hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
幼児期における移動運動の発達に関する縦断的研究

本研究は,走運動が成就されていない幼児を対象に移動運動を撮影し,2台のビデオカメラを設置してDLT法を用いて3次元で記録(60fps)してきた男女合わせて12名の幼児の移動運動の発達を縦断的に追跡し,その内4名は小学校に就学するまで約5年間にわたり,走運動の発達をとらえた.おもな結果は以下のようにまとめられる.1.歩行から走運動出現までの発達過程は歩行,リープ動作^<1)>および走運動の3つの移動形態に分けることができた.その過程において平均速度は1.61-1.80m/sへ増大し,ストライド,ストライドの身長比およびピッチも40.6-43.0cm,0.489-0.515,4.14-4.21Hzへそれぞれ増大した.移動運動の発達は歩行からリープを経て走運動が出現する順序であった.リープ動作の速度,ストライドおよびストライドの身長比は走運動に近いものであった.また,リープ動作には優位脚^<2)>があり,側性がみられることが示唆された.こうした優位脚のキックによるリープ動作を繰り返しながら次第に走運動が可能となると推察された.すなわち,リープ動作は歩行から走運動への移行過程における移動運動の発達の中で1つの主要なプロセスとして考えられた.2.走り始めてから6歳までの間で走運動の発達は,(1)走運動成就以降において側性に依存した発達がみられたこと,(2)足先の外輪や膝の外転の動きが減少したこと,(3)膝関節を中心とした上下方向の屈曲伸展動作から次第に脚を前後に動かすような走動作へ変容したことが示唆された.本研究の結果は,幼児期における運動発達の特徴を理解する上で有益な示唆が得られるものであった.^<1)>リープ動作:1歩において非支持局面がみられる移動運動^<2)>優位脚:非支持局面の出現頻度の多い脚本研究は,走運動が成就されていない幼児を対象に移動運動を撮影し,2台のビデオカメラを設置してDLT法を用いて3次元で記録(60fps)してきた男女合わせて12名の幼児の移動運動の発達を縦断的に追跡し,その内4名は小学校に就学するまで約5年間にわたり,走運動の発達をとらえた.おもな結果は以下のようにまとめられる.1.歩行から走運動出現までの発達過程は歩行,リープ動作^<1)>および走運動の3つの移動形態に分けることができた.その過程において平均速度は1.61-1.80m/sへ増大し,ストライド,ストライドの身長比およびピッチも40.6-43.0cm,0.489-0.515,4.14-4.21Hzへそれぞれ増大した.移動運動の発達は歩行からリープを経て走運動が出現する順序であった.リープ動作の速度,ストライドおよびストライドの身長比は走運動に近いものであった.また,リープ動作には優位脚^<2)>があり,側性がみられることが示唆された.こうした優位脚のキックによるリープ動作を繰り返しながら次第に走運動が可能となると推察された.すなわち,リープ動作は歩行から走運動への移行過程における移動運動の発達の中で1つの主要なプロセスとして考えられた.2.走り始めてから6歳までの間で走運動の発達は,(1)走運動成就以降において側性に依存した発達がみられたこと,(2)足先の外輪や膝の外転の動きが減少したこと,(3)膝関節を中心とした上下方向の屈曲伸展動作から次第に脚を前後に動かすような走動作へ変容したことが示唆された.本研究の結果は,幼児期における運動発達の特徴を理解する上で有益な示唆が得られるものであった.^<1)>リープ動作:1歩において非支持局面がみられる移動運動^<2)>優位脚:非支持局面の出現頻度の多い脚本研究の目的は,月齢が12ヶ月から18ヶ月の女児6名を対象として歩行から走運動への移行過程を9ヶ月間にわたり継続的に観察することによって,移動運動の発達をとらえることであった.被験児は,健康な女児6名であり,各被験児の歩き始めの時期は生後10ヶ月から13ヶ月の間であった.自由な外遊びの中で被験児の移動運動が撮影できるような範囲を設け,2台のビデオカメラを設置(撮影速度:60fps,露出時間:1/1000)した.撮影された画像データをもとにDLT法によって3次元の座標値を算出し,ストライド,ピッチ,歩隔(width)などを求めた.歩行から走運動出現までの発達過程は歩行,リープ動作^<1)>および走運動の3つの移動形態に分けることができた.その過程において平均速度は1.61-1.80m/sへ増大し,ストライド,ストライドの身長比およびピッチも40.6-43.0cm,0.489-0.515,4.14-4.21Hzへそれぞれ増大した.移動運動の発達は歩行からリープを経て走運動が出現する順序であった.リープ動作の速度,ストライドおよびストライドの身長比は走運動に近いものであった.また,リープ動作には優位脚^<2)>があり,側性がみられることが示唆された.

こうした優位脚のキックによるリープ動作を繰り返しながら次第に走運動が可能となると推察された.すなわち,リープ動作は歩行から走運動への移行過程における移動運動の発達の中で1つの主要なプロセスとして考えられた.^<1)>リープ動作:1歩において非支持局面がみられる移動運動^<2)>優位脚:非支持局面の出現頻度の多い脚本研究の目的は,月齢が9ヶ月から15ヶ月の男児5名を対象として歩行から走運動への移行過程を32ヶ月間にわたり継続的に観察することによって,移動運動の発達をとらえることであった.被験児は,健康な男児5名であり,これまでに走動作が確認されていないものであった.自由な外遊びの中で被験児の移動運動が撮影できるような範囲を設け,2台のビデオカメラを設置(撮影速度:60fps,露出時間:1/1000)した.撮影された画像データをもとにDLT法によって3次元の座標値を算出し,ストライド,ピッチ,歩隔(width)などを求めた.各被験児の歩行から走運動までの動作は,5つのパターンに分けられ,歩行からリープ動作^<1)>を経て走運動へ移行する過程は全被験者に共通してみられた特徴であった.パターン1の歩行とパターン5の走運動を比較すると,速度が1.38m/sから1.76m/sへ有意に増加し,ストライドやその身長比もそれぞれ有意に増加した.一方,ピッチは有意な差が認められなかった.また優位脚^<2)>と反対脚^<3)>に着目すると,歩行から走運動への速度やストライドの増大は優位脚側によるものであり,この時期に側性がみられることが示唆された.歩行から走運動出現の過程でパターン2-4のようなリープ動作がとらえられた.パターン2は優位脚,パターン3は反対脚によるリープであり,パターン4は両足支持局面を挟みながら,優位脚のキックによって非支持局面を頻繁に出現させるものであった.こうしたリープ動作を繰り返しながら次第に走運動が可能となると推察された.すなわち,リープ動作は歩行から走運動への発達過程における移動運動の中で1つの主要なプロセスとして考えられた.^<1)>リープ動作:1歩において非支持局面がみられる移動運動^<2)>優位脚:非支持局面の出現頻度の多い脚^<3)>反対脚:優位脚の逆脚本研究の目的は,実験開始時において12ヶ月から20ヶ月の女児4名を対象として最初の走運動(1歳9ヶ月;First)を確認してからその後6歳まで毎年,縦断的に5年間にわたり走運動を観察することによって走運動の発達過程を明らかにすることであった.その結果は(1)-(4)のように要約できる.(1)Firstから6歳にかけて,走運動の速度は1.71m/sから3.78m/sへ有意に増大し,ストライドやその身長比も41.1cmから95.4cm,50.0%から85.4%へそれぞれ有意に増加した.一方,ピッチは3.82Hzから4.19Hzの範囲であり,顕著な違いは認められなかった.したがって,Firstから6歳への速度の増大はおもにストライドの増加によるものと考えられた.(2)Firstから6歳における速度の増加量とストライド,優位脚の速度および優位脚のストライドの増加量に有意な相関がみられた.(3)Firstから6歳にかけて非支持局面を含む歩隔の身長比とそのストライド比はそれぞれ経年的に減少する傾向が認められた.(4)3歳
コンピューターおよびフラクタル次元を応用した肺癌診断支援システムの開発

本邦において肺癌は、今や胃癌を抜き、がん死亡原因の第1位を占める疾患となった。肺癌検診の受診率も上昇しているが、胸部単純写真だけでは早期発見は困難な場合が多い。近年、肺癌発見率を上げるため、ヘリカルCTを肺癌検診に応用しようとする試みが一部の施設で行われている。このヘリカルCTは、撮影そのものは極めて短時間ですむものの、全肺野を網羅するための読影に要する労力は逆に増加する。そこで簡便かつ安価で、能率的でより正確な読影が可能となるようなコンピューターを用いフラクタル次元を応用した肺癌検診支援システムの構築を試み、その有用性を検討した。読影形態としては、従来のフィルム上の読影ではなく、CT装置からコンピューターに転送した画像データを一連の動画として再生するディスプレイ上の読影が中心となる。再生速度は任意に設定でき、読影時間の短縮が可能となり、かつ脈管や気管支などの既存構造の連続性は明瞭となった。また独立性肺野腫瘤性病変に関しても認識率の上昇が期待できた。しかし、今回我々が採用した、ダウンコンバータ-を経たビデオ信号による転送には若干の画像劣化が見られた。今後は転送速度や画質を向上させる方法の検討が必要と思われる。またここで発見された肺野原腫瘤性病変に関しては、その輪郭をトレースし、フラクタル次元を求め、辺縁の複雑さを数値化した。この段階においても輪郭を抽出するための閾値の決定によって、同一画像でもフラクタル次元が異なってくるため、その設定には注意を要し、さらにCT画像のwindow levelやwindow widthも一定にしておかねばならなかった。臨床応用には未解決な問題も多く、まだまだ時期尚早と思われるが、今後これらの問題点を解決することにより、肺癌検診の一助となり得る可能性があると思われた。この研究の要旨の一部は第14回日本画像医学会において展示・口演発表した。
大規模ニューロン・グリアネットワークの遺伝的アルゴリズム解析による脳動作原理解明

脳幹部呼吸中枢におけるニューロンとグリア細胞の活動をカルシウムイメージング法により解析し、吸息神経活動に先行して活動を開始するグリア細胞集団を見出した。カルシウムイメージングデータと呼吸神経出力の時系列解析ならびに数理モデルを用いたシミュレーションにより、ともにそれぞれが自発的にリズミックな活動を呈しうるニューロンとグリア細胞とが弱く結合し、相互に作用しあうことにより呼吸リズムが形成されていることを明らかにした。ニューロンとグリア細胞(特にアストロサイト)による脳の動作原理の理解を究極の目標としている。周期的同期発火現象の典型例としてげっ歯類の脳幹に於ける呼吸活動について、その神経ネットワークモデルを構築するために、ニューロンおよびアストロサイトと、それらの集団的活動、神経組織間の相互作用を生理学的手法により解析した。岡田は、通常のラットより作成した脳幹脊髄標本の延髄断面にカルシウムイメージング法を応用し、多数のニューロンとアストロサイトの活動を同時に計測し、アストロサイトが呼吸に同期した活動を呈することの証明を試みている。まず、ニューロンとアストロサイトとを区別するため、計測された個々の細胞のカルシウム信号パターンの解析とともに、細胞の大きさ、形、さらに計測後に固定した標本の解剖学的解析を試みている。越久は、GFP蛍光によりニューロンとアストロサイトとを区別できるGFAP-GFPマウスを用い、延髄スライス標本にカルシウムイメージング法により多数のニューロンとアストロサイトの活動を同時に計測し、計測された個々の細胞をニューロンとアストロサイトとに自動的に分類するアルゴリズムの開発を行っている。本年度は、フェニレフリンや高カリウム溶液に対する応答でニューロンとアストロサイトを弁別できるかどうかを検討した。染谷は、岡田らが計測・撮影したカルシウムイメージの動画像解析を実施し、ニューロンとアストロサイトの自動判別技術の構築を試みている。まず、静止画像の各ピクセルに対する特徴量解析を行い、クラスタリング技術を適用することでニューロンおよびアストロサイトを抽出し、細胞の大きさに基づく自動判別の実現可能性を検証した。田村は引き続きMAPLE等のソフトウェアを用いてシミュレーションの方法について検討した。細胞内カルシウム濃度を可視化しうるカルシウムイメージング法の発達により、グリア細胞なかでもアストロサイトは、ニューロンと協調して神経情報処理に積極的に関与していることが明らかにされつつあるが、本研究の目的は、ニューロンネットワークとアストロサイトネットワークの機能的相関から脳の動作原理を解明しようとするものである。この目的を達成するために、次のような研究を行った。脳スライス標本を用いて、カルシウムイメージング法により比較的少数(数十個)のニューロンとアストロサイトの活動(細胞の活動に伴う細胞内カルシウム濃度変化)を計測し、計測された個々の細胞をニューロンとアストロサイトとに自動的に分類するアルゴリズムの開発を行っている。現在、データを解析中である。低酸素は頸動脈小体の興奮を介して呼吸出力を増強させるが、一旦増強した呼吸出力は、低酸素刺激がなくなった後も数分間以上持続し、その現象は、短期呼吸増強(short term potentiation)と呼ばれるが、その機序は不明であった。低酸素後短期呼吸増強はアストロサイトによるとの仮説を立て、その妥当性を検証するため、各種刺激に対するアストロサイトの活性化を抑える薬剤、arunidic acide(ONO-2506)の効果を解析し、ONO-2506の前投与は、マウスにおいて、低酸素後短期呼吸増強を抑えることを確認した。また、遺伝的アルゴリズムによる解析技術の基礎的調査を行い、実応用問題領域への適用技術などの知見を得た。さらに、MAPLE等のソフトウェアを用いたシミュレーション、解析の方法について検討した。本研究の目的は、ニューロンネットワークとアストロサイトネットワークの機能的相関から脳の動作原理を解明しようとするものである。研究期間中に次の研究・実験を行った。・摘出脳幹標本でのカルシウムイメージング法による実験を行い、それらの実験で得られた延髄呼吸中枢のニューロンとアストロサイトの活動パターンと呼吸神経出力の相関関係を解析することを継続した。呼吸リズムは延髄preBotzinger complex領域のニューロン同士、および、アストロサイト同士、さらに、ニューロンとアストロサイトが、それぞれ興奮性に結合し、全体として呼吸(吸息)を開始させるペースメーカーとして働いているとのモデルを最終年度に構築した。・低酸素刺激による短期呼吸増強の機序について実験を行い、最終年度にアストロサイトの活性化を介するものであるということを明確に示しえた。・GFAPプロモータ制御下に、アストロサイト特異的にEGFPを発現させたトランスジェニックマウスを用い、呼吸性リズム活動を維持した脳スライス標本におけるpreBotzinger complexのカルシウムイメージングを解析した。数理モデルを用いた検討では、Hodgkin-Huxley型の周期性バースト発火する呼吸ニューロンと低周波振動するRosslerアトラクタ型のアストロサイトが相互に影響しあうモデルを用いたシミュレーションで、不規則に吸息に先行するカルシウム活動が再現できた。今後、大規模ニューロン・グリアネットワークへモデルを拡張して並列コンピュータによるシミュレーションと動物実験によって、モデルの検証を行う予定である。カルシウムイメージング動画を解析すること及びニューロンとグリア細胞の自動判別技術の構築を狙いとした時系列解析を実施した。

計算統計学本研究の目的である「ニューロンネットワークとアストロサイトネットワークの機能的相関から脳の動作原理を解明する。」を達成するために、順調に研究が進んでいる。論文発表5件、口頭発表6件という成果発表も行っていることから、おおむね順調であると考える。本研究の目的である「ニューロンネットワークとアストロサイトネットワークの機能的相関から脳の動作原理を解明する。論文発表4件、口頭発表8件という成果発表も行っていることから、おおむね順調であると考える。研究計画に書いた「計測規模の拡大し、より多数(各5001000個)のニューロンとアストロサイトを同時計測の対象とし、その内部に複数のニューロンアセンブリおよびアストロサイトアセンブリを含む大規模ニューロンネットワークおよびアストロサイトネットワークの機能的相関を解析する。」の他に、成果のところでも説明したように、GFAP-EGFPトランスジェニックマウスを用いて、アストロサイトに発現するGFAP-EGFP蛍光を教師信号とするサポートベクターマシン法による二者の弁別を試みる。低酸素後短期呼吸増強の機序をさらに解明するため、低酸素刺激後の延髄孤束核におけるアストロサイトとニューロンの機能的、解剖学的相関を詳細に解析する予定である。平成26年度は、GFAP-EGFPトランスジェニックマウスを用いて、アストロサイトに発現するGFAP-EGFP蛍光を教師信号とするサポートベクターマシン法による二者の弁別を試みる。また、時系列情報を考慮した解析への発展も試みる。また、動物およびヒトにおいて、低酸素刺激により呼吸増強を起こすと、低酸素刺激を中止した後も呼吸増強が持続する現象について、in vivoマウスでの薬理実験を行ない、低酸素刺激が呼吸ニューロンを興奮させ、興奮したニューロンがアストロサイトを活性化させるが、一旦活性化したアストロサイトは持続的にニューロンを興奮させるため、元の刺激がなくなっても呼吸増強が持続すると考察しているが、この考察に基づくモデルは、アストロサイトを中心とする神経ネットワークの可塑性、記憶のメカニズムを説明しうるかどうかについて検討する。」の他に、成果のところでも説明したように、GFAP-EGFP
ボクセル熱流体シミュレーションによる鼻腔形成手術アセスメント

鼻中隔湾曲症等の鼻腔疾患に対して行われている外科手術の効果を詳細に評価するツールの開発を目指して,実際に鼻中隔矯正及び鼻甲介切除を施した手術前後の医療用CT,MRI画像から3次元実形状鼻腔モデルを作成し,ボクセル格子法を用いた熱流体シミュレーションにより鼻腔内の流れ場と温度場の解析を行った.これらの結果から,ボクセルシミュレーションによる鼻腔形成手術アセスメントに関してその有用性を確認することができた.鼻中隔湾曲症等の鼻腔疾患に対して行われている外科手術の効果を詳細に評価するツールの開発を目指して,実際に鼻中隔矯正及び鼻甲介切除を施した手術前後の医療用CT,MRI画像から3次元実形状鼻腔モデルを作成し,ボクセル格子法を用いた熱流体シミュレーションにより鼻腔内の流れ場と温度場の解析を行った.これらの結果から,ボクセルシミュレーションによる鼻腔形成手術アセスメントに関してその有用性を確認することができた.ボクセル法を用いた鼻腔内気流シミュレーションを行い,鼻腔の形状や気流の特徴を捉えるために必要なボクセル格子の細分化について検討した.医療用CT画像500枚から鼻腔を含む頭部の3次元ポリゴンモデルを再構築し,ボクセルピッチを0.1から1.5mmの範囲で変化させて鼻腔のバイナリボクセルモデルを作成した.気流のシミュレーションには,3次元非定常熱流体ソルバーV-Sphere(理化学研究所VCADシステム研究プログラム)を使用した.その結果,鼻腔内の流れの特徴を表す圧力損失や流量分配等の定量的指標が,ボクセルピッチ0.2mm程度以下でほぼ一定値となることがわかった.シミュレーション結果の妥当性を検証するために,2倍スケールの透明シリコーン樹脂製の鼻腔流路を作製し,染料注入による鼻腔内流れの可視化を行った.シリコーン樹脂流路はラピットプロトタイピング造形による鼻腔の3次元ロストモデルを使用して作製した,作動流体には,シリコーン樹脂流路と屈折率の等しい体積濃度50%のグリセリン水溶液を使用した.可視化実験では,鼻腔内の鼻前庭部に渦や再循環領域の発生を伴う特徴ある流れのパターンが観測され,またこのような流れの基本的なパターンはボクセルシミュレーションでよく再現されていることが確認された可視化実験では,鼻腔上部の嗅覚部や下部の鼻甲介付近において流れの不安定性,非定常性や乱れが生じることもわかった.粘膜を模擬した熱交換モデルを考案し,鼻腔エアコンディショニング機能の熱流動ボクセルシミュレーションを行った.熱交換モデルでは,気流との熱伝達によって温度が変化する壁面の粘膜層セルと,深部で一定温度を維持する熱源セルを仮定した.従来のin vivo温度測定結果を参考にして,粘膜層セルには0.00170.0083K/Wの熱抵抗値,熱源セルには34°Cの温度一定条件を与えた.ボクセルシミュレーションで得られた鼻腔壁面温度とin vivo測定温度はいずれも鼻先から20mm付近で30°C程度に低下する傾向を示すことから,本モデルにより鼻腔壁面温度変化の基本的な特徴を再現可能であることが確認出来た.ボクセルシミュレーション結果との比較検討を目的として,CT画像より鼻腔実形状を模擬した透明シリコーン流路を作製し,鼻腔内吸気流れの可視化・PIV計測を行った.流れの可視化は染料注入法により行った.PIV計測は,鼻腔モデルにレーザーシートを照射し,トレーサー粒子からの散乱光を高速度カメラで撮影することにより行った.その結果,鼻腔内部で局所的に流れのパターンが大きく変化し,鼻孔から鼻弁付近でのジェット流や鼻腔上部前方での再循環流が観測され,ボクセルシミュレーション結果との比較的よい一致が確認出来た.一方,ジェット流境界近傍で強い非定常性が観測され,シミュレーションでは再現できていない流れの特徴も明らかとなった.鼻中隔湾曲症等の鼻腔疾患に対して行われている外科手術の効果を詳細に評価するツールの開発を目指して,実際に鼻中隔矯正及び鼻甲介切除を施した手術前後の医療用CT, MRI画像から3次元実形状鼻腔モデルを作成し,ボクセル格子法を用いた熱流体シミュレーションにより鼻腔内の流れ場と温度場の解析を行った.ボクセル格子法は,従来の境界適合格子と非構造格子による解析法と比較すると,格子生成に掛かるコストが大幅に削減されるが,その一方で形状近似精度や境界層の解像度などに問題が生じる.本研究では手術前後の鼻腔の複雑形状にボクセル格子法を適用することの妥当性・有効性の検討を行い,特に鼻腔壁面の形状と境界層の解像度が流れ場と温度場に及ぼす影響を考察した.ヒトの生理的呼吸条件を参考にして,吸気一定流量・温度条件(230 ml/s,25 °C)と壁面一定温度条件(34 °C)を与えて鼻腔内の流れ場と温度場を解析した.従来の境界適合格子と非構造格子による解析法による結果と比較した結果,ボクセルモデルの格子解像度をピッチ0.20 mm程度まで細かくすることにより,境界適合格子モデルと同等な速度分布が得られることがわかった.また,吸気流れの鼻腔出口における温度についても精度良く再現することが可能で,鼻腔の加温機能を適切に評価できる精度を有していることがわかった.これらの結果から,ボクセル熱流体シミュレーションにより手術前後の鼻腔内の圧力損失,左右鼻腔や各鼻道への流量分配,鼻腔の加温機能の変化を評価することが可能であり,鼻腔形成手術アセスメントに関してその有用性を確認することができた.ほぼ計画通り,鼻腔内流れの熱

流動ボクセルシミュレーションとモデル実験による可視化・PIV計測の手法を確立し,それぞれ結果を得ることが出来た.24年度が最終年度であるため、記入しない。鼻腔疾患を有する鼻腔形成手術前後の鼻腔形状をモデリングし,ボクセルシミュレーションを実施する.エアコンディショニング機能のシミュレーション結果の妥当性を評価するために,従来の境界適合・非構造格子を用いた汎用熱流体解析ソフトFluentでも熱流動シミュレーションを実施する.24年度が最終年度であるため、記入しない。
溶出時間のデータベース化による超深度定量プロテオミクスの実現

本研究は、溶出時間の高精度な補正技術によるペプチド情報のデータベース化とシグナルとノイズの効率的な分離によって高深度定量プロテオミクス技術を開発することを目的とする。溶出時間補正およびシグナル・ノイズ分離のアルゴリズムを開発し、ヒト肝臓ミクロソームのトリプシン消化産物を用いて検証した。その結果、既存法と比較して開発法は精度よく偽陽性を除去し、濃度のタンパク質由来ペプチドを同定し比較できることが明らかとなった。また、異なる2施設間での補正精度を解析した結果、補正精度が低下するが、解析可能であることが明らかとなった。解析技術を用いて臨床検体を解析しネットワーク解析やバイオマーカー探索に応用した。本研究は、溶出時間の高精度な規格化と復元の技術によるペプチド情報のデータベース化とシグナルとノイズの効率的な分離によって高感度・高深度定量プロテオミクス技術を開発することを目的とする。溶出時間およびシグナル・ノイズ分離のアルゴリズムを作製するためには、再現性を検討するデータと既知の陽性を解析したデータが必要である。このデータを取得するサンプルとして、ヒト肝臓ミクロソームのトリプシン消化産物に200種類のペプチド混合液の濃度を変えて添加し、同一のサンプルをMS/MS ALL法及びショットガン法によって解析した。本資料をすでに構築した初期技術によって検証した結果、データベースを用いた方法は従来のショットガンと比較してより低濃度までペプチドを同定するとともに定量性が高いことが明らかとなった。また、開発技術を用い、異なる2施設において同一のデータベースを用いて解析を行ったところ、十分に解析が可能であることが明らかとなった。また次年度計画のFDR計算法の開発を前倒しで行い、基礎技術を開発した。昨年度に前倒しで行ったFalse Discovery Rate計算法の評価を行ったところ、市販ソフトウェアの汎用False Discovery Rate計算法よりも低濃度のシグナルまで検出することが可能であることが明らかとなった。また、データベース保管形式をタンパク質ではなくペプチドを中心としてデータベースに変更することによって、偽陽性データの検証の性能を向上させた。溶出時間の補正方法を既存の複数の方法と比較を行った結果、開発したオーバーラップピークのシフト補正方法が最も補正精度の高いことが明らかとなった。さらに、既存のペプチド情報のデータベースとデータ融合を行うことによって、ヒト全プロテオームの約半分をカバーするデータベースを構築した。さらに、構築データベースを用いて統合失調症患者の前頭葉プロテオームの解析、脳腫瘍患者の髄液プロテオームの解析、がん患者血液のプロテオーム解析を実施し、ネットワーク解析やバイオマーカー探索に応用した。当初計画を順調に進めるとともに、当初次年度に計画していたFDR計算法の開発を前倒しで進めている。プロテオミクス当初計画を加速するとともに、共同研究先に最新技術を導入し複数施設での検証を進める。主に旅費が当初計画(30万円)より格安チケット等の使用により圧縮されたことによる。繰り越し分についてはH27年度の早い時期に消耗品費として使用する計画である。
吸入麻酔薬の心筋保護効果に基づいた新規心筋保護法の開発

虚血心筋の再灌流時に発生する心筋虚血再灌流傷害は、細胞内Ca2+過負荷がその主な原因の一つと考えられている。吸入麻酔薬は心筋リアノジン受容体(RyR2)やstore-operated Ca2+ entry(SOCE)チャネルなどのCa2+輸送タンパク質を標的とし細胞傷害を抑制する。マウス摘出心臓における虚血再灌流実験において、RyR2阻害薬およびSOCEチャネル阻害薬は虚血再灌流後の心機能障害を有意に改善させた。このことから、これらのCa2+輸送タンパク質を抑制することで虚血再灌流傷害から心臓を保護する可能性が示された。我々は、虚血再灌流傷害モデルであるオキシゲンパラドックスやCa2+パラドックスの細胞レベルの発生に、心臓リアノジン受容体(RyR2)、store-operated Ca2+ entry (SOCE)チャネルなどの種々のCa2+輸送タンパク質が密接に関与しており、また吸入麻酔薬セボフルランはこれらのCa2+輸送タンパク質に作用して細胞保護作用をもたらすことを明らかにしてきた。本課題では、これらのCa2+輸送タンパク質がどのように心臓虚血再灌流傷害の発生に関わっているかについて、臓器(心臓)レベルで検討を行い、吸入麻酔薬の虚血心筋に対する保護作用の統合的理解を確立するとともに、臨床に適応できる心筋保護法を構築することを目的として、研究を行っている。平成26年度は正常心における虚血再灌流傷害へのSOCEチャネルやRyR2の関与を検討するための実験を行った。ランゲンドルフ灌流装置下に圧測定用バルーンを挿入した正常マウス摘出心臓に30分の全虚血、60分の再灌流を施し、処置中の心機能(左室developed pressure(LVDP)および左室拡張末期圧(LVEDP))を測定した。この虚血再灌流処置により、再灌流後のLVDPの低下やLVEDPの上昇といった心機能の低下が発生する。ここで、再灌流直後の5分間にSOCEチャネル阻害薬のLa3+(10 μM)、2-APB(5 μM)を投与することで、LVDPの改善、LVEDPの低下が認められたことから、虚血再灌流傷害へのSOCEチャネルの関与が明らかとなった。また、RyR2阻害薬のフレカイニド(1 μM)を虚血前5分間と再灌流後20分間に投与することでも、LVDPの改善とLVEDPの有意な低下が認められた。これより、RyR2の虚血再灌流傷害への関与が明らかとなった。我々は、虚血再灌流傷害モデルであるオキシゲンパラドックスやCa2+パラドックスの発生に、心臓リアノジン受容体(RyR2)、store-operated Ca2+ entry(SOCE)チャネルなどの様々なCa2+輸送タンパク質が密接に関与しており、また吸入麻酔薬セボフルランはこれらのCa2+輸送タンパク質に作用して細胞保護作用をもたらすことを明らかにしてきた。平成27年度は、transverse aortic constriction(TAC)手術によって作製した心肥大モデルマウスの左心室筋細胞を用いて、オキシゲンパラドックスならびにCa2+パラドックスの発生率を、そのコントロールであるShamマウスと比較して検討した。H2O2(10 microM)の投与によるオキシゲンパラドックス(細胞内Ca2+過負荷による細胞拘縮)の発生率は、TACマウスの左心室筋細胞においてShamマウスと比較して有意に高くなった。TAC心筋細胞、Sham心筋細胞におけるこれらのオキシゲンパラドックス発生率は、2%セボフルランの投与にて、いずれも有意に減少した。また、Ca2+パラドックスの発生率も、正常心筋細胞と比較して、TAC心筋細胞では有意に増加したが、TAC心筋細胞においても、セボフルランの投与によりこのCa2+パラドックスの発生が抑制されることを明らかにした。正常マウス心筋細胞におけるオキシゲンパラドックスならびにCa2+パラドックスについては、RyR2やSOCEチャネルを介するその発生メカニズムが解明できている。また、正常マウス心臓における虚血再灌流傷害の発生にもこれら、RyR2、SOCEチャネルが関与していることが、その阻害薬を用いて明らかにできている(平成26年度)。病態心の一つである肥大心の心筋細胞におけるオキシゲンパラドックス、Ca2+パラドックスに関しては、正常心筋細胞よりもその発生率が増加することが明らかにでき、現在そのメカニズムについてRyR2やSOCEチャネル、Ca2+/カルモデュリン依存性キナーゼ(CaMKII)などのCa2+制御タンパク質を中心に、検討している。我々は、虚血再灌流モデルであるオキシゲンパラドックスやCa2+パラドックスの発生に、心筋リアノジン受容体(RyR2)、store-operated Ca2+ enntry(SOCE)チャネルなどの様々なCa2+輸送タンパク質が密接に関与しており、また吸入麻酔薬セボフルランはこれらのCa2+輸送タンパク質に作用して細胞保護作用をもたらすことを明らかにしてきた。本課題では、これらのCa2+輸送タンパク質がどのように心臓虚血再灌流傷害の発生に関わっているかについて、臓器(心臓)レベルで検討を行い、吸入麻酔薬の虚血心筋に対する保護作用の統合的理解を確立するとともに、臨床に適応できる心筋保護法を確立することを目的とする。

平成28年度は、transverse aortic constriction(TAC)手術によって作製した心肥大モデルマウスの左心室筋細胞を用いて、オキシゲンパラドックス発生メカニズムを検討した。TAC心筋細胞におけるオキシゲンパラドックス(H2O2投与による細胞内Ca2+過負荷を伴う細胞拘縮)の発生率は、TAC手術を行わないShamマウスより単離した左心室筋細胞と比較して、有意に増加した。Sham心筋細胞と比較してTAC心筋細胞では、活性型RyR2の発現が増加していた。また、薬剤により筋小胞体機能を喪失させることで、TAC心筋細胞におけるオキシゲンパラドックスの発生率が減少したことから、TAC心筋においては、RyR2機能の亢進を伴う筋小胞体機能異常により、細胞傷害が発生しやすい状態であることが確認できた。病態心である肥大心においては、虚血再灌流傷害モデルであるオキシゲンパラドックスが、正常心と比較して発生しやすいこと、また、そのメカニズムとして、RyR2機能亢進に伴う筋小胞体機能異常の関与を明らかにした。TAC心筋細胞におけるこのRyR2機能亢進には、種々のCa2+制御タンパク質を修飾するCa2+/カルモデュリンキナーゼII(CaMKII)の関わりが示唆される結果も得られ、現在詳細に検討中である。我々は、心臓虚血再灌流傷害の実験的モデルであるオキシゲンパラドックス(活性酸素種による心筋細胞傷害)やCa2+パラドックス(store-operated Ca2+ entry, SOCEによる心筋細胞傷害)を用いて、虚血再灌流傷害の発生メカニズムや吸入麻酔薬による心筋保護効果メカニズムの解明を検討してきた。その結果、これらの細胞傷害の発生には、種々のCa2+制御タンパク質(TRPCチャネルや心筋リアノジン受容体など)の異常が関与しており、吸入麻酔薬はこれらのCa2+制御タンパク質を抑制することで、心筋細胞保護効果をもたらすことを明らかにしてきた。このことより、心臓虚血再灌流傷害の発生にTRPCチャネルや心筋リアノジン受容体が関与する可能性が示唆された。そこで、マウス摘出心臓をランゲンドルフ灌流下に虚血・再灌流を施し、その間の心機能を測定し、これらのCa2+制御タンパク質の阻害薬を投与することで、虚血再灌流後の心機能が改善するかを検討した。コントロール群では、虚血再灌流後の心機能が有意に低下したが、TRPCチャネル阻害薬である2-APBやLa3+、心筋リアノジン受容体阻害作用をもつフレカイニドをそれぞれ灌流液に投与した群では、コントロール群と比較して、虚血再灌流後の心機能が有意に改善した。この結果は、心臓虚血再灌流傷害の抑制において、TRPCチャネルや心筋リアノジン受容体などのCa2+制御タンパク質が新たな治療標的となり得ることを示唆するものである。虚血心筋の再灌流時に発生する心筋虚血再灌流傷害は、細胞内Ca2+過負荷がその主な原因の一つと考えられている。吸入麻酔薬は心筋リアノジン受容体(RyR2)やstore-operated Ca2+ entry(SOCE)チャネルなどのCa2+輸送タンパク質を標的とし細胞傷害を抑制する。マウス摘出心臓における虚血再灌流実験において、RyR2阻害薬およびSOCEチャネル阻害薬は虚血再灌流後の心機能障害を有意に改善させた。
肝幹細胞を利用した糖尿病治療戦略

I型糖尿病は、膵β細胞の減少が本態の疾患であり、この減少に基づきインスリン投与を生涯必要とする。自己や近縁者の細胞をインスリン産生細胞へ分化させ、長期間レシピエントに拒絶されなければ、インスリン治療から開放される夢の治療といえる。骨髄キメラモデルを作成し、個体の全般的な免疫機能を保ちつつ該当移植抗原に対する免疫応答のみを抑制した状態の誘導を効率化するドナー特異的免疫寛容のモデルを作成した。これは、免疫抑制剤を用いずに移植片を生着させる新たな方法として注目され長期に移植細胞や臓器が生着することを目的としている。レシピエント内にドナー由来細胞が存在するキメリズムの状態は、ドナー特異的免疫寛容の誘導の一手段であり、キメリズムの形成と維持により、移植片を長期に生着させることが可能となる。もうひとつの目的としてキメリズムおよび移植片の生着の維持には免疫担当細胞としての脾臓細胞が有用であり、MHCが一部合致する細胞の存在により、特異的免疫寛容が維持されることを証明した。移植片の生着の維持のためには、個体の全般的な免疫機能を保ちつつ該当移植抗原に対する免疫応答のみを抑制した状態(ドナー特異的免疫寛容)の状態を作り出すことがポイントとなると考えた。このキメリズムの形成と維持により移植片を長期に生着させることが可能となる。方法:C3Hをレシピエントとし致死量の放射線を照射した後、異系の骨髄を移植して骨髄混合キメラモデルを作成した。次にDay30に骨髄ドナーと一部MHCが一致するB6の皮膚の移植をおこない生着させた。レシピエントと同種のC3H、骨髄ドナーと同種のB6D2F1、レシピエントと皮膚ドナーとのF1(B6C3F1)マウスの脾臓細胞をそれぞれDay60に投与する3種類のモデルを作成し、末梢血におけるキメラ細胞の種類と割合の推移を経時的に計測しキメリズムの維持と皮膚移植片の生着との関係を評価した。B6C3F1マウスの脾臓細胞を投与した群では、骨髄混合キメリズムが破壊された後も、脾臓細胞由来のB6C3F1細胞が増加、皮膚移植片は維持され生着した。この現象は、脾臓細胞の投与でキメラ細胞が置き換わり、新たなキメリズムを形成、維持することで、特異的免疫寛容が維持され移植片の生着も維持されることが示唆されるものである。この結果はSplenocytes can replace chimeric cellsand maintain allograft tolerance.としてTransplantation.2007Nov l5;84(9):1168-73.へ報告した。前年度報告の続きとして、肝切除の刺激により骨髄のある分画の細胞が肝細胞などの内胚葉系の細胞にmRNAレベルではあるが分化が開始する事を発見した。この現象を肝臓における遺伝子発現を現在マイクロアレイを用いて網羅的に解析した結果、TNFやIL-6で誘導されるCXCケモカインや炎症性蛋白、CXCケモカインによって遊走してきた免疫系の細胞に特異的に発現する遺伝子群がAAF/PHxの肝臓で発現が誘導されることが判明した。近年、炎症性ケモカインが肝の再生を促進する働きがあることが報告されており、ケモカインは、マクロファージやモノサイトといった炎症性細胞のみならず生体内のさまざまな細胞に対する多岐にわたる作用が明らかになってきた。この結果はHepatic gene induction in murine bonemarrowafter hepatectomy.としてJ Hepato1.2006Feb;44(2):325-33.で報告した。移植片の生着の維持のためには、個体の全般的な免疫機能を保ちつつ該当移植抗原に対する免疫応答のみを抑制した状態(ドナー特異的免疫寛容)を近縁者脾細胞を利用することで効率よく維持することに成功した。この結果は骨髄移植で置き換えた造血幹細胞はMHCの一部合致した脾細胞で脾細胞由来の造血幹細胞に置き換えられ、MHCの一部合致した移植片(皮膚)も拒絶されることなく正着し続ける。(Hayashi et al. Transplantation. 2007;84:1168-73)で報告した。この現症に関わる特定の細胞集団を特定することで、機序の一端を明らかにすることを主眼とした。ドナーの脾細胞中のT細胞によりレシピエントの造血系が破壊され、ドナー脾細胞中の造血幹細胞の生着と増殖がおきる。

その際、レシピエントの造血系を攻撃する細胞集団と、ドナー脾細胞の造血幹細胞の増殖が同時に進行している。予想される結果として、全脾細胞の静注では静注後約2週目よりドナー由来細胞(b/k)が増加、レシピエント由来細胞(b)は減少する(脾細胞移植2週後から造血幹細胞の置換がおこる)。1.T細胞を除去した脾細胞静注では、レシピエントの造血系細胞の置換はおこらない。2.CD4+T細胞を除去した脾細胞移植では全脾細胞を静注した場合と比較し、移植後2,3,4週目でのレシピエント由来細胞(b)の割合が高かった。つまり造血系細胞の置換が遅延する。3.CD8+T細胞を除去した脾細胞移植では,レシピエントの造血系細胞の置換はおこらない。4.制御性T細胞を除去した脾細胞静注では全脾細胞を静注した場合と比較し、造血系細胞の置換の速さが促進される。以上4つの現象を検証することで効率よいキメラの維持および免疫寛容に関わる細胞集団を特定する。肝幹細胞を用いて糖尿病を治療するために、大きく2つの実験系を構築した。一つ目は、膵ラ氏島のβ細胞へ胎生期に高発現するPDX-1遺伝子を幹細胞へ導入するためのベクターの作成である。アデノウイルスを用いたこのベクターの作成は終了しFITC(蛍光)標識したこのベクターをマウス肝細胞へ系門脈内投与を行ったところ、門脈周囲の肝細胞にFITCの蛍光を確認可能となった。しかし、一過性の発現であり持続かつ、高頻度の発現がなくては実用に耐えうる方法とはならないため更なる工夫が必要と考えられた。次の試みとして、他者からの幹細胞もしくは、膵β細胞の移植による糖尿病治療の可能性を検討した。自己幹細胞を移植する移植片の生着の維持のためには、個体の全般的な免疫機能を保ちつつ該当移植抗原に対する免疫応答のみを抑制した状態(ドナー特異的免疫寛容)を近縁者脾細胞を利用することで効率よく維持することに成功した。この結果は骨髄移植で置き換えた造血幹細胞はMHCの一部合致した脾細胞で脾細胞由来の造血幹細胞に置き換えられ、MHCの一部合致した移植片(皮膚)も拒絶されることなく正着し続けるモデルを開発した。(Hayashi et al. Transplantation. 2007 ; 84 : 1168-73)で報告した。この現症に関わる特定の細胞集団を特定することで、より高効率で免疫抑制剤を使用しない細胞移植の成立を検討した。ドナーの脾細胞中のT細胞によりレシピエントの造血系が破壊され、ドナー脾細胞中の造血幹細胞の生着と増殖がおきる。その際、レシピエントの造血系を攻撃する細胞集団と、ドナー脾細胞の造血幹細胞の増殖が同時に進行した。CD4+かつCD25+の制御性T細胞を除去した脾細胞静注では全脾細胞を静注した場合と比較し、造血系細胞の置換の速さが促進され、より早く効率の良いキメラ置換の条件を確認した。
リンイリドとセレンを用いたセレノセレニンの合成と反応

リンイリドと硫黄との反応によりチオカルボニルル化合物が得られることは既にStaudingerにより報告されているがその後の研究例はわずかであった。我々はリンイリドとチイランとの反応においてチオアルデヒドが生成することを見いだした。このことから再びリンイリドと硫黄との反応に興味をもち、同様にチオアルデヒドが生成することを明らかにした。一般にチオアルデヒドは不安定なので、ジエン類との環状付加体として単離している。この様にチオカルボニル類が容易に得られることから、同様な反応でセレノカルボニル化合物が得られるのではないかと考え、反応を行なった結果、セレノアルデヒド、セレノケトンが発生し、これらはシクロペンタジエンあるいは2,3ージメチルブタジエンなどと環状付加体を与える事が判明した。さらに、これまでに不安定とされていたセレノベンゾフェノン類の単離にも成功した。単離したセレノベンゾフェノンを種々のジエンやオレフィンと反応させ、これまでに知られている反応と全く異なった結果が得られた。リンイリドを二級アミンの存在下、硫黄と反応させるとチオアミドが得られることが明らかとなった。さらにセレンと反応させると相当するセレノアミドは得られずジアミンが得られた。リンイリドの代わりにホスホネートカルバニオンを用いるとセレノアミドが得られることが判明した。チオアルデヒド、セレノアルデヒドが容易に得られるので、チオスルフィン、セレノセレニンの合成についても検討した。リンイリドと過剰の硫黄の存在下、無水マレイン酸との反応を行なうと好収率で相当するチオスルフィンの付加体が得られることが明らかとなった。この方法によるセレノセレニンの生成には現在のところ成功していない。リンイリドは酸素や硫黄と反応して、ケトンやチオカルボニル化合物が得られることは良く知られているが、セレンと反応してセレノカルボニル化合物を得ることは我々により開発された。この反応をさらに詳しく検討してきた。反応をシクロペンタジエン存在下で行うと、通常のDielsーAlder型の生成物のほかに環状ジセレニドが得られた。セレンを過剰に用いると収率が向上することから、この化合物は反応の途中で短寿命ながらも存在するセレノセレニン(R_2C+SeSe)から生成するのではないかと考えた。ジエンとしてシクロペンタジエン類を用いた系でのみ反応が進行すること、ベンゼン還流など少し高い温度で反応しやすいこと、ESRによりラジカル種を検出していることなどから必ずしもこの仮定は正しくないがさらに詳細を検討中である。イリドとセレンとの反応をアミン存在下で行うとジアミンであるアミナ-ルと共に低収率ながらセレノアミドが得られることが判った。この反応をホスホン酸アニオンを用いて行なうこと好収率でセレノアミドが得られることがあきらかとなった。反応はイリドをもちいた場合と同様にセレノアルデヒドを経由して進むものと考えている。セレノカルボニル化合物はかさだかい置換基をもちいると安定になり単離することが可能となるが、セレノベンゾフェノンの単離例はない、リンイリドとセレンとの反応過程において反応溶液がこい緑色になることからセレノベンゾフェノンの単離を試みた。この化合物は溶液中で安定に存在することを、核磁気共鳴および質量スペクトルにより確認した。この様に、リンイリドとセレンとの反応より出発して種々の新しい型の反応および生成物が得られることがあきらかとなってきた。リンイリドが酸素や硫黄と反応して、ケトンやチオカルボニル化合物が得られることは良く知られているが、セレンと反応してセレノカルボニル化合物を得ることは我々により開発された。この反応をシクロペタジエン存在下で行うと、通常のDielsーAlder型の生成物のほかに環状ジセレニドが得られた。

セレンを過剰に用いると収率が向上することからこの化合物は反応の途中で短寿命ながらも存在するセレノセレニン(R_2C=SeSe)から生成するのではないかと考えた。ジエンとしてシクロペンタジエン類を用いた系でのみ反応が進行すること、ベンゼン還流など少し高い温度で反応しやすいこと、ESRによりラジカル種を検出していることなどから必ずしもこの仮定は正しくないがさらに詳細を検討中である。アセチレン類との反応も行い六員環化合物(環状付加生成物)のほかに、七員環セレニドを単離した。その化合物の生成機構は検討中である。イリドとセレンとの反応をアミン存在下で行うとジアミンであるアミナ-ルと共に低収率ながらセレノアミドが得られることが判った。この反応をホスホン酸アニオンを用いて行なうと好収率でセレにアミドが得られることがあきらかとなった。反応はイリドをもちいた場合と同様にセレノアルデヒドを経由して進むものと考えている。セレノカルボニル化合物はかさだかい置換基をもちいると安定になり単離することが可能となるが、セレノベンゾフェノンの単離例はない。リンイリドとセレンとの反応過程において反応溶液がこい緑色になることからセレノベンゾフェノンの単離を試みた。この化合物は溶液中で安定に存在することを、核磁気共鳴および質量スペクトルにより確認した。セレノベンゾフェノンと種々の試薬との反応を現在検討中である。リンイリドと硫黄との反応によりチオカルボニル化合物が得られることは既にStaudingerにより報告されているが、その後の研究例はわずかであった。我々はリンイリドとチイランとの反応においてチオアルデヒドが生成することを見いだした。このことから再びリンイリドと硫黄との反応に興味をもち、同様にチオアルデヒドが生成することを明らかにした。一般にチオアルデヒドは不安定なので、ジエン類との環状付加体として単離している。この様にチオカルボニル類が容易に得られることから、同様な反応でセレノカルボニル化合物が得られるのではないかと考え、反応を行なった結果、セレノアルデヒド、セレノケトンが発生し、これらはシクロペンタジエンあるいは2、3ージメチルブタジエンなどと環状付加体を与える事が判明した。さらに、これまでに不安定とされていたセレノベンゾフェノン類の単離にも成功した。チオアルデヒド、セレノアルデヒドが容易に得られるので、チオスルフィン、セレノセレニンの合成についても検討した。リンイリドと過剰の硫黄の存在下、無水マレイン酸との反応を行なうと好収率で相当するチオスルフィンの付加体が得られることが明らかとなった。この方法によるセレノセレニンの生成には現在のところ成功していない。
絶対温度が負となる非粘性2次元点渦系での粒子性に由来する拡散項の理解

渦の大規模構造形成は,木星の大赤斑や鳴門の渦など,普遍的に見られる現象であるが,そのメカニズムについては不明なことが多い。本研究では, Onsagerが提唱した負温度点渦系を対象とし,渦の構造形成について,絶対温度をパラメタとして力学過程を理解することを目標とする。これまでの様々な研究から構造形成には拡散項が大きな鍵を握ることが示唆されているので,本申請では拡散項の定量的評価を試みたところ,久保公式の拡張となる結果が得られた。拡散項は1/Nに比例するため,粒子数無限大の熱力学的極限で,非粘性となる。2次元非粘性渦度方程式には、Diracのデルタ関数の集合で書かれる離散解(点渦解)を有する。点渦という「粒子」の集合が運動している系には、点渦同士の衝突に類する効果により実効的な粘性がでることが経験則として指摘されてきた。たとえば、点渦数に依らず系の全循環を一定にするようなシミュレーションを行うと、これらは連続極限において同一の時間発展をするはずであるが、線型成長率などは一般的に粒子数の関数となり収束しないことが多い。しかし、定量的な評価というのは、限られた配位の場合に限られていた。今回、我々は、羽鳥が導いたKlimontvich表式に基づく結果を2次元オイラー方程式に適用し、粒子性に由来する衝突項を解析的に評価することに成功した。結果は当初の予想通り、粘性テンソルは、時間相関で表されるGreen-久保公式に、流れに由来する位置の相関が加わったものとなっており、流れがある系に対するGreen-久保公式の拡張となっていると考えている。これは、点渦解をもつオイラー方程式はマクロな方程式ではなくミクロな方程式であり、点渦解をもつミクロな方程式の平均化をして得られる方程式が本来のオイラー方程式であると考えると理解できる。点渦数が少ない希薄な場合は平均化後の方程式も非粘性であるが、点渦数が増えると平均化後の方程式に粘性項が現れる。2次元非粘性渦度方程式は,Diracのデルタ関数の集合で書かれる離散解(点渦解)を有する。点渦という「粒子」の集合が運動している系には,点渦同士の衝突に類する効果により実効的な粘性がでることが経験則として指摘され,平成22年度に粒子性に由来する衝突項を解析的に評価することに成功した。今回は,この結果をもとに,点渦系に対する運動論的方程式を導き,平衡状態への緩和がどのように行われていくのか,緩和時間などを含めて総合的に評価を行った。当初,点渦系を記述する運動論的方程式にはFokker-Planck方程式の右辺に含まれる摩擦項が現れないと予想していたが,点渦系が同一の循環をもつ場合について詳細な計算を行った結果,摩擦項に対応する効果があること,および渦度ω(r)が,ω(r)=ω_0exp[-βΩ_0ψ(r)](ただし,ω(r):渦度場,ω_0:渦度の係数,β:逆温度,Ω_0:点渦の循環(定数),ψ(r):流れ関数)の形の分布になるとき,拡散項と摩擦項が釣り合い,Fokker-Planck方程式の右辺はゼロとなること,点渦数が無限大の連続極限で拡散項と摩擦項の効果は相殺してゼロとなることを明らかにした。また,点渦系は点渦同士の相互作用を決めるGreen関数が,長距離力である重力と本質的に同等であるため,点渦系の緩和時間は,重力多体系の緩和時間であるN^2に比例すると考えるのが一般的であったが,上記の結果は,点渦系の緩和時間がNに比例することを示唆している。これら一連の結果は,点渦法という数値シミュレーション技法が,高レイノルズ数の流体系に向いた方法であることを明らかにしたという点で,大きな成果であると言える。
ゲノム断片の再整列によるゲノム構造変異の同定法の構築

本課題では、本提案ではゲノム構造の変異を検出できる系を開発し、実用化することを目指す。方法としては以下の通りである。1.トランスポゾンとインテグラーゼを用いてバーコード配列ペアをゲノムDNAにランダムに挿入する。2.その後バーコードペアの内側を切断する。3.その結果、切断箇所を挟んで同一のバーコードが存在することになり、バーコードをたどることによって、となり同士であったフラグメントが分かるしくみの構築を目指した。これによってゲノム断片の再整列ができ、ゲノム全体の構造を解析することができる。各種トランスポゼースの大腸菌による発現精製を試みた。その結果、Tc1、Tn10, Tn7A, Tn7CおよびTn5について目的の分子量の位置に発現蛋白質を認めた。Tc1についてはHis-tagによる精製を、Tn10についてはHis-tagおよびintein-tagによる精製を試みた。Tc1は十分量の発現に成功したが、封入体を形成したため、培養コンディションや尿素による変性状態での精製とリフォールディングを試みたが発現蛋白質が不溶化するなど困難を極め、精製には至っていない。一方でTn10においてはintein-tagおよびHis-tagによる精製に成功した。そこで本酵素の活性を確認する目的で、Tn10トランスポゾン配列を含むDNA配列をTn10とともに反応させたところ、Tn10への結合活性を認めた。また、ゲノムDNAとTn10トランスポゾン配列を含むDNA配列とTN10を反応させ、300 bpの間隔でTn10が挿入したと認められる結果を得た。期間内ではバーコード付きのトランスポゾンをゲノムに挿入し断片化するまでには至らなかったが、引き続き本開発を継続させていきたいと考えている。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究課題では、ゲノムの完全解読法の開発をとおして、ゲノム構造の変異を検出できる系を開発し、実用化することを目指す。1.トランスポゾンとインテグラーゼを用いてマイクロアレイ基盤で作製した4 x 1012種のバーコード配列ペアを【割り符】としてゲノムDNAにランダムに挿入する。3.その結果、切断箇所を挟んで同一のバーコードが存在することになり、バーコードをたどることによって、となり同士であったフラグメントが分かるしくみである。この系はExome解析を補完する解析法と考えている。今年度はトランスポゼースの選定と大腸菌による発現、精製を試みた。トランスポゼースとしてはゲノムに非特異的にトランスポゾンを挿入できるcut and pasete型挿入タイプのものTn7A, B, C三量体、Tn5, Tc1, Tn10を選択した。それぞれに対してHisタグおよびtag乖離反応が容易なintein tagによる精製用ベクターにトランスポゼースをクローニングし、複数の宿主大腸菌によって発現誘導を行った。いくつかの組み合わせで適切な分子量のタンパク質発現が検出できたため、それらについて発現タンパク質の精製を行った。特にTn10にintein tagを付加した場合に高いタンパク質発現が得られ、chitinカラムによる吸着とDTTによる還元状態下でのintein tagの分離と発現タンパク質の溶出を行った。その結果、SDS-PAGEにより目的の分子量のタンパク質が確認され、あわせてCBB染色レベルでは夾雑タンパク質がないことを確認した。当初計画では、初年度でトランスポゼースの酵素活性測定とゲノムへの挿入実験を行う予定であった。