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真核生物におけるＤ型アミノ酸の機能と制御機構の解明

様々な神経疾患との関連が示唆され、ある種の神経疾患におけるマーカーとして利用できる可能性があるD-セリンの96ウェルプレートに対応した簡便・迅速な酵素定量キットを開発し、これを用いたヒト尿中D-Ser動態を解析した。また、セリンラセマーゼ、D-セリンデヒドラターゼ両酵素の触媒機構を詳細に解析し、細胞性粘菌における両酵素の欠損株の作製とその解析を行った。哺乳類の推定D-Asp合成酵素(アスパラギン酸ラセマーゼ、Got1l1)の酵素学的解析、欠損マウスの解析を行い、同タンパク質が哺乳類におけるD-Aspの主要な合成酵素でない可能性を見出した。本年度は、我々が以前、出芽酵母より見出したD-セリン特異的分解酵素、D-セリンデヒドラターゼ、を用いたD-セリンのハイスループット定量キットの上市を完了した。本法は96ウェルを用いたD-セリンデヒドラターゼと乳酸脱水素酵素の共役アッセイ系であり、ヒト尿中などに含まれるD-セリンを迅速、簡便に定量可能である。また、真核微生物におけるD-セリンの新規機能解明を目的として、細胞性粘菌に存在するD-セリン代謝関連酵素すなわち、セリンラセマーゼ、D-セリンデヒドラターゼの欠損株を作製し、さらに同欠損株の相補株も所得した。一方で、これら遺伝子破壊株をベースとした多重破壊株創出を目的とし、両欠損株における薬剤耐性カセットの除去も行った。これら欠損株を用いて相補株の生育や発達過程へ影響を検証した。さらにリアルタイムPCRによる各D-セリン代謝酵素の発現プロファイル解析を行った。これら解析の結果、D-セリンの制御が細胞性粘菌の発達過程ー特にSlug形成過程前後ーにおいて極めて重要な意義を有する可能性が示された。これらと並行して、哺乳類のD-アスパラギン酸合成酵素と示唆されるアスパラギン酸ラセマーゼ(DR)の酵素学的解析や同遺伝子のノックアウトマウスを用いた、脳、海馬、精巣などのD-アスパラギン酸量を含めたアミノ酸分析を行った。本年度は、現在までに構築した二種類のD-Ser酵素定量法(すなわち試料中D-Serを出芽酵母由来D-セリンデヒドラターゼ(Dsd1p)により特異的にピルビン酸へ変換し、その後、乳酸脱水素酵素(LDH)、もしくはピルビン酸オキシダーゼと共役させることで定量する酵素定量法)の臨床利用を目指し、LDHを用いた酵素定量法の96穴プレートへの適用、およびそのキット化に取り組み、これを完了した。これにより本定量法を用いたヒト尿中D-Serの簡便なスクリーニングが可能となった。なお、本定量法キットは、上市の準備を進行している。さらに、本キットを利用し、少人数の被験者の、尿中D-Serの日内、日間変動の解析を実施した。また、Dsd1pの構造、機能相関の解明を目指し、Dsd1pの結晶化を試みた。本酵素の結晶析出条件の検討が難航したため、分裂酵母、バクテリア由来オーソログの過剰発現系の構築に取り組み、これを完了した。また、Dsd1pにおけるピリドキサールリン酸のピリジン環窒素に相互作用する残基(Y203)に着目した触媒機構解析を行い、本酵素反応がE2機構によって進行している可能性を示した。哺乳類におけるD-アスパラギン酸の機能解析の為に、バキュロウイルス-昆虫細胞系、およびピキアを用いたマウス推定アスパラギン酸ラセマーゼ(DR)の発現系を検証した。しかしながら、いずれの場合も目的タンパク質を可溶画分に得ることはできなかった。このため、哺乳類細胞を用いた発現系の構築を検証することとした。哺乳類におけるアスパラギン酸ラセマーゼとして報告されたGot1L1が、真に哺乳類のD-Asp合成酵素であるかを検証した。Got1L1ノックアウトマウスの作出と組織中D-アスパラギン酸量の定量、また、リコンビナントタンパク質の調整とそのin vitroにおける酵素活性を検証した。その結果、Got1L1ノックアウトマウスの海馬や精巣におけるD-アスパラギン酸レベルは野生型酵素と、ほぼ同レベルであることが判明した。さらに、調整したリコンビナントタンパク質が、報告されたようなアスパラギン酸ラセマーゼ活性を有さないことが明らかとなった。以上の結果、少なくともGot1L1が哺乳類における主要なD-アスパラギン酸合成酵素ではないことを明らかとした。また、D-アミノ酸経口投与の腸内細菌層への影響についても検証した。腸内細菌叢は発ガンや生活習慣病などヒトの健康状態との関与が示唆されており、加齢や食餌成分によって変動することが報告されている。D-アスパラギン酸またはD-セリン混合餌を投与し、マウス糞便からDNAを抽出し、リアルタイムPCR法、DGGE法で解析した。

D-アスパラギン酸が全バクテリア数に対するFirmicutes門バクテリア比率を減少させることや、Bacteroidetes門バクテリア比率を増加させる可能性を見いだした。特に、Clostridium属細菌やLactobacillus属バクテリアを減少させる傾向が認められた。生化学酵素学本研究課題は本年度(1)血中D-セリンの定量を可能とする高感度D-セリン定量酵素定量法のキット化、(2)細胞性粘菌D-セリン代謝関連酵素のノックアウト株の作製とそのフェノタイプ解析、酵素学的解析を予定していた。(1)については尿中D-セリンの定量が可能となる簡便、迅速なD-セリン酵素定量キットの上市を果たしたものの、血中阻害因子の簡便な除去法の確立が難航した。(2)については、セリンラセマーゼ、D-セリンデヒドラターゼの欠損株の作製が完了し、また、来年度予定していた、これら株の多重破壊株作製を目指した薬剤耐性除去株も構築した。さらに、各欠損株の相補株についても作製が完了し、フェノタイプの解析を進行している。これに加え、来年度に予定していた、推定アスパラギン酸ラセマーゼ(DR)欠損株の各臓器のD-アスパラギン酸を含めたアミノ酸分析にも着手している。以上から、(1)の研究計画については若干遅延しているものの、それ以外においては概ね順調、もしくはそれ以上の進展で研究が進行していると考えている。本研究課題は今年度、(1)D-セリン酵素定量法のキット化と、それを用いた動態解析。(2)Dsd1pの構造、触媒機構の解析。(3)DRの発現系の構築とその性状解析。について実施を予定していた。以下にその達成度を述べる(1):ほぼ予定通りか、それ以上のスピードで、研究が進行した。(2): Dsd1pの結晶化条件の検討に難航した為、そのターゲットをDsd1pから、そのオーソログへ変更することとした。オーソログの発現系は構築が完了し、その構造解析を引き続き検討する予定である。一方で、Dsd1pの触媒機構の解析は、予想以上の進展がみられた。(3):DRリコンビナントタンパク質の異種発現系の構築は難航した。哺乳類細胞を用いたリコンビナントタンパクの所得を目指している。全体の進行状況としては、概ね順調に進行していると考えている。今後の研究の推進方法として、前項(1)、血中D-セリンの定量を可能とする高感度D-セリン定量酵素定量法のキット化については、今後引き続き検討を続ける。それ以外の項目については、研究実施計画に沿った研究遂行が可能である。また、現在までに我々が得たデータから、哺乳類アスパラギン酸ラセマーゼについては、過去に示唆された酵素(DR)以外のD-アスパラギン酸合成酵素が存在する可能性が提起されている。この知見は非常に興味深く、より詳細なDRノックアウトの影響を解析するとともに、D-アスパラギン酸生合成の全容解明を目指していきたい。平成25年度は、(1)臨床利用を目指した、血清中D-セリン量の酵素定量法のキット化、(2)細胞性粘菌D-セリン代謝関連酵素の欠損株作製と、そのフェノタイプの検証、およびこれらD-セリン代謝酵素の性状解析の実施を予定している。また、前年度において未達となった、Dsd1pの構造解析、DRリコンビナントタンパク質の発現系の構築、およびその性状解析についても取り組む予定である。研究の進捗状況と旅費の使用額が予算と比べ少ないことによる。
継承階層prologを核とした知識表現言語の作成

本研究では,豊かな表現力と高速な推論機能とを持った知識表現言語PAL89を作成した。この知識表現言語の核は,継承階層PrologーPALである。継承階層PrologーPALが可能としているクラス集合束縛変数は,自然言語処理などの意味表現にとって非常に自然で強力な道具を提供している。本研究では,これを発展させた制約論理型言語PAL89を実現した。その特徴は,1.クラス束縛変数の機能を大幅に拡大した。すなわち,(1)クラス束縛変数をマルチクラスに拡大して,多重継承に当る処理などを宣言的に自然に実現した。(2)継承階層コンパイラや継承階層インデキシングの機能を実現し,さらなる高速化を図った。2.コンスパタ-にもクラス(タイプ)を導入し,「typed prolog」を定式化し,その理論を与え,PAL89に実装した。これにより,継承階層PrologーPALはさらに機能が拡大された。これは,例からの学習や,自然言語仕様からのプログラム合成などのシステムを実現することによって,極めて有用な枠組みであることが実証された。3.制約付き変数が導入された。これにより,ユ-ザ-は,既存のオブジェクトとはユニフィケ-ションが異なる新しいオブジェクトを制約付き変数として自由に導入できる。これは,デュアル・プログラミング(まずオブジュクトを定義し,次にそれらの関係を論理プログラミングするという,2段階のプログラミング)を可能にした。1.はじめに、研究計画にあわせて実績の概要を述べる。(1)最良優先探索、仮説推論の2つの機構が作成された。(2)知識表現言語PALの仕様と実現方法の全体設計が行なわれた。(3)上記(1)で作成された2つの機構と、メインとなる継承階層Prologを持ちより、ワークステイション上に総合システムPALが構築された。(4)自然言語処理実験システムTALKを統合システムPAL上に構築し、統合システムの動作の検証とデバッグを行なった。また、データベース問い合せプログラムや、言語による図形操作プログラムを移植し、動作を確認した。また、ユーザーズ・マニュアルの作成を開始した。(5)次年度のシステム改善のために、TALKを基礎とした自然言語処理システムを設計開発中である。2.システムの機構に関するものとしては、以下の研究項目が達成された。(1)マルチクラスを含む集合束縛変数の機構、(2)黒板機構、(3)継承階層コンパイラ機構、(4)継承階層クローズインデキシング機構、(5)最良優先探索機構、(6)仮説推論機構3.得られた主な知見は次の通りである。(1)知識表現言語PAL上では、自然言語理解の基本構造である段階的詳細化過程を簡単かつ明解に実現できる。また得られた自然言語処理システムは高速である。(2)マルチクラスなどを含む集合束縛変数は、段階的詳細化の要である。(3)黒板による処理は、照応などの高度なプログラムを書くのに非常に便利である。(4)記述をエレガントに保ったまま、処理をさらに高速化するために、部分計算の機構を言語の基本的な要素の1つとして取入れることが有効である。4.平成元年度は、(1)応用システムを試作し、知識表現言語PALを改善洗練する、(2)新たに重要性が判明した機能(部分計算機構、言語処理のための最良優先探索アルゴリズム)についての、実現技術についての検討と試作、評価を行う、(3)試作された言語機能のうち、最終的に何を残せばよいかの取捨選択を行う、(4)ユーザーズ・マニュアルの作成と改良と印刷を行なう。本研究では、豊かな表現力と高速な推論機能とを持った知識表現言語PAL89を作成した。この知識表現言語の核は、継承階層Prolog-PALである。継承階層Prolog-PALが可能としているクラス集合束縛変数は、自然言語処理などの意味表現にとって非常に自然で強力な道具を提供している。本研究では、これを発展させた制約論理型言語PAL89を実現した。

その特徴は、1.クラス束縛変数の機能を大幅に拡大した。すなわち、1クラス束縛変数をマルチクラスに拡大して、多重継承に当る処理などに宣言的に自然に実現した。2継承階層コンパイラや継承階層インデキシングの機能を実現し、さらなる高速化を図った。2.コンスパタ-ンにもクラス(タイプ)を導入し、「typed prolog」を定式化し、その理論を与え、PAL89に実装した。これにより、継承階層Prolog-PALはさらに機能が拡大された。これは、例からの学習や、自然言語仕様からのプログラム合成などのシステムを実現することによって、極めて有用な枠組みであることが実証された。3.制約付き変数が導入された。これにより、ユ-ザ-は、既存のオブジェクトとはユニフィケ-ションが異なる新しいオブジェクトを制約付き変数として自由に導入できる。これは、デュアル・プログラミング(まずオブジェクトを定義し、次にそれらの関係を論理プログラミングするという、2段階のプログラミング)を可能にした。
ロボットマニピュレータのセンサレス力制御に関する研究

センサレス力制御に関する本研究は,問題を接触力のセンシングとその制御に大別して進めた.1.接触力推定機構の構成(1)外乱オブザーバの手法に基づき,伝達系のねじれトルクおよびアーム角を利用した接触力推定機構を構成した.このとき,ねじれトルクの検出にはトルク計および動ひずみ測定器を用いた.(2)次に,アームおよびモータの角度情報のみにより接触力推定機構を構成し,その性能をロードセル・計装用増幅器による接触力の直接計測と比較した結果,両場合ともオブザーバの帯域内では良好な推定性能を有することが確認できた.(3)しかしながら,(2)の場合にはロボットの正確な物理パラメータが事前情報として必要となった.2.トルク制御系の構成アーム角情報を利用して伝達系のねじれトルクを制御する制御系を外乱オブザーバの手法に基づいて構成したが,パーソナルコンピュータを用いたシミュレーションの段階で,オブザーバの推定遅れのために良好な制御性能が達成できないことが判明した.3.センサレス力制御系の構成(1)トルク制御系の構成が実現できなかったので,接触力推定機構により算出した接触力を利用したモデル規範型適応制御系(MRACS)を構成し,これによりセンサレス力制御系を構成した.(2)制御対象が非最小位相系となったため,zオペレータを用いたMRACSでは制御系が不安定となった.(3)そこで,δオペレータを用いてMRACSを構成したところ,異なる剛性を持つ種々の対象物に対して良好な力制御が実現できた.センサレス力制御に関する本研究は,問題を接触力のセンシングとその制御に大別して進めた.1.接触力推定機構の構成(1)外乱オブザーバの手法に基づき,伝達系のねじれトルクおよびアーム角を利用した接触力推定機構を構成した.このとき,ねじれトルクの検出にはトルク計および動ひずみ測定器を用いた.(2)次に,アームおよびモータの角度情報のみにより接触力推定機構を構成し,その性能をロードセル・計装用増幅器による接触力の直接計測と比較した結果,両場合ともオブザーバの帯域内では良好な推定性能を有することが確認できた.(3)しかしながら,(2)の場合にはロボットの正確な物理パラメータが事前情報として必要となった.2.トルク制御系の構成アーム角情報を利用して伝達系のねじれトルクを制御する制御系を外乱オブザーバの手法に基づいて構成したが,パーソナルコンピュータを用いたシミュレーションの段階で,オブザーバの推定遅れのために良好な制御性能が達成できないことが判明した.3.センサレス力制御系の構成(1)トルク制御系の構成が実現できなかったので,接触力推定機構により算出した接触力を利用したモデル規範型適応制御系(MRACS)を構成し,これによりセンサレス力制御系を構成した.(2)制御対象が非最小位相系となったため,zオペレータを用いたMRACSでは制御系が不安定となった.(3)そこで,δオペレータを用いてMRACSを構成したところ,異なる剛性を持つ種々の対象物に対して良好な力制御が実現できた.
防災教育の観点を導入した野外調査・地域学習の指導修得モデルの構築のための開発研究

本研究では、教員養成課程の学生のための防災教育の観点を導入した野外調査・地域学習の授業モデルを構築した。具体的には、流域生活圏の野外調査における巡検モデルの構築、災害地名や災害景観に着目した地域学習における授業モデルの構築、歴史学習と連携させたESD(持続可能な開発のための教育)の観点を導入した地域学習における教材モデルの開発などである。とくに地域学習における授業モデルは、防災教育として、また地歴連携を考えるうえで、発展的な研究につながる意味で意義あるものとなっている。教員養成課程における授業開発として、防災教育の観点を導入した野外調査・地域学習の指導修得モデルの構築と実施にあたった。具体的には、研究項目1流域圏の野外調査における指導修得のための授業モデルの構築と実施、研究項目2流域生活圏の災害地名や災害景観に着目した地域学習における授業モデルの構築と実施、研究項目3歴史学習と融合させたESDの観点を導入した地域学習における指導修得のための教材モデルの開発である。研究項目1では、木曽三川流域の自然環境と輪中地帯の流域生活圏を対象として、基礎的な野外調査のための巡検を授業や演習等で実施し、受講者の気づきや感想を踏まえて、授業モデルの構築と検証をはかることができた。研究項目2では、災害地名や災害景観のある事例に関して、地理学系の学会での研究発表や、「川の国土の未来ー防災教育のあり方ー」をテーマとしたシンポジウムで研究報告し、意見交流を踏まえて、授業モデルの構築と検証をはかることができた。研究項目3では、砺波平野流域や三波川地帯、美濃街道や西国街道等、歴史学習と融合させたESDの観点を導入した地域学習における教材モデルの開発のための現地調査を実施することができた。とくに、地すべり地の棚田に着目した地域教材や、防災の観点を盛り込んだ都市計画からみた地域教材等を開発し、研究論文として発表した。また、ESDに関しては、教育系の学会による「地理教育としてのESDへのアプローチ」のテーマのシンポジウムで、コメンテーターを務めた。教員養成課程における授業開発として、防災教育の観点を導入した野外調査・地域学習の指導習得モデルの構築にあたった。具体的には、身近な地域の学習や地域学習の活性化をはかるために、研究項目1流域生活圏の野外調査における指導習得のための授業モデルの構築、研究項目2流域生活圏の災害地名や災害景観に着目した地域学習における授業モデルの構築である。研究項目1では、木曽三川流域の自然環境と輪中地帯の流域生活圏を対象として、基礎的な野外調査のための巡検を実施した。観察対象は、おもに沖積平野と輪中地帯の特質の関わるもので、歴史学習との融合をはかった学習内容とした。研究項目2では、「押切」「押堀」「抜山」「津波」などの災害地名や災害景観のある事例をとりあげ、教材の開発に必要な文献や史料、地形図、絵図(古地図)、景観写真などを活用した開発教材を作成し、授業モデルとして提示し、論文として発表した。事例地域である長野県(七会地区)の野外調査では、災害地名や災害景観が確認でき、来年度における授業モデル構築のための教材開発の見通しを立てることができた。また、四国の中央構造線に関わっては、防災教育の観点から、教材開発の方向を検討し、論文として発表した。加えて、多自然川づくりに関わる河川環境の教材開発では、防災的な視点からも言及し、論文として発表した。研究期間全体を通して、教育養成課程の学生を対象した授業開発として、防災教育の観点を導入した野外調査・地域学習の指導修得モデルの構築と実施にあたった。最終年度は、研究項目2流域生活圏の災害地名や災害景観に着目した地域学習における授業モデルの構築と実施、および、研究項目3歴史学習と融合させたESDの観点を導入した地域学習における指導修得のための教材モデルの開発を行った。研究項目2では、境川(旧木曽川)流域の自然環境と輪中地域の流域生活圏を事例地域として、地域観察のための巡検を教員養成課程の学生を対象とした授業や演習などで実施した。地域観察のための観察ポイントを設問形式で具体化するとともに、補助線を用いた観察ポイント(断面図作成)のまとめ方などを開発して、教材モデルとしての学習効果を明らかにした。また、長野市七二会地区の地すべり地形を事例地域として、教育学部学生向けの巡検モデルを検討し、写真教材などで学習効果を検証した研究論文を発表した。研究項目3では、瀬戸内・島嶼地域の持続性を考える地域教材の開発として、沖家室(周防大島)を事例地域とした「沖家室(周防大島)の人びとと暮らし」の授業プランを作成し、授業や演習などで実施した。また、震災などから都市計画の意義を考える地域教材の開発として、東京(首都圏)をおもな事例地域とした「震災などからみた都市の防災・減災」の授業プランを作成し、授業や演習で実施した。研究期間全体を通して、災害地名や災害景観に着目した防災教育として意義のある授業プランを提示できたことは大きい。

また、歴史学習と融合させた地域教材は、地歴融合を考えるうえで発展的な研究につながる意味で、意義のあるものとなった。研究項目13で開発した内容は、関連学会などでその成果を報告(発表件数5)し、研究論文として発表(論文件数9(うち査読付論文5)、図書1)した。社会科教育本年度、実施予定の研究項目2流域生活圏の災害地名や災害景観に着目した地域学習における授業モデルの構築と実施、研究項目3歴史学習と融合させたESDの観点を導入した地域学習における指導修得のための教材モデルの開発については、ほぼ達成できたため、おおむね順調に進展していると判断できる。また、事例地域である砺波平野流域や三波川地帯、美濃街道や西国街道等、歴史学習と融合させたESDの観点を導入した地域学習における教材モデルの開発のための現地調査が実施できたことも大きい。加えて、これらの事例地域に関わって、防災教育の観点から教材モデルを提示した論文を発表できたこともある。本年度、実施予定の研究項目1流域生活圏の野外調査における指導習得のための授業モデルの構築、研究項目2流域生活圏の災害地名や災害景観に着目した地域学習における授業モデルの構築については、ほぼ達成できたため、おおむね順調に進展していると判断できる。また、事例地域である長野県(七会地区)の野外調査では、災害地名や災害景観が確認でき、来年度における授業モデル構築のための教材開発の見通しが立ったことも大きい。さらに、四国の中央構造線や多自然川づくりに関わっても、防災教育の観点から論文を発表できたこともある。研究項目1と研究項目2を踏まえて、研究項目3砺波平野流域や三波川地帯、美濃街道や西国街道等、歴史学習と融合させたESDの観点を導入した地域学習における指導修得のための教材モデルの開発を実施していく。とくに、開発した教材モデルは、授業や演習等で実施し、受講生の気づきや感想を踏まえて、学習効果を明らかにしていく。また、研究項目1と研究項目2については、継続して開発した教材モデルを検証し、現地調査を補充し、地域学習における指導修得のための教材モデルの発展的な修正をはかる。研究項目13で開発した教材モデルは、関連学会などで発表し、発表内容を含めて報告書にまとめ、公表していく。現在までの研究項目1と研究項目2を踏まえて、新たな研究項目3歴史学習と融合させたESD(持続発展教育)の観点を導入した地域学習における指導習得のための教材モデルの開発を実施する。研究項目3で実施するのは、応用的な野外調査の観察項目・作業内容を構築するための、防災的観点からみたこれからの地域づくりのための野外調査、都市計画図やハザードマップなどの読解、歴史的な自然災害などの把握と考察である。また、研究項目2は継続して、現在までに開発した教材の検証を実施し、現地での野外調査を補充し、地域学習における指導習得のための教材の発展的な修正をはかる。開発した教材は、関連学会で論文として発表する。現地調査に関わる必要な記録メディアや関連図書等の購入時期を一部次年度にしたため、次年度の使用額が生じた。研究項目2と3に関わる現地調査を実施するため、必要な記録メディアや調査・研究旅費を使用計画としている。
高等植物細胞での液胞への蛋白質輸送の分子機構

高等植物細胞における液胞は,動物細胞でのリソソーム様機能を持つのみならず,貯蔵タンパク質として知られる一連の蛋白質を液胞内に多量に蓄積することにより,アミノ酸源の貯蔵部位としても働くことが知られている.この液胞への蛋白質蓄積機構の解析の過程で,我々は,サツマイモ貯蔵タンパク質スポラミン前駆体N-末端プロペプチドが液胞への輸送シグナルとして機能すること,プロ型前駆体の形で粗面小胞体上で合成されたプロスポラミンはゴルジ装置で分泌系から仕分けされた後に液胞へと輸送され液胞内でプロ領域が切断除去されることにより成熟型スポラミンとして蓄積すること等を見出している.本研究では,プロスポラミン等を用い,液胞への蛋白質輸送系の分泌系からの仕分けに関わる構造体と仕分けに関わる分子の同定を行うことにより,蛋白質の植物液胞への輸送の分子機構を解明することを目的としている.本年度は,上記の機構の解析のために,スポラミン前駆体の液胞へ輸送に関わる分子の検索を行った.in vitroで生育させたサツマイモ幼植物体の葉を6%庶糖溶液に浮かべて3日間インキュベートすると,サツマイモ塊根に匹敵する量のスポラミンの蓄積が観察される.この処理を22°Cという低温で行うことにより,抗スポラミン抗体および抗プロペプチド抗体を用いた免疫ブロットでの解析の結果,プロ型スポラミン前駆体の蓄積も観察された.22°Cで庶糖処理した葉を出発材料としてゴルジ装置に富む画分を調製したところ,この画分にプロスポラミンが濃縮される事を見出した.そこで,この画分にDSS,EGS等のクロスリンカーを作用させる事により,SDS-PAGEにより見かけの分子量53kDaに泳動されるスポラミンと他の蛋白質の複合体を特異的に検出することができた.クロスリンカーを作用させた膜画分をアルカリや高濃度の塩処理によりこの複合体は膜画分に回収されたことから,この複合体はプロスポラミンとゴルジ装置の約30kDaの膜蛋白質との複合体であり,この30kDaの膜蛋白質はスポラミン前駆体の液胞への仕分けにかかわる分子の侯補である事を見出した.高等植物細胞における液胞は,動物細胞でのリソソーム様機能を持つのみならず,貯蔵タンパク質として知られる一連の蛋白質を液胞内に多量に蓄積することにより,アミノ酸源の貯蔵部位としても働くことが知られている.この液胞への蛋白質蓄積機構の解析の過程で,我々は,サツマイモ貯蔵タンパク質スポラミン前駆体N-末端プロペプチドが液胞への輸送シグナルとして機能すること,プロ型前駆体の形で粗面小胞体上で合成されたプロスポラミンはゴルジ装置で分泌系から仕分けされた後に液胞へと輸送され液胞内でプロ領域が切断除去されることにより成熟型スポラミンとして蓄積すること等を見出している.本研究では,プロスポラミン等を用い,液胞への蛋白質輸送系の分泌系からの仕分けに関わる構造体と仕分けに関わる分子の同定を行うことにより,蛋白質の植物液胞への輸送の分子機構を解明することを目的としている.本年度は,上記の機構の解析のために,スポラミン前駆体の液胞へ輸送に関わる分子の検索を行った.in vitroで生育させたサツマイモ幼植物体の葉を6%庶糖溶液に浮かべて3日間インキュベートすると,サツマイモ塊根に匹敵する量のスポラミンの蓄積が観察される.この処理を22°Cという低温で行うことにより,抗スポラミン抗体および抗プロペプチド抗体を用いた免疫ブロットでの解析の結果,プロ型スポラミン前駆体の蓄積も観察された.22°Cで庶糖処理した葉を出発材料としてゴルジ装置に富む画分を調製したところ,この画分にプロスポラミンが濃縮される事を見出した.そこで,この画分にDSS,EGS等のクロスリンカーを作用させる事により,SDS-PAGEにより見かけの分子量53kDaに泳動されるスポラミンと他の蛋白質の複合体を特異的に検出することができた.クロスリンカーを作用させた膜画分をアルカリや高濃度の塩処理によりこの複合体は膜画分に回収されたことから,この複合体はプロスポラミンとゴルジ装置の約30kDaの膜蛋白質との複合体であり,この30kDaの膜蛋白質はスポラミン前駆体の液胞への仕分けにかかわる分子の侯補である事を見出した.
造血系シグナル伝達における細胞質チロシンキナーゼ及び核移行転写制御因子の特異性

エリスロポエチン(EPO)の自然標的細胞である赤芽球系細胞において、エリスロポエチン受容体(EPOR)の下流のJAKファミリーとSTATファミリー遺伝子の発現を解析した。検索対象は、フェニルヒドラジンで誘導された貧血症マウスの脾腫から分離された正常とみなされる赤芽球系細胞と、Friend白血病ウィルス(多血症株)で誘導されたマウス脾腫から分離された赤芽球系細胞を用い、それぞれをTER119抗体を指標に分画した標品について純度が得られた。これらの細胞においてEPOR特異抗体で沈降する蛋白をJAKファミリーの抗体で検索したところ、前者では、EPO依存性にJAK2、STAT5がチロシン燐酸化され、STAT5は核内へ移行し、STAT5A、Bが結合するGAS配列、PRE配列と特異的に結合した。後者では、EPOの有無に拘わらず、JAKI、STAT5が恒常的にチロシン燐酸化されていたが、STAT5は核内移行を示さず、従ってSTAT5の結合するGAS、PRE配列とは結合できなかった。この系にEPOを添加したところSTAT5は瞬時に核移行を示し、EPOとの共働ではじめて増殖シグナルを送ることが初めて示され、ウィルス性白血病発症における、ウィルス遺伝情報とサイトカインシグナルの強調した機能発揮が明らかにされた。今後EPO/EPOR、gp55/EPORを介するSTAT5のチロシン燐酸化状態の差を同蛋白の燐酸化、アミノ酸の同定を含め検討したい。他方、フレンド白血病細胞系ではEPOR下流のRas機能を打ち消すDN-Rasを導入・発現させると分化が誘導され、MAPK回路がこの現象に関与していることが示され、現在、各種阻害剤を用いてその詳細を検討している。エリスロポエチン(EPO)の自然標的細胞である赤芽球系細胞において、エリスロポエチン受容体(EPOR)の下流のJAKファミリー、STATファミリーを解析した。検索対象は、フェニルヒドラジンで誘導された貧血症マウスの脾腫から分離された赤芽球系細胞と、Friend白血病ウイルス(多血症株)で誘導されたマウス脾腫から分離された赤芽球系細胞で、夫々、81%、92%の純度を保っていた。前者では、EPO依存性に、JAK2,STAT5がチロシン燐酸化され、STAT5は核内へ移行し、STAT5が結合するIRF-1プロモーターのGAS配列、β-カゼインプロモーターのPRE配列と特異的に結合した。後者では、EPOの有無に関わらず、JAK1,STAT5が恒常的にチロシン燐酸化されていたが、STAT5は核内移行を示さず、従ってSTAT5の結合するGAS,PER配列とは結合できなかった。従ってFriend白血病ウイルスのgp55(env由来)はEPORに結合するが、JAK1は恒常的にチロシン燐酸化するもののこの経路で恒常的にチロシン燐酸化するSTAT5は核に移行せず、従って、他の転写因子が増殖に使われているらしい。今後、EPO/EPOR,gp55/EPORを介するSTAT5の燐酸化状態を明らかにしたい。検討対象は、フェニルヒドラジンで誘導された貧血症マウスの脾腫から分離された正常とみなされる赤芽球系細胞と、Friend白血病ウイルス(多血症株)で誘導されたマウス脾腫から分離された赤芽球系細胞を用い、それぞれをTER119抗体を指標に分画したところ81%、92%の純度が得られた。これら細胞においてEPOR

特異抗体で沈降する蛋白をJAKファミリーの抗体で検索したところ、前者では、EPO依存性にJAK2、STAT5がチロシン燐酸化され、STAT5は核内へ移行し、STAT5が結合するIRF-1プロモーターのGAS配列、β-カイゼンプロモーターのPRE配列と特異的に結合した。後者では、EPOの有無に拘わらず、JAK1、STAT5が恒常的にチロシン燐酸化されていたが、STAT5は核内移行を示さず、従ってSTAT5の結合するGAS、PRE配列とは結合できなかった。従ってFriend白血病ウイルスのgp55(env由来)はEPORに結合するが、JAK1は恒常的にチロシン燐酸化するもののこの経路で恒常的にチロシン燐酸化するSTAT5は核に移行せず、EPOとの共働ではじめて核移行をし、増殖シグナルを送るらしい。今後EPO/EPOR、gp55/EPORを介するSTAT5のチロシン燐酸化状態を明らかにしたい。他方、フレンド白血病細胞系ではEPOR下流のRas機能を打ち消すDN-Rasを導入・発現させると分化が誘導され、MARK回路が増殖に関与していることが示された。エリスロポエチン(EPO)の自然標的細胞である赤芽球系細胞において、エリスロポエチン受容体(EPOR)の下流のJAKファミリーとSTATファミリー遺伝子の発現を解析した。検索対象は、フェニルヒドラジンで誘導された貧血症マウスの脾腫から分離された正常とみなされる赤芽球系細胞と、Friend白血病ウイルス(多血症株)で誘導されたマウス脾腫から分離された赤芽球系細胞を用い、それぞれをTER119抗体を指標に分画した標品について純度が得られた。これら細胞においてEPOR特異抗体で沈降する蛋白をJAKファミリーの抗体で検索したところ、前者では、EPO依存性にJAK2、STAT5がチロシン燐酸化され、STAT5は核内へ移行し、STAT5A、Bが結合するGAS配列、PRE配列と特異的に結合した。この系にEPOを添加したところSTAT5は瞬時に核移行を示し、EPOとの共働ではじめて増殖シグナルを送ることが初めて示され、ウイルス性白血病発症における、ウイルス遺伝情報とサイトカインシグナルの強調した機能発揮が明らかにされた。今後EPO/EPOR、gp55/EPORを介するSTAT5のチロシン燐酸化状態の差を同蛋白の燐酸化、アミノ酸の同定を含め検討したい。他方、フレンド白血病細胞系ではEPOR下流のRas機能を打ち消すDN-Rasを導入・発現させると分化が誘導され、MAPK回路がこの現象に関与していることが示され、現在、各種阻害剤を用いてその詳細を検討している。
BSO結晶の二光波混合による位相格子の書込み研究

酸化ケイ素ビスマス(Bi_<12>SiO_<20>;BSOと略記)結晶の二光波混合による光増幅度をBSO結晶の結晶構造と関連づれて測定を行なうとともに、結晶光学的観点から測定結果の解析をした。1.光増幅度の二光波混合内角依存性二光波干渉により結晶内に形成する位相格子の格子間隔は、二光波間の内角に依存し、内角値で1315度,格子間隔で23μmにおいて最大の光増幅度を得た。格子間隔と光増幅度の相関はH.Kogelnikの回折理論から説明できることを検証した。2.二光波照射面と光増幅度二光波間の内角を14度に固定し、BSO結晶を〈ITO〉軸を中心に回転して得られる光増幅が回転角に大きく依存するという新しい知見を見いだした。光増幅の回転角依存性は、BSO結晶のもつ屈折率異方性による回折効率の変化から解析できることを明らかにした。3.直流電界の印加方向と光増幅度回析効率を高め、光増幅度を大きくするために、二光波混合でフォトリフラクティブ効果により誘起される電場をさらに外部からの直流電圧印加により大きくした。2.で得られた結果を踏まえ、以下の新しい知見を得た。BSO結晶を〈ITO〉軸を中心に回転し、光増幅が増加する回転角域では、印加電圧の増加とともに光増幅度は大きくなり、5KV/cm以上で飽和傾向がある。一方、光増幅が増加しない回転角域では、電圧を印加したにもかかわらず光増幅は起こらない。外部場印加による結晶回転角と光増幅との関係は、電場印加方向と結晶内に形成される位相格子の移動方向とに依存することで説明できた。
複雑流体における熱交換メカニズムの分子論的解明および高効率熱輸送媒体の設計開発

2018年度は,プログラムの拡張,計算モデルおよびパラメータの妥当性の確認を行った.粘度の計算に関しては,これまでの研究において開発済みであった仮想的密度勾配法を用いたプログラムを利用した.具体的には,添加剤として界面活性剤を選択し,管内流れを与えた.まず速度分布,流量,圧力分布を算出し観察したところ,安定した管内流れが再現できていることを確認した.その後,管内の流速,管内壁の化学的な相互作用,界面活性剤濃度を検討パラメータとして変化させたところ,過去の実験と同様の傾向を得ることができた.また,界面活性剤の自己集合構造と粘度の関係性を調査し,ある程度の粘度が制御できることを示した.これらの結果は,投稿論文としてすでに発表されている.熱伝導率の計算に関しては,ナノ粒子分散系を検討した.平衡状態のシミュレーションを行い,Green-Kubo法を用いて熱伝導率の算出を試みた.熱伝導率のナノ粒子体積分率依存性を確認したところ,実験での結果と同様に濃度が増加するとともに,熱伝導率の増加も観察された.その後,ナノ粒子表面の化学的性質に着目し,熱伝導率とナノ粒子が形成する自己集合構造の関係を調べた.具体的には,疎水性ナノ粒子,親水性ナノ粒子,Janus(疎水面,親水面を伏せ持つ)ナノ粒子を用意し,それぞれのナノ流体に関する熱伝導率の濃度依存性を調べた.その結果,熱伝導率はナノ粒子が形成するクラスターサイズに依存することが分かり,ある程度の熱伝導率が制御できることを示した.これらの結果は,投稿論文として現在投稿中である.当初予定していたプログラム開発・拡張とシミュレーションモデルの作成は順調に進めることができている.さらにそれらの妥当性もおおよそ完了している.ナノ流体の粘度に関しては,界面活性剤を添加剤として選択し,界面活性剤の自己集合構造と粘度の関係性に関する投稿論文を出版することができている.一方,熱伝導率に関しては,ナノ粒子表面の化学的性質をパラメータとし,ナノ粒子が形成する自己集合構造と熱伝導率の関係性を調べた.熱伝導率に関する結果は,投稿論文として現在投稿中である.このようにプログラムの拡張,計算モデルおよびパラメータの妥当性の確認にとどまらず,本課題の目的である「ナノ流体における熱交換に関する分子論的なメカニズムの解明」につながる結果が一部出始めているため,当初の計画以上の進展があったとした.再現したシミュレーションをもとに,ナノ流体における熱交換の分子論的なメカニズムを解明する.粘度については,本年度ではナノ粒子分散系を検討する.流動下におけるナノ粒子の扱い方や,実際の系に近づけるためにより大きな計算系を用意するために,プログラムコードの開発を行う.検討パラメータは,ナノ粒子表面の化学的性質,ナノ粒子体積分率,溶媒の疎水性等,流速等を考えている.熱伝導率については,前年度に作成したプログラムを元により多くの検討パラメータを振り,どの因子が熱伝導率の挙動に影響するのかを明らかにする.また非平衡シミュレーションにも取り組む予定である.2018年度は,プログラムの拡張,計算モデルおよびパラメータの妥当性の確認を行った.粘度の計算に関しては,これまでの研究において開発済みであった仮想的密度勾配法を用いたプログラムを利用した.具体的には,添加剤として界面活性剤を選択し,管内流れを与えた.まず速度分布,流量,圧力分布を算出し観察したところ,安定した管内流れが再現できていることを確認した.その後,管内の流速,管内壁の化学的な相互作用,界面活性剤濃度を検討パラメータとして変化させたところ,過去の実験と同様の傾向を得ることができた.また,界面活性剤の自己集合構造と粘度の関係性を調査し,ある程度の粘度が制御できることを示した.これらの結果は,投稿論文としてすでに発表されている.熱伝導率の計算に関しては,ナノ粒子分散系を検討した.平衡状態のシミュレーションを行い,Green-Kubo法を用いて熱伝導率の算出を試みた.熱伝導率のナノ粒子体積分率依存性を確認したところ,実験での結果と同様に濃度が増加するとともに,熱伝導率の増加も観察された.その後,ナノ粒子表面の化学的性質に着目し,熱伝導率とナノ粒子が形成する自己集合構造の関係を調べた.具体的には,疎水性ナノ粒子,親水性ナノ粒子,Janus(疎水面,親水面を伏せ持つ)ナノ粒子を用意し,それぞれのナノ流体に関する熱伝導率の濃度依存性を調べた.その結果,熱伝導率はナノ粒子が形成するクラスターサイズに依存することが分かり,ある程度の熱伝導率が制御できることを示した.これらの結果は,投稿論文として現在投稿中である.当初予定していたプログラム開発・拡張とシミュレーションモデルの作成は順調に進めることができている.さらにそれらの妥当性もおおよそ完了している.ナノ流体の粘度に関しては,界面活性剤を添加剤として選択し,界面活性剤の自己集合構造と粘度の関係性に関する投稿論文を出版することができている.一方,熱伝導率に関しては,ナノ粒子表面の化学的性質をパラメータとし,ナノ粒子が形成する自己集合構造と熱伝導率の関係性を調べた.熱伝導率に関する結果は,投稿論文として現在投稿中である.このようにプログラムの拡張,計算モデルおよびパラメータの妥当性の確認にとどまらず,本課題の目的である「ナノ流体における熱交換に関する分子論的なメカニズムの解明」につながる結果が一部出始めているため,当初の計画以上の進展があったとした.再現したシミュレーションをもとに,ナノ流体における熱交換の分子論的なメカニズムを解明する.粘度については,本年度ではナノ粒子分散系を検討する.

流動下におけるナノ粒子の扱い方や,実際の系に近づけるためにより大きな計算系を用意するために,プログラムコードの開発を行う.検討パラメータは,ナノ粒子表面の化学的性質,ナノ粒子体積分率,溶媒の疎水性等,流速等を考えている.熱伝導率については,前年度に作成したプログラムを元により多くの検討パラメータを振り,どの因子が熱伝導率の挙動に影響するのかを明らかにする.また非平衡シミュレーションにも取り組む予定である.
ロバスト制御のためのモデリングに関する研究

1.制御対象の分母と分子の相対次数が正確にわかると低感度でロバスト安定な制御系が構築できることが知られている.正確な相対次数が得られない場合でも指定した角周波数で低感度でロバスト安定な制御系を構成する方法を提案した.この方法は,制御対象が不安定な場合にも適用できる方法である.この実現には,正確に制御対象の相対次数が得られない場合でも,制御対象に並列に相対次数1の補償器を加えると,見かけ上並列システムの相対次数は1となる.この並列システムを新たな制御対象とみなすと,この制御対象の相対次数が1となり,構築した理論を適用し,低感度でロバスト安定な制御系が達成することができた.(1)1入力1出力のシステムに対するモデリングと制御系設計アルゴリズムを構築し,その成果を学術講演会で口頭発表を行った.(2)多入力多出力のシステムに対するモデリングと制御系設計アルゴリズムを構築し,その成果を学術講演会で口頭発表を行った.(3)この方法の問題点が見つかった.適用可能な制御対象のクラスが狭く,全ての制御対象に適用できるものではなかった.2.理論の有効性を確認する適当な実験装置,3慣性系実験装置を本補助金により製作した.3.提案したアルゴリズムで3慣性系のモデリングを行いシミュレーションを行い,本アルゴリズム有効性を確認した.4.現在,位置制御実験を行っている.実験結果をまとめ,学術論文誌に投稿する予定である.5.本補助金による学術的な成果の一部を,国際会議にて口頭発表を行った.6.今後は,以下の研究をする予定である.(1)閉ループモデリングを用いた,不安定系に対するモデリングと制御系の同時設計を行うアルゴリズムを構築する.(2)適用可能な制御対象のクラスを広くする,もっと一般的な設計手順を構築する.1.制御対象の分母と分子の相対次数が正確にわかると低感度でロバスト安定な制御系が構築できることが知られている.正確な相対次数が得られない場合でも指定した角周波数で低感度でロバスト安定な制御系を構成する方法を提案した.この方法は,制御対象が不安定な場合にも適用できる方法である.この実現には,正確に制御対象の相対次数が得られない場合でも,制御対象に並列に相対次数1の補償器を加えると,見かけ上並列システムの相対次数は1となる.この並列システムを新たな制御対象とみなすと,この制御対象の相対次数が1となり,構築した理論を適用し,低感度でロバスト安定な制御系が達成することができた.(1)1入力1出力のシステムに対するモデリングと制御系設計アルゴリズムを構築し,その成果を学術講演会で口頭発表を行った.(2)多入力多出力のシステムに対するモデリングと制御系設計アルゴリズムを構築し,その成果を学術講演会で口頭発表を行った.(3)この方法の問題点が見つかった.適用可能な制御対象のクラスが狭く,全ての制御対象に適用できるものではなかった.2.理論の有効性を確認する適当な実験装置,3慣性系実験装置を本補助金により製作した.3.提案したアルゴリズムで3慣性系のモデリングを行いシミュレーションを行い,本アルゴリズム有効性を確認した.4.現在,位置制御実験を行っている.実験結果をまとめ,学術論文誌に投稿する予定である.5.本補助金による学術的な成果の一部を,国際会議にて口頭発表を行った.6.今後は,以下の研究をする予定である.(1)閉ループモデリングを用いた,不安定系に対するモデリングと制御系の同時設計を行うアルゴリズムを構築する.(2)適用可能な制御対象のクラスを広くする,もっと一般的な設計手順を構築する.
火炎伝播特性に及ぼす渦核の伸張及び相互干渉効果に関する実験的研究

本研究では,渦核中を伝播する火炎の特性及び渦核が伸張されるような流れ場における渦核中の火炎伝播特性を調べることを目的としている.得られた研究成果をまとめると以下のようになる.1.渦の強さ,渦核の大きさ及び混合気の当量比を変えて,渦核中の火炎伝播特性を測定した.その結果,渦核中の火炎伝播速度は,混合気の不足反応物質のルイス数Leの効果を受け,同一の火炎温度においてもLe<1.0の火炎伝播速度は,Le>1.0のそれより大きな値になる.2.Le<1.0の混合気における渦核内を伝播する火炎の消炎限界は,Le>1.0の混合気の消炎限界より広い.3.渦核内の最大周速度及び火炎面前後の密度比を一定とした場合,ルイス数に依存して火炎速度は2つの値をとる.これは,最大周速度と密度比が決まれば,渦核内の火炎速度が一義的に決まるとするChomiakの理論と大きく異なる.4.渦核内の火炎先端形状を考慮した火炎伝播モデルを用いて算出された火炎速度は,定性的に実験結果と一致するが,定量的には一致しない.従って,渦核中の火炎速度を定量的に予測するためには,渦核内を伝播する火炎の先端形状だけでなく,渦核内の火炎構造や化学動力学的な特性を考慮した火炎伝播モデルを検討する必要がある.5.渦核が伸張すると,渦核内の火炎速度は渦核が伸張されていない場合に比べて,大きく増加する.本研究では,渦核中を伝播する火炎の特性及び渦核が伸張されるような流れ場における渦核中の火炎伝播特性を調べることを目的としている.得られた研究成果をまとめると以下のようになる.1.渦の強さ,渦核の大きさ及び混合気の当量比を変えて,渦核中の火炎伝播特性を測定した.その結果,渦核中の火炎伝播速度は,混合気の不足反応物質のルイス数Leの効果を受け,同一の火炎温度においてもLe<1.0の火炎伝播速度は,Le>1.0のそれより大きな値になる.2.Le<1.0の混合気における渦核内を伝播する火炎の消炎限界は,Le>1.0の混合気の消炎限界より広い.3.渦核内の最大周速度及び火炎面前後の密度比を一定とした場合,ルイス数に依存して火炎速度は2つの値をとる.これは,最大周速度と密度比が決まれば,渦核内の火炎速度が一義的に決まるとするChomiakの理論と大きく異なる.4.渦核内の火炎先端形状を考慮した火炎伝播モデルを用いて算出された火炎速度は,定性的に実験結果と一致するが,定量的には一致しない.従って,渦核中の火炎速度を定量的に予測するためには,渦核内を伝播する火炎の先端形状だけでなく,渦核内の火炎構造や化学動力学的な特性を考慮した火炎伝播モデルを検討する必要がある.5.渦核が伸張すると,渦核内の火炎速度は渦核が伸張されていない場合に比べて,大きく増加する.本研究では、渦核内を伝播する火炎の特性及び渦核が伸張されたり、相互干渉するような流れ場における渦核内の火炎伝播特性を調べ、乱流燃焼を解明するための基礎資料を得ることを目的としている。本年度の研究結果をまとめると以下のようになる。1.渦の強さ、渦核の大きさ及び渦核が相互作用するような渦輪発生装置を製作した。2.渦の強さ、渦核の大きさ及び混合気の当量比を変えて、渦核中の火炎伝播特性を測定した。その結果、渦核中の火炎伝播速度は、混合気の不足反応物質のルイス数の効果を受け、同一の火炎温度においてもLe<1.0の火炎伝播速度は、Le>1.0のそれより大きな値となる。3.Le>1.0の混合気における渦核内を伝播する火炎の消炎は、渦核内の火炎伸張によって決まり、Le<1.0の混合気における消炎は、火炎伸張によるものでない。4.渦核の干渉するパターンは、実験条件によって異なる。従って、各干渉パターンでの渦核の伸張を定量的に評価し、渦核内での火炎伝播速度との関連を詳細に検討する必要がある。本研究では,渦核中を伝播する火炎の特性及び渦核が伸張されたり,相互干渉するような流れ場における渦核中の火炎伝播特性を調べることを目的としている.本年度の研究成果をまとめると以下のようになる.1.渦核内の最大周速度及び火炎面前後の密度比を一定とした場合,ルイス数に依存して,火炎速度は2つの値をとる.これは,最大周速度と密度比が決まれば,渦核内の火炎速度が一義的に決まるとするChomiakの理論と大きく異なる.2.渦核内の火炎先端形状を考慮した火炎伝播モデルを用いて算出された火炎速度は,定性的に実験結果と一致するが,定量的には一致しない.従って,渦核中の火炎速度を定量的に予測するためには,渦核内を伝播する火炎の先端形状だけでなく,渦核内の火炎構造や化学動力学的な特性を考慮した火炎伝播モデルを検討する必要がある.3.渦核が伸張すると,渦核内の火炎速度は渦核が伸張されていない場合に比べて,大きく増加する.以上,本年度の研究結果の一部は,日本機械学会東海支部豊橋地区講演会で発表した.
ユビキチン修飾不良品糖タンパク質の系統的精密化学全合成

細胞内には天然型の立体構造を取れずに正しく機能しない不良品糖タンパク質が生成する。それが蓄積すると病気の原因となるため、ユビキチンープロテアソーム系(UPS)という経路で分解除去される。本研究では、糖タンパク質のUPSによる分解機構を調べるためのプローブとして、ユビキチン化された糖タンパク質を精密化学全合成し、UPSアッセイ系を用いてその分解の様子を分析した。このような巨大で複雑な修飾タンパク質の合成例は世界でもほとんどなく、本研究により世界最先端の合成技術が確立できた。さらに、糖タンパク質の分解経路の研究に合成プローブを用いるという新たな方法論を導入することができた。本研究では、細胞が恒常性を保つため、本来の立体構造を取ることができなかったミスフォールドした糖タンパク質を細胞内から分解除去する経路について詳細に調べることを目的とし、そのプローブとしてミスフォールドしかつユビキチン修飾された分子量2万程度の糖タンパク質の初の全合成を目指している。その要素技術として、1)糖鎖構造の異なる高マンノース型糖鎖の調製とそれを用いた糖ポリペプチド鎖の合成、2)ユビキチン化のためのユビキチンの合成、3)糖ポリペプチドとユビキチンとの連結、が必要である。まず、1)については、すでに調製法が確立しているM9糖鎖に加えてM7糖鎖の分離精製を検討し条件を確立した。今後、M7糖鎖については目的とする分岐構造を持つものかどうか確認する必要がある。2)については、76残基のユビキチンを3つのペプチドセグメントに分割して各セグメントの固相合成に成功した。今後、各セグメントの連結法を検討する。一方、大腸菌発現による合成も検討し、N末端側にタグ配列を入れることで発現が可能であることを確認した。3)については、糖ポリペプチドとユビキチンの連結部位に導入するδ-メルカプトリシンの合成法を検討した。安価なラセミ体のδ-ヒドロキシリシンを出発原料とし、酵素による光学分割を行うルートで固相合成に利用可能なFmoc保護δ-メルカプトリシン誘導体の合成法を確立した。今後、必要量の合成を行い、1,2)のペプチド合成に組み込んで目的とするユビキチン修飾不良品糖タンパク質プローブの合成を目指す。そしてこれを細胞質に導入しその分解状況を追跡する。また、糖鎖構造、ユビキチンの数、位置の異なる一連の糖タンパク質の全合成も検討し、分解経路における糖鎖とユビキチン修飾の関係を全合成を利用し系統的に調べることを目指す。糖タンパク質は天然型の立体構造を取ることで、生体内で酵素などとしての機能を発揮することができる。天然型の立体構造が取れなかった糖タンパク質は、不良品の目印であるユビキチンという小さなタンパク質を付加され分解除去される。本研究では、細胞がその恒常性を保つために備えている、本来の立体構造を取ることができなかった(ミスフォールドした)糖タンパク質を分解する経路を詳細に調べることを目的とし、そのプローブとしてミスフォールドしかつユビキチン修飾された分子量2万程度の糖タンパク質の初の全合成を目指している。そのための要素技術として、昨年度は、1)ユビキチンの合成に必要な3つのペプチドセグメントの合成、2)糖ポリペプチドとユビキチンとの連結に必要なδ-メルカプト-L-リジンの合成法、を確立した。本年度は、1)ユビキチン化を行うためのC-末端を活性化したユビキチン全長ポリペプチド鎖を3つのペプチドセグメントから合成した。また、2)合成したδ-メルカプト-L-リジンを組み込んだCC motif chemokine 1 (CCL1)の糖ペプチド鎖を合成し、δ-メルカプト-L-リジン部位でC-末端を活性化したユビキチン鎖との連結をおこなった。そして、3)ユビキチン修飾された高マンノース型糖鎖を持つ糖タンパク質CCL1全長糖ポリペプチド鎖の合成を達成した。今後、このユビキチン化M9-CCL1のフォールディングを検討し、CCL1部位が天然型の立体構造をもったものとミスフォールドしたものの合成を検討する。そして、CCL1部位の立体構造の解析をおこない、無細胞抽出系を用いて合成プローブが分解されていく経路を調べる予定である。糖タンパク質は天然型の3次元立体構造を取ることで、生体内で酵素などとしてその機能を発揮する。天然型の立体構造が取れなかった(ミスフォールドした)糖タンパク質には、不良品の目印としてユビキチンという小さなタンパク質が付加されて、細胞質にある分解経路により除去される。細胞にはその不良品を分解して捨てる経路があり、その経路がうまく働かず不良品糖タンパク質が細胞内に溜まると病気になる。本研究では、その分解経路を詳細に調べるための分子プローブとして、ユビキチンで修飾されたミスフォールド糖タンパク質の合成をおこなった。昨年度は、ユビキチン修飾された高マンノース型糖鎖を有する糖タンパク質CCL1の全長糖ポリペプチド鎖の合成を達成した。本年度は、化学合成法を確立した高マンノース型糖鎖を有するユビキチン化CCL1全長糖ポリペプチド鎖のさらなる供給をおこなうとともに、酸化還元条件下および還元条件下でのフォールディングを検討し、CCL1部位が天然型の立体構造を取ったもの、およびジスルフィド結合を持たずに天然型の立体構造をとっていないものを作り分けた。さらに、合成したユビキチン化CCL1プローブを市販の無細胞抽出液に添加し、このプローブが分解される様子を質量分析をもちいて観察した。