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法勝寺と諸寺を結ぶ伝承文化圏の研究

若手研究(B)は、『今昔物語集』という一つの宗派に片寄らない仏教説話集の生成の環境を知る為に、現在は、失われた寺院であり、院の発願により建立された宗派のない寺院である法勝寺の蔵書、法勝寺という<場>の復元と諸寺との関係を明らかにしようという目論見で出発した研究である。従来の『今昔物語集』研究では、その構造的な分析と成立圏の問題は別の次元で扱われてきており、殊に成立圏については、興福寺や比叡山といった文化圏が想定され論争されてきた。しかし、申請者は、こうした独自の教学をもたない文化圏として、法勝寺を中心とする六勝寺文化圏を想定した。法勝寺は院政を開いた白河院の御願寺であった。申請者は様々な調査と分析を行い、『今昔物語集』の成立時期には、法勝寺を中心とする院御願の寺院がその他の宗派の寺院との関係において、中核的役割を果たしていた事実があることを発見した。平安時代末の法勝寺をとりまく各宗派の動向は、浄土信仰ひとつとりあげてみても、天台宗のみならず、真言宗の側にも取り入れられていたのであり、世相に敏感な各宗派が似たような学問を形成しつつあったらしいことがうかがわれた。また、栄西のような院と直接結びついた僧が法勝寺と南都の寺院との両方に関わって活躍していたことも知られている。そうした学問上の、あるいは、政治上のネットワークの一つの要として、法勝寺は存在していたことが明らかとなったのであり、今昔物語集の成立がある宗派に偏りを示さないのは、こうした時代背景によるものであることが判明した。今年度は、蔵書目録のなかの奥書から法勝寺の伝来の本、及び、法勝寺について言及した本を拾う作業をした。その為に、手に入る限り、多くの蔵書目録を購入した。また、効率を挙げる為に、コンピュータを購入し、データの保存を行った。収集した資料のうち、特に「今音物語集」と同時代にあたる平安末期のものについて検討し、幾つかの知見を得た。一つは、これまでの研究史では、法勝寺は法会以外の時には実態がない寺とされてきたが、実際には、本の書写を行ったという奥書が幾つも残されており、日常も機能していたという事実である、また、それらの本の書写の奥書から明らかになったのは、法勝寺には宗派を超えた寺院間のネットワークが存在していたということである。具体的には、天台系の寺院である青蓮院、南都興福寺の末寺である清水寺などがあり、特に青蓮院との関係は、長宴の流派の三昧僧を通じて深いものがあることを発見した。このことは、「今昔物語集」のような雑多なものが編纂される社会的背景として重要である。他に、記録と往生伝と「平家物語」から法勝寺に関わる部分を抜き出す作業を行った。そこから、法勝寺に見られる日常的な僧の役割を考察し、法勝寺の僧の社会的位相を明らかにした。法勝寺には、往生伝と関わって、四種三昧僧を住まわせる場が用意されており、台密三昧教の聖教である「三陸抄」が法勝寺三昧僧長実によって書かれている。これらのことは、法勝寺が谷流の四種三昧行の拠点として、名聞利養を捨てる場であると同時に、様々な宗派の連結点の一つとしての役割を果たしていたことを示しているという結論を得た。以上のことを研究会において発表し、論文の形とした。今年度は、蔵書目録のなかの奥書から法勝寺の伝来の本、及び、法勝寺について言及した本のデータを論文の中で公表した。また、昨年から今年にかけて発表された新出資料とそれらとの総合的な考察を行った。中世になると、法勝寺は東大寺の宗性や台密穴太流の円観が大きく関わっていくことになり、ここには、平安時代の末期と同様、宗派を超えた面が見られるということ、また、昨年度、法勝寺には、往生伝と関わって四種三昧僧を住まわせる場が用意されており、台密三昧教の聖教である「三陸抄」が法勝寺三昧僧長実によって書かれていることから、法勝寺が谷流の四種三昧行の拠点として名聞利養を捨てる場であると同時に、様々な宗派の連結点の一つとしての役割を果たしていたことを示しているという結論を得たが、中世においても遁世と三昧流とが法勝寺の特徴として継承されているという知見を得た。これらの知見は、文学の分析においても『平家物語』に登場する法勝寺の僧のモデルを考えるうえで有益であり、また、『太平記』の亡卒の怨霊の供養を行う場として現れる法勝寺の位相を読み解く上で重要な視座となるが、特に、今年度、文学との関係で重点的に取り組んだのは、和歌とそれを詠む場としての法勝寺との関係である。これは、貴族社会と寺院社会という二つの社会と法勝寺との関係を立体的に示すという試みでもある。その結果、法勝寺という場で詠まれた和歌、あるいは、それを詠んだ歌人には、幾つかの特徴が見てとれた。法勝寺において和歌を詠む歌人のグループは、白河院、鳥羽院に関わる貴族、女房達、あるいは、歌林苑に出入りする者達であり、そこで、詠まれる和歌は、花・月・雪という院の御幸(自然の支配を示す行事)に関わる歌題を好むということである。

それの指し示すところは、法勝寺の場が貴族社会において治天の君を象徴する場として機能していたということである。以上のことを論文の形とした。若手研究(B)は、『今昔物語集』という一つの宗派に片寄らない仏教説話集の生成の環境を知る為に、現在は、失われた寺院であり、院の発願により建立された宗派のない寺院である法勝寺の蔵書、法勝寺という<場>の復元と諸寺との関係を明らかにしようという目論見で出発した研究である。従来の『今昔物語集』研究では、その構造的な分析と成立圏の問題は別の次元で扱われてきており、殊に成立圏については、興福寺や比叡山といった文化圏が想定され論争されてきた。しかし、申請者は、こうした独自の教学をもたない文化圏として、法勝寺を中心とする六勝寺文化圏を想定した。法勝寺は院政を開いた白河院の御願寺であった。申請者は様々な調査と分析を行い、『今昔物語集』の成立時期には、法勝寺を中心とする院御願の寺院がその他の宗派の寺院との関係において、中核的役割を果たしていた事実があることを発見した。平安時代末の法勝寺をとりまく各宗派の動向は、浄土信仰ひとつとりあげてみても、天台宗のみならず、真言宗の側にも取り入れられていたのであり、世相に敏感な各宗派が似たような学問を形成しつつあったらしいことがうかがわれた。また、栄西のような院と直接結びついた僧が法勝寺と南都の寺院との両方に関わって活躍していたことも知られている。そうした学問上の、あるいは、政治上のネットワークの一つの要として、法勝寺は存在していたことが明らかとなったのであり、今昔物語集の成立がある宗派に偏りを示さないのは、こうした時代背景によるものであることが判明した。
ESIがもたらす新たな救急看護師の役割拡大に向けた基盤的研究

本研究の目的は熟練看護師が行うEmergency Severity Index(ESI)を用いた緊急度判定精度とその有効性を検証することである。救急医療では増加する受診患者に対して、医師の診察を受ける優先順位を判定する緊急度判定が注目されている。本研究では、この判定を補助するシステムであるESIに注目した。ESIはわが国の救急臨床で運用されている現行の判定基準よりも患者の診察待機時間を減少させる効果が期待できる。私たちは中堅看護師を対象とした教育介入研究(RCT)で、ESIが救急患者への正確な緊急度判定を可能にするという示唆を得た。さらに、ESIは熟練看護師の経験と専門性を活かし、診察待機時間の減少に向けた新たな看護師の活躍の場を拡大することが期待できる。本研究では熟練看護師によるESIを用いた緊急度判定と医療リソースの予測精度を教育介入研究(RCT)で検証し、救急外来における課題の一つである診察待機時間の減少が期待できる。初年度は所属機関での倫理委員会の承認を得た上で、一次教育介入を実施した。尚、本研究は看護師を対象とした臨床試験であるため、公開データベースである大学病院医療情報ネットワーク(UMIN)に登録した。同意の得られた看護師に対して、緊急度判定の一致度、使い易さ、判定時間、検査・処置の予測精度について検証した。その結果、中堅看護師を対象とした結果と同様に、ESIは高い評価者間一致を示し、特に緊急度の高い患者への感度が優れていることが示唆された。その結果を踏まえ、次年度に向けた新たな研究協力施設の募集に向けて、関連学会の交流集会で研究成果の一部を発表し、新たな研究協力施設への依頼を実施中である。次年度は、新たに同意の得られた研究施設での教育介入を実施するとともに、研究成果の論文投稿を実施する。当初の計画に沿って、初年度の目標である一次教育介入を予定通り実施し、緊急度判定の一致度、使い易さ、判定時間、検査・処置の予測精度について検証した。その結果をもとに、二次教育介入施設を調整中である。次年度は、一次教育介入で得られた知見を踏まえて、追加施設での教育介入を実施するとともに、研究成果の論文投稿を実施する。
メリステムにおける核内倍加周期の抑制機構

多くの植物細胞はDNA複製と細胞分裂が交互に起きる細胞分裂周期を経た後、細胞分裂を伴わずDNA複製のみ起こる核内倍加周期に移行する。核内倍加周期への移行は、通常細胞が伸長生長を伴った最終的な分化を開始する時期に起きるため、植物の形態形成を司る重要な過程の一端であると考えられる。本研究ではシロイナズナのメリステムで細胞分裂周期を促進し、核内倍加周期を抑制する分子機構の解明を目指している。私達が解析を進めている新規変異体high ploidy 2 (hpy2)では、茎頂・根端のメリステム領域が縮小し、同時に一部のメリステム細胞が異所的に肥大生長する。今年度行った解析から、hpy2のメリステム領域ではcyclin Bやcyclin-dependent kinase Bを始めとする細胞分裂制御因子の発現量が低下し、メリステム細胞が野生型より早く核内倍化周期に移行することが明らかになった(Ishida et al. Plant Cell 2009)。またHPY2遺伝子がこれまでに未報告のSUMO E3 ligaseをコードしていることを確認し、実際にHPY2がin vivo及びin vitroでSUMO E3 ligaseとして機能することを実験的に示した。さらにHPY2が主にメリステムの分裂細胞で発現すること、またメリステムのパターン形成に関与する転写因子PLETHORAI (PLT1)及びPLT2の下流で機能することを解明した。これらの結果からHPY2によるSUMO化翻訳後修飾機構が、PLT依存的なシグナル経路を介して細胞周期の転換及びメリステムの維持過程を制御することが明らかになった。さらにオーキシンが細胞分裂周期から核内倍加周期への移行過程を調節するというこれまで知られていなかった新規の生理的作用を持つことを明らかにした(Ishida et al. Development 2010)。特にオーキシンの濃度勾配が予測されるシロイナズナの根端メリステムにおいて、TIRIにAUXIIAA-ARF依存的なオ二キシンシグナルのレベルが高いと核内倍加が抑制され、その結果細胞分裂活性が維持されること、一方オーキシンシグナルレベルが低下すると核内倍加周期への移行が促進され、核相の上昇が始まることを解明した。
グローバル化する東アジアにおける包括的安全保障

本年度は、昨年度までの研究を継続するとともに、最終年度にあたり研究の集約と研究書および研究雑誌への論文掲載、また研究集会などにおける報告を主目的とした。各メンバーが執筆した論文については下記のリストを参照されたい。共同研究の成果は立教大学の平和・コミュニティ研究機構が出版している叢書、計3巻での執筆である。各巻の主題は、「コミュニティと平和」「移動するアジア」「ローカル・コミュニティにおける平和政策」であり、2007年度前半の刊行にむけて順調に進捗している。また、シュラーズと五十嵐は、環境問題と女性の政治参加について国会や全国の自治体の女性議員にインタビューを重ねてきた。その成果は日英両語で刊行する予定である。これらの研究にも表れているように、本研究ではグローバリゼーションの影響下における包括的安全保障の諸問題、その理論と実践を研究対象とするとともに、実践の主体として「市民」を想定しているが特徴である。すなわち、ローカルからリージョナル、グローバルの各レベルのコミュニティにおける包括的安全保障の諸問題に取り組むのは、コスモポリタンな価値観を共有し、それらを実現しようとする人々であり、NGOや自治体であるという観点からこの研究を行なってきた。市民の立場からする包括的安全保障の理論構築と実践の分析が、本研究に一貫した視点であった。グローバリゼーションによって変容した東アジアの安全保障の現実を分析し、理論的に整理して、『東アジア安全保障の新展開』(明石書店、2005年4月10日刊行予定)をまとめた。ここでは、環境、ジェンダー、海賊、薬物の密輸、テロリズム、経済関係の安全保障において持つ意義など、グローバリゼーションにともなって顕在化し、伝統的な安全保障では捉えることができない課題について現状を分析し、理論的な整理を試みた。同時に、米国の単独行動主義やアジア諸国における協調的関係の進展など、この地域の国際的な関係の変化を分析した。次に、このような安全保障の変化を、今後どのような方向性によって受け止め、実証的研究を重ね、理論化するかについて、2004年7月に函館でこの地域の安全保障に関する調査を行なった際に開いたセミナーにおいて討論し、「人間の安全保障」に一部共鳴しつつも、これと比較して、より主体性を重視した「市民の安全保障」の方向へ向かって研究を進めて行くこととした。そのために、市民社会的な構造を想定して、NGOや自治体の担当者にヒアリングして、それらの構想やネットワークなどをめぐって討論した。上記のような方向においてさらに研究を進めるために、参加メンバーは理論的・実証的にポイントとなる課題を選んで海外調査を行なった。すなわち、各メンバーが担当分野に関する研究を進めるための資料収集やインタビューを行ない、今後の研究のステップとした。あるいは、海外において開催されたシンポジウム等に出席し、これまでの研究成果を報告し、また他の出席者の報告から知識・情報の収集の機会として役立てた。引き続き、グローバリゼーションの影響下における新しい安全保障の状況分析と理論化をめぐる共同研究を行なっている。本年度初めに出版した、五十嵐暁郎、佐々木寛、高原明生(編著)『東アジア安全保障の新展開』(明石書店)は、その中間報告となっており、グローバリゼーションの影響による安全保障論の転換とその意味、日本における安全保障概念の再検討、新しい安全保障論に照らした今日の日本の試み、東アジアにおける安全保障をめぐる国際的状況の変化、米国の単独行動主義、環境・エネルギーの安全保障論、経済安全保障論、ジェンダーの視点からの安全保障論、テロリズムの理論的考察などを分析、発表した。その後も、東アジアにおける安全保障、国際関係の変化や、この地域の国際関係やそれをめぐる意識についての歴史的な考察、経済的な発展とそれによる全体状況の変化、さらに市民社会における安全保障についての意識などについて、さらに深い考察をめざしている。また、現在の世界で最も注目されている平和研究所であるスペインのバルセロナ自治大学平和文化研究所(escola de cultura de pau:所在地Edifici G6Campus de la UAB 08193 Bellaterra (Cerdanyola del Valles) Barcelona, Spain)の活動に刺激を受け、地域社会や地方自治体、NGOとの連携における平和研究活動について強い関心を持ち、近く共同研究などの活動に取りかかりたいと考えている。

各メンバーが執筆した論文については下記のリストを参照されたい。共同の成果としては、五十嵐と佐々木寛によるオンデマンド授業のビデオ「平和と安全保障」がある。これは、本研究の主題である包括的安全保障の理論にもとついて、理論、日本および東アジアの現状、テロリズムや環境・エネルギー、ジェンダーなどの各論をめぐって論じたものであり、昨秋より立教大学および早稲田大学において授業に供されている。もう一つの共同の成果は立教大学の平和・コミュニティ研究機構が出版している叢書、計3巻での執筆である。各巻の主題は、「コミュニティと平和」「移動するアジア」「ローカル・コミュニティにおける平和政策」であり、2007年度前半の刊行にむけて順調に進捗している。これらの研究にも表れているように、本研究ではグローバリゼーションの影響下における包括的安全保障の諸問題、その理論と実践を研究対象とするとともに、実践の主体として「市民」を想定しているが特徴である。すなわち、ローカルからリージョナル、グローバルの各レベルのコミュニティにおける包括的安全保障の諸問題に取り組むのは、コスモポリタンな価値観を共有し、それらを実現しようとする人々であり、NGOや自治体であるという観点からこの研究を行なってきた。市民の立場からする包括的安全保障の理論構築と実践の分析が、本研究に一貫した視点であった。
身体イメージ彩色図法による精神疾患の早期スクリーニングの研究

自身の身体の状態・感覚に焦点を当て、そのイメージを2枚の身体図に彩色することで心身への気づきを促進し、健康支援を行う心理技法「身体イメージ彩色図法」を開発した。本技法の実施によって、対象者の抑うつ感や疲労感が有意に低減することが確認されているが、本技法では身体イメージの彩色作業を通じて対象者の抱える心身の健康問題・自己イメージが外在化されるため、様々なアセスメントに使用が可能である。このアセスメント機能をうつ症状などの精神疾患のスクリーニングに利用し、身体図の彩色パターンの特徴解析によって未病期を含めた症状の早期発見・早期対応を実現する分析スキームを構築することを目的としている。主な研究業績を以下に示す。(1)うつ症状などの精神疾患の有無や程度と、身体イメージの彩色図のパターンの特徴解析を行った結果、抑うつ状態の身体感覚の可視化ならびに抑うつ状態の軽減・状態不安の低減への有用性が認められた。うつ症状などの精神疾患のスクリーニングや予防的なメンタルケアに役立てる可能性が示された。しかしながら,分析スキームの構築については,十分とはいえず,更なる検討が必要である。(2)ストレスマーカーの唾液アミラーゼを用い、身体イメージ彩色図法の生理的作用の定量的分析を行なった。その結果、唾液アミラーゼ活性が有意に低下し、ストレス低減効果が認められた。(3)身体イメージ彩色図法を用いた発達障害・アレキシサイミアの支援について事例研究を行なった。身体図の彩色を用いた外在化は、対象者の自己客観視の契機ともなり、第三者との情報(状態)共有も容易であった。自己の情動を意識し表現することが困難な者であっても、自己の情動への気づきの促進、および支援が期待できる。(4)モバイル端末を利用した身体イメージ彩色図法システムにより、健康支援への効果的な活用方法とセルフ・トリートメント効果の検証を行った。自身の身体の状態・感覚に焦点を当て、そのイメージを2枚の身体図に彩色することで、心身への気づきを促進し、健康支援を行う心理技法「身体イメージ彩色図法」を開発した。本技法の実施によって、対象者の抑うつ感や疲労感が有意に低減することが確認されているが、本技法では、身体イメージの彩色作業を通じて対象者の抱える心身の健康問題・自己イメージが外在化(可視化)されるため、様々なアセスメントに使用が可能である。このアセスメント機能を、うつ症状などの精神疾患のスクリーニングに利用し、身体図の彩色パターンの特徴解析によって未病期を含めた症状の早期発見・早期対応を実現する分析スキームを構築することを目的としている。初年度である本年度は、(1)身体イメージ彩色図法のデータ収集と症状別彩色パターンの予備的な特徴解析を実施した。対象者の状態・うつ症状などの精神疾患の有無や程度と、身体イメージの彩色図のパターンの特徴解析を行うため、幅広い対象者でフィールドテストを実施し、有効データの調査・蓄積と予備分析を行った。並行して、アウェアネス後の自由記述内容の検討を行った。(2)身体イメージ彩色図法の生理的作用の定量的分析を行なった。身体イメージ彩色図法を実施することで、生理的にどのような影響があるのか、ストレスマーカーの唾液アミラーゼを用い定量分析を行なった結果、唾液アミラーゼ活性が有意に低下し、ストレス低減効果が認められた。(3)モバイル端末を利用した身体イメージ彩色図法システムの検証とデータ収集を実施した。近年その表現力や操作性が飛躍的に向上し、年齢層を問わず社会に広く受け入れられつつあるタブレット型モバイル端末を、紙ベースの従来方式の実施と並行して本研究に利用した。すでに開発済みの試験的システムを本格的に運用し、セルフ・トリートメント効果の検証と、彩色パターン等のデータを集積した。現在までの達成度として、以下の点があげられる。(1)対象者の状態・うつ症状などの精神疾患の有無や程度と、身体イメージの彩色図のパターンの特徴解析を行った。その結果、軽度抑うつ状態の身体感覚の可視化ならびに抑うつ状態軽減支援についての有用性が認められた。また、状態不安の低減効果があることがわかった。(3)身体イメージ彩色図法を用いた発達障害学生の支援について事例研究を行なった。発達障害では自身の心身に対する理解が難しく、問題などへの認識のずれや、ない場合も多い。また、感情などを言葉で表現することが苦手な場合も多い。対象者自身の自己認知や状況把握のためのツールとして、また、支援者が対象者とともに振り返りながら、気づきを得えつつ、支援のヒントを得るためのツールとして、本法の活用ができるのではないかと考えられた。(4)モバイル端末を利用した身体イメージ彩色図法システムの検証とデータ収集を実施し、セルフ・トリートメント効果の検証と、彩色パターン等のデータを集積した。

このアセスメント機能を、うつ症状などの精神疾患のスクリーニングに利用し、身体図の彩色パターンの特徴解析によって未病期を含めた症状の早期発見・早期対応を実現する分析スキームを構築することを目的としている。平成28年度・29年度は、(1)身体イメージ彩色図法のデータ収集と症状別彩色パターンの特徴解析を実施した。対象者の状態・うつ症状などの精神疾患の有無や程度と、身体イメージの彩色図のパターンの特徴解析を行うため、幅広い対象者でフィールドテストを実施し、有効データの調査・蓄積と分析を行った。並行して、身体イメージ彩色図法実施後の自由記述内容の検討を行った。(2)身体イメージ彩色図法が与える精神心理的作用の定量分析を行なった。不安感情レベルによって状態不安の変化に相違が現れるかを検討した結果、高特性不安群・コントロール群とも状態不安が有意に低下した。さらに高特性不安群では不安存在を示唆するネガティブ感情がコントロール群より有意に低下した。(3)ストレスマーカーの唾液アミラーゼを用い身体イメージ彩色図法の生理的作用の定量的分析を行なった結果、唾液アミラーゼ活性が有意に低下し、ストレス低減効果が認められた。(4)モバイル端末を利用した身体イメージ彩色図法システムの検証とデータ収集を実施し、セルフ・トリートメント効果の検証と、彩色パターン等のデータを集積した。現在までの達成度として、以下の点があげられる。(1)対象者の状態・うつ症状などの精神疾患の有無や程度と、身体イメージの彩色図のパターンの特徴解析を行った。その結果、軽度抑うつ状態の身体感覚の可視化ならびに抑うつ状態軽減支援についての有用性が認められた。また、状態不安の低減効果があることがわかった。(2)ストレスマーカーの唾液アミラーゼを用い、身体イメージ彩色図法の生理的作用の定量的分析を行なった。その結果、唾液アミラーゼ活性が有意に低下し、ストレス低減効果が認められた。(3)身体イメージ彩色図法を用いた発達障害学生の支援について事例研究を行なった。発達障害では自身の心身に対する理解が難しく、問題などへの認識のずれや、ない場合も多い。また、感情などを言葉で表現することが苦手な場合も多い。対象者自身の自己認知や状況把握のためのツールとして、また、支援者が対象者とともに振り返りながら、気づきを得えつつ、支援のヒントを得るためのツールとして、本法の活用ができるのではないかと考えられた。自身の身体の状態・感覚に焦点を当て、そのイメージを2枚の身体図に彩色することで心身への気づきを促進し、健康支援を行う心理技法「身体イメージ彩色図法」を開発した。本技法の実施によって、対象者の抑うつ感や疲労感が有意に低減することが確認されているが、本技法では身体イメージの彩色作業を通じて対象者の抱える心身の健康問題・自己イメージが外在化されるため、様々なアセスメントに使用が可能である。
P進 Poincar'e 級数とその応用

各研究分担者は関係図書を購入し関係する研究会に出張、参加し研究仲間と情報を交換し意見を交わした。目的とした研究課題については当初の目的を遂行することが出来た。よく知られているように、Q上の不定符号四元数環から得られる志村曲線はその判別式の因子の素数pに関する完備体Qpまで係数拡大すると、それはPGL_2(Qp)に含まれる適当な数論的不連続部分群Gに対応するMumford Curveとしても得ることが出来る。このとき、一つ一つの保型形式をQp上で個別にidentifyして扱いたいと言う欲求を持つのは自然なことであろう。一つの解答はde Shalit,P.Schneider等によるp-進のEichler-Shi-mura同型である。これはp-進Modular formをGの群としてのcohomologyの元として認識するものであるが、このcohomologyはある意味で(例えば、Gのdeformationに関して不変であるので)弱い構造しか持ち得ない。これを克服する一つの立場はP-進Poincar'e級数を考えることである。我々はp-進Poincar'e級数を定義し、その基本的性質を調べた。一つの基本的な結果はp-進Poincar'e級数のp-進周期はrationalである、ということである。応用としては、判別式が65以下の不定符号四元数環のfull modularの志村曲線についてその(事実上の)方程式を与えた。この際には、計算機を使用することも必要であったが、そのCPU時間は1年を越えた。また、Common Lispと言う計算機言語も有効に用いられた。以上をpreprint“On-p-adic Poincar'e Series and Shimura Curves“としてまとめたので、いずれ投稿する予定である。
頭位変化および頭位変換による視運動性眼振および視運動性後眼振の三次元解析

耳石器が関与していると言われている、垂直方向の視運動性後眼振OKN、視運動性後眼振OKANの上下差に関して検討した。正常成人20名を対象に、正面座位、仰臥位、懸垂頭位で、60°/Sの垂直OKN、step刺激で、OKNの利得gainとOKANの時定数TOsをサーチコイルシステムを用いて眼球運動を記録し、パラメータとした。OKANのgainでは、各頭位で上向き優位であった(p<0.05)。OKANのTCsでは、各頭位で上向き優位(P<0.01)、各頭位間での上下差の変化を見ると正面座位と比べ仰臥位で有意に減少(p<0.05)、これが懸垂頭位でさらに有意に減少していた(p<0.01)。さらに、正常成人4名を対象に重力方向の変化が耳石器に十分に浸透する充分な時間をとるため、正面座位、右45°側臥位、右90°側臥位の各頭位で体位変換1時間後のOKANのTCsをみたが、統計学的に有意差はみられなかった。今回、耳石器に加わる重力方向を変えたことによる上下差の変化を予想したが、各パラメータに上向き優位の方向優位性は確認できたが、減少はみられたものの逆転はみられなかった。また、充分耳石器が重力方向の影響に慣れた後のパラメータには変化はみられなかった。以上のことから、垂直方向OKN、OKANの上下差には、耳石器入力のみならず視覚入力や中枢神経内での再構築など、他の修飾因子の関与が予想された。垂直方向の視運動性眼振(OKN)、後眼振(OKAN)について我々は、正常成人でOKNの利得、OKANの初期速度(IV)および時定数(TCs)を検討した。被験者の頭部に磁場誘導ヘルメットをつけて、被験者の頭位を自由に変換できるようにし、動的な状態でOKANのIV、TCsの変化を解析し、さらに、今回は眼球運動はサーチコイルで記録、三次元でとらえて解析することができるシステムをつくり、重力方向の変化がOKANのIV、TCsに対してどのように現れるかを垂直、水平、回旋の三次元で計測することを目的とした。今年度は、(1)被験者の頭部に装着する磁場発生装置および磁場誘導ヘルメットを開発した。現有の、1)視覚刺激装置(第一医科)、2)眼球運動記録用サーチコイルシステム、3)視覚刺激投影用半球型スクリーンを利用し、被験者の頭部に磁場発生装置および磁場誘導ヘルメットを装着して、被験者の頭位を自由に変換できるようにして、動的な状態で眼球運動の変化を検討した。さらに(2)三次元限球運動記録のため、従来に二次元記録サーチコイルシステムを改良し、三次元記録システムとし、(3)眼球運動の記録、データ解析に、新たに高速で演算処理の可能なパソコンを導入した。尚、被験者として正常成人20名を対象に、垂直方向の視運動性刺激をステップ刺激3090°/Sで与えてOKNの利得を算出、さらに、視運動性刺激の後に暗所にしてOKANを検討した。これらの結果について、第18回日本平衡神経科学会(松本市、信州大学主催)において発表した。
都市化による土壌の化学的性質の変化－特に酸の中和－が都市林の炭素動態に及ぼす影響

都市林周辺の都市化の進行に伴い、都市林土壌の酸が中和され、炭素濃度が高まる傾向にある。本研究は都市化に伴う土壌の酸の中和が、土壌での炭素動態を変化させるしくみを明らかにすることを目的とする。土壌の酸の中和が土壌での有機物動態を変化させ、都市林土壌の炭素濃度を増加させるしくみを解明するために、(1)都市林土壌の酸性が土壌の養分特性に及ぼす影響、(2)土壌の養分特性が植物から土壌に供給される有機物(落葉落枝)の質(分解されやすさ)におよぼす影響、(3)土壌酸性が土壌中で有機物を分解・無機化する微生物の量や活性に及ぼす影響、およびそれらの相互作用について検討する。
自由空間に置かれたメゾスコピック粒子の生成とその状態分析

本研究班の研究課題は、非常に多岐に渡っているが、本年度に得られた主要な成果は以下の通りである。(尚、本研究班の研究会を平成3年11月25、26日(実験系)及び12月24、25日(理論系)に行い、分担者相互の連絡を取るとともに今後の研究の方針についても討議した。研究会の講演要旨は既に小冊子として印刷されている。)1)高密度中性クラスタ-の発生:サイズ選別したクラスタ-イオンを光脱離により中性化し、高密度に収束させる実験を炭素10量体について行った(都立大グル-プ)。その結果、イオン状態よりも中性状態のほうがはるかに高密度化が計れることが確かめられた。今後、装置パラメ-タ-の最適化により、さらに高密度化を実現する。2)トラップによるクラスタ-の閉じ込め:RFトラップによる炭素クラスタ-の閉じ込め実験が開始され、正負イオンの同時閉じ込めが確認された(都立大グル-プ)。3)質量分析法等による多彩な研究:合金クラスタ-の反応性(慶応大グル-プ)、希ガスクラスタ-の振動状態、安定性(東大グル-プ)、金属クラスタ-のス-パ-シェル構造(阪大グル-プ)、金属及び半導体クラスタ-の光物性(神戸大グル-プ)、フラ-レンの単離と物性測定(三重大、都立大グル-プ)等の研究が着々と進んでいる。4)理論的解析(理論グル-プ):超微粒子内の励起子と光学非線型性、クラスタ-のトンネル分光、液体金属超微粒子、超微粒子の構造と動力学、高温超伝導体のクラスタ-理論、超微粒子の統計力学、金属クラスタ-の分裂等について精力的に研究されている。
診療フレーム解析による救急医療の標準化阻害因子とその解決策に関する研究

救急領域では診療の標準化による医療安全への取り組みは他の領域と比較して遅れがちである。このことは救急医療の専門性を可視化し確立する際の障壁となっており、これが非救急専門医が救急医療を敬遠する一因となっている。対象症例が多く、2次救急施設で取り扱われることの多い、来院時に軽症の外傷と判断され経過観察となる症例群を、開発した臨床プロセスチャートを用いて可視化して解析し、他の領域との診療フレーム構造と普遍的に異なる点を明らかにし、併せてそこに潜むリスクを明らかにした。解剖学的傷病名でなく、重症度でエントリーさせるところが従来の診療フローと比較して特徴的であった。さらに集中治療領域において、初療患者でなく、入院患者への診療アプローチ方法の標準化を目指した。既に集中治療中の症例に対する着眼点について、日々の着眼点の蓄積を行った。これを領域ごとにまとめ可視化するプロトタイプを作成した。いわゆるA(気道)B(呼吸)C(循環)D(神経)を部分へのアプローチを完全に可視化する形とし、記載も統一することにより、A-B-C-Dの相互の影響と、アプローチの標準化が可能となった。さらにその中でも非救急専門医に対してAの問題について掘り下げを行ってみると、アプローチの得手不得手の原因が明らかにされた。本年度の研究により経験値が高い者の特徴や、経験値が低い者の陥りやすい点、効率的な教育方法、が明らかになり、医療安全に資すると共に教育効果を上げる手法が開発された。救急領域では診療の標準化による医療安全への取り組みは他の領域と比較して遅れがちで、現状ではインシデント報告の蓄積や確認項目のIT化による改善が試みられているにすぎず、そのため救急医療の専門性を可視化し確立する際の障壁となっている。診療アプローチが他の診療科と異なるため、他診療科スタッフから敬遠されがちで、標準化が困難とされてきた。社会的ニーズが高まっている、特に1-2次救急の診療担当者は、日常は救急以外の様々な専門性で仕事をしている非救急専従医であるが、診療フレームと呼ぶべき思考過程の違いに注目して救急医療の質保証を検討した研究はない。救急診療の専門医と非専門医の診療フレームがどのように異なるか、患者状態適応型パスシステムの臨床プロセスチャートを用いて実診療を可視化したのものを用いて検討した。さらに、DPC様式を用いて診療行為を抽出し、多施設問における標準化診療の比較を試みた。救急領域の中でも集中治療中の病態へのアプローチは特に困難で、集中治療室から非専門医の足が遠のく原因となっているが、これを平易に理解するためのアプローチを標準化の観点から開発した。本年度は、実診療を上記臨床プロセスチャートの各ユニットに書き留め蓄積する作業を進めた。今まで困難であった質の評価が行えた。今後これを用いてリソース消費・配分を解析できる。また、チャートのルートを外れる症例の蓄積はそのままリスクの度合いを表しているため、これを可視化し定量化した上で診療現場に還元できる。救急領域では診療の標準化による医療安全への取り組みは他の領域と比較して遅れがちで、救急医療の専門性を可視化し確立する差異の障壁となっており、これが非救急専門医が救急を敬遠する一員となっている。今年度は、対象症例が多く、2次救急施設で取り扱われることの多い、来院時に軽症の外傷と判断され経過観察となる症例群を、開発した臨床プロセスチャートを用いて解析し、他の領域との診療フレーム構造と普遍的に異なる点を明らかにし、併せてそこに潜むリスクを明らかにした。また、臨床プロセスチャートのユニット間移動(診療ルート)の解析・ベンチマークにより質の評価を行った。すなわち診療ルート解析から急変して呼吸管理が必要になった例、退院調整が長引いた例などはルート解析のみでその割合が判り、これはリスクの度合いそのものである。起こりやすいリスク、陥りやすい事象、経過におけるそれらの時期、対処とその反応、その後の経過を数値的として明らかにした。

これを病-病連携にも応用し、近年社会問題化している救急リソース消費についても解析を行った。さらに今後、集中治療領域における、初療患者でなく、入院患者への診療アプローチ方法の標準化を目指す。このフレーム構造解析から判明した、集中治療中の症例に対する着眼点について、既に蓄積を開始している。これを領域ごとにまとめ可視化すると、経験値が高い者の特徴や、経験値が低い者の陥りやすい点、効率的な教育方法が明らかになる。救急領域では診療の標準化による医療安全への取り組みは他の領域と比較して遅れがちである。このことは救急医療の専門性を可視化し確立する際の障壁となっており、これが非救急専門医が救急医療を敬遠する一員となっている。対象症例が多く、2次救急施設で取り扱われることの多い、来院時に軽症の外傷と判断され経過観察となる症例群を、開発した臨床プロセスチャートを用いて可視化して解析し、他の領域との診療フレーム構造と普遍的に異なる点を明らかにし、併せてそこに潜むリスクを明らかにした。解剖学的傷病名でなく、重症度でエントリーさせるところが従来のパスコンテンツと比較して特徴的であった。本年度はこれまでの結果を受けてさらに、集中治療領域において、初療患者でなく、入院患者への診療アプローチ方法の標準化を目指した。既に集中治療中の症例に対する着眼点について、日々の着眼点の蓄積を行った。これを領域ごとにまとめ可視化するプロトタイプを作成した。いわゆるA(気道)B(呼吸)C(循環)D(神経)を部分へのアプローチを完全に可視化する形をとり、記載も統一することにより、A-B-C-Dの相互の影響と、アプローチの標準化が可能となった。さらにその中でも非救急専門医に対してAの問題について掘り下げを行ってみると、アプローチの得手不得手の原因が明らかにされた。本年度の研究により経験値が高い者の特徴や、経験値が低い者の陥りやすい点、効率的な教育方法、が明らかになり、医療安全に資すると共に教育効果を上げる手法が開発された。
トウゴウヤブカのゲノムの遺伝生化学的研究

この2年間の課題研究で,ヘキソキナーゼ(HK),キサンチン脱水素酵素(Xdh),アルデヒド・オキシダーゼ(Ao), 6-phosphogluconate脱水素酵素の遺伝子座を決定することができた.乳酸脱水素酵素(Ldh), malic enzyme(ME)は完全な, monomorphicであったため,今まで調べた集団系統では,その遺伝子座を決定することはできなかった.さらに別の地域の集団を調べる必要がある.現在までに,決定された遺伝子地図とネッタイシマカ, Ae.scutellarisの地図と比較すると, 3種の進化過程におけるゲノムの変化が著しいことがわかる.形態的に似ている3種の染色体でも,遺伝生化学的に内容に多いに変化が起きたことがあきらかになった.例えば,トウゴウヤブカの性染色体にあるGpi, Odh, Pgm, HK, Idh, Gpdは,ネッタイシマカでは常染色体に存在し,一方, 6Pgdは,トウゴウヤブカ,ネッタイシマカ, Ae.sculellansでは共通して,第3連鎖群に存在する.しかも,ネッタイシマカ, Ae.scuteldarisの場合と異なって,トウゴウヤブカの性染色体には多くの酵素遺伝子座が発見された.このことから,トウゴウヤブカの性染色体は3種の染色体のうち,最も長い染色体であるかもしれない.ヤブカでは,一般に最も短い染色体に性決定遺伝子がのっておるが,トウゴウヤブカはその点,例外的かもしれない.これはFinlaya亜属(トウゴウヤブカが属する)とstegomyia亜属(ネッタイシマカ, Ae.scutellarisが属する)との相違点の一つかもしれない.さらに,多くの遺伝子座を決定することによって,ゲノムの変化が詳しくなるはずであるが,特にトウゴウヤブカの性染色体に焦点をあわせて,今後も追究したい.この2年間の課題研究で,ヘキソキナーゼ(HK),キサンチン脱水素酵素(Xdh),アルデヒド・オキシダーゼ(Ao), 6-phosphogluconate脱水素酵素の遺伝子座を決定することができた.乳酸脱水素酵素(Ldh), malic enzyme(ME)は完全な, monomorphicであったため,今まで調べた集団系統では,その遺伝子座を決定することはできなかった.さらに別の地域の集団を調べる必要がある.現在までに,決定された遺伝子地図とネッタイシマカ, Ae.scutellarisの地図と比較すると, 3種の進化過程におけるゲノムの変化が著しいことがわかる.形態的に似ている3種の染色体でも,遺伝生化学的に内容に多いに変化が起きたことがあきらかになった.例えば,トウゴウヤブカの性染色体にあるGpi, Odh, Pgm, HK, Idh, Gpdは,ネッタイシマカでは常染色体に存在し,一方, 6Pgdは,トウゴウヤブカ,ネッタイシマカ, Ae.sculellansでは共通して,第3連鎖群に存在する.しかも,ネッタイシマカ, Ae.scuteldarisの場合と異なって,トウゴウヤブカの性染色体には多くの酵素遺伝子座が発見された.このことから,トウゴウヤブカの性染色体は3種の染色体のうち,最も長い染色体であるかもしれない.ヤブカでは,一般に最も短い染色体に性決定遺伝子がのっておるが,トウゴウヤブカはその点,例外的かもしれない.これはFinlaya亜属(トウゴウヤブカが属する)とstegomyia亜属(ネッタイシマカ, Ae.scutellarisが属する)との相違点の一つかもしれない.さらに,多くの遺伝子座を決定することによって,ゲノムの変化が詳しくなるはずであるが,特にトウゴウヤブカの性染色体に焦点をあわせて,今後も追究したい.乳酸脱水素酵素(LDH),Malic enzyme(ME)の遺伝子座決定のため、新しい対立遺伝子を探すため、野外集団を5個所から採集した。これら5集団もすべて、実験室集団と同じLdh,Me対立遺伝子だけを保有しておった。従って、Ldh,Me対立遺伝子は現在まで調べた集団では完全なmonomorphicであることがわかった。これらの遺伝子座決定には、さらに、別の野外集団を調査する必要がある。キサンチン脱水素酵素(XDH)については、数種の戻し交配を行った。その結果、第3連鎖群に次の順序で乗っておることがわかった。つまり、bl(bleached pupa)-40 map units-pm(plum eye)-6map units-Xdh。一方、アルデヒド酸化酵素(ALDOX)については、実験は未完であるが、その遺伝子座は性染色体(第1連鎖群)の性決定因子(M/m)から約30 map unitsのところに乗っていることがわかった。ALDOXについてはさらに、実験を続ける予定である。
血小板とフォンウィルブランド因子の相互作用を中心とした血栓形成の制御

血栓は、血小板GPIbと血漿タンパク質であるフォン・ビルブランド因子(VWF)の相互作用が発端となって形成される。本研究では、VWFに特異的に結合してGPIb依存性の血小板凝集を惹起するヘビ毒由来タンパク質のボトロセチン2に着目し、VWFやGPIbとの結合に重要なアミノ酸残基を同定した。さらにGPIbとの結合に関与する2つの塩基性アミノ酸を酸性アミノ酸に置換することで、VWFに結合するが血小板凝集を惹起せず、逆にVWFのによる血小板凝集を阻害する変異体ボトロセチン2の作製に成功した。本研究はVWFを標的としたユニークな抗血栓剤の開発につながる可能性を示唆した。1)ボトロセチン2のVWF及びGPIb結合必須部位の特定cDNAを用いて組換えボトロセチン(rBot2)を発現させ、Ala置換変異導入ボトロセチンの、固相化したVWFとGPIbに対する結合能をDot-blot法やELISA法を用いて解析した。これまでの先行研究で、α鎖のGluα107、β鎖のAspβ70、Aspβ88、Argβ115、Lysβ117などのアミノ酸残基をAlaに置換した5種類の変異体rBot2は血小板凝集誘起活性が低下することを見出している。これらのうち、Aspβ70、Aspβ88、Gluα107のAla置換変異体でVWFとの結合活性の低下がみられた。またArgβ115、Lysβ117の各変異体ではグリコカリシンとの結合活性が低下していた。一方、GPIbのN末端側に接触すると予想して調製したGluα48、Aspα50、Lysα108、Aspα109、Leuβ59、Lysβ60のAla置換体などは、野生型と同じ血小板凝集惹起活性を示した。これらの結果から、rBot2を構成するアミノ酸残基のうち、Aspβ70、Aspβ88、Gluα107はVWFとの結合に、Argβ115、Lysβ117はGPIbとの結合に関与するものと推定された。2)抗血栓性ドミナントネガティブ・ボトロセチンの作製Argβ115、Lysβ117の変異体がVWFとの結合能はそのままに、GPIbとの結合能が低下していたことから、さらにこれらの塩基性残基を酸性アミノ酸に置換することでより強い反発が観察されることを期待して、逆荷電のGluに置換した変異体を作製した。このダブル変異体はVWFとの結合能は変化しなかったが、血小板凝集惹起活性は示さず、さらにリストセチンによる血小板凝集を濃度依存的に阻害した。この結果から、VWFに特異的に結合しGPIb依存性血小板凝集を阻害する変異体と考えられる。1)昨年度までに,ボトロセチン2のβ鎖に関してVWFとの結合及びGPIbとの相互作用に重要なアミノ酸残基を同定した。また,逆荷電にした2箇所のアミノ酸変異を導入することで,VWFに結合するが血小板GPIbとの結合活性を持たない変異体の作製に成功した。さらに,この変異体はリストセチンによる血小板凝集惹起(RIPA)を阻害することを明らかにした。本年度は,この変異体がずり応力惹起血小板凝集(SIPA)に及ぼす影響を奈良医大輸血部(松本教授)との共同研究により行った。その結果,VWFとの結合に重要なアミノ酸であるβ鎖のAsp70をAlaに置換した変異体はVWFとの結合をELISA系では示さず,血小板凝集惹起活性も弱かったが,SIPAでは血小板凝集を促進させた。また,GPIbとの結合が低下する1アミノ酸置換の変異体はSIPAを阻害せず,促進的に作用した。これに対し,逆荷電にした2箇所のアミノ酸置換変異体はRIPA阻害と同様に,SIPA凝集を阻害した。すなわち,VWFに結合する活性はそのままに血小板との相互作用を持たず,逆に血小板の相互作用を抑制する新規のタンパク質であることが示された。2)さらに,ボトロセチン2とVWFとの複合体の立体構造モデルから,両者の接触点をサーベイし,先の2箇所の荷電アミノ酸に加えていくつかの候補荷電アミノ酸残基を選定し,これも逆荷電アミノ酸に置換することでより強い血小板凝集阻害効果を狙って発現を行った。3種類の発現体はいずれもRIPAを阻害した。組換えタンパク質の発現量が少ないため,SIPAへの影響を調べたり,定量的な比較はできていない。3)2014年度は,第9回日本臨床検査学教育学会(東京),第61回トキシン・シンポジウム(徳島)でこれまでの成果について口演発表した。ヘビ毒由来のボトロセチン2は、フォン・ビルブランド因子(VWF)に結合し、血小板GPIbとの結合を介して血小板凝集を導く。これまでにボトロセチン2のVWF結合に重要なアミノ酸残基とGPIbとの結合に重要なアミノ酸残基を明らかにし、GPIb結合に関与する2つの塩基性アミノ酸を酸性アミノ酸であるGluに置換した変異体は、血小板凝集を惹起しないだけでなく、リストセチンや高ずり応力による血小板凝集を阻害する、全く逆の活性を持つことを明らかにしてきた。

最終年度では、これら2箇所のアミノ酸残基を、別の酸性アミノ酸であるAspに置換した変異体を発現させ検討した。Asp置換変異導入組換えボトロセチン2は、Glu置換変異体とほぼ同等のリストセチン凝集抑制活性を示した。このことから、GluやAsp置換がボトロセチン2の立体構造に影響することも考えられるが、むしろ塩基性から酸性基に置換したことによる静電的な反発が阻害活性の原因であると考えられた。ただし、Asp変異体はGlu変異体に比べ細胞での産生量が低く、Glu変異体を産生する方が有利と考えられた。一方、ヒトの培養細胞での組換えタンパク質の発現以外に、昆虫細胞を利用した大量発現系の構築を試行した。和光純薬のプラスミドにボトロセチン2のcDNAを組み込んだものを調製し、昆虫細胞系発現を委託した。得られた培養上清から抗体カラムでボトロセチン2を精製したところ、α、β鎖からなるヘテロ2量体ボトロセチン2の産生に成功した。培養が小規模のため量的には少なかったが、これで大量培養に移せば十分量の組換えボトロセチン2を調製できることが示唆された。今後、Glu変異導入ボトロセチン2を使ったin vivoやex vivo系での抗血栓作用の検証の他、昆虫細胞系での変異体の発現をめざす予定である。血栓は、血小板GPIbと血漿タンパク質であるフォン・ビルブランド因子(VWF)の相互作用が発端となって形成される。本研究では、VWFに特異的に結合してGPIb依存性の血小板凝集を惹起するヘビ毒由来タンパク質のボトロセチン2に着目し、VWFやGPIbとの結合に重要なアミノ酸残基を同定した。さらにGPIbとの結合に関与する2つの塩基性アミノ酸を酸性アミノ酸に置換することで、VWFに結合するが血小板凝集を惹起せず、逆にVWFのによる血小板凝集を阻害する変異体ボトロセチン2の作製に成功した。本研究はVWFを標的としたユニークな抗血栓剤の開発につながる可能性を示唆した。当初考えていた以上に変異導入がうまく行かず,形質転換体がとれなかったため変異体cDNAがなかなか得られなかった。その原因として,変異導入に用いるPCR用プライマーの設計や温度プログラムが影響するものと思われた。プライマーの再設計やプログラムの試行錯誤を経て,変異体cDNAの調製に成功できた。しかし,cDNAを得たものの,アミノ酸変異によってはヘテロダイマーとしての発現量が少なく,十分なタンパク質が得られなかった。電荷を逆にした複数箇所の変異導入がボトロセチン2の立体構造に微妙な影響を及ぼし,ダイマー形成を妨げた可能性が考えられた。その他,マンパワーが不足しており,実験する時間が少なかったことも原因である。血栓止血学1)これまでの成果を国際血栓止血学会で発表するほか,論文として投稿する。2)塩基性アミノ酸を酸性アミノ酸に置換する際にこれまで,グルタミン酸への置換を行ってきたが,アスパラギン酸への置換の影響を調べる。3)AKTApure装置が設置される予定であり,粗毒からのタンパク質の精製を再開する。標準物質としてのボトロセチンやビチセチンの精製のほか,VWFをターゲットとした新規結合タンパク質のスクリーニングをめざす。4)これまでのin vitro系の実験に加え,モデルマウス等を用いてのin vivo系の実験を模索し,変異導入ボトロセチンの抗血栓性を検証したい。5)講義等の時間が多く,まとまった研究時間を作ることが難しいが,夏休み等の時間を利用して全力を注ぐ。タンパク質の発現が、培養細胞を用いているため収量が多くなく、多種類の変異体のcDNA設計からプラスミド調製、トランスフェクション、タンパク質の精製を経ての活性測定は非常に時間と労力を必要とする。平成25年度は大学院生の頑張りもあって一定の成果を上げることができたが、今後つめるべき点がいくつかあり追加実験を予定している。
初期地球環境に相対的に多く存在したアミノ酸種を用いた原始的タンパク質の構築

前年度までに、10アミノ酸種だけから再構成されたにもかかわらず、80°C以上まで安定な立体構造を形成する単純化型ヌクレオシド二リン酸キナーゼ改変体を得た。この10アミノ酸種のうちの8アミノ酸種が、初期地球環境に比較的豊富に存在したと推定されているアミノ酸種と一致した。この単純化改変体は、80°C以上まで安定な立体構造を保つが、本来の触媒機能であるリン酸基転移活性を検出限界以上では示さなかった。今年度は、この単純化改変体に触媒活性以外の機能がないか検討した。単純化改変体といくつかの一本鎖RNAとの結合を、ゲルシフトアッセイによって解析したが、結合は観察できなかった。次に、10アミノ酸種で再構成された単純化改変体とATPとの結合アッセイをおこなったが、同様に、結合は観察できなかった。一方で、13アミノ酸種で再構成された改変体では、ATP結合活性が観察された。この研究成果によって、本研究課題の研究期間は終了するが、今後、13アミノ酸種で再構成された改変体から系統的かつ網羅的にアミノ酸種類を減らすことによって、ATP結合活性に必要な最少アミノ酸種類(数)を明らかにできるのではないかと期待される。また、前年度までに復元した真正細菌共通祖先型トリオースリン酸イソメラーゼと古細菌共通祖先型トリオースリン酸イソメラーゼの物性解析をおこなった。その結果、どちらの祖先型トリオースリン酸イソメラーゼも、現存の酵素と比べると小さいながらも触媒活性を示し、80°Cを超える温度まで安定であることが明らかとなった。本研究課題の期間は終了するが、今後、祖先型トリオースリン酸イソメラーゼのアミノ酸組成単純化によって、可能な限り、初期地球環境に豊富に存在したと推定されているアミノ酸だけから再構成することを試みる計画である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。異なる13アミノ酸種から再構成された2つの単純化型ヌクレオシド二リン酸キナーゼのアミノ酸組成の比較から、両単純化型改変体に共通して含まれた11アミノ酸種を「必須アミノ酸」と定義し、初期地球環境に比較的豊富に存在したと推定されているアミノ酸種と比較した。その結果、必須アミノ酸のうちのAla, Asp, Glu, Gly, Leu, Pro, Valの7アミノ酸種が、初期地球環境に比較的豊富に存在したと考えられているアミノ酸と一致した。すなわち、初期地球環境に比較的豊富に存在したアミノ酸を主成分として、活性を持った安定なタンパク質を再構成することに成功した。一致しなかった残りのHis, Asn, Arg, Tyrの4アミノ酸種は、触媒活性には重要なアミノ酸であるが、安定性への寄与は小さかった。以上の結果に基づき、本研究では、13アミノ酸種から再構成された単純化型ヌクレオシド二リン酸キナーゼからさらにHis, Asn, Tyrの3アミノ酸種を他のアミノ酸に置換することで欠損させた。その結果得られた10アミノ酸種で再構成された改変体からは触媒活性は検出できなかった。しかし、変性温度は11°C向上することを見出した。さらに、TIMバレル構造の少数アミノ酸種による再構成のため、TIMバレルタンパク質であるトリオースリン酸イソメラーゼの分子系統解析と、祖先配列の推定および祖先型トリオースリン酸イソメラーゼの復元をおこなった。推定した祖先配列のうち、真正細菌共通祖先に相当する2つの祖先配列をコードする人工遺伝子を合成し、大腸菌内で発現した。その結果合成されたタンパク質は、70°Cで10分間熱処理してもほとんど変性せず安定であることを見出した。異なる13アミノ酸種から再構成された2つの単純化型ヌクレオシド二リン酸キナーゼに共通して含まれた11アミノ酸種を、初期地球環境に比較的豊富に存在したと推定されているアミノ酸種と比較したところ、7アミノ酸種が初期地球環境に比較的豊富に存在したと考えられているアミノ酸と一致した。この結果から、初期地球環境に比較的豊富に存在したアミノ酸を主成分として、活性を持った安定なタンパク質を再構成できることを実証することができた。さらに、一致しなかった残りの4アミノ酸種のうちのHis, Asn, Tyrを、13アミノ酸種で再構成された単純化型ヌクレオシド二リン酸キナーゼからさらに欠損させた。その結果得られた10アミノ酸種で再構成された改変体は触媒活性を失ったが、変性温度が11°C回復した。以上の結果は、初期地球に比較的豊富に存在したアミノ酸種は、安定なタンパク質立体構造の形成に重要であり、それ以外のアミノ酸は、タンパク質の機能の多様化に重要であることを示唆するものであったので、誌上発表をおこなった。また、原始的なタンパク質立体構造と考えられているTIMバレル構造を持つホスホリボシルアントラニル酸異性化酵素を、コンビナトリアル進化工学によって限られたアミノ酸種で再構成することを検討したが、配列全長を15アミノ酸種で再構成したホスホリボシルアントラニル酸異性化酵素が沈殿しやすい傾向があることを見出した。そこで、同じくTIMバレル構造を持つトリオースリン酸イソメラーゼの真正細菌共通祖先型および古細菌共通祖先型の復元を試み、成功した。以上の結果により、次年度以降に、復元した祖先型トリオースリン酸イソメラーゼを出発材料にしてアミノ酸組成単純化によって、初期地球環境に豊富に存在したと推定されているアミノ酸だけを用いた再構成に取り組むことが可能となった。