hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
エネルギーダイナミクスからみた超臨界水の特異性の解明

その結果、チタンサファイアレーザーの二倍波(388nm)で励起し、基本波(776nm)でプローブするシステムにおいて、時間分解能およそ300fsで、蛍光寿命が5ns以上の分子に対しても十分なS/Nで時間分解蛍光スペクトルを測定できるシステムを構築した。この光学システムに高温高圧セルを組み込み、予備実験として常温常圧下のメタノール中でのクマリン153の蛍光ダイナミックストークスシフトを測定することに成功した。さらに、三倍波発生システムを新たに構築し、三倍波励起でペリレン/シクロヘキサン系で蛍光スペクトルの時間変化の測定をおこなったところ、初期過程において顕著なスペクトル形状変化を見出した。今後、スペクトル形状と振動余剰エネルギーとの関連付けを行い、超臨界水や超臨界シクロヘキサン中での実験を進める予定である。一方で、振動エネルギー緩和をエネルギーの受け手から測定するアプローチとして、超臨界流体中でのアズレン分子に対する過渡回折格子法による測定を行い、溶質溶媒のエネルギー移動における機構を検討した。また、超臨界水中の分子の溶媒和の相補的なデータを得るため、パラニトロアニリンの超臨界水中における振動構造を共鳴ラマンスペクトルにより評価することに成功した。その結果、溶媒分子とつよくカップリングするニトロ基の振動数に、特徴的な密度変化が見られることが明らかとなった。類以の化合物であるN,N-ジメチル-p-ニトロアニリンにおいては、共鳴波長によって振動スペクトルが変化する現象を見出した。同様の測定を超臨界水と対比されるイオン液体に対してもおこない、ラマン分光法で見られる振動数の揺らぎが、特徴的な溶媒依存性を示すことを明らかにした。今年度は水素結合性の超臨界流体である超臨界メタノール中でのペリレンの振動緩和過程を光カーゲート法による時間分解蛍光測定により評価した。まず、ペリレンの蛍光スペクトル形状の振動余剰エネルギー依存性を調べるために、衝突頻度のすくない気相蒸気において、ナノ秒のレーザーを用いて種々の励起波長で蛍光スペクトルを測定した。その結果、スペクトル形状はアズレンやナフタレンの場合と同様、振動余剰エネルギーが大きいほどスペクトル構造がなくなる傾向を示した。一方、光カーゲート法で、540Kの温度条件で種々の圧力でのメタノール中でのペリレンの時間分解蛍光スペクトルを測定した。光励起後の初期過程におけるスペクトルの形状変化を気相での振動余剰エネルギー依存性と対応させることにより、種々の圧力条件下での振動緩和速度を決定することに成功した。その結果、換算密度0.7から2.1程度の領域において振動緩和速度の密度依存性は非常に小さく、常温常圧での緩和速度と比較して5倍程度遅くなっていることがあきらかとなった。これは、溶媒分子間の水素結合数の変化と類似の傾向である。同様の実験を超臨界シクロヘキサン、超臨界水で試みたが、分解等の問題により現時点では成功していない。また、超臨界水や超臨界アルコール中での溶媒和に振動スペクトルの観点から検討を加えた。
様々な栄養状態における細胞内のタンパク質分解システムの新たな分子機構の解明

アミノ酸プールには通常タンパク質の生合成に必要なアミノ酸量の1/4があり、飢餓時にアミノ酸プールの恒常性を維持するには活発にタンパク質を分解してアミノ酸を供給する必要があり、この分解を担う系がオートファジー・リソソーム系である。しかし、近年、ユビキチン・プロテアソーム系もこの分解系に関与していることが示されているが、その分子機構はほとんど明確でない。本研究では、主なアミノ酸供給源である骨格筋ではなく、肝臓と脳に着目し、栄養応答とストレス応答の両観点からプロテアソームの発現・機能、その分子構成・動態及びそれらを制御調節しているシグナル伝達系の同定を動物などを用いて解析を行う。
脂質代謝調節因子 Lipin1 の制御による肥満解消への戦略

脂質代謝調節因子Lipin1の機能を制御する新たな因子を同定するために、プロテオミクスの手法を用いて解析した。その結果、解糖系に関わる因子、ユビキチン-プロテアソームに関わる因子、プロリンの生合成関わる因子がLipin1と相互作用していた。次にユビキチン-プロテアソーム関連因子に着目し、この因子とLipin1の詳細な分子機構を解析した。その結果、Lipin1タンパク質の安定性はユビキチン-プロテアソーム関連因子によって制御されていた。Lipin1は、生体内において脂質代謝の恒常性を維持するのに重要な因子である。具体的には細胞質においてトリグリセリド生合成する酵素として機能する一方、核内においは転写共役因子として脂肪酸酸化関連遺伝子の転写を調節している。これらLipin1の2つの機能はどのような機構で制御されているのかほとんどわかっていない。本研究では、プロテオミクスの手法を用いてLipin1と相互作用する因子を同定することで、Lipin1がもつ2つの脂質代謝機能の新たな制御メカニズムを解明することを目的とした。前年度までにLipin1と共沈したタンパク質複合体をLC-MS/MSを用いて解析し、Lipin1と相互作用する候補タンパク質を得た。本年度はこれら候補タンパク質とLipin1との相互作用が実際に細胞内で行われているか否かを共発現による免疫沈降法で調べた。その結果、解糖系に関わる因子、ユビキチンープロテアソームに関わる因子、プロリンの生合成に関わる因子がLipin1と相互作用していた。次にユビキチンープロテアソーム関連因子に着目し、この因子とLipin1が相互作用する詳細な分子機構の解析を行ったところ、この因子とLipin1タンパク質が結合する部位を同定できた。また、Lipin1タンパク質はユビキチンープロテアソーム関連因子と相互作用することにより、ポリユビキチン化されることがわかった。最後にヒト肝癌由来細胞株とプロテアソーム阻害剤を用いて、内在性のLipin1タンパク質の安定性を調べたところ、Lipin1がプロテアソームにより調節されていることを解明した。これらのことからLipin1は、今回新たに見出したユビキチンープロテアソーム関連因子と相互作用することによりLipin1タンパク質の安定性を制御しており、この分子機構を介して細胞内の代謝機能を調節していることが予想された。最初にエピトープタグの1つであるV5タグを融合させたLipin1発現プラスミドを作製した。次に作製した発現プラスミドをヒト子宮頸癌HeLa細胞にリポフェクション法で導入し、細胞全抽出液を調製した。そして、調製した細胞全抽出液と抗V5抗体を用いて免疫沈降後、得られたサンプルを用いてWestern Blottingと銀染色を行った。その結果、Lipin1およびそれと共沈した複合体と予測されるバンドが確認できた。そこで、このサンプルを用いてLC-MS/MS解析を行ったところ、核と細胞質のシャトルタンパク質やアポトーシスの際にDNA断片化に関わるタンパク質などLipin1と相互作用が報告されていない数十個のタンパク質を見出すことができた。これらの解析結果のうち、コントロールと十分な差があると考えられる7個のタンパク質についてのcDNAクローニングを行った。現在、Lipin1と相互作用する候補タンパク質とLipin1が実際に相互作用するか免疫沈降法を用いて確認している。本研究の目的は、Lipin1の特徴である2つの機能、すなわちトリグリセリド生合成と脂肪酸酸化についての制御メカニズムを解明することで、肥満症に対する治療戦略を提唱することである。この目的を達成するために本研究では、Lipin1をターゲットとした免疫沈降法とLC-MS/MSを組み合わせたプロテオミクス解析を使い、Lipin1相互作用因子を探索・同定を行う。当初の予定では、ヒト肝癌由来FLC4細胞を用いて免疫沈降を行う予定であったが、FLC4細胞で解析したところLipin1タンパク質と相互作用している因子が少なかった。これはFLC4細胞中にLipin1タンパク質を十分量発現させることができなかったことに起因すると考えられる。そこで、プラスミドの導入効率が高い細胞であるヒト子宮頸癌HeLa細胞に変更し同様な検討を行ったところ、Lipin1と共沈する複数のタンパク質を得ることができた。その後、プロテオミクスの手法を用いて、Lipin1相互作用因子の候補を見出すことができ、今年度予定していた計画を達成できた。

また今年度の研究では、次年度に予定していた相互作用因子のcDNAクローニングもすでに完了しており、当初の計画以上に本研究は進展している。次年度では研究計画書通りに、LC-MS/MSで探索した因子とLipin1との関係性を明らかにし、これら因子がLipin1のもつ機能にどのような影響を与えるかを調べていく。具合的にはLipin1の相互作用因子の候補として着目した因子とLipin1が実際に相互作用をしているか否かについて調べるために、細胞中にLipin1とその候補因子を共発現させ、免疫沈降法により解析する。次にLipin1との相互作用が確認できた因子について、Lipin1の細胞内局在に与える影響をWestern Blotting法や免疫蛍光染色法により解析する。さらにLipin1とその相互作用因子が結合することにより、Lipin1のもつ2つの機能にどのような影響を及ぼすか調べる。これらの解析を通じて、Lipin1を基盤とした肥満治療に向けた新たな予防・治療法を提唱したいと考えている。本研究を遂行するにあたり、遺伝子工学、培養用試薬・器具等を必要とするため、それぞれの購入にあてることにする。また本研究の成果を発表するために学会出張経費、ならびに本研究の推進に必要な調査・情報収集のための出張旅費に使用する。
ヒト神経芽腫のTRKを介するシグナル伝達系の解析

1.NBのTRK-Aを介するシグナル伝達系の解析:1)NB株(n=4)では種々の段階でNGFのシグナル伝達が遮断されており、核内(c-fos)までシグナルが伝達されるNB株は少ない。2)臨床NB組織(n=24)を用いたNGFのシグナル伝達では、早期病期(病期1と2)ではで13/14例(93%)でNGFのシグナルが伝達される。3)一方、進行病期(病期3と4)では6/10例(60%)でシグナルが伝達され、早期病期症例に比較してNGFのシグナル伝達が遮断されにくいことが判明した。2.NBのTRK-Bを介するシグナル伝達系の解析:2)シグナル伝達の解析では、BDNF、NT-3とNT-4/5により、TRK-B、Shc、ERK-1とERK-2などのシグナルが伝達蛋白のチロシン燐酸化が起こり、さらに核内(c-fos)までシグナルが伝達されることが判明した。3)以上より、TRK-Bを介するシグナル伝達は、少なくともShcとMAP kinaseを介して、核内に伝達されることが判明した。以上、NBでのTRK-ATとRK-B受容体とそれらのシグナル伝達の解析は、NBの予後を解明するのに役立つと考えられた。現在まで、下記の神経芽腫(NB)の増殖と分化に果たす神経栄養因子の役割を検討した。(1) NB細胞株(予後不良の患児より樹立)(n=20)と(2)NB腫瘍組織(n=20)で、TRK-AとTRK-B受容体の発現をNorthern法とRT-PCR法で検討した。2.神経栄養因子、TRK family受容体と細胞シグナル伝達:(1) NB細胞株を神経栄養因子で処理し、TRK-AとTRK-B受容体の発現の変化をRNAと蛋白レベルで検討した。(3)神経栄養因子のTRK-AとTRK-B受容体を介するシグナル伝達が、細胞核内に伝達されるか否かを初期遺伝子(c-fos)の発現(Norther法)で検討した。(4)予後良好のNB腫瘍組織の初代培養細胞で、神経栄養因子のTRK family受容体を介する細胞シグナル伝達を検討した。その結果、予後良好群(腫瘍組織)と不良群(細胞株)でのNB細胞のTRK family受容体を介する細胞シグナル伝達系の相違点が明らかとなった。以上の結果、次の2点が明らかになった。(1)NBでのNGFまたはBDNFのシグナルは、TRK-AまたはTRK-B、Shc、ERK-1、ERK-2のチロシン燐酸化を介する経路で伝達される。(2)TRK-AはNBの分化に、TRK-Bは増殖に関係している。1.NBのTRKーAを介するシグナル伝達系の解析:1)NB株(n=4)では種々の段階でNGFのシグナル伝達が遮断されており、核内(c-fos)までシグナルが伝達されるNB株は少ない。2.NBのTRKーBを介するシグナル伝達系の解析:2)シグナル伝達の解析では、BDNF、NTー3とNT-4/5により、TRKーB、Shc、ERK-1とERK-2などのシグナル伝達蛋白のチロシン燐酸化が起こり、さらに核内(c-fos)までシグナルが伝達されることが判明した。
高齢者の咀嚼能力検査システムの開発

研究の目的:咀嚼機能の評価法の一つとしての咀嚼能力測定法には,咀嚼能率を求める篩分法やアンケート法など様々な方法が用いられてきたが,前者は被検食品の物性,測定方法の煩雑さ,正確さに問題があり,後者は客観的評価が出来ないという欠点を抱えている.我々は人工試料カプセルを用いた咀嚼能力のエネルギー表示法(Nakashima at al : J Oral Rehabil 16:373-380,1989)に注目した.しかし同試料は有歯顎には有効である事を確認したが,咀嚼力の小さい義歯装着者や高齢者では測定困難であった.同方法は,ゴムカプセル内に封入された色素内包顆粒が外力により破壊され漏出し,この濃淡を吸光度計で測定し,これをエネルギー値に置換し咀嚼粉砕能力として表示する仕組みになっており,その回収率も100%と正確である.我々はカプセルの硬度,弾性,大きさ等を改良し,健康な高齢者のみならず,障害高齢者をも含めたすべての対象者に適応出来る人工試料カプセルの開発を目標とした.結果:11年,12年の基礎実験で高齢者用カプセルは基本カプセルに比べて色素顆粒のグラノ測定硬度を約1/2(487.3)に、さらにゴムカプセルの厚さも薄くして(0.34±0.02mm)弱い咀嚼力の高齢者にも適用できるように,直径×長さ(1mm×20mm)の桿状形状に決定した.さらに基礎実験で人工試料カプセルのエネルギー変換式は以下のように求めた.有歯顎用カプセルY=0.1206X,高齢者用カプセルY=0.0655X(X:吸光度値Y:エネルギー変換値(joule))13年度は同カプセルを用いて,咀嚼能率測定のための有歯顎者で咀嚼回数の決定を行いさらに,附属病院受診の65歳以上の総義歯使用ボランティアの咀嚼能力を高齢者用カプセルと篩分法で測定し両者の相関を明らかにした.またカプセルが高齢者の咀嚼能力測定に適したテキスチャーであるかどうかの主観的評価をアンケート法により確認した.以上の一連の研究から我々が開発した高齢者用咀嚼機能測定カプセルの臨床有効性が示唆された.咀嚼機能の評価法の一つとしての咀嚼能力測定法には,古くから篩分法など様々な方法が用いられてきたが,いずれも被検食品の物性,測定方法の煩雑さ,不正確さなどの問題をかかえている.我々は中島の人工試料カプセルを用いた咀嚼能力のエネルギー表示法{ゴムカプセル内に封入された色素内包顆粒が外力で破壊され漏出した色素濃淡を分光光度計にて測定し,咀嚼粉砕能力をエネルギーで表示する方法で,その回収率も100%と正確である}(1989J Oral Rehabil 16;373-380)に注目したが,同試料は有歯顎には有効であることを確認したが咀嚼力の小さい義歯装着者や高齢者には測定困難であった.そこで我々はカプセルの硬度,弾性,大きさ等を改良し,障害高齢者を含めた義歯使用の対象者の咀嚼能力測定に適応出来る人工試料カプセルの開発を目標とし試作した.有歯顎用の基本カプセルに対し以下の条件でテストカプセル製造依頼した.1.色素内包顆粒の条件⇒最大限軟性になるように調合されたコーティング剤を造粒した食用赤色色素にコーテイングした顆粒(軟性顆粒),顆粒硬度=基本顆粒硬度960.4の約1/22.ゴム製カプセル条件⇒最大限薄くしたもの(基本ゴム厚み0.54±0.02mm)今後各カプセルの基本テストを行い,義歯用に最も適した性状,形態カプセルを決定する.研究の目的:咀嚼機能の評価法の一つとしての咀嚼能力測定法には,咀嚼能率を求める篩分法やアンケート法など様々な方法が用いられてきたが,前者は被検食品の物性,測定方法の煩雑さ,正確さに問題があり,後者は客観的評価が出来ないという欠点を抱えている.我々は人工試料カプセルを用いた咀嚼能力のエネルギー表示法(Nakashima at al : J Oral Rehabil 16:373-380,1989)に注目した.しかし同試料は有歯顎には有効である事を確認したが,咀嚼力の小さい義歯装着者や高齢者では測定困難であった.同方法は,ゴムカプセル内に封入された色素内包顆粒が外力により破壊され漏出し,この濃淡を吸光度計で測定し,これをエネルギー値に置換し咀嚼粉砕能力として表示する仕組みになっており,その回収率も100%と正確である.我々はカプセルの硬度,弾性,大きさ等を改良し,健康な高齢者のみならず,障害高齢者をも含めたすべての対象者に適応出来る人工試料カプセルの開発を目標とした.

結果:11年,12年の基礎実験で高齢者用カプセルは基本カプセルに比べて色素顆粒のグラノ測定硬度を約1/2(487.3)に、さらにゴムカプセルの厚さも薄くして(0.34±0.02mm)弱い咀嚼力の高齢者にも適用できるように,直径×長さ(1mm×20mm)の桿状形状に決定した.さらに基礎実験で人工試料カプセルのエネルギー変換式は以下のように求めた.有歯顎用カプセルY=0.1206X,高齢者用カプセルY=0.0655X(X:吸光度値Y:エネルギー変換値(joule))13年度は同カプセルを用いて,咀嚼能率測定のための有歯顎者で咀嚼回数の決定を行いさらに,附属病院受診の65歳以上の総義歯使用ボランティアの咀嚼能力を高齢者用カプセルと篩分法で測定し両者の相関を明らかにした.またカプセルが高齢者の咀嚼能力測定に適したテキスチャーであるかどうかの主観的評価をアンケート法により確認した.以上の一連の研究から我々が開発した高齢者用咀嚼機能測定カプセルの臨床有効性が示唆された.咀嚼機能の評価法の一つとしての咀嚼能力測定法には,古くから篩分法など様々な方法が用いられてきたが,いずれも被検食品の物性,測定方法の煩雑さ,不正確さなどの問題をかかえている.我々は中島の人工試料カプセルを用いた咀嚼能力のエネルギー表示法{ゴムカプセル内に封入された色素内包顆粒が外力で破壊され漏出した色素濃淡を分光光度計にて測定し,咀嚼粉砕能力をエネルギーで表示する方法で,その回収率も100%と正確である}(1989 J Oral Rehabil 16;373-380)に注目したが,同試料は有歯顎には有効であることを確認したが,咀嚼力の小さい義歯装着者や高齢者には測定困難であった.そこで我々はカプセルの硬度,弾性,大きさ等を改良し,障害高齢者を含めた義歯使用の対象者の咀嚼能力測定に適応出来る人工試料カプセルの開発を目標とした.A高齢者用カプセル構成の試作有歯顎用の基本カプセルに対し以下の条件でテストカプセル製造を依頼した.1.色素内包顆粒の条件⇒最大限軟性になるように調合されたコーテイング剤を造粒した食用赤色色素にコーテイングした顆粒(軟性顆粒).顆粒硬度=基本顆粒硬度960.4の約1/22.ゴム製カプセル条件⇒最大限薄くしたもの(基本ゴム厚み0.54±0.02mm)Bカプセルの基礎テスト1.各カプセルの基本テストを行い,義歯用に最も適した性状,形態カプセルを決定した.2.吸光度とエネルギーの関係を求めた.100g700gの7種類の顆粒重量(x mg)を破壊した時の吸光度との関係から,顆粒1個を破壊するために必要なエネルギー(y Joule)を決定y=x/1顆粒の重量×1顆粒破壊エネルギー今後実際に高齢者の咀嚼能力をにカプセルを用いて測定し,その臨床有効性の検討を行う予定である.研究の目的:咀嚼機能の評価法の一つとしての咀嚼能力測定法には,咀嚼能率を求める篩分法やアンケート法など様々な方法が用いられてきたが,前者は被検食品の物性,測定方法の煩雑さ,正確さに問題があり,後者は客観的評価が出来ないという欠点を抱えている.我々は人工試料カプセルを用いた咀嚼能力のエネルギー表示法(Nakashima at al : J Oral Rehabil 16:373-380,1989)に注目した.しかし同試料は有歯顎には有効である事を確認したが,咀嚼力の小さい義歯装着者や高齢者では測定困難であった.同方法は,ゴムカプセル内に封入された色素内包顆粒が外力により破壊され漏出し,この濃淡を吸光度計で測定し,これをエネルギー値に置換し咀嚼粉砕能力として表示する仕組みになっており,その回収率も100%と正確である.我々はカプセルの硬度,弾性,大きさ等を改良し,健康な高齢者のみならず,障害高齢者をも含めたすべての対象者に適応出来る人工試料カプセルの開発を目標とした.結果:11年,12年の基礎実験で高齢者用カプセルは基本カプセルに比べて色素顆粒のグラノ測定硬度を約1/2(487.3)に、さらにゴムカプセルの厚さも薄くして(0.34±0.02mm)弱い咀嚼力の高齢者にも適用できるように,直径×長さ(10mm×20mm)の桿状形状に決定した.
パーソナルヘルスケア安心安全用フェムトグラム高感度MEMSベースピエゾ振動子の研究開発

安全安心は国民にとって重要な課題であり、健康産業はこれからの重要な産業と期待される。本研究では健康管理モニタリング用のキーコンポーネントである微小高感度センサを開発する。これらセンサは持ち運びが可能で、犬の鼻程度の感度を持ち、火薬や毒物の検査、あるいは人体の発する臭いから健康管理を行う用途に利用可能であり、国民の安全安心、健康の向上にとって有用な技術と期待される。しかし、このようなセンサは高感度化のために問題点がある。振動型センサを利用する場合には損失が問題となる。振動のQ値(共振の鋭さの度合い)が大気中では大きく取れず、真空中以外では高感度計測が困難になる。上下に振動するための空気抵抗、付け根からの振動エネルギーの逃げ、材料の内部摩擦である。これらを避けるために、本研究開発ではディスク型の振動子を採用する。ディスク振動子はワイングラスの振動と同様にディスクの2次元方向のゆがみ振動であるために、上下振動が少なく、振動の節を固定子とすれば、上記の振動が極限まで抑えられ、大気中でも極めて高感度のにおいセンサを開発できる。本研究開発ではマイクロマシニングを利用し、超小型で高感度なセンシングシステムを試作し、実験的に開発を進めた。におい分子の計測によるヘルスケアシステムを開発している。フェムトグラムオーダーの高感度な振動型MEMSセンサの開発を行っている。振動型センサにおいては振動の鋭さを示すQ値がセンサ感度を決定する。振動子に分子が吸着すると振動数が変化することにより、吸着分子の質量を計測する。今回はピエゾ素子で振動を行い、ピエゾ電流を計測することにより、におい分子をセンシングするカンチレバー型マイクロセンサチップを試作した。振動子のQ値を低下させる要因としては、振動中の空気によるダンピング、支持部分からのネネルギ損失(サポートロス)、内部摩擦に基づく損失、各材料層の界面での損失等々である。空気によるダンピングは大気圧に近づくほど大きくなる。デバイスが小さくなるとエアダンピングやサポートロスは小さくなるが、内部摩擦等は大きくなる。またピエゾ膜等で複合化された構造では、界面でのロスがエアダンピングと同程度になることを確認した。カンチレバー型センサチップに加えて、ディスク型振動子についても検討を行った。ディスク型チップはカンチレバー型のように上下方向の振動を起こさないために、エアダンピングの影響が極めて小さく、大気中でも高感度センシングがおこなえる。ピエゾ駆動を利用したディスク振動子を制作した。有限要素解析を利用し、振動の節の部分をサポート部分と一致させることにより、極力サポートロスが少なくなるようにデバイスを設計した。同時にPZT圧電材料部分での界面での損失が最小となるように駆動部分の設計を行い、デバイスの試作を行った。ピエゾ材料のドライエッチングについても検討を行った。通常行われるArの物理エッチングはエッチング速度が低いために、SF6との混合ガスによるエッチングを行い、最適化を行った。またエッチング時における表面の損傷等についてAFMを利用して評価を行った。最適なエッチング条件下において、圧電特性等の劣化は見られなかった。
計算創薬技術を用いたマクロライド骨格を持つ新規キチナーゼ阻害剤の構造最適化

天然由来のキチナーゼ阻害剤argifinの環状ペプチド骨格をマクロライド骨格で置換することで得られた新規キチナーゼ阻害剤と霊菌由来のキチナーゼBの結合様式を、分子動力学シミュレーション、分子ドッキング計算、および自由エネルギー計算により解析した。さらに、得られた結合様式に基づいて、より強い阻害活性が期待できる誘導体の分子設計を行った。本年度は、我々が最近得たマクロライド骨格を持つ新規キチナーゼ阻害剤と霊菌のキチナーゼB(ChiB)の相互作用解析を行うための準備として、以下の内容の研究を行った。1ドッキング計算に用いる鍵穴構造の準備:先ず、ChiBと環状ペプチド性キチナーゼ阻害剤Argifinの複合体X線結晶構造(PDB:1HOI)を用いて、水溶液中でのMDシミュレーションを1700ps行なった。次に、初期構造からの座標に関するRMSDをプロットすることで、後半1000psのRMSDの値がほぼ一定であり、MDシミュレーションが平衡に達していることを確認した。そこで、後半1000psの溶液構造アンサンブル(全200スナップショット)について、触媒部位周辺のアミノ酸残基(全32個)の座標に関するクラスタリング解析を行った。その結果、890psと1505psの二つのスナップショットが代表溶液構造として選択された。最後に、この2つの代表溶液構造から、水分子とArgifinを取り除くことで、ドッキング計算に用いる鍵穴構造を用意した。2マクロライド骨格を持つ新規キチナーゼ阻害剤の立体配座解析:ドッキング計算は、通常、マクロライド骨格のような環状骨格についての柔軟性を計算中に考慮することができない。そのため、環状骨格については、ドッキング計算前に立体配座解析を行う必要がある。そこで、当研究室の自動配座解析プログラムCAMDASを用いて、新規キチナーゼ阻害剤の立体配座解析を行った。その結果、環状骨格の構造が異なる全部で746個の立体配座集団を得た。今後は、本年度得られた鍵穴構造と新規キチナーゼ阻害剤の立体配座集団を用いてドッキング計算を行う予定である。本年度は、計算化学手法により、我々が最近得たマクロライド骨格を持つ新規キチナーゼ阻害剤と霊菌のキチナーゼB(ChiB)の結合様式を解析した。先ず、昨年度行った立体配座解析により得られた新規キチナーゼ阻害剤の配座集団を用いて、ChiBの代表鍵穴構造に対するドッキング計算を行った。次に、評価関数Glidescoreを用いて上位ドッキングポーズを選択した。続いて、MM-PBSA法を用いて上位ドッキング複合体構造の自由エネルギー計算を行い、最も低い自由エネルギー値を与えたドッキング複合体構造を結合様式モデルとして選択した。最後に、結合様式モデルの周りにあらわな水分子を発生させてエネルギー極小化計算を行うことで、水分子を介した間接的な相互作用についても考察を行った。その結果、1.新規キチナーゼ阻害剤は、ChiBの4つのアミノ酸残基(D142、E144、Y214、およびD215)の側鎖と全部で5つの直接水素結合相互作用を形成しそうであること。2.新規キチナーゼ阻害剤が有する14員環マクロライド骨格は、ChiBのW97、F191、およびW220により形成される疎水性ポケットに収まり、そこで疎水相互作用を形成しそうであること。3.新規キチナーゼ阻害剤の5位と12位の炭素に存在する2つの水酸基とChiBのD215主鎖酸素原子およびD316側鎖酸素原子の間において、水分子を介した間接的な水素結合相互作用が存在しそうなこと。が示唆された。今後は、この得られた結合様式に基づいて、新規キチナーゼ阻害剤の構造最適化を行う予定である。マクロライド骨格を持つ新規キチナーゼ阻害剤Aのイン・シリコ構造最適化ここでは、平成22年度に得られた、マクロライド骨格を持つ新規キチナーゼ阻害剤Aと霊菌キチナーゼB(ChiB)の結合様式モデルに基づいて、阻害剤Aの構造最適化を行った。先ず、結合様式モデルを詳細に観察したところ、(1)阻害剤Aの11位の水酸基に疎水性アルキル鎖を付加した誘導体は、chiBのF190、F191、およびL265と新たな疎水性相互作用、及びvan der Waals相互作用を形成できそうなこと、(2)阻害剤Aの5位の水酸基は水分子を介してChiBのD316と水素結合相互作用をしているので、その水酸基をエチルアルコールのような原子団で置き換えた誘導体は、水分子を介した水素結合相互作用を模倣できそうなこと、が示唆された。そこで、11位の水酸基をメトキシ基、イソプロポキシ基、およびイソブトキシ基で置換した誘導体(1)(3)、阻害剤Aの5位の水酸基をエチルアルコール、およびエチルアミンで置換した誘導体(4)、(5)を考案し、それぞれの誘導体とChiBの複合体モデル構造をコンピュータ上で作製した。MM-GBSA法を用いた精密結合自由エネルギー計算を行ったところ、誘導体(2)、および誘導体(5)の結合自由エネルギーが大きく改善されそうなことがわかった。

以上の結果より、阻害剤Aの11位の水酸基をイソプロポキシ基で置換し、かつ、5位の水酸基をエチルアミンで置換した誘導体が非常に有望そうであることがわかった。イン・シリコスクリーニングを利用した低分子量キチナーゼ阻害剤の探索ChiBのX線結晶構造に対するデータベース化合物の高速ドッキング計算を行うことで、低分子量キチナーゼ阻害剤BおよびCを同定することに成功した。以上の結果は、新規な抗真菌薬、殺虫剤、および喘息治療薬の開発に非常に有益な情報を与えることができると思われる。
肝癌のPIVKA-IIを標的としたIL-12遺伝子導入によるDNAワクチン療法

PIVAK-II蛋白に対するin vitroでの特異的免疫応答確立を目標としたが、非常に困難であった。そこで、新規分子標的を検討するため、Nodule in nodule型肝癌より、肉眼的に分化度の異なる部分からそれぞれRNAを抽出し、DNAマイクロアレイで包括的に遺伝子解析をした所、低分化型の部分で、Fibroblast growth factor receptor 2(FGF-R2)が高分化型の部分より、32倍の発現強度がある事が判明した。そこで、肝癌46切除例に対してFGF-R2の免疫組織化学染色を施行した所、門脈浸潤部など癌浸潤部で強く染色され、FGF-R2陽性群が有意に予後不良であった。この結果を持って、現在論文執筆中である。FGF-R2は肝癌に対する免疫治療を含めた分子標的となる可能性がある。IL-12遺伝子治療を基盤とするDNAワクチン治療に関しては、PIVKA-IIに対する特異的免疫応答の確立が困難と判断したため、Dedritic cell(DC)局注によるIL-12遺伝子治療の増強効果を検討した。マウス皮下肝癌モデルにおいて、DCの腫瘍内局注を追加することにより、エレクトロポレーション法によるIL-12遺伝子治療による腫瘍増殖抑制効果だけではなく、肺や肝などへの遠隔転移抑制効果の増強を認めた。この結果を持って論文執筆中である。IL-12遺伝子治療を基盤として、DCの局注を追加する事で、強力なDNAワクチン治療を実現できる可能性がある。1.肝癌特異的免疫誘導に関する新規蛋白の同定(1)樹状細胞(Dedritic cells : DC)抽出系の確立:マウス(C3H/HEN)骨髄細胞からのDC抽出系を確立した。Flowcytometryを用いて、MHCclassI・CDllb・CD80・CD40・CD86の発現を認め、CD4・CD8・Gr1の発現を認めない細胞集団(成熟したDC)の抽出に成功した。次にヒト末梢血からこの細胞集団が抽出可能か検討し、PIVKA-II蛋白を7-9merに切断(数百パターン)して抗原提示が速やかに行われる部位を検討する。(2)Nodule in nodule型肝癌を用いた包括的遺伝子・蛋白解析による新規癌抗原の検討(1)Nodule in nodule型肝癌における癌化・分化誘導規定因子の解析:Nodule in nodule型肝癌と肝癌移植例(全肝摘出)より、同一個体内で分化の異なる癌部(正常部・高分化部・中分化部・低分化部)のRNA抽出3例に成功した。現在、DNAマイクロアレイを用いた包括的遺伝子解析を開始したところであるが、一定の見解を得るにはもう少し時間が欲しい。2.マウスモデルにおける上記肝癌特異抗原を用いた新規DNAワクチン治療の検討マウスモデルにおける肝癌モデルおよび遺伝子導入実験系は既に確立しており、上記実験結果が整理され次第移行可能である。
遠距離介護を可能にする地域ケアシステムについての研究

今年は、「遠距離介護とコミュニティの関連」を明らかにする研究計画の最終年次にあたり、特に山口市内に居住し、別居子を持つ高齢者に対する聞き取り調査をおこなった。そのなかから、地域の人的資源(近隣住民とのつながり)に生きがいを見いだしながらも、別居家族(特に子ども)に精神的な拠り所を求めている老親の姿が明らかになった。これまで、遠距離介護に関するインタビュー調査の傾向として、遠距離介護をおこなっている別居子に対する調査が中心であった。そこで、本研究において、別居子を持ちながら、地域で生活を続ける高齢者へのインタビュー調査が実施できたことは、遠距離介護を多角的に考えるうえで、非常に意義のあるものとなった。そして、初年度の別居子に対する質問紙調査と、次年度の遠距離介護を実践している別居子へのインタビュー調査、さらに今年度の老親へのインタビュー調査の結果から、老親の住む地域が遠距離介護支援のためにできることと、望ましいサービス体制、並びに地域が遠距離介護支援に取り組むことのメリットなどを明らかにした。本研究によって達成した、老親の住む地域における遠距離介護支援の望ましいあり方とその必要性についての認識を基盤として、今後は、別居子のワーク・ライフ・バランスと遠距離介護との関係に焦点をあてる。そして、地域における遠距離介護支援が別居子のワーク・ライフ・バランスにどう影響するのかという分析をおこない、超高齢社会における労働政策と地域福祉政策を考察していきたい。遠距離介護と地域ケア資源との関連を明らかにするため、本年度は別居子への質問紙調査を実施した。調査項目の設計にあたっては、遠距離介護の支援をおこなっているNPOによって実施された「遠距離介護の実態調査」および、遠距離介護に関する文献や家族社会学の領域における先行研究を参考にした。また、本研究の独自性でもある「地域ケア資源との関わり」については、別居子ゆえの心理的負担や利用サービスと同時に緊急時の対応についても質問項目を設けた。調査対象として、老親(山口県在住)と別居しており、同時に親の身辺について不安を感じる年代(40-60歳)の人々を選定する必要があったため、山口七夕会(関東在住の山口県出身者の会)と山口大学経済学部同窓会の関東支部の協力を得て、909通の調査票を送付した。これに対して292通の有効回答が得られ、現在データ入力を進めている。当初の計画通り、統計分析は来年度に入り次第実施し、その成果について、学会報告と雑誌への論文発表をおこなう。さらに、来年度に予定している「聞き取り調査」への協力者を求める項目を調査票に設けたところ、予想以上の協力者を得ることができた。これにより質的調査(遠距離介護実践中の親子、もしくは遠距離介護経験のある子が対象)の実現が可能となった。また、質的調査の分析方法としては「グラウンデッドセオリーアプローチ」を想定しており、方法論についての文献研究も並行しておこなった。既存の調査、文献研究から得られた知見のうち重視するのは、地域に求められる遠距離介護支援サービスとして「緊急時の老親の安否確認」が重要であるという点である。この点について、山口市への聞き取り調査をおこない、緊急通報システムの構築推移や利用実績を確認した。民間企業による安否確認機器の開発・販売も増加する中、サービスを誰が(契約者は誰か)利用するのか、また、サービス利用は別居子および老親の安心のために役立つのか、という視点を持つことの重要性を認識した。来年度は、本年度の研究において把握できた緊急時の老親の安否確認をトータルにおこなっている団体に対する追加的な聞き取り調査を実施し、質問紙調査の結果と併せて、質的調査の実施へとつなげる。別居子による老親ケアの実態と地域ケア体制との関連を明らかにするために平成17年度に実施した質問紙調査のデータ分析をおこなった。その結果、別居子の抱える問題として、日頃生活をともにしていないがゆえに、老親の体調の変化や日常生活の様子を把握できないことへの不安と、同時に、突発的な老親の心身状況の変化に対応できないことへの不安の大きさが明らかになった。しかしその一方で、不安を解消する拠り所としての選択肢は少なく、地域にある福祉資源(近隣住民や福祉サービスなど)よりも血縁(老親の近くに住むきょうだいなど)に頼っているという実態がみえてきた。また、将来、老親の介護が必要になったときの対応として、遠距離介護を選択するか否かについては別居子のきょうだい関係が影響を与えていることがわかった。これは、要介護高齢者の身体介護を丸抱えできないという遠距離介護の特質ゆえに、自分の他に老親のケアに携わることのできる担い手が確保できる場合に、遠距離介護が選択される傾向にあると指摘できる。この質問紙調査の結果から、これまで別居子による老親支援という視点をとりいれてこなかった地域福祉のあり方を問い直し、遠距離介護を支援することは、高齢者にとっては「生活の質(Quality of Life)」の向上につながり、地域福祉にとっては地域の枠を越えた福祉資源の掘り起こしになるという指摘をおこなった。さらに、実際に遠距離介護を実践する8名の別居子に対して、2006年10月中旬から11月上旬にかけて合計約16時間に及ぶ聞き取り調査を実施した。そのなかで、別居子が遠距離介護を実践するに至る経緯及び、仕事と遠距離介護との両立に焦点を絞ってインタビューをおこなった。また、遠距離介護を支援する日本で唯一のNPO法人への聞き取り調査も実施し、設立の経緯及びサービスの実施について明らかにした。

そのなかから、地域の人的資源(近隣住民とのつながり)に生きがいを見いだしながらも、別居家族(特に子ども)に精神的な拠り所を求めている老親の姿が明らかになった。これまで、遠距離介護に関するインタビュー調査の傾向として、遠距離介護をおこなっている別居子に対する調査が中心であった。そこで、本研究において、別居子を持ちながら、地域で生活を続ける高齢者へのインタビュー調査が実施できたことは、遠距離介護を多角的に考えるうえで、非常に意義のあるものとなった。そして、初年度の別居子に対する質問紙調査と、次年度の遠距離介護を実践している別居子へのインタビュー調査、さらに今年度の老親へのインタビュー調査の結果から、老親の住む地域が遠距離介護支援のためにできることと、望ましいサービス体制、並びに地域が遠距離介護支援に取り組むことのメリットなどを明らかにした。本研究によって達成した、老親の住む地域における遠距離介護支援の望ましいあり方とその必要性についての認識を基盤として、今後は、別居子のワーク・ライフ・バランスと遠距離介護との関係に焦点をあてる。そして、地域における遠距離介護支援が別居子のワーク・ライフ・バランスにどう影響するのかという分析をおこない、超高齢社会における労働政策と地域福祉政策を考察していきたい。
胸部CT画像における経時的サブトラクションを用いたコンピュータ支援診断

本研究の目的は,胸部マルチスライスCT画像における病巣の経時変化を強調することが可能な経時的サブトラクション画像の手法を開発し,結節状陰影の検出を目的としたコンピュータ支援診断(CAD)に応用することである.本研究に関する平成18年度の研究実績の概要は次の通り.1.アーチファクトの少ない経時的サブトラクションアルゴリズムの開発昨年度に開発したアルゴリズムを基に主に次の改良を行った.1)昨年度までは,ローカルマッチングで得られたシフトベクトルに対してElastic matchingを適用していたが,グローバルマッチングとローカルマッチングから得られた合成シフトベクトルに対してElastic matchingを適用することで,グローバルマッチングでの誤差を修正することが可能となった.2)シフトベクトルに対応した変形過去CT画像の各ボクセル値に対して,現在CT画像とのボクセルマッチングを行った.本研究で新たに開発したボクセルマッチングとは,変形過去CT画像の注目ボクセルに対応する現在CT画像の近傍領域から,最も類似したボクセル値を探索し,その注目ボクセルのボクセル値を置き換える処理である.ボクセルマッチングにより,拍動の影響などで,肺血管の1ボクセル程度のずれも整合させることが可能となり,極めてアーチファクトの少ない経時的サブトラクションCT画像が得られ,結節状陰影などの経時変化が大きく強調されるようになった.2.画像データベースに含まれている結節状陰影の経時変化を有する20症例に本手法を適用して,ヒストグラム分析によるアーチファクトの評価を行ったところ,全症例に対してボクセルマッチングの大きな効果が確認された.3.アーチファクトが極めて少ない差分画像が得られるために,単純なしきい値処理だけで,新たに出現した結節状陰影の検出が可能となり,CADへの応用が強く示唆された.本研究の目的は,ボリュームデータを持つ胸部マルチスライスCT画像に対する経時的サブトラクションの手法を開発し,結節状陰影の検出を目的としたコンピュータ支援診断(CAD)に適用することである.本研究に関する平成17年度の研究実績の概要は次の通り.1.胸部マルチスライスCT画像に対応する経時的サブトラクションアルゴリズムの開発ボリュームデータを持つ胸部マルチスライスCT画像に対応する経時的サブトラクションの手法を開発した.マルチスライスCT画像に対するグローバルマッチングおよび局所的なローカルマッチングを伴う非線形画像変形(ワーピング)において,3次元的な画像処理技術を用いた,特に,過去および現在CT画像におけるVOI間のテンプレートマッチング法で得られたすべてのローカルシフトベクトルに対して,Elastic matchingによる非線形補間を試み,線形補間法と比較した.その結果,この手法を適用すると,アーチファクトの少ないサブトラクションCT画像が得られて,新しく出現した結節状陰影が強調されることが示された.2.コンピュータによる結節状陰影の検出アルゴリズムの開発サブトラクションCT画像を対象として,結節状陰影の検出を目的としたコンピュータ支援診断アルゴリズム開発の予備的研究を行った.本格的なアルゴリズムの開発は,平成18年度に行う予定である.3.胸部マルチスライスCT画像を含むデータベースの構築本研究のために,4列の検出器を持つマルチスライスCTスキャナーで撮影されたCT画像を含む画像データベースを構築した.データベースに含まれる症例数は20症例で,それぞれ過去および現在のCT画像で構成されている(8症例の現在CT画像には結節状陰影が含まれる).平成18年度も,データベースの構築は継続する予定である.本研究の目的は,胸部マルチスライスCT画像における病巣の経時変化を強調することが可能な経時的サブトラクション画像の手法を開発し,結節状陰影の検出を目的としたコンピュータ支援診断(CAD)に応用することである.本研究に関する平成18年度の研究実績の概要は次の通り.1.アーチファクトの少ない経時的サブトラクションアルゴリズムの開発昨年度に開発したアルゴリズムを基に主に次の改良を行った.1)昨年度までは,ローカルマッチングで得られたシフトベクトルに対してElastic matchingを適用していたが,グローバルマッチングとローカルマッチングから得られた合成シフトベクトルに対してElastic matchingを適用することで,グローバルマッチングでの誤差を修正することが可能となった.2)シフトベクトルに対応した変形過去CT画像の各ボクセル値に対して,現在CT画像とのボクセルマッチングを行った.本研究で新たに開発したボクセルマッチングとは,変形過去CT画像の注目ボクセルに対応する現在CT画像の近傍領域から,最も類似したボクセル値を探索し,その注目ボクセルのボクセル値を置き換える処理である.ボクセルマッチングにより,拍動の影響などで,肺血管の1ボクセル程度のずれも整合させることが可能となり,極めてアーチファクトの少ない経時的サブトラクションCT画像が得られ,結節状陰影などの経時変化が大きく強調されるようになった.2.画像データベースに含まれている結節状陰影の経時変化を有する20症例に本手法を適用して,ヒストグラム分析によるアーチファクトの評価を行ったところ,全症例に対してボクセルマッチングの大きな効果が確認された.3.アーチファクトが極めて少ない差分画像が得られるために,単純なしきい値処理だけで,新たに出現した結節状陰影の検出が可能となり,CADへの応用が強く示唆された.
材料表面層の機械的特性の傾斜化による疲労抵抗機能の改善

塩浴窒化された一般構造用圧延鋼SS400とイオン窒化された低炭素鋼S15CKの疲労特性と疲労破壊機構が検討された。また、隙間部や孔部を適切にイオン窒化するための条件が検討され、その結果以下のことが明らかになった。(1)窒化処理されたSS400では、疲労き裂は化合物層と拡散層の剥離部から発生した後内部の拡散層へ伝ぱし、十分き裂が成長した後で表面の化合物層の脆性破壊が起こり最終破断にいたることが分かった。(2)窒化材の疲労強度は、窒化前に材料中に存在していた内部組織の影響を受け、転位組織を有する圧延材を窒化した方が焼鈍材を窒化したものよりも疲労強度が向上することが分かった。(3)窒化前に存していた転位組織は窒化処理過程で再編すること、またそれらの組織はさらに疲労によってセル組織へと変化することが分かった。(4)イオン窒化されたS15CKでは、窒化物は針状を呈し、疲労き裂はこれらの針状の窒化物から発生し、またそれらを連結しながら伝ぱして破壊にいたることが分かった。(5)隙間部や孔の周囲を適切に窒化するには、反応ガス中の窒素の比率やガス圧力を増加させることが有効であることが分かった。また、窒化の促進にはホローカソード法が有効であることが分かった。1.窒化処理した一般構造用圧延鋼SS400の疲労特性について転位組織的観察に基づいて研究を行った結果,最表層の化合物層には単位組織は全く形成されず,その下の拡散層では転位運動が抑制されることが分った。2.窒化により表面硬化されたローラは,無処理ローラに比べて,接触疲労寿命が著しく延びるが,その原因は,表面の化合物層内に疲労き裂が停留するためであることが明らかになった。3.イオン窒化した低炭素鋼S15CKでは,最表面の鉄窒化物を除去してもその疲労強度は変わらないこと,および疲労き裂は鉄窒化物と基材の境界部に沿って発生することが分った。1.2.25%の予歪を与えた後塩浴窒化したSS400の疲労強度は焼なまし材を窒化したものに比して疲労強度が向上し,内部組織が窒化効果を高めることが分った。2.イオン窒化処理による腐食疲労強度は低中炭素鋼では多少の改善が見られる程度であったが,共析鋼程度の高炭素鋼では相当の改善が見られた。また,低温度イオン窒化処理はステンレス鋼の腐食疲労強度の低下防止に有効なことが分った。3.塩浴窒化されたS45Cローラを用いて接触疲労試験を行った結果,化合物層に垂直に発生したき裂は拡散層には伝ぱせず,化合物層内に停留することが分った。また,化合物層を除去するとき裂は「油圧型」で伝ぱし,化合物層による強化機構が明らかになった。1。窒化前に材料中に存在していた転位組織は窒化処理によって再編すること,またこれらの再編した転位はN原子と強固に固着しており,このために窒化鋼の疲労強度が向上することが分った。2。ステンレス鋼の窒化の迅速化のために,ホローカソード放電を積極的に利用する迅速イオン窒化法を提案した。この方法では,適切な処理条件を選べば同じ厚さの硬化層を得るための窒化時間を1/2以下にすることが可能であった。3。塩沿窒化されたS45Cローラによる接触疲労試験を行い,すべり率を変化させてその影響を調べた。その結果,窒化層を持つ場合には,すべり率の影響は認められなかった。一方,窒化層を除去し,拡散層を表面とするローラでは,すべり率が正のローラ表面にのみき裂は発生し,すべり率の影響が認められた。
蝸牛線維細胞を標的としたBrn-4欠損マウスへの骨髄間葉系幹細胞移植

本研究では遺伝性難聴の新規細胞治療法の開発を目的として骨髄間葉系幹細胞の内耳への最適移植法を検討した。移植用幹細胞としてはC57BL/6マウス由来H1/A骨髄間葉系幹細胞(MSC)株にEGFP(緑色蛍光)またはHcRed(遠赤色蛍光)遺伝子を安定的に強度発現する細胞株を樹立した。同細胞をマウスへの経半規管外リンパ液還流法により内耳への移植を行った。移植手術前に蝸牛線維細胞に選択的障害を与える薬剤3-nitoropropionicacid (3NP)により移植前に軽微な炎症を惹起したところ、細胞導入効率が大幅に上昇した。更にこの誘導機構の解析により、ケモカインMCP1とその受容体CCR2による誘導機序が示されたため、CCR2遺伝子を内耳より単離し発現用プラスミドを構築した。これを移植細胞に導入したところ、細胞生着効率が飛躍的に向上した。これらの条件検討を推進することにより新規細胞治療法がBrn-4変異等による遺伝性難聴に対する更に効果の高い治療法として聴力改善につながると考えられる。本研究では蝸牛線維細胞を標的とした骨髄間葉系幹細胞移植の効果的な細胞導入法を開発するため以下の実験を行い、成果が得られている。移植用幹細胞の樹立成育医療センター研究所生殖医療研究部との共同研究により移植用骨髄間葉系幹細胞(MSC)を得た。まずC57BL/6マウス由来H1/A骨髄間葉系幹細胞株にEGFP遺伝子(緑色蛍光)をレトロウイルスにて発現させ、安定的に強度な蛍光を発する細胞を選抜クローニングした。さらにH1/Aより遠赤色光を発するHcRed発現細胞も同様の方法にて作成し二種類の移植用細胞を樹立した。幹細胞の経半規管移植後半規管および外側半規管に小孔をあけ、後半規管より2x10^5cellsを還流し、小孔の修復のためにMSCの無接着培養により作成した細胞塊(cell sphere)を小孔部に挿入することにより術後のリンパ液の漏出を抑えた。同方法により挿入された移植細胞塊は術後2週間においても半規管組織内において維持、さらには進展していることが確認されている。移植細胞の検出経半規管移植後の組織を抗GFP抗体での免疫蛍光染色により移植細胞の組織進入を解析したところ、前庭線維細胞組織内、蝸牛ラセン板縁組織内に移植細胞の生着を確認した。移植後の聴力を術後8週間までモニタリングしたが、手術による聴力低下は正常動物でも難聴モデルにおいても見られなかった。現在、細胞導入効率を向上させるためにRho活性化剤で細胞運動・浸潤を高めることが知られるLPA (Lysophosphatidic acid)を幹細胞と同時投与を行い、現在解析を行っている。本研究では蝸牛線維細胞を標的とした骨髄間葉系幹細胞移植の効果的な細胞導入法を開発することを目的とし以下の実験により良好な結果が得られている。移植用幹細胞の作製:移植用骨髄間葉系幹細胞(MSC)作製のため、C57BL/6マウス由来H1/A骨髄間葉系幹細胞株にEGFP遺伝子(緑色蛍光)をレトロウイルスにて発現させ、安定的に強度な蛍光を発する細胞を選抜クローニングした。更に成体内耳より新たに間葉系幹細胞様細胞を樹立しその分化能解析から有毛細胞の特異的マーカーMyo7aの発現と頂部にアクチン重合を伴う巨大繊毛を確認し、内耳有毛細胞様の細胞に分化することが明らかとなった。幹細胞の経半規管移植:後半規管および外側半規管に小孔をあけ、後半規管より2x10^5 cellsを還流した。Brn-4欠損マウスの作製:癌研究所(東京、有明)にて凍結保存したBrn-4欠損マウスの受精卵を順天堂大学動物施設にて融解し、C57BL/6J系統のレシピエントマウスに移植してBrn-4欠損マウスの個体を得た。これらの交配、遺伝子タイピングによる選抜により大量の同欠損マウスを作製中である。移植細胞の検出:経半規管移植後の組織をGFP蛍光検出により移植細胞の組織進入を解析し、前庭線維細胞組織内、蝸牛ラセン板縁組織内に移植細胞の生着を確認した。

更に蝸牛線維細胞に選択的障害を与える薬剤3-nitoropropionic acid (3NP)により移植前に軽微な炎症を惹起したところ、細胞導入効率が大幅に上昇した。更にこの誘導機構の解析により、ケモカインMCP1とその受容体CCR2による誘導機序が示唆されたため、CCR2遺伝子を内耳より単離し発現用プラスミドを構築した。これを移植細胞に導入したところ、細胞生着効率が飛躍的に向上した。これらの条件検討を推進することにより新規細胞治療法がBrn-4変異等による遺伝性難聴に対する更に効果の高い治療法として聴力改善につながると考えられる。