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FUS/TLSのメチル化による核-細胞質シャトリング制御と凝集体形成機序の解明

FUS/TLSは通常は核内に局在するが、FUSのC端の核移行シグナル(NLS)に遺伝子変異を有するFUS/TLS変異体は細胞質に偏倚し凝集体を形成する。当該研究では、「メチル化によるFUS/TLSの核-細胞質シャトリングの制御機構」と、「FUS/TLSによる凝集体の形成機序と意義」の解明の2点を中心に解析を行った。その結果、アルギニンメチル化がFUS/TLSと核内輸送体との結合を制御することや、凝集体が他のRNA結合タンパク質を係留(sequester)することを明らかにした。現在までに、(1)「メチル化によるFUS/TLSの核-細胞質シャトリングの制御機構」に関しては、1FUS/TLSの核-細胞質シャトリングの制御機構にC端付近のRGG部位のアルギニンメチル化が関与すること、2メチル化阻害剤によりFUS/TLSのC端NLS(核移行シグナル)変異体の細胞質での凝集体形成が抑制されること、3メチル化阻害剤はFUS/TLSの核内凝集体を形成を惹起する結果を得た(論文投稿中)。神経生物学今後は、(1)「メチル化によるFUS/TLSの核-細胞質シャトリングの制御機構」に関しては、メチル化阻害剤によるFUS/TLSの核内凝集体の意義を解析したい。2014年に家族性ALS患者の線維芽細胞のFUS/TLSの核内凝集体を認めるという報告(Mol Biol Cell. 25(17):2571-8)があり、FUS/TLSの核内凝集体が発症メカニズムの一因の可能性が示唆される。特に、FUS/TLSのRibosomal biogenesisに及ぼす影響を中心に解析する。(2)「FUS/TLSによる凝集体の形成機序と意義の解明」に関しては、FUS/TLS凝集体によるRNA顆粒の形成障害が、細胞機能にどういう意義を持つかを解析する予定である。これまでに確立したマウス運動神経細胞由来のNSC34細胞によるテトラサイクリン誘導性FUS/TLS発現株を利用し、FUS/TLSの細胞質凝集体が、神経特異的遺伝子のmRNAのスプライシングやRNA品質管理に及ぼす影響を解析する予定である。当該年度は、予定通りFUS/TLSとTransportinの結合部位の同定、各種メチル化阻害薬のFUS/TLS変異体への影響、ストレス顆粒形成を惹起するストレス同定を行い、また、テトラサイクリン誘導性のFUS/TLS変異体発現系の細胞株確立のためのプラスミド構築が終了した。課題としては、Transportinの結合部位の同定は予定通り進んだが、更に詳細な部位の同定が必要である。また、汎メチル化阻害薬の効果は解析が終了したが、汎メチル化阻害薬以外のPRMT1特異的なメチル化阻害薬の解析が必要である。当該年度に予定した物品購入後に、当該助成金が残高として残ったため。まず、昨年度に構築したテトラサイクリン誘導性FUS/TLS変異体発現系のプラスミドを用いSH-SY5Y,NSC-34細胞株を確立する。その細胞株を用いて以下の研究計画を予定している。(1)メチル化によるFUS/TLSの核-細胞質シャトリングの制御機構の解明当該年度は、PRMT1特異的阻害薬の解析、メチル化が他のタンパク修飾(例:リン酸化)と相互作用する可能性や、脱メチル化酵素の存在を検証する。具体的な解析方法は、脱メチル化酵素の候補を挙げ、in vitro methylation assayでメチル化修飾の変化を解析する。また、タンパク修飾の各種阻害剤を投与し形態学的に細胞内局在の変化を解析する。次年度に物品費として使用予定。
骨形成因子を添加した再構成Matrix人工骨の開発とその臨床応用

1.[骨形成因子]ウシ脱灰骨から骨形成因子(BMP)の最終精製物で同定されたアミノ酸配列すべてWazneyらの報告によるBMPー3に含まれるものであった。2.[骨形成因子を添加した再構成Matrix人工骨]Tricalcium phosphate(TCP)Hydroxyapatite(HA)の骨の主成分と骨形成因子を再構成することにより、材料表面に骨を直接分化誘導能させ得ることが認められ、TCPとHAでは誘導される骨量に差はなかった。しかし添加した骨形成因子量の割に誘導骨量が少ないことから、それが生体内で早期に散逸する可能性が示唆され、骨形成因子の徐放システムの開発が望まれた。そこで徐放システムとして検討したPlaster of Paris(PLP:セッコウ)では、粗ーBMP単独での確実な骨誘導に必要なBMP量は3mgであるのに対し、BMP・PLP複合体(1:5)ではその量を1mgまで減らすことができ、精製を進め、比活性を上げたBMPではBMP・セッコウ複合体(1:10)の条件でその量をさらに0.25mgまで減少し得た。BMP・PLP複合材の骨組織中での有用性はラットおよびサルの実験で補填部に活発な骨形成が観察され、骨領域においてもPLPは徐放システムの一つとして有用なことが認められた。3.[臨床応用]ヒト歯牙の基質中の骨形成因子を応用し、自己歯牙脱灰基質を作製した。それを主疾患の加療手術時の骨欠損部に填入し骨形成性の促進を検討した。結果は歯牙脱灰基質によると思われる炎症性反応、異物反応等はどの症例においても認められず治癒した。しかし最も期待した骨形成因子による骨形成はレントゲン上、確認できなかった。これは検知方法の問題もあると思われるが、含有骨形成因子の絶対量の不足あるいは母床骨の標的細胞の問題が大きいと考えられ、今後重要な課題である。研究経過:1、Hydroxyapatite等のリン酸カルシウムの骨の主成分と骨形成因子を再構成することにより、材料表面に未分化間葉系組織から骨を分化誘導能させ得ることが認められた。2、ウシ骨より精製した骨形成因子はugオ-ダ以下の量で異所性に骨を形成する。この段階まで精製が進むとTGF-βと分離することができ、軟骨を誘導するTGF-βと骨を誘導する骨形成因子とは別の成長因子であることがわかってくると同時に、本来の骨誘導には両者が微妙に関連している可能性が推察された。3、セッコウは微量に精製された骨形成因子においても、その散逸を防ぎ骨誘導の適切な場を提供することが認められた。しかしセッコウ+骨形成因子に、さらに人工材料を加えた実験系では必ずしも骨形成は活発ではなかった。反省点:1、ウシ骨より精製した骨形成因子はugオ-ダ以下の量で異所性に骨を形成し、軟骨を誘導するTGF-βと骨を誘導する骨形成因子とは別の成長因子であることがわかり、本来の骨誘導には両者が微妙に関連している可能性が推察されたことから、今後の臨床応用のためには、単に一種類の骨形成因子を補填材料に混合するだけでなく、複数の成長因子の放出、その量、時期、速度などを複雑にコントロ-ルする必要があると思われ、早急に上記を満たす徐放システムの開発が望まれた。

2、骨形成因子の臨床応用に関しては、人のそれの精製が検体の不足から遅れており、まずはじめに最も安全な自己歯牙脱灰基質の臨床的有用性から検討することとした。1.[骨形成因子]ウシ脱灰骨から骨形成因子(BMP)の最終精製物で同定されたアミノ酸配列はすべてWazneyらの報告によるBMPー3に含まれるものであった。2.[骨形成因子を添加した再構成Matrix人工骨]Tricalcium phosphate(TCP) Hydroxyapatite(HA)の骨の主成分と骨形成因子を再構成することにより、材料表面に骨を直接分化誘導能させ得ることが認められ、TCPとHAでは誘導される骨量に差はなかった。しかし添加した骨形成因子量の割に誘導骨量が少ないことから、それが生体内で早期に散逸する可能性が示唆され、骨形成因子の徐放システムの開発が望まれた。そこで徐放システムとして検討したPlaster of Paris(PLP:セッコウ)では、粗ーBMP単独での確実な骨誘導に必要なBMP量は3mgであるのに対し、BMP・PLP複合体(1:5)ではその量を1mgまで減らすことができ、精製を進め、比活性を上げたBMPではBMP・セッコウ複合体(1:10)の条件でその量をさらに0.25mgまで減少し得た。BMP・PLP複合材の骨組織中での有用性はラットおよびサルの実験で補填部に活発な骨形成が観察され、骨領域においてもPLPは徐放システムの一つとして有用なことが認められた。3.[臨床応用]ヒト歯牙の基質中の骨形成因子を応用し、自己歯牙脱灰基質を作製した。それを主疾患の加療手術時の骨欠損部に填入し骨形成性の促進を検討した。結果は歯牙脱灰基質によると思われる炎症性反応、異物反応等はどの症例においても認められず治癒した。しかし最も期待した骨形成因子による骨形成はレントゲン上、確認できなかった。これは検知方法の問題もあると思われるが、含有骨形成因子の絶対量の不足あるいは母床骨の標的細胞の問題が大きいと考えられ、今後重要な課題である。
若手看護師がバーンアウトすることなく就業継続意思を強めるための新プロセスモデル

海外で重視されているJob Embeddedness(JE:根付き)の概念を取り入れ、日本の看護師の就業継続意思への説明変数になりうるかを検討すること、さらに職場環境、バーンアウト、JE、メンター、認知再解釈思考と就業継続意思との因果関係を包括的に描いたプロセスモデルの構築をめざすことであった。解析の結果、当初の予測は支持されず、日本においてJEを単独の説明変数と結論づけるのは時期尚早と考えられた。そのため、次にメンターは就業継続意思に影響を及ぼすかを確認した。その結果、メンターは看護師の職場においての共同体、自身の職務効力感と就業継続意思に直接的な影響をおよぼすことが示唆された。研究の目的:若手看護師(新人ー経験5年目)がバーンアウトすることなく、職場に根付き、就業継続意思を強めるための包括的なプロセスモデルを開発することである。就業継続意思を目的変数とするモデル構築をおこなうが、これまで投入されていた職務満足度あるいは組織コミットメントなどの従来の説明変数ではなく、今最も説明力があるとされている新たな概念Job Embeddedness (根付き)を取り入れたモデルを開発することである。研究実績の概要:・文献レビュー等を通して、本研究において妥当なJE尺度を選定した。選定した尺度の翻訳作業を行った。・職場環境測定尺度を本研究において妥当な尺度とするために、構成概念、質問項目内容、項目順列、回答方法、等の再検討を行った。・職場環境測定尺度の改訂版の質問紙を作成した。・仮説モデルの理論的検討:予備調査に盛り込む調査項目・内容、測定尺度等を検討した。・仮説モデルの実際的検討:予備調査に用いる測定尺度の最終決定をした。・予備調査に係る準備・作業を早め、予備調査を実施した。研究成果の発表:2014年6月日本精神保健看護学会第24回学術集会、9月20th International Network for Psychiatric Nursing Research、11月第34回日本看護科学学会学術集会において、本研究の研究成果の一部を発表した。さらに、2014年9月第24回日本産業衛生学会産業医・産業看護全国協議会が開催したシンポジウムに招待され、本研究の研究成果の一部を活用して発表した。11月にはベトナムHaiphong医科薬科大学が開催した看護シンポジウムに招待され、同様のことを行った。2015年2月日本産業衛生学会・第56回産業精神衛生研究会に招待され、本研究の研究成果の一部を活用して特別講演を行った。研究実績の概要:・予備調査において収集したデータから、JEモデルと職務満足度及び組織コミットメントを用いた既存モデルとを比較検討した。その結果、日本の看護師を対象とした場合、就業継続意思に対してJEは説明力を十分有するとは言えない結果を得た。・そのため、研究デザインを見直し、JEと就業継続意思との因果関係等を描いている仮設モデルを縦断面から検討することとした。・倫理審査の承認を得た後、ネット調査会社を活用して、ベースラインのデータ収集を終えた。さらに、数か所の病院に調査協力を依頼し、データ収集中である。平成28年度に実施予定であった本調査を平成27年度に実施することができたためである。ただし、研究デザインの変更を行ったため、平成28年度においても追跡調査を行う予定である。研究の目的:若手看護師がバーンアウトすることなく、職場に根付き、就業継続意思を強めるための包括的なプロセスモデルを開発することである。就業継続意思を目的変数とするモデル構築をおこなうが、これまで投入されていた職務満足度あるいは組織コミットメントなどの従来の説明変数ではなく、海外においては最も説明力があるとされ始めている新たな概念Job Embeddedness (根付き)を取り入れたモデルを開発することである。研究実績の概要:平成28年度の研究実施計画に基づき、ほぼ計画どおりの実施を行った。ネット調査会社を活用して、ベースラインのデータ収集に参加した看護師500名を1年間追跡調査した。データ収集を終え(追跡数285名)、データ照合を確認し、解析のための準備を整えたところである。次年度に、本格的な解析に取り組む計画となっている。病院対象の追跡調査の実施がやや遅れているが、Web調査による追跡調査の実施については計画どおりに遂行できている。研究実績の概要:平成29年度の研究実施計画に基づき、計画どおりの実施を行った。Job Embeddednessが日本の看護師を対象とした場合、就業継続意思を説明する独立した変数と言い切れない事が解析を通して判明した。そのため、さまざまな視点から解析を行い、下記の研究成果を出していった。

海外で重視されているJob Embeddedness(JE:根付き)の概念を取り入れ、日本の看護師の就業継続意思への説明変数になりうるかを検討すること、さらに職場環境、バーンアウト、JE、メンター、認知再解釈思考と就業継続意思との因果関係を包括的に描いたプロセスモデルの構築をめざすことであった。解析の結果、当初の予測は支持されず、日本においてJEを単独の説明変数と結論づけるのは時期尚早と考えられた。そのため、次にメンターは就業継続意思に影響を及ぼすかを確認した。その結果、メンターは看護師の職場においての共同体、自身の職務効力感と就業継続意思に直接的な影響をおよぼすことが示唆された。平成27年度に実施予定であった予備調査を平成26年度に実施することができたためである。予備調査において収集したデータから、JEモデルと職務満足度及び組織コミットメントを用いた既存モデルとを比較検討した。その結果、日本の看護師を対象とした場合、就業継続意思に対してJEは説明力を十分有するとは言えない結果を得た。そのため、研究デザインを見直し、JEと就業継続意思との因果関係等を描いている仮設モデルを縦断面から検討することとした。平成27年度において、ベースラインのデータ収集を一部終えることができた。さらに、数か所の病院に調査協力を依頼し、データ収集中である。1年後の追跡調査を実施する予定であるが、その見込みはついている。研究デザインの変更により、研究計画も一部修正されることになったが、当初計画より前倒しで研究を進めていたため、これによる研究実施の遅れは生じない。今後の研究の推進方策として、研究代表者と分担者間で役割分担をより明確にし、各自の役割を遂行するようにしていく。そのため、会議(メール会議含む)開催時において、研究代表者は各自の役割を明確に示し、同意を得ることとする。また、データ収集の方法としてWeb上調査と共に、縦断的な調査に協力を申し出ている病院を対象にしたデータ収集も併せて行うこととする。次年度が本研究の最終年度になるが、研究成果のまとめの年としている。そのため、研究遂行に関して余裕があると予測できるため、遅れの回復は十分可能であり、支障をきたさない。今後の研究の推進方策として、研究代表者が病院調査に協力してもらっている研究者との連携をさらに強め、対象施設の状況を鑑みながら、追跡調査の実行可能性を探っていく。Web調査によるデータのみでの解析も可能であるため、場合によっては計画を変更していく。29年度が最終年度であるため、記入しない。精神保健看護学平成27年度の研究実施計画は、平成26年度に実施できた予備調査からのデータを用いて、Job Embeddedness (JE)尺度の翻訳版の検討と完成、職場環境測定尺度の改訂版の検討と完成、JEモデルと職務満足度及び組織コミットメントを用いた既存モデルの比較分析をすることが主な内容となっている。
実験的肝転移腫瘍に対するTNF徐放製剤の治療効果の検討

TNFとfibrin gelの混合製剤はTNF20万JRUとfibrin gelを混合gel化させ燐酸緩衝液(PBS)中に静置するというin vitroの実験系において,PBS中で約1週間にわたり徐法効果を有することがEnzyme-Linked Immuno-Sorbant Assay法による解析で確認され、in vivoでもBALB/cマウスの皮下移植腫瘍内(同系大腸癌細胞株colon26)で同様に1週間停滞することが腫瘍組織の抗TNFポリクローナル抗体を一次抗体とした免疫組織染色により確認された。その抗腫瘍効果も著しくTNF5万JRUとfibrin gelを混合してマウス皮下移植腫瘍に投与した場合57%で腫瘍は完全に消失した。副作用発現の指標として体重減少の程度を経日的に観察したが混合製剤を投与したものでは同量のTNFを単独で投与したものに比較し体重減少は明らかでなかった。TNFとlipiodolの混合製剤はBALB/cマウスに経門脈的にcolon26を投与し作製した肝転移モデルを用いたin vivoの実験系で系門脈的投与により肝転移腫瘍を中心とした肝臓内にTNFは約2週間にわたり停滞することが確認された。またその抗腫瘍効果も著明でありTNFを単独投与したものと比較し薬剤投与後2週間における肝転移結節数は混合製剤を投与したもので有意に少なく(肝表面結節数:TNF単独=3.8±1.8,混合=17.5±5.5)組織学的にも腫瘍内壊死像は明らかであった。しかし体重減少は混合製剤を投与したものが単独投与に比較し著しかった。以上のようにTNFとfibrin gelおよびTNFとlipiodolの混合製剤は副作用に注意し、腫瘍内直接投与、あるいは選択的血管造影下での投与といった方法で用いれば臨床的にも応用可能であると考えられた。TNF(PT-050,大日本製薬) 20万JRUとfibrinogen16mgをaprotinin溶液0.2mlに溶解し、24穴マルチプレート内でthrombin溶液0.05mlと混和しwell内でgel化させた。各wellに燐酸緩衝液(PBS)1.25mlを加えて、経時的,経日的にPBSを採取しPBS中のTNF濃度を抗ヒトTNF-alphaモノクローナル抗体を用いたEnzyme-Linked Immuno-SorbantAssayにより測定した。この結果、PBS中のTNF濃度(ng/ml)は30分後=3.4,1時間後=8.4,2時間後=8.9,6時間後=9.5,24時間後=11.2,2日目=10.6,5日目=7.0,7日目=2.2,14日目=0.2でありその徐放性が確認された。6週齢BALB/cマウス背部皮下に1×10^6個の同系大腸癌細胞株colon26を移植し移植腫瘍内にTNF 5万JRUとfibrinogen16mgをaprotinin溶液0.2mlに溶解したものを投与し、さらに同部位にthrombin溶液0.05mlを投与して局所でgel化させた。投与後、経日的に腫瘍を摘出し、抗ヒトTNF-alphaポリクローナル抗体を1次抗体とした免疫組織化学染色を施し、腫瘍局所おけるTNFの停滞性を検討した。その結果TNFはTNF・fibrin gel投与後、約1週間にわたって腫瘍組織中に認められた。以上の結果よりTNFとfibrin gelの混合製剤はin vivo,in vitroともにTNFの徐放性を有することが確認された。
レーザ直描テーラーメードクラッド形状を有した導波路型可視域レーザ

フェムト秒レーザの多光子吸収により透明バルク材料内部に屈折率変化を誘起し光導波路コアとする場合、屈折率変化の不均一性から伝播ロスが無視できず導波路レーザには適さない。フッ化ガラスはレーザ照射条件によっては負の屈折率変化が起きることから、クラッドをレーザ直描することが可能である。書き込みには時空間レンズ光学系を用いることで深さ方向の空間分解特性を著しく改善し、Pr:ZBLANガラスへの導波路書き込みを行い導波路特性を調べた。HeNeレーザで計測した導波路損失は0.56dB/mであり明確な導波路伝播が実現できた。ただし、誘起屈折率変化は予想よりも低く現状の導波路NAは0.015であった。フェムト秒レーザーの多光子吸収により透明バルク材料内部に屈折率変化を誘起し光導波路とする先行研究はあるが、屈折率変化の不均一性からコアとして利用すると伝播ロスが無視できず導波路レーザーへの応用には適さない。そこで、フッ化ガラスはレーザー照射条件によっては負の誘起屈折率変化が起きることを利用したクラッド書き込み実験を行った。用いたレーザーはkHz動作のフェムト秒レーザーである。繰り返し照射による熱の蓄積が無視できる条件になる。屈折率変化は閾値以上のパルスエネルギーであればほぼ一定の変化になる。昨年度に構築した時空間集光光学系と屈折率変化計測用の干渉測定光学系を用いてレーザー照射条件の決定を行った。時空間集光法は、一般的空間集光系に比べて、深さ方向の集光に関する閉じ込め効果が明らかに優れることがわかり、深さ方向に20 μm以下の加工分解能を実現できた。また屈折率変化も干渉画像計測によって鮮明に観測することに成功した。旋状痕を書き込める自動ステージを構築し、直径25 μmのコアになるよう10 μmピッチで毎秒1 mmの速度でクラッドを書き込んでレーザー導波路作製した。HeNeレーザーで計測した導波路損失は0.56dB/mであり、明確な導波が実現できることを確かめた。導波路製作システムは完成したが、課題として残ったのは、誘起屈折率変化が予想よりもかなり低いため、導波路NAが0.015と低く、半導体レーザーによる励起が難しい点である。一方、レーザーによる屈折率変化を用いたBragg回折鏡をPr:ZBLANファイバに書き込む実験を行い、フェムト秒レーザー描画によるコアへの周期構造書き込みが機能することを確かめた。ガラス内部の微小空間にフェムト秒レーザーパルスを集光することで永続的な屈折率変化を誘起できることは確立された知見である。我々は,現有のフェムト秒レーザー装置を用い,この屈折率変化を誘起する追試実験を行った。本研究では,誘起屈折率分布を光導波路形成に用いるが,通常のレンズを用いて繰り返し周波数1 kHzのフェムト秒レーザーを集光しても円形の屈折率変化は書き込めないことを確かめた。そこで,回折格子によって周波数成分を角度分散させ,集光点で再び周波数成分を重畳して短パルス化することができる時空間レンズ光学系を構築した。この光学系によって明らかに誘起屈折率分布形状が改善できることを確かめた。また,回折光学系を用いて理論的にも確かめた。導波路ガラス試料は,Pr3+ドープZBLANガラスを用意し,光学研磨した。このガラスは,フェムト秒レーザーを集光することで屈折率が低下することが知られており,誘起屈折率変化を起こした部分をクラッドとして用いる本研究の目的に合う。フェムト秒レーザーを集光し,導波路の断面に花びら状に誘起屈折率分布を配列し,長手方向に数mmの描画を行えるよう,直線ステージを構築し制御系の動作を確認した。システマチックに導波路を書く行程において,屈折率変化の書き込みをリアルタイムで観察する必要があると判断し,その観測系の調査と構築を行った。本ガラス導波路レーザーは,青色半導体レーザー励起可視波長可変Pr3+レーザーとして動作させることを最終目的にしている。そこで,Pr3+レーザーの要素技術を完備するため,青色半導体レーザー励起Pr:YLFレーザーのレーザー実験も並行して行った。Cr4+:YAGが可視域で過飽和吸収体として動作することをはじめて見いだし,受動Qスイッチおよび受動Qスイッチ・モード同期動作を実現した。フェムト秒レーザーでガラス中に側面から描画する場合,通常の集光ではなく,時間レンズ集光系を用いることで屈折率変化断面形状がレーザー共振器用導波路形成に適していることを確認した。これは本研究で提案する新しい手法であり,これを確認した上で,導波路書き込み用の自動走査型ステージを設計し構築が終了した。また,Pr:ZBLANガラス

材料も入手でき,屈折率変化を直線状に形成できるまでは確認できた。現在,HeNeレーザで導波路伝播を確認するまでには至っているが,クラッド描画によるコア閉じ込め特性の測定には至っていない。システマティックに描画する段において,当初は不要と思われてたリアルタイムでの誘起屈折率分布のイメージングがプロセスを評価するために必要と気づき,この観察系のデザインと構築に予想していなかった時間が必要となった。当初は24年度中に導波路型Pr:ZBLANガラスレーザーの発振までを予定していたので,やや遅れている。Pr:ZBLANガラスへの導波路的な長い屈折率変化を自動的に描画するセットアップはでき上がっているので,クラッド描画によってコアで効率よく導光するための最適な屈折率変化,クラッド形状を決定する。Pr3+レーザーの発振波長である波長633nmに対応するHeNeレーザーをプローブにし,導光特性を測定する。Pr:ZBLANは長さ5cm程度で十分なレーザー利得長を達成するので,励起用青色レーザーの導波特性も計測し,レーザー発振に必要なコアサイズを決定する。この時,青色レーザーのビームパターンに整合するコア形状がレーザー発振に適すかどうかを調査する。レーザー共振器は,導波路を書き込んだ後に端面に誘電体多層膜を形成することで構築する。平面導波路構造のメリットは導波路構造をデザインできる点であり,横方向に10程度のアレイが等間隔で並んだマルチ導波路を形成する。かつ,出口部には単一の1次元導波路を構築することでアレイレーザーの回折・干渉を許容してTalbotセルフイメージング効果を誘起させる。本手法によりコヒーレント結合が可能となる。コヒーレントに結合したレーザーを共振器内で集光させ,そこに過飽和吸収体を配置して受動Qスイッチコヒーレントアレイを実現するのが最終目的になる。フェムト秒レーザーを照射しながらガラス内部のサブミリ空間における屈折率変化が観測できる位相顕微計測系を構築する。そのための光学系として主として消耗品支出を行う。Prドープガラスの光学研磨代および共振器用誘電体鏡蒸着代を支出する。また,Pr:YLFレーザーの成果を国際会議で発表するために海外出張費を支出する。
MRIとNIRSの相補性を利用した気分障害の鑑別診断法・予後予測法の開発

NIRSとrs-fMRI/構造MRIを組み合わせた診断鑑別法の検討のため、引き続き気分障害患者のリクルートを行い、平成30年度は、NIRS検査についてはうつ病圏患者21名、双極性障害患者7名の測定を加え、そのうち、うつ病圏10名、双極性障害4名についてはrs-fMRI/構造MRIをあわせて施行した。また、うつ病圏から双極性障害への診断変更の予測可能性の検討のため、過去にうつ病圏と診断されすでに画像検査を行った者を対象とした初回評価後1.5年後または3年後の追跡調査を継続した。平成30年度は16名の追跡調査を行い、結果として4名の患者において診断変更がなされた。さらに、45名の大うつ病性障害感を対象として、初回および1.5年後の2時点における言語流暢性課題中のNIRS信号を用いた解析を行った。結果として、中前頭回領域においては状態像の変化に伴うNIRS信号の経時的な変動を認めなかった一方で、右下前頭回領域においては、うつの重症度の変化に伴って経時的に変動しているという所見が得られ、同領域がうつ症状およびその重症度の形成に重要な役割を担っていることが示唆された。加えて、左上・中側頭回領域の初回測定時のNIRS信号が大きいほど、1.5年後のうつ症状が軽度であるという結果が得られ、脳機能の評価による予後予測の可能性が示唆された。大うつ病性障害患者において、状態像の変化またはうつ症状の重症度の変化に伴って脳機能が経時的に変動するという知見は、高精度の鑑別診断法の開発のために、症状の影響を考慮した検討が有効であることを示唆するものであり、本研究の推進につながるものと考えられる。また、NIRS信号により将来の重症度が予測できる可能性が示唆されたことで、MRIのデータを加えた包括的な検討により、症状の遷延や再発についてのより精緻な予後予測マーカーの開発に寄与することが期待される。引き続き初回および追跡調査を行いながら、NIRSとrs-fMRI/構造MRIを組み合わせたうつ病圏と双極性障害の診断鑑別、および、予後予測可能性について、平成28年までのデータも加えた解析を進めていく。また、追跡率を高め、より包括的な予後の把握のため、主治医への転帰調査を開始しており、これらのデータを含めた検討を加えていく予定である。NIRSとrs-fMRI/構造MRIを組み合わせた診断鑑別法の検討のため、東京大学医学部附属病院における入院または外来通院中の患者のうち、DSM-IV-TR基準に準拠した構造化面接により、うつ病圏または双極性障害に該当する者を対象として、NIRS検査およびrs-fMRI/構造MRIを施行した。画像検査を行った者については、基礎的な指標に加え、うつ症状や躁症状の重症度を含む、脳画像パラメータに影響を及ぼす可能性がある指標の取得も行った。対象者には研究計画の内容について口頭及び文書にて詳細に説明を行い、文書にて同意を得た。NIRS検査時に用いる言語流暢性課題パラダイムはすでに確立しており、MRIについては革新脳・脳プロ標準プロトコルガイドラインを用いた撮像を行った。平成29年度は、NIRS検査についてはうつ病圏患者25名、双極性障害患者2名の測定を行い、そのうち、うつ病圏14名、双極性障害2名についてはrs-fMRI/構造MRIをあわせて施行した。また、うつ病圏から双極性障害への診断変更の予測可能性の検討のため、過去にうつ病圏と診断され、すでに画像検査を行った者について、初回評価後1.5年後または3年後の追跡調査を行い、初回評価後の診断変更や症状変化についての調査を行った。平成29年度は24名の追跡調査を行い、結果として2名(8.3%)の患者において診断変更がなされた。NIRSとrs-fMRI/構造MRIを組み合わせたうつ病圏と双極性障害の診断鑑別、および、予後予測可能性について、平成28年までのデータも加えた予備的解析を進めている。気分障害患者のNIRSおよびrs-fMRI/構造MRIデータの取得が進められており、既存のデータと合わせた解析準備が整っている。一方で、双極性障害患者の割合が少ない点は今後の課題である。うつ病圏の患者を対象とした初回NIRSデータ取得後の追跡調査は順調に進んでいる。NIRSおよびrs-fMRI/構造MRIのマルチモダリティーデータ取得後の追跡調査を行う体制もすでに構築出来ている。

結果として、中前頭回領域においては状態像の変化に伴うNIRS信号の経時的な変動を認めなかった一方で、右下前頭回領域においては、うつの重症度の変化に伴って経時的に変動しているという所見が得られ、同領域がうつ症状およびその重症度の形成に重要な役割を担っていることが示唆された。加えて、左上・中側頭回領域の初回測定時のNIRS信号が大きいほど、1.5年後のうつ症状が軽度であるという結果が得られ、脳機能の評価による予後予測の可能性が示唆された。大うつ病性障害患者において、状態像の変化またはうつ症状の重症度の変化に伴って脳機能が経時的に変動するという知見は、高精度の鑑別診断法の開発のために、症状の影響を考慮した検討が有効であることを示唆するものであり、本研究の推進につながるものと考えられる。また、NIRS信号により将来の重症度が予測できる可能性が示唆されたことで、MRIのデータを加えた包括的な検討により、症状の遷延や再発についてのより精緻な予後予測マーカーの開発に寄与することが期待される。画像検査を含めた初回評価と、1.5年後および3年後の追跡調査を引き続き行っていく。また、双極性障害患者のリクルート数の増加、および初回評価後の追跡率向上のための施策の検討を行う。引き続き初回および追跡調査を行いながら、NIRSとrs-fMRI/構造MRIを組み合わせたうつ病圏と双極性障害の診断鑑別、および、予後予測可能性について、平成28年までのデータも加えた解析を進めていく。また、追跡率を高め、より包括的な予後の把握のため、主治医への転帰調査を開始しており、これらのデータを含めた検討を加えていく予定である。予定していた学会への参加を見送ったことにより、旅費の実支出額が想定を下回った。次年度は、主に旅費に合算して使用する予定である。
硫化銅精鉱の酸化酸浸出の促進を目指したマイクロ波加熱処理の開発

銅精鉱の浸出速度および浸出率の向上を目的に、高品位黄銅鉱と各種銅精鉱をAr雰囲気中で加熱処理し、組成分析、X線回折分析、CuCl_2系およびFe_2(SO_4)_3系浸出液による浸出実験をおこなった。また、マイクロ波加熱を浸出の前処理に適用することについて検討した。その結果以下の知見を得た。1.精鉱の組成分析で産地によって成分に大きな差が見られたが、XRDでは、いずれの精鉱からも強い主成分のChalcopyrite(CuFeS_2)のピークと、弱いQuartz(SiO_2)のピークが同定された。2.精鉱を電気炉加熱処理すると700°Cから2θ=29°のChalcopyriteのピークの移行が見られた。加熱処理により硫黄が僅かに揮発しChalcopyriteの結晶構造がα型からβ型へ変化していることがわかった。また、Bornite(Cu_5FeS_4)のピークも確認出来るようになった。比表面積は、硫黄の揮発が起こるにもかかわらず、減少することがわかった。3.電気炉加熱処理した精鉱をCuCl_2系およびFe_2(SO_4)_3系浸出液で浸出すると、処理無に比べCuの浸出率が向上することが確認された。CuCl_2系溶液では、電気炉加熱処理の効果は浸出温度80,90°Cの浸出開始から2時間までで僅かに見られた。Fe_2(SO_4)_3系溶液では、加熱処理によりCuの浸出率が増加し、浸出温度40°Cの時と比べると80,90°Cの時の方が加熱処理の効果が大きかった。4.マイクロ波加熱処理により精鉱中のChalcopyriteがα型からβ型へ結晶構造変化することが確認された。Bomiteへの分解も確認された。また、浸出実験よりCuの浸出率の向上が確認された。5.加熱処理方式の違いによってCuの浸出率に有意な差はなかったことから、短時間の加熱処理でも浸出の促進に効果のあることがわかった。本研究では、黄銅鉱を主体とする銅精鉱の均質化および反応性の向上を目的としてマイクロ波による加熱処理をおこない、浸出率の向上を図る。平成18年度は、産地により構造や組成が鉱石ごとに異なるので、実験に用いる銅精鉱(マムート、エルツベルグ、ロスペラプレス)の性状調査をおこなった。マイクロ波加熱処理との比較のために、電気炉を用いて中性雰囲気、500800°Cで2時間バイ焼を行い、銅精鉱の構造変化の調査とバイ焼試料の浸出特性を800°Cバイ焼のロスペラプレスを用い、塩化銅系溶液と硫酸鉄系溶液を浸出液、浸出温度4090°C、浸出時間0.524hで浸出を行い以下の知見を得た。1.XRDでは、いずれの銅精鉱からも強い主成分のChalcopyrite(CuFeS_2)のピークと、弱いQuartz(SiO_2)のピークが同定された。エルツベルグのみ僅かにBornite(Cu_5FeS_4)のピークも見られた。2.化学分析では、Cu 2036%、Fe 1925%、S 2230%、SiO_2 49%と産地によって大きな差が見られた。

3.バイ焼したすべての試料で700°Cから2θ=29°付近のChalcopyrite(CuFeS_2)のピークの移行が見られた。またBornite(Cu_5FeS_4)のピークも確認できるようになった。バイ焼により硫黄が僅かに揮発しChalcopyriteの結晶構造が変化していることが分かった。4.塩化銅系溶液では、バイ焼の効果は浸出温度80、90°Cの浸出開始から2hまでで僅かに見られた。硫酸鉄系溶液では、バイ焼により浸出率が増加し、浸出温度40°Cの時と比べると80、90°Cの時の方がバイ焼の効果が大きかった。5.バイ焼無しの場合では、硫酸鉄系溶液に比べ塩化銅系溶液の方が浸出率は高かった。6.バイ焼後の浸出残渣のXRDでは、Sのピークが確認できた。本研究では、黄銅鉱を主体とする銅精鉱の均質化および反応性の向上を目的としてマイクロ波による加熱処理をおこない、浸出率の向上を図った。平成18年度に外部加熱の電気炉バイ焼により銅精鉱中の硫黄が僅かに揮発し、CuFeS_2の結晶構造が変化していることを明らかにした。バイ焼によりCuの浸出率の向上が見られた。平成19年度は加熱方式の違いによる影響を比較するため、内部加熱のマイクロ波加熱装置を用いてアルミナルツボに銅精鉱ロスペラプレスを入れ、インコネル保護管に入れたK型シース熱電対で測温、発振機の出力を調節し、Arガス雰囲気中で800°Cまでおよそ1分半で昇温し、その温度で5分間保持後放冷した。バイ焼試料の性状と構造変化の調査と0.5mol/L Fe_2(SO_4)_3+0.2mol/L H_2SO_4浸出液で、浸出温度60°C、撹拌速度250rpm、固液比2%、浸出時間0.524hで浸出をおこなった。また浸出開始1hでFeSO_4を添加して酸化還元電位を変化させた実験もおこない、以下の知見を得た。(1)バイ焼後の試料は、熱電対保護管の周りで溶融しているようで塊を形成しており、全量の40%程度だった。(2)バイ焼後の試料のXRD分析で、CuFeS_2ピークの移行およびCu_5FeS_4への分解が確認された。(3)赤外線放射温度計でも試料の測温を試みたが、加熱により試料から発生するガスのために測温できなかった。(4)加熱方式の違いによるCuの浸出率の差はなかった。(5)この浸出液組成では、Fe^<3+>の濃度が高くFeSO_4を添加した場合0.75Vから0.68Vまでしか溶液電位は低下せず、FeSO_4添加によってCuの浸出率は向上しなかった。(6)マイクロ波加熱によるバイ焼後の試料の今回の浸出条件での残渣のXRDでは、Sのピークは確認されなかった。
動的大規模環境における高速なカメラ位置推定手法

拡張現実等やロボティクスで用いられるカメラの自己位置姿勢推定は時間等の変化によって照明条件が変化すると,精度が低下する場合がある.本研究ではコンピュータグラフィックスを用いて照明条件のシミュレーションを用い,あらかじめ様々な照明条件の画像作成し,実画像と合わせて機械学習を行うことによって照明条件の変化に頑健な手法を開発した.拡張現実でバーチャル環境と実環境の幾何学的整合性をとるための方法の一つに,事前に作成した特徴量データベースと実画像の特徴量をマッチングさせてカメラの位置姿勢を推定する自己位置推定がある.しかし常に変化している実世界で自己位置推定を行う場合,時間帯や天候によって光源環境が変化する.その結果,入力画像とデータベース内の特徴量のマッチングの失敗による自己位置の精度の低下が問題となる.このような問題について,多様な条件を含む特徴点群に対してマハラノビス距離を用いて特徴点のマッチングを行うことで,全てのデータを参照することなく特徴点のマッチングを行う手法を開発した.この手法ではあらかじめ実環境から構築したCGモデルを用いて様々な光源環境のシミュレーションを行い,各環境下において抽出した特徴点の中から代表点を選択し,各点について光源変化に対する特徴量の平均値と共分散行列をデータベースに記録する.一般的なマッチング手法では,すべての特徴点の特徴量とのユークリッド距離を計算する必要があるのに対し,提案手法では同一とみなせる特徴点に対しては平均値とのマハラノビス距離の計算のみで済むため,距離の比較回数を大幅に削減することができる.ただ,マハラノビス距離の計算にはユークリッド距離より大きな計算量を要するため,提案手法では特徴量に対して主成分分析を行い次元を削減することで計算量を削減する.上記手法の場合,シミュレーションと現実の乖離が課題である.本研究計画ではさらに,自己符号化器で実画像の特徴量をバーチャル画像の特徴量に変換することによって,シミュレーションとの乖離を解決した.またランダムフォレストを用いることで高速で精度の高いマッチングを実現した.実験の結果,提案手法では従来手法と比較して少ない判定時間で精度の高い自己位置推定が行えることを確認した.当初予定していた手法とは異なるが,自己符号化器の導入によってバーチャル環境と実環境の乖離問題について解決できた.また,ランダムフォレストを導入することで高速化がある程度実現された.上記理由から,概ね順調に進展していると言える.拡張現実でバーチャル環境と実環境の幾何学的整合性をとるための方法の一つに,事前に作成した特徴量データベースと実画像の特徴量をマッチングさせてカメラの位置姿勢を推定する自己位置推定がある.しかし常に変化している実世界で自己位置推定を行う場合,時間帯や天候によって光源環境が変化する.その結果,入力画像とデータベース内の特徴量のマッチングの失敗による自己位置の精度の低下が問題となる.このような問題について,本研究計画では引き続き光源環境の変化をコンピュータグラフィックスでシミュレーションを行い,光源環境に対して頑健な特徴量データベースを作成することで解決する.この手法の場合,実際の画像とシミュレーションとの画像では乖離が問題となることが本研究でわかっており,ニューラルネットの一種ではる自己符号化器を用いることで実画像の特徴量をバーチャル画像の特徴量に変換することによって,シミュレーションとの乖離を解決した.またランダムフォレストを用いることで高速で精度の高いマッチングを実現した.実験の結果,提案手法では従来手法と比較して少ない判定時間で精度の高い自己位置推定が行えることを確認した.29年度の研究ではさらに手法の改善を行い,さらに高速かつ光源環境が変化しても推定精度が維持される手法を開発した.さらに詳細な評価実験や他の先行手法との比較実験を行い.最先端の手法よりも良い精度でカメラ自己位置姿勢の推定を行えることを確認し,SIFT特徴量だけでなく,他の特徴量でも同様の変換が可能であることを確認した.処理時間についても改善を行い,拡張現実等のアプリケーションにおいて実用的な速度で動作することを確認した.拡張現実等やロボティクスで用いられるカメラの自己位置姿勢推定は時間等の変化によって照明条件が変化すると,精度が低下する場合がある.本研究ではコンピュータグラフィックスを用いて照明条件のシミュレーションを用い,あらかじめ様々な照明条件の画像作成し,実画像と合わせて機械学習を行うことによって照明条件の変化に頑健な手法を開発した.実験をより大規模な実験に移行する.CGモデルで変化するパラメータをより多く設定し,より多様な変化に対応できるDBの構築を目指す.対象とする環境も大規模なものを想定し,多数の部屋からなる建物の内外の全てや,工場の内部,小規模な町などを想定してDBを構築する.また,そのような環境では,物体の位置が移動したり建物が変わったりする,人や車など,多数の移動物体が存在するなど,変化が常に発生している.そのような動的な環境に対応可能な対応点探索手法の開発を行う.このような環境では,これまでの特徴点でシンプルに表現することは難しいと考えられる.そのため,物体の物理的な移動や他の物体による隠れの発生しやすさを事前確率として対応点の信頼性を表現する.これによって,物体の移動等によって不安定になりやすい特徴点の影響を制限する手法を開発する.探索の高速化については,あらかじめ早期棄却できるように特徴点を分類しておく手法や,DBを時間,天候等のコンテクストに基づいて分類しておき,クエリとなる画像のコンテクストから適切なDBを選択する手法の開発を行う.コンピュータビジョン以前の研究で使用していた機材を使う事ができたため,また,一部の学会発表については共同研究者に発表を依頼することができたため.当初の計画を変更して深層学習を用いた手法を開発しているため,効率的にネットワークの学習を行うための計算機を購入する.
ヘテロ原子置換ケイ素アニオン種における新規反応の開発と反応性制御

研究代表者らは,ケイ素上にヘテロ原子官能基を有するケイ素アニオン種の化学について研究をおこなってきた。今回,ケイ素-テルル結合の切断によるシリルリチウムの合成法を開発し,テルル官能基を有するシリルリチウムの合成に初めて成功した。ジメシチルジクロロシランに2モル量のリチウム-フェニルテルラートを反応させることにより,ジ(フェニルテルロ)ジメシチルシラン1を合成した。この1にフェニルリチウム(2.2モル量)をTHF中,-50°Cで作用させるとテルル-リチウム交換反応が進行し,(フェニルテルロ)ジメシチルシリルリチウム2が収率80%で生成した。これはテルル官能基を有するシリルリチウム化合物の初めての例である。また,テルル-リチウム交換反応が有機リチウム化合物の合成のみならず,シリルリチウム化合物の合成にも有効であることを示した初めての例となった。また,1にリチウムナフタレニド(3モル量)をTHF中,-50°Cで作用させるとケイ素-テルル結合の還元的切断が起こり,シリルリチウム2が収率73%で生成した。このシリルリチウム2は-50°Cでは安定で,クロロシランと反応しジシランを与えた。一方0°Cにおいては,シリルリチウム2からα-脱離によりジメチルシリレンが生成した。これはトリエチルシランによって捕捉され,ヒドロシランを収率11%で与えた。硫黄官能基を二つ有するシリルリチウム化合物としてジ(メシチルチオ)メシチルシリルリチウム1を合成し,その反応性を検討した。この1の合成には,トリ(メシチルチオ)メシチルシラン2のケイ素-硫黄結合を切断する方法を検討した。反応条件を検討した結果,2にTHF中,-50°Cでリチウムナフタレニドを3モル量作用させると,一つのケイ素-硫黄結合が選択的に切断され,シリルリチウム1が収率79%で生成することを見出した。同様の条件下,リチウムナフタレニドを2.2モル量用いた場合には原料2が残存し,4モル量用いた場合には1の収率は大幅に低下した。また,ジ(メシチル)メシチルクロロシランを同様の方法で還元した場合にも,1の収率は大幅に低下した。ケイ素-硫黄結合の還元的切断によるシリルリチウム化合物の合成は,前例のない新しい方法である。シリルリチウム1は-50°Cでは安定で,クロロスタンナン,ヨウ化メチルとも反応し,それぞれシリルスタンナンおよびメチルシランを与えた。また,THF中における1の^<29>Si NMRの化学シフト値は37.4ppmであった。また1は0°C付近で数時間で分解した。ジフェニルアセチレンを共存させると,シラシクロプロペンが生成した。同定は各種NMRスペクトル解析によりおこなった。この結果は,1のα-脱離により(メシチルチオ)メシチルシリレンが発生したことを示唆している。本反応は硫黄置換シリレンの発生法としても興味深い。
スギさし木苗の「形」をコントロールする-肥大成長促進メカニズムの解明 -

本研究は、制御環境下におけるスギさし木苗の育成試験を通して、スギの肥大成長量の増加メカニズムを明らかにすることを目的とする。様々な1)光環境条件下(異なる日長及び光質条件)や、2)温度環境条件下で研究材料の育成を行い、肥大成長量と葉量の変化を同時かつ経時的に追跡する。肥大成長に影響する環境条件および葉量増加との関連性を明らかにし、肥大成長量を決定している樹木の成長ダイナミクスを解明する。
免疫性脱髄性ニューロパチーの軸索脆弱性の病態解明：TAG-1の役割

末梢神経系の維持には軸索ー髄鞘間の相互作用が重要な役割を担うことが指摘されている。我々はCIDPにおいて、傍ランビエ絞輪部に分布するTAG-1のアミノ酸置換が分子機能を修飾し、再髄鞘化機序にかかわることを過去に指摘した。今回、TAG-1を欠損した動物モデルに髄鞘構成成分より構成される抗原を人為的に導入して自己免疫性神経炎を惹起したところ、脱髄のみならず軸索障害が形態的・電気生理学的に顕在化することを示した。このことからTAG-1をはじめとする分子群は末梢神経の発生はもとより、傷害発生後の髄鞘再生にかかわる重要な要素であり、この破綻は不可逆性の病態をきたしうることが示唆された。EAN誘導後2-4週間におけるclinical scoreとcage activityはTAG-1 KOで顕著な増悪を示した。さらにその後は野生型はEAN誘導前の運動機能に回復する一方、TAG-1の運動障害は緩徐に増悪を示した。またTAG-1 KOは後肢における筋萎縮が顕在化するとともに、体重減少が遷延する傾向が有意であった。病理学的にはsciatic nerveのトルイジンブルー染色ならびにときほぐし標本から、野生型における脱髄に加え、TAG-1 KOでは軸索障害の合併が認められた。以上より、TAG-1の欠損が脱髄に伴う軸索障害を顕在化し、筋萎縮に反映される不可逆性の病態に関与することが判明した。これには脱髄後の再髄鞘化機転の障害による軸索脆弱性を示唆する結果と考えられる。ヒトの脱髄性ニューロパチーであるCIDPに対してもTAG-1の異常が軸索障害(筋萎縮・CMAP低下)との相関を報告した我々の報告と合致している。TAG-1ノックアウトマウスに末梢神経由来ペプチド(P0)による実験的自己免疫性神経炎(experimental autoimmune neuritis, EAN)を導入した結果、野生型マウスへのEAN誘導よりも顕著な軸索障害の合併(軸索脆弱性)が示された。抗原提示細胞における共刺激因子であるB7-2を欠損することにより慢性進行性の末梢神経障害をきたすマウス(B7-2ノックアウトNOD)が近年報告されたことから、これを新規に導入し臨床病理学的な特徴から、CIDPのモデルとしての妥当性を検証した。本マウスはEANのような受動免疫を必要とせず、生後20週前後より炎症細胞の浸潤を伴う末梢神経限局性の脱髄を誘導できることが判明した。この結果を受けて、前述のTAG-1ノックアウトマウスとの交配によるTAG-1/B7-2ノックアウトマウス(NOD系統)の新規作成を開始した。交配第一世代では自己免疫機序が認められないことから、NODとしてのバックグラウンドが自己免疫機序の誘導に重要と考えられた。現在はNODとしての背景に入れ替えるための戻し交配が進行している。またTAG-1/B7-2ノックアウト以外に、B7-2ノックアウトマウスに対し、CIDPの治療として確立した免疫グロブリン療法を施行し、治療効果を確認している。現在までのところ、発症後一定の週齢以降のマウスには効果は認めないものの、発症前の早期治療導入が、プラセボ投与群に比べ良好な運動機能維持を示すことが判明しつつあり、表現型以外にも電気生理や病理学的な検証を行っている。TAG-1は傍ランビエ絞輪部のjuxtaparanodeに発現する免疫グロブリンスーパーファミリーに属する分子であり、その役割はいままで不明とされてきた。我々はTAG-1ノックアウトマウスの形態観察を行い、末梢神経に電験レベルでの異常は確認されないことを明らかにした。ただし髄鞘構成分子のP0由来ペプチドをアジュバントとともに投与し実験的自己免疫性神経炎(EAN)を誘導したところ、脱髄所見のみならず軸索障害が顕在化することを光顕レベル(ときほぐし標本)ならびに電顕レベルの両者で確認されている。本マウスはEAN誘導後より顕著な体重減少をきたすなど軸索障害の顕在化を示した。よってTAG-1は脱髄から髄鞘再生に至る病態を構成し、その破綻は軸索障害をきたすことが示唆された。過去に我々はTAG-1 non-synonymous SNPsから構成される特定の遺伝子型がヒトCIDPの治療反応性に相関し、筋萎縮や電気生理所見もそれを裏付けることを報告した。そこで今回、慢性経過のCIDPの病態を反映しうる細胞性免疫主体の動物モデル(B7-2 KO)とTAG-1 KOとのdouble knockoutモデルの作成を試みた。交配8世代におけるdouble knockout個体まで作成し、ホモ同士の交配ではdouble knockoutの産出が極めて困難なことが示された。この結果を受けて胎生致死の可能性を確認する目的で、B7-2ホモ交配かつTAG-1ヘテロ交配の妊娠子宮の吸収痕確認を行ったところ、一定の割合で吸収痕の存在が明らかとなった。また正常胎児と吸収痕のジェノタイピング解析から、double knockout個体は高率に胎生致死に至ることが示され、TAG-1は髄鞘再生のみならず胎生初期の髄鞘形成においても重要な役割を担うと考えられる。

今回、TAG-1を欠損した動物モデルに髄鞘構成成分より構成される抗原を人為的に導入して自己免疫性神経炎を惹起したところ、脱髄のみならず軸索障害が形態的・電気生理学的に顕在化することを示した。このことからTAG-1をはじめとする分子群は末梢神経の発生はもとより、傷害発生後の髄鞘再生にかかわる重要な要素であり、この破綻は不可逆性の病態をきたしうることが示唆された。安定的に自己免疫性の脱髄性ニューロパチーを誘導できる、新規モデルマウスの導入が完了した。さらに本マウスとTAG-1ノックアウトマウスとの戻し交配により、自然発症の慢性進行性脱髄をきたすとともに、軸索脆弱性を背景に有する病態を示す動物モデルを入手した。これにより軸索ー髄鞘相互作用機序の解明が期待できるとともに、軸索障害機序をきたす病態を網羅的に解析する手段を得た。また本研究はモデルマウスを用いているため、ヒトの末梢神経生検標本では検証が不可能な、脊髄や神経根を対象にした評価も可能となるため。免疫性神経疾患NOD系統を背景にしたTAG-1/B7-2ノックアウト系の樹立まで、あと数世代の戻し交配を継続する。完成した後には本マウスを用いて脱髄に伴う軸索障害機序の病態解明を本格化する予定である。また治療的介入をヒトCIDPモデルマウスに行うことで、今まで未知とされる免疫グロブリンの作用機序解明への進展が期待される。免疫グロブリン製剤投与後の運動機能、電気生理所見、病理像の変化をプラセボ群と比較検討する予定である。ヒトの疾患であるCIDPにおいて、脱髄に伴う軸索障害によるIVIg治療反応性や予後への影響はすでに我々の報告するところである(Iijima M, et al. Neurology. 2009;73:1348-52)。今年度は同様の結果を動物モデルで再現できるかを目的としたが、当初の予定通りTAG-1の異常が臨床像や軸索障害に関与する結果を得ることができたため。3月に行った患者検査の支払いが平成27年度になる。現在作成した系は単相性かつ進行の早い臨床像を呈することから、よりヒトのCIDPに近いとされる臨床像(緩徐進行性、慢性経過)と高度の障害をきたすモデル(B7-2 KO NODマウス)を導入し、その臨床病理学的特徴を解析する予定である。これが確認された後、現在保有するTAG-1 KOマウスとのdouble knockout系を作成し、これによる軸索障害の顕在化の有無を検証する。これらと平行して、TGA-1 KO + EANモデルもしくはB7-2 KO NODに対してヒトで用いられる治療法を導入し、治療効果を検証する予定である。本年度より翌年度にかけて予定している患者検査への支払いに充当する。