hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Ｓ１Ｐ受容体を標的としたＩＢＤ新規治療法の開発

IBDにおける特異的な免疫学的異常、特に病原性T細胞のS1P/S1P受容体システムに関した知見をリンパ球動態制御による治療に応用するために、平成23年度において研究実施計画に沿って1、マウス正常T細胞/病原性メモリーT細胞のS1P/S1P受容体システム依存するFTY720の影響の検討および2、マウス慢性大腸炎モデルに対するFTY720療法の確立を行った。その結果、既報にあるナイーブT細胞のみならず病原性メモリーT細胞にもS1P受容体が発現していることがわかった。in vitroにおいてFTY720は単離したこれらの細胞に対しアポトーシスを誘導せず、各種細胞表面抗原の発現、ホーミング受容体の発現に影響をしなかった。次に、ナイーブT細胞移入腸炎モデルに対しFTY720を投与した結果、移入後8週の臨床スコア、組織学的スコアともに著明に改善することがわかった。また、末梢血および大腸粘膜CD4+T細胞数は著明に減少していた。各臓器CD4+T細胞の細胞表面抗原、ホーミング受容体発現はFTY720投与による影響は見られなかった。サイトカイン産生能についてFTY720投与群ではTh1およびTh2ともにサイトカイン産生を抑制した。以上より、炎症性腸疾患の慢性大腸炎モデルであるナイーブT細胞移入腸炎モデルに対しFTY720は腸炎を著明に抑制することがわかった。予定研究計画に沿って実験計画を進行し良好な結果を得ている。メモリーT細胞移入腸炎モデルに対してもFTY720が腸炎を抑制したため、既存のFTY720は二次リンパ節にリンパ球を隔離し免疫抑制作用を発揮するという機序では説明がつかない。前段階としての脾臓欠損メモリーT細胞移入腸炎モデルにおいてFTY720の腸炎抑制作用が認められ、現在、二次リンパ組織が完全に欠損したマウスにおける新規の腸炎モデルを作成し、同モデルに対してもさらにFTY720の腸炎抑制作用が認められるか検討中である。現在メモリーT細胞移入腸炎モデルに対してもFTY720が腸炎を抑制するかを検討している。同モデルにおいて腸炎を抑制するのであれば、既存のFTY720は二次リンパ節にリンパ球を隔離し免疫抑制作用を発揮するという機序では説明がつかないため、二次リンパ節が欠損したマウスにおける腸炎モデルを作成し、同モデルに対しさらにFTY720の腸炎抑制作用を検討する予定である。脾臓欠損メモリーT細胞移入腸炎モデルに対するFTY720の腸炎抑制効果の検討をしている。有効であれば、FTY720の新規の効果発現機序の解明のために、二次リンパ組織欠損腸炎モデルでのFTY720の有効性および骨髄病原性T細胞への影響の検討するため、二次リンパ組織の欠損したマウスモデルを作成し、病原性メモリーT細胞を移入し腸炎モデルを作成する。同モデルに対してもFTY720投与後の腸炎の抑制効果、リンパ球数の変化、細胞表面抗原の発現の差異などを解析し、骨髄由来の病原性T細胞に対するFTY720の有効性を検討する。その後にヒト病原性T細胞のS1P/S1P受容体依存性遊走モデルに対するFTY720の効果と難治性炎症性腸疾患患者に対する臨床研究を開始する予定である。メモリーT細胞移入腸炎モデルに対するFTY720の腸炎抑制効果の検討をしている。
光学的手法を用いた非侵襲的血糖値・ヘモグロビンA_<1c>同時測定システムの開発

1.近赤外拡散反射光を用いた非侵襲血糖計測システムの開発近赤外拡散反射光を用いて、ブドウ糖濃度0mg/dlと1000mg/dlの水溶液のスペクトルを測定し、差スペクトルを算出した結果、6000cm^<-1>周辺でブドウ糖固有のスペクトルを認めた。さらに、ブドウ糖固有のスペクトル強度とブドウ糖濃度との関連を多変量解析した結果、ブドウ糖濃度01000mg/dlの範囲において、相関係数r=0.84と高い相関が認められた。さらに、健常者を対象に非侵襲血糖計測システムの基礎的検討を行った。ブドウ糖固有のスペクトル強度とブドウ糖濃度との関連を多変量解析により解析した結果、ブドウ糖濃度70300mg/dlの範囲において、前腕屈側で得られたスペクトルと血糖値の間に相関係数r=0.68と有意相関が認められた。また、糖尿病患者の前腕屈側のスペクトルを計測、健常者と同じ解析を行った。その結果、ブドウ糖濃度80260mg/dlの範囲において、前腕屈側で得られたスペクトルと血糖値の間に相関係数r=0.60と有意相関が認められた。2.近赤外拡散反射光を用いた非侵襲ヘモグロビンA_<1c>計測システムの開発ヘモグロビンA_<1c>の近赤外域における固有スペクトルを同定すべく、ヘモグロビンA_<1c>測定用サンプルの吸光スペクトルから既知のヘモグロビン濃度の全血のスペクトルを差し引くことにより、ヘモグロビンの糖化によるスペクトルの変化を導出し、近赤外域におけるヘモグロビンA_<1c>固有のスペクトルを同定した。さらに、多変量解析により、ヘモグロビンA_<1c>5.28.6%の範囲において、相関係数r=0.64と有意の相関を認めた。次に健常者の前腕屈側のスペクトルを多変量解析により、ヘモグロビンAA_<1c>4.55.3%の範囲において、相関係数0.41と有意の相関は認められなかった。同様の検討を糖尿病患者において行った結果、ヘモグロビンA_<1c>5.28.1%の範囲において、相関係数0.54と有意の相関を認めた。次に、近赤外拡散反射光の浸透深度を推定すべく、5%ゼラチン水溶液を冷凍し、cryomicrotomyによる薄切標本を作製した。これを生体のファントムとして用い、近赤外拡散反射光の浸透深度を推定した結果、40μm以上となった。さらに、ブドウ糖固有のスペクトル強度とブドウ糖濃度との関連をpartial least square(PLS)methodによる多変量解析により解析した結果、ブドウ糖濃度01000mg/dlの範囲において、相関係数r=0.84と高い相関が認められた。

さらに、血清、血漿及び全血の生体試料にブドウ糖を添加し、ブドウ糖濃度801000mg/dlの血清、血漿及び全血試料を作成、それぞれの試料のスペクトルを拡散反射プリズムを用いて測定し、近赤外域におけるブドウ糖固有のスペクトルの吸光強度とブドウ糖濃度との関係を回帰分析した、その結果、血清、血漿、全血それぞれ、相関係数0.72、0.70、0.48であった。2.近赤外拡散反射光を用いた非侵襲ヘモグロビンA_<1c>計測システムの開発ヘモグロビンA_<1c>の近赤外域における固有スペクトルを同定すべく、ヘモグロビンA_<1c>測定用サンプルの吸光スペクトルから既知のヘモグロビン濃度の全血のスペクトルを差し引くことにより、ヘモグロビンの糖化によるスペクトルの変化を導出し、近赤外域におけるヘモグロビンA_<1c>固有のスペクトルパターンを同定した。さらに、多変量解析を用いることにより、ヘモグロビンA_<1c>5.28.6%の範囲において、相関係数r=0.64と有意の相関を認めた。1.近赤外拡散反射光を用いた非侵襲血糖計測システムの開発近赤外拡散反射光を用いて、健常者を対象に非侵襲血糖計測システムの基礎的検討を行った。測定部位は指尖、前腕屈側、上腕屈側、耳朶とし、10%ブドウ糖溶液を点滴静注することにより、血糖値を80300mg/dlの範囲で変動させながら、近赤外拡散反射によるスペクトルを測定した。糖負荷前のスペクトルをベースとし、負荷後に得られたスペクトルからの変化量を算出、血糖値の変化に伴うスペクトルの変化を抽出することにより、ブドウ糖固有のスペクトルの抽出を行った。さらに、ブドウ糖固有のスペクトル強度とブドウ糖濃度との関連をpartial least square (PLS) methodによる多変量解析により解析した結果、ブドウ糖濃度0300mg/dlの範囲において、前腕屈側で得られたスペクトルと血糖値の間に相関係数r=0.68と有意相関が認められた。また、糖尿病患者において、食前及び食後2時間までの前腕屈側のスペクトルを計測、PLS methodにより、健常者と同じ解析を行った。その結果、ブドウ糖濃度0260mg/dlの範囲において、前腕屈側で得られたスペクトルと血糖値の間に相関係数r=0.60と有意相関が認められた。2.近赤外拡散反射光を用いた非侵襲ヘモグロビンA_<1c>計測システムの開発In vitroにおける検討結果を基に、ヘモグロビンA_<1c>の近赤外拡散反射光を用いた非侵襲計測を試みた。健常者の前腕屈側で得られたスペクトルを収集し、PLS methodによる多変量解析を用いることにより、ヘモグロビンA_<1c>4.55.3%の範囲において、相関係数はr=0.41と有意の相関は認められなかった。健常者においては、ヘモグロビンA_<1c>の範囲が狭いことも、相関が得られにくい原因と考えられたため、同様の検討を糖尿病患者においても行った。その結果、ヘモグロビンA_<1c>5.28.1%の範囲において、相関係数はr=0.54と有意の相関を認めた。
Mn-Ge系反強磁性インバーおよびエリンバー合金

1.合金の作製および熱処理;偏析や内部欠陥の少ない健全な合金を得るためには高純度のMnを用いた方が良く、同時に合金化も容易になる。溶解方法は、アーク溶解および高周波炉あるいはタンマン炉による溶解の併用が望ましい。溶解,熱処理時における雰囲気としては高純度Arガスが適している。また、単結晶はタンマン-ブリッジマン法により溶湯からの緩徐凝固法により作製し、無歪切断機により主軸方向のものを切り出して使用した。2.構造解析および諸特性の測定;結晶構造の解析は各種の2元および3元合金について行い、β,γ,εあるいはそれらの混合相を確認した。諸物性はおおむね150700K間で測定した。磁性および電気比抵抗の測定からNeel点を決定し、また他に低温における磁化の異常性は存在しないことを確認した。熱膨張測定からNeel点以下でインバー特性を、弾性測定からNeel点付近でエリンバー特性を観測し、磁気測定の結果との対応性を確かめた。また、両特性を共有する合金も見出した。X線解析から求めたaおよびc軸方向の熱膨張は単結晶のそれとほぼ一致し、Mn-Ge系合金の異常熱膨張は大きな磁気体積効果と異方的熱膨張が関与し、弾性率の異常は可逆相変態と大きなΔE効果に起因していることが明らかになった。3.機械的性質および組織観察;硬度の測定結果に基づいて、(γ+ε)混合相中最良の加工性を呈する合金系を得、切削,旋削あるいは鍛造試験を行い多くの合金において良好な結果を得た。特にミッシュメタルあるいは軽希上類元素を添加した場合に被削性の改善効果が著しく、光学顕微鏡および走査電子顕微鏡による組織および破面観察によってつぎのことが明らかになった。すなわち、ミッシュメタル等を添加した合金の組織中には細かい針状の析出物が多数見出され、これが粒界をピン止めするためにε相の脆性を防止すると考えられる。
一方向凝固合金の多軸クリ-プにおける結晶すべり系間の相互作用

本研究では,まずニッケル基一方向凝固合金の多軸クリ-プにおける結晶すべり系間の相互作用を実験的に調べるため,IN738LC一変向凝固合金の薄肉円管試験片(内径9mm,外径11mm,ゲ-ジ長25mm)を用い,引張り・ねじり組合せクリ-プの途中でねじり応力を反転する試験を試験温度850°Cでいくつか行った.用いた試験片は軸方向が結晶の[001]方位に一致するものである.次に,結晶すべり系間の相互作用を理論的に検討するため,結晶すべり理論に基づくクリ-プ構成式を用いて試験結果の解析を行った.この結果,次の知見が得られた.1.かなり加速クリ-プに入った段階,すなわち材料がかなり軟化した状態でねじり応力を反転したところ,いずれの試験でもねじり応力の反転後に引張りおよびねじりクリ-プ速度の減少が観察され,その後クリ-プ速度は再びクリ-プ変形の進行とともに加速した.ただし,クリ-プ破断時間および破断ひずみは,ねじり応力の反転の影響をほとんど受けなかった.2.結晶すべり理論に基づく解析では,有限変形を返定し,結晶格子回転の影響を考慮したが,材料軟化は等方のパラメ-タにより記述した.この結果,上の述べたねじり応力反転後のクリ-プ速度の減少は,結晶格子の回転によりほとんど説明でき,材料軟化に異変性に異方性を考慮する必要のないことがわかった.3.以上の結果を総合すると,ニッケル基一方向凝固合金の多軸クリ-プにおける材料軟化は等方的に進行しており,したがって結晶すべり系間の相互作用は等方的であると言える.本研究では,まずニッケル基一方向凝固合金の多軸クリ-プにおける結晶すべり系間の相互作用を実験的に調べるため,IN738LC一変向凝固合金の薄肉円管試験片(内径9mm,外径11mm,ゲ-ジ長25mm)を用い,引張り・ねじり組合せクリ-プの途中でねじり応力を反転する試験を試験温度850°Cでいくつか行った.用いた試験片は軸方向が結晶の[001]方位に一致するものである.次に,結晶すべり系間の相互作用を理論的に検討するため,結晶すべり理論に基づくクリ-プ構成式を用いて試験結果の解析を行った.この結果,次の知見が得られた.1.かなり加速クリ-プに入った段階,すなわち材料がかなり軟化した状態でねじり応力を反転したところ,いずれの試験でもねじり応力の反転後に引張りおよびねじりクリ-プ速度の減少が観察され,その後クリ-プ速度は再びクリ-プ変形の進行とともに加速した.ただし,クリ-プ破断時間および破断ひずみは,ねじり応力の反転の影響をほとんど受けなかった.2.結晶すべり理論に基づく解析では,有限変形を返定し,結晶格子回転の影響を考慮したが,材料軟化は等方のパラメ-タにより記述した.この結果,上の述べたねじり応力反転後のクリ-プ速度の減少は,結晶格子の回転によりほとんど説明でき,材料軟化に異変性に異方性を考慮する必要のないことがわかった.3.以上の結果を総合すると,ニッケル基一方向凝固合金の多軸クリ-プにおける材料軟化は等方的に進行しており,したがって結晶すべり系間の相互作用は等方的であると言える.
上田秋成を中心とした和学者研究

近世中後期を代表する和学者・歌人であった上田秋成を中心に、主としてその学問や周辺人物との交流の様相、また同時代和学者たちの古典注釈を考察することにより、上方和学壇の諸相解明へのアプローチを試みてきた。特に、秋成の数少ない門人の一人であった林鮒主に焦点をあて、彼が京都和学壇において、秋成をはじめ、橋本経亮、賀茂季鷹、城戸千楯、上洛した本居宣長、荒木田久老といった人物たちと多岐に亘る交渉を持っていたことを示し、京都和学壇における鮒主の位置づけを試みた。その研究成果は、「林鮒主と京都の和学者たち」と題して学会発表し(ヨーロッパ日本学研究協会第13回国際大会、於エストニア・タリン大学、2011年8月)、論文「林鮒主の和学活動」としてまとめた(『国語国文』第80巻第11号、2011年11月)。また、賀茂真淵が万葉調歌人として顕彰した源実朝『金槐和歌集』と、秋成が万葉調歌人と評した田安宗武『天降言』をめぐって、秋成が抜粋・書写を繰り返していたことを指摘するとともに、従来真淵説と秋成説の二説が存していた、真淵評注本『金槐和歌集』から秋成が抜粋した『金槐和歌集抜莢』(大通寺蔵)に残る奥書を、その内容の検討を通して秋成奥書と断定した。そのうえで、『金槐和歌集抜莢』と『田安亜槐御歌』(『天降言』からの秋成による抜粋本)が、上方や伊勢の和学者らに伝播していく様相を明らかにし、近世中後期の上方和学壇における、実朝・宗武といった万葉調歌人と、その背後にある万葉学や真淵学への関心の高まりを浮かび上がらせた。その研究成果は、「上田秋成の宗武・実朝をめぐる活動とその周辺」と題して学会発表(日本近世文学会、於日本大学文理学部、2011年6月)し、現在論文を執筆中である。
パーキンソン病モデルラットにおける口腔領域の痛覚過敏のメカニズムの解明

パーキンソン病(PD)の口腔顔面領域の痛覚への影響をPDラットモデルを用い検討した。PDモデルラットの上口唇に4%ホルマリンを0.05mL注射し、疼痛関連行動と痛みの上行性神経路に関する各神経核(三叉神経脊髄路核、視床下部室傍核、橋の結合腕傍核)と、下行性疼痛抑制系に関する各神経核(中脳水道周囲灰白質、青斑核、大縫線核)におけるc-Fos陽性細胞の数をカウントした。その結果、視床下部室傍核における大細胞群では、対照群に比べてFos陽性細胞数が有意に少なかった。ドパミンの枯渇によって視床下部室傍核の活動が変化し、内側脊髄視床路やオキシトシンを介する鎮痛効果に影響が及んだ可能性が考えられた。パーキンソン病(PD)は、黒質神経細胞の変性によりドパミンの産生が減少する疾患である。これまでPDにおける口腔領域の痛覚への影響を検討するため、黒質細胞を破壊し作製した片側PDモデルラットを用い、三叉神経領域へのホルマリンテストに対する疼痛関連行動(PRB)と三叉神経脊髄路核(Vc)でのc-Fosの発現を調べた。その結果、PRBおよびc-Fos発現の増加が認められ、PDモデルラットは痛覚過敏状態にあることが判明した。さらに痛覚異常の特徴について検討したところ、PDによる運動や認知機能障害の関与の重要性が示唆された。しかし、PDにおける痛覚過敏のメカニズムは依然として不明である。本研究では、黒質線条体系のドパミンの枯渇により生じる痛覚過敏の原因を痛みの上行性神経路および下行性抑制系の機能の変調にあるとの仮説を立て、関連する中枢の各部位の神経活動を免疫組織学的に検討する。1.6-OHDA投与による黒質線条体系の破壊が、痛覚の上行性神経路へおよぼす影響:6-OHDA投与による黒質線条体系のドパミンの枯渇により作製したPDモデルラットでは、Vcでのc-Fos発現が増加し、痛覚過敏状態が誘発されることが明らかとなっている。そこで、さらに上位中枢への痛覚の上行性神経路に対する黒質線条体系の破壊の影響を検討するため、ホルマリンテストにより、視床後内側腹側核(VPM)、視床下部室傍核(PVN)、橋の結合腕傍核(PBN)におけるc-Fos発現を調べる。2.6-OHDA投与による黒質線条体系のドパミンの枯渇が、痛覚の下行性抑制系(セロトニン系およびノルアドレナリン系)へおよぼす影響:PDモデルラットにおける痛みの下行性抑制系への影響を検討するため、ホルマリンテストにより中脳中心灰白質(PAG)の腹外側・外側、青班核(CN)、縫線核(大縫線核:MRN、背側縫線核)に生じるc-Fos発現を調べる。我々は、以前の研究において、PDが口腔領域の痛覚に及ぼす影響を検討するため、黒質細胞を破壊した片側PDモデルラットを作製し、モデルラットの三叉神経領域へのホルマリンテストに対する疼痛関連行動(PRB)と三叉神経脊髄路核(Vc)でのc-Fosの発現を調べた。そこで、本研究では、PDによって口腔領域に生じる痛覚過敏のメカニズムを解明するため、黒質線条体系のドパミンの枯渇が、痛みの上行性神経路および下行性抑制系の機能へどのような影響を及ぼすかについて免疫組織学的手法を用いて明らかにすることを目的とした。研究1.PDモデルラットの上口唇へのホルマリン注射による痛みの上行神経路のc-Fos発現の検討:痛みの上行性神経路に関する各神経核(三叉神経脊髄路核(Vc)、視床後内側腹側核(VPM)、視床下部室傍核(PVN)、橋の結合腕傍核(PBN))におけるc-Fos陽性細胞の数をカウントする。研究2.PDモデルラットの上口唇へのホルマリン注射による痛みの下行性抑制系への影響:痛みの下行性抑制系を構成する神経核(中脳水道中心灰白質(PAG)の腹外側・外側部、青班核(CN)、縫線核(大縫線核:MRN、背側縫線核))のc-Fos陽性細胞の数をカウントし、その影響を検討する。研究1、2より痛覚過敏のメカニズムを解明する。平成26年度、27年度は以下のように研究を進めた。1PDモデルラットの作製:8週齢の雄性SDラットの内側前脳束に6-OHDAを投与することにより、黒質のドパミン神経の細胞死を引き起こし、ドパミンを枯渇させ、片側PDモデルラットを作製した。黒質線条体系のドパミンを枯渇状況の評価は、行動学的変化と組織学的変化で確認した。2ホルマリンテストの実施:PDモデルラットの上口唇(眼窩下神経領域)に2%ホルマリンを0.05mL注射し、炎症性疼痛を誘発し、ホルマリンテストを実施した。注射後の顔面こすり運動などの疼痛関連行動(PRB)を観察した結果、PDモデルラットは痛覚過敏状態にあることが判明した。3痛みの上行神経路、およびの下行性抑制系への影響:ホルマリンテスト後、脳切片を作製し、免疫組織化学的手法を用いて、痛みの上行性神経路に関する各神経核(三叉神経脊髄路核(Vc)、視床後内側腹側

核(VPM)、視床下部室傍核(PVN)、橋の結合腕傍核(PBN))におけるc-Fos陽性細胞の数をカウントした。さらに、痛みの下行性抑制系を構成する神経核(中脳水道中心灰白質(PAG)の腹外側・外側部、青班核(CN)、縫線核(大縫線核:MRN、背側縫線核))のc-Fos陽性細胞の数をカウントし、その影響を検討した。その結果、Vcにおけるc-Fos陽性細胞は増加するが、PAGのc-Fos陽性細胞には変化がないことが判明した。その他の部位については現在検討中であり、本来であれば平成27年度中に完了の予定であったが、やや進行が遅れている。パーキンソン病(PD)は、黒質神経細胞の変性によりドパミンの産生が減少する疾患である。PD患者は口腔顔面領域の痛覚に異常をきたしている可能性が、臨床的な観察から推測された。そこで本研究では、その詳細について明らかにする。6-OHDAの投与により黒質細胞を破壊して作製した片側PDモデルラットを用い、三叉神経領域へのホルマリンテストに対する疼痛関連行動(PRB)と三叉神経脊髄路核(Vc)でのc-Fosの発現を検討した。その結果、PRBおよびc-Fos発現の増加が認められ、PDモデルラットは痛覚過敏状態にあることが判明した。次に痛覚異常のメカニズムを検討するため、黒質線条体系のドパミンの枯渇が、痛みの上行性神経路および下行性抑制系へ及ぼす影響を免疫組織学的手法を用いて明らかにする。PDモデルラットの作製は、8週齢の雄性SDラットの内側前脳束に6-OHDAを投与することにより、黒質のドパミン神経の細胞死を引き起こし作製した。黒質線条体系のドパミンの枯渇状況の評価は、行動学的変化と組織学的変化で確認した。口腔顔面領域の痛覚への影響を調べるため、PDモデルラットの上口唇(眼窩下神経領域)に2%ホルマリンを0.05mL注射し、炎症性疼痛を誘発し、ホルマリンテストを実施した。注射後の顔面こすり運動などの疼痛関連行動(PRB)を90分間、観察し、PRBの回数をカウントした。また、痛みの上行性神経路のc-Fos発現を観察するため、深麻酔下に断頭し、脳切片を作製した。免疫組織化学的手法を用いて、痛みの上行性神経路に関する各神経核(三叉神経脊髄路核(Vc)、視床後内側腹側核(VPM)、視床下部室傍核(PVN)、橋の結合腕傍核(PBN))におけるc-Fos陽性細胞の数をカウントした。さらに内側前脳束に生理食塩水を投与した対照群と比較した。研究開始当初、研究分担者であった者が移動となったため研究の遂行が困難となった。その交代として研究分担者を追加したが、当初の予定通りには研究が進まず、大幅な遅れとなってしまった。現在、ホルマリンテストを上口唇で行った場合の、痛みの上行性神経路として、三叉神経脊髄路核(Vc)、視床後内側腹側核(VPM)、視床下部室傍核(PVN)、橋の結合腕傍核(PBN)における、c-Fos陽性細胞の数をカウントし、内側前脳束に6-OHDAの代わりに生理食塩水を投与した対照群との比較を行っている。現時点での6-OHDA群7例、対照群7例のカウントが終了し、統計学的解析を行っているところである。パーキンソン病(PD)の運動系や自律神経系の異常についてはよく知られているが、痛覚への影響については十分に解明されていない。本研究では、PDモデルラットを用い、その詳細について明らかにする。1PDモデルラットの作製は、ラットの左側内側前脳束に6-OHDAを投与することにより、黒質のドパミン神経の細胞死を引き起こし作製した。黒質線条体系のドパミンの枯渇状況の評価は、メタンフェタミン投与による誘起回転と免疫組織学的変化で確認した。
シンクロトロン放射X線散慢散乱ラジオグラフィによるシリコン微小欠陥の検出

本科学研究補助金に関る研究の目的は、シリコン中の微小欠陥を散乱X線を用いて検出することである。これを達成するために、(A)SSDを組みこんだ散乱ラジオグラフィの新しいシステムの試作開発、および(B)超平面波を用いたトポグラフィによる微小欠陥検出方法の改良、(C)それによる微小欠陥の検出、(D)SSD組込み散乱ラジオグラフィ装置による各種材料の観察とシリコン微小欠陥観察、以上の4つのステップを踏んだ。結果的には(D)項の1部以外は、予期した以上の成果を上げることができた。(D)は(A)の装置のソフトとハードのシステム製作が63年12月末に完成したので、現在実験継続中である。以下具体的に述べる。(1)A項の散乱ラジオグラフィのシステムについては、日本機械学会誌(63年2月)と理学電機ジャーナル(63年10月)に紹介した。SSD組込みのシステムについては現在執筆中である。(2)B項およびC項については、Jpn.J.Appl.Phys(1987ー6)とPhoton Factory Activity Report(1987/1987ー5)に報告した。この研究でシリコンの結晶を消衰距離(ξg)の厚さまで薄くすると、通常の厚さ(μ^<-1>:μは線吸収係数)の試料では観察不可能な微小欠陥が検出されることを見いだした。CZ結晶中のas grown欠陥の形態を初めて観察した。FZ結晶における微小欠陥の存在も検出できた。これは平成1年2月25日の実験結果で、現在執筆中である。以下具体的に述べる。本科学研究費補助金による研究目的は,シリコン・ウェーハー中の微小欠陥をトポグラフ的に検出するX線散乱ラジオグラフィ装置の試作と,それによる材料研究である.そこで今年は,以下のような仕事をして,所期の成果が得られたので,具体的に述べる.(1)X・Y試料走査装置の製作を完了した.1ステップ2.1μmの高精度を実現した.マイクロコンピュータによる画像データの記録を行う.(2)検出系として,半導体検出器(SSD:pure Ge)によるエネルギースペクトルの分析を行う装置部分の試作が完了した.但し, SSDの納入が遅くなって(これは科研費以外の研究費),全システムの装置製作は,実際の予定より数ヶ月遅れ, 2月になってしまった.MCA(科研費による)は予定のとおり納入組立を完了.(3)マイクロコンピュータを動かすMS-FORTRANのプログラム作製が思いのほか時間を要したが,スペクトルのピータ位置を記録するモデルプログラムを作り上げることができた.(4)これらの装置によるシリコンの実測を間もなく始める.(5)放射光を使うトポグラフィに関しては,3結晶法を用いた超平面波(0.01秒)のトポグラフィによる薄い(消裏距離のオーダー)シリコン中の微小欠陥の検出に成功した.以上のとおり,本年度の研究実施計画がほぼ達されたので,いよいよ次は散漫散乱のSSDによる検出に着手できる段階となった.本科学研究費補助金による研究の全体目的は、シリコン中の微小欠陥をトポグラフ的に検出するX線散乱ラジオグラフィ装置の試作とそれによる材料研究である。今年度は、昨年度に引き続き、SSDを組みこんだ散乱ラジオグラフィ装置の試作開発を進め、これと平行して放射光実験施設における超平面波トポグラフィによる微小欠陥の検出を試み、所期の成果が得られたので、以下具体的に述べる。(1)昨年度試作完了したX-Y走査装置にZ軸、O軸の走査機構を加えた。Z軸は散乱トモグラフィ観察のために必要である。O軸は本研究に関連するコンピータトモグラフィ(CT)の機能のためである。これでシンチレーション検出器を取りつけることにより、当研究で提案した散乱ラジオグラフィ観察が可能となった。(2)SSD-マルチチャンネルアナライザ(MCA)のシステムは、ADCを50MHzから200MHzへグレードアップし、将来的発展にそなえた。

SSDは、他研究費を使ってプリアンプ部を含め、今年度中期に整備した。(3)SSD-MCAのシステムと試料走査および、回折(散乱)データのサンプリングを一台のマイクロコンピータで行なわせるための制御プログラム全体を完成させ、システムが所期の設計どおりに作動することを確認した。MS-FORTRANを用いたこのソフト部分の作成作業が思いのほか時間を要し、63年12月末完成。(4)同上の新しいシステムを用いた各種材料の観察を行なった。用いる散乱線の種類によって、同時に数種の画像(トポグラフ)データが得られた。しかし、シリコンの散慢散乱線は実験室のX線源では弱すぎるので、高エネルギー物理学研究所で実験しなければならない。(5)超平面波トポグラフ観察に関して、消衰距離(3X^^<g)程度の薄いシリコン結晶を用いると微小欠陥の検出が可能であることを、平成1年2月27日の実験で明らかにした。
動脈硬化の発生・進展におけるマクロファ-ジの意義

動脈硬化の発生、進展に占めるマクロファ-ジの動態を先ず人の剖検例動脈を用いて検討し、次いで日本人にとって重要な脳動脈硬化におけるマクロファ-ジの役割をウサギを用いて実験病理学的に検討し、最後に動脈内膜へのマクロファ-ジの侵入機序をin vitroの実験系を用いて検討した。得られた研究成果の概要は次の通りである。1.人の動脈硬化巣におけるマクロファ-ジの存在様式を抗白血球単クロ-ン抗体を用いて検討した。大動脈内膜への血液細胞、とくに単球とTリンパ球の侵潤は小児期より明らかで、若年者の肉眼的正常部に見出された細胞は脂質空胞に乏しい単球/マクロファ-ジの形態を示していた。内膜の変化が進み、脂肪斑が形成されると多数の泡沫細胞が出現するが、このような泡沫細胞の大多数は単球/マクロファ-ジ由来であることが判明した。これらの泡沫細胞の間にはやはり多数のTリンパ球が存在していた。マクロファ-ジとTリンパの密接な相互関係の存在は病巣の超微形態学的検討からも明らかであった。より進行した粥腫を特徴づける泡沫細胞もその大多数が単球/マクロファ-ジ由来とみなされた。Tリンパ球の浸潤の程度は症例により、部位により差があり、多分、病変の活動性ないし時期的な違いを反映しているものと思われた。2.脳動脈硬化症は脳卒中の基礎となっている重要な疾患であるが、動物実験によって起こすことは困難とされていた。今回の研究では高血圧と高コ血症を負荷し、脳動脈を独自の方法により系統的に調査することにより、脳動脈の特定の部に単球/マクロファ-ジの内皮細胞への粘着と内皮下への侵入に端を発する動脈硬化がウサギ脳動脈に発生することを明らかにした。3.高コ血症動物のマクロファ-ジは内皮細胞への粘着性、内皮細胞表面での運動性が亢進しており、また、マクロファ-ジに対する走化性物質を分泌していることをin vitroの検討により明らかにした。動脈硬化の初期病変は内膜における泡沫細胞の出現を特徴としている。特に高コレステロール血症(高コ血症)の下で発生する動脈硬化の発生初期に単球/マクロファージ(Mφ)の内皮細胞への粘着とその内皮下への浸潤がみられることより、泡沫細胞の起源としてMφが有力視されている。我々は抗ウサギMφ単クローン抗体を作成し、ウサギ動脈硬化の発生初期にMφおよびMφ由来泡沫細胞が重要な役割を果していることを明らかにした。昭和63年度の研究では、人の動脈硬化におけるMφの存在様式、また実験的にはMφと内皮細胞の粘着の機序、高コ血症によるMφの機能の変化の有無ともしう有るとすればその動脈硬化発生における影響について特に検討した。〔結果とまとめ〕人の動脈硬化におけるMφの重要な関与が明らかとなった。Mφは小児の肉眼的に正常に見える内膜の時期に内皮下に集簇し始め、細胞質内に脂質を蓄積し、泡沫細胞へと変貌し、動脈硬化の初期病変である脂肪斑の重要な構成細胞であることが種々の単クローン抗体を用いた人剖検大動脈の免疫細胞学的検討により判明した。また、脂肪斑にはMφとともにTリンパ球、とりわけT_8細胞の存在も重要で、両者が密接に相互作用を示しながら肉芽腫的色彩の強い病変発生を促していることが、とくに電顕的観察から明らかになりつつある。

実験的にはin vitroの系を用いて、Mφと内皮細胞の粘着は温度と2価の陽イオン(Mg^<++>、Ca^<++>)依存性で、内皮細胞をLDLやVLDLで前処置すると有意に亢進することが判明した。高コ血症下のMφは内皮細胞への粘着能が高く、運動も盛んであることを顕微鏡テレビ装置により明らかにした。MφはMφ走化因子を分泌するが、この機能は高コ血症動物において有意に亢進していた。以上の実験的研究より高コ血症下ではMφと内皮細胞は粘着しやすく、また、Mφの内皮下への侵入が起こりやすいことを示唆していた。動脈硬化の発生、進展に占めるマクロファ-ドの動態を先ず人の剖検例動脈を用いて検討し、次いで日本人にとって重要な脳動脈硬化におけるマクロファ-ジの役割をウサギを用いて実験病理学的に検討し、最後に動脈内膜へのマクロファ-ジの侵入機序をin vitroの実験系を用いて検討した。得られた研究成果の概要は次の通りである。1.人の動脈硬化巣におけるマクロファ-ジの存在様式を抗白血球単クロ-ン抗体を用いて検討した。大動脈内膜への血液細胞、とくに単球とTリンパ球の侵潤は小児期より明らかで、若年者の肉眼的正常部に見出された細胞は脂質空胞に乏しい単球/マクロファ-ジの形態を示していた。内膜の変化が進み、脂肪斑が形成されると多数の泡沫細胞が出現するが、このような泡沫細胞の大多数は単球/マクロファ-ジ由来であることが判明した。これらの泡沫細胞の間にはやはり多数のTリンパ球が存在していた。マクロファ-ジとTリンパ球の密接な相互関係の存在は病巣の超微形態学的検討からも明らかであった。より進行した粥腫を特徴づける泡沫細胞もその大多数が単球/マクロファ-ジ由来とみなされた。Tリンパ球の浸潤の程度は症例により、部位により差があり、多分、病変の活動性ないし時期的な違いを反映しているものと思われた。2.脳動脈硬化症は脳卒中の基礎となっている重要な疾患であるが、動物実験によって起こすことは困難とされていた。今回の研究では高血圧と高コ血症を負荷し、脳動脈を独自の方法により系統的に調査することにより、脳動脈の特定の部に単球/マクロファ-ジの内皮細胞への粘着と内皮下への侵入に端を発する動脈硬化がウサギ脳動脈に発生することを明らかにした。3.高コ血症動物のマクロファ-ジは内皮細胞への粘着性、内皮細胞表面での運動性が亢進しており、また、マクロファ-ジに対する走化性物質を分泌していることをin vitroの検討により明らかにした。
3・4次元多様体の研究

4次元多様体のトポロジーに関しては、4次元球面には固定点が1点のみとなるようなコンパクト群の可微分な作用は存在しないことがモジュライ空間とその上の群作用を考えることにより証明できた。4次元球面上の1-インスタントンのモジュライ空間の微分幾何に関しては、3種の自然なリーマン距離が入ること、そして各々の断面曲率を厳密に決定し、1種は正、残りの2種は負であることを示した。とくにPopov-Fadeevの距離に関する断面曲率はxとlogxの有理式として記述できるが、それ自身興味深い関数であった。計算機による数式処理を有効に利用して、その正値性・単調性を示すことができたが、このようなxとlogxの多項式でx=1の近くでみかけよりずっと高次の無限小になるといった現象を内在する関数は数式処理との関連でも今後注目されることになろう。3次元多様体のトポロジーに関しては、大阪市立大学理学部河内明夫助教授との共同研究の他、大学院生垣水修君の博士学位論文「3次元多様体の半安定端の境界」に代表される多様体の無限遠の近傍の研究に進展があった。解析学では俣野博助教授(研究協力者)と大学院生陳旭彦君の共同による「非線形楕円型微分方程式の解の漸近挙動」に関する無限次元力学系を用いた研究は、2次元の場合のある方程式の特異点のある解の完全な分類を与え、3次元の場合にも発展する勢いである。その他、4次元多様体の中の輪環体を大学院生関根光弘君が詳しく調べ、ある型の埋め込みの特徴付けに成功した。又、数理物理学との関連では素粒子論グループと交流を試みた。多様体上のリーマン距離の変形によるモジュライ空間の変形についても種々の調査研究を行った。
チロシンキナーゼ型受容体の非定型的活性化：がん病態制御における次なる標的

前年度に引き続き、チロシンキナーゼ型受容体の非定型的活性化に関する研究を進めた。まず、ErbB4については、ERKを介するフィードバック阻害機構の解析を行った結果、他のErbB受容体と共通の機構として膜近傍領域のThr-674のリン酸化に加えて、C末端側のSer-1026のリン酸化が関与していることを実証した。また、メラノーマ患者において認められるErbB4の活性化変異体は、フィードバック機構の異常によるものである可能性を示した。また、これらの結果を論文としてまとめた。グリオブラストーマの発がん遺伝子であるEGFRvIII変異体の活性調節機構に関する研究を行った。ErbB受容体の共通のフィードバック阻害機構は、EGFRvIIIにおいても正常に認められ、Thr-669のリン酸化が関与していることがわかった。次に、現在治療に用いられている化学療法剤テモゾロミドの作用を検討した結果、p38を介したEGFR Ser-1015のリン酸化が誘導された。このリン酸化に伴い、EGFRvIIIのエンドサイトーシスが認められた。EphA2のSer-897のリン酸化による非定型的活性化に関する研究においては、浸潤・転移能の高いヒト乳がん細胞株MDA-MB-231細胞を用いて検討を行った結果、リン酸化されたEphA2がラメリポディア様構造に局在化することがわかった。これには、Rab11やそのアダプター分子Rab11FIP1が発現するリサイクリングエンドソームによる小胞輸送が関与していることを見出した。さらに、これら分子をノックダウンすることにより、細胞運動能が有意に低下することをタイムラプスイメージング解析で実証した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。チロシンキナーゼ型受容体の非定型的リン酸化について検討した。まず、リガンド刺激時のEGFRのリン酸化制御機構として、新たにp38によってリン酸化される細胞内ドメイン内のSer-1015に対するリン酸化抗体を作製した。ウェスタンブロットにより、リガンドやサイトカイン刺激時に効率的にリン酸化が起こっていることがわかった。また、免疫細胞染色により、細胞内にエンドサイトーシスしたEGFRがリン酸化されていることがわかった。これらの結果は、p38を介した非定型的なEGFRのエンドサイトーシスが起こっていることを示す重要な結果である。ErbB4については、ERKを介した膜近傍ドメイン内のThr-674のリン酸化がチロシンキナーゼ活性のフィードバック阻害に関与することを明らかにした。このリン酸化部位は、EGFRやErbB2にも保存されており、ErbB受容体の共通のフィードバック阻害機構の存在が示された。また、ErbB4の場合はC末端側のSer-1021/1026のリン酸化がERKを介して起こっていること、これら部位もフィードバック阻害機構に関与していることを示唆する結果が得られた。EphA2のC末端Ser-897リン酸化は、がん細胞の運動能を制御することを報告している。本年度は、細胞運動能に関与する上皮間葉転換(EMT)誘導時のEphA2発現について検討した。肺がん細胞株A549をTGF-βで刺激した時のEphA2の発現を検討した結果、EGFRやFGFR1を介したMEK/ERK経路の活性化がEphA2の発現を強く誘導することがわかった。また、Ser-897リン酸化も誘導された。細胞染色の結果、リン酸化されたEphA2はラメリポディア様構造に限局して発現していた。研究計画の最も重要なEGFRの非定型的リン酸化機構に関して、新たな抗体の作製に成功し、メカニズム解明に大きく前進した。また、EphA2のがん悪性化における役割解明においても、EMT化との関連性を見出した。その他のRTKの解析についても一定の前進があることから、一部計画が未達の課題もあるが全体計画は概ね順調に進展している。前年度に引き続き、チロシンキナーゼ型受容体の非定型的リン酸化について検討を行った。まず、EGFRについては、前年度に作製したSer-1015のリン酸化特異抗体を用いて検討を行った。その結果、リガンド刺激時におけるp38を介したSer-1015リン酸化が、非定型的なEGFRエンドサイトーシスを誘導していることがわかった。また、抗がん剤のシスプラチンなどのストレスシグナルに対してもSer-1015リン酸化による非定型的なリン酸化が起こっていることを明らかにした。さらに、EGFRに活性化変異のある非小細胞肺がん細胞においても、同様の制御機構が働いていることを見出した。したがって、非定型的なEGFRの活性調節機構は、様々な発がん機構や分子標的薬耐性に関与していることが示唆された。次に、ErbB4については、膜近傍ドメイン内のThr-674とC末端領域のSer-1026が協調してチロシンキナーゼ活性を調節していることを見出した。両者をアラニンに置換した変異体においては、恒常的なチロシンキナーゼの活性化が認められ、さらにERK活性化を介したフィードバック調節を受けないことがわかった。また、メラノーマ細胞においてP675S変異はThr-674の隣のアミノ酸であり、この変異がThr-674フィードバックリン酸化を阻害することによりチロシンキナーゼ活性が上昇している可能性が考えられた。ERK下流のRSKによるEphA2のSer-

897リン酸化については、増殖因子等の刺激においてはERKを介しているのに対して、タンパク質合成阻害剤アニソマイシンなどのストレスシグナルにおいては、ERKよりもむしろp38がRSKを活性化しEphA2のリン酸化を誘導していることがわかった。EGFRについては、リン酸化抗体の作製により目的の非定型的リン酸化の役割を示すことができ、研究成果を論文化することができた。また、ErbB4やEphA2についても、論文作成の目途がつく段階まで進展した。さらに、その他のチロシンキナーゼ型受容体の研究についても、新たな研究成果を得るまでの実験系の確立した。前年度に引き続き、チロシンキナーゼ型受容体の非定型的活性化に関する研究を進めた。まず、ErbB4については、ERKを介するフィードバック阻害機構の解析を行った結果、他のErbB受容体と共通の機構として膜近傍領域のThr-674のリン酸化に加えて、C末端側のSer-1026のリン酸化が関与していることを実証した。また、メラノーマ患者において認められるErbB4の活性化変異体は、フィードバック機構の異常によるものである可能性を示した。また、これらの結果を論文としてまとめた。グリオブラストーマの発がん遺伝子であるEGFRvIII変異体の活性調節機構に関する研究を行った。ErbB受容体の共通のフィードバック阻害機構は、EGFRvIIIにおいても正常に認められ、Thr-669のリン酸化が関与していることがわかった。次に、現在治療に用いられている化学療法剤テモゾロミドの作用を検討した結果、p38を介したEGFR Ser-1015のリン酸化が誘導された。このリン酸化に伴い、EGFRvIIIのエンドサイトーシスが認められた。EphA2のSer-897のリン酸化による非定型的活性化に関する研究においては、浸潤・転移能の高いヒト乳がん細胞株MDA-MB-231細胞を用いて検討を行った結果、リン酸化されたEphA2がラメリポディア様構造に局在化することがわかった。これには、Rab11やそのアダプター分子Rab11FIP1が発現するリサイクリングエンドソームによる小胞輸送が関与していることを見出した。さらに、これら分子をノックダウンすることにより、細胞運動能が有意に低下することをタイムラプスイメージング解析で実証した。引き続き、計画通り解析を進めていく予定であるが、論文化を達成することを最大目標として取り組むとともに、進捗の期待される課題により一層注力する。引き続き、計画通りに研究を進めていく予定であるが、ErbB4やEphA2などの論文化を重点化して進める。また、EGFRにおいては新たな非定型的リン酸化部位の同定やその役割の探索など行う。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
マイクロレーザー技術を応用した補綴装置内部への情報書き込み法の開発

2011年3月に東北地方において、東北地方太平洋沖地震が発生したことに付随して,歯科医療の身元判明のための重要性が再認識されることとなった.天然歯が残っている人に対しては,カルテと照らし合わせて判断することができるが,義歯を装着している人に対しては,義歯を見ることでその人を判別する.その際,義歯に何かしらの個人を判別するものがあればその作業は非常に簡便なものとなるのは明らかである.これまでも義歯に外部から彫刻する方法は考えられてきたが,それ自体が傷となり,プラークや汚れが沈着する原因となる.そこで,物体の内部に彫刻することができるマイクロレーザー彫刻技術を義歯に応用する方法を考案,試行した.今回の研究では,予算的にレーザー加工機・彫刻器を購入することができなかったため,一般企業に彫刻を依頼した.一般にレーザー彫刻は空気と水以外の素材であれば大抵のものに加工が可能であるため,アクリル製の義歯には問題はなかった,ただ,平面に対しての加工が一般的であるため,義歯の曲面に加工ができるかという問題はあったが,最終的に問題なく加工が行えた.加工できるデザインとして,写真がどこまで再現できるかという疑問はあったが, Adobe Photoshopによってイラスト状に編集することで,充分に判別可能なものが得られた.この技術は義歯製作途中ではなく,できたものに後から施行することができる技術である.デザインやPCでの処理の時間を省いた加工時間は実質23分程度であり,困難な作業も必要としない.また,企業に依頼するにしてもおおよそ1,0002,000円で加工が可能である.よって,マイクロレーザー技術は情報書き込み法として充分応用可能であることが示唆された.2011年3月に東北地方において、東北地方太平洋沖地震が発生したことに付随して,歯科医療の身元判明のための重要性が再認識されることとなった.天然歯が残っている人に対しては,カルテと照らし合わせて判断することができるが,義歯を装着している人に対しては,義歯を見ることでその人を判別する.その際,義歯に何かしらの個人を判別するものがあればその作業は非常に簡便なものとなるのは明らかである.これまでも義歯に外部から彫刻する方法は考えられてきたが,それ自体が傷となり,プラークや汚れが沈着する原因となる.そこで,物体の内部に彫刻することができるマイクロレーザー彫刻技術を義歯に応用する方法を考案,試行した.今回の研究では,予算的にレーザー加工機・彫刻器を購入することができなかったため,一般企業に彫刻を依頼した.一般にレーザー彫刻は空気と水以外の素材であれば大抵のものに加工が可能であるため,アクリル製の義歯には問題はなかった,ただ,平面に対しての加工が一般的であるため,義歯の曲面に加工ができるかという問題はあったが,最終的に問題なく加工が行えた.加工できるデザインとして,写真がどこまで再現できるかという疑問はあったが, Adobe Photoshopによってイラスト状に編集することで,充分に判別可能なものが得られた.この技術は義歯製作途中ではなく,できたものに後から施行することができる技術である.デザインやPCでの処理の時間を省いた加工時間は実質23分程度であり,困難な作業も必要としない.また,企業に依頼するにしてもおおよそ1,0002,000円で加工が可能である.よって,マイクロレーザー技術は情報書き込み法として充分応用可能であることが示唆された.
好塩基球を標的とした難治性皮膚疾患、難治性そう痒症の病態解析と新規治療法の開発

難治性皮膚疾患である慢性痒疹、アトピー性皮膚炎の痒疹結節部ならびに経皮感作食物依存性アナフィラキシーの発症機序の解析と新規治療法の開発する。好塩基球の活性化に亜鉛が関与しているかマウス、ヒト好塩基球を調整してFceRIを介した刺激を加え細胞内の亜鉛濃度を測定するとともに亜鉛トランスポーター、メタルチオネイン(MT)の発現を遺伝子、蛋白レベルで確認する。難治性皮膚疾患モデルマウスを用いて特に亜鉛トランスポーター欠損マウス、MT欠損マウス、好塩基球欠損マウスに難治性皮膚疾患のモデルマウスを誘導しワイルドタイプを比較検討して皮膚疾患誘導に重要な役割を果たすか検討するとともに新規治療法を開発する。
C1gコラーゲン部に対する自己抗体のループス腎炎における病因的意義

研究代表者は、C1q固相法によってSLE血清中に検出されるC1q結合性物質が免疫複合体ではなくC1qコラーゲン部に対する自己であることをこれまでに明らかにしてきた。この自己抗体の病因的意義を明らかにするため、本研究において、抗C1q自己抗体の腎糸球体への沈着がループス腎炎の発症・増悪に関与している可能性を検討した。すなわち、C1qが腎糸球体に一旦沈着するとそれを介して新たに抗C1q自己抗体が沈着するという最近得た知見に基づいて、腎糸球体免疫沈着物の形態・再構成、沈着部位、沈着の遷延化におよぼす抗C1q自己抗体の影響を検討した。陽性荷電免疫複合体(cationized HSA/antiHSA)-C1q結合物をマウスに投与し、C1qを含有する腎糸球体免疫沈着物を作製した。一方、C1qを伴わない腎糸球体免疫沈着物のモデルとして、還元アルキル化陽性荷電免疫複合体を投与したマウスを用いた。これらのマウスに、C1qアフィニティカラムによって精製した抗C1q自己抗体の投与によって、免疫沈着物の腎糸球体基底膜内皮側への沈着は有意に延長した。これより、抗C1q自己抗体は、免疫沈着物内のC1qと結合することによって、腎炎の遷延化に関与している可能性が示唆された。腎への作用形式をさらに広範に検討するため、C1qコラーゲン部に対するモノクロナール抗体を作製したが、モノクローナル抗体と抗C1q自己抗体とでは、免疫化学的特質が著明に異なっており、このため直接の比較検討は困難であった。そこで、現在、代表的なループスマウスであるMRL/1prマウス由来のモノクローナル抗体を作製中である。並行して、抗C1q自己抗体のループス腎炎罹患腎よりの抽出を行なった。抗C1q自己抗体とC1qとの結合が塩や酸では解離しがたいことによると想定されるが、抽出量は微量で、解析には不十分であった。より多くの試料を収集し、再度、抽出を試みている。
血行性転移に関わる血小板依存的ながん増殖機構の解明と阻害剤の創製

本研究は、血小板との相互作用依存的に活性化されるがん細胞内のシグナル伝達経路を明らかにし、その経路の阻害剤を創製することで血行性転移阻害剤とすることを目的に行った。研究代表者は、血小板と肉腫細胞の直接的相互作用が、肉腫細胞の増殖と薬剤抵抗性を亢進することで腫瘍悪性化に寄与することを見出し、その鍵となるシグナル伝達経路としてPI3K-Aktを特定した。さらに、肉腫細胞は血小板凝集促進因子Aggrus依存的に血小板凝集を誘導することが示されたことから、抗Aggrus中和抗体が血行性転移阻害剤として有用である可能性が示唆された。本研究課題は、がんの根治を目指した新規治療法開発の為に、がんの血行性転移阻害剤の開発を行うことを目的とする。すなわち、血行性転移の際にがん細胞と血小板が形成する凝集塊をin vitro共培養系で再現することで、血小板依存的ながん細胞の増殖亢進機構を明らかにする。今年度は、昨年度に同定した分子が血小板依存的ながん細胞の増殖亢進に寄与する可能性や、上流のレセプター分子に関して検討を行った。昨年度、血小板との共培養により肉腫細胞株の増殖が優位に亢進することや、その際にAktリン酸化が亢進することを示した。そこで、PI3K阻害剤LY294002を用いた検討を行ったところ、LY294002処理により血小板依存的な肉腫細胞の増殖亢進がキャンセルされることが確認された。また、血小板と肉腫細胞の相互作用はAdriamycin誘導性のアポトーシスに対する抵抗性を付与することや、この抵抗性がLY294002処理によりキャンセルされることを明らかにした。次に、血小板依存的な肉腫細胞の増殖亢進機構の引き金となる分子を探索したところ、肉腫細胞における血小板凝集促進因子Aggrusの高発現を見出した。また、血小板依存的に増殖を亢進する肉腫以外の幾つかのがん腫においてもAggrusの発現を確認した。そこで、Aggrusの活性を阻害する抗Aggrus中和抗体が血小板依存的な増殖亢進および血行性転移に与える影響を検討したところ、抗Aggrus中和抗体は肉腫細胞の増殖亢進に大きな影響を与えなかったが、いくつかのがん細胞の血行性転移を阻害することを確認した。以上より、血小板と肉腫細胞の相互作用は、肉腫細胞の増殖能と薬剤抵抗性を亢進することで腫瘍悪性化に寄与することや、その鍵となるのはPI3K-Akt経路であるという新たな知見を得た。さらに、抗Aggrus抗体が血行性転移阻害剤として有用である可能性が示唆された。すなわち、血行性転移の際にがん細胞と血小板が形成する凝集塊を、がん細胞と血小板の共培養系で再現することで、凝集塊中における血小板依存的ながん細胞の増殖促進機構を明らかにする。本年度は、血小板と共培養したがん細胞が増殖能を亢進する分子機構を解明することに重点を置いて研究を行った。計画当初、血小板が無核であることに着目し、二本鎖DNA量を定量することで共培養条件下のがん細胞の増殖能を比較する予定であった。しかし、血小板単独で測定した場合にも強い蛍光シグナルを検出したため、検出方法の改善を試みた。具体的には、蛍光タンパク質(ZsGreen)を安定的に遺伝子導入したがん細胞株を樹立し、血小板との共培養条件下でZsGreenの蛍光強度を指標にがん細胞の増殖能を測定した。これにより、血小板由来のシグナルはバックグラウンドと同程度に改善されたため、以降はZsGreen発現がん細胞株を用いて検討した。まず、血小板との共培養で増殖能が亢進するがん腫を探索したところ、ある肉腫において顕著な増殖能の亢進が観察されたため、この肉腫由来の細胞株を主たる解析対象とした。次に、血小板と共培養した肉腫細胞株の細胞破砕液をリン酸化タンパク質検出アレイで解析することで、血小板依存的な細胞増殖シグナルを仲介する分子の同定を試みた。共培養開始2時間後にいくつかのシグナル伝達分子のリン酸化が観察された。そこで、個々の分子に関するリン酸化抗体を用いてウエスタンブロット法で確認したところ、血小板依存的なリン酸化を受けるシグナル伝達分子が同定された。現在、このシグナル伝達分子が血小板依存的な増殖能亢進に寄与する可能性を阻害剤やノックダウン実験で検討し、この分子の上流に位置するレセプター分子の同定に努めている。