hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
中央構造線の連続コアによる断層帯内部構造解析

中央構造線(MTL)掘削コアは深度473.9mでMTL領家帯と三波川帯の岩石境界であるMTLを貫いている.コアは断層帯内部構造から,450°C以上の温度条件から地表付近に至る多様な条件での断層活動を記録している.小断層に基づく応力逆解析から,断層活動は大きく4つのステージに分類され,このうち最初のステージにおいて脆性-塑性遷移を経験した.これらの中で微細構造解析による脆性-塑性遷移領域の力学的性質,変質鉱物によるステージごとの熱水活動の状況,炭質物のラマン分光解析による脆性断層での摩擦発熱を明らかにした.中央構造線(MTL)掘削コアは深度473.9mでMTL領家帯と三波川帯の岩石境界であるMTLを貫いている.コアは断層帯内部構造から,450°C以上の温度条件から地表付近に至る多様な条件での断層活動を記録している.小断層に基づく応力逆解析から,断層活動は大きく4つのステージに分類され,このうち最初のステージにおいて脆性-塑性遷移を経験した.これらの中で微細構造解析による脆性-塑性遷移領域の力学的性質,変質鉱物によるステージごとの熱水活動の状況,炭質物のラマン分光解析による脆性断層での摩擦発熱を明らかにした.本研究の目的は,三重県松阪市飯高町赤桶に掘削された中央構造線(MTL)を貫くボーリングコアを主な対象として,(1)MTLの断層帯内部構造の正確な把握,(2)三波川変成岩の上昇を含めたMTLの履歴,(3)断層深部の物性と歪の集中や内陸大地震発生との関わりの解明にある.このために,20年度は,以下の研究を実施した.(1)各深度の構成岩石と断層帯の内部構造:柱状図を作成するとともに,MTL近傍のコアについて検層結果と照らし合わせて定方位化するとともに,各深度においてX線回折法により断層活動による変質鉱物を明らかにした.また,一部試料の研磨片作成,薄片作成・薄片観察を実施した.これにより,断層の深部と浅部の変形の重複関係が明らかになりつつある.この中でかつての地震活動を示すシュードタキライトも見つかった.さらに,脆弱部においては非破壊で内部構造を把握できるX線CTスキャンの画像取り込みを開始した.(2)領家帯側のマイロナイトの古応力:薄片観察により,応力推定に使える鉱物の検討を行ない,燐灰石が候補となった.(3)流体包有物の分布様式:薄片で流体包有物の観察を行なうとともに,名古屋大学で高温ステージを導入した(4)実験室での弾性波速度・電気伝導度測定:内熱炉のセットアップを行った.本研究の目的は(1)断層帯内部構造の正確な把握,(2)MTLの履歴を明らかにする,(3)断層深部の物性と歪集中や内陸大地震発生とのかかわりを解明することである.今年度はコアの基本記載作業に基づく断層帯内部構造の正確な把握はほぼ完了した.さらに,この記載結果に基づきコア中の断層岩が被った古応力を求めることで,中央構造線周辺の岩石が塑性変形領域から脆性領域に隆起する過程でたどった変形履歴,また各履歴に対応した断層帯内部構造を明らかにした.この際,当初各履歴に対応した構造の形成温度を,流体包有物解析により求める予定であった.しかし断層帯内部の流体包有物は断層物質の脆さのために回収が困難であった.一方,同様の目的はX線粉末による断層物質中の変質鉱物解析によって達成可能であることからX線粉末による変質鉱物解析を行った.以上により,当初目的としていた,(1)MTL断層帯内部構造の正確な把握,(2)地質学的に重要な課題であるMTLの履歴についてはほぼ目的を達成しつつある.次に,(3)断層深部の物性と歪集中や内陸大地震発生とのかかわりを解明に向け,今後の基本戦略を立てる上での基礎データとして,断層の歪集中に伴う剪断発熱の痕跡を検証するための,炭質物のラマン分光法による解析,および脆性-塑性遷移条件付近での歪集中過程を明らかにするための,マイロナイト中の石英の結晶定向配列をSEM-EBSDによる解析,歪集中に伴う物質移動を明らかにするための全岩分析を開始した.断層深部の歪集中過程を観測によりとらえるための基礎研究としての弾性波測定については,測定システムとしては,装置設計とシステム耕地が一応完成したが,細かい調整はまだ必要である.一方,上記記載により中央構造線周囲の断層岩は異なる変形を何度も経験しており,仮に弾性波速度が測定できたとしてもこれが,断層深部の歪週過程を観測によりとらえるための基礎研究になるかには疑問があり,今後の方策の検討が必要である.本研究の目的は中央構造線(MTL)の掘削コアの解析を通じて(1)正確な断層帯内部構造,(2)MTLの履歴,(3)断層深部の歪集中や内陸大地震発生との関わりを解明することであり,最終年度である2010年度は,上記目的をほぼ達成できた.(1)コアの基本的記載を全深度で完成させ,断層帯内部構造を明らかにした.(2)応力逆解析による履歴の復元に基づき.領家帯マイロナイトを形成した応力場を被った後正断層性応力場.南北圧縮場,現在の応力場である東西方向の圧縮場の順に,脆性変形の応力場の変遷を経験したと推定した.

さらに,変形構造と変質鉱物の解析を合わせることで,葡萄石の形成の後,正断層性の応力場を経験し,正断層性の応力場と同時期に濁沸石の形成が始まり,現在の応力場の下で終了したと推定した.なお断層深部の歪集中を考える上で重要な脆性-塑性遷移は領家帯マイロナイトを形成した応力場の中で経験している.(3)(1)断層岩の微細構造解析から,脆性-塑性遷移直上での剪断強度が30MPa未満であるのに対し,脆性-塑性遷移直下のマイロナイトの被った差応力は280MPa近く,対照的な力学的性質が明らかになった.(2)脆性-塑性遷移直下のマイロナイトについて,(1)の差応力,応力逆解析に先行研究で求められている温度圧力条件を考慮することで,具体的な応力テンソルの絶対値を決定した,これにより,マイロナイトの流動中の歪集中と応力の関係の議論が可能となった.(3)物質境界としてのMTL(深度473.9m)から下盤側の深度555mまでの岩石は著しく破砕し,とりわけ474.5mから477.25mの範囲の断層ガウジ帯の多い部分がMTLの中心部と考えられる.変質鉱物の解析からこの領域の変形温度はおおよそ150°Cと推定される.一方,含有される炭質物のラマン分光解析から,周囲の変成帯に比較した,MTLの断層発熱の可能性が示唆された.
情動を制御する嗅覚コミュニケーションの全容解明

フェロモン分子同定に関する研究安寧フェロモン分子を同定するためには、安寧フェロモンを放出することが知られている2系統のラットから捕集されたサンプルと、放出しないことが知られている1系統のラットから捕集されたサンプルを比較することで、安寧フェロモン分子を絞り込んでいくこととした。その結果、ラットから捕集した匂いに含まれる76成分を同定することができた。また、各系統のラットから捕集した匂いを比較した結果、安寧フェロモンを放出する系統には存在する一方で、安寧フェロモンを放出しない系統には存在しない物質が4つ存在することが明らかになった。そのため、現在はこの4物質のフェロモン活性を検討すべく、準備を行っている。フェロモンの中枢作用メカニズム関する研究安寧フェロモン作用の神経メカニズムとして、活性化した前嗅核後部が外側扁桃体核間細胞塊を活性化することで扁桃体外側核を抑制する、という神経メカニズムが想定された。そのため、この可能性をより詳細に検討するために研究を進めているところである。また同時に、安寧フェロモンが放出を促す脳内神経伝達物質を検討するために、より簡便な生物検定系の開発を目指した。その結果、ラットが他のラットの近傍に滞在する時間を測定すると、安寧フェロモンを放出する系統のラットの近傍に滞在する時間が長いことが明らかになり、生物検定系を確立することができた。またこの検定系を用いて、例えばオキシトシンといった、いくつかの神経伝達物質の関与を検討する準備を始めた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本年度に得られた主要な成果は以下の通りである安寧フェロモン分子同定に関する研究:これまでの研究結果より揮発性であることが確認された安寧フェロモンを、効率的に捕集する方法の開発を試みた。その結果、麻酔下ラットのある特定の体表領域から匂いを回収し、それを被験動物に提示したところ、条件刺激に対する超音波発生を抑制し、すくみ行動を抑制することが明らかとなった。このことから、現在の方法にて安寧フェロモンを回収することが可能であることが明らかとなった。上記の方法を用いて安寧フェロモンの系統差を検討したところ、例え異なる系統のラットであっても、その系統が同じ集団から派生した場合には安寧フェロモンを産生することが明らかとなった。フェロモンの中枢作用メカニズム関する研究:安寧フェロモンは前嗅核後部を活性化することで、最終的に扁桃体の活性化を抑制することが示唆されているが、前嗅核後部の抑制性ニューロンが扁桃体を直接的に抑制するのか、興奮性ニューロンが扁桃体を抑制する他の神経核を活性化することで間接的に扁桃体を抑制するのかが不明であった。そこで、社会的緩衝作用が観察された際に、どちらのニューロンが活性化するのかを、免疫組織科学的に検討することとし、現在解析を進めているところである。これまでの研究により、警報フェロモンの中枢作用は不安回路の活性化であることが示唆されていた。そこで、不安回路において重要な働きを担っている分界条床核に焦点を当て、警報フェロモン作用における分界条床核の役割を検討した。その結果、分界条床核を不活化すると、警報フェロモンは危険評価行動を引き起こさなくなることが明らかとなったことから、分界条床核が重要な役割を担っていることが示唆された。安寧フェロモンに関しては、麻酔下のラットからフェロモンを効率的に捕集する方法を開発することに成功した。この方法はフェロモン分子同定に向けた全ての解析を可能とすることから、研究計画の初年度において開発に成功したことは、本研究計画の成功に向けて最上のスタートを切れたと考えられ、フェロモン分子の同定への展望が開けたと考えられた。また、中枢作用メカニズムの解明に向けても着実に研究を進めていると考えてる。警報フェロモンに関しても、これまで間接的に示唆されていた分界条床核の関与を薬理学的手法により直接的に示すことができ、メカニズムの解明に向けた研究が着実に進んでいると考えられる。以上を勘案すると、研究計画はおおむね順調に進展していると考えられる。本年度に得られた主要な成果は以下の通りである。安寧フェロモン分子同定に関する研究安寧フェロモン分子を同定するためには、吸着剤を用いてフェロモンを捕集し、その内容物を分析することが必要である。その際、捕集物の中に夾雑物が少なければ少ないほど分析精度が上昇することが知られている。前年度までの研究結果より、麻酔下ラットから安寧フェロモンを人工的に放出させる手技を確立することができた。そのため、清浄な空気で満たされた実験装置内に麻酔下ラットを静置し、人工的に放出させた安寧フェロモンを吸着剤に捕捉するフェロモン捕集システムの構築を目指した。その結果、サンプルに含まれる物質を定性的に検出することができるシステムを構築することができたため、安寧フェロモン分子同定に使用可能であることが明らかとなった。今後、サンプルに含まれる物質を定量的に解析することで、フェロモン候補分子を絞り込んでいく予定である。フェロモンの中枢作用メカニズム関する研究安寧フェロモン作用に重要な働きを担っている前嗅核後部は、これまでほとんど解析が行われてこなかった神経核であるため、その神経科学的特性に関する情報が非常に乏しい神経核であった。

そこで安寧フェロモン作用における働きを明らかとするため、免疫組織科学的に検討を進めている。また同時に前嗅核後部を電気生理学的にも解析を行うべく、必要となる準備を整え終えたところである。前年度までの研究により、警報フェロモン分子の1つである4-メチルペンタナールは、鋤鼻上皮に発現している受容体のうちV1Rファミリーに属する受容体で受容されることが明らかとなってきた。この警報フェロモン受容体を同定するために、4-メチルペンタナールを受容した鋤鼻上皮細胞が発現しているV1R受容体を組織細胞化学的手法によって同定することを目指し、それに必要となる技術を習得することができた。安寧フェロモン分子同定に関しては、夾雑物が非常に少ない状態でフェロモン分子を吸着剤に捕捉するシステムの構築に成功した。フェロモン分子同定に必要な基盤となるシステムを構築できたことは、本研究計画の達成に向けて着実に進んでいると考えられた。また中枢作用メカニズムの解明に関しては、安寧フェロモン作用に重要な役割を担っている前嗅核後部に対して様々な方法を用いて解析を行うことが可能となったため、研究が着実に進んでいると考えている。また警報フェロモンの中枢作用メカニズムに関しても、その受容体同定に向けて必要となる全ての手技を習得することができた。また同時に、フェロモン作用に重要な役割を担っている分界条床核へとフェロモン情報を伝達している神経核を同定すべく、行動神経学的解析にとりかかり始めることができたため、こちらも研究が着実に進んでいると考えられる。以上を勘案すると、研究計画はおおむね順調に進展していると考えられる。本年度に得られた主要な成果は以下の通りである。安寧フェロモン分子同定に関する研究安寧フェロモン分子を同定するためには、吸着剤を用いてフェロモンを捕集し、その内容物を定量的に分析することが必要である。そこでまず、全てのサンプルにある一定量加えることにより、サンプルに含まれる各化学物質の量を定量的に解析することを可能とする標準物質を選定した。その結果、エチルノナノネートが最適であることが判明した。次に、安寧フェロモンを放出することが知られている系統のラットから捕集されたサンプルと、放出しないことが知られている系統のラットから捕集されたサンプルを比較することで、安寧フェロモン分子を絞り込んでいくこととした。その結果、3系統のラットからサンプルを作製することができた。フェロモンの中枢作用メカニズム関する研究安寧フェロモン作用の神経メカニズムとして、活性化した前嗅核後部が扁桃体外側核を抑制することが挙げられている。しかし前嗅核後部はこれまでほとんど解析が行われてこなかった神経核であるため、その神経科学的特性に関する情報が非常に乏しい神経核であった。また扁桃体外側核を抑制できる神経メカニズムに関しても、先行研究が乏しい状況であった。そこで免疫組織科学的に検討を進めた結果、活性化した前嗅核後部が外側扁桃体核間細胞塊を活性化することで扁桃体外側核を抑制する、という神経メカニズムが示唆された。警報フェロモン分子の1つである4-メチルペンタナールは、鋤鼻上皮に発現している受容体のうちV1Rファミリーに属する受容体で受容されることが明らかとなってきた。そこで4-メチルペンタナールを受容した鋤鼻
指向性反発特性を有する制震ダンパーの開発

本研究では、連結振り子方式をパッシブ型制震装置として構成するために、擬似的な負剛性を有する連結材として「指向性反発型制震ダンパー」の開発を目指した。本課題研究では、指向性反発機構の実験用試験体を試作して、その特性・問題点を検証するとともに、本制震ダンパーの適用に有効性が見込まれるような構造物系の振動特性と構造条件について、数値シミュレーション、実測調査による分析・評価を行った。1.連結振り子ダンパーの特性の有効な適用法として、免震構造物系の免震層ダンパーとして利用するハブリッドシステムの制震効果を検証した。免震層、上部構造物系の周期の条件と連結振り子による制震効果との関連を数値シミュレーションにより評価するともに、免震層の設置位置を建物中間部とする中間層免震構造への適用性についても検討を行った。2.隣接建物連結方式の制御系において構造体の各部に減衰量を分散配置するケースを想定し、構造躯体各部分の周期、連結材の剛性に応じて、躯体ならびに連結材に分担させるべき減衰量の最適分配条件について検証するとともに、本制震ダンパーの適用性を検討した。3.木質構造のように床構面において剛床仮定が成立しない構造物系において、隣接建物連結方式の制御システムと同様の振動制御法が適用可能との着眼から、床構面ないし壁構面に、指向性反発機構を適用する制震手法の適用性を検討するために、木質建物の実地加振による振動特性の分析調査を実施し、ダンパー設置の効果を評価するための立体振動解析モデルの作成を行った。4.ワンサイドベアリングの利用により、押し引きの滑り抵抗に指向性を持たせた指向性摩擦機構の実験用試験体の設計・試作を行った。振動台を利用した予備実験を実施し、ダンパーの履歴性状に見られる擬似的な負剛性効果の再現性について検証を行うとともに、試作モデルの駆動性状に含まれる問題点を調べた。本研究計画では、負の剛性を持つ連結材が必要な連結振り子方式や隣接建物連結方式を想定した制御系において、擬似的に負の剛性効果を再現できるようなパッシブ型エフェクタとして、新たに「指向性反発型制震ダンパー」を開発することを目指し、初年度は以下の研究項目に着手した。1.負の剛性を必要とする連結振り子系を免震建物へ複合設置したハブリッドシステムを想定し、数値シミュレーションによりその制震効果を検証した。負の剛性を持つエフェクタを内蔵した連結振り子ダンパーを用いれば、上部構造物系が比較的柔で免震の適用には不利な場合においても免震効果が改善可能であることを確認した。また、このような連結振り子の応用型免震系に導入する「指向性反発型制震ダンパー」に要求される性能を定量的に評価した。2.木質構造のように仕口部において比較的大きな変形性能を有する構造システムの耐震補強用として負の剛性効果を持つエレメントの利用を想定し、変形能力を低下させずに減衰性能を向上するような制震手法の可能性に着目した。そこで、「指向性反発型制震ダンパー」を木質構造へ適用した場合の有効性を検討するために、木質構造の実大加振実験データの集積と振動性状の分析調査を実施した。3.指向性反発機構の試作のために、各種ベアリングやダンパーに関する資料収集調査を実施し、自転車のペダルに利用されているベアリングを利用し、押し引きの滑り抵抗に指向性を持たせるような指向性摩擦機構の実験用試験体の設計・試作を行った。大阪大学大学院工学研究科の制震システム検証用振動台を利用した予備実験を実施し、ダンパーの駆動性状と擬似的な負剛性効果の再現性について検証を行い、現段階の試作モデルにおける問題点を調べ、次年度において試験体に改良を加えるべき箇所について検討を行った。

振動台を利用した予備実験を実施し、ダンパーの履歴性状に見られる擬似的な負剛性効果の再現性について検証を行うとともに、試作モデルの駆動性状に含まれる問題点を調べた。
細菌の細胞分裂ダイナミクスの構造機能相関解析

FtsAの結合によるFtsZへの影響を活性測定(酵素カップリング法と化学的リン酸定量法)によって確認したところ、FtsAの結合によってFtsZの活性が上昇することがわかり、協調現象を初めてアッセイで示すことができた。さらに、蛍光エネルギー移動(FRET)を利用してタンパク質-タンパク質相互作用(PPI)を阻害する化合物の探索を行った。その結果、10種を超える化合物が得られたが、再現性が乏しかったため現在活性測定法などから検証している。さらに、黄色ブドウ球菌(MRSA)のFtsZのX線構造解析を行ったが、FtsZは同一結晶の中に、大きく構造が違う2種(構造A, B)で存在していることがわかった。結晶化条件は生理的条件に近い条件(pH 7.5, 100mM NaCl)であることから、FtsZは溶液中で大きく揺らいでいることを示唆していた。これは、FtsZで初の発見である。別途、個々で得られたFtsZの結晶を、新規阻害剤(米国ラトガース大のD. Pilch教授らが開発してきたもの)を含む溶液にソーキングして解析したところ、その阻害剤は構造選択的に結合していた。この結果は、FtsZの構造選択的阻害剤の可能性を示唆している。27年度が最終年度であるため、記入しない。黄色ブドウ球菌を種として選抜することによって、これまで大量に精製することが困難とされてきたFtsZとFtsAをmgオーダーで精製した。懸案となっていたFtsAのATPase活性を確認すべく、精製したFtsAのATPase活性を測定した。酵素カップリングの系を用いて測定したところ、野生型FtsAには小さな活性があり、変異体V211N FtsAにはその約10倍の活性があることが分かった。その理由を明らかにすべく、野生型FtsAとV211Nの立体構造を結晶構造解析によって決定した。その結果、ATP結合部位の水の構造とリン酸リリースパス周辺の立体構造が少し異なることがわかり、V211Nのみで高いATPase活性がある理由が明らかとなった。更に、FtsZとFtsAの結合比を決定するために、FtsZ-FtsA複合体を精製し、それをエレクトロスプレーイオン化質量分析法によって測定した。その結果、FtsZとFtsAは1:1の比で結合することが分かった。さらに、FtsZ-FtsA複合体を小角散乱法によって測定して、その複合体の立体構造を低分解能ながら決定することができた。黄色ブドウ球菌を種として選抜することでFtsA, FtsZともに大量かつ高純度の精製に成功し、またFtsA単体についてはX線結晶構造解析に成功した。FtsZ-FtsA複合体の相互作用解析にも着手できていて発展が見込まれる一方で、複合体の構造解析に関しては、結晶化には成功しているものの、構造解析が可能な高分解能データの収集が困難であった。そこで新たにX線小角散乱法に取り組んだが、これについては予想外に良いデータが得られ、FtsZ-FtsA単体の分子の外形まで決定できることができた。よって、おおむね順調に進展していると考えている。FtsZ単体の多量体形成様式やFtsZ-FtsA複合体の構造決定にまでは至っていない。今後は、FtsZ-FtsAの協調現象メカニズムを解明すべく、酵素カップリング法や化学的リン酸定量法など幾つかの活性測定法を試験して最適化した後に、その協調現象を解明する。さらに、蛋白質間相互作用に着目した阻害剤探索を行う予定である。また、NMRより多くのX線小角散乱のデータの蓄積によって、FtsZ単体の多量体形成様式とFtsZ-FtsA複合体の立体構造の決定をしたいと考えている。
組織文化と組織パフォーマンスの因果関係に関する研究

組織文化と業績の因果関係の方向性を検証するために,上場企業に勤務する600名の従業員に対して質問紙調査を行い,171名から回答を得た(回収率28.5%)。データ分析の結果,「イノベーション」「部品間コミュニケーション」「階層間コミュニケーション」「従業員志向」の4次元からなるスケールが開発された。本研究の研究方法は,第1段階として,上場企業から組織文化に関する定量データを収集し,第2段階として,1年後,2年後,3年後・・・の当該組織における業績指標(売上高利益率等)との関係を多変量解析によって分析するという手順を踏む。したがって,現時点では,組織文化と業績との因果関係に関する結果は得られておらず,今後,時系列的に分析を進める予定である。なお,組織文化が業績に影響を与えるプロセスを探索するために,本研究では,組織文化と組織変革との関係に着目し,追加調査項目として,「組織変革が実施されている程度」,「組織変革の認知の仕方」,「組織変革に参加する姿勢」等に関する要因を導入した。これらの要因を分析した結果,組織文化は,組織メンバーの組織変革に対する認知や,組織変革への参加姿勢に影響を与えていることが明らかになった。このことから,組織文化は,組織変革を促進したり抑制したりする働きをすることによって,長期的な業績に影響を与えていることが示唆された。組織文化-業績の関係は,これまでブラックボックスであったが,本研究によって両者をつなぐプロセスを解明する上での手がかりが得られたと考えられる。
高齢者の運動習慣による脳内シナプス増強に関する実験動物学的研究

ラットにおけるトレッドミル走行が大脳皮質運動関連領域および小脳皮質におけるグルタミン酸受容体と後シナプス蛋白の発現および機能修飾に与える影響について検討した。1日40分の中等度のトレッドミル走行を10日間および4週間行った。大脳皮質では、10日間介入でグルタミン酸受容体を含む後シナプス受容体mRNA発現量の低下が認められたが、4週間介入後ではこれらのmRNA発現低下は認められなかった。一方、小脳皮質では10日間介入により、グルタミン酸受容体の中でもAMPA受容体の特異的リン酸化が増強し、4週間介入後にはAMPA受容体のmRNA発現の低下が認められた。本年度は、ラットの走行運動が脳内NMDA受容体を取り巻くシナプス増強に与える影響について同定するための生化学的実験手技を確立した。シナプス増強の生化学的指標として、ラット脳皮質および海馬におけるNMDA受容体のNR2サブユニット(NR2AおよびNR2B)のリン酸化により、PSD-95等の後シナプス膜蛋白との相互作用を増強し、チャンネル活性が促進されると考えられた。そこで、採取した脳皮質・海馬組織を破砕してサンプルとし、NMDA受容体およびこれと相互作用する結合蛋白を精製し、この精製サンプルに対して電気泳動・western blottingを行い、これをチロシン-リン酸化抗体によりプローブしてチロシンリン酸化を定量した。更にNR2A、NR2B抗体により再プローブすることにより、NR2サブユニットのリン酸化程度を定量するに至った。同様に抗PSD-95抗体のプローブの後、NR2抗体により再プローブすることによりNR2サブユニットとPSD-95の相互作用の程度を同定するに至った。当初、脳組織破砕後のサンプルにおいてNMDA受容体の溶液への可溶が難しく、免疫沈降を目的とする遠沈の上澄からの採取と抗体反応における同定が困難であった。そこで界面活性剤の調整と従来の破砕の後、超音波振動破砕を加えることにより、NMDA受容体の溶液中へ溶解を確認するに至った。現在、走行ラットとそのコントロール群を対象に同上の実験手法に従い、走行によるNMDA受容体を取り巻くシナプス増強の定量化を進めている。運動が脳内シナプス受容体の機能修飾に与える影響を検討するため、成体ラットを対象に10日間および4週間の1日50分間の中等度トレッドミル走行運動を課した。介入後、大脳皮質運動野および小脳皮質を採取し、定量的PCR法に基づくmRNAの発現の定量、ウェスタンブロッティング法に基づく蛋白量とその修飾についてコントロール群と比較した。運動野においては、10日間介入により主要なシナプス受容体であるNMDA受容体NR2Bサブユニット、AMPA受容体GluR1サブユニット、更にPSD-95のmRNA発現量の減少が認められたが、4週間介入ではこれらのmRNA発現量の低下は生じなかった。一方、10日間介入ではNR2Bサブユニットの長期増強に関与する特異的リン酸化が進んでいた。このためNMDA受容体リン酸化による機能修飾によるチャンネル効率の向上に伴い、より少ない受容体産生レベルでの効率的代謝の獲得が示唆された。小脳皮質においては、10日間介入により主要なシナプス受容体であるAMPA受容体GluR2サブユニットのmRNAの発現量の低下が生じ、その後、4週間介入でも同様のGluR2 mRNA発現量の低下が認められた。また、10日間介入により長期抑制に関与するGluR2サブユニットの特異的リン酸化が促進したが、4週間介入では同様のリン酸化促進は認められなかった。以上の所見から、脳内シナプス受容体の産生および機能修飾が運動介入の期間に依存的に調整されていることが明らかとなり、学習の素子となる長期増強、長期抑制の機構に対する可塑的効果が示唆された。
ブテノライダルレチノイドによる発がん抑制

ブテノライド環を持つ種々のレチノイドを合成し、in vitroでの抗発がんプロモーター活性を調べた。その中で最も効力の高かったKNK-41について、in vivoにおける発がん抑制効力を検定した結果、肝発がん実験モデルなどにおいて有効であることが明らかとなった。そこでKNK-41の作用機序について検討を開始した結果、培養がん細胞において、がん遺伝子の発現を抑制すること、細胞周期のG1/G0アレストを起こすことなどが明らかになった。本年度は、細胞周期に関する点をさらに詳細に解析した。代表的ながん抑制遺伝子の一つであるRB遺伝子にコードされているpRBは、細胞周期におけるG1後期のrestriction point (R点)を越えるために中心的な役割りを果していることが明らかにされている。また、Waf 1遺伝子にコードされているp21は、pRBの機能を制御するシステムの一員として働いている。そこで、G1/G0アレストを起こす作用のあるブテノライダルレチノイドがRB遺伝子やWaf 1遺伝子の発現を調節する作用を持っている可能性は十分にある。この点を検討する目的で、まず、ルシフェラーゼをレポーター遺伝子としたベクターにRB遺伝子プロモーターあるいはWaf 1遺伝子プロモーターを組み込んだプラスミドを培養細胞に導入し、検定系を確立した。RB遺伝子プロモーター活性検定用細胞にブテノライド化合物を作用させると、ルシフェラーゼ活性の促進が見られた。本検定系においても、KNK-41の効力が最も高かった。さらに、KNK-41は、Waf 1遺伝子プロモーター活性も促進することが証明された。以上の結果は、がん抑制遺伝子の発現を促進させることがブテノライドレチノイドによる制がん作用機序の一要因となっている可能性があることを示唆している。
一般住民への運動習慣導入による身体健康指標改善効果に関する無作為化介入研究

1.目的:生活習慣病一次予防としての危険因子是正を目的とした無作為化介入研究によって、運動習慣および健康教育が健康増進に果たす役割の科学的根拠を示す。2.方法:40歳以上70歳未満の男性もしくは閉経後女性を対象とし、インフォームドコンセントがえられ登録時健診を受けた316名(男性111、女性205名)を、無作為化割付プログラムで、A(対照)群105名、B(運動介入)群106名、C(運動・栄養介入)群105名に割付けた。栄養状態は食事歴法調査にて評価し、理学所見、呼吸機能、血管弾性、自律神経、採血、および体力検査を実施し、登録時成績には群間差はなかった。3.介入期:運動指導は毎週150分の速歩時間の確保、栄養指導は摂取エネルギーの適正化、n-3系不飽和脂肪酸一日摂取量2.9g、および食物繊維一日摂取量2.0gの増加を目標に指導した。参加者には歩数計が貸与され、日常の歩数をモニターし健康手帳に記録した。指導は、毎月の実技を含めた講習会とNews Letter送付による情報提供であり、月毎に、健康情報誌がA,B,C各群に、運動情報誌がB,C群に、栄養情報誌がC群にそれぞれ送付された。BおよびC群には運動指導講習会、さらにC群に対しては栄養指導講習会が開催された。10ヶ月間に、のべ778名がそれぞれの講習会に参加し、平成18年2月に終了時検診を実施、249名が受診し、結観察率は78.8%であった。5.結果:運動介入B、C群で、年間速歩が対照群に比較して有意に上昇し、BMIはすべての群で低下した。血清トリグリセリドがすべての群で低下し、HDL-Cがすべての群で増加し、栄養介入C群では、n-3不飽和脂肪酸の摂取量が有意に増加した。6.結論:本研究は、対照群を含めた参加住民の健康指標を改善し、栄養指導群において食生活の改善をもたらした。研究課題は略称を「札幌ライフスタイルスタディー」とし、将来的な生活習慣病予防に向けた運動指導、栄養指導および健康教育と健康診断を組み合わせた無作為化介研究として、北海道栄養士会、他移動運動指導士会の協力のもとに、それぞれ栄養部会、運動部会を立ち上げ、介入プログラムの開発を行ってきた。栄養指導プログラムは、(1)摂取エネルギーの適正化、(2)n-3系多価不飽和脂肪酸摂取量の増加、(3)食物繊維摂取の増加を中心に作成された。運動プログラムは、生活習慣病予防効果と持久力トレーニングとして意義を持つ歩行として、すくなくとも10分間以上の速歩を週150分行うものとして作成された。一般住民7,800余名へのdirect mailによる参加募集により、334名の参加希望を得、平成17年2月7日2月17日の2週間に亘り、住民に対する一般検診(理学検査、体組成、呼吸機能検査、血管弾性度、自律神経検査、心電図、採血)および体力測定(全身反応時間・垂直跳び・長座位体前屈・握力・エアロバイクによる最大酸素摂取量)を施行した。

登録時検診結果に基づき、対象症例の適格性の判定を行い、3名の不適格症例を除く316名を、大学病院医療情報ネットワーク(UMIN)によって開発された最小化法を用いて三群(対照群、運動介入群、運動栄養指導介入群)に割付け、平成17年3月から、毎月の予定でニューズレター(健康編、運動編、栄養編)を送付するとともに、運動および運動栄養介入群にたいし、それぞれの講習会を第三土曜日、および第四土曜日に開始した。登録時検診成績と体力測定結果は、現在解析中である。1.目的:生活習慣病一次予防のための危険因子是正を目的とし、日常生活における健康教育や運動習慣導入が健康増進に果たす役割の科学的根拠を示す。2.方法:40歳以上70歳未満の男性もしくは閉経後女性を対象とし、平成17年1月に募集を開始、433名の参加希望者のうち、インフォームドコンセントおよび2月に実施した登録時健診を受け、かつ除外基準に抵触しなかった316名(男性111、女性205名)を、UMINの最小化法を用いた割付けプログラムで、A(対照)群105名、B(運動介入)群106名、C(運動・栄養介入)群105名に割付けた。登録時健診(理学所見、呼吸機能、血管弾性、自律神経、採血、および体力検査)の結果は、年齢、性別、BMI、喫煙率、血圧値、コレステロール値などに差がなかった。同時に、食事歴法調査にて栄養状態を、SF36およびPOMSでQOL、気分の調査を行った。3.介入観察期:3月より介入を開始し、運動指導は毎週150分の速歩時間の確保、栄養指導は摂取エネルギーの適正化、n-3系不飽和脂肪酸一日摂取量2.9g、および食物繊維一日摂取量2.0gの増加を目標に指導した。参加者全員に歩数計が貸与され、日常の歩数をモニターし健康手帳に記録した。指導方法は、毎月の実技を含めた講習会の開催とNews Letter送付による情報提供であり、3月から12月までの毎月に、健康情報誌がA,B,C各群の参加者全員に、運動情報誌がB,C群の運動介入群に、栄養情報誌がC群の栄養介入群にそれぞれ送付された。さにBおよびC群には運動指導講習会およびC群に対しては栄養指導講習会が開催された。10ヶ月間に、のべ778名がそれぞれの講習会に参加した。4.終了時健診:平成18年2月に実施した終了時健診には249名が受診し、結果として観察率は78.8%であった。
臨床試験における承諾の機能と限界に関する比較刑法的研究

〔本研究の全体像〕本研究は、臨床試験における承諾の法的機能と限界を明らかにすることで、臨床試験を安定的に運用するための解釈論的基盤を提供し、もって被験者の健康・福祉を確保することを目的とする。このような目的を達成するために、本計画は、以下の2つのテーマに分けて研究を進める。第1が、臨床試験における正当化の全体構造(以下「テーマI」とする。)についてである。このテーマIでは、ドイツ法、およびこれと体系を同じくするスイス法との比較を試みることで、臨床試験における正当化の全体像を解明し、そのなかで承諾が解釈論上どのように位置づけられるかを明らかにする。第2が、「被害者/被験者の承諾」の刑法解釈論的意義(以下「テーマII」とする。)についてである。このテーマIIでは、ドイツ法の分析を基軸としつつも、これまで検討が不十分であったスイス・オーストリア法をも比較対象とすることで、臨床試験における「被験者の承諾」固有の刑法解釈論的意義を明らかにする。〔平成30年度の研究内容〕平成30年度は、上記〔本研究の全体像〕のうち、テーマIIの検討に軸足を置いた。わが国の刑法典が承諾の一般原理に関する規定を置いていないのに対し、ドイツ刑法典とオーストリア刑法典には承諾に関する規定が存在する。このうちドイツ法における議論は、わが国にもすでに一部紹介されているが、近時、医療問題に対する法的関心の高まりを受けて、ドイツでの議論は再び盛り上がりをみせている。それにもかかわらず、そこでの最近の状況は、わが国ではあまり共有されていないように見受けられる。しかも、オーストリア(さらに、これと議論状況が類似するスイス)の議論に至っては、満足に紹介すらされていないのが現状である。そこで平成30年度は、以上のようなドイツ語圏刑法学研究の空隙を埋めるべく、ドイツ・スイス・オーストリア法の全体像を把握することを目標とした。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。)についてである。)についてである。
蚊の卵形成機構の分子生物学的研究ビテロジェニン遺伝子のクローニングと構造解析

トウゴウヤブカの卵形成機構を遺伝子レベルで解明するため、卵黄タンパク質の前駆体であるビテロジェニンの遺伝子発現機構の解析を行っている。トウゴウヤブカの卵黄タンパク質は分子量の違いからp200、p67、p63(分子量200kDa、67kDa、63kDa)の3種に分けることができるが、既に、p200のビテロジェニンcDNAクローンの単離に成功し、p200に対するmRNAはすくなくとも2種あることを示唆する結果を得ている。本研究の目的は、まだ単離していないp67とp63のビテロジェニンcDNAクローンの単離を行い、トウゴウヤブカの3種のビテロジェニンmRNAの構造を明らかすることである。トウゴウヤブカ雌成虫のmRNAを鋳型に、オリゴ(dT)をプライマーにして合成したcDNAを、形質発現ベクターであるλZAPIIに組み込みcDNAライブラリーを作成した。このcDNAライブラリーをイムノスクリーニングしたところ、p200に対するウサギ抗血清では1×10^4プラークから25個の陽性クローンを得ることができた。一方、p67、p63に対するウサギ抗血清では32×10^4プラークをスクリーニングしたにもかかわらず陽性プラークを全く得ることができなかった。この結果は、トウゴウヤブカの3種のビテロジェニンのmRNAは一本のビテロジェニンmRNA上にあり、3′-poly(A)側にp200のビテロジェニン領域、その5′側にp67とp63のビテロジェニン領域があることを示唆していると考えられるため、現在、p200のcDNAの5′末端領域のアンチセンスプライマーやランダムヘキサマーをプライマーとした複数のcDNAライブラリーを作成し、ビテロジェニンmDNAの5′端側のcDNAクローンおよびp67、p63のcDNAクローンの単離を進めているところである。
心不全に対する金ナノロッドを用いた心臓限局温熱療法の開発

ナノ粒子である金ナノロッド(GNRs)を心不全マウスの静脈内に投与することにより心筋炎症部位にGNRsが集積することを初めて明らかにした。集積のメカニズムとしては心筋炎症部位での血管透過性の亢進と推測される。さらに、心臓に近赤外レーザーを照射し、心臓に集積したGNRsを発熱させることにより心筋に熱ショックプロテイン(HSP90)が発現した。GNRsはバイオイメージング、光温熱治療や薬物送達へ応用できる。GNRsを抗体修飾することにより、効率的に心不全心筋へ集積させることが可能となる。心臓限局温熱療法による心不全治療開発の基礎研究として意義のある研究と考えられた。[具体的研究内容]昨年度行った正常マウスの心嚢膜内に金ナノロッドを注入する方法を、心不全を発症している疾患モデルマウスに応用した。具体的には心不全発症した12週齢マウスに全身麻酔し気管内挿管した後、開胸し直接心嚢膜内に極細注射針で金ナノロッドを50μL注入。注射後の心嚢膜の穴は手術用接着剤で閉鎖した。心臓部位のレーザー照射は近赤外レーザーを200から360mWまで段階的に変化させ、高感度サーモメーターにより表面温度を測定。さらに直腸内温度センサーで深部体温を測定した。その結果、260mW照射により照射部位の表面温度は約42°Cに上昇することがわかった。直腸温度には変化は認められなかった。ただし、心不全マウスのため手術中に死亡する率が高く、レーザー照射までできたマウスは非常に少なかった。開胸せずに心嚢膜内に金ナノロッドを注入する方法の必要と考えられる。[意義・重要性]本研究で使用する心不全マウスは、人の心不全と同様の経過をたどり、半年程度で約半数のマウスが心不全死する。この心不全マウスで金ナノロッドを用いた心臓局所温熱治療による心不全改善効果が認められれば、人への応用に一歩近づくことになる。これまでの全身温熱治療に対し心臓局所温熱治療の優位性を示すことができれば、より良い心不全治療の開発につながるものと期待される。[今後の研究計画]心嚢膜内投与がうまくいかない場合の対応として提案していた静脈内投与による心不全心筋内への金ナノロッド取り込み実験を行う。心筋内への取り込みが確認できれば、近赤外線レーザー照射により心臓自体の温熱が可能となる。[具体的研究内容]マウスの心臓限局温熱システムの開発。(1)マウスの心嚢膜に金ナノロッドを注入する確実な方法の開発:具体的にはマウスに気管内挿管した後、肋骨を切開し直接心嚢膜内に極細注射針で金ナノロッドを50μL注入。注射後の心嚢膜の穴は手術用接着剤で封印する。(2)レーザー照射の条件設定と温度測定:近赤外レーザーを200から360mWまで段階的に変化させ、好感度サーモメーターにより表面温度を測定。以後の実験はこの条件で行った。(3)心筋内HSPの発現の測定:上記の条件で心臓表面にレーザー照射(約10分)後、心臓を取り出してWestern blotによりHSPの発現を測定した。コントロールの金ナノロッドなしと比較しHSPの上昇が認められた。ただし、HSPの発現が認められない個体もあるためさらなる条件設定が必要である。[意義・重要性]金ナノロッドを用いた心臓局所温熱により心筋内HSPの発現を可能にした。これまでの全身温熱では全身の臓器(心臓、肺、肝臓、腎臓、腸管など)が加温されていたため、心臓のみの温熱効果が明らかではなかった。さらに、全身温熱には脱水などの全身への影響も避けられなかった。今後、心臓局所温熱の心機能や全身への影響を研究し、全身温熱と比較することにより局所温熱の優位性を明らかにしたい。[具体的研究内容]心筋特異的TNFα過剰発現心不全(TG)マウスの尾静脈からポリエチレングリコール修飾した金ナノロッド(GNRs)を注入し、心臓へのGNRsの集積および温熱効果を明らかにした。1GNRs(Au平均1.66mM)を6か月齢のTGマウスと正常マウス(WT)に尾静脈投与した(10 μL/g体重)。2448時間後に心臓と脾臓を取り出し、臓器に含まれる金重量を誘導結合プラズマ質量分析装置(ICP-MS)にて測定した。その結果、脾臓に含まれる金重量はTGマウスとWTマウスで変化なかったが、心臓にはTGマウスの方が約2倍量の金の集積が認められた。

WT vs. TG; 96.2±40.6 vs. 81.7±24.1ng/mg (脾臓, P>0.05), 22.2±8.6 vs. 42.3±25.3 ng/mg (心臓, P<0.05)。2電顕像でGNRsがTGマウス心筋内に存在していることを証明した。3近赤外線レーザー照射により、心臓に取り込まれたGNRsが発熱するかを、高感度サーモメーターとWestern botにより明らかにした。近赤外線レーザー(260mW)10分照射によりGNRs投与TGマウスの心臓にはHeat shock protein(HSP)90の発現が認められたが、同様の処置をしたWTマウスの心臓には近赤外線レーザー照射してもHSP90の発現は認められなかった。[意義・重要性]ポリエチレングリコール修飾したGNRsが心不全マウスの心筋に集積することを初めて明らかにした。さらに、心臓に集積したGNRsを近赤外レーザー照射で発熱させることにより心筋にHSP90が発現した。将来的にはGNRsを抗体修飾することで効率的に心不全心筋へGNRsを集積できると考えられる。以上、心臓限局温熱療法による心不全治療開発の基礎研究として意義のある研究と考えられた。循環器内科学マウスの心嚢膜は、当初の予想より破れやすく、金ナノロッドの心嚢膜内注入法は極細シリコンチューブ留置法から直接心嚢膜に注射する方法に変更した。しかし、正常マウスに比べ、心不全マウスは予想以上に術中、術後の死亡率が高いため、心不全マウスの実験が滞っている。したがって、より侵襲の少ない方法の開発が急務である。マウスの心嚢膜は、当初の予想より破れやすく、極細シリコンチューブを留置して金ナノロッドを注入するシステムの開発を目指したが、成功率が低いため直接心嚢膜に注入する現在の方法に落ち着いた。詳細なレーザー照射条件設定を行うために、共同研究者からレーザー照射システム一式を借り受け、予備実験を行った。ある程度めどがついたため当初の予定通りレーザーシステムを購入したが、当初予定した規格ではなく、レーザーパワー調節ができないタイプであったため無償交換してもらった。以上の理由からレーザーシステムの納入が遅れてしまい。実験スケジュールにやや遅れが生じた。心嚢膜内投与がうまくいかない場合の対応として提案していた静脈内投与を行う。連携研究者らは、ポリエチレングリコール(PEG)修飾することにより生体適合性を有した金ナノロッドを開発し、静脈投与による血中半減期は数時間にも及ぶことを明らかにしている。さらに担癌マウスを用いた実験で、静脈内投与した金ナノロッドはEPR(enhanced permeability and retention)効果により腫瘍組織に分布する。本モデルマウスでは心筋炎を生じているため、炎症部位での血管内皮や微小血管障害により金ナノロッドが血管外へ漏出するのであれば、心筋に金ナノロッドが集積される可能性がある。金ナノロッドを静脈投与した際の心臓を含む組織内分布は、組織を王水で溶解後、誘導結合プラズマ質量分析装置(ICP-MS)で金の定量、あるいは、組織薄膜切片の銀増感による染色にて行うことができる(連携研究者に依頼)。具体的には下記実験項目行う。対象:12週齢マウス(正常マウスと心不全マウスそれぞれ3匹)
ヒト脳セロトニン神経伝達機能の定量的イメージングに関する研究

日本の社会情勢の変化に伴い、近年鬱病の罹患率が増加傾向にあり、その病因の解明と治療法の確立が重要となっている。脳内でのセロトニン代謝が、鬱病も含めた精神疾患に関与しているという報告は多いが、セロトニンの脳内合成率や受容体の機能の解明はまだ十分には行われていない。本研究では、セロトニン合成能および受容体機能の定量測定の簡便化と、動物実験でのセロトニン作動性神経系の機能解明および臨床応用を目指して、基礎実験と人でのPET検査を行っている。まず、定量測定の簡便化においては、動物実験での測定法の改良が図られた。入力関数を得るための頻回の動脈採血は、その解析とともに時間、労力を要するため、セロトニン合成率の計測に用いるαメチルトリプトファンを使った動物実験で新しい簡便法を検討した。ラットに対し、抗うつ薬投与を行い、同数のコントロール群との脳内セロトニン合成率の差を比較した。簡便法として、標準入力関数を用いた方法(方法1)と、標準入力関数を1点採血で校正した方法(方法2)を考案し、それぞれの誤差を求めた。分布容積算出の誤差は、方法1,2とも10%未満と良好な結果が得られた。また、速度定数を個々の入力関数にて算出した群と比較すると方法1,2とも有意な差は認められなかった。結果として、セロトニン合成率の計測には簡便法が利用できると考えられた。臨床応用としては、同じトレーサーを用いた鬱病患者のPET検査で、正常コントロール群との脳内セロトニン合成率の差を検討し、有意な局所差を認めた。また、セロトニン受容体作動薬投与による脳血流量の変化を測定し、その効果を検討した。健常成人を対象に、酸素15標識水を用いたPET検査にて脳血流量(CBF)および動脈-毛細血管血液量(V_0)を測定した。測定はセロトニン受容体_<1B/1D>作動薬服用前、服用40-80分後(10分間隔)の任意の3点で行なった。CBF、V_0とも服用前と比べ、最大13%の低下を示した。CBF、V_0の最大作用発現時間は、それぞれ服用60分前後であり、服用80分後には服用前の値に戻っていた。セロトニン受容体_<1B/1D>作動薬は、脳大血管の血管収縮によるCBF、V_0の低下をもたらし、その回復は脳小血管におけるCBF低下時の自動調節に関与することが示唆された。1)動物を用いた基礎的検討セロトニン神経機能異常を呈する疾患モデル動物として、うつ病モデルである嗅球切除ラット(OBXラット)を検討した。OBXラットはうつ病モデルとして以前より確立されており、セロトニン神経伝達機能の異常を呈することが知られている。比較的簡単な手術手技により安定してうつ病モデルを作成することが可能であり、セロトニン神経伝達機能異常の解析法の検討には適していると考えられた。

2)セロトニン細胞機能の定量的解析法の検討本年は従来から用いられる解析法の簡便化に関する検討を行った。従来、セロトニン合成能の計測に用いられるαメチルトリプトファン(αMTrp)法は、各実験動物において入力関数を得るため頻回の動脈採血が必要であり、血液データの解析にも時間と労力を要する。ここで本法に用いる計算法(graphl analysls)では、一般的には各時点におけるトレーサの血中濃度より、ある時点までの積分値が重要であることが判っている。特にαMTrpのように組織移行率の低いトレーサでは、セロトニン合成が大きく変化しても、投与後ある一定の時間の血中濃度、積分値に与える影響は少ないと予想される。そこで標準入力関数の概念を適応できるとの仮定のもとに、以前に行った実験データを解析した。セロトニン神経伝達機能に大きく影響を与えると予想される数種の薬剤の急性、慢性投与実験を含む50匹4群のラットのデータを解析したところ、種々の薬剤投与群、正常群等の間に体重補正後の入力関数に明らかな相違は見られなかった。また一部の群から作成した標準入力関数を他の群に使用して得られたセロトニン合成指標は、本来の結果と有意な相違を認めなかった。従って、今後の研究において、この簡便法を用いてセロトニン合成能を評価することが可能と考えられた。日本の杜会情勢の変化に伴い、近年鬱病の罹患率が増加傾向にあり、その病因の解明と治療法の確立が重要となっている。脳内でのセロトニン代謝が、鬱病も含めた精神疾患に関与しているという報告は多いが、セロトニンの脳内合成率や受容体の機能の解明はまだ十分には行われていない。本研究では、セロトニン合成能および受容体機能の定量測定の簡便化と、動物実験でのセロトニン作動性神経系の機能解明および臨床応用を目指して、基礎実験と人でのPET検査を行っている。まず、定量測定の簡便化においては、動物実験での測定法の改良が図られた。入力関数を得るための頻回の動脈採血は、その解析とともに時間、労力を要するため、セロトニン合成率の計測に用いるαメチルトリプトファンを使った動物実験で新しい簡便法を検討した。24匹のラットに対し、抗うつ薬の急性・慢性投与を行い、同数のコントロール群との脳内セロトニン合成率の差を比較した。脳のセロトニン合成率の指標として用いる分布容積、速度定数はグラフ解析法にて算出した簡便法として、標準入力関数を用いた方法(方法1)と、標準入力関数を1点採血で校正した方法(方法2)を考案し、それぞれの誤差を求めた。分布容積算出の誤差は、急性投与群における方法1で8.8%、方法2で6.3%、慢性投与群における方法1で11.7%、方法2で5.5%と、良好な結果が得られた。また、速度定数を個々の入力関数にて算出した群と比較すると方法1,2とも有意な差は認められなかった。結果として、セロトニン合成率の計測には簡便法が利用できると考えられたが、1点採血にて校正を行う方がより信頼性の高い値が得られることがわかった。臨床応用としては、同じトレーサーを用いた鬱病患者のPET検査で、正常コントロール群との脳内セロトニン合成率の差を検討し、有意な局所差を認めた。また、セロトニン受容体作動薬投与による脳血流量の変化を測定し、有意な変化を認め、薬剤の有効性を確認しつつある。目本の社会情勢の変化に伴い、近年、うつ病の罹患率が増加傾向にあり、その原因の解明と治療法の確立が重要となっている。
蛋白工学とクライオ電子顕微鏡を用いた分子立体構造に基づくタンパク質モーター機構の研究

我々が得た成果をまとめると以下のようになる。1.アクトミオシン複合体中でのミオシンN端近傍のアミノ酸位置を同定した。2.アクチン上のトロポミオシン結合位置を同定した。この位置に導入した変異はカルシウム制御における協同性を増加させた。3.メタノールは、細いフィラメントを弛緩状態にトラップする。4.電子線トモグラフィー法により収縮中のタンパク質のクロスブリッジの立体情報を得た。5.クライオ電子顕微鏡法により、溶液中に存在するモータータンパク質ミオシンの単一分子を可視化することに成功した。6.らせん対称性を用いない新しい三次元再構成法により、1.6nmに及ぶ高分解能の細いフィラメントの三次元像をはじめて得た。7.らせん対称性を用いた新しい解析法により、弛緩時のミオシンフィラメントの三次元構造を得た。8.電子顕微鏡像解析のためのプログラム開発を容易にする為の環境Eosを開発した。9.キネシン-チューブリンの複合体の構造をはじめて明らかにした。10.クライオ電子顕微鏡法により、細いフィラメントのカルシウム濃度による構造変化を捉えた。11.細いフィラメントの準結晶を使った研究により、トロポニンを直接観察できた。12.天然の細いフィラメントの構造を解き、その中のネブリンの結合位置を見いだした。13.部分修飾されたアクトミオシン複合体の研究により、硬直状態のミオシンのアクチンへの結合の仕方にサブドメイン間で違いがあることが分かった。14.アクチンのサブドメイン内の揺らぎの情報を得ることが出来た。ディクチオ型粘菌の遺伝子操作により、ミオシン重鎖のN端近傍(Asp5)にシステインを導入し、金原子クラスター(Au_<11>)を標識し、その位置をクライオ電子顕微鏡法によって三次元的に決定することができた。現在はアクチン遺伝子を改変してシステインを特定の部位に導入することを目的として、まず、現存のアクチン分子にある反応性システイン(Cys374)をアラニンに変えた改変アクチンを精製し、マレイミド試薬にほとんど反応しない事を確認している。この改変遺伝子に、新たに反応性システインを導入し、改変アクチンを精製している。高角傾斜が可能な対物レンズが導入され、現在その振る舞いを吟味している。同レンズ用の試料汚染防止装置も組み込み、その効果についても吟味している。同装置はビーム位置の安定性を損なう恐れもあり、特にこの点について詳しく検討する。高角傾斜像シリーズ(60度まで)を基準参照点を利用してアラインするプログラムは完成した。アクチンを改変して、トロポミオシン結合部位が変わる部位を新しく1ヶ所見い出した。すでに見つけたものと併せて3ヶ所となったので、トロポミオシン結合部位を推定できるようになった。アクチン・トロポミオシン・トロポニン複合体の構造を、Caイオンの有無で比較し、有意な構造変化を捉えることに成功した。ディクチオ型粘菌の遺伝子操作により、ミオシン重鎖のN端近傍(Λsp5)にシステインを導入し、ここに金原子クラスターを標識し、その位置をクライオ電子顕微鏡によって三次元的に決定した。この結果をX線結晶解析で決定されたミオシン分子と比較することにより、アクチンと相互作用しているミオシンのN端の三次元的位置を決定することが出来た。ミオシンのN端はアクチンから遠い側にあり、アクカリ軽鎖と近い部位に存在していることの、実験的な根拠が初めて得られた。アクチンのトロポミオシン結合部位は、活性型の細いフィラメントでは、アクチンの内側のドメインにあることが、三次元像再構成法の結果の解釈から推測されてきた。本研究により、アクチンを改変し、このドメインのアミノ酸を荷電アミノ酸と非荷電アミノ酸の間で変化させるとトロポミオシン結合能が変化するが、逆に外側のドメインでこのような変異を導入しても、トロポミオンの結合能には変化が無い。