hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ポーリンチャネルの開閉調節の分子的及び構造的機構

緑膿菌は日和見感染症の主要起因菌である。緑膿菌は多くの抗生物質に自然耐性を示す。その原因の一つは外膜の障壁性に由来し、それは外膜の透過孔が小さいからである。報告者は外膜蛋白のうちでproteinC,D2,E1がポーリンであることを発見し、これらポーリンの透過孔は小さいことを明らかにしてきた。一方カルバペネム系薬剤のイミペネムは高い抗緑膿菌活性を示す。ところがイミペネムに耐性な菌が出現するようになり、その多くはproteinD2が欠損していた。そしてproteinD2にはイミペネム及び塩基性アミノ酸の結合サイトがあると報告された。そこでproteinD2の構造と機能を明らかにする目的で研究を行った。そしてproteinD2は孔形成ドメインとゲート形成ドメインからなり、物質透過の調節を行うチャンネルであることを発見した。そこで報告者はproteinD2のゲート開閉調節因子を調べた。proteinD2のゲートドメインにはCa^<2+>結合蛋白にあるCa^<2+>結合サイトと相同な配列のあることがわかった。そこでproteinD2にCa^<2+>を加えると蛋白の蛍光が変化し、Ca^<2+>の結合が示された。次にCa^<2+>を加えるとproteinD2のポーリン活性が増加した。しかしゲートを分解するとCa^<2+>による活性化は見られなくなった。これはCa^<2+>がゲートドメインに結合し活性化する調節因子であることを示す。次にprotein D2はペプチドを分解しアミノ酸を取り込むためのプロテアーゼ活性をもつのではないかと報告者は考えた。そして以下の結果を得た。(1)proteinD2にペプチド基質を加えると、基質の分解が見られた。(2)セリンプロテアーゼの特異的阻害剤であるDFPの処理により、分解反応は阻害された。(3)[^3H]で標識されたDFPは特異的にproteinD2を標識した。以上の結果はproteinD2そのものがプロテアーゼ活性をもつことを示す。これまでに知られているチャンネル蛋白の中でプロテアーゼ活性をもったチャンネル蛋白の存在を示したこの発見はチャンネル蛋白研究に新たな境地と開くと考えられる。緑膿菌薬剤耐性の一因は外膜の持つ薬剤透過障壁性にある。その外膜で栄養物、老廃物や薬剤の透過孔を形成する蛋白がポーリンである。緑膿菌外膜にあるOprD2蛋白がポーリンである事、およびOprD2蛋白は従来のポーリンと同様な孔を形成する領域(ドメイン)を持つと同時にその孔の開閉を行うゲートも持つ事を申請者は明らかにしてきた。そして本研究期間でOprD2チャンネルのゲートの開閉を調節する因子の一つがCa^<2+>である事を明らかにした。Ca^<2+>に注目した理由は、本蛋白のゲートドメインの一次構造の中に、Ca^<2+>結合配列と相同な配列が見いだされたからである。

まずOprD2蛋白の蛍光を測定してみると、Ca^<2+>濃度に依存して蛍光の強度が変化する事が観察され、OprD2がCa^<2+>親和性を持つ事が示された。次にCa^<2+>結合がOprD2ポーリンの活性に影響するかをリポソーム再構成系を用いて調べた。その結果、Ca^<2+>を加えると濃度依存的にポーリン活性が増大し最大で3倍の活性化がみられた。ところがトリプシンでゲートを壊したOprD2ではこの様な活性化は起こらなかった。以上の結果は、Ca^<2+>がゲートドメインに結合し、それによって孔の開閉の平衡状態が開いた側にシフトし活性化が起こった事を示唆している。Mg^<2+>イオンなど他の二価カチオンではこの様な活性化の効果はみられず、Ca^<2+>がOprD2チャンネルのゲート開閉の特異的な調節因子である事が示された。x線結晶解析によるOprD2チャンネルの立体構造の解明を目指して、OprD2蛋白を大量に発現する系を確立し、それから蛋白を大量に精製し、結晶化を試みる。まずクローン化したOprD2遺伝子を高発現ベクターに連結し大腸菌あるいは緑膿菌にそれを入れ、蛋白の発現を調べる。そしてこの様な発現ベクターをうまく大腸菌に入れる事に成功したところである。現在この菌での蛋白発現を調べている。緑膿菌は日和見感染症の主要な起因菌である。病院内感染の中で高頻度で見られるものも緑膿菌感染症である。緑膿菌は多くの抗生物質に自然耐性を示し、その原因の一つは外膜の障壁性にあり、それは外膜に存在する物質透過孔が小さいことに由来する。報告者は緑膿菌外膜蛋白質のうちでprotein C,D2,E1の蛋白がポーリンであることを発見し、これらポーリンの透過孔は小さいことを明らかにしてきた。一方カルバペネム系薬剤のイミペネムは高い抗緑膿菌活性を示す。ところがイミペネムに耐性な菌が出現するようになりこれの多くはproteinD2を欠損していた。またproteinD2にはイミペネム及び塩基性アミノ酸に対する結合サイトのあることが報告された。そこでproteinD2の構造と機能を明らかにする目的で研究を行った。そしてproteinD2はチャンネル形成ドメインとゲート形成ドメインからなり、物質透過の調節を行うチャンネル蛋白であることを発見した。次にproteinD2はペプチドを分解しアミノ酸を取り込むためのプロテアーゼ活性をもつのではないかと報告者は考えた。そして以下の結果を得た。(1)proteinD2にペプチド基質を加えると、基質の分解反応が観察された。(2)セリンプロテアーゼの特異的阻害剤であるDFPでproteinD2を処理すると基質分解反応はほぼ阻害された。(3)[^3H]で標識されたDFPで処理したところ、特異的にproteinD2蛋白が標識された。以上の結果はproteinD2そのものにプロテアーゼ活性のあることを示している。(4)proteinD2の触媒残基であると考えられるSerをDFPで修飾したときに、ポーリン活性の減少が見られた。これはプロテアーゼの活性部位がチャンネル孔の近くにあることを示唆している。
凍結細胞スフィアを用いた簡便な新規in vitro毒性評価系評の確立

本研究の目的は,新たな細胞凍結技術を用いて、凍結保存可能なin vitro試験用のプレートを開発することである。マウス皮膚線維芽細胞を用いた。通常の平面培養された細胞では、解凍後ほとんど細胞の生存が得られなかった。次に、スフェロイド培養を行ったところ、解凍後も細胞の生存が得られることを確認した。凍結解凍に適切なスフェロイドの大きさ、凍結保護剤の濃度、凍結保護剤の量について検討を行い、最適化を行った。また、凍結したスフェロイドに培地を添加し、洗浄することなく安定した細胞増殖が得られた。本研究により、凍結保存が可能で、解凍後直ちに使用可能なin vitro試験用のプレートのプロトタイプを作成した。従来薬剤等の安全性試験には動物が用いられてきた。しかしながら、動物愛護の立場からできるだけ動物を用いない安全性試験の実施が進められている。その中で最も有用性が高いのが、培養細胞を用いたin vitro試験である。その一方で、評価には細胞の調製や播種といった煩雑な操作が必要であり、実施可能な施設は限られていた。本研究の目的は、新たな細胞培養技術であるスフィア培養に着目し、この技術を用いて凍結保存可能なin vitro試験用のプレートを開発することである。はじめに、細胞源としてNIH-3T3細胞およびマウス由来線維芽細胞を用いて、スフィア形成条件の検討を行った。スフィア形成には、回転培養およびスフィア形成専用プレートの両方を比較したが、いずれにおいても効率的にスフィア形成が可能であった。また、形成されるスフィアの大きさは細胞数に依存した。回転培養では、適切な回転速度と濃度を維持することが重要であった。1つのスフィアを各プレートに1つずつ播種し、凍結保護剤を用いてプレート上で凍結した。解凍後の細胞の生存および増殖率について検討を行った。コントロールとして、プレート上で培養した細胞をそのまま凍結した群と、単離してペレットとした通常の培養細胞の凍結条件を使用した。通常のペレットによる凍結条件では、解凍24時間後で95%以上の生存率が得られた。また、ディッシュ上で培養した細胞については、解凍24時間後の生存率は0%であった。一方スフィアについては、すべてのスフィアにて細胞の増殖を認めた。また、スフィアの大きさが小さい場合には増殖に限界があり、大きい場合には壊死する細胞が多く、安定した凍結保存が困難であった。平成28年度の実験から安定したスフィアによる凍結解凍条件を決定することができた。これまで確立してきたスフィア培養技術を用いることで、プレート上で安定して細胞の凍結、解凍が可能であることを示すことができた点が、最も大きな成果と言える。また、通常の細胞を接着培養したプレートでは生存率が0%であったことから、本技術の有用性が示された。スフィアについては細胞カウントができないために生存率は確認できないが、すべてのスフィアから安定して細胞増殖が得られたことから、in vitro試験システムとして使用可能と考えられた。従来薬剤等の安全性試験には動物が用いられてきた.しかしながら,動物愛護の立場からできるだけ動物を用いない安全性試験の実施が進められている.その中で最も有用性が高いのが,培養細胞を用いたin vitro試験である.安全性のみでなく治療効果のスクリーニングにも利用され,ますますその有用性が増している一方で,評価には細胞の調製や播種といった煩雑な操作が必要であり,実施可能な施設は限られていた.本研究の目的は,新たな細胞凍結技術を用いて凍結保存可能なin vitro試験用のプレートを開発することである.特に、解凍後直ちに使用可能なin vitro試験システムはを開発することである。スフィア培養は,神経幹細胞の培養法として1992年に報告されて以来徐々にさまざまな細胞の培養に応用されるようになった.もともと幹細胞の選択培養法として開発されてきた経緯から,それ以外の実用的な応用については十分検討されてこなかった.われわれは、このスフェロイド培養された細胞を用いることで、凍結、解凍後直ちに使用可能なin vitro試験用プレートの開発を行った。初めに、通常の培養プレート上で線維芽細胞の培養を行い、凍結、解凍を行ったところ、ほとんど細胞の生存が得られなかった。次に、スフェロイドの状態で凍結し、解凍を行ったところ、すべてのスフェロイドから生存細胞を回復することができた。本研究期間では、凍結解凍に適切なスフェロイドの大きさ、凍結のための凍結保護剤の濃度、凍結のために必要な最小限の凍結保護剤について検討を行い、最適化を行った。また、得られた凍結細胞に実際に培地を添加し、洗浄することなくすべてのスフェロイドから細胞増殖が得られることを確認した。本研究によって凍結解凍後直ちに使用可能なin vitro評価系を開発を行った。今後動物実験からin vitro評価系への移行が一層進むことが期待される.本研究の目的は,新たな細胞凍結技術を用いて、凍結保存可能なin vitro試験用のプレートを開発することである。

本研究により、凍結保存が可能で、解凍後直ちに使用可能なin vitro試験用のプレートのプロトタイプを作成した。今後の課題としては、スフィアをプレートに固定する方法である。すべてのスフィアで凍結、解凍後の生存が得られたが、スフィアは凍結あるいは解凍後にプレート内で移動したため培養細胞の分布には偏りがあり、そのままの条件では評価が困難となる可能性がある。また、解凍後ただちに評価するためには、使用する凍結保護剤の量を最小限とする必要があり、この点についても今後の検討が必要である。しかしながら、実験に必要な環境は整っており、これまでの研究も順調に推移していることから、研究期間内に実験を終了することは可能と考えている。再生医療これまでに講座で使用していた血清を用いたため、その費用が不要となった。また、細胞の凍結保存に用いるプレートを小さいものにしたため、効率的に実験を行うことが可能となったため。次年度はスフィアの固定技術を確立する必要があるが、類似の研究もこれまでにはあまり行われておらず、どの程度の実験が必要となるか予測困難である。したがって、次年度に持ち越された研究費については、固定条件の確立のために必要となるものと考えている。また、実際に使用可能なin vitro試験システムとするためには、さまざまな細胞についても同様の方法が可能かどうかを検討する必要がある。もし次年度繰り越した金額に余裕があれば、その他の細胞にも対象を広げて検討を行う予定である。
更新世の氷期ー間氷期サイクルが日本列島周辺魚類の分布形成に与えた影響の解明

本研究では,氷期-間氷期サイクルが日本列島周辺の海産魚,および通し回遊魚の分布パターン形成に与えた影響を明らかにすることを目的として研究を進めた.海産魚では,北太平洋に広く分布する寒海系魚類に海域間で遺伝的・形態的差異が認められるケースが多くみられたほか,暖海系魚類では,間氷期に対馬海峡によって個体群が分化した後,氷期の海退で二次的接触や交雑が生じたと考えられるパターンが複数の種で確認された.氷期-間氷期サイクルが淡水魚に与える影響については多くの研究例があったが,本研究の結果,海産魚や通し回遊魚でもその影響が大きいことが明らかとなった.本研究では,氷期-間氷期サイクルが日本列島周辺の海産魚,および通し回遊魚の分布パターン形成に与えた影響を明らかにすることを目的として研究を進めた.海産魚では,北太平洋に広く分布する寒海系魚類に海域間で遺伝的・形態的差異が認められるケースが多くみられたほか,暖海系魚類では,間氷期に対馬海峡によって個体群が分化した後,氷期の海退で二次的接触や交雑が生じたと考えられるパターンが複数の種で確認された.氷期-間氷期サイクルが淡水魚に与える影響については多くの研究例があったが,本研究の結果,海産魚や通し回遊魚でもその影響が大きいことが明らかとなった.本研究は,日本周辺の海産魚および通し回遊魚の現在の分布パターンがどのように形成されたかを解明するものであり,第四紀更新世(約260万年前から約1万年前)の氷期-間氷期サイクルの海洋環境変動が主要因の一つであるという仮説のもとに分析を行ってきた.寒海系魚類では,メバル属魚類のヨロイメバル複合種群,ムラソイ複合種群とキツネメバル複合種群に関する成果を論文として報告した.ヨロイメバル複合種群に含まれるヨロイメバル・コウライヨロイメバルは対馬海峡をはさみ,氷期-間氷期サイクルで種分化が起きた可能性が考えられた.ムラソイ複合種群とキツネメバル複合種群は2種を含んでいるものの,交雑が起こっていることが明らかとなり,特に後者では海洋環境が交雑の頻度に関わっていることが示唆された-また,ダンゴウオ科のコンペイトウは北太平洋に広く分布していると考えられていたが,遺伝的分析の結果,北西太平洋と北東太平洋の集団は遺伝的に大きく異なっているだけでなく,北西太平洋では日本海・オホーツク海にも有意な遺伝的分化が見られた.これはおそらく氷期の海水準低下に伴い,集団分化が起こったものと考えられる.暖海系魚類では,ウシノシタ科のデンベエシタビラメとアカシタビラメは今まで同種とされることが多かったが,形態および遺伝的分析から,別種とするのが妥当であることを明らかにした-しかし,有明海,瀬戸内海,日本海西部などで両種の交雑個体群が認められ,海水準変動との関係が考えられた.通し回遊魚では,山梨県西湖でクニマスおよび同属のヒメマスについてマイクロサテライトDNA分析を行い,両種が西湖では生殖的隔離を保っていること,両種間の遺伝的分化レベルは小さく,ヒメマス(ベニザケ)の地域個体群間の差異に相当することを明らかにした.本研究は,日本周辺の海産魚および通し回遊魚の現在の分布パターンがどのように形成されたかを解明するものであり,第四紀更新世(約260万年前から約1万年前)の氷期-間氷期サイクルの海洋環境変動が主要因の一つであるという仮説のもとに分析を行ってきた.寒海性魚類ではダンゴウオ科魚類に焦点を当てて研究を進めた.特にコンペイトウ類で,北西太平洋と北東太平洋の集団に大きい遺伝的分化が認められたほか,オホーツク海と日本海集団の間にも遺伝的・形態的差異が認められ,これらは氷期-間氷期サイクルにより分化が生じた可能性が高い.また,ダンゴウオの日本海集団と太平洋集団にも大きい遺伝的分化を見いだした.今後,より詳細な分析を行う予定である.暖海性魚類では,コノシロの種内に,深く分化した2つのミトコンドリアDNA系統が部分的に重複しつつ側所的に存在することが明らかとなった.重複分布域での生殖隔離の有無を調べるために多数のマイクロサテライトDNAマーカーを単離した.アカシタビラメ-デンベエシタビラメでは,前年度はAFLP法を用いて氷期の二次的接触によって生じたと思われる交雑の痕跡を検出したが,より詳細に分析するために,これらについても新規のマイクロサテライトDNAマーカーを単離した.また,スズキ属についてもミトコンドリアDNAとマイクロサテライトDNA分析によって,やはり氷期の二次的接触によって生じたと考えられる交雑の痕跡を見出した.通し回遊性魚類では,西湖のクニマスの発育に伴う形態変化を詳細に調べてヒメマスと比較し,結果を論文として発表した.また,本栖湖では両種の交雑に由来すると考えられる標本が少数見つかっていたため,より多くの個体についてミトコンドリアDNAを用いて調査したところ,クニマスの遺伝的要素を持つ個体が3割近く見出された.このため,マイクロサテライトDNAによる分析を進めている.本研究は,日本周辺の海産魚および通し回遊魚の現在の分布パターンがどのように形成されたかを解明するものであり,第四紀更新世の氷期-間氷期サイクルの海洋環境変動が主要因の一つという仮説で研究を行ってきた.最終年度として、下記の研究を行った。

寒海性魚類では,ゲンゲ科サラサガジ,ダンゴウオ科コンペイトウ,クサウオ科アバチャン,イカナゴ科について,海域間に明瞭な形態的・遺伝的差異を認め,それが氷期の隔離による可能性を示した.これらは,昨年度に論文として公表した.コンペイトウ,アバチャンについては分類学的な検討も必要であるため,投稿論文を準備中である.北太平洋には,日本海,オホーツク海などの半閉鎖的海域が多いが,多くの分類群で海域間に遺伝的・形態的差異が認められ,氷期における隔離がこれらの集団構造に影響を与えていることが示唆された.暖海性魚類では,昨年度までにコノシロの種内に深く分化した2つのミトコンドリア(mt)DNA系統が存在することを明らかにしたが,今年度は分析地点と個体数を増やして確認を行い,結果を論文として発表した.また,新しく開発したマイクロサテライト(ms)DNAマーカーによって重複分布域での両系統間の交配状況を調べ,遺伝子流動が制限されている可能性があることを確認した.この両系統は,氷期の隔離により成立し,その後二次的接触が生じたと考えられる.他に,タビラクチ,ミミズハゼ類等についてもmtDNA分析により分布形成の過程を調べた.通し回遊性魚類では,山梨県本栖湖においてクニマスとヒメマスの交雑状況をmsDNAおよびmtDNA分析によって調べた.その結果,本栖湖には西湖と異なり純粋なクニマス個体は見出されず,ヒメマスとの間で交雑群を形成していることが判明した.クニマスは間氷期に分化したと推定されるが,未だヒメマスとの間に交配後隔離は成立していないと考えられる.26年度が最終年度であるため、記入しない。魚類系統分類学26年度が最終年度であるため、記入しない。研究対象とする魚種や研究の進め方(標本採集と分析)については,フィールド調査の進み具合により,臨機応変に変更を行ったところもある.しかし,全体としては見ると,暖海系魚類,寒海系魚類,通し回遊性の魚類ともに順調に進展しており,最終年には予定通りの計画を遂行できる見込みである.対象とする魚類は,標本採集の進行状況に応じて臨機応変に対応できており,分析は滞りなく進んでいる.全体としては見ると,暖海系魚類,寒海系魚類,通し回遊性の魚類ともに十分なデータは得られており,論文化も順調である.最終年には予定通りの計画を遂行できる見込みである.26年度が最終年度であるため、記入しない。研究対象とする魚種は,暖海系魚類,寒海系魚類,通し回遊性の魚類にわけて研究を進めている.最終的に得られた複数種のデータから;各種の示す分散・分断・個体群拡大等の歴史を重ね合わせて全体としての層序構造を描くことを目標としているため,今年度は特に暖海系魚類,寒海系魚類,通し回遊性それぞれのデータの蓄積と言うことに重点を置き,計画を進める.研究対象とする魚種は,暖海系魚類,寒海系魚類,通し回遊性の魚類にわけて研究を進めている.最終的に得られた複数種のデータから,各種の示す分散・分断・個体群拡大等の歴史を重ね合わせて全体としての層序構造を描くことを目標としており,今年度は特に補足的データを収集してデータを強固にするとともに,各研究対象魚のデータをまとめて比較・考察して公表する.26年度が最終年度であるため、記入しない。研究対象となる魚類標本の採集、分析、研究成果の発表と刊行のために、繰越金74,738円を含めて使用する。標本の分析は分子解析のために試薬を購入する。採集した魚類標本は追試のために永久保存を行うが、そのための容器を購入する。研究成果の発表は該当学会で行い、論文は査読付の学会誌で行うので、そのための旅費と印刷費に使用する。研究資料である魚類標本を入手したが、分子分析が行われていない。
正常ヒト造血幹細胞における細胞内シグナル伝達機構の解析

アポトーシス阻害因子であるinhibitor of apoptosis (IAP)ファミリーは、バキュロウイルスが感染した昆虫細胞の不死化因子として発見された。ヒトIAPファミリーにはcIAP1 (cellular IAP1)、cIAP2、XIAP (X-linked IAP)、NAIP (neuronal apoptosis inhibitor protein)及びsurvivinが存在し、腫瘍化との関連も指摘されている。本研究においては、ヒト好中球におけるIAPファミリーの発現とアポトーシス制御におけるその役割を解析した。ヒト好中球には、cIAP1、cIAP2及びXIAP mRNAの発現が認められた。これらの分子のうち、cIAP2の発現が顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)剌激により特異的に誘導され、GM-CSFによっては誘導されなかった。cIAP2 mRNAの発現増加は、G-CSF剌激30分後にすでに認められ、cIAP2蛋白質の増加は1時間後に認められた。cIAP2蛋白質の増加は、G-CSFの投与を受けている健常人ドナーから得られた末梢血好中球でも認められた。G-CSF刺激によるcIAP2 mRNA及び蛋白質の発現増加、STAT3のリン酸化及び抗アポトーシス作用は共にAG490(JAK2阻害剤)により抑制された。慢性好中球性白血病患者から得られた成熟好中球においては、cIAP2 mRNAの過剰発現が認められ、好中球の生存も著しく延長していた。一方、慢性骨髄性白血病患者から得られた成熟好中球ではcIAP2 mRNAの過剰発現は認められず、好中球の生存も正常であった。これらの結果は、G-CSFがJAK2-STAT3を介してcIAP2を特異的に誘導することにより抗アポトーシス作用を示し、また、慢性好中球性白血病においては、cIAP2の過剰発現が好中球数の増加と白血病化に関与していることを示唆している。
細胞周期制御におけるカルシウム情報伝達系の意義:特に血管内皮・平滑筋細胞について

1.細胞周期進行における[Ca^<2+>]iの上昇の重要性。ニッケル(Ca^<2+>流入阻害)とリアノジン(Ca^<2+>放出阻害)の同時処理により[Ca^<2+>]i上昇を完全に阻害した状態では、血小板由来増殖因子(PDGF)による細胞周期のG_0期⇒G_1期移行やエンドセリンによるG_1期⇒S期/M期移行は、阻害されなかったが、アンギオテンシンによるG_1期⇒S期/M期移行は、阻害された。サイクリックAMP/Aキナーゼ情報伝達系の活性化により、[Ca^<2+>]iは低下するにも拘らず、細胞周期はG_0期⇒G_1期へ進行した。高グルコースは、[Ca^<2+>]iに影響を与えずに、細胞周期をG_1期⇒S期/M期へ進行させた。以上の結果から、1)[Ca^<2+>]i上昇は、G_0期⇒G_1期移行にとって必須ではない。2)[Ca^<2+>]i上昇は、G_1期⇒S期/M期移行にとっては重要な役割を果たしているか、その重要性の程度は増殖刺激の種類によると考えられた。2.細胞周期進行に伴うCa^<2+>チャネルのタイプの変化。G_0期細胞は、LタイプCa^<2+>チャネルのみを有している。しかし、細胞周期がG_1期、S期と進行するにしたがって、LタイプCa^<2+>チャネルは減少し、TタイプCa^<2+>チャネルが著明に発現されてくる。さらに、細胞周期がM期となると、TタイプCa^<2+>チャネルが消失し、LタイプCa^<2+>チャネルのみとなる。このようなCa^<2+>チャネルのタイプの変化は、Ca^<2+>動態調節に影響を与えると考えられ、現在、細胞周期進行に伴うCa^<2+>動態調節機構の変化について検討中である。3.セリン/スレオニン燐酸化酵素であるAキナーゼの活性化によって引き起こされるプロトオンコジーンの発現やG_0期⇒G_1期への細胞周期進行において、セリン/スレオニン燐酸化のみならず、ある核蛋白質のチロシン燐酸化も重要な役割を果たしている事が解った。4.血管内皮細胞には、エンドセリン(ET)のET_A受容体が存在し、[Ca^<2+>]i上昇を引き起こす事が解った。
チーム・パフォーマンス向上を志向した学生感情調節尺度とグループ風土評価尺度の開発

平成29年度の構成概念の検討において明らかとなった課題をもとに、基盤とする理論やモデルを再検討し、測定概念を「協同学習に参加する大学生のチーミング・パフォーマンス性向」に部分修正した。平成30年度は、尺度開発の第1段階目調査として、チーミング・パフォーマンス性向の構成概念を基盤として作成した質問の試作版ステートメントの妥当性を検討し暫定版尺度を作成するところまでを目標とした。2019年3月に倫理委員会に申請して承認を得た後、ウェブ調査会社(株式会社クロス・マーケティング社)に依頼して、国際標準教育分類ISCED-56(短期大学、高等専門学校、二・三年制の専門学校、大学、四年制専門学校)の高等教育機関に在籍している学生を対象としてweb調査を実施した(調査期間2019/4/242019/4/26)。目標対象数としていた150名(有効回答率100%)を確保でき、現在、統計解析の結果をもとに、試作版ステートメントの妥当性を検討し、暫定版尺度を作成している段階である。暫定版尺度が作成でき次第、すみやかに本年度の目標である第2段階目調査(研究目的は、暫定版尺度を用いた調査を実施し、その因子構造と実践的利便性を検討して予備尺度を作成す)に進む予定である。構成概念とそれをもとにした試作版ステートメントの作成、および倫理委員会の申請・承認に時間を要したため。平成30年度の目標である暫定版尺度を作成次第、すみやかに今年度の目標である第2段階目の調査を進める。本研究は、アクティブ・ラーニングで重要なメソッドの一つである協同学習におけるチーム・パフォーマンス向上を視野にいれて、保健医療分野の大学生が協同学習中の自身の感情調節(emotional regulation)の程度を自己評価する『チーミング・プロセス感情調節評価尺度』と、協同学習グループの感情風土(emotional climate)を評価する『ワークグループ風土評価尺度』を考案し信頼性・妥当性を検証することを目的としている。平成29年度は、「感情調節」「チームの感情風土」および「チーム・パフォーマンス」に関連する和洋書および国内・外の研究論文を収集し知見を整理した。その結果をもとに、尺度開発の基盤となる概念枠組みをオリジナルに作成することを本年度の目標としたが、海外論文等において隣接概念の尺度が確認されたことから、英語のオリジナル版を邦訳して信頼性・妥当性を検証する計画に変更するか、尺度開発の構成概念について改めて検討している段階である。また大学生を対象としたオンライン調査について計8社の関連業者の情報を比較検討した。業者によって、モニターのサンプリング方法やサービス内容、概算金額などにかなりの相違があり、本研究の目的を達成するためにどのようなデータ収集方法が最適であるか比較検討中である。文献の詳細な検討の結果、研究計画の方向性を再検討する課題に直面したため。平成30年度は、平成29年度に明らかになった課題を検討するなかで研究の方向性を明確化し、倫理委員会への申請・承認を得て、オンライン調査の準備を進めていく。消耗品費の値引きがあったため、5,318円の残額となった。次年度の消耗品費に使用予定。平成30年度に実施目標としていた第1段階目のweb調査の実施が、2019年4月にずれ込んだため。2019年度は、第1段階目の調査と第2段階目のweb調査2回分を支出として使用予定である。
発癌と細胞増殖制御における燐酸化チロシン蛋白の役割

1.細胞増殖因子によって誘導される受容体のチロシンキナーゼの活性化や、がん遺伝子産物のキナーゼ活性によって起る蛋白のチロシン燐酸化が本当に増殖シグナルの起点になるのかという問題について:(1)チロシンキナーゼ活性を阻害する薬剤ハービマイシンが癌細胞を正常化すること。(2)インスリン、IGF-1、EGFの受容体のチロシンキナーゼ部位に対する部位特異抗体でこれらの増殖因子による刺激が遮断されること。(3)発がん性を持たせたc-erbB-2のキナーゼ部位のLysをMetに変えるとキナーゼ活性がなくなると共に発癌性を失われること見出した。これらの結果はチロシンキナーゼが必要という考えを支持する。2.増殖シグナル伝達に働く、チロシンキナーゼの標的蛋白は何か:(1)線維芽細胞をEGFやPDGFなどで刺激すると急速にチロシン燐酸化される41Kと43K蛋白が細胞質中にあり、この燐酸化は細胞DNA合成誘導の程度と一致する。(2)インスリン刺激によって急速にチロシン燐酸化される蛋白としてインスリン受容体と185K蛋白をすでに見出しているが、ラット遊離脂肪細胞について、抗燐酸化チロシン抗体を用いたイムノブロッティング法で調べると、さらに60K蛋白を細胞質中に見出した。3.A431細胞のEGF受容体の細胞の外に露出している部分がいわゆるエクトキナーゼによってチロシン燐酸化される可能性が強くなった。その部位と信号伝達における意義は今後の問題である。
非可聴域高周波振動に対する皮膚感受性に関する研究

人間の聴覚は、20kHzを超える空気振動を認知できないことが一般に知られている。しかし近年、聴覚医学および脳生理学の分野で、この可聴閾を超える高周波の弾性振動に対する人間の感受性に関する興味深い知見が報告されている。第1は、可聴域の音声信号で振幅変調した可聴域を超える高い周波数の搬送波を弾性波として骨導で被験者に呈示すると音声の明瞭な認知が可能であるという現象である。第2は、超可聴域高周波成分を可聴域音とともに被験者に呈示すると、可聴域音のみを呈示した時に比較して、視床および上部脳幹を含む脳深部の局所脳血流が統計的有意性をもって増加し、同時に脳波背景律動のアルファ帯域成分のパワーが脳深部の血流と有意に相関して増減する現象である。本研究では、気導を介した聴覚呈示では認知できない可聴域をこえる高周波弾性振動が、皮膚の機械的振動を介して神経系におよぼす影響を生理学的に解明するために、自然環境音や楽器音に含まれる可聴域をこえる広帯域非定常高周波振動成分を聴覚ならびに皮膚から振動として呈示するシステムを開発するとともに、機能的MRI装置の中で高周波振動成分を呈示することが可能なシステム開発をおこなった。本年度は、100kHzまで平坦な特性をもったバイチャンネル音呈示システムを開発し発表した。またそのシステムとセラミック圧電素子を用いたヘッドフォンを組み合わせて、周波数特性に改良を加えた結果、80kHz程度まで実用水準で呈示可能な機能的MRI用システムを構築した。このシステムをもちいて、気導ならびに耳介周囲の骨導を介して高周波成分を含む音と含まない音の影響を計測した。本研究では、気導を介した聴覚呈示では認知できない可聴域をこえる高周波弾性振動が、皮膚の機械的振動を介して神経系におよぼす影響を生理学的に解明するために、自然環境音や楽器音に含まれる可聴域をこえる広帯域非定常高周波振動成分を皮膚接触により機械振動として呈示するシステムの開発と、高周波振動成分に対する皮膚感受性を評価するための方法論の開発を目的とする。本年度は、周波数特性に改良を加え広帯域化を図ったセラミック振動子をもちいて、広帯域高周波成分をできるだけフラットな周波数特性で皮膚接触呈示するためのシステム開発の基礎的検討と、広帯域振動情報の再生システムの構築をおこなった。レーザードップラー測定装置およびFFT周波数解析装置をもちいて機械的振動の周波数特性を計測したところ、100kHzにまでおよぶ帯域で機械振動を伝達することが可能であることが示された。今後、このシステムをもちいて生体計測を実施していく予定である。
新規な分子空孔の設計に基づく含カルコゲン元素相乗系化合物の創製

生体内では、複数の高周期典型元素の相乗効果が機能の発現に重要な役割を果たしている例が多く見られる。しかし、高周期典型元素相乗系化合物の中には、人工系では二量化や不均化、自己縮合などを起こしやすいために不安定な化学種が多くある。タイプ1ヨードチロニン脱ヨウ素化酵素(ID-1)は、セレノシステイン残基を活性中心として甲状腺ホルモン前駆体であるチロキシンの脱ヨウ素化を触媒する。しかし、その触媒サイクルの機構解明は、ヨウ化セレネニル(R-Sel)中間体の不安定性ために従来極めて困難であった。本研究では、ナノスケール分子空孔を活用することで中間体の安定化も図り、仮説として提唱されてきた反応機構の各過程を直接的に検証した。まず、独自に開発したナノスケールのボウル型立体保護基(Bpq基)を活用し、セレノールとN-ヨードスクシンイミドとの反応によりヨウ化セレネニルを安定に合成・単離し、結晶構造を明らかにした。次に、ID-1触媒サイクル第1段階のモデル反応として、Bpq基をもつセレノールをチロキシンモデル化合物のジョードフェノールに作用させたところ、対応するヨウ化セレネニルおよびモノヨードフェノールの生成が確認された。これは、セレノールによるジョードフェノールの脱ヨウ素化が可能であることを示した初めての例である。続いて、第2段階のモデル反応として、Bpq基をもつヨウ化セレネニルとチオールとの反応について検討した。種々のチオールとの反応について検討した結果、還元力が強いジチオスレイトールを用いた場合にヨウ化セレネニルがセレノールまで還元されることを見出した。以上の結果から、ID-1触媒サイクルとして提案されてきた各化学反応過程の存在が初めて実験的に示された。
ヒノキアスナロ林の分布と群落種組成の成因に関する研究

1.ヒノキアスナロの分布域は,能登半島を南限として北は北海道檜山地方まで,温量気候では暖温帯から亜高山帯上部まで広い範囲に及ぶが,その生育地も地理的には散発的である.その群落型は,桧山,津軽,下北,上北などではブナ・ヒノキアスナロ林が,北上山地ではコメツガ・ヒノキアスナロ林が,さらに弘南地方や鴬宿地方,佐渡島ではスギ・ヒノキアスナロ林がみられるほか,アオモリドドマツ(吾妻山,早池峯,日光鬼怒沼山),ワラジロガシ(能登,佐渡)と混生し多彩であ.2.ヒノキアスナロは,スギ分布より寡雪的で夏期に乾燥に傾く地域でとくに濃い分布密度を示している.このことは,スギが裏日本型の湿潤気候に適応するのに対し,ヒノキアスナロは裏日本型から表日本型に移行する準湿潤気候に適応していることを示している.ヒノキアスナロは多雪山地では低地に限られるが,寡雪山地では高地にまで及んでいる.海抜高度が降積雪量と関係することを考慮すれば,ヒノキアスナロの分布や生育の限界は降積雪量に深く関わっていることが明かである.3.ヒノキアスナロを含むThuionsis属は第三紀針葉樹林の構成種として東北日本の各地で氷期を越えて生存しえたことは,花粉化石や大型化石が最終氷期最盛期や晩氷期堆積物から検出されることによって立証される.北日本の最終氷期最盛期におけるヒノキアスナロのrefugaとして森林ツンドラと針葉樹林が考えられる.4.ヒノキアスナロの主な群落型(フナ・ヒノキアスナロ林,コメツガ・ヒノキアスナロ林,スギ・ヒノキアスナロ林)の成立のメカニズムを,ヒノキアスナロの生態的特性と後氷期植生変遷にもとずいて考察した結果,現存するヒノキアスナロ個体群は各地でそれぞれ氷期を生きながらえた個体群の末裔であると考えられる.1.ヒノキアスナロの分布域は,能登半島を南限として北は北海道檜山地方まで,温量気候では暖温帯から亜高山帯上部まで広い範囲に及ぶが,その生育地も地理的には散発的である.その群落型は,桧山,津軽,下北,上北などではブナ・ヒノキアスナロ林が,北上山地ではコメツガ・ヒノキアスナロ林が,さらに弘南地方や鴬宿地方,佐渡島ではスギ・ヒノキアスナロ林がみられるほか,アオモリドドマツ(吾妻山,早池峯,日光鬼怒沼山),ワラジロガシ(能登,佐渡)と混生し多彩であ.2.ヒノキアスナロは,スギ分布より寡雪的で夏期に乾燥に傾く地域でとくに濃い分布密度を示している.このことは,スギが裏日本型の湿潤気候に適応するのに対し,ヒノキアスナロは裏日本型から表日本型に移行する準湿潤気候に適応していることを示している.ヒノキアスナロは多雪山地では低地に限られるが,寡雪山地では高地にまで及んでいる.海抜高度が降積雪量と関係することを考慮すれば,ヒノキアスナロの分布や生育の限界は降積雪量に深く関わっていることが明かである.3.ヒノキアスナロを含むThuionsis属は第三紀針葉樹林の構成種として東北日本の各地で氷期を越えて生存しえたことは,花粉化石や大型化石が最終氷期最盛期や晩氷期堆積物から検出されることによって立証される.北日本の最終氷期最盛期におけるヒノキアスナロのrefugaとして森林ツンドラと針葉樹林が考えられる.4.ヒノキアスナロの主な群落型(フナ・ヒノキアスナロ林,コメツガ・ヒノキアスナロ林,スギ・ヒノキアスナロ林)の成立のメカニズムを,ヒノキアスナロの生態的特性と後氷期植生変遷にもとずいて考察した結果,現存するヒノキアスナロ個体群は各地でそれぞれ氷期を生きながらえた個体群の末裔であると考えられる.1.遺存群落としてのヒノキアスナロ林の分布と種構成の解析は、先年度の資料によって可能になった。それによると北上山地のものはコメツガ林の組成に近似する傾向がある。ここの種間関係とくに共存種関係を種多様性の測定を通して検討した。種数一面積関係,種数一個体数関係,種一優占度順位関係などの種多様度指数はブナ林やコメツガ林に比べて、ヒノキアスナロ混合林で高い。しかし、これらの指数はヒノキアスナロ純林の林床植生では極端に低下して、林床の植生の構成が林冠の種構成に関連しそのNicheの分割と不可分の関係にあることが推察される。とくにヒノキアスナロの優占度が高くなることは、単に光遮閉に止まることのみならず、葉堆の吸水性・保水性を通して林床環境の変化をもたらすことによる効果が期待される。2.Thujopsis属とその近縁種の花粉の識別法はほぼ確立できたので、第四紀の古い年代から現世に至るまでの植生史を明らかにすることができる。とくに下北地方においては、花紛分析用試料としてほぼ完全なものを収集しているので、この地方の植生史の細部が明らかにできる見通しである。3.桧山・下北・津軽地方を中心に中気候の解析を通してヒノキアスナロの分布もしくは分布密度との関係を検討した。それによると、一部で古生層など、古い年代の地質に結びついた分布があるものの、生育期の乾燥月数の多い地域ではヒノキアスナロの分布がみられないか、もしくは分布密度が低い傾向を示すことが明らかになった。

このことは水文気候がこの樹種の遺存に深く係わっていることを示すもので、詳細な検討を展開する必要がある。今後、北上山地でも同様の検討を加えるとともに、山体の斜面方位などの地形的・小気候的スケールでの対応関係の分析によって確証が得られるものと考えられる。
HLA抗原の肝細胞膜上発現機序の解析

1.HLA抗原の発現機序について1)癌遺伝子の活性化との関連について---HLA class I抗原やベーター2-ミクログロブリン(β_2m)の局在と癌遺伝子ras産生蛋白p21の局在を肝組織切片上で比較検討したが,個々の細胞レベルではそれらの発現に明らかな関連性を見出しえなかった.現在, C-myc遺伝子産物の発現との関連性を検討中である.2)DNAのメチル化との関連について---培養肝細胞あるいは肝癌細胞形質膜上のHLA class I抗原の発現はDNAのメチル化と関連していることが5-azacytidineを用いた実験で明らかになった.2.HLA抗原と他の膜上分子の相互作用・相互関係について1)肝組織連続切片上, B型肝炎ウィルス関連抗原の発現とHLA class I抗原やβ_2mの発現の間に個々の細胞レベルでは関連性を見出しえなかった.2)培養肝癌細胞上のHLA抗原とHBs抗原の発現増強がDMSOや5-azacytidineによる処置によって同時に誘導されることが示され,それらの抗原の相互作用を検討する際によい実験系となると判断された.3)肝癌細胞や肝細胞形質膜上の上皮成長因子レセプター(EGFR)の発現の変動はHLA class I抗原の発現の変動とよく合致することが明らかとなった.すなわち,免疫組織化学的研究上, EGFRは正常肝細胞膜にほとんど指摘されないが,肝炎や肝硬変など病的肝組織でその発現が明らかとなり,肝癌細胞形質膜上で強く発現されることが示された.3.マウスを対象とした実験が進行中である.また,分子生物学的解析において共同研究が可能となったので,その方面の研究が進行中である.1.HLA抗原の発現機序について1)癌遺伝子の活性化との関連について---HLA class I抗原やベーター2-ミクログロブリン(β_2m)の局在と癌遺伝子ras産生蛋白p21の局在を肝組織切片上で比較検討したが,個々の細胞レベルではそれらの発現に明らかな関連性を見出しえなかった.現在, C-myc遺伝子産物の発現との関連性を検討中である.2)DNAのメチル化との関連について---培養肝細胞あるいは肝癌細胞形質膜上のHLA class I抗原の発現はDNAのメチル化と関連していることが5-azacytidineを用いた実験で明らかになった.2.HLA抗原と他の膜上分子の相互作用・相互関係について1)肝組織連続切片上, B型肝炎ウィルス関連抗原の発現とHLA class I抗原やβ_2mの発現の間に個々の細胞レベルでは関連性を見出しえなかった.2)培養肝癌細胞上のHLA抗原とHBs抗原の発現増強がDMSOや5-azacytidineによる処置によって同時に誘導されることが示され,それらの抗原の相互作用を検討する際によい実験系となると判断された.3)肝癌細胞や肝細胞形質膜上の上皮成長因子レセプター(EGFR)の発現の変動はHLA class I抗原の発現の変動とよく合致することが明らかとなった.すなわち,免疫組織化学的研究上, EGFRは正常肝細胞膜にほとんど指摘されないが,肝炎や肝硬変など病的肝組織でその発現が明らかとなり,肝癌細胞形質膜上で強く発現されることが示された.3.マウスを対象とした実験が進行中である.また,分子生物学的解析において共同研究が可能となったので,その方面の研究が進行中である.
瞬目反射条件付けに伴う小脳皮質活動の可視化

瞬目反射条件付けはマウスからヒトまで種を越えて共通に見られる古典的条件付けの一つであり、条件刺激として「音」を、無条件刺激として「まぶたへの侵害刺激」を用いて両者を組み合わせて繰り返し提示した場合、音だけでまぶたを閉じる条件反応が引き起こされる行動学的現象である。瞬目反射条件付けでは、単に音刺激と目を閉じるという行動が結びつけられて学習されるだけではなく、音が聞こえてからどの程度時間が経過してから目を閉じるかという時間を含めた形で記憶が形成される。本研究では、瞬目反射条件付けに伴う小脳皮質活動を可視化することで、条件付けが小脳皮質のどこで、どのように獲得され、保持されるかを明らかにすることを目的とし、本年度は以下の成果を得た。蛍光Ca^<2+>指示タンパク質であるcameleonを神経細胞特異的プロモーターによって発現するトランスジェニックマウスを作成し、単離小脳において表面よりcameleonによる蛍光シグナルが観察可能であることを明らかにした。また、85dB、1kHzの音を条件刺激、まぶたへ埋め込んだ電極による電気刺激を無条件反応として用いる、マウス瞬目反射条件付けの実験技法の修得を行った。さらに、瞬目反射条件付け遂行中のマウスの小脳皮質表面から神経細胞の活動によって生じる蛍光シグナルの観察を可能とすることを目的に、瞬目反射条件付けのための動物固定装置と高感度CCDカメラを用いた光学測定装置を組み合わせた実験装置を新たに構築した。
精子を作る植物が持つcAMP合成酵素を中心とするcAMP信号系の生理機能の解明

さまざまな生物のシグナル伝達機構において、サイクリックAMP(cAMP)がセカンドメッセンジャーとして機能しているが、植物ではcAMPの生理機能は明確に示されていない。最近、私たちの研究グループは、新奇のcAMP合成酵素(CAPE)をゼニゴケから発見し、CAPEはゼニゴケのみならず、精子を用いて有性生殖を行う緑色植物に保存されていること、CAPE遺伝子がゼニゴケ造精器で特異的に発現していることを明らかにした。これらの結果から、CAPEを中心とするcAMPシグナル伝達機構が、精子機能の調節に働いていることが予想される。本研究では、ゼニゴケのCAPE遺伝子破壊株を用いて精子形成と精子運動能を中心に解析し、cAMPの生理機能を明らかにすることを目的としている。本年度は、ゼニゴケCAPE遺伝子破壊株の表現型を中心に解析した。無性芽や葉状体の成長と形態、雄器托、雌器托の発生タイミングや形態には異常が見つからなかった。CAPE遺伝子破壊株の雄器托に水滴を与え、精子を放出させたところ、精子が凝集して塊になることや、細胞壁の殻の中に留まる精子が多く観察された。光学顕微鏡による観察では、核を含む頭部と二本の鞭毛を確認でき、精子形態に大きな異常は見つからなかった。しかし、野生株の精子が直線的に水中を泳ぐのに対し、CAPE遺伝子破壊株では直線的な移動がなかった。cAMPが遊泳に必要な鞭毛運動調節に関わることが示唆された。さらにヒメツリガネゴケを材料にCAPE遺伝子の解析を開始した。ヒメツリガネゴケのゲノムにCAPE遺伝子が1コピー存在し、相同組換え法によりCAPE遺伝子破壊株を作製した。ヒメツリガネゴケにおいても表現型の解析が可能になった。今年度は、ゼニゴケCAPE遺伝子破壊株を解析し、表現型を見つけることが一番の課題であり、その目標は概ね達成することができた。また、ヒメツリガネゴケでも解析を開始し、ヒメツリガネゴケCAPE遺伝子破壊株を構築することができた。植物におけるcAMPシグナル伝達機構の生理的役割の解明に向けた重要な発見と、植物種縦断的に解析する基盤を構築できたため、概ね順調であると判断した。ゼニゴケCAPE遺伝子破壊株に、CAPE遺伝子を戻して表現型が回復することを確認する。CAPE遺伝子にはcitrine遺伝子を融合し、CAPEの細胞内局在を同時に調べる。造精器、精子における細胞内局在を観察し、特に精子においては、頭部、鞭毛など、どの部分に局在するかを詳細に観察する。精子運動と関連づけてcAMPシグナル伝達機構の働きを予測し、その後の解析方針を考える。

構築したゼニゴケCAPE遺伝子破壊株等の植物体のcAMP量を測定することを予定し、cAMP量測定キットの購入費を当初計上していた。本研究において非常に重要なデータとなるため必須な解析であるが試薬費が高額である。そのため、CAPE遺伝子破壊株へCAPE遺伝子を入れ戻した相補株が完成した時点で集中的にcAMP量を測定することで、試薬費を節約することを計画し、今年度のcAMP量測定キットの購入を控えた。また、CAPE遺伝子破壊株の解析が順調に進んだため、当初予定していたよりも分子生物学研究関連試薬を購入せずに済んだことも理由である。次年度は、今年度に計画していた分と合わせてcAMP量の解析等に使用し、研究をさらに進展させる。
超音波造影法に基づく腎内血流分布調節とNa排泄機構の解明

腎内血流分布の変化は尿濃縮やNa排泄などの腎の有する体液調節機構に重要な役割を果していると考えられているが、これまで局所腎血流をin vivoで正確かつ簡便に評価する方法は開発されておらず、ヒトでの検討は全く行われていないのが現状である。本研究では、腎血流分布とNa排泄機構との関連を明らかにする目的で、最近研究代表者が開発した超音波造影法を用い、生理食塩水負荷による細胞外液量増大時や内皮由来nitric oxide(NO)合成阻害時のNa排泄と腎内血流分布の変化をin vivoにおいて経時的に検討した。超音波造影法による腎内血流分布の評価に関しては、超音波装置に東芝社製SSH-65A、超音波造影剤にマイクロバブルを含むsonicated 5% albumin溶液を用い、まず雑種成犬を対象に基礎的検討を行い、超音波造影剤の至適投与量(sonicated 5% albumin 0.150.25ml/kg動注)を決定すると共に、acetylcholine腎動注時には腎皮質表層に比し、皮質深層で血流増加が有意に大であることを確認した。また低用量のNO合成阻害剤N^°-nitro-L-arginine methyl esterは、総腎血流量や腎内血流分布に有意な影響を与えることなく、基礎Na排泄量や生理食塩水負荷による細胞外液量増大時のNa利尿を有意に抑制し、このNO合成阻害によるNa排泄の抑制作用は、angiotensinII受容体(AT_1)拮抗剤であるL-158,809投与下では完全に消失することから、angiotensinIIに依存したものであることが示唆された。更に本研究では超音波造影法のヒトへの応用を目的として、ガラクトース/パルミチン酸より成る超音波造影剤を用い、腎血管病変やびまん性腎疾患を有する症例を対象に検討を重ね、造影剤の動脈内投与により、腎血流シグナルの良好な増強効果が得られることを確認した。今後、腎血流シグナルの定量的評価法の確立により、腎内血流分布とNa排泄機構との関連がヒトにおいても明らかになるものと期待される。腎内血流分布の変化は尿濃縮やNa排泄などの腎の有する体液調節機構に重要な役割を果たしている。本研究では、腎内血流分布の調節機構における内皮由来nitric oxide (NO)役割を明らかにする目的で、最近研究代表者が開発した超音波造影法を用い、動物実験においてNO合成阻害時の腎内血流分布とNa排泄の変化を検討した。超音波造影法による腎内血流分布の評価に関しては、超音波装置に東芝社製SSH-65A、超音波造影剤にマイクロバブルを含むsonicated 5% albumin溶液を用い、雑種成犬を対象に、NO合成阻害剤N^G-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) 0.110μg/Kg/min腎動注前後で検討を行った。その結果、低用量のL-NAMEは総腎血流量や腎内血流分布には有意な影響を与えることなく、基礎Na排泄量や生理食塩水負荷時のNa利尿を有意に抑制した。またこのNO合成阻害によるNa排泄の抑制作用は、angiotensinII受容体(AT_1)拮抗剤であるL-158,809投与下では完全に消失し、angiotensinIIに依存したものであることが明らかとなった。

現在さらに高用量のL-NAMEやNO合成の基質となるL-arginineを用い、腎灌流圧を一定にした条件下で、これらの腎内血流分布に及ぼす影響を検討中である。更に本研究では超音波造影法のヒトへの応用を目的として、ガラクトース/パルミチン酸より成る超音波造影剤を用い、腎血管病変やびまん性腎疾患を有する症例を対象に検討を重ね、造影剤の静脈内投与によりドプラ信号の良好な増強効果が得られることを確認した。現在腎血流シグナルの定量的評価法の確立を急いでおり、今後は本法により腎内血流分布とNa排泄機構との関連がヒトにおいても明らかになるものと期待される。
生涯体育につながる小・中・高校と連続した持久走の開発

持久走中の生理学的特性や運動学的特性,走者の意識から生涯体育につながる持久走の指導法を検討した.小学5年生男子30名(1,000m),中学2年生男子57名(2,000m),高校2年生男子27名(3,000m)を対象に,1最大努力の全力法,2「ややきつい」感じのRPE法,3走能力により走距離を選択する内回り法の3つの持久走を実施した.中学生と高校生の全力法では走速度と心拍数の経時的低下から,高い運動強度による疲労感や痛みが持久走嫌いを助長した.RPE法と内回り法では持久走中,走速度と心拍数が維持された.RPE法が最も好まれた方法であった.小学生では,3種類の持久走間に顕著な差はなかった.本研究は、持久走の方法論に着目し、生涯体育につながる効果的な持久走の指導法を明らかにすることを構想している。このため、特徴の異なる3種類の代表的な持久走(全力法、内回り法、RPE法)を取り上げ、持久走中の生理学的特性、運動学的特性、及び走者の意識の視点からそれぞれの持久走の特性を比較検討する。2年度としての今年度は、高校2年生男子27名を対象に,3,000mを最大努力で走る全力法.RPE13「ややきつい」で3,000mを走るRPE法.異なる距離の3種類のトラックをクラス全員がほぼ同じ時間で走るように持久走能力の高い生徒に外側を,低い生徒に内側を走らせる内回り法の3種類の持久走を実施した.走速度,ストライド長,ストライド頻度,心拍数を持久走中に継続して測定した.また、指導法実施前後に持久走に対する意識調査を実施した.その結果,全力法では持久走の経過に伴い走速度の顕著な低下が認められ,高い運動強度による疲労感や痛みが持久走嫌いを助長させる可能性が示唆された.一方,RPE法と内回り法では持久走の間中、走速度が維持された.これは,それぞれ主観的運動強度と他者追従という走速度の指標を得たことによるものであると考えられた.このことから,自己のペース配分や運動強度への気づきが,持久走に対する好印象を助長させる可能性が示唆された.また、この結果を踏まえて中学生を対象に、3種類の持久走中の生理学的特性、運動学的特性、及び走者の意識のアンケート調査の全ての測定を実験計画通り実施した。生涯体育につながる効果的な持久走の指導法を明らかにするため、特徴の異なる3種類の代表的な持久走を取り上げ、持久走中の生理学的特性、運動学的特性、及び走者の意識の視点からそれぞれの持久走の特性を比較検討した。初年度(H23年度)は、高校2年生男子27名を対象に3,000mの持久走を実施した。持久走の種類は、1全距離を最大努力で走る全力法、2主観的運動強度(RPE)の尺度が13「ややきつい」の努力感で走るRPE法、3クラス全員がほぼ同じ時間で走り終わるように持久走能力に応じて3つの長さのトラックを選択して走らせる内回り法の3種類であった.走速度,ストライド長,ストライド頻度,心拍数を持久走中に継続して測定した.また、指導法実施前後に持久走に対する意識調査を実施した.その結果,全力法では持久走の経過に伴いストライド長に依存して走速度の顕著な低下が認められた。また、心拍数も経時的に低下傾向を示し、高い運動強度による疲労感や痛みが持久走嫌いを助長させる可能性が示唆された.一方,RPE法と内回り法では持久走の間中、走速度が維持された.これは,それぞれ主観的運動強度と他者追従という走速度の指標を得たことによるものであると考えられた.このことから,自己のペース配分や運動強度への気づきが,持久走に対する好印象を助長させる可能性が示唆された.2年度(H24年度)は中学2年生男子57名を対象に3種類の2,000m持久走を実施した。その結果、前年度の高校生とほぼ同様の結果が得られた。最終年度(H25年度)は小学5年生男子30名を対象に3種類の1,000m持久走を実施した。その結果、3種類の持久走間に顕著な差は無く、小学生の段階では各持久走の特性を理解して走る弁別能力が十分に発達していないことがうかがえた。