hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
口腔癌幹細胞を標的とした分子標的治療法の開発

新規の分子標的薬の開発には目覚ましいものがある。しかし、口腔癌に対する分子標的治療は開発が遅れている。そこで、治療に抵抗して生残り、再発の原因となる癌幹細胞を治療対象とし、新たな分子標的をターゲットとした研究を進めて行くことが重要である。癌幹細胞マーカーとしてCD44陽性細胞を抽出し、sphere形成が出来ること確認した。Safingolによる細胞死は、抗酸化剤で抑制されることから、活性酸素が関与すること、その過程にendo Gのミトコンドリアから核へのトランスロケーションが関係することが分かった。Endo Gは口腔癌に対する分子標的となると考えられた。しかし、口腔癌に対する分子標的治療は他領域の悪性腫瘍に比べて開発が遅れており、まだ始まったばかりである。大きな期待が持たれたEGFRをターゲットとした分子標的治療も、従来の治療を大きく凌駕する結果は得られていない。頭頸部癌では2007年に癌幹細胞としての性格を示す細胞群が報告されて、CD44が癌幹細胞マーカーとして知られている。癌幹細胞の調整法はFACSを用いてソーティングする方法、磁気ビーズによる分離法が知られている。現在MACS社の磁気標識を利用し、ビーズにてCD44陽性細胞を分離していくことが出来た。今後このCD44陽性細胞を用いて、癌幹細胞の分子標的治療、とりわけ抗癌剤耐性に対して大いに貢献できると考える。また抗癌剤と抗癌剤とを併用した研究は数多くされている。単純に併用することではこれまでの抗癌剤と同様に正常細胞への傷害は避けられない。しかし腫瘍におけるシグナル異常の特異性を明らかにするとともに各シグナルの阻害効果及びどの阻害剤の併用が最も効果的になるかについて検討するが重要と考えた。Safingolは単剤でcaspase非依存的にアポトーシスを誘導すること、GGTI-298を用い細胞の運動、浸潤能についてはすでに報告している。このGGTI-298とsafingolとの併用にて相乗効果が起こるを確認した。癌幹細胞マーカーとしてCD44を用い、CD44陽性細胞を抽出し、sphere形成ができるところまで確認した。また、研究代表者は、これまで分子標的として発癌プロモーターの細胞内受容体であるプロテインキナーゼC(PKC)に着目し、その阻害剤であるsafingolによる口腔癌細胞のcaspase非依存的アポトーシスを明らかにしてきた。safingolによる細胞死は、抗酸化剤で抑制されることから、活性酸素が関与すること、その過程にendo Gのミトコンドリアから核へのトランスロケーションが関係することが分かった。口腔癌今年度予定していた、MACS社の磁気標識を利用し、ビーズにて効率的にCD44陽性細胞を分離していくことが出来た。safingolを用いてcaspase非依存的な経路におけるアポトーシスメカニズムを解明していくとともに、CD44陽性細胞におけるその効果を確認していく。建て替え論文掲載費が188351円が3月末に生じたが、不足が生じたため、次年度に処理することとした。論文掲載費を使用後は、ほぼ当初の計画通りの額のため、当初の計画通り使用予定である。
顎関節症節痛患者における非侵襲的疼痛評価法の確立

目的:顎関節症患者に対し、安静時咬筋組織血流測定(生物学的評価)と多軸評価(含むVAS、圧痛評価、QOL、日本語版マギル疼痛質問票歯科版、心理評価など)を組み合わせた疼痛評価を行い、筋痛評価を非侵襲的かつ、生物学的・心理学的に行う方法を確立する。方法:片側に筋痛を訴える顎関節症患者を連続抽出し、研究の同意取得後、咬筋筋血流を測定した。66名が本研究に参加したが、これらの中でデータ欠損のない63例(研究参加時のMR画像診断:顎関節症I型33名、II型7名、III型20名、IV型3名)を用いた。統計学的検討には構造化方程式モデリングの多重指標モデルを用いた双方向因果モデルを作成して解析した(SPSS ver11,AMOS ver5)。このモデルには潜在変数として「生物的評価」、「疼痛評価」および「心理評価」を設定し、疼痛評価の観測変数には疼痛側咬筋および側頭筋前部筋束部の加圧疼痛スコア合計、マギル疼痛質問票歯科領域版感覚的表現(VAS)および日常生活障害度を用いた。生物的評価には近赤外線組織血流計(バイオメディカルサイエンス、PSA-IIIN)疼痛側の還元Hb値、疼痛側と非疼痛側の還元Hb値差、疼痛側と非疼痛側の組織酸素飽和度差を、心理的評価にはHospital Anxiety and Depression Scaleの不安及び抑うつ得点ならびにマギル疼痛質問票歯科領域版情動的表現(VAS)を用いた。多重指標モデルでは潜在変数間にパスを設定し、因果の方向を変えて64通りのモデルを検討した.結果:Browne-Cudeck規準O(BCCO)で検討した結果(BC<=2.285)、6種類のモデルが選択された。この6種類モデルの臨床的妥当性から疼痛評価→心理的評価→生物的評価へのパスが引かれたモデル、心理的評価→生物的評価と疼痛評価の両者にパスを引くモデル、および心理的評価→生物的評価→疼痛評価へのパスが引かれたモデルが適切と考えられた。結論:筋痛評価は心理状態評価と生物的筋血流評価で行える可能性が示され、その因果推論が可能となった。本研究の目的は顎関節症患者に対し、安静時咬筋組織血流測定(生物学的評価)と多軸評価(含むQOL、心理評価)を組み合わせた疼痛評価を行い、筋痛評価を非侵襲的かつ、生物学的・心理学的に行う方法を確立することである。本研究は2施設でデータを集積し、他の施設で分析する方式を採用している。現在までにデータ集積装置の設置は終了し、解析方法まで含めてそれぞれの倫理委員会で臨床研究の承諾を得た。片側に筋痛を訴える顎関節症患者を連続抽出し、研究の同意が得た後、咬筋筋血流を測定した。研究参加時のMR画像診断の結果、筋性疼痛症例は19例、復位性関節円板転位症例4例、非復位性関節円板転位症例7例の計30例であった。

これら全例を用いた結果を途中解析すると、開口量は疼痛側酸化ヘモグロビン量(相関係数=0.590)、疼痛側還元ヘモグロビン(相関係数=0.585)、および非疼痛側酸化ヘモグロビン量(相関係数=0.557)、還元ヘモグロビン(相関係数=0.602)と有意な相関が見られたが、VAS値とは相関はみられなかった。現在、患者の不安、抑うつ傾向、性格傾向などは分析中であり、今回の報告には間に合わないが、少なくとも筋痛を訴える顎関節症患者は開口量と咬筋の酸素飽和度に関係しており、仮説のなかの生物学的評価法は少なくとも妥当性があることが示されたと考えている。さらに症例を増やし、多軸評価の結果を出す予定である。目的:顎関節症患者に対し、安静時咬筋組織血流測定(生物学的評価)と多軸評価(含むQOL、心理評価)を組み合わせた疼痛評価を行い、筋痛評価を非侵襲的かつ、生物学的・心理学的に行う方法を確立する。方法:2施設でデータを集積し、他の施設で分析する方式を採用している。現在までにデータ集積装置の設置は終了し、解析方法まで含めてそれぞれの倫理委員会で臨床研究の承諾を得た(2003)。片側に筋痛を訴える顎関節症患者を連続抽出し、研究の同意が得た後、咬筋筋血流を測定した。研究参加時のMR画像診断の結果、健常者8名、筋性疾痛症例は28例、関節円板転位症例27例、変形性関節症3例の計66例であった。これらの中でデータ欠損のない63例を用い、多重指標モデルを用いた双方向因果モデルを作成して解析した。このモデルには潜在変数として「生物的評価」、「疼痛評価」および「心理評価」を設定し、疼痛評価の観測変数には疼痛側咬筋および側頭筋前部筋束部の加圧疼痛反応、マギル疼痛質問票歯科領域版および日常活動制限度を用いた。生物的評価には疼痛側の還元Hb値、酸化Hb値、疼痛側と非疼痛側の還元Hb値差および開口量を、心理的評価にはHospital Anxiety and Depression Scaleの不安及び抑うつ得点ならびにアイゼンク性格傾向質問票短縮版の神経症性格傾向得点を用いた。多重指標モデルでは潜在変数間にパスを設定し、因果の方向を変えて8通りのモデルを検討した.結果:Browne-Cudeck規準0(BCCO)で検討した結果、BCC0=2.8で生物的評価と疼痛評価および生物的評価と心理的評価の間に有意なパス係数を認めた。生物的評価すなわち生体内変化は心理的状態に影響し(r^2=0.24)、その影響を受けた心理状態は患者の訴える疼痛評価に多大に影響していた(r^2=0.72)。結論:筋痛評価は心理状態評価と生物的筋血流評価で行える可能性が示された。目的:咀嚼筋筋痛を有する顎関節症患者に対し、両側の安静時咬筋組織血流測定(生物学的評価)と多軸質問票評価(日常生活障害(LDF-TMDQ)、心理評価(HADS)、日本語版マギル疼痛質問票(JDMPQ)など)で患者評価を行い、患者自身による筋痛の感覚的疼痛評価を生物学的・心理学的な評価法によって客観的かつ非侵襲的に評価する方法を確立する。今年度は最終年度であり、データ解析、解析結果に関する専門家とのデスカッション、学会報告および報告書の作成を目的とした。方法:データ解析は多重指標モデル(双方向因果モデル)を用いた(AMOS、Ver.5)。このモデルでは潜在変数として生物的評価、疼痛評価および心理評価を設定し、観測変数には疼痛側咬筋および側頭筋前部筋束部の加圧疼痛スコア合計、JDMPQ感覚表現点数およびLDF-TMDQを用いた。生物的評価には疼痛側咬筋還元Hb値、疼痛側と非疼痛側の還元Hb値および酸化Hb値差を、心理的評価にはHADSの不安及び抑うつ得点ならびにJDMPQ情動表現点数を用いた。多重指標モデルでは潜在変数間の因果の方向を変えたモデルで検討した。
ヒドロキシル基直接導入反応による官能基密集型多環式天然物の全合成

ウアバインは細胞膜上に存在するNa+/K^<+->ATPaseを阻害する強心性ステロイド配糖体である。AB環及びCD環がシス縮環した炭素骨格上に多数の酸素官能基を有しており、有機合成は極めて困難である。我々はウアバインの効率的全合成を目指し、AB環とD環をそれぞれ合成し、これらを連結する収束的全合成戦略を立案した。現在までに、ウアバインのステロイド骨格の構築を達成しており、以下詳細を説明する。AB環の合成法はすでに確立されているため、D環の合成を行った。文献既知のシクロペンタジオンをDIBALを用いて還元した後、生じた水酸基をTBS基で保護した。続いて、末端オレフィンを酸化的に切断してアルデヒドへと変換した後、Horner-Wadsworth-Emmons反応によってエノールエーテルとした。この化合物のTBS基をAc基へと変換し、D環を合成した。それぞれ合成して調達したAB環とD環を用いてウアバインのステロイド骨格の構築を検討した。D環を臭素で処理することにより生じたジブロモ体にAB環を作用させ、α-プロモアセタールを得た。種々のラジカル反応を検討した結果、酸素雰囲気下でBu_3SnHとEt_3Bを用いた条件に付すことでラジカル環化が進行し、C9-C11の炭素-炭素結合を有する生成物が得られた。この化合物のAc基を除去した後、生じた水酸基を酸化して、ケトンへと変換した。このケトンにKN(TMS)_2を作用させると、位置・立体選択的アルドール反応によりC8-C14の炭素一炭素結合が形成され、ウアバインのステロイド骨格を有する生成物が得られた。今後は、さらなる官能基変換を行い、ウアバインの収束的合成経路を確立する。高度に酸化された天然物の合成において、直接的に酸化度を高める方法は未だ確立されていない。そこで、短段階で酸化度を高め、全合成を簡略化する新しい酸化反応の開発を目指し、隣接置換基を利用するヒドロキシル基直接導入反応を計画した。具体的には、ジオキシラン発生部位であるケトンを持つ置換基を設計し、これをリンカーを介して、エーテル結合で種々の基質と連結した。構造や長さの異なるリンカーを使い分けることで特定のC-H結合のみ活性化し、選択的かつ直接的な酸化反応を実現することを目的とする。第二級アルコールにトリフルオロメチルケトンを持つ置換基を導入し、H_2O_2を作用させると、酸素置換基により活性化されたC-H結合が速やかに酸化され、ケトンが得られた。次に、第三級アルコールに置換基を導入し、Oxoneを作用させると、置換基近傍に存在する複数の不活性なC-H結合のうち第三級C-H結合のみが選択的に酸化され、酸化物が得られた。さらに、同様の置換基を連結したフェノール類縁体にOxoneを作用させると、オルト位が酸化され、環化したヘミアセタールが得られた。以上のように、新たに開発した隣接置換基を用いて、1.エーテルの酸化2.不活性な第三級C-H結合の酸化3.フェノール類縁体のオルト位選択的な酸化反応を開発した。特に、不活性な第三級C-H結合の酸化では、既存の方法では困難であった1,3-ジアキシアルの関係にあるヒドロキシル基の直接的な導入に成功しており、これは特筆すべき結果である。ウアバインは細胞膜上に存在するNa+/K+-ATPaseを阻害する強心性ステロイド配糖体である。我々はウアバインの効率的全合成を目指し、AB環部とD環部をそれぞれ合成し、これらを連結する収束的全合成戦略を立案した。現在までに、AB環部とD環部の合成経路を確立しており、以下詳細を説明する。市販されており、容易に入手可能な(-)-ペリルアルデヒドを原料としてAB環部のエナンチオマーの合成を検討した。AB環部のシスデカリン骨格は既知のDiels-Alder反応で構築した。その後5工程でジアリルアルコールへと誘導し、水酸基の関与を利用したエポキシ化により立体選択的にA環上の酸素官能基を導入した。さらに8工程で酸化度の調整とB環の官能基化を行い、AB環部のエナンチオマーの合成を達成した。次いで、D環部の合成に着手した。出発原料であるメチルシクロペンタンジオン類縁体にフランを付加してエノンとした後、CBS還元で不斉点を導入した。生じた水酸基をかさ高いTBSで保護し、立体選択的な水素添加反応を行った。続いてTBSを除去し、水酸基をケトンへと酸化した後、位置・立体選択的にアリル基を導入した。その後3工程の官能基変換により、目的のD環部の合成を達成した。以上のように、必要な官能基を備えたAB環部、D環部の合成経路を確立した。今後は、鍵反応であるカップリング反応を検討する予定である。

現在までに、ウアバインのステロイド骨格の構築を達成しており、以下詳細を説明する。AB環の合成法はすでに確立されているため、D環の合成を行った。文献既知のシクロペンタジオンをDIBALを用いて還元した後、生じた水酸基をTBS基で保護した。続いて、末端オレフィンを酸化的に切断してアルデヒドへと変換した後、Horner-Wadsworth-Emmons反応によってエノールエーテルとした。この化合物のTBS基をAc基へと変換し、D環を合成した。それぞれ合成して調達したAB環とD環を用いてウアバインのステロイド骨格の構築を検討した。D環を臭素で処理することにより生じたジブロモ体にAB環を作用させ、α-プロモアセタールを得た。種々のラジカル反応を検討した結果、酸素雰囲気下でBu_3SnHとEt_3Bを用いた条件に付すことでラジカル環化が進行し、C9-C11の炭素-炭素結合を有する生成物が得られた。この化合物のAc基を除去した後、生じた水酸基を酸化して、ケトンへと変換した。このケトンにKN(TMS)_2を作用させると、位置・立体選択的アルドール反応によりC8-C14の炭素一炭素結合が形成され、ウアバインのステロイド骨格を有する生成物が得られた。今後は、さらなる官能基変換を行い、ウアバインの収束的合成経路を確立する。
天疱瘡の新治療に向けたＩｇＧサブクラス解析とＩｇＧ４除去療法

天疱瘡は表皮細胞の細胞間接着因子であるデスモグレイン(Dsg)に対する自己抗体によって生じる疾患で、自己抗体についてのさまざまな解析が進められている。われわれが行った天疱瘡におけるIgGサブクラスの解析の結果、総IgG中のIgG4の割合の増加が示され、更に抗Dsg抗体のIgG4サブクラスの上昇が確認された。また、患者血清からIgG4を除去することによる病原性の低下を、表皮細胞解離アッセイで確認した。同一患者における疾患活動性とIgG4の相関について、疾患活動期・寛解期におけるIgG4を測定し複数の患者で検討した結果、Dsg特異的IgG4濃度は活動期で明らかに高いことが分かった(p=0.04)。天疱瘡に対する治療について、過去の研究の多くは自己抗体の抗原認識部位である可変領域に注目して来たが、われわれは自己抗体の定常領域の違いであるIgGサブクラスに注目し、IgGサブクラス除去療法に向けた研究を実施した。本研究では、天疱瘡自己抗体サブクラス(IgG1, IgG4)を定量できる方法を確立し、尋常性天疱瘡と落葉状天疱瘡患者における抗デスモグレイン(Dsg)3抗体、抗Dsg1抗体のIgG4サブクラスの増加が示され、IgGサブクラス解析により総IgGに占めるIgG4の割合の上昇が示された。さらに、IgG4を除去することにより、表皮細胞解離アッセイで病原性を低下させることが示された。一方で器官培養における病原性の評価は、実験系が不安定であり、評価可能な結果が得られなかった。また、IgG4産生が上昇している疾患活動期の天疱瘡患者においては、IgG4陽性メモリーB細胞が増加していることが確認された。これらの結果より、さらに同一患者における疾患活動性とIgG4の相関について、病初期・寛解導入期・寛解期におけるIgG4値を測定し、複数の患者で検討したが、一定の傾向はみられていない。さらに症例を増やして解析を実施している。本研究は天疱瘡治療におけるIgG4吸着除去療法が有効である可能性を示した点に意義がある。免疫抑制療法が主流である天疱瘡治療において、将来的にはIgG4除去療法、または抗IgG4抗体治療により、免疫抑制を伴わない安全かつ有効な治療へと繋がる重要な研究である。IgG4関連疾患においてステロイドが著効することから、IgG1とIgG4の量比が治療反応性と相関する可能性があり、治療反応性に関する解析は今後検討すべき重要な課題である。活動期の天疱瘡患者において総IgGに占めるIgG4の割合と抗Dsg-IgG4について解析し、さらに増加しているIgG4を選択的に除去することで、治療効果が期待できるかどうかを検討した。はじめに天疱瘡患者におけるDsg特異的IgGサブクラスを定量するため、定量可能な抗Dsgモノクローナル抗体(IgG1)のプラスミドをもとに同一の抗原を認識するIgG4抗体を作成した。これらの抗体をもとにDsg1、Dsg3がウェルに固相化されたプレートを用いたELISA法で標準曲線を作成し、PV 27例、PF 16例の抗Dsg-IgG1、-IgG4を測定した。また、商業ベースのキットを用いてPV患者、PF患者と健常人の血清総IgGに占める各サブクラスの定量を行った。さらに3例のPV患者血清からカラムを用いてIgG4のみを除去し、IgG4除去前後の病原性の変化および精製したIgG4の病原性の比較を、表皮細胞解離アッセイを用いて行った。その結果、PV患者のIgG4に占める抗Dsg3-IgG4の割合は0.167.0%(中央値7.1%)であった。IgG1に占める抗Dsg3-IgG1の割合の中央値は0.5%であり、有意な差がみられた。PF患者においてもそれぞれ4.2%、1.2%とIgG4の割合が高かった。また、IgGサブクラスについてPV、PF患者と健常人を比較すると、血清総IgG4のみが有意差をもって増加していた。さらにIgG4を除去したPV患者IgGと、除去前のPV患者IgGとを比較したところ、表皮細胞解離アッセイで病原性を平均81%減少させていた。さらに吸着除去したカラムから精製したIgG4が他の血清IgG画分よりも病原性があることが示された。致死的な感染症や二次発癌のリスクを有する現在の免疫抑制治療に代わり、IgG4特異的除去療法が安全かつ有効な治療として有用である可能性が示された。本研究を進めるために必要な病原性・非病原性モノクローナル抗体(IgG1)は、研究協力者であるAimee S. Payneより提供を受けている。これにより研究の効率化が図られている。

また、すでに行っていた基礎実験である、天疱瘡患者と健常人のIgGサブクラス解析の結果より、天疱瘡患者におけるIgG4の上昇が明らかになっていた。今年度の研究においては、非病原性モノクローナル抗体(IgG1)から非病原性モノクローナル抗体(IgG4)の作成から開始したが、プラスミドから制限酵素およびPCRを使用した抗体作成において、適切な指導を享受しながら実験を進めることができ、この間は非常に順調であった。また、抗Dsg IgG1およびIgG4の測定に関しては、商業ベースで購入が可能なDsg ELISAキットを使用することで、確実に結果を得ることができ、研究は順調に進んだ。患者が保有する自己抗体からIgG4を除去することによる病原性の変化をみるために、器官培養した正常ヒト皮膚中に血清を注射し水疱形成の有無を見る方法と、培養表皮シートを用いた患者血清による分離アッセイとを行ったが、前者については有意な結果が得られなかった。この部分において、研究が停滞したが、後者の実験により、IgG4除去による病原性の変化を示すことが出来た。全体としては、我々の教室は天疱瘡研究で多くの研究成果を発表してきており、教授の天谷雅行のもとで定期的にミーティングを行い、進捗状況を確認し、進めて行く研究体制が順調な進展に寄与していると思われる。一方で、一般診療を行いながらすすめていく研究ゆえに時間的な制約があり、計画を上回る成果は得られていない。これまでの研究が概ね順調に進展していることから、今後も体制を維持して研究を進めていく予定である。次年度はまず、前年度の研究に続き、IgG1除去により天疱瘡患者血清の病原性がどう変化するのかを解析する。すなわち前年度にIgG4について行った研究と同様に、IgG1についても抗体除去を行い病原性を評価する。病原性の評価については、IgG4の解析と同様に2通りの方法を用いるが、前年度に結果が得られなかった正常ヒト皮膚を用いた器官培養中への血清の注射については、問題点を検証しながら進めていく。また、これらの実験結果から、IgG4と病勢の相関が示唆された場合には、抗Dsg IgG4 ELISAの標準化を目指し、検査としての安定性と信頼性(鋭敏度・特異度)を検証する。また、IgG4産生が上昇している疾患活動期の天疱瘡患者においては、IgG4陽性メモリーB細胞が増加していることが予想されることから、フローサイトメトリー、ELISPOT解析により、疾患活動期天疱瘡患者血中のIgG4陽性メモリーB細胞を解析する。さらに、ジフテリア毒素を結合させた抗IgG4抗体を作成し、IgG4陽性メモリーB細胞を選択的に破壊する実験を行う。これらの研究と平行して、IgE, IgAに関して、患者血清の抗体の定量と病原性の解析を行う。すなわち、病原性・非病原性モノクローナル抗体(IgG1)のプラスミドからIgG4を作成した方法を用いて、病原性・非病原性モノクローナル抗体(IgA, IgE)を作成する。これらを用いたELISA法を成功させることを含めて次年度の目標とし、さらにはIgA, IgE除去による病原性評価へと、継続的に研究を進めていく予定である。昨年度と同様に、主に各種試薬、器具、培地などの購入に研究費が必要で、その他にIgGサブクラスまたはIgAまたはIgE除去のためのカラム作成、表皮細胞解離アッセイ、フローサイトメトリー、ELISPOT解析や抗体作成に研究費を使用する。また、研究成果を発表するため学会参加をするとともに、論文を作成し投稿する。
オルガネラ成立過程の初期段階を緑藻細胞内共生リケッチアを用いて解明する

本研究課題は、緑藻細胞内に共生するリケッチア"Candidatus Megaira polyxenophila"(通称“MIDORIKO")のゲノム情報を用いて、細胞内共生体遺伝子水平伝播の段階的発展によってバクテリア共生体がホストによる制御を受ける過程を解明することを目的とする。前年度解読したMIDORIKOゲノム配列を用いて、近縁リケッチア目バクテリアには存在しない遺伝子を探索し、系統解析を実施した。結果、スペルミジン/プトレシントランスポータをコードするオペロンのアミノ酸配列が、デルタ・ガンマプロテオバクテリアと近縁な位置関係となり、他綱のバクテリアの水平伝播に由来すると推測された。スペルミジンは細胞内バクテリアにおいて細胞内環境への適応に関与すると考えられており、MIDORIKOはホスト細胞内環境への適応の過程でオペロンを獲得した可能性がある。また、MIDORIKOからホストへの細胞内共生体遺伝子水平伝播の規模を解明するため、東京農業大学と共同で、ホスト緑藻カルテリアNIES-425株(ホスト株)および非ホストカルテリアNIES-424株(対照株)のトランスクリプトーム解析を実施した。結果、ホスト株と対照株双方のトランスクリプトームデータから、MIDORIKO遺伝子配列に類似した配列を断片的に持つ転写産物を発見したが、発現量は低く、真核生物の遺伝子発現構造を持たなかった。対照株から発見されたMIDORIKO類似配列はホスト株とは異なるため、コンタミネーションではなく、過去にMIDORIKOに近縁なリケッチアが一時的に共生し、消失した可能性がある。本研究から、相互依存的な共生関係が成立していない段階でも、既に細胞内共生体遺伝子水平伝播の初期段階である、共生体配列のホストゲノムへの水平伝播が生じうる一方、機能遺伝子として発現するまでには至らないことが推測された。29年度が最終年度であるため、記入しない。申請者は、緑藻細胞内に共生するリケッチア(通称“MIDORIKO")のゲノム情報を用いて、細胞内共生体遺伝子水平伝播の段階的発展によってバクテリア共生体がホストによる制御を受ける過程を解明し、ミトコンドリアのオルガネラ化進化過程を推測することを目的として研究を行っている。本年度は「MIDORIKOゲノム配列の解読」を実施した。単細胞緑藻カルテリア(Carteria cerasiformis)からMIDORIKOを単離濃縮し、抽出したDNAを高速シーケンサによって解読した。得られたDNA配列から、混入した緑藻由来の配列を除去し、80か所以上存在するリピート領域に由来するギャップ・ミスアセンブル領域の修正を行った。結果、MIDORIKO染色体に相当する1本の環状DNA配列(1.5 Mbp)と、3本のプラスミド様環状DNA配列(121/75/61 kbp)を得た。ゲノムDNA配列から予測されたペントースリン酸経路において、近縁リケッチアでは失われている遺伝子の一部が残存していることが判明した。遺伝子を失ったリケッチアは節足動物をホストとするため、MIDORIKOにおける遺伝子の残存は緑藻ホスト環境に特異的である可能性がある。一方、MIDORIKOゲノムDNA配列中に、近縁リケッチアのヒト感染に関連する遺伝子の類似配列を発見した。MIDORIKOが他の細胞に感染した例はないが、この結果はMIDORIKOの細胞感染能力を示唆し、さらに、MIDORIKOと緑藻細胞の共生が比較的最近生じたという予想(Kawafune et al. 2015 PLOS ONE)を裏付ける。解読したゲノムは、本課題の今後の研究に用いるとともに、節足動物をホストとし哺乳類への感染性を持つリケッチア科バクテリアとの比較を行うことで、ホスト特異性や病原性のメカニズムと起源の解明に寄与する。本年度完了予定であった「MIDORIKOゲノム配列の解読」は、ゲノムの品質向上のための作業が予定より増大したため、やや遅れている。ゲノム解読過程で得られたMIDORIKOのDNA配列には、トランスポザーゼをコードしたリピート領域が70か所存在する他、配列の重複が10組存在したため、ミスアセンブル領域やギャップが多数生じていた。近縁リケッチアとMIDORIKOの遺伝子の順序が大きく異なっているため、近縁リケッチアのゲノム配列を元に機械的に修正する方法は使用困難であった。よって、配列の修正はリードデータを元に手作業で行い、修正不可能な部分はPCRとサンガーシーケンスにより解読した。また配列解読後は、微生物アノテーションパイプラインサービスMigap(国立遺伝学研究所)により機械的に同定された遺伝子を手作業でチェックし、偽遺伝子を除去している。近縁リケッチアには見られないユニークな遺伝子や、逆に近縁リケッチアの遺伝子に極めて類似した配列を持つ偽遺伝子が多く発見されたため、それらの同定はデータベースとの類似度に基づく機械的アノテーションのみでは不十分である。以上の作業により、他2種の緑藻由来のMIDORIKOについてはゲノム解読の実施には至らなかったが、最初の1種について、ほぼ完全長のゲノムDNA配列と正しく同定された遺伝子情報が得られたため、今後の作業効率は向上すると考えている。

本年度はMIDORIKOゲノム配列を用いて「共生体としてのMIDORIKOの性質の解析」を実施した。単細胞緑藻Carteria cerasiformisをホストとするMIDORIKOについて、国立遺伝学研究所の協力によってPacBioを用いたロングリードシーケンス(リード長1-10 kbp)を実施し、前年度決定したゲノムDNA配列の確認と修正を行った。決定したMIDORIKO完全長ゲノム配列(環状DNA配列1.5 Mbp、プラスミド様環状DNA配列3本121/75/61 kbp)に対し、複数のバイオデータベースに対する検索結果を組み合わせたアノテーションを行い、1583 CDSs、3 rRNA、35 tRNA、1 tmRNA、72偽遺伝子を予測した。代謝経路予測の結果、解糖系、ペントースリン酸経路、アミノ酸・ビタミン合成経路は他のリケッチア目バクテリアと同様に不完全であり、ホスト依存的な栄養性が推測された。一方、他のリケッチア目バクテリアの遺伝子と類似しない240遺伝子が同定され、その中には細胞内ストレス耐性に関与すると考えられているスペルミジンの、合成と輸送に関連する遺伝子が含まれた。また、IV型分泌装置の構成要素VirB3、B4、B6をコードした領域は、病原性リケッチアを含むリケッチア科バクテリアでは保存的であるが、MIDORIKOゲノムでは欠損していた。以上から、リケッチアの中でMIDORIKOのみが持つ緑藻ホストとの共生能力に、細胞内ストレス耐性への適応と弱毒化が関係することが示唆された。本年度は、前年度完了しなかった「MIDORIKOゲノム配列の解読」に加えて「共生体としてのMIDORIKOの性質の解析」を行ったため、その後実施予定であった「核ゲノム配列の解読」が遅れている。前年度、MIDORIKOゲノム配列に対し、微生物アノテーションパイプラインサービスMigap(国立遺伝学研究所)により機械的に遺伝子同定を行ったが、偽遺伝子や、既知の配列と類似性が低い遺伝子、また極めて保存性が高い遺伝子に対して誤判定が多いことが判明した。本年度は、新たにCDS探索ソフトウェアGlimmer、タンパク質ドメイン統合検索データベースInterPro、タンパク質機能的類似性情報データベースKEGG Orthologyを用いて、全アノテーション結果の検証と修正を行った。さらに、tmRNAや、挿入配列、転移性イントロンの同定、偽遺伝子の同定を行った。このため作業が増大したが、正確なアノテーションを行うことができた。得られたMIDORIKOゲノム完全配列とアノテーション結果から、「核ゲノム配列の解読」に先行して「共生体としてのMIDORIKOの性質の解析」を実施した。MIDORIKOの持つ遺伝子と他のリケッチア目バクテリアを比較することで、MIDORIKO独自の遺伝子の獲得と欠損を明らかにし、それらがMIDORIKO独自の緑藻ホストとの共生能力に関係すると予測した。これらの結果は本研究のみならず、リケッチア目バクテリアの病原性やホスト特異性の進化の解明に寄与するものである。「核ゲノム配列の解読」は、以上の作業の追加、さらに、PacBioを用いたロングリードシーケンスの結果
セレノシリルエテンの立体選択的[2+1]還化付加反応と生理活性物質合成への応用

最近、我々は1-セレノ-2-シリルエテン(1)と求電子性オレフィンとのルイス酸存在下での反応でケイ素の1,2-シフトを伴う[2+1]環化付加反応によりシクロプロパンが得られることを見い出した。この反応はこれまでに見られなかった新しいタイプの反応で合成的有用性の検討が待たれる。生成するシクロプロパンはセレン、ケイ素を含むいくつかの官能基で修飾されており、種々の官能基変換により有用な生理活性物質等への変換が期待される。1. (1)とβ-カルボキシル基及びβ-アシル基置換メチレンマロン酸エステルとのZnBr_2存在下の反応でシス置換シクロプロパンを立体選択的に53-69%の好収率で得た。生成物を合成殺虫剤であるピレスロイドの有用な合成中間体に変換した。2. (1)とメチレンマロン酸t-ブチルエステル(2)とのZnBr_2又はZnI_2存在下の反応でシクロプロパンとシクロブタンの約2:1混合物として84-91%の収率で得た。反応生成物シクロプロパンをアミノシクロプロパンカルボン酸であるコロナミン酸および2-アルキル置換誘導体、2,3-メタノアスパラギン酸誘導体への立体選択的な変換に成功した。この合成ルートは2-置換アミノシクロプロパンカルボン酸の有用な一般的合成法となり得る。3. (1)とホスホノアクリル酸エステルをSnCl_4存在下で反応させ、シクロプロパンを95-96%の高収率で立体選択的に得た。反応生成物シクロプロパンを生物学的に興味が持たれるアミノシクロ口プロパンホスホン酸誘導体へ立体選択的に変換した。すなわち、生成物シクロプロパンをNaIO_4と反応させアルデヒドとし、NaBH_4でアルコールとし、続いて加水分解した後酸性にし、ラクトンとした。ラクトンをアンモニアと反応させたのちエステル化し、生じたアミドをHofmann転位でアミノシクロプロパンホスホン酸誘導体へ変換した。最近、我々はケイ素、セレン組み合わせ試薬である1-セレノ-2-シリルエテン(1)とビニルケトン(2)やメチレンマロン酸エステル(3)とのルイス酸存在下での反応でケイ素の1,2-シフトを伴う[2+1]環化付加反応によりシクロプロパン化合物が得られることを見い出した。この反応はこれまでに全く見られなかった新しいタイプの反応で合成的有用性の検討が待たれている。生成するシクロプロパン化合物はセレン、ケイ素を含むいくつかの官能基で非対称に修飾されており、種々の官能基変換により有用な生理活性物質等への変換が期待される。平成8年度の研究では、求電子試薬として反応性の高い,カルボニル基を3つ持つオレフィン(4),(5)を試みた。求電子オレフィン(4),(5)は一部は既知であるが、Wittig反応を用いた簡便な一般的合成法を開発し合成した。その結果、1,1-tri(alkoxycarbonyl)olefin(4)又は1,1-di(alkoxycarbonyl)-2-acyl olefin(5)と(1)とのZnBr_2の存在下での-30°Cでの反応でシス置換シクロプロパンを53-69%の好収率で立体選択的に与えた。生成物の立体化学は2D-NOESYによって決定した。また、本反応の立体選択性を、反応機構を分子軌道を用いて推察することにより説明した。生成したセレン、ケイ素を含むシクロプロパン化合物を、合成殺虫剤であるピレスロイドの有用な中間体に変換し、本反応の有用性を示した。

すなわち、生成物シクロプロパンをNaIO_4と反応させアルデヒドとし、NaBH_4でアルコールとし、続いて加水分解した後酸性にし、ラクトンとした。ラクトンをアンモニアと反応させたのちエステル化し、生じたアミドをHofmann転位でアミノシクロプロパンホスホン酸誘導体へ変換した。最近、我々はケイ素、セレン組み合わせ試薬である1-セレノ-2-シリルエテン(1)とビニルケトン(2)やメチレンマロン酸エステル(3)とのルイス酸存在下での反応でケイ素の1,2-シフトを伴う〔2+1〕環化付加反応によりシクロプロパンが得られることを見い出した。この反応はこれまでに見られなかった新しいタイプの反応で合成的有用性の検討が待たれる。生成するシクロプロパンはセレン、ケイ素を含むいくつかの官能基で修飾されており、種々の官能基変換により有用な生理活性物質等への変換が期待される。平成9年度の研究では、(1)とメチレンマロン酸エステル(3)との反応生成物シクロプロパンをアミノシクロプロパンカルボン酸のひとつであるコロナミン酸の誘導体とその類似物への立体選択的な変換に成功した。すなわち、(1)と(3)をZnI_2存在下で反応させ、シクロプロパン(3)とシクロブタン(4)との2:1混合物として84%の収率で得た。これを混合物のままLiAlH_4でエーテル中-78°Cで反応させ、続いてNaBH_4と-30°Cで反応させ、選択的に還元しモノアルコール(8)としたのち、TBDMS基で保護しシリルエーテル(9)とした。(9)をNaIO_4とTHF-H_2O中反応させアルデヒド(10)とした。この段階でシクロプロパンを完全に精製することができ、面倒な(3)と(4)の分離の操作を省略することができた。(3)と(4)の混合物からの(10)の総収率を算出すると約35%である。(10)をWittig試薬と反応させ、続いてジイミド還元した後、TBAFでシリルエーテル除去、NaIO_4,RuCl_3酸化しカルボン酸(11a,b)とした。(11a,b)をアジドに変換したのちCurtius転位でコロナミン酸誘導体とその類似物へ変換した。この合成ルートは置換アミノシクロプロパンカルボン酸の一般的合成法のひとつとなり得る。最近、我々はl-セレノ-2-シリルエテン(1)と求電子性オレフィンとのルイス酸存在下での反応でケイ素の1,2-シフトを伴う[2+1]環化付加反応によりシクロプロパンが得られることを見い出した。(1)とメチレンマロン酸エステル(2)との反応生成物シクロプロパンをアミノシクロプロパンカルボン酸であるコロナミン酸および2-アルキル置換誘導体、2,3-メタノアスパラギン酸誘導体への立体選択的な変換に成功した。すなわち、(1)と(2)をZnI_2存在下で反応させ、シクロプロパン(3)とシクロブタン(4)との2:1混合物として84%の収率で得た。これをLiAlH_4、続いてNaBH_4と反応させ、選択的に還元したのち、TBDMS基で保護した。さらにNaIO_4とTHF-H_2O中反応させアルデヒド(10)とした。(10)をWittig試薬と反応させ、続いてジイミド還元した後、TBAFでシリルエーテル除去、NaIO_4,RuCl_4酸化しカルボン酸(11)とした。
食を起点とした地域創生の理論形成及び一地域を想定したパイロットプランの作成

地方における漁業・農畜産業等の食糧に関する第一次産業とフードビジネスを対象にいかに地域創生を行うかの理論形成と実践的なパイロットプラン作りを試みるために、一次産品類型に応じた生産、食品加工イノベーションをマーケティングの観点から、日本および可能ならば外国まで範囲を広げて類型化する。そしてまた、地域外販売における新しいビジネスモデルに関する理論的枠組み構築を実施する。これらにより、アカデミックな貢献に加えて実践的な成果を目的に過疎地域でパイロットプランを地域と協議しつつ作成し、実現可能で受容可能なプランで実践的地域創生政策立案を行う。
電場における地盤環境中汚染物質の輸送特性に関する研究

本研究は、研究代表者が開発した電気泳動・拡散数値計算コードを電気浸透やそのほかの土壌・地下水環境で起こりうる反応を取り込んだ汎用性の高いコードへ改良することと、改良された数値計算コードの適用性を検証するための実験データの取得、さらに実験結果と数値計算結果の比較による適用性の検討を目的とした。平成13年度には、数値計算コードの改良を行った。従来の電気泳動・拡散数値計算コードでは化学反応項を推定する方法に、非線形最小二乗法を用いていたが、この方法では適切な解が得られないことが想定された。そのため化学反応項の推定部分に、遺伝的アルゴリズムやSCE-UA法などの大域的探索手法を用いる方法を提案した。この方法は陽イオン交換反応を考慮した数値計算コードとして作成し、従前に行われた室内カラム実験の結果と比較し、SCE-UA法が非線形最小二乗法の代替手法として用いることができる可能性が示唆された。平成14年度には、数値計算コードの検証に用いる実験データの取得に関して、電気化学的修復法そのものの水理化学的特性の把握も含めて検討した。電気化学的処理を施した場合の重金属やその他の土壌中化学種の動態について比較し,透水性や粘土含量の影響,また物質移動に寄与するメカニズムについて実験的に考察し、同時に実験結果を数値計算コードの検証に用いることを目的とした。実験からは透水性が高く粘土含量が低い土壌条件で,この手法が有効であるということが分かった。また,電気泳動速度,電気浸透流速および水圧による流速を評価した結果,電気泳動が、最もイオン輸送に効くことが明らかとなった.現段階では数値計算コードの完成に至っていないが、重金属の表面錯形成反応と陽イオン交換反応を考慮したモジュールを完成しており、この成果を踏まえ直ちに電気化学的修復モデルを完成させる。本研究は、(1)研究に先立って開発した電気泳動・拡散数値計算コードを電気浸透やそのほかの土壌・地下水環境で起こりうる反応を取り込んだより汎用性の高いコードヘと改良することと、(2)改良された数値計算コードの適用性を検証するための実験データの取得、(3)実験結果と数値計算結果の比較による適用性の検討を目的としている。本年度まず数値計算コードの改良について、電気泳動・拡散コードでは化学反応項を推定する方法に非線形最小2乗法を用いていたが、この方法では適切な解(反応項)を得られない場合があるため、遺伝的アルゴリズム(GA)や集団混合進化法(SCE-UA法)といった大域的探索手法を用いる方法を検討した。この方法は、陽イオン交換反応を考慮した数値計算コードとして作成し、従前に行われた室内カラム実験の結果と比較し、SCE-UA法が非線形最小2乗法の代替手法として用いることができる可能性が示唆された。本件で得られた知見に関しては、地下水学会誌へ投稿中である。次に数値計算コードの検証用の実験データの取得に関しては、重金属では無いが、2価の陽イオンであるCaを模擬汚染物質と考え、これを混合した土壌をカラムに充填し、土性などの土壌特性のCaの挙動に及ぼす影響や砂質土壌に対するCaの移動特性について、流水式洗浄方式と電気化学的方式の効率の違いについて検討した。これらの実験結果は、電気化学的汚染除去法の特性を把握することと、今後開発予定の数値計算コードの検証用に用いることができる。
潮干狩りにおける人間の行動特性を考慮した海洋環境解析システムの構築

海洋環境の評価にあたっては、単に物理的・化学的な評価だけでなく、海洋の生態系を包含したものが求められている。また、都市近傍の内湾や沿岸域の環境評価にあたっては単に自然環境としての評価だけでなく、人間の社会活動との関連性の評価を含めた総合的な評価が不可欠である。そこで、本研究では東京湾内で1979年に竣工した人工干潟で,現在では天然の干潟に近い良好な状態にあり、かつ市民の憩いの場としても定着している「海の公園」を対象として、年により現存量の80%もの貝を採取する潮干狩りでの人間行動に関するモニタリングを継続的に実施し、潮干狩りの行動特性と貝の現存量の関連性に関する数理モデルの構築を試みた。平成19年度も人工干潟で潮干狩りを行っている人(利用者)のモニタリングおよびアンケートなどを定期的に行い、利用者数の年間変動と季節・天候・潮汐などとの関連性を調査した。その結果、本研究において昨年度開発した人間行動のシミュレーションモデルに基づく潮干狩りの人間行動とその空間分布と潮干狩りによるアサリ採取量の予測モデルによる数値計算結果が、本研究の中で独自に調査したアンケート調査結果や当該海域のアサリの現存量の変化量の実態との差が数%程度と非常に精度良く示していることが確認された。これにより、潮干狩りという行動が当該海域のアサリの現存量に与えている影響の定量化を行うことが可能となった。さらに、干潟域を含む湾内の物理的な流れ場を再現する数値モデルを構築および空間的な現存量予測のモデルを構築した。このモデルによる流場解析と貝(アサリ)の現存量の密度の高い部分の空間分布とを比較した結果、潮が最も引いたときの汀線付近に貝の現存量の密度が高いことが明らかになった。これらの数値結果は、感覚的な分布を裏付けるものになったとともに、都市近郊の干潟での人為インパクトの定量化の面で大いに資する結果となった。平成17年度はまず、人工干潟である海の公園を調査域として潮干狩りを行っている人(利用者)のモニタリングおよびアンケートを行った。特に今年度は、当該海域のアサリ保護を目的とした公園条例が新たに施行されたことから、利用者の利用形態が変化することが予見され、アンケートの結果からもその条例の影響が観察された。また、利用者数の年間変動と季節・天候・潮汐などとの関連性の調査を行った。その結果、平成17年度の当該海域のアサリの現存量に関しては、従来では調査では観察されたことのない大型アサリが確認されたことから、条例によるアサリの保護の影響があるものと考えられる。これらの調査内容に関しては、横浜市主催の当該海域に関する連絡協議会および学会等の研究委員会においても報告し、全国紙の地方版にも掲載された。一方、潮干狩りおける人間行動の数理モデル化に関しては、アンケート結果、ならびにビデオ画像の解析データに基づいた行動パターンの分析を行い、そのモデル化とモデル化に基づいた数値シミュレーションコードの原型を開発した。本コードは本研究において、全くオリジナルに開発した数値シミュレーションプログラムであり、数値シミュレーションの結果と実際に公園に出入りした利用者の滞在時間分布や潮干狩りを行っている人の空間分布との検証から、かなり合理的で妥当なモデル化が行われていることが確認された。そのシミュレーションコードの結果に基づいた考察により、利用客の潮干狩り行動が、現存量の分布状況よりも、海底起伏や時々刻々変化する水深に対する依存度が大きいことが確認された。これらの研究結果に関しては、平成18年度に開催される国内学会および国際会議において発表が予定されている。平成18年度には平成17年度に引き続き、人工干潟である海の公園を調査域として潮干狩りを行っている人(利用者)のモニタリングおよびアンケートを行った。特に今年度は、当該海域のアサリ保護を目的とした公園条例が平成17年から施行されたことから、利用者の利用形態が変化することが予見され、アンケートの結果からもその条例の影響が観察された。その結果、平成17年度の観測において従来では調査では観察されたことのない大型アサリが確認された点についても、平成18年度の観測においても引き続き大型アサリが観測された。こうしたアサリ保護の条例とアサリ資源量との関連性などの調査結果に関しては、横浜市主催の当該海域に関する連絡協議会および国内学会の研究委員会、国際会議などにおいても随時報告し、調査結果に関してはメディアにも取り上げられた。一方、潮干狩りおける人間行動の数理モデル化に関しては、アンケート結果、ならびにビデオ画像の解析データに基づいた行動パターンの分析を行い、平成17年度に開発した数値シミュレーションコードの改良を行った。そのシミュレーションコードの結果に基づいた数ヶ月をターゲットとした数値シミュレーションや考察により、利用客の潮干狩り行動特性と海の公園のアサリの現存量と関連性に検討を行った。また、18年度の国内学会(日本船舶海洋工学会)での講演が若手優秀講演賞を受賞した。平成19年度においてもこれらの研究成果は国内会議・国際会議において発表が予定されている。

また、都市近傍の内湾や沿岸域の環境評価にあたっては単に自然環境としての評価だけでなく、人間の社会活動との関連性の評価を含めた総合的な評価が不可欠である。そこで、本研究では東京湾内で1979年に竣工した人工干潟で,現在では天然の干潟に近い良好な状態にあり、かつ市民の憩いの場としても定着している「海の公園」を対象として、年により現存量の80%もの貝を採取する潮干狩りでの人間行動に関するモニタリングを継続的に実施し、潮干狩りの行動特性と貝の現存量の関連性に関する数理モデルの構築を試みた。平成19年度も人工干潟で潮干狩りを行っている人(利用者)のモニタリングおよびアンケートなどを定期的に行い、利用者数の年間変動と季節・天候・潮汐などとの関連性を調査した。その結果、本研究において昨年度開発した人間行動のシミュレーションモデルに基づく潮干狩りの人間行動とその空間分布と潮干狩りによるアサリ採取量の予測モデルによる数値計算結果が、本研究の中で独自に調査したアンケート調査結果や当該海域のアサリの現存量の変化量の実態との差が数%程度と非常に精度良く示していることが確認された。これにより、潮干狩りという行動が当該海域のアサリの現存量に与えている影響の定量化を行うことが可能となった。さらに、干潟域を含む湾内の物理的な流れ場を再現する数値モデルを構築および空間的な現存量予測のモデルを構築した。このモデルによる流場解析と貝(アサリ)の現存量の密度の高い部分の空間分布とを比較した結果、潮が最も引いたときの汀線付近に貝の現存量の密度が高いことが明らかになった。これらの数値結果は、感覚的な分布を裏付けるものになったとともに、都市近郊の干潟での人為インパクトの定量化の面で大いに資する結果となった。
急速に進行する膵管がんの特性を規定する分子メカニズムの解明

本研究は、膵管がんの発症と進展に寄与する要因の解明を目指して実施した。代表者は、SV40 virusに由来するT抗原がPanINに発現する状況が生じると、急速に進行する膵管がんへと進展すること、および膵管がんに特徴的なtube forming growthが、TGFβシグナルの活性化により制御されていることを明らかにした。これらは、自然に存在するポリオーマウイルスが膵管がんの発症に関与している可能性を示唆するものであるとともに、EMTを誘導するKey Factorとして、TGFβが管状構造を形成しながら浸潤性に進展してゆく膵臓がん増殖のメカニズムを解明かにしたものである。本研究の目的は、急速に進行する難治性膵管がんの進展とその発がんメカニズムを解明することであり、このためにこれまでに作成した「急速に進行する膵管がんを発症する遺伝子改変マウス」の解析を出発点に以下の2件の研究を行っている。1)上皮間葉系変換(EMT)の制御機構の解明と、2)急速に進行する難治性膵管がんがPancreatic intraepithelial neoplasia (PanIN)より直接発生するかの解明である。本年度1)では、これまでに作成しておいた膵管がん細胞株および比較対象となる不死化膵管上皮細胞を用いて、形態学的解析と分子生物学的解析を関連付けて、EMTとTube形成の分子制御機構の解析を進めた。2)では、Tet-Onシステムの導入で急速に進行する難治性膵管がんの発生時期を調節できるようにした遺伝子改変マウスについて、C57BL/6へバッククロスを完成させて、ゲノム置換率を100%とした。がん研究で使用するマウスの生産体制の確立と、KrasG12Dの単独発現でPanINを生じる時期の確定、そして膵管がんを生じるのに必要なDox投与量を最適化した。1)に関しては、3Dタイムラプス顕微鏡によってEMTの誘導される経時的なプロセスを解明し、走査電顕と透過電顕によって同プロセスに出現する細胞を解析し、超微形態学的な細胞の特性を明らかにした。これらの形態学的評価解析法を確立できたことで、TGFβ処理によって生じるTube形成とEMTのプロセスを、シームレスに解析評価することが可能になった。次にDNAアレイ解析を行い、TGFβ処理および未処理の対比を機軸として、TGFβ処理で誘導されるEMTの過程で発現の変化する遺伝子群(mRNA)を同定した。同定した遺伝子は、リアルタイムPCRシステムにより定量測定し、結果の検証作業を進めているところである。これまでのところ、TGFβ処理でTube形成が誘導され、逆にTGFβシグナルの阻害はTube形成を抑制してSphereを形成することが明らかとなっているが、これに連動して特徴のある遺伝子の発現変動を確認している。2)に関して申請者は、Cre/loxP依存的かつTet-On依存的にT抗原発現させることで「急速に進行する膵管がんを発症する新しい遺伝子改変マウス」の作成を進めてきた。これを出発点に、複数のマウスラインをC57BL/6へ7代以上のバッククロスを行い、B6ゲノム置換率を100%とした。発がん研究で使用するマウスの生産体制の確立を行うとともに、KrasG12Dの単独発現でPanINを生じる時期を確定するとともに、マウスへの飲水投与で膵管がんを生じるのに必要なDox投与量の最適化をおこなった。本研究の目的は、急速に進行する難治性膵管がんの進展とその発がんメカニズムを解明することである。そこで、これまでに作成した「急速に進行する膵管がんを発症する遺伝子改変マウス」の解析を出発点に、以下の2つの課題に取り組んでいる。本年度1)では、作成した膵管がん細胞株および比較対象となる不死化膵管上皮細胞における管状構造形成とEMTの関連性、並びにその制御メカニズムを明らかにした。2)では、KrasG12Dに加えてDox投与依存性にtsTAgを発現するようにした遺伝子改変マウスを対象に、病理学的な解析を進めた。同マウスは、Doxの飲水投与によって膵管がんを発症して2週間以内に死亡することから、膵管がんの発症と生存期間はDox飲水投与を開始したマウスの週齢に拠らないことを明らかにすることが出来た。一方、KrasG12Dのみを単独発現するマウスの膵臓は、PanINが確認できるものの、明らかな発がんは認められなかった。KrasG12Dを持たない、Dox投与によるtsTAgを膵臓に単独発現するマウスも同様であり、投与開始後に膵炎を生じるものの8週間以内に死亡するものはなかった。現在、生じたがんがPanINとの連続性を有するかどうかなど、病理組織学的な解析を進めているところである。1)に関して、3次元培養におけるMorphogenesisから、Tube forming cloneとSphere forming cloneを単離することができた。Sphere forming cloneはTGFβ処理によってTube forming cloneへ形質転換するのに対し、Tube forming cloneはTGFβ阻害剤処理にSphere forming cloneへと変化することを明らかにした。さらにTGFβシグナルが標的とする86遺伝子の発現について、形成されたSphereとTubeを対象に検討したところ、Tubeでの発現が2倍以上高い、6遺伝子を見出した。これらの遺伝子はTGFβ処理・TGFβ阻害剤処理に連動した発現の変動があり、膵管がんにおける管状構造形成を特徴づけるものと考えられた。