hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アクアポリン4の黄斑浮腫への関与と、その制御による治療

また、TGN-020を週1回の頻度で腹腔内投与した場合についても検討している。糖尿病黄斑浮腫は抗VEGF療法が有効であるが反復投与が必要で網膜浮腫にVEGF以外の関与が予想される。水チャンネルのアクアポリン(AQP)4は網膜ミュラー細胞に発現する。そこでミュラー細胞の容積変化にVEGFとAQP4が関与するか検討した。糖尿病ラット網膜においてVEGFの発現は網膜内層に強くAQP4も増強した。AQP4の発現はGFAPと共染色した。VEGFの蛋白レベルは糖尿病ラットで有意に増加した。また、VEGFに暴露したミュラー細胞の細胞容積は増大し、TGN-020により抑制された。網膜におけるAQP4の制御が糖尿病黄斑浮腫治療の一助となる可能性がある。今後は、網膜ミュラー細胞だけでなく、網膜血管内皮細胞についても検討し、また、アクアポリン4の一酸化窒素を介した網膜血流への影響については、レーザースペックル法で実際に血流測定を試みる予定である。また、今回実験と文献検索を進めてきて、酸化ストレスがHIF-1の発現を介してVEGFやアクアポリン4の発現を誘導することがわかっているので、網膜における酸化ストレスの関与についても実験も計画し、アクアポリン4の網膜浮腫への関与についてさらに検討したいと思う。今後は網膜の血管の細胞についても同様の実験系で検討し、またvivo実験ではレーザースペックル法を用いてラットの網脈絡膜や視神経乳頭血流への影響について検討したいと思う。眼科次年度では、次のステップとして、アクアポリン4の網膜血流への影響をvivoで調べるため、レーザースペックル装置のラット用測定用補助具が必要となりその補助具や培養細胞を購入予定で次年度使用額が必要であるため。次の実験系として、アクアポリン4の眼循環に与える影響を検討するため、網膜血管の培養細胞の購入や培養に必要な薬剤、物品の追加購入、またレーザースペックルの機器が不調にて装備費が必要のため。今までの実験データの再現性を確認し、アクアポリン4の網膜血流への影響をvivoで検討する。また、vitro実験としては、網膜ミュラー細胞だけでなく、網膜血管細胞も用いて今年度と同様FACS解析も行う。アクアポリン4の眼循環に与える影響を検討するため、レーザースペックル装置を完備してvivo実験を行う。また、網膜血管細胞についても前回同様FACS解析やウエスタンブロット解析等を行う予定である。
発癌モデルマウスを用いたＡＩＤによる炎症性発癌メカニズムの解明

IL-10-/-マウスの大腸粘膜上皮細胞におけるAID発現の役割について検討するために、AIDを欠損させたAID-/-マウスとIL-10-/-マウスを交配し、ダブルノックアウトマウス(IL-10-/-AID-/-マウス)を作成した。IL-10-/-AID-/-マウスにおける腸炎像及び大腸組織における各種のサイトカイン産生量はIL-10-AID+/+マウスとほぼ同等であり、AIDはIL-10-/-マウスの腸炎の発生や持続、炎症性サイトカイン産生には影響を及ぼさないものと考えられた。続いて、IL-10-/-マウスの大腸上皮粘膜細胞で発現するAIDによって遺伝子変異が導入されるのかを明らかにするために、IL-10-/-AID+/+マウスとIL-10-/-AID-/-マウスの大腸上皮における遺伝子変異生成頻度について比較検討した。Colitis-associated cancer(CAC)の発生に関連すると考えられている遺伝子のうち、Apc,Ctnnb1,Krasの各遺伝子の変異生成頻度には明らかな差を認めなかったが、興味深いことにIL-10-/-AID+/+マウスの大腸上皮におけるp53遺伝子には2.17bases/104と高率に変異がみられたのに対し、IL-10-/-AID-/-マウスでは0.71bases/104と有意に変異頻度が低下していた。ヒトのCAC発生過程では、早期にp53遺伝子に高率に変異が生成され、その後の段階でAPC,KRAS遺伝子に異常が生じることが報告されている。今回の解析結果は従来のヒトの報告と一致しており、AIDがp53遺伝子に変異を導入することでCACの発生に関与する可能性が示唆された。さらに、生後約50週齢のIL-10-/-AID+/+マウスおよびIL-10-/-AID-/-マウスにおける大腸癌の発生頻度について比較検討したところ、IL-10-/-AID+/+マウスでは22匹中6匹で盲腸に浸潤性の大腸癌が認められたのに対し、IL-10-/-AID-/-マウスの盲腸には癌の発生を認めなかった。この結果より、慢性的な炎症刺激によってAIDが発現することが大腸発癌過程において重要である可能性が示唆された。今回我々は、AIDを欠損させることにより、慢性炎症からの腸発癌がp53遺伝子変異生成頻度の低下を伴って抑制されることを動物モデルを用いて初めて明らかにした。今後、AIDによる遺伝子変異生成機序がさらに解明され、AIDをターゲットとした分子標的治療が臨床の現場にも応用されることが強く期待される。平成23年度の研究計画に掲げた、IL-10-/-AID-/-マウスの大腸粘膜の評価、遺伝子変異の評価、腫瘍発生頻度の評価はいずれもほぼ計画通りに達成されており、おおむね順調に進展していると考えられる。上記研究内容は現在投稿中であり、必要に応じて掲載に必要な追加実験を行う予定である。本研究課題の内容については大きな変更点はない。20週齢以降のIL-10-/-マウスの大腸について病理組織学的に検討したところ、野生型マウスに比較し、強い炎症性変化を認めた。この慢性炎症は特に盲腸において顕著な傾向にあった。また、各種炎症性サイトカインの発現について定量RT-PCRにて検討したところ、TNF-alpha, IL-1beta, IL-6などの各種炎症性サイトカインや、IL-12, IFN-gammaなどのTh1サイトカインの発現上昇を認めた。また、IL-10-/-マウスの大腸におけるAIDの発現について検討したところ、定量RT-PCRにて、IL-10-/-マウスの大腸では野生型マウスに比較し、有意なAID発現の上昇が認められた。さらに、AID特異的なプローブを用いたin situ hybridizationにより、上皮細胞に異所性にAIDが発現していることが分かった。以上の結果より、IL-10-/-マウス大腸では、慢性的な炎症刺激に伴いAIDが上皮細胞に異所性に発現している可能性が示唆された。肝細胞や胃粘膜上皮細胞では、AIDはNF-kappaB依存性に発現していることを以前我々は明らかにしている。IL-10-/-マウスの大腸上皮におけるAIDの発現メカニズムを調べるため、約40週齢のIL-10-/-マウスに対しTNF-alpha receptor抗体の投与実験を行った。その結果、TNF-alphaをはじめとする各種炎症性サイトカインの発現は減少し、大腸上皮におけるNF-kappaB活性は低下した。さらに、TNF-alpha receptor抗体を投与したマウスでは、大腸上皮におけるAIDの発現量の有意な減少も認められた。以上の結果は、IL-10-/-マウスにおける慢性腸炎に伴うAID発現が、TNF-alphaなどの刺激によるNF-kappaB活性化経路に依存している可能性を示唆している。IL-10-/-AID-/-マウスにおける腸炎像及び大腸組織における各種のサイトカイン産生量はIL-10-AID+/+

マウスとほぼ同等であり、AIDはIL-10-/-マウスの腸炎の発生や持続、炎症性サイトカイン産生には影響を及ぼさないものと考えられた。続いて、IL-10-/-マウスの大腸上皮粘膜細胞で発現するAIDによって遺伝子変異が導入されるのかを明らかにするために、IL-10-/-AID+/+マウスとIL-10-/-AID-/-マウスの大腸上皮における遺伝子変異生成頻度について比較検討した。Colitis-associated cancer(CAC)の発生に関連すると考えられている遺伝子のうち、Apc,Ctnnb1,Krasの各遺伝子の変異生成頻度には明らかな差を認めなかったが、興味深いことにIL-10-/-AID+/+マウスの大腸上皮におけるp53遺伝子には2.17bases/104と高率に変異がみられたのに対し、IL-10-/-AID-/-マウスでは0.71bases/104と有意に変異頻度が低下していた。ヒトのCAC発生過程では、早期にp53遺伝子に高率に変異が生成され、その後の段階でAPC,KRAS遺伝子に異常が生じることが報告されている。今回の解析結果は従来のヒトの報告と一致しており、AIDがp53遺伝子に変異を導入することでCACの発生に関与する可能性が示唆された。さらに、生後約50週齢のIL-10-/-AID+/+マウスおよびIL-10-/-AID-/-マウスにおける大腸癌の発生頻度について比較検討したところ、IL-10-/-AID+/+マウスでは22匹中6匹で盲腸に浸潤性の大腸癌が認められたのに対し、IL-10-/-AID-/-マウスの盲腸には癌の発生を認めなかった。この結果より、慢性的な炎症刺激によってAIDが発現することが大腸発癌過程において重要である可能性が示唆された。今回我々は、AIDを欠損させることにより、慢性炎症からの腸発癌がp53遺伝子変異生成頻度の低下を伴って抑制されることを動物モデルを用いて初めて明らかにした。今後、AIDによる遺伝子変異生成機序がさらに解明され、AIDをターゲットとした分子標的治療が臨床の現場にも応用されることが強く期待される。平成23年度の研究計画に掲げた、IL-10-/-AID-/-マウスの大腸粘膜の評価、遺伝子変異の評価、腫瘍発生頻度の評価はいずれもほぼ計画通りに達成されており、おおむね順調に進展していると考えられる。上記研究内容は現在投稿中であり、必要に応じて掲載に必要な追加実験を行う予定である。本研究課題の内容については大きな変更点はない。
尿路上皮癌のheparanaseを介した癌進展メカニズムの解析と新規治療への応用

ヘパラン硫酸プロテオグリカン(syndecan-1)の活性化酵素であるheparanaseに着目し、その機能を分子生物学的に解析した。Heparanaseの抑制により、細胞の増殖能は約40%程度抑制され、またアポトーシスを誘導した。阻害剤の使用で濃に細胞活性は低下し、浸潤能も抑制された。Heparanaseの阻害により、autophagyは抑制する効果も認めた。Heparanaseは尿路上皮癌において、アポトーシスの抑制し、浸潤能やautophagyを促進する作用がある。Heparanaseを抑制することで癌の増殖、進展を抑制できることが示唆された。syndecan-1の活性化酵素であるheparanaseに着目し、その機能を血管新生やサイトカインといった観点から分子生物学的に解析するとともに、臨床病理学的検討も加え、heparanaseを標的とした尿路系腫瘍における分子標的治療の確立を目的とし、研究を開始した。尿路上皮癌における、heparanaseの機能につき検討を行った。尿路上皮癌において、正常尿路上皮細胞と比較して、heparanaseの発現は高く、heparanaseの発現を抑制することで、細胞の増殖能が低下することが示された。細胞実験でheparanaseをノックダウンすることにより、細胞増殖能が低下、アポトーシスの亢進、遊走能、浸潤能の抑制効果を認めた。また、阻害剤の投与によっても同様の知見が得られた。次に、BBNを用いた膀胱癌発生モデルマウスによる、heparanase阻害剤の膀胱内投与実験でも、コントロールに対し腫瘍の進展の抑制、細胞増殖能の抑制効果、アポトーシスの亢進、血管新生の抑制、上皮間葉転換(Epithelial-Mesenchymal Transition /or Transformation, EMT)の抑制効果を確認できた。さらに同様の動物実験において、BCG膀胱内注入療法との併用により、更なる抗腫瘍効果を見出すことができた。とくに筋層浸潤の抑制効果が強くみられ、癌の浸潤能に対する抑制効果として今後、期待ができる。細胞実験、動物実験をとおして、仮説として打ち立てたheparanaseの機能につき、仮説通りの実験結果を得られた。また、その更なるメカニズムについて今後検討の余地がある。RK-684の使用で濃度依存的に細胞活性は低下し、浸潤能も約40%抑制された。またHeparanaseの阻害により、autophagyは抑制する効果も認めた。尿路上皮癌におけるheparanaseの機能として、アポトーシスの抑制効果、血管新生の促進効果、Autophagyの抑制効果が見受けられたが、そのpathwayについての検討を行っているところで、今後、どういったメカニズムで現象が起こっているのかを検討する余地がある。尿路上皮癌
気液2相流体の電気流体力学現象の定量観測と現象論的解析

本研究は,電気流体力学分野で重要な流れ場の解析を対象に、粒子画像流速測定法の適用技術を応用して気液2相流体の電気流体力学流場を計測すると同時に,その電気流体力学効果の現象論的解析方法を具体化することを研究の目的として実施した。本年度は,流体内部の誘電的性質および電気伝導特性を定量化して電気流体力学に関する無次元化解析方法を具体化し,特に気液2相流体流れ場の電気流体力学効果を誘電性効力および電気伝導性効力から定量化を行うことができた。以下に本年度の研究実施内容と成果について記述する。1.気液2相流体流場における誘電特性と電気伝導特性の解析電気流体力学現象は流体内部の誘電的特性と放電による電気伝導特性の単独作用あるいは複合作用が支配的な要素である。本研究では気相および液相における誘電的特性および電気伝導特性を測定した。具体的には,気相微弱放電が本現象のきっかけとなっていることから,これに伴う各相流体内部の誘電性効力を定量的に算出すると同時に,電気伝導に伴う荷電粒子に働く電気伝導性効力を算出した。2.気液2相流体流場における電気流体力学効果の現象論的解析本研究では、誘電性効力および電気伝導性効力と電気流体力学的誘因による流れ場の関係について実験結果に基づいた解析を実施した。具体的には,電気流体力学効果に及ぼす誘電性効力項を無次元化したDielectric Electric Rayleigh Numberと電気伝導性効力項を無次元化したConductive Electric Rayleigh Numberに重点を置いて本現象を解析した。そして,これらの諸量と流れ場の諸量との関係について整理し,本現象の物理的ファクターを定量化した。その結果、新たな気液2相流のEHD無次元化パラメータを見出して、気液2相流体の電気流体力学効果の解析方法および理論的取り扱いについて具体化した。本研究は,電気流体力学分野で重要な流れ場の解析を対象に,その流速ベクトル分布を定量化するために粒子画像流速測定法(Particle Image Velocimetry : PIV)の適用技術を応用して,気液2相流体の電気流体力学流場を計測すると同時に,その電気流体力学効果の現象論的解析方法を具体化することを研究の目的として実施した。すなわち,まずPIVによって気液2相流体の電気流体力学効果を具体化する極めて重要な第一歩になる解析結果が得られた。以下に本年度の研究実施内容と成果について整理して記述する。1.粒子画像流速測定法の適用本研究では工学的に重要な非定常流れ場の計測を含めて現象論的に解析を行いたいので,PIVによる流速ベクトル分布の計測を実施した。本現象における2次元流れの計測には,この画像相関による粒子画像流速測定法を適用させた。また,本研究では主に2次元流れ場の解析を実施するが,流れの3次元性への遷移についても無次元化解析を進めたいので、遺伝的アルゴリズムによる時間的複数画像間のトレーサ粒子,あるいは空間的複数画像間のトレーサ粒子軌跡を個々に対応付けることにより流速測定を行う手法を適用した。その結果、PIV手法の適用により電気流体力学現象に基づいた流れ場の速度分布を定量化することができた。2.気液2相流体流場のPIV計測と解析本研究では,まず、気液2相流体の電気流体力学流場の定量的な計測を実現するために,この気液2相流場の流れの可視化観測システムを構築した。次に,上記のPIVによる電気流体力学流場の流速分布計測の結果に基づいて,数値的解析から流れ関数と圧力分布を算出し、さらにエネルギー密度分布等を算出することにより本現象の流体力学的効果の特徴を具体化した。その結果、次年度に計画している気液2相流の無次元化パラメータによる解析方法の具体化な知見を得た。
神経性食思不振症に対するオキシトシンの効果－ＮＩＲＳによる検討－

我々は、神経性食思不振症(AN)では、背景に自閉症スペクトラム障害を有している患者が存在するという仮説の元に、社会的機能を反映すると考えられる対人場面での会話課題および様々な精神疾患で検討が行われている語流暢性課題中の脳活動を、NIRSを用いてその特徴を調べた。ANでは、健常者と比較して会話中の脳活動はほぼ維持されているが、語流暢性課題中の脳活動は一部に双極性障害のパターン(賦活ピークの遅延)を示す症例が存在することが明らかになった。またANでは体重減少時にはうつ病パターン(賦活ピークの減少)を示し、体重増加時には健常者のパターンを示す症例が存在することが明らかになった。本年度は、神経性食思不振症患者について、平成24年度に確立した「対人場面での会話課題によるNIRS検査法」を用いて、前頭葉、側頭葉を中心として脳機能計測を実施し、その有効性を確認することを目的とした。また以前に統合失調症、大うつ病性障害、双極性障害で取得してある語流暢性課題施行中のNIRSデータとも比較するため、語流暢性課題も同時に測定を行うこととした。また平成24年度に開発したデータ管理用ソフトウェア「NIRSデータ管理」でのデータ管理を開始し、その有効性について確認した。また測定結果を被験者にフィードバックするレポーティングシステムも追加機能として開発することとした。神経性食思不振症2例を対象をし、昨年度開発した「対人場面での会話課題によるNIRS検査」を行い、予備的検討を行った。測定を行った2例とも、会話中前頭領域、側頭領域ともに大きな賦活が認められ、その大きな賦活は会話中ほぼ維持されることが分かった。一方で前頭極領域では、基本となる大きな賦活に、発話相/聴取相の変化に応じた小波が重畳するという波形パターンを示した。これらの結果は、以前に行った健常者における検討のパターンと似た波形であり、神経性食思不振症を対象とした場合も実際の対人場面における会話課題による評価の有効性を示す事が出来た。また測定したデータのデータ管理用ソフトウェア「NIRSデータ管理」への登録を開始したが、登録、検索作業ともに大きな問題なく行うことが出来た。またレポーティングシステムについても開発し稼働することが出来たが、課題ごとに血流賦活の程度が異なり、表示パラメーターを工夫する必要があることが明らかになった。本年度は、「対人場面での会話課題によるNIRS検査法の確立」を目的とし、行動評価およびデータ管理についての検討、開発を行った。現在までの検討の中で、まだ不十分である会話中の行動評価についての客観的な手法を取り入れることを検討した。従来の会話課題施行中のビデオカメラの測定に加えて、試行可能な客観的な行動指標について様々な検討を行った。病態生理学的な側面から特に自閉傾向に関連の深い「視線制御」について、近年開発されている視線検出装置を用いて行うこととした。視線制御の定量化については、tobii社製のアイトラッカーをNIRS装置と同時に用いて行うこととしその使用方法について、技術講習を受け、測定法および解析法について習熟した。またアイトラッカーを使用した状態での会話課題施行中のNIRS測定の可能性について検討を行った。このことにより、自然な状態の会話における脳血流計測と観察可能な行動の同時定量評価の可能性について検討した。また得られたデータの解析方法について購入したパーソナルコンピューターにデータベースを構築するため、データ管理用のソフトウェア「NIRSデータ管理」をvisual studioにより開発した。開発したソフトウェアにより、多数のNIRSデータと様々な被験者情報のデータベースを構築できる環境を作成した。このことにより、対象患者の症状評価、行動評価の管理が合理化され、人為的なデータ管理ミスの起きにくい環境が構築できた。本年度は、神経性食思不振症患者について、平成25年度の検討を踏まえて、以前に検討を行った統合失調症、大うつ病性障害、双極性障害で取得してある語流暢性課題施行中のNIRSデータとの比較を行うため、会話課題と同時に測定した語流暢性課題中のNIRS波形について検討を行った。神経性食思不振症患者5例を対象とし、うち一例については体重減少時(BMI=16.4)と体重増加時(BMI=32.9)の比較を行った。1回測定を行った4例のうち1例は健常者に近いパターンを示し、2例は双極性障害のパターンに似ていた。1例はアーチファクトの混入が多く、判定が困難であった。2回測定を行った症例は、体重減少時はうつ病の波形に似ており、体重増加時は健常者のパターンに近くなった。これらのことから、神経性食思不振症患者には双極性障害の波形パターンを有するものが比較的存在すること、体重変化とともに波形パターンが変化し、体重減少時にはうつ病パターンを示す症例が存在することが明らかになった。

一方で会話課題中のNIRS活動は、全般的に側頭部、前頭部とも賦活が大きく、発話相/聴取相の変化に応じた小波も観察され、健常者と同様のパターンを示した。これらのことから神経性食思不振症では、健常者と比較して会話中の脳活動はほぼ維持されているが、語流暢性課題中の脳活動は一部に双極性障害のパターンを示す症例が存在することが明らかになった。我々のグループは、会話課題中の脳活動は、健常者と比較して、統合失調症、大うつ病性障害、双極性障害それぞれに特徴的な変化を示すことを報告しており、語流暢性課題と会話課題の比較をする事が、精神疾患のより正確な診断へ寄与する可能性を示した。精神医学平成24年度に確立した「対人場面での会話課題によるNIRS検査法」を用いて神経性食思不振症を対象に実際に試行し、予備的検討を行えており、またその評価の有効性についても確認したため。また平成24年度に開発したデータ管理用ソフトウェア「NIRSデータ管理」の稼働も開始しており、順調に稼働していることが確認されたため。会話課題中の客観的な行動指標の選定および使用、評価については確立しており、おおむね順調に推移している。平成25年度に確認したNIRS検査法を用いて、前頭葉、側頭葉を中心として脳機能計測を実施する。また以前のデータと比較するため、語流暢性課題も同時に測定を行う。対象は引き続き神経性食思不振症(AN)、健常者とし、得られたNIRSデータについて、群間比較、行動結果(測定に用いる言語流暢性検査の課題遂行成績などの会話の行動成績)、臨床症状(ANの程度EAT-26、自閉性の程度AQ、体重Body Mass Index)、機能レベル(機能の全体的評定尺度GAF)や服用している向精神薬との関連を検討する。またデータベースの機能を拡張し、より最適化された検索、登録、レポーティングシステムの開発を続ける予定である。精神疾患患者について、平成24年度に確立したNIRS検査法を用いて、前頭葉、側頭葉を中心として脳機能計測を実施する。対象は神経性食思不振症(AN)40名、健常者40名とし、測定は同一被検者に対し2回行い、オキシトシンおよび偽薬を投与する無作為化二重盲検クロスオーバー試験を行う。初回測定と2回目の測定間隔は7日間とする。オキシトシンはアスペルガー障害(AD)の研究で用いられている点鼻スプレー式(Novartis)による鼻腔内投与を行う。得られたNIRSデータについて、行動結果(測定に用いる言語流暢性検査の課題遂行成績、視線方向などの会話の行動成績)、臨床症状(ANの程度EAT-26、自閉性の程度AQ、体重Body Mass Index)、機能レベル(機能の全体的評定尺度GAF)や服用している向精神薬との関連を検討する。該当なし
マウス異質性ミトコンドリアゲノムの遺伝原理モデル構築と制御技術の開発

哺乳類において2種類以上のミトコンドリアDNA(mtDNA)分子種が細胞内に存在する異質性の状態が、子孫へ伝達するときの遺伝様式を解明するために、マウスを用いた遺伝モデル構築を行った。また異質性mtDNAについて、その割合を測定するための方法を詳細に検討することによって、従来の問題点を克服した条件下での測定が可能となるように測定方法の改善を実施した。さらに異質性mtDNA遺伝に影響を及ぼす可能性のある因子として、mtDNAに結合しその機能維持に必要な遺伝子について、ゲノム編集の技術を用いてノックアウトマウスの作製を実施した。本申請課題では、異質性(ヘテロプラズミー)の状態にあるミトコンドリアDNA(mtDNA)分子種が、子孫へどのように伝達していくのか、その遺伝モデルを構築することを、また異質性mtDNA遺伝に影響を与える原因や要素を探索し、どのような生物学的機能により制御されているのか明らかにすることを目的としている。本年度はヘテロプラズミーの状態にある2種類のmtDNA割合の測定法について、近縁の2系統のマウス由来mtDNA割合の測定法を、複数の系統の組み合わせによっても測定が可能となるようにPCR-RFLP法による測定法の検討を行った。また、mtDNAヘテロプラズミーの状態に影響を及ぼす可能性が考えられる遺伝的因子として、mtDNAとタンパクの複合体であるミトコンドリア核様体を形成するタンパクに着目し、そのノックアウト(KO)マウスの作製に取り組んだ。1つの遺伝子を対象としたKOマウスについては作製されており、ホモ接合体の樹立を含めた系統維持や凍結保存を進めている。また、樹立できたラインについてはシークエンス解析を実施し、標的遺伝子に変異が導入されていることが確認された。さらにウエスタンブロット法により、KOマウスの組織において標的としたタンパクが検出されないことが確認された。現在はさらにそのKOマウスの生物学的特徴の解析を行っており、また、これ以外の遺伝子を対象としたKOマウスの作製を進めている。哺乳類における異質性(ヘテロプラズミー)ミトコンドリアDNA(mtDNA)遺伝モデルの解明を目指し、昨年度に引き続き新規ヘテロプラズミー系統の作製に取り組んだ。昨年度とは異なる手法によって供与系統由来ミトコンドリアの導入を行い、すでに構築したPCR-RFLPによる測定方法によって供与・受容系統のmtDNAの割合を測定した結果、これまでよりも比較的高率で導入されている個体を得ることができた。得られたヘテロプラズミー個体と野生型との交雑を行うことで系統樹立を実施中である。系統樹立を行う過程において、得られた子孫におけるヘテロプラズミーの程度について解析を実施し、現在までに2系統のマウス由来mtDNA分子種が様々な割合で子孫へ伝達している様子が観察されている。また、得られた子孫の個体を用いて、細胞や組織レベルにおけるヘテロプラズミーの程度について解析を実施した。細胞レベルの解析においては、単一の体細胞を調製するために初代培養細胞の調製を行い、得られた細胞からの測定を実施しており、現在までに同一個体からの単一細胞群において様々な割合で2系統のマウス由来mtDNA分子種が存在している様子が観察されており、さらに検証を進めている。組織においては、様々な組織におけるヘテロプラズミーの程度について測定を実施し、2系統のマウス由来mtDNAの組合せによってはその存在様式が異なる可能性が現在までに示唆されており、さらに検証を進めている。異質性(ヘテロプラズミー)の状態にある哺乳類ミトコンドリアDNA(mtDNA)の遺伝様式の解明を目指し、遺伝モデルとなるマウス系統および測定系の開発を行い、異質性mtDNAの割合について、細胞や組織、世代間における検討を行った。本年度は、昨年度までに樹立した2系統のマウス由来mtDNA分子種を有するヘテロプラズミー系統を用いて、より正確な測定系を構築するためのさらなる技術的改良を中心に行った。本計画で採用しているPCR-RFLPについて、PCRサイクル数の増加に伴い測定値に影響を与えることが想定されるアーティファクトを抑えるために、標的となるDNA試料濃度等に対応したPCRサイクル数を設定することが可能となる実験系を構築した。本方法の有効性を検証した結果、用いた検出系においてアーティファクトが検出限界以下となるように極力抑えた状態で異質性割合を測定可能となることが現時点までに確認されている。この改良した測定法を用いて、異質性mtDNAの割合を、founder世代の個体の尾について検証したところ、最大で十数パーセント程度の供与系統由来mtDNAの導入が確認された。さらに調べた限りの各組織においても、その割合には差があるものの、異質性mtDNAが検出された。この異質性mtDNAが子孫へ伝達する様子を検証するために、F1世代の個体の尾における測定を行った結果、様々な割合で伝達されている様子が確認された。新規ヘテロプラズミー系統が作製され、細胞や組織、世代間における解析が進んでいる。

実験動物学現在までに樹立されているヘテロプラズミー系統において、さらに細胞や組織、世代間における解析を進める。またすでに樹立されたミトコンドリア核様体を形成するタンパクに関わる遺伝子改変マウスとの交雑を行い、これらの遺伝子がヘテロプラズミー状態に与えうる影響について検証する。ヘテロプラズミー割合の測定法についてさらなる条件検討が必要で、ヘテロプラズミー系統の作製に時間がかかっている。一方で、mtDNAヘテロプラズミー状態を解析するための新規KOマウスの作製は進んでいる。主として効率的に新規マウス系統が作製されたため。ヘテロプラズミー割合を測定するためのPCR-RFLP法と、他手法についても詳細な条件設定のための検討を行うとともに、ヘテロプラズミー系統の開発を行う。また現在も進めている遺伝子改変マウスの開発を引き続き行い、新たな系統を樹立しヘテロプラズミーに対する効果や機能についての解析を行う予定である。主に分子生物学的手法による解析の充実のために、関連する試薬購入等への使用予定とする。マウス系統作製数が予定数よりやや少ないため。主にマウス系統の作製費用として予定する。
腫瘍内投与磁性体をRF誘導加温することで得られる抗腫瘍効果についての実験的研究

兎VXII移植腫瘍にDextran Magnetite(DM)を注入、RF誘導加温し、加温特性と効果を検討した。注入2日目DMは細胞周囲に存在、5日後に消失。注入後加温、DM存在下腫瘍内温は45度に達し5日目CT上DM残存した。鉄染色でDMは細胞質内に存在。兎腫瘍で45度30分の加温が可能で腫瘍の縮小と増大速度の遷延を認めた。結果、DM注入後RF加温で腫瘍細胞内にDMが取り込まれ、再度の誘導加温が可能である。兎にVXH腫瘍を移植して担癌モデルを作成し、腫瘍内にDextran Magnetite(DM)を注入して誘導加温を行い、その加温特性と治療効果について検討した。DMには、市販のMRISPIO用造影剤であるResovistを用いた。まず、兎VX IIにDMを26G針で注入しその腫瘍内での消長をCTスキャンで経過を見た。また、腫瘍を経時的に摘出しBerlin Blue鉄染色を行ってて検索した。その結果、腫瘍内には2日目にはDMの存在が認められた。DMは細胞の周囲に存在した。しかし5日後にはDMの集積は無く、肺、肝、腎にも認められなかった。これはCTスキャンでも確認された。次に、DM注入後直ちにRF加温を行った。最新のRF加温機金沢大学長野研究室第3号機による加温では、DMが存在する腫瘍内温度は5分以内に45度まで加温出来た。DMを注入しない腫瘍においては、同加温機での加温は39度に留まった。加温後5日目でCTスキャンを行うと、腫瘍内にDMの残存が認められた。腫瘍を摘出し組織を鉄染色すると、DMは腫瘍内に取り込まれていることが判った。このことより、今後は腫瘍内にDMを注入した直後に加温すれば、DMは腫瘍細胞内に留まり、再度の加温でも温熱効果が期待できるものと考えられた。次に、VX II腫瘍にDMを注入直後に加温を行った。加温は今のところ1回行っている。腫瘍内温度と近傍の大腿筋の温度、肛門内体温を測定した。結果、CTスキャンで腫瘍内にDMが確認される腫瘍では容易に45度までの加温が可能であった。8匹の兎腫瘍のうち7匹で45度30分の加温が可能であった。腫瘍の大きさを毎日キャリパーで測定した。7匹中3匹で腫瘍の消失を認めた。兎にVXII腫瘍を移植して担癌モデルを作成し、腫瘍内にDextran Magnetite(DM)を注入して誘導加温を行い、その加温特性と治療効果について検討した。DMには、Resovistを用いた。兎VXIIにDMを26G針で注入しその腫瘍内での消長をCTスキャンで経過を見た。また、腫瘍を経時的に摘出し鉄染色を行った。腫瘍内には2日目にもDMが細胞の周囲に存在した。しかし5日後には集積は無く、CTスキャンでも確認された。DM注入後直ちにRF加温を行った。DMが存在する腫瘍内温度は5分以内に45度まで加温出来た。加温後5日目のCTスキャンでは、腫瘍内にDMの残存が認められた。細胞内を詳細に検察すると,DMは細胞質無いに取り込まれており,これは加温しない場合は起こらなかった.このことから,腫瘍内にDMを注入した直後に加温すれば、DMは腫瘍細胞内に留まり、再度の加温でも温熱効果が期待できるものと考えられた。これはまったく新しい知見である。次に、VXII腫瘍にDMを注入直後に加温を行い,5日後に再度加温を行った。結果、第1の加温でCTスキャンで腫瘍内にDMが確認される腫瘍では容易に45度までの加温が可能であった。6匹の兎腫瘍のうち4匹で45度にて30分の加温が可能であった。腫瘍の大きさを毎日キャリパーで測定したところ,4匹中2匹で腫瘍の縮小と増大の遷延を認めた。現在,肝転移モデルを作成中であり,肝腫瘍に対する治療の有用性について実験を行う予定である。腫瘍内には2日目にはDMが細胞周囲に存在したが、5日後にはCT上集積は無いことが確認された。

DM注入後直ちにRF加温を行った。DMが存在する腫瘍内温度は5分以内に45度まで加温出来た。加温後5日目のCTでは、腫瘍内にDMの残存が認められた。腫瘍を摘出し組織を鉄染色すると、DMは腫瘍内に取り込まれていることが判った。細胞内を詳細に検察すると,DMは細胞質内に取り込まれており,これは加温しない場合は起こらなかった。このことから,腫瘍内にDMを注入した直後に加温すれば、DMは腫瘍細胞内に留まり、再度の加温でも温熱効果が期待できるものと考えられた。次に、これを実証するために、VXII腫瘍とその他各種人がん細胞セルライン、大腸癌株2種、胃がん株2種を培養し、DMを添加、加温した場合と加温しなかった場合で細胞質内に取り込まれるDMを観察した。その結果、44°Cに培地を加温することでDMの細胞質内移行が促進されることが顕微鏡下で明らかになった。次に、VXII腫瘍にDMを注入直後に加温を行い,5日後に再度加温を行った。腫瘍内温度と近傍の大腿筋の温度、肛門内体温を測定した。結果、第1の加温でCTスキャンで腫瘍内にDMが確認される腫瘍では容易に45度までの加温が可能であった。6匹の兎腫瘍のうち4匹で45度にて30分の加温が可能であった。4匹中2匹で腫瘍の縮小と増大速度の遷延を認めた。以上の結果により、腫瘍にDMを注入してRF誘導加温を行うことで腫瘍細胞内にDMが取り込まれ、再度の誘導加温が可能である。これは人がん細胞においても効果が期待できると考えられた。
大規模バイローム解析システムの構築および新規同定ウイルスの分子進化解析

本研究はウイルスの多様性を明らかにするために、さまざまな生物・環境からシークエンスされたメタゲノム・トランスクリプトームデータから新規ウイルス配列とその塩基多型の同定し、分子進化解析する。この目的のために、下記のバイローム(大規模ウイルス配列)解析システムを平成31年度の夏までに構築し、東京大学医科学研究所のスーパーコンピュータSHIROKANEで運用を開始する。その後は、共同研究者らのサンプルを始めとして、公共配列データベースを活用し、さまざまなメタゲノム・トランスクリプトームデータのバイローム解析を行う。
クリの花粉発芽調節物質に関する研究

本研究の結果、クリの雌花では、花柱が伸長している間は花粉の発芽はなく、花柱の伸長が停止した後花粉が発芽を開始すること、また、伸長中の花柱の滲出液、抽出液中には顕著に花粉発芽、花粉管伸長を抑制する物質が存在することが確認された。さらに、HPLCによる花柱滲出液、抽出液の分析から、花柱伸長初期濃度が高く、花柱の伸長が停止して花粉発芽が始まるころ濃度が低下する物質が確認され、Retention time(Rt)からこの物質はシキミ酸ではないかと考えられた。また、花柱伸長初期の同物質と同濃度のシキミ酸を添加した培地では花粉の発芽は著しく抑制された。花柱抽出液中のシキミ酸量に換算したその濃度は、花柱1mg当たり花柱突出初期約、8μg、花柱の伸長が終了して柱頭上で花粉が発芽を開始するころ約3μgであった。花柱滲出液中の糖は、花柱伸長初期と花粉発芽開始期ころ濃度が高かった。しかし、胚珠は、花柱が伸長を停止して柱頭上で花粉発芽が始まるころは珠心も未分化で発達初期であった。柱頭上の花粉発芽がピークに達するころようやく胚のう母細胞の減数分裂が始まった。HPLCの分析条件を変えた場合、花柱抽出液のシキミ酸に近い物質のRtは、標準のシキミ酸のRtと多少ずれていた。クムマトグロムの詳細な検討から、柱頭上での花粉発芽期を挟んだ経時変化においてまったく正反対の出現を示す物質が確認された。これらの物質は、ピークは近かったが、花柱上部で花粉管が見られる前と花粉管が確認できなくなるころ出現するものと、花柱上部での花粉管の確認状況とほぼ重なって出現し、花粉管が確認され始めのころ、それに先だって濃度が急上昇するものとであった。これらの物資の出現状況と、胚珠の胚のう発達との間には、明確な関連性は認められなかった。したがって柱頭上での花粉発芽・花粉管伸長は柱頭および花柱自体の生産する花粉発芽調節物質によって調節されるものと考えられた。クリの雌花は6月中旬乳白色をした花柱の束を突出し、開花が始まる。また、雄花もこのころ開花する。しかし、柱頭での花粉発芽は花柱の突出時から伸長停止期まではまったく起こらない。平成9年度はクリ`伊吹'を用いて、どのような物質がこうした花粉発芽・花粉管伸長の調節に関わっているのかを検討した。(1)花柱突出時から経時的に採取した雌花をFAAで固定し、各子房ごとに縦断した花柱をアニリンブルーで染色して蛍光顕微鏡下で花粉管を観察した。その結果、6月下旬7月初旬ころ花柱上部で発芽した花粉管が見られ始め、7月上旬ころ花粉管が認められた花柱の割合はピークに達した。(2)経時的に採取した雌花の花柱水抽出液を花粉発芽培地に添加し、花粉発芽率・花粉管伸長を調べた。その結果、花粉発芽率・花粉管伸長は中心子房、側子房とも花柱突出時に近いほど抑制が顕著になり、また、花柱の伸長が停止し、花柱上部に花粉管が見られるころ抑制はなくなった。(3)この水抽出液のポリフェノール量をホーリンデニス法で定量した。その結果、中心子房、側子房とも花柱突出まもなくのころポリフェノール量は最も多かった。

(4)UV検出器とODSカラムの付いた高速液体クロマトグラフィーを用いて、数種のフェノール物質(タンニン酸、クロロゲン酸、ガ-リック酸、ケイ皮酸、クマリン、O-クマル酸、シキミ酸)についてスタンダードを作り、抽出液におけるそれらの検出を行った。その結果、250nmの波長域でシキミ酸が検出され、かつ、その量は花粉の発芽が抑制された時期に顕著に多かった。(5)花粉発芽培地に、検出されたシキミ酸量と同量のシキミ酸を添加してやると、花粉発芽率は顕著に抑制された。以上のことから、クリの柱頭・花柱における花粉発芽の調節・抑制にはポリフェノール物質、中でもその前駆物質であるシキミ酸が大きく関わっている可能性が考えられた。花柱突出時から経時的に採取した雌花(`伊吹')の花柱抽出液から、カラム恒温槽を付けたHPLCを用いて年度と同様のフェノール関連物質(タンニン酸、クロロゲン酸、ガーリック酸、ケイ皮酸、クマリン、O-クル酸、シキミ酸)の検出を行った。その結果、昨年度の結果と同様、花柱伸長期、花粉発芽が抑制される時期は、その初期ほど高濃度のシキミ酸が検出され、花柱の伸長が停止し花粉が柱頭上で発芽を開始する時期に最低濃度になった。さらに、花粉発芽培地にシキミ酸を添加した場合も、シキミ酸は濃度に比例して花粉発芽をに抑制した。花柱1mg当たりのシキミ酸量は花柱突出間もなくのころは約8μg、花柱の伸長が終了して柱上で花粉が発芽を開始する時期には約3μgであった。また、花柱伸長期に他のフェノール関連物質は検出さなかった。一方、パラフィン包埋した組織切片での観察から、花柱の伸長初期には胚珠の形成はまだ始まったばかりで、花粉が花柱上部で確認されたころ胚珠内部に珠皮や珠心が認められた。しかし、この時期においても、珠心内の胚のう母細胞はわずかに形成されただけであった。したがって、花柱内の花粉発芽抑制物質はシキミ酸であり、花柱伸長終了期におけるシキミ酸の減少は、胚珠の生長よりむしろ花柱自体の生長と関わるものと考えられた。また、システィン硫酸法により花柱抽出液、滲出液中の全糖含量を定量した結果、糖は花柱伸長初期と、花柱伸長終了期に多かった。おそらく、花柱伸長初期の高糖含量は花柱伸長のための養分として、花柱伸長終了期のそれは花粉発芽のための養分として使われるものと思われる。しかし、後者の場合でも、この時期胚珠はまだ胚のう母細胞が形成され始めたばかりであったことから、花柱内の花粉管伸長についても、その生理作用は胚珠による誘導というよりむしろ花柱自体の役割によるものと考えられた。これまでのHPLCを用いた花柱滲出液・抽出液の分析から、花柱伸長初期ほど濃度が高く、柱頭上で花粉発芽が始まるころ濃度が低下する物質が認められ、Retention timeが標準シキミ酸に近かったことからシキミ酸ではないかと考えられた。しかし、本年度、'筑波'の花柱抽出液をHPLCで分析したところ、Retention timeが標準のシキミ酸で10.5、花柱抽出液のそれに近いものが10.4であったことから、この物質はシキミ酸とは異なる可能性も考えられた。また、同じ分析から、Retention time11.0の物質とRetention time11.3の物質は、柱頭上での花粉発芽期を挟んだ経時変化においてまったく正反対の出現状況を示し、前者は花柱上部で花粉管が見られる前と花粉管が確認できなくなるころ出現し、一方、後者は花柱上部での花粉管の確認状況とほぼ重なって出現、濃度も同様に変化し、さらに、花粉管が確認され始めのころ、それに先だって後者の濃度が急上昇した。両物質は花粉発芽調節物質の可能性もあり、さらに検討が必要と考えられた。胚珠は、柱頭上で花粉の発芽が始まった時点では珠心の分化もなく、花粉発芽がピークに達したころ
光操作によるマルチスケール機能イメージング法の開発

本研究は、光照射によって、蛍光活性化する生理機能センサータンパク質を開発することで、生きた細胞内や個体内の、ナノからマクロに及ぶ、様々な空間スケールにおける生理機能を高感度に観察する手法を構築することを目的とした。昨年度に作製したPA-GFPとDsRedをFRETのドナー・アクセプターとして利用した光活性化型Ca^<2+>指示薬PA-cameleonは光活性化前の状態でもDsRedによる青色励起光の吸収により蛍光が観察されたため、光活性化の利点の1つである高いコントラストを実現することができなかった。その一方で、405nmのレーザーを照射し、PA-GFPを活性化すると、緑色の蛍光が現れ、リガンド刺激に伴う細胞内Ca^<2+>濃度の変化を捉えることができた。本年度はDsRed以外の赤色蛍光タンパク質や緑色光を吸収するが蛍光性の無い色素タンパク質を用いる事で光活性化によるコントラストのさらなる増加が実現できないかを検討した。その結果、試験管内、細胞内のいずれにおいても405nmの刺激光照射によって不可逆的に無蛍光状態から蛍光性を獲得することが確認され、刺激光の照射範囲をガルバノミラーなどで制御することで、培養ディッシュ上の特定の細胞にPA-cameleonを出現させ、その細胞内のCa^<2+>動態を高いコントラストで可視化することに成功した。さらに、ゼブラフィッシュ幼魚における特定の筋細胞の自発的収縮とCa^<2+>濃度の変化を同時に観察することにも成功した。本方法はCa^<2+>指示薬以外のFRET指示薬にも原理的には応用可能であるため、光活性化指示薬開発のための汎用的指針として、その利用が期待される。本研究は、光照射によって、蛍光活性化する生理機能センサータンパク質を開発することで、生きた細胞内や個体内の、ナノからマクロに及ぶ、様々な空間スケールにおける生理機能を高感度に観察する手法を構築することを目的とする。本年度は高効率FRETに基づく光活性化が可能なCa2+指示薬PA-cameleonの作成を行った。PA-cameleonはECFP(シアン色蛍光タンパク質)とVenus(黄色蛍光タンパク質変異体)間のFRETに基づくCa^<2+>センサータンパク質、Yellow Cameleon3.60のECFPとVenusをそれぞれPA-GFP(光活性化型緑色蛍光タンパク質)とRFPに置換することで作成した。エネルギードナーとなるPA-GFPは紫(外)光照射により活性化され、緑色蛍光タンパク質として機能するようになるものである。従って、PA-cameleonは紫外光を照射する前はドナー分子が存在しないため、ドナーを励起する光を照射しても蛍光が観察されず、紫外光照射によって初めて蛍光性を獲得し、FRET指示薬として機能すると考えられた。しかしながら、PA-cameleonを哺乳類の培養細胞に発現させ、488nmの青色光で励起したところ、RFPが直接励起されてしまい、光活性化の利点の1つである高いコントラストを実現することができなかった。一方、405nmのレーザーを照射し、PA-GFPを活性化すると、緑色の蛍光が現れ、リガンド刺激に伴う細胞内Ca2+濃度の変化を捉えることができた。今後は各種RFP(dsRed, mRFP, mCherry, TagRFPなど)に置換することでRFPの直接励起を回避するができるかどうかを検討していく。
細胞内寄生菌のマクロファージ活性化と細胞内寄生の分子機構

(1)リステリアの主要病原因子であるIisteriolysin O(LLO)}よマクロファージ内食胞膜の傷害活性を有し細胞内生存に必須の分子であるが、同時に極めて強いサイトカイン誘導活性を示す。細胞膜傷害活性はこの種の蛋白のC末端に依存的、TH 1誘導に必須のインターフェロンγ(lFN-γ)産生を促す活性はN末端依存的であることが明確に示された。(2)LLOなどサイトカイン誘導活性を示す類似ファミリー分子は、何れもまずマクロファージに作用してIL-12の発現亢進、IL-18の活性化を介してNK細胞を刺激し、結果的に内因性IFN-γの産生を促すことを明らかにした。(3)同じリステリア属菌種のL..seeligeri, L.. ivanovilにはLLO遺伝子(励と相同性の高い遺伝子が存在するにも関わらず、それらのサイトカイン誘導活性にみられる極端な違いにはN末端側の構造の違いと、それを認識する細胞質内因子が関与することを解明した。(4)LLOによるサイトカイン誘導にはTLRを介さない膜傷害によるCQイオン流入に依存した機構も存在することを示した。(5)結核菌生菌によるIFN-γ誘導にも菌の代謝が必須であり、増殖に伴い産生される生菌特有のタンパク因子の関与が示された。(6)LLOおよび関連タンパクのサイトカイン誘導活性を利用してアレルギーの制御が可能であることが動物実験で示された。結核菌が示すサイトカイン誘導活性やマクロファージ殺菌からのエスケープに関与する新規遺伝子とその発現タンパクを検索同定することにより、結核菌の病原機構を明らかにすることが本研究の主要目的である。そのために、温度感受性マイコバクテリオファージを用いてトランスポゾン挿入を行い、ランダムな変異株を多数作製することを可能とする技法の確立に重点を置き、迅速発育抗酸菌では可能となり、遅発育菌への応用へ展開している。これとは独立して、M.bovis BCGの生菌と死菌にみられるサイトカイン誘導能の違いを解析する実験も進め、とくに免疫防御の誘導に必須なIL-12およびIFN-γ誘導活性が、Middlebrook 7H10培地から無タンパクSauton培地に移して極めて早期に遊離する成分であり、生菌のlysateに存在することが判明した。現在その生化学的性状の解析を進めている。すでにリステリアのLLOについて明らかにしたように、生菌によるIFN-γ誘導にはマクロファージからのIL-12+IL-18の産生誘導が必須で、主としてTLR2を介する可能性を示す成績が、TLRの強制発現細胞系を用いて得られた。病原性と並んで重要な問題である結核菌の薬剤耐性機構についても新たなアプローチをおこなっている。種々の知見から、薬剤耐性変異に宿主マクロファージからのストレスが関与する可能性が考えられ、これを検証する実験を開始した。本年度は種々薬剤耐性遺伝子の変異検出法を確立し、マクロファージとの共培養により主にEB耐性変異の誘導がどのように変化するかの基礎実験が進行中である。菌の発育が遅いため充分な成績は未だ得られていないが、結核菌と同じく細胞内寄生菌であるリステリアは、マクロファージ内での病原遺伝子発現が活性酸素ストレスにより亢進することを見出しており、新たな展開が期待できる。マクロファージの殺菌をエスケープして細胞内寄生を可能とし、宿主に強いサイトカイン応答を誘導する結核菌およびリステリア属菌が示すマクロファージ活性化の分子機構を明らかにする目的で研究を行い、次の成績が得られた。(1)BCGにトランスポソン挿入して数十の変異株が得られたが、その中には著明なサイトカイン誘導活性を喪失したものはみられなかった。また、これまで確立した観察方法でみる限り、P-L fusionの抑制活性の喪失変異株も認められなかった。結核菌(H37Rv株)における変異株作製は進行中である。(2)結核菌生菌の培養上清中に存在するIL-12

産生誘導活性因子は、易熱性でプロテアーゼ処理で失活する蛋白が主体で、分子量や約20,000前後と孝えられたので、精製を進め、アミノ酸配列を決定しつつある。(3)結核菌生菌や分泌性の活性蛋白によるIL-12などTH1サイトカインの誘導には、マクロファージ表層のTLR2を介したシグナル伝達が必要であり、CD14やTLR4は関与しないことがノックアウトマウスを用いて明かとなった。(4)結核菌のリファンピシン耐性を規定するrpoB遺伝子の特定の変異誘導に、活性酸素が関与することを支持する成績が得られ、マクロファージ内での結核菌の持続的細胞内寄生が耐性変異頻度を高める可能性が示唆された。(5)別種の細胞内寄生菌であるリステリア(Listeria monocytogenes)を用いて、細胞内寄生とマクロファージ活性化(サイトカイン発現誘導)の関連を解析し、食胞からの脱出がサイトカイン発現に必須であるが、加えて細胞質へエスケープした菌がサイトカイン誘導活性の高いサイトリシン蛋白を産生することが必要であることが明かとなった。この結果はさらに、単なるグラム陽性菌の菌体表層構造だけでは実際には強いTH1応答は誘導されないことを示した。感染宿主に強いサイトカイン応答を誘導する細胞内寄生菌のうち、結核菌およびリステリア属菌が示すマクロファージ活性の分子機構を明らかにする目的で研究を行い、次の成績が得られた。1)結核菌生菌の培養上清中に存在するIL-12産生誘導活性因子のうち、プロテアーゼ処理で失活しDNase抵抗性の因子の精製を進め、分子量約13万の蛋白を最も比活性の高い候補分子とした。既知の熱ショックタンパクやα抗原とは異なることを支持する性状であり、さらに精製しアミノ酸配列の部分決定から遺伝子を決定したい。2)結核菌感染による宿主遺伝子発現のうち菌の代謝や細胞内での新たな菌側遺伝子発現によるものを解析する手段として、ストレプトマイシン依存性変異株を取得し、16SrRNAの530 loopに唯一の塩基変異を検出した。この菌を感染させSM存在の有無で解析を進めている。3)別種の細胞内寄生菌であるリステリア(Listeria monocytogenes)の主要病原因子LLO遺伝子(hly)の完全欠損株を樹立し、LLO関連タンパクの変異遺伝子をプラスミド性に導入し、サイトカイン発現の誘導には、菌体の食胞からの脱出が必要条件ではあるが十分条件ではなく、N末端のPEST配列に規定されたサイトカイン誘導活性を保有するタンパクがエスケープした細胞質内で産生されることが併せて必須であることが示された。結核菌が感染マクロファージを活性化しTh1細胞応答を誘導する上で重要なIL-12の産生誘導因子について結核菌培養上清からの精製を進めてきた。本年度は精製過程で得られた候補画分をSDS-PAGEで展開し、認められた1本のバンドを質量分析計にて解析した結果、結核菌のフェリチンと同定された。新たな自然免疫リガンドの候補として今後の解析が期待される結果であった。結核菌が感染宿主細胞内で長期生存し増殖する機序として、感染マクロファージではアポトーシスやネクローシスが阻害されている可能性について、種々のカスパーゼ阻害剤を用いて解析した。感染細胞では一定のアポトーシスがみられたので、zVADfmkによりカスパーゼを阻害した。
バイオ・サーファクタントの多様性と正電荷リポソームによるがん遺伝子治療

遺伝子治療は遺伝病の根元的治療法になるだけでなく、癌やエイズの治療にも有効である。しかし、病原性ウイルスベクターによる遺伝子治療においては、不慮な事故例も報告されている。この問題を解決するため、研究代表者らは正電荷コレステロール誘導体を素材とした安全性の高い非ウイルスベクター(正電荷リポソーム)の開発に取り組んできた。代表者らの新規ベクターは高い安全性はもちろんのこと、遺伝子導入効率においても既存の非ウイルスベクターを大きく凌駕した。その上、正電荷リポソームにバイオ・サーファクタントを含有させると遺伝子導入効率が飛躍的に増大することを発見した。また、本年は、バイオサーファクタントMEL-Aに含まれる2個の脂質残基が不飽和にすると、飽和の場合と比較して、遺伝子導入効率が100倍以上も増大するというも画期的な研究成果をえた。そこで、このバイオ・サーファクタント含有リポソームの遺伝子治療に応用するための基礎データの蓄積、遺伝子導入機構の解明、ならびに、動物を用いた遺伝子治療の実験を行った。その結果、(1)バイオ・サーファクタントの分子構造(分子種)により遺伝子導入の効率が大きく増大することを発見した。(2)不飽和脂肪酸誘導体が画期的な遺伝子導入効果を与える。(3)共焦点レーザ顕微鏡を用いた実験から、MEL-Aはカプセル化した正電荷リポソーム・DNA複合体の細胞膜への吸着、細胞内への取り込み過程を顕著に促進した。(4)担がんマウスの実験から、バイオ・サーファクタント含有正電荷リポソームは遺伝子治療の研究に大きく寄与し、非ウイルスベクターとしてのがん遺伝子治療に有用である等の多くの画期的成果を得た。