hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
画像処理を援用した疲労き裂進展挙動のナノスケール動的計測システムの開発

また,双晶境界に沿ったき裂進展では,モードIとモードIIIの混合モード下のき裂進展となっていることが確認された.無負荷状態と荷重負荷状態におけるき裂先端近傍を連続的に観察することで,モードI成分のき裂先端開口変位(CTOD)の変化と,モードIII成分のき裂先端せん断変位(CTSD)の変化を分離してナノスケールで計測することができた.そしてき裂発生直後の疲労き裂は,分岐・屈曲を繰返しながら進展するが,そのような分岐・屈曲挙動とCTOD,CTSD変化の関連を定性的に明らかにした.また,一方向性3%ケイ素鋼板の疲労き裂進展試験を行い,疲労き裂先端近傍を原子間力顕微鏡で観察し,得られた顕微鏡画像に対して画像処理を施した.その結果ナノスケールのひずみ計測が可能となった.計測されたき裂先端近傍におけるナノスケールひずみ分布と,分岐・屈曲を伴う疲労き裂進展挙動の関連を明らかにした.昨年度までに作成した,原了間力顕微鏡下での試験が可能な平面曲げ疲労試験機を用いて試験を実施し,疲労き裂の発生と進展挙動のナノスケール動的観察に関するデータ収集を行った.微小切欠きを有するα黄銅の平面曲げ疲労き裂進展試験を行った.1結晶粒内疲労き裂の初期進展挙動として以下の知見が得られた。疲労き裂は粒内のすべり系のうちシュミット因子の高いすべりが優先的に作動することによって、荷重軸に対して傾いて進展するが、同一すべり面を繰返し転位が移動することで繰返しひずみ効果が生じ、き裂は停留する。その後、き裂先端もしくは極後方の二次すべり系の作動の影響が大きくなり、き裂は屈曲もしくは分岐して進展方向を変える。しかしながら、二次すべり系は本来シュミット因子はそれほど大きくなく、ある程度進展した後、一次すべり系が作動し始めることで、さらに屈曲する。疲労き裂はこのように作動すべりの方向の変化にともなって、分岐・屈曲を繰返しながら進展する。α黄銅には同一すべり系でも特にすべり易い面が存在し、二次すべり系が作動する際にこの特にすべり易い面が利用できる場合には、屈曲の間のき裂進展量は比較的人きくなるのに対して、利用できない場合には短い間隔で頻繁に屈曲を繰返す。さらに疲労き裂の初期進展挙動に及ぼす結晶粒界の影響を調べ、き裂先端でのすべりを結晶粒界が抑制することで、き裂進展速度は低下し、特に結品方位差が大きい場合には停留し、二次すべり系へと屈曲することが明らかとなった。
水熱法による複合酸化物厚膜の形成反応に関する研究

水熱法により付着力が良好な多層膜を得るには(下層)膜と(上層)膜の間に化学反応を介した結晶核形成を起こさせることが、有効であるという昨年度の結果をもとに、基板直上に析出する膜の反応性を調べるため、いくつかのチタン酸塩が単味で析出する条件の探索をおこなった。また、種々の合成条件における出発原料や生成膜の溶解量を測定を試み、基礎的データの収集した。まず、基板であるチタニウム金属箔を、Sr、Ba、Caの各塩化物水溶液およびKOH水溶液とともに100°C以上の水熱条件下で反応させることにより、基板上にSrTiO_3、BaTiO_3、CaTiO_3を成膜した。各系における、基板上での生成相およびその生成条件を明らかにし、反応後に溶液内に残留する金属イオンの濃度を測定した。さらに、生成膜の反応性の指標として、SrTiO_3およびCaTiO_3に関しては、成膜させた基板を種々の濃度のKOH溶液中で水熱処理を行い、液相中の溶質濃度を測定することにより、各条件における膜の溶解度を推定した。その結果、不純物の析出しない成膜条件として、各物質に対して原料塩濃度に最適値が存在することがわかった。特にSrTiO_3の系では、反応温度が高く、KOH濃度が高い条件では、SrTiO_3、と共にSr(OH)_2が基板上に析出した。膜の溶解実験では、SrTiO_3では溶液温度が高く、KOH溶液の濃度が高いほど液相中へのストロンチウムの溶出量は多かった。これに対し、CaTiO_3では溶液温度が高いほどカルシウムの溶出量が多くなったのは、SrTiO_3と同様であったが、KOH濃度が高い場合はカルシウムの溶出は認められなかった。合成条件による不純物相の生成は、膜と原料の溶解度との関係から説明が可能であり、膜の反応性を明らかにすることにより、多層膜の合成条件の決定が容易となることが期待できる。本年度は水熱法によって生成する,基板-膜界面の反応層を積極的に利用して,多層膜・選択して合成実験を行った。基板であるチタニウム金属箔を、Ca、Ba、Pbのいずれかを含む無機塩の水溶液と、KOH水溶液とともに100°C以上で加熱して反応させた。つぎに、膜を形成させた基板に対し、多層膜を形成させるための実験条件を探索した。その結果、良好な付着力を得るには、基板と膜、(下層)膜と(上層)膜の間に化学反応を介した結晶核形成を起こさせることが、有効であることがわかった。基板あるいは下層膜表面に付着力に富んだ結晶核を生成させるには、基板あるいは下層膜の組成の一部が溶液中に溶出する一方で、核形成の場である基板本体や下層膜の骨格を形成する物質はその形態を保っている必要がある。基板の溶解条件や下層膜の生成条件をその「溶解しやすさ」=「反応しやすさ」という観点からも検討したところ、この「溶解のしやすさ」が直上に目的とする膜を生成させられるかどうかを左右していることが明らかになった。本研究では、当初、目的とする結晶核の生成の可能性の有無を、均一系の平衡論に基づいた熱力学的なモデルから推測しようと試みた。しかしながら、系内のどこで核生成が生じても目的生成物を得られる可能性のある粉体の場合と異なり、膜の場合は、基板上あるいは下層膜表面という特定の場所に目的の物質を析出させなければならないので、来年度は不均一系、しかも速度論を加味したモデルの構築とそのための基礎データの収集を行うことになる。具体的には、反応系内での溶液の化学組成や、固体の相組成の経時変化を扱うことが必要であろう。

これに対し、CaTiO_3では溶液温度が高いほどカルシウムの溶出量が多くなったのは、SrTiO_3と同様であったが、KOH濃度が高い場合はカルシウムの溶出は認められなかった。合成条件による不純物相の生成は、膜と原料の溶解度との関係から説明が可能であり、膜の反応性を明らかにすることにより、多層膜の合成条件の決定が容易となることが期待できる。
環境ストレスの血液-脳関門に及ぼす影響に関する研究

ダイオキシン(2、3、7、8-テトラク口口ジベンゾ-p-ジオキシン;TCDD)の摂食、飲水、運動活性に及ぼす影響を、ラットを用いて20週間にわたり検討した。7週齢のWistar系雄性ラットにTCDD1μg/kg/weekを経口投与し、摂食・飲水・運動活性測定装置に入れ、経時的に各パラメーターを測定した。その結果、TCDD投与群の体重増加は対照群に比較して、投与4週後より有意に抑制され、9週以降その差はより顕著であった。また、TCDD投与群は対照群に比べ、概して運動量の増加が認められ、特に16週目以降有意な増加が認められた。しかし、運動量の日内リズムに変化ま認められなかった。なお、摂食および飲水量についてはTCDD投与の影響は認められなかった。これらの結果より、TCDD摂取による体重増加抑制は摂食・飲水行動の抑制によるものではないこと、および成熟ラットにおいてもTCDD摂取により活動性が高まることが示唆された。次に、コミュニケーションボックスを用いて、ラットに精神的ストレスまたは身体的ストレスを負荷し、血液-脳関門の透過性に変動をきたすかどうかを検討した。透過性は静脈内にエバンスブルー色素を投与し、その脳実質内への移行の度合いを脳各部位について測定し、インタクト群と比較した。その結果、大脳皮質においてストレス負荷群で明らかな血液-脳関門の透過性の亢進が認められ、その程度は精神的ストレス負荷群の方がより高かった。また、海馬においてもストレス負荷により透過性亢進の傾向を示した。したがって、ストレス負荷により血液-脳関門の透過性が亢進し、普段では透過しえない物質でも脳内に移行しやすくなることが示唆される。このことより、TCDD投与群に精神的または身体的ストレスを負荷した場合、TCDDの運動活性に及ぼす影響がさらに大きくなる可能性が示唆された。諸種環境ストレスの脳機能に及ぼす影響を調べ、血液-脳関門の破綻を含む脳保護機構破綻の機序に如何なる因子が関与しているのかを解明していくのにあたり、まず、ダイオキシン(2、3、7、8-テトラクロロジベンゾ-p-ジオキシン;TCDD)の摂食、飲水、運動活性に及ぼす影響を、ラットを用いて検討した。7週齢のWistar系雄性ラットにTCDDlμg/kg/weekを経口投与し、摂食・飲水・運動活性測定装置に入れ、経時的に各パラメーターを測定した。なお、対照群には溶媒を経口投与した。その結果、TCDD投与群は対照群に比べ体重増加の抑制が認められた。また、投与2週後より運動活性の日内リズムに変調が認められる例も現れ始めた。しかし、摂食、飲水にはTCDD投与の影響はまだ認められていない。なお、まだ測定進行中であり、例数追加中であるので統計処理は行っていない。次に、コミュニケーションボックスを用いて、ラットに精神的ストレスを負荷し、身体的ストレス負荷群およびいずれも負荷しないインタクト群との間で血液-脳関門の透過性に差があるのか、脳の部位ごとに分けて検討した。指標としては、静脈内に投与したエバンスブルー色素の脳実質内への移行を蛍光光時計を用いて測定した。その結果、大脳皮質、海馬、線条体の3部位でストレス負荷群に色素の透過性亢進が認められた。さらに、この色素透過性の亢進は精神的ストレス負荷群の方が高かった。したがって、ストレス負荷により血液-脳関門の一部に破綻が起こったものと推察される。

このことより、TCDD投与群に精神的または身体的ストレスを負荷した場合、TCDDの運動活性に及ぼす影響が大きくなる可能性が示唆される。現在、TCDD投与量の低用量の設定も含め、すでに実験に着手している。ダイオキシン(2、3、7、8-テトラクロロジベンゾ-p-ジオキシン;TCDD)の摂食、飲水、運動活性に及ぼす影響を、ラットを用いて20週間にわたり検討した。7週齢のWistar系雄性ラットにTCDD1μg/kg/weekを経口投与し、摂食・飲水・運動活性測定装置に入れ、経時的に各パラメータを測定した。なお、対照群には溶媒を経口投与した。その結果、TCDD投与群は対照群に比べ体重増加の有意な抑制が認められた。また、TCDD投与群は対照群に比べ、概して運動量の増加が認められ、特に16週目以降有意な増加が認められた。しかし、運動量の日内リズムに変化は認められなかった。なお、摂食および飲水量についてはTCDD投与の影響は認められなかった。次に、コミュニケーションボックスを用いて、ラットに精神的ストレスまたは身体的ストレスを負荷し、血液-脳関門の透過性に変動をきたすかどうかを検討した。透過性は静脈内にエバンスブルー色素を投与し、その脳実質内への移行の度合いを脳各部位について測定し、いずれのストレスも受けていないインタクト群と比較した。その結果、大脳皮質においてストレス負荷群で明らかな血液-脳関門の透過性の亢進が認められ、その程度は精神的ストレス負荷群の方が身体的ストレス負荷群よりわずかながら高かった。また、海馬でもいずれのストレス群も透過性亢進の傾向を示した。したがって、ストレス負荷により血液-脳関門の透過性が亢進し、普段では透過しえない物質でも脳内に移行しやすくなることが示唆される。このことより、TCDD投与群に精神的または身体的ストレスを負荷した場合、TCDDの運動活性に及ぼす影響がさらに大きくなる可能性が示唆された。
自己免疫性骨髄不全症候群における疾患特異的γδT細胞の同定と機能解析

自己免疫性骨髄不全症候群のひとつである後天性慢性赤芽球癆の病因と病態を明らかにするために、γδT細胞抗原受容体のレパートリー解析を行った。赤芽球癆患者においてはVδ1+γδT細胞の増加、Vδ2+γδT細胞の減少が認められた。再生不良性貧血においてはVδ1+γδT細胞の増加は認められなかった。赤芽球癆患者におけるCDR3δ1のサイズ分布は解析した13例中9例で偏りが認められたが、健常人10例中7例においてもCDR3δ1のサイズ分布に偏りが認められた。異なった慢性赤芽球癆の症例間で共通のCDR3δ1アミノ酸モチーフは認められなかった。以上より、Vδ1+γδT細胞の増加は後天性慢性赤芽球癆における特徴的なT細胞レパートリーの変化であるが、その増殖はCDR3を介した抗原認識によるものではないことを示唆するものと考えられた。本研究の目的は自己免疫性骨髄不全症候群におけるTリンパ球の抗原受容体の差異に基づく病因論的意義、特に疾患特異的γδT細胞の存在と機能を明らかにし、免疫病態と診断およびその治療効果判定における新たな指標を同定することである。副次的目的はγδT細胞の生体内における役割を明らかにすることである。骨髄不全症候群の各病型におけるγδT細胞サブセットを含むリンパ球サブセットをフローサイトメトリー法により定量化し、健常人をコントロールとして再生不良性貧血、骨髄異形成症候群および赤芽球癆におけるT細胞サブセットを解析した。日本人のコントロールとして120名のドナープールを確保し、リファレンスデータを確立することができた(論文投稿中)。その結果、赤芽球癆においてVδ1+γδT細胞が疾患特異的に増加していることが明らかとなった。赤芽球癆において増加しているVδ1+γδT細胞の生体内での活性化状態について、活性化マーカーを用いてフローサイトメトリー法にて解析したところ、HLA-DRの発現が亢進していることが判明した。T細胞抗原受容体のクロナリティ解析により、赤芽球癆において増加しているVδ1+γδT細胞のクロナリティは一定の傾向を示さないことが明らかとなった。現在赤芽球癆におけるTCRαβ+T細胞のレパートリーを合わせて解析中であり、赤芽球癆の発症メカニズムにおけるVδ1+γδT細胞の役割について明らかにしたいと考えている。骨髄不全症候群の各病型におけるγδT細胞サブセットを含むリンパ球サブセットをフローサイトメトリー法により定量化し、健常人をコントロールとして再生不良性貧血、骨髄異形成症候群および赤芽球瘍におけるT細胞サブセットを解析した。日本人のコントロールとして120名のドナープールを確保し、リファレンスデータを確立した。(Michishita Y, etal. Int J Hematol 2012)。その結果をもとに骨髄不全症候群における解析を行ったところ、赤芽球瘍においてVδ1+γδT細胞が疾患特異的に増加していることが明らかとなり、T細胞抗原受容体CDR3領域に非依存性の反応であることが強く示唆された(Michishita Y, et al.米国血液学会2011)。赤芽球瘍において増加しているVδ1+γδT細胞の生体内での活性化状態について、活性化マーカーを用いてフローサイトメトリー法にて解析したところ、HLA-DRの発現が亢進していること、さらにTCRαβ+T細胞のHLA-DRの発現も亢進していることが明らかとなったため、現在赤芽球瘍におけるTCRαβ+T細胞のレパートリーを合わせて解析中であり、赤芽球瘍の発症メカニズムにおけるγδT細胞およびαβT細胞の役割について明らかにしたいと考えている。自己免疫性骨髄不全症候群のひとつである後天性慢性赤芽球癆の病因と病態を明らかにするために、γδT細胞の動態と抗原受容体の解析を行った。γδT細胞サブセットの動態はフローサイトメトリー法により末梢血中におけるVδ1+γδT細胞およびVδ2+

γδT細胞数を定量し、健常人および再生不良性貧血と比較した。γδT細胞のクロナリティはcomplementarity-determining region-3 (CDR3)サイズスペクトラタイピングにて、また構造の決定はDNAシークエンシングにて行った。その結果、慢性赤芽球癆患者においてはγδT細胞レパートリーの変化があり、Vδ1+γδT細胞の増加、Vδ2+γδT細胞の減少が認められた。再生不良性貧血においてはVδ1+γδT細胞の増加は認められなかった。赤芽球癆患者におけるCDR3δ1のサイズ分布は解析した13例中9例で偏りが認められたが、健常人10例中7例においてもCDR3δ1のサイズ分布に偏りが認められ、Vδ1+γδT細胞のオリゴクローナルな反応は赤芽球癆に特徴的とは言えなかった。異なった慢性赤芽球癆の症例間で共通のCDR3δ1アミノ酸モチーフは認められなかった。以上より、Vδ1+γδT細胞の増加は後天性慢性赤芽球癆における特徴的なT細胞レパートリーの変化であるが、その増殖はCDR3を介した抗原認識によるものではないことを示唆するものと考えられた。骨髄不全症候群のうち赤芽球瘍において特徴的なVδ1+γδT細胞の増加を明らかにできたことは特筆に値する。24年度が最終年度であるため、記入しない。赤芽球瘍において増加しているγδT細胞の造血に対する作用をin vitroにおいて解析するとともに、αβT細胞のレパートリーを同時に解析する。
ゲノム編集技術を用いた簡便・正確・高効率なＳＮＰ改変法の開発

本年度は、高効率かつ正確性の高い新規SNP改変技術の確立に先立つ技術基盤について整備するために、以下の通り研究を実施した。本研究の新規SNP改変法は、ゲノム上の任意の配列を切断できる人工ヌクレアーゼとマイクロホモロジー媒介末端結合(Microhomology mediated end joining: MMEJ)修復を利用することによって高効率かつ簡便にSNP改変を導入する。MMEJは、DNAの二本鎖切断(Double Strand Break: DSB)を修復する経路の一つだが、その効率については活性化できる余地が残っていた。そこで本研究では、ヒト培養細胞においてMMEJ修復の関連遺伝子を過剰発現することによって、MMEJ修復に関連した遺伝子改変技術の高効率化を実現した。まず、ヒト培養細胞を用いたレポーターアッセイを用いてMMEJ修復を活性化する遺伝子についてDSB修復に関連すると考えられる10以上の遺伝子をスクリーニングした結果、EXO1がMMEJ修復効率を約2倍活性化することが明らかになった。さらに、EXO1の過剰発現によるMMEJ修復経路の活性化を通じて、遺伝子改変技術の効率が上昇することを確認した。本研究室では、既にMMEJ修復を利用した簡便かつ汎用性の高いノックイン法について発表していたため(PITCh法)、EXO1の過剰発現によって同法が高効率化することを証明した。結果として、ヒト培養細胞へのPITCh法の適用時にEXO1を過剰発現させると、ノックイン効率がおよそ1.5倍上昇することが分かった。本研究によって確立された高効率化技術に関しては、2016年11月にBMC genomics第17巻1号に論文として掲載された。この手法の開発によって、MMEJ修復を利用した新規SNP法の基盤整備を完了したため、今後本法のSNP改変への応用を進める計画である。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
哺乳動物を特徴づける遺伝子発現調節機構の進化

転写因子において、GC配列に富んだトリプレットによってコードされるアミノ酸であるアラニン、グリシン、プロリンの含量と、遺伝子のコドン3番目のポジションでのGC含量との間には正の相関が存在すること、転写因子の活性化ドメインはそれぞれの生物系統群に非常に特徴的なアミノ酸構造から成っていること、を発見した。また、生物進化の過程でのゲノム環境の変化によって転写因子のアミノ酸組成が大きく変動し、この変動を象徴的に示すものとして単一アミノ酸反復配列の創設があり、個々の転写因子における単ーアミノ酸反復配列の種類ならびに位置はゲノム遺伝子のGC含量に対応する形でそれぞれの生物系統群に非常に特異的であること、を明らかにした。以上の発見に基づき、転写活性化ドメイン内に存在する単一アミノ酸反復配列構造が遺伝子発現に及ぼす影響を実験的に検証した。単一アミノ酸反復配列をもたない転写因子の転写活性化ドメイン内に人為的に単一アミノ酸反復配列を導入し,単一アミノ酸反復配列が転写活性化能に与える定量的影響を測定したところ,23倍の転写活性の修飾が観察された。また、哺乳動物の転写因子classIIIPOUとクロストークする因子をクローニングした後、転写活性化ドメイン内のプロリン・リピートのみを欠失させた変異体を作成し,両者間の蛋白質間相互作用を定量した。プロリン・リピートのみの欠失で相互作用はほぼ完全に失われ,野生型遺伝子でもこのプロリン・リピートをもたない両生類のorthologous geneをもちいて転写仲介因子との蛋白質間相互作用を定量したところ,期待通り相互作用は観察されなかった。以上の結果から,脊椎動物の進化過程における単一アミノ酸反復配列構造の付加によって哺乳動物の遺伝子発現調節機構に機能上の大きな変化が生じていることが明らかとなった。「転写因子において、GC配列に富んだトリプレットによってコードされるアミノ酸であるアラニン、グリシン、プロリンの含量と、遺伝子のコドン3番目のポジション(すなわち、異なる塩基に変わってもアミノ酸は変化しない場所)でのGC含量との間には正の相関が存在すること」、そして、「転写因子の活性化ドメインは、それぞれの生物系統群に非常に特徴的なアミノ酸構造から成っていること」、を発見した。また、「生物進化の過程でのゲノム環境の変化によって転写因子のアミノ酸組成が大きく変動し、この変動を象徴的に示すものとして単一アミノ酸反復配列の創設があり、個々の転写因子における単一アミノ酸反復配列の種類ならびに位置は、ゲノム遺伝子のGC含量に対応する形で、それぞれの生物系統群に非常に特異的であること」、を明らかにした。以上の発見に基づき、中枢神経系に特異的な転写因子であるclassIIIPOUをもちいて、転写活性化ドメイン内に存在する単一アミノ酸反復配列構造の生物系統群における違いが遺伝子発見にどのような影響を及ぼしているのかを明らかにするために、(1)in vitroの転写活性測定系としてGAL4 one hybrid systemを用いて量的影響に関する解析をおこなった。その結果、哺乳類(ヒト)と爬虫類(アノールトカゲ)の間には約2倍の転写活性化能の違いが存在することが明らかとなった。そこで、(2)遺伝子発現に及ぼす影響を、関連する種々の因子と転写因子とのクロストークの面から解析するために、哺乳動物のclass III POUに特徴的な単一アミノ酸反復配列とクロストークする因子の探索をGAL4 two hybrid systemを用いておこなった。その結果、5種類の仲介因子のクローニングに成功した(その詳細は現在解析中である)。当申請研究課題の代表者である植田は最近、GC配列に富んだトリプレットによってコードされる単一アミノ酸反復配列構造は哺乳動物の転写因子に特徴的な構造であることを発見し、GC圧の変化という同時間的な変化によって哺乳動物の多数の転写因子に生じたこのような構造変化が哺乳動物を特徴づける種々の形質の遺伝的・分子的基盤となっている可能性を示した。

当研究は、以上の発見を土台として、哺乳動物の転写因子を構造的に特徴づけている単一アミノ酸反復配列構造が哺乳動物の遺伝子発現調節にどのような特徴を与えたのか、すなわち、単一アミノ酸反復配列構造の付加によって哺乳動物の遺伝子発現調節機構は機能的にどのように変わったのかを探っている。本年度は、昨年度yeast two hybrid systemをもちいてクローニングに成功した「中枢神経系に特異的な転写因子である哺乳動物のclass IIIPOUに特徴的な単一アミノ酸反復配列とクロストークする因子」の解析を中心にすすめた。塩基配列決定によって推定したアミノ酸配列を配列データベースとの間でホモロジーサーチをおこなった結果、うち1つのクローンが細胞増殖に関連する既知の因子そのものであることが判明した。Delection assayによりclass IIIPOUbrain-1においてはプロリン・リピートならびにグリシン・リピートを含む領域がクロストークに関与しているとの結果を得た。この因子は配列上のホモロジーから遺伝子ファミリーを形成しているが、他のファミリーメンバーとの間ではclass IIIPOUはクロストークせず、特異的なクロストークであることも判明した。特異的なクロストークを数量化するために反応速度論的解析を現在進めている。研究代表者・植田は最近,GC配列に富んだトリプレットによってコードされる単一アミノ酸反復配列構造は哺乳動物の転写因子に特徴的な構造であることを発見し,「GC圧の変化によって哺乳動物の多数の転写因子に生じた単一アミノ酸反復配列構造が哺乳動物を特徴づける種々の形質の遺伝的・分子的基盤となっている」との仮説を提起した。本研究は当仮説の実験的検証であり,本年度は,前年度までに遺伝子構造を明らかにした単一アミノ酸反復配列からなる哺乳動物のclassIIIPOU遺伝子の転写活性化ドメインとクロストークする転写仲介因子をもちいて,両因子間のクロストークに関する単一アミノ酸反復配列の影響を定量した。すなわち,in vitro mutagenisisにより転写活性化ドメイン内のプロリン・リピートのみを欠失させた哺乳動物のclassIIIPOU brain-1遺伝子を作成し,yeast two hybrid systemをもちいてクローニングしてきた転写仲介因子との蛋白質間相互作用を定量した。その結果,プロリン・リピートのみの欠失で蛋白質間相互作用はほぼ完全に失われた。そこで,野生型遺伝子でもこのプロリン・リピートをもたない両生類のorthologous geneをもちいて転写仲介因子との蛋白質間相互作用を定量したところ,期待通り相互作用は観察されなかった。また,単一アミノ酸反復配列をもたない転写因子の転写活性化ドメイン内に人為的に単一アミノ酸反復配列を導入し,単ーアミノ酸反復配列が転写活性化能に与える定量的影響を測定したところ,23倍の転写活性の変動が観察された。
ラットおよびマウス大脳皮質感覚野からのin vivoパッチクランプ記録法の確立

大脳皮質体性感覚野における感覚情報処理機序を明らかにするため、ラットまたはマウスの体性感覚野細胞からのパッチクランプ記録法の確立を目的とした。麻酔したラットまたはマウスを脳脊髄固定装置にセットし、皮膚を切開した後、頭蓋に記録用のチェンバーを固定した。頭蓋骨にドリルを用いて約2mmのホールを開け、パッチ電極を刺入し記録を行った。記録を行った体性感覚野の90%以上の細胞で周期的なburstingが観察された。このburstingは膜電位を変えるとその振幅は変化するものの、頻度には変化がみられなかった。また、グルタミン酸受容体拮抗薬のCNQXによって可逆的に抑制された。さらに、このburstingは呼吸や心拍動とは全く相関を示さなかったが、EEGとは有意な相関を示した。次に、気管内挿管を行いisoflurenで麻酔深度をコントロールすると、低濃度では頻度が増大し、深麻酔下では頻度が低下した。麻酔深度の変化に伴って得られたburstingの頻度の変化はEEGともよく一致した。以上の結果から、burstingは記録細胞自体が持つ性質ではなく外から入力したシナプネ応答であると結論され、さらにEEGの発生と密接に関与していることが推測された。今までの研究から視床は単なるリレーニューロンではなく、末梢からの感覚入力を修飾していることが示されている。そこで、burstingの発生起源として視床を考え、stereotaxicに視床にカニューレを刺入し、GABA_A受容体の作動薬であるmuscimolを微量注入した。その結果濃度依存性にburstingは抑制された。以上の結果から大脳皮質細胞から記録されたburstingは視床における皮質投射ニューロンの同期した入力によって惹起されていると考えられた。視床における同期にはGABAergicニューロンが重要な役割を果たしている可能性が考えられた。本研究で目的とした大脳皮質細胞からのin vivoパッチクランプ記録法はほぼ確立することが出来た。本方法は大脳皮質のほとんどの部位からの記録が可能で、また、小脳や脳幹からの記録も可能であり、今後広い分野での適用が期待される。本申請者は既にラットおよびマウスを用い、脊髄後角細胞からのin vivoパッチクランプ記録法を確立し、皮膚刺激によって誘起されるシナプス応答の解析を行っている。この方法を大脳皮質に適用し、第一次体性感覚野における感覚情報処理機構を明らかにすることを目的とした。ラットまたはマウスを麻酔後、脳脊髄固定装置にセットした。頭蓋にプラスチックの記録用チェンバーを歯科用セメントを用いて固定した後、第一次感覚野に相当する部位にドリルを用いて穴を開けた。硬膜に加えた切開を通してパッチ電極を刺入し、ホールセルクランプ記録を行った。記録した細胞にneurobiotinを注入し、実験後にその部位と形態とを解析した。記録を行った90%以上の細胞では、28Hzの膜電流のオシレーションが観察された。また、その頻度は麻酔レベルによって規定され、浅麻酔では頻度が上昇、深麻酔では低下した。また、ウレタンの代わりにバルビタール剤を用いて麻酔を行うとオシレーションは消失した。さらに、皮質表面からグルタミン酸AMPA受容体の拮抗薬であるCNQXを投与すると、オシレーションは可逆的に抑制された。記録と同側および反対側からEEGを記録し、オシレーションとの関連を見たが、明らかな相関が見られた。今までの研究から、大脳皮質におけるオシレーションの発生には、視床からの入力の関与が報告されているため、視床に刺激電極またはGABAA受容体アゴニストであるmuscimolを注入したときの変化を調べた。その結果、電気刺激およびmuscimol注入によってオシレーションの著明な抑制が見られた。以上の結果から、大脳皮質細胞で観察されたオシレーションは視床が起源と考えられ、おそらくGABAニューロンが視床-皮質投射ニューロンの同期発火をコントロールしており、その出力が大脳皮質細胞におけるオシレーションの発現に寄与している可能性が示唆された。

そこで、burstingの発生起源として視床を考え、stereotaxicに視床にカニューレを刺入し、GABA_A受容体の作動薬であるmuscimolを微量注入した。その結果濃度依存性にburstingは抑制された。以上の結果から大脳皮質細胞から記録されたburstingは視床における皮質投射ニューロンの同期した入力によって惹起されていると考えられた。視床における同期にはGABAergicニューロンが重要な役割を果たしている可能性が考えられた。本研究で目的とした大脳皮質細胞からのin vivoパッチクランプ記録法はほぼ確立することが出来た。本方法は大脳皮質のほとんどの部位からの記録が可能で、また、小脳や脳幹からの記録も可能であり、今後広い分野での適用が期待される。
水産物中のヒドロキシ脂質およびアルデヒド類を利用した新規の品質評価法の開発

昨年度は,人為的に生魚(コイ:Cyprinu carpio)に四塩化炭素を腹腔内に投与し肝疾患を誘導させ,ヒドロキシ脂質を初めとする脂質関連物質の挙動についての報告を行い,ヒドロキシ脂質ならびに4-hydroxy-2-hexena1(HHE)はストレス指標として有効であることを示した。本年度は,養殖場で発生した各種魚病に感染した生魚について分析を行った。4魚種(トラフグ,ヒラメ,ブリ,カンパチ)のアルデヒド類を分析した結果,全魚種において病気魚のHHEならびにプロピオンアルデヒドが増加していた。また,病気魚の過酸化脂質量ならびにヒドロキシ脂質量は増加していた。一方,脂質クラスならびに脂肪酸組成は,病気による変化が見られた。また,ビタミンEならびにA量は,一部の病気魚において減少が確認された。以上の結果から,生魚の肝臓中のアルデヒド類ならびにヒドロキシ脂質量を測定することによって,生魚の健康状態の指標となることが示唆された。また,HHEとプロピオンアルデヒドの生成量について相関性を見たところ強い相関が見られ,ともにn-3系脂肪酸由来の酸化物であることから,新たな,品質指標となることが示唆された。生魚を用いて生魚の品質を生体内のヒドロキシ脂質を指標として評価を行った結果、病気>養殖>天然の順にヒドロキシ脂質が蓄積していた。また、この時のビタミンE含量を測定した結果、ビタミンE含量が高いほどヒドロキシ脂質の蓄積を抑制することが示唆された。この現象を、魚類株化細胞(Hepa-T1:ティラピア肝臓由来)を用いて検証を行った結果、ストレスを与えることによってヒドロキシ脂質が蓄積し、さらにヒドロキシ脂質の蓄積によりビタミンEの含量が減少したことから、ビタミンEがヒドロキシ脂質の蓄積に関わることが示唆され、生魚と同様な結果が得られた。以上の結果から、ヒドロキシ脂質の蓄積量の測定により、魚類の品質を判別することが可能となった。次に、アルデヒド類(特に4-hydroxy-2-hexenal:4HH)を利用した指標の有効性を検討するために、4HHを含むアルデヒド類の分析方法の開発を行った。その結果、1,3-cyclohexanedione(CHD)試薬を用いてアルデヒド類を蛍光標識化し高速液体クロマトグラフィーで分析する方法を開発した。この方法により、4HHの分析は既知の分析法より高感度に分析することが可能となり、さらに、他のアルデヒド類(ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピルアルデヒド)の同時分析も可能となった。この方法を利用し、サバを用いて鮮度評価を行ったところ、劣化の順に4HH量が上昇し汎用的に用いられているK値との相関性も見られ、さらに、K値よりも鋭敏な指標あった。以上の結果から、ヒドロキシ脂質および4HHを利用した生魚の品質評価法の可能性が示唆された。昨年度の報告から、生魚の品質を生体内のヒドロキシ脂質を指標として評価を行った結果、病気>養殖>天然の順にヒドロキシ脂質が蓄積し、生体の健康状態の指標となり得る事が判明したため、本年度は病気魚について、詳細な検討を行った。生魚(コイ:Cyprinus carpio)に四塩化炭素を腹腔内に投与し肝疾患を誘導させ、ヒドロキシ脂質を初めとする脂質関連物質について分析を行った。この結果、哺乳類を用いた研究と同様に、脂質含量ならびにトリアシルグリセライドの増加が確認された。また、ヒドロキシ脂質の著しい増加も確認され、昨年度の報告を示唆するものであった。次に、アルデヒド類(特にn-3系脂肪酸の酸化によって生じる4-hydroxy-2-hexenal : HHE)を利用した健康指標の有効性を検討するために、昨年度はHHEを含むアルデヒド類の分析方法について報告したが、本年度はn-6系脂肪酸の酸化から生じる4-hydroxy-2-nonenal(HNE)の分析方法についても検討を行った。HNEは哺乳類における酸化ストレス指標として利用されているが、水産に着目した場合、潜在的にn-6系脂肪酸も含まれており養殖の飼料には栄養強化のためにn-6系脂肪酸を添加している事例もある。昨年度の方法を参考にHNEとHHEを同時に分析する方法について検討を行った。その結果、方法を改良することにより最良の分離が得られ、同時分析が可能となった。この方法を用いて上述の四塩化炭素を投与したコイのアルデヒド類を分析した結果、酸化ストレスにより生じた種々のアルデヒドが検出され、HHEとHNEはともに増加した。特にHHEの増加が顕著であり、ヒドロキシ脂質量の増加との相関性も見られた。一方、HNEはHHEと比較すると著しい増加は見られなかったが、ヒドロキシ脂質との相関性は見られ、ストレス指標の有効性が示唆された。

また,HHEとプロピオンアルデヒドの生成量について相関性を見たところ強い相関が見られ,ともにn-3系脂肪酸由来の酸化物であることから,新たな,品質指標となることが示唆された。
多次元生体信号記録法による手触りの神経機構の解明

本研究は、物体の形態や材質を推定し、如何なる感覚受容器・脳領域が推定に貢献しているのかを明らかにすることによって、触覚の質感認知機序の理解をすることを目的とした。そのために、2頭のマカクサルから末梢体性感覚ニューロン群、広域大脳皮質活動、筋活動、上肢の運動軌跡を同時に記録し、物体は把持中の手の運動に対する感覚受容器・脳領域の貢献度をスパース直線回帰法により検討した。その結果、自分の意思で物体を把持する随意運動であっても、手の筋活動の30%は末梢感覚ニューロン由来の脊髄反射で生成され、残りの70%は大脳皮質からの脊髄運動ニューロンへの下行性入力により生成されていることが分かった。末梢感覚ニューロンの投射先である体性感覚野の活動の起源を解明する目的で、体性感感覚野活動を末梢感覚ニューロンと他の大脳皮質領野の活動から説明することを試みた。その結果、自分の意思で物体を把持する随意運動中の体性感覚野の活動は、末梢感覚ニューロンと体性感覚野ニューロンによって生成されていることが明らかになった。一方で、体性感覚野の活動は、驚いたことに物体に接触するずっと前に活動し、手の運動、筋活動更には体性感覚ニューロンの活動ニューロンよりも早い時間で活動が観られ、運動を生成する運動野の活動とほぼ同じ時間に活動が開始していた。この体性感覚入力がない時間に活動を開始する体性感覚野の活動は、運動野活動により推定できることが分かった。また、この先行する体性感覚野の活動は、麻酔下で他動的に物体を把持する時と同じように手の運動をさせたときにには消失した。この結果は、これまで物体の触覚を知覚する体性感覚野には物体に接触する前に、あらかじめ次に起こる予測される体性感覚入力情報が大脳皮質運動野から入っていることが明らかになった。27年度が最終年度であるため、記入しない。平成25年度は、目標であった覚醒行動下のサルよりDRGニューロン群活動とECoG電極による多チャンネル皮質脳波の同時記録に1頭のサルで成功した。それに加え、上肢の運動軌跡と16の筋肉の筋活動の同時記録に成功した。記録されたDRGニューロンには筋紡錘、手や腕に受容野を持つ皮膚感覚ニューロンが含まれていた。そのDRGニューロン活動から、指、手首、肘、肩の運動キネマティクス(関節角度及び角速度変化)をスパースロジスティック解析を用いて、高精度に推定することに成功した。また、運動キネマティクスからDRGニューロンの発火パターンを推定することにも成功した。この結果から、体性感覚一次ニューロンであるDRGニューロン群活動には指を含む上肢の精密は運動情報有することが明らかになった。この成果は論文として投稿し、査読中である。体性感覚一次ニューロンであるDRGニューロン群活動が大脳皮質体性感覚野との関係を検討する目的で、DRGニューロン群活動とECoG電極から記録された大脳皮質体性感覚野の活動を推定したところ、DRGニューロン群活動から40ー200Hz(高γ帯域)のECoG信号は精度良く推定に成功したが、10ー40Hz(αからγ帯域)のECoG信号の推定精度が低かった。この結果はDRGニューロン群活動は大脳皮質体性感覚野へ伝えられ、高γ帯域活動として表現されていることが明らかとなった。

2頭のサルで覚醒行動下のサルよりDRGニューロン群活動とECoG電極による多チャンネル皮質脳波の同時記録をする計画であったが、1頭でのみしかできなかったしかしながら、2頭目サルのトレーニングは修了し、26年度には達成する予定である。27年度が最終年度であるため、記入しない。アクティブタッチによる手触りの質感認知には、手と物体の接触面を能動的に動かすことにより、物体表面の情報をより得ようとする。これは、体性感覚主導ではなく、身体運動を起こす運動関連領野からのトップダウン信号が末梢感覚情報を積極的に作り出していると考えられる。今回の申請では、体性感覚一次ニューロンであるDRGニューロン群と大脳皮質運動関連領野を含む広域な大脳皮質領域からの皮質脳波の同時記録によって得られたデータから、アクティブタッチによる手触りによる物体質感情報の流れをGranger Causality解析を用いて明らかにする。
粘膜免疫の特殊性を応用した腸管免疫統御療法の開発

本研究は炎症性腸疾患の発症・慢性化機序解明のため、既存の研究とは全く視点を変え、研究代表者が独自に見いだした粘膜局所におけるIL-7を介した新しい免疫調節機構、活性化IL-7レセプター陽性腸管粘膜内リンパ球による炎症惹起機構の考え方に加え、腸管粘膜再生の概念を導入することにより、腸管局所免疫機構の特殊性を利用した新しい治療法の開発を目指す目的で行われた。本年度の研究では腸管上皮細胞によるIL-7産生機構の詳細な解析を行った。その結果、1)ヒト腸管上皮(IEC)細胞株の解析により、IL-7産生が転写レベルで制御されることを見いだした。2)IL-7産生には遺伝子上流のIRF-E(Interferon Regulatory Factor-Element)を介する調節が重要であり、転写因子IRF-1/IRF-2がその結合蛋白であった。3)Tet-On強制発現とsiRNAノックダウン解析から、IRF-1/IRF-2の両者がIL-7産生を正に制御すると同時に、IRF-2は構成的、一方IRF-1は刺激依存性のIL-7誘導因子であることが明確になった。4)ヒト大腸組織に特徴的な分布様式でIRF-1/IRF-2が発現することより、ここに示したIL-7産生機構が生体においても重要であることが示された。以上の成果は、ヒトにおけるIL-7分泌の調節機構を初めて示す知見であると同時に、IRF-1/IRF-2の新しい協調機構を提示するものでもある。また、IRF蛋白機能を人為的に制御することにより腸管上皮によるIL-7産生を調節しうる可能性が示され、慢性大腸炎の新規治療法開発の基盤となる可能性が示された。来年度以降、現在解析しつつある腸管上皮の分化を制御する機構を担う分子に対するターゲット療法を開発することは今後、創薬に発展すると考えられる。
放牧草地における牧草および家畜の生長予測

牛群が放牧されている草地を、植物群落ー牛群ー土壌生物群で構成される系、すなわち生態システムとして把え、植物と家畜の相互作用を調べるとともに、そこでの牧草と牛群の成長予測を目標に、システム分析的なアプローチを試みている。予測のためのシミュレーションは、次の段階の研究として準備しているが、本研究では、シミュレーションモデルの作成に必要なパラメータを定量的な実測値から得ることを主なねらいとし、以下の成果を得た。1)数式モデルの特徴:生態システムの三大構成要素である牧草(生産者)、放牧牛群(消費者)、土壌生物群(分解者)の成長を、基本的には同形のコンパートメントモデルで表現したこと、何れにも潜在的成長力を想定してこれに相応するエネルギー要求量を先ず求め、現実にはこれが制限されて制限要求量となり、さらにこれが現実の供給量とのバランスされたのちに現実の成長が発現する、という生物の把え方で統一したことが特徴である。2)草地の生産力:放牧牛群への餌の供給量は、牧草群落の生長速度によって決定される。2年間にわたり、放牧期間と休牧期間(他牧区への輪換期間)の牧草生長量、枯死量、リター(植物遺体)量を実測、牛群による採食量も測定し、ほぼ1ヵ月12回の割合で可食部生産量と増体量を調べた。これらをエネルギー単位の値に換算し、投射された太陽エネルギー(日射量)から可食部、採食部、可消化エネルギー、代謝エネルギーそして蓄積エネルギーとしての増体までの各エネルギー変換効率を求めた。季節別には、春季と初秋に増体が高く、夏季と晩秋に低くなり、牧草の生長速度とやや似た推移となったが、可消化エネルギーから代謝エネルギーへの変換効率がかなり増体の変動に影響し、次いで牧草の消化率が関係していた。前者の効率は、英国ARCが用いている効率より著しく低く、モデル開発にとって重要な課題であることが示唆された。本研究は放牧草地と牛群を植物群落放牧牛群土壌生物の三者で構成される生態システムとして把え、牧草と牛群の両者が相互に影響を及ぼしつつ生長する過程を数式で表現し、かつ現地の物質・エネルギー循環量を併せて実測することで、植物と牛の生長を再現、予測しようとする。乳牛の子牛が放牧されている草地で、植物体の単位土地面積あたり乾重、窒素量および子牛の体重増加、生長の季節的な推移を実測した。植物体は時期別に地上部を葉身、茎・葉鞘・稈、立枯、リターの各部分に別け、また可食部、株部、採食部、残食部にそれぞれを区分した。地下部も季節別に採取した。これらをエネルギー量に換算し、植物体全体および各部分のエネルギー量の時期別推移を求めて数式モデルの係数とした。一方、放牧牛については、牧草採食量からエネルギー摂取量を求め、テレメトリーによる心拍数と放牧行動型ごとの時間とからエネルギー消費量を推定し、牛群のエネルギー収支を時期別に求めた。子牛の増体実測値は、5月>7月>8月>10月の順に鈍化し、春季には1kg前後で高かったが夏季以降低くなった。この増体をエネルギー換算し、これに運動に伴うエネルギー消費量を加えた値は、摂取した飼料から家畜体内で代謝されたエネルギー量に当たる。この値と、草地の草量変化から推定した採食量に基づいて求められたエネルギー摂取量とは、春季、夏季はほぼ一致したが、10月中旬は後者が著しく高くなった。

増体が夏季以降低下する原因は、家畜の代謝の側面と牧草の消化率や供給量など植物側の両方の要因が交絡したものと考えられる。この点を解析するため、数学モデルによるシミュレーションを行なおうとして数式群を組み立てている。春季・夏季については、放牧育成子牛の生長はほぼ予測可能との見通しを得た。
膜面新規ヘム鉄の役割解明を目指す高等植物チトクロムb6f複合体のX線構造解析

シトクロムbc複合体は、b型チトクロム、c型チトクロム、鉄硫黄タンパク質を含む複数のサブユニットから構成され、電子伝達に共役したプロトン輸送を行う膜タンパク質複合体である。チトクロムbc複合体には、構造研究が豊富なミトコンドリア型bc1複合体の他に、b6f複合体と呼ばれる植物型、好気的に生育する細菌が持つ細菌型bc1複合体が存在している。我々は光合成電子伝達における循環電子伝達と膜面新規ヘム鉄との関係に着目している。循環電子伝達は鉄硫黄型反応中心である光化学系I複合体とシトクロムb6f複合体の間で起こる反応である。光化学系I複合体は緑色硫黄細菌など酸素発生を伴わない光合成細菌から進化してきたことがわかっているので、光合成硫黄細菌Chlorobium tepidumが持つ光合成反応中心とFNR、シトクロムbc1複合体にも着目し、並行して構造研究を行っている。C.tepidum FNRについては2.2オングストローム分解能で構造解析に成功した。我々は、結核菌など感染症の原因となる細菌の代謝系にも着目して研究を展開してきた(Inaoka 2008)。我々は、結核菌M.tuberculosis由来チトクロムclcサブユニットの可溶性ドメインをクローニングし、大腸菌で大量発現させ精製した組換え体サンプルを用いて結晶構造解析を行った。その結果、解離会合を繰り返すミトコンドリア型の可溶性チトクロムcとは、全く異なる様式でチトクロムc酸化酵素へ直接電子伝達する構造基盤が明らかになった。また、膜界面における効率の良い電子伝達を支える膜タンパク質複合体同士による超複合体形成に関しても、構造上の新しい知見を得ることが出来た。我々は高等植物チトクロムb_6f複合体のX線構造解析を目指して結晶化を進めているが、現在までに構造解析可能な単結晶を得ていないので、並行して研究を進めている病原菌のシトクロムbc_1複合体の構造研究について報告する。今回取り上げた、結核菌に代表される高G+C型グラム陽性菌が持つシトクロムbc_1複合体は、ゲノム解析から非常に特徴的なサブユニット構造をとることが報告されている。シトクロムc_1サブユニットと可溶性シトクロムcが天然に融合したシトクロムc_1cサブユニットを持ち、ミトコンドリア型とはある程度異なった分子メカニズムでH^+ポンプ機能を担っている可能性が指摘されている。本研究では、このように特徴的な構造を持つ結核菌型シトクロムbc_1c複合体に注目し、その構造研究に取り組んだ。シトクロムbc_1c複合体全体の構造解析に関しては、シトクロムc_1cサブユニットの一部が外れて不均一な試料となってしまい易いため、結晶化には成功していない。結核菌型シトクロムc_1cサブユニット単独での構造解析に関しては、大腸菌を用いた大量発現に成功し、精製したサンプルを用いて結晶化を行ったところ、良質な単結晶を得ることができた。KEK-PFの放射光を用いて回折強度データを収集し、Fe-SAD法で位相を決定して、2.9Å分解能で構造解析した。決定したX線構造の特徴を詳細に検討した後、分子内部での電子伝達経路を検証し、他のマルチヘムシトクロムの構造と比較・検討を行った。次に、ミトコンドリア型シトクロムbc_1複合体の複数の結晶構造を参考に、結核菌型シトクロムc_1c周辺の電子伝達経路と分子間相互作用について考察を行った。
液体窒素温度成膜法による薄膜ヘッド用高飽和磁化軟磁性薄膜の開発

本研究では、飽和磁化を低下させてしまう不純物をあまり添加しなくても膜中の結晶粒の微細化が可能な、独自の薄膜化技術(液体窒素温度に保った低温基板上に、イオン衝撃を加えながら薄膜を堆積するという独自の薄膜作製方法や、100V以下の低電圧でスパッタ堆積を行う低電圧スパッタ法、数十kHzのパルス電圧を印加してスパッタを行うパルススパッタ法、対向配置のデュアルスパッタ法などの新しいスパッタ成膜技術を開発するとともに、これらのスパッタ装置を用いて、磁性材料の中で飽和磁化の最も大きな純鉄、および鉄・コバルト合金薄膜を作製することによって、2.2 T以上の高飽和磁化を持つ軟磁性薄膜を実現することを目指した。その結果、(1)液体窒素温度堆積法と、イオン衝撃とを組み合わせることで、Fe膜においては、結晶粒径の微細化と、配向性の改善により、軟磁気特性の顕著な改善が可能なこと、(2)Fe-Co系の薄膜に関しては、Fe系の場合とは異なり、液体窒素温度堆積法では十分な軟磁気特性を持つ薄膜を実現するには至っていないが、スパッタ電圧を低下することにより膜の配向性や粒子成長の変化や圧縮応力の低減が可能であった。(3)Fe-Co薄膜の軟磁気特性の改善に大きな効果があることが報告されている下地層の効果について検討した結果、パーマロイ下地層上に成膜することでFe-Co膜の微細化が引き起こされること、Ta下地層の上に形成したパーマロイ下地膜はTa下地の無い場合に比べるとより小さな粒径を持ち、その上に堆積したFe-Co膜の細密面(110)配向性が著しく改善されることが分かった。このような、粒子の微細化と配向性の改善が軟磁気特性の改善したものと思われる。一方、スパッタ電圧や、スパッタ時の放電電流。スパッタガス圧によっても膜の構造は変化するものの、下地層による変化の方が著しく、スパッタ条件等の、成膜条件の制御による顕著な軟磁気特性の改善は困難であった。本研究では、高飽和磁化軟磁性薄膜材料め開発を目的として通常のスパッタ法に比べて極めて低い電圧でスパッタする低電圧スパッタ法、液体窒素温度での膜堆積法、パルス電源により発生させたプラズマを用いたスパッタ法等を組み合わせた、新しいスパッタ膜堆積法を開発するとともに、これを用いて優れた軟磁気特性を持つ膜を実現することを試みている。今年度は、上記研究を推進するための準備としてまず、通常のマグネトロンスパッタ装置に54.24MHzの高周波電源からも電力供給ができるようにすることによって、100V以下の低電圧でもスパッタを可能とするとともに、100kHzまでの周波数およびパルス幅を可変できるパルス電源を購入して、パルスプラズマの生成、デュアルスパッタ等の技術を使った成膜も可能とした。低電圧スパッタ装置を用いて純鉄薄膜の作製を試みた結果、プラズマ密度を増すことにより100Vの低電圧でも数十nm/min以上の堆積速度での成膜が可能であり、かつプラズマ密度を上げて低電圧で膜の作製を行うことにより、結晶性の良好な純鉄膜が作製できることが明らかになった。この結果は低電圧でのスパッタにより、数百eVの高エネルギー粒子による基板衝撃が抑制され、結晶性の良好な結晶粒の成長が促進されることを示唆している。低温成膜と低電圧スパッタを組み合わせた方法による膜の作製は現在調査中であるが、従来法と比べてより軟磁気特性に優れた膜の実現が期待できる。今後はスパッタ純鉄膜の堆積過程を明らかにするとともに、作製条件の最適化を行い、より低保磁力で磁歪が5x10^<-6>以下の軟磁性鉄薄膜を実現する。さらに窒素やCなどの微量添加により軟磁気特性の改善や高安定性を実現するとともに、純鉄より大きな飽和磁化を持つFe-Co系軟磁性薄膜についても検討を進めていく予定である。

このような、粒子の微細化と配向性の改善が軟磁気特性の改善したものと思われる。一方、スパッタ電圧や、スパッタ時の放電電流。スパッタガス圧によっても膜の構造は変化するものの、下地層による変化の方が著しく、スパッタ条件等の、成膜条件の制御による顕著な軟磁気特性の改善は困難であった。本研究では、高飽和磁化軟磁性薄膜材料の開発を目的として通常のスパッタ法に比べて極めて低い電圧でスパッタする低電圧スパッタ法、液体窒素温度での膜堆積法、パルス電源により発生させたプラズマを用いたスパッタ法等を組み合わせた、新しいスパッタ膜堆積法を開発するとともに、これを用いて優れた軟磁気特性を持つ膜を実現することを試みている。平成14年度は(1)上記研究に用いるための低電圧スパッタ装置の特性改善、(2)異常放電の無い安定なスパッタ法として注目を集めているパルススパッタ法の検討、(3)対向ターゲット式スパッタ法を用いた下地層による軟磁気特性の改善効果の検討、(4)上記低電圧スパッタ法による特性改善効果の検討を行った。その結果、(1)については、スパッタ陰極付近の磁界分布を改善することで、直径10cmの純鉄ターゲットを装着した状態でも54.24MHzの高周波電源からの電力供給時に、100V以下の低電圧でも1A以上の高イオン電流でのスパッタ動作が可能となり、従来の装置に比べて5倍以上の高堆積速度での薄膜の作製を可能とした。この結果は、rf-dc結合形低電圧スパッタ装置の低電圧動作特性が、スパッタ陰極の磁界強度と分布を工夫することで著しく改善できることを明らかにしたもので、高性能低電圧スパッタ装置の実現に有効である。(2)のパルススパッタ法については、パルス電圧印加時および切断時のプラズマ状態を詳細に検討し、パルススパッタ法が、パルス幅、パルス電圧を調節することによって、特に酸化物などの薄膜作成に有効であることを確認した。(3)では、パーマロイ下地層上にFe-Co合金膜を作製することによる何磁気特性の改善効果を確認したものの、十分な軟磁性膜を実現するところまでは至っておらず、それらの原因について調べるとともに、アルミナ添加などの方法による軟磁気特性の改善についても検討を進めている。(4)では、スパッタ電圧を下げることによって、結晶粒の配向性が著しく改善できること、液体窒素温度製膜と低電圧スパッタ法を組み合わせることで、純鉄薄膜の軟磁気特性が改善できることが分かった。低電圧スパッタの効果として期待される、応力の小さな薄膜の作製については、現在検討中である。今後は、継続して本研究で試みている上記新しいスパッタ堆積法を用いた場合の薄膜成長過程の特徴を明らかにするとともに、低保磁力の軟磁性薄膜を実現のための条件を探索していく。本研究では、2.2T以上の高飽和磁化軟磁性薄膜材料の開発を目的として通常のスパッタ法に比べて1/3以下の低い電圧でスパッタできる低電圧スパッタ法、液体窒素温度での膜堆積法、パルス電源により発生させたプラズマを用いたスパッタ法等を組み合わせた、新しいスパッタ膜堆積装置を製作するとともに、これを用いた軟磁性薄膜の実現を試みて来た。昨年度までの研究で、純鉄ターゲットを用いた場合にも、100V以下の低電圧で、かつ1A以上のイオン電流でスパッタ可能な低電圧スパッタ装置(rf-dc結合形マグネトロンスパッタ装置で、(1)ターゲット上での磁界強度を0.14T以上に増強、(2)54.24MHzの高周波を使用)を実現するとともに、プラズマ密度をさらに上げた場合にも、安定にスパッタ可能な、パルススパッタ法を採用することで、従来のスパッタ法に比べて、堆積速度を落とさずに、高エネルギー粒子による衝撃ダメージが少ない薄膜作製法が実現できることを示してきた。