hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞運動制御の新展開：筋収縮調節タンパク質トロポニンによる細胞運動の制御

クマムシ非横紋筋細胞のトロポニンについて:抗トロポニンI(TnI)抗体を用いた染色によりTnIが咽頭部を除くからだ全域の非横紋筋細胞のアクチン線維ネットワークに存在することを明らかにした。咽頭部の非横紋筋細胞には、抗原性が異なるTnIアイソフォームがあると推測した。クマムシのホモジェネートから、ATP,EGTAを含む弛緩溶液によりTnIをもつアクチン線維が解離することを見いだし、遠心分離法によりこのアクチン線維を分離、Western blotによりTnIバンドを同定した。材料の量的な制約の故、これ以上の解析はできなかったが、成果を論文発表した。無脊椎動物非横紋筋のトロポニンの分離、機能解析等についての比較生理化学的研究法を、これまでの研究実績、研究経験に基づいてとりまとめ、考察して論文としてまとめて発表した。ナマコのアクチン線維の分離と構成タンパク質の解析:ナマコの体壁を構成する非横紋筋から天然アクチン線維を分離、SDS-PAGE解析、このアクチン線維にはトロポニンやトロポミオシンに相当するバンドは検出されなかった。ナマコの体壁非横紋筋にはトロポニンがない可能性が示唆されるが、次年度、方法を改善して更に検討することにした。線虫のカルポニン様タンパク質(UNC-87)の機能特性:カルポニンは脊椎動物非横紋筋に存在するアクチン結合タンパク質で、アクチン-ミオシン相互作用の制御因子として働く。線虫にはこれと構造的ホモロジーがあるUNC-87(アクチン結合タンパク質)が存在する。無脊椎動物でのトロポニンによる収縮運動の制御に影響を与える可能性があるので、UNC-87の機能特性を解析した。その結果、UNC-87はアクチンに結合するのみならず、ミオシンにも結合し両者を架橋、アクチン-ミオシン相互作用に抑制的に作用するという特異な機能をもつことを見出した。1)非横紋筋のモデルとして取り上げた微小動物クマムシの非横紋筋で、アクチン線維にトロポニン成分の存在をイムノブロット法で検出し、また、トロポニ含有アクチン線維が解離させる既知の条件(低Caイオン濃度、ATP存在)でアクチン線維が解離することからトロポニンの存在を確認、トロポニンがこの非横紋筋細胞の運動制御に関与することを示唆できたのは大きな成果である。2)これまで棘皮動物ウニの筋(平滑筋)にトロポニンはないと結論されているが、トリノアシ筋、ナマコ筋でトロポニンの不在を確認、後口動物の進化過程で、棘皮動物全般にトロポニンは欠損、原索動物(ナメクジウオ、ホヤ)で初めてトロポニンが出現するという結論に至った。3)扁形動物(プラナリア)の非横紋筋細胞からアクチン線維の分離には成功したが、内在するプロテアーゼに妨げられ、トロポニンの解析(局在および機能解析)は滞っている。プラナリアのトロポニンは組み替え体蛋白質を用いる方法論に切り替えて進みつつある。次年度に成果が得られるであろう。微小動物であるクマムシの非横紋筋のアクチン線維にトロポニンが存在することを明確に示し、更に低Caイオン濃度、ATPにより収縮運動装置からアクチン線維が解離することから、トロポニンがこの非横紋筋細胞の運動制御に関与することを示唆できたのは大きな成果である。しかし、材料の量的制約から、トロポニンの機能特性の解析は出来なかった。扁形動物(プラナリア)の非横紋筋細胞からアクチン線維の分離には成功したが、内在するプロテアーゼのためにトロポニンが分解されるようで、アクチン線維のミオシンとの相互作用のカルシウム依存性は十分認められず、方法論の改善の必要性が明らかになった。ほ乳類筋上皮細胞のトロポニンについては種々の抗体をテストしたが、適切に機能する抗体が手元になく、購入した物も上手く機能せず、研究は停滞した。
前頭連合野-運動野神経回路における行動系列学習機構のモデル解析

本研究は,動物が感覚刺激に対して数百ミリ秒で適切な行動を生起できるようになる神経情報処理機構の解明を目的としている.これまでの研究で,この高速神経情報処理の機構として細胞の発火潜時の差による競争機構の仮説を提唱し,この仮説のもとでサル側頭葉の細胞応答が定量的に説明できることを示した.本年度は,この機構が他の生理学データから導かれる諸条件の下で適切に働きうるかを調べた.すなわち,刺激に対する1次視覚野細胞の応答潜時には刺激の明るさにより最大30ミリ秒の差がある.また,上側頭溝細胞の視覚刺激に対する応答潜時は聴覚刺激に対するそれよりも約100ミリ秒長い.それにもかかわらず神経系は複数の明るさの異なる視覚刺激や視覚刺激と聴覚刺激を総合して数百ミリ秒の内に適切な行動を生起できる.一方,我々の仮定する機構は細胞の発火潜時の差という数ミリ秒の時間差を利用した情報処理機構である.この機構が上記のような複数の原因による応答潜時の差の下で適切に働きうるのかを神経回路モデル上で調べた.まず,1次視覚野の神経回路モデルを構成し,それに30ミリ秒の応答潜時の広がりをもつ興奮入力を入れて上記機構の働きを調べた.次に2経路(視覚路と聴覚路)の投射するSTP野の回路モデルを構成し上記の100ミリ秒の潜時差をもつ興奮入力を入れて上記機構の働きを調べた.次に、2経路(視覚路と聴覚路)の投射するSTP野の回路モデルを構成し上記の100ミリ秒の潜時差をもつ興奮入力を入れて回路挙動を解析した.その結果,本機構は刺激入力の潜時にばらつきがあってもすべての入力が揃った後は直ちに適切な応答を出すことが本モデル上で示された.これから,本機構が脳内の神経系でも適切に働きうることが示差された.本研究は,動物が感覚刺激に対して数百ミリ秒で適切な行動を生起できるようになる神経情報処理機構の解明を目的としている.これまでの研究で,この高速神経情報処理の機構として細胞の発火潜時の差による競争機構の仮説を提唱し,この仮説のもとでサル側頭葉の細胞応答が定量的に説明できることを示した.本年度は,この機構が他の生理学データから導かれる諸条件の下で適切に働きうるかを調べた.すなわち,刺激に対する1次視覚野細胞の応答潜時には刺激の明るさにより最大30ミリ秒の差がある.また,上側頭溝細胞の視覚刺激に対する応答潜時は聴覚刺激に対するそれよりも約100ミリ秒長い.それにもかかわらず神経系は複数の明るさの異なる視覚刺激や視覚刺激と聴覚刺激を総合して数百ミリ秒の内に適切な行動を生起できる.一方,我々の仮定する機構は細胞の発火潜時の差という数ミリ秒の時間差を利用した情報処理機構である.この機構が上記のような複数の原因による応答潜時の差の下で適切に働きうるのかを神経回路モデル上で調べた.まず,1次視覚野の神経回路モデルを構成し,それに30ミリ秒の応答潜時の広がりをもつ興奮入力を入れて上記機構の働きを調べた.次に2経路(視覚路と聴覚路)の投射するSTP野の回路モデルを構成し上記の100ミリ秒の潜時差をもつ興奮入力を入れて上記機構の働きを調べた.次に、2経路(視覚路と聴覚路)の投射するSTP野の回路モデルを構成し上記の100ミリ秒の潜時差をもつ興奮入力を入れて回路挙動を解析した.その結果,本機構は刺激入力の潜時にばらつきがあってもすべての入力が揃った後は直ちに適切な応答を出すことが本モデル上で示された.これから,本機構が脳内の神経系でも適切に働きうることが示差された.
感染モデルを用いた自然免疫系から獲得免疫系への連携機構の解析

これまでの解析から、Toll-like receptor (TLR)を介した自然免疫系の活性化が、樹状細胞の成熟誘導を介して、Th1応答を中心とした獲得免疫系の誘導に重要であることが明らかになっている。そこで、実際の個体レベルでの自然免疫系から獲得免疫系への橋渡し機構を、TLRを介した自然免疫系の活性化の消失するマウスに感染モデルを導入し解析した。トリパノソーマ原虫Trypanosoma cruziを、TLRを介した自然免疫系の活性化の消失するMyD88/TRIF二重欠損マウスに感染させると、感受性が極めて高くなるにもかかわらず、抗原特異的なCD4陽性細胞からのIFN-gamma産生を指標にしたTh1応答は正常に誘導されていることを見出した。また、MyD88/TRIF二重欠損マウス由来の樹状細胞にT. cruziを感染させても、樹状細胞の成熟が正常に誘導された。そこで、MyD88/TRIF二重欠損マウス由来の樹状細胞にT. cruziを感染させて、正常と同様に誘導されてくる遺伝子群をDNAマイクロアレイで解析した。その結果、ある一群の遺伝子群がMyD88/TRIF二重欠損マウス由来の樹状細胞でも、正常に誘導されてくることを見出した。今後、これら遺伝子群がTLR非依存的に誘導されてくるメカニズムを明らかにするとともに、これら遺伝子群がT. cruzi感染によるTLR非依存的なTh1誘導に関与しているのかを明らかにしていく予定である。
ニフエジピン歯肉増殖症におけるアポトーシス

一般的に、増殖症はその組織の細胞数の著しい増加を伴うが、これらは細胞増殖の促進と細胞死の抑制との両方の機構により制御されていることが最近、示唆されている。これまで多くの報告がニフェジピンの直接的な歯肉細胞の増殖促進効果を否定していることから(Nishikawa S et al.JPeriodontol 62:30-35,1991)、本疾患は、ニフェジピンが歯肉を構成する細胞のアポトーシスに何らかの影響を与えた結果、発現する可能性が示唆される。そこで、本研究では、1993年に(Morisaki I et al.Jperiodontol,28.396-403,1993)に我々が確立したニフェジピンによる歯肉増殖症のラットモデルを用い、1)歯肉組織中の、アポトーシスの代表的指標とされるトランスグルタミナーゼ(TG)(EC2.3.2.13)活性2)歯肉組織中のアポトーシス関連タンパク(増殖核抗原など)の発現およびDNAの分解が、薬剤投与によって、どのように変化するかを検索し、ニフェジピン歯肉増殖症とアポトーシスとの関連を検討した。その結果、ニフェジピン投与によって歯肉組織中のTG活性だけでなく、歯肉上皮のアポトーシス陽性細胞数(TUNEL陽性でかつPCNA陰性の細胞の数)も減少することが明らかとなった。アポトーシスの一連の過程に関与する酵素の多くが(エンドヌクレアーゼやTG)、カルシウム依存性の酵素であることをふまえて考察すると、本実験結果から、Ca^<2+>チャンネルブロッカーであるニフェジピンが歯肉組織中の両酵素の活性化を抑制することによって、アポトーシスのサイクルを遅延させた結果、歯肉に増殖症を惹起させる可能性が示唆された。ラットのニフェジピン歯肉増殖症の発症機序におけるアポトーシスの意義を検討するため、アポトーシスの関連マーカーと考えられているトランスグルタミナーゼ(TG)の活性を種々の実験系で測定し、以下の結果を得た。(1)TG活性のラット歯肉中での存在、その活性量、細胞内局在を明らかにするため、20日齢ラット歯肉のTotal homogenateを遠心し、核、膜、ミクロゾーム、サイトゾル成分を分画し、それぞれに含まれるTG活性を測定した。併せて、同様に肝臓から調製された成分の活性も測定し、歯肉と比較した。その結果、歯肉のTotal homogenate、核、膜画分中の活性は、肝臓にくらべ約4-6倍高いこと、歯肉ではミクロゾーム及びサイトゾル画分は他の画分に比べ約33%であるのに対し、肝臓では膜およびサイトゾル画分にその活性の大半が含まれていることが明らかとなった。(2)20日齢ラット歯肉のTG活性(Total homogenate)の日齢による変化を調べたところ、40日齢(20日齢の約50%)まで経時的に下降し、そのレベルで70日齢まで維持されることが明らかとなった。(3)20日齢ラットにニフェジピン含有飼料を与え10日間飼育したところ、歯肉TG活性は対照ラットの約50%となることが明らかとなった。TGがカルシウム依存性の酵素であることをふまえて考察すると、上記の結果から、カルシウム拮抗薬であるニフェジピンが歯肉組織中TGの活性化を抑制することによって、アポトーシスのサイクルを遅延させた結果、歯肉に増殖症を発症させる可能性が示唆された(Nishikawa et al. J Periodontol, in press)。

また、ラットにおいて歯肉のみに増殖が生じること、日齢の高いラットではニフェジピンによって歯肉に増殖が生じないという事実(Ishida et al. J Periodontol, 66:345-350,1995)は、歯肉のTG活性が、活性の高いとされる肝臓よりもさらに約4-6倍高いこと、日齢とともにTG活性が低下するという結果で説明されることが示唆された。一般的に、増殖症はその組織の細胞数の著しい増加を伴うが、これらは細胞増殖の促進と細胞死の抑制との両方の機構により制御されているこいとが最近、示唆されている。これまで多くの報告がニフェジピンの直接的な歯肉細胞の増殖促進効果を否定していることから(Nishikawa S et al.JPeriodontol 62:30-35,1991)、本疾患は、ニフェジピンが歯肉を構成する細胞のアポトーシルに何らかの影響を与えた結果、発現する可能性が示唆される。そこで、本研究では、1993年に(Morisaki I et al.J Periodontol.28.396-403,1993)に我々が確立したニフェジピンによる歯肉増殖症のラットモデルを用い、1)歯肉組織中の、アポトーシスの代表的指標とされるトランスグルタミナーゼ(TG)(EC2.3.2.13)活性2)歯肉組織中のアポトーシス関連タンパク(増殖核抗原など)の発現およびDNAの分解が、薬剤投与によって、どのように変化するかを検索し、ニフェジピン歯肉増殖症とアポトーシスとの関連を検討した。その結果、ニフェジピン投与によって歯肉組織中のTG活性だけでなく、歯肉上皮のアポトーシス陽性細胞数(TUNEL陽性でかつPCNA陰性の細胞の数)も減少することが明らかとなった。アポトーシスの一連の過程に関与する酵素の多くが(エンドヌクレアーゼやTG)、カルシウム依存性の酵素であることをふまえて考察すると、本実験結果から、Ca^<2+>チャンネルブロッカーであるニフェジピンが歯肉組織中の両酵素の活性化を抑制することによって、アポトーシスのサイクルを遅延させた結果、歯肉に増殖症を惹起させる可能性が示唆された。
腸間膜白色脂肪組織形成におけるFGF受容体2の役割とその分子メカニズムの解明

腸間膜白色脂肪組織の形成において、FGF受容体2が間質血管に発現するFGF9をリガンドとして、おそらくエネルギー消費を抑制し、その結果、脂肪脂肪のサイズが増加(肥大)することが明らかになった。また、FGF受容体2のリガンドの候補として期待したFGF21は、代謝状態に合わせて脂肪細胞のトリグリセリドの分解に重要な役割を果たすものの、FGF受容体2のリガンドではないことが明らかになった。白色脂肪組織の形成において、成熟脂肪細胞の肥大化過程は重要である。脂肪細胞特異的FGF受容体2遺伝子欠損マウスにおいて腸間膜白色脂肪組織の脂肪細胞の肥大が抑制されることから、そのメカニズムについて検討を試みた。その結果、脂肪細胞特異的FGF受容体2遺伝子欠損マウスでは、脂肪合成や脂肪分解に関わる因子の発現は変化が見られなかったが、エネルギー消費に関わる因子UCP2の発現が亢進していた。従って、FGF受容体2はエネルギー消費を抑制し、その結果脂肪細胞の肥大を亢進するものと考えられた。また、FGF受容体2のリガンドの同定を試みた。一般にFGFは傍分泌因子として働くことから、FGF受容体2に結合親和性があり、かつ腸間膜白色脂肪組織に発現するFGFリガンドを検討したところ、FGF9が腸間膜白色脂肪組織のSV画分に特異的に発現していることを見出した。腸間膜白色脂肪組織の組織片にFGF9を添加することによりUCP2の発現が抑制されることも明らかにした。以上の結果から、生体の腸間膜白色脂肪組織の形成過程では、FGF9-FGF受容体2のシグナリングにより、エネルギー消費が抑制され、脂肪細胞のサイズが増加することが明らかとなった。一方、肥満症発症時にも脂肪細胞の肥大化が進むことが知られている。そこで、脂肪細胞特異的FGF受容体2遺伝子欠損マウスを高脂肪食で飼育し、肥満症発症時のFGF受容体2の役割について検討を試みた。5ヶ月齢まで高脂肪食で飼育したものの、体重や脂肪組織重量に明瞭な差は認められなかった。従って、FGF受容体2を介するシグナリングは肥満症時における脂肪細胞の肥大には関与しないことが示唆された。白色脂肪組織は生体の余剰エネルギーを蓄積する器官というだけではなく、生体のエネルギー代謝を調節する重要な器官である。申請者は、白色脂肪細胞の肥大化にFGF受容体2を介するシグナリングが重要な役割を果す事を明らかにした。本年度では、このFGF受容体2のリガンドの可能性が考えられたFGF21について、遺伝子改変マウスの作製と解析を行った。FGF21遺伝子欠損マウスはメンデルの法則に従って出生した。またその後も外見上明らかな表現形質は認められなかった。しかし、8週齢以降、FGF21遺伝子欠損マウスは、野生型マウスに比較し体重の増加傾向が観察された。そこで、2ヶ月齢マウスの組織重量を検討したところ、多くの組織の重量に大きな差は無かったが、白色脂肪組織の重量増加が認められた。この白色脂肪組織の重量増加は、細胞内にトリグリセリドを蓄積した白色脂肪細胞のサイズの増加、すなわちトリグリセリド蓄積の増加が原因であった。従って、FGF21遺伝子欠損マウスは通常食飼育下で肥満傾向を示すことが明らかになった。この白色脂肪細胞の肥大の分子メカニズムについて検討を行ったところ、FGF21遺伝子欠損マウスにおいては白色脂肪組織におけるトリグリセリド分解活性の減少と、トリグリセリド分解酵素の発現減少が認められた。また、血中パラメーターを検討したところ、白色脂肪組織におけるトリグリセリド分解の結果生じる遊離脂肪酸濃度の減少が認められた。以上の結果を総合して、FGF21は白色脂肪組織における脂肪分解を促進し、白色脂肪組織の増大を抑制していることが明らかになった。しかし、FGF受容体2遺伝子欠損マウスの表原形質とFGF21遺伝子欠損マウスとは異なっていたことから、FGF21がFGF受容体2のリガンドではないことが明らかとなった。以上、本研究で得られた知見は、基礎生物学だけではなく、肥満症の発症、治療法開発にも貢献するものと期待される。
ウエットデニューダー／ミストチャンバー法による越境酸性汚染物質の富士山頂定点観測

富士山頂における大気中水溶性酸性ガスと粒子状物質に含まれる陰イオンを観測するための分析システムを開発した。本分析システムは,酸性ガスと粒子状物質のデータ1時間に1つずつ出力する。本システムを富士山頂で稼働させ,大気中のHNO3,SO2,NO3-及びSO42-を連続測定した。後方流跡線解析より,アジア大陸で放出された高濃度のSO42-が観測地点に輸送されていることが示唆された。研究代表者が考案した新規濃縮概念「ポストカラム濃縮法」を実用レベルに発展させる。すなわち、ポストカラム濃縮法をウエットデニューダー法とミストチャンバー法を連結した分析システムに導入し、水溶性酸性ガス/粒子状物質自動追跡システムを構築する。続いて、本システムを自由対流圏高度に位置する富士山頂で稼働させる。東アジア大陸から流入する酸性汚染物質の挙動を追跡することで、日本国内における越境酸性汚染物質の実態を解明することが本研究の目標であり、健康被害を及ぼす酸性環境汚染物質を正確に実態把握することが本研究の最終目的である。本年度は、検出システムの高感度化を図るため、イオンクロマトグラフのポストカラム部で濃縮可能な濃縮器の製作を検討した。濃縮器の稼働条件を最適化することにより、本研究の測定対象成分である塩化物イオン、硝酸イオン及び硫酸イオンを約10倍濃縮可能な濃縮器を製作できた。また、単位時間あたりの大気吸引量が大きくなるにつれて、ガス/粒子状物質捕集部で捕集される物質量は多くなり、より低濃度の酸性汚染物質の定量が可能になる。そこで、1試料あたりのガス/粒子状物質の捕集量を増加させるため、大吸引流量でもガス/粒子状物質の混合大気からガス分子のみを選択的に捕集できるウエットデニューダー及びこれを通過した粒子状物質を完全に捕集できるミストチャンバーの製作を検討した。吸引流量10 L/minまで利用できるウエットデニューダーと吸引流量6 L/minまで利用できるミストチャンバーを製作できた。本研究の目的は、日本国内における越境酸性汚染物質の実態を解明することである。本年度は、ウエットデニューダー/ミストチャンバーをイオンクロマトグラフに組み込み、酸性汚染物質を高時間分解能で追跡可能な分析システムを構築した。本システムは、酸性ガスとPM2.5中陰イオンのデータを1時間にそれぞれ2つずつ出力する。本システムを徳島市の大気分析に適用することでシステムの性能を評価した。大気観測を開始する前に、濃度既知のCl-、NO2-、NO3-、SO42-混合溶液をオンライン分析システムに導入し、水溶性酸性ガスとPM2。5に含まれる陰イオンの検量線を作成した。いずれの検量線においても、決定係数は0。999以上と良好な値が得られた。検量線の傾き及び検量線用ブランク液で測定した10σ値を用いて定量下限(LOQ)を算出したところ、HClは0.78nmol m-3、HONOは0.14nmol m-3、HNO3は0.04nmol m-3、SO2は1.23nmol m-3、Cl-は0.73nmol m-3、NO2-は0.13nmol m-3、NO3-は0.04nmol m-3、SO42-は1.14nmol m-3であった。続いて、約3週間の連続観測を行ったところ、観測期間中に得られた試料のうち、HClは7.4%、Cl-は26.3%がLOQを下回ったが、その他の目的成分は97.1%以上がLOQ以上であった。また、観測期間中に、ミストチャンバーに装着する疎水性フィルターの交換を1回、イオンクロマトグラフの溶離液に使用する純水の補充を2回行う必要があったが、これらに要した時間を除いた全観測期間の97.9%をメンテナンスフリーで稼働させることができた。本年度の主な研究目標は、大気汚染物質を高時間分解能で追跡可能な分析システムの構築である。構築したシステムは、酸性ガスとPM2.5に含まれる陰イオン成分のデータを1時間にそれぞれ2つずつ出力可能であり、実際の大気分析に適用したところ、約3週間の間、ほぼメンテナンスフリーで稼働させることに成功したことから、本研究は順調に進展している。本年度は、ウエットデニューダー/ミストチャンバーをイオンクロマトグラフに組み込み込んだ酸性汚染物質分析システムの高感度化をはかり、富士山頂で使用できるように改良した。本システムは、酸性ガスと粒子状物質に含まれる陰イオンのデータを1時間にそれぞれ1つずつ出力する。続いて、夏季に富士山頂で分析システムを稼働させ、酸性ガスと粒子状物質に含まれる陰イオン成分の挙動を追跡した。観測期間の98.4%において定量限界以上の大気汚染物質データが得られた。このときの酸性ガス濃度の平均値(n = 64)は、それぞれHNO3: 2.82nmol m-3、SO2: 3.68nmol m-3、粒子状物質に含まれる陰イオンの平均値(同)は、それぞれNO3-: 0.36nmol m-3、SO42-: 6.21nmol m-3であった。これらは地表面(徳島市)における観測値(HNO3: 9.54nmol m-3、SO2: 101.57

nmol m-3、NO3-: 25.16nmol m-3、SO42-: 92.61nmol m-3)に比べて極めて低い値であった。後方流跡線解析により、富士山頂に流入した気塊は、A:日本海経由、B:ロシア・中国北部経由、C:朝鮮半島経由、D:東シナ海経由の4つに大別することができた。観測期間中、気塊の流入方向は経時的にAから順にDへと変化していった。なお、24時間内に気塊の流入方向が大きく変化した日があったが、本研究では1時間毎に観測データが得られているため、これらの日においても観測データを気塊の流入方向毎に分類することが可能であった。また、大気汚染物質データを後方流跡線データと対応させることにより、高濃度のSO42-がアジア大陸から流入していることが明らかとなった。さらに,アジア大陸を通過した気塊に含まれるSO2は大陸の酸化剤の存在により,SO42-へ酸化が促進されていることが示唆された。富士山頂における大気中水溶性酸性ガスと粒子状物質に含まれる陰イオンを観測するための分析システムを開発した。本分析システムは,酸性ガスと粒子状物質のデータ1時間に1つずつ出力する。本システムを富士山頂で稼働させ,大気中のHNO3,SO2,NO3-及びSO42-を連続測定した。後方流跡線解析より,アジア大陸で放出された高濃度のSO42-が観測地点に輸送されていることが示唆された。本年度の主な研究目標は、ポストカラム濃縮法の高感度化と大吸引流量で稼働するウエットデニューダー/ミストチャンバーの製作である。ポストカラム濃縮器による濃縮率は約10倍であり、ウエットデニューダー/ミストチャンバーで利用可能な吸引流量はそれぞれ10 L/minと6 L/minであったことから、本研究は順調に進展している。本年度構築したシステムを富士山頂(低い大気圧)で使用できるように改良する。続いて、夏季に富士山頂で分析システムを稼働させ、酸性ガスとPM2.5に含まれる陰イオン成分の挙動を高い時間分解能で追跡する。得られたデータを後方流跡線解析や気象データを用いて解析し、バックグランド大気と日本国内に流入する越境酸性汚染物質の実態を明らかにしてゆく。分析科学研究室ホームページ環境化学26年度に高性能化したポストカラム濃縮器とウエットデニューダー/ミストチャンバーをイオンクロマトグラフに組み込み、富士山頂に流入する酸性汚染物質を15分の時間分解能で追跡可能な分析法を構築する。また、富士山頂ではガス/粒子状物質の捕集液を頻繁に補充することが困難なため、イオン交換樹脂を用いる捕集液の再利用を検討し、1ヶ月間は捕集液を補充せずに稼働するシステムに改良する。続いて、富士山頂で本システムを稼働させ、酸性汚染物質の挙動を高い時間分解能で追跡する。国内旅費の支出が少なかったため、次年度使用額39,464円が生じた。分析システムの評価に必要な消耗品の支出が少なかったため、次年度使用額29,163円が生じた。富士山頂におけるモニタリングの実施と研究成果を発表するための旅費として使用する。分析システムの長期間の使用による劣化が予想されるカラム等の物品費および富士山頂におけるモニタリングの実施と研究成果を発表するための旅費、施設利用費、資材輸送費、学会参加登録費として使用する。
脳神経系におけるα１，６フコースと統合失調症様行動に関する研究

N型糖鎖の根元にα1,6フコースを転移する糖転移酵素(Fut8)欠損マウス海馬CA1領域での長期増強(LTP)の形成が野生型マウスより減弱していた。LTPの形成に中心的な役割を果たすと考えられているAMPA受容体の性質とα1,6フコース欠損の関係を検討したところ、AMPA受容体のシナプス後肥厚における発現に量的変化は見られなかったがAMPA受容体のリン酸化が欠損マウスでは亢進していた。AMPA受容体はそのサブユニットの構成によりチャネルの性質が決まるがGluA1/2複合体・GluA2/3複合体ともにホモ欠損マウスで増加していた。平成25年度は以下の2つの視点から平成24年度に行った解析もとに発展させた。1・神経細胞間ネットワークの機能変化の解析と細胞内部のシグナルネットワークの変化の解析から、NMDA受容体以外の受容体のα1,6フコース修飾がシナプス可塑性に重要な働きをしている事を見出し、その作用メカニズムもFut8欠損細胞を用いた受容体の強制発現系を構築することで、その概要明らかにした。現在、より詳しい解析を実施している。2・コンディショナルノックアウトマウスの作製:全身生にFut8を欠損させたマウスは統合失調症様の行動異常の他に、軽度の肺気腫様変化も認められる。このような身体的変化が異常行動の原因となっていることを除外した解析を目的に、脳特異的Fut8欠損マウス作製のため、floxedマウスの作成を終えた、現在CamKIIプロモーターで発現が制御されたCre発現マウスとの交配を行っている。平成24年度は以下の3つの視点から解析を行った。1・神経細胞間ネットワークの機能変化の解析:統合失調症を発病すると脳の情報処理が障害される。脳の情報処理はシナプスの伝達効率の可塑的変化であることから、海馬スライス標本を作製し、長期増強(LTP)と二連パルス抑制の変化(第一反応の集合活動電位に対する第二反応の集合活動電位の減少)を指標に解析を行い、α1,6フコース欠損により、脳の情報処理が影響をうけることを明らかにした。2・細胞内部のシグナルネットワークの変化の解析:神経細胞内部の情報伝達ネットワークも神経細胞間ネットワークと同様にシナプス可塑性に重要な働きをしている。Fut8のターゲットタンパク質の候補として、NMDA受容体を神経芽細胞種由来の株化細胞に構築し、NMDA受容体の機能変化をCaイオンの移動で捕らえる系を構築した。強制発現系を用いて得た結果をノックアウトマウス由来の初代培養神経を用いて確認中である。3・コンディショナルノックアウトマウスの作製:全身生にFut8を欠損させたマウスは統合失調症様の行動異常の他に、軽度の肺気腫様変化も認められる。このような身体的変化が異常行動の原因となっていることを除外した解析を行うため、Fut8の触媒部位をCre組換え酵素標的配列loxPで挟んだES細胞を作製し、キメラマウスを得た。25年度はキメラマウスからヘテロマウスを作製し、CaMKIIプロモーターで発現する組み換え酵素Cre発現マウスと交配することで、脳特異的にFut8を欠損したマウスを作製する。糖タンパク質に付加された糖鎖は様々な生物活性を持つと考えられているが、特定の糖鎖構造との関係を示した研究は少ない。本申請課題は申請者らがN-結合型糖鎖の根元にα1,6フコースを転移する糖転移酵素(Fut8)欠損マウスに見出した認知障害に焦点を当て、認知障害の機序を糖鎖による機能分子の質的変化の視点から明らかにする事を目標に行なった。平成25年度までに、Fut8を高発現していて古くから神経細胞分化モデルとして使われてきたPC12細胞をもちいてFut8欠損細胞を作製し、アクチビン受容体を介するシグナル異常により神経突起形成に支障が生じることを明らかにした。さらに、海馬の電気生理学的解析を行ない、α1,6フコース修飾がシナプス可塑性に重要な働きしている事を見出した。平成26年度は、シナプス後肥厚のAMPA型グルタミン酸受容体数の増加が可塑性に重要であると考えられていることから、AMPA受容体に注目して解析を行なった。Fut8欠損にAMPA受容体数の減少が予測されたが、意外にもサブユニット構成に関わらず複合体形成能が亢進し、受容体数が増加していることを見出した。これらの結果は、多様な構造をもつ糖鎖修飾を受ける糖タンパク質中でも、Fut8の標的タンパク質の機能はα1,6フコースの有無という単糖一つ分の僅かな違いにより制御されており、その乱れが記憶・学習の基礎過程である可塑性の減弱とシナプス後肥厚のAMPA受容体数の増加という、相反すると思われる現象に関わっていることを示している。Fut8

欠損マウスは軽度の肺気腫様変化も認められる。脳・神経系特異的な機能解析を行うため、Fut8のfloxedマウスを作製し、CaMKIIプロモーターCre発現マウスと交配を行っているが、期待値を大きく下回る匹数の欠損マウスしか得られず、解析には至っていない。。糖鎖生物学以下の研究実施状況から、おおむね順調に進展していると思われる。記憶や学習に基本的な役割を果たしている海馬に焦点を絞り、シナプス伝達効率と細胞内シグナル伝達関連タンパク質の糖鎖修飾による機能変化を明らかにした。特に、α1,6フコース修飾の影響と神経伝達物質に対する応答に与える影響の検討から、昨年度注目していたNMDA受容体以外にシグナル伝達に関わる分子を特定し、その作用機序も明らかにした。現在、より詳しい解析を実施している。また、糖鎖を標的にした統合失調症モデルマウスの確立についても、脳の部位特異的Fut8欠損させたマウスを作製するため、floxedマウスの作成を終えた、現在CamKIIプロモーターで発現が制御されたCre発現マウスとの交配を行っている。まだ解析に供する脳特異的欠損マウスを得るには至っていないが、26年度の夏までには表現系の解析を開始する予定である。認知障害発現におけるα1,6フコースの役割の解明については「研究業績」欄に記載したようにおおむね順調に進行している。具体的には記憶や学習に基本的な役割を果たしている海馬に焦点を絞り、シナプス伝達効率と細胞内シグナル伝達関連タンパク質の糖鎖修飾による機能変化を明らかにした。また、糖鎖を標的にした統合失調症モデルマウスの確立についても、脳の部位特異的Fut8欠損させたマウスを作製する行程の内、キメラマウスの作製まで進むなど、ほぼ順調に進展している。平成25年度に得た結果を基に以下の解析を行うとともに、より信頼度の高い結果を得るため、平成25年度の結果を別の角度から検証する。1・α1,6フコースの有無による標的タンパク質の機能解析(神経細胞の発達に及ぼすFut8欠損の影響):NMDA受容体以外の膜受容体の機能がα1,6フコース修飾が無くなることによって低下することがわかったので、そのメカニズムを明らかにするため、新たに1分子イメージングの手法を用いた解析を行う。2・コンディショナルノックアウトマウスの表現系の解析:a,ターゲット領域での部位特異的Fut8遺伝子欠損・発現消失の確認をタンパク質・mRNAで確認する。b,統合失調症のモデルマウスとしてのその症状の類似性・薬物投与によるヒトの症状改善効果との類似性の検討を行動薬理学的に行う。c,脳内モノアミンの定量ドパミンやセロトニンなどが病態に深く関与すると考えられているので、脳内モノアミンの変化を脳の各部位ごとにHPLCを用いて定量する。平成24年度に得た結果を基に以下の解析を行うとともに、より信頼度の高い結果を得るため、平成24年度の結果を別の角度から検証する。1・α1,6フコースの有無による標的タンパク質の機能解析(神経細胞の発達に及ぼすFut8欠損の影響):統合失調症の原因に神経発達障害仮説があることから、妊娠16日目のFut8欠損胎仔マウスの海馬領域から神経細胞をとりだし、シナプス形成に対するα1,6フコース修飾の影響と神経伝達物質に対する応答に与える影響を検討する。2・コンディショナルノックアウトマウスの表現系の解析:a,ターゲット領域での部位
鉄筋コンクリートシェルの耐荷力と縁ばりの効果に関する研究

鉄筋コンクリート(以下R/C)シェルは建築物の屋根構造やタンク、サイロなどの産業構造物に用いられる。境界部が切り取られ、連続体の特性が損なわれたR/Cシェルに対して局所的な曲げが卓越して崩壊することを防止し、構造特性の優位性を保つことが必要である。そこで、R/Cシェルの設計指針策定に必要となる基礎資料とするため、設置する縁ばりの形状や配置法を分析した。分析の結果、補強のために必要な補講ばりは最適な寸法が存在し、はりの上部とシェルの中立軸を接合することで補強の効果が発揮できることを示した。平成26年度は子午線方向縁ばりを有するR/C円筒シェルの曲げ耐力分析を行った。そして、数値解析によりR/Cシェルの耐荷力特性と崩壊特性を分析し、最適な縁ばりの形状を求めた。また、試験体の製作、実験装置の組み立てを行った。数値解析においては、縁ばり形状、鉄筋量、配置法をパラメータとして耐荷力をパラメトリックに分析した。支点は4隅各点、荷重は16点擬似等分布荷重とした。分析を行った平面形状が960x960mm厚さ10mmの半径は688mmの部分球殻では縁ばりによる荷重増加を考慮した場合に高さ4cm、幅2cmが最適であることが明らかになった。また、縁ばりの接合方法としては、縁ばりの高さ方向の中間点を接続する場合が最も耐荷力が高く、縁ばりのない場合より4倍の強度を示すことが明らかとなった。数値解析についてはこれまでの耐荷シェル要素に加え、シェルと梁の接合をスムーズに行うため、ソリッド要素を用いた解析を行った。解析法は日本建築学会大会、ICCT2014に発表した。分析結果はISEC8(2015年開催予定)に投稿した。試験体の製作は、上記の平面形状が960x960mm厚さ10mmの円筒形で半径は688mmでライズスパン比は1:5とした。所有している鋼製型枠を使用して形状初期不整を除去し、縁ばりを設置するために型枠を製作した。試験体は数値計算による最適縁ばりのサイズをもとに、鉄筋量3種類について作成した。支持条件・載荷条件は数値計算と同様とした。加力システムの油圧源、コントロール部分は現有のものを使用し、50kNジャッキを8本および高圧ホース、分配器を追加購入した。しかし、加圧フレームの設計と油圧システムの構築に時間を要し、載荷試験には至らなかった。・前年度の研究実績に基づき、子午線方向に縁ばりを有する部分円筒シェルの外力に対して自重や積雪荷重などの重力方向の荷重と水圧、土圧のような法線方向の二種類の荷重を考慮して、縁ばりと鉄筋コンクリート(R/C)シェルの取り付け位置(重心、はり上端、はり下端)による変形応力状態ならびに終局耐力について数値的に分析した。載荷方法による差異はあるが、重力方向の荷重に対しては、縁ばりの重心、法線方向の荷重に対しては縁ばりの上縁とR/Cシェルの接合が適切であると結論付け、国際会議2件に発表した。・周方向縁ばりを有するR/C円筒シェルについて曲げ耐力分析を行った。そして、R/Cシェルに対して縁ばりの設置に伴う自重の増加を考慮して耐荷力特性と崩壊特性を分析し、最適な縁ばりの形状を求めた。また、最適形状の縁ばりに対して、縁ばりとR/Cシェルの取り付け位置(重心、はり上端、はり下端)による変形、応力状態ならびに終局耐力について数値的に分析した。縁ばりの適切な接合方法も分析した。分析結果は平成28年度に国際会議に発表予定である。・周方向縁ばりについての実験的な解析は、最適形状の確定が遅れたため、現在型枠を作成中である。28年度前半には実施の予定である。補強対象の部分円筒シェルは8体の製作が終わっている。・また、R/Cシェル補強をテーマに文献調査したところ、R/C冷却塔の不同沈下に対応したR/C構造の補強の必要性が記述されていたため、地中ばりによる支持部分の構造の補強が可能であることに着目し、数値解析による分析を行った。得られた結果は国際会議に発表し、学会誌に公表した。当初計画における構造全体の補強に関しては数値解析による分析は計画通りに進んでいる。補剛ばりの最適形状、補剛ばりと鉄筋コンクリートシェルの適切な接合位置についても明らかになった。文献調査を行ったところ、鉄筋コンクリート冷却塔に関する不同沈下のための補強に着目した。これについて地中ばりによる補強について、変形、強度、応力分析を行った。3年間にわたり、鉄筋コンクリート(R/C)円筒シェルの自由縁に接合した縁ばりの寸法、接合位置がR/Cシェルの耐荷力に及ぼす影響を数値解析により分析し、実験解析と検証した。最終年度は、載荷条件と縁ばりの接合位置について、主として数値解析によりパラメトリックな解析を行い、縁ばりとR/C円筒シェルの耐荷力向上について定性的、定量的な分析を行った。分析結果は国際会議に発表し、アイデアを学術論文作成に適用した。実験解析では載荷試験を行い、過去に行った載荷試験結果とともに数値解析との検証を行った。期間を通じて、数値解析ではR/C円筒シェルの子午線方向と周方向について縁ばり寸法をパラメトリックに分析し、縁ばりのための重量増加を加味した場合に最適な形状が定められることを示した。

また、縁ばりの接合点を縁ばり重心点、上端部、下端部に設定し、等しい断面の縁ばりを配置した場合に、いずれの縁方向に対しても、積雪荷重を想定した鉛直載荷のもとでは縁ばりの上端とR/Cシェル面を接合した場合に耐荷力に優位性がみられた。また土圧、水圧を想定した法線圧力載荷に対しては縁ばりの下縁に接合した場合に耐荷力の優位性が認められるものもあった。実験解析では縁ばりの形状を変化させて載荷試験を行った。縁ばりの設置によりR/C円筒シェルの耐荷力向上は見られ、縁ばりの寸法変化による耐力の向上は見られたが、定量的には明確な結論を得るに至らなかった。縁ばり接合位置については数値計算と同様の試験体の製作を行ったが、接合部の製作が精度良く行うことができなかったので数値解析ほどの優位性は得られなかった。載荷方法についてはR/Cシェルの変形に載荷システムが追従できないため、従来のトーナメント方式が有効であると考える。実験については多くの課題を残すことになったが、引き続き精度のよい実験が得られるよう推進してゆきたい。鉄筋コンクリート(以下R/C)シェルは建築物の屋根構造やタンク、サイロなどの産業構造物に用いられる。境界部が切り取られ、連続体の特性が損なわれたR/Cシェルに対して局所的な曲げが卓越して崩壊することを防止し、構造特性の優位性を保つことが必要である。そこで、R/Cシェルの設計指針策定に必要となる基礎資料とするため、設置する縁ばりの形状や配置法を分析した。分析の結果、補強のために必要な補講ばりは最適な寸法が存在し、はりの上部とシェルの中立軸を接合することで補強の効果が発揮できることを示した。数値解析については十分な進展が得られた。実験解析については油圧システムの構築と載荷フレームの設計が遅れたため、実験に至らず、やや遅れ気味であるが、試験体の追加製作、実験に進めることができるものと考える。・数値的分析においては、鉄筋コンクリートシェルの補剛法について、順調に推移しており、円筒シェル以外の補強に分析を広げる。・実験解析を実施し、数値解析結果との比較を行う。また、積雪等にみられる半載荷状態に対して実験解析を進める。工学27年度は、初めに26年度計画の実験を組み込み、当初の計画通り、周方向縁ばりを有するR/C円筒シェルについて曲げ耐力分析を行う。同時に数値解析を進め、当初の計画通り実行する。・予定に入れていた海外出張(ACIコンベンション)が4月開催になったため。・型枠製作が遅れているため。レーザー変位計の予定価格との相違(不足)により生じた余剰。・ACIコンベンションの出張旅費・型枠作成に使用次年度の予算を加えて変位計の追加購入を行う。
細胞内環境応答性人工核酸による血管内皮細胞マイクロＲＮＡ制御と脳梗塞治療薬の開発

本年度は、マイクロRNA機能制御による効果的な脳梗塞治療薬開発を目指し、人工核酸誘導体を核酸医薬へと応用する上で重要な課題として指摘されているオフターゲット効果の克服のため、細胞内環境応答性人工核酸による虚血性疾患選択的核酸医薬系ならびにRNase H活性を利用した触媒的核酸医薬系の構築に取り組み、両方法論の有効性の実証に成功した。虚血性疾患選択的核酸医薬系の構築においては、当研究室で報告してきたペプチドリボ核酸(PRNA)の適用を提案し、脳梗塞のペナンブラと呼ばれる虚血領域において選択的に薬効発現可能な第二世代PRNAの開発に成功した。第二世代PRNAでは、リボース骨格とグルタミン酸誘導体から構成されるPRNAに対してリシンリンカーを介してフェニルボロン酸誘導体を導入することにより、虚血細胞と正常細胞間における細胞内pH変化のみによってPRNAの核酸塩基部配向を自在に制御できることを見出した。さらに、第二世代PRNAの薬効発現に重要な核酸塩基部配向変化pH(pKs)はハメット則に従い、フェニルボロン酸フェニル基上への置換基導入によりチューニング可能であり様々な疾患へと適用できる画期的な方法論である。触媒的核酸医薬系の構築においては、より高効率な標的RNA切断を達成する為に、DNA-ペプチド核酸(PNA)/PRNAキメラ分子を設計・合成し、RNase Hによる標的RNA切断後の解離過程促進を目的とした新規方法論の構築に成功した。本キメラ分子を用いることにより、切断後RNA断片の複合体安定性が生体内環境37度以下になるような位置で選択的に標的RNAを切断できれば、切断後速やかに解離し、核酸医薬のターンオーバー数が飛躍的に向上することを見出した。また、キメラ分子を適切に設計することにより、標的RNAの部位特異的一箇所切断が可能となりゲノム編集ツールなど幅広い応用が期待される。脳梗塞などの虚血性疾患選択的なマイクロRNA阻害を達成する為に、細胞内環境応答性ペプチドリボ核酸(PRNA)による虚血性疾患選択的核酸医薬系ならびにRNase H活性を利用した触媒的核酸医薬系の構築に取り組んだ。虚血性疾患選択的核酸医薬系構築においては、当初計画していた通り、PRNAに対するフェニルボロン酸誘導体導入に成功し、pH変化に基づくanti-syn核酸塩基部配向制御を円二色性スペクトル解析により実証した。さらに、様々な置換基導入によりanti-synスイッチングpH(pKs)がハメット則に従い自在にチューニングできることを見出し、本結果は期待以上の成果である。さらに、PRNAとフェニルボロン酸誘導体との分子間ホウ酸エステル結合形成においては、pKsの濃度依存性があるのに対して、PRNA-フェニルボロン酸複合体からなる第二世代PRNAにおける分子内ホウ酸エステル結合形成においては、pKsは基質濃度に依存せず一定値を示すことをハメットプロットに基づき示すことができ、分子内フェニルボロン酸誘導体導入の有効性を示すとともに、細胞内においても第二世代PRNAが投与量に依存せず効果的に機能できる可能性が示唆された。触媒的核酸医薬系の構築においては、X線結晶構造およびモデル構造に基づき、DNA-アミド骨格人工核酸キメラ分子を設計・合成した。当初の計画通り、DNA-人工核酸アミドジャンクション部位での選択的RNA切断と高効率触媒的RNA切断の実証に成功した。さらに、様々なDNA-人工核酸キメラ分子誘導体を合成し、詳細な機能解析の結果、DNAへの人工核酸導入位置・構造の違いによって標的RNAの切断部位を自在に制御可能であることを見出した。本結果は、DNA-人工核酸キメラ分子が配列特異的RNA切断ツールや新規ゲノム編集法などへ応用可能であることを示す予想を遥かに上回る成果である。今年度は、ハメット則に基づく構造設計により脳梗塞選択的薬効発現が期待できるPRNAの開発に成功した。今後は培養細胞を用いた脳梗塞モデル系において、PRNAによるマイクロRNA阻害効果の検討を行う。具体的には、miR155に相補的なPRNAを設計・合成し、低酸素培養による細胞内pH低下に応じた阻害効果の変化について検討することで、PRNAによる薬効発現スイッチングを実証する。また、miR155の標的部位の最適化も重要な課題であり、ストランドインベージョン機構を利用した標的多様性の拡大にも取り組む。DNA-人工核酸キメラ分子の系においては、現在、培養細胞を用いた細胞内在性RNase Hによる標的mRNA切断に基づく翻訳阻害効果について検討しており、今後の展開が期待される。本系においては、in vivo実験への適用を見据え、より実用的な核酸医薬としての展開のため、3'-DNA末端に対して糖部架橋型核酸(LNA)の導入およびホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合へと改変したキメラ分子を設計・合成することにより標的核酸親和性とヌクレアーゼ耐性の向上を目指す。このようにして、最適化したPRNAフラグメントとDNA-人工核酸キメラ分子フラグメントをHuisgen双極子環化付加反応(CuAAC)により連結し、キメラPRNAコンジュゲートを合成する。キメラPRNAコンジュゲートの標的核酸との相互作用特性、ストランドインベージョン特性、標的RNA切断特性、タンパク質発現抑制活性についてin vitro系において評価したのち、培養細胞ならびにモデルマウスを用いて本方法論の実証に取り組む。

本年度は、マイクロRNA機能制御による効果的な脳梗塞治療薬開発を目指し、人工核酸誘導体を核酸医薬へと応用する上で重要な課題として指摘されているオフターゲット効果の克服のため、細胞内環境応答性人工核酸による虚血性疾患選択的核酸医薬系ならびにRNase H活性を利用した触媒的核酸医薬系の構築に取り組み、両方法論の有効性の実証に成功した。虚血性疾患選択的核酸医薬系の構築においては、当研究室で報告してきたペプチドリボ核酸(PRNA)の適用を提案し、脳梗塞のペナンブラと呼ばれる虚血領域において選択的に薬効発現可能な第二世代PRNAの開発に成功した。第二世代PRNAでは、リボース骨格とグルタミン酸誘導体から構成されるPRNAに対してリシンリンカーを介してフェニルボロン酸誘導体を導入することにより、虚血細胞と正常細胞間における細胞内pH変化のみによってPRNAの核酸塩基部配向を自在に制御できることを見出した。さらに、第二世代PRNAの薬効発現に重要な核酸塩基部配向変化pH(pKs)はハメット則に従い、フェニルボロン酸フェニル基上への置換基導入によりチューニング可能であり様々な疾患へと適用できる画期的な方法論である。触媒的核酸医薬系の構築においては、より高効率な標的RNA切断を達成する為に、DNA-ペプチド核酸(PNA)/PRNAキメラ分子を設計・合成し、RNase Hによる標的RNA切断後の解離過程促進を目的とした新規方法論の構築に成功した。本キメラ分子を用いることにより、切断後RNA断片の複合体安定性が生体内環境37度以下になるような位置で選択的に標的RNAを切断できれば、切断後速やかに解離し、核酸医薬のターンオーバー数が飛躍的に向上することを見出した。また、キメラ分子を適切に設計することにより、標的RNAの部位特異的一箇所切断が可能となりゲノム編集ツールなど幅広い応用が期待される。脳梗塞などの虚血性疾患選択的なマイクロRNA阻害を達成する為に、細胞内環境応答性ペプチドリボ核酸(PRNA)による虚血性疾患選択的核酸医薬系ならびにRNase H活性を利用した触媒的核酸医薬系の構築に取り組んだ。虚血性疾患選択的核酸医薬系構築においては、当初計画していた通り、PRNAに対するフェニルボロン酸誘導体導入に成功し、pH変化に基づくanti-syn核酸塩基部配向制御を円二色性スペクトル解析により実証した。さらに、様々な置換基導入によりanti-synスイッチングpH(pKs)がハメット則に従い自在にチューニングできることを見出し、本結果は期待以上の成果である。さらに、PRNAとフェニルボロン酸誘導体との分子間ホウ酸エステル結合形成においては、pKsの濃度依存性があるのに対して、PRNA-フェニルボロン酸複合体からなる第二世代PRNAにおける分子内ホウ酸エステル結合形成においては、pKsは基質濃度に依存せず一定値を示すことをハメットプロットに基づき示すことができ、分子内フェニルボロン酸誘導体導入の有効性を示すとともに、細胞内においても第二世代PRNAが投与量に依存せず効果的に機能できる可能性が示唆された。触媒的核酸医薬系の構築においては、X線結晶構造およびモデル構造に基づき、DNA-アミド骨格人工核酸キメラ分子を設計・合成した。当初の計画通り、DNA-人工核酸アミドジャンクション部位での選択的RNA切断と高効率触媒的RNA切断の実証に成功した。
放射線治療による癌組織内の癌関連遺伝子発現の変化と治療効果判定への応用

アポトーシスは組織内に起こる細胞死の一形態であるか、放射線照射によって誘導されることは良く知られている。しかしin situで腫瘍や正常組織内でのその誘導についてはDNAラダリングやHE染色で検討されているにすぎない。我々はアポトーシスの最初の段階である、DNAの断片化をin situで免疫組織化学的に検出し、その経時的変化あるいは組織別の誘導の違いについて検討を行った。正常組織の検討として、マウスを用い全身照射を行った。腫瘍についてはマウスの2種類の腫瘍を後足に植えて局所照射を行った。経時的に各臓器あるいは腫瘍組織を摘出しHE染色及びDNA断片化の免疫組織化学的検討、さらにPCRと免疫組織化学的手法の両者による癌遺伝子の発現を検討した。いずれの組織でも照射直後よりDNAの断片化が検出され、従来報告されているDNAラダリングやHE染色による検討よりも早期から、アポトーシスの過程が始まっていることが明らかになった。また、正常組織では一回照射量が多い程組織障害が強くなるが、これに伴ってDNA断片化のみならずアポトーシス小体出現など光顕的な変化も早くから認められた。腫瘍組織では、放射線高感受性腫瘍を用いたが、本来の壊死性変化が含まれることから、DNA断片化の検討のみではアポトーシスとの鑑別が不十分であると考えられた。現在、各臓器間でのアポトーシス出現の差や、照射量での違い、癌遺伝子発現との関係について検討中である。