hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
漢字を入力とした脳内イメージの可視化研究

また各種のメタファー、アナロジーと本イメージ生成ツールのパラメータとの対応関係の詳細検討、最適化を行う事により、入力情報に対応した豊富なイメージ方法を生成するシステム全体としての機能を確立させる。(次年度の研究費の使用計画)研究成果について国内外のシンポジウムや学会で発表し、他の研究者との意見交換を考えている。また国内外の美術館等で情報・資料収集を行うため、出張旅費を計上する予定である。さらにデザイン編集支援ツールの改良・強化のための物品(パソコン、画像制作ツール等)を購入予定である。人間が入力漢字に対応してアナロジー、レトリック、メタファーなどの思考法を用いて脳内イメージを想起させるプロセスをシミュレートする事が出来、デザイン編集支援ツールとしての応用が可能となる。本ツールは人間の想起過程をビジュアライズする機能を持つが、それがさらなる人間想起過程を刺激する事になり、脳内イメージがいろいろな広がりがもてると考えられる。また応用としては、脳内イメージにあたるものを、外部の場所に対応させた記憶=絵画や建築における想起法も研究する予定である。研究の最終年度として、システム開発のチューニングを行うための、研究材料費とする。研究成果を世界で認めてもらうために、システム開発に力を入れる。また評価実験等のため、他分野の方々ともコラボレーションを行うので、そのために予算を使用する。研究成果について国内外のシンポジウムや学会で発表し、他の研究者との意見交換を考えている、また国内外の美術館博物館で、情報・資料収集を行う為、出張旅費を計上する予定である。デザイン編集支援ツール作成の為の物品(パソコン、画像制作ツール等)を購入予定である。
Ncxノックアウトマウスを用いた腸管神経発生の分子機構と巨大結腸発症機構の解明

1.Reporter gene assay:当教室において既に、Ncxの標的候補遺伝子としてEndothelin converting enzyme-like 1 (Ecel1)を見出していた。本年度この遺伝子について解析を行なった。既報のEcel1 promoter領域とその近傍の配列を検索し、Ncxの結合配列を見出した。Ecel1 promoter領域のluciferase constructと、Ncxの結合配列に変異を入れた同領域のluciferase constructを作成し、SH-SY5Yにtransfectionし活性を比較したところ、変異を入れたconstructで約2倍のプロモーター活性の上昇がみられた。また、SH-SY5Y細胞でNcxをノックダウンするとEcel1の発現が上昇した。以上よりNcxはEcel1の発現を抑制していることが明らかになった。2.腸管神経培養:本年度は主に実験系の確立を行なった。E12.5の胎児腸管を摘出し、組織を分離して細胞を播種し神経を培養した。細胞の採取法、播種細胞数、培養日数等を検討した。また、培養した細胞をニューロンマーカーのTuj1, HuC/D、シナプスマーカーのSynapsinI、Ecel1等で蛍光免疫染色し、その染色条件を検討した。現時点で、細胞を14日間培養することで、培養した神経が形成する神経節様構造の数がWTに比べNcx-KOで多いという結果を得ている。3.組織学的解析:本年度は、WT及びNcx-KOマウス腸管におけるシナプス形成の評価と神経成熟の評価を行なった。シナプスマーカーであるSynapsinI、未熟神経のマーカーであるDcx, PSA-NCAM、成熟神経のマーカーであるNeuN, MAP2を用いて免疫染色を行い、WTとNcx-KOで神経の成熟度の差異を比較した。その結果、2週齢のマウスではNcx-KOでAuerbach神経叢のSynapsinIの発現低下がみられたが、4週齢のマウスでは両者に違いはみられないという結果が得られた。その意義については現在検討中である。その他のマーカーでは両者に違いはみられなかった。また、Ecel1がAuerbach神経叢内に発現することを確認した。全体として、Ncx抗体に非特異的反応が多く次の行程に進めていないものが多いことと、腸管神経培養の手技の確立と培養条件の検討に時間を想定以上の時間を要したことで、やや遅れていると判断する。以下それぞれの項目について具体的な進捗状況を示す。1.Reporter gene assay: Ecel1のluciferase assayは完了できた。Ncxの結合を確認するChIP assayに関して、市販のNcx抗体には非特異的な反応が多く同実験を行うことが困難であった。そこで独自にNcx抗体を作成したが、同様に非特異的な反応が多く、まだ同実験を行うに至っていない。また、Ecel1以外のNcxの標的候補遺伝子の解析については未着手である。2.腸管神経培養:培養までの手技と培養条件の検討に時間を要したが、実験系を確立できた。現在この培養系を用い、WTとNcx-KOの差異を比較する手法(免疫組織染色、RNAや蛋白の抽出、フローサイトメトリー等)の確立を急いでいる。免疫組織染色の染色条件は、神経の細胞数や形態を評価する為に必須なTuj1, HuC/D, Ecel1等のタンパクに関しては定まっており、染色した画像を評価できる状況まで到達した。RNAや蛋白の抽出は、検体量が少なく現在まで成功していない。フローサイトメトリーを使用した評価は、予備実験を行い可能と考えているが、詳細な実験条件の決定には至っていない。3.組織学的解析:シナプスマーカーであるSynapsinI、成熟・未熟マーカーであるDCX, MAP2, NeuN, PSA-NCAMについて検討を行なった。その他、グリア細胞マーカーのGFAP、交感神経マーカーでのTH、副交感神経マーカーのChE等の染色・比較検討に関しては未着手である。また、Ecel1の組織中の局在は確認することができたが、Ncxは抗体に非特異的反応が多く、特定に至っていない。1.Reporter gene assay: Ecel1 promoter領域に対するChIP assayが良質な抗体がないことにより現在困難な状況である。自作の抗体をNcx-KOマウスのembryo powderを用いて更なる精製を行う、あるいはNcx-flagタンパクを作成し、flag抗体を使用してChIP assayを行うことを検討している。また、まだ未着手である他のNcx標的候補分子に対しても、そのプロモーター領域とNcx結合配列の検索を行い、実験を行なっていく予定である。2.腸管神経培養:本年度で確立された実験系を用いて、WTとNcx-KOの差異を検討していく。現時点で差が得られている、神経節様構造の数の差について、その理由を追求していく。具体的には神経細胞の増殖能の評価やアポトーシス細胞の数の差等の項目を検討する予定である。また形態学的評価だけでなく、RNAやタンパクの発現レベルといった視点からも両者の差異を検討する予定である。更にその違いがEcel1の発現の違いによる起こるのかどうかを、Ecel1をノックアウト、あるいはノックダウンした細胞を用いて検証していきたいと考えている。3.組織学的解析:まだ未検討の神経サブセットにWTとNcx-KOで違いがあるのかを検討していく。また、現時点までに評価した項目についても、継時的な観察に関しては不十分な部分があり、更なる追求をしていきたいと考えている。また、腸管内におけるNcxの局在の評価を行う必要がある。

上記の如く更なる抗体の精製を行うか、あるいはin situ hybridizationでの評価に切り替えることなどを検討している。1.Reporter gene assay:当教室において既に、Ncxの標的候補遺伝子としてEndothelin converting enzyme-like 1 (Ecel1)を見出していた。本年度この遺伝子について解析を行なった。既報のEcel1 promoter領域とその近傍の配列を検索し、Ncxの結合配列を見出した。Ecel1 promoter領域のluciferase constructと、Ncxの結合配列に変異を入れた同領域のluciferase constructを作成し、SH-SY5Yにtransfectionし活性を比較したところ、変異を入れたconstructで約2倍のプロモーター活性の上昇がみられた。また、SH-SY5Y細胞でNcxをノックダウンするとEcel1の発現が上昇した。以上よりNcxはEcel1の発現を抑制していることが明らかになった。2.腸管神経培養:本年度は主に実験系の確立を行なった。E12.5の胎児腸管を摘出し、組織を分離して細胞を播種し神経を培養した。細胞の採取法、播種細胞数、培養日数等を検討した。また、培養した細胞をニューロンマーカーのTuj1, HuC/D、シナプスマーカーのSynapsinI、Ecel1等で蛍光免疫染色し、その染色条件を検討した。現時点で、細胞を14日間培養することで、培養した神経が形成する神経節様構造の数がWTに比べNcx-KOで多いという結果を得ている。3.組織学的解析:本年度は、WT及びNcx-KOマウス腸管におけるシナプス形成の評価と神経成熟の評価を行なった。シナプスマーカーであるSynapsinI、未熟神経のマーカーであるDcx, PSA-NCAM、成熟神経のマーカーであるNeuN, MAP2を用いて免疫染色を行い、WTとNcx-KOで神経の成熟度の差異を比較した。その結果、2週齢のマウスではNcx-KOでAuerbach神経叢のSynapsinIの発現低下がみられたが、4週齢のマウスでは両者に違いはみられないという結果が得られた。その意義については現在検討中である。その他のマーカーでは両者に違いはみられなかった。また、Ecel1がAuerbach神経叢内に発現することを確認した。全体として、Ncx抗体に非特異的反応が多く次の行程に進めていないものが多いことと、腸管神経培養の手技の確立と培養条件の検討に時間を想定以上の時間を要したことで、やや遅れていると判断する。以下それぞれの項目について具体的な進捗状況を示す。1.Reporter gene assay: Ecel1のluciferase assayは完了できた。Ncxの結合を確認するChIP assayに関して、市販のNcx抗体には非特異的な反応が多く同実験を行うことが困難であった。
原始真核生物を求めて : 新奇真核微生物の形態・発現遺伝子・ミトコンドリアゲノム解析

ディスコバ生物群は、単細胞真核生物からなる単系統群であり、4つのサブクレード、即ちヘテロロボサ類、ユーグレノゾア類、ヤコバ類、ツクバモナディダ類から構成される。ヤコバ類の一種であるReclinomonas americanaのミトコンドリア(mt)ゲノムはもっとも原始的な遺伝子構成を保持しているため、R. americanaを含むディスコバ生物群はmtゲノムの初期進化を考察する上で極めて重要な生物種であると考えられている。ツクバモナディダ類はTsukubamonas blobosa(TKB055株)の発見と共に2011年に確立されたが、この時点ではディスコバ生物群内部でT. globosaの系統的位置は確定できなかった。本研究では、次世代シークエンス技術を用いたT. globosaのトランスクリプトーム解析を行い、そこから生成した配列データを基に157個のタンパク質(アミノ酸)配列をふくむ巨大アライメントを作製した。この157タンパク質アライメントによる系統解析では、姉妹群となるヘテロロボサ類とユーグレノゾア類の基部からT. globosaが分岐した。また、我々はT. globosaのmtゲノムを完全解読することに成功した。T. globosa mtゲノムは、全長48,463塩基対(AT含量66.2%)の環状分子であり、52個のタンパク質と29個のRNAをコードしていた今後157タンパク質系統解析により解明したディスコバ生物群内部の系統関係をもとに、T. globosaのmtゲノムと他のディスコバ生物のmtゲノムとを比較することにより、この生物群内部でのmtゲノムにおける遺伝子構成の進化を精度よく推測することが可能となる。ミトコンドリア(mt)は細胞内共生したバクテリアを起源とし、バクテリア型のミトコンドリアDNA(mtDNA)を保持する。mtは祖先真核生物で獲得されたとすると、祖先的真核生物のmtDNAは祖先的な特徴をもつ可能性が高い。ヤコバ類Reclinomonasはゲノムサイズ・遺伝子数が最大である「祖先的」mtDNAを持ち、祖先的真核生物の候補の1つである。ユーグレノゾア、ヘテロロボーサ、ヤコバ類は単系統であり、近年ディスコバ生物群と総称されている。これまでに我々が行った分子系統解析により、新奇真核生物TKB055株はディスコバ生物群の新たなメンバーであることが判明している。本研究の目的は、TKB055株を(1)形態観察、(2)網羅的発現遺伝子(EST)解析と大規模分子系統解析、(3)mtDNAの全ゲノム配列の決定、を通じた原始真核生物細胞に関する新たな知見の獲得である。H22年度には以下の作業を行った。1.透過型電子顕微鏡による形態観察により、TKB055株がディスコバ生物群特有の形態的特徴を持っているか精査した。また、小サブユニットリボソームRNAをはじめ、複数のタンパク質遺伝子配列をもちいた分子系統解析の結果と合わせ、TKBO55株をTsukubamonas globosaとして正式に記載した(Yabuki,Inagaki,Ishida.2010Protist 210:523-538)。2.EST解析を行うため、T.globosa細胞の大量培養を行った。培養細胞から全RNAサンプルを調製し、パイロシークエンス用のcDNAライブラリー作成とシークエンシングの準備を行った。3.T.globosaのmtDNA解析の準備として、濃度勾配遠心法によるミトコンドリア画分の精製、全DNAサンプルからのmtDNAの精製を試みた。試した2つの方法は出発材料が大量に必要であり、T.globosaの増殖速度・細胞収量を鑑みると現実的ではないことが分かった。そこで、全DNAサンプルからRolling circle amplificationによる環状mtDNAの増幅を試みた。

ミトコンドリア(mt)は細胞内共生したバクテリアを起源とし、バクテリア型のミトコンドリアDNA(mtDNA)を保持する。mtは祖先真核生物で獲得されたとすると、祖先的真核生物のmtDNAは祖先的な特徴をもつ可能性が高い。ヤコバ類Reclinomonasはゲノムサイズ・遺伝子数が最大である「祖先的」mtDNAを持ち、祖先的真核生物の候補の1つである。ユーグレノゾア、ヘテロロボーサ、ヤコバ類は単系統であり、近年ディスコバ生物群と総称されている。これまでに我々が行った分子系統解析により、新奇真核生物Tsukubamonas globosa(TKB055株)はディスコバ生物群の新たなメンバーであることが判明している。本研究の目的は、T.globosaを(1)形態観察、(2)網羅的発現遺伝子(EST)解析と大規模分子系統解析、(3)mtDNAの全ゲノム配列の決定、を通じた原始真核生物細胞に関する新たな知見の獲得である。H23年度には以下の作業を行った。1.次世代シークエンス用cDNAライブラリーを作製し、網羅的発現遺伝子(EST)解析を行った。このデータからT.globosaのディスコバ生物群内での系統的位置を決定するため、系統解析に用いる160遺伝子程度を選定し予備的な系統解析を開始した。2.Rolling Circle Amplification(RCA)法により増幅したmtDNAサンプルからDNAライブラリーを作製し、パイロシークエンスを行った。その結果T.globosa環状mtDNAゲノムの塩基配列を完全決定した。完全決定されたmtゲノムは約47kbpであった。
心筋細胞における細胞周期制御機構に関する研究

本研究の目的は、心筋細胞における細胞周期の制御機構を明らかにし、細胞分裂再開による心筋細胞再生という形での心不全の新しい治療法の可能性を検討することである。そのために、細胞周期制御蛋白であるcdk2,cdc2の心筋細胞特異的トランスジェニック・マウスを作製し、それらの心臓を解析することにより、心筋細胞における細胞周期制御機構を明らかにし、心筋細胞再生の可能性につき検討を加えることを目的として研究した。cdc2の心筋細胞特異的トランスジェニック・マウスが正常に発生、生育するのに対して、cdk2の心筋細胞特異的トランスジェニック・マウスは心肥大が認められたが、個々の心筋細胞のサイズはむしろ小さく、細胞分裂が亢進している結果と考えられた。cdk2の心筋細胞特異的トランスジェニック・マウスでは心不全を合併し、発現の多いラインは死亡した。cdk2,cdc2の心筋細胞特異的トランスジェニック・マウスで、このような差異が生じるメカニズムは明らかではないが、DNA、RNAレベルでは問題ないが、蛋白レベルで生成されていないことが明らかになった。Post-transcriptionalな制御がなされている可能性が考えられた。今回の解析により、心筋細胞における細胞周期制御機構の一部を明らかにし、心筋細胞再生の可能性につき検討を加えることができたと考える。本年度は、心筋細胞における細胞周期の制御機構を明らかにし、細胞分裂再開による心筋細胞再生という形での心不全の新しい治療法の可能性を検討するために、細胞周期制御蛋白であるcdk2,cdc2の心筋細胞特異的トランスジェニック・マウスを作製し、それらの心臓を解析した。心肥大心筋細胞肥大および心不全の評価作製したcdk2,cdc2の心筋細胞特異的トランスジェニック・マウスのF2を12週齢でsacrificeし、body weight,heart weightを測定し、さらに心肥大の目安としてheart weight/body weightを計算する。また、lung weight,liver weight,pleural effusionをチェックし心不全の程度について評価した。その結果、cdc2の心筋細胞特異的トランスジェニック・マウスでは発生は正常で心肥大をきたさないにもかかわらず、cdk2の心筋細胞特異的トランスジェニック・マウスでは心肥大が見られ発現量の多いラインではマウスは2週齢死亡した。組織学的には細胞数の増加が観察された。このことは、心筋細胞が細胞分裂を再開したことを意味する。来年度は、cdk2,cdc2の心筋細胞特異的トランスジェニック・マウスにおける差異を詳細に検討することにより心筋細胞における細胞周期の制御機構を明らかにすることを目標とする。
炭素化合物の熱力学的平衡に着目した花崗岩生成環境の推定

本研究は,オーストラリアおよび日本で採取した各種系列(Sタイプ/Iタイプおよびチタン鉄鉱系列/磁鉄鉱系列)の花崗岩に含まれる気体炭素化合物の分析を行い,各系列に特徴的な気体炭素化合物の組成を明らかにし,それらの成分の熱力学的平衡に着目して花崗岩生成時の温度・酸素分圧などの推定を試みたものである。研究方法として,花崗岩試料を密閉容器内で破砕し,その際放出される気体をガスクロマトグラフに導入して,含まれている炭素化合物の分析を行った。本研究の成果として,オーストラリアおよび日本の花崗岩いずれについても,従来の鉱物学的な研究結果と調和する気体炭素化合物の組成の特徴が明らかとなった。例えばオーストラリアの花崗岩については,Iタイプは明らかに二酸化炭素に富む傾向が見られたが,Sタイプにはこのような分布の偏りは認められなかった。このことは,温度・対数酸素分圧ダイアグラムにおいて,Iタイプは二酸化炭素・メタンバッファを示す線から離れた二酸化炭素側に分布するのに対して,Sタイプは同バッファを挟むように分布するとした過去の研究結果と調和的であった。一方日本のものについては,還元的環境で生成されたと考えられるチタン鉄鉱系列はメタンに富む傾向を示したこと,酸化的環境の磁鉄鉱系列からはメタンがほとんど検出されなかったことのいずれも鉱物学的な特徴とよく一致した。そして二酸化炭素・メタンの組成が,岩石生成時の酸化還元度を示す指標として有効であることをより具体的に検証するために,個々の試料について鉄の分析を行い,三価鉄/二価鉄比と二酸化炭素/メタン比との間に正の相関関係があることを見いだした。花崗岩生成時の温度・酸素分圧などの推定については,これに必要な岩石中極微量プロパンの分析値が用いた分析装置の検出感度の不足によって十分得られず,分析装置の感度向上が本研究を推進してしく上での今後の課題である。本研究は,岩石試料を密閉容器内で破砕し,その際放出される気体炭素化合物の分析を行い,その組成から岩石生成環境の推定を行うものである。対象試料として,日本及びオーストラリアの花崗岩を選定した。これは両地域とも鉱物学的方法によって,花崗岩の起源や分類が古くから行われており,本研究の結果との比較検討を行う上で最適な試料と判断したからである。分析の結果,日本の花崗岩について,酸化的環境で生成したと考えられる磁鉄鉱系列の花崗岩から放出された気体は二酸化炭素に富みメタンに乏しく,還元的環境で生成したと考えられるチタン鉄鉱系列ではその逆の傾向を示した。これは酸化・還元環境が,各炭素化合物の炭素に結びついている酸素・水素の数に影響するという事前の推察と見事に一致するものである。また,オーストラリアの花崗岩については,堆積岩起源と考えられるSタイプの花崗岩では,エタンが含まれる試料が多くあったが,火成岩起源と考えられるIタイプの花崗岩からはエタンがほとんど検出されなかった。これはエタンが,堆積物に含まれる有機物起源であることを示唆し,花崗岩の起源についての有用な情報をもたらすことを意味している。これらの結果について,2001年1月にオーストラリア・メルボルンで開催されたアラン・ホワイト・シンポジウムで招待講演を行い,鉱物学者から高い関心を呼んだ。また,その折に花崗岩研究の第一人者であるホワイト博士及びチャペル博士と議論を行った。その中で,本研究ではIタイプ花崗岩について酸化的なもののみを分析していたことを指摘され,シンポジウム終了後にチャペル博士と共に,還元的なIタイプ花崗岩の採取を行った。この試料の分析は引き続いて来年度に行う。
クリニカルパスを活用した病院BSCと時間主導型原価計算の関係性に関する研究

本研究は、クリニカルパスを活用した病院バランスト・スコアカード(以下、病院BSC)と時間主導型の病院原価計算の関係を、日仏米の国際比較の観点から整理することで、医療におけるマネジメント・コントロール及び原価計算のあり方を検証することを目的としている。具体的には、患者ケアサイクルに焦点を充てたマネジメントツールとして地域連携クリニカルパスを活用した病院BSCの特徴を明らかにし、当該BSCのKPI指標として、「時間」を配賦基準とした病院原価計算(時間ベースの病院原価計算)で算定されるキャパシティ情報(業務遂行に用いられる資源の量)を用いることの有用性を検証することを目的としている。本研究は、医療分野で活用されているクリニカルパスに着目し、クリニカルパスとの関連で病院BSC及び時間ベースの病院原価計算の関係性を明らかにしようとしている点に、学術的な特色・独創的な点がある。そこで本研究では、1「地域医療を対象にした病院BSC」に対する地域連携パスの有用性に関する研究と、2クリニカルパスを活用した「時間ベースの病院原価計算」の導入運用に関する研究の2つの課題に取り組むことで、クリニカルパスを活用した病院BSCと時間主導型の病院原価計算の体系的な分析整理を行う。以上の研究を行うにあたり、地域連携クリニカルパス(以下、地域連携パス)と病院BSCの関連性について研究調査を進めていきながら、同時に時間主導型活動基準原価計算(TDABC)の研究成果をクリニカルパスに関連させながら研究を進めていく。具体的には、クリニカルパス・地域連携パスの文献資料や学会誌の収集を行い、最新の病院BSCや病院TDABCの事例を掲載した書籍や学会誌などの資料収集も行う。文献収集だけではなく、国内を中心に実際の病院訪問調査を行い、病院BSCおよび病院原価計算に対する現場の意見も積極的に取り入れる。平成30年度は、病院原価計算(ABC及びTDABC)に関連した研究を行った。具体的には、1アメリカ病院経営における「価値」概念の内実と病院TDABCの特徴に関する研究と、2DPCデータから抽出した「診療行為回数」を用いた病院原価計算システムの検証を行っている。1は、オバマ政権下での医療保険制度改革(オバマケア)を運用面で支える病院「価値」概念の内実を明らかにすると同時に、キャプラン、ポーターなどハーバード・ビジネス・スクール教授陣が着手した病院TDABCプロジェクトの実態を分析している。本研究から、「医師の働き方改革」の解決策として取り上げられているタスク・シフティングをはじめ、院内の様々な業務プロセスをコスト面から「見える化」する意義を提示している。以上の研究成果は、平成31年度に単著として出版予定である。2の研究成果は、(1)水野真実・足立俊輔・丸田起大「患者属性と患者別収益・費用の関係性ーDPCデータを活用した患者別活動基準原価計算にもとづく考察ー」(日本原価計算研究学会第44回全国大会、平成30年9月1日)、(2)水野真実・足立俊輔・丸田起大「患者別収益性評価に対する間接費配賦方法の影響ー活動基準原価計算と限界利益法の意義ー」(会計理論学会第33回大会、平成30年10月7日)で報告しており、平成31年度にはそれぞれの研究成果を公刊する予定である。例えば、(2)は共同研究者の協力のもと、院内財務データに変動費・固定費の区分を組込み、固定費に対しては応能主義配賦(限界利益比例)を行う原価計算データの有用性について、現場の医療従事者からの意見を取り入れながら検証している。本研究では、1「地域医療を対象にした病院BSC」に対する地域連携パスの有用性に関する研究と、2クリニカルパスを活用した「時間ベースの病院原価計算」の導入運用に関する研究の2つの課題に取り組むことで、クリニカルパスを活用した病院BSCと時間主導型の病院原価計算の体系的な分析整理を行う。平成29年度は、病院BSCに関する研究発表を行い、平成30年度は、病院原価計算(ABC及びTDABC)に関連した研究を行っている。平成30年度は、これまで着手していなかった「クリニカルパスと時間主導型ABCの関係性」を中心に研究を進め、当該研究成果を博士論文に組み込み、平成31年度(令和元年)に著書として公刊予定にしている。加えて、平成31年度は、病院BSCと原価計算システムの関係性の研究成果としてまとめることも検討している。病院の実務研究においては、熊本機能病院(熊本県熊本市)の他、公立八女総合病院(福岡県八女市)が調査対象病院に加わっている。平成30年度には実施しなかったものの、沖縄県のちばなクリニック・徳山クリニックの病院BSCも調査予定にしている。調査は、病院BSCの「財務の視点」に関するKPI指標と、アウトカムに関連するKPI指標のバランス、変革エージェント・スポンサーの存在意義に着目して実施する予定にしている。平成29年度に渡仏した成果は、時間要素を重視した原価計算であるフランスのUVA法と関連させ、病院TDABCやRVU法(相対価値尺度法)など、時間要素を配賦基準とした原価計算の国際比較研究として進めていく予定である。

具体的には、患者ケアサイクルに焦点を充てたマネジメントツールとして地域連携クリニカルパスを活用した病院BSCの特徴を明らかにし、当該BSCのKPI指標として、「時間」を配賦基準とした病院原価計算(時間ベースの病院原価計算)で算定されるキャパシティ情報(業務遂行に用いられる資源の量)を用いることの有用性を検証することを目的としている。本研究は、医療分野で活用されているクリニカルパスに着目し、クリニカルパスとの関連で病院BSC及び時間ベースの病院原価計算の関係性を明らかにしようとしている点に、学術的な特色・独創的な点がある。そこで本研究では、1「地域医療を対象にした病院BSC」に対する地域連携パスの有用性に関する研究と、2クリニカルパスを活用した「時間ベースの病院原価計算」の導入運用に関する研究の2つの課題に取り組むことで、クリニカルパスを活用した病院BSCと時間主導型の病院原価計算の体系的な分析整理を行う。以上の研究を行うにあたり、地域連携クリニカルパス(以下、地域連携パス)と病院BSCの関連性について研究調査を進めていきながら、同時に時間主導型活動基準原価計算(TDABC)の研究成果をクリニカルパスに関連させながら研究を進めていく。具体的には、クリニカルパスや地域連携パスの基本的な文献資料や学会誌の収集を行い、最新の病院BSCや病院TDABCの事例を掲載した書籍や学会誌などの資料収集も行う。文献収集だけではなく、国内を中心に実際の病院訪問調査を行い、病院BSCおよび病院原価計算に対する現場の意見も積極的に取り入れる。平成29年度は、病院BSCに関連した研究成果を幾つかの雑誌で発表している。主な研究成果は、1病院BSCとクリニカルパスを取り上げ、両者の関連性を文献レビューに基づいて、クリニカルパスが病院BSCにどのように活用されているかを明らかにしたこと、2病院BSCが医療安全にどのように貢献しているのかを文献レビューに基づいて明らかにしたことの2点である。1の研究成果は、足立俊輔・末盛泰彦「病院BSCにおける医療安全の位置づけ」『医療と安全』第7号、2017年8月、2の研究成果は、足立俊輔「病院BSC構築におけるクリニカルパスの位置づけ」『九州経済学会年報』第55集、2017年12月で発表している。平成28年度に着手した研究成果(丸田起大・足立俊輔「我が国における病院BSC実務の多様性と形成要因ーケースレビューにもとづく探索的研究ー」『産業経理』(産業経理協会)、2015年4月)の英訳を行い、Journal of Medical Safetyに投稿した。また、2017年9月にパリ・ナンテール大学に赴き、クズラ教授(パリ・ナンテール大学、専攻:マネジメント・コントロール論)及びモケ教授(パリ・クレテイユ大学、専攻:社会的責任戦略コントロール論)と、フランスにおけるマネジメント・コントロール論について意見交換を実施した。なお、パリ第5大学(パリ・デカルト大学)にて、フランスの病院原価計算の第一人者であるデュクロ(Charles Ducrocq)教授とフランス病院原価計算について意見交換を行う予定であったが先方の諸事情により実現できなかった。しかし、デュクロ教授とは、今後も病院TDABCやUVA法について議論を重ねていく予定である。以上の渡仏した研究成果については、これまでの病院BSCや病院TDABCの研究成果に関連させながら研究を進めていく予定である。
Evx2遺伝子の機能及びその高次発現調節機構解析

これまで、129sv-C57Bl/6交雑系における観察からEvx2遺伝子欠損マウスの表現型として行動異常が考えられた為、その行動遺伝学的解析を目的とし、Evx2欠損のC57Bl/6へのバッククロスを行い、F7の取得を完了した。現在、それらのヘテロ接合体を交雑し、行動及び解剖学的解析の準備を進めている。また、Evx2-Hoxdl3間に存在するクロマチンバウンダリー(境界領域と呼ぶ)の解析においては、ES細胞を用いた、ターゲティドトランスジーンの手法により約2,5kbのDNA断片を単離した。しかしながら、それ以上の短縮により、境界領域としての機能が失われることが判明し、多種の蛋白質-DNA相互作用が境界機能発現に必要とされることが判明した。本活性試験は全て本DNA断片が存在しているHox遺伝子近傍で行われており、現在、本DNA断片によるHox近傍以外の挿入点における境界形成機能の発現の可能性を検討している。また、境界領域の本来の候補であった断片全体である5kbの断片を用いた解析においては、本来のゲノム上での機能と同様脳、中枢神経系のみで活性が見られ、肢芽及び生殖原基での活性は見られなかったが、今回単離された2.5kbにおいては全ての細胞において活性を発現することが見い出された。そこで、残りの2.5kbによる細胞特異性を付与する調節機能が示唆され、現在はその調節機能解析を中心として、DNaseI高感受性試験、メチレーションの有無等の生化学的解析を行っている。また、その調節領域をゲノムから欠失させたマウスをES細胞を用いたターゲッティングにより作製している途上であり、配偶子へのトランスミッションを待っている。Evx2遺伝子欠損変異をES細胞を用いたターゲッティング技術を用い、作製した。行動に異常が見られる可能性が高いため、行動試験を可能とするため、本来のESを樹立した129Svの血統からの影響を排除することを目的としてC57Bl/6系統へのバッククロスを現在行っている。現在F4に至っている。Evx2遺伝子及び、Hoxd13遺伝子発現調節に関しては、やはりES細胞を用いたターゲッティドトランスジーンの手法を用い、そのESからマウスを樹立、そのマウスでの遺伝子発現の変化を解析するという方法で行っている。これら二つの遺伝子は近傍に位置し、その発現調節の一部は共通のエンハンサーによってなされていると考えられているにも関わらず、胎生中期において、中枢神経系における遺伝子の発現の有無という点で大きく異なっている。これはエンハンサー及び二つのプロモーターの相互作用を調節しているDNA配列がこの二つの遺伝子間に存在するためと考えられており、その存在の確認及びその機能的な最小の断片を単離することを試みている。本研究において、本手法により、その存在の確認は終了している。さらにその神経系での発現の相違をもたらすDNA断片は、その機能を完全に発揮するためには約2Kbに渡る複合的な塩基配列を必要とすることが判明し、それ以上の短縮が不可能であることを見い出した。現在、そのDNA断片が異なる染色体環境においてその機能(エンハンサー、プロモーターの相互作用の調節)を発揮することを確認している。
微生物のエンドグリコシダーゼを活用した新奇な生理活性物質の生産とその酵素的解析

本研究は微生物のエンドグリコシダーゼの糖転移活性を活用して、さまざまな生理活性複合糖質の組換え型エンドグリコシダーゼの大腸菌による大量発現:糸状菌Mucorhiemalisのエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(Endo-M)の遺伝子を大腸菌に導入し、IPTGによる発現誘導を行うことなく、20°Cにて長時間培養することにより本酵素を多量発現させることに成功した。2.部位特異的変異により糖転移活性を向上させた変異酵素の取得:Endo-Mの活性中心付近の構成アミノ酸である217番目のTyr残基をPheに置換した変異酵素Y217Fが高い糖転移活性を有することを見出した。3.Endo-Mのグライコシンターゼ化:Endo-Mの175番目のAsn残基をAlaに置換した変異酵素N175Aを取得し、本変異酵素がN-結合型糖鎖に対する加水分解と糖転移活性を失っていたが、反応中間体であるオキサゾリン構造を有する糖鎖を供与体として糖転移反応を触媒することを見出した。反応生成物は加水分解されずに生成し続け、本変異酵素がグライコシンターゼ様に機能することが示された。N175Aを用いて抗HIV活性を有する糖ペプチドを極めて高い収率で酵素合成した。4.エンド-α-N-アセチルガラクトサミニダーゼの糖転移活性によるムチン型糖鎖のペプチドへの付加:ビフィズス菌の本酵素の遺伝子を大腸菌に導入して得られた組換え型酵素を用い、ガラクトシルβ1-3N-アセチルガラクトサミンα1-pNPを糖鎖供与体として、糖転移活性を検討した結果、SerやThrのみならず、ムチンの部分ペプチドMUClaにもムチン糖鎖を転移付加することを見出した。この結果は人工ムチン合成の可能性を示唆するものである。本研究は微生物のエンドグリコシダーゼの糖転移活性を活用して、さまざまな生理活性複合糖質の合成を行うとともに、その技術の確立を目指した酵素的解析を行うことを目的としている。平成18年度における研究実績は次の通りである。1.組換え型エンドグリコシダーゼの大腸菌による大量発現:糸状菌Mucorhiemalisのエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(Endo-M)は酵母Candida boidiniiにその遺伝子を導入して発現する系が既に構築されているが、本研究においては遺伝子操作が容易な大腸菌での発現系の確立を試みた。Endo-Mの遺伝子をpET23ベクターに繋ぎ、大腸菌BL21に導入して、IPTGによる発現誘導を行うことなく、20°Cにて長時間培養することにより可溶性タンパク質として多量に発現させることに成功した。これをHis-Tag融合型の酵素として大腸菌で容易に大量生産できる系を確立した。2.部位特異的変異により糖転移活性を増進させた変異酵素の取得:Endo-Mの糖転移活性の増進を意図して、活性中心付近の構成アミノ酸の置換を試みた。その結果、保存性の高いアミノ酸であるN-末端より217番目のアミノ酸のチロシン残基をフェニールアラニンに置換した変異酵素を作成したところ、高い糖転移活性を有することを見出した。3.エンド-α-N-アセチルガラクトサミニダーゼの糖転移活性によるムチン型糖鎖のペプチドヘの付加:ビフィズス菌の本酵素の遺伝子を大腸菌に導入して得られた組換え型酵素を用い、ガラクトシルβ1-3N-アセチルガラクトサミン(Galβ1-3GalNAc)α1-pNPをムチン型糖鎖の供与体として、糖転移活性を検討した結果、糖やアルコールばかりでなく、セリンやスレオニンのような水酸基を持つアミノ酸、更にムチンの部分ペプチドのMUClaにもムチン糖鎖を転移付加することを見出した。

この結果は人工ムチンの合成の可能性を示唆するものである。4.組換え型Endo-α-GalNAc-aseの基質特異性の検討:さまざまなpNP-α-二糖を基質にして加水分解反応により、本酵素の基質特異性を調べた。その結果、Galβ1-3GalNAcのみならず、Glcβ1-3GalNAc、GalNAcβ1-3GalNAcに対しても作用することを確認した。この結果より、さまざまな構造の0-結合型糖鎖が糖転移活性の供与体として活用できることが示唆され、さまざまな0-結合型糖鎖を持つ機能性糖鎖複合体を化学-酵素合成できることが示唆された。本研究は微生物のエンドグリコシダーゼの糖転移活性を活用して、さまざまな生理活性複合糖質の合成を行うとともに、その技術の確立を目指した解析を行うことを目的としている。平成19年度における研究実績は次の通りである。1.糸状菌Mucorhiemalisのエンドーβ-N-アセチルグルコサミニダーゼ(Endo-M)の部位特異的変異によるグライコシンターゼ化:既に、Endo-Mの組換え酵素の触媒部位周辺のアミノ酸を変異導入することにより、高い糖転移活性を示す変異体酵素Y217Fを取得しているが、さらに本酵素が属するGHファミリー85のホモログ間で完全保存されているN175の変異体酵素N175Aを取得した。本変異体酵素はN-結合型糖鎖に対する加水分解と糖転移活性を失っていたが、反応中間体であるオキサゾリン構造を有する糖鎖を供与体として糖転移反応を触媒することを見出した。しかもその反応生成物は加水分解されずに生成し続け、N175Aはグライコシンターゼ様に機能することが示された。この結果より、N175はオキサゾリン反応中間体構造の形成に関与する重要な残基であることが示唆された。また、N175Aを用いて、抗HIV活性を有する糖ペプチドを合成したところ、極めて高い収率で目的物が得られた。2.Bifidobacterium longumのエンドーα-N-アセチルガラクトサミニダーゼの糖転移活性を用いた生理活性糖ペプチドの合成:血圧抑制作用を有する生理活性ペプチドPAMP-12はC-末端から2番目のアミノ酸残基がSer残基である。この残基にB.longumのエンドグリコシダーゼの糖転移活性によってムチン型糖鎖を付加し、生理活性糖ペプチドを酵素合成した。また、Ser残基をThr残基に変換したPAMP-12(SllT)を合成し、本酵素による糖転移活性を調べたところ、生成物量が1/4に減少した。この結果より、Thr残基はSer残基に比べて、ムチン型糖鎖を転移付加し難いことがわかった。
ヒト表皮角化細胞におけるIκBζによるIL-17誘導性遺伝子発現制御の解明

本研究では、初年度より、IκB familyの1つである核内蛋白のIκBζがヒト表皮角化細胞におけるIL-17による遺伝子発現の制御において必須の因子であることを検討していたが、海外から同様の内容で複数の論文報告がなされた。そこで研究の軌道を修正し、(1)IκBζと同じ核内IκBファミリー蛋白であるBcl-3との相互作用の有無、(2)IL-17刺激による遺伝子発現においてIκBζ以外の重要な分子、の2点につき検討を進めることとした。アトピー性皮膚炎では乾癬類似の病理組織所見をとることがあることが知られているが、表皮におけるBcl-3とIκBζの発現パターンを検討したところ、乾癬とほぼ同様であることが明らかになった。以上の結果は、乾癬型組織の形成に、Bcl-3とIκBζの発現が重要であることが示唆された。一方で、Bcl-3の活性化を制御することが知られているCYLDの発現は、乾癬では減弱していた。この三者の相互作用が乾癬とアトピー性皮膚炎の病態をわけている可能性があると考え、本年度は、培養表皮角化細胞において、それぞれの強発現・ノックダウンを行うことで、遺伝子発現における相互作用、またそれぞれの分子の結合の有無を検討した。さらに、IL-17で発現が誘導され、乾癬の病態形成に重要であるCCL20の発現とIκBζの関係に注目して検討を行った。IL-17によるCCL20の発現は、IκBζのsiRNAにより完全に抑制されるが、一方でERK経路の阻害によっても抑制され、ERKの抑制はIκBζの発現に関与しない。そこで、IL-17レセプターからERK経路の活性化に至る経路を検討し、src familyが関与していることを明らかとした。本年度は、IκB familyの1つである核内蛋白のIκBζが、ヒト表皮角化細胞におけるIL-17による遺伝子発現の制御において必須の因子であることを明らかとするために検討を行った。まず、正常皮膚より分離培養した表皮角化細胞に、各種サイトカインを添加し、time-courseでIκBζのmRNAの発現を検討した。IκBζは、IL-17刺激で特異的に発現が誘導され、mRNAのstabilityによるものではないことを確認した。次に、培養表皮角化細胞にアデノウイルスベクターによりIκBζを強発現させ、発現が誘導される遺伝子を検討した。乾癬病変部に発現が増強している抗菌ペプチド、サイトカイン、ケモカインの発現がIκBζの強発現で誘導されることを確認した。また、IκBζと結合して遺伝子発現を制御することが報告されているp50を、IκBζの強発現系でsiRNAを用いてノックダウンし関与を検討したところ、p50の関与する群と関与しない群があることが明らかとなった。続いて、siRNAを用いてIκBζを表皮角化細胞でノックダウンした。恒常状態での遺伝子発現に与える影響は限局的であったが、IL-17を添加したとき、表皮角化細胞に発現が誘導される主要な遺伝子の多くで、その発現が抑制された。以上の結果は、IL-17により誘導される遺伝子発現にIκBζが必須であることを示しており、さらには乾癬の病態における重要性を示唆するものであった。平成28年度の計画はほぼ達成できた。本研究の当初の目的は、IκB familyの1つである核内蛋白のIκBζが、ヒト表皮角化細胞におけるIL-17による遺伝子発現の制御において必須の因子であることを明らかとすることであったが、この1年間で海外から複数の報告がなされた。そこで研究内容につき軌道を修正し、これまで我々が検討していたIκBζと同じ核内IκBファミリーのBcl-3との相互作用につき検討を進めることとした。前年度までの検討で、IκBζはヒト表皮角化細胞において、ディフェンシンやS100Aファミリーの発現を誘導することを明らかとした。他の細胞腫における検討では、IκBζはBcl-3同様にp50と結合して遺伝子発現を誘導すると報告されている。そこで、まずIκBζとp50の結合の有無を検討した。アデノウイルスベクターを用い表皮角化細胞に強発現させたBcl-3はp50と結合したが、同様の方法で強発現させたIκBζとp50の結合は確認できなかった。我々はBcl-3が乾癬表皮の全層に強く発現していることを報告したが、IκBζの発現を検討したところ主に表皮上層に認められた。日本人のアトピー性皮膚炎では、IL-17がある程度関与しており、乾癬類似の病理組織所見をとることがあることが知られているが、このときにもBcl-3とIκBζの発現パターンは乾癬に類似していることが明らかになった。一方で、Bcl-3の活性化を制御するCYLDの発現は、乾癬では減弱していた。この三者の相互作用が乾癬とアトピー性皮膚炎の病態をわけている可能性があると考え、さらに検討中である。乾癬におけるIΚB

ζの関与はすでに複数の報告が出ているため、乾癬の炎症に関わる遺伝子発現に関与することを我々が明らかにしたBcl-3とIΚBζの関連、ユビキチンを制御するCYLDとIΚBζとの関連について研究を進め、順調に進展している。本研究では、初年度より、IκB familyの1つである核内蛋白のIκBζがヒト表皮角化細胞におけるIL-17による遺伝子発現の制御において必須の因子であることを検討していたが、海外から同様の内容で複数の論文報告がなされた。そこで研究の軌道を修正し、(1)IκBζと同じ核内IκBファミリー蛋白であるBcl-3との相互作用の有無、(2)IL-17刺激による遺伝子発現においてIκBζ以外の重要な分子、の2点につき検討を進めることとした。アトピー性皮膚炎では乾癬類似の病理組織所見をとることがあることが知られているが、表皮におけるBcl-3とIκBζの発現パターンを検討したところ、乾癬とほぼ同様であることが明らかになった。以上の結果は、乾癬型組織の形成に、Bcl-3とIκBζの発現が重要であることが示唆された。一方で、Bcl-3の活性化を制御することが知られているCYLDの発現は、乾癬では減弱していた。この三者の相互作用が乾癬とアトピー性皮膚炎の病態をわけている可能性があると考え、本年度は、培養表皮角化細胞において、それぞれの強発現・ノックダウンを行うことで、遺伝子発現における相互作用、またそれぞれの分子の結合の有無を検討した。さらに、IL-17で発現が誘導され、乾癬の病態形成に重要であるCCL20の発現とIκBζの関係に注目して検討を行った。IL-17によるCCL20の発現は、IκBζのsiRNAにより完全に抑制されるが、一方でERK経路の阻害によっても抑制され、ERKの抑制はIκBζの発現に関与しない。そこで、IL-17レセプターからERK経路の活性化に至る経路を検討し、src familyが関与していることを明らかとした。IκBζが乾癬の遺伝子発現、IL-17による遺伝子発現において必須の因子であるという報告が海外からあった(Johansen C, et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2015)。そこで、本研究の目的を「IκBζが、ヒト表皮角化細胞におけるIL-17による遺伝子発現の制御において必須の因子であることを明らかとする」からさらに発展させ、今後は以下の点を検討する。我々は最近、Th17サイトカインの1つであるIL-22がSTAT3を介して表皮角化細胞にBcl-3の発現を誘導し、Bcl-3がp50と結合することでIL-22刺激による後期の遺伝子発現を制御していることを明らかにしている。IL-22はIL-17と協調して乾癬に高発現する遺伝子群の発現を増強させ、ここにもBcl-3が関与していることを確認しているが、同時にIκBζも関与していることが示唆される。同じ核内IκBファミリーに属するBcl-3とIκBζがどのように相互に作用しているのかを明らかにする。また、IL-17により発現が抑制されることの知られているCTACK(CCL27)、は、IκBζのノックダウンで発現が亢進する。CTACKはアトピー性皮膚炎の病態に関与するケモカインであることから、Th2サイトカイン、ケモカインとIκBζに注目して検討を行う。CYLDがIκBζの活性化に関与するか、CYLDの発現抑制がBcl-3やIκBζの誘導する遺伝子発現にどのような影響を与えるか、さらにはCYLDの発現抑制メカニズムなどについて検討し、これら分子のアトピー性皮膚炎と乾癬における役割を明らかにする。平成28年度の実験計画は順調に遂行できたが、「今後の研究の推進方策」に記載したように、海外から先に論文報告がなされたため、既報告の実験をなぞるのみとなる実験を省略し、今後の推進方策を検討していたため、次年度使用額が生じた。
高精度時系列プロテオミクスによるシグナル伝達攪乱機構のシステム解析

シグナル伝達系は細胞の増殖・分化等の基本的な生命活動を制御しており、その破綻は癌をはじめとする種々の疾患の発症と密接に関連することが知られている。本研究課題において、我々はタンパク質安定同位体標識(SILAC)法と高精度nanoLC-MS/MS型質量分析システムを用いてピロリ菌感染応答における胃癌細胞内シグナル伝達系のシステム解析を行い、感染応答によるリン酸化プロテオームの時系列動態情報、並びに病原因子CagAの包括的結合蛋白質情報を取得した。近年H.pylori感染において、病原因子の一つであるCagAが胃上皮細胞内のシグナル伝達因子をチロシンリン酸化し、細胞の癌化に関与することが明らかとなってきた。本研究課題では感染による病態をシステムレベルで理解するために、H.pylori感染におけるシグナル伝達因子の時系列活性変動データを包括的に取得することを目標とする。本研究グループはこれまでにSILAC(Stable Isotope Labeling by Amino acids in Cell culture)法をベースにしたチロシンリン酸化ネットワークの相対変動解析法(Blagoev et al., Nat. Biotechnol., 22, 1139-1145, 2004)を基盤として方法論の改良に取り組み、(1)チロシンリン酸化蛋白質の包括的回収・特異的溶出法の開発、(2)溶出物の一括酵素処理によって調製されたサンプルに関するショットガン解析を行うためのnanoLC-MS/MS測定系の構築、そして(3)得られた生データから自動で相対定量を行う情報解析システムの開発を進め、サンプル調製から活性変動データの作成に至るまでスループットが非常に高い実験系を確立している(Oyama et al., Mol. Cell. Proteomics, 8: 226-231, 2009)。平成24年度は、より網羅的なリン酸化シグナルネットワークの解析に向けてチタニアカラムによるリン酸化ペプチドの精製に関する検討を行い、チロシンリン酸化のみならずセリン、トレオニンリン酸化を含めた包括的なリン酸化プロテオームデータを取得するシステムを確立した。平成25年度は、微量蛋白質群を分子量に基づいて液中で分離・回収することが可能なGelfree 8100systemを用いて試料の前分画を行い、分画ごとにリン酸化ペプチドサンプルの調製及び測定を進めることにより、16,000を超えるリン酸化ペプチドに関するH.pylori感染後の時系列活性変動情報を取得した。

平成23年度はSILAC法を用いてヒト胃上皮細胞内のチロシンリン酸化シグナル伝達因子群に関してH.pylori感染後5タイムポイントの時系列データを取得し、さらに相互作用プロテオミクス法によりCagAの新規結合蛋白質を併せて同定した。nanoLC-MS/MSオンラインシステム(3台)、タンパク質同定検索エンジン(Mascot)、サンプル調製に用いる真空遠心機等、高感度プロテオミクス解析を行う全ての設備を本研究グループで現有しており、また研究分担者の秦はnanoLC-MS/MSシステムの操作技術やメンテナンス技術をほぼ完全に習得し、自在にシステムを操作することができる状態にある。従来設置されていたDiNa-QTof2(KYA technologies社、Waters社)、DiNa-QSTAR Elite(KYA technologies社、AB SCIEX社)システムに加えて精度、スキャンスピード等が大幅に改善されたDiNa-LTQ Orbitrap Velos ETD (KYA technologies社、Thermo Fisher Scientific社)システムが現在稼働しており、東京大学医科学研究所内のプロテオーム専用施設にて安定した測定環境の中、順調にデータを取得している状況である。微量蛋白質群を分子量に基づいて液中で精製することが可能なGelfree 8100systemを用いて試料の前分画を行い、分画ごとにサンプル調製及び測定を進めることにより、計測データの網羅性を更に上げる。上記で確立した大規模リン酸化プロテオミクス解析技術を用いてH. pylori感染によるリン酸化時系列活性変動データを包括的に取得し、インジェヌイティーパスウェイアナリシス(IPA)をはじめとするパスウェイ解析ソフトウェアを用いてシグナル経路ごとのリン酸化活性変動をシステムレベルで詳細に解析することにより、感染応答によるシグナルネットワークの摂動の実態を明らかにする。平成21年度末に東京大学医科学研究所附属疾患プロテオミクスラボラトリーに導入された2次元nanoLC-MS/MSシステム(DiNa-LTQ Orbitrap Velos ETD)を用いて、リン酸化プロテオームに関するハイスループット時系列定量システムの構築に向けた予備検討を行い、200μgのヒトHeLa細胞抽出液を出発試料として1,300種類以上のリン酸化ペプチドを同定することが可能となっている。今後、上記で確立した大規模リン酸化プロテオミクス解析技術を用いてH.pylori感染におけるリン酸化時系列データを包括的に取得し、病態との関連をシステムレベルで解析する。本研究課題で行うプロテオーム解析は高い定量精度が求められる実験系であり、測定サンプル間の相互コンタミネーションは極力抑えなければならない。そのため、nanoLCに関する消耗品(nanoLC用トラップカラム、nanoLC用分析カラム、ESIスプレイヤー)は適切な頻度で新しいものに付け替える。その他、胃上皮細胞を培養するための細胞培養用のプラスチック製品、解析サンプルの調製に用いるリン酸化因子精製試薬、オシネジ、キャピラリー等のnanoLC関連の消耗品を購入する。