hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
認知症性疾患の神経変性メカニズムにおけるRNA・蛋白相互作用の関与

ショウジョウバエで発見されたToll蛋白は膜貫通型受容体であり、自然免疫として関与しているが、哺乳類においては、Toll-like receptors(TLRs)が自然免疫に関係する新しい蛋白質群を構成しており、中枢神経系においても発現が認められている。この中でTLR-3は2本鎖RNAとの結合によりシグナル伝達することが知られ、下流にはタウ蛋白をリン酸化するJNKやp38 MAPKなどのストレスキナーゼが存在し活性化される、TLR-3の発現レベルを検討したところ、AD脳においてTLR-3は有意に発現亢進していることが認められた。また、免疫組織化学的検討をおこなったところ、老人斑内にいくつかのTLR-3陽性細胞が認められた。アミロイド高発現トランスジェニックマウスTg2576において検討を行ったところ、Tg2576においてTLR-3は有意に発現亢進しており、老人斑内および老人斑の外にも数多くのTLR-3陽性細胞が認められた。さらに、SH-SY5Y細胞にmethylene blueなどこよる酸化ストレスを与えると細胞内のRNAは酸化し、8-OHGが生成されるが、この条件下にてタウ蛋白のリン酸化が確認された、酸化RNA複合体と細胞内のTLR-3との直接の関係は明確ではないが、JNKやp38MAPKなどのストレスキナーゼが活性化されていることから、何らかの関連性が示峻された。以上より、アミロイド産生過剰からオリゴマーレベルでの可落性アミロイドβの刺激によって、TLR-3の発現が活性化され、あるいは酸化ストレスが惹起され、それを通してADの炎症性変化に関与している可能性が示唆された。
臨床用MRIを用いたアルツハイマー病発症前診断を可能にする位相画像技術の開発

本研究結果は、アルツハイマー病の主な病理的原因の一つと考えられているアミロイドβの蓄積(アミロイド老人斑)を、医療保険を用いて撮像可能な診療用MRIで可視化を可能にし、さらに、アルツハイマー病発症前程度のアミロイド老人斑の存在も検出可能にする技術の研究と開発を行ったことである。本研究では、幅広く臨床で使用できる技術とするために、全ての臨床機で利用できる情報である位相画像情報を用い、その上簡易で再現性の高い技術となるように、位相情報の解析法を確立することができた。研究成果は、MRIの先駆的研究を掲載する英文雑誌に掲載され、国際・国内学会での招待講演を多く受けるなど、多方面に成果が上げられた。本研究では、アミロイド老人斑を脳に蓄積するAPP23マウス脳を用いた、検出実験と人のデータを大学病院にて撮像し、検出手法の改善と、臨床所見と画像所見との一致度を観察する検討を平行して行っている。マウス脳を用いた検討は、本年度でAPPマウスを9、11、13、16、30ヶ月齢を2例から3例ずつと、30ヶ月齢を除く各月齢のコントロールマウス脳を最低1例ずつ撮像することができた。撮像には、in-vivo, ex-vivoそれぞれで行い、臨床条件に近い、surfaceコイルとチャンピョン画像となるsolenoidコイルを用いた。得られた画像は、予定通り位相差強調画像化法によりコントラスとを再構成し、アミロイド斑内の鉄に注目して強調を行った。強調後の画像は、二値化後、6E10抗体による染色画像と比較検討を行い、位相差強調画像化法が正確にアミロイド斑を描出していることを、定量的に確認した。この結果を臨床に適用するために、二値化後のデータを観察範囲内の信号密度に変換し、信号密度としても、もちろん相関があることを確かめた。このような密度化の処置は、臨床画像条件が動物実験の条件に比べて、低空間分解能であることを考慮したためである。また、得られたデータから、定量化が高精度に可能であることも確認し、臨床応用が可能であることを示すことができた。臨床試験では、患者群と年齢と性別をコントロールした健常群に分け、臨床撮像時間を3分台として撮像を行い、頭頂葉、上側頭葉、後頭葉、前頭葉で、皮質内に信号があるかを、定量・定性的に検討を行った。例数は各10例程度であるが、統計的熊差を持って、位相差強調画像化法による画像コントラストは、健常群と患者群を区分することが可能であることを示した。前年度に引き続き、人とマウス脳を病院と動物用MRIを用いて研究を行った。マウス脳では、前年度に引き続いて同じ月齢のマウスを撮像し、例数を増やすことで、問題としていた統計的信頼度の確保を目指した。染色技術では鉄染色の偽陽性排除の研究を行い、検出能の向上に努めた。また老人斑の発生に伴って老人斑内部では炎症も起こりうると考え、長期の炎症に伴って発生する石灰化の検出が一つのキーワードになり得るのではないかと考え、石灰化の検出を染色によって可能にするために、カルシウム染色を行った。カルシウム染色の結果、大きな老人斑では沈着が認められ、我々の予想通りの結果となった。小さな老人斑も石灰化を含むと考えられるが、免疫染色と一致しているかは現在検討中である。位相画像との比較は、極めて複雑で、鉄による位相成分と、カルシウム(石灰化)による位相成分が入り交じっており、特に大きな石灰化を含むもの以外では、その存在を直接検出することは難しかった。しかしながら、すでに開発済みの2成分モデルを用いることによって、石灰化の存在を検出できるのではないかと考え、次年度への課題として検討を進めている。このように、マウスを用いた検討では、従来の鉄沈着をキーワードとした検出法以外でも、石灰化を介した(もしくは鉄と組み合わせた)検出法も早期発見に寄与するのではないかという結果を得た。ヒトへの応用は、多重エコー法を用いたPADRE画像作成と、これらの重み付けによる老人斑検出が可能ではないかと考えて、研究を進めた。平行して従来検討を進めている2D法による臨床画像取得も続けた。3D多重エコー法を用いることにより、2D法では区分が難しく臨床医から問題であると報告されていた(連続する)血管と老人斑との区分を連続性だけでなく、信号値の違いで表現することが可能になり、より臨床向けの画像を作成することを可能にした。マウス月齢は従来取得してきた月齢に加えて、20ヶ月、25ヶ月を加えることができた。また、各月齢での例数を増やすことができたため、統計的な確度が増した。さらに動物実験では、石灰化が老人斑検出に使用できる可能性を指摘できたため、全く新しい知見として有用であると考えられる。人への応用は、従来続けていた2Dによる撮像法での臨床検査を続けて、国際学会発表や受賞を経験した。例数も30例近くまで増えて、現在論文化の検討を行っている。また、従来臨床上問題になっていた、皮質内部の血管と老人斑との区分のために、新たに多重エコー法を用いた3D撮像法とその再構成法の工夫を行い、より検出能の高い画像を作成することに注力した。その結果、血管と老人斑との区分を容易にすることを可能にし、より精度の高い発症前診断可能な画像の作成につながったと考えられる。

当該年度が始まってすぐに、熊本地震が発生し、予定していた多施設による臨床研究を行うことができなかった。しかしながら、それまでに行ってきた2D-GRE法による初期臨床検討がかろうじて終了していたため、これを学会発表、論文発表を行った。論文は現在投稿ちゅであり、査読結果待ちである。さらに、年度途中9月から、予定していた海外施設(タイ・Siriraj病院)との共同研究を再開した。これは、AD・MCI患者のアミロイドPET, RIを撮像して、本研究で開発した技術を用いてmulti-echo 3D-GRE法で撮像し、取得した位相画像データをもとに再構成されたPADRE画像との相関を観察する研究である。現在のところ、40例ほどが収集されている。当初の予定では80から100例を予定していたため、半数に至ったところで年度末を迎えた。しかしながら、この例数の時点でmulti-echoで取得した場合の再構成パラメタは、予想されるTE依存性が再現されたことから、本研究で得られた知見は、ほぼ正しいことが証明された。最終年度で検討が終了できなかったため、1年の延長を行い、上記検討を進めている。また、オーストラリアとも研究を再開した。国内では、新たに緊急の多施設共同研究を行い、汎用性の高い3D-multi-echo法で得られた画像から、臨床スコアともっとも相関の高い再構成パラメタの検討を行うこととしている。すでに、6施設が参加することが決まっており、これらの施設からのデータを合わせて100例のデータを一年以内に収集し、臨床用の撮像パラメタを決定する予定としている。熊本地震のために、当初予定していた外部機関との臨床検討が行えなくなり、地震からの回復のために要した半年程度の遅れが生じている。しかしながら、一年間の延長申請を行い、次年度での論文投稿を含めた終了を見込んでいる状態であるため、やや遅れている状態と考えている最終年度では、本来予定されていた臨床データの収集・解析を中心にし、学会発表や論文発表にも力を注いだ。さらに、過年度に実現できなかった多施設共同研究を実行・実行準備を行い、よりデータ数が多く施設が行っても結果が出るような体制作りを行って、本研究課題が期間終了後も発展できるように努力した。過年度より共同研究を始めていた、タイのSiriraj病院との研究は症例数が80例を超え、データ解析に入ることとなった。データ解析には同時に取得されたPETデータと臨床評価を加え、どの部位の信号が最もこれらのデータとの相関があるかを検討した。この場合の信号とは、前年度に検討を始めた単純な位相信号のTE依存性の外に、本研究で開発された交点法によって得られた、加齢に伴う鉄沈着とアミロイドに含まれている鉄を区分する位相閾値のTE依存性の二つを指している。これらの結果、位相閾値が、もっとも臨床評価との相関があることが示唆され、特に、前頭葉と側頭葉、前頭葉と後頭葉の間の位相閾値の違いが臨床評価(スコア)との相関が強いことがわかり、今後、新たにはじめるであろう技術実装に向けた開発に具体的な手法がえられた結果となった。この最終年度では、さらに、国内の他施設で共同研究を始める準備を行った。まず4月にキックオフミーティングを開き、熊本大学がリーダーシップをとって倫理委員会を始め事務的手続きを行い研究を統括することが決められ、9月に倫理委員会の承認後、各施設で撮像技術の導入も含めた検討を始めた。現在の所、いち早くデータを取得することができた施設がすでに50例以上の臨床例と健常例を取得し、上記手法で臨床評価との相関の検討を始めている。
薬物治療最適化に向けたセルフマイクロモニタリング系の開発と在宅・薬局での実践

本研究では、我々が新たに提唱するセルフマイクロモニタリング系(「マイクロTDM」と命名)の開発を行った。「マイクロTDM」とは、薬局薬剤師が薬局や患者居宅等にて、簡便かつ低侵襲な自己採取法により得た微量検体を用い、薬効の指標値を測定・解析することにより、患者の薬物治療を評価・適正に管理することである。マイクロTDMの薬物治療の評価・適正管理への有用性が示された。一方、マイクロTDMの特徴である自己採取法を活用した指先生化学検査を、多数の薬剤師と共に、一般市民等に対して実施できた。一般市民等の健康状態の自己把握であり、セルフメディケーションの基盤となることが示された。本研究の目的は、薬局薬剤師が、患者、診療所などと連携し、在宅・保険薬局での薬物治療の最適化に向けた、簡便かつ低侵襲な自己採取法による微量体液検体を用いたセルフマイクロモニタリング(薬物濃度測定等を行い、薬物治療状態を評価する)系の開発とその有用性を評価することである。マイクロTDM(Therapeutic Drug Monitoring)と呼称した。マイクロTDMの有用性の確認と問題点の抽出のため、1.事前に薬局薬剤師の実習研修を開催しマイクロTDMの手法を徹底、2.診療所とその処方せん対応薬局で、10名のテオフィリン服用患者において指先穿刺による自己採取微量血液を用いてマイクロTDMを実践、3.薬局薬剤師・医師・患者へのアンケートを行った(広島大学疫学研究倫理審査委員会で承認済)。今後解決すべきいくつかの問題点が出されたが、薬物治療の適正管理へ向けたマイクロTDMの有用性が示唆された。また本成果は、「薬局薬学」に投稿し、受理された。薬局薬剤師は、患者からの「聞き取り」情報だけでは、薬物療法の効果判定と有害事象の発見に限界がある。従って、我々は客観的なデータを得るため、セルフマイクロモニタリング系(「マイクロTDM」と命名)の開発を行った。「マイクロTDM」とは、薬局薬剤師が薬局や患者居宅等にて、自己採取法により得た微量検体を用い、薬効の指標値を測定・解析することにより、患者の薬物治療を評価・適正に管理することである。薬物療法の適正管理へのマイクロTDMの有用性が示唆された、興味深い事例を学会発表することができた。また、マイクロTDMの自己採取後の処理をより簡便にするために、乾燥濾紙及び質量分析計を用いた、バルプロ酸、ガバペンチン血漿中濃度測定法を開発した。バルプロ酸、ガバペンチンは、抗てんかん薬であり、ハイリスク薬であるが、在宅患者に多い神経障害性疼痛の第一選択薬の一つである。一方、マイクロTDMの特徴である自己採取法を利用した指先生化学検査(総コレステロール、中性脂肪、尿酸、HbA1c、血糖)は、より多数の薬剤師と共に、一般市民等に対して実施できた。指先生化学検査は、セルフメディケーションの基盤となることが、アンケート結果により示唆された。昨年夏までに、指先生化学検査に参加した一般市民等の人数は、約3,200人と大規模となった。また、薬局薬剤師の一般市民等に対して、指先生化学検査を実施するニーズは、大変大きいことがわかった。本研究の目的は、患者、薬剤師、医療機関などとの連携を利用し、在宅・保険薬局での薬物動態の把握を通じ、薬物治療の最適化に向けた、簡便かつ低侵襲な自己採取法による微量体液検体を用いたセルフマイクロモニタリング系の開発とその有用性を評価することである。セルフマイクロモニタリングとは、低侵襲かつ簡便な自己採取(セルフ)で数μLの微量体液検体(マイクロ)を用いてモニタリング(薬物濃度測定を行い薬物治療状態を評価する)することであるが、マイクロTDM(Therapeutic Drug Monitoring;治療薬物モニタリング)と呼称した。研究実施計画の(1)対象患者および(2)対象薬剤の選択については、保険薬局、医院を選定し、慢性疾患でハイリスク薬服用患者をテオフィリン服用患者とし、広島大学疫学研究倫理審査委員会で審査中である。抗けいれん薬のフェノバルビタール、フェニトイン、カルバマゼピンについては、血漿20 μL程度で高速液体クロマトグラフィー(HPLC)法を利用した同時分析を実施可能にした。(3)生体試料については、様々な生体サンプルでの倫理審査を一度に行うのは困難なことから、現在の申請は血液での審査とした。(4)生体試料は、保険薬局からの車での運搬とし、(5)測定方法は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、エンザイムイムノアッセイ(EIA)が微量血液にても使用可能であることを確認した。当研究室で所有するガスクロマトグラフィー質量分析計(GC-MS)を用いて評価するためオランザピンの測定法を開発し、マイクロTDMに対しての有効性が確認できた。

(6)測定結果の解析方法についてはPEDAソフトにて、1点のテオフィリン血中濃度からの解析が可能であった。(7)情報の伝達はe-mailにて、必要書式の作成を行った。以上、マイクロTDMの枠組みは構築済みであり、審査が承認された後すみやかに実施したい。テオフィリン濃度の定量・解析では、患者の約半数は今後の定量・解析を希望したが、「針を自分で刺すのには抵抗がある」患者が10名中7名と多かった。また、薬剤師にとっても、提供を受けた血液の遠心による血漿採取等が負担となっているものと考えられた。このため、昨年度(今後の推進方策)にて述べた、微量血をろ紙にスポットする検体採取法(dried blood spot(DBS)法)では、ろ紙を乾燥した状態で搬送・保存し、スポットを溶媒抽出後測定するため、スポットおよび検体搬送が簡便である。加えて、全血以外に血漿や尿にも応用可能である。そこでマイクロTDMの改善を目的にDBS法のマイクロTDMへの応用を考えた。対象薬として、脳梗塞後の痙攣発作予防目的で使用されているバルプロ酸やカルバマゼピン等の抗てんかん薬は有効血中濃度範囲が狭く、患者間の個体差も大きいため、薬物治療を適正に管理するためにはTDMが有用である。しかし、バルプロ酸およびガバペンチンは、微量血漿中では免疫測定装置で定量測定できないため、DBS法の活用を試み、血漿での定量化を実施、学会発表した。マイクロTDMの枠組みは構築できたが、広島大学疫学研究倫理審査委員会での審査中であるため、保険薬局における実際の患者でのマイクロTDMの実施が遅れている。本研究の新規性のために、また審査書類の論述法に慣れていなかったため、審査書類の作成に関しての審査が遅れていると思われる。審査が承認された後、すみやかに実施すれば、遅れは挽回できると考えている。また、様々な生体サンプルでの倫理審査を一度に行うのは困難なことから、現在の申請は血液に絞り込んだ審査となるように変更した。これらのことから、今後の研究の推進方策に若干の変更を行う予定である。中規模病院での倫理委員会の許可は取得済みである。薬剤師を中心としたワルファリン(経口抗凝固薬)のPT-INR(プロトロンビン時間国際標準比;外因系凝固活性化機序を反映する検査であり、ワルファリンの効果を示す)の測定を実施した。指先穿刺により自己採取した微量血を用いてポイント・オブ・ケア・テスティン(POCT)製品を利用して行った。POCTとは被験者の傍らで医療従事者が行う検査である。従来は外部委託によりPT-INRを得ていたことから、速やかな治療開始や患者からの信頼性の向上などの効果が認められ、治療薬物モニタリングに対しての薬剤師の寄与による効果を高く評価できた。また、POCT機器の利用価値を実感することができた。昨年度マイクロTDMを実施したテオフィリン服用患者は、外来患者であった。本年度は、在宅患者でのマイクロTDMの有用性の確認と問題点の抽出を実施したいと考えている。また、昨年度バルプロ酸およびガバペンチンのDBS法を利用した血漿での定量化を実施可能とした。しかし、マイクロTDMを簡便に実施するためには、全血でのスポットでの定量化が必要と考えられる。従って、バルプロ酸およびガバペンチンの全血での定量化を実施する。
細胞・基質間相互作用による骨代謝の調節機構と老人性骨粗鬆症におけるその異常の解明

骨代謝にかかわる細胞の分化および機能の局所的調節機構と老人性骨粗鬆症などの病的状態おけるその異常の解明を目的として、骨局所における骨芽細胞と細胞外基質間の相互作用、骨髄細胞と癌細胞の相互作用、骨髄細胞と内皮細胞の相互作用の仕組みとその役割に焦点をあてて研究を進めた。特に、骨基質蛋白の受容体であるインテグリンを介して活性化される細胞内シグナルの骨芽細胞分化における重要性について、骨形成因子(BMP)シグナルとの関連に重点を置いて検討した。また、チロシンキナーゼ領域をもつ非インテグリン・コラーゲン受容体の役割についても合わせて検討した。さらに、骨転移などの特殊な病態における癌細胞や内皮細胞の破骨細胞形成に対する作用について細胞間相互作用という観点から研究を行った。1.基質コラーゲンへの接着による骨芽細胞の分化形質の発現機序:骨芽細胞の分化には、基質I型コラーゲンと細胞膜α2β1インテグリンとの結合によるFAK-ERK系の活性化およびBMP-Smadシグナルの活性化が重要であることを明らかにした。また、チロシンキナーゼ活性を持つコラーゲン受容体DDR2はFAKおよびPI3キナーゼと複合体を形成しそれらのリン酸化を促進することを明らかにし、その骨芽細胞における重要性が示唆された。2.細胞・基質間相互作用と骨芽細胞分化誘導因子との関連:FAKシグナル欠損状態ではSmadの核移行は阻害されないものの、Smad依存性の標的遺伝子の転写が抑制されることが明らかとなった。また、FAKの下流シグナルとしてRas-MEK1-ERKが直接にSmad依存性の転写に関与することが示された。これらの成績は、基質コラーゲン由来のシグナルが骨芽細胞の分化と機能獲得に必須であることの機序の解明につながるものである。1.基質コラーゲンへの接着による骨芽細胞の分化形質の発現機序の解明:(1)新規コラーゲン受容体である非インテグリン型チロシンキナーゼ受容体DDRの骨芽細胞分化における役割を明らかにするため、細胞内キナーゼ領域や細胞膜貫通領域をそれぞれ欠失したDDR発現ベクターを作成し骨芽細胞に導入したところ、骨芽細胞分化の抑制が認められた。これは、インテグリンのみならず多様なコラーゲン受容体が骨芽細胞の分化に重要な役割を果たすことを示す新たな知見である。(2)チロシンキナーゼ活性を持つDDRの下流の情報伝達系の解明に、各々の情報伝達分子の活性化や蛋白-蛋白結合を免疫学的に検討する手法を用いて解析したところ、コラーゲン刺激下でDDR2とFAKおよびPI3キナーゼが複合体を形成することが明らかとなった。これは、DDR2の機能を明らかにすることにつながる新たな知見である。2.細胞・基質間相互作用と骨芽細胞分化誘導因子との関連の解明:骨芽細胞の分化には、基質I型コラーゲンと細胞膜α2β1インテグリンとの結合によるFAK-MAPキナーゼ系の活性化およびBMP-Smadシグナルの活性化が重要である。これら2つのシグナル伝達系のクロストークを検討した結果、Smad1のリンカー領域がMAPキナーゼによりリン酸化されることにより、Smad1依存性転写活性が上昇すること、FAK-MAPキナーゼ系はSmad1の核内移行には大きな影響を及ぼさないことが明らかとなった。

1.基質コラーゲンへの接着による骨芽細胞の分化形質の発現機序の解明:チロシンキナーゼ活性を持つコラーゲン受容体DDRの下流の情報伝達系の解明に、各々の情報伝達分子の活性化や蛋白-蛋白結合を免疫学的に検討する手法を用いて解析したところ、コラーゲン刺激下でDDR2はFAKおよびPI3キナーゼと複合体を形成しそれらのリン酸化を促進することが明らかとなった。また、キナーゼ領域を欠失したDDR2遺伝子を導入することにより、コラーゲン刺激による内因性DDR2のチロシンリン酸化が促進されることから、DDR2細胞外領域はコラーゲンと結合することによりDDR2のクラスター形成を促すことが示唆された。これは、骨芽細胞におけるDDR2の機能を明らかにすることにつながる新たな知見である。2.細胞・基質間相互作用と骨芽細胞分化誘導因子との関連の解明:骨芽細胞の分化には、基質I型コラーゲンと細胞膜α2β1インテグリンとの結合によるFAK-ERK系の活性化およびBMP-Smadシグナルの活性化が重要である。これら2つのシグナル伝達系のクロストークを検討した結果、FAKシグナル欠損状態ではSmadの核移行は阻害されないものの、Smad依存性の標的遺伝子の転写が抑制されることが明らかとなった。また、FAKの下流シグナルとしてRas-MEK1-ERKが直接にSmad依存性の転写に関与することが示された。これらの成績は、基質コラーゲン由来のシグナルが骨芽細胞の分化と機能獲得に必須であることの機序の解明につながるものである。
ヒストン修飾パターンによる転写制御の解明

乳癌細胞株をTGF-βで処理すると、上皮間葉転換を誘導できる。EZH2のノックダウンでH3K27me3の修飾レベルを低下させ、修飾の有無による転写変化を調べた。その結果、転写には著しい変化をもたらさなかった。EZH2欠失B細胞を解析し、H3K27me3のレベルの低下によって、転写が活性化している遺伝子リストを得た。この時のエンハンサーの活性を調べるためにヒストンH3K4me1の変化を調べた。EZH2欠失によりH3K4me1が変化しているゲノム領域を確認することができたが、その領域がエンハンサーとしていずれの遺伝子を制御しているかについては、明確な結論を得ることができなかった。Bリンパ球をモデル細胞として用いた。B細胞は分化段階特異的にマーカーとなる分子の転写量が変化することが知られているからである。そして、B細胞由来のリンパ腫では、EZH2の変異が報告されていることからも、B細胞の増殖と分化にEZH2が制御するヒストン修飾とそれにともなう転写の変化が関与していることが期待されたからである。まず、成熟B細胞でEZH2をshRNAを用いて欠失させ、外因性抗原によって増殖と分化を誘導した。正常細胞とEZH2欠失細胞での転写状態とH3K27me3の修飾の変化を網羅的に探索した。具体的には、次世代シークエンサを用いてRNA sequenceおよびChIP sequenceを行った。分化段階に応じてBリンパ球は細胞の形態を大きく変え、単一細胞あたりのRNA量が大きく変化することが予想されたので、修飾量および発現量のサンプル間比較と解釈について、個別の遺伝子の変化やRNA量の精緻な定量を行い、細胞あたりのRNA量を算出し補正を行った。EZH2欠失細胞では、予想通りHistoneH3K27me3のレベルが低下しており、それにともなって100あまりの遺伝子の転写活性化が認められた。膵β細胞における外環境の変化にともなうinsulinの分泌などの反応を調べるために、MIN6細胞を用いて、転写とH3K27me3修飾の関係を調べた。MIN6細胞で、培地にglucoseを添加することによって、insulin、c-fos、srxn1などの転写が上昇することを確認した。EZH2の発現の抑制株や活性化型変異を過剰発現した細胞を作製し、glucoseに応答性を検討している。引き続きBリンパ球をモデル細胞として用いた研究を継続した。B細胞は分化段階特異的にマーカーとなる分子の転写量が変化することが知られているので、有用なモデルケースであるからである。またB細胞由来のリンパ腫では、EZH2の変異が報告されていることからも、B細胞の増殖と分化にEZH2が制御するヒストン修飾とそれにともなう転写の変化が関与していることが期待される。前年度に取得した正常細胞とEZH2欠失細胞での転写状態とH3K27me3の修飾の変化の網羅的に探索した結果を解析した。その結果、EZH2欠失細胞では、予想通りH3K27me3のレベルが低下していた。また、転写が活性化している遺伝子リストを得ることもできた。それによると、100あまりの遺伝子が転写活性化し、かつH3K27me3のレベル低下を認めた。しかし、EZH2依存的に転写とH3K27me3状態が制御されている遺伝子について、プロモーターの塩基配列、クロモゾーム上の位置、GO解析などを行ったが、その特徴を見出すことはできなかった。膵β細胞における外環境の変化にともなうinsulinの分泌などの反応とそれを制御している転写とエピゲノム変化に関する研究に着手した。MIN6細胞では、培地にglucoseを添加するとこれまでの報告通りinsulin、c-fos、srxn1などの転写が上昇することが確認された。これらの遺伝子は、基底レベルではH3K27me3が高いレベルで認められるが、glucoseによって転写が活性化するとH3K27me3の修飾が低下し、転写量とH3K27me3の負の相関関係が見出された。さらにEZH2の発現の抑制株を作成し、glucoseに対する応答性を検証したところ、insulin、c-fos、srxn1のglucoseに対する転写応答性は、EZH2の活性に依らず変化が見られた。モデル細胞として選んだBリンパ球とMIN6細胞の実験おおむね順調に進み、いくつかの決定的データを取得することに成功した。しかし、網羅的データの解析から、転写を制御する修飾を産み出す機構の解明については、未だそれを強く示唆するデータの取得に至っていない。MIN6細胞については、安定的な培養条件を確立することに時間を要した。その理由は明らかではないが、結果としてグルコース添加による転写環境の変化を調べることができ、網羅的なデータを取得することができた。この網羅的解析については、研究開始時からデータを取得するための技術的な問題の解決はしており、今年度は、それぞれのサンプルについて、網羅的に転写量とH3K27me3レベルの検討を行う予定である。また、glucose添加から転写とエピゲノム変化の時系列的変化についても調査を行う予定である。血球細胞および乳癌細胞をモデル細胞として用いて研究を継続した。乳癌細胞株をTGF-βで処理をすると、上皮細胞マーカーの発現が低下し、間葉系細胞のマーカーの発現が認められることが知られているので、これをモデル細胞として用いた。

この細胞で、H3K27me3の修飾酵素であるEZH2をノックダウンしてH3K27me3の修飾レベルを低下させて間葉系細胞のマーカーの発現の変化を調べることを試みた。EZH2のノックダウンにより細胞全体のH3K27me3が大幅に低下することを確認した。そこでTGF-βによる転写の変化を誘導し、EZH2による修飾の有無が転写変化に影響を与えるかを調べた。その結果、予想に反して、転写変化には著しい変化をもたらさなかった。次に、B細胞におけるEZH2の意義を調べる目的でEZH2欠失細胞の解析を行った。予想通りH3K27me3のレベルが低下していた。また、転写が活性化している遺伝子リストを得ることもできた。それによると、H3K27me3のレベル低下している遺伝子のうち100あまりの遺伝子の転写が活性化していた。この時、エンハンサーの活性を調べるためにヒストンH3K4me1を調べた。EZH2欠失によりH3K4me1が変化しているゲノム領域を確認することができたが、その領域がエンハンサーとしていずれの遺伝子を制御しているかについては、明確な結論を得ることができなかった。膵β細胞における外環境の変化にともなう反応とそれを制御している転写とエピゲノム変化に関する研究については、転写プロファイルを取得した。大きく転写が変化している遺伝子について解析を進め、エピゲノム変化との相関を検討した。乳癌細胞株をTGF-βで処理すると、上皮間葉転換を誘導できる。EZH2のノックダウンでH3K27me3の修飾レベルを低下させ、修飾の有無による転写変化を調べた。その結果、転写には著しい変化をもたらさなかった。EZH2欠失B細胞を解析し、H3K27me3のレベルの低下によって、転写が活性化している遺伝子リストを得た。この時のエンハンサーの活性を調べるためにヒストンH3K4me1の変化を調べた。モデル細胞として選んだBリンパ球とMIN6細胞のうち、Bリンパ球の実験おおむね順調に進み、いくつかの決定的データを取得することに成功している。一方で、MIN6細胞については、安定的な培養条件を確立することに時間を要し、グルコース添加による転写環境の変化を調べる段階へ到達することが当初の予定より3ヶ月ほど遅くなった。網羅的解析については、研究開始時から技術的な問題の解決は終了しているので、適切な再現性が十分に確認できる細胞培養条件が決定すれば、その条件で、サンプルの取得を目指すことにしている。Bリンパ球をモデル細胞として用いて多くの知見を得ることができた。次年度からは免疫グロブリン遺伝子の発現と遺伝子の核内配置についての研究を開始する。そのために3Cシークエンスの条件検討と、解析法の開発をまず行う。十分に再現性を持って解析が可能となれば、EZH2の活性型変異を発現する細胞を用いた解析を行い、EZH2の活性化とそれに伴うH3K27me3の変化が遺伝子の核内配置にどのような変化をもたらすのか解析を行う。同様に、glucose刺激によって発現が誘導される遺伝子について、核内配置の変化をMIN6細胞を用いて調べる。
神経軸索ガイダンスを制御する成長円錐形質膜の非対称性エンドサイトーシスの研究

神経細胞から伸びた軸索突起が標的に到達して神経回路が構築される。軸索先端部(成長円錐)は、細胞外のガイダンス因子を読み取り、正しい方向に旋回することができる。本研究課題では、反発性ガイダンス因子は細胞質カルシウムシグナルを介して成長円錐でのエンドサイトーシスを非対称化すること、このエンドサイト-シス非対称化は反発性旋回の必要十分条件であることが明らかになった。さらに、エンドサイト-シスとエキソサイトーシスのアンバランスが成長円錐の旋回を駆動することを証明した。軸索先端部(成長円錐)は、細胞外環境に存在するガイダンス因子を認識して標的へ到達し、正しい神経回路を構築する。本年度は、反発性軸索ガイダンス(成長円錐が反発性因子を避ける方向に旋回すること)の駆動機構の解明を目的とし、成長円錐での非対称的な形質膜の取り込み(クラスリン/ダイナミン依存性エンドサイトーシス)に関する研究を行った。ニワトリ胚由来の脊髄感覚神経細胞を培養し、赤色蛍光蛋白質付加クラスリンと緑色蛍光蛋白質付加ダイナミンを遺伝子導入し、エバネッセント照射野での蛍光蛋白質の挙動を観察することで、成長円錐でのクラスリン被覆ピット/小胞の動態を単一ピット/小胞レベルで可視化した。単位面積あたりのクラスリン被覆ピットの出現頻度をエンドサイトーシスの定量値とした。成長円錐の細胞外に反発性因子(セマフォリン3A)の濃度勾配を作製したところ、高濃度セマフォリン3Aに遭遇した片側でより多くのエンドサイトーシスが観察された。次に、クラスリン依存性エンドサイトーシス阻害剤であるmonodansylcadaverine(MDC)で処理した軸索が、反発性因子(セマフォリン3A、ミエリン関連糖タンパク質)に応答するか否かを検証した。いずれの反発性因子も、MDC存在下では軸索突起を反発することはできなかった。さらに、細胞質Ca^<2+>シグナルによる反発性旋回がエンドサイトーシスを必要とするか否かも検証した。エンドサイトーシスを阻害する各種変異タンパク質(epsin1_<R63L+H73L>、AP180_<C-terminus>、dynamin1_<K44A>)を過剰発現した成長円錐は、反発性Ca^<2+>シグナルに応答せずに直進した。以上の実験により、成長円錐での非対称的なクラスリン/ダイナミン依存性エンドサイトーシスが反発性軸索ガイダンスを媒介することが判明した。伸長過程にある軸索突起の先端部(成長円錐)は、細胞外環境に存在するガイダンス因子を認識して標的へ到達し、正しい神経回路を構築する。成長円錐での非対称的Ca^<2+>シグナルが形質膜の取り込み(クラスリン/ダイナミン依存性エンドサイトーシス)を促進し、その結果として反発性軸索ガイダンス(成長円錐が反発性因子を避ける方向に旋回すること)が駆動される仕組みを研究した。実験は、ニワトリ胚由来の脊髄感覚神経細胞の初代培養系を用いて行った。反発性Ca^<2+>シグナルはCa^<2+>依存性タンパク質脱リン酸化酵素カルシニューリンを介してクラスリン/ダイナミン依存性エンドサイトーシスを促進することを発見し、成長円錐の反発性旋回もカルシニューリン活性を必要とすることを証明した。しかし、誘引性Ca^<2+>シグナルはクラスリン/ダイナミン依存性エンドサイトーシスに影響を及ぼさず、カルシニューリン活性あるいはクラスリン/ダイナミン依存性エンドサイトーシスを阻害しても誘引性旋回は抑制されなかった。誘引性Ca^<2+>シグナルがクラスリン/ダイナミン依存性エンドサイトーシスを促進しないのは、誘引性Ca^<2+>シグナルに含まれるCa^<2+>誘発性Ca^<2+>放出(リアノジン受容体を介する小胞体からのCa^<2+>放出)がタンパク質リン酸化酵素cdk5を介してエンドサイトーシスを阻害することに起因した。さらに、成長円錐での非対称的な膜動態は旋回を誘発するための十分条件であることを証明し、エンドサイトーシスとエキソサイトーシスがそれぞれ反発と誘引を駆動するという基本原理を発見した。以上の成果を、米国の科学誌「Neuron(ニューロン)」に発表した。発生過程の軸索先端部(成長円錐)は、細胞外環境のガイダンス分子を認識して正しい方向へ旋回する。成長円錐での非対称的カルシウムシグナルが形質膜の供給(エキソサイトーシス)と取り込み(クラスリン/ダイナミン依存性エンドサイトーシス)のバランスを変化させ、その結果として成長円錐が旋回する仕組みを研究した。誘引性カルシウムシグナルがエンドサイトーシスを抑制する経路にCyclin-dependent kinase 5(Cdk5)およびカルシウム/カルモジュリン依存性キナーゼII(CaMKII)が介在することを明らかにし、これらキナーゼを阻害した成長円錐では誘引性カルシウムシグナルがエンドサイトーシスとエキソサイトーシスの両者を促進することを証明した。

エンドサイトーシスとエキソサイトーシスの両者が亢進した状態では成長円錐は直進したが、各種阻害剤によりエンドサイトーシスとエキソサイトーシスの一方を抑制すると、成長円錐はエンドサイトーシス抑制側あるいはエキソサイトーシス亢進側に向かって旋回した。以上、エンドサイトーシスとエキソサイトーシスのアンバランスが成長円錐の旋回を駆動することを明らかにし、そのシグナル伝達機構の一端を解明した。成長円錐でのエンドサイトーシスを制御するカルシニューリンおよびCyclin-dependent kinase 5(Cdk5)の基質を同定するために、これらフォスファターゼ/キナーゼの基質となり得るタンパク質phosphatidyl inositol(4)phosphate 5 kinase type Iγ(PIPKIγ)をクローニングし、リン酸化/脱リン酸化されるアミノ酸を置換した変異体を作製した。これら変異体を、ニワトリ胚脊髄後根神経節神経細胞に遺伝子導入して、成長円錐の旋回アッセイおよび膜動態の解析を行うための実験系を確立した。
低温プラズマ表面ナノ構造制御による高感度可視光応答性を示す新規複合化光触媒の創製

低温プラズマ表面ナノ構造制御により、以下に示すそれぞれ異なるメカニズムで可視光応答性を示す新規な複合化光触媒を創製した。(1)窒素プラズマ処理により、窒素ドーピング層を表面に持つ酸化チタン・遷移金属ドープ酸化チタンをそれぞれ調製し、バンドギャップの狭窄化を実現させた。(2)有機銅化合物のプラズマCVDによりCu含有層を複合化させた酸化チタンを調製し、可視光励起電子がCuを還元することで多電子還元機能の発現を実現させた。(3)窒素プラズマドーピング層を持つNbドープ酸化チタン(n型半導体)とCuBi_2O_4(p型半導体)の複合化微粒子はそれぞれの半導体の可視光励起により励起電子がn型半導体からp型半導体に移動するZ-スキームを実現させた。光酸化系半導体と光還元系半導体を複合化することにより、可視光による二段励起が可能となる高感度化光触媒を創製することを目的として、候補となる光酸化系半導体と光還元系半導体の開発研究を行い、以下の成果を得た。1.光酸化系半導体マグネトロン窒素プラズマ処理により、酸化チタン薄膜への窒素ドーピングによるTi-N結合が優勢的に形成されることを明らかにした。窒素ドーピングに伴って、酸素欠陥も形成されるが、空気中473Kで熱処理することにより、酸素欠陥を消失させTi-N結合を残存させることが可能であり、可視光応答性が向上することを明らかにした。バンドギャップ狭窄化した遷移金属ドープ酸化チタン薄膜の調製法は確立したので、プラズマ窒素ドーピング処理と組み合わせることにより、光酸化系半導体のバンド構造制御の可能性が明らかになった。2.光還元系半導体(1)タンタル窒化物半導体:ペンタエトキシタンタル/窒素混合ガスを用いて、酸化チタン微粒子表面上にタンタル窒化物層が形成できることを明らかにした。窒素雰囲気で熱処理することにより、プラズマCVD処理酸化チタン微粒子の可視光応答性が向上することを明らかにした。この可視光応答性向上の要因として、熱処理に伴って酸化チタンへの炭素ドーピングが起こることが考えられる。(2)Cu-Bi酸化物半導体:CuBi_2O_4よりも長波長の可視・赤外光吸収を示すCu_xBi_yO_zを見出し、またプラズマスパッタリングによりCu_xBi_yO_z薄膜を作製できることを明らかにした。以上の(1)及び(2)の成果により、光酸化系半導体表面に光還元系半導体層を形成させた複合化光触媒が調製できる可能性を明らかにした。光酸化系半導体と光還元系半導体を複合化することにより、可視光による二段励起が可能となる高感度光触媒を創製することを目的として、候補となる半導体のバンド構造制御の検討、及び光酸化系半導体/光還元系半導体複合化光触媒薄膜・微粒子の開発研究を行い、以下の成果を得た。1.半導体のバンド構造制御マグネトロン窒素プラズマ処理により、Nbドープ及びZrドープTiO_2微粒子薄膜への窒素ドーピングにより、それぞれ長波長光吸収が認められバンドギャップの狭窄化が起こることを明らかにした。フラットバンド電位は窒素プラズマ処理後も殆ど変化しないことから、窒素ドーピングにより価電子帯準位のネガティブシフトが起こると考えられる。2.複合化光触媒薄膜TiO_2微粒子薄膜表面にアセチルアセトナト銅によるプラズマCVD層を形成させることができた。空気雰囲気熱処理前後のプラズマCVD層にはCu含有が認められ、TiO_2への炭素ドーピングは起こらないことを明らかにした。プラズマCVD層形成TiO_2微粒子薄膜は熱処理することで、可視光吸収が顕著となり可視光応答性が増大することを明らかにした。プラズマCVD層形成後の吸収端は500nm付近にあることから、TiO_2の価電子帯からプラズマCVD層のCu(II)への界面電荷移動が起こると考えられる。またトリフェニルビスムチンによるプラズマCVDによりBi含有層が形成できたことより、Cu-Bi酸化物層を形成できる見通しを得た。3.複合化光触媒微粒子ペンタエトキシタンタル/窒素混合ガスによるプラズマCVD層をSiO_2微粒子表面に形成させ、373Kの窒素雰囲気熱処理により、可視光応答性が発現することを確認した。SiO_2の替わりに窒素ドープしたNbドープTiO_2微粒子を用いることにより、可視光による二段励起を起こす可能性が考えられる。光酸化系半導体と光還元系半導体を複合化することにより、可視光による二段励起が可能となる高感度光触媒を創製することを目的として、平成21年度に引き続いて光酸化系半導体/光還元系半導体複合化光触媒薄膜・微粒子の開発研究を行い、以下の成果を得た。1.複合化

光触媒薄膜WO_3微粒子薄膜表面にアセチルアセトナト銅によるプラズマCVD層を形成させた。プラズマCVD前後で可視光吸収端は殆ど変化しなかったが、光触媒作用の可視光応答性は増加したことより、可視光励起電子がCVD層中のCu(II)を直接還元し、多電子還元機能が発現することが明らかになった。これより、同様のプラズマCVD層を形成させたTiO_2微粒子薄膜において、多電子還元機能により可視光応答性が発現することが確証できた。2.複合化光触媒微粒子Nbドープ酸化チタン微粒子を窒素プラズマ処理することにより調製されたNb・窒素コドープ酸化チタン微粒子は可視光吸収を示すが、可視光応答性は殆ど示さなかった。しかしこれにCuBi_2O_4微粒子を複合化させると、可視光応答性が発現したことより、Nb・窒素コドープ酸化チタン微粒子の伝導帯の光励起電子がCuBi_2O_4微粒子の価電子帯に移動して正孔と結合し、コドープ酸化チタン側で酸化反応、CuBi_2O_4側で還元反応が起こることが明らかになった。このような可視光二段励起によるZ-スキームの発現は、WO_3微粒子とCu_xBi_yO_z微粒子の複合化においても確認した。したがってNb・窒素コドープ酸化チタン微粒子に、ペンタエトキシタンタル/窒素混合ガスによるプラズマCVD層を形成させ、373Kの窒素雰囲気熱処理により可視光二段励起による高感度光触媒を創製できることが明らかになった。
脊髄横断損傷モデルにおける免疫抑制剤による脊髄内神経伝導路の再生および機能回復

われわれはこれまでラット損傷後根神経の脊髄内再生に対して免疫抑制剤は形態学的な神経再生を促進することを報告してきた。免疫抑制剤は形態学的に末梢神経の中枢神経内への再生を促進したが、運動機能や脊髄内の後根神経以外の伝導路については検討しなかった。平成9-10年度にラット脊髄横断損傷モデルに免疫抑制剤をして脊髄下行路、上行路の形態学的再生を観察し、運動機能の回復を評価する研究を計画した。第一段階として、ラット脊髄横断損傷モデルを作成したが、横断損傷の部位は下肢の機能的評価を可能にするために第8胸椎レベルとし、ラットを3群に分けて損傷方法の比較検討した。第一群では第8胸椎の椎弓切除を行い、硬膜を含めて横断損傷を作成した。第二群では最小限の椎弓切除(第8胸椎下方5分の1)を行い、硬膜を含めて横断損傷を作成した。第三群では第8胸椎下方5分の1を椎弓切除ののち、硬膜、クモ膜、軟膜を切開して軟膜下で横断損傷を作成した。第一群では術後死亡率が第三群に比べ有意に高かった。また、第一・二群では下肢運動機能の回復は殆どみられなかったのに対し、第三群では下肢のweight supportはできなかったが上下肢が協調しての歩行様運動がみられた。第三群では硬膜を切断しないため断端どうしが密着しており、また椎弓切除が最小限のため胸椎のalignmentが正常に近く保たれることから、これらの要素が脊髄下行路の再生に促進的に作用するものと考えられた。次に免疫抑制剤をこのモデルに投与し、大脳皮質運動野下肢領域に蛍光色素Dilを注入して錐体路を標識したが、コントロール群も含めて現在まで錐体路は腰髄レベルで良好に標識されていない。また、免疫抑制剤投与群においてより活発な下肢の運動がみられたが、weight supportがみられないため、hip,knee,ankle各関節での運動を記録するのは困難で現在、評価方法を再検討中である。われわれの昨年度までの研究でラット損傷後根神経の脊髄内再生に対して免疫抑制剤は形態学的な神経再生を促進した。対照群の後根神経は脊髄内に殆ど再生しなかったのに対し、免疫抑制剤投与群の後根神経は旺盛に脊髄内に再生した。免疫抑制剤投与群では対照群に比べ、再生神経の直径は太く、矢状面方向に再生する傾向があった。このように免疫抑制剤は形態学的に末梢神経の中枢神経内への再生を促進したが、運動機能や脊髄内の後根神経以外の伝導路については検討していなかった。今回、ラット脊髄横断損傷モデルに免疫抑制剤をして脊髄下行路、上行路の形態学的再生を観察し、運動機能の回復を評価する研究を計画した。研究の第一段階として今年度はラット脊髄横断損傷モデルの作成を行った。横断損傷の部位は下肢の機能的評価を可能にするために第8胸椎レベルとし、ラットを3群に分けて損傷方法の比較検討した。

次に免疫抑制剤をこのモデルに投与し、大脳皮質運動野下肢領域に蛍光色素Dilを注入して錐体路を標識したが、コントロール群も含めて現在まで錐体路は腰髄レベルで良好に標識されていない。また、免疫抑制剤投与群においてより活発な下肢の運動がみられたが、weight supportがみられないため、hip,knee,ankle各関節での運動を記録するのは困難で現在、評価方法を再検討中である。
球の弾性表面波の周囲ガスへの漏洩に基づく高真空から加圧域まで使える真空計

球状弾性表面波(ボールSAW)素子におけるSAWの超長距離伝搬を用いて漏洩減衰の圧力依存性を測定し、加圧域から使える真空計の実現を図った。多重周回するSAWの散乱抑制に有用なAl製のすだれ状電極の素子を作製した結果、大気圧(100 kPa)の窒素ガス中で1 m伝搬した周回波をS/N=20で観察でき、振幅減衰曲線から減衰を精密に測定できた。ここから圧力に依存しない素子固有の減衰を差し引いて漏洩減衰の圧力依存性を測定した結果、300 kPaから0.03 kPaの範囲で線形性が見られた。以上の結果から、ボールSAW素子による漏洩減衰測定を用いた加圧域から使える真空計の基礎を確立することができた。ボールSAWセンサの多重周回伝搬を用いて、昨年度より広範囲における圧力測定を実現した。原理として、ランガサイト(langasite; LGS)製のボールSAWセンサ(周波数150 MHz,直径3.3 mm)を圧力可変の容器に設置し、多重周回波形を測定した。減衰αは振幅減衰曲線を指数関数にフィッティングすることにより計算し、αを0 kPaに外挿することにより漏洩減衰とは無関係な減衰α_Pを決定し、式α_L=αーα_Pにより漏洩減衰(leaky attenuation;LA)の係数α_Lを求めた。多重周回により波形の計測精度が高かったため、理論的に求めた減衰定数の値にも、信頼性があることがわかる。実験では、圧力100 kPaのN2において波形を測定した結果、1 m (97周)伝搬した周回波がS/N=20で測定された。次に、3種類の圧力で測定された減衰曲線の対数表示を行った。200 kPaに加圧しても測定が可能であり、大気圧以上における耐久性が示された。LAの測定値の真空圧依存性においては、0.01 kPaに至るまで線形性が見られた。さらに、LGSの密度5750 kg/m3とSAWの速度2380 m/sを用いて近似理論により計算した結果(破線)は、ほぼ実験結果を再現できた。ただしわずかな差異があるが、これはSAWの速度が伝搬経路に沿って連続的に変化することにより説明し得る。これらの結果から、ボールSAWセンサが大気圧を超えて利用可能な真空センサを実現できることを示すことができた。またこれによって、当初の研究目的である、高真空から加圧域まで使える真空計の可能性を示すことができた。以上の成果は、半導体製造プロセスなどにおける真空度のロバストな計測法として、応用物理学的にも有意義な成果であると考える。これまで半導体製造や金属加工に使用する真空装置において圧力数Paから数kPaまでで動作する真空計として、ピラニー真空計が最も普及している。しかし、数kPaを越えて大気圧100kPaに至る範囲では、ピラニー真空計は遷移領域から対流領域となり、応答が非線形で感度が低く使用できない。一方、圧電結晶基板に電極を形成し弾性表面波(surface acoustic wave; SAW)を送受信するSAW素子では、周囲ガスへのSAWの漏洩による減衰があるが、平板の素子では減衰による振幅変化が小さく真空計として利用できない。そこで本研究では、結晶球にSAWを周回させるボールSAW素子では伝搬距離が平板より100倍以上長いため、周囲ガス圧の変化で漏洩減衰が変化する際のSAWの振幅変化が拡大されることを利用して、数kPaから1気圧(100kPa)以上までの圧力領域で使える初めての真空計を創出する基礎を確立する。24年度は2年計画の研究の初年度として、基礎的な原理を検証するとともに、次年度に最終成果を達成する基盤を確立した。具体的には、水晶単結晶を球状に加工して作成した直径3.3mmのボールSAW素子を真空装置に設置して、真空排気による減圧空気の圧力をピラニー真空計および容量型真空計を用いて圧力を計測しつつ、その空気への弾性表面波の漏洩による減衰を計測した。その結果、等方性固体を仮定したSlobodonik,Jrによる漏洩減衰の近似式によって、計測結果を半定量的に再現できることを見出した。また、常圧より高圧側の3気圧まで使用可能な素子収納容器と配管の設計を行い、真空から高圧まで測定できる圧力計の評価を行う体制を整備できた。申請前の予備実験において、4Paにおける減衰定数を素子固有の減衰定数と仮定すると、漏洩減衰の近似理論により4Paと大気圧における減衰定数の変化の説明を試みた場合、一致の精度は低かった。これは近似理論が多くの仮定に基づくためと推定される。

24年度は、弾性表面波の周囲ガスへの漏洩に基づく大気圧から低真空まで使える真空計の基礎を確立するため、ボールSAW素子の漏洩減衰を数Paの真空から100kPaの大気圧までの広い圧力範囲で計測し、低真空から大気圧までの圧力と漏洩減衰の校正曲線を作成し、実用的な圧力計として使用できることを明らかにした。すなわち、まず水晶のボールSAW素子を薄膜作製用の真空装置内に設置し、小型ディジタル直交検波器により送受信するシステムを構築し、ピラニー真空計のほかに容量型真空計を用いて、ピラニー真空計が使用できない圧力範囲の圧力を計測し、同時に、SAWの多重周回波形を測定することで、数Paの真空から100kPaの大気圧までの広い圧力範囲におけるSAW減衰定数の変化を測定して、容量型真空計により計測した圧力値と比較し、漏洩減衰の理論計算結果を比較した。24年度は、SAWの多重周回波形を測定することで、数Paの真空から100kPaの大気圧までの広い圧力範囲におけるSAW減衰定数の変化を測定して、容量型真空計により計測した圧力値と比較し、漏洩減衰の理論計算結果を比較した。しかし、この近似理論が結晶の異方性によるSAWの音速変化を無視するなど、多くの仮定に基づくため、減衰定数の計算値を用いた真空計の絶対校正には限界が存在すると予想される。そこで25年度は、真空引き開始後に、特定の周回数のSAWの振幅応答と真空計の出力の動的時間変化を比較して校正曲線として用いる実験式を作成し、ボールSAW素子の真空計としての基礎を確立する。このため、対流領域と遷移領域を経て、分子の熱伝導と比例するクヌーセン領域に到達するまでの圧力を真空計により計測し、漏洩減衰値と圧力の関係を求めるために、4Paから100kPaの間でディジタル直交検波器を用いた振幅応答の測定を行う。次に、圧力計を導入して、大気圧より高圧側の3気圧程度までの圧力において、圧力とボールSAW素子の出力の振幅を比較する。これにより脆いシリコンやセラミック製の容量型真空計の使用できない領域で、ボールSAW素子により初めて真空領域と加圧領域を統一的に測定できる革新的真空計の概念を実証する。次年度の研究費は、真空バルブなどの真空部品、高圧側の圧力計の部品、ボールSAW素子の駆動のための直交検波回路部品等の購入、研究員の雇用、謝金、旅費等に使用する計画である。