hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
骨芽細胞と破骨細胞の制御活性を有する新規骨粗鬆症治療薬の開発研究

本年度は、破骨細胞特異的Ifrd1欠損マウスの作製と、その表現型の解析を行った。また、初代培養骨芽細胞を用いて、Ifrd1の発現制御メカニズムの詳細な解析を行うとともに、Ifrd1による転写因子脱アセチル化機構の詳細なメカニズムを検討した。その結果、破骨細胞特異的Ifrd1欠損マウスでは、Ifrd1全身欠損マウスや骨芽細胞特異的欠損マウスと違い、骨量、骨形成速度および破骨細胞数に変化は認められなかった。一方、破骨細胞特異的欠損マウスにRANKL投与処置を施すと、野生型マウスと比較して骨量の低下の度合が著明に抑制されていた。in vitroの解析において、Ifrd1による転写因子脱アセチル化の機構を検討したところ、Ifrd1欠損細胞では、NF-kB、b-cateninの転写因子と、脱アセチル化酵素HDAC1との相互作用が低下していることが明らかになった。以上の結果より、破骨細胞特異的Ifrd1欠損マウスにおいては、Ifrd1全身欠損マウスや、骨芽細胞特異的欠損マウスと違い、正常時での骨量の変化は認められなかったが、病態時における骨量の低下が抑制されていることが示された。また、Ifrd1はNF-kB、b-cateninのHDAC1との相互作用を調節することにより脱アセチル化を制御し、転写因子の機能を調節することが明らかとなった。このことから、Ifrd1を抑制することのできる薬物は破骨細胞と骨芽細胞の両方に働くことで骨量を増加させる骨粗鬆症の治療により有効な薬の候補になる可能性が考えらる。骨粗鬆症や慢性リウマチなど骨関節系疾患には難治性のものが多いので、本研究が予防や治療に向けた新しい薬物治療理論の展開に大きく貢献することを期待したい。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、Ifrd1全身欠損マウスと組織特異的Ifrd1欠損マウスの作成とそれを用いた骨表現系の解析を行った。また、Ifrd1欠損マウスから調製した初代培養骨芽細胞を用いて、骨芽細胞分化マーカーの発現をReal-time PCR法とWestern blotting法により定量を行った。その結果、Ifrd1全身欠損マウスでは野生型マウスと比較して骨量の増加が認められた。また、骨芽細胞特異的Ifrd1欠損マウスにおいて、全身欠損マウスと同様の表現型が観察された。野生型マウスとIfrd1欠損マウスから単離した骨芽細胞を用いて骨芽細胞分化マーカーの発現を解析したところ、Type I collagen, Osteocalcin, OsteoprotegerinのmRNA発現量がIfrd1欠損骨芽細胞では有意に増加していた。また骨芽細胞分化のマスターレギュレーターであるRunx2/Osxのタンパク質発現が上昇していた。また、Ifrd1欠損骨芽細胞では、NF-kB p65とbeta-cateninタンパク質のアセチル化が亢進しており、ルシフェラーゼレポーターシステムを用いて各転写因子の活性を測定したところ、Ifrd1欠損骨芽細胞ではNF-kBシグナルの低下とbeta-cateninシグナルの亢進が認められた。以上の結果より、骨芽細胞におけるIfrd1は、タンパク質の脱アセチル化を介してNF-kBシグナルを亢進させることによる同細胞の分化制御機構を調節するとともに、beta-cateninシグナルを抑制することによる破骨細胞形成支持機構も同時に調節することにより、骨恒常性を協調的に制御している可能性が示唆された。当初の研究計画であった、in vitroで転写調節因子であるInterferon-

related developmental regulator 1(Ifrd1)の骨代謝における詳細な役割が転写因子の脱アセチル化を介する調節であることを明らかにすることができた。また、当初の計画では2年目以降の予定であったトランスジェニックマウスの作成とその表現系の解析に着手することができ、Ifrd1全身欠損マウスと、骨芽細胞特異的欠損マウスでは骨量の増加が起こることを見出すことができた。27年度が最終年度であるため、記入しない。今後は、骨芽細胞におけるIfrd1の発現上昇メカニズムについて詳細な検討を行うとともに、破骨細胞と骨芽細胞に発現するIfrd1が骨代謝にどのような影響を与えているかについて更に検討を行うため、脱アセチル化を制御する機構とIfrd1との関わりを明らかにし、Ifrd1を介した脱アセチル化が破骨細胞と骨芽細胞の成熟に必要なシグナルにどのような影響を与えるか検討する予定である。また、破骨細胞特異的Ifrd1欠損マウスを作成し、このマウスを用いたin vivoでの骨形態計測を行う予定である。
超臨界法によるナノ薬剤粒子担持DDSキャリアの新規創製

平成30年度においては,前年度に引き続き,汎用的に用いられているメソポーラスシリカであるMCM-41をモデル担体,DDS(ドラッグデリバリーシステム)への応用が望まれている代表的な難溶性の非ステロイド性抗炎症物質であるイブプロフェンをモデル薬剤とした検討を実施した.超臨界CO2法(333 K, 15 MPa)によるイブプロフェン含浸後のMCM-41に対して,透過型電子顕微鏡(TEM)像及び窒素吸着法による分析を行った結果より,メソポーラスシリカ細孔内への薬剤含浸を確認した.更に,温度333 K,圧力815 MPaの条件下において,超臨界法によるメソポーラスシリカMCM-41への薬剤含浸量の圧力依存性を検証した.その結果,圧力増加に伴い薬剤含浸量は低下したが,この圧力依存性は本系に係る2つの因子,(i)超臨界CO2へのイブプロフェンの溶解度,及び(ii)超臨界CO2中におけるシリカへの薬剤の吸着平衡から説明可能であった.以上,研究期間内の成果をまとめると,本研究では超臨界法によるナノDDSキャリア創製プロセス実現に向けた萌芽的検討を行い,従来法である液相法と比べメソポーラスシリカ細孔内への高い薬剤含浸量を達成することができた.また超臨界法においては圧力条件によって薬剤含浸量が大幅に変化し,超臨界CO2中におけるイブプロフェンの溶解度及び吸着平衡の影響が示唆された.今後は超臨界CO2中における薬剤の吸着平衡測定などによる含浸プロセスの定量的モデル構築,及び徐放性試験の実施が課題である.近年の医薬品開発においては,(i)新薬候補の多くが難水溶性であり,溶解性向上に向けた微粒化が必要,(ii)薬効増大,副作用軽減に向けたドラッグデリバリーシステム(DDS)の開発が必要という2つの課題がある.そこで本研究では,これら2つの課題を同時に解決する方法として,超臨界CO2に薬剤を溶解させた後,メソポーラスシリカの有するナノ細孔空間に薬剤粒子を含浸・担持させることよってDDSキャリア創製する手法(超臨界法)に着目した.平成29年度においては,汎用的に用いられているメソポーラスシリカであるMCM-41をモデル担体,DDSへの応用が望まれている代表的な難溶性の非ステロイド性抗炎症物質であるイブプロフェンをモデル薬剤とした検討を行った.超臨界法による実験では,まずシリカと薬剤を封入したバスケットを高圧セル内に入れ,そこに超臨界CO2を供給した.続いて所定温度,圧力条件下でセル内を攪拌し,所定時間経過後に減圧することで目的のサンプルを得た.温度333 K,圧力15.0 MPa,含浸時間24 hの条件にて実験を行なったところ,窒素吸着法による分析結果からメソポーラスシリカ細孔内への薬剤含浸が確認された.さらに熱重量分析(TGA)による定量の結果,従来法である液相法(エタノールまたはヘキサンを溶媒とした場合)と比べ,超臨界法による高い薬剤含浸量を達成した.これは超臨界流体の有する細孔内への高浸透性などに起因する結果と考えられ,本手法の優位性が示唆された.当初の計画通り,超臨界法によるナノ薬剤粒子担持DDSキャリア創製へ向けた基礎的検討として,モデル担体及びモデル薬剤を用いた実験・分析までを行うことが出来たため概ね順調に進展していると考えている.平成30年度においては,前年度に引き続き,汎用的に用いられているメソポーラスシリカであるMCM-41をモデル担体,DDS(ドラッグデリバリーシステム)への応用が望まれている代表的な難溶性の非ステロイド性抗炎症物質であるイブプロフェンをモデル薬剤とした検討を実施した.超臨界CO2法(333 K, 15 MPa)によるイブプロフェン含浸後のMCM-41に対して,透過型電子顕微鏡(TEM)像及び窒素吸着法による分析を行った結果より,メソポーラスシリカ細孔内への薬剤含浸を確認した.更に,温度333 K,圧力815 MPaの条件下において,超臨界法によるメソポーラスシリカMCM-41への薬剤含浸量の圧力依存性を検証した.その結果,圧力増加に伴い薬剤含浸量は低下したが,この圧力依存性は本系に係る2つの因子,(i)超臨界CO2へのイブプロフェンの溶解度,及び(ii)超臨界CO2中におけるシリカへの薬剤の吸着平衡から説明可能であった.以上,研究期間内の成果をまとめると,本研究では超臨界法によるナノDDSキャリア創製プロセス実現に向けた萌芽的検討を行い,従来法である液相法と比べメソポーラスシリカ細孔内への高い薬剤含浸量を達成することができた.また超臨界法においては圧力条件によって薬剤含浸量が大幅に変化し,超臨界CO2中におけるイブプロフェンの溶解度及び吸着平衡の影響が示唆された.今後は超臨界CO2中における薬剤の吸着平衡測定などによる含浸プロセスの定量的モデル構築,及び徐放性試験の実施が課題である.今後は、担持効率に対する圧力,薬剤種,担体種依存性を検討するとともに,徐放性能に関する試験を、試作サンプルを用いて実施する予定である.基本的には計画通りの執行であった.しかし,予定した備品の納入価格が予算よりも少し低廉になったこと,また消耗品であるサンプルなどの経費に若干差異が生じたことが理由である.なお,この残金については,次年度に予定している種々の担体の購入に充てる予定である.
線維肉腫細胞の増殖に包含されるアポトーシスの解析

生体で増殖している種々の肉腫組織には、自ら死に至る機序であるアポトーシスを起こしている細胞が混在する。私達は血清依存株のGc-4SD線維肉腫細胞を用いて、培養液から血清を除去すると、細胞増殖が抑制されるとともにアポトーシスが誘発され、その発現過程にはクロマチンの高分子量断片形成が含まれることを報告した。今回、同様のアポトーシスが、血清等の蛋白質の非存在下でも対数的に増殖するGc-4SD細胞の亜株、Gc-4PF線維肉腫細胞の増殖にも発現しているのかどうかを調べた。培養時の形態より、Gc-4PF細胞ではM期の細胞とアポトーシス細胞が全体によく散見された。フローサイトメトリー法でHoechst 33342に高染性の小型なアポトーシス細胞が、無蛋白培養においてGc-4SD細胞と同様に発現しており、全細胞の約3分の1が、この死滅過程の発現細胞であり、高分子のクロマチンの断片が確認され、蛋白除去時のGc-4SD細胞に発現したアポトーシスと同様の死滅過程である事が薩認された。細胞周期を調べると、無蛋白培養においてGc-4SD細胞はG_<0/1>期への集積がみられたが、Gc-4PF細胞では、S期の細胞が10%増えていた。以上より、Gc-4PF細胞が、無蛋白培養系で増殖するのに、アポトーシスを抑制することより、むしろアポトーシスを受け入れて細胞分裂の制御を変えることにより対数増殖を維持していることが示唆された。次に、増殖関連分子種の発現を検索したところ、p53に発現低下、細胞周期制御分子ではp34^<cdc2>に蛋白レベルの発現低下の回復が確認された。今後、線維肉腫細胞の増殖に包含されているアポトーシスを制御する分子群の発現を広く、そして詳細に検索することにより、線維肉腫の増殖に発現するアポトーシスを解明し治療に応用したい。腫瘍茶房の増殖動態にアポトーシスが関与していることが着目されている。私たちは、血清依存株のGc-4 SD線維肉腫細胞を用いて、培養液から血清を除去すると、増殖が抑制され、アポトーシスが誘発されることを報告した。今回、同様のアポトーシスが、血清等の蛋白質の非存在下でも対数的に増殖するGc-4 SD細部の亜株、Gc-4 PF線維肉腫細胞の増殖にも発現しているのかどうかを調べた。1)培養時の形態より、Gc-4 SD細胞は牛胎児血清存在下ではM期に入っている細胞が確認された。しかしながら、無蛋白培養液中ではM期の細胞は消失し、細胞質の断片化を呈するアポトーシス細胞が散見されるようになった。一方、Gc-4 PF細胞ではM期の細胞とアポトーシス細胞が全体によく散見された。2)フローサイトメトリー法でHoechst 33342に高染性の小型なアポトーシス細胞が、無蛋白培養においてGc-4 SD細胞と同様に発現しており、全細胞の約3分の1が、この死滅過程の発現細胞であった。3)このアポトーシスの発現は、アガロースゲル電気泳動では高分子のクロマチンの断片として確認され、蛋白非存在下での親株であるGc-4 SD細胞に発現たアポトーシスと同様の死滅過程である事が確認された。4)DNAをPIで染色してフローサイトメトリー法で確認すると、無蛋白培養においてGc-4SD細胞はG_<0/1>期への集積がみられたが、Gc-4 PF細胞では、S期の細胞が10%増えていた。

以上、本年ではGc-4 PF細胞が、無蛋白培養系で増殖するのに、アポトーシスを抑制することより、むしろアポトーシスを受け入れて細胞分裂の制御を変えることにより対数増殖を維持していることが示唆された。今後、さらに細胞分裂の詳細な検討を定量的に行うとともに、これらの現象に関与する分子の解明を行う予定である。血清依存株のGc-4SD線維肉腫細胞は、培養液から血清を除去すると増殖が抑制され、アポトーシスが誘発される。昨年度、同様のアポトーシスが蛋白質の非存在下でも対数的に増殖するGc-4SD細胞の亜株、Go-4PF線維肉腫細胞の増殖にも発現しているのを確認した。本年度は、Gc-4PF細胞の分裂制御に関与するメカニズムを細胞周期関連分子の発現を調べることによって一部明らかにする事に成功した。1)細胞数の計測より実際の生細胞の増殖曲線が得られる。細胞周期のそれぞれの時間の計測を行うと1周期の所要詩間が確認される。Gc-4PF細胞ではこの2つの時間に著しい隔たりがあることが判明した。この差をアポトーシスの発現頻度からコンピューターを用いて定数的に説明を試みたところ、予想以上の一致を見て、増殖動態に発現しているアポトーシスの定量的証明ができた。2)腫瘍細胞の分裂の中に、アポトーシスが包含されていることを培養系で定数的に確認した報告は今までのところ見当たらない。国際学会に報告したところ、放射線物質の標識で得られた増殖動態と類似したかなり正確な定量的解析が得られていることが確認できた。3)アポトーシス関連分子ではp53、細胞周期制御分子ではP34cdc2に蛋白レベルの発現の差が認められた。4) mRNAレベルの発現をRT-PCR法で調べると、やはりp53のメッセージレベルに明らかな差を認めた。以上、本年度では繊維肉腫の増殖の中にアポトーシスの発現を定量的に証明し、一部の分裂制御分子の発現が蛋白あるいはmRNAのレベルで関与していることが明かとなった。今後、これらの分子に着目して関連を持つ分子群の発現を検索することにより、線維肉腫の増殖に発現するアポトーシスを解明し治療に応用したい。1.昨年度までに、線維肉腫細胞の無蛋白培養株Gc-4PF線維肉腫細胞の増殖に包含されていることを確認し、増殖動態の中で細胞分裂とアポトーシスが一定の割合いで発現していることを定量的に証明した。さらに、Gc-4PF細胞の分裂制御に関与するメカニズムに、アポトーシス関連ではp53、細胞周期制御分子ではp34^<cdc2>が関与することを明らかにした。本年度はさらに分子機構を検索してp53関連のp21にもこの肉腫増殖の動態に関与を示唆する発現形式があることを明らかにした。2.Gc-4PF線維肉腫細胞の増殖にアポトーシスが包含されていることより、腫瘍細胞自身が増殖を抑制する因子の分泌をしているかどうかを調べたところ、培養上清に認められ、その分子生物学的特性を検索した。1)倍溶液による増殖抑制は、細胞数により発現時期が異なり、多いほど早期に抑制が見られた。2)培養上清によりアポトーシスはむしろ抑制された。3)培養上清の添加により細胞周期の発現パターンが変化した。4)陽イオン交換体と陰イオン交換体で、いずれも2つのピークを認めた。これらが線維肉腫細胞の増殖に包含されているアポトーシスの発現に関与している可能性を示唆した。以上、本年度では線維肉腫の増殖の中に発現するアポトーシスに関与する分子種を明らかにし、さらにシグナルを介する機構の存在を示唆することができた。
オノマトペの言語的統合性に関する日韓対照研究

2018年度は当該研究課題で博士論文を書き上げ、学位を授与した。本研究の研究目的は、日韓オノマトペの統合性を左右するものにはどのようなものがあるのか、日韓両言語間に統合性の差があるのか、通言語的に日韓両言語はどのように位置づけられるのか、という3つである。考察の結果、以上の課題を遂行することに成功した。研究概要を簡単に述べると、(1)統合性を測定する諸尺度の提示を行い、意味的特定性、メタファー拡張の有無、口語性、非慣習性の4つの尺度を提示した。(2)日本語より韓国語の方が統合性が高いという結論を導き出すことに成功した。また、本研究では、オノマトペの統合性を、文法的生起可能性と母語話者の日常会話のデータという2通りの観点より考察することで、これまでの研究で、明確に論じ分けられてこなかった当該の課題を包括的に取り上げることができた。更に、統合性の進度に関する議論にとどまらず、その背景として考えられる根本的な要因を探索し、5つの仮説を提示することができた。本研究による考察結果は、日韓オノマトペをオノマトペ類型論(ideophone typology)という大きな地図の上に配置させんとするものである。従来、日本語と韓国語は、言語体系の近似性ゆえに、当該研究において同じグループに括られてしまいがちであった。このことからも、本研究で初めて明らかになった日韓両言語の相違は、本研究における大きな成果であり、いまだスケッチの段階であるオノマトペ類型論に着実な貢献を果たすものと期待される。博士論文では主に形態統語的統合性を中心に議論を進めてきたが、現在はこの他にも語彙的統合性について更に論を広げている。例えば、韓国語オノマトペの中には慣用句の一部として使われるオノマトペが数多く存在する。この課題については3月に学術論文としてまとめることができた。また、口語におけるオノマトペ使用にも議論を進め、韓国語オノマトペの中に認識モダリティーマーカーとして機能するものがあるということが明らかになった。この課題については5月の国際会議にて発表を行った。今後の研究計画としては、口語におけるオノマトペの使用についてさらに議論を進めていきたいと思っている。博士論文における考察で、日韓オノマトペはかなり類似する統語構造を持ちながらも実際の日常会話の使用においては異なる様相を見せることがわかった。今後はこの点に重点を置き、具体的にどのようなところが違い、その違いを生む根本的な要因にはどのようなものがあるのかについて、議論を深めていきたい。
脳動脈瘤発性および破裂に関する、分子生物学的機構の研究

1.脳動脈瘤動物モデルの作成と脳動脈瘤検出法について検討した。7週齢Sprague-Dawley雄性ラット(n=20)に対し、両側の後腎動脈結紮による腎性高血圧と右総頸動脈の結紮による血液動態変化を誘発し、vascular corrosion castsから観察された脳動脈瘤の形態学的変化をStageIIIIに分類。StageI:血管内皮細胞軽度変化(不規則な走行)、StageII:血管内皮細胞膨張および血管壁の隆起、StageIII:嚢状に発達した動脈瘤。さらにcorrosion castによる電子顕微鏡下での観察結果を基に分類した脳動脈瘤形成に至る初期変化を免疫組織学的に評価した。StageIでは血管内皮細胞の欠落に伴うeNOS発現の減少がみられた。stageIIでは病巣へのmacrophageの浸潤や中膜からの平滑筋遊走などの炎症性初期変化が観察された。stageIIIでは増加したmacrophage陽性細胞の強い発現がドーム状弛緩部周囲に観察され、炎症性変化が進行していると推察された。血管壁の蛋白分解などによる血管壁の緋薄化がドーム状弛緩に進展し、脳動脈瘤形成に至ることが示唆された。しかし雄性ラットでは嚢状に発達した脳動脈瘤の発生頻度が低く再現性よく高率に脳動脈瘤を誘発するmodel動物を作製する課題が残された。2.再現性よく高率に脳動脈瘤を誘発するmodel動物を作製するため、7週齢SD雌性ラットを用い腎性高血圧と血液動態変化誘発に加えて両側の卵巣摘出(OVX+)を行った。嚢状動脈瘤(60%)がOVX無処置群(20%)より有意に増加し、ACA-OA分岐部とACA fenestration部に好発した。この結果から卵巣摘出によるホルモンの影響が脳動脈瘤形成に寄与すると考えられた。【脳動脈瘤動物モデルの作成】7週齢Sprague-Dawley雌性ラット(n=20)に対し、両側の後腎動脈結紮による腎性高血圧と右総頸動脈の結紮による血液動態変化を誘発させ、さらに1%NaCl投与による、高血圧を促進させた。2ヶ月後にsacrificeした後、vascular corrosion castsを作成して、Willis動脈輪部位の脳動脈瘤を評価する。観察された脳動脈瘤の形態学的変化をStageIIIIに分類した。Stage I:血管内皮細胞軽度変化(不規則な走行)(下図B)Stage II:血管内皮細胞膨張および血管壁の隆起(下図C)Stage III:嚢状に発達した動脈瘤(下図D)【卵巣摘出(OVX)を施したラットにおける、脳動脈瘤誘発】7週齢Sprague-Dawley雌性ラット(n=45)のうち、15匹に両側の後腎動脈結紮による腎性高血圧と右総頸動脈の結紮による血液動態変化を誘発させ、さらに両側の卵巣摘出を行った(OVX+群)。比較対象として、両側の後腎動脈結紮と右総頸動脈の結紮だけを行った群(n=15、OVX-群)と何も行わなかったコントロール群(n=15)を用いた。その結果、卵巣摘出を行ったOVX+群ではStage IIIの動脈瘤様変化が60%(15匹中9匹)で認められ、OVX-群(20%)やcontrol群(0%)に較べて優位に上昇していた。このことから卵巣摘出が動脈瘤形成を大きく促進すると考えられた。好発部位はACA-OA次いで分岐部ACA fenestration部であった上記結果は、誌上報告の予定である。7週齢

Sprague-Dawley雄性ラット(n=20)に対し、両側の後腎動脈および右総頸動脈結紮により腎性高血圧および血液動態変化を誘発し、さらに1%NaCl投与により、高血圧を増進させた。2ケ月後に麻酔下にて脱血、PBSに次いで4%パラホルムアルデヒドを心臓から全身に灌流、固定後、脳を摘出し、凍結切片を作成した。先に実施したcorrosion castによる電子顕微鏡標本での観察結果を基に分類した脳動脈瘤形成に至る初期変化に対応すると考えられる変化が以下の例数認められた。StageI:血管内皮細胞の軽度変化:n=5StageII:血管内皮細胞膨張および血管壁の隆起:n=4各血管内皮および血管壁の変化を免疫組織学的に検討した。StageIでは血管内皮細胞の欠落に伴うeNOS発現の減少がみられた。StageIIでは病巣へのmacrophageの浸潤や中膜からの平滑筋遊走などの炎症性初期変化が観察された。StageIIIでは増加したmacrophage陽性細胞の強い発現がドーム状弛緩部位周囲に観察され、炎症性変化が進行していると推察された。血管壁の蛋白分解などによる血管壁の緋薄化がドーム状弛緩に進展し、脳動脈瘤形成に至ることが示唆された。本結果は投稿中である。
昆虫概日時計間の相互同調に関わる視髄両側性巨大ニューロンの同定とその機能解析

コオロギ視髄は26対の視髄両側巨大ニューロン(MBN)により、単シナプス的に連結されている。MBNはいずれも視覚性介在ニューロンであり、形態と受容野から4種に大別できる。HPLC-ECDにより、MBN細胞体を含む組織に含まれる生体アミノ類を分析したところ、セロトニン、ドーパミン、オクトパミン、5-HIAAそれに幾つかの未知物質が検出された。MBNはセロトニン、ドーパミンの抗体で標識されないため、オクトバミンあるいはこの未知物質を伝達物質としている可能性がある。MBNの電気刺激後は反対側視葉のセロトニン量及びドーパミン量が現象することから、これらのアミンがMBNの情報伝達計に関与する可能性が示唆された。4種のMB具のうちどれが左右の視葉概日時計間の相互同調に関係しているのかを、片側の視神経を切断し更に正常側の複眼を部分破壊した個体を用いて調べたところ、複眼後方背側部に受容野を持つMBN-4がそれらしことが示唆された。このニューロンの応答性の照度依存性、時刻依存性を解析したところ、自発放電がほとんどなく光照射に対してはon,offで一過性の応答を示すこと、その応答性は夜間の方が有意に高く、夜間のスパイク数は蛭の約2倍であることなどがわかった。しかし、応答の照度依存性は極めて低く、高照度でもスパイク頻度は夜間で50Hz、昼では25Hz程度であった。その他のMBNはいずれも、応答の高い照度依存性、時刻依存性を示すことが明かとなった。これらの事実は、MBN-4が応答のスパイク数によって時計の時刻情報をコードし、反対側の時計へ伝達している可能性を示唆している。また、応答性やその日周変化は各MBNグループによって異なることから、時計の相互同調系に関わるMBN-4以外のMBN群の時計システムに関連してそれぞれ独自の生理的機能を持つらしいことが示唆された。コオロギ視の髄は26対の視髄両側性巨大ニューロン(MGN)により、単シナプス的に連結されている。MGNはいずれも視覚性ニューロンであり、形態と受容野から4種に大別することができる。8年度はまずMGNがどのような神経伝達物質を含むかを検討した。反対側視葉第2キアズマ切断端よりニッケルをバックフィルすることにより標識したMGN細胞体を含む組織を単離し、HPLC-ECDにより細胞体に含まれる生体アミン類を分析した。その結果、5-ヒドロキシインドール酢酸(5-HIAA)と微量のセロトニン、それに幾つかの未知物質が検出された。その中で最も多量に含まれていたのがセロトニンとN-アセチルセロトニンの間に流出する未知物質であった。現在までのところ、セロトニンの抗体ではMGNは標識されないので、この未知物質が伝達物質である可能性が高い。今後この物質が何かを決める必要がある。MGNの電気刺激後、反対側視葉のアミン量を定量した結果、5HIAAとN-アセチルドーパミンが有意に増加することがわかった。今後の検討を要するが、MGNの情報がセロトニン系、ドーパミン系を介して反対側時計に作用する可能性が示唆された。さらにこれまでに同定されている4グループのMBNのうち、どれが左右の視葉概日時計間の同調系に関与するものかを明らかにするため、片側の視神経切断に加えて、正常側複眼の部分破壊を行った。

明暗13:13のもので、手術個体の盲目側時計の自由継続周期が正常側時計との位相角に依存した変化を示すかどうかを解析すると、複眼後方背側部を切断した場合にのみ、位相依存的周期変調が阻害された。このことは、この領域に受容野を持つMBN4が左右同調系に関わることを示唆している。周期変調の大きさと方向性が両者の位相角に依存していることから、MBN4の概日リズムが周期変調すなわち時計間同調機構に重要であることを示唆された。コオロギ視髄は26対の視髄両側性巨大ニューロン(MBN)により、単シナプス的に連結されている。MBNはいずれも視覚性介在ニューロンであり、形態と受容野から4種に大別できる。昨年度の研究により、このうち複眼後方背側部に受容野を持つニューロン(MBN4)が、左右の概日時計間の同調に重要であることが示唆されたが、今年度は、まずこの点を行動実験により確かめた。さらに、MBNの応答性の概日リズムを明らかにするため、それぞれの単一MBNにルシファーイエロ-を充填したガラス管微小電極を刺入し、応答性を各種の照度で記録し、光誘起反応と潜時を昼と夜で比較した。応答解析後、ルシファーイエロ-を細胞内に電気泳動的に注入し、形態学的な解析を行い、既に同定されている4グループのニューロン群のうちどれに属するのかを検討した。その結果、いずれのMBNにおいても応答性は夜間高くなることがわかった。しかし、その応答性は受容域ごとにかなり異なることも分かった。MBN-4は自発放電がほとんどなく、光照射に体してはon,offで一過性の応答を示した。応答性は夜間の方が有意に高く、夜のスパイク数は昼の約2倍であった。しかし、昼夜共に応答の照度依存性は他のニューロン群に比べ極めて低かった。その他のMBNはいずれも、応答の高い照度依存性、時刻依存性を示すことが明かとなった。これらの事実は、MBNが応答のスパイク数によって時計の時刻をコードしている可能性を示唆している。また、応答性やその日周変化は各MBNグループによって異なることから、時計の相互同調系に関わるMBN4以外のMBN群もそれぞれ独自の生理的機能を持つらしいことが示唆された。
珪藻と細菌の相互関与による記憶喪失性貝毒生産

1、これまでの検討で、P.multiseriesの高度なドウモイ酸生産には細菌の存在が必要なことが分かっている。細菌自身のドウモイ酸生産の可能性を確かめるため、同種の単種培養途中で珪藻を取り除いた細菌を含む画分を調製し、同じ条件で5週間培養を続けたがドウモイ酸の生産はまったく見られず、細菌単独ではドウモイ酸を生産しない可能性が強く示唆された。2、P.multiseriesのaxenic培養を同種のnon-axenic培養と分画分子量50,000の透析膜で隔てて培養したところ、3週目以降non-axenicに近いレベルのドウモイ酸の上昇が見られた。この結果により、珪藻と細菌が相互に関与するドウモイ酸生産には、分子量50,000以下の化合物が関与し、珪藻と細菌が必ずしも接触する必要のないことが示唆された。3、N.navis-varingicaの単種培養における鉄の挙動とドウモイ酸の生産を調べたところ、P.multiseries同様、培地中の無機態の溶存鉄がまず取り込まれて枯渇したあと、珪藻画分の鉄含量の増加にリンクするように珪藻中のドウモイ酸が増加し、N.navis-varingicaにおいても不溶鉄を珪藻が取り込む過程でドウモイ酸が生成してくるという仮説が支持された。4、N.navis-varingicaはドウモイ酸(DA)ばかりでなく、イソドウモイ酸A(IA)やB(IB)を含む複数成分を生産した。その毒組成はDA-IB typeが多く、フィリピンの特定の場所から分離された株のみがIA-IB typeであった。同種はわが国、ベトナム、フィリヒ.ンに広く分布するが、その毒組成は南になるほどIBの割合が高い傾向が見られた。単種培養では同一株内の毒組成は安定であったが、無菌化することによってそれまでなかったIAを生産するようになる株が複数見られた。(1)細菌単独のドウモイ酸生産:珪藻と細菌の相互関与によるドウモイ酸(DA)生産を実証する第一歩として、細菌単独ではDA生産が起こらない可能性を培養実験で追求した。すなわち高度にDAを生産するPseudo-nitzschia multiseriesをnon-axenic培養し、DA濃度が上昇し始める培養1週目とDA濃度が明らかに上昇した3週目に、フィルターで珪藻を除いた細菌を含むろ液画分を調製し、同条件で培養を続けた。その結果、珪藻を含む元の培養はDAを高度に生産したのに対し、珪藻画分を除いたろ液画分ではDA生産は認められなかった。また、同種のaxenic培養にDA生産enhance能を有する細菌を添加した培養実験も実施し、同じ結果を得ている。この結果は細菌単独ではDA生産が起こらないことを示唆する。(2)P.multiseriesのaxenic培養をnon-axenic培養中で分画分子量約12,000の透析膜で隔てて培養するとnon-axenic培養は高度なDA生産能を示すがaxenic培養はほとんどDAを生産しないことがこれまで確かめられている。今回は分画分子量50,000の透析膜で両培養を隔てた培養実験を行ったが、axenic培養が早めに死滅してしまい明瞭な結果は得られなかった。(3)Nitzschianavis-varingicaにおけるDA生産と鉄の取り込みの関係:P.multiseries同様高度なDA生産能を示すN.navis-varingicaのnon-axenic培養を行いDA生産と鉄の関係を調べたところ、P.multiseries

同様培地中の溶存鉄が枯渇したあと単位細胞当たりのDA倉量の増加が見られ、それとパラレルに細胞中の鉄含量の増加が観察された。この結果はN.navis-varingicaにおいてもDA生産が鉄の取り込みに関連して起こることを示唆する。(4)N.navis-varingicaのASP毒組成:DA異性体のイソドウモイ酸A(IA)やB(IB)生産株を分離したフィリピンに加えて、わが国やペトナムのN.navis-varingicaの毒組成を調べたところ、DA+IBタイプが主でフィリピンで分離されたIA+IBタイプは見つからなかった。DA+IBのある株を無菌化するとその組成がIA+IBに変わり、その培地画分をnon-axenicのそれで置換するとDA+IBに戻る現象が見られた。この結果はある種の細菌がASP毒組成に影響を及ぼすことを示唆する。1.P.multiseriesと細菌の相互関与による高度なDA生産を追求する一環として、P.multiseriesのaxenic株をnon-axenic株と透析膜で隔てる培養実験を行っているが、分画分子量12,000の透析膜で隔てた場合non-axenic側では高度なDA生産が見られるにもかかわらず、axenic側ではほとんどDA生産が見られないことがこれまで分かっている。今年度は分画分子量50,000の透析膜で隔てた培養実験を実施した結果、培養期間中axenic側の細胞のDAも徐々に増加して4週目ではnon-axenic(2.1pg/cell)の1/3(0.7pg/cell)に達した。この結果は珪藻と細菌が相互関与するDA生産が、分子星12,00050,000かあるいは透析膜を通過しにくい構造を有する低分子化合物を介して行われる可能性を示唆する。2.DA生産誘導実験;未了に終わった。但しP.multiseries培養の溶存鉄が枯渇した時期にフェオフォルバイド等のポルフィリン化合物を加えて、そのDA生産能を化合物なしの場合と比較する実験を早急に実施すべく準備中である。4.N.navis-varingica培養から調製した細菌を含む培地画分に数種のASP毒を添加しその濃度を5週間に渡って調べたが、徐々に減少するのみで他の成分には変化せず、同種の毒組成は培養中安定であると考えられた。また、昨年に引き続き各地で同種を分離して毒組成を調べた結果、同種の毒組成には地域差があることが明らかになってきた。5.N.navis-varingicaおよびP.multiseriesの無菌培養株の培地画分を他の毒組成を示す有菌培養の細菌を含む培地で置換・培養したが、前年と異なりその毒組成が変わることはなかった。しかし新たに作製した無菌株2株のうち1株は毒組成がDA-IBからDA-IB-IAと新たにIAを生産するようになり、同種のASP毒生産に及ぼす細菌の作用は、あるとしても複雑なことが示唆された。またP.multiseriesを長期培養した場合、DAばかりでなくIA、IBなどの異性体も増加(全毒量の15-25%)してくることが分かった。
緑藻ボルボックス科藻類の生活環制御に関する研究

ボルボックス科藻類はもとより藻類の生活環の制御因子解析に関する研究は人工環境下における培養実験系で行われてきた。一方、これら藻類は自然界、特に成育場所である水圏において多種多様な他の生物と環境に影響をうけながら生存している。生活環の実体と機構解明のために本研究は培養実験と生態学的調査研究の両面から行われ、次のことが明らかになった。(1)津軽十二湖湖沼群の鶏頭場の池、落口の池、越口の池および王池におけるボルボックス科藻類のVolvox、Eudorina、Pandorinaおよび各種優占植物性プランクトンの季節的消長が明らかになった。(2)湖沼環境としての下記の因子の周年にわたる量的変動が明らかになった:全-N、NO_3-N、NO_2-N、NH_4-N、Si、Cl、各種クロロフィル量、糖、タンパク、全-P、PO_4-P、水温、溶存酸素、pH等。(3)ボルボックス科Haematococcusの増殖における栄養要求性、特に窒素源やセルビオ-ス等の炭素源要求性が明らかになった。(5)さらに本研究結果から、藻類の培養系における増殖と生活環の主要制御因子であるアンモニア態および硝酸態窒素が自然界の数百倍から数10万倍であることが明らかになった。このことは培養実験による制御因子解析は異常環境下の研究であると考えられる。従って、本来の生活環制御因子解析研究のためには、自然界に近い培養系の開発と生態学的調査研究がより進められる必要が早急な課題であると結論された。本年度は天然湖沼のフイールドを津軽十二湖湖沼群内の7湖沼とし各湖沼の環境分析と植物性プランクトン特にボルボックス科藻類の優占種に着目してその季節的消長を調べた。さらにヘマトコックスの室内培養実験を行い、その生活環における栄養要求、制御因子解析と細胞学的観察をつづけてきた。1.各湖沼の周年にわたる水温、透明度、PH、溶存酸素量等の変動、現存量に関するクロロフィル量、糖・タンパク質量の変動および湖沼の水質分析としては全窒素、アンモニア態、硝酸態および亜硝酸態窒素、全リン酸、無機リン、ケイ酸および塩素量等に関する定量分析を試みた。その結果約50年前の吉村信吉、小久保清治らの溶存酸素量の調査結果と比較して、無酸素境界層の位置、冬季の無酸素量の深度の移動および溶存酸素量の極大層と季節的変化との関連からほとんど差異が認められず、予想に反して非常に自然状態が維持されていた。さらにクロロフィル量から見た各湖沼の現存量の差異、無酸層にかかわらずクロロフィル量の極大層の存在等その他多くの新知見を得た。2.ボルボックス科藻類の季節的消長に関する調査結果からEudorinaelegonsとVolvox aureusが優占種として認められた。湖沼によって出現時期と生存深度等に差異が認められた。これらの消長と環境分析結果から現在その相関解析を行っている。3.ヘマトコッカスの培養系の実験では完全合成培地の作製、各種栄養塩と増殖および生活環制御因子としての役割、蛍光色素法による細胞形態変異の検討等を調べてきた。その結果Ca要求が増殖では少ないが細胞壁の形態維持に関与していることが明らかとなった。又同種内の3株の比較実験から株間に増殖におよぼす栄養要求の差異とアキネート形態の変異が認められた。最終年度である本年度は前年度に引き続き津軽十二湖湖沼群内の7湖沼の環境分析と植物性プランクトン、特に、ボルボックス科藻類の優占種に着目してその季節的変遷を定量的に調査した。さらにヘマトコッカスの室内培養系における実験によって、その生活環における栄養要求と制御因子解析を行った。1.ボルボックス科藻類での優占種はVolvox aureusとEudorina elegansであった。

V.aureusは1湖沼で夏期にE.elegansは多くの湖沼で夏から秋・冬期にかけて優先し春期にはみられなかった。生育深度はV.aureusが表層なのにくらべE.elegansは比較的深い酸素量と光量のとぼしい10m層まで広く分布していた。2.各湖沼の周年にわたる水温、透明度、pH、溶存酸素量の変動、生物現存量としての各種クロロフィル量、糖、タンパク量の変動および湖沼水中の全窒素、アンモニア態、硝酸態とよび亜硝酸態窒素、全リン酸、無機リン、ケイ酸および塩素等の定量分析を行ってきた。3.天然水界に対して比較するために、ヘマトコッカス、ゴニウム等の培養実験により、増殖におよぼす窒素源の要求、糖の利用ならびに耐性体形成、性発現制御に関する要因解析を行った。以上の結果から、天然湖沼でのボルボックス科藻類の出現は環境中に栄養塩、特に窒素源が少なくなる夏から冬期であり、ケイ藻等は比較的栄養塩の多い春に集中した。所が培養実験での窒素は天然に比べ数百倍から数千倍の濃度を要求していた。増殖だけではなく生活環の耐性体形成や有性生殖の制御要因である窒素源の欠乏は天然で一時期をのぞいて周年おこっていることになる。自然界で示すこれら藻類の生活環制御因子と培養系で関与する制御因子とは相当異なっている可能性が明らかになった。
有機・生体分子からなる機能性薄膜の配向の制御とその物性の評価

生体関連分子からなる2次元配向膜の研究は、なぜ分子が自己集合により機能的組織体を形成するのかという問題に対して重要な情報が得られるだけでなく、新素材の開発等の視点からも注目されている。この薄膜の物性の研究において、我々は近年開発された走査型プローブ顕微鏡を用いると原子・分子レベルの直接観察という視点に立ち、官能基単位の分解能で、構造、電子物性と分子間相互作用の3つの観点に基づいた機能性薄膜の物性の研究方法を試みることができる。そこで、第1に、固液界面に形成した有機分子単分子膜の走査型トンネル顕微鏡(STM)観察からSTMによる有機分子内の個々の原子の識別が可能であるかを検討した。実験には2本の炭化水素鎖の中央に官能基を挟んだ直鎖状分子を用いた。これらの分子の2次元配向は官能基の種類によって大きく異なった。さらに、1分子のSTM像において炭化水素鎖のコントラストを基準にして他の領域の原子団のコントラストを比較することにより、有機分子内での個々の原子の識別が可能であることを示した。第2に、2次元配向における炭化水素鎖の影響を脂肪酸からなる単分子膜を用いて検討し配向は炭化水素鎖の数の偶奇性によって異なることを示した。脂肪酸は不斉炭素原子を持たないので3次元の結晶構造には鏡像関係の単位格子は存在しない。しかしながら、2次元の膜においては炭化水素鎖を主軸にした回転が制限されるために単位格子に鏡像関係が生じることを明らかにした。第3に、リン脂質/コレステロールの2成分からなる薄膜の相分離状態に着目し分子間の電荷ー電荷間の相互作用とドメイン境界に働く力の大きさを検討した。生体関連分子からなる2次元配向膜の研究は、なぜ分子が自己集合により機能的組織体を形成するのかという問題に関して重要な情報が得られるだけでなく、工業的には新素材の開発等の視点からも注目されている。この種の分子は界面を利用すると自己集合により構造をとることが知られている。そこで、本研究では、第1に、固液界面を利用して有機・生体分子の2次元配向膜をグラファイト基板上に作成し、その薄膜の物性を走査型トンネル顕微鏡(STM)を用いて測定した。実験にはアルカン、アルコール、脂肪酸、コレステロール、コレステロールエステル、フタロシアニン、及び、2本の炭化水素鎖の間にアミン、ソルフィド、エーテル、エステル、ケトン基を挟んだ直鎖状の有機分子を用いた。その結果、分子内の各種の官能基はトンネル現象によって識別することが可能であることと官能基の選択は有機分子から成る2次元配向膜の制御において重要であることが分かった。第2に、有機分子の自己集合に気液界面を利用した(ラングミュアーブロジェット(LB法)。脂肪酸、リン脂質、コレステロール、及び、リン脂質とコレステロールの2成分系からなる2次元配向膜(LB膜)を作成し、原子間力顕微鏡(AFM)により分子の配向を検討した。また、薄膜に熱を加えることにより起こる膜中の分子の再配列も検討した。特に、2成分系の薄膜においてはナノメートルの分解能でドメインとその形状を検討し、従来の光学顕微鏡では得られなかった詳細な情報を得た。結果は分子の頭部に電荷を持つ場合、分子頭部間の電荷-電荷の相互作用とドメイン境界におけるラインテンションがドメインの形状変化に関係があることを示唆する。
光電子分光法による高温超伝導発現機構の解明

角度分解光電子分光、軟X線吸収分光法および走査トンネル分光法を用いて、世界に先駆けて、以下に記す高温超伝導発現機構に直接結びつく電子構造についての知見を得た。1.角度分解光電子分光により我々が世界で初めて見出したフェルシ準位を横切るバンドの存在を、より高品質の試料を用い、さらにより高い信号-ノイズ比の実験で確認した。この事により、高温超伝導体におけるフェルミ液体状態の存在は確立した。2.逆光電子分光実験により、フェルミ準位上に有限の非占有電子状態が存在する事を見出した。この実験結果は、上記(1)の結果を支持して、高温超伝導体にフェルミ液体状態が存在する事を、非占有電子構造の立場から示すものである。3.ホ-ルのド-プ量を変化させた試料についての酸素のK吸収スペクトルの測定より、ド-プされたホ-ルは主に酸素の2P軌道に入る事が明らかとなった。4.単結晶試料についての偏極軟X線吸収実験より、フェルミ準位上の酸素の2P軌道は面内の対称性、つまりx-y対称性を持つ事を見出した。5.単結晶試料を用いた走査トンネル分光実験より、フェルミ準位上の酸素の2P軌道は結晶内のBi0面内では無くCuO_2面内に存在している事を見出した。6.電子ド-プ型高温超伝導体についての軟X線吸収分光実験より、この系においては、ドイツのカ-ルスル-エの研究グル-プが主張しているような酸素の2P空準位はフェルミ準位上に存在している事を見出した。
休養・睡眠の自己調節プログラム構築のための日中短時間睡眠の生活実践的活用

【研究の背景】健康づくりの指針「健康づくりのための睡眠指針2014」が厚生労働省より策定されているが,国民の生活スタイルの変化や勤労形態の多様化,社会のグローバル化などにより,一義的に対応できない状況になっている。申請者は,これまで生体リズムを研究してきて,食事,運動,休息及び睡眠の生活リズムが心身の健康状態に深く関連していることをデータでもって確認してきた。最終的には個々人のオーダーメイドの休養・睡眠プログラムの作成が必要と考え,基礎研究に取り組んできた。今回は,そのなかでも日中の眠気現象に焦点を当て,夜間の睡眠との関連性を検討した。【研究目的】1)日中短時間睡眠の精神身体的リフレッシュ効果,だるさ等の有無を検討すること。2)日中短時間睡眠前後の心理的,生理的な指標の変化があるか検討すること。【研究方法】1)アンケート調査:心理学的な分析として,心理的評定,身体的評定から成る自己評定質問紙を実施した。2)実験的分析:同意の得られた大学生16名から唾液の採取を行った。生理学的な分析として,メラトニン,コルチゾールの時系列的分泌量を指標とした。実験条件は日中の短時間睡眠前後の心理的,生理的指標の差異,統制条件は,短時間睡眠をとらない場合とした。【研究成果】予備調査において, 95%の学生が日中眠気を感じることがあり,夜間睡眠の質よりも量との相関が確認された。本実験において,短時間睡眠の効果は個人差が大きく,心理的評定及び生理的指標の変化において,予期に反して有意差が認められなかった。一方メラトニンの安定分泌群は,不安定群よりも有意に心身状態が良好であり,不安定群は,日中においてコルチゾールの高い分泌リズムが続くことが示された。このことより,夜間の睡眠が日中の眠気に関連しており,夜間睡眠時にメラトニンが十分分泌される生活リズムがオーダーメイドプログラム作成の基礎となることが示唆された。
イネ穂培養限界のブレ-クスル-

培養後1週間で停止する従来のイネ穂培養による子実成長の限界を打破するために、培養液吸収過程について穂の切断位置と培養環境の改良を試みた.その結果、穂軸を穂首節よりさらに下位の節間から切り取り茎断面を増やすこと,低湿度下で従来の半分の培養液を吸収させて蒸散を促進させた条件下で培養すると、子実成長をさらに1週間程度延長できた.培養後1週間で停止する従来のイネ穂培養による子実成長の限界を打破するために、培養液吸収過程について穂の切断位置と培養環境の改良を試みた.その結果、穂軸を穂首節よりさらに下位の節間から切り取り茎断面を増やすこと,低湿度下で従来の半分の培養液を吸収させて蒸散を促進させた条件下で培養すると、子実成長をさらに1週間程度延長できた.イネの穂を切り取り液体培地に漬ける穂培養法では,一週間は圃場と同等の子実乾物増加がみられたものの,それ以降はほとんど停止する(Kobata et al.,2001).そこで本研究は,穂培養条件下で子実成長の早期停止がおきず,成長を長期に渡り維持できる穂培養システムを新たに開発することを目的とした.作期を数回にずらして水田栽培したコシヒカリを出穂約5日後に下位節間で切除し,アンチホルミンで穂首以下を滅菌し,穂の基部を培地につけて培差し.培地には60gl^<-1>のスクロースと1/2MS培地を用いた.恒温器内において,培地を培養中カビが発生しないように冷蔵庫内で5°Cに保ち,穂は気温30°C,光強度84μmol・m^<-2>s^<-1>で24時間照射した.実験は2回繰り返した.従来のように穂軸の第二節間から培地に漬ける区(対照区),穂軸の維管束断面を大きくするために従来の穂首節間より下位節間から培養液に漬ける区(太茎区),また,穂を長時間高糖濃度の培養液に漬けることによるストレスを避けるために,穂軸下端を二つに切って半分に培地半分を蒸留水に漬けた区(茎割区)と,朝8時から16時まで培地に漬け16時から翌朝8時の間は暗黒条件で蒸留水に漬ける区(漬替区)を設けた.その結果,従来の穂培養法で培養した穂(対照区)に比べ,下の節間から培養した方(太茎区)が2週目も平均一籾重は増加した.ただし,それ以降同時期の圃場における一籾増加には及ばなかった.また,漬替区では,子実成長期間をさらに延ばしたものの培養当初から籾重の増加は低かった.以上から,従来の穂首節間よりさらに下位節間を培養液に漬けて培養することは子実の乾物増加継続に有効な手段と考えられる.しかし,さらに成長持続期間を高く長く延ばす必要がある.茎を漬け替えて培養する方法では,圃場の子実重よりかなり低い値となったものの子実の成長停止は延長されたことから,下位の節間から残して茎を長くした穂で,培養液と蒸留水に漬け替えて培養をすれば,より圃場に近い子実重増加を長期間維持できると期待される.イネの穂を切り取り液体培地に漬ける穂培養法では,一週間は圃場と同等の子実乾物増加がみられたものの,それ以降はほとんど停止する(Kobataetal.,2001).そこで本研究は,穂培養条件下で子実成長の早期停止がおきず,成長を長期に渡り維持できる穂培養システムを新たに開発することを目的とした.作期を数回にずらして水田栽培したコシヒカリを出穂約5日後に下位節間で切除し,アンチホルミンで穂首以下を滅菌し,穂の基部を培地につけて培養した.培地には60gl^<-1>のスクロースと1/2MS培地を用いた.恒温器内において,培地を培養中カビが発生しないように冷蔵庫内で5°Cに保ち,穂は気温30°C,光強度84μmol・m^<-2>s^<-1>で24時間照射した.実験は2回繰り返した.従来のように穂軸の第二節間から培地に漬ける区(対照区),穂軸の維管束断面を大きくするために従来の穂首節間より下位節間から培養液に漬ける区(太茎区),また,穂を長時間高糖濃度の培養液に漬けることによるストレスを避けるために,穂軸下端を二つに切って半分に培地半分を蒸留水に漬けた区(茎割区)と,朝8時から16時まで培地に漬け16時から翌朝8時の間は暗黒条件で蒸留水に漬ける区(漬替区)を設けた.その結果,従来の穂培養法で培養した穂(対照区)に比べ,下の節間から培養した方(太茎区)が2週目も平均一籾重は増加した.ただし,それ以降同時期の圃場における一籾増加には及ばなかった.また,漬替区では,子実成長期間をさらに延ばしたものの培養当初から籾重の増加は低かった.以上から,従来の穂首節間よりさらに下位節間を培養液に漬けて培養することは子実の乾物増加継続に有効な手段と考えられる.しかし,さらに成長持続期間を高く長く延ばす必要がある.

茎を漬け替えて培養する方法では,圃場の子実重よりかなり低い値となったものの子実の成長停止は延長されたことから,下位の節間から残して茎を長くした穂で,培養液と蒸留水に漬け替えて培養をすれば,より圃場に近い子実重増加を長期間維持できると期待される.これらの成果を学会において発表した。5°Cに保った濃度3%の培養液中に穂首節から漬け、穂を30°Cの気温下で穂培養する従来の方法に対して、穂の上位節から2節下で切除し、培養液を半分の濃度3%、穂を除湿機を入れた人工気象器に入れて湿度40-50%にして蒸散を促進する方法、さらに培養液にリン酸を添加する方法、下位節で切除した穂を湿度60%,12時間明期に3%の培養液、湿度90%、12時間暗期に蒸留水に自動的に漬けかえる方法、によって培養期間の延長を試みた結果の取りまとめを行った。すなわち、いずれも従来の6%培養液で穂首節から培養する場合に比べて、圃場の80%の成長が二週間まで延長された。また、培養液の漬け変えは、漬けたままの場合よりもやや優れた。リン酸の添加はやや成長が促進されたものの明確な効果は認められなかった。以上の結果から、低位節からの培養液吸収と低い濃度の培養液は穂培養による子実成長期間の延長に有効であること、明暗期の穂の漬け変えは効果があるものの装置の作成や調節など操作が複雑化するために利点はあまり高くないとみなされみ。これらの結果は、コムギに比較してイネの穂で一週間以上の穂培養が困難である理由は、培養液吸収の茎断面の小ささによる閉塞の起こりやすさ、あるいは低温の培養液に対する脆弱性による可能性がある。本手法ではさらに長期にわたる子実成長は圃場に比べ劣っており、今後新たな問題解決が図られる必要がある。