hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ペプチド作動性ナトリウムチャネルの機能発現に関わる分子機構に関する研究

本研究課題では、ペプチド作動性Na+チャネルであるアメフラシのFMRFamide作動性Na^+チャネルの機能発現に関わる分子機構に関する研究を行った。その結果、チャネルの一次構造における552位アミノ酸部位がチャネルポア外縁部に存在しておりチャネルの活性化や脱感作機構に関わることを明らかにした。また、この部位のアミノ酸側鎖の電荷がチャネル電流の整流性に影響を与えることを明らかにし、このチャネルが内向き整流性を示すのは、552位アミノ酸がアスパラギン酸であることによることを示した。本研究課題では、動物の神経系に存在する最も多種多様な情報伝達分子であるペプチドによる神経情報伝達を分子レベルで理解するための研究の一環として、ペプチド作動性ナトリウムチャネルであるFMRF amide作動性Na+チャネルの機能発現に関わる分子機構を明らかにすることを目的としている。本年度は、主に、以下の2点に関する研究を進めた。(1)FMRFamide作動性Na+チャネルに対する二価イオン作用の定量的解析カットオープンオオーサイト法により、FMRF amide作動性Na+チャネル電流を解析し、それにおよぼすCa2+の作用を検討した。その結果、FMRF amide作動性Na+チャネル電流は電位依存性を示し、過分極側でより大きな電流が流れることが明らかになった。また、膜電位を過分極側にジャンプさせたときに見られる緩和過程は、細胞外のCa2+濃度に依存してその速度や大きさが変化することが明らかになった。(2)チャネルポア外縁部の変異体チャネル作成と機能解析先行研究により、FMRF amide作動性Na+チャネルの552位のアスパラギン酸がチャネルに対する二価イオン作用に関わっていることを示唆する結果を得ていたので、この部位の点変異体を複数種類作成し、変異体チャネルの機能を電気生理学的手法で解析した。その結果、この部位のアミノ酸残基の側鎖の物理化学的性質により、チャネルの活性化、脱感作、FMRF amide感受性が変化することが明らかになった。以上の研究成果については、2008年の日本動物学会、北米神経科学会にて発表した。本研究課題では、動物の神経系に存在する最も多種多様な情報伝達分子であるペプチドによる神経情報伝達を分子レベルで理解するための研究の一環として、ペプチド作動性ナトリウムチャネルであるIFMRFamide作動性Na^+チャネルの機能発現に関わる分子機構を明らかにすることを目的としている。本年度に進めた研究は以下の通りである。[1] 552位のアミノ酸側鎖の物理化学的性質がチャネル機能に及ぼす影響の解析新たな552位点変異体チャネルを作成し、これまでに作成していたチャネルとともに、アフリカツメガエル卵細胞をチャネルの発現系として、微小電極法およびカットーオープンオオーサイト法による詳細なチャネル電流解析を行った。これらの研究成果の一部を、国内学会及び国際学会にて発表し、また原著論文としても公表した。さらに、552位にシステインを導入した点変異体チャネルにおいて、種々のSH修飾剤を用いることで、この部位の側鎖の物理化学的性質を変化させることにより、チャネル機能にどのような影響があらわれるかを検討した。計画[1]に多くの時間を要したため、予定していた計画[2]、[3]は予備的実験のみおこなった。[2]細胞外液瞬間交換法によるチャネル活性化のキネティクス解析本方法を適用する細胞系である哺乳類培養細胞にFMRFamide作動性Na^+チャネルを発現させるためのベクターの構築をおこなった。[3] FMRFamide作動性Na^+チャネルの単一チャネル解析アフリカツメガエル卵においてFMRFamide作動性Na^+チャネルの単一チャネル解析を行うために、条件設定に必要な予備的検討を行った。これまでの研究により、FMRFamide作動性Na^+チャネルの552位アミノ酸部位がチャネルポア外縁部にあり、アミノ酸側鎖がチャネルポア内面を向いていることが明らかにされ、552位のアミノ酸側鎖の物理化学的性質によってチャネルのゲート機構が変化することが示されている(Kodani & Furukawa, Zool Sci, 2010)。本年度は、これらの成果をさらに進展させるための研究を展開し、次のような成果を得た。1.アフリカツメガエル卵をチャネルの発現系として、カットオープンオオーサイト法を用いた膜電位ジャンプ法により、細胞内外の透過および非透過イオンがチャネルの活性化やコンダクタンスに対する影響を明らかにした(第81回動物学会大会で発表)。2.552位アミノ酸の点変異体の一つであるD552C変異体を用いて、その側さの物理化学的性質を変化させるシステイン修飾剤を作用させることによるチャネル機能の変化を解析し、552位のアミノ酸側鎖がチャネル機能におよぼす効果を検討した(第32回比較生理生化学会大会、第81回動物学会大会で発表)。3.チャネル活性化、脱感作のキネティクス解析をより高時間分解能で解析するため必要な恒常的にFMRFamide作動性Na^+チャネルを発現する哺乳類培養細胞の構築を試み、安定してFMRFamide作動性Na^+チャネルを発現する細胞株を確立できた。
ヒトiPS細胞由来網膜色素上皮細胞を用いた創薬研究

ヒトiPS細胞から作製した網膜色素上皮細胞(RPE)を用いて、過去に臨床でRPEへの毒性が指摘されている組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)の毒性試験と薬効試験を行った。コントロールとしてRPE株化細胞と胎児RPEを用いた。各RPEを様々なtPA濃度で培養し、細胞毒性・形態・成長因子分泌・RPE特有遺伝子発現について評価した。iPS-RPEと胎児RPEは同様の毒性評価・形態変化を認めたが、RPE株化細胞は異なる変化を示した。一方、RPE機能である成長因子分泌と遺伝子発現に関しては変化はなかった。iPS-RPEは胎児RPEと同様の薬剤抵抗性を示したため、創薬研究の有用なツールの可能性がある。加齢黄斑変性などが原因で発症する網膜下血腫に対して、tPA(組織プラスミノーゲン活性化因子)を併用した外科的な血腫除去が現在行われている。しかし、これまでに薬剤毒性による網膜色素上皮(RPE)の障害と思われる報告がいくつかなされている一方で、tPAの安全性試験の報告は神経細胞に対する評価が中心で、臨床像で障害が示唆されているRPEに対する報告は無い。そこで生体のRPEと同様の性質を持つヒトiPS細胞由来RPEを作製し、tPA含有の培地で培養することで薬剤安全性を評価し、臨床で障害が報告された濃度との間に、どの程度の一致性や相関性があるかを明らかにする。この結果により、今後のiPS細胞の創薬研究全体における安全性試験の結果解釈の一つの基準となりうる可能性がある。実験は、2つのラインのヒトiPS細胞(253G1、454E2)からRPEに分化誘導した後、RPE特有の遺伝子発現や機能(PEDFやVEGFの分泌)を確認した。次に、様々な濃度tPA含有培地で1日培養後に死細胞率をLDH aasayを用いて評価した。結果は253G1では1000ug/ml以上・454E2では500ug/ml以上で細胞が障害されたが、臨床で障害が報告された50ug/ml以下では障害を認めなかった。一方で、RPEの細胞株であるARPE19を用いてtPAの毒性を評価したところ、iPS細胞由来RPEと同様に500ug/ml以上で細胞が障害されたが、臨床で障害が報告された50ug/ml以下では障害を認めなかった。現在、当初の計画通りヒトiPS細胞由来RPEに対するtPAの毒性評価まで終了している。加齢黄斑変性などが原因となり重篤な視力障害を引き起こす網膜下血腫に対して、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)を併用した血腫除去術が行われているが、これまでに薬剤毒性と思われる網膜色素上皮細胞(RPE)障害が報告されている。そこでRPEに対するtPAの安全性を、医薬品の研究開発ツールとして期待されているヒトiPS細胞から作製したRPE(iPS-RPE)と、RPE株化細胞(ARPE19)、胎児RPEを用いて評価した。RPEを様々なtPA濃度(0、10、20、100、200、1000、2000、4000ug/ml)の培地で1時間と24時間の培養後、経時的(1、7、28日後)に形態評価を行った。また、細胞毒性評価としてLDH活性、細胞機能評価として色素上皮由来因子(PEDF)と血管内皮増殖因子(VEGF)の分泌量、RPE特有遺伝子の発現(RPE65、RLBP1、MERTK、VMD2)を評価した。結果は、1時間添加では、ヒトiPS-RPEと胎児RPEは2000ug/ml以上で明らかな形態異常を認め、200ug/ml以下では細胞障害を認めなかったが、ARPE19は全ての濃度において細胞障害を認めた。24時間添加では、全ての濃度でヒトiPS-RPEと胎児RPEに細胞障害を認め、また添加7日後でも細胞障害を認めた。一方、RPEの機能評価はいずれにおいても明らかな異常や細胞間の差を認めなかった。24時間添加により、臨床で用いられている濃度においても遷延する細胞障害を認めたため、tPAが長時間残存する方法は避けるべきである。またiPS-RPEは胎児RPEと同様の薬剤抵抗性を示したため、創薬研究の有用なツールの可能性がある。今後、障害を認めなかった濃度におけるRPEの機能(サイトカイン分泌:ELISA法を用いてVEGFとPEDFの分泌量、バリア機能)を評価する予定である。眼科
腸内細菌群におけるプラスミド性クラスCβ-ラクタマーゼの解析と簡易検出法の検討

平成14年度はプラスミド性クラスCβ-ラクタマーゼCMY-9について遺伝学的かつ酵素学的解析を行い、この構造遺伝子が薬剤耐性遺伝子の集積機構であるインテグロンに関連して存在し、またクラスCβ-ラクタマーゼとしては例外的に第四世代セフェム薬にも耐性を付与することなどを明らかにし論文発表した。平成15年度は大腸菌臨床分離株が染色体性に産生する特殊なAmpC型クラスCβ-ラクタマーゼについて詳細に解析した。この酵素は活性部位に面する三アミノ酸の欠失を有しているが、その結果セフタジジムなどの広域セフェム薬への親和性が高まり産生菌の耐性化に寄与していること、また同時にクラスCβ-ラクタマーゼとしては例外的にスルバクタム、タゾバクタムといったβ-ラクタマーゼ阻害薬への親和性も高まっていることなどが明らかとなった。分子モデリングを行った結果、構造的にもこの特殊な基質特異性が説明されることがわかった。この成果は現在論文投稿中である。さらにクラスCβ-ラクタマーゼ産生菌の簡易判別法としてクラスCβ-ラクタマーゼ阻害作用を持つ3-アミノフェニルボロン酸を浸透させたディスクを用いる方法を考案し、現在引き続き実用化に向けた検討を行っている。またβ-ラクタム薬と併用されることの多いアミノ配糖体系抗菌薬に高度耐性を付与する新しい耐性機構として、霊菌の臨床分離株が産生する16S rRNAメチル化酵素RmtBを同定、シークエンスと機能解析を行い論文発表した。プラスミド性クラスCβ-ラクタマーゼ産生菌は他のクラスのβ-ラクタマーゼ産生菌に比べ現時点での分離頻度は極めて低い。そこで既に臨床分離大腸菌株よりクローン化してあった新しいプラスミド性クラスCβ-ラクタマーゼ(CMY-9)についてその酵素学的解析と遺伝子周辺領域の解析を行った。その結果、CMY-9は以前に台湾より報告された近似のβ-ラクタマーゼであるCMY-8に比し代表的な広域セフェム薬であるセフタジジムの加水分解効率が優位に高まっていることが明らかとなったが、CMY-9では唯一85位のアミノ酸がCMY-8のグルタミン酸からアスパラギン酸に置換しており、その影響であると考察された。この酵素活性の相違はセフタジジムの最小発育阻止濃度にも2管の上昇をもたらしていた。CMY-9遺伝子は耐性遺伝子などの集積構造であるインテグロンの下流に存在し、インテグロンとの間には遺伝子の転位に関与するトランスポゼーズをコードすると推測される遺伝子が同定された。このトランスポゾン様構造はクラスCβ-ラクタマーゼDHA-1遺伝子や一部のクラスACTX-M.型β-ラクタマーゼ遺伝子でも報告されつつあり、これがインテグロンと複合的に機能し薬剤耐性遺伝子の集積に関与していることが示唆される。一方、プラスミド性クラスCβ-ラクタマーゼ産生菌のスクリーニングを並行して行ったところ、これまでに臨床分離腸内細菌よりCMY-2、DHA-1の各クラスCβ-ラクタマーゼ産生菌を国内で初めて同定した。新年度はこれら複数の菌株を用い、主にディスク法を用いたクラスCβ-ラクタマーゼ産生菌の簡易判定法を検討する予定である。
磁性人工格子を用いた多値記録手法による超高密度磁気記録材料への応用研究

本研究は最近物理学・化学・材料工学の広範な分野で重要な研究テーマとなっている3次元磁性人工格子の1つのドメインを記録の単位として磁性媒体を構成し、超高密度の記録媒体の実現を目指したものである。この3次元人工格子を記録媒体に用いることにより、従来1bitずつ記録していた手法から多bitを記録領域に記録する方法に改良し、高密度化、高転送レート化を図る。この実現のために、その記録媒体としての材料化の可能性、作製プロセスの決定、熱的安定性、外磁場に対する応答性を探り、最終的には記録媒体の画期的なブレークスルーを目指している。今年度はこの3次元人工格子を作製する方法の1つと考えられる、高真空中での金属蒸気の断熱膨張によるクラスター生成と薄膜成長をモンテカルロ直接法により明らかにした。気相からの成膜過程やクラスター堆積過程は通常、連続体として扱えないほど薄いガスの中で行われている。具体的にはガスの平均自由行程と系の代表的な長さの比で定義されるクヌッセン数が大きい条件であり、ガスの運動はナビエ・ストークス方程式では表せない。そのため、これらのガスの運動を解くためには個々の原子の運動を追跡して、全体のガスの運動を求める必要がある。本研究では、その手法の一つであるボルツマン方程式の確率解法(モンテカルロ直接法)をガス中のクラスター成長に適用し、さまざまな条件下で生成するクラスターの大きさの分布をシミュレーションした。具体的には、(1)飛行する距離、(2)外壁の温度、(3)原料のガスと不活性ガスの混合比のクラスターの大きさの分布への影響を調べた。さらに、得られたクラスターの大きさと並進速度をクラスター堆積過程の原子レベルシミュレーションの入力データとして計算に使い、基板表面での堆積過程のダイナミックス、さらにその堆積膜の物性値を求め、最適な成膜条件を見い出す研究へと展開している。そのためには、その記録媒体としての材料化の可能性、作製プロセスの決定、熱的安定性、外磁場に対する応答性を探り、記録媒体の画期的なブレークスルーを目指している。今回、この多値記録の記録プロセスのシミュレーションを行った。大量のデータを格納するために超高密度記録達成のための研究は多数なされている。最近では磁気薄膜を使い、2次元表面での密度を上げる試みがされている。また高密度記録の実現のために多値記録を用いる研究もある。本研究では多値記録が磁気的異方性を含む2次元、3次元人工格子の配置により簡単に達成できることを示した。さらに、この新しい手法を使い、超高密度記録が達成可能なものであることを示した。磁性人工格子中のスピン配列は磁気双極子の相互作用を含む古典的ハイゼンベルグ型の非線形方程式を解くことにより求めた。磁性人工格子のHysteresis loopを様々な磁気的配置において得た。その結果は超高密度記録メディアとしての可能性を示すものであった。磁気的性質および多値記録の評価はHysteresis loopを用いて行った。その結果、ドメインを多数もつ3次元の場合は2次元よりも多値のbit数が増えて、より高密度になる可能性が示された。熱的安定性など実際の使用を考慮したケースでのシミュレーションが欠如しているため、現在までには3次元磁性人工格子を用いた製品は実用化されていないが、今後はそれを克服していく予定である。

さらに、得られたクラスターの大きさと並進速度をクラスター堆積過程の原子レベルシミュレーションの入力データとして計算に使い、基板表面での堆積過程のダイナミックス、さらにその堆積膜の物性値を求め、最適な成膜条件を見い出す研究へと展開している。
建物の裏面に回り込む津波の波圧力特性の解明

本研究では、水路実験から建物背面に回り込む津波の流速、浸水深を観察し、津波波力に及ぼす影響について検討する。通常、自由流出による水路実験では、発生させる津波は津波高さに比べて流速が速い射流となることが一般的で、流量が小さく、津波の継続時間が短い。それが建物背面へと差し掛かると背面に回り込む前に剥離し、建物背面への回り込み現象の再現を困難にする。建物背面の津波性状を観察するためには、実験時に津波が建築物背面に回り込むための十分な流量を確保し、継続時間を増やす必要がある。平成29年度までの簡易水路実験装置における水路実験では、建築物前面および背面の流速、浸水深を計測することで、建物背面の津波の基本的な性状を確認した。また,建物形状を変化させることで裏面に回り込む津波の津波高さ、裏面の波圧の変化を観察し、その傾向を把握した。この実験から、建物形状については津波方向に対して建物幅が大きく影響を及ぼし、建物奥行きについては影響が少ないことが分かっている。平成30年度は水路実験の本実験を秋田工業高等専門学校環境都市工学科の実験水路を使用し行った。本実験では,これまでの簡易水路実験装置における実験と同様に,建築物前面および背面の流速、浸水深,波力の計測を行っている。その結果によると,建物に作用する波力は建物前面の流速から得られる動圧による水平力と建物前面および背面の浸水深の差によって生じる水平力の和として説明できることが分かった。また,本実験で特に注目するパラメータは建築物前面および背面の波圧で,小型圧力センサーを使用し計測を行った。その結果,大まかな建築物前面および背面の波圧の傾向を把握することができた。平成28年度の研究ではそれらの実験方法の検討を行った。まず、自作した簡易実験水路で実験を行い、建築物前面および背面における流速、浸水深の関係を整理した。その後、実験水路貯水槽を拡張し、貯水量(総流量)を大幅に増加させた実験を行い、前述の実験結果との比較を行った。水路実験の結果より、建築物前面および背面の流速、浸水深を計測することで、建物背面の津波の基本的な性状を確認した。また、総流量を大幅に増加させた実験を行い、津波の持続時間を長くすることが可能であることが確認できた。水理実験により建築物背面に回り込む津波の性状を確認するためには、総流量を十分に確保し津波の継続時間を伸ばす必要があると考えられる。今後は建物背面に回り込んだ津波による波圧などの観察を行い、建物背面の津波性状を考慮した対津波設計の確立に有用なデータの提供を試みる。申請時の研究計画において、平成28年度は簡易水路実験装置を使用し仮試験を行う計画となっている。簡易水路実験装置とは、アルミ材による骨組にアクリル板を貼り付け止水した簡易な水路実験装置であり、申請者が過去の研究により作成したものである。簡易水路実験装置は、計画段階では実験における貯水量が少なく、建物の背面に回り込む津波を再現することが困難である。そのため、本研究ではこの水路実験装置に改良を施し、建物裏面に回り込む津波の性状を確認できる水路とする必要がある。平成28年度の実験では、この簡易水路実験装置の改良および建物裏面に回り込む津波の性状確認を第一の目標とする。この仮試験については、実験手法の妥当性の検証や計測、データ整理方法の検証について次年度予定している本実験のパイロット試験的役割を持たせ、本実験で問題が生じにくいようにあらかじめ問題点をあぶり出す効果を期待している。平成28年度の水理実験では、建築物背面に回り込む津波の確認、建築物背面における津波流速、波高の計測、建築物背面に津波が回り込んだ状態での建築物に作用する津波波力の計測ができ、建築物背面に回り込む津波の大まかな性状を把握することができた。一方で、平成28年度の水理実験では、建築物背面に作用する津波波圧の計測、背面に作用する津波波圧の分布特性の観察ができず、これらの影響については今後、さらなる検討を必要とする。以上より、現在までの研究の進捗状況について、おおむね順調に進展していると判断した。平成28年度の研究では、建築物前面および背面の流速、浸水深を計測することで、建物背面の津波の基本的な性状を確認した。

また、貯水量を大幅に増加させた実験を行い、津波の持続時間を長くすることが可能であることが確認できた。一方で平成28年度に行った簡易水路実験装置における水路実験では建物形状が一通りの実験のみ行っており、建物形状における変化は観察されていない。本研究で特に注目する津波の建物裏面への回り込みについては、建物形状(特に建物平面形状、津波進行方向に関してのアスペクト比)が大きくかかわっていると考えられる。平成29年度の研究では、建物形状を変化させることで裏面に回り込む津波の津波高さ、裏面の波圧の変化を観察し、その傾向を把握した。この実験から、建物形状については津波方向に対して建物幅が大きく影響を及ぼし、建物奥行きについては影響が少ないことが分かった。さらに建物幅と水路幅からなる閉塞率に着目して実験を行い、これにより、建築物背面に回り込む津波の大まかな性状を把握することができたと考えている。平成29年度は簡易水路実験装置を使用し水路実験を行った。簡易水路実験装置とは、アルミ材による骨組にアクリル板を貼り付け止水した簡易な水路実験装置であり、申請者が過去の研究により作成したものである。簡易水路実験装置は,平成28年度の実験において貯水量を大幅に増加させることで建物背面への津波の回り込みを観察することができるように改良された。これにより大まかな建物裏面に回り込む津波の性状確認ができた。この仮試験については、実験手法の妥当性の検証や計測、データ整理方法の検証について次年度予定している本実験のパイロット試験的役割を持たせ、本実験で問題が生じにくいようにあらかじめ問題点をあぶり出す効果を期待している。平成29年度の水路実験では、目的としていた建物平面形状を変えた場合における建築物背面に回り込む津波の確認、建築物背面における津波流速、波高の計測、建築物背面に津波が回り込んだ状態での建築物に作用する津波波力の計測ができ、建築物背面に回り込む津波の大まかな性状を把握することができた。以上より、現在までの研究の進捗状況について、おおむね順調に進展していると判断した。本研究では、水路実験から建物背面に回り込む津波の流速、浸水深を観察し、津波波力に及ぼす影響について検討する。通常、自由流出による水路実験では、発生させる津波は津波高さに比べて流速が速い射流となることが一般的で、流量が小さく、津波の継続時間が短い。それが建物背面へと差し掛かると背面に回り込む前に剥離し、建物背面への回り込み現象の再現を困難にする。建物背面の津波性状を観察するためには、実験時に津波が建築物背面に回り込むための十分な流量を確保し、継続時間を増やす必要がある。平成29年度までの簡易水路実験装置における水路実験では、建築物前面および背面の流速、浸水深を計測することで、建物背面の津波の基本的な性状を確認した。また,建物形状を変化させることで裏面に回り込む津波の津波高さ、裏面の波圧の変化を観察し、その傾向を把握した。この実験から、建物形状については津波方向に対して建物幅が大きく影響を及ぼし、建物奥行きについては影響が少ないことが分かっている。平成30年度は水路実験の本実験を秋田工業高等専門学校環境都市工学科の実験水路を使用し行った。本実験では,これまでの簡易水路実験装置における実験と同様に,建築物前面および背面の流速、浸水深,波力の計測を行っている。
心不全における慢性炎症成立機構の解明と新規治療標的の探索

慢性心不全は、先進国における主たる死因の一つであり、その予後は極めて不良であるが、この10年以上、革新的な治療法は提案されていない。近年、心不全の病態形成に炎症反応が重要であることが報告されているが、その詳細は十分には明らかにされていない。本研究では、マウス実験的自己免疫性心筋炎においてIL-6を介したTh17細胞の誘導が炎症惹起に必須であること、マウス梗塞後心筋炎症においてマクロファージが死細胞貪食を介して炎症制御に寄与していることを見出した。これらの結果は、炎症制御を機序とする新規心不全治療法の開発を期待させる。自己免疫性心筋炎モデルにおける炎症の発症メカニズムの解析を行った。自己免疫性心筋炎は、雄性Balb/cマウスにミオシン重鎖ペプチドを2回免疫することで発症させた。まず、心筋炎の発症時期に、心筋組織内でIL-17の発現が増強することを明らかにした。さらに、IL-17の発現増強に伴ってTh17細胞の分化に必須の転写因子であるRORγtの発現上昇を認めたことから、自己免疫性心筋炎の心筋組織にTh17細胞が浸潤していることが示唆された。そこで、心筋炎組織から浸潤している炎症細胞を単離し、FACS解析を行った。その結果、浸潤細胞中にIL-17+/CD4+細胞が存在することが明らかとなった。Th17細胞がnaive T細胞から分化する過程において、IL-6が必須であることが知られている。そこで、IL-6受容体阻害抗体の心筋炎に対する作用を検討した。その結果、IL-6受容体抗体を免疫前に投与した場合には、自己免疫性心筋炎の発症が抑制されるとともに、RORγtの発現誘導が抑制されたが、免疫後にIL-6受容体抗体を投与しても抑制効果は認められなかった。さらに、RORγtノックアウトマウスは、自己免疫性心筋炎の発症に対し抵抗性を示すことが示された。以上のことから、自己免疫性心筋炎の発症には、IL-6/RORγt系を介したTh17細胞の誘導が必須であることが明らかになった。自己免疫性心筋炎モデルは、ウイルス性心筋炎のモデルとされており、ウイルス性心筋炎から心不全に至る過程にIL-6/RORγt系が重要であり、IL-6受容体抗体がその治療に有効である可能性が示唆された。不全心筋における慢性炎症反応は、心不全の重大な増悪因子である。しかし、自己免疫性心筋炎ではTh17細胞を介した慢性炎症機構の関与が重要であるのに対し、臨床的にcommonな病態である心筋梗塞後の心不全心筋での慢性炎症の成立機序は不明である。申請者はこれまで心筋保護サイトカインに関する研究を行い、急性期の心筋細胞死の回避が、梗塞後慢性期の炎症反応を抑制することを明らかにしてきた。本年度は、梗塞後心筋組織において細胞死が誘発されたのち、慢性炎症が成立する機構の解明を目的として計画を遂行した。これまで、細胞死貪食に関連する遺伝子を欠損したマウスを用いた研究から、死細胞除去障害が、自己免疫性疾患の発症につながることが知られているが、梗塞後死細胞除去と炎症慢性化との関連に関しては未だ十分に研究されていない。本研究では、マクロファージで死細胞貪食受容体CD93を過剰発現するマウス(CD93TGマウス)を作製した。このマウスのマクロファージでは予想通り貪食能が亢進していることが、ビーズ貪食アッセイで確認できた。そこで、CD93TGマウスにおいて冠動脈を結紮し、心筋梗塞を作製したところ、梗塞後心筋リモデリングが抑制された。非常に興味深いことに、CD93TGマウスの心筋に浸潤するマクロファージは、抗炎症性マクロファージであることが示唆された。以上のことから、梗塞後心筋組織における死細胞貪食は、炎症の原因となる死細胞内容物を除去するのみならず、マクロファージの極性を変化させる可能性が示唆された。心不全において、慢性炎症が重大な増悪因子であると考えられているが、急性炎症が慢性化するメカニズムは依然不明である。一方、ウイルス性心筋炎をはじめとした心筋炎の多くは、急性期には著しい炎症細胞の浸潤と細胞外基質の沈着を認めるものの、その後、炎症は消退し、慢性化することなく自然治癒する。これまで我々は、自然治癒する心筋炎症のモデルである実験的自己免疫性心筋炎(Experimental Autoimmune Myocarditis、EAM)モデルを用いて、EAMの発症には、IL-6によるRORγtを介したTh17細胞の誘導が必須であることを示してきた。今年度は、自然治癒のメカニズムを解明することを目的に、EAMにおけるTreg/Th17バランスに着目して研究を行った。その結果として以下の知見を見出した;

1心筋炎の進行に伴って、Th17細胞とともにTreg細胞が心筋組織の中に浸潤すること2心筋組織に浸潤したTregは、心筋炎症を抑制すること3Tregの心臓への遊走は、炎症反応非特異的なものではなくTh17細胞依存性であること。以上のことから、心筋炎の自然治癒には、TregとTh17の細胞間相互作用が重要であることが示された。これらの成果は、これまで不明であった臨床における心筋炎の治癒メカニズムを提案するという重要性を有している。また、上記の自然治癒機構の破綻が、心筋炎の慢性化の原因となると予想され、心筋炎症の慢性化メカニズムの一端を明らかにするものと期待される。年度内に論文発表に至ったことが挙げられる。また、並行して行っている研究からTh17細胞の新規機能の手がかりを得ており、研究が大きく進展する可能性がある。25年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の成果は、心筋炎の自然治癒機構を解明したものであり臨床的にも基礎科学的にも価値が高い。また、Th17細胞とTreg細胞との新らたな相互作用を明らかにした点で、循環器領域のみならず、他の研究領域に貢献しうるものである。心筋炎終息時のTh17細胞が消失する。Th17細胞のcell fateを、発現遺伝子プロフィールを経時的に検討することにより解明する。今後の推進方策は以下の2点である;1心筋炎の自然治癒の破綻を惹起しうるサイトカインを同定する2心筋炎との比較のもと、自然治癒しない炎症である心筋梗塞後炎症におけるTregの動態を検討する。
国際貿易理論による雪エネルギー有効利用に関する研究

前年度の積出港の研究手法と同様に陸揚港としての適性が確認されたオーストラリア・シドニー、ケアンズ、タイ・バンコック、フィリピン・マニラ、インドネシア・ジャカルタ港に関してフィールド調査を実施した。現地訪問の上、自治体、並びに前年度に予め協力先として選定された研究機関との意見交換を経て最適港候補の技術的、並びに経済的な評価(使用可能期間、雪置場面積、内陸への雪資源輸送利便性、陸揚設備、雪輸出に関する法規制、自治体の協力体制等)により更なる順位付けを実施する。本件に関しても関係する専門家として商社、船会社、港湾業務委託会社等に手続きと経済的な観点よりヒアリングを実施した。需要者に関しては大規模な雪資源の冷熱利用を前提として地域冷房施設、並びに冷蔵倉庫を想定の上、陸揚港としての適性が高い地区の需要者候補を政府、及び自治体資料により調査の上、リストアップの後、有望先のフィールド調査を現地研究者の協力も得て実施した。雪資源利用による需要者の冷熱供給設備(大型ショッピングセンター、大型ホテル、大型冷蔵倉庫向けを想定。)に関する技術的問題の有無に関しては適宜、空調設備会社、並びにエネルギーサービス会社から専門的な意見を聴取の上、研究対象とする。経済的な試算に当たっては、本件においても一般的な既存化石エネルギー資源(石炭、石油、天然ガス等)の発生する単位当たりの冷熱量、及び同じく輸送費と雪の単位冷熱量と研究によって推察される冷房費用を比較検討することにより、より実現に向けた問題点が明らかになるように得られたデータの整理を工夫した。1雪資源の積出港と輸送方法の技術的、及び経済的な評価とその最適化に関する研究日本海側、東北、及び北海道地区の積雪量が多く大規模な輸送船(国際的に汎用船の標準規格とされるパナマックス級船舶が寄港可能な港である国際拠点港湾、及び重要港湾が雪資源の積出港として機能するか否かを政府統計資料、港湾関係資料、並びに地方自治体の刊行物、電力会社等を調査、インタビューの上、最適港候補を富山新港、室蘭港に絞り込んだ。加えて現地自治体、並びに研究機関の協力も得ながら適宜、フィールド調査、関係者からのヒアリングを経て最適港候補の技術的、並びに経済的な評価(雪資源量、雪質、使用可能期間、雪置場面積、内陸からの雪資源輸送利便性、積出設備、雪輸出に関する法規制、自治体の協力体制等)により更なる順位付けを実施した結果、石炭バラ積み船バックカーゴとしての南半球の雪輸送が物理的に可能であることは確認できたことは大きな成果であった。また輸送方法に関しては、学内外の研究者の協力を得て通常のバラ積船舶(保温材なし。)、断熱船(保温材あり。)、及び冷蔵船(冷蔵設備あり。)の3種について雪の輸送に関して文献による技術調査、及び適合調査を行い、更に輸送期間の雪の挙動に関するシュミレーションの為の実験設備を設計、準備して輸送中の雪の誘拐挙動を調べる実験に着手した。加えて専門家として商社、造船会社、船会社、港湾業務委託会社等に技術的、及び経済的な観点より委託調査の可能性に関して打診中。2雪資源の陸揚港と需要者の技術的、及び経済的な評価とその最適化の研究雪資源の輸送先は輸送期間が比較的短い東南アジアと豪州に限定して調査、関係先へのインタビューを実施した結果、常夏の東南アジアでは冷熱需要が旺盛でその需要地である都市部に近い港としてバンコック港、及びシドニー港が研究対象として最もふさわしいことが明らかになった。本研究に関しては申請書にも記述した通り、日本の豊富な雪資源を大規模に海外に輸出して有効利用しようとする過去の研究例が全くない為、イノベーターに特有の問題として情報収集や、ベンチマークの参照が困難である。新規の未利用再生可能エネルギーの利用に関する研究分野を創出することが期待される価値のある研究ではあるが、関係先から新しい発想のエネルギーバリューチェーンの構築に関する研究に対する理解を得ることが難しく助成頂いている予算内での研究委託、または実験協力先の探索に多大な時間を浪費している状況。これを打開する為に自前での試行錯誤しながら実験設備の設計、準備をせざるを得ない状況の為、従来の研究計画にやや遅れが出ている。1雪の輸送中の融解挙動の実験による評価:雪の長期輸送中の融解挙動は経済性の試算に必要なデータである為に独自の実験設備を製作してその評価を実施した。結果は良好で赤南半球の想定陸揚港であるシドニー付近まで輸送するのにかかる2週間の融解による損失は5%以内であり経済性の試算が可能な範囲であることが分かった。2雪資源の陸揚港と需要者の技術的、及び経済的な評価とその最適化:積出港の研究手法と同様に陸揚港としての適性が確認された3港に関してフィールド調査を実施した。バンコック港とシドニー港に関しては現地訪問の上、自治体、並びに前年度に予め協力先として選定された研究機関との意見交換を経て最適港候補の技術的、並びに経済的な評価(使用可能期間、雪置場面積、内陸への雪資源輸送利便性、陸揚設備、雪輸出に関する法規制、自治体の協力体制等)を実施した。需要者に関しては大規模な雪資源の冷熱利用を前提として地域冷房施設である北海道ガスや新千歳空港も現地補門の上、調査研究した。並びに冷蔵倉庫を想定の上、陸揚港としての適性が高い地区の需要者候補を政府、及び自治体資料により調査の上、リストアップの後、有望先のフィールド調査を現地研究者の協力も得て実施した。

国際貿易理論に基づいた雪エネルギーの利用に関して重要な研究項目である積出港調査と輸送中の雪の挙動に関するデータ収集が完了したこと。また陸揚港の一部調査も既に完了しており、追加調査を得て全体の経済性を評価で飽きる目途がついている為。前年度の積出港の研究手法と同様に陸揚港としての適性が確認されたオーストラリア・シドニー、ケアンズ、タイ・バンコック、フィリピン・マニラ、インドネシア・ジャカルタ港に関してフィールド調査を実施した。現地訪問の上、自治体、並びに前年度に予め協力先として選定された研究機関との意見交換を経て最適港候補の技術的、並びに経済的な評価(使用可能期間、雪置場面積、内陸への雪資源輸送利便性、陸揚設備、雪輸出に関する法規制、自治体の協力体制等)により更なる順位付けを実施する。本件に関しても関係する専門家として商社、船会社、港湾業務委託会社等に手続きと経済的な観点よりヒアリングを実施した。需要者に関しては大規模な雪資源の冷熱利用を前提として地域冷房施設、並びに冷蔵倉庫を想定の上、陸揚港としての適性が高い地区の需要者候補を政府、及び自治体資料により調査の上、リストアップの後、有望先のフィールド調査を現地研究者の協力も得て実施した。雪資源利用による需要者の冷熱供給設備(大型ショッピングセンター、大型ホテル、大型冷蔵倉庫向けを想定。)に関する技術的問題の有無に関しては適宜、空調設備会社、並びにエネルギーサービス会社から専門的な意見を聴取の上、研究対象とする。経済的な試算に当たっては、本件においても一般的な既存化石エネルギー資源(石炭、石油、天然ガス等)の発生する単位当たりの冷熱量、及び同じく輸送費と雪の単位冷熱量と研究によって推察される冷房費用を比較検討することにより、より実現に向けた問題点が明らかになるように得られたデータの整理を工夫した。1雪資源の陸揚港と需要者の技術的、及び経済的な評価とその最適化に関する研究積出港の研究手法と同様に陸揚港としての適性が確認された2港(バンコック港、シドニー港)に関して出張によるフィールド調査を実施する。本件に関しても関係する専門家として商社、船会社、港湾業務委託会社等に手続きと経済的な観点よりヒアリングを実施する。需要者に関しては大規模な雪資源の冷熱利用を前提として地域冷房施設、並びに冷蔵倉庫を想定の上、陸揚港としての適性が高い地区の需要者候補を政府、及び自治体資料により調査の上、リストアップの後、有望先のフィールド調査を現地研究者の協力も得て実施する。経済的な試算に当たっては、本件においても一般的な既存化石エネルギー資源(石炭、石油、天然ガス等)の発生する単位当たりの冷熱量、及び同じく輸送費と雪の単位冷熱量と研究によって推察される冷房費用を比較検討することにより、より実現に向けた問題点が明らかになるように得られたデータの整理を工夫する予定。
時間割引から探るこころの時間～異種間比較の枠組構築

動物は遅れて得られる報酬よりすぐに得られる報酬を好む。これは遅延報酬の価値を主観的に割り引いているからであると考えられている。この割引の時間的特性は、遅延期間中にただ連続的に時間が経過するときには双曲型で、試行をまたいで離散的に時間ステップが進むときには指数型になることが示唆されている。脳内に連続的な時間と離散的な時間が存在し、役割の異なる割引を行っている可能性がある。遅延報酬に対する選好の時間特性は多種の動物で観測されており、同一の比較基準で脳内時間に関わる特性を比較するための土台として有用と考えられる。研究代表者は先行研究で、強化学習理論の中で時間割引を取り入れた「割引価値問題」という枠組みを動物行動に適用すると、しばしば枠組み自体が破綻することを示した。そして、破綻しない枠組みを構築するためには、時間割引特性の異なる時点(イベント)が存在する必要があり、そのイベント間に経過する連続時間とイベントによって時間ステップが進むときでは異なる特性の割引となることが導出された。全く異なる目的のために導出した結果が、他の実験的知見と整合したため、提案した枠組みは本質に近づいている可能性が高いと考えられる。この仮説を確かめるため、平成26年度は行動課題設計と連続時間での理論的枠組みの整備を行い、平田班(計画研究C01)との共同研究で類人猿での予備実験を開始した。平成27年度は、類人猿での実験の遂行を理論的にサポートした。また礒村班(公募研究D01)との共同研究で、海馬リップルに2種類のサブタイプがあることを発見し、それぞれが、過去の報酬と未来の報酬を反映していることを突き止めた。27年度が最終年度であるため、記入しない。脳内に連続的な時間と離散的な時間が存在し、役割の異なる割引を行っているのではないだろうか。この枠組みを確かめるための行動実験課題を設計した。離散的な時間ステップとその連続的な間隔を制御して、選択肢それぞれに報酬遅延と報酬量を割り当て、試行を越えた効果を導入しながら、連続的な遅延時間の効果も同時に導入した課題を設計した。できるだけ少数の試行数で提案した枠組みの正当性を判別するための課題パラメータサーチを行った。さらに領域内の平田班(チンパンジー・ボノボ対象)との共同研究を開始し、類人猿に合わせた具体的な課題設計と課題の実装を行い、平田班において予備実験を開始した。領域内の動物実験を行っている班との議論の成果として、計画調書に記載した行動実験課題より、さらに簡潔に動物実験が可能な行動実験課題に修正した点以外は、計画通りに進んでいる。

この計画修正は、今後、共同研究を通じて動物実験を行っていくにあたり、より円滑にする修正であり、今後の順調な進捗を期待できる。27年度が最終年度であるため、記入しない。平田班との共同研究により、実際の動物実験の実施に向けて、推進する。動物実験において、予想外の問題が生じる可能性があるが、問題が生じた段階で対処する。
非水系での生体膜機能の再現およびその機能の展開

生体膜類似の二分子膜特性を非水溶媒中で再現し、二分子膜の機能を拡張することを目的としてつぎのような検討を行った。i)光学活性を有し、かつ水素結合によって分子集合安定化が得られる人工脂質として、L-グルタミン酸を基本骨格とするトリアミド型両親媒性化合物の分子設計ならびに合成を行った。ii)上記脂質の分散挙動をメタノール、エタノール、クロロホルム、テトラヒドロフラン、ベンゼン、トルエン、シクロヘキサン中で調査し、ほとんどの溶媒でゲル化が起こることが確認された。iii)ゲル化の機構を調査するため、走査電子顕微鏡観察あるいは透過電子顕微鏡観察を行い、繊維状の会合体が絡み合ってネットワークが形成されていること、希薄溶液ではゲル化は観察されないが、そのキャスト膜について観察すると、やはり繊維状の会合体が多数生成していることが確認された。また、指示薬としてシアニン系色素を混合し、その可視スペクトルを調査したところ、溶媒の種類によって異なるが、ある濃度以上の脂質濃度で吸光係数が著しく減少することが認められた。透過型電子顕微鏡観察により、ゲル化はしないが、脂質の会合が認められている濃度領域が存在することを確認した。すなわち、濃度の増加によりまず脂質の会合が始まり、続いて会合体の成長、、会合の増加を経てゲルを形成するような会合体ネットワークを形成するものと結論した。ここまでの段階で得られた知見をもとに、つぎのような展開を行った。a)脂質頭部にピレニル基あるいはジメチルアニリノ基をもつL-グルタミン酸を基本骨格とするトリアミド型両親媒性化合物を合成し、エキシマー生成やエキシプレックス生成などのケイ光特性の調査を通じてベンゼン、シクロヘキサンあるいはシクロヘキサン/エタノール等の有機溶媒中での会合・分散挙動を調査した。その結果、温度の低下にともなう混合分散状態からの相分離挙動を推定できることが判明した。b)金属イオンをコアとする錯体の配位構造が有機溶媒中での会合・分散挙動に及ぼす効果を調査するために、金属イオンへの配位能をもつピリジン、あるいはビピリジンを頭部にもつL-グルタミン酸を基本骨格とするトリアミド型両親媒性化合物の分子設計ならびに合成を行った。生体膜類似の二分子膜特性を非水溶媒中で再現し、二分子膜の機能を拡張することを目的として下記のような検討を行った。i)光学活性を有し、かつ水素結合によって分子集合安定化が得られうる人工脂質として、L-グルタミン酸を基本骨格とするトリアミド型両親媒性化合物を分子設計ならびに合成を行った。iii)ゲル化のメカニズムを調査するため、下記のような分析を行った。走査電子顕微境観察:110mMのベンゼンゲルを凍結乾燥したものについて調査すると、繊維状の会合体が絡み合ってネットワークが形成されていることが判明した。透過型電子顕微鏡観察:0.010.1mMのような希薄溶液ではゲル化は観察されないが、そのキャスト膜について観察すると、やはり繊維状の会合体が多数生成していることが確認された。吸収スペクトル:指示薬としてシアニン系色素を混合し、その可視スペクトルを調査したところ、溶媒の種類によって異るが、ある濃度以上の脂質濃度で吸光係数が著しく減少することが認められた。

透過型電子顕微鏡硯察により、ゲル化はしないが、脂質の会合が認められる濃度領域が存在することを確認した。すなわち、濃度の増加によりまず脂質の会合が始まり、続いて会合体の成長、会合体数の増加を経て、ゲルを形成するような会合体ネットワークを形成するものと結論した。生体膜類似の二分子膜特性を非水溶媒中で再現し、二分子膜の機能を拡張することを目的としてつぎのような検討を行った。i)光学活性を有し、かつ水素結合によって分子集合安定化が得られる人工脂質として、L-グルタミン酸を基本骨格とするトリアミド型両親媒性化合物の分子設計ならびに合成を行った。ii)上記脂質の分散挙動をメタノール、エタノール、クロロホルム、テトラヒドロフラン、ベンゼン、トルエン、シクロヘキサン中で調査し、ほとんどの溶媒でゲル化が起こることが確認された。iii)ゲル化の機構を調査するため、走査電子顕微鏡観察あるいは透過電子顕微鏡観察を行い、繊維状の会合体が絡み合ってネットワークが形成されていること、希薄溶液ではゲル化は観察されないが、そのキャスト膜について観察すると、やはり繊維状の会合体が多数生成していることが確認された。また、指示薬としてシアニン系色素を混合し、その可視スペクトルを調査したところ、溶媒の種類によって異なるが、ある濃度以上の脂質濃度で吸光係数が著しく減少することが認められた。透過型電子顕微鏡観察により、ゲル化はしないが、脂質の会合が認められている濃度領域が存在することを確認した。すなわち、濃度の増加によりまず脂質の会合が始まり、続いて会合体の成長、会合の増加を経て。ゲルを形成するような会合体ネットワークを形成するものと結論した。ここまでの段階で得られた知見をもとに、つぎのような展開を行った。a)脂質頭部にピレニル基あるいはジメチルアニリノ基をもつL-グルタミン酸を基本骨格とするトリアミド型両親媒性化合物を合成し、エキシマー生成やエキシプレックス生成などのケイ光特性の調査を通じてベンゼン、シクロヘキサンあるいはシクロヘキサン/エタノール等の有機溶媒中での会合・分散挙動を調査した。その結果、温度の低下にともなう混合分散状態からの相分離挙動を推定できることが判明した。b)金属イオンをコアとする錯体の配位構造が有機溶媒中での会合・分散挙動に及ぼす効果を調査するために、金属イオンへの配位能をもつピリジン、あるいはビピリジンを頭部にもつL-グルタミン酸を基本骨格とするトリアミド型両親媒性化合物の分子設計ならびに合成を行った。
新しい幾何学的フラストレーション系物質-水酸塩化物における新奇量子磁性の解明

本研究は新しい幾何学的フラストレーション系物質-水酸塩化物における磁気秩序とスピン揺らぎの共存を発見し、新しいd電子系パイロクロア構造の新物質シリーズ-水酸塩化物M_2OH)_3X(M:Cu,Ni,Co,Fe,Mn等の磁性イオン、X:Cl,Br,Iのハロゲンイオン)の存在、及びこれらに広く存在するバラエティに富んだ特異的な量子磁性を明らかにした。本研究は新しい幾何学的フラストレーション系物質-水酸塩化物を系統的に調べ、新奇磁気相転移の解明と共に、磁気イオンの違い及び元素置換、高圧、外場などのスピン制御によって秩序とスピン揺らぎの共存がどのように変化するか、また反強磁性と強磁性を決定するファクターが何であるかを究明し、この新しい幾何学的フラストレーション系水酸塩化物における新規量子磁性を解明することは目的である。初年度の19年度は(1) Cu_2(OH)_3Cl単の結晶育成と磁気構造の決定(2) Co_2(OH)_3ClとCo_2(OH)_3Brの磁気構造の決定要素の究明(3)強磁場、高圧下によるスピン制御の効果(4)元素置換等によるスピン制御の効果(5) M_2(OH)_3X系の物質合成・単結晶成長と磁気構造とスピンダイナシックスの解明を目標に研究を進めた結果、(1)を除いた各項目において平均当初目標の70-80%程度の達成度を果たした。これらの成果は6編の国際誌学術論文と13件の学会発表にて公表した。本研究は新しい幾何学的フラストレーション系物質-水酸塩化物を系統的に調べ、新奇磁気相転移の解明と共に、磁気イオンの違い及び元素置換、外場などのスピン制御によって秩序とスピン揺らぎの共存がどのように変化するか、また反強磁性と強磁性を決定するファクターが何であるかを究明した。20年度は(3)強磁場下によるスピン制御の効果(4)元素置換等によるスピン制御の効果(5)M_2(OH)_3Xの物質合成・単結晶成長と磁気構造とスピンダイナミックスの解明を目標に研究を進めた結果、(1)を除いた各項目において平均当初目標の70-80%程度の達成度を果たした。これらの成果は6編の国際誌学術論立と26件の学会発表にて公表した。21年度は(3)強磁場下によるスピン制御の効果(4)元素置換等によるスピン制御の効果(5)M_2(OH)_3Xの物質合成・単結晶成長と磁気構造とスピンダイナミックスの解明を目標に研究を進めた結果、各項目において平均当初目標の70-80%程度の達成度を果たした。これらの成果は2編の国際誌学術論文と17件の学会発表に反映されている。
大脳皮質の機能的再構築を制御する神経ネットワーク

ある感覚器が事故や病気などにより障害を受けた時、残存している感覚器系(特に大脳皮質)において神経回路の再構築が起こることによりその能力の向上などがみられる。一つの感覚を失った動物の脳内では、残存している感覚の機能を向上させるシグナルを送りだす脳領域が存在し、その脳領域により形成される神経ネットワークが存在すると考えられる。しかしながら、脳内のどの領域がこのような現象をコントロールしているかは未だ明らかではない。本研究では感覚器損傷後の大脳皮質の機能的再構築による機能向上を制御する責任脳領域を同定し、その領域により形成される神経ネットワークの活動を制御することを目的とした。本実験では、視覚機能を剥奪した動物を用い、神経活動依存的に発現が誘導されるc-Fos等の早期発現遺伝子(IEG)を免疫組織化学的に検出し、脳内の各領域におけるIEG陽性細胞数を視覚剥奪ラットと正常ラットで比較することにより感覚器損傷後に活動が変化する脳領域を同定することを試みた。バレル皮質に投射する背側縫線核のc-Fos陽性細胞数を正常ラットと視覚剥奪ラットにおいて比較したところ、視覚剥奪ラットにおいてc-Fos陽性細胞数の有意な増加がみられた。また、視覚野に投射する背側縫線核の領域についてはc-Fos陽性細胞数の有意な差はみられなかった。さらに視覚剥奪後の早い段階(12時間)で内側前視索核においてc-Fos陽性細胞数の有意な増加がみられた。26年度が最終年度であるため、記入しない。一つの感覚を失った動物の脳内では、残存している感覚の機能を向上させるシグナルを送りだす脳領域が存在し、その脳領域により形成される脳内神経ネットワークが存在すると考えられる。本実験では、視覚機能を剥奪した動物を用い、神経活動依存的に発現が誘導されるc-Fos等の早期発現遺伝子(Immediate early gene : IEG)を免疫組織化学的に検出し、脳内の各領域におけるIEG陽性細胞数を視覚剥奪ラットと正常ラットで比較することにより感覚器損傷後に活動が変化する脳領域を同定することを試みた。c-Fos陽性細胞数が正常ラットに対して視覚剥奪ラットの方が多く存在する領域を検討したところ、内側前視索核(MnPO)と背側縫線核(DRN)においてc-Fos陽性細胞数の有意な増加がみられた。このことから内側前視索核と背側縫線核が感覚機能代償を制御する神経ネットワークにおいて重要な役割を果たす脳領域であることが示唆された。本課題の当初の予定として、初年度は「早期発現遺伝子を用いた脳内神経活動マッピング」により責任領域を同定することであり、現在の成果としてその候補となる領域を同定しているため、本研究は概ね進展している。平成26年度は前年度の成果により同定した責任脳領域の機能阻害実験を行い、大脳皮質の機能的再構築における役割を明らかにすることを目的とする。視覚剥奪後に活性化する脳領域の神経毒による破壊による機能評価を行い、さらにはAllatostatin receptor systemもしくはハロロドプシン等の光遺伝学的手法を用い一過性の可逆的活性阻害により、視覚剥奪後に活性化する脳領域の時空間的操作による機能評価を行う。
アセチルCoA合成酵素遺伝子欠損マウスの肥満抵抗性の分子基盤の解析

アセチル-CoA合成酵素(AceCS)は酢酸とCoAから、アセチル-CoAを合成する。AceCS2は骨格筋・心筋に主に発現し、絶食やI型糖尿病など、血中のグルコースが低下するとき、もしくはI型糖尿病などブドウ糖の利用が傷害されケトン体合成・利用が重要となるときに顕著に発現が上昇するが、個体レベルでの役割は不明である。そこで我々はアセチル-CoA合成酵素(II型)(AceCS2)遺伝子の欠損マウスの作成によってこの酵素の個体における役割を解析した。AceCS2はケトン体である3-hydroxy-butyric acidやacetoacetateを基質とすることが予測されたが、これらの血中レベルは量群間で差は認められず、in vivoのRIのラベル体を腹腔内投与したクリアランス実験では、その後TCAサイクルでの代謝産物である^<14>CO_2の量にも差は認められなかった。しかしながら、AceCS2の最も強い基質であるアセテートは血中から代謝されず、呼気中へCO_2の代謝産物もほとんど検出されなかった。ガスクロマトフィーによる解析では、血中のアセテート濃度はAceCS2-/-マウスで6倍程度の増加が見られた。以上より、アセテートは、低血糖、糖尿病などのケトジェニックな状態で生産され、ケトン体や長鎖脂肪酸同様エネルギー源として必須なものであることが示された。そしてケトジェニックな状態で転写が上昇するAceCS2はこれらの代謝に必須であることが示された。KLF15はアミノ酸を分解する酵素群の転写制御を担い、絶食などでおこる低血糖時にグルコースを新生する重要な役割を担う転写因子であるが、これに加え、KLF15の標的遺伝子としてのAceCS2は絶食などグルコースを利用できないときに、アセテートをエネルギー源、あるいは糖新生に寄与する重要な役割を担うことが示唆された。アセチル-CoA合成酵素(II型)(AceCS2)遺伝子の欠損マウスの作成によってこの酵素の個体における役割を解析した。AceCS2は主に骨格筋に発現し、絶食やI型糖尿病、授乳期などのケトン体の利用が重要となるときに発現が上昇する。欠損マウスでは、授乳期に成長障害が生じ、この時期を越すと通常の成長に戻る。このマウスはレプチン欠損のob/obマウスとの掛け合わせでも同様に授乳期の成長障害が起こることから、レプチンシグナルとは独立した要素によるものと判明した。さらに、成長ホルモンやインスリン様成長ホルモン値には野生型マウスと比べ同様の値を示し、体重あたりの摂食量、摂食関連ホルモンには無関係であった。授乳後のAceCS2欠損マウスの解析では、通常食では授乳後1ヶ月程度で体重が野生型に追いつく。しかし、低糖高脂肪食では体重の増加の減少が見られた。以上から、このマウスの代謝障害の本態はケトン体の利用障害が予測され、授乳直後に低糖高脂肪食を与えると約50%のマウスが死亡した。生き残ったマウスも顕著な体重増加の低下が認められた。成熟マウスの解析では、絶食時には体温の低下が有意に起こり、トレッドミルの持久運動実験では持久力の低下が見られた。さらに、ケトン体利用が著しいI型糖尿病のモデル動物であるストレプトゾトシン投与では野生型と比較し明らかな生存曲線の低下が認められた。以上より、AceCS2はケトン体である3-hydroxy-butyricacidやacetoacetateを基質とすることが予測され、in vitroの実験では、AceCS2はacetoacetateを基質(Km値;1mM)とし、酢酸と比較し35%程度の基質特異性が認められた。絶食や1型糖尿病のケトジェニックな状態ではケトン体が2-4mMまで上昇することから、基質として十分可能なKm値と考えられた。以上より、AceCS2はケトジェニックな状態で転写が上昇し、ケトン体を基質とする酵素であること、そして、ケトン体をエネルギーとして有効利用が必要なI型糖尿病などのときに必須な酵素であることを提示するものであった。