hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
レーザー励起三重項状態を用いたNMR信号の飛躍的増大法の開発と応用

NMRはミクロな立場から豊富な情報をもたらす非常に強力な分光法であるが,感度が低いという大きな欠点がある.従って,表面・界面や微小領域の観測やきわめて大きな分子の研究は難しいのが現状であり,感度を飛躍的に向上させる手法の実現が希求されている.本研究の目的は,レーザー励起三重項分子の動的核偏極を用いたNMR信号の増大化の方法を,物理的,化学的,生物学的に興味深い,一般的な物質に対して,しかも,粉末や溶液状態の試料に適用できるように改良する初の試みにチャレンジすることである.まず,99.2%の水素を重水素で置換した単結晶ナフタレンに0.015mol%のペンタセンをドープした試料を作成し,レーザー励起とESR照射により水素核スピンの偏極を試み,150Kで熱平衡の34万倍にあたる67.5%という巨大な偏極を得ることが出来た.偏極増大の時定数は420sであった.また,より実用性の高い試料として,粉末試料での偏極を試み,ペンタセンをドープした重水素化ナフタレンの粉末試料で、100Kで熱平衡のおよそ10000倍の偏極を達成した.さらに,重水素化していないナフタレンとペンタセンの粉末試料で、100Kで熱平衡のおよそ3000倍の偏極を達成することが出来た.これらの結果より,例えば,包摂化合物のようなゲストーホスト分子認識を行っている系において,ペンタセンをドープしたナフタレンを導入し,この巨大な偏極を用いることで高感度な観測が可能になると期待される.また,この大きな偏極の応用として,NMR量子コンピュータにおけるスピン系の初期化および感度向上なども考えられる.NMRはミクロな立場から豊富な情報をもたらす非常に強力な分光法であるが,感度が低いという大きな欠点がある.従って,表面・界面や微小領域の観測やきわめて大きな分子の研究は難しいのが現状であり,感度を飛躍的に向上させる手法の実現が希求されている.本研究の目的は,レーザー励起三重項分子の動的核偏極を用いたNMR信号の増大化の方法を,物理的,化学的,生物学的に興味深い,一般的な物質に対して,しかも,粉末や溶液状態の試料に適用できるように改良する初の試みにチャレンジすることである.まず,99.2%の水素を重水素で置換した単結晶ナフタレンに0.015mol%のペンタセンをドープした試料を作成し,レーザー励起とESR照射により水素核スピンの偏極を試み,150Kで熱平衡の34万倍にあたる67.5%という巨大な偏極を得ることが出来た.偏極増大の時定数は420sであった.また,より実用性の高い試料として,粉末試料での偏極を試み,ペンタセンをドープした重水素化ナフタレンの粉末試料で、100Kで熱平衡のおよそ10000倍の偏極を達成した.さらに,重水素化していないナフタレンとペンタセンの粉末試料で、100Kで熱平衡のおよそ3000倍の偏極を達成することが出来た.これらの結果より,例えば,包摂化合物のようなゲストーホスト分子認識を行っている系において,ペンタセンをドープしたナフタレンを導入し,この巨大な偏極を用いることで高感度な観測が可能になると期待される.また,この大きな偏極の応用として,NMR量子コンピュータにおけるスピン系の初期化および感度向上なども考えられる.今年度は,p-テルフェニルにドープしたペンタセンの光励起三重項状態を用いた動的核偏極を行う装置を開発し,核偏極の過程を研究するために,以下の実験を行った.(1)試料に98%重水素化したp-テルフェニルを用いて,残りの2%のプロトンのスピン偏極を熱平衡時に比べて40000倍に増大することに成功した.このようなプロトンが希釈されている系では,スピン拡散が起こらない.したがって,実験で確かめられたような希薄なプロトンスピンの高偏極は,光励起した三重項状態の電子スピンの偏極が数十オングストローム以上離れたプロトンに直接移動していることを示している.この現象を使うことにより,炭素13などの希薄スピンの偏極が可能にあると考えられ,現在その実験の準備を行っている.(2)ペンタセンが試料中で均一に光励起されているかどうかを確認するため,試料へのレーザー入射方向に磁場勾配をかけて核スピン偏極の1次元NMRイメージング実験を行った.その結果,励起レーザー光の強度を十分に上げれば光が奥まで浸透していくことを見出した.また,弱いレーザー強度でも,励起レーザー光の波長をペンタセンの吸収極大からずらし,故意に吸収効率を下げることによって試料の奥まで光が通り,均一にペンタセンを励起できることを示した.この結果により,粉末試料を用いても高偏極が得られる可能性が確認できた.NMRはミクロな立場から豊富な情報をもたらす非常に強力な分光法であるが,感度が低いという大きな欠点がある.従って,表面・界面や微小領域の観測やきわめて大きな分子の研究は難しいのが現状であり,感度を飛躍的に向上させる手法の実現が希求されている.本研究の目的は,レーザー励起三重項分子の動的核偏極を用いたNMR信号の増大化の方法を,物理的,化学的,生物学的に興味深い,一般的な物質に対して,しかも,粉末や溶液状態の試料に適用できるように改良する初の試みにチャレンジすることである.

まず,99.2%の水素を重水素で置換した単結晶ナフタレンに0.015mol%のペンタセンをドープした試料を作成し,レーザー励起とESR照射により水素核スピンの偏極を試み,150Kで熱平衡の34万倍にあたる67.5%という巨大な偏極を得ることが出来た.偏極増大の時定数は420sであった.また,より実用性の高い試料として,粉末試料での偏極を試み,ペンタセンをドープした重水素化ナフタレンの粉末試料で、100Kで熱平衡のおよそ10000倍の偏極を達成した.さらに,重水素化していないナフタレンとペンタセンの粉末試料で、100Kで熱平衡のおよそ3000倍の偏極を達成することが出来た.
文明と広域ネットワーク：生態圏から思想、経済、運動のグローバル化まで

本年度は、2017年度に開催した国際シンポジウム「メコン・コモンズからメコン共同体へ」の成果を英語書籍として刊行する準備を進めた。2019年2月にはタイ(国立遺伝子生命工学研究センター、マヒドン大学、チェンマイ大学、メコン機構)およびベトナム(南部社会科学院)の執筆予定者と出版企画の打ち合わせを行った。同時に当該研究課題に関する資料を収集した。2019年2月には、国際ワークショップ「アジア域内の南-南型人口移動の現状と課題ーインドの経験を中心に」(一橋大学)を分担者の森の主導で実施した。2019年3月には、文理融合アプローチを深めるべく、国際シンポジウム「アジアの農村の持続性ー都市と地方の共存共栄は可能か」(千葉大学柏の葉キャンパス)を分担者の高垣の主導で開催した。グローバル・コモンズ研究会も継続して実施し、今年度は4回開催した。研究会では、東南アジアに携わる専門家から現地の最新動向について報告された。個々の研究活動については以下の通りである。五十嵐は、メコン地域を中心に政府機関・国際機関などを訪問し、コモンズに関わる研究調査を行った。高垣は、2017年に実施したザンビアにおける難民キャンプでの調査結果およびタイにおける果樹農家の高齢化に関わる調査結果を発表した。森は、パリにおける難民問題と市民社会の役割に関する研究をまとめた。丸山は、南部アフリカにおける先住民族と観光の関係について報告した。渥美は、「独占的競争」経済の分析手法により、グローバル問題、とくに競争政策の国際的波及や貿易政策の都市へのインパクトなどの一連の応用研究を実施した。石田は、憲法制定を陰で支えた民主主義者ネットワークと、日伊両国の外務省を比較による戦間期国際政治史の再構築を図った。横田は、中東最大のイスラーム主義運動であるムスリム同胞団の活動状況に関するインタビュー調査をトルコ・フランスで実施した。コモンズをキーワードとして文理融合を目指した国際シンポジウムの成果を英語書籍として公表するために、タイおよびベトナムの執筆者と打合せを実施したことで、出版の準備を大きく進めることができた。打合せ後も継続して密に連絡を取り合っており、フォローアップも着実に実施している。加えて、アジアの農村をテーマとする国際シンポジウムを実施できたことは、和文による研究成果となる『国家を超えるネットワーク(仮)』の自然科学的部分を埋める重要な機会となった。さらに、2017年度より継続的に開催してきた「グローバル・コモンズ研究会」は、文理融合アプローチを強く意識したものであり、文理融合を目指す上述書の理論的枠組みを再考する場となった。最後に、移民・難民プロジェクトによる国際ワークショップでは、トランスナショナルネットワークに関わる研究を深めることができ、和文による研究成果となる『移民・難民の「グローバル関係学」の形成を目指して(仮)』の内容を大きく進めることができた。今年度からは、これまでの研究成果を出版物としてまとめる段階に入る。2017年度に実施した国際シンポジウム「メコン・コモンズからメコン共同体へ」の内容を、文理融合アプローチから英文書籍として刊行する準備を進める。このために、Book Proposalとサンプルチャプターの用意に取り組み、今年度中にPeer Reviewを受ける。加えて、和文による2冊の研究成果の刊行を目指す。1つは、代表の五十嵐を編者とする『国家を超えるネットワーク(仮)』であり、代表の五十嵐は序章、分担者の高垣はアジアの農村における人の移動、丸山は南アフリカの先住民運動と国際組織、石田はドデカネス諸島(ギリシア)、横田は西欧でのムスリムコミュニティにおけるムスリム同胞団のネットワークを、特任研究員の小松は沖縄を担当する。B01班からは酒井(2003年以前のイラク反体制組織の欧米向け展開)と佐川(エチオピアのグローバルな開発とローカルなコミュニティ)が参加する。これらに加えて、昨年度に実施した国際シンポジウム「アジア農村の持続性」に登壇した自然科学系の研究者にも執筆を依頼する。もう1つは、分担者の森を中心に、『移民・難民の「グローバル関係学」の形成を目指して(仮)』であり、(1)「南」から「南」への移動、(2)「北」から「南」/「北」から「北」への移動、(3)国際移民・難民とグローバル関係学、の三部構成となる予定である。その他、2019年12月に実施予定の国際会議(タイ)へも参加も予定している。計画研究B03では、国家間関係ではカバーできない、地球規模で共有される諸問題と諸現象が増加している現状を踏まえ、グローバルな問題解決アプローチとグローバル・コモンズの創生の可能性を探ることを目的とする。2016年度は、主に以下の活動を行った。まず、グローバル・コモンズを地域ごとに考えることを出発点として、東南アジア・メコン地域に焦点を絞り、11月に国際シンポジウムを計画研究A02と共催し、国際法、国際経済、国際政治などの枠組みからASEANとメコンの地域主義にアプローチした。その成果を出版した。1月には、メコン開発の現状とNGO、メコン地域における人身売買・人身取引とNGOに関する特別講演を開催した。さらに、グローバル・コモンズの基盤となりうるグローバル市民社会の量的分析に向けて、グローバル市民社会に関するデータベースを購入、市民社会ネットワークの数の推移や地域ごとの変化の計量分析に努めた。一方で、分担者による個別の調査研究を着実に進め、代表者がベトナム、ラオス、イギリス、フランス、ベルギーでグローバル・コモンズ、リージョナル・コモンズ、ローカル・コモンズに関する現地調査を実施した他、分担者はイタリア、ドイツ、イギリス、トルコ、ザンビア、南アフリカなどで聞き取り調査や資料収集を行った。

特に、ザンビアでは、難民キャンプを訪問し、農学の視点からのフィールド調査の準備作業を行った。また、環境問題を扱う観点から、11月には駐日イラク大使館などの協力を得て、イラク南部湿地帯の現状を巡るセミナーを開催した。文理融合を目指す本計画研究では、農学や環境学など、理系分野の研究との協働を推進する。2016年度の活動は、主として代表者が専門とする東南アジア、特にメコン流域地域の地域間関係のさまざまなネットワークについて、調査を進めた。メコン流域諸国に関して、繰り返し現地調査を行い、国家主体間ネットワークのみならず、地方行政体やNGOの持つサブ地域ネットワークの在り様について、聞き取り調査を中心に実施できたことは、大きな成果である。また、本計画研究のなかで文理融合型研究の核となる高垣によるアフリカでの調査研究は、ザンビアでの難民キャンプ視察が実行できたことにより、来年度以降の本格的調査の準備が整った。本領域では、2017年度より計画研究横断型のプロジェクトとして「移民・難民・多文化共生」プロジェクトが立ち上がることが決まっているが、計画研究B03は、高垣のアフリカ難民調査の他、横田がトルコ在住の移民社会におけるエジプト・ムスリム同胞団の活動拡大を取り上げた調査を行い、難民を対象とした調査を行っているため、「移民・難民・多文化共生」プロジェクトのなかで中心的な役割を果たしうる準備を整えることができた。今年度、研究計画B03班では、研究計画A02班との共催で、2018年2月に国際シンポジウム「メコン・コモンズからメコン共同体へ」を開催した。メコンをフィールドとして、メコンの第一線で活躍する研究者等を招聘し、コモンズに必要な条件や要素を文理の垣根(歴史学、社会学、国際政治学、国際関係論、国際経済学、開発学、農業経済学、生物工学、地理学、公衆衛生学、工学、農学、土壌学など)を越えて議論した。このシンポジウムを通じて当初の研究計画で掲げた移民、人権、環境・生態系、情報技術、農業・食料安全保障、疫病、国境を越えた経済活動、市民社会ネットワークを具体的に取り上げた。また、文理融合とコモンズ研究を発展させるために、メコン機構とMOUを締結し、学術研究連携を進めた。加えて、グローバル・コモンズ研究会を立ち上げ、2017年6月に第1回研究会を開催し、コモンズ概念について班員全体で共有した。2017年7月に第2回研究会を開催し、理系の視座からを取り入れるために、宇宙デブリを専門とする外部講師を招いた。個別の調査研究も着実に進め、代表者がベトナム・カンボジア・タイを中心にコモンズに関する現地調査を実施した。分担者は、イギリス・オランダ・イタリアで外交資料の調査、ヨーロッパにおけるムスリム移民への排外的感情・差別行為の増加の問題の調査、ザンビアの難民キャンプにおける農業活動・資源配分の実態調査、トルコ・フランス・スウェーデンのムスリム同胞団関係者に対する調査、グローバルな先住民運動の展開に関する研究の整理、経済のグローバル化と模倣品に関する研究をそれぞれ進めた。
加齢に伴う二次リンパ組織内細胞間相互作用の変容による疾患発症の分子機構解明

昨年度に引き続き二次リンパ組織内でANGPTL2を発現する細胞の同定を免疫染色法にて実施した。これまでにANGPTL2を発現する細胞として同定した細網繊維芽細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞に加え、抗原刺激によりリンパ節の二次濾胞内に形成される胚中心に存在し、B細胞におけるクラススイッチや抗親和性IgGを産生するプラズマ細胞への分化に重要な役割を果たす濾胞樹状細胞においてもANGPTL2が発現していることを見出した。そこで、これら二次リンパ組織内に発現するANGPTL2の意義を検討する目的で、Angptl2欠損マウスを用いてコラーゲン誘導性関節炎マウスモデルを作製した。その結果、野生型マウスは2回目の免疫後3週間で全てのマウスが関節炎を発症したのに対し、Angptl2欠損マウスでは著明に関節炎の発症が抑制された。さらに、血中のIgMおよびIgG1レベルには差を認めないが、野生型マウスに比べAngptl2欠損マウスでは有意にIgG2cレベルが低いこと、野生型およびAngptl2欠損マウス由来B細胞はin vitroにおけるクラススイッチの誘導に差を認めないことが明らかとなった。また、野生型マウスおよびAngptl2欠損マウスの骨髄をそれぞれ野生型マウスおよびAngptl2欠損マウスに移植し、同様に関節炎モデルを作製した場合、ドナーの遺伝型に関わらずレシピエントがAngptl2を欠損している場合に関節炎の症状が抑制された。これらの結果から、免疫細胞以外のストローマ細胞に由来するANGPTL2がB細胞におけるクラススイッチに重要であることが示唆された。28年度が最終年度であるため、記入しない。平成27年度においては、二次リンパ組織内のANGPTL2発現細胞を同定する目的で、免疫染色法もしくはリンパ組織の細胞懸濁液から各種細胞をセルソーターにて単離し発現解析を行った。リンパ節においては、単離した各ストローマ細胞における発現を検討したところ、細網繊維芽細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞においてANGPTL2が豊富に発現していることを見出した。そこで、野生型マウスとAngptl2 KOマウスに卵白アルブミンとCFAをともに皮下注射し、ANGPTL2がリンパ節におけるT細胞増殖および組織構築における意義を検討した。その結果、Angptl2 KOマウスでは、野生型マウスに比べ、上述のストローマ細胞数や抗原特異的T細胞の増殖が少ない傾向にあった。現在、再現性の確認を行いリンパ節のストローマ細胞由来ANGPTL2による免疫応答制御の可能性について検討を行っている。本研究の準備研究において、ANGPTL2が胸腺組織のストローマ細胞においても発現している可能性を見出していた。そこで、蛍光免疫染色法によりANGPTL2を発現する責任細胞を検討したところ、繊維芽細胞や血管内皮細胞、胸腺髄質上皮細胞において発現していることが明らかとなった。当初の計画通り、リンパ組織において細網繊維芽細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞がANGPTL2を発現する細胞であること、胸腺組織においては、繊維芽細胞や血管内皮細胞、胸腺髄質上皮細胞であることを見出した。さらに、リンパ節のストローマ細胞由来ANGPTL2が免疫応答制御に関わっている可能性を示唆するデータも得られている。また、来年度に予定している免疫老化と白血病の病態発症・進展におけるSASPとしてのANGPTL2シグナルの意義解明研究で使用するSpa-1とAngptl2のダブルKOマウスの作製を完了し、来年度の研究準備も整えていることなどから、本研究計画はおおむね順調に進展していると考える。

本年度に同定したリンパ組織内のストローマ細胞由来ANGPTL2による免疫応答制御機構の解析や胸腺組織のストローマ細胞由来ANGPTL2の生理的意義解明研究を中心に行うとともに、作製したSpa-1とAngptl2のダブルKOマウスとSpa-1 KOマウスを用いて、白血病の発症率や病態の重症度を解析することで、免疫老化に伴う白血病の病態発症・進展におけるSASPとしてのANGPTL2シグナルの意義解明を目指す。28年度が最終年度であるため、記入しない。
湿式法によるp型TFTの創製

酸化銅プレカーサー溶液を用いて,ケイ素/二酸化ケイ素基板上に薄膜形成し,その薄膜のトランジスタ特性を調べた。調製した溶液を基板に滴下し,スピンコート法で塗布,乾燥後にAr気流中で熱処理して,酸化銅薄膜を形成した。昇温速度,熱処理時間などの熱処理条件を種々検討し,約30 nmの膜厚の酸化銅薄膜を形成した。トランジスタ特性を半導体パラメータアナライザで調べた。形成した膜は,ゲートバイアスが-10 Vのときに高いオン/オフ電流比(ON/OFF比)がとれ,トランジスタとして動作した。このように,化学的湿式法でp型TFTの形成を達成した。実用化に向けては,さらに高いオン/オフ電流比が必要である。昨年度の目標は,分子プレカーサー法を用いてp型酸化物TFTの作製を試みることである。効果的に研究を進める上で,既製品や報告例のある材料を用い,半導体層のみCu2O薄膜を形成した。分子プレカーサー法で形成したp型Cu2O薄膜が薄膜トランジスタとして動作するかを確認する目的で,シリコン酸化膜付シリコン基板上に形成した。ドレインとソースは,金を蒸着して測定した。しかし,Cu2O単一相をこの基板上で形成することは,困難だった。ガラス基板上には,安易に形成できるが,Cu2O薄膜形成は,基板の影響があることがわかった。そこで,Cuを含むCu2O膜やCuOを含むCu2O膜など,熱処理時間変化による特性変化を調べた。金属銅を含むCu2O膜は,トランジスタとして動作しなかったが,CuOを含むCu2Oは,トランジスタとして動作が確認できた。しかし,線形領域の立ち上がりや飽和領域の傾きが鈍く,Cu2O単一相薄膜の形成が必須である。現段階では,分子プレカーサー溶液を設計し,Cu2O単一相膜の形成条件を確立した。このトランジスタ特性は,測定段階であり,本年度の大きな目標である。以上のことから,Cu2Oの作成条件を探索するとともに,Cuを含むCu2O膜の形成を応用して銅薄膜の形成を試みた。これは,膜内部の有機物をコントロールすることで容易に形成することができ,これらに関して学会や論文として発表した。今後は,この銅薄膜をソース,ドレインに使用する予定である。昨年度は,分子プレカーサー法によるCu2O薄膜の形成を達成した。本年度は,この分子プレカーサー法で形成したp型Cu2Oをチャネル層に用いたTFTの作製と,このTFTのデバイス特性を調べることを目的とした。調製したプレカーサー溶液をSi/SiO2基板上に,マイクロピペッターを用いて50 &micro;L滴下し,スピンコート法で塗布した。これを,乾燥機に入れ,10分間プレヒートした後,青色透明のプレカーサー膜を得た。このプレカーサー膜をAr気流中で熱処理して,酸化銅薄膜を形成した。しかし,この酸化銅は,II価または銅金属を含む膜だった。無アルカリガラス基板上では,再現性高いCu2O単一相薄膜形成が可能であったが,Si/SiO2基板上では,Cu2O単一相薄膜形成は,困難だった。したがって,分子プレカーサー法によるCu2Oの形成は,使用する基板に依存して,形成条件が変化することがわかった。一方で,CuOを含むCu2OのTFT特性を調べた。それは,VGの出力電圧によってVDSとIDSの依存関係が変化した。しかし,飽和状態は示さなかった。まだ,飽和状態が観察できなかった原因は判明していないが,一つの原因は,Cu2Oの中に不純物としてCuO結晶が含有していたためと考えられる。Cu2O単一相を形成するために,Si/SiO2基板の表面状態の影響を考え,基板の洗浄方法を変更した。しかし,この条件でもSi/SiO2基板上にCu2Oが再現良く形成できなかった。現在は,下地層にMgOなどの絶縁膜を一層形成し,Cu2O単一相の薄膜形成を試みている。ガラス基板上では,容易に形成したCu2O単一相が,基板の違いで形成困難であったことから,計画からやや遅れている。本年度は,当初の目的である化学的湿式法の分子プレカーサー法を用いて,p型酸化物薄膜トランジスタ(p型TFT)の形成を達成した。昨年度に検討したCu2Oプレカーサー溶液を用いて,Si/SiO2基板上に薄膜形成し,その薄膜トランジスタ特性を調べた。マイクロピペッターを用いて調製した溶液を基板に滴下し,スピンコート法で塗布した。これを,乾燥器に入れ,10分間プレヒートした後,青色透明のプレカーサー膜を得た。昇温速度,熱処理時間などの熱処理条件を種々検討し,Si/SiO2基板上に約30 nmの膜厚のCu2O薄膜を形成した。その薄膜にマスクを用いて金電極を形成し,トランジスタ特性を半導体パラメータアナライザで調べた。形成した膜は,ゲートバイアスが-40 Vのときに高いオン/オフ電流比(ON/OFF比)がとれ,トランジスタとして動作した。これらの具体的な成果内容は,論文,学会を通じて発表する。更なる高いオン/オフ電流比を目指して,アニール処理方法の検討またはシアンなどによる化学的な処理によるダングリングボンドの補修が効果的であると考える。先に継続して,これらを検討する。

また,今後の展開として,これらの研究成果をベースにn型酸化物薄膜トランジスタの形成を分子プレカーサー法で試み,それらを組合せた透明CMOSの形成など,様々な応用展開を考えている。以上のことから,3年間にわたる研究により当初の目的である化学的湿式法の分子プレカーサー法を用いて,簡便にp型酸化物薄膜トランジスタ(p型TFT)の形成を達成した。酸化銅プレカーサー溶液を用いて,ケイ素/二酸化ケイ素基板上に薄膜形成し,その薄膜のトランジスタ特性を調べた。調製した溶液を基板に滴下し,スピンコート法で塗布,乾燥後にAr気流中で熱処理して,酸化銅薄膜を形成した。昇温速度,熱処理時間などの熱処理条件を種々検討し,約30 nmの膜厚の酸化銅薄膜を形成した。トランジスタ特性を半導体パラメータアナライザで調べた。形成した膜は,ゲートバイアスが-10 Vのときに高いオン/オフ電流比(ON/OFF比)がとれ,トランジスタとして動作した。このように,化学的湿式法でp型TFTの形成を達成した。実用化に向けては,さらに高いオン/オフ電流比が必要である。CuOを含むが酸化膜付きシリコン基板上にCu2O薄膜を形成し,その薄膜がp型TFT特性を示したことは,重要である。これまでにp型Cu2O薄膜を化学的湿式法で形成したことが無く,溶液法で形成したCu2Oが特性を示した点は,評価できる。しかし,その特性は,未だ不十分で改善が必要である。また,先に来年度の目標だった金属薄膜の形成を達成し,それを論文化した点は,評価できると考える。分子プレカーサー法でのCu2O薄膜形成は,下地層の影響があることがわかった。したがって,MgOやZrO2など絶縁体を1層目に形成し,その膜上にCu2O薄膜形成を試みる。また,基板も導電性ガラスなどを用いてその上に同様に絶縁膜を形成するなど条件を変えてTFTの形成を試みる。ナノ材料化学今後は,Cu2O薄膜単一相の結果を参考に,配位子とCu2O薄膜のホール効果測定,TFT特性の相関を調べる。具体的には,プレカーサー溶液中に含まれる錯体を設計し,その溶液で形成した膜のホール移動度の相関を先に調べる。そして,ホール移動度を制御した膜を利用して,TFT特性の変化を調べる。また,透明導電膜上に絶縁膜を形成し,その上にCu2O薄膜を形成する透明TFTの形成も試みる。本年度は,論文投稿が遅れ,そのために使用する予定の校閲費や投稿費用が使用できなかたことから差額が生じた。論文校正で使用予定していたが,論文執筆が遅くなり差額が生じた。今年度は,最終年度であることからも,論文校閲費や投稿費用に使用する予定である。本年度は,論文校正に使用する予定である。
アミノ酸バランスを軸とした歯周病に伴う微生物叢代謝変動の解析

歯周病は現代社会に広く蔓延するバイオフィルム感染症であり、進行すると口腔の健康状態を著しく損なうだけでなく、全身の健康にも影響を及ぼし、医療経済に打撃を与える。近年の微生物叢研究の進展に伴い、バイオフィルム内の特定の細菌ではなく、バイオフィルム全体の機能の変化に着目した新たな病因論が生まれつつある。特に、バイオフィルム内の代謝活動が病原性を表す一つの尺度として注目されている。これまでに私は基礎・臨床研究の両面から、歯周病に伴う細菌叢の代謝変動に関する研究を行ってきた。その結果、細菌集団内でのアミノ酸代謝変動が病態形成に関与する可能性を見出した。現在、10種のモデル細菌のアミノ酸産生能・要求性、さらには複数菌種によるアミノ酸栄養共生機構をin vitro/in silicoの両面から解析するとともに、ヒト歯垢サンプル中の細菌種とメタボロームの相関を解析することで、基礎実験の妥当性の検証を進めている。まず当研究室が所有するUPLCおよびGC-MSを用いて、微生物の菌体内・外のアミノ酸を定量するための培養系の確立と技術基盤の構築に努め、現在までに単一・混合培養系における菌体内外のアミノ酸プロファイルの安定的な測定に成功している。その結果、複数の口腔細菌間で予想以上に様々なアミノ酸を依存し合っている実態が示唆された。またGC/MS解析により、いくつかの細菌の組み合わせでアミノ酸発酵の亢進を認め、栄養共生が集団内のエネルギー戦略に関わることが示唆された。また個々の菌種の保有する生合成経路を加味した数理モデル構築も進め、歯周病細菌集団における栄養戦略の解明に取り組んでいる。一方、臨床研究に関しては歯垢のサンプリングが終了した段階で、今後ネットワーク解析等の手法を用いた解析を行う。基礎実験については、培養系および測定系の最適化が終了し、これにより安定的な微生物のアミノ酸代謝産物プロファイルの取得に成功している。また菌叢の複雑化に伴い、菌対外のポリアミンが増加し、それによりkeystone病原体であるPorphyromonas gingivalisのバイオフィルム形成と解離を促進する可能性を示す知見を得ている。現在、この結果の一部を論文にまとめている。臨床研究についても、検体採取が完了した段階であり、おおむね順調に進展している。当初の予定通り、in vitro/in silicoの両面から口腔細菌のアミノ酸栄養共生機構を観察・モデル化するとともに、ヒト歯垢サンプル中の細菌種とメタボロームの相関を解析することで、その妥当性を検証する。また検体採取と同時に実施した歯周病検査の結果から、歯周病由来慢性炎症を定量的に表現し得るPeriodontal Inflamed Surface Area(PISA)を算出し、歯周病重症化に伴うアミノ酸代謝産物と菌種の変動をネットワーク解析等の手法を用いて分析する予定である。未来の歯科医療には、天然の歯・口腔の保全に努める健康管理型医療の実現が期待されている。そのためには、疾患と健康の境界を明確にし、患者がどの程度健康なのかを分子レベルで理解する個別化医療・精密医療の実現が求められる。本研究は、上記視点からも未来の健康管理型社会の実現に向け、有用な知見を与えることが予想される。

また検体採取と同時に実施した歯周病検査の結果から、歯周病由来慢性炎症を定量的に表現し得るPeriodontal Inflamed Surface Area(PISA)を算出し、歯周病重症化に伴うアミノ酸代謝産物と菌種の変動をネットワーク解析等の手法を用いて分析する予定である。未来の歯科医療には、天然の歯・口腔の保全に努める健康管理型医療の実現が期待されている。そのためには、疾患と健康の境界を明確にし、患者がどの程度健康なのかを分子レベルで理解する個別化医療・精密医療の実現が求められる。本研究は、上記視点からも未来の健康管理型社会の実現に向け、有用な知見を与えることが予想される。
長期標準年輪曲線の広域ネットワーク拡充とそれに基づく木材産地推定法の検討

ヒノキ科樹木の長期標準年輪曲線構築とそのネットワーク化を行い、木質遺物を対象とした日本での木材産地推定の可能性について検討した。その結果、1)多くの現生材標準年輪曲線を構築し、ネットワーク内での年輪幅変動が、大まかに4つの地理的にまとまったグループになる可能性を示唆した、2)北東アジアの広域的な春気温復元に成功した、3)東北北部関東を中心に、木質古文化財で、700-1000年長の曲線を新たに複数構築し、これらの年輪幅変動が現生材と同様の地理的区分にまとまることを確認した。今年度は、研究の初年度として研究組織の有する標準年輪曲線のネットワーク化および標準年輪曲線の延長を重点的に行った。現生標準年輪曲線のネットワーク化については、本科研費の研究組織全員が参加した会議で各自のもつデータの共有化の合意を形成し、全標準年輪曲線のリスト化を行った。また、研究組織外からも四国や近畿の標準年輪曲線の提供を受けた。これと平行して、現生標準年輪曲線の空白域を埋めるため、新たなサンプリングを実施した。具体的には、兵庫県加西市(スギ)、銘木館(立山:スギ、ネズコ、静岡:スギ)などであり、これらの試料について計測作業を行った。また、研究分担者が担当している近畿の古建築(談山神社、願泉寺)の古材と研究代表者の有する東京の遺跡出土材由来の標準年輪曲線とがクロスデーティング可能なことが新たに判明し、木材産地について推定するため、データの蓄積と検討を行った。標準年輪曲線の延長については、主として資料の不足している江戸時代を対象に試料収集と計測を実施した。具体的には、解体修理中の瑞巌寺本堂(江戸時代、宮城県松島市)、護国寺月光殿(江戸時代、東京都)、および十三盛遺跡(平安時代、青森県)などである。瑞巌寺では、天井板、建具、床板など150点の部材から画像データを収集した。このうち、一部の計測をおこない、建造年代と矛盾のない16世紀末の年代を得た。護国寺でも同様に70点以上の試料収集を行い、計測を行った。今年度は、研究の2年目として、地理的、時代的に標準年輪曲線が不足している部分のデータ収集と解析を重点的に行った。現生標準年輪曲線の広域ネットワーク化については、研究分担者と協力し、九州大学宮崎演習林を中心にツガ現生材年輪試料(コアおよび円盤)を30点以上収集した。また、連携研究者、研究協力者との協力により、奈良県吉野のスギ、ヒノキ現生材および兵庫県加西のスギ現生材を多数収集し、年輪幅計測と解析を行った。現在までの試料収集により、一部に未計測の試料はあるものの、当初計画した試料の空白地を埋めるという目的は、ほぼ達成する見通しがたった。一方、標準年輪曲線の延長については、主として試料の不足している江戸時代を対象に、試料収集と計測を実施した。具体的には、・瑞巌寺本堂(江戸時代、ヒノキ・アスナロ材、宮城県)、護国寺月光殿(江戸時代、ヒノキ材、東京都)、十三盛遺跡(平安時代、アスナロ材、青森県)である。護国寺月光殿、十三盛遺跡では計測を完了、瑞巌寺でも、天井板、建具、床板など150点の部材のうち約2/3の計測を完了し、順次、データの解析を進めている。現在までの顕著な成果としては、東北北部において7世紀から16世紀までをカバーする1000年近いアスナロの標準年輪曲線構筆に成功しており、この成果を日本文化財科学会で報告する予定である。また、この標準曲線と現生材の標準曲線とのギャップを埋めるため、江戸時代後期の試料の探索を行った結果、来年度、この時代の弘前藩関係の出土材調査を行うことができる見通しが立った。今年度は、研究の最終年度として、昨年度までに収集した現生・考古試料の測定と解析、および本研究の目標である標準年輪曲線広域ネットワークに基づく年輪変動の地域的区分および木材産地推定の可能性について検討した。現生標準年輪曲線の広域ネットワーク化については、研究分担者、連携研究者と協力し、新たに九州大学宮崎演習林のツガ標準年輪曲線および奈良県吉野のスギ・ヒノキ標準年輪曲線構築を行った。これらに加え、他の年輪研究者が有する各地の標準年輪幅曲線を参照し、年輪幅変動の地域区分を行った。その結果、ヒノキ科およびツガの年輪幅変動は、青森秋田、宮城関東、中部近畿四国、四国九州という大きく4つの共通した変動を持つグループに分けられることが明らかになった。また樹種の違いよりも地理的区分の方が年輪変動に影響を与えることもわかった。現状では、日本海側の曲線が少ないなど、まだ不明の点もあるが、今後の木材産地推定に向けて、ヒノキ科標準曲線のネットワークと基本的な地域区分のデータが得られたことは大きな成果であった。

一方、標準年輪曲線の延長については、主として試料の不足している江戸時代を対象に、試料収集と計測を実施した。具体的には、弘前藩津軽家上屋敷跡(17世紀19世紀)など、江戸時代の江戸遺跡である。弘前藩上屋敷では、現生材と考古材との間にギャップがある18世紀初頭以降および19世紀中頃以降の遺構から出土したアスナロ材を集中的に計測・検討した。その結果、数点の試料がギャップを埋める可能性を示したものの、まだ試料数が少なく、確固たる標準年輪曲線構築には至らなかった。しかしながら、今後、アスナロ材の曲線延長が実現する可能性を格段に高めたと評価できる。本研究の目的のうち、現生標準年輪曲線の広域ネットワーク化については、ほぼ予定の試料収集を達成し、今後解析を進める状態になっている。一方、標準曲線の延長については、未だに江戸時代後期のギャップが埋められていないが、来年度、この時代の遺跡試料を調査できる見通しが立ったため、総合的に見て(2)と判断した。24年度が最終年度であるため、記入しない。現生標準年輪曲線の広域ネットワーク化については、一部未計測試料の年輪幅計測を早急に進め、その後、当初の予定通り、各標準年輪曲線の地域区分を検討する予定である。一方、標準年輪曲線延長では、来年度調査予定の江戸時代後期の遺跡調査を5月中に着手し、最優先でデータ解析を進めることで、古文化財試料と現生材試料とのギャップを埋め、当初計画通り、長期標準年輪曲線構築を達成する予定である。
T細胞によるグリアコネキシン喪失機構の解明とそれに基づく脱髄疾患の新規治療法開発

以前、私たちは多発性硬化症などの中枢神経系脱髄疾患の病理組織の検討で、疾患活動性が高い患者の巨大病巣においてコネキシン(Cx)蛋白が広範に脱落していることを見出した。本研究では、マウス培養細胞を用いてグリア細胞のCx蛋白の減少機序を検証した。結果、Th1細胞が産生するIFNγがミクログリアを活性化し、IL-1βなどの炎症性サイトカインを産生し、それがアストロサイトに作用しCx43発現を減少させることを解明した。Cx蛋白の脱落は細胞間のシグナル伝達をつかさどるギャップ結合の破綻を招き、グリア間で維持されているホメオスターシスを障害し、中枢神経系脱髄疾患の病態を増悪させると考えられる。まず、アストロサイトに発現する代表的なコネキシン(Cx)蛋白であるCx43の発現を低下させる因子を見つけることから開始した。マウスの脳組織からグリア細胞の初代培養を開始し、そこにヘルパーT細胞由来の代表的なサイトカインである、インターフェロン(IFN)-γ、インターロイキン(IL)-4、IL-17などで刺激したところ、IFN-γによって濃度依存的にアストロサイトのCx43の発現が低下することを見出した。ここで培養したグリア細胞にはアストロサイトのみでなく、ミクログリアも混在していることから、磁気ビーズで標識された抗CD11b抗体を用いて、ミクログリアの分離を行い、アストロサイトのみを取り出した。培養アストロサイトをIFN-γで刺激したところ、Cx43の発現に変化がみられず、IFN-γによるアストロサイトのCx43減少には、ミクログリアを介することが示唆された。次に分離したミクログリアにIFN-γを作用させ、その培養上清でアストロサイトを刺激したところ、Cx43の発現低下がみられ、アストロサイトのCx43発現低下には、ミクログリア由来の液性因子を介していることを見出した。その液性因子を同定するため、ミクログリアをIFN-γで刺激した培養上清中の複数のサイトカイン濃度を測定し、IL-1βや腫瘍壊死因子(TNF)-αが増加していることを見出した。そこで、IL-1βおよびTNF-αでアストロサイトを刺激したところ、両因子が作用した時にのみCx43の発現が低下した。以上の研究から、ヘルパーT細胞のうちTh1細胞由来のIFN-γがミクログリアに作用し、IL-1βおよびTNF-αを産生させ、これらのサイトカインがアストロサイトのCx43を減少させることを見出した。アストロサイトの初代培養細胞を使用するにあたり、従来予定していた方法ではミクログリアの混在が無視できないため、磁気ビーズ標識抗体を持ちた分離法へ変更した。またT細胞の分離・分化において、細胞の生存率や分化の程度が一定せず、その条件検討に想定以上の時間を要した。以上の点で予定以上に時間を要したため、その後の研究に遅れが生じている。以前、私たちは多発性硬化症などの中枢神経系脱髄疾患の病理組織の検討で、病巣においてコネキシン(Cx)蛋白が広範に脱落していることを見出した。この変化がみられる人では疾患活動性が高く巨大病巣を形成していることから、このCx蛋白発現低下は中枢神経系脱髄疾患の病変形成・拡大に寄与すると考えた。本研究では、そのCx蛋白(特にアストロサイトのCx43)発現抑制機序についてマウス培養細胞を用いて明らかにした。初年度、炎症性サイトカインのうちインターフェロン(IFN)γがミクログリアを活性化し、この活性化ミクログリアが産生するインターロイキン(IL)-1βなどの炎症性サイトカインがアストロサイトに作用し、Cx43の発現を減少させることを示した。最終年度は、実際に多発性硬化症で病態に深く関与すると考えられているT細胞が実際にアストロサイトのCx43を減少させるのかを検証するため、マウス脾臓細胞からナイーブCD4+ T細胞を分離し、1型ヘルパーT (Th1)細胞、Th17細胞、制御性T細胞を誘導した。そのうちIFNγを産生するTh1細胞のみがアストロサイトのCx43発現を低下させることが示された。また実際にCxの発現変化が多発性硬化症の病態を悪化させるのか、Cx43のコンディショナルノックアウトマウスを作製し、多発性硬化症の実験モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘導し、病態がどう変化するかについては、現在検証中である。以上より、多発性硬化症において中枢神経系に浸潤するTh1細胞が産生するIFNγがミクログリアを活性化し、IL-1βなどの炎症性サイトカインを産生し、それがアストロサイトに作用しCx43発現を減少させることを解明した。Cx蛋白の脱落は細胞間のシグナル伝達をつかさどるギャップ結合の破綻を招き、グリア間で維持されているホメオスターシスを障害し、病態を増悪させると考えられる。

Th1細胞が主に産生するとされるIFN-γが、ミクログリアを介してアストロサイトのCx43を減少させることが分かったため、実際にTh1細胞にも同様の作用があるのかを細胞培養系を用いて検討する。Th1細胞にアストロサイトのCx43を減少させる作用があるのであれば、MOGペプチド反応性Th1細胞やTh17細胞をマウスに移入することで実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を誘導し、Th1細胞移入のものとTh17細胞移入のもので重症度に差があるのかを検討する。またCxのコンディショナルノックアウトマウスを用いてEAEを誘導し、中枢神経系脱髄におけるCx蛋白の重要性について評価する。神経免疫学研究の予備実験に想定以上の時間がかかったため、予定より研究が若干遅れ、そのために一部の研究費が余り次年度使用額が生じた。27年度に行う予定であったT細胞培養の分離・培養・分化を行い、その細胞上清を用いてグリア細胞を刺激し、Cxの発現変化を28年度に調べる予定である。その研究に必要な培地・試薬等の購入に使用する予定である。
アフリカトリパノソーマの病原性因子の探索および機能解析

トリパノソーマ病原性因子を同定するため,第一に,貧血発生因子トランスシアリダーゼの着目し,トリパノソーマ昆虫型で報告されているシアリダーゼ様遺伝子断片(TS1およびTS2)のトリパノソーマ血流型での発現解析,虫体シアリダーゼ活性,およびワクチン接種による感染に対する貧血阻害および感染防御効果を検証した。その結果,血流型でのTS1発現が確認され,TS1免疫マウスではパラシテミア阻害効果はみられなかったものの,貧血阻害および感染防御効果が認められた。よって,血流型発現TS1は原虫病態と関連があると考えられた。第二に,病原性因子とワクチン分子には関連があると仮定し,効果的なワクチン開発およびワクチン抗原スクリーニングを目的に,マンノース被覆オリゴマンノースリポソーム(OML)のアジュバンド効果を解析した。すなわち,リーシュマニア感染に対し,虫体可溶物封入OMLの抗原特異的1型ヘルパーT(Th1)免疫応答誘導能,および感染防御効果の報告(清水ら,2003および2007)を基に,アフリカトリパノソーマ,トキソプラズマ,およびバベシア感染に対するOMLのワクチン効果を解析した。その結果,虫体可溶物封入OMLのワクチン効果はトキソプラズマ感染でみられたものの(生存率57%),アフリカトリパノソーマおよびバベシア感染ではみられなかった(同0%)。また,アフリカトリパノソーマ虫体可溶物封入OMLは,陽性コントロールであるウシ血清アルブミン(BSA)封入OMLに比べ,回収脾臓細胞培養上清中のインターフェロンガンマ(IFN-γ)誘導能を抑制した。本研究より,TS1は病原性因子であることが明らかとなった。また,OMLワクチン効果は封入抗原に依存していることから,様々な原虫遺伝子組換え体の封入OMLワクチン効果を解析すれば,病原性候補遺伝子のスクリーニングが可能と考えられた。よって現在,TS1を含めた組換え体封入OMLワクチンを製作し,その効果を解析中である。
DNAフィンガープリントによるアユクローン系統識別および形質評価法に関する研究

本研究の目的は、ゲノム操作魚の遺伝的特性を表す理論を構築し、雌性発生魚およびクローン魚を用いて各種形質の特性を解明することにある。供試魚として、海産系アユ野性集団から第2極体放出阻止型雌性発生2倍体、第1卵割阻止型雌性発生2倍体およびクローン魚の作出を試み、それら仔稚魚の作出に成功した。これらの供試魚を用いて、個体識別・親子鑑定・クローン系統の識別に有効なDNAフィンガープリント法の簡便化のため非RI法およびRAPD-PCR法を採用し、その有効性を確認した。対照2倍体のDNAフィンガープリントは個体特異的であった。一方、RAPD-PCR法の泳動像についてはクローン魚はすべての切断片を共有していることが確認され、クローンの作出の成功が証明された。卵割型雌性発生2倍体では、完全ホモ化にともないバンド数が減少し、遺伝子型の分離によりBSI値が低下することが確認された。クローン魚を用いて、量的諸形質の遺伝率を推定するため、形態的、生理的、生態的形質を個体別に測定した。遺伝分散推定のため、混合飼育したクローン群の測定値にもとずき、表現分散および変動係数を算出した。クローン群において遺伝変異のレベルの高い形質と低い形質が識別された。本研究の目的は、雌性発生魚およびクローン魚の遺伝的特性を表す理論を構築し、ゲノム操作魚を用いて予測される各種形質の特性を解明することにある。まず、個体識別・親子鑑定・クローン系統の識別に有効なDNAフィンガープリント法の簡便化のための実験を行い、非RI法の有効性を確認した。供試魚として、海産系アユ野生集団から第2極体放出阻止型雌性発生2倍体、第1卵割阻止型雌性発生2倍体およびクローン魚の作出を試み、それら仔稚魚の作出に成功した。これらの作出のため、現有のフレンチプレスを利用した。ゲノム操作の成功の確認のため、DNAフィンガープリントおよびアイソザイムの電気泳動像を検出した。電気泳動像の検出には現有の設備を利用した。一方、対照2倍体のDNAフィンガープリントは個体特異的であったことから、クローン魚の作出が証明された。一方、卵割型雌性発生2倍体では完全ホモ化にともないバンド数の減少が確認された。遺伝分散推定のため、雌性発生2倍体およびクローン群の測定値にもとずき、表現分散および変動係数を算出した。雌性発生2倍体における変異の拡大およびクローン群における変異の縮小のレベルにもとずき、遺伝変異のレベルの高い形質と低い形質が識別された。本年度までに、供試魚として、海産系アユ野生集団から第2極体放出阻止型雌性発生2倍体、第1卵割阻止型雌性発生2倍体およびクローン魚の作出を試み、それら〓稚魚の作出に成功した。これらの供試魚を用いて、個体識別・親子鑑定・クローン系統の識別に有効なDNAフィンガープリント法の簡便化のため非RI法を採用し、その有効性を確認した。対照2倍体のDNAフィンガープリントは個体特異的であり、クローン魚はすべての切断片を共有していることが確認され、クローンの作出の成功が証明された。雌性発生2倍体における変異の拡大およびクローン群における変異の縮小が観察され、遺伝変異のレベルの高い形質と低い形質が識別された。

供試魚として、海産系アユ野生集団から第2極体放出阻止型雌性発生2倍体、第1卵割阻止型雌性発生2倍体およびクローン魚の作出を試み、それら仔稚魚の作出に成功した。これらの供試魚を用いて、個体識別・親子鑑定・クローン系統の識別に有効なDNAフィンガープリント法の簡便化のため非RI法およびRAPD-PCR法を採用し、その有効性を確認した。対照2倍体のDNAフィンガープリントは個体特異的であった。一方、RAPD-PCR法の泳動像についてはクローン魚はすべての切断片を共有していることが確認され、クローンの作出の成功が証明された。卵割型雌性発生2倍体では、完全ホモ化にともないバンド数が減少し、遺伝子型の分離によりBSI値が低下することが確認された。クローン魚を用いて、量的諸形質の遺伝率を推定するため、形態的、生理的、生態的形質を個体別に測定した。遺伝分散推定のため、混合飼育したクローン群の測定値にもとずき、表現分散および変動係数を算出した。クローン群において遺伝変異のレベルの高い形質と低い形質が識別された。
筋組織の異所性骨化に基づく運動器の形成と再生機構の解明

筋芽細胞C2C12を用いて、Bone morphogenetic protein(BMP)の細胞内情報伝達系と、その調節因子を解析した。その結果、転写因子Smadを介した経路が骨芽細胞分化の誘導や筋分化の抑制に重要であり、この抑制経路として転写因子Zranb2や膜上の補助受容体DRAGONを同定した。筋組織で骨化が進行する進行性骨化性線維異形成症は、BMP受容体のALK2の細胞内領域にアミノ酸置換を伴う遺伝的な変異が生じ、Smad経路が構成的に活性化されることが原因と考えられた。本研究では、筋組織内で異所性骨化が進行する遺伝性疾患(進行性骨化性線維異形成症;FOP)をモデルとし、筋組織の発生・再生機序や、骨・軟骨組織の形成機序の解明を目的とする。我々は、FOPでは、強力な骨形成促進活性を有するBone Morphogenetic Protin (BMP)の受容体が1アミノ酸の置換されることで、常に活性化されて骨形成シグナルを伝達することを示した。この受容体を筋芽細胞で発現させると、筋芽細胞の筋分化を抑制し、代わりに骨芽細胞分化を誘導した。また、マウス肢芽由来細胞で変異受容体を発現させると軟骨分化を誘導し、ゼブラフィッシュで過剰発現させるとBMP刺激と同様に拝復軸形成に異常を来すことが判明した。そこで、遺伝的に活性化されたBMP受容体を阻害し、関連疾患の新しい治療法や予防法の開発を目指して、BMPシグナルの抑制機構を解析した。FOPで活性化されたBMP受容体のシグナルは、BMPの補助受容体と考えられてきたDRAGONを共発現すると抑制されることが判明した。また、BMP受容体による細胞内情報伝達には転写因子Smadのリン酸化が重要で、この脱リン酸化を促進するホスファターゼPPM1Aは、BMP活性を阻害することが明らかとなった。この機序を解析した結果、PPM1AはSmadの脱リン酸化を促すだけでなく、Smadのプロテアソームを介した分解を促進することでBMPシグナルを抑制することが判明した。従って、BMPによる骨化を抑制する方法として、DRAGONやPPM1Aの発現を促すような新しい方法が可能であると考えられた。本研究では、全身の骨格筋組織内で異所性骨化が進行する遺伝性疾患として知られる進行性骨化性線維異形成症(FOP)を疾患モデルとし、筋組織の発生・再生機序や、骨・軟骨組織の形成機序の解明を目的とする。すでに我々は、主たるFOPの発症機序として、骨形成促進活性を有するBone Morphogenetic Protein(BMP)受容体であるALK2が遺伝子変異によりアミノ酸置換されることで、構成的に活性化されることを示した。そこで、ALK2より下流の細胞内シグナル伝達因子として、転写因子Smadの機能とその制御機構に着目した。ALK2を含む活性化されたBMP受容体は、Smad1/5/8のC末端に位置するSer-Val-Ser(SVS)モチーフの2つのSer残基をリン酸化する。これらを酸性アミノ酸であるアスパラギン酸に置換すると、BMP受容体非依存的に活性化されることが判明した。このSmad1/5はBMP作用の中で特に骨芽細胞分化に重要であり、筋分化の抑制作用は、Smad1/5と複合体を形成するSmad4が重要であった。Smad4は、BMPシグナル依存的に核内でE4F1と呼ばれる転写調節因子と複合体を形成し、筋分化を抑制するId1などの転写因子を誘導すると考えられた。また、活性化されたSmad1/5を脱リン酸化してBMP活性を阻害すると考えられていたホスファターゼであるPPM1AとSCPIは、どちらも別の細胞内分子を脱リン酸化することで、BMPによる骨芽細胞分化を阻害することが明らかとなった。従って、BMPによる骨化を抑制する新しい方法として、Smad1/5のリン酸化阻害剤や、PPM1AやSCPの発現促進などが有効であると考えられた。Bone Morphogenetic Protein(BMP)は、筋組織内で異所性骨化を誘導し、in vitroにおいて筋芽細胞の分化成熟を抑制しながら、代わりに骨芽細胞への分化を誘導する。このBMPの作用は、細胞膜に存在するBMP受容体によって活性化される転写因子Smadによって核内へと伝達されると考えられている。我々は、構成的活性型Smad1の過剰発現で、BMPの初期応答遺伝子Id1の発現や、筋芽細胞から骨芽細胞への分化を誘導できることを示した。これらの結果は、Smadを介したBMPシグナルが、細胞分化と増殖の両者を制御していることを示唆する。そこで本研究では、Smad1の結合因子を探索した。FLAGタグを付加したSmad1をHEK293細胞に過剰発現させ、抗FLAG抗体を用いてSmad1結合分子を回収し、LC-MS/MS解析で分子を同定した。

同定された分子の中に、BMPとの関連が報告されたことがないZnフィンガー型転写調節因子Zranb2が含まれていた。Zranb2はSmad5/8とも会合し、これらが誘導する初期応答遺伝子の転写や、骨芽細胞分化を抑制した。この抑制作用には、Zranb2のSRドメインを介した核局在が重要であった。NF-kBのp65はSmadのDNA結合を阻害して生物活性を抑制したのに対し、Zranb2はSmadのDNA結合を抑制しなかった。Zranb2は、転写に必要な補助因子とSmadの会合等を阻害する事でBMP作用を抑制すると考えられる。本研究から、BMPの異所性骨誘導作用はSmadを介したものであり、それが細胞内の他の転写制御因子によって正または負に制御される機構が明らかになった。