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保険契約における因果関係論の再構成

アメリカでは、原因の競合等の因果関係の問題につき、合理的期待に基づき事案ごとに妥当な解決を探るという方向性と、恣意性を排除し、明確な基準の確立を図るという方向性がある。後者の場合の基準としては、引き受けた危険の範囲内かどうかが問題になる。複数の原因間に相互関係がある場合には、相互関係を評価し、先行危険が現実化したかで判断することが考えられる。この解釈において、作成者不利の原則などの契約解釈準則にどの程度依拠するかは、原因の競合を最終的には契約解釈が尽きたところでの何を原因とみるかの問題と位置付けるかどうかによる。これは機能的には、解釈準則での処理が妥当かによる。日本の保険契約における因果関係論では海上保険における議論が一般論としても参照されることが多く、その点で若干一般論としては不適切な議論がみられる。たとえば、海上保険はオール・リスク型であり、包括的に危険を引き受けるという形をとりつつ、免責条項で担保範囲を限定するという形になっているところ、そのような形式を背景として因果関係が議論されることがある。このような議論は保険契約における一般論としてはそのまま採用することは適切ではない。アメリカにおける保険契約に関する因果関係論について、研究を進めた。アメリカではこの問題に関する判例は錯綜しており、アメリカの研究者自らが、これを整理することはできないと述べるほどである。したがって、判例の状況としてアメリカの法状況を明確にする試みはあまり有益ではない。重要なのは、様々な因果関係についての考え方を抽出することである。基本的な発想において、特徴的なのは、免責危険と担保危険が協働してれば免責という考え方は伝統的な考え方ではあるものの、現在では、保守的アプローチといわれることもあり、あまり支持されていないことである。これは日本の一般論としてよくいわれるところとは対照的である。そして、複数の原因が協働している場合にはどれが近因かで判断する近因アプローチが最もひろくみられるものであるが、それだけではなく、複数の原因のうち1つが担保危険であれば保険者の責任を認めるリベラル・アプローチもみられる。リベラル・アプローチの妥当範囲については、第一当事者保険と責任保険で異なるという議論がみられる。主に、海上保険における伝統的な因果関係論の整理、分析に時間を費やした。因果関係論の出発点として、日本では、相当因果関係の考え方が支持されているといえる。もっとも、英米法における近因説をとらないという意味では、相当因果関係説が支持されているといえるとしても、相当因果関係の中身が明確であるわけではない。相当因果関係の内容は、大きくいえば、ある事実を原因として、他方の事実が通常生じるものといえるときには相当因果関係があるということであるが、通常生じるということがどの程度の蓋然性を指すのかはまったく明確ではない。これを前提として、保険事故に含まれていない非担保危険、保険事故に含まれているが免責事由とされている免責危険に分けて、それぞれが協働することによって損害が発生した場合、事実上それぞれの危険が重複的に存在し、その結果損害が発生しているが、協働しなくても損害が発生したと考えられる場合などに分けられて議論がされている。免責危険が絡んでいる場合には保険者の免責を認める傾向が強いが、免責危険ということで一律に扱うことが合理的か、非担保危険か免責危険かは約款の書き方の問題であり、その違いにより結論を変えることに合理性があるかどうかなどの問題が指摘されているところである。相当因果関係の内容が明確ではないことも含めて、これらの問題は、やはり因果関係論を一般的に論じることの限界を示すものであり、保険給付の種類ごとの個別の検討を深める必要がある。因果関係につき、免責事由と担保事由の協働のケースの処理として、アメリカ判例でもっとも広く採用されているのは、近因アプローチである。これは近因である事実が免責事由か担保事由かで保険者の責任の有無を判断するものである。ただし、近因とは何かは不明確であり、因果連鎖において起点となる、後続の危険事故を生じさせた原因(起動的近因)という理解や、結果発生について支配的な原因(支配的近因)という理解などがある。また、原因が競合する場合にも、複数の原因が因果連鎖の形でつながっている場合(因果連鎖ケース)と、単独では結果を生じさせない複数の事由が協働することで結果が発生するという場合(協働ケース)があり、起動的近因という考え方は因果連鎖ケースにしか妥当しないなど適用される場面についての議論もある。このように近因とは何かについての理解は確立したものとはいえないが、近因アプローチをとることの意義として、契約当事者の合理的期待の保護に資することが強調されることが多く、近因もそのような見地から考えるべきであるといわれることがある。原因の競合の場合に、保険者の責任を認めるリベラル・アプローチも契約当事者の合理的期待の保護に資する点、また、処理が簡明で予測可能性が高まる点からある程度支持されている。

ただし、リベラル・アプローチが妥当するのは、複数の原因が相互に独立している場合であるという判例も多い。もっとも、独立しているとはどういう場合かは明確ではない。このように近因アプローチについても、リベラル・アプローチについても契約当事者の合理的期待保護という見地から支持されるところがあるが、因果関係の問題において契約当事者の合理的期待保護がどのような地位を占めるか、すなわち契約解釈の問題なのかどうかも問題となる。商法日本の議論状況をまとめたうえで、アメリカの議論についての研究を進めている。アメリカでの議論は錯綜しているが、根本的なところで日本とは異なる考え方がみられる。すなわち、免責危険と担保危険が協働している場合には、どちらが支配的な原因(近因)かで責任の有無を判断する考え方が根強いのであるが、近因の判断の不明確さなどから批判も強い。しかし、批判的見解は協働の場合には、保険者の責任を認めるという方向で議論しており、日本のように免責を認める議論はむしろほとんど支持されていない。このような状況であることから、何らかの示唆を得ることが期待されるところであり、おおむね順調であるといえる。海上保険における伝統的な議論の整理、分析はほぼ終わり、具体的な局面における分析を始めている。ここまでの研究により、従来の議論が足りなかった点を明らかにすることができた。すなわち、相当因果関係説が支持されているとはいえ、その内容は明確ではない。これが明確ではないというのは、本研究の視角からすれば、ある意味では当然のことである。相当因果関係を担保範囲の設定の問題であると理解すれば、合理的な担保範囲は、当該保険給付の趣旨にしたがって変わってくることが考えられるのであり、これを一般化して論じても、中身のない抽象的な表現しか出てこないのは当然とも考えられる。このような見地からすれば、合理的な担保範囲が保険給付の種類によって異なることが契約で明示されている例が信用保険ではてん補範囲が直接損害に限るとされているケースであると理解することもできる。保険数理モデルからみた因果関係論、イギリス、アメリカにおける、保険の経済社会システムにおける意義についても、まだ、途中ではあるが、理解を深めるよう研究中である。この点につき、アメリカでは、特に生命保険については損害保険等と比べて保険者が免責を主張する局面が限られているところがある。これは民間の保険が社会保障において有する意義が大きいところに根ざしているのかもしれない。以上のような状況であることから、おおむね順調に進展しているものと評価できる。アメリカでは、因果関係論は、最近の展開としては、ハリケーンや地震を素材として議論されているという側面が大きいようである。この点は事前には認識していなかったことであるが、因果関係論の具体的適用のあり方として参考となるところが大きいと思われ、このような議論をフォローしつつ研究を進めていくことを考えている。また、契約解釈という見地から因果関係論を考察するという点に関して、アメリカでは約款解釈の準則とされる、合理的期待の法理等との関連も強く意識されているところがある。
コロイド微粒子混合系の偏析による超規則構造を用いた方向性光エネルギー移動

方向性の有る光エネルギー移動の実現を目的として、コロイド混合微粒子水分散液における合金結晶形成と偏析現象を用いて超規則構造を自己組織的に発現させる試みを、本課題研究最終年度においても継続実施した。最終年度においては、シリカ、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチルの3種類の単分散コロイド粒子について、自己組織化による散逸構造発現を更に最適化し、特に大面積での構造形成において超規則構造と呼べる二重構造のリング発現を実現した。また、現象の一般化と実用化を目的とし、これら3種類の球形単分散コロイド粒子以外の微粒子系についても、それらの乾燥散逸構造形成を調査した。1.前年度の研究により、水溶性色素吸着による発現構造の可視化が実現した。この手法を更に最適化することで、発現した偏析構造を解析時間のかかる走査プローブ顕微鏡で精査する必要が無くなり、研究に必要な時間の大幅な短縮が可能となった。また、色素濃度分布を構造発現でコントロールできるようになったため、方向性の有る光エネルギー移動が3次元構造内で実現できることとなった。2.シリカ、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル以外の異方系コロイド微粒子として、ファインマイカ(平均直径2マイクロメーターの薄片状)、酸化チタン微粒子(粒径55ナノメートルの立方体形)の乾燥散逸構造発現を調査した。両微粒子とも水溶性色素で良好な着色が得られ、カバーガラス、フラットシャーレ、時計皿上で、それぞれ特徴有る乾燥散逸構造を発現した。3.特に、フラットシャーレ、時計皿を用いて発現させた大面積の乾燥散逸構造で、多重リング構造など超規則構造と呼ぶべき構造発現が観察された。この発現には、分散液の重力対流及びマランゴニ対流が重要な役目を果たしていると説明された。3次元的な色素分布も制御可能で、光エネルギーの方向性移動が実現できることとなった。コロイド混合微粒子水分散液における合金結晶形成と偏析現象を用いて、自己組織的に超規則構造を発現させ、方向性の有る光エネルギー移動を実現する目的のため、初年度においては、シリカ、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチルの3種類の単分散コロイド粒子について、1)滴下する液量、2)分散液の濃度、3)乾燥温度、4)コロイド粒子の種類、5)分散媒の種類、のパラメータを変化させながら、自己組織化による散逸構造発現を実施した。単一微粒子系、合金結晶系、超規則構造系において発現する乾燥パターンの評価を行うため、評価方法として、動径分布関数や2次元フーリエ変換の効率的利用体制を確立した。更に、コロイド微粒子に色素を吸着させ、それらを混合した系で蛍光発光特性を評価した。これらより、光エネルギー移動の指向性の程度を評価する方法の目処が確立された。具体的な成果としては、1.粒径または粒子密度の異なる2種類のコロイド微粒子の混合系において、発現する乾燥散逸構造をCCD顕微鏡、共焦点顕微鏡、走査プローブ顕微鏡を用い、結晶化及び偏析の定量的評価を実現した、2.発現した乾燥散逸構造の表面と裏面、中心部と外周部で大きな偏析効果が見られた、3.この偏析効果を目視でも検証できるようにするため、片方の微粒子を色素で着色し乾燥散逸構造を発現させた。この結果、肉眼でも微粒子の偏析が一目瞭然に評価できる様になった。4.乾燥散逸構造の発現温度を室温から摂氏70度まで変化させ、偏析効果の発現に液対流が大きく寄与していることを明らかとした。5.分散液中に発現したコロイド結晶にNd:YAGレーザーの2次高調波を照射し、空間的コヘレンシーのある発光を観測した。再現性を更に確認する必要があるが、これにより方向性の有る光エネルギー移動が実現可能であることが示された。初年度における研究計画は、微粒子最密充填結晶構造の直接観察として3種のコロイド微粒子それぞれについて、十分な脱塩によりコロイド結晶を発現させることを目的とした。コロイド微粒子は、それぞれ密度、屈折率、表面特性が異なるものが選ばれており、大きな偏析効果や色素吸着効果が得られる。コロイド結晶の発現は彩光色より肉眼でも確認できるが、反射スペクトル測定より結晶の格子定数を簡便に、そして定量的に評価可能である。コロイド結晶は、その構成粒子間隔がちょうど光の波長領域にあるため、結晶面間隔を反射スペクトルより計算で求めることができる。距離スケールは千倍ほど異なるが、X線結晶回折と同様な方法である。具体的実験方法としては、ガラス基板上にコロイド分散液を滴下し、これの自然乾燥による散逸構造の発現を様々な条件下で直接観察することである。この間、CCD顕微鏡による乾燥パターン変化のビデオ録画、時間分割反射スペクトル測定によるブラッグピーク波長の変化測定を同時に実施した。反射スペクトルは0.5 mmの空間解像度を持ち、発現パターン各位置での測定を行える。コロイド結晶を発現したPMMA微粒子水分散液液滴の、乾燥に伴うブラッグ反射ピークの変化を見ると、最初600 nm領域にあった反射ピークが、連続的に短波長シフトした。これはすなわち、分散液が結晶を発現したまま乾燥して、最密充填構造を発現している事を示す。これら、本研究課題申請時に初年度の目標としたものが、全て実現できた。

コロイド混合微粒子水分散液における合金結晶形成と偏析現象を用いて、自己組織的に超規則構造を発現させ、方向性の有る光エネルギー移動を実現する目的のため、平成29年度においても、シリカ、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチルの3種類の単分散コロイド粒子について、1)滴下する液量、2)分散液の濃度、3)乾燥温度、4)コロイド粒子の種類、5)分散媒の種類、のパラメータを変化させながら、自己組織化による散逸構造発現を実施した。平成29年度に於いては、1.微粒子混合系における乾燥散逸構造の発現時に、偏析に関わる2種類の微粒子の片方を水溶性色素で着色し、偏析効果が目視でも明らかになるようにする、2.大面積の乾燥散逸構造を発現させ、これまでのカバーガラス上での結果と比較することでその形成メカニズムを明らかにすると共に、実用目的も視野に入れた研究を行う、ことを重点的に実施した。1.どちらの微粒子をメチルバイオレット等の色素で着色するかは、微粒子に対する色素の吸着量を定量的に調べ、一番吸着量が多い組み合わせを選んだ。片方の微粒子を着色後、2種類の微粒子を混合した分散液から乾燥散逸構造を発現させた結果、目視でも明らかに分かる偏析が見られた。結果を定量化するため、標準カラー版でCCD顕微鏡の色補正を行い、画像処理ソフトで色素濃度を検定した。2.カバーガラス上だけでなくフラットシャーレ、時計皿を用いて乾燥散逸構造を発現させた。時計皿ではカバーガラスと同様、周囲から中央へと乾燥が進んだが、フラットシャーレでは中央から外周へと乾燥が進んだ。いずれの系でもその大面積に関わらず、顕著な偏析効果の発現が見られた。フラットシャーレにおいては乾燥条件により二重の偏析も発現し、液蒸発に伴う液対流が中央部と外周部で発生したことが示唆された。初年度においては、微粒子最密充填結晶構造の直接観察として3種のコロイド微粒子それぞれについて、十分な脱塩によりコロイド結晶を発現させた。コロイド微粒子は、それぞれ密度、屈折率、表面特性が異なるものが選ばれており、大きな偏析効果や色素吸着効果が得られる。ガラス基板上にコロイド分散液を滴下し、これの自然乾燥による散逸構造の発現を様々な条件下で直接観察した。この間、CCD顕微鏡による乾燥パターン変化のビデオ録画、時間分割反射スペクトル測定によるブラッグピーク波長の変化測定を同時に実施した。コロイド結晶を発現したPMMA微粒子水分散液液滴の、乾燥に伴うブラッグ反射ピークの変化を見ると、最初600 nm領域にあった反射ピークが、連続的に短波長シフトした。これはすなわち、分散液が結晶を発現したまま乾燥して、最密充填構造を発現している事を示す。次年度においては、微粒子混合系が発現する乾燥散逸構造における偏析効果を重点的に調査し、色素により着色を用いることで偏析効果を簡便に明白に示すことに成功した。また、構造形成の実用化を視野に入れ、発現構造の大面積化に取り組み、直径約7センチの大きさでも偏析が顕著に起こることを見出した。これら、本研究課題申請時に初年度の目標としたものが、全て実現できた。方向性の有る光エネルギー移動の実現を目的として、コロイド混合微粒子水分散液における合金結晶形成と偏析現象を用いて超規則構造を自己組織的に発現させる試みを、本課題研究最終年度においても継続実施した。最終年度においては、シリカ、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチルの3種類の単分散コロイド粒子について、自己組織化による散逸構造発現を更に最適化し、特に大面積での構造形成において超規則構造と呼べる二重構造のリング発現を実現した。
日本で継承されてきた助産ケアの探索と標準化に向けた再構築

本研究の目的は、日本独自の助産ケアとして分娩後出血の予防ケアと臍帯遅延結紮のメカニズムまたは構成要素を明確化することである。分娩後出血の予防ケアについて、子宮収縮に関与するメカニズムを明らかにするために、自然経過群、授乳群、冷罨法群の子宮収縮周期と持続時間を測定した。その結果、子宮収縮は徐々に短縮するが、出血量とは関係ないことがわかった。臍帯遅延結紮の概念は、【母子を中心とした環境】【女性・助産師・家族の協同】【正常性のアセスメント】【異常予防のケア】【異常時の迅速な対応】【母子の内分泌機能を活性化するケア】【助産師の黒子的姿勢】の7つが抽出された。本研究で焦点化する助産ケアを「分娩誘発ケア」「分娩第3期のフィジオロジカルマネジメント」「分娩後出血の予測と対応」「代替医療」とし、文献検討および実態調査を進めた。「分娩誘発ケア」については開業助産師へのインタビュを行いその特徴を明らかにした。「分娩第3期のフィジオロジカルマネジメント」は概念分析を行い、「分娩後出血の予測と対応」は実態調査、そして助産師が用いる「代替医療」についてシステマティックレビュの作成を開始した。日本で継承されてきた助産ケアとして、分娩後出血の予防ケアおよび生理学的臍帯結紮について、各々のメカニズム探索とランダム化比較試験に向けてのプレリミナリースタディを行った。文献検討および実態調査により、主要な分娩後出血の予防ケアとしては、子宮の冷罨法があげられた。子宮の冷罨法は、日本において助産師が古くから実施している方法である。そのメカニズムを明らかにするため、17名の産婦を対象に分娩後の子宮収縮活動をトコメーターにて測定した。その結果、分娩第3期から徐々に間隔が広がる規則的な子宮収縮が認められた。また、授乳によって間隔は短くなることも明らかになった。一方、子宮の冷罨法によって収縮の頻度は変わらなかった。このデータを基盤に子宮冷罨法の効果を検証するラインダム化比較試験における介入プロトコルを作成した。生理学的臍帯結紮については、分娩第3期のフィジオロジカルマネジメントの概念分析によりその要素を抽出し、医療介入と考えられる早期結紮と生理学的な結紮、つまり遅延結紮を定義し、アウトカムを明確化した。さらに、助産所における生理学的結紮の方法を観察し、児娩出後の産婦の姿勢、児を置く場所(母親の胸)と保温方法、臍帯結紮までの時間、切断の方法などを介入のプロトコルを作成した。設定した介入プロトコルの実施可能性を検討するためにプレリミナリースタディを行い、修正を加えた。同時に、サンプルサイズの算定も行った。研究体制を整え、円滑に研究を進めることができた。医歯薬学計画に従って、研究を遂行していく。研究の実施に関わる支出が平成26年度となるため。データ収集を円滑に開始し、計画どおりに終了する。
MCMC法によるボロノイ空間分割配置データの統計解析法の開発

自然界に見られる多角形分割のデータが山積しているが、それらの統計解析を行うための手法が未開発である。われわれはこの状況を打開するため、MCMC法を多用した統計的方法を開発した。われわれが用いた統計モデルは広範囲の多角形分割パターンを再現できることが判明し、モデルに含まれるパラメータの推定も行うことができるようになった。自然界では多結晶金属に現れる粒界、森林における樹冠による空間分割、生物組織に見られる細胞パターンなど、種々の多角形分割データが得られる。われわれの研究の究極的な目標は、これらのデータに対する統計モデルを構築し、統計解析法を開発することである。まず、所与の多角形分割データから多角形の中心点を求めるアルゴリズムを開発して、元のデータをボロノイ空間分割と見なすことにより、MCMC法によるモデル化を行った。N個の点が与えられているとき、そのボロノイ多角形分割に関して、次の相互作用ポテンシャルを導入した。すなわち、隣接するボロノイ多角形の辺長を含む項、ボロノイ多角形の面積2乗和の項及び辺長2乗和の項のそれぞれにパラメータを掛けたポテンシャルである。そして所与の多角形分割はこのポテンシャルの下で平衡にあると仮定して、MCMCシミュレーションを行った。その結果、パラメータを変えることによりランダム型・集中型・規則型の広範なタイプの多角形分割が実現できることが分かった(H20年度統計数理研究所年度研究報告会にて一部を発表)。さらに、シミュレーションで得られた上述のデータから、元のパラメータを推定する近似尤度法の開発に取り組んだ。本研究の主たる目的は研究代表者らが進めてきたMCMC法を用いた空間点配置の統計解析手法をボロノイ・デローネイ空間分割配置の問題に拡張・発展させることである。H21年度は前年度に提案した相互作用エネルギー・モデルを改良して、より広範囲の配置に対応できるモデルを提出し、それを「ボロノイ・セル相互作用モデル」と名付けた。このモデルに現れるパラメータ値の様々な組み合わせに関して、シミュレーション・データを生成してDiggle et.al.(1994)で与えられた疑似尤度法を適用し,パラメータ推定を試みた。その結果、推定された値は疑似尤度法に由来する若干のバイアスが見られるものの、配置の再生には十分な値が得られることが分かった。この結果については2009年度統計関連学会連合大会で口頭発表した。その後、疑似尤度法の適用を次年度に本格実施するための準備を行うとともに実データへの適用を目指して観測された空間分割データをボロノイ多角形分割として近似する方法に着手した。その他、H21年度はランゲルハンス細胞に関する多角形分割データへの点配置としての相互作用推定等について、査読付き論文(共著)を発表した。本研究はこれまで研究代表者らが推進してきたMCMC法による空間点配置の統計解析法の開発を、ボロノイ・デローネイ空間分割配置の問題(これも研究代表者が進めてきた研究テーマである)に拡張・発展させることがそもそもの目標である。最終年度のH22年度は、前年度に「ボロノイ・セル相互作用モデル」として提出した3パラメータへの拡張モデルについて検討し、種々のパラメータ値に対して計算機シミュレーションを行い、より広範囲の多角形分割配置が実現できることを確認した。そして、前年度に実施した疑似尤度法によるパラメータ推定を改良して、シミュレーション・データに対する解析を行った結果、配置の再生には十分満足な値が得られることが分かった。この結果については、2010年度統計関連学会連合大会、および第70回形の科学シンポジウムで口頭発表した。その後、実データへの適用の試みとして、ランゲルハンス細胞の多角形分割配置データを解析して、われわれの開発した手法が実データに適用できることを示した。そして研究成果を論文発表する準備を開始した。その他に、「MCMCとその周辺-空間統計と乱数を中心にして」と題する解説論文(石黒真木夫編:近代科学社から出版予定)を書いた。
卵子内精子注入法を利用した新しい遺伝子欠損マウス維持法の開発

【1】卵子内精子注入法を利用した新しい遺伝子欠損マウス維持法の開発のためにODF2 KOキメラマウスを材料にして、そのphenotypeである突起付精子がヘテロマウスに継続して維持されることを指標にして、下記の確認実験を行った。1)電顕レベルでODF2 KOキメラマウスのphenotypeである突起付精子とヘテロマウスのphenotypeである突起付精子の構造を比較したところ、突起部分の構造が同じであり、ヘテロに継続されていた。2)ヘテロマウスに関して次の点が判明した:(1)成熟精子のgenotypingにより、ODF2遺伝子が欠損した精子が確かに存在していること、(2)リアルタイムPCR法により精巣のODF2遺伝子発現量が減少していること、(3)Western blot法によりODF2タンパク質量が減少していること。(4)雄は不妊であるだけでなく、突起付精子の異常形態出現率がキメラマウス雄精子よりも多いこと。【2】精細胞レベルでhaploinsufficiencyがどのように起こるかに関して、下記の点を明らかにした。Western blotと免疫染色を行い、ODF2 KOヘテロ雄マウスの場合は精子形成段階においてhaploinsufficiencyが高率に起こっていた。このことが、成熟精子に見られるphenotypeである頭尾部離断の原因になっていると示唆された。ここまで当初の目的は達した。【3】さらにgeneticなヘテロ出現率とphenotype出現率との相関に関する拡大研究(突起付精子をBDF/F1wild卵子にICSIしてヘテロ雄/雌マウスのN数を増やすこと)を試みたが、十分量を確保するには至らなかったため継続することにした。以上の結果の有用部分について、論文を作成中である。最終目的である「卵子内精子注入法を利用した新しい遺伝子欠損マウス維持法の開発」する過程で、次の5点を明らかにした。【1】ODF2キメラマウスやヘテロマウスの突起付精子は、genotypingを含む遺伝子レベルや免疫電顕を含む形態レベルにおけるphenotypeと一致した。このphenotypeについて、電顕レベルを含めた詳細な解析を行った。【2】自然交配で不妊となるODF2KOキメラマウス雄でも、キメラ率の高いマウスに特有の精子を選別後wild雌卵子にICSIすることにより、ヘテロ雄/雌が得られることを証明した。【3】ODF2KOヘテロ雌とwild雄との自然交配で安定的にヘテロ雄が得られることを証明した。ODF2ヘテロ精子(突起付)をODF2KOヘテロ卵子にICSIしたところ、ODF2KOヘテロ雄/雌は得られたが、現在のところ、ODF2KOホモ雄/雌は得られていない。発生過程でlethalになっている可能性があると示唆されている。【4】ODF2KOキメラマウスの不妊の場合、「精子形成段階で精細包にhaploinsufficiencyが高率に起こり、結果的に成熟精子のphenotypeとして頭尾部離断が起こることが原因である」ことが示唆された。キメラおよびヘテロの精細胞でhaploinsufficiencyがどのように起こるかについて、遺伝子レベルとタンパク質レベルで解析中である。【5】ICSI胚とヘテロ胚を凍結保存した。
食道表在癌に対する内視鏡的粘膜切除術の適応拡大をめざした悪性度診断に関する研究

早期・表在食道癌の発見例の増加と共に、本邦では食道粘膜癌に対する内視鏡的粘膜切除術(EMR)が広く行われるようになっている。粘膜上皮(m1)と粘膜固有層(m2)にとどまる癌はリンパ節転移を有せず、EMRの絶対的適応となっているが、粘膜筋板に達するもの(m3)や粘膜下層表層に浸潤するもの(sm1)でも1015%のリンパ節転移を有するにすぎない。食道癌の外科的根治術の手術侵襲の大きさ、術後のQOLへの影響を考慮すると、この群の出来るだけ多くの症例をEMRで治療することを目的に検討した。m3・sm1癌124例を全国主要施設から集め、内視鏡写真,切除標本,病理プレパラートを検討し、リンパ節転移のない群を検討した。隆起と陥凹の混在するもの,低分化型,INFγ,ly(+)にリンパ節転移が多かった。この群の症例に遭遇したら、腫瘍径4cm以上のもの,0-I,0-III,O-IIa+IIcのものは外科的切除術を行う。残りの症例にはEMRを行い、病理組織を検討し、中分化型,INFβ,ly(+)のもの,中分化型,INFγのもの,低分化型のものを外科的切除術の適応とし、他のものは経過観察でよいことが判明した。これでm3・sm1癌の58.9%の人が外科的切除を受けないですむことになる。食道表在癌とfactor-8の関係をみると、癌病巣周囲の血管新生はm3から始まり、factor8染色性とリンパ節転移の間に有意の関連が認めらえた。食道表在癌とKi67のモノクローナル抗体MIB-1を用いて増殖能をみると、m3から急にそのLabeling Index(LI)が増加し、増殖能の上昇が示唆された。MIB-1のLIはリンパ管侵襲,リンパ節転移と有意の相関を示した。食道早期癌のうち粘膜上皮(m1)と粘膜固有層(m2)にとどまるものは、リンパ節転移をきたすことはなく、内視鏡的粘膜切除術(EEMR)の絶対的適応である。しかし、粘膜筋板に浸潤するもの(m3)や粘膜下層表層(sm1)に達するものでは1015%にリンパ節転移が認められる。この群でEEMRの適応となるものはどんなものかを明かとした。全国諸施設から外科的根治術を施行し、病理組織学的に深達度m3,sm1とされた症例124例を集めた。m3 65例sm1 59例で、このうちリンパ節転移を有していたものはm3 9例13.8%,sm1 13例22.0%合計22例17.7%であった。これらにつき腫瘍長径,臨床病型,分化度,浸潤度,脈管侵襲とリンパ節転移の関係を調べた。(1)腫瘍径とリンパ節転移との関係はn(+)例の31.8%が4cm以上で、4cm以上の21.2%がn(+)であったが、両者に一定の傾向が認められなかった。(3)分化度では高分化型5.6%,中分化型18.2%と比べ低分化型は60.0%とリンパ節転移率が高かった。(4)浸潤度ではinfα0%,infβ19.1%と比べ,infγは71.4%とリンパ節転移率が高かった。

(5)ly(+)はリンパ節転移が36.4%とly(-)2.9%に比べ有意(p<0.05)にリンパ節転移が多かった。臨床的にEEMRの適応外と考えるO-I型,O-III型,OIIa+IIc型や腫瘍径4cm以上を除くとこの中にリンパ節転移を有する症例の81.8%が含まれる。これ以外の症例にEEMRを適応してみてmod.diff.でinfβly(+),infγ,poorly.diff.のものを外科的切除術の適応とするとsensitivity100%でリンパ節転移陽性例を外科的治療することとなる。また、内視鏡所見からEEMRの適応外と考えられるものの中に、リンパ節転移を有するものの82%が含まれていることになる。m3,sm1も積極的にEEMRを適応していくべきと考える。早期・表在食道癌、とくに粘膜癌の増加により、内視鏡的粘膜切除術(EMR)が急速に普及してきた。粘膜上皮内(m1),粘膜固有層(m2)にとどまるものは絶対的適応となるが、粘膜筋板(m3)や粘膜下層表層(sm1)のものの大部分もリンパ節転移はなく、外科的切除術の侵襲および術後のQOLへの影響を考慮すると、可及的にEMRを適応したい。m3・sm1癌の悪性度診断を行うために、食道表在癌の深達度別に第VIII因子,Ki67,p53,PCNAなどにつき検討し、その病態を研究した。血管新生については、第VIII因子関連抗体を用い、腫瘍増殖についてはKi67のモノクローナル抗体であるMIB-1を用いて免疫組織化学的局在を調べ、computer image analizerで解析した。血管新生をみるとm1・m2と比べ、m3から腫瘍内平均血管面積の増大が認められた。また、m3・sm1群でリンパ節転移(n)や脈管侵襲(ly,v)の関係をみると、陽性のものは陰性のものより腫瘍外平均血管面積は有意に高かった。腫瘍増殖をみると、やはりm1・m2に比べm3からMIB-1のLabaling Index(LI)の有意の増加を認め、また、n,ly,の陽性のものは陰性のものよりLIが有意に高かった。食道表在癌ではm1・m2からm3へ増殖する過程で、血管新生や増殖能の増加が認められ、また、n+ly+などの悪性度因子とも有意に相関していることが判明した。現在、さらにp53,PCNA,などについても結果が出つつある。
21世紀の表面実装化学工学と高密度接続バンプ

本研究では実装化学工学の基盤を構築する。実装化学工学とは、半導体素子間の配管(配線)とフローチャート(接続)、装置仕様(パッケージング)を行い、個々の素子の性能を最終の電子機器に反映させることである。その中でも配管の役目をする高密度接続材料を電流密度分布の観点から検討した。また実装研究の普及を目的に化学工学会に実装プロセス工学部会を設立した。1.高アスペクト比バンプ形成;高アスペクト比ではキャビテイ外部の強制対流は内部を有効に攪拌しない。そのため、カソード近傍の溶液とバルク溶液との密度差を利用した自然対流が必要となる。そこで高アスペクト比バンプ形成と自然対流との関係を数値流体解析と実験とから検討した。カソード径が200μmでアスペクト比が1.0では、密度差対流が働き、キャビテイ内部を有効に攪拌する。カソード径が100μm以下になると、密度差対流が働かず、物質移動は拡散が支配する。2.電流密度分布と添加剤;分極測定から添加剤の働きを理解した。電流密度分布を数値解析と実験から検討した。COGでは、周辺の盛り上がったバンプ形状が異方性導電膜中の導電粒子をより多く捕獲し接続特性を向上させる。周辺の盛り上がったバンプ形状には、セレン酸の添加が効果がある。中央の盛り上がった形状についても検討した。またビルドアップ基板やダマシンめっきのビア穴埋に用いるCuめっきの4種類の添加剤のメカニズム詳細についても検討した。3.バンプが存在する時の形状制御;複数個のラインが隣接した場合の相互作用について隣接間隔とPe数との関係を検討した。4.表面実装化学工学の構築;化学工学会内に実装プロセス工学部会を設立した。会員は40社、10大学である。化学工学会の部会導入に合わせでエレクトロニクス部会へと発展する。実装化学工学とは、半導体素子間の配線(配管)、パッケージング(装置仕様)を行い、個々の素子の性能を最終の電子機器に反映させることである。また実装研究の普及を目的に化学工学会に実装プロセス部会を設立した(研究成果の図書・雑誌等報告書参照の事)。研究実績を以下に示す。1.高アスペクトキャビテイ内の対流と拡散高アスペクト比のキャビテイへのバンプ形成に関し、数値流体解析で拡散律速下の電流密度分布を解析した。アスペクト比が大きくなると、電流密度分布は頂点が鋭く対称となる。キャビテイ外部での対流はその内部を有効に攪拌しなくなる。2. CSP実装に用いる高アスペクトバンプと自然対流CSPとフリップチップをめざしたアスペクト比の大きいキャビテイへのバンプ形成に関し、バンプ形成実験を行った。アスペクト比が1.0のキャビテイでは、カソードの設置角度の増大に伴いバンプの下端が盛り上がった。カソード上の密度差対流のため、キャビテイ外で大きな渦を発生する。この渦が再びキャビテイ内へと流入し、バンプ下端に衝突しバンプ下端部が盛り上がる。3.バンプ形状制御と添加剤の影響-その実用特性Chip on Glass(COG)では、周辺の盛り上がったバンプ形状が異方性導電膜中の導電粒子をより多く捕獲し接続特性を向上させる。周辺の盛り上がったバンプ形成には、セレン酸の添加が効果があり、形状変化はWa定数と二次電流密度分布とで説明出来る。

実装化学工学とは、半導体素子間の配線(配管)、パッケージング(装置仕様)を行い、個々の素子の性能を最終の電子機器に反映させることである。その中でも配管の役目をする高密度接続材料を電流密度分布の観点から検討した。また実装研究の普及を目的に化学工学会に実装プロセス部会を設立し、活動を開始した。研究実績を以下に示す。1.高アスペクト比バンプ形状形成:CSPのビアポストに用いるバンプ形成において、隣接キャビティの密度差対流の影響を実験及び数値流体解析から明らかにした。あわせて、高さの均一性が得られるビアポスト径とビアポストピッチとの関係を明確にした。また、加熱により、密度差対流の増大を確認した。ビルドアップ基板のビア穴埋において、分極曲線から穴埋機構を分類した。そして、Tafel領域、拡散律速領域の穴埋機構を明確にした。また、4種類の添加剤の有効性を確認した。半導体のAlに替わる配線として注目されているCuダマシン法において、4種類の添加剤の機構を分極測定、結晶形態の観察より明らかにした。Clはマクロステップを形成する。PEGはマクロステップ端面に優先的に吸着しめっきの成長を抑制する。JGBはPEGの拡散律速性を増大させ、ビア穴内部に優先的に析出させる。SPSは結晶を微細化させ微細ビアに入りやすくする。2.電流密度分布と添加剤:Niバンプ形成において、高密度接続材料に最適な中央に凸のバンプ形状形成を条件を見出した。レジスト側壁角度と添加剤のめっき成長抑制作用により、中央に凸の形状が出現する。3.多数バンプが存在する時の形状制御:複数個のバンプ形成時、隣接キャビティの物質移動の相互作用について検討した。低Pe数では外部拡散が支配的である。隣接間隔が狭いと隣接部の電流密度が減少する。一方高Pe数では、貫通流が支配的となる。隣接間隔が狭いと、下流側キャピテイ高さが減少する。4.その他:孔内の物質移動を促進するため、超振動撹拌を検討した。分極により超振動の効果を確認した。金バンプの形状制御を検討した。添加剤、支持電解質で形状制御し、硬度測定、金属組織を明確にした。
放射線誘起還元場における貴金属複合ナノ粒子生成プロセスに関する研究

放射線を照射すると、貴金属イオンを含む水溶液中では還元性化学種が発生し貴金属イオンが還元され、貴金属微粒子が生成する。本研究では、放射線照射による水溶液中での貴金属複合ナノ粒子生成過程をガンマ線照射後数分から数時間の範囲で紫外-可視吸収スペクトルの時間変化を測定することにより観察した。貴金属ナノ粒子の生成過程は水溶液の温度、pHなどの変化による影響を受けることを明らかにした。ガンマ線照射による水溶液中での複合ナノ粒子生成プロセスにおいて、水溶液の条件を変化させることによりガンマ照射で生成した中間活性種による貴金属イオンの還元反応と照射終了後の未反応イオンの化学的還元反応を制御することを試みた。水溶液の温度等の条件による粘度の変化がナノ粒子生成過程に与える影響を中心に検討した。ガンマ線や電子線を照射して貴金属複合ナノ粒子を合成するプロセスでは、吸収線量率と吸収線量、界面活性剤の種類・濃度や水溶液の温度などの条件を変化させることにより金属イオンの還元速度や量を制御し、粒子サイズなどを制御することが可能である。本研究では水溶液の温度などの条件による粘度の変化に着目して金ナノ粒子生成の過程について検討した。水溶液中の金イオンが還元されると表面プラズモン吸収によるピーク(520nm付近)が現れることを利用し、ガンマ線照射後の塩化金酸-ポリビニルアルコール(PVA)水溶液の紫外-可視吸収スペクトルの経時変化から金ナノ粒子の収量の時間変化を測定した。室温で照射した試料では、照射終了後8分以降で金ナノ粒子生成よる表面プラズモン吸収のピークが現れ、照射終了後40分前後を境に2つの速度成分が観測された。照射中、照射後を通して40°Cで保持した試料では、照射終了直後に既に金ナノ粒子生成によるピークが現れており、室温で照射した試料に比べて照射後40分まではより速い立ち上がりが見られた。しかし照射後60分以降の挙動には両者の間で差が見られなかった。PVA水溶液の粘度測定の結果では室温と比較して40°Cで保持した試料では粘度が低下したため、金イオンの還元反応が促進され金ナノ粒子の成長が速やかに起きたと考えられる。本研究では水溶液の温度とpHの違いによるの変化に着目して複合粒子形成前の金ナノ粒子生成の過程について検討した。NaOH添加により高pH側にシフトさせると、放射線照射後2分から数時間の範囲では金ナノ粒子の表面プラズモン共鳴吸収ピークの立ち上がりが速くなった。放射線照射による金ナノ粒子生成過程での凝集特性を調べるため、水溶液の温度とpHを変化させてゼータ電位を測定した。ゼータ電位の絶対値は高pH側になるにつれて減少し、pH8付近で0近くまで減少していることから、表面電位の変化により生成した金ナノ粒子前駆体が凝集しやすくなり金ナノ粒子の生成が促進されたと考えられる。
脳特異的遺伝子導入法による発生後期過程の脳機能形成でのミクログリアの役割の解析

ミクログリアはマクロファージ様の性質を持つ中枢神経系細胞で、炎症反応やウイルス感染、神経変性などの多くの脳内ストレスに反応し活性化されストレス因子を産生する。本研究は脳の発生や機能形成におけるミクログリアの役割をinvivoで検討し、以下のような成果を得た。1.我々が樹立したミクログリア株細胞に外来性遺伝子を導入し、独自に開発した脳特異的バイオターゲッティング法を用いることによって、目的遺伝子を脳に特異的に発現させることに成功した。また、導入したミクログリアは脳に生着し、数ヶ月にわたって生存することがわかった。2.一過性前脳虚血モデルにおいて脳特異的バイオターゲッティング法でミクログリアを虚血性神経細胞死巣に導入してinvivoで直接ミクログリアの老化促進ストレス応答を検討するシステムを開発した。この系でみられる遅延性神経細胞死は活性化ミクログリアを抹消から導入しておくことによって抑制されることがわかった。3.GFP恒常的発現骨髄細胞を正常マウスに移植するシステムを確立し、骨髄細胞移植における脳親和性細胞の存在やその性質について検討した。その結果、GFP陽性細胞が末梢臓器だけでなく脳実質にも、clusterを形成して存在する事を発見したが、脳に移入した細胞は末梢臓器に移入する細胞とは異なる性質を持つことが判った。本年度は以下のように主に解析システムの確立をおこなった。1.株化ミクログリアへの遺伝子導入:ミクログリア機能遺伝子のうち種々の機能にかかわる事が示唆されているTNF受容体遺伝子をPCR法によりクローニングした。えられた遺伝子を発現ベクターに組み込み株化ミクログリアへ導入して安定発現株を選択している。2.脳切片での解析系:大脳皮質および海馬切片を作製して株化ミクログリアを導入しacuteおよび培養下での形態変化、神経細胞死、膜電位変化に対する影響を調べ、共培養下のミクログリアの動態が解析できることがわかった。3.胎児脳への遺伝子導入:ラット脳への末梢動脈経由のミクログリア移入システムは既に確立してある。神経回路形成以前からプロテアーゼインヒビターやサイトカインのアンタゴニスト、NOSなどのミクログリア機能遺伝子を発現するミクログリアを導入して、回路形成過程を含んだLTP形成におけるミクログリアのプロテアーゼやサイトカイン、NOSなどの作用を調べるために、妊娠12日から20日の胎児に経子宮的に遺伝子導入したミクログリアを注入して出生させ、注入細胞が脳で見られるかどうかを調べたところ。3週齢の動物脳においても標識された細胞が確認できた。4.生体脳への遺伝子導入:transient transfectionで導入したlacZ遺伝子を発現するミクログリアをマウス尾静脈に注入したところ導入遺伝子は脳に特異的に導入できることがわかった。transient transfectionでは導入後3週間で導入直後の発現量の約1/3程度保持されていることがわかった。第2年次として本年度は以下のような解析をおこなった。1.株化ミクログリアへの遺伝子導入:脳の発生や機能発現に関与するGDNFおよびBDNF遺伝子をGFPと共発現する用に組み換えたものを株化ミクログリアヘ導入して安定発現株を選択している。2.脳切片での解析系:大脳皮質切片を培養して株化ミクログリアを添加すると集合電位がテタヌス刺激を加えることなく増大することが判り、ミクログリアの脳高次機能への関与が考えられた。現在、ミクログリアの責任因子について解析を進めている。3.生体脳への遺伝子導入:GFP安定発現ミクログリアを末梢血管経由で脳内に導入すると1-2週面で休止ミクログリア様の分岐状形態に変化し、その後3-5ヶ月に渡って脳内で生存することが判った。4.ミクログリアの脳内局所導入するための方法の開発:スナネズミの前脳虚血-再還流系での遅延性神経細胞死がおこる海馬CA1領域に末梢血管経由で導入したミクログリアが集積することが判った。第3年次として本年度は以下のような結果を得た。

また、導入したミクログリアは脳に生着し、数ヶ月にわたって生存することがわかった。2.一過性前脳虚血モデルにおいて脳特異的バイオターゲッティング法でミクログリアを虚血性神経細胞死巣に導入してinvivoで直接ミクログリアの老化促進ストレス応答を検討するシステムを開発した。この系でみられる遅延性神経細胞死は活性化ミクログリアを抹消から導入しておくことによって抑制されることがわかった。3.GFPトランスジェニックマウスの骨髄細胞を正常同型マウスに移植し骨髄キメラを作製し、GFP陽性細胞をレシピエントマウス体内において追跡できる系を確立した。レシピエントの脳と末梢臓器において、GFP陽性細胞が移行していることが確認でき、それらのほとんどはクラスターを形成していた。脳におけるクラスターは、末梢臓器に比較して未分化であり通常の単球では発現しえない抗原を発現していることを示した。したがってミクログリアの発生的起源は、血液を循環している単球に由来するのではなく未分化な骨髄前駆細胞が脳実質中に移行し血球系の細胞とは独立した分化をとげたものである可能性を示唆できた。
Th1/Th2バランスからみたHAM発症分子機構の解明と治療法開発の基礎的検討

1,HAM患者末梢血CD4陽性Tリンパ球におけるTh1マーカー陽性細胞についてTh1マーカーであるE-selectin ligand発現細胞が増加していることとその機能検索においてTh1サイトカインであるIFN-γ産生が著明に亢進していることを明らかにし,さらにE-selectin ligand発現にはHTLV-Iが関与している可能性を示した(論文投稿中)。2,HAM患者末梢血CD4陽性Tリンパ球の機能検索(3)HAM患者末梢血CD4陽性Tリンパ球ではFas抗原の発現亢進と共にapoptosis抑制系の蛋白であるBcI-xLの発現も亢進していてFas/Fas ligandを介したapoptosisに抵抗性を持つ可能性を示した(論文投稿中)。3,HAM患者血清・髄液におけるTh1関連(IL-12,IFN-γ)およびTh2関連(IL-4,IL-10)サイトカインの検索では,Th1関連サイトカインが高値を示すことを明らかにした(J Neuroimmunol 95:185-189,1999)。4,HAMに対するペントキシフィリン治療前後におけるTh1およびTh2関連サイトカインの動態の検索では,その治療が有効な症例ではTh2サイトカインが上昇してくることを明らかにした(Inten Med 38:717-721,1999)。以上のように,HAM患者末梢血CD4陽性Tリンパ球ではHTLV-Iのhigh proviral loadを基盤としてTh1/Th2バランスが極端にTh1に偏り(Med Hypotheses,in press),そのことがHAMの発症・病態に強く関与していることを明らかにした。2、HAM患者末梢血CD4陽性Tリンパ球の機能面の検索。3、HAM患者血清・髄液におけるTh1関連及びTh2関連サイトカインの検索。血清・髄液におけるTh1関連(IL-12、IFN-γ)及びTh2関連(IL-4、IL-10)サイトカインの検索において、HAM患者では対照群に比較しTh1関連サイトカインは有意に高値であることを明らかにした。これらの結果ではHTLV-Icarrierと比較しても明らかに有意な差があり、HAM患者に特異的な現象と考えられる(J Neuroimmunol、in press)。4、治療におけるTh1関連及びTh2関連サイトカインの動態の検索。HAM患者に対するペントキシフィリン療法の前後で血清中Th1/Th2関連サイトカインの変動を検索した結果、その療法が有効な症例ではTh2サイトカインが上昇してくることが明らかにした(Internal Med、submitted)。以上のように、HAM患者末梢血Tリンパ球ではTh1/Th2バランスがTh1に傾いていることが明らかにされつつある。さらに、それらのTh1細胞は組織内に容易に浸潤しやすいことが推測される結果を得た。HAMに対する治療面に関しては、ペントキシフィリン療法で示したようにTh1/Th2バランスの是正がその治療効果と相関していた。これらの事実は今後のHAMに対する治療法の展開における重要性を示唆していると考えられる。1;HAM患者末梢血CD4陽性Tリンパ球におけるE-selectin陽性細胞機能とHTLV-1感染との関係についてHAM患者末梢血CD4陽性Tリンパ球では,Th1マーカーであるE-selectin ligand発現細胞が増加していることとそのE-selectin ligand陽性細胞の機能検索においてTh1サイトカインであるIFN-γ産生が著明に亢進していることを明らかにした。さらに,E-selectin ligand陽性細胞群ではHTLV-I proviral loadがE-selectin ligand陰性細胞群に比較して有意に高いことを明かにした。以上の事実よりHAM患者でのTh1へのimmune deviationは血管内皮細胞との接着における最初のステップであるrollingにおいて重要な役割を果たしているE-selectin ligand陽性CD陽性T

リンパ球の増加に起因し,E-selectin ligandの発現にはHTLV-I感染が強く関与していることが示された(論文投稿中)。2,HAM患者末梢血CD4陽性Tリンパ球の機能検索(2)HAM患者末梢血CD4陽性Tリンパ球ではFas抗原の発現亢進と共にapoptosis抑制系の蛋白であるBcl-xLの発現も亢進していてFas/Fas ligandを介したapoptosisに抵抗性を持ち,そのことが中枢神経系の慢性炎症に強く関与していることを示した(論文投稿中)。3,HAM患者血清・髄液におけるTh1関連(IL-12,IFN-γ)およびTh2関連(IL-4,IL-10)サイトカインの検索HAM患者では対照群(HTLV-I seropositiveおよびseronegative control)に比較してTh1関連サイトカインは有意に高値であることを明らかにした(JNeuroimmunol95:185-189,1999)。4,HAMに対する治療におけるTh1およびTh2関連サイトカインの動態の検索pentoxifylline療法の前後で血清中Th1/Th2関連サイトカインを検索した結果,その治療が有効な症例ではTh2サイトカインが上昇してくることが明らかにされた(Intern Med38:717-721,1999)。以上のように,HAM患者末梢血Tリンパ球ではHTLV-Iのhigh proviral loadを基盤としてTh1/Th2バランスが極端にTh1に偏り(Med Hypotheses,in press),そのことがHAMの病態に強く関与していることが示された。
ALS病因タンパク質FUSの細胞間伝播及び神経細胞障害性発揮メカニズムの解明

本研究では、家族性ALS病因タンパク質FUSの神経細胞間伝播、及び神経細胞障害性発揮の分子機序を明らかにすることを目標としている。1. FUSの神経細胞間伝播機序の解明。前年度に樹立したsplit-luciferase complementationを利用したFUS伝播センサー細胞を用い、FUSの細胞外放出に機序として、前年度unconventional放出機序であることを見出し、さらに本年度lysosome阻害薬、オートファジー阻害薬で阻害されないこと、さらに培養上清中に放出されたFUSが100,000 xgの超遠心の上清画分に存在することから、exosome放出機序を関与していないことを明らかにした。また、アルギニンメチル化阻害薬AdOxの添加によりFUS伝播が促進することを見出し、さらに前年度樹立したAAV9-FUS発現マウスにおいても、伝播のdonor neuron、recipient neuron双方が低メチル化FUS抗体に陽性であることを見出し、FUSの低メチル化がFUS重合・伝播に関与することを明らかにした。2. FUSの神経細胞障害性発揮機序の解明。TDP-43あるいはFUSを複眼に過剰発現することにより複眼変性を呈するショウジョウバエを用い、ストレス顆粒形成に関与するdAtaxin2を欠損ショウジョウバエと交配した。その結果TDP-43の毒性は軽減したもののFUSの毒性は軽減せず、TDP-43とFUSは異なる機序で神経毒性を発揮する可能性を見出した。また前年度明らかにしたFUS毒性を軽減するCKI delta/ipsilonについて、In vitro実験系で、CKI delta/ipsilonによるFUSのリン酸化セリン残基をタンパク質解析により明らかにした。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。1FUSの神経細胞間伝播機序の解明。まず培養細胞系でFUSの細胞間伝播を測定する実験系としてsplit-luciferase tagを付加したFUSを発現させたHEK293細胞を樹立し、FUSの細胞間伝播を測定するFUS伝播センサー細胞の樹立に成功した。そして、本実験系を用い、FUSがbrefeldin Aによって阻害されないunconventionalな経路で細胞外に放出されることを見出した。また、アデノ随伴ウイルスを用いてbicitronicにdTomatoとFUSを発現する実験系を樹立し、FUSの神経細胞間伝播を可視化する実験系の樹立に成功し、通常核内に存在するFUSが伝播によって細胞質に局在することを確かめた。これは何らかの異常性を獲得したFUSが神経細胞間を伝播した可能性を示唆するものである。2FUSの神経細胞障害性発揮機序の解明。FUSと過剰発現することにより進行性の複眼変性を呈するFUS tgショウジョウバエを用い、FUSの細胞外局在が毒性を増悪すること、さらにFUSの毒性はアミノ末端側のlow-complexity領域を介した自己重合に依存することを見出し、論文発表した(Matsumoto, Human Mo;ecular Genetics, in press, 2018)。さらに、casein kinase I delta/ipsilonを発現させることにより、FUS tgショウジョウバエの毒性が軽減することを見出し、現在low-complexity領域内でのリン酸化部位を同定しつつある。まず、神経細胞間伝播機序の解明のため、(I)細胞間伝播現象実証、(II)細胞間伝播分子機序の解明、(III)伝播能獲得機序の解明、の3段階の研究を計画している。これまでにFUSの神経細胞間伝播を測定するFUS伝播センサー細胞、及びFUSの神経細胞間を可視化する実験系の樹立に成功し、FUSが神経細胞間を伝播しうることを世界で初めて明らかにしたことから、(I)のステップは完了し、(II)の段階へ研究は進んでいる。また伝播したFUSの細胞質局在現象も見出しており、(III)の解明の端緒となると考えられる。また神経細胞障害性発揮の解明のため、(I)神経毒性分子内責任領域の同定、(II)神経毒性発揮分子機序の解明、(III)細胞間伝播が神経変性に及ぼす影響の解明、の3段階の研究を計画している。これまでにFUSの細胞質局在、及びlow-complexity領域を介した分子間重合が毒性に必須であることを見出したことから、(I)のステップは完了し、(II)の段階へ研究は進んでいる。また、毒性緩徐する手法としてcasein kinase I delta/ipsilonの効果を見出した。これはFUS-opathy患者の新たな治療法開発の切っ掛けとなることが期待される。これらの理由から本研究はおおむね順調に進んでいると言える。前年度に樹立したsplit-luciferase complementationを利用したFUS伝播