hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ナトリウム重炭酸共輪送体の選択的阻害による腎癌転移抑制の試み

Na-HCO_3共輸送体(NBC1)は種々の臓器に発現し、酸・塩基平衡の保持や組織恒常性の維持のうえで極めて重要な役割を担っている。NBC1には同一遺伝子に由来する腎型輸送体kNBC1と膵型輸送体pNBC1の2種のバリアントが存在している。申請者らはkNBC1がヒト正常腎の近位尿細管基底側膜に強く発現しているが、同時に腎癌組織にも強く発現していることを報告した。本研究は腎癌におけるNBC1の意義を明らかにすることを主な目的として立案された。各種ヒト腎癌由来の培養細胞を特異的抗体を用いたWestern blot法により検討したところ、殆どすべての細胞においてkNBC1,pNBC1双方の発現を確認した。またこれらの細胞において蛍光色素BCECFを用いた細胞内pH測定によりやはりNBC1の輸送活性を確認した。次にBoydenチャンバーを用いた細胞遊走能を検討したところ、これらの癌細胞の遊走能はNBC1阻害剤によって著しく減弱することが示された。これらの結果はNBC1が腎癌の転移活性に強く関与することを示している。さらにNBC1の意義を明らかにするために抗NBC1作用を有するリボザイム遺伝子を安定導入した細胞株の作成を試みている。またマウス由来の腎癌細胞においても同様なNBC1作用を確認している。一方、ラット腎におけるNBC1バリアントの局在を調べるために免疫組織化学的検討を施行した。その結果、ヒト腎と同様に近位尿細管基底側膜における強いkNBC1の発現を確認した。しかし同時に近位尿細管管腔側におけるpNBC1の発現も弱いながら確認できた。このpNBC1発現の生理的意義を明らかにするためにラットにアンモニア投与を行い酸血症モデルを作成した。しかしpNBC1の局在は変化せず、酸・塩基調節との関連はあきらかでなかった。ナトリウム・重炭酸共輸送体(NBC1)は種々の細胞に発現し、重炭酸の分泌・再吸収ならびに細胞内pH調節機構にとって極めて重要な役割を果たしている。我々は正常の腎臓においては本来近位尿細管基底側膜に発現しているNBC1がヒト腎癌(RCC)組織組織にも豊富に発現していることを同定し、報告してきた。今回、NBC1の腎癌における意義をより明らかにするため、培養ヒトRCC細胞を用いて実験を続けている。現在までに細胞内pH測定実験により、Na/H交換輸送体(NHE1)、C1/HCO3交換輸送体(AE)に加えて、NBC1機能活性が悪性度の異なる各種RCC細胞株に発現していることを確認した。またNBC1蛋白発現についてもアイソフォーム特異的抗体を用いたWestern解析により確認された。さらに共焦点レーザー顕微鏡を用いた免疫組織化学的解析によりNBC1はRCC細胞質内のみならず細胞膜にも発現していることが確認された。一方、細胞遊走能を調べる実験系において、悪性度の高いRCC細胞株の遊走能は重炭酸輸送体の非特異的阻害剤であるDIDSならびにNBC1特異的阻害剤により著明に抑制されることが確認された。しかしこの細胞の遊走能はNHE1阻害剤によっては全く影響を受けなかった。またNBC1阻害剤およびNHE1阻害はともに細胞内pHを著しく低下させており、遊走能は細胞内pHの変化によってのみ影響を受けているのではないことが示された。これらの知見はおそらくNBC1が腎癌細胞内局所の容積調節を促し、腎癌の転移機構において極めて重要な働きを担っていることを強く示唆している。今後さらにNBC1に対するアンチセンスなどを用いた実験を予定している。転移性腎癌は予後不良であり、既存の化学療法・免疫療法に対して抵抗性を示すため、新たな発想に立った分子治療法の開発が求められている。

Na-HCO_3共輸送体(NBC1)は酸・塩基平衡や細胞内外のpH調節、および組織恒常性の維持などに非常に重要な生理的役割をになっており、同一遺伝子(SLC4A4)に由来する主要な二つのヴァリアント、腎型輸送体(kNBC1)および膵型輸送体(pNBC1)が存在する。kNBC1は主に正常腎の近位尿細管基底側膜に強く発現し、この部位の重炭酸再吸収を司っている。ヒト腎癌組織にもkNBC1の強い発現が見いだされた。ある種のイオン輸送体(Na/H交換輸送体、NHE1など)が癌細胞の転移活性と密接な関連を有することが報告されているので、腎癌細胞におけるNBC1の意義について、特に転移活性との関連について解析を行った。1)ヒト腎癌由来の細胞株におけるNBC1発現をWestern blot法にて解析したところ、全ての細胞株において強いNBC1発現を確認した。またマウス腎癌由来の細胞株(RENCA細胞)においても同様にNBC1発現を確認した。kNBC1が優位であったが、一部の細胞株ではpNBC1の発現も確認された。2)蛍光色素(BCECF)用いた細胞内pH測定実験などにより、これらの細胞株にはNa-HCO3共輸送体(NBC)活性が発現していることが確認された(NBC1活性を反映したもの)。3)Boydenチャンバーを用いてこれらの腎癌由来の細胞株の遊走能を評価したところ、NBC1の特異的阻害剤(S0859)によって強く抑制されることが確認された。即ち、腎癌細胞は他の組織由来の癌細胞と異なり、その遊走能はNBC1に強く依存していることが示唆された。なお、NBC1発現を抑制する作用が確認されている抗NBC1リボザイム(Rz-NBC1)を一過性に発現させると、腎癌細胞の遊走能は有意に抑制されたことにより、NBC1と遊走能の深い関連が確認された。in vivoでの腎癌転移モデル作成の前段階として、Rz-MBC1の安定高発現株の作成を試みているが、現在までにこれらの株は著明な発育障害を生じ、継代が困難である。NBC1は腎癌の転移機構だけでなく、増殖・発育機構においても何らかの役割を担っていると推察される。
経口投与可能なタンパク質医薬品の創製

ラクトフェリン(LF)の腸管吸収におけるキャリア分子としての可能性を検討する目的で、LFとタンパク質医薬品であるG-CSFとの融合タンパク質を作製し、小腸上皮様細胞Caco-2への取り込み、および、マウスの腸管吸収を調べた。G-CSFはCaco-2へ取り込まれなかったが、LFと融合させることで、細胞内に取り込まれるようになった。一方、融合タンパク質をマウスの胃内へ投与した場合には、G-CSFによる好中球数の増加は観察されなかった。本研究では、ラクトフェリン(LF)をキャリア分子として使用し、他のタンパク質医薬品をLFに結合させた融合タンパク質は、LFと同様の腸管吸収動態を示して腸管から吸収されると考えた。LFに融合するタンパク質医薬品は、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)を選び、遺伝子組換え法で、N末端側、およびC末端側にLF全長が位置するLF全長/G-CSF、G-CSF/LF全長融合タンパク質を安定発現するdhfr遺伝子欠損CHO細胞株を樹立した。さらに、LFの腸管吸収に必要な一次配列を明らかにすることを目的として、LFのN末端側半分の配列であるN lobeに注目し、N末端側、およびC末端側にNlobeが位置するN lobe/G-CSF、G-CSF/N lobe融合タンパク質を安定発現するdhfr遺伝子欠損CHO細胞株を樹立した。融合タンパク質の発現は、T 175cm^2フラスコを用いた静置培養で行った。各細胞株を無血清培地に細胞濃度1x10^6 cells/mlで捲き込み、7日間培養して培地上清を回収した。その後、細胞は新しい無血清培地に再懸濁してさらに7日間培養を行った。各融合タンパク質の精製は、陽イオン交換担体であるMacroCap SP(GEヘルスケアバイオサイエンス社)を使用した。無血清培地で培養した培地上清を、10mMリン酸バッファー(pH7.6)で平衡化したカラムに注入して、融合タンパク質をカラム担体に結合させた。10mMリン酸バッファー(pH7.6)で洗浄後、0.2M NaClを含む10mMリン酸バッファー(pH7.6)から、0.1M刻みでNaCl濃度を上げるステップワイズ塩濃度溶出法で融合タンパク質を溶出させた。この方法で純度約90%以上の融合タンパク質を得ることができた。本研究では、ラクトフェリン(LF)をキャリア分子として使用し、他のタンパク質医薬品(ここではG-CSF)をLFに結合させた融合タンパク質は、LFと同様の腸管吸収動態を示して腸管から吸収されると考えた。ラクトフェリン(LF)全長/G-CSF、G-CSF/LF全長、LF N-lobe/G-CSF、G-CSF/LF N-lobe融合タンパク質の他に、本年度新たに、LFのN末端側アミノ酸配列1-90と251-332(以下N1領域と呼ぶ)とG-CSFとの融合タンパク質を安定発現するdhfr遺伝子欠損CHO細胞株を樹立した。各融合タンパク質は、陽イオン交換担体であるMacroCap SPを用いて精製した。上記融合タンパク質の中で安定的に発現、精製することが可能だったのは、LF全長/G-CSF、LF N-lobe/G-CSF、LF N1/G-CSF、G-CSF/LF N1であった。これら融合タンパク質のG-CSF活性はほぼ保たれていた。次に、ラクトフェリンの腸管からの吸収モデルとして使用されている小腸上皮細胞であるCaco2を用いて、各融合タンパク質の細胞内取り込みを調べた。精製した各融合タンパク質は、そのアミノ基を用いて蛍光試薬であるAlexa Fluor 488で標識した。まず、陽性コントロールであるウシLFと陰性コントロールであるG-CSFを用いて、Caco2細胞への取り込み条件を検討した。1週間培養して分化したと考えられるCaco2に対して、ウシLFは37°Cでは取り込まれたが、4°Cでは取り込まれなかった。37°Cでの取り込みは、ATP阻害剤であるNaN3やsucroseで阻害されたことから、特異的なものと考えられる。一方、G-CSFは温度に関係なく取り込まれることはなかった。この確立した条件で、各融合タンパク質のCaco2細胞への取り込みを評価していく予定である。ラクトフェリンの腸管からの吸収モデルとして使用されている小腸上皮様細胞であるCaco2を用いて、ラクトフェリン(LF)全長/G-CSF、LFのN末端側半分の配列であるN-lobe/G-CSF融合タンパク質の細胞内取り込みを調べた。G-CSF単体は細胞内に取り込まれなかったが、ラクトフェリン(LF)全長/G-CSFとLF N-lobe/G-CSF融合タンパク質はともに37°Cで取り込まれ、4°Cでは取り込まれなかった。

37°Cでの取り込みは、ATP阻害剤であるNaN3や未標識過剰量のヒトLFで阻害されたことから、この取り込みはレセプター介在性であり、LFの取り込みルートで細胞内に取り込まれたものと考えた。LF全長/G-CSF融合タンパク質に関しては、In vivoでの腸管吸収実験を実施した。雄15匹のB6D2F1/Crljマウスに、投与量50 mg/kgで単回胃内投与し、投与後12、24、36および48時間に採血を行い、好中球数を測定した。融合タンパク質を投与したマウスに死亡の発現は認められず、一般状態および体重においても異常は認められなかった。LF全長/G-CSF融合タンパク質群はコントロールであるG-CSF群と同様の好中球数の推移を示し、融合タンパク質群での好中球数の上昇は認められなかった。好中球数の上昇が認められない点については、融合タンパク質が腸管から吸収されないのか、腸管から吸収されても全身に循環されないのか不明なため、今後この点を詳しく検討する予定である。融合タンパク質を調製することができ、そのG-CSF活性はほぼ保たれていた。また、ラクトフェリンの腸管からの吸収モデルとして使用されている小腸上皮細胞であるCaco2への細胞内取り込みの条件を確立することができた。24年度が最終年度であるため、記入しない。作製した融合タンパク質のCaco2への細胞内取り込みを調べていく。この系で細胞内取り込みが確認できた融合タンパク質を大量調製して、動物実験で実際に腸管から吸収されるか調べる予定。
エゼクター式吸収器によるハイブリッド吸収ヒートポンプの高効率化に関する研究

エゼクターは,動作流体の膨張過程において不可逆損失として熱エネルギーに変換されてしまう力学的エネルギーを回収することができる.このため,吸収式冷凍機に用いられているいくつかの膨張弁のかわりにエゼクターを採用し,この力学的エネルギーを吸収器内圧力の上昇に用いることで冷凍機の大幅な効率向上が可能である.そこで,本研究では,シミュレーションによりエゼクターの特性解析ならびにエゼクターを吸収冷凍機に組み入れた場合の性能を評価することを目的とする.まず,エゼクターならびに吸収式冷凍機のシミュレーションモデルを構築した.ここでは,エゼクターを駆動流ノズル,吸引流ノズル,混合部,ディフューザーからなるシステムと見なし,それぞれの要素を連続方程式,エネルギー方程式,断熱効率からなる数式モデルで表す.そして,それぞれのモデルを接続することによりエゼクター全体のモデルを構築した.同様の手法で,吸収式冷凍機全体のモデルも構築した.その結果,まず,エゼクターの特性として排出流の排圧が最大となる最適な混合部入口圧力が存在することが明らかとなった.この点では,エゼクター内でのエントロピー生成が最小となる.また,水-アンモニアを作動媒体とする吸収式冷凍機において冷凍機の蒸発温度が-10°Cの場合には約15%もの性能向上が見込めることがわかった.吸収式冷凍機において,冷媒の吸収過程をエゼクター内で行うと,吸収溶液あるいは冷媒の膨張エネルギーを回収できるため,蒸発器における冷媒の気液平衡圧力よりも高い圧力下で冷媒の吸収を行うことが可能となる.このようなエゼクター式吸収器をハイブリッド空調システムに組み込むと,吸収溶液の濃度幅が増大し,吸収溶液の顕熱の上昇に必要な熱量,冷媒の精留に必要な精留熱量を低減でき,ハイブリッド空調システムの効率が大幅に向上する.しかし,このようなタイプの吸収器は新規なものであることから,その基礎特性すらほとんど検討がなされていない.そこで,本研究では,エゼクター式吸収器の基礎特性を明らかにし,実用化に向けた指針を明らかにする.本年度はまず,計画にもとづいてエゼクターの文献調査を行った.その結果,単相流のエゼクターに関してはいくつかの報告があり,これを用いて圧縮式冷凍機の性能が向上できることが明らかとされていることがわかった.一方で,本研究のような2成分2相流エゼクターに関する研究はほとんどなく,どの程度の性能が得られるか明らかとなっていないことがわかった.また,アンモニアー水を作動媒体とする2成分2相流エゼクターの簡易なシミュレーションモデルの構築を行った.ここでは,エゼクターを駆動流ノズル,吸引流ノズル,ディフューザー,混合部が接合されたシステムとみなしてモデル化し,それぞれの連続方程式,エネルギー方程式,断熱効率からなる解析モデルを構築した.そして,シミュレーションにより,エゼクター効率等を明らかにすることができた.また,エゼクターの性能を十分発揮するためには,ハイブリッド空調システムの設計を駆動流の流量をできうる限り大きくする点で行うことが重要であることがわかった.エゼクターは,動作流体の膨張過程において不可逆損失として熱エネルギーに変換されてしまう力学的エネルギーを回収することができる.このため,吸収式冷凍機に用いられているいくつかの膨張弁のかわりにエゼクターを採用し,この力学的エネルギーを吸収器内圧力の上昇に用いることで冷凍機の大幅な効率向上が可能である.そこで,本研究では,シミュレーションによりエゼクターの特性解析ならびにエゼクターを吸収冷凍機に組み入れた場合の性能を評価することを目的とする.まず,エゼクターならびに吸収式冷凍機のシミュレーションモデルを構築した.ここでは,エゼクターを駆動流ノズル,吸引流ノズル,混合部,ディフューザーからなるシステムと見なし,それぞれの要素を連続方程式,エネルギー方程式,断熱効率からなる数式モデルで表す.そして,それぞれのモデルを接続することによりエゼクター全体のモデルを構築した.同様の手法で,吸収式冷凍機全体のモデルも構築した.その結果,まず,エゼクターの特性として排出流の排圧が最大となる最適な混合部入口圧力が存在することが明らかとなった.この点では,エゼクター内でのエントロピー生成が最小となる.また,水-アンモニアを作動媒体とする吸収式冷凍機において冷凍機の蒸発温度が-10°Cの場合には約15%もの性能向上が見込めることがわかった.
チベット仏画制作センターにおける伝統技材用法と継承に関する研究

1.研究の目的:本研究目的は,チベットの伝統的な美術工芸の技材と継承に関し青海省黄南チベット族自治州同仁県,レプコン(Rebg-gong)地方の調査にある。当地は,チベット仏教の信仰に根ざす仏画(タンカ),金属工芸,繍仏,金銅仏,泥塑像,仏塔,木工,バターの彫刻など工房や個人の家,寺院で分散し制作され続けて生産供給地と同時に集積地としての文化的特長がある。一方で中国辺境部への急速な経済発展がすすむなかで,伝統文化の変容,少数民族の漢族化などにより固有の民族文化の衰退がすすみつつある。そのためチベット人の芸術と文化的な伝統の集積と現状調査が課題である。調査項目は,(1)仏教信仰を荘厳する金属工芸と絵画の伝統的な表象芸術調査,及び(2)寺院壁画,仏画(タンカ)芸術の現状調査である。2.研究の成果:現地の伝統文化については,チベット文書と仏画を基礎資料に用いチベット工芸、絵画を現地調査(20042007年)した。(1)現地の工芸文化の特長は,信仰、芸能活動と一体化している点にある。伝統行事は,アムド地方の古い様式の法舞(寺の主催),及び六月会で龍舞,軍舞,神舞と呼ぶ芸能(村毎の主催)が開催される。両行事は,共に身体に工芸・装飾品をつけ年一度の伝統的な工芸品が出揃う特長的な芸能の場である。つぎに(2)仏画(タンカ)芸術は,寺の一部に遺されてきた壁画,個人収蔵品を調査した.見いだした壁画は,当地の縁起(ウートン上寺),密教図像(ゴマル寺小弥勒堂),仏教壁画(同寺の大弥勒殿),ツォンカパ伝記壁画(同寺の大集会堂)等のアムドの古い壁画で,取り外し可能なパネル式壁画の裏に隠匿されている事を調査により解明した。現在の問題は,寺の僧侶(画師)が原壁画に修復を加えているため,著しく壁画に変化が進んでいる。調査では個人の収集家から,仏画数点(十一面観音菩薩像,護法神像など)の保存状態を確認できた。それぞれが当地の生産供給地と同時に集積地としての文化的特長を備えた優品である。平成16年度の研究実績1.青海省黄南藏族自治州同仁県(熱貢地区)にのこる仏画文化について夏期調査(16年7/238/14)チベット仏教文化の基層をなす仏画美術調査のため、黄南藏族自治州同仁県を調査した。当地の仏画、工芸美術は古くより熱貢芸術として知られチベット仏教美術の一大生産・供給拠点と同時に美術集積地である都乎村、〓賽日村、郭麻日村、吾屯村上・下村にて制作工房、寺院の壁画状態の基礎調査をすすめた。本調査の結果、当地の工房集団が有する伝統技材・用法の概況を知ることが出来た。2.チベットの有形・無形文化について平成16年冬調査(17年2/32/10)(1)有形文化財の調査:黄南藏族自治州同仁県にて、以下の調査を実施・白馬(紅崖)

寺、郭麻日寺、吾屯下寺、吾屯上寺、年都乎寺の密教壁画と文化財調査調査内容は、白馬(紅崖)寺では、創建由来と残された寺院遺構、郭麻日寺、吾屯下寺・上寺、年都乎寺は、伽藍(弥勒堂、集会堂、講堂)内陣壁画の現状とその保存と修復方法についての意見交換内陣を荘厳する仏像、工芸品の調査、弥勒堂(僧堂)の内部にある仏教壁画のその保存と修復方法に関し意見交換を行い、正確な写真撮影による記録の必要性と次年度の調査事項を確認した。・熱貢地方の仏画/金属工芸/刺繍仏画などの工房にて伝統技材・用法と文化財調査金属工芸(吾屯下寺),刺繍仏画(年都乎村),仏画(郭麻日寺)の工芸工房を訪問,伝統-継承の課題を抽出した(2)無形文化財の調査:郭麻日寺にてチベットアムド地方伝統である法舞い芸能調査1861年シャツオン寺から将来された特徴ある本法舞いの儀礼および儀式を調査し記録をすすめた。平成17年度の研究実績の概要1.青海省黄南藏族自治州同仁県(熱貢地区)にのこる伝統文化について夏期調査(17年7/278/1)本国際共同調査は、服部、更〓(青海民族学院)、韓によりチベット仏教の基層をなす荘厳芸術および原始信仰にもとづく芸能・美術のその現状と伝統性を黄南藏族自治州同仁県(熱貢地区)にて継続調査した。当地は、14世紀頃よりチベット美術の一大生産・供給拠点の熱貢芸術として知られ、そして今も同仁県各地では各種の美術工芸工房、および個人収蔵品が当地に残る集積地でもある。(1)有形文化財の調査:・仏教文化と文化財調査:同仁県年都村の明代碑文、同仁県各地寺院の新出壁画(文革期に村人が上塗りし遮蔽)、寺院や神廟の荘厳の文化について資料調査をすすめた。また各村の神廟、内陣を荘厳する現状を調査し、さらに当地に残る伝統工芸集団による金属工芸(吾屯下寺),刺繍仏画(年都乎村),仏画(郭麻日寺)工房訪問により仏画(絵画、繍画)、工芸品(金銅仏、法器、楽器)の現状調査と記録をすすめた。(2)無形文化財の調査:アムド地方伝統である「六月会」調査・芸能文化と文化財調査:同仁県土族(蔵族)の「六月会」(ルロ)祭りを四合吉、鮮乎烈、保安、浪加、吾屯村上・下村の軍舞い、神舞い、龍舞いと集積される荘厳の文化の撮影記録し資料化をすすめた。2.研究成果:本調査の結果、西藏(ウー)から伝播したチベット仏教文化を当地の工芸集団が中国・江南、蒙古への伝播ルートに沿った中継と伝播の役割りを果たした。その結果、静態的な文化領域チベットの宗教に関する荘厳美術と工芸美術、および動態的な文化領域として祭祀・芸能(六月会)が伝統への影響とチベット芸術の今日的状況の総括的な把握が出来た。本研究の目的と概要実績:本研究の目的は、チベット文化圏の密教仏画(タンカ)制作の伝統について中国側と共同での調査研究にある。調査背景にある中国の急激な経済発展により伝統の文化の変貌が余儀なくされている状況に対し、本研究計画は、仏画芸術の文化が伝統的に残る中心地青海省黄南藏族自治州同仁県(旧・熱貢(レブコン)地方)に焦点をあて、当地で継承されてきた伝統的な仏画文化の調査をすすめる点にある。調査項目は、(1)青海省黄南藏族自治州同仁県の年都乎寺(ニェンドウフ)、〓寳日(ガサイリー)、郭麻日(クオマリー)、吾屯村上・下寺(ウートンシャン・シャ)、の五地区に点在する寺院仏画壁画、仏画(タンカ)芸術の図像である。当地の調査が資する内容は、芸術・文化の伝統にあり、1302年に仏教僧のナンソ・サムテンリンチェンが当地の寺院創建に各地から芸術集団(画家、彫刻家、工芸家、建築家)に参加要請して以降、芸術家達が定住し、寺院壁画、仏画、金属工芸品の制作が絶えることなくチベット仏教芸術の一大創作・生産地となり、同時に芸術集団による、チベット仏画の制作と文化集積地として今日に至っている伝統が重要視できる。
内因性酸化ストレス応答の分子機構の解析とその調節による網膜変性抑制

明環境と暗環境で飼育したラットの網膜について,プロテオミクスの手法を用いた,発現蛋白の解析を行った。いくつかの特定の機能を有した蛋白質群が,網膜保護に関与していることを示唆する実験結果が得られた。遺伝操作マウスと脂肪酸調整食餌の組み合わせにより,網膜内の脂肪酸組成を人工的の改変することに成功した。網膜内の脂肪酸組成の違いにより,光による網膜傷害の感受性が調節されることを明らかとした。種々の内因性及び外因性ストレスに対する生体応答反応は,生体恒常性維持機構の本態と考えられる。本研究は,光(可視光)ストレスに対する網膜・視細胞の応答反応の分子機構を理解することで,将来の網膜疾患治療のための基礎的知見を得るごとを目的とする。特に,内因性生体防御因子の誘導に本質的に関わることが報告されつつある転写因子nuclear factor erythroid 2-related factor2 (Nrf2)-antioxidant-responsiveelement(ARE)経路の網膜内での光ストレス応答機構についで検討を行いたい。加えて,網羅的実験手法を用いて,網膜内の新規ストレス応答機構の探索を行いたい。マウス・ラットへの可視光照射による網膜光傷害モデルは,視細胞・網膜色素上皮細胞の選択的脱落を来たし,加齢黄斑変性,網膜色素変性といった視細胞の変性・脱落を伴う疾患の病態モデルである。我々は,以前,明環境(400ルクス)で飼育したラット・マウスは,網膜光傷害(3000ルクス, 24時間)に対し抵抗性獲得すること,また,副腎摘出したマウスは、網膜光傷害に対し抵抗性獲得することを報告した。本年度は,明環境と暗環境で飼育したラット網膜,副腎摘出及び非摘出マウス網膜の網膜について,プロテオミクスの手法を用いた,発現蛋白の解析を行った。次年度以降研究計画を継続する予定である。本研究は,光(可視光)ストレスに対する網膜・視細胞の応答反応の分子機構を理解することで,将来の網膜疾患治療のための基礎的知見を得ることを目的とする。我々は,以前,明環境(400ルクス)で飼育したラット・マウスは,網膜光傷害(3000ルクス,24時間)に対し抵抗性獲得すること,また,副腎摘出したマウスは,網膜光傷害に対し抵抗性獲得することを報告した。昨年度は,明環境と暗環境で飼育したラット網膜について,プロテオミクスの手法を用いた,発現蛋白の解析を行った。本年度は,可視光及び紫外光の分光光照射実験を行い,各光波長による網膜傷害の定量化に成功した。ラットにおける光傷害の光線スペクトラムが明らかとなった。
異なる環境に生育するシャジクモの生態的分化をもたらすオルガネラゲノム遺伝子の解明

本研究の目的は、淡水藻類シャジクモの生態的2型をモデルに、分化をもたらした適応的な遺伝子を探索し、種分化の初期段階を生み出す原動力である生態的分化を分子レベルで明らかにすることである。成果は生物多様性を創出する分子基盤に理解を与え、また他の植物に比べて蓄積の非常に多くない車軸藻類の博物学的情報(分布、分類、系統など)にも貢献する。本研究では、自然選択検出のための多型解析を行うことにより、候補となる遺伝子領域を探索する。また、培養実験を行い2型間での生理的特性の違いを検出する。そして交雑実験により、遺伝子探索で得られた候補領域の遺伝型と生理的特性の相関を調査する。各実験には、主に新規に採集するシャジクモの集団を材料として供する。このため、日本全国の様々な水環境において材料収集を実施している。収集することができた187集団のサンプルのうち、33集団分についてそれぞれの単藻培養株を単離し、代表株として確立することに成功した。培養株ならびに天然株を用い、分光光度計による光合成色素組成の測定を行ったが、本研究では生態的2型間での有意な差異は確認できなかった。集団解析のために必要なDNAマーカー候補として、ESTデータよりマイクロサテライト領域を探索し、複数株を用いた多型スクリーニングを行った結果、39の多型領域が確認された。PCR増幅のmultiplexingを行う効率化を計った結果、10セットのmultiplexingに成功した。これらについては論文投稿を準備中である。野外調査で蓄積された全国の車軸藻類の種分布データは、愛媛県と京都府のレッドデータブックで新設される車軸藻類の項に反映させ、種選定と執筆を行った。また、分布と保全に関して特に重要だと思われる希少種シラタマモについては、国立環境研究所に株を寄託すると共に、分布や形態に関する知見を論文発表する予定である。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、シャジクモの生態的2型をモデルに、種分化の初期段階における生態的分化をもたらした適応的な遺伝子を探索し、最終的に特定することである。生態的分化の原動力を分子レベルで明らかにすることで、生物多様性を創出する分子基盤に理解を与えることに貢献する。本研究全体の計画における解析には、新規に採集するシャジクモの集団、ならびにこれまでの研究で得られた株の一部を材料として供する。このため、初年度の計画通り日本全国の様々な水環境において材料収集を実施した。採集のための野外出張を9回実施し、その結果43地点の集団を発見しサンプルを収集した。さらに、種同定の依頼として譲渡された車軸藻類(アウトリーチ活動の欄を参照)のサンプル中に確認された40集団のシャジクモもサンプルとすることができた。今年度のみで今後の解析を実施するために十分な材料といえる合計83集団599個体の収集することができた。これらの材料を用い、核ゲノム・オルガネラ両ゲノムについて、これまでよりも多くの多型領域を用いて自然選択検出のための集団遺伝学解析・進化生物学的解析を行い、生態的2型間の自然選択をこれまでの研究よりも確かに検証/検出する計画である。このために必要な、シャジクモの多型DNA領域のマーカー開発を以下のように実施した。一般に超多型領域とされるSimple Sequence Repeat (SSR)領域を、ESTデータ(坂山未発表)より探索し網羅的にPCRプライマーを設計した。異なる地域集団由来の8株間を用い、71遺伝子座についてPCR増幅効率のスクリーニングを行い、効率の良いものについてキャピラリーシーケンサーによるアリルの決定を実施して多型の確認を行った。その結果、高PCR増幅効率かつ多型性を示す32の遺伝子座が確認された(平均アリル数:4.0個)。現在までにこれらの遺伝子座の内の13については地域集団内(河口湖の16個体)の個体間における多型性も確認している(平均アリル数3.6個,その他の遺伝子座については解析進行本研究の目的は、遺伝的に分化している淡水性大型緑色藻類シャジクモの生態的2型をモデルに、分化をもたらした適応的な遺伝子を探索し、種分化の初期段階を生み出す原動力である生態的分化を分子レベルで明らかにすることである。成果は、生物多様性を創出する分子基盤に理解を与え、また、他の植物に比べて蓄積の多くない車軸藻類の博物学的情報(分布、分類、系統など)にも貢献する。研究全体の計画における各解析や実験には、新規に採集するシャジクモの集団、ならびに過去の研究で得られている株の一部を材料として供する。全国からの車軸藻類の種同定依頼により譲渡されたサンプル(アウトリーチ活動の欄を参照)を含めると、合計187集団1062個体の収集することができている。ここで、採集で蓄積された車軸藻類の全国の標本データ・分布データは、愛媛県レッドデータブックならびに京都府レッドデータブックで新設される車軸藻類の項目に反映させ、種の選定・執筆にも携わった(分担執筆,編集中: 2014年発行予定)。また、分布や保全に関して特に重要だと思われた琵琶湖でのホシツリモの発見(車軸藻類の1種)については、同種内の遺伝的多様性に関する知見とともに、論文発表した。

シャジクモの生態的2型の解析のために必要なDNAマーカー候補として、シャジクモのESTデータ(坂山ら,未発表)よりマイクロサテライト領域を探索し、複数個体を用いた多型スクリーヒングを行った結果、これまでに32の多型領域が確認されている。これらを上記計画のDNAマーカーとして用い、集団遺伝学的解析を実施している最中である。また、同時にマーカー増幅PCRのmultiplexingを行う効率化を計っている。多型マーカー開発とmulttplexingについては、論文投稿を準備中である。本研究の目的は、淡水藻類シャジクモの生態的2型をモデルに、分化をもたらした適応的な遺伝子を探索し、種分化の初期段階を生み出す原動力である生態的分化を分子レベルで明らかにすることである。成果は生物多様性を創出する分子基盤に理解を与え、また他の植物に比べて蓄積の非常に多くない車軸藻類の博物学的情報(分布、分類、系統など)にも貢献する。本研究では、自然選択検出のための多型解析を行うことにより、候補となる遺伝子領域を探索する。また、培養実験を行い2型間での生理的特性の違いを検出する。そして交雑実験により、遺伝子探索で得られた候補領域の遺伝型と生理的特性の相関を調査する。各実験には、主に新規に採集するシャジクモの集団を材料として供する。このため、日本全国の様々な水環境において材料収集を実施している。収集することができた187集団のサンプルのうち、33集団分についてそれぞれの単藻培養株を単離し、代表株として確立することに成功した。培養株ならびに天然株を用い、分光光度計による光合成色素組成の測定を行ったが、本研究では生態的2型間での有意な差異は確認できなかった。集団解析のために必要なDNAマーカー候補として、ESTデータよりマイクロサテライト領域を探索し、複数株を用いた多型スクリーニングを行った結果、39の多型領域が確認された。PCR増幅のmultiplexingを行う効率化を計った結果、10セットのmultiplexingに成功した。これらについては論文投稿を準備中である。野外調査で蓄積された全国の車軸藻類の種分布データは、愛媛県と京都府のレッドデータブックで新設される車軸藻類の項に反映させ、種選定と執筆を行った。また、分布と保全に関して特に重要だと思われる希少種シラタマモについては、国立環境研究所に株を寄託すると共に、分布や形態に関する知見を論文発表する予定である。26年度が最終年度であるため、記入しない。初年度で、研究全体に必要不可欠な野外生体サンプルを十分量収集することができた点、単藻培養株を確立した点、および集団解析に用いる多型DNAマーカーの開発に成功した点については当初の計画通り完了させることができた。しかしながら、それらを用いた集団解析/生理実験については予備的なデータを収集するに留まった。多型解析に必要な野外サンプルを集団レベルで十分量収集することができ、分布情報を大幅な更新に成功した点、生理生態的実験に必要な株を確立した点、および集団解析に用いる多型DNAマーカーの開発に成功した点、そして解析の効率化(PCR multiplexing)については計画に準じている。それらを用いた多型解析/生理実験については新知見を得られるほどのデータの収集には至らなかった。
日本の市場規制に関する史的研究-電力・石油・自動車・コンピュータ・流通の事例-

本研究では、日本における市場規制の生成、展開、後退のプロセスを、歴史的実証的に検討した。検討に際しては、電力業・石油産業・自動車産業・コンピュータ産業・流通業に関するケース・スタディーに力点をおいた。本研究の成果の一部は、次ぎの二つの論文として発表された。(1)「日本の企業システムと『市場主義』」『組織科学』第32巻第2号、1998年。(2)「規制緩和と日本の産業ー石油産業の事例ー」橋本壽朗・中川淳司編『規制緩和の政治経済学』有斐閣、2000年。論文(1)では、1990年代半ばに高まりをみせた市場主義の主張は、具体的で建設的なヴィジョンに欠け、既存のシステムを全否定してそのメリットをも棄却してしまうおそれがあることを問題にした。そして、金融システムの変革と生産システムの継続という、市場主義とは異なる現在の経済危機への処方箋を提示した。論文(2)では、まず、石油産業に代表される規制産業においては、政府の介入と産業の脆弱性とのあいだに相互増幅作用がみられることを明らかにした。つまり、政府の介入が、産業の脆弱性をもたらす側面とともに、産業の脆弱性が政府の介入を招く側面も存在することを指摘したのである。この後者の側面が意味をもつ限り、規制緩和を進めたとしても、それがただちに当該産業の体質強化につながるわけでない。規制緩和を真に有意義なものにするには、期限つきで政府介入を活用しながら、政府介入そのものを必要としないような産業の体質を強化するという、現実的で柔軟な発想を導入することが求められている。此れが、論文(2)の結論である。第2次世界大戦後の日本における市場規制の展開を、主として産業政策と寡占間競争、企業間関係などに焦点をあわせながら研究している。具体的には、電力・石油・コンピュータ・自動車・流通の五つの産業を取り上げるが、電力と石油については過去にひと通り検討したことがある(橘川武郎「電気事業法と石油業法」『年報近代日本研究13経済政策と産業』山川出版社、1991年、および橘川武郎『日本電力業の発展と松永安左ヱ門』名古屋大学出版会、1995年)ので、平成8年度は流通にウエイトをおいて研究を進めた。今後、平成9年度は自動車とコンピュータを重点的に分析し、10年度に全体を総括したいと考えている。1.戦後の日本では、市場と組織(企業)の中間領域である中間組織が、広汎に発展したことを確認した。そして、代表的な中間組織である企業集団を取り上げ、その基本的機能は株式相互持合いによる株式安定化にあり、その付加的な機能は取引コストの削減や情報の交換、リスク・シェアリングなどにあることを、明らかにした。2.戦後の日本における生活様式の変化(例えば、衣や食の洋風化)が、流通のあり方にどのようなインパクトを与えたかを、歴史的にあとづけた。その結果、日米構造協議等で市場の開放性を阻害するものとして問題視された日本的取引慣行(例えば、委託仕入、派遣店員や複雑で曖昧なリベートなど)には、それなりの経済合理性が内包されていることが明らかになった。3.戦後の日本において、石油精製業・石油化学工業・電力業などは、政府による規制が強かった点で代表格と言える産業である。しかし、一連のケース・スタディを通じて、これらの産業においても、旺盛な企業家精神の発露や、活発な民間企業の事業展開がみられたことが、明らかになった。石油精製業における出光佐三(出光興産)の活動、電力業における松永安左エ門とその後継者達(木川田一隆・芦原義重・横山通夫ら)の活動、石油化学工業におけるエチレン年産30万トン基準(1967年)を乗り越えた一連の共同・輪番投資などは、その典型だと言える。

4.今後は、流通業・電力業・石油精製業・石油化学工業だけでなく、自動車産業・コンピュータ産業についても、ケース・スタディを行う予定である。日本において市場規制が導入された歴史的事情、それが果たした機能とその反面での問題点を、各産業のケース・スタディーを通じて、実証的に解明した。取り上げた産業は、流通・石油精製・石油化学・電力・金融(銀行)・自動車・コンピュータなどであり、これら検討成果の多くは、すでに学術論文ないし研究書として発表した(具体的に言えば、流通については「11研究成果」の[雑誌論文]の1、3、7、10。石油精製については[雑誌論文]の4、9と[図書]の2。石油化学については[雑誌論文]の5。銀行のついては[雑誌論文]の6。電力と自動車については雑誌論文]の8。)まだ、未発表のコンピュータのケイス・スタディについても、現在、日本電気に焦点を合わせた業績を執筆中である。本研究では、上記の各産業についてのケース・スタディをふまえて、日本の政府・企業間関係や政府・業界間関係の全体像についても、仮説の提示を試みた。戦後日本経営史研究の新視角を提示した「11研究成果」の[雑誌論文]の2、産業政策を分析するに当たっての企業の視点の重要性を強調した同8、消費の側からのアプローチの重要性を指摘した同10、安易な「市場主義」論を批判的に検討した同11、集積する中小企業の役割に注目した[図書]の1などが、その成果である。本研究を通じて明らかになった最も重要な事柄は、日本の政府・企業間関係や政府・業者間関係を考察する場合には、まず政府の役割に光を当てる従来の方法に代えて、第一義的には企業や業界の動向に注目する新たな視角を導入しなければならないという点である。
ハムストリング肉離れ再発における複合要因の解明ー線維化した筋組織と他要因の関連ー

ハムストリング肉離れは再受傷率の高いスポーツ外傷であることが知られている。本研究では、再受傷リスクの高さに関与すると考えられる、線維化した筋組織の残存と伸張性収縮時の筋力や筋活動の低下、筋束長の短縮といったハムストリングの機能的・器質的問題との関連を明らかにし、ハムストリング肉離れ再発の原因解明に繋がる新たな知見を提供することを目的とする。
骨折治癒過程における骨再生制御遺伝子の網羅的検索

C57B6マウス右側大腿骨に直径1mmのホールを形成し、0日(ホール形成直後)、1日、2日、3日、4日、5日後に灌流固定し、大腿骨を切りだした。切り出す2時間前にBrdUを腹腔内注射し、増殖期にある細胞をラベルした。その後、浸漬固定、パラフィン包埋切片を作製し、HE染色にて形態学的に骨折修復経過を観察する一方、ホール周囲へのBrdU陽性細胞の浸潤経過を免疫組織化学染色にて検索した。形態学的に、0日目ではホール形成部位の組織は円形に消失しており、1日目には出血、浮腫が観察された。2日目では出血、浮腫に加えて円形細胞の浸潤が顕著であり、ホール周囲には幼弱な肉芽組織が局所的に観察された。3日目、ホール周囲の肉芽組織形成が顕著となり、4日目以降、線維化が進行していた。BrdU免疫組織化学を用いた検索では、ホール内にBrdU陽性細胞の浸潤がみられるのは3日目からであり、その後は陽性細胞が増加した。一方、ホールから両側1mmのマージンをもうけて同部位を経時的に摘出し、RNAを調整し、骨芽細胞のマーカーであるalkaline phosphataseおよびosteocalcinプライマーを用いてRT-PCRを施行し、β-tubulinをコントロールとして相対的発現濃度を比較した。その結果、alkaline phosphataseは3日目から、osteocalcinは4日目から発現が増加した。これらの結果により、ホール周囲において、未分化間葉系細胞が骨芽細胞へと分化するのは3日目から4日目と推察された。これらの組織からmRNAを調整し、正常大腿骨から調整したmRNAをコントロールとしてDNAチップにて解析した。DNAチップの解析結果においても、ALP、OCNの発現は対照群に比較して増大しており、このモデルマウスがトランスクリプトーム解析に有用であることがしめされた。

これらの結果により、ホール周囲において、未分化間葉系細胞が骨芽細胞へと分化するのは3日目から4日目と推察される。現在、これらの組織からmRNAを調整し、正常大腿骨から調整したmRNAをコントロールとしてDNAarrayにて解析中である。C57B6マウス右側大腿骨に直径1mmのホールを形成し、0日(ホール形成直後)、1日、2日、3日、4日、5日後に灌流固定し、大腿骨を切りだした。切り出す2時間前にBrdUを腹腔内注射し、増殖期にある細胞をラベルした。その後、浸漬固定、パラフィン包埋切片を作製し、HE染色にて形態学的に骨折修復経過を観察する一方、ホール周囲へのBrdU陽性細胞の浸潤経過を免疫組織化学染色にて検索した。形態学的に、0日目ではホール形成部位の組織は円形に消失しており、1日目には出血、浮腫が観察された。2日目では出血、浮腫に加えて円形細胞の浸潤が顕著であり、ホール周囲には幼弱な肉芽組織が局所的に観察された。3日目、ホール周囲の肉芽組織形成が顕著となり、4日目以降、5日目骨断端部に未分化な間様系細胞の浸潤が顕著となった。BrdU免疫組織化学を用いた検索では、ホール内にBrdU陽性細胞の浸潤がみられるのは3日目からであり、その後は陽性細胞が増加した。一方、ホールから両側1mmのマージンをもうけて同部位を経時的に摘出し、RNAを調整し、骨芽細胞のマーカーであるalkaline phosphatase(ALP)およびosteocalcin(OCN)プライマーを用いてRT-PCRを施行し、β-tubulinをコントロールとして相対的発現濃度を比較した。その結果、alkaline phosphataseは3日目から、osteocalcinは4日目から発現が増加した。これらをALP、OCNをプローブとしたISHにて検索したところ、Northern Hybridizationと同様の結果が得られた。次に間葉系細胞浸潤が顕著な5日目、基質沈着が顕著な10日目、さらに正常大腿骨からからmRNAを調整し、DNAチップにて解析した。いくつかの分子の局在等の解析をさらに進めている。
都市境界層乱流クロージャーモデルの新展開とその応用

有効体積率Gと表面積密度Aの概念に基づく都市キャノピ-層乱流モデル(平岡ら、1989)を、z_*座標系のメソスケール気象モデルに組み込んだ。これを用いた都市域の大気境界層の日変化についての特徴を冬季の野外観測データと比較し、キャノピ-層乱流モデルが観測結果を定性的にサポートすることを確認した。長さスケールモデルの定式化の感度解析も行った。キャノピ-層効果を含む長さスケールの補正は、夜間の都市域の乱流混合を促進する方向に作用するが、温位と風速に対する差は、Therry and Lacarrere(1982)の診断式を持ちいた場合と大きな差を生じなかった。日中の対流混合層形成時には、キャノピ-層効果が相対的に小さくなることが示され、キャノピ-層は夜間の安定成層時の都市域の大気境界層再現に特に重要であることが判明した。今年度は、モデルの基本的特徴を把握するために、鉛直2次元の理想化された条件での結果を中心に示した。今後は、キャノピ-層の存在を含む長さスケールモデルの再検討を進めるとともに、より実用的な都市境界層乱流モデルを目指し、1)地表面熱収支式へのキャノピ-層の効果(建築物の面積割合の考慮)、2)キャノピ-層の大気放射過程への効果の定式化、3)人口排熱と建物の蓄熱効果の導入を行う必要がある。
消化器癌のミトコンドリアDNA変異と抗癌剤耐性との関連を分子生物学的に解明する。

近年、癌細胞の抗癌剤に対する耐性の獲得に関してmtDNAの変異も関与していることが分かってきた。我々は、変異mtDNAの意義を明らかにするために、癌細胞においてmtDNAの変異が抗癌剤耐性に関与するかを、同一の細胞核をもちmtDNAのみが異なる癌細胞(cybrid cell)を作成して実験系を完成した。5FU, CDDP、CPT-11、Gemcitabineをこれら細胞群に作用させ薬剤に対する耐性を比較検討した。in vitro、in vivoの両実験において変異型ミトコンドリアDNAを有するCybrid細胞が高い抗癌剤耐性を示した。また当初、変異ミトコンドリアDNAは膵臓癌由来のみを使用していたが、胃癌、大腸癌由来の変異ミトコンドリアDNA由来のCybrid細胞も作製し、同様の結果を得た。消化器癌における癌細胞および正常細胞由来のミトコンドリアDNAとHELA細胞由来のρ0細胞を元としたCybrid細胞を)樹立し、Back groundを比較した後にIn Vitro, In vivoの実験を行った。膵臓癌由来のcybrid細胞に関してはH21年までにその意義を発表しており、今年度以降は他の消化器癌においても同様な結果が得られるかの検討である。1)ミトコンドリアDNAのシークエンスが解明している(mit map, http://www.mitomap.org/)消化器癌cell lineCAPAN1、BxPc3、Panc1、Hs766TをミトコンドリアDNAのdonor細胞とするCybrid細胞を作製した。更にCybrid細胞のBack GroundがWild mtDNA cybridと相違ないかを検討し、Doubling timeにおいてWild typeがやや速い事が判明した。更にin vittroにおいて抗癌剤ジェムザール(GEM)、シスプラチン、タキソールにおいて抗癌剤耐性に差を認めた。2)カスパーゼ活性は上位のカスケードにおいて活性を認めた。Cytchrome C dependent apoptosisであった。(2)ROSについてもMutant mtDNAにおいて発生量は多かった。Complex Iを阻害することによりanti-apoptosisを認めたことでROSの産生能力とapoptosis耐性に密接な関連があることが分かった。消化器癌における癌細胞および正常細胞由来のミトコンドリアDNAとHELAへ細胞由来のρ0細胞を元としたCybrid細胞を)樹立し、Back groundを比較した後にIn vitro,In vivoの実験を行った。また、ミトコンドリアDNA変異癌細胞は転移・浸潤傾向が強いとの臨床報告から、その検証をIn vitroで行った。1)ミトコンドリアDNAのシークエンスが解明している(mitmap,http://www.mito map.org/)消化器癌cell lineCAPAN1、BxPc3、Panc1、Hs766TをミトコンドリアDNAのdonor細胞とするCybrid細胞を作製した。Cytchrome C dependentapoptosisであった。ComplexIを阻害することによりanti-apoptosisを認めたことでROSの産生能力とapoptosis耐性に密接な関連があることが分かった。3)WildおよびMutant cybrid細胞において、メンブレン装置(Publish済み)を用いてその(1)Invasive assayと(2)Migration assayを行った。(1)(2)何れの検討でもMutantがWildを大きく上回っており、ミトコンドリアDNA変異癌細胞の転移・浸潤能がより高い事が細胞生物学的に証明された。更に、各種蛋白、細胞膜レセプターの発現に関しても検討中である。癌細胞ではミトコンドリアDNA体細胞変異が高率に起こっていることは周知の事実であった。しかし、その意義・それが原因により起こる事象については明らかにされていなかった。我々の2009年度までの実験において、癌細胞の核はHeLa細胞を使用。またミトコンドリアDNAとして野生型は成人の血小板、線維芽細胞を使用、変異型は膵臓癌cell lineを使用して実験モデル(Cybrid)を作成して変異型ミトコンドリアDNAを持つ癌細胞が野生型のそれを持つ癌細胞よりも抗癌剤耐性(STS,5FU,CDDP)を示す事をIn vitroにて証明した。更に、その機序はanti-apoptosisの機構である事も解明した。

今回、In vivoに実験を広げることと、膵臓癌以外の癌腫や、その他の抗癌剤においても同様の結果が得られるか検討した。H24年度の研究成果として2各種細胞由来のCybrid細胞クローンを複数樹立できた。Back gound計測し、コントロールと同等の性質を持たないものは除外した。3In vitroにおいてCPT-11とGEMは5FU、CDDPと同様に変異型ミトコンドリアDNACybrid細胞において高い抗癌剤耐性を示した。これらを更なる論文にまとめ、現在投稿中である。さらに国際学会において発表し、新しい知見との意見を頂いている。膵臓癌以外の消化器癌におけるミトコンドリアDNA体細胞変異と抗癌剤耐性に関する研究はおおむね順調に進展しており、更にDNA体細胞変異の有無による転移・浸潤能の変化まで研究が進んだため。24年度が最終年度であるため、記入しない。現在は、In vitro・In vivoにしてもCell lineからの実験である。今後は臨床検体から直に実験を行い、より臨床応用可能な体制をとりたい。病院内、大学内の倫理委員会提出準備中である。
脳蘇生の形態学的評価法の確立、ならびに視床下部を中心とした機能的回復過程の探究

今回の一連の研究により一過性の軽度の脳虚血において、それを反復することでいわゆる遅発性細胞死が広範囲にわたってみとめられることを見いだした。具体的にはgerbilにおいて5分間の脳虚血状態を3時間間隔にて4回反復した後には、大脳皮質、視床、線条体、海馬と広範囲にわたり神経細胞死をみとめ、かつ大脳皮質、視床、線条体においては神経細胞死が典型的なアポトーシス形態を示すことを見いだした。しかしながら、視床下部、脳幹においては生命維持に重要な機能をつかさどると考えられる神経細胞が低酸素に対して、著しい抵抗性をしめすことがわかった。脳細胞は低酸素状態によりすべての細胞が同じように障害されるわけでなくしかも細胞群により障害が認められる時期が異なるとされてきたが、短時間の反復虚血による神経細胞死が遅発性のアポトーシスの機序に関連しておこりうること考えられることから脳蘇生を行いうる可能性がある。虚血後脳蘇生の目的にて低体温による脳保護効果につき引き続き検討中であるが、反復虚血後においても低体温による脳保護効果が示唆される所見をつかんでいる。また、反復虚血後も視床下部、脳幹においては神経細胞が遅発性のアポトーシスの所見をみとめなかったが、神経内分泌機能を視床下部室傍核の神経細胞におけるオキシトシン、及びバソプレッシンの免疫組織化学にて検討したところ、これら下垂体後葉ホルモン分泌細胞には形態学上の変化が見られず低酸素状態にに対して著しい抵抗性がみとめられた。現在少なくとも動物実験においては、軽度の低体温が虚血障害から神経細胞を蘇生させることが確実視されている。最近一過性脳虚血モデルにおいて、虚血再環流後から開始する低体温でも神経細胞を致死的過程から蘇生させうることが証明されている。また臨床においても脳低体温療法は最近注目を集めているが、脳卒中にしても外傷にしても、発作や受傷後ある時間の経過の後に開始されるのが通常であるが、それでもこの低体温療法が有効である報告が散見されるようになってきた。そこで今年度は砂ネズミの一過性前脳虚血モデルを用い、虚血後の低体温が砂ネズミ海馬において、形態学的に、遅発性神経細胞死ひいてはアポトーシスを示唆する所見が抑制されるか否かに焦点をあてて検討した。1)脳血流再灌流後の経時的変化を調べる目的で、虚血解除後に3日から7日間の生存期間をおいたモデルで、脳虚血後の低体温療法が核の形態学的変化を含め遅発性神経細胞死特有の変化を防ぎうることが電子顕微鏡レベルでも明らかになった。2)TUNEL法による検索で、核内DNAの変化も有意に抑制されることも明らかになった。またアポトーシス促進過程で発現するBax蛋白も、低体温により発現が抑制されることが免疫組織化学的手法により明らかとなった。3)虚血後の神経細胞の変化がtherapeutic windowをもつ積極的な細胞死であり、低体温療法による可逆性の過程を明らかにすることで臨床応用での発展性も期待できる。
協力的光反応過程のダイナミクスの探究

TTF(ドナー:D)-CA(アクセプター:A)結晶においては構成分子間のクローン相互作用が重要な役割を果しており、低温においてはD、A分子間の電荷移動度の大きなイオン性相に、高温においては電荷移動度の小さな中性相になっている。この中性-イオン性相転移は光励起によっても引き起こされる。今年度の研究では、この光励起を約100フェムト秒の超短パルス光で行ないその後の反射率変化を調べることで、局所的電荷移動励起から巨視的ドメイン形成への相転移初期過程の追跡を行ない相境界癖の運動の様子を明らかにした。次に、ポリエン類の光異性化反応に関与している電子励起状態(2^1Ag)には、π電子間の電子相関(協力的相互作用場)が重要な役割を果たしている。この励起状態を2光子励起によって直接励起すれば、通常の1光子励起状態を経由する光異性化反応とは異性体の生成比率が全く異なっていることが期待される。実際にスチルベン、ジフェニルブタジエンの光異性化反応によて生成する異性体の比率が、共鳴1光子励起と非共鳴2光子励起では大きく異なることを、今年度明らかにした。また2光子反応励起スペクトルが、2光子蛍光や誘導吸収で求められている2光子励起状態2^1Agのそれとほぼ一致していることも確認した。これは、室温、溶液中、縮退したエネルギーを持つ電子状態の共存、という不利な条件下でも光反応経路の選択が可能なことを示している。