hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高分解能分子分光学的手法を活用した生体機能とくに情報伝達の機構の解明

ことに、Ar-(CH_3)_2O及びNe-(CH_3)_2O錯体に関してはinversion運動に加えて、メチル基内部回転運動によるスペクトル線分裂を観測・解析して、ポテンシャル障壁など有用な情報を引き出した。また、神奈川工科大学のFTMW分光器で測定され、かねてより解析を行ってきた1,1ジメチルシラシクロブタンの純回転スペクトルの研究に関する論文がJournal of Molecular Spectroscopy誌に発表の運びとなった。
メカノセンシンングによる４D血管形成の構成的解析

血管ネットワークは、体の隅々まで張り巡らされており、生命活動の根幹的な役割を担う。血管の高次機能やその破綻機構を明らかにするためには、血管形成の仕組みの理解が欠かせない。血管形成の仕組みは、おおむね次の3つのプロセスを経る。1まず、無秩序な構造の原始血管網が作られる。2次に「血管リモデリング」と呼ばれるダイナミックな形態変化が起こり、3結果として組織立った血管パターンが作られる。これら3つの過程のうち、とくに2の血管リモデリングの機構は、ほぼ未解明のまま残されている。本研究では血管リモデリングの理解に向けて、「血流刺激→細胞による感知と応答(細胞移動など)→血管再編成→血流の更なる変化」という、ミクロからマクロまでを繋ぐ一連のメカノセンシング機構を、構成的に解析することを目的としている。昨年度までに血流の局所的操作法の開発を進めてきた。モデル動物として用いているニワトリ胚は、初期発生の過程において血管形成やリモデリングが2次元平面上で進行するため、局所的な操作を高解像度で行うことができる。本年度は外来遺伝子の局所的なトランスフェクション法を、卵黄動脈をターゲットとして最適化した。そしてこれらの方法を用いて、内在性VEカドヘリン(Cdh5)を、心臓形成に影響を与えることなく、卵黄動脈特異的にShRNAーノックダウンする方法に成功した。従来の血管操作研究では、循環器系関連遺伝子のノックアウト/ノックダウンにより心臓形成が異常になり、その結果として血液循環が損なわれることによる二次的な影響としての血管形成不全が起こることから、血管形成や血管リモデリングを制御する遺伝子ネットワークの研究が困難であったが、我々が開発した局所的な血管遺伝子操作法により、遺伝子カスケードの詳細な解析基盤がほぼ整備された。二次平面血管構造を利用した遺伝子導入と、それによる遺伝子操作法の開発は順調に進んでいる。しかしながら、当初は今年度までに血管リモデリングを司る遺伝子カスケードの解析を計画していたことを考えると、進捗状況はやや遅れていると判断している。一方で、研究を進める段階で、当初は予期していなかった新しい現象を発見するなど、当初の計画をより有意義な研究へと修正しながら進めていることから、それに伴う方法論や顕微鏡の整備などを適宜導入している。具体的には、右側の血流操作によって、遠く離れた左側の血管形成が大きく影響をうけるという現象の観察などである。血流ー血管リモデリングに注目したこれらの研究から新しい萌芽が生まれている可能性があり、当初の計画に加えてこれらの萌芽も重要視していきたい。世界的にみてもほとんど類をみない「生体内の局所的な血管を、心臓に影響を与えることなく操作する」方法を開発できたことから、今後はこれらの方法を駆使してさまざまな候補分子を解析する予定である。特に、すでに開発している血流の局所的操作法と組み合わせることにより、1)血流が速いときには血管内皮細胞が血流に逆行して移動する、2)血流が遅いときには血管内皮細胞が血管壁から剥離する、という独自に見出した二つの現象に注目する。具体的には、候補遺伝子を導入してGOFやLOFさせたときに、先述の(1)や(2)の現象を阻害するようなものを探索する。これらの解析をとおして、血流刺激を感知する分子機構を理解し、そして血流が血管リモデリングを制御するしくみの解明へと向かいたい。本年度は、血流刺激と細胞による感知・応答との相関を知るために、血流の局所的操作法の開発を行った。モデル動物として用いたニワトリ胚は、初期発生の過程において血管形成やリモデリングが2次元平面上で進行するため、さまざまな実験的操作が可能である。そこで卵黄動脈のリモデリングに注目し、その血流を局所的に停めるために、右側背側大動脈内に粘度の高いグリセロールを注入したところ、右側の卵黄動脈のリモデリングに異常がみられた。これらのことから、血流刺激が血管内皮細胞によって感知されていることが確認された。グリセロール注入法に加えて、レーザーマイクロ照射による血流阻害法も試みている。また、血管内皮細胞が血流刺激をどのようなしくみで感知しているかについて、候補遺伝子群を探索中である。レーザーマイクロ照射による血流阻害法については、すでに先行研究として公表されているだめ、スムーズに行えると期待していた。しかしながら、論文に記載されている方法では、我々が目的としている高解像度の解析ができない可能性が浮上した。照射するターゲットの絞り込みが十分にできないことが考えられる。そこで、さらにターゲットを絞り込むためのよりミクロなレーザー照射装置の作製を余儀なくされた。

血管の高次機能やその破綻機構を明らかにするためには、血管形成の仕組みの理解が欠かせない。血管形成の仕組みは、おおむね次の3つのプロセスを経る。1まず、無秩序な構造の原始血管網が作られる。2次に「血管リモデリング」と呼ばれるダイナミックな形態変化が起こり、3結果として組織立った血管パターンが作られる。これら3つの過程のうち、とくに2の血管リモデリングの機構は、ほぼ未解明のまま残されている。本研究では血管リモデリングの理解に向けて、「血流刺激→細胞による感知と応答(細胞移動など)→血管再編成→血流の更なる変化」という、ミクロからマクロまでを繋ぐ一連のメカノセンシング機構を、構成的に解析することを目的としている。モデル動物として用いているニワトリ胚は、初期発生の過程において血管形成やリモデリングが2次元平面上で進行するため、さまざまな実験操作が可能である。そこで本年度は、血流刺激の細胞による感知・応答の分子機構の解明に向けて、血管のサブタイプ特異的な遺伝子導入効率の最適化を行った。トランスフェクション試薬(脂質)とDNAとの混合体を心臓に注入すると、血流にのって注入DNAが拡散することで、トリ胚のさまざまな血管内皮細胞に遺伝子導入が可能であることがわかった。なかでも卵黄動脈をターゲットとした遺伝子操作法の開発を集中的に進めたところ、DNA/脂質混合体の注入時期や注入場所(たとえば背側大動脈)を調節することで、遺伝子導入効率が大きく変化することがわかった。生体内における心臓・血管発生のしくみを利用した、新たな血管操作法の基盤を整備することができた。市販のトランスフェクション試薬を用いた血管内皮サブタイプ特異的な遺伝子操作法に関しては、これまで例がない。そこでこれらの研究成果を、研究コミュニティに広くかつ迅速に発信するために原著論文としてまとめるべく、入手可能な試薬を多種類購入して、それらを比較する必要があった。そのうちいくつかは、製造上の事情から納品時期が遅れるなど、計画が若干遅れた。加えて、血管内皮サブタイプ特異的な遺伝子操作にあたり、siRNA法の導入も試みたが、デザインしたsiRNAが期待通りの発現抑制効果を示さなかったことから、新たな配列を再設計する必要があるなど、予定よりも手間取る作業があった。血管ネットワークは、体の隅々まで張り巡らされており、生命活動の根幹的な役割を担う。昨年度までに血流の局所的操作法の開発を進めてきた。
顎機能異常者に付与すべき前方指導要素、特に水平面内における方向の検討

顎機能異常患者を治療する際に咬合を新たに付与する必要がある患者群が存在する。このような場合にはスプリント治療によって得られた咬合,顎位を参考にして治療を進めることが多いが,その治療は施行錯誤的であり,どのような顎位を与えるかについての明確な指針はまだない。この指針を得ることを目的として以下の検討を行った。東京医科歯科大学歯学部補綴科に受診している顎機能異常患者3名を被験者として,スプリントのアンテリアルガイダンスをレジンを添加することにより変化させ,スプリントの摩耗面の観察を経時的に行うとともに,下顎運動を測定し,スプリント装着時,非装着時の顆頭運動を解析した。その結果,スプリントのアンテリアルガイダンスをレジン添加によって変化させても時間の経過とともにスプリントが摩耗すると,その摩耗跡は患者個々である程度一定の傾向を示すことが明らかとなった。すなわち,水平面内での歯牙指導要素を一時的にレジンで変化させても,患者固有の顎運動を変化させることは難しいことが示唆された。しかし,今後,アンテリアルガイダンスを変化させる材料を金属のような摩耗性の低いものでの検討を行う必要がある。また,スプリント装着時と非装着時の顆頭運動の収束性を解析したところ,スプリント装着によって,下顎の側方運動時の顆頭運動の収束性が変化する傾向が認められた。すなわち,顎機能異常患者における新たな顎位付与において,顆頭運動の収束性を調べることが一つの指針になると考えられる。平成5年度は東京医科歯科大学歯学部付属病院補綴科に受診している顎機能異常患者を被験者として、スプリントの磨耗面の観察と機能時の下顎運動経路との比較をおこなう前段階としてスプリントの磨耗跡の有無、形状、方向性等について観察を行っている。その結果、被験者個々のスプリント磨耗跡には、方向性、形状等にある程度、規則性があることが示唆されている。被験者個々の下顎運動との関連についてはこれから検討を始める予定である。また、スプリント観察の過程において、被験者のブラキシズムが、消失してしまうなど、予期せぬことが観察された。通常スプリントを装着しても、スプリント上でブラキシズムを行っている場合が多く、どのような理由でブラキシズムが消失したかを検討する必要がある。平成6年度は東京医科歯科大学歯学部付属病院補綴科に受診している顎機能異常患者を被験者として、スプリントの摩耗面の観察と機能時の下顎運動経路との比較をおこなう前段階としてスプリントの摩耗跡の有無、形状、方向性等について観察を行っている。その結果、被験者個々のスプリント摩耗跡には、方向性、形状等にある程度、規則性があることが示唆されている。被験者個々の下顎運動との関連についても検討を始めている。また、スプリント観察の過程において、被験者のブラキシズムが、消失してしまった例が観察された。通常スプリントを装着しても、スプリント上でブラキシズムを行っている場合が多い。どのような理由でブラキシズムが消失したか咬合のみならず患者の日常生活など広い視野で検討する必要がある。平成7年度は東京医科歯科大学歯学部付属病院補綴科に受診している顎機能異常患者を被験者として、スプリントの磨耗面の観察と機能時の下顎運動経路との比較をおこなうためスプリントの磨耗跡の有無,形状,方向性等について観察を行っている.その結果,被験者個々のスプリント磨耗跡には,方向性,形状等にある程度,規則性があることが示唆された.被験者個々の下顎運動との関連については当教室で開発された赤外線発光ダイオードを評点とし2台のセルスポットカメラで解析写真測量学の計測原理を応用して,下顎の動態を測定する下顎運動測定システム(セルスポットシステム)を用いて測定を行ったが,装置の調子が思わしくないため,新たに当教室に配備された非接触型3次元6自由度下顎運動解析のためのコンピュータシステムである小野測器製JM-1000システムを用いて計測を新たに行っている.

このシステムは下顎運動経路,関節雑音,咬合音,筋電位を総合的に観察し,顎機能異常の鑑別診断,歯科治療における顎機能の客観的評価を目的に開発されたものである.
ヒトpericyte特異的マーカーの検討および病理診断学への応用

マウスの遺伝子解析と免疫組織化学的検討を行い、新規pericyteマーカーとしてmyosin 1B(MYO1B)を見出した。MYO1Bとh-CDを組み合わせると、ヒト皮膚の血管壁細胞はMYO1B+h-CD-(pericyte)、MYO1B+h-CD+(mural cells)、MYO1B-h-CD+(vSMC)に分類できた。ヒト皮膚perivascular tumorsの検討では、血管平滑筋腫はvSMCsの特徴を有する、グロームス腫瘍はpericyteとvSMCsの中間的特徴を有する、筋周皮腫には形態学的、免疫組織化学的に血管平滑筋腫に近い特徴を有するものがあることを見出した。10%ホルマリン固定・パラフィン包埋されたヒト病理検体に応用可能なpericyte特異マーカーを検討するために、まず16種類のタンパク質(αSMA、tropomyosin、PDGFRB、CD13、CD73、CD90、CD146、MYH9、desmin、NG2、RGS5、NGFR、KCNJ8、DLK1、CD248およびABCC9)に対する抗体を使用して、ヒト皮膚の免疫組織染色を行ったところ、どの抗体もpericyte特異的ではないことを証明した。そこで、新規のpericyteマーカーの検索を行うために、DsRedNG2トランスジェニックマウス(NG2はマウスにおけるpericyteのマーカー)の肺からpericyte-richであるlinnegNG2posCD146pos分画を、C57BL/6マウスの肺からfibroblast-richであるlinnegCD146negSca-1pos分画およびvascular smooth muscle cells (vSMCs)-richである大動脈を採取した。それらからRNAを抽出して、遺伝子プロファイルを比較し、定量PCR法で確認したところ、新規のpericyteマーカーの候補を複数見出した。そこで、10%ホルマリン固定・パラフィン包埋されたヒト皮膚の免疫組織染色を行い、myosin 1B(MYO1B)がpericyteに発現していたが、vSMCsとfibroblastsには発現していないことを証明した。さらに、MYO1Bが全身臓器のpericyteに発現していることを確認した。10%ホルマリン固定・パラフィン包埋ヒト皮膚材料において、MYO1Bと平滑筋マーカーであるhigh-molecular weight caldesmon(h-CD)を組み合わせることで、皮膚の血管壁細胞はMYO1B+ h-CD-であるpericyte、MYO1B+ h-CD+であるmural cellsおよびMYO1B- h-CD+であるvSMCに分類できることを見出した。平成26年度で、我々は新しいpericyteマーカーとしてMYO1Bを発見した。一方、DsRedNG2トランスジェニックマウス(元来のバックグランドはC57BL/6、SJLおよびFVBの混合状態)をC57BL/6マウスにバッククロスすることを以前より継続しており、この1年間にて16世代目から20世代目を完成し、腫瘍の移植に使用することが可能となった。以上のことから、おおむね順調に進展していると判断した。10%ホルマリン固定・パラフィン包埋ヒト病理検体に応用可能なpericyte特異マーカーを検討するためαSMA、PDGFRB、CD90など16種類の蛋白に対する抗体を用いてヒト皮膚の免疫染色を行い、どの抗体もpericyte特異的ではないことを証明した。新規pericyteマーカー検索のため、マウスpericyte、fibroblast、大動脈平滑筋細胞からRNAを抽出し、マイクロアレイによる遺伝子解析および免疫組織化学的検討を行ったところ、myosin 1B(MYO1B)がpericyteに発現していたが、血管平滑筋細胞(vSMCs)とfibroblastsには発現していないことを確認した。平成26年度において、pericyteマーカーとして我々が発見したMYO1Bは、腫瘍細胞におけるpericytic differentiationの検出に使用できることを証明した。また、DsRedNG2トランスジェニックマウス(元来のバックグランドはC57BL/6、SJLおよびFVBの混合状態)をC57BL/6マウスにバッククロスすることを以前より継続しており、この1年間にて12世代目から16世代目を完成し、腫瘍の移植に使用することが可能となった。主に鼻腔や副鼻腔に発生する腫瘍に、“glomangiopericytoma"と呼ばれる腫瘍がある(かつてはsinonasal typeのhemangiopericytomaとよばれていた)。電子顕微鏡による観察ではpericyteの特徴を有しているとの報告がある。皮膚のperivascular tumorの時と同様に、免疫組織化学的にMYO1Bとh-CDの発現を検討し、鼻腔の“glomangiopericytoma"の特徴を明らかにしたい。結果によっては、MYO1Bは鼻腔の“glomangiopericytoma"を診断する際の良いマーカーとなる可能性がある。DsRedNG2トランスジェニックマウス(元来のバックグランドはC57BL/6、SJLおよびFVBの混合状態)をC57BL/6マウスにバッククロスすることを約5年間行っており、現在までに20世代目を完成した(理論上、99.99%以上の遺伝子がC57BL/6由来である)。

そして、DsRedNG2/C57BL/6において、C57BL/6マウスから発生した細胞株化された腫瘍細胞(メラノーマB16や大腸癌colon 26など)の皮下graft(同種移植)を作製し、腫瘍の発達とそれに伴うNG2陽性pericyteを含む血管新生を、生体組織透明化技術などの最新技術を使用することで三次元的に可視化することをまずは目標とする。病理学2DsRedNG2トランスジェニックマウス(元来のバックグランドはC57BL/6、SJLおよびFVBの混合状態)をC57BL/6マウスにバッククロスすることを約4年間行っており、現在までに16世代目を完成した(理論上、99.99%以上の遺伝子がC57BL/6由来である)。
強力なLAK活性を有するLGL白血病細胞を用いたLAK機構の解析

LAK活性を有するLGL白血病細胞の表面は230KdのLH49抗原が存在して、これは、LAK活性のないLGL白血病細胞には見出されなかった。このLH49抗原は、健常人末梢血PBLの約30%に存在することがわかった。LH49のNK活性とLAK活性とのかかわりあいについては今後の検討を要する。本LGL白血病細胞はstimulatorcellと培養することによりLAKーCFを放出することがわかった。この活性は本細胞のcell tocellでみた細胞障害能と平行していた。さらに、LAKーCFとNKーCFはその標的細胞スペクトラムが異なっていることが判明した。この液性因子は分子量20Kdであった。しかしイオン交換クロマトグラフィーの結果から、本活性物質の構成は均一物質ではないことが判明した。p55Tac IL-2レセプターはT細胞がILー2や抗原などの刺激を受けるとその表面に出現することが知られている。しかし、もともとILー2レセプターの検出されない健常人PBLやLGL白血病細胞がILー2刺激でなぜLAK化するかは興味のもたれる点であった。我々は、ヨード化ILー2を化学的に細胞膜と架橋する方法を用いてLGL白血病細胞表面にp75の第2のILー2レセプターが存在することを見出した。(1)LAK細胞の癌さい法認識機構の解明-LAKに特異学クローン抗体の作製-LAK活性を有する本白血病細胞を抗原として単クローン抗体を作成した. 152個の陽性クローンについてスクリーニングを行なった結果分子量120kdのLH10を分子量240kdの抗原を認識するLH49が得られた.これらの抗体は本血病細胞特異であり,他のT細胞性白血病細胞とは調べるかぎり反応せず健常人抹消血リンパ球の18-25%と反応する. LH49と従来より知られているNKH-1とは分子量で近似しているが,本細胞がもともとNKH-1抗原が陰性のところから異なった抗原であると考えられる.これらはLGL亜分画を認識する新しい単クローン抗体であることが示唆される.(2)LAK細胞由来細胞障害因子(LAKCF)の同定.本白血病細胞由来しAKFを従来知られているNKCFと比較したところ次下の特異性が見出された.すなわち,標的細胞をK562にとるかぎりLAKCFとNKCFの間での増殖阻害脳に差異は見られなかった.しかし標的細胞をRaji細胞にとると, LAKCFはNKCFより硬度な障害脳に見られる為現在さらなる精製検出方法を鋭意検討中である.(3)LGL白血病表面にTac抗原とは異なる第2のIL-2のIL-2レセプター(IL-2R), P75の検出.この白血病の細胞障害能はIL-2刺激で量的質的に拡大し,増殖も見られたが従来IL-2Rと考えられたTacは見出されなかった.私達はchuricel crosslinking法を用いてP55Tacとは異なる新しいIL-2R, P75が白血病細胞表面に存在することを見出した.そのアフィニィフティーは1.14-6.08nM(kd)でレセプター数は1500/cellである.したがって本白血病細胞の細胞障害能の拡大はIL-2がTacではなくて,このP75に結合することにより活性化の第一段階がスタートすることが明らかにできた.LAK活性を有するLGL白血病細胞の表面は230KdのLH49抗原が存在して、これは、LAK活性のないLGL白血病細胞には見出されなかった。本白血病細胞のNK活性がW6/32抗体により実全に抑制された。しかし、この抑制能はW6/32抗体でも腹水型のものを1/100(V/V%)作用したときのみ見られFusion細胞の培養上澄のみを同量作用したものではまったく見出されなかった。しかし、この量の培養上澄型のW/32を加えて、さらにFITC標識抗家兎抗血清を作用させ蛍光顕微鏡で検鏡すると100%のものが陽性であった。以上の点から、W6/32の作用は過剰の抗体が存在するときのみ見出されるという奇妙な結果が得られた。

この作用については抗体によるものなのか、腹水型にしたときの血清成分によるものなのか今後の検討が必要であろう。2.p55とは異なる新しい第2のILー2情報伝達可能なILー2レセプターp75の検出。LGL白血啓細胞はT細胞及びNK細胞のILー2による活性化すなわちLAK化の研究に適している。しかし、このp55Tac ILー2レセプターのない細胞がいかにしてILー2で活性化を受けるかという点に関しては不明であった。LGL白血病細胞表面の^<125>I標識ILー2に対するレセプターの検出をchemical cross-linking法を用いて試みて見た。すると、分子量75kdのp55とは異なる第2のILー2レセプターが新鮮分離時に無刺激ですでに表現されていことを見出した。ま本細胞の増殖は、二次的に誘導されるp55Tacとp75との共同作業により最大限達成されることを明らかにした。3.LGLーCFをコードしているCDNAのクローニング現在までのところクローニング後のスクリーニングに耐るまで充分にLGLーCFが精製できていない。今後さらに精製を進める予定である。
知的障害者と健常者の合同ダンス活動における両者の「からだ」への意識変容について

2003年4月からの知的障害者と大分大学学生とのダンスや福祉レクリエーション・サービスを通して、両者の「からだ」への意識変容を検証した。ダンス活動では、活動を進めていく中で、」大学生は戸惑いつつ,障害者との活動を進めていく過程で,知的障害者を観察し,健常者との違いを明確に把握することができた。他者と自分の違いを認識すること,他者の生を実感することは,健常者間でも求められる。しかしながら,知的障害者に実際に接することで,観念的でしかなかった「健常者」「知的障害者」の相違の根拠を認識することによって,自信を持って「他者と接する」ことができるようになった。それはまた自己の改革を導出することにもなった。知的障害をもつ人々の生活をみると,彼らはその障害の特殊性から,生きるための生活そのものも家族やボランティアや福祉施設等の組織的支援への依存度が高い。そういうわけで,福祉レクリエーションの掛け声は少しずつ高まっているとはいえ,生活のなかに,「こころとからだ」の楽しみを日常的に求めることは困難な状態に置かれている等の考察に至った。結論的には、知的障害者と大学生はダンス活動やレク・サービスを媒介とした交流で,「からだ」を実感する様々な体験を蓄積していき,お互いに生き生きとした「からだ」への認識を深めることができたと考えられる。2003年4月からの知的障害者(社会福祉法人シンフォニー利用者)30名と大分大学教育福祉科学部学生50名の共同によるダンス活動内容の記録、大学生による知的障害者の活動観察、大学生による活動に関する意識調査、活動映像等の資料を収集終了し、整理を実施している。1.活動内容・「ひょっこり探検隊お宝発見!」というテーマで約15分の舞踊作品を構成。各練習会はこの作品の創作・練習を中心に進めた。・作品構成は、全員振り付けダンス「ひょっこりひょうたん島」→探検をテーマにした1-1.5分程度の6グループによる小作品→全員振り付けダンス「世界に一つだけの花」・ナレーションを入れて物語り展開を具体的にした。・1グループは約10-15人(知的障害者は2-5名、大学生5-10名)。全80名による作品となった。2.収集資料・2003年5月から2004年1月の間に開催した月例練習会5回における知的障害者の活動観察:知的障害者1名につき、大学生14名による活動観察記録。・発表会前後の知的障害者の観察記録:2003年11月30日大分市福祉の集い、2004年1月25日大分大学創作舞踊発表会の2回の発表会における知的障害者1名につき、大学生14名による活動観察記録。・各練習会参加大学生への発見と困惑に関する意識調査・大学生リーダー4名による各知的障害者の詳細な活動観察・各練習会の活動映像3.資料整理現在、資料整理の途中である。・大学生への意識調査からは、知的障害者に対して「意表をついた想像力」「想像以上に親交ができた」「自己の世界が広がった」などのへの肯定的な変容がみられた。・知的障害者には、「ダンス活動時には日頃見られない笑顔、行動の活発さがが頻発する」「ダンス練習会を楽しみに生活している」「ダンス練習時以外に大学生と会話をすることが多くなった」などに特徴的な変容がみられた.2003年4月からの知的障害者と大分大学学生とのダンスや福祉レクリエーション・サービスを通して、両者の「からだ」への意識変容を検証した。ダンス活動では、活動を進めていく中で、大学生は戸惑いつつ,障害者との活動を進めていく過程で,知的障害者を観察し,健常者との違いを明確に把握することができた。

それはまた自己の改革を導出することにもなった。知的障害をもつ人々の生活をみると,彼らはその障害の特殊性から,生きるための生活そのものも家族やボランティアや福祉施設等の組織的支援への依存度が高い。そういうわけで,福祉レクリエーションの掛け声は少しずつ高まっているとはいえ,生活のなかに,「こころとからだ」の楽しみを日常的に求めることは困難な状態に置かれている等の考察に至った。結論的には、知的障害者と大学生はダンス活動やレク・サービスを媒介とした交流で,「からだ」を実感する様々な体験を蓄積していき,お互いに生き生きとした「からだ」への認識を深めることができたと考えられる。
使い捨て繊維製品の快適性を目指した吸水性合成繊維の応用

使い捨て繊維製品には、使い捨てオムツ、衛生用品、清掃用拭取り布、化粧用品、医療用品などがあり、それらの素材には、一般に、吸水性のある木綿、レーヨンやでんぷん加工品が用いられている。当該研究者は、これまで加工の困難であった撥水性材料のポリプロピレン繊維を吸水性にする技術を開発して、特許出願を行った。この技術を基に、さらに、ポリエチレンやポリエステル繊維を吸水性にして、これまでの使い捨て繊維製品の代用とする可能性を追及することを目的とした。ポリプロピレン、ポリエチレンおよびポリエステルからなる不織布について、(1)酸化による活性化、(2)親水性高分子処理、(3)モノマーのグラフト化の組み合わせ、すなわち、(1)と(2)、(1)と(3)、(1)、(2)と(3)の三つの組み合わせと、触媒の併用によって、撥水性繊維を吸水性にする条件を検討した。その結果、(1)は1分から30分、(2)は1分から3時間、(3)は5分から1時間の範囲で処理が可能となった。処理時間の長短は、処理した材料の吸水性の耐久性に反映するが、コスト軽減のため、前処理時間の合計で、3分の可能性が得られた。なお、ポリプロピレンと同様の処理で、ポリエチレンやポリエステル繊維の処理は可能であった。これまでの天然繊維素材の代用となるのみでなく、「洗浄が容易で乾燥が速い」というメリットが生まれた。例えば、「使い捨ての清掃具」は、「使い捨て」としてもよいが、また、「再利用」も可能となった。ポリプロピレン、ポリエチレンおよびポリエステルは、各種不織布の端切れ、ボトルなどの廃棄物から再利用が可能であり、本研究の親水化処理法は有効であった。撥水性のポリプロピレン性不織布の吸水性化を行い、新しいタイプの使い捨て繊維製品の外部カバーへの応用の可能性が見出された。各種ポリプロピレン繊維の新しい表面処理のために、3種類の加工法、(1)活性化処理+親水性高分子処理、(2)活性化処理+親水性高分子処理+親水性モノマーのグラフト化+触媒・熟、(3)活性化処理+モノマー・グラフト化+光反応を開発してきた。目的に応じて、これらの方法を選択して、最適な条件を検討した。使い捨てオムツの被覆材料であるポリプロピレン不織布の吸水性は、適当な耐久性があれば十分であるため、容易で安全性の高い(1)の方法が望ましいと考えた。親水性高分子では、ポリビニルアルコール(PVA)が最適と見られた。処理温度、時間、触媒の有効性、処理物の耐洗濯性を検討した。市販の使い捨てオムツの素材は、単に、界面活性剤の含浸処理を行っているため、耐水性が極めて低いが、本研究による製造物の特性は、この欠点を改善できた。より密度の高いポリプロピレン不織布は、医療用、化粧品用、あるいは、エレクトロニクス製品の部品に適しており、その改良は、より耐久性の高い吸水性を得るために、(3)の方法または、その改良法を検討した。その結果、処理試薬、温度、光照射時間、その他の処理時間に、最短の条件を設定した。家庭用の使い捨て雑巾として,吸水性を与えたポリプロピレン不織布の用途の可能性を検討した。なお、製造物の実用特性は、企業との共同研究として、実験を行い、検討中である。
細胞の老化とX線照射による細胞死に関する検討

今回の研究では,以前から報告されている放射線感受性を決定する因子の一つである"p53に依存したアポトーシス"のみにとらわれることなく,細胞自体の放射線感受性の違いが何に起因するのかを明らかにすることを目標とした.とくに,照射後の分裂死と形態が似ている老化を念頭においた.検討に用いた細胞は,p53 statusの異なる種々の細胞株(放射線によりアポトーシスを起こすwild-type p53を有するヒトPNET (primitive neuroectodermal tumor)細胞株,同一起源でwild-type p53を有し照射によるアポトーシスを誘発する卵黄嚢腫瘍細胞株とmutant-type p53を有し照射によりアポトーシスが誘発されにくい卵黄嚢腫瘍細胞株)である.照射によるアポトーシスを抑制する目的でcaspase-3/CPP32inhibitorで処理し,アポトーシスの多寡ならびにcaspase-3/CPP32 activityを検討したところ,すべての細胞株でcaspase-3/CPP32 activityは低下し,それに伴い照射によるアポトーシスが抑制され,放射線感受性も低下した.しかし,老化に関連したタンパクの多く(とくにCDK inhibitorの一つであるp21/WAF-1/CIP-1)は,wild-type p53を有する細胞株では照射後の発現増強を認め,mutant-type p53を有する細胞株では照射による発現変化を認めなかった.そこで,p53に依存しないアポトーシスの経路を検討する目的でcaspase-9とMAP kinase(とくにERK)の照射後の発現変化も追加検討したが,ともに明らかな変化は認めなかった.今回の結果からは,照射によるアポトーシスを抑制した状態でもp53 statusがその細胞自体の放射線感受性に影響している可能性が残された.今回の研究では,以前から報告されている放射線感受性を決定する因子の一つである"p53に依存したアポトーシス"のみにとらわれることなく,細胞自体の放射線感受性の違いが何に起因するのかを明らかにすることを目標とした.とくに,照射後の分裂死と形態が似ている老化を念頭においた.検討に用いた細胞は,p53 statusの異なる種々の細胞株(放射線によりアポトーシスを起こすwild-type p53を有するヒトPNET (primitive neuroectodermal tumor)細胞株,同一起源でwild-type p53を有し照射によるアポトーシスを誘発する卵黄嚢腫瘍細胞株とmutant-type p53を有し照射によりアポトーシスが誘発されにくい卵黄嚢腫瘍細胞株)である.照射によるアポトーシスを抑制する目的でcaspase-3/CPP32inhibitorで処理し,アポトーシスの多寡ならびにcaspase-3/CPP32 activityを検討したところ,すべての細胞株でcaspase-3/CPP32 activityは低下し,それに伴い照射によるアポトーシスが抑制され,放射線感受性も低下した.しかし,老化に関連したタンパクの多く(とくにCDK inhibitorの一つであるp21/WAF-1/CIP-1)は,wild-type p53を有する細胞株では照射後の発現増強を認め,mutant-type p53を有する細胞株では照射による発現変化を認めなかった.そこで,p53に依存しないアポトーシスの経路を検討する目的でcaspase-9とMAP kinase(とくにERK)の照射後の発現変化も追加検討したが,ともに明らかな変化は認めなかった.今回の結果からは,照射によるアポトーシスを抑制した状態でもp53 statusがその細胞自体の放射線感受性に影響している可能性が残された.
細胞外分子シャペロンの新たな機能と病原細菌のバイオフィルム形成機構

細胞質でタンパク質の品質管理を担う分子シャペロンClpBおよびDnaKは、黄色ブドウ球菌の細胞外マトリクスにも含まれ、バイオフィルムの形成を正に制御する。ClpBは6量体リング構造を形成し、凝集した基質タンパク質の脱凝集を担うが、菌体外ではこれらの生理構造・機能とは全く異なる様式でバイオフィルム形成に関与することを見出した。これら分子シャペロンの機能を抗体や低分子化合物を用いて阻害することで、バイオフィルム形成や薬剤寛容性の菌の出現を抑制できることを明らかにした。本研究では細胞外に排出された細胞質分子シャペロンDnaK、ClpBのバイオフィルム形成における役割や作用機序の解明を目指し、以下の点について検討した。1変異体DnaK発現プラスミドの作製:野生型DnaK発現プラスミドをもとに10種類のDnaK変異体タンパク質を発現するプラスミドを作製し、それらの発現を確認した。今後、全ての変異体タンパク質を精製し、バイオフィルム形成に与える影響を調べる。2ClpBと相互作用するタンパク質の同定:プルダウンアッセイによりClpBと相互作用する黄色ブドウ球菌細胞表層タンパク質の探索を行った。その結果、Eap(Extracellular adherence protein)が同定された。黄色ブドウ球菌eap欠損株(Δeap)では、野生株に比べてClpBの結合が低下したことから、ClpBはEapを足場として黄色ブドウ球菌の細胞表層に結合する可能性が示された。しかし、ClpBはΔeap株に対しても弱いながら結合することから、他の分子とも相互作用する可能性がある。現在、それらの特定を試みている。3DnaKおよびClpBの局在解析:蛍光抗体ラベル法により、バイオフィルム内部における細胞外分子シャペロンの分布を明らかにすることが出来た。また、大気圧走査電子顕微鏡を用いた抗体ラベル観察と重金属ラベル観察により、黄色ブドウ球菌のバイオフィルム内部におけるDnaKとClpBの局在と細胞の分布を詳細に調べた。その結果、バイオフィルム底面においてDnaKとClpBが細胞表層に局在することが示された。これらにより、非破壊かつ高い抗原性を保った状態で目的とする細胞外分子シャペロンの挙動の一端を明らかにすることが出来た。以上の成果の一部は、第5回欧州微生物学会および第10回国際AAAタンパク質会議において発表した。本研究では、細胞外に排出された細胞質分子シャペロンDnaKおよびClpBのバイオフィルム形成における役割や作用機序を解明することを目的とし、以下の点について検討した。1変異体ClpBを用いた機能ドメインの解析:8種類の変異体(ドメイン欠損変異体6種&ATPase活性を失った変異体2種)を用いて、黄色ブドウ球菌バイオフィルム形成の促進効果を解析した結果、少なくともN末端ドメインからMiddleドメインまでの領域が重要であることと、従来より知られていた分子シャペロンとしての機能(凝集タンパク質の脱凝集)は必須ではないことを明らかにした。2バイオフィルム形成におけるDnaKおよびClpBの役割:バイオフィルム形成のプロセスは、初期付着と成熟の2つのステージに大別されるが、DnaKとClpBはバイオフィルム形成のすべてのステージにおいて黄色ブドウ球菌の細胞表層に存在していることを蛍光抗体染色法により明らかにした。また、DnaKとClpBはすべてのステージにおいてバイオフィルム形成を有意に促進しうることを明らかにした。これらの結果より、DnaKとClpBは初期付着から成熟までの過程において重要な役割を果たしている可能性が示唆された。3様々な病原細菌に対するDnaKおよびClpBのバイオフィルム形成促進効果:DnaKとClpBはグラム陽性細菌の黄色ブドウ球菌だけでなく、グラム陰性細菌である大腸菌と緑膿菌のバイオフィルム形成も促進することがわかった。これらの成果は、分子シャペロンの機能をめぐる概念を大きく書き換える新しい知見である。また、細胞外分子シャペロンのバイオフィルム形成促進機能が黄色ブドウ球菌のみならず、他の病原細菌においても認められたことより、単なる一細菌における興味深い現象の発見だけにとどまらず、医学的・細菌学的重要性を示すことができた。1DnaKの変異体解析:ATP加水分解活性、基質との相互作用、コシャペロン(補助因子)であるDnaJファミリータンパク質およびGrpEとの相互作用、などの機能を失った部位特異的DnaK変異体と部分欠損DnaK変異体の機能を大腸菌バイオフィルムモデルを用いて評価した。その結果、従来より報告されているDnaKの生理機能がバイオフィルム形成に重要であることを明らかにし、コシャペロンの必須性に関しても新しい知見を得た。2DnaKを標的としたバイオフィルム阻害法の確立:海外のグループによって報告されているDnaK阻害剤のなかから、大腸菌のバイオフィルム形成を阻害する化合物を探索した結果、フラボノールの一種であるミリセチンがバイオフィルム形成を阻害することを見出した。また、ミリセチンはDnaKの生理機能を阻害することで、バイオフィルム形成に重要な細胞外アミロイド線維curliの産生を抑制することがわかった。さらに、ミリセチンは大腸菌だけでなく、臨床的に問題視されているMRSAを含む黄色ブドウ球菌のバイオフィルム形成も阻害しうるとこが明らかとなった。3細胞外分子シャペロン特異的抗体を用いたバイオフィルム形成阻害:抗ClpBポリクローナル抗体を培地に添加することにより、黄色ブドウ球菌のバイオフィルム形成が特異的に阻害されることを確認した。このことは、抗バイオフィルムワクチンの開発に有益な知見であると考えられる。4黄色ブドウ

球菌以外のバイオフィルム形成における細胞外分子シャペロンの効果:精製したClpBおよびDnaKをコレラ菌と緑膿菌の培養液に添加することで、バイオフィルムの形成が促進されることを示した。これまでに我々は、分子シャペロンであるDnaKが菌体外アミロイド線維curliに依存した大腸菌のバイオフィルム形成に重要であることを見出している。さらに、天然フラボノールの一種であるMyricetin (Myr)を用いることでcurli依存的な大腸菌のバイオフィルム形成を濃度依存的に抑制できることを報告している。本研究では、大腸菌をモデルとして、Myrおよびその類縁体を用いて、バイオフィルム形成と薬剤寛容性(トレランス)を示す休眠状態の菌(persister)を抑制できるかを検討した。Myr及びその類縁体8種類を選択し、大腸菌K-12株のバイオフィルム形成に与える影響を調べた。その結果、Myrの類縁体No. 4(MD4: Myricetin Derivative No. 4)がMyrを加えた場合より効果的にバイオフィルムの形成を抑制できることを見出した。MD4の50%バイオフィルム阻害濃度(IC50)は5.6 μMであり、Myr(IC50=46.2 μM)よりもおよそ10倍高い活性を示した。透過型電子顕微鏡により細胞外構造体を観察したところ、MD4を添加した場合にcurliの産生が抑制されていることが示された。また、curliの産生に関わるタンパク質の発現を確認したところ、MD4の添加によりcurliの産生に必須なCsgDおよびRpoSの量が減少することを見出した。さらにRT-PCRの結果から、csgD mRNAおよびrpoS mRNAがMD4添加時に減少することが分かった。これらの結果より、MD4はRpoSより上流の制御因子の機能を阻害している可能性が示唆された。次に、トレランスにRpoSが重要であると報告されていることから、MD4を用いることによりpersisterを抑制できるかを検討した。その結果、MD4と抗菌剤との併用により薬剤抵抗性の菌を効率的に殺菌できることが示された。以上より、バイオフィルムを阻害することだけに留まらずpersisterも抑制できることから、MD4は慢性感染症の予防に極めて有効であると考えられる。細胞質でタンパク質の品質管理を担う分子シャペロンClpBおよびDnaKは、黄色ブドウ球菌の細胞外マトリクスにも含まれ、バイオフィルムの形成を正に制御する。ClpBは6量体リング構造を形成し、凝集した基質タンパク質の脱凝集を担うが、菌体外ではこれらの生理構造・機能とは全く異なる様式でバイオフィルム形成に関与することを見出した。これら分子シャペロンの機能を抗体や低分子化合物を用いて阻害することで、バイオフィルム形成や薬剤寛容性の菌の出現を抑制できることを明らかにした。DnaKの変異体解析、細胞外分子シャペロン特異的抗体を用いたバイオフィルムの形成阻害、黄色ブドウ球菌以外のバイオフィルム形成における細胞外分子シャペロンの効果に関しては、おおむね当初の計画通りに進展した。
鳥類のゲノム編集・自由自在

鳥類であるニワトリのゲノム編集は,標的となる1細胞期受精卵の取扱いかが困難なため,他の生物種に比べて遅れていた。実施者は,標的細胞に始原生殖細胞(PGC)を選択し,この培養方法を新たに開発した。その結果,ゲノム編集による遺伝子ノックアウトニワトリの作出に成功した。しかし,ゲノム編集のもう一つの利点であるノックイン技術は,従来の相同遺伝子組換えでは低効率のため成功例が少ない。そこで本研究では,広島大学で開発されたゲノム編集技術を活用した高効率ノックイン法であるPITCh法をさらに改変し,鶏卵中に有用タンパク質を効率よく蓄積させる新たな手法を構築する。
植生の根茎葉系の作用を考慮した地圏・気圏一体の水文学確立のための水文素過程の研究

植生は、地圏と気圏とを結ぶ径路であり、根系は土壌中の水分や化学物質のシンクである。葉は気圏への水蒸気のソ-スであるばかりでなく、光合成作用によって炭酸ガスを吸収し酸素を放出し、蒸散作用によりあるいは遮蔽効果により気温暖和の作用を行う。本研究は、植生の効果を考慮し地圏と気圏を一体として取扱う水文学の確立のための基礎研究である。1.風洞付きライシメ-タ-による実験:長さ4m、幅35cm、風路部高さ50cm、土壌部高さ50cmの風洞を二台製作し、一台は裸地のままあるいは芝生とし、他の一台は(稲科の)雑草を植え、比較実験を行い、次の結果を得た。裸地、芝生に対し雑草は日射の遮蔽と蒸散の効果により流下方向に大きな気温低下(最大3ー4°C)と湿度上昇(最大5g/m^3)をもたらす。雑草風洞のCO_2シンク量は日射量と、水蒸気ソ-ス量は飽差量と高い相関をもち、土壌水分は2次元的な因子として作用する。熱シンク量は水蒸気ソ-ス量及び流入温度で説明される。2.枯葉の保温効果:芝生とその上に枯葉層を作った場合の冬期夜間の風速・気温・地温等を測定し、長波放射による枯葉層上面の冷却・枯葉層内の保温効果を調べた。3.数値モデルNEO-SPAM,Soil,Plant,Atmospheric Modelの開発とシミュレ-ション:植生の存在を考慮した気流の運動および連続の方程式、熱および炭酸ガスの拡散方程式、根系をシンクとした土壌中の水分移動に関する不飽和浸透方程式、および新たに導いた植生の気孔の蒸発散・光合成作用を表す式により非定常三次元場の数値モデルを開発し、実験結果をシミュレ-トした。また、植生の配列が気候暖和に及ぼす効果を調べた。さらに植生による気候暖和が葉による遮蔽作用よりも、蒸散作用によるものであることを明らかにした。1.目的:大気ー植生ー土壌圏の水循環や都市環境を物理学・流体力学的に調べ、また都市環境における植生の果たす役割を量的に評価するために、模型実験および数値モデルによる解析を行う。2.模型実験:野外に2台の風洞および降雨装置付きのライシメーターを設置し、一台は裸地のままとし、他の一台には草を植えて比較実験を行った。測定項目は、大気および植生キャノピーについては、日射量・風速・温度・湿度・CO_2濃度であり、土壌については水分量・温度である。これらの測定から、湿度分布の勾配とCO_2濃度の勾配の間に強い相関のあること、ライシメーター入出口間のCO_2フラックスの差と日射量の間には、風速の強弱をパラメーターとする関数関係が存在すること、土壌水分量の減少は風洞出口の湿度フラックスに等しいことなどが明らかになり、数値モデル構築の基礎的関係式を得ることができた。3.数値モデルによるシミュレーション:大気圏については、Navier-Stokes方程式、気温・湿度・CO_2についてはそれぞれFick型の拡散式(5変数)、土壌については水分移動(飽和浸透)に関するRichardsの方程式、土壌水および土壌粒子についての熱輸送方程式(3変数)、植生については植生の水ポテンシャル方程式、葉面における熱収支式、根茎葉系の熱輸送方程式(3変数)の計11個の変数よりなるシステムを2次元非定常問題として解いた。

その結果、植生が単に太陽熱を遮断する日傘効果のみではなく、根系よりの水分輸送による蒸散に伴う潜熱による効果が、気候緩和に大きな役割を果たしていることを明らかにした。植生は、地圏と気圏とを結ぶ径路であり、根系は土壌中の水分や化学物質のシンクである。葉は気圏への水蒸気のソ-スであるばかりでなく、光合成作用によって炭酸ガスを吸収し酸素を放出し、蒸散作用によりあるいは遮蔽効果により気温緩和の作用を行う。本研究は、植生の効果を考慮し地圏と気圏を一体として取扱う水文学の確立のための基礎研究である。1.風洞付きライシメ-タ-による実験:長さ4m、幅35cm、風路部高さ50cm、土壌部高さ50cmの風洞を二台製作し、一台は裸地のままあるいは芝生とし、他の一台は(稲科の)雑草を植え、比較実験を行い、次の結果を得た。裸地、芝生に対し雑草は日射の遮蔽と蒸散の効果により流下方向に大きな気温低下(最大3ー4°C)と湿度上昇(最大5g/m^3)をもたらす。雑草風洞のCO_2シンク量は日射量と、水蒸気ソ-ス量は飽差量と高い相関をもち、土壌水分は2次元的な因子として作用する。熱シンク量は水蒸気ソ-ス量及び流入温度で説明される。2.枯葉の保温効果:芝生とその上に枯葉層を作った場合の冬期夜間の風速・気温・地温等を測定し、長波放射による枯葉層上面の冷却・枯葉層内の保温効果を調べた。3.数値モデルNEOーSPAM、Soil、Plant、Atmospheric Modelの開発とシミュレ-ション:植生の存在を考慮した気流の運動および連続の方程式、熱および炭酸ガスの拡散方程式、根系をシンクとした土壌中の水分移動に関する不飽和浸透方程式、および新たに導いた植生の気孔の蒸発散・光合成作用を表す式により非定常三次元場の数値モデルを開発し、実験結果をシミュレ-トした。また、植生の配列が気候緩和に及ぼす効果を調べた。さらに植生による気候緩和が葉による遮蔽作用よりも、蒸散作用によるものであることを明らかにした。
感染防御抗原Ligタンパク質を介したレプトスピラの細胞接着機構の解明

レプトスピラは人獣共通感染症であるレプトスピラ症の起因菌であるが,その病原性機構はほとんど明らかになっていない.レプトスピラ症の多彩な臨床症状は,レプトスピラが多様な臓器に接着・侵入することで引き起こされる.研究代表者はこれまでの研究から,他の病原性細菌の細胞接着因子と相同性のある病原性レプトスピラのLigタンパク質を同定し,このタンパク質がレプトスピラの接着因子として機能しているかについて解析を行ってきた.しかしながら,培養細胞へのレプトスピラの接着において,Ligタンパク質が接着因子として機能しているとの決定的な証明を行うことはできなかった.そこで,レプトスピラの細胞接着因子を網羅的に解析するために,ファージディスプレイ法により,培養細胞への接着に必須のレプトスピラ遺伝子の同定を試みた.全ゲノム配列が明らかになっているレプトスピラFiocruz L1-130株よりゲノムを抽出・断片化を行い,13kbの大きさの断片を回収し,T7ファージの10Bキャプシドタンパク質との融合タンパク質としてファージ上に提示するゲノムライブラリーを作製した.このライブラリーをFiocruz株の保菌動物であるラットの腎臓上皮由来培養細胞NRK-52Eへの結合を指標にスクリーニングを行い,結合するクローンを選抜し,インサートの塩基配列を決定した.独立した6回のスクリーニングを行い,結合ファージクローンのインサートの配列を決定したところ,同一の塩基配列をもつクローンが認められた.今後これらのクローンのレプトスピラ遺伝子について,組換えタンパク質の作製を行い,その組換えタンパク質がレプトスピラの培養細胞への接着を阻害できるかについて明らかにすることで,レプトスピラの接着因子の同定を行っていく.レプトスピラは、人獣共通感染症であるレプトスピラ症の起因菌であるが,その病原性機構はほとんど明らかになっていない.レプトスピラ症の多彩な臨床症状は,レプトスピラが多様な臓器に接着・侵入することで引き起こされる.そこで本年度はレプトスピラの細胞接着機構を明らかにすることを目的に,レプトスピラの培養細胞への接着実験の確立と接着阻害実験に必要な組換えタンパク質および抗血清の作製を行った.上皮由来の培養細胞3種類HeLa,NRK52E,Vero細胞を用いて,レプトスピラUP-MMC-NIIDおよびNIID7をmoi,インキュベーション時間をかえて,細胞への接着,侵入を免疫染色法により蛍光顕微で観察を行った.レプトスピラはHeLa>Vero>NRK52Eの順に接着性が良く,またmoi 100,インキュベーション時間2時間が,細胞接着の観察を行うのに適当であった.この細胞接着機構へのLigタンパク質の関与を明らかにするために,LigA-mタンパク質全長,N末端あるいはC末端欠損組換えタンパク質の発現,精製,またLigA-mタンパク質に対する抗血清の作製を行った.現在これら発現タンパク質あるいは抗血清によるレプトスピラのHeLa細胞への接着阻害実験の予備的検討,すなわち組換えタンパク質あるいは抗血清の至的濃度の検討を行っている.また全ゲノム配列が明らかになっているレプトスピラのデータベースより,他の細菌の接着因子と相同性のある遺伝子の探索を行い,これらの接着候補遺伝子がUP-MMC-NIIDにも存在することが明らかになったので,これらについても,接着への関与を明らかにしていく.レプトスピラは、人獣共通感染症であるレプトスピラ症の起因菌であるが,その病原性機構はほとんど明らかになっていない.レプトスピラ症の多彩な臨床症状は,レプトスピラが多様な臓器に接着・侵入することで引き起こされる.研究代表者は昨年度までの研究から,他の病原性細菌の細胞接着因子と相同性のある病原性レプトスピラのLigタンパク質を同定した.本年度はこのLigタンパク質の宿主細胞側のカウンターパート(レセプター)をBacterial Two Hybrid法により探索した.レプトスピラ細胞表面に露出し、細胞接着に機能すると考えられるLigタンパク質のイムノグロブンリンドメイン6個を含むC末端領域をbaitとし,preyにはHeLa細胞および肺組織のcDNAライブラリーを用いてスクリーニングを行った.その結果HeLa細胞由来cDNAライブラリーのスクリーニングからは,ヘモグロビンがLigタンパク質と結合する宿主タンパク質候補として同定された.レプトスピラはヘモグロビンに対して走化性を示すことがこれまでに報告をされており,環境中で宿主動物の血液中のヘモグロビンを感知し,そこに集まることができるのではないかと考えられている.今後レプトスピラのヘモグロビンに対する走化性のレセプターとしてLigタンパク質が機能しているかについて更なる研究を行う.また肺組織cDNAライブラリーのスクリーニングからは内皮細胞に発現する膜タンパク質が結合タンパク質候補として同定された.今後はレプトスピラの内皮細胞に対する細胞接着性を検討するとともに,このタンパク質がLigタンパク質のレセプターとして機能しているかについても更なる研究を行う.レプトスピラは人獣共通感染症であるレプトスピラ症の起因菌であるが,その病原性機構はほとんど明らかになっていない.レプトスピラ症の多彩な臨床症状は,レプトスピラが多様な臓器に接着・侵入することで引き起こされる.研究代表者はこれまでの研究から,他の病原性細菌の細胞接着因子と相同性のある病原性レプトスピラのLigタンパク質を同定し,このタンパク質がレプトスピラの接着因子として機能しているかについて解析を行ってきた.しかしながら,培養細胞へのレプトスピラの接着において,Ligタンパク質が接着因子として機能しているとの決定的な証明を行うことはできなかった.

そこで,レプトスピラの細胞接着因子を網羅的に解析するために,ファージディスプレイ法により,培養細胞への接着に必須のレプトスピラ遺伝子の同定を試みた.全ゲノム配列が明らかになっているレプトスピラFiocruz L1-130株よりゲノムを抽出・断片化を行い,13kbの大きさの断片を回収し,T7ファージの10Bキャプシドタンパク質との融合タンパク質としてファージ上に提示するゲノムライブラリーを作製した.このライブラリーをFiocruz株の保菌動物であるラットの腎臓上皮由来培養細胞NRK-52Eへの結合を指標にスクリーニングを行い,結合するクローンを選抜し,インサートの塩基配列を決定した.独立した6回のスクリーニングを行い,結合ファージクローンのインサートの配列を決定したところ,同一の塩基配列をもつクローンが認められた.今後これらのクローンのレプトスピラ遺伝子について,組換えタンパク質の作製を行い,その組換えタンパク質がレプトスピラの培養細胞への接着を阻害できるかについて明らかにすることで,レプトスピラの接着因子の同定を行っていく.