hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
銅チタン系光触媒を用いた排水処理の研究

エネルギーと環境問題は、地球規模での最重要課題であり、この解決のためにはクリーンで無尽蔵なエネルギー供給システムの開発が必要となる。光触媒を用いて太陽光のエネルギーにより水を水素と酸素に分解することにより、再生可能でクリーンなエネルギー貯蔵・輸送媒体である水素が得られる。この手法において太陽光を効率よく水素に変換するためには、利用可能な波長範囲の拡張と各波長での量子収率の向上という二つの要素を改善しなければならない。現在のところ、バンドギャップが2.7eVで480nm程度までの光しか水分解には直接利用できず、さらにバンドギャップが小さく長波長側まで吸収できる材料を開発する事が課題となっていた。最近、LaMgxTa1-xO1+3xN2-3xの組成で表される材料が600nm付近の可視光まで利用できる水分解光触媒であることが見出された。この材料をベースとして高活性化や活性発現の要因について明らかにすることにより、さらに高効率な水分解光触媒の開発が期待できる。本研究ではLa1-xCaxTaO1+xN2-xおよびLaMgxTa1-xO1+3xN2-3xという組成であらわされる材料を検討したところ、両者ともO:N比が2:1になる組成が最も活性が高いことが明らかになった。以上、この系統のペロブスカイト型酸窒化物の水分解活性発現には上記のような組成制御が効果的であることが明らかになった。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、可視光を十分に吸収できる材料を開発し、それを用いて光触媒としての特性を向上させることである。代表的な光触媒として知られているのは酸化チタンであるが、これは吸収端が約400nmであり、紫外光しか吸収できない。その場合、自然光もしくは人工光源を用いたいずれの場合も光の吸収効率は低く、より長波長側の光(可視光)まで吸収できる化合物の利用が望まれる。ごく最近、所属のグループでLaTaON2という化合物をベースとした可視光応答材料が開発された。この化合物は価電子帯上端が浅い準位にあるN2p軌道から構成されるために、金属酸化物に比べてバンドギャップが縮小する。このLaTaON2のTaサイトにMgを導入することにより可視光で水の分解反応が進行することが見出されており、本研究ではLaTaON2およびLaTaON2 : Mgをベースとして、様々な異元素を導入し、高活性化を図る。また、系統的な探索を行うことにより、高い活性を示すための要因を明らかにしていく。LaTaON2はペロブスカイト構造を有する化合物であるが、ここには二つの異なるカチオンサイトがある。Laサイトは、主にイオン半径が大きいCa, Sr, Ba, Li, Na, Kのようなアルカリ金属およびアルカリ土類金属が占有する。一方、TaサイトはLaに比べてイオン半径の小さいMg, Sc, Ti, Zr, Hfが占有する。これまでのところ、LaサイトをCa、TaサイトをScで置き換えることを検討した。その中で、LaTaON2もしくはLaTaON2 : Mgより高い水分解活性を示すものが見出されている。今後、他の元素置換や様々な光触媒反応への適応を検討していく。以前とは異なる新しい実験手法を多く習得する必要があったため、研究成果はまだ出ていないが、そのために必要な準備を行っている段階である。実験手法は既に大部分をマスターしたので今後は成果を出すための実験データの取得に移行できると思われる。今後は頻繁にデータ整理とディスカッションを繰り返して系統的にデータを取得していくことを計画している。
神経細胞のアポトーシスにおけるユビキチンの役割

まず、砂ネズミの一過性前脳虚血後の海馬CAl神経細胞におけるユビキチンの変化を、free form、conjugated formそれぞれについてradioimmunoassayおよびELISAにより定量化した。その結果、前記の免疫染色の結果と一致した。すなわち、一過性前脳虚血後の海馬CAl神経細胞ではfree formのユビキチンが減少し、それが回復しないが、それ以外のCA3あるいはdentate gyrusの神経細胞ではユビキチンの減少は一過性であり、48時間後にはコントロールレベルまで回復した。また、conjugated formのユビキチンは両者で著明に増加し、CA3/dentate gyrusの神経細胞では24時間後にはコントロールレベルまで回復したが、CAl細胞では48時間後でも高値を保ったままであった。In situ hybridizationを用いて、致死的5分間前脳虚血後のユビキチンmRNAの発現を調べると、虚血耐性獲得の有無に拘わらず、海馬全域あるいは大脳皮質で発現の著明な増加を認めた。CAl細胞では虚血後translation blockによってfreeformユビキチンが合成されず、虚血耐性獲得後はそのtranslationが回復することが明らかになった。freeformユビキチンの減少は、その先のプロセスであるユビキチン/プロテアソームシステムによるタンパク質分解の低下を引き起こす。これらの現象が細胞死にともなう単なる結果なのか、それとも細胞死に何らかの関与をするプロセスなのかを検証した。ラット大脳皮質の初代培養神経細胞を作用機序の異なった複数のプロテアソーム阻害剤で処理し、プロテアソーム活性を低下させたところ、いずれの方法でも、caspase-3の活性化とそれに引き続くアポトーシスが誘導された。以上の結果はアポトーシスの一種と考えられる海馬の遅発性神経細胞死の過程にユビキチンが関与していることを示している。ユビキチンは76アミノ酸残基からなる蛋白であり、ATP依存性の非リソゾーム細胞内蛋白分解系に必須の要素である。変成蛋白にユビキチンが結合すると、それは速やかに26Sプロテアゾームにより分解される。しかし、この制御系は変成蛋白の処理のみならず、各種の細胞内の短半減期の調節蛋白の総量制御にも関わっている。この中にはアポトーシスに関連するp53やNF-kBなどの蛋白も含まれている。われわれは既に虚血による海馬CA1錐体細胞の遅発性神経細胞死において、非常に早期にユビキチンの免疫染色性が激減し、それがフリーのユビキチンの減少に基づくものであることを示してきた(Am J Pathol 148:249-257,1996)。さらにこの変化を詳細に裏付けるために、次の実験をおこなった。(1)ユビキチンのfree form、conjugated formをそれぞれradioimmunoassayおよびELISAにより定量し、前記の免疫染色と一致する結果を得た。(2)虚血耐性(J Cereb Blood Flow Metab 11:299-307,1991)を穫得した条件下では、free formは減少せず、返って虚血後に増加した。これは海馬神経細胞がストレス応答を示したものと考えられる。(3)砂ネズミユビキチンのRNA probeを作成し、上記と同一の条件下でin situ hybridizationを行い、mRNAレベルでは、いずれの条件下でもmRNAの発現を認めることが確認できた。耐性のない条件下では、蛋白合成を認めず、translational blockのかかっていることがわかった。

まず、砂ネズミの一過性前脳虚血後の海馬CA1神経細胞におけるユビキチンの変化を、free form、conjugatedformそれぞれについてradioimmunoassayおよびELISAにより定量化した。その結果、前記の免疫染色の結果と一致した。すなわち、一過性前脳虚血後の海馬CA1神経細胞ではfree formのユビキチンが減少し、それが回復しないが、それ以外のCA3あるいはdentate gyrusの神経細胞ではユビキチンの減少は一過性であり、48時間後にはコントロールレベルまで回復した。また、conjugated formのユビキチンは両者で著明に増加し、CA3/dentate gyrusの神経細胞では24時間後にはコントロールレベルまで回復したが、CA1細胞では48時間後でも高値を保ったままであった。In situ hybridizationを用いて、致死的5分間前脳虚血後のユビキチンmRNAの発現を調べると、虚血耐性獲得の有無に拘わらず、海馬全域あるいは大脳皮質で発現の著明な増加を認めた。CA1細胞では虚血後translation blockによってfreeformユビキチンが合成されず、虚血耐性獲得後はそのtranslationが回復することが明らかになった。freeformユビキチンの減少は、その先のプロセスであるユビキチン/プロテアソームシステムによるタンパク質分解の低下を引き起こす。これらの現象が細胞死にともなう単なる結果なのか、それとも細胞死に何らかの関与をするプロセスなのかを検証した。ラット大脳皮質の初代培養神経細胞を作用機序の異なった複数のプロテアソーム阻害剤で処理し、プロテアソーム活性を低下させたところ、いずれの方法でも、caspase-3の活性化とそれに引き続くアポトーシスが誘導された。以上の結果はアポトーシスの一種と考えられる海馬の遅発性神経細胞死の過程にユビキチンが関与していることを示している。
水素結合による活性化とキラルな相間移動触媒を利用した水中不斉触媒反応の開発

私は、求電子剤を活性化するチオウレアを不斉反応に展開するためチオウレア構造と求核剤を活性化するアミノ基を同一分子内に持ち合わせる新規多機能型触媒を開発した。種々の反応を検討した結果、本触媒がニトロオレフィンへのマロン酸ジエステルの不斉マイケル反応に於いて、高収率、高エナンチオ選択的(up to 93%ee)に目的付加体を与えることを見い出し報告している。また、本反応を用いることでGABA_B受容体の選択的なアゴニストである(R)-( )-Baclofenの不斉全合成を高収率、短工程で行うことに成功した。さらに非対称な1,3-ジカルボニル化合物を求核剤に用いたニトロオレフィンへの不斉Michael反応は求核剤側、求電子剤側の2点に不斉中心が生じるため、反応の制御が難しく、ごく最近まで高いエナンチオ選択性を達成している例はなかった。しかし私の開発した多機能型チオウレア触媒を用いれば高エナンチオ及びジアステレオ選択的に不斉Michael反応が進行することを見い出した。また、速度論的解析やNMR実験などから推定反応機構を示し、これらを報告した。私の設計した多機能型チオウレア触媒がニトロメタンを求核剤として用いる反応においても有効に機能し、N-ジフェニルフォスフィノイルイミンとのAza-Henry反応において良好な立体選択性(up to 76%ee)で目的成績体を与えることを明らかにし報告した。さらなる基質の検討を行った結果、N-Bocイミンを用いることで選択性はさらに向上し最高95%eeでニトロメタンの付加反応が進行することを明らかにした。また炭素鎖の伸長したニトロアルカンを求核剤に用いると求核剤であるニトロアルカン側とイミン側の二つの反応点に不斉中心が生じるが、高エナンチオ及びジアステレオ選択的に反応成績体を得ることに成功した(up to 99%ee, up to 90%de)。これまでに求電子剤を活性化する有機触媒としてウレア誘導体が知られている。ウレアやチオウレアの二つの水素原子はヘテロ原子の孤立電子対と水素結合を起こすことで酸触媒として機能すること期待できるが、報告例は少ない。そこで私は、チオウレアと水素結合を起こしやすいと考えられるニトロンを基質に選択し種々反応を検討したところ、TMSCNやケテンシリルアセタールのニトロンへの求核付加反応がチオウレアにより顕著に促進されることを明らかにし、報告した。チオウレアが酸触媒として機能することを明らかにしたが、その触媒能はそれほど強くない。そこで、チオウレア構造と求核剤を活性化する官能基を同一分子内に持ち合わせるならば、チオウレア構造で求電子剤を活性化するのと同時に別の官能基で求核剤を活性化できるのではないかと考えた。さらに両官能基を不斉骨格上に配置することで、求核剤と求電子剤の接近に対し空間的な制約を与え立体選択的に目的成績体を与えるのではないかと考え、チオウレア構造とアミノ基を持ち合わせる多機能型有機触媒を設計、合成した。この触媒がニトロオレフィンへのマロン酸ジエステルの不斉マイケル反応に於いて、高収率、高立体選択的に目的付加体を与えることを見い出し報告した。私の設計した多機能型触媒がニトロ官能基を有する化合物を効率良く活性化することが明かとなったので、ニトロアルカンを求核剤として用いる反応を検討した。求電子剤としてイミンを用いたところ(Aza-Henry反応)、反応は円滑に進行し、目的成績体を良好な立体選択性で与えることを明らかにし報告した。

また炭素鎖の伸長したニトロアルカンを求核剤に用いると求核剤であるニトロアルカン側とイミン側の二つの反応点に不斉中心が生じるが、高エナンチオ及びジアステレオ選択的に反応成績体を得ることに成功した(up to 99%ee, up to 90%de)。
学習障害児における眼球運動制御と聴覚認知の研究

本研究者らは学習障害児(LD児)における眼球運動障害と聴覚認知傷害について研究を続けているが、平成11年度は各々についてさらに詳細に検討した。(1)眼球運動:本年度は衝動性眼球運動(saccade)の他に滑動性眼球運動(smooth pursuit)を健常児とLD児について調べた。Smooth pursuitでは、特に初期成分を検討する目的でRashbassのstep-ramp刺激を用いた。LD児では、初期の速度を形成する能力が低下しておりまた、視覚のフィードバックを要する定常状態でもゲインが有意に低下していた。また、saccadeのコントロールを調べるmemory guided saccadetaskでもLD児は、反射性のsaccadeの抑制困難と潜時の延長、視標との誤差の増大がみられた。これらのことから、LD児では眼球運動の制御に関与する前頭眼野、前頭前野の傷害が示唆される。(2)聴覚認知聴覚認知を調べるためにミスマッチ陰性電位(MMN)を用いた。防音室内で坐り、ビデオを見せながらヘッドホーンにより標準刺激として/da/、逸脱刺激として(a)最も弁別の難しい/ga/,(b)比較的容易な/i/(c)1000Hz純音を混合して与え、EEGをFz,Cz,Pz,C3,C4から導出し加算処理した。結果は、対照群では全ての逸脱刺激に対してMMNの出現が見られたが、LD群では/ga/ではほとんど出現していなかった。開始潜時は対照群では/ga/で潜時の延長が見られたが、LD群では/ga/の他に/i/でも延長が見られた例が多かった。このことは、LD群では明らかな逸脱刺激であっても大脳聴覚野レベルでの言語音どおしの自動弁別に問題があることを示唆している。
薬用キンポウゲ科植物の組織分類学的研究

1.Clematis(センニンソウ)属植物に関する成果:中国産のC.leiocarpa Oliv.およびC.uncinata Champ.の葉の内部形態的特徴を明らかにした。その結果、本種の学名をC.uncinata Champ.var.coriacea Pamp.とすることは不適当であることが明らかになった。また同時に、四川省産の漢薬「威霊仙」には両植物の地上部を基源とするものがあることを新知見として得た。2.Aconitum(トリカブト)属植物に関する成果:ネパ-ル産の本属植物A.orochryseum Stapfの塊根の内部形態的特徴を研究した。その結果、従来Delphinium属植物の地下部であるとされてきたネパ-ル薬物NIRBISIの1原植物としてA.orochryseumが利用されていることを新知見として得た。さらに韓国に自生するA.triphyllumNakaiの塊根をも検討した結果、本属植物の塊根の種による内部形態的特徴は、従来指摘されてきた形成層輪の形状以外にも、皮層の厚さ、皮層中の厚膜細胞の量などにも認められることを明らかにした。3.Coptis(オウレン)属植物に関する成果:日本および中国産の同属植物全8種3変種の、各器官の内部形態を詳細に検討した。その結果、葉においてはさく状柔細胞の大きさに種の特徴が認められ、根茎においては厚膜細胞の有無で日本産と中国産が区別されるなどの新知見を得た。以上の結果に基づき、各地の市場で入手した本属植物由来の生薬の基源を明らかにした。4.富山医科薬科大学和漢薬研究所民族薬物資料館書所蔵標本中の、ネパ-ルで採集されたRanunculaceae(キンポウゲ)科植物標本を整理し、一覧表を作成した。1.Aconitum(トリカブト)属植物に関する成果ネパ-ル産の本属植物A.orochryseum Stapfの塊根の内部形態的特徴を研究した。その結果、従来Delphinium属植物の地下部であるとされてきたネパ-ル薬物のNIRBISIの1原植物としてA.orochryseumが利用されていることを新知見として得た。さらに韓国に自生するA.triphyllum Nakai(A=jaluense Kom.subsp.jaluense)の塊根をも検討した結果、とくに母根において維管束しょうの発達程度に大きな変異が認められ、またその変異は地上部の各形質の変異とは無関係であることが明らかになった。これら一連の研究の結果、本属植物の塊根の種による内部形態的特徴は、従来指摘されてきた形成層論の形状以外にも、皮層の厚さ、皮層中の厚膜細胞の量などにも認められることを明らかにした。2.Coptis(オウレン)属植物に関する成果日本および中国産の同属植物全8種3変種の、各器官の内部形態を詳細に検討した。以上の結果に基づき、中国大陸、台湾、香港、日本、ネパ-ルなどの各地の市場で入手した本属植物由来の生薬多数の基源を明らかにした。3.富山医科薬科大学和漢薬研究所民族薬物資料館書所蔵標本中の、ネパ-ルで採集されたRanunculaceae(キンポウゲ)科植物標本を整理し、一覧表を作成した。
ラット大腸発癌モデルにおける化学予防の検索

目的:癌の化学予防に関する研究は、近年の癌の基礎的研究の分野で重要な課題となっている。今回、ラット大腸発癌モデルを用い、発癌剤1,2-dimethylhydrazine(DMH)投与開始時から、化学予防剤として米糠より抽出した免疫賦活剤アラビノキシランの投与を行う群と、抗血管新生剤フマギロールを投与する群を作製し、発癌剤のみを投与する無治療群とで病理組織学的な検索を行い、化学予防効果の比較検討を行った。材料と方法:6週齢雌性Wistar系ラットにDMH 20mg/kgを週1回10週連続皮下注した。DMH投与当日からアラビノキシラン50mg/kgを飲水中に混ぜて投与する群と、フマギロールの10mg/kgと30mg/kgを週2回皮下注する2群の計3群の治療群を作製した。発癌剤のみを投与した群を無治療群とした。実験開始15週目と30週目にラットを屠殺し、全大腸を一塊として摘出した。15週目は前癌病変とされるaberrant crypt foci(ACF)を検索した。ACFは摘出した大腸を近位大腸と遠位大腸に分け、それぞれ腸間膜側にて展開し濾紙に貼り付け、10%ホルマリンで24時間固定した後水洗し、0.2%メチレンブルーで2分間染色して顕微鏡下に発生数を数量化して判定した。30週目は同様に近位大腸と遠位大腸に分けて、肉眼的に腫瘍数を計測すると共に10%ホルマリンで固定後、H.E.染色を行い、癌とポリープに分類した。また、無治療群ならびに治療群の計4群における30週までの生存率を比較した。結果:(1)ACFの発生数(n=23):近位大腸および遠位大腸のいずれにおいても、アラビノキシラン投与群とフマギロール30mg/kg投与群が無治療群に比べてACFの発生数が有意に(p<0.05)低値であった。なお、フマギロール10mg/kg投与群は無治療群に比べACFの発生数は減少していたが有意差はなかった。(2)腫瘍(ポリープ及び癌)の発生数(n=26):無治療群の30週目の全大腸癌発生率は55%であった。近位大腸では、無治療群;ポリープ2、癌14、アラビノキシラン投与群;ポリープ6、癌9、フマギロール30mg/kg投与群;ポリープ5、癌8、フマギロール10mg/kg投与群;ポリープ7、癌10であった。遠位大腸では、無治療群;ポリープ2、癌8、アラビノキシラン投与群;ポリープ1、癌5、フマギロール30mg/kg投与群;ポリープ3、癌4、フマギロール10mg/kg投与群;ポリープ3、癌3であった。治療群はいずれも癌の発生数は減少していたが、いずれの群においても無治療群に比べ有意差はなかった。(3)生存率(n=26):生存曲線から実験終了の30週目における生存率をみると、無治療群32%、アラビノキシラン投与群100%、フマギロール30mg/kg投与群62%、フマギロール10mg/kg投与群80%であった。即ち、アラピノキシラン投与群は無治療群に比べ有意な延命効果を認めた(P<0.05)。結論:アラビノキシランもフマギロールも腫瘍発生数では有意な抑制効果を来さなかった。しかし、前癌病変とされるACF発生数はアラビノキシラン及びフマギロール30mg/kg投与において、有意に抑制され、かつアラビノキシランでは、実験途中死がなく延命効果が認められた。結果:

(1)ACFの発生数(n=23):近位大腸および遠位大腸のいずれにおいても、アラビノキシラン投与群とフマギロール30mg/kg投与群が無治療群に比べてACFの発生数が有意に(p<0.05)低値であった。なお、フマギロール10mg/kg投与群は無治療群に比べACFの発生数は減少していたが有意差はなかった。(2)腫瘍(ポリープ及び癌)の発生数(n=26):無治療群の30週目の全大腸癌発生率は55%であった。近位大腸では、無治療群;ポリープ2、癌14、アラビノキシラン投与群;ポリープ6、癌9、フマギロール30mg/kg投与群;ポリープ5、癌8、フマギロール10mg/kg投与群;ポリープ7、癌10であった。遠位大腸では、無治療群;ポリープ2、癌8、アラビノキシラン投与群;ポリープ1、癌5、フマギロール30mg/kg投与群;ポリープ3、癌4、フマギロール10mg/kg投与群;ポリープ3、癌3であった。治療群はいずれも癌の発生数は減少していたが、いずれの群においても無治療群に比べ有意差はなかった。(3)生存率(n=26):生存曲線から実験終了の30週目における生存率をみると、無治療群32%、アラビノキシラン投与群100%、フマギロール30mg/kg投与群62%、フマギロール10mg/kg投与群80%であった。即ち、アラピノキシラン投与群は無治療群に比べ有意な延命効果を認めた(P<0.05)。結論:アラビノキシランもフマギロールも腫瘍発生数では有意な抑制効果を来さなかった。しかし、前癌病変とされるACF発生数はアラビノキシラン及びフマギロール30mg/kg投与において、有意に抑制され、かつアラビノキシランでは、実験途中死がなく延命効果が認められた。癌の化学予防に関する研究は,近年の癌の基礎的研究の分野で重要な課題となっている。今回ラット大腸発癌モデルを用い,発癌剤1,2-dimethylhydrazine(DMH)投与開始時から,化学予防剤として米糖より抽出した免疫賦活剤アラビノキシランの投与を行う群と発癌剤のみ投与するコントロール群を作成して病理組織学的に化学予防の効果を検討した。方法:6週齢雌性Wister系ラットにDMH20mg/kgを週2回10週連続投与した。DMH投与当日からアラビノキシラン50mg/kgを飲水中に混ぜて投与する治療群(10匹)とDMH投与のみのコントロール群(10匹)を作製した。DMH初回投与から30週目に屠殺剖検し,大腸肛門を1塊として摘出し,全大腸を近位と遠位に2分割して,ホルマリン固定した。化学予防の効果はまず前癌病変とされるaberrant ctypt foci(ACF)の発生数を0.2%メチレンブルー染色後,全大腸(約20cm長径)にわたり計測し,数量化して判定した。結果:コントロールの近位大腸においてはACFの1crypt:321個,2crypt:243個,3crypt:159個,4crypt以上:94個であり,遠位大腸では1crypt:1029個,2crypt:922個,3crypt:949個,4crypt以上;854個であった。一方,治療群の近位大腸では1crypt:179個,2crypt:233個,3crypt:142個,4crypt以上;54個であり,遠位大腸では,1crypt:56個,2crypt:146個,3crypt:30個,4crypt以上;4個であった。即ち,治療群はコントロール群に比べ全大腸にわたりACFの発生数の減少を認め,特に遠位大腸においては有意差を認めた。結論:DMHによるラット大腸発癌モデルにおいて,アラビノキシランは化学予防物質になり得る可能性が示された。
白血病細胞の分化に関する生化学的研究

1、ターミナルトランスフェラーゼ(TdT)に対するモノクローナル抗体(MoAb)の作製については、これまでに抗体産生細胞株上清より、51種類のTdTのMoAbの精製に成功しているが、現在、種々のヒト白血病細胞株及び、臨床材料(骨髄塗抹標本)等を用い、螢光抗体法による染色を行ない、生化学的酵素活性の測定結果ともあわせて検討し、false pesitive又はfalse negatineの結果を与えるMoAbを除外することにより、より特異性の高いMoAbを探している。最終的には、血液の基礎研究及び臨床の分野にわたって、十分に利用可能な特異性の高いMoAbを選び出すことを目標としている。2、ヒト白血病細胞のグルココルチュイド(GC)レセプターのMoAb作製に関しては、白血球数の多い白血病症例から、leukapheresisを用いて得たサンプルのうち、GCレセプターの数が多い症例の芽球を用いて、DNA cellulose,高速液体クロマトグラフィー,Phospho celluloseカラムにより、簡単な検討を開始し、2ピークのGCR分画を検出している。今後、臨床材料のみでなくヒトリンパ性白血病細胞株を大量に培養採取して、さらに精製の過程を進めていく予定である。3.K-562の5-azacytidine(5-AzaC)によるヘモグロビン合成細胞への分化誘導に関しては既に報告したが、最近、ヒト急性リンパ性白血病(ALL)症例の芽球及びALL白血病細胞株を5-AzaCで処理すると、芽球のTdT活性,TdT陽性細胞の減少及び、膜糖転移酵素活性が増加することを見出した。これ等の現象が5-azacytidine処理による白血病芽球の生化学的分化の一面を示すものであるかを現在、検討中である。
レチナールシッフ塩基を保存しない微生物型ロドプシンの海洋性藻類における機能解明

本研究では、多くのロドプシンが保存しているリジン残基を持たないロドプシンRh-noKの機能解明を目指す。Rh-noKは、分子機能と生理機能のいずれもが未だ不明である。そこで、Rh-noKを持つ真核藻類G. thetaが比較的容易に培養できることに着目し、分子機能と生理機能の両方を解明する。分子機能解明に関しては、酵母発現より得たRh-noKに対して相互作用因子を探索し、相互作用時の機能測定を行う。生理機能に関しては、G. thetaの遺伝子操作技術の確立を目指すとともに、様々な培養条件でのRh-noKの発現解析や蛍光抗体染色を行うことで発現様式を明らかにし、その生理機能を異種発現系で検証する。
日本における近代植物学の創始者とされる伊藤圭介についての標本資料分析に基づく評価

伊藤圭介(1803-1901年)は、わが国の植物学の創生期にある江戸時代末から明治初期にかけて重要な役割を果たした代表的な本草学者である。圭介は同時代の他の学究と異なり、江戸時代に来日したシーボルトから直接植物学を学び、習得した知見を明治時代の近代植物学確立の基礎に役立てたといわれている。本研究では、1)国内外に分蔵される圭介の植物標本・資料を分析して、2)圭介がどの程度、当時のヨーロッパにおける植物学を理解し、3)そこで得た知識を日本における植物学の確立と発展に役立てることができたのか、についての考察に欠かせないデータの集積を行った。分析の対象とした伊藤圭介関連標本群のうち、国内にある圭介の標本は、国立科学博物館に未整理状態で収蔵されている。平成29年度に引き続き、これらの標本について1)植物の異同を調べ、2)どれが1点の標本であるかを確認し、3)標本に付随する紙片に記入された文字データの解読を行い、4)将来のデータベースに利用できるよう、整理を進めた。また、首都大学東京所蔵のシーボルトコレクション中の圭介標本についても、存在を確認し、データベース化のためのデータを収集した。国外にある圭介の標本として、質量共に重要な標本はオランダの生物多様性センター所蔵のシーボルトコレクション中の圭介標本である。この標本を継続して調査し、分類学の立場から分析を行った。さらに、ドイツ・ミュンヘン植物標本館において、ツッカリーニがシーボルトならびにビュルガーより入手した植物標本の中に圭介標本が含まれていたか否かを調べた。これらの研究成果は、平成30年度に論文にまとめた。江戸時代末から明治初期にかけてのわが国の植物学の発展上に重要な役割を果たしたことで知られる代表的学者が伊藤圭介(1803-1901年)である。圭介は、他の同時代の学究と異なり江戸時代に来日したシーボルトから直接植物学を学び、そこで習得した知見を明治時代の近代植物学確立の基礎に役立てたといわれている。しかし、圭介の行った研究の実態には不明の点が多くある。分析の対象とした伊藤圭介関連標本群のうち、国内にある圭介の孫、篤太郎に残した標本は、国立科学博物館に未整理状態で収蔵されている。この標本について、確認作業を行ったところ、台紙には貼付されておらず、ほとんどすべてが畳紙に挟まれた状態で保存されていることが判った。しかも1点の畳紙(実際は古新聞が多い)に複数点の枝などが挟まれている場合も多くあることが判明した。このような標本については、1)植物の異同を調べ、2)どれが1点の標本であるかを確認し、3)標本に付随する紙片に記入された文字データの解読を行い、4)将来のデータベースに利用できるよう、整理を進めた。他方、国外にある圭介の標本として、最も数も多く、かつ重要な標本であると考えられるオランダ国家多様性解析センターに収蔵される標本を閲覧し、これらの一部について分類学の立場から分析を行った。平成27年度に検討を行った標本の中で、ツクバネは、圭介が採集したと考えられる標本が、Calycopteris joanという学名で新種発表の際の原資料として利用されたことを明らかにし、その事実と意義について口頭発表をおよび論文発表を行った。国立科学博物館にある未整理標本が、予想を越える虫害等の損傷を受け、また、標本が非常に脆く、そして壊れやすいため、その取り扱いに手間取った。また、1点の畳紙に複数点の枝などが挟まれている場合が多く、植物の異同を調べ、どれが1点の標本であるかを見極めるのが難しく、検討に時間を要した。さらに、毛筆による手書きの文字は予想を超え判読が難しく、データ化のための文字入力に適した人材を得ることができず、データ入力を進めることができなかった。オランダ国ライデンの圭介標本は、植物標本室がライデン大学から国家生物多様性解析センターに移管となり、別の場所に標本が移動した際、行方不明となった標本を見つけ出すのに時間を要した。伊藤圭介(1803-1901年)は、わが国の植物学の発展上にある江戸時代末から明治初期にかけて重要な役割を果たしたことで知られる、代表的な本草学者がである。他の同時代の学究と異なり圭介は、1来日したシーボルトから直接植物学を学び、習得した知見を明治時代の近代植物学確立の基礎に役立てたといわれている。平成27年度に引き続き、これらの標本について1)植物の異同を調べ、2)どれが1点の標本であるかを確認し、3)標本に付随する紙片に記入された文字データの解読を行い、4)将来のデータベースに利用できるよう、整理を進めた。他方、国外にある圭介の標本として、最も数も多く、かつ重要な標本であるオランダの生物多様性センターのシーボルトコレクションに含まれる圭介

標本を閲覧し、これらの一部について分類学の立場から分析を行った。さらに、およびドイツ・ミュンヘン植物標本館において圭介標本の収蔵の有無を調べた。平成28年度に検討を行った標本の中で、ムラサキは、生物多様性センターに収蔵される圭介が採集したと考えられる標本が、Lithospermum murasakiの新種発表の際の原資料として利用されたことを明らかにした。また、同じくナチュラリス生物多様性センターのMitchella undulataツルアリドオシの圭介標本は、シーボルトによりラベルが手書きされているものの原資料として利用されたことを示す証拠はみつからなかった。国立科学博物館にある未整理標本が、予想を越える虫害等の損傷を受けているだけでなく、標本そのものが非常に脆く、壊れやすいため、その取り扱いに手間取ったことが最大の理由である。加えて、1点の畳紙に複数点の枝などが挟まれている場合が多く、植物の異同を調べ、どれが1点の標本であるかを見極めるのが難しく、検討に時間を要した。さらに、毛筆による手書きの文字は予想を超え判読が難しく、データ化のための文字入力に適した人材を得たものの、データ入力作業には予想以上の時間を要した。オランダ国ライデンの圭介標本は、植物標本室がライデン大学から生物多様性センターに移管となり、国家予算の都合で、やや突然に別の場所に標本が移動し、現在は仮置き状態にあるため、標本の取り出し等の閲覧作業に予想以上の時間を要した。伊藤圭介(1803-1901年)は、代表的な本草学者で、わが国の植物学の発展上にある江戸時代末から明治初期にかけて重要な役割を果たした。圭介は他の同時代の学究と異なり、来日したシーボルトから直接植物学を学び、習得した知見を明治時代の近代植物学確立の基礎に役立てたといわれている。本研究では、1)国内外に分蔵される圭介の植物標本・資料を分析して、2)圭介がどの程度、当時のヨーロッパにおける植物学を理解し、3)そこで得た知識を日本における植物学の確立と発展に役立てることができたのか、についての考察に欠かせないデータの集積を行った。分析の対象とした伊藤圭介関連標本群のうち、国内にある圭介の標本は、国立科学博物館に未整理状態で収蔵されている。平成28年度に引き続き、これらの標本について1)植物の異同を調べ、2)どれが1点の標本であるかを確認し、3)標本に付随する紙片に記入された文字データの解読を行い、4)将来のデータベースに利用できるよう、整理を進めた。また、首都大学東京所蔵のシーボルトコレクション中の圭介標本についても、存在を確認し、データベース化のためのデータを収集した。この仲にシーボルト自身により、学名が記されている標本があり、キヨスミウツボの原資料の可能性がある標本があり、詳しく検討したが、原資料とは考えられないことを平成29年度に論文で発表した。国外にある圭介の標本として、質量共に重要な標本はオランダの生物多様性センター所蔵のシーボルトコレクション中の圭介標本である。この標本を継続して調査し、分類学の立場から分析を行った。さらに、およびドイツ・ミュンヘン植物標本館において、ツッカリーニがシーボルトならびにビュルガーより入手した植物標本の仲に圭介標本が含まれていたか否かを調べた。これらの研究成果は、平成29年度に論文として発表した。
腸管感染症のイムノターゲット・メタゲノミック診断

本研究では、腸管感染症においてIgAが結合している細菌を分離することで、次世代シークエンサーによる診断を容易にすることを目的とし、その分離・解析技術の確立を目指した。健常人のヒト糞便を材料とし、IgA結合細菌をセルソーターを用いて分離を試みたが、細菌核酸は得られなかった。代替法として磁気ビーズ法により分離したところ16S rDNA PCRに成功したが、次世代シークエンサーにより菌叢解析を行った結果IgA結合と非結合に差が見られなかった。蛍光顕微鏡下ではIgA結合細菌が観察されているのでレーザーマイクロダイセクション等の直接観察下で分離する手法が有効と考えられる。現在開発中の次世代シークエンサーを応用した網羅的感染症診断システムによる腸管感染症の診断では、腸内フローラのデータがノイズとして混入し、標的の病原体がマスクされる問題が生じる。本研究ではこの問題を解決するため、腸内の微生物集団のうち、免疫応答を引き起こしている群を分泌抗体のIgAを利用してセルソーティングを行い分画する。さらにこの方法と次世代シークエンサーによる解析を組み合わせた「イムノターゲット・メタゲノミック診断法」を開発する。バックグラウンド情報として正常フローラに対するIgAの結合をセルソーティングで解析し、続いて、感染検体で検討することで感染症の診断に適応することを目指している。平成25年中に、健常人ボランティアから糞便の提供を受け、その糞便に含まれる微生物の中からIgAが結合しているものを抗ヒトIgA抗体と蛍光標識抗体を用い、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、全ての糞便試料から蛍光を発するIgA陽性の細菌を観察した。IgA陽性の細菌は、顕微鏡観察下で全細胞(ヨウ化プロピジウム陽性細胞)の1-2%程度存在していた。また、細菌体表面の蛍光量は細胞間で一様でないことから、菌に付着したIgAの量は細菌ごとに異なることが示唆された。この結果を受け、オンチップバイオテクノロジーズ社のセルソーターFishman Rによりソーティングを試みた。その結果、細菌に付着したIgAの発する蛍光量が一般的なDNAの蛍光染色と比べて低いため蛍光陽性と陰性を明確に区別をすることが困難であった。そこで蛍光顕微鏡観察の結果を参考に、細胞集団のうち蛍光の強い方から1.5%をソーティングし、これをIgA陽性群と定義した。本研究では、腸管感染症においてIgAが結合している細菌を分離することで感染症の次世代シークエンサーによる診断を容易にすることを目的とし、その分離・解析技術の確立を目指した。健常人ボランティアから提供を受けた糞便を材料とし、常在細菌叢の中からIgAが結合している分画をセルソーターを用いて分離した。これを蛍光顕微鏡で確認したが、IgAに由来する蛍光を発する細菌は確認できなかった。そこで、代替法として準備していた磁性ビーズによる分離を試みた。IgA結合性の画分から核酸を抽出し、16S rDNAユニバーサルプライマーを用いてPCRを行ったところ、バンドが得られた。続いて、次世代シークエンサーによる菌叢解析を行った結果、その菌叢はビーズ未処理の糞便細菌叢のものと類似していた。前年度に行った、IgA結合性細菌の蛍光顕微鏡観察の結果によると、明らかにある特定の細菌がIgA結合性を示し、糞便全体の細菌構成とは異なっていた。このことからビーズによる分画処理は非特異的な結合に由来するものと推測された。ビーズへの非特異的な結合を防ぐため、ビーズ表面の官能基が疎水性のものと親水性のものを用意し、それぞれへの細菌の非特異的結合をリアルタイムPCRで見積もった。その結果、いずれのビーズへも少数ではあるものの細菌が非特異的に結合することがわかった。これらの結果を合わせて考えると、IgA結合性細菌を高精度で分取するのは難しい技術であり、たとえFACSでIgA結合性のシグナルが出ていても蛍光顕微鏡などで確認をしなければならないと考えられる。このところ腸内細菌叢のIgA結合性画分を分取した論文が発表されているが、その分取精度については検討が必要と思われる。また、顕微鏡観察下でIgA結合細菌のみを分取するレーザーマイクロダイセクション法の利用を検討する必要もあると思われた。細菌学当初の計画ではソーティングした細胞群からDNAを抽出し、これを次世代シークエンサーによりシークエンスすることで、そこに含まれる細胞の生物種を推定する予定であった。当該年度中に、IgA陽性細胞のソーティンと、健常ボランティアより提供を受けた糞便中のIgA陽性細胞の観察は完了した。しかしながら、当初予定していた微量DNAの抽出からシークエンシングまでの過程で問題が生じている。

ソーティングを行った結果、IgA陽性細胞を500個程度を得たものの、現在用いている核酸抽出法(MO BIO社PowerSoilDNA Isolation Kit)では用いる細胞数が少なすぎるためか核酸抽出に成功しなかった。現状では、得られた核酸抽出溶液を鋳型とし、16S rRNAユニバーサルプライマーを用いたPCRを行った結果、ソーティング細胞由来の抽出核酸とnon-template controlの間に優位な差を認めなかった。ソーティングする細胞数をさらに増やす検討も試みたが、細胞数を増やすとソーティング精度が著しく悪化するため、希薄な濃度の細胞を用いる方が本研究の目的には適している。核酸抽出の方法にさらなる工夫が必要であると考えられるが未だ達成されていない状況である。また、ソーティング後の細胞を蛍光顕微鏡で確認する必要があるが、細胞のほとんどが細菌であること、またその細胞数があまりに少なすぎるため顕微鏡下での観察が不可能であったため、系の確立には至っていない。研究の達成度を律速している要因を解決するべく分画細胞数を更に増やすアイデアとして、細胞分画法の変更を検討している。すなわち、ストレプトアビジン標識磁性ビーズとビオチン標識抗体を用いて、免疫沈降を行う。この方法では、セルソーターよりも多量の細胞を結合させることができるため十分量の細胞が確保できるものと期待している。研究計画に記載したマウスのシトロバクター感染モデルについては、既に感染実験を終了しており、糞便試料を保管している。最終年度はこの試料を用い、セルソーターもしくは磁気ビーズを利用した免疫沈降法によりIgA陽性細胞を分画する予定である。さらに、分画した細胞から核酸抽出を行い、次世代シークエンサーにより核酸配列を決定する。さらに、核酸抽出法についても改善が必要である。現在微量核酸に特化した核酸抽出キットを購入し、それぞれの収量と純度を検討しているところである。核酸抽出法の純度すなわち環境由来核酸の汚染に対して、本来目的とする抗体が結合した微生物由来核酸がどれだけ精製できるか検討する。このため評価系として、大腸菌と表皮ブドウ球菌を陽性コントロールとして使用する。大腸菌の外膜タンパクであるOmpCの抗体を用いた免疫沈降法により大腸菌のみを分画し、その核酸を精製する。このときの大腸菌由来核酸を特異的プライマーを用いたリアルタイムPCRを用いて評価する。研究代表者は平成26年度から所属機関が大阪大学から岡山大学へ移転したため、実験を継続するために本年は不足物品の購入費と旅費の請求が増加すると考えられる。
女性の肥満の特性解明-性ホルモンのレプチン受容体情報伝達に及ぼす影響-

女性の肥満の原因を明らかにするために、女性ホルモン(エストロゲン)が、重要な食欲抑制ホルモンである「レプチン」の働きにどのような影響を及ぼすか調べました。レプチンの働きがよくわかるように、レプチン受容体(レプチンを受け取るタンパク)の遺伝子を組み入れた細胞を用いました。その結果、女性ホルモンは、レプチンの働きを強める、すなわち、女性ホルモンが食欲を抑制することが推測されました。肥満はメタボリックシンドローム、動脈硬化性疾患の重要基盤と考えられている。よって、肥満の病態を解明することは、その予防および治療に直結することから、社会的貢献は計り知れない。一方、女性と男性では肥満の臨床像(頻度、年齢分布など)が大きく異なっており、女性の肥満の特性およびその分子生物学的機序の解明は、肥満の全体像を明らかにし予防および治療法を確立する上で非常に重要と考えている。我々は、ヒト腎細胞HEK293を用いてレプチン受容体安定発現型細胞株を樹立し、女性ホルモン(エストロゲンとプロゲステロン)がレプチン受容体情報伝達に及ぼす影響を検討している。エストロゲン及びプロゲステロンはステロイドホルモンの一つであり、我々は既にデキサメサゾがレプチン受容体の情報伝達を抑制することを報告していた。平成19年度の実験では、非常に興味あることに、これらの性ホルモンは同じステロイドホルモンでありながら、レプチンの情報伝達を増強し、予想とは反対の結果を得た。エストロゲン及びプロゲステロンは種々の濃度と時間で前処置し、レプチン刺激によるSTAT3のリン酸化をウエスタンブロッティングで繰り返し検討しているが、その結果は非常に再現性の高いものである。現在、レプチン受容体情報伝達の上流側(STAT3の上流)JAK2の変化を検討するとともに、関連する情報伝達経路の抑制剤を使用し、その増強効果のメカニズムを検討中である。(平成20年度にこれらの性ホルモン作用についてメカニズムを中心に実験を進め、とりまとめる予定である。)女性ホルモン「エストロゲン」がレプチン受容体に及ぼす影響について、レプチン受容体安定発現細胞株を用いて検討した。ヒト腎細胞株HEK293とマウスのlong-formレプチン受容体遺伝子を組み込んだpcDNA3.1/Zeoを用いて、リポフェクタミン法にてレプチン受容体安定発現細胞株(以下、HEK293ObRb)を作成した。HEK293ObRbを、エストロゲンで前処置し、100nMレプチンで15分間刺激した。エストロゲンは、1、2,4,8、16、24,48時間の前処置を行い、その濃度は1、10,100nM前後で変化させた。細胞を可溶化後、上清をSDS-PAGEに展開した。レプチン受容体細胞内情報伝達の中軸は、Janus kinase2(JAK2)とsignal transducers and activators of transcription3(STAT3)であり、レプチンが結合するとJAK2およびSTAT3がリン酸化される。JAK2のリン酸化は、ヒト肝癌細胞株Huh7にObRbおよびJAK2をライポフェクタミン法にて遺伝子導入し検討した。細胞可溶化上清を用いて、抗リン酸化STAT3、抗リン酸化JAK2を一次抗体としウエスタンブロッティングを行った。4-24時間のエストロゲン前処置でSTAT3のリン酸化が増強し、その濃度は100nMが至適濃度であった。エストロゲン前処置にて、Huh7においてはJAK2のリン酸化の増強は認めなかった。さらに、エストロゲンのレプチンの情報伝達増強作用がMAP(mitogen activated protein)kinaseカスケード介するか否かを、その阻害剤を用いて検討したが、MAP kinaseカスケードの関与は明確ではなかった。この結果は、女性ホルモンの代表である「エストロゲン」が摂食中枢において抑制的に作用するという重要な事実を示唆した。
B7/TLRを介した造血幹細胞の自己複製機構と骨髄腫瘍発生との関連性の解析

造血幹細胞はすべての血液細胞を作る能力に加えて強い自己複製能を持つ。我々や他のグループは表面抗原を用いてHSCsのheterogeneityを報告し、特定の分化指向性を持つ亜集団を分離してきた。今回、CD86マーカーを用いたTLR欠損骨髄のscreeningにより、自己複製能に影響を及ぼす遺伝子背景の選定を行った。骨髄競合試験ではTLR6欠損HSCsが野生型に比べて強い自己複製能があることが示された。JAK2V617F Tgマウスで起こる真性多血症は、TLR6遺伝子欠損に関わらず同様に発症した。これらの結果はHSCsの自己複製能の強化は血液病態を悪化させるのに十分ではないことを示唆している。平成26年度の目標は、各TLR遺伝子欠損マウスの骨髄プロファイル解析によって、骨髄の変化を検出し、造血幹細胞(HSC)の自己複製に関わる遺伝子背景の選別を行うことである。TLR1,2,3,4,5,6,7,9KOマウスを購入し、骨髄中の前駆細胞/ HSCの解析を行った。各遺伝子欠損マウス3匹から大腿骨、頸骨、寛骨を回収し、骨髄/ HSC数を計測した。その結果、骨髄総細胞数は野生型、KO群間で差は認められなかった。一方、HSCの質をモニターするCD86の発現解析ではTLR4, 6KOで発現が低下していた。また、分化の下流に位置するLymphoid primed progenitorやリンパ球前駆細胞は減少していた。また、骨髄B細胞の中でもB220HiのB細胞に減少が認められた。一方、リンパ球形成能試験でのCD19陽性細胞の形成には差が認められなかった。これらの結果より、TLR4,6KOではMyeloid系分化が促進されていることが示唆された。慢性炎症が血液腫瘍に与える影響を解析するため、LPSやPoly I:Cの最適濃度の検討を行った。興味深いことに、LD 50の濃度よりも10000倍薄い濃度(0.1μg)でのLPS腹腔内投与はSca-1マーカーの上昇に至った。また、HSCも脾臓に移行しており、移行後のHSCは骨髄HSCと同レベルのCD86を発現していた。つまり、極めて弱い免疫反応に対してもHSCのnicheが応答し、HSCや前駆細胞の表現型や細胞の組織内局在が変化することが明らかとなった。造血幹細胞(Hematopoietic Stem Cells: HSCs)は、自身が発現するToll like receptorによって病原体の侵入を感知し、免疫担当細胞への分化を迅速に開始する。その一方で、炎症に伴ってCD86陰性のHSCsが増加し、CD86-HSCsは限定的な自己複製能とリンパ球形成能しか示さない。つまり、炎症はHSCsの数を変化させるだけでなく、質的な変化をもたらす。また、真性多血症モデルマウスて&#12441;は、CD86-HSC亜集団が増大し、myeloid系前駆細胞の分化が促進されている。そこで本研究では、TLR欠損による炎症の抑制が造血細胞の分化/自己複製や真性多血症発症にどのような影響を与えるかを解析した。その結果、TLR6KO由来骨髄ではMyeloid系分化が促進されていることが示唆された。14週齢までのTLR欠損真性多血症モデルマウスの末梢血の解析では、非欠多血症マウスと同様に高い赤血球/血小板値を示し、TLR欠損は真性多血症発症に与える影響は大きくないことが示唆された。今後は、TLR欠損真性多血症の生存曲線/組織病変等の解析を通じて、さらに病態の進行との関連性を調査する予定である。当初の計画通り、遺伝子欠損マウスの選別が終了した。TLRKO4,6においてMyeloid系の分化が更新しやすいことが、HSCの表現型、前駆細胞数より明らかとなった。また、TLR1,3はB細胞数の上昇が認められたことから、TLR4,6KOとは逆の作用が示唆された。一方、微生物検査上の問題から、TLRKOマウスを動物施設に導入できなかったため、解析マウス数を増やすことができなかった。今後、顕微授精によるクリーンナップを行ってマウスの解析個体数を増やし、より正確なデータの収集を目指す。放射線用量及び、helper細胞数の条件検討を行い、Donor由来細胞のキメリズム95%の最適条件が得られた。TLRKOの由来の移植実験までは到達できなかったが、移植実験に必要なマウスの準備、実験条件が決定した。また、TLR antagonist/agonistによる慢性炎症が真性多血症の悪性化に寄与するか否かの予備試験として行った実験により、HSCは予想よりもずっと早く炎症に応答するという結果が得られた。

この結果により、骨髄前駆細胞の早期判定により、新たな薬効評価試験に用いられる可能性が示唆された。27年度が最終年度であるため、記入しない。血液学、免疫学、分子生物学平成27年度は選別したTLR欠損の遺伝的背景がHSCの疾患である真性多血症にどのような影響を与えるかを解析する。現在、真性多血症動物モデルのコンディショナルノックインマウス(KI)とトランスジェニックマウス(Tg)が作製され利用されているが、本研究ではTgマウスを用いる。その理由として、1) TgマウスとKIマウスの表現型は同じであること2)ホモヘテロアリルの判別が1つの遺伝子座でよく、マウスの交配時間を短縮できること3)末血の表現型が明確であること、があげられる。申請者は共同研究者とのMTAを交わし、平成27年度7月にJAK2 Tg miceを導入予定である。また、TLRKOマウスの卵子とTgマウスの精巣による顕微授精によって、マウスのクリーンアップと初期交配に要する時間の短縮を図る。また、平成26年度にrecipient CD45.1xCD45.2マウスを作製した。TLRKO (CD45.2)と野生型CD45.1由来のHSCを移植し、末血によるキメリズム解析によって自己複製の強さの判定を行う。3B7/TLR欠損により影響を受け、HSCの機能を制御する分子の同定これまでの研究から、TLR4,6KOはmyeloid分化傾向が促進されている可能性が示唆された。そこで、細胞周期、Lineage master遺伝子、自己複製関連遺伝子、血管内皮細胞遺伝子等の発現解析を野生型及びTLRKO HSC間で行い、分化促進メカニズムの解析を行う。また、選定された遺伝子をHSCで過剰発現させることにより、目的遺伝子がHSCの自己複製を促進/抑制するかどうかを検討する。