hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
微生物の自然免疫制御物質の探索と活性発現機構の解明

自然免疫は、貪食細胞の活性化、抗菌ペプチドや炎症性サイトカインの産生により微生物を排除する生体防御機構である。自然免疫は炎症、免疫、感染、アポトーシスなどに関連することから、その制御物質は創薬に役立つと考えられている。我々は、微生物に含まれる自然免疫制御物質を探索した。その結果、2種の化合物を活性物質として単離した。それらの作用機構が明らかになり、新しいタイプの抗炎症薬、感染防御薬、敗血症治療薬が開発されることが期待される。自然免疫は全ての多細胞生物が有する普遍的な生体防御機構である。自然免疫は獲得免疫の成立にも必須であることから、免疫学研究の中心になっている。自然免疫を制御する化合物は敗血症や日和見感染症などの治療薬のリード化合物、または自然免疫機構を解明するためのバイオプローブになりうると考えられる。われわれはヒトと昆虫の自然免疫機構の類似性に着目し、これまでに遺伝子導入ショウジョウバエを用いた自然免疫制御物質を探索するための独自のスクリーニング系を開発した。本研究では、約10,000種の微生物抽出物に関してスクリーニングを実施した。その結果、10^<-8>Mの濃度で自然免疫抑制作用を示すアルカロイドをはじめとする数種の有望化合物を単離した。現在、本アルカロイドがヒトの細胞においてインターロイキン産生を制御するかどうかを検討している。また、構造変換によってより強力な作用をもつ化合物を合成している。さらに、自然免疫制御物質を探索している過程で、われわれは昆虫寄生菌の1種である黒姜病菌を大量に培養して得た培養液から強烈な細胞毒性を示す数種の関連化合物(MF関連化合物と仮称)を得た。MF化合物はジテルペノイドとピロンとが縮合した珍しい構造をもつ。これらの化学構造に関しては、物理化学的データと相互の化学変換等により決定した。また、MF化合物の各種誘導体を合成し、構造-活性相関に関する考察を加えた。自然免疫が獲得免疫の成立に深く関わっていることが示されている。現在では、自然免疫異常は、炎症、感染、アポトーシスなどの多岐にわたる疾患に関係することが明らかになっている。本研究では、昆虫機能を活用して、天然資源に含まれる自然免疫制御物質を探索した。(1)微生物由来の自然免疫制御物質の探索われわれが独自に開発した遺伝子組み換えショウジョウバエを用いたアッセイを用いて、約8, 000種の微生物抽出物の自然免疫制御作用をスクリーニングした。その結果、ベンゾイルピロール系化合物であるセラストラマイシンAと新規なジヒドロベンゾピロン誘導体を、それぞれ自然免疫抑制および活性化物質として見出した。さらに、セラストラマイシンAの構造として提示されていた2種の構造異性体を合成的に得ることにより、その構造を確定した。セラストラマイシンAは、10ng/mlでショウジョウバエの自然免疫を強く抑制した。さらに、セラストラマイシンAは、哺乳類細胞を使った実験では、炎症性肺疾患や急性、慢性リューマチ患者で亢進しているケモカインIL-8, MCP-1の産生を100ng/mlで抑制した。一方、ジヒドロベンゾピロン誘導体は、10μg/mlでショウジョウバエの自然免疫系を上昇させた。(2)昆虫寄生菌・黒姜病菌の細胞毒成分自然免疫制御物質を探索している過程で、昆虫寄生菌の1種である黒姜病菌を大量に培養して得た培養液から強烈な細胞毒性を示す新規なジテルペンーピロン系化合物メタリジンA, Bを単離した。両化合物の化学構造は、物理化学的データと相互の化学変換等により決定した。さらに、両化合物の各種誘導体を合成し、構造-活性相関に関する考察を加えた。
ナノ電気機械効果による半導体量子ドットにおける新たなブロッケード機構の理論研究

橋梁構造の力学的な不安定性と、その上に作製された単電子トランジスタとの相互作用による新たな電子輸送に関するブロッケード現象を理論により明らかにし、その現象を考慮した電気伝導特性を導いた。具体的には以下の通りである。:ソース・ドレインおよび量子ドットと基盤間に加えられたゲート電圧により、橋梁部分に静電力が働き基盤方向へたわむ。この構造の変化がゲートキャパシタンスの増加を生じさせ、電子の伝導特性を変化させる。ゲート電圧をさらに増加させると、静電力と均衡を保っていた弾性的な復元力が限界に達し、力学的な不安定性が生じる。この臨界電圧を超えると橋梁部分は突然に基盤へ落下する。両者の間に電荷の移動がなければ、両者は印加電圧が解放されるまで静電力により、くっついた状態が維持される。この臨界状態の近傍では、構造の柔軟性は著しく低下し、外力に対し過敏に応答する。トンネル伝導により量子ドット上の電子数が変化すると、それに応じて量子ドットに働く静電力は不連続に変化する。構造不安定臨界電圧近傍では、この微小な静電力の変化により、橋梁部分が大きく変位する。そのため、量子ドットの基盤からの平衡距離は余剰電子数に依存して不連続に減少し、量子ドットと基盤間の静電容量を増加させる。量子ドットの電子輸送特性は、量子ドットとソース電極、ドレイン電極およびゲート電極間との静電容量によって決定されるため、量子ドット・ゲート電極間の静電容量の変化は電子のトンネル条件を変えることとなる。すなわち、ソースまたはドレインと量子ドット間のトンネル透過の生じるソース・ドレイン電圧とゲート電圧に関する条件が、電子がソース電極から量子ドットに入ってくる場合と、その電子がドレイン電極へ出て行く場合とで異なることになる。オーソドックス理論から予備的な計算をすると、電子がトンネル効果でソースから量子ドットへトンネルした後、構造変形のためドット内の化学ポテンシャルが低下し、ドレインへのトンネル透過の条件が満足されなくなることがソース・ドレイン間の電位差が小さい場合に生じることが判った。また、先に量子ドットからドレインへ電子がトンネルした後に、構造変形のため量子ドット内の化学ポテンシャルが増加しトンネル透過に対して新たなバリアーとして働くことが判った。これらの解析から、トンネル透過の条件の変化はソース・ドレイン間の電位差が小さい場合、すなわちゼロバイアス近傍の電気伝導特性に著しい効果を及ぼすことが判った。ソース・ドレイン間の電位差が小さい場合、コンダクタンスはゼロとなり、構造の変形が新たなブロッケード現象を引き起こすと期待される。ナノ電気機械効果を利用し、新たな特性を持つ単電子トランジスタの開発に向け理論的な研究を行っている。これまでに行った研究は以下の通りである。マイクロスケールの長さを持つ厚さ10ナノメートル程度の、半導体物質を用いた両持ち梁構造を措定し、その中央部に量子ドットを形成した単電子トランジスタを考える。両持ち梁構造はソースとドレイン電極として働き、それらを支持している基盤はゲート電極として働く。ゲート電極と量子ドットおよびソース・ドレイン間に電圧を印加すると、引力が働き電気的な性質が変化する。

これまでの研究では、この電気的特性の変化の電子伝導への変化を明らかにした。その結果、印加電圧により両持ち梁構造が力学的に不安定になるに従い、構造が量子ドット上の電子数の変化に敏感に反応し変形する。この変形が電子のトンネル透過に対して新たなブロッケード機構として働くことを見いだした。この結果を論文として発表した。この解析では、両持ち梁のエネルギー散逸を大きいと仮定しているが、その仮定に関する評価を現在行っている。また、電子数の変化に対する両持ち梁の動力学的な応答についてもこれまでに調べてきており、現在論文を執筆中である。橋梁構造の力学的な不安定性と、その上に作製された単電子トランジスタとの相互作用による新たな電子輸送に関するブロッケード現象を理論により明らかにし、その現象を考慮した電気伝導特性を導いた。具体的には以下の通りである。:ソース・ドレインおよび量子ドットと基盤間に加えられたゲート電圧により、橋梁部分に静電力が働き基盤方向へたわむ。この構造の変化がゲートキャパシタンスの増加を生じさせ、電子の伝導特性を変化させる。ゲート電圧をさらに増加させると、静電力と均衡を保っていた弾性的な復元力が限界に達し、力学的な不安定性が生じる。この臨界電圧を超えると橋梁部分は突然に基盤へ落下する。両者の間に電荷の移動がなければ、両者は印加電圧が解放されるまで静電力により、くっついた状態が維持される。この臨界状態の近傍では、構造の柔軟性は著しく低下し、外力に対し過敏に応答する。トンネル伝導により量子ドット上の電子数が変化すると、それに応じて量子ドットに働く静電力は不連続に変化する。構造不安定臨界電圧近傍では、この微小な静電力の変化により、橋梁部分が大きく変位する。そのため、量子ドットの基盤からの平衡距離は余剰電子数に依存して不連続に減少し、量子ドットと基盤間の静電容量を増加させる。量子ドットの電子輸送特性は、量子ドットとソース電極、ドレイン電極およびゲート電極間との静電容量によって決定されるため、量子ドット・ゲート電極間の静電容量の変化は電子のトンネル条件を変えることとなる。すなわち、ソースまたはドレインと量子ドット間のトンネル透過の生じるソース・ドレイン電圧とゲート電圧に関する条件が、電子がソース電極から量子ドットに入ってくる場合と、その電子がドレイン電極へ出て行く場合とで異なることになる。オーソドックス理論から予備的な計算をすると、電子がトンネル効果でソースから量子ドットへトンネルした後、構造変形のためドット内の化学ポテンシャルが低下し、ドレインへのトンネル透過の条件が満足されなくなることがソース・ドレイン間の電位差が小さい場合に生じることが判った。また、先に量子ドットからドレインへ電子がトンネルした後に、構造変形のため量子ドット内の化学ポテンシャルが増加しトンネル透過に対して新たなバリアーとして働くことが判った。
肺癌における化学療法感受性とチロシンキナーゼ遺伝子変異

補助化学療法を施行された肺癌患者における化学療法感受性因子、ERCC1のC8092Aおよびcodon118C/T遺伝子多型を検討した。肺扁平上皮癌におけるNRF2遺伝子変異を検索し、コピー数の増加やMRP3(多薬剤耐性関連たんぱく)蛋白発現、臨床病理学的背景との相関を検討した。新たなチロシンキナーゼ遺伝子変異の探索を次世代シーケンスにより網羅的に行った結果、KIF5B/RET遺伝子転座を同定した。RET阻害剤が転座例に有効である可能性が示唆され、FISH法を用いたKIF5B/RET同定法を確立した。一方EGFRおよびKras遺伝子増幅と、肺癌そのものについての予後の検討をFISHおよびリアルタイムPCR法を用いた解析を行った。この結果、肺癌におけるEGFR遺伝子増幅が予後と相関しており、この結果は、第13回世界肺癌学会で発表し、Lung Cancer誌に掲載された。癌における遺伝子増幅(コピー数)の異常の検索について、Matthew Meyersonらとの共同実験をすすめ、網羅的に解析する中でMCL1とBCL2L1遺伝子増幅が高頻度に認められることを見いだし、2010年の2月にNature誌に共同発表を行った。これら遺伝子については肺癌に関する報告がほとんどなされていないため、今後さらに検討を加えていく予定である。肺癌に対するEGFRを分子標的としたゲフィチニブなどの抗癌剤感受性では、特に耐性に関わるものとしてKras遺伝子が注目されている。今回われわれは肺癌におけるKras遺伝子変異および遺伝子増幅について、リアルタイムPCR法および、FISHを用いた解析を行い、J Thorac Oncol誌に掲載された。チロシンキナーゼ遺伝子は癌で高率に遺伝子変異を起こすことから、癌における分子標的として注目されているが、われわれは肺癌におけるMEK1およびAKT2遺伝子変異について検討を行い、J Thorac Oncol誌に掲載された。肺癌のKrasやMEK1 AKT2遺伝子変異は主に腺癌でみつかる遺伝子変異であるが、今回肺の扁平上皮癌で多く見つかる遺伝子変異としてNRF2(NFE2L2)遺伝子の変異を検索し、遺伝子変異例では有意に予後が不良であることを報告してきた。肺癌における新たな分子標的を探索する目的で、Dana Farber Cancer Instituteとの共同研究により次世代シーケンスを用いて、肺癌、非喫煙者のKIF5B/RET遺伝子転座を同定してNature Medicine誌に報告した。この遺伝子転座は主に腺癌患者において数%存在することがわかり、いくつかのバリアントを同定した。国内の他2グループからも同様の報告がなされている。この遺伝子転座を導入した細胞株では、RETをターゲットとするバンデタニブ、スニチニブ,ソラフェニブなどの分子標的薬に対し高感受性を持つことがわかった。この遺伝子転座は将来の標的因子として有望であるため、今回われわれは肺癌におけるKIF5B/RET遺伝子転座およびRET遺伝子発現について、リアルタイムPCR法および、FISHを用いた解析を行い、特許を出願中である。FISHについては独自のBACクローンを組み合わせて用い、改良を行っている。また蛍光ではなく通常の顕微鏡でも観察可能なシステムへ移行できるかどうか模索を行っている。肺癌のEGFRやKIF5B/RET遺伝子変異は主に腺癌でみつかる遺伝子変異であるが、今回肺の扁平上皮癌で多く見つかる遺伝子増幅としてFGFR1遺伝子のコピー数を検索し、臨床病理学的因子との相関について、Mol Med Rep誌に報告した。しかしながら海外で報告されているDDR2遺伝子変異については同定できなかった。現在DDR2においてみつかったpolymorphismと遺伝子発現についての相関を検討している。
発達期低タンパク質栄養摂取による統合失調症関連行動異常誘発の分子基盤

本研究は、発達期の低タンパク質栄養が成熟期の脳機能変化を導く分子基盤の解明を目的とした。疫学研究からは発達期の栄養飢餓により成熟期に統合失調症等の精神疾患罹患リスクの増加が指摘されているが、関与する分子機序は明らかになっていない。本研究ではマウスをモデルに,妊娠期から授乳期の母体にタンパク質制限食を給餌することで生育させた次世代個体の成熟期における脳内分子機能変化について解析を行った。その結果、低タンパク質栄養状態に曝されることで、血液脳関門を構成する脳血管細胞の形質膜輸送体発現が変化し、前頭前野においては大規模な遺伝子発現変化を惹起し,それらの変化は顕著な性的二型性を呈す事を明らかにした。本研究は,発達期の低タンパク質栄養制限が成熟期おいて統合失調症に伴う感覚情報フィルタリング機能障害を導く分子基盤の解明を目的としている。研究代表者は妊娠期から授乳期まで雌性マウスに食餌タンパク質含量を通常の1/2に減らしたタンパク質制限食を与えることで,次世代のF1マウスにおいて感覚情報フィルタリング機能を評価する行動試験である驚愕反応のプレパルス抑制(PPI)が制限群雌性特異的に障害されていることを明らかにした。これらの予備成果を基に,以下の項目について研究を実施した。まずF1世代におけるBDNFを含むニューロトロフィンファミリーの遺伝子発現変化を解析した。その結果,対照群(通常食摂取)に対して制限群雌性F1個体脳においてBDNFを含む複数のニューロトロフィンファミリーの遺伝子発現変化を確認した。制限群雄性個体ではこれらの遺伝子発現変化は観察されなかったため,雌性特異的なPPI障害との強い関連性を推測している。続いてマイクロアレイ解析により,制限群F1雌性個体脳では対照群と比べ約4000遺伝子の有意な発現変化が起こっていることを見いだした。これらの遺伝子は多様なGOカテゴリーに属していた。また,申請時に得ていたF1世代雌雄個体での脳内アミノ酸不均衡は,いずれもPPI測定後にアミノ酸分析を行っていた。PPI測定は防音装置内に拘束された状態で行われるため、一種のストレス状態にある。その影響がアミノ酸不均衡として現れている可能性を検討するため、雌雄野生型マウス(C57BL/6J)でPPI測定を行い,非測定群と脳内遊離アミノ酸組成を比較した。その結果,制限群雌性F1個体脳特異的に変化しているアミノ酸については,いずれもPPI測定によって影響を受けないことが明らかとなった。さらに血中遊離アミノ酸とホルモン類を測定し,制限群雌性特異的に変化している分子群を確認した。研究代表者は妊娠期から授乳期まで雌性マウスにタンパク質制限食(通常の1/2量)を与えることで,次世代のF1マウスにおいて同機能を評価する行動試験であるプレパルス抑制(PPI)が雌性制限群特異的に障害されていることを明らかにした。その表現型に係る分子機序の解明を目指し,平成26年度マイクロアレイによる大脳皮質での網羅的遺伝子発現解析に着手,雌性制限群と対照群の間に約数千に及ぶ遺伝子の発現変化を見いだした。平成27年度では詳細にその発現変化について検討を行なった。さらに懸案だった血液能関門の解析も実験条件を最適化することによって実施できた。具体的に以下の項目について成果を得た。1)雌性制限群特異的PPI障害に関与する候補分子群の絞り込み:マイクロアレイによって同定された雌性制限群脳で発現変化遺伝子は,神経伝達機能,細胞内代謝,情報伝達,転写制御等の多様な遺伝子を含んでいた。比較発現解析から,雌性特異的に変化している情報伝達経路を同定することが出来た。この経路の構成分子は,ヒト統合失調症患者死後脳での発現変化が報告されている。さらに雌性制限群において細胞内代謝経路の減弱をタンパク質レベルで確認できた。2)血液脳関門アミノ酸輸送体発現解析:制限群及び対照群の雌雄個体脳から脳血管細胞を調製し,絶対定量プロテオミクス解析に供した。その結果,当初予想していたLAT等のアミノ酸輸送体は雌雄の制限群において発現量に有意な変化は認められなかった。しかし雌性制限群特異的に増加している輸送体2種を同定した。これらの輸送体には,甲状腺ホルモンを基質とするものが含まれていた。ヒト統合失調症患者ではで血中甲状腺ホルモン濃度変化例が報告されていることから関連が示唆された。平成27年度は,前年度に実施したマイクロアレイ解析結果について,統合失調症との関連が報告されている神経機能及び代謝制御関連遺伝子を中心にmRNA及びタンパク質発現についてより詳細に検討を行った。その結果,既に同定済みの神経栄養因子に加え,雌性特異的に変化している情報伝達経路を同定し,その中でも鍵となる分子の活性低下をタンパク質レベルで確認できた。この分子は,ヒト統合失調症患者死後脳での発現変化が報告されており,PPI障害との関連を推定している。一方で雌雄制限群共通に,対照群に比べて一群の最初期遺伝子の発現が低下していることも見いだし,神経機能全般の低下を呈すことを確認した。すなわち発達期低タンパク質栄養の影響は雌雄で異なった脳内分子発現・機能変化を生じさせ,その影響は当初の予想よりも広範囲に及び事が明らかになった。これらは予想外の発見であり,発達期タンパク質栄養の重要性を改めて示すことができた。

さらに血液脳関門アミノ酸輸送体発現解析からは,代謝調節作用を持つ甲状腺ホルモンを基質とする輸送体の発現変化を見いだした。ヒト統合失調症患者において同ホルモン量の変化例があることから,表現型との関係性を推定している。雌性制限群は血中及び脳内で遊離アミノ酸の不均衡状態を呈すが,その原因は当初予想していた血液脳関門でのアミノ酸輸送体発現変化では無く,末梢臓器及び脳内での代謝変化に起因することが推定された。一方で,昨年度見いだした制限群雌性ホルモン変化の原因として卵巣での分子及び形態変化を予想したが,雌性ホルモン産生関連酵素類の発現や卵巣内部形態に顕著な変化は認められなかった。そこで性周期を同定した上で雌性ホルモン測定を再度実施することとし,再度その調製を行った。これらの進捗状況より,検討すべき課題について一定の結果が得られ,予想以上の変化も発見したことから,概ね順調に進展したと判断した。昨年度までの解析結果を基盤に、以下の2項目について進展を得た。1)制限群特異的な遺伝子発現/タンパク質機能変化解析:成熟期大脳において制限群雌雄共通および雌性制限群特異的に変化している神経機能関連分子のグルーピングを行い、その上流機序について検討を行った。まず昨年度見いだした雌雄共通の神経活動関連遺伝子発現低下へ関与する分子の探索を行い、強い寄与が推定される転写因子Xの活性減弱をタンパク質レベルで見いだした。この転写因子は神経系の多様な情報伝達系によって活性が制御され、その活性化は神経活動の指標となることが知られている。さらに雌性制限群大脳において細胞内での糖代謝および各種神経伝達物質シグナルの中継点となるタンパク質リン酸化酵素Yの活性減弱をタンパク質レベルで確認できた。Y遺伝子がノックアウトされたマウスはプレパルス抑制障害を呈すことが報告されている。Yの下流には神経機能に関わる複数の基質タンパク質が知られているが、それらのリン酸化レベルも低下しており、雌性制限群では本経路の減弱が行動異常に関連すると推定された。2)甲状腺ホルモンシグナル解析:昨年度の脳血管細胞プロテオミクス解析から、雌性制限群特異的な甲状腺ホルモンを基質とする輸送体Zの発現変動を見いだした。ヒト統合失調症患者ではで血中甲状腺ホルモン濃度の変化が報告されていることから、雌性制限群脳内での同ホルモン作用の異常が予想された。甲状腺ホルモンは標的組織内で核内受容体を介して転写制御することで作用発現する。そこで同ホルモン標的分子について発現を検討し、雌性制限群大脳で複数の標的遺伝子発現異常を見いだした。雄性制限群では変化しておらず、雌性制限群大脳での甲状腺ホルモン作用異常が示唆された。以上の結果より、発達期タンパク質栄養不全により雌性大脳において統合失調症に関わる分子群の発現/機能変化が惹起されることが示された。本研究は、発達期の低タンパク質栄養が成熟期の脳機能変化を導く分子基盤の解明を目的とした。疫学研究からは発達期の栄養飢餓により成熟期に統合失調症等の精神疾患罹患リスクの増加が指摘されているが、関与する分子機序は明らかになっていない。
肝胆系移行における薬物間相互作用予測システムの開発

1.ヒト、ラット肝臓における薬物の経細胞輸送をモデル化した系として、薬物の取り込みおよび排泄に関与するヒトorganic anion transporting polypeptide 2 (OATP2)/multidrug resistance associated protein 2 (MRP2)、ならびにラットOatp4/Mrp2共発現系を生理的な極性を維持した状態で構築することに成功した。両トランスポーターの典型的な基質であるestradiol-17β-glucuronide、pravastatinなどは、basalからapical方向へのベクトル輸送がみられた。また、ラットin vivoにおける肝クリアランスと共発現系の経細胞輸送クリアランスとの間には、補正係数を乗じることで非常に良好な相関がとれることが明らかとなり、本実験系がin vivo肝排泄の予測に用いうる可能性が実証された。2.トランスポーターが関与する疑いのある臨床での有害事象の事例解析として、シクロスポリンA(CyA)とセリバスタチン(CER)の相互作用メカニズムを、OATP2発現系ならびにヒト凍結肝細胞などを用いて検証した。その結果、CyAはCERのOATP2を介した輸送を低親和性で阻害し、その阻害定数は、ヒト肝細胞で得られた値、また臨床での非結合型薬物濃度とほぼ同等であること、またCyAによるCERの代謝阻害の程度が比較的弱いことから、メカニズムの一つとしてOATP2を介した肝取り込み過程における相互作用を提唱することができた。また、カチオン性のビグアニド系抗糖尿病薬の肝、腎への輸送メカニズムを調べたところ、いずれもOCT(organic cation transporter)1,2により輸送され、またOct 1(-/-)マウスにおいて、肝臓への分布が低下したことから、肝へはOCT1が、腎へはOCT1,2が関与している可能性があり、肝へのOCT1を介した取り込みが、乳酸アシドーシスの副作用の一因となっていることを示唆した。ヒト肝における薬物輸送を簡便に評価する系として、薬物の血管からの取り込みおよび胆管への汲み出しのそれぞれに関与しているOATP2およびMRP2を、極性細胞として既に樹立されているMDCK細胞に導入した発現系を構築した。OATP2およびMRP2の局在を免疫染色法を用いて調べたところ、それぞれbasal, apicalに局在していることが確かめられたことから、今回構築した発現細胞は、肝における方向性のある薬物輸送を評価する系として用いることが可能であることが示唆された。実際に、両者の典型的な基質であるestradiol 17β-D-glucuronideおよびpravastat inの輸送を見たところ、vectorのみを導入したMDCK細胞やOATP2のみを導入した細胞に比べて、basalからapical1への有意に高い輸送が見られた。有機カチオン輸送担体であるOCT1およびOCT2の発現系を構築し、各種ビグアニド系抗糖尿病薬の肝および腎への輸送に対する関与について調べた。この結果、今回用いたビグアニド系抗糖尿病薬(metformin, buformin, phenformin)のすべてがOCT1, OCT2の両方に基質として認識されることから、これらの薬物の肝への輸送に対して、OCT1が、腎への輸送にはOCT1, 2が関与している可能性があることが示された。また、OCT1を介した肝への高い取り込みが、乳酸アシドーシスの副作用の一因になっている可能性があることも示唆された。昨年ヒトにおいて取り込み(OATP2)・

排泄(MRP2)両方の共発現系を作成し、胆汁排泄のin vitroモデルの構築に成功したが、本年は、in vivoの胆汁排泄能力との相関をみるために、ラットでの有機アニオン輸送に重要なトランスポーターであるOatp4/Mrp2の共発現系を構築した。本発現系でも同様に、多くの有機アニオンのbasalからapical方向へのベクトル輸送が観察された。また、各化合物の経細胞輸送クリアランスと、ラットin vivoにおける肝クリアランスとの間には、ある補正係数を乗じることで非常に良好な相関がとれることが明らかとなり、本実験系がin vivoでの胆汁排泄の予測につかえる可能性が実証された。2.シクロスポリンA-セリバスタチンのOATP2を介した肝取り込み過程における相互作用の検討シクロスポリン(CyA)とセリバスタチン(CER)の肝臓における相互作用のメカニズムを明らかにする目的で、まず、肝取り込み過程の柑互作用が起こりうるかを検討するため、ヒト凍結肝細胞ならびにOATP2遺伝子発現細胞を用いて輸送阻害実験を試みた。その結果、ヒト肝細胞、OATP2発現系の両方においてCyAはCERの輸送を低親和性(阻害定数Ki<1μM)で阻害し、そのKi値はほぼ同一であった。また臨床におけるCyAの蛋白非結合型濃度はki値付近と見積もられ、肝取り込み過程における相互作用が疑われる結果を得た。一方、CERはCYP2C8,3A4による代謝をうけるので代謝過程における相互作用も考えられたが、ヒト肝ミクロソームを用いた代謝阻害実験より30μMCyA共存下でもCERの代謝阻害は部分的であったことから定量的に代謝阻害では両薬物の相互作用を説明できないことを明らかにし、初めてトランスポーターを介した取り込み過程の相互作用を定量的に解析した研究となった。
エンドセリン-1による不整脈誘発作用の検討(虚血病巣の関与)

本研究では、エンドセリン-1(ET-1)が心筋虚血の病態に憎悪因子として関与し、心筋に対する直接作用から特に電気生理学的変化、不整脈を誘発する原因となることを実験的に検討した。実験(1)ET-1による心筋虚血憎悪作用の証明(2)ET-1による心筋虚血時の不整脈発生機序の検討(3)ET-1抗体による不整脈抑制作用の評価。(方法)雑種成犬10頭を静脈麻酔後両側開胸し左前下行枝バイパスを作成した。ET-1冠動脈内投与(150pmol/min持続投与)による心筋虚血と誘発された不整脈を冠動脈狭窄(20-40%冠血流減少)によるモデルと対比検討した。まず冠狭窄モデルの大動脈圧、冠淮流圧、冠血流量、心筋組織血流量(マイクロスフェア-法)を測定し、前後で高解像度心筋内マッピング法により不整脈の伝播様式および刺激伝播速度を検討した。さらに拍動心高速切断圧迫凍結装置により心断面NADH蛍光を撮影し、心筋虚血部位別の代謝産物(ATP,CP,NADH,NAD)を測定した。ET-1投与群でも同様に実験した。予定したET-1抗体は犬に使用できる量を入手できなかった。(結果・考案)冠狭窄群では有意な不整脈を生じなかった。ET-1投与群ではn=1は心室細動、n=2は電気的交互脈、n=2は上室性期外収縮を生じたが、心室頻拍あるいは心室性期外収縮を生じなかったため、心室を対象とする高解像度心筋内マッピング法は施行できなかった。すなわちET-1が催不整脈性のあることは有意であったが、その機序の検討はできなかった。ET-1により得られた虚血領域は冠狭窄より広範囲かつ心外膜側により強かった。測定した心筋組織血流および虚血代謝産物の違いでは説明できない点で、ET-1の血流減少によらない虚血憎悪作用の存在が示された。
放射光ナノビームＸ線分析による大気粉塵中の放射性物質の起源解明

2011年3月に発生した福島第一原子力発電所事故により,大量の放射性物質が環境中へと放出された。事故由来の放射性核種は事故後4年以上が経過した今日においても環境中から検出されている一方で,放出された放射性物質自体がどのような物理的・化学的性状を有していたかは不明な点が多い。本研究では事故直後につくば市の気象研究所で捕集された放射性Csを含む大気粉塵,通称「Csボール」に対して,大型放射光施設SPring-8のBL37XUにおいて縦横1マイクロメートル以下に集光したX線ビームを用い,蛍光X線分析(XRF)による化学組成分析,X線吸収端近傍構造分析(XANES),粉末X線回折分析(XRD)を1粒子レベルで行い,詳細な化学的性状を明らかとした。XRFの結果,CsボールはCs以外にもRb,Zr,Mo,Sn,Baといった様々な重元素を含み,これらは核燃料の核分裂生成物(FP)であると考えられる。さらに一部の試料からは核燃料由来と思われるUも検出された。粒子は燃料およびFP以外にもSi,Fe,Znといった原子炉母材に由来とすると考えられる元素も含有していた。さらにXRFによってCsボールから検出された元素のうち,FP由来と思われるMoおよびSn,母材由来と思われるFeとZnについて,K吸収端のXANESを測定したところ,いずれも高酸化数のガラス状態であることが明らかとなった。Csボールがガラス状態であるとする結果は,XRDでピークが検出されなかったことからも支持された。以上の分析より,事故当時炉内が燃料周辺だけではなく構成物を含めて高温熔融状態にあり,ベントや水素爆発によって大気中へと放出された際に急冷され,ガラス粒子を形成したという放出シナリオが予想された。またガラスは水に対して安定であることから,Csボール中の放射性物質や重元素は環境中に溶出しづらい一方で,長期的な影響を持つことが懸念される。26年度が最終年度であるため、記入しない。福島第一原子力発電所事故により放出された放射性物質の性状解明を目的として,事故直後につくばで捕集された放射性大気粉塵粒子の放射光マイクロビーム複合X線分析を行った。この粒子は電子顕微鏡を用いた先行研究により,Csを含む直径2マイクロメートル程度の球形粒子であることが明らかとなっている。この粒子に対して,1粒子レベルで蛍光X線分析(XRF)による化学組成分析,X線吸収端近傍構造分析(XANES)による化学状態分析,粉末X線回折分析(XRD)による結晶構造分析を行い,詳細な化学的性状を調べた。マイクロマニュピレータを用いて,大気粉塵フィルターから3点の放射性大気粉塵粒子を採取した。XRFの結果,粒子からは微量のUが検出された。さらにCs以外にも様々な重元素が含まれることが明らかとなり,その大部分は核燃料であるUの核分裂生成物に起源づけられた。この結果から,核分裂生成物の中でも沸点の低いCsやIのみが高温で揮発して大気中に放出されたという従来説を覆し,核燃料であるUとその核分裂生成物が炉の内部またはごく近傍から直接的に微小粒子として大気中へと放出されたという結論が導かれた。粒子に含まれる遷移元素についてXANESによる化学状態分析を行ったところ,いずれも高酸化数の状態で存在していることが明らかとなった。この結果は,この粒子が酸化的な雰囲気で生成したことを示している。さらにXANESのスペクトル形状を参照物質と比較した結果,粒子中の元素がガラス状態で存在していることが分かった。さらに粒子そのものの結晶性を調べるためにXRDを行ったところ,回折ピークは検出されず,非晶質であることが示された。本研究により,核燃料のUとその核分裂生成物を含む放射性粒子が事故により大気中に放出され,福島原発から170キロメートル離れた関東のつくばにまで到来していたという事実が明らかとなった。

Csボールがガラス状態であるとする結果は,XRDでピークが検出されなかったことからも支持された。以上の分析より,事故当時炉内が燃料周辺だけではなく構成物を含めて高温熔融状態にあり,ベントや水素爆発によって大気中へと放出された際に急冷され,ガラス粒子を形成したという放出シナリオが予想された。またガラスは水に対して安定であることから,Csボール中の放射性物質や重元素は環境中に溶出しづらい一方で,長期的な影響を持つことが懸念される。26年度が最終年度であるため、記入しない。当初の予定では,放射性大気粉塵が捕集されたフィルターをそのまま放射光施設で分析する予定であった。この場合,フィルター上に捕集された無数の大気粉塵粒子の中から目的の放射性粒子を見つけ出すことが最大のネックであり,分析上の課題であった。しかしマイクロマニュピレータを用いることで,フィルターから放射性大気粉塵粒子のみを摘出し,1粒子単位で分析することが可能となった。これによって分析上の課題の大部分がクリアされたと言える。実際に摘出された放射性粒子に対して3種類の分析法(XRF,XANES,XRD)を適用した結果,その化学的性状に関する非常に多くの情報が得られたことから,本研究で着目した放射光マイクロビームX線分析の有用性が実証されたと言える。特に粒子中に微量ながらUが存在することが解明できた点は特筆すべき成果の一つであり,XRFによるUの検出だけに留まらず,UのXANES分析からも粒子中のUの存在を示すことができた。また本研究のXANESおよびXRDから明らかとなったこの粒子がガラス状態であるとする知見も,Cs以外の核分裂生成物が粒子中に含まれていたというXRFの分析結果と合わせて,粒子の生成・放出過程を理解する上できわめて重要な情報である。このように,放出された放射性大気粉塵自体の性状解明に留まらず,事故当初の炉内の状況や事故原因の解明にも繋がる有益な知見が数多く得られた。さらに本研究で得られた知見は,放出された放射性物質の環境中での動態のシミュレーションにおいても重要な1次情報になるものと期待される。当該年度の研究によって,直径数マイクロメートルの微小粒子に対する放射光マイクロビーム複合X線分析の有用性が明らかとなり,試料調製法も含めて,基本的な分析技術は確立されたと言える。今後の方針として,確立されたこの分析法を問題の放射性大気粉塵へと適用し続けるだけでなく,他の様々な試料へと応用する。得られたデータから,福島第一原発事故により放出された放射性物質の実態と影響をより正しく評価する。第一に,より福島第一原発に近い地域に飛散した放射性大気粉塵を分析する。当該年度で分析対象とした大気粉塵粒子は原発から100キロメートル以上離れたつくばで捕集されたものであるが,より原発に近い地域には,本研究で分析した粒子とは異なる性状を持った放射性大気粉塵粒子が飛散していた可能性が考えられる。そこで実際に福島県内の規制区域に立ち入り,放出されてから今日まで環境中に残存し続けている放射性物質を採取する。当該年度に分析した粒子と化学的性状を比較することで,放出された放射性物質とその放出過程に関して,より正確な理解を目指す。第二に,飛散した放射性大気粉塵が付着した植物,特に農作物を分析する。原発近郊に生育した植物には,イメージングプレートを用いたオートラジオグラフィによって,粒子状の放射性物質が付着していることが明らかとなっている。
レナリドミドの体内動態に及ぼすABCB1遺伝子多型の影響

【研究目的】難治性疾患の多発性骨髄腫に対する新規治療薬であるレナリドミドは、非常に優れた効果を発揮するが、その体内動態は未解明な部分が多い。レナリドミドはin vitroにおいてP糖蛋白(P-gp)の基質であることが報告されている。P-gpには遺伝子多型が存在し、中でもABCB1 C3435T変異により薬物等の排泄は50%程度低下するとの報告がある。本研究ではレナリドミドの血中濃度動態と遺伝子多型(ABCB1 C3435T)の相関を検討することを目的とした。【研究方法】本研究は、秋田大学医学部倫理委員会の承認を既に得ている。レナリドミドを服用中の再発・難治性多発性骨髄腫患者21名を対象とし、レナリドミド服用0,1,2,4,8,12時間後に採血を行い、血液サンプルを収集した。得られた検体について、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)定量方法を用いて血中濃度を測定した。また患者検体よりDNAを抽出し、PCR-RFLP法を用いてP-gpの遺伝子多型(ABCB1 C3435T)について解析した。【研究成果】最高血中濃度到達時間は服用後14時間におよび、最高血中濃度は34.6316.9ng/mlと非常に大きなバラツキをもって観察された。また血中濃度一時間曲線下面積(AUC)も患者間で大きな変動が認められた(191.81334.3ng・h/ml)。P-gpの遺伝子多型(ABCB1 C3435T)については14例の解析が終了し、C/Cが6例、C/Tが7例、T/Tが1例であった。これよりレナリドミドの投与量で補正したAUCとABCB1 C3435Tに関し検討した結果、C/C群とTアレル保持群の2群間に有意な差は認められなかった(34.9±20.0vs55.2±34.6ng・h/ml/mg,P>0.05)。今後更に例数を増やし検討を進めていく予定である。
センダイウイルスベクターを利用した歯髄細胞からの人工多能性幹細胞誘導方法の検討

現在、染色体に組み込まれないベクター系として、京都大学のエピゾーマルプラスミドを用いたものと、産総研およびDNAVEC社のセンダイウイルスベクターを用いた2種類が存在している。われわれは、京都大学と共同で、ヒト歯髄細胞よりエピゾーマルプラスミドベクター法によってiPS細胞を樹立した。本研究では、その成果をふまえて、センダイウイルスベクターを用いた樹立を試み、ヒト白血球抗原(HLA)ハプロタイプホモiPS細胞の樹立に成功した。本年度は、前年度までにセンダイウイルスベクターによって樹立したiPS細胞の染色体検査をおこない、異常が生じていない事を確かめた。また、無血清培地で培養した歯髄細胞からも、センダイウイルスベクターを用いてiPS細胞誘導をおこない複数のiPS細胞ラインを得た。その効率は、血清入りの培地をもちいて樹立した場合と比べて、ほぼ同程度であった。樹立されたiPS細胞について、未分化マーカーの発現解析と、テラトーマ形成による多分化能を確かめた。これらの結果をふまえて、JSTの山中iPS細胞特別プロジェクトの中で提案した、人白血球抗原(Human Leucocyte Antigen, HLA)ハプロタイプホモiPS細胞を樹立する手段として、DNAVEC社のセンダイウイルスベクターを使用することができると結論し、日本人における出現率5位のHLAハプロタイプホモ細胞(DP263)から、iPS細胞を樹立した。さらに、日本人での出現度2位のHLAハプロタイプをホモで持つiPS細胞をを得るために、HLAローカスの2ローカスがホモで、Aローカスのみがヘテロの歯髄細胞を選び、Zinc FInger Nuclease (ZFN)による特異的変異導入を試みた。現在までに、ZFN1種類の設計が終了し、来年度は2種類目の設計をおこなう。これらのZFNを発現させた歯髄細胞から直接iPS細胞を誘導するために、センダイウイルスベクターを使用する。ベクター導入後の、スクリーニングにはHLA特異的な抗体による染色と、セルソーターを利用するが、本年度はスクリーニング用の抗体の検討と、ラベリングをおこなった。現在のところ、ゲノムに遺伝子挿入が無い「安全な」iPS細胞誘導方法として、いくつかの方法が報告されている。国内で実用化されているのは、京都大学iPS細胞研究所のエピゾーマルベクターシステムと、ディナベックと産業総合技術研究所が開発されたセンダイウイルスベクターシステムである。われわれが、岐阜大学で樹立した3種類のヒト白血球抗原(HLA)ハプロタイプホモ歯髄細胞のうち、2種類を京都大学のエピゾーマルベクターシステムで、3種類をセンダイウイルスベクターシステムを用いてiPS細胞化した。そのすべてについて、未分化マーカー発現とテラトーマ形成能を評価して、多能性を持つiPS細胞であることが確認できた。特に、日本人に最も頻度が高いHLA型をホモに持つDP74を、エピゾーマルベクターシステムによってiPS細胞化した454E2については、理化学研究所バイオリソースセンターに寄託済みであり、他の研究者へ配布も始まっている。この細胞については、われわれの手で自動培養装置を用いた大量培養実験をおこない、CGH解析と、癌関連遺伝子領域のディープシークエンシング解析によって、有害な変異が起きていないことを確認した。また、一時的な低酸素環境がiPS細胞誘導効率を上げることを論文発表し、現在センダイウイルスベクターを用いた誘導にも使えるかどうかを検証している。さらに、若年者と成人から得られた歯髄細胞間で、iPS細胞誘導効率が異なることを発見し、その原因のひとつと考えられるDLX4遺伝子について、特許申請をおこなった。本件について、MBL社に技術供与をおこない、DLX4遺伝子をセンダイウイルスベクターに組み込んだキット開発が進んでいる。本年度は、HLAハプロタイプホモの歯髄細胞2ライン(DP74, DP94)から、DNAVEC社および産業総合研究所(産総研)のセンダイウイルスベクターを用いて、iPS細胞誘導をおこなった。センダイウイルスタンパク質に対する抗体を用いて、感染効率を比較したところ、山中4因子が別々のベクターに挿入されたDNAVEC社のベクターの方が、4因子を一つのベクターにまとめた産総研ベクターよりも、感染効率は高い傾向が見られた(ほぼ100%)。実際のiPS細胞様コロニーの誘導効率は、0.2%前後であり、どちらのベクターも同様の効率を示した。レトロウイルスベクターと比較しても、ほぼ同等の効率であった。iPS細胞様クローンからのベクター除去に関しては、多能性幹細胞で発現するmiRNAの標的配列を有する産総研ベクターが優れていたが、DNAVEC社ベクターも、温度感受性を利用した除去をおこなわずとも、多くのクローンで自然除去が起きていたことから、実用上は問題ないと思われる。樹立されたiPS細胞ラインについては、未分化マーカーの発現と免疫不全マウスでの奇形腫の形成により、多能性を確認できた。因子数の削減については、DNAVEC社の房木先生が既に改良ベクターによる検討をおこなっているとの情報が得られたため、本年度の主要な検討事項からはずした。

無血清培地についての検討もおこない、Lonza社の間葉系幹細胞用培地「MSCGM-CD」のみが、ヒト歯髄細胞の増殖をサポートできる事が分かった。しかし、この培地を用いた増殖しない細胞も多く、更なる改良を加えながら、引き続き血清入りの培地でも細胞を単離する必要があるだろう。当初、センダイウイルスベクターの評価を目標としていたが、歯髄細胞を用いた場合には、レトロウイルスベクター、プラスミドベクター、産総研センダイウイルスベクター、DNAVEC社センダイウイルスベクターのすべてで、0.2%前後という高い効率で、iPS細胞誘導ができた。そのため、われわれは供給が安定しているDNAVEC社のベクターをスタンダードとして用いている。研究歴1年未満の大学院生を含めて、複数の実験者によって、多少の効率のばらつきはあっても、iPS細胞誘導ができる事が確認された。さらに、無血清培地で樹立した歯髄細胞からもiPS細胞誘導を試み、血清入り培地で樹立した細胞とほぼ同じ効率でiPS細胞を樹立できた。この事は、センダイウイルスベクターの感染効率が血清の有無に左右されない事を示しており、今後のiPS細胞樹立方法として有効である事を示している。このように、歯髄細胞とセンダイウイルスベクターの組み合わせの有用性が確認できたことより、われわれが山中教授と共同で進めてきた、HLAハプロタイプホモiPS細胞の樹立にも、センダイウイルスベクターを積極的に利用しようと考えている。当初、2種類のみ見つかっていたHLAハプロタイプホモ歯髄細胞からは、すでにiPS細胞が樹立されているが、本年度3番目のHLAハプロタイプホモ歯髄細胞からもiPS細胞が樹立できた。また、まだ見つかっていないHLAハプロタイプについても、人工的に変異を導入して擬似的にHLAハプロタイプホモiPS細胞を樹立方法を試みており、進展状況としては予定した以上の成果を上げている。これらの成果については来年度中に論文にまとめる予定である。HLAハプロタイプホモ歯髄細胞2ラインから、センダイウイルスベクターを用いてiPS細胞ラインを樹立できた。DNAVEC、産総研の2種類のベクターは、iPS細胞誘導効率に関してはレトロウイルスベクターに匹敵し、充分な性能を発揮する事が確かめられた。因子数減少に関しては、今回検討からはずしたが、山中教授と五島先生により、新たにGlis1という因子が発見される等、リプログラミング因子については世界の研究動向を見ながら進めて行くべきであると考えている。また、臨床研究に向けた無血清培地の検討も進め、Lonza社との共同研究も視野に入れた研究が、順調に進んでいる。(1)無血清培地で培養した歯髄細胞から誘導したiPS細胞の解析を終わらせ、論文にまとめる。(2)設計済みのZFNを用いて、HLAローカスの特異的な変異導入を試みる。しかし、予備実験によりZFNの活性が充分ではない可能性があり、特異性を下げたZFNの再設計を予定している。その予算として、本年度の予算を一部繰り越してある。
持続可能な地域実現へむけた保育所での里山保全・資源循環事業の連携効果と行政の役割

本研究は、近畿圏の都市近郊地域を対象に、これまで個別に実施されていた里山保全事業と資源循環事業の連携運用による相乗的効果の把握と行政の役割について検討すると共に、持続可能な地域づくりの実現における幼児教育の場での既存事業の連携運用の有効性を考察しようとするものである。今年度は、堺市ならびに堺市内の保育園の協力により、堺市が推進している資源循環事業(いきごみさん)の出前講座の園児の体験、保育士による給食残滓のたい肥化を実施してもらい、その様子を参与観察した。また秋の遠足の里山活動において、4歳児クラス52名、5歳児クラス57名の計109名の園児に、里山生物資源(落葉落枝等)の収集してもらい、園児自らの関心に基づき回収されうる量や種類を把握した。当該園では給食に係る生ごみが、一人当たり平均で約50g排出されていたこと、市の事業で推奨する方法によるたい肥化によって園が無理なく削減できる生ごみ量は約2900g/月であることが示唆されている。また、里山生物資源の収集量については平均で一人あたり約60gであること、また4歳児クラスの平均収集量は5歳児クラスを大きく上回ることが示された。さらに、4歳児クラス・5歳児クラスともに10g未満から100g以上と収集量の幅が広く、種類も多岐にわたっていたことから、4歳児・5歳児クラスでは年齢差による収集量には大きな違いは生じず、それぞれの興味や関心などによる個人差が大きいと推察された。そのほか、次年度以降に予定している園周辺農地のたい肥受け入れ可能性の検討にむけ、現地の土地利用調査の実施とGISデータ構築も実施した。市の出前事業イベント等の日程は前年度中に概ね決定してしまうことが多く、さらに今年度は台風の影響もあり、里山生物資源の収集が当初検討していたよりも遅く、気温の低い時期に実施することとなってしまった。そのため、成分分析については今年度中に実施するのではなく、分解が十分にすすむことが期待される次年度の春までやむなく延期することとなった。そのほかの園児の保護者へのアンケート実施に向けた園との調整などは順調に進んでおり、GISデータの構築については、当初の計画以上に進展している。今後は、今年度園児が収集した里山生物資源を活用したたい肥化を実施し、その成分分析を実施する。また、園でのイベントや保護者への情報提供の前後で、園児の保護者へとアンケートを実施し、望ましい地域の将来像、たい肥化や里山活動への参加意思の変化など、保護者への波及効果についても調査を行う。次年度使用額のすべては、当初本年度中に予定していたが延期になったたい肥の成分分析費用である。今年度は台風等の影響もあり里山生物資源収集の時期が遅れ、たい肥化がうまくすすまない冬季にかかってしまった。そのため、里山資源を活用したたい肥生成は春季に延期することとなった。春季に生成されるたい肥の成分分析費用として6月に使用する予定である。
膜酸性リン脂質の大腸菌細胞増殖における役割の分子遺伝学的解析

2つの研究計画を併行して実施し、以下のような成果が得られた。i)lpp欠損変異株では酸性リン脂質が全く欠損した状態でも増殖しうることを発見した。lpp遺伝子の発現誘導系を構築し、LPPの誘導合成により細胞が死につつあるときに、LPPが細胞の膜のどこにあり、どのような状態にあるかを検討した。既報の結果からの推定とは異なり、酸性リン脂質の完全欠損においてもLPPはプロセスされ外膜画分に移動していることが示され、LPPの存在状態そのものは酸性リン脂質欠損の致死性と無関係である可能性が示唆された。ii)酸性リン脂質の欠損による高温感受性を抑圧するサプレッサー変異株を解析する計画において、得られた変異株48株の約半数がrcsCとrcsFの挿入破壊によることを明らかにした。更にrcsB変異の導入によりこの変異が同様に高温感受性を抑圧することを示した。これらの事実からrcs制御系の支配化にあることが知られるcps(capsular polysaccharide synthesis)の転写レベルを測定したところ、酸性リン脂質の欠損によりcpsB転写物の顕著な昂進と、サプレッサー変異株における、昂進した転写の野生型株レベルへの復帰が見出された。しかしながら、cpsB遺伝子の破壊そのものによっては、高温感受性はサプレスできなかった。これらの事実は、rcs制御系の支配化にあるcps以外の何か別の遺伝子の発現の昂進が高温感受性をもたらすこと、また酸性リン脂質欠損がMDOの欠損をもたらしrcs制御系を昂進させる可能性を示唆した。残された半数の変異株にはrcsCとrcsFに挿入変異は無いことを明らかにした。このことは、これらの変異の塩基配列解析が新たな知見に導く可能性を示しており、これは新規課題とすることとした。平成10年度は以下のように2つの研究計画を併行して実施した。酸性リン脂質完全欠損で増殖するlpp欠損変異株のサプレッション機構既に、lpp欠損変異株では、酸性リン脂質が全く欠損した状態でも増殖しうることを発見している。このことは野生型大腸菌細胞における酸性リン脂質の役割が、従来の理解とまったく異なる可能性があることを示しており、このため以下の2点からこのサプレッション機構を解析した。i)完全欠損株の性質:様々な培養条件を検討した結果、完全欠損抹は、低塩濃度培養に感受性であり、高温での培養、アンピシリン、SDSの添加に対しては、pgsA3変異株(総リン脂質の0.3%の酸性リン脂質をもつ)に比べて、顕著に感受性が昂進していることを見出した。これらの結果は、総脂質の0.3%以下の微量の酸性リン脂質を必須とする、未知の膜機能の存在を示唆している。ii)代替えとなりうる他の微量脂質あるいは生合成中間体の有無:^<32>Pによるリン脂質の標識実験により、完全欠損株では、生合成中間体ホスファチジン酸が4%にも達すること、また、その他の未同定のリン脂質も総脂質の2.3%に及ぶことが明らかとなった。酸性リン脂質を必須とする細胞機能に関与する遺伝子の検索酸性リン脂質の欠損による増殖阻害を抑圧するサプレッサー変異株をさまざまな条件下で分離解析する実験計画において、今年度は、酸性リン脂質完全欠損による高温感受性を抑圧する変異株を48株分離し、高温での増殖速度の違いから、これらの株を9のクラスに分類した。これらのサプレッサーの分離は、mini Tn10(CM^r)のトランスポゾンの挿入による遺伝子破壊により、。これら各クラスから2株ずつを選び、DNAの塩基

配列解析を行っており、これにより酸性リン脂質を必須とする細胞機能(とりわけ高温での増殖)に係わる遺伝子を明らかにしつつある。平成11年度は以下のように2つの研究計画を併行して実施した。i)lpp欠損変異株では酸性リン脂質が全く欠損した状態でも増殖しうることを発見した。lpp遺伝子の発現誘導系を構築し、LPPの誘導合成により細胞が死につつあるときに、LPPが細胞の膜のどこにあり、どのような状態にあるかを検討した。既報の結果からの推定とは異なり、酸性リン脂質の完全欠損においてもLPPはプロセスされ外膜画分に移動していることが示され、LPPの存在状態そのものは酸性リン脂質欠損の致死性と無関係である可能性が示唆された。ii)酸性リン脂質の欠損による高温感受性を抑圧するサプレッサー変異株を解析する計画において、今年度は、得られた変異株48株の約半数がrcsCとrcsFの挿入破壊によることを明らかにした。更にrcsB変異の導入によりこの変異が同様に高温感受性を抑圧することを示した。これらの事実からrcs制御系の支配下にあることが知られるcps(capsular polysaccharide synthesis)の転写レベルを測定したところ、酸性リン脂質の欠損によりcpsB転写物の顕著な昴進と、サプレッサー変異株における、昴進した転写の野生型株レベルへの復帰が見出された。しかしながら、cpsB遺伝子の破壊そのものによっては、高温感受性はサプレスできなかった。これらの事実は、rcs制御系の支配下にあるcps以外の何か別の遺伝子の発現の昴進が高温感受性をもたらすこと、また酸性リン脂質欠損がMDOの欠損をもたらしrcs制御系を昴進させる可能性を示唆した。残された半数の変異株にはrcsCとrcsFに挿入変異は無いことを明らかにした。このことは、これらの変異の塩基配列解析が新たな知見に導く可能性を示しており、これは新規課題とすることとした。