hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
タンパク質の新規酸化修飾産物を用いた脳血管疾患の予防マーカーの開発

脳血管疾患には酸化傷害が関わっているが、その予防マーカーとして我々が見いだしたトリプトファン残基のニトロ化(NO2Trp)の有用性を検討した.すでに脳卒中易発性高血圧発症ラット(SHRSP)の脳卒中発症直前の血清において,アポリポプロテインE(ApoE)のNO2Trp化を見いだしているが、そのNO2Trp化が臓器での傷害を反映するものであるかの検討のため、心臓、脳、肝臓、腎臓でApoEを調べた。ApoEのNO2Trp化は確認できなかったが、心臓、脳、肝臓で新たなタンパク質のNO2Trp化を見いだし、特に肝臓のarginosuccinate synthaseは高血圧の発症への関与が示唆された。平成26年度は、高血圧モデルの血清中に認められるトリプトファンニトロ化Apolipoprotein E (ApoE)が、高血圧下の循環器や脳血管の障害を反映するものであるのかを明らかにする為、循環器や脳におけるApoEのトリプトファンニトロ化を調べた。脳卒中発症直前の18週齢の自然発症高血圧モデルSHR-SPの心臓及び大脳からタンパク質抽出を行い、抗ニトロトリプトファン抗体を用いたウエスタンブロッティングと質量分析により、ニトロ化タンパク質の検出を試みた。その結果、それら臓器ではニトロトリプトファン生成が顕著に増加していることが示された。質量分析によるトリプトファンニトロ化タンパク質の同定の結果、心臓ではGlyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、Triosephosphate isomeraseha、Galactoside 2-alp-L-fucosyltransferase 2、Voltage-dependent anion-selective channel protein 1の4種タンパク質中に、大脳ではProprotein convertasesubtilisin/kexin type 7、Tubulinbeta-2A chain、Alpha-enolase、Beta-enolase、LIM/homeobox protein Lhx5の5種タンパク質中にニトロトリプトファンを確認した。現状では、ApoEのニトロ化の検出は成功していないが、現在質量分析条件等の改良を試みているところである。この検出に成功し次第、トリプトファンニトロ化ApoEの生成と高血圧の進行度との相関の解析に着手する。また、今回新たに心臓や大脳で発見された他のトリプトファンニトロ化タンパク質についても、ニトロ化による機能傷害と高血圧下での各種病態形成との関連性に関して解明してゆく予定である。血清において見いだされ、本研究の目標であったアポEタンパク質のニトロ化トリプトファン生成が肝臓に於いても見いだすことが出来なかった。LC-MS/MSの検出条件等も検討したが、心臓、脳、肝臓のいずれも見いだせなかった。そのため、当初の計画であった、「ラット血中にニトロ化アポEを投与して血管および脳組織での動脈硬化等の病態を調べる」という介入実験は断念する事にした。方向を変え、し、そのニトロトリプトファン修飾とSHR-SPでの症状との関連を探ることを考えた。我々は動脈硬化部位などの疾患病変部でアポリポプロテインEのトリプトファンニトロ化が生じているという作業仮説のもと研究を遂行してきた。しかし前年度までの研究で、心臓や脳など各種組織中からはアポリポプロテインEのトリプトファンニトロ化を検出できなかったことから、トリプトファンニトロ化アポリポプロテインEの生成は血中で生じているのではないかという新たな仮説を立てた。そこで、血中でトリプトファンニトロ化を受けているアポリポプロテインEの詳細を調べるために、血中リポタンパク質を簡易的に分画し、各画分中のトリプトファンニトロ化アポリポプロテインEの有無を調べた。その結果、LC-MS/MS解析によって、VLDL/LDL/キロミクロンを含む画分中にトリプトファンニトロ化アポリポプロテインEが生じていることを明らかにした。同様の画分のアポリポプロテインA-1にもニトロトリプトファンが検出された。また、in vitroで組み換え体アポリポプロテインEに対し活性窒素種を曝露する実験を行ったところ、コレステロールの非存在下では高分子量の部分にニトロトリプトファンが検出だれたが、モノマーには検出されなかった。一方、コレステロールと混和したアポリポプロテインEではin vivoと同様にモノマーのアポリポプロテインEニトロ化が認められた。これらの結果から、血中でコレステロールと結合状態にあるアポリポプロテインEがトリプトファンニトロ化の標的となっている可能性が示された。今後どの様な仕組みでトリプトファンがニトロ化されるのか検討する予定である。平成26年度は髙血圧症の発症および脳卒中発症までの各週齢(5,10,15,20週齢)での血清、脳組織、循環器(心臓)でのアポEタンパク質のニトロトリプトファン生成について検討する予定であったが、臓器での検出が予定どおり出来なかった。LC-MS/MSの検出条件等を現在検討中である。この点が予想外であった。

この様な予想外の困難に直面したため、当初の計画にあった、ラット血中へニトロ化アポEを投与して血管および脳組織での動脈硬化等の病態を調べるという介入実験は、次年度以降に延期した。前述の様に、SHR-SPの各臓器で特異的に見いだされたニトロトリプトファン含有酵素のうち、血圧調整と脳卒中に関与しそうな酵素に注目する事とした。特に、SHR-SPの肝臓でニトロトリプトファンが増加している酵素のうち、血圧の調整に関連する可能性が考えられる、arginosuccinate synthaseに注目し、高血圧発症との関連を追求する事方向を変える。同じ酵素の腎臓でのニトロ化を今年度検討することにした。腎臓の酵素は、一酸化窒素の代謝に重要な役割を持つことが知られていて、血圧の調整に深く関わっている。生物化学現在、LC-MS/MSの検出条件等を改良し、大脳および心臓でのニトロトリプトファン化アポEの検出を試みているが、もし、うまく検出出来ない時には、臓器でのニトロ化アポEの検出は中止し、血清のみで病態との関連を調べるか、あるいは、臓器で見いだされたニトロ化タンパク質が血清でもSHR-SP特異的なニトロ化タンパク質見いだせないか検討する予定である。また、肝臓、腎臓に関してもSHR-SP特異的なニトロ化タンパク質の検出を行う予定である。
魚類遺伝子の発現調節領域の構造および機能の解明

コイのαグロビン遺伝子プロモーター活性がアクチビンAにより誘導されるかどうかを調べたところ、ヒトの血液系細胞であるK562細胞株ではプロモーター活性に上昇が認められたが、コイの鰭由来細胞であるGF細胞株ではプロモーター活性の上昇は認められなかった。このことから、コイのαグロビン遺伝子も血液系細胞であれば、アクチビンAによりプロモーター活性が誘導されることがわかった。4種類の魚類の培養細胞株にネオマイシン耐性遺伝子をコードしているpSTneoを導入したところ、ネオマイシン耐性細胞が4種類それぞれの細胞株から得られた。導入したネオマイシン耐性遺伝子は細胞のゲノムに組み込まれていることもわかった。このことからネオマイシン耐性遺伝子は魚類培養細胞においても有用な選択マーカー遺伝子として利用できることが確認できた。コイからクローン化したαグロビン遺伝子とβグロビン遺伝子は塩基配列、サザーンブロット法およびPCR法の解析により、同一のDNA断片上に隣接し、それらは互いの上流領域を向き合わせて存在していることがわかった。αグロビン遺伝子とβグロビン遺伝子の開始コドン間の塩基数は約800塩基で、塩基のアデニンおよびチミンの含有量が多いことがわかった。向かい合ったαグロビン遺伝子とβグロビン遺伝子それぞれのセンス鎖は互いのアンチセンス鎖であり、独特の対称配列を示した。コイのalphaグロビン遺伝子(No.3)プロモーターをCATアッセイ用ベクタープラスミドに連結し、ヒトの血液系細胞であるK562細胞株およびコイの鰭由来細胞であるGF細胞株に導入した。導入したプロモーターの活性がアクチビンAにより誘導されるかを調べたところ、K562細胞株ではプロモーター活性に上昇が認められたが、GF細胞株ではプロモーター活性の上昇は認められなかった。このことから、コイのalphaグロビン遺伝子も血液系細胞であれば、アクチビンAによりプロモーター活性が誘導されることがわかった。ネオマイシン耐性細胞からDNAを抽出しサザーンブロットハイブリダイゼーション解析を行ったところ、ネオマイシン耐性遺伝子は細胞のゲノムに組み込まれていることがわかった。このことからネオマイシン耐性遺伝子は魚類培養細胞においても有用なマーカー遺伝子は魚類培養細胞においても有用なマーカー遺伝子であることが確認できた。ティラピアの卵巣由来細胞株TO-2にコイalphaグロビン遺伝子を導入し、遺伝子が転写されるかをノーザンハイブリダイゼーションで調べたところ、コイalphaグロビン遺伝子が転写されていることが確認された。このことから、コイのalphaグロビン遺伝子のプロモーターは非血液系細胞でも認識され転写される機能を有していることがわかった。ふ化直後のコイからRNAを抽出し、RT-PCRによりalphaグロビン遺伝子cDNAを増幅した。この増幅DNA断片の塩基配列を決定したところ、既知のコイalphaグロビン遺伝子と全く異なるタイプのalphaグロビン遺伝子ファミリーに属するものであることがわかった。このことから、コイのalphaグロビン遺伝子も他の高等真核生物と同じく、発生段階によって転写される遺伝子が異なることが示唆された。コイからクローン化したαグロビン遺伝子とβグロビン遺伝子は同一のDNA断片上に隣接し、それらは互いの上流領域を向き合わせて存在していることがわかった。αグロビン遺伝子とβグロビン遺伝子の開始コドン間の塩基数は約900塩基で、向かい合ったαグロビン遺伝子とβグロビン遺伝子それぞれのセンス鎖は互いのアンチセンス鎖であった。両遺伝子ともに基本的なプロモーター領域であるTATA boxおよびCAAT box様の配列が存在し、αおよびβグロビン遺伝子のCAAT box様配列に挟まれた領域は塩基AおよびTに富んでいた。さらに、これらのクローンとは別に単離していた他の7種類のグロビン遺伝子クローンにおいても、サザーンブロット解析およびPCR法による解析によりαグロビン遺伝子とグロビン遺伝子が約900塩基の距離で上流領域を向かい合わて隣接していることがわかった。PCR法による解析により、種々のコイ(カガミゴイ、スワヤマトゴイ、ドイツゴイ、サクヤマトゴイ、ヤセイゴイ)のゲノム上においても、αグロビン遺伝子とβグロビン遺伝子は約900塩基の距離で上流領域を向かい合わせた位置関係でコードされていることが明らかとなった。

以上のことからコイではαグロビン遺伝子とβグロビン遺伝子が約900塩基の間隔で互いに逆向きにコードされて一組となり、これがゲノム上に複数個で連座してクラスターを形成していることが明らかとなった。
スカベンジャー受容体ファミリーの生体内発現と病態における役割

私どもは、ヒトクラスAスカベンジャー受容体に特異的な抗体を作製し、第7回国際CD会議で本受容体に新しいCD番号であるCD204が付与された。ヒト正常組織の検討では、CD204は、全身に分布する多くの組織Mφに構成的に発現がみられ、種々の炎症性局所への浸潤Mφにも強い陽性所見が得られた。このことからCD204はMφにおけるパターン認識受容体として外来異物認識に重要な役割を果たすものと考えられ、脂質代謝のみならず自然免疫においても重要な役割を果たすものと考えられた。さらに培養単球をGM-CSFおよびIL-4の共存下で樹状細胞への分化を誘導すると、約1015%にCD204陽性所見が得られ、CD204が樹状細胞における抗原提示機能に関与する可能性が示唆された。同じくクラスAに属するMARCO受容体は、LPS刺激によって全身のMφに発現が誘導され感染防御への関与が明らかにされているが、私どもは高脂血症によって惹起される非アルコール性脂肪肝炎では肝クッパー細胞に本受容体が誘導されることを見いだした。この発現誘導には、高脂血症状態における門脈血中のエンドトキシン濃度上昇が関与する可能性が考えられた。内皮に発現されるクラスE受容体であるLOX-1については、LOX-1HとApoE蛋白の二重欠損マウスを用いて動脈硬化病巣形成の程度を検索したが、コントロール群と比較して有意な動脈硬化抑制は観察されず、粥状硬化形成に関しては、LOX-1は重要な役割を果たしていないと結論した。一方、LOX-1は、マウスおよびヒト胎盤で最も発現が強く、マウス胎盤ではグリコーゲン細胞に、ヒト胎盤ではcytotrophoblastに各々陽性像が認められ、スカベンジャー機能以外の機能を果たしている可能性が示唆された。スカベンジャー受容体は、従来、粥状硬化におけるマクロファージや平滑筋細胞の泡沫細胞化に深く関与する受容体として注目されてきたが、このスカベンジャー受容体ファミリーに属する新たな受容体が発見されるに連れて、それぞれの受容体は、粥状硬化のみならず、生体内における種々の生理機能や病的反応に深く関与することが明らかになってきた。私どもは、クラスAに属するSR-AI, II(CD204)に対する特異性の高いモノクローナル抗体を作製し、ヒト組織におけるSR-AI, IIの分布を検討した。その結果、SR-AI, II(CD204)は正常状態で全身に分布する大多数のマクロファージに既に発現が認められ、種々の炎症性疾患では、浸潤マクロファージや肉芽腫性疾患における類上皮細胞や多核巨細胞に強い陽性所見が得られた。これらの結果から、SR-AI, IIはマクロファージにおける外来異物認識に重要な役割を果たすものと考えられる。また、アルツハイマー病の老人斑におけるミクログリアにも陽性所見が得られ、粥状硬化病巣のマクロファージや糖尿性腎症における糸球体マクロファージにおけるAGE(advanced glycation end product)などの内因性の老廃物の取り込みにも関与するものと考えられる。粥状硬化の検討では、SR-AI, IIは脂肪線状におけるマクロファージとともに、粥腫周囲のマクロファージに陽性で、他方、クラスBに属するCD36は、進行した粥状硬化病巣の粥腫中心部に陽性となり、SR-AI, IIとは異なる分布を示した。この二種の受容体は粥腫の進行度の応じて、果たす役割が異なるものと思われる。現在、クラスAに属するMARCO受容体ならびにクラスEに属するLOX-1の発現と分布の検討に力を入れており、それぞれ脂質代謝に重要な役割を担うことがわかってきた。

クラスAスカベンジャー受容体(SR-AI, II)に特異的な抗体を作製し、第7回国際CD会議でその有用性を発表し、本受容体に新しいCD番号であるCD204が付与された。また本抗体は、適切な抗原賦活処理を行うことで、パラフィン切片に応用可能であることを明らかにした。CD204は全身に分布する多くの組織マクロファージ(Mφ)に構成的に発現が認められ、炎症巣への浸潤Mφや肉芽腫性疾患における類上皮細胞や多核巨細胞に強い陽性所見が得られた。これらの結果から、CD204はMφのパターン認識受容体として自然免疫に重要な役割を果たすものと考えられた。さらにアルツハイマー病の老人斑におけるミクログリア、粥状硬化病巣の泡沫化Mφ、糖尿性腎症における糸球体Mφにも陽性で、変性脂質やAGEなどの内因性の老廃物の取り込みにも関与するものと考えられる。同じくクラスAに属するMARCO受容体(Macrophage Receptor with Collagenous Structure)は、LPS刺激によって全身のマクロファージに発現が誘導され感染防御への関与が明らかにされているが、私どもは高脂血症病態において肝クッパー細胞に本受容体が誘導されることを見いだした。この発現誘導には、高脂血症状態における門脈血中のエンドトキシン濃度上昇が関与する可能性が示唆された。内皮に発現されるクラスE受容体であるLOX-1(Lectin-like oxidized LDL receptor-1)については、胎盤に最も強く発現が認められ、免疫組織化学ならびにin situ hybridizationによって、マウス胎盤ではグリコーゲン細胞に、ヒト胎盤ではcytotrophoblastに各々陽性像が認められた。今後、このような発現様式が病的状態とどの様な関連を示すかを更に検討したい。私どもは、ヒトクラスAスカベンジャー受容体に特異的な抗体を作製し、第7回国際CD会議でその有用性が評価され、本受容体に新しいCD番号であるCD204が付与された。抗CD204抗体は適切な抗原賦活処理を行うことで、パラフィン切片に応用可能であり、ヒト正常組織の検討では、CD204は、全身に分布する多くの組織マクロファージ(Mφ)に構成的に発現がみられ、種々の炎症性局所への浸潤マクロファージにも強い陽性所見が得られた。このことからCD204はMφにおける外来異物認識に重要な役割を果たすものと考えられ、パターン認識受容体として、脂質代謝のみならず自然免疫においても重要な役割を果たすものと考えられた。一方、組織学的にランゲルハンス細胞やinterdigitating cellなどの樹状細胞は陰性であったが、培養単球をGM-CSFおよびIL-4の共存下で樹状細胞への分化を誘導すると、未熟樹状細胞で約10%、成熟樹状細胞で約1015%にCD204の陽性所見が得られ、樹状細胞の分化段階によってはCD204が樹状細胞に誘導されることが確認された。このことは、CD204が樹状細胞における抗原提示機能に関与する可能性を示唆し、樹状細胞におけるCD204の役割解明が今後の課題となった。同じくクラスAに属するMARCO受容体(Macrophage Receptor with Collagenous Structure)は、LPS刺激によって全身のマクロファージに発現が誘導され感染防御への関与が明らかにされているが、私どもは高脂血症によって惹起される非アルコール性脂肪肝炎において肝クッパー細胞に本受容体が誘導されることを見いだした。
ヒト唾液中のヒスチジン含有ペプチドに関する研究

1.ヒスタチン類の分離、精製ヒスタミン遊離物質として、ヒト唾液から分離した高ヒスチジン含有ペプチド、F-Aは1988年にヒスタチン5と命名されたものと同一ペプチドであった。そこで酸性下に熱処理した唾液からヘパリンカラムと高速液クロ(HPLC)を用いてヒスタチン1、3および5を同時に迅速精製する方法を開発した。唾液中に存在するヒスタチン1、3と5の割合は1:1:1であった。これらのアミノ酸組成および一次構造を決定した。2.ヒスタチン類のヒスタミン遊離機構精製したヒスタチン類を用いてラット腹腔から分離した肥満細胞からのヒスタミン遊離の機構について検討した結果1)ヒスタチン類によるヒスタミン遊離は濃度依存的におこり、ED_<50>はヒスタチン3と5は13μM、ヒスタチン1は100μMであり、ペプチドの塩基性の強さと分子量に関係していた。2)このヒスタミン遊離反応は温度に依存しており27°ー37°Cに至適温度があり、pHは中性から酸性側で著明であった。3)温度37°Cにおいて反応は10秒以内に最大に達した。4)このヒスタミン遊離は肥満細胞内の乳酸脱水素酵素の漏出を伴わなかった。従ってヒスタチンによるヒスタミン遊離は開口分泌様式によるものと考えられる。3.ヒスタチン類の抗菌作用の機構1)カブトガニの血球抽出液を用いるLimulustestにおいてグラム陰性菌の内毒素成分リポポリサッカリド(LPS)によるゲル形成反応をヒスタチンは阻害した。2)感作血球から補体による溶血反応はLPSにより阻害されるが、ヒスタチンはこの阻害を反転した。3)LPSとヒスタチンはゲル内沈降物を形成した。以上の成績は唾液中には一群のヒスタチンが存在し、口腔内の自然防禦成分として役立っていることを示唆している。1.ヒト唾液中の高ヒスチジン含有ペプチンの分離と精製ラット肥満細胞からのヒスタミン遊離活性を指標にして,ヒト混合唾液からヒスチジンを多量に含むペプチド類をDEAE-Sepharose,CM-Cellulose,及びBio:Gelカラムを用いて分離した.この分画を更に高速液体クロマト法(HPLC)により精製した.現在までに分子量の異る4種類のペプチドを得た.各々のペプチドは10-5-10-6Mの範囲で,それぞれラット膜腔から分離した肥満細胞からヒスタミンを遊離した.またこれらはラット皮膚の血管透過性を著明に亢進した.この亢進は抗ヒスタミン剤のジフェンヒドラミンによって完全に阻止された.これらのペプチド類をSalivary histamine releasing peptides(SHRP-1-4)と命名した.2. SHRPの一次構造の決定SHRPsのうち比較的多量に得られたSHRP-2と4について,自動Edman法及びカルボキシペプチダーゼ法によって,それらの一次構造の決定を試みた.その結果, SHRP-2はアミノ酸残基24個からなる塩基性のペプチドであり,そのN未満はAsp, C未満はTyrであった.一次構造としてはAsp-Ser-His-Ala-Lys-Arg-His-His-Gly-Tyr-Lys-Arg-Lys-Phe-His-Gla-Lys-His-His-Ser-His-Arg-Gly-Tyrと推定された.またアミノ酸残基33のSHRP-4についても目下構造決定中であるが,このペプチドのN未満から24番目まではSHRP-2と全く同じ構造であることが分った.他のSHRPsについても同様に検討中である.以上の成績から考察すると,ヒト唾液中に存在するSHRPsは共通の前駆蛋白質から出発し,分泌ないしは,分泌の過程において小さな断片のペプチドに分解されることが強く示唆された.1.ヒスタチン類の分離、精製ヒスタミン遊離物質として、ヒト唾液から分離した高ヒスチジン含有ペプチド、F-Aは1988年にヒスタチン5と命名されたものと同一ペプチドであった。

2)感作血球から補体による溶血反応はLPSにより阻害されるが、ヒスタチンはこの阻害を反転した。3)LPSとヒスタチンはゲル内沈降物を形成した。以上の成績は唾液中には一群のヒスタチンが存在し、口腔内の自然防禦成分として役立っていることを示唆している。1.ヒト唾液中の高ヒスチジン含有ペプチド(ヒスタチン類)の精製先に報告した精製法は、イオン交換、ゲル濾過および高速液クロ法(HPLC)によるものであるが、今回はこれを改良し、迅速に分離、精製する方法を開発した。クエン酸刺激によって得た唾液をpH3-4に調整100°C、5分間加熱した後、ヘパリンゲルのカラムを用いて分画した。各画分は更にHPLCで精製した。得られた総ヒスタチン量は唾液100ml当り約6mgであった。精製したヒスタチン類についてアミノ酸組成および一次構造を決定した。その結果、これらはアミノ酸残基38、32および24分子量はそれぞれ4929、4063、3037であるヒスタチン1.3および5に相当するペプチドであった。これらペプチドにはそれぞれヒスチジン7残基を含有していた。2.ヒスタチン類によるヒスタミン遊離の機構ヒスタチン3と5は同程度の強さ(ED_<50>=13μM)でヒスタミンを遊離した。一方ヒスタチンのED_<50>は100μMであった。これらヒスタチンによるヒスタミン遊離反応は温度に依存し、pHの中性から酸性側で著明におこった。温度37°Cでは10秒以内に完了し、このヒスタミン遊離は細胞内の乳酸脱水素酵素の遊離は伴わなかった。従って開口分泌様式によるものと考えられる。3.抗エンドトキシン作用1)カブトガニの血球抽出液を用いたLimulus testにおいてヒスタチン類は内毒素(LPS)の作用に拮抗した。2)LPSによる補体活性化をヒスタチン類は阻止した。3)種々のLPSに対してヒスタチン類はグル内沈降物を形成した。以上の成績からヒト唾液中に存在するヒスタチン類は口腔内の最近のLPS部位に結合し、殺、静菌的に働いていること、および口腔内の炎症の過程に何らかの役割をしていることが強く示唆された。
がん浸潤・転移における膜型マトリックスメタロプロテアーゼ新規機能の解析

本研究の目的はヒトがん組織において広範に発現し、悪性度・浸潤性との相関性が高い膜型マトリックスメタロプロテアーゼー1(MT1-MMP)活性制御分子・新規基質を検索し、その浸潤・転移に果たす役割を解析することにより、MT1-MMPを分子標的とした診断・治療法の開発へと発展させることにある。我々はこれまでにMT1-MMPが細胞運動、増殖に重要なExtreacellular-Signal Regulated Kinase(ERK)の持続的な活性化に必須の役割を果たすことを報告してきた。今回このシグナル伝達の中心分子であるFocal Adhesion Kinase(FAK)のリン酸化に果たすMT1-MMPの役割を検討した。細胞をファイブロネクチン、コラーゲン上にまくと接着斑が形成されFAKの397番目のTyrがリン酸化されるが、MT1-MMP活性を阻害すると、このTyrリン酸化が過剰に蓄積し接着斑が肥大化することを見出した。すなわちMT1-MMPによる細胞と細胞外基質との接着制御は接着斑形成のターンオーバーを促進し、結果として持続的なシグナル伝達を可能にすることが明らかとなった。また、がん組織で通常認められるMT1-MMPによるMMP-2のプロセシングについて、プロセシングされたMMP-2の酵素活性を検討した。MT1-MMPによるMMP-2のプロセシングにはその阻害因子であるTIMP-2が必須であるが、プロセシングを受けたMMP-2が実際に酵素活性を有するためには、きわめて限られた範囲内のTIMP-2濃度でなければならないことを見出した。この知見はTIMP-2のがん組織での果たす役割を考慮するうえで重要と考えられた。
出土文物による後漢地域社会の研究

本研究計画に従い、後漢墓を中心とした出土文物の報告雑誌・報告書から、後漢時代に関する報告をすべてカ-ド化し、それに基づいて文献を収集し、それらを通読して一覧表を作成する、という作業を行った。実際に作業に着手してみると、その報告数が膨大で、現在『文物』・『考古』の両誌の整理を了えた段階で、約500もの報告を数えるに至った。恐らく地誌を含めると、六七百の報告、墓数にして千座位の数に達すると推算される。この整理から一覧表を作成し、その出土地点を当時の郡県地図におとしてみると、以下の知見が得られた。1.発掘墓数からみると、首都洛陽の周辺、准水・長江下流域、長江中流域、四川盆地の諸郡と、遼東・南海の両郡が多い。従来文献的に考えられてきた当該時代の発展地域に入らない長江中流域(特に長沙・〓章両郡)や辺境の遼東・南海両郡に多く、発展地域たる山東に比較的少ないのは意外であるが、発掘工作の進展度とも関連しているのであろう。2.中心地域と周辺地域の発掘墓分布からみると、前者では地域内に広範囲に分布しているのに対し、後者では郡治所の周囲にほぼ限定されている、という特徴がみられる。このことは、磚・石室墓の建造や豪華な副葬が可能な階層、当時の文献で豪族と呼ばれる階層の分布とほぼ対応しているとみられ、後者の地域での階層分化が進展していないことを推測できる。3.文献史料では不明な、特に長江以南の地域において、副葬品の水準が相当高いものもあり、それらのより精細な検討から、当該地域の性格や中心地域とのつながりを明らかにする可能性が得られた。とりわけ、次の六朝期に多出する青瓷は、後漢中晩期墓からもかなり出土し、陶磁器生産技術や生産地、地域間流通の問題など、興味深い課題が新たに得られた。
遺伝子発現と塩基多型に基づくオオムギ系統進化の推定

・約93,000のESTからUnigeneを作成し,DNAアレイに利用するクローンを選抜して,blast検索結果に基づいて一部を選抜して予備的なDNAアレイシステムを開発した.また,植物RNAの自動抽出システムの開発に目処がついた.・国際オオムギESTコンソシアムを形成している米国,ドイツ,フィンランド,英国のプロジェクトと共同でESTデータベースを開発した(http://harvest.ucr.edu/).また,この結果に基づいて米国NSF予算でAffymetrix杜からカスタムオリゴアレイを開発済みで,2003年6月頃から販売予定である.・Unigeneのクローンを整列化して,品種間に存在するSNPを確認したところ,約1,300のUnigeneに存在する約4,000個のSNPを検出し,少なくとも500Unigeneに存在するSNPがアミノ酸の非同義置換によることを明らかにした.また,これらのSNPを特許申請した.・Unigene由来のプライマーを設計し,100以上のESTを連鎖地図上にマップした.また,コムギにおけるPCR増幅も確認し,Triticeae(コムギ連)の比較ゲノム解析の準備を進めている.さらに,これらの情報に基づいて,SNPを利用したオオムギESTのマッピングをオオムギおよびコムギの集団で進めている.・約93,000のESTからUnigeneを作成し,DNAアレイに利用するクローンを選抜して,blast検索結果に基づいて一部を選抜して予備的なDNAアレイシステムを開発した.また,植物RNAの自動抽出システムの開発に目処がついた.・国際オオムギESTコンソシアムを形成している米国,ドイツ,フィンランド,英国のプロジェクトと共同でESTデータベースを開発した(http://harvest.ucr.edu/).また,この結果に基づいて米国NSF予算でAffymetrix杜からカスタムオリゴアレイを開発済みで,2003年6月頃から販売予定である.・Unigeneのクローンを整列化して,品種間に存在するSNPを確認したところ,約1,300のUnigeneに存在する約4,000個のSNPを検出し,少なくとも500Unigeneに存在するSNPがアミノ酸の非同義置換によることを明らかにした.また,これらのSNPを特許申請した.・Unigene由来のプライマーを設計し,100以上のESTを連鎖地図上にマップした.また,コムギにおけるPCR増幅も確認し,Triticeae(コムギ連)の比較ゲノム解析の準備を進めている.さらに,これらの情報に基づいて,SNPを利用したオオムギESTのマッピングをオオムギおよびコムギの集団で進めている.
糖尿病を進行させるβ細胞死のメカニズム解明と治療法の開発

糖尿病が進行するのはインスリンを分泌する膵β細胞が減少するためと考えられている。Wolfram症候群では、膵β細胞が消失して糖尿病を発症するが、その原因遺伝子WFS1は2型糖尿病遺伝子でもある。今回の研究ではWfs1欠損マウスをモデルとして、肥満に伴うインスリン抵抗性がβ細胞に不可となりβ細胞死を招くこと、そのメカニズムに小胞体ストレスが関係することなどを明らかにした。また、β細胞では、WFS1蛋白はインスリン分泌顆粒にも豊富に存在し、分泌顆粒内の酸性化維持に重要であることを発見した。インスリン分泌調節にも関与する可能性がある。2型糖尿病はインスリン抵抗性とインスリン分泌不全が相まって発症する。また、発症後も治療にかかわらず徐々に血糖コントロールは悪化する。つまり進行性である。2型糖尿病の進行には膵β細胞の緩徐な減少が重要な役割を持つ。我々はWolfram症候群の原因遺伝子、WFS1を欠損するwfs1欠損マウスをモデルとして研究を進めた。軽度の肥満とインスリン抵抗性を有するwfs1欠損agoutiマウスでは生後16週頃からアポトーシスによるβ細胞が選択的脱落のために高血糖を来す。インスリン抵抗性はβ細胞に小胞体ストレスが惹起し、wfs1欠損マウスのβ細胞は小胞体ストレスに感受性が高いため容易にアポトーシスに陥ることが示唆された。インスリン抵抗性改善薬であるpioglitazoneの投与によりwfs1欠損agoutiマウスでのβ細胞のアポトーシスは回避され、糖尿病発症はほぼ完全に抑制された。この時、ラ氏島での小胞体ストレスは予想外に減少しておらず、pioglitazoneによるβ細胞への直接保護作用が存在する可能性も示唆された。Microarrayでの解析によりラ氏島及びMIN6細胞でpioglitazoneにより発現が誘導される候補分子を同定し、実際、この遺伝子プロモーターに存在するPPARγ結合部位にPPARγがpioglitazone依存性に結合することを見いだし、解析を進めている。また、WFS1蛋白は小胞体のみならず、インスリン分泌顆粒に豊富に存在することが明らかになった。ここでのWFS1の役割と、その欠損がもたらす影響について解析を進めている。Wolfram症候群は若年性の視神経萎縮とインスリン依存性糖尿病を主徴とし、WFS1遺伝子の欠損により発症する。患者は10歳前後で膵β細胞を選択的に喪失し、糖尿病を発症する。WFS1遺伝子はまた、その遺伝子内のSNPsが2型糖尿病発症のリスクを規定しており、2型糖尿病遺伝子としても重要である。従って、WFS1遺伝子の機能、その欠失によるβ細胞死のメカニズム解明、さらには治療法の開発はWolfram症候群のみならず、2型糖尿病においても重要である。WFS1蛋白は小胞体に発現され、細胞内カルシウムホメオスターシス、小胞体ストレス応答に関与することが現在までの研究で明らかになっている。今回、我々は膵β細胞においてはWFS1蛋白が小胞体に加えて、インスリン分泌顆粒に存在することを見いだした。wfs1欠損マウスのβ細胞では、インスリン分泌顆粒の酸性化が低下し、インスリンのプロセッシングが障害される。されに興味深いことに、wfs1欠損マウスではインスリン分泌顆粒の細胞内での局在の変化が観察された。つまり、β細胞内のインスリン分泌顆粒の総数は変化していないが、細胞膜直下で、膜に接する分泌顆粒の数が減少していた。インスリン分泌顆粒の酸性化はインスリンのプロセッシングに重要であると同時に、インスリンのエクソサイトーシスにおいて、「プライミング現象」に関与することが示唆されている。細胞膜直下に存在するインスリン顆粒とそれらが「プライミング」されているか否かは同義ではないが、両者の関連を推測することは理にかなったことである。wfs1欠損マウスでは、β細胞量が進行性に減少すると同時に、あるいは、それ以前からブドウ糖応答性のインスリン分泌が障害されている。WFS1蛋白がインスリン分泌顆粒にも存在するという今回の知見は、WFS1蛋白のβ細胞での新たな機能を示唆するものであり、その異常がβ細胞機能障害をも説明しうる。wfs1欠損マウスをモデルとしたWolfram症候群の治療法開発に関しては、以前にpioglitazoneが肥満により著しく加速される糖尿病発症を有効に抑制することを示しているが、その分子メカニズムについて解析を進めている。pioglitazoneで発現誘導される興味深い標的分子候補を同定している。また、新たな糖尿病治療薬である、インクレチン関連薬(GLP-1受容体作動薬、DPP-4阻害薬の有効性について検討を進めている。Wolfram症候群は若年発症インスリン欠乏型糖尿病と視神経萎縮を主徴とする遺伝性症候群である。Wolfram症候群の患者では、膵β細胞が選択的に消失する。我々はその原因遺伝子WFS1を同定した。

WFS1遺伝子内のSNPsが2型糖尿病と関連することが示され、2型糖尿病遺伝子としても認知されている。WFS1蛋白は細胞内では小胞体に存在し、小胞ストレス応答に関与する。Wfs1欠損マウスをAgouti変異(A/Ay)導入により軽度肥満にするとβ細胞の脱落が加速され、それはピオグリタゾン(以下Pio)により抑制される。ここにPioのラ氏島内遺伝子発現調節が関与している可能性がある。A/Ayマウス単離ラ氏島およびMIN6細胞ではPioによりアドレノメデュリン(以下AM)の発現が増加していた。MIN6細胞での抗PPARγ抗体によるChIPアッセイでは、Pio存在下でのみPPARγがAMのプロモーターに結合した。ThapsigardinによるMIN6細胞でのcleaved caspase-3の発現は、100nMのAMペプチドの添加により約30%減少した。Pioが、PPARγの活性化を介してラ氏島でAMの発現を誘導し、β細胞保護作用を発揮しうることが示唆された。さらにβ細胞でのWFS1蛋白の機能を検討するために、β細胞内での局在を検討したところ、小胞体のみならず、インスリン分泌顆粒に豊富に存在した。Wfs1遺伝子ノックアウトマウスの膵β細胞では、インスリン分泌顆粒の形態や数は野生型と比較して有意な差を認めなかったが、細胞膜に接して、あるいはそのごく近傍に存在する顆粒数は減少しており、局在変化が認められた。Wfs1遺伝子ノックアウトマウスの膵β細胞では分泌顆粒内の酸性化が減弱していた。顆粒内の酸性化はプロインスリンのプロセッシングに重要であるが、Wfs1遺伝子ノックアウトマウスの血中、ならびに、ラ氏島では、インスリン/プロインスリン比が低下していた。顆粒内酸性化は、インスリンの開口放出に際して「プライミング」にも必要である。Wfs1遺伝子ノックアウトマウスではブドウ糖応答性のインスリン分泌も障害されており、その障害パターンの詳細な検討を進めている。
酸性雨を軽減する水源かん養林の保育作業と水質および水量の変化

愛媛大学農学部付属演習林の普通植栽区(スギ3,000本/ha)、疎植栽区(スギ1,000本/ha)および極疎植栽区(スギ500本/ha)の現実林分の集水域で、酸性雨の影響を軽減するため、長期的な視点から水質や水量の変化を継続して調査すると共に、今回は特に短期的な視点から人工降雨によって、造成初期の保育作業、すなわち、下刈り作業の影響を具体的に検討した。その結果、1.渓流水の水量は、普通植栽区、疎植栽区および極疎植栽区の順に増加傾向であったが、3者の間に有意な差は認められなかった。下刈り作業の方法では、全面刈り区、対照区および坪刈り区の順に渓流水は増加傾向であったが、3者の間に有意な差は認められなかった。2.土壌水分は植栽方法の相違では、普通植栽区、疎植栽区および極疎植栽区の順に増加傾向であったが、3者の間に有意な差は認められなかった。下刈り作業の方法では、全面刈り区、対照区および坪刈り区の順に土壌水分は増加傾向であったが、3者の間に有意な差は認められなかった。3.土壌水のpHは普通植栽区と疎植栽区で酸性雨の影響により表層土で弱酸性であったが、15cm深と30cm深では、植栽方法と作業方法の相違に関係なく、土壌の緩衝作用によりほぼ中性であった。渓流水のpHは同様に7.0前後で推移した。4.土壌水と渓流水の陰イオンと陽イオンの一部には、普通植栽区、疎植栽区と極疎植栽区との間に相異が認められたが、有意な差ではなかった。以上の結果から、酸性雨地帯でスギ、ヒノキを植栽する場合には、ha当たり500本程度にし、下刈りは坪刈りにすることによって、従来の普通植栽の造成および保育作業に比べ、酸性雨による土壌への負荷を軽減できることと、土壌水分の保持が可能であることを明らかにした。今後は、この手法の普及拡大に努めることが重要である。
頭蓋内圧亢進にともなう脳内遺伝子発現の変化

申請者らは,頭蓋内圧コア真という病態を分子生物学的アプローチで解析すべく,ストレス遺伝子応答,グリア機能の変化および浸透圧調節遺伝子の検索等の研究目標を掲げた.また臨床に沿った病態解析モデルの確立を試みた.研究期間内に得られた新たな知見は,1,実験水頭症ラットにおけるグルタミン酸トランスポーター(GLAST)の役割:GLASTは浸透圧調節トランスポーターであるとともに,興奮性神経毒であるグルタミン酸の回収を行う膜蛋白である.水頭症急性期の急激な頭蓋内圧亢進・脳室拡大とともに,脳室周囲の反応性グリアにGLAST遺伝子の発現亢進を認めた.脳室拡大や髄液浮腫に対し脆弱な脳室周囲組織で,過剰放出されたグルタミン酸の処理や局所浸透圧の調節の目的でGLASTが誘導されたものと推察した.水頭症とグルタミン酸の動態を関連づけた初の報告である(Masago et al.1996).2,頭蓋内圧亢進コントロールモデルの作成とストレス応答:ラット大槽に人工髄液を注入し,随意に頭蓋内圧を調節できるモデルを開発した.頭蓋内圧亢進とともに大脳皮質,海馬神経細胞や視床下部の諸核においてc-fos等のimmediate early genesの発現を認めた.頭蓋内圧変動が高次脳機能や生理機能に及ぼす影響の一端を明らかにした(Matsumoto et al.1995).3,くも膜下出血(SAH)モデルの確立:SAHは急性頭蓋内圧亢進をきたす代表疾患であるが,小動物で再現することは困難であった.申請者らはラット頭蓋内血管をナイロン糸で貫くことで確実にSAHを再現することに成功した.SAH後は大脳皮質,海馬辺縁系,視床等広範な領域にhsp70,c-fos遺伝子が発現することを明らかにした.さらに海馬での遅発性神経細胞死を示唆する所見も得られた.SAH基礎実験に関しては先駆的な知見である.申請者らは,頭蓋内圧コア真という病態を分子生物学的アプローチで解析すべく,ストレス遺伝子応答,グリア機能の変化および浸透圧調節遺伝子の検索等の研究目標を掲げた.また臨床に沿った病態解析モデルの確立を試みた.研究期間内に得られた新たな知見は,1,実験水頭症ラットにおけるグルタミン酸トランスポーター(GLAST)の役割:GLASTは浸透圧調節トランスポーターであるとともに,興奮性神経毒であるグルタミン酸の回収を行う膜蛋白である.水頭症急性期の急激な頭蓋内圧亢進・脳室拡大とともに,脳室周囲の反応性グリアにGLAST遺伝子の発現亢進を認めた.脳室拡大や髄液浮腫に対し脆弱な脳室周囲組織で,過剰放出されたグルタミン酸の処理や局所浸透圧の調節の目的でGLASTが誘導されたものと推察した.水頭症とグルタミン酸の動態を関連づけた初の報告である(Masago et al.1996).2,頭蓋内圧亢進コントロールモデルの作成とストレス応答:ラット大槽に人工髄液を注入し,随意に頭蓋内圧を調節できるモデルを開発した.頭蓋内圧亢進とともに大脳皮質,海馬神経細胞や視床下部の諸核においてc-fos等のimmediate early genesの発現を認めた.頭蓋内圧変動が高次脳機能や生理機能に及ぼす影響の一端を明らかにした(Matsumoto et al.1995).3,くも膜下出血(SAH)モデルの確立:SAHは急性頭蓋内圧亢進をきたす代表疾患であるが,小動物で再現することは困難であった.申請者らはラット頭蓋内血管をナイロン糸で貫くことで確実にSAHを再現することに成功した.SAH後は大脳皮質,海馬辺縁系,視床等広範な領域にhsp70,c-fos遺伝子が発現することを明らかにした.さらに海馬での遅発性神経細胞死を示唆する所見も得られた.SAH基礎実験に関しては先駆的な知見である.申請者らは平成7年度の研究立案で,頭蓋内圧亢進の解析に水頭症ラットを作成しA)c-fosなどのimmediate early geneの発現,B)FGF受容体の発現,C)グリア機能の変化,D)浸透圧調整トランスポーターとの関連の検索という4つの研究目標を掲げた.今年度はこのうちA),C),D)において新たな知見が得られた.1,カオリン水頭症ラットにおけるグルタミン酸トランスポーター(GLAST)の役割:GLASTは浸透圧調節トランスポーターであるとともに,興奮性神経毒であるグルタミン酸の回収に関わる膜蛋白である.本モデルにおいて水頭症発生1週目に,急激な頭蓋内圧亢進・脳室拡大とともに脳室周囲の反応性グリア細胞にGLAST mRNAの発現亢進を認めた.頭蓋内圧下降につれてGLAST mRNAの発現は通常レベルに復帰した.脳室拡大や髄液浮腫に対し脆弱な脳室周囲白質において,浮腫液や異常放出されたグルタミン酸の吸収,頭蓋内圧緩衝の目的でGLASTがグリア細胞に出現するものと推察された.過去にGLASTと水頭症を関連づけた報告はなく新たな知見と考えた.2,急性頭蓋内圧亢進とimmediate early gene(IEG)の発現:ラット大槽に人工髄液を注入し,随意に頭蓋内圧をコントロールできるモデルを新たに開発した.

頭蓋内圧亢進とともに大脳皮質や海馬神経細胞,視床下部の諸核においてc-fos,c-junの発現を認めた.その発現形態は脳圧亢進による全脳虚血のものとは異なっていた.頭蓋内圧亢進というストレスが中枢神経系に与える影響を遺伝子レベルで評価した報告はなく,治療を考える上で重要な知見と考えらた.今後の展開として,より臨床に近いくも膜下出血モデルや局所脳損傷モデルを確立し,頭蓋内圧亢進や脳浮腫の発生と遺伝子応答について解析する予定である.申請者らは,頭蓋内圧亢進という病態を分子生物学的アプローチで解析すべく,ストレス遺伝子応答,グリア機能の変化および浸透圧調節遺伝子の検索等の研究目標を掲げた.また臨床に沿った病態解析モデルの確立を試みた.研究期間内に得られた新たな知見は,1,実験水頭症ラットにおけるグルタミン酸トランスポーター(GLAST)の役割: GLASTは浸透圧調節トランスポーターであるとともに,興奮性神経毒であるグルタミン酸の回収を行う膜蛋白である.水頭症急性期の急激な頭蓋内圧亢進・脳室拡大とともに,脳室周囲の反応性グリアにGLAST遺伝子の発現亢進を認めた.脳室拡大や髄液浮腫に対し脆弱な脳室周囲組織で,過剰放出されたグルタミン酸の処理や局所浸透圧の調節の目的でGLASTが誘導されたものと推察した.水頭症とグルタミン酸の動態を関連づけた初の報告である(Masago et al. 1996). 2,頭蓋内圧亢進コントロールモデルの作成とストレス応答:ラット大槽に人口髄液を注入し,随意に頭蓋内圧を調節できるモデルを開発した.頭蓋内圧亢進とともに大脳皮質,海馬神経細胞や視床下部の諸核においてc-fos等のimmediate early genesの発現を認めた.頭蓋内圧変動が高次脳機能や生理機能に及ぼす影響の一端を明らかにした(Matsumoto et al. 1995).3,くも膜下出血(SAH)モデルの確立:SAHは急性頭蓋内圧亢進をきたす代表疾患であるが,小動物で再現することは困難であった.申請者らはラット頭蓋内血管をナイロン糸で貫くことで確実にSAHを再現することに成功した.SAH後は大脳皮質,海馬辺縁系,視床等広範な領域にhsp 70, c-fos遺伝子が発現することを明らかにした.さらに海馬での遅発性神経細胞死を示唆する所見も得られた.SAH基礎実験に関しては先駆的な知見である.
障がい者競泳選手支援に向けた抵抗力測定法の開発

流水プールで実施可能な泳者に働く抵抗力の定量化システムを構築し,身体に障がいを有する泳者の泳動作中に働く抵抗力を明らかにすることを目的とした.測定は,流水プールにて泳者を牽引した状態で実施した.その結果,クロール泳中の抵抗力の変動と身体の動作との関係を評価することができた.また,測定結果から各対象者における泳動作の長所や具体的な改善点を明らかにすることができた.次年度に障がい者競泳選手を対象として泳動作中の抵抗力測定を実施するため、健常競泳選手を対象として測定を実施し、測定方法の有用性や妥当性を検証した。抵抗力の測定方法は、牽引装置を用いてクロール中の抵抗力を測定した先行研究での理論を応用し、回流水槽にて行った。本研究では、クロールでの測定に加え、バタフライ、背泳ぎ、平泳ぎでの測定を実施した。その結果、全力でのクロール中の抵抗力は最大値で348N、平均値で171Nを示し、先行研究と同程度の値が得られた。また、試技中は抵抗力を経時的に測定することができ、回流水槽での流速を全力泳時より10%高く設定することの妥当性が確認された。また、背泳ぎに関しても最大値で294N、平均値で153Nの抵抗力を示し、経時的に抵抗力を計測できることが確認された。しかしながら、バタフライと平泳ぎに関しては、クロールと背泳ぎと比較して泳速度の変動が大きいことや、身体が鉛直方向に大きく浮き沈みするため、各ストローク周期中には測定のためのケーブルにたるみが生じ、抵抗力を計測できない局面が存在した。また、身体が最も深く沈む局面では、バタフライで669N、平泳ぎで545Nが計測され、腰部に取り付けたケーブルに大きな張力が生じ、泳動作の妨げとなることが明らかとなった。これらの結果から、クロールと背泳ぎについては同様の方法論にて抵抗力の測定が可能であるが、バタフライと平泳ぎについては実施が困難であると考えられ、次年度はクロールと背泳ぎの2泳法を対象として研究を実施することとした。本研究課題の当初計画では、初年度に健常競泳選手を対象として泳動作中の抵抗力測定方法の検証を行い、2年目に障がい者競泳選手を対象としての測定を実施することとなっている。初年度については計画通り健常競泳選手を対象とした測定を実施し、次年度の測定に向けてデータを収集することができた。2年目に実施予定の測定についても問題なく準備が進行している。平成28年度は、平成27年度に有用性を検証した泳動作中の抵抗力測定法を用い、身体に障がいを有する競泳選手の泳動作中の抵抗力を測定した。測定は強化合宿中に実施し、パラリンピック日本代表選手5名を含む8名の選手が参加した。平成27年度の検証実験において、バタフライや平泳ぎのように泳速度の変動が大きな泳法の抵抗力を正確に測定できないことが明らかになったことから、全ての測定参加者のクロール泳中の抵抗力の変動を評価した。その結果、身体的に健常な泳者を対象とした先行研究と同様に、ストローク周期中の抵抗力の変動や左右の非対称性を定量的に評価することができた。本研究にて計測されたストローク動作1周期中の平均抵抗力は56.0 Nから151.5 Nであり、健常な競泳選手を対象とした先行研究(185.2 Nから335.1 N)と比較して小さな値を示した。このような抵抗力の差は,対象とした泳者の泳速度や身体の大きさを反映したものと考えられ、推進力や発揮パワーが健常エリート選手と比較して小さいことを示している。また、抵抗力の変動は、リカバリー局面後半からグライド局面後半に抵抗力が増加する現象が見られ、手部が入水する動作が大きな抵抗になっていることが明らかとなった。特に、障がいによる制限を受けない側での手部の入水が大きな抵抗を生んでいる泳者が多く見受けられ、障がいによって推進力を得られないことが、反対側の身体のリカバリー動作における抵抗力の増大に関与することが示唆された。これらの測定により得られた情報は、抵抗力のデータと同期された泳動作の映像とともに各選手の指導者にフィードバックを行った。流水プールで実施可能な泳者に働く抵抗力の定量化システムを構築し,身体に障がいを有する泳者の泳動作中に働く抵抗力を明らかにすることを目的とした.測定は,流水プールにて泳者を牽引した状態で実施した.その結果,クロール泳中の抵抗力の変動と身体の動作との関係を評価することができた.また,測定結果から各対象者における泳動作の長所や具体的な改善点を明らかにすることができた.これまで健常競泳選手を対象として検証した方法論を用いて、障がい者競泳選手を対象とした抵抗力測定を実施する。今後の実験では、これまでの実験結果から抵抗力の測定が実施可能であることが確認されたクロールと背泳ぎを対象に行う。水泳競技方法論
HTLV-1ぶどう膜炎患者末梢血におけるサイトカイン遺伝子発現の解析

HTLV-1感染で発症する「HTLV-1ぶどう膜炎(HU)」は、慢性再発性のぶどう膜炎である。HUの病態については、T細胞を主体としたリンパ球浸潤が認められ、浸潤細胞中に常にHTLV-1感染細胞が存在すること.ウイルス遺伝子及び選択的なIL-6mRNAの発現が認められることが特徴であることを明らかにしてきた.又、新鮮浸出細胞を用いたものおよび浸出細胞由来のTcell cloneを用いた結果から、眼内浸出Tリンパ球においては、IL-6およびTNF-αの発現が特徴であることを明らかにしてきた.対象としてHU患者、無症候性キャリアー、他のぶどう膜炎患者の末梢血から単核球を分離し、Tcellを分画したRNAを抽出した.抽出したtotal RNA lugを用いてcDNAを作製し、RT-PCRで解析した。対象とした、サイトカインmRNAはIL-1α、IL-2、IL-4、IL-6、TNFα、IFNgとした.そのPCR産物はpolyacrylamidegelで電気泳動しelectro-blotによってmembraneへ転写し、サイトカインのprobeを用いてhybridize(シグナルの強度をバイオイメージアナライザーで測定した.これらをもとにサイトカイン遺伝子の発現レベルをβ-actinのそれとの相対比として定量的に解析した.発現レベルに特異性の認められたサイトカインに関して、ELISA法によって血中のタンパクレベルの測定を行ったIL-6、TNFα、IFNg等のRT-PCRのデータとELISA法によるデータとをつき合わせて解析、検討中である.HTLV-1感染で発症する「HTLV-1ぶどう膜炎(HU)」は、慢性再発性のぶどう膜炎である。対象とした、サイトカインmRNAはIL-1α、IL-2、IL-4、IL-6、TNFα、IFNgとした.そのPCR産物はpolyacrylamidegelで電気泳動しelectro-blotによってmembraneへ転写し、サイトカインのprobeを用いてhybridize(シグナルの強度をバイオイメージアナライザーで測定した.これらをもとにサイトカイン遺伝子の発現レベルをβ-actinのそれとの相対比として定量的に解析した.発現レベルに特異性の認められたサイトカインに関して、ELISA法によって血中のタンパクレベルの測定を行ったIL-6、TNFα、IFNg等のRT-PCRのデータとELISA法によるデータとをつき合わせて解析、検討中である.