機能的役割を解明するために、オステオカルシン、BSP、I型コラーゲン、オステオポンチン遺伝子の転写制御に対するOsterixの関与を、レポーターアッセイにより検討したが、効果は認められなかった。以上の結果より、Osterixの標的遺伝子は、これら既知の骨芽細胞マーカー以外であると推察された。1.骨芽細胞分化におけるOsterixの機能的役割の検討Osterixのアイソフォームが、骨芽細胞系細胞に発現していることを確認したので、未分化間葉系細胞から骨芽細胞への分化過程におけるこのアイソフォームの機能的役割を検討した。その結果、Osterixアイソフォームの過剰発現により、骨芽細胞への分化が著明に促進された。この効果は、BMP2の存在下で増強された。従って、Osterixは、BMP2シグナルと協調して、骨芽細胞分化を制御していることが強く示唆された。2.Osterix抗体の作成Osterixの生化学的ならびに細胞生物学的機能の検討を可能とするために、抗Osterix抗体の作成を試みた。その結果、ウエスタンブロティング法および免疫沈降法にてOsterixの検出可能な抗体が、確認できた。3.Osterixの発現調節

Osterixの発現制御に対するCbfa1の役割を検討するために、Cbfa1を未分化間葉系幹細胞に過剰発現させたところ、Osterixの発現が誘導された。さらに興味あることに、Cbfa1遺伝子欠損マウスより樹立された未分化間葉系細胞株にBMP2を作用させると、Osterixの発現が誘導されることが見出された。従って、Osterixは、BMP2シグナルにより、Cbfa1依存性および非依存性の経路にて発現が制御されていることが明らかとなった。4.Msx2による骨芽細胞分化制御機構BMP2により誘導される転写制御因子Msx2の骨芽細胞分化に対する役割を検討した結果、Msx2は、Cbfa1非依存的に骨芽細胞分化を促進することが見出された。1.骨芽細胞分化におけるOsterixの役割未分化間葉系細胞およびマウス骨芽細胞にOsterix遺伝子を過剰発現させると、骨芽細胞分化が誘導された。またOsterix遺伝子の過剰発現は、Runx2遺伝子欠損マウス由来の未分化間葉系細胞のALP活性を誘導した。従って、Osterixは、Runx2と非依存性に骨芽細胞分化を誘導しうることが明らかとなった。2.Osterixの発現調節機構未分化間葉系細胞にRunx2遺伝子を過剰発現させると、Osterix遺伝子の発現が誘導された。さらに、Runx2遺伝子欠損マウス由来の未分化間葉系細胞に、BMP2を作用させると、あるいは、BMP2シグナル伝達分子Smad1および4を過剰発現させると、Osterixの発現が誘導された。以上の結果より、BMP2は、Runx2依存性および非依存性にOsterixの発現を調節していることが明らかとなった。3.Osterixにより発現誘導される遺伝子の探索骨芽細胞分化過程におけるOsterixの分子機能を明らかにするために、Microarrayを用いて、Osterixにより、発現調節される遺伝子の探索を行った。その結果、約200の遺伝子が、Osterixにより発現誘導されることが見出された。これら遺伝子の内、5倍以上の発現増加するクローンの発現ならびに機能の解析を行った。4.BMP2とIhhのクロストーク骨芽細胞分化誘導効果を有するIhhと、BMP2シグナルのクロストークを検討した結果、Ihhにより活性化されるGliと、Runx2が共役して、骨芽細胞分化を促進していることが、見出された。1.骨芽細胞分化に対するOsterixの役割Osterixの過剰発現により未分化間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化誘導が、認められた。Microarray解析の結果、Osterixの過剰発現により誘導される遺伝子群とRunx2(Cbfa1)過剰発現により誘導される遺伝子群に相違を認めた。
メタボロミクスを用いたフレイル・認知機能低下に対する超早期リスク判別指標の開発

本年度は、鶴岡メタボロームコホート研究参加者のうち、6年後調査(18年度実施)に参加した年齢65歳から80歳のサブコホート集団2916名を対象に、フレイルに関連する身体機能および歩行に関する評価を実施した。これは、当初の計画である2000名を上回る参加者数であった。あわせて、12時間絶食後の血液・尿検体を採取した。身体機能評価は、歩行機能解析(4m、6m:圧力センサを用いた歩行評価システムによる歩行速度および歩行パターン解析)、体組成(ボディコンポジションアナライザー高精度体成分分析装置による)、筋力(握力および脚伸展力検査による下肢筋力測定)、SPPB(Short Physical Performance Battery)、骨密度検査(女性)を実施した。メタボローム解析は、前処理後、直ちに-80°Cで保管し、順次、CE/MS法による網羅的解析に供した。本年度は、800検体の血漿メタボローム測定を完了した。あわせて、インスリン抵抗性指標、炎症バイオマーカー(アディポネクチン、空腹時インスリン(HOMA-IR)、IL-6)、骨マーカー等の測定を実施した。また、2019年度に認知機能検査を含む調査を実施するための準備を進め、共同研究機関となる地域基幹病院棟との調整を行うとともに、参加者のリクルートへ向けた準備を行った。2019年3月には、コホート研究参加者の一部地域において、認知機能検査を含む調査への参加呼びかけを郵送にて行い、希望があった約400名を対象に、計16回に分けて調査説明会を実施した。フレイル調査への参加者は、当初計画を上回って順調に実施できた。また、2019年度の認知機能検査を含む調査についても、リクルートを開始し、およそ400名の参加者を集め、順調に進展している。初年度は概ね順調であり、2019年度は、認知機能検査、MRI検査を含む認知症予防調査を実施する。共同研究機関となる地域基幹病院でのMRI検査の実施について、病院側が機器の入れ替えを予定していることが判明したことから、調査への影響を最小限に抑えるよう工夫する。