hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規カルコパイライト型リン化物の探索と太陽電池への応用

本研究では,ZnSnP2の薄膜表面形態の改善に向けて,新規化合物の探索を行った。MgやCaを含む化合物の場合は大気中の水分との反応が避けられないため,CdSnP2が有望であることがわかった。また,ZnSnP2とCdSnP2は全率で固溶し,組成に応じてバンドギャップが変化することを明らかにした。薄膜作製については,Cd-Sn膜を前駆体としてリン化することによりCdSnP2が得られることがわかったが,目的の固溶体膜を得るまでには至らなかった。一方で,ZnSnP2とCdSnP2のキャリアタイプの違いを利用してpn接合を形成できることがわかり,新たなデバイスへの展開が期待できる結果を得た。X-Sn-P (X = Mg, Ca, Ba)系における実験については、まず、Ma-Sn-P系について取り組んだ。これまでの研究により、Ma-Sn薄膜をスパッタリングにより成膜した場合、Ma2Snの形成により、Sn粒子の粗大化をを抑制し、微細な組織を有することが分かっている。そこで、当初の実験予定を入れ替え、このMa-Snをリン化することで、MaSnP2薄膜の作製を試みた。Zn-Sn系と同様の条件でリン化を行ったところ、MgSnP2の形成は確認できなかった。そこで、当初の予定に組み込んでいた、平衡実験による等温断面図の作成を行った。500Cでの平衡実験試料のXRD結果からは、MgSnP2は確認されず、Sn, Mg(OH)2のみが同定された。これは、平衡実験後にはMgSnP2が形成されていたものの、分析する過程で大気中の水分と反応して分解したのか、そもそもMgSnP2が平衡相として存在しないのかいずれかは、現在のところ分からない。一方、Cd-Sn-P系については、実験的に作成したZn-Cd-Sn-P4元系状態図から、500Cでは(Zn,Cd)SnP2が全率固溶系であることを確認した。さらに、状態図に基づいて溶液成長を行い、(Zn,Cd)SnP2バルク結晶を得た。この結晶に関して、拡散反射率測定によりバンドギャップを見積もったところ、1.35eVであり、固溶体形成によりバンドギャップが制御できることがわかった。次に、Cd-Sn膜のリン化によるCdSnP2成膜を試みた。当初、スパッタリングでCd-Sn膜の成膜を行う予定であったが、種々の検討の結果、Cdの毒性等を考慮して、水溶液からの電解めっきにより成膜を行うこととした。めっきで成膜を行う場合、特にSnに関しては、スパッタリングよりも平滑な膜が得られることを見出しており、今後、平滑なリン化物薄膜の作製が期待できる。X-Sn-P(X=Mg,Ca,Ba)系における実験については,今年度はCa-Sn-P系について取り組んだ。Mg-Sn-P系と同様,まずは平衡実験によりカルコパイライト相の存在確認を行った。Caの出発材料としては市販のCa3P2を用いた。その結果,Mg-Sn-P系と同様,カルコパイライト相の存在は確認できず,水酸化物と思われる化合物がXRDで同定された。以上のことから,アルカリ土類金属を用いた場合は,空気中の水分との反応が避けられないため,すでにカルコパイライト相の存在が確認できているCd-Sn-P系に注力することとした。Cd-Sn-P系については,前年度までにバルク結晶の育成方法を確立していたため,本年度は結晶の物性評価と薄膜作製を行った。まず,フラックス法により作製したバルク結晶の物性評価を行ったところ,従来の報告の通り,バンドギャップは1.1eV,キャリアタイプはn型であった。ZnSnP2はp型伝導を示すことから,ZnをCdに変えることでキャリアタイプが変わることは興味深い。続いて,リン化法によるCdSnP2薄膜の作製を試みた。前年度の結果から前駆体のCd-Sn膜は電解めっきにより作製する予定であったが,装置を改良することによりスパッタリングで成膜が可能となったため,これにより成膜を行った。リン化条件の検討を行い,単相のCdSnP2膜を得ることに成功した。また,リン化後のCdSnP2膜は最稠密面である(112)面に配向していることがわかった。表面形態については,ZnSnP2膜に見られたような数ミクロンの大きさの突起物は確認されず,比較的平坦であった。これは,当初の目論見どおりCd-Sn系の金属間化合物形成が関わっていると考えられ,今後調査していく予定である。これまでに,いくつかの元素に関しては調査が終わっており,有力な候補はCdSnP2であると結論付けている。したがって,最終年度は当初の予定通りZnSnP2とCdSnP2との固溶体薄膜の作製に注力できる。また,CdSnP2薄膜の表面形態はZnSnP2よりも平坦であることがわかっており,固溶体形成によりZnSnP2薄膜の表面形態改善が期待できる。

MgやCaを含む化合物の場合は大気中の水分との反応が避けられないため,CdSnP2が有望であることがわかった。また,ZnSnP2とCdSnP2は全率で固溶し,組成に応じてバンドギャップが変化することを明らかにした。薄膜作製については,Cd-Sn膜を前駆体としてリン化することによりCdSnP2が得られることがわかったが,目的の固溶体膜を得るまでには至らなかった。一方で,ZnSnP2とCdSnP2のキャリアタイプの違いを利用してpn接合を形成できることがわかり,新たなデバイスへの展開が期待できる結果を得た。本年度は,まず,(Zn,Cd)SnP2の成膜に取り組んだ。スパッタリングによりZn-Cd-Sn前駆体を作製し,これをリン化することで成膜を試みた。前駆体に関しては前年度の結果を踏まえて,電解めっきではなく,スパッタリングによって成膜することとした。しかし,装置の都合上,3元同時スパッタリングを行うことが現時点で困難であり,また,これまで使用してきたリン化用の炉の再整備に時間がかかったため,本研究項目は今後の検討課題とした。一方で,当初の計画にはなかったが,ZnSnP2, CdSnP2のキャリアタイプの違いを利用したpn接合形成に取り組んだ。ZnSnP2,CdSnP2のバルク結晶をフラックス法により作製し,これらをリン蒸気雰囲気下で熱処理を行い,拡散接合させた。その結果,接合面全面ではないものの,一部の領域でZn, Cdの相互拡散が見られ,接合を確認できた。この試料に対して,スパッタリングにより電極を作製し,Cu/p-ZnSnP2/n-CdSnP2/Sn試料を作製した。これを用いて電流ー電圧特性を評価したところ,整流作用が確認された。この試料には,電極としてCuおよびSnを用いているが,これらはそれぞれZnSnP2, CdSnP2に対してオーミック電極となることを以前の研究で確認している。したがって,観察された整流作用はZnSnP2/CdSnP2界面がpn接合を形成していることに起因すると結論付けた。さらに,ダイオード特性を解析したところ,再結合電流成分が大きく電流ロスが大きいことがわかった。今後,これをデバイスとして応用するためには,界面構造の最適化が必要であると考えられる。Mg-Sn-P系に関しては、カルコパイライト相が平衡相として存在していない可能性があり、本年度の結果から他の系に注力することが有効であることがわかった。一方、Cd-Sn-P系に関しては、バルク結晶であるものの固溶体の作製に成功しており、バンドギャップの制御にも成功している。また、成膜手法についても、平滑な表面組織を得るためにはスパッタリングよりも電解めっきの方が有効であることを見出している。以上、当初の研究予定とは順序が異なるものの、ZnSnP2の薄膜表面組織改善に向けていくつかの有効な方針を得ている。まず,CdSnP2薄膜の表面の平坦性の要因を特定する。Cd-Sn系の金属間化合物が関わっていると考えられるが,前駆体のCd-Sn膜にはその存在は確認されない。一方で,前駆体Cd-Sn膜のSn粒径はZn-Sn膜の粒径の10分の1程度であり,この微細化がリン化後の表面形態に影響を及ぼしていると考えられる。そこで,Cd-Sn膜のリン化過程を調査する。これと平行して,Zn-Cd-Sn前駆体膜の作製に取り組む。現在のところ,3元同時スパッタもしくは,Cd-Sn/Zn積層,Zn/Cd-Sn積層の3パターンを検討する予定である。これらの前駆体膜およびリン化条件の検討を行い,(Zn,Cd)SnP2固溶体膜の作製条件を確立する。作製した固溶体膜については各種分析を行い,表面形態および物性への影響を明らかにすると共に,ZnSnP2太陽電池の高効率化への指針を得る。結晶成長28年度が最終年度であるため、記入しない。
重症呼吸不全に対する超微量の一酸化窒素吸入法と酸素化能の増強法の確立

重症呼吸不全に対しNO吸入濃度を0,125,250,500ppb及び1,2,4,8,16ppmと変更した結果と長期投与の結果から、125500ppb単位の超微量NO吸入でも酸素化が改善すること、NO吸入療法下では炭酸ガスの排出も促進されること、適切なNO吸入濃度は24ppmの付近に存在すること、低濃度のNO吸入であれば約73日に及ぶ長期NO吸入でも全く副作用なく患者を救命できること、重症呼吸不全患者に対するNO吸入療法の長期予後は原疾患の重症度に左右されることが示唆された。更に、NO吸入療法により酸素化が改善するためには肺高血圧の存在が不可欠であること、酸素化改善の程度は肺高血圧の重症度に比例するという新知見を得た。本研究は、超微量のNO吸入療法の意義と長期NO吸入療法の安全性を確立しつつある。更に、重症呼吸不全に対する重要な救命手段としてNO吸入療法の意義を明らかにしつつある。更に、研究成果は、NO吸入療法による酸素化改善の程度を前もって予測できることを明らかにしつつある。ところで、動物実験ではNO吸入療法と肺血管収縮薬との併用効果を認めなかった。しかし、実験の過程でNO吸入療法下で酸素化が改善するためにはNOガスが肺胞に到達することが不可欠であることに気付きNO吸入療法下でpositive end-expiratory pressureやin-verse ratio ventilationと併用すると酸素化能が増強するという酸素化能を増強するための臨床的で具体的な方法を見出すことに成功した。
日本人2型糖尿病患者における血清脂質と糖尿病性腎症に関する多施設共同疫学研究

本研究は日本人2型糖尿病患者において生化学的検査、生理検査、生活習慣、大血管障害、細小血管障害、使用薬剤の評価を実施し、横断的・縦断的に解析することで血清脂質が細小血管合併症の発症・進展へ与える影響を明らかにすることを目的とする。愛媛大学医学部附属病院およびその関連施設に通院中の2型糖尿病患者を対象としてデータの取集を行った。ベースラインデータのうち、データ欠損のない763例を対象として解析を行った。糖尿病性腎症の評価は推定糸球体濾過量(eGFR)および尿中アルブミン量を用い、日本腎臓学会の定義に基づいて行った。早朝空腹時尿中のアルブミン値を尿中クレアチニン値で補正したものを24時間尿中アルブミン量の推定値として用いる。血清脂質については早朝空腹時に採血を実施し総コレステロール、LDL-C、HDL-C、中性脂肪、レムナントリポ蛋白、Lp(a)を測定した。中性脂肪、レムナントリポ蛋白、Lp(a)は対数分布をとるため正規分布へ近似して解析に使用した。ロジスティック回帰分析を用い、糖尿病性腎症に対するLDL-C、HDL-C、log-中性脂肪、log-レムナントリポ蛋白、log-Lp(a)のオッズ比を算出した。年齢、性別、BMI、糖尿病罹病期間、収縮期血圧、拡張期血圧、飲酒歴、喫煙歴、ACE阻害薬/ARBの内服、スタチンの内服を潜在的交絡として調整した。糖尿病性腎症に対するLDL-C、HDL-C、log-中性脂肪、log-レムナントリポ蛋白、log-Lp(a)のオッズ比(95%信頼区間)はそれぞれ1.00(0.99 - 1.01)、1.00 (0.97 - 1.01)、6.88 (1.31 - 36.10)、1.40 (0.39 - 5.03)、2.87 (1.51 - 5.46)であり、糖尿病性腎症と中性脂肪、Lp(a)の間に正の関連がみられた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。血清脂質は大血管障害抑制のため重要な治療ターゲットとされているが、糖尿病性腎症など細小血管合併症の発症・進展への関連や治療介入効果は明らかでない。本年度は質問調査票を作成し、データ収集の体制を確立し、愛媛大学医学部附属病院に通院中の患者を対象としてデータの収集を実施した。既存データベースと統合した約800例での探索的な中間解析では多変量解析において糖尿病性腎症の有病率と血清中性脂肪との間に有意な正の関連がみられた。血清HDLは糖尿病性腎症と負の関連を示す傾向にあったが現時点では多変量解析での有意差はみられていない。各種脂質改善薬の内服と糖尿病性腎症の有病率との間には、現時点では有意な関連はみられなかった。更なる症例の集積を行い詳細な解析を行うことを予定している。本研究を遂行するための方法の確立は十分に進んでいる。愛媛大学医学部附属病院での症例収集は終了し予定通りデータクリーニングを開始している。

糖尿病性腎症に対するLDL-C、HDL-C、log-中性脂肪、log-レムナントリポ蛋白、log-Lp(a)のオッズ比(95%信頼区間)はそれぞれ1.00(0.99 - 1.01)、1.00 (0.97 - 1.01)、6.88 (1.31 - 36.10)、1.40 (0.39 - 5.03)、2.87 (1.51 - 5.46)であり、糖尿病性腎症と中性脂肪、Lp(a)の間に正の関連がみられた。本年度は愛媛大学医学部附属病院での症例を対象にデータ収集を行った。次年度は収集したデータのクリーニングを行い、既存のデータベースと統合した上で解析を実施する予定である。また、その他の愛媛県の主幹病院における糖尿病症例のデータ収集を実施する。研究計画については特に変更はない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
実世界情報並列計算基盤の開発

実環境で頑健に動作する情報システムを構築するために,多岐にわたる情報科学技術の諸分野を融合する必要性が高まっている.本研究の目的は,実世界情報並列計算フレームワークを構築し,異なる種類のデータを扱える新しいシステムを開発することを通じて,汎用の計算基盤の構築と応用例を示すことである.具体的には,情報爆発で開発されているInTrigger上で動作するシステムを開発した.標準の並列計算用ライブラリMPIは,クラスタには対応していても,複数のクラスタで構成されるグリッドには必ずしも対応していない.そこで, A02支援班で開発されているグリッド用のMPIライブラリMC-MPI(Multi-cluster MPI Librarv)を用いて,グリッド上で動作するリング状にネットワークした計算ノードでパイプライン処理するシステムや,異なる条件の計算を同時並列に行い,結果を集約するシステムを開発した.その上で,多数の生物学的神経モデルを同時並列に計算し,シミュレーションを行った.また,任意の実世界情報を扱えるシステムを開発することを目的として,運動学習支援システムを開発した.従来ネットワークに対応していなかった運動計測データを扱うソフトウエアをサーバとクライアントに分け,クライアント側にハードウエアを接続し,サーバは任意の計算機上に配置できるように構成した.運動学習支援システムは,運動の特徴量をリアルタイムに学習者にフィードバックすることができる.この他,会話支援システムなどの認知活動支援システム,マルチスケール神経モデルで構成され.計測装置と接続可能なオープンブレインシミュレータ,脳活動,認知活動計測装置などを開発し,評価実験を行った.以上を通じ,汎用の実世界情報並列基盤フレームワークと,それを用いたアプリケーションの開発に成功した.実環境で頑健に動作する情報システムを構築するために、多岐にわたる情報科学技術の諸分野を融合する必要性が高まっている。我々は、平成14年度から18年度まで実施された、東京大学21世紀COE「情報科学技術戦略コア」の中で、認識技術と並列計算技術を融合し、高精度およびリアルタイムの動画像認識システムの開発に成功した。具体的には、並列計算ツールであるGXP, MPICH, SCALAPACKを用い、リング状にネットワークしたクラスタでパイプライン処理するシステムや、大規模な行列計算を高速に行うシステムを構築し、高精度およびリアルタイムの動画像認識を実現した。このシステムにおいて、入力データは動画像列であり、用いたアルゴリズムは、高度局所自己相関特徴抽出(CHLAC)を用いたが、多様な入力データを扱い、任意のアルゴリズムを扱える共通計算基盤があれば、実世界情報システムを効果的に構築できると考えられる。本研究の目的は、これらのソフトウエアを出発点として実世界情報並列計算フレームワークを抽出し、異なる種類のデータを扱える新しいシステムを開発することを通じて、汎用の計算基盤の構築と応用例を示すことである。本年度は、下記の課題に取り組んだ:1、実世界情報並列計算フレームワークの抽出、2、オープンブレインシミュレータの開発、3、行為の自他帰属性の内部処理システムの開発、4、神経細胞の三次元形状抽出システムの開発。実環境で頑健に動作する情報システムを構築するために,多岐にわたる情報科学技術の諸分野を融合する必要性が高まっている.本研究の目的は,実世界情報並列計算フレームワークを構築し,異なる種類のデータを扱える新しいシステムを開発することを通じて,汎用の計算基盤の構築と応用例を示すことである.具体的には,情報爆発で開発されているInTrigger上で動作するシステムを開発した.標準の並列計算用ライブラリMPIは,クラスタには対応していても,複数のクラスタで構成されるグリッドには必ずしも対応していない.そこで, A02支援班で開発されているグリッド用のMPIライブラリMC-MPI(Multi-cluster MPI Librarv)を用いて,グリッド上で動作するリング状にネットワークした計算ノードでパイプライン処理するシステムや,異なる条件の計算を同時並列に行い,結果を集約するシステムを開発した.その上で,多数の生物学的神経モデルを同時並列に計算し,シミュレーションを行った.また,任意の実世界情報を扱えるシステムを開発することを目的として,運動学習支援システムを開発した.従来ネットワークに対応していなかった運動計測データを扱うソフトウエアをサーバとクライアントに分け,クライアント側にハードウエアを接続し,サーバは任意の計算機上に配置できるように構成した.運動学習支援システムは,運動の特徴量をリアルタイムに学習者にフィードバックすることができる.この他,会話支援システムなどの認知活動支援システム,マルチスケール神経モデルで構成され.計測装置と接続可能なオープンブレインシミュレータ,脳活動,認知活動計測装置などを開発し,評価実験を行った.以上を通じ,汎用の実世界情報並列基盤フレームワークと,それを用いたアプリケーションの開発に成功した.
アンジオテンシン受容体ノックアウト・マウスを用いた心臓リモデリングの解析

野生型マウスの心筋梗塞を作成後4週間(WTMI)で偽手術を施行した群に比べて、左室収縮期圧および左室内圧一次微分は低値、左室拡張末期および収縮末期径は高値であった。アンジオテンシン受容体ノックアウト・マウスに心筋梗塞を作成(KOI)するとWTMIに比べて左室リモデリングが改善したが、偽手術を行った群に比べると左室内腔の拡張が見られた。KOMIにみられたリモデリングはアルドステロン受容体拮抗薬によって完全に抑制された。KOMIの非梗塞部心筋においてアルドステロン産生酵素CYP11B2の遺伝子発現と組織アルドステロン含量は偽手術を行った群に比べて増加していた.非梗塞部心筋における脳性ナトリウム利尿ペプチド、タイプ1およびタイプ皿コラーゲンの遺伝子発現はMTMIに比べてKOMIで抑制されたが、偽手術施行群に比べて増加していた。スピロノラクトンの同時投与によって、その発現は抑制され、偽手術施行群と差はなかった。生後3週令の野生型(WT)およびアンジオテンシン受容体ノックアウト・マウス(KO)において、大動脈狭窄(TAC)による圧負荷肥大心を作成し、4週後に心エコー検査と血行動態測定を行った。心エコー検査による左室拡張末期径はWT-TAC群でWT-sham群に比べて大であった。KO-TAC群とKO-sham群で差はなかった。収縮末期径はWT及びKOの圧負荷群において各々のsham群より大であった。WT及びKOマウスにおいてTACによって心臓内脳性ナトリウム利尿ペプチドのmRNAは増加した。タイプIコラーゲンmRNAレベルはWT及びKOマウスのTAC群において増加したが、タイプ皿コラーゲンは変化しなかった。スピロノラクトンはKOマウスにおける圧負荷によるこれらの変化を完全に抑制した。アンジオテンシン受容体ノックアウト・マウスに心筋梗塞を作成(KOMI)するとWTMIに比べて左室リモデリングが改善したが、偽手術を行った群に比べると左室内腔の拡張が見られた。KOMIの非梗塞部心筋においてアルドステロン産生酵素CYP11B2の遺伝子発現と組織アルドステロン含量は偽手術を行った群に比べて増加していた。非梗塞部心筋における脳性ナトリウム利尿ペプチド、タイプ1およびタイプIIIコラーゲンの遺伝子発現はWTMIに比べてKOMIで抑制されたが、偽手術施行群に比べて増加していた。以上より、アンジオテンシン受容体ノックアウト・マウスにおいても心筋梗塞による左室リモデリングが生じ、このリモデリングはレニン・アンジオテンシン系を介さない局所アルドステロンの産生によることが明らかとなった。アンジオテンシン変換酵素阻害薬リシノプリルを同時投与によって組織アルドステロンの産生は抑制されなかったため、アンジオテンシン・タイプ1a受容体以外の経路を介するアンジオテンシンIIの作用の関与は否定的であった。副腎皮質刺激ホルモン受容体の遺伝子発現がATMIの非梗塞部心筋で増加しており、同受容体を介するレニン・アンジオテンシン系以外のアルドステロン産生経路が梗塞後リモデリングに関与すると思われた。生後3週令の野生型(WT)およびアンジオテンシン受容体ノックアウト・マウス(KO)において、大動脈狭窄(TAC)による圧負荷肥大心を作成した。

それぞれ無治療群とアルドステロン受容体拮抗薬スピロノラクトン20mg/kg/day投与群に無作為割付した。4週後に心エコー検査と血行動態測定を行った。左室心筋からRNAを抽出し、心肥大・線維化に関わる遺伝子レベルをRT-PCR法によって測定した。圧負荷群における上行大動脈・下行大動脈圧較差は約80mmHgで、各群に差はなかった。WTマウスにおいて4週後に心重量はsham手術施行群に比べて圧負荷群で高値であった。心エコー検査による左室拡張末期径はWT-TAC群でWT-sham群に比べて大であった。KO-TAC群とKO-sham群で差はなかった。収縮末期径はWT及びKOの圧負荷群において各々のsham群より大であった。左室内径短縮率はsham手術施行群に比べて、圧負荷群で低値であった。KOマウスにおいても圧負荷群において左室内径短縮率は低値であった。左室重量、右室重量及び肺重量もWT及びKOマウスのTAC群において大であった。KOマウスにおいても認められたTACによるこれらの変化はスピロノラクトンによって抑制された。WT及びKOマウスにおいてTACによって心臓内脳性ナトリウム利尿ペプチドのmRNAは増加した。タイプIコラーゲンmRNAレベルはWT及びKOマウスのTAC群において増加したが、タイプIIIコラーゲンは変化しなかった。Transfoming growthfactor-beta1のmRNAはWTおよびKOマウスのTAC群において増加した。ConnectivetissuegrowthfactorのmRNAレベルもWTおよびKOマウスのTACによって増加した。Tissue inhibitor of metalloproteinase 1および2もWTおよびKOマウスのTACによって増加した。スピロノラクトンはKOマウスにおける圧負荷によるこれら遺伝子発現を完全に抑制した。以上の成果から、マウスにおける圧負荷心肥大にはアンジオテンシンIIを介さないアルドステロンが関与することが明らかとなった。現在心臓内アルドステロン産生酵素CYP11B2の遺伝子発現とアルドステロン含量について検討中である。
中国雲南省カルスト生態系における"石漠化"に伴う植生退行現象の解析

中国雲南省石漠化地域において,植生回復の潜在的な能力を検討するために,土壌堆積状況に応じた木本の定着状況とその定着による植生回復促進作用について調査を行った。調査は,石漠化が進行する地域を,岩レキの露出が顕著な岩礫地と岩レキの崩落等によって生じた土壌堆積地に区分し行った。両区分は昨年度までの調査で,分布する植生の種組成・相観が異なること,後者は20年以上にも渡って同様な景観のままであることがわかっている。両立地に出現した木本個体は,単位面積当たりの個体数,種数ともに土壌堆積草地で多かった。一方,シダ,ツル等を含む草本種は種数,多様性において岩レキ草地で高かった。既に定着した木本個体が植生回復に与える効果を定量化するために,その林冠下で生育する植物の種組成,被度,高さなどを,同様な環境で,その比較する林冠と同じ面積のオープンサイトに生育する植物の種組成,被度,高さなどと比較した。その結果,土壌堆積地では定着した木本種の林冠下では,周辺のオープンサイトに比べ,被度が有意に低下したのに対して,岩礫地では林冠下とオープンサイトで有意な差は認められなかった。これは,土壌が少なく乾燥に頻繁に曝される岩礫地に生育する木本種は,土壌が多く湿潤な土壌堆積地に生育する木本種に比べて,光,水,栄養などを巡る競合で,他個体に与える影響が弱いためと考えられ,強いストレス条件下では種内・種間競合が弱いという定説を支持する結果といえる。以上より,土壌堆積地では,遷移過程で競合排除によって種の入れ替わりが速やかに進行し,攪乱後の植生回復が早いのに対して,岩礫地では競合が強く働かないために,個体,種の入れ替わりが遅く遷移が停滞する傾向にあることが示唆された。また,土壌堆積地では,潜在的に遷移進行は可能であるにも関わらず,20年以上も停滞する原因としては,地域住民による木本稚樹の伐採が考えられた。中国雲南省の文山壮族苗族自治州西畴県において,石漠化による植生退行現象を解明するために植生調査区を設定した。調査区は地質の相違、生能系劣化程度に応じて,石灰岩地およびご近接した非石灰岩地にそれぞれ高木林区,低木林区,草原区をそれぞれ35カ所に設定した。石灰岩地高木林区は,Elaeocarpus属,Lithocarpus属の高木が林冠に優占することが多かった。林冠構成種は大きいものでも胸高直径で10cm程度,樹高で20m程度であった。低木層以下は種多様性が極めて高く,地表の露岩およびその亀裂部,土壌堆積部の配置に応じて植物が生育していた。石灰岩地低木林区は,Cyclobalanopsis属,Platycarya属の木本からなる二次林で,低木層にはItea属,Diospyros属,Boehmeria属の植物が優占していた。草本層は,高木林区に比べて種組成が単純であった。石灰岩地草原区は,イネ科のCapillipedium parviflorum, Eremopogon delavayi, Themeda triandra var. japonicaが優占し,低木種,木本種とも出現頻度は低かった。非石灰岩地高木林区はLihtocrpus属,Castanopsis属およびFagus属などブナ科の木本が高木層に優占することが多く,胸高直径5080cmの個体が散在していた。低木層以下は石灰岩地に比べて単純で,区内では露岩が少なく,土壌がよく堆積していた。非石灰岩地低木林区はSchima属の木本からなる疎林で,Calicarpa属低木などが広く分布した。また,近隣に植栽されているコウヨウザンが実生として侵入していることも特徴的であった。非石灰岩地では遷移の進行が速いためか草原として停滞しているところは確認できなかったため,本年度の調査は見送った。現在,現地の研究協力者が調査対象地を探索している。中国南西部では森林伐採,過耕作など過剰な人間活動に伴う環境負荷によって生態系の劣化が顕著となり,深刻な場合には植生および土壌被覆が完全に消失し石灰質岩が裸出化する現象が起きている。中国ではこの現象を"石漠化Rock Desertification"と呼び,砂漠化,土壌塩類化と同様に,深刻な環境問題としてその保全対策を講じ始めている。しかし,砂漠化や土壌塩類化に比べ,石漠化の退行過程には不明な点が多く,現在行われている対策は対処療法的な植林などに過ぎない。そこで,石漠化を引き起こす直接的な要因を推定し,対策プログラムの一助とするために,中国南西部カルスト地域における石漠化過程,特に植生退行現象の解析を行った。調査地域は中国南西部における石漠化問題の代表地の一つである雲南省文山壮族苗族自治州西畴県とした。調査は人為影響の少ない小橋溝自然保護区を石漠化地域の修復および保全目標となる生態系モデルとして選び,攪乱停止後の遷移年数に応じて,石灰岩地および非石灰岩地の高木林,低木林,草原にそれぞれ調査枠を設定した。調査枠内では,林冠および林床植生の種多様性,群落構造,胸高断面積合計などを計測した。

その結果,石灰岩地は,非石灰岩地に比べて,樹木の生長が遅く,種組成および高さや胸高直径の階構造が単純であること,林床の種多様性は高いことが示唆された。また遷移段階別に種組成を比較すると,非石灰岩地では各段階間で組成的な共通性が高いのに対して,石灰岩地では組成的な共通性がやや希薄で,特に伐採後間もない草地では,その後の遷移段階と種組成の共通性が極めて低かった。これらより,石灰岩地では林床植生が林分全体の種多様性を高めているが,遷移の進行が遅く,特に木本種の再生が遅く,場合によっては木本種の定着が困難であることが示唆された。中国雲南省石漠化地域において,植生回復の潜在的な能力を検討するために,土壌堆積状況に応じた木本の定着状況とその定着による植生回復促進作用について調査を行った。調査は,石漠化が進行する地域を,岩レキの露出が顕著な岩礫地と岩レキの崩落等によって生じた土壌堆積地に区分し行った。両区分は昨年度までの調査で,分布する植生の種組成・相観が異なること,後者は20年以上にも渡って同様な景観のままであることがわかっている。両立地に出現した木本個体は,単位面積当たりの個体数,種数ともに土壌堆積草地で多かった。一方,シダ,ツル等を含む草本種は種数,多様性において岩レキ草地で高かった。既に定着した木本個体が植生回復に与える効果を定量化するために,その林冠下で生育する植物の種組成,被度,高さなどを,同様な環境で,その比較する林冠と同じ面積のオープンサイトに生育する植物の種組成,被度,高さなどと比較した。その結果,土壌堆積地では定着した木本種の林冠下では,周辺のオープンサイトに比べ,被度が有意に低下したのに対して,岩礫地では林冠下とオープンサイトで有意な差は認められなかった。これは,土壌が少なく乾燥に頻繁に曝される岩礫地に生育する木本種は,土壌が多く湿潤な土壌堆積地に生育する木本種に比べて,光,水,栄養などを巡る競合で,他個体に与える影響が弱いためと考えられ,強いストレス条件下では種内・種間競合が弱いという定説を支持する結果といえる。以上より,土壌堆積地では,遷移過程で競合排除によって種の入れ替わりが速やかに進行し,攪乱後の植生回復が早いのに対して,岩礫地では競合が強く働かないために,個体,種の入れ替わりが遅く遷移が停滞する傾向にあることが示唆された。また,土壌堆積地では,潜在的に遷移進行は可能であるにも関わらず,20年以上も停滞する原因としては,地域住民による木本稚樹の伐採が考えられた。
血中抗体医薬品のPOC分析を可能にするマイクロ流体糸基板センサー

病院の診療室やベッドサイド、さらには在宅で行う検査、すなわちPoint of Careで、1滴の血液から血中抗体医薬品濃度のモニタリングができる安価、簡便、使い捨ての糸基板マイクロ流体分析デバイス(microfluidic thread-based analyticaldevices; μTADs)を開発した。マーカー抗体の特異的な認識、抗体濃度に応じたレシオメトリック(青から緑色)なシグナルの変化、生物発光によるシグナルの発生という機能が集約されているbioluminescent antibody sensing proteins (LUMABS)をμTADsに応用した。μTADsの基礎評価を行い、紙基板マイクロ流体分析デバイスと比べて、少ないサンプル量での抗体の定量分析が可能であることを確認した。一つのデバイス内に6つの糸を組み込むことで、6つのターゲットを同時に分析することを可能とした。また、デバイスの保存安定性の向上のために、生物発光基質フリマジンの保存安定性向上も達成した。フリマジンは長期的な保存安定性が低く、デバイスの長期保存には適さないため、3位のカルボニル基を保護することで、安定性を向上させた新規誘導体を4種類合成した。これらは水溶液中での保存安定性が向上することがわかった。このように、これまでの紙基板マイクロ流体分析デバイスで問題となっていた分析に必要なサンプル量、保存安定性を改善することができた。当初の研究計画通り、糸基板に変えることでさらに少量での抗体濃度の定量分析を達成できている。また、生物発光基質フリマジンの安定性向上のための誘導体化も順調に進んでおり、保存安定性の向上も確認できている。Point of Careでの分析のために、スマートフォンでデバイスの生物発光シグナルを撮影することでの定量分析法について検討していく。また、デバイスの長期保存安定性についても評価していく。フリマジン誘導体の水溶液中での保存安定性は確認しているため、デバイスに組み込むことでの保存安定性を評価する。得られた結果については、学会発表、学術誌への投稿を行う。
細胞内寄生体に対するT細胞性免疫応答誘導手法の開発

2年間の研究遂行の結果、以下の知見を確立する事に成功した。即ち、1、細胞内寄生体に対するワクチン手法の開発を目指すための実験系を、Trypanosoma cruziを用いた動物実験モデルで確立した。2、原虫抗原trans-sialidasesurface antigen(TSSA)をコードするDNAワクチン手法により、MHC拘束性にB6マウスのみが防御され、この応答がT細胞依存性である事を証明した。3、抗原上にANYNFTLVというCD8陽性T細胞誘導エピトープを同定し、本エピトープに対する免疫応答を指標にワクチン効果を判定できる実験系とした。4、IL-12遺伝子をgenetic adjuvantとして用いる共免疫手法を施行した結果、ワクチン手法効果が増強される事を証明した。5、NK T細胞の特異活性化物質を用いたワクチン手法の増強効果を検討した結果、本細胞群の活性化はむしろワクチン手法へ悪影響を及ぼす可能性がある事を示唆した。6、CD28-CD80/CD86補助刺激経路が、T細胞誘導を目的とするワクチン手法の効果発現に必須である事を証明した。7、新規のgenetic adjuvantを検索した結果、RANKL遺伝子がDNAワクチンおよび組換えウイルスを用いた免疫時に、CD8陽性T細胞の誘導レベルを増強し、防御免疫効果を高める事を初めて明らかにした。一方、CD40L遺伝子は、従来報告されていたようなadjuvantが無い事を示唆した。その他、4-1BBL遺伝子にもadjuvant効果が無い事が示された。8、また、他の細胞内寄生体であるLeishmania majorを用いた実験の結果、ICOS/B7RP1補助刺激経路が細胞内寄生体感染に対する防御免疫応答の誘導に欠かせないものである事を示した。これら一連の結果より、細胞内寄生体に対する普遍的なT細胞ワクチン手法の最適条件が示され、今後の検討へつながる解析結果となった。本年度は、新たなCD8陽性T細胞誘導エピトープの検索については現在進行中であるが、既に同定した配列ANYNFTLVへの免疫応答を指標にしたT細胞性免疫応答誘導手法の開発については以下に記載する新たな知見の確立があった。即ち、細胞内寄生体Trypanosoma cruzi原虫特異抗原遺伝子とIL-12遺伝子との共免疫により、ANYNFTLV特異的なCD8陽性T細胞の誘導が促進され、感染実験においてマウスの生存が改善され防御免疫応答が増強された。しかしながら、4-1BBL遺伝子、CD40L遺伝子との共免疫実験では、これらの遺伝子によるDNAワクチンの防御免疫効果増強活性を認めなかった。一方、自然免疫系との組合せ免疫療法により獲得免疫応答であるDNAワクチン効果が増強されるか否かを検討した。DNAワクチン投与時ないしは原虫感染時にNatural killer T(NKT)細胞を特異的活性化物質であるα-galactosylceramideにより刺激を加え、原虫感染実験およびCD8陽性T細胞の誘導レベルの判定を通しで期待される効果が誘導されるかを調べた。しかしながら、NK T細胞の活性化により、ANYNFTLV配列特異的なCD8陽性T細胞の誘導はむしろ有意に抑制され、感染実験においても血中原虫密度上昇のDNAワクチン投与による抑制効果がNK T細胞の活性化により消失し、最終的な生存率も悪化する事を明らかにした。最後に、補助刺激分子修飾によるT細胞性免疫応答誘導手法への効果を検討した。今年度はCD28-CD80/CD86補助刺激分子活性化経路のDNAワクチン効果への影響を検討したが、本補助刺激分子経路の欠失によりANYNFTLV配列特異的なCD8陽性

T細胞の誘導は全く観察されなくなり、DNAワクチンによる防御免疫能も消失する事が明らかになった。2年間の研究遂行の結果、以下の知見を確立する事に成功した。即ち、(1)細胞内寄生体に対するワクチン手法の開発を目指すための実験系を、Trypanosoma cruziを用いた動物実験モデルで確立した。(2)原虫抗原trans-sialidasesurface antigen(TSSA)をコードするDNAワクチン手法により、MHC拘束性にB6マウスのみが防御され、この応答がT細胞依存性である事を証明した。(3)抗原上にANYNFTLVというCD8陽性T細胞誘導エピトープを同定し、本エピトープに対する免疫応答を指標にワクチン効果を判定できる実験系とした。(4)IL-12遺伝子をgenetic adjuvantとして用いる共免疫手法を施行した結果、ワクチン手法効果が増強される事を証明した。(5)NKT細胞の特異活性化物質を用いたワクチン手法の増強効果を検討した結果、本細胞群の活性化はむしろワクチン手法へ悪影響を及ぼす可能性がある事を示唆した。(6)CD28-CD80/CD86補助刺激経路が、T細胞誘導を目的とするワクチン手法の効果発現に必須である事を証明した。(7)新規のgenetic adjuvantを検索した結果、RANKL遺伝子がDNAワクチンおよび組換えウイルスを用いた免疫時に、CD8陽性T細胞の誘導レベルを増強し、防御免疫効果を高める事を初めて明らかにした。一方、CD40L遺伝子は、従来報告されていたようなadjuvantが無い事を示唆した。その他、4-1 BBL遺伝子にもadjuvant効果が無い事が示された。(8)また、他の細胞内寄生体であるLeishmania majorを用いた実験の結果、ICOS/B7RP1補助刺激経路が細胞内寄生体感染に対する防御免疫応答の誘導に欠かせないものである事を示した。これら一連の結果より、細胞内寄生体に対する普遍的なT細胞ワクチン手法の最適条件が示され、今後の検討へつながる解析結果となった。
胎児期・新生児期の栄養状態に起因する成人期の遺伝子発現異常の分子メカニズムの解明

本研究では、正常出生体重群、胎児発育不全群、さらに、胎児期栄養状態の影響を検討するため母体体重変化にも注目し、ヒト胎盤を試料に、エピゲノム制御の一つである、DNAメチル化の程度を比較検討した。その結果、正常出生体重であっても、妊娠全期間の母体体重変化が適正範囲を外れると、胎盤エピゲノムに揺らぎが生じやすくなることを認めた。また、胎児発育不全例では、母体体重変化には依存しない胎盤エピゲノムの揺らぎがあることが示唆された。妊娠期低栄養食の母獣から生まれた、新生仔肝臓における、レプチンレセプターの低発現の原因の分子メカニズムとして、エピジェネティック調節異常に注目した。レプチンは摂食抑制ホルモンである。当該年度において、レプチンレセプター遺伝子のプロモーター領域のDNAメチル化異常の箇所を新たに2か所同定した。現在、この異常領域と作用するトランス因子の同定を試みている。成熟期の食環境をはじめとする環境因子が、トランス因子の活性を変化させる可能性は、妊娠期の栄養状態にかかわらず、生じうる。同じ環境変化に対する応答の脆弱性を決定づける受け手側の原因の一つとして、今回同定した、妊娠期の母体の低栄養に起因するメチル化異常領域を指標に、この領域と作用するトランス因子の活性を変化させる環境因子とは何なのか?を、栄養環境の点から明らかにすることができる。さらに、同じトランス因子の調節下にあるレプチンレセプター遺伝子以外のエピジェネティック調節異常の同定に今後つなげていくことができると考えられ、妊娠期の母体の低栄養に起因する代謝異常のメカニズムを明らかにできると考えられる。また、当該年度は、全ゲノムの7,8割のプロモーター部位のメチル化情報をカバーすることができることが知られている、Reduced Representation Bisulfite Sequencing(RRBS)法を確立することができた。現在、得られた結果を解析中である。これにより、よりゲノム全体に近い遺伝子領域を対象に、妊娠期低栄養に起因するエピジェネティック調節異常を明らかにすることができる。本研究では、胎児期の栄養状態とエピジェネティックな変化を介した遺伝子発現異常との関連の詳細を明らかにすることを目的とした。具体的には、胎児発育遅延例および正常出生体重例を対象に、胎児期栄養状態に起因するエピジェネティックな影響をヒト胎盤で解析した。胎児期栄養状態は、妊娠期母体体重増加量を指標に評価した。胎児発育遅延例(14例)の胎盤における、約45万か所のCpGサイトのDNAメチル化率を検出した結果、正常出生体重例(19例)のそれと比べて、有意に共通してメチル化が変化するようなCpGサイトは見いだされなかった。また、妊娠期母体体重増加量を不足、適正、超過の3群に分類し、その影響を胎児発育遅延例、正常出生体重例でそれそれ解析したところ、群別に共通して変化するメチル化CpGサイトは検出されなかった。したがって、胎児発育遅延の原因となる共通したエピジェネティック異常、あるいは胎児期栄養状態に起因する共通したエピジェネティック異常が本解析に用いたサンプル群からは胎盤にあるとは考えられなかった。ところが、それぞれの胎盤サンプルにおいて、DNAメチル化率の外れ値の頻度を数えたところ、正常出生体重例内では、妊娠期母体体重増加量が適正範囲から外れれば外れるほど、その頻度が増えることを認めた。胎児発育不全例では、適正体重増加群であっても、正常出生体重例のそれに比べると外れ値が高頻度で検出された。本研究において、正常体重出生児であっても、妊娠全期間の母体体重変化が適正範囲を外れると、胎盤エピゲノムに揺らぎが生じやすくなることを認めた。また、胎児発育不全例は母体体重変化には関連しない胎盤エピゲノムの揺らぎがあることが示唆された。本研究成果は、適切な妊産婦栄養管理の指標として、また、成人期の代謝異常危険予測因子としての応用展開が期待される。当該年度に計画していた、動物実験モデルより、結果を得ることができており、次年度解析予定の検体も順調に集まっている。25年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、入手できているヒト検体の解析をすすめ、これまで得られた実験動物の結果、並びに他研究者らによって報告されている実験動物の結果と照らし合わせていく。
新規C型糖転移酵素の探索と同定

先行研究の結果を踏まえて、DPY19以外のC型糖修飾酵素が存在するか否かを検証する必要が生じたため、昨年度よりCRISPR/Cas9を用いたDPY19ファミリーのノックアウト細胞の樹立を試みていた。DPY19L1、DPY19L2、DPY19L3、DPY19L4のそれぞれについて、特異的なgRNAの設計を行いゲノム編集が出来ることが確認された。現在各遺伝子のノックアウト細胞の樹立を行っている。一方でC型糖修飾が起こらないことが報告されているショウジョウバエ由来S2細胞を用いた我々の解析結果から、特定のタンパク質においてはS2細胞中でもC型糖修飾が起こることが示唆された。そこでショウジョウバエの遺伝子をデータベースで確認したところ、dpy19遺伝子は存在していることが確認された。またS2細胞における遺伝子発現を確認したところ、dpy19遺伝子の発現が確認された。そこでS2細胞のdpy19をゲノム解析したところ、2ヶ所においてデータベースに登録された配列と異なる塩基が確認された。さらにその内の1ヶ所はアミノ酸変異を伴う変異であった。このことから、このアミノ酸変異がS2細胞においてdpy19が活性を持たない原因である可能性が示唆された。今後さらなる検証を行う。さらに、S2細胞中でC型糖修飾が確認されたタンパク質について、S2細胞でdpy19をノックアウトしたところ、そのC型糖修飾が減少することが確認された。以上の結果から、当初の目標としていた新規C型糖転移酵素は存在しない可能性が示唆された。タンパク質の糖鎖修飾の一種であるC型糖修飾(C-mannosylation)は、その機能の多くが未解明であったが、近年の研究によりタンパク質の分泌や細胞内輸送、酵素活性など様々なタンパク質機能に影響を及ぼすことが分かってきた。また我々の先行研究ではDPY19ファミリータンパク質の1つDPY19L3がC型糖修飾酵素であることを世界に先駆けて報告し、さらにはDPY19ファミリー以外のC型糖修飾酵素の存在を示唆した。そこで本研究では、DPY19ファミリー以外のC型糖修飾酵素が存在するか否かを詳細に検証し、新規C型糖修飾酵素を同定することを目的とした。まず、新規C型糖修飾酵素をスクリーニングするための系を構築した。既にC型糖修飾がその分泌に重要であることが分かっているR-spondin1 (Rspo1)と、分泌型ルシフェラーゼ(Gluc)の融合タンパク質(Rspo1-Gluc)を過剰発現する細胞を樹立し、Rspo1-Glucの分泌がC型糖修飾により制御されるか否かを評価した。その結果、C型糖修飾の阻害によりRspo1-Glucの分泌は抑制されたことから、1次スクリーニング系を確立した。また、2次スクリーニング系であるC型糖修飾の有無をSDS-PAGEにより分離する手法は既に確立済みであり、これにより新規C型糖修飾酵素のスクリーニング系が構築できた。一方で我々が用いた手法とは異なるCRISPR/Cas9を用いた遺伝子ノックアウトにより、マウスDPY19L1及びDPY19L3がC型糖修飾酵素活性を有することが報告されたことから、新規C型糖修飾酵素が存在するか否かを詳細に検証する必要性が生じた。そこで我々もCRISPR/Cas9を用いてDPY19ファミリーをノックアウトし、検証を行うこととした。現在これらのノックアウト細胞を樹立中である。当初の研究計画では、新規C型糖修飾酵素の探索のための1次及び2次スクリーニング系が構築でき次第、siRNAライブラリを用いたスクリーニングを開始する予定であった。しかし、系を構築している最中に他の研究グループより、我々の用いた手法とは別の手法であるCRISPR/Cas9を用いた方法で、マウスDPY19L1とDPY19L3がC型糖修飾酵素活性を有することが報告された。この報告から、我々が探索を試みているC型糖修飾酵素は新規ではなく、DPY19L1あるいは他のDPY19ファミリーである可能性が浮上した。これは本研究計画の根幹に関わる部分であり、我々も検証する必要があると考えた。そこで先行研究と同様の手法であるCRISPR/Cas9を用いた遺伝子ノックアウトにより再検証を行うこととした。現在、DPY19ファミリーをそれぞれノックアウトした細胞株の樹立を行っている。当初計画のRspo1に対する新規C型糖修飾酵素は上記のように存在しない可能性が浮上した一方で、別の実験結果から他の複数のC型糖修飾タンパク質でやはりDPY19ファミリー以外の新規C型糖修飾酵素が作用している可能性が強く示唆されている。以上のことから、当初の目的通り新規C型糖修飾酵素は存在しその探索は可能であると考えられるため、おおむね順調に進展していると考えられる。

そこでショウジョウバエの遺伝子をデータベースで確認したところ、dpy19遺伝子は存在していることが確認された。またS2細胞における遺伝子発現を確認したところ、dpy19遺伝子の発現が確認された。そこでS2細胞のdpy19をゲノム解析したところ、2ヶ所においてデータベースに登録された配列と異なる塩基が確認された。さらにその内の1ヶ所はアミノ酸変異を伴う変異であった。このことから、このアミノ酸変異がS2細胞においてdpy19が活性を持たない原因である可能性が示唆された。今後さらなる検証を行う。さらに、S2細胞中でC型糖修飾が確認されたタンパク質について、S2細胞でdpy19をノックアウトしたところ、そのC型糖修飾が減少することが確認された。以上の結果から、当初の目標としていた新規C型糖転移酵素は存在しない可能性が示唆された。現在までに新規C型糖修飾酵素の探索のためのスクリーニング系は構築できているものの、探索を行おうと考えている酵素が新規ではない可能性が生じてきたため、まずはその検証を行う必要があると考えている。現在、先行研究と同様の手法であるCRISPR/Cas9によるDPY19ファミリーのノックアウト細胞を樹立しているため、その樹立が出来次第、その培養上清よりRspo1を精製し、質量分析によりC型糖修飾の有無を解析することで、Rspo1に対する新規C型糖修飾酵素が存在するか否かを検証する。一方でRspo1に対する新規C型糖修飾酵素が存在しない可能性を鑑み、DPY19ファミリー以外の新規C型糖修飾酵素が作用していると示唆されている他のC型糖修飾タンパク質でも解析を進める。まず、これらタンパク質でも上記と同様にCRISPR/Cas9を用いた方法でDPY19の可能性について検証する。この検証と同時に、これらC型糖修飾タンパク質のC型糖修飾の機能を検証し、スクリーニングに用いることのできる表現型を探索する。これらの検証を行うことで、新規C型糖修飾酵素が作用しており、最もスクリーニングに用いやすいC型糖修飾の機能を有するタンパク質を選定する。最後に、選定したタンパク質をスクリーニングへと応用する系を考案し構築後、その系が確かにC型糖修飾の有無を判別可能か否かを検証する。
イソキノリンキノン系抗生物質の合成研究

グラム陽性菌類あるいは真菌類に強い殺菌活性を持つ天然物アルカロイドの5,8-イソキノリンキノン系化合物群(Mimocin,Renierol,Renierone,Cribrostatin-1など)およびイソキノリン-3,5,8(2H)-トリオン系化合物群(Mimosamycin,Cribrostatin-2,Perfragilin A,Perfragilin Bなど)に対し、これらの共通母格となる多置換イソキノリン骨格を共役1-アザヘキサトリエン系の電子環状反応を鍵ステップとした新規合成法の開発を検討した。更に、この合成法を用い5,8-イソキノリンキノン系天然物合成を試みた。その結果、第1に原料のベンズアルデヒドより、2行程を経て鍵化合物へと誘導後、熱電子環状反応を行うことで多置換イソキノリンの新規合成法を開発できた。第2に、この実験結果をもとに、5,8-イソキノリンキノン系化合物に応用した。まず、これら天然物群の構造中に共通して見られる1-位のヒドロキシメチル基を最初から組み込んだ1-アザヘキサトリエン系化合物を設定し電子環状反応を行うことにした。即ち、原料のベンズアルデヒドにイソプロポキシジメチルシリルメチルマグネシウムクロリドを反応させ1,2-ジオール体とした後、一級アルコール部のシリル化、次いで二級アルコール部のケトンへの酸化、オキシム化を行い鍵化合物へと誘導し,熱電子環状反応を行うことで1-ヒドロキシメチルイソキノリン体に誘導することができた。現在、5,8-イソキノリンキノン体への酸化反応を試みることで天然物への誘導を検討中である。
骨吸収抑制・骨形成促進バイファンクショナル高分子医薬の創製

RANKLは、成熟破骨細胞形成を刺激するシグナル入力因子として広く認識されているが、我々は、骨芽細胞に発現するRANKLは、破骨細胞成熟過程で放出される膜小胞エクソソームに組み込まれたRANKを受容し、骨形成促進活性を示すことを見出している。そこでこのRANK含有エクソソームをミミックする高分子化合物を創製することで、RANKL正方向シグナルを遮断すると同時に、RANKL逆シグナルを入力する化合物になると考え、検討を進めた。RANKL細胞外ドメインに結合するW9ペプチドのN末端に、ビオチン修飾を施した化合物は、未修飾のW9ペプチドと比較して、大幅に薬理活性が増大することが明らかとなった。申請者らのこれまでの検討から、骨芽細胞表面に発現しているRANKLは、成熟破骨細胞から分泌されるRANK含有エクソソーム小胞と結合して刺激を受容し、骨芽細胞内にシグナルを発生して骨形成を促進することが見出され、カップリングを構成する分子機構の1つであると考えられる。また、RANKL骨芽細胞内シグナル発生においては、エクソソームによるRANKLの架橋が起点となっていることも明らかとなっている。本研究ではこれらの背景に基づき、RANKエクソソームの性質をミミックし、骨芽細胞表面においてRANKLを架橋し、骨形成を促進すると同時に、破骨前駆細胞上のRANKとの結合を阻害して破骨細胞の形成を抑制する、バイファンクショナルな高分子の創製を目指す。初年度である平成26年度は、ナノ粒子のコア構造の合成を進めると共に、ランダムペプチドを提示するファージディスプレイ・ライブラリを用い、RANKL細胞外ドメインに選択的に結合するペプチドリガンドの取得を試みた。幾つかの候補ペプチドは取得できたものの、過去に報告されているペプチドのアフィニティを超えるものではなかったため、今後はペプチドリガンドの探索を継続すると共に、既知のW9あるいはOP3-4ペプチドもペプチドリガンドとして用いていく。幾つかの候補ペプチドは取得できたものの、過去に報告されているペプチドのアフィニティを超えるものではなかったため、既知のW9あるいはOP3-4ペプチドもペプチドリガンドとして用いることとした。平成27年度は、W9ペプチドを用い、ナノ粒子化の検討を進めた。その結果意外なことに、W9ペプチドのN末端にビオチンを導入することで、未修飾のW9ペプチドと比較して数十倍に活性が増大することを見出した。ビオチンは脂溶性が比較的高く、W9ペプチドの自己会合を促進して、非共有結合的なナノ粒子の形成が生じていると考えられ、現在この点に関して最終確認を実施している。ナノ粒子の核となるPEG修飾デンドロンの合成は完了した整形外科学平成27年度は、最適なペプチドリガンド取得を目指したファージライブラリのスクリーニング継続すると共に、RANKLに結合することが既に知られている、W9およびOP3-4ペプチドをリガンドとして用いて、高分子コアに多数のペプチドを担持させたナノ粒子の作成と評価を実施する初年度に実施したライブラリー探索では、最適なペプチドリガンドが見いだせなかったため、合成ペプチドの購入を行わなかった。次年度っは、ペプチドリガンドの探索を継続すると共に、既知のペプチドリガンドであるW9およびOP3-4を代替として用いる予定であり、これらのペプチドの購入に必要となる。