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ポリADP-リボシル化酵素による遺伝子複製と発現の制御

ポリADP-リボシル化酵素は、真核細胞のクロマチンに存在し、種々の核蛋白上に核酸様ホモポリマーであるポリADP-リボースを合成する酵素である。本酵素は広く一般の細胞核に検出され、組織特異性はないが、その含有量は増殖に速い組織、特に癌細胞で高く発現しており近年DNAの複製と転写に重要な役割を果たすことが示唆され、注目を集めている。また本酵素の遺伝子発現は、諸種ステロイドホルモンによって抑制され、その制御の様式が解明される必要があるが、ステロイドホルモンの合成自身が、諸種代謝物質に制御されるので、ステロイド合成の遺伝子レベルでの発現制御の解明が必要である。そこで我々はこれらの事項を解明する為に研究を進め、以下の知見を得た。(1)ポリADP-リボシル化酵素のプロモーター領域のクローニングを行った。この部位はTATAおよびCAATボックスを持たないが、2個のGCボックスを有している。転写開始点は、ATGコドンの上流99の位置にあり、本遺伝子の発現はCAMPとホルボールエステルによって著明に促進を受ける。(2)本酵素をin vitroで共存させるとDNAの複製が顕著に促進する。これはα型ポリメラーゼに特異的で、βやγ型の複製には効果がない。すなわちDNA複製のラギング鎖の合成に効果を有するものと考えられる。この効果は抗ポリADP-リボース合成酵素抗体によって特異的に消失することから、修飾反応ではなく、本酵素自身が直接DNAポリメラーゼαおよび鋳型DNAに結合して促進を行うものと考えられる。(3)ステロイドの作用を調べる一環として、コルチゾール、アルドステロン、エストロゲンを合成する酵素のcDNAを単離しその塩基配列を決定し、さらにその遺伝子の制御機構を解析した。ポリADPーリボシル化酵素は、真核細胞のクロマチンに存在し、種々の核蛋白上に核酵様ホモポリマ-であるポリADPーリボ-スを合成する酵素である。本酵素は広く一般の細胞核に検出され、組織特異性はないが、その含有量は増殖の速い組織、特に癌細胞で高く発現しており、近年DNAの複製と転写に重要な役割を果たすことが示唆され、注目を集めている。(1)ポリADPーリボシル化酵素のプロモ-タ-領域のクロ-ニングを行った。転写開始点は、ATGユドンの上流99の位置にあり、本遺伝子の発現はCAMPとホルボ-ルエステルによって著明な促進を受ける(2)本酵素をin vitroで共存させるとDNAの複製が顕著に促進する。これはα型ポリメラ-ゼに特異的で、βやγ型の複製には効果がない。この効果は抗ポリADPーリボ-ス合成酵素抗体によって特異的に消失することから、修飾反応ではなく、本酵素自身が直接DNAポリメラ-ゼαおよび鋳型DNAに結合して促進を行うものと考えられる。(3)ステロイドの作用を調べる一環として、コルチゾ-ル、アルドステロン、エストロゲンを合成する酵素のcDNAを単離しその塩基配列を決定し、さらにその遺伝子の制御機構を解析した。〔A〕ポリADP-リボシル化酵素をin vitroで共存させるとDNAの複製が顕著に促進する。

この効果は抗ポリADP-リボース合成酵素抗体によって特異的に消失することから、修飾反応ではなく、本酵素自身が直接DNAポリメラーゼαおよび鋳型DNAに結合して促進を行うものと考えられる。〔B〕ポリADP-リボシル化酵素はステロイドホルモン合成の制御に関与することが報告されているが、ステロイド合成のメカニズム自身の実態が明らかにされておらず、本年は、その分子遺伝学的基礎の解明を試みた。(] SY.encircled1. [)コルチゾール合成酵素(P-450_<11>β)のcDNAおよびゲノム遺伝子を単離し、その構造を明らかにすると同時にその制御の実体を解析した。(] SY.encircled2. [)アルドステロン合成酵素(P-450c_<18>)のcDNAを単離し、P-450_<11>βと構造が93%同一であることを明らかにした。しかし、ゲノム遺伝子のプロモーター領域は55%の同一性しか認められず、制御機構が異なることが示唆された。(] SY.encircled3. [)エストロゲン合成酵素のcDNAおよびゲノム遺伝子を解析した。
極限環境を生き抜く南極クマムシの生存戦略に迫る

本研究では、南極の固有クマムシ種を用いて室内実験を行うことで、南極の極限環境に生息する陸上動物の生活史や繁殖特性を初めて明らかにすると共に、緩歩動物門における繁殖老化についても世界で初めて解析した。さらに、南極で採取され30年と半年の間凍結していたコケ試料からクマムシを抽出し、蘇生と繁殖に成功したことで、南極クマムシの驚異的な長期生存能力を示すこともできた。極度の低温や乾燥、限られた繁殖期間という、生物にとっての極限環境の一つと考えられる南極において、広域に分布している南極の固有種であるクマムシAcutuncus antarcticusが、その極限環境においてどのように成長し、繁殖しているのかを明らかにすることを目的に、下記の実験・調査を行った。平成26年度は、まず異なる温度下でA. antarcticusを飼育することで、生活史や繁殖の温度特性を調べた。その結果、わずかな温度差で、A. antarcticusの生存期間や世代時間、繁殖成績が大きく変化することが分かった。また、A. antarcticusは10°Cから15°Cにおいて最も繁殖成績が高く、南極に生息する固有種であるにも関わらず、その至適温度は比較的高いことがわかった。南極に生息する微小動物の生活史や繁殖の温度特性について明らかにしたのは、本研究が初めてである。以上の研究成果は国際学会において口頭発表を行うと共に、国内学会においても発表した。また26年度は第56次日本南極地域観測隊に参加し、南極においてフィールド調査を行った。2015年1月に、昭和基地周辺露岩域に生育するギンゴケ群落内に温湿度ロガーを設置した。本ロガーの記録データは2016年1月に回収する予定であり、回収データから、A. antarcticusが生息する南極のギンゴケ群落内における、繁殖期間の長さ、繁殖期間における温度変動と環境ストレスの頻度や強度、また冬期の温湿度変動を調べる。極度の低温や乾燥、限られた繁殖期間という、生物にとっての極限環境の一つと考えられる南極において、広域に分布している南極の固有種であるクマムシAcutuncus antarcticusが、その極限環境においてどのように成長し、繁殖しているのかを明らかにすることを目的に、下記の実験、解析、成果発表を行った。本年度は、これまでに取得した一定温度下で飼育したA. antarcticusの繁殖に関するデータを解析し、寿命が長ければ産卵回数や産卵総数は増えるが、孵化率や孵化にかかる日数などの繁殖パラメーターは日齢の影響はほとんど受けずに、本種においては繁殖老化がほとんど起らないことを明らかにした(Tsujimoto et al. Hydrobiologia 2016)。緩歩動物門において繁殖老化について言及をしたのは本研究が世界で初めてである。また、南極で採取され30年間半凍結していたコケ試料からA. antarcticusを抽出し、蘇生と繁殖に成功した(Tsujimoto et al. Cryobiology 2016)。クマムシのこれまでの長期生存記録は9年が最長であったため、その記録を大幅に更新した。さらに、蘇生後の回復状況や繁殖状況までを詳細に記録したことにより、30年以上にわたる長期保存によってDNA損傷が蓄積されていた可能性や、それらを蘇生後に徐々に回復している可能性が、新たに明らかとなった。また本年度は、昨年度に第56次日本南極地域観測隊に参加し、2015年1月に昭和基地周辺露岩域に生育するギンゴケ群落内に設置した、温湿度ロガーの記録データを回収した。平成27年度においては、室内実験の一つであった、一定温度下の生活史に関する実験データの解析を終えて論文にまとめることができた。また、30年間半凍結していたクマムシの蘇生・繁殖に成功し、その成果を発表することができたため、おおむね順調に進んでいる。最終年度には、南極クマムシAcutuncus antarcticusの異なる温度下におけるトランスクリプトーム解析実験で得られたデータの分析を行った。その結果、発生や卵発生関連遺伝子の発現が温度依存で変動しており、低温でのエネルギー生産や卵発生の抑制などが示唆された。また、南極の昭和基地周辺露岩域に生育するギンゴケ群落内に設置した温湿度ロガーの記録データを回収したが、致命的なデータエラーがみつかり、A. antarcticusが生息する南極のギンゴケ群落内における、繁殖期間の長さ、繁殖期間における温度変動と環境ストレスの頻度や強度を明らかにするには至らなかった。本研究課題においては、南極に広域に分布している固有種であるクマムシA. antarcticusの室内実験を行うことで、南極の極限環境に生息する陸上動物の生活史や繁殖の温度特性を初めて明らかにすると共に、緩歩動物門における繁殖老化についても世界で初めて明らかにすることができた。さらに、南極で採取され30年半の間凍結していたコケ試料からA. antarcticusを抽出し、蘇生と繁殖に成功したことで、南極クマムシの驚異的な長期生存能力を示すこともできた。この研究では、30年以上にわたる長期保存によってDNA損傷が蓄積されていた可能性や、それらを蘇生後に徐々に回復している可能性が示され、長期生存研究に新たな視点を提供した。本課題を実施することにより、これまで謎に包まれていた南極陸上動物の生存戦略に関する理解が多いに進展した。今後、本課題で得られた手法やデータを基盤とした、さらなる研究の展開が期待される。

さらに、南極で採取され30年と半年の間凍結していたコケ試料からクマムシを抽出し、蘇生と繁殖に成功したことで、南極クマムシの驚異的な長期生存能力を示すこともできた。平成26年度においては、室内実験の一つである生活史と温度特性に関する実験データを全て取得することができたため、安定環境下における生態調査を終えることができた。また、南極における生息環境を調べるための南極におけるフィールド調査も実施できたため、おおむね順調に進んでいるが、一部に遅れもある。26年度での開始を予定していた環境耐性能力を調べる室内実験については、第56次日本南極地域観測隊への参加と準備に時間をとられ、取りかかることができなかった。本実験に関しては、27年度に集中して行いデータを取得する予定である。平成28年度においては室内実験を行うと共に、これまでに得られたデータの解析を行う。まずは室内実験でA. antarcticusの凍結・乾燥耐性能力を調べる。また、南極において取得・回収した生息環境における温度・湿度データの解析を行い、ギンゴケ群落内の年間温湿度変動を調べる。フィールド調査で得られた生息環境内の年間温湿度変動と、室内実験で得られた、A. antarcticusの一定温度下や異なる温度帯における生活史、環境耐性能力を合わせて、本種が南極の極限環境においてどのように成長し、繁殖しているのかを明らかにする。生態学平成27年度においては室内実験を行い、A. antarcticusの環境耐性能力と、環境ストレス下の生活史を調べる。平成28年度には、これらの室内実験を全て終わらせる。フィールド調査で得られた生息環境内の年間温湿度変動と、室内実験で得られた1各温度帯における生活史、2各成長段階における凍結・乾燥耐性能力、3環境ストレスを与えた際の生活史、繁殖生態のデータから、南極の極限環境においてA. antarcticusがどのように成長し、繁殖しているのかを明らかにする。以上の結果をもとに、極限環境を生き抜く南極クマムシA. antarcticusの生存戦略を明らかにする。平成27年度においては、平成26年度に得られたデータの解析および論文執筆を優先させため、予定していた環境耐性実験は予備実験のみを実施した。本年度に、慶応大学先端生命科学研究所の荒川和晴特任准教授の協力のもと、クマムシ環境耐性実験の予備実験を実施した内容を踏まえて、平成28年度に環境耐性実験を行うこととした。そのため、環境耐性実験を実施するための実験消耗品等購入費用を平成27年度に使用しなかった。環境耐性実験等を実施するための環境試験機を予算内で購入することができないことが分かり、機器のレンタルをして実験を行うことに研究計画を変更することとなった。平成26年度においては、日本南極地域観測隊の準備・出張に長期間かかることとなり、予定していた環境耐性実験に取りかかることができないため、平成27年度に機器のレンタルをし、環境耐性実験等を行うこととした。
Hyper-Kahler多様体の研究

Hyper-Kahler多様体とは四元数の関係式を満たす三つの概複素構造I,J,Kを持つリーマン多様体で、それぞれについてKahler多様体になっているものである。compactな場合はK3曲面や4n次元のtourusなどが代表的な例となっている。noncompat hyper-Kahler多様体の興味深い例は江口-Hanson,Gibbons-Hawkingにより、重力理論との関連で発見された。これらはA型の四次元のhyper-Kahler多様体と呼ばれている。その後、Hitchin,KronheimerによってDynkin図式との関連が指摘され、A_k,D_k,E_6,E_7,E_8型の四次元hyper-Kahler多様体が全て構成された。(k=1,2,3,・・・)Hyper-Kahler多様体とは四元数の関係式を満たす三つの概複素構造I,J,Kを持つリーマン多様体で、それぞれについてKahler多様体になっているものである。(k=1,2,3,・・・)
東アジア日本語学習者の発話・知覚における破裂音の習得メカニズムとその中間言語研究

(1)(3)の調査に基づき、論文4本(投稿中含む)と学会口頭発表5本にまとめ、(1)(5)の研究成果を明らかにすることができた。(1)韓国人学習者の破裂音の発話・知覚縦断調査(2003年7月2004年2月)、(2)天津外国語大学、上海外国語大学、韓国の慶煕大学校における合成音声を使った破裂音の範疇知覚に関する言語間調査(2004年2月3月)、(3)慶煕大学校(2004年9月)、上海市同済大学(2005年1月)における破裂音とアクセントに関する調査を行なった。(1)東アジアの日本語学習者は共通して破裂音の習得が困難である。生成と知覚の両面からの研究が少ない韓国人学習者(ソウル方言)は、生成では日本語の有声破裂音と韓国語の語頭の平音(lax)を同一音として捉えて発音していることに大きな問題があり、知覚では日本語の語頭の無声破裂音を母語の濃音(forced)に近づけて聞くことに大きな混同の要因があるとする習得のメカニズムが解明できた。(2)北京語と上海語、韓国語話者の破裂音習得を音響音声学的に分析した結果、生成と知覚ともに上海語話者の習得が早く北京語話者の習得が最も困難であった。知覚では、北京語・上海語話者は語中の無声破裂音を有声破裂音に、韓国語話者は語頭の無声破裂音を有声破裂音に誤聴した。発話では3方言話者ともに語頭の有声破裂音が難しく、母語に有声破裂音が存在する上海語・韓国語話者も、上海語話者は母語の無声無気音で、韓国語話者は母語の平音(語頭)で発音していた。(3)韓国人学習者は、破裂音習得はアクセントにも母語干渉があり、基本周波数で調べた結果、語頭に無声破裂音を含む語は頭高型に、有声破裂音を含む語は第1拍目が低く第2拍目に上昇する起伏型で発音する傾向があった。(4)北京・上海・韓国語学習者の日本語破裂音の範疇知覚について、VOTの異なる合成音声を作成して調べた結果、語頭では北京・上海語学習者、語中では韓国語学習者の範疇知覚が、日本語母語話者と一致し、言語間で範疇知覚が異なっていた。本年度は、(1)分析機器の充実、(2)調査資料(合成音声資料)の作成(2003年7月、12月)、(3)日本語学校で学ぶ韓国日本語学習者の初級・中級レベルの発話・知覚における縦断研究のための調査(2003年7月、10月、2004年1月)、(4)天津外国語大学、上海外国語大学・慶煕大学校(ソウル市)における言語間の破裂音範疇知覚に関する調査を行った(2004年2月3月)。第1回知覚調査の資料をもとに、母語の破裂音が有気と無気の2項対立がある中国語(北京語)話者、激音・濃音・平音の3項対立のある韓国語(ソウル)話者を中心に分析した結果、次のことがわかった。破裂音を含む有意味語と無意味語の調査では、両言語話者ともに有声破裂音の方がよく聞けていることがわかった。

韓国人学習者は、先行研究によれば語頭の有声破裂音に関する知覚が難しいとの指摘と多少異なっていた。両言語話者間で大きな違いがあったのは、日本語の無声破裂音の知覚で、中国人学習者は語中に位置する無声破裂音を有声破裂音に誤聴する傾向が見られ、韓国人学習者は、語頭の無声破裂音を有声破裂音に誤聴する傾向が見られた。中国人学習者は、先行研究で指摘されているように、日本語の語中の無声破裂音が母語の無声無気破裂音に近い音であるために、有声破裂音にとらえらてしまうことに関係があると思われる。また、韓国人学習者は、語頭に位置し帯気性のある激音・平音、または濃音のいずれかの音に引きつけて日本語の語頭の無声破裂音を知覚し識別していると考えられるが、日本語の無声破裂音は帯気性が弱い音であるために、無声破裂音としてではなく有声破裂音としてとらえ、そのために語頭の無声破裂音を有声破裂音に誤聴するのではないかと思われる。(2003年度第17回日本音声学会全国大会予稿集207-212)本年度は、(1)(5)を中心に研究活動を行った。*昨年度の調査をまとめた結果、韓国人日本語学習者の破裂音の習得について、知覚と生成(音響音声学的実験に基づく)の両面からまとめた先行研究がなかったことから、韓国人学習者の日本語破裂音習得の研究結果を中心に報告するとともに、(2)(3)の調査を行った。(1)平成15年度に行った調査結果の分析並びに研究結果の発表と論文化・「韓国人日本語学習者の破裂音習得-知覚と生成-」(『JSLS2004』言語科学学会第6回年次国際大会254-255)・「韓国人学習者の日本語破裂音の縦断的習得研究-知覚-」(『三重大学留学生センター紀要』第7号44-45)・「韓国語を母語とする日本語学習者の破裂音習得-知覚と生成」(投稿中)(2)本年度調査の「韓国語・上海語話者の母語における破裂音と高さ(F_0)に関する調査」、「韓国語・上海語話者の日本語における破裂音と高さ(F_0)に関する調査」のための調査項目のリストアップを行った。(3)韓国ソウル市慶煕大学校国際教育院大学校(2004年9月)、中国上海市同済大学(2005年1月)を訪問し、発音および知覚調査を行い、データの収集を行った。(4)昨年度ソウル(慶煕大学校)、天津(天津外国語大学)、上海(同済大学)で収集した「合成音声による刺激音の知覚データ」の整理および分析を行った。本年度は、(1)(2)を中心に研究活動を行なった。*平成15年、16年の研究成果で未発表の成果(a.韓国語・北京語・上海語話者の破裂音の範疇知覚、b.韓国語・北京語・上海語話者の日本語の有声・無声破裂音の発話における習得、c.韓国人日本語学習者の破裂音の習得-知覚と生成のメカニズム)について、3つの学会で研究報告を行った。また、第2言語習得理論の立場から見た本研究の成果として、破裂音習得における母語干渉と習得プロセスを中心に中間言語構築過程についての論文をまとめ、さらに、韓国人日本語学習者の語頭破裂音を含む語のアクセントパタンについての論文をまとめた。(1)平成15、16年度に行った調査結果の分析、データの整理(2)これまでの研究成果の口頭発表と論文化・「母語干渉と習得プロセス-破裂音習得から見た中間言語構築-」『三重大学国際交流センター紀要』創刊号通巻第8号、15-28.・「韓国人学習者の日本語破裂音の習得-知覚と生成のメカニズム-」(投稿中)・「韓国人日本語学習者の語頭破裂音を含む語のアクセントパタン」(投稿中)・「日本語破裂音の発音習得における共通性と相違性-北京・上海・ソウル方言話者」『2005年度日本音声学会全国大会予稿集』日本音声学会、161-166、2005.9.・
SID-1分子の内在性リガンドの同定と応用

RNAi(RNA干渉)は、遺伝子機能阻害のための頻繁に使われる技術である。この現象が初めて線虫C. elegansで発見された当初より、二本鎖RNAが細胞間を伝播することが知られており、SID-1という分子は、伝播するRNA干渉の際の二本鎖RNAの取り込みに必要であるとされる少数の蛋白質をコードする。我々は、エンドサイトーシスメカニズムが取り込みに関わっている可能性を検討するために、vps-45遺伝子変異体を調べたところ、ほとんどの遺伝子については弱い表現型であったが、gon-1遺伝子RNAiを行うと、抵抗性であった。GON-1蛋白質はメタロプロテアーゼをコードし、DTCと体壁筋での蛋白質の分泌に必要な分子であることが判明した。また、この分泌機能には、GONドメインのみが必要であることが明らかになった。線虫は初めてRNAiが発見された生物である。その初期より、RNAiが組織や細胞を越えて伝播することが知られている。例えば、餌の大腸菌に二本鎖RNAを発現させておくと、それを食べた線虫やその子供に遺伝子発現抑制の表現型が出るが、恐らく、腸で取込まれた二本鎖RNAは、細胞間隙を介して、他の組織に取込まれて作用すると考えられる(feeding RNAiと呼ばれている)。その現象に必須の分子としてSID-1と呼ばれる膜蛋白質が記載されているが、その作用メカニズムには不明の点が多い。我々は、siRNAが細胞から細胞へ伝播する際にSID-1が受容体として働いていると考え、まず、siRNAの伝播様式からどのような分子形態で伝播が起こるかを絞り込みたいと考えた。我々は、線虫の表皮にGFPを発現しておき、GFPに対するfeeding RNAiを施すことにより、表皮の蛍光が消失することを利用してスクリーニングを行うことにした。小胞輸送に関わる分子(小分子G蛋白質やSM蛋白質、SNARE蛋白質)遺伝子に対するRNAiを予め行っておき、その個体に対してGFPに対するRNAiを行って、蛍光の消失が起こらない遺伝子をスクリーニングしている。現在、小胞のエンドサイトーシスや放出に関わる分子などが陽性となっており、siRNAは、小胞の形で分泌されたものが再度、別の細胞に取込まれる可能性を検討している。このような小胞膜上の分子がSID-1のリガンドとなり、特異的なエンドサイトーシスを介して取込まれる可能性があり、引き続き絞り込みを行いたい。線虫は初めてRNA干渉(RNAi)が発見された生物である。例えば、餌の大腸菌に二本鎖RNAを発現させておくと、それを食べた線虫やその子孫に遺伝子発現抑制の表現型が出る(feeding RNAiと呼ばれる)が、おそらく、腸で取り込まれた二本鎖RNAは、細胞間隙を介して、他の組織に取り込まれて作用すると考えられる。その現象に必須の分子として、SID-1と呼ばれる膜蛋白質が記載されているが、その作用メカニズムには不明の点が多い。我々は、二本鎖RNAが細胞間を伝播する際に、SID-1がその受容体として働いていると考え、二本鎖RNAの伝播様式からどのようなメカニズムでその現象が起こっているのかを解析しようとしている。線虫の表皮にGFPを発現しておき、GFPに対するfeeding RNAiを施すことにより、表皮の蛍光が消失することを利用し、これを阻害する遺伝子のスクリーニングを行った。小胞輸送に関わる分子に対してのRNAiをかけたのち、上記のアッセイを行うことで、蛍光の消失が起こらない遺伝子を探索した。現在、エンドサイトーシスやエキソサイトーシスに関わる分子群がスクリーニングでヒットしており、そのうちの、この現象に関わることが初めて明らかになったarf-1.2分子の機能を調べた。arf-1.2分子は、エンドサイトーシスにも、エキソサイトーシスにも関わっているように見えた。一方、rab-7遺伝子は、エンドサイトーシスに関わると考えられるが、RNAiでは胚が致死になり、蛍光の消失が見られないが、変異体で検討すると、RNAiの伝播が正常に起こっていることが明らかになった。RNA干渉(RNAi)は、今現在、広く生命科学研究に使用されている遺伝子機能阻害技術の1つである。RNAiは最初に線虫でその現象が発見された時より、組織・細胞間を伝播することが明らかになっており、その際には、SID-1という膜蛋白質が必要であることが知られている。この分子は、高等生物にもホモログが存在しており、高等生物でマイクロRNAが細胞間を伝播することが類似の現象の可能性がある。

哺乳類細胞へのsiRNAの導入効率を上げるために、SID-1を含んだRNAの取り込み機構の分子メカニズムの解明を行うことを目的とした。また、siRNAが細胞から放出されることも必要であり、その現象の分子機構の解析も行うこととした。線虫個体を用いて、feeding RNAi(餌に二本鎖RNAを発現する大腸菌を供する)を行うと、標的遺伝子の機能阻害の表現型を得ることができる。我々は、エンドサイトーシスに関わる分子VPS-45で非常に弱いRNAi伝播の現弱が見られたことから、これがSID-1と何らかの関わりを持っていると考えた。しかし、表現型が弱く、再現性が低いことから、表現型エンハンサーとなる遺伝子を探索した。VPS-45変異体にGON-1メタロプロテアーゼのfeeding RNAiを作用させると、ほとんど効果がみられず、個体は比較的健康である。一方、gon-1;vps-45二重変異体は極めて病的であり、gon-1がvps-45と共同して、RNAi伝播に関わる可能性が示唆された。GON-1の機能を解析したところ、積荷に種類によらず、体壁筋とdistal tip cellでの分泌に必須の分子であることが明らかになった。細胞への取り込みと細胞からの放出について、一層の解析を続ける予定である。また、エンドサイトーシスに関わる新規分子の単独変異で、RNAi伝播が起こらなくなるものを見出した(投稿準備中)。
スラブ-マントル反応による元素移動多様性の実験的研究

本研究は,研究代表者が進める輸送過程に関する地球内部物質の特性解明の一部として,スラブ-マントル反応による元素移動多様性の実験的研究を行った。マントル遷移層に到達して周囲のマントルと熱平衡,化学平衡に向かう条件でメルト(流体)移動,元素拡散,による混合が進行する。しかし,スラブサイズの完全な均一化は活発な対流運動渦の中でも困難であり,元素種と鉱物特性によって特徴的な不均一性を生ずることが考えられる。本研究の目的は,スラブ停留条件の玄武岩物質とマントル・ペリドタイトの反応実験を行う。高精度微量元素分析により,相平衡関係,元素分配関係だけでは理解できない元素移動度の多様性を明らかにし,遷移層,最上部下部マントルのスタグナント・スラブに起源を持つ地球化学的起源領域の特性検討である。(1)九州大学で,平成15年4月研究代表者の移動に伴い理学部付属工場に設置した中型キュービック装置と愛媛大学から移管を受けた二段式マルチアンビル装置で,高温高圧物性の研究環境を整備した。(2)沈み込むスラブの中で最も特徴的な微量元素供給源は海洋プレート上面を構成する玄武岩である。マントルの起源領域は,単純なペリドタイトと玄武岩およびその由来成分の混合によって生成されるのではなく,元素移動特性とペリドタイトの組織に支配された元素移動効率が重要であると考えられる。実験は,玄武岩-ペリドタイト試料に対し, 3-16GPa, 1400°C, 10180分加熱で行った。境界から離れたペリドタイト中にも,玄武岩起源の微量元素の増加が検出され,そのパターンは,従来想定されている単純な玄武岩メルトの付加では説明が困難である。この理由として粒界拡散を元素移動の素過程としたモデル旨に基づいて解析を進め,論文を公表した(文献1 Tomonaga et al., 2008)。高圧相多結晶体における挙動に関しても解析中である。本研究は,研究代表者が進める輸送過程に関する地球内部物質の特性解明の一部として,スラブーマントル反応による元素移動多様性の実験的研究を提案する。マントル遷移層に到達して周囲のマントルと熱平衡化学平衡に向かう条件でメルト(流体)移動,元素拡散,による混合が進行する。高精度微量元素分析により,相平衡関係,元素分配関係だけでは理解できない元素移動度の多様性を明らかにし,遷移層,最上部下部マントルのスタグナント・スラブに起源を持つ地球化学的起源領域の特性を検討する。(1)九州大学では平成15年4月研究代表者の移動に伴い,理学部付属工場に中型キュービック装置を設置した。一段式8mm角で約5GPaまでの高圧合成装置として,本年度研究発表の合成実験を行った。我々は,マントルの起源領域が,単純なペリドタイトと玄武岩およびその由来成分の混合によって生成されるのではなく,元素移動特性とペリドタイトの組織に支配された元素移動効率が重要であると考え予備的な実験解析を行った。実験は,玄武岩-ペリドタイト試料に対し,玄武岩は部分溶融,ペリドタイトは固体の条件下3GPa,1300°C,1060分で行った。この理由として粒界拡散を元素移動の素過程としたモデルに基づいて解析を進め,数度の学会発表を経て,論文投稿中である。

境界から離れたペリドタイト中にも,玄武岩起源の微量元素の増加が検出され,そのパターンは,従来想定されている単純な玄武岩メルトの付加では説明が困難である。この理由として粒界拡散を元素移動の素過程としたモデル旨に基づいて解析を進め,論文を公表した(文献1 Tomonaga et al., 2008)。高圧相多結晶体における挙動に関しても解析中である。
果実における糖組成の制御機構の解明による品質の改良

果実に転流されたスクロースは、多くの場合グルコースとフルクトースに分解された後、キナーゼによってリン酸化され、呼吸やデンプン合成等に利用される。本研究では最も甘い糖であるフルクトースをリン酸化するフルクトキナーゼに注目し、本酵素遺伝子の生理的役割の解明と、アンチセンス遺伝子の導入に伴うフルクトースレベルの向上による甘さの増進を試みた。トマトにはFrk1とFrk2の2種類のフルクトキナーゼ遺伝子が存在するため、それぞれ果実における発現をin situハイブリダイゼーションにより解析した。その結果、Frk1は組織全体に一様に発現していたが、Frk2は中果皮の内層及び種子とその周辺に局在していた。おそらくFrk1は細胞の基本的な代謝に関与する酵素であるのに対して、Frk2はデンプン合成及び種子成長など炭水化物を多く吸収すると思われる組織で機能すると考えられた。次に両フルクトキナーゼ遺伝子のアンチセンス遺伝子を作成し、トマトへの形質転換を行った。はじめに用いたプロモーターはエチレン誘導型のE8プロモーターであったが、フルクトキナーゼ活性の抑制が不十分で糖組成に変化は見られなかった。これは本プロモーターが果実成熟期でのみ働く誘導型のため、アンチセンス遺伝子の発現が遅かったためと考えられる。次に構成的に発現するカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターを用いたところ、Frk2のアンチセンス遺伝子を導入したいくつかの個体において活性の抑制されたものが得られ、可溶性糖の若干の増加が見られた。以上のように、果実におけるフルクトキナーゼの生理機能とその利用による果実品質の改良の可能性が示された。果実における糖組成は、品質決定要因として重要である。スクロースとして果実に運ばれてきた光合成産物は、多くの場合グルコースとフルクトースに分解された後、キナーゼによってリン酸化され、呼吸やデンプン合成等に利用される。本研究では、このキナーゼが糖組成を決定する一要因であると考え、特に最も甘い糖であるフルクトースをリン酸化するフルクトキナーゼに注目した。すなわち、本酵素遺伝子の生理的役割の解明と、アンチセンス遺伝子の導入に伴うフルクトースレベルの向上による甘さの増進を試みる。まずフルクトキナーゼのトマト果実における発現組織の解明と機能の検討を行うため、トマト果実の切片を作製し、これにフルクトキナーゼcDNAより調製したRNAラベルプローブをハイブリダイズさせ、トマト果実のどの組織にシグナルが得られるか解明した。その結果、フルクトキナーゼ1は組織全体に一様に発現していたが、フルクトキナーゼ2は中果皮の内層及び種子とその周辺に局在していた。おそらくフルクトキナーゼ1は細胞の基本的な代謝に関与する酵素であるのに対して、2はデンプン合成及び種子成長など炭化水物を多く吸収すると思われる組織で機能すると考えられた。現在、両フルクトキナーゼ遺伝子のアンチセンス遺伝子を作成し、トマトへの形質転換を行っている。現在、構成的に発現するカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターを用いて同様の実験を行っている。昨年度はフルクトキナーゼの発現解析を行いその生理的機能を明らかにしたので、本年度はアンチセンス遺伝子の導入を行った。

トマトにはFrk1と2の2種類のフルクトキナーゼ遺伝子が存在するため、その両方についてアンチセンス遺伝子を作成し、トマトへの形質転換を行った。はじめに用いたプロモーターは果実特異的でエチレン誘導型のE8プロモーターであったが、フルクトキナーゼ活性の抑制が不十分で糖組成に変化は見られなかった。これは本プロモーターが果実成熟期でのみ働く誘導型のため、アンチセンス遺伝子の発現が遅かったためと考えられる。次に構成的に発現するカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターを用いて同様の実験を行った。その結果、Frk1のアンチセンス遺伝子を導入した個体については活性が抑制されたものはみられなかったが、Frk2については果実での活性が抑制された個体がいくつか得られた。活性低下のみられた個体について、成熟時の果実の糖組成を検討したところ若干の変動がみられたので、現在さらに詳細を検討中である。本研究ではアンチセンス遺伝子を導入した個体において、特に成長において変化はみられなかったものの、果実の糖組成を制御できる可能性が示された。
最先端・次世代半導体デバイス実用化のためのハイドープSi表面の表面科学的研究

リンやボロンのハイドープ層を硝酸酸化処理することにより、過剰にドープするされた領域を除去し、欠陥を低減することにより、シリコン太陽電池の低コスト高効率化が可能である。表面構造の平坦性の向上により、さらなる特性向上も期待できる。また、リンやボロンのハイドープ層を恒久保存メモリの配線に利用する場合は、ハイドープ領域を表面より数nm下に形成するか、SiやSiO2などの保護層を用いることで超長寿命化が期待できる。ボロン(B)ハイドープシリコン単結晶基板と気相拡散法によりBドープしたシリコン基板のドーパントの分布をSIMSを用いて観察した。ハイドープシリコン単結晶基板では、3μmの深さでも均一にBが存在していた。一方、気相拡散法によりドープしたシリコン基板では、表面から1μmより深い所では、ドープ量が徐々に減少するが、フッ硝酢酸で1minエッチングするだけで、最表面の濃度は約10%減少し、表面から離れる意連れて急激にドーパント密度が減少していた。フッ硝酢酸エッチングの時間を2minにしてもドーパント密度の減少はわずかであり、表面のハイドープ層を選択的にエッチングできた。この条件を用いて、気相拡散法によりBドープしたシリコン基板最表面をエッチングし、硝酸酸化法によって表面をパッシベーションし、SiN膜を堆積した。さらに、430°Cで低温アニールし、SiN膜中の水素を用いて、Si/SiO2界面に存在するSiダングリングボンドを水素終端した後に、μ-PCD法を用いて少数キャリアライフタイムを測定した。シリコン基板の少数キャリアライフタイムは、フッ硝酢酸中でエッチングを行っていない基板では2428μsであったが、この表面をフッ硝酢酸中でエッチングを行うことにより、3141μsまで増加した。この結果から、最表面のB濃度が高いと、このBハイドープ層やこれと硝酸酸化膜の界面に、再結合中心が多いことが分かった。また、走査型トンネル電子顕微鏡(STM)を用い、HFエッチングにより自然酸化膜を除去した後のBハイドープシリコン単結晶基板の表円構造の観察と走査型トンネル分光(STS)測定を行った。原子レベルで平坦な表面が観測でき、場所によって、STSが異なることが分かった。また、超長期保存メモリの加速耐湿性試験の結果の検討を行い、SiN保護膜の小孔を通して水が浸入しうることを見出した。実際に用いる結晶型シリコン太陽電池ウェハのシリコン界面の特性の評価を行った。太陽電池に用いるテクスチャー基板を用いて、リン(P)をハイドープしたp型シリコン基板およびリンおよびボロン(B)をハイドープしたn型シリコン基板表面に硝酸酸化膜を形成し、Si/SiO2界面特性の評価を行った。保護膜には、ポスト熱酸化膜を用いた。また、その後に、Si/SiO2界面の欠陥であるSiダングリングボンドを消滅させるために水素中アニールを行った。p+ Si/n Si/ p+ Si、n+ Si/n Si/ n+ Siおよびn+ Si/p Si/ n+ Si構造に対し、硝酸酸化を行うことによりSi/SiO2界面特性が大きく改善され、ポスト熱酸化を行っても、硝酸酸化膜が有る方が少数キャリアライフタイムは、570%向上した。これは、硝酸酸化膜のSi/SiO2界面の良好な特性が、ポスト熱酸化後でも維持され、界面準位密度の低減に極めて効果的であることも分かった。特に、ボロン(B)をハイドープしたn型シリコン基板表面では、少数キャリアライフタイムの向上が著しかった。これは、太陽電池特性を劣化させることが知られているボロンリッチ層がシリコン表面にでき硝酸酸化により効果的に除去されることが示唆された。また、p型Si基板上で硝酸酸化したものとそうでないものを、熱酸化後、水素処理をし、表面にAlドット電極、裏面に全面Al電極を形成し、コンダクタンスー電圧曲線を測定し、Si/SiO2界面での界面準位密度を評価した。これにより、界面準位密度が10%以上も低減することが分かった。また、電気容量ー電圧特性から固定電荷密度も求めたが、硝酸酸化膜の有無で明瞭な変化は見られなかった。昨年度の結果も併せて考えると、硝酸酸化膜は、p型およびn型の両シリコン基板表面のパッシベーションに非常に有効であることを明らかにした。p型太陽電池の実際の構造により近い、SiN保護膜兼パッシベーション膜を最外層に形成した、Si/SiO2/SiN構造を作成した。両面にtexture構造を形成したSi基板を用い、POCl3中で両面にPのハイドープ層を形成した。このSiO2を硝酸酸化処理により形成し、ポスト熱酸化することにより形成すると、ライフタイムもimplied VOCも大きく向上した。また、同様な結果が、Bをハイドープしたn型Si基板上でも観測された。これらの結果は、ハイドープ層表面の硝酸酸化処理、ポスト熱酸化処理とSiN膜の堆積により、量産プロセスにおいても、硝酸酸化処理がハイドープシリコン表面の改質に有効であることを示唆した。Alを用いたハイドープ層の形成も試みた。Alペーストを印刷し、焼成することでハイドープ層を形成し、余分なAlを塩酸で除去した。p-Si基板上では、Bハイドープ層を形成することにより、少数キャリアライフタイムの向上が見られたが、硝酸酸化膜やSiN膜を用いたパッシベーション膜を形成したp-Si基板上のものと比較すると、少数キャリアライフタイムは減少し、Alの局所的ドープにより、表面近傍での再結合中心の低減を行うことが重要であることが示唆された。

そこで、Alペーストを局所的に印刷し、この表面での分光学的測定を行い、測定結果の解析を継続中である。また、片面鏡面研磨したn型Si(111)単結晶基板を太陽電池のtexture表面のモデル表面とするため、表面のシート抵抗が60Ω/□になるように、POCl3を用いてPをハイドープし、フッ化水素酸でPSGを除去した表面の構造を走査型トンネル電子顕微鏡を用いて観察した。原子レベル以外に、数nm以上の凹凸とともに原子レベルでも凹凸が観察され、界面準位の低減には、界面の構造も検討する必要があることを明らかにした。リンやボロンのハイドープ層を硝酸酸化処理することにより、過剰にドープするされた領域を除去し、欠陥を低減することにより、シリコン太陽電池の低コスト高効率化が可能である。表面構造の平坦性の向上により、さらなる特性向上も期待できる。また、リンやボロンのハイドープ層を恒久保存メモリの配線に利用する場合は、ハイドープ領域を表面より数nm下に形成するか、SiやSiO2などの保護層を用いることで超長寿命化が期待できる。表面に実際の太陽電池に用いるテクスチャー構造とハイドープ層のある太陽電池基板上での硝酸酸化処理の最適条件の探索に成功し、パッシベーション効果を実証し、また、新たにボロンリッチ層の除去に硝酸酸化を用いる研究課題を見出しており、太陽電池に用いるハイドープ層のパッシベーションの研究は、予定より大きく進んだ。研究室内のXPSが故障したため、ハイドープ基板上の酸化膜の組成や膜厚の評価がまだであるが、XPS測定を行える施設を見つけたので、早期に行う。表面化学引き続き、ボロンリッチ層の除去を行う硝酸酸化法の最適条件を探索する。XPSを用いて、硝酸酸化処理前後でのシリコン表面の組成を明らかにする。また、SiN保護膜を形成した際のSi/SiO2界面特性の評価をμ-PCD法により測定した少数キャリアライフタイムにより行う。さらに、気相拡散法を用いたボロンハイドープ基板の作製が完了したので、これを用いて、拡散法の違いによるハイドープ層の特性の比較と、硝酸酸化による表面パッシベーションと表面エッチング方法の研究・開発を行う。また、一般的に太陽電池プロセスで用いられているAl電極により形成したハイドープ層との物性の比較を行う。STMによる表面形状観察やSTSによる表面電子状態の評価も進める。ハイドープシリコン表面の水蒸気との反応の観察とメカニズム解明を行う。相対湿度80%/80 ̊Cの加湿高温加速試験機で、ハイドープシリコン表面と水蒸気を反応させる際に、硝酸酸化膜がシリコン表面の有無による、シリコン表面の構造、組成、電子状態、酸化膜厚などの違いをXPS、TEM、STMおよびSTSなどにより明らかにする。これにより、恒久保存メモリ「デジタルロゼッタストーン」のためのハイドープシリコン配線の有用性や硝酸酸化膜による長寿命化について検証を行う。ハイドープ単結晶基板および気相拡散を用いてドープしたシリコン基板のドーパントの分布をSIMSにより定量し、計画通りに進んでいる。ドーパント塗布液を用いた固相拡散法による表面近傍ドープについては、表面抵抗測定からおおよその拡散温度を決定したので、SIMS測定を近日中に行う予定である。イオン注入については、より安価な業者を探索中である。
地球温暖化に適応するための海藻類の新品種開発手法の確立

近年、海藻類の需要は増大している一方で地球温暖化による生育不順などの影響により生産量は安定しておらず、花が咲かない海藻類では品種改良が進んでいない。海藻の生育には微生物の共在が必須であり、陸上植物では共生微生物の種類に応じて植物の性質が変化することが知られている。そこで本研究では意休温暖温暖化に対応できる海藻類の作出することを目的として、ゲノム科学的視点から海藻類と微生物の相互関係の解明に迫る。そのためのモデル海藻として、2種のゲノムが解読されている褐藻モズク類を用いる。高温耐性を持つモズク新品種改良法を確立し、地球温暖化に影響されない海藻類の作出に取り組む。
完全制御多分割原子炉心照射カプセルの試作と中性子照射損傷基礎過程の研究

本研究は、照射中はもとより照射前後の実験条件を厳格に制御した原子炉心中性子照射を系統的能率的に行い得る照射装置をシステムとして完成し、これを用いた照射実験の解析から材料の中性子照射損傷の基礎過程の知識を体系化し、核分裂炉材料の改良および核融合炉材料の開発の基礎を構築することを目的として、遂行してきた研究の最終年度のものである。本年度の研究成果は二段階に記述できる。多段制御照射カプセルによる照射の実行と照射後実験・解析、および完全制御多分割原子炉心照射カプセルの開発の完了である。本研究の前半で開発した多段制御照射カプセルを材料試験炉JMTRに用い、炉中心に対して対称位置に従来型の制御と改良型の制御を与えた結果、金属・合金を主軸とした多種の材料に導入された損傷構造には、極端な場合には100%の差が生じることが確認された。また、改良型照射により核融合中性子照射との直接の比較がはじめて可能となり、核分裂一核融合中性子照射相関係数が材料の種類と発達する欠陥構造の種類により大きく変化することが定量的に明らかになった。これらの成果は、国際的にも従来型の原子炉照射法の欠陥を認識・理解せしめ、改質への大きな動きとなりつつある。本研究の最終目標である炉心照射カプセルを多分割し原子炉運転中に随時部分的に試料を取り出すことのできる完全制御多分割炉心照射カプセルに関しては、最も肝要な試料と熱媒体との熱的接触と機械的不接触の両立のための技術の開発を経て、原子炉挿入時と同形のモックアップテストにより技術的な問題点を洗い出し、それらを解決することにより技術開発を完了した。開発した多分割カプセルによる照射の実行は原子炉の運転計画との整合性のため平成4年度以降となるが、第一段の多段カプセルによる成功からみて成果が確実に期待される。従来の原子炉心照射の致命的ともいえる欠陥を取り除くとともに損傷基礎過程を解明するのに最も適した構造の多段多分割完全制御原子炉心照射装置の試作を開始すると同時に、この照射手法の有効性を実証するために原子炉研究所材料試験炉JMTRを用いて試行照射を行った。日本原子力研究所大洗研究所の原子炉照射技術専門家および照射装置の専門メ-カ-の技術者との回数を重ねた協議検討により、多段分割方式原子炉心照射装置の概念設計をほぼ完了した。この方式は国際的にも経験のない方式で、安全性も含めて誤動作は許されず、原子炉外での模擬試験装置の製作が第一の課題となり、これを製作した。(1)管状の照射装置の炉心部分を長さ方向に三分割(熱媒体と呼ぶ)し、強力な発熱体を装荷することによりそれぞれを独立な温度に設定できるが、炉運転中に照射試料の一部を随時炉心外に移動させた場合の残留試料と移動試料の両者の温度保持が最も困難な課題であり、模擬装置は炉心内と全く同一の条件を再現できる。(2)円筒形の熱媒体は円周方向に6分割され軸方向に沿った6ケ所の縦穴に試料ミニカプセル(標準試料500個装填可能)を挿入するが、このミニカプセルは炉運転中に炉心外まで長距離確実に移動できることが必要である。薄肉ガイド管を通じての移動機械は模擬装置でテストできるが、原子炉心外からの駆動部の試作試験は2年度となる。多分割ではないが多段の中性子束温度相関履歴完全制御の炉心照射を材料試験炉JMTRにより実行した。

一本の炉心照射装置をその軸方向に四段に分割してその一部に従来型の温度制御を与え、完全制御を与えたものと結果を比較したもので、理論的に予測していた通り材料の種類と温度の組合せによっては両者の間に決定的な差があることが判明し、多段多分割方式の必要性が確認された。照射中はもとより照射前後の実験条件を厳格に制御した原子炉中性子照射を系統的能率的に行い得る照射装置をシステムとして完成し、これを用いた照射実験の結果の解析から材料の中性子照射損傷の基礎過程の知識の体系化を可能とし、核分裂炉材料の改良および核融合炉材料開発の基礎を構築することを目的として開始された3ケ年計画の本研究は、その2年度において日本原子力研究所材料試験炉JMTRを用いての試行照射の第3回目を成功させるとともに、本格的多段多分割照射カプセルの設計製作に必要な基礎デ-タを着実に蓄積し、最終年度である次年度での最終目的の達成への可能性を確実なものとした。前年度までに行われた2回の試行照射は高温領域を目的としたもので、低温領域を目的とした第3回目の試行照射で必要な温度領域を全てカバ-し、全ての温度領域に対して中性子束一照射温度の相関履歴の完全制御の必要性が確認された。制御された条件のもとで照射された試料の核分裂中性子照射損傷構造の定量的計測結果は核融合中性子照射(核融合中性子源RTNSーIIによる)の結果と直接比較することが可能となり、両者の類似と差異が材料の種類、欠陥構造の種類および照射温度により幅広く変化することが見いだされ、その差は同一の損傷エネルギ-で比較して最大30倍にまで達することが判明した。上記の試行照射により多段(最大4段)カプセルによる相異なる温度の組み合せの同時制御照射の技術は確立した。他方、多分割方式による原子炉運転中での試料の移送機構に関しては、その最重要技術であるカプセル内熱媒体と試料ミニカプセルの熱接触と可動性を両立させるための検討を、温度制御・移送機構確認装置を製作して実験を重ねることにより行われた。熱接触を保つための銅メッシュ押入方式および移送を円滑におこなうためのステンレス内ばり方式が検討され、熱媒体と試料ミニカプセルの最適ギャップの決定等の基膜デ-タを獲得した。本研究は、照射中はもとより照射前後の実験条件を厳格に制御した原子炉心中性子照射を系統的能率的に行い得る照射装置をシステムとして完成し、これを用いた照射実験の解析から材料の中性子照射損傷の基礎過程の知識を体系化し、核分裂炉核融合炉材料開発の基礎を構築することを目的として、遂行してきた研究の最終年度のものである。本年度の研究成果は二段階に記述できる。即ち、多段制御照射カプセルによる被照射試料の照射後実験と解析、および完全制御多分割原子炉心照射カプセルの開発の完了である。本研究の前半で開発した多段制御照射カプセルを材料試験炉JMTRに用い、炉中心に対して対称位置に従来型の制御と改良型の制御を与えた結果、金属・合金を主軸とした多種の材料に導入された損傷構造には、極端な場合には100%の差が生じることが確認され、改良型照射による核融合中性子照射との直接の比較が可能となった。またこの成果は、国際的にも従来型の原子炉照射法の欠陥を認識・理解せしめ、改質への大きな動きとなりつつある。本研究の最終目標である炉心照射カプセルを多分割し原子炉運転中に随時部分的に試料を取り出すことのできる完全制御多分割炉心照射カプセルに関しては、最も肝要な試料と熱媒体との熱的接触と機械的不接触の両立のための技術の開発を経て、原子炉挿入時と同形のモックアップテストにより技術的な問題点を洗い出し、それらを解決することにより技術開発を完了した。
肝胆膵の発生・分化の分子機構の解明とその障害による小児疾患の病態解析

膵臓と胆管の器官分化を決定する分子機構は、まったく不明である。また、糖尿病の再生治療法を開発するためには、膵幹細胞からβ細胞を分化させる必要があるが、分化の制御機構にも不明な点が多い。本研究により、Notchシグナルの標的となる転写因子Hes1が膵臓と胆管の器官分化、および内分泌・外分泌組織を含めた膵幹細胞の分化方向を制御する分子として作用していること、さらに発生期の膵幹細胞にHes1が過剰発現すると糖尿病を発症することが判明した。膵臓と胆管はいずれも前腸上皮に存在する前駆細胞に由来するが、器官分化の分子機構は不明である。我々はNotchシグナルの胆管系と膵臓の器官分化における意義を検討した。【方法】Hes1欠損マウスと過剰発現マウス(膵臓幹細胞や胆管原基に発現する転写因子Pdx1のプロモーター制御下に、Hes1とEGFPを発現するトランスジェニックマウス)を作成し、膵臓と胆管の発生過程を解析した。【結果】Hes1欠損マウスの胆管発生では、胆管芽は発生するが、総胆管や胆嚢は形成されず、胆管上皮は管腔構造をとらずに、内分泌や外分泌組織を有する膵臓様組織に分化した。胆管系と膵臓の原基は共にPdx1陽性で相互に可塑性に富んでいるが、胆管上皮ではHes1が持続的に発現して膵臓化プログラムを抑制することにより管腔構造が維持されることが判明した。一方、Hes1過剰発現マウスの膵臓では膵管のみが形成され、膵実質細胞は全く発生しなかった。膵管の上皮細胞では未熟性を示すマーカー(Pdx1,Glut2,βカテニン)が検出されるので、Hes1の過剰発現により膵臓幹細胞の分化・成熟が停止し、未分化能を維持したままの細胞が膵管にとどまった状態で出生したものと考えられる。【考察と結論】本研究により、系統発生的に近縁な胆管と膵管の原基には共に膵臓実質細胞への分化能を有する幹細胞が分布しているが、Hes1の時間・空間的な発現レベルの制御によって膵臓と胆管系の器官分化が可能になることが判明した。Hes1は神経細胞や膵臓細胞の分化を誘導するbHLH型転写因子を抑制するリプレッサーとして作用する。この機能が胆管系と膵臓の器管分化を可能にする分子基盤を担っていると考えられる。1.昨年度に引き続いて、Notchシグナルの胆管系と膵臓の器官分化における意義を検討した。本年度はとくに、膵臓のランゲルハンス島形成におけるHes1の役割について解析した。【方法】Hes1過剰発現マウス(膵臓幹細胞や胆管原基に発現する転写因子Pdx1のプロモーター制御下に、Hes1とEGFPを発現するトランスジェニックマウス)のランゲルハンス島の形成状態を検討し、膵臓の発生過程を解析した。さらに、一部の遺伝子組み換えマウスで糖尿病を発症するので、その病態についても検討した。【結果】Hes1過剰発現マウスでは、Hes1の発現量により膵臓幹細胞の分化の方向性や程度が大きく変化した。(1)Hes1の高発現ラインマウスの膵臓では未分化な膵管のみが形成され、膵実質細胞は全く発生しなかった。このマウスは出生時から高度の高血糖を示し、出生後1週間以内にすべて死亡した。このマウスの膵臓幹細胞では未熟性を示すマーカーであるPdx1、βカテニン、Glut2などが出生後も陽性を示した。(2)Hes1の過剰発現が低レベルの場合は、ランゲルハンス島の形成が不十分でIslet Cell Massが減少していた。本研究ではHes1の過剰発現が比較的低レベルのマウス3ラインを詳細に解析した。これらの3ラインの中では糖尿病を発症するマウスが出現した。とくにIslet Cell Massの減少度が著しいマウスでは、新生児期からインスリン欠乏性の糖尿病を発症した。また個々のβ細胞機能には大きな異常はないことから、インスリン欠乏はIslet Cell Massの減少によると推測された。2.本年度は肝臓発生の障害によって起こる進行性家族性肝内胆汁うっ滞症(PFIC)1型並びに2型を鑑別するための遺伝子診断系の開発を開始した。とくに、これらの遺伝子の構造は大きく、変異のホットスポットも認められないため、より簡便なWAVEシステムを利用して遺伝子変異を検索する方法を採用した。これにより、肝移植前に移植後経過の良否が推測できるので、臨床的意義は大きいと期待される。膵臓の幹細胞に発現する転写因子Pdx1のプロモーター制御下に、Hes1を発現するトランスジェニックマウスを用いることにより、Notchシグナルが膵臓幹細胞の増殖分化を制御していることが証明された。すなわち、Hes1の過剰発現が著しい場合には膵臓内分泌も外分泌もまったく形成されず、膵臓低形成になって出生数日以内に死亡する。