hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新しい機能を持つ翻訳途上鎖の探求

翻訳途上で機能する蛋白質性の因子が近年見出されつつある。そのような背景を受け、新しい機能を持つ翻訳途上鎖の探索を目指した。その過程で、一般的なタンパク質が驚くほど高頻度で翻訳伸長の一時停止をしている事を見出しつつある。一方、このことが、翻訳途上でのみ働く新規因子の同定を困難にしている。既に同定した翻訳途上で働く因子の改変から、新しいセンサーを作成した。また、オリジナルのセンサーが膜組込機構の解析に有用であることを示した。本研究の研究代表者らのこれまでの研究を含む幾つかの報告から、翻訳伸長の途上で働くユニークなタンパク質の存在が明らかにされてきた。本研究では、まだ発見されていない新しい機能を持つ翻訳途上鎖の探索、および、既に同定されている機能的翻訳途上鎖を遺伝子改変することで、本来のものと異なる新しい機能を持つ翻訳途上鎖の構築を目指した。新規アレストタンパク質の探索については、翻訳途上鎖にユニークな性質であるC末端にtRNAが共有結合しているという特徴を利用することで、合成完了後のタンパク質と区別可能である。その性質を利用し、大腸菌の遺伝子のうち、およそ1000個をこれまでシステマティックに探索した。その結果、予想外のことに、全体の80%以上の遺伝子が、タンパク質合成の途上で少なくとも1回以上伸長を一時停止させることが分かった。このことは、翻訳伸長の一時停止が一般的なタンパク質にとっても普遍的であることを示しており、これまでの我々の翻訳に対する見方を大きく変えるものとなった(投稿準備中)。一方、あまりにも多くのタンパク質が翻訳伸長を一時停止させるという予想外の結果は、この中から、翻訳途上で働く因子を同定することを困難にさせた。新規アレスト因子の探索には、実験上のさらなる工夫が必要であると思われる。一方、アレスト因子を改変して様々なセンサーを開発するプロジェクトは、タンパク質の膜透過や膜組込の幾つかの経路を感知すると思われるセンサーをデザインできた。願わくば、蛋白質局在化装置以外の細胞装置を感知するセンサーを開発したいとの野望があったが、こちらはまだ成功していない。一方、オリジナルのMifMをセンサーとして利用し、膜組込装置の分子機構を解明することを試み、膜組込装置と基質膜蛋白質との静電的相互の重要性を発見し、これまで知られていなかった新しい蛋白質膜組込の機構の存在を提唱することが出来た。新規機能を持つ翻訳途上鎖の構築を目的とし、枯草菌MifMのC末端の翻訳アレストモチーフを維持したまま、そのN末端を様々な形に改変した。例えば、分泌シグナル配列や、膜貫通シグナルなどを融合したような変異MifMを構築した。本来MifMは、枯草菌細胞中で、蛋白質膜組込を担うYidCの活性をモニターするが、構築した変異MifMのうち一部のものは、YidC依存的膜組込経路とは異なる蛋白質局在化経路をモニターするものへとその性質を変化させたことが示唆された。このことは、MifMのC末端アレストモチーフとN末端のアレスト解除シグナルを組み合わせる事で、YidC膜組込経路モニタリング以外の、新規の機能を持つ翻訳途上鎖を構築することが出来ることを示唆している。このことを受け、蛋白質局在化以外の生物学的プロセスをモニターする機能的翻訳途上鎖のデザインも同時に進行中である。例えば、エネルギー依存的蛋白質分解を行うプロテアーゼの認識配列をMifMのN末端に融合させたものなどを構築した、しかしながら、現在の所、これらのプロテアーゼの活性をモニターするような融合遺伝子は得られておらず、この場合には、さらなる最適化が必要であるものと思われる。MifMだけでなく、翻訳アレストモチーフを持つ大腸菌SecMの改変も視野に入れており、SecMの翻訳アレスト状態に呼応してlacZ遺伝子が発現するようなプラスミドを構築中である。期待通り、SecMの翻訳アレストが起こる条件で、lacZ遺伝子の誘導が観察されたが、その程度は弱く、プラスミドのコピー数を低下させるなど、さらなる改変が必要である。新規機能を持つ翻訳途上鎖の構築のため、枯草菌MifMの改変を行ったところ、本来の機能であるYidC依存的膜組込経路のモニタリング以外の働きをしている可能性のある融合翻訳途上鎖が得られた。このことは、枯草菌MifMの改変により新たな機能的翻訳途上鎖が構築可能であることを示唆しており、本研究のアプローチが有望であるという希望が得られた。特に、蛋白質局在化の経路に関しては、良い結果が得られつつある。一方、蛋白質局在化以外の機能を持つようなものに関しては、さらなる最適化が必要であり、また、MifMのみならず、SecMの利用も必要かも知れない。枯草菌MifMのN末端改変により、新規機能を持つ翻訳アレスト因子の構築を続行する。また、翻訳アレストモチーフの固有の性質が、翻訳アレスト解除に様々な形で影響する可能性を考え、大腸菌SecMを利用し、同様のアプローチを行う。

一方、新規翻訳アレスト因子を天然のプールから検索するために、ペプチジルtRNAの精製や、ペプチジルtRNAを保持できる電気泳動を用いたスクリーニングを行う。該当なし
CaOーMgOーAl_2O_3ーSiO_2系の超高圧下での溶融関係の研究

CaOーMgOーAl2O3ーSiO2系のマントル構成鉱物種と平衡に共存する液の化学組成を超高圧実験により決定した.精度の高い実験を実現するために,高圧実験試料部内の温度勾配を減らし,均質な温度分布を得ることができるヒ-タ-を開発した.また,実験に先立ち,出発試料をX線回折装置,EPMAによってキャラクタリゼ-ションを行ない,結晶化の程度が実験結果に及ぼす影響をしらべ,出発物質としては,一旦ガラス化して均質化したものを高温高圧下で結晶化させたものを使用した.実験の結果,マントル構成鉱物種と平衡に共存する液のCa/Al比は,Alに富む相がスピネルである場合にはほぼ1であるが,ガ-ネットが安定な領域では圧力の増加とともに増加することが判明した.このことは,Ca/Al比がほぼ1に近い地球始源物質の溶融によっても,高圧下ではア-キアンのコマチアイトのようなCa/Al比が高いマグマを生成できることを意味する.10GPa付近の高圧下までは液はCaにとむ輝石とCaに乏しい輝石と共存できるが,さらに高圧下では輝石の固溶範囲が広がり,単一の輝石のみしか安定でなくなるため,液組成は一義的には決まっていない.さらに,天然系との比較を行なうため,玄武岩システムの高圧実験も行ない,液と共存鉱物との主成分元素の分配を調べた.10GPa以上の高圧下ではガ-ネットの組成が圧力増加につれて変化するが,共存する液との主成分元素の分配は大きく変化しない.しかし,Naのような微量元素については圧力増加に伴う分配係数の変化が大きく,天然系でのマグマ発生の問題を議論するためにはCaOーMgOーAl2O3ーSiO2系にくわえて,Naを含む系での高圧実験が重要であることが判明した.本年度は高圧下での実験に用いるヒ-タ-の改良を行なうとともに、CMAS系の溶融関係を明らかにするための実験を10GPaまでの高圧下で行なった。本年度のグラファイトヒ-タ-の設計変更により、試料部分を1mmの厚みにとどめれば、内部の温度勾配を10°C以下に抑えることができるようになり、計測された温度と実際の試料温度との差をほぼ無視できる程度に改良された。このヒ-タ-を用いて高圧実験では特に6GPaでカンラン石、輝石、ガ-ネットと共存する液組成(invariant point)の決定に重点をおいた。実験に先立って、これまでの他の研究者による実験も含めて検討した結果からの圧力でのinvariant pointの化学組成を予想し、この組成に近い出発試料を5種類作成した。これら出発試料それぞれの溶融関係を明らかにしたうえで、chemographicな手法によりinvariant pointの液組成を絞り込んだ。この結果、地球史初期のArchean時代に特徴的にみられるコマチアイトマグマの少なくとも一部は、マントル物質の6GPa付近の圧力下での部分溶融によって生成しうる事が明らかになった。この研究に際して、特に留意した点は出発試料の状態である。完全なガラス試料を使用した場合には実験後の結晶が小さすぎてEPMAなどの分析には適さないが、微晶質の出発試料を用いたときには比較的粒径の大きい結晶が得られ、分析が可能となった。このような、出発試料のキャラクタリゼ-ションには今年度購入したX線発生装置が重要な役割を果たした。更に来年度に予定しているより高圧での実験に備えてランタンクロマイトのヒ-タ-を改良し温度勾配を少なくする実験も行なった。これによって、15GPa程度の圧力までは比較的温度勾配の小さいヒ-タ-が使用できるようになった。CaOーMgOーAl2O3ーSiO2系のマントル構成鉱物種と平衡に共存する液の化学組成を超高圧実験により決定した.精度の高い実験を実現するために,高圧実験試料部内の温度勾配を減らし,均質な温度分布を得ることができるヒ-タ-を開発した.また,実験に先立ち,出発試料をX線回折装置,EPMAによってキャラクタリゼ-ションを行ない,結晶化の程度が実験結果に及ぼす影響をしらべ,出発物質としては,一旦ガラス化して均質化したものを高温高圧下で結晶化させたものを使用した.実験の結果,マントル構成鉱物種と平衡に共存する液のCa/Al比は,Alに富む相がスピネルである場合にはほぼ1であるが,ガ-ネットが安定な領域では圧力の増加とともに増加することが判明した.このことは,Ca/Al比がほぼ1に近い地球始源物質の溶融によっても,高圧下ではア-キアンのコマチアイトのようなCa/Al比が高いマグマを生成できることを意味する.10GPa付近の高圧下までは液はCaにとむ輝石とCaに乏しい輝石と共存できるが,さらに高圧下では輝石の固溶範囲が広がり,単一の輝石のみしか安定でなくなるため,液組成は一義的には決まっていない.さらに,天然系との比較を行なうため,玄武岩システムの高圧実験も行ない,液と共存鉱物との主成分元素の分配を調べた.10GPa以上の高圧下ではガ-ネットの組成が圧力増加につれて変化するが,共存する液との主成分元素の分配は大きく変化しない.しかし,Naのような微量元素については圧力増加に伴う分配係数の変化が大きく,天然系でのマグマ発生の問題を議論するためにはCaOーMgOーAl2O3ーSiO2系にくわえて,Naを含む系での高圧実験が重要であることが判明した.CaOーMgOーAl2O3ーSiO2系のマントル構成鉱物種と平衡に共存する液の化学組成を超高圧実験により決定した.

実験に先立ち,出発試料をX線回折装置,EPMAによってキャラクタリゼ-ションを行ない,結晶化の程度が実験結果に及ぼす影響をしらべ,出発物質としては,一旦ガラス化して均質化したものを高温高圧下で結晶化させたものを使用した.高圧実験は試料室内の温度勾配を抑えたヒ-タを用いて行なった.実験の結果,マントル構成鉱物種と平衡に共存する液のCa/Al比は,Alに富む相がスピネルである場合にはほぼ1であるが,ガ-ネットが安定な領域では圧力の増加とともに増加することが判明した.このことは,Ca/Al比がほぼ1に近い地球始源物質の溶融によっても,高圧下ではア-キアンのコマチアイトのようなCa/Al比が高いマグマを生成できることを意味する.10GPa付近の高圧下までは液はCaにとむ輝石とCaに乏しい輝石と共存できるが,さらに高圧下では輝石の固溶範囲が広がり,単一の輝石のみしか安定でなくなるため,液組成は一義的には決まっていない.さらに,天然系との比較を行なうため,玄武岩システムでの高圧実験も行ない,液と共存鉱物との主成分元素の分配を調べた.10GPa以上の高圧下ではガ-ネットの組成が圧力増加につれて変化するが,共存する液との主成分元素の分配は大きく変化しない.しかし,Naのような微量元素については圧力増加に伴う分配係数の変化が大きく,天然系でのマグマ発生の問題を議論するためにはCaOーMgOーAl2O3ーSiO2系にくわえて,Naを含む系での高圧実験が重要であることが判明した.
生体膜の揺らぎによるポリペプチドの拡散と膜透過の動的多核ＮＭＲ解析

脂質二分子膜内外の分子の運動をNMRで直接観測し、膜の熱的な揺らぎにもとづく物質の輸送過程を明らかにした。まず、観測困難な“細胞サイズベシクル(直径1020 μm)"中の分子の運動状態が、汎用されるナノサイズベシクル(直径100 nm前後)と異なることを見出した。次に、膜内コレステロールが膜揺らぎを調節して、物質輸送を制御する様子を明らかにした。さらに、揺らぎによる膜透過を、生きた細胞を用いてNMRリアルタイム計測し、速度論解析を行うことがが可能となった。このような動的NMRによる速度論解析が、ペプチド鎖の切断など、ペプチドの生化学反応の時間分解計測に適用可能であることを見出した。我々は、24年度に、直径1020 μmの細胞サイズベシクル(CSV)が細胞膜モデルとして有用であること、CSVは表面の曲率が小さいにもかかわらず、膜中のリン脂質分子が、膜の垂直方向に大きく揺らいでいる(突出運動する)ことを明らかにした。この成果にもとづき、25年度は、上記の膜の揺らぎが疎水性の物質によってどのように制御されるかを検討した。実際の生体膜には、膜を貫通するタンパク質やコレステロールなど疎水性の成分が多く存在するからである。研究では、距離情報から膜表面の凹凸を見積もることができる「核オーバーハウザー効果」を膜揺らぎの指標ととして用いた溶液NMR計測を行い、膜の揺らぎにおよぼす疎水性物質の影響について検討した。疎水性のモデル物質として、ビスフェノールAとパルミチン酸の重水素化物を選択した。その結果、ビスフェノールAは膜中のリン脂質の揺らぎ(突出運動)を抑制するが、パルミチン酸はリン脂質の垂直方向の揺らぎにほとんど影響を与えないことが明らかとなった。両者の相違について、膜中での結合様式から考察することができた。これらの成果を取りまとめて、学術誌に投稿する予定である。さらに、生きた細胞を用いた膜透過の研究も開始した。細胞膜を透過する性質をもつオクタアルギニンペプチドを用いて、膜透過をNMRで定量解析するための予備計測を行った。その結果、生体膜の熱揺らぎにもとづく透過過程をNMRで時間分解計測するための最適な条件を見出した。平成24年度は、ペプチドの拡散や膜透過の場となる“生体膜"の「熱的な揺らぎ」に焦点を当てた。特に、実際の細胞膜に近いモデルとして期待される直径1020マイクロメートルの巨大ベシクルを対象として、膜中のリン脂質のダイナミクスを高分解能溶液NMRで初めて捉えた。その結果、細胞サイズのベシクルでは、膜のモデルとして汎用されるナノサイズのベシクル(直径100800ナノメートル)と動的な構造が著しく異なることを見出した。細胞サイズベシクル中の脂質分子の環境や局所的な運動状態は、曲率の大きなナノサイズのベシクル中とほぼ同じであった。しかし、リン脂質分子全体の回転運動は、細胞サイズベシクル中で遅くなることが分かった。回転運動に起因する分子回転相関時間は、細胞サイズベシクル中でサブ秒秒と計算され、報告されている従来のナノサイズベシクル中の相関時間(ピコ秒ナノ秒)よりも著しく大きかった。また、リン脂質の頭部親水基と膜内部の疎水基間の相互作用を示す相関が、スペクトル上で観測された。NOE enhancement factorと相関時間から親水基・疎水基間の距離を求めると、約0.4 nmとなり、膜の親水部と疎水部がかなり接近することが分かった。この結果は、細胞サイズベシクルのような曲率が小さい膜中においても、リン脂質が膜面の垂直方向に大きく揺らいでいることを示すものである。今回得られた知見は、膜の揺らぎと物質の透過の相関など、生体機能を理解する上で重要であると考えられる。これらの成果は、Chem. Phys. Lett.誌に掲載された。1.前年度に実施した「細胞サイズの膜の熱揺らぎが、膜中の疎水性物質によってどのような影響を受けるか」に関する研究の成果を取りまとめた。論文は、Membrane、40巻(2015年1月発行)に掲載された。2.膜中のコレステロールが薬物輸送をどのように制御するかに着目し、フッ素原子を含む麻酔剤・セボフレンを用いて、セボフレンの膜輸送に関する動的多核NMRによる検討を行った。膜中のコレステロール含量を変化させながら、セボフレンの1Hおよび19F NMR化学シフト、緩和時間、拡散係数を測定した。その結果、セボフレンの膜への取り込みがコレステロールによって抑制されることを定量的に示すとともに、コレステロールによる膜の流動性の低下がセボフレンの取り込み効率を下げることを、膜脂質の拡散測定から明らかにした。成果は取りまとめてJ. Oleo Sci.誌に投稿し、同誌の63巻(2014年11月発行)に論文が掲載された。3.親水性でありながら、疎水性の細胞膜を透過するといわれているオクタアルギニンペプチドについて、膜の熱揺らぎに基づくヒト白血病細胞株への輸送過程を、NMRを用いて分単位の時間分解で計測した。細胞内のペプチドを識別するために、フッ素標識したペプチドを合成して使用した。19F NMRシグナルの強度の変化をリアルタイムで追跡してペプチド濃度の推移を明らかにし、これをもとに、定量的な速度論への展開を試みた。1.オクタアルギニンペプチドの細胞膜透過過程について、速度論にもとづく解析を継続した。

揺らぎによるペプチドの膜輸送を理解するために、より信頼度の高いモデルを構築する必要性が明らかとなった。この課題について、平成27年度より開始した基盤研究(C)「In-Cell NMRによる生きた細胞への薬物輸送のリアルタイム定量解析」において、さらに検討する予定である。2.一方、本課題で用いた動的多核NMR解析の方法論が、ポリペプチド自体の生化学的反応のリアルタイム計測に応用できることを見出した。ポリペプチドの特定部位で自発的に進行するペプチド結合の切断反応をNMRを用いてリアルタイム計測し、速度論的解析を行った。成果は、2016年2月15日発行のScientific Reports電子版に公開された。脂質二分子膜内外の分子の運動をNMRで直接観測し、膜の熱的な揺らぎにもとづく物質の輸送過程を明らかにした。まず、観測困難な“細胞サイズベシクル(直径1020 μm)"中の分子の運動状態が、汎用されるナノサイズベシクル(直径100 nm前後)と異なることを見出した。次に、膜内コレステロールが膜揺らぎを調節して、物質輸送を制御する様子を明らかにした。さらに、揺らぎによる膜透過を、生きた細胞を用いてNMRリアルタイム計測し、速度論解析を行うことがが可能となった。このような動的NMRによる速度論解析が、ペプチド鎖の切断など、ペプチドの生化学反応の時間分解計測に適用可能であることを見出した。オクタアルギニンペプチドの細胞膜透過過程をNMRで計測し、速度論に基づく解析を実施した。当初、26年度中に解析を終了する予定であったが、解析方法について再度検討を行ったため、年度内に結果を取りまとめることが不可能となった。生物物理化学オクタアルギニンペプチドの細胞膜透過過程の速度論的解析を完了し、成果を取りまとめて学術誌に公表する予定である。生体膜には、膜貫通タンパク質やコレステロールといった疎水性の成分が多く含まれることから、そのような環境で、膜の熱揺らぎがどのように制御されるかを明らかにすることは重要である。25年度には、実際の細胞サイズに匹敵するモデル細胞を用いて、膜の熱揺らぎに対する疎水性物質の影響を検討することができた。膜の揺らぎに対する疎水性物質の効果が一様ではなく、膜中における存在様式によって揺らぎの制御機構が異なるという今回の知見は新しく、今後膜を介した物質透過を研究するための新しい手掛かりになると期待される。現在、これらの成果を取りまとめて学術誌に投稿する段階に至っていることから、研究が順調に進展したものと考えられる。ペプチドの拡散や膜透過を引き起こす駆動力となる“生体膜の熱的な揺らぎ"について、ナノサイズから直径1020マイクロメートルという細胞サイズのモデル膜までを研究対象として、NMRで相違点を明らかにすることができた。ペプチドの拡散・膜透過機構を理解するための新しい手掛かりが得られたと考えられる。今回の成果が学術誌に掲載された点からも、当該研究に対する一定の評価が得られたものと考える。膜透過に関するNMRデータ解析の再検討を行ったため、26年度中に解析結果をまとめることができなかった。そのため、年度内に成果の公表を行うことが不可能となり、未使用額が発生した。
顎顔面正中部の形成を担う神経堤細胞の挙動と制御:発生系譜をふまえた解析

本研究では,ニワトリ胚頭蓋底軟骨の発生起源やその形成に関与する分子機構について調べた。頭蓋底軟骨を形成する頭部神経堤細胞の由来を調べた結果,頭蓋底軟骨は正中部領域とそれを挟んだ両側の軟骨から構成されていた。正中部領域の形成過程ではFoxd3が強く発現し,軟骨分化への関与が示唆された。また,正中部領域の軟骨原基ではPNAレクチンが結合する糖鎖が発現していたのに対し,両側軟骨原基での発現は弱かった。以上から,頭蓋底軟骨は性質の異なる二つの軟骨原基から構成されることが示唆された。顔面骨格は,頭部神経堤細胞群の最前端に生じ,眼胞上方または下方を移動する二つの細胞群から形成される(眼上神経堤細胞と眼下神経堤細胞)。二つの神経堤細胞は,移動経路の異なる同じ細胞群とされてきた。本研究では,これらの細胞群は顔面の特定領域を形成するように,発生の初期から移動能や接着など挙動が別々に制御されている可能性を検証する。本年度は,挙動制御に関わる分子として転写因子のFoxd3とSix2に注目し,顎顔面形成過程でのこれらの発現パターンを調べた。従来,Foxd3は神経堤細胞の誘導や分化維持に関わる分子とされているが,その機能欠損動物では顔面正中部の低形成が認められる。そこで顔面原基の増殖・形態形成過程での関与を予想し,この過程での発現を調べた。その結果,原基が形成される発生段階では,多くは神経細胞の発現に限定されていたが,後に顔面正中部となる内側鼻隆起先端の細胞でも発現が認められた。一方,Six2の変異マウスでは頭蓋底を形成する骨格の低形成が認められる。顎顔面形成過程でのSixファミリーの関与を調べるため,Six2に加え,Six1,Six3もクローニングしてその発現を調べた。Six3は従来報告されているように,脳胞を含む神経管底部で帯状に発現していたが,顔面原基での発現は認められなかった。これに対し,Six1とSix2は顔面原基および頭蓋底骨格形成過程で発現が認められた。特にSix2は頭蓋底骨格の基礎である梁軟骨形成時にその周辺で発現しており,軟骨形成への関与が示唆された。Six1はSix2より狭い領域で一部をSix2に重複して発現していることから,両者の機能は重複している可能性が考えられる。背景頭蓋底顔面正中部を構成する骨格は,頭部神経堤細胞群のうち最前端に生じ,眼胞の上方または下方を移動する二つの細胞群から形成される(眼上神経堤細胞と眼下神経堤細胞)。従来,二つの神経堤細胞は同じ性質を有するとされてきたが,本研究では,両者の細胞挙動の差異が骨格形態の多様性をもたらすと仮定し,その検証を目指している。結果(1)頭蓋底骨格形成に関与する転写因子の解析:変異マウスの解析から,転写因子のFoxd3は顔面正中部形成に関与することが示唆される。頭蓋底骨格を形成する主体である頭部神経堤細胞での2つの遺伝子の発現時期やその部位の詳細について解析した。Foxd3は顔面の形態形成が顕著な発生段階で,従来報告されている神経細胞の発現だけでなく,顔面正中部となる内側鼻隆起内にある間葉細胞でも発現が認められた。背景に記したように頭蓋底骨格を形成する2群の神経堤細胞に注目し,培養系でのFoxd3の発現を比較したが,発現量に大きな差は認められなかった。そのため,Foxd3変異による正中部分の欠損・低形成は,神経堤細胞が目的とする部位に移動・定着し,骨格を作る過程までの段階に問題があると考えられた。(2)頭蓋底や顔面正中部骨格で強く発現する糖蛋白質の解析:体幹部軟骨の分化初期の細胞では,ピーナツレクチンのPNAが結合する分子(PNA結合分子)が細胞膜上に発現する。このことに注目し,ニワトリ胚頭蓋底の形成過程でPNA結合分子の発現を調べた。その結果,頭蓋底正中部に位置する軟骨ではその形成初期からPNA結合分子の発現が観察されたが,この軟骨を挟むように形成される軟骨ではPNA結合分子の発現はごく弱かった。以上から頭蓋底顔面正中部を作る骨格は,PNA結合分子を発現する正中部軟骨と,その両側に位置しPNA結合分子を発現しない軟骨に由来することが示唆される。背景頭蓋底顔面正中部を構成する骨格は,胚の最前端に生じた頭部神経堤細胞が,眼胞の上下に沿って顔面形成部位に移動して形成される。本研究では,正中部骨格の領域特異性をもたらす分子機構の解明を目指している。結果

(1)これまでの解析で,顔面正中部を作る軟骨(総梁軟骨)の中央領域を占める細胞では,その膜表面にピーナツレクチンのPNAが結合する分子(PNA結合分子)が発現することを見出している。本年度はPNA-BMと総梁軟骨形成との関連を調べる目的で,総梁軟骨形成を促進するSonic hedgehog (Shh)に注目した。Shhシグナルの阻害剤であるSANT-1をニワトリ胚に滴下して発生させると,総梁軟骨など正中部軟骨の形成が阻害される。SANT-1処理胚でPNA-BMの発現を調べた結果,総梁軟骨の形態異常とPNA-BMの発現低下が関連していた。特に,総梁軟骨の左右の棒状軟骨が正中部で融合しない表現型の胚では,PNA-BMの発現は観察されなかった。したがって,PNA-BMの発現は梁軟骨をつなぐ中央の軟骨の形成と関連すると考えられ,正常な総梁軟骨形成のマーカーになると予想された。(2)頭蓋底骨格形成におけるFoxd3の機能解析:遺伝子変異動物の解析から,Foxd3は顔面正中部形成に関与することが示唆される。Foxd3の発現を調べた結果,顔面正中部となる内側鼻隆起を構成する間葉細胞で発現することが観察されたが,この発現は鼻隆起内の軟骨形成領域よりも先端部に限定され,軟骨分化領域では低下していた。Foxd3と軟骨分化との関連を調べるために,内側鼻隆起の間葉細胞を培養してFoxd3を過剰発現させた結果,軟骨分化が抑制された。Foxd3のKOマウスでは頭部軟骨/骨の分化亢進が報告されており,顔面隆起間充織で発現するFoxd3は神経堤細胞の軟骨分化を負に制御すると考えられた。本研究での到達目標は,顎顔面形成を担う頭部神経堤細胞が,その性質から大きく2群に区分され,それぞれが固有の形態形成を行うことを細胞あるいは分子レベルで示すことにある。主目的の一つに,Foxd3の細胞挙動制御における発現解析と機能解析があるが,現段階では発現解析にとどまっている。一方で,頭蓋底形成への関与が示唆されているSix2の発現解析や,部位特異的糖蛋白質の発見など,当初計画とは異なる視点から到達目標に近づいていると言え,全体としては順調と考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は最終年度であるので,機能解析に重点をおくこととする。Foxd3とSix2については主に神経堤細胞の培養系を用い,それぞれの分子の発現亢進や機能阻害により,細胞の挙動変化や分化状態についての情報を得る予定である。培養系の確立が問題だったが,昨年度中に克服した。一方,昨年度の研究で見出した部位特異的糖蛋白質については,その発現部位の詳細についてと,分子実体を明らかにするための生化学的な解析を行う予定である24年度が最終年度であるため、記入しない。
小児用超小型右心系人工心筋の開発

微細径形状記憶合金線維と微小制御技術とを駆使した超小型の埋込型小児用人工心筋の開発を目的とし、血行力学的に複雑な先天性心疾患の有効な血行動態補助を実現するため(a)心外導管を外部から収縮させて肺循環を支援する微小形状記憶合金アクチュエータの開発、(b)心室壁で収縮拡張させる超小型循環補助装置開発の2点に焦点を絞って開発研究を行い、組織保護のための熱制御を可能とした右心系循環補助装置設計の基礎構築ができた。本研究の目的は、小児右心系補助循環装置として微細系の形状記憶合金線維(バイオメタル)と現在開発中のナノセンサ・マイクロ制御装置とを駆使して、必要な血液循環を力学的にサポートする超小型の埋込型小児用マイクロ人工心筋を開発することである。これは、心室壁もしくは下大静脈-肺静脈を接続する心外導管の外部に装着され、生体の血液循環系にとって"必要なときに必要なだけ"血液ポンプとして血液拍出を補助するもので、心臓の外面に設置されるため血栓の形成等の心配もない。本年度は、ナノテク形状記憶合金(バイオメタル:100MPaのオーダで10%程度収縮し、直径数マイクロメートルまで加工可能な線材)を基盤アクチュエータとする小児用右心血液補助人工心筋のプロトタイプ完成を目標とした。複雑な先天性心疾患に対する血行力学的補助のため、(a)心外導管を外部から蠕動的に収縮拡張させて肺循環をサポートする微小形状記憶合金アクチュエータ開発、(b)右心室ポーチを心室壁面上で収縮拡張させる超小型循環補助デバイス開発の2点の焦点を絞って研究開発を進めた。研究成果として、心外導管を収縮させる形態の循環補助デバイスによる収縮拡張により、Fontan循環を模擬した水力学的評価において、最大収縮期圧60mmHgを達成し、心外導管に対する拍動圧補助が可能であることが示された。また、小児Fontan循環シミュレーションモデルにおいて、心外導管収縮補助メカニズムにより管内流のForward flowが増大する効果が示された。昨年度までに、ナノテク形状記憶合金を基盤アクチュエータとする小児用右心血液補助人工心筋のプロトタイプ完成を目標とし、複雑な先天性心疾患に対する血行力学的補助のため、(a)心外導管を外部から蠕動的に収縮拡張させて肺循環をサポートする微小形状記憶合金アクチュエータ開発、(b)右心室ポーチを心室壁面上で収縮拡張させる超小型循環補助デバイス開発の2点の焦点を絞って研究開発を行った。本年度は、まず(a)心外導管型の完全埋め込み式循環補助装置の駆出支援効率の増大をはかり、Fontan循環シミュレーションモデルにおいて(1)心外導管の収縮拡張比、(2)心外導管への外部からの収縮力の検討を行った。それらの結果から、右心低圧系の循環においては、過大な収縮加圧により逆行性の流量が増大し、したがって壁面加圧力および壁面収縮変位に閾値があることが示された。また、(b)右室ポーチ補助人工心筋に関して動物実験により左室拡張障害なく選択的に右室側を収縮可能な構造を新たに考案し、有効な血行力学的効果が得られることが確かめられた。これらの成果は、形状記憶合金線維を応用した新たな小児用循環補助の方法論となり得ることを示しており、最終年度にさらに有効性を検証してゆく。本研究の目的は、小児右心系補助循環装置として微細径の形状記憶合金線維(バイオメタル)と現在開発中のナノセンサ・マイクロ制御装置とを駆使して、必要な血液循環を力学的にサポートする超小型の埋込型小児用マイクロ人工心筋を開発することである。これは、心室壁もしくは下大静脈-肺静脈を接続する心外導管の外部に装着され、生体の血液循環系にとって、"必要なときに必要なだけ"血液ポンプとして血液拍出を補助するもので、心臓の外面に設置されるため血栓の形成等の心配もない。これまで、血行力学的に複雑な先天性心疾患の有効な血行動態補助を実現するため、(a)心外導管を外部から蠕動的に周期的に収縮させて肺循環をサポートする微小形状記憶合金アクチュエータの開発、(B)右心室ポーチを心室壁面上で収縮拡張させる超小型循環補助デバイス開発の2点に焦点を絞って研究開発を行った。

本年度までに得られた、独自に開発したFontan循環試験装置において、開発した心外導管の収縮拡張比と心外導管への加圧収縮力の検討成果に基づき、(a)心外導管の主流方向への連続的な壁面収縮を可変制御コントローラを試作、(b)Fontan循環時の壁面収縮支援速度による順方向流れ加速評価、(c)肥大した心臓壁の曲面形状に沿った人工心筋サポートによる周方向収縮効率増大のための心室測地線解析による装着形状の検討を行った。併せて、バイオメタルのマイクロロボティクス制御手法を応用して人工心筋デイバス表面温度制御による収縮速度調節系の機能評価を行った。それらの成果に基づき、心室収縮機能の自然収縮の帰納的拡張障害なく、形状記憶合金の収縮時蓄熱放熱による血流と組織障害を考慮した駆動制御閾値の設定が可能となり、選択的に有効な血行支援を可能とする力学的制御方法と形態設計の基礎的設計方法論が構築できた。震災後想定より実験環境復旧が遅れたため、開発した人工心筋システムの動物実験評価がマイルストンよりも遅れたが、年度後半までに、各種評価および新たな実験を集約的に再開でき、基礎開発部分の進展と、動物実験での埋め込み血行動態評価を行い、当初の目標値を達成した。この成果概要には記載していないが、健常成山羊を用いたFontan循環モデルによる肺循環評価を実施できる状況を整えた。24年度が最終年度であるため、記入しない。Fontan循環モデルにおける基礎的検討から、低圧系における有効な循環補助のための高度な制御が必要となり得ることが明らかとなった。循環生理学的観点から肺循環に対する外部からの血行力学的サポートに関しては未だ有効な検証方法がなく、循環シミュレータおよび動物実験モデル(下大静脈-肺動脈吻合循環モデル)により開発した心外導管サポートシステムの循環動態評価を行ってゆく。これらの検討は研究当初予想された範囲内であり、各種センサを活用して完全埋め込み可能な微小アクチュエータを応用した右心系循環補助システム基盤を創成する。
熱帯海洋域における海面温度と大気の可降水量の日変化に関する研究

大規模場の運動と水蒸気変動の関係を調べた.その結果,大規模場の運動に伴って水蒸気は3-4日周期の変動をしており,この3-4日変動がSSTの顕著な日周期により変調を受けた結果として,可降水量の日周期がみられることが分かった.この水蒸気の変動は,熱帯で最も卓越する大気擾乱の1つであるマッデン・ジュリアン振動の発達期に観測されたという点で重要で,マッデン・ジュリアン振動のメカニズム解明にも繋がる可能性のある成果である.大規模場の運動と水蒸気変動の関係を調べた.その結果,大規模場の運動に伴って水蒸気は3-4日周期の変動をしており,この3-4日変動がSSTの顕著な日周期により変調を受けた結果として,可降水量の日周期がみられることが分かった.この水蒸気の変動は,熱帯で最も卓越する大気擾乱の1つであるマッデン・ジュリアン振動の発達期に観測されたという点で重要で,マッデン・ジュリアン振動のメカニズム解明にも繋がる可能性のある成果である.熱帯海洋上の対流活動は,対流活発期においては明け方に降水の極大となる一方で,対流抑制期の海上風が弱く静穏な状況下では,夕方に降水の極大となることが良く知られている.海面温度(SST)は,海上風が弱く静穏な状況下で,顕著な日変化を示す.こうした対流抑制期の顕著なSSTの日変化は,海上における夕方の降水活動に影響を与えていることが幾つかの研究で示唆されている.しかし,これまで間接的な状況証拠だけの議論が行われており,SSTと降水の日変化の関係は,未だに結論が出ていない.以上の背景から本研究では,「対流活動に大きな影響を与える可降水量に注目し、数値モデルによるシミュレーションデータと観測データを比較しながら,対流抑制期の日中の可降水量の変動特性と、その変動における海面フラックスや大規模場の運動等の影響を明らかにする」ことを具体的な目的としている.上記の研究目的に対して,21年度は、次のデータを取得・整備した.(1)フルレ島とガン島で行っているGPS-可降水量観測データ(2)大規模スケールの運動による可降水量日変化の寄与を定量的に評価する為の全球モデルによる数値シミュレーションのデータ.特に(2)に関しては、解析の結果、以下のことが判明した。対流圏の熱帯域における力学場、特に温度は、大気潮汐と考えられる顕著な半日周期を示していた。この温度の半日周期は、力学的な温度低下を通じて水蒸気の凝結量の増加を促すことで、日中の降水量の増加に寄与していることが分かった。この結果は、SSTの変動が存在しない場合でも日中の降水量増加をもたらす可能性があるということを明らかに点で重要で,この研究では,これまでにない降水メカニズムを指摘したと言う点で,大きな成果が現時点で得られていると考える(論文として投稿し,受理された).熱帯海洋上の対流活動は,対流活発期においては明け方に降水の極大となる一方で,対流抑制期の海上風が弱く静穏な状況下では,夕方に降水の極大となることが良く知られている.海面温度(SST)は,海上風が弱く静穏な状況下で,顕著な日変化を示す.こうした対流抑制期の顕著なSSTの日変化は,海上における夕方の降水活動に影響を与えていることが幾つかの研究で示唆されている.しかし,これまで間接的な状況証拠だけの議論が行われており,SSTと降水の日変化の関係は,未だに結論が出ていない.以上の背景から本研究では,「対流活動に大きな影響を与える可降水量に注目し、数値モデルによるシミュレーションデータと観測データを比較しながら,対流抑制期の日中の可降水量の変動特性と,その変動における海面フラックスや大規模場の運動等の影響を明らかにする」ことを具体的な目的としている.上記の研究目的に対して,22年度は,日中の可降水量変動について定量的な評価を行い,海面からのフラックス量だけは,可降水量の日中の増大を説明するには足りず,大規模場の運動による収束などを考える必要があることがはっきりと示した.そのため,熱帯海洋上の観測データを用いて,大規模場の運動と水蒸気変動の関係を調べたところ,大規模場の運動により水蒸気は3-4日周期の変動をしており,更に,この3-4日変動がSSTの顕著な日周期により変調を受けた結果として,可降水量の日周期がみられることが分かった.この水蒸気の変動は,熱帯で最も卓越する大気擾乱の1つであるマッデン・ジュリアン振動の発達期に観測されたという点で重要で,マッデン・ジュリアン振動のメカニズム解明にも繋がる可能性のある大きな研究成果であると考える(以上の内容を論文として投稿し,受理された).
胸腺内アセチルコリン受容体のアポトーシスと重症筋無力症の発症に関する研究

目的:重症筋無力症(以下MG)は、胸腺に、胸腺過形成(胸腺炎)または胸腺腫などの異常を伴う。我々は、MGの自己抗原であるニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)蛋白が、胸腺内、特に、胸腺上皮性細胞に存在し、アポトーシス誘導抗原である、Fasと共存することを報告してきた。nAChR蛋白のアミノ酸配列内には、T細胞エピトープがあるが、Fas蛋白のアミノ酸配列は、それらのエピトープを共有していることを見い出して、国際神経筋学会に発表し(Kawanami S, et al. Muscle & Nerve Supp 7, S122, 1998)、論文は、投稿中である。本研究は、胸腺内細胞構築のどこに、自己免疫のtriggerとなる、nAChR抗原が存在するかを研究し、MGにおける、自己免疫の、発症機構を明らかにすることを目的とした。方法と結果:胸腺内nAChRについては、各種抗体を用いた免疫組織染色を行い、胸腺組織内のnAChR蛋白や、Fas抗原蛋白の存在については、胸腺抽出物を用いた、ECL-Western blotにより検索を続けてきた。さらに、培養胸腺組織細胞におけるnAChRの有無について、同様に研究し、平成12年5月の神経学会総会に発表の予定である。nAChRのsubunitsについて、ヒト横紋筋肉腫の培養細胞系(TE-671)において検討し、RNA分離、cDNA合成、各々のプライマーを用いたreverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR)の条件を決定した[Rhabdomyosarcoma cell line (TE-671)におけるアセチルコリン受容体の発現。臨床神経37:1308,1997].これらの実験条件を応用して、平成10年度、本科学研究費補助金により購入させて頂いた、Gene Amp In Situ PCR system 1000を使用し、胸腺組織におけるnAChR遺伝子の発現について、研究を開始した。Biotin標識deoxynucleotideを用い、凍結切片において、In situ PCRを行い、labeled streptavidin-biotin(LSAB)法による、免疫組織染色を応用し、Alkaline phosphataseを発色させることにより、増幅されたnAChR-DNAの検出に成功した。この方法は、多方面の研究に応用が可能であり、MG及び、正常対照の胸腺組織において、研究を続けている。結論:nAChRは、胸腺の上皮性細胞のうち、免疫組織学的には、髄質、皮質の両者に認められたが、In situ PCRによると、subunitにより、その分布を異にすることが推定された。このnAChR-FCTを抗原として、ラットにexperimerital autoimmune myastheniagravis(EAMG)を、惹起することに成功している。胸腺内のリンパ組織ではなく、上皮細胞に、apoptosisを誘導するFas抗原が存在していることをmonoclonal抗体を用いた、免疫組織染色法により観察した。生化学的には、Westernblotにより、胸腺腫に、nAChRの4 subunitsとFasがはあることを見出し、生化学的にも、アミノ酸配列にhomologyがあることを報告している(Kawanami S,Mori S et al.,submitted)。本研究は、このnAChRとFas抗原の局在を、polyclonal,およびmonoclonal抗体を用いた免疫組織学的方法と併せて、nAChRのsubunitおよびヒトFasのprobeを用いて、過形成胸腺、ヒト正常胸腺、胸腺腫において、in situ hybridizationの方法により、細胞レベルで検討している。臨床神経37:1308,1997].これらの実験条件を応用して、平成10年度、本科学研究費補助金により購入させて頂いた、Gene Amp In Situ PCR system 1000を使用し、胸腺組織におけるnAChR

遺伝子の発現について、研究を開始した。Biotin標識deoxynucleotideを用い、凍結切片において、In situ PCRを行い、labeled streptavidin-biotin(LSAB)法による、免疫組織染色を応用し、Alkaline phosphataseを発色させることにより、増幅されたnAChR-DNAの検出に成功した。この方法は、多方面の研究に応用が可能であり、MG及び、正常対照の胸腺組織において、研究を続けている。結論:nAChRは、胸腺の上皮性細胞のうち、免疫組織学的には、髄質、皮質の両者に認められたが、In situ PCRによると、subunitにより、その分布を異にすることが推定された。目的:重症筋無力症(以下MG)は、胸腺に、胸腺過形成または胸腺腫などの異常を伴い、MGの自己抗原であるニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)蛋白が、胸腺内に存在することが知られている。我々は、nAChR内には、T細胞エピトープがあるが、アポトーシス誘導抗原である、Fasは、それらのエピトープを共有していることを見い出して発表し(Kawanami S,et al.Muscle&Nerve Supp 7,S122,1998)、論文は、投稿中である。本研究は、胸腺内細胞構築のどこに、自己免疫のtriggerとなる、抗原が存在するかを検索し、MGにおける自己免疫の発症機構を明らかにすることを目的とした。方法と結果:胸腺内nAChRについては、各種抗体を用いた免疫組織染色を行い、胸腺組織内のnAChR蛋白や、Fas抗原蛋白の存在については.胸腺抽出物を用いた、ECL-Western blotにより検索を続けてきた。さらに、培養胸腺組織細胞におけるnAChRの有無について、同様に検討し、平成12年5月の神経学会総会に発表の予定である。nAChRのsubunitについて、TE-671の培養細胞系において検討し、RNA分離、cDNA合成、各々のプライマ-を用いたRT-PCRの条件を決定した[Rhabdomyosarcoma cell line(TE-671)におけるアセチルコリン受容体の発現。臨床神経37:1308,1997].これらの実験条件を応用して、平成10年度、本科研費により購入した、Gene Amp In Situ PCR system 1000を使用し、胸腺組織におけるnAChR遺伝子の発現についての研究を開始した。この方法は、多方面の研究に応用が可能であり、MG及び、正常対照の胸腺組織において、検索を続けている。
分子遺伝学を応用したブタ体細胞クローン動物の開発研究

本研究の当初の目標は体細胞クローンブタの作出であったが、2000年に体細胞クローンブタの作出成功例が報告されたため、2000年度以降は核移植胚作成の材料となる未成熟卵や初期胚の生理機構と発生制御因子の動態を解析し、クローン作出の効率向上に向けた基礎研究を行うことに主眼を置いた。(1)まず、成熟卵からのスピンドル除去、体細胞核注入といったクローン作出過程により、発生に重要な細胞分裂期促進因子(MPF)やMAPキナーゼ(MAPK)が除去される可能性を検討した結果、MPFはほとんど除去されず胚発生に影響しないが、MAPKは約20%が除去され発生に影響する可能性を示唆した。(2)次に核置換されて成熟卵内で凝縮した体細胞染色体にこれらの因子が局在してくるかを検討した結果、チューブリンが集合したものはMPF, MAPKが集合するが、チューブリンが集合しないものではMPF, MAPK共に集合しないことが明らかとなった。またチューブリンが集合したものの率は卵活性化後の前核形成率と良く一致し、チューブリン集合がその後の発生能と関連することを示唆した。(3)次に成熟過程において減数分裂再開と同時に起こる蛋白質合成パターン変化を制御する因子の候補としてMPFとMAPKを仮定し、これらのmRNAやアンチセンスRNAの卵注入により活性を変動させ、蛋白質合成パターンの解析を行った。その結果、蛋白質合成パターンの変化はMPF活性により誘起されることを見出し、MAPK活性はこの過程には無関係であることを示した。(4)最後に初期胚発生に特異的に見られる、間期を持たずDNA合成(S)期と分裂期を繰り返す特殊な細胞周期の原因として、S期開始の抑制制御因子であるRb蛋白質の欠如を仮定した。まず初期発生過程のRb発現状態をmRNAと蛋白質レベルで検討し、4細胞期から胚盤胞期までRbは実質的に存在しないことを示した。次にRb発現ベクターの初期胚注入により、Rb発現胚では特異的に初期発生が有意に抑制されることを確認した。以上の結果は卵の生理機構として哺乳動物のみならず全ての種を含めて初めて明らかにされたものであり、クローン作出の効率を高めるための基礎データとして貴重なものと考えられる。本研究の最終的な目標は体細胞クローンブタを作出すること、さらにその過程で胚の発生を左右する重要な要因の動態を解析することである。本年度は核移植胚の再構築技術の確立に重点を置き、マウスで報告されている方法を基にブタに適するよう改変した。まずブタ成熟卵から第二減数分裂中期の紡錘体を識別する方法として、卵を蛍光色素で染色した後に蛍光顕微鏡下で判別する方法を用いた。卵子に対する悪影響を考慮し蛍光照射時間は数秒以内とし、ピエゾ装置を用いて紡錘体の除去に成功した。現在1回に30個ほどの核除去卵が作成可能である。次にウシ、マウスで成功例が報告され採取も容易な卵丘細胞の核をドナー核とし、直接卵細胞質中に注入する方法を採用して、現在のところ1回に15個ほどの核移植ができるようになっている。移植された核は卵の高MPF活性を反映して核膜崩壊、染色体の凝縮が起こることを確認した。

現在卵子の活性化法としてストロンチウム、エタノール、バナデイト、チメロザールを検討し、バナデイト、チメロザール以外は効果が低いとの結果を得ている。活性化機構を勘案しチメロザールを主に用いていく予定である。活性化後前核が形成されることは確認しているが、まだ卵割を起こすには至っていない。また、本年度は核除去卵の細胞分裂制御因子の動態も解析した。未成熟卵から核(GV)の除去法を確立し、1回に50個以上の核除去卵の作成が可能となった。これを培養し、タンパク質合成、卵成熟制御因子(MPF)およびMPF活性に影響すると考えられるMAPKの活性を測定したところ、正常卵と全く同様の動態を示し、卵はたとえ核が無くても細胞質に分裂を進ませる力が備わっていることを確認した。このことは体細胞核移植の場合、当面は卵細胞質のこれらの因子により発生が進行することを示した点で意義あるものと思われる。本研究の当初の目標は体細胞クローンブタを作出することであったが、昨年3つの研究グループから体細胞クローンブタの作出に成功したと報告された。そこで本年度は、この作成を第一目標とするのではなく最適な方法を探ること、さらにその過程で胚の発生を左右する要因、具体的には核移植胚の卵割制御因子の動態を解析していくことに主眼を置いた。クローン作出過程では成熟卵からスピンドルを除去し体細胞の核を注入するが、発生に重要な役割を果たす細胞分裂期促進因子(MPF)やMAPキナーゼ(MAPK)はスピンドルに局在すること、また体細胞核にはこれらが存在しないことが培養細胞や無脊椎動物の卵で報告されている。そこでスピンドルの除去に伴ってこれらの因子を共に除去してしまう可能性について検討した。その結果、MPFは極わずかしかスピンドルに局在しておらず、この除去は胚発生に影響しないこと、一方MAPKは約20%がスピンドルに局在しており、発生に対する影響が無視できないことを明らかにした。改善策として体細胞注入時にMAPKを共に注入することが考えられる。次に核置換されて成熟卵内で凝縮した体細胞の染色体にこれらの因子が局在してくるかを検討した。その結果、チューブリンが集合したものに関してはほぼ全てにMPF,MAPKが集合してくるが、チューブリンの集合が見られないものではMPF,MAPK共に集合しないことが明らかとなった。またチューブリンが集合したものの割合は卵活性化後に前核を形成する率と極めて良く一致しており、チューブリンが集合したもののみがその後の発生を起こし得ることが示唆された。以上、今回の結果は体細胞核による再構築胚における卵割制御因子の動態を調べた初めての物であり、今後のクローン胚の発生を改善していく上での基礎データとなるものと期待される。本研究の当初の目標は体細胞クローンブタを作出することであったが、2000年に体細胞クローンブタの作出成功例が報告されたため、昨年度以降は核移植胚作成の材料となる未成熟卵や初期胚の生理機構と発生制御因子の動態を解析することにより、クローン作出効率向上に向けた基礎研究を行うことに主眼を置いている。本年度は、(1)成熟過程において減数分裂再開と同時におこるタンパク質合成パターン変化を制御する因子を探ること、(2)初期胚発生に特異的に見られる、間期を持たずDNA合成期と分裂期を繰り返す特殊な細胞周期がどのような機構で出現するのか、の2点に注目した。
中学校で展開する放射線の独自教材の作成と協調授業の萌芽的研究

2012年度から実施されている中学校理科の学習指導要領では、放射線に関する学習項目が復活したが、3年生の理科のまとめの単元「科学技術と人間」に数ページの記載があるだけである。そこで中学13年生でも実施可能な放射線についての学習計画や学習教材を作成し、国民一人一人が放射線に対して正しい知識に基づいて判断し、自ら行動できるような学習基盤を作成し、実践することを本研究の目的としていた。たとえば、教材作成のために身のまわりの放射線の測定の実施や、中学13年生の理科の授業の中で扱ってきた放射線の単元を整理した(投稿準備中)。一方、高等学校での放射線の実験・実習の実態調査を行い、高等学校では放射線に関する授業がほとんど実施されていないことを明らかにした(投稿中)。また、放射線に関連する事項として、学校行事として「オーロラを見よう!」という理科海外研修旅行を企画・実行し、太陽風が地球の磁場の磁力線によって影響を受け、窒素原子や酸素原子と衝突した際に生じるオーロラの発生時にγ線の線量を測定するなどの活動を行った。これらの調査・実践の結果、中学校の理科の学習において、以前のような「エネルギーの単元」の一部として放射線を扱うのではなく、純粋に放射線について学習できるような授業の必要性を再確認することができた。本研究によって、放射線の学習に必要な基礎的な題材を集めることができたので、今後はテキストを完成し実践報告を投稿する予定である。