hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
選択的オートファジー基質Ｎｂｒ１を介した脂肪酸分解制御機構

肝臓特異的オートファジー欠損マウスを用いた詳細な生化学的、そして網羅的な脂質分子解析を行った。その結果、オートファジー不全により、脂肪酸酸化を抑制する核内受容体コリプレッサー1(NCoR1)が蓄積し、その結果として脂肪酸酸化が顕著に抑制されることを発見した。つまり、NCoR1が栄養飢餓に応じて「オートファゴソーム」という膜構造体に局在するGABARAPと特異的に結合し、オートファジー依存的に分解されることを見出した。そこで、オートファジーによるNCoR1の分解の意義を検討するため、マウスの肝臓においてオートファジー必須遺伝子Atg7を欠失させた結果、NCoR1が肝臓に過剰に蓄積し、マスター転写因子であるペルオキシソーム増殖剤活性化受容体α(PPARα)が抑制されることを確認した。さらに、肝臓特異的Atg7欠損マウスは、栄養飢餓に応じた脂肪酸酸化関連遺伝子群の遺伝子発現やエネルギー源のケトン体産生を著しく低下させることも確認した。すなわち、栄養飢餓に応じてNCoR1がオートファジー依存的に分解されることにより効率的にPPARαが活性化し、脂肪酸酸化が促進されることを意味する(Nat. Commun. 2019)。本研究成果の特徴は、現在、国内外で未曾有の発展を遂げているオートファジー研究の中でも、選択的オートファジーによる細胞生理機能、特にオートファジーによるNCoR1の分解に焦点を当てたことにある。今回の研究から、オートファジーが単に脂質を分解するだけでなく、その分解産物である脂肪酸の代謝をも促進することで、効率的な脂質代謝を可能にしていることが分かった。したがって、オートファジーの活性化がこれら生活習慣病の効率的な予防、治療を可能にできると考えられる。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。選択的オートファジーの機能障害が直接、代謝異常疾患、神経変性疾患、がんなどの重篤疾患の発症に関与することがつぎつぎと明らかにされてきた。しかしながら、選択的オートファジーを介した代謝調節機構は不明のままであった。p62とNbr1は、選択的オートファジーの基質ないしはアダプターとしてユビキチン化タンパク質に結合することが知られている。p62に関する研究が進む一方で、Nbr1に関する研究は国内外でほとんど進展が見られない。重要なことに、Nbr1の異常蓄積は、アルコール性肝炎、脂肪肝などのヒト肝疾患と関連するが、それらの病態形成とNbr1の関わりは不明である。選択的オートファジーによるNbr1代謝の生理的意義を明らかにするため、肝細胞特異的オートファジー必須遺伝子Atg7欠損マウス肝臓を用いて網羅的なメタボローム解析、リピドーム解析、血液生化学を行った。その結果、オートファジー欠損マウス肝臓において、「アセチルCoAの産生減少」、「アシルカルニチンの異常な蓄積」、そして「飢餓時のケトン体産生低下」が見られた。この原因は、β酸化に関わる一連の遺伝子群の発現低下によるものであった。この原因は脂肪酸分解のマスターレギュレーターであるPparαを負に制御する核内コリプレッサーNCoR1が核内に蓄積し、その結果Pparαを不活化させ、β酸化に関わる一連の遺伝子群の発現低下を起こすことに起因していた。NCoR1の核内蓄積が脂肪酸分解障害の原因であることが分かったので、NCoR1核内蓄積の分子機構を明らかにするために、タンパク質相互作用解析、細胞内局在解析を行った。その結果、NCoR1はLIR /GIMを有し、LIR/GIMを介してオートファゴソームに局在するGABARAPファミリータンパク質と相互作用すること、そして最終的にオートファジーによって選択的に分解されていることが明らかとなった。年次計画通り、網羅的なメタボローム解析・遺伝子発現解析を行い、さらにはNCoR1核内蓄積の分子メカニズムを明らかにすることができたから。肝細胞特異的オートファジー必須遺伝子Atg7欠損マウス肝臓を用いたリピドーム解析から、Atg7欠損マウス肝臓においてアシルカルニチンが異常に蓄積していること、血液生化学解析から、飢餓時のケトン体産生が損なわれていることを見出した。この原因を明らかにするために遺伝子発現解析を行った結果、オートファジー欠損肝臓においてβ酸化に関わる一連の遺伝子群の発現低下が見られ、脂肪酸分解(β酸化)が抑制されていることが明らかになった。また、これらと同様の結果が、Atg7 p62二重欠損マウス肝臓においても見られた。この原因は脂肪酸分解のマスターレギュレーターであるPparαを負に制御する核内コリプレッサーNCoR1が核内に蓄積し、その結果Pparαを不活化させたことに起因していた。このβ酸化に関わる一連の遺伝子群の発現低下はAtg7 p62 NCoR1三重欠損マウス肝臓において回復した。NCoR1の核内蓄積の分子機構を明らかにするためにタンパク質相互作用解析、細胞内局在解析を行った結果、NCoR1はLIR /GIMを有すること、LIR/GIMを介してオートファゴソームに局在するGABARAPファミリータンパク質と相互作用すること、そして最終的にオートファジーによって選択的に分解されていることを明らかにした。一方、選択的オートファジー基質Nbr1は初代マウス肝細胞にアデノウイルスを用いて発現させるだけで、NCoR1の蓄積およびβ酸化に関わる一連の遺伝子群の発現障害を引き起こすことがこれまでにわかっている。

したがって、Nbr1の蓄積はオートファジー欠損肝臓と同様にNCoR1の分解を阻害することが示唆される。この分子機構を明らかにすることが今後の課題である。肝臓特異的オートファジー欠損マウスを用いた詳細な生化学的、そして網羅的な脂質分子解析を行った。その結果、オートファジー不全により、脂肪酸酸化を抑制する核内受容体コリプレッサー1(NCoR1)が蓄積し、その結果として脂肪酸酸化が顕著に抑制されることを発見した。つまり、NCoR1が栄養飢餓に応じて「オートファゴソーム」という膜構造体に局在するGABARAPと特異的に結合し、オートファジー依存的に分解されることを見出した。そこで、オートファジーによるNCoR1の分解の意義を検討するため、マウスの肝臓においてオートファジー必須遺伝子Atg7を欠失させた結果、NCoR1が肝臓に過剰に蓄積し、マスター転写因子であるペルオキシソーム増殖剤活性化受容体α(PPARα)が抑制されることを確認した。さらに、肝臓特異的Atg7欠損マウスは、栄養飢餓に応じた脂肪酸酸化関連遺伝子群の遺伝子発現やエネルギー源のケトン体産生を著しく低下させることも確認した。すなわち、栄養飢餓に応じてNCoR1がオートファジー依存的に分解されることにより効率的にPPARαが活性化し、脂肪酸酸化が促進されることを意味する(Nat. Commun. 2019)。本研究成果の特徴は、現在、国内外で未曾有の発展を遂げているオートファジー研究の中でも、選択的オートファジーによる細胞生理機能、特にオートファジーによるNCoR1の分解に焦点を当てたことにある。今回の研究から、オートファジーが単に脂質を分解するだけでなく、その分解産物である脂肪酸の代謝をも促進することで、効率的な脂質代謝を可能にしていることが分かった。したがって、オートファジーの活性化がこれら生活習慣病の効率的な予防、治療を可能にできると考えられる。選択的オートファジー基質Nbr1は初代マウス肝細胞にアデノウイルスを用いて発現させるだけで、NCoR1の蓄積およびβ酸化に関わる一連の遺伝子群の発現障害を引き起こすことがこれまでにわかっている。この原因を明らかにするために、肝細胞特異的Nbr1欠損マウス、肝細胞特異的Atg7 Nbr1二重欠損マウス、肝細胞特異的Atg7 p62 Nbr1三重欠損マウスなどを用いて網羅的なメタボローム解析、リピドーム解析、遺伝子発現解析を行う。これらのオミクス解析から得られた情報をもとに、肝臓におけるNbr1を介した転写因子PPARα阻害による代謝経路への影響について、その主因となる制御タンパク、または酵素を細胞内発現解析や遺伝子ノックダウンの手法を用いた生化学、細胞生物学的検証により決定する。さらには、Nbr1が細胞内に過剰に存在するときになぜNCoR1が蓄積するのかを解析する。具体的にはタンパク質相互作用解析、細胞内局在解析を行いNbr1の選択的分解の分子メカニズムを明らかにする。NCoR
新しい甘味蛋白質(クルクリン及びマピンリン)の大量精製法の確立と活性部位の解明

1.マピンリン同族体の精製法を確立した。中国雲南地方で採取した種子を石油エーテルで脱脂したのち、0.5M食塩水で抽出した。抽出液を硫安で塩析したのち、CM-セファロースカラムを用いて分画した。各画分をイオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過により、さらに精製した結果、5種類のマビンリン同族体(I-1,I-2、II,III,IV)を得ることに成功した。2.免疫化学的手法により検討した結果、マビンリンIIの抗体と他の甘味タンパク質(モネリン、ソーマチン)および甘味誘導タンパク質(ミラクリン、クルクリン)との間には、交差反応がみられなかった。一方、マビンリンIIの抗体は、他のすべてのマビンリン同族体と交差反応を示した。3.マビンリンの同族体の甘味活性の熱安定性を比較した。II、III、IVの活性は80°Cで1時間加熱しても失活しなかったが、I-1のそれは失活した。4.マビンリンI-1、III、IVの全一次構造を決定した。各同族体のアミノ酸配列順序には、高い相同性がみられた。とくに、I-1とIIIでは3個のアミノ酸が異なるだけであった。このうち1個はIVに存在しないし、もう1個はIIで置換がみられないので、残りの1個のアミノ酸残基(B鎖の47番目)が熱安定性に寄与していることが明らかになった。5.マビンリン同族体のシステイン残基は、A鎖には2個、B鎖には6個存在し、これらはすべて同じ位置にあり、また、ジスルフィド結合の位置もすべて同じ位置に存在することを明らかにした。1.マビンリンの精製法を確立した。中国雲南地方で採取した種子をn-ヘキサンで脱脂したのち、0.5M食塩水で抽出した。抽出液を硫安で塩析したのち、CM-セファロ-スカラムを用いて分画した。各画分をゲルろ過でさらに精製した結果、5種類のマビンリン同族体(I,II-1,II-2,III,IV)を単離することに成功した。これらはいずれも逆相高速液体クロマトグラフィ-により、純品であることが確認された。2.先に開発したクルクリンの抽出法を改良し、簡便な精製法を確立した。以前は抽出の際にホモジナイザ-を用いていたが、発泡するなど欠点があった。今回、超音波発生器を用いるとより効率よく、且つ簡単に抽出されることがわかった。また、金属アフィニティ-クロマトグラフィ-により、食塩水抽出液から1段階で精製する方法を確立した。3.マビンリンIはA鎖・B鎖の2本のポリペプチドから構成されており、アミノ酸配列順序を決定した結果、A鎖は33個のアミノ酸残基から、B鎖は72個のアミノ酸残基から構成されていることが明かになった。さらに、両鎖には8個のシステイン残基が存在し、これらはすべてジスフィド結合していることが確認された。4.マビンリンIは耐熱性をもち、中性溶液で100°C、48時間加熱しても活性が失われない。5.クルクリンのcDNAクロ-ニングを行った。その結果、クルクリンはN末端とC末端に22のアミノ酸残基を有するプレプロ体のプロッセシングによって成熟体になることが示唆された。1.昨年度開発したクルクリンの抽出法を改良した。すなわち、食塩水での抽出は、あらかじめ水で洗浄し、不純物を除去した後に行っていたが、水による洗浄は十分でない上に、C.latifoliaの実が褐変するという欠点があった。このことを解決するために種々検討した結果、酸性条件下(pH1.84.0)で洗浄すると不純物が選択的に除去され、褐変もせず、以下の抽出がスムースに行われることがわかり、より簡便な精製法を確立することができた。さらに、以前は抽出の際にホモジナイザーを用いていたが、発泡するなど欠点があった。今回、超音波発生器を用いるとより効率よく、抽出されることがわかった。2.マビンリンの精製法を確立した。各画分をゲルろ過でさらに精製した結果、5種類のマビンリン同族体(I-1,I-2、II,III,IV)を単離した。3.マビンリンIIはA鎖・B鎖の2本のポリペプチドから構成されており、A鎖は33個、B鎖は72個のアミノ酸残基からそれぞれ構成されている。また、システイン残基はA鎖には2個、B鎖には6個存在している。本年度はこれらのジスルフィド結合位置をすべて決定した。4.クルクリンのcDNAの大腸菌での発現を行った。この結果、クルクリン抗体と交差反応を示すタンパク質が発現していることが確認された。しかしながら、甘味誘導活性は認められなかった。

2.免疫化学的手法により検討した結果、マビンリンIIの抗体と他の甘味タンパク質(モネリン、ソーマチン)および甘味誘導タンパク質(ミラクリン、クルクリン)との間には、交差反応がみられなかった。一方、マビンリンIIの抗体は、他のすべてのマビンリン同族体と交差反応を示した。3.マビンリンの同族体の甘味活性の熱安定性を比較した。II、III、IVの活性は80°Cで1時間加熱しても失活しなかったが、I-1のそれは失活した。4.マビンリンI-1、III、IVの全一次構造を決定した。各同族体のアミノ酸配列順序には、高い相同性がみられた。とくに、I-1とIIIでは3個のアミノ酸が異なるだけであった。このうち1個はIVに存在しないし、もう1個はIIで置換がみられないので、残りの1個のアミノ酸残基(B鎖の47番目)が熱安定性に寄与していることが明らかになった。5.マビンリン同族体のシステイン残基は、A鎖には2個、B鎖には6個存在し、これらはすべて同じ位置にあり、また、ジスルフィド結合の位置もすべて同じ位置に存在することを明らかにした。
生薬、漢方薬、民間薬などの天然薬物の睡眠調節作用の解明

本研究は、不眠に用いられている天然薬物中の睡眠調節成分の単離、同定、及びその作用機構の解明を目的とする。沖縄県で不眠に用いられているユリ科植物アキノワスレグサについて、本植物の根、葉及び花の水抽出エキスを調製し、マウスの運動量に及ぼす効果を検討した。その結果、何れのエキスもマウスの合計運動量を有意に減少させた。そこで、最も強い活性が認められた根の水抽出エキスについて分離を行い、グルタミン酸誘導体であるoxypinnatanine(1), longitubanineA(2)及びB(3)を単離した。この内、活性試験を行うに十分な量を単離した化合物1について、投与後の運動量を測定したところ、1は100mg/kg投与でマウスの運動量を有意に減少させた。したがって、1の鎮静効果が今回明らかとなった。次に、本植物の根、葉及び花における1の分布について、HPLCを用いて検討した。その結果、1は何れのエキスにも含まれることが明らかとなり、各エキスの活性に関与している可能性が示唆された。しかし、強い鎮静効果を示した根において、1の含量が最も少なかったことから、根の活性本体は1以外の化合物である可能性も考えられた。一方、本植物の睡眠効果を検討するため、根の水抽出エキス投与後のラットの脳波を測定したが、エキスはレム睡眠及びノンレム睡眠共に影響を及ぼさなかった。従って、活性本体及び1の活性メカニズムの解明については、引き続き今後の課題である。次に、生薬サンソウニンのエタノール:水(2:1)エキス及び水エキスを調製した後、マウスの運動量に及ぼす効果を検討した。その結果、エタノール:水(2:1)エキスはマウスの運動量を減少させた。さらにエキスの分離を行い、サポニンであるjujubosideA、jujubosideB及びフラボノイドであるspinosinを単離した。得られたこれら化合物についてもマウスの運動量に及ぼす効果を検討した。その結果、jujubosideAにマウスの運動量を減少させる効果がみられた。本化合物の睡眠効果については現在検討中である。本研究は、(1)生薬、漢方薬、民間薬等の天然薬物の中から不眠に用いられているものについてスクリーニングを行い、(2)その中で睡眠効果の認められたものから睡眠調節作用をもつ成分を単離、同定し、(3)脳内の睡眠物質の濃度測定や睡眠覚醒障害モデル動物を用いた睡眠解析等を行うことで、その作用機構を解明することを目的とする。本年度は以下の結果を得た。1.不眠に用いられている天然薬物(サンソウニン、ヤコウトウ、アキノワスレグサ等)のエキスを調製した後、各エキスをマウスに経口投与し、ロコモーターアッセイにより運動量の変化を調べた。その結果、サンソウニンおよびアキノワスレグサのエキスにマウスの運動量を減少させる効果がみられた。次に、サンソウニンおよびアキノワスレグサのエキスの分離を繰り返し行い、サンソウニンよりjujuboside A, jujuboside B, spinosinを単離し、アキノワスレグサよりoxypinnatanineを単離した。得られたこれら化合物についてもマウスに経口投与し、運動量の変化を調べた。その結果、jujuboside Aおよびoxypinnatanineにマウスの運動量を減少させる効果がみられた。

2.さらに、サンソウニンおよびoxypinnatanineに関しては、ラットに経口投与し、脳波・筋電図を測定し、その周波数や波形を自動睡眠解析ソフトで解析した結果、いずれもビーグル投与時に比べてノンレム睡眠時間を延長する効果が見られた。本研究は、不眠に用いられている生薬、漢方薬、民間薬等の天然薬物の中から睡眠調節作用をもつ成分を単離、同定し、脳内の睡眠物質の濃度測定や睡眠覚醒障害モデル動物を用いた睡眠解析等を行うことで、その作用機構を解明することを目的とする。沖縄県で不眠に用いられているユリ科植物アキノワスレグサについて、睡眠効果を検討する第一段階として本植物の根、葉および花の水抽出エキスを調製し、マウスの運動量に及ぼす効果を検討した。その結果、何れのエキスも投与7時間後の合計運動量を有意に減少させた。そこで、最も強い活性が認められた根の水抽出エキスについて、活性成分解明の目的で各種カラムクロマトグラフィーを繰り返し行い、化合物1-3を単離した。1-3は、各種スペクトルデータから、グルタミン酸誘導体であるoxypinnatanine(1)、longitubanine A(2)およびB(3)とそれぞれ同定した。この内、活性試験を行うに十分な量を単離した化合物1について、投与後の運動量を測定したところ、1は100mg/kg投与でマウスの運動量を有意に減少させた。したがって、1の鎮静効果が今回明らかとなった。次に、本植物の根、葉および花における1の分布について、HPLCを用いて検討した。その結果、1は何れのエキスにも含まれることが明らかとなり、各エキスの活性に関与している可能性が示唆された。しかし、強い鎮静効果を示した根において、1の含量が最も少なかったことから、根の活性本体は1以外の化合物である可能性も考えられた。一方、本植物の睡眠効果を検討するため、根の水抽出エキス投与後のラットの脳波を測定したが、エキスはレム睡眠およびノンレム睡眠共に影響を及ぼさなかった。従って、活性本体および1の活性メカニズムの解明については、引き続き今後の課題である。
T細胞CXCR3発現の悪性中皮腫早期診断・予防マーカーとしての有用性

アスベスト起因性胸膜プラークおよび悪性中皮腫症例の末梢CD4+ T細胞はケモカインレセプターCXCR3発現が健常人に比べて有意に低下しており, IFN-γ発現は悪性中皮腫症例のみで有意に低下していることを見出した.実験的にヒトCD4+ T細胞へのアスベスト慢性曝露はCXCR3とIFN-γ発現誘導を阻害する一方で, IL-17発現を高めることを示し,免疫担当細胞へのアスベスト曝露は抗腫瘍免疫機能の減弱に加えて,腫瘍の増殖促進に関与する可能性を示唆した.アスベスト起因性胸膜プラークおよび悪性中皮腫症例の末梢CD4+ T細胞はケモカインレセプターCXCR3発現が健常人に比べて有意に低下しており, IFN-γ発現は悪性中皮腫症例のみで有意に低下していることを見出した.実験的にヒトCD4+ T細胞へのアスベスト慢性曝露はCXCR3とIFN-γ発現誘導を阻害する一方で, IL-17発現を高めることを示し,免疫担当細胞へのアスベスト曝露は抗腫瘍免疫機能の減弱に加えて,腫瘍の増殖促進に関与する可能性を示唆した.アスベスト慢性曝露による悪性中皮腫は3050年という長期潜伏期間を経て発症し,また,その予後が非常に悪いという理由で早期診断が重要な鍵となっている。これまでに,免疫担当細胞へのアスベスト曝露による抗腫瘍免疫機能の減衰について研究を進めており,アスベスト繊維の一種であるクリソタイルがHTLV-1不死化T細胞株MT-2や末梢血CD4^+T細胞への慢性曝露により,活性化T細胞やTh1型のT細胞に発現しているケモカインレセプターCXCR3の細胞膜における発現とIFN-_γ産生を低下させることを見出した。更に,末梢血CD4^+T細胞におけるCXCR3の細胞膜における発現は,健常人(HD)に比べてアスベスト起因性胸膜プラーク症例(PP)と悪性中皮腫症例(MM)で有意に低いことを明らかにした。そこで,本研究では,アスベスト曝露後の免疫指標としてCXCR3の有用性を確認するため,HD,PP,MMの末梢血CD4^+T細胞について,抗腫瘍免疫を活性化するIFN-γの遺伝子発現と産生量を測定し,CXCR3発現低下と抗腫瘍免疫機能の関連性について解析を行った。末梢血CD4^+T細胞は抗CD3/CD28抗体(各2μg/ml)で刺激後,培養5日目に細胞と培養上清を回収した。MMにおけるIFN-γ遺伝子発現はHD,PPに比べて有意に低下していたが,培養上清中のIFN-γ値に有意差は認められなかった。CD4^+T細胞の細胞膜CXCR3発現と培養5日目のIFN-γ遺伝子発現の相関性は,有意差はなかったが,HDは緩やかな正の相関性を示し,予想と反してPPは逆相関を示した。また,MMはいずれの発現も低いため相関性を示さなかった。本研究結果からCXCR3発現低下とは異なり,CD4^+T細胞のIFN-γ産生能の減弱はアスベスト曝露と中皮腫の存在により誘導されることが示唆され,腫瘍を持たないPPではIFN-γ産生能が維持されているため抗腫瘍免疫機能がある程度保たれていると推察された。まとめると,アスベスト曝露はCXCR3発現低下により正常な細胞遊走活性の破綻と,腫瘍発生によるIFN-γ産生能の低下により抗腫瘍免疫機能を減衰させると考えられた。昨年度は,石綿曝露が誘導する免疫異常として,ヒトCD4^+ T細胞へのin vitroの石綿慢性曝露実験を基に,中皮腫症例の末梢CD4^+ T細胞におけるTh1型ケモカインレセプターCXCR3とIFN-γ発現低下を見出した。そこで本年度は,腫瘍の増殖に関与しており治療標的として注目されているTh17細胞から産生される炎症性サイトカインIL-17について,in vitroで石綿慢性曝露したCD4^+CXCR3^±T細胞のIL-17発現を解析し,CXCR3およびIFN-γ発現の関連性について検討することを目的とした。曝露実験には,健常人由来の末梢血単核球細胞からFACS AriaによってCD4^+ T細胞,CD4^+CXCR3^±T細胞を分取し用いた。細胞は,抗CD3/CD28抗体で刺激しIL-2存在化で増殖させ,白石綿存在・非存在化で培養した。曝露4週間後に白石綿を除去した細胞は,FACSによる細胞膜のCXCR3発現解析およびIL-17とIFN-γの細胞内発現解析に供した。CD4^+ T細胞とCD4^+CXCR3^- T細胞のCXCR3発現は,CD4^+CXCR3^+ T細胞に比べると低いが,抗CD3/CD28抗体刺激により高まり,白石綿曝露により低下した。一方,CD4^+CXCR3^+ T細胞のCXCR3発現は石綿曝露で変化しなかった。IFN-γ発現は,白石綿曝露により全ての細胞において阻害された。IL-17発現は,白石綿曝露により全ての細胞において高まっており,中でもCD4^+CXCR3^+ T細胞において発現の高い細胞が顕著に認められた。

また,抗CD3/CD28抗体刺激したCD4^+CXCR3^+ T細胞は,白石綿曝露によってTh1細胞の転写因子であるT-bet発現が阻害される一方で,Th17細胞の転写因子であるRORγtの発現が高められており,白石綿曝露によるIFN-γ産生阻害,IL-17産生促進したサイトカイン産生変化の結果と一致していた。これらの結果から,中皮腫症例の末梢CD4^+ T細胞のCXCR3発現低下は石綿曝露によるCXCR3発現誘導の阻害と,CXCR3発現細胞の減少により生じており,石綿曝露はTh1型のCXCR3発現誘導とIFN-γ産生を阻害することで抗腫瘍免疫機能の減弱を引き起こし,IL-17を産生するRORγt陽性細胞を誘導することで腫瘍の増殖を促す可能性が示唆された。今後,免疫診断指標への利用に更なる期待が持たれるところである。
細胞外ドメインシェディング誘導の新規分子機構と、その病態生理学的意義の解明

我々は、メタロプロテアーゼのM16ファミリーに属するnardilysin(N-arginine dibasic convertase; NRDc)が、EGFファミリーに属するヘパリン結合性EGF様増殖因子(HB-EGF)の結合蛋白質であることを明らかにした(Nishi他EMBO. J, 2001)。HB-EGFは膜結合型の前駆体として生成され、細胞外ドメインシェディングを受けて分泌型(活性型)となる。NRDcのHB-EGF膜結合型前駆体への生理作用を検討する過程で,我々はNRDcがHB-EGFのシェディングを増強すること、この増強効果はTACEの活性化を介していることを明らかにした(Nishi他JBC, 2006)。NRDcはTACEと結合し、TACEの切断酵素活性を直接増強した。強調すべきは、シェディング誘導因子であるホルボールエステルがNRDcとTACEの複合体形成を増加することであり、これまで全くわかっていなかったADAM蛋白質、そして細胞外ドメインシェディングの活性化機構の一端を明らかにしたことである。更に、NRDcのシェディング増強効果はHB-EGFに限定されずTNF-α、アミロイド前駆体タンパク質(APP)など、広範な膜蛋白質に及ぶこと、NRDcはTACE以外のADAM蛋白質の活性も増強することを示し(Hiraoka他J. Neurochem, 2007, Hiraoka他BBRC, 2008)、NRDcが細胞外ドメインシェディングの普遍的な活性化因子である可能性を示唆した。一方、我々の未発表データは、動脈硬化巣などの慢性炎症性疾患や、悪性疾患の病巣において、NRDcの発現が上昇していることを示している。前立腺癌の手術後標本を用いた詳細な検討では、NRDcの発現が、細胞の増殖マーカーの発現と非常に強い正の相関を示した。以上からNRDcは、TNF-αなどのサイトカインやEGFファミリーの増殖因子の細胞外ドメインシェディングによる活性化を介して,上記疾患群の進行に寄与している可能性が示唆された。これらをふまえ、今後個体レベルにおけるNRDcの生物学的機能を明らかにするため、NRDc欠損マウスの表現型解析を行う。膜近傍部での蛋白分解により、膜蛋白質の細胞外ドメインが不可逆的に切断される現象を、細胞外ドメインシェディングという。我々は、ヘパリン結合性EGF様増殖因子(HB-EGF)の新規結合蛋白質としてメタロプロテアーゼM16ファミリーに属するnardilysin(NRDc)を単離同定したが、最近NRDcがHB-EGF膜結合型前駆体のシェディングを増強することを明らかにした(Nishi他JBC 2006).NRDcはHB-EGFおよびADAM17(TACE)と複合体を形成し、TACEの活性化を介してHB-EGFのシェディングを増強した。更に、NRDcのシェディング増強効果はHB-EGFに限定されず広範な膜蛋白質に及ぶこと、NRDcはTACE以外のADAM蛋白の活性も増強することを示し,これまで不明であったADAM蛋白質、そして細胞外ドメインシェディングの活性化機構の一端を明らかにした。一方、我々はごく最近NRDc欠損マウスの作製に成功したが、同ホモ接合体は、顕著な成長遅延を呈した(下図)。今回の研究期間で、目的

1)NRDc欠損マウスの表現型を詳細に解析し、成長遅延を呈するメカニズムを解明すること、目的2)疾患モデルマウスを用いてNRDc-TACEによるシェディング誘導の病態生理学的意義を解明することを目指す。NRDc-シェディング-個体の発育という未知のリンクを解明すること、特にこれまで生物学的機能が不明であったプロテアーゼ(NRDc)が、いかにして個体発育という生命現象の根幹を制御しているかを明らかにすることで、タンパク質分解研究における新たな展開を推進したい。我々は、メタロプロテアーゼのM16ファミリーに属するnardilysin(N-arginine dibasic convertase;NRDc)が、EGFファミリーに属するヘパリン結合性EGF様増殖因子(HB-EGF)の結合蛋白質であることを明らかにした(Nishi他EMBo. J, 2001)。HB-EGFは膜結合型の前駆体として生成され、細胞外ドメインシェディングを受けて分泌型(活性型)となる。NRDcのHB-EGF膜結合型前駆体への生理作用を検討する過程で,我々はNRDcがHB-EGFのシェディングを増強すること、この増強効果はTACEの活性化を介していることを明らかにした(Nishi他JBC, 2006)。NRDcはTACEと結合し、TACEの切断酵素活性を直接増強した。強調すべきは、シェディング誘導因子であるホルボールエステルがNRDcとTACEの複合体形成を増加することであり、これまで全くわかっていなかったADAM蛋白質、そして細胞外ドメインシェディングの活性化機構の一端を明らかにしたことである。更に、NRDcのシェディング増強効果はHB-EGFに限定されずTNF-α、アミロイド前駆体タンパク質(APP)など、広範な膜蛋白質に及ぶこと、NRDcはTACE以外のADAM蛋白質の活性も増強することを示し(Hiraoka他J. Neurochem, 2007, Hiraoka他BBRC, 2008)、NRDcが細胞外ドメインシェディングの普遍的な活性化因子である可能性を示唆した。一方、我々の未発表データは、動脈硬化巣などの慢性炎症性疾患や、悪性疾患の病巣において、NRDcの発現が上昇していることを示している。前立腺癌の手術後標本を用いた詳細な検討では、NRDcの発現が、細胞の増殖マーカーの発現と非常に強い正の相関を示した。以上からNRDcは、TNF-αなどのサイトカインやEGFファミリーの増殖因子の細胞外ドメインシェディングによる活性化を介して,上記疾患群の進行に寄与している可能性が示唆された。これらをふまえ、今後個体レベルにおけるNRDcの生物学的機能を明らかにするため、NRDc欠損マウスの表現型解析を行う。
マルチメディア移動体通信における情報の時間構造保持・回復機構の研究

本研究の成果は,以下の4種類に大別できる.1.無線LANハンドオーバ環境において蓄積音声・ビデオ伝送時のメディア同期品質について検討した.WaveLAN(2Mbps)を用いた実験を行い,連続メディア再送制御方式RVTRとビデオの動的解像度制御を併用することによって音声の出力品質を向上できることを明らかにした.また,WaveLANとPHS間での垂直ハンドオーバ方式を提案し,実験によりその有効性を示した.2.PHS64kbpsベストエフォートサービス用連続メディアトラヒック制御方式のメディア同期品質を実験により評価した.特に,同じ基地局内で意図的に回線容量を変更できる屋内実験と,公衆基地局間のハンドオーバにより回線容量を変更する屋外フィールド実験の両方により,提案方式の有効性を実証した.3.BluetoothによりLANアクセスをするシステムにおける蓄積音声・ビデオ伝送について検討した.まず,無線LANからの干渉やBluetoothのパケット種別がメディア同期品質に及ぼす影響を実験により評価した.次に,RFCOMM Maximum Frame Sizeとベースバンドパケットペイロード長のセグメンテーション不整合が,スループットとメディア同期品質に及ぼす影響を評価した.更に,ネットワークの状況に応じてパケット種別を適応的に切り替える方式を考案し,その有効性を実験により立証した.4.有線・無線統合網における端末間同期制御については,WaveLAN無線LANとIP有線網とから構成される実験網を構築し,無線端末がハンドオーバする場合の端末間同期制御方式について検討した.音声・ビデオを,有線網上のサーバから無線端末と有線端末とにマルチキャスト伝送する場合のメディア同期品質を実験により測定し,端末間同期制御の有効性を定量的に示した.本研究の成果は,以下の4種類に大別できる.1.無線LANハンドオーバ環境において蓄積音声・ビデオ伝送時のメディア同期品質について検討した.WaveLAN(2Mbps)を用いた実験を行い,連続メディア再送制御方式RVTRとビデオの動的解像度制御を併用することによって音声の出力品質を向上できることを明らかにした.また,WaveLANとPHS間での垂直ハンドオーバ方式を提案し,実験によりその有効性を示した.2.PHS64kbpsベストエフォートサービス用連続メディアトラヒック制御方式のメディア同期品質を実験により評価した.特に,同じ基地局内で意図的に回線容量を変更できる屋内実験と,公衆基地局間のハンドオーバにより回線容量を変更する屋外フィールド実験の両方により,提案方式の有効性を実証した.3.BluetoothによりLANアクセスをするシステムにおける蓄積音声・ビデオ伝送について検討した.まず,無線LANからの干渉やBluetoothのパケット種別がメディア同期品質に及ぼす影響を実験により評価した.次に,RFCOMM Maximum Frame Sizeとベースバンドパケットペイロード長のセグメンテーション不整合が,スループットとメディア同期品質に及ぼす影響を評価した.更に,ネットワークの状況に応じてパケット種別を適応的に切り替える方式を考案し,その有効性を実験により立証した.4.有線・無線統合網における端末間同期制御については,WaveLAN無線LANとIP有線網とから構成される実験網を構築し,無線端末がハンドオーバする場合の端末間同期制御方式について検討した.音声・ビデオを,有線網上のサーバから無線端末と有線端末とにマルチキャスト伝送する場合のメディア同期品質を実験により測定し,端末間同期制御の有効性を定量的に示した.本年度は,フェージングに伴う回線状態の劣化と,ハンドオーバ等による通信の中断や回線容量の変化に対処するために,主として連続メディア再送制御方式とトラヒック制御方式とについて研究を行った.まず,連続メディアの誤りや欠落を再送により回復して高いメディア同期精度を達成できる方式としてRVTRを提案し,その有効性を実験により明らかにした.最初に,補助金により購入したデータチャネルシミュレータSX/12-2を用いてフェージングによるバースト誤りを模擬的に発生し,RVTRの基本性能を測定した.続いて,ハンドオーバによる通信の中断に起因するパケット欠落を回復するために,RVTRの適用を考えた.特に,無線LANであるWaveLAN(2Mbps)を用いて蓄積音声・ビデオを伝送し,ハンドオーバ時のメディア同期品質を測定する実験を行った.そして,RVTRの有効性を示した.更に,ビデオの動的解像度制御を併用することによって音声の出力品質を向上できることも明らかにした.次に,移動体通信システムとしてPHSを用いる場合について検討を行った.64kbpsベアラ対応基地局,ダイアルアップルータ及びフェージングシミュレータを用いて64kbps屋内実験システムを構築した.そして,64kbpsベストエフォートサービス(64kbpsと32kbpsとの間で回線容量が動的に切り替わる)を利用したインターネットアクセスにより蓄積音声・ビデオを転送する実験を行った.特に,回線容量変化に有効に対処するために、片道遅延時間を利用したトラヒック制御方式を提案し,その有効性を立証した.更に,来年及び再来年度の研究の準備として、WaveLANとPHS間での垂直ハンドオーバの実験を開始した.蓄積音声・ビデオ伝送に適した垂直ハンドオーバ方式を提案し実装した.そして,提案方式と、筆者らが以前に提案したVTRメディア同期アルゴリズムとを併用することにより、提案方式だけの場合よりもメディア同期品質を向上できることを確認した.無線回線の劣化・中断・容量変化に対処するための連続メディア伝送・メディア同期方式を前年度に引き続き検討するとともに,端末間同期制御方式の研究も行った.移動体通信システムとして,WaveLAN(IEEE802.11準拠無線LAN),64kbpsベアラ対応PHS,そしてBluetoothを用いた.検討項目と得られた結果は以下の通りである.まず,前年度に提案した連続メディア再送制御方式RVTRを用いてビデオ・音声を伝送し,バースト誤りが生じた場合の蓄積メディア同期品質を実験により測定した.その結果,RVTRは,再送を行わない方式に比べてメディア同期品質を改善できることを示した.

次に,昨年度に提案したPHS64kbpsベストフォートサービス用連続メディアトラヒック制御方式のメディア同期品質を実験により評価した.特に,同じ基地局内で意図的に回線容量を変更できる屋内実験と,公衆基地局間のハンドオーバにより回線容量を変更する屋外フィールド実験の両方により,提案方式の有効性を実証した.また,BluetoothによりLANアクセスをするシステムにおいてビデオと音声とを伝送し,Bluetoothのパケット種別がメディア同期品質に及ぼす影響を実験により評価した.実験においては,無線LANなどの直接拡散システムからの干渉を模擬的に発生させるための擬似無線環境を研究室内に構築した.続いて,同じ実験システムを用いて,RFCOMM Maximun Frame Sizeとベースバンドパケットペイロード長のセグメンテーション不整合が,スループットとメディア同期品質に及ぼす影響を評価した.更に,WaveLANとIP有線網とを統合した屋内実験網を構築し,端末間同期制御を行った.有線網側の一つのサーバから,一つの無線端末ともう一つの有線端末とに,ビデオ・音声をマルチキャスト伝送した.無線端末がハンドオーバする場合に端末間同期制御方式を適用し,その有効性を定量的に示した.本年度は,Bluetoothによるビデオ・音声伝送のメディア同期と,有線・無線統合網における端末間同期制御の2種類の研究を行った.Bluetoothについては,まず,ビデオ・音声伝送を対象として,RFCOMM Maximum Frame Sizeとベースバンドパケットペイロード長のセグメンテーション不整合について,昨年度の研究を発展させた.特に,セグメンテーション不整合がスループットやメディア同期品質に及ぼす影響を,実験により評価した.実験では,DSSSシステムからの干渉を白色雑音で模擬し,メディアサーバは一つの受信端末に音声・ビデオを送信した.次に,Bluetoothによるビデオ・音声伝送において,パケット種別の違いがメディア同期品質に及ぼす影響を調査して,無線通信環境に応じてパケット種別を適応的に選択する指針を明らかにした.筆者らが以前に提案したメディア同期制御方式を実装し,その有効性も確認した.更に,ネットワークの状況に応じてパケット種別を適応的に切り替える方式を考案し,その有効性を実験により立証した.更に,Bluetooth LANアクセスシステムにおいて,ポイント・ツー・マルチポイント通信を行う時に,規格で規定されているポール間隔による帯域割り当てを行う場合に生じる二つの問題点を明確にした.
高度リン酸化澱粉及びアントシアニン色素を含有する馬鈴薯の生体内の脂質代謝及び抗酸化機能に及ぼす影響

試作品有色ポテトフレークの健康機能性について以前、有色馬鈴薯(北海92号(紫),北海91号(赤))からポリフェノールを抽出し、この抽出物をガラクトサミンにより肝障害を誘発したラットに投与して、その障害抑制効果について確認した。今回は試作品有色ポテトフレーク(キタムラサキ、北海91号、北海92号)をラットに4週間投与した時、抗酸化効果及び腸内環境への影響腸内環境に及す影響を調べた。(1)抗酸化効果:肝臓中の抗酸化酵素、SOD及びグルタチオンペルオキシダーゼ等遺伝子発現が有色ポテトフレーク投与で対照群に対して有意に高い値を示した。さらに北海92号投与群の血清中の抗酸化能が対照群に対して有意に高い値を示した。(2)腸内環境への影響:盲腸内容物重量は各投与群に有意な差はみられなかったが、盲腸内pHは全ての有色ポテトフレーク投与群が対照群に対して有意に低い値を示した。内容物中の短鎖脂肪酸濃度は酢酸、プロピオン酸、酪酸および総短鎖脂肪酸において、全ての有色ポテトフレーク投与群が対照群に対して高い傾向を示し、特に酢酸、酪酸および総短鎖脂肪酸では有意に高い値を示した。盲腸中の嫌気性菌は全ての有色ポテトフレーク投与群が対照群に対して有意に高い値を示した。Bifidobacteriumは有意差が見られなかったが、Lactobacillusは全ての有色ポテトフレーク投与群が対照群に対して高い傾向を示し、特に北海91号投与群では有意に高い値を示した。糞便中の総胆汁酸濃度は北海92号投与群では対照群に対して有意に高い傾向を示した。以上のより、有色ポテトフレークの投与は肝臓や血清中の抗酸化能を高め、さらに腸内環境改善にも有効であることから、健康機能性を有する可能性が示唆された。馬鈴薯アントシアニンの健康機能性の解明(1)動物実験による抗酸化活性への影響の解明有色馬鈴薯に含まれる色素成分を含む画分を抽出して、ガラクトサミン(GalN)誘発肝障害ラットに2週間経口投与を行った。その結果色素成分抽出画分が血清の肝毒性の指標となるGOT、GPT、ALP、LDHの値を有意に抑えた。さらに、生活習慣病の原因の一つである過酸化脂質に対する抗酸化活性について検討した結果、肝臓では過酸化脂質濃度がGalNを投与することにより有意に増加するのに対して赤色素及び紫色素画分を投与した区では減少する傾向がみられた。特に紫色素画分では過酸化脂質濃度を有意に低下させていた。また、肝臓で過酸化水素を水と酸素に変換することによって無毒化させるときに働く還元型グルタチオン濃度は両色素画分投与区で増加する傾向がみられ、特に紫色素画分投与区で有意に増加させていた。抗酸化活性に関わる肝臓抗酸化酵素では、スーパーオキシドアニオンを水と酸素に解毒する過程で働く抗酸化酵素マンガン依存性スーパーオキシドジスムターゼ(MnSOD)のmRNA発現が赤色素画分投与区でGalN投与、非投与に関わらず有意に増加することが確認された。このことから、有色馬鈴薯に含まれる色素成分に酸化抑制効果を有することが明らかとなった。(2)試験管レベルでの抗酸化活性の確認試験管レベルでアントシアニン系色素のラジカル消去能については紫色素画分、赤色素画分及び白イモであるトヨシロ、ホッカイコガネについて標品であるケラシアニン及びマルビニンと比較した。その結果、勝系4号(赤色素)では34%、勝系3号(紫色素)で51%、北海88号(紫色素)で37%の抗酸化活性がみられた。それに対して白イモでは49%程度の抗酸化活性しかみられなかった。以上の結果より、試験管レベルでの抗酸化活性は生体での抗酸化活性と同様の効果が確認された。

以上のより、有色ポテトフレークの投与は肝臓や血清中の抗酸化能を高め、さらに腸内環境改善にも有効であることから、健康機能性を有する可能性が示唆された。
古文書による社寺建築等の復元と中世の建築工事に関する研究

本研究は、奈良時代から室町時代までの神社・寺院・住宅の造営のための材木注文書を用いて詳細な復元図を作製し、構造形式及び細部意匠についての復元考察と建築部材名称の解明を行うとともに、中世における建築工事の実態とその変遷を明らかにすることを目的とするものである。本年度は、本研究の最終年度であり復元考察を論考にまとめるとともに、古文書等の分析を行った。建保四年(1216)「御宝殿造営用材注文」及び承久元年(1219)「鷹尾社遷宮宝殿指図井用途直法注文」による鷹尾神社本殿については、通常の本殿を省略した形式あるいは格式を下げた形式を呈すること、本社である高良大社の影響が少なからず見られることが明らかとなった(「承久度鷹尾神社本殿」『日本建築学会計画系論文集』第77巻・第679号)。文永七年(1270)「アサメ殿用材注文」(アサメの漢字は女偏に盛)による香取神宮アサメ殿についても、通常の神社本殿と比べて省略された形式あるいは格式を下げた形式を呈することが分かった(「文永度香取神宮アサメ殿の復元」、査読中)。いずれの復元考察においても、現存遺構のみでは知り得なかった構造形式及び細部意匠を有することが判明した。加えて、材木注文書による復元は正確かつ詳細であり、その実証的な復元案は現存遺構に準ずる資料的価値を有するものであることの確証を得ることができた。また、復元考察の過程で解明された建築部材名称を統合、検証したところ、鎌倉時代に関してはある程度の普遍性を持つことが判明した。古文書の精読に加え、材木注文書による復元方法を確立できたことにより、従来の復元研究を進展することができた。特に、類例の少ない鎌倉時代の神社建築に対して、本研究における復元案を現存遺構の補完資料として加えることができたことは、大きな成果と言える。平成22年度は主として、文献資料から神社・寺院・住宅の造営に関する材木注文書の抽出を行い、同時に詳細な復元考察が可能となるものを選別した。そのうち、厳島神社の材木注文書である暦仁二年(1239)の「伊都岐島社未造分屋材木等注進状」により、仁治度朝座屋および仁治度御厩については、具体的な復元考察を行った。復元の結果、仁治度朝座屋は、随所に格式の高い意匠が取り入れられていたことが確認され、本社及び客神社祓殿以下の付属社殿において、最も高い格式を呈していたことが判明した。仁治度御厩は、馬の世話をする空間として庇の柱間を広くとること、馬の荷重を支えるため身舎の床板を厚くすることなど、他の付属社殿には見られない、厩独自の特徴を有していたことが判明した。それらの成果はそれぞれ、「仁治度厳島神社朝座屋の復元考察」(『芸備地方史研究』第275・276号)、「仁治度厳島神社御厩の構造形式について」(『厳島研究』第7号)と題した論文にまとめた。また、復元対象となる建築の実地調査(伊勢神宮内宮別宮荒祭宮正殿等)を行った。それとともに、復元する際に必要となる建築細部意匠の研究のため、各時代の建築(瑠璃光寺五重塔、法界寺阿弥陀堂、醍醐寺金堂・五重塔等)を実地調査し、細部意匠の資料収集を行った。本研究は、奈良時代から室町時代までの神社・寺院・住宅の造営のための材木注文書を用いて詳細な復元図を作製し、構造形式及び細部意匠についての復元考察と建築部材名称の解明を行うとともに、中世の建築工事の実態とその変遷を明らかにすることを目的とするものである。平成23年度は主として、昨年度に抽出した材木注文書による復元考察を行った。復元対象としたのは、建保四年(1216)「御宝殿造営用材注文」及び承久元年(1219)「鷹尾社遷宮宝殿指図井〓用途直法注文」による鷹尾神社本殿、文永七年(1270)「アサメ殿用材注文」(アサメの漢字は女偏に盛)による香取神宮アサメ殿、永正六年(1509)「大講堂造営支度注文」による多武峰妙楽寺講堂である。そのうち鷹尾神社本殿については、先学における史料の誤読を改め復元考察をした結果、経済的事由により通常の本殿を省略した形式あるいは格式を下げた形式を呈すること、本社である高良大社の影響が少なからず見られることが明らかとなった。香取神宮アサメ殿については、材木の長さまで詳細に検討し考察した初めての復元案となる。この両者は、ほぼ完全な材木注文書による復元であるため、類例の乏しい鎌倉時代の神社本殿及び仮殿について新たな知見を提供する重要な例と言える。また、多武峰妙楽寺講堂については、部分的な材木注文書による部分復元であるが、建築部材名称についてはほぼ解明できた。古文書の精読に加え、材木注文書による復元方法をある程度確立できたことにより、従来の復元研究を少なからず進展することができたと言えよう。

なお、鷹尾神社本殿の復元考察については、「承久度鷹尾神社本殿について」と題して広島史学研究会大会(2011年度)において口頭発表を行った。本研究は、奈良時代から室町時代までの神社・寺院・住宅の造営のための材木注文書を用いて詳細な復元図を作製し、構造形式及び細部意匠についての復元考察と建築部材名称の解明を行うとともに、中世における建築工事の実態とその変遷を明らかにすることを目的とするものである。本年度は、本研究の最終年度であり復元考察を論考にまとめるとともに、古文書等の分析を行った。建保四年(1216)「御宝殿造営用材注文」及び承久元年(1219)「鷹尾社遷宮宝殿指図井用途直法注文」による鷹尾神社本殿については、通常の本殿を省略した形式あるいは格式を下げた形式を呈すること、本社である高良大社の影響が少なからず見られることが明らかとなった(「承久度鷹尾神社本殿」『日本建築学会計画系論文集』第77巻・第679号)。文永七年(1270)「アサメ殿用材注文」(アサメの漢字は女偏に盛)による香取神宮アサメ殿についても、通常の神社本殿と比べて省略された形式あるいは格式を下げた形式を呈することが分かった(「文永度香取神宮アサメ殿の復元」、査読中)。いずれの復元考察においても、現存遺構のみでは知り得なかった構造形式及び細部意匠を有することが判明した。加えて、材木注文書による復元は正確かつ詳細であり、その実証的な復元案は現存遺構に準ずる資料的価値を有するものであることの確証を得ることができた。また、復元考察の過程で解明された建築部材名称を統合、検証したところ、鎌倉時代に関してはある程度の普遍性を持つことが判明した。古文書の精読に加え、材木注文書による復元方法を確立できたことにより、従来の復元研究を進展することができた。特に、類例の少ない鎌倉時代の神社建築に対して、本研究における復元案を現存遺構の補完資料として加えることができたことは、大きな成果と言える。現段階において、抽出した材木注文書を用いて順次復元を行うと同時に、各復元図及び復元考察の成果発表に向けて準備を進めている。また、その過程で材木注文書による復元方法をある程度確立できたことは継続的に同様の復元していく上で大きな足掛かりとなることが見込まれる。現在までは個別に復元研究を進めてきたが、今後はそれらの成果を体系的に纏める必要がある。まずは、復元考察によって解明された建築部材名称を統合し、その変遷あるいは普遍性を検証する。そして、材木注文書を分析することにより、往時の生産形態とその変遷について明らかにする。なお、材木注文書の分析については、現在のところ未着手であるため、迅速に進める必要がある。
エクソン・シャッフリング仮説に基づく新規多機能性タンパク質の創出

骨や歯に発現するDentin Matrix Protein 1の石灰化反応機能モチーフと、Phage Display法により取得されたチタン結合ペプチドを、MolCraft法を用いて連結し、コンビナトリアルタンパク質集団を作成した。その集団の中から、チタン結合と石灰化反応促進作用を併せもつタンパク質を取得し、チタン表面をリン酸カルシウムでコーティングすることに成功した。また、結晶成長学的観点から詳しい解析を行ない、世界で初めてタンパク質が誘導するハイドロキシアパタイト結晶形成機構を解明することに成功した。これらの知見は、特に医工学生体材料分野の発展に貢献する。Dentin Matrix Protein 1(DMP1)は、象牙質などで発現し、生体内でのハイドロキシアパタイト形成に関与するタンパク質と考えられている。このタンパク質のアミノ酸配列中に、ESQESおよびQESQSEQDSからなる領域がある。化学合成したこれら二つのペプチドは、カルシウムイオン存在下で集合体を形成し、リン酸カルシウム溶液からのハイドロキシアパタイトの形成を促進する。また、RKLPDAからなるペプチドは、チタン表面に結合する能力がある。本年度は、(1)これら三つのペプチドをコードする遺伝子をMolcraft法により組み合わせ、人工タンパク質の遺伝子ライブラリーを構築した。(2)任意に選んだ遺伝子を大腸菌内で発現させ、20種類の人工タンパク質を得た。(3)これらの人工タンパク質の、リン酸カルシウム石灰化作用を解析するための実験系を構築した。具体的にはタンパク質をリン酸水溶液に溶解し、これに塩化カルシウム水溶液を混合する。するとリン酸カルシウムの析出や転移が起こる。この析出・転移に伴うpH変化を観測する方法である。この方法により18種類の人工タンパク質と、比較のためにBSA、リゾチーム、フォスビチンなどの天然のタンパク質の活性を調べた。(4)その結果、6種類の人工タンパク質に、タンパク質濃度依存的な石灰化反応促進作用が観測された。人工タンパク質#64は1μg/mLの低濃度で、また#68は25-125、#72は5-25μg/mlの濃度で明確な促進活性を示すことが分かった。ハイドロキシアパタイトなどのリン酸カルシウムは骨や歯の主要な無機成分であり、その結晶成長は、Dentin Matrix Protein 1(DMP1)などの酸性タンパク質の働きにより制御されている。本研究では、リン酸カルシウムの結晶成長を人工的に制御する方法の確立を目指し、それに利用可能なタンパク質を、エクションシャッフリングの原理を模倣して構築することを目標としている。昨年度は、DMP1のアミノ酸配列中に存在する二つの酸性機能ペプチド(ESQES,QESQSEQDS)を様々な数や順番で組み込んだ人工タンパク質の集団を構築し、その集団の中からリン酸カルシウムの結晶成長を促進するタンパク質を得ることに成功した。本年度は、人工タンパク質の促進機構を詳細に理解するために、時間分割静的光散乱実験による測定を行った。その結果、(1)人工タンパク質存在下では、リン酸カルシウム結晶の形成および析出が促進されることが再現された。(2)反応の初期に約340nm程度のアモルファス粒子が生成し、その後、結晶性の粒子に転移することが確認された。(3)人工タンパク質は、転移の機構を変化させること、具体的には、直接転換による転移を誘導することが明らかになった。さらに、人工タンパク質の結晶形成促進能(あるいは核生成促進能)を、タンパク質比存在下では核生成が起きない比較的過飽和度の低いリン酸カルシウム水溶液を用いて調べたところ、9種類の人工タンパク質に、析出促進活性が見られた。それらの至適濃度、親水/疎水性度、および等電点などは異なっていた。つまり、結晶形成促進能を持ちつつ、物理化学的な性質の異なる人工タンパク質を、構築できた。チタンは生体適合性に優れた金属であり、医工学生体材料として使用されている。しかし、チタン自身の骨への結合活性は弱い。そのため、移植手術後数ヶ月間、患部に負荷をかけられず、患者は不自由な生活を強いられる。チタンの骨への結合を促進する目的で、骨の無機成分であるリン酸カルシウムがチタン表面にコートされる。しかし、実用化されているプラズマスプレイ法では、超高温下でコーティングを行うため、骨に類似した結晶性をもつリン酸カルシウムをコーティングすることができない。骨類似リン酸カルシウムでチタン表面をコートするには、生体環境に近い条件下で、チタン表面にリン酸カルシウムを析出する必要が有る。生体内でのリン酸カルシウムの析出は、骨形成に関与する蛋白質により制御されている。蛋白質を用いた生体内に近い条件下で、チタン表面にリン酸カルシウムを析出させることができれば、骨結合活性に優れたチタンインプラントを開発できる。申請者はこれまで、骨形成蛋白質の一つであるDentin Matrix Protein 1由来のペプチドと、ファージディスプレイ法により取得されたチタン結合ペプチドを組み合わせ、エクソン・シャッフリングを摸倣したコンビナトリアル蛋白質集団を構築し、その集団の中から、リン酸カルシウム結晶形成を促進する蛋白質を取得することに成功している。