hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
耐酸性のあるフッ化物皮膜形成によるMg合金の表面改質

本年は,(1)これまでに当研究グループが提案してきたマグネシウム合金の耐食性改善手法のうち,高純度マグネシウム被覆法とフッ化物被覆法を重畳させて表面改質を試みたこと,および(2)フッ化物皮膜の微細組織を詳細に観察/分析したこと,の2点で進展があった.(1)については,SPring-8において,側傾法により残留応力測定を行った結果,高純度Mg中間層のない試料で171MPa,高純度中間層のある試料で125MPaの圧縮残留応力があることがわかった.すなわち,高純度Mg層を中間層とすることにより,応力緩衝効果があり,残留応力を低下させていることが明らかとなった.また,0.02NのHC1水溶液中に浸漬して,水素気泡発生までの時間を測定したところ,高純度Mg中間層の無い試料では,浸漬後0.2ksで気泡発生が見られたが,高純度Mg中間層をもつ試料では0.5ksまで抑制でき,高純度Mg層を形成することにより,耐食性が改善されることが示された.この浸漬試験後,SEM-EDSにより,水素気泡の発生箇所の分析を行った結果,高純度Mg中間層の無い試料ではAl-Mn系の介在物が確認されたのに対し,中間層を形成した試料では,Mg以外の元素は検出されなかった.(2)上記結果が示すところは,フッ化物処理の下地として,高純度Mg層を形成させておくことにより,不純物起因の介在物を起点とする腐食開始を防ぐことが可能であるということである.しかし,高純度Mg層を有する試料においても,開始までの時間は長くなるものの,いずれ腐食が始まる.この事実は,フッ化物皮膜に耐酸性が無いか,あるいは皮膜中になんらかの欠陥が存在し,基板が直接腐食性溶液に接するか,のいずれかによる.これを確証するため,および,フッ化物皮膜の微細組織を明かにするために,フッ化物処理を施した試料を,塩酸:メタノール=1:2溶液に浸漬してみた.その結果,基板のマグネシウム合金は完全に溶解し,フッ化物皮膜が溶液中に残留した.これをメッシュにすくいとって,TEM試料とし,観察/電子線回折の解析を行った.得られたTEM像には,1μm程度の暗いコントラストの結晶粒が多数見られ,その中に,同程度の寸法の明るいコントラストの結晶粒が散在している状況が見られるだけであり,クラック,穴などの欠陥は観察されなかった.すなわち,フッ化物皮膜自体は,33%HCl水溶液にも耐えるだけの耐酸性を有している.しかし,おそらく微細な欠陥を含むため,溶液の侵入を完全には防ぎえず,腐食が開始するもとの思われる.TEM観察可能な範囲は狭いため,上記観察を行った部分にはそのような欠陥部は含まれなかったのであろう.欠陥はTEMのスケール以内であるが,存在確率は観察視野以上に大きいものであると考えられる.本年は、下記(1)(3)を明らかにした.(1)これまでフッ化処理のために、NaBF_4を軟鋼るつぼを使用して溶融させていた.このため、塩水噴霧試験時に表面に水酸化鉄の茶褐色の汚れが付着し、皮膜中にFeが混入していることを示していた.しかし、通常の塩水浸漬試験などでは、この混入Feによる耐食性劣化が認められなかったため、特に対策を講じなかった.しかるに、本年度、クロスカットを施した試料について塩水浸漬試験を行った結果、クロスカット部の腐食が激しいことが判明した.その理由の一つとして、皮膜中のFeとクロスカット部のMgの間で局部電池が形成されることが考えられた.そこで、るつぼをアルミナ製のものに換え、試料を溶融塩中に保持するカゴは白金製に換えた.そのようにして作製したフッ化物被覆材にクロスカットを施した試料について、3日間の塩水浸漬試験を行ったところ、クロスカット部でも、ほとんど腐食が生じないという良好な結果が得られた.(2)クロスカット部の腐食は、糸状腐食と同様な機構によることが示された.すなわち、フッ化物被覆無し材にクロスカットを施して塩水試験を行ったところ、腐食減量は軟鋼るつぼを使用して作製したフッ化物被覆材よりも少ないことが明らかとなった.この原因は、皮膜にFeが混入している場合にはクロスカット部に腐食が集中し、腐食生成物を剥がしながら深く進行するためと考えられる.クロスカットを施さない場合は、無論フッ化物被覆材の方が優れる.(3)フッ化物皮膜のTEH観察結果およびSEM-EDXによる観察・分析により、フッ化物皮膜は2重構造になっていることが明らかとなった.
無毒フグ肝臓中のフグ毒成分に関する研究

筆者はこれまでフグ肝臓中におけるフグ毒の存在形態について調べてきた。その過程において無毒肝臓中に既知のTTX類縁物質とは明らかに挙動の異なる成分の存在を認めた。そこで、本研究では有毒種に分類されているものの、毒性を示さなかったシマフグ肝臓中のTTX成分組成を調べ、そこで新たに見い出されたTTX関連物質について検討を加えた。シマフグ肝臓を試料とし、食品衛生検査指針のフグ毒試験法に従って毒性を調べ、抽出液の一部をTTXアナライザーに付してフグ毒成分の分析を行った。次に、未知TTX関連物質を得るため、シマフグ肝臓に0.05M Tris-酢酸緩衝液(pH8.2)を加えて均質化し、ホモジネートを遠心分離、限外濾過後,Sephadex G-50、Bio-Gel P-4、およびBio-Rex 70カラムクロマトグラフィーで順次精製した。これをアルカリ分解後、TMS誘導体化してGC-MS分析に供した。その結果、マウス試験により毒性を示さなかったシマフグ肝臓(5MU/g未満)からはTTXなど既知の有毒成分は検出されなかった。未知TTX関連物質は限外濾過Amicon PM-10膜(分画分子量1万)を通過し、Sephadex G-50およびBio-Gel P-4カラムクロマトグラフィーにおいてそれぞれカラム体積付近に溶出され,Bio-Rex 70カラムには吸着されなかった。こうして部分精製された成分をアルカリ分解,TMS誘導体化し、GC-MS分析したところC9塩基の存在が確認された。しかし、マウス(腹腔内投与)に対して毒性は示さず、分子量はHPLC(Diol-60カラム)分析の結果、1100前後と推定された。本成分は塩酸加水分解でもかなり安定で、生体内での変換については今後さらに検討する必要がある。
レーダホ-ミングにおけるレドームの影響

レーダ誘導を行うホ-ミングシステムにおける誤差距離はレドームの厚さが適切でないと増大する.本研究では従来クラッタ解析などに用いてきた用いてきたシステムブロック図を基本とし,これにレドームの影響を組み入れ,非線形共分散解析法を用いて系統的に解析する方法をとった.平成7年度は飛翔体を3次モデルとして取り扱った.まず,レドームを組み入れたブロック図について,非線形要素リミタを除いて安定性解析を行うと共に、状態方程式,共分散方程式を導いた.シミュレーションはレドーム・エラー・スロープを飛翔中一定とした場合,変動するとした場合について行った.前者においては,システムのパラメータをノミナル値の前後に変化させ,レドーム・エラー・スロープ対誤差距離の関係を求めた.後者については,レドーム・エラー・スロープがステップ状に変化する場合,および実際に近いと思われる正弦波状に変化する場合についてそれらの影響を求めた.平成8年度は飛翔体を5次モデルとして取り扱った.まず,安定性解析により,レドーム・エラー・スロープが負の場合しか不安定性が現れない3次モデルとは異なり,正の場合も不安定領域が現れることを示した.ついで,5次モデルに伴う状態方程式,共分散方程式を求め,これをプログラムに組み入れる作業を行った.シミュレーションにおいてはまず,3次モデルと同じノミナル値を用い,比較を行った結果,上述した不安定性が現れること,誤差距離が約2倍になるなど5次モデルの方が厳しい結果を与えることが分かった。3次モデルのノミナル値は5次モデルにはやや不適当なことが分かったので,新しいノミナル値を定め、レドーム・エラー・スロープが飛翔中一定の場合と,変化する場合についてパラメータスタディを行った.これらの結果から従来断片的にしか得ていなかったレドームの影響をほぼ解明することができた.レーダ誘導を行うホ-ミングシステムにおける誤差距離はレドームの厚さが適切でないと増大する.本研究では従来クラッタ解析などに用いてきた用いてきたシステムブロック図を基本とし,これにレドームの影響を組み入れ,非線形共分散解析法を用いて系統的に解析する方法をとった.平成7年度は飛翔体を3次モデルとして取り扱った.まず,レドームを組み入れたブロック図について,非線形要素リミタを除いて安定性解析を行うと共に、状態方程式,共分散方程式を導いた.シミュレーションはレドーム・エラー・スロープを飛翔中一定とした場合,変動するとした場合について行った.前者においては,システムのパラメータをノミナル値の前後に変化させ,レドーム・エラー・スロープ対誤差距離の関係を求めた.後者については,レドーム・エラー・スロープがステップ状に変化する場合,および実際に近いと思われる正弦波状に変化する場合についてそれらの影響を求めた.平成8年度は飛翔体を5次モデルとして取り扱った.まず,安定性解析により,レドーム・エラー・スロープが負の場合しか不安定性が現れない3次モデルとは異なり,正の場合も不安定領域が現れることを示した.ついで,5次モデルに伴う状態方程式,共分散方程式を求め,これをプログラムに組み入れる作業を行った.シミュレーションにおいてはまず,3次モデルと同じノミナル値を用い,比較を行った結果,上述した不安定性が現れること,誤差距離が約2倍になるなど5次モデルの方が厳しい結果を与えることが分かった。3次モデルのノミナル値は5次モデルにはやや不適当なことが分かったので,新しいノミナル値を定め、レドーム・エラー・スロープが飛翔中一定の場合と,変化する場合についてパラメータスタディを行った.これらの結果から従来断片的にしか得ていなかったレドームの影響をほぼ解明することができた.1.シミュレーションプログラムの計画・作成・検証レドームの影響を非線形共分散解析するためのプログラム仕様を作成した.レドームにより生じる誤差角は,レドーム・エラー・スロープ,飛翔体の測度,経路角,回転時定数の関数として表し,ブロック図を組み込むこととした.飛翔体を3種の時定数とリミタから成る3次モデルで表し,これに上記のレドームの影響を付加したシステムブロック図を作成した.ブロック図から状態方程式,共分散方程式を誘導し,プログラム作成を行った.このプログラムの検証には,筆者等が開発した汎用の共分散評価プログラムSAMSを用いた.2.システムの安定性検討シミュレーションの実施に先立ち,システムブロック図の安定性を検討した.解析を容易にするため,リミタを除いた線形系とし,ラウスの方法を用いて判定した.この結果,レドーム・エラー・スロープが,システム定数により定まる,負のある値以下になると不安定になることが判明した.これはシミュレーション結果を判断する上で有益な目安となった.3.シミュレーションの実施(1)一定レドーム・エラー・スロープの場合レドーム・エラ・スロープは飛翔中一定値をとると仮定して,これを変数とし,対応する誤差距離を求めた.目標の横加速度,各種雑音(グリント,フェーディング、受信機雑音、クラッタ),誘導回路時定数,比例航法定数,リミタレベル,飛翔体回転時定数等を用いてパラメータスタディを行った.(2)変動レドーム・エラー・スロープの場合一般にレドーム・エラー・スロープは飛翔中に変動すると考えられる.本研究では,飛翔時間に対し,ステップ状および正弦波状に変化するとして誤差距離を求め,(1)との対比を行うと共に,考察を加えた.4.結果の公表レーダ誘導を行うホ-ミングシステムにおける誤差距離はレドームの厚さが適切でないと増大する.本研究では従来クラッタ解析などに用いてきたシステムブロック図を基本とし,これにレドームの影響を組み入れ,非線形共分散解析法を用いて系統的に解析する方法をとった.

平成7年度は飛翔体を3次モデルとして取り扱った.まず,レドームを組み入れたブロック図について,非線形要素リミタを除いて安定性解析を行うと共に、状態方程式,共分散方程式を導いた.シミュレーションはレドーム・エラー・スロープを飛翔中一定とした場合,変動するとした場合について行った.前者においては,システムのパラメータをノミナル値の前後に変化させ,レドーム・エラー・スロープ対誤差距離の関係を求めた.後者については,レドーム・エラー・スロープがステップ状に変化する場合,および実際に近いと思われる正弦波状に変化する場合についてそれらの影響を求めた.平成8年度は飛翔体を5次モデルとして取り扱った.まず,安定性解析により,レドーム・エラー・スロープが負の場合しか不安定性が現れない3次モデルとは異なり,正の場合も不安定領域が現れることを示した.ついで,5次モデルに伴う状態方程式,非分散方程式を求め,これをプログラムに組み入れる作業を行った.シミュレーションにおいてはまず,3次モデルと同じノミナル値を用い,比較を行った結果,上述した不安定性が現れること,誤差距離が約2倍になるなど5次モデルの方が厳しい結果を与えることが分かった。3次モデルのノミナル値は5次モデルにはやや不適当なことが分かったので,新しいノミナル値を定め、レドーム・エラー・スロープが飛翔中一定の場合と,変化する場合についてパラメータスタディを行った.これらの結果から従来断片的にしか得ていなかったレドームの影響をほぼ解明することができた。
在宅療養へのナラティヴ・アプローチ

21世紀日本社会の医療において、在宅療養の推進が既によく知られた特徴となっている。現在進行形で発達を続ける医療技術は、人々がよく生きるチャンスを増大させるが、それがダイレクトに人々のよき生に結びつくとは限らない。そのギャップの部分で人々がどう苦しみむのかを明らかにする必要がある。本研究は、難病をもつ人や、その人を受け入れる施設など多岐にわたる事例調査を行った。方法として用いたナラティヴ・アプローチは、難病等患者の在宅療養をいかに支援していくかという点でも、非常に大きな示唆を与えることがわかった。平成25年度の研究成果として、在宅療養の中できわめて重要な位置を占めると考えられるピア・サポートに関して、基本的な視座であるナラティヴ・アプローチの整備と、事例分析への応用とのいずれをも含む研究成果を発表したことが挙げられる。具体的には、日本社会学会第86回大会(2013年10月12-13日、慶應義塾大学三田キャンパス)における一般研究報告「ピア・サポートの社会学に向けて」、および、編著『ピア・サポートの社会学ーALS、認知症介護、依存症、自死遺児、犯罪被害者の物語を聴く』晃洋書房,2013年11月)の出版を挙げられる。これらの研究実績によって、今後在宅療養を考えていくにあたっては、医療システムや福祉サービスを整備するだけでは不十分であり、それらのシステムやサービスが、個人が病いのプロセスを生きる自己物語にどう結びつき、活かされるかという次元への着眼が今後ますます重要になることが示されたと考える。その他に、在宅療養にも関心をもつ医療者等の研究会においても、セルフヘルプ・グループをテーマとして研究報告を行い、活発なディスカッションを行った(「コミュニティにおけるセルフヘルプ・グループの機能と可能性」Medical Studioコミュニティ医療デザイン研究会、2013年9月15日)。本年度計画に含まれていた、取り扱う事例の追加、差し替え等について、点検と再検討を行い、それに関する情報収集。申請者のいる地域において、高次脳機能障害に関するピア・サポート推進の機運が高まり、またその背景として、高次脳機能障害を抱える本人および家族が在宅療養において直面する困難の実態が、まだ十分には明らかにされていないことが明らかになった。平成24年度は、既に申請者の研究や問題関心を理解したうえでの調査研究依頼、もしくはそれに類する信頼関係が既に構築されている事例に関する調査研究を計画した。当初より、どの事例について良好な関係のもと調査を継続できるかには流動的な側面がある点に留意し、実際の調査の進展にあわせて、実質的な研究成果の発表およびその準備を進めること旨としていた。結果として、事例のうち、(1)ALS患者会(申請書における事例2)、および、(2)医療依存度の高い人でも暮らせる家として主に独居者向けの賃貸集合住宅を営む事業者(申請書における事例4)、というふたつの事例に関して主に進展があった。得られた研究成果としては、第一に、在宅療養を患者自身が病いを生きる者として成り立たせていく支えとしてのピア・サポートの重要性を具体的かつ論理的に指摘することができた。第二に、在宅療養のプロセスの上に、上記(2)を含めた基盤的な生活の「場」を位置づけ、その絶対的な量の不足と、少数例が存立する制度的基盤もしくは近年の制度変化について掘り下げた論究を行なった。結論的には、意欲的な少数事例が今後拡大していくことを予感させる材料もなくはないが、もともとそのような意欲的な少数事例が発生していくにあたって社会制度がそれらを後押ししたとはいえ<ない>部分があるため、事態は楽観できず、今後の注視を必要としていることがわかった。第三に、それらの制度的変化の必要性をたえず適切に主張するために、現行の環境下での、在宅療養を<生きる>存在としての患者がどの程度実現可能なのかを探求する必要性を再確認し、ピア(仲間)を含めて、専門職などさまざまな存在を物語を創るための他者としてとらえなおす視座を具体的な事例研究を通して整備していくべきであることを、学会発表等により知見として提出した。平成26年度は、まず、前年度から引き続いて、在宅療養の中できわめて重要な位置を占めると考えられるピア・サポートに関して、基本的な視座であるナラティヴ・アプローチの整備を進めた。その成果は、「ピア・サポートとナラティヴ・アプローチー方法論的観点から」(『N:ナラティヴとケア』第6号,pp.27-33)にまとめられた。次に、患者(もしくは家族)の自己物語にかかわる他者としての専門職という観点から、臨床心理士との学際的交流を行った(「神経難病に臨床心理士はどのようにかかわりうるのか?ー社会学の観点からの提言ー」日本心理臨床学会第33回秋季大会自主シンポジウム)。臨床心理士は、在宅療養において長期的に自己を支えるうえで重要な存在になりうるが、神経難病への造詣をもつ臨床心理士の育成が急務である。事例として昨年度追加した高次脳機能障害では、各都道府県における高次脳機能障害支援センターおよびコーディネーターと連携しながら、面談型ピア・サポートに関する研究を行った。支援センターおよびコーディネーターの配置は支援制度上の大いなる前進ではあるが、きわめて長期におよぶ在宅療養を支えるうえでは、未開拓の部分が多く、それを突破するためにピア・サポート事業がはじめられたという位置づけが明らかになった。このように、本年度の特筆すべき成果としては、専門職支援者の配置と層の薄さがともに明らかになった点が挙げられる。今後は、専門職の参入を無条件に称揚するのではなく、あくまでもナラティヴの聞き手という観点から提言や評価を行える社会学を整えていく必要がある。

研究機関の終盤を迎え、本研究が第一に焦点をおいてきたALS(筋委縮性側索硬化症)に関する研究のまとめの一段階を遂行した。また、それと併せて、難病ピア・サポートをテーマとする当事者同士の交流への参与観察、高次脳機能障害のピア・サポート活動への参与観察を遂行し、データを蓄積した。ALS研究に関しては、まず本研究がALSの社会的文脈をいかに語るかという点に最初の焦点が合わせられた。結論的には、ALSという病いに向けられるまなざし、もしくは与えられる意味の変容、すなわち「不治の病い」として死を待つ終末期のイメージから、ある種の機能的障害を持ち続けながら、医療的ケアのもとに「生き続ける」可能性へと人々の認識が変容しつつある流れとしてとらえられた。とはいえ、これは全面的な「変容」ではなく、一部の理解ある人々を除けば専門家も患者自身も意味「変容」の影響を被っているわけではない。先行研究をレヴューしたところ、病いの語り研究の流れに位置づけられる社会学的研究(看護学専門家による質的調査研究を含む)と、社会学の中でも障害学の影響を受けながら生存をめぐる社会とのせめぎあいという視点を導入する規範論的研究とが重要と考えられた。ただし、前者においては、病いの自己物語形成において他者とのやりとりが果たす役割に関する考察を深めることが必要であり、後者においては、生存という理念の重要性をただ主張するだけではなく、自己決定という理念との矛盾や患者や家族が行う折り合いの付け方まで視野に入れたうえでそれらを生き難さとして認識する必要性が、考察の結果として導きだされた。さらにALS患者におけるピア・サポートの重要性を考察するにあたって、他の難病や高次脳機能障害におけるピア・サポートとの共通性および相違点も重要な観点であることが確認された。在宅療養のナラティヴ・アプローチを考えるうえで、示唆に富む事例であるALSに関して成果報告への前進が見られた。また、他の難病や高次脳機能障害に関するデータも参照することで、視野の広がりも担保できた。「病院の世紀」が終焉を迎え、在宅療養が推進されるようになった時代においては、病いをもつ人が、在宅療養を支援する制度的サービスの助けを借りて生きる人生をいかに作っていくかがきわめて重要であり、それに対してナラティヴ・アプローチが貢献する部分が少なくないことが明らかになった。たとえばALSの場合、医療技術の発達によって、おおよそ1980年代ごろを境に「三年ほどで死を迎える」という言説の信憑性がゆらぎ、長く生きる可能性に注目が集まるようになる。このとき、ナラティヴ・アプローチは、社会の移行的であるがゆえに分裂的な情況が、データ(患者の語り)の中に反映し、迷いと逡巡として観察できることを明らかにできた。これは、とりもなおさず支援の必要性、規範的な正当性を支持する。つまり、語りの内部にゆらぎを抱え込むような患者の自己はきわめて不安定であり、自己決定を任せるには脆弱である。このことこそが、患者の苦しみに他ならないのである。
分子レベルより見た蚊の生化学的系統分類学の試み

日本産蚊科についての従来の形態学による分類体系を、種々の酵素の電気泳動像で蛋白質分子レベルから生化学的に比較することにより系統学的に考察した。研究費交付の決定があった時期には既に蚊のシ-ズンは終わっており、野外で採集できる蚊の種類も僅かであったので、西表島と石垣島で多くの種類を採集し北九州へ持帰って実験をした。その後、琉球大学医学部へ電気泳動装置や試薬を持参し、研究室を借て琉球列島産の多数の系統を能率よく比較分析し成果を挙げることができた。特に本土には分布していない属や種が多く含まれており、また同一亜属内の類縁関係も比較検討することができた。重点的に調べられた酵素はブドウ糖燐酸ムタ-ゼ(PGM)、ブドウ糖燐酸イソメラ-ゼ(GPI)、リンゴ酸酵素、ヘキソキナ-ゼ、エステラ-ゼなどである。多くの種類で酵素多形現象が認められたが、全く変異を示さない酵素や集団も見られた。例えばクロツノフサカやフタクロホシチビカのPGMでは4対立遺伝子の組合せによる著しい多形を示したにも拘らず、GPIに関しては調べられたそれぞれ139個体および267個体では全く変異が見られなかった。また別種のGPIのヘテロ個体は3本のアイソザイムバンドを示すことから、ヘテロ型のバンドは2種類のサブユニットからなる2量体の雑種分子であること、それに対しどのヘテロ型でも2本のバンドしか示さないPGMの場合ではそれぞれの対立遺伝子が単量体の酵素蛋白を作るものと推定された。幼虫消化管の脱水素酵素阻害物質については液体クロマトにかけて分離し、分子量ほぼ20万の蛋白質であると推定された。また、LDH,MDH,PGM,GPIなどの酵素も分子量20数万から30数万と広く分布していた。さらにこれらの酵素の主なバンドについても等電点電気泳動法により等電点を測定した。これらのデ-タはコンピュ-タに入力し、また近い内に発表する予定の英文論文の原稿や原図の作成にも威力を発揮している。
化石タンパク質と化石DNAにもとづく絶滅生物の分子遺伝学的研究

軟体動物の現生種(キサゴ、ホタテガイ、ワスレガイ、カキ)と化石種(トウキョウホタテ)について殻体タンパク質を、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動(SDS-PAGE)により異なる分子量をもつタンパク質ごとに選別して抽出した。変質している可能性の高い結晶間に挟在するタンパク質を漂白して除去したのち脱灰して結晶内のタンパク質のみを取り出した。抽出したタンパク質は、特定のアミノ酸の部位でタンパク質を切断する性質を持つプロテアーゼを用いて切断し、得られた断片の長さの変異からタンパク質中のアミノ酸配列の変異を推定した.化石と現生サンプルのタンパク質の切断パターンを比較したところ、ほとんど一致しており、このことから続成作用の影響はすくなく、化石中に極めて良好にタンパク質が保存されてきたことが明らかになった。次に、含まれているタンパク質の比較から,これらの種の系統の推定を試みたところ、カキとホタテガイが最も近く、キサゴがもっとも遠いという結果が得られた。これは、18S_1・DNAによって求めた系統関係と一致した。長野県野尻湖層群の泥炭層から得た更新世の化石昆虫と、静岡県上土遺跡より得られた完新世の昆虫遺体(セマルガムシ、ゴミムシ類)から、DNAを抽出し、PCR法によりミトコンドリア16S_1・DNAと核18S_1・DNAを増幅した。その結果約130塩基対のDNAの増幅に成功した。これらのうち18S_1DNAの塩基配列を決定した結果、化石昆虫のDNAは、現生の同一種または近縁種のDNAに最も近いことが分かった.このことから化石昆虫のDNAが増幅されたと考えられる.軟体動物の現生種(キサゴ、ホタテガイ、ワスレガイ、カキ)と化石種(トウキョウホタテ)について殻体タンパク質を、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動(SDS-PAGE)により異なる分子量をもつタンパク質ごとに選別して抽出した。これらのうち18S_1DNAの塩基配列を決定した結果、化石昆虫のDNAは、現生の同一種または近縁種のDNAに最も近いことが分かった.このことから化石昆虫のDNAが増幅されたと考えられる.まず軟体動物の現生種(キサゴ、ホタテガイ、ワスレガイ、カキ)と化石種(トウキョウホタテ)について殻体タンパク質を、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動(SDS-PAGE)により異なる分子量をもつタンパク質ごとに選別して抽出した。これは、18SrDNAによって求めた系統関係と一致した。長野県野尻湖層群の泥炭層から得た更新世の化石昆虫と、静岡県上土遺跡より得られた完新世の昆虫遺体から、DNAを抽出し、PCR法によりミトコンドリア16SrDNAと核18SrDNAを増幅した。その結果、約300塩基対のDNAの増幅に成功した。現段階では塩基配列の解読は行っていないが、今後配列を解析し現生種との比較を行いたいと考えている。変質している可能性の高い結晶間に狭在するタンパク質を漂白して除去したのち脱灰して結晶内のタンパク質のみを取り出した。

次に、含まれているタンパク質の比較から,これらの種の系統の推定を試みたところ、カキとホタテガイが最も近く、キサゴがもっとも遠いという結果が得られた。これは、18SrDNAによって求めた系統関係と一致した。長野県野尻湖層群の泥炭層から得た更新世の化石昆虫と、静岡県上土遺跡より得られた完新世の昆虫遺体(セマルガムシ、ゴミムシ類)から、DNAを抽出し、PCR法によりミトコンドリア16SrDNAと核8SrDNAを増幅した。その結果、約300塩基対のDNAの増幅に成功した。これらのうち18SrDNAの塩基配列を決定した結果、化石昆虫のDNAは、現生の同一種または近縁種のDNAに最も近いことが分かった.このことから化石昆虫のDNAが増幅されたと考えられる.軟体動物殻体中に含まれるタンパク質を抽出し、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動(SDS-PAGE)により異なる分子量をもつタンパク質ごとに選別した。抽出したタンパク質は、特定のアミノ酸の部位でタンパク質を切断する性質を持つプロテアーゼを用いて切断し、得られた断片の長さの変異からタンパク質中のアミノ酸配列の変異を推定した。抽出を試みたのは、軟体動物の現生種(キサゴ、ホタテガイ、ワスレガイ、カキ)と化石種(トウキョウホタテ)である。化石種のトウキョウホタテガイと現生のホタテガイのタンパク質の分子量で分けたタンパク質構成とその切断パターンを比較したところ、ほとんど一致しており、このことから続成作用の影響はすくなく、化石中に極めて良好にタンパク質が保存されてきたことが明らかになった。次に、含まれているタンパク質の比較から、これらの4種の系統の推定を試みたところ、カキとホタテガイが最も近く、キサゴが最も遠いという結果が得られた。これは、軟体動物で一般に予想される系統関係と一致しており、このことからタンパク質に基づいて、化石まで含めた系統関係の推定が可能であることがわかる。次に長野県野尻湖層群の泥炭層から得た更新世の化石昆虫と、静岡県上土遺跡や大阪府の各地より得られた完新世の昆虫遺体(ガムシ類、ゴミムシ、ハムシ類)から、DNAを抽出し、PCR法によりミトコンドリア16SrDNAと核18SrDNAを増幅した。その結果、それぞれ約300塩基対のDNAの増幅に成功した。これらのうち18SrDNAの塩基配列を決定した結果、静岡から得られた化石昆虫のDNAは、現生のセマルガムシのDNAに最も近いことが分かった。このことから化石昆虫のDNAが増幅されたと考えられる。しかし、それ以外のものについては他の遺伝子の混入により、化石以外のDNAが増幅されたと考えられ、より効率的な抽出のためにはさらなる改善の余地がある。
HIV-1 Vpu蛋白の抗ウイルス宿主因子BST-2に対する抑制機序の解明

HIV-1 Vpu蛋白は抗ウイルス宿主因子BST-2を細胞表面から消失させることによりウイルス粒子の細胞外放出を促進させる機能を有する。本研究ではVpuの抗BST-2活性における宿主補助因子を探索することを目的とした。Vpu結合蛋白を免疫沈降法にて調整、プロテオーム解析により複数の候補蛋白を同定した。各候補蛋白の発現ベクターを作製、Vpuと共発現させて免疫沈降及び細胞内局在性実験を行った。Vpuとの結合性及び共局在性が確認できた候補蛋白についてノックダウン実験を行った結果、Vpuの抗BST-2活性に影響を与えなかったことから、これらの候補蛋白がVpuの他の機能に関与する可能性が示唆された。Vpuによる細胞表面BST-2/tetherinのdown-regulationに関するメカニズムについては未だ明らかにされていない。これまでに我々は、Vpuがその膜貫通(transmembrane;TM)領域を介してBST-2とTM-to-TMによる相互作用を行っていることを明らかにし、更にVpu TMのみではBST-2には結合できるものの、抗BST-2活性を有しないことを明らかにしてきた。このことからVpuの抗BST-2活性には、TMのみならず、細胞質内(cytoplaslmic tail;CT)領域も重要で、このCT領域に既知の宿主蛋白βTrCP以外の未知の宿主コファクターが相互作用してBST-2のdown-regulationに関与している可能性が考えられる。今年度はまずVpuのcofactorの検索を試みるべく、Vpu野生型(WT)、βTrCP結合不全変異体(2/6)またはCT欠損変異体(ΔCT)を、BST-2発現ベクターとコトランスフェクトした細胞を用いて免疫沈降法を行った。Vpu-WTとVpu2/6のみで認められた約80kDaのバンドを用いて、プロテオーム解析を行った結果、候補蛋白Aが同定された。この蛋白は実際にVpuと相互作用したが、ノックダウン実験ではVpuの抗BST-2活性に全く影響が出なかった。したがって、候補蛋白Aは他のVpuの機能に関与する可能性が考えられるものの、BST-2を抑制する機能には関係しないことが判った。ここまで行ったcofactor同定実験において(i)従来の免疫沈降法を使用している為、IgG heavy/light chain (55kDa、25kDa)付近に存在する候補蛋白を見過ごす可能性がある、(ii)BST-2を標的とした免疫沈降である為、BST-2と相互作用するVpuに更に相互作用するcofactorを得るうえでは非効率である、という問題点がある。これらを解消すべく、現在、VpuにHaloTag^<TM>を付加させた発現ベクターを作製し、HeLa細胞にトランスフェクションした後に、抗体フリーの方法であるHaloLink^<TM>Resinを用いた沈降法によりcofactorを検索している。これまでに我々は、Vpuがその膜貫通(transmembrane;TM)領域を介してBST-2とTM-to-TMによる相互作用を行っていることを明らかにし、更にVpuTMのみではBST-2には結合できるものの、抗BST-2活性を有しないことを明らかにしてきた。このことからVpuの抗BST-2活性には、TMのみならず、細胞質内(cytoplasmic tail;CT)領域も重要で、このCT領域に既知の宿主蛋白βTrCP以外の未知の宿主コファクターが相互作用してBST-2のdown-regulationに関与している可能性が考えられる。昨年の免疫沈降実験においてIgG heavy/light chain(55kDa、25kDa)付近に存在する候補蛋白を見過ごした可能性を考慮して、今年度はVpuにHaloTag^<TM>を付加させた発現ベクターを作製して抗体フリーの方法であるHaloLink^<TM>Resinを用いた沈降法によるcofactor検索を試みた。HaloTag付加型のβTrCP結合不全変異体(2/6)またはCT欠損変異体(ΔCT)Vpu発現ベクターを作製してHeLa細胞にトランスフェクトした後に免疫沈降反応を行ったが、Vpu結合蛋白の収量が不十分であった。その改良型として恒常発現系で行うべくレンチベクター版を作製し、293T細胞にトランスフェクトして大量調製したベクターウイルスを用いてHeLa細胞へのトランスダクションを行った。その後、細胞を溶解してHaloLink Resinを加えて免疫沈降反応を行った。免疫沈降物を精製して二次元電気泳動を行い、Cy3/Cy5染色によるスポット比較を2/6及びΔCTVpu間で行った。その結果、2/6Vpuにおいて有意に結合していると考えられる候補蛋白70種類ほどをピックアップした。現在ハイスループツト型MS解析により同定中である。

したがって候補蛋白の同定に引き続いて行う予定であった、Vpuとの間接的あるいは直接的結合能の検討、Vpuとの共局在性の検討、または候補蛋白によるVpuのユビキチン化の検討、等の実験は次年度へ持ち越しとなった。Vpuによる抗ウイルス宿主因子BST-2のdown-regulationについての詳細な分子機序は未だ不明である。我々はこれまでにVpuの細胞質内領域にある52・56番目のリン酸化セリンに結合するユビキチンライゲース複合体サブユニットβTrCPがVpuの宿主補助因子として重要であること、更にVpuの抗BST-2活性におけるβTrCPへの依存性は部分的であることを明らかにしてきた。そこで本研究課題においてはβTrCP以外のVpuの補助因子の探索を試みた。昨年度に樹立した安定発現細胞からの抗体フリー沈降法を以下の通り実施した。レンチベクターによりVpu-HaloTag融合蛋白を安定発現させたHeLa細胞の大量培養を行い、その細胞融解液を用いてHaloLink Resin沈降法により調整した沈降物をSDS-PAGEで分離、ゲルの銀染色後に切り出したバンドのプロテオーム解析を行った。得られた9種類の候補蛋白の発現ベクターを作製、それらを用いて各候補蛋白とVpuとの相互作用の有無について免疫沈降法により検討したところ、2種類の蛋白がVpuと結合活性を示すことが分かった。更に間接蛍光抗体法により細胞内局在性を検討したが、候補蛋白とVpuとの明らかな共局在性は認められなかった。現在、全ての候補蛋白のノックダウン実験を行うべく各shRNA発現レンチベクターを作製している。これらを用いて候補蛋白の発現を低下させることにより、Vpuの抗BST-2活性の減弱化が認められるか否かについて今後検証する予定である。ちなみに本研究期間中に、HIV専門誌"Current HIV Research"において、特集号"HIV-1 Vpu and BST-2/tetherin"のGuest Editorを務め、本研究課題に関連する総説(全8編)を、欧米の著名な研究者達と共に総勢8グループで共同執筆した。本年度の研究計画では、Vpu結合蛋白候補が同定された後に機能解析へと展開していく予定であったが、スクリーニングが完了していないため、それらの実験は次年度へ持ち込しとなった。しかしながら、今回樹立した改良型実験系については、今後幅広い応用が可能であるという点において非常に満足いく結果となった。24年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、当初トランスフェクションによるVpu発現を試みていたがHeLa細胞における遺伝子導入効率に限界があり、Vpu結合蛋白のトータル収量が不十分であった。そのため、蛋白発現方法をトランスフェクションによる一過性発現系からレンチベクターによる恒常発現系にシフトすることでより多くのVpu結合蛋白を回収することを試みた結果、量的な問題を克服することができた。
心臓樹状細胞を賦活化するメカニズムに関する研究

心筋特異的タンパクである心筋ミオシンに着目し、この抗原感作によるラット自己免疫性心筋炎・心筋症モデル(EAM)を検索した。本モデルはTリンパ球による細胞性免疫が主病態である。研究の結果、T細胞エピトープの同定、ミオシン特異反応性Tリンパ球株の樹立、さらにこの細胞株を移注する心筋炎トランスファーモデルの作成に成功した。EAMの病態のさらなる解明には心筋免疫を特異的に賦活する免疫担当細胞、特に心臓樹状細胞の動態検索が欠かせない。本研究を遂行したところ、心臓樹状細胞を含めた免疫担当細胞の探索には対象細胞の標識化が必須であることが明らかとなった。そこで、今回、GFPトランスジェニックラットの開発に成功し、免疫担当細胞の局所動態の観察がはじめて可視化された。現在、(1)GFP発現心筋炎惹起性Tリンパ球株の樹立と細胞移注によるEAMの惹起実験、(2)移注した免疫担当細胞の体内動態観察および心臓局所での組織学的同定、などの研究を次々と展開している。正常心筋はβ1受容体優位であり、交感神経刺激を介してGs蛋白シグナルが出され、心収縮が促進する。しかし、心不全ではβ1受容体がdown-regulationすることにより相対的にβ2受容体の役割が増大する。この病態ではβ2受容体Gi蛋白により心機能は抑制化される。ところで、β受容体刺激は自己免疫性心筋炎(EAM)に対してβ1受容体効果は影響を与えないが、β2遮断効果は増悪、β2刺激効果は心筋炎を抑制する。この結果は、心不全の病態におけるβ2受容体が心機能調節としての働きだけでなく、炎症の修飾因子としても機能していることを教えている。そこで、百日咳毒素(PTX)、特異的Gi蛋白阻害薬を使い、Gi蛋白シグナル系がEAMにどのような影響を与えているか、心臓樹状細胞も含めて実験的に検討してみた。実験的心筋炎、EAMはミオシン直接免疫による(aEAM)と心筋ミオシン特異的T細胞株の移入による心筋炎(tEAM)にて作成した。その結果、ミオシン免疫と同時にGi蛋白を阻害する導入期実験でEAMは増悪した。この経路ではPTXによる臓器特異的自己免疫障害発現助長効果と同一の機序が想定される。しかし、in vivo実験でのT細胞増殖反応ではPTX投与でも有意な変化を示さなかった。一方、心筋炎発症直前にGi蛋白シグナルを阻害した効果期投与実験では、心筋炎が抑制された。即ち、PTXの二方向性効果が確認された。これは、PTXが心筋β2受容体に直接作用したのではなく、特異的炎症性T細胞並びに心臓樹状細胞に直接・間接に効果を及ぼし、炎症性細胞浸潤を抑制した結果と考察される。さらに、PTXを暴露した心筋炎惹起性T細胞の移入によるEAM抑制効果は、Gi蛋白シグナル阻害の標的がT細胞や心臓樹状細胞など炎症細胞自体であることを教えてくれた。これらから、PTXにより修飾を受けた心臓樹状細胞を含む炎症細胞がEAM抑制に強く関与していることが明らかとなった。しかしながら、PTXはT細胞サイトカイン産生系を抑制してはいなかった。これは別経路による心筋炎制御の存在を示唆している。今後、標的臓器、心臓への細胞浸潤における接着分子発現や炎症細胞ローリング作用なども含めた機序解明が必要と総括される。前年度は特異的Gi蛋白阻害薬を使い、Gi蛋白シグナルが実験的自己免疫性心筋炎(EAM)を二方向性に修飾することを報告し、心臓樹状細胞も含めた実験結果を報告した。そこで今回は、サイトカインの修飾効果とラジカル刺激の修飾効果について検索した。代表的幹細胞刺激因子であるエリスロポエチン(EPO)はPI-3K/Akt系路の活性化を通じて心筋細胞のアポトーシスを抑制する。しかし、心臓樹状細胞を含めた心筋の自己免疫応答については全く不明である。以下の実験系について検索した。(1)EAM全期(導入期と効果期)のEPO効果、(2)導入期に限局させた検討、(3)効果期へ限局させた検討、(4)in vitro実験a.EPOでの細胞増殖試験、b.EPO下のT細胞細胞増殖試験、c.EPO下での抗原提示細胞増殖試験(心臓樹状細胞を想定して)、である。

その結果、(1)EAMの全経過においてEPOは心筋炎を有意に抑制した。(2)効果期に比較して導入期に限局したEPO投与は組織学心筋炎スコアを有意に抑制した。(3)細胞増殖試験では濃度に依存せずEPOは心筋炎惹起性T細胞の増殖を抑制せず、各濃度のEPO暴露は抗原提示細胞の活性を抑制しなかった。従って、幹細胞刺激因子サイトカインは自己免疫応答の導入を抑制するものの、心筋樹状細胞への抑制効果は少ないと推定される。次いで、自己免疫応答におけるラジカルスカベンジャーによる電気的・構造的リモデリングの予防効果についても検索した。代表的なラジカルスカベンジャーであるnicaravenを用い、EAMでのリモデリング予防効果が投与タイミングによりどのように修飾されるかを検討した。その結果、nicaraven超急性期治療群で、ROS抑制に基づく電気的及び構造的リモデリングの顕著な抑制効果が認められた。心筋樹状細胞の活性化にはROSシグナルも関与していると思われる。この研究を遂行するうえで、我々は心臓樹状細胞を賦活化するメカニズムを可視化することにも努力を傾注してきた。その結果、カラーバイオエンジニアリング手法を用いて、このメカニズムの一端を可視化することに成功した。実験的自己免疫性心筋炎は健常ラットへの心筋炎惹起性T細胞株を移注することでも発症することが可能である(トランスファー心筋炎)。しかしT細胞の賦活化や心臓樹状細胞の体内動態、それに病像形成に関する情報を今まで可視化することができなかった。それは、カラーバイオエンジニアリング手法を用いた心筋炎惹起性T細胞株や心臓樹状細胞の可視化モデルの作成が困難であったことによる。加えて移注細胞とホスト由来の細胞との相互関係の中で発症するトランスファー心筋炎では個々の細胞の由来が識別困難であったためである。我々は、カラーバイオエンジニアリングを用いてGFP発現ラットから取り出した心筋炎惹起性T細胞株(GFPMTL)の樹立に成功した。これを用いて心臓樹状細胞の賦活化状態を可視化することも可能にした。この成果はGFP発現ラットによる心筋樹状細胞の動態研究のみならず、GFPMTLを使ったトランスファー心筋炎による心筋樹状細胞を賦活化するメカニズムの解明研究に大きな道を開いたと評価できる。
大脳皮質内微小動脈の血管収縮調節機構の解析

血流量の調節の異常は、虚血性脳症をはじめとするさまざまな脳病変の発生に寄与していると考えられているにもかかわらず、実際に脳血流量を規定する抵抗血管である終末細動脈のレベルでのin vitroの血管の収縮性の検討は殆どなされていない。そこで大脳皮質深部細動脈を直接単離し、微小灌流法を用いノルアドレナリン、セロトニンに対する収縮能を検討した。実験は定静水圧の条件下でstop-flowにておこなった。血管の片側をクランプしflowを最小限に制し、他側から30mHgの静水圧を負荷することにより、血管内腔は定常状態に保たれた。Heppes緩衝リンゲル液内においては、血管の平均内径は39.9±3.7μmであった(n=7)。血管外より加えた10^<-7>Mのノルエピネフリンは5分間で細動脈を内径の変化で21.1±2.0%収縮させた(n=7)。n=5の血管において、10^<-6>Mのノルエピネフリンに対する収縮能は、10^<-8>Mのα1アンタゴニストであるプラゾシンによって抑制されなかったが10^<-6>Mのα_2アンタゴニストであるヨヒンビンにより著明に抑制された。n=7の血管で、血管外から加えた10^<-7>Mから10^<-5>Mのノルエピネフリンは細動脈をdose-dependentに収縮させた。n=5血管で、血管内腔より加えた10^<-6>Mのノルエピネフリンも細動脈を内径の変化で14.8±3.1%収縮させた。セロトニンに対しても細動脈の収縮能が認められた。血管外より加えた10^<-10>Mのセロトニンは5分間で細動脈を内径の変化で10.9±1.5%収縮させた(n=8)。n=8の血管で、血管外から加えた10^<-10>Mから10^<-6>Mのセロトニンは細動脈をdose-dependentに収縮させた。10^<-6>Mのセロトニンに対する収縮能は、10^<-8>Mの5HT_2アンタゴニストであるケタンセリンにより著明に抑制された。血管内腔より加えたノルエピネフリンは細動脈を収縮させたがセロトニンは内腔より加えた場合、収縮能は全く認められなかった。このことよりノルエピネフリンは血液側と脳実質側の両方から脳血流を調節している可能性があるが、セロトニンは血液側からは脳血流の調節に関与しないことが推測された。
分化瞬目条件づけを用いた視知覚処理の客観的測定法の検討

ヒトの知覚処理の客観的な測定方法の検討のために,パブロフ型条件づけを視知覚の測定に応用した。条件づけを用いることによって,その存在に論争のある非網膜座標の方位残効を観察でき,これにより条件づけを用いた測定の感度が高いことが示唆された。また,条件づけを用いて必要な処理が異なる複数の顔弁別課題を行ったところ,視覚刺激と空気の提示時間間隔を操作することによって,これらの顔知覚処理の細かい違いを捉えられることが示された。これらの結果から,知覚測定における条件づけの有用性が示された。心理物理学的測定法は観察者の主観的な判断に頼っているため,先入観等のバイアスの影響を避けられない。本研究では,より客観的な測定法について検討するために,パブロフ型条件づけの一種である分化瞬目条件づけを視知覚の測定に応用した。本年度は,分化瞬目条件づけを残効の測定に応用することを試みた。条件づけを用いて,その存在について論争のある非網膜座標の方位残効を検討することにより,条件づけによる測定の感度を検討した。実験では,右に傾いた格子刺激に対して空気を対提示して,瞬目条件づけを学習させた。その後,左に傾いた格子刺激を数秒間提示して順応させた後に垂直の格子刺激を提示すると,垂直の格子刺激に対して瞬き反応が生じた。この瞬き反応は,残効によって垂直の格子が右に傾いて知覚されたため生じたと考えられる。そして,この残効によって生じた瞬き反応は,順応刺激とテスト刺激を網膜座標において異なる位置に提示した時にも観察された。網膜座標に依存しない方位残効が観察されたことにより,条件づけを用いた測定が心理物理学的測定より感度が高い可能性が示された。分化瞬目条件づけを残効の測定に応用することに成功し,その成果が国際学術誌(Scientific Reports)に掲載された。これによりパブロフ型条件づけの知覚測定への有用性を示すことができた。本研究では,より客観的な測定法について検討するために,分化瞬目条件づけを視知覚の測定に応用した。本年度は,条件づけによる測定法がどの程度高次視覚における細かい処理の違いを捉えることができるかを検討するために,分化瞬目条件づけを用いて顔の弁別課題を行った。顔と物体の弁別,他人の顔の弁別,目と口だけが異なる部品変更顔の弁別,目と口の位置だけが異なる配置変更顔の弁別という,必要な処理のレベルが異なる4つの弁別課題を行い,瞬目条件づけにおいて視覚刺激と空気の提示の時間間隔を操作することにより,これらの処理の違いを検出できるかどうかを検討した。その結果,顔同士の弁別では顔と物体の弁別と比べて,視覚刺激と空気の時間間隔がより長くなければ条件づけが成立しなかった。また,他人の顔の弁別より,部品変更顔,配置変更顔の弁別の方が,条件づけの成立により長い刺激と空気の時間間隔が必要であった。これらの結果から,条件づけにおいて刺激と空気の時間間隔を操作することによって,視覚処理の細かい違いを観察できることが示された。さらに,同様の弁別課題を心理物理学的な手法で測定した結果,条件づけを用いた測定の方が心理物理学的測定より,弁別にかかる時間が短かった。この結果から,心理物理学的測定法より条件づけによる測定の方が必要な処理ステップが少ないことが示唆された。今後も分化瞬目条件づけの視知覚測定への応用可能性を検討していく。次年度は,条件づけを用いた測定法が,どの程度高次視覚における細かい処理の違いを捉えることができるかを検討する。そのために条件づけを用いて顔の弁別課題を行う。29年度が最終年度であるため、記入しない。知覚心理学29年度が最終年度であるため、記入しない。
ロイコトリエンB4受容体の生体内・細胞内における役割の解明

強力な生理活性脂質であるロイコトリエンB4の生体内における役割を解明する目的でロイコトリエンB4受容体(BLT1)を欠損するマウスを作成した。現在純系化を進めつつあり、今後表現形の解析を行う予定である。さらに、BLT1の好中球、マクロファージ特異的な発現の分子機構を解明し、転写因子Sp1とゲノムDNAのメチル化がBLT1の白血球特異的な発現に重要であることを明らかにした。ヒトLTB4受容体のC末端のリン酸化部位や、細胞内のGタンパク質共役部位と推定されるアミノ酸を欠損した二種類の変異BLT発現ベクターを作成し、CHO細胞に発現させた。これらの細胞を用いて、LTB4による細胞内カルシウム上昇における脱感作現象、化学走化性の濃度依存性を測定したが、野生型受容体と違いは観察されなかった。またラット、モルモット、マウスからBLT1を単離したさらにBLT1の転写機構の解明を行う目的で単離したBLT1遺伝子の近傍に、BLT1と相同性を有する新規受容体遺伝子を発見し、これがロイコトリエンB4を認識して細胞内にシグナルを伝達する受容体であることを明らかにし、これをBLT2と命名した。BLT2に関して詳細な解析を行ったところ、ロイコトリエンB4以外にも12-ヒドロキシテトラエン酸によっても活性化されることを見いだした。またBLT1またはBLT2を過剰発現したCHO細胞を用いて、これまでに開発されたロイコトリエンB4受容体拮抗薬に対する再評価を行なった。1)LTB4受容体欠損マウスの作成マウスロイコトリエンB4受容体(BLT)のゲノムDNAを元に、LTB4受容体欠損マウス作成のためのターゲッティングベクターを作成した。マウスES細胞を形質転換し、ネオマイシン耐性株をサザンブロット、PCR法にて解析し組み替えES細胞を得た。キメラマウスを得る目的で、マウスブラストシストにマイクロインジェクションしたが、キメラ率の低いマウスしか得られなかったため、現在再度マイクロインジェクシションを行っている。2)変異型LTB4受容体の作製と解析ヒトLTB4受容体のC末端のリン酸化部位や、細胞内のGタンパク質共役部位と推定されるアミノ酸を欠損した二種類の変異BLT発現ベクターを作成した。これらをCHO細胞に遺伝子導入し、ネオマイシンで選択して耐性株を得た。これらの細胞を用いて、LTB4による細胞内カルシウム上昇における脱感作現象、化学走化性の濃度依存性を測定しているところである。またラット、モルモットからBLTを単離した。(Toda,et al,BBRC,Masuda,et al,Biochem.J.,Bioe,et al,Eur.J.Pharmacol.)3)ラット急性腎不全モデルにおけるLTB4の寄与の検討ラット腎動脈結紮・再灌流で引き起こされる急性腎不全モデルにおいて、BLT拮抗薬の事前投与で腎不全の発症が抑えられたこと、BLT発現CHO細胞が腎臓内に遊走したことから、この疾患におけるLTB4の関与を示した。(Noiri,et al.PNAS)強力な生理活性脂質であるロイコトリエンB4の生体内における役割を解明する目的でロイコトリエンB4受容体(BLT1)を欠損するマウスを作成した。さらにBLT1の転写機構の解明を行う目的で単離したBLT1遺伝子の近傍に、BLT1と相同性を有する新規受容体遺伝子を発見し、これがロイコトリエンB4を認識して細胞内にシグナルを伝達する受容体であることを明らかにし、これをBLT2と命名した。

またBLT1またはBLT2を過剰発現したCHO細胞を用いて、これまでに開発されたロイコトリエンB4受容体拮抗薬に対する再評価を行なった。以上より、ロイコトリエンB4の生理作用における受容体分子の同定、解析を行ったとともに、今後生体内におけるロイコトリエンB4の役割を解明するための遺伝子欠損マウスの作成に成功した。