hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
腎明細胞癌における間充識形質獲得並びに代謝再編との関連に関する研究

本研究期間において、昨年度に同定した間葉形質を獲得した腎明細胞癌におけるEZH2の発現制御、EZH2によるArf6、AMAP1、EPB41L5の発現誘導に関わる候補制御分子群の絞り込みを進めた。EZH2の発現について高転移性及び薬剤抵抗性を示す細胞、786-O、それらの遺伝子の発現が低く転移性及び薬剤抵抗性が低い細胞、A704の遺伝子発現の比較から複数種類の候補転写因子について検討を行い、候補因子の1つを786-O細胞において抑制することによりEZH2のmRNA発現が減弱し、浸潤性転移性が抑制されること、また、A704で恒常的活性化型の当該候補転写因子を発現させることでEZH2の発現が亢進することを見出した。EZH2によるArf6の翻訳段階での遺伝子発現誘導に関わる候補制御分子群として、前者についてはeIF4Aの阻害分子として知られるPDCD4の発現抑制を介した活性化の分子機序を見出した。この現象は、腎癌だけでなく膵癌細胞モデルにおいても再現された。AMAP1については、いくつかの候補分子の中でmTOR経路の活性抑制に関わるAMPKの抑制を介した分子機序を見出している。EPB41L5について、EZH2による癌抑制遺伝子TP53の抑制がZEB1の活性化につながることを示唆する実験結果を得ている。TGFβ刺激により誘導される上皮-間充織形質転換においてミトコンドリアの形態が分裂タイプに変化することを見出した。このことは、間葉形質獲得に伴いATP産生をTCA回路から解糖系へと変換したことが示唆される。また、腎明細胞癌においてEZH2がミトコンドリアの分裂に関わるDNM1Lなどの分子の発現亢進に関与することも見出している。腎癌の間葉形質獲得に伴うミトコンドリアの形態変化を介した細胞内活性酸素種の量的制御にArf6経路が関与することが示唆される。腎明細胞癌におけるEZH2の発現制御、EZH2によるArf6、AMAP1、EPB41L5の発現誘導の分子機序の一端を見出すことができたこと、並びに、腎癌の間葉形質獲得に伴うミトコンドリアの形態変化を介した細胞内活性酸素種の量的制御にArf6経路が関与すること示唆する知見を得たことは、当初の計画通りである。また、次年度へ向けた当該候補分子群に関する病理学的解析についての準備を進めた。さらに、Arf6経路による細胞内活性酸素種量の抑制に関連した検討について、新たに専門家との協力体制を構築し、解析を進めている。従って、おおむね順調に進展していると判断した。EZH2の発現、EZH2によるArf6、AMAP1、EPB41L5の発現誘導に関わる候補制御分子群のin vivoにおける機能解析を進める。即ち、当該候補分子群の発現を抑制した786-O細胞をヌードマウスに異種移植することによる腫瘍形成能、SunitinibあるいはTemsirolimusなどの抗癌剤耐性、及び、肺転移性に与える影響について検討を進める。また、候補分子に関する病理学的解析を進め生物学・医学的的意義を検討する。さらに、EZH2及びArf6経路による、間葉形質獲得に伴う細胞内活性酸素種の量的制御の分子機序について、オートファジー/マイトファジーによるミトコンドリアの品質管理への関与の可能性及びミトコンドリア内膜における活性酸素種産生抑制に関わる分子群の局在や機能制御の可能性についての検討を進める。本研究は、間葉形質を獲得した腎癌におけるエピジェネティック制御によるArf6を中心とした癌浸潤・転移に特化した分子装置の創出と活性化、及び、代謝リプログラムにおける細胞内活性酸素種の量的制御の分子機序とArf6経路との関連を検討し、その分子機序の解明を目的とする。本研究期間において、EZH2及びArf6経路構成分子群の遺伝子発現が亢進し、高転移性及び薬剤抵抗性を示す細胞として786-O、それらの遺伝子の発現が低く転移性及び薬剤抵抗性が低い細胞としてA704を用いたRNA-seq.解析を行いEZH2発現促進転写因子及び抑制転写因子候補を挙げ、EZH2遺伝子プロモーター上にある当該候補転写因子の結合する可能性があるか否かを解析ソフトJASPAR及びMEMEを用いた査定を行った後、腎癌のTCGA database解析によりEZH2発現と正あるいは負の相関が見られるものを絞り込みいくつかの転写因子候補を同定した。同様に、EZH2によるeIF4A13遺伝子群の発現誘導を介したArf6の翻訳活性化、mTOR及びRaptorの発現誘導を介したAMAP1の翻訳活性化に関わる候補転写因子群を同定している。また、EPB41L5ついてはEZH2によるZEB1の発現誘導に関わるいくつかの転写因子候補を見出している。細胞の酸素消費速度及び細胞外酸性化速度を検討することにより、Arf6, AMAP1, EPB41L5の発現を抑制することにより解糖系が低下することを観察した。癌悪性度進展と関連したEMTにおいてミトコンドリアの形態が分裂タイプに変化することを見出した。例えば、T細胞ではその活性化に伴いATP産生をミトコンドリア呼吸から解糖系へと変換し、ミトコンドリアの形態が分裂タイプに変化することが報告されていること等から(Buck et al. Cell, 2016)、癌の間葉形質獲得に伴うミトコンドリアの形態変化を介した代謝リプログラムにArf6経路が関与することが示唆される。

786-O細胞におけるEZH2の発現制御、EZH2によるArf6、AMAP1、EPB41L5の発現誘導に関わる分子群のスクリーニングを行い、複数の候補制御分子を同定したこと、酸素消費速度及び細胞外酸性化速度を検討において、Arf6, AMAP1, EPB41L5の発現を抑制することにより解糖系が低下すること、癌悪性度進展と関連したEMTにおいてミトコンドリアの形態が分裂タイプに変化することを見出しことは、当初の計画通りである。一方、Arf6経路による細胞内ROS量抑制に関連したマイトファジーによるミトコンドリアの除去の可能性とミトコンドリア内膜におけるROS産生抑制に関わる分子群の局在や機能制御に関する検討については現在解析中である。従って、おおむね順調に進展していると判断した。本研究期間において、昨年度に同定した間葉形質を獲得した腎明細胞癌におけるEZH2の発現制御、EZH2によるArf6、AMAP1、EPB41L5の発現誘導に関わる候補制御分子群の絞り込みを進めた。EZH2の発現について高転移性及び薬剤抵抗性を示す細胞、786-O、それらの遺伝子の発現が低く転移性及び薬剤抵抗性が低い細胞、A704の遺伝子発現の比較から複数種類の候補転写因子について検討を行い、候補因子の1つを786-O細胞において抑制することによりEZH2のmRNA発現が減弱し、浸潤性転移性が抑制されること、また、A704で恒常的活性化型の当該候補転写因子を発現させることでEZH2の発現が亢進することを見出した。EZH2によるArf6の翻訳段階での遺伝子発現誘導に関わる候補制御分子群として、前者についてはeIF4Aの阻害分子として知られるPDCD4の発現抑制を介した活性化の分子機序を見出した。この現象は、腎癌だけでなく膵癌細胞モデルにおいても再現された。AMAP1については、いくつかの候補分子の中でmTOR経路の活性抑制に関わるAMPKの抑制を介した分子機序を見出している。EPB41L5について、EZH2による癌抑制遺伝子TP53の抑制がZEB1の活性化につながることを示唆する実験結果を得ている。TGFβ刺激により誘導される上皮-間充織形質転換においてミトコンドリアの形態が分裂タイプに変化することを見出した。このことは、間葉形質獲得に伴いATP産生をTCA回路から解糖系へと変換したことが示唆される。また、腎明細胞癌においてEZH2がミトコンドリアの分裂に関わるDNM1Lなどの分子の発現亢進に関与することも見出している。腎癌の間葉形質獲得に伴うミトコンドリアの形態変化を介した細胞内活性酸素種の量的制御にArf6経路が関与することが示唆される。腎明細胞癌におけるEZH2の発現制御、EZH2によるArf6、AMAP1、EPB41L5の発現誘導の分子機序の一端を見出すことができたこと、並びに、腎癌の間葉形質獲得に伴うミトコンドリアの形態変化を介した細胞内活性酸素種の量的制御にArf6経路が関与すること示唆する知見を得たことは、当初の計画通りである。また、次年度へ向けた当該候補分子群に関する病理学的解析についての準備を進めた。さらに、Arf6経路による細胞内活性酸素種量の抑制に関連した検討について、新たに専門家との協力体制を構築し、解析を進めている。
活性型/抑制型GATA3複合体の形成と制御メカニズムの解明

GATAファミリーは造血系や心臓、肝臓、腸管などの発生を制御する転写因子で、GATA3は胸腺内でのT細胞の発生とアレルギー疾患発症の要となるTh2細胞の分化を制御している。申請者はこれまでGATA3が機能の異なる複数の複合体を形成し、様々なターゲット遺伝子の発現を活性化または抑制することでTh2細胞の分化をコントロールしていることを明らかにしてきた。本研究では、GATA3が受ける翻訳後修飾に注目し、これまで不明であったGATA3複合体の形成メカニズムを世界に先駆けて明らかにする事を目的とした。本研究により、GATA3のアルギニン残基(R256, R261)がメチル化修飾を受けている事が明らかになった。アルギニンメチル化修飾を受けたGATA3はTh2サイトカインであるIL-4、IL-5、IL-13のうち、IL-5だけを特異的に誘導できない事が明らかになった。その分子メカニズムとして、アルギニンメチル化GATA3はHeat shock protein 60 (Hsp60)と強く会合し、Hsp60がRNA polymerase IIによるIL-5遺伝子の転写伸長反応を阻害している事が明らかになった。IL-5は好酸球性アレルギー炎症の惹起に重要な因子であり、その制御は新たなアレルギー疾患治療法の開発につながる事と考えられている。アルギニンメチル化状態を疑似したGATA3変異体をTh2細胞に導入する事により、Th2細胞からのIL-5産生が特異的に抑制された事から、GATA3のアルギニンメチル化状態の制御が、より副作用の少ないIL-5特異的なアレルギー疾患治療法の開発につながる事が期待される。
歯科材料から溶出する徴量物質の生体障害誘起の可能性の検討

歯科材料の副作用は体液中での成分の微量溶出が主因と考えられている。従って、歯科材料の体液中における溶出動態や、溶出物の毒性情報を明らかにしておくことが歯科材料の安全性を考える上で重要である。本研究はこのような見地に立って、4種のTi合金Ti6A14V,Ti5A12.5,Fe,Ti5A13Mo4Zr,TiーNiをin vitroで唾液中に14週間浸漬し、成分元素の溶出量を原子吸光およびICPで経時的に測定するとともに、溶出物の毒性を微量で毒性を発現する感作性、変異原性について研究し、得られた濃度ー作用関係から歯科材料の障害誘起性の可能性について検討した。1.Ti合金の溶出:ヒト唾液中での合金からTiおよびAlの溶出は、試料を粉末化して行った。Ti6A14V,Ti5A12.5Fe合金粉末からの、浸漬14週間のTiの累積全溶出量はそれぞれ1045、1016ng/100mg合金、浸漬6週間のAlの累積全溶出量は165.0、480.0ng/100ng合金であり、いずれの合金からも長期間継続した溶出を認めた。しかし、その量は微量であり、毒性学的には遺伝毒性には遺伝毒性、感作性が問題となると考えられる。2.NiおよびCdの抗原性:ICRおよびBALB/c系マウスを用い、NiCl_2飲水中添加または金属Ni皮下埋植し、血中金属量の定量と免疫学的検討をCdCl_2飲料水中添加または金属Cd皮下埋植と比較した。1)Ni経口投与または皮下埋植したICRおよびBALB/c系マウスにおいて、抗核抗体の誘導を認めなかった。Cd経口投与ICR系マウスにおいて抗核抗形成を17%認めた。2)NiCl_2経口投与BALB/cマウスにおいてリンパ球のLPS、ConーA、PHAによる幼若化が増加し、金属Ni皮下埋植群ではConーAによる幼若化のみが増加した。3)NiまたはCdを投与したマウスの脾臟リンパ球のT細胞、B細胞の出現率は対照群との間に有意差を認めなかった。4)金属Cd皮下埋植ICRマウスでは対照群に比して脾リンパ球T細胞のサプレッサ-T、ヘルパ-T細胞出現率の有意の低下が認められた。歯科材料は生体内で腐食し、材料成分またはそれらの分解産物が微量溶出し、生体障害の一因となると考えられている。本年度はインプラント用金属材料のTiー6Alー4V及びTiー5Alー2.5Fe合金について生体模擬条件下における組成金属の溶出量及び溶出物の感作性について検討した。

1.Ti合金からの組成金属の溶出:Tiー6Alー4V(以下TAV合金)及びTiー5Alー2.5Fe(以下TAF合金)の試験片をフリ-ズミルを用いて微粉末化し、組織培養用培地EagleMEMに300mg/2ml浸漬し、100回/分/3時間/日振盪下37°Cで70日間インキュベ-トした。培地は1週間ごとに更新した。採取した浸漬液中の元素のうちTiは本補助金で購入したプラズマ発光装置で、その他元素はフレ-ムレス原子吸光装置で測定した、17日浸漬、821日浸漬及び2270日浸漬においてTAV合金ではTiの溶出量は検出限界以下であった。TAF合金では1.4及び1.1pg/mg合金/日の溶出を認めた。TAV合金では17日、821日及び2270日の各浸漬期間にAl73.0±28.1、52.5±12.1、1.4±1.1、V194.3±17.6、95.3±13.3、16.5±4.7pg/mg合金/日の溶出を、TAF合金ではAl25.7±6.3、4.7±0.9、0.4±0.4、Fe31.9±34.2、17.3±1.6、3.0±0.6pg/mg合金/日の溶出が認められた。2.Ti合金溶出物の感作性:合金浸漬液についてマウスC57BL/6を用いたリンパ球幼弱化試験を実施し、現在継続観察中である。以上の結果からTi合金は生体内で良好な耐食性を有し、生体適合性を有するとされているが、体液模擬条件下で組成合金の溶出があることが明らかにされた。特に近年中枢神経及び骨の疾患との関連が注目されているAlの溶出が認められたことはTi合金の長期埋入においてその安全性上注目すべきことである。歯科材料は生体内で腐食・劣化し、材料成分が溶出し、溶出物が生体障害の主因となる。特に生体内に長期間装着する材料については微量溶出物の有害作用の有無を明確にする必要がある。本研究はこのような見地に立ち、インプラント用および矯正用Ti合金4種をヒト唾液に10週間浸漬し、成分元素の溶出量を測定するとともに、成分元素の1つであるNiおよび比較の対照としてのCdについてマウスに対する免疫毒性に関する検討を行った。1.Ti合金からのヒト唾液中への組成金属の溶出:各金属100mg/2ml唾液、37°C、15回転/時間の条件で、3,7日,2,4,6,10週後のTi,Alの溶出量を測定した。いずれの合金においてもTiの溶出を認めたが、NiーTi線の3日後のTi溶出量は20.7ng/日であった。溶出量はその後減少したが、3週間後でも2.8ng/日の溶出があった。TiAlFe合金微粒子3日後の溶出量はTi 18.4ng/日、Al 58ng/日であった。2.NiおよびCdの免疫毒性:マウス(ICR,4週齢,♂)に対し、Ni,Cd微粒子1mg/匹を皮下投与またはNiCl_2 0.042mg/ml、CdCl_2 30ppmを飲料水に加え経口摂取させ、4,8週間後にmitogen(LPS,ConーA)によるリンパ球幼若化反応、抗核抗体およびT細胞(脾臓)のヘルパ-、サプレッサ-比(H/S比)を調べた。CdまたはNi皮下投与および経口投与4週間後にLPSによるリンパ球幼若化反応は対照群より亢進される傾向であった。Cd皮下投与4週間後のH/S比は増加傾向であった。抗核抗体は検出されなかった。以上の結果から歯科材料からの微量溶出元素による免疫系への作用についてより詳細な検討の必要性が示唆された。当初の研究計画はほゞ達成された。今後この方法を用い、Tiの免疫系への影響の検討が可能となった。
自閉スペクトラム症児の母子関係強化に関する遺伝子多型解析と脳機能画像研究

科学的根拠に基づいた自閉スペクトラム症(ASD:Autism Spectrum Disorder)児への養育支援のあり方を探るため、養育支援の介入前後における母子双方の脳機能計測と神経伝達物質関連遺伝子多型の同定を行う。養育支援プログラムとしては、親子相互交流療法(PCIT:Parent Child Interaction Therapy)を用い、母子関係を強化する。そしてPCITによる介入前後での脳機能の変化と、神経伝達物質関連遺伝子多型との関連について検討する。これらの知見が養育支援の方針に示唆を与え、高まる養育支援ニーズに対し効率的な対応が可能となることを目指す。
イオン液体を用いたＭＥＭＳマイクロイオン源の研究

成果を列挙する。1)500μm間隔で25(5X5)個の先端半径50nm以下、エミッタ半径50μm、高さ150μmのマルチマイクロエミッタを作製するマイクロマシニング技術を開発した。2)作製したマルチマイクロエミッタを用いてイオン液体(1エチル3メチルイミダゾィウムテトラフルオロボレート([EMIM]-[BF4])からイオンビームを形成することに成功した。3)マルチマイクロエミッタから引き出されたマイクロイオンビームによりSi基板が化学的にエッチングされることを確認した。目的に照らした実績フレキシブル同時並行マイクロファブリケーションプロセスを目的としたマイクロイオン源アレイを開発した。以下に具体的に列挙する。1)先端半径数nm数10nmのイオン源エミッタアレイを作製するマイクロマシニング技術を開発した。2)極低蒸気圧であるイオン液体、1エチル3メチルイミダゾィウムテトラフルオロボレート([EMIM]-[BF4])をイオン材料として1)のマイクロイオン源をに適用し高電流密度イオンビームを実証した。3)1)、イオンエミッタアレイおよび2)のこのイオン液体貯蔵溝をイオン源マイクロエミッターアレイととして集積化に成功した。4)本マルチマイクロイオン源のイオンビーム特性を検証するために雑音の少ないイオン引き出し電流およびイオンビーム電流、さらにはイオンビームにおけるイオン種の精密測定を行う目的で専用の評価装置および評価技術を確立した。5)[EMIM]-[BF4]を用いたイオン源から射出されたイオンはシリコン基板に照射した場合にシリコンと結合して揮発性の化合物SiF4を形成することを四重極質量分析により確認した。6)マイクロ集束イオンビームによるSi基板加工面をAFM, SEM等により評価しエッチング面がイオン加速電圧により微細にエッチングされていることを確認した。エッチング速度はガリウムイオン源を用いた場合よりも数倍大きい。成果を列挙する。フレキシブル同時並行マイクロファブリケーションプロセスを目的としたマイクロイオン源アレイを開発した。具体的にはイオン液体である1エチル3メチルイミダゾィウムテトラフルオロボレート([EMIM]-[BF4])をイオン発生用材料として適用した高電流密度マイクロイオン源を実現した。このイオン液体用貯蔵溝をイオン源マイクロエミッターアレイとの集積化をシリコン基板上にマイクロマシニング技術により集積化を図った。マイクロエミッターアレイは、シリコン深堀エッチングと等方性エッチングを組み合わせて先端半径数十nmを実現したものであり、さらに特殊な表面処理によりイオン液体に対する濡れ性を高くすることにより実現した。さらに本マイクロイオン源アレイのイオンビーム特性を検証するために専用の真空装置を試作し、雑音の少ないイオン引き出し電流およびイオンビーム電流、さらにはイオンビームにおけるイオン種の精密測定を可能とした。実験結果によればこの[EMIM]-[BF4]を用いたイオン源から射出されたイオンはシリコン基板に照射した場合にシリコンと結合して揮発性の化合物を形成することを確認した。マイクロイオン源のイオン発生物質としてイオン液体を用いることの利点は、従来のガリウムイオン源と異なり、加熱が不要であること、ガリウムのようにシリコン半導体に悪影響を及ぼさないこと、構造が単純でマイクロ化に適していること、などが実証された。当初の計画通り、マイクロイオン源アレイをマイクロマシニングを用いて作製する技術を開発した。さらにこの作製したマイクロイオン源アレイを用いてイオン放出実験を行い、イオン源アレイからのイオンビーム放出を確認した。同時に、放出されたイオンビームによりエッチング加工が可能であることを確認した。1.マイクロイオン源のレンズ系の設計と作製2.マイクロイオン源アレイの試作3.マイクロイオン源アレイによるシリコン基板のイオンビームエッチング特性の把握4.マイクロイオン源アレイによるシリコン基板の反応性イオンビームエッチング特性の把握マイクロイオン源試作検討のためのプロセス経費および材料経費に使用。また学生のRA経費として使用する。今年度は研究をイオンエミッタアレイに集中したが、次年度は、マイクロイオン源のレンズ系の設計と試作を主として研究を実施する。
精神障害者の自立支援のための地域再生と社会関係資本の開発に関する研究

本研究は、1990年代以後急速に進められる精神保健医療・福祉政策、実践のパラダイムシフト、特に「脱施設化」、さらに「ポスト脱施設化」社会への移行に関する抵抗因の解明と新たな市民社会の仕組みとその構築に関する方法の具体的提案を行うことにあった。2年間にわたる研究の中において、わが国の精神障害者を巡るこうした新しい社会の形成に関する困難は、ひとつに1960年代以後に進む国際的な地域移行におけるわが国が背負ってきたねじれが解消されず、その強い残存、特に財政的、方法的な医療モデルへの依存があり、いまひとつは市民社会における事業展開への地域力の不足があった。しかしこうした状況下におけるわが国においても、新たな方法や価値、規範を含む事業が生まれ始めており、それらは調査等で明らかになったように「方法の当事者化」や「場の地域化」とネットワークの相互乗り入れを前提に、新たなつながりと協働の形成を軸にしたさまざま事業モデルの「発見」「開発」「強化」として整理、提案することができた。本研究の概要は、1990年代以降の精神保健医療・福祉の政策および実践的課題である脱施設化社会への移行に際して、問題点の解明と移行後の社会モデルを提示するための構成フレームについて検討することにある。本年度は次の点を中心に検討を行った。1.ポスト脱施設化社会の形成と運用(1)移行前の脱施設化社会に対する認識と評価(歴史的蓄積・政策動向・国際基準・同意承認)(2)次社会の形成と運用にかかる新たな社会的関心と関与の具現化2.協働型社会における地域力の構成要素とサービス供給体制のありかた(1)精神保健福祉領域の指定管理者制度によるサービス供給(鹿児島市精神保健福祉交流センターの事例から)(2)地域コミュニティにおける協働参画(三鷹市C-cafe、三鷹市市民協働センターの事例)まず、これまでの精神障害者のケアの歴史また政策面においても本人不在で受け皿づくりに集中してきたこと、つまり社会の関心は本人ではなく病気や障害またその治療や対策にあったこと、さらに現在の改革は地域においての関与(コミュティケア)を求めるものであるが、そこにいたるまでの価値規範の承認がなされていないがゆえに社会的入院の解消の遅れにみるように地域移行が進まない点を明らかにした。続くポスト脱施設化社会の運営をめぐっては、「方法の当事者化」と「場の地域化」の軸において関与の具現化をとらえる必要がある。それを基礎自治体での政策設計とサービス供給体制における協働のパターンとの関連から鹿児島と三鷹の実践をとりあげた。そこでは、活動や関心のたかまりと蓄積、ニーズに即したサービス供給のありかたの工夫という点において参画の枠の広がりを確認した。本研究は、精神保健医療・福祉の政策および実践的課題におけるポスト脱施設化社会を支える新たな市民生活のしくみの解明と具体的提案を行うことにあり、最終年度にあたる今年度は、次の2点を軸に研究を進めた。1点目は「緩やかな支援ネットワークの形成要因」と「社会関係資本」との関連、2点目は「地域における新たな権利と義務」の検証である。1点目の支援ネットワークの形成要因については、前年度に引き続き鹿児島市精神保健福祉交流センター等での事業の推移と克服されるべき課題について追調査を行った。当センターは平成18年の開設時より、平成16年に設立された有限会社が指定管理者として選定されサービスを行っており、精神保健医療・福祉の新しいサービス供給体制への移行の側面において注目される点でもある。この地域が他の都道府県と比較して精神科病院、家族、専門家といったことへの依存指数の高い地域であるにもかかわらず、サービスの量や範囲、利用者数を増やし、さらにネットワークの形成と発展がみられる点などは、社会関係資本の概念整理において重要な知見を得ることができた。続く2点目は、ICTの活用によるデジタル・インクルージョンの検討とともに、地域再生と個々人がエンパワメントをしていくための課題を確認した。さらにこうした事業体をCSO(市民社会組織)と位置づけ、地域社会の課題との関連性を評価する中で、総合的な地域力としての福祉的評価軸、またエンパワメントの評価軸などの開発が今後の課題として明らかになった。
生殖補助医療(ART)に用いる乏精子症患者精子のゲノムインプリントの解析

生殖補助医療(ART)がゲノムインプリントにどのような影響を及ぼすのか評価するため、男性不妊症精子検体を用い、7種類のインプリント遺伝子のアレル特異的メチル化領域のDNAメチル化についてBisulphite-PCR法を用い、異常の頻度、程度、影響を受けやすい遺伝子について解析した。その結果、24.7%(24/97)にメチル化インプリントの異常を認めた。異常の程度は精液所見と相関し、重症乏精子症の60%は異常を呈した。また、その原因として、メチル化酵素が関与している事が示唆された。本年度の計画は以下の如くで、ほぼ順調に行われた。(1)精子DNAの抽出:124症例精子DNAを抽出した。精子は体細胞の混入がないように、swim-up法にて精子細胞のみを回収した。年齢、既往歴、生活歴、常用薬等の患者情報を登録した。(意義)IVF-ETやICSIなどに用いる精子のインプリント遺伝子のメチル化の解析を行い、異常の頻度、程度、影響を受けやすい遺伝子の有無に関する検討を行い、ART治療後の出生児のインプリント病の病因解析となる。(重要性)少子高齢化、晩婚化の進む我が国の、今後さらに増加するART不妊治療の安全性や危険性について評価される点で非常に重要である。1)男性不妊(乏精子症)精子のインブリント遺伝子のDNAメチル化解析精子124例(重度15 ;中等度乏精子症18 ;正常91)の精子よりDNAを抽出し、7種類のインプリント遺伝子のDNAメチル化解析を行った。卵子型インプリント(LIT1, ZAC, PEG1, PEG3)と精子型インプリント(H19, RASGRF1, GTL2)について、Bisulphite(BS)-PCR法でDNAメチル化について解析した。その結果、1)24.7%にメチル化インプリントの異常を認めた(精子14.4%、卵子20.6% ;両方45.8%)に異常を認めた2)メチル化インプリント異常を示したのDNNT3A, 3Lの遺伝子解析精子検体にてメチル化インプリント異常を呈す24症例の末梢血DNAより、DNMT3A及び3L遺伝子の遺伝子変異について解析した。1)DNMT3A, 3Lの塩基置換が7例認められた(ミスセンス変異4例、ナンセンス変異3例)2)メチル化異常と相関するDNA多型がDNMT3Lに2カ所(2例)みられ、いずれも精液見は重症乏精子症であった。3) ART出生児(5歳児)の両親へのアンケート調査1)男女ともに出生時は低身長、低体重であるが、身体的発育は正常2)ICSI児で、探索(新しいことに挑戦する能力)と社会(コミュニケーション能力)指数が低い児が多く認められた3)ART児の胎盤機能低下(胎盤早期剥離、前置胎盤)の産科合併症の頻度は単胎でおよそ3倍4)5歳児における奇形発生率は3.3%(22/672)ICSI児にインプリント異常症(Prader-Willi)が1例認められた(意義)IVF-ETやICSIなどに用いる精子のインプリント遺伝子のメチル化の解析を行い、異常の頻度、程度、影響を受けやすい遺伝子の有無に関する検討を行い、ART治療後の出生児のインプリント病の病因解析となる。
細胞外小胞は、異種細菌間情報伝達のシグナル運搬役となりうるか?

近年の微生物研究における革新的な発見として、微生物が産生する低分子化合物(シグナル)を介した微生物間情報伝達が急発展している。しかし、細胞間におけるシグナルの動態の理解は重要にもかかわらず、未解明のままである。一方、多くのグラム陰性細菌は細胞外に小胞(ベシクル)を分泌し、その中にシグナルが存在することが明らかになってきた。そこで本研究は、「細胞外小胞(ベシクル)は、異種細菌間情報伝達のシグナル運搬役となりうるか?」を検証する。グラム陰性菌でメンブランベシクルと呼ばれる小胞体を細胞外に生産することが明らかとなっている。メンブランベシクルは外膜から遊離した直径20250 nmの細胞外小胞であり、タンパクが多く含まれる。さらには微生物間コミュニケーションで用いられるシグナル物質の運搬体としても働いている。細胞外に放出されたベシクルは同種の細胞に融合することが観察されているが、果たして異種間でそのような現象が起こるのかについてはほとんど分かっていない。こうした知見を得ることはメンブランベシクルの生理的、生態的意義解明へ向けての第一歩となる。そこで、本研究では、まず、Pseudomonas aeruginosaにより生産されたメンブランベシクルが異種細菌に融合するのかを調べた。Pseudomonas aeruginosaが生産したメンブランベシクルを回収し、それをFITCにより蛍光ラベリングした後に3回洗浄し、Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Pseudomonas stuzeri, Pseudomonasdenitrificansに暴露した。30°Cで2時間培養後、細胞を生理食塩水で洗浄し、細胞の蛍光強度を測定した。その結果、メンブランベシクルを暴露したサンプルでは蛍光が検出された。この結果は蛍光ラベルされたメンブランベシクルが細胞に融合したころを示唆している。しかし、メンブランベシクルに含まれるシグナル分子が、相手側細胞に伝達されたかは、Pseudomonas aeruginosa以外のグラム陽性細菌を含む他の細胞では確認出来なかった。今後、さらに詳細に調べる必要がある。そこで、本研究ではPseudomonas aeruginosaにより生産されたメンブランベシクルが異種細菌に融合するのかを調べた。本年度はその実験系の確立を行った。今後はさらに様々な細菌種で同様の試験を行い、メンブランベシクルの宿主域を検討するとともにその意義について解明していく。23年度はメンブランベシクルのグラム陰性さらにグラム陽性細菌への移行を確認することを目的としており、それらについてアッセイ系の構築に成功すると共に、証明が出来た。続いて、メンブランベシクルによるシグナルの伝達効率について詳細な解析を進める。具体的には、メンブランベシクル中に含まれるシグナルが、シグナル単独で細胞外に存在している場合と比較して、高いか否かを調べる。また、以上は、グラム陰性および陽性細菌に対しても調べることで、メンブランベシクルのシグナル運搬機能について明らかにしていく。ベシクルに含まれるシグナルが受容菌の細胞内へ伝達されるかを検証し、ベシクルが異種細菌間コミュニケーションにおいてシグナル伝達の重要な役割を担っているかを明らかにする。具体的には、i)シグナル(PQS)を含むベシクル、ii)シグナル(PQS)を含まないベシクル、およびiii)シグナル(PQS)のみ、それぞれによる受容菌への効果を比較することで、ベシクルが他の細菌へのシグナル運び屋として機能しているかを検証する。
血管透過性亢進モデルマウスを用いた血管透過性亢進の抑制方法の検討

血管透過性亢進は重症患者の予後を悪化させるため、動物実験などによる制御方法の探索が必要である。本研究は、従来動物を犠死させる必要があった血管透過性評価の非侵襲的方法の開発と、その亢進の制御方法の探索を目的とした。評価方法の開発では、蛍光イメージング測定システムで非侵襲的に評価したマウスの足底蛍光度が、従来の肺血管透過性評価結果と同じ傾向を示し肺の蛍光度とも強く相関するため、非侵襲的肺血管透過性評価に有用であることを明らかにした。制御方法の探索では、エリスロポエチンが敗血症マウスの血管透過性亢進を制御しうる可能性を見出した。今後、さらなる薬剤や適切な使用方法の探索につき、検討を重ねていく。血管透過性の亢進は、輸液量の増加や浮腫の増大、生命予後の悪化を招く。血管透過性の亢進を制御することは、重症患者の生命予後を改善させる可能性があるが、その制御方法は確立しておらず、適切な治療薬も明確になっていない。本研究は、血管透過性亢進の制御方法の開発を目的としている。18G針により穿孔を作成した、盲腸結紮穿孔による腹膜炎性敗血症モデル(CLPモデル)で、十分な血管透過性亢進が得られることを確認したため、実検には同モデルマウスを用いた。現在一般に用いられている血管透過性の評価方法には、色素を投与したマウスから臓器を摘出し、漏出した臓器中の色素を測定する方法や、開胸や開腹手術で臓器を露出した上で、顕微鏡で観察する方法などがあるが、いずれも侵襲的である。そのため、長期的な観察や複数のtime-pointでの評価は困難であり、精度の高い実験結果を得るための障壁となっていた。今年度は、同一個体での継時的な観察を可能とし、新規治療法開発の一助とするため、Perkin Elmer社のIVIS Lumina II imaging systemを用いて、蛍光による非侵襲的な血管透過性評価方法の開発を行った。本法は、近赤外線蛍光色素を投与した動物において、体表の血管透過性を測定することで、その程度を評価する方法であるが、実験の結果、体表の血管透過性が深部臓器である肺の血管透過性と相関することが明らかとなった。この、新規非侵襲的血管透過性評価方法については現在論文作成中である。引き続き、本法による評価を用いた、血管透過性亢進の制御方法の開発を行う予定である。本年度は、CLPマウスのほか出血性ショック(THS)による血管透過性亢進モデルマウスを確立することと、非侵襲的な血管透過性評価方法を開発することを目的とした。CLPマウスでは、18G針を用いて腸管穿孔を行うことで、確実に血管透過性亢進を再現できるモデルを安定して作成できるようになった。一方、技術的な面からTHSマウスの作成には難渋し、年度中に安定してTHSマウスを作成することはできなかった。そのため、CLPとsham、血管透過性の抑制を目的としてステロイドを投与したマウスを用いて、非侵襲的な血管透過性評価方法の開発を行った。非侵襲的な血管透過性評価方法の開発には、Perkin Elmer社のIVIS Lumina IIimaging systemを用いた。同装置では、蛍光色素を投与した動物に励起光を照射することで、蛍光を定量化することが可能となる。既報から、血管透過性亢進状態では蛍光色素が血管外漏出するため、その蛍光度が血管透過性の程度を反映すると考えられた。また、蛍光色素には様々な特性があるが、短時間の半減期を持つため血管内のbackgroundの影響を除外しやすく、かつ、分子量が小さく血管外に漏出しやすいPerkin Elmer社のGenhance 750が、血管透過性の評価に有用であると考えられた。これらの機材を用いて実験を行った結果、非侵襲的に測定したマウスの足底の蛍光度は、CLPとsham、ステロイド投与群の間で有意に異なり、さらに、ex vivoで観察した肺の蛍光度と強い相関を認めることが判明した。以上の結果から、足底の蛍光度測定は、非侵襲的な血管透過性評価や、肺の蛍光度、すなわち、肺の血管透過性の予測に有用と考えられた。この結果を非侵襲的な血管透過性評価方法の開発としてまとめ、現在論文を作成中である。重症病態では血管透過性が亢進する。血管透過性の亢進は臓器浮腫を惹起し、その機能障害を引き起こし、予後の悪化にもつながる。そのため、その亢進を制御することは重症患者の救命のために重要であり、その探索研究のためには動物実験が有用な手段となる。しかし、従来の動物実験における血管透過性の評価では摘出した臓器を用いる必要があったため、動物を犠死させる必要があり、血管透過性の重症度と生命予後とを同一個体で評価することが不可能であった。その問題点を解決するため、蛍光イメージング測定システムを用いた、蛍光度評価による非侵襲的血管透過性評価方法の開発を行った。その結果、足底の蛍光度は、全身性炎症反応で障害される肺の蛍光度と非常に良く相関することが明らかとなり、さらには、各個体における蛍光度の強弱は、従来から血管透過性の指標として用いられてきたEvans blue色素の血管外漏出量と同様の傾向を示すことも明らかとなった。

よって、足底の蛍光度評価は、肺の蛍光度、すなわち、肺の血管透過性の非侵襲的評価に有用と考えられ、それを英文論文として報告した。この新規評価方法は、今後の血管透過性に関する病態解析ならびに治療学研究を大いに推進させうるものと考えられる。また、その新規評価方法を用いて、血管透過性亢進を制御する可能性が示唆されているが、その効果が明らかではない複数の薬剤についての検証を行った。その結果、盲腸結紮穿孔手術による敗血症モデルマウスにおいて、手術前にエリスロポエチンを投与した場合に血管透過性の亢進を抑制しうる可能性が示唆された。しかし、手術後投与時の薬効や、生命予後の改善効果については明らかではなかった。これら、血管透過性亢進を抑制する薬剤についての探索研究については、引き続き検討を続ける予定である。血管透過性亢進は重症患者の予後を悪化させるため、動物実験などによる制御方法の探索が必要である。本研究は、従来動物を犠死させる必要があった血管透過性評価の非侵襲的方法の開発と、その亢進の制御方法の探索を目的とした。評価方法の開発では、蛍光イメージング測定システムで非侵襲的に評価したマウスの足底蛍光度が、従来の肺血管透過性評価結果と同じ傾向を示し肺の蛍光度とも強く相関するため、非侵襲的肺血管透過性評価に有用であることを明らかにした。制御方法の探索では、エリスロポエチンが敗血症マウスの血管透過性亢進を制御しうる可能性を見出した。今後、さらなる薬剤や適切な使用方法の探索につき、検討を重ねていく。CLPによる敗血症モデルマウスにおいて安定した血管透過性亢進が得られるようになったため、同モデルを用いて、新規血管透過性制御方法を開発する。方法としては、CLPと薬剤投与群を比較し、血管透過性の抑制効果やバイオマーカーの動態を検討することで、薬剤の治療効果につき検討する。また、今回開発した非侵襲的な評価方法を用いることで、これまで犠死せしめることが必要であったためできなかった、複数のtime-pointにおける血管透過性の評価や、同一個体における、血管透過性制御の効果と生存時間への影響の検討などを行う。救急集中治療医学初年度は、動物購入費、飼育費用、実験器材購入費、蛍光試薬購入費、統計ソフト購入費などに助成金を使用した。これらに要した費用は当初の予定よりも安価であったが、これは、当該研究費の助成を受ける前より、研究室にそなえてあった物品を使用することが可能であったためである。次年度繰越金により、これらの購入を要する。また、学会発表が遠方とはならなかったため、旅費を要さなかったことも、繰越金が生じることに関係した。H28年度の購入が間に合わなかった、動物飼育、実験消耗品などの備品を購入する。また、現在作成中の、蛍光トレーサーを用いた非侵襲的な血管透過性評価方法の開発についての論文を、オープンアクセス紙に投稿予定であるため、投稿料を要する。これらに関する費用に、繰越金の大半を使用する予定である。当初より、H29年度には血管透過性抑制試薬を購入し、その試薬の臨床効果について研究する予定としているため、当該年度の助成金は、予定通り同試薬購入や、実験器材の購入、学会や論文発表などの費用に使用する予定である。
p62-Keap1-Nrf2 pathwayによる大腸癌抗癌剤耐性機序の解明

p62-Keap1-Nrf2経路はNQO1等の抗酸化ストレス蛋白を誘導している。NQO1は癌細胞においては抗癌剤耐性に関与することが知られている。本研究の目的は進行大腸癌におけるNQO1発現と予後の関連を明らかにすることである。KRAS野生型大腸癌において、NQO1陰性例はNQO1陽性例に比べ、病勢制御率が有意に良好であった。さらに、NQO1陰性例は無増悪再発期間、全生存期間も有意に良好であった。KRAS野生型進行大腸癌において、腫瘍におけるNQO1発現検索は、化学療法の効果または予後に関する有効な予測因子となる可能性がある。申請者らは、KRAS遺伝子変異のないKRAS野生型大腸癌であっても、薬物療法が奏効しない症例が存在することに着目し「メインストリームであるOncogenic Ras-MEK-ERK pathwayとは別経路が大腸癌の抗癌剤耐性機序に関与している」と考えた。そこで、p62-Keap1-Nrf2 pathwayが大腸癌の抗癌剤耐性に関与しているという仮説を立て、これを証明することを研究目的とした。平成26年度の研究実施計画として、(1)切除標本におけるp62/Nrf2/NQO1発現についてモノクローナル抗体を用いた免疫染色を行った。本研究51例の対象症例中、78.4%の症例でNQO1が発現し、21.6%はNQO1陰性であることが明らかとなった。Nrf2は細胞質、核内の染色分布に差異を認めており、評価方法を検討中である。p62については、リン酸化p62の染色を行い、個別化の評価を行っている。いずれの結果も大腸癌抗癌剤耐性機序における新知見であると考えている。(2)KRAS遺伝子変異については対象症例で検索済みであり、化学療法施行例においてはRECIST v1.1に準拠した効果判定を行った。予後については全例で最新情報を常にアップデートしている。KRAS statusとNQO1発現を組み合わせた予後解析を行ったところ、統計学的な有意差を認めた(P = 0.049)。特にKRAS野生型かつNQO1発現陰性症例では、予後が良い可能性が示唆された。その理由として抗癌剤の奏効が関与している可能性を考えており、免疫組織化学染色の結果と実臨床の関連が明らかになると考えている。(3)p62タンパク発現、Keap1 mutationについての分子生化学的検索を平成27年度以降に行っていく予定である。平成27年度までに以下の研究・解析を行った。(1)切除標本におけるNrf2/NQO1発現についてモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学染色を行った。(2)KRAS遺伝子変異については対象全症例で検索済みである。KRAS statusとNQO1発現を組み合わせた生存解析を行ったところ、統計学的な有意差を認めた(P = 0.049)。(3)NQO1の抗癌剤耐性機序の証明のために、抗癌剤治療を行った47例でprogression free survivalとの関連を解析した。化学療法施行例においてはRECIST v1.1に準拠した効果判定を行った。NQO1の発現の有無と奏効率、PFS、OSの関連を解析している。NQO1の発現解析は予定通りすでに終了している。一方で、p62、Nrf2の免疫組織学染色については、当初入手した抗体による染色では個別化が困難であった。NQO1と臨床データとの関連については概ね順調に進捗しており、途中経過報告として、研究会での発表(第101回新潟消化器病研究会)、学会発表(第115回日本外科学会学術集会、World Congressof Surgery,Aug. 2015, Bangkok)、論文化(新潟医会誌129(6):300-308,2015)を行った。現在、NQO1の抗癌剤耐性機序の証明のため、RECIST判定による奏効率、PFS、OSとの関連について解析中であり、併行して英文論文化の準備を行っている。p62-Keap1-Nrf2経路はNAD(P)H:quinone oxidoreductase-1(NQO1)等の抗酸化ストレス蛋白を誘導している。NQO1は酸化還元サイクル、酸化ストレスから細胞を防御しているが、癌細胞においては抗癌剤耐性に関与していることが知られている。本研究の目的は進行大腸癌(局所進行または転移再発大腸癌)におけるNQO1発現と予後の関連を明らかにすることである。47例(男性28例、女性19例、年齢中央値62歳(範囲:17-78))を対象とした。

腫瘍組織の免疫染色には抗NQO1モノクローナル抗体を用いた。NQO1発現と患者背景、化学療法奏効率、予後について検討した。化学療法の効果判定(完全奏効、部分奏効、安定)はRECIST v1.1を使用して行った。大腸癌においては抗EGFR抗体経路が重要な役割を果たしているため、KRAS野生型、変異型に分けて比較検討を行った。47例のうち、31例(66.0%)がKRAS野生型であり、16例(34.0%)はKRAS変異型であった。37例(78.7%)はNQO1発現陽性であり、10例(21.3%)はNQO1発現陰性であった。KRAS野生型において、NQO1陰性例はNQO1陽性例に比べ、有意に病勢制御率が良好であった(P = 0.028)。さらに、NQO1陰性例は無増悪再発期間、全生存期間も有意に良好であった(P = 0.041、P = 0.043)。KRAS野生型進行大腸癌において、腫瘍におけるNQO1発現検索は、化学療法の効果または予後に関する有効な予測因子となる可能性がある。p62-Keap1-Nrf2経路はNQO1等の抗酸化ストレス蛋白を誘導している。NQO1は癌細胞においては抗癌剤耐性に関与することが知られている。本研究の目的は進行大腸癌におけるNQO1発現と予後の関連を明らかにすることである。KRAS野生型大腸癌において、NQO1陰性例はNQO1陽性例に比べ、病勢制御率が有意に良好であった。さらに、NQO1陰性例は無増悪再発期間、全生存期間も有意に良好であった。NQO1の発現解析は予定通りすでに終了している。一方で、p62、Nrf2の免疫組織学染色については、当初入手した抗体による染色では個別化が困難であった。染色濃度による分類や、別抗体による染色などを検討している。NQO1と臨床データとの関連については概ね順調に進捗しており、途中経過報告として研究会での発表や和文論文化を行った。進行再発大腸癌におけるNQO1発現と予後の関連についての新知見が得られている。現在、英文論文化に向けて準備中である。NQO1発現と臨床データの関連について解析が進みデータをまとめつつ、英文論文執筆中である。追加実験にかかる物品費用、学会発表にかかる旅費、英文論文に関わる費用を計上する。大腸癌NQO1発現と臨床データの関連について解析が進み、World Congressof Surgery(Aug. 2015, Bangkok)での発表を予定している。研究費は免疫組織化学染色に用いる抗体、学会発表にかかる旅費、英文論文に関わる費用などに使用する予定としている。p62免疫組織化学染色による個別化が困難であったため、リン酸化p62の染色を検討している。p62タンパク発現、Keap1の遺伝子変異など、分子生化学的検討を進めるため、生化学的研究実績のある分担者を含め、3名の分担者を追加して研究を促進していく予定である。概ね計画通りに進行しており、現在、英文論文作成中である。年度内に英文校正まで達成しなかったため若干の予算が繰越となった。当初の予定よりもp62,Nrf2,Keap1免疫組織
クロム系硬質薄膜の合成と切削工具、摺動部材および精密金型への応用

本年度は最終年度であり,4元系窒化物を作製し,その評価を実施した.本研究の最終目的はクロム系薄膜にAl添加し,現在使用されているTi系窒化物薄膜を凌駕できるかを明らかにし,実用化研究への指針を示すことである.さらに本研究で得られた最良のCrl-xAlxN膜に少量のTiを添加した(Ti, Cr, Al, Si)N薄膜においては,Al含有量の増加に伴い,結晶構造が変化し,Al55at.%以下では立方晶単相を示した.また,Al58at.%以上ではAl含有量の増加に伴い立方・六方晶の混合相から六方晶単相へ結晶構造変化を起こした.(Ti, Cr, Al, Si)N薄膜の微小硬度は,結晶構造と関係があり,立方晶と六方晶とでは比較的,立方晶で高硬度が得られた.また,Al44.0at.%で最大硬さ31.0GPaとなった後,Al含有量の増加に伴い微小硬度が26.0GPaまで低下した.TEM観察で,立方晶(Ti, Cr, Al, Si)Nの結晶粒が5-10nm程度に微細化されており,それに対し,六方晶の(Ti, Cr, Al, Si)Nは50-200nmで粗大であることが確認された.以上より,(Ti, Al)NにSiおよびCr元素を添加することにより,(Ti, Al)Nを凌駕するセラミックス薄膜が得られた.また,熱安定性と耐酸化性を向上させるのに,Si添加が効果的であることが明らかとなった.本年度は最終年度であり,4元系窒化物を作製し,その評価を実施した.本研究の最終目的はクロム系薄膜にAl添加し,現在使用されているTi系窒化物薄膜を凌駕できるかを明らかにし,実用化研究への指針を示すことである.さらに本研究で得られた最良のCrl-xAlxN膜に少量のTiを添加した(Ti, Cr, Al, Si)N薄膜においては,Al含有量の増加に伴い,結晶構造が変化し,Al55at.%以下では立方晶単相を示した.また,Al58at.%以上ではAl含有量の増加に伴い立方・六方晶の混合相から六方晶単相へ結晶構造変化を起こした.(Ti, Cr, Al, Si)N薄膜の微小硬度は,結晶構造と関係があり,立方晶と六方晶とでは比較的,立方晶で高硬度が得られた.また,Al44.0at.%で最大硬さ31.0GPaとなった後,Al含有量の増加に伴い微小硬度が26.0GPaまで低下した.TEM観察で,立方晶(Ti, Cr, Al, Si)Nの結晶粒が5-10nm程度に微細化されており,それに対し,六方晶の(Ti, Cr, Al, Si)Nは50-200nmで粗大であることが確認された.以上より,(Ti, Al)NにSiおよびCr元素を添加することにより,(Ti, Al)Nを凌駕するセラミックス薄膜が得られた.また,熱安定性と耐酸化性を向上させるのに,Si添加が効果的であることが明らかとなった.金属材料等の表面に数ミクロンのセラミックス系硬質膜を被覆する表面処理技術が切削工具,摺動部材,精密金型をはじめとする工業分野で注目されている.カソディックアークイオンプレーティング法は物理蒸着法の1つであり,固体のアーク放電および高電圧のバイアスを印加するため,作製した膜には準安定な結晶構造が出現し,また優れた物理的特性を有することが知られている.これらの薄膜は,通常立方晶形のものが製品として使用されているが,立方晶から六方晶に相転移する領域で,特に高硬度を示すとの報告がある.しかしながら,電子顕微鏡やX線回折を用いた詳細な研究は報告例がなく,統一的に理解されていないのが現状である.そこで本研究では,金属原子を2種類以上含んだ多元系窒化物薄膜を作製し,X線回折法や高分解能透過型電子顕微鏡を用い,第2金属元素量および相変態に対する物性変化と微構造との関係を系統的に明らかにすることを目的とした.16年度は,Ti_<1-X>Al_XNにCrを添加することでAl固溶限界の拡張を試みた.さらに作製した薄膜の熱処理による高温安定性およびアルミニウム原子の熱拡散が結晶構造に与える影響について調べた.立方晶Ti_XCr_YAl_ZNのAl固溶限界は73at.%まで増加し,立方晶から六方晶への相変態に対応し,微小硬度が29GPaから27GPaまで減少することがわかった.そして900°Cに加熱すると,アルミニウム原子の熱拡散により立方晶から六方晶への結晶構造変化が生じ,1000°Cでは,格子定数が増加した.また,新規クロム系窒化物薄膜を作製するために,ボロン(B)元素添加による新たな硬質薄膜を作製した.具体的にはCr_<1-X>Al_XNをベースにB元素を添加し,微小硬度,微構造,耐酸化性を評価した.その結果,B元素を10at.%添加することによりCr_XAl_YB_ZNの硬度は27GPaから33GPaまで増加した.さらにB含有量の増加に伴い,格子定数は0.411nmから0.409nmまで減少した.17年度の目的は,クロム系4元系硬質薄膜をカソーディックアーク型PVD法により,切削工具,摺動部材および金型技術等へ応用することである.

耐酸化,高硬度および耐摩耗性に優れたCr1-xAlxN膜を凌駕するため,TiおよびSiを添加し,格子定数および硬さを測定し,以下の結果を得た.また,切削工具,摺動部材に求められる特性である熱安定性について,熱処理後による(Ti,Cr,Al,Si)N膜の微構造,微小硬度の変化もあわせて調べた.・(Ti,Cr,Al)N膜にSi元素を添加することにより耐酸化性の向上,微小硬度が上昇した.・成膜時のバイアス電圧の増加に伴い,結晶構造がhexagonalからcubicへ配向した.・熱処理前の膜表面に観察されているドロップレットと呼ばれる金属組成を主とする球状の塊が熱処理後の膜表面では減少し,膜表面および膜中に存在しているドロップレヅトが熱処理によって拡散したと考えた.・バイアス電圧ごとの熱処理による硬さ変化を測定し,成膜時のバイアス電圧により熱処理前の硬さ,および熱処理後の硬さ変化が異なることを見出した.また,熱処理による結晶構造の変化もバイアス電圧により異なることを明らかにした.全体として,Si添加が薄膜を硬化させることが明らかとなった.今後,高分解能電子顕微鏡を用い,原子レベルで薄膜-基板界面を断面から観察し,併せて有限要素法によりコンピュータシミュレーションする予定である.特に,基板として用いる超硬合金中のWCと薄膜との結晶方位関係も重要と考える.本年度は最終年度であり,4元系窒化物を作製し,その評価を実施した.本研究の最終目的はクロム系薄膜にAl添加し,現在使用されているTi系窒化物薄膜を凌駕できるかを明らかにし,実用化研究への指針を示すことである.さらに本研究で得られた最良のCr1-xAlxN膜に少量のTiを添加した(Ti, Cr, Al, Si)N薄膜においては,Al含有量の増加に伴い,結晶構造が変化し,Al55at.%以下では立方晶単相を示した.また,Al58at.%以上ではAl含有量の増加に伴い立方・六方晶の混合相から六方晶単相へ結晶構造変化を起こした.(Ti, Cr, Al, Si)N薄膜の微小硬度は,結晶構造と関係があり,立方晶と六方晶とでは比較的,立方晶で高硬度が得られた.また,Al44.0at.%で最大硬さ31.0GPaとなった後,Al含有量の増加に伴い微小硬度が26.0GPaまで低下した.TEM観察で,立方晶(Ti, Cr, Al, Si)Nの結晶粒が5-10nm程度に微細化されており,それに対し,六方晶の(Ti, Cr, Al, Si)Nは50-200nmで粗大であることが確認された.以上より,(Ti, Al)NにSiおよびCr元素を添加することにより,(Ti, Al)Nを凌駕するセラミックス薄膜が得られた.また,熱安定性と耐酸化性を向上させるのに,Si添加が効果的であることが明らかとなった.