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生物多様性の文化的価値に着目した保全法制度に関する研究-天然記念物制度再考

文献調査の成果の一部として、法学研究81巻12号に「「狩猟の場」の議論を巡って」を発表した。当該論文は、明治25年に成立した旧狩猟法の制定過程を題材にしたものだが、野生動物保護管理において、科学的な判断だけではなく、地域社会と自然との関係性と文化を踏まえた政策立案が必要であることと、鳥獣管理の担い手として地域中間集団の重要性を説いている。人と自然の関係性にかかわる現地調査については、実際の天然記念物の指定地(豊岡市、富山県内、奄美大島、沖縄本島など)のほか、天然記念物指定にこだわらず、長野県秋山郷などの自然との関係性を密接に有している狩猟関係の地域において行った。特に沖縄については、天然記念物指定種ジュゴンの主要な生息地である沖縄県名護市辺野古が、米軍嘉手納基地の移転候補地となっており、本年も現地調査を行い、関係者からヒアリング調査も行った。辺野古のジュゴン問題は、研究代表者が継続して研究している題材であるが、本年度においては、現在進行中の訴訟に関し、意見書等を執筆した。この意見書は、学術的視点に立ったもので、本研究の成果の一部を応用しているものである。そのため、早期に公開したいが、まもなく裁判の判決が出るため、それを待って発表する所存である。また同じく沖縄で、環境訴訟が行われている天然記念物種の生息地であるヤンバル地域の調査を行った。ヤンバルにおいては、ノグチゲラ、ヤンバルクイナなどの天然記念物の生息地に林道工事や皆伐が行われている。ヤンバルの森林は琉球王国時代から林業利用されており、調査においても文化的伝統は確認できたが、現代の森林施業や林道工事との文化的な連続性には疑問もあり、生物多様性の持続的利用の観点からも問いなおす必要があるとわかった。今後は引き続き、文献調査を継続したいと考える。
高周期14族元素シクロブタジエンジアニオンの創製

高周期14族元素からなる不飽和小員環化合物は、高周期元素多重結合の化学のみならず、芳香族化合物の化学としても化学的性質の解明には興味がもたれる。本研究では、特にシクロブタジエンジアニオンの高周期14族元素類縁体を合成し、その反応性および構造を明らかにした。テトラシラシクロブタジエンジアニオンをカリウム塩として合成することに成功した。また、そのケイ素原子をゲルマニウムやスズに置き換えた誘導体も合成している。これらはいずれも環状6π電子系の化合物である。実験的かつ理論的に構造上の特徴を精査した結果、非芳香族化合物であることが明らかになった。また、このジアニオン誘導体はさまざまな遷移金属原子に対して環状π配位子として作用することが分かった。本研究期間中にW,Mo,Zr,Hf,.Co,Fe,Ru,Rhを中心金属としたサンドイッチ型、ピアノイス型遷移金属錯体の合成、構造解析に成功した。さらに、フェロセンのシクロぺンタジエン配位子の一つを、ケイ素原子2つとゲルマニウム原子1つを含む高周期14族元素からなるシクゴペンタジエン配位子で置き換えた新規なフェロセン誘導体の合成にも初めて成功した。その特異な構造をX線結晶構造解析、NMR、Cychc VoltammetryおよびDFT計算によって明らかにした。高周期14族元素シクロブタジエンジアニオンを創製するための第一段階として、まずジハロシクロメタレンもしくはテトラハロシクロメタランのアルカリ金属あるいはアルカリ土類金属による還元反応を系統的に研究した。この期間内の特筆すべき発展として、効率的なシクロブタジエンジアニオン高周期元素類縁体の合成法を確立したことを挙げる。環を構成する元素はケイ素、ゲルマニウム、スズである。今回合成に成功した全ての化合物の詳細な分子構造に関しては、分光学的手法およびX線結晶構造解析を用いて調べた。その結果、高周期14族元素シクロブタジエンジアニオンは非芳香族分子であり、芳香族性を示すことの知られている母体のシクロブタジエンジアニオンとは対照的であった。またこれらの観測結果は、理論計算によっても信頼性の高いレベルで再現されている。一方、アルカリ土類金属で還元した場合には、シクロブタジエンジアニオンではなく、ビシクロ[1.1.0]ブタン2,4-ジアニオン構造をした化合物が得られた。これらは高度に歪んだトリシクロ構造をしている。今回合成した化合物の化学的性質を調べてみると、炭素類縁体とは大きく異なる性質の化合物であることが分かった。この傾向は有機分子と有機金属分子の本質的な差異を反映したものだと考えられる。高周期14族元素シクロブタジエンジアニオンおよびビシクロ[1.1.0]ブタン2,4-ジアニオンは、分子内に2つの負電荷を有することから容易に類推できるように、結合形成反応に利用できる。そこで様々な求電子試剤との反応を行った結果、不飽和結合をもつ環状分子、多環式化合物、13族元素/14族元素ハイブリット型分子等といった、他の方法論では合成困難であると思われる分子構造でさえ効率良く合成できた。現在、環状ジアニオンという特性を活かした新規合成法の開発にむけて研究を進めている。平成18年度基盤研究Cの研究期間中に得た成果を以下にまとめると、1アルケンの高周期元素類縁体(Si,Ge,Sn)に関する新しい知見2テトラシラシクロブタジエンを配位子とする金属錯体の化学3シクロプロペンの高周期元素類縁体(cyclo-R_4E_3(E=Si,Ge,Sn)の合成と反応性の解明4高周期14元素を骨格にもつビシクロ[1.1.0]ブタン誘導体の特異な構造と反応性上記4項目に特に進展があった。1に関する特筆すべき成果は、安定なスズ-スズ二重結合化合物、ジスタンネンR_2Sn=SnR_2(R=SiMe^tBu_2)の合成であり、これは溶液中でも安定な二重結合を保っている初めての化合物である。2のトピックスでは、[{η^4-(^tBu_2MeSi)_4Si_4}Fe(CO)_3]を合成し、その構造決定に成功した。

さらに先行研究のある炭素類縁体,[(η^4-H_4C_4)Fe(CO)_3]との比較し、ケイ素配位子としての特徴を明らかにした。3ではシクロプロペンの高周期元素類縁体R_4SiGe_2 and R_4Ge_3(R=SiMe^tBu_2)の効率的合成法を見いだし、精密な構造解析と詳細な化学反応性の検討を行った。その中でも塩化メチレンにより増炭反応および環拡大反応が進行したことは高周期元素不飽和結合であるがゆえの反応であり、特に詳しく研究を行った。4のトピックスでは、高度に歪んだ骨格であるために構造化学的に興味のもたれていたビシクロ[1.1.0]ブタン誘導体、我々の今回の研究では骨格4原子がSi_3CとGeSi_2Cの化合物を合成し、その構造を明らかにした。以前よりビシクロ[1.1.0]ブタン誘導体はその原子価異性体との相対安定性に関して研究がなされていたが、今回、骨格を形成する元素の種類を変化させることで、以前の研究では見つかっていなかった異性化などの反応性が見つかり、高周期典型元素化学の最新の研究成果として発表した。高周期14族元素からなる不飽和小員環化合物は、それ自身反応活性であり、その化学的性質の解明には興味がもたれる。本研究では特にシクロブタジエンジアニオンの高周期14族元素類縁体を合成し、その反応性および構造を明らかにした。昨年度中に達成した特筆すべき成果としては、(1)シクロブテンの構造異性体であるビシクロ[1.1.0]ブタンの合成に成功した。構造解析の結果、極めて短いSi-Si結合を有することを明らかにした。この化合物は高い歪みエネルギーのため、容易に異性化し原子価異性体であるシクロブテンやシクロペンテン誘導体を与えることが分かった。(2)高周期14族元素からなるシクロブタジエンを配位子とした様々な遷移金属錯体を合成し、その構造および物理化学的手法による諸物性値の決定、また理論計算をもちいた電子構造の理論的考察を行った。(3)フェロセンのシクロペンタジエン配位子の一つを、ケイ素原子2つとゲルマニウム原子1つを含む高周期14族元素からなるシクロペンタジエン配位子で置き換えた新規なフェロセン誘導体の合成に初めて成功した。その特異な構造をX線結晶構造解析、NMR、サイクリックボルタンメトリーおよびDFT計算によって明らかにした。
小児失語症の言語・認知評価法の開発と言語指導・教育に関する研究

4年間にわたる小児失語症に関する本研究では、次のような成果が得られた。1.小児失語症の臨床像を把握:国内外の先行研究および最近の研究を概観し、アンケートによる全国実態調査を通じて失語症児にみられる言語・認知面の問題や指導・教育の問題点を分析した。小児失語症児の性差については、原因疾患が頭部外傷による場合には男児が女児よりも2倍強多かった。学齢に達した失語症児達は、高学年になるほど特別支援学級や養護学校などに所属しており、通常の学級や学校で教育を受けることが困難になっていることが推察された。2.頭部外傷により失語症を呈した2症例の長期経過:小児失語症の原因疾患の中で、最も発症率が高い頭部外傷による失語症児2例について、長期にわたり経過を追跡し、言語・認知面や行動面の問題と言語聴覚士の指導および教育のかかわりの重要性について考察した。3.小児失語症検査の開発:未開発の小児失語症検査に関して、幼児小学低学年用の構文能力検査と漢字音読検査を試作し、健常児および失語症児に実施した結果、失語症児の構文能力や漢字音読の問題が明らかになった。今回の評価や分析は、学齢期の失語症児が抱えている学習困難や言語の問題についての指導・教育に有用であることが示唆された。4.まとめ:以上より、小児失語症の評価・指導には次のような視点を踏まえた取り組みが重要と思われる。1)小児失語症の問題の本質を把握し、長期的な指導の継続が重要である。2)発達的な視点と高次脳機能障害に対する視点に立った取り組みが必要である。3)言語面の障害に加えて、非言語面の障害により学習困難が生じやすいことを配慮する。4)心理面、社会適応の問題に配慮する必要がある。5)特に学齢前の小児失語症児に適した評価・指導法の開発が必要である。本年度は、本研究の初年度として以下のような資料収集および分析を行った。1.既存の成人失語症検査テストバッテリーについての調査:進藤は日本における総合失語症検査として標準化がなされている、(1)標準失語症検査、(2)WAB失語症検査、(3)老研版失語症鑑別診断検査の聴く、話す、読む、書く、計算の各モダリティごとに分析を行った。2.国内外の言語発達検査の諸資料の調査・分析:進藤と玉井は、Atlantaのコンベンションセンターで開催された2002年度American Speech-Language-Hearing Association (ASHA)の学会に参加し、海外における言語発達研究の最前線に関する情報の収集・調査を行い、合わせて文献・書籍などの収集、情報の分析を行った。3.失語症検査開発のための教具・教材資料の調査・収集:進藤と荻野は上記の国際学会や国内学会、国内専門店などより、開発可能生の高い教具・教材について検討した。4.欧米の小児失語症検査バッテリーについての調査:進藤、玉井と加我は海外の小児失語症に関する文献を収集し、検査バッテリーについて検討した。5.小児失語症の症例検討:進藤は小児失語症を中心とする小児高次脳機能障害の評価とコミュニケーション指導について概観し、自験例に基づき、必要なテストバッテリーについて検討した。小児失語症の文献研究を通じて、"小児失語症は成人の失語症と比較して回復が早く予後が良好である"という従来の考え方ではなく、小児失語症では、たとえ日常会話レベルまで回復しても、学習上の問題が残存すると指摘されていることが分かってきた。

さらに、玉井は自験例を通じて、頭部外傷による小児失語症例における言語機能と非言語機能の回復経過について検討を行った。本年度は、本研究の2年目としで以下のような研究を行った。1.国内外の小児失語症の評価法・指導法に関する文献調査:進藤、荻野、玉井、加我は、昨年に継続して国内および国外の(1)失語症児の検査・評価法、(2)失語症児の訓練・指導法に関する文献を収集し、検討した。2.小児用構文理解・産生検査の作成と実施:進藤、荻野は、研究協力者の院生と共に小児用構文理解能力および構文産生能力検査を考案し、健常児70名(4歳6歳)と後天性小児失語症児4名(6歳、7歳、9歳、17歳の各女子)に検査を実施した。その結果、(1)聴覚的構文理解課題では、4歳児は非可逆文、5歳児は主語が文頭にくる可逆文および前置詞を含む構文、6歳児は受動態、使役態、主語と目的語の語順が逆になった構文が理解可能であった。失語症児では、全例とも4歳レベルは通過し、5歳レベルも再刺激で正答できたが、6歳レベルの課題から蹟きがみられた。(2)構文産生課題では、健常児の4歳児は非可逆文、5歳児は可逆文、6歳児は受動態の産生が可能であった。使役態は6歳児であっても産生困難であった。失語症児では健常児群と比べて、5歳レベルの課題から遅れがみられ、格助詞、態ともに習得が遅れており、歴年齢でのレベルと比べて稚拙な文の産生が目立った。以上の結果から、本検査は、小児失語症児の言語評価として適用可能ではないかと思われた。3.小児失語症に関するアンケート調査の実施:進藤、荻野、玉井は、小児失語症児の言語症状や学習困難な状況および失語症児の評価法・指導法についてのアンケートを作成し、全国の言語聴覚士のいる小児施設334箇所(言語聴覚士協会会員名簿、コミュニケーション障害学会会員名簿より)および全国公立学校難聴言語障害教育研究協会事務局44箇所にアンケート用紙と返信用封筒を送付し、実態調査を行った。アンケートには、失語症児の背景、言語行動面(対人関係、ことばの聴覚的理解力、ことばの表現力、読字力と読解力、書字力と作文力、数と計算、記銘力)、行動面、学習面、および失語症児に用いている評価・言語指導、指導上苦労していることなどの項目を設定した。現在、アンケートを回収・分析中である。本年度は、本研究の3年目として以下のような研究を行った。1.小児失語症に残存する言語症状についての文献研究(最近10年の我が国の報告例より):進藤、荻野、玉井、加我は、国内小児施設における小児失語症児の訓練・指導法に関する文献を収集、検討する中で、失語症児に残存する言語症状について調査した。その結果次のような特徴が認められた。(1)語彙の貧困さ(低頻度語に顕著)、(2)漢字の音読障害、(3)漢字の書字障害、(4)短文の復唱障害、(5)統語障害、(6)意味理解障害、(7)心理社会適応などの問題、(8)失語症以外の高次脳機能障害などがみられ、それらが学習不振を引き起こしている。2.小児失語症の評価についての調査:進藤、荻野、玉井、加我は、国内外の文献調査より、失語症児の言語評価法について、海外で用いている評価として、(1)成人の失語症検査、(2)小児の発達検査、(3)小児失語症検査の開発(Whurr et al.:1998)、日本で用いている検査として(1)成人の標準失語症検査、(2)ITPA言語学習能力診断検査、(3)WISC-R、(4)小児失語症構文検査2004について検討した。
ポリアミン及びその誘導体によるNMDA受容体活性の制御機構

1.大腸菌のスペルミジン取り込み系の基質(スペルミジン)結合蛋白質(PotD)のスペルミジン結合部位は、そのX線結晶構造解析ならびに変異potDの活性測定より同定された。このPotDのスペルミジン結合部位とホモロジーのある部分をNMDA受容体上で探索したところ、N-末端側とM3とM4の膜貫通領域の間の細胞表面に露出しているペプチド部分で相同性が認められた。PotDのスペルミジン結合には、酸性アミノ酸残基が最も強く関与していたので、相同性の認められた領域の酸性アミノ酸残基を中性アミノ酸残基に置換して、NMDA受容体活性を測定した。NMDA受容体活性発現にはグルタミン酸、グリシンが必須であり、ポリアミン、特にスペルミンは受容体活性を二面的に調節している。すなわち、脱分極時では活性を促進し、過分極時では活性を阻害する。この活性促進にはGlu342、Asn616、Asp669が関与し、阻害にはAsn616、Glu621、Asp669が関与していた。すなわち、スペルミンは脱分極時と過分極時で結合部位が変わり、NMDA受容体活性を調節していることが示唆された。2.種々のビスエチルテトラアミン及びビスエチルペンタアミンを合成し、これらポリアミン誘導体のNMDA受容体活性に対する効果を検討したところ、BE4444(1,19-ビスエチルアミノ-5,10,15-トリアザノナデカン)が過分極時で最も強い阻害活性を有していた。しかし、BE4444は脱分極時の促進活性をほとんど有していなかった。3.更に強力なポリアミンアンタゴニストを探索したところ、N^1ーダンシルスペルミン及びN^1-(n-オクタンスルフォニル)スペルミンが1μMでほぼ100%活性を阻害した。これら化合物をリ-ド化合物として、ポリアミン誘導体の医薬品としての開発を目指す。大腸菌スペルミジン取り込み系の基質(スペルミジン)結合蛋白質(PotD)のスペルミジン結合部位は、そのX線結晶構造解析ならびに変異PotDの活性測定より同定された。このPotDのスペルミジン結合部位とホモロジーのある部分をNMDA受容体上で検索したところ、N-末端側とM3とM4の膜貫通領域の間の細胞表面に露出しているペプチド部分で相同性が認められた。2種々のビスエチルテトラアミン及びビスエチルペンタアミンを合成し、これらポリアミン誘導体のNMDA受容体活性に対する結果を検討したところ、BE4444(1,19-ビスエチルアミノ-5,10,15-トリアザノナデカン)が過分極時で最も強い阻害活性を有していた。

3.更に強力なポリアミンアンタゴニストを探索したところ、N^1ダンシルスペルミン及びN^1-(n-オクタンスルフォニル)スペルミンが1μMでほぼ100%活性を阻害した。これら化合物をリ-ド化合物として、ポリアミン誘導体の医薬品としての開発を目指す。
神経栄養因子増強活性天然物６α，７αおよび７α，２０－ジヒドロキシアノネンの合成

6α, 7αおよび7α, 20-ジヒドロキシアノネンは神経栄養因子増強作用を有することから,抗アルツハイマー病薬や学習改善薬開発のためのリード化合物として多くの研究者から期待されている.我々はキラルオキサゾリジノンを不斉補助基に持つα,β-不飽和カルボン酸へのジビニル銅試薬の1,4-付加反応が高いジアステレオ選択性で進行し,テトラアルキルキラル四級炭素を構築できることを見いだした.続けてSHMDSで処理したのち,ヨードメタンと反応させ,α-メチル化を行うと高ジアステレオ選択的に隣接位に不斉中心を導入できることも見いだした.テトラアルキル不斉四級炭素と他の不斉炭素が隣接する構造単位は多くの天然有機化合物に含まれており,その立体選択的かつ効率的な構築法の開発は合成化学的に重要な課題の一つである.しかしながら,現在のところ汎用性のある方法はあまり知られていない.今回,申請者は2のα-アルキル化が高いジアステレオ選択性で進行することを見いだし,さらに,(Z)-α,β-不飽和カルボン酸誘導体を同様な反応により3とは相対配置が異なるアルキル体6に導くことに成功した.まずは以前報告した方法1に従い,1,4-付加前駆体1を調製した.3-ブチン-1-オールを根岸ヨードメチル化およびTBDPS化により(E)-ヨードアルケンへと変換後,Pd(PPh3)4触媒存在下一酸化炭素挿入を伴うキラルオキサゾリジノンとのカップリングにより1を得た.立体選択的に(Z)-ヨードアルケンへと変換し,(2R)-2-フェニルオキサゾリジノンとのカップリングにより4を得た.次に1をビニル銅錯体との反応に付し,3S : 3R = 95 : 5で3を得た.同様な条件で4を処理したところ,3S : 3R = 9 : 91で3と逆の配置の6が優先して得られた.続いて,3をTHF中SHMDSで処理した後,ヨードメタンを加えて反応させたところ,高収率かつ高ジアステレオ選択的に(2R,3S)-配置を有するメチル体9が得られた.同条件下ヨードアリルやヨードベンジルを用いると若干の選択性の低下が見られるものの,まずまずの収率で10または11が得られた.一方,6を同条件下ヨードメタンと反応させたところ,3と相対配置の違う(2S,3S)-体12が同程度のジアステレオ選択性で得られた.このことより,3位の不斉はオキサゾリジノンの不斉誘導に影響を与えないことが分かった.不斉1,4-付加反応によってβ-テトラアルキル不斉4級炭素を構築した基質のα位水素をSHMDSで引き抜き種々のアルデヒドと反応させた.その結果,電子吸引性あるいは中性のアルデヒドではアルドール後,脱オキサゾリジノンを伴ってラクトン化が進行し,主としてβ-ラクトン体が得られることを見いだした.アルドール反応条件下で一挙にβ-ラクトンが生じる現象は世界初の発見である.一方,電子供与性アルデヒドを用いるとアルドール体からの脱炭酸か起こり,オレフィン体が生成することも見いだした.最近,多様な生物活性を示すことで注目を集めている(+)-bakuchiolを不斉1,4-付加反応/アルドール反応(脱オキサゾリジノン,脱炭酸を伴う)の連続反応を鍵とするルートで,ゲラン酸からわずか4段階という短工程で全合成することに成功した.6α, 7αおよび7α, 20-ジヒドロキシアノネンは神経栄養因子増強作用を有することから,抗アルツハイマー病薬や学習改善薬開発のためのリード化合物として多くの研究者から期待されている.我々はキラルオキサゾリジノンを不斉補助基に持つα,β-不飽和カルボン酸へのジビニル銅試薬の1,4-付加反応が高いジアステレオ選択性で進行し,テトラアルキルキラル四級炭素を構築できることを見いだした.続けてSHMDSで処理したのち,ヨードメタンと反応させ,α-メチル化を行うと高ジアステレオ選択的に隣接位に不斉中心を導入できることも見いだした.テトラアルキル化不斉四級炭素に他の不斉炭素が隣接した構造単位は多くの天然有機化合物に含まれており,その立体選択的かつ効率的な構築法の開発は合成化学的に重要な課題の一つである.しかし,その汎用性のある方法はほとんど知られていない.最近我々は(R)-フェニルオキサゾリジノンを不斉補助基として有する2aの不斉1,4-付加反応(S)-配置のテトラアルキル四級炭素を有する付加体が高ジアステレオ選択的に得られることを見いだした.我々はそれを基質としたα-アルキル化によりテトラアルキル化不斉四級炭素の隣接位に新たな不斉中心を導入できないか検討した.一方,(Z)-体を基質とし,一連の反応を行うと3位エピマーが生成するものと予想され,立体分岐的合成法となりうることが示唆される.そこで,その反応についても検討することにした.まず,3-ブチン-1-オールを根岸ヨードメチル化,水酸基の保護により(E)-ヨードアルケンへと変換した.次いで,一酸化炭素挿入を伴う(R)-フェニルオキサゾリジノンとカップリングにより,1,4-付加前駆体を調製した.これを不斉1,4-付加反応に付したところ,(3S)-配置を有する付加体が高ジアステレオ選択的に得られた.

これをSHMDSで処理した後,CH3Iと反応させたところ,メチル体が高いジアステレオ選択性で得られることを見いだした.さらに,種々のハロゲン化アルキルまたはアルデヒドによるα-アルキル化またはアルドール反応を検討した.その結果,ヨウ化アリル,ヨウ化ベンジル,アセトアルデヒドを用いた場合に良好な選択性で目的物を与えることが判明した.一方,(Z)-ヨードアルケンを不斉1,4-付加に付したところ,若干選択性が低下することがわかった.続けて,上記と同様にしてα-メチル化を行ったところ,中程度の収率ながら高ジアステレオ選択的に3-エピ体が得られることも見いだした.ジヒドロキシアノネン類の合成における最大の鍵となるのが8,9位の立体制御である.我々はキラルオキサゾリジノンを不斉補助基とするα,β-不飽和カルボン酸誘導体とビニルまたはアリル銅試薬の1,4-付加反応が高いジアステレオ選択性で進行し,不斉テトラアルキル四級炭素を構築できることを見いだし,さらに続けてSHMD Sで処理した後,種々のアルキルはライドまたはアルデヒドと反応させることで連続不斉中心を構築できる方法を開発した.これによりジヒドロキシアノネン類の合成における課題の3/2程度を達成できたものと考えている.本研究のターゲットであるジヒドロキシアノネンの最も導入困難なテトラアルキル炭素の不斉とそれに隣接する炭素上の不斉の導入に成功した.これにより本合成研究の鍵中間体を短段階かつ高エナンチオ選択的に得ることが出来た.上記方法によって得られた中間体の炭素鎖伸長を行った後,分子内ディールス・アルダー反応によってデカリン骨格形成を行い,側鎖部のフラン関係性を行い,全合成を達成する計画である.計画に従い,上記で得られた鍵中間体を利用し,ジエンパートとカップリングさせた後,分子内Diels-Alder反応を行ってデカリン骨格の形成を行った後,側鎖部分のフラン環を形成して合成を完了する予定である.実験に必要な試薬の購入,研究結果発表のための旅費,論文投稿に必要な経費に使用する計画である.実験に必要な試薬や器具などの消耗品の購入,研究結果発表のための旅費,論文投稿などに必要な経費に使用する計画である.
視覚系の物体間の距離推定メカニズムの解明

視覚系の主な機能は「何が」「どこに」あるかを視覚情報から認識することだが、「どこに」を処理する機能である空間認識の中でも、刺激の大きさや長さを推定する機能は空間の奥行きや構造を認識する上できわめて重要である。最近、高密度のテクスチャに順応すると、その後に呈示される物体間の距離や刺激のサイズの見えが縮小することを発見した(Hisakata, Nishida & Johnston, 2015)。本研究ではこの効果の基本的な時空間特性を検討し、その結果がサイズ順応による効果では説明できないこと、両眼性処理段階で発生していることを明らかにした。本年度は、"密度ー距離順応"の基本的な空間特性として、まず大きさ順応現象との相違を検討した。従来の大きさ順応現象は刺激単体の大きさに対して生起すると考えられているが、個々のドットが形成する全体的な順応刺激サイズ(順応エリアのサイズ)に対しても生起する可能性がある。この全体的刺激サイズがドット間の知覚距離またはテスト刺激の知覚的大きさを縮小させるのではないか、という指摘に対して追加の実験的検討を行った。実験は元の実験で用いた順応刺激と同時に黒い枠を呈示するものだった。実験の結果、枠があるにもかかわらず、高密度刺激に順応するとドット間の距離やテスト刺激の知覚サイズが縮小することが明らかになった。この効果は低密度順応後にはみられなかった。この結果を踏まえ、本研究の成果を国際誌へ論文として投稿中である。また順応効果の奥行き選択性を検討するため、2つのモニター画像をそれぞれの眼に入力する両眼分離呈示装置(ハプロスコープ)の構築を行った。論文投稿にあたり、従来知られている順応効果との差異を検討するより基本的なコントロール実験を行う必要があった。そのため、本来実施予定であった奥行き選択性についての実験は今年度中に実施できなかった。本年度は立体視実験装置の構築を完了することができたため、引き続き計画書に従い研究を遂行していく。今年度は、"密度-距離順応"についてその基本的な現象について国際学会誌に論文を投稿し、採択された。また、順応効果の奥行き選択性を検討するため、両眼分離呈示装置を用いて順応刺激とテスト刺激をそれぞれ異なる奥行き面に呈示する実験を行い、予備データを得た。予備実験では密度-距離順応では順応刺激とテスト刺激の奥行き面が異なると順応効果が減少する傾向が見られたが、よりはっきりとした結論を得るためには詳細なパラメータの調整が必要である。また、構築した両眼分離呈示装置ではナイーブな被験者の奥行き知覚が困難な場面が多々あったため、より両眼画像を融合しやすい環境や視覚刺激に調整する必要があることが明らかになった。基本的な現象について、査読付き国際学会誌に論文が採択されその妥当性が認められた。また、奥行き選択性を検討する実験について、当初予定していた通りの計画で予備実験を完了し、その問題点などを明らかにすることができた。今年度は、"密度-距離順応"について、それが視覚系の単眼・両眼処理段階のどちらで発生しているのか処理段階についての切り分けの実験と、現象の両眼視差選択性が存在するかどうかを検討する実験を行った。まず処理段階の検討であるが、両眼分離呈示装置を用いて順応刺激とテスト刺激が異なる眼に呈示されても順応効果量が変化しないかどうかを検討した。実験の結果、順応効果の転移率はどの参加者でもほぼ1であり、現象が両眼性処理段階で発生していることを示していた。両眼性処理段階の関与が示されたことから、"密度-距離順応"が奥行き面に対して選択性をもつかどうか検討した。奥行きについての知覚はさまざまなものがあるが、今回の実験では量的な奥行き手がかりとなる両眼視差による奥行き知覚を用いた。実験では、順応刺激とテスト刺激をそれぞれ異なる奥行き面に呈示し、テスト刺激である2点のドット間距離が変化するかどうかを計測した。その結果、順応刺激が異なる奥行き面に呈示されたとしてもテスト刺激に対する縮小効果は減少せず、この現象には両眼視差選択性がないことが明らかになった。本実験結果を日本基礎心理学会にて発表し、国際論文誌へ投稿準備中である。さらに、"密度-距離順応"の時間特性について検討するため、順応刺激の呈示時間とリフレッシュ頻度の影響を実験的に調べた。以前に発表した論文(Hisakata,Nishida & Johnston,2016)や現象観察において、順応刺激のテクスチャのドット位置がある程度時間変化することが効果量をあげることがわかっていた。結果として、順応刺激がもつ時間周波数が高いほど縮小効果が大きく、また20msほどの短時間の順応でも知覚的距離の縮小が引き起こされることが明らかになった。今年度は予定していた順応効果の奥行き選択性、および順応効果の時間特性を実験的に検討する。

順応刺激とテスト刺激をそれぞれ異なる奥行き面に呈示する実験についてパラメータの調整を行い、本実験を遂行する。また、両眼分離呈示装置を用いて順応刺激とテスト刺激が異なる眼に呈示されても順応効果量が変化しないかどうかを検討する実験を行う。それらの実験結果を国内・国際学会にて発表する。29年度が最終年度であるため、記入しない。実験心理学29年度が最終年度であるため、記入しない。
水土保全や地力向上に資する土壌改良による侵食抑制技術の開発と評価・予測法の確立

農地では大規模化や近代的な農業形態が導入されたため,土壌侵食や土壌に含まれる栄養塩の流亡が顕著になっており,地力の低下や流出した土砂や栄養塩による水域の自然環境劣化に大きく関与している。そこで本研究課題では,土壌侵食の程度を決定する土壌の物理性の因子は何なのか,団粒化の促進等の土壌の物理性を改善させる土壌改良が土壌侵食を効果的に抑制することができるのか,について実証的な研究を遂行することによって,持続的な作物生産と環境保全型の農業方法の両立を目指す。さらに,土壌改良に用いる資材に沈砂池の堆積土を還元利用することで,堆積土の処理方法が未解決という社会的な問題を解決に導くことを目指す。
超短波帯の電磁波による生体内費侵襲計測技術の開発と生活支援への応用

高度な医療福祉機器は、わが国の国民や先進国の人々の医療・福祉に大きく貢献してきた。しかし、多くの発展途上国では、これら高度な機器の恩恵を受けることは少なく、先進国においても、高度な医療・福祉にかかる膨大な費用が重荷となっている。研究代表者の属する研究グループでは、このような見地から長年にわたり、広く人類に貢献しうる、簡便で安全な医療福祉技術の研究開発を行っている。現在はその中の、電磁波による生体内非侵襲計測技術の研究に注力している。この技術は、超短波帯等の微弱な電磁波を、接近させた小型アンテナ間で送受信する際、アンテナの近くに水分など、比誘電率の高い物質があるとその影響で電界強度が変化する現象を応用して、生体内の誘電率や水分の分布の計測を行うものである。試作、実験、改良による測定用アンテナの最適化、計算機シミュレーション等を行って、医療・福祉分野における実用装置開発に道筋をつけるのが本補助金による研究の目的である。平成19年度においては、検出可能なファントムの最小径の確認、最適測定周波数、二次元画像構築について実験的に検討した。まず、異なるいくつかの直径の円筒形水槽を用いて測定実験を行った。その結果直接測定結果から読み取れる最小径は26mmであった。しかし、より小さい直径の水槽においてもスカート曲線が変化するので、検出できる可能が示された。次に、14、30と54MHzの三種類の周波数で、円筒形水槽の測定を行った。周波数の違いから、結果への顕著な違いは認められなかった。2次元画像構築については、二つの角形水槽の測定結果に対して、デジタルフィルター技術を適用して、もとの水槽の断面により近い画像の構築を試みた。フィルターを工夫することで、二つの水槽が分かれている画像が構築できた。本年度の研究により、今後の応用研究に必要な測定限界、周波数との関係に関する基礎データが得られ、また、二次元画像構築の可能性、問題点などが示された。初年度である平成18年度(7か月間)においては、まず、二次元画像化のための計算処理について、シリンダー状の水槽を用いて測定を行い、二次元画像の再構築のために必要なフィルターの形式、前処理、画像化処理について工夫した。従来行っている別の方法と同品質の画像が得られた。また、周波数の違いによる測定結果への影響について検討するため、これまで用いていた50MHz帯よりも低い周波数である2から30MHzにて測定実験を行った。その結果、概ね14から30MHzにおいては、従来の50MHzと比較して、波長の違いほど解像度に差が出ないことが明らかになった。これは、アンテナ間隔、アンテナと被検体との距離が波長よりも著しく短いためと考えられる。今後の実験では、生体への浸透性、感度を主眼に条件を設定することが重要であるとの指針が得られた。

フィルターを工夫することで、二つの水槽が分かれている画像が構築できた。本年度の研究により、今後の応用研究に必要な測定限界、周波数との関係に関する基礎データが得られ、また、二次元画像構築の可能性、問題点などが示された。
メニーコア時代に向けた高速・高精度固有値計算アルゴリズムの開発

本課題では,メニーコアプロセッサの性能を引き出す固有値計算アルゴリズムの開発を目的として研究を行った.本研究の主な成果は次の通りである.(1)マルチコア/メニーコア向け固有値計算アルゴリズムの実装と性能評価(3)高い並列性を持つベクトル逐次添加型直交化アルゴリズムの開発本課題では,メニーコアプロセッサの性能を引き出す固有値計算アルゴリズムの開発を目的として研究を行った.本研究の主な成果は次の通りである.(1)マルチコア/メニーコア向け固有値計算アルゴリズムの実装と性能評価(3)高い並列性を持つベクトル逐次添加型直交化アルゴリズムの開発本年度は次の2つの項目について研究を行った。(1)マルチコアプロセッサ向け固有値計算アルゴリズムの実装と性能評価メニーコア向けアルゴリズムの準備として、48個のコアを有するマルチコアプロセッサ向けに、対称密行列固有値計算のアルコリズムを実装し、性能評価を行った。本アルゴリズムは演算のほとんどをlevel-3 BLAS(行列乗算)で行うことができるため、マルチコアプロセッサにおけるメモリアクセス競合の影響を受けにくく、従来のアルゴリズムに比べて性能向上を達成しやすいと予想される。Intel Xeonを搭載した8コアサーバ、及びAMD Opteronを搭載した6コアサーバで評価の結果、本アルゴリズムは従来のLAPACKに比べて最大2倍の性能を達成できることが示された。一方、コア数を増やした場合に、前処理に当たる帯行列化の部分が性能ネックになることも判明し、今後コア数を増やした場合の課題が明らかとなった。(2)AllReduce型ハウスホルダーQR分解法の誤差解析Level-3nLAS型の対称密行列固有値計算では、QR分解が計算の部品として重要な役割を果たす。このQR分解は、精度の観点から、ハウスホルダー法を用いて行う必要があるが、従来のハウスホルダー法は並列粒度が小さく、コア数を増やした場合の性能ネックになることが予想されている。これに対し、2007年にAllReduce型と呼ばれる新しい大粒度のハワスホルターQR分解の手法が提案されている。そこで、この手法に対して理論誤差解析を行った。その結果、この手法は従来のハウスホルダーQR分解と同等以上の精度を持つことを明らかにした。今後は、この手法を対称密行列固有値計算のプログラムに組み込む予定である。本年度は次の2つの項目について研究を行った。(1)帯ヘッセンベルグ行列向けの高精度固有値計算アルゴリズムの開発メニーコア向けの固有値計算アルゴリズムでは,入力の密行列をまず帯行列に変換するため,帯行列の固有値計算法が重要である。本年度は,帯行列の特殊な場合である帯ヘッセンベルグ行列に対する固有値計算法を開発した。本手法は,行列がtotally nonnegtiveという性質を持つ場合には必ず収束し,かつ,全固有値を小さい相対誤差で計算できるという特徴を持つ。また,本手法の収束を加速するための原点シフトの導入法も提案した。今後,本手法を一般の帯行列に対して拡張する予定である。(2)高い並列性を持つベクトル逐次添加型直交化アルゴリズムの開発逆反復法による固有ベクトルの計算では,固有値が密集する場合,固有ベクトルの直交化という処理が必要である。また,最新のMR3アルゴリズムにおいても,固有値間の相対ギャップが小さい場合には,直交化が必要になることがある。これらの直交化は,従来,修正グラム・シュミット法を用いて行われてきたが,直交精度が十分でなく,また計算が逐次的であるという問題点があった。これに対して本研究では,コンパクトWY表現という技法を用いることにより,高い直交精度を持ち,かつ並列化可能な直交化手法を開発した。また,本手法を逆反復法による固有ベクトル計算に適用し,有効性を確認した。(1)ブロックヤコビ法に基づく固有値解法の超並列化行列の固有値問題に対する並列アルゴリズムは数多く提案されている。しかし、既存のアルゴリズムの多くは大規模問題をターゲットとしており、小規模問題で超並列計算機を活用することは想定していない。一方、分子軌道法や第一原理分子動力学法などでは、1万元程度の比較的小さい固有値問題を超高速に解きたいという需要が存在する。このような問題に対して、ブロックヤコビ法の適用を検討した。ブロックヤコビ法は、密行列に対して直接に対角化のための反復計算を行う手法であり、計算量は多いが、演算パターンが単純で通信が大粒度であるという特徴を持つ。本研究では、2次元行列分割を用いたブロックヤコビ法について性能モデルを作成し、弱スケーラビリティの意味で優れた並列性能を持つことを明らかにした。また、スーパーコンピュータ「京」上での性能評価により、このことを確認した。(2)符号付き最小特異値に基づく非線形固有値問題の解法非線形固有値問題A(λ)=0は、電子状態計算や流体力学の安定性解析など多くの分野で重要な問題である。本研究では、大規模疎行列を係数とする非線形固有値問題に対する数値解法を開発した。非線形固有値問題の固有値λは、行列A(λ)を特異にするλの値として特徴付けられる。したがって、A(λ)を定数行列と見たとき、その最小特異値が0になるようなλを求めればよい。しかし、特異値は通常、非負の実数として定義されるため、A(λ)の最小特異値はλに対して滑らかでない関数となり、その零点を求めるのが容易でない。そこで本研究では、λに関して滑らかな関数となる符号付き特異値を導入した。

この量を使ってA(λ)が特異となるようなλを求めることで、非線形固有値問題が効率的に解けることを数値実験により確認した。24年度が最終年度であるため、記入しない。
グリア系フィラメントの新たな役割-歯根膜における存在意義-

Glial fibrillary acid protein(GFAP)はグリア系中間径フィラメントの一つで、これまで中枢神経系の星状膠細胞に特異的な細胞骨格性のタンパクと考えられてきた。しかしながら、このGFAPが星状膠細胞以外にも、腸管神経系のシュワン細胞、神経切断後の終末シュワン細胞、培養シュワン細胞といった末梢神経系のグリア細胞に発現することが知られてきた。本研究では歯根膜におけるGFAPの出現を免疫細胞化学、免疫電顕法、RT-PCR法、Westem Blotting法を用いて検討した。得られた成果は以下の通りである。1.歯根膜では終末前領域の神経線維にGFAPの免疫活性が観察されたが、終末部では免疫活性を欠いていた。2.歯根膜終末前領域のシュワン細胞がGFAP陽性を示した。3. Westem blottingでも、三叉神経節に明瞭なGFAPの陽性反応が観察された。4.三叉神経節および歯根膜組織から抽出したtotal RNAを対象とした合成オリゴヌクレオチドプローベを用いたRT-PCR法でも、明瞭なGFAPのmRNAが観察された。これらの結果は、GFAPが中枢神経系のグリアばかりでなく、末梢神経系のシュワン細胞ならびに軸索に含まれていることを示している。また、GFAPが終末前領域の軸索に含まれていることから、このタンパクが神経線維の支持、補強に関与していることが示唆された。以上の結果を論文としてまとめ、現在投稿準備中である。なお、これら一連の研究の遂行に、本研究補助金により購入した画像解析用パーソナルコンピューターが活用された。
小孔形成レクチンを基盤とした細胞傷害能を有する新規機能性分子の構築

本研究では、小孔形成能を有するレクチンであるCEL-IIIを基盤分子として、ガン細胞除去などの応用が考えられる新規細胞傷害性機能性分子を創出することを目的にCEL-IIIの小孔形成能の制御系の構築、およびCEL-IIIのガン細胞傷害性について調査した。H29年度までに小孔形成能制御のためのCEL-IIIへのSS結合の導入による還元剤活性型CEL-IIIの作製を試み、6つのCEL-III変異体(I10C/S348C、Y155C/S328C、W286C/T329C、I330C/S350C、E331C/S350C、V341C/V345C)の発現系を構築した。H30年度では、それらの変異体のうち還元剤存在下でのみ溶血活性を発現し、活性の制御が可能なCEL-III変異体E331C/S350Cについて還元剤に対する特徴づけとガン細胞に対する活性の調査を行なった。まず、還元剤に対する影響を調べたところ、50%の溶血に必要な還元剤濃度は、ジチオトレイトール(DTT)とβ-メルカプトエタノール(β-ME)が同程度に低く、ついでL-システイン塩酸塩(L-Cys)、還元型グルタチオン(GSH)の順であった。同じ還元剤濃度で溶血速度を比較したところβ-ME>DTT>L-Cys>GSHの順で速かった。DTTやβ-MEは細胞の増殖等に影響を与えるため、次にGSHの存在下、非存在下で4種のガン細胞(U937、K562、MOLT-4、HeLa)に対するCEL-IIIおよび変異体E331C/S350Cの影響を調査した。すると、CEL-IIIはU937以外のガン細胞の増殖を抑制すること、および変異体E331C/S350CはGSH非存在下ではガン細胞の増殖を抑制しないが、GSH存在下ではその増殖を有意に抑制することが明らかになり、還元剤によりその活性の制御が可能なガン細胞傷害性機能性分子の構築を行うことができた。本研究では、小孔形成能を有するレクチンであるCEL-IIIを基盤分子として、ガン細胞除去などの応用が考えられる新規細胞傷害性機能性分子を創出することを目的に、1)CEL-IIIの小孔形成能の制御系の構築、2)ランダム変異等の導入によるCEL-IIIの糖結合特異性の改変、および、3)1と2を組み合わせた新規なガン細胞特異的傷害性CEL-III分子の創出を行う。今年度は、まず上記1)の小孔形成能制御のために、CEL-IIIへのジスルフィド(SS)結合の導入による還元剤(GSH)活性型CEL-IIIの作製を試みた。分子モデリングの結果から、CEL-IIIの糖認識ドメイン(CRD)と小孔形成ドメイン(PFD)間にCys残基を導入した変異体(I10C/S348C及びY155C/VS328C)、及びPFD中の2つのα-ヘリックス間にCys残基を導入した変異体(W286C/T329C、I330C/VS350C、E331C/VS350C及びV341C/V345C)の発現系を構築した。変異体タンパク質の発現、精製を試みたが、一部の変異体については発現量が少なかったので、十分量が精製された変異体について、GSHの存在、非存在下で溶血活性を測定した結果、GSH非存在下でも、ある程度の溶血活性を保持していることが明らかになった。次に上記2)糖特異性の改変については、CRD1のアミノ酸残基をランダムに変異したCRD1ライブラリーの作製を試みた。まず、特定アミノ酸残基にランダム変異が導入されたロングプライマーを用いてPCRで遺伝子を増幅し、これをファージディスプレイ用ベクターに連結して大腸菌に導入した。これまでに、サイズとして、10万ほどのライブラリーが構築できたので、各種ガン化細胞株(U937、他)を用いて、ガン化細胞株特異的なCRD1変異体のスクリーニングを行う予定である。研究内容1)の小孔形成能制御のために、CEL-IIIへのジスルフィド(SS)結合の導入による還元剤(GSH)活性型CEL-IIIの作製を試みたが、タンパク質の発現量が少なかったため、一部の変異体については、GSH存在、非存在下における測定が行えず、また、測定できた変異体についても、GSH非存在下において、ある程度の活性を保持していることが明らかになった。このことから1箇所のSS結合の導入では、溶血活性の制御が行えない可能性が示唆されており、今後、複数のSS結合の導入を行う必要があると思われる。上記2)糖特異性の改変については、これまでのところ順調に計画が進んでいる。H28年度は、上記1)の小孔形成能制御のためのCEL-IIIへのSS結合の導入による還元剤活性型CEL-IIIの作製を試みたが、効果的な制御作用を示す変異体を得ることができなかったので、H29年度はその変異体作製を継続した。

6つのCEL-III変異体(I10C/S348C、Y155C/S328C、W286C/T329C、I330C/S350C、E331C/S350C、V341C/V345C)の発現系を構築し、蛋白質発現・精製を行い、還元剤の存在、非存在下で溶血活性を測定した結果、いくつかの変異体では還元剤非存在下において溶血活性を示さず赤血球凝集活性のみを示し、更に還元剤存在下では1つの変異体(E331C/S350C)で溶血活性を示したことにより、CEL-IIIの小孔形成能を制御できる変異体を得ることができた。次に上記2)糖特異性の改変については、作成したファージライブラリーを使用して、ガン化細胞株(U937)を用いて、ガン化細胞株特異的なCRD1変異体のスクリーニングを行った結果、1種類のクローンを得ることができ、その構造的特徴について解析した。研究内容1)の小孔形成能制御のために、CEL-IIIへのジスルフィド(SS)結合の導入による還元剤活性型CEL-IIIの作製を試み、1種類の変異体が還元剤による制御作用が可能な変異体として機能しうることが示された。しかし、制御に必要な還元剤濃度については、より詳細な検討が必要であり、場合によっては、より効果的な制御機構の導入のために、E331C/S350C変異体を中心にした詳細な変異体解析の必要性が考えられる。上記2)糖特異性の改変については、昨年度作成したファージライブラリーの配列にミスが見つかり、新しくライブラリーの構築も行ったため、スクリーニングと塩基配列の解析が遅れ、上記1)との組み合わせによる傷害性CEL-III分子の構築まで、至らなかった。本研究では、小孔形成能を有するレクチンであるCEL-IIIを基盤分子として、ガン細胞除去などの応用が考えられる新規細胞傷害性機能性分子を創出することを目的にCEL-IIIの小孔形成能の制御系の構築、およびCEL-IIIのガン細胞傷害性について調査した。H29年度までに小孔形成能制御のためのCEL-IIIへのSS結合の導入による還元剤活性型CEL-IIIの作製を試み、6つのCEL-III変異体(I10C/S348C、Y155C/S328C、W286C/T329C、I330C/S350C、E331C/S350C、V341C/V345C)の発現系を構築した。H30年度では、それらの変異体のうち還元剤存在下でのみ溶血活性を発現し、活性の制御が可能なCEL-III変異体E331C/S350Cについて還元剤に対する特徴づけとガン細胞に対する活性の調査を行なった。まず、還元剤に対する影響を調べたところ、50%の溶血に必要な還元剤濃度は、ジチオトレイトール(DTT)とβ-メルカプトエタノール(β-ME)が同程度に低く、ついでL-システイン塩酸塩(L-Cys)、還元型グルタチオン(GSH)の順であった。同じ還元剤濃度で溶血速度を比較したところβ-ME>DTT>L-Cys>GSHの順で速かった。DTTやβ-MEは細胞の増殖等に影響を与えるため、次にGSHの存在下、非存在下で4種のガン細胞(U937、K562、MOLT-4、HeLa)に対するCEL-IIIおよび変異体E331C/S350Cの影響を調査した。すると、CEL-IIIはU937以外のガン細胞の増殖を抑制すること、および変異体E331C/S350CはGSH非存在下ではガン細胞の増殖を抑制しないが、GSH存在下ではその増殖を有意に抑制することが明らかになり、還元剤によりその活性の制御が可能なガン細胞傷害性機能性分子の構築を行うことができた。
ユニークな基質特異性を持つアシル基転移酵素の構造機能解析

マクロラクタム抗生物質ビセニスタチン生合成において、アシル基転移酵素VinKはアシル運搬タンパク質間のジペプチド基質の受け渡し反応を触媒する。その際VinKはアシル運搬タンパク質をタンパク質間相互作用により認識していると考えられる。本研究では、独自に開発したクロスリンク法を用いることによりVinKとアシル運搬タンパク質の複合体の結晶構造を決定することに成功した。これにより、アシル基転移酵素によるアシル運搬タンパク質の認識機構が初めて原子レベルで明らかになった。また、部位特異的変異解析を行うことにより、ジペプチド基質の認識機構に関しても知見を得た。マクロラクタム抗生物質ビセニスタチンの生合成において、アシル基転移酵素VinKは、ジペプチジル基をアシルキャリアタンパク質(ACP)であるVinLから、ポリケタイド合成酵素上のACPドメイン(VinP1LdACP)へと受け渡す反応を触媒する。このアシル基転移反応において、VinKはジペプチジル基部位に加えて、VinLとVinP1LdACPの2種類のACPをタンパク質間相互作用により認識していると考えられる。本年度はVinKのACP認識機構を明らかにすべく、VinKとACPの複合体の結晶構造解析を試みた。まず、VinKとACPを混合して結晶化を行ったが、共結晶を得ることはできなかった。VinKとこれらのACP間の相互作用が一時的で弱く、安定な複合体を形成しないことが原因と考えられた。そこで、クロスリンク反応により、VinKとVinL間、VinKとVinP1LdACP間がそれぞれ共有結合でつながった安定な複合体を調製した。次に、これらの結晶化を行った結果、VinK-VinL複合体の結晶が得られたので、放射光施設にてX線回折データを収集し、VinK-VinL複合体のX線結晶構造を決定した。決定した複合体結晶構造において、VinKのArg153、Met206、Arg299の3つのアミノ酸残基が静電的相互作用と疎水的相互作用によりVinLを認識していた。これらの3つの残基を変異させ、等温滴定型カロリメトリー測定を行ったところ、いずれの変異体においてもVinLとの結合親和性が顕著に減少したことから、決定した複合体結晶構造の妥当性が裏付けられた。また、これらの変異体ではアシル基転移活性も減少したことから、タンパク質間相互作用とアシル基転移活性は相関していることも明らかになった。当初の目的であるVinK-VinL複合体の結晶構造解析に成功し、VinKとVinL間のタンパク質間相互作用を明らかにすることができたため。本研究成果はポリケタイド化合物生合成に関わるアシル基転移酵素とACP間のタンパク質間相互作用を原子分解能で明らかにした初めての例であり、Proc. Natl. Acad. Sci. USA誌に掲載された。マクロラクタム抗生物質ビセニスタチン生合成において、開始基質である3-アミノイソブタン酸ユニットはアラニル化されジペプチド体となった後、アシル基転移酵素VinKによってポリケタイド合成酵素上のアシルキャリアータンパク質(ACP)ドメインへと受け渡される。このアラニル基は最終生成物には含まれず、ポリケタイド伸長反応中の非酵素的な環化反応を防ぐ役割をしていると考えられる。この非酵素的な環化反応を防ぐために、VinKはアラニル化されたジペプチド体を選択的にポリケタイド合成酵素に受け渡す必要があると考えられる。実際に、VinKは3-アミノイソブタン酸の転移活性は低いのに対し、3-アミノイソブタン酸のアミノ基がアラニル化されたジペプチド体の転移活性は高いことから末端のアラニル基を認識していると考えられる。このようなジペプチド選択性は既知のアシル基転移酵素には見られない性質であり、ジペプチド認識機構に興味が持たれた。本年度はVinKのジペプチド認識機構を明らかにすべく、VinKとジペプチド体アナログの複合体の結晶構造解析を試みた。しかし、共結晶を得ることはできなかった。そこで、ドッキング解析結果に基づき、ジペプチド末端のアラニル基と相互作用すると考えられたアミノ酸残基の変異体を作製し、アシル基転移活性を測定した。その結果、Glu109とSer266の変異体では転移活性が低下したことから、これらの残基がアラニル基の認識に関わっていると考えられた。VinKのジペプチジル基認識機構を明らかにするべく、ジペプチジル体との共結晶化を試みる。また、ジペプチジル基認識に関わると予想されるアミノ酸残基の変異体を作製し、ジペプチジル基転移活性が変化するかを調べる。他のポリケタイド化合物生合成に関わるアシル基転移酵素とACP間のタンパク質間相互作用についても結晶構造解析や変異体解析などの方法により調査する。

農学VinKのジペプチジル基認識機構の解析とACP認識機構の解析を同時に進めることを計画していたが、予想以上に早くVinK-VinL複合体の結晶構造解析に成功したため、初年度はACP認識機構の解明に重点を置き、研究を進めた。これに伴って、必要経費についても変更が生じ、その結果として、次年度への研究費繰り越しが生じた。次年度は、結晶構造解析、変異体酵素の作製と解析などに取り組む予定であり、研究費の大半は試薬やキット類など消耗品購入のための物品費に充てる。また、学会への参加と成果報告を予定しており、研究費の一部を旅費に充てる予定である。