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自然造形物の曲線・曲面構造の分析とそれに基づく形状モデリングに関する研究

1.曲線構造の分析技術の開発曲線の性質を解析する手法として,曲率対数分布図を提案した.この分布図を用いると,美しい曲線は収束型,発散型,定速型,山型,谷型に体系化される.また,遺伝的アルゴリズム(GA)とスプラインを用いて曲線を自動的にセグメンテーションする手法を開発した.この手法は,特異点を持つ複雑な形状データに対しても適用可能である.開発した手法を用いて,自然造形物や人工物の特徴を解析し,その有効性を確認した.2.自然造形物・工芸品・工業製品の曲線構造の分析自然造形物や工芸品における曲線を広く採取・分析し,それらの曲線の性質を明らかにした.また,工業製品における曲線の性質と比較し,特徴を明らかにした.その結果,自然造形物と工芸品における曲線は,上記の体系化された美しい曲線の中の,発散型と定速型が大半であることが分かった.また,自然造形物では,工業製品における曲線に頻繁に用いられている収束型は少ないことが分かった.3.応用技術および周辺技術の開発リバースエンジニアリングのための曲線の自動フェアリングシステムを提案した.このシステムは,曲面の測定とキーラインデータの抽出,曲線のあてはめ,曲率単調曲線への分割,曲線の性質の分析,視覚言語への置き換え,キーラインの再構成,により構成されている.また,リバースエンジニアリングにおいて曲線・曲面を創成するために必要な"多面体"の面構造分析を行い,視覚言語として体系化した.さらに,自動車のフロントマスクと人の顔の形態要素間の類似関係を調べ,それらの間には一致する形態的特徴が数多く存在することを明らかにした.1.曲線構造の分析技術の開発曲線の性質を解析する手法として,曲率対数分布図を提案した.この分布図を用いると,美しい曲線は収束型,発散型,定速型,山型,谷型に体系化される.また,遺伝的アルゴリズム(GA)とスプラインを用いて曲線を自動的にセグメンテーションする手法を開発した.この手法は,特異点を持つ複雑な形状データに対しても適用可能である.開発した手法を用いて,自然造形物や人工物の特徴を解析し,その有効性を確認した.2.自然造形物・工芸品・工業製品の曲線構造の分析自然造形物や工芸品における曲線を広く採取・分析し,それらの曲線の性質を明らかにした.また,工業製品における曲線の性質と比較し,特徴を明らかにした.その結果,自然造形物と工芸品における曲線は,上記の体系化された美しい曲線の中の,発散型と定速型が大半であることが分かった.また,自然造形物では,工業製品における曲線に頻繁に用いられている収束型は少ないことが分かった.3.応用技術および周辺技術の開発リバースエンジニアリングのための曲線の自動フェアリングシステムを提案した.このシステムは,曲面の測定とキーラインデータの抽出,曲線のあてはめ,曲率単調曲線への分割,曲線の性質の分析,視覚言語への置き換え,キーラインの再構成,により構成されている.また,リバースエンジニアリングにおいて曲線・曲面を創成するために必要な"多面体"の面構造分析を行い,視覚言語として体系化した.さらに,自動車のフロントマスクと人の顔の形態要素間の類似関係を調べ,それらの間には一致する形態的特徴が数多く存在することを明らかにした.1.GAを用いた曲線・曲面の最適セグメーションの研究平面曲線の形状要素の抽出に適した,データあてはめの方法を研究した.特に,複雑な形状についてセグメンテーションとスムージングを同時に行う手法を開発した。またこの手法を,グラフィックデザイナー作品解析に用いて,デザイナーの意図(特徴)を抽出する研究を行った.2.自然造形物の曲線・曲面構造の分析に関する研究リバースエンジニアリング技術において曲線・曲面を創成するためには,まずその曲線・曲面構造を表す"多面体"が必要であることが明らかとなり,本年度はこの研究に取り組んだ.その研究成果の一部は論文として既にまとめあがり,現在デザイン学会に投稿中である.また曲線の印象などを分析する手法として多変量解析などがある.これらの手法をまとめ,解析プログラムを独自にカスタマイズする必要もあり,「コンセプトデザイニング」を執筆するとともに,それに付属する解析ソフトも作成した.これは今後,曲線の印象の分析などに用いる予定である.3.非接触計測機を用いた3次元計上計測と,それに基づく3次元形状モデリングに関する研究自然造形物の形状要素を抽出するために,ヒトや動物の形状計測を行った.入力装置として光学式の非接触形状計測装置を用い,形状とテクスチャを同時に計測した.特に和歌山大学に保存されている日本狼の剥製は世界で5体しか現存しておらず,非常に貴重である.それを3次元ディジタルデータとして保存し,インターネットで公開する電子仮想博物館を構築した.1.認知幾何の拡張とプリミティブへの応用について一般的に用いられている全てのプリミティブや特殊な面の成り立ちをしている多面体について,面構造分析を行った.その結果抽出された多面体を視覚言語として体系化した.2.視覚言語を用いた曲線の自動フェアリングシステムについてリバースエンジニアリングのための曲線の自動フェアリングシステムを提案した.このシステムは,曲面の測定とキーラインの抽出,曲線あてはめ,曲率単調曲線への分割,曲線の性質の分析,視覚言語への置き換え,キーラインの再構成,により構成されている.3.自然造形物と工芸品における曲線を広く採取するとともに,それらを分析し,どのような性質であるのかを明らかにした.また,工業製品における曲線の性質と比較し,どのような特徴があるのかを明らかにした.

その結果,自然造形物と工芸品における曲線は,我々が体系化した曲線群の中の「発散型」と「定速型」が大半であることが分かった.また,自然造形物では,工業製品における曲線に頻繁に用いられている「収束型」はほとんど存在しないことが明らかとなった.本研究の成果は,デザイン学会論文誌に投稿,査読中である.4.実数遺伝子を用いた遺伝的アルゴリズムを開発した.また,それをスプラインを用いたデータあてはめへ応用し,節点を自動的に決定することに成功した.この成果は,ラスベガス(米国)で開催された国際会議IASTED Int.Conf.onComputer Graphicsand Imaging 2000で発表され,注目を集めた.1.自然造形物の曲線・曲面の分析では,人工物との比較が有益である.自然造形物や人工物は複雑な形をしているものが多い.このため,本研究では分析手法の一部として,スプラインを用いたデータあてはめを利用してきた.そこで,筆者らが最近開発した手法の紹介をかねて,従来の手法をサーベイし総合論文として発表した.2.自然造形物と工芸品における曲線を広く収集し,その性質を分析した.また自動車を中心とした工業製品における曲線の性質と比較し,特徴を明らかにした.その結果,自然造形物と工芸品における曲線は,筆者らが体系化した曲線群の中の発散型と定速型が大半であった.また,工業製品における曲線に用いられている収束型は,ほとんど存在しないことがわかった.3.リバースエンジニアリングへの応用のための曲線の自動フェアリングシステムを提案した.本システムは,次の5つのステップから構成されている.(1)クレイモデルからのキーラインデータの抽出,(2)スプラインを用いたキーラインデータの近似,(3)曲率単調曲線の抽出,(4)曲率単調曲線の性質の分析,(5)視覚言語への置き換えとキーラインの再構成.提案手法はデザイナの意図する曲線を容易に生成できる特徴がある.4.自動車のフロントマスクデザインは,ヘッドランプのことを'目'といったり,エアインテーク形状のことを'口'というように,よく人の顔に例えられる.本研究では,イメージという視点から自動車のフロントマスクや人の顔の形態要素間の類似関係を明らかにした.具体的には,主成分分析,クラスター分析を用いて自動車のフロントマスクと人の顔を4つのクラスターに分類し,各クラスターにおける誇張画の特徴を考察した.その結果,フロントマスクと人の顔との間には,一致する形態的特徴が数多く存在することが明らかとなった.
ヒトiPS細胞由来再生心筋細胞を用いた難治性不整脈の治療法の開発

iPS細胞を用いた不整脈研究の条件検討には大量の心筋細胞が必要であるため、スピナーフラスコによる回転浮遊培養系を用いた心筋細胞の大量培養法の開発と効率的な心筋細胞純化精製法の開発を行った。人工ヌクレアーゼを用いて心筋細胞特異的転写因子(NKX2-5)と刺激伝導系遺伝子のプロモーター下に蛍光蛋白をノックインした組換えヒトiPS細胞を作製し、心筋細胞刺激伝導細胞への分化および蛍光タンパクの発現を確認した。大型動物への不整脈治療のための心筋細胞移植の基礎実験を行い、ブタにテレメトリー送信機を植え込み不整脈の評価系を確立した。本年度はヒトiPS細胞からの心筋細胞分化法を検討し、効率のよい分化法を確立した。また、今後心室への心筋細胞移植のためには梗塞巣の失われた組織を補填できるだけの大量の心筋細胞が必要となるため、スピナーフラスコを用いた浮遊培養系による心筋細胞の大量培養法を確立した。さらに、純化精製することで大量の純度の高い心筋細胞を安定的に作出することに成功した。刺激伝導系細胞を純化精製するためにヒトのHCN4に蛍光タンパク質をノックインしてマーキングするために、TALENおよびCRISPR/Cas9システムを用いてiPS細胞の遺伝子組み替えを開始した。まずは心筋細胞のみが純化精製されていることを確認するために心筋細胞の特異的転写因子(NKX2-5)のプロモーター下に蛍光蛋白のDsRedをノックインしたヒトiPS細胞を作製し、心筋細胞への分化および蛍光タンパクの発現を確認した。HCN4のプロモーター領域はGCが多く、5'アームの作製のためのPCRに苦労したが、DMSOを用いることで解決した。また、3'アームのクローニングに成功し、ドナーベクターの作製はほぼ終了した。Knock-in遺伝子は必ずしもサイレンシング等の影響で計算通り遺伝子発現がおこらないことも想定されるため、HCN4の3'側に2A配列を用いて蛍光タンパクを発現する融合タンパクの作製も開始し、アームのクローニングにも成功し、蛍光タンパクおよび2A配列を挿入することでドナーベクターを完成させた。さらに、Cel1 assayによりTALENおよびCRISPRのヒトiPS細胞における活性を確認した。大型動物への精製心筋細胞移植の基礎実験としてマイクロミニブタを用いて免疫抑制剤のプロトコール(タクロリムス、MMF、プレドニゾロンの三剤併用)を確立した。炎症細胞の浸潤をおさえ、異種移植におけるヒトiPS細胞由来心筋細胞の生着を確認した。昨年度に樹立したNkx2-5-DsRedノックインiPS細胞に続き、本年度はヒトiPS細胞にペースメーカー細胞特異的な遺伝子であるHCN4に蛍光タンパクのtdTomatoをノックインした組換えiPS細胞を樹立した。すなわち、HCN4のプロモーター下にtdTomatoを挿入したdonor vectorを完成させ、CRISPR/Cas9を用いてヒトiPS細胞にノックインした。薬剤耐性のコロニーをピックアップし、細胞株化した。junction PCRとサザンブロットにより適切にtdTomatoがノックインされ、かつoff targetにノックインされていない細胞株を選択した。Nkx2-5-DsRed iPS細胞とHCN4-tdTomato iPS細胞を心筋細胞に効率よく分化誘導させることにより、表現形を確認した。心筋細胞の分化が進むに従い、Ds-RedとtdTomato陽性の細胞が増加することを確認した。また、蛍光顕微鏡、FACSによりDs-RedとtdTomatoの発現を確認し、他の心筋細胞特異的マーカーと共染色することで性質を確認した。ブタにテレメトリー送信機を植え込み不整脈の評価系を確立した。また、ブタの電気生理検査のシステムを検討し、カテーテルアブレーションを用いて洞不全症候群、房室ブロック、心室頻拍のブタに心筋細胞およびペースメーカー細胞を移植する体制を整えた。本年度はまず、ブタに心筋細胞およびペースメーカー細胞を移植するための基礎実験、特に心臓に心筋細胞を移植した際の安全性の検討を行った。移植に伴う不整脈の発生頻度を確認するために全身麻酔下でマイクロミニブタへの心筋細胞の移植を行った。心筋細胞をブタの心臓に移植する際に発生する不整脈の有無や、種類、不整脈の発生期間等を観察した。研究の過程でブタへの心筋細胞の移植研究を十分に行うには、大量の心筋細胞が必要であることが明らかとなった。我々は既にスピナーフラスコを用いた回転浮遊培養法を開発しているが(Stem Cells Transl Med. 2014Dec;3(12):1473-83)、大量培養された心筋細胞を移植に最適な状態で用意するには、心筋細胞にダメージを与える事のない、より効率的な心筋細胞の純化精製法が必要であることが明らかになった。特に未分化幹細胞の混入による腫瘍形成の危険のみならず、繊維芽細胞等の非心筋細胞の混入によるリエントリーの形成が心室頻拍等の重篤な不整脈の原因となることがすでみ報告されており、移植前には極めて純度の高い心筋細胞を準備する必要性がある。また、FACSを用いた心筋細胞とペースメーカー細胞の選別は非心筋細胞の混入があると極めて効率が悪いため、あらかじめ心筋細胞のみに純化精製しておく必要性があることも判明した。未分化ES/iPS細胞と心筋細胞の代謝の相違を研究の結果、多能性幹細胞は解糖系とグルタミン酸化によりATPを合成していることが明らかになった。

また、心筋細胞はピルビン酸を効率的に利用しATPを合成していることが明らかになり、新規純化精製法を用いることで心筋細胞中に含まれている未分化細胞の混入率を0.001%以下にまで引き下げる事に成功した。この純化精製法は論文化し、iPS細胞移植による最大の懸念である腫瘍化の抑制が国際的に高く評価された。(Cell Metabolism. 2016Apr 12;23(4):663-74.)iPS細胞を用いた不整脈研究の条件検討には大量の心筋細胞が必要であるため、スピナーフラスコによる回転浮遊培養系を用いた心筋細胞の大量培養法の開発と効率的な心筋細胞純化精製法の開発を行った。人工ヌクレアーゼを用いて心筋細胞特異的転写因子(NKX2-5)と刺激伝導系遺伝子のプロモーター下に蛍光蛋白をノックインした組換えヒトiPS細胞を作製し、心筋細胞刺激伝導細胞への分化および蛍光タンパクの発現を確認した。大型動物への不整脈治療のための心筋細胞移植の基礎実験を行い、ブタにテレメトリー送信機を植え込み不整脈の評価系を確立した。ヒトiPS細胞から心筋細胞への分化効率は安定しておらず、大型動物に移植するだけの細胞を獲得するのは非常に困難である。この問題を大量分化培養の系を確立することで解決した。また、心筋細胞の分化効率は100%ではないため仮に分化後すぐに心筋細胞を移植すると多くの非心筋細胞を同時に移植する事になる。非心筋細胞が心筋細胞の生着を妨げることにより電気生理学的な機能回復の障害となる。大量培養した心筋細胞を純化精製する技術を確立することで心筋細胞のみの移植が可能となり、前臨床試験へとすすむ基盤を確立した。さらに、本プロジェクトの最大のポイントは、心筋細胞特異的に蛍光タンパクを発現するNkx2-5-DsRedノックインiPS細胞とペースメーカー細胞特異的なHCN4のプロモーター下に蛍光タンパクを発現するHCN4-tdTomatoノックインiPS細胞を樹立することができるかにある。ヒトのiPS細胞は一般的に相同組換えの効率がマウスの細胞と比較して非常に悪い。TALE nuclease、CRISPR/Cas9により相同組み替えの効率は飛躍的に高まったが、心筋細胞特異的に遺伝子をノックインしたヒトiPS細胞株の報告は極めて少ない。本年度までにすでにこの目標を達成することができ、細胞の解析を行った。FACSを用いてソーティングした心筋細胞、ペースメーカー細胞を選択的に培養し移植することが可能である。本年度は、テレメトリーシステムによりマイクロミニブタでの不整脈の評価系を確立しており、ブタの心臓電気生理学検査システム構築の目処をつけた。昨年度の研究で免疫抑制剤の種類、量も確定しており、使用するブタの選定も終了している。アブレーションにより洞不全症候群、房室ブロック、リエントリーによる心室頻拍の疾患モデル動物を作製し、心筋細胞、ペースメーカー細胞による移植効果を確認する体制が確立されている。循環器内科平成27年度は、純化心筋細胞、ペースメーカー細胞をブタの疾患モデルに移植することで不整脈に対する細胞治療のproof of conceptを確立する。Nkx2-5-DsRed iPS細胞とHCN4-tdTomto iPS細胞をWnt抑制低分子化合物等を用いて心筋細胞に大量に分化誘導する。
セラーズの哲学と20世紀英米圏における実在論哲学の影響関係をめぐる研究

研究課題であるウィルフリッド・セラーズの哲学が有する実在論的性格について、主に後期セラーズの存在論的立場を特徴づける「絶対プロセスの形而上学」に焦点をあわせて研究を行った。より具体的には、以下のような内容で研究を行った。「絶対プロセスの形而上学」を言語哲学的な側面から分析した「主体(主語)なしの生起subjectless occurrings」と呼ばれるセラーズの発想にとくに注目し、その哲学的意義を明らかにした。後期セラーズの形而上学を対象とする研究の中でも、「主体(主語)なしの生起」にとくに注目した研究は皆無といってよい状況にあるが、「主語なし」で文章を構成することのできる日本語の特性を媒介にすることで、取り扱いの難しい(すなわち統一的解釈の困難な)後期セラーズの哲学を読み解くための視座を提供することができるのではないか、という発想がこの研究の大きな特長である。「プロセスの形而上学」と「存在論的一元論」という二つの存在論的立場について、その相互の関係性がどのようになっているのか、を明らかにする研究を行った。両者とも、「形而上学を回避する分析哲学」の傾向を覆し、「分析哲学の手法を用いた新しい形而上学」の動向として近年大きな注目を集め、かつ、大きな成果を収めつつある分野であるにもかかわらず、両者の関係を問う研究はほとんどなされていない現状に一石を投じることを目指したわけである。本研究の大きな成果として、「主体(主語)なしの生起」という特性に注目することで、後期セラーズの形而上学を、西田や道元とった日本思想の代表的な立場との連続性のもとに位置付けることができるのではないか、という独創的な発想に十分な説得力を与えることができたと考えている。「ウィルフリッド・セラーズの哲学について、その全貌を明らかにする」という目標を達成する一環として、交付申請書に記載された目的・計画に従いつつ、とくに次の諸点について明らかにした。(1)「進化的自然主義というキーワードとのつながりからセラーズの哲学体系のあり方を明らかにする」という研究計画において、研究成果を得た。より具体的には、セラーズの後継者であるルース・ミリカンとロバート・ブランダムの理論とセラーズ自身の哲学を比較・検討し、セラーズの哲学には一見対立するかにみえるミリカンの「進化的自然主義」とブランダムの「社会プラグマティズム」を総合的に取り込む哲学的ポテンシャルが見出されうることを明らかにした。また、本項目に関連する研究成果を、応用哲学会、The Second Conference on Contemporary Philosophy in East Asia (2nd CCPEA)、The Collective Intentionality IXにおいて発表するとともに、論文「`The Return of the Dad: On Millikan-Brandom Debate about the Legacy of Wilfrid Sellars'」として公開した。(2)セラーズ哲学のキーワードである「所与」概念について、従来提示されたことのない新しい視点からのアプローチを試みた。より具体的には、7世紀インドで仏教論認識論を展開したダルマキールティの「アーカーラ」という概念とセラーズにおける「所与」概念の関係について、比較哲学的観点からの検討を行った。また、その研究成果を、筑波大学における国際シンポジウム“Philosophy Across Cultures: Transmission, Translation and Transformation of Thought"において発表した。「ウィルフリッド・セラーズの哲学について、とくに20世紀英米圏における実在論哲学との影響関係に注目しつつ、その全貌を明らかにする」という目標を達成する一環として、交付申請書に記載した目的・計画に従いつつ、とくに次の諸点について明らかにした。(1)「アメリカにおけるプラグマティズムの伝統とセラーズの哲学との関係を明らかにする」という課題の遂行において、一定の成果を得た。より具体的には、セラーズの哲学を根本のところで特徴付ける「メタ言語的唯名論」の発想について、それがセラーズの後継者であるブランダムの「プラグマティックな表出主義」においてどのような仕方で継承されているかを明らかにした。そして、このことを通じて、「プラグマティスト」としての性格づけから距離を取ろうとするセラーズ自身の言明にもかかわらず、セラーズの哲学をプラグマティズムの伝統の内部に位置付けることが可能であることを明確にした。なお、その研究成果については、関西哲学会における共同討議「真理論」の提題発表として公表した。(2)「世界の実在的あり方」を記述する哲学的モデルの一つである「絶対プロセス」の理論に注目し、そのセラーズ的枠組みを「知覚経験」の分析に適用することによって、セラーズにおける「実在的世界の知覚」のあり方がどのような仕方で明確にされうるかを明らかにした。なお、その研究成果については、国際ワークショップ「Comparative Philosophy of Perception」で発表した。交付申請書に記載した「研究の目的」に即した内容の研究を、国内・国際の定評ある複数の学会で発表し、また、その成果については、論文の形で公表(ないし英文査読誌に投稿)することができた。以上から、本年度の研究の進捗状況については、おおむね順調に進展していると判断することができる。「ウィルフリッド・セラーズの哲学について、とくに20世紀英米圏における実在論哲学との影響関係に注目しつつ、その全貌を明らかにする」という目標を達成する一環として、交付申請書に記載された目的・計画に従いつつ、とくに次の諸点について明らかにした。1)現代アメリカを代表するセラーズ派の哲学者であるロバート・ブランダムの真理論に注目し、ヒュー・プライスやルース・ミリカンといった(ブランダム同様、セラーズに決定的な影響下に独自の理論を構築している)

哲学者との対比を通じて、「表出主義的プラグマティズム」の立場から提出されたブランダムの真理論について、その哲学的意義と射程を評価した。また、その研究成果を、査読誌論文として公表した。(「表出主義的プラグマティストの真理観」、『アルケー』)2)セラーズ哲学における「写像」の理論に焦点を合わせ、通例セラーズに好意的な解釈者の間ですら積極的な評価がなされてこなかったその哲学的意義を明らかにした。より具体的には、ルース・ミリカンによるセラーズの写像解釈が取り上げられ、ミリカンの解釈がはらむ弱点の指摘とともに、セラーズのテキストを適切に解釈するとき、彼の写像の理論にどのような哲学的ポテンシャルが見出されうることになるかを論じた。(Naozumi Mitani, Picturing and Meta-Linguisitc Expressivism, "Contemporary and Applied Philosophy, Selected Papers of 2nd CCPEA")交付申請書に記載した「研究の目的」に即した内容の研究を、国際レベルのワークショップで発表し、また、その成果については、国内・国際レベル双方において査読誌論文の形で公表することができた。以上から、本年度の研究の進捗状況については、おおむね順調に進展していると判断することができる。ウィルフリッド・セラーズの哲学について、次の諸点を明らかにした。1)セラーズのよく知られた概念である「世界における人間のイメージ」について、よく注目される「科学的イメージ」と「明白なイメージ」の関係を超えて、通常は検討されることのない「原初的イメージ」に出発点を取る研究を行った。より具体的には、以下の諸点を明らかにした。A)「パーソン」をめぐるセラーズの説明を仔細に検討すると、彼の「明白なイメージ」と「原初的イメージ」の解釈をめぐって、ある明白な矛盾が見出される。B)その矛盾は、意外なことに、彼とは思想的伝統を完全に異にする道元および西田幾多郎の哲学に注目することで、解決のための手がかりを得ることができる。C)「汎自己主義」とも呼ぶことのできる道元の難解な世界理解について、これまた驚くべきことに、後期セラーズの哲学に属する「絶対プロセスの形而上学」および「主体なしの生起」と呼ばれる構想に注目することによって、その明確な解釈を与えることが可能である。D)つまり、道元と西田を媒介とすることで、中期セラーズのテキストが示す重大な矛盾を、後期セラーズのテキストに依拠する仕方で解決することが可能である。2)上記の成果を発展的に継承する方向で、以下の研究を行った。世界の有りようを、「固定された実体と変化する属性」のカテゴリーではなく、「恒常的に流動するプロセス」という観点から分析・記述してみせる後期
内耳アデニル酸シクラーゼ結合型G蛋白複合体に対する利尿剤の作用

内耳におけるアデニル酸シクラーゼ活性は血管条に強いことがわかっているが,アデニル酸シクラーゼやこれによって生成されるcAMPは内リンパ液の生成や調節,蝸牛内電位(EP)の調節,さらに蝸牛の情報伝達に関与しているといわれている。そしてこれらの酵素は2つのホルモン(エピネフリンとバソプレシン)によってコントロールされており,これらのホルモンレセプターは細胞膜においてG蛋白と結合している。このG蛋白はアデニル酸シクラーゼ系を活性化して細胞内の生理応答が引き起こされる。耳毒性を持つ利尿剤のフロセマイド(FU),エタクリン酸(EF)はアデニル酸シクラーゼを阻害してcAMPの生成を減少させるとすでに報告されている。モルモット蝸牛を取り出して脱灰し,クライオスタットで8mumの切片を作成した。これにウサギ抗Gタンパク質抗体を反応させた後,さらにヤギFITC抗ウサギIgGを反応させて蛍光顕微鏡下に蝸牛におけるGタンパク質の局在を調べたところ,Gタンパク質は血管条に最も高密度に局在していた。この結果よりFU,EAのアデニル酸シクラーゼ阻害作用は,G蛋白を介しての作用である可能性があると予想された。これを証明するため,以下の研究を計画している.モルモット蝸牛から血管条を採取し集めた血管条組織をホモジネートしてタンパク質定量を行った後,2-4mg/mlのタンパク質濃度に調整する。ここにATPを加えた後,Gタンパク質のアナログ(GMP-PNP)でアデニル酸シクラーゼを刺激してATPの代謝を活性化させ,その上清をcAMP測定用とする。ここにcAMP抗体を反応させてcAMP量を求めるが,抗体を反応させる前にFU,EAを加えた場合にcAMPの生成量が減少するかどうかを調べる。もし,Gタンパク質を阻害するのであればアデニル酸シクラーゼ系は活性化されず,従ってcAMPの生成は減少するはずである。
微小切欠きを導入した炭素繊維の破壊靭性測定に関する研究

本研究では、FIB装置を用いた微細加工により切欠きを導入することで、信頼性の高い破壊靭性試験を実施し、炭素繊維の破壊靭性値を導出することを目的としている。これを実現するため、「切り欠き加工形状の最適化」を実施し、各種加工条件で作成可能な切り欠き寸法並びに形状について検討した。その結果、FIB加工で使用するビーム系を10nm(公称値)に設定して加工することで、最小50 nm程度の先端幅を持つ切り欠きの作成が可能であることが明らかになった。この結果をふまえ、「炭素繊維の破壊靱性値測定」の一環として、先端幅の異なる破壊靱性試験を実施し、先端幅200nm程度までの小さい領域で先端幅によらず一定の破壊靱性値を得ることが可能となった。得られた実験結果に対し、「異方性を考慮した有限要素法による解析」を実施した。解析に当たっては、異方性の弾性定数が必要となるため、せん断弾性率、繊維軸に垂直な方向の弾性率の測定方法について検討して実測値を得ることができた。これにより、解析が可能となった。本研究の目的の一つである、「試験の再現性向上」については、フォルダー形状について検討したが、現段階では従来以上の再現性が得られていない。これについてはさらに検討を要する。本年度は、研究目的に記載の「(1)切り欠き加工形状の最適化」を主に実施し、各種加工条件で作成可能な切り欠き寸法並びに形状について検討した。その結果、FIB加工で使用するビーム系を10nm(公称値)に設定して加工することで、最小50nm程度の先端幅を持つ切り欠きの作成が可能であることが明らかになった。この結果をふまえ、「(4)炭素繊維の破壊靱性値測定」の一環として、先端幅の異なる破壊靱性試験を実施した。本試験では、従来の試験方法を踏襲した。その結果、先端幅200nm程度までの小さい領域で先端幅によらず一定の破壊靱性値を得ることが可能となった。また、それより大きな先端幅の場合、得られる破壊靱性値が先端幅の増加とともに上昇した。このことは、200nm以上の領域では導入したノッチが亀裂として機能せず、破壊靱性試験としては不適切であったことを示唆するものである。得られた実験結果から破壊靱性値を算出するためには、破断加重と初期亀裂長さより計算することが必要となる。本研究では「(3)破壊靱性値導出のための応力解析」において、有限要素法から求めることを想定している。これを実施するためには、炭素繊維自身の弾性特性を知ることが必要となるが、繊維軸方向以外の特性はほとんど知られていないのが実情である。そこで、せん断弾性率を求めることを目的として、ねじり振動法による測定方法を検討し、せん断弾性率の測定を可能にした。以上のように、本年度は(1)を完了し、(3)および(4)の検討を行った。来年度は、(3)の解析方法を確立するとともに、(2)の目的である、より再現性を向上させるための試験方法の検討を実施予定である。本年度は以下の項目について検討を実施した。[1]炭素繊維の破壊靱性値測定現在試験片として用いている炭素繊維(IM600)については、(a)亀裂長さ依存性、(b)亀裂幅依存性を調査し、破壊靱性値の妥当性について検討し、200nm以下の亀裂幅で一定の値を得る事が確認された。これが真の破壊靱性値を与えるものと考えられた。[2]有限要素法による解析炭素繊維は大きな異方性を有するため、破壊靱性値の計算には従来の計算方法を用いて求めることができない。そこで、有限要素法を用いて応力解析することで、異方性材料の破壊靱性値の計算を実施した。解析に当たっては、異方性の弾性定数が必要となるため、あらかじめ実験的に求める。このため、昨年度測定方法を検討したせん断弾性率の測定を実施するとともに、繊維軸に垂直な方向の弾性率の測定方法について検討した。

実験方法としては、現有のナノインデンターにより繊維の押し込み試験を実施し、有限要素法による解析結果との関係から、弾性率を推定する。この結果を元に、各種繊維の破壊靱性値を計算する事が可能となった。[3]試験の再現性向上破壊靱性試験の再現性を向上させるため、るフォルダー形状について検討したが、現段階では従来以上の再現性が得られていない。これについてはさらに検討を要する
再生医療への応用を目指したケラチンを基本材料とする生体適合性材料の研究

羊毛ケラチンの再生医療用材料としての可能性を検討するため、他の高分子との複合化、化学修飾、成型法の検討、ケラチンに豊富に含まれるSH基を利用した生物活性分子による修飾、及び動物細胞増殖への影響を調べ、次のような結果を得た。1.キトサンとの複合化により抗菌性を有し強度の高いフィルムが得られた。また、ジエポキシ化合物による架橋により延伸性のある、水耐性に優れたフィルムを得ることができた。2.細胞接着ペプチドRGDSでケラチンのSH基を修飾することで、細胞接着能の向上したフィルムを得た。3.多孔性の凍結乾燥ケラチンスポンジのSH基にリゾチームを固定化したところ、リゾチームとスポンジ間をS-S結合でつないだ場合にはリゾチームの徐放化が、S-C結合でつないだ場合にはリゾチームが安定に保持されることがわかった。4.凍結乾燥ケラチンスポンジの凍結乾燥条件を検討した結果、-20°C、3日間の凍結で直径約100μmの均一な孔を有するスポンジが得られた。このスポンジ上でマウス線維芽細胞を培養したところ、単位面積あたりの細胞数が市販培養皿の37倍に達した。また、増殖が停止した後も細胞は長期間維持された。5.ケラチンだけで強度に優れたフィルムを作製するため、羊毛より抽出した還元ケラチンをスプレードライ法により粉末化しこれを圧縮成型した。圧縮成型条件を検討した結果、均一透明で強度の高いプラスチック様のフィルムが得られた。このフィルムは水耐性に優れ、また動物細胞の接着増殖を支持した。1.羊毛より抽出した還元型ケラチンをキトサンと混合し、ケラチン-キトサン複合フィルムを作製した。ケラチンフィルムは脆弱で取扱い困難であったが、10-30%のキトサンの混合により、強度,柔軟性に優れたフィルムとなった。ケラチンフィルムは塩基性水溶液中で高い膨潤度を示し、キトサンフィルムは中性以下のpHの水溶液中で激しく膨潤し、膨潤後乾燥するとフィルムの強度を失うが、複合フィルムにすることで、それぞれのpHで膨潤が抑制され、膨潤後再乾燥したフィルムでもその機械的強度が保持され、水環境で使用し易いフィルムとなった。さらに、複合フィルムで大腸菌を処理すると,フィルムへの吸着により大腸菌の減少が見られた。フィルムへの大腸菌の吸着は不可逆的であった。一方、動物細胞は複合フィルム上に吸着し良好に増殖を示した。以上のようにケラチンにキトサンを添加することで強度に優れ生態親和性も有するフィルムが作製できた。2.羊毛由来還元型ケラチンの凍結乾燥によりケラチンスポンジ(円柱状;直径1cm,厚さ0.2mm)を作製し、スポンジ上でのマウス線維芽細胞の培養を試みた。凍結乾燥条件を検討した結果、-20°C,3日間の凍結条件で直径約100μmの均一な孔を有するスポンジが得られることがわかった。このスポンジにマウス線維芽細胞を播種したところ、播種後1時間で細胞の吸着が観察され、その後少なくとも7日間良好な増殖が観察された。(倍化時間:29.0時間)細胞の増殖は播種後23日にスポンジ表面が完全に細胞に覆われるまで続いた。さらに、43日目まで培養を続けたところ,細胞数はスポンジ当り420740万で一定であり、細胞の形態には全く変化が見られなかった。直径1cmの円表面の細胞数は同面積の培養ディツシュの37倍になり、ケラチンスポンジが長期の高密度培養の細胞支持体として優れていることが示された。1.ケラチンはシステイン残基を豊富に含むことを特徴とする。我々は羊毛より抽出した還元型ケラチンのSH基を利用して、別途合成した細胞接着モチーフ、Arginine-Glycine-Asparatic acid-Serine (RGDS)によりケラチンを修飾した。RGDSモチーフはケラチンのアミノ酸1000残基当り6090個導入されていた。

RGDSケラチン及び未修飾ケラチンによりガラス表面をコートし、その表面上でマウス線維芽細胞の培養を行い、細胞培養基質としての能力を比較した。細胞播種後1時間において、RGDS-ケラチンコート表面はケラチンコート表面やガラス表面の1.52倍量の細胞の接着が認められた。また、RGDS-ケラチンコート表面への接着細胞数はコートしたタンパク量の増加と共に上昇した。初期細胞接着数を反映して、RGDS-ケラチン表面の細胞はケラチンやガラス表面よりも早くコンフルエントになることがわかった。以上の結果より、ケラチンはそのSH基を修飾することで高機能化できることが示された。2.我々はこれまでケラチンにグリセロールを添加したり、キトサンと複合化することで透明かつ適度な強度をもった薄膜を作成することができた。しかしながら、水中で薄膜を使用するとグリセロールは溶出し、キトサンとの複合薄膜は激しく膨潤した。今回、ケラチンをジエポキシ化合物により架橋したところ、強度を有し、しかも水中での膨潤も抑制された薄膜が作成できた。この架橋ケラチン薄膜上で細胞培養を試みたところ、未修飾ケラチン薄膜と比較し、初期細胞接着が強く抑制されていた。しかしながら接着した細胞は増殖したことから架橋ケラチンは細胞毒性のない生体適合性材料であることがわかった。1.ケラチンはシステイン残基に富むことを特徴とする。羊毛より抽出した還元型ケラチンを凍結乾燥すると、システイン残基の空気酸化によりS-S結合が形成され非水溶性のケラチンスポンジが得られるが、なおフリーのSH基もスポンジ上に残存していることが確認された。このフリーSH基に生物活性分子としてリゾチームを固定化することを試みた。二官能性の架橋剤としてSPDPとSulfo-SMCCを用いた。SPDPはS-S結合で、Sulfo-SMCCはS-C結合でケラチンスポンジとリゾチームをつなぐ。どちらの架橋剤を用いてもケラチンスポンジのSH基にリゾチームが固定化された。スポンジ上でのリゾチームの安定性を調べたところ、S-Cを介して結合したリゾチームは中性緩衝液中3ヶ月以上安定であったが、S-S結合を介して結合したリゾチームは徐々に放出され21日目にはスポンジ上の活性は消失した。このように、ケラチンスポンジは架橋剤を選択することで、生物活性分子の安定固定化担体にも、徐放化器材にもなり得ることが示唆された。2.還元ケラチン水溶液をキャストして得られるフィルムは、強度が充分でなくグリセロールの添加やキトサンとの複合化により使用可能なフィルムを得てきた。ケラチンだけで強度を有するフィルムを得るため、還元ケラチン粉末の圧縮成型によるフィルムの作製を試みた。その結果、S-sulfo型ケラチンに等量の水-エタノール(1:9)を加え120°Cで圧縮成型を行なうことで、ケラチンだけからなる強度、透明性並びに非水溶性を有するプラスチック様のフィルムを得ることができた。本フィルム上においてマウス線維芽細胞は良好に接着し増殖した。
リンパ性フィラリアの制圧を目指すチランダマイシン類天然物の全合成研究

我が国を含む先進国ではさほど問題とはならないものの、発展途上国などにおいて深刻な公衆衛生上の問題である「顧みられない病気」の代表的なものの中に、微小な線虫によって引き起こされるリンパ性フィラリア症がある。本研究においては、最近、有効な殺フィラリア線虫活性を有する事が明らかにされたチランダマイシンBの全合成研究を行った。その結果、Marshallらのキラルアレニル亜鉛種のアルデヒドへの付加、リチオフランのカップリング、Achmatowicz反応を経るビシクロ環構築、Wittg反応を経て既知中間体へと到達し、チランダマイシンBの形式合成を達成した。我が国を含む先進国ではさほど問題とはならないものの、発展途上国において深刻な公衆衛生上の問題であり、製薬企業が研究対象としにくい「顧みられない病気(Neglected Disease)」の代表的なもののひとつにリンパ性フィラリアがある。本疾患は象皮病という悲惨な身体障害の原因となり、患者の貧困、患者に対する偏見等が大きな問題となっている。WHOは本疾患制圧を目指し、アルベンダゾール、イベルメクチンといった既存薬の大量配布を行ってきたが、すでにこれらの薬剤に体制を示すフィラリア線虫の出現が報告されており、さらに肝障害等の副作用も見られる事から新たな治療薬の開発が望まれている。本研究においては、最近、強力な糸状虫のアスパラギンアミノアシルtRNA合成酵素(AsnRS)阻害活性を有し、有効な殺フィラリア線虫活性を示す事が明らかとなった天然物チランダマイシンBの全合成研究を行っている。本年度においては、まずフルフラール誘導体の有機触媒不斉Baylis-hillman反応を基盤として不斉中心を構築し、フラン環の酸化に基づくビシクロ骨格の構築等をへて宮下らの中間体へと導いた。つづいてHWE反応に基づくジエノイルテトラミン酸単位を導入した後、脱保護をへてチランダマイシンBの全合成を達成した。今後はチランダマイシンBのより効率的な合成方法の開発をおこなう。具体的には、連続不斉中心の構築に焦点を当て、不斉還元的アルドール反応に基づくアプローチを検討する。2011年、ShenらによってStreptomyces sp. 17944より一連のチランダマイシン類天然物が単離された(Org. Lett. 2011, 13, 2034.)。チランダマイシンA,チランダマイシンB等一部のチランダマイシン類は既知化合物であったが、改めて詳細な生物学的検討がなされ、特にチランダマイシンBが強力な抗フィラリア線虫活性を有する事が明らかにされた。リンパ管フィラリアは何世紀にもわたって治療、予防ができない「顧みられない病気(Neglected Disease)」となっており、新たな新薬の開発が求められている。今回、有機合成化学からのリンパ性フィラリア制圧への貢献を目指して、チランダマイシンBの全合成研究を行った。本年度は、まず、フルフラール誘導体の還元的アルドール反応、若しくは立体選択的クロチル化によって連続不斉中心の足がかりを構築する方法を試みたが、何れの反応も満足のいく結果が得られなかった。そこで合成戦略を再検討し、(S)-3-(((4-methoxybenzyl)oxy)methoxy)-2-methylpropanalを基質として、Marshallらのアレニル亜鉛種を用いる方法によって、4連続不斉中心のうちの3不斉中心を構築することが出来た。続いてリンドラー還元、PMB基の除去、酸化、リチオフランとのカップリングを行った。現在カップリング体の立体配置の確認を行っている。我が国を含む先進国ではさほど問題とはならないものの、発展途上国において深刻な公衆衛生上の問題であり、製薬会社が研究対象としにくい「顧みられない病気(Neglected Disease)」の代表的なものに糸状虫感染症であるリンパ性フィラリア症がある。WHOはリンパ性フィラリアの制圧を公衆衛生における世界的な課題とし、その方策の一つとして、特にフィラリアの成虫に対する新たな効果的治療薬の開発を最優先事項として打ち出している。本研究において代表者は、リンパ性フィラリア症制圧に有機合成化学の立場から貢献すべく、最近、有望な抗線虫活性を有することが分かったチランダマイシン類天然物の全合成本研究課題の目的と定めた。本天然物は、生活活性のみならず、高度に官能基化された化学構造や連続する不斉中心を有することからも魅力的な合成標的と言える。本年度においては、チランダマイシンBの新たな合成ルート確立に向けて検討を行った。即ち、市販のmethyl (S)-3-hydroxy-2-methylpropanoateを出発原料として、Marshallらのキラルアレニル亜鉛種のアルデヒドへの付加によって連続不斉中心を構築した。続いて、アセチレン部をPd-PEIを用いてアルケンへと還元後、リチオフランの立体選択的付加などを通して不斉中心を構築し、Achmatowicz反応を経てビシクロ環を形成後、既知中間体に導いて形式合成を達成した。

その結果、Marshallらのキラルアレニル亜鉛種のアルデヒドへの付加、リチオフランのカップリング、Achmatowicz反応を経るビシクロ環構築、Wittg反応を経て既知中間体へと到達し、チランダマイシンBの形式合成を達成した。当初計画していた、還元的アルドール反応、不斉クロチル化に基づく経路は実現しなかったものの、Marshallらのアレニル亜鉛種を用いて不斉中心を構築する方法を確立できた。有機化学Marshallらのアレニル亜鉛種を用いて不斉中心を構築する方法を確立できたので、今後は、リチオフランとのカップリング、クロスメタセシス反応等を経て、宮下らの既知中間体へと導く予定である。チランダマイシンBの初の天然型光学異性体の合成に成功した。代表者は当該年度に所属機関を異動した。異動に当たって主に、学会出席の計画に大幅な変更が生じ、旅費支出が少なくなったことが次年度使用額が生じた主な理由である。又、購入を予定していた試薬の一部を別の研究資金で購入したことも未使用額が生じてしまった理由の1つである。チランダマイシンBのより効率的な合成方法の開発をおこなう。具体的には、連続不斉中心の構築に焦点を当て、不斉還元的アルドール反応に基づくアプローチを検討する。未使用額が生じたものの、研究の進行自体にはさほど影響は出ていない。これらは試薬、硝子器具の購入に充てる計画である。
超流動転移点近傍における表面張力の異常に関する^3He不純物効果

液体^4Heの超流動転移点近傍での表面張力の振る舞いは、超流動転移というバルクの性質の変化が表面にどのような影響を与えるか、という基本的な問題を提起して興味深い。さらに、液相一気相臨界点を異なり、転移点の高温測低温測ともに表面が存在するというユニークな特徴を持つ。本研究では、液体^4Heに不純物として^3Heを加え、転移点近傍の表面張力が定量的にどのように変化するかを測定することにより超流動転移と表面張力の関係を明らかにする。具体的には、1)表面張力の異常はBose凝縮体(または超流動密度)に結びつけられるかどうか。2)MikheevとFisherにより指摘された2mKの異常の不純物効果とそのメカニズムはなにか、について新しい知見を得ることを目的とする。本研究では、実験の準備としてクライオスタットの改良および測定系の安定度を向上させる改良を行うと同時に、これまでに、予備的な実験として次のことを行った。1)液体^4Heの表面張力の絶対値の測定:最近、フランスのグループは、薄膜の第3音波の測定より表面張力の絶対値がこれまでの値より6%ほど大きいと報告した。本実験では、試料液体の厚さの変化による表面張力の絶対値の系統誤差を評価したが系統誤差は見られず、これまで報告された絶対値に一致する結果を得た。2)小量の^3Heを不純物として混合したときの表面張力の測定:液体^4He試料に0.14%の^3He不純物を混合し、λ点近傍の表面張力の異常を測定した。予備的な測定があるが、純粋な^4Heとほぼ同様な振る舞いをすることが見いだされた。つまり、上記の2mKの異常は^3He不純物の濃度には依存しない。これは、この異常のメカニズムの解明に手がかりを与えるものと期待される。
BMP-2遺伝子発現ベクターとRANKL結合ペプチドによる新規骨形成法の開発

骨形成を促進する試薬として知られているタンパク質であるBMP-2には、ヒトに骨形成を導くためにはBMP-2の大量投与が必要であり、そのために、炎症が惹起される。また、大量の精製タンパク質が必要なためにコスト面の問題もあり、広く臨床応用はされていない。我々はこれらBMP-2の問題を抑えるために、BMP-2と骨形成促進ペプチドとの併用によりBMP-2の使用量を抑えても骨形成を促進できる方法を開発してきた。一方、BMP-2の遺伝子を導入する場合は局所注射でタンパク誘導が可能であり、必要以上のBMP-2が発現せず、タンパク精製の必要が無いため、費用も抑えられる。先行実験では、レトロウイルスを用いた遺伝子発現ベクターでは、うまく骨を誘導できたが、ウイルスベクターに比べてより安全な非ウイルス性ベクターを用いて、BMP-2遺伝子を発現させてみると骨形成量は、ウイルスベクター使用時比べて少量であった。そこで、本研究では、BMP-2遺伝子発現非ウイルス性ベクターと、BMP-2誘導による骨形成を促進するRANKL結合ペプチドとの併用により、非ウイルスベクターの低い骨誘導能を補えなると仮定し、実験を始めた。大阪歯科大がとの共同研究により、精製したBMP-2あるいはBMP-2/7を用いて骨を誘導することを試みた。2017年度行った実験を何度か行ったが、ベクターのみの群に比べて、ペプチドの担体である粒子状のゼラチンハイドロゲルのみを注射した群のほうが大きな新生骨が現れた。予想と反して、骨形成ペプチドを注射した群では新生骨量は少なかった。モデルを変えて、マウスの頭蓋骨欠損部にGFPを組み込んだBMP-2ベクターを用い、さらにカチオン性の担体にベクターを含浸させることにより、エレクトロポレーションを行わずに遺伝子導入を行ったが、骨形成促進ペプチドによる相乗効果は認められなかった。BMP-2/7のヘテロダイマーの遺伝子導入により、マウスの筋肉内に異所性骨石灰化を誘導することができたが、骨形成促進ペプチドによる相乗効果が認められなかったため、骨欠損部に新生骨を誘導する実験系で再度骨形成促進ペプチドの相乗効果を試した。結果はやはり、ペプチドの効果は認められなかった。カチオン性の担体を用いることによりエレクトロポレーションを行わずとも、遺伝子導入が可能となり骨誘導が観察されたことは、興味深い。ただ、本研究の目的が導入効率が悪い非ウイルス性ベクターの欠点を補う方法として骨形成促進ペプチドの添加効果は明らかでなかったことから、やや遅れていると判断した。使用している骨形成促進ペプチドは、RANKL分子に親和性の高いペプチドであり、その骨形成促進作用の発現は骨芽細胞上のRANKL分子に結合し、骨芽細胞を直接刺激することが考えられている。我々はRANKLが骨形成促進の受容体として働くことにより、骨芽細胞分化を促進することを発表したが、我々の骨形成促進ペプチドが作用するためには、RANKLを発現する細胞の周りにペプチドがうまく存在する必要がある。一方、ペプチドは注入法により投薬しているが、遺伝子が導入された箇所の周囲にペプチドを作用させるためには、相当熟練の技が必要であるため、ペプチドの投与を局所投与ではなく、全身投与に切り替えて、遺伝子導入効率の悪さを補う骨形成促進ペプチドの相乗効果を検討する予定である。口蓋裂患者にとって骨欠損部における骨形成は、歯牙の萌出スペース獲得による咬合改善へとつながる、不可欠な要素である。また、大量の精製タンパク質が必要なためにコスト面の問題もあり、広く臨床応用されていない。我々はBMP-2のこれらの問題を抑えるために、BMP-2と骨形成促進ペプチドとの併用によりBMP-2の使用量を抑える試みを行ってきた。昨年度はまずマウスを用いてすでに研究分担者である河井がBMP-2遺伝子発現ベクターよりも効率的に骨を再生する成績を示しているBMP-2/7の遺伝子ベクターを用いて骨を誘導することを試みた。マウス腓腹筋にベクターを注射した後、エレクトロポレーションにより遺伝子導入を行った。不思議なことに、ベクターのみの群に比べて、ペプチドの担体である粒子状のゼラチンハイドロゲルのみを注射した群のほうが大きな新生骨が現れた。BMP-2/7のヘテロダイマーの遺伝子導入を非ウイルスベクターを用いておこなった。エレクトロポレーション法を用いて遺伝子を導入したので、マウスの筋肉内に異所性骨石灰化を誘導することができた。ところが、ペプチドによりより大きな骨が形成されることを期待したが、大きくはならなかった。

また、ペプチドが含有しない足場材料だけの注入では、ベクターのみで形成された骨よりも大きな骨が形成された。その原因として、おそらくペプチドの足場材料であるゼラチンハイドロゲルが発現したBMP-2/7タンパクを吸収することにより、タンパク質が長い間にわたり徐放したことが原因と考えられた。ペプチドにより相乗効果が得られなかった理由として、BMP-2との併用は実績があったが、BMP-2/7との併用は試したことが無かったことが考えられた。このように予想と違った結果が得られたため、やや進行が遅れているとした。骨形成を促進する試薬として知られているタンパク質であるBMP-2には、ヒトに骨形成を導くためにはBMP-2の大量投与が必要であり、そのために、炎症が惹起される。また、大量の精製タンパク質が必要なためにコスト面の問題もあり、広く臨床応用はされていない。我々はこれらBMP-2の問題を抑えるために、BMP-2と骨形成促進ペプチドとの併用によりBMP-2の使用量を抑えても骨形成を促進できる方法を開発してきた。一方、BMP-2の遺伝子を導入する場合は局所注射でタンパク誘導が可能であり、必要以上のBMP-2が発現せず、タンパク精製の必要が無いため、費用も抑えられる。先行実験では、レトロウイルスを用いた遺伝子発現ベクターでは、うまく骨を誘導できたが、ウイルスベクターに比べてより安全な非ウイルス性ベクターを用いて、BMP-2遺伝子を発現させてみると骨形成量は、ウイルスベクター使用時比べて少量であった。そこで、本研究では、BMP-2遺伝子発現非ウイルス性ベクターと、BMP-2誘導による骨形成を促進するRANKL結合ペプチドとの併用により、非ウイルスベクターの低い骨誘導能を補えなると仮定し、実験を始めた。大阪歯科大がとの共同研究により、精製したBMP-2あるいはBMP-2/7を用いて骨を誘導することを試みた。2017年度行った実験を何度か行ったが、ベクターのみの群に比べて、ペプチドの担体である粒子状のゼラチンハイドロゲルのみを注射した群のほうが大きな新生骨が現れた。予想と反して、骨形成ペプチドを注射した群では新生骨量は少なかった。モデルを変えて、マウスの頭蓋骨欠損部にGFPを組み込んだBMP-2ベクターを用い、さらにカチオン性の担体にベクターを含浸させることにより、エレクトロポレーションを行わずに遺伝子導入を行ったが、骨形成促進ペプチドによる相乗効果は認められなかった。BMP-2/7のヘテロダイマーの遺伝子導入により、マウスの筋肉内に異所性骨石灰化を誘導することができたが、骨形成促進ペプチドによる相乗効果が認められなかったため、骨欠損部に新生骨を誘導する実験系で再度骨形成促進ペプチドの相乗効果を試した。結果はやはり、ペプチドの効果は認められなかった。カチオン性の担体を用いることによりエレクトロポレーションを行わずとも、遺伝子導入が可能となり骨誘導が観察されたことは、興味深い。ただ、本研究の目的が導入効率が悪い非ウイルス性ベクターの欠点を補う方法として骨形成促進ペプチドの添加効果は明らかでなかったことから、やや遅れていると判断した。