hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
低出生体重児における症候性サイトメガロウイルス感染症の実態調査と予防

CMV陽性母乳を与えられた23例中、出生後血清または尿中CMV-DNA陽性となったのは1例(4.3%)で、臨床症状としてはAST,ALTの上昇を認めたのみであった。【結論】超早産児を対象とした検討でCMV陽性母乳よりの感染は4.3%と低値であった。CMVの感染価は凍結処理により減少する。我々の施設では母乳を凍結保存しており、海外からの報告との差異は母乳の処理方法にあると考えられた。前回同様今回の検討でも重篤な感染を起こしたものはおらず、凍結処理により臨床上問題となるCMV感染はほぼ起こらないと考えられた。【目的】近年独国のHamprechtらは、サイトメガロウイルス(CMV)が母乳を通じて低出生体重児に感染した場合、敗血症様重症感染をはじめとする症候性感染が起こると報告した。母乳は低出産体重児にとって必要欠くべからざる栄養源であり、壊死性腸炎の予防にも役立っている。もし、母乳が低出産体重児に重症ウイルス感染を引きおこしているなら新生児医療において重大な問題である。そこで今回我々は、わが国における低出生体重児での母乳を介したCMV症候性感染症の実態を明らかにするために、超早産児におけるCMVの経母乳感染についての検討を行った。【方法】2003年4月2004年9月に当院とその関連施設に入院した在胎28週未満または出生体重1000g未満で、献乳を含む母乳栄養を行った児(27人)及びその母親(25人)を対象とした。ウイルス学的検討はReal-time PCR法を用い、出生時とその後2週間毎に尿、血清、母乳中のCMV-DNA量を測定した。先天性CMV感染症、その他のウイルス感染症、先天性奇形症候群、胎児水腫の症例は除外した。【結果】児の在胎期間は26.4(23.7-32.6)週、出生体重は802(512-1108)gであった。CMV抗体陽性の母親21例(84%)中全例の母乳よりCMV-DNAが検出された。CMV陽性母乳を与えられた23例中、出生後血清または尿中CMV-DNA陽性となったのは1例(4.3%)のみであった。尿中および母乳中CMV-DNAのUL144遺伝子領域の塩基配列は100%一致しており、母親母乳からの感染が疑われた。我々の施設では母乳を凍結保存しており、海外からの報告との差違は母乳の処理方法にあると考えられた。
一分子生理学を超えて：生体分子機械を力で優しく働かせる

たんぱく質分子機械が働く仕掛けを探るのに、個々の分子が働いている現場を顕微鏡下で直接観て、さらに必要なら力を加えて応答を観るのが、一分子生理学である。従来は妨害方向に力をかける例が多かったが、外力で積極的に「働かせてやる」ことによる理解を目指した。働かせて得た成果ばかりとは言えないが、回転分子モーターの逆回転によるATP合成の仕組みを始めとして、リニア一分子モーター、DNA上で働く分子機械、さらに超分子レベルにおいて細胞分裂機構などにつき、多くの知見を得た。回転分子モーターF1の回転子を磁気ピンセットによりATP合成方向に回転させ、蛍光性AD(T)Pを用いて、回転角と3つの活性部位における化学反応の関係を調べた。合成は基本的に加水分解の逆の道筋をたどることが分かった。ヌクレオチド親和性の角度依存性も分かり、Boyerの結合変化説を実証しつつある。活性部位に結合したヌクレオチドの数は常に2であり、ATP結合の直後だけ一瞬3になることが確かめられた。従来必要とされてきた3個目は、活性と無関係な弱い結合によること、燐酸は加水分解直後に放出されること、なども分かった。回転軸を半身に削いでしまった変異体でも、高速回転するだけでなく、野生体の半分のトルクを発生できる。(2)ATP合成酵素脂質膜に再構成することにより、ATP駆動での膜内回転を示せたが、プロトン駆動によるATP合成方向の回転は検出できなかった。その後ATP合成活性のはるかに高い再構成法を見いだしたので、合成回転の可視化に再挑戦する。(3)リニアー分子モーターATPに駆動されるミオシンの爪先上下運動を詳細に解析し、投稿した。また、ミオシンVとアクチン間の結合力には方向性があること、斜めに引っ張られてもミオシンVは歩き続けられること、などを示した(4)その他II型トポイソメラーゼがDNAの絡まりをほどくときの見かけのprocessivityは1μm程度であり、DNAのブラウン運動によると分かりつつある。Reverse gyraseに関しても、一分子だけでDNAを何回も捻り続けることを示唆するデータが取れ始めている。紡錘体(染色体分裂装置)はラダビーボールの形をしているが、外力で紡錘体を変形させて大きさが変わってしまっても形状が保たれることが分かり、その機構を調べている。たんぱく質一分子でできた回転モーター(F1-ATPase)の出す回転力を、回転角の関数として求めた。回転子に磁気ビーズを付け、磁気ピンセットで弱い力で回してやると、ビーズの向きの磁場からのずれからF1の出す力が分かる。エネルギー変換の仕組みの基本を解明できた。また、回転子部分には、回転力発生に必須なアミノ酸残基は1つもないことも示せた。回転子としての機能は、大体の形だけが決めることになる。さらに、ATP合成酵素(F1はその一部)に付き、ATP駆動のプロトンポンプ活性を調べた。プロトン/ATP比を、初めて実験的に求めることができた。電位で開閉するイオンチャネルの、手動開閉に成功した。チャネルの電位センサー部分にハンドルを導入し、手動操作で引っ張ったところ、通常より数十mV低い膜電位の下でもチャネルが開いた。ただし極めて難しい実験で、必要な張力など定量的研究に進めるには、手法のさらなる改良が必要である。DNAの二重螺旋をさらにきつく巻く酵素(Reverse gyrase)の働きを、初めて一分子観察した。磁気ピンセットによりほどき気味にしてやると、さっと(従来の見積りより二桁速く)巻き上げる。助けるつもりできつく巻くと、今度は巻きすぎを検知して巻き戻す。わずかにきつく巻いた状態を保つことにより、DNAを保護すると思われる。作動機構のモデルを提出した。細胞分裂時に細胞をくびり切る、収縮環の再構成に成功した。細胞状のカプセルの中にたった3種類の要素(アクチン、ミオシン、アクチン束化因子)を封入するだけで、赤道部分にリング構造が自動的にできあがる。ミオシン濃度を上げると、このリングは自発的に収縮する。また、細胞分裂時の染色体を分配する装置である紡錘体において、染色体運搬に関わる分子モーターを同定した。さらに、Forminによるアクチン重合の単位ステップも検出できた。前年度に引き続き、回転分子モーターF_1-ATPaseの3つの活性部位それぞれのATPおよびADPに対する結合・解離速度常数を回転角の関数として決定した。いずれも回転角に対して100倍以上変化し、角度依存性はなめらかであった。結合常数は4桁以上の変化を見せ、ATPとADPでは角度依存性がずれていた。また、回転子頭部を完全に削除した変異体でも回転することが分かり、回転特性を調尺べている。この酵素は、少量のSDS(界面活性剤)存在下でかえって活性化され、回転分子数も増えることが示された。

(2)ATP合成酵素F_0F_1の親戚であるV_0V_1-ATP合成酵素のATP駆動の回転において、30度おきのサブステップが見えた。V_0部分の対称性(V_0-cサブユニット12個)を反映するもので、ATP駆動のモーター(V_1)の回転がプロトンモーター部分(V_0)での相互作用の影響を受けることが初めて示された。F_0F_1-ATP合成酵素に関しては、新しい再構成法の開発により、好熱性酵素としては初めてATP合成反応の基質依存性や温度依存性を決定できた。脂質膜に再構成したF_0F_1のATP駆動回転によるプロトンポンプも顕微鏡下で可視化されつつある。(3)その他II型DNAトポイソメラーゼのprocessivityは、従来の報告と異なり有限で、約10秒たつと酵素はDNAから離れてしまうことを示した。Reverse gyraseによるDNA回転は、DNA中に相補性を欠くバブル領域を導入すると速くなる。しかしバブルをたくさん入れるほど速くなるわけではなく、何が速度を決めるのか検討中である。紡錘体(染色体分裂装置)が力学的操作に対して形状を保とうとするような応答を示すのは、微少管の脱重合やモーター活性が関わっていることが分かりつつある。回転分子モーターF1-ATPaseの逆回転によるATP合成に関し、ADPが結合する角度近辺では、燐酸の存在によりATPの結合が阻害されることが分かった。効率よいATP合成を保証する仕掛けである。昨年度までの結果と合わせ、燐酸有りと無しそれぞれにおけるATPおよびADPの結合・解離速度定数の回転角依存性が求められ、Boyerの結合変化説の実体を示すことができた。また、回転子頭部を削除しさらに回転軸部分にも置換を入れた変異体がミクロンサイズのビーズを回転させられることが分かり、これまでの結果と合わせ、トルク発生に必須な天然のアミノ酸残基は一つもないことが示せた。好熱菌のATP合成酵素を用い、合成の駆動力である膜電位とpH差のそれぞれが、合成速度に全く同等の寄与をすることを示した。片方が負でも両者の代数和が等しければ合成速度が等しくなることを示したのは初めてである。また、ATP合成の逆反応としてのATP分解駆動のプロトンポンプ活性を定量できるようになった。ポンプ活性の直接定量は、他の生物種においてもこれまで報告がない。イオンチャネルの手動開閉を目指し、電位センサーを始め何カ所かに、操作用のハンドルを遺伝子的に導入した。発現効率に差があるが、いずれも単一チャネル電流を確認できた。その他、DNAの二重螺旋をさらにきつく巻くreverse gyraseは、100回転以上にわたりprocessiveにDNAを回転させられることが分かった。微少管の両端に結合して脱重合させる蛋白質MCAKが、1 pN程度の力を出すモーター作用があることを示し、染色体移動に力を発揮し得ることを証明した。紡錘体(染色体分裂装置)の形状保持機構に関し、外力刺激後の時間に応じて弾性的ないし粘性的応答を示すことが分かり、粘弾性モデルを構築している。電位依存性イオンチャネルの手動開閉に成功した。まず、電位センサー部分に遺伝子的にタグを導入したカリウムチャネルを培養細胞に発現させた。細胞膜をパッチピペットで保持し、種々の膜電位を印加しながらチャネル電流を計測した。
鼻孔放射の観測とモデル化及びその個人性について

本研究では、鼻孔放射を観測しモデル化するともにその個人性について検討することを目的とした。男性10名の被験者から、鼻孔近傍の音圧、鼻壁での振動加速度、正面音声をAD変換器3チャンネルを用いて、口唇放射と鼻孔放射の度合い(鼻孔放射度)を観測した。音声資料は、鼻音/ma/、/na/と5母音、および/cvcv/(c=b,d,g v=a,i,u,e,o)である。語頭のバズでは鼻孔放射度は個人性があり、/m/と同等な者から-10から-15dBまでの者までばらつきがあった。また、語中のバズでは、語頭と鼻孔放射度が低い場合が多かったが、同等な場合もあった。また、バズから母音、母音からバズへの変化は、比較的早く変わる話者が多数であったが、ゆるやかに変わる話者が見られた。周波数分析の結果、バズ区間の鼻孔放射は第2から第3高調波までが主成分であることがわかった。この被験者のうち3名について頭部矢状面におけるMRI動画データを観測した。その結果、軟口蓋の厚さは、個人差があること、母音での軟口蓋の厚さは、母音によって異なること、バズ部分では、後続母音によって異なるが、後続母音部分と大差がないことがわかった。これは、音声データの観測と異なるようであるが、母音部における観測データでは/i/が薄く、/a/が厚く、鼻孔放射度が/i/で大きい結果と整合性があるので、バズ部分における軟口蓋の様子をさらに観測する必要がある。これを声道の音響モデルに取りいれ合成音声を作成し、鼻孔放射区間(バズ区間)と口唇放射(母音区間)を分けたほうが、合成音がなめらかにつながることを確認した。バズ時の鼻孔放射は軟口蓋の弛緩によって起こることは、上記から明らかであるが、個人性を定量的に取り扱うまでにはいたらなかった。本研究では、鼻孔放射を観測しモデル化するとともにその個人性について検討することを目的とした。一つは、鼻孔放射を観測して、個人性について検討した。まず、無響室にて、被験者は鼻壁に小型加速度計を装着し、プローブ・マイクロホンを鼻孔の近くに、また、胸部の前にコンデンサ・マイクロホンをおく。さらに通常のコンデンサ・マイクロホンを口唇から1メートルの位置におき、これら4入力をA/D変換器を通してパソコンに録音した。音声資料は、鼻音/ma/、/na/および/VCV/(V=/a/、/i/、/u/、/e/、C=/b/、/d/、/g/、/p/、/t/、/k/)で、男性話者10名である。これらをデータベースとした。波形を観測し、母音/i/や有声破裂音のバズでは、鼻孔放射が大きいことを観測した。エネルギーの分析結果より、/b/、/d/、/g/では全体の20%から70%は鼻孔放射であり、個人差も大きいことを明らかにした。他方、計測データに基づいて軟口蓋の調音モデルを構築し、鼻音化音声を合成するため、これまで各音素環境での鼻音化と非鼻音化音声を発話するときの、口唇音、口腔内音圧、鼻腔内音圧及び軟口蓋の振動の同時計測を行った。計測データの分析により、発話時、軟口蓋の状態(硬さ)は話者の制御による能動的な変化成分と、口腔内の音圧による非能動的な変化成分があることを明らかにした。これらのメカニズムを考慮にいれて軟口蓋モデルの構築を検討している。

本研究では、鼻孔放射を観測しモデル化するともにその個人性について検討することを目的とした。男性10名の被験者から、鼻孔近傍の音圧、鼻壁での振動加速度、正面音声を3チャンネルをAD変換器を用いて、口唇放射と鼻孔放射の度合い(鼻孔放射度)を観測した。音声資料は、鼻音/ma/、/na/と5母音、および/cvcv/(c=b,d,g v=a,i,u,e,o)である。語頭のバズでは鼻孔放射度は個人性があり、/m/と同等な者から-10から-15dBまでの者までばらつきがあった。また、語中のバスでは、語頭と鼻孔放射度が低い場合が多かったが、同等な場合もあった。また、バズから母音、母音からバズへの変化は、比較的早く変わる話者が多数であったが、ゆるやかに変わる話者が見られた。周波数分析の結果、バズ区間の鼻孔放射は第2から第3高調波までが主成分であることがわかった。この被験者のうち3名について頭部矢状面におけるMRI動画データを観測した。その結果、軟口蓋の厚さは、個人性があること、母音での軟口蓋の厚さは、母音によって異なること、バズ部分では、母音によって異なるが、母音部分と大差がないことがわかった。これは、音声データの観測と異なるようであるが、母音部における観測データでは/i/が薄く、/a/が厚く、鼻孔放射度が/i/で大きい結果と整合性があるので、バズ部分における軟口蓋の様子をさらに観測する必要がある。これを声道の音響モデルに取りいれ合成音声を作成し、鼻孔放射区間(バズ区間)と口唇放射(母音区間)を分けたほうが、合成音がなめらかにつながることを確認した。バズ時の鼻孔放射は軟口蓋の弛緩によって起こることは、上記から明らかであるが、個人性を定量的に取り扱うまでにはいたらなかった。
不適切環境に対するウシの適応戦略の個体差

家畜福祉レベルの指標として注目されてきている常同行動の調査を行った。人工哺乳黒毛和種子牛は模擬舌遊び行動を10日齢から始め、早期離乳(42日齢)後にピークとなり、その時点で同時に舌遊び行動も出現させた。また、摂食行動が盛んとなる150日齢にも増加傾向となった。吸乳行動や摂食行動の抑制が、舌遊び行動の誘発要因として実験的にも推定された。補助乳首の提供、粗飼料細切、飼育方式(離乳後の群飼・単飼)の効果を検討した結果、社会的探査も含む探査行動、吸乳行動、ならびに摂食行動の抑制の総合的効果が舌遊び行動の誘発要因と考えられた。乳首形状の違いにより吸乳時間を変え、加えて粗飼料制限(飽食の半分量)の効果を検討した。吸乳時間を伸ばした場合、吸乳前に高まった血中cortisolレベルは吸乳後急激に低下し、吸乳時間制限のストレス性が明らかとなった。吸乳時間制限区では、舌遊び・模擬舌遊び行動は多くなる傾向にあった。粗飼料飽食区を半量区に、半量区を飽食区にした結果、舌遊び・模擬舌遊び行動は前者では有意に増加し、粗飼料制限の効果が明らかとなった。品種間差を黒毛和種、ホルスタイン種、それらの雑種で比較した結果、前二者で舌遊び行動が出現し、個体差が大きく、しかも2極化(多発牛、少発牛)する傾向となった。多発牛は通常飼育下では探査行動が多く、横臥行動が短い傾向を示し、新奇環境下では新奇環境への侵入までの時間が短く、探査行動が多く、活動的で積極的な性質を有していた。驚愕刺激を与えた結果、心拍反応が早く、しかも急激に低下する傾向を示し、交感神経系の反応性の高さも示した。舌遊び行動の前後および最中に心拍数を計測した結果、実行中に有意に低下し、実行後も低下し続ける個体も存在した。今回明らかとなった心拍数の低下は、ヒトの場合には、安寧をもたらす減少程度であり、ウシにおいても舌遊び行動の安寧効果が示唆された。人工哺乳で少なくなる吸引行動を助長する補助ニップルの有無、粗飼料細切の有無、および単飼・群飼の3要因計画で子牛を人工哺乳実験に供した。その結果、心理的攪乱状態が示す葛藤・異常行動である舌遊び関連行動、身繕い行動、模擬舌遊び行動および舌遊び行動が出現した。心理的攪乱程度の高いレベルに呼応する模擬舌遊び行動は、10日齢から出現し、離乳直後まで増加し、その後減少する傾向にあった。それに対し舌遊び行動は模擬舌遊び行動が低下し始める60日齢より出現し、継続するため模擬舌遊び行動の発展型とも考えられた。60日齢以降には摂食行動も急速に発達したため、その行動と舌遊び行動との関連が示唆された。要因としては単飼の効果が最も強かった。補助ニップルは吸引行動を助長はしたが、吸乳時間数と補助ニップル吸引時間数とを合計しても自然哺乳時間数までには達せず、吸乳時間の代用にはなり得ないものと考えられた。粗飼料細切の効果は認められなかった。要因であった単飼の効果には場所の効果も含まれており、処理間での行動の違いを検討した結果、単飼に伴う社会行動や探査行動の抑制のほか、哺乳時間数や粗飼料摂食時間数の多寡も含まれており、更なる検討が必要であると考えられ、来年度にそれらの要因を加え再度検討する計画とした。反応の品種間差は大きく、黒毛和種、F1、ホルスタイン種の順に葛藤・異常行動は激しかった。また同品種内でも行動の個体差は明確であった。葛藤・異常行動を高頻度で行う個体は、休息行動が少なく探査行動が多かった。高頻度牛ではアンドロジェンレベルが低頻度牛の2倍の高さであった予備調査の結果と考えあわせると、これらの個体の外部刺激に対して積極的・活動的に対応する戦略個体である可能性が示唆された。低刺激状態に対応し、様々な行動を試み、最終的に定型的な行動を発達させるのかもせず、これらの検証を今後行う予定である。

品種間差を黒毛和種、ホルスタイン種、それらの雑種で比較した結果、前二者で舌遊び行動が出現し、個体差が大きく、しかも2極化(多発牛、少発牛)する傾向となった。多発牛は通常飼育下では探査行動が多く、横臥行動が短い傾向を示し、新奇環境下では新奇環境への侵入までの時間が短く、探査行動が多く、活動的で積極的な性質を有していた。驚愕刺激を与えた結果、心拍反応が早く、しかも急激に低下する傾向を示し、交感神経系の反応性の高さも示した。舌遊び行動の前後および最中に心拍数を計測した結果、実行中に有意に低下し、実行後も低下し続ける個体も存在した。今回明らかとなった心拍数の低下は、ヒトの場合には、安寧をもたらす減少程度であり、ウシにおいても舌遊び行動の安寧効果が示唆された。24頭(雄10,雌14)の黒毛和種人工哺乳子牛の舌遊び行動を宮崎大学農学部付属住吉牧場(S牧場),宮崎県畜産試験場(T牧場)および東北大学農学部附属農場(K牧場)で調査した(各牧場N=8)。すべての供試牛を2日齢で母牛から分離・単飼し,42日齢まで人工哺乳した。12週齢まで人工乳を不断給餌し,その後配合飼料を体重のおよそ1-2%給与した。舌遊びおよび模擬舌遊び行動(常同行動)の出現量より,各牧場ごとになるべく同数になるように多発群および少発群に分類し,各群の行動・生理的特徴を調査した。舌遊び多発群では探査行動が多く,横臥時間が短いことが認められた。他の維持行動、社会行動に関しては差は認められなかった。新奇環境(オープンフィールド)に導入すると、常同行動多発個体は少発個体に比べて探査行動が有意に多かった。また新奇環境内に設置したポールを倒した個数体は多発群に多かった。さらに,オープンフィールドに入るまでの時間が短い傾向にあった。多発群の平均心拍数は前半4分間は少発牛より高い傾向,その後少発牛よりも低く推移する傾向にあった。天井から金属バケツを落とすという驚愕刺激に対しては、行動差は認められなかったが、オープンフィールド移動直後1分間の心拍数は多発群で高い傾向にあった。驚愕刺激提示直前(5秒前)に対する刺激提示直後(5秒後)の心拍数増加率は,多発群で有意に高くなった。これらの特徴から舌遊び行動多発個体は,活動的で環境に積極的に働きかける性格がうかがえた。また驚愕刺激提示直後の心拍数増加率も,多発個体の方が有意に高くなったことから、多発個体は交感神経系の反応性が高いものと考えられ、交感神経系の反応性が高いという生理的基盤が積極的性格を形成している可能性も示唆された。そして,舌遊び行動とはその積極的個体が種々の行動を抑制(吸乳,摂食など)された場合に出現・助長する行動である可能性が示唆された。これまで、舌遊び行動の誘発要因および意義・機能を実態調査の中から類推してきたが、最終年にあたり、実験的な裏付け調査を行った。1.誘発要因の類推実態調査から、吸乳行動や摂食行動の抑制が舌遊び行動の誘発要因として類推された。そこで、ほ乳用乳首の穴を操作することで、吸乳時間の長区(平成518秒)と短区(平均93秒)を設け、行動、血中コルチゾールレベルを比較した。その結果、長区では舌遊び行動が短くなり、吸乳後のコルチゾールレベルは急激に低下した。離乳後、粗試料の給摂量の通常量区と倍量区を設け、行動を比較した。倍量区では葛藤行動の指標である身繕い行動は少なく、舌遊び行動も少なく、その後通常区にすると身繕い行動の増加と舌遊び行動の1.5倍増がおこった。通常区では身繕い行動と舌遊び行動は多く、反転すると舌遊び行動は1/10に減少した。
ATP合成酵素におけるエネルギー共役機構の解明

ATP合成酵素(F_0F_1-ATPase)は,酸化的リン酸化において,膜を介したH^+輸送に共役してATPを合成している.本研究では,ATPの合成/加水分解の触媒作用とH^+輸送路を通るイオンの輸送とが,どのようにして共役しているかを明らかにするため,我々がエネルギー共役を調節していることを明らかにしたγサブユニットに着目し,β/γサブユニット間の相互作用を解明するべく研究を進めた.我々が既に単離していた大腸菌γサブユニットのフレームシフト変異株(γfs)では,γサブユニット(286アミノ酸)の277番目のコドンにフレームシフト変異が起きた結果,7残基長くなった変異γサブユニットが生合成される.この変異株のin vivoでのATP合成活性は非常に低下していたので,βサブユニット上に抑圧変異を同定したところ,γサブユニットのフレームシフト変異が,βサブユニットのβArg-52→CysおよびβGly-150→Aspの変異でそれぞれ抑圧されることが明らかになった.興味深いことに,βGly-150残基は,触媒活性に必須なβLys-155, βThr-156に近接していた.また,γfs/βCys-52の二つの変異をもつ酵素の活性は野性型の70%まで回復していたが,γfs/βAsp-150変異酵素ではATPase活性の回復は見られなかったことから,この変異株では協同性が回復したと考えた.以上の結果は,γサブユニットとβサブユニットの相互作用が,触媒活性あるいは協同性に重要であることを示していると考える.これらの結果についてはJ. Boil. Chem.に報告した.ATP合成酵素(F_0F_1-ATPase)は,酸化的リン酸化において,膜を介したH^+輸送に共役してATPを合成している.本研究では,ATPの合成/加水分解の触媒作用とH^+輸送路を通るイオンの輸送とが,どのようにして共役しているかを明らかにするため,我々がエネルギー共役を調節していることを明らかにしたγサブユニットに着目し,β/γサブユニット間の相互作用を解明するべく研究を進めた.我々が既に単離していた大腸菌γサブユニットのフレームシフト変異株(γfs)では,γサブユニット(286アミノ酸)の277番目のコドンにフレームシフト変異が起きた結果,7残基長くなった変異γサブユニットが生合成される.この変異株のin vivoでのATP合成活性は非常に低下していたので,βサブユニット上に抑圧変異を同定したところ,γサブユニットのフレームシフト変異が,βサブユニットのβArg-52→CysおよびβGly-150→Aspの変異でそれぞれ抑圧されることが明らかになった.興味深いことに,βGly-150残基は,触媒活性に必須なβLys-155, βThr-156に近接していた.また,γfs/βCys-52の二つの変異をもつ酵素の活性は野性型の70%まで回復していたが,γfs/βAsp-150変異酵素ではATPase活性の回復は見られなかったことから,この変異株では協同性が回復したと考えた.以上の結果は,γサブユニットとβサブユニットの相互作用が,触媒活性あるいは協同性に重要であることを示していると考える.これらの結果についてはJ. Boil. Chem.に報告した.
発癌シグナルにおけるK63型と直鎖状ポリユビキチン鎖の機能的クロストークの解明

成人T細胞白血病(ATL)は、ヒトT細胞白血病ウイルスI (HTLV-1)の感染が原因となり、50年以上の潜伏期間を経て発症する極めて予後不良の白血病・リンパ腫である。HTLV-1はTaxとHBZという二つの発癌タンパク質を産生するが、Taxが感染初期に起こる感染T細胞の不死化と腫瘍化に、HBZは腫瘍化とその後の腫瘍細胞の維持に関与すると考えられている。代表者は、Taxタンパク質が転写因子NF-κBの活性化を介してT細胞増殖因子IL-2やその受容体α鎖(IL-2Rα)を発現誘導することを示し、この発現誘導で形成されるIL-2のautocrine刺激による異常増殖が癌化の引金になるというモデルを提唱した。実際、NF-κBの活性化能を欠失したTax変異体は癌化能を消失することからTaxによるNF-κBの活性化は「発癌シグナル」と考えられている。前年度までにTaxが直鎖状ユビキチン鎖を合成するLUBAC複合体をIKK複合体にリクルートすることでK63型と直鎖状ユビキチン鎖のハイブリット鎖を合成することでIKK複合体の高分子化と活性化を誘導することを示した。今年度はTaxで活性化したIKK複合体を精製しその構成因子を質量分析器で解析し、actin結合タンパク質で機能が十分に分かっていないDrebrinを同定した。DrebrinのノックダウンはTaxによるNF-κB活性化を減弱させたがTNFαによる活性化には影響を与えなかった。即ちDrebrinはTaxによるIKK活性化に特異的に働くタンパク質であることが予想された。さらに解析したところDrebrinはTaxとIKK複合体の結合を著しく促進することがわかった。即ちATL発症に重要な役割を果たすTax特異的なNF-κB活性化を制御する新たな因子を見出しその作用機構の一部を明らかにすることに成功した。28年度が最終年度であるため、記入しない。Nuclear factor-kB (NF-kB)は炎症性サイトカイン、ケモカイン、抗アポトーシス分子、増殖因子などの発現を制御する転写因子で、炎症反応、免疫応答、細胞分化や増殖といった様々な生命現象に関与している。一方で、制御異常による恒常的なNF-kB活性化は炎症性疾患やがんの原因となることが知られており、ヒトT細胞白血病ウイルスI (HTLV-1)のTaxタンパク質は恒常的なNF-kB活性化を誘導して細胞の不死化を引き起こし成人T細胞白血病を発症させると考えられている。Taxタンパク質によるNF-kB活性化の分子機構について無細胞系を用いて1)鎖型特異的な脱ユビキチン化酵素を用いた解析、2)ユビキチンのリシン残基をアルギニンに置換した変異体を用いた解析を実施し以下の点を明らかにした。1)活性化にはK27型、K63型、直鎖状ユビキチン鎖の合成が必要である。2)K63型ユビキチン鎖の合成にはUbc13がE2として機能する。3)活性化には直鎖状ユビキチン鎖合成複合体(LUBAC)が必須である。4)Taxを介してLIUBACはIKK複合体に結合し、LUBAC/Tax/IKKからなる複合体を形成する。この複合体形成にユビキチン化は必要ない。5)質量分析からTax依存的にIKK複合体にK63型及び直鎖状ユビキチン鎖が結合していることが明らかになった。これまでに我々や他のグループからK63型ユビキチン鎖がTaxによるNF-kB活性化に必要であることが報告されていたが、我々は加えてK27型や直鎖状ユビキチン鎖が必要であることを明らかにした。また、不活性化型のLUBAC/Tax/IKK複合体形成にユビキチン反応は必要としないが、活性化型のマクロ複合体形成にはK63型及び直鎖状両者のユビキチン鎖が必須であることを世界で初めて明らかにした。一方、K63型ユビキチン鎖形成にUbc13が必須であることは示したがE3酵素については同定できなかった。今後はマクロ複合体をさらに解析しE3酵素を探索する必要がある。

今年度はTaxで活性化したIKK複合体を精製しその構成因子を質量分析器で解析し、actin結合タンパク質で機能が十分に分かっていないDrebrinを同定した。DrebrinのノックダウンはTaxによるNF-κB活性化を減弱させたがTNFαによる活性化には影響を与えなかった。即ちDrebrinはTaxによるIKK活性化に特異的に働くタンパク質であることが予想された。さらに解析したところDrebrinはTaxとIKK複合体の結合を著しく促進することがわかった。即ちATL発症に重要な役割を果たすTax特異的なNF-κB活性化を制御する新たな因子を見出しその作用機構の一部を明らかにすることに成功した。1)多くのサイトカインシグナルにおいてK63型ユビキチン鎖合成のE3であるTRAF6と直鎖状ユビキチン鎖合成であるLUBACは協調してNF-kBを合成している。しかし、協調の分子機構には不明な点が多い。我々はすでに無細胞系でのTRAF6によるNF-kB活性化系を確立しているので初めにHOIL-1Lノックアウト細胞でのTRAF6によるNF-kB活性化を検討する。反応系にK63R-Ub,HA-Ubや種々のDUBを添加しNF-kB活性化への影響を解析するとともにTRAF6,IKK,LUBACを免疫沈降しK63型。直鎖状ユビキチン鎖依存的なマクロ複合体形成や結合タンパク質変化を解析する。以上の実験結果からTRAF6とLUBACが協調するシグナルにおける異鎖間クロストークを解明する。2)悪性度の高いBasal-like乳癌では、恒常的なNF-kB活性化が癌幹細胞の増殖維持に関与することを報告している。そこで乳癌細胞の破砕液を用いた無細胞系システムで恒常的NF-kB活性化の分子機構を解明する。28年度が最終年度であるため、記入しない。
歯牙移動における完全型ならびに断片化オステオカルシン投与の効果に関する研究

実験的歯牙移動に及ぼすオステオカルシン局所投与の影響を経時的に検索する目的で,エルジロイクローズドコイルスプリングを用いて,ラット上顎右側第1臼歯を30グラムの矯正力で近心方向に移動した.実験群としてオステオカルシン1μgをラット第1臼歯根分岐部にマイクロシリンジを用いて投与した.対照群としてはPBSを投与した.次に投与開始後,1,2,3,4,5日目に一群6匹ずつ屠殺した.通法に従い,上顎骨のパラフィン切片を作製し,破骨細胞のマーカーである酒石酸耐性フォスファターゼ染色を行った.両群ともに1日目では近心歯槽骨に破骨細胞は認められなかった.オステオカルシン投与群では対照群と比較して2日目,3日目に著明な破骨細胞の増加を認めた.一方,対照群ではオステオカルシン投与群に比べ,破骨細胞数は明らかに少なかった.また,破骨細胞の出現のピークも4日目とやや遅れていた.これらの結果からオステオカルシンの投与により局所の破骨細胞が増加し,歯牙移動の促進が起こったことが示唆された.次にこのオステオカルシンの効果をオステオカルシンに対する中和抗体で阻害できるかどうかを検討する目的でラットオステオカルシンアミノ末端20残基に対する抗体を作製した.オステオカルシンアミノ末端20残基(N20)を合成し,この合成ペプチドをKLHにコンジュゲートした.このN20-KLHをFCAと乳化させ,家兎に免疫した.得られた抗血清からラットオステオカルシンのN20ペプチドをリガンドとしたsepharose CL6Bカラムを作製し,抗N20IgGをアフィニティー精製した.この精製により,抗N20IgGを約10mg得ることができた.得られた抗体の特異性ならびにタイタ-はwesthm blottingで確認した.westhm blottingレベルで,2000倍希釈で十分検出可能である比較的タイタ-の高い抗体を得ることができた.実験的歯牙移動に及ぼすオステオカルシン局所投与の影響を経時的に検索する目的で,エルジロイクローズドコイルスプリングを用いて,ラット上顎右側第1臼歯を30グラムの矯正力で近心方向に移動した.実験群としてオステオカルシン1μgをラット第1臼歯根分岐部にマイクロシリンジを用いて投与した.対照群としてはPBSを投与した.次に投与開始後,1,2,3,4,5日目に一群6匹ずつ屠殺した.通法に従い,上顎骨のパラフィン切片を作製し,破骨細胞のマーカーである酒石酸耐性フォスファターゼ染色を行った.両群ともに1日目では近心歯槽骨に破骨細胞は認められなかった.オステオカルシン投与群では対照群と比較して2日目,3日目に著明な破骨細胞の増加を認めた.一方,対照群ではオステオカルシン投与群に比べ,破骨細胞数は明らかに少なかった.また,破骨細胞の出現のピークも4日目とやや遅れていた.これらの結果からオステオカルシンの投与により局所の破骨細胞が増加し,歯牙移動の促進が起こったことが示唆された.次にこのオステオカルシンの効果をオステオカルシンに対する中和抗体で阻害できるかどうかを検討する目的でラットオステオカルシンアミノ末端20残基に対する抗体を作製した.オステオカルシンアミノ末端20残基(N20)を合成し,この合成ペプチドをKLHにコンジュゲートした.このN20-KLHをFCAと乳化させ,家兎に免疫した.得られた抗血清からラットオステオカルシンのN20ペプチドをリガンドとしたsepharose CL6Bカラムを作製し,抗N20IgGをアフィニティー精製した.この精製により,抗N20IgGを約10mg得ることができた.得られた抗体の特異性ならびにタイタ-はwesthm blottingで確認した.westhm blottingレベルで,2000倍希釈で十分検出可能である比較的タイタ-の高い抗体を得ることができた.
ウイルス性食中毒の迅速診断法の開発

食中毒原因ウイルスのうちヒトアストロウイルス(HAstV)に注目し、迅速で簡便な診断法を開発することを目的とした。検査法の確立にあたってHAstV血清型18型までに存在する共通抗原の存在領域を明らかにすることとした。HAstVのキャプシドをコードするORF2全長とそのフラグメントをプラスミドに組込み大腸菌を用いて組換え蛋白の作製を試みた結果、全長(795アミノ酸)の組換え蛋白は18型まで認識するモノクローナル抗体3A3と反応したが、C末端(363795アミノ酸)は認識されなかった。この結果とHAstVの塩基配列上からもN末端に3A3の認識領域があることが考えられたが、N末端(1363アミノ酸)の発現クローンを得ることは出来なかった。そこで、全長を発現するクローンをテンプレートにポイントミューテンションを利用した、C末端欠損クローンを作製した。しかしながら、この方法においても蛋白の発現が確認されなかった。全長またはC末端(369795アミノ酸)の蛋白発現は確認されたことから、C末端領域に何らかの転写醜節機能が存在することが示唆された。ノロウイルスについても同様の報告がなされ、今回のテーマとした共通抗原の解析を進めることができなかったが、HAstVの転写、複製機構の解明につながると思われた。14年度に計画していた大腸菌を用いたアストロウイルス蛋白の発現に関して1.抗原性を有するキャプシド蛋白の全長およびディレーションミュータントの作製全長の蛋白と血清型特異的な領域と考えられる部分(Ast3-13/del1-1089)のディレーションミュータントの作製に成功した。全長の蛋白は約90kDaとAst3-13/del1-1089は約50kDaと推定された。これらは親株に対するポリクローナル抗体と反応した。全長の蛋白は血清型特異的モノクローナル抗体とは反応しなかったが、群特異的モノクローナル抗体とは反応した。このことは群特異的抗体が大腸菌を用いて作製したディレーションミュータントとも反応する可能性を示している。そこでN末端の保存性の非常に高い領域に計画した3種類の部分的蛋白質の発現に取組み、そのうちの2種類の蛋白について発現クローンが取れた。現在、クローンの再確認を行っている。クローン確認後、ウエスタンによる解析をすすめる。
米国における教育制度改革の政策評価

本研究では、過去20年に渡って米国で推進されてきた教育制度改革の効果を検証した。具体的には、入学する公立校を生徒が直接選ぶことができるようにした学校選択制度、そして優秀な成績を収めた学校と教員に対してボーナスを支給する成果報酬制度、といった新たな制度を導入したことで、生徒の学力にどのような影響が生じたのかを検証した。学校選択においては、従来考えられていた学校間の競争効果だけではなく、各学校の生徒構成が変化することで生じる同級生効果の影響が大きいことが示された。また成果報酬では、基準を満たさなかった学校が翌年には生徒の成績を向上させる傾向にあることが示された。本研究では、米国で導入が進む初等教育の制度改革を分析対象としている。今年度はとくに、米国で広く普及した学校選択制度(チャータースクール制度)に焦点を当て、学校間競争が生徒の学力に及ぼす影響について分析を進めた。学校選択制度の導入によって、生徒は学区に関わらず入学する学校(公立校)を選べるようになるが、これは学校側の視点からは他校との競争(新入生および予算獲得)が促進されることにつながる。このような学校選択制度が、公立校の間に競争を生み、そのことによって各学校の教育水準が向上すると期待されているものの、既存研究の結果は必ずしも正の効果を示しておらず、逆に教育の低下につながったと結論付けるものもあり、経済学者の間でも意見が分かれている。本研究では、従来の論文が学校間競争を学校単位で定義していたのに対し、まずは学年単位で競争を再定義した。これは米国の小中学校では必ずしも学年が統一されていないことに着目したものであり、そのことによって、同じ学校の生徒であっても、在籍している学年によって、他校に転出できる生徒とできない生徒が存在することを区別することができた。その結果、従来の研究では、競争効果を過小評価していたと示すことができ、これまで考えられていたよりも大きな正の効果があり、競争が学力向上につながっていると推定した。分析には生徒レベルの精緻なパネルデータを利用しており、本研究から得られる知見は、日本の学校選択制度を議論する上でも参考になるものと考えられる。2年間を通して計画に沿って研究を実施し、米国で実施された各種の教育制度改革を評価する論文を4本執筆した。内訳は、学校選択制度に関する論文が2本、および教員に対する成果報酬制度に関するものが2本である。そのうちの1本である“Direct and Indirect Impact of Charter Schools' Entry on Traditional PublicSchools: New Evidence from North Carolina"は海外査読誌Economics Lettersに掲載された。最終年度は、その他のワーキングペーパーを海外学会で報告し、そこでのフィードバックをもとに論文を改訂する作業に充て、それらは現在海外査読誌に投稿中である。学校選択制度においては、学校がお互い競争することで教育の質が向上する効果と、生徒の構成が変わることで学力の向上につながる効果の2つが存在し、それらを区別して推定することができた。また、成果報酬の研究においては、目標を達成した学校の教員にボーナスを支給することは、必ずしも当初想定したような効果に結びついていないことを示した。本研究は日本における教育制度に対する示唆も大きく、引き続き研究を進めていく予定である。学会報告、論文推敲、学術誌掲載と、順調に進展している。労働経済学、計量経済学今後は、学校間の競争効果として推定されたもののうち、どの程度が同級生の転出入による効果によるものなのかを分析する。また、学校選択制度と同様に導入が広がっている、成果主義報酬制度の分析も進めていく。リサーチ・アシスタントを採用しなかったこと等により、次年度使用額が生じている。次年度は主に、学会報告、英文校正、論文投稿等に研究費を使用する。
昆虫フェロモン受容体を利用した新規神経回路活動操作技術の開発

本研究では、昆虫フェロモン受容体を利用して、特定のニューロンの活動を興奮性に制御する新規の遺伝学的技術の開発に取り組んだ。チロシン水酸化酵素遺伝子プロモーター制御下に、IR8a/IR84a遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを作成した。スライス電気生理、in vivo電気生理において、青斑核(LC)の活動はフェロモンの添加により亢進し、マイクロダイアリシスにおいて、大脳皮質ノルアドレナリン遊離レベルの増加が誘導された。LC活性化は、味覚嫌悪記憶の想起を増強した。以上の結果から、フェロモン依存性イオンチャネルの発現により、特定ニューロンの活動を興奮性に制御することが可能となった。脳機能を媒介する神経機構を理解するためには、神経回路を構成する特定のニューロンの行動生理学的な役割の解明が必須である。これまで、目的のニューロンの機能を改変するため、さまざまな遺伝子操作技術の開発が進展してきた。本研究では、昆虫フェロモン受容体を利用して、特定のニューロンの活動を興奮性に制御する新規の遺伝学的技術の開発に取り組む。ショウジョウバエより単離されたionotropic receptor (IR)は、フェロモン依存性のイオンチャネルを形成する。これらのうち、IR8a/IR84a複合体は、フェニルアセトアルデヒドあるいはフェニル酢酸に反応する受容体を形成する。本年度は、チロシン水酸化酵素(tyrosine hydroxylase, TH)遺伝子プロモーターの下流にIR8a/IR84a遺伝子を持つトランスジェニックマウスを作製し、導入遺伝子を発現する細胞のフェロモン応答を電気生理学的な検出を試みた。トランスジェニックマウスの脳幹青斑核におけるIR8a/IR84aの発現を検出し、スライス電気生理学実験によりフェニルアセトアルデヒド応答の誘導されることを確認した。また、in vivoの電気生理実験を行い、iontophoresisによって導入したフェロモンによって青斑核活動の促進することが示唆された。本年度は、in vivo電気生理におけるフェロモン応答をさらに確かめるとともに、青斑核の活性化の影響を行動レベルで解析する。このために、味覚嫌悪反応実験を用いて、条件付け刺激にも用いられた味覚物質を口腔内に導入し、嫌悪反応が誘発されるまでの潜時を測定した。リガンドとして、フェニルアセトアルデヒドを用いて飽和濃度である0.2%溶液をCSにした場合、味覚嫌悪反応の潜時の顕著な短縮は認められなかった。もうひとつのリガンドであるフェニル酢酸を0.4%および0.6%溶液をCSとした応答を現在解析中である。また、今後、リガンドによって実際に脳内のノルアドレナリン分泌が増加するか否かについて、マイクロダイアリシスを用いて検討する計画である。本年度は、in vivo電気生理においてフェニル酢酸投与によりトランスジェニックマウス青斑核(LC)の神経活動の増進が誘導された。また、マイクロダイアリシスにおいて、フェニル酢酸投与により、大脳皮質ノルアドレナリン遊離レベルの増加が誘導された。さらに、味覚嫌悪反応実験を用いて、条件付け刺激にも用いられた味覚物質を口腔内に導入し、嫌悪反応が誘発されるまでの潜時を測定した。フェニル酢酸0.4%および0.6%溶液を記憶想起の直前に投与することによって、トランスジェニックマウスの味覚反応潜時の短縮が認められ、記憶想起を増強する可能性が示唆された。昆虫フェロモン受容体に対するリガンドは、フェニルアルデヒドとフェニル酢酸であるが、フェニルアセトアルデヒドは水溶液に0.2%でまでしか溶けなかった。in vitorでは、この濃度で高い反応性を示すが、in vivoではこの濃度での脳内投与では行動学的な相違を見出せなかった。

そのため、もうひとつのリガンドであるフェニル酢酸を用い、より高濃度でのレスポンスを解析する必要性が生じた。また、行動学的な解析とともに、実際のノルアドレナリン放出量が増加するか否かの解析も重要であり、マイクロダイアリシス実験の準備を行った。分子神経生物学フェニル酢酸を用い、より高濃度(0.4%, 0.6%)の溶液を脳内投与した際の味覚嫌悪反応に対するレスポンスを解析する計画である。また、マイクロダイアリシスを用いて、リガンド投与によって脳内のノルアドレナリン放出量が増加するか否かを解析する。昆虫フェロモンによってスライス実験およびin vivo電気生理実験においてイオンチャネルの応答が確認できたため。前述の理由で、行動実験とマイクロダイアリシスによる実験を行うため。特定のニューロンのフェロモンによる活性化に起因する行動変化を明らかにする。このために、トランスジェニックマウスの青斑核の活動を活性化し、味覚嫌悪条件反応の促進効果を評価する。上記の実験のため、消耗品(実験動物、試薬、器具類)を購入する。平成26年3月物品購入、平成26年4月支払いとなったため、当該年度の支出に含まれなかった。既に平成26年3月に物品購入している。
p53ドミナント・ネガティブ変異体の同定および機能解析

野生型p53発現プラスミドをHIS、URA3を利用してα接合型出芽酵母株に導入した。一方、網羅的p53ミスセンス変異ライブラリーは、a接合型出芽酵母株にEGFPレポータープラスミドと2314種類の変異p53発現プラスミドをそれぞれTRP1、LEU2を利用して導入した。Α接合型出芽酵母株と2314種類のa接合型出芽酵母株をYPDプレート上で接合したコロニーをSC-trp-leu-his-uraプレートと5-FOA含有SC-trp-leu-hisプレートそれぞれに移しコロニー形成能を観察し、ドミナント・ネガティブ変異体のスクリーニングを行った。野生型p53発現プラスミドを栄養要求性マーカーHIS、URA3を利用してα接合型出芽酵母株に導入した。一方、網羅的p53ミスセンス変異ライブラリーは、a接合型出芽酵母株YPH499に2314種類の変異TP53発現プラスミドとEGFPレポータープラスミドをそれぞれ栄養要求性マーカーLEU2、TRP1を利用して導入した。尚EGFPレポータープラスミドにはWAF1のp53応答配列を挿入してある。α接合型出芽酵母株と2314種類のYPH499株をYPDプレート上で接合した。接合したコロニーは3種類のプラスミド(野生型p53発現プラスミド、変異p53発現プラスミド、EGFPレポータープラスミド)を持つ2倍体細胞が増殖したものである。接合したコロニーをSC-trp-leu-his-uraプレートと5-FOA含有SC-trp-leu-hisプレートそれぞれに移し37°Cで48時間培養し、コロニー形成能を観察した。URA3は野生型p53発現プラスミドにおいてTP53のcDNAの下流に挿入されており、Uraは野生型p53依存性である。野生型p53がp53ドミナント・ネガティブ変異体と接合した場合には、SC-trp-leu-his-uraプレート上でコロニーの形成は抑制される。また、Ura+細胞では5-FOAが5-FUに変換するため細胞は増殖できず、5-FOA含有プレート上でドミナント・ネガティブ変異体と接合したコロニーのみが増殖するため、ドミナント・ネガティブ変異体が同定できる。このようにしてスクリーニングしたドミナント・ネガティブ変異体は哺乳類細胞内でさらに詳細に解析し、ドミナント・ネガティブ作用のメカニズムについて詳細な知見を得ることを可能にする。α接合型出芽酵母株と2314種類のYPH499株をYPDプレート上で接合したコロニーをSC-trp-1eu-his-uraプレートと5-FOA含有SC-trp-leu-hisプレートそれぞれに移し37°Cで48時間培養し、コロニー形成能を観察した。UR43は野生型p53発現プラスミドにおいてTP53のcDNAの下流に挿入されており、Uraは野生型p53依存性である。このようにしてスクリーニングしたドミナント・ネガティブ変異体を哺乳類細胞内でさらに詳細に解析するため同定したドミナント・ネガティブ変異TP53につき、哺乳類細胞用のプラスミドに導入する作業にとりかかっているところである。変異p53発現プラスミドを作成後、野生型p53発現プラスミドとルシフェラーゼレポータープラスミドと共に哺乳類細胞に共発現させルシフェリンを加えた際の発光減少の有無を確認し、酵母細胞内での現象が哺乳類細胞内でも再現されるか否かを確かめる予定である。
神経根内コンパートメント症候群に関する実験的研究

【方法】Spraguc-Dawley系雌ラット29匹(200-250g)の左第5腰神経根とその後根神経節を対象とした。全身麻酔下に左第5腰神経根とその後根神経節を露出し、尾椎間板から採取した髄核を神経根上に設置した(髄核群)。対照は、手術創部の筋を同量採取して神経根上に設置した(対照群)。各群4匹では頚動脈にカテーテルを挿入し血圧をモニターしながら、以下の実験を行った。実験1(血流):レーザー・ドップラー血流計を用いて、髄核または筋の設置前から設置後3時間(n=10)、4時間(n=8)までの後根神経節の血流の変化を計測した。実験2(内圧):マイクロピペット法(先端径4μm)を用いて、髄核(n=7)または筋(n=4)設置前と設置後3時間における後根神経節の内圧を計測した。実験1と2の計測を終了後に、神経根と後根神経節を採取して組織学的検討を行った。統計学的検討には、ANOVAとStudent's paired t-testを用いた。【結果】髄核または筋の採取、設置、および設置後の経過において血圧の明らかな変化は認められなかった。実験1(血流):髄核群では、設置後2時間経過以降に血流の減少が認められた。その減少は設置前に比べて10-20%であった(p<0.01)。一方、対照群では、血流の変化は認められなかった。実験2(内圧):設置前の内圧は、髄核群では2.6±1.2cmH20であり、対照群では2.1±0.6であった。設置後3時間の内圧は、髄核群では7.5±4.6であり、設置前の値と比較して有意に上昇していた(p<0.05)。対照群では設置後の値は2.0±0.8であり、設置前の値と比較して変化は認められなかった。組織学的には、髄核群で後根神経節内に浮腫が認められた。また、症例によりaxonやmyelinの変化が髄核群で認められた。急性神経根圧迫モデルの作製と生理学的検討雑種成犬30頭を検討の対象とした。全身麻酔下にL6とL7の椎弓骨切りを行い、第7腰神経根を出した。神経根にATS air compression systemに連結した円筒型バルーンを巻き、ATS air compression systemを用いて0mmHg(n=5)、10mmHg(n=5)、30mmHg(n=5)、50mmHg(n=5)、100mmHg(n=5)、150mmHg(n=5)の圧力を加えた。マイクロスコープ下に、圧迫部位の神経根の観察を行い、神経内毛細血管の血流が途絶する神経内膜腔圧の危険閾値を検討した。圧迫開始直前、直後、その後15分毎に圧迫部の頭尾側における神経根の血流と圧迫部を挟んだ伝導速度を測定した。圧迫時間は2時間とし、圧迫解除後の変化は1時間観察した。神経伝導速度は圧迫部の神経根を挟んだ頭尾側で神経根を刺激して腓腹筋から活動電位を導出し測定した。

その後、神経根を摘出し、Karnovsky固定、Richardson染色を用い神経根内浮腫の有無を組織学的に検討した。(結果)ATS air compression systemの圧力と神経内膜腔圧は正の相関関係を有していた。マイクロスコープ下の神経根の観察では、150mmHgの圧力で神経内毛細血管の血流は途絶した。神経伝導速度は、100mmHg以上のの圧力で他群に比し有意に低下した。【方法】Sprague-Dawley系雌ラット29匹(200-250g)の左第5腰神経根とその後根神経節を対象とした。全身麻酔下に左第5腰神経根とその後根神経節を露出し、尾椎間板から採取した髄核を神経根上に設置した(髄核群)。対照は、手術創部の筋を同量採取して神経根上に設置した(対照群)。各群4匹では頚動脈にカテーテルを挿入し血圧をモニターしながら、以下の実験を行った。実験1 (血流):レーザー・ドップラー血流計を用いて、髄核または筋の設置前から設置後3時間(n=10)、4時間(n=8)までの後根神経節の血流の変化を計測した。実験2 (内圧):マイクロピペット法(先端径4μm)を用いて、髄核(n=7)または筋(n=4)設置前と設置後3時間における後根神経節の内圧を計測した。実験1と2の計測を終了後に、神経根と後根神経節を採取して組織学的検討を行った。統計学的検討には、ANOVAとStudent's paired t-testを用いた。【結果】髄核または筋の採取、設置、および設置後の経過において血圧の明らかな変化は認められなかった。実験1(血流):髄核群では、設置後2時間経過以降に血流の減少が認められた。その減少は設置前に比べて10-20%であった(p<0.01)。一方、対照群では、血流の変化は認められなかった。実験2(内圧):設置前の内圧は、髄核群では2.6±1.2cmH20であり、対照群では2.1±0.6であった。設置後3時間の内圧は、髄核群では7.5±4.6であり、設置前の値と比較して有意に上昇していた(p<0.05)。対照群では設置後の値は2.0±0.8であり、設置前の値と比較して変化は認められなかった。組織学的には、髄核群で後根神経節内に浮腫が認められた。また、症例によりaxonやmyelinの変化が髄核群で認められた。