hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アート型銀塩基を用いた芳香環の新規官能基化反応

芳香族銀化合物は、リチウムやマグネシウム、亜鉛、銅といった金属種に比べて調製法が限られており、これまで有機金属化合物としての反応性はほとんど調べられてきませんでした。我々はまず、芳香族銀アート化合物の合成法として、deprotonative ortho argentationを開発しました。本手法によって、芳香環上に多数存在するC-H結合のうち特定のC-H結合についてメタル化反応が進行し、高い位置・化学選択性にて様々な芳香族銀化合物を合成することができるようになりました。芳香族銀アート錯体の調製に必要となるアミド銀アート塩基の構造はX線結晶構造解析およびDFT計算を用いて明らかにしています。また、生じる芳香族銀アート中間体は、芳香族アニオン等価体として種々の求電子剤と効率よく反応することがわかりました。我々は特に、ジスルフィドやジアゾニウム塩との反応に着目して、ジアリールスルフィドやジアリールアゾ化合物の効率的合成法へと展開しました。これらの生成物は、天然物や医薬品、機能性分子として注目されている重要な分子群です。また、芳香族銅化合物を用いた「芳香族C-H結合同士の酸化的クロスカップリング反応」も効率よく進行する条件を見出しました。既存の芳香族クロスカップリング反応は芳香環上の目的の反応点をハロゲン化やメタル化等によって規定し、これらを基点に反応を行います。我々が今回見出した方法は、事前の修飾化を必要としないため、廃棄物や合成段階数の削減につながるため、基礎・応用の両面で重要であると考えられます。これまで報告例がほとんどない芳香族銀アート化合物の調製法を開発し、その構造および反応性を明らかにしました。研究結果について、現在は論文を執筆中です。開発した芳香族銀アート種の調製法は、既存の芳香族メタル化反応と比較しても、極めて高い官能基許容性を有することがわかりました。さらに、生じる芳香族銀中間体は天然物や機能性分子の部分構造として重要なジアリールスルフィドやジアリールアゾ化合物を容易に与えることを見出しました。さらに、芳香族銅化合物についても、比較的温和な条件で芳香族C-H結合同士を直接的クロスカップリングする反応を見出しました。今後の検討によってその反応特性を明らかにし、次年度内に論文を発表する予定です。(A)これまでに芳香族銀アート種の調製法を確立することができたため、これを用いて求核種としての一般的な反応性について精査しました。次年度は、芳香族銀アート種を新たな活性化法に付すことで、高反応性活性種として知られている芳香族ラジカルの発生法へと展開することを企画しています。芳香族ラジカルは高度に不安定な化学種であるために、その活用法は限られてきましたが、調製に用いる試薬を新たに設計することで反応を制御し、精密有機反応へと展開できると考えています。(B)芳香族C-H結合同士の直接的クロスカップリング反応は、事前の修飾化を必要としないクロスカップリング反応であり、基礎・応用の両面で注目されていますが、これまでに実用的な報告例はほとんどありません。我々は、ジアリール銅アート中間体の調製法を開発し、これを適切に酸化することで上記反応を達成するべく種々の検討を行ってきました。今後はさらなる高効率化を目指した反応条件の検討を行うとともに、基質一般性を精査します。

さらに、芳香族銅化合物についても、比較的温和な条件で芳香族C-H結合同士を直接的クロスカップリングする反応を見出しました。今後の検討によってその反応特性を明らかにし、次年度内に論文を発表する予定です。(A)これまでに芳香族銀アート種の調製法を確立することができたため、これを用いて求核種としての一般的な反応性について精査しました。次年度は、芳香族銀アート種を新たな活性化法に付すことで、高反応性活性種として知られている芳香族ラジカルの発生法へと展開することを企画しています。芳香族ラジカルは高度に不安定な化学種であるために、その活用法は限られてきましたが、調製に用いる試薬を新たに設計することで反応を制御し、精密有機反応へと展開できると考えています。(B)芳香族C-H結合同士の直接的クロスカップリング反応は、事前の修飾化を必要としないクロスカップリング反応であり、基礎・応用の両面で注目されていますが、これまでに実用的な報告例はほとんどありません。我々は、ジアリール銅アート中間体の調製法を開発し、これを適切に酸化することで上記反応を達成するべく種々の検討を行ってきました。今後はさらなる高効率化を目指した反応条件の検討を行うとともに、基質一般性を精査します。
確率的な５次元テンソル光線空間に基づく映像からの写真現像

本研究は,「カメラの設定を行い,被写体を視野に収めてからシャッターを切る」というこれまでの常識的な撮影方法から,「カメラの設定値を変えながらビデオを撮影し,後から計算処理で所望の状態の画像を現像する」という撮影のパラダイムを変えることで,今まで以上の画質と高い臨場感,機能性を実現する撮影方法の確立を目指す.処理の流れとしては「撮影」,「再構成」,「現像」の3つのステップを行うこととなる.そのために,大量の情報を効率的に扱える新たなデータ構造や,撮影・現像方法の検討を行う.そのデータ構造には,光線空間と呼ばれる光の位置・角度を保持する4次元空間を基に,値を一意ではなく確率的に変動可能な状態で保持できるように5次元テンソルへと拡張する.加えて,コンピュテーショナルフォトグラフィの研究で用いられてきた連射撮影やフラッシュの活用,パノラマ画像や超解像,ぼけ生成などの研究を,このデータ構造を用いて包括的に捉えることで,この研究分野の体系化を試みる.今年度は,多数取得される画像を統合させる「再構成」のための情報としてデプスマップによる3次元情報の剛体位置合わせと,オプティカルフローによる情報の位置合わせについて検討した.また,統合後の「現像に相当する」画像処理を行うためのHDR画像合成や自由視点画像合成アルゴリズム,リフォーカシングアルゴリズム,霞除去アルゴリズムについて検討した.また,その中で用いられるフィルタリング手法であるガウシアンフィルタやバイラテラルフィルタ,ガイデットフィルタ,DCTフィルタといった空間フィルタリングの高速化,高精度化手法を検討し,高速かつ高精度な現像が可能にした.本研究は,各処理を(1)撮影,(2)再構成,(3)現像の3段階に分けて進めものである.そして,これら処理と従来のコンピュテーショナルフォトグラフィの研究との関連を明らかにすることで,この分野の研究の体系化を進める.今年度は,まず撮影環境として,通常のスマホや一眼レフに加えてデプスセンサを購入し,それらの撮像環境を整備した.そして,アプリケーションとしてHDRや,自由視点画像合成を対象として,再構成手法の様々な検討を行った.まず,自由視点画像合成に関しては,デプスセンサの剛体レジストレーションをより簡単かつロバストに可能なキャリブレーションパタンを構築した.そしてHDRに関しては,まず通常のスマートフォンで映像を撮影し,カメラの運動が少ない場合と大きい場合で,レジストレーションがどの程度可能かを検証した.このレジストレーションには複数の動きベクトル推定アルゴリズムを適用して検証した.加えて,デプスセンサを用いてそのレジストレーションの精度が向上できるか試みた.最後に,現像処理においては,複数の画像を結合するためのフィルタリング処理が重要となる.そのフィルタリングの高速化,高精度化を行うために,ガウシアンフィルタ,バイラテラルフィルタ,ガイデットフィルタといった基礎的なフィルタについて,これまで以上に高速に動作する近似高速化アルゴリズムを提案し,またそのアルゴリズムが高速に動作するようなハードに合わせた実装方法を検討した.加えて,高速なぼけ復元アルゴリズムの検討を行った.Google pixelに代表されるように,カメラ内での連射,複数カメラの撮影データから高精度な画像を生成する流れが進んでいる.しかし,本研究のように大きな範囲を動作した画像群から高精度な画像を現像するという挑戦的な試みまでは進んでいない.しかしながら,そのハードウェア等は現実的な計算時間で画像処理を追わらせるために重要なファクターである.そのため,そのようなハードウェアに基づいて撮影する方法を新たに考案する.加えて当初の予定通り,複数の画像合成アプリケーションに応じた作ったレジストレーション方法からの再構成方法を統合し,包括的にコンピュテーショナルフォトグラフィのアプリケーションを考えることができるフレームワークを構築していく.密な光線空間を基に,実際に処理する場所を考慮して確率的にデータの有無が確認可能なデータ構造を構築し,間引き処理や選択的な画素の取得が可能なデータ構造の構築を目指す.これらと並行して,コンピュテーショナルフォトグラフィの基盤的な役割を果たすフィルタリングの高精度化,高速化の研究を引き続き進めていく.特にエッジ保存平滑化フィルタであるバイラテラルフィルタやガイデットフィルタの近似高速の達成を目指す.これらのフィルタは,再構成処理,現像処理どちらでも用いるため,このフィルタの高速化,高性能化が達成できれば大きく性能が向上する.本研究は,「カメラの設定を行い,被写体を視野に収めてからシャッターを切る」というこれまでの常識的な撮影方法から,「カメラの設定値を変えながらビデオを撮影し,後から計算処理で所望の状態の画像を現像する」という撮影のパラダイムを変えることで,今まで以上の画質と高い臨場感,機能性を実現する撮影方法の確立を目指す.処理の流れとしては「撮影」,「再構成」,「現像」の3つのステップを行うこととなる.そのために,大量の情報を効率的に扱える新たなデータ構造や,撮影・現像方法の検討を行う.そのデータ構造には,光線空間と呼ばれる光の位置・角度を保持する4次元空間を基に,値を一意ではなく確率的に変動可能な状態で保持できるように5次元テンソルへと拡張する.加えて,コンピュテーショナルフォトグラフィの研究で用いられてきた連射撮影やフラッシュの活用,パノラマ画像や超解像,ぼけ生成などの研究を,このデータ構造を用いて包括的に捉えることで,この研究分野の体系化を試みる.今年度は,多数取得される画像を統合させる「再構成」のための情報としてデプスマップによる3次元情報の剛体位置合わせと,オプティカルフローによる情報の位置合わせについて検討した.また,統合後の「現像に相当する」画像処理を行うためのHDR画像合成や自由視点画像合成アルゴリズム,リフォーカシングアルゴリズム,霞除去アルゴリズムについて検討した.

また,その中で用いられるフィルタリング手法であるガウシアンフィルタやバイラテラルフィルタ,ガイデットフィルタ,DCTフィルタといった空間フィルタリングの高速化,高精度化手法を検討し,高速かつ高精度な現像が可能にした.本研究は,各処理を(1)撮影,(2)再構成,(3)現像の3段階に分けて進めものである.そして,これら処理と従来のコンピュテーショナルフォトグラフィの研究との関連を明らかにすることで,この分野の研究の体系化を進める.今年度は,まず撮影環境として,通常のスマホや一眼レフに加えてデプスセンサを購入し,それらの撮像環境を整備した.そして,アプリケーションとしてHDRや,自由視点画像合成を対象として,再構成手法の様々な検討を行った.まず,自由視点画像合成に関しては,デプスセンサの剛体レジストレーションをより簡単かつロバストに可能なキャリブレーションパタンを構築した.そしてHDRに関しては,まず通常のスマートフォンで映像を撮影し,カメラの運動が少ない場合と大きい場合で,レジストレーションがどの程度可能かを検証した.このレジストレーションには複数の動きベクトル推定アルゴリズムを適用して検証した.加えて,デプスセンサを用いてそのレジストレーションの精度が向上できるか試みた.最後に,現像処理においては,複数の画像を結合するためのフィルタリング処理が重要となる.そのフィルタリングの高速化,高精度化を行うために,ガウシアンフィルタ,バイラテラルフィルタ,ガイデットフィルタといった基礎的なフィルタについて,これまで以上に高速に動作する近似高速化アルゴリズムを提案し,またそのアルゴリズムが高速に動作するようなハードに合わせた実装方法を検討した.加えて,高速なぼけ復元アルゴリズムの検討を行った.Google pixelに代表されるように,カメラ内での連射,複数カメラの撮影データから高精度な画像を生成する流れが進んでいる.しかし,本研究のように大きな範囲を動作した画像群から高精度な画像を現像するという挑戦的な試みまでは進んでいない.しかしながら,そのハードウェア等は現実的な計算時間で画像処理を追わらせるために重要なファクターである.そのため,そのようなハードウェアに基づいて撮影する方法を新たに考案する.加えて当初の予定通り,複数の画像合成アプリケーションに応じた作ったレジストレーション方法からの再構成方法を統合し,包括的にコンピュテーショナルフォトグラフィのアプリケーションを考えることができるフレームワークを構築していく.密な光線空間を基に,実際に処理する場所を考慮して確率的にデータの有無が確認可能なデータ構造を構築し,間引き処理や選択的な画素の取得が可能なデータ構造の構築を目指す.これらと並行して,コンピュテーショナルフォトグラフィの基盤的な役割を果たすフィルタリングの高精度化,高速化の研究を引き続き進めていく.
腫瘍内浸潤免疫系細胞の細胞動態を指標にした口腔癌に対するオーダーメイド治療の開発

口腔扁平上皮癌(Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC)の予後予測因子として,TNMなどの臨床病態因子や種々の分子が検討されているが,いまだ明確な候補因子は見いだされていない。そこで本研究では,OSCCの臨床病態とMICA,sMICAおよび腫瘍内浸潤免疫細胞との関連性を明らかにした。その結果、個人個人にあったオーダーメイド医療の可能性が示唆された。これまでの研究で、再発症例では,腫瘍内浸潤細胞密度は低下していた。特にCTおよびIM部におけるCD45ROの発現低下と再発には有意な相関関係を認めた。浸潤免疫細胞密度が高いほど,生存期間の延長を示した。特にCD45RO陽性細胞浸潤密度と生存期間には有意な相関関係が認められた。また浸潤免疫系細胞密度が高いほど,無病生存率も高いことが明らかとなった。StageIやII症例であっても,CD45RO発現が低い症例の無病生存率は低下していた。一方,stageIV症例であっても,CD45ROの高発現症例では高い無病生存率を示した。以上の結果から,口腔扁平上皮癌組織において,腫瘍細胞によるMICAの発現と,腫瘍内浸潤免疫細胞の浸潤密度は正の相関関係がある事が示された。特にCD45RO陽性メモリーT細胞の浸潤動態は,口腔扁平上皮癌の再発,無病生存率および生存率と有意に相関していたことから,MICAおよびCD45RO分子は,口腔扁平上皮癌の腫瘍免疫において重要な機能を果たしているとともに,口腔扁平上皮癌の予後予測因子として非常に有用であることが示された。今後、メモリーT細胞の分化誘導に関する遺伝子についてもさらに検討していく。前年度までの報告で、浸潤免疫系細胞密度が高いほど,無病生存率も高いことが明らかとなった。Stage IやII症例であっても,CD45RO発現が低い症例の無病生存率は低下していた。一方,stage IV症例であっても,CD45ROの高発現症例では高い無病生存率を示した。口腔扁平上皮癌組織において,腫瘍細胞によるMICAの発現と,腫瘍内浸潤免疫細胞の浸潤密度は正の相関関係がある事が示された。メモリーT細胞の表出するCD45分子の選択的スプライシングにおいて,ヘテロ核リボ核蛋白質L様分子(hnRNPLL)が誘導性制御因子として機能している可能性が報告されている。刺激を受けたT細胞では,hnRNPLLの発現量が上昇する。またhnRNPLLの発現を抑制するとCD45RAの発現量は上昇し,CD45RO発現量は低下すること,一方hnRNPLLの過剰発現で,CD45RAの発現量は低下し,CD45RO発現量は高くなることが報告されている。実際OSCC組織由来RNAを用い,リアルタイム定量PCR法にてhnRNPLLの発現を検討した結果,CD45RO遺伝子発現量と正の相関関係(P<0.01)を認めた。したがって,hnRNPLLの発現を制御することによりメモリーCD8^+T細胞の分化維持促進を制御することが可能ではないかと考えられた。さらに本分子の制御は先に述べたようなメモリーT細胞を用いた免疫細胞治療を行う際に,移入細胞の活性を腫瘍組織内で長期間維持させるためにも有用と考えられた。
口腔粘膜上皮バリア機能の3D解析

これまでに報告されている共焦点顕微鏡と3D構築ソフトを用いたマウス耳介上皮におけるタイトジャンクションの観測方法を基本として、より口腔粘膜上皮に適したタイトジャンクションの観察方法を確立するために染色時間や試薬濃度のといった条件を検討した。その結果、1次染色時間を増加することで従来の方法よりもより鮮明にマウス口腔粘膜のタイトジャンクションの構成タンパク質であるClaudin-1、Claudin-4や裏打ちタンパク質であるZO-1の観察が可能となった。本研究はヒト口腔粘膜上皮におけるタイトジャンクション(tight junction: TJ)の分布や構造、TJ直下の樹状細胞、免疫担当細胞を3Dで同時に観察できる方法を確立することが第一の目的である。TJ構成蛋白質にはclaudinファミリー蛋白があり、表皮においてはClaudin-1と-4が発現していることが既に示されている。平成27年度は抗Claudin-1抗体に加え、TJ裏打ち蛋白である抗ZO-1抗体を用いて、野生型マウス口腔粘膜上皮を各種抗体で染色後、共焦点顕微鏡で観察し、TJが最適に観察できる抗体希釈濃度、染色時間などの条件を検討した。結果はマウス耳介上皮で既に確立されている染色方法ではマウス口腔粘膜上皮のTJを観察することができなかったため、染色時間を2日延長することで共焦点現鼻鏡でTJ構造の観察は可能となった。しかし、3D構築ソフトを用いた立体構造観察では鮮明なデータを得ることができなかった。今後、ソフト処理や撮影条件を検討する必要があると思われる。次年度は、マウス口腔粘膜上皮をより鮮明に観察する条件を検討、確立し、その手法にてヒト口腔粘膜における最適な染色条件を確立することが目標となる。マウス口腔粘膜上皮においても耳介上皮と同様にTJの三次元構造を確認することができたため。本研究の最終的な目的はヒト口腔粘膜上皮におけるタイトジャンクションの分布や構造を三次元的に観察できる方法を確立することである。そのため、マウス口腔粘膜におけるタイトジャンクションの三次元的な観察方法を確立することが第1の目標としている。しかし、マウス耳介上皮において既に確立している共焦点顕微鏡と3D構築ソフトを用いた観察方法では、マウス口腔粘膜上皮のタイトジャンクション構成蛋白質Claudin-1、-4やタイトジャンクションの裏打ち蛋白質であるZO-1の存在は確認はできるものの、不鮮明であった。そこで、平成28年度はその染色時間や濃度などの条件を検討し、観察方法をより最適化することを目的とした。そのため、1日毎における継時的な抗体浸透度を確認した。その結果、耳介上皮タイトジャンクションの観察方法では1次染色時間を24時間としていたものを48時間に増加することで以前の方法よりも鮮明な観察をおこなうことが可能となった。この実験結果を基に、次年度ではヒト口腔粘膜上皮においても同様に観察可能か検討することが目標となる。平成28年度はマウス口腔粘膜上皮における最適な観察方法を確立するまでに時間を要したため、当初の研究計画よりもヒト口腔粘膜上皮の観察方法を検討開始までに至らなかったため。本研究の目的はヒト口腔粘膜上皮におけるタイトジャンクションの分布や構造を三次元的に観察できる方法を確立することである。当初はマウス口腔粘膜におけるタイトジャンクションの三次元的観察方法を確立することを第一段階の目標としていた。これまでに報告されているマウス耳介上皮における共焦点顕微鏡と3D構築ソフトを用いた観測方法を基本として、より口腔粘膜上皮に適した方法を確立するために染色時間や試薬濃度のといった条件を検討した。得られた実験結果を基に、健常ヒト口腔粘膜上皮におけるプロトコルを確立し、同様にTJ構造を三次元的に観察することが次段階の目標としていたが、現時点では実験条件の検討までしかできておらず、今後、口腔粘膜上皮を角化・非角化上皮に分類し、表面バリア機能の脆弱と考えられる頬粘膜や舌下粘膜などの非角化上皮と口蓋、舌、歯肉といった角化上皮におけるTJ分布、また各種接着蛋白(claudin,ZO-1)発現についてはリアルタイムPCR法なども用いながら比較検討を行うことが課題となる。本研究は今後、ヒト口腔粘膜上皮におけるTJ構造を観察する予定である。そのため、試料提供を受ける際に、慶應義塾大学医学部倫理委員会へ実験計画が適切な計画であることを承認申請しなければならない。今後はヒト口腔粘膜上皮におけるタイトジャンクションの三次元的観察方法を検討することが目標となる。そのために、慶應義塾大学医学部倫理委員会に実験計画の承認申請を行う必要がある。口腔外科当初の使用予定よりも安価に機器及び試薬の購入が可能であったため。抗体使用量が予定よりも少なくなったため。次年度の実験実施に伴い、適切に使用する。
坑道断面仕上げロボットの関する研究

本研究は、発破後の坑道断面を検査してその断面を仕上げるロボットの開発を目的とした。最初に、資料収集、文献調査により掘削作業の現状と問題点を明らかにし、そして坑道断面仕上ロボットの評価システムの項目を検討してその開発方針を決定した。この結果を踏まえて、5自由度の垂直多関節型ロボットと安価でごみに強く非接触型の超音波センサ-とを組み合わせた坑道断面形状自動検出測定システムを開発し、その特性を実験的に検討すると同時に、ロボットの種々の制御方法、超音波センサ-で迅速に精度良く、かつ定量的に形状を測定できるソフトを開発した。そして、このシステムを用いて、簡単な形状から岩石まで、実際に対象物を検出測定してその有効性を確かめた。その結果、実際の坑道断面を検出測定する場合、どんな三次元形状でも定量的に測定できることが実験的に得られ、かつその精度は縦、横、高さ方向において10mm以内の誤差であり、十分実用的であることがわかった。また、種々の制御方法で検出測定された対象物の形状のデ-タをもとに、それらを様々な視点からリアルタイムで瞬時に見られるようにパ-ソナルコンピュ-タによった画像処理を行った。その結果は実際面でも効果的であることが確認できた。さらに、このシステムで測定された寸法が基準断面と一致するように修正するために、油圧ブレ-カの破壊力を制御できる因子を実験的に求めることを試みた。その結果、供給圧力によるよりも、むしろ平均供給流量を制御することによってそれが可能であり、かつ効果的であることが明らかになった。以上、本研究によりほぼ初期の目的を達成することができた。しかしながら、本研究は骨組みだけの研究であり、今後は本研究で開発、提案したシステムの各部のより詳細な研究が必要である。特に、掘削作業全体を一つのシステムとして総合的にとらえ、さらに実際の現場で検証する必要がある。交付申請書に記載した設備を予定にしたがって購入し、研究はロボット、センサ-の資料収集調査を含め計画どうりに進んでいる。すなわち、形状を非接触で認識できる各種センサ-の中で、坑道内の環境条件に十分対応ができ、かつ測定範囲の大きいセンサ-として超音波センサ-を選定し、購入したマイクロロボットに取付けうる装置を設計製作した。一般に市販されている超音波センサ-は距離のみが測定できるものであり、従ってその特性を検討するため、簡単な形状を有する物体を種々の条件を実験的に求め、その基礎的なデ-タを収集し、形状および高低を検知するアルゴリズムを作成し購入したマイクロコンピュ-タ上にディスプレイさせた。距離だけの測定から超音波センサ-で任意の形状を精度良く認識できる補正するソフトをも含めたアルゴリズムを開発した。この結果、その精度も高くかつ定量的に検出できたことは坑道断面仕上げロボットとしても基本的には十分であることが確認できた。しかし、実際の坑道断面の状態は予想もできない複雑さがあると考えられ、より高速でより正確に定量化できる補正ソフトをも含めたものを今後検討する必要があることが指摘できた。またマイクロロボットの基本特性も確定でき、そのロボットで超音波センサ-の位置と方向を自由に制御できるロボットとセンサ-とを結合させたソフトも作成しその結果も満足できるものとなっている。さらに、浮き石の除去と坑道断面を所定の形状に仕上げるための余分の岩石のはつりのために使用する油圧ブレ-カの破壊力を実験的に検討して考察し、岩石の硬さ、性質など種類によってその破壊力を簡単に制御できる可能性があることがわかり、かつそれらの結果が定量化できた。本研究は、発破後の坑道断面を検査してもの断面を仕上げるロボットの開発を目的とした。

最初に、資料収集、文献調査により掘削作業の現状と問題点を明らかにし、そして坑道断面仕上ロボットの評価システムの項目を検討してその開発方針を決定した。この結果を踏まえて、5自由度の垂直多関節型ロボットと安価でごみに強く非接触型の超音波センサ-とを組み合わせた坑道断面形状自動検出測定システムを開発し、その特性を実験的に検討すると同時に、ロボットの種々の制御方法、超音波センサ-で迅速に精度良く、かつ定量的に形状を測定できるソフトを開発した。そして、このシステムを用いて、簡単な形状から岩石まで、実際に対象物を検出測定してその有効性を確かめた。その結果、実際の坑道断面を検出測定する場合、どんな三次元形状でも定量的に測定できることが実験的に得られ、かつその精度は縦、横、高さ方向において10mm以内の誤差であり、十分実用的であることがわかった。また、種々の制御方法で検出測定された対象物の形状のデ-タをもとに、それらを様々な視点からリアルタイムで瞬時に見れるようにパ-ソナルコンピュ-タによった画像処理を行った。その結果は実際面でも効果的であることが確認できた。さらに、このシステムで測定された寸法が基準断面と一致するように修正するために、油圧ブレ-カの破壊力を制御できる因子を実験的に求めることを試みた。その結果、供給圧力によるよりも、むしろ平均供給流量を制御することによってそれが可能であり、かつ効果的であることが明らかになった。以上、本研究によりほぼ初期の目的を達成することができた。しかしながら、本研究は骨組みだけの研究であり、今後は本研究で開発、提案したシステムの各部のより詳細な研究が必要である。特に、掘削作業全体を一つのシステムとして総合的にとらえ、さらに実際の現場で検証する必要がある。
湿潤環境で生体組織に接着する医療用フィルムの創製

ブタ皮膚由来アルカリ処理ゼラチン(AlGltn)を用いてヘキサノイル化AlGltn(HxAlGltn)を合成し、多孔フィルムを調製した。ポロゲンと溶媒の固液比を制御することにより、1-63%の気孔率を有する多孔フィルムが得られた。多孔フィルムの大腸組織表面に対する接着強度は、同一の気孔率においてHx基を導入したものがしていないものよりも約3倍高かった。ラット皮下に多孔膜埋入後の組織切片を血管新生マーカーの発現量を評価した結果、Hx基が効果的に血管新生因子を吸着・徐放促進することが明らかとなった。疎水化アルカリ処理ゼラチン(hm-AlGltn)の合成は、AlGltnをdimethyl surfoxideに溶解し、窒素雰囲気下において、元のAlGltn中の全アミノ基に対して10、30、40 %が置換される条件で合成した。分子内のアミノ基の求核置換反応により、hexanoyl (Hx: C6)、decanoyl (Dec: C10)、stearyl (Ste: C18) chlorideがAlGltnに導入され、導入率が約10、30、40 %のH xAlGltn、DecAlGltn、SteAlGltnが得られた。熱架橋後のhm-AlGltnフィルムを超純水に浸漬した後の含水率は、42%Hx導入AlGltn(t42HxAlGltn)が他のフィルムと比較して最も含水率が低かった。一方、水に対する接触角変化を評価した結果、t42HxAlGltnフィルム表面は、水濡れ性変化率がオリジナルAlGltnと同様に高いことが明らかとなった。一方、hm-AlGltnフィルムのブタ動脈外膜に対する接着性は、疎水基鎖長が短く、導入率が高いほど高い傾向があった。すなわち、t42HxAlGltnが最も高い接着強度を示すことが明らかとなった。また、接着強度測定後の組織界面をヘマトキシリン-エオジン染色した後に観察した結果、t42HxAlGltnとt38DecAlGltnのみがブタ動脈外膜上に残留しており、凝集破壊をしていることが確認された。アルカリ処理ゼラチン(AlGltn)分子中のアミノ基に対する各疎水基導入率が約30mol%の疎水化AlGltnについて検討を行った。(それぞれhexanoyl基32%導入AlGltn: 32HxAlGltn、decanoyl基24%導入AlGltn: 24DecAlGltn、stearyl基26%導入AlGltn: 26SteAlGltn)。1H-NMR測定により、疎水基の鎖長が長くなるほど、アルキル鎖に帰属される1.3ppmのピークが強く測定されることが分かった。また、FT-IR測定においては長鎖脂肪酸のC=Oに帰属される2357cm-1や脂肪酸とAlGltn分子のアミノ基の結合におけるC-Nに帰属される2332-2323cm-1のピークが各hm-AlGltnで強く見られたことから、各鎖長のhm-AlGltnが生成されたことが確認できた。次に、10wt%となるようにそれぞれAlGltn、32HxAlGltn、24DecAlGltn、26SteAlGltnをヘキサフルオロイソプロパノールに溶解した溶液2.5mLをキャスト後に静置することで疎水化AlGltnの膜を得た。得られた膜の水接触角を評価すると、26SteAlGltnはAlGltnよりも優位に高い値が得られたのに対し、24DecAlGltnはAlGltnとほとんど変化はなかった。一方、HxAlGltnは導入率にかかわらず接触角がAlGltnよりもわずかに低い値となった。従って、HxやDecなどの短鎖長の疎水基でAlGltnを疎水化した場合、水濡れ性はAlGltnとほぼ変わらないと考えられた。次に、得られた膜とブタ大腸組織表面との接着強度を比較した。32HxAlGltnの接着強度が他の膜と比較して優位に高く、剥離界面における組織上の膜の残存量も多かったことから、32HxAlGltnが湿潤組織と強固に接着することが明らかとなった。さらに、ブタ大腸表面上に導入率の異なるHxAlGltn平膜を接着させたのちに、生理食塩水流により加圧することで、耐圧強度(シーリング強度)を評価した。その結果、Hx基導入率が高いほど耐圧強度が高くなることが明らかとなった。アルカリ処理ゼラチンのリジン残基の一部をヘキサノイル基に置換したヘキサノイル化ゼラチンを有機溶媒中でNaClをポロゲンとしてクエン酸から合成した架橋剤を用いて架橋し多孔膜を調製した。得られた多孔膜を皮下にラット皮下に埋入すると、成長因子フリーの条件でin vivoにおいて血管新生を促進する効果を見出し、特に気孔率の大きい多孔膜が効果的であることを明らかにした。また、血管新生に関与する因子と疎水化ゼラチンとの相互作用解析の結果から、周辺組織から放出される血管内皮細胞増殖因子の疎水化ゼラチンへの結合と徐放により血管新生が促進されることを明らかにした。さらに、ポアサイズと軟組織接着性について評価した。平均ポアサイズが80μm程度になると高い組織接着性を示すことが明らかとなった。接触角測定による吸水速度と相関があることから、毛細管現象により軟組織表面の水分を吸収すると同時に表面のヘキサノイル基が組織に浸透し、高い接着性を有することが示唆された。

ブタ皮膚由来アルカリ処理ゼラチン(AlGltn)を用いてヘキサノイル化AlGltn(HxAlGltn)を合成し、多孔フィルムを調製した。ポロゲンと溶媒の固液比を制御することにより、1-63%の気孔率を有する多孔フィルムが得られた。多孔フィルムの大腸組織表面に対する接着強度は、同一の気孔率においてHx基を導入したものがしていないものよりも約3倍高かった。ラット皮下に多孔膜埋入後の組織切片を血管新生マーカーの発現量を評価した結果、Hx基が効果的に血管新生因子を吸着・徐放促進することが明らかとなった。種々の導入率と鎖長を有する疎水化ゼラチンを合成し、膜状に成形することでブタ大腸に対する接着性およびシーリング強度と材料組成の関係を明らかにしており、計画通りに進んでいると思われる。27年度が最終年度であるため、記入しない。生体材料ヘキサノイル基を導入したアルカリ処理ゼラチンフィルムは、湿潤状態にある大腸組織や血管組織に対して効果的に接着することを明らかにしている。その為、今後の研究においては、生体吸収性ポリエステルとの複合化/コーティングを継続しつつ、フィルムを多孔化することで毛細管現象等を利用した生体組織からの水分の吸収と接着を効果的に行う条件についても検討を行う。種々の疎水基鎖長および導入率を合成した疎水化アルカリ処理ゼラチン(hm-AlGltn)を調整し、フィルムへの成形と湿潤血管組織に対する接着性を評価した。その結果、疎水基鎖長が短く、導入率の高い条件(ヘキサノイル基、42%導入)において最大接着強度を示すことが明らかとなった。さらに生体組織-フィルム剥離界面の観察の結果から、フィルムの剥離は、凝集破壊によるものであることを明らかにするに至っており、当初の計画以上に進展していると言える。当初予定していた装置購入が他の予算で購入できたため、初年度の残額が大きくなった。平成26年度はその残額を減らすことができた。対象となる湿潤組織を循環器系組織の血管で行ってきたが、消化器系組織の大腸に対しても評価を拡大する。さらに体内で適用後の組織浸潤・血管新生も見据えて疎水化ゼラチンを用いた多孔質フィルムの作成にも展開し、湿潤組織に対する接着性評価と疎水基および多孔質フィルムの気孔率との関係を明らかにする。平成27年度は、最終年度となるため予算の執行をより計画的に行う予定である。当初エバポレーターを購入予定であったが、他からの調達が可能になった。また、1年を通して対応できる研究補助員の雇用を予定していたが、適任者が見つからなかったため、次年度使用額が生じた。研究補助員を雇用し、研究を加速する予定である。
西南北海道の熱水性金属鉱床における金銀,レアメタルの賦存特性に関する研究

豊羽,手稲およびその周辺の熱水性金属鉱床における金銀,レアメタルの賦存特性を主として鉱物科学と流体包有物から検討した.豊羽多金属鉱脈型鉱床の南西地域では,金銀,およびビスマス,インジウム,テルルなどのレアメタルが局部的に濃集している.金はエレクトラムとして存在し,その含銀量と推定される生成温度の範囲はそれぞれ1455atom.%,230290°Cであり,北西部の前期生成脈の場合と比較すると含銀量は低く,温度は高い.銀はビスマスとともにPb-Bi-Ag鉱物として産するほか,ともに方鉛鉱中に少量含まれる.また,テルル鉱物(ヘッス鉱,含テルルカンフィールド鉱),カンフィールド鉱としても認められる.これらの鉱物を伴う鉱石は,流体包有物から250320°Cの温度で45%の塩濃度の鉱液から生成したと考えられる.そのほか銀は四面胴鉱に319wt.%含まれることがわかった.インジウムは主にケステライト,黄錫鉱,閃亜鉛鉱にそれぞれ最大6.8wt.%,2.3wt.%,4.8wt.%伴われ,インジウム品位の高い鉱石は上述の銀鉱石と同様な条件で生成したと考えられる.手稲鉱床と春香山鉱化帯(手稲鉱床の西方約8km)では,金銀はエレクトラムのほか,テルル化物として産すること,ビスマス鉱物を伴うことを特徴とし,流体包有物から推定される鉱化流体の性質も非常に類似している.したがって、K-Ar年代値など既存のデータを総合すると,西南北海道の浅熱水性金鉱床は53.6Maにかけて金銀,テルル,(ビスマス)の高硫化タイプ(手稲,春香山鉱化帯,小別沢)に始まり,3.5Ma前後の金銀,テルル,セレンのタイプ(千歳)を経て1Maの金銀,セレンの低硫化タイプ(光竜)へと鉱化作用の性質が変化した可能性が考えられる.豊羽,手稲およびその周辺の熱水性金属鉱床における金銀,レアメタルの賦存特性を主として鉱物科学と流体包有物から検討した.豊羽多金属鉱脈型鉱床の南西地域では,金銀,およびビスマス,インジウム,テルルなどのレアメタルが局部的に濃集している.金はエレクトラムとして存在し,その含銀量と推定される生成温度の範囲はそれぞれ1455atom.%,230290°Cであり,北西部の前期生成脈の場合と比較すると含銀量は低く,温度は高い.銀はビスマスとともにPb-Bi-Ag鉱物として産するほか,ともに方鉛鉱中に少量含まれる.また,テルル鉱物(ヘッス鉱,含テルルカンフィールド鉱),カンフィールド鉱としても認められる.これらの鉱物を伴う鉱石は,流体包有物から250320°Cの温度で45%の塩濃度の鉱液から生成したと考えられる.そのほか銀は四面胴鉱に319wt.%含まれることがわかった.インジウムは主にケステライト,黄錫鉱,閃亜鉛鉱にそれぞれ最大6.8wt.%,2.3wt.%,4.8wt.%伴われ,インジウム品位の高い鉱石は上述の銀鉱石と同様な条件で生成したと考えられる.手稲鉱床と春香山鉱化帯(手稲鉱床の西方約8km)では,金銀はエレクトラムのほか,テルル化物として産すること,ビスマス鉱物を伴うことを特徴とし,流体包有物から推定される鉱化流体の性質も非常に類似している.したがって、K-Ar年代値など既存のデータを総合すると,西南北海道の浅熱水性金鉱床は53.6Maにかけて金銀,テルル,(ビスマス)の高硫化タイプ(手稲,春香山鉱化帯,小別沢)に始まり,3.5Ma前後の金銀,テルル,セレンのタイプ(千歳)を経て1Maの金銀,セレンの低硫化タイプ(光竜)へと鉱化作用の性質が変化した可能性が考えられる.西南北海道の熱水性金属鉱床のうち,最大規模を有する豊羽多金属鉱脈型鉱床の南西地域における金銀,レアメタルの賦存特性について検討を行った.本地域は試錐探査の結果,多金属鉱化作用が広範囲に及んでいることが明かとなり,今後の開発が有望である.試錐で着脈した鉱石について検討した結果,以下のことが判明した.1.Auは,1)黄鉄鉱,少量の閃亜鉛鉱,方鉛鉱,Bi,Sn,W鉱物を鉱染状に伴う石英質鉱石,2)黄鉄鉱-黄銅鉱-(閃亜鉛鉱)-石英の塊状鉱,3)黄鉄鉱-閃亜鉛鉱の脈状鉱,4)閃亜鉛鉱-石英の塊状鉱にエレクトラムとして含まれる.エレクトラムは一般に530μmの粒径で,1)の鉱石では石英中,2)4)の鉱石では黄鉄鉱または閃亜鉛鉱中,あるいはそのいずれかと石英の粒間に認められる.その含銀量(atom.%)と流体包有物または閃亜鉛鉱-黄錫鉱組み合わせから推定される生成温度は1)で1428%,230240°C,2)と3)で4050%,260290°C,4)では多くが2555%(3787%と不均質な粒子も存在する),250280°Cである.2.Agは,黄鉄鉱に富み,少量の黄銅鉱と黒色閃亜鉛鉱,石英を伴う塊状鉱中にPb-Bi-Ag系鉱物として認められるほか,時にTeを伴う銀鉱物(ヘッス鉱と含Teカンフィールド鉱)が存在する.

この種の鉱石は250320°Cの温度で45%の塩濃度の鉱液から生成したことがわかった.Agはそのほか黄錫鉱や四面銅鉱にも微量に含まれており,Ag品位に少なからず寄与していると推測される.3.Inは,閃亜鉛鉱中に0.nwt.%,最大4.8wt.%含まれているほか,黄錫鉱中にも0.nwt.%認められる.In品位の高い鉱石は,上記Agと同様な条件で生成したと考えられる.4.以上のうち,Inは南東部の出雲・信濃両脈と類似するが,AuとAg,Teは異なった特徴を示している.西南北海道の熱水性金属鉱床のうち,手稲鉱床と春香山付近の鉱化帯における金銀,レアメタルの賦存特性について検討を行った.手稲鉱床は金・銅を主とする金鉱床であり,金銀鉱物はエレクトラムのほか,sylvanite,hessite等のテルル化物として産すること,bismuthinite,emplectiteなどのビスマス鉱物を伴うことを特徴とする.金盛脈産鉱石中の石英に含まれる流体包有物の均質化温度と塩濃度(NaCl相当)は,それぞれ196263°C,1.41.9wt%の範囲にあり,前者はとくに200240°Cに集中している.一方,春香山の南方(手稲鉱床の西方約8km)に多数分布する石英脈の一部に金銀,銅,錫,ビスマス等の鉱物が伴われることがわかった.金銀はエレクトラム(1819atom.%Ag)のほか,テルル化物(petzite,hessite)として産する.ビスマスはtellurobismuthite,tetradymiteのほか,四面銅鉱にも0.28.3wt%に含まれる.また,錫はsatannoidite,mawsoniteとして少量産する,石英中の流体包有物の均質化温度と塩濃度はそれぞれ198282°C,1.22.2wt%である.以上,手稲鉱床及び春香山付近の鉱化帯から得られた鉱物学的特徴,流体包有物データはきわめて類似しており,かつ両者のK-Ar年代は45Ma(沢井・板谷,1996;MMAJ,1996など)と同様であることから,この地域の鉱化作用は鮮新世前期に生じた一連のいわゆる高硫化型に属するもので,テルルを伴った金銀・ビスマス鉱物で特徴づけられるものと考えられる.
連続式超臨界二酸化炭素法による非加熱・低エネルギー殺菌・食品加工技術の実用化

本研究課題の遂行により、以下の成果を挙げた。1)ミクロバブル超臨界二酸化炭素法による微生物殺菌及び胞子失活メカニズムの解析Saccharomycescerevisiaeの死滅に及ぼす溶存CO_2濃度と処理温度の影響を解析し、殺菌挙動が一次反応に従うこと、殺菌に関して処理温度と溶存CO_2濃度が等価であることを明らかにした。また、Aspergillus niger胞子の死滅挙動は一次反応式に従うこと、温度と溶存CO_2濃度は等価であること、温度と溶存CO_2濃度の間には明瞭な交互作用があることを明らかにした。2)本処理による酵素失活メカニズムの速度論的解析とエネルギー効率の評価酸性プロテアーゼやグルコアミラーゼ等の本処理による失活をpHとの関連のもとに解明した。α-アミラーゼのD値(35°C、30MPa)は5.0minであり、70°Cの熱処理におけるD値(227min)よりも短かく、また酸性プロテアーゼのD値(30MPa、50°C)は15.4minであり、50°Cの熱処理での233minより短かく、低エネルギー性を証明した。このときタンパク質の不可逆的なコンフォメーション変化が起こり、酵素・タンパク質機能が失活することを明らかにした。3)提案技術により製造された食品の品質評価オレンジ果汁を本装置に供し、試料とCO_2の分離方法が果汁の香気損失に及ぼす影響を検討し、香りの損失の少ない処理法を開発した。また食品(魚醤等)の脱臭にも有効であることを確認した。4)タンパク質高次構造の改変と機能変化の解析卵や牛乳アレルゲンの分解を試み、プロテアーゼ消化性の向上を認めたが、本処理装置ではアレルゲン性の明確な低減化までは対応できなかった。5)食品産業における処理条件の確立と実用化装置の完成島津製作所及び北海製罐と共同研究体制を組織している。現在の装置は処理速度250kg/hであり、小型試験機による結果を再現し得るものであるが、装置のスケールアップが今後の課題である。本研究はCO_2を作用体として、これをミクロバブル化・超臨界状態で生産プロセスに供給するシステムを開発することによって、エネルギーミニマム型の新規殺菌・酵素失活、並びに有用・有害物質分離の諸技術として展開するものである。平成11年度の成果1.小型連続装置の試作:実用装置を前提として、処理槽容量200ml、試料供給能540ml/min、CO_2供給能18ml/min、処理圧力630MPa、処理温度3080°Cの装置を設計、試作し、各部の整合性、耐久性等を検討し、改良を加えた。2.殺菌・酵素失活機構:生残率・失活曲線の解析によって、殺菌・酵素失活が、1)細胞・蛋白質表面へのCO_2の吸着(低密度CO_2)及び細胞膜・蛋白質分子内へのCO_2の侵入(高密度CO_2)による直接的な高次構造破壊、2)連続システムでの瞬間的(≦2ms)減圧に伴う侵入CO_2の急膨張による大きな構造破壊、によってもたらされることを明らかにし、これらを電顕により確認した。3.本試作装置によると、35°C、610MPa、CO_2流量2ml(対試料5%)で10^6オーダーの完全殺菌(E. Coli、L. previs、S. cerevisiae)、酵素失活(α-amylase、lipase0.10.25mg/ml)が達成された。4.アレルゲン性を解析するインビトロ及びインビボ実験系を確立し、本装置で処理されたモデル蛋白質(卵白アルプミン等)の機能変化を解析中である。また、有用・有害物質分離に本法を応用するため、各種柑橘果皮からの成分抽出の基礎実験を行っている。平成12年度の計画:1)実用小型装置の完成、2)殺菌・酵素失活機構の解析、3)蛋白質高次構造と機能変化、4)生酒等実用試料への適用、5)各種機能性物質の抽出・分離、などを行う。平成12年度は、主に試作小型連続処理装置の実用化に向けての装置の改良と処理条件の確立を行った。試料の安定な送液はシリンダー型ポンプをプランジャー型ポンプに替えることで、また熱伝対ON-OFFセンサーを取り付けることで効率のよい気相分離を可能とした。また、CO_2ポンプを改善し、吐出圧を向上させることで10μm微細フィルターの目詰まりの防止と低濃度CO_2供給時の溶存CO_2濃度の上昇を達成し、殺菌・酵素失活効果を向上させることが可能となった。これらの装置改善によって、微生物殺菌(使用菌体Saccharomyces cerevisiae;処理圧力20Mpa;処理温度35°C;試料流量15mL/min;滞留時間13min;CO_2供給量4.30-9.59g/min)では、培地共存の影響を消去でき、さらにエタノール無添加時や低濃度CO_2供給時にも10^6オーダーの完全殺菌を達成した。また、酵素失活(使用酵素Bacillus subtilis由来α-amylase、Aspergillus niger由来acid protease;

処理条件は同上)については、酵素の至適pH及び温度において溶存CO_2濃度が増加することから、最も効果的な失活を達成できることを明らかにした。これらの結果は、微生物殺菌・酵素失活においては本装置の実用化の目途が立ったことを示している。さらに、今年度は食品アレルゲンタンパク質を同条件下に処理し、プロテアーゼ消化性の向上及び抗原性の低減化についても検討し、タンパク高次構造、特にα-ヘリックス構造の破壊が重要な要因になることを認めている。食品タンパク質の機能性変化及び超臨界CO_2による抽出効果の解析は、本装置の最終的実用化と共に平成13年度に実施する予定である。本研究課題の遂行により、以下の成果を挙げた。1)ミクロバブル超臨界二酸化炭素法による微生物殺菌及び胞子失活メカニズムの解析Saccharomycescerevisiaeの死滅に及ぼす溶存CO_2濃度と処理温度の影響を解析し、殺菌挙動が一次反応に従うこと、殺菌に関して処理温度と溶存CO_2濃度が等価であることを明らかにした。また、Aspergillus niger胞子の死滅挙動は一次反応式に従うこと、温度と溶存CO_2濃度は等価であること、温度と溶存CO_2濃度の間には明瞭な交互作用があることを明らかにした。2)本処理による酵素失活メカニズムの速度論的解析とエネルギー効率の評価酸性プロテアーゼやグルコアミラーゼ等の本処理による失活をpHとの関連のもとに解明した。α-アミラーゼのD値(35°C、30MPa)は5.0minであり、70°Cの熱処理におけるD値(227min)よりも短かく、また酸性プロテアーゼのD値(30MPa、50°C)は15.4minであり、50°Cの熱処理での233minより短かく、低エネルギー性を証明した。このときタンパク質の不可逆的なコンフォメーション変化が起こり、酵素・タンパク質機能が失活することを明らかにした。3)提案技術により製造された食品の品質評価オレンジ果汁を本装置に供し、試料とCO_2の分離方法が果汁の香気損失に及ぼす影響を検討し、香りの損失の少ない処理法を開発した。また食品(魚醤等)の脱臭にも有効であることを確認した。4)タンパク質高次構造の改変と機能変化の解析卵や牛乳アレルゲンの分解を試み、プロテアーゼ消化性の向上を認めたが、本処理装置ではアレルゲン性の明確な低減化までは対応できなかった。5)食品産業における処理条件の確立と実用化装置の完成島津製作所及び北海製罐と共同研究体制を組織している。現在の装置は処理速度250kg/hであり、小型試験機による結果を再現し得るものであるが、装置のスケールアップが今後の課題である。本研究はCO_2を作用体として、これをミクロバブル化・超臨界状態で生産プロセスに供給するシステムを開発することによって、エネルギーミニマム型の新規殺菌・酵素失活、並びに有用・有害物質分離の諸技術として展開するものである。平成13年度は、試作小型連続処理装置を用いて微生物殺菌や酵素失活、有用・有害物質の除去効果についてさらに検討を行い、実用化装置の開発を遂行した。微生物殺菌については、Saccharomyces cerevisiaeの死滅に及ぼす溶存CO_2濃度と処理温度の影響を解析し、殺菌挙動が一次反応に従うこと、殺菌に関して処理温度と溶存CO_2濃度が等価であることを明らかにした。
iTRAQ法による網羅的膜蛋白質の解析を用いた子宮平滑筋肉腫の新しい治療法の樹立

子宮平滑筋肉腫は極めて予後不良であり新規治療法の開発がのぞまれる。申請者は子宮平滑筋肉腫(LMS)において特異的に発現している候補蛋白質としてATP7AおよびATP7Bを選別した。LMS細胞株に対し、siRNAを用いATP7AおよびATP7Bの発現を抑制したところ、Cisplatinの50%阻害濃度がそれぞれ17.0 μMから6.1 μM、4.3 μMへと有意に低下した(p<0.01)。同条件下で細胞内プラチナ濃度を計測したところ、細胞内プラチナ濃度がコントロール株と比較し有意に上昇しており(p<0.01)、ATP7AおよびATP7Bはシスプラチン取り込みや排出に関与していることが示された。網羅的蛋白質発現解析により同定された子宮平滑筋肉腫において特異的に発現している候補蛋白質の臨床検体および細胞株における発現膜蛋白質を解析するiTRAQ法による網羅的解析にて、子宮平滑筋肉腫に特異的に発現する蛋白質候補として、蛋白質Aと蛋白質Bを同定した。このうち蛋白質Aは、子宮平滑筋肉腫細胞株3株のうち、1株で発現を認めた。臨床検体における評価では18例の検体のうち、12例(66.7%)と発現を認めていた。蛋白質Aの発現の子宮肉腫における役割の検討蛋白質Aを発現する子宮平滑筋肉腫細胞SK-LMSにおいて、蛋白質Aの発現をsiRNAを用いて抑制したところ、増殖速度が有意に減少した(p<0.05)。これらのことから、子宮平滑筋肉腫において特異的に発現する蛋白質Aが、子宮平滑筋肉腫の増殖において重要であることが示唆された。蛋白質Aが子宮平滑筋肉腫細胞において増殖にどの様に働いているか子宮平滑筋肉腫細胞株であるSK-LMSに対してsiRNAを用い蛋白質Aの発現を抑制した上で、アポトーシス関連蛋白であるCaspase3を評価したところ上昇を認めず、増殖の抑制はアポトーシスが誘導されたためでないことがわかった。網羅的蛋白質発現解析により子宮平滑筋肉腫において特異的に発現している候補蛋白質を同定し、治療標的となり得る蛋白質としてATP7AおよびATP7Bを選別した。子宮平滑筋肉腫細胞株(SK-LMS, SKN, SK-UT1)を用い、ATP7AおよびATP7Bの発現をWestern Blotting法にて解析を行ったところSK-LMS細胞株においてATP7A、ATP7Bの強発現を、SKN細胞株においてATP7Aの強発現を認めた。臨床検体26例を用い、免疫組織学染色にて解析を行ったところATP7Aは20例(77%)で、ATP7Bは14例で発現を認めた(54%)。SK-LMS細胞株に対し、siRNAを用いATP7AおよびATP7Bの発現を抑制したところ、シスプラチンのIC50(50%阻害濃度)がそれぞれ17.0 microMから6.1 microM、4.3 microMへと有意に低下した(p<0.01)。これら、プラチナ感受性の改善の機序解明のため、シスプラチン暴露後の細胞内プラチナ濃度を計測したところ、ATP7AおよびATP7Bをノックダウンした状態では細胞内プラチナ濃度がコントロール株と比較し有意に上昇していたため(p<0.01)、ATP7AおよびATP7Bはシスプラチン取り込みや排出に関与していると考えられた。In vivoの解析やより詳細な機能解析を行うため、ATP7AおよびATP7BのshRNAをSK-LMSに対して遺伝子導入し、それぞれの発現を恒常的に抑制したSK-LMS ATP7A shRNA株およびSK-LMS ATP7B shRNA株を樹立した。本研究期間において、in vivoの解析を行うことができなかったため、今後in vivoの解析を行う予定である。また、ATP7AおよびATP7Bの阻害剤の作成を行いATP7AおよびATP7Bを治療標的とした治療法を開発していく予定としている。医歯薬学25年度計画はほぼ終了している。細胞接着・細胞間相互作用・細胞移動について評価を行っていないのは、蛋白質Aの抑制が非常に効果的に増殖抑制を示しており、こちらの機序解明を優先させるべきと考えられたためである。蛋白質Aの子宮平滑筋肉腫の増殖に関わるメカニズムの解析蛋白質AのSKNもしくはSK-UT1細胞株において強制発現による増殖の変化(2)蛋白質Aの強制発現による蛋白質の発現の変化(3)子宮平滑筋肉腫における蛋白質Aの役割の検討(4)蛋白質Aと増殖に関わるpathway解析(5)蛋白質Aに対する中和抗体の作成蛋白質Aの発現抑制による子宮平滑筋肉腫の増殖抑制は既に証明できたが、逆に、蛋白質Aの強制発現による子宮平滑筋肉腫細胞の増殖の変化を検証する。またこれに伴うpathwayの変化等も解析する。

最後に、マウスを用いて、蛋白質Aに対する中和抗体の作成を試みる。中和抗体を作成できた場合、それを用いてマウスにおける子宮平滑筋肉腫細胞の増殖を抑制できるかを検討する。蛋白質Aの子宮平滑筋肉腫の増殖に関わるメカニズムの解析、マウスを用いた蛋白質Aに対する中和抗体の作成の為、物品購入を控えた。蛋白質Aの子宮平滑筋肉腫の増殖に関わるメカニズムの解析、マウスを用いた蛋白質Aに対する中和抗体の作成の為、必要物品の購入を予定している。