hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ウイルス感染病態の進行におけるヘパラン硫酸とヘパラナーゼ

これらの事実からマスト細胞が細胞外のヘパラナーゼを取り込んで分泌顆粒内に再構成する機構を想定し、取り込み過程における硫酸化糖鎖の切断の有無が取り込みのオンオフを制御していることをヘパラナーゼ阻害剤を用いた細胞試験により示した。本研究課題の遂行において、上皮細胞へのウイルス感染に関わる分子を明確に同定するには、該当遺伝子を欠損する「ノックアウト」細胞の構築が不可欠であると考えられた。研究分担者・山本博士との共同でこの点が解決されつつある。肺上皮細胞A549に対する遺伝子導入について、山本博士には長年のノウハウがあり、この技術と星薬大での発現解析法とを組み合わせることで、ノックアウト細胞の構築まであとわずかのところにこぎつけた。研究分担者・安達博士との共同で、組織修復に関与するヘパラナーゼについて、上皮細胞への作用、組織に分布するマスト細胞における発現調節の両面から検討を行った。安達博士によって合成されたヘパラナーゼ阻害物質を活用することにより、上皮細胞の増殖調節におけるヘパラナーゼの関与、またヘパラナーゼのマスト細胞への取り込み機構、の両者について新たな知見を示すことができた。本研究課題の目的は「ウイルス感染機構と、その後に生じる上皮組織の障害機構を解明し、これを阻害する薬理学的手法を見出す」ことである。ウイルス感染機構についての独自の視点として、ヘパラン硫酸がインフルエンザウイルスの感染過程を何らかの形で調節することを予備的に見出していたが、詳細は不明であった。そこで、ヘパラン硫酸のコアタンパク質であるシンデカン-1、-2についてcrispr-Cas9による遺伝子ノックアウト細胞を得るためのベクターを構築し、平成30年度はベクターを導入した細胞集団からクローンを確立し、ここから両アレルに変異をもちシンデカン-1遺伝子の発現を欠くノックアウト細胞を選別した。この細胞の表面におけるシンデカン-1タンパク質の発現は確かに消失していたが、意外なことに、ヘパラン硫酸の発現はむしろ上昇しており、これに伴ってインフルエンザウイルスの感染効率も上昇した。一方、ウイルス感染に伴う上皮細胞死の検討に際して、感染時に上皮細胞内で発現上昇することが知られているヘパラナーゼ遺伝子に着目した。上皮細胞株をヘパラナーゼ阻害物質で処理したところ、増殖抑制ならびに低血清時における細胞死を誘導することを新たに見出した。この事実は、ヘパラナーゼの発現が細胞の生存や組織修復に関わる可能性を示唆する。生体内で外因的なヘパラナーゼを保持する細胞としてマスト細胞が挙げられる。マスト細胞は前駆体タンパク質を優先して取り込むが、取り込まれにくい成熟体が共存する条件で、取り込み受容体となるヘパラン硫酸の発現が低下することを見出した。また、この取り込みはヘパラナーゼ阻害物質で抑制された。取り込みに関わるヘパラン硫酸がシンデカン-4によって提示されることを、遺伝子ノックダウンの実験で示した。
JAK2キナーゼを介したエリスロポエチンレセプターからの細胞内情報伝達機構の解析

JAK2とエリスロポエチン(エポ)レセプターとのin vivoにおける結合を、種々の変異レセプターを発現させた細胞を用い分析したところ、Jak2はエポ刺激依存性にエポレセプターと結合し,活性化されエポレセプターおよび自身のチロシンリン酸化を引き起こすことが明らかとなった.Jak2との結合と活性化の誘導は,C末端領域を欠如するも増殖刺激伝達能は正常のレセプターにおいても認められた.一方,膜近位部で他のサイトカインレセプターとの相同生領域に点突然変異を有するレセプターでは,Jak2との結合と活性化や他のキナーゼの結合は全く認められなかった.以上の結果より,エポレセプターは細胞内膜近位部においてJak2と結合し活性化することにより増殖シグナルを伝導することが強く示唆された(Blood84;1501-7,1994).JAK2の各領域を大腸菌もしくはCOS細胞に発現させ,エポレセプターとの結合および活性化に必要な領域をin vitroおよびin vivoにて検討したところ,C末端部分のキナーゼ領域が重要な役割を果たすことが見出された(投稿準備中).エポ刺激によるRas/MAPキナーゼ経路の活性化について検討したところ,エポレセプターはC末端領域依存性にShcのチロシンリン酸化とAsh/Grb2との結合を誘導しこの経路の活性化を惹起することを見出した(J.Biol.Chem.269:29962-29969,1994).しかし,この経路の活性化は種々の変異レセプターを発現させた細胞において,レセプターのJak2活性化能および細胞増殖誘導能とは相関を示さなかった.一方,エポレセプターはVavのチロシンリン酸化とPim1キナーゼの発現誘導を引き起こしたが,これらはJak2の活性化および細胞増殖シグナルと密接に相関し,細胞増殖シグナルの伝達に重要な機能を有することが強く示唆された(Blood84:4135-4141).JAK2とエリスロポエチン(エポ)レセプターとのin vivoにおける結合を、種々の変異レセプターを発現させた細胞を用い分析したところ、Jak2はエポ刺激依存性にエポレセプターと結合し,活性化されエポレセプターおよび自身のチロシンリン酸化を引き起こすことが明らかとなった.Jak2との結合と活性化の誘導は,C末端領域を欠如するも増殖刺激伝達能は正常のレセプターにおいても認められた.一方,膜近位部で他のサイトカインレセプターとの相同生領域に点突然変異を有するレセプターでは,Jak2との結合と活性化や他のキナーゼの結合は全く認められなかった.以上の結果より,エポレセプターは細胞内膜近位部においてJak2と結合し活性化することにより増殖シグナルを伝導することが強く示唆された(Blood84;1501-7,1994).JAK2の各領域を大腸菌もしくはCOS細胞に発現させ,エポレセプターとの結合および活性化に必要な領域をin vitroおよびin vivoにて検討したところ,C末端部分のキナーゼ領域が重要な役割を果たすことが見出された(投稿準備中).エポ刺激によるRas/MAPキナーゼ経路の活性化について検討したところ,エポレセプターはC末端領域依存性にShcのチロシンリン酸化とAsh/Grb2との結合を誘導しこの経路の活性化を惹起することを見出した(J.Biol.Chem.269:29962-29969,1994).しかし,この経路の活性化は種々の変異レセプターを発現させた細胞において,レセプターのJak2活性化能および細胞増殖誘導能とは相関を示さなかった.一方,エポレセプターはVavのチロシンリン酸化とPim1キナーゼの発現誘導を引き起こしたが,これらはJak2の活性化および細胞増殖シグナルと密接に相関し,細胞増殖シグナルの伝達に重要な機能を有することが強く示唆された(Blood84:4135-4141).
ｐｉＲＮＡ経路関連因子Ｍａｅｌｓｔｒｏｍの分子機能解析

Maelstrom(Mael)は,生殖組織特異的RNAサイレンシング機構の中核因子であるpiRNAの生合成に必須の因子である.本研究では,現在樹立されている唯一の生殖細胞由来培養細胞であるカイコ卵巣由来BmN4細胞を用いて,Maelの分子機能と作用機序を解明することを目的とした.【Maelの作用点の解析】次世代シーケンサーを用いた網羅解析により,Mael発現抑制下におけるpiRNA第一次生合成因子SiwiのpiRNAの質の変化を検証したところ,piRNA第二次生合成因子Ago3やVasaの発現を抑制したときと同様の変化傾向が認められた.以上から,MaelはAgo3のpiRNA生合成に寄与することで,引き続いて起こるpiRNA第二次生合成依存的なSiwiのpiRNA生合成を促進することが示唆された.【Mael-RNA結合の必要性の解析】Mael-RNA結合に必須のアミノ酸を同定し,このRNA結合変異体を用いたレスキューアッセイを試みたところ,変異体はFLと同程度までpiRNA生合成量を回復した.以上から,MaelのHMG-boxドメインにおけるRNA結合はpiRNA生合成に不要であることが示された.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。Maelstrom(Mael)は,生殖組織特異的RNAサイレンシング機構の中核因子であるpiRNAの生合成に必須の因子だが,その分子機能や作用機序は未知である.そこで本研究では,現在樹立されている唯一の生殖細胞由来培養細胞であるカイコ卵巣由来BmN4細胞を用いて,Maelの分子機能を明らかにし,piRNA生合成経路の全容を解明することを目的とする.本年度は以下の研究を実施した.【カイコMael(BmMael)の作用点の解析】これまでの実験から,BmMaelはpiRNA前駆体のプロセシングに寄与する因子であることが推測された.そこでより正確な作用点を同定するべく,BmMaelの発現を抑制したBmN4細胞から,同経路の中核的因子であるSiwiやBmAGO3に結合するRNAを回収し,網羅解析を行った.その結果,piRNAの第二次生合成のみに寄与するBmAGO3が結合するpiRNAの量に著しい減少が認められ,BmMaelはpiRNA第二次生合成において機能しうることが示唆された.【BmMaelに結合する二本鎖RNAの解析】これまでの実験から,BmMaelのHMG-boxドメインが特に二本鎖RNAに対して嗜好性を示すことは判明していた.そこで当嗜好性がpiRNA生合成に寄与するか否かを明らかにするべく,BmMaelモノクローナル抗体を用いたiCLIP法によりBmMaelに結合するRNAを回収した.今後網羅解析を進めることで,BmMaelが特異的に結合するRNA配列を同定することが期待される.【BmMael複合体の関連因子間分子間相互作用の解明】BmMaelの発現を抑制したBmN4細胞において,SiwiなどのBmMaelと結合するpiRNA生合成因子の発現量変化,および複合体形成変化を解析した.その結果,BmMaelの発現抑制により複合体の形成は不安定化することを明らかにした.【BmMaelの作用点の解析】piRNA生合成経路におけるBmMaelの作用点が,第二次生合成であることを示した.より正確な作用点を同定するべく,来年度も継続予定である.【BmMaelに結合する二本鎖RNAの解析】BmMaelモノクローナル抗体を用いたiCLIP法によりBmMaelに結合するRNAを回収した.来年度以降に予定していた研究であったが,前倒して進めた.来年度も継続予定である.【BmMael複合体の関連因子間分子間相互作用の解明】BmMaelの発現を抑制したBmN4細胞において,SiwiなどのBmMaelと結合するpiRNA生合成因子の発現量変化,および複合体形成変化を解析し,BmMaelの発現抑制により複合体の形成は不安定化することを明らかにした.来年度も継続予定である.Maelstrom(Mael)は,生殖組織特異的RNAサイレンシング機構の中核因子であるpiRNAの生合成に必須の因子だが,その分子機能や作用機序は未知である.そこで本研究では,現在樹立されている唯一の生殖細胞由来培養細胞であるカイコ卵巣由来BmN4細胞を用いてMaelの分子機能を明らかにし,piRNA生合成経路の全容を解明することを目的とする.本年度は以下の研究を実施した.これまでに,BmMaelはpiRNA第二次生合成経路で機能することを明らかにした.本年度は,BmMaelと同様に第二次生合成因子であるBmVasaを比較対象とし,RNAi法によりそれぞれを発現抑制したときのSiwi結合piRNAについて次世代シーケンサーによる網羅解析を行うことで,BmMaelの正確な作用点を同定しようと試みた.【BmMaelに結合するRNAの解析】これまでに,BmMaelがRNAと結合するのに必須と考えられるアミノ酸を同定した.本年度は,このRNA結合がpiRNA生合成に寄与するか否かを検証するべく,RNA結合変異体コンストラクトを作製した.また,iCLIP法により前年度すでに回収済みだったBmMael結合RNAについて網羅解析を行い,BmMaelが特異的に結合するRNA配列の同定を試みた.【BmMael複合体の関連因子間分子間相互作用の解明】

これまでに,BmMaelの発現を抑制したBmN4細胞ではpiRNA生合成因子から構成されるBmMael複合体の形成が不安定化することを明らかにした.本年度は,BmMaelの発現抑制時におけるpiRNA生合成因子の細胞内動態を免疫染色法によって解析した.また,リコンビナントタンパク質を用いたin vitroのプルダウンアッセイにより,BmMael複合体構成の全貌を解明しようと試みた.本年度は以下の実験を実施し,BmMaelはNuageの足場となってpiRNA第二次生合成経路に寄与するという仮説モデルを立てた.【BmMaelの作用点の解析】BmMaelおよびBmVasaそれぞれを発現抑制したときのSiwi結合piRNAについて網羅解析を行ったが,二者間に相関は認められなかった.BmMaelのより正確な作用点を同定するべく,他の第二次生合成因子にも着目して来年度も継続予定である.【BmMaelに結合するRNAの解析】BmMaelがRNAと結合するのに必須と考えられるアミノ酸,R19とK20に点変異を入れたRNA結合変異体コンストラクトを作製した.piRNA生合成におけるBmMaelのRNA結合の必要性を明らかにするべく,来年度も継続予定である.また,BmMael結合RNAについて網羅解析を行った.その結果,BmMaelが結合するRNAの配列に特徴はみられなかったが,トランスポゾン配列のセンス側と好んで結合する傾向が確認できた.【BmMael複合体の関連因子間分子間相互作用の解明】BmMaelの発現を抑制したBmN4細胞において,SiwiやBmQin,BmSpn-EといったBmMaelと結合するpiRNA生合成因子の細胞内動態を解析した.その結果,BmSpn-EとBmQinのNuage局在が失われ,細胞質全体に散ったことから,2因子のNuage局在にはBmMaelが必要であることが示唆された.さらに,BmMaelやSiwiのリコンビナントタンパク質を用いたin vitroのプルダウンアッセイにより,BmMaelやSiwiとBmSpn-Eは直接結合しないことも明らかにした.BmMael複合体形成における因子間のヒエラルキーをより詳細に明らかにするべく,来年度も継続予定である.Maelstrom(Mael)は,生殖組織特異的RNAサイレンシング機構の中核因子であるpiRNAの生合成に必須の因子である.本研究では,現在樹立されている唯一の生殖細胞由来培養細胞であるカイコ卵巣由来BmN4細胞を用いて,Maelの分子機能と作用機序を解明することを目的とした.【Maelの作用点の解析】次世代シーケンサーを用いた網羅解析により,Mael発現抑制下におけるpiRNA第一次生合成因子SiwiのpiRNAの質の変化を検証したところ,piRNA第二次生合成因子Ago3やVasaの発現を抑制したときと同様の変化傾向が認められた.以上から,MaelはAgo3のpiRNA生合成に寄与することで,引き続いて起こるpiRNA第二次生合成依存的なSiwiのpiRNA生合成を促進することが示唆された.【Mael-RNA結合の必要性の解析】
細胞内タンパク質の分解と生理的意義

平成6年10月30日から開催される第10回細胞内蛋白質分解に関する国際会議(第10回ICOP)で取り扱うトピックスを決定することを目的として討議を重ねた。各班員が各自の専門領域を中心に最新の話題を整理しすると共に、世界20ヶ国以上の専門家からいけんを聴取し、現在最も話題性のあるトピックスや近い将来面白く発展すると思われる話題を集約した。これらの結果について全班員の班会議を3回、小規模の集会を5回、及び公開シンポジウムを1回開催し、集められた話題について討議し、話題の整理を行なった。その結果、ホットな話題として、抗原蛋白質のプロセッシングと提示、細胞分化、脳神経機能と長期記憶増強、蛋白質分解の初発段階の選別機構等の正常な生体機能とプロテアーゼの研究で最近大きな進展があったとの認識で一致し、これらの話題を中心にセッションをつくることにした。また、プロテアーゼの構造と機能相関では特に、メタロプロテアーゼのX線解析が行なわれ、癌の浸潤・転移、リューマチなどに作用するプロテアーゼに対するドラッグデザインが行なわれつつあり、一大トピックスであること、さらに、アルツハイマー病とプロテアーゼの関係が明確になってきたので、アルツハイマー病における蛋白質分解についての概説も重要で、これら2つを基調講演にすることにした。アポトーシス、ウイルス感染、高血圧、骨粗しょう症などに関しても、プロテアーゼ作用の機能との関連で重要であり、適当な話題であることで一致した。以上のホットな面でのセッションの他に、種々のプロテアーゼとインヒビターの構造と機能、生理作用など、基本的話題を扱う基本的なセッションを組み合せてICOPの講演を行なうことにした。
意識の解明に迫る比較認知神経科学

本研究計画では、動物の認知や学習に関する実験心理学的・神経生物学的な比較研究を通して、ヒトを含めた動物の意識に迫るというのが当初の目的であった。国際共同研究加速基金(B)への採用に伴って、こちらの若手研究については、わずか半年で終了という経緯になった。今後、本研究計画での目的は、新しく採用された予算などにおいて、より拡大し、発展した形で継続していくことになる。半年間という短い期間ではあったが、若手研究の研究費による支援によって、早稲田大学や共同研究先機関において、齧歯類の独自の行動実験設備を構築することができた。その成果は、早稲田大学の学部生である松尾友貴さんや、慶應義塾大学のポスドクである藤巻峻さん、同じく慶應義塾大学の学部生である盛田一孝さんらの献身的な努力によって大いに助けられ、日本動物心理学会において2件のポスター発表を行うことができた。そこでは、自分たちで構築した頭部固定によるパヴロフ型条件づけ課題を用いて、動物の時間認識やその学習を調べるための実験系について報告することができた。こうした行動実験の基盤をもとに、神経生物学的な操作・計測技術の樹立にも着手することができ、現在も、オプトジェネティクスをはじめとした神経生物学的な技術や、画像解析による行動の精緻な解析を、実験心理学へと導入させているところである。それだけでなく、生理学研究所での分野横断型のシンポジウムや、関西学院大学応用心理科学研究センターなどで遂行中の研究成果を交えた内容について講演を行った。若手研究者の研究基盤の整備という意味でも、若手研究者による、さらに若い学生たちとの共同研究という意味でも、ある程度の実績をあげることができたと思っている。この支援によって生み出された可能性を糧に、今後も、精力的に研究に取り組んでいきたい。
大正期の林間学校に関する比較史的研究 -地域性を活かした野外活動に着目して-

本研究では、(1)各府県の林間学校の活動内容の一部には地域的特色が反映され一定の成果を挙げていたこと、(2)一方で、林間学校が「虚弱児童」の養護と密接に関係していたため、その教育目的、時間割、活動内容等を総合的にみると全国的に画一化された傾向があったことを明確にした。また、調査を通じて(3)地域によっては他の野外活動により強く地域的特色が反映されている事例が多数あることも明らかになった。本年度は、以下の2点についての調査研究を実施した。1、大正期の東京市における林間学校の調査・研究従前からの東京市に関係する研究成果に加えて、新たに東京市社会局による「御殿場夏期林間学校」と「佛蘭西寄贈病院」が三田「有馬ヶ原」で実施した林間学校の調査を行った。また、その成果を「大正末期の東京市における林間学校-御殿場夏期林間学校と佛蘭西寄贈病院-」(『早稲田教育評論』22巻1号、2008年)としてまとめた。2、各府県における林間学校の調査大正期の林間学校に関する書籍によると、当時、林間学校が実施されていた地域として、香川県、大阪府、宮城県などが挙げられている。そこで、本年度はそれぞれの地域における史料調査を実施した。具体的には以下の通りである。(1)香川県における史料調査香川県の場合は、事前調査を行い各関係機関の史料収蔵状況を調査した。その結果、香川県公文書館・香川県歴史資料館・香川県教育センターには教育関係の史料があまり収蔵されていないことが明確となった。そこで、対象を香川県立図書館に保存されている新聞・雑誌に限定して調査を行い、香川県における林間学校の史料を多数集めた。(2)大阪府における史料調査大阪府の調査は、大阪府公文書館に保存されている学校関係文書と、府立中之島図書館が所蔵する図書を対象に調査を実施し、多数の史料を収集した。(3)岐阜県における史料調査岐阜県では岐阜県立図書館に所蔵されている『岐阜県教育』を対象に史料調査を実施し、林間学校関係の記事を収集した。(4)宮城県における史料調査宮城県では宮城県公文書館所蔵の学校関係文書を対象として調査を実施し、関連する史料を収集した。今後は、上記の調査結果を基に、地域性に着目しながら分析を進め、大正期の各府県の林間学校の特質を明確にする。本年度は、東京府、大阪府、岐阜県、香川県、宮城県について、(1)林間学校実施の地域的要因、(2)各地域の教員らの問題意識、(3)野外教育の理論、(4)林間学校の実際と工夫について明確にすることを目的に公文書館等での資料調査を実施した。これまでの研究成果は以下のようになる。東京府と大阪府については、大都市特有の都市問題とその影響により増加した「身体虚弱児」の健康増進を目指して林間学校が企図されていた。そのため健康増進のための学校衛生的な活動が主であり、地域性を活用した活動は少なかった。ただし、訪問先の地理・歴史など開催地について学ぶ時間を設けている。次に岐阜県は、後に文部省学校衛生官として林間学校の普及に努めた大西永次郎が県の衛生主事をしていた。このため、同県においても主として健康回復を目指す林間学校が中心である。ただし、子どもたちの生活圏内で実施されるケースが多く、地域生活の実地学習的な側面も見受けられた。香川県については、明治末期から「臨地教授」と呼称される地域学習が夏季に実施されていた。大正期になると、これに健康増進という目的が加えられ「林間学校」の形態をとるようになる。このため、地元の習俗や歴史を学ぶ機会も多く取り入れられており、地域性を活かした活動が多数みられた。宮城県の「林間学校」についても「虚弱児童」の健康増進を目的とするものが多い。ただし、同県では北国という地域性を活用し、寒中水泳など冬季の野外教育が実践されていた点が特質と言える。最後に本研究を総括すると、大正期の各府県の林間学校は主として健康増進が主であったが、地理・歴史の実地学習を通じて地域の習俗等を学ぶ機会が設定されており、地域性を活用した事例がある程度見受けられた。また、本研究により、これまで未開拓であった大正期の林間学校の全国的状況を一定程度明確にすることができたと考える。
外科的血栓塞栓症の成因と病態の解析、とくに凝固制御機構の新しい分析法の確立と応用

1.血液凝固線溶異常分子の構造解析:フィブリノゲン(以下Fbg)の異常分子の解析を本研究期間中も継続して全国諸機関から依頼された。これらの中、とくにフィブリンの重合障害をもつものはほとんど変異がγ鎖のC末寄りの限られた領域(γ275375位)に集中していた(γArg-275→His、2例;同→Cys4例,Met-310→ThrにAsn-308へのオリゴ糖付加、1例;Asp-330→Tyr、1例;Arg-375→Gly、1例).これらはすべて遺伝子のコドン内での一塩基置換で説明され、γ鎖のこの限られた領域の構造がフィブリンの重合、すなわち血栓の形成に重要であることが示された。上記の変異の中、Arg-275→His以外はすべて未報告の新しい変異型であった。これらについて目下遺伝子解析を進めている。2.培養血管内皮細胞(EC)と凝固線溶因子との相互反応:ECがprotein C(PC)を生合成し、細胞膜表面に発現しているという新しい知見を得た。PCは凝固の進展に際してトロンビンによって活性化され、プロテア-ゼ(APC)に転じ、Va、VIIIa両因子を限定分解することによって凝固を抑制するビタミンK依存性蛋白質で、肝での生合成のみ明らかにされている。EC表面での活性はもとより、PCを規定するメッセンジャ-RNAを抽出、同定したことは、EC単独で抗血栓性機能を発現することを示したもので、今後更に検討を加えたい。3.凝固線溶因子に対するモノクロナル抗体の作成と応用:Fbg、PC、凝固IX、X、XIIIの諸因子およびPAI-1、thrombin・antithrombinIII複合体に対してモノクロナル抗体を作成し、その性状を解析した。中でもγ鎖(85-302)ペプチド、D分画N末立体構造を認識するmAbは上述1におけるFbgの構造解析に威力を発揮した。またその他の抗体も凝固線溶関連因子の相互反応に応用した。1.異常フィブリノゲンの構造と機能の分析:本研究初年度、6家系で新しい3型を含むアミノ酸置換を同定した。また従来分析して来た異常分子でも新しい置換型を同定した。中でも、γ鎖275位アルギニン→システイン置換は4家系で同定された。置換システインにさらに遊離システインがジスルフィド結合していること、またγ鎖310位メチオニン→スレオニン置換例では新たに糖付加の構造が形成されたことからγ鎖308位アスパラギンにオリゴ糖の付加が証明された。これらはフィブリンの重合に関与する領域での2重の構造異常であり、著明なフィブリン重合障害が認められている。後者では架橋形成も悪く、事実、著しい外傷後出血と創傷治癒遅延が特徴的であった。2年度に分析を進めたい。2.プロテインC異常症の解析:1才時から重篤な血栓塞栓症(脳血栓、DVT、肺塞栓)に罹患している18才女性でプロテイン(PC)の欠損(父から)と分子異常(母から)が見出された。異常分子ならびに遺伝子解析から、活性化に際してトロンビンにより開裂される重鎖12位のアルギニンがトリプトファンに置換(CGG→TGG)しており、活性化されない異常分子と判明した。構造と機能異常が明示された世界最初の症例である。

3.培養血管内皮細胞(VE)を用いた血栓形成機構の分析:ヘパリンとの結合能を欠く異常アンチトロンビンIII(ATIII)はVEとも結合し難く、VE上で進行する血栓形成機序を制御し得なかった。この事は生理的な血栓制御機序の分析に有用な情報と考えられる。4.トロンビン・ATIII複合体形成機序の解析:当該複合体に対して作成したモノクローナル抗体を応用し、ATIIIによるトロンビンの中和反応を分析した結果、反応初期に不安定なアシル複合体中間体が形成されることが認められた。この中間体は従来仮設として提唱されていた。以上14の成績を研究発表欄に記載の如く報告又は報告予定である。1.血液凝固線溶異常分子の構造解析:フィブリノゲン(以下Fbg)の異常分子の解析を本年度も継続した(研究発表ア.10、12、13、16;イ.2ー4;ウ.2)。これらの中、フィブリンの重合障害例は殆ど差異がγ鎖のC末寄りの限られた領域(γ275375位)に集中していた(γArgー275→His、同→Cys、Metー310→ThrにAsnー308へのオリゴ糖付加、Aspー330→Tyr、Argー375→Gly)。これらはすべて遺伝子のコドン内での一塩基置換で説明され、γ鎖のこの領域の構造がフィブリンの重合、すなわち血栓の形成に重要であることが示されたので目下遺伝子解析を進めている。2.培養血管内皮細胞(EC)と凝固線溶因子との相互反応:ECがprotein C(PC)を生合成し、細胞膜表面に発現しているという新しい知見を得た。PCはビタミンK依存性蛋白質の一つで、これまで肝での生合成のみが明らかにされている。EC表面での活性はもとより、PCを規定するメッセンジャ-RNAを抽出、同定したことは、ECが単独で抗血栓性機能を発現することを示したもので、重要な知見と考える(研究発表イ.1、5)。1)抗Fbg γ鎖抗体:Fbgの構造解析に有用で実際本研究でも威力を発揮した。2)FbgーD分画のアミノ基末を認識する抗体:血栓症やDICの血中に特異的に出現するDダイマ-の検出に有用で、実地応用を検討している。3)その他の抗体:当該分子の精製と分子構造と機能の解析・臨床的には、血栓塞栓症やDICでのこれら諸因子の変動を検討し診断と病態把握への応用性が確認された(ア.10ー16;イ.1ー7)。
自閉症スペクトラム障害における脳波の信号源推定

自閉症スペクトラム障がい児の客観的診断方法の確立のため、通常脳波の2倍の電極数を用いた頭皮脳波を解析し背景波や突発性異常波の信号源推定を行い、各人の頭部MRI上に描写することを研究の目的とした。得られた脳波をもとに解析ソフトを用いて信号源推定を実施したが、以下の問題点を解決できず有意義な結果を得ることができなかった。1.頭皮脳波で得られたデータにおいて信号源推定に用いるための特徴的背景波や突発性異常波が見られないケースが多く見られた。また突発性異常波の信号源推定を実施しても、全体を通して一定の傾向や特徴的な所見はなく、データを蓄積することができなかった。2.信号源推定の結果を各患者のMRIに重ね合わせて正確な脳部位に描写させる必要があったが、空間的な位置座標を脳波とMRIで一致させることができなかった。位置座標を一致させるための方法として、あらたな機器の購入以外に根本的な解決策を見出せなかった。結果として信号源推定結果と各患者のMRI画像に大幅なずれが生じてしまい、脳部位の正確な位置に信号源推定結果を描写することができなかった。3.自閉症スぺクトラム障がい児における頭部MRI撮影は、鎮静剤を用いた検査が必要となることが必須であり、また鎮静剤を用いてもMRI検査が中断してしまいデータを得ることができないこともみられた。以上の問題点をクリアできず有意義な結果を得ることができなかった。研究計画や実施手技を再度見直し、今後も継続して脳波の解析を行い、自閉症スペクトラム障がい児における特徴的な所見を見出していきたい。自閉症スペクトラム障害児の客観的診断法の確立を目的として、頭皮脳波を用いた背景波や突発性異常波の信号源推定のための準備を行った。当初通常脳波の2倍の電極数を用いた脳波検査を予定していたが、当院の脳波計において現状では制限があり、予算の都合上通常電極数での脳波測定に変更し実施している。また信号源推定結果を描写するための頭部MRIを並行して実施している。しかし自閉症スペクトラム障害児における頭部MRI検査では検査に対する協力を得られないことが多く、鎮静剤を用いての検査が必要となる等の問題で、脳波記録を得られた全員に対し確実に頭部MRI検査を実施できていないのが現状である。本年度、脳波検査を実施した人数は20人に対し、頭部MRI撮影を同時に実施できたのは5人である。現在脳波検査と頭部MRI検査の両方を得られた自閉症スペクトラム障害児に信号源推定を実施し頭部MRI上に描写しデータの集積を行っている。本年度の計画として、自閉症スペクトラム障害児に対して頭皮脳波と頭部MRIを実施しデータを集積する予定だったが、特に頭部MRI検査を実施できないケースが多く発生し、計画よりもかなり遅れてしまっている。次年度に集積されたデータを解析し、自閉症スペクトラム障害患者に対する信号源推定結果を用いた客観的診断方法の確立を目指していくと同時に、データの蓄積のために脳波検査と頭部MRI検査を並行して実施しさらなるデータの蓄積を実施する予定である。発達障害児に対する脳波検査や頭部MRI検査を実施するにあたり検査への協力が得られにくく、鎮静剤を用いる状況が多い。そのため検査を順調に実施できていない状況が多くデータの集積が滞ってしまっているため。自閉症スペクトラム障害の客観的診断法の一つとして、頭皮脳波を用いた背景波や突発性異常波の信号源推定のためのデータ集めを行った。当初通常電極数での脳波測定を実施していたが、2倍の電極数を用いて脳波検査を実施することが可能となり、新たなデータを収集している。信号源推定を実施するための頭部MRIデータが必要とされるが、自閉症スペクトラム障害児のMRI検査では、鎮静を必要とするケースが多く、確実に画像検査を実施できないケースが多くデータの収集が遅延している。可能な限り脳波検査とMRI検査を両方実施し、自閉症スペクトラム障害児に対する信号源推定結果をもちいた客観的診断法の確立を目指していく。

3.自閉症スぺクトラム障がい児における頭部MRI撮影は、鎮静剤を用いた検査が必要となることが必須であり、また鎮静剤を用いてもMRI検査が中断してしまいデータを得ることができないこともみられた。以上の問題点をクリアできず有意義な結果を得ることができなかった。研究計画や実施手技を再度見直し、今後も継続して脳波の解析を行い、自閉症スペクトラム障がい児における特徴的な所見を見出していきたい。現在集積されたデータの解析を実施している。しかし当初予定していたデータ数に到達できていないため、次年度以降も脳波検査とMRI検査を実施しデータの集積を継続していく予定である。当初通常電極数での脳波検査を実施していたが、通常の2倍の電極数で脳波検査を実施できるようになり、再度脳波データを集積している。しかし当初予定していたデータ数に到達できていないため、次年度以降も脳波検査とMRI検査を実施していく。研究成果の発表と情報収集のための学会出席の旅費を計上していたが、研究計画の遅れにより発表を行うことができなかったため。(理由)データを蓄積するためのハードディスクの購入等を計画していたが、データ蓄積の遅延により未購入のため。また研究成果の発表と情報収集のための学会出席の旅費を計上していたが、参加ができなかったため(使用計画)引き続き研究発表と情報収集のために学会出席するための旅費と集積データの蓄積のためのハードディスクの購入1.物品費として集積したデータを解析するためのPCや保存するためのハードディスク等の購入2.研究のための情報収集、研究成果の発表のための旅費
低温合成によるりん酸鉄基リチウムイオン伝導体のナノスケール構造評価

リチウムイオン電池用正極材の候補として、オリビン型LiFePO_4が注目されている。しかし、その電気化学的特性と構造変化との関係等については不明な点が多い。本研究では液相法と比較的低温の固相反応法を組み合わせてLiFePO_4粒子を合成し、その充放電特性やFeの化学状態等について検討した。LiFePO_4中のFeの化学状態は、放射光によるFe K吸収端のX線吸収スペクトルのその場測定により、繰り返し充放電特性とFeの化学状態とが相関をもつことを明らかにした。また、ポリオール法で合成したLiFePO_4粒子の構造や充放電特性に及ぼす還元性雰囲気下における熱処理の効果等についても調べ、適切な熱処理により試料のX線回折ピーク位置の変化が確認され、格子歪の緩和が起こることを示唆する結果が得られた。熱処理により充放電容量も増大し、適切な熱処理が試料特性を向上させるのに有効であることを明らかにした。異なる原子価をもつ鉄イオン[Fe(II)とFe(III)]からなる酸化鉄は、様々な興味深い挙動を示す。たとえば、Green Rustは、水溶液中でFe(III)主体のオキシ水酸化鉄等へと変化する。また、りん酸鉄基リチウムイオン伝導体[Li-Fe-PO_4]もFe(II)とFe(III)からなる酸化鉄の一つである。この化合物では、Liイオンの酸化鉄微粒子へのインターカレーションが起こっているが、その原子価や結晶性の変化については十分わかっていない。本年度は、Green Rust(SO_4等が入った酸化鉄)酸化の基礎過程を調べると共に、液相と固相のルートを併用してりん酸鉄リチウムイオン伝導体の合成を試みてきた。りん酸鉄リチウムの合成では、まず液相法により2価の鉄とリン酸の化合物を作製し、次にそれにリン酸三リチウムと混合し、ガス中での熱処理によりLiFePO_4を合成した。合成した試料のXRD測定から、この微粒子はほぼ単相のLiFePO_4でできていることを示した。また、X線吸収分光測定により前駆体の化合物は鉄の2価とリン酸からなっており、リン酸鉄リチウムでは鉄の化学状態は2価の状態であることが確認された。さらに、充放電特性の評価により、合成したLiFePO_4の容量は、理論容量よりも大幅に小さい値であったが、動作電位はLiFePO_4の動作電位であることが確認された。作製した試料の電気容量が低い主な原因として、LiFePO_4粒子の電気伝導度が低いことや粒子粗大化によりリチウムの拡散速度が低下していることなどが考えられる。今後は、カーボン被覆による導電性の向上および粒子径の制御を試みることにより、容量の増加を図るともにLiの動きに伴う鉄の化学状態変化を明らかにする予定である。たとえば、オリビン型りん酸鉄基リチウムイオン伝導体[Li-Fe-PO_4]もFe(II)とFe(III)からなる酸化鉄の一つであり、この化合物へのLiイオンのインターカレーションが起こり、興味深い電気化学的性質を示すが、その原子価や結晶性の変化については不明な点が多い。平成21年度は、液相と固相のルートを併用してりん酸鉄リチウムイオン伝導体の合成を試みた。りん酸鉄リチウムの合成においては、まず液相法により2価の鉄とリン酸の化合物を作製し、次にそれにリン酸三リチウムと混合して、ガス中での熱処理によりLiFePO_4を作製した。合成した試料の精密X線解析から、この微粒子はほぼ単相のLiFePO_4でできていることを示した。さらに、X線吸収分光法により前駆体の化合物は鉄の2価とリン酸からなっており、リン酸鉄リチウムでは鉄の化学状態はほぼ2価の状態であることを示した。さらに、充放電特性の評価により、合成したLiFePO_4の容量は理論容量よりも大幅に小さい値であったが、実際の動作電位はほぼLiFePO_4の動作電位になっていることが確認された。合成した試料の電気容量が低い原因として、LiFeO_4粒子の電気伝導度が低いことや粒子粗大化によりリチウムの拡散速度が低下していることなどが考えられるが、カーボン被覆による導電性の向上および粒子径の制御や容量の増加を図るともに、実際の粒子におけるLiの動きに伴う鉄の化学状態変化等を明らかにしていく。本年度は液相法によるオリビン型のHFePO_4粒子の合成および評価に取り組んだ。

合成においては、エチレングリコールに硫酸第一鉄およびリン酸を溶解した溶液に、水酸化リチウムを溶解した溶液を混合した後、393Kで24時間反応させて生成物を得た。走査電子顕微鏡観察により、この生成物は数十nm程度の微粒子の凝集粒子であり、X線回折測定にょり、得られた粒子はほぼオリビン型のLiFePO_4単相であることがわかった。しかし、リン酸鉄水和物とリン酸三リチウムの固相反応により作製した既報のLiFePO_4の定数を比較すると、今回液相法で作製したLiFePO_4粒子のaおよびb軸が長く、c軸が短く、格子が歪んでいることが明らかになった。また、この粒子の0.1Cで測定した充放電容量は、理論容量である170mA/gよりも遥かに小さな110mAh/g程度であった。さらに、この液相法で合成したLiFePO_4粒子の特性を向上させるために、アルゴンと水素の混合ガス雰囲気下で熱処理を施した。773K以下で熱処理を施した粒子でも、単相状態は保持されたが、この熱処理により回折ピークがシフトすることが分かった。リートベルト解析により、今回の方法で作製したLiFePO_4粒子の格子定数は、熱処理により固相法で合成した既報のLiFePO_4の値に近づき、格子歪みが緩和されることが示唆された。さらに、熱処理により、FeのK吸収端のX線吸収スペクトルは熱処理により低エネルギー側にシフトし、熱処理前よりも大きい160mAh/g程度の充放電容量(0.1Cでの測定)になることを示した。つまり、LiFePO_4粒子の充放電容量は、格子歪やFeの化学状態等と密接に関係していることが明らかになった。
MnSOD遺伝子改変動物による内耳活性酸素種処理機構の解明

Manganese superoxide dismutase (MnSOD)はミトコンドリア内に局在する抗酸化酵素である。本研究では全身性MnSODヘテロ欠損マウス(Sod2+/-)を背景動物を対照として騒音曝露後の聴力変化、内耳組織学的変化を解析した。騒音曝露より7、14日後の聴力閾値はSod2+/-群で20dB程度の有意な上昇を示した。組織学的には外有毛細胞障害が主でSod2+/-群では蝸牛の全回転で有意に生存率が低下していた。MnSOD減少に伴い騒音曝露後の聴力回復遅延と外有毛細胞障害が生じることが示され、内耳における酸化ストレス処理にMnSODが関与することが示唆された。聴覚や平衡障害をきたす内耳障害は種々の要因から内耳における活性酸素種(ROS)が増加し、ミトコンドリア機能不全に陥ることがその重要な原因の一つと考えられているが、内耳障害時のROS処理機構は明らかではない。MnSOD(Manganese superoxide dismutase; SOD2)はミトコンドリア内に存在する主要な抗酸化酵素であり、本研究ではMnSOD遺伝子改変動物を用いて内耳障害時のROS処理機構を解明すべく研究を行った。はじめに、MnSOD floxマウスとCAG-Creマウスを交配させて全身性MnSODヘテロ欠損(Sod2+/ー)マウスを作製し、背景動物であるC57BL/6マウスを対照(Sod2+/+)とした。次に各群に120dB SPL、4kHzオクターブバンドノイズを4時間暴露し、一過性騒音性難聴を生じさせた。聴力は騒音暴露前、1時間後、1、3、7、14日後に聴性脳幹反応(ABR)にて4、8、16、32 kHzの閾値を測定した。騒音暴露14日後の内耳切片を作製し、蝸牛の頂、中、基底回転における内/外有毛細胞生存率を解析した。その結果、騒音暴露1時間後の平均ABR閾値はSod2+/ーが88.4dB、Sod2+/+が84.5dBと同程度の難聴を示したが、その後の聴力の回復はSod2+/ー群の方が悪く、騒音暴露14日後ではSod2+/ーが54.0dB、Sod2+/+が43.4dBとSod2+/ー群が有意に高かった。内有毛細胞生存率はSod2+/ーが頂回転で軽度の低下を示すのみであったが、外有毛細胞生存率は全回転でSod2+/ー群が有意に低下していた。以上より、MnSOD減少に伴って騒音暴露後の聴力回復遅延と有毛細胞障害が生じることが示され、内耳におけるROS処理にMnSODが関与することが示唆された。これらの結果をもとに翌年度の研究を遂行予定である。全身性MnSODヘテロ欠損マウス(Sod2+/ー)を作成し、騒音曝露後の聴力変化、組織学的変化を観察することはできたが、その後は遺伝子改変動物が十分に作成できず、騒音曝露直後の酸化ストレスマーカー測定や、有毛細胞特異的MnSOD欠損マウスを作成するための準備が進まなかった。以上の理由で本研究課題の進捗はやや遅れている。全身性MnSODヘテロ欠損マウス(Sod2+/-)を作成し、背景動物であるC57BL/6マウスを対照(Sod2+/+)として、騒音曝露後の聴力変化および内耳の組織学的変化を検証した。騒音曝露前、1時間後、1、3、7、14日後の聴性脳幹反応(4000、8000、16000、32000 Hz)は曝露前、1時間、1日後の聴力においては両群間で有意差を認めなかったが、以降の聴力閾値は各周波数でSod2+/-群の方がSod2+/+と比較して20dB程度の有意な閾値上昇を示した。騒音曝露後14日目の検体を用いた組織学的評価については、有毛細胞は外有毛細胞の障害が主で蝸牛基底回転から頂回転にかけてSod2+/-群において生存率が有意に低下していた(p<0.01)。内有毛細胞は頂回転においてSod2+/-群で生存率低下を認めた(p<0.05)。血管条を血管条厚、ラセン神経節をラセン神経節細胞密度を用いて解析を行ったが、蝸牛基底回転から頂回転にかけてどちらも両群間で有意差を認めなかった(p>0.05)。MnSODホモ欠損マウスは生後早期に死亡するため、内耳有毛細胞特異的MnSOD欠損マウスの作成や不死化内耳培養細胞House Ear Institute-organ of Corti 1(HEI-OC1)へのMnSOD siRNA導入を試みたが、安定した系を確立することができず、その表現型を評価することはできなかった。以上よりMnSOD減少に伴って騒音曝露後の聴力回復遅延と有毛細胞障害が生じることが示され、内耳における酸化ストレス処理にMnSODが関与することが示唆された。

騒音曝露より7、14日後の聴力閾値はSod2+/-群で20dB程度の有意な上昇を示した。組織学的には外有毛細胞障害が主でSod2+/-群では蝸牛の全回転で有意に生存率が低下していた。MnSOD減少に伴い騒音曝露後の聴力回復遅延と外有毛細胞障害が生じることが示され、内耳における酸化ストレス処理にMnSODが関与することが示唆された。有毛細胞特異的MnSOD欠損マウスの作成し、その表現型を解析することは研究期間内での達成は困難と考えられる。このため、聴力評価は不能であるが、不死化内耳培養細胞House Ear Institute-organ of Corti 1 (HEI-OC1)にMnSODのSiRNAを導入することでin vitroのMnSODノックダウン実験系を確立し、内耳組織におけるMnSOD活性低下のモデルとして代用し、内耳毒性薬物などのストレス負荷後の抗酸化酵素活性やストレスマーカー測定、細胞カウントを行い、当初の実験の代替とする。28年度が最終年度であるため、記入しない。耳科学28年度が最終年度であるため、記入しない。
クロム化合物をターゲットとした新超伝導体探索

本研究課題では、クロム化合物を中心とした層状結晶構造を有する物質群をターゲットに新超伝導体探索を行った。クロム化合物KxCrSe2(x = 0, 0.5)に着目し、キャリアドーピングおよび圧力印加による超伝導化を試みた。常圧で絶縁体的なK0.5CrSe2は圧力印加により電気抵抗は小さくなるが、10GPa以下では金属化しないことがわかった。また、超伝導化には至らないものの、CrSe2にLiインターカレーションによるキャリアドーピングが可能であることを見出した。加えて、層状構造を持つ超伝導体ZrP2-xSexについて詳細な物性測定および電子状態計算を行い、超伝導機構を明らかにした。本研究の目的および実施計画に従い、クロム化合物をターゲットとした新超伝導体探索を行った。データベース等を用いた候補物質の絞り込みの結果、第一の候補物質として層状クロム化合物であるCrSe2に着目した。この物質は構造相転移および電荷秩序を起こすことが知られており、この秩序相を抑制することで超伝導化する可能性がある。秩序相の抑制方法として、まずドーピング制御を試みた。そこで着目したのが、この物質の類縁化合物であり、Kが層間に挟まれたKxCrSe2である。KxCrSe2は合成手法と結晶構造に関する報告があるものの、その物性は報告されていない。そこで、フラックス法を用いてKxCrSe2単結晶を合成し、物性測定を行った。電気抵抗の温度依存性から、この物質は絶縁体的であることが明らかになった。また、KxCrSe2単結晶をヨウ素溶液中に投入することで、Kを引き抜くことも可能である。これにより、CrSe2単結晶の作製にも成功した。続いて、第二の候補物質として、2014年に報告されたクロム化合物超伝導体K2Cr3As3に着目し、その類縁化合物の探索を行った。K2Cr3As3は非従来型超伝導機構の可能性が指摘されており、元素置換等を施した類縁化合物でより高い超伝導転移温度が実現することが期待される。そこで、Kを同じアルカリ金属であるNaおよびLiで置換することを試みた。高圧法およびフラックス法を用いた合成を試みたが、現在までのところ目的の物質は得られていない。これはイオン半径の違い、すなわち、Kに比べてNaやLiは小さいため、結晶構造が安定化されないことが原因と考えられる。本研究の目的および実施計画に従い、クロム化合物を中心とした層状結晶構造を持つ物質群を対象に新超伝導体探索を行った。前年度に引き続きKxCrSe2(x = 0, 0.5)に着目し、キャリアドーピングおよび圧力印加による超伝導化を試みた。K0.5CrSe2単結晶を用いて、圧力下での電気抵抗測定を行った。常圧では絶縁体的な振る舞いを示し、圧力印加によって5GPaまでは電気抵抗が小さくなった。しかし、5GPaを越えると再び電気抵抗が大きくなった。K0.5CrSe2は圧力印加により金属化しないことが明らかになった。圧力印加により、何らかの相転移が起こった可能性が示唆される。またCrSe2単結晶について、Liインターカレーションによるキャリアドーピングを試みた。Kをデインターカレーションして得られる物質であることから、層間にLiが容易に入りキャリアドーピングが可能であることを見出した。Liインターカレーション前後の試料の磁化測定を行ったが、2K以上では超伝導転移は確認されなかった。層状化合物超伝導体ZrP2-xSexについて、詳細な物性測定と電子状態計算を行った。この物質はSe置換量によって超伝導転移温度Tcが変化する。電気抵抗は電子・格子相互作用が主に作用していると考えられ、また残留抵抗率はSe置換量とともに増大する。比熱測定からは、Tcの変化は状態密度の変化と相関していることが明らかになった。電子状態計算の結果が実験結果と整合することと併せると、弱相関BCS機構によって超伝導が発現していると結論付けられる。ZrP2-xSexはSe置換により結晶構造が変化し超伝導化するユニークな物質であり、結晶構造制御という新超伝導体探索の指針を与える点で重要である。当初の研究目的に従い、クロム化合物に着目して新超伝導体の候補物質を挙げ、その合成に着手している。KxCrSe2やA2Cr3As3(A = Li, Na)の合成に取り組みその物性評価を行うプロセスは適切なものであると考えている。新物質探索においては合成手法・条件の最適化が常に問題となることを考慮すると、おおむね順調であると言える。

特にKxCrSe2に関しては、超伝導化には至っていないものの、未報告の物性を確認したことの意義は大きい。27年度が最終年度であるため、記入しない。超伝導第一には、昨年度に引き続きCrSe2に着目し、秩序相の抑制による超伝導化を試みる。具体的には、CrSe2単結晶へのK以外の元素のインターカレーション置換を試みる。また、CrまたはSeに対して元素置換を行うことが可能か、置換が可能であれば物性が変化するかを調べる。さらに、高圧力印加による秩序相の抑制を試みる。第二には、データベースを用いて新たな候補物質となるクロム化合物を調査し(例えばYCr2Si2を候補物質の一つと考えている)、既知物質の合成・評価を拡張し、元素置換による新物質の探索を行う。
神経ペプチドPACAPの成体網膜神経幹細胞への作用と網膜神経再生機構の解明

ラット高眼圧モデルを用いてPACAPによる網膜保護効果を評価したところ、PACAPは二峰性の網膜神経細胞死抑制効果を示し、cAMPとMAPキナーゼを介していることが示された。また、ヘテロ型PACAP遺伝子欠損マウスではNMDA硝子体内投与後の網膜障害が野生型と比較して有意に増加した。以上の結果より外因性・内因性のPACAPが神経節細胞に対して保護効果を示すことが明らかになった。さらに、NMDA投与後の網膜ではBrdU標識細胞が投与3日目でピークとなり、それらBrdU細胞のほとんどがマイクログリア/マクロファージであった。さらにPACAP硝子体投与群では網膜神経保護効果を示すとともに網膜内マイクログリア/マクロファージ数も増加させることが明らかになった。PACAPの神経保護機構にはマイクログリア/マクロファージの網膜内の増加が関連する可能性が示唆された。目的:神経ペプチドであるPACAPはラットにおける高眼圧または視神経損傷による視神経傷害を抑制することが報告されている。近年、網膜傷害誘導後に網膜に未分化神経系細胞が観察され、その細胞が神経節細胞への分化能を有していることから、成体網膜神経幹細胞の存在が示唆された。しかし、PACAPによる正常時および網膜障害時における網膜神経幹細胞の増殖・分化に対する作用は不明である。そこで、本年度はまずマウス硝子体内へのNMDA硝子体内投与による網膜神経障害モデルを確立し、PACAP同時投与による網膜保護効果について検討した。方法と結果:成熟雄マウスをセボフルレンにて全身麻酔し、角膜輪部よりNMDA(40nM)を硝子体内に投与した。PACAP投与群ではPACAPをNMDAと同時に硝子体内に投与した。投与1、3、7、14日後に眼球を摘出して網膜連続パラフィン切片を作成し、HE染色およびTUNEL染色後に網膜神経節細胞数を計数した。NMDA投与群の神経節細胞数は投与1日後から減少し始め、7日目以降は生存細胞数は一定となった。神経細胞死を検出するためにTUNEL染色を行ったところ、NMDA投与3日後にTUNEL陽性細胞が最大となった。PACAPの神経節保護効果を示す最適有効濃度を評価した結果、PACAP10-10M投与群の神経節細胞数は有意に高値を示した。さらに、投与3日後のTUNEL陽性細胞はNMDA単独投与群と比較して有意に減少した。考案・結論:以上の実験結果よりNMDA投与によるマウス網膜傷害モデルが確立され、さらに外因性PACAPの微量投与はNMDAによる網膜神経節細胞死を抑制することが明らかになった。今後は正常時および網膜傷害時に増殖細胞を標識するBrdUを用いて成体神経幹細胞を標識し、PACAPの成体幹細胞に対する作用を評価する。昨年度において、申請者はマウス硝子体内へのNMDA硝子体内投与による網膜神経障害モデルを確立し、PACAP同時投与による網膜保護効果について明らかにした。そこで本年度はヘテロ型PACAP遺伝子欠損マウスを用いてNMDAによる網膜障害を評価し、内因性PACAPの神経保護作用について評価した。さらにNMDA投与後の網膜における増殖細胞数の動態を組織学的に評価した。方法と結果:成熟雄マウス(野生型およびヘテロ型PACAP遺伝子欠損マウス)をセポフルレンにて全身麻酔し、角膜輪部よりNMDA(40 nM)を硝子体内に投与した。野生型マウスにおいて、NMDA投与群の神経節細胞数は投与1日後から減少し始め、7日目以降の生存細胞数は一定となった。一方、ヘテロ型PACAP遺伝子欠損マウスでは網膜のPACAP発現量が約50%となっており、NMDA投与後の網膜障害が野生型と比較して有意に増加した。さらに、NMDA投与後の網膜では内顆粒層におけるBrdU標識細胞が投与1日目から増加し、3日目でピークとなった。

緑内障は進行性の網膜神経節細胞死と定義される。現在、緑内障に対する効果が確立されているものは降眼圧治療のみであるが、これに抵抗性の緑内障も存在するため、網膜神経細胞を保護する薬剤の開発が望まれている。本年度申請者らは野生型マウス及びヘテロ型PACAPKOマウスを用いてNMDA硝子体内投与による緑内障モデルを作成し、網膜神経節細胞死を評価した。野生型マウスにおいて、NMDA投与群の神経節細胞数は投与1日後から減少し始め、7日目以降の生存細胞数は一定となった。神経細胞死を検出するためにTUNEL染色を行ったところ、NMDA投与3日後にTUNEL陽性細胞が最大となった。一方、ヘテロ型PACAP遺伝子欠損マウスでは網膜のPACAP発現量が約50%となっており、NMDA投与後の網膜障害が野生型と比較して有意に増加した。以上の結果より内因性PACAPはNMDA誘導性の神経節細胞死に対して保護効果を示すことが示唆された(Endo et al. 2011)。さらに、NMDA投与後の網膜では内顆粒層におけるBrdU標識細胞が投与1日目から増加し3日目でピークとなった。これらBrdU陽性細胞を成体網膜神経幹細胞と考えられているミュラー細胞マーカーとの2重免疫染色を行ったが、技術的に両陽性細胞の検出は困難であった。しかし、マイクログリア/マクロファージマーカーとの2重免疫染色により、それらBrdU細胞のほとんどがマイクログリア/マクロファージであることが示唆された。さらにPACAP硝子体投与群では網膜神経保護効果を示すとともに網膜内マイクログリア/マクロファージ数も増加させることが明らかになった。以上の結果から、PACAPは免疫系細胞を調節することにより神経保護作用を発揮している可能性が考えられる。