hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
神経細胞に特異的な糖タンパク質に関する分子生物学的研究

1)糖タンパク質の精製および部分アミノ酸配列の決定凍結乾燥したイナゴ頭部を、クロロホルム/メタノールで脱脂後、0.9%塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液(PBS)で糖タンパク質を抽出した。この抽出物を材料に、ウエスタンブロットにおける抗HRP抗体との反応性を指標として、硫安分画、ConAカラム、抗HRP抗体を固定化したアフィニティーカラムにかけ、最終的に調製用電気泳動で分画し、43kDaおよび35kDaの糖タンパク質を精製した。ペプチドシークエンサーにより、この35kDaの糖タンパク質のアミノ末端より20残基のアミノ酸配列を決定した。またこの35kDa糖タンパク質をリシルエンドペプチダーゼで消化後、逆相HPLCで分離したペプチド画分についてアミノ酸配列を決定した。2)糖鎖の精製および構造決定精製した43kDa糖タンパク質をヒドラジン分解で糖鎖を切り出し、還元末端を2-アミノピリジンと反応させピリジルアミノ化(PA化)することにより蛍光標識した。このPA化糖鎖を、逆相カラム、アミドカラムを用いて分画し、数種の画分を得た。そのうちの主要な画分が、HPLCにおいてHRP糖鎖とよく似た挙動を示したので、この画分が抗HRP抗体と反応性を示す糖鎖であると思われた。そこでこの画分を、イオンスプレー式質量分析計を用い、MSおよびMS/MS分析を行った結果、HRP糖鎖と同じパターンを示した。また、この糖鎖を600MHz1H-NMRで測定した結果、HRP糖鎖と同じパターンを示した。このことより、イナゴの神経系に発現している、抗HRP抗体と反応性を示す糖鎖は、HRP糖鎖と同じ構造であることが示唆された。
認知症ケアを担う高度介護専門職養成におけるプログラム教授方法に関する開発研究

デンマークにおける認知症ケアの介護人材養成は、1資格取得のためのSOSU学校での学び、2現任教育の2種類がある。SOSU学校では、アクティブラーニングの手法を用いて、学生に関心を持って自らが意欲的に学ぶようにしていた。さらに、介護のコンテストなどを学内で開催し、学生たちのやる気を引き出すような工夫がされていた。一方で、現任教育は、プライセンター内で完結させず、研修機関と協働でプログラムを開発し、現場で必要なことを職種別・経験別で研修していた。平成25年度は、文献研究、および現地調査を行うこととした。まず、文献研究では、これまでに日本の職業訓練教育がどのように成り立ってきたのかについて、先行研究をレビューした。デンマークの介護専門教育を行うSOSU学校にて平成26年3月にヒアリング調査を実施した。そこで、義務教育後(日本でいうところの中卒同等程度)から始まる各種専門職業教育では、どう教えるかの工夫がされており、特にアクティブラーニングの手法を取り入れた取り組みがされている。さらに、デンマークでは介護の仕事をする人の中に移民の人たちもいるため、国語(デンマーク語)の授業やデンマークの文化について学ぶ授業もあり、人種を超えて介護教育を可能にするプログラムを立案している状況がわかった。さらに、授業中のロールプレイは、教室内に常設してあるビデオカメラで撮影し、立ち位置、目線、声掛けの仕方について振り返りを行っている。また、介護に関するコンテストを開催し、学生のやる気と技術の向上を図っている。これまで介護士の養成については、日本での先行研究のなかでも、プログラムの中身までは触れたものはなく、多くは、2種類の介護士の資格制度を整備したことの紹介にとどまっていたため、今年度の具体的な教育の方法にまで踏み込んだ本研究のヒアリングで得られた成果は、日本の外国人労働者の介護業界への参入やそれに伴う教育など今後検討されていることに対して寄与することができる。平成26年度は、認知症ケアの高度介護専門職養成に関して、1実際の介護現場で研修がどのように組み立てられているのか、2高度専門職の最新の動向についてヒアリングを通して明らかにした。実際の介護現場における職員の研修については、デンマークヒロード市のプライセンターをフィールドとしたが、そこでは、介護現場の職員に必要となる知識・技術をプライセンター内で研修するのではなく、外部の「職業ホイスコーレUCC」と言われる外部の研修機関と共同でプログラム開発を行っている。外部に研修を受けにいく形式ではあるものの、介護現場側もそこで行われる研修について一定のイニシアチブを持っている点において、今日の我が国の介護現場に示唆を与えるものである。具体的には、上半期4週間、下半期4週間の計8週間行われている。上半期には、病気としての認知症に焦点を当て、主として病理学と薬理学を看護専門的な関連から学ぶ。下半期には、理論、コミュニケーション、協働、文書化、質の向上について重点を置いている。高度専門職の最新の動向としては、「家族コンサルタント」という専門職を自治体に新たに配置しはじめていることが明らかになった。この職種は、認知症コーディネーターと協同し、主に家族の支援をするための専門職である。このような専門職の配置は、近年始まったばかりであり、今後具体的な働き方などについては次年度の研究としていく。平成27年度は、認知症ケア専門職の具体的職務とその養成について、「家族コンサルタント」に注目した。近年、「家族コンサルタント」がデンマークの各自治体に配置されており、主として、認知症の家族をもつ配偶者への支援が行われている。家族コンサルタントは、市内にオフィスを構え、勉強会や集会ができるようなスペースを確保しながら、家族と面談や家族同士の集いの場を開催している。このことを通して、認知症コーディネーターと家族コンサルタントが一体となり、支援していることが明らかとなった。昨今、介護現場での取り組みとしてアクティビティが注目されている。特に認知症ケア分野では、「回想ダンス」という実践が広がりを見せており、介護現場で働くスタッフに対する「回想ダンスインストラクター」養成の取り組みも始まっており、約500名のインストラクターが養成されている。最も大事にされていることは、ダンスの「技術」ではなく、なぜこの取り組みが「認知症の人にとって良いのか」という理論をスタッフ自身が理解することだと言われている。単に「楽しむことをリードする」のではなく、スタッフが「なぜするのか」を理解することによって、より認知症の人にとって大切な取り組みになるのである。アクティビティは、プライセンターだけではなく、在宅でくらす高齢者にとっても注目されている。できるだけ長く在宅で生活ができるように、作業療法士等が関わり、「自分でできることを増やしていく」ための取り組みが始まっている。例えば、「買い物に行く」という行為が難しくなった高齢者に対して、もう一度できるよう支援する。身体機能評価を行い、日常生活で何を訓練したらよいかを明確にし、プログラム化したうえで、ホームヘルパーが適切にその訓練ができるよう指導する。3が月程で評価をしながら、できることを増やしていくというものだ。平成26年度に予定していたデンマークヒロード市/コペンハーゲン市でのヒアリングがほぼ終わっているため。高齢者ケア

平成27年度については、以下のことについて行う。・認知症コーディネーターと協同する新たな専門職である「家族コンサルタント」がどのように認知症家族とコミットし役割を果たしているのかについて明らかにする。・近年、認知症ケアにかかわる専門職養成において、特にデンマークでは国家戦略として「予防」と「リハビリテーション」を“アクティビティ"として実施しており、その実際と効果について現地での取り組みの視察とヒアリングを通して現状把握を行う。平成25年度に予定していた現地でのヒアリングと文献研究がほぼ終わってるため。本年度は、以下のことについて行う。・デンマークの介護士養成校にて引き続きヒアリングを行い、教員資格や教員間スーパービジョンの方法などについて具体的取り組みの様子などについても明らかにする。・日本では、介護福祉士養成専門学校における調査およびヒアリングを行い、プログラムや教授方についての現状把握を行う。デンマークの現地調査で知り得た書籍が、日本で輸入することが困難となったため、入手するのに時間がかり、翻訳することができなかったため。現地調査の期間が平成25年度末から平成26年度であったため、現地通訳にかかった費用などの清算が年度内に行われなかった。前述のことより、平成25年度中の予定していた研究費執行ができなかった。すでに入手した資料、書籍翻訳代として使用する。また、現地通訳代金を清算する。
イオン交換機構に基づく可逆性抗菌性歯面塗布材の開発

我々は、う蝕予防を目的とした抗菌性歯面塗布材の開発を企画し、平成8年度平成10年度に科学研究費補助金[基盤研究(B)(2)、課題番号08457505]を得てトリエチレングリコールジメタクリレート(TEGDMA)を主体とし、それに重合できる陽イオン交換基としてメタクリル酸を加え光重合化したレジンに陽イオン性抗菌剤である塩化セチルピリジニウム(CPC)をイオン結合で保持させることに成功した。本研究は、この歯面塗布材の実用化を図り、種々の問題点を解決するものである。元来、本塗布材は1液型の構成で考えられてきた。しかし、自発重合と低温によるCPCの析出が問題となった。重合禁止剤の配合等を試みたが、重合不良等のために断念し、操作性はやや低下したが2液型の構成に変更した。すなわちCPCとメタクリル酸を一方に、重合触媒を他方に全量配合し、TEGDMAの量を案分して両液の液体成分量を等しくした。この処置により自発重合並びにCPCの析出の問題は解決されたうえ1液型では必要であったエタノールの添加も不要になった。さらに、実用化に重要な機械的性質として吸水率、吸水膨張率、吸水による硬さ変化を、検討した。吸水率、吸水膨張率はコントロールとしたMMA系即時重合レジンより高く、それぞれ約4倍および3倍になった。しかし、吸水による硬さ変化はMMAレジンより安定性は低いが、それほど劣っている訳ではなかった。本塗布材はフィラーを含まず、重合収縮率は大きいと考えられるので、大きい吸水膨張率は重合により接着界面に発生する応力の緩和には役立つであろう。また、象牙質に対しては本塗布材のみの適用でかなりの接着強さが得られるようである。我々は、う蝕予防を目的とした抗菌性歯面塗布材の開発を企画し、効果が高い溶出型でありながら永続性を兼備えるために、イオン交換機構の導入を考えた。平成8年度平成10年度に科学研究費補助金[基礎研究(B)(2)、課題番号08457505]を得てトリエチレングリコールジメタクリレートを主体とし、それに重合できる陽イオン交換基としてメタクリル酸を加え光重合化したレジンに陽イオン性抗菌剤である塩化セチルピリジニウム(CPC)をイオン結合で保持させることに成功した。本抗菌性レジンはイオン交換樹脂として働き、周囲の環境が中性ないしアルカリ性の場合はCPCを保持しているが、酸性に傾く(pH<6.5)と保持していたCPCを遊離して強力な抗菌力を発揮する。そしてCPCの遊離が進んで抗菌力が低下してきても、中性環境下で高濃度のCPCで処理するとCPCを再吸着し、抗菌性を回復することにより永続性を持った溶出型の抗菌性を実現できた。本研究は、この歯面塗布材を実用化するためのもので、本年はまずシェルフライフの改良を行った。CPCは4級アンモニウム塩であるため重合に対して促進的に働く。そのため調整後数日で自然重合する事があった。そのため、重合禁止剤としてハイドロキノンを0.05%添加することにより、自然重合を阻止することができた。さらに、セルフエッチングボンディング材としての可能性について検討し、ヒト抜去歯のエナメル質と象牙質に塗布・光硬化させた試料をSEMとマイクロラジオグラフィーで観察し、歯面と塗布材との接合状況を観察している。

平成8年度平成10年度に科学研究費補助金[基盤研究(B)(2)、課題番号08457505]を得てトリエチレングリコールジメタクリレートを主体とし、それに重合できる陽イオン交換基としてメタクリル酸を加え光重合化したレジンに陽イオン性抗菌剤である塩化セチルピリジニウム(CPC)をイオン結合で保持させることに成功した。本抗菌性レジンはイオン交換樹脂として働き、周囲の環境が中性ないしアルカリ性の場合はCPCを保持しているが、酸性に傾く(pH<6.5)と保持していたCPCを遊離して強力な抗菌力を発揮する。そしてCPCの遊離が進んで抗菌力が低下してきても、中性環境下で高濃度のCPCで処理するとCPCを再吸着し、抗菌性を回復することにより永続性を持った溶出型の抗菌性を実現できた。本研究は、この歯面塗布材を実用化するためのもので、昨年度はシェルフライフの延長を図り、重合禁止剤を添加することにより実用に差し支えないものが得られた。本年度はこの新しい処方の試作塗布材について検討した。その結果、重合禁止剤の添加は重合性の低下を生じ塗布剤被膜の強度が不足する事になることが明らかとなり、これを避けるための方策について検討している。歯髄為害性についての検討も始めたが、現在のところまだ明らかな結果は得られていない。我々は、う蝕予防を目的とした抗菌性歯面塗布材の開発を企図し、効果が高い溶出型でありながら永続性を兼備えるために、イオン交換機構の導入を考えた。平成8年度平成10年度に科学研究費補助金[基盤研究(B)(2)、課題番号08457505]を得てトリエチレングリコールジメタクリレート(TEGDMA)を主体とし、それに重合できる陽イオン交換基としてメタクリル酸を加え光重合化したレジンに陽イオン性抗菌剤である塩化セチルピリジニウム(CPC)をイオン結合で保持させることに成功した。本抗菌性レジンはく周囲の環境が酸性に傾く(pH<6.5)と保持していたCPCを遊離して強力な抗菌力を発揮する。本研究では本塗布材の実用化を図った。前年度の研究では、塗布材の保存性を高めるために重合禁止剤の配合を試みたが、重合性が低下した。また、従来の配合比では室温が10°C程度に低下するとCPCが析出して来ることが明らかとなった。そのため操作性が落ちるが、2液型の構成にすることを検討した。必要量のTEGDMAを2等分し、一方に光増感剤と促進剤、他方にメタクリル酸とCPCを配合して2液性とした。これにより重合性を低下させることなく、温度低下によるCPCの析出を防止することができ、塗布剤の冷蔵庫保管も可能になった。また、必要な機械的性質の検討として、吸水量、吸水膨張量、吸水による硬度変化、歯質への接着性を調べた。吸水量および吸水膨張率については、コントロールとした即時重合MMAレジンの約3倍に達した。
糖化ストレスによる精神疾患の発症・重篤化メカニズムの解明

うつ病等の精神疾患と糖尿病はいずれも重点対策が必要な5大疾病と位置づけられている。これら2疾病は独立した事象ではなく、双方向性の増悪作用が示唆されており、併存症が問題になっているが、糖尿病がうつ病を増悪させる分子・細胞メカニズムは未解明である。そこで本研究では多臓器円環の観点からこの問題に取り組む。我々が新規に作成した糖尿病ーうつ病併存症モデルマウスを用いて、全身性の細胞応答、行動指標、脳内スパイン動態を多軸的・縦断的に測定する。さらに網羅的分子測定により、糖尿病によるうつ病増悪作用の分子メカニズムを探る。網羅的測定で得られた候補分子は阻害剤の脳内直接投与等により、因果関係の解明に挑戦する。
EPMAスペクトルの測定と分子軌道計算による製銑製鋼スラグの構造と反応性の検討

本申請研究では、Si K_βおよびO K_αX線発光スペクトルの測定と分子軌道計算によるそのシミュレーションにより、スラグの構造と塩基度との関係を解明する試みを行った。平成11年度、同様の検討をSiO_2-CaO 2成分系スラグのO K_αX線発光スペクトルにも適用した結果、計算結果は実験結果とよく一致することが分かった。平成12年度、固体結晶と液体のランダム構造との共通点と相違点の理解を目指し、純SiO_2について、多形である石英、クリスバル石とその溶融ガラス、およびSiO_2-CaO 2成分系の輝石(CaSiO_3)とその溶融ガラスのSi K_βX線発光スペクトルを測定した。純SiO_2および輝石の両者共に、固体結晶と溶融ガラスとの間には、スペクトル形状に大きな相違は認められなかった。したがって、溶融するとランダム構造を形成するものの、そのランダム構造を構成するクラスターの対称性はある程度良好であると判断してよい。なお、2300Kの温度範囲で、クリスバル石とその溶融ガラスの熱容量を測定した結果も、両者の差異は小さく、溶融してランダム構造をとっても、配置のエントロピーに大きな変化がないと推測した。これらの結果は、スラグのX線発光スペクトルをある程度対称性良好なディスクリートアニオンモデルで評価できることを示した、平成10、11年度の結果を裏付けるものである。スラグの構造と性質に関する研究は素材工学上最も重要な分野の1つである。しかしながら、高温液体状態に由来する実験の困難さから、構造と物性、構造と塩基度との間には、不明な問題が数多く残されている。本申請研究も、スラグの構造と化学的特性との関係を解明するための1つの試みであり、金属酸化物の含有に伴うSiK_βおよびOK_αX線発光スペクトルを分子軌道法によって解釈し、スペクトルの形状変化の原因をSiイオンおよび酸素イオンの局所的電子状態の変化として捉え、化学的反応性すなわち塩基度を理解することを目的としている。本申請研究も、スラグの構造と化学的特性との関係を解明するための1つの試みである。スラグ中金属酸化物の濃度が変化すると、構造が変化して、X線発光スペクトルが変化する。前年度、申請者らは、分子軌道計算に金属酸化物の濃度の概念を取り入れる方法を考案し、SiO_2-CaO 2成分系スラグのSi K_βX線発光スペクトルをシミュレーションした。その結果、CaO濃度に伴う構造変化を推定し、塩基度を解釈できた。本年度、Siイオンの結合相手である酸素イオンの検討を行い、O K_αX線発光スペクトルをシミュレーションした。まず,Ca^<2+>が配位するディスクリ-トアニオンSiO_4Ca^<4->、Si_2O_7Ca^<4->、Si_3O_9Ca_<4->、Si_3O_<10>Ca^<6->、Si_4O_<12>Ca^<6->、Si_6O_<15>Ca^<5->、Si_8O_<20>Ca^<7->およびSi_9O_<21>Ca^<5->のそれぞれについて、各分子軌道のO 2p成分の部分状態密度(PDOS)、Q_<2p>を求めた。ついでこのQ_<2p>と分子動力学研究で得られた所定のCaO濃度における各ディスクリ-トアニオンの存在比率、m_iとの積Q_<2p>m_iにガウス関数を適用して総和をとり,CaO濃度を取り入れたO 2pPDOS曲線を計算した。その結果、CaO濃度を取り入れたO 2p PDOSの計算結果は、62.4mol%SiO_2-37.6mol%CaOおよび43.3mol%SiO_2-56.7mol%CaOスラグのO K_αX線発光スペクトルと一致することがわかった。

さらに、各ピークのディスクリ-トアニオンの帰属を調べることにより、塩基度の解釈に結びつけることにも成功した。本申請研究では、Si K_βおよびO K_αX線発光スペクトルの測定と分子軌道計算によるそのシミュレーションにより、スラグの構造と塩基度との関係を解明する試みを行った。平成11年度、同様の検討をSiO_2-CaO 2成分系スラグのO K_αX線発光スペクトルにも適用した結果、計算結果は実験結果とよく一致することが分かった。平成12年度、固体結晶と液体のランダム構造との共通点と相違点の理解を目指し、純SiO_2について、多形である石英、クリスバル石とその溶融ガラス、およびSiO_2-CaO 2成分系の輝石(CaSiO_3)とその溶融ガラスのSiK_βX線発光スペクトルを測定した。純SiO_2および輝石の両者共に、固体結晶と溶融ガラスとの間には、スペクトル形状に大きな相違は認められなかった。したがって、溶融するとランダム構造を形成するものの、そのランダム構造を構成するクラスターの対称性はある程度良好であると判断してよい。なお、2300Kの温度範囲で、クリスバル石とその溶融ガラスの熱容量を測定した結果も、両者の差異は小さく、溶融してランダム構造をとっても、配置のエントロピーに大きな変化がないと推測した。これらの結果は、スラグのX線発光スペクトルをある程度対称性良好なディスクリートアニオンモデルで評価できることを示した、平成10、11年度の結果を裏付けるものである。
クロイソカイメン由来オカダ酸結合タンパク質の探索、構造決定、及び複合体解析

前年度までに、27位トリチウム標識オカダ酸に対する結合活性を指標にクロイソカイメンからタンパク質精製を行い2種類のオカダ酸結合タンパク質(Okadaic Acid Binding Protein ; OABP1,OABP2)を単離することに成功している。相同性検索の結果、OABP2は新規性の高い配列を有するタンパク質であることが明らかとなった。そこで、本年度においてOABP2とオカダ酸の結合親和性、及びその結合様式の評価を行った。27位トリチウム標識オカダ酸を用いた結合試験によりオカダ酸とOABP2との解離平衡定数をScatchardプロット解析を行った結果、Kd=0.9nMと強い結合親和性を有していることが示された。OABP2のオカダ酸に対する認識特異性をプロテインホスファターゼ(PP)阻害剤またはオカダ酸誘導体による競争阻害実験により調べた。OABP2とトリチウム標識オカダ酸の結合は、オカダ酸と同じくPP1やPP2Aの強力な阻害剤として知られるミクロシスチンLRやカリキュリンAによる阻害を受けなかった。一方、オカダ酸誘導体はいずれもオカダ酸の結合を阻害し、PP類とは選択性が異なることが明らかになった。7位または24位ヒドロキシル基にスペーサーを介してビオチンを導入した誘導体はオカダ酸と同程度のIC50値を示し、メチルエステル体、27位誘導体は阻害活性がそれぞれ約1/10、1/100に低下した。以上のことからOABP2はPP類とは異なる様式でオカダ酸を認識していることが示唆された。複合体構造に関する詳細な情報をX線結晶構造解析により得ることを計画して、結晶化用のOABP2の大量調製を大腸菌発現系により行った。精製した発現タンパク質の結合活性を評価した結果、天然体とほぼ同様の親和性を有していることが示された。現在、結晶化条件を検討中である。また、OABP2がクロイソカイメンに特異的に存在することを、光親和性標識プローブを用いた検出法により示した。OABP2の配列の新規性、オカダ酸に対する強い結合親和性、種特異性から、当タンパク質がクロイソカイメン体内に大量に蓄積されている細胞毒オカダ酸に対する自己耐性機構に何らかの形で関与している可能性が示された。カイメンから種特異的に単離される生理活性物質は共生微細藻による生産であると提唱されているが、十分な証明はなされていない。今回、示された固有の結合タンパク質の存在、すなわち耐性の特異性により、共生関係の特異性を説明でき得るものと考えている。
卵管繊毛の制御機構と卵管不妊に関する研究

本研究計画初年度は1ホルモン応答条件の比較、2卵管内分泌液の成分分析の2つを柱とした生体での評価を計画していた。しかしながら性周期や週齢の異なるメスマウスの卵管繊毛の観察及び解析からはその運動強度に有意な差は認められなかった。この原因として摘出した組織の培養液中成分が摘出組織、繊毛運動にとって最適の条件であることから生体内の条件を反映していない可能性が示唆された。そこで培養液条件の検討が必須であり、計画2年目はこの条件検討を実施する計画である。本研究計画では野生型マウスでの繊毛運動制御及び繊毛運動の環境からの運動制御を明らかにするとともに、繊毛運動を制御するとされるタンパク質を欠損させたマウス(Tgマウス)を作製することでそのメカニズムを明らかにすることを目的の一つと考えた。当初の計画では初年度は遺伝子ホモ欠損マウスを作製するために交配を行うとともに野生型マウスでの解析を進める計画であったが、多く交配させたことや計画よりも多くの産仔を得ることができたことなどから予定よりも早くホモ欠損マウスを確立することができた。このことを受け、計画では2年目の後半に計画していた遺伝子欠損マウス組織と野生型マウスでの繊毛運動の運動評価を実施した。その結果、卵管繊毛、気管繊毛、脳室繊毛の運動に大きな差は認められなかったものの、初期胚の繊毛においては野生型マウスの繊毛が周期的な円運動を行うのに対し、Tgマウスの繊毛は円運動を取らないことが明らかとなった。遺伝子欠損マウスの中には内臓逆位を示す個体が約半数おり、この内臓逆位の原因は初期胚の繊毛の運動異常に起因するものであると考えられる。また、遺伝子欠損マウスの胎仔から胎仔性線維芽細胞を採取、培養し細胞ストックを獲得した。2年目計画にもある「培養細胞の樹立・解析」と「培養細胞でのカルシウム上昇の可視化」といったin vitroの解析系の確立を目指す。当初計画していた野生型マウス組織での繊毛運動制御は初年度達成することはできなかったが、遺伝子欠損マウスの作製及びそこからの細胞取得といった2年目計画の準備はすでに整っている。また当初計画にはなかったが、卵管繊毛だけでなく、脳、気管、初期胚などの繊毛運動について比較することができた。特に野生型マウスと遺伝子欠損型マウスの様々な繊毛の運動を比較した結果、運動に差の生じる繊毛と差の生じない繊毛があることは今後の計画に大きな示唆を与えるもの出会った。具体的には、差が生じる繊毛は1つの細胞から1本の繊毛が生じる単繊毛で円運動を行うのに対し、差が生じなかった繊毛は1つの細胞から複数の繊毛が生えている多繊毛で波打ち運動を行うものであった。このことから運動方向、運動様式が異なるこれらの繊毛は制御機構が異なる可能性が大いに考えられる。今後、野生型繊毛の環境応答を解析する上で、この運動様式には注意したい。以上のことから、当初の計画からやや離れてしまった部分も少なくはないが、多くの知見を得ることができ、初年度としては大いに進展したものと考えられる。今後の研究の推進方策について、まず2年目は計画通りin vitroでの解析系の確立を目指す。すでに野生型マウス及び遺伝子欠損型マウスから胎仔性線維芽細胞を採取し、不死化とリプログラミングによる人工多能性幹(iPS)細胞の樹立を試みている。iPS細胞を樹立後は分化誘導により繊毛細胞への分化誘導を試みる。すでに国内の研究グループが気管繊毛細胞への分化誘導に成功したとする論文発表を行っており、これに習い私は卵管繊毛細胞(卵管上皮細胞)への分化誘導を試みる。このためにまず分化誘導の手技を学ぶとともに、分化誘導因子を同定する必要がある。これに関してはすでに報告されたいくつかの論文及びデータベースによる情報をもとに候補を絞り込む。また、初年度に計画した野生型繊毛の環境による運動制御の解析が未完成であり、この原因が摘出した組織の培養条件にあると考えられる。したがって今後はこの培養条件を検討し、安定した測定・解析環境の確立を目指す。そのためには培養に最適化された条件からスタートするのではなく、生理食塩水やハンクス緩衝液のような無栄養状況を基に、ホルモン試薬や運動制御候補因子を添加し、繊毛運動への影響を測定することが望ましいのではないかと考えている。

このことを受け、計画では2年目の後半に計画していた遺伝子欠損マウス組織と野生型マウスでの繊毛運動の運動評価を実施した。その結果、卵管繊毛、気管繊毛、脳室繊毛の運動に大きな差は認められなかったものの、初期胚の繊毛においては野生型マウスの繊毛が周期的な円運動を行うのに対し、Tgマウスの繊毛は円運動を取らないことが明らかとなった。遺伝子欠損マウスの中には内臓逆位を示す個体が約半数おり、この内臓逆位の原因は初期胚の繊毛の運動異常に起因するものであると考えられる。また、遺伝子欠損マウスの胎仔から胎仔性線維芽細胞を採取、培養し細胞ストックを獲得した。2年目計画にもある「培養細胞の樹立・解析」と「培養細胞でのカルシウム上昇の可視化」といったin vitroの解析系の確立を目指す。当初計画していた野生型マウス組織での繊毛運動制御は初年度達成することはできなかったが、遺伝子欠損マウスの作製及びそこからの細胞取得といった2年目計画の準備はすでに整っている。また当初計画にはなかったが、卵管繊毛だけでなく、脳、気管、初期胚などの繊毛運動について比較することができた。特に野生型マウスと遺伝子欠損型マウスの様々な繊毛の運動を比較した結果、運動に差の生じる繊毛と差の生じない繊毛があることは今後の計画に大きな示唆を与えるもの出会った。具体的には、差が生じる繊毛は1つの細胞から1本の繊毛が生じる単繊毛で円運動を行うのに対し、差が生じなかった繊毛は1つの細胞から複数の繊毛が生えている多繊毛で波打ち運動を行うものであった。このことから運動方向、運動様式が異なるこれらの繊毛は制御機構が異なる可能性が大いに考えられる。今後、野生型繊毛の環境応答を解析する上で、この運動様式には注意したい。以上のことから、当初の計画からやや離れてしまった部分も少なくはないが、多くの知見を得ることができ、初年度としては大いに進展したものと考えられる。今後の研究の推進方策について、まず2年目は計画通りin vitroでの解析系の確立を目指す。すでに野生型マウス及び遺伝子欠損型マウスから胎仔性線維芽細胞を採取し、不死化とリプログラミングによる人工多能性幹(iPS)細胞の樹立を試みている。iPS細胞を樹立後は分化誘導により繊毛細胞への分化誘導を試みる。すでに国内の研究グループが気管繊毛細胞への分化誘導に成功したとする論文発表を行っており、これに習い私は卵管繊毛細胞(卵管上皮細胞)への分化誘導を試みる。このためにまず分化誘導の手技を学ぶとともに、分化誘導因子を同定する必要がある。これに関してはすでに報告されたいくつかの論文及びデータベースによる情報をもとに候補を絞り込む。また、初年度に計画した野生型繊毛の環境による運動制御の解析が未完成であり、この原因が摘出した組織の培養条件にあると考えられる。したがって今後はこの培養条件を検討し、安定した測定・解析環境の確立を目指す。そのためには培養に最適化された条件からスタートするのではなく、生理食塩水やハンクス緩衝液のような無栄養状況を基に、ホルモン試薬や運動制御候補因子を添加し、繊毛運動への影響を測定することが望ましいのではないかと考えている。
美術鑑賞学習におけるデジタルツールを活用した思考の可視化方略の効果と課題

本研究は、美術鑑賞においてデジタルツールを活用して思考の可視化を促す学習方略を開発し、その効果と課題を実証的に考察するものである。具体的には、美術鑑賞プロセスでのグループワークにより、学習者同士が問いや感想、解釈を共有し、作品のメッセージやナラティブをデジタルツールで映像表現することで、学習者の意味生成と思考の深化を促す学習方略を構築する。その効果と課題の検証は、学習者へのインタビューや鑑賞エッセイのテキストデータとショートビデオ映像の分析によって行う。大学生でのパイロット・スタディから、漸次、対象を中等教育の生徒に拡充する。研究成果は、フォーラムの開催と国内外の学会発表により行う。
知的連鎖体験教育プログラムの開発　～データマイニングと知識マップの活用～

発見が次の発見を誘発すること、複数の発見が結びついて新たな発見が導き出されることは、科学の醍醐味である。本研究の目的は、この「知の連鎖」の体験を支援するコンピュータ・ソフトウェアを開発することと、それを用いた教育プログラムを作ることである。開発したソフトウェアは、パソコン上で動作するもので、日本の59地点の気温データを収めたデータ格納部と、そのデータから簡単な操作でグラフを作成するデータ可視化サブシステム、グラフから得られた知見の統合を支援する情報統合サブシステム(知識マップ・システム)から構成されている。このソフトを用いた試行授業の結果、ソフトは使いやすくプログラムは有効との知見を得た。(1)知識マップのルールの作成:発想法・論理学・人工知能等の過去の研究をもとに、気温データの分析に利用可能で、小学校高学年児童でも理解可能と思われる知識マップ作成ルールのプロトタイプをつくった。(2)知識マップの試作:既存のデータマイニング入門教育システムを用いて気温データ内に見いだされるパターン、ならびにパターンとパターンとの間の関係を、前述のルールに基づいて知識マップに描くことを試みた。(3)ルールの見直し:知識マップの上記作成過程を通じて、知識マップ作成ルールを見直し、同ルールの改善を図った。(4)授業構想策定:知識マップをもとに、授業構想をまとめた。この際、知識マップ作成について、初期の計画を再検討した。本研究の開始時点では、学習者各自が知識マップ作成専用のシステムを使用して、それを使って各自で発見体験することを前提としていた。しかしながら、既存のブログシステムを活用すると、クラス内での知識・発見を集約でき、より教育効果が上がるとの指摘を外部から受けた。そこで、学習者がブログで自らの発見や知見をクラス内に伝え、これをもとに新たな発見を引き出す授業を考案した。(5)タブレット端末機種検討:研究当初は、一般的なアンドロイド系のタブレット端末を利用する予定でいた。しかし、多くの学習者が使い慣れているウィンドウズ系のタブレット端末が安価で販売されるようになったこと、小学生の学習専用のタブレット端末が発売されるようになったことから、機種選定をやり直した。(1)知識マップシステムの実装完了:知識マップシステムの設計を完了し、さらに実装も完了した。ただし、OSにはWindowsを採用した。これによりタブレット端末およびパーソナルコンピュータの両方で使用可能なものになった。(2)知識マップシステムへの気温グラフの取り込みと保存機能実現:知識マップシステムには、気温データのグラフも取り込めるようにし、ユーザが発見した事実や推測と、その根拠となるグラフを同時に記録でき表示できるようにした。(3)知識マップシステムでの高次の発見過程記録機能実現:知識マップシステムでは、気温グラフからの1次的発見だけでなく、複数の1次的発見を統合した高次の発見、さらにそれらを統合したより高次の発見をユーザが記録できりようにし、その発見に至る推論過程も記録して事後に追跡できるようにした。(4)知識マップシステムでの報告書作成支援機能実現:知識マップシステムでは、単にユーザによる発見を支援し記録するだけでなく、報告書の作成も支援する機能を付加した。(5)気温データ・グラフ表示システムのデータ最新化:知識マップシステムと連動させて用いる気温データ・グラフ表示システムのデータ更新を完了し、2015年12月31日までのデータを利用可能にした。(6)教員用説明書作成:知識マップシステムを気温データ・グラフ表示システムと連動させて使用して発見を体験するための教員用説明書を作成した。(7)現場教員の意見聴取と授業試行準備:小学校理科専任教員、高等学校理科(地学)教員への上記教材に関する聞き取り調査を行い評価を得た。また、大学生を対象とする授業の準備を完了した。(1)知識マップシステムの設計ならびに実装が完了した。気温グラフの取り込みや推論過程の後追いができる、あるいは報告書作成支援ができるなどの点では、初期の目標を満たすものになった。ただし、機能が増えた分だけ操作が複雑化した。検討が必要である。(2)知識マップで用いる気温データグラフ表示システムのデータを最新のもの(2015年12月31日現在)に更新完了した。利用者(学習者)のモチベーション向上に貢献すると考える。(3)知識マップシステムを気温データグラフ表示システムと連動させて使用して発見を体験するためのユーザへの説明書が完成した。ただし、知識マップシステムの機能が多いため説明書も若干ページ数の多いものとなってしまった。(4)上記教材に関する小学校理科専任教員、高等学校理科(地学)教員等への聞き取り調査を行い評価を得た。高等学校では知識マップシステムが利用できるのではないかという感触を得た。(5)上記教材を用いた大学生対象授業の準備が整った。受講者からのフィードバックが期待される。(1)大学生を対象とした実証授業の実施:大学生を対象に、気温データ・グラフ表示システムと知識マップ・システムを統合した教材を用いて、実証授業を2回実施した。第1回目の授業では、主としてマニュアルの可読性と操作の難易についての検証を行い、第2回目の授業においては、知識マップを用いた発見体験授業プログラムについての受講生の評価を得ることに主眼を置いた。その結果、1受講者にとってシステムの操作は容易なものであり、マニュアルを見て簡単に操作を習得できることが分かった。ただし、2当初用意した習熟用のトレーニングの量が受講生に過重であり、負担を感じさせるため、整理し簡略化する必要があることも分かった。一方、3発見体験に関しては、グラフが容易に作成できること、大量のデータを利用できることなどから、受講生が興味を持てたことが分かった。

さらに、4授業後に発表会を開催したところ、そこでの他の受講者の発表に興味が持てたことも分かった。他の学生の持つ、自分と異なった視点が関心を呼んでおり、発表会の重要性も確認できた。(3)授業プログラムの改良:上記の実証授業の結果を受けて、授業プログラムの中のシステム操作習熟のためのトレーニングを簡易化し、受講者の負担感を軽減するようにした。(4)教材システムの改良とデータ更新:実験室内での追検証中、教材システム内で用いられている表示や用語に不適切なもの、分かりにくいものが発見されたので、これらを修正した。さらに、2017年度以降に学習者に関心を持って利用してもらえるよう、最新のデータ(2016年度の気温データ)をシステム内に追加した。発見が次の発見を誘発すること、複数の発見が結びついて新たな発見が導き出されることは、科学の醍醐味である。本研究の目的は、この「知の連鎖」の体験を支援するコンピュータ・ソフトウェアを開発することと、それを用いた教育プログラムを作ることである。開発したソフトウェアは、パソコン上で動作するもので、日本の59地点の気温データを収めたデータ格納部と、そのデータから簡単な操作でグラフを作成するデータ可視化サブシステム、グラフから得られた知見の統合を支援する情報統合サブシステム(知識マップ・システム)から構成されている。このソフトを用いた試行授業の結果、ソフトは使いやすくプログラムは有効との知見を得た。1「知識マップのルールの作成」、2「知識マップの作成とルールの見直し」までは、計画通りに進んだ。ただし、3「授業構想策定」の段階で、ブログシステムを活用して教育効果を上げる案が浮上し、これを取り込むために予定の時間を超過した。また4「タブレット端末の機種選定」に関し、前述のとおり、新たな機種が多数発売されたため、予定より時間を要した。この結果、平成26年度末に完成予定であった、タブレット端末用データマイニング入門システムの設計完了が、平成27年度にずれ込み、業者への実装発注も平成27年度にずれ込んだ。ただし、3と4の遅れは、研究上の問題発生が原因ではなく、より選択肢が広がったことによるものであり、またタブレット端末に新機種を採用することで、システム開発・実装の期間が短縮できる見込みである。この結果、現在の遅れは、今後の研究進行の大きな妨げにはならないと考える。(1)学校現場での実際の教育への利用を通して、システムならびに付帯教材の評価を行う。特に、1操作の難易度、2説明書の分かりやすさ、3発見体験の容易さや楽しさ、4科学的発見への興味・関心の向上について調査する。(2)上記評価の結果からシステムならびに付帯教材の改良を行う。特に1操作の容易さ、2説明書の分かりやすさに重点を置く。(3)成果を学会等で報告し、評価を受ける。
分子運動性超分子の異方性スキャホールドによる歯根の安定保持可能な歯周組織の再生

ポリロタキサンは多数の環状分子を線状高分子が貫通した超分子構造体であり、その構造特性として環状分子が線状高分子鎖に沿って運動する分子運動性が期待される。これまでにこのポリロタキサンを被膜した表面の分子運動性調節によって間葉系幹細胞や線維芽細胞、血管内皮細胞、骨芽細胞、肝臓細胞の細胞機能操作に成功している。そこで本研究課題では硬組織と軟組織とから構成される歯周組織の再生を目的として、分子可動性を賦与した3次元ポリロタキサン細胞接着足場を構築するとともに、生体内における複合組織の再生基盤技術の確立に取り組む。平成30年度は、骨再生に有利なアテロコラーゲンと歯肉組織の再生速度を調節し得るポリロタキサンゲルを組み合わせた新たなゲルを設計および作製した。このゲルは、片方の面にポリロタキサンゲル、もう一方の面にアテロコラーゲンゲルを配しており、ポリロタキサンゲルとアテロコラーゲンゲルとの界面を相互侵入網目(IPN)化することで2種類の異なるゲルを連結させた構造をもつ。具体的な作製方法として、はじめにα-シクロデキストリンの空洞部を貫通したポリエチレングリコール鎖の両末端をビニルベンジル基で封鎖した後、α-シクロデキストリン部位にメチル基を導入しポリロタキサン架橋剤を合成した。その際、α-シクロデキストリンの仕込み量によって、α-シクロデキストリン貫通数を調節した。任意の濃度に調整したポリロタキサン架橋剤およびアクリルアミドの水溶液をアテロコラーゲンゲル上に展開し、境界面を膨潤させた後、ラジカル重合を行うことによってポリロタキサン/アテロコラーゲンゲルを作製した。現在、このゲルのそれぞれの面における線維芽細胞の細胞接着性・伸展性・増殖性を評価している。骨再生を促すアテロコラーゲンゲルと歯肉再生を調節し得るポリロタキサンゲルを組み合わせた相互侵入網目構造ゲルを細胞接着足場として作製することに成功した。また次年度にむけてモデル動物やヒト歯周組織由来細胞の準備などもすすめており、おおむね順調に進展していると判断した。現在、歯周組織の一部を外科的に切除したモデルマウスの作製をすすめている。同時に、ヒト歯周組織由来間葉系幹細胞の採取および培養を行っている。今年度は、それらの動物や細胞を用いてポリロタキサン/アテロコラーゲンゲルが歯周組織再生に与える効果について評価を行う。ポリロタキサンの分子可動性が歯肉細胞の再生速度に与える影響についても、細胞形態、増殖速度、産生タンパク質の観点から評価を行う予定である。ポリロタキサンの特徴は線状高分子鎖が多数の環状分子の空洞部を貫通した機械的な連結にあり、環状分子は線状高分子鎖に沿って自由自在に回転・滑動する性質(分子運動性)が期待される。これまでにポリロタキサンを基盤としたバイオ表面の分子運動性調節によって細胞機能が操作できることを報告している。本研究課題では、歯根膜と骨様組織とから構成される歯周組織を再生するための基盤技術を確立するために、軟組織と硬組織間で分子運動性が傾斜分布したポリロタキサンゲルを細胞接着足場として構築することを目的としている。平成28年度は、環状分子であるシクロデキストリンを貫通した線状高分子であるポリエチレングリコールの両末端にシンナモイル基を修飾したポリロタキサンを合成した。シンナモイル基は、紫外光を照射によって二量化し、分子間を架橋することが知られている。そこでシンナモイル基の光二量化反応を利用したポリロタキサンゲルの作製を試みた。しかしながら光照射時間およびポリロタキサン濃度条件について検討したものの、得られたポリロタキサンゲルは十分な強度を得ることができず足場として成型加工することが困難であった。そこでポリロタキサンのポリエチレングリコール鎖両末端にビニルベンジル基を修飾したポリロタキサン架橋剤を設計し、水溶性モノマーとの共重合によるポリロタキサンヒドロゲルの構築を試みた。具体的には、過硫酸アンモニウムおよびtetramethylethylenediamineを用いたアクリルアミドとの共重合によって新たなポリロタキサンヒドロゲルの作製を行った。この開始剤濃度およびポリロタキサン架橋剤濃度を調節することによって足場として成形加工可能なポリロタキサンゲルの構築に成功した。当初設計していたポリロタキサンヒドロゲルにおいて十分な強度が得られなかったため、その再設計が必要となり、想定していた実験計画に遅れが生じた。そこでポリロタキサン架橋剤を改めて設計し直し、迅速に合成に取り掛かることによって成形加工可能なポリロタキサンゲルを期間内に作製することができたため、おおむね順調に伸展していると判断した。これまでにこのポリロタキサンを被膜した動的表面の分子運動性調節によって細胞機能が操作できることを報告している。本研究課題では、分子運動性が傾斜分布したポリロタキサンゲルを細胞接着足場として作製し、硬組織と軟組織とから構成される複合組織である歯周組織の再生基盤技術を確立することに取り組む。平成29年度は、ポリロタキサン架橋剤を主成分としたヒドロゲル上における細胞機能応答について解析を行った。ポリロタキサンヒドロゲルを用いて線維芽細胞の培養を行ったところ、細胞の初期接着性が究めて低く、僅かに接着した細胞は分子運動性調節に関わらずその伸展がほとんど認められなかった。そこで細胞接着を促すウシ血清タンパク質やフィブロネクチンをゲル表面にコーティングすることを試みたが、細胞接着性の改善には至らなかった。

そのため新たなポリロタキサン架橋剤としてシクロデキストリン部位に細胞接着性ポリペプチドであるアルギニン-グリシン-アスパラギン酸(RGD)モチーフを修飾したRGD-ポリロタキサン架橋剤を設計・合成した。このRGD-ポリロタキサン架橋剤を用いてヒドロゲルと作製したところ、細胞の初期接着性および伸展性が向上した。RGDモチーフを修飾していないヒドロゲルにおいてほとんどの細胞が接着しなかったことから、RGD-ポリロタキサンヒドロゲル上の細胞は分子運動するシクロデキストリンのRGDモチーフを介して接着しており、ポリロタキサンの分子運動性が直接的に細胞へ伝達されることが期待できる。ポリロタキサンにRGDモチーフを修飾することによって、分子運動性調節による細胞機能操作が高く期待されるポリロタキサンハイドロゲルの作製が可能となったため、おおむね順調に進展していると判断した。ポリロタキサンは多数の環状分子を線状高分子が貫通した超分子構造体であり、その構造特性として環状分子が線状高分子鎖に沿って運動する分子運動性が期待される。これまでにこのポリロタキサンを被膜した表面の分子運動性調節によって間葉系幹細胞や線維芽細胞、血管内皮細胞、骨芽細胞、肝臓細胞の細胞機能操作に成功している。そこで本研究課題では硬組織と軟組織とから構成される歯周組織の再生を目的として、分子可動性を賦与した3次元ポリロタキサン細胞接着足場を構築するとともに、生体内における複合組織の再生基盤技術の確立に取り組む。平成30年度は、骨再生に有利なアテロコラーゲンと歯肉組織の再生速度を調節し得るポリロタキサンゲルを組み合わせた新たなゲルを設計および作製した。このゲルは、片方の面にポリロタキサンゲル、もう一方の面にアテロコラーゲンゲルを配しており、ポリロタキサンゲルとアテロコラーゲンゲルとの界面を相互侵入網目(IPN)化することで2種類の異なるゲルを連結させた構造をもつ。具体的な作製方法として、はじめにα-シクロデキストリンの空洞部を貫通したポリエチレングリコール鎖の両末端をビニルベンジル基で封鎖した後、α-シクロデキストリン部位にメチル基を導入しポリロタキサン架橋剤を合成した。その際、α-シクロデキストリンの仕込み量によって、α-シクロデキストリン貫通数を調節した。任意の濃度に調整したポリロタキサン架橋剤およびアクリルアミドの水溶液をアテロコラーゲンゲル上に展開し、境界面を膨潤させた後、ラジカル重合を行うことによってポリロタキサン/アテロコラーゲンゲルを作製した。現在、このゲルのそれぞれの面における線維芽細胞の細胞接着性・伸展性・増殖性を評価している。骨再生を促すアテロコラーゲンゲルと歯肉再生を調節し得るポリロタキサンゲルを組み合わせた相互侵入網目構造ゲルを細胞接着足場として作製することに成功した。また次年度にむけてモデル動物やヒト歯周組織由来細胞の準備などもすすめており、おおむね順調に進展していると判断した。平成28年度に、作製したポリロタキサンヒドロゲルを用いて生体外(in vitro)での細胞機能応答について解析を行う。
表面波モードマイクロ波大口径プラズマの生成と制御

次世代のサブミクロンプロセス用プラズマとして、筆者が先に極微量元素分析用に研究開発した、表面波モードのOkamoto cavity(USA patent:No.4933650,Ana1.Sci.,7(1991)283)を大型化して(H面を拡大;26.4cm,E面を縮小;0.8cm)、外部磁場を用いることなく、低圧(≧10^<-3>Torr)で、cut-off密度以上の高密度(≧10^<12>/cm^3)で低温(≦3eV)の大口径(20cm)の静かで安定したプラズマを生成することに成功した。すなわち、プラズマはこのcavityにマイクロ波電力(2.54GHz,1kW)を供給して放電管(直径:16cm,石英)内に生成し、プロセスチャンバー(40x40x20cm^3,ステンレス)内に拡散させた。放電管はcavityの中央にE面方向から挿入するとともにチャンバーに接続し、こられの内部をターボ分子ポンプを用いて排気した(10^<-6>Torr)。プラズマ(今回はアルゴン)の発光スペクトルと物理量(電子密度や温度など)の空間分布の測定には、分光器(200-900nm)とプローブを用いた。プラズマは、3-100mTorrの範囲で安定に生成することができた(400-800watt)。プラズマ生成部から10cm下流の軸上で電子密度は3.5x10^<11>/cm^3,電子温度は3.2eV,イオン電流密度は21mA/cm^2,均一性は±5%で直径14cmが得られた(4mTorr,700wattのとき)。さらに下流で、より大口径(20cm以上)で均一なプラズマの得られる可能性があり、プロセス用プラズマとして有望であることが明らかになった。
軸鞭毛遺伝子の解析によるボレリアの進化遺伝学的研究

ライム病ボレリア媒介性のシュルツェマダニ、野鼠血液および野鳥寄生のシュルツエマダニから分離培養したボレリアの分子生物学的性格付けをおこなった。5株のボレリアはずべて38kDaの鞭毛蛋白を有し、これはライム病ボレリアの41kDa蛋白に較べて分子量が小さく、回帰熱ボレリアに近いものであった。そのうちの一株の鞭毛遺伝子をクローンして塩基配列を明らかにし、ライム病、回帰熱ボレリアの鞭毛遺伝子の配列とそれぞれ比較したところライム病ボレリアとは83%、回帰熱ボレリアとは91%の相同性を示した。さらにリボソームRNA遺伝子の構成も回帰熱ボレリアと一致し、制限酵素切断点の配列もよく保存されていた。ついで、この分離株のG+C含量を高速液体クロマトグラフィーにより測定してボレリア属細菌のG+C含量と一致する(2830%)ことを確認した。さらに回帰熱ボレリアおよびライム病ボレリアとのゲノムDNA hybridizationを行って互いの相同性を検討した。現在までにライム病ボレリアは3種が報告されているがすべての種との相同性は10%以下であり、回帰熱ボレリアとの相同性も50%以下であった。これらすべての実験結果はこの分離株がボレリア属の新種であることを示している。さらに16S rRNA遺伝子の塩基配列も決定し、他のボレリアと比較したところライム病ボレリア種とは95%、回帰熱ボレリアとは97%の相同性が確かめられた。この結果も我々の分離したボレリアが新種であることを支持していた。以上の結果から、このボレリア種は回帰熱ボレリアに近い起源をもちながら、ライム病ボレリア媒介マダニに寄生するように適応した結果、ここで明らかにしたような分子生物学的性質を有するようになったと考えられた。
不死化ヒト肝細胞を用いたハイブリッド型人工肝臓の作製

【目的】初代培養肝細胞を用いたハイブリッド型人工肝臓の研究開発が進んできている。しかし初代培養肝細胞は、通常の培養条件では数週間程度しか維持させることができず、次々と死滅していく。また初代培養肝細胞は安定供給も難しく、これらのことが初代培養肝細胞を用いたハイブリッド型人口肝臓作製にあたっての大きな制限となっている。私は、アデノウイルスベクターを用いるとラットおよびサルの初代培養肝細胞にSV40初期遺伝子を導入、形質転換させ得ること、長期培養、不死化さらに大量培養が行えることを見いだした。今回同様の方法によりヒト肝細胞の不死化(平成9年度)およびこれを用いたハイブリッド型人工肝臓の作製を試みた。【方法・結果】1.組み替えウイルスベクター感染後のSV40T抗原一過性発現率はMOI(multiplicity of infection)に依存性であった。2.組み替えウイルスベクター感染後の形質転換コロニー形成率は10^6個に対して約100個の形質転換コロニーが出現した。3.長期継代培養と不死化:形質転換コロニーを6ヵ月以上長期継代培養し不死化したと考えられる肝細胞は18ヵ月以上良好に増殖している。4.Urea合成能およびチロシンアミノトランスフェラーゼ(TAT)活性は長期継代培養していくと経時的に低下していくことが判明した。5.SCIDmouseへの移植によりこの不死化肝細胞が癌化しないことを確認した。6.poly-N-p-vinylbenzyl-β-D-lactonamide(PVLA)修飾シャーレ上での3次元培養を試みた。PVLA修飾シャーレ上での単層培養は安定し行えているが、3次元培養は安定して行えていない。これには密度の問題が関与していると考えられる。至適3次元培養の条件を検討中である。【結語】単層培養では経時的に肝細胞機能が減弱していくことが平成10年度の研究で明らかとなった。このため今後は、機能をよりよく温存する可能性が高い高密度3次元培養を用いたハイブリッド型人工肝臓の作製を試みたい。目的初代培養肝細胞を用いたハイブリッド型人工肝臓の研究開発が進んできている。また、初代培養肝細胞は安定供給も難しく、これらのことが初代培養肝細胞を用いたハイブリッド型人工肝臓作製にあたっての大きな制限となっている。私は、アデノウイルスベクターを用いるとラットおよびサル初代培養肝細胞にSV40初期遺伝子を導入、形質転換させうること、長期継代培養、不死化さらに大量培養が行えることを見いだした。今回同様の方法によりヒト肝細胞の不死化(平成9年度)およびこれを用いたハイブリッド型人工肝臓の作製を試みたい。方法および結果1.組み替えウイルスベクター感染後のSV40T抗原一過性発現率:ヒトアデノウイルス5型のE1A、E1B遺伝子を複製能欠損SV40初期遺伝子と組み替えたアデノウイルスベクターを種々のMOI(multiplicity of infection)でヒト初代培養肝細胞に添加し37°Cにて2時間培養、さらに48時間培養後にエタノール固定し、抗SV40T抗原抗体を用い免疫染色を行った。T抗原陽性率はMOI 100では約20%、MOI 10では約4%、MOI 1では0.5%以下であり、MOIに依存性であった。