hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
温度成層型蓄熱槽の任意変動入力条件に対応した槽内混合モデルに関する研究

本研究では,水蓄熱方式である温度成層型蓄熱システムの最適設計および最適蓄熱運転を最終目標とし,蓄熱槽への入力流量および温度が任意に変化する条件での種々の実験を行い,蓄熱槽内の温度分布を十分な精度で予測できるモデルを構築とこのモデルの検証とを目的としている.平成15年度は,昨年度の実験では,入力温度を十分な精度で制御できなかったので,追加の実験を行い,平成14,15年度の実験結果を用いて,任意変動入力条件に対応した槽内混合モデルを作成し,モデルの検証を行った.モデルの作成にあたって,モデルの予測精度を左右する完全混合域の深さは,一定入力条件のモデルと同様の実験式を利用し,本研究では,この実験式中に含まれる蓄熱槽内水の基準密度の決定方法に的を絞り,槽内温度分布の予測精度の高いモデルを開発した.開発した温度成層型蓄熱槽の任意変動入力条件に対応した槽内混合モデルは,定流量・温度ステップ変動入力条件に対応した槽内混合モデルと同様に,槽内を鉛直方向に二つの領域に分けてモデル化した.入力口側に形成される混合域は,槽への入力が混合域全体に2次式で表される分布形で入力されるものとし,それぞれの深さで,水平方向に一様温度となるものと仮定してモデル化した.出口側に形成される一次元拡散域は,一定入力のモデルと同様に,槽の水平断面内でも温度が一様であるとし,垂直方向の拡散と移流による熱の移動を考慮したモデル式とした.このモデルを用いた槽内温度分布の推移の計算結果は,槽上部から流入する条件で,流入口付近の槽内水温が入力温度よりも高い場合に,計算結果と実験結果は若干の差が見られる結果となったが,その他の入力条件では,実験結果と非常に良く一致した.本研究では,水蓄熱方式である温度成層型蓄熱システムの最適設計および最適蓄熱運転を最終目標とし,蓄熱槽への入力流量および温度が任意に変化する条件での種々の実験を行い,蓄熱槽内の温度分布を十分な精度で予測できるモデルを構築とこのモデルの検証とを目的としている.平成14年度は,槽内混合モデルの検討のための実験データ蓄積のため,実験を行った.現有実験装置は,任意の流量・温度での入力を手動で制御可能であった.そこで,あらかじめ想定した任意の入力条件を実現するため,装置内のバルブをパーソナルコンピュータを用いて制御することを可能とした.これにより,多様な入力条件での実験を行うことが可能となり,実システムの入力条件を再現することも可能となった.平成14年度は,以下に示した入力条件の実験を行った.1入力温度一定で,入力流量が変動する条件:この条件は,蓄熱槽からの放熱時,空調機から蓄熱槽に還る水温が一定に制御されている場合で,空調負荷に応じて流量が変動する場合を想定したものである.・流量が,単調増加・減少する条件・流量が,ステップ状に増加・減少する条件・流量が,増減を繰り返す条件2入力流量一定で,入力温度が変動する条件:蓄熱時のヒートポンプから蓄熱槽に還る流量が一定で,外界条件によりヒートポンプの効率が変動して,槽への還り水温が変動する場合や,放熱時,負荷に応じた流量制御が機能していない場合を想定した実験.・入力温度が,単調上昇・低下する条件・入力温度が,上昇・低下を繰り返す条件本研究では,水蓄熱方式である温度成層型蓄熱システムの最適設計および最適蓄熱運転を最終目標とし,蓄熱槽への入力流量および温度が任意に変化する条件での種々の実験を行い,蓄熱槽内の温度分布を十分な精度で予測できるモデルを構築とこのモデルの検証とを目的としている.平成15年度は,昨年度の実験では,入力温度を十分な精度で制御できなかったので,追加の実験を行い,平成14,15年度の実験結果を用いて,任意変動入力条件に対応した槽内混合モデルを作成し,モデルの検証を行った.モデルの作成にあたって,モデルの予測精度を左右する完全混合域の深さは,一定入力条件のモデルと同様の実験式を利用し,本研究では,この実験式中に含まれる蓄熱槽内水の基準密度の決定方法に的を絞り,槽内温度分布の予測精度の高いモデルを開発した.開発した温度成層型蓄熱槽の任意変動入力条件に対応した槽内混合モデルは,定流量・温度ステップ変動入力条件に対応した槽内混合モデルと同様に,槽内を鉛直方向に二つの領域に分けてモデル化した.入力口側に形成される混合域は,槽への入力が混合域全体に2次式で表される分布形で入力されるものとし,それぞれの深さで,水平方向に一様温度となるものと仮定してモデル化した.出口側に形成される一次元拡散域は,一定入力のモデルと同様に,槽の水平断面内でも温度が一様であるとし,垂直方向の拡散と移流による熱の移動を考慮したモデル式とした.このモデルを用いた槽内温度分布の推移の計算結果は,槽上部から流入する条件で,流入口付近の槽内水温が入力温度よりも高い場合に,計算結果と実験結果は若干の差が見られる結果となったが,その他の入力条件では,実験結果と非常に良く一致した.
白血病や脳神経疾患の病態解析及び治療に有効な新規RNAiベクターの開発

本研究において、T7RNAポリメラーゼを利用した細胞質内で直接siRNAを発現できるRNAiベクターの開発を行った。HeLa細胞又はA549細胞において、ルシフェラーゼ発現プラスミドpGL3-controlによるルシフェラーゼ発現は、T7RNAポリメラーゼ発現プラスミドpCMV-T7RNAPとT7RNAポリメラーゼによってルシフェラーゼに対するsiRNA発現を誘導するプラスミドベクターpT7-RNAi-Luのコトランスフェクションによって有意に抑制された。さらに、HeLa細胞のp53タンパク質発現は、pCMV-T7RNAPとT7RNAポリメラーゼによってp53遺伝子に対するsiRNA発現を誘導するプラスミドベクターpT7-RNAi-p53のコトランスフェクションによって有意に抑制された。以上の結果より、本研究において開発した新規RNAiベクター系が、期待した機能を有することを確認できた。RNA干渉(RNAi)は、短い2本鎖RNA(siRNA)を直接細胞内へ導入する、又はsiRNAを発現するベクター(RNAiベクター)を細胞内へ導入することで標的遺伝子の発現を特異的に抑制する手法である。RNAiは遺伝子の機能解析に利用されているが、白血病細胞や神経細胞のような遺伝子導入効率が低い細胞ではRNAiの利用が困難である。一般に、細胞内に導入されたプラスミドベクターは、細胞質を経由し、核内に到達して遺伝子を発現する。ところが、細胞質から核内への移行効率は非常に低く、導入されたプラスミドベクターの大部分は細胞質に留まる。そのため、従来遺伝子導入効率が低いとされる細胞でも、実際は相当量のベクターが細胞内に導入されると考えられる。そこで、細胞質内で直接siRNAを発現できるベクターは、遺伝子導入効率が低い細胞の機能解析に利用できるRNAiベクターと成り得る。以上のことから、本研究では細胞質内で直接siRNAを発現できるRNAiベクターを開発することを目的とする。本年度はT7RNAポリメラーゼ発現プラスミドベクターpCMV-T7RNAP及びT7RNAポリメラーゼによってがん抑制遺伝子p53に対するsiRNA発現が誘導されるプラスミドベクターpT7-RNAi-p53を作製した。また、pT7-RNAi-p53の対照としてpT7-RNAi-L及びpT7-RNAi-LacZも作製した。続いて、当研究室においてHeLa細胞及びA549細胞の培養系を立ち上げた。今後、細胞培養系を用いて新規RNAiベクターシステムが機能するのかを確認する予定である。RNA干渉(RNAi)は遺伝子の機能解析に利用されているが、白血病細胞や神経細胞のような遺伝子導入効率が低い細胞ではRNAiの利用が困難である。本年度は、昨年度組換えたプラスミドベクター(T7RNAポリメラーゼによってがん抑制遺伝子p53に対するsiRNA発現が誘導されるプラスミドベクターpT7-RNAi-p53、pT7-RNAi-p53の対照であるpT7-RNAi-L及びpT7-RNAi-LacZ)の導入したオリゴDNAの配列を確認し、期待した配列であることを確認した。次に新規RNAiベクターシステムが機能するのか培養MCF7細胞及びA549細胞を用いて検討するため、β-ガラクトシダーゼ発現プラスミドpCMVβを用いてプラスミドベクターの遺伝子導入条件の検討を行った。24ウェルプレートに細胞を播種し、SuperFect試薬(キアゲン社製)を用いてpCMVβを遺伝子導入した後、β-ガラクトシダーゼ染色を行ったが、青く染色された細胞は観察できなかった。今後、β-ガラクトシダーゼより検出感度の高いルシフェラーゼを用いた検出系を用いて、新規RNAiベクターシステムの機能を確認する予定である。

一般に、細胞内に導入されたプラスミドベクターは、細胞質を経由し、核内に到達して遺伝子を発現する。ところが、細胞質から核内への移行効率は非常に低く、導入されたプラスミドベクターの大部分は細胞質に留まる。そのため、従来遺伝子導入効率が低いとされる細胞でも、実際は相当量のベクターが細胞内に導入されると考えられる。そこで、細胞質内で直接siRNAを発現できるベクターは、遺伝子導入効率が低い細胞の機能解析に利用できるRNAiベクターと成り得る。以上のことから、本研究では細胞質内で直接siRNAを発現できるRNAiベクターを開発することを目的とする。本年度は、新規RNAiベクターシステムが機能するのか培養A549細胞及びHeLa細胞を用いて検討した。ルシフェラーゼ発現プラスミドpGL3-Controlと共にT7RNAポリメラーゼ発現プラスミドpCMV-T7RNAP及びpT7-RNAi-Luを導入すると、ルシフェラーゼの発現は有意に抑制した。この結果から、作製したベクターシステムは機能することが明らかとなった。続いて、新規ベクターシステムが内因性遺伝子産物の発現を抑制できるか確認するため、p53タンパク質の発現抑制効果を検討した。培養HeLa細胞にpCMV-T7RNAP及びpT7-RNAi-p53を導入したところ、p53タンパク質の発現を有意に抑制することができた。以上の結果から、本研究によって作製した新規RNAiベクターは、標的とする内因性遺伝子産物を効果的に抑制できることが明らかとなった。今後は、HL-60細胞やPC-12細胞等の培養細胞を用いて、標的遺伝子産物の抑制効果や細胞増殖抑制効果を確認する予定である。作製したプラスミドベクターを培養細胞へ遺伝子導入するトランスフェクション条件の検討に時間を要した為。24年度が最終年度であるため、記入しない。新規RNAiベクター系の機能解析を培養細胞を用いて検討するため、ヒト乳がん細胞株MCF7又はヒト肺がん細胞株A549へpCMV-T7RNAPとpT7-RNAi-p53の両者をコトランスフェクションし、p53タンパク質の発現量の変化を測定する。次に、前骨髄性白血病細胞HL-60又は神経細胞PC-12に対しても同様の実験を行い、p53タンパク質の発現量の変化を測定する。
物理的意味を持つリーマン距離に基づく生体運動の理解

多関節系の運動をリーマン距離の観点から力学的・数学的に特徴づけ,これを利用し,多関節運動の慣性誘発効果(慣性,コリオリ,遠心力のみによる運動効果)の度合いを計測する「慣性誘発度メジャー」を構築した.このメジャーにより人間の運動を解析したところ,運動途中で慣性誘発運動に近い傾向を示し,この結果は人間が慣性誘発効果を利用するように自身の身体(多関節系)を協応させて動かしているとの示唆をもたらした.さらに,この力学解析を踏まえ,慣性誘発効果を利用した多関節ロボットの運動制御法を設計した.多関節系の運動をリーマン距離の観点から力学的・数学的に特徴づけ,これを利用し,多関節運動の慣性誘発効果(慣性,コリオリ,遠心力のみによる運動効果)の度合いを計測する「慣性誘発度メジャー」を構築した.このメジャーにより人間の運動を解析したところ,運動途中で慣性誘発運動に近い傾向を示し,この結果は人間が慣性誘発効果を利用するように自身の身体(多関節系)を協応させて動かしているとの示唆をもたらした.さらに,この力学解析を踏まえ,慣性誘発効果を利用した多関節ロボットの運動制御法を設計した.多関節系の慣性運動をリーマン距離の観点から力学的・数学的に特徴づけ,それに基づいた,生体運動の解析手法,多関節ロボットの運動制御法を示すことを,本研究の目的としている.本年度は,リーマン距離による多関節運動の解釈,生体運動における慣性誘発効果の度合いを測る「慣性運動メジャー」の提案を行った.回転関節により結合される剛体リンク系のとり得る姿勢全体の集合は,微分可能多様体とみなせる.この多様体に,多関節系の慣性行列からなるリーマン計量を定義すると,その多様体はリーマン多様体となる.このリーマン多様体で適当に選んだ2点(各点は多関節系の各姿勢に対応する)において, 2点間をリーマン距離で結ぶ測地線は,力学的には,多関節系が2姿勢間を慣性誘発力(慣性力,遠心力,コリオリカ)のみの作用によって動くときの運動に対応することを明らかにした.平面4自由度剛体リンクアームの場合,リンクに枝分かれのある場合(人間の全身モデル)について運動のシミュレーションを行い,それらが力学的に自然で滑らかな運動であることを確認した.さらに,多関節系のある部分が環境と接しながら運動する場合,すなわち,ホロノミック拘束のある場合でも,拘束条件を満足する姿勢の部分集合を考えれば,その集合がリーマン部分多様体となり,拘束のない場合と同様に扱えることを示した.また,これらのリーマン距離の力学的性質に基づき,人間の運動中の慣性誘発運動の度合いを測る慣性運動メジャーを提案し,その効果をコンピュータ上で作り出した力学的に理想的な運動に適用することで確認した.慣性運動メジャーは,人間が慣性をどのように扱っているか,運動中のどの区間で慣性を利用しているかを定量的に示し得る.現在,実際のリーチングデータにこのメジャーを適用し,運動解析を行っている.その他,慣性誘発効果を巧みに利用する,多関節ロボットの運動計画の可能性を示唆した.多関節系の慣性運動をリーマン距離の観点から力学的・数学的に特徴付け,それに基づいた生体運動の解析手法,多関節ロボットの運動制御法を示すことを本研究の目的としている.本年度は,昨年度に提案した「慣性誘発度メジャー(慣性運動メジャー)」を実際の人間のリーチング動作に適用し,運動解析を行った.このメジャーは,リーマン距離の力学的特徴を利用しており,多関節運動の慣性誘発効果(慣性,コリオリ,遠心力のみによる運動効果)の度合いを計測可能である.このメジャーを用いて運動解析をしたところ,熟練した滑らかな運動では,運動初期と末期で慣性誘発運動から遠くなるのに対し,運動中盤では極めて近くなる結果を得た.この結果から,人間は慣性誘発効果を利用するように自身の腕(多関節系)を協応させて動かしているとの示唆を示した.また,このメジャーは,大腿義足使用者の日常生活動作(ADL)の向上を目指した歩行解析への応用も試みられた.義足歩行熟練者はある程度重みのある義足を好むといわれるが,その微妙な調整には,義肢装具士の長年の勘や使用者の使用感に頼るところが多い.大腿義足歩行の遊脚期運動に慣性誘発度メジャーを適用したところ,慣性誘発運動に近い運動と使用者の主観評価の結果に有意な相関が見られ,これまで経験に頼ってきた運動評価を慣性誘発度メジャーによって定量的に評価可能なことを示した.こうした生体運動の慣性誘発効果利用の特徴を踏まえ,運動中に慣性誘発効果を利用するロボットアームの運動制御法を考案した.慣性誘発効果の支配的なシステムでは,運動途中に制御入力が無くても,協調がとれて効率の良い運動が実現可能であることを数値シミュレーションにより確認した.
培養細胞系を用いたWnt/Winglessシグナル伝達経路の生化学的解析

Dsh蛋白質はWnt/Wgシグナル並びにPlanarPolarityシグナルに関わるJNK経路を仲介する多機能のシグナルトランスデューサーで、Drosophila、マウスの多くの組織に恒常的な発現が認められる。DIX、PDZドメインがWnt/Wgシグナルに必須であり、またDEPドメインがJNKシグナルに関わる。最近生物活性を保ったWnt-3a標品が使用可能となった為、Wntシグナル伝達にともなってDvl-1,2分子が示す生化学的変化の性状を、マウスやヒトの各種培養細胞を用いて解析し、Dshファミリー蛋白質の基本的機能を同定する事を試みた。まず、1)マウスNIH3T3,L,C57MG細胞を可溶性Wnt-3a蛋白で3時間処理すると、βカテニン蛋白の著しい細胞質内蓄積が観察され、さらにそれと同時にDvl-1,2分子のSer/Thrリン酸化の亢進に伴うバンドシフトが生じた。ここに初めてDshと同様に、DvlもWnt刺激によりリン酸化を受け、活性化される可能性が示された。2)Dvl-1,2分子の動物細胞での強制発現はアポトーシスを誘導した。しかしDrosophilaのclone8翅原基細胞やSchneider S2細胞では、メタロチオネイン誘導型ベクターを用いる事によってDvl-1,2分子の誘導発現をする細胞株の樹立が可能で、強制発現させるとDrosophilaのDshの場合と同様に、Arm蛋白の蓄積ならびにDE-cadherin誘導、そして、Dvl-1,2分子の高度のSer/Thrリン酸化が生じた。Dvl-1,2蛋白はclone8細胞内の主に細胞質に斑点状に局在した。3)更にDsh,及びDvl-1,2分子には、ともに免疫共沈されてくるプロテインキナーゼが存在し、そのうちの一つはPDZドメインに結合するCasein kinase IIであった。4)さらに、Dvl-1,2蛋白の強制発現はZW3によるTauリン酸化活性を阻害する事を、リン酸化型特異的抗Tau抗体を用いたIn vivo assayによって初めて明らかにした。5)またSchneider S2細胞内でのDsh,及びDvl-1,2過剰発現によるArm蛋白の蓄積はCasein kinase Iの特異的阻害剤であるCKI-7により完全に消失した。6)現在Dvl-1,2分子の強制発現によるJNK経路の活性化機構についてリン酸化型特異的Jun抗体を用いて検討中である。
胎仔脳が出産のタイミングを決めているか?

胎仔の視床下部-下垂体-副腎系が分娩の開始を決定している可能性を示唆する過去の報告にもとづき、ラット胎仔脳を電気刺激することによって母体の子宮筋の収縮を誘発できるかどうかを検討した。母体の子宮筋に収縮力センサーを縫着後、子宮から胎仔を取り出して、私たちが考案した胎仔固定装置に胎仔の頭部を装着固定した。頭皮および頭蓋骨を切除後胎仔脳に刺激電極を刺入し、電気刺激を加えて母体の子宮筋の収縮を観察した。刺激部位は、これまでの破壊実験の報告などから視床下部室傍核を中心に刺激を行った。反応がある場合には、刺激開始後1分から5分程で子宮収縮が増強した。しかし、刺激開始前に子宮収縮が顕著な場合には胎仔脳刺激後に子宮収縮の抑制が見られたり、逆に子宮収縮があまり起きていない状態で胎仔脳を刺激すると子宮収縮が増加するという現象も見られた。現状では刺激により子宮収縮の状態が変化する例は見られるものの、安定した結果はまだ多くは得られていない。この原因として、麻酔の影響によって子宮筋の収縮が弱くなっていることと、胎仔脳が非常に小さいため脳内の特定部位を毎回正確に刺激するのが困難なことなどが考えられる。今後、これらの問題点を克服するためのさらなる工夫が必要である。また、実験の再現性が高まり明確なデータが得られるようになれば、次に胎仔脳の刺激によって生じる子宮筋収縮を仲介する物質が何であるか、またそれがどのような経路を経て母体子宮へと伝達されるかを究明していく予定である。
熱弾性問題の新しい境界要素解析法と特異応力場への応用

非線形非定常熱伝導問題の新しい境界要素法と,これをき裂を持つ熱弾性体の特異応力場の解析に応用することをまず研究した.温度依存の材料定数を持つ非線形熱伝導問題にKirchhoff変換を施して準線形の方程式系に変換したのち,これに境界要素法を適用して数値解を求める新しい解析法を提案した.時間軸を一定時間要素で分割すれば,この解析法はきわめて効率的なものになることを,いくつかの実用例について検討した.この研究成果は英文で公表した.一方,き裂を含む弾性体に熱負荷が加わるときの種々のき裂モード下での応力拡大係数の境界要素解析法を,特に実用上重要な3次元問題について開発した.表面き裂を含むいくつかの実用例に適用して一連の設計資料を求め,その成果を公表した.この解法は従来の解析法に属し,温度場の情報は熱伝導方程式を解くことにより求め,これを静弾性問題に対する境界要素法を改良した熱弾性問題の解析法に用いて応力場を定めるものである.温度場と変位場とを連成させた方程式系を一挙に境界要素法で解く方法が開発できたならば,さらに効率的な熱応力問題の解析ができるはずである.この新しい解析法には,他の分野でも最近注目されているHormanderの方法を応用できる.新しい基本解をこの方法で誘導し,通常の境界積分方程式の定式化の組込めばよい.本研究の後半では,線形問題ばかりでなく,非線形問題にもこの新しい解法を構築することを中心に研究した.まず,この新しい解析法の理論的側面について考察し,その成果を公表した.つぎに, 2次元および3次元定常熱弾性問題について新しくBEMソフトウェアを開発し,具体的に応用して一連の設計資料を得た結果を公表した.本解法を最も効果的に応用できる連成熱弾性問題については今後の研究課題である.非線形非定常熱伝導問題の新しい境界要素法と,これをき裂を持つ熱弾性体の特異応力場の解析に応用することをまず研究した.温度依存の材料定数を持つ非線形熱伝導問題にKirchhoff変換を施して準線形の方程式系に変換したのち,これに境界要素法を適用して数値解を求める新しい解析法を提案した.時間軸を一定時間要素で分割すれば,この解析法はきわめて効率的なものになることを,いくつかの実用例について検討した.この研究成果は英文で公表した.一方,き裂を含む弾性体に熱負荷が加わるときの種々のき裂モード下での応力拡大係数の境界要素解析法を,特に実用上重要な3次元問題について開発した.表面き裂を含むいくつかの実用例に適用して一連の設計資料を求め,その成果を公表した.この解法は従来の解析法に属し,温度場の情報は熱伝導方程式を解くことにより求め,これを静弾性問題に対する境界要素法を改良した熱弾性問題の解析法に用いて応力場を定めるものである.温度場と変位場とを連成させた方程式系を一挙に境界要素法で解く方法が開発できたならば,さらに効率的な熱応力問題の解析ができるはずである.この新しい解析法には,他の分野でも最近注目されているHormanderの方法を応用できる.新しい基本解をこの方法で誘導し,通常の境界積分方程式の定式化の組込めばよい.本研究の後半では,線形問題ばかりでなく,非線形問題にもこの新しい解法を構築することを中心に研究した.まず,この新しい解析法の理論的側面について考察し,その成果を公表した.つぎに, 2次元および3次元定常熱弾性問題について新しくBEMソフトウェアを開発し,具体的に応用して一連の設計資料を得た結果を公表した.本解法を最も効果的に応用できる連成熱弾性問題については今後の研究課題である.非線形非定常熱伝導問題の新しい境界要素法と、これをき裂を持つ熱弾性体の特異応力場の解析に応用することを中心に研究した。温度依存の材料定数を持つ非線形熱伝導問題にKirchhoff変換を施して準線形の方程式系に変換したのち、これに境界要素法を適用して数値解を求める新しい解析法を提案した。時問軸を一定時間要素で分割すれば、この解析法はきわめて効率的なものになることを、いくつかの実用例について検討した。一方、き裂を含む弾性体に熱負荷が加わるときの種々のき裂モード下での応力拡大係数の境界要素解析法を、特に実用上重要な3次元問題について開発した。表面き裂を含むいくつかの実用例に適用して一連のデータを求めて設計資料とすることを試みた。この解法では、温度場の情報は熱伝導方程式を解くことにより求め、これを静弾性問題に対する境界要素法を改良した熱弾性問題の解析法に用いて応力場を定めるものである。いわば二段階の解析法を採用している。温度場と変位場とを連成させた方程式系を一挙に境界要素法で解く方法が開発できたならば、さらに効率的な熱応力問題の解析ができるはずである。この新しい解析法には、他の分野でも最近注目されているH【o! ̈】rnanderの方法を応用できる。新しい基本解をこの方法で誘導し、通常の境界積分方程式の定式化に組込めばよい。線形問題ばかりでなく、非線形問題にもこの新しい解法を構築することを目標に今後の研究を進める予定である。また、き裂近傍の特性を考慮したき裂要素を用いる応力拡大係数の計算法についても考察する。
生物分子モーターの回転を自在に操る新しい実験システムの開発

本研究では、葉緑体型ATP合成酵素の活性制御がγサブユニットの2本のαヘリックスの相対的な位置のズレに起因すると予想し、γサブユニットの中心軸を構成するαヘリックスの相対位置を任意に動かすことで活性がどのように変化するかを評価すること、γサブユニット下部のチオールスイッチ部分の配列を光駆動スイッチタンパク質に置き換え、光のオンオフあるいは波長の切り替えによって酵素活性および回転の調節を行うことを目指して研究を行った。さらに、ATP合成酵素の加水分解活性の測定に一般に用いられるカップリングアッセイ法の感度を大幅に向上し、1分子レベルで溶液状態の酵素の活性を測定することを目標として、極微量の溶液小胞中に封じ込めた酵素の動態を蛍光を用いて簡便にモニターできる実験系の開発を行った。本研究では、葉緑体型ATP合成酵素γサブユニットのチオールスイッチ部分の配列を、光駆動スイッチタンパク質であるフォトトロピンのLOVドメイン、光合成細菌のBLUFドメイン、シアノバクテリアのGAFドメインにそれぞれ置き換え、光のオンオフあるいは波長の切り替えによって酵素活性および回転が調節出来るかどうかを調べることを目指した。まず、制御領域に光応答タンパク質のスイッチ部分を遺伝子操作によって導入し、新たな制御機能を付加することを試みた。対象としたのは、既に構造が解析されている光駆動スイッチタンパク質であるフォトトロピンのLOVドメイン、光合成細菌のBLUFドメイン、およびシアノバクテリアのGAFドメインである。本年度は、BLUFドメインについて、ATP合成酵素のγサブユニットのチオールスイッチ部分との置き換えを試みたが、いずれの場合にもγサブユニット単独、複合体いずれにおいても融合タンパク質を得ることができなかった。このため、γサブユニットをこれらのスイッチドメインを導入する部分で切断したタンパク質として発現させるための遺伝子を作成し、複合体形成の可否を調べている。ATP合成酵素の加水分解活性の測定に一般に用いられるピルビン酸キナーゼと乳酸脱水素酵素を共役させ、NADHの酸化によってモニターするカップリングアッセイ法の感度を向上させることを目的として、連携研究者の竹内昌治准教授(東大・生産技術研)の協力を得て少量の溶液小胞中(オイル中の水玉)に封じ込めた酵素の動態を簡便にモニターできる実験系の開発を実施した。カップリングアッセイにシステムを応用するために、まず一段階で蛍光変化の起こる酵素系としてグルコース6リン酸脱水素酵素の実験系を確立し、その酸化還元応答を微少小胞中で観察できる実験系を確立した。昨年度の研究では、光合成細菌のBLUFドメインを、ATP合成酵素の制御領域のスイッチ部分に遺伝子操作によって導入することを試みたが、γサブユニット単独、複合体いずれにおいても融合タンパク質を得ることができなかった。そこで、本年度は、シアノバクテリアのGAFドメインを用いてγサブユニットとの融合タンパク質の作成条件を検討した。色素団を保持したGAFの発現はATP合成酵素発現系に用いる大腸菌で可能となったため、γの制御スイッチ領域に導入する系の確立を進めている。また、別に行った生化学的な実験により、γを構成する2本のヘリックスの相対的な位置をずらすことで酵素活性を実際に変動させることに成功した。ATP合成酵素の加水分解活性の測定に一般に用いられるピルビン酸キナーゼと乳酸脱水素酵素を共役させ、NADHの酸化によってモニターするカップリングアッセイ法の感度を向上させることを目的として、連携研究者の竹内昌治准教授(東大・生産技術研)の協力を得て少量の溶液小胞中(オイル中の水玉)に封じ込めた酵素の動態を簡便にモニターできる実験系の開発を昨年に引き続き実施した。カップリングアッセイにシステムを応用する試みとして、研究に用いたレドックス酵素であるグルコース6リン酸脱水素酵素の実験系について、生成物であるNADPHをさらに別の蛍光物質にカップリングアッセイを用いて置き換える実験系の確立に成功し、系全体の感度を1000倍以上向上させることに成功した。現在、この共役系とグルコース6リン酸脱水素酵素を油中の小胞に封じ込め、個々の小胞の蛍光の増大を定量的に観察できる実験系を構築している。
思春期における生体内酸化ストレスに影響する要因の分子疫学的研究

本研究では、中学校・高等学校の生徒を対象とし、尿中8-Hydroxydeoxyguanosine(80HdG)、尿中7-Methyleguanine(m^7Gua)をHPLC-ECD法によって検出、分析を試みる。併せて、対象集団の主観的ストレスとライフスタイル、ライフイベントなどの関連要因に関する情報も自記式調査表によって収集し、推定要因との関連性の検討を同一コホートにて縦断的に行う。また、同意を得られた場合のみ、肘静脈からの採血により、酸化ストレス度と抗酸化力の測定も行う。以上の測定・調査を1年に1回、2年にわたって計2回実施することで、思春期の生体内酸化損傷レベルとライフスタイルなど関連要因の評価を行うことを主たる目的とした。その結果、尿中8-Hydroxydeoxyguanosine、尿中7-Methyleguanineのレベルは、成人対象に比べて低い傾向を示していた。また、血清中における酸化ストレスレベル(Reactive Oxygen Metabolites:ROM)と抗酸化力(Biological Antioxygen Potentials:BAP)も成人対象の先行報告結果に比して良好な傾向であった。これら生物学的指標のレベルと主観的ストレスとライフスタイル、ライフイベントとの線形関係に基づいた関連性を分析した結果、有意な相関が部分的に示された。これら指標の縦断的変動への影響要因の同定を試みたが、顕著な結果は見出せなかった。ただし、線形関係基づいた分析とは別に、ROMとBAPの値を用いてクラスター分析法により対象者を分類して種々の変量を比較した結果、酸化ストレスレベルと抗酸化力のバランス(いわば抗酸化能)がライフスタイルをはじめとする様々な要因と関連していたほか、尿中80HdGおよびm^7Guaと関連していた。以上より、思春期における生体内酸化ストレスの評価については、抗酸化能レベルを用いた検討が有用であることが示唆された。わが国の思春期における生体内酸化ストレス損傷に影響する日常生活要因について検討を行なうため、提示した研究デザインに従って測定・分析を行なった。つまり、平成20年度においては、生体内酸化ストレス損傷レベル測定のための採血と採尿、精神心理的ストレスレベルと日常生活行動実態を明らかにする無記名自記式質問紙調査を、福岡県内の公立高等学校2校の生徒に実施し、末梢血血漿における酸化ストレスレベルと抗酸化ストレスレベルの分析および質問紙調査票の分析を完全に終了している。血漿検体を用いた酸化ストレス・抗酸化ストレスレベルの分析の結果、血中のヒドロペルオキシド(活性酸素・フリーラジカルにより酸化反応を受けた脂質・たんぱく質・アミノ酸・核酸などの総称)のレベル、および血漿中抗酸化力レベルは、ほとんどの対象者で適正値であった。しかし、適正外の値を示した対象者も各々数名見出された。これらマーカーレベルに影響を及ぼす顕著な精神心理パターンを明確に見出すことは出来なかったが、日常生活要因との関連性分析を行なったところ、統計的に有意な相関関係が複数見出された。以上のような本研究知見を先行研究と比較すると、本研究で適用した酸化ストレスレベルと抗酸化ストレスレベルの分析結果には、少なくとも、被験者の年齢や健康状態により相当な相違があることが伺われた。すなわち、身体疾患や老化などには反応しやすいが、慢性疾や老化のリスクが低い思春期の場合は、定量値に差が出にくいことが示唆された。この点の重要性を明らかにするため、血中酸化ストレスと尿中酸化ストレス指標(8-OH-dGとm^7Gua)との相関分析を鋭意試みている最中である。
老人介護素材としての軟骨型プロテオグリカンの開発

(プロテオグリカンの機能)1.マラリア感染米国ペンシルバニア州立大学医学部のProf. D. C. Gowdaの研究室にて、『マラリア原虫に感染した赤血球の胎盤への結合を仲介するプロテオグリカン構造の解析』に関する共同研究を行った。その結果、軟骨型プロテオグリカン糖鎖のコンドロイチン4-硫酸部分にマラリア感染赤血球の胎盤への結合を阻害する機能があることが分かり、プロテオグリカンのマラリア感染阻害薬としての新たな機能が明らかとなった。2.潰瘍性大腸炎プロテオグリカンをデキストラン硫酸(以下DSSと略す。)実験腸炎に投与し、腸炎の抑制効果を、肉眼的出血、白血球数、赤血球数、ヘモグロビン値、そして、大腸の長さ等から検討した。その結果、DSS投与による腸管障害は、プロテオグリカンの投与により、症状、血液学的所見において著明に軽減された。(プロテオグリカンの糖鎖工学的合成)1.糖鎖部分プロテオグリカンの糖鎖は、結合領域と呼ばれる四糖を介してコアタンパク質に結合している。精巣性ヒアルロニダーゼの糖転移活性を利用することにより、この結合領域を含む、種々な糖鎖を合成することに成功した。2.タンパク質への導入エンド-β-キシロシダーゼの糖鎖転移反応を利用して、コアタンパク質へのグリコサミノグリカン糖鎖を導入することに成功した。したがって、糖鎖が欠損していたり、不完全であるリコンビナントタンパク質の糖鎖の回復や修復が可能となった。プロテオグリカンの供給システムの確立青森県沿岸で採れたシロサケの頭部を-30°C保存から解凍(4°C、20時間)し、生理的食塩水で洗浄後、カミソリを用いて鼻軟骨を取り出した。尚、一回の実験は約800g(50匹相当)の鼻軟骨を出発材料として使用した。冷アセトンと冷クロロホルム-メタノール(2:1)を用いて脱脂し、デシケーター中、減圧乾燥を行い、サケ鼻軟骨の脱脂乾燥粉末を70g得た。これを各種タンパク質分解酵素阻害剤を含む、20倍量(w/v)の4Mグアニジン塩酸(50mMトリス塩酸緩衝液、pH7.3)中(以下これを緩衝液1とする)で、4°Cにて24時間抽出後、ステンレスのメッシュ(150um)にて濾過し、その濾液を10,000rpm、4°Cにて60分間遠心分離を行い、その上清(約1.4l)を粗プロテオグリカン抽出画分(乾燥品としては7.2g)として得た。この粗プロテオグリカン抽出画分に水を加えて2倍に希釈後、3倍量(v/v)の冷95%(v/v)エタノール-1.3%(w/v)酢酸カリウムを加え撹拌後、4°Cにて30分間の遠心分離で、その沈殿画分を回収した。続いて、1lの7M尿素(50mMトリス塩酸緩衝液、pH7.3、前述と同じ各種タンパク質分解酵素を含む)に溶解し、同緩衝液2で平衡化した陰イオン交換樹脂(DEAE-Sephacel)を用いて分画を行った。この分画過程において、次の3種類の方法を検討した。1)バッチ法、2)カラムクロマト法、3)スーパーフローカラムクロマト法である。その結果、従来用いてきたバッチ法は操作としては単純であるが、最初から最後まで人手に頼わざるを得ない。そこでカラムクロマト法を試みた。その結果、いずれの場合も、分離能に変化は無かったが、流速に大きな差が示され調製時間の短縮が可能となった。従って、プロテオグリカン供給システムとして、スーパーフローカラムクロマト法を適用した。その結果、サケ50匹より最終精製プロテオグリカンを約5g得ることが可能となった。プロテオグリカンの新素材としての可能性探索i)

動物実験による炎症性腸疾患に対する効果炎症性腸疾患に対し現在根本的な治療法は開発されていない。そこで、サケ鼻軟骨プロテオグリカンをデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)実験腸炎に投与し、腸炎の抑制効果を調べた。方法はCD-1マウスに対し4%DSS投与と4%DSSに加え11%プロテオグリカン投与の2群に分け自由摂取させた。それぞれの症状(下痢、血便)、生存率、体重変化を観察した。また、5日目に犠牲死させ腸管の病理検索を行った。その結果、DSS投与による腸管障害は、プロテオグリカンの投与により、症状、消化器官、生存率、病理所見において著明に軽減された。プロテオグリカンは、原材料や生成過程により生体に対し基本的に無害と考えられ、将来、炎症性腸疾患の治療薬として期待される。ii)プロテオグリカンシートの開発と癒着防止剤としての効果フィルム状のプロテオグリカンシートの作成を試みた。その結果、100%プロテオグリカンから成る無色透明なプロテオグリカンシートを作成することに成功した。次に、このプロテオグリカンシートを用いて、腹腔内癒着に対する効果を検討した。方法は、ICR(CD-1)マウスをエーテル麻酔下に腹部正中切開を加え、腹部創より約1cm離れた左右の壁側腹膜に電気メスにてそれぞれ剥離した。剥離創よりおおきめのプロテオグリカンシートを付着させ、周りをナイロン糸にて縫合した。術後一週間目に再開腹し、腹腔内組織の剥離創に対する癒着を評価した。その結果、プロテオグリカンシートには、癒着を防止する効果はなく、その反対に組織と組織を結合させる接着因子としての効果があることが示された。従って、熱傷の他、床ずれ(褥創)治療などの老人介護用治療剤、または皮膚移植、肝移植の際に組織の接着を促進させる効果が期待される。(プロテオグリカンの機能検査)1.マラリア感染米国ペンシルバニア州立大学医学部のProf. D.C. Gowdaの研究室にて、『マラリア原虫に感染した赤血球の胎盤への結合を仲介するプロテオグリカン構造の解析』に関する共同研究を行った。その結果、軟骨型プロテオグリカン糖鎖のコンドロイチン4-硫酸部分にマラリア感染赤血球の胎盤への結合を阻害する機能があることが分かり、プロテオグリカンのマラリア感染阻害薬としての新たな機能が明らかとなった。2.潰瘍性大腸炎プロテオグリカンをデキストラン硫酸(以下DDSと略す。)実験腸炎に投与し、腸炎の抑制効果を、肉眼的出血、白血球数、赤血球数、ヘモグロビン値、そして、大腸の長さ等から検討した。その結果、DSS投与による腸管障害は、プロテオグリカンの投与により、症状、血液学的所見において著明に軽減された。(人工プロテオグリカンの糖鎖工学的合成)1.糖鎖部分プロテオグリカンの糖鎖は、結合領域と呼ばれる四糖を介してコアタンパク質に結合している。精巣性ヒアルロニダーゼの糖転移活性を利用することにより、この結合領域を含む、種々な糖鎖を合成することに成功した。2.タンパク質への導入エンド-β-キシロシダーゼの糖鎖転移反応を利用して、コアタンパク質へのグリコサミノグリカン糖鎖を導入することに成功した。したがって、糖鎖が欠損していたり、不完全であるリコンビナントタンパク質の糖鎖の回復や修復が可能となった。
カルシウム関連の酵素とホルモン,Cキナーゼと活性ビタミンDによる発癌の促進と抑制

発癌の促進と抑制のメカニズムを、カルシウムに関係する酵素とホルモンすなわちCキナーゼと活性型ビタミンDの面から分析する。プロモーション実験系としては、培養細胞を用いた二段階トランスフォーメーション系およびマウス皮膚の二段階発癌実験系を用いた。1.発癌プロモーションにおけるCキナーゼの意義:Cキナーゼ研究に適した細胞を得るため、42種の細胞株をスクリーニングした。ラットの表皮由来のFRSK細胞はホルボールエステル結合とCキナーゼのダウンレギュレーションが非常に速いことを見出した。このダウンレギュレーションはタンパク分解酵素阻害剤によって阻害されることから、Cキナーゼがタンパク分解酵素によって、膜結合領域と活性部位に分解するためであると結論した。Cキナーゼによってリン酸化される標的タンパクをマウス皮膚二段階発癌実験系を用いて検討した。特異的にリン酸化されるタンパクとして、分子量34K、40Kのタンパクを固定したが、その機能はまだ不明である。2.活性型ビタミンDによる発癌の促進と抑制:血中カルシウム濃度の調節ホルモンである活性型ビタミンDは、細胞分化と発癌プロモーションの調節にも関与していることを、これまでに明らかにしてきた。今回、活性型ビタミンDは、マウス表皮由来のJB6細胞およびNIH3T3、BALB3T3細胞に軟寒天内増殖を誘導することを見出した。これに伴って、両3T3細胞では、K-ras癌遺伝子転写が活性化された。活性型ビタミンDによる遺伝子転写コントロールを調べるためステロイドホルモンによって誘導されることがすでに確認されているマウスの乳癌ウィルスLTRおよびメタロチオネィン遺伝子について調べたところ後者が活性型ビタミンDによって誘導されることがわかった。活性型ビタミンDによる細胞内カルシウム濃度をFURA-【II】法で測定したが、大きな変化はみられなかった。
自己形成バリア層による次世代のLSI配線の開発

近年の半導体配線微細化の動きによって、配線金属と絶縁体の間に成膜されるバリア層の厚さをさらに薄くすることが求められている。その薄さは32nm世代の配線では2nmということがロードマップには示されており、今後さらなる微細化が進めば、さらにバリア層を薄くする必要が出てくる。従来の成膜方法である物理気相成長(PVD)では薄く均一にバリア層を形成することには限界が来ており、さらに微細配線トレンチへの埋め込み性悪さが問題となっている。そこで、化学気相成長(CVD)を用いることで、これらの問題を解決するために研究を行った。特に、当該年度の研究では、化学気相成長(CVD)によって形成されるMn窒化物の構造を透過電子顕微鏡(TEM)により同定した。その結果、格子定数a=3.815Åのfcc構造を持つMnN_4である事が分かった。52:1のアスペクト比を持つ配線溝へのCVD-MnN_4のトレンチへのステップカバレッジを調査した結果、成膜温度を下げることにより、カバレッジ性が向上する事が分かった。CVD-MnN4とCVD-Cuの密着性をテープテストにより評価した結果、Cu/CVD-MnN4は非常に強い密着性を持つ事が分かった。また、CVD-MnN4の表面形態(130°C成膜)は、比較的平滑であり、成膜後、熱処理する事により荒くなる事が分かった。また、成膜時に水素あるいはアンモニアを導入する事で、MnとNの濃度比を変化させる事が可能であった。以上のような知見によって、CVDによってバリア層をトレンチへ極薄・均一に成膜できる可能性が示された。TEOS-SiO2基板に形成した配線溝(幅18nm、深さ125nm)に化学気相成長法によってMnNを成膜した後、同じ方法によってCu-Mn合金を成膜した。走査電子顕微鏡による断面観察によるとCu-Mn合金配線が配線溝を埋めていることが確認できた。ナノレベルのボイド形成の可能性については、透過電子顕微鏡(TEM)を用いて調査する必要がある。また、TEOS-SiO2平面基板上にMnNを形成して、界面近傍の断面TEM組織を観察したところ、20nm程度の非常に厚い反応層が形成されていた。C-V測定によって反応層の比誘電率を調べたところ2.7であり、多層配線構造として用いるには、充分に低い値である。また、熱処理後のフラットバンド電圧に明確なシフトが見られないことから、拡散バリア性は良好であった。しかし、拡散バリア層としては厚すぎるため、反応層の組成と構造を同定し、形成原因を明確にする必要がある。一方で、基板をlow-k膜にしたところ、反応層の厚さは3nmに減少した。形成された層の構造、組成、電気特性、拡散バリア性は今後調査する予定である。
ゲノミクス・トランスクリプトミクス的アプローチによる異形花型不和合性の機構解明

異形花型自家不和合性(HetSI)は自己花粉を排除する自家不和合性形質と花の形(花型)と連鎖した現象である.アマ科植物のHetSIの機構解明のために原因遺伝子であるS遺伝子候補の単離とS遺伝子座領域の解析を行った.トランスクリプトームの解析からは,あらたに4つの候補遺伝子の単離に成功した.ゲノム解析からS遺伝子座領域が1Mbp以上にわたることを明らかとした.すべての候補遺伝子はこの領域に含まれるが,その相対的な配置は明らかになっていない.そこで,ベニバナアマのゲノム配列を明らかにするためにショットガンシークエンシングとde novo assemblyを行い,今後の新たな研究基盤を構築した.本研究では異形花型自家不和合性の分子機構を明らかにするために,アマ科の異形花型自家不和合性章句物であるベニバナアマを次世代シークエンサーを用いて解析している.異形花型自家不和合性は,一般の自家不和合性の様に自己花粉を認識・排除するだけではなく,自家不和合性の表現型と花の形(雌蘂の長さ)が連鎖している現象である.サクラソウやソバなどと違い,材料のサイズや遺伝子組換えの点から,ベニバナアマは有利な点が多い.一方,ゲノムデータベースの整備など,研究の基盤となるデータの蓄積が乏しい.そこで,H25年度はトランスクリプトーム解析を行った.unigeneのデータも無いので,まず雌蘂,葯,花粉のライブラリーのリード配列から,de novo assemblyを行い,約9万のコンティグからなるLG12Rデータベースを作成した.さらに,そのデータベースを元にリードをマッピングするRNA-seq解析を行い,花型に関連する発現パターンを示す約150の遺伝子を特定した.このように150の遺伝子まで絞り込めたが,さらなる解析を行うには十分なレベルとは言いがたい.そこで,遺伝解析を組合せる事を検討しているが,H25年度はそのための分離集団も作成した.このように,H25年度は本格的な解析のための基盤となる材料やデータベースを作成し,H26年度以降の解析に利用する予定である.ベニバナアマの異形花型自家不和合性では,thrumとpinという異なる形態の花が存在しており,交雑は異なる形の花の間でしか成立しない.本年度は作成した分離集団を展開し,花形態とその遺伝様式の調査と花器官のRNA-seqのデータから転写産物でS遺伝子座に連鎖している遺伝子の探索を行った.・花形態とその遺伝様式の調査:分離集団51個体を利用して花の形態を調査した.正確な花形態の識別法を開発し,2つの形態の分離比が1:1である事と異形花型自家不和合性が1遺伝子座支配である事が明らかになった.また,異形花型自家不和合性とは直接関係ないがR遺伝子座と名付けた花弁色(赤,白,ピンク)を制御する遺伝子座がS遺伝子座に連鎖していることが明らかになった.・S遺伝子座に連鎖している遺伝子の探索:分離集団の花器官のRNA-seq解析をおこなった.K-mer比較解析を行い,thrum特異的な遺伝子はもちろん,SNVレベルでの違いがある転写産物コンティグを同定した.約2000のコンティグが得られ,mappingデータから30ほどのコンティグがthrum特異的であると推察された.そのうち2割程度がS遺伝子座に連鎖していると考えられた.特に花柱側で2つの有望な遺伝子が同定された.これら遺伝子に関しては,ベニバナアマはもちろん,アラビドプシスやタバコなどのモデル植物での形質転換体の作出を行っているところである.平成26年度にF1分離集団を利用したRNA-seqのリード配列の比較から、TSS1やTSW4といったS遺伝子座に連鎖する重要な候補遺伝子を単離した。得られた候補遺伝子はトランスクリプトーム比較であるため、S遺伝子座に連鎖した遺伝子がすべて明らかになっているわけでは無い。現在の所、候補が得られているのは雌ずい側の因子だけであり、同じS遺伝子座に座乗すると考えられている雄ずい側の因子については、有力な候補が得られていない。また、S遺伝子座の構造を明らかにするのは、S遺伝子座の獲得と維持といった進化学的な意味合いでも重要なことである。そこで、平成27年度はRNA-seqと同じ分離集団についてDNA-seq解析を行い、サブリード比較から染色体配列を明らかにすることにした。Thrumとpinの25個体のDNA-seqデータを前年度と同様にサブリードに分割・カタログ化し、比較を行いThrum特異的なサブリード配列を特定した。Thrum特異的な配列を含むリードを抽出し、S遺伝子座由来のリードのみでde novo assemblyを行った。その結果、約15,000のコンティグが得られた。全リード配列をマッピングし、Sとsハプロタイプ間での配列特異性を確認したところ、800コンティグがSハプロタイプ特異的であると推察された。S特異的配列の長さは合計すると約1Mbpになる。現在は得られたコンティグ配列内に新たな候補遺伝子がないか検証しているところである。前年度のトランスクリプトームの解析に引き続き、ゲノムレベルでの解析を行った。Sハプロタイプ特異的な領域が1Mbp以上にわたり、予想以上に解析対象の領域が大きかった。しかし、RNA-seqデータとの照合から、領域の長さに対して存在する遺伝子数は多くなく、特に障害になりそうな大きさではないと考えられる。

自家不和合性は自己の花粉では受精・種子形成に至らない現象である.異形花型自家不和合性の植物ではこれらthurmとpinと呼ばれる2つ形態の花が存在し,花形間でしか受精が成立しない.本研究ではアマ科植物のベニバナアマ(Linum grandiflorum)を材料として,異形花型自家不和合性を制御する遺伝子座(S遺伝子座)の特定と,その遺伝子本体の単離を目的としている.昨年までの解析から候補遺伝子を幾つか単離しているが,その機能解析は十分に成されていない.また,新たな候補遺伝子を単離するために,S遺伝子座領域の塩基配列を明らかにすることは必須である.平成28年度では,染色体配列を明らかにするためPacBioを利用したゲノム配列のde novo assembly解析を行った.また,候補遺伝子についてはモデル生物での形質転換実験を行った.ゲノム配列に関しては,PacBioRSIIを利用して解読を行いアセンブリーを行ったがN50の値が不良で解析に耐えうるコンティグ配列は得られなかった.フローサイトメトリーでゲノムサイズを改めて解析すると,予想の4倍以上のゲノムサイズである事が明らかとなった.つまり,アセンブリーのためのリード数が不十分であると考えられた.そこで,PacBioのSequelを利用して,更にデータ量を増強して解読を行ったところ,比較的ゲノムサイズに類似した規模のゲノム配列が得られ,S遺伝子座領域も広範囲にわたってカバーしていると考えられ,今後の解析に重要な知見がもたらされると期待される.形質転換実験については,アラビドプシスとタバコで候補遺伝子の過剰発現体を作成した.多少の花柱長の変化はあったが,異形花型自家不和合性で観察されるほどの明確な形質変換は認められなかった.これにかんしてはヘテロの系での実験では無く,ベニバナアマを使った解析が必要と考えられる.異形花型自家不和合性(HetSI)は自己花粉を排除する自家不和合性形質と花の形(花型)と連鎖した現象である.アマ科植物のHetSIの機構解明のために原因遺伝子であるS遺伝子候補の単離とS遺伝子座領域の解析を行った.トランスクリプトームの解析からは,あらたに4つの候補遺伝子の単離に成功した.ゲノム解析からS遺伝子座領域が1Mbp以上にわたることを明らかとした.すべての候補遺伝子はこの領域に含まれるが,その相対的な配置は明らかになっていない.そこで,ベニバナアマのゲノム配列を明らかにするためにショットガンシークエンシングとde novo assemblyを行い,今後の新たな研究基盤を構築した.分離集団の一次スクリーニングとk-mer比較解析から,有力な候補遺伝子を追加できた.また,形質転換実験も開始しており,ほぼ予定通りに進んでいる.DNA-seqはIllumina hiseqを利用しており、S特異的なコンティグは平均長が1000bp程度で、構造解析などを行うには不十分な長さである。そこで、コンティグのscaffolding等を行うためにPacBio RSIIやmate-pairの解析を行い、よりながいコンティグを得る。RNA-seqのデータと合わせ、雄性側の候補遺伝子の絞り込みを行う。同時に他の種のRNA-seq解析を行い、共通する遺伝子などを同定し、候補遺伝子の絞り込みに利用する。28年度が最終年度であるため、記入しない。
生物多様性の文化的価値に着目した保全法制度に関する研究-天然記念物制度再考

(1)大正期における天然記念物制度発足の前後及び先立つ明治期の旧狩猟法制定時の立法議論に関する文献調査を通じ、従来は積極的な評価がされていなかった19世紀後半から20世紀初頭の自然保護法制度には、人と自然との文化的関係性を考えるにあたって、参考となるものがあることがわかった。特に天然記念物制度には、科学に立脚した普遍的要素と、地域に立脚した多様性・個別性の二面の要素があり、自然科学だけではなく、自然の文化的、社会的価値も包含できる制度であることが読み取れた。また、旧狩猟法は近代日本最古の自然保護法制度であるが、野生動物を利用した伝統的な生業、それもコモンズ的な資源管理を行ってきたものを近代土地所有権の下でどのように矛盾なく存続させうるかが焦点となり、文化的・社会的関係性を断ち切らない制度が選択されたことがわかった。(2)兵庫県豊岡、沖縄県名護及びやんばるといった天然記念物指定動物の生息地や、東日本の伝統的狩猟が残る山村におけるフィールドワークを通じ、自然保護法制には、従来重視されてきた普遍的な科学的価値だけではなく、地域に根差した個別性を認める多様性、または曖昧さが必要であることが確認された。天然記念物制度に関しては、従来欠点とされた指定基準の不明確さは、むしろ多様な地域性を取り入れた「曖昧さ」として積極的に評価しうる。即ち、上からの普遍性・科学性に基づく指定に加え、地域からの下からの指定が可能な制度の良さである。この長所は、ひいては地域おこしにも連結することも確認された。また、狩猟法制についても適度に利用して保存するといった関係が民俗知として存在しており、それを制度的に取り込むのには、地域性を認め、地域中間集団の活用などの非画一的な対応が必要であるとの結論に達した。19年度においては、天然記念物制度の形成を把握する意味から、戦前の文部省外郭団体機関誌「史蹟名勝天然記念物」の解読を高橋が中心に行っている。天然記念物制度の創設には、当時の国家主義的背景が語られることが多いが、近年注目されつつある、人と自然の関係性や、生物多様性サービスの文化的側面を既に一定程度取り込んだ制度であるという仮説を立て、これを裏付ける見地から、従来この制度の欠点とされた「曖昧さ」を逆に長所ととらえる意見発信を、池田が中心に行った。また高橋は、比較法的視点から、米国の文化財保護法に該当するNational Historical Preservation Act (NHPA)の研究を行っている。特に、NHPAを利用して、日本の天然記念物ジュゴンを米軍基地建設から守ろうという訴訟が米国裁判所を舞台に起きており、高橋はこの訴訟の推移を注意深く見守っている。NHPAには、天然記念物制度はなく、動植物は保護対象になっていないが、この訴訟の判決において、裁判官は、文化相対主義の観点から動物の文化財的価値を明言しており、米国環境法の中でも、新しい動きである。この訴訟に関連して高橋に、国際的NGOであるWWFなどから研究会への出席依頼や、来る20年次の環境法政策学会で評論を依頼されたりしており、論文としてまとめる予定である。現地調査は、20年度を主とするが、19年度においても、豊岡市のコウノトリ生息地調査や、富山市内の鴨網猟が行われていた旧共同狩猟地のヒアリングなども行った。本年度は、本助成研究の最終年度でもあり、天然記念物制度成立の背景の理解のための文献調査と、人と自然の関係性にかかわる天然記念物や狩猟地の現地調査を重点的に行った。文献調査については、帝国議会議事録と、19年度に購入した雑誌「史跡名勝天然紀念物」のバックナンバーの読解を行い、天然記念物制度成立当時の立法者や官僚の自然保護に関する政策観や思想を検討した。