hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
前立腺癌アンドロゲン応答性増殖・浸潤転移関連遺伝子の同定、および治療への応用

(1)アンドロゲン依存性LNCaP細胞からアンドロゲン非依存性株LN-REC4とLNCaP-SFを樹立した。(2)castrationしたscid mouseの皮下に移植しても増殖が促進される理由のひとつに細胞からのVEGFの発現亢進による血管新生亢進が考えられた。(4)cDNA arrayの際に用いたRNAを使って再びRT-PCRにて発現の違いを確認し、artifactなのか本当にDHTで発現の変化した遺伝子なのか明らかにすることができ、さらにもう一度LNCaPとLNCaP-SFでDHTによる刺激を行い、RNA抽出、RT-PCRを行って再現性があるかどうかを確認した。(5)cDNAmicroarrayでスクリーニングした遺伝子16,785genesのうちLNCaPで2倍以上発現の亢進している遺伝子は374genes,LNCaP-SFでは581genes。両細胞で発現の亢進している遺伝子は184genes認められた。また、LNCaPで2倍以上発現の減弱している遺伝子は623genes,LNCaP-SFでは388genesあった。このうち両細胞で発現の減弱している遺伝子は105genes認められた。また、LNCaPで発現が亢進し、LNCaP-SFで発現が減弱した遺伝子は22genesあり、その逆は1geneのみであった。(1)アンドロゲン感受性前立腺癌細胞LNCaPに10nM DHTをそれぞれの細胞に添加24時間後、あるいは無添加24時間後にtotal RNAを抽出する。これらのRNAのquality確認のために、RNAから逆転写酵素をもちいてcDNAを合成し、house keeping geneのGAPDH,β-actinの発現量に違いがないかをRT-PCRにて確認した。また、LNCaPで代表的な遺伝子(アンドロゲン受容体、PSA)の発現の違いの有無も確認した。(2)DHTの有無で発現の変化する遺伝子をcDNA micro arrayを用いてそれぞれの細胞において同定した。LNCaP細胞とLNCAP-SF細胞で共にDHTにより発現が亢進する遺伝子・低下する遺伝子、LNCaP-SF細胞で発現が亢進するが、LNCaPで発現が変わらないか、逆に低下する遺伝子、LNCaP-SFで発現が低下し、LNCaPで発現が逆に亢進する遺伝子などが判明した。(3)cDNA arrayの際に用いたRNAを使って再びRT-PCRにて発現の違いを確認し、artifactなのか本当にDHTで発現の変化した遺伝子なのか明らかにすることができ、さらにもう一度LNCaPとLNCaP-SFでDHTによる刺激を行い、RNA抽出、RT-PCRを行って再現性があるかどうかを確認した。(4)同様にしてアンドロゲン受容体のないホルモン非依存性前立腺癌細胞株PC-3とDU145でも発現がどのようになっているかを確認した。(1)LNCaP由来のアンドロゲン非依存性株LN-REC4とLNCaP-SFをcastrationしたscid mouseの皮下に移植しても増殖が促進される理由のひとつに細胞からのVEGFの発現元進による血管新生亢進が考えられた。(4)cDNAmicroarrayでスクリーニングした遺伝子16,785genesのうちLNCaPで2倍以上発現の亢進している遺伝子は374genes,LNCaP-SFでは581genes。また、LNCaPで2倍以上発現の減弱している遺伝子は623genes, LNCaP-SFでは388genesあった。
新生児に対する母親の応答性に関する研究

産褥早期における新生児に対する母親の応答性を明らかにするために、13名の母子に対して産褥4日目に授乳場面のビデオ撮影を行った。母子のsensitivityの評価にはPrice(1983)のAssessment Mother Infant Sensitivity Scale(AMIS)を用いた。また新生児の状態と母親の応答反応との関係を明らかにするため、AMIS得点の高い事例と低い事例に対してイベントレコードを作成し時系列的に分析を行った。AMISは産後3ヶ月以内の授乳場面における母子のsensitivityの評価尺度で、母親項目15・児項目7・二者関係項目3の3下位尺度で構成され、各項目15点で評定される。日本語版は研究者らが作成し、産褥早期における信頼性と妥当性を検討したものを使用した。(AMIS日本語版の内的整合性:母親項目α=0.85、児項目α=0.61、二者関係項目α=0.26)二者関係は産褥早期に関してはまだ検討の余地があるため今回分析対象から外した。3名による評定者間一致率(KendallのW)は母親項目W=0.77(P<0.01)、児項目W=0.85(P<0.01)である。対象のAMISの平均得点は母親項目54.3±5.2、児項目19.1±4.0であった。1)AMIS得点の高い事例と低い事例を時系列的に分析すると、児に対する注視と声かけの頻度・生起時間に違いが見られた。また得点の高い母親の応答は児の状態変化に対して連鎖していた。2)AMIS得点の低い母親の児には得点が低いケースと高いケースの両方が見られた。前者は児がまどろみがちで母親の働きかけは一方的かあるいは少ない状態が観察された。後者では母親の関心が児の状態に向いておらず、より養育的にハイリスクな状態であると考えられ、母親の応答性を妨げている要因について明らかにしていく必要があると考えられた。
市場統合と生活水準変動の比較経済史的研究

近代化過程におけるイギリスと日本の市場統合と生活水準・制度・技能との関係について、新資料の収集・整理を基礎に、研究を進めた。また、時系列分析などの、比較的に新しい方法を用いて分析を行った。イギリスに関しては、近代部門の熟練工である機械工の労働市場統合につき、全国的な賃金格差収束過程が、労働移動のような市場における変化と、全国的な団体交渉制度の形成などの制度的変化によって説明されることを明らかにした。また、日本に関しては、建設部門の熟練工である大工の労働市場統合の中心が、明治期後半から、西日本から東日本に移動していることを示し、それに対する制度的対応を明らかにした。近代化における市場統合と生活水準変動に関する日英比較研究のため、今年度は以下の成果を得た。1.イギリス労働市場について、イギリス機械産業雇用者連合(EEF)の賃金資料を収集し1856-1965年におよぶ、全国70数か所の地域別賃金データ系列の整理をほぼ完成した。これは、熟練工労働市場の変化をみる上で極めて重要なデータであり、イギリスにおいても、同様のデータは大工・農業労働者について、T.HattonとG.R.Boyerが整理したものしかない。また、本データを用いた分析結果の一部を、社会経済史学会・近畿部会(09年10月)、ケンブリッジ大学地理学部(10年2月)、ウォーリック大学人文学部等(10年2月)において報告・検討した。また、市場統合の大きな要因の一つである労働移動についての資料収集を行った。合同機械工組合(ASE)の組合員移動記録につき、1865年から1895年まで7,000ページの撮影し、一部の整理を終了した。2.日本の熟練工労働市場について、大工の賃金決定に関する制度的資料の収集を行った。明治初期に設立された京都の大工組合会社の総規約を調査・分析を行った。また、関東における大工組織の形成につき、大工職組合皮匠会の資料、また明治30年の横浜の大工争議を調査した。明治期の大工組織の研究は少なく、この研究は日本の労働市場の近代化について新しい知見を与えるものである。22年度は、1.労働移動と市場統合との関連を数量的に明らかにすること、2.新技術・制度の導入・災害の影響と市場統合の関連を明らかにすることなどを目標とした。うち、「1」については、イギリスの機械工労働組合の移動資料を1865年1914年まで撮影を完了し、そのうち1894年までのデータ・ベースを作成した。これは総計214,288件の全イギリスの諸都市間の労働移動データであり、労働者名・年齢・職種などが記録される重要性なもので、全体を計量可能な形で整理したものは本研究が初めてである。このデータをもとに、労働移動のパターン・労働移動と市場統合の関係について考察し、その一部を研究会・学会等で報告した。労働移動は近隣所地域間での移動が確認され、19世紀後半における移動率の低下が見いだされた。労働市場統合との関係は、目下のところ、強い関係性が見いだされずにいるが、地域・都市・指標の調整などにより、その関係性が見いだされることが期待される。「2」については大きく2点の進展があった。まず、日本については、明治期の大工組織の再編に関して、京都の大工会社総則を新資料として確認し、その内容の分析を行った。関西地域では大工の労働市場が分解する傾向にあったが、制度的にはそれに抗する動きがあったことが示された。イギリスについては、機械工の技術の標準化について、機械産業関連の技能伝播について、技能マニュアルに注目し、19世紀初頭から20世紀初頭までの技能伝播のパターンを整理した。今年度は、当初からの研究目的である3点、1.労働移動と市場統合との関連を数量的に明らかにすること、2.新技術・制度の導入の影響と市場統合の関連を明らかにすること、3.実質賃金・体格などの生活水準指標と市場統合の関連を明らかにすること、をもとに計画された「研究実施計画」にしたがって、以下のような研究実績があげられた。1.については、昨年度以来のイギリス機械工の労働移動と市場統合の関連を研究するためのデータ整備をほぼ完了した。昨年度は1865年94年のデータ・ベース化を行ったが、今年度は1895年1914年のデータ入力と整理を終了し、昨年度入力しなかったデータ中の労働者の年齢も入力した。これにより、移動労働力の諸属性による労働市場統合への影響の相違が推測することが可能になった。2.については、日本の熟練工労働市場の事例研究として引き続き、京都を中心として明治-昭和戦前期に大工の産業組織の変遷を調査した。京都の「大工会社」の実態を明らかにするため、新聞資料などの収集を行った。また、日本の熟練工の事例として、酒造業の職人である杜氏の資料収集を行った。

特に、当時の技能形成にかかわる徒弟制度について、各地の酒造業組合の業界誌・組織史を収集・分析した。3.については、すでに完成している20世紀初頭から30年代までの男子身長変化と市場統合度の関係性についての簡単な回帰分析を行った。また、研究進展についての検討するため、イギリスに基盤を置く経済史研究学会であるEconomic History SocietyのAnnual Conferenceでの報告を行った。また、社会経済史学会の全国大会で報告を行い、建設的な議論の交換を行った。
大規模な言語資料の調査・分析に基づく、日本語文法の慣習的記述の再検討

本研究の主要な成果について記す。1.現代日本語の研究における大規模な電子化コーパスの利用を可能にするためのソフトウェアを開発した。このソフトウェアは、前年度までに試作を終えていたものをさらに発展させたもので、『朝日新聞記事データベースCD-HIASK』(紀伊国屋書店・日外アソシエ-ツ)の1987年度から1992年度までの版に収められた記事データを読み出し、通常のテクストファイルとしてハードウェア上に展開するものである。これによって生成されたテクストファイルには検索を始めとして任意の処理を施すことができる。我が国における電子化コーパスの利用は世界的に見てはなはだしく立ち遅れており、本ソフトウェアの開発の成功はそうした状況に対する大きな貢献を意味するものである。2.上記のソフトウェアを利用して、現代日本語の述語の形態論についての詳細な調査・分析を行い、論文の形で発表した。一般の文法書では、「です」の否定形を「ではありません」とすることが慣例化しているが、現実には「ではないです」の形もしばしば用いられる。本研究では、上記のデータベースから否定形の用例数万例を採取し、形式の使い分けに関わる諸要因を種々の角度から解明した。また、そのほかにも、副詞・形容詞などの意味・用法についても分析を試みた。これらの分析結果についても、発表すべく用意しているところである。
好熱性細菌由来タンパク質を基盤分子に用いた高耐久性人工酵素の創成

本研究では、酵素の化学に基づく分子設計を、耐熱・耐久性に優れたタンパク質を対象に施し、研究室レベルにある人工酵素に実用性を賦与することを目的としてきた。耐熱性ペルオキシダーゼの創出は、主な成果の一つである。この研究では、好熱菌由来の電子伝達タンパク質、チトクロムc_<552>に対し、過酸化水素を酸化剤に用いる一電子酸化酵素、ペルオキシダーゼの触媒機構をアミノ酸置換法によって導入し、常温から70°Cの温度域で持続的な活性を示す耐熱性の人工ペルオキシダーゼを造り出すことに成功した。この人工酵素は、触媒回転数では、天然のものに及ばないが、70°C付近までタンパク質が変性せず、温度の上昇とともに触媒活性が増大する高い構造安定性を有する。したがって、ここで得られた知見を基に、更なる分子設計を行えば、より高い触媒回転数を有する高耐熱性酵素が実現できるであろう。人工酵素の触媒機構と失活過程については、すでに解明を終えており、触媒の活性と持続性の向上に必要な分子設計指針も得ている。今後、指針に従ったタンパク質の機能改変を行い、耐熱性人工ペルオキシダーゼの実用性をさらに高める予定である。本研究で得られた結果は、好熱菌由来タンパク質が、化学を基盤とする人工タンパク質の研究において、有用な骨格分子として利用可能であることを明らかにし、この組み合わせが、実用的な人工タンパク質創成に向けた方法論の一つであることを示せたと考える。好熱菌をはじめとする極限環境微生物には、これまで有用な機能がないために利用できていないタンパク質資源が数多く存在する。それらのタンパク質も本法を用いることにより、人工タンパク質の基盤分子としての利用が可能となり、天然以上のもしくは、天然にはないタンパク質の創造につながる可能性がある。本研究の目的は、好熱菌Thermus thermophirus由来のヘムタンパク質、シトクロムc552(Cyt c552)を利用して、実用環境で利用可能な耐熱性の人工酸化酵素、殊にペルオキシダーゼ、カタラーゼを創生することである,前年(17年)度の予備実験では、ペルオキシダーゼ反応機構に基づくCyt c552への部位特異的変異導入で、Cytc552が70°Cの高温でも機能する耐熱性ペルオキシダーゼに改変可能であることを示したが、18年度の研究では、その際の反応機構、失活過程の解明に焦点を絞り、耐熱性ペルオキシダーゼの更なる長寿命化を目指した。その結果、酸化活性種が生成する際、活性中心の近傍に位置するチロシン45にラジカルが生成し、これが起点となってヘムの分解反応の進行することが明らかとなった。その後の実験で、このチロシン残基をフェニルアラニンに置換すると、活性はやや低下するものの、酵素活性の持続性が向上することがわかり、現在は酵素の活性と持続性の更なる向上に目指した研究を続けている。本研究の成果は、現在学術雑誌に投稿中である。上述、酵素機構解明の過程では、ペルオキシダーゼ短寿命中間体の観測にも成功している。Compound 0と呼ばれるこの中間体は、これまで160Kでの凍結溶液中でしか観測することができなかったが、Gyt c552のもつ特異な疎水空間を利用することによって、室温での観測に成功した。また長寿命化により、これまで未知であったCompound 0の反応性を直接観測することにも成功しており、ペルオキシダーゼ反応機構でのMissing ringの一つを埋めることができた。本研究の成果は、発表論文(Ichikawa Y, Nakajima H, Watanabe Y, ChemBioChem)に掲載されている。好熱菌由来タンパク質チトクロムc552への新たな機能の賦与を目指した。

当初の計画では、ヘムを有機金属錯体(ロジウムPhebox錯体)へと置換する予定であったが、この置換反応は難しく現在も実現に向けた諸策を検討中である。一方、ヘムの中心金属である鉄を他の金属イオンに置換することには成功しており、亜鉛並びコバルトに置換した金属置換チトクロムc_<552>を得た。このうち、亜鉛置換チトクロムc_<552>(ZnCyt c_<552>)を自己集合膜で修飾した電極に固定したところ、ZnCyt c_<552>の電子吸収スペクトルに対応した光電流を得ることができ、10 Hz程度の光のON・OFFに対し、良好な電流応答特性が得られた。作成した電極モジュールは、水溶液の広い温度域で高い安定性と耐久性を示し、タンパク質本来の性質が、モジュール化後も保たれることが分かった。その後、ZnCyt c_<552>の分子全体を対象とする全軌道計算を行ったところ、亜鉛ポルフィリン部位の光励起によるタンパク質内の電子の流れがアミノ酸残基レベルで推定可能となり、電子の経路に当たるアミノ酸残基に変異導入を行うことで、光電流が抑制されることが分かった。この結果を利用すれば、光電流に整流特性を持たせることも可能であり、今後本系を利用したタンパク質フォトダイオードを作成する予定である。なお、本研究の成果は、アメリカ化学会誌のJACSに近々掲載される予定である。
多層的生体評価系による細胞成長因子利用手段の開発

近年多くの成長因子・サイトカインが発見され、それらを新薬として実用化することへの期待が高まっている。しかしながら、これら新生理活性物質の生理作用評価系は細胞株を用いた評価系が主流であるため、その生体への有効性の検討が困難を極めており、成長因子・サイトカインの生体評価系の確立が急がれている。本研究では、多方面の研究分野において、生理学・病理学などのin vivo実験系を開発してきた一線の研究者により、成長因子・サイトカインの生体評価系の開発を行った。その結果、1)神経成長因子がテンカン発症を遅延させる効果を有すること、2)腫瘍成長因子ーαが性腺刺激ホルモン放出ホルモンの分泌を制御する視床下部の電気活動を抑制すること、3)体外受精・初期胚操作の上で、大きな問題であった、培養系における初期胚発生停止現象が、アクチビンにより解除されること、4)アクチビンが下垂体の卵胞刺激ホルモン分泌細胞の分化増殖を促進すること、5)形質転換成長因子ーβが妊娠維持に必須な卵巣からのプロゲステロン分泌を促進する作用を有すること、6)チモシン関連ペプチドであるオビオペプチドが、原虫・細菌感染症の予防・治療に有効であること、7)ヒドラの刺胞反応を利用して、成長因子・サイトカインの超高感度測定系の開発に成功したことなど、成長因子・サイトカインが新治療薬として有効に作用する疾病についての新しい知見を数多く得る一方、新生理活性物質の評価系として極めて有効な生体評価系の開発にも成功した。本研究は、これまで未知であった種々の細胞成長因子の生体に対する効果を、基礎医学・獣医学分野において確立されている各種生体評価系において検索し、それらを有機的に結合して種々の細胞成長因子の医療応用などへの新たな可能性を見いだそうとするものである。本年度はまず当初に計画した各種細胞成長因子の調製・修飾、各研究分担者への配付をおこない、各生体評価系における使用法、投与法等についての試験的検討をおこなった。その結果、いくつかの細胞成長因子の生体に対する効果について以下に述べるような新知見を得た。インビトロでのマウス初期胚発生は、現在用いられている体外受精法では発生の途上で卵分割の停止が見られるが、Erythroid differentiation factorにこの発生停止を解除する効果のあることが発見された。これは、ヒトあるいは家畜における受精卵移植技術の改良に大きく貢献するものである。また、Nerve growthfactor(NGF)もしくは抗NGF抗体の第三脳室投与のキンドリング発現に対する遅延効果、中枢神経系へのエストロジェンポジティブフィ-ドバックにおけるNGF依存性神経機序の存在、ならびに、脳内acidic Fibrobalast Growth Factorの摂食応答への関与など、これらの精神医学領域における脳疾患治療薬、あるいは神経支配機構に関与する因子としての可能性が示された。細胞成長因子の投与法に関しては、局所微量投与法を新たに開発し、従来の全身性の投与に比べて約1/100の量で細胞成長因子の生体効果を観察することが可能となった。さらに、ヒドラを用いたバイオアッセイ系を開発し、これまで困難であった細胞成長因子の超微量の定量(100ag1ng)が可能となった。このように、本年度は本研究を推進するうえで不可欠な成長因子の投与法・解析法の著しい洗練ならびに、細胞成長因子の新たな生体内効果の発見などの成果を得、次年度へ向けて二次評価系(ある評価系で実証された効果の他の評価系での再検討)を組織するための充分な基盤整備がおこなわれた。21世紀の新薬としての期待を集め、近年多くの成長因子・サイトカインが発見されたが、これらの新生理活性物質の生理作用に関する知見は、主に培養細胞を用いた研究結果に基づくものであり、生体における生理作用の発現についての研究は未だ緒についたばかりである。そのためこれら成長因子・サイトカインを医学・農学の応用科学において、新薬として有効に利用することが未だ困難な状況にある。

本研究では、この状況を改善することを目的として、脳神経学・内分泌学・発生工学・微生物学・免疫学などの分野で確立されている各種生体評価系における成長因子・サイトカインの作用について研究を行ない、本年度は次の様な新知見を得ることができた。脳神経学的評価系では、抗NGF抗体の第3脳室内投与が、テンカンモデルであるキンドリングの発現に抑制的効果をもたらすことが明かとなり、NGFがテンカン発現に重要な役割を演じていることが示された。また、視床下部による生殖機能調節機構における成長因子の作用解明に役立つ新たな生体評価系として、LHRHニュ-ロンの発火活動を反映する多ニュ-ロン発火活動の測定方法を開発することに成功した。また、内分泌学的評価系では、TGFーβがPRLと同様に、ラット培養黄体細胞のプロゲステロン分泌維持作用を示すこと、またPRL作用が抗TGFーβ抗体の存在により消失することが明かとなった。さらに、in vivoでも黄体内にTGFーβが発現していることが示され、TGFーβが生体におけるPRL作用を仲介していることが示唆された。発生工学的評価系では、マウス初期胚培養系において問題とされていた発生停止現象が、アクチビンによって解除されることが前年度までに明らかとなっていた。本年度の研究により、生体内での初期胚発生過程でアクチビンが卵管上皮および初期胚自体により生産される生理的な胚発生促進因子であることが明かとなった。このことは、本研究により開発された、アクチビンを用いた初期胚培養法が、従来の方法よりも生理学的条件を満たした新しい初期胚培養法として、有望であることを示している。近年多くの成長因子・サイトカインが発見され、それらを新薬として実用化することへの期待が高まっている。しかしながら、これら新生理活性物質の生理作用評価系は細胞株を用いた評価系が主流であるため、その生体への有効性の検討が困難を極めており、成長因子・サイトカインの生体評価系の確立が急がれている。本研究では、多方面の研究分野において、生理学・病理学などのin vivo実験系を開発してきた一線の研究者により、成長因子・サイトカインの生体評価系の開発を行った。その結果・1)神経成長因子がテンカン発症を遅延させる効果を有すること、2)腫瘍成長因子-αが性腺刺激ホルモン放出ホルモンの分泌を制御する視床下部の電気活動を抑制すること、3)体外受精・初期胚操作の上で、大きな問題であった、培養系における初期胚発生停止現象が、アクチビンにより解除されること、4)アクチビンが下垂体の卵胞刺激ホルモン分泌細胞の分化増殖を促進すること、5)形質転換成長因子-βが妊娠維持に必須な卵巣からプロゲステロン分泌を促進する作用を有すること、6)チモシン関連ペプチドであるオビオペプチドが、原虫・細菌感染症の予防・治療に有効であること、7)ヒドラの刺胞反応を利用して、成長因子・サイトカインの超高感度測定系の開発に成功したことなど、成長因子・サイトカインが新治療薬として有効に作用する疾病についての新しい知見を数多く得る一方、新生理活性物質の評価系として極めて有効な生体評価系の開発にも成功した。
ウェルシュ菌α毒素遺伝子のプロモーター上流に存在するベント構造の機能解析

ウェルシュ菌ホスホリパーゼC遺伝子(plc)のプロモーター上流には3つのphased A-tracts(-66-40)が存在する。この領域は折れ曲がり(ベント)構造を形成し、プロモーターとRNA polymerase(RNAP)との接触領域の拡張により転写開始複合体の形成を容易にする。面白いことにこのベントDNAの折れ曲がりの度合いが増強される低温ほど、下流のplcプロモーターの転写促進が顕著に観察された。このことはphased A-tractsによる転写促進が低温依存的であることを示している。(Katayama,S.et al.1999.EMBO J.18(12):3442-3450.)3つのphasedA-tractsがRNAPのどの部位と結合するのかを明らかにすることはベントDNAの転写促進の分子機構を解明するために重要である。これまでの大腸菌RNAPに関する知見から、phased A-tractsはRNAPαサブユニットと結合する可能性が高いと考えられる。このことを示すために、まずウェルシュ菌RNAPαサブユニットの遺伝子(rpoA)を含む領域1.6kbをPCRで増幅し、その全塩基配列を決定した。このrpoA遺伝子の塩基配列から予測されたアミノ酸配列は、精製したウェルシュ菌RNAPαサブユニットのN末端配列と一致した。rpoAのcodingregionをpET11-aに挿入後、大腸菌内で大量発現させ、αサブユニット(α-WT,315aa)を精製した。同様の方法でαサブユニットのN末端ドメイン(α-NTD,228aa)、C末端ドメイン(α-CTD,79aa)をそれぞれ精製した。3つのphasedA-tractsとplcプロモーターを持つDNA断片(3AP)と精製α-WT、α-NTD、α-CTDを25°Cで共存させ、gelretardation assayを行った。α-WTとα-CTDは3Apに結合したが、α-NTDは結合できなかった。この結果から、phased A-tractsにRNAPのαCTDが結合する可能性が示された。現在、3Apとα-WT、α-CTDの接触領域を明確にするため、ヒドロキシルラジカルフットプリンティングを用いた解析を進めている。ウェルシュ菌ホスホリパーゼC遺伝子(plc)のプロモーター上流の3つのphasedA-tractは折れ曲がり(ベント)構造を形成し、転写活性を促進する。我々はこの領域をUAS「upatream activation sequence」と命名した。UASとRNAPとの相互作用と転写促進の分子機構を明らかにするため、平成10年度は以下の研究を行った。UASによる折れ曲がりの度合い(低温で増強)と転写活性の相関を調べた。UASを持つplcプロモーター断片(3Ap)と欠く断片(0Ap^1)を鋳型DNAとして等モル共存させるin vitro転写を行った。転写量の比(3Ap/0Ap^1)は、25°Cで31倍、37°Cで4.6倍、45°Cで1.9倍となり、低温ほど転写促進効果が顕著であった。UASの転写促進効果は低温において形成されるベント構造によるものであることが示唆された。大腸菌rrnB遺伝子等で提唱されているUPエレメントのコンセンサス

配列とUASの配列は-41-44と-47-57の範囲で73%とよく一致する。大腸菌rrnB P1プロモーター上流のUPエレメントとplcプロモーターを持つ断片(+UP-plc)と欠く断片(-UP-plc)で、転写量比(+UP-plc/-UP-plc)を調べた。おもしろいことに25°Cで14倍、30°Cで8倍、37°Cで4倍、41°Cで3倍、45°Cで4倍となり、弱いながらUPエレメントによるplcプロモーターの転写促進も低温依存性であることが示された。UPエレメントによる転写の活性化はその配列にRNAPのαサブユニットのC末領域が結合することによると考えられている。以上のことからUASによる転写促進にはαサブユニットが関与していることが強く示唆された。現在、αサブユニットのどの領域にUASが結合するのか明確にするための研究を申請書通り進めている。ウェルシュ菌ホスホリパーゼC遺伝子(plc)のプロモーター上流の3つのphased-A-tractsは折れ曲がり(ベント)構造を形成し、低温依存的に転写活性を促進する。我々はこの領域をUAS「upstream activation sequence」と命名した。そして、UASがRNAポリメラーゼ(RNAP)との接触を強めることを示した。(Katayama,S.et al.1999.EMBO J.18(12):3442-3450.)さらに3つのphased-A-tractsがRNAPのどの部位と結合するのかを明らかにすることはUASとRNAPとの相互作用による転写促進の分子機構を明確にするために重要である。平成10年度の研究と大腸菌RNAPに関する知見から、UASはRNAPαサブユニットと結合する可能性が高いと考えられる。これを証明するために、平成11年度は以下のように研究を進め、成果を得た。まずウェルシュ菌RNAPαサブユニットの遺伝子(rpoA)を含む領域1.6kbをPCRで増幅し、その全塩基配列を決定した。このrpoA遺伝子の塩基配列から予測されたN末端のアミノ酸配列は、精製したウェルシュ菌RNAPαサブユニットの配列(25残基)と一致した。rpoAのcodingregionをpET11aに挿入後、大腸菌BL21(DE3)pLysS株で発現させ、αサブユニット(α-WT,315aa)を精製した。同様の方法でαサブユニットのN末端ドメイン(α-NTD,228aa)、C末端ドメイン(α-CTD,79aa)をそれぞれ精製した。3つのphased-A-tractsとplcプロモーターを持つDNA断片(3Ap)と精製α-WT、α-NTD、α-CTDを25°Cで15分間共存させ、gel retardation assayを行った。α-WTとα-CTDは3Apに結合したが、α-NTDは結合できなかった。この結果から、UASにRNAPのα-CTDが結合する可能性が示された。
サービタイゼーション戦略に関する理論的拡張と実証研究

本研究の目的は,製造業におけるサービス化の取り組み,即ちサービタイゼーション(servitization)現象に焦点を当て,多分野にわたる従来研究を通底する論理の考究とサービタイゼーション戦略のメカニズムの解明を通じて,既存理論の補完と拡張を試みることである。2018年度は全研究期間の初年度にあたり,研究計画では次の目標を設定した。即ち,多分野にわたる従来研究を体系的に精査し,サービス化現象をあらわす多様な専門用語の視点,カバーしうる範囲,および前提条件を考察し,それらの用語間の相違と到達点を整理することである。これに対して2018年度の実績は次のとおりである。Web of science, Emerald, Elsevierなど複数の電子ジャーナル・データベースに掲載された国際ジャーナルを中心に関連論文の検索とレビューを行った。その結果,(1)既存研究における「サービタイゼーション」という用語の多義性,即ち製造業のサービス化現象に関して様々な用語が使われ,たとえ同じ用語であっても強調点が異なればそれに含まれた意味も異なることが確認できた。(2)製造業におけるサービタイゼーションへの期待をめぐって,既存研究ではある程度のコンセンサスを確認することができた反面,このコンセンサスは実証研究に裏付けられた実践的な意味合いの検討が十分に展開されてこなかったことも判明した。(3)既存研究においていくつかのサービタイゼーション戦略の類型化を確認することができたが,それらの戦略は特定の企業事例に基づくものが多く,その戦略のメカニズムの解明と理論構築は十分に行われていない実態が浮き彫りになった。こうした文献レビューで得られた知見は研究成果に示した雑誌論文にて報告した。計画にあるとおり,初年度はサービタイゼーション戦略に関する文献レビューを体系的に行い,既存研究の実態と到達点を確認することができた。その結果,次年度以降の研究方向性がより鮮明になり,本研究を大きく前進させることができた。2019年度は本研究期間の2年目にあたり,年度研究目標は,製造業におけるサービス化の実態を調査し,サービタイゼーションの構造分析を行うことである。経済社会のサービス化の勢いが増すなか,製造業のサービス化の必要性は広く認識されているものの,ある企業が成功し他の企業がその取り組みにつまずき撤退する羽目に陥ってしまう。初年度の研究知見を踏まえて,製造業のサービス志向,サービス化のための条件,備えるべき能力とサービタイゼーション戦略の関係などについて,日本の製造業を中心に調査し,その実態を明らかにする。また年度の研究結果については,準備が整い次第,国内・外の雑誌や学会において順次発表することを予定している。次年度は一定規模のアンケート調査やフィールド調査を計画しており,調査費用と調査用旅費を確保するために,初年度の経費から4万円程度繰り越しすることにしました。
緑膿菌の多剤耐性化プロセスに着目した新規制御法の構築

現在まで感染症の制御は、殺菌を主体に行われてきた。しかし、殺菌剤の利用とともに耐性菌が出現し、大きな社会問題となっている。現時点で全ての抗生物質や消毒剤の利用を制限することは難しく、消毒剤を利用しながらも耐性株を出さない制御法が確立されれば、人類に対する貢献度は計り知れない。そこで本研究では、多剤耐性化プロセスを明らかにし、それを抑制することで、耐性菌そのものを出さない制御法の確立を目指し、研究を行った。緑膿菌の耐性化に必須となる遺伝子およびタンパク質も同定に成功し、新たな耐性菌制御に向けた大きな知見を得ることができた。8bpの欠失が起きることにより、緑膿菌はMexTタンパク質を発現し、薬剤を細胞外へ排出するトランスポーターを亢進することで、多剤耐性化する。そして、この現象を大腸菌でも再現することができている。そこで、昨年に引きつづき、この8bpの欠失を起こすのに係わる遺伝子を同定すべく、大腸菌の全遺伝子の網羅的欠失株Keio collectionに、緑膿菌-大腸菌shuttle vectorであるpMMB67EH (10 kb)に、緑膿菌の8bpの欠失の起こる領域と、その欠失後出現してきたORFにコードされている蛋白質のターゲット遺伝子であるmexEF (5 kb)遺伝子領域を導入した、8bp欠失アッセイプラスミドを構築し、導入した。その結果、約4000株への導入を全て完了し、耐性株の出現効率が著しく低下した形質転換体を選択することに成功した。さらに、詳細な解析を加えるためのアッセイ系の構築を行っており、耐性化に関わる新規の機構を有する遺伝子の絞り込みを行える状態になっている。また、欠失される側の遺伝子の解析に関しても詳細に解析を進め、欠失される遺伝子は、7でも6bpでもなく、やはり8bpのみであることもほぼ突き止めた。現在、その欠失機構の詳細を明らかにすべく解析を進めている。予定通り進んでいる。殺菌剤(抗生物質や消毒剤)の利用とともに耐性菌が出現し、大きな社会問題となっている。従来、耐性菌の解析は、その耐性機構の解明が主で、“どのような機構で耐性菌が出現するのか"、その耐性化のプロセスに着目して研究を進めたものはほとんど存在しない。本課題では、モデル微生物として容易に多剤耐性化を起こし臨床現場で常に問題となっている緑膿菌を用いて、緑膿菌の耐性化の過程を詳細に解析し、耐性化に必須となる遺伝子およびタンパク質を同定し、その阻害剤、つまりは耐性化の阻害剤or抑制剤を開発することを目的・目標として研究を進めた。まず、耐性化に係わる遺伝子の同定を行った。約4000株の変異株それぞれに構築したアッセイプラスミドを一つずつ導入して形質転換体を4000株作成し、アッセイを行った結果、耐性化のプロセスに関わる重要な因子の同定することに成功した。その一つを破壊することにより、大腸菌では耐性株がほとんど出現しなくなることを突き止めた。しかし緑膿菌では生育に必須であったため、破壊することはできなかったが、緑膿菌のその因子を大腸菌のその因子破壊株に対して相補することで耐性菌の出現が著しく回復することから、その因子が耐性株を出現させる因子である因子であることが明らかとなった。そこで、予定通り因子の取得同定に成功したので、計画に従い、その阻害剤の開発に着手した。現在スクリーニングのアッセイ系の確立を進めている。(1) MexTの出現に関与する遺伝子、タンパク質の同定(担当:間世田、大政)8bpの欠失が起きることにより、緑膿菌はMexTタンパク質を発現し、薬剤を細胞外へ排出するトランスポーターを亢進することで、多剤耐性化する。そして、この現象を大腸菌でも再現することができていた。そこで、本年度はこの8bpの欠失を起こすのに係わる遺伝子を同定すべく、大腸菌の全遺伝子の網羅的欠失株Keio collectionに、緑膿菌-大腸菌shuttle vectorであるpMMB67EH (10 kb)に、緑膿菌の8bpの欠失の起こる領域と、その欠失後出現してきたORFにコードされている蛋白質のターゲット遺伝子であるmexEF (5 kb)遺伝子領域を導入した、8bp欠失アッセイプラスミドを構築し、導入した。現在、約2000株への導入を完了し、耐性株の出現効率を実際に測定した。その結果、その効率が著しく低下した形質転換体を数株選択することに成功している。これらの遺伝子は、大腸菌の機能未知遺伝子のものと、機能が明らかになっている遺伝子と双方が分離されている。

後者の明らかになっている機能は、8bpの欠失に関わるものとはかけ離れているため、これらのものについても、今後の展開が期待できるものとなっている。(2)候補遺伝子破壊緑膿菌の作成(間世田)(1)で候補に挙がった8bpの欠失に関与する遺伝子を緑膿菌ゲノム上で破壊し、その破壊株での耐性株の出現効率を測定するために、緑膿菌欠失変異株の作成を進めている。現在、3株作成した。現在まで感染症の制御は、殺菌を主体に行われてきた。しかし、殺菌剤(抗生物質や消毒剤)の利用とともに耐性菌が出現し、大きな社会問題となっている。現時点で全ての抗生物質や消毒剤の利用を制限することは難しく、消毒剤を利用しながらも耐性株を出さない制御法が確立されれば、人類に対する貢献度は計り知れない。従来、耐性菌の解析は、その耐性機構の解明が主で、“どのような機構で耐性菌が出現するのか"、その耐性化のプロセスに着目して研究を進めたものは存在しない。そこで本研究では、モデル微生物として容易に多剤耐性化を起こし臨床現場で常に問題となっている緑膿菌を用いて、緑膿菌の耐性化の過程を詳細に解析し、耐性化に必須となる遺伝子およびタンパク質を同定し、その阻害剤、つまりは耐性化の阻害剤or抑制剤を開発することを目的・目標として研究を進めた。約4000株の一遺伝子変異株ライブラリーの菌、1株1株を薬剤の含有しているプレートに塗布し、耐性株が出てこない変異株を丁寧にスクリーニングした。その結果、明らかに耐性遺伝子以外の変異で耐性株が出現しない株、約10株を取得することに成功した。相補実験にも成功し、当初の最大に目標の一つであった耐性化に必須となる遺伝子およびタンパク質の同定に成功することができた。一方、様々な環境要因を変化させ、耐性株の出現頻度を測定したところ、酸素の有無以外においては、耐性株の出現において大きな変化は認められなかった。酸素の分圧を変化した場合に耐性株の出現頻度に変化が見られたことについては、体内の酸素分圧の異なる環境では耐性株の出現頻度が変化していることを物語っている。このように、当初の大きな目標であった耐性化に必須となる遺伝子およびタンパク質の同定に成功したことから、これらの阻害剤は耐性株を出現させない新たな制御薬になり得る。細菌学実際に大腸菌でのアッセイ系を構築できている点。特異的な欠失を簡易的にアッセイする系を構築できている点。実際に、欠失に関わる遺伝子をアッセイ系を用いて取得できている点。約4000株の大腸菌に変異株全てでアッセイを終了している点。更に、欠失される遺伝子側の欠失条件の解析に着手できている点。総じて、当初の予定以上に結果が出ている点で、十分達成できていると判断した。研究当初の計画では、以下に示す5つの項目に対して研究を進める予定であった。1MexTの出現に関与する遺伝子、タンパク質の同定2候補遺伝子破壊緑膿菌の作成3マイクロアレイによるクロラムフェニコールで高発現する遺伝子の同定4ターゲットDNAへの変異の導入と欠失効率5同定された遺伝子産物の阻害剤の開発検討。これらは全て、多剤耐性化へのプロセスに関わる因子、すなわち、抗生物質の分解のような耐性因子ではなく、その分解酵素を生み出すといった耐性化の因子の同定を進めるための研究計画であります。
接尾辞木に基づく大規模文字列索引の効率よい構築アルゴリズム

本年度は、前年度提案より進めているデータ圧縮に関する研究を発展させ、テキストの走査により圧縮に用いる辞書の評価と再構築を繰り返すことによって圧縮率を高めた手法を提案した。VF符号はデータ圧縮手法の一つであり、分節木と呼ばれる、文字列の集合を表す辞書を用いて、テキストを辞書の要素の列に変換することで圧縮を実現する。このため、いかに圧縮に有用な文字列を辞書に含めるかが、高い圧縮率の実現に重要である。しかし、最適な辞書を構築することは困難であることが知られている。近年ではKidaやKleinによって接尾辞木を用いた分節木構築法が提案されているが、VF符号はLZ法などの手法に対し圧縮率で劣っていた。これに対し提案手法では、分節木を用いてテキストを圧縮する際、分節木のどの文字列がよく用いられるか解析し、その結果を用いて分節木を再構築、つまり訓練することで圧縮率を高める。計算機実験では、訓練を繰り返すことでgzipと同程度の圧縮率を達成している。この圧縮法はVF符号の一種であり、特殊なアルゴリズムを用いて圧縮したテキストデータに対し復号を伴わずに高速に文字列検索を行う、圧縮照合と呼ばれる手法に適しており、大規模テキストデータベースからの高速な検索の実現への適用が期待される。また、本年度は語頭符号に対する接尾辞木の構築アルゴリズムを示した。この結果はAnderssonやInenagaらによって研究されている単語接尾辞木を発展させたものであり、来年度6月にCPM2011で発表予定である。本年度は,接尾辞木の重要な応用のひとつとして,VF符号と呼ばれるデータ圧縮方式に関して圧縮率を向上させたアルゴリズムを提案した.この成果は,2008年に喜田が提案したSTVF符号を基に,山本らが2001年に提案したAIVF符号のアイディアを適用し,圧縮時に用いられる分節木の構築アルゴリズムを改良したものである.本手法の特長は,圧縮時の符号決定規則にAIVF符号と同様の小さな変更を加えることで,STVF符号に比してより柔軟に分節木を構築できる点にある.これにより,テキスト中に頻出な部分文字列をより効率よく分節木に格納することができ,圧縮率を高めることが可能である.また,提案手法はSTVF符号と同様に,圧縮済みデータから復号せずに直接パターン照合を行う圧縮照合と呼ばれる技術へ適用することができるため,元のデータから照合するより高速に処理可能であるという特長も受け継いでいる.英文テキストデータによる計算機実験では,STVF符号に対し圧縮率と圧縮照合速度の改善を確認した.来年度への課題としては,さらによい圧縮率と圧縮照合速度を達成するべく,本データ圧縮手法を改善していくことがまずあげられる,また,本年度間に合わなかった索引構築アルゴリズムの提案をし,最終的な目的である大規模文字列索引の構築アルゴリズムを確立する予定である.その後は,本年度提案したデータ圧縮も含め,より多くの実用的な応用を視野に入れつつ,提案手法の有効性を検証していきたい.本年度は、前年度提案より進めているデータ圧縮に関する研究を発展させ、テキストの走査により圧縮に用いる辞書の評価と再構築を繰り返すことによって圧縮率を高めた手法を提案した。
認知症の画像検査のためのマルチモダリティコンピュータ支援診断ツールの開発

本研究では専門医でさえも難しいとされる認知症の原因疾患の鑑別を行うためのアルゴリズムを提案し、それに基づいた識別システムを作成した。システムは臨床情報と画像検査所見から代表的な7疾患を識別器する7つの識別器を組み合わせることで、総合的に診断を行う方式を採用した。今後各識別器のパラメータをさらに至適化し、より精度の高いシステムにバージョンアップして、広く発表していく予定である。平成20年度においては、橋本と佐々木による臨床データの収集と彌富による装置の設置と識別器プログラムの作成に分かれて研究が行われた。臨床データの収集においては、アルツハイマー病の症例を中心に、レビー小体型認知症、認知症を伴うパーキンソン病、前頭側頭型認知症、皮質基底核変性症、進行性核上麻痺、正常圧水頭症、脳血管性認知症の症例について行われた。データは臨床症状、高次脳機能検査所見、MRI検査所見、脳血流SPECT検査、心臓交感神経機能検査(MIBG)所見からなり、MRIと脳血流検査については通常の画像処理の他に、画像統計解析を行い(VSKAD法ならびに3D-SSP法、eZIS法)、それらの結果をデータに加えた。平成21年度にはさらに調査症例を増やし、これらを整理して以下に記述する識別プログラムにかける計画である。識別プログラムの作成は購入したワークステーション上において行われた。アルツハイマー病かそうでないのかを識別するためのバイナリクラス識別器のためのプログラミングをはじめに行った。この識別器は線形モデル、人工ニューラルネットワーク、サポートベクターマシーンをベースにした3種類のものを用意し、多数の原因疾患を鑑別するマルチクラス識別器は入工ニューラルネットワークをベースにしたものを作成した。さらに各識別器の診断制度を評価するためのleave-one-out cross validation法を実行するためのプログラムも用意した。認知症の症例データはまだ完全ではないため、上記プログラムをテストするためにすでに持っている黒色腫の良悪性を鑑別する研究や周術期心事故予測の研究で使用したデータを試験的にかけてみたところ、概ね良好な結果が得られた。平成21年度においても、橋本と佐々木による臨床データの収集と彌富による識別器プログラムの作成とその検証、実際にプログラムを用いての解析に分かれて研究が行われた。臨床データの収集においては、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、認知症を伴うパーキンソン病、前頭側頭型認知症、皮質基底核変性症、進行性核上麻痺、正常圧水頭症、脳血管性認知症の症例について引き続き行われた。データは臨床症状、高次脳機能検査所見、MRI検査所見、脳血流SPECT検査、心臓交感神経機能検査(MIBG)所見からなり、MRIと脳血流検査については通常の画像処理の他に、画像統計解析を行い(VSRAD法ならびにeZIS法)、それらの結果をデータに加えた。平成21年度ではこのなかでデータ収集が進んでいるレビー小体型認知症、認知症を伴うパーキンソン病について解析を施行するためのデータの整理を行った。平成20年度に購入したワークステーション上においてすでに作成したサポートベクターマシーン識別プログラムを用いて、パーキンソン病/レビー小体型認知症かそうでないのかを識別するためのバイナリクラス識別を行った。多くの臨床指標、検査指標のなかでMIBGの洗い出し率と心臓/縦隔比が鑑別に有用であったが、これらの疾患についてはMIBG検査自体の診断精度が高いため、従来から用いられてきた線形の識別器と今回導入したサポートベクターマシーン識別器との間で診断精度に大きな差はなかった。今後サポートベクターマシーンの有用性が期待できるアルツハイマー病などのデータについて検討を行う予定である。認知症の症例データのみでなく、プログラムの作動をテストするためにすでに持っている黒色腫の良悪性を鑑別する研究や周術期心事故予測の研究で使用したデータを試験的にかけて随時精度評価を行っている。平成22年度においては、臨床データの収集が終了し、疾患ごとの識別器プログラムの作成と識別器の組み合わせ方の研究、それらの方法の精度評価が行われた。臨床データの収集においては、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、皮質基底核変性症、進行性核上麻痺、正常圧水頭症、脳血管性認知症の症例について引き続き行われ、データ収集はほぼ終了した。データは臨床症状、高次脳機能検査所見、MRI検査所見、脳血流SPECT検査、心臓交感神経機能検査(MIBG)所見からなり、MRIと脳血流検査については画像統計解析を行い(VSRAD法ならびにeZIS法)、それらの結果をデータに加えた。平成20年度に購入したワークステーション上においてすでに作成したサポートベクターマシーン識別プログラムを用いて、上記7疾患の各々について、その疾患かそうでないのかを識別するためのバイナリクラス識別を行った。認知症の症例データのみでなく、プログラムの作動をテストするためにすでに持っている黒色腫の良悪性を鑑別する研究や周術期心事故予測の研究で使用したデータを試験的にかけて随時精度評価を行ってきた。識別器の診断精度は疾患により異なり、感度、特異度は概ね80-95%程度であったが、脳血管性認知症ではやや精度が低かった。これら7つの識別器を組み合わせて総合的に原因疾患を診断するプログラム(フローチャート)の作成も行った。
マウスモノクローナル抗体による血小板膜蛋白GPIIb-IIIaの機能-構造関連の解析

血小板膜糖蛋白GPIIb-IIIa複合体(α_<IIb>β_3インテグリン)は、障害を受けその内皮下組織が露出した血管内壁において、vWfやフィブリノゲンなどの接着蛋白の受容体として血小板-基質間、血小板-血小板間の相互作用を介した止血あるいは病的血栓形成に重要な役割を果たしている。今回、GPIIb-IIIa複合体の受容体機能発現のメカニズムを検討するため、抗ヒトGPIIb-IIIa複合体マウスモノクローナル抗体PT25-2を作成した。本抗体PT25-2は(1)フィブリノゲン依存性に血小板凝集を惹起し、(2)FabフラグメントにてもIgGと同様の血小板凝集作用を有し、(3)prostaglandin E_1、indomethacin、aspirin、sodium nitroprusside、cytochalasin Dなど既知の強力な細胞内刺激伝達阻害剤によってもその作用は影響を受けず、また細胞内のCa^<2+>濃度の変化および放出反応も惹起しなかった。そして、PT25-2のエプトープは二つのサブユニットによって維持される複合体構造に依存性であり、静止状態のGPIIb-IIIa複合体上に存在していることが明らかとなった。これまでGPIIb-IIIa複合体の受容体機能を誘導する抗GPIIbもしくは抗GPIIIaサブユニット抗体は種々報告されているが、PT25-2はそのいずれとも性質を異にしており、この抗体の取得によってGPIIb-IIIa複合体上には高次構造をフィブリノゲン受容体へ変化させる、いわばスイッチの役目をしている特定部位が存在することが明らかになった。
Push/Pull血液透析濾過器における輸送現象の解明

Push/Pull透析濾過(HDF)における輸送現象を把握するため、水溶液系の基礎実験を通じ以下のように検討した。1)透水性実験試験透析濾過器であるPAN17DXの純水濾過係数の値は3x10^<-5>cm^3(cm/sPa)となった。2)単純濾過実験みかけの阻止率の値は,アルブミン1.0,ミオグロビン0.10-0.16,ビタミンB12以下の分子量物質でほぼ0の値が得られた。3)透析実験,透析濾過実験溶質除去能を表すクリアランス(CL)と濾液流量(QF)の関係を-450<QF<180ml/minの範囲で求めたところ,QF=0(血液透析,HD)の値をはさみ,尿素では上に凸,ミオグロビンでは下に凸状の曲線が得られた。従ってミオグロビンでは,Pull相(QF>0)でのCL増加分がPush相(QF<0)でのCL減少分よりも大きいためPush/Pull HDFの方がHDより優位に,尿素では逆の結果が容易に予想された。4)Push/Pull HDF実験リザ-バ容量VD=150mlのバッグと可逆ローラポンプからなるOne Bag方式Push/Pull HDF実験より得られた時間平均CL値は,3)から予想されたものと同様な傾向が得られたが,その値は4)の実験値の方が3)からの推算値よりも絶対値で小さいことが明らかとなった。例えば,ミオグロビンのHDのCLは,実測値で44,推算値で46ml/minであるのに対し,Push/Pull=100/300ml/minのHDFでは,実測値57,推算値81ml/minであった。これはPush相→Pull相,Pull相→Push相の切替え直後の非定常状態の影響が反映されたものと思われた。5)非定常透析濾過実験切り替え後10秒ごとの溶質透過量を調べた結果、例えばミオグロビンでは、Push相は直前のPull相最後の血液側濃縮状態を改善するような希釈過程が、Pull相は直前のPush相最後の希薄された状態からの濃縮過程が非定常的に働くことが明らかとなった。さらに実際に臨床応用した時の最適操作条件を模索したところ、QPull,QPushならびにVDいずれも大きいほど、高分子溶質の除去に優れることが明らかとなった。研究計画にもとづき,PAN17DX(polyacrylonitril)を試験透析濾過器として,1)透水性実験,2)単純濾過実験,3)透析実験,4)透析濾過実験,5)Push/Pull透析濾過実験および6)非定常透析濾過実験を施行した。その結果,1)純水濾過係数の値は3x10^<-5>cm^3/(cm s Pa)となった。2)みかけの阻止率の値は,アルブミン1.0,ミオグロビン0.10-0.16(濾液流量Q_F=-300150ml/min),ビタミンB_<12>以下の分子量物質でほぼ0の値を示し,強いQ_F依存性を示す溶質はみあたらなかった。