hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
インスタントンのモジュライ空間の幾何と表現論

特に、交叉ホモロジー群の全体の次元だけではなく、各次数の次元に意味をもたせた、いわゆるJantzen予想について、幾何学的に証明する方針をつけた。この結果は、アファイン・リー代数の場合には従来の手法では知られていなかった。コンパクト・リー群Gと、その四元数体上の表現Mが与えられたとき、物理学者は3次元のN = 4超対称性ゲージ理論とよばれる場の量子論を考え、特にそのゲージ理論のクーロン枝とよばれる、超ケーラー多様体を研究していた。しかし、その定義には、「量子補正」とよばれる数学的に厳密な取り扱いがなされていない手続きが含まれており、クーロン枝の数学的な定義は与えられていなかった。そこで、数学的に厳密な定義を与える試みを始めた。まず、複素射影直線P^1から超ケーラー商M///G (ただし、スタックμ_C^{-1}(0)//G_Cとして扱う)への、ゲージσ-模型をとり、そのモジュライ空間の、自然な消滅サイクルに係数を持つコホモロジー群を考える。この定義は、位相的場の理論に動機づけされるが、量子ヒルベルト空間として無限次元のものが出てくることが、特徴的である。しかし、これがクーロン枝の座標環になると予想されることから、当然である。その指標を計算すると、物理学者のCremonesi,Hanany and Zaffaroni [3]が与えたクーロン枝の構造環の指標を与えると主張されているモノポール公式と同じになることを証明した。予定していたKazhdan-Lusztig予想に対する新しいアプローチについての論文の執筆は、さらに遅れているが、一方で超対称性ゲージ理論のクーロン枝の立場から、今までの研究に対して新たな視点が得られた。この研究は、始めたばかりであり、理論の基礎づけに時間がかかると思われるが、比較的簡単に検証できることについては、予期した結果が得られた。特にMがN + N^*という形で与えられている場合に、ある無限次元のモジュライ空間を導入し、その同変ホモロジー群に合成積によって可換環の構造を導入し、そのスペクトラムとして、クーロン枝をアファイン多様体として定義する方法を提案した。多くの例で、物理学者が計算していたものと一致することを検証でき、この定義は正しいと確信している。物理学者のAlday-Gaiotto-立川によって、ゲージ理論とW代数との対応が発見された。これを、数学的に厳密な立場から「インスタントンの枠付きモジュライ空間の上で、同変コホモロジー群を考えると、それがW代数の表現の構造を持ち、様々なコホモロジー類が、W代数の頂点作用素などを用いて書き下される」と理解し、これに関連した研究を行った。
内因性ジギタリス様ナトリウム利尿因子の同定と本態性高血圧の成因に関する研究

本態性高血圧症の原因物質と考えられる内因性ジギタリス様物質と高血圧との関係を検討し、内因性ジギタリス様物質の部分精製と化学的性質を一部解明した。ヒト血中内因性ジギタリス様物質の測定はウワバイン免疫活性で行った。またウサギポリクロナル抗体とマウスモノクロナル抗体を作成して血中のウワバイン様免疫活性を測定した。内因性ジギタリス様物質の部分精製は本態性高血圧症患者の血漿をクロロホルム・メタノ-ル抽出し、高速液体クロマトグラフィにて精製した。本態性高血圧症患者血中にはウワバイン様免疫活性が認められた。血中ウワバイン様免疫活性は減塩食で有意に低下し、増塩食で有意に増加した。血中のウワバイン様免疫活性をCLCーCNカラム、HCGー15SHカラムなどにて部分精製し、質量分析計の結果、分子量数百の脂質であることが判明した。原発性アルドステロン症患者の術前にはウワバイン様免疫活性が検出されたが、術後には検出されなかった。抗ウワバインモノクロナル抗体はウワバイン、ジコキシン、ウワバゲニンなど(ステロイド骨格のAーBーCーD環がcisーtransーcis型)やウザリゲニン(transーtransーcis型)ともに結合活性を示し、アルドステロン、コルチゾ-ル、アンドロステロンなど(transーtransーtrans型)や胆汁酸(cisーtransーtrans型)とは全く結合しなかった。またラムノ-ス(ウワバイン糖鎖部分)、ブチロラクトン(ウワバインラクトン部分類似構造)やアラキドン酸やリノ-ル酸などの脂肪酸類、PAF等とも結合活性を示さなかった。ウワバイン様免疫活性の部分精製により、本因子の分子量が数百程度の低分子物質であり、モノクロナル抗体の特異性の結果から、本因子の構造部分にステロイド構造のBCD環の立体構造がtransーcis型の構造のみを識別し、その構造はメチル基、水酸基および水素原子が同じ方向に配位して並ぶ構造である可能性があることが明らかになった。目的:本態性高血圧症の原因物質と考えられる内因性ジギタリス様物質と高血圧との関係を検討し、内因性ジギタリス様物質の部分精製と化学的性質を一部解明した。方法:ヒト血中内因性ジギタリス様物質の測定はウワバイン免疫活性で行った。結果:本態性高血圧症患者血中にはウワバイン様免疫活性が認められた。血中のウワバイン様免疫活性をCLC-CNカラム、HCG-15SHカラムなどにて部分精製し、質量分析計の結果、分子量数百の脂質であることが判明した。抗ウワバインモノクロナル抗体はウワバイン、ジゴキシン、ウワバゲニンなど(ステロイド骨格のA-B-C-D環がcis-trans-cis型)やウザリゲニン(trans-trans-cis型)ともに結合活性を示し、アルドステロン、コルチゾ-

ル、アンドロステロンなど(trans-trans-trans型)や胆汁酸(cis-trans-trans型)とは全く結合しなかった。またラムノ-ス(ウワバイン糖鎖部分)、ブチロラクトン(ウワバインラクトン部分類似構造)やアラキドン酸やリノ-ル酸などの脂肪酸類、PAF等とも結合活性を示さなかった。考察:ウワバイン様免疫活性の部分精製により、本因子の分子量が数百程度の低分子物質であり、モノクロナル抗体の特異性の結果から、本因子の構造部分にステロイド構造のBCD環の立体構造がtrans-cis型の構造のみを識別し、その構造はメチル基、水酸基および水素原子が同じ方向に配位して並ぶ構造である可能性があることが明らかになった。本態生高血圧症例の血漿ウアバイン様ナトリウム利尿因子の精製をさらに進めるとともに、部分精製物質の性状につき検討を加えた。本態性高血圧症例の血漿クロロフォルム・メタノ-ル抽出し、抽出物をインプロパノ-ルを移動相としたシアノプロピル順相カラムにより極性に従い分離し、Na^+、K^+ーATPase抑制活性を有する分画を収集した。この分画をさらにテトラヒドロフランを移動相としたNSGー15H分子節カラムにより精製し、さらにシアノプロピル順相カラムおよびNSGー15H分子節カラムにより精製を繰り返し、比較的極性の弱い、分子量約600のほぼ単一ピ-クを得ることができた。一方ウアバインに対するモノクロナル抗体を作成し、この抗体はウアバインのCD環のtranーcis型の立体構造およびラクトン環を認識することを明らかにした。血漿より部分精製したNa^+、K^+ーATPase抑制活性を示す分画の希釈曲線はウアバインの検量線と平行したことから、本因子の構造に、メチル基、水酸基および水素原子がウアバインと同様に同方向に配位し、しかも、ラクトン環構造の一部を含める部位が存在していることが示唆された。今回の系における^3Hーウアバインのモノクロナル抗体への結合への50%抑制を示すこの分画量は200ml血漿相当量であった。さらにこのモノクロナル抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィ-を作成し、この分画の最終精製を行なっている。また血漿中ウアバイン様ナトリウム利尿因子の濃度測定のため、このモノクロナル抗体を用いた免疫測定法を作成中である。
アルコール類の脱水型アリル化触媒の開発と応用

非対称なエーテル化合物合成は、現在もなお、19世紀中ごろに確立された手法に基づいている。原子効率は低く、廃棄物量も多い。環境問題が顕在化する中で、アルコールからの脱水型エーテル合成が理想であることは言うまでもない。この現状を鑑み、ROH+R'OH→ROR'+H_2Oの触媒化に挑戦した。交差性を高めるため一方のアルコールをアリルアルコールとし、無溶媒で触媒以外の添加剤を一切加えることなくアリルエーテルを脱水的に合成する新しい方法論の開拓を目的とした。当研究グループで開発されたアリルエーテル結合切断触媒に注目し、その機構的考察から逆反応化の可能性を引き出した。その結果、カチオン性CpRu/2-キノリンカルボン酸触媒を0.0005モル量用いて、アルコールとアリルアルコールを1:1に混合するだけで最高97%の収率で対応するアリルエーテルに変換できることを見いだした。基質一般性、化学選択性も高い。Eファクタ、原子効率、操作性のいずれの観点からも従来法を優る。本触媒の反応機構に関し、各種分光光学実験、理論計算を用いて検証した。本反応がπ-アリル機構で進行し、Ru(IV)-π-アリル種が休止状態にあることを明確に示した。アリル基へのアルコール基質の求核攻撃毅階にエネルギー障壁がある。発生するRu(II)はアリルアルコールと直ちに酸化的付加反応して脱水的にRu(IV)-π-アリル種を再生する。2-キノリンカルボン酸のσ供与性sp^2窒素原子とモノアニオン性Cp基が中心金属へ配位することによりRu(II)の求核性が向上し、カルボン酸のプロトンがアリルアルコールのヒドキシ基酸素原子と水素結合ネットワークを形成することにより求電子性が向上する。この相乗効果がπ-アリル錯体形成の根幹にあり、「レドックス介在型ドナー・アクセプター二官能性触媒」概念の正当性を実証することができた。アリルエーテルは1,3水素移動反応、[3.3]シグマトロピー転位、多量化反応等の有機反応に用いられる重要な物質群である。アリル基の構造の単純性、酸や塩基に対する安定性、遷移金属に対する潜在的高反応性から、ヒドロキシ基の保護体としても注目される。アルコールの効率的アリル化が必要となる理由である。本研究では、当研究室で確立したCpRu/2-キノリンカルボン酸混合触媒によるアリルアルコール類の脱水型触媒的アリル化反応において、以下の項目に焦点を置いて更なる展開をはかる。(a)多官能性有用物質合成への応用、(b)分子間アリル化反応から分子内アリル化反応への展開、(c)触媒的不斉アリル化反応への展開、(d)機構解明研究、を実施し、この新反応の合成的有用性を高める。本年は(d)に関し、触媒探索の課程で得た分子触媒設計のための新たな指導原理「レドックス介在型ドナー・アクセプター二官能性触媒(RDACat)」を提唱、その正当性を詳細に検証した。速度論実験、速度式解析により、本反応の律速が、アルコールの求核攻撃段階である事が分かった。反応の基質およびルテニウムの濃度に対する次数はそれぞれ0次、1次となる。核磁気共鳴分光実験、X線結晶構造解析から、触媒サイクル中の中間体である、endo-[CpRuIV(π-C_3H_5)(C_9H_6NCOO)]PF_6の、溶液および結晶中での構造を確認した。触媒構造-活性相関、分子軌道計算をもとに、RDACatの正当性を確認した。モノアニオン性三座配位子Cpとσドナー性の高いsp^2N原子がRu(II)に配位して、その求核性が向上する。その他、カルボキシラート配位子の電子非局在化能や、低LUMOエネルギー準位のキノリン骨格が還元的脱離プロセスを円滑化することで循環性獲得に重要な役割を演じていると考えられる。

発生するRu(II)はアリルアルコールと直ちに酸化的付加反応して脱水的にRu(IV)-π-アリル種を再生する。2-キノリンカルボン酸のσ供与性sp^2窒素原子とモノアニオン性Cp基が中心金属へ配位することによりRu(II)の求核性が向上し、カルボン酸のプロトンがアリルアルコールのヒドキシ基酸素原子と水素結合ネットワークを形成することにより求電子性が向上する。この相乗効果がπ-アリル錯体形成の根幹にあり、「レドックス介在型ドナー・アクセプター二官能性触媒」概念の正当性を実証することができた。
東北、北海道における鉄技術の復元とその伝播

本報告書は5章から成る。以下に各章ごとに概要を述べる。第1章は、本研究の目的と研究にいたる経緯などを述べ、研究地域選択に当り、事前調査の状況や自然環境を考慮したいきさつを概略した。東北、北海道の両地域において、鉄を軸にして文化的接触関係を解明しようと試みた研究であるため、広範囲な地域から、発掘調査地点を選択するのは難しいことであった。北海道では擦文時代の集落趾が海岸沿いに分布する状況から、十勝の太平洋側の両部海岸沿いの地域に注目し探査した。立地条件が適当と思われる大樹町のホロカヤントウ周辺の遺跡群に焦点を定め、予備調査を行った後、浜大樹2遺跡を発掘調査の対象とした。測量調査の後、竪穴住居1基のトレンチ調査を開始した(詳細は第2章)。東北地方では津軽半島の市浦村、十三湖の北側、岩木川の河口に位置する唐川城跡から発見された炉跡の発掘調査を行った。十三湖は日本海をめぐる交流の拠点としても重要な位置にあり、その後背地の岩木山山麓一帯は、鉄関連の炉跡が多く発見され、鉄生産の拠点と考えられる。東北北部の鉄技術の解明のためには重要な地域である(詳細は第3章)。第2章は、浜大樹2遺跡の測量調査、トレンチ発掘調査の結果について概略する。竪穴遺構は完掘されていないが、東北地方との接触関係のみならず、さらに北方の千島方面との接触関係をも考慮する必要のある事が判明した。今後、将来の継続調査を見通して、オホーツク文化の住居も混在しているのか検討の必要がある。住居内炭化物の同定を依頼した(詳細5章)。第3章は、唐川城跡遺跡の鉄関連炉の発掘調査について概略する。調査した炉は、精錬炉の可能性が大きい。炉の開口部炉底に、浅い皿状の窪みがあり、流出した生成物を炉底に受ける構造になっており、溶けた銑鉄を空気酸化によって脱炭するという操作が行われていたと考えられる。分析結果(詳細4章)からも銑鉄の流通に関係する生産活動が唐川城跡でも行われていたと考えることは十分可能なである。第4章は、唐川城跡出土の鉄滓、炉壁材の分析結果を示し、そこから炉の機能を推察し報告する。第5章は、浜大樹遺跡、唐川城跡両遺跡出土の炭化物の同定から北海道、東北の古環境の復元を試みた。本年度実施した予備調査は、北海道と東北を関係づけることができ、北海道への伝播に関連ある地域、具体的な証拠がえられる可能性がある地域を選定した。東北地方での鉄関連遺構が出土した遺跡も探査した。東北地方で新たに発見され竪型炉は青森埋蔵で発掘している朝日山遺跡と岩手県山田町の後藤遺跡で確認され実見した。また東町の明美遺跡も興味ある鉄製品が発見され、発掘が必要な遺跡と考える。

北海道では擦文時代の集落趾が海岸沿いに分布する状況から、海岸部から上陸して内陸部に浸入していくような状況を考え、上陸しやすいような立地をそなえた十勝の太平洋側の南部海岸沿いの地域に注目し探査した。現在の十勝川河口の十勝太若月遺跡からはすでに擦文時代住居趾から鍛冶炉に使用される羽口が見つかっている。しかし十勝の南部太平洋海岸地域はあまり調査がおこなわれていない。そこで太平洋海岸南部沿いの地域で、また立地条件が適当と思われる大樹町のホロカヤント遺跡群に焦点を定め、現地で予備調査を行った。当該遺跡群は6ケ所の擦文時代の竪穴住居群があり、総面積約17000m2ある。竪穴数だけでも推定150くらいはあるとされている。このうちの1ケ所である十勝ホロカヤント-竪穴群は昭和37年に8日間の簡単な発掘調査が行われているが詳細がよくわからない。このため現況を確認調査し、4軒の発掘された竪穴を確認した。その他の竪穴でも盗掘が行われた可能性が見受けられた。さらに残り5ケ所の包蔵地として記載されている晩成1、晩成2、晩成3各遺跡の確認調査をおこなった。晩成2遺跡については、竪穴1軒近辺に擦文土器片が散在し表採を行った。黒曜石製の剥片も採集した。時期としては複合している可能性がある。来年度はこのホロカヤント遺跡群を発掘調査し、具体的な証拠をえたいと考える。さらに浜大樹1、浜大樹2遺跡を調査したが、確認できなかったので再確認調査の必要がある。本年度は十勝太平洋岸の竪穴住居の試掘調査と青森県津軽地方で11世紀と思われる鉄関連炉の発掘調査を実施した。昨年予備調査を行った北海道十勝の南部、大平洋岸地域の擦文時代の竪穴住居群のうち、分布調査の結果から遺跡群の南端部に位置する浜大樹2遺跡の竪穴群を発掘することにした。ここは未踏調査地で周囲の環境は海岸段丘上の牧草地、孤立地帯なため発掘環境は困難な場所であるが、竪穴の分布範囲を確認する必要があった。将来の継続調査を見通して発掘可能な住居址を1軒選択し、その位置を含む範囲で測量調査を行い、グリッド設定をした。発掘した竪穴はかなり大型の住居であり、窪地面積が広く、深いため今年度は南北の試掘トレンチを入れるにとどまった。出土遺物は古手の擦文土器の底部が出土した。さらに今回の調査中、近くからオホーツク土器片が採集された。近年千歳市から完形のオホーツク式土器が出土し、オホーツク文化の道内分布域が再検討されており、興味深い資料である。当地の竪穴住居群の中にも、深い竪穴があり、これが当地の擦文の住居の特徴なのか、又はオホーツク文化の住居も混在しているのか検討の必要がある。住居内炭化物の年代測定を依頼してある。東北地方の調査では、青森県市浦村の唐川城跡で鉄関連炉を発掘調査した.鉄関連炉が発見された唐川城跡は、津軽地方の北部に位置し、津軽平野を貫流する岩木川の河口にある十三湖の北側の山丘上に立地する。十三湖は日本海沿岸の海上交易や岩木川水系の背後にある平野部を考慮すると、交易の拠点として重要な位置にある。北海道への鉄製品や鉄技術の流入の問題で、鉄関連の遺跡から擦文土器が出土していることも注目でき、今回も擦文土器片が出土した。北海道への鉄製品や鉄関連技術の伝播は擦文文化期において鉄製品が増加することから10世紀頃と考えられているが、この時期の東北地方北部との文化的接触の実体を明らかにするためには、どうしても東北地方北部の鉄生産の様相、鉄技術を解明する必要がある。津軽地方一帯は10世紀前後の鉄関連炉が多く発見され、古代の鉄生産を解明するのには重要な地域で、ここがつかめれば北海道への見通しもかなり掴めると確信した。鉄滓の分析、炭化物の分析、年代測定などを依頼してある。
リン酸化によるRB蛋白質とp53の生理機能の制御

G1/S移行期には、サイクリンD1-Cdk4、サイクリンE-Cdk2の順で、少なくと2種類のキナーゼがRB蛋白質のリン酸化を行うと示唆されている。しかし、なぜ何種類ものキナーゼが関与するのかということと、それらがどういうように使い分けされているのかということは、ほとんどわかっていない。本研究はそれを解明することを目的とした。RB蛋白質上には約13ケ所のリン酸化部位があるが、われわれにはこれらの部位を特異的に認識する抗体をほぼすべて作製してきたので、これを積極的に活用した。そして、次の諸点を明らかにした。1)RB蛋白質上のCdk4特異的部位がリン酸化されているとE2F-1との複合体形成が見られないのに対して、Cdk2特異的部位がリン酸化されていても複合体は形成される。2)RB蛋白質のC末端側には、リン酸化に際してCdk2が先ず結合する部位が存在する。一方、p53上にも約13ケ所のリン酸化部位がある。これらのリン酸化の生理的意義を研究するために、われわれはこれらの部位を特異的に認識する抗体をほぼすべて作製してきた。そして、すでに、Ser15のリン酸化がp53の活性化に重要であることを明らかにしてきたが、他の部位についてもこれらの抗体を用いて意義を明らかにすることを試みた。1)Ser20のリン酸化もp53の活性化に重要であり、かつ、そのリン酸化はDNA傷害や複製のチェックポイントに重要な働きをするChk2とChk1らしい。2)カフェインが放射線に対する感受性を高めることは以前から知られていたが、これはATMとATRのキナーゼ活性を阻害することによって引き起こすらしいことを明らかにした。3)p53のSer46のリン酸化がp53によるアポトーシス誘導能を制御していることを見いだした。1.RB蛋白質上の14カ所すべての推定リン酸化部位に対応する抗体を、化学合成したペプチドを抗原として用いて作製した。Ser780とSer807についてはモノクローナル抗体もできた。2.大腸菌で発現させて精製したRB蛋白質を、精製したサイクリンD1-Cdk4、サイクリンE-Cdk2、サイクリンA-Cdk2あるいはサイクリンB-Cdc2でリン酸化した後、これらのリン酸化部位特異的抗体によるウエスタンブロッティングにかけて解析した結果、昨年すでに明らかにしたSer780のほかに、Ser795とSer807とは、サイクリンD1-Cdk4でよくリン酸化されるが他のCdk類ではほとんどリン酸化されない部位であることがわかった。これとは逆に、Thr356、Ser612、Thr821やThr826はCdk2ではよくリン酸化されるが、サイクリンD1-Cdk4ではほとんどされない部位であることがわかった。推定リン酸化部位を含む非リン酸化ペプチドをこれらのCdk類でリン酸化する実験によっても同様の特異性が得られた。そして、同調化した細胞の抽出物をこれらのリン酸化部位特異的抗体によるウエスタンブロッティングにかけて解析した結果、in vivoでも同様な特異性があることが確認できた。3.p53のほぼすべての予想されるリン酸化部位(約10カ所)と2カ所のアセチル化部位を特異的に認識する抗体が作製できた。4.p53は普通の細胞ではごく微量しか存在しないけれども、ガンマ線や化学発癌物質などでDNAにダメ-ジを受けると増加してきて、転写活性化能ももつようになる。その際、mRNAは増加しない。そのメカニズムを初めて解明した。即ち、DNAダメ-ジによってp53のN末端から15番目にあるセリン残基のリン酸化が誘導されて、MDM2蛋白質がp53に結合しなくなり、その結果、安定化されて、転写活性化能も高まることを明らかにした。1. p53上の推定されるリン酸化部位(約13カ所)を特異的に認識する抗体をほぼすべて作製した。C末端側の2カ所のアセチル化部位に対する抗体も作製した。2. Ataxia telangiectaciaの原因遺伝子であるATM蛋白質がプロテインキナーゼの活性をもち、しかも、p53のSer15を直接にリン酸化することを証明した。3. ATMのファミリーであるATRについても同様のことを見い出した。4. DNAダメージ後に、p53のSer20,46のリン酸化やLys373,382のアセチル化が起きることも見い出した。5. N末端側のSer15,20,33がin vivoでリン酸化されるためには、C末端側にあるテトラマー形成ドメインが必要であることを見つけた。6.一方、RB蛋白質上にある約13ケ所のリン酸化部位を認識する抗体をほぼすべて作製したが、それを用いて、Cdk4によるリン酸化部位とCdk2によるリン酸化部位とを区別できることを示した。7.さらに、これらを用いて、RB蛋白質のC末端側には、リン酸化に際してCdk2が先ず結合する部位が存在することも明らかにした。

RB蛋白質上には約13ケ所のリン酸化部位があるが、われわれにはこれらの部位を特異的に認識する抗体をほぼすべて作製してきたので、これを積極的に活用した。そして、次の諸点を明らかにした。1)RB蛋白質上のCdk4特異的部位がリン酸化されているとE2F-1との複合体形成が見られないのに対して、Cdk2特異的部位がリン酸化されていても複合体は形成される。2)RB蛋白質のC末端側には、リン酸化に際してCdk2が先ず結合する部位が存在する。一方、p53上にも約13ケ所のリン酸化部位がある。これらのリン酸化の生理的意義を研究するために、われわれはこれらの部位を特異的に認識する抗体をほぼすべて作製してきた。そして、すでに、Ser15のリン酸化がp53の活性化に重要であることを明らかにしてきたが、他の部位についてもこれらの抗体を用いて意義を明らかにすることを試みた。1)Ser20のリン酸化もp53の活性化に重要であり、かつ、そのリン酸化はDNA傷害や複製のチェックポイントに重要な働きをするChk2とChk1らしい。2)カフェインが放射線に対する感受性を高めることは以前から知られていたが、これはATMとATRのキナーゼ活性を阻害することによって引き起こすらしいことを明らかにした。3)p53のSer46のリン酸化がp53によるアポトーシス誘導能を制御していることを見いだした。
アメリカ大統領による法に依拠しない法執行能力の獲得：覚書という大統領令を中心に

アメリカ大統領は様々な形式で行政組織に命令を下す。その総称は「大統領令」と呼ばれる。典型は、具体的な法律を明記して行政組織に法執行を命じる行政命令(executive order)だが、オバマ政権とトランプ政権では大統領覚書(presidential memorandum)が増加している。覚書では根拠法は示さなくともよいとされる。さらに覚書の中には、大統領に法律上の権限がないはずの事柄について命じるものもある。なぜ、どのようにアメリカ大統領は法律に依拠しない形で命令を下すのだろうか。そして、憲法上の抑制と均衡から逸脱するように見える大統領の行動に、他の部局はどのように対抗しうるのだろうか。
オストメイトと配偶者の性機能に関する縦断研究-夫婦の相関と性差に着目して

ストーマ保有者(オストメイト)の性的問題や医療現場における性の相談の実態を把握する目的で、以下の3点を実施した。(1)女性性機能尺度(Female Sexual Function Index : FSFI)日本語版の作成。(2)ET/WOCナース対象の質問紙調査。看護師の約6割が、主に男性患者から性について種々の相談を受けていたが、女性患者や配偶者からの相談が少なかった。(3)ストーマケアを担当する医師対象の質問紙調査。医師の半数強が性相談を受けていた。術前説明では、患者属性や臨床的条件によって性的問題の説明行動が変化していた。平成18年度は、以下の3点につき研究を実施した。1.女性用性機能尺度日本語版妥当性の検証アメリカで開発された女性用性機能尺度(FSFI)の日本語版標準化作業については、平成17年度時点ですでに乳がん患者を対象としたプレテストを実施して言語的妥当性および信頼性を確認していた。18年度は、特に妥当性を検証する目的で、健常女性サンプル120名を用いた解析を実施し、本尺度の妥当性(因子的妥当性、判別的妥当性、併存的妥当性)を確認した。因子的妥当性については因子分析を、判別的妥当性については閉経前後の対象者間のFSFI得点の比較を、併存的妥当性については「閉経周辺期女性の自覚症状測定尺度」の性機能症状因子6項目(中塚ら,2005)とFSFI得点の比較、および対象者の主観的性的満足度(Visual Analog scale)とFSFI得点の比較を実施した。いずれも高い妥当性が検証された。FSFI日本語版は、19年度以降に実施する質問紙調査で用いる予定である。2.関連文献および資料の収集オストメイト男女のQOL、心理的適応、性機能障害、ボディイメージ、カップル関係全般に関する学術論文を収集した。加えて、国内外の関連支援団体が作成する患者用パンフレットおよび医療従事者向けの教材の収集を行った。3.オストメイトと配偶者を対象とする面接調査の準備上記文献レビューに基づき、オストメイト自身および配偶者に対する半構想化面接で用いるインタビューガイドを作成した。インタビューガイドには、患者と配偶者それぞれが認識する生活上の困難、性行為における問題、問題への対処方策、カップル関係全般の変化、医療者に望む支援などが含まれた。平成19年度は、以下の2点について研究を実施した。日本ET/WOC協会会員看護師約570名を対象に、郵送無記名自記式調査を実施(回収率35%)。ET/WOCナースが臨床現場でストーマ保有者から性相談を受ける頻度、性相談の内容、ストーマ保有者の性に関する情報ニーズ、仮想質問への対応(自由記述)などについて質問した。性相談の具体的内容の詳細は従来ほとんど明らかにされていなかったため、今回の調査内容は今後の支援の在り方を検討する上での基礎資料として活用が期待される。現状では特に男性成人患者からの性相談が多く、ET/WOCナースが対応に苦慮するケースも認められた。またET/WOCナースの間で性に関する情報ニーズが高いことが明らかになり、情報ニーズ内容の分析に基づき、ET/WOCナースに向けた性相談教材のコンテンツを検討した。2.若年ストーマ保有者が経験する困難(性行為、カップル関係について)の実態把握調査の準備若年女性ストーマ保有者の自助グループの協力を得て、若年女性ストーマ保有者が経験する性行為やカップル関係の困難の詳細を把握する調査の具体的内容と実施方法について検討した。3.関連文献および資料の収集18年度に続き、ストーマ保有者男女のQOL、心理的適応、性機能障害、ボディイメージ、カップル関係全般に関する学術論文を収集した。調査Aストーマ保有者の診療を担当する医師への質問紙調査日本ストーマ・排泄リハビリテーション学会に所属する医師全員516名を対象として、無記名郵送自記式質問紙調査を実施(有効回答率36.1%)。医師がストーマ保有者から性相談を受ける頻度と相談内容、性機能障害に関する術前説明の実態、ストーマ保有者の性に関する態度と情報ニーズなどについて質問した。全体の51%が過去に性相談を受け、相談者は男性成人患者が多かった。ストーマ造設による性機能障害の可能性を術前に患者全員に説明する医師は43%に留まり、医師の説明行動は患者の性別・家族構成・臨床的条件など複数の要因に影響されることが明らかになった。「性相談も医師の仕事」とする回答は約9割にのぼり、性に関する医師の情報ニーズが高いこと、さらに、医師が知りたい性関連情報の具体的内容も明らかになった。本調査の結果は、前年度に実施したET/WOCナース調査の結果とあわせ、医療者向けの教材や研修会開発への活用が期待できる。

また臨床現場における医師と看護師の役割分担の検討においても重要な基礎資料となる。調査B若年女性ストーマ保有者調査前年度に引き続き、若年女性ストーマ保有者団体の協力を得て、資料の収集と性関連問題に関するヒアリングを実施。当初は郵送自記式質問紙調査を準備していたが、ヒアリングにより若年女性ストーマ保有者の個人属性による性的困難のバリエーションが極めて大きいことが明らかになり、質問紙の設問項目の再検討を余儀なくされた。今後も継続検討する予定である。若年ストーマ保有者の性的困難に関する国内外の資料収集およびヒアリングの知見は、ライフステージにあわせた支援を構築する上で重要な資料となる。
再生/細胞治療用血液細胞のスフェロイド形成による低傷害・高効率遺伝子導入法の開発

樹状細胞へのEGFP遺伝子組換えアデノウイルスベクターを介した遺伝子導入モデルを用いて、従来の遺伝子導入方法における効率の低さ、あるいは細胞への傷害性の問題を回避できるスフェロイド形成を利用した遺伝子導入法を開発した。これにより、スフェロイド形成の利用が再生/細胞治療用血液細胞への新たな低傷害・高効率遺伝子導入法となり得ることを示した。治療用ex vivo遺伝子導入細胞の製造には、高い遺伝子導入効率と低い細胞傷害性を有する遺伝子導入法が不可欠である。アデノウイルスベクターはこれらの特長を備えたベクターであるが、吸着受容体発現の乏しい血液細胞に対する効力は十分とはいえない。この問題点を解決し、かつ、それがベクターの改変を必要としない手法であれば、その応用性は極めて高い。そこで、本研究においては細胞塊(スフェロイド)細胞塊形成によって細胞単体では発揮されていない接着因子を活性化し、侵入受容体として機能させる可能性を検討し、スフェロイド形成を利用した再生/細胞治療用血液細胞への低傷害・高効率遺伝子導入法を開発することを目的とする。はじめに、ex vivo遺伝子導入細胞としてヒト末梢血単球由来樹状細胞を用いて、樹状細胞モデルによるスフェロイド形成システムの構築を行った。そこで、複数の形成法を試行し、細胞塊の三次元的大きさ・数の決定・細胞表面抗原の発現に関わる培養環境因子の抽出を行った後、EGFP遺伝子組換えアデノウイルスベクターを介した遺伝子導入にて、遺伝子導入効率/遺伝子発現強度、および細胞生存率を測定し、手法の最適化検討を行った。その結果、樹状細胞モデルでは低接着加工処理培養容器、U底、回転振盪の併用は、接着加工処理、F底、回転振盪なしの場合よりも効果的にスフェロイド形成が行われ、かつ、より少ないウイルスベクター粒子数で高い発現が見られることが確認された。このことから、スフェロイド形成の利用が再生/細胞治療用血液細胞への新たな低傷害・高効率遺伝子導入法となり得ることが示された。
蝸電図を用いた蝸牛における時間情報の研究

従来から内耳機能の測定法として行われていた蝸電図を用いて,語音をデジタル処理した検査音を刺激音とすることにより,ヒトの蝸牛(内耳)におけるの語音に対する一次聴神経の発火パターンの総和(action potential=AP)を観察することで時間情報を評価し,これまで全く研究されていないヒト蝸牛における語音の時間情報を初めて明らかにした.この方法では正常耳で母音の時間情報ほ基本周波数に一致するような強いAPとして観察され、異なる母音同士野の相違は確認、できなかったが、子音の時間情報は音圧レベルの小さい破裂音でも強いAPを観察するなど音声波形・ソナグラムなどとは異なった情報がえられることがわかった。さらに内耳性難聴耳では正常耳に比較し、母音の時間情報の変化より子音の時間情報の変化がより顕著に出現し、内耳性難聴者における子音弁別能の低下するという臨床上これまでよく知られた現象の一因が明らかにされた。また、これらの結果をぶまえ内耳性難聴者における聴力改善を目指した音声の増幅法(周波数情報はそのままで時間情報を増幅)を開発した。本方法による補聴器を作成し、従来の補聴器では語音弁別の改善を見なかったものでも語音弁別能が改善する症例を確認した。本圧縮法は、雑音下でも音声の識別がこれまでの補聴器より容易でfittingがほとんど不要で簡便に調節できる利点があることから医療機器への応用だけでなく人工内耳・電話器など幅広い応用が可能な方法である。言語の内耳での時間情報処理を調べるため,語音刺激による蝸電図を測定した.内耳性難聴者に対し有性子音を含むCV音節[ma][ba][da]を刺激音とする語音蝸電図を測定すると正常耳で認められる,破裂部の強いCAPが認められなかった.また,時間情報を強調するべく開発した時間窓ごとの音声圧縮変換(TD-1)によって上記CV音節を変換した刺激音で破裂部などの特徴的なCAPが認められるようになった.このことから内耳性難聴者では時間情報の面からも正常耳と異なる情報が中枢に向け送られていることが明らかになり,時間情報を強調する音声圧縮変換で変換すると内耳性難聴者でも正常耳の時間パターンでCAPが観察され,内耳からの出力が改善されたことを客観的に判断することができた.母音[a][I][u][e][o]を刺激音とした語音蝸電図では刺激音毎のCAPの違いは認められず,母音については時間情報の果たす役割は子音に比べ小さいであろうことが客観的に観察することができた.また,われわれはそれまで論争に決着がついていなかった複合音で聞こえるlow-pitchの原因も内耳で音声処理の特徴からくるものと考え,4000Hzと6000Hzを中心とした位相差100Hz600Hzのさまざまな複合音を作成し,正常耳で蝸電図を記録した.その結果,位相差に一致したCAPが出現する場合に聴覚心理学的にlow-pitchも聴取でき,CAPの出現しない場合には聴取できなかった.したがって,複合音におけるlow-pitchの聴取は内耳においてCAPの発生によるものであることがわかった.従来から内耳機能の測定法として行われていた蝸電図を用いて,語音をデジタル処理した検査音を刺激音とすることにより,ヒトの蝸牛(内耳)におけるの語音に対する一次聴神経の発火パターンの総和(action potential=AP)を観察することで時間情報を評価し,これまで全く研究されていないヒト蝸牛における語音の時間情報を初めて明らかにした.この方法では正常耳で母音の時間情報ほ基本周波数に一致するような強いAPとして観察され、異なる母音同士野の相違は確認、できなかったが、子音の時間情報は音圧レベルの小さい破裂音でも強いAPを観察するなど音声波形・ソナグラムなどとは異なった情報がえられることがわかった。
骨形成再現に向けた旋回培養法による骨オルガノイド大量作製及び新たな活用法構築

近年、様々な細胞を利用して実際の臓器の持つ機能を再現できる3次元構造物であるオルガノイド(Organoid)を用いた基礎研究、発生生物学、疾患モデルとしての応用が活発に行われている。しかし、未だに骨細胞の特性また骨形成を再現できるin vitroモデルは報告されていない。申請者は旋回培養法にてiPS細胞を用いた骨オルガノイドの作製法を確立し、実験管内での骨形成及び骨系疾患に対する薬剤スクリーニング、また骨疾患iPS細胞を用いたin vitro疾患モデルとしての活用が期待される。さらに骨オルガノイドを骨形成不全症モデルに移植し、再生医療への有用性を明確にする。
電磁石駆動式人工心臓の研究

人工心臓駆動装置は、電磁石の可動鉄心の動きを、リンク機構により拡大し、ディカップリングばねを介してリテイナープレートに伝達し、このリテイナープレートで血液室のダイアフラムを動かし、血液を拍出する方式とした。電磁石設計用のCAEプログラムを開発した。これにより、電磁石の印加電流をパラメータとしたストローク・吸引力特性を求めることができるようになった。また、伝達機構用CAEプログラムと血液ポンプ・生体循環系シミュレーションプログラムを開発した。これらのプログラムを統合し、コンピュータシミュレーションを行うことで、系全体の動特性を求めながら、電磁石駆動式人工心臓の設計を行い、チタン合金を用いて試作した。電磁石材として、スリーナインの純度を持つ電磁軟鉄を選択した。このため、飽和磁束密度は2〔T〕以上の値が得られたが、強い磁気余効のため、磁気的立ち上がり特性が大幅に劣化した。試作した人工心臓ポンプ血液循環系シミュレータに接続し、出力特性試験を行った。その結果,i)チタン合金で製作したため、加工精度を十分維持することができず、各部で大きな摩擦による損失が生じる。ii)電磁石のギャップ管理を正確に行うことができず、多くの電流を消費してしまう、iii)ラッチも確実に行うことができなかったため、一旦ばねに貯えた機械エネルギーを無駄に放出してしまう,などのことが明らかとなった。以上の原因から、電磁石駆動装置のエネルギー変換効率は、初期に意図していた値より大幅に低下してしまった。これらの結果を十分検討し、今後体内植込み可能な電磁石駆動式人工心臓システムを開発するために必要な、CAEプログラムに改良を加えた。また、できるだけエネルギー伝達機構を簡素化することが重要であるとの見解を得たことから、これに沿ったあらたな電磁石駆動方式を提案することができた。
プロフィラグリンのプロセシングにおけるC末領域の機能解析とガレクチン７の共同作用

申請者は、プロフィラグリンのC末端領域に着目し、このC末ペプチドがプロフィラグリンのプロセシングに影響を及ぼす重要なドメインであると仮定し研究を行った。さらに、申請者らの以前の研究データからガレクチン7とC末端領域との関わりにも注目した。フィラグリンは、前駆体であるプロフィラグリンが分解されて初めて表皮バリア機能としての役目を果たす。アトピー性皮膚炎では、プロフィラグリンのプロセシングが正常に行われていない可能性が示唆されており、このことが、バリア機能異常に影響を及ぼすと考えられる。従って、本研究は、治療の基盤を創出する上で極めて重要である。申請者はこれまでに、CMVプロモータ制御下で3種類のフィラグリンC末端領域(野生型、変異型、C末端欠損型)発現ベクターを構築した。これらのベクターをCOS-7細胞へ導入し、mRNAおよび蛋白の発現を確認した。その結果、それぞれのベクター由来のmRNAおよび蛋白の発現を確認することが出来た。また、発現量に差が生じることはなかった。従って、C末端領域が何らかの機能を有する可能性が示唆された。
多様体の幾何学的構造を保つ自己同型群の研究

本研究は可微分多様体の微分同相群、Lipschitz同相群、可微分G-多様体の同変微分同相群、更に曲面上の擬アノソフ同相群の研究を行い以下のような研究成果を得た。1.可微分多様体Mの恒等写像とイソトピックであるコンパクトな台をもつMの微分同相全体のなす群D(M)はその交換子群と一致して、完全群であることが良く知られているが、Mが境界を持つ場合もMの次元が2次元以上の場合に同様なことが成立することを証明した。この結果を用いるとHirzebruch-Mayer O(n)-多様体Mに対してコンパクトな台をもち恒等写像とG-イソトピックな同変微分同相群D_G(M)が完全群であることを示すことができる。また葉層構造を保つ多様体の場合にも応用される。2.有限群Gの表現空間をVとする。Sternbergの線形化定理とTsuboiによる葉層層構造の葉を保つ微分同相群が完全なことを用いてホモロジー群H_1(D_G(V))を決定した。またこの結果を用いて微分軌道体Mに対してH_1(D(M))も計算できることを示した。3.モジュラー群Γ=SL(2,Z)が上半平面Hにメビウス変換として作用するとき、軌道空間H/Γに対してH_1(D(H/Γ))はΓの双曲的固定点対応する特異点の情報を記述していることを示した。次にHに尖点を付け加えた空間H^*の軌道空間を考察し、H_1(D(H^*/Γ))が双曲的固定点と尖点情報を記述していることを示した。この方法は更にフックス群の場合に拡張できることも証明した。4.種数gの有向閉曲面上の擬アノソフ同相写像に対する拡大度(dilatation)の最小値を決定する問題は、基本的かつ未解決である。これまでに知られている擬アノソフ同相写像の構成方法に関して、各種数における最小値を上から評価する重要な例を、懸垂アノソフ流のバーコフ切断を調べることにより発見した。5.当科学研究費も用いて国内外の微分同相群の研究を活発に行っている研究者による「微分同相群と関連分野」研究集会を開催し多くの成果発表および研究交流が行われた。Thurstonにより境界をもたない可微分多様体Mの恒等写像とイソトピックな可微分同相群D(M)はその交換子群と一致して、完全群であることが証明されて良く知られている。境界を持つ場合はFukuiによりMの次元が1であるとき、D(M)は完全群ではなくその1次元ホモロジー群が求められている。今年度は最初に境界をもつ可微分多様体Mで次元が2以上の場合にD(M)の完全性を研究した。この問題については、Sternbergの定理とTsuboiによる葉を保つ葉層構造の微分同相群が完全群であることを用いて解決した。この結果を用いるとHirzebruch-Mayer O(n)-多様体Mに対して恒等写像とG-イソトピックな同変微分同相群D_G(M)が完全群であることを示すことができる。

次に有限群Gの表現空間Vについて、D_G(V)の1次元ホモロジー群を研究した。この問題についても上記のSternbergの定理、Tsuboiの葉層構造についての結果がG作用を持つ場合も成立することを調べて、D_G(V)の1次元ホモロジー群を完全に決定した。この結果は可微分G-多様体の同変微分同相群、および可微分軌道体Mについても適用されてそれぞれD_GM)、D(M)の1次元ホモロジー群を決定することができる。またこの結果はコンパクトハウスドルフ葉層構造の場合にも適用できて、葉層構造を保つ微分同相群の1次元ホモロジー群を決定することができる。更にこの結果は離散群作用をもつ多様体Mについて、その軌道空間を考察して、Mの主要な不変量との関連があることが示される。この方向については17年度に研究を進める予定である。上記で得られた結果は今年度国内、国外の多くの研究集会、国際会議で発表を行った。また論文として発表する予定である。本研究は可微分多様体の微分同相群、Lipschitz同相群、可微分G-多様体の同変微分同相群、更に曲面上の擬アノソフ同相群の研究を行うことが目的である。平成17年度は以下のような研究を行った。1)これまでに有限群Gの表現空間.Vに対して、コンパクトな台をもち恒等写像とイソトピックなVの同変微分同相全体のなす群D_G(V)の1次元ホモロジー群H_1(D_G(V))を求めて、その結果を用いて以下のことを導いた.・可微分G-多様体Mに対してH_1(D_G(M))を決定・可微分軌道体Mに対してH_1(D(M))を決定これらの結果と方法を用いてモジュラー群の場合に考察した。即ちΓ=SL(2,Z)が上半平面Hにメビウス変換として作用するときを考える。このときその軌道空間H/Γに対してH_1(D(H/Γ))はΓの双曲的固定点対応する特異点の情報を記述していることが分かる。次にHに尖点を付け加えた空間H*の軌道空間を考察した。この空間はモジュラー群の理論では2次元リーマン球面として取り扱うがここでは、可微分軌道体を一般化した特異点をもつ多様体として考える。このとき尖点の回りでは無限群が等方部分群となり、通常の変換群の方法では取り扱うことができないが、この揚合はスライスに相当するが存在してH_1(D(H*/Γ))が双曲的固定点と尖点情報を記述していることが分かる。この方法は更にフックス群の場合にも適用できることが分かった。2)種数gの有向閉曲面上の擬アノソフ同相写像に対する拡大度(dilatation)の最小直を決定する問題は、基本的かつ未解決である。これまでに知られている擬アノソフ同相写像の構成法法に関して、各種数における最小値を上から評価する重要な例を、懸垂アノソフ流のバーコフ切断を調べることにより発見した。
酵素１分子の活性揺らぎと進化能の関係

「同一の遺伝情報」を持つ細胞集団においても、個々の細胞の表現型には揺らぎが存在することが知られている。我々の最近の研究から、このような「表現型の揺らぎ」は、酵素1分子レベルでも生じることが分かってきた。つまり同一のDNAから合成した酵素1分子においてもその活性には揺らぎが存在するのである。このような「表現型の揺らぎの大きさ」と「進化」には相関があり、大きな揺らぎを示す表現型ほど進化速度が速くなるという理論が最近報告されている。しかしこの理論がどういった表現型や進化に適用できるかどうかは未だ自明ではない。そこで本研究ではマイクロチャンバーデバイスを用いた酵素の定量進化実験系を確立し、酵素1分子の活性揺らぎと進化能との関係を明らかにする。本年度では1分子DNAのマイクロチャンバー内への封入、1分子DNAからの酵素発現・活性定量、1分子DNAの回収・増幅のプロセスに注目し、これらのプロセスの最適化を行った。1分子DNAのマイクロチャンバー内への封入および1分子DNAからの酵素発現・活性定量においては、ドロップレット形成に用いるオイルやデバイスの流路設計が結果に大きく影響することが判明した。そこでそれらの最適化を行うことで、より均一に封入・酵素発現・活性定量が可能な条件を見出した。また1分子DNAの回収・増幅においては、回収に用いるキャピラリーの径やPCR条件の最適化を行い、プロセスの再現性を向上することに成功した。さらに封入後の活性定量とデバイスからの1DNAの回収を自動で行う自動回収装置を開発し、活性定量から回収までの自動化にも成功している。最終的に確立した実験系を用いて、野生型よりも活性の上昇した変異体を複数個取得することに成功している。これら活性の上昇した変異体の1分子活性分布を計測したところ、活性揺らぎの大きさは分子種によって様々な値を持つことが分かった。本年度で目標とした1分子DNAのマイクロチャンバー内への封入、1分子DNAからの酵素発現・活性定量、1分子DNAの回収・増幅のプロセスについて既に最適化を完了している。さらに最終的に確立した実験系を用いて、野生型よりも活性の上昇した変異体を複数個取得することにも成功している。さらに活性によらずランダムにピックアップした変異体の1分子活性分布の計測も行ったところ、平均活性が低い変異体ほど活性揺らぎが大きくなる傾向が得られている。そのため順調に進展しているといえる。今後は確立した定量進化実験系を用いて進化実験を繰り返し、より高活性なALPへと複数代進化させていく。得られた各世代の変異ALPの1分子酵素活性計測から活性揺らぎ幅を評価し、1分子の活性揺らぎと進化能との関係を明らかにする。さらに活性揺らぎの異なるALP変異体を起点とした進化実験を行い、起点に用いるALPの活性揺らぎ幅がALP分子の進化能にどう影響するのかを明らかにする。また高活性変異の選択による定方向進化だけでなく、中立変異や低活性変異選択を取り入れた非定方向進化をスクリーニングに取り入れた進化実験を行い、各進化の道筋における活性値の変動と活性揺らぎ幅との関係を明らかにし、それらが進化能、特に進化の遅くなった最終世代の到達活性にどう影響するのかを明らかにしたい。

これら活性の上昇した変異体の1分子活性分布を計測したところ、活性揺らぎの大きさは分子種によって様々な値を持つことが分かった。さらに活性によらずランダムにピックアップした変異体の1分子活性分布の計測も行ったところ、平均活性が低い変異体ほど活性揺らぎが大きくなる傾向が得られている。そのため順調に進展しているといえる。今後は確立した定量進化実験系を用いて進化実験を繰り返し、より高活性なALPへと複数代進化させていく。得られた各世代の変異ALPの1分子酵素活性計測から活性揺らぎ幅を評価し、1分子の活性揺らぎと進化能との関係を明らかにする。さらに活性揺らぎの異なるALP変異体を起点とした進化実験を行い、起点に用いるALPの活性揺らぎ幅がALP分子の進化能にどう影響するのかを明らかにする。また高活性変異の選択による定方向進化だけでなく、中立変異や低活性変異選択を取り入れた非定方向進化をスクリーニングに取り入れた進化実験を行い、各進化の道筋における活性値の変動と活性揺らぎ幅との関係を明らかにし、それらが進化能、特に進化の遅くなった最終世代の到達活性にどう影響するのかを明らかにしたい。
新規リケッチアの特異的診断法開発及び産業動物の疾病と生産性に及ぼす影響解明

我が国に生息するエーリキア類に対する特異的PCR、および紅斑熱リケッチア種を鑑別するPCR-RFLP法を開発し、マダニと野生動物に新規病原性リケッチアが常在していることが明らかとなった。また牛末梢血からAnaplasma phagocytophilumおよびAnaplasmabovis近縁の遺伝子が検出され、わが国の牛がこれら病原体に感染していることが明らかとなった。しかし感染牛はとくに異常な症状を呈しておらず、また遺伝子解析では我が国の病原体は既知種とは別種である可能性が示唆され、病原性も異なる可能性が考えられた。本年度は対象となる新規リケッチア病原体の遺伝子解析を行い、種特異的PCRの開発をするとともに、北海道内の放牧地周辺におけるベクターと保菌動物の調査を行った。1.エールリヒア各病原体の16S rRNAおよびクエン酸合成酵素遺伝子(gltA)に注目し、種特異的PCRを開発した。gltA配列に基づくPCRの感度が良好であった。リケッチア各病原体では互いに塩基配列が非常に近似しており、種特異的PCRが確立できず、制限酵素多型による鑑別を行った。2.野生動物およびマダニを材料にした疫学調査(3)北海道十勝管内の放牧地等から採取したマダニから、属特異的PCRと遺伝子解析によりリケッチア性病原体を検索したところ、シュルツェマダニ(IP)からRickettsia helveticaおよび'Candidatus Rickettsia tarasevichiae'と近縁(99.8%)な遺伝子断片が、また別のEhrlichia strainHFと遺伝子配列が100%一致するものが検出された。さらにヤマトマダニからはEhrlichia strain HF近縁(99.9%)の種が検出された。これらのことから、産業動物を取りまく環境中には新規病原性リケッチアが野生動物とマダニのなかで生息しており、マダニ寄生等を通じて家畜にも感染する危険があると考えられた。本年度は種特異的PCR等を利用して、放牧地およびその周辺における野生動物と牛について、また小動物を歩哨動物として全国的な調査を行った。またリケッチアを含むマダニが媒介性病原体の診断法を確立した。1.野生動物および牛を材料にした調査北大静内研究牧場に放牧中の牛78頭の末梢血および同放牧地内で捕獲されたエゾシカ22頭を検索したところ、(1)Anaplasma phagocytophilum特異的PCRでは牛1頭(1.3%)が陽性を、またエゾシカ10頭(45.5%)が陽性であった。陽性牛にとくに臨床症状はみられなかった。遺伝子解析ではいずれの検体も既知エゾシカ由来株と高い相同性を示し、また欧米株とは別のcladeを形成しており、我が国のA. phagocytophilumは欧米株と病原性が異なる可能性が考えられた。(2)Anaplasmabovis特異的PCRでは牛12頭(15.4%)とエゾシカ5頭(22.7%)が陽性を示した。A.bovis陽性牛にも臨床症状は認められなかったが、遺伝子解析ではアフリカ株との相同性が高かった。今後我が国においては、牛のみならず、ヒトや馬に関しても両病原体の臨床症状の発現等について注意するとともに、ベクターや浸潤状況を明らかにする必要がある。2.小動物を歩哨動物とした全国的調査全国35都道府県の犬1207頭および猫584頭を歩哨動物としてリケッチア血清疫学調査を行ったところ、犬20頭(1.7%)猫4頭(0.7%)がRickettsia japonica抗体陽性であった。日本紅斑熱患者発生のない地域においても、R. japonica特異的抗体陽性動物が確認されたことから、今後これらの地域における患者発生に注意する必要があると考えられた。またマダニ寄生機会の多い動物はリケッチア感染症疫学の歩哨動物として有用と考えられた。3.マダニ媒介性病原体の診断法確立マダニが媒介する産業動物の疾病であるアナプラズマ、バベシア等の分子生物学的及び血清学的診断法を開発した。1.新規リケッチアの特異的診断法の確立我が国に生息する紅斑熱リケッチア各病原体は互いに塩基配列が非常に近似しており、種特異的PCRが確立できず、制限酵素多型による鑑別を行った。日本に生息する4種の紅斑熱リケッチアR. japonica、R. asiatica、R. helvetica、R. tamuraeのScaA遺伝子に基づくPCR産物を制限酵素を用いて切断することにより迅速に種を鑑別することができることがわかった。2.新規リケッチアの疫学的性状の解明

沖縄県与那国島の黒毛和種牛15頭のうち、12頭(80.0%)がA. phagocytophilum種特異的PCRで陽性を、また8頭(53.3%)がA.bovis種特異的PCRで陽性を示した。うち6頭(40.0%)は両方に陽性を示した。A. marginaleおよびA. centraleに対してはすべて陰性であった。遺伝子解析の結果、与那国島牛由来A. phagocytophilumは本州・北海道のニホンジカ由来A. phagocytophilumと高い相同性を示し、また与那国島牛由来A. bovisの遺伝子解析でも本州と北海道のニホンジカ由来A. bovisとの相同性が高かった。3.新規リケッチア感染が産業動物の健康状態と生産性に及ぼす影響の解明沖縄県与那国島の黒毛和種牛15頭のうち、A. phagocytophilum種特異的PCRで陽性を示した牛12頭には特異的な症状はみられなかった。遺伝子解析では欧米株とは別のcladeを形成しており、我が国のA. phagocytophilumは欧米株と遺伝子性状だけでなく病原性が異なる可能性が考えられた。