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部分安定化ジルコニアのマルテンサイト変態とイオン電導度の関係に関する研究

Y_2O_3を3mol%含む部分安定化ジルコニアおよびそれにAl_2O_3を添加した試料を常温圧粉ー焼結法で作製し,加熱・冷却の熱サイクルや等温時効処理を施こし,熱処理に伴う正方晶(T)【double half arrows】単斜晶(M)相変態(マルテンサイト変態)挙動を調べた。1.T→M変態に伴って,イオン電導度が上昇することが判明した。2.室温800°C間の加熱・冷却の熱サイクル数とともに,試料表面でのT→M変態量が増した。さらに,その変態は試料表面から内部へと進展し,その進展に伴って粒界割れを起こすことも判明した。As点(M→T変態温度)は熱サイクル数にかかわらずほば同じであったが,Ms点(T→M変態温度)は熱サイクルに伴って上昇した。この挙動は,割れによる自由表面が増加し、膨張を伴う変態に対する拘束力が減少したためと考えられる。したがって、T→M変態挙動にはT相粒界の結合力が大きく関与しているとみなされた。3.Al_2O_3添加によりT→M変態は抑制された。特に,試料内部への変態の進展を著しく抑制することが判明した。4.T→M変態は等温的にも起こり,その変態量(f)と時間(t)の関係は、JohnsonーMehl式(f=1ーexp(ーbt^n),b,nは定数)で表わされ,n値は約1であった。そのn値は、Al_2O_3添加に関わらずほぼ同じであったので,Al_2O_3添加によるT→M変態の抑制には,核生成の抑制に大きく関与していると推測された。5.Al_2O_3添加試料の粒界破面には,Al_2O_3およびY_2O_3量がマドリックス中より多く,これらが粒界に偏析していると考えられる。これら偏析で粒界の結合力が増し、そのため、T→M変態の進展が抑制されたと考えられるが,この偏析現象の詳細については、今後の研究を待ちたい。
薬物性口内炎におけるプロスタグランジンの役割の解明と新しい口腔ケア法の確立

小児期悪性腫瘍の化学療法に使用されているアルキル化剤(シクロフォスファミド)を成長期のマウスに投与し、口腔領域におよぼす影響を検討した。薬剤投与群では、歯周組織で歯根膜繊維や歯根形成などの変化が認められ、歯の支持組織としての機能へ影響をおよぼしていると考えられた。また舌の上皮構造の変化が認められ口内炎発症に関与すると考えられたが、歯周組織にあらわれたほどの大きな変化は認めなかった。小児期悪性腫瘍の治療の際に用いられる抗腫瘍薬の副作用として口内炎や歯の形成障害が認められる。多様な疾患に関与するPGE_2は、炎症の発症にも関係が深い。今回は、悪性腫瘍の治療の際に口腔内でどのような変化が起こるかを調べるために、化学療法でよく用いられる抗腫瘍剤のうちシクロフォスファミドを選択し、成長期のマウスを用いて、歯周組織でのPGE_2の産生の変化および歯根形成など歯周組織に対する影響を検討した。研究には、歯根形成開始時期にあたる小児期のマウスを用い、対照群と実験群の2群に分け、抗腫瘍薬のシクロフォスファミドを選択し、30mg/kgとなるように腹腔内投与した。薬剤投与後4日および8日後にネンブタール深麻酔下にて、潅流固定を行い頭蓋部の試料を採取した。採取された試料から舌や顎骨などの軟組織および硬組織の試料を採取し、必要に応じて脱灰など処理を行った後、HEおよび免疫組織学染色を行って、歯周組織の変化や歯根形成中の象牙芽細胞の変化および歯根の形態への影響を観察した。軟エックス写真から歯根形成の抑制が認められた。軟組織でのPGE_2の産生については現在検討中である。この研究を行うことにより、抗腫瘍剤によってPGE_2の産生が口腔内ではどのような動態を示すかを明らかにし、抗腫瘍剤によるPGの合成と口内炎発症の関係について検討する。悪性腫瘍治療中の副作用の1つである口内炎は、患児らが食事や睡眠などの基本的な生活を送っていく上で疼痛や口腔清掃不良といった支障を与える原因の1つとなっていることが多い。このようなストレスが患児のQOLを著しく低下させているので、PGの合成のコントロールを行うことができ口内炎が予防されれば、患児の苦痛の軽減ができる可能性があると考えている。研究には、歯根形成開始時期にあたる小児期のマウスを用い、対照群と実験群の2群に分け、抗腫瘍薬のシクロフォスファミドを選択し腹腔内投与した。経日的な変化をみるため歯根形成完了までの間数日を選択し、ネンブタール深麻酔下にて、潅流固定を行い頭蓋部の試料を採取した。抗腫瘍薬投与群では、体重の増加不良や脱毛といった副作用と考えられる変化が認められた。また、頭部軟エックス写真から歯根形成の抑制が認められ、薬剤の投与濃度依存的にその影響が強く現れていた。経日的な変化としては、薬剤の投与を中止すると切歯部では歯根形態が正常へ戻る傾向をしめしたが、臼歯部においては歯根形成への影響がのこり形成不良が継続した。今回は、悪性腫瘍の治療の際に口腔内でどのような変化が起こるかを調べるために、化学療法でよく使用される抗腫瘍薬のうちアルキル化剤のシクロフォスファミドを選択し、成長期のマウスを用いて舌の変化、歯根形成および歯周組織に対する影響を検討した。研究はM1歯根形成開始時期にあたる小児期のマウスを用い、実験群にはシクロフォスファミドを30,50,100,200mg/kgとなるよう腹腔内投与した。薬剤投与後4,8および12日後にネンブタール深麻酔下にて潅流固定し試料を採取した。採取された舌や顎骨などの試料を固定・脱灰など処理後、HEおよび免疫組織学染色を行った。また歯根の形態変化を観察するためにマイクロCT撮影も行った。

薬剤の影響は濃度依存的に体重の増加抑制としてあらわれた。また、マイクロCT撮影より歯根形成の抑制が確認された。HE染色では、実験群の下顎臼歯歯根部(M1)の象牙芽細胞は形態が変化して象牙質の形成量も減少して不規則となっていた。経日的に歯根長の短縮が明瞭となった。また歯根周囲の歯根膜繊維の走行も乱れを認めた。軟組織である舌では、低濃度作用群では重層扁平上皮層の構造は大きな変化は認めなかったが、高濃度作用群では構造の崩壊を認めた。上皮組織のマーカーとしてサイトケラチンを用いた免疫染色を行ったところ、歯根形成先端部のヘルトヴィッヒ上皮鞘の形態が変化しており、歯根形態の異常や歯根長短縮に関与していると考えられた。シクロフォスファミドの副作用として歯周組織や口腔軟組織に影響があらわれることが示唆され、悪性腫瘍の治療時には口腔にあらわれる症状についても説明し、口腔ケアに注意が必要であると考えられた。
東アジアの「水」を巡る「伝統の森」の文化の資料化

東アジアには、山・川・海と地域社会が深く関わる「伝統の森」文化が遍く存在する。伝統芸能の原点の祭りを行う空間であり、五感に広がる風景でもある。現在、その文化の認識希薄と人為的影響・生態的危機の共通課題により、未来に持続保全が困難である。本研究は、東アジア(日本・韓国・台湾)における「伝統の森」の文化の資料化である。「伝統の森」の空間位置・植生・生育状況・由来・地域誌を図鑑形式で100カ所の資料化を完成させた。東アジアの「伝統の森」の生態保全と文化継承に寄与し、自然と共生する豊かな文化を未来に繋ぐものである。「伝統の森」は、「水」の恵みをもたらし、地域・集落の開拓、災害誌(地震・干ばつ・洪水等)、文化伝来など人間社会の「生」の様々な営みと深く関わる。多様な生き物を育む森としても重要な役割を果たしてきた、生きとし生ける「命の歴史」を繋ぐ空間として長い間培われた「生態的価値」の森でもある。2014年度は、東アジアの「伝統の森」の文化を、研究分担者と各地の研究協力者が現地調査を行い、地域誌・古絵図・祭礼・植生などを網羅した「文化誌的図鑑」の準備作業を行った。調査内容は、次の項目である。1、調査地約85ヶ所の写真撮影を行い、森の空間位置の記述を行った。2、森の植生・生育状況を樹木専門家・樹木医等と確認して、図鑑形式でまとめた。3、森の古図、資料収集は、収集可能な限り行い、由来・地域誌等の文献を中心に調べて、データを文化誌図鑑形式で、1カ所につき1枚程度にまとめた。2014年の調査の結果、伝統の森の保全が良い所と都市化等の人為的要因と病虫害や鹿、鳥等の動物の増加により被害がある所が明らかになった。循環する水の原点にもなり、文化的生態的も貴重な伝統の森の持続保全は、社会全体において再認識の意義は大きい。これらのの成果と結果を社会に広く発信する為、論文発表とともに「神都高千穂と神代川のかわまちづくりシンポジウム」において、東アジアの水を巡る伝統の森の文化誌の資料化の意義等を発表した。本企画は、東アジアにおける水を巡る「伝統の森」の文化の資料化である。2015年度は、2014年度行った調査地の中で、祭礼を中心に調査を行い、写真撮影と共に文化誌の記録を行った。更に日本と韓国で新たな調査を実施して、合計95ヶ所の調査と記録を行った。伝統の森の「空間位置」・「植生・生育状況」・「由来・文化誌」を1ヶ所につき1枚の「文化誌図鑑」形式で、作成を行った。これまで調査研究で、明らかになったのは大きく次の三点である。1、東アジアにおける水を巡る「伝統の森」の空間位置は、「水源涵養林」、「河畔林」、「里の森」、「海辺林」として類型できる。その多くは、人々が日々の生活や様々な思いで、木々を植えて作られた森が多いことが分かった。2、祭礼調査では、地域社会は水を巡る宗教・象徴的意味と共に地域社会がお互い連携して、協力する仕組みが祭礼を通して表されることを確認できた。3、「伝統の森」の持続的保全は、地域社会、行政、そして民間団体の協力が重要であることを確認できた。なお、これらは、今後論文にまとめる。また、2015年度は資料化のみならず、海岸林の実践的保全の為、地域社会と行政の共同参加の意見交流会を2015年6月25日佐賀県虹の松原と10月20日韓国蔚山市で行った。そして、1、2、3の成果を2016年3月5日滋賀県立大学でワークショプを開催して、共同メンバー等8名により発表を行った。2015年度は、2014年度植生・生育調査を行った85ヶ所の内に日本と韓国の特徴的な祭礼がある伝統の森を中心に調査を行い、写真撮影と共に文化誌の記録を行った。日本と韓国の新たな調査を10カ所行い、合計95ヶ所の調査と記録を試み、企画当初の目標55カ所を大幅多い調査地の記録ができた。文化誌図鑑の完成と共に日本の水を巡る伝統の森の論文を作成中である。2016年度は、東アジアの水を巡る伝統の森の調査を持続保全に焦点を合せて行った。また、各地の写真、古図、空間位置、生態状況、由来、地域誌を図鑑の形式で資料化を進めた調査の結果、次のようなことが分かった。1、台湾は、水を巡る「伝統の森」をマングローブ林を中心に行い、高度成長期に、オヒルギは絶滅して、メヒルギやヒルギダマシの2種類が多く増加している状況が分かった。一方、近年、マングローブに関する社会における関心が高まり、環境教育や観光、地域活性化等に再利用されていることが分かった。2、韓国の「伝統の森」は、歴史的に作られた河畔林や海岸林が多く、特に海岸松林の保全の為、民間団体を中心に積極的活動が分かった。近年、「伝統の森」の中に風景の鑑賞と地域の文化活動等の拠点になる「亭子」が作られている。3、日本の「伝統の森」は、持続保全に焦点を合わせて官・民、地域社会が一体になって保全に取り込む森の調査を行った。

なお、一連の成果は、論文発表と共に2016年6月3日、石垣市での講演会を通して、地域社会に研究成果の還元を試みた。今後、東アジアの「伝統の森」100カ所の文化誌をまとめて、日本、韓国、台湾の比較論文と共に刊行を試みる計画である。東アジアには、山・川・海と地域社会が深く関わる「伝統の森」文化が遍く存在する。伝統芸能の原点の祭りを行う空間であり、五感に広がる風景でもある。現在、その文化の認識希薄と人為的影響・生態的危機の共通課題により、未来に持続保全が困難である。本研究は、東アジア(日本・韓国・台湾)における「伝統の森」の文化の資料化である。「伝統の森」の空間位置・植生・生育状況・由来・地域誌を図鑑形式で100カ所の資料化を完成させた。東アジアの「伝統の森」の生態保全と文化継承に寄与し、自然と共生する豊かな文化を未来に繋ぐものである。2014年度は、東アジアの水を巡る伝統の森の調査を、約85カ所で実施した。当初計画では55カ所であったが、調査を行ううち、人為的・自然的な要因によって危機的状況におかれている伝統の森が多く存在することが明らかになった。そのため、資料化をより多く実施して広く社会に還元する必要性が高いと考え、調査地を100カ所に増やしたものである。方法は、「山・河・里・海」を繋ぐ視点で水と関わる森を選定し、一次的調査を行った。地域誌・古絵図・祭礼・植生などを網羅した「文化誌的図鑑」の準備のため、これらの調査結果を1カ所につき1枚の図鑑形式にする方向で作業を進めている。台湾の水を巡る伝統の森を「マングローブ林」に着目して、現地調査を行い、文化誌に追加を行う。東アジアにおける水を巡る「伝統の森」100ヶ所を、1カ所に1枚の森の植生・生育状況と文化誌の資料化を完成する。日本と韓国の「伝統の森」を河畔林、海辺林の文化と持続保全を論文にまとめる。また、台湾と沖縄県の水を巡る伝統の森を、マングローブ林に着目して比較の視点で考察する。これらを統合して、東アジアにおける水を巡る「伝統の森」と持続保全をテーマにした論文を年度末まで完成予定である。文化学2014年度の調査地について、祭礼を中心に再度調査を行い、「文化誌図鑑」形式の一覧表を完成する予定である。2015年度は、新たに設けた調査地15カ所余りの調査を行い、東アジア100ヶ所の調査表を完成する予定である。調査は、2014年度の調査項目に祭礼を加えて行い、文化誌図鑑に反映する。古図・文献資料を収集して、図鑑形式の報告を完成させる。その成果を学会で発表を行う予定である。また、研究分担者及び研究協力者は、文化誌図鑑に基づいて、論文を作成する予定である。また、今後、文化誌図鑑と論文をそれぞれ書物として刊行する予定である。文化的にも生態的にも貴重な伝統の森を未来の世代に繋ぐ基盤を作る。調査地の都合、祭礼の時期が合わなかったため、調査と資料整理を2015年度に繰り越した。2014年度に行なえなかった調査の旅費と資料整理(写真整理、古絵図整理、文章の訂正等)のために使用する。
先天性心疾患に伴う肺高血圧症の病態進展における炎症シグナルの役割

シャント性心疾患における肺血流増加は著しい肺血管リモデリングを引き起こすが、これまでその病態機構は明らかでなかった。我々は肺血流量増加と低酸素血症を合併するマウス病態モデルを構築しこのモデルを用いた解析を行った。マウスの左肺を切除した後、低酸素飼育を行うことにより、著しい肺血管リモデリングを呈するモデル(シャント性心疾患モデル)を作成した。このマウスモデルを用いて、肺血管周囲に浸潤するマクロファージをフローサイトメトリーを用いて経時的に解析したところ、間質のM2マクロファージの早期浸潤が血管平滑筋増殖に関わること、間質マクロファージの除去により肺血管リモデリングが軽減することが明らかとなった。診断技術ならびに心臓外科手術の進歩により多くの成人先天性心疾患患者の予後は改善してきたにも関わらず、肺高血圧症合併ACHD患者の予後は依然として悪いことが知られている。シャント性心疾患における肺血流増加は著しい肺血管リモデリングを引き起こすが、これまでその病態機構は明らかにされて来なかった。マウスの左肺を切除した後、8.5%酸素下での低酸素飼育を行うことにより、著しい肺血管リモデリングを呈するモデル(シャント性心疾患モデル)である。このモデルは低酸素ストレスと定量性を持った右肺動脈血流増加を背景とした、臨床上のシャント性心疾患の病態を反映した病態モデルと考えられる。平成28年度は、このマウスモデルを用いて、肺血管周囲に浸潤するマクロファージをフローサイトメトリーを用いて経時的に解析した。特に血管平滑筋細胞の増殖期に集積するマクロファージに着目したところ、間質のM2マクロファージの早期浸潤が血管平滑筋増殖に関わること、間質マクロファージの除去により肺血管リモデリングが明らかとなった。続いて細胞集団特異的なLoss of function approachによりこのマクロファージ亜集団のシャント性心疾患モデルにおける機能的役割を検証している。本研究では、低酸素ストレスによる炎症細胞浸潤がシャント性疾患において肺血管リモデリングを増悪させる機構の解析を通じて、炎症制御、マクロファージのM1/M2機能制御というアプローチを新たな治療法開発の一助とすることを目指す。構築したシャント性心疾患モデル、および低酸素飼育のみ施行したマウス(低酸素単独)、左肺切除のみ施行したマウス(High flow単独)を用いて、肺血管周囲に浸潤するM1/M2マクロファージをフローサイトメトリーを用いて経時的に解析した。その結果、シャント性心疾患モデルマウスにおいて低酸素+High flowの負荷後早期にM2マクロファージの浸潤が一過性に増加することが明らかになった。M1マクロファージや肺胞マクロファージの浸潤増加は認めなかった。また、クロドロネートリポソーム静脈注射することにより間質のマクロファージ除去を行うと肺血管リモデリングが抑制されるという結果を得た。ただし、クロドロネートリポソーム静脈注射では間質のM1,M2マクロファージともに除去されることから、M2マクロファージ特異的な役割を明らかにするために、現在、マクロファージ特異的なM2機能欠損マウス(Lysm-HIF2αマウス)を用いたモデルマウス作成、phenotypeの評価、M1/M2マクロファージの挙動の解析を行っている。一方、本研究実施を通じて、M2マクロファージ増加のタイミングで肺血管周囲への好酸球浸潤が増加するという新しい事実をも認めており、M2マクロファージ集積の上流因子として肺血管リモデリングにおける好酸球の役割にも注目している。好酸球ノックアウトマウスであるGATAマウスおよびM2機能が欠失したSTAT6ノックアウトマウスを用いて解析を行っている。重要な細胞亜集団を同定し、そのノックアウトマウスの作成も終了しているためおおむね順調に進展しているとの認識である。平成29年度にはM2マクロファージの上流因子として好酸球に注目し好酸球→M2マクロファージ経路がシャント性心疾患モデルにおいて肺血管リモデリングを増悪させていることを明らかにした。また肺血管とともに右室リモデリングの程度を解析した。

シャント性心疾患における肺血流増加は著しい肺血管リモデリングを引き起こすが、これまでその病態機構は明らかでなかった。我々は肺血流量増加と低酸素血症を合併するマウス病態モデルを構築しこのモデルを用いた解析を行った。マウスの左肺を切除した後、低酸素飼育を行うことにより、著しい肺血管リモデリングを呈するモデル(シャント性心疾患モデル)を作成した。このマウスモデルを用いて、肺血管周囲に浸潤するマクロファージをフローサイトメトリーを用いて経時的に解析したところ、間質のM2マクロファージの早期浸潤が血管平滑筋増殖に関わること、間質マクロファージの除去により肺血管リモデリングが軽減することが明らかとなった。HIF依存的なM2機能がマクロファージにおいて欠失しているLysm-HIF2αマウスを用いたモデルマウス作成、肺血管リモデリングや右室負荷に関わるphenotypeの評価、M1/M2マクロファージの挙動の解析を行う。同時にHIF依存的なM1機能欠失マウスにおいての解析も行う。マクロファージのM1/M2極性が肺血管リモデリング過程で果たす役割を解明した後、そのM1/M2極性を至適に調節すること、あるいはM1/M2マクロファージ特異的なケモカインレセプターの阻害薬を利用して肺血管リモデリングの軽減を図る治療法の開発を目指す。具体的にはHIF-1α阻害薬であるRX-0047(Rexahn社)やHIF活性化薬FG-2216(FibroGen)を用いHIF活性を介してM1, M2機能の調節を行う。M1, M2機能をそれぞれ至適に制御することにより、マウスモデルを用いて肺血管リモデリングを予防する最適な制御法を見出す。医歯薬学循環器内科学阻害薬や抗体を使用した実験に未着手でありこれら薬剤の購入をしていないため。また予定よりも少数のマウス個体でphenotypeがでたためマウスの飼育維持にかかる費用が節約できたため。主にノックアウトマウス実験を行っているため、マウスの飼育、維持に使用する。また、HIF1阻害薬やHIF活性化薬、抗体を投与してのrescue実験を予定しているためこれら薬剤の購入に使用する。また論文執筆、学会発表を行う。
野生果樹自生地の分布・構造と保全に関する応用植生学的研究

しかし、野生果樹は一般に陽樹的性格をもつため、保全に際しては、こうした生理的特性を十分考慮する必要がある。火山地や岩角地のように、自生地の群落が自然条件に規定されて、放置しても遷移がすすまない場合には、自生地を保護することが有効な手段である。しかし、放置すれば遷移がすすむような場合には、むしろ陽樹林を持続させる保極的な植生管理が必要である。ヤマモモ・タチバナは、薪炭林利用のような人為的なインパクトがあってはじめて維持されてきたものである。適正な管理が放棄されたいま、植生は自然植生へと遷移し、その結果、野生果樹が、消滅したり、更新できないといった問題が引き起こされている。燃料革命により、野生果樹の宝庫ともいえる陽樹林の存立基盤が薄らいでいる今日、あらたな視点での自生地保全が必要とされる。伊豆・浮山地区におけるヤマモモ樹の保存事例は遺伝資源の保存と自生地の緑地的利用が共存しうる可能性を示している。すなわち、ここでは、別荘開発の際にヤマモモを伐採せず、逆に取り込んだ形で開発を行った。その結果、遺伝資源が庭木として保存されることになったのである。また、高知県でかえって樹勢が増している例をみることができた。今後も自生地を保全していくためには、こうした野生果樹遺伝資源保存と自生地の緑地的利用の共存も検討していく必要がある。本研究は,野生果樹自生地の分布と環境特性をマクロに把握するとともに,暖温帯,冷温帯,亜寒帯に自生する野生果樹をとりあげ,その生育地の現状を植生学的に調査し,野生果樹の生育と植物群落の構造・動態との関係について分析することを目的としている.また,そうした調査・分析の結果をふまえて,野生果樹遺伝資源を保全しつつ森林を利用することが可能となるような植生管理方策について検討することも大きな課題である.そこで,本年度は,以下のような点について,研究を実施した.1.緑の国勢調査から,野生果樹自生地のリストアップを行い,植生タイプごとの階層ダイヤグラムを作成し,そこにおける果樹の地位を評価した.2.暖温帯の野生果樹自生地の例として,伊豆半島・浮山地区のヤマモモ自生地(スダジイ林),戸田地区のタチバナ自生地(クヌギ林)をとりあげ,植生調査,果樹変異調査を行った.以上の研究結果から,以下のような点が明らかになった.1.ヤマモモ・タチバナ樹の残存状況と更新過程は,それらを含む群落構造の差(主に人為的影響の差異を反映していると考えられる)とよく対応していることが分かった.2.群落内の野生果樹の果実変異は,群落分布・構造と関係していることが明らかとなった.したがって,野生果樹遺伝資源保存のためには,群落構造そのものの保全が重要であるといえる.次年度は,冷温帯の例として,山形・上山地区のアケビ自生地,亜寒帯の例として,長野県・軽井沢地区のブルーベリー自生地,富士山のコケモモ自生地をとりあげ,今年度と同様の手法で,研究を実施するとともに,全体をとりまとめて,野生果樹自生地を保全するための植生管理方策を提案する予定である.しかし、野生果樹は一般に陽樹的性格をもつため、保全に際しては、こうした生理的特性を十分考慮する必要がある。しかし、放置すれば遷移がすすむような場合には、むしろ陽樹株を持続させる積極的な植生管理が必要である。ヤマモモ、タチバナは、薪炭林利用のような人為的なインパクトがあってはじめて維持されてきたものである。

伊豆・浮山地区におけるヤマモモ保存樹の保存事例は遺伝資源の保存と自生の緑地的利用が共存しうる可能性を示している。すなわち、ここでは、別荘開発の際にヤマモモを伐採せず、逆に取り込んだ形で開発を行った。その結果、遺伝資源が庭木として保存されることになった。また、高知県室戸市では貸別荘地のなかに保存されたタチバナが周辺の適度な伐開によってかえって樹勢が増している例をみることができた。今後も自生地を保全していくためには、こうした果樹遺伝資源保存と自生地の緑地的利用の共存も検討していく必要がある。
1-セレノ-2-シリルエテンを用いる不斉シクロプロパン化反応の開発

不斉シクロプロパンの合成法の開発は重要な課題である。最近、我々は1-セレノ-2-シリルエテン(1)と求電子オレフィンとのルイス酸存在下での反応で、新規なケイ素の1,2-シフトを伴う[2+1]環化付加反応により、シクロプロパン化合物が得られることを見出した。昨年度の研究で、不斉補助基として(ι)ーメントールを導入した光学活性求電子オレフィン(2a-c)を用いてジアステレオ選択性を調べたところ、高いジアステレオ選択性でシクロプロパン化合物が得られることがわかってきた。本年度の研究ではまず、得られたシクロプロパン(3a)を既知の有用合成中間体である光学活性シクロプロパン(7)に誘導して(3a)の絶対配置の決定を行なった。その結果、得られた(7)の比旋光度と既知の(7)との比較により、シクロプロパン(3a)は2S体である。また、(7)は69-71%eeである。(3a)の絶対配置は反応機構から予想したものと一致した。また、(7)への変換により本反応の実用性を示した。さらに(3a)の合成的有用性を拡大するため選択的還元から始まる変換反応を行ない、不斉アミノシクロプロパンカルボン酸誘導体の重要合成中間体である(10)とした。次に、(1)とトリカルボニル置換オレフィンである(2b)の反応における化学収率が満足いくものではなかったのでさらにβ位のエステル基のかわりにケトン基を導入した求電子オレフィン(2d)を用い反応速度を大きくする試みを行なった。(1),ZnI_2,(2d)のCH_2Cl_2溶液を-30°Cで5.5-8時間攪拌した。その後、Et_3Nによって反応を停止しシクロプロパン(3d)を得た。(2d)と(1)との反応はトリエステル(2b)に比べ比較的早い時間で進行し(3d)を与え、化学収率は62-84%と向上した。(3d)のdeは約95%である。
19世紀アメリカ文学におけるピューリタニズムの変容-ディキンスンを中心に

1.広くピューリタニズムの変容を調べるに当たり、ディキンスンが当時書き送った手紙を翻訳することで、彼女の自然観・宗教観・社会観を検討した。それらの手紙とは、(1)文芸評論家T.W.Higginsonへの手紙、(2)親友であった新聞社主筆Samuel Bowlesへの手紙、(3)晩年の恋人であったLord判事への手紙、(4)学校時代の友達、兄、妹や従妹たちへの手紙である。2.フルブライト研究員に選ばれ、ブラウン大で2001年に学んだ時の、St.Armand教授の助言を得て、Paul Ferlazzo, Emily Dickinsonの翻訳を進めて来た。3.近い将来、ディキンスンの伝記を書く目的で、ディキンスンに関する年譜を整備した。4.難解なディキンスン詩の翻訳がまだ十分でないわが国の事情に鑑み、秀詩100を翻訳し、発表した。また詩の特徴とその読み方例を示すことで、D詩への案内の役を果たした。5.アマースト大学のカリキュラムを調べることで、当時の教育が地学や農政学等実利的科学に重きを置く反面、正統的キリスト教を重視した宗教的な色彩の強いものであることを確認した。6.今後は19世紀アメリカと同時代のイギリスの文化・宗教との連続性の研究の必要性を痛感し、現在、伝統と反伝統の立場から研究中である。1.ピューリタニズムの変容を鯛べるに当たり、ディキンスンが詩作の指導を仰いだ評論家・社会改良家のT.W.Higginsonの思想との関係を調べつつ、ディキンスンからヒギンスンへの主要な手紙を翻訳した。『丈学研究』97(2000年3月。さらにディキンスンの知友である新聞社の主筆SamuelBowlesや判事Lordとの関係に見られる彼女の自然観・教会観などを調べた。『文学研究』98。さらには、ディキンスンの学生時代の彼女の学校友達、兄、それに従妹たちへの手紙に見られる彼女の教会や学校に対する態度の変化を調べた。『文学研究』99。2.フルブライト研究員に選ばれ、2001年9月から12月まで、ディキンスン研究の権威であるアメリカはブラウン大学のSt.Armand教授の下で親しく研究する機会を得た。3.『九州アメリカ文学』42号(2000.11)に「隠遁詩人ディキンスンのマグマ」と題する論文を発表した。4.彼女が学んだMt-Holyoke Semmaryでのカリキュラムと近しいと当時のアマースト大学で学んだ内村鑑三のアメリカ留学時代のカリキュラムなどを比較点検することで、当時のアマースト大の教育が自然科学を中心とする実学に重きを置く反面、キリスト教的な信仰を重んずる宗教的な色彩の強いものであることを確認した。5.今後はアメリカのNewEnglandと同時代のイギリス19世紀文化・宗教の連続性の研究の必要性を痛感し、現在イギリス丈学を伝統と反伝統の立場から研究中である。1.ピユーリタニズムの時代的変容を調べるに当たり、ディキンスンが詩作の指導を仰いだ評論家・社会改良家のT.W. Higginsonの思想との関係を調べる目的で、ディキンスンからヒギンスン宛の主要な手紙を翻訳した。ディキンスンの自然観・(反)教会制度観・恋愛観などを調べる目的で、彼女の親友の新聞社主筆Samuel Bowlesと判事Otis Lord宛の手紙を翻訳した。さらにはピューリタン色の強い当時の宗教に対する態度の変化を調べる目的で、彼女の兄、妹、学校友達への手紙を翻訳し、解題を付した。(雑誌論文等の欄を参照)2.日米教育(フルブライト)委員会派遣の上級研究員に選抜され、ディキンスン研究の権威であるアメリカはブラウン大学のSt. Armand教授の下で、親しく研究する機会を得た(2001年9月12月)。また教授とともにアマーストに出かけ、U. Mass大のPorter教授、Mt. Holyoke大のBenfey教授たちと懇談した。またSt. Armand教授の来日(2002年5月)に際し、立教大でのシンボジアムに参加した。

3.『九州アメリカ文学』42号(2002年11月)に「隠遁詩人ディキンスンのマグマ」と題する論文を発表した。4.ディキンスンの父が理事を務めていた当時のアマースト大学で学んだ内村鑑三の留学時代のカリキュラムなどを点検し、当時の教育が実証主義の自然科学を重視しつつ、他方でキリスト教的な信仰を重んずる宗教的な色彩の強いものであったことを確認した。5.アメリカ・ピユーリタニズムの伝統を今日、継承するものとして、『トマス・ウルフ論集』(共同執筆)とスタインベックについての論文を出版し、学会誌の書評で取り上げられた。1.ピューリタニズムの変容を、ディキンスンを中心にして捉えるために、彼女の難解な詩を正確に読むことは当然として、ディキンスンの主要な書簡を訳出することが大事と考え、翻訳をしてきた。それらはディキンスンが詩作の指導を仰いだボストンの評論家のT.W.Higginsonへの手紙、ディキンスンの親友であった新聞社の主筆Samuel Bowlesへの手紙、マサチューセッツ最高裁判事Otis Lordへの手紙、それに身内や友人たちへの手紙である。2.我が国においては研究書の翻訳が少ないことに鑑み、最も標準的なディキンスン研究書であるPaul Ferlazzo, Emily Dickinson(Twayne)の翻訳を開始し、紀要等に発表した。これは2004年中に上梓予定である。3.ディキンスンと同時代のニューイングランドの作家たちについて研究を進めているが、まずHawthorneの幻の処女作と言われるFanshaweについて、そのアメリカ的ピューリタニズムの側面について小論を発表した。4.同じくニューイングランド出身の作家Henry Jamesの有名な"The Turn of the Screw"の幽霊像を詳細に点検し、そこに見られる抑圧された性とピューリタニズムとの関連について、小論を発表した。5.ディキンスンの父が理事をしていた当時のアマースト大学で学んだ内村鑑三の留学時代のカリキュラムなどを点検し、当時の教育が自然科学を重視する反面、キリスト教の信仰を重んずる宗教的な色彩の強いものであったこと、それらがディキンスンの教育と重なるものであること等を確認した。
洞結節細胞の膜伸展に伴う電流の解析

洞結筋細胞の自動能は機械的伸展刺激に伴って亢進することが知られている。しかし,そのイオン機序に関する研究は全く行なわれていなかった。昨年度の本研究費による研究で,初めて洞結筋細胞の膜伸展刺激により伸展誘発性クロール(Cl)電流が活性化されることを発見し,この電流が洞結筋細胞の伸展刺激に伴う自動能の亢進に関与する可能性を報告した。この電流は歩調取り電位の領域では内向き電流として関与するため自動能に対しては促進的に働くが,伸展刺激に対する過度の自動能亢進を制御するためには,CI電流に拮亢する外向き電流が必要であると考えられる。そこで,本年度は伸展刺激に伴う外向き電流として重要と考えられる伸展誘発性カリウム(K)電流を測定し,その電流の性質および発現機序を明らかにした。家兎単一洞結筋細胞にガラスパッチ電極を用いて電圧固定法を行なった。細胞外に低浸透圧液を潅流することにより細胞膜は伸展されると共に外向き電流が活性化された。この電流は細胞内液にセシウムを用いた状態では認められずK内液を用いた状態で活性化された。この電流の平衡電位は細胞外液のK濃度に依存し,バリウムやキニンにより抑制させたことより,伸展に伴って活性化されたK電流であることが確認された。このK電流の性質はCI電流と同様な時間非依存性電流であったが,このK電流は細胞外のカルシウム(Ca)の除去,または細胞内Caのキレートにより抑制されることより,その活性化の機序にはCaイオンが必須であることが確認された。以上のことより洞結節細胞の膜伸展刺激によりCa依存性のK電流が活性化されることが確認され,この電流が外向き電流として膜伸展に伴う自発興奮頻度を調節している可能性が示唆された。叉,今回の研究により膜伸展に伴う細胞外Caの流入も引き起こされることが予測されたため,今後は伸展刺激に伴うCaの細胞内への流入機序に関する研究を行なう予定である。
がん性疼痛患者におけるオピオイド鎮痛薬の体内動態と薬効・副作用の変動予測法の構築

オピオイド鎮痛薬の体内動態や薬剤感受性には、大きな個人差が存在する。この個人差を予測するための根拠となる臨床データは乏しく、現状、医薬品添付文書に基づく画一的な投与設計が行われている。本研究では、がん性疼痛患者を対象として、オキシコドンの体内動態と鎮痛・有害作用発現および耐性形成について、薬物代謝酵素、薬物輸送担体およびオピオイド受容体の遺伝的要因およびがん悪液質の進行度に基づき評価を行った。日本人のがん患者では、オキシコドン徐放錠の有害作用発現に及ぼす薬物代謝酵素、薬物輸送担体およびオピオイド受容体の遺伝子変異の影響については、ほとんど評価されていない。本研究では、オキシコドンおよび活性代謝物のオキシモルフォンの血中動態に基づいて、がん患者におけるオキシコドン徐放錠の有害作用発現に及ぼすCYP2D6、ABCB1およびOPRM1の遺伝子変異の影響について評価した。血漿中オキシコドン濃度はCYP2D6およびABCB1の遺伝子変異の影響を受けなかった。血漿中オキシモルフォン濃度はCYP2D6*10ノンキャリアに比べ、*10キャリアで低い傾向を示した。濃度比(オキシモルフォン/オキシコドン)はCYP2D6*5ノンキャリアに比べ、*5キャリアでは有意に低値を示し、*10ノンキャリアに比べ、*10キャリアで低い傾向を示した。嘔吐の発現率では、CYP2D6*5ノンキャリアと比較して、*5キャリアで高い傾向が見られ、*10ノンキャリアと比較して、*10キャリアで有意に低値を示した。一方、ABCB1とOPRM1の遺伝子変異は、オキシコドン徐放錠の嘔吐の発現率に影響を及ぼさなかった。また、オキシコドン徐放錠による便秘や中枢性有害作用の発現率については、CYP2D6、ABCB1およびOPRM1の遺伝子変異の影響は認められなかった。以上より、がん患者において、CYP2D6の遺伝子変異がオキシモルフォン生成経路に影響し、オキシコドン徐放錠による嘔吐の発現に関与することが考えられた。がん患者の多くは、外科療法、化学療法および放射線療法による栄養摂取状態の悪化により、低アルブミン血症をきたす。一方、進行がんにおいては、がん細胞の組織浸潤により、α1酸性糖タンパクのような炎症性タンパクが誘導される。本研究では、がん患者におけるアルブミンやα1酸性糖タンパクの血中挙動のオキシコドンの遊離形分率、耐性形成および中枢性有害作用に及ぼす影響について評価した。がん性疼痛に対し、オキシコドン徐放錠の服用を開始した47名の患者を対象とした。対象としたがん患者の血清アルブミン値は、正常域に比べ低値を示した。一方、血清α1酸性糖タンパク値は、正常域に比べ高値を示した。また、血清アルブミン値については、オキシコドンの遊離形分率との有意な負の相関が認められるものの、血清α1酸性糖タンパク値では、相関性は確認されなかった。血清アルブミン値は、オキシコドンの耐性形成の指標となるopioid escalation indexとの正の相関が認められた。さらにがん患者における血清アルブミン値の低下と中枢性有害作用の発生率の上昇には、有意な関係が示された。一方、血清α1酸性糖タンパク値は、opioid escalation indexや中枢性有害作用に影響を及ぼさなかった。以上より、がん患者において、血清アルブミン値はオキシコドンの遊離形分率に影響を及ぼすことが示された。さらに血清アルブミン値は、オキシコドンの耐性形成や中枢性有害作用にも、影響を及ぼすことも示された。がん悪液質では、肝臓における急性期タンパク質の合成に伴い、CYP3Aの活性が低下する。本研究では、がん患者におけるオキシコドンの体内動態、ベースライン投与量および中枢性有害反応に及ぼす悪液質の影響について評価した。対象はがん性疼痛に対しオキシコドンによる治療を開始した47名とした。がん悪液質の進行度については、Glasgow prognostic score(GPS)により、ステージ分類を行った。オキシコドンの服用12時間後におけるオキシコドンとノルオキシコドンの血中濃度を評価した。オキシコドンによる臨床効果として、初回タイトレーション後、4週間のベースライン投与量および中枢性有害反応を評価した。対象患者におけるGPSは、0(7名)、1(21名)および2(19名)であった。オキシコドンの血中濃度は、GPSの増加とともに有意に上昇した。さらにその濃度比(ノルオキシコドン/オキシコドン)は、GPSの増加とともに有意に低下した。また、オキシコドンの増量頻度および速度は、GPSの増加とともに有意に低下した。一方、オキシコドンによる中枢性有害反応の発現率は、GPSの増加とともに有意に上昇した。また、GPSを構成する血清アルブミン濃度については、オキシコドンの増量頻度との間に有意な関係が認められた。一方、オキシコドンの血中濃度とオキシコドンの増量頻度および中枢性有害反応の発生率との間には、直接的な関連性は認められなかった。

以上より、がん患者において、悪液質は代謝異常や栄養異常を介して、オキシコドンの臨床効果に影響を及ぼすことが示された。
低温で高い触媒効率を発揮する低温活性酵素の構造要因の解明

本研究では、好冷菌Shewanella sp.由来のCold-active protein-tyrosine-phosphatase(CAPTPase)について、活性発現能と触媒部位近傍構造の柔軟性維持に必須な構造要因との相関性を明らかにすることを目標とした。高分解能X線結晶構造解析から、CAPTPaseの触媒部位が主に化学結合力の弱い疎水性相互作用で構築されていることを明示した。これらの疎水性相互作用を形成するアミノ酸残基を置換した変異型酵素の機能解析から、触媒部位において亜鉛イオンと配位結合するA78、H80、D114を正しく配置させるために必要と考えられる疎水性部位(Zn-1部位)において、V79、V85、I115、L145、I307の側鎖による疎水性相互作用が本酵素の機能発現に寄与する柔軟性維持に重要であることを示した。さらに、D114を含むループに位置するI115をメチオニンに置換したI115M変異型酵素の触媒効率が野生型酵素のそれの1.65倍の値を示すことを見出し、その立体構造を1.5Åの分解能で決定した。野生型酵素とI115M変異型酵素について、決定した立体構造を比較したところ、主鎖構造の相違は認められなかったが、変異型酵素においては置換したM115の側鎖がalternative conformationを示した。この結果から、野生型酵素に比べて高い活性を示すI115M変異型酵素では、115番目のアミノ酸残基がイソロイシンよりも疎水性の低いメチオニンへ置換されることによって、Zn-1部位の化学結合力が弱められ、野性型酵素に比べて高い柔軟性がZn-1部位に附与されたと考えられた。即ち、CAPTPaseにおいては、触媒部位近傍に位置するZn-1部位を形成する疎水性アミノ酸側鎖の化学結合力が触媒効率に影響する1要因であると結論した。好冷菌Shewanella sp.の低温活性protein tyrosine phosphataseが低温で効率よく活性を発現するためには、活性中心(触媒部位及び基質結合部位)近傍構造の柔軟性維持が重要である。本研究では、本酵素の触媒部位近傍構造の柔軟性維持に寄与する構造要因を解明することを目的とした。i)触媒部位近傍に位置し、低温活性発現に関与する部位のVal79、Val85、Ile115、Leu145、Ile307を置換した変異型酵素の酵素的特性を解析したところ、Val79をIle、Leu、Met、Pheに置換した変異型酵素のkcat値は、野生型酵素(WT)よりも低く、また、Val85、Leu145、Ile307を疎水的結合力の弱いアミノ酸に置換した変異型酵素においても、低い値を示した。一方で、I115の変異型酵素I115M、I115Fでは、それぞれWTの1.2倍、1.4倍のkcat値を示した。ii)野生型酵素の1.2倍のkcat値を示したI115M変異型酵素の立体構造を1.5Aの分解能で決定した。その結果、I115M変異型酵素では、上記に示した5つのアミノ残基を含むループ構造の温度因子が、野生型酵素のそれに比較して上昇していることを見出した。これらの結果から、本酵素の低温における活性発現には、金属イオンと配位するAsp78、His80、Asp114を含むループ近傍構造における疎水性相互作用の化学結合力があると推定した。現在、上記5つのアミノ酸残基側鎖の組み合わせを変えた変異酵素のライブラリーを構築している。

本研究では、好冷菌Shewanella sp.由来のCold-active protein-tyrosine-phosphataseについて、低温活性発現能と触媒部位近傍構造の柔軟性維持に必須な構造要因との相関性を明らかにすることを目標とした。本酵素の低温活性発現に重要となる構造要因を知るためには、さらに高分解能でのX線結晶構造解析によって得られる、原子の異方性やmultiple conformationなどの柔軟性に関する情報の取得と低温で活性が変化した変異型酵素との構造の比較が必須であると考えられる。そこで、野生型酵素の立体構造をSpring-8放射光を用いて1.1Åの高分解能で決定した。また、変異型酵素の機能解析から、触媒部位において亜鉛イオンと配位結合するAsp^<78>、His^<80>、Asp^<114>を正しく配置させるために必要と考えられる疎水性部位(MI部位)において、Val^<79>、Val^<85>、Ile^<115>、Leu^<145>、Ile^<307>の側鎖に働く疎水性相互作用が本酵素の機能発現に寄与する柔軟性維持に重要であることを推定した。さらに、5°Cにおけるkcat値が野生型酵素のそれの約1.2倍の値を示す変異型酵素(I115M変異型酵素)の立体構造を1.5Åの分解能で決定した。変異型酵素においてはMI部位に位置しているMet^<115>の側鎖が2つのconformationを有していた。この結果から、野生型酵素に比べて高い活性を示すI115M変異型酵素では、115番目のアミノ酸残基がIleよりも疎水性の低いMetへ置換されることによって、MI部位の化学結合力が弱められ、野性型酵素に比べて高い柔軟性がMI部位に附与されたと考えられた。即ち、本酵素においては、触媒部位近傍に位置するMI部位を形成する疎水性アミノ酸側鎖の化学結合力が低温での効率よい活性発現に寄与する1要因であると結論した。
行動遂行時のノンスパイキング介在神経シナプス電流のホールセル記録法による解析

行動遂行中のアメリカザリガニProcambarus clarkii Girardのノンスパイキング介在神経活動をホールセル記録法によって解析するための実験的基盤を確立する目的で、微小・パッチ電極が適用可能な無麻酔全体標本の開発、電圧固定実験によるノンスパイキング介在神経膜電流の測定・解析、実体解剖顕微鏡下でのパッチ電極のin situ細胞への適用、の3点に的を絞って研究を進めた。その結果、1)トレッドミル上を歩行する無麻酔全体標本を開発し、その腹部最終神経節内の前運動性ノンスパイキング介在神経からシナプス活動を記録して、その生理学的特徴を調査し、歩行運動系による姿勢反射のゲート機構におけるノンスパイキング介在神経の機熊的役割を明らかにした。また、2)ノンスパイキング介在神経の樹状案起でのシナプス電流の時間・空間的分布に大きな影響を持つ突起膜の電位依存型膜コンダクタンスを、ガラス管微小電極を用いた不連続膜電位固定法により解析し、脱分極依存性の外向き整流性質が3種類のカリウムコンダクタンスの働きによって実現していることを実験的・理論的に証明した。さらに、3)実体顕微鏡下でin situの神経節ニューロン細胞体表面を機械的に露出して、これにパッチ電極を適用してその膜の単一カリウムチャンネル活動を記録可能であることを示した。これらの結果は、行動遂行中の全体標本に、パッチ電極を適用してその中枢ニューロンのシナプス電流を記録・解析するための基盤を確立するものである。従来、無脊椎動物のin situ中枢ニューロンにパッチ電極を適用した例は非常に少ないが、今回の研究結果は、行動遂行中の全体標本にも、パッチ電極をin situ中枢ニューロンに適用して、そのシナプス電流を記録・解析することが可能であることを示している。アメリカザリガニ中枢神経系内のノンスパイキング介在神経から、歩行運動およびこれと関連した姿勢制御行動の遂行にともなうシナプス電流をホールセル記録法により計測する目的で、本年では、ベルト型トレッドミル上での実験動物にガラス管微小/パッチ電極を適用する実験システムの確立を目指した。また、実験動物の動きの自由度を最大限に保証するために、トレッドミル装置の改良を行った。ベルト型トレッドミル上でザリガニが歩行運動を遂行している間に、ガラス管微小電極を用いて、その腹部神経節内のノンスパイキング介在神経を含む各種中枢細胞のシナプス活動を記録した。その結果、細胞により、歩行運動の開始、継続、終止と関連した固有のシナプス活動を示すことが判明した。大部分の細胞では、リズミカルな歩行運動中に持続性のシナプス活動が観察されたが、これは歩行運動の遂行に関する情報を中枢内に伝える随伴性活動と考えられる。細胞の形態は、いずれも生理実験終了後に蛍光色素による細胞内染色により確認した。又、本年度は、従来のベルト型に代えて使用するための球形クラマ-型トレッドミルシステムを開発した。最小限の拘束条件で固定した状態で実験動物に直径約12cmの発泡スチロール製球の上を歩かせ、球の動きを光学的にモニターすることによって、歩行運動の開始と終止、歩行の速度と方向を定量化することが可能であった。このトレッドミルシステムには、従来通りの電極保持装置を設定することが可能である。これらの結果により、行動遂行中のザリガニ中枢神経系にホールセル記録法を適用する技術的基盤が確立された。次年度は、微小電極に代えてパッチ用電極を用い、ブラインド法によりin vivoの細胞からホールセル記録を行う予定である。歩行運動遂行中にアメリカザリガニ中枢ニューロンのシナプス活動をホールセル記録するため、今年度は、無麻酔全体標本が歩行運動を行うことができるトレッドミル装置を開発し、これを用いてガラス管微小電極による細胞内記録法を確立するとともに、in vitro標本を用いて、ブラインド・パッチ電極法の適用を試みた。

腹部最終神経節内の尾扇肢運動ニューロン、前運動性ノンスパイキング介在ニューロンなど各種の中枢ニューロンに細胞内電極を刺入して調査した結果、トレッドミル上の歩行時にも安定してシナプス活動を記録することが可能であることが判明した。シナプス活動以外には、歩行運動中も静止電位に変化は認められず、微小電極が安定して細胞内に維持されることが示された。この標本・トレッドミル装置は、ホールセル記録においても使用可能と考えられる。一方、in vitro標本は、腹部最終神経節を単離したのち、実験用チェンバー内の生理食塩水中でシリコン底面に不動化した。細胞体層が存在する腹側を上にして、神経節表面の結合組織性の神経節鞘をピンセットとマイクロシザーズを用いて除去したのち、ピペッティングにより、細胞体表面の疎性結合組織を取り除いた。運動遂行中のシナプス活動をホールセル記録するためには、作動距離が十分に長い(>20cm)実体顕微鏡下に標本をおく必要がある。今年度は、この状態でギガシール状態を確立することを目標とした。電極には、10mlのシリンジを用いて手動的に陽圧をかけながら細胞表面を探索した。電極先端の位置は、実体顕微鏡下で直接確認するのが困難であり、電極に電流を通電して、その抵抗をモニターしながら推定した。この方法で、電極先端が細胞体層に接近する様子は確認することができたが、ギガシール達成することはできなかった。細胞体層表面をさらに酵素処理する必要性も考えられるが、これまでの微小電極による細胞内記録での結果から、酵素処理の細胞に与える損傷も十分に考慮する必要があり、次年度の課題である。行動遂行中のアメリカザリガニのノンスパイキング介在神経活動をホールセル記録法によって解析するための実験的基盤を確立する目的で、今年度は、腹部神経節の単離標本を用いて、ニューロンの細胞体を実体顕微鏡下で露出し、パッチ電極を適用して、その膜での単一チャンネル電流記録を行った。電極にはザリガニの生理食塩水か、もしくはGarcia-Colunga et al.(1999)記載の溶液を充填した。電極抵抗は生理食塩水中で4-8MΩであった。短形波パルスに対する電極の電流応答をオシロスコープでモニターしつつ、陽圧をかけ、細胞体の表面に付着していると思われる細胞外基質を吹き飛ばしながら、実体顕微鏡下で油圧式微動マニプレータを用いて徐々に電極を細胞体に近づけ、Giga-seal状態を確立した。さらに、細胞体膜から、自発性のチャンネル開閉による単一チャネル電流を記録することに成功した。保持電位を静止電位に設定した状態で外向き電流であることから、カリウムチャンネルと推定された。これらの結果は、実体顕微鏡下でパッチ電極をザリガニ中枢ニューロンに適用することが可能であることを示している。また、ニューロン細胞体の露出は、単離標本の他、全体標本でも可能である。従来、無脊椎動物のin situ中枢ニューロンにパッチ電極を適用した例は非常に少ないが、今回の研究結果は、行動遂行中の全体標本にも、パッチ電極を適用してその中枢ニューロンのシナプス電流を記録・解析することが可能であることを示している。