hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
人工音声実験と声帯・口腔系の運動による音声生成の力学的研究

障害者代用人工声帯,代用人工音声開発を目的として、実人間の音声発音機構のメカニズムを力学的な立場から解明し、この結果を利用して、生体模擬人工子音と人工母音の音声生成実験を行う一方、一連の理論解析によって、そのメカニズムを理論的に明らかにした。主な結果は次の通りである。(1)声帯声帯軟骨声帯筋から成る実人間声帯系と等価な人工広帯域発音装置を試作して、模擬生体筋張力と声帯膜の大きさを変化させた一連の呼気流実験を行った結果、膜の振動と源音声が150Hzから2000Hzまでの任意の広帯域で自励振動と発音を構成する事を実験的に明らかにした。これより人工声帯生成の見通しが得られた。(2)動的超弾性有限要素解析理論と流体連成解析理論を構築して、これを組み合わせた一連の解析から実人間の声帯および試作人工声帯の広帯域自励振動生成のメカニズムを理論的に解明し、理論と実験がよく一致する事を示した。(3)音声源音からの5母音生成が口腔系を模擬した結合共鳴箱の原理に基づいて容易に発現できる事を実験的に明らかにし、実人間のもとの比較してよい相関のある事を示した。(4)非定常音場の有限要素法を開発して、口腔声道形状を3次元スプライン関数表現する方法を開発しこれらを組合わせて、5母音生成用の声道形状を理論的に逆探索できるシステムを構築した。数値解析により得られる5母音の周波数構造は実験とよく一致し、人工の5母音用口腔声道形状生成の見通しが得られた。(5)人工舌と人工口腔を組合わせたk,t,s子音生成実験を行って、子音の周波数構造が頭部の38kHz帯雑音スペクトルと後続5母音の組み合わせで形成できる見通しを実験的に明らかにした。(6)Lighthillモデルと乱流場のk-εモデルと用いた子音頭部源音生成の理論解析を行い、k,t,s音について口唇出口部実人間音声計測結果、から、逆問題として、理論解析により推定した舌狭め部の子音源音の周波数スペクトルをk-εモデルによる解析結果と比較した結果、よい相関のある事を示した。これより、人工子音生成に関する見通しと理論モデルについての見通しを得た。声帯源音声を支配する声帯系と,子母音系の発生や調音を司る口控・声道系を組合せた音声生成機構を主として力学的な立場から明らかにする。本第1年度は源音声発生機構と,母音系の調音機構について次の研究を行なった。(1)東芝病院MRI装置を用いて,日本語母音発音中の声帯と声道立体形状を計測した。輪切24断面の数値データから,レーザ硬化,光感樹脂を用いて声道立体形状を各母音につき作成した。(2)シリコンゴムを用いて作成した人工声帯と母音別声道形状を組合せて,グロアによる呼気流を与えた源音及び母音生成実験を,母音毎に実施し,声門下圧,声道流速,レーザー変位計による声帯振動計測,および生成された人工音声の収録とFFT分析を行なった。この結果,あ,い,えの3母音の人工音声の周波数特性やパワーレベルは実人間のそれと比較的よく一致する結果が得られた。(3)声帯系を2質点系にモデル化したシミュレーションを行ない,源音生成実験と比較して,その有効性と課題を明らかにした。

即ちスリット付の2枚の生体膜の位相差振動と呼気圧変動を組合せた連続体系の動的モデルの取扱いが必要である事が判明した。(4)そこで生体軟組織超弾性体の有限変形解析用有限要素法プログラムに,質量行列,減衰行列を追加して2層生体膜の自励振動を,3次元動的有限要素法で解析するための理論とプログラムを開発中であり,約80%の研究が終了した。(5)研究室保有の固気液連成系の振動解析プログラムを,非定常音場と固体振動の連成解析用に拡張中である。(70%終了)これを上記(4)と組合せて,口控・声道系の共鳴周波数(源音声の整数倍)および子音頭部の破裂音のシミュレーションが行なえるようにする。障害者代用人工声帯,代用人工音声開発を目的として、実人間の音声発音機構のメカニズムを力学的な立場から解明し、この結果を利用して、生体模擬人工子音と人工母音の音声生成実験を行う一方、一連の理論解析によって、そのメカニズムを理論的に明らかにした。主な結果は次の通りである。(1)声帯声帯軟骨声帯筋から成る実人間声帯系と等価な人工広帯域発音装置を試作して、模擬生体筋張力と声帯膜の大きさを変化させた一連の呼気流実験を行った結果、膜の振動と源音声が150Hzから2000Hzまでの任意の広帯域で自励振動と発音を構成する事を実験的に明らかにした。これより人工声帯生成の見通しが得られた。(2)動的超弾性有限要素解析理論と流体連成解析理論を構築して、これを組み合わせた一連の解析から、実人間の声帯および試作人工声帯の広帯域自励振動生成のメカニズムを理論的に解明し、理論と実験がよく一致する事を示した。(3)声帯源音からの5母音生成が口腔系を模擬した結合共鳴箱の原理に基づいて容易に発現できる事を実験的に明らかにし、実人間のもとの比較してよい相関のある事を示した。(4)非定常音場の有限要素法を開発して、口腔声道形状を3次元スプライン関数表現する方法を開発し、これらを組合わせて、5母音生成用の声動形状を理論的に逆探索できるシステムを構築した。数値解析により得られる5母音の周波数構造は実験とよく一致し、人工の5母音用口腔声道形状生成の見通しが得られた。(5)人工舌と人工口腔を組合わせたk,t,s子音生成実験を行って、子音の周波数構造が頭部の38kHz帯雑音スペクトルと後続5母音の組み合わせで形成できる見通しを実験的に明らかにした。(6)Lighthillモデルと乱流場のk-εモデルと用いた子音頭部源音生成の理論解析を行い、k,t,s音について口唇出口部実人間音声計測結果から、逆問題として、理論解析により推定した舌狭め部の子音源音の周波数スペクトルを、k-εモデルによる解析結果と比較した結果、よい相関のある事を示した。これより、人工子音生成に関する見通しと理論モデルについての見通しを得た。
RFID(ICタグ)を用いた重度障害者のためのマウスピース型電動車椅子操作装置

頸椎損傷などの重度障害者用のために舌運動によって操作する,マウスピース型の操作装置を開発した.従来,口腔内に操作装置を持ち込むことは電源確保の問題から困難とされていたが,本研究では受動型ICタグ(RFID)を利用することによりこの問題を解決した.当該口腔内コントローラーは利用者の口腔内に設置し,舌により操作する.また,発信された操作信号は頬脇に設置したアンテナで受信し,小型PCを用い電動車椅子を制御している.本研究では試作機を製作し,性能を評価したところ,十分な特性・操作性が得られ,本システムの実利用の可能性が示唆された.頸椎損傷などの重度障害者用のために舌運動によって操作する,マウスピース型の操作装置を開発した.従来,口腔内に操作装置を持ち込むことは電源確保の問題から困難とされていたが,本研究では受動型ICタグ(RFID)を利用することによりこの問題を解決した.当該口腔内コントローラーは利用者の口腔内に設置し,舌により操作する.また,発信された操作信号は頬脇に設置したアンテナで受信し,小型PCを用い電動車椅子を制御している.本研究では試作機を製作し,性能を評価したところ,十分な特性・操作性が得られ,本システムの実利用の可能性が示唆された.<背景・目的>本開発研究では受動型ICタグ(RFID)を利用することにより,重度障害者でも利用可能なマウスピース型の操作装置の開発を行っている.しかし,RFIDは周波数の高低や水分・脂肪などにより影響を受けるため,本年度は様々な環境下におけるRFIDの通信特性の実験的検討を行った.<実験方法>1)タグ&アンテナの相対姿勢の影響タグと受信機(アンテナ)のと通信位置・姿勢を変化させ,大気中の通信距離の関係を求めた.2)周波数の変化と通信特性134.2kHzタイプと13.56MHzタイプの2種類のタグを用い,水中の通信距離につていて検討した.また,ヒトの口腔内への設置を模倣し,タグを肉塊中に挿入しての検討も行った.実験には(A)ガラス封入型タグ,(B)ディスク型タグ,(C)フィルム状タグと(D)プラツチック封入型タグの4種類を用いた.<結果・考察>1)送受信機と本体送受信機とタグとの相対位置による通信特性が明らかとなった.2)134.2kHzタイプの通信距離は若干短い傾向にあったが,いずれのタグにおいても十分な通信距離を確保できていた.ここで,現在のRFID産業では13.56MHz以上の周波数帯域のタグが多用されていることから,本研究では13.56MHzタイプを使用することが望ましいと考えられた.頸椎損傷や筋ジストロフィーなどの重度障害者にとっては,移動はもちろん,電動車椅子の操作や福祉機器の利用にまで困難が伴う.この様な重度障害者のために,様々な操作装置が開発されているが,それぞれ一長一短があり,新たな操作装置の開発も望まれている.そこで,我々は重度障害者においても最後まで残される機能の1つである舌の動作に着目して,マウスピース型の操作装置の開発を行っている.これまでの検討より,13.56MHzタイプのRFIDが当該コントローラーに相応しいことが明らかになっている.そこで,それらのRFIDタグを4個実装した口腔内コントローラーの試作を行い,その性能について実験的検討を行った.具体的な平成19年度の実施内容は下記の通りである.1.口腔内装置の回路・基板設計・製作リモートコントローラーを口腔内に設置可能とするため形状や外形寸法を検討し,回路・専用基板の設計・製作を行った.2.制御プログラムの製作本研究では,最終的にマウスピース型リモートコントローラーを用いて模型車の運転制御を行った.このシステムの構成としては,本研究室で試作した口腔内リモートコントローラー,RFID識別装置(タカノ社製),制御にスタンドアロンタイプのマイコン(cRIO,日本ナショナルインスツルメンツ社製)を利用した.この結果,本研究で構築したシステムにおいて,舌動作を利用して模型車の運転を行うことができた.頸椎損傷や筋ジストロフィーなどの重度障害者にとっては,移動はもちろん,電動車椅子の操作や福祉機器の利用にまで困難が伴う.この様な重度障害者のために様々な操作装置が開発されているが,新たな操作装置の開発も望まれている.そこで,我々は重度障害者においても温存され易い随意機能の1つである舌の機能に着目して,舌で操作するマウスピース型の操作装置の開発を行っており, 13.56MHzタイプのRFIDチップを4個搭載したマウスピース型口腔内リモートコントローラーを試作している.今年度は実際に口腔内に設置したin vivo状況下で下記の実験的検討を行い,各結果を得た。1.〈通信特性に関する検討〉当該口腔内リモートコントローラーから発信された操作信号は,利用者の頬の横,口腔の正面もしくは顎の下に設置したリードアンテナによって受信され,専用コントローラーで制御される.そこで,これら各アンテナ設置位置に対して,安定的に通信が行える最大通信距離(MCR)を測定した.その結果, MCRは18.9±8.6052.8±12.0mmであり,頬脇もしくは口腔や顎の直下にアンテナを設置することにより,安定的な通信が得られることが明らかとなった.2.〈操作性に関する検討〉操作の容易性や操作の正確性を評価するために, 10名の被験者に「前/後進,右/左折」の指示をランダムに120回与え,操作の正確性を実験的に評価した.また,操作し易いスイッチの硬さも併せて検討を行った.

その結果,低押下力で操作可能なSoft typeのコントローラーは,過度の疲労時を除き,約95%以上の正確性で操作されていることが分かった.3.電動車椅子の操作市販の電動車椅子に上記システムを付設し,当該口腔内コントローラーを用いた電動車椅子の運転・操作に成功した.以上より,開発した口腔内コントローラーの実利用の有効性が示唆された.
ニーマン・ピック病C型の神経変性機構の解明

ニーマン・ピック病C型(NP-C)は、細胞内コレステロールの小胞輸送に関与する分子NPC1の欠損によって、小児期の神経変性を特徴とする疾患である。この疾患のモデルマウスでは神経症状の進行とほぼ平行して、プルキンエ細胞と視床VPL/VPM核神経細胞が脱落する。さらに、後根、後索、後索核などの感覚系が特異的に変性をおこすことを見出しつつある。本研究課題は、プルキンエ細胞と知覚経路が系統的に変性する機構を明らかにすることを課題とする。NP-Cとモデルマウスでは、臓器へのコレステロール、糖脂質の蓄積を特徴とするが、これらの脂質の蓄積が直接の神経障害とはなり得ない可能性が指摘され始めている。我々は、(1)NPC1蛋白質が関与する細胞内脂質輸送経路の解析、(2)NP-C細胞で増加・減少しているmRNA群の解析と言う2つのアプローチによって、NPC1欠損による神経変性機構の解明を目指している。初年度は、NPC1蛋白質がリソソーム・後期エンドソームからの脂質輸送だけではなく、早期エンドソームから細胞膜への輸送にも関与する可能性を報告する。ガングリオシッドGM1と結合するコレラトキシン(CT)をプローブとして、NP-C細胞(患者細胞およびCHO-npc1^<trap>細胞)での分布を調べた。NP-C細胞ではコレステロールの蓄積とは異なる領域に蛍光標識CTの蓄積を認めた。この蓄積はRab-5陽性の小胞で、早期エンドソームと考えた。^<125>I-標識CT負荷後の動態を検討し、NP-C細胞では結合するCTの量には変化がないにもかかわらず、培地中に高分子のまま放出されるCT量が減少し、細胞内のCTが多いことを見出した。さらにCT負荷後のcAMPの上昇が高いことを見出した。NP-C細胞では早期エンドソームに取り込んだCTの細胞外への排出過程にも欠陥があり、細胞内でCTの蓄積とCTによる細胞の活性化が持続する可能性が示された。さらにモデルマウス初代培養プルキンエ細胞の樹状突起周辺にCTが蓄積していることを見出した。NP-CではガングリオシッドGM1によって認識される因子の作用が強く発現し、そのために神経細胞変性に結びつく可能性を示している。今後、脳内でGM1と特異的に結合するリガンドを同定し、この仮説を証明していく。
Rifampicinのドラッグリポジショニングによる認知症の進行抑制

アルツハイマー病の2つの原因分子アミロイドβとtauを同時に抑制可能な既存医薬品rifampicinが、疾患の進行を抑制できる可能性について検証する。アルツハイマー病では、脳に蓄積したアミロイドβの影響で生じる毒性tauが、神経変性を引き起こすと同時に、隣接する細胞間を伝播して脳内で変性領域を拡大することが知られている。このメカニズムに基づき、アミロイドβとtauの毒性体を同時に抑制できるrifampicinが、1細胞内での毒性tauの形成、2分泌後の毒性tau、3毒性tauの細胞内取り込み、をそれぞれ低下させることを培養細胞系で確認し、tau伝播モデルマウスでその伝播抑制効果を検証する。
グローバル金融危機・経済危機からのアメリカ経済の回復過程の特質と問題点の実態研究

本研究の結果、主に次の2点が解明できた。(1)アメリカ経済は、緊急対策による厳しい財政制約のもと、異例の連銀量的緩和(QE13)が機能不全に陥った民間金融部門に替わって「グローバル成長連関」を基本で維持し、緩慢な回復軌道をたどった。危機後8年を経て、経済成長率や失業率、企業収益、自動車販売台数、株価など、多くの経済指標が金融危機以前の水準をほぼ回復してきているが、(2)中期的に見ると、「国内成長連関」の再構築と「グローバル成長連関」の維持という大きな「ジレンマ」を内包し、2016年大統領選挙動向にもそれが大きく反映された。当選したトランプ大統領の経済諸政策も相互に矛盾する性格となっている。本研究は、基盤研究(A)(2009-12年度)の成果を受け、世界経済回復の最大の焦点であるアメリカ経済の回復過程の特質と問題点を、(1)金融・財政、(2)実体経済ー産業企業動向と主要都市状況(金融危機後の住宅・グローバルシティ状況)が焦点ーの二面から、その世界的影響を含めて実態的に解明するものである。26年度は、在米研究の機会を最大限利用し、1マスメディア・Web情報、各種論稿の収集と分析と、所属先(Department of Economics, Univ. of Mass., Amherst)における、Michael Ash産業・企業)、Gerald Epstein(金融)、James Crotty(金融)、Robert Pollin(マクロ政策)、David Kotz(制度分析)、Carol Heim(都市論)各教授等の専門研究者との日常的な議論および各種Workshopでの議論を通じて、事態の経過のリアルタイムなフォローを進めるとともに、2アメリカ各地の実態調査を軸に研究を進めた。2については、かつて金属加工業の全米拠点の一つであるコネティカット川流域の近隣地域("Precision Valley")やボストン等ニューイングランド、カリフォルニア州の都市と産業実態調査(私費にて実施)と並んで、当初計画にはなかった主要シェールオイル地帯でかつ農業の重要性の高い北西部のモンタナ、南・北ダコタ、コロラド、アイダホ、ミネソタ各州等について、都市および農村部の実態調査を実施した。研究成果は、Economic Theory Workshopで報告(研究成果欄に記載)するとともに、共著書2冊(出版社入稿済み)と編著1冊の担当章執筆と編集作業を進めた(研究成果欄に記載)。またテキスト『現代アメリカ経済』(有斐閣、2003年)の増補改訂作業を進め、基本部分を仕上げた。本研究は、基盤研究(A)(2009-12年度)の研究成果と知見・在米研究(2013-14年度)の成果を受け、グローバル金融危機・経済危機からの世界経済回復の最大の焦点であるアメリカ経済の回復過程の特質と問題点を、在米研究によるリアルタイムな事態のフォローを核に、データ収集と分析、実態調査、米国研究者との研究連携・協力を組み合わせ、(1)当面最大の問題である金融(「量的緩和」の転換と制度改革)と連邦財政問題、および、(2)その影響のもとでの産業企業動向および主要都市状況(金融危機後の住宅・グローバル・シティ状況)を中心とする実体経済動向の二面を焦点とし、その相互影響と世界的影響を含めて解明し、日本の成長戦略・政策対応の中期的(3年ー5年)展望と指針を得ることを目的とする。平成27年度は、在米研究終了に伴い研究拠点を日本に移し、収集済みのデータ資料および関連文献の読み込みと分析に、この間の新たな展開についての研究を加え、最終年度に向けて研究の総合化を図った。その結果、主に、(1)「グローバル成長連関」の機能不全と財政制約が続くなか、国内の成長連関の形成は十分ではなく、依然アメリカ経済回復は緩慢であること、そのため、(2)いったんは「量的緩和」の終了と利上げに転じたFRBの金融政策は、中国その他新興経済に対する影響が大きいことと相まって足踏みを続けている、という2点が明らかになった。こうした知見を織り込んでこれまでの研究成果を、図書3冊(理論面・アメリカを含む先進経済・新興経済に関する共著書)にて刊行し、得られた理論的知見は、経済理論学会第63回年次大会共通論題報告にて公表した。さらに編著1冊の刊行(アメリカー新興経済関係の編著)を進めた。当初計画した渡米現地調査は、在米研究時と大きな状況変化が見込まれなかったため最終年度に先送りしたが、全体に研究は計画以上に進展している。平成26年度の、1)リアルタイムの事態の推移のフォロー、および、2)都市状況・産業動向の実態調査を柱とした、在米研究機会を最大限利用した研究活動を受け、平成27年度は、研究拠点を日本に移し、収集済みのデータ・資料・関連文献の分析と現地実態調査の成果および現地研究者との議論の整理・分析に、さらにこの間の新たな展開についての研究を加え、主に次の4点の知見を得た。(1)金融危機前の「グローバル成長連関」の基本関係はFRBの異例の「量的緩和」(QE)で維持されているが、民間金融部門の機能不全が続き、アメリカおよびグローバルな成長を促進する機能は大きく低下している。(2)大統領予備選動向にも顕著に現れている「格差」拡大・中低所得者層の不調が改善されず、社会的分断と亀裂による政治的アプリアによって財政制約が依然大きい。(3)そのため、実体経済面では、住宅市場、企業設備投資、雇用・消費動向など、アメリカ経済の回復は依然緩慢である。

(4)一定の経済回復を受けて、FRBの金融政策は、金融機能の正常化に向けて、異例の「量的緩和」の終了と利上げに転じたが、中国その他新興経済の減速を招き、その影響が大きいため、「出口戦略」は足踏みを続けている。以上の知見を織り込み、これまでの研究成果を図書3冊(理論面およびアメリカを含む先進経済・新興経済に関する共著書)にて刊行し、また、理論面での知見を経済理論学会第63回年次大会の共通論題報告として発表した。さらに1冊の刊行(アメリカー新興経済関係の編著)を進めている。昨年度計画したこれまでの研究成果と現地実態とを付き合わせ、また現地研究者との意見交換を図る渡米現地調査は、在米研究時と大きな状況変化がないと判断されたため、国内研究を優先して平成28年度に先送りしたが、研究実績から判断して、研究は計画以上に進捗していると判定できる。最終年度である平成28年度は、研究成果の全体的総括を中心として、1.渡米調査・研究交流(9月7日-24日)、2.「トランプ現象」の分析、3.地方再生問題の比較研究の3点を重点的に研究した。2.では、渡米調査の知見をあわせた分析を通じ、オバマ政権8年間の米経済の回復過程の特質と問題点を集約的に示すことを解明した。3.では、地方再生問題の比較研究のため、群馬県利根・沼田地区の実態調査を進めた。本研究全体を通じ、金融危機・経済危機からの米経済の回復過程は、主に財政・金融的手段(量的緩和)を通じて「グローバル成長連関」を維持しつつも、国内成長連関の再建が大きな課題であり、トランプ政権が当面する最大の問題であることが明らかとなった。本研究全体の研究成果を織り込み、『現代経済の解読(第3版)』(共著)と『グローバル金融危機後の世界経済の変貌』(編著)の刊行を進めた。本研究の結果、主に次の2点が解明できた。(1)アメリカ経済は、緊急対策による厳しい財政制約のもと、異例の連銀量的緩和(QE13)が機能不全に陥った民間金融部門に替わって「グローバル成長連関」を基本で維持し、緩慢な回復軌道をたどった。危機後8年を経て、経済成長率や失業率、企業収益、自動車販売台数、株価など、多くの経済指標が金融危機以前の水準をほぼ回復してきているが、(2)中期的に見ると、「国内成長連関」の再構築と「グローバル成長連関」の維持という大きな「ジレンマ」を内包し、2016年大統領選挙動向にもそれが大きく反映された。当選したトランプ大統領の経済諸政策も相互に矛盾する性格となっている。26年度における、1)リアルタイムの事態の推移のフォロー、および、2)都市状況・産業動向の実態調査を柱とした、在米研究機会を最大限利用した研究活動を通じて、研究課題に対して主に次の3点についての基本動向が把握できたことで、研究はほぼ計の画通りに進捗していると判定できる。1「財政の崖」・医療保険(「オバマ・ケア」)問題でとりわけ中間戦況を巡って顕著に現れた、「格差社会」の拡大と人種間亀裂が重複したアメリカの社会的分断の拡大を原因とした民主党・共和党の政治的アポリアによって連邦財政の機能不全が続くなか、経済回復の政策的フレームワークが民間金融部門の機能不全を大規模に代替・補完するFRBによる異例の「量的緩和(QE)」に大きく依存する状況が続いている。
分子プローブ型キラルデンドリマーアミン配位　Ｇｄ－ＭＲＩ　造影剤の合成と機能評価

平成27年度は、末端に活性エステル基を有する平均分子量2,000および5,000のPEG鎖がデンドリマー末端の6つのアミノ基全てに導入された新規造影剤(1)(2)の合成に成功した。次に、合成した新規造影剤(1)、(2)のin vitroでのT1短縮能を評価した結果、新規造影剤(1)、(2)は、臨床用GdーMRI造影剤Magnevistの約5倍、および2倍の高い1H縦緩和能を示した。しかしながら、1つだけPEG鎖を導入した造影剤(3)と比較すると、緩和能は低い値に留まった。この結果は、分子量の大きなPEG鎖が導入されることにより、造影剤の分子サイズが増大し、造影剤分子の回転速度が抑制される効果よりも、PEG鎖が6つ導入されたことにより、Gd金属周りが立体的に混み合い、Gdへの水分子の配位が妨げられ、結果として水分子の交換速度が遅くなる効果の方が、水の縦緩和能r1に大きく反映されたためと考えられる。さらに、新規造影剤(1)、(2)の担癌マウスを用いたin vivo MRIを撮像し、体内動態と癌への集積能を評価した。その結果、造影剤(1)では投与24時間後にマウスで癌部位のコントラストの向上が認められた。さらに、投与24時間後にマウスを犠牲死させ、癌部位のGd量を原子吸光光度計で測定した結果、新規造影剤(1)、(2)では投与量の約5 %がEPR効果により癌部位に集積していることが明らかとなった。新規造影剤(1)、(2)はいずれもがん組織への集積が確認されたが、新規造影剤(1)の方が(2)よりも緩和能が高いため、MRIでのがんの検出には新規造影剤(1)が有効であると考えられる。以上より、本研究では、最終目的である“分子プローブ型キラルデンドリマーアミン配位GdーMRI造影剤の合成と機能評価"について、EPR効果に起因する受動的ターゲティング能を有する新規GdーMRI造影剤の開発に成功した。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、高い造影能と"がん"への集積性を併せ持つ概念的に新しい"分子プローブ型デンドリマーGd-MRI造影剤"の創製を目的として研究を行っている。平成25年度は、まず、コアである1,4,7-トリアザシクロノナン(TACN)の1つの窒素原子にマレイミド基を、また、残り2つの窒素原子に第二世代のキラルデンドロンを結合させた配位子を合成し、このマレイミド基に末端チオール基を有する乳がん特異的認識能をもつ抗HER2部分抗体(anti HER2-scFv)の導入を行い、最後にGdC13と錯化させることにより、"分子プローブ型新規キラルデンドリマートリアミン配位Gd-MRI造影剤の合成と機能評価"を行った。本造影剤について、7Tの小動物実験用MRI装置によるin vitroでの造影能の評価を行った結果、臨床用MRI造影剤であるMagnevist^Rの約3倍の大きいr_<1>を示すことが明らかとなった。同様に、マレイミド基に末端チオール基を有する分子量2,000、10,000、および30,000のポリエチレングリコール(PEG)鎖を導入し、ステルス効果とEPR (Enhanced Pemleability and Retention)効果による「がん」への集積性が期待される新規Gd-MRI造影剤の合成に成功した。導入したPEG鎖の分子量が大きくなるに従って、r_<1>値が増大し、分子量30,000のPEG鎖を導入した造影剤は、Magnevist^Rの約6倍の大きいr_<1>値を示した。末端ポリオール型キラルデンドリマートリアミン配位Gd-MRJ造影剤については、第一第三世代のデンドリマー造影剤を合成し、デンドリマー世代が大きくなるに従って、rl値が大きくなることを明らかにした。さらに、末端ポリアミノアルコール型デンドリマートリアミン配位Gd-MRI造影剤については、ラセミ体に加えて、新たに全ての不斉点がRおよびSのキラルな造影剤をエナンチオ選択的に合成し、その機能評価を行った。本研究では、高い造影能と“がん"への集積性を併せ持つ概念的に新しい“分子プローブ型デンドリマーGdーMRI造影剤"の創製を目的として研究を行っている。平成26年度は、末端ポリアミノアルコール型キラルデンドリマートリアミン配位GdーMRI造影剤のさらなる高機能化を目的として、アミノ基をトリガーとするポリエチレングリコール鎖(PEG、平均分子量5,000)、および代表的なタンパク質であるウシ血清アルブミン(BSA、約66.000 Da)の導入に成功した。一方、末端にアジド基を有するポリアジドアルコール型キラルデンドリマートリアミン配位子の合成を行った。合成した配位子のアジド基を利用し、末端プロパルギル基を有するPEG鎖を導入するため、銅触媒を用いるHuisgen cycloaddition(Click Chemistry)について検討した。銅触媒、配位子、還元剤、および溶媒等について検討を行ったが、現在のところHuisgen Cycloadditionには成功していない(no reaction)。この原因としては、ポリアジドアルコール型キラルデンドリマー配位子のコアである1,4,7-triazacyclononaneが銅触媒に強く配位することにより、触媒失活が起こったことが考えられる。

平成27年度は、末端に活性エステル基を有する平均分子量2,000および5,000のPEG鎖がデンドリマー末端の6つのアミノ基全てに導入された新規造影剤(1)(2)の合成に成功した。次に、合成した新規造影剤(1)、(2)のin vitroでのT1短縮能を評価した結果、新規造影剤(1)、(2)は、臨床用GdーMRI造影剤Magnevistの約5倍、および2倍の高い1H縦緩和能を示した。しかしながら、1つだけPEG鎖を導入した造影剤(3)と比較すると、緩和能は低い値に留まった。この結果は、分子量の大きなPEG鎖が導入されることにより、造影剤の分子サイズが増大し、造影剤分子の回転速度が抑制される効果よりも、PEG鎖が6つ導入されたことにより、Gd金属周りが立体的に混み合い、Gdへの水分子の配位が妨げられ、結果として水分子の交換速度が遅くなる効果の方が、水の縦緩和能r1に大きく反映されたためと考えられる。さらに、新規造影剤(1)、(2)の担癌マウスを用いたin vivo MRIを撮像し、体内動態と癌への集積能を評価した。その結果、造影剤(1)では投与24時間後にマウスで癌部位のコントラストの向上が認められた。さらに、投与24時間後にマウスを犠牲死させ、癌部位のGd量を原子吸光光度計で測定した結果、新規造影剤(1)、(2)では投与量の約5 %がEPR効果により癌部位に集積していることが明らかとなった。新規造影剤(1)、(2)はいずれもがん組織への集積が確認されたが、新規造影剤(1)の方が(2)よりも緩和能が高いため、MRIでのがんの検出には新規造影剤(1)が有効であると考えられる。以上より、本研究では、最終目的である“分子プローブ型キラルデンドリマーアミン配位GdーMRI造影剤の合成と機能評価"について、EPR効果に起因する受動的ターゲティング能を有する新規GdーMRI造影剤の開発に成功した。当初の計画通りに進展している。末端ポリアミノアルコール型キラルデンドリマートリアミンGdーMRI造影剤にPEG鎖やBSAを導入し、さらに高感度かつ高機能なGd-MRI造影剤の合成に成功した。27年度が最終年度であるため、記入しない。今後はPEG鎖やBSAを導入した新規造影剤の担癌マウスを用いたin vivo MRIを撮像し、体内動態とがんへの集積能を明らかにする。さらに末端アミノアルコール型造影剤に乳癌特異的抗HER2抗体を導入した新規造影剤の合成を行う。これまでに合成したポリアミノアルコール型造影剤あるいはマレイミドを有するポリオール型造影剤にポリエチレングリコール(PEG)鎖を導入した造影剤のEPR効果による受動的ターゲティング機能を、一方、乳癌特異的抗HER2抗体を導入した造影剤の能動的ターゲティング機能をマウスを用いるin vivo実験により明らかにする。最終的には、受動的あるいは能動的ターゲティング能を有する造影剤の絞り込みとさらなる改良を繰り返すことにより、本研究の最終目的である“分子プローブ型キラルデンドリマーアミン配位GdーMRI造影剤の合成と機能評価"を達成する。さらに最も高い感度と機能(癌集積性)を有し、最も毒性の低い造影剤について大量合成法を確立し、非(前)臨床試験への移行を判断する。マレイミド基を有する末端ポリオール型キラルデンドリマートリアミンGd-MRI造影剤の合成とその高機能化と機能評価について研究を進めているが、さらに、高機能化が容易な末端ポリアミノアルコール型キラルデンドリマートリアミンGd-MRI造影剤の合成に成功した。
細胞分裂から分化への変換を統御する分子機構の解明

本研究では細胞分裂から分化への転換機構を明らかにするために、シロイヌナズナの根において、B型レスポンスレギュレーターの分解制御に関わるKRPの機能解析と、DNA倍加を引き起こすエピジェネティックな制御機構の解析を行った。その結果、ある種のKRP遺伝子が根の移行領域で発現し、DNA損傷ストレス下での細胞分裂から分化への移行促進に重要な役割を果たしていることを見出した。また、オーキシンがクロマチン構造制御を介して、細胞分裂から分化への移行に関与している可能性を示した。細胞が分裂から分化へと変換するプロセスは、多細胞生物の発生を支える基盤として重要である。本研究では、シロイヌナズナの根において細胞分裂から分化への変換を制御する機構の中でも、特に植物ホルモンを介した制御と、その上流のエピジェネティックな制御機構に焦点をあてて研究を進めている。本研究により、細胞分裂から分化への変換を高次レベルで統御するコアな制御系の解明を目指している。シロイヌナズナの根において細胞分裂から分化への切り換えが行われるのは、細胞分裂周期がDNA倍加周期へと転換する領域(transition zone, TZ)である。これまでの研究により、TZにおいてはサイトカイニンがオーキシンシグナルと拮抗し、G2/M期進行を阻害することによりこの転換が為されることが示唆されている。しかし、TZにおいてサイトカイニンシグナルがいかに制御されているかはほとんど明らかにされていない。そこで、まずサイトカイニンシグナル伝達に働くレスポンスレギュレーターARRの転写およびタンパク質レベルの発現制御に関わる因子の機能解析を行った。その中で、ARRの分解制御に働くF-boxタンパク質KMDの一種がTZ付近で発現することを見出した。また、その変異体では根端メリステムのサイズが短くなることを明らかにした。また、このKMDの発現制御にエピジェネティック制御が関わっていることがわかった。以上の結果から、エピジェネティック制御の下でARRの蓄積がコントロールされ、TZでのサイトカイニンシグナルの強度が制御されていることが示唆された。シロイヌナズナの根において細胞分裂から分化への切り換えが起こるのはtransition zone (TZ)と呼ばれる領域である。これまでの研究で、TZにおいてサイトカイニンシグナルがオーキシンシグナルと拮抗することが示されていた。そこで、サイトカイニン情報伝達に関わるB型レスポンスレギュレーターの分解に関わるF-boxタンパク質KMDに注目して解析したところ、KMD2がTZ付近で発現することを見出した。そこで、平成27年度はKMD2の発現及び機能解析を進めたところ、KMD2の発現はDNAメチル化状態により変化し、さらにサイトカイニンの一種であるトランスゼアチン処理により低下することを明らかにした。また、KMD2の変異体では根端メリステムサイズの減少が、また過剰発現体では拡大が見られることを明らかにした。これらの結果から、TZにおいてKMD2の発現はサイトカイニンにより一定レベルで抑制され、それによりB型レスポンスレギュレーターの発現が保証され、細胞分裂から分化への転換が実現すると考えられた。さらにDNA損傷ストレスを与えた際のKMD2過剰発現体の表現型を観察したところ、DNA損傷によるメリステムサイズの減少(根の伸長阻害)が起きにくくなっていることが示された。このことは、通常植物にストレスがかかるとサイトカイニンの生合成が活性化されメリステムサイズが縮小するが、この迅速なストレス応答にはサイトカイニン依存的なKMD2の発現抑制によるB型レスポンスレギュレーターの蓄積制御が重要であることを意味している。根においてはサイトカイニンと拮抗するオーキシンの濃度勾配が細胞分裂と分化の制御、さらにはメリステムサイズの制御に重要であることが知られている。そこで、オーキシンとエピジェネティック制御との関係性を調べるため、DAPI染色によるクロマチン構造の解析も行い、オーキシンシグナルがクロマチン構造を制御する一要因となっていることを見出した。KMDによるサイトカイニンシグナルの制御がストレス時の細胞分裂と分化の制御に重要な役割をもつことを明らかにすることができたから。根においては、頂端側から基部側にかけてオーキシンシグナルの勾配が存在する。これまでの研究から、このオーキシンシグナルの勾配と、transition zone (TZ)で活性化されるサイトカイニンシグナルにより、細胞分裂から分化への転換が行われることが示唆されている。一方で、シロイヌナズナの根におけるDNA倍加を伴う分化転換に際してはクロマチン構造の変化が重要であること、またオーキシンシグナルがクロマチン構造を制御する要因となっていることを見出している。以上のことから、オーキシンシグナルの低下がクロマチン構造制御を介して分化転換を促していると考え、オーキシンによるクロマチン構造の制御機構に焦点をあてて研究を行った。まず、DAPI染色によりクロモセンターを、また180 bpプローブに用いたFISHによりセントロメア領域を検出し、それぞれのシグナルの重なり具合をもとに染色体の凝縮度を解析した。その結果、オーキシンの変異体では染色体構造が変化していることが示唆された。次に、オーキシンに応答するヒストン修飾酵素遺伝子を探索したところ、ある種の遺伝子が野生型植物のオーキシン処理、あるいはオーキシン関連遺伝子の変異体において発現量が変化していることを見出した。そこで、それらのGUSまたはGFPレポーター系統を作出し、根端において発現する遺伝子を絞り込んだ。現在、これらの遺伝子の多重変異体を作成中であり、この変異体を用いてクロマチン構造や細胞分裂から分化への転換について解析する予定である。一方で、分化転換直前で量的に変化するヒストン修飾も見出している。現在、そのヒストン修飾を担う酵素

遺伝子についても解析を進めており、発現様式、変異体の表現型、異所的発現の効果等を調べることにより、細胞分裂から分化への転換に関わるエピジェネティックな要因であるかどうか検討している。本研究では細胞分裂から分化への転換機構を明らかにするために、シロイヌナズナの根において、B型レスポンスレギュレーターの分解制御に関わるKRPの機能解析と、DNA倍加を引き起こすエピジェネティックな制御機構の解析を行った。その結果、ある種のKRP遺伝子が根の移行領域で発現し、DNA損傷ストレス下での細胞分裂から分化への移行促進に重要な役割を果たしていることを見出した。また、オーキシンがクロマチン構造制御を介して、細胞分裂から分化への移行に関与している可能性を示した。特定のKMDがエピジェネティック制御の対象となっていること、またサイトカイニンシグナルの調節に関わっていることを明らかにすることができたから。オーキシンによるクロマチンの構造制御について詳細に解析するとともに、その制御に関わるエピジェネティック制御因子を特定する。28年度が最終年度であるため、記入しない。植物分子生物学KMDのエピジェネティック制御の実体を明らかにする。また、KMDとARRのイメージング解析を同時に行うことにより、KMDによるARRの蓄積制御の生理的意義を明らかにする。ARR遺伝子のプロモーター解析を中止し、その代わりにオーキシンによるエピジェネティック制御機構の解析を始めたため。KMDのレポーター系統の入手に手間取り、制御の鍵を握るKMDの同定に時間がかかったため。エピジェネティック制御機構の解析を進めるため、エピジェネティック制御因子の阻害剤や免疫染色に用いる試薬の購入、さらにChIP解析等に使用する予定である。ARRと合わせたKMDのイメージング解析の実験に用いる。
材料内部における物質移動動的解析技術の開発

鉄と炭素の反応をTEM内で直接観察することを試み、炭素中へ鉄が進入していく様子をその場観察することに初めて成功した。この現象は鉄/炭素系で考えられる融点より遙に低温で起きたが炭素中の鉄は液体のごとく自由に変形しながら炭素中を移動した。また酸化鉄にライム(CaO)を添加した試料で鉄だけで無くカルシウムも動かせることを確認し、TEM内でスラグ生成を制御できる可能性を示した。本研究は物質内部における反応が引き起こす成分元素の移動過程を透過型電子顕微鏡(TEM)で解析することを可能にしようとするものである。前年までに確立した炭素蒸着を利用した酸化鉄との反応解析法をより精密に、また多くの材料に適用できるようにすることを狙っている。そこで20年度は鉄と炭素の反応の解析を試みた。実験方法は酸化鉄を純鉄に取り替えただけであるが、試料作製法は下地が酸化物から金属に変わるため大幅に変更している。この実験は常に炭素と相手物質が接触していることが必要なため蒸着面を清浄にしなければならない。この場合酸化物は割ることで容易に清浄な表面(=破面)を得られるが、鉄は金属のため割ることは困難である。そこで蒸着面をFIBで研磨し、表面を平坦にした。この場合転位ループなどの混入も懸念されるが、鉄そのものが変化するわけではないので鉄と炭素の反応は観察可能である。この試料を加熱するとおおよそ500°C付近から反応が開始、高温ほど速まる傾向が見られた。また反応の形態は鉄/炭素界面から炭素側へ析出物が成長するというものであった。加熱後EDS、EELSで析出物の分析を行うと、析出物がほとんど鉄で構成されていることが判明した。この結果から、炭素と鉄は本来鉄中に浸炭が起きないような低温でも活発に反応することを示しており、特に炭素中に容易に鉄が侵入することを示している。そこで21年度は更に精密に鉄と酸素の組成比をわずかに変えた材料で鉄と炭素の反応性の違いを明らかにすることを試みた。実験に使用したのは鉄と酸素比ががほぼ1:1のウスタイト(FeO)であるが、この物質は他の酸化鉄と異なり、安定ではなく通常鉄がわずかに欠損していることが知られている。そこでこの欠損率を1%程度変化させて炭素との反応性を解析した。その結果、鉄の欠損量が多いほど反応温度が上がることが判明した。具体的には鉄の欠損量が約6%の試料では500°C未満で反応が始まり、7%の試料では600°C付近で反応が始まった。この温度範囲はウスタイトの安定存在領域未満の温度であるため、ウスタイト自身が自己分解した可能性も否定できない。また、鉄欠損は通常空孔の形で存在しているため、鉄が密の方が鉄として析出しやすいとも考えられる。しかし、一方でわずか1%程度の欠損率の変化だけでありこれだけの大きな変化が起こることとの因果関係はさらに詳細に検討する必要がある。また反応はいずれも炭素/鉄界面から析出が起こり炭素側へ進行するという形で起こり温度が高くなるほど析出物の成長は速まった。しかし析出物を分析した結果ほとんど鉄と炭素しか検出されず、析出物は炭素により還元された結果発生したことが確認できた。これまで実際に行ったことはウスタイト(FeO)の炭素による還元過程のその場観察であり、その結果ウスタイトの還元に関して数々の知見を得ることが出来た。22年度は実際の高炉製鉄においても重要な添加剤の一つで、いわゆるカルシウムフェライトを形成するカルシウムの効果をTEM内その場観察で確かめることを目的とした。扱った試料は全てカルシウムが固溶したウスタイトに限定したため最大原子濃度で6%弱までの試料を作製した。その結果バルク試料での実験結果では酸化鉄還元を促進すると考えられていたものがTEM観察では反応を抑制する傾向が見られた。具体的にはカルシウム濃度が高まるほど、反応開始温度が上昇する傾向が認められた。特に6%含有試料ではカルシウムを含まない試料より200度以上反応温度が上昇した。しかし、一旦反応が起き始めると急速にウスタイトと炭素の界面に析出物の発生、成長が見られ純ウスタイトの場合のように温度によって反応速度を制御することはできなかった。また、界面付近に鉄の析出相ができたのは純ウスタイトと大差なかったがそのすぐ下にカルシウムが濃縮された結晶粒が形成し、鉄だけでなくカルシウムも炭素との界面に向かって動くことが判明した。このカルシウム濃縮相は6%含有試料でのみ形成され、これは高温下で、事実上カルシウムが析出してウスタイトとの新しい複合化合物を形成したことを示している。

さらにこれまでに得られた結果を踏まえ、調査対象範囲を還元だけで無く製鉄後に残るスラグにも広げ、その足がかりとして海洋中の藻場育成に利用され始めた製鋼スラグの構造変化についても解析を行った。具体的にはスラグと浚渫土の混合物に海藻が付着するのに適度な硬度を持つメカニズムを解析し、水の役割をモデル化した。
脳梗塞治療法の開発を見据えた長寿遺伝子産物Sirt1による脳虚血抵抗性機序の解明

長寿遺伝子サーチュイン(SIRT1)の働きを脳で2-3倍程度に高めると、脳卒中が原因となる認知症を予防できるという仮説のもと、脳のサーチュイン量が通常の2ー3倍になるよう遺伝子操作したマウスを作成し、頸動脈を狭窄させる(細くする)手術を行って、認知機能の変化を観察した。普通のマウスでは両側の頸動脈を狭窄させると認知機能の障害(認知症)が起こったが、サーチュインが脳で働くよう操作したマウスでは頸動脈を狭窄させても、認知機能が正常に保たれ、脳血流がほとんど減少しなかった。サーチュインが働くと血管を拡張させる物質(一酸化窒素)を合成する酵素がオンの状態に保たれ、脳血管が拡張したことが原因だった。プリオンプロモーターを用いたトランスジェニックマウス(Tgマウス)作成システムを用い,マウス脳に哺乳類Sirt1を過剰発現させた.Sirt1-Tg/野生型マウスに10分間の一過性両側総頸動脈閉塞(BCAO)または永久両側総頸動脈狭窄(BCAS)負荷を加えた.レーザースペックル血流計(Omegazone)を用いて脳血流を評価したところ,BCAO群においては,野生型マウスで閉塞10分後に脳血流が前値の平均20%(n=4)にまで低下したのに対して,Sirt1-Tgマウスは平均45%(n=6)までの低下にとどまった.さらに,BCAS群においては,野生型マウスで狭窄2時間後の脳血流が前値の平均75%(n=6)まで低下していたのに対して,Sirt1-Tgマウスは全く低下しなかった(平均95%, n=5).この保護効果はSirt1活性化薬レスベラトロールによって再現され,内皮型一酸化窒素合成酵素阻害薬cavtratin投与によって消失した.このことから,Sirt1-Tgマウスは高い一酸化窒素産生能によって脳循環予備能を維持していることが明らかとなった.近年長寿遺伝子と称されるサーチュインの一つSIRT1は,これまで心筋梗塞などの心血管障害,アルツハイマー病などの神経変性疾患において抗アポトーシス作用,抗酸化作用を介して保護作用を発揮することが報告されてきたが,脳血管系への直接的な作用については報告がなかった.そこで,本研究では,SIRT1過剰発現マウスに対して両側総頚動脈に約50%の狭窄手術(BCAS手術)を行うことで,SIRT1による脳虚血抵抗性を検証した.野生型マウスと比較してSIRT1過剰発現マウスでは,BCAS術後1か月の認知機能,脳病理所見が有意に保たれた.こうしたSIRT1の効果は,内皮型一酸化窒素合成酵素(eNOS)の阻害薬Cavtratinの投与により消失したことから,eNOSの活性化による脳血流量改善作用を介することが明らかとなった(Hattori Y, et al. Stroke 2014).BCAS手術後に野生型マウスではeNOSのアセチル化が見られたが,SIRT1過剰発現マウスではアセチル化eNOSはほとんど観察されず,脱アセチル化酵素SIRT1の作用によりeNOSのNO産生能が維持されたことがその機序と考えられた.以上より,SIRT1は脳血流量改善作用によって脳循環不全の予防・治療に寄与しうると考えられた.SIRT1は,より重度の虚血侵襲(両側総頚動脈閉塞術)に対しても脳血流量維持効果を有することが判明した(Hattori Y, et al. NeuroReport 2014).以上より,SIRT1を標的とする創薬が,脳梗塞や脳循環不全による認知症の予防・治療法の開発に結び付くことが期待された.脳卒中学Sirt1-Tgマウスは高い一酸化窒素産生能によって脳循環予備能を維持していることが明らかとなり,現在までに得られたデータをまとめて論文投稿中のため.1動脈/血管機能の評価:ラテックス灌流法や5%二酸化炭素吸入下でのFITC-dextranを用いた脳表血管のリアルタイムイメージング,さらにはHE染色やPECAM抗体を用いた免疫染色法にて血管の構造・機能を評価する.また,BrdU(0.5 mg/Kg体重)腹腔内注射1日後の血管壁へのBrdU取り込みを血管内皮細胞増殖能の指標として評価する.2行動学的評価:Rotarodによる運動機能評価,バーンズ迷路/放射状迷路による認知機能評価を行う.3組織学的評価:免疫染色による,Sirt1の標的因子,p53, NFκB, FOXO1, Ku70の発現量の変化の検討を行う.

さらには,HE染色,GFAP染色,MHC-II染色による大脳皮質・海馬の微小梗塞の検索を行う4Tie2プロモーターとGFAPプロモーターを用いた新規Tgマウスの創生:上述したプリオンプロモーターは神経細胞,血管内皮,アストロサイトに目的タンパク質を発現させており,Sirt1-Tgマウスの虚血耐性機序をより細胞特異的に解析するために,血管内皮特異的(Tie2プロモーター),アストロサイト特異的(GFAPプロモーター)にSirt1を発現するマウスを作製し,上記と同様のメカニズム解析を行う.5Sirt1活性化薬レスベラトロールを用いた臨床応用:Sirt1を活性化する薬剤として上述したレスベラトロールが知られている.国立循環器病研究センターに通院中の頸動脈狭窄患者に対してレスベラトロールを投与する臨床試験を行う.レスベラトロールは既にサプリメントとして販売されているため,疫学研究に関する倫理指針に則った臨床試験計画を現在策定中である.研究の進展に伴い,顕著な脳循環予備能の改善という,当初予想し得なかった新たな知見が得られたことから,その知見を使用し十分な研究成果を得るために,当初の研究計画を変更する必要が生じたことにより,その調整に予想外の日数を要したため年度内に完了することが困難となった.詳細な実験のために,マウスの購入.
慢性副鼻腔炎に対する新規治療法の開発

アレルギー性鼻炎や慢性副鼻腔炎を代表とする鼻粘膜における炎症性疾患の病態として過剰な鼻汁産生と粘膜浮腫があり様々な分子が関与しているが、今回はペリオスチンについて解析を行った。ペリオスチンの発現量と線維化、およびアレルギー性炎症との関連を検討するために好酸球性副鼻腔炎患者における鼻ポリープ組織に対し免疫組織化学染色を施行した。その結果、鼻ポリープ組織の繊毛上皮下間質中にびまん性にペリオスチンの発現を認めたが非好酸球性副鼻腔炎患者と比較して明らかな差異は認められなかった。ペリオスチンはアレルギー性/非アレルギー性によらず、鼻ポリープ組織の上皮下間質層に発現することが明らかとなった。ヒト鼻粘膜細胞および気道上皮細胞の細胞株を用いて、periostinの各splicing variantの発現量と線維化との関連を検討するため以下の実験を行った。1)ヒト鼻粘膜細胞および気道上皮細胞の細胞株でのperiostinsplicing variantの発現の確認を行った。ヒト鼻粘膜細胞および気道上皮細胞の細胞株であるCCL30, A549細胞をRPMI-1640下に培養し、ウエスタンブロッティング法でperiostin蛋白の発現を確認し、正常鼻粘膜組織と比較検討のうえベースラインを設定した。正常鼻粘膜組織と気道上皮細胞株とのperiostinsplicing variantの発現は差が認められなかった。1)splicing variant発現の検出を行った。IL-4/IL-13にて細胞株を刺激し、periostinの発現を亢進させる。ベースラインと比較して、どのsplicing variantで発現の亢進が起こるかを比較検討した。現時点ではすべてのsplicing variantで発現の亢進が起こって起こっているもの考えられた。3)periostin遺伝子強制発現後の線維化実験を行った。periostinの各splicing variantを組み込んだプラスミドを作成した。各細胞株に導入し、過剰に発現させ、上気道における主要な線維化成分であるfibronectinとcollagen Vの産生をELIZA法にて測定している。periostinの各splicing variantを組み込んだプラスミドを作成したが、各splicing variantの組み込みに時間を要した。各細胞株に導入し、過剰に発現させ、上気道における主要な線維化成分であるfibronectinとcollagen Vの産生をELIZA法にて測定しているが、細胞株への導入効率が悪く実験の再現性が得られなかった。periostinの各splicing variantの発現量と線維化との関連を検討するため以下の実験を行った。1)ヒト鼻粘膜細胞および気道上皮細胞の細胞株でのperiostinsplicing variantの発現を検討した。ヒト鼻粘膜細胞の細胞株であるCCL30細胞および気道上皮細胞の細胞株であるA549細胞をRPMI-1640下に培養し、ウエスタンブロッティング法でperiostin蛋白の発現を確認し、正常鼻粘膜組織での発現と比較検討したところ、正常鼻粘膜組織と気道上皮細胞株とのperiostinの各splicing variant発現量に差は認めなかった。2)IL-13にて細胞株を刺激し、どのperiostinの各splicing variantで発現の亢進が起こるか比較検討したところ、各splicing variantで発現量は亢進していたが、有意な差は認められなかった。3)各細胞株にperiostin遺伝子を強制発現した後、上気道における主要な線維化成分であるfibronectinとcollagen Vの産生をELIZA法にて測定することにより各splicing variantの線維化作用を検討しようとしたが細胞株への導入効率が悪く、再現性が得られなかったため断念した。続いて、非好酸球性性および好酸球性ポリープにおけるペリオスチンの作用を検討するために免疫組織化学染色を行った。非好酸球性、好酸球性ともに上皮下の間質に強い発現を認めた。好酸球性ポリープの間質は浮腫状変化が強く、ペリオスチンの発現も浮腫状の間質全体にびまん性に発現している傾向を認め、非好酸球性ポリープに比べ発現量が多い傾向が認められた。各細胞株へのperiostin遺伝子を強制発現モデルを作成しようとしたが、細胞株への導入効率が悪く、再現性が得られなかったため断念した。実際の患者組織におけるペリオスチン発現の検討を先行して行っている。ペリオスチンの発現量と線維化、およびアレルギー性/好酸球性炎症との関連を検討するために、抗POSTN抗体を用いて好酸球性副鼻腔炎患者と非好酸球性副鼻腔炎患者における鼻ポリープ組織に対し免疫組織化学染色を施行した。陽性コントロールとして子宮頸がん組織を用いた。好酸球性症例、非好酸球性症例ともに、繊毛上皮下の間質中にびまん性ペリオスチンのに発現を認めるものが多く、また一部の症例では血管内皮にも発現を認めた。好酸球浸潤の程度とペリオスチンの発現の程度に明らかな差異は認めなかった。線維化組織とペリオスチン発現との関連は明らかではなかった。抗POSTN抗体はATRAS社製とAviva社製のものを用いたが、発現部位はおおむね一致しており、免疫組織化学染色の再現性を確認した。陽性対照として用いた子宮頸がん組織では扁平上皮内に淡い発現と、基底細胞層に強い発現を認めた。