hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
近赤外光による脳内血液量の周期的変動を指標とした新生児の新しい脳機能検査法の研究

近赤外光を用いた脳機能モニターは、ベッドサイドで患児を拘束せずに測定できる利点がある。ヒトの大脳皮質でモニターされるヘモグロビンの自然な低周期性変動が脳機能の活性化の評価に及ぼす影響や新生児期の脳障害の病態をモニターすることを目的とし、多チャンネルの近赤外分光装置を使用し、脳障害のない新生児を対象に脳内ヘモグロビン濃度の自然な変動を自然睡眠時に測定し、変動周期を検討した。(対象及び方法)正期産児10例(在胎週数3740週、出生体重23583400g、測定日齢212)と早産児11例(在胎週数2334週、出生体重4742048g、測定日齢36163)。光トポグラフィーを使用し、両側の側頭部に12chの4×4cmのプローブ(投光受光部間距離20mm)を装着し、自然静睡眠時に0.1秒毎に10分間連続測定した。酸素化ヘモグロビン(oxyHb)と脱酸素化ヘモグロビン(deoxyHb)の周期的変動について,24chの180秒間のデータをパワースペクトル(PSD)解析し,早産児と正期産児を比較検討した。(結果及び考察)周波数帯を0.020.06,0.060.10,0.100.15Hzに区分し正期産児と早産児を比較した結果,oxyHbのPSDは、周波数帯0.020.06では正期産児が81±4(SD)%,早産児が69±15%で正期産児が有意に高値を示した。0.060.10では正期産児が16±4%,早産児が28±14%で早産児が有意に高値を示したdeoxyHbのPSDについても、0.020.06で正期産児が、0.060.10で早産児が各々有意に高値を示した。以上より正期産児において低周波数帯の成分が多いことが見出された。この現象については不明であるが,出生後の脳発達の差異を示しているかもしれない。新生児・未熟児において中枢神経障害を来す疾患は、脳内の酸素代謝異常即ち脳エネルギー代謝異常に起因するので、病態の解明と予防法の確立には脳内の酸素化状態と循環状態をモニターすることが重要である。今年度の研究では、光トポグラフィーを用いて、頭蓋内病変を有しない正常な早産児と正期産児の脳内ヘモグロビン濃度の自然な変動を自然睡眠時に測定し、変動周期を検討した。(対象及び方法)正期産児10例(在胎週数3740週、出生体重23583400g、測定日齢212)と早産児5例(在胎週数3134週、出生体重16622048g、測定日齢3673)。光トポグラフィーを用い、左右の側頭部に12チャンネルの6×6cmのプローブを装着し、静睡眠時に約10分間連続測定し、酸素化ヘモグロビン(oxyHb)と脱酸素化ヘモグロビン(deoxyHB)の周期的変動について早産児と正期産児を比較検討した。(結果及び考察)

正期産児の左右側頭部のoxyHbとdeoxyHBの周期的変動は、各々左側が3.1±0.6、2.9±0.5サイクル/分、右側が3.1±0.6、2.9±0.6サイクル/分で、早産児のそれらは、左側が3.9±0.6、4.1±0.7サイクル/分、右側が4.0±0.6、4.1±0.6サイクル/分で左右差は認められなかった。正期産児と早産児の比較では、正期産児の方がoxyHb、deoxyHBの周期的変動は有意に少なかった。早産児の測定時の修正在胎週数は3841週で、正期産児と有意差は無いので、この現象については不明であるが、この日齢の早産児では血液ヘモグロビン濃度が低下しているので、脳活動のための酸素供給をサイクル数の増加で補っている可能性が考えられる。今後、未熟児症例数を増やすと共に、中枢神経障害を来す疾患について検討する。近赤外光を用いた脳機能モニターは、ベッドサイドで患児を拘束せずに測定できる利点がある。ヒトの大脳皮質でモニターされるヘモグロビンの自然な低周期性変動が脳機能の活性化の評価に及ぼす影響や新生児期の脳障害の病態をモニターすることを目的とし、多チャンネルの近赤外分光装置を使用し、脳障害のない新生児を対象に脳内ヘモグロビン濃度の自然な変動を自然睡眠時に測定し、低周期性変動をパワースペクトル解析にて検討した。測定は正期産児(n=10)については生後2週以内、早産児(n=5)については修正在胎週数が正期で行った。24ch光トポグラフィーを使用し、両側の側頭部に各々4×4cmのプローブ(投光受光部間距離20mm)を装着し、自然静睡眠時に0.1秒毎に10分間連続測定した。解析には体動のない連続180秒間の記録を24chから1ch選択し、パワースペクトル解析を行った。周波数帯は、0.02 0.04、0.04 0.06、0.06 0.08、0.08 0.10、0.10 0.12,0.12 0.15Hzに区分し、各々の区分周波数帯のスペクトル面積を全面積で除して規格化した(PSD)後、正期産児と早産児を比較検討した。結果および考察:酸素化ヘモグロビンのPSDは、周波数帯0.04以下では2群間に有意差はなく、0.04 0.06では正期産児が54±13(SD)%,早産児が37±15で正期産児が有意に高値を示した。しかし0.06 0.08では正期産児が9±5%,早産児が27±10で早産児が有意に高値を示した。0.08以上では2群間に有意差はなかった。脱酸素化ヘモグロビンのPSDについては、0.02 0.04で正期産児が、0.06 0.08で早産児が各々有意に高値を示した。以上より正期産児において低周波数帯の成分が多いことが見出されたが今後症例数を更に増やすと共に、中枢神経障害を来す疾患について検討する。
骨代謝に対する骨髄顆粒球の作用に関する研究

平成9年までの研究により我々は、低回転型の骨代謝を示す老化促進モデルマウスSAMP6では、骨量減少に先立ち骨髄造血が亢進していることや若年期から骨髄中の顆粒球が増加していること、その骨髄顆粒球の増加がG-CSFの発現亢進に起因することなどを報告した。そこで、この骨髄顆粒球の増加と骨量減少の関連を解析するため、16週齢のSAMRlにG-CSF(1μg/day)を連日皮下投与し、3週後に骨髄細胞のflow cytometry解析を行うとともに、大腿骨の骨密度を計測した。G-CSFを投与したR1マウスでは、vehicle投与群に比べ抗Gr-1抗体陽性の顆粒球が骨髄において著しく増加していた。その骨髄顆粒球造血の亢進はSAMP6に類似していた。またG-CSF投与群では、大腿骨の骨密度が著明に減少していた。また、これらのマウスの脛骨より無菌的に骨髄細胞を採取し、ALP染色を用いたコロニーアッセイにより骨芽細胞前駆細胞であるCFU-Fを測定したところ、G-CSF投与群では、vehicle投与群に比して有意に減少していた。これらの事実は、G-CSFを投与したRlマウスの骨量減少が、SAMP6と同様に骨形成の低下に起因していることを示唆するものである。さらに、G-CSFの骨代謝調節作用を解明するため、8週齢雄性ddyマウスの脛骨より骨髄細胞を採取し、G-CSFを添加し培養してみたところ、濃度依存的に顆粒球の分化は増加するものの、この培養細胞における骨芽細胞の機能は、G-CSF添加群とコントロール群の間に有意な差は認めなかった。この事実は、G-CSFが直接骨芽細胞に作用し骨量を減少させているのではなく、in vitroにおいて骨髄間質細胞をはじめとする骨髄微小環境に作用して、骨代謝をコントロールしている可能性を示唆するものである。低回転型の骨代謝を示す老化促進モデルマウスSAMP6と正常な老化を示すSAMR1の脛骨より骨髄細胞を採取し、flow cytometryにより骨髄中の造血系細胞を週齢を追って解析したところ、SAMP6では骨量減少に先立って骨髄造血が亢進していること、および若年期から骨髄中の顆粒球が増加していることが明らかとなった。一方で、正常に老化が進行するSAMR1の骨髄では、24週以降加齢が進むと顆粒球が増加した。そこでこの顆粒球増加の原因を明らかにするため、SAMP6及びSAMR1の骨髄細胞よりtotal RNAを抽出し、RT-PCR法にてG-CSFmRNAの発現を解析したところ、SAMP6ではG-CSFmRNAの発現が亢進しており、SAMP6における骨髄顆粒球の増加がG-CSFの産生亢進に起因することが示唆された。さらにG-CSFによる骨髄顆粒球増加と骨量減少の関連を解析するため、16週齢のSAMR1にG-CSF(1μg/day)を連日皮下投与し、3週後に骨髄細胞のflow cytometry解析を行うとともに、大腿骨の骨密度を計測した。またG-CSF投与群では、大腿骨の骨密度が著明に減少しており、P6マウスに類似した低骨密度を呈した。以上の結果より、SAMP6ではSAMR1とは異なり、若年期より骨髄中の顆粒球が増加しており、骨髄造血環境の老化が早期に起こることが示唆された。また、SAMP6の骨髄においてG-CSFの発現が亢進していることと、SAMR1にG-CSFを投与して骨髄顆粒球を増加させるとSAMP6様の造血亢進と骨量減少を認めたことから、G-CSFに依存した骨髄造血環境の変化が骨の老化と密接に関連していることが示唆された。

さらに、G-CSFの骨代謝調節作用を解明するため、8週齢雄性ddyマウスの脛骨より骨髄細胞を採取し、G-CSFを添加し培養してみたところ、濃度依存的に顆粒球の分化は増加するものの、この培養細胞における骨芽細胞の機能は、G-CSF添加群とコントロール群の間に有意な差は認めなかった。この事実は、G-CSFが直接骨芽細胞に作用し骨量を減少させているのではなく、in vitroにおいて骨髄間質細胞をはじめとする骨髄微小環境に作用して、骨代謝をコントロールしている可能性を示唆するものである。
白金族元素吸着ポリマーの特性の解明及び高レベル廃液からの分離回収への適用研究

本研究は、ベタイン型ポリマーの硝酸水溶液中の白金族元素(Ru, Rh, Pd)に関する吸着挙動の評価及び、その応用としてクロマトグラフィー法を用いた硝酸水溶液からの白金族元素分離回収法の提案を目的としている。平成30年度としてはPd, Rh, Ru以外の金属イオンとしてFe(III), Co(II), Ni(II), Ag(I)についても検討を行なった。その結果、これらのイオンに関しては、0.1 Mの硝酸溶液で若干の鉄の吸着が見られたが、0.1-3 Mの硝酸溶液でその他の金属イオンの吸着は起こらなかった。したがって、ベタイン型ポリマーは、Pd, Rh, Ruに高い選択性を持っていることがわかった。クロマトグラフィー試験の結果としては、アミン混合硝酸溶液からPd, Rh, Ruを全量ポリマーに吸着させ、硝酸で洗浄することで、Rh, Ruを溶離させ、チオ尿素を含む硝酸溶液でPdを分離することができた。また、Pdの吸着メカニズム解析をPd K edge XAFS測定やab initio計算により進めた。結果として、ベタイン型ポリマーの官能基であるカルボキシレートが配位することで、Pdを吸着していることが示唆された。一方、RuやRhに関してもXAFS測定で検討を行なったが、カルボキシレートが配位しているという明確な結果は得られなかった。この違いが、ベタイン型ポリマーから硝酸で溶離する際の挙動の違いに影響している可能性がある。本研究成果として、Ru, RhからPdを分離できることが明らかになった。また、上述のようにベタイン型ポリマーは、Fe(III), Co(II), Ni(II), Ag(I)に吸着性をほとんど示さないことから、これらの金属イオンを含む硝酸溶液からRu, Rh,またはPdを分離できる可能性が示唆された。初年度としては、ベタイン型ポリマーの硝酸水溶液中のRu(III)に関する吸着挙動について検討を行った。具体的にはベタイン型ポリマーとRu(III)を含む硝酸水溶液を混合し、混合前後の水溶液中の金属イオンの変化から吸着率を算出した。その結果、pH1付近で高い吸着率を示し硝酸濃度の上昇に伴い吸着率が減少するが、硝酸濃度1M以上において、吸着率が徐々に上昇していくことが確認された。水素イオン濃度や硝酸イオン濃度のみを変化させ検討を行った結果、水素イオン濃度が低く、硝酸イオン濃度が高い溶液条件において吸着率の上昇が確認された。硝酸を吸着したベタイン基の水素イオンとRuイオンのカチオン交換による吸着と予想される。赤外分光法を用いて、Ruを吸着後のポリマーを調べたところ、吸着前後でカルボキシレートのピークのシフトが観測されたことから、ベタイン基のRuへの配位が吸着に関与していることが示唆された。トリエチルアミンを水溶液に添加した系でも同様にRuの吸着挙動の検討を行った。その結果、トリエチルアミンの添加量が多いほど、水溶液中の水素イオン濃度が減少し、一方で、Ruの吸着率の増大が確認された。これより、アミンの効果は、硝酸水溶液中の水素イオン濃度を減少させ、Ruの吸着を促進させることであると考察した。Ruとベタイン型ポリマーの反応を評価するために必要な吸着データや分光学的データを得ることができた。平成29度としては、ベタイン型ポリマーの硝酸水溶液中の白金族元素に関する吸着挙動の温度依存性について検討を行った。具体的にはベタイン型ポリマーと3種の白金族元素を含む硝酸水溶液(0.1-3 M)を6.560度の温度で混合し、混合前後の水溶液中の金属イオンの変化から吸着率を算出した。その結果、Ru(III)に関しては、実験した温度領域及び硝酸濃度で温度上昇に伴う吸着率の増加を確認した。一方、Rh(III)に関しては、硝酸濃度1 M以上で若干の吸着率の上昇が起こった。Pd(II)に関しては、温度依存性は確認できなかった。そこで、Ruの温度上昇による吸着率増大現象を明らかにするために、異なる温度条件での振とうしたRuを含む0.1 M及び3.0 M硝酸溶液及びそれらの溶液からRuを吸着させた樹脂のRu K edge XAFSを測定した。その結果、溶液及び樹脂中で共に温度上昇に伴うRuの構造の変化は確認できなかった。したがって、温度上昇によるRuの吸着率増大は、Ru吸着反応の速度上昇によるものと予想される。錯化剤については、白金族元素の吸着のマスキング試験から検討し、チオ尿素でもっとも吸着率の減衰が確認された。硝酸溶液中及び吸着剤中のRuのXAFS測定から、Ruの吸着前後の配位構造評価ができ、Ruの吸着反応の温度影響について考察することができた。

その結果、これらのイオンに関しては、0.1 Mの硝酸溶液で若干の鉄の吸着が見られたが、0.1-3 Mの硝酸溶液でその他の金属イオンの吸着は起こらなかった。したがって、ベタイン型ポリマーは、Pd, Rh, Ruに高い選択性を持っていることがわかった。クロマトグラフィー試験の結果としては、アミン混合硝酸溶液からPd, Rh, Ruを全量ポリマーに吸着させ、硝酸で洗浄することで、Rh, Ruを溶離させ、チオ尿素を含む硝酸溶液でPdを分離することができた。また、Pdの吸着メカニズム解析をPd K edge XAFS測定やab initio計算により進めた。結果として、ベタイン型ポリマーの官能基であるカルボキシレートが配位することで、Pdを吸着していることが示唆された。一方、RuやRhに関してもXAFS測定で検討を行なったが、カルボキシレートが配位しているという明確な結果は得られなかった。この違いが、ベタイン型ポリマーから硝酸で溶離する際の挙動の違いに影響している可能性がある。本研究成果として、Ru, RhからPdを分離できることが明らかになった。また、上述のようにベタイン型ポリマーは、Fe(III), Co(II), Ni(II), Ag(I)に吸着性をほとんど示さないことから、これらの金属イオンを含む硝酸溶液からRu, Rh,またはPdを分離できる可能性が示唆された。これまでに取得したRuとベタイン型ポリマーの基礎的な吸着データを基に、水溶液の温度上昇に伴うRu吸着率の増加現象に関する挙動の解明を進める。温度上昇時にRuを吸着したベタイン型ポリマーに関してXAFSやFT-IR測定を行い、吸着時の温度上昇の有無による分子構造の変化についても検討を行う予定である。平成28年度及び平成29年度で得られた情報を基に分離条件を検討していく。実験が円滑に進み試薬等の消費量が予定より少なかったため次年度は、カラムクロマトグラフィー試験を予定しているため、フラクションコレクター及びその試験に関わる消耗品の購入を考えている。試薬の購入を予定している。
加速度のマイクロ計測による潜水性海鳥の最適採食行動の研究

海鳥はクジラやアザラシにくらべ体重補正するとはるかに長く深く潜水する。その生理的メカニズムの解明のため室内実験がくりかえされてきた。潜水中は酸素供給が制約されるため最適採食行動の理論的研究テーマとしても注目されている。しかしながら、潜水中のエネルギーコストと餌獲得の測定が困難なため実証研究は不十分であった。本研究は野外の海鳥の潜水行動と餌捕獲を詳細に測定して、変化する海洋環境中での最適潜水戦略を分析した。特に、動物が水中で直面する浮力と遊泳抵抗という物理的困難に対するストローク調節に着目した。そのため、自由に深く潜水する間のあしけりおよび羽ばたき運動を装着型データロガーで記録しその高い潜水能力にともなう運動エネルギーをもとめると同時に、潜水中のハビタット利用と餌獲得をカメラロガーで記録した。その結果、1)足かきによるコストの上昇と遊泳速度の上昇による移動時間の短縮の利益をてんびんにかけて足かきを調節している、という新しい仮説を提出し、2)毎秒2m程度の遊泳速度を保つために、羽羽ばたき潜水専門家と海生ほ乳類では、ストローク頻度を体重の0.3乗で小さくしているが、3)羽ばたきあるいは足けりで海中と空中の両方を移動するグループでは、この基本ラインからはずれたストローク頻度を持っており、これは、物理条件が異なる媒体の両方を、翼あるいは翼と足ひれで、それなりに効率よく移動するための妥協であることが推察された。さらに、4)飛行中の羽ばたき周波数を数分レベルで記録することによって、その潜水バウト後の体重増加、つまり採食量が推定できること、5)映像データから異なるハビタットの利用頻度とそこでの詳細な採食鼓動を解析できることがわかった。また、ベーリング海で繁殖するハシブトウミガラスの野外調査を行い、6)年によって、海氷状況の変化とともに変わる水温構造と,それによって生じる餌生物の種組成や鉛直分布の違いの影響を受け,異なる年の間で採餌潜水行動を変化させていることを明らかにした。本研究の実施にあたり、その参考とするために既存の野外観測データを解析し、本研究テーマにかかわる部分の研究とりまとめをおこなった。1)翼ではばたくペンギンやウミガラス、いずれも沈降中は深度とともに急速に低下する浮力抵抗につり合うよう平均的な前進出力を低下させて、ほぼ一定の速度で遊泳したが、その速度は種ごとに異なっていた。ペンギンでは多分出力を変えて、ウミガラスは打ち上げによる出力を変えることで、前進出力頻度を調整していた。以上の推論は、定速遊泳を仮定しており、実際には彼等は羽ばたきに伴い急な加速減速をくりかえすため、これに見合ったモデルの構築が必要である。一方、いずれの種でもパワーストローク時間とその時の最大出力はほぼ一定に保たれていると考えられた。2)プリビロフ島に繁殖するハシブトウミガラスが、繁殖地周辺の島周りにできる湧昇域で採食する時は、数十メートルまでの深い潜水をし、はなれた海域で水温躍層がある場所では、20-30mの水温躍層深度まで浅い潜水をすることがわかった。餌の鉛直分布に関する知識をもっている可能性が示唆される。3)60-90mまで潜水するアオメウは40m程度で中性浮力に達すると予想される。沈降浮上はほぼ鉛直に行われた。沈降中は低下する浮力にあわせるように足かき頻度を、グライド時間を延ばすことで、低下させており、速度は40-50mで最大であるがほぼ一定だった。

底から40-50mまでの浮上中は足かき頻度を低下させ、速度はやや低下し、40-50mで最低速度に達して足かきを停止し、その後受動的に浮上した。このような速度変化パターンは最適遊泳速度仮説からは説明できない。足かきは運動とコストがかかるが、さらに抵抗が上昇するのでそれをうちけす仕事が必要になる。このような足かきによるコストの上昇と遊泳速度の上昇による移動時間の短縮の利益をてんびんにかけて足かきを調節している、という新しい仮説を提出した。スコットランドのメイ島でヨーロッパヒメウにカメラロガーを装着する予備実験を行った。その結果、装着方法やデータ解析手順を確立しつつある。浅い場所では十分な光量があり、餌の捕獲や海底景観などの映像が得られたが、深いところでは映像がまだ荒いことがわかった。さらに器具の改良が望まれる。これらの成果をふまえ、生態学会大会で本テーマに関する自由集会を開き、現時点でのとりまとめをフィードバックして、今後の研究実行計画を打ち合わせる予定である。1)スコットランドのメイ島でヨーロッパヒメウにカメラロガーを装着し、そのマイクロハビタット利用と餌獲得を明らかにした。また、背中と首に加速度深度ロガー(D2GT)を装着し、体の加速度から潜水中の足かきを、首の加速度変化から採食行動を研究した。ヨーロッパヒメウは岩やソフトコラルが優先するハビタットで主にギンポを食うとともに、砂ハビタットでの採食も頻繁におこなうことがわかった。餌生物を映像で確認はできなかったが、砂ハビタットでは、イカナゴを捕食していたと考えられ、この場合は最適潜水モデルがあてはまりやすいと予想された。ひとつの潜水バウトでは、砂か岩いずれかのハビタットを利用し、1日のなかでは両方のハビタットを利用する個体が多かった。砂ハビタットで採食する場合は、バウト中の深度変化が小さく、体軸を下に向け、時折頭だけ動かして嘴を砂にはげしくつつき入れる行動が、画像および胴体と首の加速度変化から確認された。岩やソフトコラルが優先するハビタットでは、底滞在中も体が水平になることが多く、横への移動が頻繁であると推定された。岩やソフトコラルのハビタットで採食中は他の個体はまったく撮影できなかったが、砂のハビタットで採食中はしばしば他の個体が写っていた。海洋環境変化によって主要な餌が利用できなくなった場合、それに替わる餌を捕食することがどのようなメカニズムで海鳥の生活に影響するか明らかにする為に、こういった映像データは役に立つだろう。これらの成果は、日本島学会、太平洋海鳥会議で発表された。2)アラスカのプリビロフ島で、ハシブトウミガラスに深度温度ロガーまたは加速度深度ロガー(D2GT)を装着しその採食行動を調べるとともに、雛への餌の観察、胃内容物の調査、血液の安定同位体比の分析によって、これらの個体の食性を明らかにした。2004年は2006年に比べて水温は全体的に高かった。2004年には高SST海域の利用頻度が高く、また潜水深度分布のピークが水温路肩直下の深度と一致していた。一方で2006年は島に近い低SST海域側の利用頻度が高く、潜水深度分布のピークと路層の深度との関連性は、2004年ほど明確ではなかった。2004年にはイカナゴ、タラが優占したのに対し、2006年にはイカ、カレイ、タラが優占していた。
遺伝子発現型腫瘍融解性ウイルスを用いた胃癌オーダーメイド治療の開発

切除不能進行・再発胃癌に対する現在の治療は十分ではない.現在腫瘍融解性ウイルスを用いた治療が期待されており,このウイルスは遺伝子の変異により腫瘍特異的に増殖するがウイルス増殖に必要な遺伝子の変異により抗腫瘍効果が十分でない場合もある.本研究では個々の症例で適切な遺伝子を選択・制御したウイルスの構築を目的とした.免疫染色で遺伝子発現を検討・選択して治療効果の改善を認め,ウイルスを用いた胃癌への治療効果の改善が示唆された.切除不能進行・再発胃癌に対する現在の治療は十分ではない.現在腫瘍融解性ウイルスを用いた治療が期待されており,このウイルスは遺伝子の変異により腫瘍特異的に増殖するがウイルス増殖に必要な遺伝子の変異により抗腫瘍効果が十分でない場合もある.本研究では個々の症例で適切な遺伝子を選択・制御したウイルスの構築を目的とした.免疫染色で遺伝子発現を検討・選択して治療効果の改善を認め,ウイルスを用いた胃癌への治療効果の改善が示唆された.本年度(平成22年3月31日)の研究実施計画I.スキルス胃癌よりのサンプル組織の採取・細胞株の樹立・遺伝子プロファイル作成1) 2004年から2009年に施行したスキルス胃癌切除例のホルマリン固定標本を用いて免疫染色にて各種遺伝子の発現について検討を行った。現在までにTGF-β1およびthrombospondin-1についての免疫染色を施行しており、TGF-β1については40例中19例で発現を認めた。thrombospondin-1については現在免疫染色の結果を検討中である。また、その他の遺伝子についても免疫染色等での発現の検討を予定している。II.遺伝子発現プロシァイルの解析および遺伝子の選択免疫染色による遺伝子発現について解析中である。III.強制発現候補遺伝子およびsiRNA発現型プラスミドの構築I・IIの結果に基づきClontech社製QUICK-Clone cDNAから目的遺伝子の5'および3'プライマーを設定し、high fidelity型PCR酵素KOD plus(東洋紡)を用いたPCRにてcDNAの増幅を予定する。これをクローニングし、遺伝子発現型プラスミドに挿入して発現型プラスミドの構築を予定している。siRNA発現型プラスミドの構築については遺伝子発現解析の結果に基づきsiRNAオリゴDNAを設計し、タカラバイオ社製pBA-sihU6に挿入して構築を予定している。手術標本からのサンプル採取を行い,腫瘍組織からの遺伝子プロファイルを解析・腫瘍細胞株の樹立を試みたが,術前化学療法施行のため腫瘍組織の線維組織への置換が強く,また腫瘍組織中の腫瘍細胞のviabilityが低かったため腫瘍細胞のみの単離培養が困難で,4型胃癌切除標本中の腫瘍細胞の腫瘍細胞株の樹立は行えなかった.切除標本からのmicrodissectionによる腫瘍細胞の遺伝子発現プロファイル解析結果は解析可能な切除症例数が少なく,遺伝子発現プロファイル解析では明らかな発現の上昇および低下の傾向は認められなかった。そのため免疫染色にて4型胃癌の発現分子を検討した。4型胃癌では免疫染色でTGF-betaの発現低下を認め、TSP-1の発現も低下が認められたためTGF-betaを強制発現遺伝子候補としてTGF-beta発現型腫瘍融解性ヘルペスウイルスを新規に作成した。新規に作成したTGF-beta発現型腫瘍融解性ヘルペスウイルスおよびTSP-1発現型腫瘍融解性ヘルペスウイルスにより既存の4型胃癌細胞株での治療実験を行い、MOI=0.01では抗腫瘍作用の上乗せ効果を有意に認めたがMOI=0.1では有意差は認めなかった。ウイルスの増殖能については発現遺伝子の導入によりウイルス複製能の変化は認めなかった現在他の遺伝子についても4型胃癌細胞での発現分子の免疫染色による検討を行い、遺伝子発現・抑制型腫瘍融解性ヘルペスウイルスを作成して4型胃癌治療に対するウイルスライブラリーを作成中である。
アルドラーゼB遺伝子転写制御因子の構造, 機能および発現

ラットアルドラーゼB遺伝子(以下B遺伝子)の組織特異的な発現機構を解析するために, B遺伝子に組織特異的な転写に関与するシスエレメントの解析,そのようなce l type-specific promoterに結合する因子の同定およびその発現に関する解析を行ない,以下のことが判明した.B遺伝子上流域をCAT遺伝子に結合させたもの,およびその5欠失体を種々作成し,いくつかの培養細胞に導入しCATの発現を見るという方法(CATアッセイ)でB遺伝子のプロモーター領域を検索した結果, cap site上流-520-120bpの領域中に, call type-specificに機能するプロモーターが存在することが判明した.次に上記領域に結合する因子の存在をDnase Iフットプリント,ゲルシフトアッセイ,およびサウスウエスタン法で調べた. Dnase Iフットプリントから-160-100bpの領域中に少なくとも3カ所(5側から,サイトC,サイトR,サイトA)の蛋白結合サイトがあることが判明した.このうち2カ所,サイトAおよびCは同一の蛋白によって認識されることがゲルシフトアッセイによって示された.蛋白の認識する塩基配列から上記サイトAおよびCに結合する因子はすでに報告されているAP-Iあるいはそれに関連する因子であると予想された.サイトBに結合する因子は,胎仔の発生過程で増加し,化学発癌過程で減少する.サウスウエスタン法でこの因子の分子量を調べた結果,約32.5Kであった.この結合活性の増減は, B遺伝子の転写活性と相関するので, B遺伝子に正に作用するtrans-actingj因子と考えられた.現在本研究で見いだした因子の精製を行っており,それらの機能をin vitroの転写系でくわしく解析することを考えている.また,上記因子が多の肝特異的な遺伝子に対し同時に作用するかどうかという点も興味あるところである.ラットアルドラーゼB遺伝子(以下B遺伝子)の組織特異的な発現機構を解析するために, B遺伝子に組織特異的な転写に関与するシスエレメントの解析,そのようなce l type-specific promoterに結合する因子の同定およびその発現に関する解析を行ない,以下のことが判明した.B遺伝子上流域をCAT遺伝子に結合させたもの,およびその5欠失体を種々作成し,いくつかの培養細胞に導入しCATの発現を見るという方法(CATアッセイ)でB遺伝子のプロモーター領域を検索した結果, cap site上流-520-120bpの領域中に, call type-specificに機能するプロモーターが存在することが判明した.次に上記領域に結合する因子の存在をDnase Iフットプリント,ゲルシフトアッセイ,およびサウスウエスタン法で調べた. Dnase Iフットプリントから-160-100bpの領域中に少なくとも3カ所(5側から,サイトC,サイトR,サイトA)の蛋白結合サイトがあることが判明した.このうち2カ所,サイトAおよびCは同一の蛋白によって認識されることがゲルシフトアッセイによって示された.蛋白の認識する塩基配列から上記サイトAおよびCに結合する因子はすでに報告されているAP-Iあるいはそれに関連する因子であると予想された.サイトBに結合する因子は,胎仔の発生過程で増加し,化学発癌過程で減少する.サウスウエスタン法でこの因子の分子量を調べた結果,約32.5Kであった.この結合活性の増減は, B遺伝子の転写活性と相関するので, B遺伝子に正に作用するtrans-actingj因子と考えられた.現在本研究で見いだした因子の精製を行っており,それらの機能をin vitroの転写系でくわしく解析することを考えている.また,上記因子が多の肝特異的な遺伝子に対し同時に作用するかどうかという点も興味あるところである.
非熱平衡プラズマと触媒の相互作用による高効率排ガス分解

本研究は,触媒と非平衡プラズマの相互作用を積極的に利用することで,窒素酸化物等の排ガス分解効率を飛躍的に向上させることを目的としたものである。特に,ガスとの接触面積が大きく,圧力損失の小さいハニカムセラミックスを利用することで,新しい放電リアクタの開発を目指したものである。本年度は,モノリス型と呼ばれるレンコン形状のハニカムセラミックスを用いた放電リァクタを試作し,静電誘導型(SI)サイリスタを用いた全固体高繰り返しパルス電源を用いてガス分解実験を行った。実験に用いたガスは,一酸化窒素を純窒素で200ppmに希釈した模擬排ガスで,触媒には酸化チタンを利用した。本年度の実験結果から得られた知見を以下にまとめる。1,酸化チタン触媒存在下においては,酸化チタンが酸化触媒として作用することにより,一酸化窒素の二酸化窒素への変換が促進される。2,触媒の作用は,非平衡プラズマから放射される紫外光(主に窒素分子からの発光)による光触媒効果によるものである.3,モノリス型ハニカムセラミックス中の放電は,セラミックス表面状態により多大な影響を受ける。ハニカムセラミックス表面での一酸化窒素の吸着効果はほとんど観測されなかった.これは,今回利用したハニカムセラミックスの表面構造によるものであると考えられる。5,今回の実験では,純窒素希釈の模擬排ガスを使用したため,酸化触媒による効果は非常に小さかったものの,ハニカムセラミックスと放電を組み合わせることで,これまで報告されている分解効率を凌ぐ効率(NO分解率56.2%において,12g/kwh)を得ることに成功した。本研究は、非熱平衡プラズマ中のラジカル反応と各種触媒による化学反応との相互作用により高効率な排ガス分解を実現することを目的とする。本年度はその準備段階として、排ガスとの接触面積の大きなハニカムセラミックス中で安定した非平衡プラズマを生成し、非平衡プラズマとセラミック壁との相互作用を確認するための実験を行った。まず、大気圧下にて安定した非平衡プラズマを発生させるために、SIサイリスタとパルストランスを組み合わせた高速パルス電源を制作した。パルストランスに強磁性アモルファス鉄心を用い、SIサイリスタを大電流ゲート駆動することにより、波高値40kV、パルス幅100ns、繰り返し周波数2kHzを実現した。このパルス電源をハニカムセラミックスを用いた放電リアクターに接続することにより、大気圧下において安定なプラズマが生成されることを確認した。このリアクターに一酸化窒素を純窒素で希釈した模擬排ガスを通すことにより、最大95%の一酸化窒素を分解することに成功した。リアクターに用いたハニカムセラミックスには、排気フィルター用のコージェライトと水フィルター用のモノリス型多孔質アルミナセラミックスを用いた。実験結果から、多孔質アルミナセラミックスを用いた場合、リアクター内部での二酸化窒素生成が大幅に低減できるとう知見を得た。これは、セラミックス表面での反応が非平衡プラズマ中での体積反応とは異なることを示す結果であり、触媒作用との併用の可能性を示すものであると考える。
実用的学習速度を達成する新学習則の開発

本申請研究の目的は、実際的な規模のニューラルネットワークの学習において、実用に耐えうる学習速度を得ることのできる学習アルゴリズムを開発する事である。本研究における高速学習の基本原理は、私が開発したLocal Feature Learning Algorithmであるが、この方式には上記目的で述べたように、実用的な問題に適用出来るように拡張することが必要である。初年度は、多次元から1次元への関数学習へのLocal Feature Learning Algorithmの適用ついては、人間がスクロールする画面上でマウスを動かし、その軌跡から、将来マウスが通るべき経路を予測する問題を設定し検討を行い、多次元から1次元への関数学習問題としての検討を行い、多次元から1次元への学習においての効果を確認する事が出来た。この成果を元に最終年度である今年度は、Local Feature Leaming Algorithmが目的関数の高次の微分情報を利用することで学習の高速化を行っているが、入力を多次元化したこの問題では、その微分情報を正確に計算するには、非常に多くの計算量を必要とするが、本研究では、データ点として与えられる任意の一方向に対してのみこの微分値に相当する変化量を利用することでの効果を実験的な手法検討を昨年度に引き続き行った。その結果、多次元入力・多次元出力でも効果が現れることが確認できた。また、更なる高速学習を目指すために、Local Feature Learning Algorithmに使われるパラメータの動的な変更についての検討を昨年度に引き続き行った。パラメータの切り替えのタイミングについては効果的なスケジューリング則を得るところまでは到達できなかった。しかしながら、多次元から多次元への学習において計算量の非常にかかる正確な微分情報を計算せずとも、Local Feature Learning Algorithmを適用することで高速化が可能であることから、実用化へ一歩近づいたものと思われる。そこで、初年度である今年度は、多次元から1次元への関数学習へのLocal Feature Learning Algorithmの適用ついては、人間がスクロールする画面上でマウスを動かし、その軌跡から、将来マウスが通るべき経路を予測する問題を設定し検討を行った。この問題では、入力としてサンプル間隔を設定することで、過去に遡った実マウス経路の複数点を用いる事で多次元入力を実現し、将来のマウスの位置を予測値として出力することで、多次元から1次元への関数学習問題としている。Local Feature Learning Algorithmが目的関数の高次の微分情報を利用することで学習の高速化を行っているが、入力を多次元化したこの問題では、その微分情報を正確に計算するには、非常に多くの計算量を必要とするが、本研究では、データ点として与えられる任意の一方向に対してのみこの微分値に相当する変化量を利用することで実現を試みた。その結果、多次元化した場合にはこの方式でも十分な学習の高速化がなされることを確認できた。このことは、実計算時間の軽減に直接結びつく結果で有用である。しかしながら、定量的な評価までは至っておらず、また、多出力への拡張も必要であり次年度も引続き検討する予定である。また、更なる高速学習を目指すために、Local Feature Learning Algorithmに使われるパラメータの動的な変更についての検討を行った。その結果により、学習過程においてこのパラメータを0に設定することで、通常の学習方法よりも高精度の関数近似を実現出来る事を確認する事が出来た。ただし、このパラメータの切り替えのタイミング等の検討は次年度の課題として残った。
境界適合格子を用いた乱流LESにおけるダイナミックSGSモデルの定式化と数値検証

計算機性能の向上により、乱流直接解析の可能性が開かれたものの適用範囲はごく限られており、直接解析の適用できない複雑な乱流場の解析手段としてラージ・エディ・シミュレーション(LES)が注目されている。LESでは、乱流の主要な変動は直接計算し、計算格子より小スケール運動のみをモデル(SGSモデルと呼ばれる)化するため、統計平均モデルに比べて近似の影響は小さいと考えられている。従来まで、Smagorinshkiモデルと呼ばれる代数式型の簡易なモデル化が広く用いられてきたが、複雑乱流への適用するには多くの欠点が指摘されている。近年では、壁近傍や低レイノルズ数流れでの挙動を正しく予測し、かつモデル定数をダイナミックに決められるダイナミックSGSモデルの適用が注目され、数々の基礎研究が行われている。本研究では、さらに工学的に実用性の高い流れ問題を解析をするために、一般座標系格子の差分法および非構造格子の有限要素法用いた場合の応用解析についてダイナミックSGSモデルへの適用を行った。その際、各々の離散化手法に敵した空間フィルターの定式化とその検証が重要な課題となる。解析対象としては、解析結果の比較・検討のためのデータベースが充実していることから、チャネル乱流を取りあげた。差分法においては、Gaussian空間フィルターとVolume空間フィルターの差分式の精度評価、BardinaによるScale Similarityモデルに基づくダイナミックSGSモデルの定式化とSGS応力分布の予測、局所平均化によるダイナミックSGSモデルの数値不安定性の改善について、チャネル乱流の解析を通して数値検証を行った。一方、有限要素法においては空間フィルターの定式化と非構造格子におけるダイナミックSGSモデルの数値誤差の評価について、同様にチャネル乱流を解析対象として数値検証を行った。
日本鉱山絵巻の分類と鉱山技術の伝播・交流に関する研究

江戸時代に全国の鉱山の中心的存在であった佐渡金銀山は、鉱山技術のみでなく鉱山絵巻製作にあたっても他鉱山に影響を与えたことを、佐渡金銀山絵巻と石見銀山絵巻との比較などから明らかにした。佐渡金銀山絵巻は新技術の導入や管理体制の変化に伴って部分的に内容が更新されながら百数十年にわたって描き継がれ、国内外に100点以上の所在が確認されているのに対し、石見銀山をはじめとする国内鉱山の絵巻の数は継続的な製作の傾向が少なく、その数もそれぞれ10点に満たないことも傍証となることを指摘した。本研究は,全国の鉱山絵巻についてその分類や年代特定を試みながら,鉱山技術と鉱山絵巻作成の伝播・交流を体系的に明らかにし,それらを近世日本鉱山史全体のなかに位置づけようとするものである.本年度は,東京大学,国立歴史民俗博物館,岩手大学,岩手県立博物館,石川県立歴史博物館,魚津市教育委員会等が所蔵する絵巻原史料16点を調査した.また写真等で4点の絵巻史料のデータを入手し,計20点の構成・内容等を分析した.この結果,各地で確認される鉱山絵巻は,各鉱山の特色を示しながらも,展開・構図に強い類似性が確認された.とりわけ,越中松倉金山絵巻として伝えられる絵巻は,明らかに佐渡金銀山絵巻の展開・構図をモチーフとしたものであることが確認された.ここから,各地の鉱山絵巻の成立そのものも,各種鉱山技術同様に,石見や佐渡といった先進鉱山の絵巻を手本として描かれるようになった可能性を示すことができた.特に佐渡金銀山絵巻は100点以上の存在が知られ,数量や質において他の鉱山のそれを圧倒しているため,佐渡金銀山絵巻を軸とした比較検討が有効であることが確認できた.また,文献調査を併行し,調査絵巻に描かれる諸技術(坑内の排水器具等)の導入年代等を調査し,鉱山間の技術の伝播・交流や絵巻作成年代等について検討を行った.本研究は、全国の鉱山絵巻についてその分類や年代特定を試みながら、鉱山技術と鉱山絵巻作成の伝播・交流を体系的に明らかにし、それらを近世日本鉱山史全体のなかに位置づけようとするものである。本年度は、国立科学博物館、京都府立総合資料館、三菱UFJ貨幣資料館、個人等が所蔵する絵巻原史料18点を調査した。また写真等で2点の絵巻史料のデータを入手し、計20点の構成・内容等を分析した。その内訳は、佐渡金銀山絵巻18点、石見銀山絵巻1点、生野銀山絵巻1点である。全国には多数の鉱山絵巻は、各鉱山の特色を示しながらも、展開・構図に強い類似性が確認さけた。鉱山技術については、石見銀山や佐渡金銀山といった先進鉱山の技術が日本各地の鉱山に伝播したことが知られているが、各地の鉱山絵巻の一部については、そのような先進鉱山の絵巻を手本として描かれるようになった可能性を示すことができた。特に、佐渡金銀山絵巻は100点以上の存在が知られおり、数量や質において他の鉱山絵巻を圧倒しているため、佐渡金銀山絵巻を軸とした比較検討が有効であることを再確認できた。また、昨年度に引き続き文献調査を併行し、調査絵巻に描かれる諸技術の導入年代等を調査し、鉱山間の技術の伝播・交流や絵巻作成年代等について検討を行った。本研究は、全国の鉱山絵巻についてその分類や年代特定を試みながら、鉱山技術と鉱山絵巻作成の伝播・交流を体系的に明らかにし、それらを近世日本鉱山史全体のなかに位置づけようとするものである。本年度は、新潟大学、京都府立総合資料館、個人等が所蔵する絵巻原史料16点を調査した。また写真等で2点の絵巻史料のデータを入手し、計18点の構成・内容等を分析した。その内訳は、佐渡金銀山絵巻15点、石見銀山絵巻2点、阿仁銅山絵巻1点である。これまで、日本の主要鉱山に確認される鉱山絵巻の展開・構図に強い類似性があることをみてきたが、今年度は佐渡金銀山絵巻と石見銀山絵巻の比較を中心に検討した。両絵巻はそれぞれの鉱山稼業の実態や地域性を示しながらも構成・描写内容が非常に類似している部分を具体的に確認した。佐渡金銀山絵巻の分類指標を応用し、製作年代を検討したところ、佐渡金銀山絵巻の成立(1730年代後半頃か)が先行し、石見銀山絵巻の成立(19世紀初期頃か)に影響を与えた可能性が高いことを確認した。佐渡金銀山絵巻は国内外に100点以上の所在が確認されているのに対し、石見銀山を含む他の鉱山の絵巻は、それぞれ10点に満たない数しか知られていない。このことからも、江戸時代に全国の鉱山の中心的存在であった佐渡金銀山が、鉱山技術のみでなく鉱山絵巻製作にあたっても他鉱山に影響を与えた可能性が高い。富山県の松倉金山絵巻や山口県の一ノ坂銀山絵巻も佐渡金銀山絵巻にならったものであった。
転写初期反応におけるmRNAキャッピング酵素の役割

(1)キャッピング酵素の転写反応への関与-キャッピングの時期の決定(柴垣)プロモーターの下流にC残基を一定間隔含まないC-less cassetteを持つ鋳型DNAをビオチン化し、アビジンを結合させたマグネチックビーズに固定化し、固定化鋳型DNAを作成した。HeLa細胞核抽出液を用いたin vitro転写系に固定化鋳型DNAを加え、転写開始複合体を形成させた。転写開始複合体を穏和な条件で洗浄して分離後、3'-O-Me-CTP存在下で転写反応を行わせたところ、転写と共役してキャッピングがみられた。そこでキャップの付加の時期をアデノウイルス後期主要プロモーターとヒトポリペプチド鎖伸長因子プロモーターについて調べた結果、いずれのプロモーターにおいても、RNA鎖が18nt伸長した時点でキャップの付加が起こる事を明らかにした。現在、キャップ付加前後において転写伸長複合体にどのような変化が見られるのかウエスタンブロッティングによって解析している。キャッピング酵素とRNA polymerase IIの相互作用を調べる目的で、子牛胸腺より高度に精製したRNA polymerase IIをキャッピング反応系に添加しキャッピング酵素活性に与える影響を調べた結果、CTDをリン酸化していないRNA polymerase IIを添加したのみで、キャッピング効率は約3倍上昇した。さらに、RNA polymerase IIをCTD kinaseの一つであるCAKによってリン酸化すると、リン酸化していないときに比べ約2倍にキャッピング活性が上昇した。このことは、キャッピング酵素が転写の各段階でCTDのリン酸化状態によって活性が制御されている可能性を示唆するものである。現在リン酸化されたRNA polymerase IIの構造を調べるために、変異RNA polymerase IIを作成中である。アクリルアミドの誘導体として知られるN-acrynoyl-3-aminophenylboronic acidを用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、より効率よくキャップ構造を持つRNAとキャップ構造を持たないRNAを電気泳動によって分離解析する条件の検討を行った結果、500ntのRNAについてキャップの有無により移動度に差が出る泳動条件を見いだした。(2)キャッピング酵素の転写反応への関与(柴垣、久武)転写される領域に一定の問隔をおいてC残基を挿入した特殊な鋳型DNA(C-less cassette)を作成ビオチン化し、アビジンを結合させたマグネチックビーズに固定化し、固定化鋳型DNAを作成した。転写開始複合体を穏和な条件で洗浄を繰り返すとキャッピング酵素は容易に転写開始複合体より遊離した。この転写開始複合体に精製キャッピング酵素を添加し、反応系よりCTPを除いた条件で転写反応を行わせるとC-less cassetteに依存した長さの転写産物が得られ、しかも転写産物にはキャップが付加されていた。キャップの付加が転写反応に依存して起こるのか否かを調べる為に、あらかじめ合成しておいたRNAを転写伸長反応時に添加したところ、外から添加したRNAに比べ、転写と同時にキャッピング反応が起こったものの方がキャッピングの効率が良かった。このことは、キャッピングが転写反応と共役して起こっていることを示すものであり、転写とキャッピングが共役して検出できるin vitro転写系の確立は今後キャッピング酵素の転写反応への関与を調べるうえで有用である。現在、この系を用いて、転写反応を伸長途中で停止させた転写伸長複合体中のキャッピング酵素の動向について検討を行っている。(1)キャッピング酵素の転写反応への関与-キャッピングの時期の決定(柴垣)転写される領域に一定の間隔をおいてC残基を挿入した特殊な鋳型DNA(C-less cassette)を作成ビオチン化し、アビジンを結合させたマグネチックビーズに固定化し、固定化鋳型DNAを作成した。

転写開始複合体を穏和な条件で洗浄して分離後、精製キャッピング酵素を添加し、CTP非添加の条件で転写反応を行わせたところ、転写産物には転写と共役してキャップ構造が付加された。そこでキャップ構造がどの時点で転写産物に付加されるのかを調べる目的で、様々な長さのRNA鎖が合成できる鋳型DNAを作成し、転写・キャッピング反応を行った結果、RNA鎖が1617nt伸長した時点でキャップの付加が見られた。現在、キャップが付加される前後で転写伸長複合体にどのような変化があるのか、western bottingを用いて検討している。キャッピング酵素とRNA polymerase IIの相互作用を調べる目的で、子牛胸腺より、RNA polymerase IIを高度に精製した。精製したRNA polymerase IIをキャッピング反応系に添加しキャッピング酵素活性に与える影響を調べた結果、CTDをリン酸化していないRNA polymerase IIを添加したのみで、キャッピング効率は約3倍上昇した。さらに、RNA polymerase IIをCTD kinaseの一つであるCAKによってリン酸化すると、リン酸化していないときに比べ約2倍にキャッピング活性が上昇した。このことは、キャッピング酵素が転写の各段階でCTDのリン酸化状態によって活性が制御されている可能性を示唆するものである。現在他の様々なCTD kinaseによってリン酸化されたRNA polymerase IIがキャッピング活性にどのような影響を与えるのか検討中である。(1)キャッピング酵素の転写反応への関与-キャッピングの時期の決定(柴垣)プロモーターの下流にC残基を一定間隔含まないC-less cassetteを持つ鋳型DNAをビオチン化し、アビジンを結合させたマグネチックビーズに固定化し、固定化鋳型DNAを作成した。HeLa細胞核抽出液を用いたin vitro転写系に固定化鋳型DNAを加え、転写開始複合体を形成させた。転写開始複合体を穏和な条件で洗浄して分離後、3'-O-Me-CTP存在下で転写反応を行わせたところ、転写と共役してキャッピングがみられた。そこでキャップの付加の時期をアデノウイルス後期主要プロモーターとヒトポリペプチド鎖伸長因子プロモーターについて調べた結果、いずれのプロモーターにおいても、RNA鎖が18nt伸長した時点でキャップの付加が起こる事を明らかにした。現在、キャップ付加前後において転写伸長複合体にどのような変化が見られるのかウエスタンブロッティングによって解析している。
不連続性同定のスペクトル逆問題

また、鉄梁とコンクリート梁の接合梁の損傷同定問題に対して研究した。まず接合梁の曲げを無視できるような検査を加えることが出来るときには、検査結果から損傷の再構成手続きを与えることを示した。この結果は、BC法との関連できわめて興味深い結果である。即ち、2つの異なる速度をもつ波動伝播現象の逆問題に対してはBC法の適用が困難であるため難しいとされていた問題に対する最初の結果として大きな意味を持つからである。次に接合梁の曲げ変形を許す検査に対しては、最小二乗法による損傷同定のアルゴリズムを提案した、その数値実験については、現在研究中である。
安定な表面修飾小胞体を用いる標的指向性薬物運搬体の開発

可能な限りの薬効の向上と毒性・抗原性の低減のための「ミサイル療法」の確立のために、水溶性薬物のキャリヤーとしてのリポソームおよび脂溶性薬物のキャリヤーとしてのO/Wーレシチンエマルジョンを選び、これらを細胞特異性多糖で被覆する方法を確立、実用化のための検討を行った。1.リポソームおよびエマルジョンを被覆する多糖としては、被覆効率、被覆後の安定性に優れているプルランを基盤としこれにマンノース、ガラクトース、シアル酸等の単糖を化学修飾する方法を新しく開発した。2.リポソームの多糖被覆を既に確立した方法で行ない、細胞特異性および組織指向性を検討した。1ーアミノグルコース残基、カルボキシメチル残基、およびシアル酸残基を修飾したプルランで被覆したリポソームは、マクロファージによる貧食性が極端に抑制されることを見出し、網内系を回避しうるキャリヤーの開発に目途を開いた。3.O/Wーレシチンエマルジョンを多糖で被覆することにより、エマルジョンのコロイド安定性を飛躍的に向上させることに成功した。特に生理条件下5mMCa^<2+>および150mMNa^+の存在下でさえエマルジョンの会・融合を完全に抑制できることを見出し、エマルジョン系のドラッグキャリヤーの有用性を向上させえた。4.O/Wーエマルジョンはリポソームよりもサイズが10倍近く、また通常大きい負の表面電荷を付与している。そのため多糖被覆によっても細胞特異性および組織指向性に大きな効果はえられなかった。しかし、特にマンナンで被覆した場合のみは例外で、極めて高い肺および肝への集積性が認められ、両組織への脂溶性薬物のミサイル療法の途が開けた。
ナノテクノロジーを利用した高機能細胞実験システムの開発

本研究では接着斑を基点とした焦点接着に注目し、細胞が接着する表面を数百ナノメートルの接着斑スケールで制御したナノパターン表面を開発することを着想した。微細加工プロセスにより、石英ガラス基板上に最小幅250nmのストライプ状の金ナノパターンの加工に成功した。作製した金ナノパターン基板にアルカンチオールとアルキルシランの自己組織化膜をパターニングすることで、タンパク質吸着/非吸着の高コントラストを持つナノパターン表面を実現した。開発したナノパターン表面で細胞を培養し、細胞の接着や配向性、増殖を制御した。また、マイクロチャネル内のナノパターン表面上にも細胞を配列させ、微小空間内での長時間培養に成功した。さらに制御した細胞の分化誘導に成功し、制御された細胞の分化機能は維持されていることを見出した。本ナノパターン表面を活用することで細胞を自由に接着,配列させることが可能で、マイクロチャネル内にナノパターンを構築すれば、制御した細胞を利用した高機能細胞実験マイクロデバイスが実現できると考える。以上のように本研究は、新規ナノパターン表面を用いて細胞機能を制御・利用したマイクロチップ特有の新しいシステムを開発し、マイクロ化学システムに大きな進展をもたらした。バイオアッセイやバイオリアクターなどの応用だけでなく、単一細胞レベルでの細胞解析など生命科学の基礎研究のツールとなると期待でき、今後生命科学や医学分野に貢献すると期待できる。本研究では細胞より小さなパターニング上で細胞を培養することで細胞機能を制御することに着想し、表面と細胞接着の相互関係を正確に制御できるデバイスを開発することを目的としている。更に各細胞の最良なナノパターンを並べた細胞アレイデバイスをマイクロチップに組み込み、高機能バイオデバイスを構築することを目的としている。本年度は形状・化学状態を制御したナノパターンの形成と評価、およびマイクロチャネル内にパターンを作製し、細胞を接着・生育させることを目的とした。超微細加工法により石英基板上に100nmオーダーの金属パターニングを加工した。更に金属・石英部分にそれぞれ異なった自己組織化膜を形成させることで、形状・化学状態を制御したナノパターンを作製した。パターンの評価は、走査型電子顕微鏡や原子間力顕微鏡を用いてパターン形状を確認し、飛行時間型二次イオン質量分析により表面の化学状態を確認した。このパターンにマウス繊維芽細胞を接着させたところ、パターンの形状・サイズにより細胞の形態に変化が見られた。また、数百μmの幅・深さを持つマイクロチャネル内にナノパターンを作製し繊維芽細胞を培養したところ、細胞は長期間接着・生存し、パターンを認識して形態を変化させていることが観測できた。来年度はナノパターンのより詳細な評価と、接着細胞の分化・物質生産能などを制御する予定である。更に当研究室で確立したマイクロ流体操作を駆使した新しいバイオデバイスの確立を目指す。