hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
蛋白尿発症に関わる腎上皮細胞の運動能の解析

続けて、細胞外基質内で3次元培養されたMDA-MB-231細胞の浸潤能にRabXが影響を与えるかを評価したところ、RabXの発現の抑制により浸潤の低下が見られた。以上の実験により、RabXが細胞の浸潤能に必須かつ十分であることが分かった。ポドサイトと腫瘍細胞の運動能の制御における分子機構には共通性が指摘され、腫瘍細胞の運動能の亢進は浸潤に至る。また、近年腫瘍細胞内の小胞輸送が細胞骨格と協調して浸潤に深く関わることが報告されている。そこで腫瘍細胞の浸潤に必須な低分子量Gタンパク質Rabファミリーの同定を行った。昨年度までにヒト乳腺癌由来の細胞を用いスクリーニングを実施しデータベースを用いた解析を加え、浸潤制御に関わる因子としてRabXを同定し、更にRabXの過剰発現とレスキューによる細胞外基質の分解の変化を解析した。3年目である本年は、3次元の浸潤における影響の評価を行い、RabXが浸潤に関与する分子機構の解析を開始した。腫瘍細胞を細胞外基質内で培養すると、3次元における周囲への浸潤の様子が観察できる。細胞外基質を混合して調製した2種類の3次元培養系において、薬剤誘導依存的にRabXの発現を抑制する2種類の乳腺癌細胞を事前に作製し培養すると、薬剤誘導依存的に周囲への浸潤が抑制された。また、Rabファミリーはエフェクター蛋白が結合し小胞輸送を促進することから、RabXが浸潤に関与する機序を検討するために、RabXのエフェクターの発現低下時の細胞外基質の分解能を測定した。その結果RabXのエフェクター因子AおよびBの発現低下により、乳腺癌細胞のゼラチンの分解能は低下した。RabXの発現低下は因子Aの発現低下時と同様に細胞内小器官の形態を変化させ、過剰発現により回復した。以上より、RabXが乳腺癌細胞の3次元への浸潤を制御し、RabXのエフェクターも乳腺癌細胞の細胞外基質の分解を制御することが分かった。RabXは腎臓糸球体での発現が認められ、RabXの結合蛋白の腎臓特異的ノックアウトマウスは蛋白尿を来す。今後腎臓におけるRabXの機能の解析が望まれる。二年目の本年は、スクリーニングを進め候補を大幅に絞り込むことができた。更に過剰発現系を用いてその候補因子の重要性を明らかにしたことは意義深い。また、3次元での運動能の解析は今後重要となる革新的な手法であり、他の因子にも応用が期待される。27年度が最終年度であるため、記入しない。他の腫瘍細胞でもRabXの関与する3次元での浸潤能の変化の評価を行い、更には浸潤におけるRabXの分子機構の解析を進める。その上で、ポドサイトでの運動能におけるRabX並びに関連因子の機能解析を行う。一年目の本年は、当初の予定していたポドサイトの実験系の確立は困難であったものの、他の細胞を用いた手法に変更し研究を実施したことで、スクリーニングが大幅に進んだ。このスクリーニングの結果は、腎臓ポドサイトへの応用はもちろんのこと、腫瘍などの分野でも非常に重要な因子の解明につながり、今後の発展が大いに期待される。他の腫瘍細胞における候補因子の浸潤能の影響を解析し、候補因子をさらに絞り込む。その後候補因子を恒常的にノックダウンさせた細胞株を作成し、運動能の変化をきたす機序の解明に取り組む予定である。
高機能自閉症児の指導にすぐに活用できる劇台本や紙芝居集の作成とその有用性の検討

筆者は高機能広汎性発達障害児(A児)のコミュニケーション能力の向上を願い,物語学習を中心として,一つの題材に対して「繰り返しの音読練習→紙芝居の作製→ワークシートの作成→劇練習→発表」というパターン化した指導内容を設定することを考案し,その有用性を検証した(吉村,2005)。しかし,その後,主に特別支援学級(以下,特学と明記)を担任している先生方から,「特学のように少人数の学級で行える劇台本のお手本がほとんどなく,台本の作成が困難。」という報告を受けた。そこで,これまでに筆者が指導してきた劇台本,紙芝居の台本,児童が作成した紙芝居及び実際に演技している子どもたちの劇映像等と合わせて,保護者の承諾のもと,DVD化し,学校に配布した。そして,このDVD資料が特学担任の負担軽減を図るとともに,コミュニケーション能力の向上を意図した国語科指導へ生かされるのか,特学担任との面接を通して,有用性を検討した。その結果,主に,以下の3点について,有用性を認めることができた。(1)特学担任による,教材研究の時間短縮劇台本作成の時間が,これまでの約6時間前後から,約3時間へと半減させることができた。(2)児童の見通しによる,劇や紙芝居活動への取り組みの活性化児童が,事前にDVDの劇映像を見ることにより,劇の内容の大体を具体的につかむことができるようになり,見通しをもって,意欲的に劇練習に取り組めるようになった。(3)児童の題材選択による,劇や紙芝居活動への主体的な取り組み児童がいくつかの題材から,自己選択した劇であるという思いを高めることができ,主体的な練習・発表につなげることができた。課題として,特学担任によるアンケートから,「台本数を増やし,選択の幅を広げる事が急務」であることがわかった。今後は,各学校にもお願いし,保護者の承諾のもと,できるだけ多くの電子化された劇や紙芝居の台本,児童の演じた映像等を資料化していく必要がある。
疎毛症キメラマウスによる脱毛メカニズムの検討

本年度は、平成5年度の研究成果を基に、毛包細胞の前段階として入手が容易であるヒト表皮角化細胞と既に採取法が確立しているエクリン汗腺細胞に対する発毛剤の作用の研究を行なった。(1)発毛剤であるミノキシジルの細胞のチャネルにおよぼす影響をホールセルクランプ法を用いて行なった研究では、ミノキシジルの活性型であるミノキシジルサルフェイトはエクリン汗腺細胞のKチャネルではなく主にC1チャネルを開放すること、またミノキシジル自体はKチャネルを開放することを明らかにした。したがって、発毛にはKチャネル開放による血管内皮細胞の弛緩とその結果もたらされる血流増加のみならずC1チャネルの開放が関与していることが示唆された。ヒト表皮角化細胞にバリノマイシンを作用させ、細胞容積解析法を用いてミノキシジルサルフェイトの細胞チャネルへの作用を検討した結果、C1チャネルの開放が認められエクリン汗腺での結果が支持された。しかしC1チャネルの発毛への関与の機序の解明にはさらなる検討が必要である。(2)細胞内外のCa^<2+>濃度の発毛への関与の研究では、男性ホルモンはヒト表皮角化細胞の細胞内Ca^<2+>濃度を上昇させ、ミノキシジルサルフェイトは減少させることを明らかにした。この結果より発毛には細胞内Ca^<2+>濃度が関与している可能性が示唆された。(1)、(2)に関し引き続き毛包細胞を用いて検討を行なう予定である。疎毛症キメラマウスの脱毛機序について超微形態学的あるいは免疫組織化学的に検討した結果、電顕的には、毛小皮の外側に中等度電子密度物質が認められた。毛乳頭および毛母細胞には特に超微形態学的異常およびgrowth fraction markerなどの免疫組織化学的異常は認められなかった。これらのことから疎毛症キメラマウスの脱毛には角化異常が関与すると考えられ、特にSH基とS-S結合の分布の変化が重要な役割を果していると考えられた。そこで生後3週齢の疎毛症マウスの背部にSH-oxidase活性の高い人参抽出液およびサンセイ抽出液を5週間から7週間塗布し、コントロール群と比較して疎毛の状態が抑制されるか否かを検討した。結果として投与5週間後では特に肉眼的差異は認められなかったが、7週間後では上記薬剤塗布群において、疎毛の程度はコントロール群と比較して抑制されていた。またマクロスコープを使用した単位面積あたりの毛髪数の検討においても、上記薬剤塗布群がコントロール群を上回っていた。これらのことから、人参およびサンセイ抽出液は疎毛の改善にある程度有効であることが示唆され、またSH基とS-S結合のアンバランスが関与する何らかの角化異常により疎毛症が招来されると推測された。皮膚附属器における酵素蛋白の局在については、大腸菌を用いて、5αレダクターゼ抗体を作成し、現在毛包組織の免疫組織化学的検討を行っている。育毛剤としてのminoxidilならびにその誘導体の作用機序については、従来考えられていたKチャネルの開放にくわえ、細胞容積解析法による結果、Clチャネルも開放することが証明され、細胞内PKCとの関連を検討中である。疎毛症キメラマウスは、人における先天性乏毛症の脱毛機序あるいは治療に関連するモデル動物となりうる可能性もあり、今後インボルクリンやフィラグリンなどの分布の検討ならびにビタミンA酸塗布による脱毛の抑制の有無などについて更に研究を進める予定である。

ヒト表皮角化細胞にバリノマイシンを作用させ、細胞容積解析法を用いてミノキシジルサルフェイトの細胞チャネルへの作用を検討した結果、C1チャネルの開放が認められエクリン汗腺での結果が指示された。しかしC1チャネルの発毛への関与の機序の解明にはさらなる検討が必要である。(2)細胞内外のCa^<2+>濃度の発毛への関与の研究では、男性ホルモンはヒト表皮角化細胞の細胞内Ca^<2+>濃度を上昇させ、ミノキシジルサルフェイトは減少させることを明らかにした。この結果より発生には細胞内Ca^<2+>濃度が関与している可能性が示唆された。(1)、(2)に関し引き続き毛包細胞を用いて検討を行なう予定である。
ドーパントイオン照射によるナノスケール表面改質素過程のリアルタイムSTM観察

ナノスケール半導体デバイス中のドーパントの原子論的挙動を解明するため、イオン照射によるシリコン(Si)表面の改質素過程をリアルタイムに観察するシステムを開発した。熱処理や不活性処理されたSi表面におけるイオン照射誘起構造の核形成・消長過程を捉えることに成功した。また、三次元的構造の極微細なトランジスタの電気伝導機構の解明に関する研究を、実験および計算の両面から実施した。ドーパントイオン照射によるSi表面のナノスケール改質素過程を、原子分解能でリアルタイムに観察するシステムを開発する目的で、平成20年度は以下のことを行った。(1)非破壊照準システムの開発とSi清浄表面へのドーパント注入過程のSTM観察イオンビーム照射前後の基板表面をその場かつリアルタイムに観察できる研究代表者らの独自のSTM技術を発展させ、リン(P)などのドーパントイオン照射の様子を観察するための試料非破壊型のビーム照準システムを開発した。低輝度、短寿命のPイオン源(液体金属イオン源型)のビーム照準に対応するため、ビーム走査と電流検出によりビーム照射領域を可視化する吸収電流像機構に、新規に開発したビーム照準マークとしての仮標的機構を組み合わせることで、STM観察の準備をした後にビーム照準調整できるシステムを構築した。これにより、探針先端や試料を破壊することなくビーム照準を合わせることが可能となり、実験効率を飛躍的に高めることに成功した。本システムを用いて、Pイオン照射により誘起されるステップの後退や表面空孔アイランドの形成・消失など、表面形状の構造変化の素過程を観察した。(2)表面不活性化のためのガス導入機構の準備また、浅い位置に停止したドーパントの電子状態をSTM観察するために、表面を不活性化するための水素ガス導入機構構築の準備を行った。真空排気系の設計および物品準備などが終わり、平成21年度にSTM観察後の水素終端を試みる予定である。以上の成果の意義は、“ドーパント"イオン照射固体表面のその場かつ直接観察を可能とする新しい計測装置をはじめて実現したことにある。開発した手法により、Siの超LSI製造において重要なドーパントおよび点欠陥の挙動について、原子レベルで定量的に議論できるようになりつつある。ドーパントイオン照射によるSi表面のナノスケール改質素過程を、原子分解能でリアルタイムに観察するシステムを開発する目的で、平成21年度は以下のことを行った。(1)不純物イオン照射によるSi表面ナノ改質素過程のリアルタイムSTM観察:Auイオン注入によるSi(111)表面のリアルタイム観察に成功した。初年度(平成20年度)に開発したビーム照準システムを用いて、Auイオン照射による表面改質素過程をリアルタイムSTM観察した。Auの存在を示すSi(111)-5×2Au再構成構造および空孔サイズの経過変化から、関与するAu原子の拡散速度を評価したところ、注入したAu原子は結晶欠陥とほとんど相互作用せずに移動している可能性が示唆された。実験観察困難な表面直下における結晶回復速度や拡散種の挙動に関する情報を得る方法として、本手法の有効性が実証された。(2)STM/イオン銃複合装置への水素ガス導入機構の導入:STM-イオン銃複合装置内でSi表面を水素終端できる機構を組み込んだ。水素終端はフィラメント加熱によるクラッキング方式とし、水素ガス分圧、フィラメント温度、水素ガス暴露時間などの条件を探索したところ、水素終端されたSi(001)-2×1表面の観察に成功した。本システムの構築により、Si表面へのドーパントイオン照射からの後の水素終端までの一連の処理がIn-Situできるようになった。(3)ナノワイヤトランジスタの作製:『ナノワイヤ構造』および『酸化誘起歪印加』の二つの技術を採用したナノスケールトランジスタを開発した。ナノワイヤチャネル領域に周辺酸化膜起因の歪を印加することにより、単位断面積あたりの電流駆動能力が2倍程度まで向上する事を確認した。また低温から室温領域における電気測定の結果、ナノワイヤ構造ではフォノン散乱による電流駆動能力の劣化が効果的に抑制されることが判明した。ドーパントイオン照射によるSi表面のナノスケール改質素過程をリアルタイムに観察するシステムの開発、および、ナノスケールFETの製作・設計、に関する以下の研究を行った。(1)水素終端Si表面へのPイオン照射過程のリアルタイムSTM観察Si(001)-2×1:H表面へPイオン照射し、イオン照射前後の連続STM像を解析した。その結果、イオン照射により表面に誘起される主な構造はhemihydrideであることが分かった。この構造は、入射Pイオンによる表面のmonohydrideを橿成する水素原子1個のスパッタにより誘起されると結論した。(2)ナノワイヤFETにおける酸化膜誘起歪みが電流駆動能力に与える影響調査歪印加SiナノワイヤFETを製作し、電気特性の酸化膜厚依存性を測定した。酸化膜の薄層化に伴うSi結晶歪の緩和により相互コンダクタンスが低下することを実証し、酸化膜誘起歪みによる電流駆動能力向上を支持する結果を得た。(3)シミュレーションによるナノワイヤデバイスの設計・提案(4)ナノ構造中のフォノン挙動の制御指針の獲得

酸化膜で覆われたナノS沖のフォノン緩和過程をシミュレーションし、LOフォノンの緩和時間が酸化膜厚ではなくSiサイズに依存することを見出した。
異種膵島移植における免疫寛容導入-HVJリポソーム法によるbcl-2/Fas-L移入及び多剤免疫抑制療法によるcombination therapy-

T細胞にアポトーシスを誘導するFas ligand遺伝子や、Co-stimulatory moleculeのうちの1つでT細胞の活性化を抑制するCTLA4-Ig遺伝子を、膵島へ導入することにより拒絶反応を抑制する目的で膵島移植実験を施行した。膵島への遺伝子導入法の検討ではHVJリポソーム法では膵島へ遺伝子を導入することは困難であった。一方、アデノウイルスベクターでは膵島へ高率に遺伝子導入が可能であった。CTLA4-Igを発現する組み換えアデノウイルスAd.CTLA4-Igを作成し、Vitroで膵島へ感染させた。CTLA4-Ig proteinの発現は確認できたが、これを高血糖を誘導したLEWラットへ移植した系では十分な生着延長効果は得られなかった。Ad.CTLA4-Igを全身投与することによりレシピエントへ感染させた場合も、graft survivalは無処置群(5.7±0.5日)に比較し、10.0±2.4日と軽度の生着延長を認めたのみであった。しかしさらに周術期にFK506投与を併用することにより全例100日以上生着した。Fas Ligandを膵島へ導入すると膵島のインスリン分泌能低下を認めた。またFas Ligandは好中球などの遊走作用を有し炎症作用を惹起することが最近報告されており、これを膵島へ導入し移植することは適していないと判断した。膵移植の対象となるIDDMを自然発症するBBラットを使い、全膵十二指腸移植モデルで自己免疫再発のメカニズムを解析し、RT6+キメラT細胞の中にNKT細胞が高率に含まれ、自己免疫応答を制御していることを示した。また一般に免疫寛容が得やすいとされる肝臓移植においてもNKT細胞に注目し、ラット肝移植の自然寛容系と拒絶系を用い、ドナー由来のNKT細胞が前者における自然寛容の誘導に関与することを示した。平成11年度研究実績膵島移植はインスリン依存型糖尿病(IDDM)患者に対する理想的な治療法として期待されているが、膵島は免疫原性が強く、移植に際して全膵十二指腸移植と比較して免疫寛容の誘導が困難であることが知られている。一方、移植臓器に対してT細胞にアポトーシスを誘導するFas ligand遺伝子やCo-stimulatory moleculeのうちの1つでT細胞の活性化を抑制する作用を持っているCTLA4-Ig遺伝子を導入することにより拒絶反応を抑制する報告が最近相次いでいる。我々は現在特にこのCTLA4-Ig遺伝子に注目し、膵島移植実験を施行している。1.膵島への遺伝子導入の可能性についての実験また移植後7日目の免疫応答を検討すると、MLRではT細胞の増殖能が抑制され、CMLではDonorに対するCTLactivityが抑制されていた。CTLA4-Igを発現する組み換えアデノウイルスAd.CTLA4-Igを作成し、vitroで膵島へ感染させた。Ad.CTLA

4-Igを全身投与することによりレシピエントへ感染させた場合も、graft survivalは無処置群(5.7±0.5日)に比較し、10.0±2.4日と軽度の生着延長を認めたのみであった。しかしさらに周術期にFK506投与を併用することにより全例100日以上生着した。Fas Ligandを膵島へ導入すると膵島のインスリン分泌能低下を認めた。またFas Ligandは好中球などの遊走作用を有し炎症作用を惹起することが最近報告されておりこれを膵島へ導入し移植することは適していないと判断した。膵移植の対象となるIDDMを自然発症するBBラットを使い、全膵十二指腸移植モデルで自己免疫再発のメカニズムを解析し、RT6+キメラT細胞の中にNKT細胞が高率に含まれ、自己免疫応答を制御していることを示した。また一般に免疫寛容が得やすいとされる肝臓移植においてもNKT細胞に注目し、ラット肝移植の自然寛容系と拒絶系を用い、ドナー由来のNKT細胞が前者における自然寛容の誘導に関与することを示した。
分子機能を生み出す柔らかさの時間分解観測とその発現機構解明

タンパク質は人工の分子では成し得ない高度な機能を有する。したがって、タンパク質を理解することは生命現象の理解のみならず、高度な機能性分子の創成に重要なヒントを与える。タンパク質の機能発現では、複数の機能単位が相互に連動して構造変化することが必須の役割を果たす。そのため、その機構解明には安定構造をもとにした議論のみでは不十分であり、機能する際に起きる構造変化を明らかにすることで理解が進む。本研究課題では、主に時間分解共鳴ラマン分光法を用いて、機能部位間の連動的な構造変化を可能にするタンパク質の構造変化と、構造変化を駆動する分子内のエネルギーフローを明らかにした。1.ヘムタンパク質の構造変化と機能発現機構の研究ヒトヘモグロビンは、α鎖とβ鎖の2種類のサブユニットが2つずつ会合した四量体で、サブユニット間の構造変化を介した相互作用により協同性を示す。我々はα鎖のヘムでリガンド脱離後に起きた構造変化がサブユニット界面を介してβ鎖のヘムに約20 μsで伝播することを明らかにした。これは、ひとつのサブユニットから隣接するサブユニットへの構造伝搬を観測した最初の例である。また、一酸化炭素センサータンパク質CooA、酸素センサータンパク質FixLについてもその構造ダイナミクスを調べ、機能発現機構について考察した。2.光受容タンパク質の構造変化と機能発現機構の研究レチナールタンパク質では、レチナール発色団に光異性化が起きることによってタンパク質の局所的な構造変化が誘起される。これがタンパク質の大域的な構造変化を起こし、機能が発現する。我々は、2種類のイオンポンプ(ハロロドプシンおよびグロイオバクターロドプシン)について、時間分解共鳴ラマン分光法で光サイクル中に見られる反応中間体の発色団構造を決定した。3.タンパク質内エネルギーフローに関する研究タンパク質内のエネルギーフローを、ヘムタンパク質を用いて調べた。本研究では、チトクロムb562が、へムと4本のαヘリックスからなる単純な立体構造をもつことを利用した。すなわち、αヘリックスの1ターン単位でトリプトファン残基の位置をずらした三種類の変異体を作製し、ヘムを分子ヒーター、トリプトファン残基をエネルギープローブとして用い、エネルギー伝達の量や速度の距離依存性を系統的に調べた。(1)ヘムタンパク質の構造変化と機能発現機構の研究FixLはマメ科植物と共生する根粒菌に含まれる酸素センサータンパク質で、細胞内酸素濃度を感知する。低酸素下ではリン酸化酵素活性を持ち、高酸素下では活性を抑制することで窒素固定系遺伝子の発現調節を担う。本研究では、紫外共鳴ラマン分光法による全長FixLの構造変化の観測に加え、リン酸化活性測定を行うことで、活性制御に重要な残基の構造変化を調べた。その結果、酸素の結合に伴って起きるTyr201の水素結合強度変化が活性制御に重要であることを明らかにした。(2)光受容タンパク質の構造変化と機能発現機構の研究グロイオバクターロドプシン(GR)は、光エネルギーを利用してプロトンを細胞内から細胞外へと輸送する。本研究では、共鳴ラマン分光法を用いて、ナノ秒からミリ秒領域におけるレチナール発色団の構造および周辺残基との相互作用を調べた。その結果、過渡吸収分光法による研究では1種類とされていたL中間体に2種類があること、プロトン移動に先立ってレチナール発色団とカウンターイオンとの間の水素結合が強くなりプロトン移動のエネルギー障壁を低くする構造変化が起きることを明らかにした。(3)タンパク質内エネルギーフローに関する研究ヘムを分子ヒーター、トリプトファン残基をエネルギープローブとして用い、タンパク質内のエネルギーフローを計測した。本研究では、ミオグロビン中のヘム周辺の異なる位置にトリプトファン残基を導入した変異体を用い、タンパク質内エネルギーフローの空間異方性について調べた。計画通り、タンパク質分子の柔らかさと機能発現との相関を調べる研究が進んでいる。新規に導入したレーザーを用い、幅広い波長領域で時間分解共鳴ラマンスペクトルを測定できるようになった。これを用いて、S/N比の高いスペクトルデータが得られている。1.ガスセンサータンパク質の構造変化と機能発現機構の研究FixLはマメ科植物と共生する根粒菌に含まれる酸素センサータンパク質で、細胞内酸素濃度を感知する。これまでの研究から、酸素の結合に伴って起きるTyr201の水素結合強度変化が活性制御に重要であることが明らかになっている。本研究では、時間分解紫外共鳴ラマン分光法を用いて、酸素の脱離に伴いTyr201の水素結合強度が数マイクロ秒の時定数で変化していることを明らかにした。さらに、複数のタンパク質のドメインを組み合わせたキメラタンパク質を作製し、FixLと同様の活性制御が可能であることを実証した。これは、タンパク質のアロステリーが共通の機構によって起きていることを示唆する結果であり興味深い。また、一酸化炭素センサータンパク質CooAについてもその構造ダイナミクスを調べ、機能発現機構について考察した。2.光受容タンパク質の構造変化と機能発現機構の研究グロイオバクターロドプシン(GR)は、光エネルギーを利用してプロトンを細胞内から細胞外へと輸送する。その結果、プロトン輸送に関与しているGlu132残基と発色団の間には10 Å以上の距離があるにも関わらず、初期中間体の段階で相互作用が形成されることを明らかにした。また、ナトリウムイオンポンプKR2および塩化物イオンポンプFRについてもその構造ダイナミクスを調べ、機能発現機構について考察した。

計画通り、タンパク質の柔らかさと機能発現との相関を解明する研究が進んでいる。新規に開始したキメラタンパク質を用いたアロステリック機構解明を目指す研究も軌道に乗っている。中間評価においても高い評価を得ている。本研究課題では、主に時間分解共鳴ラマン分光法を用いて、機能部位間の連動的な構造変化を可能にするタンパク質の構造変化と、構造変化を駆動する分子内のエネルギーフローを明らかにした。1.ガスセンサータンパク質の構造変化と機能発現機構の研究一酸化炭素センサータンパク質CooAについて、一酸化炭素の脱離に伴う構造ダイナミクスを、時間分解共鳴ラマン分光法を用いて調べた。可視光のプローブでヘムを、紫外光のプローブでポリペプチド鎖の構造変化を観測したところ、ヘムープロリン残基(Pro2)間結合の解離が一酸化炭素依存的な活性化の引き金になっていることが明らかになった。2.フォトクロミック蛍光タンパク質の構造変化と機能発現機構の研究蛍光タンパク質Dronpaは、蛍光を発する明状態Bと発しない暗状態A2との間でフォトクロミズムを示す。また、これらに加えて無蛍光性の状態A1の存在も報告されている。共鳴ラマン分光法はタンパク質中の発色団構造を調べるのに適しているが、Dronpaは強い蛍光を発するため可視共鳴ラマンスペクトルの測定は難しく、これまでに報告例はなかった。本研究では、適切なプローブ光の波長を探索し、かつ蛍光のバックグラウンドをスペクトル解析により除去することで、Dronpa発色団のラマンスペクトルの観測に成功した。スペクトルに基づいて、各状態での発色団の幾何構造およびプロトン化状態を決定した。3.タンパク質内エネルギーフローに関する研究ヘムを分子ヒーター、トリプトファン残基をエネルギープローブとして用い、タンパク質内のエネルギーフローを計測した。その結果、タンパク質内エネルギーフローにおいては、主鎖の共有結合を介するのではなく、原子間接触を介してエネルギーが移動していること、また溶媒の水分子が効率的なエネルギー受容体として働いていることが明らかになった。タンパク質の柔らかさと機能発現との相関を解明する研究が順調に進んでいる。レーザー装置の故障のため、年度中に予定していた実験の一部を翌年度にずらすことになったが、修理の予定ははっきりしており、また実験条件はすでに確立しているので、この計画変更は翌年度で十分カバーできる。当初計画していた研究以外にも、これまでは困難であった蛍光タンパク質の共鳴ラマンスペクトルの測定にも成功しており、この成果は翌年度行う予定の機能性蛍光タンパク質の研究に役立つ。学術論文や学会発表による成果発表も順調に進んでいる。
『西崑酬唱集』の研究-銭惟演を中心に-

本研究課題における研究成果は以下のとおりである。1、『五代呉越国銭氏の文学成果について』(中国語で執筆)本研究課題としてあげた銭惟演は、五代十国のひとつ呉越国の国王銭氏の一族である。呉越国は宋に降ったが、その一族は宋の朝廷においても科挙官僚として高位高官を占め、銭家は名家として存続しつづけた。銭惟演が北宋の初期において文壇をリードする存在であり得たのは、彼の文才によるのみならず、一族から多くの文人を輩出した銭氏の力がその背景にあったと考えられる。本稿ではまず、五代十国の時代に焦点をあて、銭惟演の先祖である歴代呉越国王やその一族が文学を愛好し、高い水準の文学作品を創作していたことを論述した。2、『北宋銭氏の文学成果のついて』(中国語で報告、執筆)1の論文において五代呉越国の各王を及びその一族が文学を好み数多くの著作を残した、ということについて述べたが、宋代においても銭氏一族は多くの文学家を輩出し続けた。それら著作の多くはすでに失われたが、『宋史』本伝や「藝文志」を見ると銭氏一族の著書はかなりの数にのぼったことがわかる。これら銭氏の文学は現在ではほとんど注目されていないが、本稿では銭氏の主要な文人(銭惟演はその一人である)の作品分析を通じて、彼らが高い水準の文学作品を創作していたことを述べ、社会的地位と著作豊富さの両面から考察して、銭氏一族が北宋においても文壇に強い影響力を持った一大勢力であった可能性を明かにした。3、『銭易論』(日本語で執筆)私は2の論文において北宋銭氏一族の文学について全体的な調査をおこなったが、本稿では特に、銭惟演と同時期に活躍し、銭惟演と文学的才能を並び称されていた銭易を取り上げ、詳しい作品分析を行った。そして銭易は当時の文壇で一世を風靡した『西崑酬唱集』に作品こそ載せていないが、西毘体の作り手として名声があり、また唐詩についても独自の視点を持っていたことを論じた。4、『西崑酬唱集』の作品(注釈を含む)のデータベース化を行った。本年度はまず研究の準備作業として、『全宋文』、『全宋詩』中の銭惟演関連の詩文、『西崑酬唱集』、年譜作成に必要な関連する歴史資料(『続資治通鑑長編』、宋人の筆記など)のデータベース化を行った。それらの資料にもとづいて、「銭惟演年譜」を作成して詩人の事跡を明らかにした。この年譜は『宋代文学家年譜』〔仮題〕(巴蜀書社)の一部として発表予定である。これは今後銭惟演の文学研究の基礎となるであろう。また中国の『西崑酬唱集』研究における第一人者曽棗荘氏の代表的研究論文『西崑十題』の翻訳を行った。この翻訳は『中央大学論集』第23号に発表予定である。さらに現在以下の論文を執筆中である。「呉越銭氏の文学」:銭惟演は呉越王銭叔の次子という名家の出身者であり、銭家は現在に至るまで多数の有名政治家、文学者、芸術家を輩出している。本稿では五代呉越国に焦点をしぼり、歴代国王や王族達の文学作品について分析を試みた。「銭惟演と『西崑酬唱集』」:銭惟演は『西崑酬唱集』に54首を載せる主要な作者である。現時、彼の集中の詩すべてを分析中である。これらの作品を楊億・劉〓等他の詩人の作品と比較して、銭惟演の詩の特徴を明らかにする。以上の研究成果については、2002年8月に中国・南京大学で開催される『第2届宋代文学国際研討会』において発表予定である。

これら銭氏の文学は現在ではほとんど注目されていないが、本稿では銭氏の主要な文人(銭惟演はその一人である)の作品分析を通じて、彼らが高い水準の文学作品を創作していたことを述べ、社会的地位と著作豊富さの両面から考察して、銭氏一族が北宋においても文壇に強い影響力を持った一大勢力であった可能性を明かにした。3、『銭易論』(日本語で執筆)私は2の論文において北宋銭氏一族の文学について全体的な調査をおこなったが、本稿では特に、銭惟演と同時期に活躍し、銭惟演と文学的才能を並び称されていた銭易を取り上げ、詳しい作品分析を行った。そして銭易は当時の文壇で一世を風靡した『西崑酬唱集』に作品こそ載せていないが、西毘体の作り手として名声があり、また唐詩についても独自の視点を持っていたことを論じた。4、『西崑酬唱集』の作品(注釈を含む)のデータベース化を行った。
非チャネル型タンパク質膜挿入マシーナリーの分子機構の解明

枯草菌は、タンパク質膜組込装置YidCのホモログを二つ持つ(SpoIIIJ、YidC2)。第一のホモログSpoIIIJの活性低下に呼応して、第二のホモログYidC2の発現が上昇する。そのため、YidC2をコードする遺伝子のほとんどをLacZに置き換えたyidC2'-lacZレポーターを持つ株は、細胞のYidC活性の低下に呼応してb-ガラクトシダーゼ活性を上昇させる。本研究では、このレポーターを利用し、YidCの機能解析や、YidCを阻害する化合物のスクリーニングを進めてきた。前年度までに、YidCを阻害する化合物のスクリーニングを行い、レポーター株のb-ガラクトシダーゼ活性を上昇させる化合物を複数得たが、これらの化合物のYidC活性阻害効果をレポーターアッセイで確認したところ、期待したほどの阻害効果を示す結果は得られなかった。そこで、本年度は、化合物のスクリーニングをさらに進め、新たな候補化合物を得た。これらについて、濃度依存性などを確認したところ、新たに得られた候補化合物の中には、これまで得られたものよりもレポーターが大きく反応するものが含まれていることが分かった。このことは、新たなスクリーニングにより、より強いYidC活性阻害効果を持つ化合物が得られた可能性を示唆している。今後、さらに化合物スクリーニングを継続しつつ、新たに得られた候補化合物のYidC阻害効果の検証を進める必要がある。また、新規YidC基質としてあらたに複数の膜タンパク質を同定した。これらには、YidC基質に共通の特徴である細胞外領域の負電荷アミノ酸がない。このことから、これまで提唱されてきた膜挿入機構とは異なる機構で膜挿入が起こっている可能性が浮上した。これらについて、YidC変異の効果を検証する必要がある。YidCの活性を阻害する化合物は、YidC依存的なタンパク質膜組込の研究を進展させる上で、研究ツールとして有用であると思われる。これまでに、YidCを阻害する活性を持つ化合物は報告されていないため、そのようなものが得られれば、意義深い。この、YidCの活性を阻害する化合物のスクリーニングが順調に進展している。前年度からさらにスクリーニングの対象を広げたことで、以前に得られたものよりもさらに有力と思われる化合物が、YidC阻害剤の候補として得られてきた。YidCの活性を測定するためのレポーター系を改変する過程で、YidCの新規基質と思われるものが複数見出された。興味深いことに、これらは、MifMのような既知の基質にみられる膜挿入に必要な性質を欠いている。このことは、MifMとこれらの膜タンパク質は、異なる性質に依存してYidCによって膜挿入していることを示唆している。予想外の結果ではあるが、基質によって膜挿入の機構に違いがある可能性が浮上しており、興味深い。(1)YidCの活性を阻害する化合物の探索:YidC活性を阻害する化合物の探索を引き続き行う。一方で、既に得られた候補化合物について、そのYidC阻害効果を、さらに検証する。YidCの活性に対する化合物の影響を調べるため、YidC活性の評価系を立ち上げる。枯草菌の系を用いて行うが、一方では、大腸菌の系を導入することを検討する。これらを確立したら、既に得られた化合物について、その阻害効果をさらに検証する。(2)YidCの新規基質の膜挿入におけるYidC変異の効果の解析YidCの新規基質が見出されたが、これらは、既知の基質MifMが有する膜挿入に必要な性質を欠いている。このような基質がどのような性質に依存して膜挿入されるのかを検討することで、YidC依存的タンパク質膜挿入の機構に迫る。その目的のため、基質やYidCの変異の膜挿入に対する効果を検証し、膜挿入に重要な基質、YidCの性質を明らかにする。枯草菌にはタンパク質膜組込装置YidCのホモログが2つ(SpoIIIJとYidC2)ある。恒常的に発現しているSpoIIIJの機能低下はYidC2の発現誘導をもたらす。この性質を利用したYidC2-lacZ融合レポーター株は、SpoIIIJの機能低下に呼応してb-galactosidase活性を上昇させる。そのため、この株のSpoIIIJに変異を導入し、yidC2-lacZの発現量を測定することで、簡便に、SpoIIIJ(YidC)の変異体の解析が可能となる。我々は、この株を利用し、YidC阻害化合物のスクリーニングを行ったところ、現在までにyidC2-lacZの発現を上昇させる化合物を得ることに成功した。今後、これらの化合物がYidC活性を直接阻害しているかどうかについて検討を行う必要がある。YidCの細胞質領域には2本のヘリックスからなる特徴的な構造がある。この構造の欠失はYidC機能を損なわせることから、この領域が重要であることが示唆されていた。我々は、この領域のシステマティックな変異解析を行い、この領域の塩基性残基がタンパク質膜組込において重要な役割を果たしている可能性を見出した。YidCは5本の膜貫通領域で膜内に親水性の溝構造を形成している。我々は、この溝に導入された変異によってYidC機能を一部損なっている可能性のあるものを、新たに幾つか見出した。溝の性質が蛋白質の膜挿入という機能を達成する上でどのようなかたちで最適化されているかについて、理解を深めるための手がかりになるかも知れないと考えている。

YidCの機能を阻害するような化合物のスクリーニングについては、現在の所幾つかの候補化合物を得ることができた。これらの候補化合物のさらなる解析にはYidCの膜組込活性をより直接的に観察する系が必要である。そのために、プロテアーゼプロテクションアッセイなどの確立を行っている。その条件検討に時間がかかることは事前に予想されていたが、解決可能な問題と不可能な問題の整理は順調に進んでいる。YidCの細胞質領域の役割を解明する目的で、網羅的な変異解析を行った。その過程で、この領域の塩基性残基の重要性が網羅的な解析から明らかになりつつある。今後、さらなる詳細な情報を得ることで、この領域の働きが理解できるかも知れないと期待している。YidCの膜内にある親水性の溝については、その機能を部分的に損なう新たな種類の変異が見出された。これまでに得られた機能欠損変異体からは見出されていなかった生育に関わる表現型も見出されており、非常に興味深い。新たな表現型を示す変異体が見出されたことから、これらの変異体の解析を進めることで、この溝の性質の重要性に関する新たな知見が見出される可能性も期待される。以上の進捗状況を総合的に判断すると、プロジェクトは現在までのところおおむね順調に進展しているものと考えられる。枯草菌は、タンパク質膜組込装置YidCのホモログを二つ持つ(SpoIIIJ、YidC2)。第一のホモログSpoIIIJの活性低下に呼応して、第二のホモログYidC2の発現が上昇する。そのため、YidC2をコードする遺伝子のほとんどをLacZに置き換えたyidC2'-lacZレポーターを持つ株は、細胞のYidC活性の低下に呼応してb-ガラクトシダーゼ活性を上昇させる。本研究では、このレポーターを利用し、YidCの機能解析や、YidCを阻害する化合物のスクリーニングを進めてきた。前年度までに、YidCを阻害する化合物のスクリーニングを行い、レポーター株のb-ガラクトシダーゼ活性を上昇させる化合物を複数得た。本年度は、この化合物のYidC活性阻害効果を確認するため、YidC基質であるMifMの膜組込をより直接的にアッセイする方法の確立を試みてきたが、まだその確立には至っていない。MifM以外の基質で膜組込アッセイを確立することも試みるべく、上記のlacZレポーターを改変する方法で新規YidC基質の探索を行ってきた。その結果、これまでに二つの膜タンパク質がYidC依存的に膜挿入されることが示唆された。興味深いことに、以前MifMの変異解析から得られたYidC基質の条件が、これらの膜タンパク質では見られず、MifMとは異なるかたちでYidCと相互作用をしている可能性が浮上した。この新たな基質も、YidC研究のモデル基質として有用であるかもしれない。前年度までに、YidCの細胞質領域の変異解析を行い、この領域の塩基性アミノ酸残基の重要性を示唆する結果を得た。本年度は、さらなる変異解析を行い、細胞質領域の特定の場所にそのような残基が位置している必要はないことが示されつつある。YidCを阻害する化合物の探索については、一次スクリーニングで得られた候補化合物の効果を確認する系の確立を目指している。しかしながら、現時点ではまだ有効なアッセイ系の確立には至っていない。
リピド中間体生合成の調節に関する研究

[2-^3H]マンノースを用いたトリチウム自殺法による選択的濃縮を経てマウス乳癌由来FM3A細胞から分離されたG258株は、単一変異でリピド中間体生合成に関して温度感受性(低温では正常にGlc_3MaN_9-GlcNAc_2-P-P-Dolまで生合成されるが、高温ではMan_3GlcNAc_2-P-P-Dol付近で生合成停止)を示し、かつ、細胞増殖に関して温度感受性を示す。すなわち、G258株においては、高温ではリピド中間体生合成が異常であるために増殖できない。このことから、G258株の細胞増殖に関する温度感受性からの回復を指標に、G258株のリピド中間体生合成変異に相補的なcDNAの分離が可能になった。昨年度は、pcD2ベクターに組み込まれたヒト肝臓cDNAライブラリーを電気穿孔法でG258株に移入し、高温で増殖できるようになった第一次形質転換候補株の分離を試みた。得られた候補株から、そのcDNAクローンを、アンピシリン耐性マーカーを指標に、大腸菌DH-1株に回収した。しかし、得られた一例は、pcD2ベクターそのものであることが、制限酵素による消化断片のアガロース電気泳動による泳動パターンから判明した。G258株のリピド中間体生合成変異に関する自然復帰変異株にpcD2ベクターそのものが移入されたことが考えられる。ところで、G258株は、親株のFM3A細胞と同様に球状の浮遊細胞であるので、DNAの移入効率が非常に悪い。そこで、今年度は、新たに、DOTAPを用いたリポフェクション法を試み、従来のDNA-リン酸カルシウムゲル共沈法、および、電気穿孔法と比較した。DNA移入効率はジェネティシン耐性マーカーの移入頻度で測定した。その結果、リポフェクション法は電気穿孔法と同程度のDNA移入効率を示し、DNA-リン酸カルシウムゲル共沈法は、それらの場合より10倍効率が低かった。このような現状から、引続き、電気穿孔法を用いて、G258株の第一次形質転換候補株の集積と解析を行っている。マウス乳癌由来FM3A細胞から、[2-^3H]マンノースを用いたトリチウム自殺法による選択的濃縮を経て分離されたG258株は、単一変異でリピド中間体生合成に関して温度感受性を示し、かつ、細胞増殖に関して温度感受性を示す。今年度はG258株のリピド中間体生合成変異に相補的なcDNAの分離を試みた。G258株は、親株のFM3A細胞と同様に球状の浮遊細胞であるので、DNA移入効率が非常に悪い。日本でFM3A細胞を用いた体細胞変異株が多く分離されているが、それらの変異株を用いたcDNAクローニングの成功例は一例のみである。G258株におけるDNA-リン酸カルシウムゲル共沈法によるジェネティシン耐性マーカーの移入効率は、ポリリジンでコートしたディッシュに、低血清培地で細胞を接着させた場合でも10^<-5>10^<-6>である。また、電気穿孔法ではジェネティシン耐性マーカーの移入効率は10^<-4>である。この電気穿孔法によってpcD2ベクターに組み込まれたヒト肝臓cDNAライブラリーによるG258株の第一次形質転換候補株の分離を試み、得られた候補株から、アンピシリン耐性を指標に、cDNAクローンを大腸菌DH-1株に回収した。現在は、電気穿孔法による移入を更に試みるとともに、移入効率が良い他の方法を開発中である。

ところで、G258株は、親株のFM3A細胞と同様に球状の浮遊細胞であるので、DNAの移入効率が非常に悪い。そこで、今年度は、新たに、DOTAPを用いたリポフェクション法を試み、従来のDNA-リン酸カルシウムゲル共沈法、および、電気穿孔法と比較した。DNA移入効率はジェネティシン耐性マーカーの移入頻度で測定した。その結果、リポフェクション法は電気穿孔法と同程度のDNA移入効率を示し、DNA-リン酸カルシウムゲル共沈法は、それらの場合より10倍効率が低かった。このような現状から、引続き、電気穿孔法を用いて、G258株の第一次形質転換候補株の集積と解析を行っている。
振動型マイクロインジェクション法の有用性の基礎的研究

遺伝子組換え動物作製効率向上のために振動型マイクロインジェクション法(VM)を考案し、その有用性を評価した。本法はマイクロピペットへの縦振動付与によって細胞内刺入および遺伝子導入を容易にすることを目指す。1号機VM装置(可聴域振動付加タイプ)を開発し、無振動の従来型マイクロインジェクション法(OM)を比較対象として、マウスの受精卵でその有用性を評価した。導入DNAはVenus遺伝子、マウスはBDF1を使用し、種々の周波数および振幅で評価した。周波数10kHzの結果を例示する。1.マイクロピペット刺入時の受精卵変形率(刺入し易さの指標)はVMの方が有意に小さく、受精卵への刺入が容易であることが判った。2.前記操作後の卵の発生状況を培養液中で4日間観察した結果、操作卵が胚盤胞期まで成長する比率はVMが有意に高く、OMの2.9倍(821269vs281269)であり、発生状況が有意に良好であった。さらに胚盤胞のVenus発現率もVMの方が有意に高く、OMの2.5倍であった。しかし死亡率はVMの方が若干高い傾向にあった。3.インジェクションの最中にピペットが核DNAを引きずり出し、卵を死亡させる'核引き現象'の頻度を比較すると、VMの方がOMより有意に少ないことも判った。これは、1本のピペットでより多くめ卵操作ができること、ピペット交換の手間も少なくなることを意味し、VMはインジェクション作業の時間効率向上やコスト削減に寄与することも判った。4.超音波縦振動(<=100kHz)を付与できる装置を開発した。超音波振動に起因する細胞傷害の懸念(cavitationや核DNA断片化など)があるため、まず安全性評価を行った。OMを対照として評価した結果、死亡率はVMの方が有意に低く、胚盤胞期進展率も有意に高かったので、超音波振動に起因する細胞傷害は無視できることが判った。本年度は振動型マイクロインジェクション法の周波数を5kHzとし、振幅は15Vの電圧付加で調節した。従来型のマイクロインジェクション法(無振動型)を対象とし、組換えDNAはvenus、マウスはBDF1を使用した。1.venus断片化の有無:venusをインジェクションピペットに入れ、上記の振動条件で1時間振動した後に電気泳動を行ったが、断片化は全く認められなかった。2.インジェクション実験:同一マウスから採卵した受精卵を均等に分配し、無作為に評価した。1本のピペットで1セットの操作を行い、合計14セット施行した。操作卵数はそれぞれ470個であった。但し、インジェクション中に全く組換えDNAが出なかった場合、振動子に異常が発生した場合は評価の対象外とした。1)受精卵刺入時変形率:マイクロピペット刺入時の受精卵の変形率は、無振動型(N=139)で32.7±6.0%(Mean±SD)、振動型(N=195)で26.2±5.9%(P<0.0001、Student's T-test)であり、振動型の方が有意に変形が少なかった。2)発生率:前記操作後の卵の発生状況を培養液中で4日間観察した(培養卵は胚盤胞までしか分裂せず、通常4日後に胚盤胞期に達する)。

無振動型では465個中72個(15.5%)が胚盤胞期まで進み、そのうち30個(全操作卵数中6.5%)にvenusが発現していた。一方、振動型では305個中87個(28.5%)が胚盤胞期まで進み、そのうち27個(8.9%)が発現していた。振動型の方が有意に胚盤胞期まで進展した(P<0.0001、x^2検定)が、venus発現率には有意差は認められなかった。また、無振動型では核DNAの引きずり出し現象は14本のピペット中6本(43%)で認められたが、振動型では14本中2本(14%)でしか認めなかった。以上の結果は振動型の有効性を示すものと考えられる。本年度は種々の周波数および振幅の振動型マイクロインジェクション法を評価した。特に、周波数10kHz、振幅7.9nm(振動子レベル)の結果を示す。従来型のマイクロインジェクション法(無振動型)を対象とし、組換えDNAはVenus遺伝子、マウスはBDF1を31頭使用した。同一マウスから採卵した受精卵を均等に分配し、無作為に評価した。1本のピペットで1セット(30個の受精卵)の操作を行い、合計9セット施行した。1)マイクロピペット刺入時の受精卵の変形率は、無振動型(N=268)で43.1±5.9%(平均±SD)、振動型(N=211)で35.4±4.5%(P<0.0001、Student's T-test)であり、振動型の方が有意に変形が少なかった。2)前記操作後の卵の発生状況を培養液中で4日間観察した。無振動型では269個中28個(10.4%)が胚盤胞期まで進み、そのうち4個(全操作卵数中1.5%)にVenusが発現していた。一方、振動型では269個中82個(30.4%)が胚盤胞期まで進み、そのうち10個(3.7%)が発現していた。結局、振動型の胚盤胞期進展率は無振動型の2.9倍(P<0.0001、x^2検定)であり、Venus発現率は2.5倍であり(P=0.1016)、振動型の方が処理後の胚の発生効率が良いことが判った。3)無振動型では核DNAの引きずり出し現象は9本のピペット中3本(33.3%)で認められたが、振動型では9本中0本(0%)であり(P=0.029、x^2test)、1本のピペットでより多くの操作ができるため経済効率も良いことが判った。また、その他の周波数・振幅でも同様の結果が得られているばかりでなく、振動型は胚盤胞期の内部細胞塊の細胞への遺伝子導入もより簡単に行えることが判った。さらに、超音波領域の周波数での振動型マイクロインジェクション装置の開発も行っている。超音波領域振動型マイクロインジェクション法(UVM)を開発し、まずその安全性評価を行った。超音波領域の振動は可聴域に比べて一般的にエネルギーが大きいため、それによる細胞への傷害が懸念さる(極端な例としてcavitation)。次に、マイクロピペット先端部の横プレによる受精卵傷害の危険性もある。マイクロピペットは約20°曲げられて使用されるため、この状態で縦振動を加えると理論的には"振幅^*sin20°"の横プレが起こることになる。UMVに関わるこれら2つの危険性の有無を振動数70と50kHzで検討した。雌BDF1から採取した受精卵をUVM群と無振動(OM)群に分け、各群30個ずつに1本のマイクロピペットで前核インジェクションを行った。導入遺伝子はGFP遺伝子で、前核がごくわずか膨らむ程度しか注入しなかった(外来DNA注入量が多いと受精卵の死亡率が高くなるので、この影響を小さくするため)。70kHzの結果を以下に示す。
フランチャイズにおける不公正な取引方法についての総合的検討

フランチャイズシステム、特にコンビニエンスストアシステムにおける不公正な取引方法については、公正取引委員会による審決後、問題意識も高まったこともあり、日本においても裁判などがなされているが問題点も多い。東アジア諸国と比較した場合には不公正な取引方法に該当する行為に対しては積極的な規制も行われていると考えられるが、いまだ問題点も多い。さらなる検討が必要である。交付申請書において、本研究は研究期間内に、まず我が国におけるフランチャイズ取引の実態及び法規制の現状について、海外(米国を中心に考えている)の規制実態とも比較する形で明らかにし、我が国におけるフランチャイズ取引における行為に対する不公正な取引方法の適用について、不公正な取引方法に関する再検討の議論を踏まえながら、あるべき規制はどのようなものであるのか、明らかにすることを目的としていると述べた。このため、研究年度初年度に当たる本年は、まず、不公正な取引方法の位置づけについての考え方を整理するため、不公正な取引方法をめぐる問題について幅広く資料を集めた上で、議論状況を整理している。上記のような文献研究に加え、文献・判例からは得られない実際の法規制の特徴及び問題点が明らかとなると考え、米国において資料収集・調査等を3月中盤に行うこととしていたが、3月11日に発生した東日本大震災のために渡米することができなくなった。このため初年度に行う予定であった当該出張は、23年度(24年3月)にフォローアップとして行う予定であった資料収集・調査と併せて行うこととした。22年度繰り越し分として、平成24年3月26日より米国に渡航し、資料収集を行い、また、ワシントンDCにおいて開催されたABA(米国法曹協会)反トラスト部会年次総会に出席し、流通における競争制限及びフランチャイズに関する最新の動向について情報収集を行った。交付申請書において、本研究は、我が国におけるフランチャイズ取引の実態及び法規制の現状について、海外(米国を中心に考えている)の規制実態とも比較する形で明らかにし、我が国におけるフランチャイズ取引における行為に対する不公正な取引方法の適用について、不公正な取引方法に関する再検討の議論を踏まえながら、あるべき規制はどのようなものであるのか、明らかにすることを目的としていると述べている。本年度は、米国におけるフランチャイズの実態を中心に検討し、論文等の検討の他、現地におけるヒアリングなども計画していた。しかしながら、東日本大震災の影響等もあり昨年度のヒアリングが行えなかったこともあり、若干研究計画に遅れが生じた。このため、ヒアリングを24年度に繰り越し、米国ハワイ州において実地調査及び資料収集を行った。米国におけるフランチャイズ契約は、日本のフランチャイズ(特に、コンビニ)契約とは拘束の範囲や程度などにおいて異なると言われていたが、必ずしもそのように言えない事例がありそうである。交付申請書において、本研究は研究期間内に、まず我が国におけるフランチャイズ取引の実態及び法規制の現状について、海外(米国を中心に考えている)の規制実態とも比較する形で明らかにし、我が国におけるフランチャイズ取引における行為に対する不公正な取引方法の適用について、不公正な取引方法に関する再検討の議論を踏まえながら、あるべき規制はどのようなものであるのか、明らかにすることを目的としている。本年度は、昨年度までに行えなかったアジア諸国でのフランチャイズの実態及び問題点を検討することに作業を集中させた。アジア諸国の中でも、経済法の整備が比較的進んでいると考えられる韓国及び台湾でのヒアリングを行い、現在その結果をまとめているところである。また、アジア諸国でのフランチャイズの実態調査と並行し、韓国国立江原大学校における国際シンポジウムにおいて、日本のフランチャイズとその問題点につき講演を行い、韓国及びドイツの研究者と議論を深めた。上記のように、ヒアリングが遅れたこともあり、少しずつ進捗が遅れている。24年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、米国のみならず他のアジア諸国等におけるフランチャイズの現状を把握した上で、日本における問題点を検討したい。