hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
全自動言語処理システムを用いたツール作成学習テンプレートの網羅的整備と共有

本研究の目的は、自然言語処理のアプリケーション構築を容易にするプラットフォームの実装である。同時に、機械学習の学習素性テンプレートを網羅的に実装・配信できるようにするのが目的である。そのために自然言語(テキスト・音声)について、機械学習統合の資源を「作る」ための全自動システムを構築する。本研究はおおきく、プラットフォームの構築、プラットフォーム上で動作するコンポーネントの構築、それらを利用した実証的な応用研究にわかれる。構築したシステムを、法律分野、医療分野、対話システム、論文処理などいくつかの異なるテーマにおける研究の基盤として利用し、その有効性を検証した。自然言語(テキスト・音声)の大規模処理は日々需要が高まっており、それ応えるには再利用性の高い資源(ツール・データ)の整備と機械学習の利用が必須である。これまで既存資源を「使う」ための自然言語処理プラットフォームを構築してきたが、自然言語処理ではドメイン依存性が高く、データに応じたツールの再学習が必要であることが多い。そこで能動学習を含めた機械学習統合の資源を「作る」ための全自動システムを構築する。本年度はそのために、主にプラットフォームの機械学習対応機能について、プロトタイプ作成を進めた。具体的には、教師つき機械学習手法を用いた訓練と、その結果の評価について、汎用性・互換性・可搬性を保ちつつ、容易に利用できるように、かつこれまでのプラットフォーム実装を極力生かし統合的なシステムとして利用可能になるように設計を検討し、プロトタイプとして実装した。また、実装した機能を現実的なタスクでテストするためのデータおよびコンポーネントの整備を進めた。自然言語(テキスト・音声)の大規模処理は日々需要が高まっており、それに応えるには再利用性の高い資源(ツール・データ)の整備と機械学習の利用が必須である。そこで機械学習統合の、資源を「作る」ための全自動システムを構築する。そのために、主にプラットフォームの機械学習対応機能について、プロトタイプ作成を進めた。具体的には、教師付き機械学習手法を用いた訓練と、その結果の評価について、汎用性・互換性・可搬性を保ちつつ、容易に利用できるように、かつこれまでのプラットフォーム実装を極力生かし統合的なシステムとして利用可能になるように設計を検討し、プロトタイプとして実装した。本年度は、このプロトタイプのテストを兼ね、いくつか実際的なアプリケーションにプラットフォームやコンポーネントを応用する実験を行った。具体的には、大学入試の自動解答、医療言語情報処理、法律文書の処理などである。初年度のプロトタイプのテスト遅れの影響による。実用的・複雑なシステムについて、コンポーネント化と学習ワークフローのプロトタイプ構築を行った。具体的には法律文書の処理、司法試験の自動解答、検索、質問応答などである。法律文書の処理・司法試験の自動解答については、国際コンテスト型ワークショップであるCOLIEE(Competition for Legal Information Retrieval and Entailment)のオーガナイザとして、法情報学の国際ワークショップJURISIN(Juris Informatics)併設のワークショップを開催するとともに、参加者として司法試験の自動解答システムを構築した。自動解答システムでは内部的に複数の自然言語処理コンポーネントを用いるとともに、開発においてこれまで構築してきた可視化ツール等を用い有用性を確認した。また、医療言語処理など他の応用アプリケーション構築においても、構築したコンポーネントの利用を行った。より基盤的な技術として、検索・質問応答のコンポーネント化を進めた。質問応答は複合的なコンポーネントからなるアプリケーションのため、その部分的な再利用を容易にすることが目的である。さらに、利用者の利便性を考慮し、従来コンポーネント化の際に準拠していた国際標準よりも、開発者にとってより容易に利用可能なAPIを定義しアクセスを可能にする方法を提案し、プロトタイプの実装を行った。これは開発者が標準を学習するハードルを下げるとともに、標準の縛りを緩くすることでソフトウェア設計の柔軟性を高め、一方で極力従来の標準準拠の実装からの変更を小さくするAPI仕様によりコンポーネント実装の共通化を図ったものである。おおむね前年度に策定した計画通りである。今年度は、実用的・複雑なシステムのコンポーネント化と学習ワークフローの構築をつつけ、プラットフォームを用いて実際の研究におけるアプリケーション構築基盤としての利用を行った。利用は下記に述べるいくつかの異なる研究分野にまたがり、コンポーネントの実行、可視化や検索などプラットフォームの基盤技術の利用などプラットフォーム全体の有用性を確認した。医療分野においては、電子カルテの処理や精神科問診データの自動分析を行った。いずれも、固有表現など単語レベルの処理から、係り受けや述語項構造などまでさまざまなレベルでの自然言語処理技術が必要となり、プラットフォームの有用性を確認する応用としても適切な課題であった。会話ゲーム「人狼」のプレイヤー自動化を目標とする人狼知能プロジェクトなど対話システム分野においては、話し言葉の処理と文生成を対象にプラットフォームを利用してシステム構築を行った。学術論文データの自動処理においては、日本語が対象の他の研究とは異なり英語を対象とし、多言語への対応を確認した。こうした幅広い応用から、プラットフォームの有用性と実用性を検証した。同時に、機械学習の学習素性

テンプレートを網羅的に実装・配信できるようにするのが目的である。そのために自然言語(テキスト・音声)について、機械学習統合の資源を「作る」ための全自動システムを構築する。本研究はおおきく、プラットフォームの構築、プラットフォーム上で動作するコンポーネントの構築、それらを利用した実証的な応用研究にわかれる。構築したシステムを、法律分野、医療分野、対話システム、論文処理などいくつかの異なるテーマにおける研究の基盤として利用し、その有効性を検証した。当初予定よりも、プロトタイプのテスト進行が遅れている。今後はさらに応用事例を増やしつつ、システムの洗練化を進める。実際のアプリケーション構築においてシステムを利用した実証実験を行い、機能の確認、不具合の対応を行い、必要に応じて新規機能やコンポーネントの追加を行う。29年度が最終年度であるため、記入しない。自然言語処理実装したプロトタイプを用いた学習および評価のワークフローを作成、テストを行い、プロトタイプの機能改良を進める。テストにおいては第三者による利用テストを通じ、非専門ユーザからのフィードバック取り込みを図る。同時に実行可能なコンポーネント・ワークフローの増加をはかり、汎用性の確認を行う。実装進捗状況の遅延による。必要費用が当初予定と異なったため。当初計画からの遅れによる。本来予定にかかわる部分を次年度に遂行する。対応額の必要消耗品の購入を計画している。遂行予定に記載の本年度研究計画におけるシステム構築に使用する。
殺虫タンパク遺伝子導入による食害抵抗性芝草の開発

本研究において、おおよそ以下のような成果が得られた.1.芝草のカルス誘導において、比較的高頻度でembryogenic callusを誘導することが可能となり、効率的なin vitro細胞一植物体再生系が確立した.2.エレクトロポレーション法による遺伝子導入において、バッファー組成の改変、電気的条件等の検討により、従来より効率的に遺伝子導入が可能になった.3.パーティクルガンによるintact細胞への遺伝子導入において、導入効率を上げるための機械的諸条件等を明かにした.4.エレクトロポレーション法によりマーカー遺伝子の導入を試み、得られた形質転換体における遺伝子の確認、導入遺伝子のプロモーターの違いによる形質発現量の差異等について検討した.5.導入を図ろうとするbt遺伝子のうち、芝草の重要害虫であるスジキリヨトウ、シバツトガに対しCrylA(c)の産生タンパクが最も殺虫活性が高いことを認めた.6.CrylA(c)の導入を図った個体について導入遺伝子の確認を行い、bt遺伝子が組み込まれた形質転換体に対してシバツトガの幼虫による摂食試験を試みたが、明らかに耐虫性を示す個体は見い出せなかった.7.導入遺伝子の殺虫活性を高めるために、1)高発現プロモーターの構造を明かにした、2)bt遺伝子コード領域の塩基配列の改変を試みている.以上のように、最終的に、目的の耐虫性個体の育成を達成するには至らなかったが、現在、高発現プロモーターとbtコード領域を接続した遺伝子、ベクターの構築、およびbtコード領域の改変が進行中であり、近々、いずれかの方法により最終目的である耐虫性個体の獲得が達成されるものと考えられる.本研究において、おおよそ以下のような成果が得られた.1.芝草のカルス誘導において、比較的高頻度でembryogenic callusを誘導することが可能となり、効率的なin vitro細胞一植物体再生系が確立した.2.エレクトロポレーション法による遺伝子導入において、バッファー組成の改変、電気的条件等の検討により、従来より効率的に遺伝子導入が可能になった.3.パーティクルガンによるintact細胞への遺伝子導入において、導入効率を上げるための機械的諸条件等を明かにした.4.エレクトロポレーション法によりマーカー遺伝子の導入を試み、得られた形質転換体における遺伝子の確認、導入遺伝子のプロモーターの違いによる形質発現量の差異等について検討した.5.導入を図ろうとするbt遺伝子のうち、芝草の重要害虫であるスジキリヨトウ、シバツトガに対しCrylA(c)の産生タンパクが最も殺虫活性が高いことを認めた.6.CrylA(c)の導入を図った個体について導入遺伝子の確認を行い、bt遺伝子が組み込まれた形質転換体に対してシバツトガの幼虫による摂食試験を試みたが、明らかに耐虫性を示す個体は見い出せなかった.7.導入遺伝子の殺虫活性を高めるために、1)高発現プロモーターの構造を明かにした、2)bt遺伝子コード領域の塩基配列の改変を試みている.以上のように、最終的に、目的の耐虫性個体の育成を達成するには至らなかったが、現在、高発現プロモーターとbtコード領域を接続した遺伝子、ベクターの構築、およびbtコード領域の改変が進行中であり、近々、いずれかの方法により最終目的である耐虫性個体の獲得が達成されるものと考えられる.ノシバの外植体(種子)から植物体再分化能を有する培養細胞“embryogenic callus"を高頻度に誘導する方法を開発した.すなわち従来のオーキシン(2,4-D)を加えたカルス誘導培地に、更にサイトカイニン(BA or TDA)、チアミン、リボフラビン、α-ケトグルタル酸を添加することにより、誘導率を従来の1-2%から最高28%にまで高めることができた.これらの多数のembryogenic callusを液体振盪培養に移し、選抜を繰り返すことにより、長期間、再分化能を維持したままのsuspension培養系を確立した.ノシバ及びベントグラスの培養系を用い、マーカー(bar)及び殺虫タンパク(bt)遺伝子のco-transformationを試みた.遺伝子導入法としてプロトプラストを用いたエレクトロポレーション法に加え、新たに開発された、intactな培養細胞に直接導入可能な“particle-gun"法を試みた結果、エレクトロポレーション法により多数のビアラフォス抵抗性形質転換ベントグラスが得られ、約25%の確率でbt遺伝子も同時に導入されていた.particle-gun法では、gusマーカー遺伝子を用いたtransient assayにより導入条件の最適化を図った後、intact cellにstableな遺伝子導入を試みたが、現在のところ導入効率は低く、数個体が得られた段階である.bt遺伝子の導入が確認された個体の葉を用いて芝草の重要害虫である鱗し目ガ(シバツトガ、スジキリヨトウガ)の幼虫による食害テストを行ったが、現在のところ、今回用いたwild-typeの遺伝子では十分な抵抗性を発現する個体が認められていない.微生物由来であるbt遺伝子のコドンは植物細胞中での転写、翻訳がうまく行われない可能性があり、現在、植物細胞中で高発現が期待される改変遺伝子の合成を試みており、合成後ベクターを構築し、再導入を試みる予定である.植物のintact cellへ直接、遺伝子導入が可能な新たな導入法であるparticle gunを用いた方法に関し、gus遺伝子による導入効率の向上を検討した結果、プラスミドDNAのパーティクルへの吸着法、パーティクルサイズ、ターゲット細胞用培地の浸透圧、等の調節、改善により、従来法の6-7倍の高い効率で芝草培養細胞への遺伝子導入が可能となった.

現在、この条件下でstableな形質転換を進めている.エレクトロポーション法により既に得られている多数のベントグラスの形質転換個体について、PCR、PCR-サザン法により導入遺伝子の解析を行った結果、目的の遺伝子(bt)とマーカー遺伝子(bar)とを別々のプラスミドによりco-transformする方法より、両遺伝子をタンダムに連結し、単一のプラスミドを用いて導入する方法の方が、導入効率が約3倍高いことが認められた.bt遺伝子(wild-type)の導入が確認された個体についてシバツトガ幼虫による耐虫性の生物検定を繰り返し行ったが、明かに耐虫性を示す形質転換体を選抜することはできなかった.また、ウエスタン法による解析でも現在までに目的のタンパクは検出されていない.導入遺伝子の発現を高める目的で、幾つかの改変プロモーターを用いてgus活性を比較したところ、CaMV35Sプロモーターのエンハンサーを多数重複させ、更にΩ配列を挿入した場合等に非常に高い発現が認められた.従って、これらの高発現プロモーターを用いてbt遺伝子を再構築し、導入を試みる予定である.コード領域のコドン改変による合成bt遺伝子に関しては、全塩基配列の解析結果から、コード領域を7ブロックに分け、各ブロック毎に翻訳効率が高まるようなコドンのタイプへの改変を進めている。
トロンボモジュリンの血管内皮保護薬としての臨床応用に向けた分子基盤の解明

血管内皮細胞上に発現し、凝固を負に制御しているトロンボモジュリンが、シグナル伝達経路ERKを介して抗アポトーシス蛋白Mcl-1の発現を誘導して、サイトカインや免疫抑制剤による細胞傷害から血管内皮細胞を保護することを明らかにした。また、その活性部位は上皮細胞増殖因子様領域に局在し、抗凝固作用とは無関係であることを明らかにした。血管内皮細胞上に発現し血液凝固を司る膜たんぱく質トロンボモジュリンの血管内皮細胞保護作用とその作用機序を明らかにする研究を行った。臍帯血管内皮細胞(HUVEC)をトロンボモジュリンに暴露すると、細胞内シグナル伝達経路ERKが活性化して、抗アポトーシス蛋白質MCLー1が発現誘導されることを見出した。トロンボモジュリンは血管内皮細胞の増殖を刺激し、血管新生を盛んにすることを試験管内及び実験動物を用いて証明した。造血細胞移植後に免疫抑制剤として使用するシクロスポリンやタクロリムスはHUVECに細胞障害を与えるが、トロンボモジュリンとともに投与すると、細胞障害が緩和されることを試験管内の実験及び実験動物を用いて証明した。可溶性トロンボモジュリンは3つのドメインから構成されている。遺伝子工学の技術を駆使して、各種トロンボモジュリン変異遺伝子を作成して、動物細胞に遺伝子導入後これら変異蛋白質を産生、純化し獲得した。これら様々なトロンボモジュリン変異蛋白質をHUVECに暴露して血管内皮細胞障害の度合いを比較検討したところ、上皮細胞増殖因子様ドメインに、トロンンボモジュリンの細胞保護作用が局在していることを突き止めた。更に、トロンボモジュリンの細胞保護作用は、抗凝固活性を失う遺伝子変異を挿入した変異蛋白質にも認められ、抗凝固作用とは無関係であることが判明した。これらの結果は、今後出血の副作用を懸念する必要のない血管内皮細胞保護に特化した創薬の可能性を示唆する重要な知見である。造血細胞移植後に発症する類洞閉塞症候群(SOS)や正着症候群(ES)に合併する播種性血管内凝固症候群(DIC)を、遺伝子組換えトロンボモジュリン製剤(rTM)で治療すると、rTMで治療を受けなかったDIC患者と比較して、移植100日目の予後と全生存期間が有意に改善することを報告した(Eur J Haematol. 2013;91:442-7)。また、我々はrTMを使用すると、SOSやESに合併する浮腫が改善することから、rTMが血管透過性亢進を抑制する新規な機能を持っていることに気づき、それを明らかにする基礎研究を行った。ヒト臍帯静脈血管内皮細胞(HUVEC)を免疫抑制剤シクロスポリン(CsA)に暴露後誘発される血管透過性亢進モデルを用いて、rTMの効果を検証した。HUVECはCsAの暴露を受けるとsrcのリン酸化を介して細胞表面のVE-cadherinがリン酸化を伴い細胞質内に移行し、細胞接着が緩むことを見出した。また、CsAにより、HUVEC内で転写因子nuclear factor kappa B(NF-kB)が細胞質内から核内に移行し、IL-6やIL-1bの産生が増加し、これらサイトカインが更にsrc/VE-cadherinのリン酸化を増強させ、細胞間接着を緩くすることを見出した。興味深いことに、rTMはsrcのリン酸化とNF-kBの核内意向を阻害することで、VE-cadherinの細胞表面からの消失を抑制し、細胞間接着を強固に維持することを見出した。次に、TMの各種変異蛋白質を作成し、src抑制作用を持つ領域の同定を行った。上皮細胞増殖用ドメインの4番目と5番目の領域にその作用が局在することを同定した。CsAは血管内皮細胞に透過性亢進を誘導するのみならず、細胞障害を誘導しアポトーシス死を惹起するが、TMは細胞シグナル伝達経路ERKの活性化を介して抗アポトーシス蛋白Mcl-1を発現誘導し、血管内皮細保護作用を有することを明らかにした。血管内皮細胞上に存在するトロンボモジュリン(TM)は、血液凝固線溶系を制御する重要な蛋白質である。TMは2008年5月に世界初の遺伝子組換えTM製剤(rTM)として発売され、播種性血管内凝固症候群(DIC)治療に広く臨床使用されてきている。本研究者は、豊富な本剤の使用経験の中から造血幹細胞移植後の重篤な合併症を伴う患者において著効例を経験し、本剤は抗凝固作用以外に血管内皮保護作用を有することを世界で初めて見出した。本研究では、この新規なTMの血管内皮保護作用の詳細な機序を検討するとともに血管内皮保護薬としての新たなTM開発を見極めることを目的とした。H23年度の研究で、造血細胞移植時に免疫抑制剤として使用するシクロスポリン(CsA)が臍帯静脈血管内皮細胞(HUVEC)にアポトーシスを誘導し、隣り合う血管内皮細胞同士の結合が減弱する結果、血管内皮の透過性を亢進させること、そこにrTMを投与するとアポトーシスからHUVECは保護され、血管内皮細胞の機能も維持されることを証明した。

更に、rTMの血管内皮細胞に及ぼす新規作用を検討した結果、rTMはHUVECにおいて、細胞増殖刺激因子ERKを活性化し、抗アポトーシス蛋白Mcl-1の発現を誘導することが明らかとなった。次に申請者は、TMがMcl-1の発現を誘導し血管内皮細胞保護を司る活性部位の同定を試みた。各種TM変異体発現ベクターを構築し変異蛋白質をCOS-1細胞に発現させ、その血管内皮細胞保護作用を検証した結果、Mcl-1の誘導活性はD2ドメインのC末端側のTME45に存在することを突き止めた。当初の予定通り、トロンボモジュリンに血管内皮細胞保護作用があること、それは細胞増殖刺激因子ERKの活性化を介した抗アポトーシス蛋白質MCL-1の発現誘導によること、更にはその活性部位が上皮細胞増殖因子様ドメインに存在することまで明らかにし、当該分野で国際的に高い評価を受けている医学雑誌(Arterioscler Thromb Vasc Biol.)に論文報告することができた。当初の研究目標通り、トロンボモジュリンが血管内皮細胞保護作用を有すること、その作用機序や活性化部位まで同定できた。トロンボモジュリンの血管内皮細胞保護作用は抗凝固作用とは無関係に、上皮細胞増殖因子様ドメインに存在することが明らかになったが、今後更にその局在を切り詰めて遺伝子合成、あるいは酵母に変異遺伝子を導入し大量に産生させるなどして創薬を目指す。トロンボモジュリンの血管内皮細胞保護作用はEGF-likeドメインのN末端側TME45に存在することが明らかとなった。この部位にはトロンビンとの結合能やプロテインCの活性化能が存在しないため、血液凝固に全く作用しない。即ち、出血の副作用を懸念する必要のない、新規血管内皮細胞保護薬の期待が高まる。今後、トロンボモジュリン変異体TME45を大量に精製し、血管内皮細胞障害動物モデルでその有用性、安全性を検証予定である。既に大腸菌を用いた蛋白発現システムを用いて新規TM変異体の大量精製を試みたが、TM蛋白質はS-S結合が多いためかその立体構造が変化し、インタクトな変異TM蛋白が得られなかった。解決策として、酵母を用いて蛋白を発現精製予定である。遺伝子工学関連試薬、血管内皮細胞培養試薬等に使用する。酵母へ遺伝子導入可能な、トロンボモジュリン変異遺伝子発現システムの構築。酵母を使用したトロンボモジュリン変異蛋白質の大量精製。マウス血管内皮細胞障害モデルを用いて、トロンボモジュリン変異蛋白質の効果と安全性の評価を行う。
タンジブルユーザインタフェースを用いた複合現実型実験室(MR実験室)の構築

本研究では,複合現実技術を利用したMR実験室を構築した。この実験室では,ARToolKitにより複合現実環境を実現し,実験機器や結線をCGオブジェクトとして,現実環境(机上)に重畳表示あるいは液晶ディスプレイに表示する。これにより,安全性の高い実験環境を容易に構築することができる。また,マーカを操作のためのユーザインタフェースとして扱うことにより,現実の実験と同様に,複数の実験者がグループで協力しながら実験を実施できる環境を提供することが可能となった。さらに,実験結果を仮想的に表現することで,外乱などの影響を受けない状態での結果を,分かりやすく実験者に提示し,効率的な学習のための実験環境を提供することが可能となる。本研究は,複合現実感(MR)技術およびタンジブルユーザインタフェース(TUI)を利用して,より安全でかつ効率良く学習できる実験環境を提供するとともに,MR環境の有用性と教育効果に関する評価を行うことを目的とする.平成20年度は,主にMR環境についての基礎的な検討およびMR実験室として有用な環境についての検討を行った.1.マーカ式MRおよびTUIのユーザビリティについてマーカ式MRを実現するためには,MR環境をプロジェクタにより投影する必要がある.当初は上方からテーブルに投影することを考えていたが,実際に授業などで使用することを想定した仮環境を実際に構築して検討した所,壁に投影する必要もあることが確認できた.以上の結果より,ある程度フレキシブルにかつどこにでも構築できる環境を今後,検討していく必要があることを確認した.また,以上の検討を通じて,実際に構築する環境の仕様を策定した.2.実験コンテンツいくつかの電気実験テーマを上げ,その実現性・有効性の検討を行った.その結果,オームの法則などの基礎的なテーマをコンテンツとして作成することとした.そのコンテンツを実現するMRおよびTUIの基礎技術についてのアルゴリズムおよびプログラムの作成もあわせて行った.また,電気実験以外にも物理実験などのコンテンツの作成についても検討し,今後,作成していくこととした.本年度は基礎的な研究に注力したため成果の発表までは行えなかったが,構築する環境についての基礎をほぼ確立できた.本研究は,複合現実感(MR)技術およびタンジブルユーザインタフェース(TUI)を利用して,より安全でかつ効率良く学習できる実験環境を提供するとともに,MR環境の有用性と教育効果に関する評価を行うことを目的とする.平成21年度は,MR実験室の環境構築およびMR実験室用の実験コンテンツの作成を行い,その評価を行った.1.MR実験室の構築昨年度の検討をもとに,実際にMR実験室(MRを用いた実験環境)を構築した.本MR実験室では,机上のマーカをUSBカメラによって認識し,その上にCGで表現した仮想実験機器や導線および実験結果などを重畳表示することにより実験を行う.机上への表示には超短焦点プロジェクタを用いる.またコンテンツによっては通常の液晶ディスプレイやヘッドマウントディスプレイも用いることとした.2.実験コンテンツの作成MR実験として,オームの法則実験(電気実験)および波の観測実験(物理実験)の2つのコンテンツを作成した.オームの法則実験では,実験機器やその値,導線をCGで表現し,机上に重畳投影する.これにより機器の結線や値の変更といった実験手順をMR環境下で実現した.波の観測実験コンテンツでは,マーカをTUIとして使用することで,MR環境下でのインタラクションを実現した.これにより,対話的に波の合成や独立性を観測することを可能とした.3.実験コンテンツの評価波の観測実験コンテンツの評価実験を行った結果,次の点においてMR実験の有用性が確認できた.(1)導入教育などにおいて重要である実験に対する関心・興味の向上に高い効果がある.(2)通常では見ることのできない現象の可視化およびCG表現を用いて分りやすく提示することによって,効率的な学習を行うことができる.本研究は,複合現実感(MR)技術およびタンジブルユーザインタフェース(TUI)を利用して,より安全でかつ効率良く学習できる実験環境を提供するとともに,MR環境の有用性と教育効果に関する評価を行うことを目的とする.平成22年度は,昨年度までの検討などを元にMR実験室環境の改良およびその評価を行った.1.MR実験室の構築昨年度までに構築したMR実験室の検討をもとに,机上ではなく壁面(黒板・ホワイトボード)に配置したマーカ上にCGで表現した仮想実験機器や導線および実験結果などを重畳表示する環境を構築した.また,操作性をより向上させるために,Wiiリモコンを用いて回路の結線や実験を行うインタフェース環境を構築した.2.MR実験室の評価学生に実際に「黒板上でのMR電気実験コンテンツ」を操作してもらい,アンケートをとることによって,評価実験を行った.その結果,次の点においてMR実験の有用性が確認できた.(1)導入教育や低学年などの基礎的な内容の理科授業などにおいて重要となる実験に対する関心・興味の向上に高い効果がある.

(2)CG表現を用いることにより,より安全にかつ容易なインタフェースを持つ実験環境を提供することができる.また,実験を実際にしているという実感が得られない・器具の使い方を学ぶことができないという知見も得られた.以上の結果より,本MR実験環境は,より低学年での導入教育や理科実験において有用であるとの結果を得た.
オウム病クラミジアの増殖環を制御するｎｃＲＮＡのトランスクリプトーム解析

クラミジアは偏性細胞内寄生性を示し、宿主細胞中で性状転換を伴う増殖環を有する。申請課題ではクラミジアの増殖環の制御機構を明らかにすることを目的とし、感染細胞中におけるクラミジアのトランスクリプトーム解析(RNAseq)を行った。偏性細胞内寄生細菌のRNAseqに関する報告は殆ど無かったため、クラミジアRNAの濃縮、rRNAの酵素による分解を行い解析に供したが、ncRNAを含む新規の発現領域は認められなかった。ncRNAの同定という目標達成は出来なかったが、困難であった偏性細胞内寄生細菌のRNA抽出に関して重要な情報を得ることができた。RNAseqは他のプロジェクトで引き続き進行中である。クラミジアは属・種間で多様な宿主域、病原性を示す。クラミジアは偏性細胞内寄生性を示し、宿主細胞中で感染性粒子である基本小体(EB)から増殖能を示す網様体(RB)への性状転換を伴うユニークな増殖環を有する。増殖環は属・種間で多様性が認められ、多様な宿主域や病原性にも関連すると考えられる。申請課題では、クラミジアの増殖環の制御機構を明らかにすることを目的とする。特にnon-coding RNA (ncRNA)による遺伝子制御機構に着目する。これまでの検討により、昨年度実施したRNAseqではncRNAの同定はできなかった。これには、調整したRNAの質的、量的な問題が考えられた。今年度は、昨年度に引き続き、感染細胞からの菌体精製、さらにそれからのRNA調製法の改良を行った。調整したRNAの品質について、幾つかの遺伝子発現を検討したところ、解析に充分耐えられるものがえられるようになったのではと判断している。次年度は、RNAseqを再度試み、ncRNAの同定を含めた、目的の達成を目指す。具体的には、1)次世代シーケンサー(NGS)を用いたトランスクリプトーム解析によるクラミジアncRNAの網羅的な同定、2)同定したncRNAの標的RNA探索やin vitroにおける機能解析、を行う。ncRNAによるクラミジア宿主域決定や病原性制御という新たな概念を創出することを目指す。今年度は、NGSを用いたRNA seqを一度行ったが、種々の問題点が明らかとなった。精製基本小体および感染細胞から抽出した全RNAより、オリゴdTおよび原核生物のrRNAプローブを用いて、クラミジアmRNAの濃縮を試み、RNA seqに供した。結果、クラミジアゲノムにマッピングできたリードが約12%、そのうち98%がrRNAであった。そのため、特に感染細胞からのサンプル調製の改良を検討した。結果、感染細胞からクラミジア封入体を精製し、より高品質のクラミジアmRNAを精製する系を構築できた。申請課題では、クラミジアの増殖環の制御機構を明らかにすることを目的とし、特にnon-coding RNA (ncRNA)による遺伝子制御機構に着目することとした。これまでに、すでにゲノム配列を決定済みのChlamydia psittaci国内分離株mat116を経時的に感染させた細胞より全RNAを抽出した。市販のキットを用いて、全RNAより細菌由来RNAを濃縮し、RNAseqを行った。しかしながら、リードの大部分は宿主由来のものであり、mat116株ゲノムにマッピングされたリードは殆ど認められなかった。次に、酵素を用いて、宿主及びクラミジアのrRNAを特異的に分解する方法を検討したが、効果は認められなかった。最終年度は、これまでの検討結果と学会・論文で入手した情報を元に、細胞破壊と、マグネチックビーズを用いた宿主mRNAと宿主・細菌rRNAの除去を組み合わせてサンプル調製を行いRNAseq解析に供したところである。得られるデータの解析については、分担者が他の病原体を用いて行った方法に準じて行っている。研究期間を通じてサンプル調製に難航し目標達成は出来なかったが、他の細菌のRNAseq解析に比べ、偏性細胞内寄生細菌については、外国のグループも含め殆ど報告が無く、本研究で得られたノウハウは貴重な情報になったと考えている。次年度以降は、他のプロジェクトで引き続きクラミジアのRNAseq解析とncRNAの同定を行う予定である。

mat116株の細胞内増殖機構解明だけでなく、由来・病原性の異なるクラミジア他種株との比較検討も計画している。獣医微生物学概要のところでも述べたとおり、偏性細胞内寄生細菌のRNAseq解析は、他の人工培地で増殖可能な細菌のRNAseq解析よりも難しい点が多い。ここまでの検討で、ようやく解析に充分耐えうる質・量のRNAが確保できるようになったと考えている。偏性細胞内寄生細菌のRNAseqに関しては報告がまだ少なく、世界中の研究者が同様の問題に対していることもあり、学会等で情報交換している。ようやく、質・量共に解析に耐えうるサンプルを得られるようになったと考えており、現在の遅れは想定の範囲内である。実績概要のところで述べたとおり、RNA seq解析で有意なncRNAを同定することができなかった。しかしクラミジアは偏性細胞内寄生細菌であるため、他の人工培地で増殖可能な細菌と比較し、RNA seqが難しいであろう事は予想できたことである。今年度は、RNA調整法の再検討、改良を行うことができた。偏性細胞内寄生性細菌におけるRNA seqの報告は世界的にもまだ少なく、現時点での遅れは想定した範囲内であると考えている。調整したサンプルから、定法に従いライブラリーを作製しRNAseq解析に再び供する。解析には共同研究者が新規に導入する最新の機種を用いる予定である。得られたデータの解析を行い、目標の達成を目指す。改良したRNA調整法で再度、RNA seqを試みる。サンプルは、精製基本小体と、感染12時間後のサンプルを予定している。また、クラミジアカスタムアレイを作製するため、調整したRNAはアレイ解析にも供する。最終的にはRNA seqおよびアレイの結果を比較解析し、ncRNAの同定を目指す。RNAの調整法、得られたデータの解析法については、専門家と密にディスカッションを行えるような体制も整えることができた。平成25年度は感染細胞からのクラミジア菌体精製法の改良を中心に検討を行っていた。当初計画では、平成25年度中に、改良した方法で調整した材料を用いて解析を行う予定であった。2013年12月に、細胞内寄生生物のトランスクリプトーム解析に関する新しい論文が発表された。この論文に記載してある方法は、研究課題に非常に有用であると思われ、急遽、この方法をとりいれるべく再検討を始めた。そのため、補助事業機関延長申請をした。改良したサンプルの調製方法、すなわち、ビーズを用いた感染細胞の破壊、全RNAからのrRNAの除去により、感染細胞から、高純度のクラミジアRNAを精製する。トランスクリプトーム解析に関しては、定法に従いライブラリーを作製し次世代シーケンサーを用いた解析に供する予定である。必要に応じて、リアルタイムPCR、クラミジアアレイも実施する。
骨格系の制御システムと脂肪・血管制御系との連関およびその異常に基づく病態の解明

IL-11は骨への力学負荷により遺伝子転写が促進され、Wnt系を活性化して骨芽細胞分化を促進し骨形成に重要な役割を果たすことを示した。TGF-・阻害薬は骨芽細胞分化を促進し、成熟骨芽細胞は骨髄腫の増殖と骨破壊病変を抑制することから、TGF-・阻害薬が骨髄腫の治療薬となり得ることを示した。一部のスタチンが心拡張障害や腎血流障害の改善作用を示すこと、トロンビン阻害因子ヘパリンコファクターII(HCII)が血管平滑筋細胞の遊走増殖を阻害し動脈硬化を抑制することを臨床的・基礎的検討で示した。(1)骨形成障害に基づく病態の解明と治療法の開発力学的偵荷の免荷による遺伝子発現変化、運動負荷による遺伝子発現変化を観察する実験系を確立し、力学的負荷によりIL-11遺伝子プロモーター上のAP-1頒域に△FosB/JunD複合体が結合しSmad結合領域にSmad1が結合し両者は複合体を形成することを見庸した。更にIL-11の発現促進はWntシグナルのcanonical経路阻害因子であるDKK-1,2の発現低下をもたらし、これがIL-11による骨形成促進に関与する可能性を明らかにした。(2)多発性骨髄腫に伴う骨破壊病変の発症機序の解明と治療法の開発骨髄腫細胞による骨吸収の促進を介して骨基質より放出・活性化されるTGF-βもWntシグナル抑制因子と共に骨芽細胞の終末分化を抑制することを示した。また終末分化した骨芽細胞は骨髄腫細胞の増殖を強力に抑制することが明らかになった。そしてTGF-β阻害薬は骨芽細胞分化の促進を介して骨髄腫の生育を抑制したことから、抗骨髄腫治療へのTGF-β阻害薬の応用の可能性が開けた。(3)骨格系における循環動態の障害に基づく病態の解明と治療法の開発スタチンの一部がクルココルチコイド過剰等による循環障害に対し拮抗的に作用することを見出した。またトロンビン阻害因子であるheparincofactor II(HCII)がトロンビンの血管平滑筋細胞等の遊走・増殖促進作用を阻害することにより冠動脈再建術後再狭窄、頸動脈硬化病変の進行、末梢閉塞動脈症等に対し抑制的に作用することを臨床的および基礎的検討により明らかにした。(1)骨形成障害に基づく病態の解明と治療法の開発力学的負荷の低下に伴う著明な骨形成障害の機序を解明し、その予防・治療法を確立するため、力学的負荷による骨芽細胞分化の制御機構の解明を図った。力学的負荷によるIL-11遺伝子プロモーター上でのAP-1転写因子ΔFosB/JunD二量体とSmad1/5との複合体形成によりIL/11の遺伝子の転写が促進される。増加したIL/11はcanonical Wntシグナル抑制因子DKK-1, 2の発現抑制を介し骨芽細胞分化を促進することを示した。一方、JunDのAP-1結合活性は加齢と共に低下し、並行して骨芽細胞分化が抑制される。今回、JunDに結合し酸化ストレスによるJunD塩基領域内システインの酸化を防止しAP-1結合活性の低下を防止するMBF-1を同定した。MBF-1は加齢に伴いユビキチン化され分解されることから、老化に伴う骨芽細胞分化の抑制にこのMBF-1蛋白の低下が関与する可能性を明らかにしたる(2)多発性骨髄腫に伴う骨破壊病変の発症機序の解明と治療法の開発骨髄腫細胞の生育・増殖は骨髄微小環境において間質細胞や破骨細胞の共存下で促進される。この骨髄腫細胞の生育・増殖の促進には、その機序として、IL-6や破骨細胞からのTNF familyサイトカインBAFF/APRILなどが重要であることを示した。その機序として、IL-6は骨髄腫細胞においてJAK/STAT3経路を介して、またBAFF/APRILなどはNF-kBを介して骨髄腫細胞のセリン・スレオニンキナーゼPim-2を活性化し、Pim-2がアポトーシス誘導因子Badをリン酸化することにより抗アポトーシス作用を発揮することを見出した。(3)骨格系における循環動態の障害に基づく病態の解明と治療法の開発グルココルチコイド(GC)過剰により、酸化ストレスの増大と内皮型一酸化窒素合成酵素eNOSの発現低下を介し血管内皮機能が障害され大腿骨頭壊死を発症することを示してきた。GCはその受容体GRとの結合を介して作用するが、GRとミネラロコルチコイド(MC)受容体MRとの間にはGC親和性に殆ど相違ない。血管内皮細胞ではGC不活性化に関わる11β-HSD2の発現が低くGCがMRに結合し転写活性を促進することを見出した。

更にこれらのGC作用はGR阻害薬RU486と共にMR阻害薬スピロノラクトンにより抑制されたことから、MR阻害が血管内皮機能の改善を介して大腿骨頭壊死症の新たな予防・治療法となる可能性を示した。(1)力学的負荷による骨形成促進におけるIL-11の役割の解明:力学負荷はAP-1とSmad1/5との複合体形成を介してIL-11遺伝子の転写活性を促進し、IL-11はWntシグナルも活性化し骨芽細胞分化を促進することを見出した(PLoS ONE'10a)。更にIL-11欠損マウスの作成に成功し、骨形成低下に基づく骨密度低値を示すことを明らかにした。以上よりIL-11の骨形成における役割の重要性を示した。(2)多発性骨髄腫の骨髄微小環境下での骨破壊・腫瘍進展に対する治療法の開発:成熟骨芽細胞は骨髄腫細胞の増殖を抑制するが、骨髄腫は骨芽細胞分化を抑制し自らに好適な骨髄微小環境を形成する。TGF-β阻害により骨芽細胞分化が促進され、骨髄腫の増殖および骨破壊病変の進展が抑制されることを、SCID-rab骨髄腫移植モデルを用いたin vivoでの検討により明らかにした(PLoS ONE'10b)。(3)Wntシグナル系が骨芽細胞・脂肪細胞分化と脂肪蓄積・糖代謝に及ぼす影響:肥満者脂肪細胞で高発現する複数の因子をプロテオミクス解析により同定し、特にWntシグナル阻害因子sFRP-4に注目した。sFRP-4トランスジェニックマウスを作成し、高脂肪高蔗糖食負荷をかけたところ、インスリン抵抗性に基づく耐糖能の障害を呈することが明らかとなった。更にその詳細な機序について検討を進めている。(4)血管閉塞後の血管新生反応におけるVEGF作用発現へのアンドロゲンの関与の解明:アンドロゲン受容体(AR)欠損マウスではdoxorubicin(Dox)による活性酸素産生を介する心筋障害の発症・増悪が対照群より強く認められることを見出した(Mol Endocrinol '10)。更に、大腿動脈結紮による下肢虚血モデルにおける血管新生もAR欠損マウスでは著明に抑制されていることが明らかとなった。しかもこれがARのnon-genomic作用に基づくVEGF受容体2型(Kdr)へのPI3KやSrcの結合促進を介するAktシグナルの促進によるeNOS活性の増大および抗アポトーシス作用に基づく可能性を明らかにした。
Toll様受容体4複合体を介した自然免疫の機能におけるコアフコースの意義

自然免疫を担うマクロファージではトール様受容体(TLR)が病原体を特異的に認識し排除することが分かっています。本研究では特に「TLR4を介する自然免疫での糖鎖の役割」を明らかにするために、コアフコースという糖に着目しました。コアフコース欠損細胞を用いてTLR4をリポ多糖で刺激したところ、2種類のTLR4シグナル伝達経路のうちの1つ、インターフェロン-βの産生が特異的に抑制されることを見いだしました。これは細胞表面のTLR4複合体のCD14依存的な細胞内への輸送が抑制されたためと考えられます。すなわち、コアフコースが自然免疫で病原体センサーTLR4を介した感染防御に必須であることが分かりました。「TLR4複合体におけるコアフコース糖鎖の機能の解明」を切り口に「自然免疫における糖鎖の機能」の理解することを目的とした。TLR4は細胞膜上でMD2と複合体を形成し、グラム陰性菌の細胞壁成分であるLipopolysaccharide(LPS)を認識することでそのシグナルを伝え、炎症性サイトカインの分泌を促す。これまでの培養細胞を用いた実験で、コアフコース欠損時ではTLR4,MD2が細胞表面に正常に発現し、且つTLR4-MD2複合体を形成するにも関わらず、LPS刺激時においてそのシグナル伝達が抑制されることが分かった。LPS刺激後のTLR4-MD2複合体の動態を経時的にフローサイトメトリーで観察したところ、Fut8を欠損した細胞ではLPS刺激にも関わらずTLR4-MD2複合体が細胞表面上に保持される傾向が観察された。このことから、Fut8欠損時ではTLR4-MD2複合体はLPSとの結合が抑制され、結果、正常なLPSシグナル伝達が抑制されることが示唆された。次に、Fut8欠損マウスのマクロファージを用いたin vivoでの解析の系を立ち上げた。Fut8欠損マウスは胎生致死であり生体内でFut8欠損マクロファージの機能を検討することが不可能である。そこで、Fut8欠損マウスの胎児肝細胞由来マクロファージをドナーとし、マクロファージを欠損したレシピエントマウスに移植することでマクロファージキメラマウスを作製、LPSに対する血中炎症性物質の産生を調べることで生体内におけるコアフコースによるTLR4機能制御の役割を解明を目指した。すでに、生体内においてマクロファージを欠損させる試薬であるクロドロン酸をマウスに投与することで、体内で一時的にマクロファージを欠損させることに、また、マウス胎児肝細胞を分離し、マクロファージに分化させることに成功した。Toll様受容体(Toll-like receptors,TLR)は自然免疫を担うマクロファージなど免疫系細胞に発現し、外来の病原体特有の分子パターンを特異的に認識、病原体を排除することで感染を防御する重要な役割を果たしている。フコース転移酵素α1,6-fucosyltransferase(Fut8)は、フコースをN型糖鎖に付加させコアフコースと呼ばれる糖鎖を合成する糖転移酵素である。Fut8欠損マウスは成長遅延や肺気腫など重篤な症状を示すためコアフコースが生体に必須であることが分かるが、自然免疫における機能は不明である。そこで本研究では、自然免疫の重要な因子であるTLR4の機能制御にコアフコースが関わるか、分子レベルで明らかにすることを目的とした。リポ多糖(Lipopolysaccharide,LPS)はグラム陰性菌の細胞外膜の構成成分であり、TLR4複合体を受容体とし炎症性サイトカインの合成を誘導する。本研究で野生型、Fut8を欠損した培養細胞を用いてLPS刺激後のサイトカインの分泌を比較した結果、Fut8欠損細胞ではIL-6の分泌に差はない一方でIFN-βの分泌が著しく抑制された。そこでコアフコース欠損時のTLR4シグナルの詳細を検討した。TLR4はLPSと結合したのちに二量体を形成し、その後TLR4が細胞膜に局在したMyD88依存的シグナルによりIL-6を、TLR4のエンドサイトーシスを介したTRIF依存的シグナルによりIFN-βの発現を誘導する。Fut8欠損細胞ではLPSに対する結合性やTLR4二量体形成は正常であるにも関わらず、その後のTLR4複合体のエンドサイトーシスが変化することでシグナル伝達が抑制されることが分かった。この結果より、コアフコースは自然免疫において、TLR4複合体のエンドサイトーシスを介したサイトカインの分泌に必須であると結論できた。本研究では自然免疫の重要な因子であるTLR4に着目し、TLR4の機能におけるコアフコースの役割を明らかにすることを目的とした。そこでまず、野生型、Fut8を欠損した培養細胞を比較して、TLR4のリガンドであるLPS刺激時の表現型と、コアフコースがTLR4にどのように関わるか分子メカニズムを調べた。その結果、上記「研究実績の概要」で記した通り、コアフコースはLPS刺激におけるTLR4複合体のエンドサイトーシスに必須であり、コアフコースの欠損に起因するエンドサイトーシスの低下はIFN-βの分泌を抑制することを明らかにした。以上の結果は主にマウス胎児由来線維芽細胞等の培養細胞を用いた研究であり、他の細胞でも同様の現象が得られるかの普遍性が不明である。特にマウスマクロファージなど免疫系細胞を用いるなど、よりvivoに近い条件で調べる必要がある。

そこで、Fut8欠損マウスは多くが胎生致死となるために、Fut8を欠損した胎児肝細胞由来マクロファージを用いた測定系を手掛けたが、研究室の閉鎖に伴う研究機関の変更と雇用の不確定など研究環境の重なる変化のため、長期的なマウスの維持を伴う実験は不可能になった。より簡便なFut8ヘテロマウス由来の腹腔マクロファージを用いた解析では、野生型マウス由来の腹腔マクロファージと比較してIFN-βの分泌に差がなく、Fut8を欠損した免疫系細胞を用いた解析が望ましいと考える。このように、自然免疫の重要な因子であるTLR4において、コアフコースを介した免疫応答の機構を新たに明らかにしたことで当初の主となる目的は達成できたと考える。今後、マウスマクロファージなど免疫系の細胞を用いることで更にvivoに近い現象を検討する必要性があると考え、【現在までの進捗状況】の結論を「(2)おおむね順調に進展している。」とした。コアフコースはフコース転移酵素α1,6-fucosyltransferase (Fut8)によりフコース残基をN型糖鎖の根元に付加させることで合成される糖鎖構造であるが、Fut8欠損マウスでは成長遅延や肺気腫などの重篤な症状を示すことから、コアフコースが生体において必須であることが分かる。一方でToll様受容体(Toll-like receptor, TLR)4複合体を介した自然免疫は生命活動に重要な役割を果たすが、TLR4受容体における糖鎖の機能は不明な点が多い。そこで本研究では、TLR4複合体を介した自然免疫の機能とコアフコースとの関わりに着目し、Fut8を欠損させた培養細胞を用いてコアフコースの役割を調べた。結果、Fut8を欠損した細胞では野生型と比較して、グラム陰性菌細胞壁外膜の構成成分であるリポ多糖(Lipopolysaccharide, LPS)に対する反応性が低下することが明らかになった。詳細を調べたところ、Fut8欠損細胞ではLPSに対する結合性やその後のTLR4二量体形成は正常であるにも関わらず、その後のTLR4を含む機能的な複合体の細胞内動態が変化することでシグナル伝達が抑制されることが分かった。また、TLR4を介したシグナル伝達の重要な因子としてMD2とCD14が挙げられる。MD2はTLR4と複合体形成して細胞表面への移行やTLR4の二量体形成と関わり、CD14はTLR4を介したエンドサイトーシスに必須であることが報告されている(Cell. 2011Nov 11;147(4):868-80)TLR4,MD2,CD14のこれらの因子がコアフコースで修飾されているかを調べるたところCD14のみ修飾が検出された。これらの結果から、CD14を修飾するコアフコースの欠損がエンドサイトーシスを介したTLR4シグナルの抑制に関わると考えられる。TLR4複合体を介した自然免疫の機能とコアフコースとの関わりに着目した当課題では、Fut8を欠損させた培養細胞を用いてコアフコースの役割を調べた。TLR4シグナルにおけるコアフコースの役割を明らかにするために、TLR4シグナルの各段階1)TLR4のパートナー分子であるMD2とのTLR4-MD2複合体の形成、2)LPSとの結合、3)TLR4-MD2複合体の二量体形成、4)エンドサイトーシス、5)インターロイキン6やインターフェロンβなどの炎症性物質の発現、に着目してそれぞれ調べた。
肝斑・老人性色素斑における色素形成メカニズムの解析

色素沈着症の発症過程において、表皮細胞とのパラクリン機構によるメラノサイト活性化メカニズムが近年注目されている。なかでも、紫外線色素沈着においては表皮細胞の分泌するエンドセリンがメラノサイトを刺激し、色素産生を促すことが最近解明された。また種々の性ホルモンがメラノサイトの活性化を促進する事実も判明している。以上の事実に基づき、日常的に見られる肝斑、老人性色素斑の色素形成メカニズムにおいても上述のごとき機構が関与するか否かを解明する目的で以下の実験を行った。1:肝斑におけるエンドセリンの関与について、血中エンドセリン量をELISA法で、性ホルモン(LH、FSH、エストロゲン、プロゲステロン)RIA法で測定し、正常人のそれと比較検討した。2:老人性色素斑の表皮細胞のエンドセリンmRNAの発現を検討するために、患者より採取した病変皮膚および正常皮膚を60°Cの生食に3分留置し、表皮を剥離しAGPC法によりRNAを分離し、エンドセリン-1を増幅するプライマーを用いてRTPCRを行った。その生成物を電気泳動し、エンドセリン-1mRNAの発現を半定量的に解析した。結果1:正常人3名(平均年齢43歳)の血中エンドセリン量:卵胞期(1.43±1.04pg/ml)、黄体期(1.5±0.9pg/ml)と比較し、肝斑患者5名(平均年齢38歳)では卵胞期(1.46±1.09pg/ml)、黄体期(1.28±0.87pg/ml)と有意な差を認めず、性ホルモンの変動とも一致しなかった。2:老人性色素斑3例の病変皮膚および正常皮膚でエンドセリン-1mRNAの発現を認めたが、両者で発現量に差を認めなかった。今回の実験では肝斑および老人性色素斑の色素沈着へのエンドセリンの関与は証明され得なかった。
電荷移動型錯体による高効率二重項蛍光

これまで発光性ラジカルは光照射化等の環境で不安定と考えられてきたが、これまでの研究でその安定性を大きく向上させることに成功した。しかし、これらの安定発光ラジカルの発光効率は低く、発光効率の改善が大きな課題であった。ラジカルの発光は二重項励起状態から二重項基底状態への蛍光というユニークな性質を持ち、スピンを活かした発光材料や高効率ELデバイスへの応用が考えられる。申請者はこれまでに、発光ラジカルのフッ素原子の導入と金錯体化により安定ラジカルの発光量子収率が向上することを見出していたが、これらの相乗効果を狙った錯体を作成することでより高い発光効率を達成することができた。量子化学計算を用いて振電相互作用をについて考察することで、安定発光ラジカルの発光効率をより高めるための指針についても得ることができた。この知見に則り、金(I)カチオンに配位するカウンターの配位子の電子求引性を高めることで量子収率が向上すると予想した。具体的にはトリフェニルホスフィンの代わりにNHCカルベン配位子を用いることで、量子収率30%以上と、ジクロロメタン中、安定発光ラジカルで過去最高の発光効率を得ることができた。さらに、二重項蛍光分子の新たな応用例として、プロトンや金属等と反応して発光を変化させる陽イオンセンサーを考案した。二重項蛍光には重原子効果による失活の影響を受けないという特色があり、重原子が豊富な環境下でプローブとして独自性を発揮できる。ピリジル基やテルピリジル基といった新たな配位部位を持つ発光ラジカルを合成したところ、これまで発光への影響が見られなかった配位力の弱い金属カチオンや、消光の原因であったプロトンを加えたときに、発光強度が増加することが観測された。28年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は安定発光ラジカルの基本骨格に修飾を加えることで、安定性の向上や発光効率の改善にどのような要因が寄与するのかを見出すことを目的に研究を行った。安定発光ラジカルPyBTMの安定性や軌道準位にはラジカル中心のメチル基の周囲の6つの塩素原子が大きな役割を果たしており、これらを変更することで安定性や発光効率に影響が出ると予想される。申請者はそれらのうちピリジン環上の塩素原子に注目し、ピリジン環上の塩素原子をフッ素原子に替えたF2PyBTMラジカル及び臭素原子に替えたBr2PyBTMラジカル合成した。吸収及び発光の波長はF2PyBTM < PyBTM < Br2PyBTMの順に長波長シフトした。この変化は分子軌道のエネルギーを量子化学計算することで説明することができた。F2PyBTMはジクロロメタン中で4%とPyBTMより強い蛍光を示し、Br2PyBTMは370 nmの紫外光照射化でPyBTMよりも高い安定性を示した。F2PyBTMでの蛍光量子収率の増加はフッ素原子の持つ強い電子求引性及び発光の短波長シフトと関連付けられ、Br2PyBTMでの光安定性の増加は臭素原子の立体効果あるいは発光の長波長シフトに起因すると考えられた。以上のように合成及び計算により、安定発光ラジカルの基本骨格に関する理解が進展した。具体的な設計は当初の電荷移動型の方向性とは異なるものの、発光量子収率を向上させて安定発光ラジカルの発光物質としての有用性を示すという当研究の最終的な目標に向けて進展している。

前年度に見出された錯体化による安定発光ラジカルの光安定性及び発光効率の向上と、今年度得られた安定発光ラジカルの基本骨格に関する理解・特にフッ素原子の導入による量子収率の向上を合わせることで、これまで以上の安定発光ラジカルの発光効率を達成することを狙い、研究を進めていく。28年度が最終年度であるため、記入しない。