hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
放線菌の二次代謝・形態分化の制御におけるA-ファクターレセプターの機能の解明

A-ファクターは放線菌Streptomyces griseusにおいて二次代謝・形態分化を制御するγ-ラクトン型の微生物ホルモンである。A-ファクターと共同して機能を発揮するレセプター蛋白(ArpA)はDNA結合蛋白であり、A-ファクター非存在下では二次代謝・形態分化の開始に重要な遺伝子のプロモーター領域に結合し、その転写を抑えているものと考えられる。ArpAはA-ファクターと結合することによりDNAから速やかに解離する。本研究はArpAの機能の解明を中心にA-ファクターカスケードの全貌解明を目指したものである。1. ArpAのターゲット遺伝子に関する解析ストレプトマイシン(Sm)生合成遺伝子群の特異的アクチベーターをコードするstrRの転写活性化因子としてAdpA蛋白を精製したが、adpA遺伝子がArpAのターゲット遺伝子であることを証明した。本研究成果によってSm生産に関わるA-ファクターカスケードの主要経路を明らかにすることができた。一方、ゲルシフトとPCRを組み合わせた方法により、S.griseus染色体よりArpAが結合する配列を2つ取得し、周辺のDNA断片を取得し塩基配列を決定した。ArpAターゲット候補遺伝子に関しては、その転写制御機構および遺伝子破壊による生体内での機能について解析中である。2. X線結晶構造解析による3次元構造の決定StreptomycescoelicolorA3(2)のArpA相同遺伝子産物であるCprBの結晶化とその結晶化条件の最適化に成功し、結晶学的パラメーターを決定した。さらに、重原子置換体結晶のx線回折実験を行い、初期位相を決定するに至った。きわめて近い将来、CprBの3次元構造を明らかにすることができると考えている。CprBの3次元構造を決定できれば、比較的容易にArpAの3次元構造が決定できる。A-ファクターは放線菌Streptomyces griseusにおいて、二次代謝・形態分化を制御するγ-ラクトン型の微生物ホルモンである。S.griseusの菌体内にはA-ファクターと共同して機能を発揮するレセプター蛋白(ArpA)が存在するが、ArpAは塩基配列から予想されるアミノ酸配列内にDNA結合モチーフをもち、実際にin vitroにおいて特異的DNA結合能があり、A-ファクターの添加によってその結合能が速やかに失われる。本研究は以下の2つ戦略によりA-ファクターによる制御機能を分子レベルで解明することを目指した。1.ArpAのターゲット遺伝子の同定S.griseus染色体DNAを超音波により約500bpの長さに切断し、各断片の両端にアダプターDNAを連結した。これと精製ArpA蛋白を混合し、アクリルアミドゲルで電気泳動した。すでに示されていたArpA-(500bp)DNA複合体の移動距離をもとに、ゲルからArpA-DNA複合体を回収し、アダプターDANに対するプライマーを用いて、PCRによりArpAが結合するDNA断片を増幅した。得られたDNA断片に対して同様の操作を2回繰り返すことによって、最終的にArpAに結合する2種のDAN断片を取得した。これらのArpA結合配列周辺のDNA断片を染色体DNAよりクローン化し、塩基配列を決定した。このようにしてArpAのターゲット遺伝子の候補となる遺伝子を複数同定することに成功した。X線結晶構造解析による3次元構造の決定組み替え大腸菌からのArpAの簡便な精製方法を確立した後、PEG滴下法によるArpA蛋白の結晶化条件を蛋白濃度、緩衝液組成、pH等について様々に検討した結果、X線結晶構造解析に十分適用できるArpA結晶の取得に成功した。今後は重元素置換を行った後、X線結晶構造解析を行い3次元構造を決定する予定である。A-

ファクターは放線菌Streptomyces griseusにおいて、二次代謝・形態分化を制御するγ-ラクトン型の微生物ホルモンである。A-ファクターと共同して機能を発揮するレセプター蛋白(ArpA)はリプレッサー型のDNA結合蛋白であり、A-ファクター非存在下では二次代謝・形態分化の開始に重要な遺伝子のプロモーター領域に結合し、その転写を抑えているものと考えられる。ArpAはA-ファクターと結合することによりDNAから速やかに解離し、それまで抑えられていた遺伝子の転写が起こる。本研究では以下の2つの戦略によりArpAの機能の解明を目指した。1. ArpAのターゲット遺伝子に関する解析ストレプトマイシン(Sm)生合成遺伝子群の特異的アクチベーターであるStrRの転写活性化因子としてAdpA蛋白を精製したが、adpA遺伝子がArpAのターゲット遺伝子であることを証明した。本研究成果によってSm生産に関わるA-ファクターカスケードの主要経路を明らかにすることができた。また、昨年度取得した2つのArpAターゲット候補遺伝子に関しては、その転写制御機構および遺伝子破壊による生体内での機能について解析中である。2.X線結晶構造解析による3次元構造の決定StreptomycescoelicolorA3(2)のArpA相同遺伝子産物であるCprBの結晶化とその結晶化条件の最適化に成功し、結晶学的パラメーターを決定した。さらに、重原子置換体結晶のX線回折実験を行い、KAu(CN)_2-2H_2O置換体については結晶中の重原子の存在を示唆する結果が得られた。また、HgCl_2は、ハーカーセクションに強いピークを確認でき、非対称単位中での重原子位置を決定し、初期位相を決定するに至った。きわめて近い将来、CprBの3次元構造を明らかにすることができると考えている。CprBの3次元構造を決定できれば、比較的容易にArpAの3次元構造が決定できる。
ホログラフィック原理に基づく時空の生成機構の解明と膨張宇宙の導出

今年度は、膜の理論、量子重力理論等に関する研究を行い、2本の論文を発表した。前年度の研究では、膜の量子論の定式化に向けて、3次元の離散的なランダム体積を生成する新たな模型を構築した。膜の力学の量子化は、様々な形の膜の配位を足し上げることで行えると期待される。このような足し上げを行う方法として、膜の世界体積を離散化したものを生成する模型を作り、その連続極限をとるという方法が考えられる。前年度構築した模型もそのような模型になっており、模型の自由エネルギーの摂動展開の各項は、三角形の辺をつなぎ合わせてできる図形とみなすことができる。この模型の相互作用は半単純代数で特徴付けることができる。特に半単純代数として行列環をとり、相互作用項を特定の形にとると、生成される配位は向き付け可能な3次元空間の四面体分割のみに制限される。前年度に主に考察した模型は、単に3次元空間の四面体分割を生成する模型であり、物質場のない3次元量子重力理論に対応する模型であると考えられる。一般的な膜の理論を扱うには、膜の埋め込まれた空間の座標に対応するような自由度を入れる必要があり、これは3次元重力と結合した物資場の自由度を導入することに対応する。今年度の研究では、生成される四面体分割上に物質場に対応する自由度を載せることに成功した。これは、模型を定義する代数として、行列環と他の代数とのテンソル積をとることで実現される。模型の相互作用を工夫してとることで、四面体分割の任意の次元の単体に自由度を載せることができる。これによって、3次元ランダム体積上のIsing模型等、数理物理的にも興味深い模型を実現することも可能である。また、可解なテンソル模型として知られる色付きテンソル模型で生成されるものだけに配位を制限することにも成功した。別の論文では、模型の拡張として、向き付けられていない膜の理論に対応する模型を構築した。27年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は、超弦理論と量子重力理論に関する研究を行い、3本の論文を発表した。以下で、その研究内容を大まかに述べる。1. Holographic Holes in Higher Dimensions:ある種の時空上の重力理論はその時空の境界上の場の理論によって記述できると考えられている(ゲージ/重力対応)。本研究では、このゲージ/重力対応に基いて、重力理論における閉曲面の面積という幾何学量が、場の理論のある種のエントロピーに対応するということを詳細に調べた。2. Ramond-Ramond couplings of D-branes:超弦理論には低エネルギーで効いてくる無質量モード以外にも無限個の有質量モードが存在する。そのため、弦理論をより理解するには有質量モードの性質も理解する必要がある。我々はBSFTと呼ばれる開弦の場の理論を使って、閉弦の無質量モードの一部であるRamond-Ramond場と開弦のすべてのボソン的なモードがどのように相互作用するかを決定した。この相互作用の形は、今まで知られていたRamond-Ramond場と開弦のタキオンと無質量モードを含むものを開弦の有質量モードを含む形に拡張したものとなっており、superconnectionを使って自然に書くことができる。3. Random volumesfrom matrices:超弦理論と非摂動的には等価であると考えられているM理論には力学的自由度を持つ膜が存在すると考えられている。しかし、膜の理論を素朴に量子化する方法は上手くいっていない。そこで行列模型による非臨界弦理論の定式化のように、膜の世界体積をランダムに生成するような模型を使って、膜の理論を定式化する方法を考えた。この目的のため、本研究ではランダム体積を生成する新たな模型を構築した。この模型の著しい点に、模型のパラメータの適当な極限をとると、生成される空間がまともな3次元多様体の四面体分割に制限される点などがある。

模型の相互作用を工夫してとることで、四面体分割の任意の次元の単体に自由度を載せることができる。これによって、3次元ランダム体積上のIsing模型等、数理物理的にも興味深い模型を実現することも可能である。また、可解なテンソル模型として知られる色付きテンソル模型で生成されるものだけに配位を制限することにも成功した。別の論文では、模型の拡張として、向き付けられていない膜の理論に対応する模型を構築した。ゲージ/重力対応に基いて、重力理論における極小曲面の面積という幾何学量を場の理論のエンタングルメントエントロピーと関係づける笠・高柳の公式を極小曲面に限らないより一般の曲面に一般化した関係式を導出することができた。また、前年に行った超対称な局所化の方法による場の理論の厳密計算の手法を超弦理論の世界面の理論に適用することで、Dブレーンの電荷に関して新たなことがわかった。さらに、3次元量子重力理論の離散的定式化を与える新たな模型を構築することができた。27年度が最終年度であるため、記入しない。今後も引き続き、超弦理論・量子重力理論に関する研究を続け、その基本的性質を明らかにしたい。研究の推進方策としては以下のようなことを考えている。研究概要の1の論文をさらに拡張して、重力理論をホログラフィックに記述する方法を研究する。概要の2の論文で用いた超対称性な局所化の方法を使って、場の理論の非摂動的な性質を調べる。概要の3で構築した模型に膜の自由度を加え、その連続極限をとる方法を調べる。
脆性破壊の伝播・停止現象の力学モデル確立と長大亀裂問題の解明

平成28年度に開発した提案モデルによる系統的な計算を実行し,鋼板の脆性亀裂アレスト設計に関する考察を行った.本モデルによる計算結果として得られるアレスト靭性K_caの温度依存性曲線は左に凸な形状となり,この極大値としてEssential Crack Arrest Temperature (ECAT)の存在を示唆している.このECATに関して様々な影響因子の評価を行い,設計温度における任意の強度・板厚を有する鋼板の必要アレスト靭性の推定式の提案を行った.推定式で予測した必要アレスト靭性は過去の実験で得られた全ての混成型試験の結果を説明可能であることが示された.さらに,これまでの研究成果により,局所応力は劈開亀裂伝播を記述するための最も有力な破壊のクライテリオンであることは示唆されていたが,高速伝播中の亀裂先端が一定の応力を維持している実験的証拠は報告されていない.これは,現象における3次元効果により亀裂前縁の応力状態を評価することが困難であったためである.そこでまず,亀裂伝播中に理想的な2次元状態となるようなサイドグルーブ試験体を設計し,2種類の鋼板を用いて負荷応力と温度を変化させた系統的な破壊試験を実施した.その結果,それぞれの鋼板に対して試験条件によらず亀裂伝播中の局所応力はほぼ一定となることが示された.本研究の成果は,実験的事実として局所破壊応力は劈開亀裂伝播に対する材料特性値であり,鋼の劈開亀裂伝播・停止を記述する材料特性値として有効であることを示すものである.29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は,脆性破壊の伝播・停止挙動を定量的に再現可能な力学モデルを確立し,40年以上未解決である長大亀裂問題の物理的根拠を明らかにすることである.研究初年度では,(1)有限要素法を用いた高速亀裂伝播解析の精度に関する基本的な検証,(2)脆性亀裂伝播を記述するための支配方程式として最も有力な伝播破壊応力の実験計測,を行った.(1)高速亀裂伝播を模擬した有限要素解析の基礎的検証まず,節点力解放法を用いて有限要素法により鋼板の脆性亀裂伝播を模擬するための合理的なメッシュ生成ソフトウェアの開発を行った.実鋼板における加工硬化や降伏応力のひずみ速度依存性を考慮した構成式を用いることで,従来未解明であった加速度や温度勾配が高速で伝播する亀裂先端近傍の局所応力に与える影響を評価した.その結果,降伏応力のひずみ速度依存性を考慮することで亀裂先端近傍の応力・ひずみの値は亀裂加速度や温度勾配によらず,ほぼ一定となることが示された.(2)伝播破壊応力の実験計測鋼の劈開面形成を対象として成立する巨視的な支配方程式の解明に向け,巨視的な影響因子として局所破壊応力が支配因子であるという仮定(局所限界破壊応力理論)のもと,サイドグルーブ付試験片を用いた脆性亀裂伝播試験を行い,局所破壊応力の同定を行った.その結果,特性距離の考え方についてはさらなる検討を要するものの,ひとつの材料において局所破壊応力は亀裂伝播駆動力にはほとんど依存せず,低温ほどが増加する温度依存性を有することが示唆された.研究課題申請当初に予定していた研究初年度計画である「伝播破壊応力の同定」について,その基礎となる数値解析手法の精度検証を含め,ほぼ予定通りに進行している.本研究の目的は,脆性破壊の伝播・停止挙動を定量的に再現可能な力学モデルを確立し,40年以上未解決である長大亀裂問題の物理的根拠を明らかにすることである.研究2年度目では,主に素過程モデルを統合化することで,脆性亀裂の伝播・停止挙動を三眼するための基礎モデル構築と,既存の実験データを用いたその妥当性検証を行った.具体的には,(a)局所限界破壊応力に基づく破壊条件,(b)弾塑性構成式に基づく接線係数,(c)温度・ひずみ速度依存性を考慮した降伏応力,(d)動的応力拡大係数,をそれぞれ記述する定式化を連立し,繰り返し計算によって脆性亀裂伝播を再現するモデルの枠組みを構築した.特に,動的応力拡大係数の定式化においては亀裂伝播に伴う駆動力の増加によって板表面部の塑性拘束が緩和し,結果として未破断のサイドリガメントが成長,結果的に亀裂の閉口効果を発揮する効果を組み込んだ.標準幅温度勾配型アレスト試験および超広幅の混成型アレスト試験に関する過去の実験データとの比較によるモデルの妥当性検証を行った.その結果,従来の理論やモデルでは不可能であった長大亀裂条件下および高負荷応力条件下において亀裂が早期にアレストする現象が再現された.特に,混成型アレスト試験における長大亀裂に関しては,助走板から試験板への亀裂突入後,即時に伝播あるいは停止となるわけではなく,数百mm程度伝播が継続した後に停止するという遷移領域が存在することが明らかとなった.複数の素過程モデルを統合化した全体モデルを構築し,それによって従来説明困難であった長大亀裂を含めた脆性亀裂の伝播・停止挙動を説明可能なモデル体系の枠組みを予定を前倒しして確立することができた.平成28年度に開発した提案モデルによる系統的な計算を実行し,鋼板の脆性亀裂アレスト設計に関する考察を行った.本モデルによる計算結果として得られるアレスト靭性K_caの温度依存性曲線は左に凸な形状となり,この極大値としてEssential Crack Arrest Temperature (ECAT)の存在を示唆している.このECATに関して様々な影響因子の評価を行い,設計温度における任意の強度・板厚を有する鋼板の必要

アレスト靭性の推定式の提案を行った.推定式で予測した必要アレスト靭性は過去の実験で得られた全ての混成型試験の結果を説明可能であることが示された.さらに,これまでの研究成果により,局所応力は劈開亀裂伝播を記述するための最も有力な破壊のクライテリオンであることは示唆されていたが,高速伝播中の亀裂先端が一定の応力を維持している実験的証拠は報告されていない.これは,現象における3次元効果により亀裂前縁の応力状態を評価することが困難であったためである.そこでまず,亀裂伝播中に理想的な2次元状態となるようなサイドグルーブ試験体を設計し,2種類の鋼板を用いて負荷応力と温度を変化させた系統的な破壊試験を実施した.その結果,それぞれの鋼板に対して試験条件によらず亀裂伝播中の局所応力はほぼ一定となることが示された.本研究の成果は,実験的事実として局所破壊応力は劈開亀裂伝播に対する材料特性値であり,鋼の劈開亀裂伝播・停止を記述する材料特性値として有効であることを示すものである.次年度以降は,今年度の取り組みに加え,以下に示す3項目の研究を段階的に実行する.(1)サイドリガメントの亀裂閉口効果の定量化(2)素過程を記述するモデルの統合化による脆性亀裂伝播・停止挙動全体を再現可能なモデル開発(3)大型試験によるモデルの妥当性検証今後は今年度の成果を基礎として,昨年度実施した局所限界破壊応力の実測結果などを考慮した素過程モデルの精緻化を行う.また,サイドリガメントが動的に伝播する亀裂に及ぼす閉口効果についても,負荷応力・温度を変化させた複数の実験を実施し,定量化することでモデルの高精度化に向けた知見を取得する予定である.一方で,高速亀裂伝播における局所応力を高精度かつロバストに評価可能な有限要素解析手法についても検証を進める予定である.29年度が最終年度であるため、記入しない。29年度が最終年度であるため、記入しない。
光化学系I反応中心複合体の構造と機能

光化学系I(系I)反応中心複合体の構造と機能について,次のような結果を得た。1.アミノ基を架橋する試薬dithiobis(succinimidylpropionate)でホウレンソウの系I粒子(PSI-200)を処理すると,系Iのサブユニットの間に架橋がかかる。架橋されたPSI-200でも電子はP700からFB,FAまで正常に流れていてた。架橋しなかったものは熱/EG処理で容易に小さなサブユニットは反応中心から解離し,FB,FAは破壊されるが,架橋した系I粒子では,解離しなくなり,FB,FAが安定化された。2.ホウレンソウの葉緑体を表面活性剤Triton X-100で可溶化して得られるPSI-200(Chl/P700=200)を室温で2時間,照射した。その結果,DCIPH_2→MVの電子伝達活性は阻害され,クロロフィル(Chl)が退色した。一方,P700は僅かな減少であった。この光阻害やChlの退色には酸素分子が関与していること,光阻害の部位はA1であろうということが考えられる。PSI-200をHydroxylapatiteのカラムで精製した標品(HA-40と略,Chl/P700=40)では光阻害も退色もほとんど認められなかった。以上より,系I反応中心タンパク質に約100分子のChlが結合しているが,そのうち約60分子のChlはTriton X-100の存在下で遊離の状熊か,ルーズに結合していると考えられる。それらのChlは光により酸素を活性化し,この活性酸素がA1を破壊するものと考えられる。系I標品にこのようなChlが存在すると,速い光化学反応を正確に測定出来ないことがある。そのため,系I標品をHydroxylapatiteのカラムで精製して用いる必要がある。3.系I反応中心複合体をリン脂質のリポソームの中に取り込ませ,トリプシンで処理した。未処理のものより分子量が小さくなったP700を含む2種類の複合体が得られたので,活性や色素の結合量などについて調べている。高等植物の光化学系I(系I)コア複合体は少なくとも13個のサブユニットから構成され、P700A0→A1→FX(鉄ー硫黄センタ-X)→FB、FA(センタ-BとA)の反応が行われている。これらのサブユニットと機能との関係を調べるため、ホウレンソウの系I粒子をDithiobis(succinimidylpropionate)で架橋し、次のような結果を得た。1.ホウレンソウの系I粒子をエチレングリコ-ルの存在下で熱処理(熱/EG処理)すると、ほとんどの小型サブユニットが反応中心蛋白質より遊離し、55ー60°C/EG処理ではFA、FBが、65ー70°C/GE処理ではFXも破壊されるということをすでに報告した(Hoshina et al.,1989,1990)。系I粒子を架橋剤で処理すると、系Iのサブユニットの間に架橋がかかるため、熱/EG処理をしても理小なサブユニットは反応中心蛋白質から離れにくくなる。

少なくとも、PSIーC蛋白質(FA、FBを結合しているサブユニット)は反応中心蛋白質と架橋されるということを免疫化学的に確認した。このように架橋された系I粒子は55ー60°C/EG処理されても、FA、FBが破壊されにくくなるということを、閃光分光法とEPRスペクトルより明らかにした。2.系I粒子を尿素処理すると、PSIーC蛋白質が反応中心蛋白質から遊離し、FA、FBクラスタ-が破壊されるということが知られている。系I粒子を架橋すると、熱/EG処理の時と同じように尿素処理に対しても安定化された。3.系I粒子を70°C/EG処理して得られた70°C/EG反応中心蛋白質では3種類の鉄ー硫黄クラスタ-が消失していた。この反応中心蛋白質を無機の鉄と硫黄とともに嫌気的にインキュベ-トするとFXが再構成された。ところが架橋した系I粒子を同様に処理することにより得られるDSPー70°C/EG複合体では鉄ー硫黄クラスタ-を再構成することが出来なかった。これは架橋により蛋白質の電荷や構造が変わったためによるのか、その他の理由によるのか明かではなく、今後の課題である。4.以上の結果は、FA、FBが破壊される原因の少なくとも一つはPSIーCが反応中心蛋白質から遊離することによると考えられる。光化学系I(系I)粒子を強光に曝したときの光阻害についてと、系I反応中心複合体をトリプシンで処理し、断片化した複合体の性質について調べた。1.ホウレンソウの葉緑体を表面活性剤Triton X-100で可溶化して得られる系I粒子(PSI-200、Chl/P700=200)を室温で2時間、照射した。その結果、系Iの電子伝達活性(DCIPH_2→MV)は阻害され、未処理の約50%に減少した。また、クロロフィル(Chl)が退色し、未処理の約半分に減少した。一方、反応中心、P700は僅かな減少であった。PSI-200の懸濁液をアルゴンガスで置換したり、スーパーオキシド(O_2^-)のインジケーターであるチトクロームcの還元活性の測定より、光阻害には酵素分子が関与していること、光阻害の部位は第二次電子受容体、A1であるろうということが考えられる。PSI-200をHydroxylapatiteのカラムに吸着させ、Triton X-100でカラムを十分洗った後、溶出させた標品(HA-40、Chl/P700=40)では光阻害もChlの退色もほとんど認められなかった。2.1.より、系I反応中心タンパク質に約100分子のChlが結合しているが、そのうち約60分子のChlはTriton X-100の存在下で遊離の状態か、ルーズに結合していると考えられる。それらのChlは光により酵素を活性化し(O_2^-または、^1O_2などの生成)、この活性酵素がA1を破壊するものと考えられる。系I標品にこのようなChlが存在すると、Chlの三重項状態が生じたりするため、速い光化学反応を正確に測定出来ないことがある。そのため、系I標品をHydroxylapatiteのカラムで精製して用いる必要がある。3.系I反応中心複合体をリン脂質にリポソームの中に取り込ませ、トリプシンで処理した。未処理のものより分子量が小さくなったP700を含む2種類の複合体が得られたので、活性や色素の結合量などについて調べている。
浸潤を必要としない転移機構を制御する分子の解明

2.Invasion-independent metastasis modelのヒト癌への応用:外科的に切除されたヒト癌の病理組織標本を用いた検討から、腎細胞癌、肝細胞癌、甲状腺濾胞癌で高率に、肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、子宮癌、乳癌、膵癌の一部に、血行性転移におけるinvasion-independent pathwayが存在することが示された。マウスモデルに転移誘導をきたしたSLPIは種々のヒト癌に発現し、特に腎細胞癌に高い発現を示すことが明らかとなった。本研究の成果はSLPIをはじめとする新たな癌転移関連遺伝子の同定とその分子メカニズム解明の基盤となり、ヒト癌の診断・治療戦略に貢献することが期待される。我々はマウス乳癌に浸潤能を必要としない転移経路(invasion-independent pathway)があることを見いだした。本研究ではこの新しい転移の分子メカニズムの解析とヒト癌への応用の検討を行った。2)ヒト癌におけるinvasion-independent pathwayの存在:10種類の臓器に発生した癌の手術標本から高度の血管侵襲を示す症例を選抜した。腎細胞癌、肝細胞癌、甲状腺濾胞癌の多くと他の全7臓器の癌の一部において、静脈内の腫瘍に血管内皮による被覆が確認された。また、この内皮の被覆は腫瘍内の類洞状血管網の発達と有意に相関し、invasion-independent pathwayの存在を示していた(投稿中)。我々がマウス乳癌モデルを用いて提唱した新しい転移様式(invasion-independent pathway)のメカニズム解明とヒト癌への応用を目的として、以下の研究を行い、成果を得た。2.上記のようにマウス転移モデルシステムで解明されつつあるinvasion-independent pathwayの分子機構をヒト癌に応用するために、この転移様式がヒト癌にも存在するか否かを臨床病理学的に検討した。福島医大で手術的に摘出された主要10臓器の癌の血管侵襲像を顕微鏡的に観察した。肝細胞癌、腎細胞癌、甲状腺濾胞癌を始め、種々の癌の導出血管内に内皮細胞に表面を覆われる腫瘍塊が観察された。また、これらの症例の原発巣内には類洞様血管の発達が顕著であった。このことはヒト癌にもinvasion-independent pathwayを介する転移機構が存在することを示している。
国内で流通する非加熱摂取食品に潜在する細菌学的健康リスクの解明

2013年4月から2015年5月に入手した非加熱摂取食品282検体(浅漬96検体、洋生菓子88検体、魚介類加工品98検体)について、腸内細菌科菌群および食中毒起因菌の汚染実態調査を行った。腸内細菌科菌群は、浅漬92検体、洋生菓子39検体、魚介類加工品74検体より分離された。また、エンテロトキシン産生性黄色ブドウ球菌が浅漬2検体、洋生菓子2検体、魚介類加工品1検体より分離された。また、腸内細菌科菌群の菌種同定により、院内・日和見感染の原因となる細菌の汚染が明らかとなった。さらに、第三世代セファロスポリン系、ニューキノロン系抗生剤あるいはホスホマイシンに耐性を示す株の汚染が明らかとなった。2013年4月から2014年4月までに、大阪府内で流通する洋生菓子50検体、漬物98検体、魚介加工品62検体について腸内細菌科菌群、黄色ブドウ球菌、サルモネラ属菌、毒素原性および志賀毒素産生性大腸菌あるいは腸炎ビブリオの汚染実態調査を実施した。その結果、洋生菓子では28検体から腸内細菌科菌群が、5検体から黄色ブドウ球菌が検出されたが、サルモネラ属菌と毒素原性および志賀毒素産生性大腸菌はすべての検体で陰性であった。漬物では、腸内細菌科菌群は94検体、黄色ブドウ球菌は6検体から分離されたが、サルモネラ属菌と毒素原性および志賀毒素産生性大腸菌はすべての検体で陰性であった。さらに、魚介類加工品では、44検体から腸内細菌科菌群が検出され、2検体から黄色ブドウ球菌が検出されたが、毒素原性および志賀毒素産生性大腸菌はすべての検体で陰性であり、腸炎ビブリオについても28検体を検査したが、すべて陰性であった。また、国外産の非加熱摂取食品の薬剤耐性腸内細菌科菌群の汚染実態を把握するためにベトナムで流通する香辛料、ドライフードおよび菓子類の計28検体について汚染実態調査を行った。その結果、22検体から腸内細菌科菌群が分離された。平成25年度の検討より、国内産の洋生菓子、漬物および魚介類加工品ならびにベトナム産非加熱摂取食品では腸内細菌科菌群の汚染率が非常に高いことが明らかとなった。そこで平成26年度以降の研究では、分離株について菌種同定、薬剤感受性試験および薬剤耐性遺伝子の検討を実施し、これらの株がヒトの健康リスクとなりうるかについて検討を進めていく。また、黄色ブドウ球菌についてもエンテロトキシンの産生性について検討を行う。2013年4月から2015年3月までに大阪府内で流通する洋生菓子88検体、漬物類98検体、魚介類加工品98検体について、腸内細菌科菌群、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、志賀毒素産生性大腸菌を含む下痢原性大腸菌を対象とした汚染実態調査を行った。さらに、魚介類加工品については、腸炎ビブリオについても調査を行った。結果として、洋生菓子から63株の腸内細菌科菌群と7株の黄色ブドウ球菌が、漬物からは207株の腸内細菌科菌群と7株の黄色ブドウ球菌が、魚介類加工品からは139株の腸内細菌科菌群と4株の黄色ブドウ球菌が分離されたが、その他の食中毒起因菌は分離されなかった。また、20014年2月から2015年3月までにベトナムで流通するペッパー類80検体の腸内細菌科菌群の汚染実態を調査した。分離株については、生化学的性状、質量分析装置、遺伝子検出法により菌種同定を実施し、さらにディスク法による薬剤感受性を検討中である。2015年5月までに大阪府内で入手した浅漬96検体、洋生菓子88検体および魚介類加工品98検体について、腸内細菌科菌群および食中毒起因菌の汚染実態調査を行った。その結果、腸内細菌科菌群は、浅漬92検体、洋生菓子39検体、魚介類加工品74検体より分離された。また、食中毒起因菌のうち黄色ブドウ球菌が浅漬6検体、洋生菓子7検体、魚介類加工品3検体より分離され、このうち5株がエンテロトキシン産生株であった。さらに、洋生菓子由来株Hb13はmecA遺伝子陽性であった。分離された腸内細菌科菌群について、菌種同定を行ったところ、院内・日和見感染の原因菌となるC. braakii/freundii、E. cloacae complex、E. coli、P. mirabilis、K. oxytoca、K. pneumoniae、S. marcescensの汚染が明らかとなった。さらに、これら分離株の薬剤感受性試験を実施した結果、ヒトの臨床上重要な第三世代セファロスポリン系あるいはニューキノロン系抗生剤に耐性を示す株の汚染が明らかとなった。一方、国外の非加熱摂取食品の細菌汚染実態を調査するため、2014年2月から2015年3月にベトナムで市販されたコショウ類84検体について、サルモネラ属菌の定性試験ならびに腸内細菌科菌群の定量および定性試験を実施した。サルモネラ属菌は5検体より分離され、腸内細菌科菌群は78検体より分離された。

また、腸内細菌科菌群の菌種同定の結果、C. sakazakii、E. cloacae complex、E. coli、およびK. pneumoniaeの汚染が明らかとなった。また、ESBL産生株、AmpC産生株、ホスホマイシン耐性遺伝子保有株、プラスミド性キノロン耐性遺伝子保有株、キノロン耐性決定領域変異株の汚染が明らかとなった。2013年4月から2015年5月に入手した非加熱摂取食品282検体(浅漬96検体、洋生菓子88検体、魚介類加工品98検体)について、腸内細菌科菌群および食中毒起因菌の汚染実態調査を行った。腸内細菌科菌群は、浅漬92検体、洋生菓子39検体、魚介類加工品74検体より分離された。また、エンテロトキシン産生性黄色ブドウ球菌が浅漬2検体、洋生菓子2検体、魚介類加工品1検体より分離された。また、腸内細菌科菌群の菌種同定により、院内・日和見感染の原因となる細菌の汚染が明らかとなった。さらに、第三世代セファロスポリン系、ニューキノロン系抗生剤あるいはホスホマイシンに耐性を示す株の汚染が明らかとなった。平成26年度終了時点で、国内で流通する洋生菓子、漬物、魚介類加工品の計284検体について、汚染実態調査を行い400株以上の腸内細菌科菌群を分離した。また、これらに加え、非加熱摂取食品の一つであるペッパー類についてベトナムで流通する80検体を検討した。これまでに本研究で必要と考える分離株を得ることができたため、汚染実態調査は本年度までで終了とし、最終年度である次年度は菌種同定と薬剤感受性を検討し、薬剤耐性機構を菌種ごとに明らかにしていく予定である。現在、菌種同定及び薬剤感受性の検討を中心に研究を進めている。菌種同定についてはPCR法、リアルタイムPCR法およびシーケンス法を平成26年度の研究で確立したことで、より確実な同定が可能となっている。これらを踏まえ、本研究はおおむね順調に進展していると考える。食品微生物最終年度である平成27年度は菌種同定と薬剤感受性を検討し、薬剤耐性機構を菌種ごとに明らかにしていく。薬剤耐性遺伝子の検討では、ESBL耐性遺伝子を中心に検討する。また、E. cloacae complexについては、分離された検体ごとにどのような菌種が優位であるかを明らかにし、非加熱摂取食品由来株とヒト感染症起因菌との関連性について、検討する。さらに可能であれば、同一検体由来の異なる薬剤感受性を示す同一菌種の株について、PFGE解析等を実施し、遺伝的関連性を明らかとすることで、耐性機構の検討を行う予定である。平成25年度は国内で流通する洋生菓子、漬物、魚介類加工品およびベトナムで流通する香辛料等の非加熱摂取食品について腸内細菌科菌群あるいは食中毒菌の汚染実態調査を実施し、腸内細菌科菌群汚染度が高いことを明らかとした。平成26年度以降は、分離された株について薬剤感受性や保有する病原因子を検討し、ヒトの健康リスクとなりうるかを明らかにしていく予定である。これまでの検討で約400株が分離されており、菌株の解析には十分な株数が得られているため、本研究は順調に進展していると考える。志賀毒素産生性大腸菌検出のためのリアルタイムPCR法についての論文が、いまだアクセプトされていないため、掲載にかかる費用を使用しなかった。また、情報収集のための食品微生物学会が平成26年は大阪で開催されたため、その分の旅費が必要とならなかった。平成26年度は、これまでに分離された腸内細菌科菌群の菌種同定、薬剤感受性さらに薬剤耐性遺伝子の検討を中心に研究を進める。これまでの検討で約400株が分離されているため、新たな食品についての汚染実態調査は行う必要はないが、洋生菓子と魚介類加工品については検体数の上乗せを目指し、さらに継続して汚染実態調査を行っていく。
多糖体ナノゲルを用いたTNF－α拮抗薬輸送による骨形成促進作用の検討

本年度はマウス切歯抜歯窩再生モデルにおいてナノゲルとW9ペプチドの効果を検討する予定であったが、実験系の構築に手間取り行うことができなかった。そこでBMP投与モデルに関して異所性石灰化モデル、頭蓋骨欠損モデルによる詳細な検討を行った。今年度は新たな新規薬物候補として新規のTNF-αアンタゴニストOP3-4ペプチドを加えて実験を行い従来のW9ペプチドとの比較を行った。1.BMP投与による異所石灰化モデルマウス背部皮下にBMPを埋め込み1週,2週,3週,4週における経時的な骨形成実験モデルを用いた。リコンビナントBMP2はコラーゲンを担体としてゲル状とした物と、コラーゲンゲル+W9複合体、コラーゲンゲル+OP3-4複合体を背部皮下に填入した。埋め込み填入部における骨形成過程をμCT装置を用いて計測、BMDをpQCTにより定量して、骨再生のプロセスを把握した。その結果、同じ投与量のペプチドの比較でOP3-4はW9ペプチドより高い骨形成能力を有することが認められた。2.頭蓋骨欠損モデルC57BL/6Jマウスの頭蓋骨に左側に3.5mmの穴をバイオプシーパンチを用いて開けた。ゼラチンディスクにBMP、2用量のOP3-4ペプチド(0.28mg or O.56mg)あるいはW9ペプチド(0.56mg)をしみ込ませたものを埋入した。4週間後にマウスを麻酔下屠殺してコラーゲンディスクの石灰化をDXA法にて測定した。さらに石灰化組織の3次元的構造をμ-CTにより観察した。その結果、OP3-4ペプチドは用量依存的に骨形成を促進した。その効果はBMPと同程度であった。またW9ペプチドとの比較ではOP3-4はより多く骨形成を促進した。以上の研究成果よりRANKL拮抗作用を持つW9ペプチド、OP3-4ペプチドが骨形成促進作用を有することが明らかとなった。両ペプチドの骨形成機序における作用の詳細は不明であるが、これらペプチドの有するRANK-RANKL相互作用への抑制効果が何らかの機序で骨形成に促進的に働くこと思われる。本年度は研究開始の準備時期でもありマウス切歯抜歯窩再生モデル,BMP骨欠損修復モデルの構築を行った.1)マウス切歯抜歯窩再生モデルマウスの切歯を抜去して1週,2週,3週間の間に抜歯窩に再生してくる骨量を定量して,骨再生のプロセスを把握することが目的であった.マウス切歯の抜歯はかなり難しいが,抜歯数日前に切歯先端を歯科用エンジンを用いて切断すると,萌出が加速されるため比較的容易に抜歯を行うことができた.抜歯窩に生じる骨の形成を経時的に検討したところ,1週,2週目では骨の形成は十分でないが,3週目以降徐々に骨の形成は増加して10週目では海綿骨で抜歯窩は満たされた.また組織学的な解析を行い,骨形成過程に出現する細胞群の同定と蛍光色素による骨ラベリングを行い骨形態学的な解析を行ったところ,抜歯3日目より骨は出現し,表面には骨芽細胞がならび活発な骨形成を行っていた.MARは抜歯初期の2週目までが高い値を示し,その後徐々に低下する様子が観察できた.また抜歯後3週目までの形成された骨にはほとんど破骨細胞が観察されず,本実験モデルが主に骨形成のみを行っている系であることが確認できた.従って本実験モデルは骨形成におよぼすTNF-α拮抗薬の効果をin vivoで検討するのに適していることが明らかとなった.2)BMP骨欠損修復モデルマウス頭蓋骨に直径2mmの欠損を形成してBMPを填入して1週,2週,3週,4週における経時的変化を検索した.リコンビナントBMP2はコラーゲンを担体としてゲル状化して欠損部に填入したが,頭蓋骨の骨欠損部にBMPが定置しない例が多く出現した.BMPによる骨の形成は対照側に較べて増加するがそのBMD値は安定せず,本モデルが安定的な骨形成モデルとして機能するにはさらなる検討が必要と考えられた.以上の研究により次年度の研究としてマウス切歯抜歯窩再生モデルを主に使用するのがよいことが明らかとなった.これまでにTNFとRANKLに拮抗するW9ペプチドが骨量増加作用を示すことを明らかにしてきた。RANKLへの拮抗作用も骨量増加に関連する可能性があることから、本年度は以下の研究を行った。特異的にRANKL-RANK相互作用を阻害する新規のOP3-4ペプチドを用いて、In vitro実験としてマウス頭蓋骨より骨芽細胞を単離培養して、石灰化培地にて石灰化を誘導した。W9ペプチド、OP3-4ペプチドを培地に加えて7日あるいは21日間の培養後にアルカリフォスファターゼ染色とVon Kossa染色を行い、細胞の酵素活性と石灰小節の計測を行った。その結果、骨芽細胞の分化をW9ペプチド、OP3-4ペプチドが促進することが認められた。7日間培養した細胞のアルカリフォスファターゼ染色、21日間培養した石灰化結節、いずれもがペプチド未添加の対照群よりも増加することが観察された。Von Kossaサ染色で染まる石灰化基質を定量したところ、両ペプチドの石灰化促進作用を確認することができた。In vivoの実験として25週齢のC57BL/6Jマウスを用いて背部皮下にコラーゲンディスクを埋入した。

コラーゲンディスクにはBMP単独、BMP+W9ペプチド、BMP+OP3-4ペプチドをしみ込ませた。埋入4週後にマウスを麻酔下屠殺してコラーゲンディスクの石灰化をDXA法にて測定した。さらに石灰化組織の3次元的構造を観察した。マイクロCTによる解析では、マウスは背部皮下に埋め込んだコラーゲンディスクの石灰化を、BMP単独の場合に比べて両ペプチドは著しく促進した。DXAを用いた骨塩量測定の結果では、OP3-4ペプチドが特に効果が高く、また用量依存的な作用を示した。以上の実験結果から、RANKL拮抗作用を持つW9ペプチド、OP3-4ペプチドが骨芽細胞の分化・機能の促進と石灰化の促進作用を有することが明らかとなった。両ペプチドの骨形成機序における作用は不明であるが、今回発見したRANKL抑制が何らかの作用を示して骨形成に促進的に働くことが示され、創薬標的探索の観点からも本研究は重要な知見を示したものと考えられる。本年度はマウス切歯抜歯窩再生モデルにおいてナノゲルとW9ペプチドの効果を検討する予定であったが、実験系の構築に手間取り行うことができなかった。そこでBMP投与モデルに関して異所性石灰化モデル、頭蓋骨欠損モデルによる詳細な検討を行った。今年度は新たな新規薬物候補として新規のTNF-αアンタゴニストOP3-4ペプチドを加えて実験を行い従来のW9ペプチドとの比較を行った。1.BMP投与による異所石灰化モデルマウス背部皮下にBMPを埋め込み1週,2週,3週,4週における経時的な骨形成実験モデルを用いた。リコンビナントBMP2はコラーゲンを担体としてゲル状とした物と、コラーゲンゲル+W9複合体、コラーゲンゲル+OP3-4複合体を背部皮下に填入した。埋め込み填入部における骨形成過程をμCT装置を用いて計測、BMDをpQCTにより定量して、骨再生のプロセスを把握した。その結果、同じ投与量のペプチドの比較でOP3-4はW9ペプチドより高い骨形成能力を有することが認められた。2.頭蓋骨欠損モデルC57BL/6Jマウスの頭蓋骨に左側に3.5mmの穴をバイオプシーパンチを用いて開けた。ゼラチンディスクにBMP、2用量のOP3-4ペプチド(0.28mg or O.56mg)あるいはW9ペプチド(0.56mg)をしみ込ませたものを埋入した。4週間後にマウスを麻酔下屠殺してコラーゲンディスクの石灰化をDXA法にて測定した。さらに石灰化組織の3次元的構造をμ-CTにより観察した。その結果、OP3-4ペプチドは用量依存的に骨形成を促進した。その効果はBMPと同程度であった。またW9ペプチドとの比較ではOP3-4はより多く骨形成を促進した。以上の研究成果よりRANKL拮抗作用を持つW9ペプチド、OP3-4ペプチドが骨形成促進作用を有することが明らかとなった。両ペプチドの骨形成機序における作用の詳細は不明であるが、これらペプチドの有するRANK-RANKL相互作用への抑制効果が何らかの機序で骨形成に促進的に働くこと思われる。当初計画していたナノゲルを用いた薬物輸送は現在のBMPコラーゲンディスク移植を用いた方法が順調に使用できているので、次年度の課題とする。また切歯抜歯窩モデルに関しても現在のBMPコラーゲンディスク移植システムの解析が終了してから取り組みを行う予定である。ナノゲルを用いた薬物輸送システムは効果的に働くことが予想される。ナノゲルはすでに候補ゲルが有り、これを用いた輸送システムを用いた実験を今後進める予定である。
マダニと共生微生物による過酸化水素消去酵素産生機構の解明とワクチンへの応用

ヒドロキシラジカルは、生体に高度な酸化障害を引き起こすが、半減期は短く、制御は困難なため、半減期が長くかつその前段階の過酸化水素(H2O2)を制御する方が、生物に有利である。マダニは発育期で吸血が必須で、宿主血液は鉄を大量に含み、体内では多量のH2O2発生が予想される。つまり、マダニ体内におけるH2O2制御は、マダニの発育に不可欠である。一方、マダニはH2O2消去酵素かつヘム含有蛋白質であるカタラーゼ(Cat)遺伝子を有するが、ヘム合成・異化経路を欠損する。また、マダニにおいて、Catを自身で合成不可だが、蛋白質レベルでの存在が示唆される。このため、マダニ体内に存在するCat蛋白質がマダニまたは共生微生物由来と仮説を立て、マダニと共生微生物が維持すると考えられるマダニ体内環境を破綻させるマダニ防圧法を考えた。前述の仮説を基に、マダニ体内におけるCat遺伝子を、マダニ由来・共生微生物由来に分類する。まず、マダニの吸血期別(未吸血・吸血2日目)に主要臓器(中腸・卵巣・唾液腺)またはマダニ個体を採材し、RNA抽出後、トランスクリプトーム解析を行い、マダニの吸血期に関連するマダニ体内での機能性遺伝子の候補を選定した。その結果、マダニ由来Cat遺伝子は同定できたが、微生物由来の機能性遺伝子については、現在も解析を遂行中である。得られたマダニ由来Cat遺伝子配列(HlCat)は、ORFが1,500bp、499アミノ酸からなり、推定分子量は57.1 kDaでカタラーゼドメインを有していた。他生物Catとのアミノ酸配列比較により、高い相同性を有していた。次に、HlCat遺伝子配列を基に大腸菌で組換え体を作製し、その抗酸化活性をで調べたところ、抗酸化能を有していた。以上の結果から、同定されたHlCatは、一般的なカタラーゼと似た構造をしており、同様に抗酸化活性を持つことが示唆された。これまでに、マダニ個体または臓器からRNAを抽出した後、トランスクリプトーム解析を行っているが、非モデル生物であるためゲノム情報が不十分であり、in silico解析のパイプラインも試行錯誤の段階である。このため、当初予定していた共生細菌由来の機能性遺伝子の同定については、継続して遂行中である。しかし、マダニ由来のCat遺伝子の同定には成功しており、実際に同定したマダニ由来Cat遺伝子配列を基に大腸菌を用いた組換え蛋白質の作製並びにin vitro系における組換え蛋白質の抗酸化能の検証を行うことができた。以上から、当初予定していた計画から少し遅れてはいるが、おおむね順調に進展していると考えられる。平成31年2月20-22日並びに3月13-15日に愛知県の基礎生物学研究所にてRNA-seqのデータを用いた解析に関する講習を受け、解析手法を学んだ。このため、今後は、講習で学んだことを応用してマダニ由来の共生微生物の機能性遺伝子の同定を進めていく。また、平成31年4月1日から4月5日かけて、ベルリン自由大学のNijhof博士を訪ね、人工膜を使用したマダニの人工吸血系の手技を学んできたため、マダニ並びに共生微生物由来の機能遺伝子解析への応用を目的とし、日本産マダニを用いた人工吸血系の確立も進めていく。日本産マダニの完全な人工吸血系の確立に関する研究は、平成31年度若手研究の課題として採択されている。さらに、マダニ由来のCat遺伝子を同定できているため、マダニ体内における発現動態並びに局在解析、二本鎖RNAを用いた遺伝子ノックダウン解析を進めていく。次に、HlCat

遺伝子配列を基に大腸菌で組換え体を作製し、その抗酸化活性をで調べたところ、抗酸化能を有していた。以上の結果から、同定されたHlCatは、一般的なカタラーゼと似た構造をしており、同様に抗酸化活性を持つことが示唆された。これまでに、マダニ個体または臓器からRNAを抽出した後、トランスクリプトーム解析を行っているが、非モデル生物であるためゲノム情報が不十分であり、in silico解析のパイプラインも試行錯誤の段階である。このため、当初予定していた共生細菌由来の機能性遺伝子の同定については、継続して遂行中である。しかし、マダニ由来のCat遺伝子の同定には成功しており、実際に同定したマダニ由来Cat遺伝子配列を基に大腸菌を用いた組換え蛋白質の作製並びにin vitro系における組換え蛋白質の抗酸化能の検証を行うことができた。以上から、当初予定していた計画から少し遅れてはいるが、おおむね順調に進展していると考えられる。平成31年2月20-22日並びに3月13-15日に愛知県の基礎生物学研究所にてRNA-seqのデータを用いた解析に関する講習を受け、解析手法を学んだ。このため、今後は、講習で学んだことを応用してマダニ由来の共生微生物の機能性遺伝子の同定を進めていく。また、平成31年4月1日から4月5日かけて、ベルリン自由大学のNijhof博士を訪ね、人工膜を使用したマダニの人工吸血系の手技を学んできたため、マダニ並びに共生微生物由来の機能遺伝子解析への応用を目的とし、日本産マダニを用いた人工吸血系の確立も進めていく。日本産マダニの完全な人工吸血系の確立に関する研究は、平成31年度若手研究の課題として採択されている。さらに、マダニ由来のCat遺伝子を同定できているため、マダニ体内における発現動態並びに局在解析、二本鎖RNAを用いた遺伝子ノックダウン解析を進めていく。
キラリティーの自在制御な多励起子生成空間の創製と新規光機能開拓

MOFの柱状配位子は交換できるので、細孔空間特性を決定するトリガーと捉えられる。つまりキラルな柱状配位子(SとR)の交換し、空間の不斉制御ができる。これと一光子から二つの三重項励起子(T1)が生成できる一重項分裂(SF)を併用し、各特性を最大限活用させ、従来にはないキラリティー制御可能な新奇光機能性空間を構築する。次に機能性ゲスト分子を導入し、最終的に新たな光機能性材料の創製を目指す。
膜電位依存性プロトンチャネルの機能的役割と活性制御

本研究では、大量のプロトン(H^+)を短時間に細胞外に排出するユニークな機構として注目している膜電位依存症H^+チャネルの発現状況や活性制御機構をBMMC、ラット脊髄ミクログリア、マウス破骨脂肪など異なる機能を持つ細胞を用いて調べた。H^+電流の高い温度依存性はBMMC,ミクログリアで共に観察されたが、BMMCではミクログリアに比べて室温(24°C)でのチャネル活性化速度および脱活性化速度は遅く、定常電流振幅は低く、チャネル活性化のset-temperatureが細胞によって異なることが推測された。活性化型(round/ameboid)ミクログリアではH^+電流が高率(>90%)に記録され、細胞内アシドーシスによって引き起こされる細胞膨化によってチャネル活性が増大した。このH^+チャネル活性化は低浸透圧刺激によるCl^-チャネルの活性化と同様に細胞内ATPを必要としactinfilamentの重合を修飾するcytochalasin Dやphalloidmにより抑制された。アシドーシスによる細胞膨化がH^+チャネル活性を増強し強力にH^+を排出することによってcytotoxicな細胞膨化から細胞を保護していることが示唆された。これは、アシドーシスと浮腫を伴うことの多い神経疾患におけるミクログリアの機能調節機構として重要な発見である。またH^+分泌細胞の一つである破骨細胞では、H^+チャネルの発現が分化過程によって影響を受けることが明らかになった。これらの結果からH^+チャネルがそれぞれの細胞の機能的状態や分化過程と深く関連して制御され、その破錠が重大な機能障害をもたらす可能性が示唆された。私達は、大量のプロトンイオン(H^+)を短時間に細胞外に排出するユニークな機構として注目している膜電位依存性H^+チャネルが非常に高い温度依存性を持つことを、これまでにマウス骨髄幹細胞由来マスト細胞(BMMC)を用いて明らかにしてきた。本研究では、BMMC、ラット脊髄ミクログリア、ラット破骨細胞など異なる機能を持つ細胞でのH^+チャネル活性の発現状況や制御機構を調べた。round/ameboid型の活性化ミクログリアでは、H^+電流が高率(>90%)に記録され、高い温度依存性も確認されたが、ramified型の静止ミクログリアでは電流量が小さく温度上昇によっても増強しなかった。また、破骨細胞はH^+分泌細胞の一つで、ウサギ破骨細胞ではH^+チャネルの報告があるが、ラットでは、H^+チャネルの電気的特性を備えた電流は非常に小さく、温度を上昇させても増大は見られなかった。脱分極によるH^+電流の活性化過程は、BMMC,ミクログリアで共にHodgkin-Huxley型曲線(3次)でよく近似された。24°Cで、+40mVの脱分極パルスでの活性化時定数は、BMMCでは非常に遅く時には検出されない場合もあるのに比べ(2350±751ms,mean±sem;n=5)、ミクログリアでは著明に小さかった(481±31ms;n=9)。また、定常状態の電流振幅もBMMC(+40mVで6.9±2,8pA/pF;n=5)に比べミクログリアでは著明に大きかった(31.3±10.7pA/pF,n=9)。これらの結果から、(1)組織によって異なる電気的特性を持つH^+チャネルが存在する可能性、(2)H^+チャネルの発現が細胞の機能的状態あるいは培養条件と強く関連する可能性が示唆された。平成11年度は、組織や細胞の表現型によってH^+チャネルの発現や活性を変化させる因子を検索する。本年度は、主にミクログリアや破骨細胞のH^+チャネル活性の発現状況や制御機構をパッチクランプ法と細胞内蛍光シグナル(BCECF)の画像解析・顕微測光を併用して調べた。

ラット脊髄round/ameboid型ミクログリアで、細胞内pH、細胞容積、H^+電流の定量的解析を行い、(1)細胞内アシドーシスによって細胞外Na依存性に細胞の膨化が起る、(2)細胞膨化の程度(細胞直径を指標)とH^+電流の振幅の間には正の相関がある、(3)アシドーシスによる膨化とH^+電流の増加は共に細胞内ATPを必要とするがATPの加水分解には依存しない、(4)アシドーシスによる膨化とH^+電流の増加は共にactinfilamentの重合を修飾するcytochalacin Dやphaloidineにより抑制されることを明らかにした。これらの結果から、アシドーシスによる細胞膨化がH^+チャネル活性を増強し強力にH^+を排出することによってcytotoxicな細胞膨化からミクログリアを保護していることが示唆された。これは、アシドーシスと浮腫を伴うことの多い神経疾患におけるミクログリアの機能調節機構として重要な発見である。更に一定条件下での記録過程で電流振幅がしばしば変動するが、これには流出したH^+に起因する細胞膜を介するpH勾配の変化によるものとpH勾配の変化とは無関係に細胞内外環境の影響によるものがあることを明らかにした。また、破骨細胞ではサイトカイン(RankL,CSF)存在下で分化させるとH^+電流密度が増加した。その機構はまだ解明していないが、H^+チャネルの発現が培養条件や機能状態と深く関連して制御されるとが推測された。これらの結果は日本生理学会大会(1999年3月)、日本神経科学会(1999年7月)、米国生物物理学会(2000年2月)などで発表し現在論文を投稿中である。