hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
次世代型CRISPRシステムの構築によるヒト遺伝子機能解明のための基盤技術開発

本研究は、CRISPR法の改良による次世代型ヒト遺伝子機能解明のための基盤技術の開発を目的とした研究である。CRISPRシステムとは、原核生物の免疫防御システムを利用した新しいゲノム編集法であり、あらゆる生物種に応用可能な画期的技術として注目されている。CRISPR法では、標的部位を塩基配列で識別するガイドRNAがCas9たんぱく質と複合体を形成し、ガイドRNAが対合したゲノム領域をCas9が切断する。そのため、本研究ではゲノム切断活性を伴わないdCas9を用い、実験的手法とバイオインフォマティックスを用いた手法を組み合わせることで、ゲノム編集効率が高く実用的な手法を確立することに成功した。本研究は、CRISPRの改良による次世代型ヒト遺伝子機能解明のための基盤技術の開発を目的とする。本研究では、第一世代のCRISPRシステムの問題点を改良することで、第二世代の高精度および高効率のCRISPRシステムの構築を目指す。すなわち、CRISPRの分子機構の解明に基づく、ゲノム編集効率の高いガイドRNA配列の選択法、およびオフターゲット効果を回避できる目的遺伝子特異的なガイドRNA選択法を構築することを中心とし、さらに実用的なオフターゲット効果を回避できる手法を構築する。また、本手法により、従来RNA干渉法での解析が困難とされた遺伝子群のヒト細胞でのノックアウトライブラリも構築する。CRISPRシステムによるゲノム編集法は、開発されてまだ5年程度の手法であり、その特異性や効率には改善すべき点も多く残されている。まず1つは、ゲノム編集効率はガイドRNA配列によって大きく異なり、ガイドRNAによってはほとんどゲノム編集が起こらないものもあることである。さらに、もっとも大きな問題点となるのは、目的のゲノム配列領域以外にも影響を与えてしまう「オフターゲット効果」である。CRISPRシステムは目的のゲノム領域を永久的に改変してしまう方法であるため、オフターゲット効果はかなり重篤なダメージになる場合がある。特に、ヒトで利用するためには倫理的な問題にも注意を払う必要がある。そこで、本研究では、このような問題点を改良し第二世代の特異性の高い実用的なCRISPRシステムの構築を目指す。CRISPR/Cas9システムでは、ガイドとなるRNAが塩基配列の相補性に基づいて認識するゲノム領域をCasエンドヌクレアーゼが切断し、遺伝子を破壊する。本手法は、ガイドRNAとCasタンパク質を導入すれば、どのような生物種でも遺伝子に変異を誘導することが可能な優れた手法として注目されている。しかし、一方で、意図しない抑制効果を示すこともしられており、本手法ではゲノムそのものに変異を誘導するため、そのようなオフターゲット効果を排除することが重要な課題の1つとなっている。オフターゲット効果を軽減し、標的遺伝子特異的なゲノム編集を行うため、多数のレポーター遺伝子を用いた解析を行った。その結果、遺伝子配列や遺伝子上の位置などによって抑制効果に相違がみられるという興味深い結果が見出されている。Clustered regularly interspaced short palindromic repeats / CRISPR-associated proteins (CRISPR/Cas)システムは、原核生物の獲得免疫機構を利用した優れたゲノム編集法である。CRISPR/Cas9システムでは、ガイドとなるRNAが塩基配列の相補性に基づいて認識するゲノム領域をCasエンドヌクレアーゼが切断し、遺伝子の破壊を引き起こす。したがって、本手法は幅広い生物種で任意の遺伝子配列に変異を導入できる可能性を示す一方、意図しない領域に対するoff-target効果も知られている。CRISPR/Casシステムではゲノムを切断して変異を導入するため、一旦変異が導入されたゲノム領域を修復することはむずかしい。そのため、off-target効果は、将来的にヒトなどへ応用することを考慮した場合には重要な問題である。Off-target効果を軽減する1つの方法として、Cas9に変異を導入することでDNA切断活性を有しないCas9(dCas9)ヌクレアーゼが開発されている。dCas9は標的とする配列に結合することで、遺伝子を破壊することなしにその遺伝子の発現を抑制する作用がある。そのため、dCas9の作用効率は今後のCRISPR/Casシステムの応用において重要な要素の一つである。そこで、当該年度には、Cas9とdCas9の違いを明らかにするため、ヒト培養細胞を用いてレポーター遺伝子を用いた解析を行った。その結果、Cas9が効率的に作用した標的でも、dCas9を用いた場合ではその抑制作用が弱くなることがしばしば見られ、効率的に抑制が起こる配列の特性、効果を示す遺伝子中の標的部位の位置の違いなどがあることが明らかになった。本研究では、CRISPRの改良による次世代型の効率的ヒト遺伝子機能解明のための基盤技術の開発を目指している。そのため、ガイドRNA配列および塩基長などによってCRISPRによるゲノム編集の効率が異なる分子機構を解明し、効率的なCRISPRゲノム編集法の構築を目指す。さらに、CRISPRによるゲノム編集におけるオフターゲット効果の機構を明らかにすることで、オフターゲット効果を回避する方法を構築すると共に、実用的にオフターゲット効果を回避できる手法の構築を行うことを目指している。現在、dCas9を用いてCas9タンパク質との比較解析を行うことにより、それぞれの特徴が浮き彫りにされてきており、配列や遺伝子上の位置などによる相違が見られている。したがって、より詳細な解析を行うことにより、効率的な特異性の高い手法の構築に近づける状況と考えている。

CRISPRシステムとは、原核生物の免疫防御システムを利用した新しいゲノム編集法であり、あらゆる生物種に応用可能な画期的技術として注目されている。本研究では、第一世代のCRISPRシステムの問題点を改良することで、第二世代の高精度および高効率のCRISPRシステムの構築を目指した。すなわち、CRISPRの分子機構の解明に基づく、ゲノム編集効率の高いガイドRNA配列の選択法、およびオフターゲット効果を回避できる目的遺伝子特異的なガイドRNA選択法を構築することを主眼とした。CRISPR法では、標的部位を塩基配列で識別するガイドRNAがCas9たんぱく質と複合体を形成し、ガイドRNAが対合したゲノム領域をCas9が切断する。そのため、間違って標的以外の領域を切断した場合には修復は難しく、オフターゲット効果と呼ばれる。そこで、本研究ではゲノム切断活性を伴わないdCas9を基盤とした応用手法を用いた。dCas9はオフターゲット遺伝子に対する切断活性はないため安全な手法と言えるが、その抑制効果が低いことから実用的ではないと考えられていた。そこで、dCas9によるゲノム編集の効率を向上させる極めて独創的な手法を開発した。dCas9では、標的ゲノムDNAに対して効率よく対合するガイドRNAを選択することが最も重要であると考え、塩基配列に依存した塩基対合の熱力学的安定性に焦点を当て、実験的手法とバイオインフォマティックスを用いた手法を組み合わせることで、dCas9によるゲノム編集効率が高い標的配列選択の条件を確立することに成功した。本研究は、CRISPR法の改良による次世代型ヒト遺伝子機能解明のための基盤技術の開発を目的とした研究である。そのため、本研究ではゲノム切断活性を伴わないdCas9を用い、実験的手法とバイオインフォマティックスを用いた手法を組み合わせることで、ゲノム編集効率が高く実用的な手法を確立することに成功した。オフターゲット効果を軽減し、標的遺伝子特異的なゲノム編集を行うため、多数のレポーター遺伝子を用いた解析を行った。本研究では、野生型のCasタンパク質だけではなく、Casタンパク質のDNA切断活性部位に変異を入れたdCas、さらに、dCasに転写促成作用をもつVP64や抑制作用をもつKRAB遺伝子を不可したタンパク質による抑制作用を検討した。
ミクロレベルの分光画像計測による織物の光学特性の解析

物体からの反射光の鏡面反射成分は光源と同じであるが、光沢を有する織物の鏡面反射光は、光源色ではなく有彩色であることが報告されている。このような織物特有の反射特性は、糸の幾何的要因と、繊維や糸の光学的な要因による。織物の鏡面反射が物体色になる仕組みを調べ、織物の光反射モデルを構築することが目的である。本研究では、ミクロレベルの繊維のHDRマルチバンド画像を撮影し、鏡面反射光の分光反射特性を推定し、繊維の光沢の反射特性を解析した。さらに、光線追跡シミュレーションにより、繊維内部の光の伝搬を計算した。また、3Dプリンターでスケールアップした繊維構造を製作し、光学反射特性を測定して実測値と比較する。研究目的:織物には、物体色を帯びた鏡面反射成分があることが知られているが、その原因は究明されていない。本研究では、ミクロレベルの画素単位で反射スペクトルが推定できるマルチバンド分光画像を織り構造に関連づけて詳細に解析することにより、物体色を帯びた反射成分のライトトランスポートを解明し、織物のミクロレベルの質感表現が可能なCGレンダリングの実現を目指すことを目的とする。平成26年度は、比較的、測定時間が短い2ショット・マルチバンドカメラを用いて、BTF画像を計測し、物体色の指向性反射成分が、織り構造のどの部分に多く見られるか、その理由は何かを考察する計画だった。実施した研究の成果:実験の結果、織物の正反射成分は、織物の物体色スペクトルであり、光源スペクトルではなかった。正反射成分は、輝度値が非常に高いので、従来のマルチバンドスペクトル推定方法では、正しいスペクトルを推定することができなかった。そこで、反射輝度に影響されないスペクトル推定方法を新たに考案して利用することで、正反射成分が織物の物体色スペクトルであることが明らかとなった。ミクロレベルで撮影した分光画像を調べると、光源スペクトルの画素は、極、僅かであった。正反射成分が物体色スペクトルになる原因を表面下散乱から検討した結果、織物を構成する糸の単繊維を光が透過し、正反射方向に反射することで物体色スペクトルになると考えられた。重要性:従来からの反射モデルでは、正反射は鏡面反射と同じ意味であり、光源色であると考えられてきた。これは、不透明な平面物体の表面での反射モデルである。織物の場合には、ミクロレベルでは平面ではなく、また、光が透過して表面下散乱した光が指向性をもった正反射光になる。表面下散乱を考慮した反射モデルが必要である。織物には、物体色を帯びた鏡面反射成分があることが知られているが、その原因は究明されていない。我々は、単糸レベルの解析が可能な高解像度・高精度の多方向照明HDR画像計測法を開発し、マルチバンド分光画像で表面反射は表面下散乱を測定してきた。今回は、繊維断面に注目して、物体色を帯びた反射成分のライトトランスポートを解明することが研究の目的である。断面が三葉形状である絹繊維の光学反射特性を光線追跡シミュレーションで求めた。三葉形状と三角形状とで、反射光量や表面下反射の違いを求めることができた。さらに、シミュレーションの結果が正しいことを確認するために、光硬化樹脂による三次元レーザープリンターで三葉断面、三角断面の単繊維のスケールアップモデルを作成し、光学反射特性を実測した。実測と光学シミュレーションで透過率と物体色が異なるため数値評価はできなかったが、傾向は一致した。実測結果1.三葉断面、三角断面のスケールアップモデルの反射エネルギー、色度の変化の実測値はシミュレーションと同じような傾向を示した。2.反射エネルギーでは三葉断面よりも三角断面が強い。3.反射光の色度は三葉断面の方が光源色から離れる。しかし、制作したスケールアップモデルは、光硬化樹脂の透明度が低く、また、表面形状も滑らかさではなかった。光線追跡によるシミュレーションにより、三葉断面の単繊維の反射のメカニズムを解明できた。また、三次元プリンターによるスケールアップモデルを作成し、光学反射特性を実測することができた。さらに、シミュレーションの結果と実測値を比較したところ、傾向はよく合っていることが確認でき、シミュレーションの有効性が支持された。本研究では、ミクロレベルの繊維のHDRマルチバンド画像を撮影し、鏡面反射光の分光反射特性をPLSにより推定し、鏡面反射光の強度の変化に対する光沢色の変化を色度空間において追跡し、安定に光沢色の特徴を解析した。さらに、織物の微小構造に基づく光沢色変化を解析するために、織物の微小構造から観測される鏡面反射光の色度と微小構造における分布領域との関係の解析を行った。微小構造において観測される光沢は、微小面の法線が織物の法線と一致するよこ糸中心付近ほど強く、その色度座標は光源色とは遠ざかる方向へ変化した。この結果を物体色の鏡面反射の色度変化を微小構造となる単糸の幾何構造および光学特性に基づいて考察した結果、織物のたて糸とよこ糸領域の微小構造の違いによって物体色と光源色の鏡面反射光が観測されること、物体色の鏡面反射光は透過性の高い繊維に入射した表面下散乱光が三角柱状の繊維の側面で内部反射し正反射方向に選択的に出射したためであること等を確認した。次に、画像による解析では困難な、単繊維の断面形状による織物の光沢の効果を考察するために、三次元光学シミュレーションを構築し、単繊維の断面形状に基づいて、繊維内部における光の伝搬と織物の光沢を解析した。

すると、三葉断面の先端の丸みとその間の曲面形状が、繊維内部で光が全反射しやすく、複数本の単繊維が多層に並んだ時は、周辺単繊維への光の伝播が水平および深い層も含めた放射状に広がる光が観測されることが確認された。また、三葉断面形状の単繊維を束ねたよこ糸モデルでは、1層目の単繊維内での全反射によって、物体色の強い出射光が観測され、表面で生じる光源色の鏡面反射よりも2倍強く、光源色の影響が少ないことが確認された。単繊維に沿った方向での反射光の強さと色度変化を確認すると、画像解析による結果と同じ傾向を示すことが確認された。物体からの反射光の鏡面反射成分は光源と同じであるが、光沢を有する織物の鏡面反射光は、光源色ではなく有彩色であることが報告されている。このような織物特有の反射特性は、糸の幾何的要因と、繊維や糸の光学的な要因による。織物の鏡面反射が物体色になる仕組みを調べ、織物の光反射モデルを構築することが目的である。本研究では、ミクロレベルの繊維のHDRマルチバンド画像を撮影し、鏡面反射光の分光反射特性を推定し、繊維の光沢の反射特性を解析した。さらに、光線追跡シミュレーションにより、繊維内部の光の伝搬を計算した。また、3Dプリンターでスケールアップした繊維構造を製作し、光学反射特性を測定して実測値と比較する。織物の鏡面反射が物体色であることを確認できた。さらに、その物体色は、織物を構成する単糸の内部反射や内部透過による表面下散乱による反射であることをシミュレーションで確かめた。3Dプリンターで織物の織り構造を拡大したモデルを作成して計測する予定であったが、3Dプリンターの入手ができず、やや遅れが発生している。今回、三次元プリンターで使用した光硬化樹脂の透明度が低かったので、より透明度の高い樹脂でレプリカを作成して、測定してみたい。また、透明樹脂に染料を混ぜて、色付きの織構造のスケールアップモデルを作成し、反射光の測定結果がどのように変化するかを調べる。また、織物の表面下反射を考慮した異方性表面下反射モデルを構築して、CGレンダリングへの応用を試みる。感性情報処理織物の物体色を帯びる反射機構は、シミュレーションで分かってきたので、今後は、3Dプリンターを入手し、織物の織り構造を拡大したモデルを作成して計測する予定である。これにより、実験とシミュレーション結果を結び付けることができる。学会発表に行く予定であったが、別の共著者が行った為、また、アルバイトで研究補助を雇用する予定であったが、代表者の作業で問題なく行えた為。購入予定であった3Dプリンターの発売が延期されたために入手できなかったため。最終年度の研究をサポートする研究補助を雇用する。購入可能になった時点で購入する予定。
中型動物肝硬変モデルへの同種同系肝オルガノイド移植による肝硬変治療効果の検討

我々はiPS細胞から分化誘導した肝内胚葉細胞、血管内皮細胞、間葉系細胞を3D培養した肝オルガノイドを肝臓表面に移植する手法を開発中である。肝硬変患者の肝表面に組織移植を行う為には安全な剥離法、自己組織化を高める被覆剤の開発が必要である。本研究ではマウス、ラット等を用いた移植手技の確立後、中型動物での検討を行う。また従来の異種移植では拒絶反応のため長期的な生着が困難であったため、中型動物の同種肝オルガノイド移植による肝硬変の長期的治療効果を確認する。
効果的な韻律指導のための教授項目に関する研究

「自然な日本語らしい発音」のためには、韻律の諸要素を重視すべきだと言われるが、現実には、教師が自分の発音に自信がなかったり、効果的な指導法がわからなかったりすることで、十分な指導は行われていない。その現状を改善するために、まず、音声に対する教師の自己研修のための、インターネットを利用した韻律練習プログラムを公開した。そして、アクセントのミニマルペアの有効性の調査研究を行った。普段の授業から学習者の目を韻律に向けさせるには、既習語彙でミニマルペアがどのぐらいできるかについて調べる必要がある。そこで、「日本語能力試験出題基準」語彙集の初級1500語、上級10000語を対象として、アクセントの同音語弁別力調査を行った。その結果、上級語彙の同音語中、アクセントが完全に語の弁別を行うものは約2割、また、初級語彙では約4割であった。しかし、同音語自体が総語彙に占める割合は少なく、また、同品詞でまったくの同文脈に想定しうるペアは、ほとんどない。したがって、弁別機能や統語機能などをアクセント教育の意義に求めるよりは、情的評価に大きく関るものとしてアクセントも存在していると考えた方が、理にかなう。そこで、これまでのミニマルペア中心の教育ではなく、イントネーションやプロミネンスという他の韻律諸要素と連動して文の高低を形作る際の一要素としてアクセントを捉えなおし、体系的な韻律教育を行うため、音声についての多くの項目の相互の関係を明らかにし、具体的例文と結び付けて、韻律指導のための教授項目を呈示した。これらの研究成果の一部は、平成9年度日本語教育学会秋季大会(1997. 10. 5広島大学)、および、平成9年度日本語教育学会第11回研究集会(1998. 3. 8同志社女子大学)において口頭発表を行った。
好酸球性消化管疾患の発症に及ぼす体内細菌叢の影響

好酸球性消化管疾患の発症関連因子としての体内細菌叢の関与を明らかとするための検討を行った。まず、好酸球性消化管疾患の中で患者数が最も多い好酸球性食道炎の患者を対象として検討を行った。好酸球性食道炎患者はプロトンポン阻害薬を使用中の例が大部分であるため、コントロース群として10例のプロトンポンプ阻害薬未使用の健常者とともに10例の標準用量のプロトンポンプ阻害薬を1か月以上連続使用した健常者の2群を用いた。細菌叢の解析は唾液、デンタルプラーク、便を用いて16S ribosomal RNAの可変領域の塩基配列を次世代シークエンサーを用いておこなった。プロトンポンプ阻害薬使用例は健常者であっても口腔内細菌叢、腸内細菌叢に非使用者と比較してごくわずかな変化を認め、特に腸内細菌叢、口腔内細菌叢ともにStreptococcus属を中心とした増加が認められた。一方、検討した20例の好酸球性食道炎患者の口腔内と腸内細菌叢にはユニークな変化が認められた。口腔内細菌叢には好酸球性食道炎に特異的な変化は認められなかった。一方、腸内細菌叢はプロトンポンプ阻害薬使用、未使用の2種のコントロール群と大きく異なる細菌叢の変化がみられた。このような変化は逆流性食道炎患者では全く観察されなかった変化であり、好酸球性消化管疾患に特有の変化である可能性が示唆された。このような変化が発症に関わっているのか、疾患が発症したために二次的に起こった変化であるのかを明らかとするために、今後活動期の好酸球性食道炎患者と治療によって緩解状態となった好酸球性食道炎患者の腸内細菌叢を比較することが必要となると考えられる。さらに、好酸球性炎症を消化管内に起こす好酸球性胃腸炎などの疾患で同様に腸内細菌叢の異常があるかどうかを検討し、好酸球性食道炎と好酸球性胃腸炎の類似性を検討することも必要であると考えられる。好酸球性食道炎例と好酸球性胃腸炎例の口腔内と消化管内の細菌叢が健常者とどのように異なっており、それが疾患発症にどのように関係しているかを明らかとすることを目的として研究を行っている。本年度は好酸球性食道炎例と胃腸炎例の血清のTh2型のサイトカインを中心に約50種類のサイトカイン、ケモカインの測定を行った。また、これらの疾患のヘリコバクター・ピロリ感染の有病率を健常コントロールと比較する検討も行った。ヘリコバクター・ピロリ感染の陽性率は好酸球性食道炎、抗酸球性胃腸炎ともに健常者に比べて有意差を持って低く、ヘリコバクター・ピロリ感染は好酸球性消化管疾患への罹患率を低下させることが明確となった。一方、血清中のサイトカイン、ケモカインの濃度は好酸球性食道炎、好酸球性胃腸炎例と健常者の間に重なりが大きく、これらの血清中濃度の測定を持って診断の補助としたり、病勢のマーカーとすることは困難であると考えられた。大腸内の細菌が産生する水素とメタンの濃度の測定が可能であるかの検討を開始しており、健常者においても好酸球性食道炎患者においても測定が可能であることが明らかとなった。これらの腸内細菌が産生するガス成分は腸管の運動能に大きく影響することが知られており、多数例での測定と健常者との比較が重要であると考えられる。口腔内細菌と消化管内細菌に関してはサンプルの採取方法を工夫し、安定してサンプルを採取することができるように採取用のサンプリングチューブを開発した。さらに、これを用いて健常者10例において口腔内の細菌と消化管内の細菌叢の解析が可能であることを確認した。さらに、好酸球性食道炎患者が長期内服していることが多いプロトンポンプ阻害薬が口腔内と消化管内の細菌叢に対してどのような影響を及ぼしているかを検討し興味ある成績を得ている。本研究では好酸球性食道炎、好酸球性胃腸炎、そして健常者例を対象として唾液中、血清タンパク、サイトカインの測定、便中の腸内細菌の産生物の測定、口腔内と消化管内の各部位における細菌叢の解析を行って、これらを比較することで好酸球性食道炎、好酸球性胃腸炎の病態を明らかとし、病因を究明することを目的としている。現在までの検討で血清タンパクとサイトカイン類、唾液中タンパク、腸内細菌が産生するガス状物質の測定は全て確立し健常者と好酸球性食道炎、好酸球性胃腸炎例での測定を開始している。さらに、細菌叢の解析は消化管内の解析も口腔内の細菌叢の解析も確立し、さらに健常者を対象として薬剤投薬の影響の検討が終了した。薬剤の投薬の影響を検討することは好酸球性食道炎例が高頻度にプロトンポンプ阻害薬を長期使用していることを考えると非常に重要な情報が得られたこととなる。さらに、好酸球性食道炎例と好酸球性胃腸炎例の口腔内と消化管内の細菌叢解析のためのサンプルの収集は予定どうりに進んでいる。このような研究の進行状況から本研究はおおむね順調に進展していると判断している。好酸球性消化管疾患の体内常在細菌叢に関する検討を行っている。好酸球性消化管疾患は好酸球性食道炎と好酸球性胃腸炎に分類することができる。

このうち好酸球性食道炎の方が患者数が多く、対処患者を集積することが容易であるため好酸球性食道炎を対象とした研究が先行している。まず、好酸球性食道炎では治療薬としてプロトンポンプ阻害薬が投薬されている例が大部分であるため、まずプロトンポンプ阻害薬の投薬が体内の常在細菌叢にどのような影響を及ぼしているかの検討を行った。その結果、予想どうり便中の細菌叢の変化は見られた。さらに予想に反してプロトンポンプ阻害薬の投薬を行うと口腔内細菌叢の変化が生じることが明らかとなった。この点は、プロトンポンプ阻害薬を内服している好酸球性食道炎患者とプロトンポンプ阻害薬を使用していない健常者の体内常在菌の比較を行ううえで重要であると考えられる。本研究成績はすでに論文として報告した。さらに、私たちの研究グループでは、すでに好酸球性食道炎患者20例の常在細菌叢解析用のサンプルを集積しており、そのマイクロバイオーム解析を開始している。集積した20例の臨床像に関しては集積が終了しており、その半数がプロトンポンプ阻害薬を使用しており、半数が使用していない患者で構成されている。このため、プロトンポンプ阻害薬の使用が常在細菌叢に対してどのような影響を及ぼすかも解析終了後には明らかとなってくるものと考えられる。研究はおおむね順調に進行している。現在までの研究で明らかとなった点は、健常者においても好酸球性消化管疾患の治療に頻用されるプロトンポンプ阻害薬を1か月程度連用すると口腔内と腸内細菌叢の変化が起こりグラム陽性球菌の分類される細菌種が増加することが明らかとされた。腸内の細菌叢がプロトンポンプ阻害薬の使用で変化をすることは従来より報告されており、予想どうりの結果といえる。一方、口腔内の細菌叢にも類似した変化が起こることは初めて明らかとされた現象であり、その機序に大きな興味がもたれるとともに、体内各部位の常在細菌叢の検討を行う本研究においては極めて重要な現象である。実際、好酸球性食道炎患者の常在菌叢解析用の体内各部位のサンプルを20例分集積し、マイクロバイオーム解析を行っているがこの中で半数がプロトンポンプ阻害薬の長期的な投薬治療を受けており、すでに腸管内、口腔内でグラム陽性球菌が増加していると考えられる。そこで、すでに得られたプロトンポンプ阻害薬投薬が体内の常在細菌叢に及ぼしている影響を加味したうえでの好酸球性食道炎患者のマイクロバイオーム解析の結果の解析を行っていく予定である。好酸球性胃腸胃炎患者は日本における症例数が好酸球性食道炎5分の1程度であるため検体の収集はまだ完了はしていないが、好酸球性食道炎に続いて検体収集を進めている。好酸球性消化管疾患の発症関連因子としての体内細菌叢の関与を明らかとするための検討を行った。まず、好酸球性消化管疾患の中で患者数が最も多い好酸球性食道炎の患者を対象として検討を行った。好酸球性食道炎患者はプロトンポン阻害薬を使用中の例が大部分であるため、コントロース群として10例のプロトンポンプ阻害薬未使用の健常者とともに10例の標準用量のプロトンポンプ阻害薬を1か月以上連続使用した健常者の2群を用いた。細菌叢の解析は唾液、デンタルプラーク、便を用いて16S ribosomal RNAの可変領域の塩基配列を次世代シークエンサーを用いておこなった。プロトンポンプ阻害薬使用例は健常者であっても口腔内細菌叢、腸内細菌叢に非使用者と比較してごくわずかな変化を認め、特に腸内細菌叢、口腔内細菌叢ともにStreptococcus属を中心とした増加が認められた。一方、検討した20例の好酸球性食道炎患者の口腔内と腸内細菌叢にはユニークな変化が認められた。口腔内細菌叢には好酸球性食道炎に特異的な変化は認められなかった。
金属の空間配列制御を指向した超音波応答性ゲル化反応

サリチルアルジミン配位子を有する環状二核白金錯体の非発光性の有機溶液が、短時間の超音波照射によってゲル化し、発光性を示す現象を明らかにした。ゲルの発光挙動は、超音波照射時間や錯体のメチレン鎖長、キラリティにより制御が可能である。白金錯体のホモおよびヘテロキラル会合と分子集合体のモルフォロジー変化が構造特異的な発光性獲得の鍵となることが明らかとなった。本年度は、超音波応答性ゲル化反応に関する研究を行った。当研究室では、すでに環状2核パラジウム錯体による錯体超音波応答性ゲル化反応を見出しているが、この現象を他の金属錯体へと拡張するため、同様構造を有する白金錯体に関する検討を行い、その合成を確立した。メチレンスペーサーの長さの異なる白金2核錯体について、白金配位平面がcis, transの関係にある異性体を作り分け、それぞれ単結晶X線構造解析により、その構造とパッキング構造を明らかにした。これらの錯体が溶液状態で発光するのみならず、固体状態でも発光を示すことを見出した。固体発光の強度が、異性体により異なること、また、発光挙動が、分子構造と集積構造に依存することを明らかにした。これらの錯体のうち、anti-型の錯体が、短時間の超音波照射に応答して有機溶液をゲル化することがわかった。このゲル化では、溶液状態からゲル状態に相変化する際に、発光強度が大きく向上するというAIEE現象が得られた。また、超音波応答性がメチレン鎖長に依存するという興味深い結果が得られた。trans-型白金錯体のキラリティーと分子集合に関する情報を得るため、これらの錯体のHPLCを用いた光学分割を行い、さらに絶対配置の決定に成功した。分子のキラリティーとゲル化における分子配列の関係を調べたところ、メチレン鎖長が5の場合はホモキラルな分子集合が優先し、メチレン鎖長が7の場合はヘテロキラルな分子集合を起こすという、構造特異的な分子集合挙動が明らかとなった。ペンタメチレンスペーサーを有する環状2核ビス(サリチルアルジミナト)パラジウム錯体による超音波応答性瞬時ゲル化現象を拡張し、中心金属として白金を用いることで超音波刺激応答性発光増大現象を初めて達成している。本年度は、超音波刺激に応答した発光増大現象において重要な要因となる分子会合様式と発光の関係を明らかにした。ラセミ混合物の白金錯体のシクロヘキサン溶液は短時間の超音波照射(40kHz,0.45W/cm^2)に応答し瞬時にゲル化し、このゲルはUV照射下(365nm)で黄色発光する。生成したゲルは長時間安定であり発光を保持するが、加熱により溶液に戻すと発光しなくなる。一方、光学的に純粋な白金錯体の同様溶液は、超音波照射でゲル化せず発光もしない。部分的に光学活性な白金錯体を用いたゲル化の進行に伴う鏡像体過剰率の変化に関する詳細な研究から、本ゲル化が、(R)(S)(R)(S)...とヘテロキラル会合により進行することが明らかとなった。さらに、電子顕微鏡観察から、生成するゲルは、超音波照射時間が長くなるほど、繊維状構造体のバンドル構造が増大する事が分かった。ゲル繊維への集合は超音波照射時間に関わらず定量的に進行する事から、この超音波照射時間による発光制御は、集合単位の単純な嵌合構造の積層化がもたらす配位平面性の強化、固定化によって生起する事が示された。ペンタおよびヘプタメチレンスペーサーを有する環状2核ビス(サリチルアルジミナト)白金錯体による超音波応答性瞬時ゲル化現象を詳細に検討し、分子集合におけるキラリティ優先性がメチレン鎖長に依存して変化することを明らかにした。メチレン鎖長5のスペーサーを有する環状2核ビス(サリチルアルジミナト)白金錯体のラセミ混合物のシクロヘキサン溶液は短時間の超音波照射(40kHz,0.45W/cm^2)に応答し瞬時にゲル化するが、その光学活性体はまったくゲル化を起こさない。一方、メチレン鎖長7の白金錯体は、これとは逆に、光学活性体のほうがゲル化能力が高いことが明らかとなった。溶液状態およびゲル状態における分子集合体のモルフォロジーと結晶パッキング構造による研究から、この選択性の違いが、超音波によって生成する分子集合核の安定性に関係することが示唆された。
日本の企業不祥事に関する実証分析

本研究は、日本企業の不祥事が起こる原因のひとつとして、取引当事者間の情報量の格差が拡大していることが原因であると位置付けたうえで、その利害得失の比較あるいは適切な法規制のあり方について、理論的・実証的に検討した。その研究成果は、たとえば、消費者金融をはじめとする不法行為の事例研究という領域で、公表論文としてまとめられた。本研究の目的は、企業不祥事に関する経営者の意思決定と、市場の情報の非対称性との連関を経営学的側面から明らかにすることである。まず、次年度からの計量分析の基礎となる先行研究の詳細な調査とデータ整備及び先行研究に拠りながら株価の情報精度に関する様々な分析のサーベイ行い、特定の不祥事企業と金融市場との関わり合いを探るという実証的な課題に取り組んだ。特に本年度(初年度)は、幾つかの経営破綻が相次いでおり、個人投資家の資本市場に対する信頼性を大きく損なった消費者金融業を研究対象として取り上げた。交付申請書の研究計画書に基づき、日本における不祥事企業の実態を把握するために不可欠な調査に着手するとともに、法規制に関する基礎的な資料の整理を行い、今後の規制のあり方(強化・維持・緩和)についての考え方を把握することを調査の主眼とし、その考察の一部を論文とした。従来、消費者金融の諸問題は法律学の立場から論じられることが多かったが、経営学の視点からも含意を得ることができたという点で極めて意義のあるものであった。なお以上の研究成果は、「九州地区国立大学間連携教育系・文系論文集」に査読付き論文を掲載している。株主利益のため経営者を規律付ける経営者がその契約内容を実行しているかどうかの意思決定と、不祥事との関連を経済学・法律学の両側面から明らかにすることが本研究の一貫した目的である。今年度は3年計画の中間の年度として、企業価値の問題との関わり合いを探るという実証的な課題に取り組んだ。交付申請書の研究計画書に基づき、幾つかの規模の大きな不祥事が相次いでおり、なかでも金銭貸借媒介手数料をめぐる違反事件が訴訟の中で占める割合が極めて大きかった。こうした背景には、評判の失墜などにより受ける企業の受ける損失を会社ぐるみでの隠蔽工作をしたことが推測される。そこで本年度は、個人・企業を自己破産(デフォルト)に陥らせ、個人投資家の金融市場に対する信頼性を大きく損なった貸金業を取り上げることにした。具体的には、貸金市場は借り手に関する情報の非対称性が著しく、貸し倒れリスクが高いため、投資計画、個人向けの貸出約定金利や貸出額の伸びにどの様な影響を与えるかを計量的に測定した。さらに、不祥事事件として取り上げられた貸金業者と訴訟の関係を次年度に考察するため、最高裁判所を通して民事簡易裁判の訴訟件数、弁護士統計に関するデータの収集を行った。これまで企業統治の問題の多くが、少数株主と大株主との利益相反問題といったデメリットを論じたものが多いが、2000年以降に順調な融資拡大を示す貸金業者が増加したこと、上限金利規制の水準が引き下げられたこと、弁護士報酬の自由化などにより簡易裁判での訴訟が飛躍的に増加したことも無視できない影響を与えている。なお以上の研究成果は、査読付き国際学術雑誌The Japanese Economyに論文を掲載された。最終年度である次年度には、以上の研究成果をベースとして本研究の総括を行い、企業統治の問題と絡めて訴訟市場の構造そのものに焦点を当てた研究を行う。企業組織内における不祥事決定問題と、貸金市場との相互の連関を明らかにすることが本研究の目的である。最終年度である今年度は前年度の実績報告と、今年度の交付申請書の研究実施計画に基づき、貸金市場の実態ならびに不祥事発生の構造自体を定量的に探る研究を行った。特に、株主が経営者をどのように規律しているか、経営者に提示する将来の企業収益に連動する役員報酬体系と経営者による不法行為への誘引のトレード・オフ問題を回避できているかモデル分析を行った。まず、不祥事決定問題に関する研究の結論としては次のようなものが得られた。第一に、企業が不祥事を起こすかどうかは、経営者の役員賞与比率や役員持株比率に求めることができる。第二に過去に不祥事をした企業は、不祥事を起こしやすいという認識を持たれ、経営者の役員賞与が相対的に少なく、経営者に株式所有を持たせなくなる傾向にある。そのため、たとえ法律による取締りを強化して摘発しても、現状では経営者が不法行為をとることを減らすことを難しくしている。特に実証研究の成果は、日本金融学会で報告され、そこで得られた議論、さらに一年目、二年目の成果に基づき、研究全体がまとめられた。従来の先行研究で扱ってきたエージェンシー問題とは別の角度から、こうした現象を実証研究だけでなく、理論モデルを構築できたことは意義があったと考えられる。さらに、貸金市場においては、上限金利規制の水準で貸出しが行われ、供給曲線が右下がりで、かつ超過需要が発生している。また、金利規制の引き下げに対する他の消費者金融業者の追随率は低く、規制の対象でないカード会社などは必ずしも貸出金利を引き下げていない。2000年6.月に施行された上限金利規制の水準の引き下げにより、社会的余剰が増加することを理論モデルから説明することができた。
超分子ヒドロゲルライブラリーの構築と機能評価

低分子化合物の自己集合により形成する超分子ヒドロゲルは、次世代の機能性材料として魅力的な研究対象である。様々な用途に適応できる超分子ヒドロゲルの創出のために、三回対称トリスウレア構造を基盤とする超分子ヒドロゲルライブラリーを構築した。構築されたライブラリーより、適切な超分子ヒドロゲルを選択することで、その用途展開が可能となった。本研究では、超分子ヒドロゲルを支持体とする酸性未変性タンパク質の電気泳動法の開発、超分子ヒドロゲルによる色素分子の脱吸着の制御に成功した。超分子ヒドロゲルの生命科学領域における新規材料としての有用性を評価することを目的とする。研究代表者は、低分子ヒドロゲル化剤として機能する分子の基本骨格の開発を達成しており、この知見に基づき、超分子ヒドロゲルライブラリーを構築した。本年度は、主にウレイド基を有する22種類の誘導体合成を達成し、そのうち8個の化合物にゲル化能があることを明らかとした。この中には、超分子ゲルではあまり例のないチキソトロピー性を有する分子も見出された。また、超分子ヒドロゲルの応用研究として、(1)超分子ヒドロゲルを用いた電気泳動法の開発、(2)超分子ヒドロゲルを用いた細胞貯蔵法の開発、(3)超分子ヒドロゲルによる薬剤輸送システムの開発、の三つを計画しているが、本年度は(1)超分子ヒドロゲルを用いた電気泳動法の開発を重点的に行った。変性タンパク質を用いたドデシル硫酸ナトリウム(SDS)電気泳動法では、SDS濃度に依存したタンパク質の分離様式の変化を見出した。また、新規に構築したライブラリーより選抜した低分子ヒドロゲル化剤を用い、未変性タンパク質の電気泳動法の開発にも取り組んだ。その結果、酸性タンパク質の電気泳動法の開発に成功し、主に等電点に依存したタンパク質の分離に成功した。さらに、電気泳動後の超分子ゲルからのタンパク質試料の効率的な回収方法の開発を行い、遠心分離という単純な実験操作により効率的にタンパク質試料が回収できることを明らかとした。低分子化合物の自己集合により形成する超分子ヒドロゲルの生命科学領域における新規材料としての有用性の評価を目的とする。これまでの低分子ヒドロゲル化剤ライブラリーの増強を目的に、主にウレイド基を有する15種類の新規誘導体の合成を達成し、そのうち5個の化合物にゲル化能があることを明らかとした。誘導体の中から、pHに応答しゲル-ゾル相転移する低分子ヒドロゲル化剤が見出された。この超分子ヒドロゲルの動的粘弾性を測定したところ、その貯蔵弾性率は約4 kPaと既存の超分子ヒドロゲルの中では、比較的高い値を示した。また、pH以外にも、種々の金属カチオンによっても超分子ヒドロゲルの形成を誘導できることが明らかとなった。超分子ヒドロゲルの応用研究として、1超分子ヒドロゲルを用いた電気泳動法の開発、2超分子ヒドロゲルを用いた細胞貯蔵法の開発、3超分子ヒドロゲルによる薬剤輸送システムの開発、の三つを計画している。超分子ヒドロゲルを用いた電気泳動法の開発については、前年度に引き続き検討を行い、酸性タンパク質の超分子ヒドロゲルによる電気泳動の後に、電気泳動されたタンパク質が活性を保持していることを明らかにした。超分子ヒドロゲルを用いた細胞貯蔵法の開発については、現在のライブラリーの中から最良と思われる超分子ヒドロゲルを用い、細胞培養を検討した。その結果、低分子ヒドロゲル化剤と細胞の吸着が問題点として明らかとなったため、より適した低分子ヒドロゲル化剤を開発する必要性が示された。これまでの超分子ヒドロゲルライブラリーの構築により得られた知見に基づき、効率的な純水のゲル化を実現する化合物を分子設計した。有機合成の手法により、分子設計した両親媒性トリスウレア化合物の合成を達成した。期待した通り、最小ゲル化濃度1.5 mMで超分子ヒドロゲルの形成が確認された。前年度に引き続き、超分子ヒドロゲルを支持体とした、未変性タンパク質の電気泳動について検討を行った。電気泳動後の超分子ヒドロゲルよりタンパク質試料を効率的に回収する方法を検討し、凍結した超分子ヒドロゲルに純水を加え遠心分離するという、極めて簡便な手法により50%以上のタンパク質を回収できることを明らかにした。さらに、回収したタンパク質が未変性な構造を保持していることを、タンパク質の活性評価により確認した。また、電気泳動に用いる緩衝液のpHを制御することにより、これまでの酸性未変性タンパク質に加え、塩基性未変性タンパク質の超分子ヒドロゲル電気泳動も実現した。種々のタンパク質の分離を検討した結果より、超分子ヒドロゲル電気泳動における分離様式の解析を行った。その結果、両親媒性トリスウレアより形成する超分子ヒドロゲルを支持体としたとき、未変性タンパク質試料は、その等電点に強く依存した分離様式であることが明らかとなった。カルボキシル基を導入した両親媒性トリスウレアの自己集合により形成する超分子ヒドロゲルを用い、物質の吸着及び放出の制御を検討した。陽イオン性の色素分子は、超分子ヒドロゲルに効率的に吸着された。

続いてこのゲルを塩基性水溶液に浸すと、超分子ヒドロゲルの崩壊を伴いながら吸着した色素分子を放出することを明らかとした。26年度が最終年度であるため、記入しない。超分子化学26年度が最終年度であるため、記入しない。低分子ヒドロゲル化剤の候補となる化合物ライブラリーの構築に成功した。22種類の誘導体合成を達成し、それらのゲル化能を評価し、8個の化合物においてゲル化能を有することを明らかとした。また超分子ヒドロゲルの応用研究として、未変性タンパク質電気泳動法の開発に成功した。これまでの研究により37種類の低分子ヒドロゲル化剤候補分子の合成を達成し、そのうち15の分子において超分子ゲルの形成を確認することが出来ている。超分子ヒドロゲルの応用研究として、超分子ヒドロゲルを用いた電気泳動法の開発は、現状において十分な知見を得るに至った。超分子ヒドロゲルを用いた細胞貯蔵法の検討では、現存する低分子ヒドロゲル化剤を用いた際の問題点が明確となった。これまでの低分子ヒドロゲル化剤ライブラリーの更なる充実を図り、高機能な超分子ヒドロゲルの開発を実現する。また、応用研究では、タンパク質電気泳動法の詳細な研究の実施に加え、細胞貯蔵やDDSといった用途開拓を実施する。低分子ヒドロゲル化剤ライブラリーの更なる充実を図り、目的に応じた低分子ヒドロゲル化剤の開発を可能にし得る構造的と性質に関する知見の蓄積に努める。超分子ヒドロゲルを用いた応用研究において本年度は、DDSへの応用を意識した、超分子ヒドロゲルを用いた分子の吸着と放出を中心に検討してゆく。平成25年度に購入した紫外可視吸光光度計が、日本分光のキャンペーンのため予定額よりも低い金額にて購入することが出来たため。これまでの超分子ゲルに関する検討から、ゲルの形成時における分子間相互作用を評価してゆく必要性が生じている。そこで、平成26年度に赤外分光光度計を導入し、これまで開発した超分子ヒドロゲルの分子間相互作用を評価する。
東京裁判の国際関係

アメリカ、イギリス、ニュージーランド等の一次資料を調査収集し、東京裁判の起訴状の作成過程(従来ほとんど不明であった)における関係諸政府間の政治力学を分析した。その結果、第一に、起訴状は、関係諸政府の対日処罰政策が交錯した帰結点であったことが解明された。すなわち、合衆国検察陣が「共同謀議」なる英米法特有の犯罪概念を戦前期日本の対外政策に適用し、日本が「共同謀議」によって侵略戦争を行ったという論理を確立していき、イギリスほかの英連邦諸国はむしろ日本の残虐行為の処罰に主たる関心を払ったうえで政策決定に重要な役割を果たし、さらに他の非英米法系諸国は英米法系諸国への対抗心から自国の利益を起訴状に組み込んでいった。こうした各国の利害対立を経て、起訴状は、多くの訴因と異例かつ複雑な構成を有することとなったのである。第二に、東京裁判に内在する二つの側面(「文明の裁き」と「勝者の裁き」)の論理を明らかにしたうえ、その二側面が「安全保障」という根底的目的によって止揚されると立論した。すなわち、裁判の推進者たちは、侵略戦争を犯罪とする「平和に対する罪」に事後法の疑いを抱きつつも、社会防衛という公共性の見地から日本の指導者を処罰することで「規範」(=侵略戦争の犯罪化)の拘束力を高めることを裁判の公的意義とした(「文明の裁き」の論理)。しかし彼らは同時に、戦争責任を日本側に一方的に帰する公式解釈を確定し、日本人に自らの戦争の犯罪性を認識させることで、日本を戦勝国と協調しうる国家に改造するとの「権力」政治的な目的も担っていた(「勝者の裁き」の論理)。そして、これら二側面は、合衆国の安全保障政策--裁判を戦争の罪悪のシンボルとして操作することで日本の無力化を実現するもの--であったことによって止揚されるわけである。
微小管構築に必須な進化上保存された新規経路の空間・時間的制御機構

細胞骨格微小管は、径25nmの中空ポリマーからなる繊維状構造を形成し、発生過程、細胞分裂過程で種々の形態をとることによって、染色体分配・細胞極性・細胞運動などに重要な機能をもつ。細胞周期M期中期では双極性紡錘体形態(スピンドル)を取り、プラス端が染色体上の動原体(キネトコア)、マイナス端が中心体(セントロソーム、酵母ではスピンドル極体、SPB)と結合する。M期後期への移行に伴い、キネトコア微小管が脱重合し、染色分体を二つの娘細胞に分配する。近年の分子生物学の進展により、微小管プラス端における制御機構に関する研究は大きく進展したが、マイナス端制御-とりわけ中心体・SPBへの安定な係留機構に関する分子レベルの理解は乏しかった。申請者は、分裂酵母、ヒト、ゼブラフィッシュを材料に、これまでスピンドル微小管マイナス端の中心体・SPBへの係留機構を追求してきた。本基盤研究(A)では、微小管マイナス端動態制御の分子メカニズムの解析を通して、双極性微小管形成新規経路の同定とその生物学的意義の解明を研究目的とした。平成30年度は、分裂酵母を用いて次の3つプログラムについて研究を遂行し、それぞれ成果を上げることができた。(1) 5型キネシンCut7の温度感受性変異体の網羅的な分離とサプレッサー遺伝子の解析。微小管安定化因子に変異が起きるとcut7温度感受性が抑圧されることを見出した。(2)6型キネシンKlp9の生物物理学解析とその細胞周期M期における役割解析。Klp9がプラス端方向性のモーター活性をもち、M期終期における微小管伸長を促進することを示した。(3)ヒトと分裂酵母14型キネシンの機能互換性。ヒト14型キネシンHSETを分裂酵母で発現させたところ、分裂酵母14型キネシン欠損を相補できることが判明した。(1)5型キネシンCut7の温度感受性変異体の網羅的な分離とサプレッサー遺伝子の解析。cut7温度感受性株cut7-22を36°Cで培養し、高温下条件でコロニー形成できる復帰株を計25株、分離した。遺伝解析の結果、それらのサプレッサー変異は、3株が遺伝子内変異で22株が遺伝子外変異であった。次に、既知のサプレッサー株(pkl1, msd1, wdr8)と掛け合わせたところ、14株(それぞれ7株、2株、5株)がこれらの座位であった。残り8株の新規サプレッサー遺伝子を同定するため、次世代シーケンサーで全ゲノム配列を読み、変異遺伝子の検討を行った。その結果、3株は、チューブリン遺伝子(atb2, nda3)、微小管結合タンパク質(mal3)変異であった。すなわち、本研究からCut7は双極性微小管を形成させる際に、微小管重合、伸長を負に制御する機能があるという新知見を得ることができた。Klp9のM期における役割は不明であった。今回、全反射照明蛍光顕微鏡を用いて、Klp9タンパク質の物理化学的性質を精査した。その結果、Klp9は微小管上をプラス端方向に移動するモーター活性をもつことが明らかになった。また遺伝学的、細胞生物学的解析から、Klp9はCut7と協調して、M期終期(anaphase B)におけるスピンドル伸長に必須機能を有することがわかった。ヒト14型キネシンHSETの細胞内機能は不明な点が多い。今回(i)HSETが分裂酵母内でマイナス端方向性モーターとして機能し、(ii)分裂酵母14型キネシン欠損(pkl1,klp2破壊株)を相補し、(iii)過剰発現させると、中心体(SPB)不分離を惹起して細胞を致死にいたしめることが明らかになった。(1)5型キネシンCut7の温度感受性変異サプレッサー遺伝子の包括的解析。最近の次世代シーケンス解析から、現在cut7温度感受性変異サプレッサーとして、さらに4つの新規遺伝子が同定された。興味深いことにそのうち二つは、RNA結合領域(RRM)を有する進化上保存されたタンパク質をコードしていた。そこで来年度はこれらRNA結合タンパク質の微小管構築への関与について、解析を行う。特に、(i)RRMがCut7機能の抑制に必要か、(ii)細胞内局在の決定、(iii)ターゲットRNA分子の同定、の3点について実験を進める計画である。(2)Cut7がスピンドル微小管安定性を制御する機作の解明cut7変異体におけるスピンドル微小管の輝度を定量したところ、興味深いことに、顕著な上昇が観察された。さらにcut7変異体が微小管脱重合薬剤に対して耐性となることも分かった。すなわち、Cut7にはスピンドル微小管を不安定化させる機能が示唆された。そこで微小管不安定性がどのレベルで誘起されているのか?:最初の重合反応かあるいは重合後の伸長過程なのかをまず実験的に検証する。もし重合過程であるなら-チューブリン複合体とCut7の相互作用について調べる。もし伸長過程であるなら、他の微小管結合タンパク質とCut7の関連について精査する。(3)酵母-ヒト間のキネシン分子の機能保存検証。前年度ヒト14型キネシンHSETが分裂酵母内で機能できることを示した。

来年度は、ヒト5型および6型キネシン(Eg5/KIF11およびMKLP1, MKLP2)を分裂酵母内で発現させて、機能互換性の検証を行う。もし互換可能であれば、5型、6型、14型キネシンを人型のものに置き換えたhumanised分裂酵母の作成が可能となる。分裂酵母を用いてヒトキネシン阻害剤、その制御機構の解析が可能となることが期待される。細胞骨格微小管は、染色体分配・細胞極性・細胞運動などに重要な機能を持つ。これまで行われてきた多岐にわたる研究により、多様な微小管制御機構が明らかにされてきた。しかしながら、重合核である中心体に微小管を係留(アンカー)する分子機構の知見は皆無であった。申請者は先に分裂酵母を用いて、アンカー因子(Msd1-Wdr8-Pkl1複合体)を世界で初めて同定した。本基盤研究(A)では、平成28年度中に計画した3つのプログラムについて鋭意研究を遂行し、次に示した成果を上げることができた。1)14型キネシンPkl1の生化学的解析:分裂酵母14型キネシンPkl1、および微小管アンカー因子Msd1タンパク質を大腸菌で発現させ、それぞれ単一標本として精製することに成功した。現在Pkl1のATP依存的モーター活性、およびMsd1がPkl1に及ぼす影響について、全反射照明蛍光(TIRF)顕微鏡を用いて生化学的・生物物理学的に解析している。2) MWPと相互作用する新規タンパク質の検索:14型キネシンPkl1と拮抗的に機能する5型キネシンcut7温度感受性変異株を抑圧するサプレッサー変異体を多数(>50株)分離した。現在そのサプレッサー遺伝子を同定するため、次世代シークエンシングによって全ゲノム配列を決定中である。mwp変異体がcut7温度感受性株をサプレスすることから、これらサプレッサー遺伝子はMWPタンパク質と相互作用する、あるいは新規のアンカー因子をコードしていると期待される。3)Msd1、Wdr8に含まれる構造ドメインの機能解析:msd1,wdr8遺伝子にランダムに変異を導入することによって、この二つのタンパク質における機能必須領域の同定を図っている。すでにMsd1のコイルドコイル配列とWdr8のWD40繰り返し領域が必須機能を持つことが明らかになった。研究実績で前述した各プログラムについて、現在の進捗状況を具体的に記す。1)生化学的解析:分裂酵母14型キネシンPkl1はN末端のテイル領域(N)、中央のヒンジ部(M) C末端の微小管結合モーター領域(C)からなる。GFPが結合した大腸菌発現ヴェクターに全領域(N+M+C)、N+M,M+Cの3つの領域をコードするDNA断片をつなぎ、BL21株を用いてタンパク質発現を試みた。全領域N+M+Cが、過度のタンパク質分解のためその精製に工夫が必要であったが、インキュベーション時間・IPTG濃度・バッファー条件をそれぞれ検討することによって、最終的にN+M+C、N+M,M+Cの3つのタンパク質の単品精製に成功した。次のステップは全反射照明蛍光(TIRF)顕微鏡を用いたPkl1タンパク質のATP依存的モーター活性測定と微小管上でのその方向性決定である。