hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
自然免疫ストレスセンサーＮＬＲＰの新機能とその分子機構解明

自然免疫系のストレスセンサー分子であるNLRP3は多様な細胞ストレスに応じて誘導される炎症性サイトカイン分泌に中心的な役割を担っている。本研究ではNLRP3が非感染性ストレスを感知したヒトマクロファージ細胞株の炎症誘導過程においてTNF-α, IL-1βのmRNA発現誘導に寄与している事を明らかにした。更にこのNLRP3による各種遺伝子発現誘導能が、がん細胞においてはがんの悪性化を促す各種遺伝子の発現誘導にも関与している可能性を見いだした。これらの結果より、自然免疫ストレスセンサーNLRP3の遺伝子発現誘導能は多様な組織において様々な未知の役割を担っていることが示唆された。申請者らはこれまでにNLRP3が細胞ストレスを感知したヒトマクロファージ細胞株の炎症誘導過程においてNF-κBの活性化を誘導し、TNF-α, IL-1βの発現誘導に寄与している事を明らかにしている。本研究の主眼点は免疫系細胞のみならず非免疫系細胞でも発現しているNLRP3が各種遺伝子発現誘導に寄与していることを明らかにする事にある。これまでにがん細胞で発現しているNLRP3が、がん細胞の恒常的なIL-1β遺伝子発現に関与していることを、各種がん細胞株のNLRP3ノックダウン細胞を樹立し、IL-1βmRNAの発現レベルを解析することで明らかにした。本年度はNLRP3が他のサイトカイン、ケモカイン、増殖因子、マトリックスメタロプロテアーゼ等の産生にも寄与する可能性について検証し、NLRP3ノックダウンが、HT1080が産生するTGF-β、bーFGF、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP-2, MMP-9, MT1-MMP)の発現も減少させることを見いだした。MMP-2前駆体の活性型への変換も抑制されていた。MT1-MMP発現低下は大腸がん細胞株(WiDr)のNLRP3ノックダウン細胞でも確認された。TGF-β、b-FGFもIL-1β同様、がんの悪性化と密接に関わる因子であり、MMP-2, MMP-9, MT1-MMPは、がんの浸潤および転移において主要な役割を担っている細胞外マトリックス分解酵素である。これらの結果より、NLRP3が、がん細胞においても各種遺伝子の発現誘導に寄与していることが明らかとなり、NLRP3が各種因子の発現制御を介してがんの悪性化にも重要な役割を担っていることが示唆された。本研の主眼点はNLRP3によるNF-κB活性化に着目してきた申請者のこれまでの研究成果を展開し、病原体感染を伴わない各種炎症誘導過程においてNLRP3がNF-κBの活性化、各種遺伝子発現を誘導していることを証明することにある。昨年度までにNLRP3が非感染性ストレスを感知したヒトマクロファージ細胞株の炎症誘導過程においてNF-κBの活性化を誘導し、TNF-α, IL-1βの発現誘導に寄与している事を明らかにした。更に、このNLRP3による各種遺伝子発現誘導能が非免疫系細胞であるがん細胞の恒常的なIL-1β遺伝子発現に関与していること、NLRP3ノックダウンが、繊維肉腫細胞株HT1080のTGF-β、bーFGF、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP-2, MMP-9,MT1-MMP)発現を減少させることを見いだした。本年度はGEO (Gen Expression Omnibus)検索によりグリオーマにおいてNLRP3 mRNAが高発現していることを見いだし、NLRP3ノックダウンによりグリオーマ細胞株U87MGのTGF-β, MT1-MMPの発現が低下すること、MT1-MMPによるMMP2切断活性が減弱すること、in vitroアッセイにおける浸潤能が低下することなどを見いだした。IL-1β、TGF-β、b-FGFはがんの悪性化と密接に関わる因子である。MMP-2, MMP-9, MT1-MMPは、がんの浸潤および転移において主要な役割を担っている細胞外マトリックス分解酵素である。これらの結果より、NLRP3による各種遺伝子発現誘導が、がんの悪性化過程にも重要な役割を担っていることが示唆された。NLRP3-NF-κB活性化経路が細胞ストレスに起因する炎症誘導においてもIL-1β前駆体産生・蓄積に寄与しうるか調べるため、NLRP3ノックダウンTHP-1細胞の尿酸結晶およびアルミニウムアジュバント刺激に伴うIL-1β前駆体産生・蓄積をコントロールTHP1細胞と比較した。

siRNAによる一過性のノックダウンならびにshRNAによるstableノックダウン細胞いずれにおいてもNLRP3ノックダウン細胞株ではIL-1β前駆体産生・蓄積が減弱していた。これらから、病原体感染を伴わない炎症誘導においてもNLRP3がNF-κB活性化を誘導している事が示された。非免疫系組織でも発現しているNLRP3がNF-κBの活性化誘導に寄与しているか調べるため、NLRP3, IL-1βを恒常的に発現しているがん細胞株にsiRNAを導入してNLRP3発現をノックダウンし、IL-1β前駆体産生・蓄積をmRNAレベル(RT-PCR,定量PCR法)で調べた。種々のがん細胞株(HT1080, MKN45, SH10-TC, HT29, SW948, WiDr)でNLRP3ノックダウンによりIL-1βmRNA発現が減弱していた。また興味深い事にHT1080細胞が恒常的に産生しているIL-6もNLRP3ノックダウンによりmRNA発現、培養上清中への分泌が減弱していた。これらから、がん細胞においてもNLRP3がNF-κBの活性化を誘導し、がん細胞のIL-1β前駆体産生・蓄積さらには他のサイトカイン産生にも寄与していることが示された。以上の結果から、NLRP3-NF-κB活性化経路が免疫系組織のみならず、がん細胞等の非免疫組織においても非感染性細胞ストレスに伴う炎症誘導過程に重要な役割を担っている事が示唆された。本年度は、がん細胞が発現する各種因子の発現にもNLRP3が寄与していることを明らかに出来た。並行してNLRP3からNF-κB活性化に至る分子機構を解明することを目標に、Mammalian Two-Hybridシステムを応用した独自の結合スクリーニングシステムを構築し、NLRP3(及びそのアダプター分子ASC)と結合する因子をcDNAライブラリからスクリーニングすることも試みている。本年度はスクリーニングシステムを構築し、システムの有効性を確認(コントロール実験で薬剤耐性獲得クローンが出現する)した。本年度は様々な炎症誘導過程におけるNLRP3-NF-κB活性化経路の寄与を示す事を目標にしていた。そのために掲げた項目のうち、病原体感染を伴わない細胞ストレスに起因する炎症誘導系での検証並びにがん細胞におけるNF-κB活性化への寄与についておおむね目的を達成した。1、in vivo、in vitro浸潤・転移モデルでNLRP3ノックダウンがん細胞のがん特性を解析する。3、ヒトがん症例サンプルを解析し、NLRP3の発現レベルを調べる。ことにより、NLRP3による各種因子の発現制御が、がんの悪性化にも重要な役割を担っていることを明らかにすることを目指す。NLRP3を発現しているがん細胞のIL-6、ケモカイン、細胞外マトリックスメタロプロテアーゼ等の産生にもNLRP3-NF-κB活性化経路が寄与している可能性を検証する。NLRP3遺伝子の変異とリンクされているヒトの遺伝性炎症疾患においてもIL-1β前駆体産生・蓄積にNLRP3-NF-κB経路が寄与している事を示す。NLRP
脳機能を生み出すゲノム情報発現の統合的理解を探る

ショウジョウバエの嗅覚記憶はキノコ体と呼ばれる神経節で形成される。キノコ体形成に機能するWntシグナルおよび機能未知遺伝子の作用機序を解析した。さらに匂い記憶の半自動学習装置を作製し、効率の良い学習プロトコールを開発した。ショウジョウバエの視神経は視覚中枢のラミナ神経節およびメダラ神経節に投射する。ラミナ神経の分化は視神経の投射により供給されるヘッジホッグにより誘導される。シナプス前神経がシナプス後神経の発生を制御している。さらに5種のラミナ神経が、将来シナプスを形成することになる1セットの視神経軸索を包むように、ラミナカラムと呼ばれる構造を作る。この時、免疫グロプリンス-パ-ファミリーに属する分子がラミナ神経前駆細胞に発現誘導され、それの変異ではラミナカラムが形成されないことを見いだした。またこのファミリーに属する異なる分子が視神経軸索にも発現していることを見出し、その変異でも同様な表現型が観察されることからぐファミリー間での相互作用が想定される。メダラ神経は視覚葉の表面に存在する神経表皮に由来する。最内側に位置する神経表皮細胞がProneural遺伝子を発現し、その細胞は直ぐに神経芽細胞となる。これを時系列で追ってみると、最内側から始まるProneural遺伝子の発現は1細胞ずつ外側へ向がって神経表皮細胞列を上っていく。それは神経芽細胞を形成する波が規則正しく一方向に動いていく波のようあり、proneural waveと名付けた。さらにJAK/STAT信号系がproneural waveの進行を負に制御していることを見出した。本年度はPrdneural waveの分子実体がEGFシグナルであることを明らかにした。すなわちEGFシグナルが活性化されるとproneural遺伝子が活性化され、神経芽細胞に分化する。同時にRhomboid(不活性型Spitzリガンドを活性型する因子)が発現し、Spitzを活性型に変える。それにより次の神経表皮細胞が活性型Spitzを受け取り、proneural waveが進行していく。中枢の神経芽細胞が規則正しく形成されるメカニズムを明らかにした。
震災復興における地域コミュニティの回復力形成に関する社会学的研究

当該年度は、最終年度の総まとめに向けた知見と議論の蓄積、ならびに成果の公開(研究例会の主宰)に力を入れた。具体的には、環境社会学会の震災・原発事故問題特別委員会委員長として、2018年12月(「災害に向き合う環境社会学の研究・実践とは:『東日本大震災と環境社会学研究』から考える」)ならびに2019年2月(「原発災害後の地域社会と自治体:8年目からの生活再建に向けて」)の2回にわたって、学会研究例会を主宰した。この学会研究例会では、研究代表者をはじめとした学会委員会メンバーが研究報告を行うのに対して、討論者やコメンテーターを設定して応答を展開した後、フロアーも交えて総合討論をおこなう手順をとった。一般市民の参加も可能な公開型のミニ・シンポジウムの形式をとることで、2回の研究例会では、申請者が司会やファシリテーターの役割を担い行った質疑応答や議論に研究者だけではなく、一般市民や震災地域復興にかかわる関係者も参加し、有意義な機会の場となった。この研究例会の実施内容とそこでの議論については、学会のニューズレターで研究代表者が報告するとともに、2019年内に刊行予定の学会誌「環境社会学研究」に特集論文ならびに寄稿論文として、計5本が掲載予定である。また、全国の市町村職員ら約50人の研修「市町村アカデミー」において本研究課題テーマの講演・レクチャーを行い、震災復興に向けての当事者性と実践の重要性を強調した。このような個人の研究課題の成果発信にとどまらず、より領域横断的かつ重層的な社会的発信へとつなげていくことが本研究課題の特徴・強みでもあり、波及効果であると認識している。このように、当該年度は、2019年度内に研究成果の総まとめをするための準備・肉付けの位置づけに当たる研究実績の蓄積に専念した。研究課題の進行状況は順調だったが、研究代表者の体調不良により、研究成果の取りまとめを当該年度中に完了することが難しくなった。本研究課題の集大成を図るため、2019年度への期間延長を申請し、受理されたものである。本研究課題は当初、当該年度が最終年度にあたる位置づけだった。具体的には、本研究計画は北上町の二地区の被災経験を基にした復興モデルの構築に向けて、集団高台移転事業と生業復興を軸として、その中核部分を形成するものと位置づけているため、より一層の社会的発信(研究成果の公表)を目指していた。これを変更して、当該年度は、最終年度の総まとめに向けた知見と議論の蓄積、ならびに成果の公開(研究例会の主宰)に力を入れた。変更後の本研究課題のプロセスはおおむね順調である。本研究課題は、研究/実践ともに総まとめの段階にある。震災復興活動自体は、5年、10年、と続いていくことが見込まれるが、本研究はそのプロセス研究をより長期的な視野で行うべく、地元役場(北上総合支所)や復興活動にかかわるボランティアらとの協働で「当事者性と反響しあう復興史」を作成していくことを計画している。また、本研究課題のテーマに基づいて、研究代表者が主宰するかたちで、2019年内に刊行予定の学会誌「環境社会学研究」には特集論文ならびに寄稿論文として、計5本が掲載予定である。現場に向けた発信、さらに学術的発信を総合させた成果の「社会的発信」を目指し、研究/実践の一定の集大成としたい。平成27年度は当該地域社会(宮城県石巻市北上町)の動態を把握すべく、継続的な現地調査を実施し、とりわけ集団高台移転事業により集団移転が順次実行されていく地域(集落)に対して重点的なヒアリングを行った。その際には、地域社会の再編や創出のプロセスを注視し、そのための活動やワークショップの開催を並行しておこなった【住まいの再生】。申請者はとくに農業の生業復興にかんする地元農家や農業法人に対するヒアリングを重ね、当該地域において津波被害からの「農地復旧」は順調に進みながらも、農地の耕作と維持管理を担う人材・後継者の不足が深刻で「農業復興」がままならないという実態を明らかにした【暮らしの再生】。また集団高台移転事業が難航している地域(集落)では、地域課題の抽出とその実態の把握のためのヒアリング調査を行い、9月には地域住民約20人に対する集中ヒアリングを展開した。とくに時間が経過するとともに集団高台移転への参加を見送ったり、地域を離れたりする地域住民が増えてきていることに注意を払い、その動向について綿密なヒアリングを行った。こうした視点は、限られた地域からの「転出」動向だけに目を向けるのではなく、広範囲(石巻市・仙台市・宮城県ひいては東北地方)に及ぶ人びとの「地域移動」と新しい土地での定着プロセスまで視野に入れていこうとする分析視角に基づいている【地域社会の再編】。こうした知見を、平成27年度の研究成果として、平成28年2月に編著書『震災と地域再生ー石巻市北上町に生きる人びと』というかたちで上梓したが、同書は研究者の論考部分に加えて、これまでのヒアリングの蓄積から生まれた地域住民の「聞き書き」部分が多く含まれているのが大きな特徴となっている。平成27年度は当該地域社会の動態を把握するべく、集団高台移転事業や生業復興事業に関するヒアリング調査を一次調査の位置づけとしていたが、おおむね予定していた通りの質・量の調査を展開することができた。また、東日本大震災発生以降の調査・実践の軌跡を取りまとめるとともに、ヒアリング調査の知見を「聞き書き」というかたちで編著書籍として上梓することができた。

東日本大震災発生から5年という制度上の節目と、現地における居住や生活の実態間におけるズレや隙間の存在について指摘するとともに、その問題構造と、解消に向けての地元の実践活動がもつ可能性について一程度明らかにすることができたと考えている。東日本大震災から5年以上が経過し、調査対象地では集団高台移転事業が進行して、多くの集落では地域住民の新たな移転地での生活が始まった。しかしその一方で、規模が大きい新しい移転地ほど、工事の進捗ならびに移転状況が芳しくなく、いまだに仮設住宅で暮らす人々も少なくない。そこで平成28年度の本研究はとくに集団高台移転事業の移転前・移転中・移転後のそれぞれのプロセスについて、ヒアリングおよび参与観察調査を実施した。経過と進展状況を見極めながらヒアリング調査を重ねることで、これまで日本で実施されてきた集団移転事業(長崎県島原および新潟県中越)の事例から合意形成のノウハウ、移転後の地域社会の再編のあり方について参考にするとともに議論を深化させた。さらに地域社会の再編に向けては、これまでの申請者の地域調査の経験とデータを活かすかたちで地域とその生業(とくに漁業)に関する聞き書き集ならびに地域資源のブックレットの作成を進め、現在印刷発行中の状態にある。こういった取り組みと並行して共同研究者や地元役場、現地の復興応援隊と相談連携の上、ヒアリング調査を踏まえた集団移転事業と震災復興の進捗状況に関する社会ならびに生活意識調査についても共同研究者を中心にサーベイ調査を行った。また、平成27年度(2016年2月)に刊行した共編著書籍『震災と地域再生ー石巻市北上町に生きる人びと』に反響が大きく、2016年12月には環境社会学会例会にて同書が取り上げられ、「環境社会学は震災後の社会をいかに語りうるか」というテーマで書評セッションが関西学院大学大阪梅田キャンパスにて開催され、登壇者として同書の解題を行い、そのあとコメンテーター・フロアーとの議論を行った。このような社会(地元)還元につとめながら、平成29年度も引き続き調査研究の進展に努めたいと考える。とくに集団高台移転事業の移転前・移転中・移転後のそれぞれのプロセスについて詳細にするべく集中ヒアリング調査を数回行うとともに、そうしたローカルな事象が「震災後の社会」論とどのようなリンクにあるのか、予定通りの調査と考察を行うことができている。また地元の当事者との協力・協働の上で生活意識調査や聞き書き集の作成についてもおおむね予定通りに進めることができていることから、上記の進捗状況の評価としている。平成29年度は、震災復興の中長期的な展望と政策提言のための最終準備に取り掛かるとともに、調査研究から得られた知見や実践活動の経験を取りまとめ、書籍(『被災と避難の社会学』関礼子編,2018年3月刊行、東信堂)や論考(「東日本大震災と環境社会学研究」『環境社会学研究』23号:166-190、「書評リプライ『調査』と『実践』の対話から、環境社会学の災害研究に向けて:田中氏の書評に応えて」『環境社会学研究』23号:161-165)として公表し、社会的発信を行った。また、所属する環境社会学会において2017年6月より「震災・原発事故問題特別委員会」の委員長に選出され、2年間の任期で務めている。本研究の研究/実践面での成果が一程度認知されたものと受け止めている。2018年3月には、大阪府にて「原発被災と避難」をテーマとした書評セッション(ミニシンポジウム)を委員長として主宰した。
ハイポイド・ベベルギヤの性能予測と損傷予知に関する基礎的研究

本研究の結果により得られた成果は次の通りである。(1)ハイポイドギヤやベベルギヤの加工機の構造を解析して,工具の切刃が被加工物に対し相対的に描く軌跡面の求め方を明らかにし,カッター諸元と歯車加工機のセッティング条件が与えられたときに,歯車歯面を表す空間曲面が創成される状態を計算可能とした。(2)この様にしてコンピュータ内に数学的に創成される駆動歯車・被動歯車の歯面を表す空間曲面が接触し,弾性変形しながら運動を伝える状況を解析し,そのシミュレーションプログラムを構築した。(3)このシュミレーションの信頼性を確認するため,歯当りが歯筋方向に長いもの,短いもの,右上がりのもの,左上がりのものの4種類の代表的な歯面形状のハイポイドギヤを設計・製作し,負荷かみ合い試験を実施し,歯車の加工条件の関数である基本歯面形状および製作時の歯面形状誤差と歯当りパターンの形状との関係,およびそれらと角度伝達の変動状態の関係を検討した。検討の結果,開発したシミュレーションプログラムは,実際のハイポイドギヤの荷重伝達特性をよく再現するものであることが確認された。(4)ハイポイドギアの耐久試験において,駆動歯車歯元のクラック発生に伴い観測される振動のかみあい1次成分の変化を説明するため,クラック発生時の歯の剛性の低下を想定してシミュレーションを行い,観測された状態変化を検討した。その結果,歯車のかみ合いに起因する振動加速度のかみあい1次成分の変化を観察することにより,ハイポイドギアの歯の折損を早期発見し得る可能性が示さた。(5)この実験とシミュレーション結果との対比作業に於いて,シミュレーションプログラム内容の詳細な再検討を実施し,その信頼性を向上させた。これによりハイポイドギヤおよびベベルギヤの動力伝達状況のシミュレーション技術をほぼ確立する事が出来た。本研究は、幾何学的形状ならびに機構学的理論が複雑であるため、運転時の振動騒音問題を解決するのが極めて困難な状況にあり、また、これら歯車の強度的信頼性を検討する場合も、その根拠が不明の方法に経験をつけ加えて行われているハイポイドギヤおよびベベルギヤについて、その動力伝達状況のシミュレ-ション技術を確立し、設計・損傷予知の方法の基礎を作ることを目的とするものである。本年度の研究に於いては、(1)カッタ-諸元と歯車加工機における工具の運動条件が与えられたときに、歯車歯面を表す空間曲面が創成される状態と、駆動歯車・被動歯車の歯面を表す空間曲面が接触し弾性変性しながら運動を与える状況を解析し、そのシミュレ-ションプログラムを作成した。(2)歯当りが歯筋方向に長いもの、短いもの、右上がりのもの、左上がりのものとなる歯面形状を持つ4種類のハイポイドギヤを設計・製作し、負荷かみ合い試験を実施した。かみ合い試験装置は設備不可能であるため、それを所有している企業のものを使用した。この実験結果とシミュレ-ション結果を、歯当りパタ-ンの形状、角度伝達の変動状態、および、歯元応力の状態について比較した結果、開発したシミュレ-ションプログラムの妥当性がほぼ実証された。しかし、以下の2点の問題が明かとなった。(1)一枚の歯車においても、各歯の3次元的歯面形状にはかなりのばらつきがあり、どの歯のデ-タをもってその歯車の歯面形状の代表とするかが不明である。(2)極めて高精度の3次元測定機を用いて歯面形状を測定しているにもかかわらず、ある期間をおいて測定した歯面形状デ-タには無視できない差が存在する。形状が未知の粗い3次元の面形状の測定には、未だ若干の問題点が存在するようである。現在これらに対する対策を検討中である。

本研究は、幾何学的形状ならびに機構学的理論が複雑であるため、運転時の振動騒音問題を解決するのが極めて困難な状況にあり、また、強度的信頼性を検討する場合も、その根拠が不明の方法に経験をつけ加えて行われているハイポイドギヤおよびベベルギヤについて、その動力伝達状況のシミュレーション技術を確立して、低振動・低騒音化、軽量化、高信頼性化の設計を可能とし、また、ハイポイドギヤやベベルギヤに初期損傷が発生したときにおこる信号変化の状態を予測して重大損傷を予知する技術の基本を開発することを目的とするものである。本年度の研究に於いては、新たにハイポイドギヤ3セットを設計製作し、前年度に製作した歯車とともに負荷かみ合い耐久実験を実施した。その結果、運転時間の経過にともない、歯の損傷が発生・進行して行く間に、歯車に起因する振動は次第に増加して歯の折損にいたるものと、歯の折損直前に振動加速度が急激に減少するものとの、顕著な相異のある2つの場合の存在することが認められた。実験後の歯車の歯当たりと歯の破断面を観察した結果、おのおのの場合について若干の性質上の相異が認められた。そこで、最大の歯元応力の発生箇所から歯にクラックが入ることを想定し、その際、歯車振動状態がどのように変化するかをシミュレーションにより検討した。その結果、歯当たりとクラックの入り方の組み合わせによって、歯のかみ合いに起因する振動起振力の周波数構成にかなりの変化を生ずることが明かとなり、歯車損傷の初期発見技術を開発するための基礎が与えられた。また、この実験とシミュレーション結果との対比作業に於いて、シミュレーションプログラム内容の詳細な再検討を実施し、その信頼性を向上させた。これによりハイポイドギヤおよびベベルギヤの動力伝達状況のシミュレーション技術をほぼ確立する事が出来た。
溶血性レクチンＣＥＬーＩＩＩの膜孔形成糖鎖複合体構造解析

海産無脊椎動物グミ(C.echinata)由来溶血性レクチンCEL-IIIは,膜孔形成毒素(Pore-Forming Toxin: PFT)として機能する.CEL-IIIによる膜孔形成メカニズムの解明を目的として, CEL-III膜孔形成複合体のX線結晶構造解析を行った.膜孔形成複合体の結晶構造は2.9オングストロームの分解能で決定し,本構造解析によりCEL-III膜孔形成メカニズムの詳細を明らかにした.病原菌の多くはターゲットとする細胞膜に穴をあける。もしくは毒素を細胞内に送り込むための膜孔形成毒素(Pore-Forming Toxin:PFT)を有している。PFTによる膜孔形成メカニズムは病原菌の感染および毒性発現に決定的に重要であるが、未だ原子レベルでのメカニズムは明らかでない。本研究は、海産無脊椎動物グミ(C.echinata)由来PFTである溶血性レクチンCEL-IIIの膜孔形成複合体のX線結晶構造解析により,病原性および毒性発現に極めて重要なPFTの膜孔形成メカニズムを原子レベルで明らかにする事を目的とする。本年度は、昨年度に決定した「画鋲型」7量体膜孔形成型結晶構造の構造精密化を進め、最終的に分解能2.9オングストロームでの構造決定に成功した。得られた膜孔形成複合体中のプロトマー構造と、水溶性モノマー構造との比較により、膜孔形成に伴うドメイン3の移動およびαヘリックスからβシートへの大規模な2次構造変化を確認した。また、変異体解析からその重要性が示唆されているArg378の役割については、その膜孔形成複合体中の位置から、Arg378はpre-pore構造の形成に深く関わっている事が示唆された。これらの知見から、pre-pore中間体構造を経由する、CEL-IIIの膜孔形成メカニズムのモデルを提唱した。これらの解析の知見は論文にまとめ、J. Biol. Chem.誌に投稿しアクセプトされた。(Unno H, Goda S, and Hatakeyama T. J. Biol. Chem. 289(18), 12805-12812 (2014))海産無脊椎動物グミ(C.echinata)由来溶血性レクチンCEL-IIIは,膜孔形成毒素(Pore-Forming Toxin: PFT)として機能する.CEL-IIIによる膜孔形成メカニズムの解明を目的として, CEL-III膜孔形成複合体のX線結晶構造解析を行った.膜孔形成複合体の結晶構造は2.9オングストロームの分解能で決定し,本構造解析によりCEL-III膜孔形成メカニズムの詳細を明らかにした.病原菌の多くはターゲットとする細胞膜に穴をあける,もしくは毒素を細胞内に送り込むための膜孔形成毒素(Pore-Forming Toxin:PFT)を有している. PFTによる膜孔形成メカニズムは病原菌の感染および毒性発現に決定的に重要であるが,未だ原子レベルでのメカニズムは明らかでない.本研究は,海産無脊椎動物グミ(C.echinata)由来PFTである溶血性レクチンCEL-IIIの膜孔形成複合体のX線結晶構造解析により,病原性および毒性発現に極めて重要なPFTの膜孔形成メカニズムを原子レベルで明らかにする事を目的とする.本年度はその中でも特に膜孔形成複合体の結晶化条件の改良,重原子誘導体を用いた位相決定および複合体モデル構築を行い,非常に興味深いCEL-IIIの「画鋲型」7量体膜孔形成型結晶構造を決定する事に成功した.病原菌の多くはターゲットとする細胞膜に穴をあける,もしくは毒素を細胞内に送り込むための膜孔形成毒素(Pore-Forming Toxin:PFT)を有している. PFTによる膜孔形成メカニズムは病原菌の感染および毒性発現に決定的に重要であるが,未だ原子レベルでのメカニズムは明らかでない.本研究は,海産無脊椎動物グミ(C.echinata)由来PFTである溶血性レクチンCEL-IIIの膜孔形成複合体のX線結晶構造解析により,病原性および毒性発現に極めて重要なPFTの膜孔形成メカニズムを原子レベルで明らかにする事を目的とした.本年度は,昨年度に論文報告を行った膜孔形成複合体のX線結晶構造解析の成果から,更に詳細な構造変化メカニズムの解明を行うため,膜孔形成中間体形成変異体の作成,および高速AFMによる膜孔形成過程の観察を進めた.それにより中間体構造の存在を示す知見が得られ,それは今後のさらなる進展が強く期待できる成果であった.構造生物化学研究計画において、当年度はCEL-IIIの膜孔形成複合体構造の構造決定が目標であったが、その目標をクリアし、さらにモノマー構造との比較および変異体解析により膜孔形成メカニズムの解明を行った。得られた知見は論文としてまとめJBCに投稿し、アクセプトの返答を得た(J. Biol. Chem. in press)。これらの成果は、当初は来年度計画の内容であり、来年度計画の期待される成果をほぼ全て本年度でクリアしたと言える。本年度に得られた知見である、膜孔形成反応においてαヘリックスからβシートへの大規模な2次構造変化メカニズムについては、これまでに膜孔形成複合体の結晶構造解析からこれほど明確にそれを実証した例は無く、その点が雑誌のレビュアーおよび本研究の国内学会発表においても高く評価された。

CEL-IIIの膜孔形成複合体結晶構造の決定を目指し,特に当年度は結晶化条件の最適化および結晶生成の再現性向上を目標として設定し研究を進めた.各種条件検討の結果,その目的であった結晶化条件の最適化および結晶再現性の向上に成功し,最高分解能2.9オングストロームの結晶を得る事に加え,分解能3オングストローム台前半の結晶を再現性良く生成する結晶化条件を見出した.さらに,当初の計画以上の成果として,その結晶を用いて各種重原子誘導体結晶の作成,位相計算,位相改良,モデル構築および構造精密化を進め, CEL-IIIの膜孔形成複合体構造である「画鋲型」7量体構造を得る事に成功した.今年度明らかにした、CEL-IIIの膜孔形成メカニズムに関する知見は、水溶性モノマーの結晶構造および膜孔形成複合体の結晶構造から導かれたものである。その構造変化過程における中間体構造は、重要残基の変異体解析および結晶構造の特徴からある程度推測できたが、本研究成果において中間体構造自体は「推定」モデルの導出に留まっており、その中間体構造の構造解析を行う事で、膜孔形成メカニズムのより詳細な解明に繋がると考えている。中間体構造の構造解析の為には、安定した中間体構造を形成していると考えられる変異体を用いた、変異体の結晶構造解析、高速AFM観察による構造変化過程の直接観察、および計算機シミュレーション等の解析手法が有効であると考えている。そこで26年度はそれらの手法を用いた中間体構造解析に取り組み、CEL-IIIによる膜孔形成メカニズムのより詳細な解明を目指す。得られた膜孔形成7量体構造の精密化をさらに進め,その詳細な構造解析を行うとともに,初期の実験計画の1年前倒しを行い,当初26年度計画であったCEL-IIIオリゴマー-ラクトシルセラミド複合体結晶構造解析による膜孔形成複合体形成機構の解明を進める.また26年度計画として新たに,高速AFM観察によるCEL-IIIの膜孔形成形成メカニズムの解明を計画に加え,それらを総合する事でより詳細な膜孔形成メカニズム解明を行う.当初計画である試薬等の消耗品支出が、予定より少ない支出で目的の研究成果を得る事が出来た。また当該年度は、データの取りまとめ、データ解析、および論文執筆に多くの労力を費やする事となり、その分消耗品の使用額が抑えられる結果となった。次年度では当初計画からより発展させた計画とし、そのための来年度の必要費用として次年度に繰り越す計画とした。CEL-III膜孔形成中間体構造解析を進めるため、研究費は主にCEL-III変異体作成、タンパク質発現・精製・結晶化に関する機器、消耗品の購入に充てる。また、それと並行して高速AFM観察および計算機シミュレーションを行うために必要な消耗品および計算機等の購入に充てる。また、放射光施設への旅費、実験生物材料(グミ)入手に関連する費用、学会発表のための旅費としても使用する予定である。CEL-III膜孔形成複合体の構造解析,およびCEL-III -ラクトシルセラミド複合体結晶構造解析を進めるため,研究費は主にCEL-III精製およびタンパク質結晶化に関する機器,消耗品,および計算用ワークステーション(PC)の購入に充てる.また,放射光施設への旅費,実験生物材料(グミ)入手に関連する費用,学会発表のための旅費,および論文発表のための雑誌への投稿費用としても使用する予定である.
集積型ポルフィリン金属錯体の合成と機能発現

ポルフィリン分子は、ほとんど全ての金属と配位錯体を形成し、かつ拡張されたパイ電子系を有する誘起多座配位子である。従って、分子内HOHO-LUMOが小さく、機能性物質の構成成分として用いられる可能性を有す。このようなポルフィリンを共有結合で多数個連結させることによりより高い機能を発現させることが期待される。本年度はポルフィリン分子を21個連結させた新既分子の設計を行い、その合成法を確立した。合成は市販の試薬より18段階、全収率0.01%で行なった。多数個のポルフィリンを連結させることにより、この分子はこれまでにない強し吸光度を有することが明らかになった。
高地適応モデル動物としての高原ナキウサギの有用性に関する研究

海抜3,000メートル以上の高地に生息するナキウサギは高地適応モデル動物として唯一期待されている動物である。本調査研究は、中国青海省、チベット、ネパールヒマラヤ等に生息する各種ナキウサギの生態調査、捕獲調査、室内飼育繁殖ならびに各種生物学的特性を調査し、高地医学、環境生理学のモデル動物としての有用性と限界を検討し、国際的な高地適応モデルとし確立すると共に野生動物資源として保存することを目的とするものである。主たる調査国を中国とすることから、かねてより交流のある中国科学院上海実験動物中心と密接な連絡のもとに実施された。平成4年度については中国青海省に生息するクチグロナキウサギ(Ochotona curzoniae)を低地で飼育・繁殖する開発研究が、金〓蕾主任(上海実験動物中心)との研究交流において前年度から行われており、引き続き、この開発研究への専用飼料や治療薬の提供、施設の保全、技術指導等の支援が行われた。また、海抜5,000メートル以上に生息するナキウサギについてチベット高原に調査隊を派遣した。チベットは中国の自治区で政情も不安であることから、日本からの調査研究での立ち入りは難しいと予想された。金〓蕾主任の調整努力により可能となった。調査行程は、成都から飛行機でラサに入り、ラサから自動車で西ヘシガッツエ、シガ-ル、ロンブク、ザンム-と海抜5,000メートルの峠を縦走し、途中の生息地で捕獲調査を行い、ネパールへと抜けるものであった。チベット高原は砂と石の山々が連なり緑は少ない、狭い緑の平地も現地人は耕作地としていた。牧畜を主とする草原の青海省と比べ、ナキウサギに限らず野生動物も住み憎いものと推察された。シガ-ルの東の海抜4,000メートルの草原においてナキウサギを観察することができた。生息数は比較的多かった。巣穴口の首輪法(割り箸とタコ糸)によりナキウサギ5匹を捕獲することが出来た。体型からクチグロナキウサギと推察された。これら捕獲ナキウサギは、呼吸数、心電図等の生理的データを測定した。また、持ち帰った肝臓標本から上海飼育ナキウサギの死因と推察される真菌(Emmonsia sp.)が検出された。チベット高原南面のザンム-からカトマンズへの道は日差しも温かく、水と緑が多く人々の豊かさを感じた。平成5年度当初は、上海実験動物中心の鮑世民、張瑞忠により、ラサの北、海抜3,900メートルの羊八井と林周の草原でクチグロナキウサギ102匹を捕獲し78匹(♀39匹♂39匹)を上海実験動物中心に導入した。従来の経験をもとに飼育し約1カ月後、睾丸下降した♂に状態の良い♀を交配し繁殖を試みた。その後、死亡個体が続出し10月までに63匹死亡した。この原因は、寄生虫・細菌等の感染18匹、高温高湿33匹、その他12匹と予想された。死亡個体の解剖によって♀2匹の妊娠が確認された。そこで、本邦への速やかな野生ナキウサギの導入のため、ネパールヒマラヤに調査隊を派遣した。生息状況、捕獲持ち出しの可能性等を事前に確認したが、ヒマラヤの天候は不順で、生息地に到達することが出来なかった。しかし、現地の政府機関との打合せにより、公的な捕獲導入ルートを確保することができた。一方、中国の世界的な実験動物候補として小型ブタも知られている。ナキウサギに関する各地の調査において、これら小型ブタの情報を得た。そこで、上海松江県の微形香猪(広西州原産)を始めとして、貴州省貴陽の貴州香猪、雲南省西雙版納自治州の版納微形猪、雲南省昆明の微形猪を視察調査することができ、これらの小型ブタはモデル動物として期待されると思われた。高地に生息するナキウサギを高地適応モデル動物として確立するべく、中国各地に調査隊を派遣する共に現地研究機関との交流により室内飼育繁殖を行いモデル動物としての確立をはかった。中国での飼育繁殖は、捕獲、室内飼育の成功、交配行動の確認、妊娠の確認と当初順調に進歩したが、その後の進展が見られず。今回の試みでも高温高湿、寄生虫等の感染で多数死亡しており、繁殖の成功は、中国における各種技術基盤の涵養とそれらによる総合的な飼育管理システムの確立が必要であるように思えた。野生資源としてのナキウサギは年々減少していると予想される。モデル動物として確立するためには、本邦に野生動物を直接導入し我々の手により繁殖し開発する必要があると思われた。

平成4年度については中国青海省に生息するクチグロナキウサギ(Ochotona curzoniae)を低地で飼育・繁殖する開発研究が、金〓蕾主任(上海実験動物中心)との研究交流において前年度から行われており、引き続き、この開発研究への専用飼料や治療薬の提供、施設の保全、技術指導等の支援が行われた。また、海抜5,000メートル以上に生息するナキウサギについてチベット高原に調査隊を派遣した。チベットは中国の自治区で政情も不安であることから、日本からの調査研究での立ち入りは難しいと予想された。金〓蕾主任の調整努力により可能となった。調査行程は、成都から飛行機でラサに入り、ラサから自動車で西ヘシガッツエ、シガ-ル、ロンブク、ザンム-と海抜5,000メートルの峠を縦走し、途中の生息地で捕獲調査を行い、ネパールへと抜けるものであった。チベット高原は砂と石の山々が連なり緑は少ない、狭い緑の平地も現地人は耕作地としていた。牧畜を主とする草原の青海省と比べ、ナキウサギに限らず野生動物も住み憎いものと推察された。シガ-ルの東の海抜4,000メートルの草原においてナキウサギを観察することができた。生息数は比較的多かった。巣穴口の首輪法(割り箸とタコ糸)によりナキウサギ5匹を捕獲することが出来た。体型からクチグロナキウサギと推察された。これら捕獲ナキウサギは、呼吸数、心電図等の生理的データを測定した。また、持ち帰った肝臓標本から上海飼育ナキウサギの死因と推察される真菌(Emmonsia sp.)が検出された。チベット高原南面のザンム-からカトマンズへの道は日差しも温かく、水と緑が多く人々の豊かさを感じた。平成5年度当初は、上海実験動物中心の鮑世民、張瑞忠により、ラサの北、海抜3,900メートルの羊八井と林周の草原でクチグロナキウサギ102匹を捕獲し78匹(♀39匹♂39匹)を上海実験動物中心に導入した。従来の経験をもとに飼育し約1カ月後、睾丸下降した♂に状態の良い♀を交配し繁殖を試みた。その後、死亡個体が続出し10月までに63匹死亡した。この原因は、寄生虫・細菌等の感染18匹、高温高湿33匹、その他12匹と予想された。死亡個体の解剖によって♀2匹の妊娠が確認された。そこで、本邦への速やかな野生ナキウサギの導入のため、ネパールヒマラヤに調査隊を派遣した。生息状況、捕獲持ち出しの可能性等を事前に確認したが、ヒマラヤの天候は不順で、生息地に到達することが出来なかった。しかし、現地の政府機関との打合せにより、公的な捕獲導入ルートを確保することができた。一方、中国の世界的な実験動物候補として小型ブタも知られている。ナキウサギに関する各地の調査において、これら小型ブタの情報を得た。そこで、上海松江県の微形香猪(広西州原産)を始めとして、貴州省貴陽の貴州香猪、雲南省西雙版納自治州の版納微形猪、雲南省昆明の微形猪を視察調査することができ、これらの小型ブタはモデル動物として期待されると思われた。高地に生息するナキウサギを高地適応モデル動物として確立するべく、中国各地に調査隊を派遣する共に現地研究機関との交流により室内飼育繁殖を行いモデル動物としての確立をはかった。中国での飼育繁殖は、捕獲、室内飼育の成功、交配行動の確認、妊娠の確認と当初順調に進歩したが、その後の進展が見られず。今回の試みでも高温高湿、寄生虫等の感染で多数死亡しており、繁殖の成功は、中国における各種技術基盤の涵養とそれらによる総合的な飼育管理システムの確立が必要であるように思えた。野生資源としてのナキウサギは年々減少していると予想される。
ガンダーラ仏教彫刻における生天思想の造形－ディオニューソス神関連図像を中心に

申請者は、国内外の博物館、美術館を巡り、ギリシア・ローマ美術とガンダーラの仏教彫刻に見られるディオニューソス神と眷属の図像を中心に、可能な限り幅広く資料収集し、考察を行った。その結果、ギリシア・ローマ美術においては、多くのディオニューソス神と眷属の神話に関わる図像があるのに対して、ガンダーラの仏教彫刻においては、ディオニューソス神と眷属の飲酒饗宴図や交歓図が圧倒的に多いことが判明した。さらに、仏典の叙述から、ガンダーラの仏教彫刻に見られるディオニューソス神と眷属の図像が仏教の来世観である生天思想に関連していることを解明した。本研究の目的は、ギリシア・ローマ美術に見られる酒神として有名なディオニューソス神と眷属の図像と、ガンダーラ仏教彫刻に見られるディオニューソス神と眷属の図像を比較し、後者の図像が仏教の来世観(生天思想)を造形化したものであることを解明することである。ギリシア・ローマ美術に表現された、ディオニューソス神の神話に関連する図像のテーマは数多く存在する。特に多いのが、帝政ローマ時代の石棺やモザイクに表現されたディオニューソス神と眷属による飲酒饗宴や、歌舞奏楽に関連する図像である。それ故、はじめに、これらの諸図像を内容によって分類・整理し、ギリシア・ローマ美術作品に見られるディオニューソス神に関連する図像のテーマを明らかにする。この研究を行うために、2016年度は資料調査及び資料収集を行った。主に、ローマを中心に博物館や遺跡を訪れ、博物館に収蔵されているギリシアの陶器画や帝政ローマ期の石棺の中で、特に申請者の研究にとって重要な、ディオニューソス神と眷属に関わる図像を表現した作品の調査を行い、研究資料を充実させた。訪問した博物館は、ローマ国立博物館、バチカン博物館、カピトリーノ博物館、である。また、ローマ近郊ではヴェレートリの考古学博物館を訪れ、有名な石棺の写真の細部を撮影した。さらに、ローマのドイツ考古学研究所を訪れ、日本では手に入らない論文や著書の複写を行い、博物館にて撮影を行うことができなかった写真資料を収集し、補足を行うことができた。今回の調査では、特にディオニューソス神と眷属を表現した石棺の写真を多く撮影することができたので、今後の分析に生かすことができると考えられる。ローマの博物館を中心に調査を行うことができたことによって、本研究遂行に必要な、ディオニューソス神と眷属の図像資料を予想した以上に多く収集することができたため。特に、帝政ローマ時代の石棺美術、モザイクの美術の実見調査を来ない、写真資料を収集することができた。概ね研究計画通りに研究を遂行している。本研究の目的は、ギリシア・ローマ美術に見られる酒神ディオニューソス神と眷属の図像と、ガンダーラ仏教彫刻に見られるディオニューソス神と眷属の図像を比較し、後者の図像が仏教の来世観、特に生天思想の情景を造形化したものであることを解明することである。ギリシア・ローマ美術に表現されたディオニューソス神の神話に関連する図像のテーマは数多く存在するが、本年度は、昨年度訪れることができなかった欧州の博物館、美術館を訪れ、帝政ローマ期の石棺のみならず、ギリシアの陶器画に表現された陶磁器、壁画、工芸品に表現されたものについても実見調査を行った。当初の計画では、本年度はトルコを訪問する予定であったが、昨今の政治情勢を鑑みて、トルコにおける調査を断念し、ドイツのミュンヘンの彫刻館および古代美術博物館を訪問し、ディオニューソス神と眷属の図像を表現したギリシアの陶器画および帝政ローマ期の石棺、工芸品の写真撮影を行った。また、ミュンヘンでは、ミュンヘン五大陸博物館において、ガンダーラ仏教彫刻の実見調査および写真撮影を行った。同博物館のガンダーラ仏教彫刻については、日本では殆ど何が所蔵されているのかさえ知られていなかったが、この調査によって、同館の所蔵作品を確認することができた。さらに、ローマを中心に調査を行った。昨年度訪問したバチカン博物館を再び訪れ、さらに、ローマ近郊のTivoliにあるハドリアヌスの庭園、ローマ市内にある聖John・Paul教会を訪問し、ディオニューソス神と眷属の図像の写真撮影及び実見調査を行った。また、2016年7月に武庫川女子大学で開催された国際学会及び、2017年3月に早稲田大学で開催された早稲田美術史学会例会において、昨年度及び本年度の調査において収集した資料を活用し、研究発表を行った。今後は、トルコ国内を中心に調査を行う予定である。トルコで訪れる予定の博物館は、イスタンブール考古学博物館、イズミール考古学博物館、パムッカレの考古学博物館などである。これらの博物館において、ギリシアの陶器画、帝政ローマ時代の石棺、彫刻、モザイクなどを調査する。

また、アンターキア(ハタイ)の考古学博物館にはローマ帝政時代のモザイクが多く所蔵されているが、現在トルコにおいてはテロが頻発しているので、政治情勢を見極めて調査を行うか否か、調査地を変更するか否か決定したい。調査地を変更する場合、ギリシア、アテネを中心に調査を行うことを検討中である。今後、これまで収集した資料を利用して、学会発表を行い、論文を投稿するつもりである。28年度が最終年度であるため、記入しない。美術史28年度が最終年度であるため、記入しない。
二硫化炭素の脱離反応を利用した14族元素異常原子価化合物の合成と反応

炭素置換有機鉛二価化合物(プルンビレン)については、これまでの予備的研究から、立体保護基として非常にかさ高いアリール基を用いてジアリールプルンビレン1の合成に成功している。本年度はプルンビレンの反応性および構造に関する置換基の影響を調べるために、ジアリールプルンビレン1の単離とX線構造解析を行うとともに、炭素置換基と硫黄置換基を共に有するアリール(アリールチオ)プルンビレン2の合成および硫黄置換基のみを有するビス(アリールチオ)プルンビレンの合成を行った。合成には鉛一硫黄二重結合化合物プルンバンチオンにおけるAr基の転位反応という鉛の性質を活かした方法を用いた。2についてX線解析を行い炭素置換プルンビレンと比較したところ、鉛と置換基のなす結合角がより狭いV字型構造を有していることがわかった。またアルキルハライドや単体硫黄等の各種試剤による2の捕捉反応を検討したところ、炭素置換基の場合と異なり何れの場合にも付加体が得られなかったが、二硫化炭素との反応の場合には鉛一硫黄結合に二硫化炭素分子が挿入した後に不均化したと考えられる鉛(II)[ビス(アリールトリチオカーボナート)]3が生成した。この反応性の差異は置換基の電子的効果に因るものであり興味深い。得られた鉛錯体を加熱して二硫化炭素を脱離させることにより、硫黄置換プルンビレン4を合成出来た。硫黄置換プルンビレン4は^<207>Pb NMRにより炭素置換の場合と同様に単量体であることがわかった。また、生成した硫黄置換プルンビレン4に対して再び二硫化炭素を作用させることで鉛一硫黄結合に二硫化炭素二分子が挿入し、もとの鉛錯体3が再生した。すなわち二硫化炭素分子の挿入・脱離に伴い、二価鉛原子の配位状態を二配位から四配位へと熱によって可逆的に制御可能であるという興味ある結果が得られた。以上のように本研究は計画通り遂行することが出来た。
生物回転分子モーター構成素子の回転の可視化

本研究は細菌べん毛モーターの真の回転子を明らかにするために,モーター構成素子を1分子単位で蛍光標識することでモーター回転子の回転を可視化することを目指している.本年度の研究において,モーターを蛍光標識するための光活性型GFP融合タンパク質の発現系および検出系の最適化を行った.さらに平成19年度の研究において発見した,機能的なモーターにおける回転子構成タンパク質の交換現象についても研究を遂行した.この現象は当初の研究計画には含まれていない事項であるが,本申請課題研究にて発見された全く新しい事実であり,生体内における巨大分子複合体の構築および維持を理解する上で非常に重要な知見となり得る.そこで平成20年度の研究は,回転子構成タンパク質の交換反応についても研究を進めた.研究成果として以下が挙げられる.1.光活性型GFPの蛍光を発現および検出システムの最適化2.光褪色後蛍光回復(FRAP)による回転子構成タンパク質の交換反応の検出条件の確立3.回転子構成タンパク質の交換頻度の解析4.べん毛モーター構成因子のGFP融合タンパク質の拡散運動の解析システムの構築5. GFP融合タンバク質の細胞膜内における拡散運動の解析本研究は細菌べん毛モーターの真の回転子を明らかにするために,モーター構成素子を1分子単位で蛍光標識することでモーター回転子の回転を可視化することを目指している.本年度の研究において,モーターを蛍光標識するために回転子構成タンパク質FliGのGFP融合タンパク質を用いた.当初の研究計画において,構成素子1分子単位で蛍光標識する手法として,光るGFP融合タンパク質と光らないGFP融合タンパク質の共発現系を計画していたが,単一細胞における両GFP融合タンパク質の発現制御が困難であったため,光活性型GFPを用いた実験系に変更した.平成19年度の研究成果としては以下が挙げられる.1.光活性型GFPの蛍光を検出するための顕微鏡システムの導入2.回転子構成素子の光活性型GFP融合タンパク質発現系の構築3.FliG以外の回転子タンパク質のGFP融合タンパク質発現系の構築4.光褪色後蛍光回復(FRAP)による回転子構成タンパク質の交換の検出光活性型GFPは紫色光を照射した場合のみ蛍光を発するGFP変異体であり,紫色光の強度で蛍光標識の数を制御できる.また光活性型GFPを利用した光学系は,膜タンパク質の拡散など他の研究にも広く応用できる.また回転子タンパク質のGFP融合タンパク質のFRAP実験によって,構築完了後のモーターにおいて回転子のタンパク質が交換される可能性が示唆された.これは本研究で見つかった重要な知見である.本研究は細菌べん毛モーターの真の回転子を明らかにするために,モーター構成素子を1分子単位で蛍光標識することでモーター回転子の回転を可視化することを目指している.本年度の研究において,モーターを蛍光標識するための光活性型GFP融合タンパク質の発現系および検出系の最適化を行った.さらに平成19年度の研究において発見した,機能的なモーターにおける回転子構成タンパク質の交換現象についても研究を遂行した.この現象は当初の研究計画には含まれていない事項であるが,本申請課題研究にて発見された全く新しい事実であり,生体内における巨大分子複合体の構築および維持を理解する上で非常に重要な知見となり得る.そこで平成20年度の研究は,回転子構成タンパク質の交換反応についても研究を進めた.研究成果として以下が挙げられる.1.光活性型GFPの蛍光を発現および検出システムの最適化2.光褪色後蛍光回復(FRAP)による回転子構成タンパク質の交換反応の検出条件の確立3.回転子構成タンパク質の交換頻度の解析4.べん毛モーター構成因子のGFP融合タンパク質の拡散運動の解析システムの構築5. GFP融合タンバク質の細胞膜内における拡散運動の解析
TNRC6タンパク質の機能解析によるmicroRNAシステムの動作原理の解明

microRNA(以下miRNA)はmRNAに結合して翻訳抑制・mRNA分解・ポリA鎖短縮を引き起こす小型非コードRNAである。しかしmiRNAによる転写後抑制の分子メカニズムは未だ明らかになっていない。昨年度までの解析から1)miRNAによる転写後抑制はTNRC6Aタンパク質のPAM2モチーフとP-GLモチーフによって仲介されること、2)miRNAによるポリA鎖の短縮は翻訳抑制の必須ステップではないこと、3)miRNAによる抑制にPABPC1は必須ではないことが明らかとなっていた。本年度はこれらの結果をさらに詳細に解析し、以下の結果を得た。1)miRNAによるポリA鎖の短縮は翻訳抑制には本質的に必要ないが、mRNA分解には必須であることが明らかとなった。このことから、miRNAによる翻訳抑制とポリ(A)鎖短縮/mRNA分解は独立の機構によってもたらされていることがわかった。2)PAM2モチーフとP-GLモチーフの作用点を解析した結果、前者はPABPによる翻訳活性化を、後者はmRNAのキャップ構造とpoly(A)鎖に依存しない翻訳過程をそれぞれ阻害していることが強く示唆された。3)上記2点と一致して、TNRC6タンパク質はポリ(A)鎖短縮化酵素と相互作用するが、その相互作用と翻訳抑制効果には強い相関がないことが明らかとなった。これらの結果から、ゼブラフィッシュ発生過程におけるmiRNAによる転写後抑制には、PABPやポリ(A)鎖短縮に依存しない翻訳抑制機構が中心的な役割を果たしていることが明らかとなった。以上の結果は論文としてまとめ、Proceedings of National Academy of Sciences USAに投稿・受理された。本年度は、ゼブラフィッシュを用いてmiRNAよる抑制機構の中核因子TNRC6Aタンパク質の作用機序の解析を行い、以下の知見を得た。1)TNRC6Aの抑制活性を担うコアドメインを同定し、機能モチーフ解析を行なった。その結果、PABPC1と結合する既知のPAM2モチーフに加え、アミノ酸配列PPPGLを中心とする新規モチーフが翻訳抑制に貢献していることが明らかとなった。2)miRNA/TNRC6Aによる翻訳抑制へのポリA鎖短縮の貢献を明らかにするために、in vivoにおいて脱アデニル化されない安定化ポリA鎖を開発した。この技術を用いてTNRC6Aによる抑制機構を解析した結果、ポリA鎖の短縮は抑制の必須ステップではないことが明らかとなった。3)TNRC6Aに存在するPAM2モチーフとPABPC1との相互作用がin vivoにおいてmiRNAによる転写後抑制に必須かどうかを検証するため、ゼブラフィッシュ胚においてPABPC1の発現抑制実験を行った。その結果、miRNAによる抑制にPABPC1は必須ではないことが明らかとなった。以上の結果より、miRNA/TNRC6Aによる転写後抑制にはPABPC1に依存しない機構が働いていることが初めて示された。