hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
植物の光シグナル伝達機構とcGMPによる遺伝子発現調節機構の解析

植物の光応答性遺伝子の発現を調節する光シグナル伝達機構を解析するとともに光シグナル伝達を仲介する物質の同定と機能解析を目的とし、特に、光によって活性が調節されるプロテインキナーゼを検索した。また、植物遺伝子発現を調節するセカンドメッセンジャーであるcGMPにより発現調節を受ける遺伝子を検索した。ダイズ光独立栄養培養細胞(SB-P細胞)の可溶性画分に光依存的な一過的チロシンリン酸化を受けて活性化する46kDaセリン/スレオニンプロテインキナーゼを検出し、LAPK (light-signal activated protein kinase)と名付けた。特性解析の結果、LAPKはMAPキナーゼ様プロテインキナーゼであることを明らかにした。また、光照射したSB-P細胞より活性型のLAPKを部分精製した。精製酵素の特性は上記のLAPKの性質と一致した。ダイズSB-P細胞からcGMPにより発現量が変動する遺伝子をPCRサブトラクションによって複数単離した。ファイトアレキシン合成系酵素遺伝子の発現は光やcGMPによって誘導された。CDPK cDNA (CDPK-B)遺伝子プロモーターを単離し、光抑制に関与するシスエレメントの候補配列を見出した。植物の細胞内光シグナル伝達の分子機構を解析し、以下の結果を得た。1光シグナル伝達仲介物質であるcGMPの合成を司るグアニル酸シクラーゼ(GC)の存在を証明するため、アラビドプシスのcDNAライブラリーからアラビドプシスESTクローンをプローブとしてcDNAクローニングを行い、動物のGC触媒領域と一部ホモロジーを有する全長クローンを単離した。このcDNAはシグナルペプチドを含む274アミノ酸から成る疎水性の強いポリペプチドをコードしていた。2 cGMPのターゲット分子であることが推測されるcGMP依存性プロテインキナーゼのcDNAクローニングを行い、一個の完全なcGMP結合ドメインを含む完全長クローンを単離した。しかし、この遺伝子はプロテインキナーゼの触媒領域を含んでいなかった。3ダイズの光独立栄養培養細胞(SB-P細胞)中に光依存的にチロシンがリン酸化される蛋白質を見出し、その生化学的特性を解析した。その結果、本蛋白質が光によって一過的に活性化するセリン/スレオニンキナーゼであることを認めた。さらに、本キナーゼはチロシンが光依存的にリン酸化されることにより活性化することを明らかにした。また本酵素は青色光によって活性化され、青色光シグナル伝達に関与していることが示唆された。4 cGMPによる遺伝子発現調節の多様性を明らかにすることを目的に、cGMPにより発現量が変動する遺伝子をPCRサブトラクション法によって単離し、ファイトアレキシン合成系酵素遺伝子の発現がCGMPによって誘導されることを認めた。また、数種のプロテインキナーゼ遺伝子の発現がcGMPによって抑制された。これらのcGMPによって発現が誘導または抑制される遺伝子のうち、いくつかの遺伝子をクローニングした。植物の細胞内光シグナル伝達の分子機構をcGMPに焦点を当て解析し、以下の結果を得た。1.ダイズ光独立栄養培養細胞(SB-P細胞)中のcGMP合成酵素(グアニル酸シクラーゼ)、cGMP分解酵素(cGMPホスホジェステラーゼ)、及びcGMP結合タンパク質の精製と活性検出を種々の方法で試みたが、いずれの活性も検出できなかった。2.前年度クローニングした、動物のPKGのcGMP結合ドメインと塩基配列の相同性を有するアラビドプシスの全長cDNAクローンを大腸菌と酵母で大量発現させ精製した。精製タンパク質のcGMP結合活性は現在まで検出されておらず、何らかの活性化機構の存在が示唆された。3.前年度までに見出したSB-P細胞中の光シグナルによって活性化される46kDaプロテインキナーゼ(LAPK)を硫安分画、イオン交換および疎水性カラムクロマトグラフィー、ヒストンを用いるアフィニティーカラムクロマトグラフィー等により部分精製した。今後も引き続き精製を進める。4.前年度までに単離したcGMPにより発現が抑制される数種の遺伝子中にCa依存性プロテインキナーゼ(CDPK)遺伝子断片を見出し、これをプローブとしてCDPK-AとCDPK-B cDNAをクローニングした。これらの遺伝子のcGMPと光による発現抑制をノーザン分析によって確認した。この結果、植物においてcGMPがCDPK遺伝子の発現調節を通してCaシグナル伝達を制御していることが明らかになった。

植物の細胞内光シグナル伝達、特にフィトクロームを介する光シグナル伝達の分子機構を解明するため、光シグナル伝達を仲介すると考えられるプロテインキナーゼを精製し特性を解析した。また、セカンドメッセンジャーであるcGMPの役割を解明するため、cGMPによって発現が抑制される遺伝子をクローニングした。1.前年度までにダイズ光独立栄養培養細胞中に検出した光依存的な一過的チロシンリン酸化を受けて活性化する46 kDaセリン/スレオニンプロテインキナーゼ(LAPK;light-signal activated protein kinase)の特性をさらに詳細に検討した。LAPKの活性化/不活性化機構や、基質特異性等の特性から、LAPKがMAPキナーゼ様プロテインキナーゼであることを示した。また、LAPKの光による活性化は活性酸素等による二次的な影響ではないと考えられた。LAPKを各種クロマトグラフィーにより、インゲルアッセイでプロテインキナーゼとしては単一のバンドにまで部分精製した。今後、本酵素の精製と部分構造解析、cDNAクローニング、さらに遺伝学的手法による機能解析を進める。2.前年度までにPCRサブトラクション法により、ダイズSB-P細胞よりcGMPによって発現が抑制される遺伝子の一つとして得たCDPKcDNA断片をプローブとしてダイズcDNAライブラリーより全長cDNAクローン(CDPK-B)を得た。さらにinverse PCRによりダイズCDPK-B遺伝子を単離し、約1.2kbのプロモーターの塩基配列を決定した。プロモーター中には光抑制に関与するシスエレメント(RE-3)のコア配列(TGGG配列)およびエンドウpra2に報告されたDE1エレメントに類似の配列(GGATTTTA/T)が存在していた。今後、これらの配列を中心に光およびcGMPによる発現抑制に関わるシス配列とこれに結合する転写因子の解析を進める。
ポルフィリン軸配位方向へ制御された光エネルギー捕集伝達機能を持つ複合分子系の構築

前年度の研究では、アンチモン(V)テトラフェニルポルフィリン錯体の軸配位子として可視光補集機能を持つ分子を導入した新規ポルフィリン錯体の合成とその光物性について検討した結果、可視光補集分子として500nmに極大吸収波長を持つボラン-ジピリン錯体を軸配位子として導入したアンチモンポルフィリン錯体の合成に成功し、導入されたボラン-ジピリン錯体はポルフィリン環に対して十分な可視光エネルギー供与分子となり得ることがわかり、軸配位方向へ制御された光エネルギー補集伝達機能を持つポルフィリン複合分子系の構築の足がかりとなる成果が得られた。今回の研究では、片側の軸配位子としてボラン-ジピリン錯体を導入し、もう片側の軸配位子として電子供与性をもつ分子を導入した複合分子系の構築に成功し、光補集機能をもつ軸配位子からポルフィリン環へエネルギー移動した後、さらに他の軸配位子から電子移動が誘起される、軸方向へのエネルギーフロー系の開発を見出した。またさらに合成したポルフィリン錯体が有機塩素化合物に対する光触媒分解作用をもたらすことも明らかになり、これらの成果を2つの特許として出願できる成果を得た。1.出願人保田昌秀・白上努・信原一敬・近藤徹題名アンチモンポルフィリン光触媒特許出願番号特願2000-1678742000年6月2.出願人保田昌秀・白上努・信原一敬・笛田佳之題名光触媒装置特許出願番号特願2000-13359982000年11月本研究では、アンチモン(V)テトラフェニルポルフィリン錯体の軸配位子として可視光補集機能を持つ分子を導入した新規ポルフィリン錯体の合成とその光物性について検討した。その結果、可視光補集分子として500nmに極大吸収波長を持つボランージピリン錯体を選択し、この錯体配位を軸配位子として導入したアルチモンポルフィリン錯体の合成に成功した。この場合、2つのボランージピリン錯体部位が軸配位子として導入された対称型のポルフィリン錯体が得られた。合成したポルフィリン錯体の吸収スペクトルを測定した結果、ポルフィリン部位の吸収スペクトルとボランージピリン部位の吸収スペクトルの単なる重ね合わせのスペクトルが得られ、ポルフィリン環とボランージピリン部位との電荷移動等の相互作用は存在しないことがわかった。蛍光スペクトルの測定より、軸配位ボランージピリン部位からポルフィリン環の励起一重項状態への分子内電子移動が進行することがわかった。またさらにボランージピリン部位のみを光励起(500nm)すると、ボランージピリン錯体自身の蛍光が著しく消光されるととも、ポルフィリン環からの蛍光が観測された。このことは、励起ボランージピリン部位からポルフィリン環への一重項励起エネルギー移動が起こったことを示している。蛍光量子収率の測定結果から、このエネルギー移動効果は約90%となり高効率な過程であることが明らかになった。このように今回軸配位子として導入されたボランージピリン錯体はポルフィリン環に対して十分な可視光エネルギー供与分子となり得ることがわかり、軸配位方向へ制御された光エネルギー補集伝達機能を持つポルフィリン複合分子系の構築の足がかりとなる成果が得られた。1.出願人保田昌秀・白上努・信原一敬・近藤徹題名アンチモンポルフィリン光触媒特許出願番号特願2000-1678742000年6月2.出願人保田昌秀・白上努・信原一敬・笛田佳之題名光触媒装置特許出願番号特願2000-13359982000年11月
形状記憶ポリマーを用いた新しい根管充填法の開発

根管充填剤の主成分であるガッタパーチャ(トランスポリイソプレン)を架橋することによって、形状記憶ポリマーを試作した。架橋剤としては硫黄とジクミルペルオキサイド、架橋促進剤としては酸化亜鉛、架橋促進助剤としてはステアリン酸を配合した。ガッタパーチャの形状記憶機能は次のようなメカニズムにしたがって発現することが明らかになった。架橋によって形状を記憶させた試料を転移温度以上に加熱することによって軟化し変形させる。この変形させた試料を転移温度以下に冷却すると、トランスポリイソプレンの結晶性が起こり変形させた形状のまま固定される。変形を固定した試料は再び転移温度以上に加熱すると変形から開放され元々記憶していた形状へと復元する。変形回復温度は、架橋剤の添加量を調整したり、シスポリイソプレンと共架橋させたりすることによって調整が可能であり、口腔内温度以下に設定することも可能であった。また、架橋剤の添加量を増加すると弾性率が増加し、シスポリイソプレンの添加量を増加すると弾性率は低下した。この形状記憶ポリマーを用いて根管充填用ポイントを試作し、形状記憶機能を利用して封鎖性試験を行った。封鎖の対象としては、ガラス管や牛歯の根管あるいはアクリル製の人工根管などを用いた。ガラス管を用いた封鎖性試験では、約1年6ヶ月にわたって良好な封鎖が得たれた。また、牛歯を用いた封鎖性試験においては、市販の垂直加圧法用のガッタパーチャを用いた方法と比較して、優れた封鎖性を示した。また、アクリル製の人工根管を用いた封鎖性試験では、ISO規格の130番のリーマーで拡大した根管に対して良好な封鎖を示した。1.形状記憶ポリマー作製法の確立形状記憶ポリマー作製は以下の手順で行った。まず、トランスポリイソプレン(TPI)を90°Cに加熱して軟化し、十分に可塑性が得られた状態で架橋剤である硫黄、ジクミルペルオキサイドや架橋促進剤である酸化亜鉛、ステアリン酸を添加して混練りを行い作製した未加硫ゴムを試料作製用金型に填入し、20Kg/cm^3の圧力をかけ、150°Cで120分間の加熱処理で加硫を行い、形状を記憶させた。以上の手順によって作製した試料は、TPIの融点以上ではTPIの非晶化によってゴム状となり容易に変形できる。変形させた試料をTPIの結晶化温度以下まで冷却すると、TPIの結晶化によって変形が固定される。しかしながら架橋によって変形固定前の形状が記憶されており、TPIの融点以上に再び加熱することによって元の形状へと復元させることが可能である。2.理工学性質の測定根管充填材として最も適した理工学性質を持つ形状記憶機能材料を作製するために、TPIと共加硫が可能なシスポリイソプレン(CPI)を配合した試料や、架橋剤の添加量をいろいろと変えた試料を作製し、それらの熱的、機械的性質について調べた。まず、材料の粘弾性的性質を調べるために、引張圧縮試験機を用いて緩和弾性率の測定を行った。さらに、変形回復特性を調べるために、形状の回復はレーザー変位計で、また、変形回復応力は引張圧縮試験機を用いて測定を行った。その結果、TPIの結晶化による変形の固定が可能な範囲内では、CPIとTPIの共加硫や架橋密度の増大は、変形回復温度を下げるのに有効であり、変形回復温度を口腔内温度に設定することも可能であることが明らかとなった。また、CPIの配合率が高くなるにしたがって、緩和弾性率が低下し変形回復応力も低下したが、架橋剤の添加量が増加するにしたがって、緩和弾性率が上昇し変形回復応力も上昇した。以上の結果より、形状記憶ポリマーの熱的、機械的性質の調節は比較的容易に行えることがわかった。1.形状記憶機能を有した根管充填用ポイントの作製形状記憶機能を有した根管充填用ポイントの作製は以下の手順で行った。

トランスポリイソプレン(TPI)に対して、硫黄、ジクミルペルオキサイド、酸化亜鉛、ステアリン酸が、それぞれ30、1、1.25、7.5phrの配合で混練りを行い作製した未加硫ゴムを加熱軟化し、これをポイント作製用金型に填入した後20kg/cm^3の圧力をかけ、150°Cで120分間の加熱による加硫処理によって形状を記憶させた根管充填用ポイントを作製した。このポイントを90°Cで加熱軟化し、ポイント作製用金型よりも内腔が一回り細い形状をした変形用金型へ圧入した後0°Cで冷却しTPIを結晶化させることによって変形を固定した。この変形を固定した元々の形状よりも一回り細い形状のポイントは、口腔内温度(37°C)の刺激によって元の太い形状へと復元することが可能である。2.封鎖性試験ポイント作製用金型の内腔の形状と変形用金型の内腔の形状との中間的な形状になるように、抜去牛歯の根管の拡大形成を行い、EDTAとNaOClで洗浄を行った。次に元々の形状よりも一回り細い形状に変形固定を行った根管充填用ポイントを拡大形成された牛歯の根管に挿入し、37°C空気中で10分間垂直加圧を行い、根管充填用ポイントの変形を回復させて根管の封鎖を行った。根管充填用ポイントの変形の回復による根管の封鎖性を検討するために、1%フクシン溶液に111日間浸漬を行った。また、比較対象の実験として、側方加圧法や垂直加圧法による根管充填を行い、それらの封鎖性についても調べた。いずれの充填法についてもシーラーは併用しなかった。その結果、形状記憶機能を有した根管充填用ポイントを用いた根管充填法は、側方加圧法や垂直加圧法と比較して良好な封鎖を示し、根管充填剤への応用に非常に有効であることが示唆された。形状記憶ポリマーを用いて根管充填用ポイントを試作し、封鎖性試験を行った。根管充填には、ISO規格の130番のリーマーで最終拡大を行った透明な樹脂性の根管を用いた。まず、口腔内温度で形状回復が可能となるようにトランスポリイソプレン100に対して、酸化亜鉛30、ステアリン酸1、硫黄1.25、ジクミルパーオキサイド3の割合で配合し、これらの混練を行い、未架橋のコンパウンドを作製した。次に、130番のリーマーよりも一回り太い形状をポイントに記憶させるためのステンレス製の鋳型を作製し、未架橋のコンパウンドをこの金型に填入した後に、窒素ガス中で熱処理を行い、ポリマー間を架橋させることによって形状の記憶を行った。続いて、形状を記憶させたポイントを130番のリーマーで拡大した根管にスムーズに挿入できるように、130番のリーマーよりも一回り細い形状にポイントを変形させて固定した。変形固定には試作の金型を用いた。変形の固定法としては、形状を記憶させたポイントを80°C空気中で3分間加熱軟化し、これを金型に圧入して変形させた後、-11°Cで2時間冷却して、トランスポリイソプレンを結晶化させる方法によって行った。根管充填は、130番のリーマーよりも一回り細く変形固定させたポイントを、37°C雰囲気中で130番のり一マーで拡大した樹脂製の根管に挿入し、3分間プラガーで加圧する方法で行った。
精神発達障害緩和分子同定のための一卵性双生児間エピゲノム比較アプローチ

本研究の目的は、ゲノムを共有する一卵性双子間でも存在するエピゲノムの差異が存在する最近の知見を背景とする、レット症候群の一卵性双子例を対象にした精神発達障害の新規関連遺伝子を探索することである。具体的には、双子間のエピゲノム(DNAメチル化パターン)差異領域を特定し、その中から本症候群の責任蛋白質(MeCP2)によって調節されるメチル化遺伝子を見いだし、最終的に双子間での発現差異を明らかにする。平成20年度は、この目的を達成させるために、ゲノムマイクロアレイ装置で解析する試料の調整法の確立,ならびに調整された試料を用いた解析を行った。具体的にはメチル化DNAを選択的に吸着し濃縮させる,チル化DNA結合タンパク質(MBD2b)のカラムを用いて濃縮し、濃縮されたDNAサンプルにおいて、前年度に明らかにした材料であるヒトリンパ球における高メチル化領域がみられ、低メチル化領域がみられないことを、定量リアルタイムPCRにより確認した。その結果、Bisulfite sequencing法で高メチル化が認められたCDX1, PNLDC, HISTIH2BA遺伝子領域は濃縮され、同法で低メチル化が認められたPTTGIP, STCH遺伝子領域やCpGを含まないAGEH遺伝子領域は濃縮されていなかった。以上より、MBD2bのカラムはメチル化領域を選択的に濃縮していると考え、これを用いてアレイ解析を行った。その結果、高メチル化が予想される領域はメチル化が高く描出された。この基礎的研究成果をふまえ、双子間比較を行い、症状の差異に関連する遺伝子を見いだす予定である。平成19年度はこの目的に沿って研究を行い、以下を明らかにした。1.既知のMeCP2被調節遺伝子のメチル化解析これまでに明らかにされた2種の既知のMeCP2被調節遺伝子(BDNF、DLX5)のメチル化解析をbisulfite sequencing法(Kubota et al., Nat Genet1997)により行った。その結果、いずれの遺伝子においても双子間でメチル化程度の差は見いだせなかった。したがって、未知(非解析)のMeCP2被調節遺伝子のメチル化の可能性が考えられた。2.メチル化解析のための既知のMeCP2被調節遺伝子の探索探索はヒトゲノム上の遺伝子すべてを対象とする。方法はヒトゲノムマイクロアレイを用いる網羅的メチル化解析法である。具体的には上記の新しい網羅的解析技法で得られるデータが、現在頻用されているbisulfite sequencing法による定量結果とランダムに選んだ遺伝子において矛盾しないかを調べた。平成19年度は24種の遺伝子におけるメチル化定量を行い、メチル化は高値または低値のいずれかで中間的な値を示す遺伝子は少ないこと、組織にとって必要な遺伝子は低メチル化(発現)、不要な遺伝子は高メチル化(抑制)であることが判明した。この結果をふまえ、平成20年度は新法の定量性を確認後、双子患者の解析結果を得る。
組織特異的幹細胞を用いたヒト人工組織生産技術の開発

本研究では今後の発展が期待される再生医療における最重要ツールである組織特異的幹細胞を用いて肝臓・皮膚毛髪・骨軟骨などのヒト人工組織を構築する技術の開発を行った。1.肝細胞に関しては、肝障害時における肝再生で重要な役割を担っている卵形細胞並びに正常肝における幹細胞候補である肝上皮細胞に着目した解析を行った。現在までに、これらの細胞の株化を行い培養系での肝・胆管細胞への分化誘導条件の決定を行った。さらに肝障害動物への移植による肝機能回復実験に成功した。これらの成果は肝再生医療工学へ大きく貢献するものと期待される。2.皮膚毛髪に関しては発生・再生における組織間相互作用の分子メカニズムを応用した培養人工皮膚作製を目指し、基底細胞がん発生に関与していることが示唆されるShhシグナルを利用し培養表皮作製法の改良を試みた。Shh発現フィーダー細胞を用いることで培養人工皮膚作製に要する期間を短縮出来ることが明らかとなり分子生物学の知見を再生医工学へ利用することは非常に効果的であるとの結論を得た。3.骨軟骨に関してはヒト骨髄中の間葉系幹細胞の単離に成功し、軟骨・脂肪・骨細胞への分化を誘導する系を確立した。現在本細胞を用いて顎骨再生などの口腔・整形外科領域における再生医療工学技術の開発を進めつつある。以上のように本研究では再生医療工学分野での重要且つ有用な研究成果を得ることが出来た。本研究の実施において地域の枠を超えた連携は非常に有用であった。正常ラット肝臓から幹様細胞を分離し、培養・維持することができた。この幹様細胞をコラーゲン内の3次元培養系で蛋白質の変化を調べたところ、アルブミンを発現していなかった幹様細胞が1週間後からアルブミンを発現し始め、徐々に発現量を増加した。以上の結果、肝臓幹様細胞を3次元培養することによって、アルブミンを発現する、より成熟した細胞に分化させることができた。次に、毛髪再生に関する成果として、ヒト皮膚の幹細胞に特異的と知られているサイトケラチン(CK)15が、マウスの毛髪組織でも毛幹細胞のマーカーになりうることを発見した。この成果は、今後エレクトロポレーションで蛍光標識用遺伝子(GFP)を導入した毛幹細胞をCK15をマーカーにして分離できる目途がついた。骨組織再生に関する成果として、軟骨への分化を誘導する遺伝子を探究するため、ヒト胎児軟骨細胞培養系からサブトラクション法で17個の未知遺伝子断片をクローニングした。そのうちDEC1は新規のプロリン型bHLH転写因子であり、CDEPは新規のRhoGEFであった。また軟骨に特異的に発現する膜蛋白MTFをクローニングした。ATDC5細胞にDEC1あるいはMTFを過剰発現させると軟骨分化が亢進した。一方3T3細胞へCDEPを導入すると細胞が癌化した。自家軟骨細胞あるいは骨髄間葉系細胞の移植による軟骨/骨の再建法に、DEC1とMTF遺伝子は有用な道具となると期待される。現在まで確実且つ安全な毛髪再生技術は開発されていない。本研究では毛髪再生技術の開発を目指して、毛髪組織への遺伝子導入技術の確立を行った。また毛髪再生活性を持つとされる毛乳頭細胞を不死化した細胞株を樹立し毛髪再生技術への貢献を目指した。[結果と考察]エレクトロポレーション法・リポフェクション法・イオントフォレーシス法などを用いて、マウス胎児の皮膚組織やマウス成体の毛髪組織への遺伝子導入技術が開発された。これらの技術を用いることで毛髪再生促進遺伝子を用いた遺伝子治療による毛髪再生が可能となる。成体において唯一、毛髪再生能力を持つとされ、毛髪再生の要である毛乳頭組織から細胞を単離し継代培養する事で細胞株を樹立した。無限に増殖可能である本細胞を用いることで毛髪再生を促す生理活性物質を培養上清から分離精製する事が容易になると期待される。次に、ヒト間葉性幹細胞を分離し、細胞増殖促進と軟骨分化制御機構について検討した。[結果と考察]bFGF、3Y1-CM、I型コラーゲンなどを組み合わせることにより、より効果的なヒト間葉性幹細胞増殖プロトコールを確立できる可能性が示唆された。cyclopamineが軟骨分化を抑制しなかったことより、hedgehogは少なくともin vitroでのヒト間葉性幹細胞からの軟骨分化においては必須の因子ではないと推測された。

3.骨軟骨に関してはヒト骨髄中の間葉系幹細胞の単離に成功し、軟骨・脂肪・骨細胞への分化を誘導する系を確立した。現在本細胞を用いて顎骨再生などの口腔・整形外科領域における再生医療工学技術の開発を進めつつある。以上のように本研究では再生医療工学分野での重要且つ有用な研究成果を得ることが出来た。本研究の実施において地域の枠を超えた連携は非常に有用であった。発生・再生における組織間相互作用の分子メカニズムを応用した培養人工皮膚作製を目指し、基底細胞がん発生に関与していることが示唆されるShhシグナルを利用し培養表皮作製法の改良を試みた。培養表皮作製にフィーダーとして広く利用されているSwiss-3T3細胞に遺伝子導入法を用いて外来的にShh発現ベクターを導入後、薬剤選択を行いShhを発現している細胞株の樹立を行った。放射線照射により自己増殖能を失ったフィーダー細胞を用いて初代培養ヒトケラチノサイトによる人工表皮作製を行ったところ、Shh発現フィーダー細胞を用いることで作製に要する期間を短縮出来ることが明らかとなった。本フィーダー存在下では通常の培養条件よりも細胞サイズの小さなケラチノサイトが増殖する傾向があり細胞の成熟が抑制されている可能性がある。以上の内容をTissue Eng誌に報告した。また肝幹細胞候補の一つである肝上皮細胞株を用いて培養系での肝・胆管細胞への分化誘導系の確立に成功した。現在、分化誘導により作製した肝細胞を動物へ移植することで肝機能の回復を目指した再生医療工学技術の開発を進めている。
分子間力により高次構造を制御した液晶性ポリマーアロイの構築

本研究においては、水素結合相互作用を中心とした分子間力により分子を集合させ構造制御を行なうことにより、以下に示すような成果を得た。1.液晶性ポリマーネットワークの構築側鎖にスペーサーを介して安息香酸ユニットを有するポリアクリレートと、4,4'-ビピリジンや1,2-ビスピリジルエチレンなどの二官能性水素結合性分子から、カルボキシル基とピリジル基が等モルとなるようコンプレックスを作製した。このコンプレックスは、分子間メソゲンを有するネットワーク高分子構造を形成し、なおかつスメクチックA液晶性を示した。すなわち、高度な橋かけ構造にもかかわらず、水素結合の動的性質により液晶性を示す全く新しいタイプの分子配向材料が分子間力による複合化により達成された。2.強誘電性を示すカイラルスメチックC液晶性分子複合体の構築キラルな末端基を有するスチルバゾール分子と、側鎖にスペーサーを介して安息香酸ユニットを有するポリエーテルを、水素結合相互作用により複合化させ、新たに強誘電性を発現させることに成功した。この鏡誘電性液晶は電場に安定に応答した。3.水素結合による主鎖型高分子液晶のポリマーアロイ化主鎖型液晶ポリエステルの側方置換基にピリジル基を導入したものを合成した。このポリエステルと、ポリビニルフェノールのブレンドを作製した。このポリマーブレンドは、ピリジル基とフェノール水酸基との間に形成される水素結合により相溶し、均一な液晶相を示す液晶性ポリマーアロイとなった。以上、新規な液晶材料を分子間相互作用の活用により構築することができた。
インターネット上の衣服画像に対する色認識と色差の許容

現在,インターネットショッピングの普及によって,実際の商品を手に取ることなく購買活動が行われるようになってきているが,色違いによるクレームが多く,社会問題になっている.本研究では,衣服画像に対する色認識と色差の許容について数量的に知ることと,インターネットショップ上で商品画像を見る人にどのように伝えるのが良いのかを提案することを目的に,視感評価実験を行いながら研究を進める.本質的なところでは,見る人が色や風合いをどのように認識しているのかを知る基礎的な研究でもあり,衣服に対する色認識と許容の特性について考察する.また,海外でも同じ実験を行い,日本人の色認識・許容の特徴を知ることも試みる.現在,インターネットショッピングの普及によって,実際の商品を手に取ることなく購買活動が行われるようになってきているが,色違いによるクレームが多く,社会問題になっている.本研究では,衣服画像に対する色認識と色差の許容について数量的に知ることと,インターネットショップ上で商品画像を見る人にどのように伝えるのが良いのかを提案することを目的に,視感評価実験を行いながら研究を進める.本質的なところでは,見る人が色や風合いをどのように認識しているのかを知る基礎的な研究でもあり,衣服に対する色認識と許容の特性について考察する.また,海外でも同じ実験を行い,日本人の色認識・許容の特徴を知ることも試みる.
インスリン様成長因子の整理活性調節機構の解析

インスリン様成長因子(IGF)は、多くの組織・細胞の成長・分化に必須であることが広く知られている。最近になり、IGFやこのレセプターの遺伝子を過剰発現あるいは欠失させた動物を用いた解析より、IGFの生理活性が、時期特異的かつ組織特異的に合目的的に制御され、はじめて正常な発達・成長が可能となることが示されてきている。そこで、本研究では、IGFの生理活性調節機構の詳細を細胞外および細胞内情報伝達の観点から明らかにすることを目的とした。まず、種々の栄養状態・種々のホルモン投与あるいは欠乏状態・手術後の動物などを用いて、色々な組織のIGFおよびIGF結合タンパク質(IGFBP)の産生量、および血中動態、IGFレセプター発現量などを解析した。その結果、これらが異なる様式で制御されており、細胞外の情報修飾機構を介して、それぞれの生理状態に応答したIGFの同化活性の厳密な制御が行われていることがわかった。一方、内分泌細胞をはじめとした種々の細胞で、トロピックホルモンなどの他のホルモン・成長因子とIGF-Iの相乗作用が観察された。特に、甲状腺細胞では、cAMP前処理により、細胞がよりIGF-Iに反応するようなpriming機構が存在していることを明らかとした。このような現象は、肝臓やその細胞などをインスリン刺激した際にも認められ、生体内で普遍的に起こっていると結論した。これら一連の結果は、IGFの生理活性の種類や強度は、細胞の種類により、あるいは生体の発達状態・生理状態や共存する他の因子により、(1)IGF生産、(2)IGFBP生産、(3)IGFsとIGFBPsの結合状態、(4)IGFsレセプター発現、(5)IGFsの細胞シグナル伝達などの段階で複雑に制御されていることを示している。1)ラットIGFBPsの単離・精製およびcDNAのクローニング・ラットIGF-Iレセプター特異抗体の作製:ラットIGFBP-1、BP-2、BP-4を、これらの結合タンパク質を大量に生産している動物細胞の細胞培養液より単離・精製した。さらに、クローニングしたIGFBP-3cDNAを組み込んだ発現ベクターをCHO細胞に導入し、このタンパク質を大量に生産する細胞株の樹立を試みている。また、ラットIGFBP-1、BP-5の全タンパク質をコードするcDNAをクローニング、現在、これらを発現ベクターに組み込んでいる。同時に、IGF-IレセプターC末端部分ペプチドとGSTの融合タンパク質を作製中である。IGF-I標的細胞におけるcAMP情報伝達経路とIGF-I情報伝達経路の相互作用の解析:ラット甲状腺由来細胞FRTL-5をあらかじめcAMP情報伝達経路を刺激し、この後IGF-Iで刺激すると、細胞増殖が相乗的に誘導されることを発見したが、この結果は、cAMP刺激により、細胞がIGF-Iにより反応するようにprimingされることを示している。さらに、細胞のcAMP情報伝達経路を刺激する際にチロシンキナーゼ阻害剤であるgenestineを共存させると、IGF-Iとの相乗作用が観察されなくなり、cAMPによる前処理は、。IGF-I非依存性および依存性チロシンリン酸化を増強することが明らかとなった。これらの結果は、cAMP処理により活性化されるある種のチロシンキナーゼが、IGF-Iに対するprimingに重要な役割を果たしていることを示しており、これは極めて新しい知見である。現在,cAMP処理により活性化されるチロシンキナーゼの同定を進めている。さらに、cAMP経路とIGF-Iをはじめとしたチロシンキナーゼレセプターを介した経路の情報の合流が、種々の細胞で普遍的に引き起こされることを明らかにした。

1)ラットIGFBPsの単離・精製およびcDNAのクローニング・ラットIGF-Iレセプター特異抗体の作製:ラットIGFBP-1、BP-2、BP-3、BP-4、BP-5を、これらの結合タンパク質を大量に生産している動物細胞あるいは種々のIGFBPのcDNAを組み込んだ発現ベクターを導入した培養細胞の細胞培養液より単離・精製した。さらに、これらを抗原として抗体を作成中である。2)IGF-I標的細胞におけるcAMP情報伝達経路とIGF-I情報伝達経路の相互作用の解析:ラット甲状腺由来細胞FRTL-5をあらかじめcAMP情報伝達経路を刺激し、この後IGF-Iで刺激すると、細胞増殖が相乗的に誘導されることを発見したが、この結果は、cAMP刺激により、細胞がIGF-Iにより反応するようにprimingされることを示している。この相乗作用発現機構を明らかにするために検討を進めたところ、cAMP経路を刺激することにより、細胞内チロシンキナーゼ活性と同時にチロシンホスファターゼ活性が増殖し、この際p125をはじめとしたいくつかのタンパク質のチロシンリン酸化が増加することが明らかとなった。これらの結果は、cAMP経路刺激に応答したpriming効果の発現に、キナーゼとチロシンホスファターゼの活性制御によるチロシンリン酸化の変動が重要が役割を果していることを示している。さらに、cAMP経路を刺激する薬剤で前処理後、IGF-Iで処理しIGF-Iレセプターキナーゼ基質のチロシンリン酸化を追跡したところ、IRS-1・IRS-2・ShcのIGF-I依存生チロシンリン酸化が増強され、この増強されたras/MAP kinase経路に伝達されることが明らかとなった。1)IGF-Iシグナル云達に重要な分子の抗体の作成:IOF-Iレセプターキナーゼ、インスリンレセプターキナーゼの基質であるIRS-1・IRS-2・ShCに対する特異的な抗体を作成した。2)IGF-I標的細胞におζるcAMPとIGF-Iシグナルの相乗作用の発現機構の解析:ラット甲状腺由来細胞FRTLL-5をあらかじめcAMP情報伝達経路を刺激し、この後IGF-1で刺激すると、細胞増殖が相乗的に誘導されることを発見した。この相乗作用発現機構を明らかにするために検討を進めたところ、cAMP経路を刺激することにより、SrcファミリーチロシンキナーゼのなかでもAblの活性が上昇し、この際p^<125>をはじめとしたいくつかのタンパク質のチロシンリン酸化が増加することが明らかとなった。特に、チロシンリン酸化p^<125>は、PI-3 kinaseのp85制御サブユニットに結合し、PI-3 kinaseを活性化することを見出した。また、このPI-3kinaseの活性化は、cAMPによるCyclin/CDK系の活性化に必須であることがわかった。一方、cAMP経路を刺激する薬剤で前処理後、IGF-Iで処理しIGF-Iレセプターキナーゼ基質のチロシンリン酸化を追跡したところ、IRS-2・ShcのIGF-I依存性チロシンリン酸化が増強され、この増強された情報が、ras/MAP kinase経路およびPI-
多能幹細胞から内耳有毛細胞への分化と内耳再生の研究

胎生18日齢のマウスから蝸牛を取り出し、組織由来多能幹細胞を培養、分離し、セルラインとして確立した。また、音響傷害性難聴モデルマウスの作成に成功した。しかし、多能幹細胞へのマイコプラズマの感染により、実験は終了となった。1.内耳多能幹細胞のセルライン確立胎生18週のマウスから蝸牛組織を採取し、neurosphere法により継代培養をした。内耳組織由来の多能幹細胞が得られたため、これをセルラインとして確立した。免疫染色にてNestinが陽性となり、神経に分化していく可能性が強く示唆された。GFAP、Musashil、GAP-43などの成熟な、あるいは未熟な神経に発現する蛋白については検討中である。2.鼻粘膜由来多能幹細胞のセルライン確立胎生18週のマウスから鼻粘膜を採取し、上記と同様にneurosphere法で継代培養をした。鼻粘膜由来の多能幹細胞も得られたため、これもセルラインとして確立された。この細胞も免疫染色でNestinが陽性で、神経に分化していく可能性が強く示唆された。その他の蛋白の発現については現在検討中である。3.セルラインへの形質導入これらの組織幹細胞に、mathl(athol)などの転写因子を形質導入する予定である。レチノン酸、ビタミンB12、ヘパリンと共培養し、この幹細胞が神経細胞に分化していくかどうか、形態学的に観察するとともに、免疫染色を用いて神経由来の蛋白が発現するのかどうか、経時的に変化を観察する予定である。妊娠マウスをケタミン、キシラジンにて麻酔後、胎児を取りだし、イソジンにて消毒後、断頭して脳組織を取り除き、内耳を含むように蝸牛を取り出した。ペニシリン・ストレプトマイシンを含んだ生理食塩水にて組織を洗浄後、0.25%トリプシンにて組織を37°Cにて15分間留置し、細胞を分離させ、ナイロンメッシュにて骨などの不要組織を除去し、回収した細胞に成長因子を加えた培養液で継代した。ディッシュに付着する細胞と浮遊する細胞を分離し、浮遊細胞を継代した。浮遊細胞は球状なneuro-sphereを形成し、組織幹細胞として確立できた。これらの細胞からRNAを抽出し、RT-PCRにて神経系マーカーの発現をみると、Musashi1、Nestin、などの神経幹細胞を示唆する遺伝子の発現を認めた。内耳組織幹細胞セルラインを、sonic hedgehog, EGF, retinoic acid, BDNF (SERB)と共に培養すると、細胞分化が誘導され、Brn3.1、Math1、Myosin7aなどの有毛細胞マーカーが発現することが確認された。今後はパッチクランプを用いて、細胞の機能について検討したい。また、難聴モデルマウスに、この幹細胞を投与し、機能再生が図れるか、ABRにて検討したい。
ハイドロゲル埋め込み電極を用いた治療的電気刺激による嚥下障害治療モデルの開発

現在、嚥下障害の主たる治療法は嚥下機能訓練である。しかし、脳血管障害急性期では意識障害のため、高齢者では認知機能障害のため、十分な訓練が出来ない事が少なくない。神経筋電気刺激は意識状態や認知機能、全身状態によらず実施できる有用な治療法であるが、従来の体表電極を用いた方法では主として体表の知覚神経や浅層の筋肉が刺激され、舌骨上筋群に代表される嚥下関連筋を十分に刺激することは困難である。しかし、生体親和性の高いハイドロゲルを用いた埋込み電極を用いて舌骨上筋群を直接刺激することにより、従来の体表電極を用いた神経筋電気刺激を越える治療成績が得られる可能性がある。ハイドロゲル埋込み電極を用いた嚥下関連筋に対する神経筋電気刺激の有効性を検証するために、小動物実験モデルとしてラットを選択した。ラットの舌骨上筋群のうち、電極埋込に適した筋を検証した結果、形態的に顎二腹筋前腹が適していることが判明した。ラットの顎二腹筋前腹にゲル電極を固定して1-4週間電極の埋め込み実験を行なった結果、局所感染、肉芽形成、電極位置のずれ、ラット自身によるリード線離断等の問題が生じた。ゲル電極の形状と電極の位置を最適化し、電極で顎二腹筋を全周性に覆い、リード線を後頭部から体表に導出することにより、電極の固定性が良く、リード破損や感染、肉芽形成が生じないことが判明した。今年度は、この実験系を用いて、顎二腹筋の電気刺激前後の筋組織について組織学的な検討を行った。その結果、筋の長径の有意増加が確認された。断面積について、さらに個体数を増加し、検討中である。電極の埋め込み部位、電極の形態等の最適化は予定通り達成し、筋刺激後の顎二腹筋の長径の増加を確認できた。しかしながら、断面積の増加がさらに検討が必要な状態であるため。現在の実験モデルを用い、個体数の増加、刺激条件の変更などを行いながら、さらに最適な条件を探っていく。その後、嚥下障害モデルラットを用いて同様の神経筋電気刺激実験を実施し、電気刺激の前後の嚥下機能を嚥下造影等で評価する。それにより、電気刺激が単に嚥下関連筋の筋肥大効果に留まらず、嚥下機能の改善効果が得られるかを検証する。この実験系を用いて、現在筋の電気刺激条件の最適化を進めている。電極の埋め込み部位、電極の形態等の最適化は予定通り達成した。しかし、電気刺激条件の最適化が十分ではない。

ゲル電極の形状と電極の位置を最適化し、電極で顎二腹筋を全周性に覆い、リード線を後頭部から体表に導出することにより、電極の固定性が良く、リード破損や感染、肉芽形成が生じないことが判明した。今年度は、この実験系を用いて、顎二腹筋の電気刺激前後の筋組織について組織学的な検討を行った。その結果、筋の長径の有意増加が確認された。断面積について、さらに個体数を増加し、検討中である。電極の埋め込み部位、電極の形態等の最適化は予定通り達成し、筋刺激後の顎二腹筋の長径の増加を確認できた。しかしながら、断面積の増加がさらに検討が必要な状態であるため。現在行なっている電気刺激条件の最適化を完了する。その後、両側の顎二腹筋前腹に電極を埋め込み、片側の電極のみ2-4週間電気刺激を加える。その後、両側の顎二腹筋前腹を摘出し、組織学的に検討を加えることで神経電気刺激による筋肥大効果と筋損傷等の有害事象の検証を行なう。その後、嚥下障害モデルラットを用いて同様の神経筋電気刺激実験を実施し、電気刺激の前後の嚥下機能を嚥下造影等で評価する。それにより、電気刺激が単に嚥下関連筋の筋肥大効果に留まらず、嚥下機能の改善効果が得られるかを検証する。現在の実験モデルを用い、個体数の増加、刺激条件の変更などを行いながら、さらに最適な条件を探っていく。次年度使用額が無いため、記入しない。
細粒度モジュールのトレーサビリティ実現によるソフトウェア不具合検出ツールの開発

本研究では,ソフトウェアリポジトリの開発履歴データを活用した不具合予測に取り組んだ.平成23年度に完了した「細粒度モジュール履歴管理リポジトリの構築」によって,細粒度モジュールのトレーサビリティが実現したため,それを用いた不具合予測手法の構築を行った.本年度の主な成果は,次の2つである.1.細粒度モジュールに対する不具合予測モデルの構築開発履歴データを用いた従来の不具合予測は,パッケージやファイルという粗粒度なモジュールを対象として行われていた,細粒度なメソッドレベルの不具合予測は,不具合の発見に効果的で有望とされていたがこれまで実現できていなかった.これは,メソッドレベルの履歴情報収集が難しかったためである,そのため,メソッドレベルの不具合予測は本研究分野でのオープンイシューであった.この課題に対し本研究では,前年度にメソッド履歴管理リポジトリを開発することでメソッドの履歴情報収集を可能にした.これまでに提案されているメトリクス計測法をこのメソッド履歴管理リポジトリに適用し,初めてメソッドレベルの不具合予測モデルを構築できた.オープンソースソフトウェアを対象としたシミューレション実験から,メソッドレベルの不具合予測が期待どおりにファイルやパッケージレベルよりも効果的に不具合発見に役立てることを示した.2.コードクローン版管理システムの開発先のメソッドレベルの予測モデルでは,これまでに提案されているメトリクスを計測した,より有用な,また新しい知見を得るため,これまでにない細粒度モジュールの履歴情報の分析を行った,ソースコードの履歴情報として,ソースコード中での類似または一致した部分(コードクローン)の分析が注目されている.コードクローンの存在は,ソフトウェア保守を困難にする要因の一つと言われている.そのため,コードクローンの履歴情報を分析することは不具合予測モデル構築に有用であると期待できる.しかしコードクローンの履歴情報収集は容易ではなく,コードクローンに関連した有用なメトリクスを開発する試行錯誤は難しい.そこで,コードクローンの履歴分析を可能にするコードクローン版管理システムを開発した.本システムを用いてコードクローンの履歴に基づくメトリクスを収集し,不具合予測モデルを構築することは今後の課題である.また本システムによって,コードクローン履歴の詳細な分析が可能になり,新しい知見を得ることが期待できる.本研究では,ソフトウェアリポジトリの開発履歴データを活用した不具合予測に取り組んだ.本年度は,開発履歴データを細粒度なモジュール(メソッド)レベルで収集し,予測を行うシステムの構築を目指している.主な成果は,次の3つである.1.開発履歴データを活用した不具合予測研究のサーベイ:2000年から2010年に主要な英文論文誌と国際会議で発表された63編の文献を,系統的レビューして近年の動向を明らかにした.具体的には,発表論文が増加傾向にあること,従来の複雑度メトリクスに対してリポジトリマイニングに基づく開発履歴メトリクスの研究が増えていること,開発履歴メトリクスとしてコード,プロセス,開発組織,地理的位置関係といった履歴情報が用いられていること,を明らかにした.2.メソッド履歴管理リポジトリの構築:ソフトウェアリポジトリはファイルの履歴を管理する.ファイル内に存在するメソッドの履歴は,これまでは明示的に管理されていなかった.ファイルレベルの履歴情報からメソッドレベルの履歴を抽出する際の難しさは,メソッドの名前変更や移動時の対応付けにある.この問題点に対して,メソッドのソースコード間の類似度による対応付けを行うことで,各メソッドの一連の履歴情報を実用的な時間で収集,管理することを可能にした.これによってメソッドのトレーサビリティを実現するシステムを構築できた.3.メソッドレベルの予測モデルの構築:本研究では,成果2のメソッド履歴管理リポジトリを用いることでメソッドの履歴情報収集を行った.これによって,成果1で調査した開発履歴メトリクスをメソッドレベルの予測モデル構築に適用することが可能になった.本研究では,ソフトウェアリポジトリの開発履歴データを活用した不具合予測に取り組んだ.平成23年度に完了した「細粒度モジュール履歴管理リポジトリの構築」によって,細粒度モジュールのトレーサビリティが実現したため,それを用いた不具合予測手法の構築を行った.本年度の主な成果は,次の2つである.1.細粒度モジュールに対する不具合予測モデルの構築開発履歴データを用いた従来の不具合予測は,パッケージやファイルという粗粒度なモジュールを対象として行われていた,細粒度なメソッドレベルの不具合予測は,不具合の発見に効果的で有望とされていたがこれまで実現できていなかった.これは,メソッドレベルの履歴情報収集が難しかったためである,そのため,メソッドレベルの不具合予測は本研究分野でのオープンイシューであった.この課題に対し本研究では,前年度にメソッド履歴管理リポジトリを開発することでメソッドの履歴情報収集を可能にした.これまでに提案されているメトリクス計測法をこのメソッド履歴管理リポジトリに適用し,初めてメソッドレベルの不具合予測モデルを構築できた.オープンソースソフトウェアを対象としたシミューレション実験から,メソッドレベルの不具合予測が期待どおりにファイルやパッケージレベルよりも効果的に不具合発見に役立てることを示した.2.コードクローン版管理システムの開発先のメソッドレベルの予測モデルでは,これまでに提案されているメトリクスを計測した,より有用な,また新しい知見を得るため,これまでにない細粒度モジュールの履歴情報の分析を行った,ソースコードの履歴情報として,ソースコード中での類似または一致した部分(コードクローン)の分析が注目されている.コードクローンの存在は,ソフトウェア保守を困難にする要因の一つと言われている.

そのため,コードクローンの履歴情報を分析することは不具合予測モデル構築に有用であると期待できる.しかしコードクローンの履歴情報収集は容易ではなく,コードクローンに関連した有用なメトリクスを開発する試行錯誤は難しい.そこで,コードクローンの履歴分析を可能にするコードクローン版管理システムを開発した.本システムを用いてコードクローンの履歴に基づくメトリクスを収集し,不具合予測モデルを構築することは今後の課題である.また本システムによって,コードクローン履歴の詳細な分析が可能になり,新しい知見を得ることが期待できる.研究の計画時には初年度の目標として,(1)メソッド履歴リポジトリの構築を挙げていた.目標(2)メソッドレベルの予測モデルの構築は,(1)の達成後の課題であり,主に次年度の課題と計画していた.しかし,研究が順調に進み,課題(1)を早期に達成できたため,課題(2)に取り組むことができた.また,本年度の成果は,2つの論文誌と3つの国際会議へ採録されている.本年度では開発履歴データを用いたメソッドレベルの不具合予測について,開発履歴メトリクスの収集と予測モデルの構築を行った.次年度は,(a)より詳細な履歴情報収集からの予測モデル構築と(b)一体のシステム開発を目指す.(a)については,プログラム構造に対する変更操作を特定することによって,特徴的な開発履歴のパターンのマイニングを試み,またそれを用いた不具合予測を行う.また,(b)については,細粒度モジュールの構築,プログラム構造に対する変更操作の特定,開発履歴メトリクスの収集,不具合予測と不具合を予測されたモジュールの管理を統一的に扱うシステムを目指す.
昆虫の活動・睡眠・生物リズムを制御する行動遺伝子の生理機能

1.遺伝子強制発現変異体の二次スクリーニングで選抜した行動遺伝子の機能解析PDFニューロン特異的強制発現(二次スクリーニング)により絞り込みを進めた遺伝子について、活動リズムとの関わりを調査した。具体的な実験内容としては、絞り込んだ遺伝子の部分配列のInverted Repeatを導入したトランスジェニック系統を利用して、RNA干渉作用により遺伝子発現をノックダウンし、その行動形質を計測した。国立遺伝学研究所から82系統、およびオーストリアVDRCから86系統(合計168系統)のInvertedRepeat系統を入手し、時計遺伝子特異的に働くtimeless-GAL4系統と交配して、子世代の歩行活動を測定した。その結果、活動リズムが無周期になるものが2系統、周期が24.5時間より長くなるものが2系統得られた。現在、これらの系統について、ホタルの発光タンパク質Luciferaseを導入した系統を用いて、生物時計振動のモニタリングを進めている。2.FMR1遺伝子の生理機能解析先の研究課題において活動リズムとの関与を明らかにしたFMR1遺伝子について解析を進め、脳の時計細胞でFMR1遺伝子発現量が増加すると周期が遅延すること、FMR1欠損は羽化リズムの位相に影響を与えないことを明らかにした。また、FMR1遺伝子ノックアウトのバックグラウンドで、時計細胞特異的にFMR1遺伝子を導入したトランスジェニック系統を作製し、FMR1遺伝子の活動リズム形成における働きを調べた。その結果、脳全体でFMR1遺伝子を導入することで多くの個体の活動リズムが回復するが、時計細胞特異的にFMR1遺伝子を導入するだけでも約半数の個体で活動リズムが回復することが判明した。この結果から、FMR1遺伝子は、歩行活動リズムの形成において、生物時計細胞そのもので必要とされる分子であることが確認された。1.PDFニューロン特異的強制発現系統の作製と行動解析動物や昆虫の活動・睡眠リズム形成に関わる調節遺伝子の同定を目的として、ショウジョウバエGAL4-UAS遺伝子強制発現変異体の大規模スクリーニングにより抽出した遺伝子の絞り込み(二次スクリーニング)を実施した。具体的には、一次スクリーニングで得られた候補遺伝子のUAS挿入系統(GS系統)と脳の時計細胞特異的に遺伝子発現を誘導するPDF-GAL4系統を交配し、子世代(F1)の中からpdf-GAL4:UAS遺伝子を持つ個体を選抜して活動リズムの測定を行った。その結果、活動リズムが長周期化又は無周期化するGS系統を約90ライン選抜できた。現在、これらの遺伝子について解析を進めている。選抜した遺伝子の生理機能を調べるために、生物時計の振動をモニタリングするためのレポーターアッセイ法を検討した。時計遺伝子timelessのプロモーター領域にホタルの発光タンパク質Luciferaseの遺伝子を連結し、トランスジェニックハエを作製した。このハエにルシフェリンを投与し、フォトンディテクターを用いて発光量を測定した。その結果、生きたハエを用いて生物時計の振動をリアルタイムでモニタリングできることを確認した。3.FMR1遺伝子の生理機能解析先の研究課題において活動リズムとの関与を明らかにしたFMR1遺伝子について解析を進め、脳の時計細胞でFMR1遺伝子発現量が増加すると周期が遅延すること、FMR1欠損は羽化リズムの位相に影響を与えないことを明らかにした。また、FMR1遺伝子ノックアウトのバックグラウンドで、時計細胞特異的にFMR1遺伝子を回復させたトランスジェニック系統を作製した。現在、この系統を用いて活動リズムや睡眠がレスキューされるかどうか詳細に検討中である。1.遺伝子強制発現変異体の二次スクリーニング選抜した行動遺伝子の機能解析PDFニューロン特異的強制発現(二次スクリーニング)により絞り込みを進めた遺伝子について、活動リズムとの関わりで生理機能の解明を図った。

国立遺伝学研究所から82系統、およびオーストリアVDRCから86系統(合計168系統)のInvertedRepeat系統を入手し、時計遺伝子特異的に働くtimeless-GAL4系統と交配し、子世代の歩行活動を測定したところ、無周期になるものが2系統、周期が24.5時間より長くなるものが2系統得られた。現在、これらの系統について、ホタルの発光タンパク質Luciferaseを導入した系統を用いて、生物時計振動のモニタリングを実施している。2.FMR1遺伝子の生理機能解析先の研究課題において活動リズムとの関与を明らかにしたFMR1遺伝子について、神経細胞と生理機能との関連を調べた。具体的な実験内容としては、FMR1遺伝子ノックアウトのバックグラウンドで、時計細胞特異的にFMR1遺伝子を回復させたトランスジェニック系統を作製し、FMR1遺伝子の活動リズム形成における働きを調べた。その結果、脳全体でFMR1遺伝子を導入すると過半数の個体の活動リズムが回復するが、生物時計細胞特異的にFMR1遺伝子を導入するだけでも約半数の個体で活動リズムが回復することが判明した。この結果から、FMR1遺伝子は、歩行活動リズムの形成において、生物時計細胞そのもので必要とされる分子であることが確認された。