hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
優性遺伝病発症モデルマウスを用いた遺伝要因と環境要因の解析

家族性アミロイドポリニューロパチーは優性遺伝病であり、トランスサイレチン(TTR)遺伝子の異常によって発症する。その病因・病態解析を行うため、マウスTTR遺伝子をヒト正常TTR遺伝子及びヒト変異TTR遺伝子で置換したマウスの作製に成功した。また、病原微生物がいない環境でモデルマウスを飼育すると全く発症しないことを明らかにした。また、日本産野生マウス由来のMSM/MsからのES細胞の樹立に成功した。マウスTtr遺伝子破壊マウスの作製のため、DTpA-left arm-lox71-PGK-neo-loxP-pA-lox2272-right armの構造を持つ相同組換えベクターを作製した。これを用いて相同組換えを行いマウストランスサイレチン(mTtr)遺伝子を完全破壊した3つのESクローンを得た。これらを用いてキメラ胚を作製したところ、2つのクローン(KTUP10-28,KTPU10-26)から100%キメラが得られた。そのキメラを交配することにより、生殖系列への伝達を確認することができ、マウスTtr遺伝子の破壊マウスの作製に成功した。Targeted alleleをヒト野生型TTR遺伝子で置換したESクローンを単離するため、lox66-野生型ヒトTTR cDNA(hVal30)loxP-FRT-PGK-puromycin-FRTの構造を持つ置換ベクターを作製した。これをESクローンに導入し、lox66とlox71間およびloxPとloxP間の両方で組換えがおこり、最初に挿入したPGK-neo部分をhVal30遺伝子で置換したESクローンを単離した。このES細胞を用いてキメラマウスを作製し、そのキメラマウスを交配することによりヒトの野生型遺伝子を持つマウス系統を樹立した。Targeted alleleを、ヒト患者でよく見られる30番目のValがMetで置換したESクローンを単離するため、lox66-野生型ヒトTTR cDNA(Val30Met)-loxP-FRT-PGK-puromycin-FRTの構造を持つ置換ベクターを作製した。MSM/Msマウスは、我が国独自の野生マウス由来の近交系であり、このマウスについてマイクロサテライトプローブ、SNPs、BACクローンの整備がなされている。そこで、MSM/MsマウスからのES細胞の樹立を試みたところ、3ラインが樹立でき、そのうちの一つについては100%キメラを効率よく作製できることが分かった。マウストランスサイレチン(mTtr)遺伝子を完全破壊する一方、その部分にヒトTtr遺伝子を置換し、ヒトのTtrのみが発現するマウスを作製することを試みた。このため、(1)DTpA-leftarin-lox71-PGK-neo-loxP-pA-lox2272-right armという相同組換えベクターにてmTtr遺伝子完全破壊マウス(-/-)を、前者のPGK-neo部分を野生型ヒトTTR cDNA (hva130)で置換したマウスを得た。また、ヒト患者でよく見られる30番目のva1がMetで置換した遺伝子(hMet30)を挿入したマウスを樹立することにも成功した。(-/-)マウスでは、mTtr遺伝子発現はないこと、また、血清のmTTRも検出されないことを明らかにした。次に、挿入したhVal30の発現レベルをノザンブロット及びウエスタンブロット法にて解析したところ、肝臓でのmRNA量及びタンバクとしてのTTR量は高いことが分かった。ところが、。血清中のヒトTTRの量は、コントロールマウスの1、0分の一であることが分かった。このことは、分泌が悪いためか、もしくは血清中では4量体の安定性が悪く、単量体になったものが簡単に腎臓から排泄されるために血清中のレベルが低いことが考えられた。現在、2つの可能性を検討中である。一方、hVal30マウスにおける発現量が低いことから、発現を高めることを命図して、PGK-neoを削除する、hVal30 cDNAの前にIRES配列を挿入する、またはその両方を行うことを計画し、これらのマウスも樹立した。解析したところ、PGK-neoを削除すると返って肝臓における発現路湯が低下することを見出した。このことは、従来の報告とは具なり、PGK-neoがかえって転写を促進する場合のあることを示唆している。昨年度に、MSM/Msマウス由来のES細胞を樹立したが、このクローンを用いて遺伝子トラップを行ったところ、TT2 ES細胞とほぼ同程度の効率で、遺伝子トラップを行うことができることが示された。マウストランスサイレチン(mTtr)遺伝子を完全破壊する一方、その部分にヒトTtr遺伝子を置換し、ヒトのTtrのみが発現するマウスの作製に成功した。

具体的には、mTtr遺伝子完全破壊マウス(-/-)、野生型ヒトTTR cDNAを持つマウス(Va130)、また、ヒト患者でよく見られる30番目のVa1がMetで置換した遺伝子(Met30)を樹立し、交配により、(-/-)、(+/Va130)、(Va130/Va130)、(Va130/Met30)、(Met30/Met30)の遺伝子型のマウスを樹立し解析に用いた。(-/-)マウスでは、mTtr遺伝子のmRNAも血清のmTTRも検出されない。(+/Va130)と(Va130/Va130)における発現、を比較したところ、肝臓でのVa130mRNAおよびVa130タンパクの発現は、Va130の遺伝子量に比例していたが、血清中のVal30を測定したところ、(Va130/Va130)のほうが、低いことが分かった。この原因を追究したところ、分泌が悪いのではなく、Va130の4量体の安定性が悪いためであることが分かった。その原因として、マウスレチノール結合タンパクとの結合が悪いためであることを明らかにした。さらに、Met30/Met30マウスでは、4量体の安定性はVa130/Va130と比較して悪いが、2量体はより安定であることが分かった。一方、hVa130マウスにおける発現量が低いことから、発現を高めることを企図して、PGK-neoを削除する、hVa130cDNAの前にIRES配列を挿入する、またはその両方を行うことを計画し、これらのマウスも樹立した。解析したところ、いずれの改変も肝臓におけるmRNAの発現レベルが低下することを見出した。このことは、従来の報告とは異なり、PGK-neoがかえって転写を促進したり、IRES配列が効果的でない場合のあることを示唆している。ヒト変異TTR遺伝子を導入したマウスを用いて、マイロイド沈着に及ぼす環境要因を解析した。そのため、SPF(Specific pathogen free)環境とコンベンショナル(CV)環境において、マウスを飼育した。CV環境では、アミロイドが沈着するが、SPF環境ではまったくアミロイドが沈着しないことを見出した。ついで、CV環境下にての飼育期間が長ければ、それだけアミロイド沈着が増加することを明らかにした。昨年度までに、可変型相同組換え法を用いて、第1段階でマウストランスサイレチン(mTtr)遺伝子を完全破壊し、第2段階でヒトTtr遺伝子を置換し、ヒトのTtrのみが発現するマウスの作製に成功している。これのマウス系統の交配により、mTtr遺伝子完全破壊マウス(-/-)、野生型ヒトTTR cDNA(Val30)を-つ持つマウス(+/Val30),変異TTRを-つ持つマウス(+/Met30)それぞれのホモマウス(Val30/Val30,Met30/Met30)とヘテロマウス(Va130/Met30)を樹立している。これらのマウスを用いて詳細な解析を行った。(+/Val30)と(Val30/Val30)における発現を比較したところ、肝臓でのVa130mRNAおよびVa130タンパクの発現は、Val30の遺伝子量に比例していたが、血清中のVal30を測定したところ、(Val30/Val30)のほうが、低いことが分かった。
食生活の西洋化は体内システイン量への影響を介して生体機能を左右するか？

本年度はマウス血清中の低分子システイン代謝物(以下Cys代謝物)を、平成29年度に本科学研究費で購入した電気化学検出器を組み入れた高速液体クロマトグラフィーにより定量することを目指した。電気化学検出器は、前処理としての化学修飾を施す必要なく還元性を根拠にCys代謝物を検出できるので簡便であり、ステップが少ない分、測定における正確性も期待できる。今回は生体内のCys代謝物としてシステイン・シスチン・ホモシステイン・ホモシスチン・グルタチオン・グルタチオンジスルフィド、および分析の内部標準物質としてN-アセチルシステインの計7種類のCys関連物質について分析を試みた。Cys代謝物中のフリーのSH基は、タンパク質中のSH基と結合していることが多いので、この結合を解離させる還元剤添加条件下での分析についても検討した。(結果)Cys関連物質それぞれの市販品(試薬)を分析したところ、すべて分析可能であった。続いて、それらすべてを混合して分析した結果、ほぼ重ならないピークとして検出できる条件を得た。検量線も、それぞれの物質について相関係数0.99以上のよい結果を得た。次に、還元剤tris-(2-carboxymethl) phosphine(TCEP)添加条件下について検討したが、TCEPが検出すべき物質と重なって溶出されてしまい、しかもその影響は非常に強く、現況では適用不可であると判断した。最後に、除タンパクした非還元マウス血清について分析したところ、未同定の物質が数多く検出され、かつ分析したいCys代謝物それぞれとピークの重なるものの多いことが判明した。(考察)電気化学分析器は、マウス血清中の各種低分子Cys代謝物の濃度測定には不適であると判断した。次善の策として、本研究においては蛍光測定法を適用し、低分子Cys代謝物の測定にあたるべきと判断するに至った。予定していた測定系の適用が不適であることが判明したため、測定サンプルを得るべきマウスの摂食実験を展開することが出来なかった。一方で、並行して準備を進めていたこれまでの科研費研究で得られた知見をまとめた論文、すなわちβ-カロテンとレチノールが産生酵素グルタミン酸システインリガーゼの発現誘導を介して細胞内グルタチオン量を亢進させるがレチノイン酸にはこの効果が無いことを示した論文を、英文学術誌にて発表することができたので、研究成果の国際的レベルでの公表の面では進捗があった。マウス血清中の各種低分子Cys代謝物濃度を測定するためのalternativeな手立てとして、高速液体クロマトグラフィーを用いた蛍光測定法を適用しての研究継続について検討する。これは従来法とでもいうべき方法で、参考にできる研究報告は多い。蛍光色素でCys代謝物を修飾するステップや、ジスルフィドを形成している化合物に対しては還元処理をした後に修飾する必要がある等、手順が増えることになるが、それらの前処理についても、報告例は多い。一方、分析対象の血清を採取するマウスの飼育であるが、過去にはマウスの餌についてアミノ酸・たんぱく質に関するものと脂肪添加量に関するものとで、分けて実験していたが、本年度はそれらを組み合わせた和食(高Cys比・低脂肪)と欧米化食(高Met比・高脂肪)との差を中心に検討したいと考えている。本年度は、マウスを用い、餌組成と給餌期間を変化させる実験を行った。餌組成における、たんぱく質(以下Pと略)量と体内でのシステイン(Cys)合成に必要なビタミンB6(V.B6)量、および含硫アミノ酸量に着目した実験<実験1>と、脂肪量に着目した実験<実験2>の二種類の実験を行った。実験1ではまず、P(今回の実験ではカゼイン)・V.B6それぞれの多寡の影響を検討した。次に、低P低V.B6下で、Cys添加とメチオニン(Met)添加とそれら無添加の3通りの場合を比較した。実験2では、Met添加の標準量P組成(20%)下で脂肪の多寡の影響を検討した。実験1・実験2ともに、主たる検討対象はCysを含む細胞内抗酸化物質として知られているグルタチオン(GSH)量とし、これを測定することで、餌組成が生体の抗酸化性に及ぼす影響を評価した。(結果)<実験1>マウスに13週間実験食を給餌して、影響を検討した結果、3週の脾臓の粗抗原提示細胞画分や腎細胞において、標準食群に対して、低P食群、低P低V.B6食群の順でGSH量が少なくなった。次に、低P低V.B6食へのCys添加またはMet添加および両アミノ酸無添加によるGSH量への効果について検討したところ、脾臓の粗抗原提示細胞画分ではGSH量に有意な差は無かったが、腎細胞においてはCys添加によるGSH量増加が検出され、Met添加では逆に減少した(両群間に有意差あり)。<実験2>マウスに、6・12・18週間実験食を給餌して影響を検討した。その結果、脾臓の粗抗原提示細胞画分および腎臓・脳・大腸ではGSH量に有意な差は無かった。一方で、肝臓のGSH量は12週目以降、高脂肪食により低い値となった。(考察)餌組成の影響により、マウス組織中GSH量に差が検出されたが、その影響は組織により異なることが明らかとなった。本年度の実験結果より、西洋化した食事条件によるGSH量への影響は、組織によりその差がある可能性が示された。また、ビタミンB6の有無がその影響を増幅する可能性がある。

さらに、脂肪添加の影響を得るためには、6週より長い期間の給餌期間が必要であることも明らかとなった。以上の知見が得られたことから、「おおむね順調」と判断した。本年度はマウス血清中の低分子システイン代謝物(以下Cys代謝物)を、平成29年度に本科学研究費で購入した電気化学検出器を組み入れた高速液体クロマトグラフィーにより定量することを目指した。電気化学検出器は、前処理としての化学修飾を施す必要なく還元性を根拠にCys代謝物を検出できるので簡便であり、ステップが少ない分、測定における正確性も期待できる。今回は生体内のCys代謝物としてシステイン・シスチン・ホモシステイン・ホモシスチン・グルタチオン・グルタチオンジスルフィド、および分析の内部標準物質としてN-アセチルシステインの計7種類のCys関連物質について分析を試みた。Cys代謝物中のフリーのSH基は、タンパク質中のSH基と結合していることが多いので、この結合を解離させる還元剤添加条件下での分析についても検討した。(結果)Cys関連物質それぞれの市販品(試薬)を分析したところ、すべて分析可能であった。続いて、それらすべてを混合して分析した結果、ほぼ重ならないピークとして検出できる条件を得た。検量線も、それぞれの物質について相関係数0.99以上のよい結果を得た。次に、還元剤tris-(2-carboxymethl) phosphine(TCEP)添加条件下について検討したが、TCEPが検出すべき物質と重なって溶出されてしまい、しかもその影響は非常に強く、現況では適用不可であると判断した。最後に、除タンパクした非還元マウス血清について分析したところ、未同定の物質が数多く検出され、かつ分析したいCys代謝物それぞれとピークの重なるものの多いことが判明した。(考察)電気化学分析器は、マウス血清中の各種低分子Cys代謝物の濃度測定には不適であると判断した。次善の策として、本研究においては蛍光測定法を適用し、低分子Cys代謝物の測定にあたるべきと判断するに至った。予定していた測定系の適用が不適であることが判明したため、測定サンプルを得るべきマウスの摂食実験を展開することが出来なかった。一方で、並行して準備を進めていたこれまでの科研費研究で得られた知見をまとめた論文、すなわちβ-カロテンとレチノールが産生酵素グルタミン酸システインリガーゼの発現誘導を介して細胞内グルタチオン量を亢進させるがレチノイン酸にはこの効果が無いことを示した論文を、英文学術誌にて発表することができたので、研究成果の国際的レベルでの公表の面では進捗があった。研究実績の概要で述べたように、GSH量への影響が観察された組織もあったが、一方で、予想に反してGSH量への影響が観察されない組織が多かったことは、それらの組織の細胞内におけるGSH量のホメオスタシスがかなり強力である可能性を示しており、そうであるとするならば、むしろGSH以外のCys含有分子への影響を検討した方が、差が大きく検出されるかもしれない。このため、本年度研究費で購入した電気化学検出器を用いた血液中の低分子Cys化合物(システインやシスチンあるいはホモシステインやホモシスチン)の定量や、細胞抽出液中のチオール酵素の酵素活性等の測定により、検討したいと考えている。
機能的MRIを用いた認知行動課題による過食抑制効果の神経メカニズムの解明

近年、摂食制御の神経回路異常の正常化を目的とした新たな肥満治療法として、過食抑制効果のある認知行動課題が注目されている。しかし、脳画像研究はあまり行われておらず、この認知行動課題による過食抑制効果の神経学的メカニズムはほとんど明らかになっていない。また、追跡調査はほとんどされておらず、この課題の長期的な過食抑制効果はよくわかっていない。そこで、本研究では、過食抑制効果のある認知行動課題を用いた介入実験を行い、機能的MRIにより、この課題による過食抑制効果の神経学的メカニズムを明らかにし、課題実施1年後の過食抑制効果を追跡調査する。
MRIによる肝の繊維化の評価

本研究は拡散強調画像を用いたラット肝の線維化の評価であるが、平成13年度は撮影法の最適化と正常ラットの撮影を行い、平成14年度は平成13年度の結果に基づきラットの硬変肝の作成及び撮影評価を目標とした。撮影は臨床で用いられているEPI法は消化管に近接する肝臓の撮影には画像の歪みが大きく適していないためスピンエコー法を用いた。Wistar ratを用い、肝硬変モデルの作成を行った。14例で肝硬変モデルを作成し、人体に則して犬山分類を用いF1-4(F0:線維化無し、F1:門脈域の線維性拡大、F2:線維性の架橋形成、F3:小葉の歪みを伴う繊維性架橋形成、F4:肝硬変)に分類した。14例でモデルの作成が可能でF0 2例、F1 2例、F2 2例、F3 2例、F4 6例であった。6方向のそれぞれ異なる傾斜磁場によりテンソル画像が作成可能であり、FA値の測定が可能であった。その他、前年のとおりADC値、TRACE値も算出可能であった。これらはBasserらのA Simplified Method to Measure the Diffusion Tensor fromSeven MI Images (MRM39:928)を参考にして求めた。ADC値、TRACE値、FA値の平均はF0が2.08E-04、6.93E-05、4.86E-01、F1が2.35E-04、7.84E-05、5.76E-01、F2が3.21E-04、1.07E-04、5.99E-01、F3が2.49E-04、8.29E-05、6.81E-01、F4が2.78E-04、9.26E-05、6.77E-01で、F0からF4にかけていずれも値が増大する傾向がみられた。統計的有意差については例数が少ないため得られていない。今後は例数を増やして検討を行い、さらに症例の検体による検討も行いたい。今後、パルスシーケンスの検討でin vivoの測定が可能になれば非侵襲的に肝硬変の線維化の程度が測定可能であると思われる。本研究は拡散強調画像を用いたラット肝の線維化の評価であるが、平成13年度は撮影に用いるパルスシーケンスの最適化と正常ラットの撮影を行った.撮影パルスシーケンスの最適化はファントームを用い、パラメーター値の検討を行った.頭部と異なり腹部の撮影は動きによる影響が大きく、また消化管ガスによる磁化率アーチファクトがMRI画像に大きく影響する.このため、麻酔下の正常ラットを撮影し、こののち動きがない状態としてこれから摘出した肝臓を撮影して、動きおよび空気による影響による値への影響を検討した.方法ハロセン、笑気、酸素により人工呼吸を導入後、MPGパルスを印加した撮影を行った.MPGパルスのb値は約1000とし、6方向に印加し撮影を行った.MPGパルスを印加した画像と印加していない画像にそれぞれ関心領域を設定してTRACE値を求めた.引き続き、ラットより肝臓を摘出し、上記と同様に撮影を行いTRACE値を求めた.結果麻酔下のラット肝のTRACE値は平均0.0002、摘出肝は0.0003であった.摘出肝に対して麻酔下のラットのTRACE値には誤差がみられた.値は頭部領域に比較して低い値であった.平成14年度には実際に繊維肝を作成して撮影を行うが、この値との比較によっては麻酔下の撮影によるデータは使用できない可能性があり、この場合は摘出肝で比較を行うようにする必要があると考えられる.実際のテンソル値を示すFA値はTARCE値より求められるが、平成14年度にこれを行う.本研究は拡散強調画像を用いたラット肝の線維化の評価であるが、平成13年度は撮影法の最適化と正常ラットの撮影を行い、平成14年度は平成13年度の結果に基づきラットの硬変肝の作成及び撮影評価を目標とした。

ADC値、TRACE値、FA値の平均はF0が2.08E-04、6.93E-05、4.86E-01、F1が2.35E-04、7.84E-05、5.76E-01、F2が3.21E-04、1.07E-04、5.99E-01、F3が2.49E-04、8.29E-05、6.81E-01、F4が2.78E-04、9.26E-05、6.77E-01で、F0からF4にかけていずれも値が増大する傾向がみられた。統計的有意差については例数が少ないため得られていない。今後は例数を増やして検討を行い、さらに症例の検体による検討も行いたい。今後、パルスシーケンスの検討でin vivoの測定が可能になれば非侵襲的に肝硬変の線維化の程度が測定可能であると思われる。
幼児の対人情報処理と自己統制の発達(仲間との葛藤場面における意図の認知と調整)

幼児の仲間との葛藤場面では、自己と仲間の意図の対立を調整する自己統制の働きが予想される。Rubinらの対人情報処理モデルによれば、仲間の意図の認知は社会的問題解決過程の一つの要因である。そこで本研究では幼児の仲間との葛藤場面における社会的問題解決パターンを分析し、仲間の意図情報の認知と解決パターンとの関係、及びその発達的変化について検討した。幼児が集団保育場面で日常的に経験する仲間との葛藤場面について保母に聞き取り収集を行い、4種の葛藤場面(物語1:おうちごっこの仲間入り、物語2:ブランコ交代、物語3:バケツを借りる、物語4:鬼ごっこ)を設定した。4、5、6歳児に、自己と仲間を主人公にした上述の4種の社会的葛藤を示す語を2コマの線画を用いて聞かせ、それに続く解決部分を自由に話させた。次に仲間の意図情報を与え、同様に解決部分を作話させた。子どもの反応はVTR記録され、反応パターンが分析された。ブランコ交代を拒否された場合、始めの自己の意図を実現するために仲間を説得したり、仲間の意図を取り入れた解決案を提案する解決パターンを示す者は、意図情報付加前には年長児に多い。しかしこの解決パターンは仲間の意図情報を与えることにより各年齢で増加する。また鬼ごっこでタッチされて自分が転んだ場合、鬼ごっこを継続する解決パターンを取る者は年長になるにつれて多くなるが、仲間の意図情報を与えることにより年少児でも増加する。これらの結果は、幼児の仲間との社会的問題解決過程で仲間や自己の意図の認知が一つの要因として働くことを示している。従って、これらの結果はRubinらの対人情報処理モデルを支持すると言えよう。
社会福祉制度を利用した「学びの場」の存在理由と学習実践に関するミクロ分析的研究

知的障害児の後期中等教育卒業後の第三の選択肢として、就労支援施設などの福祉事業所でもなく、一般企業への就職でもない、福祉制度を利用した「学びの場」を構築しようとする動きが全国に広まっている。そこで本研究では、「学びの場」が要請されることとなった経緯を考察したのちに、「学びの場」における英会話・国語・数学などの一般教養や、運動や調理や美術などの実技修得場面へ参与観察することで、「学びの場」が障害者福祉の場でどのように実践されているかを記述する。とりわけ知的・発達障害者に対して教示可能な水準を模索するため、教示実践方法を分析し、障害者に最適化された学習実践に必要とされる方法論の提示を目的とする。
外国人日本語学習者に対する日本語の韻律の指導法の研究と教材開発

本研究は、(1)日本語教育の初級文型と表現意図のおおよそ全てを取上げ、それらの音声的・韻律的特徴を明らかにする。(2)それらの特徴を分かりやすく学習者に提示するための方法を探る。(3)初級の基本文型と表現意図からなる会話をもとに、音声・韻律指導のための教材を作成する。(4)上記教材をクラスにおいて、大方の日本語教師が効果的に使えるように指導マニュアルを作成する。ということを目的に、平成5年度から2年計画で始められた。初年度の平成5年度は、上記(1)、(2)を実施する計画であった。そのために必要な音声分析装置を8月には稼働できるようにと準備を進めてきたが、メーカーにおける品不足等から一部の機器の納入が大幅に遅れるなどしたために、当初の予定通りには研究を進展させられなかった。現在、(1)に関わる作業を昨年末以来行っている。したがって新たな知見を含む具体的な成果はいまだ得られていないというのが実情であるが、今後鋭意所期の目的に沿って研究を継続して行く予定である。なお、以下は本研究の協力者によって行われた、本研究に関連する成果の一部である。木下直子「日本語音声のリズムと日本語教育に関する一考察」東海大学大学院日本文学研究科日本語教育学コース1993年度修士論文北村よう(東海大学留学生教育センター講師)「中国語話者に対する発音指導」東海大学留学生教育センター言語・文化・教育研究会(口頭発表)本研究は、(1)日本語教育の初級文型と表現意図のおおよそ全てを取上げ、それらの音声的・韻律的特徴を明らかにする。木下直子「日本語音声のリズムと日本語教育に関する一考察」東海大学大学院日本文学研究科日本語教育学コース1993年度修士論文北村よう(東海大学留学生教育センター講師)「中国語話者に対する発音指導」東海大学留学生教育センター言語・文化・教育研究会(口頭発表)
NMRの圧力限界更新

我々は超高圧その場での1H(水素)の高分解能NMR測定の圧力記録を更新しつづけている。これまでの実績よりも,さらに高圧力でのNMR測定を実現することで,地球惑星物質中の水素のダイナミクスに関する現象を新たに発見することが本研究の目的である。そこで圧力5GPa以上において,信号強度の減少や,穿孔したダイヤモンドアンビルの強度の減少を補う新しい測定技術の開発を試みた。そのテストケースとして地球内部における代表的な含水鉱物の一つである、ブルーサイト・Mg(OH)2の1Hの高圧その場NMR測定を実現した。MS(OH)2は水素結合の状態変化が起こる圧力が比較的低いことが予測されており、また含水鉱物の中では水素濃度が最も高い。このような測定上の利点があるので、比較的容易にNMR分光が実現されると考え、含水鉱物としては最初の試料として挑戦した。これまでに取得に成功した、その粉末多結晶試料の6GPaまでのstatic 1H-NMRスペクトルでは、主ピークの半値幅が常圧よりもわずかに増加した。理論計算によると、Mg(OH)2の水素配置は、圧力と共に(1) nearly ordered、(2) dynamic disorder、(3) static disorderの順に変化する。このうち(2)の段階での水素の移動開始に伴う線幅の減少の観測を試みたが、測定圧力がまだ相転移には不十分であることがわかった。圧力により水素の移動が誘起されるこのような現象は、含水鉱物の構造相転移と水素輸送の理解にとって本質的である。これまでの我々の実績よりも,さらに高圧力でのNMR測定を実現することで,地球惑星物質中の水素のダイナミクスに関する現象を新たに発見することが本研究の目的である。具体的には圧力5GPa以上において,信号強度の減少や,穿孔したダイヤモンドアンビルの強度の減少を補う形での新しい測定を行うことが課題である。そのテストケースとして,今年度はプルーサイト・Mg(OH)2の1Hの高分解能NMR測定を行った。この物質を選んだ理由は以下の通りである:(1)硬い固体であって非金属のガスケットによる封入が有効なので信号強度の増加が期待できる。(2)水素結合対称化の圧力が比較的低いために,水素まわりの局所環境の状態変化に関連する相転移現象が予測されている。(3)1H間の双極子相互作用が比較的小さく,スペクトル幅があまり大きくならない。つまり我々がこれまで主として測定してきた氷関連物質と比較して,試料封入,測定,および結果の解析のいずれもがより容易に行えると判断された。この物質に対して繰り返し行った測定試験の結果,今年度は圧力約7GPaまでの測定を行うことができた。キュレット径を比較的大きく0.6mm程度に取ることで、試料容積の減少を最小限度に抑え、1H濃度が低い問題を補償した。この状態の試料圧縮するために必要な荷重は,これまでに開発した非磁性DACの能力の範囲内で問題なく発生することができた。なお測定の補助のために,励起パルスとプリアンプを能動的に切り替える高周波スイッチを製作して応用した。
長期経過した分譲集合住宅団地における居住者の住まい方変化と高齢者対策地域に永く住み続けるための住まいの条件と利用に関する研究

初期の分譲集合住宅団地では、増加しつつある高齢者が永く安心して住み続けられるためのストック改善と管理の対策が早急に必要となってきた。従って本研究は長期経過した分譲集合住宅における住まい方の変化と個人努力や管理組合による改善や工夫等を分析し、対策に資する資料を得ることを目的とした。平成8年度は居住者対象のアンケート調査と高齢者対策を実施した管理組合へのヒヤリングを行った。居住者を対象に行ったアンケート調査は、(1)団地内・近隣住替えの実態、(2)複数住宅所有と使用変化の実態、(3)親子同居・近居形成・分解の実態、(4)住戸内改善の実態、(5)近隣関係の実態等である。当然ながらこれらは一定程度の期間を経た分譲集合住宅地で見られるものであり、これらを左右する条件として、立地環境、価格、団地戸数規模、団地内の住宅型種類と配分、管理形態、維持保全状況等が上げられた。これら条件を勘案し、調査対象団地は前年度行った4団地(昭和40年代初期分譲団地、東京高島平、横浜ガ-デン山、千葉高洲、花見川団地)を踏まえ、同じく40年代に分譲した2団地(東京亀戸、千葉稲毛ファミール)を選定した。有効回収アンケート票数は合計956票で6団地合計で2539票となった。主な調査結果は以下の通りである。(1)郊外団地、都内団地いずれも最近入居者の所得低下・小規模世帯化が見られるが、特に郊外団地で著しく現れている。(2)近隣住み替え者と遠方からの転入者を比較すると、前者の方が後者より高齢者で通院率が低く、また世帯主・配偶者とも友人が多い。所得は都内では配偶者の常勤率が近隣住み替え者の方が高く従って世帯収入も多くなるが、郊外では近隣・遠方転入者も無職またはパートが多いため、前住地による差はない。(3)複数住宅使用世帯比率は、少数住宅型計画団地で多く、多数住宅型計画団地では少なかった。これは複数住宅型計画団地では内部住み替えが容易なためであった。(4)住宅内リフォーム実施額は世帯収入、世帯主・配偶者の友人数、中古価格、管理組合役員経験有無、住宅面積等と関連が深かった。初期の分譲集合住宅団地では、増加しつつある高齢者が永く安心して住み続けられるためのストック改善の管理の対策が早急に必要となってきた。平成7年度は居住者対象のアンケート調査と高齢者対策を実施した管理組合へのヒヤリングを行った。これら条件を勘案し、調査対象団地を昭和40年代初期分譲団地から4団地(東京高島平、横浜ガ-デン山、千葉高洲、花見川団地)選定した。有効回収アンケート票数は合計1637票であった。(1)親族近居(徒歩15分以内)はどの団地でも多く、ほぼ1/4の世帯が該当した。これらは郊外3団地では子供世帯の結婚独立、親の引き寄せによって分譲団地内に多く生じたが、高島平では、子供世帯のUターン、兄弟等の引き寄せ生じた場合が多い。(2)複数住宅使用世帯はガ-デン山の12.5%の世帯が該当し、他の3団地はこれを下回った。複数使用世帯が多く見られる団地は狭小住宅が多い場合で、大規模住宅型があってもそれが少戸数の場合であった。様々な規模の住宅型が混合する高島平では住宅の狭さを地域内住み替えで解消する傾向が強く、これらの住宅型配分は親族近居形態にも影響した。(3)地域内住み替え者は比較的世帯収入が高いが、これは地域内住み替えで配偶者の常勤勤務を保障した結果である。さらに地域内住み替え者は地域に友人が多く、管理組合役員を引き受けることの抵抗感も小さい。居住期間が短い範囲内では、遠方から転入した者より、地域内住み替え者の方が通院世帯が少なかった。(4)通院に関する中高層建物比較では、高層居住者の方が格段に通院率が高く、特に60才を越えた男性では中層、高層居住の差が著しかった。

当然ながらこれらは一定程度の期間を経た分譲集合住宅地で見られるものであり、これらを左右する条件として、立地環境、価格、団地戸数規模、団地内の住宅型種類と配分、管理形態、維持保全状況等が上げられた。これら条件を勘案し、調査対象団地は前年度行った4団地(昭和40年代初期分譲団地、東京高島平、横浜ガ-デン山、千葉高洲、花見川団地)を踏まえ、同じく40年代に分譲した2団地(東京亀戸、千葉稲毛ファミール)を選定した。有効回収アンケート票数は合計956票で6団地合計で2539票となった。主な調査結果は以下の通りである。(1)郊外団地、都内団地いずれも最近入居者の所得低下・小規模世帯化が見られるが、特に郊外団地で著しく現れている。(2)近隣住み替え者と遠方からの転入者を比較すると、前者の方が後者より高齢者で通院率が低く、また世帯主・配偶者とも友人が多い。所得は都内では配偶者の常勤率が近隣住み替え者の方が高く従って世帯収入も多くなるが、郊外では近隣・遠方転入者も無職またはパートが多いため、前住地による差はない。(3)複数住宅使用世帯比率は、少数住宅型計画団地で多く、多数住宅型計画団地では少なかった。これは複数住宅型計画団地では内部住み替えが容易なためであった。(4)住宅内リフォーム実施額は世帯収入、世帯主・配偶者の友人数、中古価格、管理組合役員経験有無、住宅面積等と関連が深かった。
近世中期における出版文化の一断面 -『六諭衍義大意』の刊行をめぐって-

本年度の研究は、近世中期の徳川吉宗の時代に社会教化のうえで大きな意味をもったと考えられる『六諭衍義大意』の刊行事業に焦点をあて、その成立過程、流布状況および利用の実態について検証し、近世から近代に至るわが国の社会教化政策の実態を明らかにしようとする目的ですすめられているものである。この目的のもとに本年度は、まず『六諭衍義大意』刊行の契機となった中国の『六諭』の存在と琉球人程順則による『六諭衍義』の刊行の経緯を中国および琉球関係史料の調査をおこない、徳川吉宗による教化本として導入されるまでの状況を跡付けた。このなかで、当時の中国、琉球および日本をとりまく外交関係に儒教思想とそれを伝達する出版という媒体の存在が大きな意味をもって存在したことが浮かびあがってきた。ただ、本年度の階段では中国の状況に関する十分な把握には至ってはいない。よってその面に関しては今後の研究計画の一つとなろう。また、琉球での『六諭衍義』の社会教化への実態が、薩摩藩を通じて徳川吉宗による江戸幕府の社会教化策に影響を与え『六諭衍義大意』や類書の教化本の刊行がかなりの範囲で行なわれたことも明らかになった。なお、その内容を含む詳細な検討は今後の研究計画の一つでもある。今後は、上に記した課題の他に近世中期の『六諭衍義大意』による社会教化の流れがその後近代に至るまで引き継がれ、わが国の教育に与えた影響について考察する。
癌細胞における転写因子NF-kappaBの恒常的活性化とその標的遺伝子の機能解析

NFkappaBの活性化は正常細胞では厳密に制御されているが、癌細胞では恒常的に活性化され標的遺伝子の発現を介して増殖や転移・浸潤などを促進する。確かにNFkappaB阻害剤は細胞増殖を抑制するが、未だに臨床で使えるものはない。NFkappaBが炎症や免疫などの広範な機能をもつことを考えれば、NFkappaBそのものではなく、NFkappaBの恒常的活性化を誘導するタンパク質のほうがより癌細胞特異的な治療標的となる可能性がある。前年度、我々は35種のヒト乳癌細胞株の遺伝子発現プロファイルとNFkappaB活性のデータベースを作成した。本年度は、これらを比較することによって、NFkappaBが活性化した乳癌細胞株は、乳腺のstem/progenitor細胞のマーカーであるCD61,CD29を高く発現していることを見出した。一方、これらの細胞株では分化した乳腺細胞のマーカーであるGATA3,FoxA1,CD10の発現は低いことが分かった。次に、NFkBの活性化に必要なリン酸化酵素IKKの構成因子であるIKKalphaのRNAiを行うと、ほとんどのNFkappaB活性化乳癌細胞株の増殖が顕著に抑制されることを明らかにした。以上の結果から、NFkappaBは、乳腺のstem/progenitor細胞由来の癌細胞にてIKKalphaを介して恒常的に活性化し、細胞増殖に重要な役割を果たしていることが示唆された。さらに、本結果はIKKalphaがstem/progenitor細胞様の乳癌細胞に対する治療標的になることも示唆している。NFκBは、癌・骨・免疫などの様々な生命現象で細胞外のシグナルに応答して活性化する転写因子である。正常細胞では、NFκBは抑制因子である1κBと結合することにより細胞質で不活化されている。サイトカインの刺激等が入ると、一連のシグナル伝達系が作動してIκBキナーゼ(IKK)が活性化し、IκBをリン酸化してプロテアソームでの分解に導く。IκBの分解によりNFκBは核移行し、標的遺伝子の発現を誘導する。このように正常細胞ではNFκBの活性化と遺伝子発現制御は厳密に制御されているが、癌細胞ではNFκBが恒常的に活性化されることにより、癌の悪性化に寄与すると考えられている。しかし、恒常的な活性化が生じる分子機構は十分に解析されていないし、これによって異常に発現する標的遺伝子の体系的な解析も行われていない。NFκBの阻害剤で治療に利用できるものはまだ開発されていないことから、NFκBによって誘導され癌の悪性形質に関わる遺伝子を特定し、その機能を人為的に活性制御できるモノクローナル抗体や低分子化合物を開発することができれば、癌に対する有望な治療薬となる。我々は、乳癌細胞におけるNFκBの標的遺伝子を同定するために、NFκBが恒常的に活性化した2種類の乳癌細胞株について、IκBsr(分解されないIκB)を安定的に発現しNFκBが抑制されたクローンを5つずつ作製した。コントロール用に、空ベクターを導入したクローンも5つずつ作製した。次に、マイクロアレイを用いて各クローンの遺伝子発現プロファイルを作成し、IκBsr発現クローンにて特異的に発現が低下した遺伝子をNFκBの標的遺伝子候補として同定した。現在、RNAiを用いて各遺伝子の機能を解析している。また、NFκBの恒常的活性化機構を明らかにするために、NFκB活性化に関わる各種のシグナル伝達因子について、RNAiを行っている。
高選択・高感度分子センシングのための多孔性・導電性配位高分子ナノシートの開発

本研究では、細孔への分子吸着により電子状態が段階的・可逆的に変化する多孔性ナノシートを開発する。このようなナノシートにおいては、サイズの定まった細孔がガス・生体分子やイオンなどを認識し、逐次段階的に電子状態が変化する。そのため、電気伝導性やスピン物性を評価することにより、存在する分子の種類・量を精密に把握でき、高選択性・高感度極薄センサデバイスとしての利用が期待される。当該年度は、以下に関して実施した。(1)ナノシートの形成状態に影響を与える条件因子の抽出:放射光施設SPring-8(兵庫)の研究者と協力して、気液界面その場X線回折(XRD)測定システムの立ち上げを行い、気液界面にてナノシートのXRDプロファイルが得られることを確認した。さらに、回折ピークの精度向上に向け、実験条件の最適化を行った。(2)溶液濃度とナノシート構造の相関解明:気液界面におけるナノシート作製において、構成要素となる有機配位子の溶液濃度が構造に及ぼす影響を調べた。その結果、ある濃度を境に、異なる結晶構造を有するナノシートが得られることがわかった。(3)気相への溶媒蒸気導入:通常のナノシート作製においては、気相は大気であるが、気相がナノシートの構造やモルフォロジーに与える影響を調べるため、気相に有機溶媒蒸気を導入した。その結果、ナノシートのサイズが大きく変化し、結晶性が向上した。(4)固体基板へ転写後の構造の評価:シリコン基板に転写後のナノシートの構造評価を、XRD測定にて行った。その結果、気液界面上の構造を保持した状態で基板に転写されていることを確認した。(5)安定性(耐熱性、耐水性)の評価:固体基板上に転写したナノシートの耐熱性評価の結果、150°Cまで構造を保持することがわかった。また、耐水性評価の結果、純水中ではナノシートが溶出し、酸性溶液中では、構造が保持されることが明らかとなった。当初の計画通り、ナノシートの作製手法に関する基礎的知見を得るための3つの項目「(1)ナノシートの形成状態に影響を与える条件因子の抽出」「(2)溶液濃度とナノシート構造の相関解明」「(3)気相への溶媒蒸気導入」と、ナノシートの機能開拓に向けた2つの項目「(4)固体基板へ転写後の構造の評価」「(5)安定性(耐熱性、耐水性)の評価」に関して進めることができた。「(1)ナノシートの形成状態に影響を与える条件因子の抽出」を遂行するためには、放射光実験施設の利用が必須だが、SPring-8への利用申請が全て採択され、順調に実験を進めることができた。今後は、材料基礎特性評価に向け、以下の3つの項目を進めていく。(1)ナノシートの分子吸着特性の評価(2)ナノシートの機械的特性の評価(3)ナノシートの電気的特性の評価本研究では、細孔への分子吸着により電子状態が段階的・可逆的に変化する多孔性ナノシートを開発する。本研究期間内においては、有機分子由来の構造設計性と遷移金属由来の電子状態の多様性を併せ持つ配位高分子に着目し、規則細孔と電荷移動パスを合わせ持つナノシートを構築する。トリフェニルベンゼン誘導体分子を用いて結晶性ナノシート(NS)を作成することに成功した。作製条件(溶媒、濃度)の異なる3種類のNS(NS1, NS2, NS3)に関して、放射光X線をX線回折測定(XRD)を行った。全ての試料において、鋭いピークが得られていることから、結晶性を有することが確認された。一方で、in-plane XRDとout-of-plane XRDのプロファイルは全く異なり、共通のピークが見られないことから、NSは完全配向(液面に対して垂直方向をc軸とすると、c軸配向)していることがわかった。3つの試料に関して、ピークの数及び位置は一致していることから、結晶中の分子配列は同じであると考えられるが、ピークの線幅には違いが見られ、気液界面における作製条件がNSの結晶性やドメインサイズに影響を与えることが示唆された。NSの加熱に伴うin-planeGIXRDプロファイルの変化を調べた。200°Cまでは室温と同様のXRDをプロファイルを示していることから、この温度まで結晶性が保たれることが明らかになった。また、50°Cにおいては、室温よりもピーク強度が大きくなっており、低温における加熱が結晶性の向上への効果があることが示唆された。実験計画通り、気液界面における錯形成反応を用いて、規則細孔を有する結晶性のナノシートを得ることができた。本研究期間内においては、有機分子由来の構造設計性と遷移金属由来の電子状態の多様性を併せ持つ

配位高分子に着目し、規則細孔と電荷移動パスを合わせ持つナノシートを構築する。電荷移動パスの形成には分子の軌道の重なりを多くする必要があるが、細孔を設けるためには分子を疎に配置させなければならない。これらの相反する条件がバランス良く満たされるようナノシートを構築していくところが本研究の斬新且つチャレンジ性を有する点である。当該年度は、以下に関して実施した。(1)参照バルク結晶の合成、構造解析、電気的特性評価:候補とする分子が目的とするナノシートを形成するかの予備判断として、同じ構成要素を用いてバルク結晶を合成し構造を調べた。バルク結晶は水熱合成法、再結晶法、溶液拡散法を用いて行った。ナノテクプラットフォーム事業の利用により、バルク結晶の元素分析を実施し、目的とする結晶が作製できていることを確認した。(2)ナノシートの形成状態に影響を与える条件因子の抽出:気液界面でのナノシート形成時に可変なパラメーターである溶液濃度、温度、pH、分子展開量、分子展開後の待ち時間、表面圧縮度合(表面圧)を系統的に変化させ、これらがナノシートの形成状態、特にシートサイズと膜厚に与える影響を明らかにした。当初の計画通り、主にナノシートの作製手法に関する基礎的知見を得るための上述の2つの項目に関して進めることができた。本研究では、細孔への分子吸着により電子状態が段階的・可逆的に変化する多孔性ナノシートを開発する。このようなナノシートにおいては、サイズの定まった細孔がガス・生体分子やイオンなどを認識し、逐次段階的に電子状態が変化する。そのため、電気伝導性やスピン物性を評価することにより、存在する分子の種類・量を精密に把握でき、高選択性・高感度極薄センサデバイスとしての利用が期待される。(1)ナノシートの形成状態に影響を与える条件因子の抽出:放射光施設SPring-8(兵庫)の研究者と協力して、気液界面その場X線回折(XRD)測定システムの立ち上げを行い、気液界面にてナノシートのXRDプロファイルが得られることを確認した。さらに、回折ピークの精度向上に向け、実験条件の最適化を行った。(2)溶液濃度とナノシート構造の相関解明:気液界面におけるナノシート作製において、構成要素となる有機配位子の溶液濃度が構造に及ぼす影響を調べた。その結果、ある濃度を境に、異なる結晶構造を有するナノシートが得られることがわかった。(3)気相への溶媒蒸気導入:通常のナノシート作製においては、気相は大気であるが、気相がナノシートの構造やモルフォロジーに与える影響を調べるため、気相に有機溶媒蒸気を導入した。その結果、ナノシートのサイズが大きく変化し、結晶性が向上した。(4)固体基板へ転写後の構造の評価:シリコン基板に転写後のナノシートの構造評価を、XRD測定にて行った。その結果、気液界面上の構造を保持した状態で基板に転写されていることを確認した。(5)安定性(耐熱性、耐水性)の評価:固体基板上に転写したナノシートの耐熱性評価の結果、150°Cまで構造を保持することがわかった。また、耐水性評価の結果、純水中ではナノシートが溶出し、酸性溶液中では、構造が保持されることが明らかとなった。当初の計画通り、ナノシートの作製手法に関する基礎的知見を得るための3つの項目
医学論文データベースからの知識ネットワーク抽出に関する研究

本研究では、論文情報のオンラインデータ化や公開アクセスが十分行われていない分野の一つである医学論文を対象に、データからの情報抽出、抽出された要素関係の分析を行なう手法の開発を行った。開発した技術が、今後実用化されると、分野の専門家でなくてもあるトピックにおける関連研究者は誰であるのかを簡単に調査できたり、重要論文を見つけられたりといった学術に関わる調査をサポートすることがより容易なることが期待される。WWW(Web)の普及により,様々なデータが電子化され公開されることにより誰にでもアクセス可能な状況になってきている.そのような流れの一つとして,学術論文に開する情報のデジタルオンライン化が進められている.特に,コンピュータサイエンスの世界では,そのようなデジタル化が精力的に行われ情報が公開されており,研究者間や会議間の関係抽出,また研究トピック抽出の研究が国内外を問わず活発に行われている.データがデジタル化され簡易アクセスが可能になれば,重要研究者,会議,トピックの抽出といった情報処理が実現可能であり,新しい事実発見に寄与でき,また学術知識の効率的な共有が可能になる.本年度は,主にWebを利用して,論文等から研究者名や会議名を抽出し,データベース化を行った.また,抽出されたデータを用いてそれらの関係を明らかにすることにより,関係が織り成す構造を通じて,データの価値を浮かび上がらせることが可能になる.関係を用いてそのような分析を可能にするアルゴリズムの開発を行った.さらに,ユーザが構築された関係から抽出される知識が妥当であるかどうかの判断を助けるためにインタラクティブ性,ユーザエクスペリエンスの商い視覚化をシステムが行う必要がある.そのような視覚化の一つのアルゴリズムとして,グラフの色付け手法を用いる手法の開発を行った.この成果は,電子情報通信学会の論文誌に掲載された.ウェブの普及により、様々なデータが電子化され公開されることにより誰にでもアクセス可能な状況になってきている。そのような流れの一つとして、学術論文に関する情報のデジタルオンライン化が進められている。特に、コンピュータサイエンスの世界では、そのようなデジタル化が精力的に行われ情報が公開されてきており、研究者間や会議間の関係抽出、また研究トピック抽出の研究が国内外を問わず活発に行われている。一方、そのような論文情報のオンラインデータ化や公開アクセスが十分行われていない分野の一つに医学論文が挙げられる。学術情報からの情報抽出、抽出された要素関係の分析は、コンピュータサイエンスの論文文献データにおいて盛んに扱われているが、本研究の対象とする医学論文データはその性質が細分化・専門化されているという点にて大きく異なる。本研究では、このようなデータからの固有表現の抽出とそれらの間の関係抽出の新しい手法の開発、および、抽出された情報を可視化する技術の開発を行った。開発した技術を応用することにより、分野の専門家でなくてもあるトピックにおける関連研究者は誰であるのかを簡単に調査できたり、重要論文を見つけられたりといった学術に関わる調査をサポートすることがより容易になる。
インポーティンベータ依存的核-細胞質間物質輸送の新規メカニズムの解明

本研究では、インポーティンベータの核膜孔複合体通過機構に対し、Ranや新たに同定したIBBP1がどのような役割を果たしているか解明することを目的としている。本年度は、当初の研究計画に従い、核膜孔を通過するインポーティンβのin vivo一分子観察、について研究を進めた。invivoでのインポーティンβの核内・核外移行の動態を解析するために、GFPタグ付きインポーティンベータを発現したHeLa生細胞の核全体にレーザーを照射し、消光されなかったインポーティンベータが核内へ輸送される様子を蛍光顕微鏡で経時観察した。インポーティンβの核内への蓄積のキネティクスは指数関数によくフィットするものであり、微分方程式を元にした数学的解析から核内・核外移行の速度定数をそれぞれ求めることに成功した。これらの解析手法により、IBBP1やRan、輸送基質がインポーティンベータの核内・核外移行へ及ぼす影響の定量的な解析が可能となった。また、昨年度から引き続きマイクロガラスピペットを用いた核膜孔一分子輸送解析系の開発も行った。原子間力顕微鏡により、HeLa細胞の核膜孔の密度と、隣り合う核膜孔間の距離を測定し、核膜孔一分子のみをとらえることができるガラスピペットの先端径を算出した後、プラーを用いて目的の先端径(300ナノメートル)のガラスピペットを作成する技術を獲得した。作成したガラスピペットにGFPタグ付きインポーティンベータを充填させ、基板上に露出させた核の上に静置したところ、インポーティンベータがピペット内の核膜孔を通過し核内へ輸送される様子が観察された。これにより、インポーティンベータの核内・核外移行の動態と、それに対してIBBP1やRanが及ぼす影響を、核膜孔一分子レベルで解析することが可能となった。まず、インポーティンベータと核膜孔複合体の相互作用と、その相互作用に対するRanの影響を明らかにするために、これまでに確立した原子間力顕微鏡を用いた一分子力測定系を用いて、インポーティンベータと核膜孔複合体構成因子(FGヌクレオポリン)の間の相互作用を一分子レベルで解析した。インポーティンベータの点突然変異体を用いた解析により、インポーティンベータの4つの結合ポケットは異なるFGヌクレオポリンに対してそれぞれ異なる結合特性を持つこと、また各ポケットはGTP結合型のRanにより異なる影響を受けることを明らかにした。この成果は核膜孔を介した物質輸送の方向性のメカニズムの解明に大きく寄与するものであり、本成果を学会誌、国際学会において発表した。次に、IBBP1がインポーティンベータと核膜孔複合体の相互作用に与える影響を調べた。ジギトニンで細胞膜および細胞質を取り除いたHeLa細胞に一定濃度のインポーティンベータと異なる濃度のIBBP1を加えたところ、IBBP1はインポーティセベータの核膜孔複合体への結合を濃度比が10:1のときまでは促進し、濃度比がそれ以上になると阻害した。この結果は、IBBP1がインポーティンベータの核-細胞質間輸送に重要な役割を果たしていることを示唆するものである。最後に、核膜孔複合体を通過するインポーティンベータ1分子の動態を可視化するシステムの確立に向け、量子ドット(Q-dot)の大きさや濃度の条件検討や、励起光の強さや画像取得の設定の調節を行った。また予備実験として、GFPタグ付きインポーティンベータをHeLa細胞で発現させ、蛍光消光回復法(FRAP)を用いてin vivoにおけるインポーティンベータの核膜孔通過の速度や細胞質・核膜・核質における拡散速度を測定した。本研究では、インポーティンベータの核膜孔複合体通過機構に対し、核一細胞質間輸送の制御因子であるRanと、インポーティンベータと相互作用する分子として新たに同定したIBBP1がどのような役割を果たしているか解明することを目的としている。本年度は、当初の研究計画に従い、1.in vitroにおけるインポーティンベータ、Ran、IBBP1の三者複合体の構造解析、2.HeLa細胞を用いたin vivo観察系の構築、3.卵母細胞核膜を用いた、インポーティンベータの核外排出時におけるRanおよびIBBP1の関与の検証、の三項目について研究を進めた。1.タンパク質結合実験を行った結果、RanがGTP結合型ならば低塩濃度条件下においてもインポーティンベータ、IBBP1、Ranは三者複合体を形成すること、RanがGDP結合型ならば三者複合体を形成しないことがわかった。2.GFPタグ付きインポーティンベータを発現したHeLa生細胞の核または細胞質全体についてFRAP解析を行うことで、in vivoにおけるインポーティンベータの核-細胞質間輸送サイクルの速度を測定する手法を確立した。この成果は、国内学会において発表した。3.核外排出を解析する系としてアフリカツメガエルの卵母細胞から摘出した核膜を用いる予定であったが、HeLa細胞核を用いても核外排出を解析できる実験系を考案したので、その確立を試み、その実験系が機能する確証を得た。今年度はこれまでに得られた知見および構築した実験手法を用いて、インポーティンベータ依存的核輸送経路の分子メカニズムの解明に向けた研究を進めていく。