hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
筋肥大・再生に伴う筋線維型制御機構の新展開

骨格筋の肥大・再生の際、新しく形成される筋線維の型(速筋型・遅筋型)の制御が重要な基盤となる。本研究では、「筋幹細胞が合成・分泌する多機能性制御因子Sema3Aが筋線維型を自律制御する」という作業仮説を細胞培養系および筋幹細胞特異的Sema3A-cKOマウスを用いて検証した。その結果、Sema3Aとその細胞膜受容体依存的な「遅筋型筋線維の形成誘導機構」の分子基盤を解明すると共に、細胞膜受容体の食品由来アゴニストを同定した。成果は"より美味しい"食肉を生産する技術開発に資する他、健康・スポーツ科学にも貢献が期待された。分化初期の衛星細胞が合成・分泌するSemaphorin 3A (Sema3A)が筋細胞特異的転写制御因子myogenin依存的に筋線維型を制御する細胞外リガンドであることを検証するため、実験計画1と2を実施した。RT-qPCRおよびwestern blottingによる実験結果の概要は以下の通りである。先ず、マウス衛星細胞株のSema3A発現をRNAi法(RNA干渉法)によってノックダウンする実験系を確立し、myogeninと成熟型ミオシン重鎖(MyHC)の発現に及ぼす影響を調べた。Sema3A特異的siRNAをリポフェクションすると、myogeninの発現が有意に抑制されるとともに、type I MyHC発現レベルが減少し、これに遅れてtype II MyHCの発現レベルが代替的に増加することを観察した。type I/II MyHCを特異的に認識する抗体を用いてを蛍光染色したところ、遅筋型筋管の形成が有意に阻害されており、この結果は上記の観察結果と符合した。また、myogeninの発現を同様にsiRNAでノックダウンするとSema3A発現には全く変化はなく、type I MyHCの発現レベルが有意に減少することも確認した。両ノックダウン系において、myogeninの共役制御因子であるMEF2DとHDAC7の発現が有意に減少することも明らかにした。これらの結果から、分化した衛星細胞(筋芽細胞)が融合し筋管(幼若な新生筋線維)を形成する際にSema3Aリガンドを合成・分泌し、自らの筋線維型を遅筋型へと初期決定するシグナリング機構(Sema3A-myogenin/MEF2D/HDAC4-type I MyHCからなるシグナリング軸)、即ち、「筋線維型の自律制御機構」が存在すると考えられた。遅筋型筋線維が優勢なヒラメ筋の衛星細胞はEDL筋(代表的な速筋)のそれに比べSema3Aの発現量が有意に高いことは、上記の分子機構の妥当性を支持している。分化初期の衛星細胞が合成・分泌するsemaphorin 3A (Sema3A)が筋細胞特異的転写制御因子myogenin依存的に筋線維型を制御する細胞外リガンドであることを検証するため、H26年度は衛星細胞特異的Sema3Aノックアウトマウス(Sema3A-cKO)を用いたIN VIVO実験の準備を進めた。先ず、Sema3A-cKOマウスの作出に関しては、Pax7CreERT2マウスとSema3ALoxPマウスの交配により生まれる仔マウスからジェノタイピングによりCreERT2およびLoxP配列がホモ挿入された個体を選別し、これらをさらに複数回交配することにより目的のPax7CreERT2-Sema3Aflox雄マウスを得た。次に、ERT2の合成リガンドであるタモキシフェンの腹腔内投与量および処理期間を至適化するなどし、タモキシフェン投与により衛星細胞特異的にSema3A遺伝子をノックアウトすることに成功した。さらには対照区の設定に関しては、当初予定していたタモキシフェン非投与マウスではなく、Pax7CreERT2マウスおよびSema3ALoxPマウスにタモキシフェンを投与する実験区が適当であると結論した。以上の成果により、Sema3A-cKOマウスを用いたIN VIVO実験、即ち、筋損傷・再生に伴う筋線維型の表現型解析を実施する準備は全て整った(H27年度に実施予定)。予備実験を既に開始し、遅筋型ミオシン重鎖の発現低下および速筋型ミオシン重鎖の代替的発現増加などの予想通りの結果を得ている。分化初期の筋幹細胞(衛星細胞)が合成・分泌するSema3Aが細胞膜受容体・転写制御因子myogenin依存的に遅筋型筋線維の形成を誘導する因子であるかどうかを調べるため、最終年度では先ず、衛星細胞特異的Sema3Aノックアウトマウス(Sema3A-cKO)を用いたin vivo実験を進めた。後肢下腿部のヒフク筋にcardiotoxinを注入し筋損傷を誘導し、筋再生が完了する損傷後28日目に、遅筋型筋線維割合の指標となる筋持久力(脛骨神経の電気刺激によって発生する最大発揮張力の経時的減衰)を測定した。最大発揮張力の初期値は有意に増加し、その経時的減衰は対照区に比べ大きかったことから、Sema3A-cKOにより遅筋型筋線維割合が減少することがわかった。次に、衛星細胞の培養系において、neuropilin2およびplexinA3をノックダウンするとmyogeninと遅筋型ミオシンの発現が有意に低下し、一方、neuropilin1およびplexinA1, 2をノックダウンするとmyogeninと速筋型ミオシンの発現が有意に増加した。

これら結果から、受容体neuropilin2/plexinA3にSema3Aが結合すると遅筋型ミオシンの発現が誘導されると共に、neuropilin1/plexinA1, 2は速筋型ミオシンの発現抑制をシグナリングしていると考えられた。従って本研究により、衛星細胞が合成・分泌するSema3Aリガンドにより細胞膜受容体・myogeninからなるシグナリング軸を介して遅筋型筋線維の形成が誘導されることが明確になった。更には、受容体neuropilin1/plexinA1, 2の食品由来アゴニストを見出し、これをラットに給餌あるいは衛星細胞培養系に添加すると遅筋型ミオシンとmyogeninの発現が増加することも確認した。遅筋型筋線維の形成を食品成分で誘導する栄養機能学的制御技術の開発を展望した。骨格筋の肥大・再生の際、新しく形成される筋線維の型(速筋型・遅筋型)の制御が重要な基盤となる。本研究では、「筋幹細胞が合成・分泌する多機能性制御因子Sema3Aが筋線維型を自律制御する」という作業仮説を細胞培養系および筋幹細胞特異的Sema3A-cKOマウスを用いて検証した。その結果、Sema3Aとその細胞膜受容体依存的な「遅筋型筋線維の形成誘導機構」の分子基盤を解明すると共に、細胞膜受容体の食品由来アゴニストを同定した。成果は"より美味しい"食肉を生産する技術開発に資する他、健康・スポーツ科学にも貢献が期待された。上述の通り、H26年度に予定していたSema3A-cKOの作出および実験条件の至適化など、研究計画は概ね順調に進行している。初年度の細胞培養系での実験結果を生体内で検証する極めて重要な実験系であり、その成果のインパクトは学術的にも極めて大きい。Sema3Aが遅筋型筋線維の形成を誘導する初期決定因子であり、その細胞内シグナリングには筋特異的制御因子myogeninとその共役調節因子MEF2DとHDAC7が関与することが証明出来ると期待される。これらの知見は、分化初期の衛星細胞が合成・分泌するSema3Aリガンドによって筋管(将来、筋線維へと成熟する)の線維型が自律的に決定されることを示しており、これまでの運動刺激説やPPARdelta/PGC1alpha転写制御説と本質的に異なる新規の制御機構であると期待される。IN VIVO実験での直接証明を待って、本研究成果を著名な学術雑誌に投稿する予定である。27年度が最終年度であるため、記入しない。筋細胞分子生理学in vitroの実験結果の生理学的重要性を直接証明するため、衛星細胞特異的Sema3Aコンディショナルノックアウトマウス(Sema3A-cKOマウス)を用いたin vivo実験を実施する予定である。マウスの作出は既に成功したので、4月下旬から実験を開始すべく準備を進めている。Sema3A-cKOマウスの後肢下腿部筋を物理的あるいは化学的に損傷させ筋再生を誘導する実験をデザインしており、この場合、衛星細胞からSema3Aが合成・分泌されないため遅筋型筋線維が形成されず、筋線維型組成(遅筋・速筋型筋線維の組成比)が元の状態に復帰しないと予想している。極めて重要かつインパクトのある実験結果になると期待している。実験の再現性も含めて確実に実施する所存である。初年度に予定していた3つの実施計画のうち2つは終了し、前述の通り良好な実験結果を得た。即ち、衛星細胞株を用いたin vitro実験系において、Sema3Aが遅筋型筋線維の形成を誘導する初期決定因子であることを証明できた。
pH選択型等速電気泳動装置の製作と分離過程の解析への応用

筆者は等速電気泳動法の分離過程及び定常状態をシミュレートするソフトウエアを開発し、多くの試料についてその妥当性について検討してきた。その結果、分離最適条件(特にpH)の予測にシミュレーションの手法が精度良く適用できる事、試料中に成分数が多い場合には、一種類のpH条件のみで全分離が可能である事は殆どないことが明らかになった。多成分試料を分析する場合、既存の等速電気泳動分析装置では一種類の電解液しか使用できないため、電解液を交換後、試料を再度注入して分析しなおす必要があった。この点を改良するため、今回の補助により現有の等速電気泳動装置(島津製作所、IP-1B)を改良して5種の異なる電解液系で同一試料の繰り返し分析が可能な等速電気泳動装置を製作した。装置作製にあたり、必要な部品およびデータ取り込みと制御に使用するマイクロコンピュータ等を購入した(別紙)。試料分離に最も大きな影響を与えるのはリーディング電解液のpHで、その調節にはpHに応じて適当な緩衝剤が使用される。この電解液の迅速な交換を実現するため、本研究ではリーディング電解液槽には単に導電性を持たせる意味からNaCl水溶液を満たし交換は行わず、試料検出器とリーディング電解液槽を接続する細管内の電解液を交換した。この際分離を妨害するカウンターイオン(アニオン分析の場合はNa)が対電極に向かって泳動するので、微量のリーディング液をゆっくりと圧送してこれを系外に排出した。この方式により試料検出後、高電圧をかけたまま試料ゾーンを試料注入位置付近にまで押戻し電解液を交換して再分析が可能になった。本装置を使用して多くの実試料を分析したが、回収率、再現性ともに良好であった。今回の研究成果についてはJ.CHROMATOGR.に近々投稿の予定である。
ゲノム複製開始点の2重鎖DNAを特異的に開裂する蛋白質高次複合体のメカニズム

細胞生物のゲノム複製は複製開始点の2重鎖DNAを特異的に開裂することで開始される。この反応はイニシエーター蛋白質が複製開始点上で形成する動的な高次複合体中で起こる。この高次複合体の形成様式と構造変化を理解することは、ゲノム複製開始反応とその制御メカニズムを解明する上で非常に重要である。そこで研究代表者は2重鎖DNA開裂反応の普遍原理を明らかにすることを研究目的とし、特に当面の目標として、超好熱性真正細菌由来の開始蛋白質(tmaDnaA)と複製開始点(tma-oriC)とで形成される高次複合体の形成様式とその制御についての理解を目指した。(1)tmaDnaA多量体形成に必要なtma-oriC最小機能領域及び、機能構造の同定についてtma-oriC最小機能領域を決定し、oriC開裂の基本となるモデルを提唱した。研究代表者は本研究成果を第80回日本遺伝学会大会において発表し、Best Papers賞を受賞した。本研究内容は、現在論文投稿準備中である。(2)tmaDnaA多量体形成のためのDnaA間相互作用解析についてtmaDnaA多量体の構造モデルに基づいてDnaA間相互作用に重要と思われるアミノ酸残基を複数予測した。このアミノ酸残基に変異をそれぞれ導入し、tmaDnaA変異体を構築し、生化学的解析を進めた。いくつかの変異体は多量体形成能を欠損していた。(3)ATP結合依存のtmaDnaA構造変化様式の解析についてDNase Iフットプリント解析を用いて、ATP結合依存の構造変化をモニターする方法を構築した。いくつかのtmaDnaA変異体はATP依存の構造変化能を欠損した。ゲノム複製のためには、イニシエーターが複製開始点で複合体を形成した後、開始点の2重鎖DNAを開裂しなければならない。この2重鎖DNA開裂反応にはAAA+ファミリー蛋白質が重要な役害を担っている。大腸菌のゲノム複製開始反応では、AAA+ファミリー蛋白質DnaAが複製開始点oriC上で動的な高次複合体を形成し、ATP結合に依存して2重鎖DNAの開裂を促す。研究代表者はAAA+蛋白質の構造特性と超好熱菌由来の精製DnaA蛋白質(tmaDnaA)の結晶構造解析に基づき、「DnaAによるリング様多量体の形成とリング中央の孔(ポア)の内側に露出したアミノ酸残基によるoriC開裂反応の促進」というモデルを提唱している。このモデルの検証のために、本計画研究ではモデル蛋白質であるtmaDnaAにより形成される蛋白質高次複合体の機能構造を解析し、AAA+蛋白質が触媒する2重鎖DNA開裂の普遍分子機構を理解することを目指した。(1)DnaAリング様複合体形成のための蛋白質間相互作用様式の解明構造解析と生化学的解析によりtmaDnaA蛋白質が形成する蛋白質高次複合体の機能構造の解明を進め、論文発表した(JBC,2008)。DNase Iフットプリント実験を用いて、DNA上でのtmaDnaA多量体形成様式を解析する方法を構築した。この方法によりATP結合に依存したtmaDnaA複合体の構造変化を検出することに成功した。(2)2重鎖開裂により生じた1本鎖DNAとDnaAポア領域との相互作用様式の解明ゲルシフト実験を用いて、1本鎖化DNAとtmaDnaA蛋白質との結合を評価する方法を構築した。変異体解析により、1本鎖化DNAとの結合能を特異的に欠損したtmaDnaA変異体を複数見いだした。これらの変異導入アミノ酸のいくつかは、DnaAポア領域に位置していた(JBC,2008;投稿準備中)。
低い磁場で駆動する高加工性Ni基メタ磁性形状記憶合金の開発

本研究の目的は、申請者らが見出したNi-Mn-X(X=In, Sn, Al)基合金を中心に、低い磁場で磁場誘起変態が発現し、高加工性を有するメタ磁性形状記憶合金を開発することである。クラジウス-クラペイロンの関係式より、磁場誘起変態の発現には母相とマルテンサイト相の磁化の差ΔMが大きいことが必要であるため、両相の磁性の起源や詳細についての情報が切望されている。そこで、本年度はNiMnZ(Z=In,Sn)3元合金およびNiCoMnZ(Z=In,Sn)合金のキュリー温度と磁気モーメントの組成依存性について系統的な調査を行った。Ni_<50-x>Co_xMn_<50-y>Sn_y合金のキュリー温度は、Co置換量xの増加に伴い直線的に上昇した。同合金の磁気モーメントは、y>20ではKanomataらの先行報告と同様にSn濃度の低下に伴い直線的な減少を示したが、y<20では増加に転じた。このような凹型の特異な磁気モーメントの組成依存性は、Co濃度の上昇に伴って薄れていき、8Co-ySn合金は5Co-yIn合金と類似の直線的な組成依存性になった。この結果は、Ni_<50>Mn_<50>合金における準安定B2相の磁気モーメントが約4.5μ_B/f.u.の非常に大きな値であることを強く示唆する。また、この現象はMn-Mn原子間距離およびMn原子の最隣接位置に占めるCoおよびNi原子の存在確率によって考察できた。この結果は、第147回日本金属学会秋期大会で学会発表を行い、Applied Physics Letters 97巻に掲載された。また、加工性の改善について、無加圧法で作製したNiCoMnSn焼結体を用いて調査した。焼結時間が長くなると気孔率は減少し、それと同時に加工性が向上した。一方で、気孔率が減少するのに伴って形状回復率が低下した。つまり、NiCoMnSn焼結体の加工性と形状回復率を両立させるには、適切な焼結時間を施す必要があることが明らかになった。この結果は、Scripta Materialia 63巻に掲載された。
法隆寺宝物館と正倉院宝物の源流に関する調査研究 -韓国所材の彫刻・工芸作品を中心に-

国立慶州博物館、国立大邱博物館、国立扶餘博物館、国立全州博物館・全南大学校博物館において、三国時代から高麗時代までの関連作品の調査を韓国側研究協力者の協力を得て、実施した。その結果、彫刻分野12件、工芸・考古分野10件の作品について、詳細な調書作成、写真撮影、実測図作成が完了した。国内においては、日本に伝存あるいは出土した関連作品について調査を行い、詳細な調書作成、写真撮影、実測図作成を行った。また、韓国側研究者を招聘し、日本国内において、関連遺品の調査を実施した。調査資料は、2ヵ年で、35mmカラーポジ1,202カット、デジタルカメラ撮影画像1,136カット、6×6判カラーポジ130カットで、35mmカラーポジについては、マウント、紙焼きを各3組作成し、日本側で2組(正副)、韓国側に1組をそれぞれ保管した。フォトCDに焼き付けたものは、日韓双方で保管し、担当研究者には該当する分野の画像をCDに焼き付けて配布した。またデジタルカメラ撮影の画像は、プリントしたものを3組作成し、日本側に2組(正副)、韓国側に1組ずつ保管した。また、画像は東京国立博物館の共有のネットワーク上に保管しており、各研究者がネットワークに接続して随時確認できるようにした。これらの調書をもとに、本文78ページ、図版160ページから構成する報告書を作成に、国内の博物館、研究者および韓国の博物館、研究機関、研究者などに配布した。彫刻は、慶州南山の山中に散在する石仏を中心に調査した。そのうち七仏庵の石仏は、日本の8世紀の彫刻との関連性が強いことが知られた。また、韓国の石仏の造像背景には、石そのものに対する信仰を包含している可能性が窺われ、今後それを追求する必要性が認識された。工芸担当は、金工は、慶州雁鴨池出土品のうち、線刻で文様が施されている作品と魚々子を打っている作品を重点的に調査した。線刻は蹴彫によるものが多く、魚々子は,規則性のあるものは1例のみで、多くは文様間を充填させるだけの不規則のものが多かった。日本では、奈良時代の金工品には、蹴彫による文様表現は少なく、宝相華の同一文様でも線刻技法に相違があることがわかった。また魚々子は日本では出現当初はまばらであったが、次第に密になる。韓国と比較すると日本はより間隙がないほど密に打っのが普通であり、中国と日本、韓国の魚々子打ちの相違が確認できた。また、染織は皇南大塚古墳出土の銅鏡に付着している麻布と平絹が発見できた。鏡をはじめに麻布で包み、さらに平絹で包む2重の包み方で、6世紀のころの鏡の収納を知ることが出来た。天馬塚古墳出土の刺繍は、鞍の褥と考えられているが、この刺繍は、糸の撚りが強く、この特徴は日本では、藤ノ木古墳出土品や法隆寺伝来の繍仏と共通するものであると確認された。考古では、ソウルの中央博物館所蔵の緑紬の托盞が東京国立博物館所蔵の托盞と一具であること、しかも百済で作られたことを知ることができた。国立慶州博物館、国立大邱博物館、国立扶餘博物館、国立全州博物館・全南大学校博物館において、三国時代から高麗時代までの関連作品の調査を韓国側研究協力者の協力をえて、実施した。国内においては、日本に伝存あるいは出土した関連作品について調査を行い、詳細な調書作成、写真撮影・実測図作成を行った。

調査資料は、2ヵ年で、35mmカラーポジ1202カット、デジタルカメラ撮影画像1136カット、6×6判カラーポジ130カットで、35mmカラーポジについては、マウント、紙焼きを各3組作成し、日本側で2組(正副)、韓国側で1組をそれぞれ保管した。フォトCDに焼き付けたものは、日韓双方で保管し、担当研究者には該当する分野の画像をCDに焼き付けて配布した。またデジタルカメラ撮影の画像は、プリントしたものを3組作成し、日本側に2組(正副)、韓国側に1組ずつ保管した。また、画像は東京国立博物館の共有のネットワーク上に保管しており、各研究者がネットワークに接続して随時確認できるようにした。これらの調書をもとに、本文78ページ、図版160ページから構成する報告書を作成し、国内の博物館、研究者および韓国の博物館、研究機関、研究者などに配布した。
非農家の協力による農村環境保全活動を促す制度条件に関する研究

非農家(都市住民)の協力による農村環境保全活動に関して,栃木県の棚田オーナー制度および農地保全ボランティア活動を主な対象として,調査分析を行った。活動参加者に対して実施したアンケート調査などから,都市住民が農村の良好な環境が保全されることを望んでおり,機会があれば協力も惜しまないという意向があることが分かった。さらに,農地保全活動を実施している地区での聞き取り調査などにより,都市住民の受け入れが成功している地区には,以下のような特徴があることが明らかとなった。・ボランティア活動参加者にその後も地元の情報を発信している。・移住者など集落外出身の人が集落中で活躍している。・団体でボランティア活動に参加しているグループがあり,継続して参加している。農村の過疎化,高齢化が進んでいる中で,このような条件を満たす集落は少数派である。都市住民の協力による農村環境保全活動をさらに拡げるためには,農村集落が都市住民を受け入れる体制を整えることが必要であり,それには市町村行政やNGOなどのサポートが不可欠である。非農家の協力による農村環境保全活動として,今年度はいわゆる「棚田オーナー制度」を研究の主要対象とし,栃木県茂木町において同制度についての実態調査を行った。調査の結果,棚田オーナー制度では,年を経るごとに実作業における非農家の貢献度が増大してきており,特に継続的に参加している会員の貢献が大きいことが明らかとなった。一方,開始当初は地元の負担が大きく,そのなかで参加者に作業め手順を教えていくこと,継続した会員を確保すること,運営面でも非農家会員の貢献を高めていくことが,制度を継続していく上で必要である。さらに,海外の資源管理制度についての研究の一環として,ニュージーランドにおける漁業資源管理制度QMSに関する調査を行った。ニュージーランドの漁業では,取引可能な個別漁獲割当(ITQ)を導入することにより,先進的な漁業資源の管理を行っている。研究機関および関連団体における聞取り調査から,資源の効率的な管理という部分では,ITQ制度は概ね有効に機能していることが明らかとなった。一方,ITQの取引きデータを分析した結果,漁獲割当(クオータ)保有者が一部の大規模企業に集中しており,実際の漁獲者とクオータ保有者が乖離していることが明らかとなった。また,原住民(マオリ)の伝統的漁業者に聞取り調査を行った結果,マオリの伝統的漁業者は,漁業資源を自分達の判断で管理する権利を重視しており,現在のQMS下で政府が一元的に資源管理についての決定を行っている点に対して不満を持っていることが明らかとなった。非農家の協力による農村環境保全活動として,前年度に引き続き「棚田オーナー制度」を研究の主要対象とし,栃木県茂木町において同制度についての実態調査を行った。茂木町は町内に三つの棚田オーナー制度が運営されている全国的にも例のない自治体である。聞取り調査の結果,棚田オーナー制度における会員(地域外住民)の貢献は,一般的に開始から年数を経るごとに大きくなっていくことが明らかとなった。したがって,この種の制度にとっては如何に長い間継続させるかということが重要である。また,棚田オーナー制度において地域外住民に期待される役割は,実作業や農村環境保全への貢献にとどまらず,地域社会の活性化に貢献することが期待されている。開始初年度のオーナー制度の参加者に対するアンケート調査の結果から,地域外からの参加者(オーナー)も,より一層の地元住民との関わり,地域社会への貢献を望んでいることが分かった。地元住民と地域外住民とのマッチングを実現する上で,地方自治体の役割は大きく,茂木町で棚田オーナー制度が成功している原因は,地方自治体によるものと推測される。以上が本年度の実態調査で明らかとなった点である。さらに,地域共有資源の管理を行う上で地域外住民も含めたメンバー間の協力・合意形成が必要となるという観点から,ゲーム理論を中心とするミクロ経済学理論を地域共資源管理に適用した文献のサーベイを行っている.非農家の協力による簾村環境保全活動として,前年度に引き続き栃木県茂木町における「棚田オーナー制度」と,栃木県で実施されている農村住民と都市住民との協働による農地保全ボランティア活動プログラム「とちぎ夢大地応援団」を研究の対象とし,実態調査を行った。栃木県茂木町においては,町の行政が農村住民と都市住民をつなぐ役割を担っているが,人的資源が限られている中で町がこの役割を続けていけるか,さらに他の市町村にも適用できるか,ということが大きな課題である。

「夢大地応援団」においても,活動の実施が市町村の働きに依存している部分があり,今後,持続的に活動を行うためには, NPOなど従来の行政組織に依存しない仕組みの導入が必要である。活動に参加している都市住民の中には,より踏み込んだ形での貢献を希望している人たちが少なからずいるので,このような人たちの力を生かす制度が必要であろう。また,海外における市民参加型の環境保全活動の事例調査として,オーストラリアなどで実施されている「ウィードバスター」プログラムを取り上げ,関係者への聞き取り調査を行った。ウィードバスターとは,外来種生物の管理・防除を一般市民の協力のもとに行うプログラムである。調査の結果,地方政府の役割が大きいのは日本と同様であるが,ウィードバスターでは,研究機関(およびボランティアとして参加する研究者)が重要な機能を担っていることが明らかとなった。今後,日本において市民参加型環境保全活動を行う上でも,大学など研究機関の役割は重要となるであろう。
統合失調症と自閉スペクトラム症の認知機能及び認知機能改善療法における異同

本研究は、精神疾患を有する者(統合失調症および自閉スペクトラム症)に対するより効果的な心理社会的治療の提供につながることを目的として取り組む研究である。注意力や記憶力、実行機能に代表される認知機能の改善を目的として行われる認知機能改善療法を実施することにより、彼らの生活機能や就労能力といった社会機能が高まり、様々な精神症状の改善が期待される。その結果、患者が地域社会で自律的に生活することが可能となり、それに伴い社会的入院が減少することが考えられる。社会的入院の減少は彼らの就労移行を促進することにつながり、患者が社会に貢献する可能性を高める点で本研究には大きな意義がある。
カーボンナノチューブの成長機構に関する理論的研究

本研究の目的はカーボンナノチューブの成長端にNi等の遷移金属原子を付加させたモデルを想定し、Ni原子の先端移動の様子や、カーボン原子等の付着の様子を観察するものである。これには、遷移状態を求めるプログラムを用いて反応のパスを求めるという作業が必要であるが、本年度は特にこのプログラムを用いた遷移金属の取り扱いおよび、この遷移状態探索のプログラムの構築を行った。昨年度から行っていたフラーレンのStone-Wales転移などに適用した計算は、プログラムの実用性を確かめる十分である満足な結果が得られた。この考察は論文にまとめChem.Phys.Lett.に掲載された。また、ナノチューブの成長には不可欠と言われている金属の触媒の影響についての考察を行った。平面波を基底とするCar-Parrinello法のプログラムCPMDの手法を用いて、ナノチューブ大量合成の際に触媒として使われる遷移金属Niについての計算を実行した。まず始めに、Ni金属原子のこのプログラムの擬ポテンシャルの作成を行い、さらにその有効性について調べるために、Ni-Cの結合について、テスト計算としてNi(CO)x分子について結合エネルギーおよびポテンシャルエネルギーの変化などの細密にわたる分析を行った。この結果は現在Chem.Phys.Lett.に投稿するために論文に執筆中である。さらに平面波基底に基づくCar-Parrinello法のプログラムのさらに改良版であるCP2Kというガウス型の基底と平面波を取り混ぜたプログラムも同時に採用してナノチューブの生成機構の検討を行っている。このプログラムは平面波基底のみのプログラムと比べて、周期的境界条件の基本セルの大きさを拡大しても計算量がセルの大きさに比例して増大しないという利点がある。そのため比較的大きな長さのナノチューブを扱う事ができ、今回のナノチューブの生成機構を探る上で非常に有効である。というのもある程度の長さのチューブ長であると安定した構造であり、成長端の反応に注目した考察ができるからである。現在このプログラムを用いて、分子動力学シミュレーションに取り組み、遷移金属とナノチューブの成長端の反応についての考察を行っている。本年度は量子化学的計算に基づく第一原理動力学のシミュレーションにより、成長途中のアームチェアーおよびジグザグの炭層ナノチューブモデルの成長タンに炭素原子や小さな炭素クラスターを衝突させてtrajectory計算を行うという思考を繰り返し、高温プラズマ中での成長端の形の変化、およびその形の違いが成長過程に及ぼす影響を調べ、成長効率のトポロジー依存性を明らかにするという研究を進めた。この成果は論文にまとめChem.Phys.Lett.に掲載された。また、ナノチューブの成長には不可欠と言われている金属の触媒の影響についての考察も行っている。この研究は途中課程であるが、平面波基底に基づくCar-Parrinello法のプログラムCPMDを用いた手法を利用したものであり、カーボンナノチューブの成長端にNi等の遷移金属原子を付加させたモデルを想定し、Ni原子の先端移動の様子や、カーボン原子等の付着の様子を観察するものである。これには、遷移状態を求めるプログラムを用いて反応のパスを求めるという作業が必要であるが、本年度は特にこのプログラムを用いた遷移金属の取り扱いおよび、この遷移状態探索のプログラムの構築等の準備段階の作業を重点的に行い、フラーレンのStone-Wales転移などに適用したテスト計算を行い、プログラムの実用性を確かめる考察を行った。フラーレンもナノチューブと同じく炭素で構成される分子であるが、このプログラムはtight-bindingなどの計算結果とも良い一致が得られ、プログラムがこの種の分子に対して有効であることが実証された。このテスト計算等の結果については論文にまとめChem.Phys.Lett.に現在投稿中である。
一過性脳虚血及び再灌流時のレドックス解析に基づいた新たな脳循環代謝障害指標の確立

本研究では虚血中及び再灌流におけるパーオキシナイトライトなどのフリーラジカルとの関連、影響する脳血管自動調節能に関連するNO、変動する神経・神経膠細胞特異的な蛋白を検討し、脳虚血を評価できる指標の模索を行った。しいては、脳梗塞のマーカーへの応用についての可能性を検討する。また、慢性脳虚血性疾患に対して、7テスラMRIにより無侵襲な脳循環予備能評価法を確立について検討した。脳梗塞の発生直後から、経時的に頚静脈血中のNO上昇が確認できた。また、頚静脈血中にアップレギュレーションを示した二つの蛋白を同定することが出来た。7テスラMRIではPETにおけるOEF画像と、非常に良い相関が示唆された。内頸動脈狭窄を有し内膜剥離術の適応となる患者を対象に、123I-IMP SPECT及びPETを用いて脳循環解析を行った。脳血流量および脳酸素摂取率から算出した。過灌流を呈した症例の中には高次脳機能障害や神経脱落症状を呈することがある。これらの病態をとらえるため123I-IMZ SPECTによるneuron densityの測定や高次脳機能の検査を術前術後に行った。これにより得られた新しい見地について、学会発表と論文発表を行った。内膜剥離術中に頚静脈からのサンプリングをおこない虚血中及び再灌流における頸静脈血中のラジカルの動態解析を行う予定とした。脳虚血に特異性が高い頚静脈血中蛋白の探索として神経細胞障害やグリア細胞障害に起因していると思われる逸脱蛋白の探索を行う。当初予定していた手法(術中脳梗塞が発生してしまった症例のサンプル中において、各サンプルから蛋白抽出を行い、それぞれを二次元電気泳動サブトラクションでスポットを拾い上げ、質量分析機でアミノ酸の配列を決定し、ターゲット分子を同定する。脳虚血特異的マーカーへの応用を検討する)以外に、近年触接サンプルからMSを用いてタンパク質のアミノ酸シークエンスを比較して、簡便にサンプル間の蛋白発現プロファイルを検討できる手法が市場に導入された。サンプル中の蛋白を網羅的に解析可能であり、当初の予定を変更し、この手法を用いて解析を行うこととした。しかしながら検査費用が高額で有り、単年度の予算では思考できないため、今年度の予算の大半を次年度に繰り越しこの解析を行う予定とした。また、IMZ SPECTの早期像がCBFを表すことを利用し、IMZ SPECTの後期像を早期像で除した計算画像はPETによるOEF画像と相関し貧困灌流を検出できることが明らかとなった。頚部内頚動脈剥離術後の認知機能障害について、MRIテンソルイメージングを用いて解析を行い、白質のFA値の低下が認知機能障害に強く相関することを明らかとした。慢性虚血性脳血管障害に対する血行再建術後に発生し、重篤な転機をたどることがある過灌流症候群や、一過性脳虚血後の再潅流障害にフリーラジカルの関与が提唱されているが、その病態については未だ不明である。今回我々はこれらの基礎的な病態解析を行うために、内頸動脈狭窄を有し内膜剥離術の適応となる患者を対象に、脳循環解析とフリーラジカル及び発現蛋白の網羅的解析を行った。脳循環検査では、123I-IMP SPECTはAcetazolamide 1g静注前後に脳血流を測定することにより,脳血管拡張能を定量した。PETで15O-水およびO2を用い,脳血流量および脳酸素摂取率から算出した。フリーラジカル及び発現蛋白の網羅的解析では、内膜剥離術中に頚静脈からのサンプリングをおこない虚血中及び再灌流における頸静脈血中のNO解析、ニトロチロシン解析、及び網羅的な蛋白発現の動態を調べるためにLC/MS/MS測定による質量分析による解析を行った。術中の脳虚血の程度は、経頭蓋的ドプラの中大脳動脈平均血流速度・近赤外線分光法による局所脳内酸素飽和度・脳波所見と比較検討した。内膜剥離術に伴い、過灌流あるいは脳梗塞を起こした症例と、それらが起こらなかった症例とを比較し検討した。質量分析による解析では、これら症例において着目すべきいくつかのピークを同定することができた。得られた結果を検討し、脳虚血に特異性が高い頚静脈血中蛋白の探索として神経細胞障害やグリア細胞障害に起因していると思われる逸脱蛋白の探索を行う基礎的な見地が得られた。

脳神経外科学123I-IMP SPECTは島津社製HEADTOME 080,核種は123I-IMPを用い、定量法はautoradiography法を用いる。Acetazolamide 1g静注前後に脳血流を測定することにより,脳血管拡張能を定量した。PETでは島津社製HEADTOME IVを用いた。脳代謝の指標としての脳酸素消費量の測定には15O-水およびO2を用い,脳血流量および脳酸素摂取率から算出した。123I-IMZ SPECTによるneuron densityの測定や高次脳機能の検査を術前術後に行った。新たに、MRIを用いた脳温測定の新たな技術を確立し、またこれを用いて慢性脳虚血慢性脳虚血患者の認知機能障害を外科的に改善できるかどうかの予知について報告を行うことができた。これら以外にも脳循環改善がもたらす認知機能改善についての解析とその予知について十分な報告が今年度も行うことができた。術中の静脈血解析では、ほぼ毎週順調にサンプリングを行うことができており、来年度の解析に十分な量が確保された。虚血再灌流により生じる過灌流は時に脳損傷を引き起こす。発生原因として虚血の程度のみならず元々存在している脳循環予備能の低下が重要な因子である。脳循環予備能はPETを用いて測定されるが、汎用性に乏しいためダイアモックス負荷SPECTで検討されることが多い。しかしながらダイアモックスには様々な副作用が存在し問題がある。本研究では現在までの検討において、ダイアモックス負荷によらない新たな手法で脳循環予備能が評価可能であることが明かとなった。いくつかの脳血管障害において重要な新たな指標と考える。また、他の解析項目においても、別な角度からの脳循環代謝障害に対する検討を進行させており、興味深い結果が得られ始めている。脳循環検査に及び解析についてはこれまで通り進めていく。8月にはSPECT機器が最新型にアップデートされる予定であり、これまでにもまして詳細な解析と新たな見地の発見が期待される。術中静脈血の解析では、まとまった症例サンプルに対して、およそ6月をめどに網羅的な測定を開始する。得られたデータの解析を行い評価検討する。これまで得られた知見を積極的に国内外に広く報告していく共に、現在進行中の検討項目を推進させ、新たな脳循環代謝障害指標の確立を進めていく。対象症例の蓄積及び臨床治療、データ収集は順調であり、研究期間内にデータの優位性は充分示せると予定である。また、次年度は虚血前と虚血後の血液サンプルを比較することにより脳虚血の指標を明かとする分子生物学的解析を進めていく。外部検査委託費の中で、タンパク質発現プロファイル解析にかかる費用が高額で、単年度の会計では十分量の処理ができない。該当年度はサンプリングに徹することとして使用予算を圧縮し、次年度使用額を増額させることで解析を完遂する予定としたため。当該年度はサンプリングに徹した。次年度は得られたサンプルの網羅的解析を順次行っていく予定である。該当なし
口腔癌における血清エクソソームを用いた診断法の開発

口腔扁平上皮癌の発症、さらに予後を左右する重要な因子である再発・転移は比較的進行してからでないと診断が困難であり、従来の診断法より非侵襲的で、高精度の診断法の確立が待たれている。近年、non-coding RNAの一種であるmicroRNA(miRNA)が、癌の発症、悪性伸展や治療抵抗性に関与することが明らかにされつつあることから、本研究では癌細胞分泌エクソソームに内包されるmiRNAに着目し、口腔扁平上皮癌患者血清エクソソームに含まれる幾つかのmiRNAを定量し、非癌患者の定量結果と比較検討を行った。【緒言】口腔扁平上皮癌の発症、さらに予後を左右する重要な因子である再発・転移は比較的進行してからでないと診断が困難であり、従来の診断法より非侵襲的で、高精度の診断法の確立が待たれている。近年、non-coding RNAの一種であるmicroRNAが、癌の発症、悪性伸展や治療抵抗性に関与することが明らかにされつつある。そこで、本研究では癌細胞が分泌するエクソソームに内包されるmicroRNA(miRNA)に着目し、患者血清に存在するエクソソームからmiRNAを抽出し、我々がこれまでに同定した口腔扁平上皮癌に特異的に発現するmiRNAを定量することにより、癌の早期診断が可能なバイオマーカーとして応用可能かどうかを検証することにした。【方法】健常人3名および口腔扁平上皮癌症例5名の血清よりエクソソームを回収。エクソソームに含まれるmiRNAを抽出し、当教室で樹立した口腔扁平上皮癌(OSC)細胞株で有意に発現が低下していたmiR-34aの発現レベルについて比較検討を行った。【結果】健常人および口腔扁平上皮癌症例の血清から回収したエクソソーム内包miR-34aの発現をリアルタイムPCRにて検討したところ、口腔扁平上皮癌症例におけるmiR-34aの発現は、健常人の0.04から0.4倍といずれの症例においても低下していた【結論】以上のことから、口腔癌患者血清に存在するエクソソーム中のmiR-34aの発現レベルは健常者血清に存在するエクソソーム中の発現レベルと比較して低下している可能性が示唆された。【目的】口腔扁平上皮癌の発症、さらに予後を左右する重要な因子である再発・転移は比較的進行してからでないと診断が困難であり、従来の診断法より非侵襲的で、高精度の診断法の確立が待たれている。近年、non-coding RNAの一種であるmicroRNAが、癌の発症、悪性進展や治療抵抗性に関与することが明らかにされつつある。【方法】健常人20名および口腔扁平上皮癌症例20名の血清よりエクソソームを回収した。エクソソームに含まれるmiRNAを抽出し、当教室で樹立した口腔扁平上皮癌(OSC)細胞株で有意に発現が上昇あるいは低下するいくつかのmiRNAの発現レベルの比較検討を行った。【結果】健常人と比較して、口腔扁平上皮癌患者血清中エクソソームにおいて有意に発現が変化する幾つかのmiRNAを見出した。本年度計画した症例数を確保できたため【目的】口腔扁平上皮癌の発症、さらに予後を左右する重要な因子である再発・転移は比較的進行してからでないと診断が困難であり、従来の診断法より非侵襲的で、高精度の診断法の確立が待たれている。そこで、本研究では癌細胞が分泌するエクソソームに内包されるmicroRNA(miRNA)に着目し、患者血清に存在するエクソソームからmiRNAを抽出し、我々がこれまでに同定した口腔扁平上皮癌に特異的に発現するmiRNAを定量することにより、癌の早期診断および予後予測が可能なバイオマーカーとして応用可能かどうかを検証することにした。【方法】健常人7例および口腔扁平上皮癌患者9例の血清および血清中エクソソームよりmiRNAを抽出した。当教室樹立口腔扁平上皮癌細胞株(OSC)において有意に発現が増加あるいは低下するいくつかのmiRNAの発現レベルについて比較検討を行った。【結果】前年度のデータと併せて、計健常人27例と口腔扁平上皮癌症例29例におけるmiRNAの発現解析を行ったが、幾つかのmiRNAに発現差は認められたものの、有意差は認められなかった。口腔扁平上皮癌症例の数が十分でなく、やや遅れていると評価した。さらに症例数を増やして検討を行う。
永井荷風の文学と歌舞伎および江戸音曲等の周辺芸能との交流の研究

永井荷風は、その作中に江戸音曲を実に頻繁に描いている。この聴覚的要素は、音読から黙読への読書習慣の変化に伴い生じてきた、近代の作品受容の変遷の一側面を、集約的に提示してくれるものと考えられる。先ず基礎作業として、永井荷風が作品中に扱っている江戸音曲を特定した。語り物すなわち浄瑠璃としては、常磐津、富本、清元の豊後三流を始め、新内や一中、薗八、さらには河東等の古曲にも触れている。また唄物では、長唄はもちろん、哥沢等の小曲類にも興味を示す。これら音曲の作中での扱い方は、歴史的背景への考察をも含め、荷風はその音色にそれぞれ別の目的を担わせる。それぞれの歌詞に関しては、現在のものとほとんど変わりがない。時に詞章について解説し、時に音の効用面を強調しと、それぞれの場合により扱い方を変化させている。大雑把には、古曲や現在あまり演奏されない作品に、滅び去るものへの愛着を示すものが多い。江戸音曲の、作中における実際的な聴覚的な効果を考察するために、現在実際の演奏されるものを聴き、その不足分を、市販されているコンパクト・ディスクやカセット・テープ、LPレコード等により聴いた。これは、より客観的な分析のために、今後コンピューターによる解析作業に移る予定である。さらにはこれを、前述のとおり黙読という読書形態の問題と関係づけて考察し、黙読という近代の受容形態の特殊性について理論付けたい。
サハリン大陸棚石油・天然ガスの「開発と環境」に関する学際的研究

平成1012年度の本研究の主たる目的は、「サハリンの開発と環境」の二律背反の問題を分析することであり、第一に開発によってどのような経済効果が生み出され、市民生活が豊かになったかを検証することにあった。しかし、本計画を開始する時点に比べてロシアの経済困難はますます深刻になり、生産分与方式による外資導入は初期の思惑通りには進まなかった。この3年間に実際に開発に着手できたのはサハリンIIプロジェクトだけであり、しかもその開発規模は小さかった。本研究では、生産分与形態が何故進まなかったかを政府の政策不在、政治家の利権抗争、意志決定メカニズムの視点から詳細に解明した。第二に環境保全の問題に関しては、アラスカの油流出時対応計画を現地調査によってつぶさに分析し、ロシア及び日本と緊急時対応計画を比較することによって、今後ロシアにおいて解決しなくてはならない問題を明らかにした。また、万一の石油流出の場合、ロシアはどのような防除体制をとり、被害が日本に及んだ場合にどのように補償するかが重要なテーマであった。我々研究チームの強い働きかけも影響して、ロシアは国際条約の民事条約及び国際基金の1992年議定書を批准した。これによって補償の糸口を確保できた。オホーツク海の厳しい気象条件の下で、氷塊下に流出油が封じ込まれた場合、どのように回収するのかの実験が引き続き行われた。かなり前進がみられたが、まだ検討の課題が残されている。本研究の平成10年度の主目標は、開発による経済発展と環境保全の問題を学際的に研究するための基礎的なデータを収集し、分析することにあった。ロシアは旧ソ連時代から情報を開示することに極めて慎重であり、この閉塞状況を打破するためにロシア・サハリン州側に共同研究を呼びかけた。紆余曲折を経て、最終的にサハリン州知事の賛同を得、今後の協力パートナーの窓口として国家環境委員会議長の指名を得た。この組織を通じて基礎的な情報収集に努めるとともに、海洋石油の「開発と環境」の両面で豊かな実績を有する英国、スコットランド、ノルウェーの経験と原油流出事故の教訓を吸収することに努力した。特に平成10年8月末には、研究代表者及び分担者13名がロシア連邦サハリン州ユジノ・サハリンスク市を訪問し、サハリン州国家環境委員会、サハリン州行政府以下関係諸機関の専門家と意見交換を行い、またNGO活動の状況を聞き取り調査した。分担者の多くは、サハリン大陸棚と気象面で類以している北海の海洋石油開発国を訪問し、原油流出事故対策、緊急防災計画、石油汚濁に関するノルウェーとロシアの協力関係等を聞き取り調査した。平成10年度の研究で明らかにされた知見は、サハリン州での石油、天然ガス開発は開発優先で、環境に対する詳細な検討が遅れていること、サハリン州の基礎的な情報すら余り開示されていないこと、経済困難による資金難のために海洋開発の豊かな経験をもつ国の情報を入手できないでいることである。2年度の研究を充実した内容にするために、ロシアを中心に外国の専門家21名を招いて「ロシアの地域:経済成長と環境」と題する国際シンポジウムを開催した。とくに、サハリン大陸棚の開発と環境の問題が大きなテーマとなって、経済成長と環境の二律背反、サハリン州の開発に対する市民意識、開発に伴う北方少数民族への影響、ベントスへの影響、オホーツク海の化学物質の状況、流氷の漂流、アラスカの原油流出事故の教訓等が討議された。サハリンと同様の厳しい海象条件をもつ北海では、ノルウェーが原油流出時の緊急事対応策の豊かな経験をもっており、これと比較することによって、サハリンの環境保全対策がいかに不十分であるかを実証した。平成12年2月にはカナダから専門家を招いてセミナーを開催し、カナダの原油流出時の防除対策、流出事故対応のための緊急防災計画、訓練、防除機資材準備について議論した。このセミナーで明らかにされたことは、縦割り社会の日本の構造がいかに緊急時に即戦力的な対応を取りにくいかである。

市場経済への移行期にあるロシアでは環境面での法的な整備が遅れており、サハリン大陸棚石油開発に関わる環境面からの法的規制についてロシア川専門家の協力を得て文献を入手・解析した。我が国によるサハリンの開発と環境に関する研究が外国で余り知られていないという実態を勘案し、北海道大学スラブ研究センターのホームページのなかに「サハリンの開発と環境」(英文)を開設した。平成12年度は本研究の最終年度に当たり、研究成果報告書を作成することを前提に、3年間の研究の総括を行うことに重点を置いた。「サハリンの開発と環境」の二律背反の問題を分析することが本研究の主たる目的であり、第一に開発によってどのような経済効果が生み出され、市民生活が豊かになったかを検証することにあった。しかし、本計画を開始する時点に比べてロシアの経済困難はますます深刻になり、生産分与方式による外資導入は初期の思惑通りには進まなかった。この3年間に実際に開発に着手できたのはサハリンIIプロジェクトだけであり、しかもその開発規模は小さかった。本研究では、生産分与形態が何故進まなかったかを政府の政策不在、政治家の利権抗争、意志決定メカニズムの視点から詳細に解明した。第二の環境保全の問題に関しては、アラスカの油流出時対応計画を現地調査によってつぶさに分析し、ロシア及び日本と緊急時対応計画を比較することによって、今後ロシアにおいて解決しなくてはならない問題を明らかにした。また、万一の石油流出の場合、ロシアはどのような防除体制をとり、被害が日本に及んだ場合にどのように補償するのかは、我々研究チームの強い働きかけも影響して国際条約の民事条約及び国際基金の1992年議定書を批准した。これによって補償の糸口を確保できた。オホーツク海の厳しい気象条件の下で、氷塊下に流出油が封じ込まれた場合、どのように回収するのかの実験が引き続き行われた。かなり前進がみられたが、まだ検討の課題が残されている。
十八世紀スコットランドにおけるハチソン以降の美学史研究

本研究の成果は、最終的には単著による『十八世紀スコットランド美学研究』(仮題)として、ないしは『十八世紀イギリス美学史研究』(仮題)の一部としてまとめる予定であるが(1992年出版予定)、その準備作業という位置づけで平成2年度に成し得た研究実績は、概要次のようなものである。1、平成2年7月29日から8月4日までイギリスのグラスゴ-に於て開催された「十八世紀スコットランド研究学会」に参加することで、美学における研究の実状、関心の傾向をある程度把握できたこと。2、イギリス美学会の所属する何人かの研究者にそれぞれ会見することで、文献一覧の作成に関する国際的協力関係確立の可能性の見通しを得、また、本研究に関する有効な助言と指導を得たこと。3、「十八世紀イギリス美学における天才論」というテ-マの研究をまとめ、その成果の一部は平成2年10月13日に広島大学に於ける美学会第41回全国大会の席上口頭発表し、また一部は『神戸女学院大学論集』第37巻第3号に発表したこと。4、イギリス美学の十八世紀における諸論点を通史的に整理し、その成果を“From Novelty to Originality"というタイトルで、平成3年2月23日に韓国嶺南大学校美術大学美学研究室主催のコロキウムの席上、口頭発表(英語)したこと。5、ジョ-ジ・キャンベルの修辞学に関する研究をまとめ、その成果の一部を平成3年3月29日に松山大学に於ける日本イギリス哲学会第15回研究大会の席上、口頭発表したこと。以上の研究実績以外に、前年度より継続中の、十八世紀スコットランド美学の原典と研究誌の調査と一覧作成は、平成2年度も作業が行なわれた。
粘菌細胞の分化における遺伝子発現の制御

細胞性粘菌の発生系では、細胞が集合して組織を形成するとその内部に2種類の細胞(予定柄細胞と予定胞子細胞)が組織の大きさに関係なく一定の割合で分化し、それぞれ組織の前後を占める。我々は、それぞれの予定細胞の分化に伴なって特異的に発現する遺伝子を用いて、細胞分化ならびに分化パタ-ン形成機構を明かにすることを目的として研究を行い、次のような成果を得た。(1)予定柄細胞に特異的に発現するecmAおよびecmB遺伝子のプロモ-タ-と大腸菌のβーガラクトシダ-ゼ遺伝子をつなげたキメラ遺伝子を形質導入した細胞をWilliamsが持参して来日し、我々が開発した組織の形態形成がおこらない液体培養条件下で培養し、得られた球形の細胞凝集塊において予定柄細胞の分化がいかに進行するかを調べた。その結果、凝集塊内では先づecmA遺伝子を発現する細胞がほぼランダムに出現し、ついでそれらの細胞が凝集塊の中心に集まることがわかった。次いで、ecmB遺伝子を発現する細胞が凝集塊の外周に出現し、やがて外周の12層のすべての細胞がこの遺伝子を発現するようになった。これらの結果は先に抗胞子抗体を用いて調べた予定胞子細胞の分化パタ-ンと鏡像をなすものである。また、先にWilliamsらが明かにした正常発生過程中の組織における両遺伝子の発現パタ-ンとも矛盾せず、組織における分化パタ-ン形成が特異的遺伝子を発現した細胞の選別によっておこることを示している。(2)予定胞子細胞の分化に伴って特異的に発現するDp87遺伝子の転写制御に係わるDNA領域を明かにするために、この遺伝子の上流域とCAT遺伝子をつなげたキメラ遺伝子を粘菌細胞に形質導入して調べた。その結果、転写開始点上流-442から-349bpの間にこの遺伝子の転写に重要な働きをもつシステム領域が存在することが示された。そこで、この領域が細胞型特異的あるいは発生段階特異的転写に関与するか否かを明かにするために、この領域をWilliamsから分与された粘菌のアクチン遺伝子のベ-サルプロモ-タ-とつなげ、大腸菌のβーガラクトシダ-ゼ遺伝子をレポ-タ-として調べた結果、このキメラ遺伝子は増殖期から強い発現を示し、予定柄および予定胞子細胞間で発現の差が認められなかった。同様なことは、Dp87遺伝子の上流域-666bpから-156bpをつなげた場合も同様であった。さらに、前述のシス領域をDp87遺伝子のベ-サルプロモ-タ-につなげた場合にも同様な結果が得られた。これらの事実は、先に同定されたシス領域が転写量の増大にのみ関与し、細胞型特異的転写に関与する領域は-349bpより下流に存在することを示唆しており、現在この領域を同定中である。(3)Dp87遺伝子のプロモ-タ-とβーガラクトシダ-ゼの遺伝子をつなげたキメラ遺伝子を粘菌細胞に形質導入し、発生過程における発現を調べた。その結果、ノザン法で調べられるmRNAの発現時期よりも早く集合中の細胞の一部で発現がみられた。これはこれまでよりも高い検出感度で個々の細胞における発現を調べることができたためと考えられる。この時期にはDP87を発現する細胞は集合流の中でランダムに現れるが、組織が乳頭状突起を形成する頃には組織の下部に集まった。この事実は、分化した細胞間の選別により特異的な分化パタ-ンがつくられるという考えを正常発生過程で予定胞子細胞の変化から初めて実験的に明かにしたものである。(4)我々が得ていた予定柄細胞に特異的なcDNADt114に対応するゲノム断片をWilliamsのゲノムDNAライブラリ-を用いてクロ-ン化した。このクロ-ンはDt114をコ-ドする全域並びにこの遺伝子の5'上流域と3'下流域を含む。(5)粘菌のcAMP合成酵素であるアデニルシクラ-ゼ遺伝子のクロ-ン化をWilliamsのゲノムDNAライブラリ-を用いて行った。その結果、この遺伝子を含む可能性をもついくつかのクロ-ンが単離されたが、他研究者との競合になったので、研究を中止した。