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非古典的Wntシグナルを介した肝幹・前駆細胞の分化調節機構の解明

研究代表者らは、マウス肝幹・前駆細胞及びヒトiPS細胞由来肝幹・前駆細胞を用いて、Wnt5aシグナルと関連する分化と増殖の分子機構を解析する研究を行った。スクリーニングを行った結果、Bone morphogenetic protein-4 (BMP-4)を候補シグナルとして抽出した。BMP-4を介したシグナル伝達により、肝幹・前駆細胞由来の増殖が抑制されること、胆管の管腔形成が抑制されること、肝細胞への成熟化が促進されることが示された。また、MMP-14は肝前駆細胞から胆管管腔構造を形成する過程を正に制御することが示された。本研究の成果は、肝再生医学の進歩に貢献しうると考えられる。研究代表者らのグループは、本研究において、(1)非古典的経路Wntリガンドを介するシグナルを中心として、細胞表面抗原によって高度に濃縮した肝幹細胞画分を用いて、その分化・増殖に関わる新たな分子機構を解析し、(2)この結果に基づき、PiggyBac Transposon法を用いてWntシグナルを調節しうるヒトiPS細胞株を作成し、その分化・増殖機構を解明する。さらに(3)有用な下流分子の同定した後に、低分子化合物ライブラリを用いて下流分子の活性化を調節しうる化合物を探索する研究を行い、今年度の成果として下記を得た。(1)非古典的経路Wntリガンドを介するシグナルを中心とした肝幹細胞画分の分化・増殖に関わる新たな分子機構の解析:リン酸化アレイシステムを用いた網羅的な解析によって、肝幹細胞画分では非古典的経路WntリガンドはCaMKII以外には強く作用していなかった。関連シグナルの探索を進めた結果、Bone Morphogenetic Protein-4はWnt5aと協調的に作用して、CaMKIIの活性化をコントロールする結果を得た。本研究成果は、さらに詳細な検討を重ねつつ、原著論文を投稿中である。さらに関連シグナルとしてMMP-14の機能解析を行い、MMP-14は肝幹/前駆細胞の胆管管腔形成を正に制御することが示され、報告した(Otani et al, Biochem Biophys Res Commun, 2016)。(2)PiggyBac Transposon法を用いて関連分子を調節したヒトiPS細胞株の作成と、その分化・増殖機構の解明:関連した転写因子であるProx1の強制発現細胞株の樹立に成功し、現在はその結果を解析中である。当初計画したとおり、(1)肝幹細胞画分の分化・増殖に関わる新たな分子機構の解析に関しては想定通りの進捗を得た。すなわち、Bone Morphogenetic Protein-4はWnt5aと協調的に作用して、CaMKIIの活性化をコントロールし、胆管形成を負に制御することが示され、新規の知見を発見した。この成果は現在、結果を原著論文として投稿している。さらには、MMP-14の欠乏が肝細胞成熟化をEGFシグナルを介して正に制御すること、逆に胆管の管腔形成を遅延させることが示され、本結果を原著論文として発表した。この結果は、MMP-14の肝幹/前駆細胞における機能を初めて報告したものである。(2)PiggyBac Transposon法を用いて関連分子を調節したヒトiPS細胞株の作成と、その分化・増殖機構の解明については、細胞株の作成に成功したところであり、その形質を評価しているところである。有望な結果を得た場合には、関連分子をCrispr/Cas9系によるknock out細胞の樹立を計画することも視野に入れている。これらの結果を基盤に、次年度はさらに研究を発展させることが期待できると考えている。研究代表者らのグループは本研究において、(1)非古典的経路Wntシグナルを中心として、細胞表面抗原によって高度に濃縮した肝幹・前駆細胞画分を用いて、その分化・増殖に関わる新たな分子機構を解析する。(2)この結果に基づき、PiggyBac Transposon法を用いてヒトiPS細胞に薬剤誘導性遺伝子カセットを導入し、Wntシグナルを調節しうる細胞株を作成し、その分化・増殖機構を解明し、(3)有用な下流分子を同定した後に、低分子化合物ライブラリを用いて下流分子の活性化を調節しうる化合物を探索する研究を行い、今年度の成果として下記を得た。(1)非古典的経路Wntリガンドとの関連シグナルとして、Bone Morphogenetic Protein (BMP)-4関連シグナルに着目し、BMP-4は肝幹・前駆細胞の増殖を抑制的に制御し、肝細胞分化を促進的に制御すること、また、このシグナルはWnt5aシグナルと相加的に作用し、協調して肝幹・前駆細胞の増殖を抑制し、胆管細胞への分化を抑制的に制御することを示し、原著論文として報告した(Hepatol Res, 2016)。同様に他の関連シグナルに関しても研究を進行中である。(2)PiggyBac Transposon法を用いてヒトiPS細胞にシグナルを調節しうる細胞株を作成・解析する研究としては、同手法によりNTCPを誘導性に強制発現しうるiPS細胞株を作成し、肝幹・前駆細胞としての分化レベルでも安定的にHBVが感染可能で、宿主細胞の自然免疫応答が維持された細胞が成立しうることを示し、原著論文として報告した(Sci Rep, 2016)。同様に、他のWnt関連シグナルを調節した細胞株を数種類樹立し、その結果を現在解析中である。(3)有用な下流分子の活性化を調節しうる化合物を探索する研究に関しても着手し、現在スクリーニングを進めている。

当初計画した通り、(1)非古典的経路Wntリガンドを介するシグナルを中心として、細胞表面抗原によって高度に濃縮した肝幹細胞画分を用いて、その分化・増殖に関わる新たな分子機構を解析する研究では、昨年度の成果として報告した研究に加えて、今年度はさらに異なる分子であるBMP-4の肝幹・前駆細胞における機能を解明した。本知見は、BMP-4の肝幹・前駆細胞の増殖における機能を直接的に証明し、かつ、Wnt5aシグナルとも協調的な相互作用を持つことを、それぞれ世界で初めて報告した点で意義のある研究となった。このように、本項目では、当初の計画通りに順調に進行しており、今後の進展もさらに期待できるといえる。(2)PiggyBac Transposon法を用いてヒトiPS細胞に薬剤誘導性遺伝子カセットを導入し、シグナルを調節しうる細胞株を作成し解析する研究についても、前記のように、新たな強制発現細胞株の樹立によって、B型肝炎ウイルス研究にも応用が可能な細胞が樹立できたことを、原著論文として報告した。その他の分子を用いた研究でも同様の戦略で新たな細胞株を樹立しつつ、新規の分子機能を明らかにしつつあり、本項目でも、当初の計画通りに順調に進行しており、今後の進展もさらに期待できるといえる。(3)有用な下流分子を同定した後に、低分子化合物ライブラリを用いて下流分子の活性化を調節しうる化合物を探索する研究については、今年度に着手を開始したところであるが、当初の計画通りのスクリーニングの進捗がみられており、次年度はさらに研究計画を発展させることが可能であると考えている。研究代表者らのグループは本研究において、(1)非古典的経路Wntシグナルを中心として、細胞表面抗原によって高度に濃縮した肝幹・前駆細胞画分を用いて、その分化・増殖に関わる新たな分子機構を解析する。(2)この結果に基づき、PiggyBac Transposon法を用いてヒトiPS細胞に薬剤誘導性遺伝子カセットを導入し、Wntシグナルを調節しうる細胞株を作成し、その分化・増殖機構を解明し、(3)有用な下流分子を同定した後に、低分子化合物ライブラリを用いて下流分子の活性化を調節しうる化合物を探索する研究を行い、成果として下記を得た。(1)非古典的経路Wntリガンドとの関連シグナルとして、Bone Morphogenetic Protein (BMP)-4関連シグナルに着目し、BMP-4は肝幹・前駆細胞の増殖を抑制的に制御し、肝細胞分化を促進的に制御すること、また、このシグナルはWnt5aシグナルと相加的に作用し、協調して肝幹・前駆細胞の増殖を抑制し、胆管細胞への分化を抑制的に制御することを示した。細胞間相互作用に着目して他の関連シグナルに関しても研究を進行した。(2)PiggyBac Transposon法を用いてヒトiPS細胞にシグナルを調節しうる細胞株を作成・解析する研究としては、同手法によりNTCPを誘導性に強制発現しうるiPS細胞株を作成し、肝幹・前駆細胞としての分化レベルでも安定的にHBVが感染可能で、宿主細胞の自然免疫応答が維持された細胞が成立しうることを示した。同様に、転写因子の調節によりiPS細胞株由来肝間葉系細胞の機能が亢進することが示された。(3)有用な下流分子の活性化を調節しうる化合物を探索する研究を行い、いくつかの候補分子を見いだしたが、その機能に関しては今後の研究が必要であると考えられた。
ヒト前立腺がん細胞の神経様細胞への分化誘導による性状変換

本研究では、前立腺がんの新しい治療法として分化誘導療法の応用を期待し、その基礎的検討を行った。まず、2種のヒト前立腺がん細胞(LNCaP、TSU-Pr1)について、種々の生理活性物質による分化誘導活性を検討した。その結果、LNCaP細胞では、ホスホジエステラーゼ阻害剤のパパベリンとプロスタグランジンE2の併用により神経内分泌様細胞に、TSU-Pr1細胞では、ホルボールエステルのTPAによりミクログリア様の細胞に、プロテインキナーゼ阻害剤のスタウロスポリンにより神経様細胞に分化誘導することが明らかとなった。またこれらの分化誘導した細胞では、軟寒天中でのコロニー形成能や、マトリゲル浸潤能といった細胞のがん化形質が低下していることが検出され、これらの分化誘導の臨床応用の可能性が示唆された。分化誘導機構の解析の一端として、増殖抑制機構についてTSU-Pr1細胞を中心に解析を行った結果、スタウロスポリンはCDKインヒビターであるp21、p27を発現誘導しG1期停止を起こしていることが示唆された。一方、TPAはp21を発現誘導しG1、G2期停止を起こしていることが示唆された。また、このTPAによるp21の発現誘導がPKC、MAPK経路を介していることや、このシグナル経路が増殖のみならず、分化形質にも関与していることが示唆された。さらに、ディファレンシャルディスプレイ法を用いて分化過程で発現変動する数種の遺伝子を同定した。以上の結果より、これら分化誘導細胞の悪性度の減少が確認され、その過程での種々な遺伝子の関与が示唆された。今後はさらに詳細に分化誘導機構を解析し、より有効な新しい分化誘導物質の探索を行うつもりである。これまで、我々はヒト前立腺がん細胞(LN CaP)がホスホジエステラーゼ阻害剤のパパベリンとプロスタグランジンE2の併用により神経内分泌様細胞に分化すること、またホルボールエステルのTPAが別の細胞株(TSU-Pr1)をミクロダリア様の形態に分化誘導することを見いだした。本年度の研究では主に、これら分化誘導過程における悪性度の変化と種々の遺伝子発現の変化について解析を進めた。その結果、LNCaPを用いた系については、分化誘導した細胞で軟寒天中でのコロニー形成能の減少や、マトリゲルに対する浸潤能の低下を検出し、分化誘導に伴い細胞の悪性度が減少していることがわかった。また種々の遺伝子の発現について解析を行い、がん遺伝子であるmycやBc1-2遺伝子の発現減少を検出した。TSU-Pr1細胞を用いた系では、分化誘導した細胞でミクログリア細胞のマーカであるエステラーゼ活性や、CD11b、LDLレセプターの発現を検出した。また、先述した系と同様に軟寒天コロニー形成能やマトリゲルに対する浸潤能の低下を検出し、分化誘導細胞の悪性度の減少を示した。遺伝子発現解析ではmyc、Bc1-2の発現減少やp21の発現誘導を検出した。以上の結果よりこれら分化誘導細胞での悪性度の減少が確認され、分化誘導療法の臨床への応用の可能性が示唆された。また、分化誘導過程に関わる遺伝子についても解析を進めている段階である。今後はさらに詳細な分化誘導機構を解析し、より有効な新しい分化誘導物質の探索を行う予定である。

その結果、LNCaP細胞では、ホスホジエステラーゼ阻害剤のパパベリンとプロスタグランジンE_2の併用により神経内分泌様細胞に、TSU-Pr1細胞では、ホルボールエステルのTPAによりミクログリア様の細胞に、プロテインキナーゼ阻害剤のスタウロスポリンにより神経様細胞に分化誘導することが明らかとなった。またこれらの分化誘導した細胞では、軟寒天中でのコロニー形成能や、マトリゲル浸潤能といった細胞のがん化形質が低下していることが検出され、これらの分化誘導の臨床応用の可能性が示唆された。分化誘導機構の解析の一端として、増殖抑制機構についてTSU-Pr1細胞を中心に解析を行った結果、スタウロスポリンはCDKインヒビターであるp21、p27を発現誘導しG1期停止を起こしていることが示唆された。一方、TPAはp21を発現誘導しG1、G2期停止を起こしていることが示唆された。また、このTPAによるp21の発現誘導がPKC、MAPK経路を介していることや、このシグナル経路が増殖のみならず、分化形質にも関与していることが示唆された。さらに、ディファレンシャルディスプレイ法を用いて分化過程で発現変動する数種の遺伝子を同定した。以上の結果より、これら分化誘導細胞の悪性度の減少が確認され、その過程での種々な遺伝子の関与が示唆された。今後はさらに詳細に分化誘導機構を解析し、より有効な新しい分化誘導物質の探索を行うつもりである。
ベネチテス目植物生殖器官の起源に関する古植物学的研究

1.北海道及び千葉県銚子の白亜紀有組織植物化石産地において調査、採集を行い、既存の標本とあわせて比較解剖学的に研究した。2.ベネチテス(キカデオイデア)目の花について、以下の新事実が確認され、従来の不明点が解消した。(1)胚珠最外層に薄い皮膜状の構造が確認され、この目の胚珠構造が決定された。(2)集合子嚢中に維管束が見つかり、集合子嚢の起源を遡及できた。(3)花托内での維管束走向が復元された。(4)花軸と主茎との形態学的関係が明らかになり、花構造の進化過程が明らかになった。3.ベネチテス目は古生代のメドゥロ-サ科植物から進化したとみられていたが、本研究によって両者の関係がさらに明確になった。4.ベネチテス目の胚珠の構造進化を解明するには、古生代の胚珠の起源にまでさかのぼる必要がある。逆に本研究によって従来の胚珠の起源に関する定説を覆すような事実も明らかになった。今後その事実をもとにして種子植物全体にわたる胚珠の進化を見直すことが課題として残された。5.ベネチテス目の形態学的研究と並行して、同時代の植物群の解析も進んでおり、ベネチテス目と同じソテツ系の裸子植物である、ソテツ類の新属(群馬県の下部白亜紀層)や、球果類(北海道)の新属を記載した。6.以上の結果は学会及び、学会誌に発表を続けており、国際的にも評価され始めている。
園芸作物の組織培養における培地組成ならびに培養条件に関する栄養生理学的研究

本研究は、野菜・花卉等の園芸作物の組織培養において、好適な培地組成および環境条件を栄養生理学的に検討しようとするものである。平成3年度は、実験1では寒天の無機要素組成について検討した。次いで実験2.1では、MS処方を基本として、寒天の種類、培養器内の湿度やCO_2濃度の影響について、さらに実験2.2では培地中のN,P,K濃度の影響について、ジャガイモ小植物体を用いて比較した。和光一級寒天(和光寒天)とDifco Bacto agar(DB寒天)とを分析したところ、前者は後者のNは7倍、K,Mgは約3倍多く含まれており、寒天の種類によってはかなりの無機要素が培地中に供給される可能性が考えられた。寒天の種類を比較すると、おおむねDB寒天のほうが良好な生育を示した。従来の培養法であるMS処方を培地とした密栓容器に比べ、通気栓をした場合にはいずれも生育が改善された。また容器が置かれる環境としては、湿度は高いほうが、CO_2濃度は低いほうが生育が良かった。さらに培地中のN濃度はMS処方(840ppm)よりかなり低い300ppMで、P濃度はMS処方(39ppm)より高い100ppmでそれぞれ生育は最大となった。K濃度は1,000ppmまで高濃度ほど生育良好となった。いずれの場合にも、外植体を置床した初期に根の生育が良いものほどその後の植物体生育も良好となることがわかった。以上のように、ジャガイモの組織培養における初期条件としては、通気が何能な培養容器を用いて、良く精製された寒天で、ある程度高い湿度に維持するのが良いことがわかった。さらに、培地の好適無機要素組成はMS処方とは異なる可能性がうかがえた。本研究は、野菜、花弁等の園芸作物の中から栄養特性の異なるものを取り上げ、これらの栄養特性に合った培地組成ならびに培養条件を、栄養生理学的な観点から検討しようとするものである。平成元年度は、本研究遂行の主体となる高周波プラズマ発光分析装置の特性について精力的に検討した。またMSや園試処方など数種の培養液および培養法を組み合わせてスタ-チスを組織培養し、外植体の成育ならびに無機要素吸収量を比較した。その結果、P、K、Ca、Mg、Na、Fe、B、Mn、Zn等に関しては、分析条件および各元素が単独で存在する場合の信頼できる分析範囲についてはかなりの程度解明できた。また多種類の元素が共存する場合、特に微量要素の測定についてはそれ自身の存在濃度の問題と多量要素の影響とから、測定にかなりの工夫が必要となる可能性が考えられた。高周波プラズマ発光分析装置は、一つの試料中に存在する多種類の元素の濃度をごく短時間で測定できるものであり、従来の原子吸光分析装置や比色計を組み合わせた分析法に比べて数倍の分析効率を期待できるだけでなく、これまで困難であったBやSi、Mo等の分析も可能と言われている。しかし、植物試料を対象にした分析例は極めて少なく、メ-カ-自身も詳細なデ-タを有していないのが現状のようである。したがって、本研究を行うに当たっては、分析試料の調整法の検討や、分析機器の特性把握から始めなければならず、植物試料を実際に分析する基礎デ-タの収集にかなりの時間を費やすことになってしまった。また、スタ-チスの組織培養の結果からは、従来使われているMS培地の優秀性は認められたものの、培養の方法によっては組成がより単純で安価な園試処方培養液の利用も充分に可能であると考えられた。本研究は,野菜・花卉等の園芸作物の組織培養において,好適な培地組成および環境条件を栄養生理学的に検討しようとするものである。平成2年度は,主に一節ごとに切り分けたジャガイモ外植体を用いて,実験1では従来の培養法であるショ糖2%・弱光・無通気条件のMurashigeーSkoog(MS)処方を対照として,改良条件であるショ糖0%・強光・通気条件のMS,1/2MS園試処方(BN),2ENを比較した。また実験2では,改良条件でMS処方におけるNH_4とNO_3の比率を変えて窒素形態の比較を行った。なおいずれの実験も,ポリエステル綿を支持材とした液体培養法を用いた。茎長は対照区に比べENでは約2倍と大きかった。またMSに比べENでは節間が長かった。外植体の生育は,従来法の対照区に比べると改良法のMSでは明らかに優れた。しかし改良条件下では,植物体の生育はMSあるいはBNなどの培地組成または濃度にはあまり影響されず,乾物重はどの処理区もほぼ同様であった。MSの場合,従来法と改良法では培地内の無機要素組成は同じであるにもかかわらず,改良法では生育が良くなると同時に,植物体中のN,K,Ca,Mg濃度が対照区より著しく高くなった。特にCaは濃度が80%も高くなるだけでなく,Nに対する比率も高くなるなど積極的に吸収されていることがわかった。このような背景には,改良条件下で通気がもたらす蒸散の効果を考えることができる。改良条件下で,MS処方を基本としてNH_4とNO_3の好適比率を検討したところ,培養液中のNH_4の比率が高まるにつれて生育は良くなり,MS処方であるNH_4:NO_3=1:2で最大の乾物重となった。しかし,それ以上にNH_4の比率が高くなると逆に生育は抑制された。

以上のように,ジャガイモにおいてはMS処方の優秀性が認められたが,それより組成が単純で安価な園試処方でもMS処方に十分匹敵すると考えられた。本研究は、野菜・花卉等の園芸作物の組織培養において、好適な培地組成および環境条件を栄養生理学的に検討しようとするものである。平成3年度は、実験1では寒天の無機要素組成について検討した。次いで実験2.1では、MS処方を基本として、寒天の種類、培養器内の湿度やCO_2濃度の影響について、さらに実験2.2では培地中のN,P,K濃度の影響について、ジャガイモ小植物体を用いて比較した。和光一級寒天(和光寒天)とDifco Bacto agar(DB寒天)とを分析したところ、前者は後者のNは7倍、K,Mgは約3倍多く含まれており、寒天の種類によってはかなりの無機要素が培地中に供給される可能性が考えられた。寒天の種類を比較すると、おおむねDB寒天のほうが良好な生育を示した。従来の培養法であるMS処方を培地とした密栓容器に比べ、通気栓をした場合にはいずれも生育が改善された。また容器が置かれる環境としては、湿度は高いほうが、CO_2濃度は低いほうが生育が良かった。さらに培地中のN濃度はMS処方(840ppm)よりかなり低い300ppMで、P濃度はMS処方(39ppm)より高い100ppmでそれぞれ生育は最大となった。K濃度は1,000ppmまで高濃度ほど生育良好となった。いずれの場合にも、外植体を置床した初期に根の生育が良いものほどその後の植物体生育も良好となることがわかった。以上のように、ジャガイモの組織培養における初期条件としては、通気が何能な培養容器を用いて、良く精製された寒天で、ある程度高い湿度に維持するのが良いことがわかった。さらに、培地の好適無機要素組成はMS処方とは異なる可能性がうかがえた。
糖尿病の発癌リスク(非酵素的糖化によるEGFリセプターのユビキチン化障害)

高糖環境に馴化したA431細胞株(HC)は通常培養細胞(NC)に比較して極めて増殖速度を低下させた。HCの細胞内総ユビキチンはマルチ鎖(MU)120ng/mg蛋白、遊離型(FU)250ng/mgとNC(MU:100ng/mg,FU:300ng/mg)と差がなく、proteasome阻害剤MG132(0.8μM)添加やEGF(100ng)添加でもMUの高度増加は認めなかった。そこでEGF受容体(R)そのものの変動をみるため独自に作製したEGFRとユビキチン化(Ub)EGFR測定係を用い、各細胞の変動をみた。EGFRは貯臓NC細胞出来抽出液100μg中のEGFRを100Uとして定量した。またUbEGFRは単位EGFRあたり抗Ub抗体反応EGFRの吸光度で得た。通常37°C培養でHC由来EGFRはNC(85U)に比らべ52Uに減少していたが、4°C培養ではNC:115U,HC:124Uと両細胞に差はなかった。一方UbEGFRは4°C2hEGF処理でも変動しないが、37°Cではlh処理でNC,HCとも未処理に比較し約1.2倍に増加していた。興味あることに通常37°C培養ですでにHCはNCに比較し1.8倍EGFRもUb化が亢進していた。37°C培養細胞抽出液のWGA(レクチン)沈降物のウェスタンブロットでもHC内のEGFRの減少と強いUb化が認められた。このようなHC由来EGFRの特徴である4°C、37°C培養条件によるEGFR、UbEGFRの変動はHCの37°C→4°C→37°Cの培養温度のシフト実験でも確認出来た。また、EGF処理後の抗リン酸化チロシン抗体による反応性はNC由来EGFRに比較しHC由来EGFRは弱かった。さらにHC由来抽出液のWGA沈降物より得たEGFRは抗AGE抗体に反応した。これらの結果から高糖環境下ではEGFRは糖化するが、EGF刺激によるinternalizationの大切なsignalであるUb化はNCと同程度であるので障害は軽度と考えられる。しかし、高糖条件下におけるHC,EGFRの早いturnover(高いUbEGFRの存在をinternalize亢進によるEGFRのUb化とすると)EGFRの供給限度を越え、そのうえリン酸化障害はリン酸化を支配するsite directedなNH_2基のUb化障害を否定できず、結果としてEGFRの量的、質的減少(異常なdown regulation)を惹起するものとみられ、高糖条件下でのsignal伝達の障害が推測できる。今後はEGFR messageの変動を高糖条件下で検討する要がある。1.使用癌細胞(A431ヒト扁平上皮細胞癌)の高グルコース環境への馴化.A431細胞は通常10%牛胎仔血清(FBS)加RPMI1640培地で維持されるが本実験系はFBSに混在する小分子増殖因子を極力除去するため、使用FBSは全てRPMI1640で予め透析し、血清の影響も極少にすべく増殖を阻害しない最少血清濃度を決定し、A431はRPMI1640(2g/lグルコース)に4%FBS添加で培養した。一方、高グルコース培地はRPMI1640に20g/lグルコースを添加し、4%FBS存在下培養を開始し、A431細胞は5週後、10倍高糖環境下で維持可能となった。MTT並びに色素排除法て測定した細胞倍加時間はA431(33時間)に比較しA431HGは49時間と増殖の遅延がみられた。EGF 100ng/ml処理A431,A431 HGをトライトンX、カリクリンA、バナジン酸ナトリウム存在下で可溶化し、cell lysateを作成した。EGF-R、燐酸化EGF-Rは(1)Cell lysateのSDS-PAGE・ウエスタンブロット(WB)による発現量、燐酸化量の変動の確認。(2)ヒツジ抗EGF-Rポリクロン抗体固相化プレートにcell lysateを添加、キャッチし、マルチユビキチン(MUB)鎖のみを認識する単クロン抗体をビオチン化した抗体をディテクターとすることによりEGF-R中MUB鎖量を半定量するsystemの実用の可能性をcheckした.Signalはビオチン化MUB単クロン抗体でも非標識抗MUB抗体、抗マウス標識抗体のsystemでも同等のsignalが得られ、この両systemとも細胞内ユビキチン化EGF-Rを検出定量できることが判明した。これらの方法論確立により次年度には高糖環境下細胞のEGF-Rのユビキチン化の程度が判明すると考えられる。またEGF-Rのglycationは通常のwhole cell lysateのSDS-PAGE・WBでは確認が困難であり、抗EGF-R抗体を用いた免疫沈降物のSDS-PAGE・WBに変更することで解決すると考える。本年度(平成9年)は研究費補助金交付決定が10月以降であったため、計画は大幅に遅延したが、使用細胞並びに研究方法の確立はすべて行ったので次年度には計画の遅れもとりもどせると考える。

HCの細胞内総ユビキチンはマルチ鎖(MU)120ng/mg蛋白、遊離型(FU)250ng/mgとNC(MU:100ng/mg,FU:300ng/mg)と差がなく、proteasome阻害剤MG132(0.8μM)添加やEGF(100ng)添加でもMUの高度増加は認めなかった。そこでEGF受容体(R)そのものの変動をみるため独自に作製したEGFRとユビキチン化(Ub)EGFR測定係を用い、各細胞の変動をみた。EGFRは貯臓NC細胞出来抽出液100μg中のEGFRを100Uとして定量した。またUbEGFRは単位EGFRあたり抗Ub抗体反応EGFRの吸光度で得た。通常37°C培養でHC由来EGFRはNC(85U)に比らべ52Uに減少していたが、4°C培養ではNC:115U,HC:124Uと両細胞に差はなかった。一方UbEGFRは4°C2hEGF処理でも変動しないが、37°Cではlh処理でNC,HCとも未処理に比較し約1.2倍に増加していた。興味あることに通常37°C培養ですでにHCはNCに比較し1.8倍EGFRもUb化が亢進していた。37°C培養細胞抽出液のWGA(レクチン)沈降物のウェスタンブロットでもHC内のEGFRの減少と強いUb化が認められた。このようなHC由来EGFRの特徴である4°C、37°C培養条件によるEGFR、UbEGFRの変動はHCの37°C→4°C→37°Cの培養温度のシフト実験でも確認出来た。また、EGF処理後の抗リン酸化チロシン抗体による反応性はNC由来EGFRに比較しHC由来EGFRは弱かった。さらにHC由来抽出液のWGA沈降物より得たEGFRは抗AGE抗体に反応した。これらの結果から高糖環境下ではEGFRは糖化するが、EGF刺激によるinternalizationの大切なsignalであるUb化はNCと同程度であるので障害は軽度と考えられる。しかし、高糖条件下におけるHC,EGFRの早いturnover(高いUbEGFRの存在をinternalize亢進によるEGFRのUb化とすると)EGFRの供給限度を越え、そのうえリン酸化障害はリン酸化を支配するsite directedなNH_2基のUb化障害を否定できず、結果としてEGFRの量的、質的減少(異常なdown regulation)を惹起するものとみられ、高糖条件下でのsignal伝達の障害が推測できる。今後はEGFR messageの変動を高糖条件下で検討する要がある。高糖環境に馴化したA431細胞株(IIC)の細胞内総ユビキチンはマルチ鎖(MU)120ng/mg蛋白、遊離型(FU)250ng/mgと通常培養株(NC)(MU:100ng/mg.FU:300ng/mg)と差がなく、proteasome阻害剤MG132(0.8μM)添加やEGF(100ng)添加でもMUの高度増加は認めなかった。EGFRは貯臓NC細胞由来抽出液100μg中のEGFRを100Uとして定量した。通常37°C培養でHC由来EGFRはNC(85U)に比らべ52Uに減少していたが、4°C培養ではNC:115U.HC:124Uと両細胞に差はなかった。一方UbEGFRは4°C2hEGF処理でも変動しないが、37°Cでは1h処理でNC,IICとも未処理に比較し約1.2倍に増加していた。。
複合体精製によるAML1及びp53の機能解析

ヒト白血病では高頻度に特異的な染色体転座が見られ、この中でAML1遺伝子はその最も高頻度な標的である。AML1の機能を調べるため、AML1複合体を精製した。その結果、CBF/PEBP2βやp300/CBPの他にMOZなどのいくつかの因子がAML1のC末端の転写制御ドメインを介して複合体を形成することが示された。MOZはヒストンアセチル化酵素であることから、AML1依存性の転写活性化への影響を調べたところ、MOZはAML1と複合体を形成して転写を活性化することが示された。MOZによるAML1の転写活性化にはMOZのAML1結合領域・転写活性化領域・核内局在領域を必要としたが、HATドメインは必要としなかった。一方、急性骨髄性白血病でみられるt(8;22)転座により生じるMOZ-CBPはAML1による転写活性化を顕著に阻害し、この阻害にはCBP領域のHATドメイン及びプロモドメインが必須であった。AML1/MOZ複合体の量はマウス骨髄性細胞M1の分化に伴って増加することから、AML1/MOZ複合体は細胞分化において重要な役割を担っていると考えられる。逆にMOZ-CBPのを強制発現させるとM1細胞の分化は阻害されることが示された。これらの結果から、MOZ-CBPによるAML1複合体の機能阻害が白血病発症の主要な原因の一つであると考えられる。また、AML1複合体を構成するCBF/PEBP2β、MOZ、p300/CBPは、すべて白血病で見られる染色体転座により融合蛋白質を生じることから、AML1複合体の機能異常が白血病発症の主要な原因の一つであることが示唆される。また、MOZは癌抑制遺伝子産物p53とも結合してp53による転写を活性化し、MOZ-CBPは転写を抑制することが明らかになった。
「音と声」に注目した保育者研修プログラムーECERS及び音環境調査に基づいてー

本研究には次の3つの目的がある。まず1保育の質の数値化=日本でECERSを学術的に利用する、次に2保育における音と声のデータ化=音環境への注意を喚起する、さらに3エビデンスの活用=保育場面へ敷衍し保育者の資質向上へ応用する、である。1年次の計画は目的1に関しては、尼崎市内保育所30カ所でECERS-3による保育の質の評価を行うことについては達成できた。1カ所に2名派遣するため、この調査を実施するために述べ60人のアセッサー(調査員)を必要とする。調査の信頼性を担保するために研究前年度には20人余りのアセッサー候補に対しトレーニング会場園を10カ所設定し原則1人3回のトレーニングを行っていた。研究1年次には、これらのアセッサーに事前研修を行い、30カ所で調査を実行した。調査後にはフィードバックを行い、次年度に向けてトレーニング会場8カ所でトレーニングを行なった。アセッサーとなっているのは幼稚園・保育所・こども園の園長・主任クラスの人材である。調査終了後はまず対象となった園に向けてスケールの説明と全体の傾向のフィードバックを2回行なった。調査対象園個別にはレポートを作成した。このことで目的1とともに3についてECERS-3を調査及びその結果の活用のパターンが形成された。1年次の研究成果で最も大きなことであるのが以上の事柄である。目的2については、音環境評価指標の試案を作成することができた。また、モニター園において音環境に対する保育者の意識、室内の物理的環境の整備への意欲を得た。2に関して、2年次での一掃の研究の展開が期待できる。1年次の研究の3本柱としては、保育の質調査、保育の音環境調査、保育者の音に対する意識調査がある。保育の質調査については全期間にわたっての調査対象園が確保でき、保育環境評価スケールを用いるのに必要なアセッサーの人数と調査の信頼性を確立するためのトレーニングが実行でき、1年次の調査は順調に行うことができた。音環境調査については機器購入にあたり予定していたものに変更があるなどして多少手間がかかったが、購入ができ、モニター園の協力も得て、試行調査が実施できた。音に関する意識調査については、1年次の調査を通しての情報蒐集により、調査票の作成ができた。調査票配布先も確保できた。研究の3本柱として保育の質の調査、保育の音環境調査、保育者の音に対する意識調査がある。保育の質の調査については30箇所での調査を23人の調査員の協力を得て実施する。調査の信頼性を確保することが引き続きの課題であり、トレーニングを継続して調査の充実を図る。調査対象クラスの保育者、対象園の園長または主任、調査員に対し音に対する意識調査を行い、その結果を分析する。保育の音環境調査についてモニター園での保育者の意識調査、条件の異なる保育室での音環境調査を実行する。

調査の信頼性を確保することが引き続きの課題であり、トレーニングを継続して調査の充実を図る。調査対象クラスの保育者、対象園の園長または主任、調査員に対し音に対する意識調査を行い、その結果を分析する。保育の音環境調査についてモニター園での保育者の意識調査、条件の異なる保育室での音環境調査を実行する。騒音計の価格が予定より上回ったこと、また予定外にソフトの購入の必要性が生じた。また来年度の調査依頼をするにあたって前だおしで書籍の購入を行う必要性があった。これらの出費オーバーのために海外出張の費用が捻出できずその差額が次年度への繰越となった。次年度には調査員用に小型騒音測定器の購入と電池の補充を予定している。
アセアンにおける人身取引対策の研究

本研究の成果は3点ある。第1はアセアンにおける労働搾取型の人身取引の実態を考察できたことだ。特にタイ、ミャンマー、カンボジア、ラオスなど多国籍の労働者を乗せた漁船での労働搾取はシーフードのサプライチェーンを通して先進国の消費者も関与しており、人身取引はビジネスと人権課題で看過できない。第2に被害者支援に有効な、当事者による自助活動(Aモデル)と支援者らによる地域密着型活動(Bモデル)を提示したことである。第3は新たな知見である。社会的に脆弱な若者は人身取引のリスクが高い。被害に遭う危険軽減のためのケイパビリティを伸張するアプローチなど、18歳で子どもと大人を分けずに若者の支援の必要を理解した。本研究はアセアンの人身取引対策、とくに人身取引被害者支援および防止に注目した国際協力に関する研究である。平成25年度は、(1)日本・タイ間の性的搾取型人身取引事例の分析、(2)タイにおける人身取引に関する国際協力の第1次調査、(3)人身取引研究会の実施が研究の目的であった。この3点についての以下述べる。(2)アセアンにおける人身取引に関する国際協力の第1次調査は2013年8月にタイにおいて実施した。この調査の成果は、人身取引対策の中でも主に被害者の社会再統合課題に焦点を絞り、支援者の役割および被害当事者によるセルフグループ形成における課題のほか、人身取引対策における日本政府とタイ政府の二国間協力の考察が可能となったことである。(3)人身取引研究会は2014年2月に、日本とアメリカにおいて人身取引被害者支援の実績があり、ミャンマーにおける人身取引対策の国際協力の現場での研修講師の経験がある専門家を招き、多様な人身取引形態(性的搾取、労働搾取)と多様な被害者(ジェンダー、年齢、学歴、出身国など)の支援について研究会を実施した。この研究会は今後も継続し、被害当事者の視点を取り入れた中長期の被害者支援モデルを構築していきたい。平成26年度は、(1)日本をはじめアセアンで共通する諸国若年層の防止と被害者の社会再統合の循環を可能とする人身取引対策の分析、(2)メコン流域諸国開発におけるベトナムカンボジアタイミャンマーに至る地域での経済発展とともに派生する移住労働と人身取引の研究、(3)アセアン地域で人身取引対策を実施する国際協力の日本とオーストラリアの国際協力の比較分析を行うことができた。(1)日本をはじめアセアンで共通する若年層の防止と被害者の社会再統合の循環を可能とする人身取引対策の分析では、有識者を迎えての研究会実施および調査研究により次のことが明らかになった。アセアン経済統合(AEC)が徐々に進み経済発展と格差が拡大するアセアンにおいて人身取引分野で共通する課題は若年層の都市部への移住労働と人身取引の防止であること、そして過去に人身取引被害当事者が社会再統合を実現する過程で人身取引防止にも寄与することが可能な事例を調査により発見し、被害者の再統合と人身取引防止の循環的な関連を分析することができた。(2)メコン流域諸国開発における南南回廊と呼ばれるベトナムカンボジアタイミャンマーに至る地域での経済発展とともに派生する移住労働の実態と人身取引の関係を、タイ・カンボジア国境のトラード県の国境で活動を実施するNGOや、タイ東部地域の人身取引の実態を警察や農家などからヒアリングを行い、情報を収集した。(3)アセアン地域で人身取引対策事業を実施する国際協力に関して、国レベルでは日本とオーストラリアの二か国の比較分析、国際機関のUN-ACT、国際NGOのヒアリング調査をミャンマーやタイで実施し、資料とともに比較分析することができた。1.日本の人身取引対策に関する国際協力と被害者保護・支援に関する研究現在、タイおよびミャンマー、ベトナムで実施されている日本の国際協力機構(JICA)の人身取引対策プロジェクトの視察およびヒアリングを行った。また、プロジェクトの共通課題である人身取引被害者の保護および支援(中長期的な再統合支援を含む)に関して、自立支援、暴力被害女性に対する支援をDV被害者支援との対比などを民間の支援団体(NGO)実践家からの示唆を得て研究を進めた。出身国に帰還する、滞在国に中長期・永続的に定住する、双方の可能性を含めた元「被害者」の生活再建、自律支援の支援方法、国際協力方法の方法論をさぐった。2.ASEAN地域内における人身取引研究タイとカンボジアの国境、カンボジアとベトナムの国境、またタイからインドネシア沖への漁船での強制労働など、近年とくに国境近辺および国境を越えて活性化している人身取引事象、また開発事業における住民の立ち退きと人身取引の関連などを研究会およびヒアリングを通して、理解を深め、より根源的な人身取引対策を考察することができた。3.10代少女の人身取引の被害防止に関する研究10代少女が人身取引の被害を受けやすくなっている日本での性産業の発達は、平成26年6月発行米国国務省の人身取引報告書の日本報告にも「JKビジネス(女子高校生を対象とした)が売春や人身取引の温床になっている」ことが指摘されている。10代の少女たちは、成人や児童の支援のカテゴリーに入らず支援の間にある。本年度の研究は、こうした若年層の脆弱性の実態と、その対策に関する研究会を開催したほか、ベトナムやタイのストリートチルドレンとの比較研究を、一部参加型調査方法を取り入れながら行った。

まずセアンにおける人身取引対策に関する文献や資料を国際会議等からも入手し、分析、検討することができ、制度を比較できたほか、当事者参加が少ないなど課題も抽出できた。さらにタイでは2015年に人身取引関連の法律が改正され、その変化と影響について引き続きフォローすることができている。とくに平成27年度は、漁船における強制労働や少数民族の移動中の殺戮などセンセーショナルな事件が発生し、人身取引問題が注目され、政府の対応も変化しつつある。またランナウェイ・ユース、ストリートチルドレンなどと呼称され、大人と子どもの間で、人身取引としてはそれほど多くの関心が払われてこなかった子ども、とくに10代の若者の脆弱性に着目し、タイやベトナム、カンボジア、日本での人身取引との関連を、人身取引被害防止や支援の方法を考察することができた。さらに、これまで、つぎに人身取引に関する国際協力や被害者支援に関して、研究会を通して研鑽を重ねており、中長期的な被害者支援モデルを構築しつつある。平成28年度は、本研究事業の最終年度として人身取引に関する研究を5つの側面から深めることができた。第1に、人身取引が人の移動(移住労働、難民など)と関連したイシューであることを確認した。とくにアセアンの中では、ミャンマーからタイ、マレーシアに移動したロヒンギャ難民や、インドネシア沖でのタイ船籍の漁船がミャンマー人、カンボジア人、タイ人などメコン地域出身の漁船労働者の強制労働問題が発生している。第2にこうした課題に対応するために、国連機関、アセアン、政府、NGO,市民団体など多くのステークホルダーがさまざまなプロジェクトを実施している。第3に搾取(人身取引)の被害に遭った人々の中には、支援を受けるだけの客体化された存在ではなく、同じような経験をした人々と痛みの経験を分かち合い、問題解決のために自助組織を形成していた。性的被害に遭った女性、労働搾取被害に遭った女性や男性など互いに支援しあうピアサポートプログラムを展開しており、新たな市民社会を醸成していた。第4にアセアン、とくにメコン地域で起きている人身取引はサプライチェーンの末端となっている。とくに漁業セクターではシーフード・サプライチェーン上で強制労働が発生しているなど日本の消費者が看過できない課題であることの認識を深めることができた。第5に、人身取引問題は、子どもと大人の中間である若者に対する中長期支援に関する実践や実践に寄与する研究が手薄であることがわかった。どの課題も国際的な対応が求められている。これらの調査研究成果の一部は、「メコン地域と日本をつなぐ人身取引問題を考えるーシーフード・サプライチェーン、"被害者“支援と当事者運動、そして私たちの役割」と題した国際シンポジウムを開催して、公開し、行政、NGO,研究者らの参加者を交えての研鑽を深めることができた。本研究の成果は3点ある。第1はアセアンにおける労働搾取型の人身取引の実態を考察できたことだ。特にタイ、ミャンマー、カンボジア、ラオスなど多国籍の労働者を乗せた漁船での労働搾取はシーフードのサプライチェーンを通して先進国の消費者も関与しており、人身取引はビジネスと人権課題で看過できない。第2に被害者支援に有効な、当事者による自助活動(Aモデル)と支援者らによる地域密着型活動(Bモデル)を提示したことである。第3は新たな知見である。
希薄窒素酸化物の温度スウィング吸収分解に用いる新規固体吸収材料の開発

蛍石型酸化物系は酸化雰囲気であれば吸収ステツプを室温に設定可能で、加えて500°C以下で脱離が完結するため、温度スウィングにおける試料への熱負荷も低く抑えることが可能である。NO_X吸収は0_2共存下で促進され、吸収と脱離が可逆的に繰り返された。MnO_X-CeO_2系のTPD測定によると、monodentate、bidentate型NO_3種は約200°C、一方イオン性NO_3は約300°Cに脱離ピークを与え、500°C以下で全NO_Xの脱離が終了した。室温と5C0°Cとの間での温度スウィングにより、可逆的なNO_X吸収脱離を安定に繰り返すことが可能になった。酸化物表面近傍に蓄積したNO_Xを単なる加熱脱離ではなく、還元性ガスとの反応によって取り除き、NO_X吸収能を再生する方法および触媒設計について検討した。H_2を還元剤とする吸収NO_XのN2への転化に対しては、Pd/MnO_X-CeO_2が最も高い活性を示した。150。C以下の低温においてPd/MnO_X-CeO_2への酸素共存下におけるNO_X吸収が飽和に達した後、H_2パルスを導入したところ、蓄積したNO_Xを一挙にN2へと還元し、NO_X吸収能を再生できることを見出した。一方、NO/0_2/H_2混合ガズを用いた定常反応の結果、Pd/MnO_X-CeO_2は酸化雰囲気(10%0_2)においてもNO_X-H_2反応を安定に持続した。NO_XのN_2への転化率は反応温度に依存し、125°Cで最大60%以上に達した。以上の結果より、H_2活性化能とNO_X吸収能を併せ持つPd/MnO_X-CeO_2触媒は、低温酸化雰囲気におけるNO_X-H_2反応を選択的に促進することが明らかになった。150。ディーゼルエンジンやガスタービンなどから発生する酸素を多量に含む排ガス中の希薄窒素酸化物(NOx)の浄化法として、固体吸収材料の利用が注目されている。本研究では、O_2,CO_2,H_2Oなど共存ガスによる被毒を受けないNOx吸収材料を探索した結果、触媒(Pd)と吸収剤(ZrO_2)とを組み合わせた系を見出した。試料の構造、組成および調製法の最適化を図ると同時に、NO吸収脱離性能および吸収NOの浄化法を詳細に検討した。含浸法で得た0.01PdO-ZrO_2のO_2およびCO_2共存下におけるNO吸収特性を示した。反応温度が低いほど高い除去率が持続し、総吸収量は30°Cで0.61mmol/g-ZrO_2に達した。試料は正方晶あるいは単斜晶ZrO_2とPdOとの混合物から成るが、NO吸収に伴う結晶相の変化は認めらない,FT-IRスペクトルによると、NOが酸化され、硝酸根として固体中に取り込まれることが明らかになった。硝酸根はPdOの有無に関わらず生成するため、NOは気相酸素でNO_2へと酸化された後、ZrO_2と反応するものと推定される。NO吸収後の試料をHe気流中で昇温した場合、NOの脱離は100°Cおよび300°Cにピークを示し、400°C以下の低温で完結した。

O_2共存下でNO吸収後の0.01PdO-ZrO_2に室温でH_2を導入したところ、N_2の発生が確認できた。この結果は、吸収除去したNOxを還元剤を用いて浄化できる可能性を示唆している。また、流通系反応装置において試料にNOを供給しながら、試料温度を吸収温度(30300°C)および脱離温度(300600°C)で周期的に変動させた場合の、出口ガスのNOx濃度を調べた。NO吸収はO_2共存下で促進され、0.6mmol/g-ZrO_2の吸収と脱離が可逆的に繰り返された。ZrO_2と0.01PdO-ZrO_2とを比較すると、後者ではNO脱離がより速やかに進行しており、PdOはNO脱離を促進する効果を有すると考えられる。蛍石型酸化物系は酸化雰囲気であれば吸収ステップを室温に設定可能で、加えて500°C以下で脱離が完結するため、温度スウィングにおける試料への熱負荷も低く抑えることが可能である。NOx吸収はO_2共存下で促進され、吸収と脱離が可逆的に繰り返された。MnOx-CeO_2系のTPD測定によると、monodentate、bidentate型NO_3種は約200°C、一方イオン性NO_3は約300°Cに脱離ピークを与え、500°C以下で全NOxの脱離が終了した。室温と500°Cとの間での温度スウィングにより、可逆的なNOx吸収脱離を安定に繰り返すことが可能になった。酸化物表面近傍に蓄積したNOxを単なる加熱脱離ではなく、還元性ガスとの反応によって取り除き、NOx吸収能を再生する方法および触媒設計について検討した。H_2を還元剤とする吸収NOxのN_2への転化に対しては、Pd/MnOx-CeO_2が最も高い活性を示した。150°C以下の低温に於いてPd/MnOx-CeO_2への酸化共存下におけるNOx吸収が飽和に達した後、H_2パルスを導入したところ、蓄積したNOxを一挙にN_2へと還元し、NOx吸収能を再生できることを見出した。一方、NO/O_2/H_2混合ガスを用いた定常反応の結果、Pd/MnOx-CeO_2は酸化雰囲気(10%O_2)においてもNOx-H_2反応を安定に持続した。NOxのN_2への転化率は反応温度に依存し、125°Cで最大60%以上に達した。以上の結果より、H_2活性化能とNOx吸収能を併せ持つPd/MnOx-CeO_2触媒は、低温酸化雰囲気におけるNOx-H_2反応を選択的に促進することが明らかになった。
養殖魚における水産用医薬品の薬物速度論的研究-ミロキサシン

本研究を着手するにあたって、HPLCによるミロキサシン(MLX)および主要代謝物であるM-1の同時定量法について検討した。次に、供試魚(養殖ウナギ)の成長速度の相違(本実験では体重差で区別し、重いグループ成長良好群、軽いグループを通常群とした)による薬物の経口投与後の体内動態について薬物速度論的に調べた。得られた結果は次の通りである。(1)本開発法によってMLXおよびM-1は妨害成分とよく分離され、シャープなピークが得られた。MLXおよびM-1をそれぞれ2ppm添加した各組織からの平均回収率は、それぞれ88および84%であり、変動係数はそれぞれ4.4および4.0%であった。検出限界は血清および筋肉で0.03ppm、肝臓および腎臓で0.06ppm、胆汁で0.1ppmであった。従って、本開発法は残留分析法確立のための基準に十分適合するものであった。(2)単回経口投与した場合、血清濃度増加速度は通常群が成長良好群の2倍以上速く、半増期は1/13であった。AUC(血漿中濃度時間曲線下の面積)は成長良好群と通常群でほぼ同じであったが,MRT(平均滞留時間)は通常群が成長良好群の2倍程度であった。MLXのTmaxは胆汁を除いた各組織で通常群の方が速かった。逆にT1/2(生物学的半減期)は各組織とも通常群が成長良好群の2倍以上であり、Et(消失時間)もそれぞれ長かった。成長良好群および通常群のすべての組織でMLXおよびM-1のグルクロン酸抱合体が検出された。未変化体および全代謝物に占める抱合体の割合は、成長良好群および通常群の各組織でほぼ同じであった。
超微粒子混練用ロ-ルみる内の粒子の流動機構の解明とミルの連続自動化システムの開発

湿式ロ-ルミルは、凝集状態にある超微粒子を含む高粘性流体(ペ-スト)をロ-ル間の狭い間隙に巻き込んで粒子の凝集状態をはずし、高粘性流体と粉砕・混練するための分散機であり、その構造が単純で、分散性能がよく、しかも、ペ-ストの操作粘度範囲が広いために、最近の先端技術材料として注目を浴びている厚膜ハイブリッドIC用導電抵抗ペ-スト、ファインセラミックス、各種有機・無機複合材(アロイ化、ブレンド、コンパウンド)などに使用される超微粒子の製造工程に広く用いられている。本研究では、ロ-ル間隙に生じるロ-ルの回転による高粘性流谷の循環流が未分散粒子間間隙通過を妨げる(間隙流体中での粒子の蓄積を促進する)ことが、分散粒子の均一化、ロ-ルミル運転の連続自動化への障壁となることに着眼し、この循環流自体を制御し、未分散粒子の蓄積を防止する方法を流体力学的観点から見いだした。この知見を基にして、このロ-ルミルの内、最も簡単な2本ロ-ルミルを回分工程で自動的に操作するために、ロ-ル間間隙を自動的に制御できるシステムを開発した。このシステムは、ダイヤルゲ-ジ、フォトインタラプタ、A/D変換器、マイクロコンピュ-タ、コントロ-ルモジュ-ル、ドライバ-、パルスモ-タおよび歯車よりなる。ダイヤルケ-ジをロ-ル外表面に設置し、これに接続したフォトインタラプタにより間隙の変動を検出し、その出力信号をA/D変換してマイクロコンピュ-タに取り込んだ。操作プログラムにより間隙の測定値と設定値との差を計算しコントロ-ルモジュ-ルに入力信号を送る。次に、ドライバ-に動作命令用パルスを送信し、パルスモ-タを回転させた。この方法により、パルスモ-タとロ-ルの取っ手の軸に取り付けた歯車の作用を利用してロ-ル間間隙を微調整した。さらに、開発した制御システムの分散性能を確かめるために、フライアッシュ粒子の分散実験を行った。その結果、本システムが予想通り満足に作動することがわかった。湿式ロ-ルミルは、凝集状態にある超微粒子を含む高粘性流体(ペ-スト)をロ-ル間の狭い間隙に巻き込んで粒子の凝集状態をはずし、高粘性流体と粉砕・混練するための分散機であり、先端材料の製造工程に広く用いられている。従来のロ-ルミルでは、ロ-ル間隙調整などの運転操作が経験的に行われているため、微粒子の均一な分散状態を効率よく得ることができず、処理に多大な時間を要した。そこで、本研究では、ロ-ル間隙に生じるロ-ルの回転による高粘性流体の循環流が未分散粒子のロ-ル間間隙通過を妨げる(間隙流体中での粒子の蓄積を促進する)ことが、分散粒子の均一化、ロ-ルミル運転の連続自動化への障壁となることに着眼し、この循環流自体を制御し、未分散粒子の蓄積を防止する方法を流体力学的観点から見いだすことにより、最も単純な二本ロ-ルミルの効率的分散と連続自動化を可能にすることを目的としている。第1年度である本年度は、小型の二本ロ-ルミル実験装置を製作し、そのロ-ル間隙に微粒子を混入させた水飴水溶液を流入させ、間隙に保持される流体(バンクと呼ぶ)中の流動機構をレ-ザ・スリット光を用いた流れの可視化、及び、粒子運動速度の測定により解明した。

また、バンク内流動を流体力学的に制御する方法を考案するには、種々の境界条件に対するバンク内流動の変化を知ることが必要であるので、有限要素法による層流ナビア・スト-クス式の解を数値計算するアルゴリズムを完成させ、実測値と比較した。この結果、バンク内の流体の循環流が粒子の粉砕・混練に悪影響を与えることが明らかになった。また、この循環流の発生を防止するためには、ロ-ル表面の回転部を薄いシ-ト状の構造物で覆う方法がベストであることが明らかになり、この技術を開発した。ロ-ルミルは高粘度分散媒の中に粒子を高度に分散させることができる分散機として、古くから塗料、インク、化粧品などの製造工程に用いられてきた。近年、ファインケミカル、セラミックス、エレクトロニクス産業が急成長するに伴い、これらに必要な素材開発および製造工程において各種のペ-ストを高度に均一化、超微粒子化できる分散機として広く用いられるようになった。なかでも、現在、工業的に広く用いられているのは3本ロ-ルミルである。しかし、この3本ロ-ルミルは生産性が低いこと、連続運転がなされていないこと、密閉系で運転が困難であるため高度な有機溶媒が使えないなどの問題点がある。特に自動化がなされていないために、熟練工が手作業によって試料の投入と掻き取りを繰り返しながらロ-ル間間隙を段階的に小さくしていくという複雑な作業をしており、熟練工の勘と経験に大きく依存しているのが現状である。そこで、本年度は前年度に続いて3本ロ-ルミルの欠点を克服し2本ロ-ルミルの連続自動化を可能とすることを目指した。具体的には、2本のロ-ル間間隙を自動的に制御できるシステムを開発することによって本格的な2本ロ-ルミルの連続運転自動法を確立し、実際に粒子の分散実験を行いその有効性を確かめた。