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7世紀出土文字史料の研究-書風と全国出土遺構に関する情報収集-

近年、7世紀の木簡が相次いで出土しており、『日本書紀』『古事記』などの編纂史料ではわからなかった新たな知見が得られつつある。しかし7世紀木簡に書かれた文字は癖の強いものであり、釈読はたいへん困難を極める。そこで本研究では、全国の7世紀木簡に関する情報を広く収集したうえで、書風を中心に検討をおこなうことにした。本年度も前年度に引き続いて、飛鳥・藤原地域の木簡を中心に整理・研究にあたったが、釈読の過程で全国の文字史料にも広く目配りをした。また、7世紀の荷札木簡全点の最調査をおこない、最新の釈文を提示することができた。具体的な成果は次のとおりである。(1)7世紀の荷札木簡339点を対象とした史料集『評制下荷札木簡集成』(奈良文化財研究所史料第76冊)を作成し、そのなかに荷札木簡研究の現状を報告した。(2)(1)の作業に付随して、8世紀初頭の木簡の再調査をおこない、「藤原宮出土荷札木簡補遺」と題するレポートを『奈良文化財研究所紀要2006』に執筆した。(3)近年出土した飛鳥・藤原地域出土木簡(石神遺跡、藤原宮跡)の最新の釈文を『飛鳥・藤原宮発掘調査出土木簡概報19』に公表した。(4)飛鳥池遺跡出土木簡の整理をおこない、木簡1点ずつの詳細な検討結果、および「木簡からみた飛鳥池遺跡」と題する論考を『飛鳥池遺跡発掘調査報告書』に執筆した。(5)酒船石遺跡出土木簡の整理をおこない、木簡1点ずつの詳細な検討結果を『酒船石遺跡発掘調査報告書』に執筆した。(6)「石神遺跡出土の仕丁木簡」と題する論文を『飛鳥文化財論攷』に執筆した。(7)「五十戸木簡の世界-荷札木簡を中心に-」と題する口頭報告を、横浜歴史博物館でおこなった。(8)2005年秋から2006年春にかけて、石神遺跡第18次調査で木簡が出土しており、その整理をおこなっている。7世紀は日本律令国家が形成される重要な時期にあたる。本年度は、出土して間もない飛鳥・藤原地域の木簡(石神遺跡、藤原宮・京跡、酒船石遺跡など)を中心に整理をおこなった。まず石神遺跡出土の木簡については、木簡学会で口頭報告するとともに(2003年12月7日)、下記11に掲げた論文2本を発表し、具注暦木簡について分析した。また、出土木簡のなかに貢進荷札が多かったこともあり、7世紀後半の地方行政の実態が徐々に判明しつつある。藤原宮・京跡出土の木簡については、「奈良・藤原京跡左京七条一坊」(『木簡研究』25、2003年)「奈良・藤原京跡右京七条一坊」(『木簡研究』25、2003年)で概要を報告し、また下記11の1に掲げた論文1本をまとめた。藤原京跡左京七条一坊出土の木簡は、これまで中務省に関わる木簡群であるといわれてきたが、再検討の結果、衛門府とみるのが正しいことを指摘した。酒船石遺跡については、「奈良・酒船石遺跡」(『木簡研究』25、2004年)、「酒船石遺跡第19・23次調査出土の木簡」(『明日香村遺跡調査概報平成14年度』2004年、刊行予定)で概要を報告した。天武朝頃の考課に関する新たな知見を得ることができた。そとで本研究では、全国の7世紀木簡に関する情報を広く、収集したうえで、書風を中心に検討をおとなうことにした。(1)近年出土した飛鳥・藤原地域出土木簡(石神遺跡、藤原宮跡)の最新の釈文を『飛鳥・藤原宮発掘調査出土木簡概報18』に公表した。(2)飛鳥寺南方遺跡出土木簡の再検討をおこない、概要を『木簡研究26』で執筆した。(3)「飛鳥・藤原地域出土木簡の表記について」と題する口頭報告を、シンポジウム「古代日本語を読む-東アジアの文字環境」第3回(奈良女子大学)でおこなった。(4)「石神遺跡出土の木簡をめぐって」と題する口頭報告を、考古学研究会関西例会でおこない、その成果を一部含み込んだ概要を『木簡研究26』で報告し、また下記11に掲げた論考を発表した。

(5)飛鳥池遺跡出土木簡の整理をおこない、木簡1点ずつの詳細な検討結果、および「木簡からみた飛鳥池遺跡」と題する論考を『飛鳥池遺跡発掘調査報告書』に執筆した。(6)酒船石遺跡出土木簡の1点ずつの詳細な検討結果をおこなっており、新年度刊行予定の『酒船石遺跡発掘調査報告書』に研究成果を掲載する予定である。(7)「律令交通制度と文字」と題する論考を『文字と古代日本3』に執筆した。近年、7世紀の木簡が相次いで出土しており、『日本書紀』『古事記』などの編纂史料ではわからなかった新たな知見が得られつつある。しかし7世紀木簡に書かれた文字は癖の強いものであり、釈読はたいへん困難を極める。そこで本研究では、全国の7世紀木簡に関する情報を広く収集したうえで、書風を中心に検討をおこなうことにした。本年度も前年度に引き続いて、飛鳥・藤原地域の木簡を中心に整理・研究にあたったが、釈読の過程で全国の文字史料にも広く目配りをした。また、7世紀の荷札木簡全点の最調査をおこない、最新の釈文を提示することができた。具体的な成果は次のとおりである。(1)7世紀の荷札木簡339点を対象とした史料集『評制下荷札木簡集成』(奈良文化財研究所史料第76冊)を作成し、そのなかに荷札木簡研究の現状を報告した。(2)(1)の作業に付随して、8世紀初頭の木簡の再調査をおこない、「藤原宮出土荷札木簡補遺」と題するレポートを『奈良文化財研究所紀要2006』に執筆した。(3)近年出土した飛鳥・藤原地域出土木簡(石神遺跡、藤原宮跡)の最新の釈文を『飛鳥・藤原宮発掘調査出土木簡概報19』に公表した。(4)飛鳥池遺跡出土木簡の整理をおこない、木簡1点ずつの詳細な検討結果、および「木簡からみた飛鳥池遺跡」と題する論考を『飛鳥池遺跡発掘調査報告書』に執筆した。(5)酒船石遺跡出土木簡の整理をおこない、木簡1点ずつの詳細な検討結果を『酒船石遺跡発掘調査報告書』に執筆した。(6)「石神遺跡出土の仕丁木簡」と題する論文を『飛鳥文化財論攷』に執筆した。(7)「五十戸木簡の世界-荷札木簡を中心に-」と題する口頭報告を、横浜歴史博物館でおこなった。(8)2005年秋から2006年春にかけて、石神遺跡第18次調査で木簡が出土しており、その整理をおこなっている。
媒介昆虫と病原菌の遺伝的変異と病原性の変異からナラ枯れの起源に迫る

日本以外に、台湾・タイ・ベトナム・インドネシアから、ナラ枯れの媒介者であるカシノナガキクイムシと病原菌のRaffaelea quercivoraを採集し、DNAを使った系統解析を行った。日本以外にも媒介昆虫も菌も存在し、菌の病原力には地域性は認められなかった。媒介昆虫の攻撃性については検討が必要であるが、本種が日本でのみ発生するのは、寄主植物の菌に対する感受性が高いことが原因と推測された。2009年4-5月にインドネシアで採集を行った。スマトラ島では、西スマトラ洲パダンのAndaras大学演習林で、切断した太い枝を餌木として設置して、約2カ月後に採集をおこなった。西スマトラ州のKerinci山国立公園、カリマンタン島では、東カリマンタン州バリクパパン周辺のSungai Wain、Bukit Soehart、Bukit Bangkiraiでは、自然の倒木かから同様に採集を行った。現地で坑道と虫体から共生菌を分離した。昆虫については、後藤が同定作業を行い、濱口がDNAで系統解析を行った。菌は、升屋が培養保存し、Raffaelea属の糸状菌に関しては同定作業中。アンブロシアキクイムシは、Xyleborus属14種、Xylosandrus属6種、Platypus属25種、Arixyleborus属3種を採集した。2010年2月には、ベトナム北部のSonla周辺で同様の採集を行った。カシノナガキクイムシ(本主のぇ櫓門に副まれるすべての成分を含む混合物を使って、誘引実験を行った。その結果、集合フェロモンの主成分であるケルキボールのみでは、対照区に比べ10-20倍のが採集されたのに対し、フェロモン成分をすべて混ぜると対照区と差がなくなった。これらの結果から、フェロモンの微量成分には、忌避効果をもつ成分が含まれているものと考えられた。そこでケルキボールに各成分を加えて誘引実験をおこなった。1成分を加えた場合、cis-piperitol追加で捕獲数が有意に増加した。2成分を加えた場合、捕獲数が減少し対照区と差が見られなくなった。これらの結果から、微量成分は単独では忌避効果を示さないが、2成分以上が混合することによって忌避効果を示したことから、野外では、過密を防ぐための抗集合フェロモンとして作用しているものと考えられた。カシノナガキクイムシ(本種)に含まれるすべての成分を含む混合物を使って、誘引実験を行った。コナラ丸太とミズナラ苗木に、病原力の異なる6系統のRaffaelea quercivoraを接種し、変色域の長さを測定した。その結果、病原性の指標となる変色域の長さは、丸太と苗木で有意な正の相関が認められた。これらの結果から、病原力の検定に丸太を使うことが可能となった。2010年10月にベトナム北部で採集を行った。Lithocarpus属10本をあらかじめ現地の伐採会社に依頼して伐倒した。1本の伐倒木から、カシノナガキクイムシの日本海型と太平洋型の両方を採集した。虫体と坑道から分離した菌は、ベトナム森林科学研究所で培養した後、日本に輸出した。升屋が培養保存し、Raffaelea属の糸状菌は同定作業中である。タイとニューギニアでカシノナガキクイムシの採集を行ったが、ニューギニアでは採集することができなかった。コナラ丸太とミズナラ丸太に、病原力の異なる3系統の日本産Raffaelea quercivoraと、台湾、ベトナム、タイ、インドネシア産のRaffaelea quercivoraを接種し、変色域の長さを測定した。その結果、コナラでは、台湾・タイ・ベトナムから採集したRaffaelea quercivoraも、日本の強病原性の系統とほぼ同等の病原力を有することが明らかにされた。これらの結果から、外国でナラ枯れが発生していない原因は、少なくとも菌が病原性を有していないからではないことが明らかにされた。外国のブナ科樹種は日本のブナ科樹種に比べて、Raffaelea quercivoraに対する抵抗性が強い可能性が示唆された。一方、ミズナラ丸太では、系統間の差が明瞭に現れなかった。

その可能性としては、コナラに比べると、ミズナラの方が概して抵抗性が弱く菌に対する過剰防御反応が大きいこと、あるいは、接種時期が野外でカシノナガキクイムシが集中加害する時期よりも遅かったことから、季節による反応の違いがミズナラの場合に大きい可能性が考えられた。これまでに、カシノナガキクイムシの記録がある国から、本研究期間内で、インドとニューギニアを除くすべての国からカシノナガキクイムシとRaffaelea quercivoraを採集することができた。また、これまで、幹録であったベトナムでは、北部と南部の2カ所から、カシノナガキクイムシを採集することができた。とくに、北部では、日本の九州南部と同様に、太平洋型と日本海型の両方のタイプが1カ所から採集することができた。
固体酸触媒におけるプロトンの動的挙動-高温での^1HMAS NMR測定

ゼオライトやヘテロポリ化合物のプロトンの状態を^1H MAS NMRによって調べ、酸性プロトンに帰因するピークの線幅は室温から100°Cの範囲で変化すること、ピークの線幅はプロトンの動的挙動(モビリティー)を反映することを明らかにした。^1H MAS NMRの測定温度範囲を更に、より実験条件に近い温度であ200°Cにまで高くすることによってプロトンの動的挙動を種々のゼオライトで調べた。H-ZSM-5(Si/Al=53)における^1H MAS NMRスペクトルのピークの線幅に及ぼす測定温度の影響を調べた。25°Cにおけるスペクトルでは4.2ppm及び1.9ppmにピークが観測される。4.2ppmのピークは酸性OH基に帰因し、1.9ppmのピークはシラノール基に帰因する。4.2ppmのピークは60°C付近からブロードニングを起こし、120°Cで線幅がもっとも広くなる。更に、高い温度にするとピークの線幅は再び狭くなってくる。この温度範囲ではケミカルシフトに変化は見られない。4.2ppmのピークに帰因するスピニングサイドバンドは温度が高くなる程ブロードとなる。一方、シラノール基に帰因するピークの線幅にはほとんど変化が見られない。測定温度を高くしたときに観測される酸性プロトンに帰因するピークの変化、即ち、ブロードニング起こし再び先鋭化するという現象はSi/Al比の異なるH-ZSM-5においても観測された。H-モルデナイトでもH-ZSM-5の場合に比べ、ピークの線幅の変化は小さいものの、同じ現象が観測された。ただし、一番ブロードとなる温度は180°C付近と、H-ZSM-5の場合に比べ高い温度であった。これまでの研究によってゼオライトやヘテロポリ化合物のプロトンの状態を^1 MAS NMRによって調べ、酸性プロトンに帰因するピークの線幅は室温から100°Cの範囲で変化すること、ピークの線幅はプロトンの動的挙動(モビリティー)を反映することを報告した。本年度は^1H MAS NMRの測定温度範囲を更に、より実験条件に近い温度であ200°Cにまで高くすることによってプロトンの動的挙動をさらに詳しく調べた。測定温度を高くしたときに観測される酸性プロトンに帰因するピークの変化、即ち、ブロードニング起こし再び先鋭化するという現象はSi/Al比のの異なるH-ZSM-5においても観測された。こうしたスペクトルの線幅の変化は、プロントが運動しているとしたモデルから理論的に導かれるFreeinduction decayの時間の関数を、フーリエ変換することによって得られるピークの線幅の変化と極めてよく一致した。

従って、温度を変化させたときの^1H MAS NMRピークの線幅の変化は、H-ZSM-5のプロトンのモビリティーの変化を反映している。1H MAS NMRの測定温度範囲を更に、より実験条件に近い温度であ200°Cにまで高くすることによってプロトンの動的挙動を種々のゼオライトで調べた。H-ZSM-5(Si/Al=53)における1H MASNMRスペクトルのピークの線幅に及ぼす測定温度の影響を調べた。25°Cにおけるスペクトルでは4.2ppm及び1.9ppmにピークが観測される。4.2ppmのピークは酸性OH基に帰因し、1.9ppmのピークはシラノール基に帰因する。4.2ppmのピークは60°C付近からブロードニングを起こし、120°Cで線幅がもっとも広くなる。更に、高い温度にするとピークの線幅は再び狭くなってくる。この温度範囲ではケミカルシフトに変化は見られない。4.2ppmのピークに帰因するスピニングサイドバンドは温度が高くなる程ブロードとなる。一方、シラノール基に帰因するピークの線幅にはほとんど変化が見られない。測定温度を高くしたときに観測される酸性プロトンに帰因するピークの変化、即ち、ブロードニング起こし再び先鋭化するという現象はSi/Al比の異なるH-ZSM-5においても観測された。H-モルデナイトでもH-ZSM-5の場合に比べ、ピークの線幅の変化は小さいものの、同じ現象が観測された。ただし、一番ブロードとなる温度は180°C付近と、H-ZSM-5の場合に比べ高い温度であった。
新規光学活性シクロペンタジエニル錯体の合成と不斉触媒反応への応用

本研究は新規光学活性キレートハイブリッド配位子の開発とその不斉触媒反応への応用を目的とした。そのため先ず、アキラルな配位子としてシクロペンタジエニル基(Cp)とホスフィノ基(PR_2)を種々の長さのメチレン鎖で結合したCp-P配位子1a-cの合成法を確立し、ついで光学活性Cp-P配位子として2種の光学活性骨格を有する2a-b,3を合成した。これらのCp-P配位子はいづれも空気に不安定な無色オイルとして得られ、スペクトル及び分析で同定した。合成したCp-P配位子と[Rh(CO)_2Cl]_2の反応で4,5などのいくつかの単核ロジウム錯体を合成し、スペクトルで同定した。シクロペンタジエニル誘導体としてインデニル基を用いると光学活性錯体5が黄色結晶性粉末として高収率で得られたが、インデン環の配向の違いによるジアステレオマー混合物が得られ、現在その分離には成功していない。
エストロゲンレセプターβによる脂質代謝関連遺伝子の制御機構の解析

閉経後女性に増加する高脂血症、動脈硬化に対してエストロゲン補充療法が有効であることは多くの報告で明らかにされてきた。われわれはエストロゲンの脂質代謝への関与について、脂肪合成の律速酵素であるLipoprotein Lipase(LPL)の発現へのエストロゲンの影響に着目し研究を進めてきた。LPL遺伝子の上流解析でエストロゲンによりrepressiveに反応する領域(-1856/-1850bp)を同定した。LPL-CATreporter遺伝子を脂肪細胞に分化させたマウス3T3-L1細胞に導入するCATassayにより、エストロゲンのLPLプロモーター活性の抑制作用は主にエストロゲンレセプターα(ERα)を介して作動している可能性が示唆され、当初想定していたエストロゲンレセプターβ(ERβ)の関与は確認できなかった。続いて動脈硬化巣の形成に重要な働きを示すマトリツクスメタロプロテイネースに着目し、その活性に対するエストロゲンの影響をヒト臍帯血管内皮細胞(HUVEC)を用いて検討した。種々のマトリックスメタロプロテイネースの中でMMP2の活性をzymographyを用いて調べたところ、エストロゲンの添加によりMMP2の活性は濃度依存的に抑制されることが示された。以上の結果からエストロゲンは脂質代謝を抑制的に制御し、また動脈硬化巣の形成に対しても抑制的に働くことで、高脂血症、動脈硬化の進展を抑える効果があることが示唆された。閉経後女性に骨粗鬆症や高脂血症の発症が増加することの原因としてエストロゲン欠乏が重要とされ、エストロゲン補充療法がこれらの疾患を予防、改善することは周知の事実である。我々はエストログンの肥満抑制作用の分子機構について、脂肪合成の律速酵素であるLipoprotein lipase(LPL)の発現に対するエストロゲンの影響を、LPL遺伝子の上流を解析することで検討した。これまでに-1856/-1850bpにエストロゲン応答領域が存在することを示し、Estradiol(E2)がLPL遺伝子の発現を抑制することで脂肪の蓄積を減少させることを明らかにした。さらにLPL遺伝子プロモーターを含むCATレポーター遺伝子を、脂肪細胞に分化させたマウス3T3-L1細胞中に導入して行うCATアッセイを用いて以下の実験を行った。1)E2のLPLプロモーター活性の抑制作用がestrogenreceptor α(ER α)あるいはestrogen receptor β(ER β)のいずれを介しているかをそれぞれのreceptorのexpression vectorを共導入して検討した。その結果ER αによりLPLプロモーター活性は抑制を受ける傾向が見られたが、ERPでは明らかな抑制は見られなかった。2)E2及びtamoxifenでLPLプロモーター活性の抑制作用に相違が見られるかどうかを検討したが、マウス3T3-L1細胞の分化の程度により、結果が異なるため、条件設定を再検討中である。また、高脂血症が原因のひとつと言われる動脈硬化におけるエストロゲンの防御機構についても検討を加えており、特に動脈硬化巣の形成に重要な働きを示すmatrix metalloproteinaseの活性に対するエストロゲンの抑制作用をzymography、westernblotを用いて確認している。LPL-CAT reporter遺伝子を脂肪細胞に分化させたマウス3T3-L1細胞に導入するCAT assayにより、エストロゲンのLPLプロモーター活性の抑制作用は主にエストロゲンレセプターα(ERα)を介して作動している可能性が示唆され、当初想定していたエストロゲンレセプターβ(ERβ)の関与は確認できなかった。

続いて動脈硬化巣の形成に重要な働きを示すマトリックスメタロプロテイネースに着目し、その活性に対するエストロゲンの影響をヒト臍帯血管内皮細胞(HUVEC)を用いて検討した。種々のマトリックスメタロプロテイネースの中でMMP2の活性をzymographyを用いて調べたところ、エストロゲンの添加によりMMP2の活性は濃度依存的に抑制されることが示された。以上の結果からエストロゲンは脂質代謝を抑制的に制御し、また動脈硬化巣の形成に対しても抑制的に働くことで、高脂血症、動脈硬化の進展を抑える効果があることが示唆された。
ハイブリッド・マクロライドの合成研究

我々は10数年来、グルコースなど安価で大量に得られる糖類を主なキラル源とし、更に各種の不斉反応の応用と新しい保護基の開発、計算科学の活用などにより、一連のマクロライド、ポリエーテルなどの合成研究を行ってきたが、本研究はそれらを発展させ、極めて複雑な構造を有する主に抗腫瘍性変型マクロライド類の合成研究と合成フラグメントの組合せとマクロ環の一部切り出しと交換による化学的ハイブリッド合成による人エマクロライドの創製への道を開くことを目的になされてきた。マクロライドのうち、最も種類の多いエノン系、ジエノン系化合物は2つのフラグメントのエステルへの縮合を経てアルデヒド部とケトホスホネート部のホーナーエモンズ型閉環によりマクロ環を構築する方が合成法として有利である。本研究では、メチノリド、ピクロノリド、タイロノリド、カルボノリド類などの合成フラグメントを合成し、先ずエステル化、ホーナーエモンズ閉環によりピクロノリドの改良合成を完成し、またタイロノリド系のハイブリッド・マクロライドも合成することが出来た。さらに典型16員環マクロライド類のラクトン骨格とエポチロンのチアゾール環側鎖部分を合わせ持つハイブリッドをデザインし、合成した。今後これらの化合物について生物活性、薬理活性などのテストを行う予定である。一方、マクロ環の一部切り出しはエリスロノリド系で試み、交換再結合、閉環によりエリスロノリド系ハイブリッドも作ることが出来た。我々は10数年来グルコースなど安価で大量に得られる化合物をキラル源として、保護基などの開発をし、一連のマクロライド、ポリエーテルなどの合成を行ってきたが、本研究はそれをさらに発展させ、極めて複雑な構造を有する主に抗腫瘍性を有する変型マクロライド類の合成研究を行うと共に、化学的ハイブリッド合成による新しい人工マクロライド抗生物質の創製への道を開くことを目的になされている。本年度は先ず合成対象として天然に最も数多く存在するエノン型(ピクロノリド、カルボノリドなど)を選び、フラグメント合成とピクロノリドノ改良合成を行った。マクロライド合成の鍵反応は一般にマクロ環構築反応であり、マクロラクトン化が普通に用いられている。しかし、エノン型マクロライドはアルデヒド体とケトホスホネート体のホーナーエモンズ反応による閉環が有利である。現在、アルデヒド体、ケトホスホネート体各5、6種合成中である。また、最初のマクロライド抗生物質のピクロマイシンのアグリコン、ピクロノリドの合成は先に完成しているが、今回、保護基を代えることにより大巾に簡易化した新合成法を確立することができた。我々は10数年来、グルコースなどで安価で大量に得られる糖類を主なキラル源とし、更に各種の不斉反応の応用と新しい保護基の開発、計算科学の活用などにより、一連のマクロライド、ポリエーテルなどの合成研究を行ってきたが、本研究はそれらを発展させ、極めて複雑な構造を有する主に抗腫瘍性変型マクロライド類の合成研究と合成フラグメントの組合せとマクロ環の一部切り出しと交換による化学的ハイブリッド合成による人工マクロライドの創製への道を開くことを目的になされている。しかし、これらの合成はまだ収率が悪く、合成法も若干複雑で大巾な改良を必要としている。また薬理活性テストなど今後行う予定である。

我々は10数年来、グルコースなど安価で大量に得られる糖類を主なキラル源とし、更に各種の不斉反応の応用と新しい保護基の開発、計算科学の活用などにより、一連のマクロライド、ポリエーテルなどの合成研究を行ってきたが、本研究はそれらを発展させ、極めて複雑な構造を有する主に抗腫瘍性変型マクロライド類の合成研究と合成フラグメントの組合せとマクロ環の一部切り出しと交換による化学的ハイブリッド合成による人工マクロライドの創製への道を開くことを目的になされてきた。マクロライドのうち、最も種類の多いエノン系、ジエノン系化合物は2つのフラグメントのエステルへの縮合を経てアルデヒド部とケトホスホネート部のホーナーエモンズ型閉環によりマクロ環を構築する方が合成法として有利である。本研究では、メチノリド、ピクロノリド、タイロノリド、カルボノリド類などの合成フラグメントを合成し、先ずエステル化、ホーナーエモンズ閉環によりピクロノリドの改良合成を完成し、またタイロノリド系のハイブリッド・マクロライドも合成することが出来た。さらに典型16員環マクロライド類のラクトン骨格とエポチロンのチアゾール環側鎖部分を合わせ持つハイブリッドをデザインし、合成した。今後これらの化合物について生物活性、薬理活性などのテストを行う予定である。一方、マクロ環の一部切り出しはエリスロノリド系で試み、交換再結合、閉環によりエリスロノリド系ハイブリッドも作ることが出来た。
視覚情報の分節化にともなう事象関連電位と視線移動

本研究では、先に行った聴覚分節化研究で得られた分節化を反映する事象関連電位(ERP)と同様な成分が、視覚情報の分節化過程でも検出されるか、その電位は時系列情報の遷移確率、学習進行過程・達成度とどのような相関関係を持っているかについて調べた。その結果、被験者は統計的情報を手がかりにして視覚情報を分節化し、N400電位がその統計的学習および分節化を定量的に反映していることを示唆した。また、視覚情報の分節化過程は聴覚分節化と同じく、領域一般性の脳処理様式で行われることが示唆された。音声言語習得の場合は、まず聴覚的に連続な刺激が切り分けられ(分節化)、次に意味と対応を持つシンボルとなる必要がある。それと同様に、視覚的な言語習得の場合においても、視覚文字列、パタンの分節化が重要である。われわれは先に行った研究の、無意味な純音単語を用いた統計的規則性を持つ連続音声の分節化課題では、分節化を反映し、学習の達成度と強く相関する事象関連電位(ERP)成分(N400)を発見した。本研究では、聴覚分節化研究で得られたERPと同様な成分が、視覚分節化過程でも検出されるか、その電位は遷移確率、学習成績・進行過程とどのような相関関係を持っているかについて調べた。実験では、まず11つの図形を作り、その中の3つの図形から一つの図形列(単語)が形成させるようにして、6個の図形列を用意した。それをランダムに隙間を空けずにつないで7分の連続刺激を作った。連続刺激の特徴としては、図形単語内の三つの図形の間の遷移確率が高く、単語と単語の間の遷移確率が低いという統計的性質を持っている。連続刺激に含まれる各図形をTVモニターに個別に呈示し、被験者に黙視してもらった。この過程で計3セッションのERP記録を行った。その結果、遷移確率がもっとも低い単語の切れ目(単語の第1図形)で、単語の第2、3図形に比べ、高い振幅のN400電位が観察された。どの程度分節化ができたかをテストして、その成績で2つのグループにわけると、分節化を示すこのERP成分は、成績の高い被験者では学習初期にもっとも強く、成績の低い被験者では、学習が進むにつれ徐々に大きくなった。これらの結果は、被験者が連続刺激の中で次に呈示される図形を予測し、統計的情報を手がかりにして分節化し、N400電位がその統計的学習および分節化を定量的に反映していることを示唆する。本研究から、視覚情報の分節化過程は聴覚分節化と同じく、領域一般性(domain generality)の脳処理様式で行われることが示唆された。言語の習得には、聴覚的に連続な音声に含まれる単語の切れ目を見つける必要がある。視覚的な言語習得の場合においても、視覚文字列、パタンの分節化が重要である。これまでに行ったERP研究では、連続系列における聴覚分節化及び視覚分節化を反映し、学習の達成度と強く相関する事象関連電位(ERP)成分(N400)を発見した(前年度成果)。本研究では、連続視覚信号の分節化(知覚学習)及び運動学習の統合過程をオンラインで評価するため、脳波計測に加え、時系列反応時間(SRT)を取り入れた、系列の運動学習課題を実施した。実験では、有限状態文法規則に従って生成された系列刺激が、音符画像として個別にTVモニターに呈示され、被験者は音符に対応するピアノキーをできるだけ速く押すというSRT課題を施行した。1センテンスには4-6チャンク(単語)が含まれ、各チャンクは3つの音符から構成された。10個のセンテンスの2回繰り返しが1ブロックとして、計9ブロックの学習が行われた。その過程で、反応時間(RT)とERPの記録を行った。その結果、RTは学習ブロックの進行に伴って短縮した。また、RTはチャンクのオンセット(第一音符)では遅くなるものの、チャンク内(第二、第三音符)及びセンテンス末端では短縮を示した。ERPでは、同じくチャンクのオンセットに対し、チャンク内の音符に比べ、刺激呈示後300-400ms区間により大きな陽性電位P3が観察された。またその電位が学習ブロックの進行につれ徐々に大きくなった。このERPのP3振幅がRTと有意な相関を示した。研究結果は、RTとERP成分は、分節化及び文法学習の進行過程を定量的に反映していることを示唆する。本研究では、系列信号の分節化及び学習進行過程における感覚運動統合学習過程を行動-生理学的指標より評価できた。

これまでに行ったERP研究では、連続系列における聴覚分節化及び視覚分節化を反映.し、学習の達成度と強く相関する事象関連電位(ERP)成分(N400)を発見した(21年度成果)。また、連続視覚信号の分節化(知覚学習)及び運動学習の統合過程をオンラインで評価するため、脳波計測に加え、時系列反応時間(SRT)を取り入れ、有限状態文法規則に従って生成される音符系列の運動学習課題を実施した(22年度)。その結果、反応時間が系列学習の進行に伴って短縮し、チャンクのオンセット(第一音符)で得られるERP振幅と有意な相関を示した。本年度の研究では、視覚情報の分節化及び統計的学習の領域一般性をさらに明らかにするため、視覚刺激呈示には数字を用いた。前年度の課題と同じく、数字刺激は有限状態文法規則に従って生成され、TVモニターに呈示され、被験者は数字に対応するピアノキーをできるだけ速く押すというSRT課題を施行した。その結果、反応時間(RT)は学習ブロックの進行に伴って短縮した。また、RTは3数字で構成されたチャンクのオンセット(予測しにくい始点)では遅くなるものの、チャンク内(比較的予測しやすい第二、第三位置)では短縮を示した。ERPでは、音符を用いた実験結果と同じく、チャンクのオンセットに対し、刺激呈示後300-400ms区間により大きな陽性電位P3が観察された。しかし、学習進行過程でのERP振幅とRTの相関は認められなかった。本研究結果から、音符を用いた前年度の研究結果は被験者の音感に依存する可能性は否定できないが、系列情報の統計的学習・分節化を示すERPと行動指標が聴覚及び視覚情報の学習過程で一致することが示唆された。
地球環境における炭素フラーレンの探索

犬山P/T境界試料中にわれわれは、フラーレンC_<60>を発見し、試料中の濃度は10pptであることをつきとめた。さらに、金華山P/T境界試料や犬山P/T境界近傍試料など複数箇所の試料から、1ppt程度のフラーレンを検出した。C_<60>はサッカーボール型分子でフラーレンの代表的物質であり、これまで主に実験室で合成されてきた。ところが近年、恐竜が絶滅した6500万年前のK/T境界の試料中にC_<60>が発見されるなど、天然試料中にも存在することが明らかになってきた。この地球環境におけるC_<60>をはじめとする炭素フラーレンは木材などの有機物の燃焼や、雷などにより炭素を含む物質が蒸発・反応したことにより生成すると考えられている。フラーレンは生成条件が上述したように特殊であり、また生成後は非常に安定で水にも不溶である。これらの性質から生成時の地球環境を推測する新しい指標として有望である。われわれがC_<60>を発見した2.5億年前のP/T境界では、全地球史史上最大規模の生物の大量絶滅が起こり、海洋生物種の95%が絶滅した。この原因として、超大陸パンゲアの生成による地殻・気候変化と海洋における酸素欠乏などがあげられているが、物証が少なくよく分かっていない。C_<60>は酸素や水素の少ない条件下で効率よく生成するので、P/T境界時のC_<60>の地殻存在濃度を時代を追って調べることにより、各時代にどのような自然環境であったかが明らかになり、生物の大絶滅を解明できる可能性がある。具体的には以下のような方法でC_<60>を発見した。まず愛知県犬山の2.5億年前の黒色泥岩層から約2kgの試料をとり粒径1mm以下に粉砕した。つぎに、珪素や鉄などのC_<60>以外の部分を取り除くため弗化水素酸で一月間溶解させた。C_<60>が含まれている不溶部分をろ過して取り出し、トルエンで超音波洗浄を用いてC_<60>を抽出した。抽出溶液を高速液体クロマトグラフィーとアレイ型検出器を用いて検出・同定した。複数箇所のP/T境界試料からC_<60>が発見されたことで、この時代に地球規模のフラーレン生成を引き起こす現象が起こっていたことが明らかになった。現在のところ生成原因はパンゲアの地殻活動に伴う山火事などで生成したものと考えている。P/T境界時の自然環境との関係とC_<60>濃度の時間・地域依存性を実験に基づいて考慮している。
発生期及び成体腎臓におけるミオシンの機能解明

腎臓は後腎間葉と尿管芽という2つの組織の相互作用によって発生し、間葉由来の上皮と尿管芽が接続して、一続きの機能単位すなわちネフロンを形成する。非筋肉型ミオシンIIA,IIBはミオシン9,10とも呼ばれ、細胞骨格を司る重要な蛋白である。特にミオシン9の変異はヒトにおいて糸球体硬化症を含む多彩な病態を呈することが知られている。本計画は、これらの遺伝子の腎臓特異的なノックアウトマウスを作成解析することで、細胞骨格が腎臓発生及び機能維持に果たす役割を解明することを目的とした。まずHoxb7Creを用いて尿管芽特異的にミオシンを欠失するマウスを作成したが、ミオシン9、ミオシン10、あるいは両方の欠失のいずれでも、腎臓の異常は認められなかった。ミオシンが尿管芽に豊富に発現することを考慮すると、意外な結果であった。次に、Six2Creマウスを用いて間葉特異的なミオシン欠失マウスを作成した。ミオシン9の欠失では尿細管の拡張と腎機能不全が認められた。しかし糸球体には明らかな異常を認めず、ヒト疾患とは異なる病態であった。一方、ミオシン9/10の欠失ではネフロンの顕著な減少によって出生直後にマウスは死亡した。発生過程のネフロンで形態異常と細胞死が見られたが、間葉上皮転換や遠近軸の決定には大きな異常は認められなかった。今後、上皮の極性などの観点での検討が必要だが、非筋肉型ミオシンが後腎間葉由来のネフロンの形成と維持に必須であることを明らかにすることができた。本計画は、これらの遺伝子の腎臓特異的なノックアウトマウスを作成解析することで、細胞骨格が腎臓発生及び機能維持に果たす役割を解明することを目的とする。今後、尿細管拡張の原因を解明する計画である。発生過程のネフロンで形態異常と細胞死が見られているため、今後、病態発症時期を同定し、その原因を組織学的に明らかにしたい。間葉上皮転換、遠近軸の決定、上皮の極性などについて詳細に検討し、ミオシン欠失による異常の本態を解明する計画である。複数の遺伝子改変マウスの作成が完了し、おおまかな症状を同定できたため。それぞれのマウスの病態発症時期を同定し、その原因を組織学的に明らかにする。特に、間葉上皮転換、遠近軸の決定、上皮の極性などについて詳細に検討し、ミオシン欠失による異常の本態を解明する。マウス、PCR試薬,抗体など購入する。
脱落・再植した歯と歯髄の保存的治療における酸素ナノバブル投与の有効性の検討

本課題は、外傷歯の治癒を促す治療法の開発のため、生理活性作用が報告されていた酸素ナノバブル水の応用可能性を探索した。調査開始時の先行研究は、生物の生存率等による調査が多く、ナノバブルの作用機序には不明な点が多かった。また、実験施設の改修延期により、計画していた実験計画の変更を余儀なくされた。そこで、外傷歯治療にナノバブル水を応用する前段階としてナノバブル水が口腔組織に与える作用の検証を行った。ヒト歯小嚢由来の細胞の培養実験において空気や酸素のナノバブルによる増殖抑制効果を認めた。ナノバブルが培養細胞と生体個体に与える影響の包括的な理解には、双方において研究の進展が必要であることが示唆された。平成26年度の研究計画調書では、本研究は外傷歯の歯牙・歯髄・歯周組織に対する酸素ナノバブルの持つ生理活性作用の治療応用を掲げていたが、研究課題採択後の調査で、ヒトもしくは動物の器官に対する酸素ナノバブル水の作用には不明な点が多く、そのメカニズムの詳細のほとんどが未だに明らかにされていないことが判明した。また、当初予定していた動物実験は、大学の動物実験施設および所属研究室の大規模改修工事の大幅な延長のため、平成26年度内の動物実験等の実施が不可能になった。そこで、研究協力者である本学の荒川真一教授、下川仁弥太非常勤講師、酸素ナノバブル水の提供を依頼している産業総合研究所の高橋正好主任研究員を交えて、研究計画の修正のためミーティングを行った。この結果、外傷歯に対する酸素ナノバブルの作用を調査する前に、ヒト口腔由来の生体組織に対する酸素ナノバブルの作用の観察から研究を始めることになった。具体的な手順は以下の通りである。1.本学歯学部附属病院・小児歯科外来で抜歯される埋伏過剰歯(歯髄)と、それに付着した歯周組織、歯小嚢を採取する。2.採取した各試料から培養細胞を作製し、ナノバブル水を含有した培地で一定期間成育させる。3.成育後の細胞の増殖度、形態学的変化、酵素活性、mRNAパターンの変化を調査する。なお、本実験の実施には、本学歯学部倫理審査委員会の承認を要し、平成27年4月末現在、承認申請中である。平成27年度は、上記実験の実施および、動物実験による酸素ナノバブル水の生体、とくに損傷を受けた歯牙・口腔組織に対する作用の調査を予定している。先行研究より、酸素やオゾンなどのナノバブルが動植物に対して成長促進や免疫賦活効果、殺菌作用を示すとされているナノバブルではあるが、その作用のメカニズムについて調査した報告は非常に乏しく、ナノバブルが動植物の生体に与える作用のメカニズムはほとんど解明されていないことが明らかになった。そこで、申請者は今後の研究プランを改善するため、学内・学外の共同研究者と検討を行った結果、ナノバブルの医療応用に先駆けて、ナノバブル水の持つ作用を分子レベル、細胞レベルで調査する方針を選択した。その第一段階として、ナノバブル水がヒト口腔由来の培養細胞の増殖力に与える影響の調査を計画した。ナノバブル水は研究協力を依頼した産業技術総合研究所から提供を受け、ヒト口腔由来の細胞は臨床的に採取が容易である埋伏過剰歯抜歯時に摘出される歯小嚢からの採取を計画し、学内倫理審査の承認後、実験を実施した。ヒト口腔由来の培養細胞を酸素、もしくはオゾンナノバブルを含有した培地で一定期間培養した細胞数の変化を計測したところ、通法の液体培地に比べてナノバブル水を含有した培地による細胞増殖効果は認められなかった。その後、培養条件や計測方法に改良を加え、ナノバブル水の影響が顕著に観察できる実験系の確立に取り組んでいる。また、この調査において、酸素ナノバブル水、オゾンナノバブル水が培養細胞の形態に与える影響についても観察していたが、酸素とオゾンのナノバブル水による培養細胞の変形など形態的な異常を認める所見は得られなかった。今後、ヒト口腔由来の細胞に対しナノバブル水による顕著な影響が認められた場合、そのメカニズムの解明のためRNAアレイなどの解析をさらに行う方針である。大学の研究室・実験室の大規模改修工事が大幅に延期していたため、平成27年度の前半は研究室や実験室の移動や設備の整備に時間を割かれて、実験ができなかった。ナノバブルが生体に与える影響について未知の点が非常に多かったため、研究計画の変更は生じたものの、平成27年度の後半からは実験室環境が整い、概ね計画通りに研究を進展できている。申請者は、申請当初は動物実験を通してナノバブル水の組織保存性の検証を検討していたが、ナノバブルが生体にもたらすとされる組織保存性や生理活性作用などの現象が報告されている一方、そのメカニズムには不明な点が非常に多く、また、所属の動物実験施設の改修工事延長等の理由により、本期間においてはヒト口腔由来の細胞を用いた基礎的な調査を行った。具体的には、学内倫理審査委員会の承認の下、ナノバブル水がヒト口腔組織へ与える作用を明らかにするため、ナノバブル水で培地を作製し(ナノバブル培地)、ヒト口腔由来細胞の培養におけるナノバブルの影響を調査している。なお、ヒト口腔由来細胞は、埋伏過剰歯の抜歯の際に摘出され、廃棄される歯小嚢をから抽出した細胞を用いて作成した。これまでの実験において、培養細胞を酸素、もしくはオゾンナノバブルを含有した培地で一定期間培養し、細胞数の変化を計測したところ、通法の液体培地に比べてナノバブル培地による細胞数への顕著な影響は認められなかった。

しかし、ナノバブル培地で培養した細胞の形態が通常の細胞と比べて若干異なる可能性がある点と、関連研究の報告より、ナノバブルに暴露される条件設定により、生物への影響が大きく異なる可能性が疑われたため、本研究もナノバブル培地の条件を変更して、ナノバブルによる生体、とくに細胞への影響が確実に観察できるナノバブル培地への暴露条件と、観察項目を模索している。ナノバブル培地によるヒト口腔由来細胞への影響が顕著に認められるナノバブル培地の条件、もしくは観察項目の設定に時間を要している。また、診療などの病院業務に割かれる時間の増加により、研究環境が厳しくなっている。ナノバブル水とは直径200nm以下の微細気泡(ナノバブル)を含んだ水のことである。ナノバブルは水の溶解度を超える含有量で存在し、通常の気泡のように水中を上昇して水面で消失せず、長期間水中に留まり、水に物理化学的に特殊な性質を持たらすことが知られている。ナノバブル水の生物への影響としては、空気や酸素のナノバブル水は生物の成長促進作用や生存率の向上、オゾンのナノバブル水による殺菌作用が報告されている。また、2017年にISO認証により、直径1μm以下の気泡をウルトラファインバブルと定義されたため、ナノバブルはウルトラファインバブルと改称されるようになったが、本課題の一連の報告はナノバブルと表記して発表を行った。本課題では、ナノバブル水の生物への作用のうち、酸素や空気のナノバブル水から報告されていた成長促進や生存率の向上作用を、外傷を受けた歯の治癒を促す治療に応用することを目的に調査を始めたが、当時の先行研究では、主に魚や農作物の一個体単位の成長に伴う体重増加や生存率による調査が多く、その作用メカニズムは解明されていなかった。よって、外傷歯の治療にナノバブル水を応用する前段階としてナノバブル水が生体組織に与える作用の検証を優先させる必要があると考え、埋伏過剰歯抜歯の際に摘出された歯小嚢の細胞を培養し、酸素やオゾンのナノバブル水で作製した液体培地におけるナノバブルの細胞への影響を調査し、国際学会にて発表を行った(2016年5月アジア小児歯科学会)。この発表の時点では、酸素やオゾンのナノバブルを含有した培地による培養細胞への細胞増殖への影響は認められなかった。しかし、以後のナノバブル水の改良や実験系の改善により、ヒト歯小嚢由来細胞の培養系において空気や酸素のナノバブルによる増殖抑制効果を認めたため、論文投稿を行った。2018年5月現在査読中である。本課題は、外傷歯の治癒を促す治療法の開発のため、生理活性作用が報告されていた酸素ナノバブル水の応用可能性を探索した。調査開始時の先行研究は、生物の生存率等による調査が多く、ナノバブルの作用機序には不明な点が多かった。また、実験施設の改修延期により、計画していた実験計画の変更を余儀なくされた。そこで、外傷歯治療にナノバブル水を応用する前段階としてナノバブル水が口腔組織に与える作用の検証を行った。ヒト歯小嚢由来の細胞の培養実験において空気や酸素のナノバブルによる増殖抑制効果を認めた。ナノバブルが培養細胞と生体個体に与える影響の包括的な理解には、双方において研究の進展が必要であることが示唆された。大学の大規模改修工事の実施とその延期のため、所属分野および大学の動物実験施設が殆ど使用できなかったため、研究計画の大幅な修正を要した。
環境中微量重金属の濃縮測定のための微生物製剤の開発

凍結乾燥製剤とした細菌を用いて排水中から微量セレンを濃縮し,グラファイト炉原子吸光法で測定する方法を開発した。種々の微生物を用いてセレンの濃縮率の検討を行ったところ,排水処理に利用されている微生物製剤から分離したBacillus cereusが最も濃縮率が高かったことから,実験にはこの菌株を使用した。セレン含有排水50mlに6%硝酸5mlを添加した後,凍結乾燥した細菌10mgを加え,2時間攪拌して菌体ヘセレンを濃縮させた。菌体を遠心分離した後,菌体分解用の硝酸(1+1) 0.7mlと原子吸光測定におけるマトリックスモディファイアとしての硝酸パラジウム(1000mg/1) 0.3mlを添加して菌体を分散した。この分散液20μlを直接グラファイト炉原子吸光装置に導入しセレンを測定した。原子吸光測定においては試料の灰化温度を段階的に1,500°Cまで上昇させることにより,菌体の灰化とセレンとパラジウムの合金化最適となり,分析感度が最も高くなることが明らかとなった。セレン濃縮における各種金属イオンの影響を検討した結果,核イオンともセレン10ppbに大して100ppb程度までは影響しなかったが,クロム酸イオン,銀イオン等は1000ppbでは負の影響を与えた。検量線は0から30ppbの範囲で直線となった。セレンの定量下限は0.5ppbであり,相対標準偏差率は2.2%であった。本方法で排水中セレンを測定したところ,一部の排水については銅-DDTC共沈濃縮/グラファイト炉原子吸光法による測定結果とよく一致した。しかし,本方法は塩濃度の高い排水には適用できなかった。本研究年度は微生によるセレンの濃縮挙動の基礎的検討を行い,微生物による微量セレン濃縮方法及び,濃縮後のセレンを原子吸光法で測定する方法を開発した。排水処理に利用されている微生物製剤ハイドロバックからセレンの濃縮率が高い細菌を分離した。Bacillus cereusと同定されたこの細菌を用いてセレン濃縮の基礎的検討を行った結果,セレンはpH2以下で定量的に濃縮されるがpH3以上では全く濃縮されなかった。10ppbのセレン溶液50mlからセレンを定量的に濃縮するために必要な細菌の量は,凍結乾燥製剤として10mgの添加で十分であることが明らかとなった。セレンを濃縮した菌体を遠心分離した後,菌体分解用の硝酸(1+1)とセレン分析におけるマトリックスモディファイアとしての硝酸パラジウムを添加して菌体を分散させた。この分散液を直接黒鉛炉原子吸光装置に導入しセレンを測定する方法を検討した結果,試料の灰化温度を段階的に1,500°Cまで上昇させることにより,菌体の灰化とセレンとパラジウムの合金化が最適となり,分解感度が最も高くなることが明らかとなった。数種類の細菌に本方法を適用した結果,種類の違いはもちろんのこと,同一種族の細菌であっても起源が異なるとセレンの濃縮率に大きな違いがあることが明らかとなった。このことは,セレンを選択的に濃縮する細菌を開発できる可能性を示唆している。細菌は種類が非常に多く凍結乾燥等の製剤化によっても死滅しないなどの性質があり,微生物製剤として広い可能性を有している。本研究年度は,凍結乾燥製剤とした細菌を用いて排水中から微量セレンを濃縮し,グラファイト炉原子吸光法で測定する方法を開発した。種々の微生物を用いてセレン濃縮率の検討を行ったところ,排水処理に利用されている微生物製剤から分離したBacillus cereusが最も濃縮率が高かったことから,実験にはこの菌株を使用した。

セレン含有排水50mlに6%硝酸5mlを添加した後,凍結乾燥した細菌10mgを加え,2時間攪拌して菌体へセレンを濃縮させた。菌体を遠心分離した後,菌体分解用の硝酸(1+1)0.7mlと原子吸光測定におけるマトリックスモディファイアとしての硝酸パラジウム(1ppm)0.3mlを添加して菌体を分散した。この分散液を直接グラファイト炉原子吸光装置に導入しセレンを測定した。原子吸光測定においては試料の灰化温度を段階的に1,500°Cまで上昇させることにより,菌体の灰化とセレンとパラジウムの合金化が最適となり,分析感度が最も高くなることが明らかとなった。セレン濃縮における各種金属イオンの影響を検討した結果,各イオンともセレン10ppbに対して100ppb程度までは影響しなかったが,クロム酸イオン,銀イオン等は1000ppbでは負の影響を与えた。検量線は0から30ppbの範で直線となった。セレンの定量下限は0.5ppbであり,相対標準偏差率は2.2%であった。本方法で排水中セレンを測定したところ,一部の排水については銅-DDTC共沈濃縮-グラファイト炉原子吸光法による測定結果とよく一致した。しかし,塩濃度の高い排水には適用できなかった。細菌は種類が非常に多く凍結乾燥等の製剤化によっても死滅しないなどの性質があり,過去の研究で主に使用されている藻類に比較して多くの可能性を有している。今後は特異的な吸着特性を持つ細菌の検索を行うと共に,分析だけでなく,金属毒性の総合的評価への応用も検討する。
ナメクジの嗅覚学習における記憶形成と読み出し過程の解明

ナメクジは匂いと忌避性の味覚(キニジンなど)を連合する嗅覚嫌悪学習を行う.嗅覚学習においては嗅覚中枢である前脳が重要な役割を果たしていると考えられている.本研究では,ナメクジの単離脳嗅覚学習系を用いる生理学的測定と分子生物学的解析により,嗅覚学習のメカニズムを解明することを目的とした.単離脳嗅覚学習において無条件刺激となる味覚神経束の頻回電気刺激は,前脳局所場電位振動の振動数を増大させ,同時に前脳バースティングニューロンの興奮とノンバースティングニューロンの抑制を引き起こした.このことから,学習時には大半のノンバースティングニューロンは抑制されることが示された.さらに触角神経束に高頻度の電気刺激を与えると,前脳における誘発電位が2時間以上の長期にわたって増加する,長期増強が生じることが示された.このような長期のシナプス伝達効率の変化が記憶の固定化のメカニズムを担っている可能性が示唆された.条件付けの30分前に体腔内にタンパク合成阻害剤であるアニソマイシンまたはシクロヘキシミドを注射すると、条件付け後2日一週間目以降の記憶保持に障害が見られ,タンパク合成が嗅覚記憶の長期的な維持に必要であることが明らかになった。そこで次に学習によって発現誘導される遺伝子をPCR-differential display法によって網羅的に探索した。ニンジンの匂いを条件刺激(CS)、苦み物質であるキニジン溶液を無条件刺激(US)として同時に提示して連合させ、対照群にCSとUSを1時間の間隔をおいて提示したものを用いた。再現性のある発現変化を示した8個の遺伝子について部分配列のクローニングを行った。ナメクジの嗅覚忌避学習においては嗅覚中枢である前脳が重要な役割を果たしていると考えられている.本研究では,最近我々が開発したin vitro嗅覚-味覚連合学習系を用いて,in vitroでの条件付け時における前脳神経活動を解析し,学習成立のメカニズムを解明することを目的としている.学習においては無条件刺激(味覚)の有無により同一の条件刺激(匂い)に対する応答性の変化が生じることから,特に無条件刺激が中枢神経回路に対して持つ効果について注目して解析を行った.忌避性無条件刺激として味覚神経束に頻回電気刺激を与えると,前脳同期振動の振動数が増大した.前脳にはバースト神経と非バースト神経の2種類の神経が存在する.これらの神経から穿孔パッチ法によって記録を行うと,無条件刺激存在下ではバースト神経ではバースト発生頻度が増大し,これに伴って非バースト神経では抑制性シナプス電位の頻度が増大して過分極した.このことから,無条件刺激は,前脳の入力神経である非バースト神経に対して抑制性の効果を持つことが明らかになった.次に嗅覚入力を模して非バースト神経に一定強度の脱分極通電を行ったときの活動電位の発生を調べた.その結果,無条件刺激存在下では非存在下に比べて,非バースト神経の発火頻度は増大していた.またこのとき,活動電位幅の延長が生じていた.以上の結果から,無条件刺激の存在下では,非バースト神経の発火が増強されていることが示された.これまでにナメクジのin vitro標本で嗅覚学習が可能なことを示したが,本年度は嗅覚学習に伴う嗅覚中枢(前脳)での可塑性を明らかにすることを目的として,前脳の神経活動を修飾する物質の探索を行った.前脳神経活動の指標となる局所場電位振動を記録し,神経修飾物質として知られているモノアミンやセカンドメッセンジャーを前脳に投与したときの変化を測定した.その結果,セロトニンとドーパミンによって局所場電位振動の振動数が増大した.