hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
核に局在するアクチン関連タンパク質ARP4が形成する複合体の機能とその調節機構

アクチン関連タンパク質(Arp)はクロマチン構造変換に関わるATP依存的クロマチンリモデリング酵素(ADCR)複合体やヒストンアセチル化酵素(HAT)複合体に最も広く存在する構成因子の1つである。ヒトおよびマウスの細胞核に局在するArp4サブファミリーの2つのアイソフォームArpNα,βのうち、ArpNβは哺乳類SWI/SNFクロマチンリモデリング複合体、P-BAF ADCR複合体、Tip60 HAT複合体、p400 SWI/SNF様複合体、c-Mycコアクチベーター複合体の構成因子であることが報告されている。一方、ArpNαはArpNβと94%の相同性を示すが、ArpNβと異なり脳で特異的に発現が検出されている。ArpNαを含んだタンパク質複合体についてはこれまで報告がなかったが、我々は免疫沈降法によりArpNαもArpNβと同様、哺乳類SWI/SNF複合体の構成因子であることを明らかにした。ArpNαはN末端40-82アミノ酸領域でのみArpNβとの相同性が低いことから、この領域がArpNαに特異的な機能に寄与していると予想し、two-hybrid screeningによりこの領域と相互作用するタンパク質として転写コリプレッサーCtBP1を同定した。哺乳類SWI/SNF複合体はglucocorticoid receptor(GR)による転写活性化に必要であるが、細胞内で発現させたArpNαはCtBP1依存的にGRの転写活性化能を抑制した。一方、このような転写活性化能の抑制はArpNβを発現させた場合には観察されなかった。このことから、脳特異的なArpNαを含むSWI/SNF複合体がArpNβを含む複合体とは異なった遺伝子の発現制御を行うことで、神経細胞の分化や機能に関与している可能性が示唆された。
強相関イッテルビウム・銅系化合物における重い電子物性

価数転移を示すYbInCu_4や高濃度近藤効果を示すYbAgCu_4などの注目すべきC15b型化合物について研究を続けた結果、これらの母体となる化合物が、同じC15b型結晶構造を持つYbCu_5であることを見いだした。YbCu_5はこれまで、六方晶CaCu_5型構造(C15b型のBeCu_5型構造とはスタッキングが異なるだけ)をとるとされてきたが、その低温相、または、高圧相として立方晶C15bYbCu_5が存在することを明らかにした。この合成条件として、1.5GPaの高圧下、900°Cでの反応によって単一相試料を得ることに成功した。磁化率は高温でYb^<3+>のキュリーワイス則を示し、10K程度で極大を持ち、低温では一定値をとる。電気抵抗は磁化率の極大以下の温度域でフェルミ液体論で予言されているような温度の2乗の依存性を示す。従って、この試料は高温で安定であったYb^<3+>の局在モーメントが低温で伝導電子との混成により非局在化する、いわゆる高濃度近藤系であると考えられる。この結果に対応し、強磁場過程を調べるとフェルミ液体状態からレベルクロッシングを起こしながら磁気モーメントが回復するメタ磁性的な振る舞いが見えられた。また、比熱測定の結果、低温での電子比熱係数は550mJ/K^2molとYb化合物中では最も大きな値となり、重い電子系化合物であることが明らかになった。更に、YbCu_<5-x>Ag_xなる系の合成を銀濃度xを1からゼロに向かって行い、その単相試料を得ることに成功し、それらについてマクロな物性の測定を行った。その結果、この系は典型的な高濃度近藤効果を系統的に示し、その特性温度がxの増大に伴い高温側にシフトしていく系であることが明らかになった。更に、価数転移を示すYbInCu_4と立方晶YbCu_5との間の擬二元系YbCu_<5-x>In_xを0≦x≦1の全組成範囲で合成し、価数転移を伴う、価数揺動系と高濃度近藤系の間のクロスオーバーを系統的に調べ、途中で近藤絶縁体的振る舞いを観測した。今後、これらの系について核磁気共鳴によるミクロな面からの電子状態の研究を行っていく予定である。
ワカメ加工業における物質フロー解析とゼロエミッション化

(1)ワカメ中に存在する成分、主に茎、根、成実葉部に含まれる粗繊維質等の成分調査を行い、分離するための前処理操作を検討した。さらに、分離から残渣の処理に至るまでを系統的かつ自動的に処理するためのモデルプラントの試作を行った。(2)具体的な粗繊維質の分離法としては、アルカリ条件で行えることが知られているため、炭酸ナトリウム等、使用するアルカリ性物質を検討し、最も簡易的に分離可能な方法を選択した。(3)残渣処理については微生物処理を用い、高濃度の残渣に対応できるシステムの構築を行った。(4)構成要素の分析には、簡易的に現有設備の紫外線吸光光度計を用い、さらに詳しい分析には液体高速クロマトグラフィーを用いることで可能となる。さらに、発生ガス等の分析については現有設備のガスクロマトグラフィーを用いた。ここで、分離用のカラム及び、検出器については新たに購入したGCMS等の高度分析器を用いた。(5)粗繊維質の改質には酵素反応を用いたが、必要に応じて粗酵素からの精製を行い、高付加価値の生産物を得られるようにした。各種成分についての最適酵素条件の検討が必要と思われたため、酵素による分解の安定性等の検討を行う再生実験を実施した。(6)研究代表者(徳島大学)では物質フロー解析、モデルプラント製作を、研究分担者(東京大学)では物質の精製、改質と酵素でのオリゴ糖生産を担当し、相互の情報交換により、ゼロエミション化システムを構築した。
歯周組織オルガノイドを併用した自家歯牙移植法の開発

自家歯牙移植の際には、移植歯歯根膜の欠損による骨性癒着、歯根吸収および移植歯歯根膜と受容側コラーゲン線維の修復不全による生着不良などの移植歯と受容側で再構築する歯周組織の不調和により移植の失敗が生じるケースがある。本研究では、準備段階として歯周組織を構築する細胞群による多層化細胞シートおよび細胞凝集体であるスフェロイドを作製する。そして、(1)作製した細胞シートおよびスフェロイドを混合したコラーゲン・ゲル包埋培養を行い、ゲル内でのシートおよびスフェロイドの再凝集化からの歯周組織オルガノイドを形成させる、(2)歯の移植モデルを作製して、オルガノイドを含有するゲルと移植歯の移植を行う。
コーダ波散乱体の空間分布と地殻・上部マントル構造の不均寛性に関する研究

本研究では、まず、インバージョン解析手法について、これまでNisigami(1991)が開発したものを改良して、対象とする活断層や活火山周辺でのブロック分割を周辺部より細かくできるようにした。この手法を、福井地震断層・白山火山を含む北陸地域、御岳火山を含む長野県西部地域、および山崎断層を含む中国東部地域に適用した。その結果は次の通りである。1.福井地震断層周辺には、深さ020kmに強い散乱体が分布する。2.白山周辺には、深さ010kmに強い散乱体が分布する。3.御嶽山の直下、深さ07kmには垂直に延びる散乱体分布が、また深さ7kmには水平に広がる散乱体分布が存在する。深さ1117kmにも傾斜した散乱体分布が見られる。4.山崎断層の中央部には、深さ020kmに強い散乱体が分布する。以上のように、コーダ波散乱体の空間分布は活断層・活火山とよく対応することが分かり、それらの周辺には強い不均質構造が存在することが推定された。また、本研究により開発された手法は活断層・活火山周辺の不均質構造を探査する有効な方法となることも分かった。今後、さらに多くの地域について、同様の調査・研究を行いたい。なお、吉岡・鹿野断層を含む地域についての解析は、現在、進行中である。
含水多成分複合システム食品モデルの低温下でのガラス相形成と氷結晶変成に関する研究

昨年まではアモルファスラクトースのエンタルピー緩和過程の詳細を種々の温度、時間でのエイジング後のDSC解析をもちいて検討した。その結果、アモルファスラクトースのエンタルピーは拡張指数型KWWにしたがって緩和すること、そしてその速度定数の温度依存性から活性化エネルギーを求めたところ、他の糖類に比べて活性化エネルギーが低いことが判明した。これは、ラクトースが他の糖類に比べて結晶化しやすいことと関連するものと考えられる。それら結果をふまえ、本年度は乳性食品に近いラクトースーカゼイン混合(3:1)アモルファスの緩和過程を調べ、アモルファスラクトースの構造緩和、水分吸着量に対する影響、ラクトース結晶化への影響について検討した。実験手法、解析手法は前年度と同様に解析を行ったところ、カゼイン混合アモルファスは、ラクトース単独のアモルファスよりも構造、エンタルピー緩和速度が遅くなるものの、その温度依存性、すなわち緩和過程の活性化エネルギーは変わらないことが示された。さらに、水分吸着量はラクトース単独、カゼイン混合物共にエイジングによって減少する傾向が見られた。同時に水分吸着量を増加させて行くと、ある水分吸着量でラクトースの結晶発生が見られるが、アモルファスラクトース単独よりもカゼイン混合系のほうが高い水分含量まで結晶化が抑制されることがわかった。アモルファスラクトースガラスは,熱的に非平衡な状態にあり常に平衡へ向かって緩和しようとする。その現象は物理的なエイジングまたはエンタルピー緩和と一般に言われる。アモルファスラクトースガラスのガラスの転移温度Tgとエンタルピー緩和を,Tg以下の様々な温度(25,60,75,90°C)で2120時間,等温エイジシグした場合の緩和エンタルピーを示差走査熱量計(DSC)を使って調べた。その結果,Tgとエンタルピー緩和が,老化時間と共に,また温度が高いほど早く進行すると分かった。エンタルピー緩和は,Tg(102°C)により近い温度では拡張指数関数的に増加し,室温(25°C)放置では一ヶ月でも大きな変化はなかった。また,Kohlrausch-Williams-watts(KWW)モデルによる解析では十分に実験的なエンタルピー緩和データにフィッティングでき,1ヵ月室温緩和配布パラメータβは,0.81-0.89の範囲にあった。エンタルピー緩和時定数(τ)は,エイジング温度とともに増加しアレニウスプロットから,緩和プロセスの活性化エネルギーが推参された。その結果ラクトースガラスは,他の糖に比べて活性化エネルギーが低いことが判明した,その原因について現在検討中である。
新しい観点にたつアレルギー予防薬を目指した肥満細胞IgE非依存性作用部位の研究

I型即時型アレルギーに関与する肥満細胞は、化学物質、ブラジキニンなどの神経ペプチド、ハチ毒などの刺激によってIgE非依存的に活性化される。IgE非依存性活性化メカニズムはGi_2またはGi_3を介することを特徴とする。しかし、肥満細胞でのIgE非依存性レセプターや作用部位は想定されていない。我々はレクチンの抑制作用から、肥満細胞のIgE非依存性レセプターがN-アセチルグルコサミンを含む糖蛋白質でらうことの間接的な証拠を得た。N-アセチルグルコサミンオリゴマーに親和性を持つチョウセンアサガオレクチン(DSA)は、このIgE非依存性活性化を誘起するレクチンであった。そこでDSAによる肥満細胞活性化を指標として、IgE非依存性経路のアンタゴニストを検索した。細胞表面でのDSAの結合を阻害することにより抑制作用をしめしたものはハプテン糖(キトオリゴ糖、N-アセチルラクトサミン)、N-アセチルグルコサミン特異性レクチンWGA(小麦胚芽レクチン)、STA(ジャガイモレクチン)、PHA-E_4(インゲンマメレクチン)、LEA(トマトレクチン)、PWM(アメリカヤマゴボウレクチン)であった。また、細胞内情報伝達経路の阻害薬であるホスホリパーゼA_2阻害薬、Giの抑制薬である百日咳毒素、塩化ベンザルコニウム、セカンドメッセンジャージブチルcAMPもDSAによる肥満細胞活性化を抑制した。しかしコンパウンド48/80、ブラジキニン、サブスタンスPでの肥満細胞活性化を抑制うるマイナスチャージのヘパリン、de-N-sulfatedヘパリンポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸はDSAでの活性化は抑制しなかった。これらの結果をふまえIgE非依存性受容体のアミノ酸配列や糖鎖の構造を明らかにすれば特異性の高いアンタゴニストの開発に結び付くと考えている。現在、分化の程度が異なる肥満細胞を材料としてIgE非依存性受容体の同定と精度を進めている。アレルギーに関与する肥満細胞は、化学物質、ブラジキニンなどの神経ペプチド、ハチ毒などの刺激によって1gE非依存的に活性化される。1gE非依存性刺激薬は腹腔肥満細胞の様な結合組織型肥満細胞を活性化するが、粘膜型肥満細胞は活性化しない。1gE非依存性活性化メカニズムは、Gi_2またはGi_3を介することを特徴とする。しかし、1gE非依存性レセプターや作用部位は想定されていない。我々はレクチンの抑制作用から、肥満細胞1gE非依存性作用部位が糖蛋白質であると想定した。平成6年度には、以下の結果を得た。1.チョウセンアサガオレクチン(DSA)による肥満細胞活性化:GlcNAcオリゴマー特異性のDSAが糖鎖特異的にラット腹腔肥満細胞を活性化することを見いだした。この活性化はDSAのハプテン糖、その他のGlcNAc特異性レクチン(抑制性レクチン)、百日咳毒素で抑制された。DSAは1gE非依存性刺激の一つであった。2.DSA結合部位の検討:マウス腹腔肥満細胞もDSAによりヒスタミンを遊離した。しかし、マウス骨髄由来肥満細胞は反応性を示さなかった。DSAの結合部位である糖蛋白質をレクチンブロッティンgで比較したところ、80-100KDa付近に差が認められた。これらの糖蛋白質の発現と反応性の関連性を引き続き検討中である。3.ブラジキニン(BK)作用部位の検討:ラット腹腔肥満細胞のBKに対する特異的結合を観察した。

粘膜型の肥満細胞では特異的結合は観察されなかった。BK結合部位はウエスタンブロッティングで検討中である。4.共焦点レーザー顕微鏡を用いた検討:DSAによるラット腹腔肥満細胞活性化が、一過的な細胞内カルシウムイオン濃度上昇と、その後の細胞骨格重合反応であることを明らかとした。この活性化の初期過程はコンパウンド48/80と類似であった。また、抑制性レクチンはDSAでの細胞内カルシウムイオン濃度上昇を抑制した。I型即時型アレルギーに関与する肥満細胞は、化学物質、ブラジキニンなどの神経ペプチド、ハチ毒などの刺激によってIgE非依存的に活性化される。しかし、肥満細胞でのIgE非依存性レセプターや作用部位は想定されていない。我々はレクチンの抑制作用から、肥満細胞のIgE非依存性レセプターがN-アセチルグルコサミンを含む糖蛋白質であることの間接的な証拠を得た(平成6年度実績)。N-アセチルグルコサミンオリゴマーに親和性を持つチョウセンアサガオレクチン(DSA)は、このIgE非依存性活性化を誘起するレクチンであった。そこでDSAによる肥満細胞活性化を指標として、IgE非依存性経路のアンタゴニストを検索した。細胞表面でのDSAの結合を阻害することにより抑制作用をしめしたものはハプテン糖(キトオリゴ糖、N-アセチルラクトサミン)、N-アセチルグルコサミン特異性レクチンWGA(小麦胚芽レクチン)、STA(ジャガイモレクチン)、LEA(トマトレクチン)、PWM(アメリカヤマゴボウレクチン)であった。また、細胞内情報伝達経路の阻害薬であるホスホリパーゼA_2阻害薬、Giの抑制薬である百日咳毒素、塩化ベンザルコニウム、セカンドメッセンジャージブチリルcAMPもDSAによる肥満細胞活性化を抑制した。しかしコンパウンド48/80、ブラジキニン、サブスタンPでの肥満細胞活性化を抑制するマイナスチャージのヘパリン、de-N-sulfatedヘパリン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸はDSAでの活性化は抑制しなかった。これらの結果をふまえIgE非依存性受容体のアミノ酸配列や糖鎖の構造を明らかにすれば特異性の高いアンタゴニストの開発に結び付くと考え受容体の精製を進めた。しかしIgE非依存性受容体は結合親和性が低く本年度の精製は達成されなかった。現在、分化の程度が異なる肥満細胞を材料としてIgE非依存性受容体の同定と精製を進めている。
大マゼラン雲の分子雲の質量関数の観測的研究

前年度の成果をうけて、さらに約2倍感度の高いの観測を行なって、前の結果を確認することに重点をおいた。その結果、以下の事項を確認できた。検出した分子雲のサイズ、線幅、質量の平均値はそれぞれ、45パーセク、7.4km/S、5×10^5太陽質量であり、銀河系内の分子雲の平均値とほぼ同じである。また、本計画の主目的である分子雲の質量スペクトルは、質量の-1.5乗に比例することがわかった。これは、銀河系内の分子雲について求められている値とよく一致している。さらに、両銀河での分子雲の最大質量は2×10^6太陽質量程度と、ほぼ等しいことが明らかになった。これらのことは、大マゼラン雲では、分子雲の質量が銀河系と類似しているにもかかわらず、銀河系には見られない巨大星団を形成していることを意味している。一方、大マゼラン雲ではCO光度が銀河系と比較して3倍程度に低いことがわかった。これは、CO-H_2比が銀河系と比較して3倍程度少ないことを示している。これらの結果は、巨大星団の起源を考えるうえで重要なものであり、今後の理論的研究の指針を与える。特に今回の結果を、巨大星団の一つであるR136領域の星の分布の性質、紫外線強度が高いこと、さらに重元素が約3分の1と少ないこと等を総合すると、巨大星団の形成前駆体と言うべき分子雲の性質について、一定の制約を課すことができる。この時、系内の紫外線の強いへびつかい座領域の性質が参考となると考えられる。本年度は当初の計画通り、^<12>CO(J=1-0)分子スペクトルを用いて大マゼラン雲の全面フルマッピングを行った。大マゼラン雲の主要部、6°×6°の範囲を2分角グリッドでマッピングし合計32,800点の観測を終了した。このように40パーセクという高い空間分解能で、大規模星団の誕生の場である巨大分子雲を大マゼラン雲全域にわたって検出したのは世界でこれが初めてである。本観測により、数万太陽質量以上の分子雲が462個検出された。これらの分子雲のうち3観測点以上の広がりを持つ55個に対して物理量を求め、カタログした。残りのサイズの小さい分子雲については、来年度搭載する230GHz帯受信器を用いて^<12>CO(J=2-1)で高空間分解能観測を行い、より精確な物理量を求める。検出した分子雲のサイズ、線幅、質量の平均値はそれぞれ、45パーセク、7.4km/s、5×10^5M_<【of sun】>であり、銀河系内の分子雲の平均値とほぼ同じである。また、本計画の主目的である分子雲の質量スペクトルは質量の-1.5乗に比例することがわかった。さらに、両銀河での分子雲の最大質量は2×10^6M_<【of sun】>程度と、ほぼ等しいことが明らかになった。これらのことは、大マゼラン雲では分子雲の性質が銀河系と類似しているにもかかわらず、巨大星団を形成していることを意味している。一方、大マゼラン雲ではCO光度が銀河系と比較して3倍程度有意に低いことがわかった。つまり、CO-H_2比が銀河系と比較して3倍程度少ないことが明らかになった。これらの結果は、重元素量の違い、つまり分子雲の冷却効率が星団形成に大きく影響を与える可能性があることを示唆している。

検出した分子雲のサイズ、線幅、質量の平均値はそれぞれ、45パーセク、7.4km/s、5×10^5太陽質量であり、銀河系内の分子雲の平均値とほぼ同じである。また、本計画の主目的である分子雲の質量スペクトルは、質量の-1.5乗に比例することがわかった。これは、銀河系内の分子雲について求められている値とよく一致している。さらに、両銀河での分子雲の最大質量は2×10^6太陽質量程度と、ほぼ等しいことが明らかになった。これらのことは、大マゼラン雲では、分子雲の質量が銀河系と類似しているにもかかわらず、銀河系には見られない巨大星団を形成していることを意味している。一方、大マゼラン雲ではCO光度が銀河系と比較して3倍程度に低いことがわかった。これは、CO-H_N比が銀河系と比較して3倍程度少ないことを示している。これらの結果は、巨大星団の起源を考えるうえで重要なものであり、今後の理論的研究の指針を与える。特に今回の結果を、巨大星団の一つであるR136領域の星の分布の性質、紫外線強度が高いこと、さらに重元素が約3分の1と少ないこと等を総合すると、巨大星団の形成前駆体と言うべき分子雲の性質について、一定の制約を課すことができる。この時、系内の紫外線の強いへびつかい座領域の性質が参考となると考えられる。
地球環境変動が極地潮沼生物相に与える影響評価

本研究は平成14年17年の4年間、主に南極の湖沼調査によって得られた湖沼生物の試・資料、湖底堆積物、コアサンプル、観測データを解析し、南極の現地の湖沼生物相の変動を探ることによって、地球環境変動が極地湖沼の生物相への影響評価を解析することを目的としている。これまでの生物相と地史的変遷・湖底の堆積物の解析により、湖沼および湖底の生物層は湖沼の地史的変遷に対してどの様な変化を遂げてきたのか、今日の湖沼生物相は権威環境の変動をどのように評価し得るのかを明らかにした。また、湖水の水塊構造、水サンプルによる栄養塩、溶存酸素量、電気伝導度、PH等の物理・化学的性質を分析し、湖沼環境と物質循環過程を明らかにした。本研究では湖水や屁の性質、湖水の温度や塩分、堆積物組成等の地史学的データによって湖沼群の類型化を試みた。すなわち氷河融水を直接受ける湖、氷河融水が河川を通じて流入している湖、雪氷の融水のみを受ける湖、および海水起源の湖水で排水口のない湖の4タイプに分けられた。湖のタイプによって特徴ある生物相を特つことが明らかになった。南極湖沼にはコケ類とシアノバクテリアからなる搭状の特異な形態を特つ底生植物群落、"コケボウズ(Moss Pillar)"が見出され、そのサイズ、年齢、シュート密度、乾燥重量、炭素量、窒素量、クロロフィル量などが測定された。コケボウズの年代測定によると、20cmで約250年を経過していることが分かった。また、コケボウズを取り巻く徹生物相については今後、8S/16SrDNAを含むゲノム解析を行う予定であるが、バイオマーカー脂肪酸によって予備的に解析すると、上部の外皮は今なお成長しているコケ類で構成されているが、上部内側はグラム染色+の細菌、下部内側はグラム染色-の細菌が優占するという興味深い事実が明らかになった。東南極のリュツォ・ホルム湾の昭和オアシスは、淡水湖高塩分塩湖まで多種多様な湖沼が多数分布する。本年度の研究により約32の湖沼が水質調査および採泥調査の解析の結果、湖水の塩分や堆積物の特徴から以下の4つのタイプに分類された。Type1:氷河融水を直接受ける湖夏季に多量の氷河融水の流入を受けるため、湖水の塩分は非常に低く、0.02psu以下である。また、水温も低く、夏季でも3°C以下である。Type2:氷河融水を間接的に受ける湖氷河融水が河川を通じて流入している湖で、湖水の塩分は0.1psu以下の淡水である。冬季の湖水温は34°Cである。夏季の後半の短い期間では、約8°Cまで湖水が上昇する。Type3:氷河融水を受けず、雪氷の融水のみを受ける湖流域に氷河のない湖沼で、冬期に積った氷田の融水が流入している湖である。湖水の流入量が少なく、塩分が0.12.0psuの淡水低塩分塩湖を示す。湖水温はType2と同様な挙動を示す。Type4:海水起源の湖水で排水口のない湖湖水面の標高は25m以下で、完新世に海洋から孤立した湖である。更に、南極昭和オアシスのスカルブスネスにあるすりばち池の水からDMSO可能細菌の分離を試み、いくつかの単独コロニーを得た。一方、16SrRNAをPCRによって増幅させ、塩基配列の決定を行い、種の同定を行った。すりばち池の8m試料からは、4種の細菌の存在が示唆された。

すりばち池の微生物群集の特徴は、南極ベストフォルドヒルにある部分循環高塩湖、エクホ(Ekho)湖およびオーガニック(Organic)湖の底泥の微生物群集と類似していることが解った。本年度は主に、南極湖沼の底に見出された典型的なコケ坊主(Moss Pillar)の構造について集中的に解析された。昭和基地周辺スカルブスネスのB4池から採取された資料に基づき、そのサイズ、年齢、シュート密度、乾燥重量、炭素量、窒素量、クロロフィル量などが計測された。コケ坊主は主に蘚類ナシゴケ(Leptobryum pyriforme)のシュートで成り立っていた。コケ坊主の上部はこのコケの緑色部で占められ、コケ坊主の下部は本種の無性繁殖体、いわゆる仮根帯に付着したチューバーで覆われていた。コケ坊主の内部はほとんど空洞になっており、著しく分解が進んでいるものと思われた。コケ坊主の内部の乾燥重量、炭素量、窒素量、クロロフィル量は全体で一様ではなく、上部で高い傾向にあった。このことはコケ坊主の上部で著しく成長が進んでいることを物語っていた。コケ坊主の年齢は上から20cm下部で250年を経過していることが理解できた。このようにB4池の水生コケの存在は検出が不可能なぐらい貧栄養な南極の湖沼において、驚くべき成長量があることを示している。一方、昭和基地周辺の宗谷海岸の73の湖沼について調査した結果、いずれの湖沼においても2種の蘚類が生育していることが確認できた。淡水池の38池でオオハリガネゴケ(Bryum pseudotriquetrum)が確認され、26池でナシゴケが確認された。ナシゴケの生育は完全な淡水池ではなくて、やや塩分を含む湖水においても見出だされた。ナシゴケはこれまでに、南極半島、クイーンモードランドに確認されているが、とくに昭和基地周辺における分布はスカルブスネスを中心にやや広がりつつある。本種の南極における分布の中心はどこにあるのか、それらがどのように分布を拡大してきたのかを南極域全体で調査検討する必要があろう。本研究では南極の昭和オアシスの湖沼から採取された堆積物コア中の地質学的、生物学的および化学的解析により、古環境変動と生物変遷を推定した。昭和オアシスの堆積物コアについてはAMS法により年代測定を行った。また、南極湖沼から得られた好冷性バクテリアの研究も行った。南極昭和オアシスのなまず池(長さ40cm)および大池(長さ32cm)の堆積速度は、それぞれ30および59y/cmで、コア底の堆積年代は、それぞれ1、200および2、000年前と見積もられた。なまず池の堆積物コアではTOC濃度が1030%と非常に高く、堆積物コアの大部分がコケを含むシアノバクテリアルマットから構成されていることを示している。TOC/TN比は深度3827cmまでは約10と低いが、25cmから表層に向かって急激に大きくなり1218となっている。コケを含む藻類マットのTOC/TN比はかなり高いので、約25cm(700年前)の深度から現在に向かってはコケ植物が出現し繁茂してきたことを強く示唆する。大池の堆積物コアではTOC濃度はなまず池と比較するとかなり低く(213%)、シアノバクテリアルマットばかりでなく土砂成分がかなり含まれている。TOC/TN比は10程度でシアノバクテリアルマットの値を示しており、大池にはコケ植物が分布していないことと一致する。TOC濃度は深度23cm(1、400年前)と5cm(200年前)では約3%と著しく低く、この時期は降雪が多く周辺から融雪水が土砂とともに流入したためと思われる。
睡眠時無呼吸症候群による低酸素ストレスと夜間頻尿発症メカニズムの解明

・マウス膀胱上皮培養細胞、膀胱平滑筋培養細胞、膀胱ex vivoカルチャー組織における時計遺伝子発現変化と、低酸素によって誘導される各種タンパク、酵素類の概日リズムを測定し、時計遺伝子リズム異常との関連を調べる。・上記組織に低酸素刺激を負荷し、誘発される概日リズム障害を調べる。・夜間頻尿モデルである時計遺伝子変異マウス(Clock mutantマウス)を用い、上記で得られた結果とClock mutantマウスの結果を比較する。・時計遺伝子代謝に作用する薬剤投与による膀胱の時計遺伝子リズム改善作用を確認する。・骨盤内低酸素モデルのラットを用い、生体外で得られた実験結果と比較する。
MRIによる温熱冷凍療法下における人体内温度分布の非侵襲画像計測に関する共同研究

本研究では各種温熱・冷却治療に臨床利用可能な温度分布画像計測の確立を目指した.平成11年度は主に要素技術の開発と評価を行った.基礎実験として前立腺肥大症患者からの摘出組織片を高分解能NMR装置(9.4T)にて観測し,そのスペクトル周波数の温度変化を観測した.この結果,コリン・クレアチン・クエン酸のピークの周波数は温度変化がなく,これらを基準として水のピークの周波数を観測することにより,内部基準を使った温度計測が可能であることがわかった.超高速磁気共鳴分光画像化法(EPSI)の磁場系列をハーバード大学のMRI装置(1.5T)での使用に合わせて最適化した.東海大学で作成したプログラムをネットワークを通じてハーバード大学の磁場系列開発用コンピュータに転送した.シミュレーターによるチェックの後,申請者が当地に赴いて動作試験ならびに実験を行った.エチレングリコールファントムでは,10s程度の撮像時間で20cmx20cmの観測視野を被う32x32ボクセルにおける良質なプロトンスペクトルを得,本磁場系列が所期の動作を達成していることが確認された.本法にて健常ボランティアの前立腺を観測した結果前立腺ならびに近傍組織を特徴づけるスペクトルを得ることができた.また脳腫瘍のレーザー手術において位相画像化法を用いた温度分布画像化を試験する機会を得,レーザーによる加温部位の位置,大きさならびに大体の温度上昇値を可視化した画像を得ることに成功した.平成12年度は代謝物質を内部基準とした温度分布画像化法をさらに検討した.まず超高速磁気共鳴分光画像化法を線状掃引型(LSEPSI)として,磁場の不均一性に対する耐性を高めた.さらに動物用の3T-MRI用プローブコイルの作製方法に工夫を加えて,コイル特性を改善した.これらの結果,20mMのクエン酸ファントム,10mMのNAA(N-アセチルアスパラ銀酸)ファントムにおいて温度の分布とその時間変化を可視化できる自己参照型の温度分布画像化に成功した.さらにこのLSEPSIにより家兔大脳内部の温度分布を,NAA基準で画像的に計測することができた.脳内のNAA濃度は10mM程度であり,この程度の低濃度の物質であっても内部基準として利用可能なことを世界に先駆けて示した.さらにヒトボランティアにおいて脳内の水-NAA間のプロトン化学シフトを測定し,その値が脳内の場所ならびに個体によって0.05ppm程度のばらつきを有することを見出した.このばらつきは温度に換算して5°C程度の差となるがこのような温度差が生理的状態にある脳では考えられないことから,脳内で絶対温度分布の計測は困難であることが示唆された.以上より本研究では外部基準法・内部基準を合わせて数多くの重要な所見を得ると共に,臨床温度分布画像化法のための基礎技術開発とその適用方法を確立し,所期の目的を達成することができた.本研究では各種温熱・冷却治療に臨床利用可能な温度分布画像計測の確立を目指した.平成11年度は主に要素技術の開発と評価を行った.基礎実験として前立腺肥大症患者からの摘出組織片を高分解能NMR装置(9.4T)にて観測し,そのスペクトル周波数の温度変化を観測した.この結果,コリン・クレアチン・クエン酸のピークの周波数は温度変化がなく,これらを基準として水のピークの周波数を観測することにより,内部基準を使った温度計測が可能であることがわかった.超高速磁気共鳴分光画像化法(EPSI)の磁場系列をハーバード大学のMRI装置(1.5T)での使用に合わせて最適化した.東海大学で作成したプログラムをネットワークを通じてハーバード大学の磁場系列開発用コンピュータに転送した.シミュレーターによるチェックの後,申請者が当地に赴いて動作試験ならびに実験を行った.エチレングリコールファントムでは,10s程度の撮像時間で20cmx20cmの観測視野を被う32x32ボクセルにおける良質なプロトンスペクトルを得,本磁場系列が所期の動作を達成していることが確認された.本法にて健常ボランティアの前立腺を観測した結果前立腺ならびに近傍組織を特徴づけるスペクトルを得ることができた.また脳腫瘍のレーザー手術において位相画像化法を用いた温度分布画像化を試験する機会を得,レーザーによる加温部位の位置,大きさならびに大体の温度上昇値を可視化した画像を得ることに成功した.平成12年度は代謝物質を内部基準とした温度分布画像化法をさらに検討した.まず超高速磁気共鳴分光画像化法を線状掃引型(LSEPSI)として,磁場の不均一性に対する耐性を高めた.さらに動物用の3T-MRI用プローブコイルの作製方法に工夫を加えて,コイル特性を改善した.これらの結果,20mMのクエン酸ファントム,10mMのNAA(N-アセチルアスパラ銀酸)ファントムにおいて温度の分布とその時間変化を可視化できる自己参照型の温度分布画像化に成功した.さらにこのLSEPSIにより家兔大脳内部の温度分布を,NAA基準で画像的に計測することができた.脳内のNAA濃度は10mM程度であり,この程度の低濃度の物質であっても内部基準として利用可能なことを世界に先駆けて示した.さらにヒトボランティアにおいて脳内の水-NAA間のプロトン化学シフトを測定し,その値が脳内の場所ならびに個体によって0.05ppm程度のばらつきを有することを見出した.

このばらつきは温度に換算して5°C程度の差となるがこのような温度差が生理的状態にある脳では考えられないことから,脳内で絶対温度分布の計測は困難であることが示唆された.以上より本研究では外部基準法・内部基準を合わせて数多くの重要な所見を得ると共に,臨床温度分布画像化法のための基礎技術開発とその適用方法を確立し,所期の目的を達成することができた.本共同研究では,脳及び肝腫瘍のレーザー手術・冷凍手術,前立腺肥大症の超音波温熱療法及び乳房繊維腺腫の超音波手術に臨床利用可能な温度分布画像計測の確立を目指している.平成11年度は主に要素技術の開発と評価を行った.まず要素技術として超高速磁気共鳴分光画像化法の磁場系列をハーバード大学のMRI装置での使用に合わせて最適化した.東海大学の研究室のコンピュータを使ってプログラミングを行い,ネットワークを通じてハーバード大学のMRI装置(1.5T)の磁場系列開発用コンピュータにプログラムを転送した.シミュレーターを使ってチェックを行った後申請者が当地に赴き,動作試験ならびに実験を行った.人体組織を模擬したエチレングリコールファントムによる動作試験では,10s程度の撮像時間で20cmx20cmの観測視野を被う32x32ボクセルにおける良質なプロトンスペクトルを得,本磁場系列が所期の動作を達成していることが確認された.本法にて健常ボランティアの前立腺を観測した結果前立腺ならびに近傍組織を特徴づけるスペクトルを得ることができた.当地においてはさらに脳腫瘍のレーザー手術において位相画像化法を用いた温度分布画像化を試験する機会を得た.レーザーによる加湿部位の位置,大きさならびに大体の温度上昇値を可視化した画像を得た.一方,本邦における基礎実験として前立腺肥大症患者からの摘出組織片を高分解能NMR装置(9.4T)にて観測し,そのスペクトル周波数の温度変化を観測した.この結果,コリン・クレアチン・クエン酸のピークの周波数は温度変化がなく,これらを基準として水のピークの周波数を観測することにより,内部基準を使った温度計測が可能であることがわかった.以上を踏まえて来年度は治療法ならびに臓器毎の温度計測上の問題点を絞り,臨床応用を基準に考えた検討を行う予定である.本共同研究では各種温熱・冷却治療に臨床利用可能な温度分布画像計測の確立を目指した.主に要素技術の開発と評価を行った平成11年度の結果に基づいて,平成12年度は代謝物質を内部基準とした温度分布画像化法をさらに検討した.超高速磁気共鳴分光画像化法を線状掃引型(LSEPSI)として,磁場不均一性に対する耐性を高めた.動物用の3T-MRI用プローブコイルの作製方法に工夫を加えて,コイル特性を改善した.これらの結果,20mMのクエン酸ファントム,10mMのNAAファントムにおいて,温度の分布とその時間変化を可視化できる自己参照型の温度分布画像化に成功した.さらにこのLSEPSIにより家兔大脳内部の温度分布を,NAA基準で画像的に計測することができた.
マウス胎児耳胞への遺伝子導入による遺伝性難聴(コネキシン30)の治療法開発

EGFPが付加されたCx30プラスミドを購入し、正常マウス耳胞(E11.5)へCx30遺伝子を注入し、エレクトロポレーション法により遺伝子導入した。E18.5、P30の時点で蝸牛を摘出し、凍結切片を作成し、蝸牛へCx30遺伝子が導入されていることを確認した。また、エレクトロポレーション法による遺伝子導入後の蝸牛の聴覚機能・形態をABR、サーフェスプレパレーションにて確認し、遺伝子導入による異常が生じないことを確認した。先天性難聴には様々な要因があるが、そのうち50%程度は遺伝性難聴によるものと言われている。遺伝性難聴の治療法は未だ存在せず、現在存在するのは人工内耳による代償治療のみとなっている。根本的な治療としては、遺伝子導入による治療法が検討されている。本研究では「胎生期内耳(耳胞)へ正常な遺伝子を導入することにより、遺伝子欠失による難聴の発現は抑制可能である」という仮説を立て、このことをヒトの遺伝子難聴モデルであるコネキシン30(Cx30)ノックアウトマウスを用いて検証することを目的としている。方法としては、キシラジン、ケタミンにてマウスを全身麻酔後、開腹を行い胎児を子宮とともに体外へ露出する。露出した子宮を自作の手術台に置き、下方よりファイバー光源で照らしながら耳胞を確認し、ガラス管をつないだマイクロマニピュレータを用いてプラスミドを注入する。遺伝子導入法として、ウイルスベクター、リポフェクション、エレクトロポレーションなどの方法がある。2008年にGubblesらが正常マウスの胎生期内耳へエレクトロポレーション法を用いて、Atoh1遺伝子を導入し、機能を持った有毛細胞が新生したと報告した。我々も、エレクトロポレーション法により胎生期内耳への遺伝子導入を試み、遺伝子治療を目指している。今後、熊本大学生命資源研究・支援センターにて凍結保存を行っているCx30ノックアウトマウス(Cx30-LacZ)を、同センターにて胚の融解、胚移植、産子を作出する。作出したCx30ノックアウトマウスが難聴マウスであることを聴性脳幹反応を用いて確認し、同マウスに正常Cx30遺伝子を導入し、これにより形態的・機能的異常の発現が抑制されるかどうかを検討する。遺伝性難聴の治療法は未だ存在せず、現在存在するのは人工内耳による代償治療のみである。方法としては、キシラジン、ケタミンにてマウスを全身麻酔後、開腹を行い胎児を子宮とともに体外へ露出し、下方よりファイバー光源で照らしながら耳胞を確認し、ガラス管をつないだシリコンチューブを用いてプラスミドを注入する。遺伝子導入法として様々な方法があるが2008年にGubblesらが正常マウスの胎生期内耳ヘエレクトロポレーション法を用いて、Atoh1遺伝子を導入し、機能を持った有毛細胞が新生したと報告した。我々は現在までに、正常マウスの胎生期内耳へGFP遺伝子を導入することに成功し、同胎児が成熟した際に、内耳において形態的・機能的異常が発現しないことをサーフェスプレパレーション、聴性脳幹反応(ABR)を用いて確認した。また、既にCx30プラスミドを作製し、凍結胚より作出したCx30ノックアウトマウスの産子にも成功している。今後、Cx30ノックアウトマウスが難聴マウスであることをABRを用いて確認し、同マウスに正常Cx30遺伝子を導入し、これにより形態的・機能的異常の発現が抑制されるかどうかを検討する。
マグネット用高温超伝導材料の微細組織制御と高臨界電流密度化

高い臨界電流密度をもつ安定なマグネット材料としては酸化物超伝導体を金属と複合することが有効である。そこでY系およびBi系銀シ-ス材をとりあげ,実用可能な特性をもつ超伝導複合材料を実現するために制御すべき材料科学的諸因子を解明し,その知見をもとに合理的な作製プロセスを検討してきた。本年度の研究実績は次のようであった。(1)Bi2223の標準組成をほずかずつづらし組織の変化を調べた。Srを増加させ,CaとCuを減少させると2212相が増加した。一方逆方向に組成をずらすと(Sr,Ca)_2CuO_3や(Sr,Ca)_3Cu_5O_xなどの相が増加した。Jcを最適にする組成はBi/Pb/Sr/Ca/Cu=1.6/0.4/1.6/2.0/2.8となった。(2)銀シ-スBi2223テ-プ材を種々な加工法と熱処理の組合せで作製し,Jcを最大にするTMT法を検討した。カセットロ-ラダイスとプレスの組合せがJcを最大にし,線引加工や左延は組織を不均一にするため不適当であることが明らかとなった。加工度を大きくするほどJcは高くなるが,77KのJcと4.2Kでの値との間に正の相関があることが見出された。(3)YBCO超伝導体に種々な酸化物を添加したところ,いくつかの系で複合酸化物が形成され,とくにBaSnO_3は粒内Jcを著しく増加させることが明らかとなった。13モルのSnO_2の添加により焼結密度は6g/cm^3以上になり,結晶粒は微細化されることも明らかとなった。(4)銀シ-スYBCOテ-プ材について室温で引張試験を行ったところ,多重破断現象が観察された。この現象を2因子ワイブル分布を仮定して解析を行ったところ破断応力とひん度因子の間にはよい相関があり,それよりワイブルパラメ-タを決めることができた。これよりテ-プ材の強度の予測がある程度可能となった。これらの実験値をテ-プ材を高強度化するための方策について検討を行った。
リボソームＲＮＡ分解による昆虫細胞の抗ウイルス応答

これまでに,核多角体病ウイルス(NPV)感染によって,全タンパク質合成停止となりウイルスの増殖が抑制されるカイコ培養細胞(BM-N細胞)において,rRNAが分解減少することを報告した.本研究では,全タンパク質合成停止の分子機構の解明を目的として,rRNA分解に関わるRNase遺伝子と,RNase活性を調節しているRNaseインヒビターの遺伝子の同定と機能解析を行った.さらに,BM-N細胞で増殖できるカイコNPVから,rRNA分解を回避する因子の同定を行った.これまでに,核多角体病ウイルス(NPV)感染によって,全タンパク質合成停止となりウイルスの増殖が抑制されるカイコ培養細胞(BM-N細胞)において,rRNAが分解減少することを報告した.本研究では,全タンパク質合成停止の分子機構の解明を目的として,rRNA分解に関わるRNase遺伝子と,RNase活性を調節しているRNaseインヒビターの遺伝子の同定と機能解析を行った.さらに,BM-N細胞で増殖できるカイコNPVから,rRNA分解を回避する因子の同定を行った.本課題は,アメリカシロヒトリ核多角体病ウイルス(NPV)感染によって誘導されるカイコBM-N細胞のrRNAの分解機構を解析することによって,NPV感染細胞が発動する全タンパク質合成停止の分子機構を明らかにすることを目的としている.動物細胞において,小胞体ストレスに応答して誘導される翻訳抑制に,28S rRNAの切断が関与していることが報告されている.rRNAの切断には,IRE1βと呼ばれるI型膜貫通キナーゼ/リボヌクレアーゼである小胞体タンパク質が機能している.そこで,本研究ではIRE1βのカイコ相同体cDNAを探索し,その機能解析を行った.まず,ショウジョウバエで同定されているIRE1相同体のアミノ酸配列を用いて,カイコゲノムのデータベースを検索した結果,IRE1相同体をコードする遺伝子(BmIRE1)の存在が見出された.そこで,BmIRE1 cDNAをRACE法によりクローニングした.得られたcDNAは1020アミノ酸残基からなるタンパク質をコードし,N末端側から膜貫通ドメイン,セリン/スレオニンキナーゼドメイン,RNaseドメインを持つことがわかった.BmIRE1 cDNAを発現ベクターに挿入し,BM-N細胞で一過性発現を行い,rRNAの分解を調査した.その結果,BmIRE1の発現はウェスタンブロット法により確認できたが,rRNAの分解は認められなかった.さらに,BmIRE1の発現をRNAi法によりノックダウンさせたBM-N細胞を用いて,NPV感染により誘導されるrRNAの分解が抑制されるかどうかを調査した.その結果,BmIRE1のノックダウンによるrRNA分解への影響はほとんど認められなかった.したがって,今回の結果から,BmIRE1がNPV感染BM-N細胞に誘導されるrRNAの分解に関与していることを示すことはできなかった.本課題は,アメリカシロヒトリNPV感染によって誘導されるカイコ由来BM-N細胞のrRNAの分解機構を解析することによって,NPV感染細胞が発動する全タンパク質合成停止の分子機構を明らかにすることを目的としている.平成25年度は,1エンドリボヌクレアーゼBmIRE1のインヒビターであることが予想されるBmRLIの同定と機能解析と,2rRNA分解を誘導するウイルス因子P143のドメイン解析を中心に行った.まず,1については,BM-N細胞から,BmRLI遺伝子のクローニングを行った.BmRLI遺伝子を発現プラスミドに挿入し,BM-N細胞に一過性発現させることにより,rRNA分解の抑制活性を調査した.その結果,Autographa californica(AcMNPV)感染により誘導されるrRNA分解に対して,抑制活性は認められなかった.そこで,AcMNPVおよびカイコNPVをそれぞれBM-N細胞に感染させて,各ウイルス感染細胞におけるBmRLI遺伝子の発現変動を調査した.その結果,rRNA分解が誘導されないカイコNPV感染では,BmRLI遺伝子のmRNA量は,感染時間に伴って増加する傾向が認められたのに対し,AcMNPV感染細胞では,感染後24時間においてBmRLI遺伝子のmRNA量は減少した.したがって,阻害因子であるBmRLIの発現は,rRNA分解誘導とパラレルに減少していることが示された.2については,rRNA分解を誘導するAcNMNPVのP143(Ac-P143)と,rRNA分解を誘導しないカイコNPVのP143(Bm-P143)の組換えタンパク質をBM-N細胞で発現することにより,Ac-P143のrRNA分解誘導に関わるドメインの解析を行った.その結果,Ac-P143タンパク質の宿主特異性決定に関わるドメインが,rRNA分解に関与していることが示された.本課題は,アメリカシロヒトリ核多角体病ウイルス(NPV)感染によって誘導されるカイコBM-N細胞のrRNAの分解機構を解析することによって,NPV感染細胞が発動する全タンパク質合成停止の分子機構を明らかにすることを目的としている.本年度は,初年度に同定したI型膜貫通キナーゼ/リボヌクレアーゼのカイコ相同遺伝子であるBmIRE1の機能解析を中心に行った.動物細胞のIRE1αおよびショウジョウバエのIRE1は,転写因子であるXBP1のmRNAのスプライシングを行い,スプライシングを受けたXBP1 mRNAは翻訳され,小胞体シャペロン群の転写を誘導する.そこで,カイコのXBP1相同遺伝子(BmXBP1)を同定し,BmIRE1によるBmXBP1 mRNAのスプライシング活性を調査した.まず,BmIRE1遺伝子を一過性発現させたBM-N細胞において,BmXBP1 mRNAのスプライシングは検出されなかった.

しかし,BM-N細胞をツニカマイシン処理することによって小胞体ストレスを誘導した場合にも,BmXBP1 mRNAのスプライシングは検出されなかった.したがって,カイコではIRE1によるXBP1 mRNAのスプライシングは保存されていない可能性がある.そこで,XBP1 mRNAのスプライシングが確認されているショウジョウバエ由来のS2細胞を用いて,BmIRE1遺伝子の一過性発現を行った.その結果,コントロールに用いたEGFP発現プラスミドを導入した細胞においてもショウジョウバエXBP1 mRNAのスプライシングが観察され,一過性発現させたBmIRE1のスプライシング活性を検出することができなかった.本課題は,アメリカシロヒトリNPV感染によって誘導されるカイコBM-N細胞のrRNAの分解機構を解析することによって,NPV感染細胞が発動する全タンパク質合成停止の分子機構を明らかにすることを目的としている.平成23年度は,NPV感染BM-N細胞から,rRNAの分解に関わるエンドリボヌクレアーゼの探索と同定を中心に研究を計画した.まず,候補遺伝子(BmIRE1)のcDNAのクローニングに成功した.つぎに,得られたcDNAを用いて機能解析に着手した.具体的にはcDNAを発現ベクターに挿入し,細胞への一過性発現を行うことによってrRNAが分解されるかどうかを調査した.しかし,今回用いた実験方法ではrRNA分解は認められなかった.さらに,BmIRE1 dsRNAによるRNAi法でノックダウンを行うことにより,rRNA分解が抑制されるかどうかを調査したが,rRNA分解の抑制は認められなかった.したがって,今回クローニングした遺伝子が,rRNA分解に関与しているかどうかは現在のところ不明であり,目的としている遺伝子の同定には至らなかった.25年度が最終年度であるため、記入しない。本課題は,アメリカシロヒトリNPV感染によって誘導されるカイコBM-N細胞のrRNAの分解機構を解析することによって,NPV感染細胞が発動する全タンパク質合成停止の分子機構を明らかにすることを目的としている.平成24年度は,1これまでにクローニングしたエンドリボクヌレアーゼの候補遺伝子,BmIRE1の機能解析と,2rRNA分解を誘導するウイルス因子の同定,3細胞側のウイルス認識因子の探索と同定,rRNA分解までのシグナル伝達を計画した.1については,BmIRE1にエンドリボヌクレアーゼ活性が保存されているかどうかを種々の方法を用いて検討したが,活性を検出するには至らなかった.rRNAの分解に関わるエンドリボヌクレアーゼの同定は,当初の計画よりも大幅に遅れている.一方,2のNPVのrRNA分解の誘導に関わる因子に関しては,p143遺伝子に着目して研究を進めた.アメリカシロヒトリNPVに加えて,AcMNPV,クワゴマダラヒトリMNPV,ハスモンヨトウMNPVのP143によりrRNA分解が誘導されること,一方,カイコNPVのP143は誘導しないことを明らかにした.
六君子湯の食欲亢進作用の細胞内メカニズムの解明

六君子湯は複数の機序によりグレリンシグナルを増強し、食欲不振を改善する。本研究では、グレリンの細胞内エフェクターであるAMPKおよびSIRT1の関与について検討を行った。グレリン受容体(GHSR1a)を発現している培養細胞に六君子湯を添加したところ、SIRT1蛋白量の増加およびSIRT1活性の上昇が認められた。また、六君子湯を投与したICRマウスにおいて心臓のSIRT1蛋白量増加と視床下部SIRT1活性の上昇が認められた。さらに、六君子湯を長期間連日投与したマウスでは、コントロールと比較して有意な寿命の延長が認められた。六君子湯は食欲改善作用に加えて抗加齢作用を有する可能性が示唆される。癌化学療法や悪液質にともなう食欲不振の病態解明は遅れており、有効な治療法も確立していない。これまで申請者らは、六君子湯およびその成分が、複数の機序によりグレリンシグナルを増強し、食欲不振を改善することを報告してきた。しかしながら、グレリンの細胞内エフェクターであるAMP依存性蛋白質リン酸化酵素(AMPK)およびNAD依存性脱アセチル化酵素1(SIRT1)に対する六君子湯の直接作用の有無は検討されていない。本研究はこの点を明らかにすることを目的とする。以上より、少なくとも細胞レベルにおいては、六君子湯がSIRT1およびAMPK活性を増強することが確認された。平成25年度は、in vivoにおける検討を行い、マウス視床下部のSIRT1およびAMPK活性に及ぼす六君子湯の影響を解析した。8週齢の雄性ICRマウスに六君子湯(1,000mg/Kg)を4日間経口投与し、視床下部および末梢臓器(心臓等)を摘出した。Total RNAを抽出し、ランダムプライマーを用いてcDNAへ逆転写した後、リアルタイムPCRにてSIRT1のmRNA定量を行った。また、凍結された視床下部および末梢臓器の一部は、ホモゲナイズした後、SIRT1に対する特異抗体を用いてwestern blottingを行った。SIRT1蛋白量およびその活性は、特異的ELISA(AdipoGen:Sirtuin 1 Intracellular ELISA Kit)およびSIRT1活性測定キット(CycLex)にて測定を行った。その結果、心臓においてSIRT1蛋白量が増加することが明らかとなった。また視床下部においてはSIRT1蛋白量の変動は認められなかったが、蛋白量当りのSIRT1活性が上昇する傾向が認められた。本研究では、グレリンの細胞内エフェクターであるAMP依存性蛋白質リン酸化酵素(AMPK)およびNAD依存性脱アセチル化酵素1(SIRT1)の関与について検討を行った。まず、グレリン受容体(GHSR1a)を発現している培養細胞(HUVEC、安的的にGHSR1aを発現させたHEK293細胞)に六君子湯を添加したところ、SIRT1蛋白量の増加およびSIRT1活性の上昇が認められた。さらに、六君子湯はGHSR1a依存的、かつグレリンと相乗的に細胞内cAMP上昇、CREBリン酸化、CREレポーター活性化をきたすことが明らかとなった。以上より、六君子湯はcAMP-CRE経路の活性化を介してSIRT1蛋白を増加させる可能性が示唆された。また、六君子湯がAMPKのリン酸化を促進し、SIRT1蛋白がAICARで増加、Compound Cで減少したことから、六君子湯によるSIRT1蛋白増加にはAMPKの活性化も関与している可能性が示唆された。次に、1618週齢の雄性ICRマウスに六君子湯(1,000mg/Kg)を4日間経口投与し、視床下部および末梢臓器を摘出し、SIRT1蛋白量およびその活性を、特異的ELISAおよびSIRT1活性測定キットを用いて測定を行った。その結果、視床下部においてSIRT1活性の有意な上昇が認められた。さらに、六君子湯(420 mg /kg/日および850 mg /kg/日)を長期間連日投与したマウスでは、コントロールと比較して有意な寿命の延長が認められた。

六君子湯は食欲改善作用に加えて抗加齢作用を有する可能性が示唆される。AMPKについての検討が未施行である。内科系臨床医学・消化器内科学AMPKについて、SIRT1と同様の検討を行う。アセチル化リジン抗体を用いた免疫沈降ーウェスタンブロットの結果が安定して得られないため。平成26年度は、雄性C57BL6マウスに六君子湯を経口投与した後、視床下部および末梢臓器(肝臓等)のSIRT1およびAMPKの定量あるいは活性測定を行う。この実験により、細胞レベル明らかとなった六君子湯の効果が、個体レベルにおいても観察されるかどうかを明らかにする予定である。