hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Znフィンガー因子の系統的遺伝子単離と転写調節における機能の解析

本研究では、発生や細胞分化に重要な役割を果たしているKruppelタイプZnフィンガー(Kruppel-ZF)遺伝子を系統的に単離し、その転写調節機能を解析することを目的とし、まずPCRに基づく効率のよいKruppel-ZF遺伝子単離法を用いて多数の新規遺伝子を単離した。そのうち2つの新しいKuppel-ZF蛋白(Mszf42/49のちにMRAZ1/2と改名)が、MRAB(Kuppel Associsted Box)と呼ばれる特徴的なドメインを持ち、GAL4DNA結合ドメインと融合させると、MRABドメインとGAL4結合配列に依存して転写を抑制することを見い出した。さらにMRAZ1/2のMRABドメインと、KAP-1(MRAB Associated Protein-1)と呼ばれる蛋白が特異的に結合するとともに、KAP-1自身に強い転写抑制活性があることを明らかにした。そこでKAP-1のKRABとの結合ドメインと転写抑制ドメインを詳細に決定したのちに、KRAZ1/2,とKAP-1が細胞内で機能的に結合しうるかmarmma1ian two-hybrid assayにより検討した。すなわちKAP-1とVP16転写活性化ドメインの融合蛋白を、GAL4KRAZl/2と共発現させると、転写抑制ドメインを欠失したKAP-1変異体では、GAL4-KRAZ1/2によって抑制されていた転写が、逆に顕著に活性化されたのに対して、全長のKAP-1では転写抑制ドメインが優勢に働き、転写は抑制された。これらの結果から、KRAZ1/2,とKAP-1が実際に細胞内で相互炸用し、さらにはKAP-1が、MRAB-ZF蛋白との複合体において機能的なco-repressorとして転写を抑制することを初めて証明した。本研究では。KruppelタイプZnフィンガー転写因子の特徴的な構造を標的とした、RT-PCR法による高感度かつ効率の良いクローニングシステムを確立し、多くの新しいKruppelタイプZnフィンガー遺伝子を単離した(論文投稿中)。次にいくつかのクローンの全長cDNAを単離したところ、2つの新規遺伝子Mszf42,49が、Kruppel associated box(KRAB)と呼ばれるドメインを持つサブファミリーに属し、また他の1つの新規遺伝子Mszf35が、Leucin rich repeat(LeR)と呼ばれるドメインを持つことが明らかになった。そこでこれらの因子が転写に対してどのような調節機能を有するか調べるために、これらの因子と酵母GAL4蛋白のDNA結合ドメインとの融合蛋白が、GAL4結合配列を上流に持つレポータープラスミドの転写活性に及ぼす影響を、ルシフェラーゼアッセイにより検討した。その結果、KRABを持つMszf42と49は濃度依存的かつGAL4結合配列に依存して転写を抑制すること、逆にLeRを持つMszf35はbasalなプロモーターに対して非常に弱いながら転写を活性化するものの、その活性化にはLeRは必要でないことがわかった。さらにMszf42と49のKRABドメインに結合する蛋白を検索したところ、KAP-1と呼ばれる蛋白がin vitro、in vivoともにMszf42と49と特異的に相互作用すること、またKAP-1をGAL4蛋白DNA結合ドメインとの融合蛋白として、直接標的DNA配列にrecruitすると転写を強く抑制することから、KAP-1がMszf42と49のKRABドメインに結合し、その転写抑制のmediatorいわゆるco-repressorとして機能することを明らかにした(論文投稿準備中)。今後は、KRABを持つMszf42と49のKAP-1を介する転写抑制の分子機構を詳細に解析を続けるとともに、その細胞生物学的な機能に関しても解析を行っていく予定である。
心筋細胞内酸素輸送の虚血に対する適応

1.ミトコンドリアの酸素消費の結果生じると考えられている細胞内酸素分布の不均一性を可視化するために、昨年度までに構築した高解像度多波長顕微分光システムの使用波長を最適化した。その結果、ミオグロビンのγ帯に相当する410nm、420nm、445nmの3波長を用いることで、単一分離心筋細胞内のミトコンドリアの局在を明瞭に画像化するとともに、細胞質ミオグロビンの酸素化度を定量できることを示した。2.1で述べたシステムを用い、細胞外酸素分圧と細胞内酸素分圧の関係を調べた。対照細胞では、細胞外酸素分圧を約7Torrまで低下させると、細胞質ミオグロビンの脱酸素化が観察された。一方、単離心筋細胞の酸素消費量を脱共役剤を用い約2倍に増加させた場合、ミオグロビンのP_<50>値(25 Torr)に比べ顕著に高い細胞外酸素分圧(約28 Torr)ですでにミオグロビンの脱酸素化がおこることがわかった。これらの結果は、細胞内外の酸素拡散抵抗がミトコンドリアへの酸素供給を規定する重要の因子であることを示唆する。3.酸素消費量増加に伴う細胞内脱酸素化が、細胞内に形成される酸素分圧勾配の増加によるものかどうかを検討するために、細胞内酸素分布の高解像度画像化をおこなった。2に述べた条件下で、特にミトコンドリア近傍に大きな酸素分圧の不均一性(酸素分圧勾配)が生じることを示した。現在、細胞内に形成される酸素分圧勾配の絶対値およびその細胞外酸素分圧への依存性を検討中である。1.今回no補助金により購入したプログラマブル分光ユニットを用い、単離心筋細胞を対象とした多波長顕微分光システムを構築した。新しく考案したデータ処理アルゴリズムにより、細胞内光吸収量の絶対値を2次元画像として得ることができた。この結果、単一細胞で、ミトコンドリアの大きさに匹敵する極めて高い空間分解能(<1μm)をもった分光計測が可能であることを示した。2.上記システムを用い、単一心筋細胞の光吸収スペクトラムを波長400nm500nmで測定した。酸素化および脱酸素化した細胞の光吸収ピークは、それぞれ416nmおよび432nmであり、すでに知られている精製ミオグロビンの吸収ピーク(γ帯)とほぼ一致した。3.上記システムでミオグロビンのγ帯に相当する波長を用い、一個の心筋細胞の平均細胞内酸素分圧が測定可能なことを示した。さらにこの結果を利用し、細胞内外の酸素分圧勾配を定量したところ、静止単一心筋細胞で約2Torrの酸素分圧勾配が観測された。また、この酸素分圧勾配は低酸素となるに伴い減少することを見いだした。この結果を、虚血および低酸素に対する細胞内酸素輸送の適応現象のひとつと解釈した。4.ミオグロビンのγ帯に相当する波長で、単一心筋細胞内に光吸収の不均一性が存在することを、再現性よく画像化できた。これをミトコンドリアの酸素消費に起因する細胞内部の酸素分圧分布の不均一性を反映するものと考えている。現在ミトコンドリアの細胞内所在の分光学的同定を行っており、ミトコンドリアの局在と光吸収(すなわち酸素分圧)の不均一性の関係を検討している。

対照細胞では、細胞外酸素分圧を約7Torrまで低下させると、細胞質ミオグロビンの脱酸素化が観察された。一方、単離心筋細胞の酸素消費量を脱共役剤を用い約2倍に増加させた場合、ミオグロビンのP_<50>値(25Torr)に比べ顕著に高い細胞外酸素分圧(約28Torr)ですでにミオグロビンの脱酸素化がおこることがわかった。これらの結果は、細胞内外の酸素拡散抵抗がミトコンドリアへの酸素供給を規定する重要な因子であることを示唆する。3.酸素消費量増加に伴う細胞内脱酸素化が、細胞内に形成される酸素分圧勾配の増加によるものかどうかを検討するために、細胞内酸素分布の高解像度画像化をおこなった。2に述べた条件下で、特にミトコンドリア近傍に大きな酸素分圧の不均一性(酸素分圧勾配)が生じることを示した。現在、細胞内に形成される酸素分圧勾配の絶対値およびその細胞外酸素分圧への依存性を検討中である。
気管支喘息発作後期における気道閉塞解除機構の解明とその臨床応用

今回、私共が開発した即時型および遅発型喘息反応モデル(モルモット)を用い、厳密かつ効率よく実験できる測定系を構築した。すなわち、対照を必ず用意し、複数の条件下の個体を同時に検討できるよう、4匹同時に肺抵抗を連続的に測定する装置を開発した。これを用いて検討した結果、抗原吸入後の遅発型喘息反応の際、気道への好酸球浸潤がピークに達する前に肺抵抗は下がり始めることを確認した。病理学的な好酸球性炎症と生理学的な気道閉塞症状がアンカップリングを起こしてくるのか、それともこの両者が本来別々に調節されているのかを検討する目的で、まず、炎症細胞の機能および数を修飾した。肥満細胞の脱顆粒を選択的に抑制する薬剤を投与した後、抗原吸入チャレンジを施行したところ、即時型および遅発型喘息反応は薬剤用量依存的に抑制されたが気道への好酸球浸潤は抑制されなかった。次に、ステロイドを投与した後、抗原吸入チャレンジを施行したところ、即時型喘息反応は抑制されなかったが、遅発型喘息反応と気道への好酸球浸潤は薬剤用量依存的に抑制された。さらに、モルモットに8GyのX線を全身照射し、IgE,IgGl量および肥満細胞の機能は温存したままリンパ球を枯渇させた状態で抗原吸入チャレンジを施行したところ、即時型喘息反応は抑制されなかったが、遅発型喘息反応も気道への好酸球浸潤も消失し、これは別個体から採取したリンパ球を移入することで回復した。すなわち、抗原吸入誘発後の遅発相における気道閉塞反応は肥満細胞とリンパ球の両者に依存し、同時相にみられる気道への好酸球浸潤はリンパ球にのみ依存することが明らかとなった。
リチウムのホスホジエステラーゼ4(PDE4)の機能発現に及ぼす影響に関する研究

1方法Sprague-Dawley系雄性ラット(日本チャールズリバー)にリチウムと三環系抗うつ薬のイミプラミンを同時に投与し、これらの併用投与がPDE4B機能発現に及ぼす影響について検討した。リチウムは0.2%炭酸リチウム含有飼料として経口的に投与し、イミプラミンは15mg/kg、1日1回腹腔内投与とした。投与2週間後に前大脳皮質、海馬を採取し、RNA抽出キットによりtotal RNAを抽出した。1検体につき20μgのtotal RNAを用い、ノーザンブロット法により定量的に解析した。ハイブリダイゼーションはホスホジエステラーゼ4B(PDE4B)特異的cRNAプローブを用いて、65°Cで18時間行った。また、断頭時に採血し、リチウム、イミプラミンの血清中濃度を測定した。統計はMann-Whitney U検定を用い、有意水準は0.05とした。2結果(1)血清リチウム、イミプラミン濃度血清リチウム濃度は、0.1%および0.2%炭酸リチウム含有飼料4週間投与群でそれぞれ、1.14±0.26mEq/l(n=9)であった。また、血清イミプラミン濃度は227±100ng/ml(n=6)であった。リチウム、イミプラミンともに血清中濃度は人における治療濃度域内であった。(2)ノーザンブロット法による解析結果炭酸リチウムおよびイミプラミン併用投与群では、海馬において対照群と比較して118.7±8.7%(n=5;p<0.05;Mann-Whitney U test)と有意な増加を認めた。一方前大脳皮質では、対照群と比較して有意な変化は認められなかった。3考察本結果から、ラット海馬におけるPDE4BmRNAの上昇がリチウムの抗うつ作用の増強効果に関係することが示唆された。1方法Sprague-Dawley系雄性ラット(130-150g)(日本チャールズリバー)に0.05%、0.1%および0.2%炭酸リチウム含有飼料を4週間投与した。対照群のラットには、炭酸リチウム非含有飼料を与えた。全てのラットは0.9%生理食塩水を自由に飲水できるようにした。尾採血を行い、原子吸光法で血清リチウム濃度を測定した。また、大脳皮質、海馬を採取し、RNA抽出キットによりtotal RNAを抽出した。2結果(1)血清リチウム濃度血清リチウム濃度は、0.05%、0.1%および0.2%炭酸リチウム含有飼料4週間投与群でそれぞれ、0.357±0.06mEq/l(n=6),0.468±0.03mEq/l(n=6),1.135±0.245mEq/l(n=9)であった。(2)ノーザンブロット法による解析結果0.2%炭酸リチウム4週間投与群では、前頭皮質において対照群と比較して129.72±8.7%(n=6;p<0.05;Mann-Whitney U test)と有意な増加を認めた。一方海馬では、対照群と比較して83.13%(n=6;p<0.01;Student t test)と有意な減少を認めた。0.1%炭酸リチウム投与群では、有意な変化は認められなかった。
prolineに富む内因性抗菌ペプチドPR-39を用いたシグナル伝達ブロックによる肝癌転移の遺伝子治療

PR-39はブタの小腸粘膜および白血球から精製されたprolineに富む内因牲の抗菌ぺプチドである.我々は,このPR-39がproteoglycan型接着分子であるsyndecanの発現を誘導するとともに,肝癌細胞の固有運動能を低下させ,細胞形態とactin構造に変化を起こすことを明らかにした.また,近年,PR-39が白血球のp47phoxのSH3 domainに結合しNADPHoxidaseの活性を抑えるという報告やPR-39がSH3 domainを有するシグナル伝達分子であるp130Casに結合するという報告が出された.そこで我々は,PR-39のシグナル伝達における機能を明らかとするために,最もよくシグナル伝達系が解明されているrasの系を用いてその増殖能に及ぼす影響と技能について検討した.ブタPR-39 cDNAをhuman acti-vated k-rasによりtransformしたNIH3T3細胞へ導入し,activated k-rasおよびPR-39蛋白をともに発現しているクローンを得た.このPR-39 transfectantについてactin構築,in vitroでの細胞増殖能,in vivoでの腫瘍形成能,Elk-1を基質としたMAPkinase活性,cyclinD1の発現およびPR-39の結合蛋白について検討した.PR-39 transfectantではコントロールのrast transformantに比べ,actin stressfiberが出現し,細胞増殖能および移植後2週での腫瘍形成能が低下していた.また,MAPkinase活性およびcyclinD1の発現が低下していた.Tagとして融合したhemagglutininに対する抗体を用いた共沈法により複数の蛋白がPR-39と結合していることが明らかとなった.PR-39の遺伝子導入はrasのシグナル伝達系に影響を及ぼし,その細胞増殖を抑制した.この機序としてPR-39のproline richregionがシグナル伝達系のSH3 domainを有するある蛋白に結合し,シグナルをブロックすることが想定された.PR-39はブタの小腸粘膜および白血球から精製されたprolineに富む内因牲の抗菌ぺプチドである.我々は,このPR-39がproteoglycan型接着分子であるsyndecanの発現を誘導するとともに,肝癌細胞の固有運動能を低下させ,細胞形態とactin構造に変化を起こすことを明らかにした.また,近年,PR-39が白血球のp47phoxのSH3 domainに結合しNADPHoxidaseの活性を抑えるという報告やPR-39がSH3 domainを有するシグナル伝達分子であるp130Casに結合するという報告が出された.そこで我々は,PR-39のシグナル伝達における機能を明らかとするために,最もよくシグナル伝達系が解明されているrasの系を用いてその増殖能に及ぼす影響と技能について検討した.ブタPR-39 cDNAをhuman acti-vated k-rasによりtransformしたNIH3T3細胞へ導入し,activated k-rasおよびPR-39蛋白をともに発現しているクローンを得た.このPR-39 transfectantについてactin構築,in vitroでの細胞増殖能,in vivoでの腫瘍形成能,Elk-1を基質としたMAPkinase活性,cyclinD1の発現およびPR-39の結合蛋白について検討した.PR-39 transfectantではコントロールのrast transformantに比べ,actin stressfiberが出現し,細胞増殖能および移植後2週での腫瘍形成能が低下していた.また,MAPkinase活性およびcyclinD1の発現が低下していた.Tagとして融合したhemagglutininに対する抗体を用いた共沈法により複数の蛋白がPR-39と結合していることが明らかとなった.PR-39の遺伝子導入はrasのシグナル伝達系に影響を及ぼし,その細胞増殖を抑制した.この機序としてPR-39のproline richregionがシグナル伝達系のSH3 domainを有するある蛋白に結合し,シグナルをブロックすることが想定された.1.方法1) Vectorの作成と遺伝子導入金コロイドをカバースリップにコートして細胞によりコロイドが貧食された面積を計った。4) Actinの染色2.結果1) PR-39遺伝子のヒト肝癌細胞株への導入PR-39遺伝子をSyndecan-1の発現が低下していて高い浸潤能を特つHLF細胞に導入した。トランスフェクタントは高いSyndecan-1の発現誘導とともに,type-l collagenに対して著しい浸潤能の低下を示し,phagokinetic track法を用いた運動能の検索でも低下を示した。細胞形態は紡錘形からコンパクトな多角形へと変化し,Actin構築の変化も認めた。2) Syndecan-1遺伝子のヒ卜肝癌細胞株への導入マウスSyndecan-1遺伝子をHLE細胞に導入した。トランスフェクタントはtype-1 collagenに対して著しい浸潤能の低下を示したが,phagokinetic track法を用いた運動能の検索では変化は認められなかった。また,細胞形態またはActin構造にも変化は認めなかった。PR-39はブタの小腸粘膜および白血球から精製されたprolineに富む内因性の抗菌ペプチドである。我々は、このPR-39がproteoglycan型接着分子であるsyndecanの発現を誘導するとともに、肝癌細胞の固有運動能を低下させ、細胞形態とactin構造に変化を起こすことを明らかにした。また、近年、PR-39が白血球のp47phoxのSH3 domainに結合しNADPHoxidaseの活性を抑えるという報告やPR-39がSH3 domainを有するシグナル伝達分子であるp130Casに結合するという報告が出された。

そこで我々は、PR-39のシグナル伝達における機能を明らかとするために、最もよくシグナル伝達系が解明されているrasの系を用いてその増殖能に及ぼす影響と機能について検討した。ブタPR-39cDNAをhumanactivated k-rasによりtransformしたNIH3T3細胞へ導入し、activated k-rasおよびPR-39蛋白をともに発現しているクローンを得た。このPR-39 transfectantについてactin構築、in vitroでの細胞増殖能、in vivoでの腫瘍形成能、Elk-1を基質としたMAPkinase活性;cyclinD1の発現およびPR-39の結合蛋白について検討した。PR-39 transfectantではコントロールのrastransformantに比べ、actin stress fiberが出現し、細胞増殖能および移植後2週での腫瘍形成能が低下していた。また、MAPkinase活性およびcyclinD1の発現が低下していた。Tagとして融合したhemagglutininに対する抗体を用いた共沈法により複数の蛋白がPR-39と結合していることが明らかとなった。PR-39の遺伝子導入はrasのシグナル伝達系に影響を及ぼし、その細胞増殖を抑制した。この機序としてPR-39のproline richregionがシグナル伝達系のSH3 domainを有するある蛋白に結合し、シグナルをブロックすることが想定された。
生体内ビタミンCの加齢依存的変動機構の解明

Senescence marker protein(SMP30)は加齢に伴い肝臓で減少する。SMP30は、多くの哺乳類の体内でビタミンC合成に必須の酵素グルコノラクトナーゼである。ヒトと同様に、SMP30遺伝子を破壊(ノックアウト)したマウス(SMP30-KOマウス)はビタミンCを生合成しない。SMP30-KOマウスはビタミンCの長期的な不足で寿命が短縮する。ヒトでは、血中ビタミンCが加齢で減少する。従って、老化とビタミンCの不足には、密接な関係が窺える。ビタミンCは、カテコールアミン(ドーパミン、ノルアドレナリン、アドレナリン)の生合成酵素、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)及びドーパミン-β-ヒドロキシラーゼ(DBH)の活性化に補因子として必要とされる。ビタミンCの加齢に伴う減少により、カテコールアミンも減少する可能性が考えられる。カテコールアミンは脳や副腎で合成され、神経伝達物質やホルモンとして重要な役割を担うとされる。しかしながら、ビタミンCの生体内におけるカテコールアミン合成系への役割は不明な点が多い。そこで本年度は、ビタミンC欠乏状態のSMP30-KOマウスにおけるカテコールアミン濃度およびカテコールアミン生合成酵素の遺伝子発現の変化を調べた。結果、ビタミンCの欠乏した副腎においてアドレナリン、ノルアドレナリン濃度が減少した。従って、ビタミンCは生体内で確かにDBHの活性化に必要であることを明らかにした。本成果はEuropean Journal of Nutritionに投稿、受理された。更に、カテコールアミンが加齢依存的に生体内で減少するかを明らかにするため、野生型マウス副腎におけるカテコールアミン濃度、および合成酵素の遺伝子発現の加齢に伴う変動を調べた。本研究により、マウス副腎でカテコールアミン濃度およびアドレナリン合成酵素のフェニルエタノールアミンNメチルトランスフェラーゼの発現が加齢で減少することがわかった。本成果は、Geriatrics & Gerontology Internationa1に掲載された。本年度は、細胞内におけるビタミンC輸送体の加齢依存的変動の解析から発展して、生合成酵素の活性化にビタミンCが必要とされるカテコールアミンの加齢依存的変動についても明らかにすることができた。カテコールアミンは生体内で神経伝達物質やホルモンとして機能する。更に、体内ビタミンCの欠乏がマウス副腎のカテコールアミン濃度や合成酵素遺伝子の発現に与える影響についても、初めて明らかにすることができた。計画は概ね順調に進展していると考える。加齢指標タンパク質30(SMP30)は、加齢に伴い肝臓や腎臓で減少する。SMP30は、ビタミンC生合成に必須のグルコノラクトナーゼである。SMP30遺伝子破壊(ノックアウト)マウス(SMP30-KOマウス)は、ヒトと同様にビタミンCを生合成できない。老化とビタミンCの不足には、密接な関係が窺える。しかしながら、生体内ビタミンCの加齢依存的な変動機構は不明である。また、細胞外からのビタミンCは、特異的輸送体であるSodium-dependent vitamin C transporter(SVCT)1,2により細胞内へ取り込まれる。本年度は、SVCT1,2の加齢変化を調べた。結果、老齢マウスの肝臓ではSVCT2mRNAの発現が増加することを明らかにした。一方、ビタミンCの排出輸送体は未だ不明である。小腸から吸収されたビタミンCはまず肝臓へと運ばれたのち、他の臓器へと分配されることから、肝臓にはビタミンC排出機構が存在すると考えられる.ビタミンC排出輸送体を探索するため、SMP30-KOマウス由来の不死化肝実質細胞株の樹立を行い、Journal of biochemistryに成果を報告した。樹立細胞株はビタミンC合成能を欠損しており、ビタミンCの動態解析に非常に有用である。本細胞株により、ビタミンC排出を陰イオンチャネル阻害剤、5-Nitro-2-(3-phenyl propyl amino)benzoic acidが阻害する可能性も示唆された。更に、ビタミンCはカテコールアミン(ドーパミン、ノルアドレナリン、アドレナリン)生合成酵素、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)及びドーパミン-β-ヒドロキシラーゼ(DBH)の活性化に補因子として必要とされる。ビタミンCの加齢に伴う減少によってカテコールアミンも減少する可能性を考え、本研究では生体でのビタミンC欠乏がカテコールアミン生合成に及ぼす影響を調べた。結果、ビタミンCは生体内で確かにDBH活性化に補因子として働き、THの活性化には必須ではない可能性も示唆された。

しかしながら、ビタミンCの生体内におけるカテコールアミン合成系への役割は不明な点が多い。そこで本年度は、ビタミンC欠乏状態のSMP30-KOマウスにおけるカテコールアミン濃度およびカテコールアミン生合成酵素の遺伝子発現の変化を調べた。結果、ビタミンCの欠乏した副腎においてアドレナリン、ノルアドレナリン濃度が減少した。従って、ビタミンCは生体内で確かにDBHの活性化に必要であることを明らかにした。本成果はEuropean Journal of Nutritionに投稿、受理された。更に、カテコールアミンが加齢依存的に生体内で減少するかを明らかにするため、野生型マウス副腎におけるカテコールアミン濃度、および合成酵素の遺伝子発現の加齢に伴う変動を調べた。本研究により、マウス副腎でカテコールアミン濃度およびアドレナリン合成酵素のフェニルエタノールアミンNメチルトランスフェラーゼの発現が加齢で減少することがわかった。本成果は、Geriatrics & Gerontology Internationa1に掲載された。本年度はSVCT1,2の野生型マウスにおけるmRNAの発現の加齢変化を解析し、マウス副腎のSVCT2および肝臓のSVCT1 mRNA発現に変化がない一方で、肝臓SVCT2の発現は24ヶ月齢で増加することを明らかにしている。また、ビタミンCを排出する輸送体を探索するため、ビタミンCを合成できないSMP30ノックアウトマウス由来の不死化肝実質細胞株の樹立に成功し、Journal of biochemistryに報告することができた。計画は概ね順調に進展しているものと考える。本年度は、細胞内におけるビタミンC輸送体の加齢依存的変動の解析から発展して、生合成酵素の活性化にビタミンCが必要とされるカテコールアミンの加齢依存的変動についても明らかにすることができた。カテコールアミンは生体内で神経伝達物質やホルモンとして機能する。更に、体内ビタミンCの欠乏がマウス副腎のカテコールアミン濃度や合成酵素遺伝子の発現に与える影響についても、初めて明らかにすることができた。計画は概ね順調に進展していると考える。老化によりビタミンCの取り込みが減少する可能性を検討するため、現在、肝臓および副腎以外の臓器におけるSVCT1,2mRNAの加齢変化についても定量的PCRによる解析を進めている。老化によりビタミンCの排出が増加する2つの可能性を検討するため、樹立した細胞株において明らかになった陰イオン阻害剤におけるビタミンCの排出の阻害について、引き続き樹立細胞株およびHPLCを用いた薬剤作用条件の検討を行っていく。また同時に、他の薬剤による阻害実験も行い、作用する輸送体の絞り込みを行う予定である。
アルツハイマー病βアミロイド線維の試験管内形成及び分解機構の解明

1.研究の目的。我々はこれまでに、アルツハイマー病βアミロイド線維(fAβ)の試験管内形成過程を、チオフラビンTを用いた分光蛍光定量法、及び閉鎖反応系を駆使して速度論的に解析して来た。その結果、Aβ蛋白からの線維形成過程が重合核依存性重合モデルで説明出来ることを明らかにした。このモデルは重合核形成過程、及び線維伸長過程より成るが、後者の過程は一次反応速度論形式に従う。これは、線維伸長が重合と脱重合の動的平衡過程であること、すなわちfAβの伸長・短縮が、Aβ蛋白の重合核あるいはfAβ断端へのstep by stepな重合、あるいはfAβ断端からのstep by stepな脱重合により起こることを示している。今回、より生体に近いモデルとして、系外からAβ蛋白が供給され続ける開放反応系を構築し、fAβの伸長、及び脱重合機構を解析した。2.成果。表面プラズモン共鳴法(SPR)を用いた反応系を構築した。最初に、重合核となるfAβをセンサーチップ上に固定化した。次いで、リン酸緩衝液(pH7.5)に溶解した各種濃度のAβ蛋白溶液を連続的に添加し、37°CにおけるfAβの伸長及び脱重合過程をリアルタイムで測定した。その結果fAβ伸長反応の初速度は、添加したAβ蛋白の濃度に比例した。これは、開放反応系においても、fAβ伸長過程が上記一次反応速度論形式に従うことを示している。さらに、Aβ蛋白を含まない緩衝液を添加すると、fAβが脱重合することを示した。次いで、重合速度と脱重合速度が均衡する濃度(臨界モノマー濃度)を直接測定したところ、約0.2μMであった。3.結語。SPRを用いた開放反応系によってfAβの伸長、および脱重合機構を解析することができた。現在、アポE等の生体分子や種々の有機化合物が上記過程に及ぼす影響を検討している。1.研究の目的。2.成果。3.結語。
内殻分極を考慮したモデルポテンシャル法の開発による水素吸蔵分子材料の理論設計

本研究課題においては、水素吸蔵特性を示す金属ナノクラスターと水素原子の相互作用解析を量子化学計算によっておこない、水素吸蔵材料の設計指針を理論的な観点から得ることを目的としている。実験から,Pdナノ粒子の水素吸蔵速度は{111}面に比して{100}面の方が速いという結晶面依存性があることが報告されている.そこで、本年度は相対論的量子化学計算および反応性力場を用いた分子動力学(MD)計算を用い、水素吸蔵速度の結晶面依存性に関して解析をおこなった。水素吸蔵過程を(1)水素原子のナノ粒子表面からナノ粒子のサブサーフェイス領域への侵入過程(2)サブサーフェイス領域からナノ粒子での拡散過程の2つに分け解析した。(1)の過程検討より、Pdナノ粒子における水素原子の吸蔵速度の結晶面依存性は、{111}結晶面から水素原子がナノクラスター内部へ侵入する際のエネルギーバリアが0.28 eV (6.46kcal mol-1)低いことに由来することが分かった。また、ナノ粒子内部での水素挙動においても、{111}面を露出させた八面体ナノ粒子のほうが、水素原子拡散係数は大きくより速く動くことができることも分子動力学計算によって明らかにされた。本研究結果は、Chem. Phys. Lett.誌に掲載されると共に、ナノ学会若手優秀ポスター賞の受賞,およびSCM社の量子化学計算プログラムパッケージADFのHighlight欄(https://www.scm.com/category/highlights/)で紹介されるという形で外部から高く評価されている。本研究より水素吸蔵特性を調整する上で、金属種の組み合わせ・構造の制御だけではなく形状制御も重要であることが理論的に示された。27年度が最終年度であるため、記入しない。低環境負荷エネルギーとして水素が注目され、水素貯蔵媒体として水素吸蔵金属の開発が求められている。バルクPdは高い水素吸蔵特性を示すが,バルクPtは水素を全く吸蔵しない。近年、水素吸蔵特性の改良を狙って、山内らによってPd, Ptナノ粒子が合成された。Pdナノ粒子は,期待と裏腹に水素吸蔵特性の低下を招く。一方、Ptはナノ粒子化により水素吸蔵能を示すようになる。これらは、ナノ粒子化によって電子状態が変化したことを示唆する結果である。初年度は、Pd・Ptクラスターに対する水素吸蔵特性の違いを量子化学計算により解析し、その結果を報告する。本研究では立方八面体のM_<55>クラスター(M=Pd, Pt)をモデルとして、PBEレベルの密度汎関数計算を行った。Pd, Ptクラスターと水素原子の相互作用エネルギー解析の結果、1(111)面からの水素吸蔵が(100)面からの水素吸蔵よりエネルギー的に有利であること、2Pd_<55>の方が安定な水素吸蔵ポテンシャルをもち水素吸蔵に有利であること、3Mss (M=Pd, Pt)いずれについても、クラスター内では八面体サイトが最安定サイトであることの3点が明らかになった。更にPd_<55>とPt_<55>に対する水素原子の安定性の違いの起源を探るために、先のPd_<55>, Pt_<55>内の水素原子が存在する八面体型サイトを抜き出したモデルについてエネルギー成分分割解析を行った。その結果、PtクラスターはPdクラスターに比べ交換反発エネルギーが大きく、これがPtクラスター内の水素原子の不安定化の主要因であることが明らかになった。Electron localization function (ELF)の解析結果は、Pt系で見られた大きな電子間反発は原子価5d軌道の相対論的膨張によってもたらされたものであることを示す。クラスターの電子状態が、水素吸蔵特性を制御していることが分かった。従来実験からは、Pd/Pt合金ナノ粒子の水素吸蔵特性はPt混成比によって変化し、Pt組成比8%、50%でそれぞれ0.40、0.20 H/Mであることが報告されている。この結果はPtの組成比によって水素吸蔵特性が調整されることを示す。本年度は、電子状態と水素吸蔵特性の関係を明らかにするため、Pd/Pt合金ナノクラスターの電子状態解析をおこなったのでその結果を報告する。立方八面体のPd48Pt7(Pt 13%)、Pd25Pt30(Pt 54%)をモデルとして、PBEレベルの密度汎関数計算を行った。従来、水素吸蔵特性には、dバンドの空き(dホール)と相関があると報告されていた為、各クラスターの状態密度(DOS)解析を行った。結果、クラスター間でdホールに大きな違いは見られず、水素吸蔵特性はdホールによって決定づけられないことが示された。そこで、Pt組成比の違いによる水素吸蔵量の違いの起源を探る為に、空間的な電子分布を解析した。クラスター内の水素原子の安定性の違いは、「電子密度分布の違いによって生じる交換反発の大きさの違い」から説明することができる。各クラスターのElectron Localization Function(ELF)を3次元的に可視化した図よりPd25Pt30の電子対分布がより広がっていることが明らかになった。この広がりはPt原子の5d軌道の相対論的膨張による。

本結果は水素原子とPd25Pt30の交換反発がPd48Pt7より大きいことを示唆する。Pt組成比の違いによって水素原子の安定性が調整されることを示唆する結果である。本研究課題においては、水素吸蔵特性を示す金属ナノクラスターと水素原子の相互作用解析を量子化学計算によっておこない、水素吸蔵材料の設計指針を理論的な観点から得ることを目的としている。実験から,Pdナノ粒子の水素吸蔵速度は{111}面に比して{100}面の方が速いという結晶面依存性があることが報告されている.そこで、本年度は相対論的量子化学計算および反応性力場を用いた分子動力学(MD)計算を用い、水素吸蔵速度の結晶面依存性に関して解析をおこなった。水素吸蔵過程を(1)水素原子のナノ粒子表面からナノ粒子のサブサーフェイス領域への侵入過程(2)サブサーフェイス領域からナノ粒子での拡散過程の2つに分け解析した。(1)の過程検討より、Pdナノ粒子における水素原子の吸蔵速度の結晶面依存性は、{111}結晶面から水素原子がナノクラスター内部へ侵入する際のエネルギーバリアが0.28 eV (6.46kcal mol-1)低いことに由来することが分かった。また、ナノ粒子内部での水素挙動においても、{111}面を露出させた八面体ナノ粒子のほうが、水素原子拡散係数は大きくより速く動くことができることも分子動力学計算によって明らかにされた。本研究結果は、Chem. Phys. Lett.誌に掲載されると共に、ナノ学会若手優秀ポスター賞の受賞,およびSCM社の量子化学計算プログラムパッケージADFのHighlight欄(https://www.scm.com/category/highlights/)で紹介されるという形で外部から高く評価されている。本研究より水素吸蔵特性を調整する上で、金属種の組み合わせ・構造の制御だけではなく形状制御も重要であることが理論的に示された。平成26年度は、申請時に第三年度の課題として設定していたPd/Pt合金ナノ粒子の電子状態計算をおこない、電子状態と水素吸蔵特性の相関について更なる知見を得ようと試みた。Pt組成比による電子状態変化と水素吸蔵特性の関係を明らかにすることは水素吸蔵合金の理論設計をする上で重要である。本年度は、(1)水素吸蔵特性がd-バンドの空きだけで説明することができないこと(2) Pt組成比によってクラスターの電子密度分布が調整されることを明らかにした。これらは、水素吸蔵材料を電子状態の情報を用いて理論設計する際の知見の1つになると考えられる。尚、計算負荷軽減を可能にする新たな相対論的量子化学計算法:CPーMCP法のプログラム実装はまだ完了しておらず、次年度の完了を目指す。合金クラスターを用いた解析結果より、本研究は「おおむね順調に進展している」と判断する。27年度が最終年度であるため、記入しない。3年目は、Pd/Pt合金ナノクラスターに加え、結晶面の違いによる水素吸蔵特性の違いに着目して水素吸蔵特性と電子状態および構造の関係に対してさらなる知見を得たい。また、原子数を増やしたモデルを扱うために理論式の導出が完了しているCP-MCP法のプログラム実装の完了を目指す。実装が完了した際は、分光学定数が既知の金属水素化物PdH・PtHの計算により検証する。
チタンの溶融塩電解

NaCl-KCl等モル溶融塩には、TiCl_2が、740°Cで少なくとも8mol%以上溶解した。LiCl-KCl共晶塩であるが、過去に溶解度が0.2mo1%としていた文献があり、これは間違いの可能性がある。また純NaClに800°Cで42mol%の溶解度があると報告している文献もあり、こちらがより正しいと推察される。電解実験は、実験の都合上、NaCl-KCl等モル溶融塩よりも融点の低いNaCl-25mass %KCl-45mass%CsCl溶融塩を用いて行った。仕込み組成1mol%濃度に相当するTiCl_3を仕込み、540°Cで金属チタンをアノードとして定電流電解を行うと、まずチタン薄膜が電析し、その後チタンが不均一に成長した。従って、最初、物質拡散律速でなかった電極反応が次第に物質拡散律速に変化した可能性がある。これは、回転電極を用いた場合でも同様であったが、回転電極を300rpm程度にすると、チタン電析膜の厚さの増加傾向が認められた。膜厚は、60分の-200mA/cm^2の定電流電解でおよそ、0.22.8ミクロン程度であった。また、薄膜部には酸素濃度が高いという特徴もあった。これは電解初期に溶融塩中の酸素濃度が高かったためと推測される。また、電解に寄らずチタンの不均化反応によっても、溶融塩に浸漬させるだけで非常に薄いチタン膜が得られた。その厚さは、60時間で、わずか0.2ミクロン以下であり、電析したチタン膜よりもはるかに薄い。一方、沖らによって報告されている定電位パルス電解でも電解実験を試行し、報告通りチタン電極に対して、1.5s-0.25V、1.5秒OVのパルス電解を行うと、90分の電解で0.2ミクロン程度の良好なチタン膜が成長した。
ハイスループットスクリーニングを用いた小細胞肺癌の新規診断法と治療法開発

肺癌のなかで悪性度が高い小細胞肺癌(SCLC)は効果的な早期診断法及び治療法が必要とされている。最近、SCLC特異的スプライシングアクティベーターnSR100(Srrm4)の発現上昇が腫瘍形成に著しく関与しているデータを報告した。本研究では、nSR100発現に関与すると推測されるmiRNAに関して患者血液中の発現を解析した結果、SCLC特異的miRNAを見出した。さらに、複数の化合物を添加後、SCLC細胞内のnSR100発現を解析した結果、nSR100発現に影響する化合物に関する知見を得た。現代社会の死因のトップである「癌」の発症機序と治療法は確立しておらず、早期診断・有効な治療法が重要である。最近、申請者は、SCLC特異的スプライシングアクティベーターnSR100(Srrm4)の発現上昇と転写抑制因子RESTアイソフォーム(sREST)の発現が腫瘍形成に著しく関与しているという新しいデータを報告した。さらに、SCLCの腫瘍形成に関係しているnSR100発現に影響する特異的miRNAを患者血液中に検出しており、SCLC患者を含む多くのがん患者と健常者の血液を用いて、これらのmiRNAの発現解析を行った。献血血液より健常者血液を、さらに患者血液は本人の同意を得て入手した。血清中のmiRNAはtotal RNAとして抽出し、miRNAの解析は特異的プライマーを用いた方法で行った。現在、各血清10-20サンプル数を継続して解析中である。申請者は、SCLC特異的異常発現をしているnSR100発現に関係しているmiRNAについて、がん患者血液中のmiRNA解析を行った。nSR100発現に影響すると考えられる4種類のmiRNAに関して、SCLC患者およびその他のがん患者とを比較し、SCLC特異的に発現しているmiRNAについて考察を行った。また、培養細胞を用いた実験で、nSR100の発現に関与するパスウェイを特異的に阻害する化合物を添加し、細胞内のnSR100発現に関して詳細な解析を行った。その結果、これまでに関与が考えられるパスウェイを阻害するとnSR100発現が減少したことから、これらのパスウェイを特異的に阻害する物質が治療に有効である可能性を考えている。研究実績の概要に示した通り、各血清の入手およびmiRNAの解析は順調で問題なく行えている。今後も解析を継続し、得られた結果をまとめる予定である。nSR100をターゲットとするリポーターアッセイ系の構築は、適切なものを検討・作成中である。分子生物学これまでの研究結果を確認するとともに、血清中のmiRNAの解析を順調に進めていく。HTSに使用できるリポーターアッセイ系の構築を進め、nSR100発現に影響する因子の探索を網羅的に行っていく予定である。当初の予定通りの経費であるが、研究の進行度により若干分次年度使用となった。当初の予定通りの研究経費であり、研究費は主に細胞培養とスクリーニングに多く用いられる。実験試薬、細胞培養試薬、動物実験など、さらに研究結果を発表する目的で、学会発表と論文投稿に用いられる。
昆虫細胞によるバキュロウイルス非依存型高効率タンパク質発現系の構築

本研究は、ウイルスによる宿主細胞のシャットオフ機構を解明し、得られた知見を基にして、昆虫細胞によるバキュロウイルス非依存型高効率タンパク質発現系を構築することを目的としている。29年度はRNAiスクリーニングによってシャットオフ誘導遺伝子を同定するためにスクリーニング系の確立を進めた。30年度も当初、BmN4-SID1細胞を使ってのRNAi実験を開始していたが、その間に新たな知見として、細胞の転写機構にliquid-liquid phase separation(LLPS)が重要な役割を果たしていることが次々と報告された。また数年前より、核小体のような膜を持たない構造体の構造維持にも、このLLPSが大きく関与していることが報告され始めていた。バキュロウイルスの転写はvirogenicstroma(VS)と呼ばれるウイルスが誘導する核内構造体で進行し、このVSもLLPSによって構造維持されていると考えられる。従って、ウイルス感染によるVS及びもう一つのウイルス誘導核内構造体peristromalregion(PR)のLLPSが、細胞内のその他のLLPSに大きく影響し、これがシャットオフ機構と関連している可能性が高くなってきた。実際、感染細胞内の核小体は、VSとPRによって、光学顕微鏡では観測できないほど凝縮されていることが分かっている。そこで30年度はVSとPRのLLPS誘導機構の解析を開始した。LLPSには天然変性領域(IDR)間の相互作用が重要であることが明らかになっている。そこで、まず、40残基以上のIDRを持つバキュロウイルスタンパク質を調査した。その結果、18種のタンパク質が見つかったので、現在、それらの遺伝子を使って、IDRを欠損させたり、IDRを相互に置換したりした組換え遺伝子を作製し、その局在の解析を進めている。研究計画を少し変更したため、進捗がやや遅れているが、本年度は、40残基以上のIDRを持つバキュロウイルスタンパク質18種のうち、VSあるいはPR局在が既に分かっているタンパク質のIE1、LEF3、GP41などを中心に解析した。IE1からIDRを欠損させたIE1-ΔIDRは、非感染細胞では、本来、核に局在するはずのIE1が細胞質局在に変化した。しかしながら、IE1のIDR単独では、細胞全体に分布し、特に核局在を示すことはなかった。一方、ウイルス感染細胞では、野生型のIE1同様、IE1-ΔIDRもVSに局在した。LEF3のIDRには核局在シグナルが存在することから、IDR単独でも核局在を示す一方、GP41のIDR単独では、IE1-IDR同様、細胞全体に分布した。次に、LEF3-IDR及びGP41-IDRをIE1のIDRと置換したIE1-[LEF3-IDR]とIE1-[GP41-IDR]の局在を調べたところ、非感染細胞では、IE1-[LEF3-IDR]は核局在を示す一方、IE1-[GP41-IDR]は細胞質に局在した。ウイルス感染細胞では、IE1-[LEF3-IDR]は強い感染阻害を引き起こし、多くの細胞でVS形成が阻害されてIE1-[LEF3-IDR]は核全体に分布し、VS局在は一部の細胞に限定された。一方、IE1-[GP41-IDR]は、主にVSに局在したが、一部の細胞では、VSに加えて細胞質にも分布した。また、野生型のIE1は他のウイルス遺伝子の転写を誘導することができるが、IE1-ΔIDR及びIE1-[GP41-IDR]は核に局在できないことから、その転写誘導能を失った。一方、IE1-[LEF3-IDR]はvp39遺伝子の転写を誘導した。今後も、ウイルスが誘導するLLPSが、宿主細胞のシャットオフに関与しているという仮説に基づいて、LLPSの解析を進める。具体的には、様々なウイルス遺伝子のORF全体やIDR部分と、Arabidopsis thalianaのcryptochrome 2 (CRY2)遺伝子を融合したキメラ遺伝子を作製し、効率的にLLPSを引き起こす遺伝子セットを検討する。その結果、効率的なLLPS誘導が可能となったのちは、LLPSとシャットオフとの関係を明らかにする。そして、最終的には、それらの遺伝子セットを持つ安定発現細胞株を作製し、光誘導型の効率的な遺伝子発現系を構築する。そこで29年度は宿主細胞のタンパク質発現抑制(シャットオフ)機構に関連するウイルス遺伝子を探索するため、RNAi法を使ってノックダウン実験を行った。当初の実験計画では各遺伝子から500bp程度のDNA断片をPCR増幅し、次にその増幅断片を用いて、2本鎖RNAを合成する2段階反応を行う予定であった。しかしより効率的にRNAiスクリーニングを行うため、in vitro Transcription T7 Kit (Takara)を用いて、1段階でsiRNAを合成して、得られたsiRNAをトランスフェクション試薬を用いてカイコ細胞に導入する方法を検討した。具体的には、先ずsiRNAのセンス鎖、アンチセンス鎖それぞれに対して一組ずつ、計4本について適切な向きにT7プロモーター配列を付加したオリゴヌクレオチドを適切な組み合わせでアニーリングし、この鋳型DNAを使ってin vitro Transcriptionを行う。最後にRNaseT1処理を行ってsiRNAを合成する。実際、この方法で作製したsiRNAとGFP遺伝子を同時にトランスフェクションしてRNAi実験を行った結果、抑制効果が確認できた。

しかし、複数回同じ実験を繰り返した場合には時として効果にばらつきも認められた。ウイルス感染に対するsiRNAの効果はトランスフェクション効率が低いために十分な抑制効果が得られなかったが、ウイルスのゲノムDNAとsiRNAを同時にトランスフェクションすることによって抑制効果を検証できた。今後はトランスフェクションの必要がないBmN4-SID1細胞を使ってRNAiスクリーニングを進める予定である。本研究開始前より進めていた「バキュロウイルス感染に伴う宿主細胞の内膜脂質のグローバルな再構築」研究に予想していたより多くの時間を費やしてしまったために本研究の進捗状況がやや遅れ気味となっている。しかしそのおかげで上記研究は現在論文を投稿することが出来、また、本研究にも良い影響を及ぼしている。すなわち、上記研究はバキュロウイルスが自身のウイルス膜を形成するために核内に脂質を蓄積すること、またそのために、宿主細胞の内膜全体の脂質配向を大きく変化させることを明らかにしている。従って、この宿主内膜構造変化を抑制することによって、発現タンパク質の精製過程を簡素化できる新規の分泌型バキュロウイルスベクターを構築することが可能となる。そこで今後はRNAi法によるノックダウン実験を使って、本研究で行うタンパク質発現抑制機構に関連するウイルス遺伝子探索に加えて、宿主内膜構造変化に関連するウイルス遺伝子も探索する予定である。本研究は、ウイルスによる宿主細胞のシャットオフ機構を解明し、得られた知見を基にして、昆虫細胞によるバキュロウイルス非依存型高効率タンパク質発現系を構築することを目的としている。29年度はRNAiスクリーニングによってシャットオフ誘導遺伝子を同定するためにスクリーニング系の確立を進めた。30年度も当初、BmN4-SID1細胞を使ってのRNAi実験を開始していたが、その間に新たな知見として、細胞の転写機構にliquid-liquid phase separation(LLPS)が重要な役割を果たしていることが次々と報告された。また数年前より、核小体のような膜を持たない構造体の構造維持にも、このLLPSが大きく関与していることが報告され始めていた。バキュロウイルスの転写はvirogenicstroma(VS)と呼ばれるウイルスが誘導する核内構造体で進行し、このVSもLLPSによって構造維持されていると考えられる。従って、ウイルス感染によるVS及びもう一つのウイルス誘導核内構造体peristromalregion(PR)のLLPSが、細胞内のその他のLLPSに大きく影響し、これがシャットオフ機構と関連している可能性が高くなってきた。実際、感染細胞内の核小体は、VSとPRによって、光学顕微鏡では観測できないほど凝縮されていることが分かっている。そこで30年度はVSとPRのLLPS誘導機構の解析を開始した。LLPSには天然変性領域(IDR)間の相互作用が重要であることが明らかになっている。そこで、まず、40残基以上のIDRを持つバキュロウイルスタンパク質を調査した。
硫黄細菌によるチオシアン及び関連硫黄化合物の分解とその遺伝子のクローニング

硫黄酸化細菌であるThiobacillus thioparusはチオシアンを唯一のエネルギー源とする。この細菌から初めて単離されたチオシアン加水分解酵素の生化学的性質を中心に研究を行った。1.チオシアン加水分解酵素の生化学的性質:新規酵素であるチオシアン加水分解酵素を単離精製した。本酵素の分子寮は142kDaであり3種類のサブユニットから構成される。チオシアンに対するKmは約11mMであった。本酵素活性は低濃度のシアンによって可逆的・非拮抗的に強く阻害を受け、シアンに対する阻害定数は14.8μMであった。シアンによる阻害は金属やSH基との反応ではなくカルボニル基との反応によるものである事が示唆された。シアンによる本酵素活性の阻害がユニークな事から、今後は阻害機構を更に詳細に解析する。2.チオシアン加水分解酵素遺伝子のクローニング:T.thioparusの染色体DNAを大腸菌細胞を用いてライブラリーを作成した。酵素の各サブユニット蛋白質に対するポリクローナル抗体を用いスクリーニングを行った結果、酵素タンパク質の合成を示す3九ローンが得られた。しかしその後の解析の結果挿入されたDNAが早い時期に脱落したことが示され、クローニング操作の改良を計りさらにスクリーニングを試みる計画である。3.硫化カルボニルの代謝:チオシアン加水分解酵素によりチオシアンは気体である硫化カルボニルとアンモニアに変換される。T.thioparusによる硫化カルボニル代謝を解析するためにチオシアン加水分解酵素を用いた硫化カルボニルの生成系の構築を行った。その結果チオシアンと酵素を30°C、80分間反応させた後そのpH調整を行うことによって、15mM以上の硫化カルボニルを基質として含む反応系を作る事が出来た。この系を用い硫化カルボニル代謝にかかわる酵素の探索などを試みる計画である。硫黄酸化細胞であるThiobacillus thioparusはチオシアンを唯一のエネルギ-源として独立栄養的な生育を行う。本細菌から初めて単離・精製されたチオシアン加水分解酵素の生化学的性質を中心に本年度は研究を行った。1.チオシアン加水分解酵素の精製本研究において申請した-80°C超低温冷凍庫は計画通り購入され、これによって本酵素が大量に精製でき、しかも安定に保存できる事が可能となった。精製した酵素を用い2の研究を行った。2.チオシアン加水分解酵素の生化学的性質本酵素によりチオシアンは硫化カルボニルとアンモニアになることが明らかとなり加水分解酵素である事が示された。本酵素は金属に対する要求性は無く、チオシアン以外の基質特異性は示さなかった。本酵素はシアンによって強い阻害を受け、8μMのKCNの存在下では酵素活性は50%に低下した。また本酵素は生育基質をチオ硫酸とした時には全く合成されずチオシアンの時にのみ誘導される等の性質が明かとなった。α及びγサブユニットに対する抗体は得られているがβに対する抗体はまだ無い。そこでSDSーポリアクリルアミドゲル電気泳動を行いβサブユニットをゲルから溶出させた後、ウサギを用いてポリクロ-ナル抗体を作成した。本酵素の各サブユニットに対する抗体を用いて今後更に生化学的諸性質について検討を行う予定である。3.チオシアン加水分解酵素遺伝子のクロ-ニングT.thioparusの遺伝子ライブラリ-をprokaryotes用発現ベクタ-を用い大腸菌を宿主として作成した。今後は各サブユニットに対する抗体を用いスクリ-ニングを行う。

1.チオシアン加水分解酵素の生化学的性質:本酵素活性は低濃度のシアンによって可逆的・非拮抗的に強く阻害を受け、シアンに対する阻害定数は14.8μMであった。シアン以外の様々な試薬との反応性を比較したところシアンによる阻害は金属やSH基との反応ではなくカルボニル基との反応によるものである事が示唆された。シアンによる本酵素活性の阻害がユニークな事から、今後はこの阻害機構を更に詳細に解析する。2.チオシアン加水分解酵素遺伝子のクローニング:T.thioparusから染色体DNAを単離しその制限酵素断片をprokaryotes用発現ベクターに組み込み大腸菌を宿主としてライブラリーを作成した。酵素の各サブユニット蛋白質に対するポリクローナル抗体を用いスクリーニングを行なった結果、酵素タンパク質の合成を示す3クローンが得られた。しかしその後の解析の結果挿入されたDNAが早い時期に脱落したことが示され、クローニング操作の改良を計りさらにスクリーニングを試みる計画である。3.硫化カルボニルの代謝:チオシアン加水分解酵素によりチオシアンは気体である硫化カルボニルとアンモニアに変換される。T.thioparusによる硫化カルボニルの代謝を解析するためにチオシアン加水分解酵素を用いた硫化カルボニルの生成系の構築を行った。その結果チオシアンと酵素を30°C、80分間反応させた後そのpH調整を行なうことによって、15mM以上の硫化カルボニルを基質として含む反応系を作る事が出来た。この系を用い硫化カルボニル代謝にかかわる酵素の探索などを試みる計画である。