hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新しいシャペロン分子探索法による神経難病治療

先天性白質形成不全症モデルマウスmsd(plp-A242V変異を有する)を用いた病理評価方法の確立とそれによる治療候補薬の効果検討を行った。1.光学顕微鏡的観察;(1)KW染色;WT;3週齢にて大脳白質の他に内包・淡蒼球内部に髄鞘化された神経線維がみいだされ4週齢WTにて、大脳白質・内包・海馬采・乳頭体視床路に髄鞘がみられる。msdでは3週齢にて大脳白質にはまったく髄鞘はみられず4週齢で淡蒼球や視床内部に有髄線維が少数みとめられた。(2)Epon包埋semithin Toluidine-blue stain;1週齢および2週齢の脊髄白質にWTでは多数、msdに少数の有髄線維を認める。4週齢視神経では、WTでは正常と考えられる多数の髄鞘線維がみられ、msdでは少数の有髄線維が認められた。2.電顕的観察;髄鞘化形成を観察したところ、視神経が安定した軸索、髄鞘の分布を認め、脊髄・大脳白質・脳梁と比較して、髄鞘化の定量に適していると考えられた。4週令のマウスの視神経像を取り込み、NIH Image-Jにて軸索、髄鞘部分を抽出。WT,msd,それぞれについて10枚の電顕画像を解析し、全視野の軸索、髄鞘の面積を定量した。その結果msdの病態として髄鞘化形成不全に加えて軸索の変性が認められることが明らかになった。以上の検討より、白質形成不全の病理像を電顕的観察定量的に評価するモデルマウスの系が確立した。この評価系で小胞体ストレスを軽減する可能性のある薬物を投与し4週齢で上記電顕的検討を行ったところ、msdの髄鞘化形成不全を軸索の変性を一部改善する効果が認められた。投与による副作用は、行動・病理学的に認めておらず、初めて先天性白質形成不全の臨床治療に近づいた。今後、更に改善度の強い候補薬を平行してスクリーニングしていく予定である。モデル疾患として選択した.Pelizaeus-Merzbacherdisease ; PMDの治療と平行して病態解析で進歩がみられた。我々はnonsense変異の重症度は、蛋白分解系への負荷の強さにより決まるのではないかとの予備実験の結果を得ており、本年度は更にこの検討を進めた。今回は軽症変異としてrsh (I186T),W152L,重症変異としてW152R, msd (A242V)変異を取りあげた。まずこれら蛋白の局在に関して、従来からいわれていたようにすべてが小胞体に局在するわけではなくW152Lのように小胞体外に局在する変異があることを本年発表したが(Neuroscience 2006)、同様の傾向をW152Rも示していることを示した。実際に小胞体に局在する異常蛋白;rshは小胞体シャペロンのカルネキシンと共沈していたがwt-PLP, W162Lでは認めなかった。またこれらの異常PLPの安定発現細胞を樹立したが、正常PLPがライソゾームと思われる顆粒、膜、突起様構造まで分布するのに対し異常蛋白はいずれも核周囲の分布を示しPLP変異によりトラフィッキング異常を起こしていることを示した。

またPLP蛋白の局在を小胞体の蛍光色素、ライソゾームの蛍光色素を用いその局在を観察し、必ずしも小胞体のみならずライソゾームにも存在することを示した。また重症変異は蛋白分解の元進が示唆された。蛋白分解がどのように行われているのか、ライソゾーム、プロテオゾーム、カルパイン阻害薬を用いそれぞれの関与を調べたところ、低発現のFLAG系では重症変異ではプロテオゾーム系の分解が主体であることがわかった。一方高発現系のGFAP系ではカルパイン分解系の関与が強いことがわかった。以上よりnonsense変異は少なくとも細胞レベルでは、小胞体のみならずライソゾーム、カルパインにより分解を受けており、これら蛋白分解系への負荷の強さが重症度を規定している可能性が示された。またmsdゴマウス治療に関しては、IP6については測定系が調整中でありまず第二の候補薬の投与を開始し、生存日数の延長が認められた。先天性白質形成不全症モデルマウスmsd(plp-A242V変異を有する)を用いた病理評価の確立とそれによる治療候補薬の効果検討を行った。1.光学顕微鏡的観察;(1)KW染色;WT;3週齢にて大脳白質の他に内包・淡蒼球内部に髄鞘化された神経線維がみいだされ4週齢WTにて、大脳白質・内包・海馬采・乳頭体視床路に髄鞘がみられる。msdでは3週齢にて大脳白質にはまったく髄鞘はみられず4週齢で淡蒼球や視床内部に有髄線維が少数みとめられた。(2)Epon包埋semithin Toluidine-blue stain;1週齢および2週齢の脊髄白質にWTでは多数、msdに少数の有髄線維を認める。4週齢視神経では、WTでは正常と考えられる多数の髄鞘線維がみられ、msdでは少数の有髄線維が認められた。2.電顕的観察;髄鞘化形成を観察したところ、視神経が安定した軸索、髄鞘の分布を認め、脊髄・大脳白質・脳梁と比較して、髄鞘化の定量に適していると考えられた。4週令のマウス視神経像を取り込み、NIHlmage-Jにて軸索、髄鞘部分を抽出。WT,msd,それぞれについて10枚の電顕画像を解析し、全視野の軸索、髄鞘の面積を定量した。その結果msdの病態として髄鞘化形成不全に加えて軸索の変性が認められることが明らかになった。以上の検討より、白質形成不全の病理像を電顕的観察定量的に評価するモデルマウスの系が確立した。この評価系で小胞体ストレスを軽減する可能性のある薬物を投与し4週齢で上記電顕的検討を行ったところ、msdの髄鞘化形成不全を軸索の変性を一部改善する効果が認められた。投与による副作用は、行動・病理学的に認めておらず、初めて先天性白質形成不全の臨床治療に近づいた。今後、更に改善度の強い候補薬を平行してスクリーニングしていく予定である。
がん看護におけるケア方略としてのタッチの臨床判断に関する基礎的研究

本研究の最終的な目標は、タッチをがん看護における方略的なケア技術として確立することであり、研究期間内に以下2つの調査を行った。「(1)質的記述研究による臨床判断の構成要素の抽出」では、【患者の苦痛や苦悩を客観的に分析する】【タッチの適否を慎重に見定める】など7つの概念が見出された。また、「(2)量的記述研究による関連要因の探索」において、看護師のバーンアウトがタッチの臨床判断の認識や実践に影響していることや、臨床経験を積むことによって実践度が高まることが示唆された。本研究の最終的な目標は、タッチをがん看護における方略的なケア技術として確立することであり、「(1)質的記述研究による臨床判断の構成要素の抽出」、および「(2)量的記述研究による関連要因の探索」の2点で構成される。平成20年度は(1)について、がん看護領域での臨床経験が5年以上の看護師8名(がん領域の認定看護師3名を含む)に対して第1段階面接(個別面接)を実施した。看護ケアで成果を得たタッチの実践について、状況の判断・コントロール、タッチの意図・方法、成果の判断の視点で分析を行い、類似性と差異性に留意して臨床判断の構成要素を抽出した。また、個別面接を行った参加者のうち3名に対しては、分析結果についての確認を行った。その結果、「患者の苦痛・苦悩を把握する」「患者に専心する時間を創出する」「患者との最良の距離をとる」「目的に合わせた方法を選択する」など25の臨床判断が抽出された。また、臨床判断に関連する要因として、タッチの有用性についての確信や患者との関係性が考えられた。今後は、概念の飽和化を目指しながら定義(説明)をさらに洗練するとともに、時間軸に沿った整理を行う。同時に、臨床判断に関連する要因を探求し、タッチの臨床判断仮説モデルの構築を目指す。本研究は「(1)質的記述研究による臨床判断の構成要素の抽出」、および「(2)量的記述研究による関連要因の探索」の2点で構成される。平成21年度は(1)について、得られたデータの分析をさらに進め、臨床判断の構成要素として抽出した概念の定義(説明)を洗練し、時間軸に沿った整理を行った。その結果、以下に述べる8つの概念に整理できた。まず、身体的苦痛の増強など、困難な状況に直面した【患者の苦痛や苦悩を客観的に分析する】ことで、【一歩踏み込むケアの必要性を認識する】に至っていた。その後、患者のおかれた状況の厳しさなどから、自身の業務を調整するなど【タッチの場面を形成する】ことや、患者の言動や表情から【今がタッチのタイミングと掴む】ことによりタッチを実践していた。同時に、患者の特性や患者との関係性から【タッチの適否を慎重に見定める】こと、距離を縮めるために遠いところをそっと触れるなど【目的に合わせたタッチの方法を選択する】ことで成果を見据えてタッチを実践していた。そして、患者の感情に焦点を当てるなど【患者の内的世界に近づく】ことから、心理的距離を縮めていき、呼吸や筋緊張のような身体的変化、言動の変化といった心理的変化から【実践したタッチを評価する】プロセスをたどっていた。また、タッチに影響する看護師側の要因として、先行研究では、臨床経験や看護教育、生育歴が報告されているが、本研究では、「臨床経験年数」「タッチの有用性についての確信」「ケア能力(ケアについての自信)」「アサーティブネス」「心身のパワー」が見出された。さらに、職場風土や職業コミットメントの影響も暗示されるなど新たな知見を得た。本研究は、「(1)質的記述研究による臨床判断の構成要素の抽出」、および「(2)量的記述研究による関連要因の探索」を通して、タッチをがん看護における方略的なケア技術として確立することを目指している。平成22年度は(1)で得られた結果をもとに、【タッチの臨床判断についての認識と実践度】について質問項目を作成し、【看護の専門職的自律性測定尺度】【日本語版バーンアウト尺度】と合わせて調査を行った。国内がん拠点登録病院337施設から100施設を無作為抽出し、看護部宛に調査協力を依頼したところ、28施設より快諾が得られたため合計1264部の調査票を配布した。郵送による回収を行ったところ、440部(回収率34.8%)の回答が得られ、尺度得点が算出可能な423部(有効回答率96.1%)を分析対象とした。対象者の背景は、年齢35±9.2歳、臨床経験は12.2±8.8年、がん看護の経験は7.1±6.2年であった。

がん患者へタッチをする際に、「患者の言葉や視線、行動に注意をはらう」「患者の心理的状態についてアセスメントする」ことを重要としていた一方で、「周りのスタッフに相談して時間を作る」「実践したタッチの評価を患者自身に確認する」については重要度が低かった。また、実践度は「患者の言葉や視線、行動に注意をはらう」「目的に合わせたタッチの方法を考える」が高かった。さらに、バーンアウトとの関連について検討したところ、特に「個人的達成感の低下」がタッチの実践度に影響していることが示された。経験年数との関連では、重要度の認識は経験年数による違いが少なかったが、実践度では「タッチのタイミングをつかむ」など多くの項目で経験を積むことにより実践度が高まることが示唆された。
3次元集積化新世代ベクトルマイクロアーキテクチャの創出

本研究では,低消費電力・高性能な次世代ベクトルプロセッサを実現するために,新たなデバイス技術として注目を集めている3次元実装技術によるマイクロアーキテクチャ設計に取り組んだ.従来の2次元設計と3次元設計をハイブリッドに活用する上での設計指針を与え,演算回路やオンチップメモリなどユニット内配線レベルからユニット間配線レベルまで,2次元配線の3次元TSV(シリコン貫通ビア)による効果的な置き換えを実現した.そして,3次元集積技術を活用して得られたプロセッサの有効性を性能評価により明らかにした.本研究では,低消費電力・高性能な次世代ベクトルプロセッサを実現するために,新たなデバイス技術として注目を集めている3次元実装技術によるマイクロアーキテクチャ設計に取り組んだ.従来の2次元設計と3次元設計をハイブリッドに活用する上での設計指針を与え,演算回路やオンチップメモリなどユニット内配線レベルからユニット間配線レベルまで,2次元配線の3次元TSV(シリコン貫通ビア)による効果的な置き換えを実現した.そして,3次元集積技術を活用して得られたプロセッサの有効性を性能評価により明らかにした.本年度は,3次元集積化新世代ベクトルアーキテクチャ設計に向けて,ALUなどの機能ユニット内、ALU/レジスタファイル間などで構成されるデータパスの構成レベル、プロセッサコアやオンチップメモリなどシステム要素間レベルの細粒度から疎粒度のすべてにわたり3次元積層化技術の適用性を評価し,アーキテクチャの概念設計を行った.まず,ベクトルプロセッサコア要素レベル3次元マイクロアーキテクチャ設計に関しては,ベクトルプロセッサコアを構成するベクトルパイプライン、レジスタファイル、オンチップキャッシュ個々をビット長等で2次元方向及び3次元方向に分割した場合の、適切な分割・配置を決定するために、実際のアプリケーション実行において、それぞれのサブ要素がどのような頻度で利用されるのかを評価し、利用頻度と実効性能の関係を分析し,3次元設計の適用可能性を詳細に評価した.また,ベクトルプロセッサコア要素間3次元マイクロアーキテクチャ設計に関しては,3次元貫通配線LSI積層技術を使うことによって得られる利得の大きいベクトルコア構成要素の検討を行い,3次元設計を適用すべき構成要素を明らかにした.さらに,ベクトルプロセッサコア間3次元マイクロアーキテクチャに関しては,ベクトルプロセッサコアに高バンド幅で大量のベクトルデータ共有を可能とするオンチップ共有キャッシュの3次元設計を進めるために、まず、オンチップメモリ容量とオフチップメモリへのアクセス頻度との関係を詳細に調査し,3次元ベクトルキャッシュ設計のための容量やバンド幅性能などの基本データを得ることができた.さらに,本アーキテクチャの評価に用いるターゲットアプリケーションとして,次世代CFDアプリケーションを検討し,基本カーネルの分析を行った.平成23年度は,平成22年度の設計の詳細化をさらに進め,3次元実装技術に基づくマルチベクトルコアプロセッサの主要構成要素である,3次元演算器,3次元マルチベクトルコア,並びに3次元ベクトルキャッシュの基本設計を完了させた.次に,これらの基本設計に基づき,3次元マルチベクトルコアプロセッサのソフトウェアシミュレータの開発を行った.併せて,次世代CFDコードであるBuilding-Cube法を本プロセッサを評価するベンチマークとして実装し,本アーキテクチャ向けチューニング手法の研究開発を行った.最後に,本ベンチマークを用いて3次元マルチベクトルコアプロセッサの性能評価を行った.性能評価の結果,3次元積層技術により、大規模なオンチップメモリの搭載が可能になり、演算性能と比較してメモリバンド幅が不足していることに起因する性能低下を軽減できると共に、メモリアクセス数を削減することで大幅な消費電力の削減が可能であることが確認できた。その一方,データパス上の配線に置いて,3次元TSVにより伝搬遅延の削減が可能な部分とそうでない部分が存在することが明らかになり,3次元化を適用すべき配線検出を容易にするツール等を研究開発することが必要であることがわかった.また,チューニング手法の研究開発では,ベクトルプロセッサにオンチップキャッシュ(ベクトルキャッシュ)を搭載した場合の性能特性について詳細に調査し、ベクトルキャッシュを有するベクトルプロセッサの性能予測モデルを提案した。この性能モデルを用いることで、アプリケーションに適した最適化手法を適用することが可能となり、実アプリケーションを用いた評価によりその有効性を明らかにした。最終年度である平成24年度は,3次元積層技術によるベクトルマイクロアーキテクチャの概念設計に基づいて設計されたソフトウェアシミュレータの開発を完了させた.そして,シミュレータを用いて,演算器レベルからレジスタトランスファーレベル,そしてマルチベクトルコア/オンチップキャッシュレベルの評価に取り組んだ.具体的には,積層型演算回路,積層型キャッシュメモリ,コア-メモリ積層等,様々な設計粒度における三次元積層技術の有効性の検討を行った.また,ベクトルプロセッサのための三次元積層型キャッシュメモリ設計を既存の2次元設計用のEDAツールを用いて行った.設計には180nmCMOSテクノロジと様々な直径のTSVを用い,キャッシュを構成するサブキャッシュとコントローラを結ぶ配線をTSVに置き換えるキャッシュ分割・積層法を検討した.さらに,提案アーキテクチャの性能評価のために,大規模CFDなど実用的なアプリケーションをベースにしたベンチマークプログラムの開発も行った.本コードは、時間発展計算で更新する情報が、仮想粒子の存否を表す小さなビット情報であり、その並進・衝突計算も1ビット幅で実行できるため、キャッシュの記憶容量を大きくできない3次元積層型プロセッサでも、CFDより強力な流体シミュレーション能力を発揮できる。また、振幅減衰率から算出した模擬可能なRe数を、プロセッサの実用性能を定量的に示す指標として利用できる。性能評価の結果,3次元積層型キャッシュメモリは,2次元実装と比べて10,000umの長配配線数を49%,面積を99%削減するとともに,メモリバンド幅を最大で2倍に向上できることを明らかにした.さらに,アウトオブベクトル処理,および高バンド幅オンチップベクトルキャッシュの相乗効果により,多くのベンチマークプログラムにおいて,低消費電力で高い実行効率で達成できることを確認した.

平成23年3月11日の東日本大震災により本年度の研究開発の開始が1ヶ月程度遅れたが,本年度の研究計画での実施項目である,アーキテクチャの基本設計,基本設計に基づくシミュレータ開発,シミュレータによるアーキテクチャの性能評価が行えたことから,おおむね順調に進展していると判断している.24年度が最終年度であるため、記入しない。最終年度の平成24年度は,基本アーキテクチャのさらに詳細な性能評価を行い,その結果をアーキテクチャの改良へとフィードバックさせ,アーキテクチャを完成させる予定である.24年度が最終年度であるため、記入しない。
肥満による肝インスリン抵抗性形成におけるプロテアソーム機能異常の意義

近年、肥満は小胞体(ER)ストレスを惹起することで肝臓および脂肪組織にインスリン抵抗性を誘導することが示された。本研究では、肥満がいかにERストレスを誘導するかの分子メカニズムを解明した。肥満状態の肝臓ではプロテアソーム(PS)活性が低下し、ポリユビキチン化蛋白質が蓄積した。このPS機能異常は、異常蛋白質の蓄積に起因するERストレスを誘導し、JNK活性化を介して肝にインスリン抵抗性を惹起した。これとは独立して、PS機能障害はFoxO1分解を抑制して肝糖新生を促進した。さらにPS機能障害によるタンパク分解抑制とERストレスの惹起がSREBP-1cを活性化して直接的に肝を脂肪化した。肥満・過栄養状態は、肝臓に小胞体ストレスをもたらし、このことがストレスキナーゼJNKを活性化させ、IRSのレベルでインスリン抵抗性を形成することが示されたが、肥満・か栄養状態がいかなる機序で小胞体ストレスを形成するかは不明のままであった。申請者は、昨年度までの研究で、肥満・糖尿病モデルマウスの肝臓では細胞内タンパク分解系プロテアソーム(PS)活性が低下し、ユビキチン化タンパクが蓄積すること、Proteasome activator 28 (PA28)ノックアウト(KO)マウスの肝臓では、プロテアソーム活性が肥満モデルマウスと同程度の約60%に低下すること、インスリン抵抗性が形成されることを示した。本年度は、これらの現象を多面的に確認し、因果関係を検証した。PA28KOマウスの肝臓では、1)ユビキチン化タンパクが蓄積した。2)小胞体が膨化し、小胞体ストレスが亢進した。3) JNK活性化がインスリン受容体基質(IRS)の活性化を抑制し、4)グルコースクランプ試験で肝糖産生が増加した。5)ケミカルシャペロンである4-Phenylbutyric acid (PBA)投与により、ERストレスとインスリン抵抗性が改善した。さらに、ラット肝癌由来H4IIEC3細胞を用いた検討では、1)選択的PS阻害剤Bortezomib処置により、ユビキチン化蛋白の蓄積、ERストレス、JNK活性化、インスリン抵抗性が生じ、2)これらの変化はPBAにより改善した。以上の結果より、従来不明であった肥満・過栄養状態による肝臓インスリン抵抗性は次のように説明されることがわかった。肥満状態の肝臓ではPS活性が低下し、ポリユビキチン化蛋白質が蓄積する。このPS機能異常は、異常蛋白質の蓄積に起因するERストレスを誘導し、JNK活性化を介して肝にインスリン抵抗性を惹起する。肥満は小胞体(ER)ストレスを惹起することで肝臓にインスリン抵抗性を誘導することが示されたが(Ozcan U etal. Science 2004, 2006)、肥満がいかにERストレスを誘導するかの分子機構は不明であった。申請者はヒト肝臓発現遺伝子情報(Diabetologia 2004 & 2007, Cell Metab 2010)から、2型糖尿病患者に肥満が加わることで、選択的タンパク質分解を担うプロテアソーム関連遺伝子群が肝臓で発現変動することを観察した(Obesity 2008)。その意義を遺伝子改変マウスと培養細胞の実験から検証した結果、肥満による肝臓でのERストレスの成因としてプロテアソーム機能障害をつきとめた(Diabetes 2013)。すなわち、肥満→プロテアソーム活性↓→ユビキチン化蛋白質蓄積→ERストレス→JNK活性化→肝インスリン抵抗性という病態を証明した。さらにプロテアソーム活性↓→FoxO1分解↓→肝糖新生↑、およびプロテアソーム活性↓によるタンパク分解↓とERストレス→SREBP-1c活性化→脂肪肝のモデルを示した。本研究は肥満2型糖尿病の肝臓において「糖新生抑制経路はインスリン抵抗性であるにもかかわらず脂質合成に対するインスリン作用は亢進している」という、従来「選択的インスリン抵抗性」として捉えられてきたパラドックスに対して新しい分子機構を示し、プロテアソームの機能を高める治療が肥満に伴う代謝異常を是正する可能性を提示した(Endocr J 2012)。申請者は2型糖尿病患者に肥満が伴うと肝臓でのプロテアソーム関連遺伝子群が協調的に発現亢進すること(Obesity 2008)を示した。近年、タンパク合成系がインスリン抵抗性や加齢に関わっている可能性が示された。一方、プロテアソームはエネルギー依存性の選択的タンパク質分解を担い、細胞周期、免疫応答など広範囲な生命現象に関与している。本研究では、これまで不明であった肥満状態の肝臓におけるプロテアソームの機能破綻がインスリン作用に及ぼす影響とその分子機構を解明することにある。

平成23年度は肥満モデルマウスである高脂肪食負荷マウスおよびdb/dbマウス、さらにProteasome activator (PA) 28ノックアウトマウスを用いてこの経路の意義を検証した。高脂肪食負荷マウスおよびdb/dbマウスの肝臓では、キモトリプシン活性を指標として定量したプロテアソーム活性が30-44%低下していた。これらのモデルマウスの肝臓では、ポリユビキチン化タンパク蓄積、ERストレス、ストレスキナーゼJNK活性化を伴うインスリン抵抗性が生じていた。そこで、プロテアソーム活性低下とインスリン抵抗性の関連を明らかにする目的で、PA28ノックアウトマウスの表現系を解析した。PA28KOマウスの肝臓におけるプロテアソーム活性は、肥満モデルマウスと同程度の約60%に低下していた。このとき、肥満モデルマウスの肝臓で観察したごとく、PA28 KOマウスの肝臓では、ポリユビキチン化タンパクが蓄積し、ERストレスが生じ、その下流のストレスキナーゼJNKが活性化し、インスリン抵抗性が生じていた。以上の結果は、従来不明であった肥満・過栄養状態によるERストレスの誘導に、プロテアソーム活性低下する可能性を示唆する。当初のヒト発現遺伝子解析結果をもとにした仮説では、肥満状態の肝臓で蓄積したERストレスを軽減するためにプロテアソーム活性が代償的に上昇することを想定していたが、実際のモデルマウスで生じていた現象は逆であった。すなわち、肥満や過栄養状態では、プロテアソーム活性は低下し、このことがERストレスに成因としてとして関与することが明らかとなった。すなわち、仮説と反対の結果から、プロテアソーム活性低下が従来不明であった肥満とERストレスを介在する経路として関与する、という新たな仮説を設定し、モデル動物と細胞の系で証明することができた。さらに、付加的な知見として、PA28KOマウスの肝臓では、核内活性型SREBP-1cの蛋白量増加と脂肪肝を呈した。また、核内FoxO1の蛋白量増加と肝糖新生酵素遺伝子発現が亢進した。これらの知見は、PS機能の低下が、インスリン作用とは独立して、脂肪肝と肝糖産生亢進に寄与することを示唆する。従来より、2型糖尿病の肝臓では、選択的インスリン抵抗性が生じている、すなわちインスリンの肝糖新生抑制作用は抵抗性になっている一方、インスリンの脂肪合成作用は亢進していることの分子機構が不明であった。申請者の知見はこの2型糖尿病の肝臓における選択的インスリン抵抗性の分子機構の一部を説明しうるかもしれない。以上の成果は米国糖尿病学会誌Diabetes 2013に掲載された。すなわち、肥満や過栄養状態では、プロテアソーム活性は低下し、このことがERストレスに成因としてとして関与する可能性が見えてきた。すなわち、予想外の結果から、プロテアソーム活性低下が従来不明であった肥満とERストレスを介在する経路として関与する、という新たな仮説が生まれた。
樹状細胞を腫瘍特異的に活性化する人工ネオ・アンティジェン担持エクソソームの開発

近年種々の抗腫瘍免疫治療法が開発されているが、ネオ・アンティジェンを持たない腫瘍細胞に対しては有効な抗腫瘍免疫が誘導されない。我々は、抗原性の高い結核菌抗原、ESAT-6の遺伝子を腫瘍細胞に導入し、「人工ネオ・アンティジェン」として発現させると高い治癒効果が得られることを見出し報告してきた。その治癒機構として、遺伝子を取り込んだ腫瘍細胞がESAT-6のエピトープを「人工ネオ・エピトープ」として提示したエクソソーム(ESAT-Ex)を分泌し、それを捕食した樹状細胞(DC)がこの結核菌抗原を「外来危険信号」と認識して、微生物抗原と同時に腫瘍に対しても免疫を強く惹起すると考えた。そこで、培養細胞でESAT-Exを調製し、培養DCに加えたところ、CD80/86およびIL-12の発現の向上が見られ、DCの活性化が確認された。ESAT-ExをB16メラノーマ細胞を移植した担癌マウスに局所投与すると、投与後すぐに高い抗腫瘍効果が観察された。DCを活性化するメカニズムと考えるには応答が早い。そこで、単球から分化させた培養細胞群にESAT-Exを加え、CD11c、CD11b、およびTNFαの発現を解析した。すると、CD11b陽性細胞(マクロファージ)でTNFαの高い発現が見られ、人工ネオ・エピトープは自然免疫も誘発して抗腫瘍効果を初期の段階から誘導することが示唆された。並行してエクソソームの凍結保存安定性の検討を行った。B16細胞から得られたエクソソームを蛍光標識し、凍結・解凍後の形態を蛍光顕微鏡で観察した。生理食塩水やPBSで分散したエクソソームは、凍結すると凝集塊を形成し、融解後も再分散はしなかった。一方、ヒアルロン酸やコンドロイチン硫酸を加えたエクソソームは凍結しても細かい分散を保ち、融解後も細かい分散が観察され、これらの糖類はエクソソームの凍結安定剤として有用であることが示唆された。研究実施計画に基づいて人工ネオエピトープ提示エクソソームの抗腫瘍効果およびそのメカニズムの検討を行い、免疫活性の機序を裏付けるポジティブな結果を得た。また、培養腫瘍細胞から得られたエクソソームの保存方法を検討し、動物臨床研究にむけての腫瘍細胞由来エクソソーム調製方法がほぼ確立した。引き続きエクソソームの保存安定性の評価を行いながら、動物臨床研究において原発性腫瘍に対する治癒効果を確認する。また、ヒト臨床研究を念頭に、腫瘍細胞由来エクソソームだけでなく、線維芽細胞などの正常細胞由来エクソソームの調製を行い、腫瘍細胞由来エクソソームと同様の効果があるのかを検討しながら、樹状細胞治療との組み合わせについても評価する。我々は、抗原性の高い微生物抗原遺伝子を「人工ネオ・アンティジェン」として腫瘍細胞に導入する新しい免疫治療戦略を開拓した。その治癒機構として、遺伝子を取り込んだ腫瘍細胞が微生物抗原エピトープを「人工ネオ・エピトープ」として提示したエクソソームを分泌し、それを捕食した樹状細胞(DC)がこの微生物抗原を「危険信号」と認識して、微生物抗原と同時に腫瘍に対しても免疫を強く惹起する、新しい免疫活性化機構を提唱した。本研究では、結核菌の抗原タンパクであるESAT-6遺伝子を導入した培養B16メラノーマ細胞から「人工ネオ・エピトープ」としてESAT-6エピトープを提示したエクソソーム(ESAT-6-Ex)を調製し、その免疫活性化のメカニズムを解析した。はじめに効率の良いエクソソームの調製条件を検討した。培養B16細胞に、ESAT-6遺伝子をコードしたプラスミドとPEIからなる二元複合体、あるいはそこにコンドロイチン硫酸を混合した三元複合体を導入し、分泌されたエクソソームを培養上澄から単離した。三元複合体を用いて遺伝子導入したB16細胞からは、二元複合体の系よりも多くのエクソソームが単離され、さらに、エクソソーム上に提示しているESAT-6エピトープの発現量も高く、三元複合体がネオ・エピトープ提示エクソソーム調製のための遺伝子導入に適していることが確認された。研究実施計画に基づいて効率よい微生物抗原担持エクソソームの調製法を検討し、発現率、および調製量の優れた遺伝子導入の方法を確立した。また、得られたエクソソームが確かにDCを活性化する機能を持つか評価するための初期的な検討を行い、評価方法をほぼ確立するとともに、一部活性化を確認するポジティブな結果を得た。

ESAT-ExをB16メラノーマ細胞を移植した担癌マウスに局所投与すると、投与後すぐに高い抗腫瘍効果が観察された。DCを活性化するメカニズムと考えるには応答が早い。そこで、単球から分化させた培養細胞群にESAT-Exを加え、CD11c、CD11b、およびTNFαの発現を解析した。すると、CD11b陽性細胞(マクロファージ)でTNFαの高い発現が見られ、人工ネオ・エピトープは自然免疫も誘発して抗腫瘍効果を初期の段階から誘導することが示唆された。並行してエクソソームの凍結保存安定性の検討を行った。B16細胞から得られたエクソソームを蛍光標識し、凍結・解凍後の形態を蛍光顕微鏡で観察した。生理食塩水やPBSで分散したエクソソームは、凍結すると凝集塊を形成し、融解後も再分散はしなかった。一方、ヒアルロン酸やコンドロイチン硫酸を加えたエクソソームは凍結しても細かい分散を保ち、融解後も細かい分散が観察され、これらの糖類はエクソソームの凍結安定剤として有用であることが示唆された。研究実施計画に基づいて人工ネオエピトープ提示エクソソームの抗腫瘍効果およびそのメカニズムの検討を行い、免疫活性の機序を裏付けるポジティブな結果を得た。また、培養腫瘍細胞から得られたエクソソームの保存方法を検討し、動物臨床研究にむけての腫瘍細胞由来エクソソーム調製方法がほぼ確立した。引き続き微生物抗原担持エクソソームの樹状細胞刺激機能を解析しながら、これらのネオエピトープ担持エクソソームによる抗腫瘍免疫活性化メカニズムの検討を行い、より効果の高いエクソソーム製剤の設計を行う。また、エクソソームと樹状細胞治療との組み合わせについても検討する。さらに、微生物抗原担持エクソソームの保存安定性についても評価する。引き続きエクソソームの保存安定性の評価を行いながら、動物臨床研究において原発性腫瘍に対する治癒効果を確認する。また、ヒト臨床研究を念頭に、腫瘍細胞由来エクソソームだけでなく、線維芽細胞などの正常細胞由来エクソソームの調製を行い、腫瘍細胞由来エクソソームと同様の効果があるのかを検討しながら、樹状細胞治療との組み合わせについても評価する。理由:エクソソーム解析キットが海外からの取り寄せのため納品が遅れた。使用計画:細胞培養に必要な試薬、エクソソーム解析試薬、治癒の実験やその抗腫瘍効果、サイトカインの解析に必要な試薬等を購入する。得られた研究成果の発表のため、学会への参加旅費に使用する。理由:エクソソーム解析キットの発注が遅れたため。使用計画:細胞培養に必要な試薬類や滅菌済みプラスチック類、エクソソームやサイトカインの解析に必要な試薬や抗体等を購入する。実験や打ち合わせのための旅費、学会への参加旅費に使用する。
リン酸・ピロリン酸代謝異常におけるセメント質および骨形成機序の解明

本研究では、生体内の硬組織、その中でも歯周組織を構成する硬組織形成細胞が、リン酸・ピロリン酸バランス異常状態でどのような反応性の違いを示すのかを、リン酸・ピロリン酸バランス異常マウスであるPC-1遺伝子異常マウスを用いて検討した。その結果、リン酸・ピロリン酸バランス異常状態では、セメント芽細胞と骨芽細胞でPC-1遺伝子発現状況が異なること、歯槽骨では骨基質タンパク質の一つであるオステオポンチンの発現領域が増加していることが明らかになった。本年度は、まず初めに、ヌクレオシド3リン酸を加水分解してピロリン酸を産生する機序により生体内のリン酸・ピロリン酸代謝を調節しているPC-1遺伝子に異常が生じて正常なピロリン酸を産生出来なくなった結果、リン酸・ピロリン酸代謝異常となったマウスの歯周組織を用いて、病理組織学的および免疫組織化学的検討を行った。これらの検討に用いる組織検体採取のために、PC-1遺伝子異常マウスの交配と飼育を行った。PC-1遺伝子異常がヘテロ状態で維持されている雌雄の個体を用いて交配を行い、生まれてきた子供のPC-1遺伝子の異常状態をチェック後、PC-1遺伝子の異常がホモ状態で保存されている子供をPC-1遺伝子異常リン酸・ピロリン酸代謝異常マウス群とし、PC-1遺伝子の異常がホモ状態で認められない子供をPC-1遺伝子異常リン酸・ピロリン酸代謝異常マウス群に対する正常コントロールマウス群として、特定の週齢まで飼育を行った後、歯周組織のサンプル回収を行った。PC-1遺伝子異常リン酸・ピロリン酸代謝異常マウス群と正常コントロールマウス群における6週齢♂を選択し、下顎骨のサンプルを回収した。これら二つの群におけるPC-1発現を観察するために組織切片を作製し、PC-1抗体を用いた免疫染色により歯周組織におけるPC-1発現を検討した。二つの群の下顎第一臼歯歯周組織の前額断の切片を用いて免疫染色を行うと、正常コントロール群の下顎第一臼歯の歯根膜部に面した歯槽骨表層の骨芽細胞にPC-1の陽性反応が認められた。さらに、セメント質表層のセメント芽細胞層には骨芽細胞層よりも強いPC-1の陽性反応が認められた。一方、PC-1遺伝子異常リン酸・ピロリン酸代謝異常マウス群では、骨芽細胞層およびセメント芽細胞層にPC-1の陽性反応はほとんど認められなかった。本年度は、昨年度に引き続きPC-1遺伝子異常マウス雄6週齢から採取し作成した下顎骨組織標本を用いた検討を行った。前年度における検索の結果、PC-1遺伝子異常マウスでは、免疫組織化学染色においてPC-1の陽性所見がほとんど認められなかったのに対して、対照群のマウスでは、セメント芽細胞層と骨芽細胞層に陽性所見が観察され、その陽性所見はセメント芽細胞層の方がより強い陽性所見であったことから、歯周組織を構成する歯根膜、歯槽骨、セメント芽細胞の構成比率を比較検討するために、歯周組織におけるセメント質と歯根膜幅径の測定を行った。下顎第一臼歯遠心根において、これらの測定を行うと、対照群マウスの下顎第一臼歯遠心根のセメント質幅径は平均1.2umであったが、PC-1遺伝子異常マウスの下顎第一臼歯遠心根のセメント質幅径は平均35.0umであり、対照群マウスに比べてPC-1変異マウスでは下顎第一臼歯遠心根のセメント質幅径が約30倍に肥厚していた。一方、下顎第一臼歯遠心根における歯根膜の幅径は対照群マウスとPC-1遺伝子異常マウスの間に有意な差は認められなかった。さらに歯周組織における硬組織基質の発現分布を検討するために、骨組織およびセメント質に豊審に含まれるオステオポンチンの免疫組織化学染色を行った。オステオポンチン陽性所見は、対照群マウスとPC-1遺伝子異常マウスの歯槽骨では、その表層部分および骨改造線に沿って認められ、対照群マウスとPC-1遺伝子異常マウスのセメント質ではその全層に渡ってオステオポンチン陽性所見が認められ、両者におけるオステオポンチンの発現分布に大きな変化は見られなかった。
単糖骨格由来合成化合物の造血器腫瘍治療薬開発に関する研究

白血病細胞に対して特異的に作用し、その進行を抑え込む新しい分子標的治療薬の開発の基礎的研究を行った。人工合成低分子化合物の設計、合成、その標的分子(遺伝子や蛋白質)の同定、作用機序を明らかにし、白血病を含めた様々な癌腫に効果があることが示された。本研究成果に基づき、より特異性の高い化合物の合成と臨床応用への基礎的研究を継続していきたい。【研究成果の目的】新規合成リン糖誘導体(TMPP/DMPP)の精製と抗白血病効果の作用機序の解明と標的分子の同定を目的とした。【研究方法と成果】(1)リン糖誘導体の白血病細胞の増殖抑制効果;白血病細胞株HL60, NB4, U937, YRK2, NOMO-1, CEM, MOLT4, SUP-B15, K562, Meg-01, SHG3細胞で、TMPPは平均IC_<50>が6.25μM、DMPPの平均IC_<50>は23.7μMであった。(2)リン糖誘導体による白血病細胞の細胞周期に与える効果とアポトーシス誘導効果;白血病細胞株U937細胞において、10μMのTMPPと20μMのDMPPでS期、G2/M期の分画の増加が認められた。さらに、20μMのTMPPで処理40時間後には、80%程度がアポトーシスを起こしていた。(3) TMPPによる細胞周期とアポトーシス関連蛋白質へ及ぼす効果の検討;10μMと20μMのTMPPでFoxM1、Skp2、CDc25B、CyclinD1、Survivin、KIS、Aurora kinase BはTMPPの濃度依存的に発現低下が認められ、CDKlのp27とp21の発現はTMPPの濃度依存的に増加が認められた。(4) TMPPの白血病臨床検体と造血前駆細胞に及ぼす影響;白血病細胞では4μMからCell viabilityの低下が認められたが、正常造血前駆細胞への影響は軽度であった。(5) TMPPの白血病細胞における標的分子の同定;ドッキングシュミレーションソフトを用い、立体構造の判明しているAurora-B, Bcl-2について検討した。Aurora-BとBcl-2はそれぞれ、-20.4と-15.3であり、TMPPとAurora-Bの結合はかなり強力であり、TMPPの直接的な標的分子の一つである可能性が示された。【考察】白血病細胞において、TMPPの作用機序は、細胞周期関連蛋白質の発現制御とアポトーシス関連蛋白質の活性化を誘導することが示された。白血病由来臨床検体においても、TMPPは細胞傷害活性を有し、正常造血前駆細胞への細胞障害作用は軽度であることが示された。TMPPの作用は細胞周期司令塔としてのFoxM1の発現制御を介するとともに、ドッキングシュミレーションの結果からは直接的なAurora-B蛋白質への結合による効果も含まれることが考えられた。[目的]リン糖の研究において、臭素を側鎖に添加させ、新規合成リン糖誘導体(TMPP)を合成した。これまでにTMPPの杭白血病効果を報告してきたが、今回、我々はドッキングシュミレーションを用いた標的分子の同定と抗白血病効果の作用機序を明らかにすることを目的とした。[方法]TMPPの細胞増殖抑制効果を種々の白血病細胞株を用いてIC_<50>で評価した。白血病細胞の細胞周期に与える効果とアポトーシス誘導効果をフローサイトメトリーにて解析した。細胞周期とアポトーシス関連蛋白質へ及ぼす効果をwestern blotにて評価した。白血病臨床検体と造血前駆細胞に及ぼす影響をcell viabilityにて評価した。白血病細胞における標的分子の同定のためにドッキングシュミレーションソフトを用いて解析した。[結果]平均IC_<50>が6.25nMであった。白血病細胞株U937細胞において、10nM処理16時間後より、G2/M期の分画の増加が認められ、G1期の分画の減少が認あられた。さらに、20nM処理40時間後には、90%程度がアポトーシスを起こしていた。また、10nMと20nMではFoxM1、Skp2、CDc25B、Cyclin D1、Survivin、KIS、Aurora Kinase Bは濃度依存的に発現低下が認められ、p27とp21の発現は濃度依存的に増加が認められた。また、bcl-2発現及びミトコンドリア膜電位についても濃度依存的に減少させた。TMPPが直接に影響する分子を同定するためにドッキングシュミレーションソフトを用い、ドッキング強度を、Udock[kcal/mol]値で表すと、Aurora-BとBcl-2はそれぞれ、-20.4と-15.3であり、TMPPの直接的な標的分子である可能性が示された。白血病患者由来白血病細胞(n=10)は4nMからcell viabilityの低下が認められ、正常造血前駆細胞への影響は軽度であった。[結語]

TMPPの抗白血病効果はG2/M期での細胞周期停止とBcl-2とミトコンドリア膜電位低下によるアポトーシス誘導効果を介することが示された。また、ドッキングシュミレーションからAurora-kinase BとBcl-2への強い結合が明らかとなり、両者の結果に整合性が認められた。以上のことから、TMPPの抗白血病効果の作用経路と標的分子が明らかとなった。[目的]前年度までのリン糖の研究において、臭素を側鎖に添加させ、新規合成リン糖誘導体(TMPP)を合成した。これまでにTMPPの抗白血病効果を報告し、ドッキングシュミレーションを用いた標的分子の同定と抗白血病効果の作用機序を明らかにした。以上の研究成果を基に本年度はさらに抗腫瘍活性の高い化合物の合成とマウスにおける白血病細胞移植実験を行い、その効果を検討することを目的とした。[方法]白血病細胞(K562細胞)をヌードマウスの背側に移植し、生着を確認後、TMPPを各種濃度にて、尾静脈より投与し、その後の腫瘍径やマウスの生存率を評価した。また、他の癌腫(肝癌細胞)をマウスに発がんさせた後に、同様にTMPPを投与して、その抗腫瘍効果や生存率も同時に評価した。また、リン糖からの新規派生合成化合物を合成し、その抗腫瘍効果を検討した。[結果]マウス尾静脈からTMPPを投与した結果、マウス血管内で静脈炎等が併発し、血栓形成傾向が認められたため、静脈投与からのTMPPの抗腫瘍効果については出来ませんでしたが、TMPPに暴露したK562細胞はマウス内での増殖は抑制され、生着は認められませんでした。また、TMPP合成過程において高濃度の合成を行えるようになったため、μM単位の濃度からnM単位の濃度での抗腫瘍効果を示すことができるようになりました。さらに、リン糖骨格における側鎖への結合物質をその他のハロゲン分子(ヨウ素)へ変更することにより、白血病細胞への抗腫瘍活性をもつ化合物の合成も行えました。[考察]TMPPの抗白血病効果はin vitroにおいては作用機序、標的分子も明らかにすることができましたが、in vivoにおいては血管内での凝固促進作用や炎症誘発作用が認められたため、TMPPの溶媒変更やより低濃度での抗腫瘍効果を今後評価していく必要があると考えられました。また、新たに合成した化合物についての抗腫瘍活性評価を今後継続していく必要があると考えられました。
中世都市の食をめぐる諸関係の研究：修道院と魚・肉業者の関係を手がかりとして

砲撃によって失われた都市史料の欠損のため、中世都市ブリュッセル研究においては社会集団の機能とネットワークの実態解明が遅れている。都市周辺に所在するグランビガール、フォレ、ラカンブル女子修道院の旧文書庫所蔵の多数の未刊行文書は都市住民に関する多くの情報を含んでいるにもかかわらずほぼ手つかずの状態にあった。本研究においては、肉・魚業者家系とこれらの修道院の関係にターゲットを絞って3つの女子修道院の13世紀前半までの未刊行史料分析を行った。その結果、都市新興エリート家系と修道院との緊密な連携が都市ブリュッセルへの食糧供給を支えていたことを明らかにした。都市ブリュッセルは12世紀後半から13世紀初めにかけて急激な都市的発展と人口増加に見舞われ、食料供給の確保は都市領主ブラバン公の急務となった。修道院文書の分析からは、まずはブラバン公の政策が明らかとなった。ブラバン公は都市周辺に設置した女子修道院に水利施設を中心とする低湿地の開発と未耕地における周辺在地有力者との権利関係の調整を委託した。同時に、新たな都市経済活動の担い手である新興都市エリート層に土地の用益権を付与することによってその多面的な活動を促進していった。さらに修道院と家系は土地の開発と利用において共同で作業を進めていったことも明らかとなった。加えて、関係文書の分析から、肉・魚業者として台頭してくる家系が婚姻関係と修道院との多面的な関係(寄進・入会・死者供養)の集積によって集団として立ち上がってくる様相を跡付けることができた。以上から、ブリュッセルでは新興家系と修道院とが周辺社会状況に応じた動態的な諸関係を構築したこと、そしてその重要な要素として女子修道院に特有の柔軟性が大きく作用したことを明らかとした。本研究においては都市ブリュッセル初期史の解明のため、13世紀前半の未刊行文書の調査と分析を行っている。計画作成時においては、都市住民に関する情報を修道院の旧文書庫所蔵の文書によって補完出来るという見通しを立て、修道院による都市家系を通じた食料供給ネットワークの解明に焦点を絞っていた。しかし、ベルギー研究者との議論と現地での調査によって、より具体的な研究状況と課題が明らかとなった。特にラ・カンブル修道院関連文書の網羅的な調査と研究の遅れが顕著であり、これによってブリュッセル都市住民と周辺状況の解明に決定的な欠落が生じているという問題が検出できた。この問題解決のために現地での史料調査と分析を進めている。その結果、修道院史料は当初の研究課題の枠をはるかに超えて、修道院が都市住民の多様な社会的ニーズに柔軟に応えていたことを明らかにしている。注目すべきは検討対象の一つであるラ・カンブル女子修道院の「女子」という特性が男子修道院よりも広範な活動を支えていた可能性である。ラ・カンブルでは所領での食料生産から都市での施療院・貧民救済、さらには周辺住民の埋葬や死者供養にまで活動が及んでいる。また修道院を経済的に支える周辺俗人の女系ネットワークの存在も浮かび上がってきた。従って、当初計画した検討課題をより広範なコンテクストにおいて再設定する必要に迫られた。新たな課題は都市近郊の女子修道院が果たした社会的機能の解明とする。まず都市近郊の女子修道院が、農村に拠点を置く伝統的な修道院と都市を場として活躍した新しい修道院との間をつなぐ役割を果たしたことに着目する。次いで詳細な文書分析によって、周辺社会の多様な必要に応えた実態の解明と社会的機能の検討を行う。以上によってこれまで明らかにされてこなかった都市史の諸側面に新たな光をあてることが可能となる。当初の計画は、修道院旧文書庫所蔵の未刊行史料状況の調査と分析であった。しかし、計画作成時においては未完成であったDiplomata Belgica(DB)の1215年12月の公開によって研究環境は大きく変化した。DBとはヘント大学研究者を中心として1250年までの現ベルギー地域の文書史料を対象として作成され、現在も更新され続けているデジタルアーカイブズである。修道院文書史料の網羅的調査という本研究の基礎を、DBの有効活用によってどこまで効率的に進めることができるか、まずそれを検証することが急務となった。DBを活用して研究対象とした修道院文書の予備調査を行った結果、以前よりもはるかに正確かつ網羅的に文書の追跡が可能となり、本研究の遂行にあたって確かな基盤を作ることができた。しかし、特にラ・カンブル修道院文書に多くの問題があることが判明した。研究代表者自身がすでに調査を終えた相当数の未刊行文書が未収録であったため、最新の成果であるDB網羅的な収集と調査の完成度に疑問が生じた。従って、今年度のベルギー滞在において、まずはDBの編集責任者と当該修道院の担当者と面談して状況の説明を求めた。その結果ラ・カンブル文書は未だに調査継続中であり、文書の目録作成を始めとする網羅的な成果が達成されるめどは立っていないという現状が確認できた。次いで、市文書館での史料調査の実施によって、DBに収録されている約50通の文書に加えて、100通以上ものDB未収録オリジナル文書の所蔵と分類状況を確認し、各文書の撮影を行うことが出来た。この成果をもとに帰国後にオリジナル文書の目録を独自に作成しつつ、内容の分析を進めている。この成果をDBへフィードバックすることによって、ベルギー学会との双方向的な研究の進展が可能となる。中世盛期における都市ブリュッセルの発展は、先行する都市周辺の農業発展に支えられている。その中心は都市の軸となって南北に走るセンヌ河沿いの湿地帯であった。

12世紀以降開発拠点に設置された三つの女子修道院(フォレ、グランビガール、ラ・カンブル)は都市有力家系と一体となって湿地の開発と未耕地生産を積極的に展開し、食料を始めとする多様な生産物を都市に供給していたと考えられる。史料的な欠如から研究の空白となっているブリュッセル初期史の解明において、これらの女子修道院の果たした社会・経済的機能が鍵となる。なぜ男子修道院ではなく、女子修道院がこのような役割を果たすことができたのか。中世盛期まで修道女に対する統一的な規範が存在しなかったため、各地域の状況に応じた多様性が許容されていた。昨年度において、男性を積極的に受け入れたフォレとグランビガールに特有の柔軟性を具体的に検証することができた。両団体は男子修道院アフリヘムの女子分院であったため、農村で所領経営を行うアフリヘム修道院の都市社会への窓口として機能していた。本院から派遣された修道士団と分院の修道女達は協力して外部社会との対応と所領の経営にあたっていた。さらに両女子分院は広大な所領を持ち、周辺農村から都市へ向かう多くの男女を内部の労働力として活用していた。修道院内部には明確なヒエラルキーが存在し、有力家系出身の修道女達は少数の特権的存在であった。出身家系との仲介役となって修道院を支えるため、彼女達には入会後も個人的な活動が認められていた。その行動は時に修道院の枠を超え、出身家系との協同によって私有財産の保持と運営が行われることもあった。また、死者供養に代表される貴族家系において女性に割り当てられてきた役割を果たすことも求められた。女子修道院は多様な人々から成る総合的な団体として都市周辺社会のニーズに細かく対応していたことを実証した。修道女・女子修道院に関しては研究の遅れが指摘されてきたが、近年めざましい進展がみられた。その典型例として挙げられるのが、昨年フランスのヴィエンヌで3日間に亘って行われた修道女をテーマとする国際研究集会である。男子修道院とは異なる女子特有の社会的機能に着目したこの研究集会に出席し、報告者達と活発に意見交換を行うことによって、日本では全く紹介されていない女子修道院研究の成果と課題について総合的な見識を持つことができた。特に、出身家系と修道女との個人的な関係が維持されるという女子修道院の特性を踏まえた上で、女子修道院と外部社会との関係、修道院内の男性と女性の関係に留意しながら研究をすすめることが、課題の達成に不可欠であることが認識できた。さらに、最新研究に基づく情報収集の結果、ブリュッセル地域を含む低ロタリンギアにおいて、二重修道院から女子参事会への移行という独特の現象が進行していたことも明らかとなった。フォレとグランビガール修道院史料の情報の中で、取り扱うことが難しかった修道女の私有財産の保持と個人的な行動という問題により柔軟なアプローチができるようになった。このような最新の研究状況を考慮すると、第一線の研究者達の前でこれまでの研究成果を報告し、意見交換を行う必要性を痛感した。
人工炭酸泉浴中に見られる徐脈、皮膚血流量増加に関わる入力機構の解明と疲労回復効果

我々は、人工炭酸泉水浴により心拍数減少がどのような経路を介して起るかについて、麻酔下のラットを用いた動物実験系によって検討した。この現象はT4-T5レベルにおける脊髄横断により消失することを示すとともに、炭酸泉から空気中に放出されるCO_2ガスの吸入などに伴う体液性経路によるという可能性を注意深く排除した。そして、上記の現象が主に神経性経路を介して起るものであるという結論を導き出した。なお、脊髄横断後にatropine処理をしたラットでも、炭酸泉水浴に伴う心拍数減少は明らかに見られるのみならず、atenolol(β1アドレナリン受容体の選択的遮断薬のひとつ)の心拍数減少効果や、総頸動脈圧迫に伴う心拍数の反射性の上昇はよく観察されることを示し、炭酸泉水浴に伴う心拍数の低下は、交感神経から心臓への遠心性インパルスの低下によると結論した。また、炭酸泉浴における皮膚血管拡張が浸漬部皮膚局所的である。経皮的に滲入した炭酸ガスが一酸化窒素(NO)産生に関与するかについては明らかではないが、血管拡張作用を持ち、局所的産生の可能性があるプロスタグランディンの関与について検討した。皮膚組織で想定される炭酸ガス分圧上昇による血管拡張の少なくとも一部にアラキドン酸代謝産物を介するものがあり、NOの介在は少ない事を示唆した。そして、ヒトを被検者とした実験では、人工炭酸泉浸漬部の筋血流量が同温水道水より32%増加し、また、動脈圧閉時のNIRSによるOxy-Hb減少速度は人工炭酸泉浸漬部で15%大きかった。測定部位組織におけるtotal-Hbは、血管内容積を反映し、血管収縮・拡張状態に影響される。これらのことから、人工炭酸泉浴が浸漬部皮膚のみならず、筋毛細血管を拡張し、組織の血液量が増え、人工炭酸泉浴による筋酸素消費量が増加することから、筋疲労の回復に有効なことが推察された。炭酸泉浴は動脈血圧の低下や除脈、また、皮膚血管拡張による皮膚血流量の増加を引き起こすことが知られている。我々は、これまでに、水温35°Cでは浴水の含有炭酸ガス濃度に依存して皮膚血流量が増加すること、血圧の顕著な変化なしに徐脈が発現し、ヒト炭酸泉浴時のモデルとなり得ることを報告した。本研究では、徐脈発現の入力メカニズム解析の第一歩として、経皮的に滲入したと考えられるCO_2によって引き起こされる変化の受容機構を検討するため、中枢への情報伝達因子として可能性のある動脈血のpH,酸素分圧(PaO_2)、二酸化炭素分圧(PaCO_2)の測定を行った。また、皮膚近傍で生じた変化が神経性求心路を通じて入力されている可能性を検討するため、脊髄切断実験も行った。動脈血pH, PaO_2、PaCO_2には水道水浴と人工炭酸泉浴の間に有意な差が見られなかった。炭酸泉浴により皮膚を通じて滲入すると推定される炭酸ガスは、PaO_2もPaCO_2も変化させなかった。これらの現象から徐脈の発現が頸動脈小体等の化学受容器を介して生ずるものではないことが示唆された。さらに、人工炭酸泉浴中に見られた徐脈及び皮膚血流量の増加は切断後に消失する傾向であった。人工炭酸泉浴中に見られる徐脈は、血液ガスなど、既知の液性因子により中枢へ運ばれる情報によるのではなく、皮膚近傍の炭酸ガス分圧上昇により生ずる変化を受容する何らかの機構があり、その情報が神経性に受容され中枢を介して心機能を変調している可能性が高いと考えられる。また、我々は人を被検者として、人工炭酸泉部分浴における浸漬部の酸素化ヘモグロビン動態について検討を開始したところである。例数は十分ではないが、人工炭酸泉により、浸漬部皮膚のみならず、筋組織の毛細血管が拡張し、血流量が増え、その結果、Oxy-Hb/Mbが増加した結果を得ている。上記の研究成果は国内外の学会または論文等で発表された。