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遺伝医療における職種間連携を担う看護職の学習支援のための基礎的研究

本研究は、遺伝医療における職種間連携を担う学習支援を目的に、遺伝医療に関する看護職の学習ニーズを明らかにした。調査の結果、看護師・助産師・保健師の看護職種によって学習支援のニーズは異なっていた。すべての看護職において「看護教育における遺伝医療の学習内容の乏しさ」「遺伝医療に関するアセスメント力不足」「遺伝医療のニーズに対応するケア提供力の不足」「遺伝医療に関する学習機会の乏しさ」が課題として共通していた。助産師では「出生前検査における倫理的葛藤」、保健師では「地域住民の遺伝医療に関する連携と協働」に関し学習ニーズが高かった。これらから遺伝医療に関わる看護職に学習ニーズに関する示唆を得た。遺伝医療が進展するなか,遺伝性疾患の患者もしくはその関係者の疑問・不安を解決することをめざし,遺伝カウンセリングが行われているが,臨床遺伝専門医,認定遺伝カウンセラーなどの専門職は少数であり,各診療科の医師,臨床心理士,地域の保健師と連携しながら,看護師は遺伝カウンセリングや遺伝医療に関わっている現状がある。そこで,遺伝医療おける職種間連携を担う看護職の学習支援を目的とし,遺伝医療に対する看護職の実践的機能および学習ニーズを明らかにする。平成24年度においては,昨年度の文献調査で得られた看護支援の現状,職種間連携の現状から遺伝医療における看護支援の実態および職種間連携の実態および課題を明らかにするための質問紙票(案)を作成した。しかし,新しい出生前診断の新聞報道以降,第19回遺伝性疾患に関する出生前診断研究会等に参加し,遺伝医療を受けるクライアントと医療職者に関する情報収集を行い,質問紙票の追加・修正を検討した。所属機関の遺伝カウンセリング部において,遺伝カンファレンスでの症例検討およびカウンセリング実施をもとに,学内および附属病院看護職を対象に,遺伝看護・遺伝カウンセリング研修会を開催し,出生前検査を考慮する女性への支援の実践報告および新しい出生前診断の情報提供を行った。遺伝医療を受ける,また考慮するクライエントへの支援の経験を有する小児科および産婦人科の看護師・助産師の看護実践上の課題を抽出した。遺伝医療が進展する中、遺伝性疾患の患者および家族もしくはその関係者の疑問や不安を解決することをめざし、遺伝カウンセリングが行われているが、臨床遺伝専門医、認定遺伝カウンセラーなどの専門職は少数であり、各診療科の医師、臨床心理士、地域の保健師と連携しながら、看護師は遺伝カウンセリングや遺伝医療にかかわっている現状がある。そこで、遺伝医療における職種間連携を担う看護職の学習支援を目的とし、遺伝家用に対する看護職の実践的機能および学習ニーズを明らかにする。平成25年度は、職種間連携の実態および課題を明らかにするために質問紙票を作成し、プレテストを行ったが、当初の想定と異なり看護職においても、看護師・助産師・保健師の職種により異なる学習ニーズがあることが判明し、さらなる質問紙票の追加・検討を行うこととなった。所属機関の遺伝カウンセリング部において、遺伝カンファレンスでの症例検討及びカウンセリング実施と共に、学内および附属病院看護職、また県・市町村自治体の保健師を対象に遺伝看護・遺伝カウンセリング研修会を開催し、「出生前検査を考慮する女性への支援」「遺伝性腫瘍(家族性腫瘍患者への支援」を行い、遺伝性がん患者への支援や出生前検査を考慮する女性の体験と遺伝カウンセリングの実際について理解するとともに、遺伝性疾患や障害をもつ女性と家族の対応と支援を検討し、看護実践上の課題を抽出し、質問紙票への追加検討に加えた。本年度(初年度)においては,遺伝医療に関わる看護職の役割・機能に関する基礎的資料の把握するために,国内で開催された遺伝関連の講演会・研究会・学習会・セミナーに参加し情報収集をするとともに文献検討を行った。現在の遺伝看護教育の状況,遺伝医療に対する看護職の実践的機能に関して,関連する国内外の文献検索(PubMed、CINAHL、医学中央雑誌)を通して、過去10年間(2001年2012年)の国内外の既存の研究の方法および結果の分析をおこなった。国内の遺伝看護教育内容については,教育機関により質・量の違いはあるが、看護教育における遺伝看護の研究・報告が増加している。看護職の機能・役割,医療の場で起こる出来事への看護職と他の医療職の対応・コミュニケーションについて検討した文献は少なかった。遺伝医療おける職種間連携,遺伝医療に対する看護職の実践的機能に関する研究が国内外でも少なく、具体的な学習支援方法やその効果が提示されていないことが明らかとなった。

調査の結果、看護師・助産師・保健師の看護職種によって学習支援のニーズは異なっていた。すべての看護職において、「看護教育における遺伝医療の学習内容の乏しさ」、「遺伝医療に関するアセスメント力不足」、「遺伝医療のニーズに対応するケア提供力の不足」、「遺伝医療に関する学習機会の乏しさ」が課題として共通していた。助産師では「出生前検査における倫理的葛藤」、保健師では「地域住民の遺伝医療に関する連携と協働」に関する学習ニーズが高かった。これらから、遺伝医療に関する看護職に学習ニーズに関する示唆が得られた。よって本研究課題を終了とし、今後は引き続き調査を行い、不足する一次資料の収集に努める中で、遺伝看護における学習支援について新たな研究枠組みによって研究課題を補完する。遺伝看護平成24年度は,文献調査で得られた看護支援の現状,職種間連携の現状から遺伝医療における看護支援の実態,および職種間連携の実態および課題を明らかにするための質問紙票を作成したが,新しい出生前診断の新聞報道等があり,遺伝医療を受けるクライアントと医療職者に関する情報収集を行い,質問紙票の追加・修正を検討する必要があった。平成25年度では,プレテストを経て実態調査を行い,遺伝医療を受けるクライエントに半構成的面接を行い,遺伝医療を受けるクライエントの心理,看護職および各職種の関わりについて聞き取り調査を行う。調査結果から,遺伝医療における職種間連携に必要な看護職の役割・機能を検討し,看護職に対する研修/教育講演を実施し,その評価を行う。また,研究成果の報告(学会発表)を行い,研究成果報告書を作成する予定である。平成25年度は職種間連携の実態および課題を明らかにするために質問紙票を作成し、プレテストを行ったが、当初の想定と異なり看護職においても、看護師・助産師・保健師の職種により異なる学習ニーズがあることが判明し、さらなる質問紙票の追加・検討を行うこととなった。所属機関の遺伝カウンセリング部において、遺伝カンファレンスでの症例検討及びカウンセリング実施と共に、学内および附属病院看護職、また県・市町村自治体の保健師を対象に遺伝看護・遺伝カウンセリング研修会を開催し、「出生前検査を考慮する女性への支援」「遺伝性腫瘍(家族性腫瘍患者への支援」を行い、遺伝性がん患者への支援や出生前検査を考慮する女性の体験と遺伝カウンセリングの実際について理解するとともに、遺伝性疾患や障害をもつ女性と家族の対応と支援を研修会参加者と共に検討し、看護実践上の課題を抽出し、質問紙票への追加検討に加えることで、より遺伝看護の実践上の課題を反映したものとなった。平成26年度では、質問紙票による調査を行い、その結果から遺伝医療における職種間連携に必要な看護職の役割・機能を検討し、看護職に対する研修/教育公演を実施し、その評価を行う。また、研究成果の報告(学会発表)を行い、研究成果報告書を作成する予定である。
プレクストリン(血小板47KD蛋白)構造を有する遺伝子の同定とその機能

細胞内情報伝達において重要かつ様々なシグナル伝達物質にpleckstrin homology(PH)が存在することが報告されてはや約2年が経つが、当初6種類に過ぎなかった蛋白質が現在では約100の蛋白質にPHが見いだされるようになった。当初の6種類の中にはチロシンキナーゼ(PTK)が存在しなかったので、PHを含むPTKを新規にクローニングしたいと考えていたが、X染色体連鎖免疫不全症の原因遺伝子としてPHを含むPTK(予想どうり)のBtkがクローニングされ、注目を浴びるに至った。計画A)に従い、1)まず、PHを有する融合蛋白の作製---pleckstrin(血小板47KDa蛋白)の保存された領域をPCRを用いてGSTとの融合蛋白を2種類作製した。大腸菌から溶出することが非常に困難であったが、次の計画に必要な量は確保できた。2)1)を用いて会合する蛋白の同定---血小板のcell lysateを用いて、会合する蛋白を探したが、現在のところ見いだしえなかった。しかし、最近になりProtein kinase C、GTP結合蛋白質、あるいは脂質と会合することが報告されたので再検討したいと考えている。自分のPHと他の報告でのPHはそれぞれ由来が違うので、異なる結果になったと考えている。B)PHを有する遺伝子の同定、機能解析---pleckstrinに存在する2つのPHをまずPCRにて、HL60細胞のcDNAより増幅し、それらをプローブに用いて他の細胞をlow stringencyにてスクリーニングした。ニワトリのB細胞であるDT40においてクロスするものがあったのでクローニングし、現在DNA配列等解析中である。現在の所、PH含有蛋白質の数は急増し、それらと会合する蛋白は見いだされてはきたが、その機能についてはまだほとんど解明されていない。したがって、細胞内情報伝達機構における重要性についてさらに検討が必要と考えられる。
再生肝細胞における増殖の調節機構に関する研究

肝蔵を外科的に部分切除すると、残余肝細胞は急速な分裂増殖を開始し、切除前の大きさにまで再生されるとそこで分裂増殖を停止する。このような肝再生には表皮増殖因子や肝細胞増殖因子が重要な役割をしていることが報告されているが、どのような機構で分裂の開始および停止の調節がなされているかについては不明である。我々は部分肝切除後の残余肝細胞蛋白質の変化を高分解能2次元電気泳動法で詳細に検索し、増殖過程の再生肝細胞中には現在まで報告の無い特異蛋白質が存在することを見いだした。そこで我々はこの蛋白質の機能、肝再生における役割、既存の増殖因子との関連などを明らかにする目的で研究を行った。得られた結果を列記する。1、特異蛋白質を精製した。精製は部分肝切除後のラットの残余肝(肝記除後324時間)から種々のクロマトグラフィ-(硫安分画、DEAEーセファロ-スカラム、ゲル瀘過、等電点電気泳動、調製用電気泳動、ConAーセファロ-スカラム)によって行った。精製標品はSDSーPAgEで単一バンドを示した。2、得られた精製蛋白質をウサギに免疫して抗血清を作成した。この抗血清は免疫電気泳動で検索するとやや不純な成分との反応が観測されたので、これらの成分に対応する抗体を正常肝細胞のホモジネ-トで吸収した特異抗血清を調製した。3、吸収した抗血清を用いたロケット免疫電気泳動による特異蛋白質の定量法を確立した。4、この特異蛋白質は肝切除後数時間目から出現し、624時間目でピ-クに達し、その後除々に消失した。開腹だけの擬手術では出現しなかった。したがってこの蛋白質は肝切除後の細胞増殖の比較的初期の段階で何らかの役割を担っていることが示唆された。成熟した肝臓では細胞の分裂増殖はほとんど行なわれていない。しかしこの肝臓を外科的に部分切除すると、残余肝細胞は急速な分裂増殖を開始し、切除前の大きさにまで再生されると分裂を停止する。このような肝再生には表皮増殖因子(EGF)や肝細胞増殖因子(HGF)が重要な働きをしていることが近年報告されているが、分裂の開始および停止の調節機構についてはなお不明な点が多い。我々は部分肝切除後の残余肝細胞の蛋白質を高分解2次元電気泳動法で分析し、現在まで報告のない特異蛋白質を見い出している。この特異蛋白質は2次元電気泳動パターンで見る限りにおいては、肝切除後数時間で出現し、その後徐々に消失した。また開腹だけの擬手術では出現しない事から細胞増殖の調節に何らかの役割を担っている事が示唆される。そこで我々は部分肝切除したラットの残余肝細胞から特異蛋白質を分離し、細胞増殖における役割を明らかにする目的で研究を進めている。本年度はまず特異蛋白質の精製、定量法の確立を主眼において研究し以下の結果を得た。1.部分肝切除後の残余肝細胞(肝切除後624時間)から特異蛋白質を種々クロマトグラフィー(硫安分画、DEAEーセファロースカラム、ゲル濾過、等電点電気泳動、調製用電気泳動など)によってほぼ均一となるまで精製した。2.得られた蛋白質をウサギに免疫して抗体を作成した。この抗体は免疫電気泳動ではやや不純な成分との反応が見られるため、正常肝細胞のホモジネートで吸収した抗体を用いて実験した。またこの吸収抗体を使用した定量法もほぼ確立された。

3.現在、得られた特異蛋白質のモノクローナル抗体を作成中である。肝臓を外科的に部分切除すると、残余肝細胞は急速な分裂増殖を開始し、切除前の大きさにまで再生されるとそこで分裂増殖を停止する。このような肝再生には表皮増殖因子や肝細胞増殖因子が重要な役割をしていることが報告されているが、分裂の開始および停止の調節機構に関してはなお不明である。我々は部分肝切除後の残余肝細胞に含まれる蛋白質を高分解能2次元電気泳動法で分析し、現在まで報告の無い特異蛋白質を検出している。この特異蛋白質は2次元電気泳動パタ-ンで見る限りにおいては、切除後数時間で出現し、その後除々に消失する。また開腹だけの擬手術では出現しないことから肝切除後の細胞増殖の調節に何らかの役割を担っていることが示唆されるものである。そこで我々は部分肝切除したラットの残余肝細胞からこの蛋白質を分離し、細胞増殖における役割を明らかにする目的で研究を進めている。前年度は特異蛋白質の精製を主眼において実験を進めたが、収量が悪く、また得られた標品も単一ではなかったため、その後の解析に困難を極めた。そこで本年度は純化された特異蛋白質を大量に得ることを目的として研究を進め、以下の結果を得た。1.部分肝切除ラットの残余肝細胞(肝切除後312時間)から特異蛋白質を種々のクロマトグラフィ-(硫安分画、DEAE-セファロ-スカラム、ゲル濾過、等電点電気泳動、調製用電気泳動、ConA-セファロ-スカラム)によってほぼ均一になるまで精製した。2.得られた精製蛋白質をウサギに免疫して抗血清を作成した。この抗血清は免疫電気泳動で検索するとやや不純な成分との反応が観測されたので、正常肝細胞のホモジネ-トで吸収した抗血清を用いて実験した。3.吸収抗血清を用いたロケット免疫電気泳動による特異蛋白質の定量法を確立した。4.現在、得られた特異蛋白質のモノクロ-ナル抗体を作成し、合成機構について検索中である。このような肝再生には表皮増殖因子や肝細胞増殖因子が重要な役割をしていることが報告されているが、どのような機構で分裂の開始および停止の調節がなされているかについては不明である。我々は部分肝切除後の残余肝細胞蛋白質の変化を高分解能2次元電気泳動法で詳細に検索し、増殖過程の再生肝細胞中には現在まで報告の無い特異蛋白質が存在することを見いだした。そこで我々はこの蛋白質の機能、肝再生における役割、既存の増殖因子との関連などを明らかにする目的で研究を行った。得られた結果を列記する。1.特異蛋白質を糖製した。精製は部分肝切除後のラットの残余肝(肝切除後324時間)から種々のクロマトグラフィ-(硫安分画、DEAEーセファロ-スカラム、ゲル瀘過、等電点電気泳動、調製用電気泳動、ConAーセファロ-スカラム)によって行った。精製標品はSDSーPAGEで単一バンドを示した。2、得られた精製蛋白質をウサギに免疫して抗血清を作成した。この抗血清は免疫電気泳動で検索するとやや不純な成分との反応が観測されたので、これらの成分に対応する抗体を正常肝細胞のホモジネ-トで吸収した特異抗血清を調製した。3、吸収した抗血清を用いたロケット免疫電気泳動による特異蛋白質の定量法を確立した。4、この特異蛋白質は肝切除後数時間目から出現し、624時間目でピ-クに達し、その後除々に消失した。開腹だけの凝手術では出現しなかった。したがってこの蛋白質は肝切除後の細胞増殖の比較的初期の段階で何らかの役割を担っていることが示唆された。
遺伝子融合を利用したPCB分解系酵素の改良

環境汚染物質として知られるポリ塩化ビフェニル(PCB)を強力に分解する分解菌の育種をめざし、ベンゼン環の開裂を行なう分解のキ-酵素である2,3-dihydroxybiphenyl dioxygenase(23DBPDO)について一連の融合酵素を構築して解析した。PCB分解菌Pseudomonassp.KKS102の23DBPDO遺伝子(bphC)とベンゼン分解菌P.putida BE81の3-methyl-catechol dioxygenase遺伝子(bnzC)とを大腸菌内での相同組換えを利用して融合酵素を構築して解析した結果、カルボキシル(C)末端側で組換わると基質特異性が明確に変化することを見いだした。C末端を欠くbphC遺伝子とbnzCのC末端領域とで相同組換えを利用した融合酵素を構築し、C末端で組み換わった融合酵素を集中的に取得したところ、基質特異性が変化する組換え位置は23DBPDOのアミノ酸残基の261番目から283番目の区間内に特定された。260番目までがbphCで261番目以降がbnzCの配列を持つ融合酵素遺伝子を素材とし、261番目から283番目の区間内でbphCとbnzCとの間で異なるアミノ酸残基を部位特異的変異手法(site-directed mutagenesis)を用いて順次置換したところ基質特異性が変化する組換え位置は270番目から283番目の区間内に限定された。この区間内でbphCとbnzCとの間で異なるアミノ酸残基を部位特異的変異手法により単独あるいは組み合わせて置換したところ最終的に280番目のアミノ酸残基(Thr)が単独で基質特異性を支配し得ることが明らかになった。一方、長岡技術科学大学・三井教授のグループとの共同研究においてKKS102の23DBPDOのX線結晶解析による3次元立体構造の解明に成功し、その知見から280番目のアミノ酸残基の側鎖による基質のフェニル基への立体障害の有無が基質特異性を支配することが示唆された。3次元立体構造の解明にも成功して構造に基づいた酵素の改良が可能になり、今後、更に本格的な酵素の改良が進められると期待される。
小児の入院と母親の付き添いがきょうだいに及ぼす影響

主に研究目的3).「小児の入院と母親の付き添いによるきょうだいの肯定的な変化を測定できる尺度を作成し、属性・背景因子との関連性を分析・検討する」について取り組んだ。大阪大学医学部保健学倫理委員会の承認を得て、全国の400床以上で小児科を有する病院に入院する小児の母親を対象に、自記式無記名質問紙調査を実施した(N=201)。調査によって得られた、小児の入院と母親の付き添いにより起こるきょうだいの肯定的な変化について、Krippennsorffの手法を用いて内容分析を行った。きょうだいの肯定的な変化は、【現状の把握】、【情動の変化・成長】、【肯定的な行動の変化・増進】、【情動のコントロール・抑制の増進】、【自立的な行動の増進】の5カテゴリーから形成されていることを明らかにした。現在、分析結果を学術雑誌に論文投稿し、採択結果を待っている。この研究より、きょうだいは、入院児の入院という家族にとっての逆境の中において、否定的な感情を抱きながらも、入院児や家族のためにがんばろうと肯定的な変化をしていることを改めに明らかにし、その変化の出現を迅速にキャッチしていき支援に繋げる資料となった。続いて、小児の入院と母親の付き添いにより起こるきょうだいの肯定的な変化の内容について、その変化の程度を4件法で調査し(N=254)、入院児のきょうだいの人格的成長尺度を作成した。この尺度は、母親の認識を通した小児の入院と母親の付き添いによるきょうだいの肯定的な変化の程度を測定できる尺度であり、その構造は「愛他的行動」、「情緒・社会的スキルの発達」、「セルフコントロール」の3因子からなる。きょうだいの人格的成長尺度が、きょうだいの人格的な成長やがんばりを認めねぎらい、否定的な変化の緩和に繋げるためのツールとして、臨床の場で広く使用されていくことを望む。
ペプチド・タンパク質のC末端アミノ酸残基の段階的分解法の確立

エドマン分解法に匹敵するC末端からの段階的な分解法を確立することはCDNAからのアミノ酸配列の決定法と補足しながら、巨大タンパク質のアミノ酸配列が微量迅速に決定出来る。チオヒダントイン法は、ペプチドのC末端アミノ酸を活性化し、これにチオシアン酸イオンを付加させ、次に、アルカリで切断する過程からなっている。従来の方法では、チオシアン酸イオンとして、チオシアン酸ナトリウムや、チオシアン酸のジオキサン溶液を用い、また、切断反応にイオン交換樹脂を用いたため、反応収率、副成物の除去、試薬の調整に手間がかかり、試料も1μmoleから100μmoleと多量を必要とした。本研究に於いて、高感度化と操作の簡略化を計り、下図のシステムを確立した。この結果、ナノモルスケールでモデルペプチドLev-GlyGlyやFor-Met-Lev-Pheのアミノ酸配列を求めることが出来た。この方法では、Ser,Cys,Lys,Arg,Hisが反応せず、ペプチドの活性化の際、トリフルオロ酢酸5μlを加えることにより、Lys,Arg,Hisは反応させることは出来たが他のアミノ酸の収率が悪くなった。現在、Ser,Cysの反応性の検討全アミノ酸の収率向上、チオヒダントインのHPLCによる一斉分析の確立を進めている。
作業記憶の回復を伴う摂食・嚥下リハビリテーション法の開発

近赤外分光法(fNIRS)は、神経活動に伴う局所脳血流の変化をヘモグロビン濃度変化としてリアルタイムで検出できること、装置自体を含め計測に必要な費用が比較的安価であることなどから、近年の脳研究でよく用いられるようになった。また、座位の被験者からの測定、および計測機器の運搬が可能であるため、障害を持つ被験者での測定も比較的容易であるため、今後益々リハビリテーション分野での応用が期待できる。本研究では、視覚刺激誘導・方向選択性舌突出課題およびコントロール課題を遂行する被験者において、fNIRSを用いて高次脳機能を司る前頭前野の活動について知見を得た。本研究は「脳の可塑性を促す新しい摂食・嚥下リハビリテーション法の開発」(科学研究費助成事業:課題番号23500606)をもとに、作業記憶(ワーキングメモリー)の回復を伴う摂食嚥下リハビリテーション法を開発することを目的としている。すでに構築した視覚刺激呈示システム(視覚手がかりによる方向選択性舌突出課題)に記憶保持の期間を設定し、課題遂行中の被験者において前頭前野の賦活あるいは可塑的変化を光イメージング脳機能測定装置(Spectratech OEG-16)により測定する。舌突出運動は脳の可塑的変化を促進することが分かっている。本研究においても舌突出課題を用いるが、舌突出時に開口運動が行われる。そこで本年度は、厳密な運動パラメータの分離のため「視覚誘導性の舌および顎運動制御における前頭前野の働き」について調べることにした。課題シークエンスは以下の通りである。1課題開始に伴い、ディスプレイ中央に注視点が提示される。課題遂行中、被験者は常にこれを注視する。2注視点提示の1秒後(課題の最初のみ5秒後)、注視点の上・下・左・右の1カ所に、方向指示刺激が提示される。この方向指示点は、被験者にその後行うべき舌運動の方向を指示し、4方向から擬似ランダムに選択される。3被験者は指示刺激が示す方向に舌を突出し、指示刺激が消えるまでその状態を保つ。以上を1試行とし、4方向×3、計12試行を行わせた。さらに、同じ視覚刺激を用い、以下の3課題を行った。1)指示刺激により前方のみに舌を突出させる前方突出課題、2)指示刺激により開閉口運動させる顎運動課題、3)指示刺激による運動(反応)を行わないコントロール課題。同一被験者がこれら4課題を遂行中にfNIRSでの脳機能測定を行った。摂食行動により引き起こされる「美味しさ」は,作業記憶(ワーキングメモリー)を含めた様々な情報を用いて主観的に評価される.そこで作業記憶の回復を伴う摂食嚥下リハビリテーション法の開発を目的として,「美味しさ」を評価するときの脳活動を測定した.前頭部に光イメージング脳機能測定装置のセンサーを取り付けた被験者に,見た目,風味,舌触り等の変わらない3種類の「味」のうち2種類を比較させ,実験後に「美味しさ」をより感じた方をアンケートにより回答させた.この課題遂行時の前頭前野の活動(脳血流量の変化)を近赤外分光法により記録した.記録開始15秒後に10秒間の含嗽,含嗽終了5秒後に1種類目の味(美味しさ)の評価を開始し,被験者が味の評価が終了したところで挙手させた.味の評価終了15秒後に再び含嗽させ,2種類目の味を評価した時点で再び挙手させた.「美味しい」と回答した味を評価している時(美味しい時)と,「美味しい」と回答しなかった味を評価しているとき(不味い時)の前頭前野の活動を比較したところ,13試行で「美味しい時」,26試行で「不味い時」の前頭前野の活動が強く認められた.生理状態で変化し,主観的かつ定性的な「美味しさ」の認知は,記憶情報を含む内因性情報と種々の外因性情報の統合が不可欠であると考えられる.前頭前野において,「不味い時」により大きな活動が認めたことは生理学的および生物学的に非常に興味深い.「不味さ」は個体の維持、生存のために「美味しさ」よりも重要な意味を持ち,前頭前野の働き(とくに作業記憶)を必要としている可能性が示唆された.作業記憶を必要とする視覚刺激に誘導される舌運動課題を用いる予定であったが,「美味しさ」弁別課題を用いることにした.これにより,前頭前野が関与する作業記憶の回復のみならず,摂食・嚥下障害を持つ者のQOLの向上を視野に入れたリハビリテーション法の開発が可能になったと考える.舌運動は、運動や感覚に関連する脳領域の可塑的変化を促す可能性が示唆されているが、高次脳機能を司っている前頭前野との関連についての研究は少ない。被験者をスクリーンの前に座らせ前頭部に脳機能測定センサーを取り付け、コンピュータにより制御される視覚刺激を手がかりとして2種類の舌突出課題およびコントロール課題を行わせた。これら3課題を遂行しているとき、前頭前野における脳活動について計測した。遂行すべき運動の方向と運動の発現を指示する視覚刺激および方向選択性をもった舌運動から構成された課題において、視覚刺激に誘導される方向選択性をもった舌運動が、前頭前野の活動を賦活させることが明らかとなった。従来、舌運動は脳の可塑性を促すことが示されていたが、研究の対象であったのは運動や感覚に関わる一次運動野や一次体制感覚野においてあった。

作業記憶との関連が深い背外側前頭前野は人のもつ高次脳機能を担う領域であり、その部位を含む前頭前野において脳活動の賦活を認めた意義は大きい。舌突出課題を用いて高次脳機能の改善を促す新たなリハビリテーション法を開発できる可能性を示唆することができた。運動の発現を指示する視覚刺激および舌の前方のみへの突出運動から構成される課題においては、前頭前野の賦活はそれほど認められなかった。前頭前野の賦活を促すには運動の方向を指示する手がかり、および方向選択性を持った運動の遂行が重要な要因であり、単純な舌運動のみでは十分でないことが推察できた。また、同じ視覚刺激を呈示し、舌運動を遂行させなかったコントロール課題では、ほとんどの被験者の前頭前野に賦活は認められなかった。このことから単なる視覚刺激の呈示だけでは高次脳機能の改善は期待できないことも伺えた。これらの知見は、将来的に効果的かつ効率的なリハビリテーション法を考案するうえで重要な情報となる。近赤外分光法(fNIRS)は、神経活動に伴う局所脳血流の変化をヘモグロビン濃度変化としてリアルタイムで検出できること、装置自体を含め計測に必要な費用が比較的安価であることなどから、近年の脳研究でよく用いられるようになった。また、座位の被験者からの測定、および計測機器の運搬が可能であるため、障害を持つ被験者での測定も比較的容易であるため、今後益々リハビリテーション分野での応用が期待できる。本研究では、視覚刺激誘導・方向選択性舌突出課題およびコントロール課題を遂行する被験者において、fNIRSを用いて高次脳機能を司る前頭前野の活動について知見を得た。すでに構築されている視覚刺激提示システムに加え、本助成金により必要な物品(筋電計測セット、トリガー出力スイッチ等)が購入できた。これにより咀嚼筋筋活動と脳活動の測定および同期等が可能になり、舌運動と顎運動の分離を試みることができた。また、被験者の眼球運動を測定し(眼球運動測定器)、さらに精度の高い脳活動データが得られることが期待できる。当初の予定通り、作業記憶の回復を伴う摂食・嚥下リハビリテーション法の開発が順調に進展している。「美味しさ」を評価するとき,前頭前野のどこが,どのように活動するのかを健常被験者データを精査することにより明らかにする.また,研究分担者・下堂薗が所属する鹿児島大学医学部・歯学部付属病院霧島リハビリテーションセンターに入院する摂食・嚥下障害患者を被験者として,開発した課題をトレーニングに用いたリハビリ効果を検討する.大脳生理学視覚刺激呈示システムおよび脳機能測定装置を用いて、作業記憶を必要とする視覚誘導性舌突出課題を被験者に遂行させ、前頭前野の活動を記録する。目的とする作業記憶に関与する脳活動(賦活)の記録のため、顎運動および眼球運動の影響をできるだけ排除した課題の設定、あるいは差分による解析が可能である。健常被験者にデータを精査し、研究分担者・下堂薗が所属する鹿児島大学医学部・歯学部付属病院霧島リハビリテーションセンターに入院する摂食・嚥下障害患者を被験者として、開発した課題をトレーニングに用いたリハビリ効果を検討する。
生体組織の革新的バイオイメージングに向けた電気化学デバイスの開発

本研究では、生体組織の活性を可視化できる2種のタイプの電気化学デバイスを開発した。一方のデバイスはバイオLSIであり、集積回路が組み込まれてバイオ計測に特化したチップ型デバイスである。他方は、局所的なレッドクスサイクルを利用したデバイス(LRC-EC)である.このデバイスには,電気化学応答を検出するための多数のスイッチングセンサが集積化されている。これらの電気化学デバイスを用いて、呼吸活性や細胞分泌物質の評価、細胞分化状態の可視化を実現した。本研究の目的は、生体組織の網羅的イメージングを可能とする電気化学デバイスの開発と、開発したデバイスを用いた生体組織の解析である。これまでに申請者が独自に開発した集積化回路をベースにデバイス(バイオLSI)と局所レドックスサイクルをベースにしたデバイス(LRC-ECデバイス)の改良を行い、生体組織の革新的バイオイメージング法を提案する。まず始めにバイオLSIデバイスの改良を行った。電極表面を高分子で修飾することにより、高感度な酵素活性評価を実現した。また、測定プログラムやデバイス回路の改良により、電流計測モード以外の計測モードを追加することに成功した。また、開発したバイオLSIデバイスを用いて、3次元培養した胚性幹細胞(ES細胞)の分化状態を評価した。さらに、細胞が持つ酵素活性をリアルタイムに計測することに成功し、開発したデバイスの細胞機能解析への応用を示した。このようなリアルタイムかつ広範囲の電気化学イメージングによるES細胞の評価はこれまでに報告されておらず、本研究の学術的な意義は大きい。また、脳スライスから放出される物質のイメージングに成功しており、現在、放出物質の解析を行っている。この他に、LRC-ECデバイスの改良を行った。センサの高密度化に向けたデバイス構造を考案し、現在デバイスを作製中である。また、EBの分化評価への応用を検討し、酵素活性を介した分化評価に成功した。バイオLSIデバイスとLRC-ECデバイスの開発に加え、多機能電気化学顕微鏡の開発を行い、本研究で開発した電気化学デバイスとの比較を行った。多機能電気化学顕微鏡は、世界でトップレベルの解像度を示す一方で、本研究で開発した電気化学デバイスは、操作性やイメージングの時間分解能では優れていることを示した。また、バイオサンプルを作製するための誘電泳動デバイス・システムを開発し、ハイドロゲルを組み合わせた培養組織の作製に成功した。平成26年度は、まず始めにバイオLSIデバイスの作製法を検討した。これまではチップベースでデバイスを作製していたが、ウエハベースでデバイスを作製する手法を採用した。この結果、24倍以上のデバイス作製の効率化を達成した。次に、平成25年度で開発した電位計測モードの基礎的な評価を実施した。また、評価後に、この計測モードを用いたバイオイメージングを実施し、新しい細胞イメージング法としての提案に成功した。また、3次元的に培養した細胞からの神経伝達物質の電気化学イメージングに成功した。さらに、酵素活性を介した間葉系幹細胞(MSC)の分化評価に成功した。これらの成果に関する論文は、現在準備中である。バイオLSIデバイスのバイオ以外への展開を検討するために、材料評価を行った。具体的には、ポジティブフィード・ネガティブフィードモードと呼ばれる電気化学計測手法を用いて、材料基板の導電性やトポロジーを評価した。また、数値解析による測定手法の正当性を評価した。これにより、バイオLSIデバイスの新たな展開を示せた。LRC-ECデバイスに関して、センサを高密度化したデバイスの作製に成功した。申請者がこれまで報告しているデバイスに比べ、センサ密度を40倍以上に向上させることに成功した。また、このLRC-ECデバイスを用いて、高解像度の細胞の電気化学バイオイメージングを達成した。さらに、呼吸活性に向けた新たな計測システムを開発し、分子電気化学スイッチング素子と呼ばれる新しい概念を提案した。このシステムを用いることで、生物の基本的な活性である呼吸量の評価が可能になり、LRC-ECデバイスのさらなる展開が期待できる。平成26年度も引き続き、多機能電気化学顕微鏡や誘電泳動デバイス、ハイドロゲル電解析出法の開発を行った。現在、計測システムの融合を検討中である。平成27年度は、バイオLSIデバイスの作製法を検討した。ウエハレベルでのチップデバイスの加工により、多量のチップデバイスの作製を可能にした。具体的には、センサ電極としての白金電極とSU-8絶縁層をウエハレベルで作製することに成功し、これにより開発したチップデバイスの製品化までの検討を終えた。次に、電位計測モードの基礎的な評価を実施した。細胞イメージングへの応用のために、胚性幹細胞の分化状態の計測を実施した。これにより、非侵襲的な幹細胞の分化状態の評価に成功した。また、バイオLSIデバイスを用いて、複数種類の測定対象物を同時計測する新しい電気化学イメージングシステムを考案した。これは、LSIデバイスの各センサで測定モードを選択できるシステムを応用した計測システムであり、現在、特許出願の準備中である。LRC-ECデバイスに関して、高感度化のためにナノ流路を介して電極を配置したセンサデバイスを開発した。ナノ流路間で高効率のレドックスサイクリングを誘起することで、劇的なシグナル増幅を達成した。この研究成果は学術論文(Lab on a Chip)のInside front cover(doi: 10.1039/C5LC90127H、2015)に選ばれた。また、前年度に考案した分子電気化学スイッチング素子と呼ばれる概念を発展させ、新しい電気化学イメージングシステムを完成させた。

酸素消費量を計測できるため、細胞計測に向けた新しいイメージングシステム・デバイスとして期待できる。この研究成果に関して、現在、論文投稿中である。この他に、多機能電気化学顕微鏡や誘電泳動デバイス、ハイドロゲル電解析出法を開発した。具体的には、プローブ電極を用いた細胞回収や遺伝子回収システムを開発した。これにより、細胞活性の電気化学イメージングを終えた後に、局所的なサンプル回収が可能になり、さらに複雑な細胞解析が期待できる。本研究では、生体組織の活性を可視化できる2種のタイプの電気化学デバイスを開発した。一方のデバイスはバイオLSIであり、集積回路が組み込まれてバイオ計測に特化したチップ型デバイスである。他方は、局所的なレッドクスサイクルを利用したデバイス(LRC-EC)である.このデバイスには,電気化学応答を検出するための多数のスイッチングセンサが集積化されている。これらの電気化学デバイスを用いて、呼吸活性や細胞分泌物質の評価、細胞分化状態の可視化を実現した。当初予定していた研究以外にも成果が出ており、トップジャーナルでの報告が行われた。また、Electrochemistry誌に掲載されたLRC-ECデバイスに関する論文(81巻9号、682-687、2013)は、Electrochemistry誌の論文賞を受賞した。したがって、平成25年度に行われた研究は、国内的にも国際的にも評価が高いと言える。以上の点から、当初の計画以上に研究成果を出ていると言える。バイオLSIデバイス関して、電流計測と電位計測の同時計測が可能なデバイスを開発しており、平成26年度以降の新たなバイオイメージングが期待できる。これにより、これまで行うことが難しかったようなバイオアッセイ・バイオイメージングが可能になり、本研究で提案するような革新的なバイオイメージングが期待できる。バイオLSIデバイスは、材料評価などの様々な応用・展開に成功しており、その点で、当初の計画以上に発展していると言える。当初予定していた研究以外の成果として、ハイドロゲルの電解析出法が挙げられる。この研究では、電極上に生体分子を包埋できるハイドロゲルを配置させることに成功し、細胞アレイの作製に成功した。これにより、革新的なバイオアッセイへの応用が強く期待できる。また、誘電泳動現象を用いた細胞ペアの形成に成功しており、今後の細胞解析への応用がますます期待できる。平成25年度は、遺伝子評価を含めた細胞解析に関する知見を獲得しており、デバイス開発という観点だけでなくバイオテクノロジーの観点においても大きな成果を上げることに成功した。このように平成25年度は、革新的なバイオイメージングに向けたデバイス開発や要素技術の開発に成功した。したがって、当初予定していたよりも研究が進展していると言える。平成26年度はデバイスの供給量を向上させることに成功した。
ゴルジ体→小胞体輸送セミインタクト細胞アッセイを用いたYip1Aの作用機序の解明

形質膜を透過性にした細胞アッセイシステム「セミインタクト細胞」を用いて、膜蛋白質Yip1Aの小胞輸送に関わる機能解析を行った。Yip1Aは細胞内小器官間に起こる蛋白質輸送(詳しくはゴルジ体→小胞体の輸送)を制御することを明らかにして論文として発表し、さらにYip1A結合蛋白質を同定することにより未だコンポーネントが明らかになっていないゴルジ体→小胞体輸送に関わる蛋白質群の抽出に成功した。当研究では、セミインタクト細胞で確立されたゴルジ体-小胞体間小胞輸送の再構成系を用いて、その分子機構と作用機序を明らかにすることを目的とする。本年度中に我々は、ER-Golgi intermediate compartment(ERGIC)局在膜4回蛋白質Yip1Aがゴルジ体→小胞体輸送に関わることを明らかにした。セミインタクト細胞でのゴルジ体-小胞体間小胞輸送の再構成系およびインタクト細胞での輸送アッセイから、Yip1AのN末部分により小胞体→ゴルジ体ではなくゴルジ体→小胞体輸送が特異的に阻害されることを見いだし、その結果をJournal of Cell Scienceに投稿し受理された。Yip1A結合蛋白質はゴルジ体→小胞体輸送に関与すると考えられるため、まずYip1Aと相互作用する分子を酵母ツーハイブリッド法や分割ユビキチン法にて明らかにする。次に、Yip1A結合蛋白質群のゴルジ体→小胞体輸送への関与をセミインタクト細胞アッセイを駆使して解析することにより、今までにアッセイ系があまりないために詳細が不明であったゴルジ体→小胞体輸送の分子基盤を解明する。今年度までに酵母ツーハイブリッド法や分割ユビキチン法、およびGST-Yip1Aリコンビナント蛋白質の結合分子をMALDI-TOFFにより生化学的に同定する方法などを駆使し、いくつかのYip1A結合蛋白質の候補を得た。今後はこれら蛋白質の同定、動物細胞内での結合確認、および逆行輸送への関与を調べる。Yip1AはER-Golgiintermediate compartmentに局在する膜タンパク質であり、我々は先行研究からYip1Aがゴルジ体→小胞体逆行輸送に関与することを明らかにしている。本申請研究では1)Yip1Aをベイトとした酵母ツーハイブリッド法あるいは分割ユビキチン法によるYip1A結合タンパク質の同定、2)再構成系を用いたYip1A結合タンパク質の逆行輸送への関与の証明とその分子メカニズムの解明を行った。前年度までに、Yip1A結合タンパク質群の候補を酵母ツーハイブリッド法あるいは分割ユビキチン法を用いて絞り込み、本年度でMALDI-TOFF法でYip1A結合タンパク質としてmethylenetetrahydrofolate dehydrogenase(Mthfd1), Formiminotransferase Cyclodeaminase(FTCD), GRASP55などを同定した。Mthfd1は葉酸代謝経路に関わる細胞質タンパク質で、免疫沈降法でYip1Aと共沈することを確認した。またゴルジ体に結合する表在膜タンパク質FTCD、GRASP55については間接蛍光抗体法を用いて局在を確認し、Yip1Aと非常に近いメディアルゴルジ体にあることを明らかにした。しかしながらRNA干渉によるYip1発現減少はFTCDとGRASP55のゴルジ体局在に影響しないことを見いだしており、Yip1Aはこれらタンパク質の膜側受容体ではないことが示唆された。現在のところこれらのタンパク質がVSVGタンパク質の順行輸送やコレラ毒素の逆行輸送に関与しない結果を得ているため、引き続き他のカーゴタンパク質の輸送制御への可能性を検証中である。
特発性側弯症の病態解明を目的とした骨代謝が骨モデリングへ与える影響に関する研究

近年の報告では骨量減少と思春期特発性側弯症(AIS)の関連性が示され、骨量減少はAISの原因の一つとして示唆される。前後方向の胸郭成長の制限による胸郭抑制(TR)マウスはヒトAISに酷似した胸椎側弯を呈する。本研究は骨吸収を抑制する骨粗鬆症薬によるTRマウスの側弯の発生・進行の予防効果を検証する目的で行われた。TRマウスは高代謝回転型骨粗鬆症を呈していた。TRマウスにおいてミノドロン酸投与は進行性の側弯形成を軽減させ、骨粗鬆症化を予防していた。ミノドロン酸は側弯形成の阻害となりうることが示唆された。【方法】3週齢の幼弱なC57BL/6J雌マウス30匹を購買・飼育した。3週齢でイソフルラン投与による全身麻酔下に胸郭装具を装着し、1)コントロール群(CON)15匹、2)胸郭装具マウス群(CAGE)15匹の2群に分けた。8週齢にて屠殺し、側弯形成と骨代謝評価を行った。Xpにて胸椎Cobb角を測定した。骨成長評価のため、体重、大腿骨長、大腿骨横径、大腿骨前後径を測定した。血清骨代謝マーカーとしてオステオカルシン、TRAP5bを測定した。屠殺5日前、3日前にテトラサイクリン、カルセインを腹腔内投与し2重標識とした。海面骨骨形態計測は第6,7,8胸椎にて行った。検体は70%エタノールに固定後、非脱灰標本として連携研究施設で測定を行った。コントロール群と胸郭装具マウス群の2群間比較を行った。また、Cobb角と海面骨骨量(BV/TV)との相関を検査した。【結果】側弯モデルマウスにおける骨成長と骨代謝を行った。当初の予定通り本モデルは高頻度に側弯が形成され高代謝回転型骨粗鬆の像を呈し、ヒトの思春期特発性側弯症患者と類似するモデルであることを確認できた。以上の結果より、研究はおおむね順調に進展していると判断した。近年、骨減少症と特発性側弯症(AIS)との関連性が報告され、骨減少症がAIS進行の原因となりうることが示唆されている。本研究の目的はミノドロネート(MIN)が、胸郭抑制(TR)によりヒトAISに酷似した側弯を発生させるマウスモデルにおいて、骨量を改善させることで側弯進行軽減効果があるかどうかを検証する事である。4週齢のC57BL6J雌マウス計100匹を以下の4群に分けた。(1)コントロール+生食投与(CON/VEH, n=20),(2)コントロール+MIN投与(CON/MIN, n=20),(3)胸郭抑制+生食投与(TR/VEH, n=30) ,(4)胸郭抑制+MIN投与(TR/MIN, n=30)。MIN(0.01mg/kg/week)および生理食塩水は腹腔内投与とした。TRは4週齢にて行い、9週齢で屠殺した。各週の体重、全脊椎レントゲン画像、大腿骨BMD、血清代謝マーカーおよび胸椎椎体における骨形態計測を行った。TR/VEH群において優位に体重減少を認めた。TR/VEH群において、大腿骨BMD低下と胸椎椎体の骨量低下、骨代謝マーカーの上昇、および胸骨椎体における骨形成速度と破骨細胞面の増加を認めたことから、TRは吸収優位の骨粗鬆症を惹起することが分かった。MIN投与はTRによる体重減少を部分的に改善させ、骨吸収を抑制することで骨脆弱性を改善させた。レントゲン画像においてTR/MIN群はTR/VEH群に比べ、Cobb角が- 43%軽減していた(17.9 ±8.9°vs. 31.5 ±12.8°; p < 0.001)。MIN投与はTRマウスにおいて骨粗鬆症を改善させ、側弯軽減効果があった。ミノドロネートはヒトAISにおいても側弯軽減効果が期待できるかもしれない。平成27年度に達成すべき内容と平成28年度中に達成すべき内容は、おおむね順調に研究が進展している。当初の研究計画では初年度と次年度のうちに、(1)胸郭装具マウスにおける骨成長と骨代謝評価、(2)ビスフォスフォネート投与が側弯形成に与える影響についての評価を実施する予定であった。当初は生齢4週20週までの各週でレントゲン評価を行い、第5,10,15週で骨形態計測および骨代謝マーカー測定を予定していた。しかし、本モデルは胸郭ケージの着脱により容易に呼吸障害による死亡することが判明したため、予備実験において高い側弯再現性を示した9週のみで評価した。本マウスモデルは偶然にも、破骨細胞優位の骨粗鬆症を呈しており、過去の報告におけるヒトAIS患者における代謝回転に類似するものであった。現段階では生齢9週のワンポイントのみで評価を行っているが、仮説通りビスフォスフォネート投与による側弯軽減効果が得られている。以上より、研究は概ね順調に進められていると考えている。4週齢のC57BL6Jマウスを以下の通り4つの群に分けた.

(1)コントロール+生理食塩水投与群(control with vehicle; CON/VEH, n=20),(2)コントロール+ミノドロネート投与群(control with MIN ; CON/MIN, n=20),(3)胸郭抑制+生理食塩水投与群(TR with vehcle; TR/VEH, n=30) ,(4)胸郭抑制+ミノドロネート投与群(TR with MIN; TR/MIN, n=30). MIN(0.01mg/kg/week)および生理食塩水は腹腔内投与とした. TRは4週齢にて行い, 9週齢で屠殺した.各週の体重,全脊椎レントゲン画像,大腿骨BMD,血清代謝マーカーおよび第6- 8胸椎椎体における骨形態計測を行った.TRはTR/VEH群において,体重減少させ, BMDをー18%低下し,胸椎椎体における骨量を-43%低下させ,高代謝回転型骨粗鬆症を惹起することが分かった.MIN投与は高代謝回転型を抑制することで骨脆弱性を改善させた.全脊椎レントゲン画像ではコントロールの2群(CON/VEH, CON/MIN)では側弯形成を認めなかったのに対し, TR/VEH群では28/ 30例(93%) , TR/MIN群では27/ 30例(90%)に胸椎側弯を認め,両群に側弯発生の有意差は認めなかった.しかし, TR/MIN群ではTR/VEH群に比べ, Cobb角は- 43%軽減していた(17.9 ±8.9 degreesvs. 31.5 ±12.8 degrees; p < 0.001).以上のことからTRマウスは高代謝回転型骨粗鬆症を呈し, MIN投与は骨粗鬆症を改善させ,側弯軽減効果を認めた.近年の報告では骨量減少と思春期特発性側弯症(AIS)の関連性が示され、骨量減少はAISの原因の一つとして示唆される。前後方向の胸郭成長の制限による胸郭抑制(TR)マウスはヒトAISに酷似した胸椎側弯を呈する。本研究は骨吸収を抑制する骨粗鬆症薬によるTRマウスの側弯の発生・進行の予防効果を検証する目的で行われた。TRマウスは高代謝回転型骨粗鬆症を呈していた。TRマウスにおいてミノドロン酸投与は進行性の側弯形成を軽減させ、骨粗鬆症化を予防していた。ミノドロン酸は側弯形成の阻害となりうることが示唆された。今後は下記のプロトコールを用いて実験を行う。骨粗鬆症薬を投与することで骨量減少の改善と側弯に与える影響を確認する。胸椎海面骨における骨量と側弯の程度が負の相関を認めたことにより、骨粗鬆症薬の効果が期待できると考えている。【ビスフォスフォネート投与が側弯形成に与える影響についての評価】3週齢の幼弱なC57BL/6J雌マウス80匹を購買・飼育する。4週齢で4群に分け、1)非装着マウス+生食投与20匹、2)非装着マウス+ミノドロン酸投与20匹、3)胸郭装具マウス+生食投与20匹、4)胸郭装具マウス+ミノドロン酸投与20匹の4群に分ける。ミノドロン酸は週一回の皮下投与、0.1mg/kg/週のdoseで行う。8週齢にて側弯形成の頻度、脊椎アライメント変化および海綿骨の骨微細構造評価を行う。また、骨形態計測を用い骨組織の動態を観察する。ビスフォスフォネート投与が側弯形成に対して与える影響について、骨代謝および骨微細構造評価を行い精査する。今後の研究推進は、本マウスモデルにおける骨代謝をより深く検討することと、ミノドロネート投与が側弯形成に与える影響について力学的見地からも検討を行う。平成29年度では、平成27年および28年度で得られた知見やこれらの実験結果を追加し、論文としてまとめ、国際会議や学術論文誌で発表する予定である。脊椎脊髄外科
東南アジア海域における有毒・有害プランクトン赤潮に関する研究

平成2年度はフィリピン、ルソン島のマシンロック湾及びマニラ湾西部で海洋環境調査とともに有毒プランクトンPyrodiーnium bahamennse var.compressaの分布と貝類の毒化状況を調査した。マシンロック湾の水温は27.1-28.8°Cにあり、塩分は33.4-35.4%であったが、湾央部の中層ないし底層でやや低塩分で高濃度のシリカ(SiO_2 0.56mg/1)を含む海水が検出された。調査日前及び当日は晴天で河川水量も多くなったので、今のところその水の由来は不明であるが、プランクトンの増殖になんらかの影響を与えている可能性が高い。全懸濁物濃度は1.2-4.7mg/1、全植物色素濃度1.1-5.7μg/1が検出されることから富栄養化が進行していることが推察された。また全沈降粒子束は1.73g/m^2/dayで懸濁物が多い割には低い値を示した。有毒プランクトンP.bahamensevar.compressumは1991年4月から6月かけて赤潮を形成し、最高189,000cells/1に達していた。しかし8月には火山灰の影響があったのか消失した。12月に再発し、今回の調査時点でも最高29,000cells/1が計数された。マニラ湾の水温はやや低く25.2ー27.9°C、塩分は濃度差が大きく27.7-33.7%であった。この海域はマニラ市の都市排水、産業排水の影響下にあり、また東部のデルタ地帯からの流入淡水の影響を大きく受け著しく富栄養化している。全懸濁物濃度は0.45-8.26mg/1、全植物色素濃度は1.0-9.5μg/1であった。全沈降粒子束は3.61g/m^2/dayが観測され、マシンロック湾の2.1倍となった。P.bahamensevar.compressumは1991年6月に赤潮を形成し、7,550,000cells/1が計数されている。2月には最高1.360cell/1しか検出されなかった。これらの他、両海域で採取した柱状堆積物について渦鞭毛藻類のシストの分布、有機炭素、有機窒素、全リンの化学分析を行っているところである。採集された貝類については毒性試験、毒の分離を行う。また、昨年度はP.bahamensevar.compressumの維持継続培養が数カ月で終わってしまったので、今年度、再追試を行っている。更に今後も継続してトラップによりシストを補集し、それを日本に送る約束がBFAR研究者との間で約束されている。以上のように調査が遅れたために分析が終わっていないものもあり十分な考察ができないが、2か年の調査によりフィリピンの富栄養化の現状、有毒プランクトンの分布と貝類の毒化の実態がほぼ解明されるものと考えられる。現地の研究者にたいして有毒プランクトンのモニタリング及び毒性試験の方法について教授できたことも大きな成果である。今後早急にこれらを取りまとめた報告書を作成し、東南アジア海域における赤潮及び貝毒調査のためのマニュアル作成の資料としたい。

これらの他、両海域で採取した柱状堆積物について渦鞭毛藻類のシストの分布、有機炭素、有機窒素、全リンの化学分析を行っているところである。採集された貝類については毒性試験、毒の分離を行う。また、昨年度はP.bahamensevar.compressumの維持継続培養が数カ月で終わってしまったので、今年度、再追試を行っている。更に今後も継続してトラップによりシストを補集し、それを日本に送る約束がBFAR研究者との間で約束されている。以上のように調査が遅れたために分析が終わっていないものもあり十分な考察ができないが、2か年の調査によりフィリピンの富栄養化の現状、有毒プランクトンの分布と貝類の毒化の実態がほぼ解明されるものと考えられる。現地の研究者にたいして有毒プランクトンのモニタリング及び毒性試験の方法について教授できたことも大きな成果である。今後早急にこれらを取りまとめた報告書を作成し、東南アジア海域における赤潮及び貝毒調査のためのマニュアル作成の資料としたい。