hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
複合型走査プローブ顕微鏡による培養血管内皮細胞の形態・機能発現の動的計測

filamentの架橋部に存在するα-actininとGreen Fluorocein Protein(GFP)の融合ベクターを内皮細胞に導入することによって、これら融合タンパクを発現させた。その結果、生きた内皮細胞のF-actinfilamentの構造を明確に観察することに成功した。我々は細胞内にGFPを恒常的に発現する単球の細胞株を得ている。現在さらに、内皮細胞骨格成分あるいは単球側に異なった波長の蛍光タンパクを発現させることを試みている。2)NOの蛍光指示薬であるDAF-2を用いて、内皮細胞内NOのリアルタイム観察を行い、単球接着・浸潤時のこれら機能分子の実時間計測を行った。その結果、単球が接着した直下の内皮細胞内NOが局所的に減少していることを見いだした。単球と内皮細胞の相互作用において、NOが何らかの関与をしていることが示唆された。3)単球一内皮間相互作用においても重要な働きをしている細胞内情報伝達分子であるCa^<2+>について、退色の影響が無く定量的で、かつ数十m秒オーダーでの実時間蛍光観察が可能な実験方法の基礎検討を行った。Fura-red(励起488nm、蛍光670)およびFluo-4(励起488nm、蛍光516nm)の混合溶液で内皮細胞を処理してリアルタイム共焦点レーザー顕微鏡で細胞を観察し、さらにFura-redとFluo-4の蛍光強度比を算出したところ、退色の影響が無く、かつ定量的に細胞内Ca^<2+>濃度の解析が可能であった。本年度は、各種の血管作動性物質に対する内皮細胞の応答を計測し、さらに本システムの他の細胞への応用として血管平滑筋細胞のメカニクス計測行った。1)アンジオテンシンIIは、血管平滑筋細胞の収縮作用によって血圧の上昇を引き起こす他、増殖因子産生、細胞増殖、細胞外マトリックス産生に影響を与えることが知られている。内皮細胞へもAT1受容体を介した増殖促進、E-selectin発現誘導などの影響が報告されているが、より詳細な循環病態生理の理解には、ナノ/サブミクロンオーダーの機能評価が必要である。そこで本研究では、アンジオテンシンが内皮細胞メカニクスに直接及ぼす影響を検討するため、アンジオテンシン投与時の内皮細胞にメカニクス応答を調べた。その結果、内皮細胞間隙に存在する接着タンパクには影響を及ぼさないが、弾性率の僅かな低下、すなわち内皮細胞が柔らかくなることを認めた。内皮細胞間接着には影響を及ぼさないことから、物質透過性の上昇にはつながらないと思われるが、弾性率の低下は内皮障壁機能の低下を意味する。2)本研究ではさらに、発症率は非常に低いが、発症した場合には極めて重篤で肺移植が必要となる原発性肺高血圧患者の肺動脈平滑筋細胞のPGI2およびNOに対するメカニクス応答を計測した。コントロール群として、肺癌患者の肺動脈平滑筋細胞の計測を行ったが、コントロール群の細胞においては、PGI2、NOに反応して平滑筋細胞の弾性率低下、すなわち細胞が弛緩して柔らかくなることが確認された。一方、原発性肺高血圧患者の肺動脈平滑筋細胞は、PGI2、NOに対して全く反応せず、病変発症原因として、平滑筋細胞の収縮・弛緩特性の不全が疑われる結果となった。
OX40-OX40リガンド系を介した免疫制御

(研究目的)OX40はTNF受容体ファミリーに属する分子で、活性化T細胞上に発現しT細胞補助刺激分子として機能する。一方、そのリガンドであるOX40Lは樹状細胞などの抗原提示細胞上に発現し、T細胞上のOX40と結合することによりT細胞にOX40刺激を与える。OX40/OX40L系の生体内機能を明らかにするためにOX40L遺伝子欠損マウスおよびOX40L遺伝子導入マウスを作製し、種々の免疫反応を解析した。(研究成果と考察)上記OX40L遺伝子改変マウスを用いて、接触性皮膚過敏反応を試みたところ、OX40L遺伝子欠損マウスでは反応が抑制され、OX40L-Tgマウスでは反応が強く増強された。アレルゲン感作マウスリンパ節より活性化ランゲルハンス細胞(LC)を単離し、OX40Lの発現を検討したところ、アレルゲン感作依存性にOX40Lの発現が観察された。さらにマウス皮膚より未感作LCを単離し、アロ抗原反応性T細胞活性化能を測定したところ、OX40L遺伝子欠損LCの抗原提示能は抑制傾向を呈し、OX40L-Tgランゲルハンス細胞はその機能が強く亢進していた。以上より、OX40Lが皮膚ランゲルハンス細胞機能において重要な役割を有していることが明らかになった。他方、OX40L-TgマウスをC57BL/6系統に戻し交配したところ、抗DNA抗体の上昇を伴う間質性肺炎と炎症成長疾患を自然発症することが明らかになった。この発症はC57BL/6系統特異的であった。さらに、OX40L-TgマウスのCD4陽性T細胞をRAG2欠損マウスに移入したところ、組織学的に同一の疾患が再現された。これらの結果は疾患発症が自己免疫機序である可能性を示唆する。一方、OX40L-Tgマウスでは可溶性蛋白抗原投与によって誘導されるはずの免疫寛容が全く誘導されず、末梢性T細胞免疫寛容が破綻していることが判明した。以上の結果より、OX40-OX40L系が免疫寛容制御に関与し、自己免疫発症と密接に関わる可能性が示唆された。OX40(CD134)はTNF受容体ファミリーの1つで、そのリガンド(OX40L)は我々がHTLV-I・Taxの転写標的遺伝子として単離したII型受容体蛋白gp34である。OX40はT細胞活性化における副刺激伝達分子の1つで、抗原刺激後一過性にT細胞に発現し、T細胞活性化に促進的に機能する。我々は最近、OX40L欠損マウスおよびOX40L遺伝子導入(Tg)マウスを作製した。それらマウスの蛋白抗原特異的記憶T細胞機能を解析したところ、OX40LがCD4陽性T細胞活性化における抗原提示細胞機能に必須であることが明らかになった。さらにOX40L遺伝子改変マウスをC57BL/6およびBALB/cマウスに戻し交配し、Leishmania major(L. major)感染実験を行った。その結果、OX40L遺伝子導入によるOX40L過剰発現はL. major抵抗性であるC57BL/6マウスを感受性にし、一方、OX40L欠損は感受性であるBALB/cマウスを抵抗性へと変化させた。これら感受性の逆転は、OX40L刺激がL.major感染におけるTh2反応惹起に強く関与していることを意味する。その機序として、T細胞側と抗原提示細胞側の機能異常の可能性が考えられる。現在、その機序について解析を継続している。一方、OX40L-Tgマウスは加齢と共に間質性肺炎および炎症性腸疾患を発症する。特発性間質性肺炎はヒト膠原病の合併症として重大な疾患であるが、その発症機序は明らかではない。OX40L-Tgマウスにおける間質性肺炎発症機序を解析するとともに、ヒト膠原病合併間質性肺炎のモデルとなりうるかどうかを検討中である。

他方、OX40L-TgマウスをC57BL/6系統に戻し交配したところ、抗DNA抗体の上昇を伴う間質性肺炎と炎症成長疾患を自然発症することが明らかになった。この発症はC57BL/6系統特異的であった。さらに、OX40L-TgマウスのCD4陽性T細胞をRAG2欠損マウスに移入したところ、組織学的に同一の疾患が再現された。これらの結果は疾患発症が自己免疫機序である可能性を示唆する。一方、OX40L-Tgマウスでは可溶性蛋白抗原投与によって誘導されるはずの免疫寛容が全く誘導されず、末梢性T細胞免疫寛容が破綻していることが判明した。以上の結果より、OX40-OX40L系が免疫寛容制御に関与し、自己免疫発症と密接に関わる可能性が示唆された。
HTLV-Iの抗体陽性者の長期追跡

HTLV-IキャリアからATL、HAM/TSPおよびHTLV-I関連疾患が発症する。キャリアの一部が数十年という長い潜伏期間を経て発症することから、ウイルス感染以外に多くの因子がこれらの発症に関与すると考えられる。1)今年度の成果はHTLV-Iと眼症(ぶどう膜炎)との関連が明らかになり、ATL、HAM/TSPに次ぐ第3のHTLV-Iが絡む疾患として確立した。九州各地特に南九州において、HTLV-I抗体陽性者でATLやHAM/TSPを発症していないキャリアノ中に、眼内の炎症病変(ぶどう膜炎)を伴う症例が多数存在する。これまで(1)成人若年者に多発。(2)HTLV-I抗体陽性者のぶどう膜昌はベーチェット、トキソプラズマ症などの既知のぶどう膜炎とは異なる眼科的臨床像を呈する。(3)HTLV-I陽性のぶどう膜炎の16%に甲状腺機能亢進症の既往歴がある、などが明らかとなった。現在、多施設共同研究で、その患者数、罹患率、病態生理、治療法と予後などが検討されている。2)HTLV-Iの世界的拡がりについての研究は、班員によりキューバ、ガーナ、パプアニューギニア、南米インディオ、中国、ソ連などで引き続き進められている。3)HTLV-I抗体陽性者数の将来予測が出された。今後数世代の間に減少することが予想される。4)HTLV-Iキャリア、HAM/TSP患者の免疫能が検討された。5)臨床的に無症状のHTLV-Iキャリアで、HTLV-I感染細胞の単クローン性増殖を持つキャリアの追跡調査がなされ、これらはATL発症のhigh risk groupであることが確認された。6)多発地域での長期追跡調査は順調に進行している。
多環式含窒素コア骨格と大環状構造を特徴とする海洋性中分子の合成研究

ハリクロニンAの合成研究:これまで確立してきた、安息香酸を原料として用い、立体選択的アルキル化および分子内シクロプロパン化反応を鍵工程とした合成経路を用いて、十分量の基質の合成を行い、アザビシクロ[3.3.1]ノナン骨格および大員環の構築について検討を行った。基質に複数存在する酸素官能基を適切に区別しながら、窒素原子上に大員環形成の足がかりとなる炭素鎖をもつアミド結合の形成を行い、数段階の官能基変換を経てアザビシクロ[3.3.1]ノナン骨格の構築を行った。さらに第一級アルコール部位を酸化することで、アルデヒドを有する化合物を得た。アルデヒドα位の酸化を経て二重結合の導入を行い、さらに大員環構築の足がかりとなるアリル基の導入を行った。デンサニンBの合成研究:これまでに確立した方法、すなわちジブロモシクロプロパンの開裂による環拡大反応、2-ニトロベンゼンスルホンアミド部位とアルコール部位との分子内置換反応、およびエノンに対する共役付加反応を用いた第四級炭素を含むビシクロ骨格の構築を経る合成経路を更に改良し、十分量の基質の合成を行える合成経路を確立することに成功した。アシル基を介して結合させたアルデヒド等価体と窒素原子を用いた分子内Mannich反応を基盤とする含窒素五員環の構築は、望みとする化合物を得ることはできなかったが、ケトンα位のアシル化を経由する方法により、含窒素五員環をもつ化合物の合成を行うことに成功した。これまでに得られている知見を活用し、さらなる環構造の構築に成功し、合成経路確立に向けて前進が見られた。これまで得られた知見を活用し、さらなる環構造の構築、官能基の変換を進めることで、合成経路の確立を目指す。
ホヤ胚中枢神経系形成の全遺伝子ネットワーク

ホヤのオタマジャクシ幼生の背側には光・重力・水圧などの変化に対応する中枢神経系が存在するが、その構成細胞数はわずか350程(ニューロンの数は約100個)という特徴を持つ。本研究では、我々が開発したカタユウレイボヤのトランスジェニック系を駆使して中枢神経系で発現する遺伝子の網羅的解析を行った結果、565の遺伝子を同定することに成功した。またこれらの遺伝子の発現追跡や機能解析などから、ホヤ胚中枢神経系形成遺伝子ネットワークに関する幾つかの新事実を発見した。本研究の目的はホヤ胚中枢神経系の発生に関わる全遺伝子ネットワークを解明することである。ホヤの発生にともなって約2600個の細胞からなるオタマジャクシ幼生が形成されるが、この幼生は脊索や背側中枢神経系をもち、脊椎動物を含む脊索動物の基本的体制を表している。その中で中枢神経系を構成する細胞数は全体で350程度で、感覚胞は約285、尾部神経索は約65(これはすべていわゆる上衣細胞である)の細胞から成る。またいわゆるニューロンの数は約100個とされ、感覚胞に約60個、運動神経節に5対10個の運動ニューロンを含む約20個、それ以外の領域に約20個存在するとされている。このわずか約350個の細胞からなる中枢神経系は光・重力・水圧などの変化に対応する幼生の充分複雑な行動を支配している。本研究においては、ホヤ胚中枢神経系の細胞系譜の完全記載と中枢神経系形成時に発現する遺伝子の網羅的記載をもとにホヤ中枢神経系の遺伝子発現アトラスを構築することである。本年度はCi-Nut:GFPをMinosに組み込んだトランスジェニック系統(神経胚期から中枢神経系の細胞のみがGFPを発現する)を利用して幼生から細胞を解離し、GFPポジティブな細胞のみを集めた。そして集めた神経系細胞からRNAを抽出し、マイクロアレイ解析を行った。2002年にドラフトゲノムが解読されたカタユウレイボヤでは遺伝子のゲノムワイドな転写産物情報をもとに44Kのオリゴヌクレオチドベースのマイクロアレイを作製されている。このアレイを駆使した解析の結果、約500近い中枢神経系遺伝子の候補を得た。現在、whole-mount in situ hybridization法によって、その特異性を確認している。本研究の目的はホヤ胚中枢神経系の発生に関わる遺伝子ネットワークを解明することである。ホヤの発生にともなって約2600個の細胞からなるオタマジャクシ幼生が形成される。脊索や背側中枢神経系をもつこの幼生の体制は、脊椎動物を含む脊索動物の体制の最も基本的なものである。その中で中枢神経系を構成する細胞数は約350で、感覚胞(脳)は約285、尾部神経索は約65(これは全て上衣細胞である)の細胞から成る。作年度にCi-Nut : GFPをMinosに組み込んだトランスジェニック系統(神経胚期から中枢神経系の細胞のみがGFPを発現する)を利用して幼生から細胞を解離し、GFPポジティブな細胞のみを集めた。2002年にドラフトゲノムが解読されたカタユウレイボヤでは、遺伝子のゲノムワイドな転写産物情報をもとに44Kのオリゴヌクレオチドベース・マイクロアレイができている。そこで、集めた神経系細胞からRNAを抽出し、マイクロアレイ解析を行った結果、約500個に及ぶ中枢神経系遺伝子の候補を得た。その中には既知の神経特異的遺伝子の他に、多くの神経ペプチド関連遺伝子が含まれていた。そこでさらにwhole-mount in situ hybridization法によってこれらの遺伝子の空間的発現パターンを解析した結果、発現プロフィルをもとに、脳領域が背側、腹側、前方部などを含む6つの領域に大別することができることが明らかになった。現在、細胞レベルでの発現の解析を進めている。本研究の目的はホヤ胚中枢神経系の発生に関わる全遺伝子ネットワークの解明を目指すものである。その中で中枢神経系を構成する細胞数はわずか350程度で、感覚胞(脳)は約285、尾部神経索は約65(これはすべていわゆる上衣細胞である)の細胞から成る。

またいわゆるニューロンの数は約100個とされ、感覚胞に約60個、運動神経節に5対10個の運動ニューロンを含む約20個、それ以外の領域に約20個存在するとされている。本年度はまず、感覚胞だけでGFPを発現するトランスジェニックラインを利用して、感覚胞のみを単離し、マイクロアレイ解析によって、感覚胞で特異的または優位に発現する565個の遺伝子の同定に成功した。これらの遺伝子の中には新規の神経ペプチドをコードするものも含まれていた。またこれらの遺伝子の空間的発現パータンの解析から、感覚胞には少なくとも数個の領域が存在することが明らかになった。次に、さまざまなトランスジェニックラインを駆使して、ホヤの変態の際に、幼生の中枢神経系の細胞がどの程度成体の中枢神経系に受け継がれていくのかを検討した。その結果、これまでの定説とは完全に異なり、幼生の感覚胞の細胞、特に上衣細胞が成体の中枢神経系の形成大きく寄与していること、さらには幼生の上衣細胞が成体の神経細胞になりうることが分かった。この研究結果は、脊椎動物の中枢神経系における神経細胞と非神経細胞(グリア細胞)の分化の可塑性に新たな疑問を投げかけたものとして注目されている。
光学的計測法を用いた仮設足場を用いない効率的・低コストな橋梁健全度診断手法の開発

本研究は、目視点検ですら容易でない海洋渡海橋、仮設足場の設置が困難な跨線橋や跨道橋等を対象とし、これまで開発・実用化されてきた3次元写真計測(SfM:Structure from Motion)、3Dレーザースキャナー、無人飛行体(ドローン)、ギガピクセル画像、画像解析技術などの種々の先進的なICRT技術を活用・発展させ、従来手法よりも効率的、効果的で、低コスト、高信頼性を有する橋梁点検手法を提示することを目的としたものである。将来的には近接目視点検の代替となり得るような橋梁点検手法の開発を目標としている。そのために、2017年度に実施した高縄手橋(長崎河川国道事務所)点検結果を検証するとともに、同橋の撤去切断桁の載荷試験において先端技術を用いた計測技術を適用し、その有効性と有用性について検証した。さらに、砂川橋(熊本河川国道事務所)、鬼橋(大村市)、三杉大橋(長崎県)を対象として、SIPインフラ開発技術等を用いてフィールド実証試験を実施し、それら機器による点検の手法及び結果の有効性と有用性について検証した。具体的には、従来手法よりも効率的、効果的で、低コスト、高信頼度の橋梁点検の要素技術として、1蝶型マーカーを用いたデジタルカメラによる橋梁の動的計測法、2高フレームレート望遠カメラを用いてトラス模型の変位・振動計測法に関して、それらの使用法や精度を検証した。さらに、橋梁維持管理システムとして、3鋼橋の塗膜劣化やボルト抜落ち、コンクリート橋のひび割れや浮き・剥離などを付与した3次元外観劣化情報システムの構築、4実計測による剛性および振動特性の評価と、3D有限要素解析によるリスク評価に基づく橋梁モニタリング手法を構築し、現場フィールド試験を実施し、その有効性と有用性を検証した。(1)2017年度に実施した高縄手橋(長崎県)点検結果を検証し、その有効性について検証した。また、砂川橋(熊本県)、鬼橋(大村市)、三杉大橋(長崎県)を対象として、SIPインフラ開発技術等を用いてフィールド実証試験を実施し、点検の手法及び結果の有効性と有用性について検証した。3Dレーザースキャナーと3D写真計測を用いて3次元形状計測を実施し、十分な精度が得られることを検証した。デジタルカメラ及びサンプリングモアレカメラによる橋梁たわみ計測は、従来の変位計による計測法と比較し十分な精度が得られることを確認した。コンクリートのひび割れ画像から木構造フィルタと機械学習を用いてひび割れ自動抽出・描画システムを開発した。(2)高縄手橋の撤去切断桁の載荷試験において、デジタル画像計測法(DICM)、サンプリングモアレ法等を用いた計測技術を適用し、従来の計測技術による計測値と比較検討し、同等の精度が得られることを確認した。(3)水無川橋(鋼トラス橋)では、加速度計、LDV、無線LAN速度計を用いて振動計測し、いずれも同じ計測値であることを確認した。また、3D計測データを用いて3次元FE解析を実施し、構造同定を行うとともに、模擬欠陥を想定した解析を実施し、たわみ影響線変化率を用いることにより欠陥箇所を特定できることを確認した。また、高フレームレート望遠カメラを用いてトラス模型の変位・振動計測法を用いて振動試験を実施し、その使用法や精度を検証した。(4)デジタル写真による橋梁たわみ計測法に関しては、2種類のカメラレンズを用いて計測距離40m100mでの計測結果の精度および有用性を確認し、さらに動的計測法について精度および有用性を検証した。2018年度は以上ような実証試験を実施し、本研究はほぼ順調に進展していると判断した。これまで提案している次の新しい計測法、1蝶型マーカーを用いたデジタルカメラ及び高フレームレート望遠カメラによる橋梁たわみ計測法、2デジタル画像相関法(DICM)による劣化情報検知、3鋼橋の塗膜劣化やボルト抜落ち、コンクリート橋のひび割れなどを付与した3次元外観劣化情報システム、4実計測による剛性評価と3次元有限要素解析によるリスク評価に基づく橋梁モニタリング手法等々について、従来計測手法と比較することにより、これらの手法が効率的、効果的で、低コスト、高信頼性を有する橋梁点検手法であることをフィールド実証試験において検証する。また、高縄手橋の撤去切断桁の載荷試験の耐荷力を有限要素解析により検証し、経年劣化や損傷を想定した3DFE解析を実施し、RC桁の劣化と剛性評価法などの基礎データと蓄積する。さらに、橋梁点検ロボットカメラやドローンを用いた損傷の画像撮影試行と現場適用性の検証本研究の有効性と有用性を検証するとともに、SIPインフラやNEDOや国交省建設技術開発研究助成等で開発された計測方法を用いてフィールド実証試験を実施し、フィールド実証試験で取得されたデータの解析と分析を行い、橋梁定期点検要領の26損傷に対応する革新的先端技術による点検法の確立し、点検結果に基づく健全度評価(長崎県方式及び国交省方式)を行い、それらの結果に基づく橋梁診断エキスパートシステムを構築し、人工知能(AI)を用いた自動診断支援システムの開発を目標とする。本研究は、目視点検ですら容易でない海洋渡海橋や仮設足場の設置が困難な跨線橋や跨道橋等を対象とし、これまで開発・実用化されてきた3次元写真計測(SfM:Structure from Motion)、3Dレーザスキャナ、無人飛行体(UAV、ドローン)、ギガピクセル画像、画像解析技術などの種々のICRT技術を活用・発展させ、従来手法よりも効率的、効果的で、低コスト、高信頼性を有する橋梁点検手法を提示するとともに、それえらの計測方法のフィールド

実証試験を実施し、有効性と有用性を検証し、将来的には近接目視点検の代替となり得るような橋梁点検手法の開発を目標として、国土交通省九州地方整備局長崎河川国道事務所管理の撤去桁である高縄手橋(長崎県大村市)を対象として現場計測載荷試験・現場計測を実施した。具体的には、従来手法よりも効率的、効果的で、低コスト、高信頼度の橋梁点検の要素技術として、(1)デジタル写真による橋梁たわみ計測法、(2)デジタル画像相関法(DICM)による鋼部材き裂検知法の使用法や精度を検証するとともに、さらに、橋梁維持管理システムとして、(3)鋼橋の塗膜劣化やボルト抜落ち、コンクリート橋のひび割れや浮き・剥離などを付与した3次元外観劣化情報システムの構築、(4)実計測による剛性および振動特性野評価と、3D有限要素解析によるリスク評価に基づく橋梁モニタリング手法を構築し、現場フィールド試験を実施し有効性と有用性を検証した。特に、(1)デジタル写真による橋梁たわみ計測法に関しては、2種類のカメラレンズを用いて計測距離40m100mでの計測結果の精度および有用性を検証した。(1)国土交通省九州地方整備局長崎河川国道事務所管理の撤去桁である高縄手橋(長崎県大村市)において、デジタル写真による橋梁たわみ計測法、サンプリングモアレ法を用いて従来の変位計による計測法と比較し十分の精度が得られることを確認した。また、高縄手橋において、3Dレーザースキャナと3D写真計測を用いて、3D形状計測を実施し、その結果を比較検討した。さらに、コンクリートのひび割れ画像から、木構造フィルタと機械学習を用いてひび割れ自動抽出・描画システムを構築した。(2)デジタル画像計測法(DICM)による変位及びひずみ計測法の精度を検証するために、RCはり試験体を製作し曲げせん断試験を実施し、従来の変位計およびひずみゲージにより得られる変位、ひずみ値と比較検討し、計測結果は同等であることを確認した。(3)水無川橋(鋼トラス橋)では、加速度計、LDV、無線LAN速度計を用いて振動計測し、三者はいずれも同じ計測値であることを確認するとともに、3Dレーザー計測データを用いて3D-FE解析モデルを作成し、FEM解析を実施し構造同定を行った。また、蒲生田橋(PC橋)では、ラフタークレーン載荷前後のたわみを上記(1)の手法により実施するとともに、3D写真計測により得られた3Dデータを用いてFE解析モデルを作成し、有限要素解析を実施し、実験結果と解析結果がほぼ一致することを確認した。(4)デジタル写真による橋梁たわみ計測法に関しては、2種類のカメラレンズを用いて計測距離40m100mでの計測結果の精度および有用性を検証し、高精度で計測することができ、1回の計測ごとの計測値のバラツキは比較的少なく安定していることを確認した。平成29年度は以上ような実証試験を実施し、本研究はほぼ順調に進呈していると判断した。本研究は、目視点検ですら容易でない海洋渡海橋、仮設足場の設置が困難な跨線橋や跨道橋等を対象とし、これまで開発・実用化されてきた3次元写真計測(SfM:Structure from Motion)、3Dレーザースキャナー、無人飛行体(ドローン)、ギガピクセル画像、画像解析技術などの種々の先進的なICRT技術を活用・発展させ、従来手法よりも効率的、効果的で、低コスト、高信頼性を有する橋梁点検手法を提示することを目的としたものである。
中学生と指導者双方に適合する中学校部活動：個人-環境適合理論をベースとして

中学生用,顧問教師用,部活動指導員用の3種類の質問紙を作成した。調査項目は,(1)客観的部活動環境(部員数,活動時間・活動頻度,活動の種類・種目等,目標・成績,経験の有無,活動場所・必要備品等の有無,指導者による指導頻度)。(2)部活動外環境(3種共通項目:睡眠時間,家族と過ごす時間。中学生用:勉強時間。)(3)主観的個人要因(部活動観)。(4)主観的P-E適合(共通項目:主観的な活動量,能力の発揮,主体性の発揮,活動場所・必要備品の充足。中学生用項目:所属欲求の充足,指導者の指導,指導者・友だち・先輩後輩との関係。顧問教師用・部活動指導員用項目:技術指導の在り方,部活経営,部員との関係,保護者の協力,学校の協力)。(5)充実感・適応(共通項目:充実感・心理的健康・向上心・自信。中学生用項目として,学校生活満足感,学習意欲。)2019年1月,男子テニス部,剣道部の顧問経験のある男性教諭1名,女子テニス部の顧問経験のある男性教諭1名にインタビューを行った。その結果,部活動に対する意識として,以下の点が見いだされた。(1)自身に経験のない部活動の顧問をすることも珍しくない。(2)自身に経験のない部活動の場合,技術面では地域人材を活かしつつ,生徒と共にあるいは生徒から学びながら,部のまとまりという面で顧問教師としての役割を果たした。(3)主任など他の職務での責任が増した途端,部活動顧問との両立が難しくなった。それまでは,それなりに部活動に携わることができた。(4)年度当初に保護者に諸事情(顧問に経験がない,月曜日は会議のため部活動はない,必要経費とそれが必要となる時期,大会の取捨選択方針など)を具体的に説明することが大切。(5)生徒個々の諸事情で休むことなどを受け入れる風土をつくることも重要。研究代表者所属先の研究倫理審査を通過した。質問紙の作成が完了した。また,質問紙調査協力者として,中学生約6000名,顧問教師約300名から内諾を得た。実施時期は2019年6月で調整中である。中学校部活動について,顧問経験のある教員にインタビューを実施した。以上から,おおむね順調に進展していると判断した。2019年6月に,中学生約6000名,顧問(副顧問)約300名,部活動指導員若干名に対して,質問紙調査を実施し,9月に調査協力校へ主要結果報告を行う。日本教育心理学会第61回総会(9月)での成果発表のための原稿〆切(2019年4月)前に質問紙データを収集できなかったため,2020年の日本教育心理学会第62回総会での成果発表に変更したい。また,上越教育大学紀要に成果の一部を投稿する。中学生用:勉強時間。

日本教育心理学会第61回総会(9月)での成果発表のための原稿〆切(2019年4月)前に質問紙データを収集できなかったため,2020年の日本教育心理学会第62回総会での成果発表に変更したい。また,上越教育大学紀要に成果の一部を投稿する。
光合成器官の形成と葉緑体機能の発現を制御する核遺伝子に関する研究

光合成器官である葉の形成には、葉緑体の正常な分化と発達が必須である。葉緑体の発達と機能の発現を支配する遺伝子の多くは核ゲノムに存在するが、その分子的基盤に関する知見は少ない。本研究では、葉緑体の遺伝情報発現系に関わる蛋白質因子を分離しその機能を調べ、それらの核遺伝子の構造と葉の形成過程における発現様式を明らかにする。今年度、得られた成果は以下の通りである。1当研究室で開発したタバコBY-2細胞核抽出液から調製したin vitro転写系を改良して、tRNA遺伝子の転写を調べた。その結果、tRNA遺伝子がRNAポリメラーゼIIIによって忠実に転写されること、及びtRNAの5'末端のプロセシング反応が効率よく起こることを明らかにした。2葉緑体遺伝子の転写プロモーターにはコンセンサスタイプ(CT)と非コンセンサスタイプ(NC-II)のものがある。今回、ATP合成酵素遺伝子オペロンの中のatpI遺伝子の転写プロモーターにもNC-IIタイプのものがあることを初めて明らかにした。また、NC-IIプロモーターからの転写を行うBY-2細胞由来の原色素体のin vitroの転写系を確立したので、この系を用いてNC-IIプロモーターからの転写に関わる成分(RNAポリメラーゼや転写因子)を分離同定する目途がついた。3タバコ葉緑体DNAに存在する保存ORFのうちycf1,ycf2,ycf5,ycf6の転写単位を決定した。ycf5とycf6の転写物が葉(葉緑体)に蓄積していたことから、光合成に関連した機能をもつことが予想された。一方、ycf1とycf2は葉緑体でも原色素体でも同程度の転写物が蓄積していたことから、光合成以外のプラスチド機能に働いていると予想された。
緑内障性視神経障害発生機序に関する実験的研究

サル眼隅角にアルゴンレ-ザを過剰照射することにより実験的緑内障眼を作製し、緑内障性視神経障害発生の機序を画像解析技法を用いてin vivoにて、また病理組織学的にin vitroにて検索した。また、人における低眼圧緑内障眼に血管拡張剤であるカルシウム拮抗剤を投与してその結果を、また濾過手術を主体とした減圧術を施行し、視神経障害改善の程度を検索し以下のような結果を得た。1.in vivoでの定量的解析の後、眼球を摘出し、摘出眼視神経乳頭を写真撮影し、得られた写真を計測したところ、我々の使用した画像解析法が、視神経乳頭の実測値に極めてよく近似した。2.実験的緑内障作製前ならびに眼圧上昇後に経時的に視神経乳頭画像解析を行い、眼圧上昇とともに視神経乳頭陥凹の深さ、容積、径が増大し、その増大率は眼圧の高さ、持続時間と有意に相関すること、陥凹径が眼圧上昇に最も鋭敏に反応することが明らかとなった。3.摘出した実験緑内障眼を光顕、電顕で検索した結果、強膜篩状板レベルの軸索の障害が中心血管に隣接する部位より始まり周辺に及ぶこと、視神経障害が軽微な時点で網膜神経線維の変性が始まることを示唆する知見を得た。このことから血液循環障害の重要性が示唆された。4.血液循環不全がその視神経障害に少なからず関与しているとされる低眼圧緑内障患者に血管拡張剤を投与したところ、25人中6人に視野障害の持続的改善がみとめられた。5.減圧手術前後で、緑内障性視神経乳頭陥凹の程度は有意に改善されたが、視野障害は鼻側視野を除きほとんど改善せず、進行した緑内障眼では眼圧が下降し乳頭陥凹が減少しても視機能の回復は難しいことがわかった。サル4頭を対象として,同時立体テレビカメラ画像解析装置により,視神経乳頭の三次元的定量を行った.その結果,ヒトと異なりサル眼視神経乳頭は陥凹が浅く,陥凹体積も小さいことが判明した.続いて,これらのサルの各々一眼に対してアルゴンレーザーを用いて下記の条件で繰り返し隅角線維柱帯を照射し,隅角線維柱帯を線維化させ実験的に続発開放隅角緑内障を発症させた.アルゴンレーザーの照射条件はスポットサイズ50um,パワー1000mw,照射時間0.2秒,照射数100/隅角半周である.眼圧が30mmHgを越え, 12ヵ月が経過すると乳頭陥凹は中心部より次第に深くなり,次第に辺縁部に向かって拡大した.陥凹の拡大,陥凹の容積の増加とともに辺縁部は狭小化した.眼圧の高さと持続時間の積と辺縁部面積/乳頭面積の間には有意の負の相関が認められた.一方,陥凹体積と眼圧の高さと持続時間の積の間には,正の相関が存在する傾向が認められた.無赤光線による網膜神経維層の検索結果では,陥凹の拡大とともに菲慢性の網膜神経線維の脱落が証明されたが局在性の濔薄化は認められなかった.サル10頭で、1眼の隅角にアルゴンレーザー照射を数回反復して行い、実験的緑内障を作製し、他眼は無処置コントロールをした。実験緑内障眼、対象眼を対象としてin vivoおよびin vitroで種々の検索を行ない次の結果を得た。1.緑内障眼視神経乳頭の画像解析:実験的緑内障作成

前ならびに眼圧上昇後に経時的にin vivoで視神経乳頭画像解析を行ない、眼圧上昇とともに視神経乳頭陥凹の深さ、容積、径が増大し、その増大率は眼圧の高さ、持続時間と有意に相関すること、陥凹径が眼圧上昇に最も鋭敏に反応することが明らかとなった。2.in vivoでの定量的解析の後、眼球を摘出し、摘出眼視神経乳頭を写真撮影し、得られた写真をディジタイザーにより計測し、我々の使用した画像解析法が、視神経乳頭の実測値に極めて良く近似することを明らかにした。3.摘出した緑内障眼を光顕および電顕で検索した結果、強膜篩状板レベルブの軸索の障害が中心血管に隣接する部位より始まり周辺に及ぶこと、視神経障害が軽微な時点で網膜神経繊維の変性が始まることを示唆する新しい知見を得た。この結果は、緑内障性視神経障害の成り立ちの上での血液環境障害の重要性を示唆し、本年度(平成元年)計画されている虚血を起こさせたサル眼での研究の必要性を裏付けるものと考えられる。サル眼に実験緑内障を作製し、緑内障性視経障害の上で血液循環障害の重要性が示唆されたことから、血液循環障害の関与が大きいとされている低眼圧緑内障の患者25人に、血液循環改善剤であるカルシウム拮抗剤を投与し、症状の改善の有無に関し経過観察したとともに、実験緑内障眼、および人緑内障眼に対し眼圧下降手術を施行し視神経障害の改善が期待されるか否かを、視神経乳頭画像解析にて検討し次のような結果を得た。1.低眼圧緑内障患者25人50眼にカルシウム拮抗剤を投与しところ6人12眼で持続的な視野障害の改善がみられた。年齢が若く、初期視野の平均感度が高く、眼圧が低く、かつ薬剤投与により拡張期血圧の下降がなく、皮膚温度テストの回復速度の速い患者ほどより改善する傾向がみとめられた。2.眼圧下降手術前後で視神経乳頭の画像解析を行ったところ、緑内障性乳頭陥凹の体積、C/D比の減少と乳頭辺緑面積の増加が85%の症例で観察された。改善の程度は、眼圧の減少の程度が大きいほど、また年齢が若いほど著明であった。視野は、鼻側乳頭に相当する部分の視野に鼻側乳頭陥凹の改善に相関した改善がみとめられたがい、その他の部位に改善はなく、乳頭陥凹の変化は後方に轡曲していた強膜篩状板が眼圧の下降とともに前ほう偏位したためで、かならずしも機能的な改善は期待できないと考えられた。以上の結果より、緑内障性乳頭障害の成立には血管因子、眼圧因子ともに重要であると考えられ、今後実験的に乳頭部の血管撃縮状態を作製しそれによる乳頭障害をおこさせた上で、眼圧あるいは治療薬に対する反応を検討していく予定である。
インプラント周囲炎関連細菌群の付着を防止するインプラントの表面改質法の開発

インプラント周囲炎は、治療法の開発が喫緊の問題となっている。初期定着細菌群のレンサ球菌群とインプラント周囲炎の関連が示唆される一方で、インプラント表面のバイオフィルム形成細菌叢の詳細は明らかでない。インプラント周囲炎部位において初期定着に関連する菌を特定し、それらをターゲットに付着抑制可能な表面改質を実施することにより、インプラント周囲炎を惹起する細菌で構成されるバイオフィルム形成の後期定着細菌群の表面付着抑制に繋がる可能性が高い。インプラント周囲炎部位の細菌をメタゲノム解析にて解析後、インプラント表面へ初期定着する細菌種を特定し、その付着を抑制するインプラント体の有効な表面改質法を見出す。
絶滅動物の細胞再生および有用遺伝子回収方法の確立

絶滅あるいは絶滅危惧種を復活させることができれば、失われた遺伝子の機能解析や産物利用が可能となる。研究代表者らはそのための基礎研究として、核移植技術を根本から見直し改善するのと同時に、クローン個体の大量生産の方法や、凍結死体、毛皮、糞や尿に含まれる細胞からクローン個体の作出を目指した。その結果、最新の技術を用いればクローン動物からクローン動物を作りだすことで無限生産の可能性を示し、また、尿に含まれている細胞からクローンを作りだすことに成功した。本研究は絶滅動物の細胞再生および未知の有用遺伝子の発掘を目標とし、マウスおよびラットをモデルとして実験を行っていく。初年度である本年は、ラットの凍結死体から採取した体細胞核を様々な方法でマウス卵子へ注入し、ラットの遺伝子を雑種という形でよみがえらせることを中心に行った。しかしラットの核すべてを注入したマウス卵子は、増殖可能な細胞株として樹立出来るものも得られたが、遺伝子発現を調べる実験には使えなかった。一方、ラット核から染色体1本だけを取り出してマウス卵子へ注入する方法を確立し、それらの卵子からES細胞の樹立を試みたところ、2株ではあるがラット染色体を1本含むマウスES細胞の樹立に成功した。このES細胞内に存在するラット染色体が何番のものであるかSKY染色法によって調べたところ、ラット9番染色体であることが予測された。そこでラット9番染色体上に存在し、マウスとはサイズの異なる遺伝子をいくつか選び出しゲノタイピングを行ったところ、その染色体がラット9番染色体であることが確認できた。次に、ラット9番染色体の遺伝子発現を調べるために、このES細胞を用いてキメラマウスを作製した。その結果、キメリズムは低いもののES細胞は多くの臓器に寄与しており、生殖細胞以外の各胚葉へ分化出来ることが明らかとなった。このES細胞はGFPが全身発現するマウスの卵子から作られているため、GFPポジティブの部位はES細胞由来である。そこでキメラマウスの臓器からGFPポジティブの部位を採取し、そこからラットの遺伝子の発現の有無をHiCEPで網羅的に解析した(放射線医学総合研究センターの安倍、荒木先生に依頼)。その結果、発現量は弱いが様々なラット遺伝子がキメラマウスのそれぞれの臓器で発現していることが確認できた。本結果は現在投稿準備中である。平成25年度は、山梨大での研究室セットアップを兼ねて、核移植の基本技術についてブラッシュアップを行い、クローン個体の出産率を高めるための基礎研究を行った。一方、より高度な技術である単一染色体移植方法については、山梨大での再現実験を行い、同時に改良を試みた。またマウスの毛皮やラットの凍結死体からダメージの少ない核の取り出し方法も引き続き検討した。これらの基礎研究によって、通常の核移植で使われているサイトカラシンの代わりにラットAという試薬を用いることで、核移植胚におけるアクチンフィラメントの異常が軽減され、出産率を2倍近くまで改善することに成功した。単一染色体移植方法は、この技術自体がこれまでなかった全く新しいものであり、再現性に問題があった。今回、染色体を識別するための蛍光ラベル抗体の処理をデメコルチン処理の後に行うと、効率よく染色体を取り出せることが明らかとなった。しかし、取り出した染色体を卵子あるいは胚へ移植する方法は、様々な方法を試みたが未だに最適な方法は確立していない。どの様な条件で卵子あるいは胚が外来染色体を受け入れるのかは26年度の課題とした。一方、室温保存した毛皮、及び糞からの核の取り出し方法については、回収率に問題があるものの、毎回確実に核を得ることができるようになってきた。毛皮の核はある程度の発生能を保持しているが、糞内の核はまだ一度も発生させることに成功していない。これも次年度の課題とする。一方、2006年から続けてきた連続核移植実験の結果を一流誌へ発表することができた。この成果は国内外で広く紹介された。平成24年度は理化学研究所から山梨大への研究室の異動があったため長期的な実験は中断せざるを得なかったが、条件検討を目的とした小規模な実験を頻繁に行うことができた。特に、2年間室温保存した毛皮からの細胞核の採取方法、および、それらの核を用いた核移植方法に関してはある程度の成果を出せた。毛皮由来クローン胚は低率ではあるが胚盤胞へ発育させることができた。残念ながらそれらの毛皮由来クローン胚を用いたntES細胞の樹立には成功していない。一方、糞中に含まれる細胞あるいは細胞核の回収を試みたが、ほとんど成功しなかった。GFPを指標に糞中から細胞の回収を試みたが、得られたGFP陽性の細胞状の塊には、ヘキスト染色によって、めったに核が含まれていないことが明らかとなった。核のある細胞を選び出す方法の開発が必要である。また、理化学研究所で研究室の異動直前まで行っていた研究でクローン技術の染色体異常に関する研究は、従来の蛍光顕微鏡を使わないで蛍光色を検出できる装置を開発し、同時にライブセルイメージングを用いたクローン胚の発生の観察で、染色体異常がクローン胚の発生を左右する大きな要因であることを突き止めた。これらの研究は、従来のUVライトによる蛍光色を長期間観察すると胚へのダメージが大きく、産仔を得るのが難しくなってしまうという問題を解決し、観察後も健康な産仔を得る新しい手法として発表することができた。平成26年度は、従来の研究を進めつつ同時並行で新たな実験の試行錯誤を開始した。

「糞に含まれる核からの個体作出」は、糞から安定した核の回収方法を確立したものの、現在まで核移植した卵子を発生させることに成功していない。核移植後、糞由来の核はめったに膨化せず、たとえ膨化しても2細胞期へ発生しなかった。このテーマは今後も継続していくが、発想の大きな転換を必要とする。「異種の単一染色体移植技術」は、工程が長いだけでなく、各工程が難しく、安定した技術になっていない。それぞれの工程を見直し改善を試みたが、十分な量の試行錯誤が出来なかったためか、良い結果を得ることが出来なかった。だが単一染色体移植は世界初の技術であり確実に再現できるため、次年度はより力を入れる予定である。その他さまざまな独立したテーマの予備的な実験を行った。将来大型動物へ胚を移植する場合、実験室から動物園などへ胚を輸送する必要がある。そこで非常にシンプルで低コストな胚の輸送方法を開発することに成功した。この成果は現在投稿中である。一方、尿から細胞を回収し、そこから世界で初めてクローンマウスを作出することに成功した。絶滅危惧種の場合、たとえ個体を得られても傷つけ細胞を回収することが困難なため、無傷でドナー細胞を回収できる方法として価値がある。今後は出産率の改善および多系統での成功例などを追加する予定である。平成27年度は最終年度ということもあり、予備実験による試行錯誤だけでなく、技術が確立でき、確実に成果を出せる実験にも力を入れた。その結果、尿に含まれる細胞からクローンマウスを作り出す実験は論文として発表出来た。この成果は読売新聞など主要な全国紙およびNHKなどのテレビで報道された。尿を利用すれば動物の体を傷つけることなくドナー細胞を回収できることを示しており、野生動物や絶滅危惧種への応用が期待できる。また、初期化促進のための新しい技術開発として、これまで行われたことのない、未受精卵を2回利用した連続核移植を試みた。現時点で初期化の改善までは成果が出ていないが、技術的に可能だということを初めて証明した成果であり、現在専門誌へ投稿中である。それ以外のテーマについては、まだ試行錯誤の段階であり、平成28年度以降も継続して行っていく。一方、本研究の実施に必要な世界最高レベルの研究環境を整えるべく、山梨大学に発生工学研究センターを設置した。外部から発生工学を専門とする教授を1名雇用し、本センターが使用できるマイクロマニピュレーターを合計17台にした。これにより、世界最高レベルの研究環境が実現できた。絶滅あるいは絶滅危惧種を復活させることができれば、失われた遺伝子の機能解析や産物利用が可能となる。研究代表者らはそのための基礎研究として、核移植技術を根本から見直し改善するのと同時に、クローン個体の大量生産の方法や、凍結死体、毛皮、糞や尿に含まれる細胞からクローン個体の作出を目指した。その結果、最新の技術を用いればクローン動物からクローン動物を作りだすことで無限生産の可能性を示し、また、尿に含まれている細胞からクローンを作りだすことに成功した。山梨大へ異動して2年目であり、初年度に全力で研究室のセットアップを行ったため、実験室の環境は整ってきた。
癌治療標的としてのTOPKの基礎的検討

MAPKK様の蛋白キナーゼであるTOPKは癌細胞の増殖や移動に深く関与している。一方、抗Her2モノクローナル抗体が臨床応用されていて、それはEGFレセプターからMAPKあるいはPI3K系にシグナルが伝達される系に働く。Raf蛋白はこのシグナル系に深く関与しており、さらにRaf蛋白はTOPKに結合する事が知られている。この研究では乳癌細胞を使ってTOPKとRafのシグナルの関連を調べる事によって、癌治療標的としてのTOPKの意義を検討した。免疫染色による検討で、TOPKの発現性は乳癌の悪性度であるHistologic Gradeと相関した。リン酸化実験等によってRafはTOPKのスレオニン198番をリン酸化する事が示され、RafがTOPKのリン酸化活性を上昇させ、Raf-TOPK結合能を上昇させることが明らかとなった。TOPKは癌とりわけ乳癌細胞においてEGF-/Her2のシグナル系において重要な役割を示している事が示され、結果、TOPKは癌治療標的として有用である可能性が示された。平成20年度では、予定通り、1)乳癌組織におけるTOPKの発現性と組織学的悪性度の検討、2)TOPK-Raf結合活性の生物学的意義の検討、3)TOPK-transgenic mouseの作製について実験を開始し、進行させている。1)の免疫組織学的検討においては、すでに目標とした組織染色ならびにTOPK染色性のスコア化と乳癌悪性度との比較を行い、予想された相関性を得ることが出来た。2)のRafとの結合性ならびにその生物学的意義の検討に於いては、TOPKとRafの結合に必須である阿見さん配列部分の同定に始まって、細胞内でのin vivo結合性など詳細に検討を進行させている。さらに生物学的な活性の検討に於いても、TOPKシグナルとRaf-MAPKシグナルとの相互関係に於いて興味ある結果を得つつありその点について目下、さらに詳しく検討を進めている。TOPKはCyclinB/cdk1キナーゼ復合体に結合して、cdk1基質のリン酸化を足進する効果があって、PRC1)蛋白のリン酸化を上昇させることによって、細胞質分裂に関与するのみならず、MAPK経路とも深く関与し、p38MAPKやJNKさらにはERKなどもリン酸化させることが明らかとなっている。それに加えて今回の検討で、Rafとの結合を介してERKシグナルをさらに増強させることが次第に明らかになりつつあり、このことは乳癌増殖におけるECFレセプター/HER2シグナルの役割とその臨床応用を鑑みるときに乳癌においてTOPKが果たす役割の大きさを示唆する内容と考えている。また、3)のトランスジェニックマウスは、既に組み替え遺伝子を作製して、ベクターに挿入、それをマウスの胚に注入する作業を進めており、じきに遺伝子過剰発現マウスが獲られるものと考えて進行させつつある。以上、本年の予定は当初のほぼ計画通り進行していて、来年度のまとめの際には投稿論文にまとめて、掲載させたいと考えている。1)乳癌組織におけるTOPKの発現性と組織学的悪性度ならびに乳癌術後の予後等との関連性の検討を行ってきた。乳癌組織標本にてTOPKの免疫染色を行い、TOPK発現の高さと乳癌のHistologic gradingとの直接的相関について検討し、この間に比較的高い相関性を認めた。乳癌術後予後とTOPK発現性との詳細な相関関係等の検討は目下進行中である。2) TOPK-Raf結合活性の生物学的意義の検討を行った。培養細胞を用いてin vivoでのTOPKとRafの結合性について検討した結果、TOPKとRafとは細胞内で結合している事が示された。in vitro実験系にてリコンビナントTOPKフラグメントとRafフラグメントの結合部位と結合活性について検討し、両者の相互結合部位をアミノ酸レベルで明らかにした。次いでTOPKおよびRafによる相互のリン酸化活性について検討した結果、、TOPKはRafやERKのリン酸化を促進する事が示された。以上より、TOPKがRafと結合することによってRas-Raf-MEK-ERK系増殖シグナルを活性化する事が明らかとなった。3)目下、TOPK-transgenic mouseの作製を進めている。以上より、TOPKは癌細胞増殖においてERKシグナルを介して重要な役割を果たしていることが明らかとなりつつある。すなわち、乳癌や大腸癌などTOPK発現性の高い癌の治療標的分分子としてTOPKが有用なものとなる可能性が示されつつある。

平成22年度では、1)乳癌組織におけるTOPKの発現性と組織学的悪性度の検討、2)TOPK-Raf結合活性の生物学的意義の検討について実験を行いまとめた。その結果、1)免疫組織学的検討においてはTOPK染色性のスコア化と乳癌悪性度との比較を総括し、TOPKの発現性と乳癌の悪性度、増殖活性との相関性を得ることが出来た。2)Rafとの結合性ならびにその生物学的意義の検討に於いては、TOPKとRafの結合に必須であるアミノ酸配列部分を同定し、細胞内でのin vivo結合性の検討を行った結果、TOPKとRafが生物学的に有意に結合して活性を示している可能性が認められた。結果、TOPKはCyclinB/cdk1キナーゼ複合体に結合して、cdk1基質のリン酸化を促進する効果があって、PRC1蛋白のリン酸化を上昇させることによって、細胞質分裂に関与するのみならず、MAPK経路とも深く関与し、p38MAPKやJNKさらにはERKなどもリン酸化させて活性化するその全貌が少しずつ明瞭となってきている。これに加え今回の研究によってTOPKはRafとの結合を介してERKシグナルを増強させることが明らかとなり、乳癌増殖におけるEGFレセプター/HER2シグナルの役割とその臨床応用においてTOPKが果たす役割の大きさを示唆するものとなった。なおトランスジェニックマウス作製はさらに実験検討中である。以上、本年の予定は当初のほぼ計画通り進行させることができ、その結果、TOPKの機能について重要な結果を得ることができた。
研究留学生にみられる日本語発話能力の変化と日本語使用環境に関する基礎的研究

1.研究目的本研究の目的は、日本語予備教育を終了し大学院へ進学した国費研究留学生のその後の日本語発話能力の変化を追跡調査し、その変化と日本語学習・日本語使用の実態とのかかわりを明らかにしようとするものである。2.研究内容本研究では、発話能力の変化を調べるために3カ月に一度被験者と面談し、(1)日本語でのインタビュー、(2)絵を見て物語を作る、(3)電話でのロールプレイ、の3つの課題を与えた。平成5年12月から平成8年7月までに延べ11回の調査を継続的に実施した。被調査者は24名、調査回数は延べ114回である。一方、日本語学習・日本語使用の実態を知るために平成5年末から平成6年にかけて研修コース終了生、その指導教官、研究室の日本人学生にアンケート調査を実施し、その結果を分析した。3.研究成果本研究の成果の一部は、『日本語研修コース修了生追跡報告書』(平成6年7月)、『日本語研修コース修了生追跡調査報告書2』(平成8年11月)として刊行されている。はじめの報告書は主としてアンケート調査の分析結果をまとめたものであり、2冊目の報告書では、アンケート調査にもとづく論文3編、発話資料の分析にもとづく論文11編(アクセント、発話速度、語彙、格助詞、終助詞、テンスとアスペクト体系などに関する研究結果)が掲載されている。4.今後の課題平成8年から発話資料のコンピューター処理をめざしてCHILDESへの入力作業を進めている。膨大な発話資料のデータベース化が今後の課題である。1発話資料の収集平成5年12月に開始した発話資料の収集作業を3ヵ月ごとに実施し、平成8年1月までに計9回の調査を行った。被験者は延べ106人、収集した発話資料は約100時間である。2発話資料の文字化とデータベース化テープ106本の内、82本は文字化が終了した。残り24本は文字化またはチェック作業の最中である。発話資料をコンピューターで分析するためにCHILDESのシステムを採用し、これまでに被験者3名の文字化資料を試験的にコンピューターに入力した。CHILDESの有効性を検証する作業を進めているところであるが、CHILDESが分析の有力な武器になることが次第にはっきりしてきている。3アンケート・面接調査の分析平成6年度に実施した調査の分析を進めるとともに再度調査の必要性、可能性を検討している。研究計画の初年度にあたる平成7年度は発話資料の収集と文字化、データベースの作成に多くの時間を取られ、資料の十分な分析には至っていない。資料の文字化作業は順調に進んでいるので、今後は音声資料のデータベース化の作業と資料の分析に力を注ぐ予定である。1.研究目的と内容本研究は、日本語予備教育を修了し大学院へ進学した国費研究留学生のその後の日本語発話能力と日本語学習・日本語使用の実態とを追跡調査しようとするものである。そのために3カ月に一度面接し、(1)日本語でのインタビュー(2)絵を見て物語を作る、(3)電話でのロールプレイ、の3つの課題を継続的に行ってきた。発話資料の収集と処理平成5年12月に開始した発話資料の収集作業を平成8年7月に終了した。3カ月ごとに実施した縦断的調査は延べ11回、被調査者24名、調査回数は延べ114回である。収集した資料の文字化作業も平成8年12月に完了した。現在、発話資料のコンピューター分析ソフトCHILDESへの入力作業を進めている。中間報告書の作成平成8年11月に当初の研究計画通り本研究の中間報告を『日本語研修コース修了生追跡調査報告書2』として刊行した。アンケート調査にもとづく論文3編、発話資料の分析にもとづく論文11編、および関連資料をまとめて掲載した。今後の課題