hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
口腔癌患者のToll様受容体関連遺伝子の包括的解析と個別的免疫療法の開発

癌治療において免疫療法が注目されているが、どのような免疫療法剤をどのような患者にしようするべきか、その基準は未だ不明である。我々は口腔癌患者の免疫細胞の遺伝子を検索することにより、各種免疫療法剤の効果が見込める患者、見込めない患者の選択基準の確立に寄与するデータが得られた。さらに、これらのデータは、効果が見込めない患者における対処法の確立にも寄与すると考えられる。癌治療において、副作用が少なく放射線や化学療法剤に抵抗性を示す癌腫にも効果があるとして免疫療法が注目されている。さらに、癌免疫療法剤の効果発現に、Toll様受容体(Toll-like receptors: TLRs)が重要な役割を演じている事も明らかになった。本研究において、我々は、口腔癌患者における、TLRシグナル関連遺伝子群について、網羅的に検索し、各種免疫療法剤(Biological response modifier: BRM)に対する反応性、治療効果と比較検討し、TLRシグナル関連遺伝子発現profileを基準とした、個別的免疫療法の確立目指す。初年度は、13名の健常人ならびに33名の治療前の口腔癌患者由来末梢血単核球(peripheral blood mononuclearcell: PBMC)において、TLR関連遺伝子の解析を行なった。13名の健常人では、すべてTLRシグナルは正常であったのに対し、口腔癌患者の中には、幾つかのTLR関連遺伝子の欠如(TLR2, TLR4, TLR9, MD-2)に伴い、下流のシグナルの不活化(転写因子NF・κB、IRF3の不活性化、MAPK群のリン酸化の低下)が認められた。In vitro実験結果より、TLR4(-)あるいはMD-2(-)患者のPBMCは、免疫療法剤OK-432の活性成分であるリポタイコ酸関連標品OK-PSAに反応せず、TLR2(-)患者PBMCはBCG細胞壁分画(BCG-CWS)に、TLR9(-)患者PBMCはCpG-ODNに反応せず、Th1型サイトカイン(IFN-γ, IL-2, IL-12, IL-18)を産生せず、細胞障害活性も発現しない傾向にあった。これらの結果は、過去の、我々および他施設からの報告と矛盾しない。免疫療法剤を含めた治療(放射線+免疫療法剤、化学療法+免疫療法剤、樹状細胞療法+免疫療法剤)治療を終了した患者については、治療効果においても同様、TLRシグナルの保存された患者様において良好な治療効果が得られる傾向にある。我々はさらに動物実験系を立ち上げた。前実験の結果、中和抗体やsiRNAによって、TLRシグナル伝達系、特にTLR4のシグナル伝達経路をブロックした場合は、OK-432、BCG等による抗腫瘍免疫活性は発現されず、これらの薬剤による抗腫瘍効果も認められなかった。この結果をもとに、19年度の実験として、TLR2、TLR4、TLR9、MD-2あるいはMyD88遺伝子を欠失させたノックアウトマウスを用いて、これらの分子とBRM製剤の治療効果との関連性を検討するモデルを確立し、実験進行中である。癌治療において,副作用が少なく放射線や化学療法剤に抵抗性を示す癌腫にも効果があるとして免疫療法が注目されている。これまでの研究において,我々は,癌免疫療法剤(BRM)の効果発現に,Toll様受容体(Toll-like receptors:TLRs)を介したシグナル伝達系が重要な役割を演じている事を強く示唆する結果を得ている。本年度は,前年度に引き続き,健常人ならびに頭頸部癌患者の末梢血単核球(peripheral bloodmononuclear cell:PBMC)において,TLR関連遺伝子の解析を行なった。15名の健常人では,すぺてTLRシグナルは正常であったのに対し,50名中9名の口腔癌患者由来PBMCでは,TLR関連遺伝子の欠如(TLR2,TLR4,TLR9,MD-2)が認められ,特にTLR4あるいはMD-2の欠損あるいは発現低下を認めた6症例では,下流のシグナルの不活化(転写因子NF-_κB,IRF3の不活性化,MAPK群のリン酸化の低下)が認められた。50例の口腔癌患者は全て,免疫療法剤OK-432を含む治療を行われているが,TLR4あるいはMD-2の欠損あるいは発現低下を認めた6症例はすべてOK-432が反応せず,良好な治療効果が得られなかった。TLR4あるいはMD-2遺伝子が欠損したノックアウトマウスを用いた動物実験において,野生型マウスでは,OK-432はIFN-γを誘導し,抗腫瘍効果を発現したが,TLR4あるいはMD-2遺伝子ノックアウトマウスにおいては,OK-432はこれらの抗腫瘍免疫活性を示さなかった。In vitro実験において,TLR4あるいはMD-2を欠損したリンパ球にこれらの分子の遺伝子導入を行うことによって,OK-432等の免疫療法剤に対する反応性を獲得し,抗腫瘍免疫活性を発現した。OK-432等の免疫療法剤BRMの活性発現には,特に,TLR4を介したシグナルが重要であり,免疫療法剤に反応しない患者には,これら分子の遺伝子導入が効果的であることが強く示唆された。癌治療において免疫療法が注目されている。

これまでの研究において、我々は、癌免疫療法剤(BRM)の効果発現に、Toll様受容体(Toll-like receptors:TLRs)を介したシグナル伝達系が重要な役割を演じている事を強く示唆する結果を得ている。本年度は、前年度に引き続き、口腔癌患者の末梢血単核球(peripheral blood mononuclearcell:PBMC)においてTLR関連遺伝子の解析を行なった。癌免疫療法剤OK-432を含む治療を受けた口腔癌患者50名中TLR関連遺伝子に異常の無かった44例中23例で腫瘍完全緩解(CR)を認めたのに対し、TLR関連遺伝子の欠如(TLR2,TLR4,TLR9,MD-2)が認められた6例では、CRは0例、全症例が部分緩解(PR)であった。治療前に頸部リンパ節転移を認めた口腔癌患者29例中TLR関連遺伝子に異常を認めなかった23例中12例で放射線+化学療法+免疫療法剤OK-432による治療後リンパ節転移の消失を認めたが、TLRs遺伝子以上を認めた6例で全ての症例で治療後もリンパ節転移が残存していた。TLR関連遺伝子以上が治療効果に重要な影響を及ぼす事が強く示唆された。特にTLR4関連遺伝子の異常が治療効果に強く影響を及ぼしていた。In vitro実験において、アンチセンスオリゴヌクレオチドや中和抗体を用いて、TLRシグナルをブロックすることにおいて、免疫療法剤によるIFN-γ、IL-12等抗腫瘍性サイトカインの誘導やリンパ球の癌細胞殺傷作用が阻害される事も確認した。OK-432等の免疫療法剤BRMの活性発現には、特に、TLR4を介したシグナルが重要であり、免疫療法剤に反応しない患者には、これら分子の遺伝子導入が効果的であることが強く示唆された。
重イオンビ-ムプロ-ブのための負イオン源開発

本研究は、ポテンシャル測定のための重イオンビ-ムプロ-ブへの適用を目的とした重負イオン源を開発し、その特性を調べ、ポテンシャル計測への適用領域を明らかにすることにあった。重イオンビ-ムプロ-ブへの適用する上で重要なことは、1.できるだけ重い重イオンが生成されること2.定常に近い運転ができること(duty factorが1に近い)3.この時、高いビ-ム電流密度が得られること4.ビ-ムのエネルギ-広がりが小さいこと(10ev程度以下)等が考えられる。我々は、プラズマスパタ-型負イオン源の重イオンビ-ムプロ-ブへの適用を考えて、以下に述べる様な研究を行なった。1.中型のプラズマスパタ-型負イオン源を製作し、定常運転で最大のビ-ム電流が得られるよう、負イオン生成のメカニズムを調べた。そのためにin situで負イオン生成電極の仕事関数を測定し、これと生成負イオンビ-ム電流密度との相関を調べた。また。負イオン生成電極の仕事関数を一定に保った条件で、負イオン生成極電圧やイオン源内プラズマと生成ビ-ム電流密度との関係を調べた。2.このイオン源で生成された負イオンビ-ムのエネルギ-スペクトルを測定し、ポテンシャルの揺動測定が可能かどうかを調べた。3.実機加速器への搭載を考え、小型負イオン源を製作し、前段加速実験を行ない、ビ-ム引き出し性能について調べた。4.プラズマスパタ-型負イオン源では、初速度をもってビ-ムがイオン源から飛び出してくるが、この場合のビ-ム引き出し、加速、収束を調べ、システム設計するのための計算コ-ドを作成した。5.現在計画されている大型ヘリカル装置について、そのための重イオンビ-ムプロ-ブに必要なビ-ムエネルギ-等を検討した。また。本研究は負イオンをベ-スとした重イオンビ-ムプロ-ブ法の適用領域を明らかにするために小型負重イオン源を製作その各種特性を調べるものである。まず本年度は内部に負イオン生成電極(表面は金)をもったカスプ型イオン源を製作してAu^-の定常ビ-ムを生成し、ビ-ム電流とイオン源出口でのエネルギ-分散を測定した。又、同時に波長の異なる2種のレ-ザ-入射による光電子電流で生成電極仕事関数を測定し、Au^-電流と仕事関数との相関を調べた。その結果、生成電極に金属セシウム蒸気を塗布し仕事関数を下げる事によりAu^-電流は急激に増大するが、仕事関数が1.5eV以下になると増大傾向に飽和が見られ、その以上セシウム蒸気を塗布すると仕事関数は低いにもかかわらず逆にAu^-電流は減少する事、仕事関数が一定の時は50-200Vの範囲で生成電極電圧が高いほどAu^-電流は増加し、またArプラズムの方がHeプラズマより数十倍生成効率がよい事、ビ-ムのエネルギ-分散は生成電極電圧50ー200Vの範囲で約514eVであり、生成電極電圧が高いほどエネルギ-分散は大きい事がわかった。以上からイオン源出口でのエネルギ-分散はかなり小さく、条件によってはポテンシャルの揺動測定にも適用可能な事、エネルギ-分散とAu^-電流量両方の使用条件を満たすには生成電極電圧、セシウム蒸気塗布量を最適値がある事がわかった。本年度はまた、Au^0、Au^+ビ-ムのプラズマ中での減衰に関しても資料収集、検討を始め、ビ-ムのエネルギ-がMeV領域になるとプラズマ中のイオンによる効果が相対的に大きくなる事が予想されこれらに関するデ-タの不足が判明した。

本研究は、ポテンシャル測定のための重イオンビ-ムプロ-ブへの適用を目的とした重負イオン源を開発し、その特性を調べ、ポテンシャル計測への適用領域を明らかにすることにあった。そのためには定常運転で最大のビ-ム電流が得られることが重要である。本年度は、昨年度製作したプラズマスパタ-型負イオン源において、in situで負イオン生成電極の仕事関数を測定し、これと生成負イオンビ-ム電流密度との相関を調べた。また、負イオン生成電極の仕事関数を一定に保った条件で、負イオン生成電極電圧やイオン源内プラズマと生成ビ-ム電流密度との関係を調べ、負イオン生成のメカニズムをあきらかにした。又、このイオン源を使用して、生成された負イオンビ-ムのエネルギ-スペクトルを測定した。その結果、タ-ゲット電圧が300V以下では、エネルギ-の半値幅(FWHM)は10eV以下であり、ポテンシャルの揺動測定が可能である事がわかった。実機加速器への搭載を考え、小型負イオン源を製作し、前段加速実験を行ない、ビ-ム引き出し性能について調べた。さらに、プラズマスパタ-型負イオン源の場合のビ-ム引き出し、加速、収束を調べ、システム設計するのための計算コ-ドを作成した。現在計画されている大型ヘリカル装置について、そのために重イオンビ-ムプロ-ブに必要なビ-ムエネルギ-等を検討した。
プロテオミクスを用いたＦＧヌクレオポリンのリン酸化による核膜孔制御の解明

核膜孔複合体は約30種類のヌクレオポリンから成り、総分子量125 MDaにも及ぶ超分子構造体である。近年、核膜孔が核ー細胞質間分子輸送だけでなく、遺伝子発現やクロマチン構築にも関与することが明らかになった。従ってヌクレオポリンと相互作用する新規分子を大規模に同定することが重要な課題となっている。研究代表者らは最近、ERK/MAPキナーゼが複数のFGヌクレオポリンをリン酸化することにより、インポーティンなどの輸送運搬体との相互作用を抑制することを明らかにした。本研究では、FGヌクレオポリンと相互作用するタンパク質をさらに検索するため、複数種のFGヌクレオポリンをビーズに固相化し、細胞抽出液からプルダウン法によるアフィニティー精製を行った。そして精製物を直接ゲル化した後、質量分析法によるタンパク質の同定を大規模に行った。その結果、様々な輸送運搬体に加えてDNA修復に関与するDNA結合タンパク質や転写制御に関与する脱ユビキチン化酵素、ヒストンシャペロンなどを同定した。FGヌクレオポリンをあらかじめERKでリン酸化させるとこれらの相互作用は全て抑制された。今後はこれらの相互作用因子について、核膜孔における生理機能とリン酸化による制御機構を明らかにする予定である。また核膜孔が約40 kDa以上の分子に対してバリアとして働く一方、より大きな輸送運搬体を能動的に通過させる分子機構は核ー細胞質間分子輸送の研究分野で最も重要視されている。本研究では、セミインタクト細胞に活性型ERKまたは不活性型ERKを加えて核膜孔でのFGヌクレオポリンのリン酸化状態を操作し、インポーティンやGFP-GFPなどの核内移行をタイムラプス観察した。その結果、FGヌクレオポリンのリン酸化によって核膜孔のバリア機能も輸送運搬体の能動輸送も制御されることが明らかになった。26年度が最終年度であるため、記入しない。核膜孔複合体を構成する約30種類のヌクレオポリンの内、約1/3はFG(フェニルアラニンーグリシン)ヌクレオポリンと呼ばれ、そのFGリピート領域は典型的な天然変性タンパク質の機能を有している。最近研究代表者らは、FGリピート領域がERK/MAPキナーゼによってリン酸化されると輸送運搬体の一つであるimportin-βとの相互作用が抑制されることを示した。本研究では、リン酸化によるFGヌクレオポリンの分子認識能の調節機構とそれによる核膜孔の機能制御をプロテオミクスやイメージングなどの手法を用いて包括的に解明することを目的としている。本年度はまず、FGヌクレオポリンの一つであるNup50に対し、Phos-tagウェスタンブロット法と抗リン酸化抗体を用いた免疫細胞染色により、Nup50上の同一部位がERKのみならず、p38 MAPキナーゼや分裂期キナーゼによってリン酸化されることを見出した。さらにHaloタグタンパク質を付加したNup50の野生型およびリン酸化不能型変異体を細胞内に発現させ、生細胞タイムラプスイメージングを行ったところ、リン酸化不能型変異体を発現する細胞では分裂期への進行が顕著に阻害されていた。またERKによって強くリン酸化されるFGヌクレオポリンであるNup50、Nup58、Nup62、Pom121、Nup153、Nup214およびNup358のFGリピート領域をビーズに固相化し、ERKによるリン酸化反応を行った場合と行わなかった場合で培養細胞抽出液からプルダウンされるタンパク質の変化を検討した。

その結果、importin-βのみならず、importin-7、importin-5、transportin、CRM1、Tap/NXF1、NTF2などの様々な輸送運搬体タンパク質との相互作用がFGヌクレオポリンのリン酸化によって抑制されることが判明した。Haloタグタンパク質を付加したNup50の生細胞タイムラプスイメージングでは、蛍光標識されたHaloタグリガンドの種類を変えることによって、GFPやmCherryなどの様々な蛍光タンパク質を発現する細胞で多重イメージングすることが容易であり、チューブリン、ヒストン、他のヌクレオポリンなどとNup50を同時に観察することで多くの情報が得られている。またFGヌクレオポリンを固相化したビーズによるプルダウンアッセイでは、様々な輸送運搬体タンパク質を再現性よく検出できており、リン酸化による相互作用の制御を予定通り明らかにできた。26年度が最終年度であるため、記入しない。プロテオミクス技術によってFGヌクレオポリンのERK依存的リン酸化部位を大規模に同定・定量するため、安定同位体アミノ酸を用いた代謝標識法(SILAC)を行う。即ち細胞を異なる安定同位体アミノ酸を含む培地で培養した後にERK経路を活性化または阻害し、混合した細胞抽出液を種々のFGヌクレオポリンに対する抗体で免疫沈降する。そして沈降物を酵素消化し、LC-MS/MSによってリン酸化ペプチドの同定と定量を行う。同定したリン酸化部位をアラニンまたはグルタミン酸に置換することにより、リン酸化不能型またはリン酸化模倣型のFGヌクレオポリンを作製し、細胞内に導入する。そして生細胞イメージング観察や下記のセミインタクト細胞を用いた核内移行アッセイを行い、核膜孔のリン酸化制御を明らかにする。核膜孔が約40 kDa以上の分子に対してバリアとして働く一方、より大きな(約100 kDa)輸送運搬体を能動的に通過させる分子機構は核ー細胞質間輸送の研究分野で最も重要な課題である。本研究では、哺乳類培養細胞をジギトニンで処理し、セミインタクト細胞でのin vitro核内移行アッセイを行う。ATPと活性型ERKまたは不活性型ERKをセミインタクト細胞に加えて核膜孔中のFGヌクレオポリンのリン酸化状態を操作し(既に作製済みのNup50の221番目のセリン残基に対する抗リン酸化抗体を用いた細胞染色によってリン酸化状態を確認する)、GFP-importin-βや2xGFPの核内移行をタイムラプス観察によって比較する。
パラメータ最適化法による心室最大エラスタンスEmaxの低侵襲的推定システムの開発

心室の最大エラスタンスEmaxは,心臓のポンプ機能を評価するための良い指標とされており,この量が得られれば虚血性心疾患などの検査や診断に大きく貢献する.しかし,従来Emaxを得るためには心室容積を侵襲的に直接計測する必要があり,これが臨床応用への大きな障害となっていた.本研究では,最近われわれが開発した,心室容積の計測と心負荷の変動がどちらも必要のないEmax推定法,すなわちパラメータ最適化法に基づいた臨床応用可能なEmax推定システムを構築することを目的とした.パラメータ最適化法に必要な計測量は,左心室圧と,心室容積の代わりに用いられる大動脈流量である.本研究で開発した方法では,まず,心臓カテーテル検査において実測した左心室圧と大動脈圧,およびトノメトリ法から計測される橈骨動脈圧に基づき,1心周期における橈骨動脈圧から大動脈圧までのシステムと駆出期における大動脈圧から左心室圧までのシステムを,それぞれ低い次数のARXモデルで表し,これらのモデルの係数パラメータを同定する.次に,これらのARXモデルに非侵襲的計測可能な橈骨動脈圧を入力することで左心室圧を推定する.一方,大動脈流量は,超音波パルスドプラ法で得られる大動脈基部流速波形と大動脈弁輪径から推定する.すなわち,数多く普及している普通の超音波診断装置から出力されるビデオ信号をパソコンに保存し,これを画像処理することによって,駆出期における大動脈流速波形の輪郭を自動的に抽出する.本研究では,以上の2つの方法を用いた左心室圧と大動脈流量の推定量に基づき.パラメータ最適化法によってEmaxを推定するシステムを構成した.現在,本システムのソフトウェア機能の大部分が実現しており,入力モジュールを付加することにより,本システム全体が完成する状況となっている.心室の最大エラスタンスEmaxは,心臓のポンプ機能を評価するための良い指標とされており,この量が得られれば虚血性心疾患などの検査や診断に大きく貢献する.しかし,従来Emaxを得るためには心室容積を侵襲的に直接計測する必要があり,これが臨床応用への大きな障害となっていた.本研究では,最近われわれが開発した,心室容積の計測と心負荷の変動がどちらも必要のないEmax推定法,すなわちパラメータ最適化法に基づいた臨床応用可能なEmax推定システムを構築することを目的とした.パラメータ最適化法に必要な計測量は,左心室圧と,心室容積の代わりに用いられる大動脈流量である.本研究で開発した方法では,まず,心臓カテーテル検査において実測した左心室圧と大動脈圧,およびトノメトリ法から計測される橈骨動脈圧に基づき,1心周期における橈骨動脈圧から大動脈圧までのシステムと駆出期における大動脈圧から左心室圧までのシステムを,それぞれ低い次数のARXモデルで表し,これらのモデルの係数パラメータを同定する.次に,これらのARXモデルに非侵襲的計測可能な橈骨動脈圧を入力することで左心室圧を推定する.一方,大動脈流量は,超音波パルスドプラ法で得られる大動脈基部流速波形と大動脈弁輪径から推定する.すなわち,数多く普及している普通の超音波診断装置から出力されるビデオ信号をパソコンに保存し,これを画像処理することによって,駆出期における大動脈流速波形の輪郭を自動的に抽出する.本研究では,以上の2つの方法を用いた左心室圧と大動脈流量の推定量に基づき.パラメータ最適化法によってEmaxを推定するシステムを構成した.現在,本システムのソフトウェア機能の大部分が実現しており,入力モジュールを付加することにより,本システム全体が完成する状況となっている.心室の最大エラスタンスEmaxは,心臓のポンプ機能を評価するための良い指標とされており,この量が得られれば虚血性心疾患などの検査や診断に大きく貢献する.しかし、従来Emaxを得るためには心室容積を侵襲的に直接計測する必要があり,これが臨床応用への大きな障害となっていた.本研究では,最近われわれが開発した,心室容積を直接計測する必要がなく,しかも負荷変動も必要のないEmax推定法,すなわちパラメータ最適化法に基づいた臨床応用可能なEmax推定システムを構築することを目的とする.パラメータ最適化法に必要な計測量は,左心室圧と,心室容積の代わりに用いられる大動脈流量である.大動脈流量は超音波ドプラ法から非侵襲的に得られるが,左心室圧はカテーテルを心室内に挿入するためかなり侵襲的である.そこで本年度では,非侵襲的計測が容易な橈骨動脈圧から左心室圧を推定する方法を提案した.すなわち,心臓カテーテル検査において実測した左心室圧と大動脈圧,およびトノメトリ法から計測される橈骨動脈圧に基づき,1心周期における橈骨動脈圧から大動脈圧までのシステムと駆出期における大動脈圧から左心室圧までのシステムがそれぞれ低い次数のARXモデルで表すことができることを明らかにした.ここで,1心周期における橈骨動脈圧と大動脈圧の平均値はほぼ等しく,駆出開始時刻の大動脈圧と左心室圧がほぼ等しいという先験的情報を使っている.このARXモデルにより,橈骨動脈圧から左心室圧を非侵襲的に推定できる可能性があることが明かとなった.次年度に残された課題は,本モデルのロバスト性をより多くの症例で確かめることと,本方法を臨床でより使いやすくするために,超音波ドプラ法との同時計測システムを構築することである.

心室の最大エラスタンスEmaxは,心臓のポンプ機能を評価するための良い指標とされており,この量が得られれば虚血性心疾患などの検査や診断に大きく貢献する.しかし,従来Emaxを得るためには心室容積を侵襲的に直接計測する必要があり,これが臨床応用への大きな障害となっていた.本研究では,最近われわれが開発した.心室容積の計測と心負荷の変動がどちらも必要のないEmax推定法,すなわちパラメータ最適化法に基づいた臨床応用可能なEmax推定システムを構築することを目的とした.パラメータ最適化法に必要な計測量は,左心室圧と,心室容積の代わりに用いられる大動脈流量である.本研究で開発した方法では,まず,心臓カテーテル検査において実測した左心室圧と大動脈圧,およびトノメトリ法から計測される橈骨動脈圧に基づき,1心周期における橈骨動脈圧から大動脈圧までのシステムと駆出期における大動脈圧から左心室圧までのシステムを,それぞれ低い次数のARXモデルで表し,これらのモデルの係数パラメータを同定する.次に,これらのARXモデルに非侵襲的計測可能な橈骨動脈圧を入力することで左心室圧を推定する.一方大動脈流量は,超音波パルスドプラ法で得られる大動脈基部流速波形と大動脈弁輪径から推定する,すなわち,数多く普及している普通の超音波診断装置ら出力されるビデオ信号をパソコンに保存し,これを画像処理することによって,駆出期における大動脈流速波形の輪郭を自動的に抽出する.本研究では,以上の2つの方法を用いた左心室圧と大動脈流量の推定量に基づき,パラメータ最適化法によってEmaxを推定するシステムを構成した.現在,本システムのソフトウエア機能の大部分が実現しており,入力モジュールを付加することにより,本システム全体が完成する状況となっている.
薬剤性パーキンソニズムにおけるシナプトタグミンファミリーの関与についての研究

抗精神病薬を内服中に顕著なパーキンソニズムを呈した統合失調症患者を対象に、シナプトタグミンファミリーの遺伝子解析を行ったところ、薬剤性ジストニアを認めた症例において、Synaptotagmin I遺伝子のintron4にヘテロ接合性に新規変異c.-18+47G/Aを認めた。また、解析を進めていく中で、統合失調症症状を呈した22q11.2欠失症候群患者の2症例において、抗精神病薬による薬剤性パーキンソニズムに違いを認めた。統合失調症治療において、神経伝達物質ドパミンに拮抗作用のある抗精神病薬の有効性が確かめられている。有害事象としてパーキンソニズムが問題になるが、その程度には個体差がある。本研究では、シナプトタグミンファミリーの遺伝子変異解析を通して、薬剤性パーキンソニズムにおける個体差発生機構の解明を試みることを目的としている。具体的には、低用量の抗精神病薬を内服中に顕著なパーキンソニズムを呈した統合失調症患者約100名を対象とし、Synaptotagmin IXV遺伝子の上流領域を含めた全エクソンのリシークエンシング解析を行い変異の有無を検討する。申請者は、健常人と抗精神病薬服用中の統合失調症患者からの採血とDNA抽出を部分的に終え、シナプトタグミンファミリーの遺伝子に関するリシークエンシング解析と変異の有無の検討を行い始めている。しかし、未だ特異な変異の発見には至っていない。中には、共通の染色体異常を有しながら統合失調症を発症し、抗精神病薬の有害事象であるパーキンソニズムに個体差が見られた症例群も認めている。今後は、更なるDNAサンプルの収集と共に、シナプトタグミンファミリーの遺伝子の解析を行っていく予定である。Taqman probeを用いた定量的PCR法により、CNV解析を含めた変異解析も行う予定である。また、抗精神病薬の用量や背景にある基礎疾患にも着目しつつ、解析の結果と抗精神病薬の有害事象との関連を検討する。解析には、多大な労力と時間がかかっている。低用量の抗精神病薬を内服中に顕著なパーキンソニズムを呈した統合失調症患者をサンプル対象と設定しているが、他の内服薬や合併症を考慮すると、さらにサンプルを収集する必要があり、研究計画の一部の見直す必要が生じた。そのため、研究の実施は当初の計画に比べてやや遅れている。本研究は、シナプトタグミンファミリーの遺伝子変異解析を通して、薬剤性パーキンソニズムにおける個体差発生機構の解明を試みることを目的としてしている。統合失調症患者で、薬剤性ジストニアを認めた5症例において、Synaptotagmin I遺伝子の上流領域を含めた全エクソンのリシークエンシング解析を行った。そこで、5症例のうち1症例において、Synaptotagmin I遺伝子のintron 4にヘテロ接合性に新規変異c.-18+47G/Aを認めた。同変異はこれまでSNPとしての報告はない。健常者50人(100アリル)においてリシークエンシング解析を行ったが、同部位の変異は認めなかった。同部位の変異によりスプライシング異常を来たし、神経伝達物質に何らかの影響が加わった結果、抗精神病薬による薬剤性ジストニアが発症した可能性が考えられた。これまで、cytochrome P450による代謝における遺伝子多型により、薬の投与に対する有害事象の個体差が生じることが知られていた。その他、薬物トランスポーターに起因した個体差についても研究されている。今回の研究で、プレシナプスの神経伝達物質放出過程における個体差が、抗精神病薬の有害事象の個体差に影響する可能性が示唆された。今後は、更なるDNAサンプルの収集を行いつつ、シナプトタグミンファミリーの遺伝子の解析を進めていく。また、Taqman probeを用いた定量的PCR法により、エクソンの欠失や重複変異の有無についても解析を行っていく予定である。分子精神医学
動的刺激が視覚・聴覚位置判断に及ぼす影響に関する実験心理学的研究

本研究課題では、動的刺激が知覚的判断に及ぼす影響というテーマに関して複数の観点から研究を進めた。具体的には、【a】ダイナミックで複雑な課題を行っているときの視覚的に有効な空間範囲の計測、【b】日常生活を撮影した動画を刺激とした際に起きる時間知覚の変容、【c】動的な刺激を観察中に生じる再認記憶の変化などに関する実験などを行った。【a】に関しては、複雑な課題を行っている時に使用される空間的範囲を測定する方法の有効性を確認した。【b】に関しては、「予測されない視覚刺激の呈示による時間知覚の変容」が、動画中の人の動作等の「区切れ」で生じうることを見いだした。【c】に関しては、予期されない視覚刺激が記憶に与える影響を調べる実験を行い、空間的予測不可能性ではなく時間的予測不可能が影響を持つことを明らかにした。また新たな展開として、聴覚刺激による知覚の乱れ、視覚物体を追跡中の注意の分散などを調べる実験を予備的に行い、視覚時空間における動的刺激の影響が、三次元空間などにも拡張できる可能性などを模索した。本年度は「動的刺激が視覚・聴覚位置判断に及ぼす影響」というテーマの中でも、特に空間的範囲の特定と時間軸への展開に重点をおいて研究をすすめてきた。具体的には、【a】ダウナミックで複雑な課題を行っているときの視覚的に有効な空間を計測する実験と、【b】日常生活で観察されるようなヒトの動きを撮影した動画を刺激としたさいに起きる時間知覚の変容、【c】動的な刺激を観察中に生じる再認記憶の向上に関する実験などを行った。【a】に関しては、視覚的に複雑な課題を行っている時に使用される空間的範囲を特定することを試み、それが実際に測定できることを示した。またその結果を網膜中心座標系と身体中心座標系に展開した。この成果は、国際学会で発表された。【b】に関しては前の研究課題で発見された「予測されない視覚刺激が提示された時に、その時間的近傍のイベントが、その予測されない視覚刺激のタイミングにより近く感じられるという現象」(temporal magnet effect)に基づくものあり、それを日常生活を撮影した動画で調査したものである。その結果、同様の時間知覚の変化が、人の動作等の「区切れ」で生じうることなどを見いだした。この成果は、現在国際誌に投稿中である。【c】に関しては、動的刺激による知覚変化が記憶に与える影響を詳しく調べる実験手法の開発を行った。予備的な実験をは既に終わっており、来年度の研究期間で本格的なデータの収集を行える状況にある。平成22年度は本研究課題「動的刺激が視覚・聴覚位置判断に及ぼす影響」という研究テーマの最終年度にあたるため、今までの研究成果の外部発表に重点を置きつつ、次の研究テーマへの展開を視野に入れた研究を進めてきた。前年度の研究において見いだされた一過性の知覚刺激による空間的・時間的歪みが生起する条件を詳しく調べるなかで見いだされた「予測されない視覚刺激が提示された時に、その時間的近傍のイベントが、その予測されない視覚刺激のタイミングにより近く感じられるという現象」(temporal magnet effect)に関しては、その記憶表象への影響、日常生活での動作を認識する際の分節の影響を詳細に調べ、そのような時間的影響が日常生活の記憶にも反映されることを示唆する結果を得た。さらには予測可能性を空間的予測可能性・時間的予測可能性に分けて調べた所、空間的な予測可能性ではなく、時間的な予測可能性が大きな影響をもつことが明らかになった。加えて、新たな展開として、聴覚刺激による知覚の乱れ、注意を向けて物体を追跡している時の注意の分散の仕方などを予備的に調べる実験を行い、視覚時空間におけるクロスモーダルな影響が存在しうること、また本研究課題で得られた知見を三次元空間に拡張できる可能性などを示唆するデータを得た。これまでの成果は査読付き論文・国際学会などで発表しているが、さらなる解析によって新しい知見が得られた場合には、逐次外部に発表していく予定である。
地域在住女性高齢者における便失禁予防・改善に向けた包括的排泄ケアプログラムの開発

わが国の地域在住高齢者の排便障害に関する研究の動向として、2000年代に入ってから介護予防への取り組みの一環としての尿失禁予防・改善を図る研究が散見されるようになってきた。しかし、尿失禁より発症率は低いものの、一度発症すると高齢者のQOLを著しく阻害する便失禁についての研究は非常に少ない状況にある。そこで本研究は、地域在住女性高齢者における便失禁の現状を把握した上で、便失禁・予防改善にむけた包括的排泄ケアプログラムの開発を行うことを目的としている。地域在住女性高齢者における便失禁の実態を把握するため、平成28年度、平成29年度にA自治体で開催された尿失禁予防講演会の参加者を対象とし、無記名記述式の質問紙調査を実施したが対象者数が少なかったため、平成30年度も引き続き調査を実施した。A市で開催された尿失禁予防講演会において質問紙調査への回答があった40名(平均年齢65.8歳、回収率48.2%)のうち、尿失禁経験者であり、かつ「過去1年間での便失禁の経験があるか」という項目について「経験あり」と回答したのは14名(35.0%)であった。この結果は、尿失禁がある者のうち約12割に便失禁を有する者がいるという先行研究よりも高い値であった。これまで、加齢に伴う骨盤底筋の脆弱化により腹圧性尿失禁発症のリスクが指摘されているが、それのみならず便失禁についても今後策を講じる必要性が高いことが示唆された。合わせて、便失禁発生による生活の支障については【医療機関選択に関する情報の必要性】、【便失禁用衛生用品の不足】、【鬱々とした気持ちを抱える】、【食事の楽しみの低下】など、便失禁に関する情報不足や高齢者のQOL低下への著しい影響が示された。本研究は、地域在住高齢女性における便失禁の現状を把握し、便失禁予防・改善にむけた包括的排泄ケアプログラムの開発を行うことを目的としている。今年度は、便失禁発症に関連する要因を分析する計画であった。平成28年度、平成29年度に便失禁の実態把握を実施したが、対象者数が少なかったため、平成30年度も引き続き便失禁実態把握のための調査を行った。地域在住女性高齢者における便失禁経験者の元々の対象者数が少数であるため、研究協力者の確保に時間がかかっている状況である。これまで、研究対象者を確保するための工夫として、尿失禁予防講演会に参加している地域在住高齢女性は、排泄障害に関する関心が高く、かつ、これまでの実態調査の結果から、尿失禁と便失禁の両方を併せ持つ対象者もいることから、引き続き、各自治体で開催する尿失禁予防講演会参加者に対し、同様の依頼を行い対象者数を増やしていく。加えて、質問紙調査に回答し研究参加への同意を得られた者に対しインタビュー調査を行うことで、便失禁の発症に関連する要因分析、便失禁が女性高齢者のQOLに与える影響及び、対処行動について概念枠組みを行っていく予定である。超高齢社会への対応として、健康寿命の延伸と、高齢者の生活の質(QOL)の向上に焦点をあてた対策が重要である。高齢者の健康寿命やQOLを低下させる要因の1つとして排泄障害がある。この排泄障害の1つである尿失禁については、近年、社会的な関心が高まり、「尿失禁外来」などの専門外来を有する医療機関も増え、マスメディアにも取り上げられるようになったことから、尿失禁の正しい知識が広く一般に認知されるようになってきた。その一方で、便失禁は著しいQOLの低下をもたらすにも関わらず、尿失禁にも増して個人の問題として秘され、その実態は明らかではない。よって本研究は、地域在住高齢女性における便失禁の現状を把握し、便失禁・予防改善にむけた包括的排泄ケアプログラムの開発を行うことを目的としている。平成28年度は、地域在住女性における便失禁の現状を明らかにするために、文献等から検討した。先行研究によると、65歳以上の高齢者の約10%が便失禁の症状を有し、約100万人の便失禁患者がいると推測されている。加えて、尿失禁有病者のうち「Double Incontinence(尿失禁と便失禁の両方の症状がある者)」の症状がある者の割合が約10%であるという調査報告もあった。A市で開催された尿失禁予防講演会に参加した地域在住高齢女性に対し、過去1年間での便失禁の経験の有無を質問したところ、58名のうち13名(22.4%)が「経験あり」と回答した。また、先行研究によると便失禁の原因は加齢、出産、骨盤内臓器に関する手術等による骨盤底筋力の低下、過敏性腸症候群等が指摘されており、行動療法として第1に選択されるのが骨盤底筋体操であった。この結果を踏まえ、次年度はさらに多くの対象者から便失禁の有病率、便失禁の発症に関連する要因を分析するためのデータを収集し、便失禁予防・改善のための効果的な介入方法について検討する。本研究では、地域在住高齢女性における便失禁の現状を把握し、便失禁・予防改善にむけた包括的排泄ケアプログラムの開発を行うことを目的としている。そのため、はじめに、文献等を用いて便失禁の現状を把握したが、地域在住高齢者における便失禁に関する研究はまだ少なく、文献収集に時間がかかった。

加えて、平成28年度には、地域在住女性高齢者における便失禁の現状を明らかにするため、質問紙票を作成し、自記式質問紙調査を行う計画としていたが、対象者地域への依頼が計画通りに捗っておらず、計画にやや遅れが生じている現状である。これまでわが国における排便障害に関する看護研究は、主に寝たきり高齢者や認知症高齢者をはじめとする要介護高齢者を対象とし、排泄ケアの工夫や介護者の排泄ケアに伴う介護負担等をテーマにしたものが多数を占めており、いわゆる一般高齢者を対象とした研究はなされてこなかった。しかし近年では、消化器内科医・外科医を中心として、地域に在住する一般高齢者を対象とした便失禁の治療や保存的療法に関する情報提供がされるようになってきた。また、便失禁という課題の特性上、本邦における疫学調査は数少ないながら、地域在住高齢者の便失禁有病率が約1割であるという報告もある。このように、同じ排泄障害である尿失禁を取り巻く状況と比較してみると、便失禁の研究は端緒についたばかりである。そこで本研究は、地域在住女性高齢者における便失禁の実態と対処行動の現状を把握した上で、便失禁・予防改善にむけた包括的排泄ケアプログラムの開発を行うことを目的としている。研究の第1段階として、平成28年度には地域在住高齢女性を対象とし便失禁の実態を把握したが、対象数が少なかったため今年度も引き続き実態把握を行った。平成29年度にA市で開催された尿失禁予防講演会に参加した地域在住高齢女性を対象とし、無記名記述式の質問紙調査を実施した。教室に参加された58名(平均年齢76.0歳)のうち尿失禁経験者であり、かつ、「過去1年間での便失禁の経験があるか」という項目について「経験あり」と回答したのは14名(31.8%、平均年齢75.3歳)であった。これは、昨年度の対象者の約2割よりも多い割合であった。これらの結果を踏まえ、次年度は便失禁の発症に関連する要因分析を進める予定である。本研究では、地域在住高齢女性における便失禁の現状を把握し、便失禁予防・改善にむけた包括的排泄ケアプログラムの開発を行うことを目的としている。今年度は、便失禁発症に関連する要因を分析する計画であった。研究の第1段階として、平成28年度に便失禁の実態把握を実施したものの、データ数がはるかに少なかったため、平成29年度も引き続き便失禁実態把握のための調査を行った。地域在住女性高齢者における便失禁経験者の数がそもそも少数であるため、研究協力者の確保に時間がかかっている状況である。わが国の地域在住高齢者の排便障害に関する研究の動向として、2000年代に入ってから介護予防への取り組みの一環としての尿失禁予防・改善を図る研究が散見されるようになってきた。しかし、尿失禁より発症率は低いものの、一度発症すると高齢者のQOLを著しく阻害する便失禁についての研究は非常に少ない状況にある。そこで本研究は、地域在住女性高齢者における便失禁の現状を把握した上で、便失禁・予防改善にむけた包括的排泄ケアプログラムの開発を行うことを目的としている。地域在住女性高齢者における便失禁の実態を把握するため、平成28年度、平成29年度にA自治体で開催された尿失禁予防講演会の参加者を対象とし、無記名記述式の質問紙調査を実施したが対象者数が少なかったため、平成30年度も引き続き調査を実施した。A市で開催された尿失禁予防講演会において質問紙調査への回答があった40名(平均年齢65.8歳、回収率48.2%)のうち、尿失禁経験者であり、かつ「過去1年間での便失禁の経験があるか」という項目について「経験あり」と回答したのは14名(35.0%)であった。この結果は、尿失禁がある者のうち約12割に便失禁を有する者がいるという先行研究よりも高い値であった。
アレルギー性鼻炎における樹状細胞活性化因子TSLPの役割

我々は今回,樹状細胞の機能調節に関与が知られ,アレルギー疾患の発症の起点になると考えられているIL-7様サイトカインのThymicstromal lymphopoietin (TSLP)に焦点を当て検討を行い,アレルギー性鼻炎(AR)患者の鼻粘膜では,正常鼻粘膜と比較して,TSLPの発現がmRNAおよび蛋白レベルで亢進していること,炎症性サイトカインやToll-like receptorリガンドの処置により鼻粘膜上皮細胞からTSLPの産生が誘導されること,TSLP処理した培養鼻粘膜上皮細胞とマウス樹状細胞株XS-52では,タイト結合分子の発現が増加することを示した.我々は今回,樹状細胞の機能調節に関与が知られ,アレルギー疾患の発症の起点になると考えられているIL-7様サイトカインのThymicstromal lymphopoietin (TSLP)に焦点を当て検討を行い,アレルギー性鼻炎(AR)患者の鼻粘膜では,正常鼻粘膜と比較して,TSLPの発現がmRNAおよび蛋白レベルで亢進していること,炎症性サイトカインやToll-like receptorリガンドの処置により鼻粘膜上皮細胞からTSLPの産生が誘導されること,TSLP処理した培養鼻粘膜上皮細胞とマウス樹状細胞株XS-52では,タイト結合分子の発現が増加することを示した.我々はこれまで、アレルギー性鼻炎(AR)患者のヒト鼻粘膜上皮において、樹状細胞に鼻粘膜上皮と同様のタイト結合蛋白が発現し、鼻粘膜上皮のバリア機能に影響を及ぼさずに樹状突起を上皮細胞間に延ばし鼻腔内の抗原を受け取る特殊な機構があることを世界に先駆けて報告した。しかし、その制御機構については不明であった。そこで今回我々は、樹状細胞の機能調節に関与が知られ、アレルギー疾患の発症の起点になると考えられているIL-7様サイトカインのThymicstromal lymphopoietin(TSLP)に焦点を当て検討を行い、以下の結果を得た。ARの鼻粘膜では、正常鼻粘膜と比較して、TSLPの発現がmRNAおよび蛋白レベルで亢進していた。また、TSLP高発現群では低発現群と比較して上皮内にLCAおよびCD11c陽性細胞が多数認められた。次に炎症性サイトカインのIL-1β/TNF-αおよびTLR2リガンドのP_3CSK_4処置によりコントロール群と比較して優位に鼻粘膜上皮細胞からTSLPの産生が誘導された。TSLP処理した培養鼻粘膜上皮細胞では、claudin-1、4、7、occludinの発現の増加に加えて、バリア機能の増加が認められた。さらにマウスの樹状細胞株のXS-52細胞ではTSLP処置により、claudin-7蛋白の発現が増加した。AR患者のclaudin-7陽性の鼻粘膜上皮内において、CD11c陽性樹状細胞もclaudin-7を発現していることが確かめられた。この研究成果は、ARにおけるTSLPの役割および鼻粘膜における上皮と樹状細胞のタイト結合の発現調節機構が分かるだけでなく、上皮バリア機能および樹状細胞の活性化を調節することにより抗原侵入を防御する予防および治療薬の効果を増加させるdrugdellverysystemにつながると考えられる。我々はこれまで、樹状細胞の機能調節に関与が知られ、アレルギー疾患の発症の起点になると考えられているIL-7様サイトカインのThymicstromal lymphopoietin (TSLP)に焦点を当て検討を行い,アレルギー性鼻炎(AR)患者の鼻粘膜では,正常鼻粘膜と比較して,TSLPの発現がmRNAおよび蛋白レベルで亢進しており,TSLP高発現群では低発現群と比較して上皮内にLCAおよびCD11c陽性細胞が多数認められること,炎症性サイトカインのIL-1β/TNF-αおよびTLR2リガンドのP_3CSK_4処置によりコントロール群と比較して優位に鼻粘膜上皮細胞からTSLPの産生が誘導されること,TSLP処理した培養鼻粘膜上皮細胞では,claudin-1,4,7,occludinの発現の増加に加えて、バリア機能の増加が認められることを示した.今回さらなる検討により,マウスの樹状細胞株のXS-52細胞ではTSLP処置により,転写因子であるNF-κBを介してclaudin-7蛋白の発現が増加し,AR患者のclaudin-7陽性の鼻粘膜上皮内において,CD11c陽性樹状細胞もclaudin-7を発現していることを確かめた.この研究成果は,ARにおけるTSLPの役割および鼻粘膜における上皮と樹状細胞のタイト結合の発現調節機構が分かるだけでなく,上皮バリア機能および樹状細胞の活性化を調節することにより抗原侵入を防御する予防および治療薬の効果を増加させるdrug deliverysystemにつながると考えられる.
イットリア安定化ジルコニア中の正孔の濃度と移動度の同時決定

イットリア安定化ジルコニアではZrO_2にY_2O_3を固溶させることにより,高温相である蛍石型構造を安定化させている。このとき同時に多量の酸素イオン空孔が生成することになり,酸素イオン導電体となる。電気化学的応用はこの酸素イオン導電性を用いているが,高温かつ高酸素分圧では微少量の正孔による電気伝導が無視できない。本研究では擬定常法により,イットリア安定化ジルコニア中の酸素透過速度を測定し,正孔の濃度と移動度を一つの測定結果から分離して求めた。まず,酸素透過速度を表す速度式を新たに導出した。ここで,P_<02>は密閉したジルコニアるつぼの内側の酸素分圧,P^*=1.01x10^5Pa,tは時間,Fはファラデー定数,Lはるつぼの厚さ,u_hは正孔の移動度,Rは気体定数,Tは絶対温度,Vはるつぼ内の容積,Aは酸素透過に対する有効断面積である。得られた結果からu_hとσ_h(=eC_hu_h)を求め,正孔濃度(C_h)を計算した。その結果,一定酸素分圧における正孔濃度は温度の上昇とともにわずかに減少することがわかった。この傾向はバンドキャップと酸素空孔の生成のエンタルピーの差から説明すべきであることを示唆した。
ホタルルシフェラーゼによるπ空間制御機構の解明

ホタルの黄緑色の発光を触媒するルシフェラーゼは1アミノ酸置換により発光色が変化する。Tyr257, Asn231, Arg220変異体を作成し、構造解析を行い、野生型と比較した。その結果、Tyr257変異体では発光体の疎水性相互作用が弱くなっていた。またAsn231変異体、Arg220変異体ではオキシルシフェリンの水素結合ネットワークが乱れていた。以上のことからいずれの構造においても励起状態のオキシルシフェリンに対し、エネルギーロスを引き起こし、その結果として赤色発光すると考えられた。ホタルルシフェラーゼによる発光反応には古くから2つの謎が知られている。それは(1)量子収率が高いこと、(2)ルシフェラーゼの1アミノ酸置換により発光色が黄緑色から赤色に劇的に変化することである。我々は黄緑色発光の野生型と赤色発光のS286N変異体ルシフェラーゼのX線結晶構造解析から、発光時における構造上の違いを見いだした。この結果、ルシフェラーゼによる発光体オキシルシフェリンの取り囲み方の違いが、得られる励起状態のエネルギーの違いを導き、発光色変化が生じることを明らかにした。そこで本研究ではルシフェラーゼの立体構造、発光スペクトル、量子収率、オキシルシフェリンの構造を相互的に解析し、未だ未解明のさらなる発光色制御機構を明らかにすることとした。本領域研究では新規高次π空間分子の創製が1つの方向性である。すでに生体空間では様々な高次π空間を使った分子が存在するが、未解明の部分が多い。そこでその詳細を理解することは、新規π空間物質の分子設計には非常に有用である。ホタルのルシフェリンールシフェラーゼ反応はπ空間を巧みに利用しており、発光色の制御は励起状態のオキシルシフェリンのπ電子空間における構造状態の違いによると考えられている。そこで申請者はルシフェリンールシフェラーゼ空間の精密構造解析によって、詳細なπ空間制御機構の解明を行い、新規π空間分子の創製に役立たせようというものである。ホタルによる黄緑色の発光反応は、発光基質ルシフェリン、ATP、分子状酸素、そして発光反応を触媒するタンパク質であるルシフェラーゼによる酵素反応である。ここで生成された励起状態のオキシルシフェリンが基底状態に落ちるときに励起エネルギーが光として放出され発光する。この反応における発光の量子収率は約90%であり、現存する発光反応の中で最も発光効率が良い。これは発光体であるオキシルシフェリンとルシフェラーゼが構成されたπ空間の中で巧みに相互作用しあうことにより生じるものであると考えられる。この詳細を明らかにするためには発光反応と立体構造の関係を明らかにすることが必要である。本研究では野生型のルシフェラーゼのみならず。様々な発光色変異体が必要となる。そこで、より迅速にルシフェラーゼサンプルを供給できる実験体制を確立しなければならない。そのためにpColdベクターを用い、His-tagによる1段階の精製によるゲンジボタルおよびヘイケボタルルシフェラーゼの迅速な大量培養・精製系の確立を行った。そしてルミノメーターを用いた発光反応の基礎的な実験を行い、発光反応実験系の確立を行った。この反応における発光の量子収率は約41%であり、現存する発光反応の中で最も発光効率が良い。この詳細を明らかにするためには発光反応と立体構造の関係を明らかにすることが必要であり、野生型のルシフェラーゼのみならず様々な発光色変異体が必要となる,野生型のルシフェラーゼにおいて緑色に光らせるためには活性部位付近で構造変化が必須である。そこでこの構造変化に関わっているTyr257をAlaに変異した変異体を作成したところ、赤色に発光色が変化した。この変異体について発光活性を測定したところ、野生型に比べ約20分の1程度にまで発光強度が減少していた。すでに得られている他の赤色発光変異体において必ずしも発光強度が減少するわけではない。そこでY257A変異体の立体構造決定を行い、野生型、発光強度がそれほど減少しない赤色発光色変異体との立体構造を比較した。その結果、発光体であるオキシルシフェリンを取り囲む程度について、Y257Aが最もゆるく、化学反応によって得られたエネルギーをロスしてしまっていることが示唆された。ホタルによる黄緑色の発光は、酵素であるルシフェラーゼの中で発光基質ルシフェリンとATP、酸素が反応し、励起状態のオキシルシフェリンが生成し、基底状態に戻るときに生じる。

この発光色は不思議なことに酵素であるルシフェラーゼのわずか1アミノ酸を変化させるだけで赤色に変化する。この仕組みを詳細に検討するためには野生型のルシフェラーゼ以外に特徴を持った発光色変異体の研究を併せて行うが必要となる。そこで様々な変異体を作成しその性質を調べたところ2つの興味深い発光色変異体を得ることができた。(1)Y257R変異体は発光色が橙色でその発光スペクトルは595nm付近にピークが1つのものであった。これまでに得られていたゲンジボタル由来ルシフェラーゼの橙色発光変異体は赤色と黄緑色の2ヶ所にスペクトルのピークが存在するものであったため、本当に橙色をメインとして発光する変異体であることから、発光の状態を研究する上では重要である。さらにpHの変化によって発光色が変わらず、ゲンジボタル由来では初めて得られたpH非感受性のルシフェラーゼである。(2)N231A変異体は赤色発光変異体であるが、構造解析を行った結果、野生型の黄緑色発光ルシフェラーゼにおいて生じる構造変化が観測された。この構造変化は黄緑色発光には必須であり、赤色発光で構造変化が捕らえられたのは初めてである。またG326S赤色発光変異体の構造解析も行い、他の赤色発光変異体と同様に構造変化が生じていなかった。G326の位置は活性部位から離れたところにあり、わずかなアミノ酸の違いによる環境の変化が、活性部位付近の動きに影響していることが明らかとなった。ホタルによる黄緑色の発光は、酵素であるルシフェラーゼの中で発光基質ルシフェリンとATP、酸素が反応し、励起状態のオキシルシフェリンが生成し、基底状態に戻るときに生じる。最近この発光色を決定する要因としてオキシルシフェリンのベンゾチアゾール基の6位が脱プロトン化され、さらには水素結合の重要性が示唆されている。しかしこの部分は立体構造から直接ルシフェラーゼのアミノ酸が水素結合しておらず、水を介した水素結合が生じていることがわかっている。この結合に関わっているN231についてAla,Aspへ変異させ、そのスペクトルと立体構造を決定し比較した。その結果、発光スペクトルはほとんど同じスペグトルを示し、立体構造も野生型でオキシルシフェリンとの水素結合に関わっている水分子が2つ観測されなかった。Ala,Aspという全く異なる性質のアミノ酸に変化させているにも関わらず、発光色が変化しなかったことを考えると、rオキシルシフェリンとの水素結合ネットワークが発光色に重要であることが示唆された。またR220A変異体についても発光スペクトルはN231変異体と同じであった。また構造解析の結果、場所はN231変異体とは異なるものの2つの水分子が観測されなかった。このことから水素結合ネットワークは黄緑色発光には必要不可欠な構造であることが判明した。