hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
精密に構造制御したポリマーブラシ付与複合微粒子の体内動態に関する基礎科学的研究

表面開始リビングラジカル重合により、分散性に優れた、ポリマーブラシ付与シリカ微粒子を合成する技術を確立した。得られた複合微粒子のタンパク質の吸着特性および体内動態挙動は、複合微粒子の構造パラメータに大きく依存した。優れた血中滞留性をしめす、濃厚ブラシ付与シリカ微粒子がEPR効果によってガン組織に選択的に集積することを明らかにした。また、蛍光標識した複合微粒子を用いることにより、ガン組織の選択的イメージングに成功した。また、ポリマーブラシ付与酸化鉄ナノ粒子が、優れた血中滞留性およびガン組織への選択的な集積性を示し、当該ナノ粒子によるガン組織のMRイメージングに成功した。表面開始リビングラジカル重合(LRP)により、分散性に優れた、ポリ(ポリエチレングリコールメタクリレート)を付与したシリカ微粒子(PPEGMA/SiP)を合成した。この際、SiPコアの粒径およびブラシ鎖長を変え、構造因子の異なる一連の複合微粒子を調製した。高圧力下(200MPa)で表面開始LPRを行い、重量平均分子量Mwが100万に及ぶ高分子量ポリマーの合成にも成功した。得られた複合微粒子の体内動態挙動を評価した。まず、コア粒子径の依存性を評価するために、グラフトポリマーの分子量(約10万)がほぼ等しく、コア粒径が異なる試料の体内動態を評価した。シリカ粒径が15nmの試料において、投与24時間後の血中残存率は約30%であり、非常に優れた血中滞留性を示した。一方、シリカ粒径が130nm、740nmと大きくなるに伴い、血中滞留性は悪くなった。この結果は、大きな粒子は血中滞留性が悪い傾向にあるという、これまでの報告に合致している。また、グラフトポリマー鎖長の依存性を評価した結果、分子量が約5万、10万、30万、40万と大きくなるに伴い、血中滞留性が良くなった。グラフト鎖の分子量が大きくなると、複合微粒子の流体力学的サイズが大きくなるためだけではなく、表面の有効グラフト密度が小さくなり、タンパクが吸着しやすくなると考えられ、血中滞留性が悪くなると推測したが、本研究結果はそれに反した。これは、複合微粒子のサイズのみならず、粒子の表面弾性率やグラフトポリマー鎖の運動性などが生体内相互作用において重要な因子であることを示唆する。表面開始リビングラジカル重合(LRP)により、分散性に優れた、ポリ(ポリエチレングリコールメタクリレート)を付与したシリカ微粒子(PPEGMA/SiP)を合成する技術を23年度までに確立した。得られた複合微粒子の体内動態挙動は、グラフト鎖の分子量およびコア粒径に大きく依存するが、タンパク質(BSA)吸着特性はグラフト密度および鎖長が極端に小さくない限り大きな差が無いことを24年度に見出した。25年度は、優れた血中滞留性をしめす、濃厚ブラシ付与シリカ微粒子がEPR効果によってガン組織に選択的に集積すること、そして、これが、粒子の流体力学的直径に大きく依存することを明らかにした。また、蛍光標識した複合粒子を用いることにより、ガン組織の選択的イメージングにも成功した。この成果を拡張発展させ、濃厚ブラシを酸化鉄ナノ粒子の合成に取り組んだ。酸化鉄ナノ粒子をシランカップリング剤で処理することにより、重合開始基を導入することができるが、その安定性はシリカ粒子の場合と比較し、高くない。そのため、ポリマーブラシ層の微粒子表面に近いところに架橋層を入れることにより、グラフト鎖が微粒子表面から脱離することを防ぐ工夫を施した。得られた複合ナノ粒子のコアである酸化鉄に特徴的な磁気特性を活かし新規MRI造影剤の開発にも取り組んだ。コア粒子を酸化鉄ナノ粒子に変えても、複合微粒子の体内動態挙動におけるグラフト鎖の分子量およびコア粒径依存性は大きく変化しなかった。それに加え、ある構造パラメータを有するポリマーブラシ付与酸化鉄ナノ粒子が、優れた血中滞留性およびガン組織への選択的な集積性をしめし、当該ナノ粒子によるガン組織のMRイメージングに成功した。23年度に得られた複合微粒子の体内動態挙動を評価した。その際、グラフト鎖の分子量が大きくなると、複合微粒子の流体力学的サイズが大きくなるためだけではなく、表面の有効グラフト密度が小さくなり、タンパクが吸着しやすくなると考えられ、血中滞留性が悪くなると推測した。しかし、結果はそれに反した。

24年度はその解明に注力した。タンパク質(BSA)吸着のグラフト密度依存性、グラフト鎖長依存性を評価したところ、グラフト密度および鎖長が極端に小さくない限り、タンパク質吸着に大きな差は見られなかった。これは、もともとタンパク質吸着性が低いPPEGMAでは、グラフト量がある程度十分であれば、タンパク質の吸着を抑制できることを意味する。また、複合微粒子に対するマクロファージの貪食特性を評価した。予備検討として、直径100nmと600nmのシリカ粒子に分子量約10万のPPEGMAをグラフとした2種類の複合粒子に対する貪食特性をフローサイトメトリー法で評価した、大きな複合微粒子の方がよく貪食された。このことから、血中滞留性はタンパク質吸着性よりも、細胞との相互作用に大きく影響されるのではないかと推察される。また、複合微粒子の弾性率を制御するために、親水性ポリマーブラシを付与した中空微粒子の合成を行った。ブラシ層を蛍光標識することにより、共焦点レーザースキャン顕微鏡で中空構造を確認できた。構造パラメータ(コア粒子径、グラフト鎖長)を変えた一連のサンプルを調製し、それらの体内動態を系統的に評価することによって、複合微粒子の生化学的特性について基本情報を得ることができたため。これにより、新たに解決すべき課題が見出せたことも意義深い。25年度が最終年度であるため、記入しない。複合微粒子の血中滞留性が、タンパク質吸着よりもマクロファージとの相互作用に大きく影響されるのではないかという推察ができたことは、今後研究を推進する上で非常に意義深いことである。構造パラメータを変え、マクロファージの貪食特性をさらに詳細に調べることにより、さらに体系化できるのではないかと考えられる。おおむね順調に展開しており研究計画の変更は必要ない。今年度に確立した微粒子合成技術を駆使すれば、次年度以降に要求される特殊構造複合微粒子の合成が達成できると期待できる。放射性同位体(125I)標識した複合微粒子を、担癌マウスに尾静脈から投与し、経時的に採血し、ガンマカウンタにより放射線強度を測定することにより、微粒子の血中残存率を評価する。また、一定時間経過後に各種臓器を摘出し放射線強度を測定することにより、微粒子の体内分布を評価する。特に、癌組織の放射線強度からEPR効果による集積率を評価する。同種の実験を各種がん細胞により行い、細胞依存性についても併せて評価する。また、抗体を担持した複合微粒子を作成し、がん組織へのアクティブターゲッティングに関する検討を行う。中空微粒子の体内動態では、第一に、形態変形の効果を明らかにする。そのために、コア粒子の粒径、グラフト鎖長、ポリマーブラシ層の架橋度などを変え、構造パラメータの異なる一連のサンプルを調製する。ポリマーブラシ層の構造を最適化することにより、優れた血中滞留性を示す、ミクロンサイズの中空微粒子の創出に挑戦する。
成人T細胞白血病の母児感染防止に関する臨床的,疫学的研究

昭和63年度よりの通算で妊婦25150例でATLウイルス抗体が検査され,113例の(0.45%)が陽性と判定された。うち妊娠終了した例は108例であるが,妊婦検診の途中で転院して分娩施設不明例,岡山県で里帰り分娩し現住所へ帰った例,新生児死亡となった例などがあるためfollw up対象例は70例である。5例は現在妊娠中である。follwup対象例のなかにも定期検診に来院しない例もあり,以下の成績は協力の得られた症例についての結果である。栄養法は64例中,完全人工乳53例,凍結母乳4例,加温母乳1例,もらい乳1例で64例中57例(89.1%)は感染防止のための栄養法を選択したが,64例中6例(9.4%)は通常の母乳栄養を選択した。臍帯血中のATLウイルス抗体は検査された53例中すべて陽性であった。出生後のfollow up成績は,生後12カ月以上経過した児は15例(うち母乳栄養3例)であり,いずれも抗体は陰性であった。家系調査の結果は,まず対象児の同胞で母乳栄養され生後1年以上経過している児についてATLウイルス抗体を検査したところ、18例中5例(27.8%)で陽性であり感染が成立していると考えられた。感染経路について妊婦,配偶者,母方父方祖父母について調査するとATL多発地域出身家系が74例中40例(54.1%),白血病家系が2例,供血歴がある妊婦が2例,家族に供血歴が1例,前述のいずれもない家系が29例(39.2%)であった。従来,配偶者感染は夫から妻への感染が主で,妻から夫への感染はないとされている。抗体陽性妊婦の配偶者(夫)について検査すると,43例中7例(16.3%)がATLウイルス抗体陽性であった。7例中配偶者(夫)の家系のみがATL多発地域である例が3例で,逆に妊婦の家系のみがATL多発地域である例が3例あった。家族全体の詳細な抗体検査は困難であるが,この結果は妻から夫への感染の可能性を示唆する結果である。妊婦12049例でATLウイルス抗体が検査され、62例が酵素抗体法とwestern blot法で陽性と判定された。すでに出生した児は50名であるが、妊婦検診の途中で転院して分娩施設不明例や、岡山県で里帰り分娩し現住所へ帰った例、follow up対象であるが出生後来院しない例なとがあるため、結局出生児50名中35名がfollow upされている。残る12例は現在妊娠中である。感染予防のための栄養法について同意の得られたのは30例で、うち29例は完全人工乳、1例は凍結解凍母乳で栄養された。同意の得られなかった5例が母乳投与されている。臍帯血中のATLウイルス抗体は検査された20例中すべて陽性であった。母乳中(初乳もしくは生後7日以内)のATLウイルス抗体は、検査された13例中9例(69.2%)で陽性であった。今年度出生した児は、まだ生後日が浅く母体よりの移行抗体(lgG)が検出されているので感染の有無についての判定は困難である。家系調査の結果は、まず今年度出生した児の同胞で母乳栄養された生後1年以上経過している児についてATLウイルス抗体を検査したところ、18例中5例(27.8%)で陽性であり感染が成立していると考えられた。次いで、配偶者(夫)について検査すると、23例中7例(30.4%)がATLウイルス抗体陽性であった。これが配偶者間の感染であるか、あるいは両者とも結婚前より抗体陽性であったのかはさらに詳細な検討を要する。従来、配偶者感染は夫から妻への感染が主で、妻から夫への感染はないとされていたが、今回の検討では妻から夫への感染を示唆する家系もあった。ATLウイルス抗原検査については今年度は測定手技の確立に努めたため、次年度より測定を開始する。昭和63年度よりの通算で妊婦19375例でATLウイルス抗体が検査され、95例(0.49%)が陽性と判定された。うち妊娠終了した例は91例であるが、妊婦検診の途中で転院して分娩施設不明例、岡山県で里帰り分娩し現住所へ帰った例、新生児死亡となった例などがあるためfollow up対象例は63例である。4例は現在妊娠中である。follow up対象例のなかには出生後の検診に来院しない例もあり、以下の成績は協力の得られた症例についての結果である。栄養法は60例中、完全人工乳49例、凍結母乳4例、加温母乳1例、もらい乳1例で61例中55例(90.2%)は感染防止のための栄養法を選択したが、61例中6例(9.8%)は通常の母乳栄養を選択した。臍帯血中のATLウイルス抗体は検査された49例中すべて陽性であった。出生後のfollow up成績は、生後18カ月を経過した児は9例であり、いずれも抗体は陰性であった。

家系調査の結果は、まず対象児の同胞で母乳栄養され生後1年以上経過している児についてATLウイルス抗体を検査したところ、18例中5例(27.8%)で陽性であり感染が成立していると考えられた。感染経路について妊婦、配偶者、母方父方祖父母について調査するとATL多発地域出身家系が71例中39例(54.9%)、白血病家系が2例、供血歴がある妊婦が2例、家族に供血歴が1例、前述のいずれもない家系が27例(38.0%)であった。従来、配偶者感染は夫から妻への感染が主で、妻から夫への感染はないとされている。抗体陽性妊婦の配偶者(夫)について調査すると、42例中7例(16.7%)がATLウイルス抗体陽性であった。7例中配偶者(夫)の家系のみがATL多発地域である例が3例で、逆に妊婦の家系のみがATL多発地域である例が3例あった。家族全体の詳細な抗体検査は困難であるが、この結果は妻から夫への感染の可能性を示唆する結果である。昭和63年度よりの通算で妊婦25150例でATLウイルス抗体が検査され,113例の(0.45%)が陽性と判定された。うち妊娠終了した例は108例であるが,妊婦検診の途中で転院して分娩施設不明例,岡山県で里帰り分娩し現住所へ帰った例,新生児死亡となった例などがあるためfollw up対象例は70例である。5例は現在妊娠中である。follwup対象例のなかにも定期検診に来院しない例もあり,以下の成績は協力の得られた症例についての結果である。栄養法は64例中,完全人工乳53例,凍結母乳4例,加温母乳1例,もらい乳1例で64例中57例(89.1%)は感染防止のための栄養法を選択したが,64例中6例(9.4%)は通常の母乳栄養を選択した。臍帯血中のATLウイルス抗体は検査された53例中すべて陽性であった。出生後のfollow up成績は,生後12カ月以上経過した児は15例(うち母乳栄養3例)であり,いずれも抗体は陰性であった。家系調査の結果は,まず対象児の同胞で母乳栄養され生後1年以上経過している児についてATLウイルス抗体を検査したところ、18例中5例(27.8%)で陽性であり感染が成立していると考えられた。感染経路について妊婦,配偶者,母方父方祖父母について調査するとATL多発地域出身家系が74例中40例(54.1%),白血病家系が2例,供血歴がある妊婦が2例,家族に供血歴が1例,前述のいずれもない家系が29例(39.2%)であった。従来,配偶者感染は夫から妻への感染が主で,妻から夫への感染はないとされている。抗体陽性妊婦の配偶者(夫)について検査すると,43例中7例(16.3%)がATLウイルス抗体陽性であった。7例中配偶者(夫)の家系のみがATL多発地域である例が3例で,逆に妊婦の家系のみがATL多発地域である例が3例あった。家族全体の詳細な抗体検査は困難であるが,この結果は妻から夫への感染の可能性を示唆する結果である。
重金属によるコラ-ゲン架橋酵素とメタロチオネインの誘導合成能に関する研究

カドミウム(Cd)の気管内投与でラット肺リジルオキシダ-ゼ(LO)活性が増加する。このような作用の惹起はCdに限られ、銅(Cu)や亜鉛(Zn)では起こらなかった。この酵素活性の増加は同時に、肺メタロチオネイン(MT)の増加を伴っていた。CuやZnの投与では酵素活性の増加もMT増加も認めなかった。またCdによって増加したLO活性はDEAE-セルロ-スカラムによるクロマトグラフィ-では単一にピ-クとして低濃度食塩溶液で溶離された。この溶離パタ-ンは高濃度食塩水で複数のピ-クに分離される正常組織のLO活性のそれとは明らかに異なっていた。しかしCdで増加した活性は時間の経過と共に高濃度食塩水で正常組織の活性とほぼ同様に複数のピ-クに分離されるようになった。これら所見からCdは肺でLOをde novoに誘導合成したと考えられる。この誘導合成はMTの其れとほぼ平行して認められた。このようにLOとMTの誘導合成は互いに連関して起こることを示唆している。すなわち、LOの合成は組織中の遊離または蛋白と弱く結合したCuによって制御されると一般に説明されている。この説明はCu欠乏症や組織内の遊離Cuに減少を特徴とするMenke's Kinky Hair症候群における低LO活性に対する他の人々の研究で明らかにされている。したがって、Cdによって誘導されたMTがCdのみならずCuとも相互作用してCu代謝の変化を来し、LO合成に有効なCuレベルを上昇させ、LO合成の増加に導くと考えられる。またCdによるLOやMT合成に先行して組織内グルタチオン(GT)濃度の減少を発見した。多分、GTの減少はCdとGTが反応する結果と考えられる。このようなGTの減少はCd毒性に対するthe first defence mechanismとして働くのみならずMTおよびLOの誘導合成に密接に関連していることを伺わせる知見をもえた。
各種病態における痛覚系の機能の解析

[目的]急性および慢性の炎症状態時や末梢神経傷害時の痛みの形成には正常では見られない機構が関与していることが明らかにされつつあるが、未解決な部分が多い。末梢の痛覚受容器のひとつであるポリモーダル受容器は急性炎症通と関係が深く、その興奮性は炎症関連物質や組織温度などにより容易に修飾される。さらに近年、末梢神経傷害時や慢性炎症痛においてはポリモーダル受容器活動への交感神経系の影響が明らかとなってきた。しかしながら受容器活動に対する炎症作動物質による修飾様式、受容器における符号変換過程、さらには中枢での他の神経系活動の影響などの詳細は不明である。これまで痛覚受容器における痛覚情報受容・変換機構は、単一神経線維の細胞外活動電位の放電頻度の変化を指標にして調べられてきたが、受容器自体においては、その微小な構造のため全く知られていない。我々は後根神経節細胞の発痛物質(カプサイシン)に対する反応が、一次求心性C線維で見られたものとよく似ているという結果を得ている。このことは受容器の膜とその細胞体の膜が同じ性質を持ち、細胞体で受容器ので痛覚情報受容・変換機構を解析できることを強く示唆する。そこで、平成6年度は脊髄神経節の初代培養細胞からの細胞内記録(日本側)およびパッチクランプ記録(日独共同)により、炎症作動物質による膜電位変化、膜電流に対する作用を正常動物で調べた。[実験方法]オスラット(Wistar,80-200g)からL4,L5,L6の両側のDRGを取り出し、Collagenaseで酵素処理(32°C、4560分)したのち、CO_2インキュベータ-(5%CO_2,37°C)で培養した。培養液にはDMEM(pH=7.4)を用い、NGF(100ng/ml)を加えた培養と加えない培養を行った。細胞内記録を行なった。実験は35ミリ分離用シャーレを記録用チャンバーとし、哺乳動物末梢神経単離用灌流液をペリスタリックポンプで灌流(1ml/min)しながら行なった。灌流液組成(mM)はHEPES,10;NaCl,150;KCl,5;CaCl_2,2;MgCl_2,1.3;Glucose,10で、100%O_2ガスで飽和し、Tris-bufferでpH=7.4に調整したものを用いた。細胞内記録(電流固定法)とパッチクランプ記録(電圧固定法)はガラス微小電極を用いて、位相差倒立顕微鏡の直視下で行なった。細胞から得られた膜電位,膜抵抗、膜電流のアナログデーターは、ペンレコーダーに記録するとともに、AD変換器でデジタル化しコンピューター解析(Pclamp6.0)を行った。細胞へ薬物の投与は安定した記録を得た後にY-tube法を用いて行なった。カプサイシン(CAP)は痛覚受容器に特異的に作用するといわれているので、細胞の同定はCAP-感受性の有無により調べた。[結果](1)24時間以内の培養では、炎症作動物質であるブラジキニン(BK)は、カプサイシン感受性細胞の膜電位、膜抵抗、膜電流に対して特に影響を及ぼさなかった。(2)48時間以上の培養細胞では、BKはカプサイシン感受性細胞を脱分極させ、その脱分極により多くの細胞は活動電位を発生した。NGFを加えた培養細胞におけるBKによる脱分極は、NGFを加えなかったものと比較して大きかった。[今後の展望]現在、BK,PGE_2反応における受容体のタイプや、それらの修飾作用等について実験を進行中である。さらに今後、正常動物と急性および慢性炎症状態の動物とで比較検討することにより、病態時における痛み形成の機構を解明出来るであろう。

培養液にはDMEM(pH=7.4)を用い、NGF(100ng/ml)を加えた培養と加えない培養を行った。細胞内記録を行なった。実験は35ミリ分離用シャーレを記録用チャンバーとし、哺乳動物末梢神経単離用灌流液をペリスタリックポンプで灌流(1ml/min)しながら行なった。灌流液組成(mM)はHEPES,10;NaCl,150;KCl,5;CaCl_2,2;MgCl_2,1.3;Glucose,10で、100%O_2ガスで飽和し、Tris-bufferでpH=7.4に調整したものを用いた。細胞内記録(電流固定法)とパッチクランプ記録(電圧固定法)はガラス微小電極を用いて、位相差倒立顕微鏡の直視下で行なった。細胞から得られた膜電位,膜抵抗、膜電流のアナログデーターは、ペンレコーダーに記録するとともに、AD変換器でデジタル化しコンピューター解析(Pclamp6.0)を行った。細胞へ薬物の投与は安定した記録を得た後にY-tube法を用いて行なった。カプサイシン(CAP)は痛覚受容器に特異的に作用するといわれているので、細胞の同定はCAP-感受性の有無により調べた。[結果](1)24時間以内の培養では、炎症作動物質であるブラジキニン(BK)は、カプサイシン感受性細胞の膜電位、膜抵抗、膜電流に対して特に影響を及ぼさなかった。(2)48時間以上の培養細胞では、BKはカプサイシン感受性細胞を脱分極させ、その脱分極により多くの細胞は活動電位を発生した。NGFを加えた培養細胞におけるBKによる脱分極は、NGFを加えなかったものと比較して大きかった。[今後の展望]現在、BK,PGE_2反応における受容体のタイプや、それらの修飾作用等について実験を進行中である。さらに今後、正常動物と急性および慢性炎症状態の動物とで比較検討することにより、病態時における痛み形成の機構を解明出来るであろう。
核酸の二重らせん形成エネルギーの予測と測定

1.各種の塩基配列をもつDNAオリゴヌクレオチドをホスホロアミダイト法によって化学的に固相合成した。これらの合成オリゴマーの二次構造のUV融解曲線から安定化エネルギーを算出した。その結果,GCとATの塩基対数が同どヌクレオチド二重らせんでもその安定性がかなり異なることが示された。例えば,GC塩基対が二つ,AT塩基対が六つからなるd(TCTATGGA)とd(AATGCATT)の自己相補的二重らせんの安定化エネルギー(25°Cにおける自由エネルギー)は-6.05kcal/mol^<-1>,-8.48kcal mol^<-1>と,2.43kcal mol^<-1>も異なることがわかった。この理由は,塩基配列,特に最近接塩基対に依存するエネルギーの総和が,二重らせん形成のエネルギーを決定していることにあることが認められた。これらの実験値および計算値より,任意の一次塩基配列に対応するDNAの安定化二次構造を予測し得るエネルギーパラメータの開発を行なった。現在のところ,約100塩基程度のDNAの溶液中での安定化及び準安定化構造の予測に成功している。2.各DNAオリゴマーの二重らせん構造の融解及び形成の反応を,温度ジャンプ装置を用いて追跡した。その結果,例えば,20°Cにおいてd(TAGATCTA)及びd(TCTATAGA)では各々40ms,50ms以内で反応は終了した。また,二重らせん形成の活性化エネルギーは,d(TAGATCTA)及びd(TCTATAGA)で,各々-2.9,-3.5kcal mol^<-1>と負の値を示した。これらの結果及び安定化エネルギーの結果より,DNA二重らせん形成の核形成には少くとも二つ以上の塩基対形成が必要であることが明らかとなった。
新規耐熱性β-ガラクトシダーゼのX線結晶構造解析

前年度には、新規好熱菌由来β-ガラクトシダーゼ(A4-βGal)の結晶構造を解明することに成功し、nativeおよびガラクトース複合体構造において1.6Åおよび2.2Å分解能の構造がそれぞれ得られた。本構造は、糖質加水分解酵素ファミリー42としては世界初の立体構造であった。本年度は、この構造のさらに詳細な解析と、その結果の国際誌への論文発表を行い、さらに、活性が大幅に上昇した変異体の機能解析・立体構造解析を行った。A4-βGalは植木鉢状の3量体構造をとっており、全体の約20%を占める接触面において強い相互作用で結びついていた。本酵素が産業上有用な酵素である所以であるところの高い耐熱性は、この強力な相互作用によるものであることが推測された。また、活性部位の形成に、隣のサブユニットの残基が関与しており、活性の発現にも3量体化が必要であることが分かった。このように多量体化により活性部位を形成している例は糖質加水分解酵素の中では初めての例であった。なお、ガラクトースの認識機構は、構造既知の大腸菌βガラクトシダーゼとは全く異なっており、新規の基質認識機構が発見された。さらに、A4-βGalの反応機構はアノマー保持機構に従うことを、ファミリー42酵素では初めて、実験的に証明した。しかし、驚くべきことに、本酵素の全体的な立体構造は、本酵素と全く異なる反応機構(アノマー反転機構)に従うβアミラーゼとよく似ていた。従って、本酵素は糖質分解酵素で普遍的に見られる(α/β)8バレルの進化の上で特異な存在であることが明らかになった。これまで、共同研究者の大津らにより、本酵素の活性が大幅に上昇する変異体(P317S, H323Yおよびそれらの2重変異体)が得られていたが、我々はこれらの機能解析により、P317Sでk_<cat>の上昇、H323YでK_mの減少が起こり、2重変異体ではk_<cat>/K_mで約5.5倍の活性上昇が引き起こされることを見いだした。現在、2重変異体で1.8Å分解能の立体構造を得ており、変異の導入に伴う構造変化が活性中心残基へ伝わることにより、活性の上昇が引き起こされることを見いだしている。本研究の成果の一部は、「応用糖質科学誌」、Journal of Molecular Biology、「構造生物」に掲載された。現在、活性の上昇した変異体の機能・構造解析に関する論文の投稿を準備中である。本年度は、新規耐熱性β-ガラクトシダーゼ(A4-βGal)の結晶構造を解明することに成功した。さまざまな条件で結晶化を行い、つくば・高エネルギー加速器研究機構・放射光施設および西播磨・SPring-8においてデータ測定を行い、MAD法により構造を決定した。現在、native構造において分解能1.6ÅでR因子16.9%、ガラクトースを含む複合体構造において分解能2.2ÅでR因子18.4%の構造をそれぞれ得ている。本構造は、グリコシドヒドロラーゼファミリー42としては世界初の立体構造である。A4-βGalは植木鉢状の3量体構造をとっており、その接触面積は大きく、強い相互作用でお互いが結びついていた。本酵素が産業上有用な酵素である所以であるところの高い耐熱性は、このサブユニット間の相互作用によるものであることが推測された。また、活性部位の形成に、隣のサブユニットの残基が関与しており、活性の発現にも3量体化が必要であることが分かつた。A4-βGalは(α/β)_8バレルフォールドをとっており、4番目と7番目のβストランドのC末端側にそれぞれ活性中心残基が存在していた。活性部位は植木鉢状分子の内壁に単量体あたり1カ所存在していた。活性中心残基では、構造既知の大腸菌βガラクトシダーゼとよく似た立体構造をとっていたが、ガラクトースの認識環境が大幅に変化していることが明らかとなった。また、活性部位がラクトース分子に適応するようなポケット状になるためには、3量体化が必要であることが見て取れた。このように多量体化によりポケット状の活性部位を形成している例はグリコシルヒドロラーゼファミリーの中では初めての例であった。本研究の成果の一部は、応用糖質科学誌に掲載予定であるが、これは2001年度応用糖質科学会での発表の紀要であるため、現在、英文誌への原著投稿論文を作成中である。

このように多量体化により活性部位を形成している例は糖質加水分解酵素の中では初めての例であった。なお、ガラクトースの認識機構は、構造既知の大腸菌βガラクトシダーゼとは全く異なっており、新規の基質認識機構が発見された。さらに、A4-βGalの反応機構はアノマー保持機構に従うことを、ファミリー42酵素では初めて、実験的に証明した。しかし、驚くべきことに、本酵素の全体的な立体構造は、本酵素と全く異なる反応機構(アノマー反転機構)に従うβアミラーゼとよく似ていた。従って、本酵素は糖質分解酵素で普遍的に見られる(α/β)8バレルの進化の上で特異な存在であることが明らかになった。これまで、共同研究者の大津らにより、本酵素の活性が大幅に上昇する変異体(P317S, H323Yおよびそれらの2重変異体)が得られていたが、我々はこれらの機能解析により、P317Sでk_<cat>の上昇、H323YでK_mの減少が起こり、2重変異体ではk_<cat>/K_mで約5.5倍の活性上昇が引き起こされることを見いだした。現在、2重変異体で1.8Å分解能の立体構造を得ており、変異の導入に伴う構造変化が活性中心残基へ伝わることにより、活性の上昇が引き起こされることを見いだしている。本研究の成果の一部は、「応用糖質科学誌」、Journal of Molecular Biology、「構造生物」に掲載された。現在、活性の上昇した変異体の機能・構造解析に関する論文の投稿を準備中である。
尿路結石予防を目的としたオステンポンチン機能的アミノ酸配列の役割解明

OPNはトロンビンで切断されることによって、SVVYGLR配列(マウスではSLAYGLR配列)が、C末端に表れることによって、a9β_1integrinとの結合能など、炎症細胞の遊走に機能すると考えられる。今回同部位に対する抗体を作製し、結石形成への影響を検討した。抗体は、北海道大学遺伝子制御研究所との共同研究により、合成ペプチド(VDVPNGRGDSLAYGLRS)をマウスに免疫して、脾臓からB細胞を採取したのち、ハイブリドーマ形成させ、モノクロナール抗体を作製した。In vitroにおいて、NRK細胞にCOM結晶を蒔いたのち、抗体を投与しCrystal cell interactionを検討したところ、抗体投与により、COM結晶の細胞への接着が低下した。In vivoにおいては、8週齢C57BL/6マウスに対して、100mg/kgのグリオキシル酸を連日腹腔内投与し、投与-1、2、5, 8日目に作成した抗SLAYGLR抗体を腹腔内に投与(250μg、500μg、1000μg)した。抗体投与群では、抗体濃度依存性に結晶形成量が減少した。また走査型電子顕微鏡により結晶形態を観察したところ、正常群の結晶は放射線状に成長する密度の高いものとなるものの、抗体投与群においては、結晶がばらばらと細かくなる傾向を認めた。OPN抗体は、細胞と結晶との接着を低下させることで、結晶形成を抑制に働くことが示唆された。同部位の抗体を臨床に応用することで、尿路結石予防における分子標的治療に繋がる可能性がある。
作用素環における力学系の代数的,位相的,測度論的研究

1.作用素環における力学系の代数的,位相的,測度論的研究:岡安は,C*環における完全縮小写像の見地からHilbert空間上の縮小作用素に関する拡大定理の拡張を試み,1変数に対応する場合については成功した.一般の場合については現在考察中である.河村は位相力学系とそれに付随する作用素環の関係について研究した.中里は,不定内積を利用してある種のC*環の微分演算子の構造について研究した.また,リ-代数の複素包絡環の*表現と正元について研究している.佐藤は,Lp(G)(Gは局所コンパクト可換群)上の平行移動に関して不変な有界作用素が作る空間において,あるスペクトルをもつ測度が存在することを示した.2.多様体上の変換群,力学系の研究:内田は,(2nー1)次元連絡閉多様体上のSL(n,C)の滑らかな作用の分類問題が,ある種の力学系の分類問題に帰着できることを示した.井伊は,リ-群のsymplectic作用によるハミルトン力学系の第一積分の構成について研究した.仲田は,n次元ユ-クリッド空間の単位開球に作用するメビウス変換の不連続群の,ポアンカレ級数の収束指数について研究した.諸沢は,無限生成フックス群の極限集合を分類し,その部分集合の大きさをハウスドルフ次元を用いて調べた.また佐伯は,2次元球面とホモトピ-同値な4次元多様体について研究した.3.代数多様体上の力学系の微分子環の観点からの研究:福田はGreenberg予想を整数環の正規底と関連ずけて研究を進めている.これらの結果のうち幾つかは既に出版されている.また他のものは投稿中ないしは投稿準備中である.1.作用素環における力学系の代数的,位相的,測度論的研究:岡安は,C*環における完全縮小写像の見地からHilbert空間上の縮小作用素に関する拡大定理の拡張を試み,1変数に対応する場合については成功した.一般の場合については現在考察中である.河村は位相力学系とそれに付随する作用素環の関係について研究した.中里は,不定内積を利用してある種のC*環の微分演算子の構造について研究した.また,リ-代数の複素包絡環の*表現と正元について研究している.佐藤は,Lp(G)(Gは局所コンパクト可換群)上の平行移動に関して不変な有界作用素が作る空間において,あるスペクトルをもつ測度が存在することを示した.2.多様体上の変換群,力学系の研究:内田は,(2nー1)次元連絡閉多様体上のSL(n,C)の滑らかな作用の分類問題が,ある種の力学系の分類問題に帰着できることを示した.井伊は,リ-群のsymplectic作用によるハミルトン力学系の第一積分の構成について研究した.仲田は,n次元ユ-クリッド空間の単位開球に作用するメビウス変換の不連続群の,ポアンカレ級数の収束指数について研究した.諸沢は,無限生成フックス群の極限集合を分類し,その部分集合の大きさをハウスドルフ次元を用いて調べた.また佐伯は,2次元球面とホモトピ-同値な4次元多様体について研究した.3.代数多様体上の力学系の微分子環の観点からの研究:福田はGreenberg予想を整数環の正規底と関連ずけて研究を進めている.これらの結果のうち幾つかは既に出版されている.また他のものは投稿中ないしは投稿準備中である.
「人生」の修辞的構築に関する計量研究

本研究では、1934年、1964年、1994年の三時点の読売新聞(関西版)から、それぞれ、110,117,116合計343の身の上相談記事を系統抽出した。これをテキストファイルとしてコンピュータに入力した。入力された身の上相談記事は、awkスクリプトを用いてコンピュータ・コーディングした。その結果、具体的には以下のようなことが明らかになった。第一に、「個々人自らが判断する生活効率の基準」を超えた社会規範、倫理に関わる言明を行っているかどうかをまず調べた。具体的には「罪」「恥」という概念のいずれかを用いているかどうかを調べた。その結果、近年になるにしたがって、このような概念を用いて自己のおかれている状況を定義するような相談記事はますます少なくなってきていることが分かった。第二に、親子、学校、近隣関係といった人間関係へ言及しているかどうかを調べた。その結果、親子、結婚、離婚といった第一次的な人間関係に言及する相談が最近になるにしたがって減少していることが分かった。第三に、相談の中にあらわれる主題の増減を調べた。貧困、病気、セクシャリティといった主題への言及は最近になるにしたがって減少していることが分かった。それに対して、「孤独」「精神的問題」「困った性格」といった個人の内面に注目するような主題が増加していることが分かった。全体としてみると、自分のおかれている状況をとらえる際に、他者や社会制度・倫理との関係を顧慮せず、自分の内面を見つめるような個人主義的人間観が強まる傾向が明らかになった。このような発見は人々が自分の人生を意味付け、記述する際に用いる修辞的な特徴を分析することによって明らかになったものである。今年度は、読売新聞紙上の身の上相談にあらわれた人々の「不幸」の特徴とその歴史的変化を探求することを通して、不定型データの分析法を模索することに研究の重点が置かれた。まず、1934年、1964年、1994年の三時点に関して、それぞれ、約110強、合計343の身の上相談記事を系統抽出した。次に、そのすべての記事をテキストファイルに変換した。1994年については、オンライン上から記事の大部分が入手できるので、テキストファイルに変換する手間はほとんど必要ないが、1964年、1934年の記事に関しては、オンライン上から入手できない。そこで、記事のコピーを入手し、OCRでテキストファイルに変換することを試みたが、文字がつぶれているため、現在のスキャナやOCRソフトの水準では、不可能であった(デジタルカメラも使ってみたが、スキャナよりも精度が低いため、うまく行かなかった)。最終的には、手作業で記事を入力した。個々の記事に関して、autocode.awkを使い、コーティングした。これを計量分析し、相談の内容、その背後にある生活世界の歴史的変化を考察した。相談者に関しては、1934年では、ほとんどが20代の女性であったのが、次第に高齢者も含めた広範な年齢層に広がっていった。相談の内容に関しては、社会関係や家族制度との軋轢から生じる悩みが次第に減っていき、自己の内面に焦点を合わせた悩みが増えていくという傾向が明らかになった。
組織球にアミロイドを異物として認識、処理させる

(1)マウスにマウスSAAの一部(マウスSAA18-35)に相当するMAPペプチドを免疫し、抗体ができるかどうかについて検討した。マウスによっては抗体価の上昇がみられ、採取した血清を用いてマウスAAアミロイドの免疫染色を行ったところ、やや反応性は弱いがアミロイドと反応がみられた。次にこのMAPペプチド(SAA18-35)の投与によりマウスAAアミロイドーシスのワクチン療法が可能であるかどうかについて検討した。MAPペプチド(SAA18-35)を免疫後、complete Freund's adjuvantとM.butyricumのエマルジョンによりAAアミロイドを惹起する実験および、AAアミロイド惹起後MAPペプチドを免疫する実験を行った。マウスによっては軽度の抗体価上昇がみられたが、アミロイド沈着の抑制あるいは吸収促進効果はみられず、逆にアミロイド惹起後免疫をおこなった群ではコントロール群と比較して多量のアミロイド沈着がみられた。コントロール群(アミロイド惹起後12週放置)では惹起後2週放置のマウスと沈着態度が異なり、赤脾髄に小結節状に沈着していた。アミロイド周囲にはF4/80陽性の組織球浸潤がみられ、これらの組織球がアミロイド吸収に関与している可能性が示唆された。免疫を行ったマウスに多量のアミロイド沈着がみられた原因として、アジュバント(Titer MAX Gold)を用いた免疫自体がアミロイド惹起刺激となってしまった可能性が考えられる。今後MAPペプチドのみによる免疫等、アミロイド沈着を誘発しない免疫方法を模索していきたい。(2)マウスに上記と同様のAAアミロイド惹起刺激を行い、さらに免疫系の賦活日的で酵母抽出物あるいはキトサンをマウスに投与したが、アミロイドの吸収促進効果はみられず、キトサンではコントロール群とほぼ同等、酵母抽出物ではやや多いアミロイド沈着がみられた。まずアミロイド沈着物と組織球の関連をみる目的でヒトAAアミロイド6例、ALアミロイド6例、Aβ2Mアミロイド3例について組織化学的および免疫組織化学的検討を加えた。アミロイド中への組織球の浸潤は症例および部位によりまちまちであり、ほとんどあるいは全く組織球浸潤がみられない部も存在した。異物型多核巨細胞はAA1例、AL5例、Aβ2M3例にみられ、巨細胞がアミロイドの小塊を取り囲んでいる部も存在した。AGEであるCMLおよびペントシジンの免疫組織化学的検討ではAL2例において一部(巨細胞がアミロイドの小塊を取り囲んでいる部)に陽性像がみられ、ALアミロイドにおけるAGEの存在を初めて証明しえたが、巨細胞が出現している多くの部は陰性であった。またAAアミロイドーシスにおいて、分解途中のSAAを検出する目的でマウスSAA81-93を認識するウサギ抗血清を作成し、免疫組織化学的検討を行ったところ、2例にアミロイドの辺縁を縁取るような陽性像が得られたが、必ずしも組織球浸潤部位とは一致していなかった。以上のことから組織球はアミロイドの沈着に必須であるとはいえず、特に異物型多核巨細胞は、アミロイドが生体から異物として認識された結果、アミロイドを吸収するために出現している可能性が示唆される。またAGEのうちCMLおよびペントシジンはアミロイドが異物として認識される課程で部分的な役割を果たしている可能性はあるが、主要な役割を担っているとは考えにくい。in vivoでの組織球によるアミロイド吸収促進実験については、マウスへのワクチンあるいは抗体投与のため、抗原とする合成ペプチドおよび、NativeなSAAとの反応が比較的弱いウサギ抗マウスAAアミロイド抗血清を作製した。今後これらの抗原あるいは抗血清投与により組織球によるアミロイド吸収促進が起こるか否かを検討する。
体節形成における、オシレーション分子Heslの解析

bHLH型転写因子であるHesファミリー分子は、様々な発生過程で働く事が報告されている。その転写抑制の分子機構は主に哺乳類培養細胞を使った実験により明らかにされており、核内で2量体を形成しDNAに結合し、転写抑制因子と結合しターゲット遺伝子の転写を抑制する機構が知られている。Hes7タンパクはユビキチンプロテアソーム系で分解される。Hes7タンパクが持つ7つのリジン残基をひとつずつアルギニンに置換した7つのK→Rミュータントを作成した。bHLH領域にある2252 55番目のリジン残基をアルギニンに置換したミュータントはそのタンパク半減期が長くなった。これら3つのサイトでユビキチン化修飾が起きていることが予測される。さらに予想外にもこの3つのミュータントは転写抑制活性が失わていた。また3つのミュータントは、二量体形成、核内移行、転写抑制因子TLEとの結合、DNA結合能は失われていなかった。一方で、Myc, SREBP, CIITA, Gal VP16など多くの転写活性化因子の活性がユビキチンやプロテアソームにより制御されている事例が報告されている。これらの実験データと知見より、Hes7タンパクもその転写抑制活性にユビキチンプロテアソーム系で制御されていると仮定し実験を行っている。現在、温度変異細胞株を用いるなどしてユビキチン化を阻害、Hes7タンパクのモノユビキチン化をミミックするコンストラクトを作成、プロテアソーム活性の阻害剤存在下などで転写抑制活性を測定している。これらの実験よりユビキチン化もしくはプロテアソーム系がHes7タンパクの転写抑制活性を制御している事を示そうとしている。HESタンパク相互作用因子の網羅的探索本研究の目的は、酵母ツーハイブリッド法を用いてbHLH型転写抑制因子Hesの生体間分子相互作用分子を網羅的に探索することで、発生過程における分子機序の解明を目指している。現在ではユビキチン化およびSUMO化によるHESタンパクの分子特性の制御の解明を目指している。前年度酵母ツーハイブリッド法でクローニングされたSUMO化経路の因子との結合を新たに共免疫沈降法を用いて証明し、結合ドメインを明らかにした。さらに現在培養細胞化でのSUMO化修飾を検討しており、その修飾部位の決定を行っている。今後は、SUMO化修飾により新たに付与される分子特性の同定を目指すと共に、その生体での意義をトランスジェニックマウスおよびノックインマウスの作製などの発生工学的手法を用いて検討する。Hesノックアウトマウスの解析左右軸形成現在までにマウス結節領域で左右非対称に発現する因子は3つの遺伝子が知られており、いずれも細胞外シグナル伝達に関与するものと考えられている。そのうちの一つの遺伝子DanteはBMPシグナルのアンタゴニストとして働くことが予想されており、マウス結節領域の右側で強く発現する(他の因子は左側で強く発現する)ことが報告されている。当研究員はマウス結節領域のHes mRNAの発現が非対称であることを示唆するデータを得ており、さらにHes mRNAの発現領域および発現時期がDanteとほぼ同じでありながらも、Hesは左側に強く発現し、Danteは右側に強く発現していることを明かにした。現在は転写抑制因子HesがDanteの転写制御に関与するものと予想しその機構の解明を目指している。一昨年度より継続しているHes1タンパクの翻訳後修飾と共に、体節形成において周期性をつかさどる事がノックアウトマウスなどの研究結果から示唆されているオシレーション分子Hes7の翻訳後修飾の研究もしており、以下のような新規な結果を得つつ今後の方向性を探っている。bHLH型転写抑制因子HES7はリジン残基を7個持つ。当研究室の以前の報告で、個々のリジン残基をそれぞれアルギニンに置換したK→Rミュータントを作成し転写抑制活性を測定したところ、HLHドメイン内の3つのリジン残基をアルギニンに置換した3つのミュータントは転写抑制能を失っている事が知られていた。昨年度よりこの3つのミュータントが転写抑制活性の喪失する機構について検討した。Hesファミリーの内Hes1分子の転写抑制機構は比較的よく調べられている。核内への移行後、ホモダイマーを形成しDNAコンセンサス配列に結合しC末端にあるWRPWモチーフを介してコリプレッサーTLE分子をリクルートする。Hesファミリー分子群は互いにドメイン構造もよく似ており、Hes7分子もHes1分子と同じ作用機序で転写抑制能を発揮すると仮定し、Hes7ミュータント分子群および野生型を培養細胞に強制発現しホモダイマー形勢、核内移行、TLEとの結合を検討した。またEMSA法でDNA結合能をWTとミュータント群で検討した。以上の4つの実験で野生型や転写抑制活性の喪失が見られなかった4つのミュータント群と3つのミュータント顕著な差は見られなかった。したがって、既知のHesファミリー分子の転写抑制機序では説明できない新たなメカニズムの存在が示唆された。一方で、Hes7タンパクがユビキチン-プロテアソーム系で分解される。野生型およびミュータントのタンパク半減期を調べたところ、転写抑制活性を失った3つのK→Rミュータント(HLHドメインのリジンを→アルギニン)は野生型などに比べてタンパク半減期が長い事が明らかとなった。この結果より、Gal4、SREBPなど多くの転写活性化因子でユビキチン化が転写活性化に必須である事が示されているものの転写抑制因子では報告が無い。

現在、我々は一つの仮説として、転写抑制因子Hes7もユビキチン化によりその活性化が制御されているのではないか?と仮定し実験を行なっている。bHLH型転写因子であるHesファミリー分子は、様々な発生過程で働く事が報告されている。その転写抑制の分子機構は主に哺乳類培養細胞を使った実験により明らかにされており、核内で2量体を形成しDNAに結合し、転写抑制因子と結合しターゲット遺伝子の転写を抑制する機構が知られている。Hes7タンパクはユビキチンプロテアソーム系で分解される。Hes7タンパクが持つ7つのリジン残基をひとつずつアルギニンに置換した7つのK→Rミュータントを作成した。bHLH領域にある2252 55番目のリジン残基をアルギニンに置換したミュータントはそのタンパク半減期が長くなった。これら3つのサイトでユビキチン化修飾が起きていることが予測される。さらに予想外にもこの3つのミュータントは転写抑制活性が失わていた。また3つのミュータントは、二量体形成、核内移行、転写抑制因子TLEとの結合、DNA結合能は失われていなかった。一方で、Myc, SREBP, CIITA, Gal VP16など多くの転写活性化因子の活性がユビキチンやプロテアソームにより制御されている事例が報告されている。これらの実験データと知見より、Hes7タンパクもその転写抑制活性にユビキチンプロテアソーム系で制御されていると仮定し実験を行っている。現在、温度変異細胞株を用いるなどしてユビキチン化を阻害、Hes7タンパクのモノユビキチン化をミミックするコンストラクトを作成、プロテアソーム活性の阻害剤存在下などで転写抑制活性を測定している。これらの実験よりユビキチン化もしくはプロテアソーム系がHes7タンパクの転写抑制活性を制御している事を示そうとしている。
キラルなNADHモデル化合物を用いた共役redox系の開発研究

我々は、高い不斉還元能を有するNADHモデル化合物を効率的に活用し、さらに高度な生体内反応のモデルへと展開していくために、本化合物を用いた共役redox系の開発研究を以下の4点を中心に行っている。1.酸化型モデル化合物から還元型モデル化合物への効率の良い変換法の確立2.触媒サイクルに最適なモデル化合物の探求3.触媒サイクルに適応可能な基質の探索4.NADHモデル化合物の高分子膜への固定化今回下図に示すような、NADHモデル化合物の1位置換基を変換するための方法を新たに開発することに成功し、本法により上述の1,2,4について幅広く検討を行った。この方法ではこれまで困難であったNADHモデル化合物の高分子への固定化も含め、様々な置換基を1位に導入することが可能となった。高分子へ固定化したモデル化合物に関してはこれまでに還元反応の進行を確認しており、現在は還元反応に用いた後の高分子結合モデル化合物(酸化型)を還元型へ変換する過程について検討を行っている。一方、実際に種々の置換基を1位に導入し、その不斉還元反応における反応速度について検討を行ったところ、反応速度定数とモデル化合物の基本骨格である1,4-ジヒドロピリジン環上の電子密度(分子軌道法により計算)との間によい相関が見られた。すなわちデモル化合物の還元能については分子軌道法により予測が可能となり、今後の分子設計に非常に有効であると考えられる。なお、この結果に関しては第114回日本薬学会年会(東京)において発表予定である。
新しいシヌクレイン遺伝子導入マウスを用いたパーキンソン病発症メカニズムの解明

α-シヌクレイン(α-syn)の遺伝子とその発現調整領域を含むBAC cloneを用いて、孤発性あるいはPARK4をモデルとするトランスジェニックマウス・ラットを作製した。α-synの凝集性や発現量を増加させる目的で、A53T変異の導入やRep1領域の改変、PDにおけるリスク一塩基変異(SNP)の導入を2か所に行い、BAC cloneを改変した。作製したモデルマウス・ラットを解析中であり、グルコセレブロシダーゼ(GBA)変異モデルとの交配モデルは、孤発性PDのよいモデルとなると期待される。時間的・予算的な制限から、Cre/loxPシステムを使用したモデル作製から、α-syn BACの改変を主としたモデル作製に計画を変更した。この際、孤発性PDのリスク因子として同定されたSNPはα-synの発現を増加させると考えられるが、我々のα-syn BAC cloneはリスクが減少するtypeのSNPを持っていることが判明した。このため、孤発性PDのリスク因子として同定された二つのalleleに対して、rs11931074(T→G)とrs3857059 (G→A)変異をRet/ET改変システムを用いて導入した。また、α-syn遺伝子の上流約10kbにあるRep1繰り返し配列に関しても、リスク因子となる繰り返し配列数(Rep 259bp→261bp)を導入した。さらに、α-synの凝集性を高めるために、A53T変異も同システムを用いて導入した。これらの改変BAC cloneを精製し、C57BL/6マウス受精卵にinjectonし、トランスジェニックマウスを作製した。さらに、BACトランスジェニックモデルにおいては、マウスよりラットの方がより高コピー数のlineを得られることが分かり、同コンストラクトを用いて、BACトランスジェニックラットも同様に作製した。現在、作製したモデルマウス・ラットを解析中であり、グルコセレブロシダーゼ(GBA)変異動物との交配モデルは、孤発性PDのよいモデルとなると期待される。パーキンソン病(PD)はカテコラミン細胞特異的細胞死と、α-シヌクレイン(α-Syn)を主成分とするLewy小体の存在を特徴とする。α-Syn遺伝子のSNP多型による発現亢進が遺伝要因として重要であり、タンパク分解系の障害など複合要因の付加で発症する。凝集化α-Synはタンパク分解装置proteasome(PS)を阻害し、生じた細胞内ストレスはα-Synの転写・凝集促進により悪循環を形成する。現在PDの特徴を再現するよい動物モデルが存在しないことが研究上の大きな障壁となっている。そこでBAC(細菌人工染色体)を用いてα-Syn遺伝子発現調整領域にCreを発現するCre/α-synマウスを作製し、1本来のα-Syn発現領域にヒトα-synを高発現するCre-loxP conditional Tgマウスを各々作製することにより、より忠実な孤発性PDマウスモデルの作製を目的とした。このマウスにおいて、α-Synの発現はCreの発現にある程度依存すると考えられ、Creの発現が実験の成否を左右すると考えられる。孤発性PDのリスク因子として同定されたSNPはCreの発現を増加させると考えられるが、我々のCre/α-syn BAC cloneはリスクが減少するtypeのSNPを持っていることが判明した。このため、我々の孤発性PDのリスク因子として同定されたSNPをCre/α-syn BACに導入することとした。ヒトα-syn BAC内で、Ret/ET systemを用いて、いくつかのリスク因子として同定されたSNPを改変した。また同様にα-syn発現上昇効果を持つとされるα-synのRep1配列の改変も行った。今後はこのBAC cloneを用いてCreマウスを作製する予定である。一方、α-syn/loxP Tgマウスに関しては、他施設から入手することとした。BAC(細菌人工染色体)を用いた、α-Syn遺伝子発現調整領域にCreを発現するCre/α-synマウスの作製において、一部方針を変更した。Cre-loxP conditional Tgマウスにおいてはα-Synの発現はCreの発現にある程度依存すると考えられ、Creの発現が実験の成否を左右すると考えられる。孤発性PDのリスク因子として同定されたSNPはCreの発現を増加させると考えられるが、我々のCre/α-syn BAC cloneはリスクが減少するtypeのSNPを持っていることが判明したため、我々の孤発性PDのリスク因子として同定されたSNPをCre/α-syn BACに導入することに方針を変更した。ヒトα-syn BAC内で、Ret/ET systemを用いて、いくつかのリスク因子として同定されたSNPやα-synのRep1配列を改変したが、改変に困難を伴い、これが研究にやや遅れがみられる主たる原因となった。本年度は改変Cre/α-syn BAC cloneを用いてCre/α-synマウスを作製する。α-syn/loxPTgマウスに関しては、他施設から共同研究として入手する予定とした。