hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
塑性ークリ-プ相互作用下の非弾性成式の構造解析への適用と寿命評価に関する研究

.FEM解析で得られた応力-ひずみ応答に基づいて寿命評価を試みたが、実験結果とほぼ対応することがわかった。長期間に渡るC-Cタイプについては今後の検討が必要である。このように、非弾性解析を行ことによって、精度よい構造解析手法と寿命評価への適用可能性が示されつつあるが、次年度では各実験結果に対する詳細な検討を行うことによって、構成式に対する総合的な評価と非弾性解析手法の確立を試みた。高温における金属材料の非弾性挙動を解析するにあたって,塑性ークリ-プ相互作用および疲労ークリ-プ相互作用が重要であるとの認識にたって,多軸応力下での非弾性構成式と寿命評価法の検討を行うとともに,非弾性構成式による切欠き材の応力・ひずみの有限要素法による解析とその寿命評価法の検討を行った。前者では,種々の非弾性構成式を用いて,薄肉円管状試験片に組合わせ引張り・圧縮とねじりの一様な応力またはひずみを負荷する7種のベンチマ-ク問題を解析し,この結果を実験結果と対応させた。つぎに,組合せ引張り・圧縮とねじりの一様なひずみを繰返し負荷したときの疲労ークリ-プ寿命を7種の寿命評価法で検討した。後者では,非弾性構成式の有限要素法による構造解析への適用の適否を検討するため,8種の構成式を用いて2種の形状の環状切欠きをもつ中実円柱に,クリ-プ,繰返し変形,引張り側にひずみ保持をもつ繰返し変形を受ける場合の切欠き底近傍の応力とひずみの解析を有限要素法で求めた。その妥当性を検証するために,高温用容量型変位計を切欠き底に溶接してひずみの測定を行い,解析結果と比較した。さらに,この環状切欠き材の疲労ークリ-プ寿命を5種の寿命評価法を用いて推定した。このとき,既存または新たに開発した有限要素法コ-ドによって,切欠き底において繰返し加えられる応力・ひずみを10サイクルまで解析し,上述の寿命評価に適用した。また,詳細有限要素解析を行わない方法として,計測したひずみ,単調負荷の場合の有限要素解析によるひずみ,切欠き底の応力・ひずみの簡易解析による結果を用いて寿命の推定も行い,上述の詳細解析の結果と比較した。一方,実験では,き裂発生寿命と破壊寿命を同定したが,前者では直流電位差を,後者では応力範囲が25%低下したときの繰返し数を基準とした。
自然言語処理と学習プロセスセンシングを用いた協調学習の形成的評価環境の構築

協調学習(複数人で複雑な課題解決をする学習方法)は,主体的・対話的で深い学びを実現する手段として有望である.しかしながら,協調学習の成功には学習中に起こる様々な問題を学習者自身で克服するための「協調スキル」が不可欠である.学習者の持つ協調スキルの様態を教授者が事前にあるいは授業中に把握できれば,グループ編成や授業中の学習支援に大変有益な情報となる.本研究では授業前に協調スキルを自動診断するシステムと,協調学習中の非言語的な振る舞いを解析診断する手法の開発を行い,学習支援に有用な情報構築を目指す.協調学習(複数人で複雑な課題解決をする学習方法)は,主体的・対話的で深い学びを実現する手段として有望である.しかしながら,協調学習の成功には学習中に起こる様々な問題を学習者自身で克服するための「協調スキル」が不可欠である.学習者の持つ協調スキルの様態を教授者が事前にあるいは授業中に把握できれば,グループ編成や授業中の学習支援に大変有益な情報となる.本研究では授業前に協調スキルを自動診断するシステムと,協調学習中の非言語的な振る舞いを解析診断する手法の開発を行い,学習支援に有用な情報構築を目指す.
食道癌の広範囲内視鏡的粘膜層剥離術を可能とする高密度コラーゲン治療デバイスの開発

早期食道癌患者に対して実施される内視鏡的粘膜下層剥離術(ESD)では、術後合併症である重篤な食道狭窄による摂食障害が生じるため、切除面積は限定されている。この狭窄は食道再生過程での筋線維芽細胞の過剰な増殖に伴う病的組織収縮に起因する。我々は、筋線維芽細胞の過剰増殖を抑制し、上皮化を促進するコラーゲン新素材、ブタアテロコラーゲンビトリゲル膜を開発した。H29年度までの動物実験の結果、ブタアテロコラーゲンビトリゲル膜の貼付により、全周性の食道粘膜切除後の食道狭窄に対する抑制効果を確認した。H30年度は、貼付方法と、ブタアテロコラーゲンビトリゲル膜と創部との接着状態に依存する組織修復状態の違いを見出し、治療効果の最適化に関する検討を行った。創部とブタアテロコラーゲンビトリゲル膜の間の接着性と創傷治癒および線維化抑制効果の評価目的で、マウス背部皮膚欠損モデルを用いた解析の結果、創部とブタアテロコラーゲンビトリゲル膜が十分に密着した場合、周囲の炎症細胞浸潤および周囲の再生組織内での筋線維芽細胞の出現が抑制されることを見出した。一方、創部とブタアテロコラーゲンビトリゲル膜との間に空隙が生じた場合、炎症細胞浸潤および筋線維芽細胞を伴う肉芽組織量は増加し、創閉鎖が有意に遅延する事を見出した。今後、ブタアテロコラーゲンビトリゲル膜による粘膜再生促進および抗線維化・抗瘢痕化作用の向上には、創部との密着性の改良が最も重要な課題であることが示唆された。早期食道癌患者に対して実施される内視鏡的粘膜剥離術(ESD)では、術後合併症として強固な食道狭窄が生じるため、切除面積は限定されており予防法も現在確立されていない。我々は、アテロコラーゲンビトリゲル薄膜による皮膚再生および瘢痕抑制効果をヒントに、ESDの粘膜剥離部に貼付し、食道狭窄を抑制する新デバイスを着想した。実験用ブタに対してESDによる全周性の食道粘膜欠損を作製し、汎用型上部消化管内視鏡と生検鉗子を用いて同部位にCVPを貼付し、クリップにて固定を行った。対象群は粘膜切除のみの未処置とした。対照群では術後1週間より食道内腔の狭窄が目立ち、2週間では高度狭窄(pin hole)に陥った。一方、CVP貼付群では良好な食道内腔の開存を認めた。摘出食道を病理組織学的に解析したところ、対象群では上皮化の遅延、粘膜表層の厚い肉芽組織形成、多数のαSMA陽性の筋線維芽細胞の出現、線維化の亢進を認めた。一方、CVP貼付群では対象群と比較し有意な粘膜欠損部の上皮化の促進、筋線維芽細胞の出現抑制、粘膜の肉芽組織形成、線維化の軽減効果を認めた。本デバイスは、貼付および固定操作が全て汎用製品を用いるため、一般施設での実施が可能であると考えられる本年度の研究において、我々は再生医療用ブタアテロコラーゲンを用いたcollagen vitrigel patch (CVP)を作製し、実験用ブタを用いてその狭窄抑制効果を示すと共に、その作用メカニズム(上皮化の促進、筋線維芽細胞出現抑制)を明らかにした。我々は、アテロコラーゲンビトリゲル薄膜による皮膚再生および瘢痕抑制効果をヒントにESDの粘膜剥離部に貼付し、食道狭窄を抑制する新デバイスを着想した。方法:実験用ブタに対してESDによる全長2 cm、全周性の食道粘膜欠損を作製した。汎用型の上部消化管内視鏡と生検鉗子を用いて同部位にCVPを貼付し、クリップにて固定を行った。対象群は粘膜切除のみ行い、CVP貼付は行わなかった。結果:対照群では術後1週間より食道内腔の狭窄が目立ち、2週間では高度狭窄(pin hole)に陥った。摘出食道を病理組織学的に解析したところ、対象群では上皮化の遅延、粘膜表層の厚い肉芽組織形成、多数の炎症細胞浸潤、αSMA陽性の筋線維芽細胞の出現、線維化の亢進を認めた。一方、CVP貼付群では対象群と比較し有意な粘膜欠損部の上皮化の促進、炎症抑制、筋線維芽細胞の出現抑制、粘膜の肉芽組織形成、線維化の軽減効果を認めた。結語:本デバイスは、貼付および固定操作が全て汎用製品を用いるため、一般施設での実施が可能であると考えられる。本年度の研究において、我々は再生医療用ブタアテロコラーゲンを用いたcollagen vitrigel patch (CVP)を作製し、実験用ブタを用いてその狭窄抑制効果を定量的に示すと共に、その作用メカニズム(上皮化促進、筋線維芽細胞出現抑制)の機序の一端を明らかにした。また、CVP貼付による創部のコラーゲン組成の変化、およびCTGFを介する筋線維芽細胞の抑制機序を明らかにした。

我々は、筋線維芽細胞の過剰増殖を抑制し、上皮化を促進するコラーゲン新素材、ブタアテロコラーゲンビトリゲル膜を開発した。H29年度までの動物実験の結果、ブタアテロコラーゲンビトリゲル膜の貼付により、全周性の食道粘膜切除後の食道狭窄に対する抑制効果を確認した。H30年度は、貼付方法と、ブタアテロコラーゲンビトリゲル膜と創部との接着状態に依存する組織修復状態の違いを見出し、治療効果の最適化に関する検討を行った。創部とブタアテロコラーゲンビトリゲル膜の間の接着性と創傷治癒および線維化抑制効果の評価目的で、マウス背部皮膚欠損モデルを用いた解析の結果、創部とブタアテロコラーゲンビトリゲル膜が十分に密着した場合、周囲の炎症細胞浸潤および周囲の再生組織内での筋線維芽細胞の出現が抑制されることを見出した。一方、創部とブタアテロコラーゲンビトリゲル膜との間に空隙が生じた場合、炎症細胞浸潤および筋線維芽細胞を伴う肉芽組織量は増加し、創閉鎖が有意に遅延する事を見出した。今後、ブタアテロコラーゲンビトリゲル膜による粘膜再生促進および抗線維化・抗瘢痕化作用の向上には、創部との密着性の改良が最も重要な課題であることが示唆された。次年度以降は筋線維芽細胞の増殖抑制メカニズムを分子細胞生物学的に明らかにすると共に、製品化を目指した、品質および形状の最適化を目指す。次年度以降は上皮化促進および炎症抑制のメカニズムを詳細に明らかにすると共に、臨床現場に即した製品化を目指し、製品形状の最適化と最終的な品質を決定する。予定していた国際学会発表に準備が間に合わず、約15万円の未使用金が発生した。本年度、国際学会に参加する予定であり、そこで繰り越し使用する。
エイズウイルス固有のプロテアーゼの合成研究

現在、エイズウイルスプロテアーゼの特異的阻害剤は副作用の極めて少ないエイズ治療薬として使用できるのではないかと有望視されている。そこでエイズ治療薬としての特異的プロテアーゼ阻害剤の開発に役立てる為に、エイズウイルス固有のプロテアーゼの化学合成を行った。1ペプチド鎖をtBoc型固相法により構築した。この際合成手順として我々の開発した効率的固祖合成法を用いた。また別に合成したフラグメントを使用してペプチド鎖の構築も行った。アミノ酸分析の結果より樹脂担体上でのペプチド鎖の構築はほぼ満足できるものであった。2合成したペプチド樹脂の一部を使用してアミノ端末を延長しビオチンを結合した誘導体及びチオール基に基ずくアフィニティーラベルを結合した誘導体を合成した。3合成したペプチド樹脂を無水フッ化水素処理により、全保護基の除去及び樹脂胆体からの脱理を行い、これをゲルろ過により精製して部分精製品を得た。この部分精製プロテアーゼは、別途合成した基質ペプチドを用いたアッセイ系において特異的でかつ強い基質分解能を有していた。4アビジン、阻害剤またはヨウ化アセチル基を結合した固定相を使用した各種アフィニティークロマトグラフィーで精製を試みた。しかしいずれの場合も非特異的吸着による不純物の混入が著しく、十分な精製は出来なかった。これはこのプロテアーゼが疎水性の高い物質であり、水溶性に乏しい為であると考えられる。部分誠意瀬プロテアーゼと基質ペプチドはプロテアーゼ阻害剤の活性測定に使用した。この結果の一部は第31回ペプチド化学討論会及び日本薬学会第114年会にて報告する。
拡張ナノ熱光学流体デバイスの創成と無標識一分子検出の実現

本研究では、研究代表者ら独自の非蛍光分子検出法である光熱変換位相差(POPS)検出法により、100 nmの拡張ナノ空間で生体分子の無標識一分子検出を実現することを目的とする。具体的には、生体分子を対象とするUV励起型かつバックグラウンドフリー化のための光学系、及び熱拡散に伴う感度低下の抑制のため熱光学特性を制御した検出用拡張ナノ流路を開発して、これまで100分子レベルであった検出感度を更に2桁向上させる。以上により、単一・可算個分子を対象とする極限の分析化学を創成する。2018年度は、フッ化カルシウムを壁面基材としたマイクロ・ナノ加工プロセスを開発して、拡張ナノ流体デバイスを作りあげた。POPS検出では、プローブ光を微分干渉プリズムにより分離して干渉させることで光の波長以下の拡張ナノ空間で試料分子から放出される熱に伴う屈折率変化を検出する。これまでのデバイスでは、拡張ナノ空間で試料分子から放出される熱が壁面基材であるガラスまで拡散していた。温度上昇に対して溶液の屈折率は減少するのに対し、ガラスの屈折率は上昇するため、結果として、屈折率変化分が減少して信号強度が低下していた。これを解決するため、温度上昇に対して屈折率が上昇する基材であるフッ化カルシウムを壁面基材として導入することにより屈折率変化分を増加させ、信号強度を上昇させる構想に至った。これを実現するため、ガラス製の拡張ナノ流路にフッ化カルシウムを集積した加工プロセスを開発し、デバイス作製に成功した。今後、作製したデバイスによって感度の向上を目指す。当初研究計画通り、2017年度はUV励起型POPSにおける光学系の問題を解決し、2018年度は拡張ナノ流路の熱光学特性を制御可能なデバイス作製を実現しているため。昨年度までに開発した光学系とフッ化カルシウムを壁面基材として用いたデバイスを用い、励起光強度の増強とノイズ低減に取り組み検出性能を評価する。最終目標として、生体分子の無標識一分子検出を目指す。平成29年度は、UV励起型かつバックグラウンドフリー化のための光学系を開発した。これまでの光学系では、プローブ光だけでなく励起光も微分干渉プリズムを通過する構造であった。しかし、これをUV励起型にするとプリズムにおける紫外励起光の透過性と可視プローブ光の干渉性の両立が困難であり、検出における感度低下の要因となっていた。そこで、励起光とプローブ光の光路を独立化させた光学系を開発することで、UV励起型でもプローブ光の高精度の干渉を実現した。これにより、干渉によるバックグラウンド低減率が従来よりも5倍高い消光比1/340を達成した。これは従来光学系によるUV励起型POPSよりも感度が桁で高い検出が可能であることを意味している。今後、新たに開発した光学系を用いて生体分子の検出性能の評価に取り組む。当初研究計画通りにUV励起型POPSにおける光学系の問題を解決してプローブ光干渉の性能向上を実現しているため。今年度開発した光学系を用いて励起光強度の増強とノイズ低減に取り組み検出性能を評価する。

一方、検出に用いる拡張ナノ流路への断熱部への組込などによる流路の熱光学特性の制御にも着手する。昨年度までに開発した光学系とフッ化カルシウムを壁面基材として用いたデバイスを用い、励起光強度の増強とノイズ低減に取り組み検出性能を評価する。最終目標として、生体分子の無標識一分子検出を目指す。
シトクロムP450camオペロン・リプレッサー(CamR蛋白質)の構造と機能解析

CamR蛋白質は、カンファー分解菌であるPseudomonas putida PpG1(ATCC17453)株のCAMプラスミド由来のリプレッサー蛋白質であり、シトクロムP-450camオペロン(camDCAB)の発現を制御する。また、このリプレッサーはcamDCABオペロンおよびcamR遺伝子も自己調節し、CamR蛋白質が一ケ所に結合することにより、camDCABオペロンおよびcamR遺伝子の転写を同時に抑制する。また、カンファー存在下ではリプレッサーは不活化され、それぞれの転写開始点から逆方向に両遺伝子群が発現される。以上のような特異的な性質を持つCamRリプレッサーの構造および機能解析を研究の目的とした。本年度は、CamR蛋白質の生化学的性質と立体構造(X線)の解明を中心に研究を行なった。CamR蛋白質の機能ドメインの解析は第3班の郷通子博士(名古屋大・理)と共同で行なった。CamR蛋白質のモジュール予測では、アミノ酸配列のN末から14-33番目(領域I)および40-59番目(領域II)の領域がDNA結合ドメインである可能性があった。このモジュールの結果を基に、二つの領域のアミノ酸を一つずつ変異させたCamR蛋白質を多数作製した。それぞれの変異CamR蛋白質のDNA結合能を測定した結果、領域Iの後半部分および領域IIの前半部分がDNA結合に重要であることがわかった。さらに、CamR蛋白質の基質(カンファー)結合部位のアミノ酸配列の特定とともに、リプレッサーの機能とそのアロステリズムを検討中である。また、CamR蛋白質の立体構造を解析するため、この蛋白質の結晶化を第3班の白木原康雄博士(兵庫教育大)と共同で進めており、やや大きな結晶を得ることが可能になった。
細胞内Ca^<2+>動態に調節されるBAD活性およびアポトーシスのイメージング

本研究では、ミトコンドリアを介した細胞死を調節する鍵となる"BADと14-3-3分子の結合・解離"を可視化する方法を新規に開発し、生きた細胞での両者の結合・解離とアポトーシスをリアルタイムに観察することによって、様々な刺激に応じた細胞死調節の実態に迫った。具体的には、BADと14-3-3分子それぞれに蛍光タンパク質CFPとYFPを付け、両分子の距離を蛍光エネルギー移動(FRET)効率で測定した。昨年度までに本方法のin vitroでの評価を終え、生きたFL5.12細胞への適用にも成功した。そして、従来BADは14-3-3分子と解離した後には速やかに細胞死を誘導すると予想されていたが、実はBADが14-3-3分子と解離しても必ずしも細胞死を導くわけではないということを明らかにした。本年度は、BADが細胞周期の進行に不可欠なキナーゼであるCdc2にリン酸化されると14-3-3分子と解離することを明らかにした。分裂を繰り返す細胞の中で、BADと14-3-3分子は細胞周期と同調して結合解離を繰り返していたのである。さらに、細胞周期の中でもBADと14-3-3分子が解離するG2/M期にはアポトーシスの進行が早いことも明らかにした。この研究成果は、増殖因子の欠乏を原因とするミトコンドリアを介した細胞死の機構が細胞周期とも連携していたという点で大きなインパクトを与えるものである。また、長らく明らかにされていなかった抗癌剤・タキソールの作用機構として、タキソールがCdc2の活性を上げることによってBADを介したアポトーシスを起こり易くするのであろうと提案した点では、がん治療法の開発にも貢献するものである。現在はこれらの成果を論文にまとめ、雑誌掲載に向けて海外のrefereeと議論しているところである。本研究では、ミトコンドリアを介した細胞死を引き起こす鍵分子であるBADの脱リン酸化状態を可視化する方法を新規に開発し、生きた細胞でBADの脱リン酸化とアポトーシスをリアルタイムに観察することによって、Ca^<2+>濃度変動などのセカンドメッセンジャーによる細胞死調節の実態に迫ることを目的としている。BADの脱リン酸化の可視化法としては、リン酸化BADと14-3-3分子が特異的に結合するので、14-3-3分子をリン酸化BAD認識プローブとして用いることにした。BADと14-3-3分子それぞれに蛍光タンパク質CFPとYFPを付け、両分子の解離を蛍光エネルギー移動(FRET)効率で測定することにより、BADの脱リン酸化状態を知る方法である。BAD-CFP、14-3-3-YFP融合タンパク質を同一細胞内に発現させ、生きた細胞内でBADの脱リン酸化を測定するつもりである。本年度は、このBAD脱リン酸化可視化法の評価をin vitroで行った。まずはBAD-CFP、14-3-3分子-YFPを組み替えタンパク質として作成しin vitroでFRET効率を測定した。蛍光分子をつける部位やリンカーの長さについて、より良い条件を探すため、10種類の分子を作り48通りの組み合わせについてFRETを測定した。期待通りにBADリン酸化に依存したFRETを起こした組み合わせの中から、特にシグナルの変化量が大きかったものを採用し、動物細胞に導入することにした。現在はレトロウイルスベクターを作成しているところである。本研究では、ミトコンドリアを介したアポトーシスを引き起こす鍵分子であるBADの脱リン酸化状態を可視化する方法を新規に開発し、生きた細胞でBADのリン酸化状態とアポトーシスをリアルタイムに観察することによって、様々な刺激に応じたアポトーシス調節の実態に迫ることを目的としている。BADのリン酸化状態の可視化は、リン酸化BADと14-3-3分子が特異的に結合することを利用し、14-3-3分子をリン酸化BAD認識プローブとして用いる方法をとった。BADと、14-3-3分子それぞれに蛍光タンパク質CFPとYFPを付け、両分子の解離を蛍光エネルギー移動(FRET)効率で測定することにより、BADのリン酸化状態を知る方法である。昨年度までにin vitroでBAD脱リン酸化可視化法の評価を終えた。本年度は、BAD-CFP、14-3-3分子-YFPを同一細胞内に発現させ、生きた細胞内でBADのリン酸化状態の変化によるシグナルの変化を測定することに成功した。さらに、これらのシステムをサイトカイン依存的なアポトーシスのモデル系として認められているFL5.12細胞に導入した。FL5.12細胞のインターロイキン3除去によるアポトーシスについて解析したところ、従来の説では14-3-3分子と解離したBADはアポトーシスを導くと考えられていたが、BADと14-3-3分子の解離は必ずしもアポトーシス導くわけではないということが解った。これはミトコンドリアを介したアポトーシス機構の解明に新しい展望を与えるものである。現在はBADと14-3-3分子の解離がアポトーシス誘導に与える影響についてさらに突き詰めて解析している。

昨年度までに本方法のin vitroでの評価を終え、生きたFL5.12細胞への適用にも成功した。そして、従来BADは14-3-3分子と解離した後には速やかに細胞死を誘導すると予想されていたが、実はBADが14-3-3分子と解離しても必ずしも細胞死を導くわけではないということを明らかにした。本年度は、BADが細胞周期の進行に不可欠なキナーゼであるCdc2にリン酸化されると14-3-3分子と解離することを明らかにした。分裂を繰り返す細胞の中で、BADと14-3-3分子は細胞周期と同調して結合解離を繰り返していたのである。さらに、細胞周期の中でもBADと14-3-3分子が解離するG2/M期にはアポトーシスの進行が早いことも明らかにした。この研究成果は、増殖因子の欠乏を原因とするミトコンドリアを介した細胞死の機構が細胞周期とも連携していたという点で大きなインパクトを与えるものである。また、長らく明らかにされていなかった抗癌剤・タキソールの作用機構として、タキソールがCdc2の活性を上げることによってBADを介したアポトーシスを起こり易くするのであろうと提案した点では、がん治療法の開発にも貢献するものである。現在はこれらの成果を論文にまとめ、雑誌掲載に向けて海外のrefereeと議論しているところである。
甲状腺癌進展におけるTERTプロモーター変異・テロメア異常の病因的意義解明

甲状腺乳頭癌が未分化癌に転化する前後の遺伝子異常、蛋白発現異常を解析し、未分化転化のリスク因子の同定を試みた。「乳頭癌に由来する未分化癌」では、BRAF、TERTプロモーターの各変異が高頻度に存在し、それらのほとんどが乳頭癌の段階で獲得されることを明らかにした。また、「未分化転化のない乳頭癌」との比較で、TERTプロモーター変異が未分化転化の独立したリスク因子であることを明らかにした。その他、PIK3CA変異、p53、TTF-1、SWI/SNF蛋白の発現異常についても検討した。これらの知見は、甲状腺乳頭癌のTERTプロモーター変異を用いたリスク分類の確立の基礎となるものである。【研究の背景・目的】甲状腺癌の約90%は高分化癌である乳頭癌で、一般に予後良好である。しかし、乳頭癌の一部は、高悪性度で予後不良な未分化癌に進展する(未分化転化)。乳頭癌から未分化癌に至る多段階的進展のメカニズムには不明な点が多く、高リスク乳頭癌を抽出、層別化するバイオマーカーは確立されていない。本研究では、乳頭癌から未分化癌に至る多段階的進展過程における遺伝子異常の継時的変化、つまり各遺伝子異常がどのタイミングで獲得されるかを解明する。【初年度の研究成果】研究初年度は、乳頭癌成分を伴った未分化癌について、乳頭癌成分と未分化癌成分のそれぞれについて遺伝子解析、蛋白発現の解析を行い、暫定的に以下のデータを得た。1)未分化転化の過程において、BRAFV600E変異、TERTプロモーター変異は乳頭癌の段階で獲得されている。また、未分化転化をきたした乳頭癌におけるTERTプロモーター変異の頻度は、純粋な乳頭癌の変異頻度よりも有意に高かった。したがって、TERTプロモーター変異は未分化癌への進展リスクを評価するバイオマーカーとなりうる。2)一方、TP53遺伝子の変異は、乳頭癌の段階では陰性で、未分化転化の際に生じている。3) ARID1AなどのSWI/SNF複合体蛋白の異常は、今回検討したなかでは確認されなかった。4)甲状腺癌で頻度の高い変異であるNRAS Q61R変異に対する変異蛋白特異的な免疫組織化学を確立することができた(Oishi N et al。Hum Pathol。2016)。【研究の意義と今後の方針】本研究の完遂より、未分化癌に進展する可能性の高い乳頭癌を適切に抽出し、術後治療を個別化できると期待される。研究目的を達成しうる技術的プラットフォームが確立できたため、次年度では症例数を増やし、高分化型甲状腺癌が未分化癌への進展する分子機構を、さらに解明したい。乳頭癌成分を伴う未分化癌3例について、乳頭癌成分、未分化癌成分のそれぞれで遺伝子異常、蛋白発現を解析した。BRAF V600E変異は全例において、乳頭癌の段階から獲得されていることが明らかになった。また、TERTプロモーター変異も全例で乳頭癌の段階からC228Tが陽性であった。一方、p53のびまん性強発現は67%の症例で認められたが、いずれも未分化癌の段階で生じていた。その他、ARID1AなどSWI/SNF複合体を構成する蛋白の発現消失は、いずれの症例でも明らかでなかった。純粋な乳頭癌で、上記症例と年齢を調整した症例を対照群として遺伝子変異を検討した。BRAF V600E変異は約90%にみられたのに対し、TERTプロモーター変異は50%程度にしか認められなかった。以上の結果から、BRAF V600E、TERTプロモーター変異をともに有する乳頭癌は、未分化癌に進展するリスクが高いことが示唆された。一般に、BRAF変異はそれ単独でも高リスク乳頭癌の指標として報告されているが、我々の解析では、BRAF変異自体は乳頭癌の中で高頻度にみられるものであり、単独ではリスク評価に不十分であると考えられた。その他の成果として、BRAF V600Eの次に頻度の高いドライバー変異であるNRASQ61Rに対する免疫組織化学を確立し、甲状腺癌においても有用であることを報告した。しかし、一部の乳頭癌は極めて予後不良な未分化癌に進展する(未分化転化)。乳頭癌が未分化癌に進展する分子メカニズムには不明な点が多く、乳頭癌における未分化転化のリスク因子は確立されていない。本研究では未分化転化の前後に生じた遺伝子異常、蛋白発現異常を解析し、各異常が生じたタイミングに注目することで未分化転化のリスク因子の同定を試みた。【方法と研究成果】乳頭癌成分を伴った未分化癌を収集し、乳頭癌、未分化癌の各成分についてBRAF、TERTプロモーター、PIK3CAの遺伝子変異、p53、TTF-1、SWI/SNF複合体の蛋白発現を解析した。本研究では以下の点を明らかにした。1BRAF、TERTプロモーターの各変異は、未分化癌においてそれぞれ91%、95%と頻度が高く、そのほとんどが乳頭癌の段階から生じていた。2PIK3CA変異は未分化癌において33%の頻度で存在した。また、未分化転化の前後どちらでも生じており、時相的に不均一であった。

3p53、TTF-1の発現異常は未分化癌でそれぞれ63%、59%に生じていた。これらの異常はすべて未分化癌成分のみで認められた。4SWI/SNF複合体蛋白の発現消失は未分化癌の7%に存在した。この異常が生じるタイミングは、未分化転化の前後で不均一だった。5未分化転化のない乳頭癌92例を対照とした多変量解析で、TERTプロモーター変異は未分化転化の独立したリスク因子であった。【研究の意義】乳頭癌におけるTERTプロモーター変異は、乳頭癌の予後不良因子であるだけでなく、未分化転化の独立したリスク因子であることを世界で初めて明らかにした(国際学術誌に投稿中)。今後、TERTプロモーター変異を用いた乳頭癌のリスク分類、治療の個別化に繋がると期待できる。甲状腺乳頭癌が未分化癌に転化する前後の遺伝子異常、蛋白発現異常を解析し、未分化転化のリスク因子の同定を試みた。「乳頭癌に由来する未分化癌」では、BRAF、TERTプロモーターの各変異が高頻度に存在し、それらのほとんどが乳頭癌の段階で獲得されることを明らかにした。また、「未分化転化のない乳頭癌」との比較で、TERTプロモーター変異が未分化転化の独立したリスク因子であることを明らかにした。その他、PIK3CA変異、p53、TTF-1、SWI/SNF蛋白の発現異常についても検討した。これらの知見は、甲状腺乳頭癌のTERTプロモーター変異を用いたリスク分類の確立の基礎となるものである。対照群となる"未分化転化をしていない乳頭癌"については、十分な症例数を確保し、BRAF V600E、TERTプロモーターの遺伝子解析が完了している。一方、"乳頭癌成分を伴う乳頭癌"は、もともと切除例が希少であることもあり、今後さらに症例を蓄積する必要がある。具体的な方策として、伊藤病院、がん研究会がん研究所病理部と研究協力することにより、現在公表に足る症例数を確保しつつある。研究計画の変更点として、いくつかの新規遺伝子異常を解析項目に加える点があげられる。乳頭癌、未分化癌の次世代シークエンス解析により、PIK3CA、SWI/SNF複合体蛋白などTERTプロモーター変異以外の新規遺伝子異常が同定された。本研究をよりよいものにするために、これらの遺伝子異常の検索を追加する必要がある。具体的には、PIK3CAはダイレクトシークエンス、SWI/SNFは免疫組織化学による解析方法を確立したので、今後はこの手法を加えてより多角的な研究を遂行していく。当初の計画分、解析に用いる技術的なプラットフォームはこれまでに確立されているため、今後もスムーズに解析が進行すると予測される。病理学
高温超伝導溶融バルク体の臨界電流密度の磁場中特性の制御

元素置換や酸素処理の履歴、出発組成などによる溶融バルク高温超伝導体の臨界電流密度(J_c)や捕捉磁場などの変化を系統的に調べた。最初にDy系の出発組成を最適化し、これにCeO_2を添加したところ、融液の染み出し量が減少して捕捉磁場が10%以上上昇した。さらにZnOの微量添加を行った結果、77KでのJ_cが3T以下の広い範囲で増大し、捕捉磁場も20%上昇した。試料径、CeO_2の有無などによらず、ZnOを0.025wt%程度添加したときにJ_cと捕捉磁場が最も高かった。次にSm系にZnOを添加したところ、捕捉磁場が1.5倍に上昇した。特にSm211相が欠乏する種結晶直下領域でもZp置換によるピン止め中心が形成されてみが向上し、捕捉磁場の増大をもたらすことがわかった。さらにNd-Eu-Gdの3元系の直径30mm以上の単結晶粒試料の育成に始めて成功した。211相のGdの比が低いほど液体窒素堤度での捕捉磁場が高いが、Gd含有量が高いと材料強度が上がり、低温で割れずに捕捉できる磁束密度が高いことがわかった。さらに、Sm-Eu-Gdの3元系でもGdの211相の割合が50%のときに、液体窒素温度での捕捉磁場が高かった。一方、溶融バルク体の酸素の拡散係数は単結晶と多結晶体の中間程度であり、銀添加により組織が繊密化すると低くなることを明らかにした。Sm系やはJ_cと捕捉磁場が高い試料を得るには低温での酸素アニールが重要であった。しかし、低温では酸素の拡散が遅いため、10気圧の高圧酸素アニールの効果を調べた。その結果に基づき、2段階処理法を考案し、その有効性を確認した。まだ、微細な組織を有すると報告されたY_2Ba_4CuZrO_yをSm系試料に添加したところ、種直下領域で欠乏するSm211相を補うピン止め中心が形成され、1mol%程度の微量添加磁場が向上することがわかった。様々な123系高温超伝導体の、元素添加や酸素処理による臨界電流密度(J_c)特性の変化を調べ、その溶融バルク体の特性との対応を探る目的で実験を行った。まず、大気中合成が可能なDy系へのCeO_2添加効果を調べた結果、J_cの変化は小さいものの、溶融時の融液の染み出しが少なく、それを反映してバルク体では捕捉磁場が10%以上上昇した。さらに、ZnOを微量添加したところ、J_cの向上が見られ、77Kでの捕捉磁場も20%上昇し、温度低下に伴う捕捉磁場の上昇率も向上した。一方、(Nd-Eu-Gd)系超伝導体の直径30mm以上の単一結晶粒試料の育成に始めて成功し、希土類サイトの組成によってJ_c特性が変化するため、211相の組成を変えることで直径30mm試料で77Kでの最大捕捉磁場1.38Tを記録した。一方、溶融バルク体内の酸素の拡散係数は単結晶試料、多結晶試料の中間にあること、銀添加による組織の緻密化により拡散係数が低下することを明らかにした。

また、Sm系ではY系よりも低温での酸素処理が必要であり、高いJ_cを得るには300°Cでのアニールが必要であること、その場合、酸素拡散が遅いために直径30mm試料で400時間以上要し、試料の大型化に伴い酸素アニールの長時間化が問題であることを指摘し、それを短縮する目的で10気圧酸素下での酸素アニールを行い、100時間でほぼ同等の捕捉磁場を有する試料が得られることがわかった。さらに、Sm/Ba置換を抑制するために通常は低酸素分圧下で育成されるSm系溶融バルク体が、大気中で育成しても予想以上に高い特性を有する原因を調べ、初期のSm/Ba置換によって組成ずれが生じるために育成の進行とともに置換が抑制され、結果として大気中であっても比較的高い特性を有する試料が得られることがわかった。本研究では様々な123系高温超伝導体の、元素添加や酸素処理による臨界電流密度(J_c)の変化を調べ、その溶融バルク体の特性との対応を探った。本年度はまず昨年度に続いて、大気中合成が可能なDy系にZnOを添加したバルク体を様々な条件で育成した。その結果、試料径、CeO_2添加の有無などにかかわらず、ZnOを0.025 wt.%程度の微量に添加したときに最もJ_cが向上し、捕捉磁場も高いことがわかった。さらに、Znは磁場誘起型のピン止め中心を形成することが期待されていたが、実際には磁場中だけでなくゼロ磁場でもJ_cが向上することが判明した。そこで、磁場中のJ_cが高いSm系にもZn添加を行ったところ、捕捉磁場が向上した。特に、バルク試料の局所的な特性を調べた結果、成長速度の違いに起因した211相の偏析が原因で特性が低下する種結晶直下領域でも、Zn添加によりJ_cが向上し、これが捕捉磁場の向上をもたらすことがわかった。また、フラックス法によるY系の単結晶も育成し、Zn添加による磁場中のJ_cの変化を調べた。さらに、最近微細な組織を有すると報告されたY_2Ba_4CuZrO_yを添加したSm系バルク試料の育成も行い、初めてバルク体の特性を評価して、1 mol%程度の微量添加で捕捉磁場が向上することを見出した。一方、希土類元素の比によってJ_cの磁場依存性が変化する(Nd-Eu-Gd)系については、昨年度に続いて出発組成をさらに幅広く変化させ、211相のGd含有量が高い場合に低温での捕捉磁場が高いことを示した。また、NdをSmに変えた(Sm-Eu-Gd)系でも同様に出発組成を変化させて直径30mmの単一結晶粒試料を育成し、J_cや捕捉磁場などを評価した。その結果、やはり211相の組成にGdが50%以上含まれているときに、特に高い捕捉磁場が得られることがわかった。
透過型電子顕微鏡内その場光励起分光測定による半導体極微小欠陥の熱的挙動の研究

透過型電子顕微鏡内その場可視分光測定により、化合物半導体GaP中における、電子線照射下での点欠陥反応について研究した。この結果は、電子励起状態での点欠陥反応の構造論、電子論両面からの研究に対する、透過電顕観察(TEM観察)下での光物性測定の有用性を示すものである。GaPに90K以上で200keV電子線照射を行い、照射後に700K以上で熱処理を加えると、照射領域のみに格子間型転位ループの形成がTEM観察された。系統的なTEM観察の結果、ループの形成は電子線照射下で導入された格子間原子対の拡散が原因と結論された。しかし照射中には格子欠陥の明瞭なコントラストは観察されない。TEM法では直接観察が困難な電子線照射下での点欠陥反応を、TEMモードのフォトルミネセンス/カソードルミネセンス法により調べた。試料は90K以下で560、725、820nm付近に残留不純物の酸素および硫黄による発光を示す。90K電子線照射で、この不純物発光の強度の減少が観測された。この結果は非発光準位を生じる照射誘起欠陥の形成を意味する。発光強度の減少は20K照射では見られないが、照射後90Kで熱処理した試料を再び20Kで測定すると照射領域のみ発光強度の減少が見い出された。この温度領域では、原子空孔は拡散できない。これらの結果は、(1)電子線照射下で導入されたフレンケル欠陥は20Kでは凍結、(2)格子間原子の熱的拡散で非発光準位を生じる複合欠陥を形成、の2点を強く支持する。90K照射で、発光強度の逆数は照射量の自乗に比例して増加した。これは複合欠が照射量の2乗に比例して生成と考えれば巧く説明でき、2個の格子間原子の拡散集合による複合欠陥、すなわち格子間原子対の生成を示唆する。これは、高温でのループ成長過程の解析より得られた結論とも一致する。
ダイヤモンドアンビルセル中の高感度高精度磁化測定装置の開発

本テーマの目的は、ダイヤモンドアンビルセル中での磁気測定の感度と精度を、われわれが開発したSQUID振動コイル磁束計を基にして、さらに向上させることである。1.ノイズの低減:検出コイルのリード線の不規則な振動を押さえるためにリード線の取付治具を改良し、SN比の良い信号が安定して得られるようになった。2.アンビルの機械的固定:アンビルに圧入した小型リングを用いてアンビルをピストンに機械的に固定する方法を開発した。非常にコンパクトに固定できるので、検出コイルやガスケットの取付に支障が起きにくい。通常行われているエポキシ樹脂による固定で問題になる磁気的バックグラウンドが解消され、さらに、アンビルの脱着を短時間に行うことが可能になった。3.複合ガスケット:一般に磁気測定には銅ベリリウムの非磁性ガスケットが使われるが、圧力上限は10GPa付近にある。磁性は銅ベリリウムより大きいが強度の高いNiCrAl合金をアンビルの先端部分が当たる部分のみに使い、これを支えるガードルを銅ベリリウムで構成した複合ガスケットを開発した。30GPaで30ミクロン以上の厚さを確保できることがわかり(銅ベリリウムでは10ミクロン以下)、磁気的には銅ベリリウム程度に非磁性で、強度的にはNiCrAlと同等のガスケットが得られた。4.30GPaまでの精密磁気測定:開発した成果を使って、これまで困難であった30GPaまでの磁性の圧力変化を調べる実験をCs_2CuF_4の試料で行った。その結果、21GPa付近で2次元面内の強磁性の消失を初めて観測し、また、バックグラウンドの大きさや再現性が従来よりも1桁改善されたことを確認した。以上、バックグラウンドノイズの原因を特定し、改善することが出来た。さらに、精密磁気測定が可能な圧力範囲を10GPaから30GPa付近まで拡大することも出来た。数GPa以上の超高圧下でのX線構造解析実験や光学測定などにダイヤモンドアンビルセル(DAC)が広く用いられているが、DAC中の高精度な磁気測定は、検出コイルの配置に大きな制約があるため、一般に非常に困難である。そのため、多くの場合、検出の容易なキュリー温度や超伝導転移温度の測定に留まっている。本テーマは、われわれが開発を続けているSQUID振動コイル型磁束計の改良を行い、DAC中の反強磁性体の信号をさらに高感度・高精度に検出できるようにすることである。平成15年度は、従来の大きな課題であるノイズの低減と測定精度の向上を行うことが出来た。[ノイズの低減]DACのクライオスタットへの脱着を容易にするために、従来、検出コイルのリード線の大部分はセロハンテープを使ってクライオスタットに固定してきた。そのため、固定が不十分になってリード線が不規則に振動し、ノイズ発生の大きな原因になることがあった。今回、リード線を再現性良く、しかも非常にコンパクトに固定するジグを考案し、一部を除いてセロハンテープによる固定をなくすことが出来た。改良の効果は大きく、SN比の良い信号が安定して得られるようになった。[測定精度の向上]従来、4K以下ではバックグラウンドが温度に反比例して大きくなり、低温での測定精度に問題があった。今回、バックグラウンドの大きな原因がアンビルを固定するエポキシ樹脂によるものであることがわかり、樹脂を変更することによりバックグランドの温度変化を大幅に低減することが出来、測定精度が大幅に向上した。さらに、ダイヤモンドアンビルに含まれる強磁性不純物もバックグラウンドとして無視できないことがわかった。これらの結果から、さらに低温-^3Heや^3He-^4He温度領域-での実験に目処をつけることが出来た。

本テーマは、われわれが開発を続けているSQUID振動コイル型磁束計の改良を行い、ダイヤモンドアンビルセル(DAC)中の微弱な信号をさらに高感度・高精度に検出できるようにすることである。今年度は、アンビルの機械的固定法と複合ガスケットの開発、そしてこれまでの研究結果のとりまとめを行った。[アンビルの機械的固定]銅ベリリウムのリングを用いてアンビルをピストンに固定する方法を開発した。検出コイルやガスケットの取付に支障がないように、小型のリングで非常にコンパクトに固定できるところに大きな特長がある。これにより、広く行われているスタイキャスト#2850による固定で問題になる磁気的バックグラウンドが解消された。さらに、樹脂の硬化時間や除去の手間などを考えなくても良いため、アンビルの脱着を短時間に行うことが可能になった。[複合ガスケット]一般に磁気測定には銅ベリリウムの非磁性ガスケットが使われるが、強度上その圧力上限は10GPa付近にある。超伝導体であるレニウムはメガバール域で使われるガスケット材であるが、4K付近から完全反磁性のテールが現れるために、これ以下の温度では使えない。われわれは、磁性は銅ベリリウムより大きいが強度の高いNiCrAl合金をアンビルの先端部分が当たる部分(力が最もかかる部分)のみに使い、これを支えるガードル(ガスケットの大部分の体積を占める)を全て銅ベリリウムで構成した複合ガスケットを開発した。これにより、磁気的には銅ベリリウム程度に非磁性で、強度的にはNiCrAlと同等のガスケットを得ることが出来た。[30GPaまでの精密磁気測定]これまでの研究結果をまとめる意味で、成果に基づいたDACやクライオスタットを使って、これまで困難であった30GPaまでの磁性の圧力変化を調べる実験をCs_2CuF_4の試料で行った。その結果、20GPa付近で強磁性の消失を初めて観測し、また、バックグラウンドの大きさや再現性が大幅に改善された(大きさについては1桁以上小さい)ことを確認した。
アクチンキャッピングプロテインの精子妊孕能への影響と発現制御機構の解析

アクチンキャッピングプロテインの精子妊孕能への関与を検討するため、体外受精(IVF)を行ったカップルの男性不妊患者でのアクチンキャッピングプロテインの発現と治療成績との関連について検討を行った。無精子症を除いた38例の射出精液の検体収集が可能で、キャッピングプロテインα3およびβ3の蛍光二重免疫染色を行った。正常形態精子100個を観察し異常染色率を算出し、IVFの治療成績との関連について検討した。検討項目は、受精率、胚盤胞到達率、受精率、妊娠率とした。精子濃度:141±75×106/mL,精子運動率:57.5±14.8%、精子奇形率:48.5±15.1%であった。周期当たりの受精率:55.7±36.8%、受精卵当たりの胚盤胞到達率:47.1±37.6%であった。異常染色率が20%未満と20%以上に分けると、各々、n=18,20、夫年齢:38.3±1.2, 39.0±1.2、妻年齢:36.7±1.1, 37.8±1.0、精子濃度:145±15, 139±14 (×106/mL)、精子運動率:56.8±3.5, 58.0±3.4、精子奇形率:44.8±3.5, 52.0±3.3であった。受精率は異常染色率20%未満:68.4%、20%以上:44.2%と有意に異常染色群で受精率が低かった。一方、胚盤胞到達率は異常染色率20%未満:41.5%、20%以上:53.1%で有意差を認めなかった。ICSIを行った男性不妊症患者の精子検体が収集出来ていない。一方、キャッピングプロテインβ3の転写開始点の予測配列の同定に難渋しており、クローニングが出来ていない。得られた男性不妊症患者のIVFによる妊娠率や生産率の結果を待つ。また、ICSIを行った男性不妊症患者でも精子検体を用いてキャッピングプロテインの発現解析を行う予定である。キャッピングプロテインのプロモーター解析については、引き続き転写開始部位の検索を行いクローニングを試みる。その上でプロモーター領域の解析を行う予定である。研究を進めていくうえで必要に応じて研究費を執行した為、当初の見込み額と執行金額が異なった。
霊長類扁桃体における情動情報と社会的情報の統合・制御機序の解明

怒り顔は、憤りを表現するとともに、見た者に恐怖を感じさせるように、社会的情報には、情動情報を伴うことがある。本研究課題では、情動情報と社会的情報が霊長類扁桃体で統合されていく過程を、行動学的・生理学的・薬理学的手法を用いて解明することを目指す。まず、サルを対象に、情動情報や社会的情報に応じて行動を適応させる動物モデルを開発する。その上で、扁桃体内の複数の神経核において、ニューロン応答が各情報より受ける影響や、各情報に対するペプチドホルモン・オキシトシンの作用を検証することから、扁桃体内での社会的情動情報の統合と制御の機序を明らかにする。
高等植物の小胞体ストレス耐性に関わるGタンパク質及びPLCシグナル伝達系の解明

植物は周囲の環境変化に適応して生命を維持するため、様々な戦略をたてながら進化を遂げてきた生き物である。近年の研究により、気温の上昇や塩濃度などの変化によってもたらされる環境ストレスが、植物の個々の細胞レベル特に細胞内小器官のひとつである小胞体レベルで明らかになりつつある。本研究では、高等植物の小胞体ストレス応答反応に、三量体Gタンパク質と脂質合成酵素のひとつが重要な働きをすることを明らかにし、その成果を3報の原著論文として英文の国際誌に報告した。平成25年度は下記の3項目に関して検証することを計画し、それらを遂行した。1)AtPLC2が根の発達に必須なPLC活性を担う主要な遺伝子であることを、薬理実験及び遺伝学的方法により示した。はじめにplc2植物体に根の発育欠損があることを明らかにした。次にAtPLC2が根の発達に必須なPLC活性を担う主要な遺伝子であることを検証するため、ProPLC2::PLC2を形質転換したplc2植物体を構築し、根の発育を観察した。その結果、PLC2を遺伝学的に相補した植物体では根の発育が回復した。さらに、plc2植物体にPLCの反応生成物であるIP3を添加したところ、根の発育欠損が相補された。これらのことから、根の発達におけるPLC活性の役割とPLC2の位置づけ、及びIP3の必須性が明らかになった。2)AtPLC2が小胞体ストレス耐性に関与することを明らかにした。plc2植物体が、ツニカマイシンが誘起する小胞体ストレスに脆弱であることを明らかにした。これまでにシロイヌナズナの小胞体ストレス応答時に発現が著しく上昇するマーカー遺伝子が複数報告されているため、BIP3を含む複数のマーカー遺伝子の発現をqRT-PCRによって調べたところ、plc2植物体では野生型と比べて、これらマーカー遺伝子の発現が上昇していることが明らかになった。3)AtPLC2の組織及び細胞内局在を同定した。ProPLC2::PLC2-GUSとProPLC2::PLC2-Venusを発現する形質転換植物を構築して、AtPLC2の組織及び細胞内局在を詳細に観察することにより、PLC2の局在を同定した。ProPLC2::PLC2-Venus植物体を用いた実験により、AtPLC2は細胞質膜だけでなく、根毛細胞の小胞様構造体にも局在することを明らかにした。1)9つのAtPLCアイソフォームのうち、plc2変異植物体に根の発育欠損があることを明らかにした。AtPLC2を遺伝学的に相補した植物体では根の発育が回復することを確認し、発育欠損がAtPLC2欠失によるものであることを示した。2)N-glycosylationの阻害剤であるツニカマイシンで芽生えを処理することにより、小胞体ストレス耐性について調べた結果、plc2変異植物体では、野生型と比較して感受性が上昇し、小胞体ストレスに対して脆弱であることを見出した。この結果を小胞体ストレスマーカー遺伝子の発現を指標にして、定量的リアルタイムPCR法によって検証した。3)組織及び細胞内特異的なAtPLC2タンパク質の発現を同定する目的で、ProPLC2::PLC2-GUS及びProPLC2::PLC2-Venus形質転換植物体を構築し、それらの発現パターンを明らかにした。平成27年度は、本研究で取得した実験結果を2本の論文としてまとめ、論文投稿を開始した。さらに、査読により要求された追加実験を行い、共に平成27年度内に掲載に至った。Plant Signaling & Behavior “Heterotrimeric G protein subunits differentiallyrespond toendoplasmic reticulum stress in Arabidopsis"においては、シロイヌナズナのゲノムにコードされた三量体Gタンパク質の各サブユニットが小胞体ストレスに対して異なる感受性を示すことを報告した。2年目であった平成26年度は、これまでの実験結果をまとめ、論文投稿段階まで到達したため順調に進展していると言える。さらに、小胞体に局在しN-glycosylationの初段階に必要な酵素であるArabidopsis Dolichol Kinase 1 (DOK1)の機能解析をAtPLC2と同様におこなうことで、その役割を明らかにした。よって全体としては、当初の計画以上に進展していると考える。細胞生物学本研究の目的及び計画は、高等植物の小胞体ストレス耐性に関わるGタンパク質及びPLCシグナル伝達系を解明するため、3年間で具体的に5項目に関して検証することであった。本年度はその最終年度にあたるが、これまで3項目に関して検証を終えている。本年度は、三量体Gタンパク質の特にベータサブユニットをコードするAGB1遺伝子に注目し、その機能を小胞体ストレス耐性に関わる観点から明らかにする。具体的に下記の実験を遂行し、問題を検証する。1)AGB1が小胞体ストレス耐性に関わることが報告されているが、その結果に異論がある。

AGB1が小胞体ストレス応答にどのように関わるか、agb1変異植物体の芽生えをツニカマイシンで処理すること及び、小胞体ストレスマーカー遺伝子の発現を指標にして、定量的リアルタイムPCR法を用いて検証する。Gα及びGγサブユニットに関してもT-DNA挿入形質転換植物の種を入手して検証する。2)AGB1タンパク質の細胞内局在を明らかにするため、ProAGB1:AGB1-Venus形質転換植物体を構築し、細胞内局在を同定する。AtPLC2タンパク質と同様の局在を示すかどうか、また小胞体ストレスに応答して局在が変化するかなど、AGB1及びAtPLC2タンパク質の挙動を明らかにする。3)AtPLC2とAGB1タンパク質が植物体内で実際に相互作用するかどうかについて、プルダウンアッセイを遂行することで、生化学的に検証する。また、AtPLC2とAGB1タンパク質のそれぞれに結合するタンパク質を、ノンバイアスな方法で同定する。初年度は上述の3項目に関して検証することを計画し、実際にその全てを遂行することができたため、順調に進展していると言える。特に、シロイヌナズナの根の発達におけるPLC活性の役割とPLC2の位置づけ、及びIP3の必須性を明らかにした点は意義深く、評価できると考える。出席予定であった学会に参加できなかったこと、及び消耗品の消費が予想より下回ったため次年度使用額が生じた。これまでのところ順調に進展している。2年目は、当初の計画どおり、1)小胞体ストレス及びGタンパク質シグナル伝達に関わるAtPLC2のシスエレメントの解析と2)AtPLC2とGβの相互作用の検証を行う。1)小胞体ストレス及びGタンパク質シグナル伝達に関わるAtPLC2のシスエレメントの解析野生型植物の小胞体ストレス応答時に、AtPLC2の発現が誘導されるか定量的なリアルタイムPCR法によって検証する。また、GTPγSの添加によりGαの活性型を維持した状態で、同じくAtPLC2の発現が誘導されるか検証する。同時にProPIPLC2::GUSを発現する形質転換植物体を用いて、上記反応に関わるシスエレメントの解析を行う。ほ乳類細胞のPLCβには、Gα及びGβγサブユニットが直接結合することが報告されている。AtPLC2のシスエレメントの候補を同定した際には、QCM (Quarts Crystal Microbalance;水晶発振子マイクロバランス測定法)を用いて、各種Gタンパク質サブユニットとの結合を検証する。2)AtPLC2とGβの相互作用の検証下記の2つの手法にて、AtPLC2とGβの相互作用について検証する:1)酵母ツーハイブリットシステム2)精製タンパク質によるプルダウンアッセイ。シロイヌナズナの芽生えからcDNAを合成し、それを鋳型として大腸菌タンパク質発現ベクターにAtPLC2とGβをコードする遺伝子をクローニングする。大腸菌内及び精製タンパク質を用いて、両タンパク質の相互作用を検証する。本年度は、7月に開催されるASPBに出席し、また研究打ち合わせを複数回計画している。物品に関しては、計画中の生化学的実験に主に使用予定である。