hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
手術侵襲と術後感染症における単球機能の解析

当科での手術症例、胃癌24例、食道癌7例、胆石症7例、大腸癌7例、HCC10例、良性疾患緊急手術4例、膵癌8例、胆嚢癌3例、乳癌6例を対象に術前、術後1,3,5,7,14日目の末梢血単核球をフローサイトメトリーでCD11b陽性単球のHLA-DR発現率を測定。血清IL-6,IL-8値はELISA法にて測定。結果はHLA-DR発現率(%)では胃癌は術前41.44で1日目35.15に減少、7日目には39.07に増加。食道癌は術前48.05で14日目67.99と漸増。胆石では術前38.69,7日目に65.77に漸増。大腸癌は術前43.61,1日目35.02,14日目47.42に漸増。HCC群は術前36.9,1、3日目には32.5,5日目以降49.8。緊急群は術前34.55,1日目65.77,3日目は42.04に減少。膵癌は術前44.46,1日目32.46,7日目は51.72に漸増、14日目は36.73。胆嚢癌は術前47.67,1日目27,94,3日目以降46.5。乳癌は術前22.48,7日目は46.31に漸増。IL-6(pg/ml)は術前、1日目、3日目の順に胃癌、37.2,67.38,41.48,HCC、24.35,30.19,21.5,膵癌、57.41,165.47,73.48と1日目が高値の推移をし、食道、51.77,48.53,58.92大腸、46.24,34.61,79.49胆嚢,54.12,39.08,64.69はと1日目に低下する推移を呈した。胆石、乳癌は術前、7日目それぞれ38.46,7.23、21.66,17.83と漸減した。緊急群は術前691.69の高値が1日目9.3と急激に減少した。IL-8(pg/ml)は胃癌8.22,14.62,7.04、HCC14.62,15.35,13.27、膵癌13.15,249.97,16.17とIL-6同様に推移し、食道41.78,27.09,46.51、大腸10.35,8.02,9.46ともIL-6同様の推移を示した。胆石3.88,3.93,2.81、乳癌3.39,2.5,2.85とIL-6とは反対の推移をした。緊急群はIL-6同様術前361.2、1日目12.98と推移した。単球の免疫能の発現には1)十分な免疫能下においては抗原量の大小に応じた発現2)免疫抑制の状態では抗原量に無関係に発現低下、が示唆された。IL-8は単球由来好中球遊走化因子として生体に合目的的に働く場合と、単球に対して抑制的に働く場合があることが示唆された。単球表面抗原の内、CD11bは単球の遊走に関与し、HLA-DRは単球/マクロファージが認識した抗原をT細胞へ提示することにより細胞性免疫に関与しているとされている。周術期における、この単球の表面抗原の変動と血中サイトカイン(IL-6,IL-8,IFN-r)の変動の関係を検討した。【対象と方法】1995年7月1996年4月までの当科での手術例、胃癌群(G群)23例、食堂癌群(E群)8例、膵臓癌(膵頭十二指腸切除例)群(P群)7例、緊急手術(良性疾患の腹膜炎)群(Em群)4例を対象とし、術前、術後1、3、5、7、14日目の末梢血単球の表面抗原CD11b及びHLA-DRのMean Fluorescence Intensity(以下MFI)をFACSCANにて測定した。また同時日における血清IL-6,IL-8,IFN-rをELISAにて測定した。これらの症例は術後感染症はみられなかった。【結果】G群;E群;P群;Em群の単球数は各群間に有意差は認めなかった。CD11bのMFIは術前値、第1病日、第14病日のG群;E群;P群;Em群それぞれ、37.7,29.8,33.0;29.6,18.6,18.3;32.1,29.4,22.5;12.3,19.1,39.7であった。HLA-DRのMFIは同様にG群;E群;P群;Em群それぞれ、62.7,
HGFによる形態形成および器官形成・再生の分子生物学的解析

組織・器官の正常な機能発現のためには高次的な細胞社会の構築が必須である。このような組織特異的な形態形成、生理的機能獲得においては上皮-間葉組織の相互作用が重要な役割を果たしていることが古くから提唱されて来た。上皮細胞の増殖、運動、形態形成を司る肝細胞増殖因子(HGF)は上皮-間葉相互作用の主翼を担う必須の因子として再生、組織修復を始めとする生体恒常性の維持に重要な役割を担うことが予想された。そこで研究代表者らは疾患モデルにおいてHGFブロック実験を行い、傷害認知の元に誘導されて来るHGFが肝臓や腎臓、肺を始めとする様々な実質臓器での組織修復・臓器保護を司る必須の生理的因子であることを明らかにした。次いで内因性修復因子の本体であるHGF(またはその遺伝子)の体外的補充が肝硬変や腎不全、心筋梗塞などの様々な急性および慢性疾患での発症予防、病態改善をもたらすことを立証した。その一方でHGFが癌組織においては浸潤・転移を促進する宿主間質由来因子であり、そのアンタゴニストとして調整したNK4が膵臓癌などの多くの悪性腫瘍の浸潤・転移を阻止することを見出した。さらに私達がHGF受容体(c-Met)のファミリー分子の探索過程で新規に同定したLIMキナーゼの機能解析を行い、その活性化制御機構と生理的機能を明らかにした。1.神経特異的HGF発現動物の作製とその解析成体神経組織に特異的な発現を呈するneuron-specificenolaseプロモーターの下流にHGF cDNAを連結し、トランスジェニック(Tg)マウスの作製を行った。遺伝子導入が確認できた9系統中、6系統で神経特異的なHGF発現・産生が認められた。胎児および成体の脳・神経組織には特に異常はみられなかった。現在、HGFの神経栄養因子としての機能を検討するため、これらのマウスの筋萎縮性側索硬化症(ALS)モデルのSOD-1 Tgマウスと交配し、神経の組織形態および機能に及ぼす影響を経時的に解析している。2.ケラチノサイト特異的HGF発現動物の作製とその解析ケラチン14プロモーターの下流でHGFを高発現するTgマウスを作製した。このTgマウスでは皮膚や毛には特に異常を認められなかったが、メラノサイトとの異所性増殖がみられた。胎児および成体皮膚組織の詳細な解析により、HGFはメラノサイトの遊走および増殖を促進することが明らかになった。3.NK4発現動物の作製HGFの分子内断面はNK4はHGFアンタゴニストとしての活性を有している。メタロチオネインプロモーターの下流でNK4を発現するTgマウスの作製を行った。遺伝子導入が確認できた15系統中、10系統でZn^<2+>投与によるNK4の高い発現誘導がみられた。その主な産生臓器は肝臓、腎臓、小腸であり、系統によっては筋や脳、肺でも高発現がみられた。現在、各種疾患モデル実験系を用いてNK4の器官・組織構築および修復に及ぼす影響を検討している。Cre-LoxPシステムを用いたc-metノックアウトマウスを作製するため、c-metゲノム遺伝子のクローニングを行い、キナーゼ領域の近傍(エクソン1418)を含むゲノム断片を基にターゲティングベクターを構築した。現在、このベクターをES細胞に導入して相同組み換え体の作製を進めている。HGFの各種難治性疾患に対する治療効果[心筋梗塞]心筋梗塞のラットモデルを作成し、心筋梗塞の進行におけるHGFの保護的役割を検討した。ラットの左心冠状動脈を結紮/解除すると、心筋梗塞の拡大に一致して血中HGF濃度は5-10倍に上昇する。そこでこの生理的機能を検証すべく心筋梗塞を発症したラットにHGF中和抗体を投与した結果、梗塞巣のさらなる拡大に一致して心機能が低下し、48時間以内に半数の動物が死亡した。逆に心筋梗塞発症に先立ってリコンビナントHGFを速やかに静脈内投与したところ、心筋細胞において抗アポトーシス分子であるBcl-xLの発現上昇に一致して心筋アポトーシスは抑制され、梗塞巣の拡大も強く抑制された。

結果的にHGF投与によって心筋梗塞ラットでの心機能は著しく改善された。[筋萎縮性側索硬化症]近年、HGFの神経栄養因子としての機能が注目されている。そこで神経変性疾患の中でも特に重篤で、治療が困難である筋萎縮性側索硬化症(ALS)に対するHGFの治療効果を検討した。まずALS発症モデルマウス(ALS-Tgマウス)では疾患の進行に伴い、脊髄組織におけるHGFおよびそのレセプター(c-Met)の発現が促進されることを見い出した。そこで神経特異的にHGFを発現するトランスジェニックマウス(NS-HGF-Tgマウス)を作成し、このマウスをALS-Tgマウスと交配させることにより、HGFのALS発症抑制効果を調べた。その結果、NS-HGF/ALS-TgマウスではALS-Tgマウスに比べて運動神経の軸索変性および細胞死が著明に改善されており、それに伴いALS発症時期の遅延ならびに寿命の延長が認められた。さらにHGFによるALS進行遅延効果は運動神経への直接作用に加えて、グリア細胞の特異蛋白質(グルタミン酸トランスポーター等)の発現制御や反応性増殖の阻害を介していることも明らかになった。本年度は肝再生および肺再生のマウスモデルにおいてHGFブロック実験を行い、傷害認知の元に誘導されて来るHGFが肝臓や肺の再生に必須の生理的因子であることを明らかにした。即ち、70%部分肝切除または左肺切除したマウスにHGF中和抗体を投与したところ、肺細胞や肺胞細胞の増殖は抑制され、逆にリコンビナントHGFの補充が肝臓や肺の傷害モデルにおいて再生を駆動すること、さらに損なわれた生理的機能を改善させることが分かった。さらに胆道閉鎖症および肺線維症のマウスモデルにおいてもHGFの中和処理によって組織再生不良に基づく組織線維化が進行した。このことから、代償期に誘導される内因性HGFは肝臓や肺の実質細胞に再生を促すとともに組織線維化を抑制する生理的機能を有することが判明した。さらに難治性疾患の代表とされる心筋症のハムスターモデルでも組織繊維化の初期では内因性HGFの産生が冗進しており、線維化の進行、心機能不全の悪化に伴いHGF産生能が阻害されることが分かった。そこでこの因果関係を明らかにすべく、HGF産生が低下し始める27週齢の心筋症ハムスターにリコンビナントHGFを投与したところ、組織繊維化の改善とともに損なわれた心筋収縮能が改善されることも分かった。以上の結果から、傷害認知の元に誘導されるHGFは急性および慢性の様々な臓器傷害に際して、実質再生を駆動するとともに間質繊維化を抑制する必須の役割を担っていることが明かとなった。このような生理活性を有するHGFの体外的補充は様々な急性・慢性疾患の病態に基づいた合理的な治療戦略となると考えられる。
糖鎖を有する蛍光性シクロデキストリンを用いる分子認識

クロモフォアで修飾したシクロデキストリン(シクロデキストリン:CD)は、多くの場合、クロモフォア部分をCDの空孔内に入れた自己包接体を形成する。しかし、ゲストと結合する際に、クロモフォアをCD空孔の内部から空孔外に追い出す。このInduced-fit挙動は、クロモフォア周辺の環境を疎水性のCD空孔から水環境に変える。クロモフォアが疎水性環境で強い蛍光を示すダンシルの場合、ゲスト包接は蛍光強度を弱くする。この蛍光強度の変化を利用してゲスト分子の存在を検出することができる。本研究ではダンシル単位を有するタンパク結合性のビオチン修飾P-CD(1)を合成し、タンパク質アビジンのビオチンへの結合がゲスト包接にいかなる効果を及ぼすか検討した。1はゲスト化合物である1-アダマンタノール添加によって蛍光ピークの強度が39.2%減少したが、アビジン存在下では4.2%の減少であった。この結果から、アビジンの存在によって蛍光性単位であるダンシルの空孔外への移動が制限されることが明らかになった。また、蛍光性単位としてダンシル、糖単位としてグルコース単位を有する修飾β-CD(2)も合成した。この場合、タンパク質であるコンカナバリンAがグルコースと結合する。現在、コンカナバリンAの2への結合が2の包接挙動にどのような影響を及ぼすか検討している。
c-MYC, HIF-1による大腸癌の抗癌剤抵抗性獲得機構の解明

本研究期間を通じて、我々は、抗癌剤抵抗性の獲得につながる微小環境として知られる、低グルコース環境下で培養されたヒト大腸癌細胞株COLO-320において、抗癌剤抵抗性が獲得され、転写因子HIF-1α活性(標的DNAに対する結合能や標的遺伝子の発現量)の増加、さらにHIF-1αノックダウンによる切断型PARP-1の増加が認められ、アポトーシスが誘導されていることを明らかにした。また、低グルコース環境下で培養されたヒト大腸癌細胞株COLO-320において、転写因子STAT3活性の増加、STAT3ノックダウンによる切断型PARP-1の増加が認められたが、HIF-1αノックダウンによる切断型PARP-1の増加に比べ、低値であった。以上より、HIF-1αが大腸癌細胞の抗癌剤抵抗性の獲得に貢献していることが明らかとなった。今後、癌関連転写因子であるc-MYCにも着目し、c-MYC阻害、HIF-1α阻害、さらにc-MYC阻害とHIF-1α阻害の併用効果を検討する予定である。低グルコース環境下で培養されたヒト大腸癌細胞株COLO-320を用いて、同様の検討を4群(コントロール群、c-MYC阻害剤10058-F4処理群、HIF-1α阻害剤Chrysin処理群、10058-F4+Chrysin処理群)において行い、抗癌剤抵抗性獲得の分子機構を解明していきたいと考えている。本年度は、大腸癌の細胞生存力におけるHIF-1αの役割を検討した。ヒト大腸癌細胞株COLO-320から核蛋白質を抽出し、ゲルシフトアッセイによりHIF-1αの標的DNAに対する結合を確認し、さらにRT-PCRにより、HIF-1αの標的遺伝子(OCT4, VEGF)の発現を確認した。また癌細胞の細胞生存力の亢進につながる微小環境として、低酸素や低栄養環境が知られており、低グルコース環境下におけるHIF-1αの活性(標的DNAに対する結合能や標的遺伝子の発現量)の変化を調べたところ、HIF-1αの活性の増加が認められた。さらにCOLO-320にHIF-1αに対するsiRNAを導入し、HIF-1αノックダウンによるアポトーシス誘導率の変化を検討したところ、通常濃度のグルコース存在環境、低グルコース環境のいずれの場合でもアポトーシスの指標である切断型PARP-1の増加が認められた。本研究成果により、HIF-1αが大腸癌の細胞生存力の亢進に貢献していることが明らかとなった。大腸癌細胞の生存力におけるc-MYCの役割を検討した。ヒト大腸癌細胞COLO-320においてc-MYCの発現・機能を抑制すると細胞生存率が低下し、5-FU処理との併用により更なる抑制効果が認められた。さらにc-MYCの発現・機能抑制によりABCトランスポーターの一つであるABCB5の発現レベルの減少も認められた。同様の結果がマウス皮下におけるxenograftモデルにおいても観察された。以上より、c-MYCの発現・機能抑制と5-FU処理との併用は大腸癌細胞の生存力の低下に有効であることが明らかになった。本研究成果は、大腸癌細胞の生存力に対するc-MYCとHIF-1の阻害効果を検討する上で参考になるため。大腸癌細胞の細胞生存力の亢進におけるHIF-1αの役割が明らかとなり、本研究成果は、次年度に行う予定である通常濃度のグルコース存在環境下及び低グルコース環境下における大腸癌の細胞生存力に対するc-MYCとHIF-1αの阻害効果を検討する上で参考とすることができるため。今後は、c-MYC阻害剤である10058-F4, HIF-1阻害剤であるchrysinを用いて大腸癌細胞の生存力に対するc-MYCとHIF-1の阻害効果を通常濃度のグルコース存在環境下および低グルコース環境下において検討する。

次年度は、c-MYC阻害剤である10058-F4, HIF-1α阻害剤であるchrysinを用いて、大腸癌の細胞生存力に対するc-MYCとHIF-1αの阻害効果を通常濃度のグルコース存在環境下及び低グルコース環境下において検討する予定である。当初の使用計画よりも低予算で実験を進めることができたため。次年度は大腸癌細胞の生存力に対するc-MYCとHIF-1の阻害効果を検討する予定であり、その実験に必要な消耗品の購入に使用する予定である。次年度は、通常濃度のグルコース存在環境下及び低グルコース環境下における大腸癌の細胞生存力に対するc-MYCとHIF-1αの阻害効果を検討する予定であり、その研究費用に使用する。
臨床判断能力を涵養する外来診療教育プログラム開発

今年度は、名古屋外来診療教育プログラム(NACTA)に参加したすべての医学生に質問紙法によるアンケートを実施し、NACTAに対する認識と、臨床実習中の他の外来実習の現状、学生の臨床判断能力の開発過程に関して調査した。データは量的・質的に検証され、これまで得られていなかった知見を得ることができた。すなわち、(1) 90%の学生は臨床実習中の臨床判断の学習到達度・知識の獲得量に満足していたが、診断の付いていない患者を外来で診る機会は0-10回/年程度、病棟では0-9回程度でしか無かった。これは診断学学習に推奨される症例数より圧倒的に少数であり、有意義な実習が行われたとは言い難い。(2) NACTAのような外来診療実習は、他の部門の臨床実習には存在せず、極めてユニークであり、学生はその意義を強く感じていた。(3)臨床判断能力を涵養するため、具体的には、1)指導医による確実な観察と指導を受けられる状態で、学生が自己主導的に多くの症例を経験できる学習環境、2)未診断の患者の医療面接と身体診察を行い、指導医や同僚と議論し、相互の知識や疾患概念を共有していく学習方略、この2つが必須となる。本研究は、日本の臨床実習における臨床判断能力開発の現状を明示した意義がある。その現状は先行研究で推奨される実習と大きな乖離があり、問題も認識されてこなかった。より良い臨床判断能力開発の具現化のため、多忙な臨床現場の中で、臨床医が効率的に教育指導できるスキル、および自己主導的な臨床実習、症例を多く共有できる学習方略、これらが必須である。今回得た知見は、臨床実習の改善の基盤となるという点で、非常に重要である。今年度は、臨床判断能力を判定する試験の開発のため、情報収集・先行文献検索・ディスカション活動を重ねた。また総合診療部の「臨床判断能力を涵養する」ための教育方略に関しても検討を同時に加えるため自己評価アンケート実施した。(1)臨床判断能力テスト開発:試験開発のため、その試験の構成・問題形式・解答形式・出題問題数について検討を重ねた。結果を要約する。*構成は臨床判断能力を問う症例問題+知識を問う多肢選択型問題と決定した。理論的には、Key Feature理論を用いた症例問題を土台にする。Page & Farmer(2005)による問題作成ガイドに基づき問題作成を行なっている。*解答形式は当初、短文解答式(SAQ)を予定も、多肢選択型問題(MCQ)がより妥当であろうと判断し、MCQを採択することとした。*問題数を症例問題30題、知識に関する問題は80問とすることで統計学的解析可能と判断した。(2)臨床判断能力テスト実施計画:試験実施はリクルートの関係上、今年度以内に実施することが出来ず、2007年4月6日に実施予定とした。*統計学的に耐えうる数として各学年約30名ずつをリクルートした。*院内の臨床受託研究審査委員会に申請し、認可された。(3)総合診療部実習における医療面接実習に関する自己評価アンケートを実施:*実習体制・効果の判定を継続的に行った。(結果は解析中)*アンケート集計結果は、臨床判断能力テストの結果の解釈の際の考察内容として扱う予定。*アンケート集計結果は、来年度以降のプログラム改編にも利用される予定である。今年度は、平成18年度に作成された、本邦初(Pubmed.医中誌検索【2007.3.11現在】)のKey Feature理論に基づいた臨床判断能力テストを実施した。テストの構成は、以下の通り2部構成とした。1)第1部:臨床判断を問う症例問題[内訳:1-1.重症で緊急性のある疾患15題+1-2.軽症で緊急性のない疾患15題]2)第2部:知識を問う多肢選択型問題[2.上記の疾患に関連した知識を問う問題90題]リクルートの結果、平成18年度ポリクリを終えた6年生33名と平成19年度ポリクリに臨む新5年生44名が集まった。試験は平成19年4月6日、全員に実施された。これら2学年の試験成績を算出し、その平均点の差をt検定により比較検討した。また診療判断能力において、差の大きさをCohen's dによるEffect Sizeに換算し、1-1,1-2のいずれが大きな向上の度合いを見たか考察した。その結果、知識も臨床判断能力のいずれの平均点が有意に向上した(p<0.00,p<0.00)。またEffect Sizeを検討した結果、1-1は0.666、1-2は0.957であり、つまり重症ではない・緊急性のない疾患に関する臨床判断能力の向上の方が大きいことを示した。これにより臨床判断能力が現在のポリクリ教育体制を通じてどの程度向上するか知見が得られた。これは日本においてほとんどデータが無かったため貴重である。今後は、どういった教育環境がこの臨床判断能力の向上に寄与したのか、総合診療部実習における医療面接実習に関する自己評価アンケートで得られた結果との関連性と合わせて研究中である。またこの臨床判断能力の向上の度合いは、外来教育体制の改善により、さらに向上するものなのかを探索していく計画である。

データは量的・質的に検証され、これまで得られていなかった知見を得ることができた。すなわち、(1) 90%の学生は臨床実習中の臨床判断の学習到達度・知識の獲得量に満足していたが、診断の付いていない患者を外来で診る機会は0-10回/年程度、病棟では0-9回程度でしか無かった。これは診断学学習に推奨される症例数より圧倒的に少数であり、有意義な実習が行われたとは言い難い。(2) NACTAのような外来診療実習は、他の部門の臨床実習には存在せず、極めてユニークであり、学生はその意義を強く感じていた。(3)臨床判断能力を涵養するため、具体的には、1)指導医による確実な観察と指導を受けられる状態で、学生が自己主導的に多くの症例を経験できる学習環境、2)未診断の患者の医療面接と身体診察を行い、指導医や同僚と議論し、相互の知識や疾患概念を共有していく学習方略、この2つが必須となる。本研究は、日本の臨床実習における臨床判断能力開発の現状を明示した意義がある。その現状は先行研究で推奨される実習と大きな乖離があり、問題も認識されてこなかった。より良い臨床判断能力開発の具現化のため、多忙な臨床現場の中で、臨床医が効率的に教育指導できるスキル、および自己主導的な臨床実習、症例を多く共有できる学習方略、これらが必須である。今回得た知見は、臨床実習の改善の基盤となるという点で、非常に重要である。
複合砂丘ダイナミクス解明に向けて：アナログ実験によるアプローチ

地球や火星など様々な天体に見られる複合砂丘・ネットワーク型砂丘の再現を念頭におき、流向が周期的に変化する一次元振動流下で準安定状態に達するベッドフォームについての二方向振動板実験に取り組んだ。実験の結果、典型的には蜂の巣状ベッドフォーム、格子状ベッドフォーム、二次元ベッドフォームが形成され、(1)流向の多様性、(2)流速、(3)流れの持続時間、(4)粉体特性がベッドフォームに及ぼす影響が明らかになった。豊浦標準砂を実験試料、平滑床を初期地形とする砂床に、各振動の作用角、振動速度、振動回数をコントロールし、方向が異なる対称振動を順次作用させる実験を行った。この際、各振動成分の振動回数は十分小さく、単振動成分ではベッドフォームが定常状態に至らないようにした。実験の結果、二次元ベッドフォーム、格子状ベッドフォーム、蜂の巣状ベッドフォームをはじめとする多様なベッドフォームが形成され、実験の諸元とベッドフォームの間には以下の関係が見られた。(1)各振動成分同士がなす角、振動速度、振動回数が等しい場合、3成分以上の振動で蜂の巣状ベッドフォームが発達し、振動成分数の増加はベッドフォームの大局的なパターンに大きくは影響しなかった。(2)各振動成分同士がなす角を変化させると、振動成分数が小さいケースと類似するベッドフォームが形成される場合があった。特に2成分実験においては、各振動成分のなす角が45度以下の際に二次元ベッドフォームが形成される傾向があり、クレストラインの伸長方向は2振動の合成成分に直交する傾向を見せた。(3)各振動成分同士がなす角を一定とした場合、振動回数を一定として振動速度を変化させたケースと、振動速度を一定として振動回数を変化させたケースで類似するベッドフォームが形成される場合があった。これらの成果については、国際ワークショップにおいて公表した。現在、非対称振動による実験を進めており、類似する成果が得られつつある。昨年度の中粒砂実験結果を踏まえて、対称振動の方向変化の影響について、平滑床を初期地形として粗粒砂、極細粒砂実験を行ったところ、同等の結果が得られた。すなわち、振動成分数、各振動成分がなす角、振動速度、振動回数に依存し、蜂の巣状ベッドフォーム、格子状ベッドフォーム、二次元ベッドフォームが形成された。また中粒砂を用いて砂量の影響について検証実験を行った結果、砂量に応じて(1)谷部のみに固定床が露出し、他の地形は十分量の砂がある場合と同等の地形となるケース、(2)固定床の露出が多く、より不規則な地形が形成されるケースが観察された。いずれにおいても十分に時間経過し地形が発達した後は、時間と共に堆積物が拡散し、地形の縮小と露出部の拡大がすすむ傾向が見られた。非対称振動実験については、非対象振動の方向制御に問題があり十分な実験を行えていないものの、対称振動実験と同様に、二方向振動のなす角により平均流向とベッドフォームの波峰線の伸張方向のなす角が異なること、特に90度の場合にはネットワーク型砂丘と類似する格子状ベッドフォームが形成されることは確認できている。非対象振動の方向を制御することができれば、さらなる研究成果を得られるものと期待している。非対称振動の方向制御の高精度化が困難であったため、粗粒砂、極細粒砂を用いて一次元対称振動実験を行い、砂量の影響を評価した。その結果、中粒砂実験と同様に、砂量に応じて谷部が露出し、バルハノイド様の地形が形成されたが、非対称振動で形成されるものと比較してホーンが不明瞭になる傾向が見られた。また、細粒高密度粒子(ホワイトアランダム)を用いた一次元対称振動実験を行ったところ、一般的な二次元ウェーブリップルマークとは異なり、リップル波峰線が菱形格子を示す三次元ベッドフォームが形成された。このような地形の形成が、粒子密度に依存するのか、粒子間に働くいわゆる“粘着性"に依存するのかについてはさらなる実験が必要であり、検討を進めている。平成27年7月から平成28年1月にかけて持病が悪化し、当初予定の遂行が困難な状況にあったため。前年度までの実験結果を踏まえ、(1)対称振動流の方向変化と振動速度、振動回数の関係、(2)堆積物の存在量、(3)堆積物粒径がベッドフォームに及ぼす影響について着目し、追加実験を行った。実験条件については前年度までの実験を踏襲し、特に2成分振動について振動回数を一定として振動速度を変える実験、および振動速度を一定として振動回数を変化させる実験を中心に行い、類似するベッドフォームが形成される条件を検討した。実験結果から、少なくても本研究の実験条件の範囲においては、振動回数の増加と振動速度の増加はほぼ等価と見なすことができた。このような関係について、堆積物の存在量および堆積物粒径を変えた実験を通して検証した結果、堆積物が中粒砂ないし粗粒砂であり、かつ堆積物が潤沢である条件、および谷部のみに固定床が露出し、同等な振動条件下で堆積物が潤沢な場合と同等のベッドフォームが形成さえる条件おいて確認することができた。

任意方向の非対称振動を発生させる機構の構造的限界により、振動方向を細かくコントロールすることが困難な状況にあり、状況の改善を試みてきた。しかし、解決には至っておらず、当初予定していた実験の遂行を難しくしている。昨年度予定していた研究および成果発表を遂行する。堆積学非対称振動の角度調整に関する問題の解決に努めた上で、非対称振動を用いた前年度の実験を継承し、一定の成果を上げることを目指す。任意方向の非対称流を発生させる機構に存在する構造的な限界により,非対称振動の角度を細かくコントロールすることが困難な状況にある.状況の改善を試みているが解決には至っておらず,当初予定していた実験の遂行を難しくしている.平成27年7月から平成28年1月にかけて持病が悪化し、当初予定の実験・学会参加遂行が困難な状況にあったため。当初予定していた国際学会への参加を取りやめたため残額が生じた。研究を通して新に生じた実験課題への対応、および研究成果とりまとめ・成果発表に充てる予定である。非対称振動の角度調整に関する問題の解決に努めた上で,非対称振動を用いた前年度の実験を継続しつつ、砂量の影響について検討する。振動板装置の角度調整機構の向上、学会参加費に充てる予定である。ベッドフォーム形状解析ソフトウェアを導入したが、納品が3月下旬であったため、支払いが4月にずれ込んだため。ベッドフォーム形状解析ソフトウェアを導入済みで有り、4月に支払いを行った。
住民検診の血餅を利用したDNAバンクの作製

従来遺伝子DNAの抽出にあたっては抗擬固剤を入れ、新たに採血するのが一般的であった。また抽出方法についても、面倒な白血球の分離やフェノールといった危険な薬剤を使用するのが通常の方法である。今回私は地域住民の遺伝子解析のため、普段は廃棄されている住民検診の血清除去の血餅を利用したDNAの容易な抽出方法を開発した。住民検診の血餅200mulをProteinase Kを含むLysis solutionで処理後、飽和食塩水とクロロホルムで混和後、上澄を90%エタノールで沈殿させDNAを回収した。エタノール沈殿の際に純エタノールを使用せず、90%エタノールを使用することにより、PCR増幅の阻害となりうる過剰な塩分、赤血球色素の除去が効率よく行われることが判明した。このDNAはかなり純粋なもので、100回以上のPCR(Polymerase chain extension)が可能で、なおかつ長期の冷蔵庫保存にも耐える。100回以上のPCRが可能ということはある遺伝子疾患についてその遺伝子坐位を特定可能であることを意味する。また方法が診療所の検査室レベルでも可能であり、危険、高価な試薬を使う必要がない。また住民検診の血餅を用いることにより検体が収集しやくすく、遺伝的集積の強いと考えられる地域の遺伝子解析を容易ならしめるものと考えられ、現在J Clin Patholに投稿中デアル。なお現在地域住民の病態、住民検診のデータのと関連について、angiotensin converting ernzyme,CYPA1A,apoproteinの遺伝子や、polymorphismを示す、遺伝子markerについてPCRで可能なものについて解析中である。
マイクロＲＮＡによるがん幹細胞抑制のメカニズム解明とがん根治を目指した治療応用

がん治療における大きな課題は、がん幹細胞の存在や治療抵抗性がん細胞の出現による再発である。つまり、通常のがん細胞だけでなく、がん幹細胞や治療抵抗性がん細胞も標的とする薬剤・治療でなければ、がんの根治は望めない。本研究では、これまでに同定しているがん抑制性の老化関連マイクロRNAのうち、がん幹細胞や抗がん剤耐性がん細胞に対しても増殖抑制効果を示すマイクロRNAを同定する。そして、がん根治可能な新規抗がん核酸医薬として応用していくことを最終目的とし、本シーズマイクロRNAのがん抑制メカニズムも明らかとする。
金属ナノ薄膜を利用した新規レーザー脱離イオン化法の開発および評価

本研究では、金属ナノ薄膜と脱離イオン化質量分析技術を組み合わせた新しいイオン化法金属薄膜を利用した表面支援レーザー脱離イオン化(MF-SALDI)法を開発して、生体分子の一斉分析に最も有効なMF-SALDI法を構築してその最適条件とイオン化特性を解明し、MF-SALDI質量分析法を用いて脂質代謝と疾患の関連性の評価を行うことを目的として研究を行った。低分子の抗精神薬オランザピンのレーザー脱離イオン化においては、ジルコニウム(Zr)薄膜とMALDIのマトリックスであるCHCAを組み合わせたマトリックスエンハンスト(ME)-Zr-SALDI法を用いることで、検出感度が向上することが本年度の研究によって見出された。Zr薄膜のみを利用するZr-SALDIではオランザピンの検出感度が極めて低く、またMALDIでは検出感度が十分でない場合があった。一方、CHCAとZr薄膜を利用するSALDIでは、従来法よりも高い検出感度が得られ、ME-Zr-SALDIの有用性が示された。本実験においては、CHCAの塗布の方法が得られるイオン量に大きく影響することが示された。CHCAの塗布方法を検討した結果、試料上にZr薄膜を調製した後でCHCAを蒸着してSALDIを行う場合が、最も薬物の検出感度が高いことがわかった。本イオン化法を適用した質量分析イメージング法を用いて、オランザピンを投与したマウスの細胞切片の分析を行い、オランザピンの局在解析を行った。その結果、マウスの胃と肝臓からオランザピンのイオンが高感度に検出され、その局在画像を得ることに成功した。当初は、MF-SALDIとして有用な金属薄膜を見出し、動物の各種細胞切片等を脂質や生体内ホルモン等を解析するところまで行う予定であった。金属薄膜を見出しその性能を向上させる手法の検討することや、所属機関の変更に伴う研究設備準備にも時間が必要であったため、研究の進展に遅れが生じた。H30年の研究で見出した、生体分子の検出に適したジルコニウム薄膜とMALDIマトリックスを組み合わせた手法を利用して、MF-SALDI-MSIを行う。動物の各種細胞切片等を準備して、生体細胞切片上の生体分子の分析を行う。それぞれの主に脂質や生体内ホルモンを中心とした生体分子を解析する。バイオマーカーとなる単一の化合物を探索するとともに、複合的に相乗効果を示す複数の生体分子を探索して解析する。本研究では、金属ナノ薄膜と脱離イオン化質量分析技術を組み合わせた新しいイオン化法金属薄膜を利用した表面支援レーザー脱離イオン化(MF-SALDI)法を開発して、様々な生体内物質を一度に検出してそれらの局在を明らかにする。主にホルモンや生体内代謝物の脂質の解析を行う。生体分子の一斉分析に最も有効なMF-SALDI法を構築してその最適条件とイオン化特性を解明し、MF-SALDI質量分析法を用いて脂質代謝と疾患の関連性の評価を行うことを目的として,研究を行った。白金薄膜を用いたPt-SALDIの最適化条件を検討し,厚さ3 nmのPt薄膜を用いると最もイオン化効率が高いことがわかった.Pt-SALDIを用いて,様々な化合物を分析してPt-SALDIと従来法のMALDIを比較した結果,フェノール系酸化防止剤イオン強度はMALDIの100倍,ステロイド系ホルモンは10倍,オリゴ糖は3倍であることがわかった.また脂質のフォスファチジルコリンはDHBマトリックスを用いたMALDIにおいては検出できたが,Pt-SALDIでは検出できず,ジアシルグリセロールはMALDIで検出できなかったがPt-SALDIで高感度に検出することができた.上記の結果より,Pt-SALDIはMALDIとは全く異なるイオン化特性を持つため,有効な分析法であることが示された.Pt-SALDIを農薬の分析にも適用し,Pt- SALDI-MSIは葉の直接分析と局在解析が可能であり,農薬浸透性を評価できることを示した.銀薄膜についても同様に検証し,白金や銀,さらに白金/銀の合金を用いて,ポリマー中の色素成分の分析を行った.Pt/Agは,Agが78%のときが最もイオン化効率が高かった.Pt/Ag-SALDIは,PtとAg-SALDIの両方のイオン化特性を併せ持つことがわかり,汎用性が高いことが示された.Pt-SALDIの最適条件を決定し,様々な種類の化合物の検出感度を評価して,Pt-SALDIの有効性を明らかにできた.Pt/Ag合金薄膜を用いたMF-SALDI-MSの最適条件についても検討して,実際にポリマー中の色素成分の分析に応用できた.Pt-SALDIとAg-SALDI,Pt/Ag-SALDIの比較評価から,Pt/Ag-SALDIはPt-SALDIとAg-SALDIの両方のイオン化特性を併せ持つことを明らかにした.Pt-SALDIに関しては,その応用としてラット脳切片上の脂質成分の質量分析イメージング,また,植物中の葉の質量分析イメージングから植物への農薬の浸透性の評価を行った.本研究では、金属ナノ薄膜と脱離イオン化質量分析技術を組み合わせた新しいイオン化法金属薄膜を利用した表面支援レーザー脱離イオン化(MF-SALDI)法を開発して、生体分子の一斉分析に最も有効なMF-SALDI法を構築してその最適条件とイオン化特性を解明し、MF-SALDI質量分析法を用いて脂質代謝と疾患の関連性の評価を行うことを目的として研究を行った。

白金薄膜を用いたPt-SALDI-MSを用いて、ステロイドホルモンの分析を行った。従来法のMALDIではステロイドを誘導体化しなければ脱離イオン化して検出することができなかったが、Pt-SALDI-MS法では誘導体化なくそれら脱離イオン化して検出することができた。MALDI-MSによる生体細胞切片の分析では、脂質のフォスファチジルコリン(PC)が高感度に検出されるが、検出できない種類の脂質も存在する。Pt-SALDI-MSでは、PCを検出できないが、MALDIでは検出できない脂質のジアシルグリセロール(DAG)を検出することができた。また、白金よりも安価な遷移金属薄膜-SALDIにおいても、Pt-SALDIの場合と同様に、DAGを検出することが可能であることが示された。MF-SALDI法による薬物とステロイドの再現性の評価を行った。MALDIでは市販のイオン化支援剤溶液の噴霧器を使って調製し、MF-SALDIではスパッタリングで金属薄膜を調製して実験を行った。薬物とステロイドの両方の化合物において、MF-SALDIの方がイオン強度の再現性が高かった。しかし、MF-SALDIとMALDIのどちらにおいても、内部標準試薬を用いて実験した場合においては、同程度の再現性が得られた。また、MALDIでは蒸着によってイオン化支援剤を試料上に塗布した場合は、イオン化支援剤溶液の噴霧器で塗布したときよりも、再現性が向上した。Pt-SALDI-MSによるステロイドホルモンの検出感度の評価を行い、従来はステロイドを誘導体化しなければ検出できなかったが、Pt-SALDI-MSでは誘導体化することなく高感度に検出できることを示すことが出来た。MF-SALDIとMALDIの再現性について評価した。MF-SALDIではMALDIよりも再現性が高く、また内部標準法を用いることで、さらに高い再現性が得られた。従来法のMALDIは再現性が低いが、イオン化支援剤の蒸着を用いることや内部標準法を組み合わせることによって再現性を改善でき、MF-SALDIと同程度の再現性を得ることができることも示すことができた。本研究では、金属ナノ薄膜と脱離イオン化質量分析技術を組み合わせた新しいイオン化法金属薄膜を利用した表面支援レーザー脱離イオン化(MF-SALDI)法を開発して、生体分子の一斉分析に最も有効なMF-SALDI法を構築してその最適条件とイオン化特性を解明し、MF-SALDI質量分析法を用いて脂質代謝と疾患の関連性の評価を行うことを目的として研究を行った。低分子の抗精神薬オランザピンのレーザー脱離イオン化においては、ジルコニウム(Zr)薄膜とMALDIのマトリックスであるCHCAを組み合わせたマトリックスエンハンスト(ME)-Zr-SALDI法を用いることで、検出感度が向上することが本年度の研究によって見出された。Zr薄膜のみを利用するZr-SALDIではオランザピンの検出感度が極めて低く、またMALDIでは検出感度が十分でない場合があった。一方、CHCAとZr薄膜を利用するSALDIでは、従来法よりも高い検出感度が得られ、ME-Zr-SALDIの有用性が示された。本実験においては、CHCAの塗布の方法が得られるイオン量に大きく影響することが示された。CHCAの塗布方法を検討した結果、試料上にZr薄膜を調製した後でCHCAを蒸着してSALDIを行う場合が、最も薬物の検出感度が高いことがわかった。
静電場に配列させた分子集合体の高効率光反応

カチオンミセル上での光増感脱ブロム化〔序〕亜鉛テトラナトリウムテトラ(p-スルホナトフェニル)ポルフィリン(ZnTPPS)は、セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)カチオンミセルに強く静電吸着される。この吸着ZnTPPSを光増感剤として、カチオンミセルと相互作用し得る1,2-ジブロモ桂皮酸(1)の一電子還元型光脱ブロム化について検討した。本研究では、静電的に反発し合う増感剤と基質間の電子移動をミセル界面の介在により向上させることを目的とする。〔結果と考察〕1,2-ジブロム桂皮酸(phCHBrCHBr【CO_2】R:1a、R=H;1b、R=Na)はトリエタノールアミン(TEOA)共存下、ZnTPPS光増感脱ブロム化を受けて桂皮酸(PhCH=CH【CO_2】R)を与える。この場合、反応系にカチオンミセルを添加することにより反応効率は10倍以上増加した。pHを上げて1aを1bにすると、10倍以上の高効率となることがわかった。1aの疎水性、1bの親水性から見てミセル系でのZnTPPSと1aの電子移動は、ミセル表面から内部へ(S→I系)起こり、ZnTPPSと1bではミセル表面上(S→S系)で起こる。これらの系の反応性は均一バルク(O→O系)と比較すると、S→S系>>O→O系S→I系の順に低下するといえる。同一のミセル系でもS→S系はS→I系に比べて高い反応活性の場を与えることは興味深い。反応量子収率はTEOAの濃度に依存し、高濃度(40mM)では6を越え連鎖的光還元である。この連鎖による収率の向上は、O→O系,S→I系では顕著でなく、ミセル表面上に基質が吸着された場合(S→S系)に連鎖反応が起こり易くなったものであろう。脱ブロム化の効率は、ZnTPPSと基質との光増感電子移動と後続する脱ブロム化の両因子により支配され得る。このうち光増感電子移動効率は上記三種の系で大きな差異はなく、後続反応の効率が反応系によって大きく異なることが明らかとなった。
新規生体イメージングモデルを用いたJCADによる血栓形成制御機構の解明

近年のヒトゲノムワイド関連研究(GWAS)によって、心筋梗塞に関連する新規の分子としてJCADが同定されたが、その機序は不明のままである。申請者はこれまでのJCAD研究の中で、JCADは血管内皮において血栓形成を制御しているのではないかと着想した。そのような中で、我々は新規に生体血栓イメージングモデルを確立した。血栓の病態は「血流、内皮、凝固」など複数因子が関わり、単一細胞の培養系や死後の病理解析では困難である。この生体血栓イメージング系によりJCADの血栓形成への影響を生体下に可視化、解明し、心筋梗塞の発症機序に迫りたい。
ユーザのふるまいと状況に応じたサービス提供に関する研究

これまでの研究成果をベースに、より精度の高い行動検知と適切なタイミングでのサービス提供の実現のために以下の項目に取り組んだ。(1)多様なユーザの習慣の違いの影響を受けないように、行動検知アルゴリズム中の閾値にユーザごとに適切な値を自動的に設定する手法。(2)falseサンプルを用いた行動パターン洗練手法。(3)サービス提供の適切なタイミングの決定手法の検討。当初、項目(3)ではなく(4)無線通信機器を活用した家の中での位置情報推定手法とユーザの物体への接触情報を組み合わせた新しい位置情報推定手法に取り組む予定であったが、科研費が申請額より減額されたことで通信機器およびセンサ類の購入が難しくなったため、項目(4)に代わり次年度の研究計画に盛り込んでいた項目(3)を実施することとした。この計画変更に関しては、科研費申請時の研究計画にて報告済みである。全体として、項目(1)および(3)の研究の進展によって研究成果を発表する機会を多く得たため、項目(2)に関する発表が本年度中に間に合わなかった。これに関しては、現在、投稿準備中である。また項目(4)に関して、本年度の研究計画としては扱わなかったものの、特別研究員および科研費の予算外での活動として、パッシブ型RFIDタグを用いた位置・歩行情報取得システムの開発および実験を行った。上記の内容に関して、計5件の論文が採択され、さらに3件の論文を論文誌に投稿中である。当初の計画どおり、CEATECJAPANおよびTRONSHOWの2つの展示会で研究を展示発表し、研究者のみならず一般の様々な方から多くの有益な意見を得た。また、本研究に関してTV取材を受け、2009年3月25日にNHK総合「おはよう日本」で放送された。研究計画はおおむね予定通り進行した。項目(4)に関しても、研究計画外の活動で進展した。これらの進捗状況から、全体として当初の予定以上の成果が得られたと考えられる。
安全性と効率性を考慮した自律走行天井クレーン液体タンク搬送制御システムの開発

本研究では,天井クレーンによる振動制御を考慮した液体タンクの3次元搬送制御系設計のため,まず,対象とする天井クレーンによる液体搬送実験装置の設計・製作し,ロッド・タンク連成系の液体搬送モデルを構築する.そして,そのモデルの妥当性をシミュレーションと実験により確認する.最後に,導出したモデルにより,スロッシング抑制の効果のある制御系設計とロッド・タンク連成系の形状や大きさについて考察する.本研究では,天井クレーンによる振動制御を考慮した液体タンクの3次元搬送制御系設計のため,まず,対象とする天井クレーンによる液体搬送実験装置の設計・製作し,ロッド・タンク連成系の液体搬送モデルを構築する.そして,そのモデルの妥当性をシミュレーションと実験により確認する.最後に,導出したモデルにより,スロッシング抑制の効果のある制御系設計とロッド・タンク連成系の形状や大きさについて考察する.鉄鋼や鋳造業における溶湯搬送では,高温で重量のある溶湯を,安全に且つ効率的に運ぶために,溶湯タンク内の液体の振動(スロッシング)を抑え,目的地に短時間で自動的に搬送する天井クレーンシステムの役割は大きく,その自動化,自律化が望まれている.本研究では,タンク内のスロッシングを抑え,目的地に短時間で自動的に搬送する「安全性と効率性を考慮した自律走行天井クレーン液体タンク搬送制御システムの開発」を行う.研究の初年度として,現有のクレーン実験装置に,ロッドと液体タンクを取り付け,申請者らが従来行った研究,「3次元液体タンクの最適搬送制御と液位,粘性変化に対する制振ロバスト性」(システム制御情報学会論文誌,Vol.40,No.4, 1996, pp.12/21)で得られた知見をもとに調査を行い,スロッシング発生のメカニズムを解明した.まず,用いるタンク形状としては,直方体タンクや円筒形タンクを用い,それぞれ液体の液位や粘性の変化について調査した.これにより,スロッシング抑制の効果のあるロッド長さとタンク形状の最適設計条件の知見を得た.また,タンク内の一次モードのスロッシングについて,簡易振り子を用いた数学モデルの導出を行い,そのモデルに基づいたシミュレーション解析と実験解析の比較を行い,モデルの妥当性の検証およびスロッシングメカニズムの解明を行った.以上の成果により,自律走行天井クレーン液体タンク搬送制御システムに関する基礎的知見を得ることができた.鉄鋼や鋳造業における溶湯搬送では,高温で重量のある溶湯を,安全に且つ効率的に運ぶために,溶湯タンク内の液体の振動(スロッシング)を抑え,目的地に短時間で自動的に搬送する天井クレーンシステムの役割は大きく,その自動化,自律化が望まれている.本研究では,タンク内のスロッシングを抑え,目的地に短時間で自動的に搬送する「安全性と効率性を考慮した自律走行天井クレーン液体タンク搬送制御システムの開発」を行う.昨年度の研究で,スロッシング発生のメカニズムについて,タンク形状,液体の液位や粘性の変化について調査した.また,タンク内の一次モードのスロッシングについて,簡易振り子を用いた数学モデルの導出を行い,モデルの妥当性の検証およびスロッシングメカニズムの解明を行った.本年度は,昨年度導出したモデルのさらなる検証を行い,タンク形状,ロッド長さの違い,特にタンクの大きさと液位レベルの違いによるスロッシング発生のメカニズムの調査を行い,搬送抑制のための最適設計条件の知見を得た.また,制振性に効果のある目標軌道の生成するフィードフォーワード制御による制振搬送制御システムと障害物回避のための回避システムの開発,さらに,限られた情報で回避経路を導出できるSrinivasらが提案している手法を用いた障害物経路計画システムの開発を行った.今後の課題として,目標軌道への追従性を向上させるフィードバック制御系を組み合わせた2自由度搬送制御系の開発や実システムへの適用があげられる.液面挙動を表す2重振り子モデルについて,タンク形状,ロッド長さの違い,特にタンクの大きさと液位レベルの違いによるスロッシング発生のメカニズムの調査を行い,搬送抑制のための最適設計条件の知見をまとめた.制振性に効果のある目標軌道を生成するフィードフォーワード制御による制振搬送制御システム制振搬送制御システムの構築には,ノッチフィルタを用い,ロッド長さやタンク形状の最適設計条件の知見とともに,搬送対象であるロッドと液体タンクの振動系が,ロッド長さやタンク形状,液体の液位や粘性によって,どの振動数帯域で共振するかを明らかにした.そして,スロッシング抑制の効果のある搬送制御システムの構築を行った.また,クレーン搬送によるスロッシングだけでなく,ロッドとタンク取り付け位置の回転運動によるスロッシングについては,回転部の粘性変化も調査し,スロッシングへの影響を考察した.今後の課題として,タンク内スロッシングの抑制機構(ハードウェア)とタンク内液体搬送の制振搬送制御システム(ソフトウェア)の両面から実システムへの適用を行い,天井クレーンによる液体タンク搬送制御系の開発を行うことが挙げられる.一方,昨年度提案開発した障害物回避のための回避システムの開発と限られた情報で回避経路を導出できるSrinivasらが提案している手法を用いた障害物経路計画システムの実機への適用についての検討を行った.
T4ファージの粒子形成に関わる分子間相互作用の解明

本研究は、蛋白質複合体のモデル系としてバクテリオファージに注目し、分子集合の過程における水溶液中の分子間相互作用を明らかにしようとするものである。本年度は特に基盤蛋白質gp13,gp14,gp16,gp17,gp48,gp54に焦点を合わせて実験を行い、以下の結果を得た。1.gp13及びgp14の単離・精製と性状解析gp13とgp14はネックを構成する蛋白質で頭部形成の最終段階で結合し、尻尾との結合部に存在すると考えられる。両蛋白質は超遠心分析の結果、単独では単量体として存在すること、また両者を混合するとgp13:gp14=1:2の比率で結合することが分かった。2.DNAパッケージング蛋白質gp16とgp17の単離・精製と性状解析2本鎖DNAファージには共通して大小2種のパッケージング蛋白質が必要である。T4ファージでは大サブユニットがgp17、小サブユニットがgp16で、後者にはATPaseはないが、前者のATPaseを50倍以上促進する。両蛋白質を単離精製し、超遠心分析を行ったところ、gp17が単量体であるのに対して、gp16は20量体と思われる分子種が主要成分で、少量の10量体と思われる分子種と平衡にあることが分かった。一方、gp16とgp17の間には弱い相互作用しか見られなかった。3.基盤形成の最終ステップに結合するgp48とgp54の単離・精製と性状解析gp48とgp54は基盤形成の最終段階で結合する蛋白質で、gp54は尾管イニシエーターを呼ばれる。両蛋白質遺伝子をクローニングし、単離精製することを試みたが、良く発現はするものの、不溶性画分に入り、発現温度、IPTG濃度など発現条件を検討したほか、コールドショックプロモーターを試みたが、可溶性画分として精製することができなかった。しかし、gp48については発現温度22°C、15時間で半分以上を可溶性画分に回収することができた。現在、結晶化の準備を進めている。本研究では、蛋白質複合体のモデル系としてバクテリオファージに注目し、分子集合の過程における水溶液中の分子間相互作用を明らかにすることを目的としている。本年度は特に基盤蛋白質gp10、gp11、gp13、gp14に焦点を合わせて実験を行い、以下の結果を得た。1.Gp10とgp11を共発現させると20°C、pH8.0で沈降係数9.3S、分子量269,700の会合体を形成しており、(gp10)_3(gp11)_3のヘテロ6量体と結論された。他方、gp10とgp11を別々に発現して20°C、pH8.0で混合しても会合は起こらなかったが、pHを6.0まで下げると会合した。この会合体は安定で、pH8.0に戻しても解離しなかった。この不可逆性の原因を探るため、以下のような実験を行った。2.pHをさらに11まで上げると(gp10)_3(gp11)_3複合体は各3量体に解離し、各3量体はこのpHでも安定であった。また、(gp10)_3(gp11)_3複合体は37°Cでは若干解離する傾向がある。同複合体は尿素により2-4M間で可逆的に解離し、6Mで完全に解離した。ただし、この濃度でも各3量体は安定に存在した。3.Gp13はネック蛋白質である。この蛋白質をコードする遺伝子13をクローニングし、大量発現に成功した。この蛋白質の超遠心分析を行った結果、本蛋白質は水溶液中では単量体として存在することが分かった。同じくネック蛋白質であるgp14のクローニング、発現にも成功したが、本蛋白質は凝集しやすい性質を持つことが分かった。3.基盤形成の最終ステップに結合するgp48とgp54の単離・精製と性状解析

gp48とgp54は基盤形成の最終段階で結合する蛋白質で、gp54は尾管イニシエーターを呼ばれる。両蛋白質遺伝子をクローニングし、単離精製することを試みたが、良く発現はするものの、不溶性画分に入り、発現温度、IPTG濃度など発現条件を検討したほか、コールドショックプロモーターを試みたが、可溶性画分として精製することができなかった。しかし、gp48については発現温度22°C、15時間で半分以上を可溶性画分に回収することができた。現在、結晶化の準備を進めている。