hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Ｉｎ　ｖｉｖｏイメージングによる唾液腺機能の可視化と神経制御システムの解明

さらに、口腔乾燥症治療薬として臨床的にも用いられているピロカルピンが、部分アゴニストとして作用し、単独では唾液腺腺房細胞の弱いCa2+応答と唾液分泌を起こすが、カルバコールやベタネコールによるCa2+応答や唾液分泌を減弱させることが明らかになった。In vivoイメージングによるCa2+応答の解析:唾液分泌とCa2+応答の関係を直接的に解析するために、アデノウイルスベクターを使ってCa2+センサー(YC-nano50あるいはG-GECO)遺伝子を顎下腺腺房細胞に導入し、顎下腺細胞のin vivo Ca2+イメージング解析を行った。その結果、ピロカルピンが小さなCa2+応答を起こすことや、ベタネコールによるCa2+応答を減弱させることが生きたラットを使って確認することができた。また、この解析で、唾液分泌には腺房細胞のCa2+応答に加えて血流が大きく関与する事が示唆された。神経刺激による唾液分泌とCa2+応答の解析:舌神経の電気刺激によって、反射性に副交感神経を興奮させることによって、唾液腺に小さなCa2+応答や唾液分泌が起こることが確認された。また、交感神経を切除したラットでは、舌神経刺激によって顎下腺の血流が大きく増加することが明らかになった。新規IP3センサーの開発:有機蛍光物質とIP3受容体のリガンド結合ドメインを使った新規IP3センサーの開発に成功した。このセンサーについては、H25年度にさらなる改良を行う計画である。前年度までに確立したintravital Ca2+イメージングシステム、血流イーメジング解析、唾液分泌のリアルタイム解析を用いて、薬物刺激による唾液腺のCa2+応答と唾液分泌の関係を詳細に解析した。アセチルコリンの静脈内投与は速やかなCa2+応答と唾液分泌を起こすのに対し、サブスタンスPやアドレナリンはゆっくりとしたCa2+応答を起こすことが明らかになった。特にアドレナリンでは、Ca2+応答が持続している間に唾液分泌が低下する現象が観察された。これらの反応には唾液腺の血流が大きく関与するものと考えられた。蛍光色素を用いた解析によってアセチルコリンが血管透過性を高めることが確認されたことから、この考えが支持された。アセチルコリン刺激による組織レベルで同調したCa2+オシレーションが起こることが明らかになった。これは本研究における最も顕著な成果であり、このCa2+オシレーションと同期して、血流や唾液分泌速度が変化することも明らかになった。薬理学的解析の結果から、このオシレーションの発生には血流の変化に対するフィードバック作用が関係する可能性が考えられた。詳細な発生機構の解明が今後の課題である。これまでの顎下腺腺房細胞におけるCa2+動態のintravitalイメージングを発展させるために、耳下腺への遺伝子導入を試みた。耳下腺開口部からのアデノウイルスベクターの導入によって、耳下腺に蛍光タンパク質を発現させることができた。また腺房以外のイメージング解析を行うために、組織へのアデノウイルスベクター注射やアデノ随伴ウイルスの効果を比較した。ウイルス注射では、腺房以外の様々な形態の細胞に蛍光が観察されたのに対し、アデノ随伴ウイルスでは遺伝子発現は認められなかった(研究協力者:村田佳織、高橋亜友美)。
タンパク質栄養の低減化の試みと適応機構の解析

タンパク質栄養の必要量はライフスタイルに適応し変化するものと考えられる。そこで、すでに成長を終えた高齢ラットにタンパク質含量の異なる飼料を与え、体成分の変化と増殖関連遺伝子の発現変動を観察し、生体のタンパク質栄養への適応能と適応機構を検討した。【方法】7ヶ月齢の雄SDラットを1ヶ月間20%カゼイン食にならした後、それぞれ0、5、10、20%カゼイン食の4群に分け、さらに53日間飼育した。実験開始日からの1週間と最終日の窒素出納を測定するとともに、開始日と最終日の体脂肪および除脂肪体成分比率をEM-SCANを用いて測定した。さらに、肝臓からPoly(A^+)RNAを調製しノーザンブロット法にてインスリン様成長因子I(IGF-1)mRNAを定量した。【結果と考察】5%カゼイン食群と10%カゼイン食群の窒素出納は1日目には大きく負に傾くが前者は4日目に、後者は2日目に窒素平衡0に戻り以後この状態を維持した。無タンパク食群の体重は実験開始から約20%減少したが、このほとんどが除脂肪体成分の減少によるものであった。他の3群はいずれも除脂肪体成分を維持した。肝臓でのIGF-1 mRNAの発現量を比較してみると、5%カゼイン食群でその発現量は非常に低く無タンパク食群とほとんど同じであった。一方、10%カゼイン食群と20%カゼイン食群では、両群間に差はなく高いIGF-1の発現量が観察された。以上の結果から、高齢ラットは5%というタンパク質含量の低い食餌でも適応し、窒素平衡と除脂肪体成分を維持することが明らかとなった。しかし、IGF-1の発現量は無タンパク質食同様に低いことから、これらのラットは代謝回転や生体機能を抑制することによって体成分の恒常性を維持するものと考えられる。
温度感受性イオンチャネルの精製と機能解析

細胞膜の上には環境の温度変化に応答して開くイオンチャネルがある。我々はゾウリムシの細胞膜にある温度感受性のイオンチャネルの精製とその性質の解析を目的とする研究を行った。チャネル蛋白の精製段階はこれまでのところ十分なものではないが、このチャネル活性を阻害するいくつかの化学物質が見つかった。特に多価の隅イオンを持つリゾチーム、ルテニウムレッド、ネオマイシンなどは、細胞外液に低濃度で加えることによりゾウリムシの温度下降刺激時に開くカルシウムチャネル活性を完全に阻害した。これらの阻害物質の作用として、(1)チャネル蛋白に結合してカルシウム流入を直接的に阻害する場合、(2)チャネルを取り巻く脂質部分に働き温度下降時の脂質の流動性の変化を阻害する場合と2つの可能性が考えられる。(2)の可能性を検証するために、生きた細胞について細胞膜脂質の流動性を測定できる装置を構築した。この装置は、細胞膜脂質を蛍光色素のラウルダンで染色しておき、紫外線の励起光を当てると脂質の流動性に依存して青と緑の蛍光強度の相対比率が変化するという性質に基づくものである。これまでに我々は、温泉から採集した比較的高温で生きる種のゾウリムシと、比較的低温でしか生きられない種のゾウリムシについてそれぞれ2種、細胞膜脂質成分の脂肪酸を調べたところ、高温耐性種の方が飽和型脂肪酸/不飽和型脂肪酸の比率が大きいとい結果を得ている。そこでこれらのゾウリムシ種について膜流動性を測定したところ、高温耐性種の方が流動性が低いという結果になった。この結果は、飽和/不飽和の脂肪酸組成比率から予想される流動性と一致している。今後さらにこの装置を用いて温度下降刺激時の流動性変化を測定し、温度感受性チャネルの機能解析を行う予定である。原生動物のゾウリムシは、温度下降刺激に応答して細胞の前端部附近に分布するCa^<2+>透過性のチャネルが一過的に開き、細胞膜の脱分極、泳ぎの方向変換が引き起こされる。このような温度変化に応答するチャネルの活性を阻害する化学物質を検索したところ、ネオマイシン、ルテニウムレッド、リゾチームなどの多価陽イオンが阻害作用を持つことが見つかった。このうちリゾチームによる阻害はリゾチームを熱変性させても、蛋白分解酵素で断片化したペプチドでも同じなので、リゾチームのもつ酵素活性は阻害作用に直接関わっていない。ゾウリムシ細胞表面でリゾチームの作用する場所を調べるために、蛍光色素(AlexaFluor660)をラベルしたリゾチームを作製しこれをゾウリムシに加えたところ、細胞の前端部附近に多く結合した。この場所は温度感受性チャネルの分布と一致する。これらの結果をもとに、リゾチームに結合する膜蛋白をアフィニティークロマトグラフィーによって分画・精製を試みた。現在までのところ、電気泳動のバンドとして10種類ほどのペプチドがとれているが、チャネル活性を持つペプチドの候補を絞り込めていない。一方、温度下降刺激によりCa^<2+>透過性のチャネルが開くには何らかの引き金が必要である。この引き金は細胞膜の構造変化によると考えられ、特に膜脂質部分の流動牲変化などが予想される。そこで実際にこのような変化が起きているかどうかを測定する蛍光顕微鏡装置を作製中である。特に多価の陽イオンを持つリゾチーム、ルテニウムレッド、ネオマイシンなどは、細胞外液に低濃度で加えることによりゾウリムシの温度下降刺激時に開くカルシウムチャネル活性を完全に阻害した。これらの阻害物質の作用として、(1)チャネル蛋白に結合してカルシウム流入を直接的に阻害する場合と、

(2)チャネルを取り巻く脂質部分に働き温度下降時の脂質の流動性の変化を阻害する場合との2つの可能性が考えられる。(2)の可能性を検証するために、生きた細胞について細胞膜脂質の流動性を測定できる装置を構築した。この装置は、細胞膜脂質を蛍光色素のラウルダンで染色しておき、紫外線の励起光を当てると脂質の流動性に依存して青と緑の蛍光強度の比率が変化するという性質に基づき、青と緑の蛍光顕微鏡画像の強度の比率を求め流動性の大小を細胞レベルで推定することができる。これまでに我々は、高温耐性がある種のゾウリムシと、比較的低温でしか生きられない種のゾウリムシについてそれぞれ2種、細胞膜脂質成分の脂肪酸を調べたところ、高温耐性種の方が飽和型脂肪酸/不飽和型脂肪酸の比率が大きいという結果を得ている。そこでこれらのゾウリムシ種について膜流動性を測定したところ、高温耐性種の方が流動性が低いという結果になった。この結果は、飽和/不飽和の脂肪酸組成比率から予想される流動性と一致している。今後さらにこの装置を用い温度下降刺激時の流動性変化を測定し、温度感受性チャネルの機能解析を行いたい。
超越整関数のファトウ成分と特異値についての研究

超越整関数の複素力学系の研究を行った。特に有理関数の力学系では決して現れることのないファトウ成分である遊走領域とベーカー領域について調べた。超越整関数がこれらの領域を持つには、無限個の特異値を持つことが必要となる。そこで、無限個の特異値をうまく扱うことができる遊走領域やベーカ領域を持つことがある超越整関数族を考えた。そして、超越整関数に広義一様収束する適当な多項式列を考えることにより、遊走領域やベーカー領域の特徴付けを与えた。またそれらの関数族のパラメータ空間の収束を示した。超越整関数族f_{a}(z)=z+exp(z)+aを考察した。この関数はパラメータによりベーカー領域や遊走領域を持つ場合がある。それらの領域上の反復合成の極限関数は無限大となる。また、これらの関数は無限個の特異値を持つ。従って、この関数族のパラメータ空間の分岐図を定義するには2次多項式族の場合のマンデルブロート集合や指数関数族の場合のように定義できない。そこで、対数持ち上げにより分岐図を定義した。その中の遊走領域を持つパラメータからなる成分とベーカー領域を持つパラメータからなる成分について考察をした。その方法としてf_{a}(z)に広義一様収束する特別な多項式族P_{d,a}(z)を考えた。しかし、サリヴァンの定理が示すように多項式は決して遊走領域を持つことは無い。また、ベーカー領域も、その定義から多項式の力学系では現れない。しかし双曲性を持つ遊走領域やベーカー領域を持つf_{a}(z)について、それに広義一様収束する多項式族P_{d,a}(z)は力学的にも収束することを示した。すなわち、多項式のファトウ成分の超越整関数のファトウ集合へのカラテオドリー収束、それと同値であるジュリア集合のハウスドルフ収束を示した。このことによりこの超越整関数のベーカー領域が吸引領域の極限であること、遊走領域が増大する吸引周期の極限であることが判る。また、分岐図についてもいくつかの成分についてその収束を考察した。指数関数族については多項式の力学的収束についての研究はある。しかし、遊走領域やベーカー領域を持つ超越整関数への力学的収束は個別の具体的関数についてはあるが、パラメータ空間については初めてである。これについては現在論文の準備中である。研究の対象として複素1パラメータの超越整関数族f_{a}(z)=z + exp(z) + aを考えた。この関数はパラメータの取り方により超越整関数特有のファトウ成分であるベーカー領域や遊走領域を持つことがある。この関数は超越整関数g_{b}=b z exp(z)の対数持ち上げとして考えることができる。このことと複素1パラメータ関数族であることを用いて、この関数族の分岐図を考察した。そして遊走領域あるいはベーカー領域を持つパラメータのなす成分について結果を得た。良く知られている結果として多項式はベーカー領域も遊走領域も持たない。しかし、どのような超越整関数であっても多項式列で広義一様収束させることができる。超越整関数f_{a}に対し、多項式列P_{a, d}(z) =(1+a/d)z + (1+z/d)^{d+1} + aを考えた。これはf_{a}に広義一様収束する。力学系において双曲性は安定した性質である。双曲性を持つg_{b}の対数持ち上げとなるf_{a}に対し、それらがベーカー領域を持つ時も遊走領域を持つ時も、多項式列P_{a, d}が力学的にf_{a}に収束することが示せた。ベーカー領域は多項式の吸引直接鉢の増大列の極限として特徴付けられた。また、ここで現れる遊走領域は吸引周期の直接鉢でその周期が無限大に収束するものの極限として特徴付けられた。さらに、P_{a, d}の分岐図のいくつかの周期成分について、それらがf_{a}の分岐図の遊走領域の成分にカラテオドリー収束することを示した。これらの結果をまとめて論文とし、雑誌に投稿した。採択された科研費で新たにパソコンを購入した。それを用いて複素力学系の数値実験を行った。特にブラシュケ積と呼ばれる有理関数について調べた。この関数は単位円周を前方不変集合に持つ。単位円周上の同相写像に、いくつかの条件を与えると、その同相写像は単位円周の近傍に拡張することができる。そのことにより適当なブラシュケ積がエルマン環を持つことはよく知られている。その条件の一つが単位円周上での写像の回転数である。ブラシュケ積を単位円周上への制限が同相写像となり、回転数がジーゲル円板を持つように定義した時のジュリア集合について考察した。ジュリア集合の点で、いかなるファトウ成分の境界にも無い点を埋蔵点と呼び、その集合を剰余ジュリア集合と呼ぶ。ジーゲル円板を持つような回転数のブラシュケ積について、その剰余ジュリア集合がアトムからなることが示せた。この結果は数理解析研究所で開催された研究集会「複素力学系の総合的研究」で発表した。この研究の発展として単位円周全体を剰余ジュリア集合に含むブラシュケ積の存在を考察している。

この場合には、そのブラシュケ積の単位円周上への制限は同相写像にはならず、回転数も定義できず、回転集合を考えなければならない。ジーゲル円板については超越整関数の場合にも考察をしている。特異有限型については、複素誤差関数の場合を調べている。ジーゲル円板が有界となる場合はあるか。すなわち、漸近値がジーゲル円板の境界上に無いような場合の回転数の存在について考察を続けている。また、特異有限型については間接超越特異値がジーゲル円板の境界に存在するかを考えている。この場合は特に(Exp(z)-1)/zの形の超越整関数について考察をしている。超越整函数の特有の力学系を調べる手段として、それに広義一様収束する多項式近似列を考える。超越整函数の函数族としてf_{a}(z)=z + exp(z) + aを扱った。これはaを複素パラメータとする函数族である。これらはaにより、超越整函数特有のファトウ成分であるベーカー領域や遊走領域を持つことが知られている。この族の函数に対し、広義一様収束する近似多項式列P_{a, d}(z) = (1+a/d)z + (1+z/d)^{d+1} + aを考える。多項式は決して遊走領域やベーカー領域を持たない。f_[a}が遊走領域を持つ場合には、それは近似多項式の周期成分の周期が無限大に発散するものの極限であることが示された。また、ベーカー領域を持つ場合には近似多項式は吸引不変成分を持ち、その吸引不動点が発散するものの極限であることが示された。さらにほとんど扱われてるいない、特異無限型の超越整函数のパラメータ空間を調べた。方法は近似多項式のそれぞれのパラメータ空間を考え、それらの双曲成分のカラテオドリー収束を考察する。そのいくつかの成分への収束が示すことにより、ベーカー領域を持つパラメータからなる成分、そして幾つかの遊走領域を持つパラメータからなる成分を求めることができた。以前にまとめた結果の構成を大はばに直し、Annales Academiae Scientiarum Fennicaeに投稿し、掲載された。超越整関数の複素力学系の研究を行ってきた。有理関数の力学系との大きな違いは超越整関数のそれはファトウ集合に遊走領域とベーカー領域を持つかもしれないということである。超越整関数が特異値を有限個しか持たない場合には有理関数同様にそのファトウ集合は遊走領域もベーカー領域も持たない。一方で超越整関数は常に多項式列の広義一様収束列の極限として表すことができる。そこで遊走領域、ベーカー領域を多項式のファトウ成分の極限として考察した。特に複素1パラメータの超越整関数族f_{a}(z)=z + exp(z) +aを考えた。この関数はaの値により、遊走領域やベーカー領域を持つことがある。この関数族のパラメータ空間において、遊走領域やベーカー領域を持つ成分を求めることができた。さらにf_{a}に広義一様収束する多項式列として特別な多項式P_{a, d}(z)を考えた。f_{a}(z)をある超越整関数の対数持ち上げとして考え、双曲性を与える。この場合にはf_{a}が遊走領域やベーカー領域を持っていたとしてもP_{
傾斜機能性材料の組織とその物性制御に関する研究

精密機器における材料物性の最大限の利用には、表面構造の改善のための傾斜機能材料の生成が不可欠である。本研究課題では、当初マクロ的な意味での傾斜機能材料すなわち高温度勾配耐熱材料のコーティング層の形成などを対象に考えていた。しかし研究の進展にともない高度技術分野においては、材料の物性、例えば磁気ヘッド磁性あるいは超精密加工面のトライボロジーに関連するような表面のミクロな構造の重要性、および材料特性の改善のための傾斜機能性物質の積層が重要となることを感じた。この場合サブミクロンの構造を持つ傾斜機能層の積層基盤としての仕上げ表面の構造はきわめて重要である。このような理由により研究の方向をこの問題へと転換するため、本課題研究の後半においては主として表面の問題を中心として研究を進めてきた。最終年度では主として精密加工された結晶材料を対象とした。はじめに、脆性材料であるフェライト単結晶の研磨面の加工歪層を種々の結晶方位について電子顕微鏡、RHEED、ラザフォード後方散乱等により調べた。その結果、表面のあらさは研摩された結晶方向により異なること、また表面から約0.02μmまでの深さまで微細に破砕された結晶領域が存在し、それより深い処には特定方向に配列した転位が存在することを明らかにし、さらにこれまで報告されているようなアモルファス層の存在を顕微鏡像として確認した。このような被砕層は秒単位の化学研摩により完全に除去しうる事を確認し、また研摩条件の設定によりこのような表面の組織形成を制御できる可能性を示した。一方、塑性の大きい材料である金属として銅単結晶の超精密切削を行った。形成される加工歪層は切込み深さに比べて非常に大きい。すなわち、超微小硬度計による測定によれば、加工歪層の深さは0.5μmの切込みに対し少なくとも1μmの深さまで達していることが分かった。Knoop圧子を用いた超微小硬度計により、この歪層は結晶方向に対応した異方性を有することを明らかにした。これらの結果は超微細構造からなる傾斜機能材料の実現とその物性の制御にきわめて重要な情報を提供するものである。傾斜機能材料の特性評価のためには、材料表面からの情報が正しく捉えられねばならない。そのために、新しい実験技術の開発(電顕による断面観察)と測定装置(超微小硬度計)の性能の確認が必要である。本年度はこの様な準備的内容の実験を中心に実施した。1)TiC/SiC傾斜組成膜の構造の解析CVD法によりC/C複合材料に種々の組成比で積層したTiC/SiC膜を透過電顕による断面観察、EPMAによる組成分析、X線回析等により調べた。その結果、設計通りの積層構造を得ることは容易ではないことが分かった。また、この製造プロセスにより生成された膜は著しい結晶配向性を有することを確かめた。これが傾斜機能性に大きく影響することは明かである。2)超微小硬度計による得られる情報の限界と問題点傾斜機能材料評価に入る前に、金属、セラミックスなど各種材料に対して、超微小硬度計によりどこまで分かるか、また何が問題となるかを調べた。押込み量ー押込み荷重曲線の立ち上がり部分の勾配は、負荷速度に大きく依存しており、負荷速度の大きいものほど表面からの深さの大きい範囲で高い見かけの硬度を示すことが分かった。

このことは、傾斜機能材料評価にあたってきわめて重要かつ注意をしなければならない点である。超精密加工されたフェライトの加工歪層の解析に本装置を用いることによって、歪層が約3μmであることが明かとなった。すなわち、少なくともこの程度の分解能で傾斜組成材料の機械的性質評価が可能であることが確かめられた。一方、金属(純Ni)の場合について、圧痕と塑性変形領域の関係を透過電顕観察と併せて検討を行い、硬度計に表示される押込み量と塑性変形の及ぶ範囲との関係を明らかにした。本年度は超音波顕微鏡(SAM)による表面皮膜の剥離の様子の観察と走査電子顕微鏡(SEM)による試料破面を横方向からの観察、および超微小硬さ計による物体表面の機械的性質の評価に関する実験を行った。1) SAMによる表面皮膜観察超音波顕微鏡法は試料を破壊せずに、その内部とくに表面近傍の様子を観察することができるきわめて有効な手段である。本研究では、PVDおよびCVDによりTiC膜をコーティングした超硬合金にVickers圧痕を付け、これによる膜の剥離の様子から、コーティング方法の違いによる密着性の違いが明確に示された(Mater.trans.JIM,33(1992))。2) SEMによる破面観察から表面皮膜ならびに表面層の解析表面に存在する種々の表面層(コーティング膜を含む)あるいは欠陥は、材料の破断に大きく反映させる。破面観察は表面の評価に有効である。(1)表面にTiCをコーティングした超硬合金の、膜の密着性、境界面を破断面から評価できることを明らかした(Mater.Trans.JIM,33(1992))。(2)超精密加工されたFerrite単結晶の表面加工層の存在による破面の違いを明らかにした(Mater.Trans.JIM,34(1993))。超微小硬さ計により表面のμm以下の範囲の性質の違いを検出できる。(1)上記のFerrite単結晶の表面層に適用し、硬さの異なる深さ領域、および弾性率の異なる深さ領域を明らかにした。(2)さらに、機械的性質の大きく異なる種々の材料からなる表面層を持った試料に適用し、この硬さ計により得られる荷重-変位曲線との対応を検討した。以上の機械的性質試験および組織学的実験により、表面・境界面およびその近傍領域が傾斜機能性材料(物性応用する機能性材料一般)の形成において、どの様な役割を演じるのか等に関する情報が多数得られた。精密機器における材料物性の最大限の利用には表面構造の改良のための傾斜機能材料の生成が不可欠である。本研究課題では当初、マクロ的な意味での傾斜機能材料を対象に考えていたが、研究対象をこの方向に転換しつつ、サブミクロンの構造を持つ傾斜機能材料の素地としての仕上げ表面を中心として研究を進めてきた。今年度は主として精密加工された結晶性材料とした。はじめにフェライト単結晶の研磨面の加工歪層を種々の結晶方位について電子顕微鏡、RHEED、ラザフォード後方散乱等により調べた。その結果、表面の粗さは研磨された結晶面方向により異なること、また、表面から約0.02μmまでの深さまで微細に破砕された結晶領域が存在し、それより深い所には特定方向に配列した転位があることを明らかにし、さらにこれまでに報告されているようなアモルファス層が存在しないことを明らかにした。また、この様な表面破砕層は秒単位の化学研磨により完全に除去し得ることを確認した。
メカニカルストレス負荷時の骨細胞および骨芽細胞分化におけるｍｉｃｒｏＲＮＡの役割

MC3T3-E1細胞をスキャフォールドブロックに接着後,培養細胞物理的刺激装置により1.5 MPa, 1時間のメカニカルストレス負荷処理を行った。miRNAアレイ解析によりmiRNA発現プロフィールの変化について解析を行った結果,メカニカル負荷処理により発現変化が8倍以上変化したmiRNAを120種同定した。この変動したmiRNAsは骨形成を促進するsemaphorin 3Aを標的遺伝子とすることが解った。以上のことから,メカニカルストレス負荷後の骨芽細胞分化において特定のmiRNAsが分化を一部制御していることが示唆された。混合ガス(95%空気-5%CO2)を用いた加圧メカニカルシステムで培養条件を検討したところ、2 MPa、24時間の加圧条件では、マウス前駆骨芽細胞(MC3T3-E1細胞)およびマウス骨細胞(MLO-Y4細胞)ともにスキャホールドから離脱し、死滅した。いくつかの培養条件を設定し、1.5 MPa、1時間の加圧メカニカルストレスを負荷する条件を決定した。このメカニカルストレス負荷条件で、MC3T3-E1細胞は分化の指標となるアルカリフォスファターゼの活性が上昇しており、骨芽細胞への分化シグナルのスイッチが入っていることを確認した。設定した1.5 MPa、1時間の加圧メカニカルストレスをMC3T3-E1細胞またはMLO-Y4細胞付着スキャホールドに与え、トータルRNAを回収し、メカニカルストレス負荷未処理細胞から回収したトータルRNAとともにmiRNAアレイ解析に供した。その結果、メカニカルストレス負荷前と負荷後に変動するmiRNAをいくつか同定した。変動の大きいmiRNAの標的遺伝子をTargetScan6.2およびmiRandaのデータベースにより解析を行い、候補遺伝子を列挙した。また、変動したmiRNAに対するprecursor miRNAまたはantisense inhibitor処理は、加圧メカニカルストレス負荷によるMC3T3-E1細胞の分化を抑制することも確認した。MLO-Y4細胞については現在、スクレロスチンのmRNA発現を指標に変動したmiRNAの中から同定を進めている。(変動したmiRNAおよびその標的遺伝子名については特許出願検討のため、本報告書では明記せず)MC3T3-E1細胞をスキャフォールドブロックに接着後,培養細胞物理的刺激装置により1.5 MPa, 1時間のメカニカルストレス負荷処理を行った。今年度、当初使用していたスキャホールドの販売停止に伴い代替品の選択およびメカニカルストレス条件の再設定に時間を割いた。また、滅菌水を用いた静水圧ストレスではコンタミが生じることもあったので、5%CO2ガスと95%空気の混合ガスを用いて加圧する方式に変更を行った。その結果、静気圧システムを使用した際の分化条件を年度末に設定するに至り、現在、この培養条件で処理したマウス前駆骨芽細胞MC3T3-E1細胞および骨細胞MLO-Y4細胞からトータルRNAを調製する段階に至っている。また、条件設定の研究と並行してMC3T3-E1細胞のBMP-2刺激における骨芽細胞分化に関わるmicroRNA-370の標的分子の同定を進め、FEBS lettersへ報告した。本研究課題では,メカニカルストレス負荷を与えた骨芽細胞の分化および骨細胞の分化制御システムにmicroRNA(以下miRNA)がどのように関わっているのかについて検討した。マウス長骨由来骨細胞様株MLO-Y4細胞およびマウス前駆骨芽細胞株MC3T3-E1細胞に加圧空気培養システムによりメカニカルストレス1.5 MPaを1時間負荷し,各細胞からsmall RNAを回収した。その後,無処理細胞のsmall RNAを同様に回収し,東レ株式会社3D-Gene miRNA arrayに供し、メカニカルストレスによるmiRNA発現プロフィールの変化について解析を行った。その結果,骨芽細胞においては,メカニカル負荷処理により発現変化が8倍以上変化したmiRNAを120種同定した(発現上昇miRNA:84種、発現低下:36種)。このアレイ解析データをもとに変動したmiRNAの標的遺伝子をバイオインフォマティック解析により推定したところ,骨芽細胞が産生し,骨形成の促進作用の機能を示すsemaphorin 3A(sema3A)を標的遺伝子とする3種のmiRNAs(miRNA-195a-5p, miRNA-322-5p, miRNA-497a-5p)に着目した。これら3種のmiRNAsのmature型を骨芽細胞に導入すると,分化指標であるALP(アルカリホスファターゼ)活性が有意に低下した。さらに,3種のmiRNAsうち最も高い変動を示したmiRNA-195a-5pを導入した細胞ではメカニカルストレス負荷後のsema3Aのタンパク発現量が上昇しなかった。以上のことから,メカニカルストレス負荷後の骨芽細胞分化において特定のmiRNAsがsema3Aを標的にすることで一部制御していることが示唆された。骨細胞におけるメカニカルストレス負荷後のmiRNAの解析については現在引き続き行っている最中である。

食品機能学,骨代謝化学昨年度、スキャホールドや加圧システムのコンタミネーション(水圧式メカニカルストレス)などで実験の進捗が予定より遅れたが、本年度は迅速なアレイ解析や機能発現確認が行えたため、この遅れをカバーできるところまでに至った。現在進行が遅れている原因は以下3点の培養条件変更などが関与している。1これまで使用していたスキャホールドが昨年度始めに販売停止となり、代替品を数点入手し、使用するMC3T3-E1細胞の接着能やメカニカルストレス負荷条件を再度検討する必要があった2静水圧では滅菌水および滅菌容器を使用していてもコンタミが発生する場合があったので、5%CO2ガスと95%空気の混合ガスを用いて加圧(メカニカルストレス負荷)をするシステムへ変更したアレイ解析の結果、変動したmiRNAを両細胞でいくつか確認した。しかし、すべてを期間中に機能解析することは不可能であるため、メカニカルストレス負荷により高変動したmiRNAに絞って機能解析を進めていく。さらには、その中でも分化制御メカニズム解析について進展できる可能性のあるmiRNAについて作業を集約していく。以下、次年度の研究取り組みを示す。1)変動miRNAの標的分子の同定マウス前駆骨芽細胞MC3T3-E1細胞および骨細胞MLO-Y4細胞をそれぞれ2MPaのメカニカルストレスを負荷しながら培養し、負荷12時間後のスキャホールドを回収する。スキャホールド内の細胞からtotalRNAを抽出後、3D Gene microRNA arrayに供し、発現変動したmicroRNAを検索する。発現変動profileを確認後、変動したmicroRNAの標的分子検索や変動microRNAに対するantisense-inhibitorやprecursorを細胞に導入することでメカニカルストレス負荷後の分化への影響について検証する。骨細胞においては、骨細胞が分化の指示を担当する細胞と考えられていることからメカニカルストレス負荷後の細胞培養液を採取し、未分化マウス前駆骨芽細胞MC3T3-E1細胞を採取培地で培養することによる骨芽細胞分化への影響を検証する。また、この培地中へ放出された分化因子がメカニカルストレス負荷後に変動したmicroRNAの標的でないか解析を進める。次年度研究費を以下の項目に使用する。2発現変動microRNAをTaqManプローブ検出を用いたReal-time PCRによる再確認3変動microRNAのantisense-inhibitorまたはprecursor導入細胞の分化への影響確認
マルチプルアミンセンサの開発

コリネ型土壌細菌Arthrobacter globiformis由来のヒスタミンオキシダーゼ(HAO)はトパキノンを補酵素とする銅含有酵素ファミリーの一つで、ヒスタミンを基質とする。我々はこれまでに本酵素を固定化し西洋ワサビペルオキシダーゼを含むオスミウムゲルを電子媒体として、電気化学的にヒスタミンを検出するヒスタミンセンサーを考案、実用化させできた。HAOはすでにクローニング済みで、さらにHis-tag付のHAOを得ている。大腸菌から発現精製した本酵素を用いて以下の検討を行った。1)HAOの生化学的性質の検討と基質チャネル改変アミンオキシダーゼの検討:HPLC-ECD法を用いてHAOの基質特異性を検討した結果、ヒスタミン、代謝物であるN^τ-メチルヒスタミン、生体内には存在しないN^π-メチルヒスタミンに対し活性比はそれぞれ100、75、117%であった。大腸菌から発現精製した本酵素の結晶化を進めている。また愛媛大学総合科学研究支援センターに設置されている無細胞系タンパク質自動合成装置を用いて変異酵素の作成とスクリーニングを進めている。2)ヒスタミン、メチルヒスタミンの測定系の開発:ヒスタミン(HA)とその代謝物であるN^τ-メチルヒスタミン(N^τ-MHA)をo-フタルアルデヒド、亜硫酸イオンと反応させプレカラム誘導体化によるHPLC-電気化学的(ECD)検出法を新規に開発し、生体サンプルへの応用を検討した。HA、N^τ-MHAさらに内部標準としてN^π-メチルヒスタミン(N^π-MHA)をo-フタルアルデヒド、亜硫酸ナトリウムとアルカリ条件下で反応させ、反応物をHPLC(ODSカラム)にて分離溶出し、電気化学検出法にて検出した。HA、N^π-MHA、N^τ-MHAはそれぞれ14.2、16.5、23.3分に溶出され検出感度は1pmolであった。マウス脳HA、N^τ-MHA含量はそれぞれ0.60、0.48nmol/gであった。コリネ型土壌細菌の一種であるArthrobacter globiformis由来のヒスタミンオキシダーゼ(HAO)はトパキノンを補酵素とする銅含有酵素ファミリーの一つで、ヒスタミンを基質とする。我々はこれまでに本酵素を固定化し西洋ワサビペルオキシダーゼを含むオスミウムゲルを電子媒体として、電気化学的にヒスタミンを検出するヒスタミンセンサーを考案、実用化させてきた。酵素の基質特異性を利用しヒスタミンのみならずカテコールアミン、セロトニンに対するマルチプルアミンセンサの開発は各種脳内アミンの同時測定を可能とし、統合失調症、気分障害、摂食障害、睡眠-覚醒障害等の病態における研究に大いに寄与するものと考えている。本年度はセンサの基礎となる酵素を人為的に改変し、基質特異性を変えた酵素を構築する目的でHAOの生化学的研究ならびに改変を試みた。HAOはすでにクローニングされ大腸菌により発現が可能となっており、さらに我々はHis-tag付のHAOを得ている。1.ヒスタミン、メチルヒスタミンの測定系の開発:o-フタルアルデヒド,亜硫酸イオン存在下で上記アミンを反応させて、電気化学法により検出した(購入したHPLC用オートサンプラー(L-2200)を活用)。本法を用いてHAOの基質特異性を検討した結果、ヒスタミン、代謝物であるN^τ-メチルヒスタミン、生体内には存在しないN^π-メチルヒスタミンに対し活性比はそれぞれ100、75、117%であった。2.本酵素の精製が容易となったことから、大腸菌から発現精製した本酵素の結晶化をすすめている。タンパク質立体構造解析によりアミンオキシダーゼの基質チャネルに相当するアミノ酸配列を明らかにし、部位特異的突然変異法を用いてヒスタミン以外の基質を選択的に触媒する酵素の改変を進めている。

HA、N^τ-MHAさらに内部標準としてN^π-メチルヒスタミン(N^π-MHA)をo-フタルアルデヒド、亜硫酸ナトリウムとアルカリ条件下で反応させ、反応物をHPLC(ODSカラム)にて分離溶出し、電気化学検出法にて検出した。HA、N^π-MHA、N^τ-MHAはそれぞれ14.2、16.5、23.3分に溶出され検出感度は1pmolであった。マウス脳HA、N^τ-MHA含量はそれぞれ0.60、0.48nmol/gであった。
肝細胞間の接着解徐と肝細胞-基質間の接着によるチロシンキナーゼとPLCγの活性化

肝細胞間の接着解除と肝細胞-基質間の接着により、イノシトールリン脂質系の代謝が促進される成績を得ている。この機序の解明のため、細胞間接着の解除(カドヘリン関与)と細胞-基質間の接着(インテグリン関与)により、チロシンキナーゼの活性化が起き、それに伴ってPLC_γが活性化され、イノシトールリン脂質代謝が促進されるかどうかについて検討を行なった。ラットを用いてコラゲナーゼ潅流法にて肝細胞を分離、培養を行った。肝細胞と基質との接触は、肝細胞のcollagen-coated dishへの播種により行ない、肝細胞間の接触の解除は、24時間培養後のconfluentになった細胞の外液からのCa^<2+>の除去によった。それらの細胞のcytosol分画を用いて、チロシンキナーゼ活性の測定をProtein Tyrosin Kinase Assay Systemを用い、PLC_γのチロシンリン燐酸化の検出は、抗PLC_γ抗体で免疫沈降された蛋白をWestern blot法を用いて抗フォスフォチロシン抗体をprobeとして行なった。細胞内IP_3濃度の測定は、脂質分画においてIP_3 Assay Systemにて測定した。肝細胞と基質との接触により、チロシンキナーゼ活性は約3倍に増加し、チロシンリン酸化PLC_γの軽度の増加と、細胞内IP_3の有意な増加を認めた。肝細胞間接着の解除では、チロシンキナーゼ活性とチロシンリン酸化PLC_γに有意な増加はみられなかったが、細胞内IP_3濃度は軽度の増加を認めた。以上の成績より、イノシトールリン脂質代謝は、肝細胞と基質との接触によりPLC_γのチロシンリン酸化により促進され、肝細胞間接着の解除では他のPLCの活性化により促進されると推察された。
モデル星間分子を用いた衝撃反応とその宇宙化学的意義

フェナントレン,ピレン,フルオランセンの3種類の有機物からなる混合物を出発物質として衝撃反応を行い,生成物をガスクロマトグラフィー,ガスクロマトグラフ質量分析計ならびに元素分析計で分析した.これらの有機物は隕石中に検出されているとともに,星間分子や星間塵中に存在が強く示唆されている有機物である.実験の結果,衝撃を被った試料は、反応を免れた出発物質,それ以外の芳香族炭化水素(PAHs),無定形炭素を含んでいた.これらのPAHs(出発物質の二量体の存在度が最も大きかった)や無定形炭素は衝撃波が出発物質に作用した結果,生成したものである.衝撃を被った試料と衝撃圧力の関係をまとめると以下のようになる.1.衝撃を被った試料の炭素元素に対する水素元素(H/C)比は衝撃圧力の増加に伴って減少する,2.衝撃を被った試料のPAHs量は25GPaまで増加するがその後急激に減少する,3.衝撃を被った試料中の反応を免れた出発物質量は27GPaまで徐々に減少するがその後急激に減少する.これらの結果をもとに,衝撃反応の反応機構を考察すると,衝撃反応は出発物質が水素を放出してより水素に乏しい物質に変化する脱水素反応であることが判った.さらに,2つの出発物質分子から1つの水素分子が抜けて二量体が生成する付加反応が優勢な反応であることも判った.これらのことにより,有機物を含む隕石が衝突現象を経験した際,27GPa以下の衝撃圧力の時には出発物質が生き残り,15GPa以下の衝撃圧力の時には存在した有機物組成がほとんど変化しないことが示唆された.フェナントレンを出発物質として衝撃反応を行い,生成物をガスクロマトグラフィー,ガスクロマトグラフ質量分析計ならびに元素分析計で分析した.フェナントレンは隕石中に検出されているとともに,星間分子や星間塵中に存在が強く示唆されている有機物である.実験の結果,衝撃を被った試料はフェナントレン,それ以外の芳香族炭化水素(PAHs),無定形炭素を含んでいた.これらのPAHs(出発物質の二量体の存在度が最も大きかった)や無定形炭素は衝撃波がフェナントレンに作用した結果,生成したものである.衝撃を被った試料と衝撃圧力の関係をまとめると以下のようになる.1.衝撃を被った試料の炭素元素に対する水素元素(H/C)比は衝撃圧力の増加に伴って減少する, 2.衝撃を被った試料のPAHs量は25GPaまで増加するがその後急激に減少する, 3.衝撃を被った試料中のフェナントレン量は25GPaまで徐々に減少するがその後急激に減少する.これらの結果をもとに,衝撃反応の反応機構を考察すると,衝撃反応は出発物質が水素を放出してより水素に乏しい物質に変化する脱水素反応であることが判る.さらに,2つのフェナントレン分子から1つの水素分子が抜けて二量体が生成する付加反応が優勢な反応であることも判る.また,本実験の高圧力領域においては,無定形炭素よりもダイヤモンドが安定な領域であるにもかかわらず,ダイヤモンドの存在は確認されなかった.このことは,出発物質の化学的・物理的性質が衝撃反応におけるダイヤモンドの生成に影響していると考えられる.出発物質を変化させ基礎的情報をさらに増やすことで,衝撃反応の研究は純粋化学や宇宙化学に対して大きな貢献をし得ることが期待される.フェナントレン,ピレン,フルオランセンの3種類の有機物からなる混合物を出発物質として衝撃反応を行い,生成物をガスクロマトグラフィー,ガスクロマトグラフ質量分析計ならびに元素分析計で分析した.これらの有機物は隕石中に検出されているとともに,星間分子や星間塵中に存在が強く示唆されている有機物である.実験の結果,衝撃を被った試料は、反応を免れた出発物質,それ以外の芳香族炭化水素(PAHs),無定形炭素を含んでいた.これらのPAHs(出発物質の二量体の存在度が最も大きかった)や無定形炭素は衝撃波が出発物質に作用した結果,生成したものである.衝撃を被った試料と衝撃圧力の関係をまとめると以下のようになる.1.衝撃を被った試料の炭素元素に対する水素元素(H/C)比は衝撃圧力の増加に伴って減少する,2.衝撃を被った試料のPAHs量は25GPaまで増加するがその後急激に減少する,3.衝撃を被った試料中の反応を免れた出発物質量は27GPaまで徐々に減少するがその後急激に減少する.これらの結果をもとに,衝撃反応の反応機構を考察すると,衝撃反応は出発物質が水素を放出してより水素に乏しい物質に変化する脱水素反応であることが判った.さらに,2つの出発物質分子から1つの水素分子が抜けて二量体が生成する付加反応が優勢な反応であることも判った.これらのことにより,有機物を含む隕石が衝突現象を経験した際,27GPa以下の衝撃圧力の時には出発物質が生き残り,15GPa以下の衝撃圧力の時には存在した有機物組成がほとんど変化しないことが示唆された.
骨代謝におけるラットフェチュインの生理的役割

フェチュインは、動物種によってその生合成臓器が異なり、また年齢によってもその発現量が大きく異なるが、ラットのフェチュインは、主として肝臓でリン酸化型として合成・分泌され、血清中で速やかに脱リン酸化される。この脱リン酸化型フェチュインは、骨などの石灰化組織の基質に沈着すると共に、骨芽細胞でもフェチュインが一部合成・分泌されている。我々は、この石灰化組織中の脱リン酸化型フェチュインが、甲状腺ホルモン(PTH)による骨吸収作用を増強することを見出した。また、この増強作用はI型コラーゲンのカテプシン-Lなどに対する感受性を高めることに由来するものであることを明らかにした。一方、リン酸化型フェチュインは、肝細胞の強力な増殖因子として知られている肝細胞増殖因子(HGF)の生物学的な活性を抑制することを見出し、リン酸化型フェチュインが、肝臓の過剰再生を抑えるカローンの一種であることを見出した。しかし、脱リン酸化型フェチュインにはHGF活性抑制作用はない。さらに我々は、ラット血清フェチュイン濃度の測定法を改良して、胎生期には低いが、出生後にその濃度が急激に増加し、2.54.5mg/mlと従来報告されている値より約1,000倍高いことを見出した。フェチュインの生理的役割の1つに、HGFなど種々の増殖因子の活性制御があげられており、血清フェチュインの濃度が高いことは、この生理作用が生体内でも作用していることを裏付けるものである。妊娠17日のマウスに^<45>CaCl_2を投与して、24時間後に胎仔から得た^<45>Ca-標識橈骨を用いるin vitro骨吸収活性剤測定系により、下記の結果を得た。1.低濃度(0.1-0.5nM)の副甲状腺ホルモン(PTH)は、我々が用いた上記の測定系では、骨吸収活性をほとんど示さなかった。しかし、ラット骨気質から精製したフェチュインを200μg/mlの濃度で加えると、骨吸収活性剤が上昇することを見いだした。2.上記のラットフェチュインによる骨吸収促進活性は、フェチュンの濃度(0-200μg/ml)及びPTHの濃度(0.1-0.5nM)に依存的であった。3.PTHは骨組織のカテプシンLの分泌を促進し、さらにPTH存在下でのラットフェチュインによる骨吸収促進活性は、カテプシンLの阻害剤であるキモトリプシンで抑制された。4.カテプシンLには、コラーゲン分解活性があると報告されている。そこで、ラットのI型コラーゲンをラットフェチュインで前処理すると、精製カテプシンLによるコラーゲン分解活性が促進されることを見いだした。5.以上の結果は、骨基質に存在するフェチュインがその周囲のコラーゲンの高次構造を変化させ、カテプシンLに対する親和性或いは感受性を高めて、PTHによる骨吸収を促進していることを示唆するものである。また、抗ラットフェチュイン抗体を蛍光色素で標識し、これも用いてマウス骨組織を染色して、本年度の補助金で購入した落射蛍光顕微鏡で観察したところ、骨芽細胞がフェチュインを合成分泌していることを確認した。なお、報告書(英文)は現在作成中である。6.上記の他に、我々は肝臓が合成・分泌しているリン酸型のフェチュインが、肝細胞増殖因子(HGF)の生物活性を阻害し、肝臓の過剰増殖を抑制する力ローンの1種であることを見いだし、報告した。(印刷中)フェチュインは、動物種によってその生合成臓器が異なり、また年齢によってもその発現量が大きく異なるが、ラットのフェチュインは、主として肝臓でリン酸化型として合成・分泌されている。このリン酸化型フェチュインは、肝細胞の強力な増殖因子として知られている肝細胞増殖因子(HGF)の生物学的な活性を抑制することを見出し、リン酸化型フェチュインが、肝臓の過剰再生を抑えるカローンの一種であることを見出した。このリン酸化型フェチュインは、血液中で速やかに脱リン酸化されるが、この脱リン酸化型フェチュインにはHGF活性抑制作用はない。

さらに我々は、ラット血清フェチュイン濃度の測定法を改良して、胎生期には低いが、出生後にその濃度が急激に増加し、2.54.5mg/mlと従来報告されている値より約1,000倍高いことを見出した。フェチュインの生理的役割の1つに、種々の増殖因子の活性制御があげられており、血清フェチュインの濃度が高いことは、この生理作用が生体内でも作用していることを裏付けるものである。また、血清中の脱リン酸化型フェチュインは、骨などの石灰化組織の基質に沈着すると共に、骨芽細胞でも1部合成・分泌されている。我々は、この石灰化組織中の脱リン酸化型フェチュインが、甲状腺ホルモン(PTH)による骨吸収作用を増強することを見出した。この増強作用は、I型コラーゲンのカテプシン-Lなどに対する感受性を高めることに由来するものである。
同時双方向性通信メディアを活用した持続可能な女子教育支援プログラム開発

本研究では、国際協力の成果の持続可能性を保持する方法として、JICA-Netを活用した遠隔ワークショップの効果的なプログラムの内容・方法・展開、コース運営、教材/マニュアル等を含むプログラム開発を試みた。研究の方法は、「研修ニーズの調査」、「遠隔ワークショップの企画・実施」、「ワークショップ用教材研究と制作」、「ワークショップの効果を評価」、「プログラム開発」、「類似事例の情報収集」である。研究内容の主たるものは、JICA-Netを介して試行した計5回の遠隔ワークショップにおけるプログラム開発、「幼児教育用ローコスト教材制作と活用の手引」の制作、および類似事例の情報取集である。遠隔ワークショップは、(1)平成15年に専門家派遣により行った技術移転のフォロー(平成18年度1回、対パキスタン。幼児教育分野)、(2)専門家派遣期間中には完成が望めない長期間の作業を要する技術移転の補完とフォロー(平成18、19年度各1回、対パプア・ニューギニア。地域啓発・学校運営分野)、(3)既に行った技術移転のフォローではなく、自力での持続可能性を維持する上で必要な意識啓発(平成20年度2回、対パプア・ニューギニア。地域啓発・学校運営、遠隔教育分野)という異なる性格と特徴を持たせた幼児教育用ローコスト教材開発は、開発途上国に共通のニーズがあることから、対パキスタンとの遠隔ワークショップの折に開発した英文版教材を基に、当日のプレゼンテーションも加味して1冊のブックレットにした類似事例の情報収集は、英国(国際開発省におけるプロジェクト終了後の技術移転フォローアップの方法/その際のテレビ会議システムの活用状況、初等・中等教育段階における理数科教育振興のための取り組み)、およびパキスタン(メディアを介したバーチャル・ユニバーシティにおける学習者の課題)で行った。本研究の前提である「開発途上国における技術移転の持続可能性の問題を解決する手段として同時双方向性通信メディアの活用は有効である」という点に焦点を当てると、遠隔ワークショップの成果と課題として、以下のことが挙げられる。参加者のほとんどがテレビ会議への参加は初めてであったが、全員がワークショップに満足した。その主たる理由は、(1)臨場感、質問も含めて意見交換のしやすさ、映像の見易さと音声の聞きやすさなどハード面、(2)プログラムの内容・展開などのソフト面である。プログラムの内容・展開では、ローコスト教材の制作と活用の講義とデモンストレーション、日本の幼児教育に関する質疑方式での情報提供(以上パキスタン)、テレビ授業の改善と持続可能性に向けたフリーディスカッション、セントラル州とポートモレスビー市で実施した「テレビ授業の持続可能調査」の報告と意見交換(以上パプア・ニューギニア)を評価する参加者からのフィードバックが目立った。今後もこの種のフォローアップ遠隔ワークショップを希望する声は、パキスタン、パプア・ニューギニア両国の参加者から挙がっている。JICA-Net活用の研修の効果は派遣・招聘経費の軽減、人材の確保の上から大きい。遠隔研修を推進する上での当面の課題を列挙する。(1)主催者(日本側)の課題:「JICAにおけるフォローアップ研修の必要性の認識」、「JICA現地事務所における遠隔研修の担当窓口の設置とそれに伴う要員の確保」、「遠隔研修を本格化するためのJICA-Net回線の確保、「遠隔フォローアップ支援を視野に入れたプロジェクト設計」、「象地関係省庁の協力」(2)参加者(国)側の課題:「最低限の治安の確保」、「日本側講師陣とフォローアップ・プログラム開発をするための遠隔研修ワーキング・グループの常置」、「ワークショップ開催に伴う事務費等負担(配布資料作成のための経費、参加者の交通費等)」、「メールなど比較的安価なコミュニケーション手段の確保」本研究では、国際協力の成果の持続可能性を保持する方法として、JICA-Netを活用した遠隔ワークショップの効果的なプログラムの内容・方法・展開、コース運営、教材/マニュアル等を含むプログラム開発を試みた。

参加者のほとんどがテレビ会議への参加は初めてであったが、全員がワークショップに満足した。その主たる理由は、(1)臨場感、質問も含めて意見交換のしやすさ、映像の見易さと音声の聞きやすさなどハード面、(2)プログラムの内容・展開などのソフト面である。プログラムの内容・展開では、ローコスト教材の制作と活用の講義とデモンストレーション、日本の幼児教育に関する質疑方式での情報提供(以上パキスタン)、テレビ授業の改善と持続可能性に向けたフリーディスカッション、セントラル州とポートモレスビー市で実施した「テレビ授業の持続可能調査」の報告と意見交換(以上パプア・ニューギニア)を評価する参加者からのフィードバックが目立った。今後もこの種のフォローアップ遠隔ワークショップを希望する声は、パキスタン、パプア・ニューギニア両国の参加者から挙がっている。JICA-Net活用の研修の効果は派遣・招聘経費の軽減、人材の確保の上から大きい。遠隔研修を推進する上での当面の課題を列挙する。(1)主催者(日本側)の課題:「JICAにおけるフォローアップ研修の必要性の認識」、「JICA現地事務所における遠隔研修の担当窓口の設置とそれに伴う要員の確保」、「遠隔研修を本格化するためのJICA-Net回線の確保、「遠隔フォローアップ支援を視野に入れたプロジェクト設計」、「象地関係省庁の協力」(2)参加者(国)側の課題:「最低限の治安の確保」、「日本側講師陣とフォローアップ・プログラム開発をするための遠隔研修ワーキング・グループの常置」、「ワークショップ開催に伴う事務費等負担(配布資料作成のための経費、参加者の交通費等)」、「メールなど比較的安価なコミュニケーション手段の確保」研究組織メンバーとの研究協議により、(1)対象国はパキスタン、(2)対象分野は幼児教育、(3)参加機関はイスラマバード市内に所在する機関(教育省、イスラマバード市教育庁,全国教育財団、CRI(国際子どもリソース)等)(4)対象者は幼児教育担当行政官および幼児クラス(Katchi Class)を付設する学校の関係者。(5)利用する同時双方向性通信メディアは「JICA-Net」,(6)条件が許す範囲でパプア・ニューギニアも視野に入れることで、以下の研究活動を行った。(1)「JICA-Net Workshop」(仮称)のための教材の開発(幼児クラスを擁する学校長のための「学校リーダーシップ・ワークシート」、幼児クラス用「ローコスト幼児教育教材」など)(2)「JICA専門家活動」終了後の対象分野・機関の状況調査(研究協力者の協力による)(3)テレビ会議システムを介した教育開発の事例収集・研究(各種学会、JICA遠隔セミナー、国連大学・国際開発高等教育機構等共催の「FASID国際開発特別講座2006」への参加、等)(4)パキスタンにおける「JICA-Net Workshop」(仮称)のフィージビリティ調査を、現地教育関係機関、JICA(本部及びパキスタン事務所)の関係者を対象に実施。
森林土壌における活性アルミニウムのスギ生育に及ぼす影響評価

酸性物貭降下量の多少、土壌型などを考慮して、岐阜・富山・群馬の各県下の13ヶ所より表層土壌およびスギ針葉を採取した。アルミニウムの植物への影響を解析するためにスギの針葉を樹冠の層位・葉齢に從って細分し分析に供した。都市及びその周縁地域では樹齢の比較的高いスギに衰退の兆候があり、主として樹冠の薄葉化(thinning)が認められた。しかし酸性化の著しいポドゾルでは衰退は認められず、酸性土壌は必ずしもスギ衰退に関係しなかった。調査した範囲では表層土壌のpH(H_2O)は3.65.4で、やや酸性化した地点が多かった。土壌の酸性化は当然塩化カリウムによって交換浸出される活性アルミニウムの増加を併う。針葉のアルミニウム含量は10ppm250ppmで、樹冠の位置によってアルミニウム濃度に特定の傾向は認められなかったが、一般的には当年生葉は1年生葉に比べてアルミニウムは少い。梢端の枯損もしくは樹冠の薄葉化の兆候のあるスギはアルミニウム含量は多い。地域や土壌母材によってアルミニウム含量は異なり、とくに火山灰の影響の大きい群馬の土壌はアルミニウム含量は著しく多い。しかしポドゾルでは土壌は酸性が強く、置換性アルミニウムが著しく多いにかかわらず針葉のアルミニウム含量は50ppmと、それほど多いとはいえない。枯損の兆候が認められるところでは、土壌表層のpH(H_2O)とpH(kcl)との差が小さかった。土壌のN-kcl抽出液のAl/Caは樹木衰退の指標になるとされているが、スギについては適応しなかった。