hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
胃癌の発生と進展におけるタイト結合蛋白クローディンの機能解析

本邦では依然として胃癌の罹患率は高く,ピロリ菌感染がその発生にかかわっているが,胃癌発生はピロリ菌感染者の数%のみである.本研究では,胃癌の発生や悪性度にかかわる因子として細胞と細胞の接着をつかさどるタイト結合蛋白に注目した.胃癌では,クローディン3の発現低下が癌細胞の増殖能と相関し,また胃に比較的特異的に発現しているクローディン18の胃癌浸潤先進部での発現低下と悪性度が相関していることを初めて明らかとした.本邦では依然として胃癌の罹患率は高く,ピロリ菌感染がその発生にかかわっているが,胃癌発生はピロリ菌感染者の数%のみである.本研究では,胃癌の発生や悪性度にかかわる因子として細胞と細胞の接着をつかさどるタイト結合蛋白に注目した.胃癌では,クローディン3の発現低下が癌細胞の増殖能と相関し,また胃に比較的特異的に発現しているクローディン18の胃癌浸潤先進部での発現低下と悪性度が相関していることを初めて明らかとした.本研究では,内視鏡的に切除した胃腺腫,早期胃癌とその背景粘膜におけるタイト結合蛋白の発現を蛍光免疫組織染色で確認し,その発現程度を定量化した.胃正常粘膜上皮,腸上皮化生粘膜上皮あるいは胃癌細胞にはクローディン(CLDN)1,CLDN3,CLDN4,CLDN18の発現を認め,それぞれの発現は,劇的に変化することが明らかとなった.胃正常粘膜上皮においては,CLDN18の発現を認め,腸上皮化生粘膜上皮では,CLDN18の発現は有意に低下し,CLDN3やCLDN4の発現を有意に認めることが明らかとなった.これらの発現は癌化によって誘導されるというよりは,癌化以前の段階で誘導されていると考えられた.またCLDN4とCLDN18の発現は,オクルーディンやZO-1の発現するタイト結合部位以外に各細胞側方部分にも発現がみられ,今後タイト結合部位の発現と側方部の発現がどのような関係にあるかを明らかにする必要がある.CLDN7の発現は,正常粘膜,腸上皮化生粘膜,胃癌細胞で明らかな変化を認めなかった.胃腺腫では,CLDN3,CLDN4の発現が有意に増加していた.胃粘膜上皮細胞の増殖マーカーとしてKi67の発現とそれぞれのクローディンの発現を検討すると,癌細胞におけるCLDN18の発現は,Ki67の発現と逆相関していた.今後は,粘膜下層へ浸潤した癌,あるいはその癌の先深部におけるこれらタイト結合蛋白の発現と増殖能について検討していく予定としている.また特異的クローディン発現細胞株を樹立し,その特異的発現による増殖能への影響を検討中である.タイト結合蛋白は,細胞間のバリア機能や細胞の極性を維持するために重要な役割を担っており,細胞表面に発現しているタイト結合蛋白の1つであるクローディン(CLDN)が最も重要な役割をしていると考えられている.CLDNには少なくとも27のサブタイプが存在することが明らかとなっており,これらサブタイプは,臓器特異的に発現し,正常上皮と癌での発現は異なることが示唆されている.本研究では,内視鏡的に切除した胃腺腫,早期胃癌とその背景粘膜におけるタイト結合蛋白の発現を蛍光免疫組織染色で確認し,その発現程度を定量化した.胃正常粘膜上皮,腸上皮化生粘膜上皮あるいは胃癌細胞にはCLDN1,CLDN3,CLDN4,CLDN7,CLDN18の発現を認め,それぞれの発現は,劇的に変化することが明らかとなった.腸上皮化生と早期胃癌のタイト結合におけるCLDN3,CLDN4,CLDN7の発現は腸上皮化生のない胃粘膜と比べて有意に高いことが明らかとなり,増殖マーカーであるKi67発現(Ki67-LI)はCLDN3と有意に逆相関し,CLDN4,CLDN7とは相関を認めなかった.粘膜下層浸潤早期胃癌の粘膜病変部と粘膜下層浸潤先進部のけるCLDNの発現を比較検討すると粘膜下層浸潤先進部においてCLDN3とCLDN7の発現は有意に低下し,CLDN4は低下傾向を示した.またそれぞれのCLDNの発現相関を検討するとCLDN3とCLDN4の発現は正の相関関係を認めたが,CLDN3とCLDN7の発現に相関関係を認めなかった.今後は,胃癌において他のCLDNの発現についても詳細に検討し,それぞれのCLDNの強制発現細胞株を用いてそれぞれのCLDNの機能解析を行う予定である.タイト結合蛋白は,細胞間の透過性を制御するバリア機能や細胞の極性を維持するフェンス機能を有しており,生体の恒常性の維持に重要な役割を担っている.クローディン(CLDN)はタイト結合蛋白の1つとして重要な役割をしている.CLDNは少なくとも27のサブタイプからなり,これらサブタイプは,臓器,細胞種特異的に発現し,さらに正常上皮と癌では発現が異なることが示唆されている.本研究では,内視鏡的に切除した早期胃癌とその背景粘膜におけるタイト結合蛋白の発現を定量化した.正常胃粘膜,腸上皮化生粘膜あるいは胃癌細胞にはCLDN1, CLDN3, CLDN4, CLDN7,CLDN18が発現し,それぞれの発現は,劇的に変化することが明らかとなった.CLDN3, CLDN

4, CLDN7のタイト結合における発現は腸上皮化生のない胃粘膜と比べて腸上皮化生粘膜と早期胃癌で有意に高いことが明らかとなり,増殖マーカーであるKi67発現(Ki67-LI)はCLDN3と有意に逆相関し,CLDN4,CLDN7とは相関を認めなかった.さらにCLDN18の胃上皮細胞における発現は,腸上皮化生のない胃粘膜と比べて腸上皮化生粘膜と早期胃癌で有意に低いことが明らかとなり,さらに早期胃癌でのCLDN18の発現は,腸上皮化生のない胃粘膜と比べて有意に低いことが明らかとなった.胃癌の粘膜下層浸潤先進部では,CLDN18の発現がKi67-LIと有意に逆相関し,粘膜下層浸潤先進部におけるCLDN18の発現低下が,癌の浸潤や転移にかかわっている可能性が考えられた.このことを証明するためにCLDN18を発現する胃癌細胞株にCLDN18 siRNAを処理し,CLDN18発現を低下させると,癌細胞増殖と浸潤能が有意に増加することが明らかとなり,CLDN18の発現低下が,胃癌の浸潤や転移にかかわっていることが初めて明らかとなったCLDN3について英文論文(査読あり)化することができ(in press)さらにもう1報論文化する見通しとなっている.また本研究に関連し,海外からの招聘講演なども行い共同研究を行っている.24年度が最終年度であるため、記入しない。各CLDNの発現変化が明らかとなったことによりそれぞれの機能的役割を検討する必要がある.CLDN18などの強制発現細胞株を樹立し,詳細な機能解析を行っていきたい.24年度が最終年度であるため、記入しない。
複合体・集合体を形成する複数の蛋白質の同時高発現系の開発

本研究では、発現させる蛋白質の分子量に上限がなく、複数のcDNAを同時に発現させることが可能な、バキュロウイルス/昆虫細胞系を利用して、複数の蛋白質から成る複合体ないし集合体を同時高発現させて精製することを目指す。材料として、染色体DNAメチルトランスフェラーゼ、Dnmt1、とこれと相互作用するPCNA(proliferating cell nuclear antigen)を用いる。昨年度までに、Dnmt1とPCNAをそれぞれ単独で発現させる組み換え型ウイルスを作製し、培養昆虫細胞に感染・発現させたところ、発現が確認された。両蛋白質をコードするウイルスを同時に昆虫細胞に感染させて、発現の至適条件を探索し、発現させた。発現させたDnmt1とPCNAを超遠心、ゲル濾過により複合体の形成状態を解析したところ、細胞内では両蛋白質は複合体を形成していないことが明らかとなった。そこで、それぞれの蛋白質を単独で発現させ精製した。脊椎動物の染色体DNAのCpG配列中のシトシン塩基の5位はしばしばメチル化されており、組織、発生段階に特徴的なメチル化模様を示す。脊椎動物では、このシトシンのメチル化は、組織特異的な遺伝子の発現、哺乳類における遺伝子刷込とX染色体の不活性化、発癌などの原因との一つとして寄与している。これは、転写因子を始めDNAに結合する蛋白質が結合配列付近がメチル化されると結合できなくなるか、メチル化されたDNAを認識して結合する蛋白質がクロマチン構造を変化させる結果であると考えられる。染色体DNAのメチル化模様は胚発生過程で組織特異的に形成され、複製時には維持される。DNAメチル化模様を触媒するDNAメチルトランスフェラーゼ(Dnmt)は複数報告されており、これらDnmtsが様々な調節を受け、染色体DNAのメチル化模様は形成・維持されている。そのうちDnmt1は、複製点に存在し複製直後のヘミメチル化DNA(2本鎖DNA CpG配列の一方のCがメチル化されている状態)を選択的にメチル化すること、DNAの修復・複製に関わるPCNA(proliferating cell nuclear antigen)と相互作用し、サイクリン依存性キナーゼ(CDK)を阻害するp21^<WAF1>と競合することが報告されている。本研究計画では、Dnmt1とPCNAを材料として、両者を昆虫細胞/バキュロウイルス系で同時に高発現させて、複合体のまま精製し、結晶化の材料を調製することを試みる。本年度は次のような結果を得た。Dnmt1とPCNAの発現系の開発:Dnmt1とPCNAを昆虫培養細胞/バキュロウイルスで発現させる系をつくった。Dnmt1については精製をした。Xenopus Dnmt1はPCNAと相互作用する:Xenopus Dnmt1はニワトリのDnmt1と同様PCNA結合に寄与するアミノ酸が保存されていないために、PCNAとは結合しないと考えられたが、予想に反して、in vitro、in vivoで結合することを見出した。
タイにおける地域環境に適応した住戸計画に関する研究

タイ住居に関する文献調査および農村調査から、タイ住居においては住戸のなかで最も広い面積をしめ、多目的に利用される広間空間の地域性について明らかにした。この広間空間は文献によると北部ではテーン、東北部ではコエィと呼ばれるが、近年では特に決まった名称をもたずそこで展開される様々な生活行為によって説明される。この広間空間は中部では半屋外のテラス空間として設けられる場合もみられる。この空間は住戸内外をつなぎ日常最も頻繁に使用されるが、僧侶を呼ぶ儀式の場として非常に重要な空間となっている。タイでは仏教信仰に基づく儀礼時には複数の僧侶を自宅へ招いて儀式を執り行う。とくに結婚式などの場合には幸運な数字と認識されている9人の僧侶が招かれることも少なくなく、壁を背にして仏像を奉る棚と全僧侶が座る場所を確保する必要がある。儀礼を行うために1柱間を2.5m前後とする、1柱間×2柱間、もしくは2柱間×3柱間で間仕切りのない広間が確保されているを明らかにした。この空間は居間的空間というよりも儀礼空間としての役割が大きいため、特定の用途に限定されない室名称として広間空間と表現することが適切と考えた。この広間空間は、農村や都市を問わず住宅に共通してみられ、湿潤熱帯という自然環境、仏教信仰が深く日常生活に浸透しているタイの社会環境に適応した住空間であることを明らかにした。伝統的住居の空間構成を反映して設計された集合住宅においても、複数住戸の共用空間として計画されたテラスが広間空間として有効に活用されてきたことを実地調査より明らかにした。高密度な都市型集合住宅の計画を考えるにあたって、タイでの生活様式に適応した広間空間をどのように計画するかは、住戸計画を考えるうえで非常に重要な要素となることについて明確に示した。タイの都市住宅の多様性や農村住居の地域性については明らかになりつつあるが、そうした住宅において共通してみられる住空間がある。それは、食事やくつろぎ、来客のもてなしや功徳を積むため僧侶を招いたり、予備寝室などとして多目的に使われ、住居に住む人と地域の人をつなぐ、住居の内と外の接点ともなるべき居間的空間(一部地域ではテラス形式)である。本研究では、テラス・居間的空間の地域性に着目して住居内外をつなぐテラス・居間的空間の機能と役割を明らかにし、タイ住居の空間構成の特徴および住戸計画のあり方について考察することを目的とする。今年度は文献調査をふまえ、現地研究者の協力を得て現地調査を実施した。伝統的住居の空間構成を反映して設計された集合住宅において、テラス・居間的空間を複数の住戸で利用する場合の特徴について機能および物理的側面から明らかにした。その結果、中部地域の伝統的住居の特徴的空間の一つであるテラス空間は、高密度な都市型集合住宅の計画を考える上において非常に興味深い空間であり、その利用方法についてもタイでの生活様式に適合しているものであり、住戸計画を考える上でのひとつの重要な空間であることが分かった。しかし、これらの空間を地域性という点からどのように解釈し、捉えることができるかという課題について、さらには今後の住戸計画のあり方についての具体的な提言については、今後も継続して調査・考察過程で明らかにしていきたい。
熱延伸3Dプリンティングによる生体用高分子材料の強化および骨類似機能化

本研究では,生体材料の一種であるポリエーテルエーテルケトンを高い負荷のかかる人工関節においても適用可能な強度に強化することを目的としている.平成30年度は,ポリエーテルエーテルケトンの強化のために必要な3Dプリンターの構築および試作造形を行い,得られた造形体の物性を評価することを目的としている.3Dプリンターの構築では,一般的な樹脂材料と比較して融点の高いポリエーテルエーテルケトンを溶融するために,400度程度まで加熱できるようヒートノズルを改良した.また,それに伴い,周囲の部品等に耐熱対策を行った.試作造形においては,種々の造形条件(溶融温度,積層ピッチ,走査速度,走査ピッチなど)や造形体と3Dプリンターの土台との定着方法について検討し,概ね3Dモデル通りの形状が造形できる基礎となる造形条件を見出した.その後,基礎となる造形条件を基に,造形条件の1つである造形時の走査速度がポリエーテルエーテルケトン造形体の機械的性質に及ぼす影響について調査した.造形時の走査速度を変化させることで,ポリエーテルエーテルケトン造形体の最大引張強さおよび引張変形強度に変化が認められた.このことは,造形条件を変化させることで,得られるポリエーテルエーテルケトン造形体の機械的性質を制御できることを示唆している.令和元年度は,造形条件が,ポリエーテルエーテルケトン造形体の結晶部の配向性や結晶化度に及ぼす影響について明らかにすることを目的としている.平成30年度は,ポリエーテルエーテルケトンの強化のために必要な3Dプリンターの構築および試作造形を行い,得られた造形体の物性を評価することを目的としている.3Dプリンターの構築では,一般的な樹脂材料と比較して融点の高いポリエーテルエーテルケトンを溶融するために,400度程度まで加熱できるようヒートノズルを改良した.また,それに伴い,周囲の部品等に耐熱対策を行った.試作造形においては,種々の造形条件(溶融温度,積層ピッチ,走査速度,走査ピッチなど)や造形体と3Dプリンターの土台との定着方法について検討し,概ね3Dモデル通りの形状が造形できる基礎となる造形条件を見出した.その後,基礎となる造形条件を基に,造形条件の1つである造形時の走査速度がポリエーテルエーテルケトン造形体の機械的性質に及ぼす影響について調査した.造形時の走査速度を変化させることで,ポリエーテルエーテルケトン造形体の最大引張強さおよび引張変形強度に変化が認められた.以上のことより,現在までの進捗状況は,概ね順調に進展している.令和元年度は、3Dプリンターの造形条件が、結晶部の配向度および結晶化度に及ぼす影響を明らかにする。(物品費:3Dプリンター用ポリエーテルエーテルケトン素材(前期・後期)、3Dプリンター関連用備品・消耗品(前期・後期)、試験・分析関連用備品・消耗品(前期・後期)/旅費:試験・分析施設での試験・分析(前期・後期)、国内学会発表(後期)/その他:試験・分析装置使用料(前期・後期)など)さらに、当初計画に加えて、作製したポリエーテルエーテルケトン造形体にレーザを照射することで変化する結晶部の配向度および結晶化度についても調査する。(物品費:レーザ加工機,ワークステーション,レーザ描画ソフトウエア(前期))令和2年度は、3Dプリンターを活用して得られる結晶部の配向度および結晶化度が機械的性質(強さ、しなやかさ、延性、衝撃吸収性およびそれらの異方性)に及ぼす影響を明らかにする。(物品費:3Dプリンター用ポリエーテルエーテルケトン素材(前期)、3Dプリンター関連用備品・消耗品(前期・後期)、試験・分析関連用備品・消耗品(前期・後期)/旅費:試験・分析施設での試験・分析(前期・後期)、国内学会発表(後期)/その他:試験・分析装置使用料(前期・後期)など)本研究では,生体材料の一種であるポリエーテルエーテルケトンを高い負荷のかかる人工関節においても適用可能な強度に強化することを目的としている.平成30年度は,ポリエーテルエーテルケトンの強化のために必要な3Dプリンターの構築および試作造形を行い,得られた造形体の物性を評価することを目的としている.3Dプリンターの構築では,一般的な樹脂材料と比較して融点の高いポリエーテルエーテルケトンを溶融するために,400度程度まで加熱できるようヒートノズルを改良した.また,それに伴い,周囲の部品等に耐熱対策を行った.試作造形においては,種々の造形条件(溶融温度,積層ピッチ,走査速度,走査ピッチなど)や造形体と3Dプリンターの土台との定着方法について検討し,概ね3Dモデル通りの形状が造形できる基礎となる造形条件を見出した.その後,基礎となる造形条件を基に,造形条件の1つである造形時の走査速度がポリエーテルエーテルケトン造形体の機械的性質に及ぼす影響について調査した.造形時の走査速度を変化させることで,ポリエーテルエーテルケトン造形体の最大引張強さおよび引張変形強度に変化が認められた.このことは,造形条件を変化させることで,得られるポリエーテルエーテルケトン造形体の機械的性質を制御できることを示唆している.令和元年度は,造形条件が,ポリエーテルエーテルケトン造形体の結晶部の配向性や結晶化度に及ぼす影響について明らかにすることを目的としている.平成30年度は,ポリエーテルエーテルケトンの強化のために必要な3Dプリンターの構築および試作造形を行い,得られた造形体の物性を評価することを目的としている.3Dプリンターの構築では,一般的な樹脂材料と比較して融点の高いポリエーテルエーテルケトンを溶融するために,400度程度まで加熱できるようヒートノズルを改良した.また,それに伴い,周囲の部品等に耐熱対策を行った.

試作造形においては,種々の造形条件(溶融温度,積層ピッチ,走査速度,走査ピッチなど)や造形体と3Dプリンターの土台との定着方法について検討し,概ね3Dモデル通りの形状が造形できる基礎となる造形条件を見出した.その後,基礎となる造形条件を基に,造形条件の1つである造形時の走査速度がポリエーテルエーテルケトン造形体の機械的性質に及ぼす影響について調査した.造形時の走査速度を変化させることで,ポリエーテルエーテルケトン造形体の最大引張強さおよび引張変形強度に変化が認められた.以上のことより,現在までの進捗状況は,概ね順調に進展している.令和元年度は、3Dプリンターの造形条件が、結晶部の配向度および結晶化度に及ぼす影響を明らかにする。(物品費:3Dプリンター用ポリエーテルエーテルケトン素材(前期・後期)、3Dプリンター関連用備品・消耗品(前期・後期)、試験・分析関連用備品・消耗品(前期・後期)/旅費:試験・分析施設での試験・分析(前期・後期)、国内学会発表(後期)/その他:試験・分析装置使用料(前期・後期)など)さらに、当初計画に加えて、作製したポリエーテルエーテルケトン造形体にレーザを照射することで変化する結晶部の配向度および結晶化度についても調査する。(物品費:レーザ加工機,ワークステーション,レーザ描画ソフトウエア(前期))令和2年度は、3Dプリンターを活用して得られる結晶部の配向度および結晶化度が機械的性質(強さ、しなやかさ、延性、衝撃吸収性およびそれらの異方性)に及ぼす影響を明らかにする。(物品費:3Dプリンター用ポリエーテルエーテルケトン素材(前期)、3Dプリンター関連用備品・消耗品(前期・後期)、試験・分析関連用備品・消耗品(前期・後期)/旅費:試験・分析施設での試験・分析(前期・後期)、国内学会発表(後期)/その他:試験・分析装置使用料(前期・後期)など)
非平衡系における界面張力の物理学

表面張力という概念は、身近な現象にも多く見られ、古くから研究されてきた。しかしながら、その研究対象はほとんどが時間変化しない系に対してのものであった。時間変化する系、すなわち非平衡系において表面張力をどのように理解すればよいかという問題は非常に重要である。そこで、本研究において、表面張力が時間変化し、かつ制御・観測が容易な実験系を構築した。また、その数理モデル化などを通して、非平衡系における表面張力の理解に迫り、流体方程式との組み合わせによってある程度は評価できることを示した。従来、界面現象に関しては、平衡論の枠組みで界面張力の影響が考慮されることがほとんどであった。しかしながらこれまでの実験結果などを考察すると、時間変化する濃度勾配があるとき、平衡系での界面張力の概念を超えた理論的枠組みを考える必要性が示唆された。そこで、(1)界面張力が時間変化する実験系のデザインおよび観察、(2)非平衡系における界面現象の物理モデル構築、(3)モデルに基づいた数値計算と実験結果の比較の3つの方法論を同時に進めていくことによって、非平衡系における界面現象のダイナミクスについて統合的な理解を進め、その根源に潜む物理の解明を目指すことを目的として研究を進めている。その結果、本年度は次にあげるような成果が得られた。・2種類の化学物質を拡散によりゆっくりと反応、結晶化させたとき、ダンベル状の構造やネットワーク状の構造をした結晶が観察された。このような現象に関する数理モデルを、結晶面により反応性と表面張力が異なることを考慮してモデリングし、その定性的な部分を再現することができた。・化学振動反応であるBZ反応は、その物質の濃度の振動とカップルして界面張力が振動することが知られている。この現象により、センチメートルスケールで物体を輸送することが可能になることを明らかにした。さらには、どのような流れが重要であるのかを調べるため、数理モデルを構築し、数値計算を行うことによってその流れのプロファイルと物体の動きを比較、考察した。本研究課題においては、平衡論の枠組みでは記述できない、非平衡系における界面現象のダイナミクスを実験、理論的考察、数値計算を組み合わせることによって解明することを目的とする。その中で本年度は、BZ反応や水-樟脳系における界面張力の振動、その制御に着目して研究を進めた。その結果、次に挙げるような成果が得られた。(1)BZ反応系において、油と反応溶液の界面をうまくデザインすることにより、Marangoni効果を利用してcmオーダーで物体を輸送することができた。また、化学波を発生させるタイミングを制御することにより、物体の輸送のタイミング、方向の制御などにも成功した。このような流れについて簡単な解析を行い、どの程度の流速が得られるのかを見積もった。(2)ペットボトルに水をいれ、口を細くしてさかさまにした系で、水の流れが振動的に起こる現象について解析した。この現象は自律振動としてみることができ、リミットサイクルを持つような簡単なモデル方程式を記述し、メカニズムの解明を試みた。(3)界面活性を持つ樟脳粒を水面に固定した系で振動現象が見られる。この振動現象に関して、水相の表面張力を変化させて振動数依存性を調べた。また、樟脳粒にかかる力と水面の変形の同時観測にも成功し、線形振動ではなく非線形振動であることを見出した。これらをもとに簡単な安定性解析の議論塗おこない、Marangoni対流が重要な役割を果たしていることを見出した。本研究課題においては、非平衡条件下における界面現象のダイナミクスを実験、理論的考察、数値計算を組み合わせることによって解明することを目的とする。その中で本年度は、昨年度の成果を受け、水-樟脳系における界面張力や表面の振動、相分離系においてみられるレーザー照射による界面の生成・消滅、界面活性剤水溶液中における非等方的な結晶成長メカニズムに関して研究を進めた。(1)昨年度に引き続き、界面活性を持つ樟脳粒を水面に固定した系で見られる振動現象について考察した。水相の表面張力を変える、水相の表面積を変える、などすることにより得られた実験結果をもとにして、その自律振動のメカニズムについて数理モデルの構築も視野に入れながら考察した。(2)水に2種の親水性高分子を混合すると、高分子の性質により相分離する現象が見られる。このような水性二相分離系において、集光レーザーを照射することにより、マイクロメートルスケールの液滴が消滅することが明らかになった。この原因について、レーザー照射による影響をもとにメカニズムを議論し、簡単なモデルを用いてメカニズムを議論した。(3)カチオン性界面活性剤水溶液中で塩化金酸を還元することにより、金のナノマイクロメートルスケールの棒状結晶(金ナノロッド)が生成することが知られている。この棒状結晶の形態が、界面活性剤水溶液がゲル化する条件下では劇的に変わることを見出した。また、このメカニズムについて議論を行った。
高分子機能材料の非晶性組織化構造・ダイナミックスに関する精密固体NMR解析

有機太陽電池や有機ELデバイスなど機能性有機材料の開発が盛んに行われている。しかし、これらはほとんどの場合非晶性であり、X線回折法はほとんど利用できないため、非晶状態でも精密な構造解析が可能である二次元二量子遷移NMR法(2D DOQSY)を開発した。この方法を用い、カルボニル炭素を10%エンリッチした非晶性ポリエチレンテレフタレート(PET)について、フェニレン環の重心間距離、相互の配向状態を表すオイラー角を精密に決定できること、すなわち、等方成分が約45%含まれていること、異方成分のフェニレン環の配向を表すオイラー角ψは0°を中心にした指数減衰的な分布をしているが、φは約35°を中心としてガウス分布をしていることを明らかにした。この方法をベースにして、有機ELデバイスに利用されている電荷輸送材料について、その局所構造・ダイナミックスと電荷輸送性能との関係を明らかにするため^<13>C,^<15>N,^2H NMRおよび量子化学計算による検討を行い、これらの方法が極めて有効なことを示した。また、非晶材料を含む固体材料のNMR共鳴線の帰属法を開発するためhomo-nuclear cross polarization(HNCP)検討し、比較的高速のMAS下では、^<13>C-^<13>C J-couplingが利用できることを明らかにした。液晶ディスプレイなどに使用されている偏光膜はポリビニルアルコール(PVA)とヨウ素の錯体で構成されているが、その錯体の構造を固体^<13>C NMRにより初めて明らかにし、hexagonal aggregation modelを提出した。さらに、酢酸菌の産生するバクテリアセルロースの生合成直後の基本構造体、サブエレメンタリーフィブリル(SEF)の構造を固体^<13>C NMRにより初めて明らかにし、結晶化を始めとするこの系の階層構造の形成過程に対する構造モデルを提出した。分子間相関解析法を確立するため、2DDOQSY法における^<13>C-^<13>C相関距離の影響を詳細に検討した。このため、既に合成しているフェニレン4級炭素を^<13>Cラベルしたポリエチレンテレフタレート(PET)非晶試料を用い、種々の相関時間における2DDOQSYスペクトルを測定し、^<13>C-^<13>C相関距離を考慮したシミュレーションスペクトルと比較・検討することにより、フェニレン環の相関距離、相互の配向を表すオイラー角を精度よく決定した。また、一方のみのCH_2炭素をラベルしたPET試料を合成し、同様な2DDOQSY解析を行った。もちろん、CH_2炭素の場合は、transとgaucheコンホメーションの違いの影響がスペクトルを複雑化するため、既に1DDOQSY法で開発しているtransとgaucheの選択観測法を併用して、解析精度を上げることを試みた。いくつかの有機発光デバイスの正孔および電子輸送物質について、^<13>Cおよび^<15>N選択ラベル試料を合成し、上記で確立した2DDOQSYにより、コンホメーション並びにパッキング状態を精密に解析した。また、化学シフト計算とその実験値の比較により、電子状態を明らかにした。有機発光デバイスや有機太陽電池の基礎的研究として、有機高分子薄膜の構造とダイナミックスを明らかにするため、現在、種々の方法で薄膜の作製を行い、微量試料について、930MHz超高磁場固体NMRによる精密解析法の開発を行っている。前年度に引き続き、2DDOQSY法による^<13>C-^<13>

C双極子相互作用を利用した分子内および分子間相関解析法をさらに精密な解析法に発展させるとともに、有機薄膜や有機エレクトロルミネッセンス(EL)デバイスの構造と分子運動の研究に応用した。有機ELデバイスに利用されているいくつかの正孔および電子輸送物質について、^<13>Cおよび^<15>N選択ラベルあるいは重水素化試料を合成し、上記で確立した2DDOQSYや二次元magic angle turning(MAT)法、あるいは重水素NMR法により、コンホメーション並びにパッキング状態あるいは分子運動性を精密に解析した。また、化学シフト計算とその実験値の比較により、電子状態を明らかにした。また、有機発光デバイスや有機太陽電池の基礎的研究として、有機高分子薄膜の構造とダイナミックスを明らかにするため、ポリエチレンテレフタレート(PET)薄膜について930MHz超高磁場固体NMRによる精密解析法の開発を行っている。また、1Hスピン拡散を利用することにより、薄膜表面近傍の高分子鎖のコンホメーション、分子運動性を解析するための新しい方法を開発している。この場合、PET薄膜表面にこの表面と親和性の高い液体状、あるいはゴム状物質を塗布することが重要で、これらの物質からの1Hスピン拡散を利用することにより、PET表面近傍の構造と分子運動が精密に解析できることを明らかにした。この方法は、種々の有機薄膜の表面構造の解析に応用可能と考えられ、今後の発展が期待される。
若年性遺伝子による小児脳難病の遺伝子治療法開発

小児難病に伴う精神遅滞の分子病態を解明し、治療策に結びつけるために本研究を行っている。小児期には、学習能力や可塑性・成長能力など、成人期にはない多様な生理的特徴がある。そのような能力を実現している分子メカニズムの解明を目的として、モデル動物であるマウスにおいて、各種の臓器で網羅的遺伝子発現解析を行った。その結果、小児期に高発現している遺伝子群を同定し、若年性遺伝子(juvenility-associated genes, JAGs)として報告した(Jam et al., Scientific Reports, 2018)。若年性遺伝子には、細胞増殖や核酸合成に関わるもののほか、多彩な遺伝子群が含まれることが判明した。バイオインフォマティクス解析の結果、若年性遺伝子および若年性lncRNAを同定した。さらなる機能解析の対象としたGm14230 lncRNAは、細胞の早期老化を抑止する機能を有するなど、顕著な生物学的機能を認めた。本研究においては、機能遺伝子をうまく活用して脳の機能再生につなげることを目的としており、有力な機能遺伝子を同定することができたと考えられるため、計画以上の伸展と判断する。脳の機能再生を動物モデルで検証する。疾患モデルとしての低酸素脳症モデルについても検討を重ねており、今後も継続していく。遺伝子導入による機能再生の効果を、単離神経細胞、脳スライス培養、およびモデル動物において検証する。試薬など実験試料の有効活用につとめた結果、5532円が次年度使用額として発生した。翌年度においても、資金の活用は最大限に有効に行い、研究をさらに進展させるための消耗品費にあてる。
足底知覚に基づいたダイナミック・タッチの有無が姿勢制御に与える影響

足底知覚課題を用いて,高齢者,脳血管患者に対し立位バランスの安定性に対し促進的に作用することが明らかになっている.足底知覚課題の性質として、課題を知覚するということは,外部の情報を探索し,知覚するという視点で解釈することができる。身体を様々に動かし対象に対して情報を探索・入手し,知覚する事をダイナミック・タッチと報告され,対象を知り、適切に運動を出力するうえでダイナミックタッチは重要である。足底知覚課題ではダイナミックタッチが誘発されその有無が立位バランスの安定性に寄与したことが考えられる.本研究はダイナミック・タッチの有無が立位バランスの促進に寄与するのかを明らかにすることを目的とする.足底知覚課題を用いて,高齢者,脳血管患者に対し立位バランスの安定性に対し促進的に作用することが明らかになっている.足底知覚課題の性質として、課題を知覚するということは,外部の情報を探索し,知覚するという視点で解釈することができる。足底知覚課題ではダイナミックタッチが誘発されその有無が立位バランスの安定性に寄与したことが考えられる.本研究はダイナミック・タッチの有無が立位バランスの促進に寄与するのかを明らかにすることを目的とする.
神経成長因子による神経突起伸張誘導の分子機構とMAPキナーゼ

1、PC12D細胞では、NGFのみならず、bFGF,EGFなどの刺激によっても神経突起が誘導された。これと相関するかたちでMAPキナーゼ活性が誘導される事実より、このキナーゼ活性の神経細胞分化への関与の可能性を考える筆者のこれまでの主張を強化した。またその内容を論文として発表した。2、MAPキナーゼのイオン交換カラムクロマトグラフィーを行い、NGF,FGF,EGFやcAMPなどの刺激によってPC12D細胞内のどの様なキナーゼが活性化されるのかについて調べ、更に突起誘導との関連性を調べた。その結果、NGF,FGF,EGFにより同一のMAPキナーゼが活性化される可能性を生化学的に示唆した。その内容を論文として発表した。3、NGF,cAMP,bFGF,EGFなどをPC12D細胞に数分処理すると、細胞周囲にアクチン染色に陽性のラッフルが形成される現象について観察し、(1)ラッフル形成は、神経突起誘導の初期反応と見られる事、(2)更にそれが蛋白質燐酸化を介して起こる事実を認め、論文として発表した。4、スタウロスポリンは、410nMで、培養幼鶏脊椎後根神経節およびPC12D細胞に対してNGFを添加したと同様に、神経突起の誘導が見られた。神経突起は、構造的に全く差が見られなかった。しかし、スタウロスポリンには、NGFの作用として知られる神経生存維持効果はなかった(論文として発表)。以上、PC12D細胞を用いて、MAPキナーゼ活性化と神経突起誘導の関連性を示し、更に神経突起誘導の初期反応と位置づけられるラッフルの形成も蛋白質燐酸化を介して起こる事を示唆出来た。しかし、キナーゼ阻害剤スタウロスポリンにNGFと類似の突起伸張作用がある事の指摘は、大変興味ある発見ではあるが、前半に示した概念とは、矛盾し、総合して解釈出来ない今後の課題である。I、PC12D細胞のNGF,dbcAMPなどの刺激による神経突起伸張は、新たな遺伝子発現を必要としない。細胞骨格系の再構成であることが示された。II、bFGFで明確な突起伸張作用が確認され、またEGFにも多少ながら突起伸張誘導が認められた。bFGF及びEGFの効果は、NGFと共存すると確認出来ない。つまり、bFGF,EGFによる突起伸張は、恐らくNGFと同じ機構による可能性が示された。III、突起伸張が、MAP燐酸化活性の上昇に相関性の在る点を指摘してきた。bFGF,EGFによってもやはり、MAP燐酸化活性の上昇が確忍され、NGF,bFGF,EGFによるMAP燐酸化活性の上昇と突起誘導について、濃度依存性を調べた結果、相関性が認められた。IV、NGFのブロッカ-、Kー252aは、bFGF,EGFによる突起形成とMAP燐酸化活性を逆に促進した。理屈は不明だが、突起形成とMAP燐酸化活性の関連性を示唆する。V、MAP燐酸化活性上昇についても、bFGF,EGFによる効果はNGFと相加性がなく、同じ活性化機構が推察された。またMAP燐酸化活性をDEAEセファロ-スカラムで分画することによって、NGF,bFGF,EGFで活性化されるキナ-ゼが同じ酸素であることが示された。VI、NGFで活性化されるMAP燐酸化酸素で、Mnイオン依存性の酸素が別に存在する事が確認された。

VII、NGF処理細胞では、数分後アクチンが細胞周辺に濃縮し成長円錐が出来る事実を認めた、しかもこれは蛋白燐酸化を介する事を明らかにした、突起形成の初期反応として今後追究して行きたい。1、PC12D細胞では、NGFのみならず、bFGF、EGFなどの刺激によっても神経突起が誘導された。これと相関するかたちでMAPキナーゼ活性が誘導される事実より、このキナーゼ活性の神経細胞分化への関与の可能性を考える筆者のこれまでの主張を強化した。またその内容を論文として発表した。2、MAPキナーゼのイオン交換カラムクロマトグラフィーを行い、NGF,FGF,EGFやcAMPなどの刺激によってPC12D細胞内のどの様なキナーゼが活性化されるのかについて調べ、更に突起誘導との関連性を調べた。その結果、NGF,FGF,EGFにより同一のMAPキナーゼが活性化される可能性を生化学的に示唆した。その内容を論文として発表した。3、HPLCによる酵素の精製については、他研究室の研究の進展状況も考慮し、断念した。MAPキナーゼを精製後、抗体を作成するとの計画も、従って中止となったが、ごく最近、MAPキナーゼ抗体の市販品が現われたので、購入し、PC12細胞の神経細胞分化におけるこの酵素の挙動について検討中である。NGF,cAMP,bFGF,EGFなどをPC12D細胞に数分処理すると、細胞周囲にアクチン染色に陽性のラッフルが形成される現象について観察し、(1)ラッフル形成は、神経突起誘導の初期反応と見られる事、(2)更にそれが蛋白質燐酸化を介して起こる事実を認め、論文として発表した。PC12細胞の亜株PC12D細胞は、神経成長因子(NGF)に素早く反応し、神経突起が誘導される。この過程には、新たなRNA合成を必要とせず、既存の細胞骨格などの再構成が考えられる。この細胞をNGF処理すると、in vitroで微小管蛋白質(MAP)を燐酸化する酵素(MAPキナーゼ)の活性が数分以内に増加する。bFGF,EGF処理によっても、同じ酵素が活性化される。cAMP上昇薬によって活性化されるA-キナーゼもMAPを燐酸化する。キナーゼ阻害剤K-252aは。NGF依存性キナーゼの活性化と突起誘導を特異的に阻害したが、cAMP依存性の効果には影響しなかった。A-キナーゼ阻害剤H-89は、cAMPによる神経突起誘導を阻害するが、NGFの効果には影響しなかった。MAP燐酸化活性の上昇と細胞からの神経突起誘導の高い相関性が示された。突起伸展の形態学的初期変化は、細胞をアクチン染色すると、NGF処理後数分で細胞周囲にラッフルが形成され、10分後には成長円錐の生じる連続的変化が観察出来、神経突起誘導の初期変化は、キナーゼ活性化とほぼ同時に起こる事が判った。チュブリン、アクチンの脱重合剤であるコルヒチン、サイトカラシン処理によって、それぞれの骨格を脱重合させても、不完全ながら突起の誘導が可能であった。この事実は突起誘導に特定の細胞骨格が必須では無い事が示唆され、細胞膜と外部環境との接着性変化がより先導的役割を果たす可能性が推察される。キナーゼを調べる為に用いた強力な阻害剤スタウロスポリンに、NGF同様の神経突起誘導脳を認めた。PC12D細胞のみならず培養鶏胚神経節細胞にもNGFと区別出来ない作用を認めた。但し、スタウロスポリンには、神経細胞の生存維持作用は全く認められなかった。
眼窩部MRスペクトロスコピーを用いた甲状腺眼症における眼窩脂肪の組成解析

研究目的:甲状腺眼症における眼窩後組織に存在するコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(以下CSP)の変化をみるために、高解像度のミリレベルプロトンMRスペクトロスコピー(以下MRS)を用いて眼窩脂肪内の代謝解析を試み、分子レベルにおける甲状腺眼症の活動性の評価を研究テーマとした。2.甲状腺眼症23例36眼(男性6例.女性17例)、年令1566歳(平均43.21±13.72歳)、健常者16名28眼(男性4名.女性12名)年令2456歳(平均38.25±10.60歳)にインフォームドコンセントを得て、MRSを測定したところ、甲状腺眼症群におけるCS:水のピーク比は0.2874±0.1357であり、正常群の0.1781±0.948に比べ有意に大きい結果が得られた。3.甲状腺眼症5例についてMRSで得られたCS:水のピーク比を縦軸に、また実際に手術で得た脂肪をELISA法にて解析して得たCSPの吸光度を横軸に示したところr=0.69で両者は相関している結果を得た。これらの結果から、MRSによって眼窩後組織中のCSPの同定が可能である。また、今回の対象となった甲状腺眼症36眼をアメリカ甲状腺学会の甲状腺眼症の重症度分類にて内訳し、MRSで得たCS:水のピーク比との関係を解析したところ、ピーク比の増加は重症度(特に眼球運動障害)と関連性があるという結果を得た。結論:MRSは甲状腺眼症の活動性評価に有用な新しい検査法である。研究計画:1.実験的に1%コンドロイチン硫酸のプロトンMRスペクトロスコピー(^1H-MRS)を用いたin vitroにおける解析を行った。2.甲状腺眼症23例:36眼(男性6例、女性17例)、年齢:1566歳(平均43.21±13.72歳)、健常者16例:28眼(男性4名、女性12名)、年齢=2456歳(平均38.25±10.60歳)でinformed consentを得て眼窩脂肪の,^1H-MRSによる解析を行った。3.甲状腺眼症5例において、眼窩減圧術の際に得られた眼窩脂肪に含まれる,コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSP)をELISA法によって吸光度を測り実際の変化を確認した。結果及び解析:1.コンドロイチン硫酸のピークは5.24ppmで得られ、それはin vitroにおける正常者及び甲状腺眼症患者の^1H-MRSでも認められた。2.コンドロイチン硫酸と水の^1H-MRSにおけるピークの比を取りその分布をみると、コントロールグループでは平均比は0.178であるのに対し、甲状腺眼症群では0.287と明らかに高い結果が得られた。p<0.013.甲状腺眼症5例について、^1H-MRSで得られたコンドロイチン硫酸と水のピーク比を縦軸に、また実際に手術で得た脂肪をELISA法によって解析して得たCSPの吸光度を横軸に示すとr=0.69で両者は相関している結果が得られた。従って、甲状腺眼症の中で、このピークが高い症例は実際にCSPが眼窩脂肪中に多く含まれていることがELISA法によって証明された。これらの解析結果から、^1H-MRSによって、眼窩後組織中のCSPの同定が可能であり、^1H-MRSは甲状腺眼症の活動性をみる有用な検査法であることが証明された。今後の研究の展開として、更に症例数を増やし^1H-MRSで得られるCSPと臨床症状との関連性について検討して行く予定である。
歯周病における根面処理と再生に関する総合的研究

歯周治療後に結合組織性付着を獲得させる根面処理法の開発と臨床応用のため、歯根膜の細胞動態と根面処理との関連性の解明を目的として、以下の結果を得た。(1)歯根膜における細胞増殖と分化の機序(高田):連続酸素消化法によって層別に分画されたPDL細胞群間には増殖能や石灰化能に違いがあり、増殖能の高い細胞はPDL中央側に、石灰化能の高い細胞は歯根面近くに存在することが明らかとなった。歯根面に接して高い増殖能と石灰化能を兼ね備えた細胞群が存在し、結合組織性新付着形成に重要な役割を果していることが示唆された。(2)歯周組織の再生過程における神経の関与(前田):歯根膜ルフィニ神経終末に高親和性神経栄養因子受容体の一つであるTrkBが発現していることを免疫組織科学により明らかにするとともに、歯根膜ルフィニ神経終末に付随する終末シュワン細胞の配列が認められたことから、発生過程における終末シュワン細胞の重要性が示唆された。(3)歯根膜の再生と恒常性維持の機構(下野):歯根膜の幅を維持しその恒常性に関与すると考えられるマラッセ上皮遺残では、CK19が強く発現するとともに、CX43で構成されたギャップ結合がみられ、歯根膜の維持におけるマラッセ上皮遺残の重要性が示唆された。(4)上皮性付着と結合組織性付着との相関(橋本):ラット付着上皮および長い付着上皮における付着機構と接着蛋白の局在を免疫組織細胞科学的に検討した結果、付着上皮の内側基底板には、Integrinと共にリガンドであるLaminin-5が局在することが示唆され、上皮性付着に重要であると考えられた。(5)Growth factorによる歯周組織の再生(菅谷):脱灰した象牙質面にrhPDGF-BBとrhBMP-2を応用し、この上で歯根膜細胞を培養、付着した歯根膜細胞のALP活性と歯根膜細胞数を計測した結果、rhPDGF-BBを使用した群では細胞増殖が亢進するとともに、rhBMP-2を用いた群ではALP活性が高まった。(6)エナメル基質蛋白による結合組織付着の獲得(山田):実験的歯周炎における歯根面露出後のエナメル基質タンパクの根面塗布の影響を検討し、EMD群における根面の酸処理が象牙質とセメント質の付着を強固にすることが示された。(7)再付着における微小循環の関与(関口):フラップ手術における露出した象牙質面にクエン酸を応用し、結合組織性付着に及ぼす影響について超微細構造レベルで検索し、クエン酸で根面処理することにより、新生セメント質を伴う結合組織性付着が促進されることが示唆された。

本研究では、結合組織性付着獲得による歯周治療後の理想的な治癒を得る事を目的として、歯根膜の細胞動態と根面処理との関連を解明し、結合組織性付着を獲得するための根面処理法の開発と臨床応用のために以下の研究を行っている。(1)歯根膜における細胞増殖と分化の機序(高田):ラット臼歯歯根膜の歯槽骨側から根面にわたる細胞群を分離培養し、細胞群間の分化増殖能を検討した。歯根表面に最も近くに存在する細胞群が他群よりも有意に高いALPase活性や石灰化物形成能示し、細胞増殖率は歯根表面に近い細胞群ほど低かった。(2)歯周組織の再生過程における神経の関与(前田):ラット実験的歯周炎群でのPGP9.5および神経ペプチドの局在を検討するとともに、歯根膜の再生に関与する神経系の栄養因子ならびに受容体をRT-PCR法にて検索し、BDNF、NT-3のmRNAおよびこれらの特異的受容体であるTrkBのmRNAが発現していることが明らかとなった。(3)歯根膜の再生と恒常性維持の機構(下野):培養歯根膜細胞およびマラッセ上皮遺残における、接着性蛋白、TGF-β、FGFの発現を検討している。(4)上皮性付着と結合組織性付着との相関(橋本):ラット実験的歯周炎群での内側基底板と半接着斑の構成蛋白およびIntegrin群を中心とした接着蛋白の局在を検討しており内側基底板ではIntegrinとCadherinが局在している可能性が示唆された。(5)Growthfactorによる歯周組織の再生(本郷):ビーグル犬実験的歯周炎群での歯根面露出後の種々のGrowth Factorの根面塗布の影響を検討している、(6)エナメル基質蛋白による結合組織付着の獲得(山田):ビーグル犬実験的歯周炎群での歯根面露出後のエナメル基質タンパクの根面塗布の影響を検討し、EMD群とGTR群では、形成されるセメント質の性状が異なることが示された。(7)再付着における微小循環の関与(関口):ラット実験的歯周炎群でのルートプレーニング後の血管鋳型標本による再付着と微小循環との関連、について現在検討を行っている。歯周治療後に結合組織性付着を獲得させる根面処理法の開発と臨床応用のため、歯根膜の細胞動態と根面処理との関連性の解明を目的として、以下の結果を得た。(1)歯根膜における細胞増殖と分化の機序(高田):連続酵素消化法によって層別に分画されたPDL細胞群間には増殖能や石灰化能に違いがあり、増殖能の高い細胞はPDL中央側に、石灰化能の高い細胞は歯根面近くに存在することが明らかとなった。歯根面に接して高い増殖能と石灰化能を兼ね備えた細胞群が存在し、結合組織性新付着形成に重要な役割を果たしていることが示唆された。(2)歯周組織再生過程における神経の関与(前田):歯根膜ルフィニ神経終末に高親和性神経栄養因子受容体の一つであるTrkBが発現していることを免疫組織化学により明らかにするとともに、歯根膜ルフィニ神経終末に付随する終末シュワン細胞の発生過程で、軸索終末の成熟前に終末シュワン細胞の配列が認められたことから、発生過程における終末シュワン細胞の重要性が示唆された。(3)歯根膜の再生と恒常性維持の機構(下野):歯根膜の幅を維持しその恒常性に関与すると考えられるマラッセ上皮遺残では、CK19が強く発現するとともに、CX43で構成されたギャップ結合がみられ、歯根膜の維持におけるマラッセ上皮遺残の重要性が示唆された。(4)上皮性付着と結合組織性付着との相関(橋本):ラット付着上皮および長い付着上皮における付着機構と接着蛋白の局在を免疫組織細胞化学的に検討した結果、付着上皮の内側基底板には、Integrinと共にリガンドであるIaminin-5が局在することが示唆され、上皮性付着に重要であると考えられた。
地域創生・都市再生とスタジアム/アリーナ

国内外での一般的評価の高いスタジアムと評価の低いスタジアム両者の建設政策決定過程とデザイン決定過程、及びその場所性を人文社会科学的(文化論的)に分析をし、地域創生・都市再活性化の視点から望ましいスタジアムの建設/設計様式及び場所性について提案をする。
内在性抗菌因子PGRPに着目した育種と飼養の抗病性シナジー強化による健全畜産戦略

薬剤耐性菌感染症の世界的拡大を受け、耐性菌の出現と拡散を防ぐ人獣横断的な取組みが課題となっている。養豚では、下痢等常在疾病対策を目的とした抗菌剤の多用が懸案であり、抗菌剤に依存しない常在疾病対策法による家畜健全育成技術の向上が喫緊の課題である。本研究では、内在性抗菌因子(ペプチドグリカン認識タンパク質;PGRP)に着目し、抗病性分子遺伝育種と抗病性イムノバイオティクス飼養の融合によるシナジー強化から抗菌剤に依存しない新たな家畜の抗病性機能強化基盤を構築する。家畜が持つ細菌認識タンパク質の遺伝子多型と細菌感染抵抗性との関連を明らかにし、この遺伝子を活性化し腸管自然免疫を増強する共生細菌を同定する。これらによる免疫増強機構を解明し、感染耐性遺伝子多型に基づく選抜と共生細菌含有飼養を併用してそれらの相乗効果により家畜の感染症耐性の強化に繋げる研究である。昆虫の自然免疫において重要な役割を持つ細菌認識タンパク質PGRPの哺乳類相同遺伝子に豚品種間で多型があることに着目し、さらに遺伝子の発現を増強するプロバイオティクス(宿主に恩恵をもたらす共生細菌)によるこの遺伝子の活性化を目指すという研究内容は独創的であり、哺乳動物腸管自然免疫の機構研究における新たな展開が期待できる。
粘液細菌の生産するポリケチドーペプチド複合型抗生物質の生合成遺伝子の解析

粘液細菌Cystobacterfuscusから我々が発見したcystothiazole Aは、抗真菌性と癌細胞に対する細胞毒性を示し、ミトコンドリア呼吸阻害により活性を示す。Cystothiazole Aや新規類縁体の代謝工学的および遺伝子工学的生産を目指して、生合成経路および生合成遺伝子の解析を行った。まず安定同位体標識化合物の取込み実験により生合成前駆体を調べた結果、イソ酪酸を開始点にしてジペプチド(Cys-Cys)、ポリケチド(酢酸-プロピオン酸-酢酸)の順で生合成されることを明らかにした。ジペプチド部位は環化して、特徴的なビチアゾール環を形成する。このことより、本物質がポリケチドとペプチドのハイブリッド型代謝物であることが確認された。一方、類縁体cystothiazole B-Fはcystothiazole Aの酸化的代謝により生産されることを、cystothiazoIe Aの投与実験により解明した。推定生合成経路に基づき、ポリケチド生合成酵素PKSの高度保存領域の一つであるβ-ケト合成酵素(KS)領域を標的としたPCRプライマーを設計し、C.fuscusのゲノムDNAを鋳型としたPCRによってcystothiazole A生合成に関与するPKS遺伝子断片の増幅を試みた。その結果,約700bpのPCR産物が得られ、その塩基配列は遺伝子配列既知の類縁化合物のKSと約90%の相同性があった。次いでこの断片を起点に遺伝子歩行実験を繰り返し、現在までにcystothiazole A生合成遺伝子の約8割(30kbp)の制限酵素地図を明らかにすることができた。現在、残る6kbp部分の制限酵素地図の解明、全遺伝子のシークエンス解析を行い、相同検索により機能を解析中である。また、適当なDNA断片を導入したベクターをC.fuscus菌に導入し、cystothiazole A生合成への関与を検討している。粘液細菌Cystobacterfuscusから我々が発見したcystothiazoleは、抗真菌性と癌細胞に対する細胞毒性を示す。Cystothiazoleやその類縁体の遺伝子工学的生産を目指して生合成遺伝子の解析を行った。まず粘液細菌C.fuscusのゲノムDNAを抽出,精製し,これを鋳型としたPCRによって,cystothiazoleの生合成に関与するポリケチド生合成酵素(PKS)遺伝子の一部を増幅することを試みた。PKSの重要な領域であり,異種間においてもDNA塩基配列が良く保存されている,β-ケト合成酵素(KS)領域とアシル基転移酵素(AT)領域を標的としたPCRプライマーを計4つ構築した。他の微生物由来のPKS遺伝子を考慮すると,PCR産物は約1.3kb程度であると予想されたが,nested PCRも含めて,考えられる全ての組み合わせで,反応温度,プライマーや鋳型DNAの濃度等種々の検討をしながらPCRを行った結果,プライマーの組み合わせのうちの1つにおいて約1.1kbのPCR産物が得られた。これをクローニングし,シークエンス解析した結果,全くPKSとは無関係のホモロジーを持つDNA断片であった。現在は標的をKS領域に絞って,さまざまなPCRプライマーをデザインし,PCRの条件検討を行っている。またPCR産物をプローブに用いてのスクリーニングを予定しているが,その際のライブラリーには,より大きいサイズのゲノムDNAを導入できるベクター(BACなど)を用いる予定である。そのために現在,数種類のゲノムDNAライブラリーを構築するために,C.fuscusの大量培養とDNAの抽出を併行して行っている。Cystothiazole Aやその新規類縁体の遺伝子工学的生産を目指して生合成遺伝子の解析を行った。