hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
光学迷彩を指向した光制御に関するトポロジー最適化法の開発

本研究では光学迷彩構造の設計を指向したトポロジー最適化法を開発し,高性能な光学クローク構造の設計に成功した。設計された最適化構造は従来の光学クロークと比較して、散乱を大きく低減し、誘電体と空気の間に明瞭な境界をもつため、誘電体境界での反射・散乱を厳密に考慮したトポロジー最適設計が可能となった。また、正則化パラメータを変えることにより、構造の周囲長の制約を変えることが可能となり、実際の作製技術に合わせた様々な複雑さを有する光学クローク構造を設計することが可能となった。レベルセット形状表現に基づくトポロジー最適設計プログラムを開発し、光学クローク構造の最適設計を行った。その結果、従来の手法で設計された光学クローク構造よりも光散乱を1/20以下に抑えることが可能な光学クローク構造を設計することが可能となり、これらの開発したプログラムを用いて更なる高性能な光学クロークの創成・設計が期待される。また、得られた研究成果は現在、応用物理で著名なApplied PhysicsLettersに投稿され、条件付き採録となっており、近日中に校正原稿を再投稿する予定である。本研究では光学クローク構造のトポロジー最適化法を新たに開発し、特定の電磁波に対し散乱を最小化することが可能な誘電体構造を設計した。従来のトポロジー最適化法では誘電体と空気の中間媒質であるグレースケールと呼ばれる領域が最適化構造内に存在し、最適化構造を実際に作成することが困難であったが、本研究で開発したトポロジー最適化法では完全にグレースケールを含まない最適化構造を設計することが可能となった。明瞭な誘電体境界をもつ最適化構造を設計することが可能となったことで、今後3Dプロンタなどの新しい作製技術との連携が期待できる。これらの成果はApplied PhysicsLettersをはじめとした論文誌や、ICMAT2013、Metamaterials 2013、WCSMO10などの国際会議でも成果が発表された。トポロジー最適設計プログラムは開発済みであるが、最適設計に関する各種パラメータの調整が難航していたが、それらの問題も解決し、現在は最適設計計算を行っている途中である。25年度が最終年度であるため、記入しない。今後は開発した最適設計プログラムをさらに改善しつつ、高性能な光学クローク構造の最適設計を行って行く。とくに周波数に関してこれまでは1つの周波数にのみ対応可能な光学クロークしか示されていないが、今後は広帯域化なども視野に入れて研究を進める。
卵巣顆粒膜細胞のアポトーシスと黄体形成

卵巣の性周期についての最大の謎は、99%以上の卵胞が排卵に至らずに生理的な細胞死を引き起こすことである(アトレジアと呼ばれる)。アトレジアの便利なアッセイ系がないため、卵胞の排卵とアトレジアのメカニズムは全くわかっていないといってよい。そこで、新たなアッセイ系を確立した。ブタ卵巣から分離した女性ホルモン分泌細胞である卵巣顆粒膜細胞を、性腺刺激ホルモン(FSH)、黄体化ホルモン(LH)の存在下で培養して、分化、成熟させ、最後には死にいたらしめることができた。この系を用いて、以下のことが明らかとなった。1)組み換えFSHを用いたところ、LHがなくても上記の系を完全に動かすことができた。2)プロゲステロン(PRG)測定から、LHの役割が、FSHで誘導された分化機能を増強して、大量のPRGを分泌させることであるとわかった。たぶん、大量のPRGで子宮が妊娠の準備をすることができるのであろう。3)成熟期のあとに発現してくるシクロオキシゲナーゼ2によるプロスタグランジンE2分泌が死を引き起こすことがわかった。4)直接の死因はプロスタグランジンによってトリガーを引かれた細胞内Ca2+の上昇とFeイオンによるフェントン反応とわかった。結論:分化、成熟を経て死にいたる卵巣顆粒膜細胞のインビトロの系を確立した。顆粒膜細胞の発達においてFSHが中心的な役割を果たし、LHは大容量のPRG分泌をうながすブースターであることが明確になった。さらに、プロスタグランジンがアトレジアに関わることを強く示唆する所見を得た。Transferrinによるブタ顆粒膜細胞(POGC)のアポトーシスの解明(結果1)細胞死にtransferrinが直接関与するのか、または、死の前準備すなわちpriming効果を及ぼすのかを調べるために、Fe-52で標識したtransferrinを用いて鉄イオンの取り込みを検討した。期待に反して鉄イオンはPOGCの分化、成熟、そして死の直前まで一定の割合で取り込まれていった。また、鉄イオンの細胞内小器官(ミトコンドリア)への取り込みも測定したが、鉄イオン分布の片寄りはなかった。したがって、死の直前に鉄イオンの取り込みが急増し、その結果ラジカルが発生して死が誘導されたのではないらしい。(結果2)上記の結果は、必ずしも死の誘導に鉄イオンが関与していることを否定しない。そこで、鉄イオンのキレート物資であるフエナントロリンをPOGCの死の直前に添加したところtransferrinによる死が抑制できた。これは死の誘導に鉄イオンが直接関与していることを示す。(結果)プロスタグランジンはPOGCに急性の死を誘導する。これは卵巣におけるアトレジアの現象を模倣する。この死もフエナントロリンは抑制できた。T/SF-1細胞株を用いた細胞分化、アポトーシスの解明(結果1)これまで、LHレセプターを発現した顆粒膜細胞の細胞株の樹立に成功したものはいない。そこで、T/SF-1細胞株にLHレセプターを発現させることを試みた。種々の条件を検討したところ培養の当初からLHホルモンを存在下、低血清で培養することにより、LHレセプターを発現させることができた。

1)組み換えFSHを用いたところ、LHがなくても上記の系を完全に動かすことができた。2)プロゲステロン(PRG)測定から、LHの役割が、FSHで誘導された分化機能を増強して、大量のPRGを分泌させることであるとわかった。たぶん、大量のPRGで子宮が妊娠の準備をすることができるのであろう。3)成熟期のあとに発現してくるシクロオキシゲナーゼ2によるプロスタグランジンE2分泌が死を引き起こすことがわかった。4)直接の死因はプロスタグランジンによってトリガーを引かれた細胞内Ca2+の上昇とFeイオンによるフェントン反応とわかった。結論:分化、成熱を経て死にいたる卵巣顆粒膜細胞のインピトロの系を確立した。顆粒膜細胞の発達においてFSHが中心的な役割を果たし、LHは大容量のPRC分泌をうながすブースターであることが明確になった。さらに、プロスタグランジンがアトレジアに関わることを強く示唆する所見を得た。
プルキンエ細胞の誕生日で規定される小脳皮質・縦縞構造の電気生理学的解析

アデノウイルスベクターを用いて、発生時期の異なるプルキンエ細胞群にのみチャンネルロドプシン2(ChR2)を発現した遺伝子改変マウスを作成した。ChR2を発現したプルキンエ細胞群は小脳皮質内に縦縞構造を作るが、これら縦縞構造のうち単一構造内のプルキンエ細胞群を局所的に刺激する方法を開発し、青色光刺激が小脳皮質内ネットワークにどのような影響を及ぼすかを調べた。また、同様の実験手法をマウス視覚野に応用した。小脳皮質プルキンエ細胞は、発生時期(誕生日)の同じ細胞どうしが集まり、縦縞状構造を形成する。これは、大脳皮質における層状構造に相当すると考えられるが、その機能的意義は明らかでない。本研究では、各縦縞構造に属するプルキンエ細胞群の入出力の違い・活動の同期性の有無などを電気生理学的に調べ、行動との対応を探る。1.アデノウイルスベクターを用いて胎生10,11,12日齢の各マウスにチャネルロドプシン2(ChR2)とGFPを発現させたとき、ウイルス導入日に応じて異なる小脳皮質領域に縦縞構造が標識されることを確認した。つぎに、ChR2を発現したプルキンエ細胞のスパイク応答が青色レーザー光刺激によって増加するかを調べた。その結果、麻酔下マウスでは、数十ヘルツの自発発火が2-3倍増加した。さらに、異なる縦縞領域のプルキンエ細胞群を上記青色レーザーにより刺激したとき、刺激領域の違いによって行動にどのような変化が見られるかを調べるべく、慢性実験用小型デバイスを開発した(岩井ら、印刷中論文)。目下、覚醒動物を用いた行動変化については、実験を継続している。2.ChR2を発現した細胞の活動を単一細胞レベルで操作し、周囲の細胞との位置関係(同一縞あるいは異なる縦構造に属するか、細胞体の距離)に応じた入出力の差異を調べるべく、2光子レーザー顕微鏡を用いた実験を開始した。GFPを発現した細胞(つまり、ChR2を発現した細胞)に、細胞内および細胞外からカルシウム感受性色素を導入することに成功している。アデノウイルスベクターを用いた外来遺伝子の導入あるいは遺伝子改変動物を用いた実験は、発生時期あるいはニューロンタイプ(例えば、興奮性・抑制性、PV+・SOM+)における個別の特徴(発火パターン、刺激選択性チューニング)やこれら細胞同士が作るネットワーク構成にも迫ることができる。本研究では、マウス小脳のプルキンエ細胞が発生時期の違いによって示す縦縞構造について、各縦縞内に属する細胞同士は類似した特徴を持ち、特定の機能を担うネットワークを形成していると仮定した。そこで、チャネルロドプシンを発現した特定のプルキンエ細胞群を人為的に活動させたとき、どのような特徴的な行動の改変が観察されるかを非麻酔慢性実験下で調べるべく、マウス用のワイアレスの小型デバイスを開発した(Neurosci.Res.,2011)。次に、チャネルロドプシンを発現した細胞は蛍光タンパク(GFP/YFP)も発現しており、2光子励起レーザー顕微鏡を用いることによってin vivoの状態で識別でき、かつ、電極を刺入することによって電気活動を記録できることに着目した。そこで、チャネルロドプシンを発現していない細胞から細胞内記録を行い、チャネルロドプシンを発現した細胞群を人為的に刺激したとき、膜電位および興奮と抑制のシナプス入力レベルでどのような影響が見られるか、チューニングなどの機能にどのような修飾が生じるかを調べる実験を実施した
マウス卵巣摘出モデルを用いた骨粗鬆症と歯周病の関連についての研究

これまでの骨粗鬆症と歯周病の関連性を明らかにするため国内外にわたり多くの臨床研究が行われてきた.その結果,骨粗鬆症と歯周病との間に関連性が示唆されてきた.しかしその関連性に関する基礎的研究は皆無である.我々は両者の因果関係を明らかにする目的で,歯周病が骨粗鬆症にどのような影響をおよぼすか動物実験にて明らかにする予定である.今年度は最初の研究として以下の実験を行った.すなわち,閉経後骨粗鬆症のモデルとして卵巣摘出マウスを用い,適時飼育した.これらのマウスを適時飼育した後屠殺し,大腿骨および脛骨より骨髄細胞を採取し,歯周病の原因である細菌のLipopolysaccharide(LPS)を添加し培養した.培養終了後,骨形成および骨吸収に対する影響を観察した.すなわち,骨形成を担う骨芽細胞の分化マーカーであるアルカリフォスファターゼの発現を染色にて,また骨吸収を担う破骨細胞の形成数を観察した.その結果卵巣摘出することにより骨粗鬆症を引き起こし,骨形成および骨吸収両者が活発に起こる高回転型の骨代謝像が認められた.すなわち,骨芽細胞分化のマーカーであるアルカリフォスファターゼ発現の亢進および破骨細胞数の増加が認められた.さらに,LPSを添加し骨粗鬆症に歯周病が重なった状況のグループでは骨粗鬆症のみのグループと比較して,さらにアルカリフォスファターゼ発現の亢進および破骨細胞数の増加が認められた.すなわち歯周病が骨粗鬆症を悪化させる可能性を示唆する結果を得ることができた.来年度はこれらの結果をふまえ,骨芽細胞,破骨細胞の分化マーカーのmRNA発現をRT-PCR法で観察したり,in vivoの実験として卵巣摘出マウスをもちいLPSを腹腔内投与し適時飼育後,大腿骨および腰椎の骨密度および骨形態計測を行う予定である.これまでの骨粗鬆症と歯周病の関連性を明らかにするため国内外にわたり多くの臨床研究が行われてきた.その結果,骨粗鬆症と歯周病との間に関連性が示唆されてきた.しかしその関連性に関する基礎的研究は皆無である.我々は両者の因果関係を明らかにする目的で,歯周病が骨粗鬆症にどのような影響をおよぼすか動物実験にて明らかにする予定である.今年度は最初の研究として以下の実験を行った.すなわち,閉経後骨粗鬆症のモデルとして卵巣摘出マウスを用い,適時飼育した.これらのマウスを適時飼育した後屠殺し,大腿骨および脛骨より骨髄細胞を採取し,歯周病の原因である細菌のLipopolysaccharide(LPS)を添加し培養した.培養終了後,骨形成および骨吸収に対する影響を観察した.すなわち,骨形成を担う骨芽細胞の分化マーカーであるアルカリフォスファターゼの発現を染色にて,また骨吸収を担う破骨細胞の形成数を観察した.その結果卵巣摘出することにより骨粗鬆症を引き起こし,骨形成および骨吸収両者が活発に起こる高回転型の骨代謝像が認められた.すなわち,骨芽細胞分化のマーカーであるアルカリフォスファターゼ発現の亢進および破骨細胞数の増加が認められた.さらに,LPSを添加し骨粗鬆症に歯周病が重なった状況のグループでは骨粗鬆症のみのグループと比較して,さらにアルカリフォスファターゼ発現の亢進および破骨細胞数の増加が認められた.すなわち歯周病が骨粗鬆症を悪化させる可能性を示唆する結果を得ることができた.来年度はこれらの結果をふまえ,骨芽細胞,破骨細胞の分化マーカーのmRNA発現をRT-PCR法で観察したり,in vivoの実験として卵巣摘出マウスをもちいLPSを腹腔内投与し適時飼育後,大腿骨および腰椎の骨密度および骨形態計測を行う予定である.
効率的なワクチン製造に向けたウイルス感染細胞におけるアポトーシス誘導機構の解明

マダイイリドウイルス病のワクチンは、魚類培養細胞により増やしたウイルスをホルマリンで不活化してワクチンとしているが、培養細胞でのウイルス産生効率が低いため製造コストの上昇につながっている。一方、培養細胞でのウイルス複製過程や細胞のウイルス複製阻害要因を明らかにできれば、効率の良いワクチン製造のヒントになる可能性がある。本研究ではマダイイリドウイルスの高効率産生系の確立を目指し、培養細胞におけるウイルスの複製阻害要因を、アポトーシスを中心として検討することを目的としている。最終的にはウイルス産生に有利な細胞の形質を明らかにすることで、培養細胞をゲノム編集技術により改変し、ウイルス産生能力の高い培養細胞株の作出につなげていく。本年度は、平成29年度に実施したウイルス感染細胞におけるRNAseqの結果を詳細に解析した。その結果、Casepaseを始めとするアポトーシス関連遺伝子の発現変動が認められたが、大きな発現変動が認められたのは一部の遺伝子に限られていた。一方、ウイルス複製阻害に関与していると思われる他の遺伝子で大きな発現変動が複数認められた。これらの情報を元に、アポトーシス関連から4種類、インターフェロン関連から3種類、RNA干渉関連から2種類、エンドサイトーシス関連から1種類、その他から1種類の遺伝子をノックダウン試験のために選定した。また、ノックダウン試験における陽性対照として、マダイイリドウイルスの遺伝子に関しても4種類(アポトーシス関連、主要カプシドタンパク質、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ)選定した。各遺伝子について3種類のsiRNAを設計して人工合成し、ノックダウン試験の準備を進めた。本年度は、ノックダウン試験のためにウイルス感染細胞における宿主関連遺伝子の発現変動解析を実施した。本研究で複製阻害要因のターゲットとして挙げているアポトーシス関連遺伝子の変動が認められたものの、一部の遺伝子に限られており、その他の複製阻害要因に関与すると思われる遺伝子でも大きな変動が認められた。このことから、ノックダウン試験においては、アポトーシス関連遺伝子だけにターゲットを絞らずにsiRNAの設計を実施した。siRNAを人工合成したものの、培養細胞におけるノックダウン試験を実施できていないために進捗状況は遅れているとした。また、本研究の最終目標をマダイイリドウイルスの培養細胞における複製阻害要因の解明と、それに続く遺伝子ノックアウトによる有用細胞の作出としていることから、ノックダウン試験の結果によっては当初の研究計画を変更し、解析の対象をアポトーシス以外の遺伝子に変更する可能性もある。前年度に作製したsiRNAを用いて、培養細胞におけるノックダウン試験を実施し、ウイルス感染時におけるウイルス複製阻害要因の解明を進める。当初の計画では、次年度においてマダイイリドウイルスが持つアポトーシス関連遺伝子と相互作用する宿主タンパク質の同定を予定していたが、これまでの結果からウイルスの複製阻害要因としてアポトーシスのみが関与しているわけではない可能性が示唆されている。本研究では、効率的なワクチン製造を命題とし、マダイイリドウイルスの培養細胞における複製阻害要因の解明を目指していることから、次年度ではアポトーシス関連遺伝子にこだわらないsiRNAを用いたノックダウン試験により、培養細胞におけるウイルス複製阻害要因の究明を進める。ウイルス性疾病のワクチン製造において、効率的なウイルス培養法は重要な課題である。マダイイリドウイルス(RSIV)では培養細胞によるウイルスの産生効率が低く、ワクチン製造に高いコストや労力を要している。本研究では、培養細胞によるRSIV高効率産生系の確立を目指し、ウイルス複製阻害要因の一つと考えられるアポトーシス誘導機構の解明を目的としている。本年度は、RSIVがイシガキダイ由来培養細胞(SKF-9)に感染した際のウイルス産生量や感染状態の把握、宿主およびウイルスの遺伝子発現状況に関して、細胞のアポトーシスに着目した解析を進めた。SKF-9に感染したRSIVは接種3648時間後にかけて細胞内のウイルスゲノム数が増加し、4860時間後にかけて培養上清中のウイルスゲノム数が増加していた。このことから本ウイルスの増殖サイクルは約60時間であると推定された。RSIV接種後7日間経過したSKF-9では、全細胞の約6080%が抗RSIVモノクローナル抗体(ウイルス複製時のタンパク質に反応し、ウイルス粒子には反応しない抗体)陽性となるが、抗RSIV粒子ウサギ抗血清には全細胞の約2040%しか反応せず、最終的な粒子形成に至る細胞が少ないことが示唆された。しかしながら、Annexin VやTUNEL法による蛍光染色では、アポトーシスがウイルス感染を抑制していることを示唆するような結果は得られなかった。RNAseqによる網羅的な遺伝子発現解析では、ウイルス感染細胞において免疫関連遺伝子やアポトーシス関連遺伝子の上昇が確認された。特にアポトーシスに関与すると思われる「caspase recruitment domain-containing protein」の発現量が未感染細胞と比べて約10倍上昇しており、この遺伝子の役割について興味が持たれた。当初の計画通りに、RSIV感染細胞におけるウイルスの複製動態を詳細に調べ、ウイルス感染細胞の多くでウイルス複製が阻害されている可能性を示した。また、ウイルス感染細胞におけるウイルスおよび宿主の遺伝子発現動態を網羅的に解析し、アポトーシス関連遺伝子や免疫関連遺伝子といったウイルスの複製阻害に関与すると思われる遺伝子発現量がウイルス感染細胞で上昇していることを確認した。しかしながら、フローサイトメトリーや蛍光顕微鏡におけるアポトーシス細胞の観察では、アポトーシスがウイルス感染を抑制しているという明確なデータを得るには至っていない。この原因が多重染色による技術的な要因が影響しているのか、実際にアポトーシスはウイルス複製阻害に関与していないのかどうかを慎重に見極めるために更なる検討が必要である。

また、RNAseqによる網羅的な遺伝子解析では、ウイルス感染強度やサンプリング時期を振ったシーケンスを実施しており、大規模なデータ解析が必要となるためこの作業にも時間を要している。このことから、全体的な進捗状況はやや遅れているとした。マダイイリドウイルス病のワクチンは、魚類培養細胞により増やしたウイルスをホルマリンで不活化してワクチンとしているが、培養細胞でのウイルス産生効率が低いため製造コストの上昇につながっている。一方、培養細胞でのウイルス複製過程や細胞のウイルス複製阻害要因を明らかにできれば、効率の良いワクチン製造のヒントになる可能性がある。本研究ではマダイイリドウイルスの高効率産生系の確立を目指し、培養細胞におけるウイルスの複製阻害要因を、アポトーシスを中心として検討することを目的としている。最終的にはウイルス産生に有利な細胞の形質を明らかにすることで、培養細胞をゲノム編集技術により改変し、ウイルス産生能力の高い培養細胞株の作出につなげていく。本年度は、平成29年度に実施したウイルス感染細胞におけるRNAseqの結果を詳細に解析した。その結果、Casepaseを始めとするアポトーシス関連遺伝子の発現変動が認められたが、大きな発現変動が認められたのは一部の遺伝子に限られていた。一方、ウイルス複製阻害に関与していると思われる他の遺伝子で大きな発現変動が複数認められた。これらの情報を元に、アポトーシス関連から4種類、インターフェロン関連から3種類、RNA干渉関連から2種類、エンドサイトーシス関連から1種類、その他から1種類の遺伝子をノックダウン試験のために選定した。また、ノックダウン試験における陽性対照として、マダイイリドウイルスの遺伝子に関しても4種類(アポトーシス関連、主要カプシドタンパク質、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ)選定した。各遺伝子について3種類のsiRNAを設計して人工合成し、ノックダウン試験の準備を進めた。本年度は、ノックダウン試験のためにウイルス感染細胞における宿主関連遺伝子の発現変動解析を実施した。本研究で複製阻害要因のターゲットとして挙げているアポトーシス関連遺伝子の変動が認められたものの、一部の遺伝子に限られており、その他の複製阻害要因に関与すると思われる遺伝子でも大きな変動が認められた。このことから、ノックダウン試験においては、アポトーシス関連遺伝子だけにターゲットを絞らずにsiRNAの設計を実施した。siRNAを人工合成したものの、培養細胞におけるノックダウン試験を実施できていないために進捗状況は遅れているとした。
義歯支持組織の除重後の挙動に関する研究-部位による回復能の相違について-

本研究は、Bモード超音波診断装置およびレーザードップラー血流計を応用した粘膜厚径計測システムを用いて、全部床義歯装着による床下粘膜への影響とその対応策について検討を行ったものである。その結果、以下の知見を得た。1.口蓋隆起が認められない被験者において、最大咬合力で噛みしめた場合の粘膜沈下量は、上下顎ともほぼ0.3mm程度であった。2.口蓋隆起が認められない被験者において、各部位の粘膜沈下率は、上顎顎堤部で0.1090.118、口蓋側方部で0.0800.089、口蓋正中部および切歯乳頭右側部で0.1270.151、下顎顎堤部で0.1650.176であった。3.口蓋隆起が認められない場合でも、口蓋正中部および切歯乳頭部におけるリリ-フの必要性が示唆された。4.口蓋隆起が認められない場合の口蓋正中部および切歯乳頭部におけるリリ-フ量は、0.25mm程度で良いことが示唆された。5.口蓋隆起が中等度のものは0.250.50mm、強度のものは0.50mm程のリリ-フが、同部位に必要であることが示唆された。6.粘膜沈下率が12.715.1%と他の部位より高い値を示した口蓋正中部を中心とする範囲で、荷重前後の血流量の変化が大きい傾向が示された。また、この範囲において除重時の粘膜回復比が他の部位より小さいことが明らかになった。床下粘膜を健康な状態に維持することは,咀嚼機能・審美性の回復とともに全部床義歯補綴の重要な目的であり,圧迫を受けやすい部位に関する情報が,機能的義歯製作の観点から必要となる。本研究は,荷重前後の床下粘膜の末梢血液循環の変化を,粘膜の特に薄い口蓋正中部を中心にレーザードップラー血流計を用いて計測し,さらに当教室で従来より行なわれている超音波診断装置および粘弾性測定装置による計測を同一部位に加え,義歯床支持粘膜の分類(一次圧負担域・二次圧負担域・リリーフ域)に科学的根拠を与えようとするものである。本研究においては,実験義歯が血流量・床下粘膜厚径・粘弾性値測定のテンプレートを兼ねているため,実験系における比重が非常に高い。そのため実験義歯は以下の点に注意して慎重に製作した。前歯部からプローブの挿入が可能となるように臼歯部のみに咬合堤を付与し,床用レジンは適合性に優れているイントプレスを用いた。荷重量を規定できるように下顎実験義歯の左右第一大臼歯相当部に小型荷重センサを設置し,センサの受圧部のみで上顎実験義歯と咬合するように調整した。また,粘膜表層の血流量は温度変化に大きく影響されるので,実験義歯口蓋部に温度センサを組み込み粘膜表面の温度をモニタリングできるようにした。同一部位を繰り返し計測できるように上顎実験義歯の各計測部位にはプローブホールを設けた。この実験義歯を用いて測定をおこなった結果,安静時粘膜厚径に対する粘膜沈下量の割合(粘膜沈下率)が,12.715.1%と他の部位より高い値を示した口蓋正中部を中心とする範囲で,荷重前後の血流量の変化が大きい傾向が示された。また,この範囲において除重時の粘膜変位の変位回復比が他の部位より小さいことが明らかになった。これらの結果は義歯機能時にリリーフすべき範囲と量を決定する判定基準となる。人口の高齢化が進む今日、有床義歯を用いた補綴処置を行う頻度が高まっている。特に、全部床義歯の必要な患者の多く高齢者であり、一般に新しい環境に対する順応性が低下している。

このような患者が新しい義歯を受け入れやすくするためには、義歯装着が床下粘膜へ及ぼす影響について、特に義歯機能時の挙動を考慮した情報が必要である。本研究は、荷重前後の床下粘膜の末梢血液循環の変化を、粘膜の特に薄い口蓋正中部を中心にレーザードップラ血流計を用いて計測し、さらに当教室で従来より行われているBモード超音波診断装置による計測を同一部位に加え、義歯装着による床下粘膜への影響とその対応策について検討することを目的とする。本研究においては、実験義歯が血流量の変化・床下粘膜厚径計測のテンプレートを兼ねているため、以下の点に注意して慎重に製作した。前歯部からプローブの挿入が可能となるように臼歯部のみに咬合堤を付与し、床用レジンは適合性に優れているイントプレスを用いた。荷重量を規定できるように下顎実験義歯の左右第1大臼歯相当部に小型荷重センサを設置し、センサに受圧部のみで上顎実験義歯を咬合するように調整した。また、粘膜表層の血流量は温度変化に大きく影響されるので、実験義歯口蓋部に温度センサを組み込み粘膜表面の温度をモニタリングできるようにした。同一部位を繰り返し計測できるように上顎実験義歯の各計測部位にはプローブホールを設けた。この実験義歯を用いて測定をおこなった結果、安静時粘膜厚径に対する粘膜沈下量の割合(粘膜沈下率)が、12.715.1%と他の部位より高い値を示した口蓋正中部を中心とする範囲で、荷重前後の血流量の変化が大きい傾向が示された。また、この範囲において除重時の粘膜変位の変位回復比が他の部位より小さいことが明らかになった。これらの結果は義歯機能時にリリ-フすべき範囲と量を決定する判定基準となる。
インドネシア・スンバワ語の現地調査および記述文法・キスト集作成

1.記述文法の作成(否定表現を中心に)昨年度までの現地調査で収集したスンバワ語のデータ分析を進め、記述文法の作成を行った。文法全体の記述を進める過程で、この言語の特徴として豊富な否定辞の存在があることが判明したため、本年度はこの点に集中して研究を進めた。その概略は以下のとおりである。この言語の独立した否定辞には(i)no「一般的な否定」、(ii)na「否定の願望」、(iii)siong「対置される『肯定』される事柄が認識されている場合の否定」の三つがあり、さらに、(i)は談話辞やアスペクト辞と共起することによってさまざまな:意味を表す。例えば、noと談話辞の一つsiが共起した形は、「強調」(だったわけではなく、ではなかった)を表し、noと別の談話辞poが共起した形は、将来起こることが予測される事態がまた成立していないことを表す。また、noとアスペクト辞kaが共起した形は、特定の事態についての否定を表す。このような否定表現についての詳細を、9月に論文「スンバワ語の否定表現」の形で公刊した。2.テキスト集作成昨年度まで収集したテキストを分析する作業を継続した。具体的には、現地で収集したテキストのテープを転写し、単語ごとに品詞、および意味の情報を付し、また、文ごとの訳も行った。五篇の民話、会話のテキストの処理を完了し、3月にウェブ上で公開した。また、そのうちの一篇をテキストBatuLanglelo(The Langlelo Stone)の形で公刊予定である。2000年6月から7月にかけて,オーストラリア,メルボルン大学,言語学科のLombok-Sumbawa research projectを訪問し,共同研究を行なった。具体的には,近隣の言語の研究者との情報交換,および,メルボルン在住のスンパワ語話者の協力を得て,言語調査を行なった。2000年8月以降は,これまでの調査の結果を文法書の形に集約する作業を行い,その成果を,博士学位論文「スンパワ語の文法の概略」の形にまとめた。(東京大学,3月に人文社会系研究科に提出,現在審査待ち)この研究では,音声面,形態論,および,統語論について記述を行った。研究の中心は統語論で,単文の構造(述部の構造,および,述部と共起する補語(名詞句,前置詞句)の構造と機能)ばかりでなく,動詞連続や複文などの機能についても,ある程度明らかにした。さらに,形式面ばかりでなく,数種類ある否定辞の意味の比較や,「強調」など談話的機能を果たす談話辞の意味の記述など,意味的,談話的内容も扱った。2000年3月以降は,テキストなどの言語資料公開作業に研究の中心を移している。具体的には,研究者および一般の人々にとって有益な情報を提供することを目的とし,物語などのテキストに訳注および関連のある写真などを付けてホームページ上で公開する作業である。(成果は三月末に,東京外国語大学アジア・アフリカ言語文化研究所のホームページで公開予定。)1.記述文法の作成(否定表現を中心に)昨年度までの現地調査で収集したスンバワ語のデータ分析を進め、記述文法の作成を行った。
フッ化炭素化合物分子の励起及び解離性イオン化の実験的研究

本研究の目的は、エッチングプラズマの性質解明のために、フッ化炭素化合物、とりわけCF_4とC_2F_6の既存のデ-タを検討し、信頼しうるデ-タを提供することである。これら分子の電離は解離を伴うので、解離性電離の研究を全電離の側定から始める。これら分子の実験的研究は、Beran(20,35,70ev)やStephan等(しきい値から180eV)が部分的に行なっている。しかし彼らの方法は、相対測定値を別の方法で決まる絶対値に規格化するものである。我々は、このような手続きを要しない絶対測定を、より広い電子エネルギ-範囲にわたって行う。本研究で用いた装置はRappと同じ方式である。但し、我々は衝突室の標的分子数密度を直接測定した。入射電子エネルギ-は、しきい値から500eVまで。入射電流は1nA以下。衝突室でのガス圧力は50μTorr以下にした。順序として、先ずArの全電離断面積を測定した。この結果をBeranが使った基準値(Asundi)や、Stephanが使った基準値(Rapp)と比較したところ、Asundiの値は我々のものより2030%大きい。一方Rappの値は我々のものとよく合う。次にCF_4の全電離所面積を測定した。Beranの値は我々の結果と合うが、彼らが基準にしているArで合わないので、この一致は偶然である。他方、Stephan等の値は70eV以上で、我々の結果よりも30%以上も低い。C_2F_6の報告者は、今まではBeranのみで、それは我々の結果と一見、合っているが、これもCF_4の場合同様、偶然の一致であろう。既存の値と本研究結果との差は、方法の違いによる。我々は絶対測定によって、信頼度の高い結果を得、主目的の一つを達成した。今後、この結果を基準にして、これら分子の各衝突過程を研究する。本研究で購入した備品:電離真空計(GIーTL3RY)は真空槽の真空度監視に、パ-ソンルコンピュ-タ(PC9801RX)とXYプロッタ(MP4400)はデ-タ取り込みとその処理に、直流電源PDM35・3はイオン捕集のために用いた。
新しい<fos>___ー関連遺伝子,<fra>___ーー2の発現誘導の機構と,その遺伝子産物の機能

今年度は、<fra>___ー2遺伝子の発現様式とFraー2(<fra>___ー2遺伝子産物)の生化学的機能に関する基礎的な情報を得るために以下の研究をおこなった。1.血清飢餓により休止期にあるニワトリ胚線維芽細胞(CEF)を血清やTPA、cーAMP、カルシウムイオノフォアにより刺激すると、6.8kと5.7kの<fra>___ー2mRNAの一過的な発現をしめしたが、誘導のkineticsは、<fos>___ーmRNAよりやや遅れ、またshutーoffが起こる時期も<fos>___ーのそれよりかなり遅れた。注目すべきことは、休止期においても6.8kのfraー2mRNAのみがbasal levelでの発現を示す点である。実際に、休止期においては、低いレベルでリン酸化を受けた40ー46kにわたる種々の分子種のFraー2タンパク質が特異抗体により検出され、これらは血清刺激により、強いリン酸化を受けて46kのタンパクへとすみやかに変化した。リン酸化を受けるアミノ酸は、セリン残基のみであって、リン酸化の程度にかかわらず、Fraー2は、細胞内で効率よくcーJunとheterodimerを形成可能であった。CEF内で観察されるbasal levelのAPー1結合活性は、このFraー2/Jun heterodimerによるものと考えられる。2.ニワトリcーDNAライブラリ-の中から、<fra>___ー2 mRNAのcーDNAを単離し、<in>___ー<vitro>___ーでFraー2の生化学的性質を調べて以下の結果を得た。1)Fraー2は、FosとほぼおなじkineticsでJunと結合し、安定なdimerを形成する。2)このheterodimerは、Fos/Junと同様、種々のApー1をふくむエンハンサ-と結合する。3)Fraー2は、Fosと異なり、Junとともにcotransfection法でF9細胞中で発現させてもTREーCATのレポ-タ-からの転写を促進しない。4)Fraー2とFosのキメラタンパク質の解析から、Fosの転写活性化配列はC端側にある。3.<fra>___ー2遺伝子の5'ーflanking regionの塩基配列を決定するとともに、転写の開始部位を同定し、1で見られた2種のmRNAが開始部位の違いによることをしめした。
一次細胞内共生系を成立させるエピトランスクリプトームの解明

本研究は、進化史上、比較的最近にシアノバクテリアを取り込んで真核光合成生物になった有殻アメーバに着目して、その若い光合成オルガネラ(シアネレ)とシアネレに近縁なシアノバクテリアについて、トランスクリプトーム解析と、包括的なRNAシュードウリジン化修飾部位の同定・比較解析を試みた。前者の解析から、一次細胞内共生進化の初期段階にあるシアネレのトランスクリプトームの全容が世界で初めて明らかになり、後者においても、有殻アメーバのシアネレのRNAシュードウリジン化修飾部位が同定されて、共生進化初期におけるオルガネラのRNA修飾(エピトランスクリプトーム)の様相が初めて明らかになった。ミトコンドリアや葉緑体を生み出した一次共生進化の初期過程で、宿主ゲノムと共生者ゲノムの機能的統合はどのように進むのだろうか。比較的最近シアノバクテリアを取り込んで真核光合成生物となった有殻アメーバにおいて、RNA修飾酵素遺伝子がシアノバクテリアからアメーバへと水平伝播していることを申請者はゲノム解析により見出した。本研究では、RNA修飾・エピトランスクリプトームがゲノムの機能的統合で果たす役割を、有殻アメーバのRNAシュードウリジン化酵素遺伝子の転移・再編成をモデルとして解明することを目的としている。平成28年度においては有殻アメーバのシュードウリジン合成酵素遺伝子のシアノバクテリアへの形質導入と光合成オルガネラ(シアネレ)のトランスクリプトーム解析を予定していた。前者については、有殻アメーバのゲノム、トランスクリプトームの配列情報が断片化・欠落していたことが、本研究を遂行する上で新たな強い障害となったため、まずPacbioシーケンサーを用いた完全長cDNA解析を行い、本生物のゲノム・トランスクリプトーム情報の整備を行った。次いで得られた高精度アノテーション情報をもとにクローニングを試みたが難航し、目的遺伝子が大腸菌の増殖を抑制する難クローニング性遺伝子であることが示唆された。一方、シアネレトランスクリプトーム解析については、対象生物が増殖不調になったため、シアネレ単離の条件検討に留まり、主たるRNAseq解析は次年度へと持ち越した。本年度の研究により有殻アメーバの高精度ゲノムアノテーションを得ることができた。その解析から、シアノバクテリアとの共生が始まるタイミングでウイルスがアメーバに感染しはじめた痕跡が見つかり、「ウイルスと細胞内共生進化の関係」が世界で初めて明らかになった。この発見については植物生理学会関連集会オルガネラワークショップにて発表された。有殻アメーバRNAシュードウリジン合成酵素の機能・特性を明らかにするため、平成28年度においては、同酵素遺伝子のシアノバクテリアへの形質転換を予定していたが、予想外にもこの遺伝子のクローニングが難航した。シュードウリジン合成酵素は、原核生物においてrRNA等の機能性RNAに作用して立体構造を変化させることから、機能性RNAの機能障害が有殻アメーバ遺伝子の形質導入により大腸菌内で引き起こされて、大腸菌の増殖が著しく阻害されたのではないかと推測される。これは申請者が提唱する「核に転移したRNA修飾酵素遺伝子が原核型共生者の増殖を制御する」という仮説とよく合致する。計画時に想定していた形ではないものの、本遺伝子の特性について、情報が皆無の状態から進展してその性質の一旦を明らかにできた点は大きいと申請者は考える。また本解析を進めるにあたり、有殻アメーバのゲノムアノテーションを一般的な分子生物学実験に使用できる水準まで整備した。そしてその解析から、ウイルス感染が細胞内共生進化に関わることを示唆するデータを得る等、新発見がもたらされた。本研究で得た有殻アメーバの高精度ゲノムアノテーションは当該分野において今後も発見をもたらす貴重な研究リソースになると考えられる。また本課題においては有殻アメーバの増殖が不安定である点が研究の律速になっていたが、この問題においても、ウイルスの関与がゲノムアノテーションの解析から示唆され、今後の培養の改善を図ることが可能になった。初年度においては、アメーバの増殖不調により予定していたシアネレトランスクリプトーム解析を行えなかったのの、シュードウリジン合成酵素遺伝子の特性について知見を得た他、情報インフラ整備により、当初においては予想もしなかった新発見、今後の研究改善に繋がる情報を得たことを鑑みて、申請者は研究の進捗は概ね順調に進展していると考える。本研究は、進化史上比較的最近にシアノバクテリアを取り込んで真核光合成生物となった有殻アメーバをモデルに、一次細胞内共生進化における「ゲノムの機能的統合」と「RNA修飾・エピトランスクリプトーム制御」の関わりを、最新のゲノム科学的アプローチにより、明らかにすることを目的にしている。平成29年度においては、次世代シーケンサーを用いた有殻アメーバの光合成オルガネラ(シアネレ)のトランスクリプトーム解析とRNAのシュードウリジン化修飾を包括的に解析するPseudo-Seqを実施した。前者においては、世界で初めて、一次細胞内共生進化の初期段階にある光合成オルガネラの転写物の全容が明らかになった。その解析から、シアネレとシアノバクテリアが類似した遺伝子発現パターンを持つことが示され、シアネレが遺伝子発現レベルで、祖先種である共生シアノバクテリアの特性を強く残していることが判明した。Pseudo-Seq解析においては、既存の手法をそのまま有殻アメーバの微量サンプルに適用することが極めて困難であることが、予備実験より示唆された。そこで、磁気ビーズによる核酸サイズ分画法を組み合わせた、必要RNA量が一桁以上少なくても済む新規の微量型Pseudo-Seqライブラリ作成系の開発を試み、最終的に有殻アメーバを含む54(27試料、2処理区)の微量サンプルのPseudo-Seqライブラリの構築に成功した。

現在、それらのシーケンス解析を行っている。Pseudo-Seq解析は、RNAシュードウリジン化という全生物界で見られる普遍的な現象を包括的に検出する手法としてCarlileらにより2014年に初めて報告されたものの、煩雑な実験手順、大量のRNAを要求する等の問題を持ち、現在においても実験系の改善が望まれる状態にある。これらの問題についても本研究は、新たな解決手法を提案した。本研究は、進化史上、比較的最近にシアノバクテリアを取り込んで真核光合成生物になった有殻アメーバに着目して、その若い光合成オルガネラ(シアネレ)とシアネレに近縁なシアノバクテリアについて、トランスクリプトーム解析と、包括的なRNAシュードウリジン化修飾部位の同定・比較解析を試みた。前者の解析から、一次細胞内共生進化の初期段階にあるシアネレのトランスクリプトームの全容が世界で初めて明らかになり、後者においても、有殻アメーバのシアネレのRNAシュードウリジン化修飾部位が同定されて、共生進化初期におけるオルガネラのRNA修飾(エピトランスクリプトーム)の様相が初めて明らかになった。平成29年度においては、当初の予定どおりに有殻アメーバとシアノバクテリアのSynechococcus類、Prochrorococcus類のPseudo-seq解析を優先して行う。また28年度に行えなかった有殻アメーバシアネレのトランスクリプトーム解析も実施する。その際、計画していた生化学的手法によるシアネレ単離は、ゲノム解読を行った有殻アメーバ株では難しいことがこれまでの解析から判明したため、単離を行わず全RNAのトランスクリプトーム解析を行った後、バイオインフォマティクス手法により、シアネレトランスクリプトを抽出して解析する。有殻アメーバのシュードウリジン合成酵素遺伝子のシアノバクテリアへの形質転換については、分子の特性から困難と考えられるものの、研究上重要であるので、29年度においても引き続き試みる。以上の解析から得られた結果をまとめて、論文発表を行う。進化28年度に想定していた有殻アメーバのシアネレのトランスクリプトーム解析実験が、同アメーバの増殖不調のために行えなかった。その費用が次年度の使用額として繰り越された。28年度に行えなかった有殻アメーバのシアネレトランスクリプトームのRNAseq解析実験を、平成29年度実施予定のPseudo-seq解析に加えて行う。
Y-Ba-Cu-O系高温超伝導体の構造欠陥と性能劣化の高分解能電顕による研究

本研究課題に関して、Y系酸化物高温超伝導体及びBi系酸化物高温超伝導体の構造を主として高分解能電顕により研究して以下の成果を得た。焼結法により作製した結晶中に面状欠陥が存在すること、面状欠陥はBaO層間への余分なCuO層の挿入によること、軸比b/aには場所的変動があり、これは酸素濃度分布の不均質性に由来すること等を示した。また、水蒸気による分解過程を研究し、分解はBaO層からのBa脱離から始まり、最終生成物は試料表面上のBaCO_3、結晶粒界上のY(OH)_3、及び残存CuOの再結合によるCuOであること等を示した。Bi原子の周期的偏在に起因する特異な非整合変調構造がb軸方向に存在する結果、結晶が著しく歪んでいることを高分解能電顕観察により見いだし、観察結果にもとずいて結晶内に縦波及び横波成分を持つ変位波の存在を仮定して構造模型をつくり、これが電子回折強度分布をよく説明することを示した。また、Biの一部をPbで置換した試料を研究し、Pb置換が結晶内部歪みをかなりの程度減少させることを見いだし、上と同様な変位波模型をつくり、電子回折強度分布を説明した。また、Pb置換量を増加させると、無置換のときの相(非整合周期4.8b_0;b_0は基本周期)の他に周期の長い相(7b_08b_0)も出現することを見いだした。Caの一部をYで置換すると、置換量の増加と共に非整合周期は次第に減少してゆき、周期4b_0、8b_0の整合相が生成する。これとは別に、非整合構造の超空間群理論による説明を行い、消滅則から超空間群N_<111>またはN_<111>を導き、変位波や原子占有確率を得て、観察像と比較してよい結果を得た。本研究の目的は高温超伝導酸化物の結晶構造や構造欠陥を高分解能電顕法により原子レベルで研究することであるが、本年度に於ては以下の研究成果が挙げられた。なお、研究計画は順調に消化しつつある。1.高分解能電子顕微鏡(JEM-2000FX、日本電子、200kV)を設置し、性能評価を行ない、本研究を遂行するのに十分な性能を有するものと判定した。2.Y系酸化物高温超伝導体の構造と欠陥の観察を行ない、双晶構造と構造不整の原子レベルでの解析を行なった。この物質の構造は斜方晶系に属し、C軸方向に各原子面が規則的に積層しているが、Ba原子面間にはさまれたCu原子面で積層不整が出現することを見出し、構造不整を明らかにした。また、軸比b/aが局所的に変動していることを見出し、これは酸素濃度が局所的に変動しているためとした。3.Gd系酸化物高温超伝導体(強磁性)の眞空中加熱による相転移をその場電顕法により調べ、昇温時には約400°Cから双晶構造がくずれはじめ、約500°Cで完全に正方晶に転移すること、冷却時には相転移はおこらないが、新たな超構造が出現することを見出した。これらの変化は酸素の離脱に伴う現象であると結論した。4.Bi系酸化物高温超伝導体における変調構造を研究し、C面に平行に積層しているBi二重原子層中でBi原子の偏析が起こり、これが強い格子歪を伴う構造変調発生の原因であるとし、新らしい変調構造模型を提出し、電子回折強度分布の説明を行なった。5.Bi系酸化物高温超伝導体の空間群を4次元空間群理論に基づいて解析した。6.酸化物高温超伝導体中の磁束分布の超微粒子

低温蒸着法による観察を試みたが、鉄超微粒子径が大きすぎたので失敗した。本年度に於いては、Y系酸化物高温超伝導体並びにBi系酸化物高温超伝体に関し高分解能電顕を主として使用して研究を行なった。1.Y系酸化物の研究.この系の超伝導体は水による性能劣化が著るしい。その機構解明のため、焼結法により作製したYBa_2Cu_3O_<7-y>の試料を室温及び55°Cの飽和水蒸気中に放置し、時間経過に伴う構造変化を電気抵抗測定、インダクタンス測定、X線回折法、高分解能電顕法により調べた。その結果、転移温度Tcは変化せず超伝導相の体積率が時間と共に減少すること、分解生成物はBa_2CO_3、Y(OH)_3及びCuOであること、分解は...ーCuOーYーCuOーBaOーCuOーBaOーCuOーYー...の積層構造のBaOーCuOーBaO層から出発すること、Ba_2CO_3は試料表面に、Y(OH)_3は結晶界面に形成されること、CuO層は結晶内でCuO結晶を形することが判明した。2.Bi系酸化物の研究.この系の超伝導体は結晶のb軸に沿って非整合長周期を示すのが特徴である。その詳細を解明するため金属元素の一部を他金属元素で置換したものについて高分解能電顕法による研究を行なった。用いた試料は液体急冷・焼鈍法及び焼結法により作製したBi_<2-x>Pb_xSrCaCu_2O_<8+y>(x=01.0;2212相),Bi_<2-x>Pb_xSr_2Ca_2Cu_3O_<10+y>(x=00.3;2223相)及びBi_2Sr_2Ca_<1-x>YxCu_2O_<8+y>(x=00.5;2212相)である。研究の結果、Pb置換試料では、x≦0.1のときの変調周期は4.8b_0(b_0は基本周期)たが、x≧0.2となるとこれと異なる変調周期をもつ相もあわせて出現し、その周期はPb置換量の増加と共に増加して7b_08b_0と変化する。Y置換試料では、x=0のときの変調周期4.7b_0からx=0.8の4.0b_0までのxの増加と共に変調周期は次第に減少するが、x=1.0になると新たな周期8.0b_0のものが出現する。また、計算像・回折強度分布と実測のものとも比較した。
食用植物種子は時計遺伝子発現を制御するか？-食による新たな疾病予防への挑戦－

24時間周期は視交差上部核で制御されている。ヒト肺老齢線維芽細胞時計遺伝子(Per1&Bmal1)と時計制御遺伝子(Sirt1)に関し、種子熱水、エタノール抽出物の影響を分析した。Per1増加は熱水、エタノール抽出物であった。Bmal1は増加、Sirt1は抑制、PER1とBMAL1転写因子は増加、SIRT1はレスベラトロールと類似、グルココルチコイド受容体は増加。種子抽出物は時計機構の標的となる可能性がある。食用植物種子(EPS)による概日リズムのリセットは可能であるか。時計遺伝子の転写因子に変化を与えることがkeyとなる。EPSは時計遺伝子のmRNA発現を活性化するか。リアルタイムPCRによるスクリーニングを行った。【EPSによるmRNA発現影響確認】20種のEPS抽出試料のうち、その効果が期待される試料をヒト繊維芽細胞に一定期間投与し、mRNA抽出を行いリアルタイムPCRにてスクリーニングを行いmRNA発現が増加しているか確認した。ターゲットとする遺伝子は、予算と発現量の関係からPer1とBmal1とし、それぞれのmRNAが食用植物種子によって活性化されるか検討した。【時計遺伝子mRNA発現のスクリーニング】〈1試料の調製〉食用植物種子(EPS)は、粉砕後以下の抽出法によって抽出した。a)熱水抽出(Hot-W)b)エタノール抽出(EtOH)し、調製試料とした。(試料抽出調製担当:研究協力者岡田瑞恵)〈2細胞の調整〉ヒト繊維芽細胞を37°C、5%CO2条件下にて、一定期間培養し、細胞の調整を行った。〈3試料投与及び培養〉一定細胞数に達した段階で、マイクロプレートに細胞を播種後、Hot-W、EtOH抽出試料を投与し、4時間培養した。〈4RNAの抽出〉調製試料を投与し培養後、各マイクロプレートwellからtotal RNAを抽出した。〈5時計遺伝子のmRNA発現〉4で抽出を行ったtotal RNAは、Per1とBmal1のそれぞれのmRNAを逆転写させcDNAを合成後、リアルタイムPCRにて測定し解析した。【結果】最終的時計遺伝子のコントロール(ハウスキーピング遺伝子)に対する発現量の比較検討から、Bmal1ついては、チンゲンサイ5.9倍、キャベツ2.2倍、ホウレンソウ1.5倍、(いずれもEtOH)、レタス2.9倍、コマツナ2.0倍、コーン1.5倍(いずれもHot-W)、また、Per1は、チンゲンサイ5.9倍、ホウレンソウ2.0倍、エダマメ1.9倍(いずれもEtOH)の発現量増大を示した。特に、問題なし。当初の研究計画通り進行しており、研究成果も得られている。食用植物種子抽出物(EPS)は、概日リズムに影響を与えるのか。この問いに対し、時計遺伝子の転写因子に影響を与えることがkeyとなると考え、本年度は平成26年度における発現へup or down-regulationしたサンプルについて、その転写因子に対する影響を確認するため、それらの転写因子量を検討した。【mRNAの発現結果から転写因子量測定による確認:方法】平成26年度に、EPSをヒト線維芽細胞に投与し、ターゲットとした遺伝子Per1, Bmal1について、各々のmRNA発現に影響を与えたEPS計8種を選択した。Per1, Bmal1転写因子の定量を行いmRNA発現の確認試験とした。試料は、平成26年度の実験で得られた細胞上清を用い、ELISA法によって測定した。【結果】EPS添加とコントロールに対する産生転写因子量の比較検討を行った。エタノール抽出のPER1の結果は、キャベツ16.4、チンゲンサイ10.8、ホウレンソウ4.3倍を示し、熱水抽出のPER1は、ニガウリ20.0、コマツナ18.2、コーン10.6、レタス10.3倍であった。これに対し、そのmRNA発現量は、キャベツ0.7、チンゲンサイ5.9、ホウレンソウ2.0倍を示し、熱水抽出は、ニガウリ0.5、コマツナ1.0、コーン0.5、レタス1.0倍であった。一方、エタノール抽出におけるBMAL1は、キャベツ2.3、ホウレンソウ2.1、エダマメ1.0、チンゲンサイ1.7倍を示し、熱水抽出は、レタス2.2、コマツナ2.0、コーン2.0、ニガウリ1.9倍を示した。これに対し、そのmRNA発現は、キャベツ2.2、ホウレンソウ1.5、ダイズ1.8、チンゲンサイ5.9倍で、熱水抽出は、レタス2.9、コマツナ2.0、コーン1.5、ニガウリ0.4倍であった。mRNA発現量と転写因子との間の関連性は、分かれる結果となった。その理由を含め、機構との関連から検討する。特に、問題なし。当初の計画通り進行しており、研究成果も予想通りの結果として得られている。我々哺乳類は、生体活動を実施するにあたり24時間周期システムが存在する。

このシステムは、視床下部中の視交差上部の核や、周辺組織(例えば肺組織)に存在する。また、このシステムは、時計遺伝子と呼ばれるPeriod (Per), ARNTL(BMAL), Clock (Clk), Cryptochrome (Cry)の4つの遺伝子が関与している。一方、若齢、老齢ヒト線維芽細胞に対する熱水とエタノール抽出両サンプルの時計遺伝子(Per1とBmal1)の活性化を報告した。Bmal、PerのmRNA発現制御は、長寿遺伝子(Sirt1)の活性化あるいは、グルココルチコイド受容体(Glucocorticoid Receptor; GR)が、リガンド依存的に核内移行して転写因子として活性化されるかのいずれかであると推察する。それ故、時計遺伝子の活性化の機構を探るため本年は、GRに対する効果を検討し、Sirt1と比較分析した。研究方法は、乾燥種子に水を加えホモジェネートし、湯煎にて加熱(95-100°C、10分間)後、60分間攪拌した。その後ろ過して熱水抽出サンプルとした。また、エタノール抽出は、種子に25倍量の70%エタノールを加え、撹拌後24時間ホモジェネートし、ろ過してサンプルとした。ヒト肺由来線維芽細胞TIG-1-60(PDL60)TIG-1-20(PDL20)は調製培養後、サンプルを加え37°C、5%CO2条件下で4時間培養し、培養後、その上清についてGR活性化への影響を測定した。結果は、若齢細胞に対するGR量(ng/mL)への影響についてチンゲンサイ0.526,ホウレンソウ0.290、コマツナ1.92、ニガウリ0.845、レタス0.230であった。一方、老齢細胞に対するGR量(ng/mL)への影響は、コマツナ1.20、コーン0.261であった。また、これらの値はSirt1の発現量との関連性が推察された。【平成27年度】EPSによる時計遺伝子のmRNA発現の結果について転写因子の定量を行う。【mRNAの発現増加を転写因子による確認】20種のEPS抽出投与における時計遺伝子Per1、Bmal1のそれぞれの転写因子PER1、BMAL1の定量を行い、各々の時計遺伝子mRNAの発現を確認する。転写因子測定試料は、平成26年度実験において得られた細胞抽出物を-80°Cで保存していた試料を使用して実験を行う。【時計遺伝子mRNA発現の確認試験】平成28年度の研究実施計画平成26,27年度の研究計画から得られた研究結果について、食用植物種子抽出物(EPS)の時計遺伝子発現機構に関し、現在推察されている機構から、これを検証するため平成28年度の研究計画を実施する。具体的には、次の2つの経路が推察されている。以上がある。それ故、これらの2経路についてそれぞれ検証する。すなわち、Sirt1/PCG-1α経路による発現であるか判断するため、Sirt1の測定を行う。また、Glucocorticoid receptorにEPSが結合し活性化するか否か、Glucocorticoid receptor kitにより測定を行う。