hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
機能相補クローニング法による新たな細胞周期制御遺伝子群の単離と機能解析

我々は細胞増殖を制御する以下に列挙するような新規の遺伝子を幾つかクローン化してきた。1.NIK1;分裂酵母のcdc2変異を相補する出芽酵母のcDNAでmRNA量がG1/S期でピークを持つ細胞周期性振動を繰り返す。その遺伝子産物は1518アミノ酸という酵母では非常に希なサイズの大きい蛋白質で分裂酵母のWeelを標的としてG2/M期を制御するNim1に類似のSer/Thrタイプのキナーゼモチーフを持っているところからNIK1(Nim1-Kin1,Kin2-like kinase)と命名した。過剰発現させたMIK1はnim1変異株を機能相補し、NIK1遺破壊株はG2期の遅延を生じ、細胞が異常に伸びた形態を示したところからNim1のホモログと結論した。2.サイクリンG結合蛋白質;West-western法によりサイクリンGと結合する新規のSer/Thrキナーゼをコードする遺伝子のクローン化に成功し、それをGAK(cyclin-G-associated kinase)と命名した。GAKはN末端側にCdk2と類似のキナーゼドメインを持ち、C末端側にアクチン結合性のテンシン(Tcnsin)、あるいはクラスリ(clathrin)に結合する機能未知のオ-グジリン(auxilin)とも強い相同性を示すドメインを有する。GAKの機能解析を継続中である。3.複製ライセンス因子;ヒトおよびツメガエルの複製ライセンス因子を構成する6つの蛋白質(xMcm2-7,hMcm2-7と命名)の遺伝子クローニングに成功し、複製ライセンス因子は確かに存在してほぼラスキーのモデルに合致する挙動を示すこと、それら酵母において複製制御に関わるものとして分子遺伝学的に解析されてきたMcm2,3,5のホモログであることを見い出した。(1)ベクターの開発とcDNAライブラリーの作製本年度はまず高効率な機能相補クローニングのための独自のベクター系を作製した。分裂酵母で発現させるためSV40プロモーター、flオリジン、T3/T7RNAポリメラーゼプロモーター、独自のマルチクローニングサイト、ARS、LEUマーカーなどを持つベクター(pLZ3)を作製した。パン酵母で機能発現させるためInvitrogen社のpYES3に独自のマルチクローニングサイトを挿入したものを作製した(pSY3およびpRY3)。これらはUra3,2μori,fl ori,GAL1,Ampなどの遺伝子やマーカーを持つ。これらをベクターとして独自に工夫したリンカープライマー法により各種のcDNAライブラリーを作製した。(2)cdc10などを宿主とした機能相補クローニングcdc10を宿主として分裂酵母cDNAライブラリーより単離したres1はパン酵母のSW14にアミノ酸が類似したアンキリンモチーフを2つ持つ蛋白質をコードし,Cdc10と複合体を構成する新規転写因子であった。亜鉛フィンガー1個とCDC36(パン酵母のG1変異株)類似配列を持つ蛋白質をコードし,そのmRNAは減数分裂に伴って大量に転写され始めるrep1はpremeiotic DNA synthesisの過程に重要な働きをすることがわかった。パン酵母から単離されたHAC1はゲルシフト法によっても証明できたようにbZIP型のCREB-likeな転写因子をコードする。その破壊株はカフェイン感受性を示しそのmRNAはG1期に転写量が増大する。cdc2,cdc13変異株を相補するヒト由来の13B68は、核マトリックス蛋白質(マトリン)モチーフを持ち同時に減数分裂過程の変異株pat1をも相補する。RNA結合蛋白質モチーフを2個ずつ持つscr2とscr3はcdc2の翻訳を誘導することで相補していることが分かった。真核生物における細胞増殖と分化(減数分裂)の接点における分子制御機構に関わる因子を単離する目的で分裂酵母のスタート近傍の変異株であるcdc

2およびcdc10変異株を機能相補する多コピー抑圧遺伝子を分裂酵母、出芽酵母、ヒト(Hela)細胞のcDNAライブラリーを用いて幾つかクローン化し、塩基配列を決定した。その大半(分裂酵母の場合)はcdc10^+/2^+遺伝子そのものであったが、出芽酵母、ヒトからはCdC2^+相同遺伝子はクローン化されたもののcdc10^+相同遺伝子はクローン化されなかった。分裂酵母からクローン化された新規遺伝子(rep1^+と命名)はZn-フィンガーを持つ転写因子で、その5'上流にTRボックスを持つ。減数分裂過程において転写の激増する減数分裂関連遺伝子である。その破壊株を作製して調べてみると、前減数分裂DNA合成の直前で停止した減数分裂の阻害された表現型を示した。一方、出芽酵母からクローン化されたcdc10の多コピー抑圧遺伝子であるAAC1はCREBに類似のbZip構造を持つ転写因子である。ゲルシフトアッセイにより、その遺伝子産物は確かにCREモチーフに特異的に結合した。AAC1遺伝子もその5'上流にT4Cサイトを持つ減数分裂過程において2つのピークを示す転写量の変動を示す減数分裂関連遺伝子である。その変動はSW16の破壊株では正常だがAWI4の破壊株ではピークが消えて変動しなくなることからSWI4による転写制御を受けていると考えられる。HAC1の破壊株は成育その他には何の影響も示さなかったがカフェインに対する生育阻害を示した。その阻害効果はPDE2の発現により回復したことからcAMP濃度上昇→cAMP依存性蛋白キナーゼの活性化→AAC1リン酸化→標的遺伝子転写制御→増殖・減数分裂制御という図式が考えられるが、その実際は現在解析中である。これら因子とCdc10蛋白との相互作用の有無とその機能の解析が今後の課題である。我々は細胞増殖を制御する以下に列挙するような新規な遺伝子を幾つかクローン化してきた。(i)NIK1;分裂酵母のcdc2変異を相補する出芽酵母のcDNAでmRNA量がG1/S期でピークを持つ細胞周期性振動を繰り返す。その遺伝子産物は1518アミノ酸という酵母では非常に希なサイズの大きい蛋白質で分裂酵母のWeelを標的としてG2/M期を制御するNim1に類似のSer/Thrタイプのキナーゼモチーフを持っているところからNIK1(Nim1-Kin1,Kin2-like kinase)と命名した。過剰発現させたNIK1はnim1変異株を機能相補し、NIK1遺破壊株はG2期の遅延を生じ、細胞が異常に伸びた形態を示したところからNim1のホモログと結論した。(ii)サイクリンG結合蛋白質;West-western法によりサイクリンGと結合する新規のSer/Thrキナーゼをコードする遺伝子のクローン化に成功し、それをGAK (cyclin G-associated kinase)と命名した。
卵子成熟と関連したヒト及びマウス流産因子の検索と人為的卵子改良の検討

ヒトの未熟卵子を人工的に成熟させた卵子(ヒト老化モデル卵子)は、40代女性の老化した卵子と同じ性質を示します。このモデル卵子を使って卵子の老化現象の解明を試みました。その結果、老化モデル卵子をある薬剤で処理すると老化現象が緩和され、受精したあとの成長が促進されることが明らかになりました。さらに、この卵子老化の緩和は、細胞分裂を調節する蛋白の量が卵子の内部で変化したことで引き起こされていた。その他にも様々な遺伝子を比較した結果、卵子の老化に伴って働きが変化している可能性のある蛋白が多数認められました。これらのデータを更に解析することで人為的に卵子を若がえらす手段を確立して行きます。本申請は雌性発生評価法を用いてヒト及びマウス卵子の成熟不良・加齢変性メカニズムを解明し、体外成熟系を利用した卵子クオリティー改良法の確立を最終目標としている。25年度にかけては(1)マウスを用いて卵子体外成熟(IVM)系の確立とIVM卵子の雌性単為発生における卵子活性化率および胚盤胞形成率低下の因子を明らかにする。(2)マウスおよびヒト未熟卵子において「卵子成熟不良と染色体異常の関連性」を検討する。(1)に対して、各種系統マウスを用いて卵子体外成熟(IVM)系の確立とIVM卵子の雌性単為発生における化学刺激による卵子活性化法の確立を行った。塩化ストロンチウムによる刺激法では、その活性化効率は若齢体内成熟卵>老齢体内成熟卵=若齢体外成熟卵>老齢体外成熟卵となり、体外成熟や老化による活性化率の低下が顕著である事を確認した。これに加えて新たに細胞内のCaイオン上昇を直接誘起すると考えられるイオノマイシンによる活性化法を導入しその有効性を確認できた。このため両活性法による活性化率、発生率の違いをもとに、多角的に成熟不良・加齢変性を検討する事が可能となった。特に、ヒト卵子ではストロンチウムの効果が弱く、イオノマイシンによる活性化が必須である事が確認でき、マウス卵子実験系とヒト卵子実験系の整合性をつける事が可能と思われた。(2)ヒト未熟卵子における成熟と染色体異常に関連する因子の検索を第一に行った。ヒト未熟卵子の微小管分布を化学薬品を用いて変化させることにより、減数分裂途中での染色体の異常分離が抑制されると同時に胚盤胞形成率が高まる事が確認された。このとき、細胞周期依存性蛋白キナーゼの局在が高まる可能性が蛍光免疫染色により確認され、このキナーゼ活性の低下が卵子形成不良に関わる因子の重要な一つである可能性が確認された。そこで、マイクロアレイによる網羅的な解析による比較が進行中である。24年度25年度にかけては(1)マウスを用いて卵子体外成熟(IVM)系の確立とIVM卵子の雌性単為発生における卵子活性化率および胚盤胞形成率低下の因子を明らかにする。(1)に対して、各種系統マウスを用いて卵子体外成熟(IVM)系の確立とIVM卵子の雌性単為発生における化学刺激による卵子活性化法の確立を第一に行った。塩化ストロンチウムは細胞膜下でのフォスフォリパーゼC上昇に関わると考えられているが、これに加えて新たに細胞内のCaイオン上昇を直接誘起すると考えられるイオノマイシンによる活性化法を導入しその有効性を確認できた。(2)に対して、マウスでは実験系の確立途中であるので、ヒト未熟卵子における成熟と染色体異常に関連する因子の検索を第一に行った。ヒト未熟卵子の微小管分布を化学薬品を用いて変化させることにより、減数分裂後の染色体の異常分離が抑制されると同時に胚盤胞形成率が高まる事が確認された。

本研究により以下の点が成果が得られた。1卵成熟の初期に微小管上を移動する細胞周期関連蛋白が卵子の老化に関与:未熟な卵核胞期卵子を微小管重合安定剤のタキソールで処理した老化卵子モデルでは老化現象が緩和され、受精後の胚盤胞形成率も上昇することを確認した。すなわち微小管分布とそれにかかわる細胞周期関連蛋白が老化関連因子であることが示唆された。2ヒト老化卵子モデルではオーロラ蛋白の発現量が低下:老化卵子モデル系とタキソール処理の組合せが老化関連蛋白の検索に有効であることが明らかになった。そこで、がん細胞において核分裂に先立ち細胞質から核に移行して染色体凝集と分配を制御するオーロラ蛋白の蛍光免疫染色を試みた。その結果、陽性コントロールの幼若マウスではオーロラ蛋白は未成熟卵子の核及び成熟卵子の紡錘体に局在するのに対し、ヒト老化モデル卵子では卵核胞内にオーロラ蛋白が検出されなかった。一方、タキソール処理後には卵核胞内で特にリン酸化オーロラ蛋白の発現上昇が認められ、卵子老化現象の一因がオーロラ蛋白の発現異常であることが示唆された。3マイクロアレイによる老化モデル卵子の遺伝子発現変化:マイクロアレイを用いてタキソール処理前後でmRNA転写量を比較した結果、サイクリンを含む細胞周期蛋白、エンドサイトシス関連膜輸送蛋白、微小繊維関連蛋白に大きな発現量の差が認められた。この結果は今後の卵子老化研究に有用な情報となった。精子、卵子および受精卵の発生遺伝学本研究は、マウス卵子の雌性単為発生胚による解析が中心であり、当初、電気刺激により非浸潤的に単為発生を誘導することを計画していた。しかしながら、現有設備である電気刺激装置が実験開始当初に故障・修理不能となり、代替機の準備に時間を要した。また、マウス卵子を用いたマイクロアレイを委託したが、原因不明のRNA分解により再度の委託が必要となった。これらの点が、研究の遅れとスケジュール変更の原因となった。本研究は、マウス卵子の雌性単為発生胚による解析が中心であり、当初、電気刺激により非浸潤的に単為発生を誘導することを計画していた。しかしながら、現有設備である電気刺激装置が実験開始当初に故障・修理不能となり、代替機購入の可能性の検討およびこれと平行して、新たなる化学物質による単為発生誘発法の代替導入が急遽必要となった。この点が、研究の遅れとスケジュール変更の原因となった。(1)「ヒト卵子成熟に伴う遺伝子発現変化の検索」:当初はマウス卵子を用いてマイクロアレイを行う予定であったが、サンプルの分解というトラブルに遭遇した。そこでヒト卵子成熟過程において変動する遺伝子を先にマイクロアレイで網羅的に検索し、それらの変化をヒト及びマウス卵子でReal time-PCRおよびウエスタンブロットを用いて発現量を詳細に検討すると共に、免疫組織化学を用いて視覚的に発現量の時間的位置的変化をとらえる。(2)「卵子成熟不良と染色体異常の関連性」:雌性発生評価ではマウス成熟不良卵子において卵活性化と極体放出が著しく乱れるため細胞膜の流動性が変化していると考えられる。また、この現象が卵割初期のモザイクや倍数性染色体異常増加の一因であることを示唆するデータを得ている。そこでアクチン分布及び表層顆粒膜の変化を蛍光色素又は抗体を用いて定量化する。同時に新たにアクチン修飾作用のある試薬とヒアルロン酸を用いて膜流動性の変化や極体放出異常を抑制する効果があるかを検証する。(3)ヒト卵子成熟において特定のキナーゼの発現量が減数分裂における染色体分配に作用し、結果として受精後の初期発生能に関わる事を確認した。
課金方式が消費者行動に与える影響に関する研究

平成30年度は、課金方式が価格イメージ及びサービスに態度に与える影響を検討した。検討にあたっては、主に課金方式の複雑性(価格複雑性)が消費者反応に与える影響に焦点を当てた。価格複雑性とは、例えば、価格を複数の構成要素に分割して示すなど、最終的な支出額を算出するのに負荷が課される程度を指す。消費者の積極的な価格比較は価格競争に巻き込まれる原因ともなる。そのため、企業視点で考えれば、価格複雑性を高めることは、利益最大化の観点から合理的戦略であるとされる。一方、消費者視点においては、価格複雑性に対して消費者反応がどのような反応をするのかについて検討される機会は少ない。本年度は、2種類の調査から定量的検証を行った。結果、(1)価格複雑性は、知覚価格にネガティブな影響を与え、結果としてサービスに対する態度にもネガティブな影響を与える可能性が高いこと、(2)価格複雑性は総支出額の過大評価に導くとともに、仮に総支出額が高くなっても、消費者は複雑な料金体系よりもシンプルな料金体系を好む傾向があること、(3)企業が価格複雑性を高める場合には、企業の利益も高まる可能性が先行研究では指摘されているが、消費者反応の視点を踏まえれば、企業の利益にネガティブな影響を与える可能性が高いこと、したがって、価格設定に際しては、消費者が知覚する価格複雑性を考慮する必要があり、企業は複雑な課金方式よりも,消費者が理解しやすいシンプルな課金方式にすべきこと等を明らかにした。平成30年度は、課金方式の複雑性と課金プラン数の視点から、(1)課金方式の価格イメージへの影響、(2)サービスに対する態度、に与える影響を検討する予定であった。課金プラン数の影響については、実証分析ができておらず、次年度において分析を行う予定である。研究計画に基づき、課金プラン数が価格イメージと消費者態度に与える影響、契約型課金を前提として消費者が課金方式を評価する際に影響する要素に関わる定量的調査を行う予定である。また、平成30年度の成果については学会(国内については日本商業学会、国外については台湾日本語言文藝研究学会などを予定)での報告、学会誌への投稿を検討している。平成29年度は、先行研究の整理を行うとともに、課金方式と消費者反応に関わる定量的検討を行った。課金方式と消費者反応をテーマとした先行研究の多くは、従量料金制と定額料金制の選択を前提として、常に合理的判断がなされるわけではないことを指摘している。一夫で、料金制選択に関する実証的研究は少なく、その結果も一貫していない。まず、従量料金制と定額料金制をテーマに、2つの視点からさらなる検討を行った。1点目に、従量料金制と定額料金制の選択に影響する要因を検討した。調査の結果、料金選択には支出の痛み(金銭を手放す際に経験する負の感情)の程度と消費目的(機能的必要性をベースとした消費/喜び・楽しみを目的とした消費)が影響しやすいことが明らかとなった。2点目に、料金選択ではなく料金評価という視点から、従量料金制と定額料金制の料金水準に対する消費者の高低判断の仕組みを検討した。調査の結果、料金の高低判断にあたっては、支出額算出のための努力回避のため、従量料金は平均支出額、定額料金は総支出額といったように、直接的な料金水準が高低判断に使われること、また、料金制の選択問題のように、従量料金制と定額料金制の両方が提供されるケースにおいては、一方の料金が外的参照価格として採用されるため、定額料金が高いと、従量料金の価格魅力度は高まりやすく、従量料金が高いと、定額料金の価格魅力度は高まりやすい関係にあることが明らかとなった。また、課金方式に関わる事例研究に伴い、フリーミアム課金方式について、無料版と有料版の評価の関係性について定量的に検討した。調査の結果、無料版と有料版の間で認識される機能差の大きさと有料版の評価にはポジティブな関係があること、無料版の使用期間の制限は有料版に対する支払い意思額を低下させづらいこと、などが明らかとなった。平成29年度は(1)先行研究のレビュー、(2)課金方式の評価・選択に関わる定量調査、(3)事例研究を行う予定であった。現在のところおおむね順調に進んでいる。

結果、(1)価格複雑性は、知覚価格にネガティブな影響を与え、結果としてサービスに対する態度にもネガティブな影響を与える可能性が高いこと、(2)価格複雑性は総支出額の過大評価に導くとともに、仮に総支出額が高くなっても、消費者は複雑な料金体系よりもシンプルな料金体系を好む傾向があること、(3)企業が価格複雑性を高める場合には、企業の利益も高まる可能性が先行研究では指摘されているが、消費者反応の視点を踏まえれば、企業の利益にネガティブな影響を与える可能性が高いこと、したがって、価格設定に際しては、消費者が知覚する価格複雑性を考慮する必要があり、企業は複雑な課金方式よりも,消費者が理解しやすいシンプルな課金方式にすべきこと等を明らかにした。平成30年度は、課金方式の複雑性と課金プラン数の視点から、(1)課金方式の価格イメージへの影響、(2)サービスに対する態度、に与える影響を検討する予定であった。課金プラン数の影響については、実証分析ができておらず、次年度において分析を行う予定である。平成30年度は、研究計画に基づき、課金方式がサービスの価格イメージ・態度に与える影響を検討する。具体的には、課金方式の複雑化及び課金方式のプラン数が価格イメージと消費者態度に与える影響をテーマに、定量的調査を行う予定である。また、平成29年度の成果については学会(国内については経営行動研究学会などを予定)での報告、学会誌への投稿を検討している。研究計画に基づき、課金プラン数が価格イメージと消費者態度に与える影響、契約型課金を前提として消費者が課金方式を評価する際に影響する要素に関わる定量的調査を行う予定である。また、平成30年度の成果については学会(国内については日本商業学会、国外については台湾日本語言文藝研究学会などを予定)での報告、学会誌への投稿を検討している。実査費用が当初よりも若干安くなったため。次年度使用額については、平成30年度の実査費用として使用する予定である。次年度使用額については、実査費用として使用する予定である。
国連海洋法条約の紛争解決手続における客観訴訟の可能性

国連海洋法条約(UNCLOS)の紛争解決手続における「客観訴訟」(あるいは「公益訴訟」)の可能性を検討する。条文上は明示されていないものの、UNCLOS紛争解決においても客観訴訟が認められると解する学説は以前から多く見られる。同時に、近年の判例においても、(明示ではないにせよ)この点を認める傾向が見られる(例:2011年の勧告的意見、南シナ海事件仲裁判断など)。日本にとっては重要な実務的な問題であり、沖ノ鳥島や商業捕鯨に関しては、客観訴訟を理由としてUNCLOS紛争解決手続に付託される可能性があり、喫緊の課題である。
インフルエンザウイルスの遺伝子変異率を規定する分子基盤の解明

A型インフルエンザウイルスの遺伝子変異率を規定する分子基盤を解明するため、ウイルスのPB1遺伝子にランダムな変異を持つウイルスライブラリーを構築した。このウイルスライブラリーの中から、(1)抗ウイルス薬に対する感受性が低下したウイルスクローン、ならびに(2)レポーター遺伝子の発現安定性が上昇したウイルスクローンを選抜した。各ウイルスクローンの遺伝子変異率のレポーターアッセイによる確認とPB1遺伝子の解析を通じて、遺伝子変異率を上昇ならびに低下させるPB1遺伝子変異を同定した。ヒトを含む様々な動物に感染して多大な健康・経済被害をもたらすA型インフルエンザウイルスは、RNA遺伝子をゲノムとする。RNA遺伝子の合成を担うRNA依存性RNAポリメラーゼ(RNA-dependent RNA polymerase;RdRp)には、遺伝子の転写・複製時にミスが生じた際の修復・校正機能(proofreading活性)が備わっていないため、RNAウイルスの遺伝子変異率は、DNAをゲノムとする生命体と比べて極端に高い。この遺伝的特性は、多くの子孫ウイルスが感染・増殖性を失うデメリットを伴う一方で、遺伝的多様性の観点からは大きなメリットとなる。とりわけインフルエンザウイルスの場合、その遺伝子変異率の高さが、宿主免疫からの回避や新たな宿主への適応、薬剤耐性化などに寄与していると考えられる。しかし、その分子基盤は明らかになっていない。本研究は、A型インフルエンザウイルスの遺伝子変異率を規定する分子基盤を解明することを目的として、PB1蛋白質に備わる4つのRdRpモチーフ(全てのRNAウイルスに幅広く保存され、RNA遺伝子の転写・複製過程において中心的な役割を担う)のコード領域にランダムな変異を持つウイルスライブラリーを構築し、その中から遺伝子変異率が大きく上昇または低下したウイルスクローンを選抜して変異部位を特定する。これまでに申請者は、上記のウイルスライブラリーの人工合成に必要な全てのプラスミドの準備を完了しており、これらのプラスミドを用いたウイルスライブラリーの作出も完了した。A型インフルエンザウイルスのRNA遺伝子の合成を担うRNA依存性RNAポリメラーゼ(RNA-dependent RNA polymerase;RdRp)には、遺伝子の転写・複製時のミスを修復・校正する機能が備わっておらず、その遺伝子変異率は、DNAをゲノムとする生命体と比べて極端に高い。この遺伝的特性は、多くの子孫ウイルスが感染・増殖性を失うリスクを負う一方で、遺伝的多様性の観点からは、宿主免疫からの回避や新たな宿主への適応、薬剤耐性化などの面で大きなメリットとなる。本研究では、A型インフルエンザウイルスの遺伝子変異率を規定する分子基盤を解明することを目的として、PB1蛋白質に備わる4つのRdRpモチーフ(全てのRNAウイルスに幅広く保存され、RNA遺伝子の転写・複製過程において中心的な役割を担う)のコード領域にランダムな変異を持つウイルスライブラリーを構築し、その中から遺伝子変異率が大きく上昇したウイルスを6クローン、低下したウイルスを3クローン、各々選抜した。各ウイルスクローンの変異部位を遺伝子解析により特定し、その遺伝子変異率の野生型ウイルスとの差異をレポーターアッセイにより確認した。以上の結果から、本研究で同定されたアミノ酸変異は、A型インフルエンザウイルスの遺伝子変異率を規定している可能性が示唆された。今後、各ウイルスクローンの遺伝子変異率をより直接的な方法で検証することにより、本研究の発見の重要性が増すと考えられる。当初の計画通り、ウイルスライブラリーの作出まで完了したため。ウイルス学作出したウイルスライブラリーをもとに、遺伝子変異率が大きく変化したウイルス株の選抜・分離を進め、遺伝子解析を通じて変異部位の特定を進めていく。謝金により年度途中に技能補佐員を採用し、技術指導等に時間を割いた結果、相対的に研究計画の遂行に直接関わる物品費(消耗品など)の支出が抑えられたため。技術を修得した技能補佐員と共に、多くの物品費を要する本研究計画を遂行していく。また、その研究成果を学会・学術雑誌等において積極的に発表・公表していく。
三分岐型から二分岐型への中等学校制度再編に伴うドイツ教育評価制度の変容

本研究は、これまのドイツに典型的な三分岐型の中等学校制度が二分岐型へと再編されるなか、その教育評価の制度はどのように変容しているのかについて、その変容過程を構造的に解明した。またそれをもとにドイツの教育評価の機能がどう変化しているのかを分析した。ドイツの学校制度は、できるだけ多くの生徒が中等前期修了資格や大学入学資格(アビトゥア)を得られるよう、生徒の進路変更をより柔軟に認める方向で変容し、その結果として分岐型制度の弾力化が生じているが、教育評価(修了資格)制度は三分岐型を維持している。その結果、教育評価に伴う生徒の包摂機能が少し強まり、選抜機能は制度的な多元化が進んでいる。本研究の目的は、ドイツの中等学校制度が三分岐型から二分岐型へと再編されるに伴い、教育評価制度がどのように変容しているのか、その変容過程を構造的、実証的に解明することである。本年度は、本研究に関連する文献、政策文書、報告書を幅広く収集した。とりわけ、ラインラント・プファルツ州、バイエルン州、ベルリン市では教育省の行政担当官および各中等学校の協力により、第一次資料が入手できたと同時に改革の実相について聞き取り調査が実施できた。本年度において重点的に調査したラインラント・プファルツ州では、2009年より基幹学校が廃止され、それを旧来の実科学校に統合した新制実科学校に再編され、二分岐型の中等学校制度に移行した。しかし、新制実科学校の内側で依然として旧来の基幹学校と実科学校の区分が残っており、修了資格もそのまま維持されていた。この州では、これまで基幹学校の修了資格しか取得できなかった生徒たちに、できるだけ実科学校レベルの修了資格を取得してもらいたいという意図で改革が進められた。ところが、改革を始めて数年が経過してみると、学校によっては、むしろ逆の現象も生じていることが判明した。すなわち、従来であれば実科学校レベルの修了資格を取得できていたような生徒たちが基幹学校の修了資格に甘んじているケースも散見されるようになったのである。これらの文献、政策文書、報告書のレビューならびに現地調査から、現在のドイツでは三分岐型から二分岐型へと制度のレベルでは再編されている一方で、児童生徒の成績評価やそれに伴う修了資格制度の改革は、依然として極めて限定的なものであることが判明した。本年度は、関連文献や文書、訪問調査による情報収集に加え、国内外の学会や研究会において本研究の進捗状況を報告することができた。情報収集では、ラインラント・プファルツ州およびバイエルン州において、教育省の行政担当官および各中等学校の協力のもと、昨年度に引き続き、さらなる調査が実施できた。その結果、特に本年度は、通信簿の改革事例についても、より詳細な資料が収集できた。また進捗状況の報告では、とりわけPISAショック以後の中等学校制度再編の動向について議論した。昨年度まではラインラント・プファルツ州に限定して考察したが、三分岐型から二分岐型への学校制度が再編される一方で、児童生徒の成績評価やそれに伴う修了資格制度は依然として三分岐型を維持していることを解明した。本年度は、その傾向がドイツ全州に当てはまるかどうかについて考察した。その結果、ドイツの中等学校制度はどの州でも、鉄道システムに例えると、3種類の学校(線路)は3本から2本(ギムナジウム+1種)になろうとしているが、修了資格(終着駅)の数は3種類のまま、ギムナジウム以外の学校(1つの線路)に2つの「路線(ライン)」を併設(相互乗入)していると解釈できるに至った。したがって、ドイツの中等学校制度が「三分岐型」なのか「二分岐型」なのかは、理論的には、学校制度を「線路」(実体概念)として考えるのか、それとも「路線」(構成概念)として理解するのかによって決まってくることがわかった。本研究の目的は、ドイツの中等学校制度が三分岐型から二分岐型へと再編されるに伴い、教育評価制度がどのように変容しているのか、その変容課程を構造的、実証的に解明することである。本年度は、関連文献や政府文書による情報収集を継続しながら、バイエルン州、ラインラント・プファルツ州、ノルトライン・ヴェストファーレン州、バーデン・ヴュルテンベルク州およびニーダーザクセン州において現地調査を実施し、教育評価制度の変容について、バンベルク大学での研究討議を通してドイツ全体の改革動向を統一的に把握しようと試みた。またこれらの成果を順次、日本比較教育学会、ヨーロッパ教育学会(ECER)、世界教育学会(WERA)および中国四国教育学会において発表した。ドイツ全体の改革動向として言えるのは、ドイツにおいても単線型制度のメリットが理解されつつも、伝統的な三分岐型の修了資格制度を維持しているため、従来の分岐型制度を急に変えるわけにはいかない。したがって、初等の基礎学校の単線型制度を中等段階まで延長し、生徒の進路変更をより柔軟なかたちで認める方策が採用されつつあるということである。すなわち、分岐型制度は弾力化するけれども、弾力化しても分岐型そのものは維持していることがわかった。他方、教育評価制度の変容は、修了資格制度が三分岐型を維持しつつも、選抜制度の複線化が進んでいることがわかった。ドイツでは生徒の進路選択において保護者の決断が尊重されるが、それでうまくいかない場合の選抜方法が、従来の学校の成績だけではなく、複数の選抜方法が準備されつつあるのである。

当初の予定通り、本研究に関わる文献や資料を通して情報収集ができ、さらにインタービュー調査や研究討議によって考察を加えることができたため。ただし、ドイツ各州の改革が同時進行で進むわけではないため、改革速度の緩やかな州の事例の情報を集めるのに時間を要し、州によっては改革動向のうち一部把握できていない可能性もあり、「おおむね順調に進展している」とした。本研究は、ドイツの中等学校制度が三分岐型から二分岐型へと改革されるなか、各州の中等学校は実際にどのように再編されたのか、またそれに伴い教育評価制度はどのように変化しているのかについて明らかにしてきた。まず、中等学校制度の改革状況について、ドイツ全体の改革動向として言えるのは、分岐型制度は弾力化するけれども、弾力化しても分岐型そのものは維持しているということである。すなわち、ドイツにおいても単線型制度のメリットが理解されつつあるが、生徒の学力レベルが異なり、また修了資格制度も異なるドイツでは、従来の分岐型制度を残さざるを得ない。したがって、初等教育段階(基礎学校)の単線型制度を中等教育段階に延長し、生徒の進路変更をより柔軟なかたちで認める方策が採用されている。次に、教育評価制度の変容について、ドイツ全体として、次のように言える。すなわち、学校制度再編により学校制度は一見すると変わりつつあるように見えるが、修了資格制度は依然として三分岐型を維持している。その一方で、選抜制度は多様化が進んでいる。具体的には、生徒の進学先の選択ではまず保護者の決断を尊重するが、それでうまくいかない場合は、学校の成績または試験によって決める。それでもうまくいかないのであれば、進学先の判断や学区制度あるいは抽選などの方法で決定し、あとは後半の進路変更を柔軟に認めて微調整を行うのである。つまり、従来のように学業成績(教育評価)が生徒たちの選別・配分機能を保持しつつも、選別・配分機能を果たす別の仕組みも導入されつつあることがわかる。本研究は、これまのドイツに典型的な三分岐型の中等学校制度が二分岐型へと再編されるなか、その教育評価の制度はどのように変容しているのかについて、その変容過程を構造的に解明した。またそれをもとにドイツの教育評価の機能がどう変化しているのかを分析した。ドイツの学校制度は、できるだけ多くの生徒が中等前期修了資格や大学入学資格(アビトゥア)を得られるよう、生徒の進路変更をより柔軟に認める方向で変容し、その結果として分岐型制度の弾力化が生じているが、教育評価(修了資格)制度は三分岐型を維持している。その結果、教育評価に伴う生徒の包摂機能が少し強まり、選抜機能は制度的な多元化が進んでいる。当初の予定通り、本研究に関わる新たな文献や資料、事例について情報が収集でき、また国内外の学会や研究会で研究の進捗状況を報告し、議論を通して(特に理論的な)考察を深めることができたため。今後は各州の改革の進展を追いながら、教育評価制度の機能的変容について理論的に説明できるように精緻な分析を行う。教育学(比較国際教育学)今後は当初の計画に沿って、ラインラント・プファルツ州を中心に、バイエルン州やベルリン市などの事例に焦点を当てて、さらに研究を進め、理論的な考察をさらに先鋭化させる。
FALS変異SOD1導入ES細胞由来in vitroモデル神経細胞の樹立と解析

FALS SOD1変異導入のためのtransgeneを脊髄運動ニューロンのモデル細胞であるNSC34細胞およびマウスES細胞に安定導入した。NSC34細胞及びES細胞有来の神経細胞にCre recombinaseをadenovirus vectorにより一過性発現させ、変異SOD1の発現を誘導した。変異SOD1を誘導した細胞は予想に反し、lacZを感染させた細胞、すなわち野生型SOD1を発現している細胞と比較して顕著な細胞死は観察されなかった。そこで、より疾患特異性の高いモデル作製のため、ES細胞から脊髄運動ニューロンに高効率に分化誘導する系の確立を目指した。この目的のため、運動ニューロンの分化に必要なSonichedgehog(Shh)を産生するCHO細胞(Shh産生細胞)を、Shhの脂質付加の状態(N末端パルミトイル化、C末端コレステロール化)に着目し3系統作製した。このShh産生細胞を我々が2003年に既に報告している神経分化誘導法へと組み入れることでES細胞から脊髄運動ニューロンへの分化誘導を試みた。ES細胞の高効率運動ニューロン分化誘導法の開発と平行し、作製したShh産生細胞および各種一過性発現系を用いて、脂質付加型Shhの細胞内輸送、分泌機構について検討を行い、N末端パルミトイル化されたShhは極めて分泌されにくいこと、これは細胞内(特に小胞体)に蓄積されているためであること、細胞外への分泌にはキャリアが必要なこと等が明らかになった。また、Shhの脂質付加のネガティプレギュレータを発見した。これらの成果は現在投稿中である。FALS SOD1変異導入のためのtransgeneを脊髄運動ニューロンのモデル細胞であるNSC34細胞に安定導入した。この細胞にCre recombinaseをadenovirus vectorにより一過性に発現させ、変異SOD1の発現を誘導した。また、ES細胞を運動ニューロンに高効率に分化誘導するために必要なSonic hedgehogを産生するCHO細胞を樹立した。実際にこの細胞を私たちが確立した神経分化誘導法に組み合わせると、ES細胞由来の神経前駆細胞において、運動ニューロンの前駆細胞のマーカーである01ig2の発現の上昇が認められた。平成16年度に改良したトランスジーン(promoter-loxP-WT-SOD1-ECFP-IRES-neo-loxP-)をES細胞に導入し、CFPの青色蛍光を指標に発現の高いクローンを複数樹立した。このうち1クローンについては神経細胞へと分化誘導可能であることを確認した。この細胞を更に筋萎縮性側索硬化症において選択的に変性する神経細胞の一つである脊髄運動ニューロンに高効率に分化誘導する目的で、運動ニューロンの分化に必要なSonic hedgehog (Shh)を産生するCHO細胞株を3系統樹立した。これらは、1)N末端パルミトイル化・C末端コレステロール化両者を有するShhを分泌する系統、2)C末端コレステロール化のみを有するShhを分泌する系統、3)N末端パルミトイル化・C末端コレステロール化いずれも有さないShhを分泌する系統である。これらの細胞の解析から、両脂質付加を有するShhを分泌する系統ではShhは非常に分泌されにくい一方で、Dispatched1の発現によりその分泌が促進されること、両脂質付加を有するShhを分泌する系統及びC末端コレステロール化のみを有するShhを分泌する系統では、Shhは一部がfurinによりN末端の1015残基が欠失すること、N末端パルミトイル化のないShh及びfurinによりN末端が欠失したShhの分泌はDispatched1により制御されないことが分かった。

これに加えて、両脂質付加を有するShhを分泌する系統及びC末端コレステロール化のみを有するShhを分泌する系統がShhを分泌するためには培地中に血清中の成分が必要なこと、無血清培地でもアルブミンまたはヘパリンを添加するとShhの分泌が促進されることが明らかになり、運動ニューロン分化の過程でShh産生細胞とES細胞由来の細胞をコカルチャーする際にこれらを添加すると有効である可能性が考えられ、現在検討中である。
光硬化型グラスアイオノマーセメントの理工学的性質におよぼす光線照射条件の影響

本研究では,光硬化型グラスアイオノマーセメントの理工学的性質におよぼす光線照射条件の影響を検討し,効果的な臨床使用法を確立することを目的として研究を継続している。二年目にあたる平成5年度は,小野瀬英雄との共同研究によりセメント泥の理工学的性質について検討した。その結果,以下の知見を得た。1.光線照射条件がセメント練和泥の理工学的性質におよぼす影響についての検討本セメントの機械的強さは光線照射後も長期にわたり向上していくことが認められ,これは見かけ上では硬化反応が終了していてもさらに進行していくためであると考えられる。また照射直後の理工学的性質は,光線の照射条件に大きく影響されるものと考えられ,照射時間の延長また照射までの時間の短さ,光強度の強さにも影響を受けた。さらにバーニッシュの塗布によって着色性は減少した。2.光線照射条件が歯質接着性におよぼす影響について本セメント硬化物の象牙質接着性については,化学重合機構を優先して発現させることは照射時期の変更では困難であり,臨床ではセメントの練和後,可及的に早く光線を照射する必要性があることを意味しているものと考えられた。光硬化型グラスアイオノマーセメントの象牙質に対する接着強さは,光エネルギーと密接な関連を有していることが確認され,光強度の低下している照射器については,照射時間の延長が,有効な臨床対処法となることが示唆された。以上から,本セメントの理工学的性質の向上という観点からは,光線照射が重要な因子となっており,その光線照射の時期としては,セメント練和後の比較的早い時期が望まれることが示唆された。本研究では,光硬化型グラスアイオノマーセメントの理工学的性質におよぼす光線照射条件の影響を検討し,本セメントの特徴を引き出しより効果的な臨床使用法を確立することを目的として研究を継続している。初年度にあたる平成4年度は,小野瀬英雄との共同研究により光線照射条件の光学的検討を行い,さらにセメント練和泥の理工学的性質について検討した。1.光線照射条件の光学的検討(1)代表的な光硬化型グラスアイオノマーセメントのFuji II LCの製造者である(株)GCは,その照射器としてGC New Light VL-2の使用を薦めているが,その照射器の光強度をラジオメーターにより測定した結果,1100-1200W/m^2の高い光強度が測定された。しかし現在市販されている光照射器では,このように高い光強度を持つ製品は少なかった。(2)光強度が長時間にわたっても安定しており,照射条件の設定に適していると考えられるアルゴンイオンレーザー照射器の光強度は,(1)で測定した光強度と同一に設定することは可能であった。(3)Fuji ll lCの光線透過率を測定したところ,厚さ2mmの試片ではA-2シェードで10%であった。2.セメント練和泥の理工学的性質について(1)硬化時間は光線照射の時期の同一と考えられた。しかし光線を照射しなくても化学硬化により硬化は進行し,Lining LC(GC)では7分30秒で,またXR lonomer(Kerr)では27分30秒で硬化が完了した。(2)稠度は練和終了から徐々に上昇するが,光線照射により測定が不可能になった。次年度は,光線照射時間や時期などの条件を変化させ,その理工学的性質におよぼす影響を検討する予定である。本研究では,光硬化型グラスアイオノマーセメントの理工学的性質におよぼす光線照射条件の影響を検討し、効果的な臨床使用法を確立することを目的として研究を継続している。

1.光線照射条件がセメント練和泥の理工学的性質におよぼす影響についての検討本セメントの機械的強さは光線照射後も長期にわたり向上していくことが認められ,これは見かけ上では硬化反応が終了していてもさらに進行して行くためであると考えられる。また照射直後の理工学的性質は,光線の照射条件に大きく影響されるものと考えられ,照射時間の延長また照射までの時間の短さ,光強度の強さにも影響を受けた。さらにバーニッシュの塗布によって着色性は減少した。2.光線照射条件が歯質接着性およぼす影響について本セメント硬化物の象牙質接着性については,化学重合機構を優先して発現させることは照射時期の変更では困難であり,臨床ではセメントの練和後,可及的に早く光線を照射する必要性があることを意味しているものと考えられた。光硬化型グラスアイオノマーセメントの象牙質に対する接着強さは,光エネルギーと密接な関連を有していることが確認され,光強度の低下している照射器については,照射時間の延長が,有効な臨床対処法となることが示唆された。以上から,本セメントの理工学性質の向上という観点からは,光線照射が重要な因子となっており,その光線照射の時期としては,セメント練和後の比較的早い時期が望まれることが示唆された。
ナノチューブトランジスターのバイオセンサー応用と官能基誘導の効果

カーボンナノチューブや有機半導体などの分子性材料は、シリコンを基盤とした既存のエレクトロニクスでは容易に実現できない優れた特徴を有しており、シリコンと相補的に用いることによって大きな相乗効果が期待される。例えば、(1)高分子フィルムなどフレキシブルなシートの上に(2)大面積の集積回路が(3)印刷など低コストプロセスで実現できる。さらに、有機トランジスタは、単体としても、化学センサーとして用いることができるなどシリコンにはない特徴を有する。また、カーボンナノチューブは、(1)コンダクタンスが電荷量に敏感で、(2)ナノメートル寸法の構造体であるため、ナノ領域におけるセンサーとして有用であると期待される。本研究では、ナノチューブのトランジスタと有機トランジスタの化学センサー応用について、それぞれを比較しながらメカニズムを解明することを目的とした研究を推進した。これまで、有機トランジスタが、高感度のガスセンサーとしての機能を持つことはベル研究所のグループによって示されたが、そのセンサー機能の原理につていは、未解明の点が多かった。本研究では、dihexylquarterthiophene(DHa4T)を用いて、有機トランジスタのガス検出において、グレインの境界が重要な役割を果たしていることを見出し、その特性を定量的に計測することに成功した。また、ナノチューブ・トランジスタや有機トランジスタの特性を水中で計ることができれば、生体関連の物質を検出する化学センサーとして利用できる。本研究では、有機トランジスタやナノチューブのチャネル層を水に直接暴露した状態でデバイスを動作させることに成功した研究成果を発展させ、ナノチューブと微小流体路を集積化するための要素技術を確立した。
XAFS/EELSを用いたリチウムイオン二次電池正極材料の熱的安定相の探索

リチウムイオン電池において,3d遷移金属を含む正極材料は,遷移金属の価数が柔軟に変化することでLiの脱離が容易に行われる.この正極材料の電池特性を決定する因子を解明するためには,基底状態および有限温度下での原子・電荷・磁気配列を知ることが極めて重要である.本研究では,第一原理計算とクラスター展開法を併用し,それらの配列を特定することを目的としている.対象とする正極材料は3d遷移金属を含んでおり,磁性を有する系である.クラスター展開法では,各原子配列の系のエネルギーをクラスター関数で展開し,有効相互作用を抽出する.しかし,磁性を有する系のエネルギーは原子配列と磁気配列の双方の自由度に依存し,従来の手法を直接適用することはできない.そこで,申請者は,クラスター展開法を磁性を有する系に適用するための手法を提案した.本手法では,まず,様々な原子・磁気配列のもとで第一原理計算を行い,磁気相互作用を計算する.次に,得られた磁気相互作用に基づき,各構造での最安定となる磁気配列を予測する.そして,この最安定な磁気配列のもとで第一原理計算を行い,磁気相互作用を繰込んだ有効相互作用を算出する.このようにして得られた有効相互作用を用いることで,磁気相互作用を考慮した基底状態の探索が可能となる.テストケースとして,本手法をMgO-NiO系においての3つの規則相を初めて計算により予測した.今回提案した手法は,リチウムイオン電池の正極材料を含めた様々な磁性化合物に適用可能である.今後は本手法を用いて,実用材料であるLixCoO_2,LixNiO_2等における基底状態及び有限温度下での原子・電荷・磁気配列のシミュレーションへと適用していく予定である.リチウムイオン電池の正極材料は3d遷移金属を含んでおり,その価数が変化することでLiの脱離が容易に行われる.このため,充放電に伴うリチウム電池の材料特性の解明には価数を含めた遷移金属の電子状態の理解が特に重要となる.物性を支配する3d電子に関する情報を直接的に得る方法として,XANES/EELSが広く用いられる.このスペクトルは,遷移金属の価数・スピン状態及び遷移金属周辺の構造を直接反映している.スペクトルの持つ情報を客観的に得るため,恣意的なパラメータを一切用いない第一原理に基づく理論計算手法の開発を行ってきた.コバルトは,-1価から+4価までの幅広い酸化数をとる事が知られており,数多くのCo-L2,3端XANESスペクトルが測定されてきた.LiCoO2及びLaCoO3はコバルトの酸化数・スピン状態,配位子,配位数が同じであるにもかかわらず,実験及び理論スペクトルには,L2,3端共にそれぞれのピークの高エネルギー側の肩の部分に顕著な違いが確認出来る.これは,XANESスペクトルはコバルトの電子状態及びコバルト周辺の局所構造により支配されるという従来の一般論とは一致しない.このスペクトルの変化を特定するため,理想的な構造を用いて系統的な計算を行ったところ,LiCoO2中ではCoO6クラスターは,最近接の3価のカチオンが形成する静電ポテンシャルの影響が大きいのに対し,LaCoO3中ではクラスター周辺のポテンシャルが均一となっており,この違いがスペクトルの変化の主たる要因であることが判明した.同時に,他の結晶構造の寄与を系統的に評価したところ,3d軌道に及ぼすマーデルングポテンシャルの影響はペロブスカイト構造(LaCoO3),岩塩型構造,スピネル構造,層状岩塩型構造(LiCoO2)の順に大きくなることがわかった.結晶構造の変化がXANESスペクトルの影響を及ぼすという結果は,従来までの最近接原子配置がスペクトル構造を決定するという常識を覆す新たな知見である.リチウムイオン電池において,3d遷移金属を含む正極材料は,遷移金属の価数が柔軟に変化することでLiの脱離が容易に行われる.この正極材料の電池特性を決定する因子を解明するためには,基底状態および有限温度下での原子・電荷・磁気配列を知ることが極めて重要である.本研究では,第一原理計算とクラスター展開法を併用し,それらの配列を特定することを目的としている.対象とする正極材料は3d遷移金属を含んでおり,磁性を有する系である.クラスター展開法では,各原子配列の系のエネルギーをクラスター関数で展開し,有効相互作用を抽出する.しかし,磁性を有する系のエネルギーは原子配列と磁気配列の双方の自由度に依存し,従来の手法を直接適用することはできない.そこで,申請者は,クラスター展開法を磁性を有する系に適用するための手法を提案した.本手法では,まず,様々な原子・磁気配列のもとで第一原理計算を行い,磁気相互作用を計算する.次に,得られた磁気相互作用に基づき,各構造での最安定となる磁気配列を予測する.そして,この最安定な磁気配列のもとで第一原理計算を行い,磁気相互作用を繰込んだ有効相互作用を算出する.このようにして得られた有効相互作用を用いることで,磁気相互作用を考慮した基底状態の探索が可能となる.テストケースとして,本手法をMgO-NiO系においての3つの規則相を初めて計算により予測した.今回提案した手法は,リチウムイオン電池の正極材料を含めた様々な磁性化合物に適用可能である.今後は本手法を用いて,実用材料であるLixCoO_2,LixNiO_2等における基底状態及び有限温度下での原子・電荷・磁気配列のシミュレーションへと適用していく予定である.
大気環境改善のための好NO_2植物の育成-野生キク科植物を用いた好NO_2遺伝子のスクリーニング

1.道路沿いに生育する野生草本植物52種、栽培草本植物61種及び木本植物37種、合計150種(500個体以上)について、重窒素トレーサー法を用いてNO_2同化能力を測定し、高いNO_2同化能を有する植物をスクリーニングした。このうち、全還元態窒素中に占めるNO_2由来の窒素の割合(NO_2-N比)を求めたところ、この値が511%以上のものが33種見いだされた。この結果は、NO_2由来の窒素が植物の窒素生理において重要な意義を持つことを示している。一般に、植物体内の遊離アミノ酸は約1週間で代謝回転するとされていることからこれらの植物はNO_2のみを窒素源として生育する可能性を有する、すなわち好NO_2植物の候補植物であることが示唆された。ダンドボロギクでの高い同化能を持つ変異個体を得る計画であったが十分な個体を育成することができなかった。このためイロイヌナズナ(NO_2吸収同化能は五番目に高い)を用い、NO_2暴露に対する遺伝子発現応答について調べた。2.これまでシロイヌナズナで得られているNR,NiR遺伝子をプローブとしてノザン解析を行った結果、いずれの遺伝子ともNO_2暴露後15分で暴露前に比べ転写量の増加が認められた。その後、30分1時間でも転写量は暴露前より増加していたが、2時間目では暴露前よりも転写量は低下しており、以後、調べた24時間目まで低い値であった。この挙動はいわゆる硝酸誘導による遺伝子の発現パターン(硝酸誘導後30分4時間で転写量は増加し、それ以後は誘導前より減少する、Chengら,1990)と同様であった。NO_2分子は植物葉内で水と反応して硝酸と亜硝酸となり、細胞内へ取り込まれると考えられるが、NO_2暴露においてもNR,NiR遺伝子の発現誘導が起こることからNO_2が少なくとも一部は硝酸として取り込まれていることが確認された。
日本型高度土地利用作物栽培システム確立のための土壌微生物機能の解明と利用

将来、日本農業の1モデルとして、休耕田などを有効利用した日本型輪作体系の確立と環境負荷を低減化した持続的なシステムの構築が考えられる。そのためには、土壌微生物の機能解析と高効率的利用が重要である。このような背景から、本研究では「ラッカセイの根系形成と根粒菌・菌根菌との相互作用」と「分子生物学的手法を利用した根圏微生物の菌叢解析」に着目した研究を行った。「ラッカセイの根系形成と根粒菌・菌根菌との相互作用」では、環境負荷の小さい栽培が期待できるラッカセイに着目し,根系形態と関連づけて根粒の形成位置と形成順序、形成量、窒素固定能力について解析した。これらの実験結果から、ラッカセイの根系形態を人為的に変化させて窒素固定能力を制御できる可能性が示唆された。さらにストレス条件下の作物栽培を改善する目的で、根粒菌と菌根菌の二重接種による効果を両者の相互作用も併せて検討した。その結果、根粒菌および菌根菌の二重接種を有効に利用することで、ストレス条件下でのラッカセイ栽培の改善が可能であることが示唆された。「分子生物学的手法を利用した根圏微生物の菌叢解析」では、分子生物学的な手法を土壌微生物の解析に適用することによって、土壌微生物の種類と量を把握し、それが作物種や栽培方法によってどのように変化するかを検討した。特にPCR-DGGEやFISHを用いた根圏に生息する細菌相の解析方法の確立に重点を置きながら、イネの水田作・畑作と、ナタネを含む輪作体系を対象に調査した結果、水田と畑地根圏細菌叢の構成菌種や優占菌種が異なることやナタネ根圏における優占菌種は環境条件によって菌量が変動することなどが確認された。本研究より、根粒菌および菌根菌と作物の共生関係の人工的な操作や根圏細菌の遺伝子レベルでのモニタリングの実施は持続的環境低負荷型の輪作システムの構築に貢献できることが示唆された。ラッカセイの根系形成について遺伝的な背景に着目して検討を行い、大きな変異があることを確認した。現在、根系形成モデルを構築しながら解析を進めている。また、ラッカセイ栽培において根粒を有効に利用するために、根粒のサイズと窒素固定能力との関係にっいて検討を行った。その結果、根粒内で根粒菌感染領域が占める割合は根粒のサイズによらずほぼ一定であり、根粒のサイズから感染領域の量を推定できることを明らかにした。また、多くの場合、根粒のサイズとアセチレン還元活性で評価した窒素固定能力との間に密接な関係があり、根粒の直径を測定すれば窒素固定能力を推定・評価できることが分かった。ただし、サイズが極端に小さいものについては窒素固定能力が低いことから、根粒の窒素能力は発育段階と密接に関係していることが示唆された。菌根菌が野菜の生育に及ぼす影響について炭を加えることで改良する試みを行った。土壌に炭と菌根菌を加えると、野菜の生育がよくなることが確認された。その場合、従来から炭が菌根菌の感染に影響することが着目されてきたが、本研究の結果、炭の何らかの影響で作物の生育が促進され、そのため菌根菌の感染が向上するフィード・フォーワード的な効果があることが示唆された。土壌微生物の研究においては、従来の培養法だけでは不十分で、新しい研究方法の開発が必要である。