hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高脂肪食負荷・肥満において活性化する新規脂肪重量調節因子の探索

我々が見出した脂肪蓄積因子ALK7は、TGFbeta受容体ファミリーに属するオルファン受容体で、その機能解明には未知リガンドを同定することが重要である。我々は、TGFbetaファミリー33種のうち、肥満あるいは過栄養状態において発現が亢進するもの4種を同定し、うち3種が細胞レベルでALK7リガンド活性があることを見出した。これらリガンド候補分子は、脂肪組織の特定細胞に高発現しており、オートクラインあるいはパラクラインの機序で作用していることが示唆された。これまで我々は、肥満症モデルマウスを用いた遺伝学的解析により、新たな脂肪蓄積遺伝子ALK7を同定し、ALK7が過栄養状態において活性化し、脂肪分解酵素リパーゼ遺伝子の発現を抑制することにより、余分なエネルギーを脂肪細胞に蓄積させる作用があることを見出した。そこで本研究では、TGFβ受容体ファミリーの一つであるALK7の未知リガンドの探索を行い、このシグナル系が肥満症の成因や病態生理にどのように関わるかを解析する。前年度の研究により、高脂肪食負荷および肥満状態において発現の誘導されるTGFβ受容体リガンド・ファミリーのスクリーニングを終え、候補因子を4種に絞り込んだ。また、これらが脂肪組織中の脂肪細胞やマクロファージに発現していることを見出したが、表面マーカーなどにより細胞分離法を用いて、さらに発現細胞の種類を限定した。実際にこれらのリガンドのリコンビナント・タンパク質が、細胞レベルでALK7を介する生物学的作用を有するかを調べるために次の実験を行った。シグナル下流因子SMADの結合配列直下にルシフェラーゼ遺伝子を発現させた293細胞において、3種のリガンド・タンパク質が、ALK7受容体とCripto共受容体の発現下でのみ、ルシフェラーゼ遺伝子の発現を促進することがわかった。また、これらのリガンド・タンパク質が、野生型およびALK7変異マウスより単離した成熟脂肪細胞でリパーゼの発現抑制を引き起こすかを調べたところ、少なくとも1種のリガンド・タンパク質がALK7依存性に抑制することを見出した。これまで我々は、遺伝子変異マウスを用いた解析から新たな脂肪蓄積遺伝子ALK7を見出した。ALK7はTGFβ受容体ファミリーの一つであり、成熟脂肪細胞に強く発現している。そこで、成熟脂肪細胞における機能を解析したところ、ALK7は過栄養状態においてリパーゼ遺伝子発現を抑制することにより、余分なエネルギーを脂肪細胞に蓄積させる作用があることがわかった。しかしながら、このようなALK7活性が長期継続するとインスリン抵抗性や慢性炎症状態を引き起こすことが考えられる。ALK7活性を抑制できれば肥満症やそれに伴う代謝異常の改善につながると考えられるが、ALK7シグナルを活性化する因子は解明されておらず、その抑制手段も不明である。そこで、本研究では、高脂肪食負荷および肥満においてALK7シグナルを活性化する新規脂肪重量調節因子の探索を行った。まず初めに高脂肪食負荷および肥満モデルマウスより単離した各組織におけるTGFβリガンドファミリー(33種類)の網羅的発現解析を行った。その結果、対照マウスに比べ、高脂肪食負荷および肥満状態で強く発現誘導される遺伝子4種を同定した。これら遺伝子は全て脂肪組織で強く発現誘導していた。次に、免疫学的手法を用いて脂肪組織中の間質血管細胞群(SVF)からマクロファージ、T細胞などの免疫系細胞などを分離し、発現細胞を調べた。その結果、これら遺伝子は脂肪細胞、マクロファージに発現していることがわかった。以上のことから、同定されたTGFβリガンドファミリーが、脂肪細胞、マクロファージにおいて、新たな脂肪重量調節因子として機能する可能性が示唆された。本年度までに、(1)網羅的発現解析から、高脂肪食負荷・肥満において活性化する新たな脂肪重量調節因子の候補として数種のTGFβリガンドファミリーを同定した。(2)それら遺伝子は、脂肪組織中の脂肪細胞、マクロファージにおいて発現していることがわかった。(3)また、TGFβリガンドファミリーのリコンビナントタンパク質を発現・精製し、in vitro実験によりALK7シグナルを活性化するか検討中である。したがって、本研究はおおむね順調に研究計画を遂行していると思われる。1.新規ALK7シグナル活性化因子の同定(1)同定されたTGFβリガンドファミリー遺伝子のリコンビナントタンパク質を発現・精製し、その活性評価する。また、免疫沈降実験により、ALK7との結合も調べる。(2)ルシフェラーゼアッセイを用いたin vitro実験によりALK7シグナルを活性化するか検討する。(3)(1)で作製したリコンビナントタンパク質を3T3-L1脂肪細胞に振りかけ、リパーゼ遺伝子発現を調べる。必要に応じてALK7など受容体を過剰発現させる。ALK7シグナル活性化因子の効果を個体レベルで解析する。(1)TSOD及び正常マウスにリコンビナントタンパク質を投与し、ALK7シグナルの活性化、リパーゼ発現、脂肪量を調べる。(2)マウス個体レベルでの耐糖能、インスリン抵抗性、血中パラメーターなどを調べ、in vivoにおけるALK7シグナルの生理的意義を解明する。

リガンドのスクリーニングをほぼ終え、より本格的な研究を翌年度に開始するために、次年度に資金を残した。次年度は、当初の計画通り、遺伝子関連試薬、抗体、マウス飼料・飼育用品などの消耗品に約80%の資金を使用予定である。残りの15%を実験動物施設利用料、5%ほどを学会参加、共同研究などのための旅費に充てる予定である。
電波空間フィルターによる速さ計測

本研究は,放送局から発信される電波が空間にその電界強度の強弱のパターンを作るマルチパスフェージング現象を利用した電波空間フィルターによる速度計測とGPSの活用について調査研究したものである.本研究では,(1)マルチパスフェージング現象の調査,(2)高速チューナの開発,(3)GPS電波の利用,(4)GPSを含むセンサ融合についての研究計画を立案し,次のような新たな知見を得ることができた。(1)マルチパスフェージング現象の調査;電波のマルチパスフェージングにより作られる電波電界強度パターンを速度計測の空間尺度として利用する場合,中央値変動と呼ばれる低周波成分が最大に誤差の原因になる.この中央値変動による影響を避けるために空間フィルタの考え方を導入し,2本のアンテナで捕らえた電界強度の空間差分をとると良いことがわかった.アンテナの数を増やすとそれに比例して精度が向上する.(2)高速チューナの開発;(1)のマルチパスフェージングを走行中の自動車から捕らえるためには,Qの低いチューナを開発しなければならない.Log増幅器を利用して,時速100km以上で走行しても十分電界強度変化を捕らえるチューナを開発した.(3)GPS電波の利用; GPSからの電波によるマルチパスフェージングの検出を試みたが,衛星自体が運動していることや,GPSシステムのサンプリング時間の問題から,(1)電波空間フィルタには現在のところ使えない.(4)GPSを含むセンサ融合;GPSからの位置情報と車両のセンサー(スピード計とレートジャイロ)の情報をカルマンフィルタを用いて融合した.地図情報が不必要な程度のポジショニングが可能であった.本研究は,放送局から発信される電波が空間にその電界強度の強弱のパターンを作るマルチパスフェージング現象を利用した電波空間フィルターによる速度計測とGPSの活用について調査研究したものである.本研究では,(1)マルチパスフェージング現象の調査,(2)高速チューナの開発,(3)GPS電波の利用,(4)GPSを含むセンサ融合についての研究計画を立案し,次のような新たな知見を得ることができた。(1)マルチパスフェージング現象の調査;電波のマルチパスフェージングにより作られる電波電界強度パターンを速度計測の空間尺度として利用する場合,中央値変動と呼ばれる低周波成分が最大に誤差の原因になる.この中央値変動による影響を避けるために空間フィルタの考え方を導入し,2本のアンテナで捕らえた電界強度の空間差分をとると良いことがわかった.アンテナの数を増やすとそれに比例して精度が向上する.(2)高速チューナの開発;(1)のマルチパスフェージングを走行中の自動車から捕らえるためには,Qの低いチューナを開発しなければならない.Log増幅器を利用して,時速100km以上で走行しても十分電界強度変化を捕らえるチューナを開発した.(3)GPS電波の利用; GPSからの電波によるマルチパスフェージングの検出を試みたが,衛星自体が運動していることや,GPSシステムのサンプリング時間の問題から,(1)電波空間フィルタには現在のところ使えない.(4)GPSを含むセンサ融合;GPSからの位置情報と車両のセンサー(スピード計とレートジャイロ)の情報をカルマンフィルタを用いて融合した.地図情報が不必要な程度のポジショニングが可能であった.1.電波空間パターンの低域成分除去電波のマルチパスフェージングにより作られる電波電界強度パターンを速度計測の空間尺度として利用する。このパターンには中央値変動と呼ばれる低周波成分が含まれる。この成分は速さ計測おける誤差の原因になる。空間フィルタの考えかたを導入してこの低域成分の除去を図った。具体的には2本のアンテナで捉えた電界強度の空間差分をとり、その出力の波形の周波数から速さを推定する。1本のアンテナの場合に比べて、きれいに低周波成分が除去され、速さ計測の精度が向上できた。2.多数のアンテナによる電波空間フィルタリング多数のアンテナを利用して空間フィルタを構成する。この場合、2本のアンテナに比べて空間周波数特性がシャープになる。このことを実測した電波電界強度パターンに適用してシミュレーションで検証した。理論から推定できるとおり精度の高い速さ計測が可能になった。3.GPSと車両局地センサーの融合同じく電波を利用するGPSと自動車速さ計とレートジャイロを融合し、より精度の高いポジショニングの方法を提案し、その妥当性を確認した。GPSのポジショニング情報と車両センサーの出力を関係づける状態方程式を作り、この状態方程式にカルマンフィルタを適用する方策を採用した。実車両、実環境で実験を行い、SAによる誤差は削除できないが、連続的にポジショニングが可能になった。これはマップマッチングを極めて容易にする。本研究は,放送局から発信される電波が空間にその電界強度の強弱のパターンを作るマルチパスフェージング現象を利用した電波空間フィルターによる速度計測とGPSの活用について調査研究したものである.本研究では,(1)マルチパスフェージング現象の調査,(2)高速チューナの開発,(3)GPS電波の利用,(4)GPSを含むセンサ融合について研究計画を立案し、次のような新たな知見を得ることができた。(1)マルチパスフェージング現象の調査;電波のマルチパスフェージングにより作られる電波電界強度パターンを速度計測の空間尺度として利用する場合,中央値変動と呼ばれる低周波成分が最大に誤差の原因になる.この中央値変動による影響を避けるために空間フィルタの考え方を導入し,2本のアンテナで捕らえた電界強度の空間差分をとると良いことが分かった.アンテナの数を増やすとそれに比例して精度が向上する.

(2)高速チューナの開発;(1)のマルチパスフェージングを走行中の自動車から捕らえるためには,Qの低いチューナを開発しなければならない.Log増幅器を利用して,時速100km以上で走行しても十分電界強度変化を捕らえるチューナを開発した.(3)GPS電波の利用;GPSからの電波によるマルチパスフェージングの検出を試みたが,衛星自体が運動していることや,GPSシステムのサンプリング時間の問題から,(1)電波空間フイルタには現在のところ使えない.(4)GPSを含むセンサ融合;GPSからの位置情報と車両のセンサー(スピード計とレートジャイロ)の情報をカルマンフィルタを用いて融合した.地図情報が不必要な程度のポジショニングが可能であった.
火山噴火災害の地域社会に及ぼす影響と住民意識

1.噴火災害に関する資料の収集と整理明治期以降の噴火災害に関する資料(公式記録、統計資料、新聞記事など)の収集と整理を以下の火山について行なった。新聞記事は、火山ごとにファィルレ、1記事1枚のカードのシステムで検索できるようにしてある。十勝岳、有珠山、樽前山、磐梯山、草津白根山、浅間山、三宅島、伊豆大島、雲仙岳、霧島山、桜島。2.地域社会の変化に関する資料収集昭和20年以降に噴火災害を経験した火山のなかから、有珠山、浅間山、三宅島、桜島の周辺市町村を対象に、社会変動に関係する統計資料(人口、人口密度、産業率など)を収集し整理した。また、社会変動を分析する理論的枠組についても検討を行なった。3.噴火災害後の復興過程に関する資料の収集前記2で対象とした噴火災害地域で、災害後の復興過程に関する資料を、統計資料、自治体史、新聞記事などから収集し整理した。4.防災対策に関する資料の収集前記火山地帯周辺市町村の防災対策(地域防災計画など)や住民の自主防災組織の現状、及びそれらの形成過程についての資料を収集、現地での防災担当者に対する面接調査を実施した。5.住民意識調査の準備61年度に実施する予定の住民意識調査について、対象地域の選定、調査内容の検討などの準備を行ない、調査旧の原案を作成した。
スポーツ経営学におけるサービス・マーケティング研究序説 -特に、公共スポーツ施設の経営におけるサービス・エンカウンターの意味と構造について-

本研究は、スポーツ消費者とスポーツサービス経営体とのサービス・エンカウンター(Czepiel et al.,1985;Zeithaml and Bitner,1996;Lovelock,1996)の動態分析によって、スポーツ経営学の領野におけるサービス・マーケティング研究の重要性について示唆することを究極的な目的としている。そこで本年度は、昨年度の研究によってフローチャートとして構造化された15のスポーツサービス・エンカウンター((1)施設に到着→(2)施設入口から駐車場→(3)駐車場に到着→(4)エントランスホールヘ移動→(5)エントランスホールヘ到着→(6)自動券売機で利用券の購入→(7)ゲート通過時→(8)ロッカールームへ移動→(9)ロッカールーム→(10)施設サービスの利用<トレーニング室、浴室・サウナ、トイレ・化粧室>→(11)精算機・ゲート退出時→(12)スポーツ情報コーナー→(13)ラウンジ・レストラン→(14)エントランスホールの退出→(15)駐車場の退出)の各接触点における「不満な出来事」が、トータルなスポーツサービスのクオリティや顧客満足及び施設ロイヤルティ等のマーケティング評価にどのような影響を及ぼすのかについて明確にすることを目的とした。そのため、福岡県立Aスポーツ施設のトレーニング室利用者(N=341)を対象に調査を実施した結果、「トレーニング室」(27.0%)、「ロッカールーム」(21.9%)、「浴室・サウナ」(14.6%)といった3つのエンカウンターにおける失敗が前述した3つのマーケティング評価に有意な影響を及ぼすということが明確にされた。換言すれば、このことは、「サービス・デリバリー・システム全体の中で最も低いサービス水準が、顧客のトータル・クオリティを決定してしまう」という「最小律の法則」(田内・浅井,1994)が成立するということを示唆している。したがって、これからのスポーツ経営学の領野においては、スポーツサービスのマーケティング・マネジメント学(理論と実践)が発展し、必要視されていかなければならない。本研究は、スポーツ消費者とサービス組織との「サービス・エンカウンター」(Czepiel et al.,1985;Bitner et al.,1985)の動態分析を射程におさめることによって、スポーツ経営学の領野におけるサービス・マーケティング研究の意味と構造について明確にすることを究極的な目的としている。そこで本年度は、過去のスポーツサービス研究についてレビューし、参与観察法と質問紙調査法によって「スポーツサービス・エンカウンター」について実証的に構造化することを研究目的とした:福岡県立Aスポーツ施設における約2ヶ月にも及ぶ利用者の行動観察と、質問紙調査(341の有効回収標本)の結果、『(1)A施設に到着→(2)施設入口から駐車場へ→(3)駐車場に到着→(4)エントランスホールヘ移動(エレベータ-内を含む)→(5)エントランスホールヘ到着→(6)自動券売機で利用券の購入→(7)ゲート通過時→(8)ロッカールームヘ移動→(9)ロッカールームの利用→(10)施設サービスの利用(トレーニング室,エアロビクス室,リラクセーションルーム,浴室・サウナ,トイレ・化粧室)→(11)精算機・ゲート退出時→(12)スポーツ情報コーナー・掲示コーナーの利用→(13)ラウンジ・レストラン等の利用→(14)エントランスホールを出る→(15)駐車場を出る→(16)A施設を出る』といった16のサービス・エンカウンターが描出され、利用者のスポーツサービス・エンカウンターを視覚的にフローチャートとして構造化することができた。また、利用者は、これらの各エンカウンターにおいてA施設側と非常に満足もしくは不満な出来事・接触(critical incidents)を体験しており、その出来事の良し悪しによってトータルなスポーツサービスのクオリティを主観的に判断しているということを仮説として演繹することができた。しかしながら、本年度は演繹された仮説(上述)や、各エンカウンターにおけるスタッフのコミュニケーション行動については分析できず、次年度に残された研究課題である。

そのため、福岡県立Aスポーツ施設のトレーニング室利用者(N=341)を対象に調査を実施した結果、「トレーニング室」(27.0%)、「ロッカールーム」(21.9%)、「浴室・サウナ」(14.6%)といった3つのエンカウンターにおける失敗が前述した3つのマーケティング評価に有意な影響を及ぼすということが明確にされた。換言すれば、このことは、「サービス・デリバリー・システム全体の中で最も低いサービス水準が、顧客のトータル・クオリティを決定してしまう」という「最小律の法則」(田内・浅井,1994)が成立するということを示唆している。したがって、これからのスポーツ経営学の領野においては、スポーツサービスのマーケティング・マネジメント学(理論と実践)が発展し、必要視されていかなければならない。
海風の卓越する大都市における「風の道」の創出に関する研究

海風の卓越する都市として大阪市を想定し、「風の道」の創出による弱風環境の改善を目的として弱風の成因と改善方法及び改善効果について研究した。弱風空間の事例として大阪市にある東横堀川公園を検討し改善案として構造物による強制的な風の流れを提案した。一般的な市街地の事例として大阪市北浜地区において夏期に測定を行い、日影の下に風が通る空間の重要性を指摘した。また、80m四方程度の都市公園のもつ夜間冷気流出現象(にじみ出し)を測定し、市街地冷却効果の程度を明らかにした。市街地の形態を角柱と円柱が規則的に並んだ状態と仮定して風洞実験と数値計算により風速の考察を行い、弱風域の性状を検討した。弱風域の事例として大阪都心部にある「東横堀川河岸公園」を取り上げ、主として2012年8月に実測調査したデータの解析を行った。東横堀川河岸公園はその周囲の状況から風環境評価のよくない公園であるが、公園内の熱環境評価では、公園の一角にある緑陰の効果が際立っていた。CFDシミュレーションの結果では風上側の建物群が弱風域形成の主原因であり、上部にある高速道路は地上付近まではあまり影響を及ぼしていないようであった。「風の道」の創出に関する事例研究では、資料の収集と整理を行ったがそれほど多くはないため、今後も継続することとした。また、「東横堀川河岸公園」の検討では建物により形成される弱風域に対して風を誘導するガイドベーン状の構造物についても検討をはじめた。「風の道」創出による弱風環境の改善に関する研究を行い、以下のような成果を得た。1)一般的な市街地として大阪市北浜地区を選び、夏季の暑熱環境下におけるオフィス街の熱環境の実態を調査した。その結果、日射の制御(日影)が必須であり、日影のもとに風による冷却効果が発揮されることがわかった。2)大阪市街地の中規模な公園(中大江公園)において、夜間の冷気の流出について測定を行った。その結果、公園から流出する0.3m/s程度の弱風を捉えることが出来た。3)角柱と円柱の比較的単純な幾何学的形態の建物を想定した規則的配置の市街地モデル実験において、ドライアイスの冷気で作った熱的に安定な弱風(層流)と風洞実験装置における風速2m/s程度の市街地風(乱流)とで比較実験を行った。建物模型背後の風に違いがあり、乱流では循環流を形成するが層流では建物背後の風はほとんど0m/sであることがわかった。4)今後、数値シミュレーションの結果を加えて総合的にまとめる予定である。当初計画した研究は、風洞実験等との考察に用いる数値計算による風のシミュレーションを除いてほぼ実施出来たことになる。昨年度に引き続き、「「風の道」創出による弱風環境の改善に関する研究」を以下のように行った。1)市街地が規則的に配列された、角柱タイプの建物に覆われている場合と円柱タイプの建物に覆われている場合を想定して、風環境について風洞模型実験により比較考察した。風洞実験は、断面30cm四方で、模型は3cm、基準風速は3m/sで行った。風速の測定位置は、建物背後と街路平行風の建物間と交差点とした。その結果、円柱タイプと角柱タイプの建物の比較では、歩行空間レベルで全体的に見ると大きな差はなかった。2)風洞実験に対応した数値シミュレーションを行った。使用した計算ソフトは、ソフトウェアクレイドル社のSTREAMの標準k-εモデルである。計算の結果は、円柱は角柱より全体的に歩行空間レベルで風速は弱かった。3)建物による遮風昇温効果を調べるため、風洞実験を行った。熱源は自動車を想定し、建物は2次元模型(高さと幅はともに5cm)で表し、直角風のみ実験を行った。その結果、歩行空間では街路断面の風上側で昇温効果が大きいことがわかった。以上を含めて、3年間にわたる海風の卓越する大都市における「風の道」の創出に関する研究の総まとめを行った。(1)市街地内の弱風域の調査・解析弱風域として大阪都心部にある「東横堀川河岸公園」を取り上げ、主として2012年8月に実測調査したデータの解析を行った。東横堀川河岸公園は南北方向に細長い敷地にあり両岸を5階建て前後の建物が立ち並び川の上部には高架道路が走っていると言った風環境評価のよくない公園である。公園内の熱環境評価では、公園の一角にある緑陰の効果が際立っている。CFDシミュレーションの結果では弱風域形成の主原因は風上側の建物群であり、上部にある高架道路は地上付近まではあまり影響を及ぼしていないようであった。(2)「風の道」の創出に関する事例研究

風の道の創出に関する事例研究を資料として収集したがそれほど多くはないため今後も継続する。また、上記(1)に述べた東横堀川河岸公園の検討で、隣接する建物により形成される弱風域に対して風を誘導するガイドベーン状の構造物について検討をはじめた。これまでの研究の総まとめを行う。また、風洞実験や実測調査との比較考察に用いる数値計算による風のシミュレーション作業を補足的に行う予定である。建築・都市環境工学「風の道」創出による弱風環境の改善案に関する研究を行う。(1)一般的な市街地形態の単純な幾何学形状の各種建物モデルによる改善案の検討を行う。現在、ドライアイスの冷気で作成した弱風(冷気流)を使用した模型実験、及びCFDによる検討を計画している。その結果から弱風環境改善のための建物形態や建物配置の提案を目指したいと考えている。(2)上記「現在までの達成度」に述べた「東横堀川河岸公園」及びその周辺の市街地を対象に具体的な市街地における「弱風環境の改善案」を検討する。必要に応じて実測調査及びCFDモデルによる計算を行い、魅力的な水辺のある市街地空間として再開発するための基礎資料となることを目指す。数値シミュレーションによる解析及び本研究の総合的なまとめを行うため、研究資料の整理を必要としており計画的に経費を残した。購入した風速計及び消耗品が予定より下回ったため。主に、研究資料の整理作業のため、アルバイト費として使用する。新たに購入予定の風速計及び消耗品の一部にあてる予定。
血液凝固・線溶因子の分子異常に関する研究

(1)先天性異常フィブリノーゲン川口および大阪の構造解析:本研究では、FPAの放出障害を伴う先天性フィブリノーゲン異常症、フィブリノーゲン川口およびフィブリノーゲン大阪の構造解析を全く新しい方法で行った。両家系の発端者ともヘテロ接合体であったので、レプチラーゼ消化を行い上清に異常分子のみを回収した。これをピリジルエチル化(Pe化)後、Pe-Aα鎖をTMS-250カラムで分離し、リジルエンドペプチターゼ消化、次いでペプチドマップを行いつつ異常ペプチドを検索した。その結果、FPAを含むペプチドK-1(29残基)が両異常分子とも約1分おくれて溶出していた(ペプチドK-1'と命名)。K-1'についてアミノ酸分析,配列分析を行ったところ、両分子共にAα鎖Arg-16がCysに置換していた。従って、両異常分子(川口と大阪)は、α-スロンビン切断部位のP1サイトのArgがCysに置換しているため、FPAの遊離がおこらないと結論した。また;異常分子(川口)のCys-16は遊離の状態で存在するのではなく、Aα鎖間でジスルフィド結合していることが明らかとなった。(2)異常プロスロンビン徳島の構造と機能相関:プロスロンビンは分子量72,000(579残基)の一本鎖糖蛋白質であり、血液凝固Xa因子により活性化され、α-スロンビンを生じるセリンプロテアーゼ前駆体である。α-スロンビンはフィブリノーゲンを限定分解し、フィブリンゲルを形成するのみならず、血小板凝集をひきおこしたり、血管内皮細胞に結合するなど、多彩な作用を有している。本研究では、抜歯後の止血が困難であった発端者より得られた異常プロスロンビン徳島の構造解析を行った結果、プロスロンビン番号でArg-418(チモトリプシン番号で101番)がTrpに置換していることを見い出し、かつArg-418が特定の基質認識部位として機能することを明らかにした。
核酸-蛋白質相互作用のX線,NMRによる研究

シンクロトロン放射光を利用して収集したBacillus stearothermophilus DBP【II】のX線データを使い、この蛋白質の構造の精密化を行なった。スタート時に用いた原子座標は3【A!°】分解能の単一同型置換法により求められた電子密度図から、FRODOプログラムにより作り上げられたものである。精密化は、HENDRICHSON & KONNERTの方法に従った。最終段階でのR値は20%にまで改善された。精密化の途中で、グラフィクスによる分子の組み立てを数度繰り返したが最初のモデルから大きくはずれることはなかった。(GLYの関与する幾つかの主鎖コンフォメーション角の逆転が見られた。)3【A!°】分解能で電子密度図に現われていなかったアームの先端付近については、精密化された電子密度図においてもやはり同様であり、アームの先端はDISORDERしていることが確認された。精密化された原子座標により、コンピュータグラフィクスを利用してDNA複合体モデルを作った。その際、アームの部分は、βリボン構造をとっていると仮定した。その結果、結合蛋白質のARG側鎖のすべてがDNAの燐酸基とコンタクトするようなモデルを組み立てることができた。NMR法による研究では、DNA結合蛋白質とヌクレオチドとの相互作用を調べることを目的とするが、そのためには、まず蛋白質からのスペクトルのアサインメントを行なう必要がある。重水置換したDNA結合蛋白質を使ってCOSYおよびNOESYを測定し、そのスペクトル上の幾つかのアミノ酸のスピン系が帰属された。高磁場シフトしたPHE側鎖、メチル基の存在から疎水核の存在が確認され、また、重水素交換速度の非常に遅い主鎖アミドが多数存在することからもX線で決定された2量体が堅い構造をとっていることがわかった。
脳内神経伝達物質の非侵襲ダイナミクス解析法-functional MRS-の確立

近年、ニューロイメージング研究においてMagnetic Resonance Spectroscopy(MRS)への関心が高まっており、機能的MRS(functional MRS; fMRS)による脳機能の解明が期待されている。中でもMEGA-PRESS法は、興奮性及び抑制性の神経伝達物質であるGABAやグルタミン酸の計測に有用であるが、それらの物質の脳内での濃度は低く、計測精度を高めるためには、適切な実験計画や解析法を構築する必要がある。本研究では、MEGA-PRESS法によるfMRS実験を行う際の最適な計測条件と解析条件について検討した。本研究は、非侵襲的に脳内の神経伝達物質や生化学的代謝産物を計測する方法である磁気共鳴スペクトロスコピー法(MRS)を用いてヒト脳機能を神経化学的な側面から評価するための技術開発を目指している。特にMRSを動的な神経化学的脳活動の計測に用いる機能的磁気共鳴スペクトロスコピー法(fMRS)の構築が目標である。研究期間中には、1. MRS時系列データ解析法の理論的・数学的定式化、2.ファントムやヒト被験者の実計測によるMRS時系列データのノイズ特性の解明、3. fMRS実験の最適実験計画の検討を行い、これらの検討結果を統合して4. fMRSの実用化を目指す。平成27年度は、上記(1)(3)の検討を開始した。ATR脳活動イメージングセンタのシーメンス社製MRI装置を用いてファントムとヒト被験者の実計測データを収集した。ファントムについては、濃度や物質の組成を変化させた全11種類を製作した。ヒト実計測では、計測データを解析法の構築と最適実験計画の検討の両方に利用できるように、先行研究で採用された異なる2種類の刺激提示方法を用いて視覚刺激実験課題遂行中の視覚野のMRS信号時系列データを収集した。またノイズ処理用の心拍・呼吸データを同時計測した。MRS時系列データ解析法は、汎用性と利便性を考慮してフリーソフトウエアとして定評のあるStatistical Parametric Mapping(SPM)とTARQUINに基づくこととし、数値演算プログラムのMATLABを用いてプロトタイプ解析プログラムを作成した。現在、一部のファントムデータと被験者データの解析に着手しており、MRSノイズ特性の評価や解析パラメータの最適化を行っている。平成28年度は引き続き、fMRI実験に最適な実験計画法と解析手順について検討する。平成27年度の研究計画では、MRS時系列データ解析法の理論的確立を行い、ファントムや被験者による実計測データを収集の後、MRS時系列データの物理的・生理的ノイズの評価、最適実験プロトコールの検討に着手することにしていた。実績として、理論面の検討においては、SPMやTARQUINの利用に目処が立ち、独自の信号処理を加えたプロトタイプ解析プログラムの作成も完了した。同時にSPMとTARQUINの連携において、いくつかの技術的課題が判明した。解析法の構築に必要なファントムデータとヒト被験者データの収集について、ヒト被験者データは3名のデータ収集が完了した。ファントムデータは製作時間を要したため、評価に必要な11種類の作成は完了したものの、データ収集は1種類のみに留まった。ファントムのデータ収集が遅れているため、MRS時系列データの物理的・生理的ノイズの評価については、今年度は主として被験者データによる生理的ノイズの評価を開始しており、次年度以降にファントムデータの充実によって物理的ノイズ評価、総合的評価へと進めていく予定である。最適実験プロトコールの検討については、ヒト被験者データの収集に際して2種類の刺激提示方法を試みており、両者間での信号検出能力の比較検討を開始している。いずれの工程も最終的な解析法や実験計画法の提案には至ってはいないが、順調にデータ収集を行い、様々な検討作業を開始できているという点でおおむね順調に進展している。平成28年度は、昨年度に引き続き、上記(1)(3)の検討を行った。MRSデータの計測については、データ収集先のATR脳活動イメージングセンタのシーメンス社製MRI装置がアップデートのため一時休止したことにより、下半期を中心に実施し、上半期はデータ解析に従事した。まず、昨年度に計測したデータの解析結果に基づいて計測パラメータの見直しを行った。次に、最近のMRS研究の動向を踏まえ、新しい解析法の導入を行った。MRI装置の再開に合わせて、新規MRI装置で新しい計測パラメータを用いたヒト被験者でのMRS測定を行った。現在、データ解析を継続中であるが、中途経過として明らかな精度の改善が見られている。また本年度は、共同研究を実施し、本研究課題で構築した解析法の一部を認知神経科学実験で計測された実データへ適用した。その成果は海外学術論文誌にアクセプトされた。

平成28年度の研究計画では、平成27年度に作成したMRS時系列データ解析法を用いて各種ファントムや複数被験者による実計測データを解析、その結果に基づき計測及び解析パラメータの変更や解析法のブラシュアップを行うことにしていた。また生理学研究所の7T MRI装置の稼働状態によってはその利用も視野に入れていた。実績として、まず昨年度計測したデータは計測パラメータ(phase cycling)によるノイズ対策が十分でなく、その結果、不適当にSN比が低いことが判明した。今年度、データ収集施設におけるMRI装置のアップデートに合わせて、MRS計測シーケンスをシーメンス社版からミネソタ大学提供の研究用シーケンスに変更し、さらに上記のphase cyclingを考慮した上で再計測を試みた。その結果、データSN比や神経伝達物質量の推定精度が著しく向上した。次に、解析法として昨年度の用いたTARQUINに加えてGannetとFDI-Aを検討することにした。これらは、TARQUINにはない優れたノイズ処理機能を持つため、これらを併用することで精度の改善が期待される。まず異なる入力データ形式に対処するためにデータ形式の変換プログラムを作成し、複数の解析法による統合的な解析プロトコルを作成中である。今年度からは、本研究課題で作成した解析法をより広範な実データに適用すべく共同研究も開始し、1件のアクセプトと1件の投稿済みを得た。7T装置での計測については、まず3T装置に比べてMRSシーケンスの確立が遅れていることを考慮し、また解析法の開発という本研究の目的においては、実験遂行が容易で先行研究との比較検討が可能な3T装置での計測が適していると判断し、今年度の実験の実施は見送った。以上、データ収集及び解析とその結果に基づく計測・解析パラメータの修正が行われている点で「おおむね順調に進展している」とした。本研究は、非侵襲的に脳内の神経伝達物質や生化学的代謝産物を計測する方法である磁気共鳴スペクトロスコピー法(MRS)を用いてヒト脳機能を神経化学的な側面から評価するための技術開発を目指している。特にMRSを動的な神経化学的脳活動の計測に用いる機能的磁気共鳴スペクトロスコピー法(fMRS)の構築が目標である。研究期間中には、1. MRS時系列データ解析法の理論的・数学的定式化、2.ファントムやヒト被験者の実計測によるMRS時系列データのノイズ特性の解明、3. fMRS実験の最適実験計画の検討を行い、これらの検討結果を統合して4. fMRSの実用化を目指す。平成29年度は、昨年度に引き続き、上記(1)(3)の検討を行った。上半期には、ATR脳活動イメージングセンタのシーメンス社製MRI装置(ミネソタ大学提供の研究用シーケンス)を利用して、7名の実験協力者での計測を行った。実験は、安静時fMRSによるテスト-再テスト法を採用し、数週間1か月程度の間を開けて計測した物質濃度の解析結果の再現性の点で、解析パラメータ等の妥当性を評価することとした。解析には、昨年度実績に基づいてアカデミック・ソフトウエアのTARQUINとGannetを用い、濃度補正法等はさらにブラッシュアップを実施した。また、テスト-
毛様体神経節細胞に局在する特異なアセチルコリン受容体の同定

鷄胚(胎生9・12日)より毛様体神経節細胞を急性に単離し、細胞内Ca^<2+>濃度([Ca]_<in>)、Na^+濃度([Na]_<in>)をそれぞれfura-2、SBFIを用いた顕微蛍光法により、またイオン電流はニスタチンperforated patch clamp法により測定した。ニコチン刺激は、一過性の電流を引き起こし、同時に[Na]_<in>を上昇させたが、これらの反応は種々のニコチン様受容体チャネル阻害剤により抑制された。また、[Ca]_<in>上昇は、L-およびN-タイプのCa^<2+>チャネル阻害剤により抑制されたことより、受容体チャネルを通過するNa^+を介した膜電位の脱分極によるCa^<2+>チャネルの活性化が[Ca]_<in>の因と示唆された。しかし、外液のNa^+を除去し脱分極を抑制した条件下で、Ca^<2+>濃度を10mMに増加させるとニコチンによる[Ca]_<in>上昇反応は有意に観察され、この反応はニコチン様受容体チャネル阻害剤により抑制された。従って、受容体チャネルをNa^+のみならずCa^<2+>も一部流入することが証明された。また、これらの反応はαブンガロトキシン抵抗性であることからα7でなくα3β4のサブユニットからなる受容体が関与すると推定した。他方、ムスカリン刺激によるCa^<2+>流入は、(1)ムスカリン刺激が[Na]_<in>を変化させないこと、(2)rampvoltage法による電流-電圧関係がムスカリンの有無により異なること、(3)緩徐なムスカリン電流は膜コンダクタンスの減少を伴うこと、(4)[Ca]_<in>反応は外液Na^+除去により減弱すること、(5)外液Na^+除去下で残存する[Ca]_<in>反応は、細胞内プールからのCa^<2+>放出を抑制するタプシガルギンより消失すること、の結果からM電流を阻害した結果生ずる脱分極および細胞内Ca^<2+>放出の両者を介することが判明した。鶏胚毛様体神経節を分離し、コラゲナーゼ、プロテアーゼ処理の後、物理的に単一細胞に分離した神経細胞を用い、ニコチン、ムスカリンによる細胞内Caイオン濃度上昇機序を検討した。細胞内Ca濃度測定は、日本分光社製CAM-200を用いたfura-2顕微測光法によつて行つた。ニコチンによる細胞内Caイオン濃度上昇は、外液Ca、または、Naイオンの除去により完全に消失し、また、Caチヤネル阻害剤であるD-600、ニフエヂピン処理により抑制されたことにより、ニオチン様受容体チヤネルを介してNaイオン流入Caイオン流入による脱分極が、膜電位依存性Caチャネルを活性化することによって生ずるCaイオン流入にもとづくことが判明した。この反応は、ニコチン様受容体アンタゴニストのみならず、アトロピンをはじめとするムスカリン様受容体アンタゴニストによっても有意に抑制された。

したがって、筋肉、中枢神経に存在するニコチン様受容体とは、サブユニット構成を異にする受容体の関与の可能性が示唆された。他方、ムスカリンによる細胞内Ca上昇は、細胞外Caに依存する成分としない成分に分けられた。前者は、電気生理学的検索によると、K電流を抑制することにより、即ち、いわゆるM電流抑制による脱分極を介する事が示唆された。事実、細胞内Ca濃度上昇は、Caチャネル阻害剤によって部分的に抑制された。後者によるCa上昇は、細胞内Ca貯蔵部位からの放出によると考えられ、高Kイオン脱分極下においても、ムスカリンにより一過性のCa上昇がみられた。この反応は、カフェイン+リアノヂン処理や、タブシガルギン処理により完全に消失し、10nMDAMPにより抑制されたが、100nMピレンゼピンでは影響されぬことにより、M_3受容体に作用することが示唆された。鶏胚(胎生9-12日)より毛様体神経節細胞を急性に単離し、細胞内Ca^<2+>濃度([Ca]_<in>)、Na^+濃度([Na]_<in>)をそれぞれfura-2、SBFIを用いた顕微蛍光法により、またイオン電流はニスタチンperforated patch clamp法により測定した。ニコチン刺激は、膜電位依存症Ca^<2+>チャネルを活性化して[Ca]_<in>を上昇させることを昨年度報告したが、(1)ニコチン刺激が[Na]_<in>を上昇させること、(2)[Na]_<in>上昇反応が種々のニコチン様受容体チャネル阻害剤により抑制されること、よりその脱分極作用はニコチン様受容体チャネルを通過するNa^+を介することが判明した。しかし、外液のNa^+を除去してもCa^<2+>濃度を10mMに増加させた条件下ではニコチンによる[Ca]_<in>上昇反応は減弱しても有意に観察され、この反応うはニコチン様受容体チャネル阻害剤により抑制されたことよりこのチャネルをNa^+のみならずCa^<2+>も一部流入することを証明した。また、これらの反応はαブンガロトキシン抵抗性であることからα7ではなくα3β4のサブユニットからなる受容体が関与すると推定した。他方、ムスカリン刺激によるCa^<2+>流入は、(1)ムスカリン刺激が[Na]_<in>を変化させないこと、(2)ramp voltage法による電流-電圧関係がムスカリンの有無により異なること、(3)緩徐なムスカリン電流は膜コンダクタンスの減少を伴うこと、(4)[Ca]_<in>反応は外液Na_+除去により減弱すること、(5)外液Na^+除去下で残存する[Ca]_<in>反応は、細胞内プールからのCa^<2+>放出を抑制するタプシガルギンより消失すること、の結果からM電流を阻害した結果生ずる脱分極を介することが判明した。
パニック症に対する個人認知行動療法のランダム化比較試験による費用効果分析

昨年度から計画変更を行い、患者と治療者が対面式で行う方式から、テレビ電話を用いた遠隔方式での認知行動療法の介入研究を行っている。平成30年度は引き続き、認知行動療法での介入、参加者のリクルートに取り組んだ。平成30年度までに、23名のエントリーがあり全員、研究参加への同意が得られた。研究参加者を介入群、コントロール群に群分けを行い、それぞれ開始前(0週)、中間(8週)、終了(16週)における評価を行っている。パニック症の重症度評価として主要評価項目であるPDSS(Panic Disorder Severity Scale)をブラインド化された第三者による構造化面接で実施、自己記入での評価として、パニック症の重症度を測るPAS(Panic and Agoraphobia Scale)、精神的健康度のPHQ-9(Patient Health Questionnare-9)、全般性不安のGAD-7(Generalized anxiety disorder-7)、医療経済評価のベースになる健康関連QOLのEQ-5D(EuroQol5-Dimension)で評価を行っている。介入群については1週1回のペースで全16回の遠隔での認知行動療法を施した。コントロール群については、16週の評価終了後に、レスキュー研究として介入群と同内容の認知行動療法を施している。レスキュー研究についても結果を明らかにする予定である。リクルートについては、近隣の医療機関への紹介依頼、千葉大学の研究参加者募集ページでの紹介、千葉大学病院認知行動療センターTwitterでの訴求、パニック症患者の会への紹介依頼を行っている。遠隔での認知行動療法の用いる全16回のセッション用の資料も作成し、実際に使用している。当初の計画では面接室で、患者と治療者の対面式での認知行動療法の実施を予定していたが、医療経済面での効果がより見込める遠隔での認知行動療法(テレビ電話などを使用)へ計画を変更した。そのため、遠隔での認知行動療法実施のための施行方法やマニュアルの整備が改めて必要となり時間を要した。2018年1月より研究を開始して、研究参加者の募集を行っているが、当初計画よりやや遅れている状況で推移している。平成31年度は、引き続きランダム化比較試験を実施する。本年9月までの募集期間を延長することで、研究の開始の遅れに対応する。応募の推移が低調であれば、web媒体などを使用した募集活動を積極的に行っていく。研究の基本デザインは堅持し、データセットが完了次第、臨床効果および医療経済効果を検討していく。本研究はパニック症患者に対し、認知の再構成、安全行動の介入、行動実験、注意のバイアスと注意のシフト・トレーニング、破局的イメージにつながる初期記憶の書き直しを含めた総合的なマニュアルに基づく個人認知行動療法(CBT)を実施し、その治療効果を検証することを目的とするとともに、QALYs (質調整生存年)換算によって費用対効果(cost effectiveness)を有するかを明らかにすることを目的としている。本研究は27年度までに我々が実施した対照群を設置しないsingle armによるopen trialを受けて行うランダム化比較試験(RCT)であり、医療経済面からみたCBTの費用対効果を測るものである。効果が認められればわが国の保健・医療サービスの向上に寄与することが期待され、ひいては医療費の効率化にも寄与することが期待される。初年度はランダム化比較試験実施に向けたデザインを作成した。具体的には27年度までに実施したsingle arm研究による効果量の結果から必要な2群の患者サンプル数の算出、対象とする患者(薬物耐性がある難治性の患者など)の設定、あるいは一定期間内に多くの患者数を集める必要があるため有効なリクルート方法(web、チラシ、広告)を検討し、作成を行った。当初の計画では患者と治療者の対面式での認知行動療法の実施を予定していたが、現在、遠隔での認知行動療法(テレビ電話などを使用)を検討し、準備を進めている。初年度はランダム化比較試験実施に向けたデザインの作成とともにし、有効なリクルート方法(web、チラシ、広告)を検討し、作成を行った。当初の計画では面接室で、患者と治療者の対面式での認知行動療法の実施を予定していたが、現在、医療経済面での効果がより見込める遠隔での認知行動療法(テレビ電話などを使用)を検討し、準備を進めている。具体的には、遠隔での認知行動療法実施のための施行方法やマニュアル作成を行っており、パイロット研究として開始している不安症(強迫性障害、社交不安症、パニック症)に対する遠隔による認知行動療法の研究を行う中で、マニュアルなども精緻化する予定である。初年度(平成28年度)はランダム化比較試験実施に向けたデザインを作成した。

具体的には27年度までに実施したsingle arm研究による効果量の結果から必要な2群の患者サンプル数の算出、対象とする患者(薬物耐性がある難治性の患者など)の設定、あるいは一定期間内に多くの患者数を集める必要があるため有効なリクルート方法(web、チラシ、広告)を検討し、作成を行った。平成29年度は、当初の計画では患者と治療者の対面式での認知行動療法の実施を予定していたが、遠隔によるの認知行動療法(テレビ電話などを使用)に計画を変更した。2018年1月より開始している。当初の計画では面接室で、患者と治療者の対面式での認知行動療法の実施を予定していたが、医療経済面での効果がより見込める遠隔での認知行動療法(テレビ電話などを使用)へ計画を変更した。そのため、遠隔での認知行動療法実施のための施行方法やマニュアルの整備が改めて必要となり時間を要した。2018年1月より研究を開始しているが、当初計画よりやや遅れている状況にある。昨年度から計画変更を行い、患者と治療者が対面式で行う方式から、テレビ電話を用いた遠隔方式での認知行動療法の介入研究を行っている。平成30年度は引き続き、認知行動療法での介入、参加者のリクルートに取り組んだ。平成30年度までに、23名のエントリーがあり全員、研究参加への同意が得られた。研究参加者を介入群、コントロール群に群分けを行い、それぞれ開始前(0週)、中間(8週)、終了(16週)における評価を行っている。パニック症の重症度評価として主要評価項目であるPDSS(Panic Disorder Severity Scale)をブラインド化された第三者による構造化面接で実施、自己記入での評価として、パニック症の重症度を測るPAS(Panic and Agoraphobia Scale)、精神的健康度のPHQ-9(Patient Health Questionnare-9)、全般性不安のGAD-7(Generalized anxiety disorder-7)、医療経済評価のベースになる健康関連QOLのEQ-5D(EuroQol5-Dimension)で評価を行っている。介入群については1週1回のペースで全16回の遠隔での認知行動療法を施した。コントロール群については、16週の評価終了後に、レスキュー研究として介入群と同内容の認知行動療法を施している。レスキュー研究についても結果を明らかにする予定である。リクルートについては、近隣の医療機関への紹介依頼、千葉大学の研究参加者募集ページでの紹介、千葉大学病院認知行動療センターTwitterでの訴求、パニック症患者の会への紹介依頼を行っている。遠隔での認知行動療法の用いる全16回のセッション用の資料も作成し、実際に使用している。2018年1月より研究を開始して、研究参加者の募集を行っているが、当初計画よりやや遅れている状況で推移している。
骨格筋により駆動される体内埋め込み型遠心ポンプの開発

より効率よく骨格筋エネルギーのポンプ作用への変換ができる小さくシンプルな血液ポンプを求めて、骨格筋により駆動される遠心ポンプの開発を行った。本システムの実現のためには、1)効率よい骨格筋収縮力の伝達方法、2)間欠的な骨格筋の収縮を、連続的回転運動への変換方法、3)筋の至適な駆動の方法等を解決する必要がある。l)については、独自に設計した力学的損失の少ない直線的に伝達装置により、まず拍動式ポンプであるプッシャープレート型人工心臓を駆動し、広背筋が安静時の左心室の機能を代行し得るほどエネルギーを有しているとの結果(広背筋の出力として約2.5-5mW/g)を得た。また機械式模擬循環回路において筋の力学的特性と至適刺激様式を、種々の前負荷、後負荷に対する筋の出力を検討したところ、至適駆動を得るためには、電気刺激のパルス幅、バースト回数の条件変更で行えることが判明した。ついで2)として開発を行ったシステムを述べる。これは骨格筋の収縮力を、扇形の平歯ギアに伝達し、ピニオンギアを介して加速してインペラ-の回転軸に伝達するもので、回転しないシェル型ローラークラッチベアリングが、ピニオンギアと平歯ギヤに挿入されているため、回転軸の回転は、平歯ギアがどちらに引かれても一方向となる。本システムを、今回備品で購入した加震器システムで、骨格筋をシュミレートして駆動し、至適な動作が得られることを確認した。これらの点から、回転軸の回転数は1500rpmを実現するシステムで、インペラ-の径は約67mm程度で左心補助可能なポンプが実現すると考えられた。そこで現在至適サイズの市販の遠心ポンプヘッドを使用して、検討中である。
バソヒビンによる血管新生と肝線維化抑制が誘導する肝癌制御機構の解析

バソヒビンは血管新生を調節する蛋白質で、血管新生を抑制するバソヒビン-1と抑制するバソヒビン-2からなる。一般的に血管新生と肝線維化が並行して起こることが知られており、バソヒビンの発現量を調節することにより肝線維化を抑制する方法を開発することを目的とした。昨年度に作製したバソヒビン-1,-2をそれぞれ特異的に認識するウサギ・ポリクローナル抗体を用いて、ウェスタンブロットと抗体染色を行った。抗バソヒビン-1,-2抗体はそれぞれ特異的にバソヒビン-1,-2組換え蛋白質を認識した。バソヒビン-1,-2の発現量が高い脳組織ライゼートでは、それぞれのノックアウトマウスでは検出されない特異的なバンドが検出された。肝臓組織ライゼートではバソヒビン-1,-2共に発現量が低いため検出できなかった。バソヒビン-1,-2をそれぞれタグを付けてHela細胞に発現させ、抗タグ抗体と抗バソヒビン-1,-2抗体で検出すると、発現細胞が共染色された。このことから作製したポリクローナル抗体は抗体染色に用いることができると分かった。バソヒビン-1,-2の発現量の高い脳切片を用いて組織染色を行うと、バソヒビン-1,-2共に神経細胞で発現していることが明らかとなった。肝臓切片でも抗体染色を行ったが発現細胞を同定できなかった。バソヒビン-1,-2とこれらの結合蛋白質であるSVBPをアルブミンプロモーターの制御下で肝細胞に発現するトランスジェニックマウスを作製した。これらのトランスジェニックマウスの肝臓においてバソヒビン-1,-2, SVBP組換え蛋白質がそれぞれ発現していることを確認し、ライン化することに成功した。更に、バソヒビン-1または-2とSVBPを同時に発現するダブルトランスジェニックマウスの作製を行っている。肝癌により国内だけでも年間3万人が死亡し、100万人以上の患者がいる。これらの患者は一般的に肝線維化と肝硬変を経て肝癌へと進行していくので、はじめのステップである肝線維化を抑制することが重要となってくる。また、肝線維化と血管新生が並行して起こることが知られており、血管新生を抑制することにより肝線維化も抑制できると考えられる。当研究課題では血管新生を調節するタンパク質であるバソヒビン-1,-2の発現を調節することにより血管新生と肝線維化を抑制することを目的とした。バソヒビン-1,-2発現細胞を同定するために、それぞれを特異的に認識するウサギポリクローナル抗体を作製した。抗バソヒビン-1,-2抗体のどちらもELISAにより抗原ペプチドを認識することを確認し、さらに組換えバソヒビン-1,-2蛋白質を用いてELISAを行ったところ抗バソヒビン-2抗体のみ認識した。更にウェスタンブロットにより抗バソヒビン-1, -2抗体の特異性を確認したところ、それぞれ組換え蛋白質を特異的に認識した。これらの結果から抗バソヒビン-1抗体は変性したバソヒビン-1を認識し、抗バソヒビン-2抗体は未変性と変性したバソヒビン-2を認識することが明らかとなった。野生型マウスを用いて胆管結紮による肝線維化モデルを作製し、これらの抗体を用いて発現細胞の解析を行った。抗バソヒビン-1抗体により中心静脈周囲の肝細胞が染色され、抗バソヒビン-2抗体により血管周辺の肝細胞と動脈内皮細胞と偽胆管が染色され、これらの細胞が肝線維化モデルにおける発現細胞と考えられた。また、バソヒビン-2欠損マウスを用いて肝線維化モデルマウスを作製し、肝線維化と血管新生に対するバソヒビン-2の働きを解析している。バソヒビン-1,-2欠損マウスを用いた肝線維化モデルマウスの作製と解析は順調に進んでいるが、発現細胞の同定に時間を要したため、過剰発現トランスジェニックマウスの作製がやや遅れているため。肝線維化と血管新生は並行して起こることが知られており、血管新生を調節することにより肝線維化も同時に制御できると考えられる。バソヒビンは血管新生を抑制するバソヒビン-1と血管新生を促進するバソヒビン-2からなり、バソヒビン-1,-2の発現量を調節することにより血管新生と肝線維化を制御し、肝線維化を抑制する方法を開発することを目的とした。今年度において、バソヒビン-2欠損マウスを用いて肝線維化モデルを作製し野生型マウスと比較した。バソヒビン-2欠損マウスでは肝線維化を促進する傾向が観られたが野生型マウスと比較して有意な差ではなかった。肝細胞特異的にバソヒビン-1,-2とこれらの結合蛋白質であるSVBPを高発現させたトランスジェニックマウスを作製するために、アルブミンエンハンサーとプロモーターの制御下でバソヒビン-1,-2またはSVBPを発現するベクターを作製した。これらの肝癌由来の細胞株での発現を確認し、トランスジェニックマウスを作製する準備を行った。肝線維化モデルにおいてバソヒビン-1,-2 mRNAの発現量が上昇することを示したが、発現細胞や発現時期などは不明なままであった。