hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
哺乳類頭部神経堤細胞の移動開始から歯・骨・軟骨形成までを解析する長期培養系の開発

すなわち、頭部神経堤細胞の移動時期からラット胚の全胚培養を開始し、2日間の培養後、顎顔面原基を摘出し器官培養を610日間行い、歯胚・メッケル軟骨・舌などの形態形成・組織分化が再現された。2)歯胚の間葉細胞の由来まず、移動前の頭部神経堤細胞を蛍光生体色素に標識し、第一鰓弓の歯胚の予定形成域に到達する頭部神経堤細胞の移動開始時期と位置を明らかにした。次にその特定した時期及び位置の頭部神経堤細胞を標識し、1)で確立した系を用いて発生を進ませ、哺乳類の歯胚間葉が中枢の神経堤細胞に由来することを明らかにした。本研究室では、ラット胚全胚培養と下顎器官培養を組み合わせることにより、哺乳類胚を材料として神経堤細胞の移動前から軟骨・歯胚・舌・洞毛などの組織分化までをin vitroで再現することが可能な長期培養系を開発している。1)長期培養系の確立A)哺乳類全胚培養系と下顎器官培養系を組み合わせることにより、頭部神経堤細胞の移動時期から歯胚・メッケル軟骨・舌などの形態形成・組織分化が起こる時期までをin vitroで再現できる長期培養系を確立した。B)哺乳類全胚培養系と上顎器官培養系を組み合わせ、頭部神経堤細胞の移動時期から歯胚・洞毛などの形態形成・組織分化が起こる時期までをin vitroで再現できる長期培養系を確立した。すなわち、頭部神経堤細胞の移動時期からラット胚の全胚培養を開始し、2日間の培養後、上顎もしくは下顎顔面原基を摘出して器官培養を610日間行った結果、歯胚・メッケル軟骨・舌・洞毛などの形態形成・組織分化がin vitroで再現された。2)歯胚の間葉細胞の由来移動前の頭部神経堤細胞を蛍光生体色素で標識し、第一鰓弓の歯胚の予定形成域に到達する頭部神経堤細胞の移動開始時期と神経管上の位置を明らかにした。次に、その特定した時期及び位置の頭部神経堤細胞を標識して、1)で確立した系を用いて、哺乳類の歯胚間葉が中脳の神経堤細胞に由来することを明らかにした。3)組織特異的な外来遺伝子の導入頭顔面領域では、内胚葉、外胚葉、神経堤細胞、一次中胚葉など多く細胞が存在しているため、頭顔面領域におけるパターン形成を明らかにするためには、これらの由来のことなる組織間の相互作用を解明することが必要である。本年度は、アデノウイルスを用いて標識遺伝子を組織特異的に導入した後、長期間培養(全胚培養+上下顎器官培養)を行う系を確立した。この系を用いた組織特異的な遺伝子導入は、哺乳類頭部の形態形成を明らかにするには、極めて有効な手段と考えられる。1)長期培養系の確立A)哺乳類全胚培養系と下顎器官培養系を組み合わせることにより、頭部神経堤細胞の移動時期から歯胚・メッケル軟骨・骨・舌などの形態形成・組織分化が起こる時期までをin vitroで再現できる長期培養系を確立した。
光周反応における複眼-単眼の役割

本研究は光周反応において、複眼や単眼による光受容がどのくらい一般的であるかを検討することを目的としている。陸生甲殻類のオカダンゴムシ成体において、まず光周反応の性質を明らかにした後、複眼の除去実験を行い、複眼が光周反応に関与している可能性のある結果を得た。同じく、オオクロナガオサムシ幼虫の側単眼の除去実験を行い、側単眼が光周性に関わっていることが示された。しかし、どちらの種も手術後の死亡率が高く、十分な数が得られなかった。そして、モリチャバネゴキブリ幼虫の複眼切除実験とアカスジキンカメムシの幼虫複眼の塗りつぶし実験は、結果がばらついていたために結論を下すことができなかった。これらについて、今後さらに実験を継続する必要がある。チャバネアオカメムシでは、光周反応において複眼が主要な光受容器として機能しており、単眼は関与しなかったが、複眼・単眼以外の光受容器も関わっていることが明らかになった。さらに、すでに光周反応の受容器として複眼が使われていることを既に私たちが明らかにしているマダラスズとルリキンバエについて、概日歩行活動リズムのエントレインメントに関わる光受容器を同じ方法で検討した。その結果、どちらの種においても概日時計には複眼とそれ以外の受容器の両方からの情報が入力することがわかった。チャバネアオカメムシの光周反応、マダラスズとルリキンバエの概日リズムに関わる複眼以外の受容器は特定していないが、これまでの研究から脳内に存在すると推定できる。これらのことから考えて、脳の光受容器はかなり広い範囲の昆虫に存在しており、光周反応において複眼と脳の光受容器のどちらを採用するか、あるいはその両方を使うかは、種ごとに違っているようであり、一般的な法則はないと考えられた。本研究は昆虫の光周反応において、複眼や単眼による光受容がどのくらい一般的かを検討するため、いくつかの昆虫および近縁の節足動物であるオカダンゴムシにおいて光周反応に関与する光受容器を明らかにすることを目的とする。本研究は実験に用いる種を野外で採集し、実験条件下の飼育方法を確立し、それぞれの虫の基本的な光周反応を明らかにする第1段階と、複眼・単眼を切除する、焼きつぶす、あるいは銀を含んだ塗料で覆うことが光周反応に及ぼす効果を調べる第2段階からなる。今年度の第1段階の研究では、オカダンゴムシ成体が20°Cでは長日条件でのみ生殖を継続し、短日条件では成長や脱皮は続くものの生殖が抑制されることが明らかになった。また、過去の研究によって既に報告されていたオオクロナガオサムシ幼虫の長日型光周反応が確認された。チャバネアオカメムシでは第2段階の複眼・単眼の切除実験を行い、本種の光周反応において複眼が主要な光受容器として機能し、単眼は関与しないことが明らかになった。他にモリチャバネゴキブリ・アカスジキンカメムシの幼虫複眼を切除することが光周反応におよぼす効果を調べる実験の結果は、例数が少なかったり結果がばらついていたりして、その解釈がはっきりしない。今後、これらの実験を継続するとともに、今年度第1段階の終了したオカダンゴムシ成体において複眼切除または塗りつぶし実験、オオクロナガオサムシ幼虫において側単眼切除実験を試みたい。昨年度光周反応の性質を明らかにした陸生甲殻類のオカダンゴムシ成体において複眼の除去実験を行い、複眼が光周反応に関与している可能性のある結果を得た。

同じく、オオクロナガオサムシ幼虫の側単眼の除去実験を行い、側単眼が光周性に関わっていることが示された。しかし、どちらの種も手術後の死亡率が高く、十分な数が得られなかった。そして、モリチャバネゴキブリ幼虫の複眼切除実験とアカスジキンカメムシの幼虫複眼の塗りつぶし実験は、結果がばらついていたために結論を下すことができなかった。これらについて、今後さらに実験を継続する必要がある。昨年度複眼・単眼の切除実験を行い、光周反応において複眼が主要な光受容器として機能しており、単眼は関与しないことを明らかにしたチャバネアオカメムシについてさらに詳細に検討したところ、複眼・単眼以外の光受容器もかかわっていることが明らかになった。さらに、すでに光周反応の受容器として複眼が使われていることを既に私たちが明らかにしているマダラスズとルリキンバエについて、概日歩行活動リズムのエントレインメントに関わる光受容器を同じ方法で検討した。その結果、どちらの種においても概日時計には複眼とそれ以外の受容器の両方からの情報が入力することがわかった。チャバネアオカメムシの光周反応、マダラスズとルリキンバエの概日リズムに関わる複眼以外の受容器は特定していないが、これまでの研究から脳であると推定できる。これらのことから考えて、脳の光受容器はかなり広い範囲の昆虫に存在しており、光周反応において複眼と脳の光受容器のどちらを採用するか、あるいはその両方を使うかは、種ごとに違っているようであり、一般的な法則はないと考えられた。
組織培養法による成熟網膜神経細胞の軸索再生に関する研究

成熟哺乳動物としてラットをもちい網膜組織を培養、再生神経突起の本数を計測することで神経再生促進因子の効果を検討した。あらかじめ上丘よりDiI,Fluoregoldなどの蛍光色素による逆行性染色にて網膜神経節細胞を標識したのち、コラーゲン培養法をもちいて無血清培養液にて網膜組織を培養した。この培養系において蛍光色素により標識された神経細胞から神経突起が再生していること、また、この神経突起は抗Thy 1抗体により染色されることから網膜内層の神経節細胞からの再生突起であることが確認できた。さらにこの培養液に4種類の神経栄養因子を各々添加し、その神経再生促進効果を検討した。この研究から神経栄養因子のうち脳由来神経栄養因子(brain-derived neurotrophic factor:BDNF)およびニューロトロフィン-4(neurotrophin-4:NT-4)に神経再生促進効果があることを見いだした。また培養初期には神経成長因子(nerve growth factor:NGF)にも神経再生促進効果が見られたがこの効果は培養日数が経つにつれ消失した。ニューロトロフィン-3(neurotrophin-3:NT-3)には培養期間を通じて神経再生促進効果はみられなかった。また、成人ヒト網膜をもちいた組織培養にても同様の結果が得られた。今後もこの培養系をもちい、培養液中に様々な物質を添加して成熟哺乳動物網膜の神経再生を解析し、中枢神経細胞からの軸索再生機構とその促進因子について研究を進める予定である。
学校教育における設計科学的視座に基づく数理科学教育の構築に関する総合的研究

本研究は,目的や価値に向き合い“あるべきものを探求する"「設計科学」の視座から学校教育の対象となる数理科学の内容や方法を同定し,それを学習領域として位置づけ,教材開発とそのカリキュラム化,授業・評価モデル,教師教育プログラムの開発を実証的に行うことを目的とする研究である。平成30年度は,研究分担者及び大学等の研究者に加え,小・中・高等学校の教諭や指導主事等,総勢48名からなる研究組織で,理念班,内容・方法班,教材・授業班,教師教育班に分かれて研究を進めた。第一に,日本数学教育学会春期大会「創成型課題研究」の部で発表した。具体的には,理念班が,本研究の目指す数理科学教育の目標,方法,内容,評価に関する主要な特徴を整理した「数理科学教育の基本的な枠組み」と,数理科学的意思決定の過程をふまえた「数理科学的意思決定に関する基本的な授業過程」を提起した。また,それらにおける価値,価値観,価値命題並びに対話の意義について明確化した。内容・方法班は,データ分析,OR理論,品質管理等に関する文献,高等学校段階を対象とする欧米のプロジェクトの教材や教科書を分析し,対象とする内容や方法を具体的に提案した。教材・授業班は,学校種別のWGに分かれ開発したケーススタディ型の教材を示した。第二に,上記の成果をもとに,理念班は,数理科学教育のカリキュラム構成モデルに関して,STEM教育に対するdisciplinaryアプローチを手がかりとして検討を進めた。第三に,内容・方法班,教材・授業班は,開発した教材の指導案を作成し,小学校2校,高等学校1校において授業実践を行い,その様相を分析した。第四に,教師教育班は,欧米のプロジェクトにおける教師教育モジュール等を分析し,数理科学教育の進展に向けた教員養成課程における科目や現職教育のためのワークショップの具体化に向けた示唆を得た。「数理科学教育の基本的な枠組み」,数理科学的意思決定の過程をふまえた「数理科学的意思決定に関する基本的な授業過程」の理念的基盤を明確化するとともに,これまでに開発した教材の授業実践も行い,その様相の分析を行った。数理科学教育のカリキュラム構成モデル,教員養成課程における科目や現職教育のためのワークショップの開発も概ね順調に進んでいる。三年次までの成果を,日本数学教育学会春期大会(6月)で発表するとともに,理念班,内容・方法班の研究成果を日本科学教育学会に投稿する。また,授業実践研究を継続し,そこでの児童生徒の様相を分析し,必要に応じて教材の修正を行う。さらに,「設計科学」を視座とする数理科学教育の実践のための教師教育プログラムの具体化を進める。本研究は,目的や価値に向き合い“あるべきものを探求する"「設計科学」の視座から学校教育の対象となる数理科学の内容と方法を同定し,それを学習領域として位置づけ,教材開発とそのカリキュラム化,授業・評価モデル,教師教育プログラムの開発を実証的に行うことを目的とする研究である。一年次である平成28年度は,研究分担者,連携研究者に加え,小・中・高等学校の教諭や指導主事等,総勢41名からなる研究組織で,理念班,内容・方法班,教材開発班,カリキュラム班,授業・評価モデル班に分かれて研究を進めた。理念班は,日本学術会議の提言「社会のための学術としての「知の統合」ーその具現に向けてー」等を踏まえ,個人や社会の価値と対峙しながら,公正で適切な判断や意思決定をしたり,部分ではなく全体としての最適な解を探ったりする上で不可欠な数理科学の学校教育上の意義について検討した。内容・方法班は,データ分析,OR理論,品質管理,グラフ理論に関する文献をリストアップし,それらを分担して分析し,学校教育の対象とする価値があり,かつ,学校教育の対象となりうる内容や方法を検討した。教材開発班,授業・評価モデル班は,学校種別のWGに分かれ,数時間で扱うケーススタディ型の教材の開発を行った。また,英国において,形成的アセスメントを用いた授業の現地調査を実施した。カリキュラム班は,高等学校の非理工系用のカリキュラムに焦点化し,英国の新しい資格試験CoreMaths,米国のTransition to College Mathematics and Statisticsプロジェクトについて調査した。その成果の一部は,日本数学教育学会誌に寄稿として掲載された。先行研究や参照すべき文献を洗い出し,学校教育おける数理科学の理念・理論的枠組み,内容と方法の検討,英国及び米国の高等学校の非理工系カリキュラムの調査を行った。また,ケーススタディ型の教材の開発を進めるとともに,授業・評価モデルの英国現地調査を行い,多く知見が得られている。二年次である平成29年度は,研究分担者,連携研究者に加え,小・中・高等学校の教諭や指導主事等,総勢51名からなる研究組織で,理念班,内容・方法班,教材・授業班(小学校WG,中学校WG,高等学校WG)に分かれて研究を進めた。理念班は,本研究が目指す数理科学教育の目標,方法・手法,内容,評価に関する主要な特徴を整理し,「数理科学教育の基本的な枠組み」と,数理科学的意思決定の過程をふまえた「数理科学的意思決定に関する基本的な授業過程」を提起した。

また,価値,価値観,価値命題について考察し,授業を進めていく上で配慮しなければならない価値観の特性,及び,プラグマティズムが今日の認識科学と設計科学の融合に影響を与えていることを明らかにし,本研究の基本的枠組みや授業過程における対話の意義について明確化した。内容・方法班は,一年次にリストアップしたデータ分析,OR理論,品質管理,グラフ理論に関する文献を分担して分析し,学校教育の対象とする価値があり,かつ,なりうる内容や方法を明確化した。教材開発班,授業・評価モデル班は,学校種別のWGに分かれ,数時間で扱うケーススタディ型の教材の開発を行った。さらに,英国の新しい大学入学資格試験科目であるCore Maths.について現地調査を実施するとともに,英国の数学教育改良プロジェクトBowland Maths.とともに,意思決定に関わる教材のスタータキットを作成した。「数理科学教育の基本的な枠組み」と,数理科学的意思決定の過程をふまえた「数理科学的意思決定に関する基本的な授業過程」を構築するとともに,これらの枠組みが,価値観と対話という視座から,設計科学と認識科学という二つの科学の融合のための枠組みとして機能していることが明確になった。ケーススタディ型の教材の開発も校種別に概ね順調に進んでいる。本研究は,目的や価値に向き合い“あるべきものを探求する"「設計科学」の視座から学校教育の対象となる数理科学の内容や方法を同定し,それを学習領域として位置づけ,教材開発とそのカリキュラム化,授業・評価モデル,教師教育プログラムの開発を実証的に行うことを目的とする研究である。平成30年度は,研究分担者及び大学等の研究者に加え,小・中・高等学校の教諭や指導主事等,総勢48名からなる研究組織で,理念班,内容・方法班,教材・授業班,教師教育班に分かれて研究を進めた。第一に,日本数学教育学会春期大会「創成型課題研究」の部で発表した。具体的には,理念班が,本研究の目指す数理科学教育の目標,方法,内容,評価に関する主要な特徴を整理した「数理科学教育の基本的な枠組み」と,数理科学的意思決定の過程をふまえた「数理科学的意思決定に関する基本的な授業過程」を提起した。また,それらにおける価値,価値観,価値命題並びに対話の意義について明確化した。内容・方法班は,データ分析,OR理論,品質管理等に関する文献,高等学校段階を対象とする欧米のプロジェクトの教材や教科書を分析し,対象とする内容や方法を具体的に提案した。教材・授業班は,学校種別のWGに分かれ開発したケーススタディ型の教材を示した。第二に,上記の成果をもとに,理念班は,数理科学教育のカリキュラム構成モデルに関して,STEM教育に対するdisciplinaryアプローチを手がかりとして検討を進めた。第三に,内容・方法班,教材・授業班は,開発した教材の指導案を作成し,小学校2校,高等学校1校において授業実践を行い,その様相を分析した。第四に,教師教育班は,欧米のプロジェクトにおける教師教育モジュール等を分析し,数理科学教育の進展に向けた教員養成課程における科目や現職教育のためのワークショップの具体化に向けた示唆を得た。
天然由来レチノイドX受容体アゴニストの生活習慣病、炎症性疾患の予防・治療への応用

生体機能調節作用が期待されるが報告が非常に少ない天然レチノイドX受容体(RXR)アゴニストに焦点を絞り、それらの探索と特性解析、疾患モデル動物への応用を試みた。特にサンズコン由来SPF1とSPF2は、RXRを介した抗炎症作用を示すこと、メタロチオネインIIの発現を亜鉛の共存下で著しく誘導すること、アミロイドβ(Aβ)による神経細胞死を抑制することを新たに見出した。一方、プロポリス由来ドルパニンはRXRとPPARγを活性化するデュアルアゴニストであり、抗炎症作用、Aβによる神経細胞死の抑制作用を有することを見出した。これらの発見はこれまでに報告のないRXRアゴニストに関する新規の知見であった。1)サンズコン由来RXRアゴニストSPF1とプロポリス由来RXRアゴニストDrupaninの生物学的特性の解析<1> PPARγやLXRアゴニストが抗炎症作用を示すことより、当研究室で見出したRXRアゴニストであるSPF1について、LPS刺激RAW264.7細胞に対する抗炎症活性を検討した。その結果、SPF1はRXR依存的にIL-6、COX-2、iNOS mRNAの産生を抑制する一方、RXR非依存的にIL-1β及びTNF-αmRNAの産生を抑制することを見出した。また、SPF1はLXRアゴニストが示す抗炎症作用を増強することが明らかになった。<2>SPF1と合成RXRアゴニストであるベキサロテンの遺伝子発現能の相違をRAW264.7細胞を用いてマイクロアレイ法で解析した。その結果、SPF1が特異的に2倍以上mRNA発現量を増加させた遺伝子は192種類、ベキサロテンが特異的に2倍以上mRNA発現量を増加させた遺伝子は138種類あった。SPF1が正常群、ベキサロテン群に比べて、GDF15やABCA1などの遺伝子mRNAの発現量を増加させた。また、SPF1とベキサロテンは同様に、メタロチオネインmRNAの発現量を大きく増加させることを見出した。この遺伝子発現パターンは、マウス腹腔マクロファージでも観察された。<3>ドルパニンの核内受容体選択性を調べたところ、ドルパニンはRXRのサブタイプα、β、γにほぼ同様に活性化すること、また、ドルパニンはPPARγにも弱い結合活性を示しRXRとPPARγに対するデュアルアゴニストであることがわかった。ドッキングスタディーより、ドルパニンは9-cis-レチノイン酸のRXR結合サイトに結合することが明らかになった。また、PPARγのフルアゴニストであるロシグリタゾンよりは弱いものの、3T3-L1前駆脂肪細胞の分化誘導能を示した。そこで、db/db肥満糖尿病モデルマウスを用いて、インスリン抵抗性の改善作用を検討したが、ドルパニンを2週間の腹腔内投与した後の空腹時血糖、グルコース糖負荷試験において有意な効果は観察されなかった。1)サンズコン由来RXRアゴニストSPF1と2(SPFs)がマクロファージ様RAW264.7細胞におけるLPSによる炎症性サイトカインや炎症関連遺伝子mRNAの産生を強く抑制することをこれまでに見出している。今回さらにその作用機序を検討したところ、SPFsは単独で抗炎症作用を示すだけでなく、LXRアゴニストあるいはRARアゴニストとの共存下でより強い抗炎症作用を示し、RXR/LXR、RXR/RARヘテロダイマーを介してインターロイキン(IL)-1β、IL-6、シクロオキシゲナーゼ、誘導性一酸化窒素合成酵素の発現を選択的に抑制することを見出した。この結果は、RXRアゴニストが新たな機序により抗炎症活性を示すことを示唆している。2)これまでに合成RXRアゴニストであるベキサロテンとSPFsの遺伝子発現誘導能に大きな相違があることを示してきた。今回、それらの遺伝子の中でメタロチオネインIIに注目して解析を進めた。その結果、RXRアゴニストがメタロチオネインIとIIの誘導することを初めて見出した。そして、ベキサロテン、9-cisレチノイン酸、ホーノキオール、ドルパニンなどのRXRアゴニストに比べ、SPFsは著しくメタロチオネインIとII、特にメタロチオネインIIを誘導することを見出した。さらに、メタロチオネインの誘導能を有することが知られている亜鉛の共存下で、SPFsは著しくメタロチオネインIIの発現を誘導することを見出した。3)RXRアゴニストドルパニンの血糖降下作用を高脂肪食餌誘発インスリン抵抗性モデルマウスを用いて解析したところ、ドルパニン処理3週間目において有意な血糖降下作用を示した。4)新規天然由来RXRアゴニストの探索の結果、厚朴の根よりすでに我々が報告しているRXRアゴニストであるホーノキオールより強いRXRアゴニスト活性を示す化合物を単離同定した。当初の研究目的は、これまでに殆ど見出されていない天然由来RXRアゴニストを探索し、合成RXRアゴニストであるベキサロテンとの活性の相違を明らかにするとともに、生活習慣病や慢性炎症清疾患への応用を目指すこと、さらに、多くのRXRアゴニストを見出し、構造と物理、生物、薬理学的特性を解析し、構造活性相関データベースを作製し、RXRアゴニストの有効な使用指針を作ることであった。今年度の研究で、新たな強力なRXRアゴニストを新たに1つ見出しており、当研究室で見出した天然由来RXRアゴニストが順調に増加しており評価できる。

また、RXRアゴニストの新規抗炎症活性、メタロチオネインIIの発現誘導活性など、当初予想しなかったRXRアゴニストの新規活性の発見は、これらのRXRアゴニストの慢性炎症性疾患、生活習慣病への応用に期待が持てる結果である。今回、ドルパニンが血糖降下作用を示したことより、今後のさらなる検討により、糖尿病、インスリン抵抗性の改善などへの応用も視野に入ってきたと考えられる。ただし、当初予定していた皮膚炎や肥満モデル動物での検討が遅れており、最終年度に精力的に進めたいと考えている。しかし、SPFsが亜鉛との相乗作用でメタロチオネインIIを著しく誘導ことより、新規亜鉛化軟膏の開発及び皮膚炎への応用は期待でき、評価できる成果と考える。RXRアゴニストの物理、生物学的特性の解析をさらに進め、データベースの構築に向けた準備も今後進める必要がある。本研究は天然由来レチノイドX受容体(retinoid X receptor : RXR)アゴニストの生理活性を明らかにし、疾患の予防・治療への応用を目指した基礎研究である。当研究室で単離同定したRXRに対する天然アゴニストとして山頭根由来フェニルプラバノンSPF1とSPF2、プロポリス由来ドルパニン、厚朴由来ホーノキオール誘導体について検討を行った。その結果、SPFsはマクロファージ系細胞に対して、炎症性サイトカインの産生を抑制することを見出し、さらにその作用はLXR(liver X receptor)アゴニストの共存下で増強されることを明らかにした。最終年度の研究においては、アルツハイマー病発症の原因の一つと考えられているアミロイドβ(Aβ)が誘導する神経細胞のアポトーシスに及ぼすSPFsの効果を検討したところ、SPFsはAβにより惹起されるアポトーシスを抑制し、その作用はアポトーシス誘導シグナルである活性酸素を消去することによる可能性を示した。そして本作用もLXRアゴニストの共存下で増強されることを明らかにした。さらに、SPFsは重金属の解毒、抗酸化、抗炎症活性を示すメタロチオネイン(特にII)を誘導することを見出し、この作用は亜鉛の存在下で著しく増強されることを見出し、活性酸素種が原因となっている炎症性疾患への応用が期待された。また、最終年度の研究において、ドルパニンはマウス初代培養アストロサイトのAβによる細胞死の誘導を、用量依存的あるいはRXR依存的に抑制することを見出した。これらの研究を通して、SPFsやドルパニンがRXR/ LXRヘテロダイマーを介して抗炎症作用やコレステロール代謝活性化作用を示すことが明らかになり、新しい作用機序を有する抗炎症剤として、動脈硬化症にとどまらず、アルツハイマー病や脳血管性認知症等の炎症性疾患の予防・治療への応用が期待された。生体機能調節作用が期待されるが報告が非常に少ない天然レチノイドX受容体(RXR)アゴニストに焦点を絞り、それらの探索と特性解析、疾患モデル動物への応用を試みた。特にサンズコン由来SPF1とSPF2は、RXRを介した抗炎症作用を示すこと、メタロチオネインIIの発現を亜鉛の共存下で著しく誘導すること、アミロイドβ(Aβ)による神経細胞死を抑制することを新たに見出した。一方、プロポリス由来ドルパニンはRXRとPPARγを活性化するデュアルアゴニストであり、抗炎症作用、Aβによる神経細胞死の抑制作用を有することを見出した。これらの発見はこれまでに報告のないRXRアゴニストに関する新規の知見であった。
プロテインCインヒビターによる腎癌の浸潤・転移抑制機序の解析

プロテインCインヒビター(PCI)は、肝臓、腎臓や精巣などで産生されるセリンプロテアーゼインヒビター(SERPIN)フアミリー蛋白質の1つで、血漿中では主として活性化プロテインC(APC)の阻害因子として、尿中ではウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベータ(uPA)の阻害因子として、精漿中では、前立腺特異抗原の阻害因子として機能する。これまでに、我々は、腎癌患者では、非癌部に比較して癌部におけるPCIの発現が著しく低下すること、PCIはuPAの活性を阻害することにより、腎癌のin vitroでの浸潤能を著しく抑制すると共に、PCI強制発現腎癌細胞の浸潤活性は、非発現腎癌細胞のそれに比較して著しく低下することを見出した。本研究では、癌細胞のin vivoにおける増殖及び転移におけるPCIの影響に関して検討した。PCI強制発現腎癌細胞及び非発現腎癌細胞を重症免疫不全症(SCID)マウスの皮内あるいは尾静脈に投与しても、両細胞共にSCIDマウスでの増殖が認められなかった。そこで、次にB16マウスメラノーマ細胞にPCI発現ベクターを導入することによりPCI強制発現B16メラノーマ細胞を作成し、PCIの癌細胞のin vivoでの増殖及び転移に対する影響を検討した。その結果、C57BL6マウスの皮内に移植したPCI発現メラノーマ細胞の増殖及び尾静脈から投与したPCI発現メラノーマ細胞の転移能は、PCI非発現メラノーマ細胞のそれらに比較して著しく低下した。さらに、PCIはメラノーマ細胞のin vitroでの浸潤能を著しく抑制すると共に、PCI強制発現メラノーマ細胞の浸潤能もまた、非発現メラノーマ細胞のそれに比較して著しく低下した。以上の結果から、PCIは種々の癌細胞でin vitroの浸潤を抑制すること、及び癌細胞のin vivoにおける増殖及び転移もまた抑制することが示唆された。プロテインCインヒビター(PCI)は、肝臓、腎臓や精巣などの生殖臓器で産生されるセリンプロテアーゼインヒビター(SERPIN)ファミリー蛋白質の1つで、血漿中では主として活性化プロテインC(APC)の阻害因子として、尿中ではウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベーター(uPA)の阻害因子として、精漿中では、前立腺特異抗原の阻害因子として機能する。尿中PCIは、腎近位尿細管上皮細胞で産生されることが知られているが、その生理的意義は明らかではない。我々は、本奨励研究の補助の基、肝臓と共に主要なPCI発現臓器である腎臓でのPCI発現の転写調節領域に関して解析を行い、そのプロモーター領域としてはSp1結合部位が、エンハンサー領域としてはAP2結合部位が重要であることを明らかにしてきた。また、これまでに、腎臓で発現されるPCIの生理的意義に関しても検討を行い、62例の腎癌患者に関して全例で、腎癌部でのPCI発現が非癌部に比較して著しく低下すること、同様に、培養腎近位尿細管上皮細胞ではPCIの発現が認められるが、腎近位尿細管上皮細胞由来の株化腎癌細胞ではその発現は消失していること、さらに、PCI発現ベクターを挿入することにより作製したPCI強制発現株化腎癌細胞の浸潤能は、非発現株化腎癌細胞のそれに比較して著しく低下する事を見出した。本年度は、これまでの研究をさらに発展させ、株化腎癌細胞の浸潤能に対するuPAおよびPCIの役割に関して検討を行った。株化腎癌細胞はuPAを発現しており、その浸潤能は新たに添加したuPAにより促進され、抗uPA抗体により阻害された。また、株化腎癌細胞の浸潤能はPCIの濃度依存性に阻害され、PCI強制発現株化腎癌細胞の浸潤能は、抗PCI抗体により阻害された。以上の結果から、PCIはuPAを阻害することにより癌細胞の浸潤を制御している可能性が示唆された。
濃厚ポリマーブラシの科学と技術

リビングラジカル重合(LRP)を固体表面に応用して超高密度のグラフト鎖集団「濃厚ポリマーブラシ」を創製するという我々の先駆的研究を合成、物性、応用の3側面から発展させ、関連する新しい研究領域を拓く基盤を築いた。より具体的には、濃厚ポリマーブラシのもつ独自で新規な、時には驚くべき諸性質を掘り起こして体系化するとともに、これに基づく新しい分子デバイス等の概念や、より精緻/汎用的な濃厚ブラシ合成法を開拓した。濃厚ポリマーブラシに関する(1)合成化学的、(2)構造・物性科学的、および(3)機能開発的研究を推進し、主に以下の成果を得た。(1)ゲルマニウム等の非遷移金属化合物を触媒とする新しいリビングラジカル重合法を開発した。この触媒は、重合制御に必要な量が僅少であることや、毒性が低いことを特徴とし、濃厚ブラシの応用分野によってはブラシ合成の基礎技術として有用であると考えられる。(2)原子間力顕微鏡法などにより膨潤ブラシ間の摩擦特性の詳細を研究した。準希薄ブラシ間の摩擦係数は、低荷重域で極めて低い値(<10^<-3>)であるが、高荷重域ではこれより23桁も高い値(10^<-1>)となった。一方、濃厚ブラシ間の摩擦係数は全ての荷重域で低い値(<10^<-3>)に留まり、準希薄ブラシのような、荷重の増大に伴う摩擦係数の転移を示さなかった。異種のブラシ(ポリスチレンとポリメタクリル酸メチル)間では、転移点が高荷重側へシフトした。この転移は、ブラシの相互貫入に関係し、濃厚ブラシにおいては、その強大な浸透圧効果のために、あらゆる荷重域で相互貫入が抑制されると結論づけた。(3)膨潤ブラシ層とタンパクの相互作用の詳細をQCM法とクロマト法で研究した。ブラシ密度が十分に高く、隣接グラフト鎖間距離がタンパクサイズに比して十分に小さいときに限り、タンパクはブラシ層にほとんど吸着しなかった。これは、タンパク-ブラシ間に特異的相互作用がない限り、ブラシ層へのタンパク吸着が、主に層内へのタンパクの浸透によって起こることを示す。濃厚ブラシを付与した単分散性シリカ微粒子の精密合成技術を確立した。この複合微粒子の分散液が、新しいタイプのコロイド結晶を形成することを熱力学的および構造科学的に証明した。本研究課題は、濃厚ポリマーブラシを(1)リビングラジカル重合(LRP)に基づく合成化学、(2)ナノ構造・物性科学、及び(3)機能開発・応用科学の3側面から包括的かつ系統的に研究するものである。先ず(1)に関する基礎研究として、ゲルマニウムやスズのヨウ化物を触媒とする新しいLRP法を独自に開発し、PSやPMMAなど分子量分布の狭い高分子の精密合成に成功し、このLRPが、ヨウ化物ラジカルの媒介する新しいタイプの活性化機構で進行することを反応速度論的に解明した。また、高圧下(3000気圧)でのLRPにより、100万を超える高分子量で分布の狭いポリマーのLRP合成に成功し、超高膜厚ポリマーブラシ合成への道を拓いた。(2)に関して、濃厚ブラシの膨潤-脱膨潤挙動について、準希薄ブラシと明確に区別されうる濃厚ブラシ独自の膨潤挙動をはじめて観測した。また、対向濃厚ブラシが、その種類によらず、良溶媒中で高加重下においても極度に低い摩擦係数を示す事実をはじめ、対向ポリマーブラシ間の表面潤滑特性の体系的理解に役立つ多くの基礎データ得た。さらに、温度応答性を有する濃厚ブラシを合成し、温度上昇とともに、その膨潤度は次第に低下するのに対して、摩擦係数は転移温度付近において急激な上昇(3桁以上)を示すことを明らかにした。(3)に関して、濃厚ブラシ付与ナノ粒子が新しいタイプのコロイド結晶を形成し、その構造がグラフト鎖長とともに変化することを見出した。また、シリカ微粒子表面からのLRPグラフト重合時に、グラフト鎖の末端に光架橋姓のシンナモイル基を有する小セグメントを導入し、この複合微粒子をコロイド結晶化させた後に光照射で架橋反応を進行させる方法で、結晶構造を壊すことなく系をゲル化させることに初歩的にではあるが、はじめて成功した。さらに、濃厚ブラシ付与カラムのGPC研究で、ブラシ層がタンパク等に対してサイズ排除効果をもつことを確認した。これはクロマトグラフィーの新しい分離機構を提案するとともに、タンパク等のブラシ表面への吸着抑制効果を実証しており、生体適合性表面としての応用の道を拓きうる。さらに、上記の膨潤挙動の観測データとともに、濃厚ブラシと異分子・異物質との相互作用の体系的に理解に役立つ。

先ず(1)に関する基礎研究として、光制御型TERP(有機テルル系LRP)の表面グラフト重合への応用に成功し、パターン化濃厚ブラシ表面の作製手法を確立した。また、昨年度開発したゲルマニウム・スズ系LRPの反応機構を解明し、可逆移動触媒重合と命名するとともに、その触媒系をリンや窒素化合物に拡大し、非金属触媒による重合制御を達成した。(2)に関して、ブラシの膨潤状態と摩擦特性の関係を種々検討するとともに、理論的考察とコンビナトリアル手法による実験的検証を併用して濃厚/準希薄ブラシの境界領域を決定し、濃厚ブラシの耐溶媒特性や潤滑機構の体系的理解を進めた。さらに、濃厚ブラシが、膨潤ゲルを対向表面としても低摩擦特性を発現すること、異種高分子斥力相互作用が摩擦低減に有効であることなど、新規トライボマテリアルとしての応用において有用な知見を得た。(3)に関して、微粒子表面ブラシの鎖長(ポテンシャル)とコロイド結晶構造の相関を解明した。濃厚ブラシ付与微粒子の機能開発の観点では、オキセタン環含有モノマーの精密グラフト重合による単分散中空微粒子の創製、高屈折率硫化亜鉛(ZnS)微粒子表面への濃厚ブラシ付与、ホウ酸担持濃厚ブラシの合成経路の確立などに成功した。また、イオン液体濃厚ブラシ付与シリカ粒子の合成とその積層膜の作製に成功し、規則配列構造に起因したイオン導電チャンネル構造の形成を示唆する結果を得た。さらに、フェニルアジド基による開始基導入法を新たに考案し、汎用ポリマーフィルム基材表面への濃厚ブラシ付与技術を確立し、タンパク等の非特異的吸着の抑制効果を確認した。濃厚ブラシ利用の範囲を拡大しうる手法である。本研究課題は、濃厚ポリマーブラシを(1)リビングラジカル重合(LRP)に基づく合成化学、(2)ナノ構造・物性科学、及び(3)機能開発・応用科学の3側面から包括的かつ系統的に研究するものである。先ず(1)に関して、本研究で確立した新しい重合系(可逆連鎖移動重合系)の重合触媒をスズ、ゲルマニウム、リンおよび窒素に続いて、酸素、炭素系にも拡張し、各系の反応速度論的研究を基礎として、広範なモノマー群の重合体の構造制御を実現した。また、高圧LRPにより、さらなる高分子量化(>500万)を実現するとともに、この技術を濃厚ブラシ合成に適用し、厚膜ブラシの合成に成功した。(2)に関しては、膨潤状態の制御された濃厚ブラシについて、摩擦係数の荷重依存性とずり速度依存性を詳細に検討し、ブラシ潤滑として流体・境界・固体潤滑という3つの機構を提案し、新規トライボマテリアルの設計指針を確立した。(3)に関して、先に開発した複合微粒子による新規コロイド結晶構造を利用すべく、初歩的にではあるが、色素添加によるレーザー発振に成功した。また、各種の親水性ポリマーの濃厚ブラシを合成し、水中での低摩擦特性を確認するとともに、タンパクの非特異的吸着抑制効果に由来して、(マウス由来L929繊維芽細胞を対象に)細胞接着が飛躍的に抑制されることを明らかにした。さらには、これらを付与した複合ナノ粒子のバイオインターフェースとしての利用を検討し、精密な構造制御による優れた血中滞留性を達成し、ガン組織への集積を確認した。他のデバイス応用として、イオン液体型濃厚ブラシ付与微粒子の制御構造膜を利用したリチウムイオン電池、濃厚ブラシの高配向・伸張構造をテンプレートとして活用した有機薄膜太陽電池などの試作に成功し、次世代デバイスとしてポテンシャルの高さを実証した。
農地圃場整備による流出特性の変化に関する研究

1.研究目的農地圃場整備(水路及び排水路)が年々進み、その増加に伴い過去の降雨特性と同じ規模にもかかわらず、流域の流出特性であるピーク流出量が増大し、かつ洪水到達時間が早くなってきている。本研究は、農地圃場整備の増加に伴うピーク流出量の増加、洪水到達時間の短縮及び応答関数(単位図)の変化等の流域特性に与える農地圃場整備の影響を検討し、降雨-流出系の流出構造を明らかにする。2.研究概要(1)過去の洪水の水文資料により、年毎の水文特性(貯留量、応答関数、ピーク流出量、流出率及び洪水到達時間)の変化を検討した(長谷部・中尾・田中)。(2).(1)により解析された結果と農地圃場整備率の年単位の時系列変化とを結びつけて、農地圃場整備による流出形態の変化を調べた(長谷部・須賀・田中・中尾)。3.主たる結論(1)逆探法により、流出成分を中間流出成分と地下水流出成分とに流出分離し、各々の系について応答関数を求めた。その結果、地下水流出系の応答関数は、洪水毎にそれは変化が認められない。それに反して、中間流出成分の単位図の変化は下記の様に明瞭に認められた。ア.応答関数のピーク流出量が経年的に増加傾向にある。イ.応答関数の洪水到達時間は経年的に短縮傾向にある。以上、二点より農地圃場整備により浸透効果・貯留効果が弱められていると考えられる。(2)農地圃場整備事業の増加率の経年の時系列変化と、(1)で求めた応答関数のピーク流出量の増加及び洪水到達時間の短縮の傾向が、ほぼ一致していたことが認められた。
真核多細胞微生物の未分化維持に関わる長鎖非コードRNAの動態追跡

原始的な真核多細胞微生物である細胞性粘菌の発生過程においても形成体(オーガナーザー)がみられ、転写因子STATaが形成体の機能発揮に重要な役割を担っている。細胞性粘菌の長鎖ノンコーディングRNA(lncRNA)であるdutA RNAがSTATaの活性化(SH2ドメインC末端側のチロシン残基のリン酸化)を調節し、分化の最終段階である子実体形成を抑えることから、dutAは形成体を介して未分化状態の維持に関与する。本研究では、ハイブリダイゼーションによらない検出法でdutAの局在変化や消失などRNAそのものの動態を追うことでlncRNAによる未分化維持メカニズムを提唱することを目的とした。そのために、RNAの3′末端にMS2リピート配列を導入した融合RNAを発現する株を確立し、MS2-GFP融合タンパク質も発現させることで、dutAの転写活性のイメージングに成功した。多細胞体個体中での汎用的な3次元RNA検出法を確立し、dutA RNAの動態検出を試みたが、MS2-GFPのノイズが高すぎて動態追跡には適さなかった。今後に向けて、ノイズ低減の工夫を施した新規の検出法の開発が必須となった。また、dutA RNAの形成体での強制発現が発生遅延を引き起こす能力を利用してdutA RNAの作動領域をある程度同定できた。現在、より詳細なマッピングと高次構造の解析を行っている。さらに、MS2リピートがタグとして付加されたdutA RNA発現株を利用したChIRPというRNA沈降実験によって、dutA RNA結合タンパク質の同定を試み、dutA RNA特異的な結合タンパク質を数種類検出することに成功した。今後、これらをクローン化し、dutA RNA複合体の構成要素とそれぞれの機能を明らかにすることで、dutA RNAの作用メカニズムの解明を目指す。28年度が最終年度であるため、記入しない。進化的に起源が不明な形成体(オーガナーザー)は、原始的な多細胞生物である細胞性粘菌の発生過程においてもみられ、転写因子STATaが形成体の機能に関わっている。細胞性粘菌長鎖ノンコーディングRNA(lncRNA)であるdutA RNAがSTATaの活性化(SH2ドメインC末端側のチロシン残基のリン酸化のこと)を調節し、分化の最終段階である子実体形成を抑えることから、dutAは形成体の機能を調節して未分化状態の維持に関与すると考えられている。本研究においては、dutA RNAがどのような作動装置として機能するのか、ハイブリダイゼーションによらない検出法でdutAの局在変化や消失などRNAそのものの動態を追うことでlncRNAによる未分化維持メカニズムを提唱することを目的とした。そのために、目的RNAの3′末端にMS2リピート配列を導入した融合RNAを発現させ、MS2-GFP融合タンパク質も発現させることで、ハイブリダイゼーションによらない汎用的なRNA検出法の確立を目指した。手法の確立により、dutA遺伝子のリアルタイムな転写のオンオフ及び局在変化や消失などRNAそのものの動態を追うことを可能にする。これにより、lncRNAが形成体においてどのように機能して制御するか、また、dutA RNA断片がSTATa遺伝子部分破壊株をサプレッションする能力を利用してdutA RNAの作動領域をマッピングしエレメントを同定することで作用機序を解明する。また、RNAが複合体として機能する可能性も考慮し、MS2リピートがタグとして付加されたdutA RNAを利用したRNA沈降実験によって、dutA RNA結合タンパク質の同定を試みる。同時にdutA RNAが作用する転写因子STATaをリン酸化するTKLキナーゼとの結合実験も試みる。内在のdutA RNAの細胞内局在についてRNA FISHの手法で検出を試みた。総括班主催の講習会で技術支援を受け、通常のRNAプローブを用いたRNA FISHを行い超高解像度顕微鏡で細胞質での存在を確認できた。次に、dutA遺伝子の転写オンオフとdutA RNAそのものの動態をライブイメージで観察する手法の開発を試みた。まず必要なノックインコンストラクトを作製した。dutA RNAの3′末端(転写終結点)のすぐ上流にMS2のリピート配列を導入した融合RNA発現するようなノックインコンストラクトを用いて、dutA遺伝子座にノックインされた株が複数得られた。これらを用いて増殖期の細胞を観察したところ、核(RFP-ヒストンH2BまたはDAPIでマーク)内にスポットとして転写の様子が観察された。dutA RNA動態追跡ため、この株を発生させて局在を観察したところ、in situハイブリダイゼーションの結果に類似し、子実体形成期にオーガナイザー領域からGFPシグナルが消失した。よって、得られた株では転写のオンオフとRNA動態の両方を同時に観察できることがわかった。この株は薬剤耐性遺伝子を除去してあるが、除去前の株を発生させてRNA動態観察したところ、同様なシグナルの消失が見られず、RNAの3′末端領域配列が効率的な分解に重要な働きを担っていると示唆された。また、dutA RNAの作動エレメント同定のため、様々な欠損変異dutA RNA発現コンストラクトの作製を行った。完成したコンストラクトをSTATa遺伝子部分破壊株と野生株に形質転換をし、目的株を選抜しているところである。27年度ではdutA RNA結合タンパク質に関する生化学的な解析は殆ど出来なかった。唯一、5′末端にタグをつけたdutA RNA発現コンストラクトを作製した。

また、ノックイン株が得られたので、MS2結合配列のリピート配列をタグとして用いることも可能になった。原始的な真核多細胞微生物である細胞性粘菌の発生過程においても形成体(オーガナーザー)がみられ、転写因子STATaが形成体の機能発揮に重要な役割を担っている。細胞性粘菌の長鎖ノンコーディングRNA(lncRNA)であるdutA RNAがSTATaの活性化(SH2ドメインC末端側のチロシン残基のリン酸化)を調節し、分化の最終段階である子実体形成を抑えることから、dutAは形成体を介して未分化状態の維持に関与する。本研究では、ハイブリダイゼーションによらない検出法でdutAの局在変化や消失などRNAそのものの動態を追うことでlncRNAによる未分化維持メカニズムを提唱することを目的とした。そのために、RNAの3′末端にMS2リピート配列を導入した融合RNAを発現する株を確立し、MS2-GFP融合タンパク質も発現させることで、dutAの転写活性のイメージングに成功した。多細胞体個体中での汎用的な3次元RNA検出法を確立し、dutA RNAの動態検出を試みたが、MS2-GFPのノイズが高すぎて動態追跡には適さなかった。今後に向けて、ノイズ低減の工夫を施した新規の検出法の開発が必須となった。また、dutA RNAの形成体での強制発現が発生遅延を引き起こす能力を利用してdutA RNAの作動領域をある程度同定できた。現在、より詳細なマッピングと高次構造の解析を行っている。さらに、MS2リピートがタグとして付加されたdutA RNA発現株を利用したChIRPというRNA沈降実験によって、dutA RNA結合タンパク質の同定を試み、dutA RNA特異的な結合タンパク質を数種類検出することに成功した。今後、これらをクローン化し、dutA RNA複合体の構成要素とそれぞれの機能を明らかにすることで、dutA RNAの作用メカニズムの解明を目指す。目的のノックイン株が予定より早く得られたので、今年度はこれを用いて詳細なイメージング解析を開始している。多細胞期の各発生段階において転写活性がスポットとして観察されるかを調べて強度を定量する。次に、dutA RNAの消失が分化の最終決定にどう連動しているのか、RNAの経時的動態を細胞種ごとにおける転写活性と分解活性の相対比を定量して追跡する。ノックイン株では薬剤耐性遺伝子カセットは除いてあるが、24個のMS2のヘアピンループ配列が存在している。内在のdutA RNAがどのような振る舞いをするのかをRNA FISHによって詳細に観察するとともに、内在のdutA RNAの動態により近づけるためにMS2配列の繰り返し数を減じたノックイン株の作製を試みる。dutA RNAの作動エレメント同定のために、初年度は様々な欠損変異コンストラクトの作製を行った。引き続き、未作製コンストラクトの作製を行ない、細胞に形質転換してSTATa部分破壊株でのサプレッサー活性と野生株での子実体形成抑制活性を指標にdutA RNA作動エレメントの同定を行う。
ウイルス遺伝子産物の再解読

単純ヘルペスウイルス(HSV)は代表的なDNAウイルスであり、ヒトに多様な病態を引き起こす。抗HSV剤アシクロビルが開発された今日においても、HSV感染症のアンメット・メディカル・ニーズ(未充足の医療要望)は多数残されている。さらに、世界市場におけるHSV感染症の医療費は、年間数千億円と膨大である。したがって、HSVは医学上極めて重要なウイルスであり、HSV研究の重要性は明らかである。HSVゲノムは約150kbpの2本鎖DNAであり、グラスゴー大学のDJ. McGeoch博士やシカゴ大学のB. Roizman博士によって、現在までに少なくとも84種類のウイルス遺伝子をコードすることが解明されている。ウイルスは限られたゲノムサイズに、多様な遺伝情報を搭載するため、進化上、様々な戦略を獲得してきた。その結果、単純にトランスクリプトーム解析を実施するだけでは、ウイルスゲノムに潜む遺伝情報の全体像を解読することは極めて困難である。事実、次世代シークエンサーによるRNA-seqの台頭後も、インフルエンザウイルスゲノムにさえ、病態発現に重要な遺伝子PA-Xがコードされていることが報告されている。したがって、ウイルス遺伝子産物の全体像を把握するには、包括的にウイルス蛋白質を直接検出することが望ましい。しかしながら、単純にウイルス感染細胞を質量解析に供するのみでは、宿主細胞に発現している数千種類の宿主蛋白質がバックグランドとなり、ウイルス遺伝子産物の全体像を検出することは困難を極めていた。これらの背景を鑑み、我々は、BONCAT法、高感度質量分析、バイオ・インフォマティクス解析の三者を有機的に結びつけ、HSV遺伝子産物を再解読する新たな手法を生み出した。本手法で同定された新規HSV遺伝子は、HSVの病態解明や新たな抗HSV戦略の糸口となることが期待される。ウイルスは感染伝播の必要性から、ウイルス粒子にゲノムをパッケージングしなければならない。この生存に必須な過程を効率化するため、ウイルスはゲノムサイズを最少化させ、遺伝子重複や選択的スプライシング等、限られたゲノムに多様な遺伝情報を搭載するための様々な戦略を獲得してきた。これらウイルスゲノムに潜む複雑な遺伝情報の全体像を解き明かすためには、単なるゲノム配列の決定やトランスクリプトーム解析だけではなく、感染細胞における包括的なウイルス蛋白質の検出が必要である。しかしながら、単純にウイルス感染細胞を質量解析に供するのみでは、大量に発現している宿主蛋白質や既知のウイルス蛋白質がバックグランドとなり、未知のウイルス遺伝子産物を検出することは容易ではない。事実、質量解析により同定された新規HSV遺伝子の報告は皆無であった。この問題を克服するため、我々は、メチオニン類似低分子(AHA)を駆使した新規合成蛋白質の標識・精製系[BONCAT法: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (2006)]、高感度質量分析計および計算科学を有機的に融合させ、HSVゲノムにコードされる新規遺伝子群を同定したこと、また、同定した遺伝子の感染細胞における発現の確認・マウスモデルにおける病態発現への関与も確認できたことから、本研究はおおむね順調に進展していると考えられる。同定済みの新規HSV病態制御遺伝子に関して、詳細な分子機構の解析を進め、成果発表に結びつける。また、同定した他の新規遺伝子の生物学的意義に関しても明らかとするため、HSVゲノム編集法とマウス病態モデルを併用し、HSV病態への関与の有無を順次解明していく。そして、HSV病態への関与が認められた新規HSV遺伝子に関しては、相互作用因子を、質量解析系を用いたインターラクトーム解析や既に保持しているHSV-1抗体ライブラリーを用いた共局在解析等により探索することで、新規遺伝子群が、如何にHSV病態に関与するのかを、詳細な分子機序を解明していく。また、同定した新規遺伝子の中には、一般的な翻訳機構によりmRNAから蛋白質が生合成されているとは考え難いゲノム上に位置していたものも多く、これらの遺伝子の翻訳過程において、internal ribosome entry site(IRES)等のノンカロニカル翻訳機構が関与していないかも順次、解析していく。その際、HSVゲノム編集法を用いた組換えHSV-1による感染細胞レベルの解析と、単独発現系を用いた非感染細胞レベルにおける解析を併用することで、個々の遺伝子発現機構が、ウイルス感染により複雑に制御させる現象なのか、ゲノム配列のみに帰属するプログラムされた現状なのかも解析する。一般に、ウイルスは感染伝播の必要性から、ウイルス粒子にゲノムをパッケージングしなければならない。この生存に必須な過程を効率化するため、ウイルスはゲノムサイズを最少化させ、遺伝子重複や選択的スプライシング等、限られたゲノムに多様な遺伝情報を搭載するための様々な戦略を獲得してきたと考えられる。しかしながら、単純にウイルス感染細胞を質量解析に供するのみでは、大量に発現している宿主蛋白質や既知のウイルス蛋白質がバック・グランドとなり、未知のウイルス遺伝子産物を検出することは容易ではない。事実、質量解析により同定された新規HSV遺伝子の報告は皆無である。

この問題を克服するため、申請者はメチオニン類似低分子(AHA)を駆使した新規合成蛋白質の標識・精製系(BONCAT法)を基盤とすることで、HSVゲノムに潜む未同定のウイルス遺伝子産物を網羅的に同定する新たな手法を確立しつつある。今日までに開発されたほぼ全ての抗ウイルス剤は、ウイルス蛋白質を標的分子とすることから、体系的に新規ウイルス遺伝子産物を同定する手法の確立は、ウイルス感染症の克服に直結する重要な研究課題であると考えられる。当初の計画通り、以下の解析を完了し、BONCAT法と高感度質量分析計を併用することで、HSV-1の新規ORF群の同定に至った。(i) HSV感染後、複数のタイムコースでメチオニン類似低分子(AHA)により新規合成蛋白質を標識し、可溶化後、Biotin-PEG-alkyneと環状化反応させることで、AHA標識蛋白質をbiotin化した。(ii)アフィニティービーズにより、biotin化したAHA標識蛋白質を精製後、常法に従い高感度質量分析に供し、新規合成蛋白質由来の質量情報を網羅的に集積し、推定新規HSV遺伝子産物を探索した。(iii)その後、簡便かつ敏速なHSVゲノム編集法を駆使し、推定新規HSV遺伝子内に、蛍光蛋白質mVenusあるいはFLAGエピトープタグを挿入した組換えHSVを作出することで、推定新規HSV遺伝子産物の発現の有無を検討した。単純ヘルペスウイルス(HSV)は代表的なDNAウイルスであり、ヒトに多様な病態を引き起こす。抗HSV剤アシクロビルが開発された今日においても、HSV感染症のアンメット・メディカル・ニーズ(未充足の医療要望)は多数残されている。さらに、世界市場におけるHSV感染症の医療費は、年間数千億円と膨大である。したがって、HSVは医学上極めて重要なウイルスであり、HSV研究の重要性は明らかである。HSVゲノムは約150kbpの2本鎖DNAであり、グラスゴー大学のDJ. McGeoch博士やシカゴ大学のB. Roizman博士によって、現在までに少なくとも84種類のウイルス遺伝子をコードすることが解明されている。ウイルスは限られたゲノムサイズに、多様な遺伝情報を搭載するため、進化上、様々な戦略を獲得してきた。その結果、単純にトランスクリプトーム解析を実施するだけでは、ウイルスゲノムに潜む遺伝情報の全体像を解読することは極めて困難である。事実、次世代シークエンサーによるRNA-seqの台頭後も、インフルエンザウイルスゲノムにさえ、病態発現に重要な遺伝子PA-Xがコードされていることが報告されている。したがって、ウイルス遺伝子産物の全体像を把握するには、包括的にウイルス蛋白質を直接検出することが望ましい。しかしながら、単純にウイルス感染細胞を質量解析に供するのみでは、宿主細胞に発現している数千種類の宿主蛋白質がバックグランドとなり、ウイルス遺伝子産物の全体像を検出することは困難を極めていた。