hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脂肪蓄積による臓器機能破綻の分子基盤の解明

レプチン受容体遺伝子欠損肥満ラット膵臓で中性脂肪蓄積の増加と、GPR40遺伝子発現の低下を明らかにした。GPR40遺伝子欠損ラットを作製し、その糖脂質代謝異常を現在、解析中である。新たなレプチン研究の動物モデルとして、レプチン遺伝子欠損ラットの作製に成功した。ヒトiPS細胞からの脂肪細胞分化誘導系を世界に先駆けて、確立し、ヒト脂肪萎縮症で疾患特異的iPS細胞を確立し、その成因解明と病態解明の為のなツールを確立にした。レプチンの抗脂肪毒性作用の検討を進めている。インスリン分泌低下型糖尿病モデルのAkitaマウスでレプチン治療の長期的な有用性を明らかにし、レプチンの抗糖尿病作用を明らかにした。これまで報告してきた、ストレプトゾトシンと高脂肪食負荷による軽症肥満2型糖尿病マウスなどの成果と合わせ、レプチンの抗糖尿病作用がより一般的な糖尿病でも有効である可能性を示した。さらにレプチンのインスリン感受性改善作用メカニズムの一つとして、中枢神経および交感神経系α作用を介した肝AMPK活性化を見出した。健常者および脂肪萎縮症患者を対象に、レプチン補充治療前後でfunctional MRI(fMRI)を用いた解析を行い、レプチンは食欲関連領域における食後の脳神経活動制御に重要であることを示した。レプチン抵抗性の発症メカニズムを分子レベルで解明することを目的として、マウスの脳神経核特異的レプチン感受性検出系を確立し、これを用いた解析を進めている。特に、既に報告している高脂肪食負荷レプチン過剰発現トランスジェニックマウス(Tgマウス)は体重増加を伴わずに短期間でレプチン抵抗性が誘導される系であり、この系を用いた解析を進めている。レプチンの脳高次機能への作用に関して、レプチンの抗うつ作用に加え、食事性肥満マウスの、海馬におけるレプチン抵抗性、認知機能障害を示し、そこにBDNF系が関与していることを明らかにした。中枢神経系におけるレプチン-BDNF系が、肥満におけるうつ、認知障害の治療標的となる可能性を更に検討中である。脂肪萎縮症の成因解明と細胞治療を発展させるため、ヒトiPS細胞からの脂肪細胞分化誘導を世界で初めて報告し、マウスへ細胞移植し生着しうることを確認した。脂肪萎縮性糖尿病患者からiPS胞の樹立に成功し、その細胞の脂肪細胞への分化誘導を行い、脂肪細胞における脂肪蓄積の分子機構を解析中である。摂食抑制や脂肪蓄積抑制などのエネルギー代謝調節で、脂肪細胞由来レプチンは主要分子の一つである。本研究は、レプチンを中心にエネルギー代謝調節を研究した。(レプチン抵抗性)高脂肪食肥満ラットでレプチン・アミリン共投与糖脂質代謝改善作用が観察された。単独投与で認められないインスリン感受性亢進、肝臓・骨格筋中性脂肪含量低下、骨格筋α2AMPK活性化が認められた。(レプチン作用)レプチン作用欠損脂肪萎縮症患者の食欲異常と摂食に関わる脳神経活動と、レプチン補充治療を検討し、脂肪萎縮症で食後食欲抑制と飽食感減弱、及びfMRIで扁桃体や線条体の神経活動亢進が観察されたが、レプチン治療で異常が改善、レプチンが扁桃体や線条体への作用が明らかになった。(レプチンの膵内分泌系への作用)Gq共役中長鎖脂肪酸受容体GPR40やGs共役脂質Oleoylethanolamide (OEA)受容体GPR119が糖応答性インスリン分泌促進に関わる可能性、及びインスリン分泌改善薬の可能性が注目されるが、レプチン受容体欠損遺伝性肥満Koletzkyラットラ氏島でGPR40と同様にGPR119遺伝子発現低下を観察し、GPR119がヒトでβ細胞のみならずα細胞で発現を明らかにした。(レプチン臨床応用)医師主導治験で脂肪萎縮症へのレプチンの治療薬薬事承認を得た。(脂肪萎縮症ヒトiPS細胞由来脂肪細胞細胞治療)ヒトiPS細胞由来脂肪細胞lipolysisや、インスリンによるAktリン酸化を認め、脂肪細胞としての機能を示した。ヒトiPS細胞由来脂肪細胞をヌードマウスに移植、生着と脂肪細胞分化遺伝子発現を観察した。(ミトコンドリア遺伝子変異患者iPS細胞)エネルギー代謝関与のミトコンドリア遺伝子変異2例でiPS細胞樹立、遺伝子変異比率感度以下低下を明らかにした。(脂肪毒性において膵臓で発現低下するGPR40遺伝子発現の病態生理的意義の解明)GPR40に関して、GPR40作動薬がグルコース応答性インスリン分泌促進による、低血糖の少ない新規の糖尿病薬として、その開発が期待されている。我々はGPR40遺伝子が膵臓β細胞で特異的に高発現し、肥満における脂肪蓄積の進展と共に膵臓でGPR40遺伝子発現が低下し、それと共に糖代謝異常が進行し、脂肪毒性を呈し、肥満の改善と共に糖代謝の改善と、GPR40遺伝子発現の改善を既に明らかにしている。GPR40遺伝子欠損マウスでは、糖脂質代謝やインスリン分泌の異常は認められていないが、マウスとヒトやラットの間で、糖代謝に種差がある事を考慮して、肥満におけるGPR40遺伝子発現低下の意義を解明する目的で、Zing Finger Nuclease(ZFN)法を用いてGRP40遺伝子欠損ラットの作成を試み、世界で初めて成功した。(肥満における脳内摂食調節系の解明)我々は肥満無しにレプチン抵抗性を来す高脂肪食負荷肝臓特異的レプチン過剰発現マウスを開発した。高脂肪食負荷肝臓特異的レプチン過剰発現

トランスジェニックマウスの解析で、視床下部弓状核のみならず、視床下部外側野と側座核でレプチン抵抗性が認められた。視床下部外側野と側座核は脳内報酬系を構成するので、脳内報酬系におけるレプチン抵抗性の意義が注目される。この研究成果は、以前のヒトfMRIの解析において、レプチン作用の欠乏した脂肪萎縮症において、レプチン投与により、脳内報酬系の神経活動が抑制されるとの我々の報告とよく合うものであり、その臨床的意義が注目される。G蛋白共役型受容体GPR40は中・長鎖の遊離脂肪酸をリガンドとし、マウス・ラット膵β細胞にほぼ特異的に高発現し、グルコース応答性インスリン分泌の増強に関与することが報告され、その治療的意義が注目されている。我々はGPR40がヒトにて膵島およびインスリノーマで高発現し、インスリン分泌の調節に関与する可能性を示してきた(Tomita, T BBRC, 2005; Diabetologia, 2006)。しかし、GPR40の発現調節やその意義は不明な点が多い。そこで、我々が新規に確立した遺伝性肥満レプチン欠損mkyo/mkyoラット(Aizawa-Abe, M Physiol Genomics, 2013)を肥満・耐糖能異常モデルとして解析し、膵島でのGPR40遺伝子発現をTaqMan PCRにて検討した。mkyo/mkyoは非肥満対照(+/+)と比べ週齢依存性に著明な体重増加をきたした。さらに、8週齢から糖負荷試験で負荷後高血糖とインスリン初期分泌低下を呈した。耐糖能異常とインスリン初期分泌低下が顕著な22週齢のmkyo/mkyoで、膵島でのGPR40 mRNAレベルを検討したところ、+/+の約1/2に著明に低下していた。また、GPR40のプロモータ領域に結合ドメインが報告され、GPR40遺伝子発現調節への関与が示唆されているPdx1のmRNAレベルがmkyo/mkyoの膵島で+/+の約1/2に低下していた。既にGPR40のヒト膵β細胞での高発現(Biochem Biophys Res Commun 338:1788-1790, 2005)およびヒトでのインスリン分泌調節への関与の可能性を報告してきた(Diabetologia 49:962-968, 2006)。しかし、GPR40の膵外作用については不明な点が多く、その生理的な意義はほとんど分かっていない。最近、研究代表者らは、不明な点の多GPR40の生理的意義の解明を目的として、従来作成の難しかったラットにおいて新規手法にてGPR40KO動物を作成した。GPR40はインスリン分泌増強に関与することから、GPR40KOラットはインスリン分泌不全モデルとなることが予想され、実際にその通りであった(投稿準備中)。一方、GPR40KOラットは非肥満でありながら、大変意外なことに、高週齢でインスリン抵抗性・脂質異常症を示した。現在、GPR40-BACトランスジェニックラットを作成して、過剰発現での表現型をGPR40KOラットと比較して、研究を継続中である。本研究でGPR40の脂質代謝異常改善のメカニズムの詳細が明らかとなることで、脂質異常症の新規治療薬の開発に繋がることが予測される。
固体の光励起二次元電子系と高密度化による相転移の研究

固体表面、界面、超薄膜、超微粒子、超格子構造等において期待される光励起状態の二次元性を研究し、その動的挙動を解明すると共に、高励起下における電子的相転移の研究にまで発展させることを目的として4ケ年計画で本研究を開始した。その間、層状半導体PbI_2の結晶性超薄膜をKCl結晶上に蒸着法により作ることに成功し、励起子の量子サイズ効果を見出した。色素とSnO_2半導体界面の発光スペクトルの研究からは、色素から半導体への電子移動による色素発光の消失を観測した。更にアントラセンの表面導波ポラリトンの存在を確認し、超放射現象を明らかにした。又、CoTe薄膜をイオンクラスタービーム法によって作り、その分光学的測定を行い、膜の性質についての知見を得た。最近では、ゼオライト中にセレンやPbI_2を導入し、セレンでは一次元鎖状構造と8リングによる光吸収を観測しPbI_2では孤立クラスターとクラスター集団による吸収を見出している。超微粒子関係ではNaCl中に導入されたCuCl微粒子が準二次元的形状をしており、厚さ方向と共に面内の励起子運動の制約による量子サイズ効果について詳細な物理的現象が明らかにされた。最後に、(C_nH_<2n+1>NH_3)_2PbI_4という結晶では、PbI_4面がアルキルアンモニウム有機層により隔たる構造をしていることに注目し、PbI_4面内に発生する励起子が凝二次元的な振舞をしていることを見出した。以上の研究を通じて、二次元電子系については種々の場合についてかなり様子が分かってきた。高密度化による電子的相転移を二次元電子系で見出す研究についてはCuCl微粒子において励起子分子の存在とその量子サイズ効果についての知見が得られた。励起子分子の研究は自然超格子(C_nH_<2n+1>NH_3)_2PbI_4でも行っているがまだ発表までに至っていない。本研究では主として(1)励起子半径より薄い超薄膜半導体の二次元電子励起状態を明らかにすること。(2)酸化物単結晶表面及び物理吸着させた有機色素との界面における電子励起状態とその移動のダイナミックスを明らかにすることを目的としている。本年度は(1)の目的を達成するために層状半導体の良質な超薄膜製造をめざしてICB法、即ちイオン化クラスター法による製造装置を組立てている。そのための排気装置を設計発注し4月納入の予定である。(2)の目的達成のために、まず酸化物単結晶の成長を行う。単結晶はフローティングゾーン法か気相成長法により作成するため、赤外線集中加熱単結晶製造装置をNEC=チデン機械から購入し、それを用いて【TiO_2】単結晶を成長させた。次に【SnO_2】単結晶をフローティングゾーン法で作ることを試みたが【SnO_2】が昇華したため失敗した。そこで現在は気相法によって成長を試みており、5mm×0.5mm×0.1mm程度の単結晶が得られている。今後は再に大きな結晶成長をめざす予定である。又非晶質【SnO_2】に【H_2TPP】色素を真空蒸着し、100°Kに冷却後、【H_2TPP】からの発見強度を膜厚を変えて測定した。【H_2TPP】の平均膜厚が10Å程度、即ち【SnO_2】

表面に分子状に附着した場合は【H_2TPP】からの励起子発光が極端に減少し10%程度しか観測されなかった。このことは【H_2TPP】から【SnO_2】へのエネルギー移動が起こり、非輻射過程が支配的になることを示している。又【SnO_2】の電気伝導度が高い場合ほど発光のクエンチング効果は大きいことを見出した。この現象は次のような機構により理解できる。【H_2TPP】で励起された電子は【SnO_2】との界面で【SnO_2】側の伝導電子の偏極による電場でイオン化し、その電子は【SnO_2】伝導電子に変わり、更に【H_2TPP】分子の正孔と再結合する。そのために【H_2TPP】の励起子による発光が減少すると考えられる。今後は【SnO_2】単結晶を基板にしたエネルギー移動機構を研究する予定である。交付申請書に記載してある3つの計画の内、第1の計画は【H_2】TPP色素と半導体界面における電荷移動の実体を知ることだが、発光強度の色素膜厚依存性、半導体Sn【O_2】の電気伝導度依存性、および発光の減衰時間に関する同種の依存性を測定した。その結果から色素内にエキシマーが発生し、その状態の正孔にSn【O_2】の伝導電子が流れ込み、一種の電荷移動型励起子が界面に発生する。更にエキシマーの構成物である電子がSn【O_2】に移動するという機構を明らかにした。このことは半導体中の電子密度に強く依存するので、金と【H_2】TPP色素の界面では更に顕著に起こることが期待され、現在実験中である。第2の計画はPb【I_2】超薄膜を用いて、その中に生じる擬二次励起子の動的挙動を明らかにすることである。Pb【I_2】超薄膜をKCI単結晶上に超高真空中で蒸着しその膜厚を変えることによって吸収と発光スペクトルを同時に測定した。その結果によると、膜厚が減少すると量子井戸効果により励起子吸収帯は高エネルギー側に移動し、非常に薄い膜では励起子エネルギーは飛び飛びになる。発光スペクトル上では厚い膜で自由励起子による発光帯が見られるが、膜が薄くなると自己束縛励起子による幅の広いストークスシフトの非常に大きな発光帯が現われ平均の膜が1層か2層の場合にはほとんどこの発光帯のみしか観測されない。このことから超薄膜になると自由励起子のエネルギーが大きくなり自己束縛された方が安定になることが分った。第3の計画はICB法による良質の薄膜の製造である。科研費で購入したICB用電源や広帯域電離真空計を使ってICB蒸着装置を完成させた。その装置を用いてCd Teの蒸着膜を作り、その吸収と反射スペクトルを低温で測定したところである。現在では末だ問題点が多く、今後、改良を進める予定である。本年度の研究実施計画では3項について研究することになっている.1.不治性金属である金と白金にH_2TPP色素を真空蒸着し,その界面に寄因する発光のスペクトルと時間応答の測定を100Kの低温で行った.その結果,金蒸着膜の場合には,高伝導度SnO_2を用いた時と同様にH_2TPPの超薄膜の状態で発光は大部消滅し,減衰時間も極端に短かくなることを見出した.このことから金と色素の界面で電荷の移動が起こっていることが分った.その他に膜厚が100を超えても発光強度の減少と減衰時間の増加がみられたので,金の場合には双極子型のエネルギー移動も起こっていることが分った.2.PbI_2をポーラスガラス中に閉じ込めて超薄膜を作ることを試みた.その試料の吸収スペクトルを測定すると励起子帯は大きく高エネルギー側にずれることを見出した.
新しいウイルスベクター発現サイトカインを用いた動物の免疫誘導法の開発

本研究の目的は、まず新しい組換え蛋白発現システムである組換えセンダイウイルス発現系を用いてサイトカインを発現させ、in vitro並びにin vivoでの生物活性を検索することである。続いて、活性が確認できたサイトカインでサイトカインネットワークの基礎的研究を行い、その基盤の上に蛋白あるいはウイルスベクターの投与による有効なサイトカインアジュバント免疫誘導法の開発に役立てることである。1)イヌIFNγ、GM-CSF、IL-8、IL-6のcDNAをそれぞれ持つ組換えセンダイウイルスを作出し、濃縮・精製することに成功し、生物活性を示すサイトカインの産生をin vitroで確認することができた。本年度は実際にイヌに投与して、in vivoでの有効性について検索した。2)イヌGM-CSF組換えセンダイウイルスを接種した発育鶏卵漿尿液より精製したGM-CSFは、イヌ由来骨髄細胞やGM-CSF依存性細胞株(TF-1細胞)の増殖を濃度依存性に誘導した。6頭の健康なイヌに投与したところ、末梢血総白血球、好中球、および単球の顕著な増加が認められた。3)同様に発現させ精製したイヌIL-8をリーシュマニア原虫感染マウスの皮膚病変部に、感染14日目より5日間に渡って投与したところ、皮膚病変の悪化(拡大)を抑制することが出来た。以上のことから、組換えセンダイウイルス発現系によるイヌサイトカインは、in vivoにおいても十分な生物活性を有することが明らかとなった。本研究の目的は、組換えセンダイウイルス発現サイトカインを用いることにより、自然宿主でのサイトカインネットワークの基礎的研究を行い、その基盤の上に、蛋白あるいはウイルスベクターの投与による有効なサイトカインアジュバント免疫誘導法を開発・確立することである。今年度は基礎的研究として以下の成果を得た。1.イヌIL-6、GM-CSFおよびIL-8の遺伝子クローンをセンダイウイルス発現ベクターに組換え、センダイウイルスレスキュー系を用いて、組換えセンダイウイルスの発現に成功した。これらウイルスを発育鶏卵に接種して漿尿液を回収し、その液中の発現蛋白の性状を解析した。2.組換えGM-CSFはSDS-PAGE法によって展開し銀染色を行ったところ、21kDaのバンドとして検出された。TF-1細胞の増殖誘導能を指標としたバイオアッセイにより生物活性を持っていることが証明された。漿尿液中にはヒトGM-CSFの20-100ngに相当する活性値を示す蛋白の産生があることが明らかとなった。本蛋白はアフィニティークロマトグラフィーによって高度に精製・濃縮が行えた。3.イヌIL-6組換えセンダイウイルスを接種した漿尿液からは分子量28kDaの特異的な蛋白が同定され、同じくアフィニティークロマトグラフィーによって高度に精製・濃縮が行えた。その生物活性は検討中である。4.イヌIL-8組換えセンダイウイルスからも分子量8kDAの特異的蛋白が確認され、限外濾過・透析後、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーによって容易に精製することができた。イヌおよびマウス好中球に対するchemotaxis assayの結果、発現蛋白は種を超えた生物学的活性を持つことが確認された。今年度は以下の成果を得た。イヌIFNγのセンダイウイルスによる発現を検討した。すなわちConA刺激したイヌの脾細胞からRNAを抽出し、イヌIFNγのORFをRT-PCRでクローニングした。このクローンからイヌIFNγのORFをセンダイウイルスの転写開始シグナルを含むプライマーを用いたPCRで増殖し、センダイウイルスベクターに挿入した。このプラスミドとN,P,L各蛋白発現プラスミドであるpGEM-N、pGEM-、pGEM-LをあらかじめT7 RNA polymerase発現組換えワクチニアウイルスを感染させておいたLLCMK2細胞にco-transfectした。co-

transfectしたLLCMK2細胞からイヌIFNγ組換えセンダイウイルスが得られた。この組換えウイルスを発育鶏卵に接種し漿尿液を回収し、抗血清を用いてウエスターンブロッティングを行ったところ、おおよそヒトと同じ大きさのイヌIFNγ特異的なバンドが検出された。またこの組換えセンダイウイルス発現イヌIFNγのウイルス増殖抑制作用を調べたところ、その活性を有していることが確認された。本研究の目的は、まず新しい組換え蛋白発現システムである組換えセンダイウイルス発現系を用いてサイトカインを発現させ、in vitro並びにin vivoでの生物活性を検索することである。続いて、活性が確認できたサイトカインでサイトカインネットワークの基礎的研究を行い、その基盤の上に蛋白あるいはウイルスベクターの投与による有効なサイトカインアジュバント免疫誘導法の開発に役立てることである。昨年度までにイヌIFNγ、GM-CSF、IL-8、IL-6のcDNAをそれぞれ持つ組換えセンダイウイルスを作出することに成功し、生物活性を示すサイトカインの産生をin vitroで確認することができた。本年度は実際にイヌに投与して、in vivoでの有効性について検索した。1)イヌGM-CSF組換えセンダイウイルスを接種した発育鶏卵漿尿液より精製したGM-CSFは、イヌ由来骨髄細胞やGM-CSF依存性細胞株(TF-1細胞)の増殖を濃度依存性に誘導した。6頭の健康なイヌに投与したところ、末梢血総白血球、好中球、および単球の顕著な増加が認められた。2)同様に発現させ精製したイヌIL-8をリーシュマニア原虫感染マウスの皮膚病変部に、感染14日目より5日間に渡って投与したところ、皮膚病変の悪化(拡大)を抑制することが出来た。以上のことから、組換えセンダイウイルス発現系によるイヌサイトカインは、invivoにおいても十分な生物活性を有することが明らかとなった。
麻痺肢への閾値下電気刺激法による促通現象の基礎研究

平成13年度は、12年度に引き続き、11年度に開発した則定系・解析系を用いて、麻痺疾患よりデータ採取および解析を行った。また、患者へは充分なインフォームド・コンセントを行った。対象は、41歳と67歳の女性2名で、どちらも乳がんの手術後に放射線療法を行い、その後、放射線ニューロパチーが生じている。上腕二頭筋の著しい筋力低下が見られており、閾値下電気刺激により一時的な筋力増強効果である促通現象が観察されている。本症例においては、両者とも最大随意筋力よりも電気刺激による誘発筋力の方が大きいことが観察された。上腕二頭筋の等尺性収縮時の筋張力と筋電図を、閾値下電気刺激を条件として則定した。電気刺激は表面電極を用いて筋皮神経に行い、刺激強度は誘発筋電位が見られない強度に設定した。そして、同筋からの筋電図を表面電極により採取した。データは、フィルター処理を行った後、積分処理とDecomposition処理を行い、筋活動変化を観察した。結果として、積分筋電量は増加していたが、リクルートメント閾値や運動単位の変化は見られなかった。また、治療的電気刺激として、1日15分を2回行い、3ヵ月後に筋力の増加が見られた。随意よりも電気刺激による筋力の方が大きいことから、H反射を利用して促通現象を起こしている可能性を検討したが、筋電図上は有意な活動電位は観測されなかった。以上より、閾値下電気刺激は、感覚神経を介して何らかの求心性効果をもたらしていると考えられるが、その生理学的機序は未解決な部分が多いと結論付けた。本研究の目標は、麻酔肢へ閾値下電気刺激を与え、その筋張力変化と運動単位リクルートメント変化を測定し、生理学的機序を解明することにある。そのために、平成11年度は、測定系・解析系を構築し健常者でその妥当性を検討した。測定系・解析系の構築は、主に藤居が行い、健常者・麻痺疾患からのデータ採取・解析は、藤居・半田が共同で行った。測定系の電気刺激装置、データレコーダー、筋電計、筋張力測定装置は現有設備を使用し、筋電採取用のワイヤー電極と解析用パソコンシステム(データレコーダーからのデータ転送システム)は新規購入した。また、健常者へは充分なインフォームド・コンセントを行った。本年度は、二つの準備的な研究を平行して進めた。(1)測定系を構築した。測定系は、電気刺激装置、筋電採取用ワイヤー電極、筋電計、筋張力測定器、データレコーダーより構成される。このうち、充分な運動単位リクルートメントを測定できるようなワイヤー電極は既存にないため、新規に開発した。(2)解析系を構築した。解析系は、解析用パソコンシステムを新規に開発した。特に、データレコーダーからのデータ転送方法とパソコンシステム内でのデータベースを高速化して、リアルタイム処理を実現した。また、自動Decompositionプログラムを開発し、健常者筋電データよりその妥当性を検討した。自動Decomposition法では、自動化するためのいくつかのパラメータが計測電極の特性に依存するため、実際に健常者よりデータを採取し、新規開発した電極で充分な運動単位の検出が行えるまで、測定系と解析系の両方を繰り返し改良を加えた。そして、安定した結果が得られる測定・解析系を構築した。平成12年度は、11年度に開発した測定系・解析系を用いて、麻痺疾想よりデータ採取および解析を行った。対象は、60歳男性の片麻痺1例であり、以下の方法で解析した。麻痺側の足関節背屈動作における等尺性収縮時の筋張力と筋電図を、閾値下電気刺激を条件として測定した。すなわち、電気刺激前と電気刺激中および電気刺激後に同じ運動課題で行った。電気刺激は、総腓骨神経に対して、前脛骨筋の誘発筋電位が見られない強度に設定した。そして、同筋からの筋電図を針電極により採取した。そして、そのデータをDecomposition法により、筋電解析を行い、運動単位リクルートメント変化を解析した。運動単位リクルートメント分析は、各運動単位のリクルートメント閾値と発火頻度を算出し、各条件下での変化をみる。結果は、電気刺激により筋張力の増加と発火頻度の増加がみられた。リクルートメント閾値は変化しなかった。また、この変化は、電気刺激終了後もしばらく続いた。以上の結果は、閾値下電気刺激が脊髄中枢神経に促通的に作用したと考えられる。

電気刺激は表面電極を用いて筋皮神経に行い、刺激強度は誘発筋電位が見られない強度に設定した。そして、同筋からの筋電図を表面電極により採取した。データは、フィルター処理を行った後、積分処理とDecomposition処理を行い、筋活動変化を観察した。結果として、積分筋電量は増加していたが、リクルートメント閾値や運動単位の変化は見られなかった。また、治療的電気刺激として、1日15分を2回行い、3ヵ月後に筋力の増加が見られた。随意よりも電気刺激による筋力の方が大きいことから、H反射を利用して促通現象を起こしている可能性を検討したが、筋電図上は有意な活動電位は観測されなかった。以上より、閾値下電気刺激は、感覚神経を介して何らかの求心性効果をもたらしていると考えられるが、その生理学的機序は未解決な部分が多いと結論付けた。
食品の抗酸化能力を評価する方法の実用化に向けた研究

我々は、様々な抗酸化物質や食品成分が活性酸素の一つであるフリーラジカルを消去する能力を評価する方法(ARAC法)、同様に一重項酸素を消去する能力を評価する方法(SOAC法)、フリーラジカルにより酸化されたビタミンEを再生する能力を評価する方法(ATREC法)を開発してきた。本研究では、これらの方法を食品の抗酸化活性の評価方法として実用化することを目的とする。本年度は、オリーブオイルなどの市販されている8種の食用油及びそれに含まれるビタミンE類のラジカル消去反応速度を測定して、ARAC値を得た。食用油の反応速度は、含まれるビタミンE類の濃度にそれぞれの反応速度を掛けた値の和にほぼ等しくなった。さらに、8種の食用油及びそれに含まれるビタミンE類の一重項酸素消去速度を測定して、SOAC値を得た。ラジカル消去反応と異なり、一重項酸素消去反応速度は、含まれるビタミンE類の濃度にそれぞれの反応速度を掛けた値の和よりも大きくなった。これは、食用油に含まれる脂肪酸などの別の成分が一重項酸素消去に貢献しているためと考えられる。同様の実験を、ミセル中のパーム油と大豆抽出物について行った。パーム油を精製してビタミンE類の濃度を高めると、一重項酸素消去反応速度は含まれるビタミンE類の濃度にそれぞれの反応速度を掛けた値の和とほぼ等しくなった。カテキン類のような柔らかい分子構造を持った分子について、密度汎関数法などを用いて構造最適化を行って、妥当なイオン化エネルギーを得る方法を開発した。得られたカテキン類のイオン化エネルギーは、酸化電位と良い相関を示した。また、ARAC,SOAC値との相関について議論した。本研究成果などに基づき、仙台で開催された第30回ビタミンE研究会にて研究代表者が第31回ビタミンE研究会の代表世話人に選ばれ、本年度の2020年1月10ー11日に愛媛大学城北キャンパスで開催することが決定したので、関連研究者たちからは当初の計画以上に進展していると評価されているものと思われる。第30回の代表世話人のご協力を得て、仙台にて松山開催を積極的に広報し、現在精力的に準備中である。また、城西大学で招待講演を行った。その他にも、国際学会誌に5報の原著論文を掲載・印刷中であり、公的研究機関では東北大学、城西大学、公益財団法人計算科学振興財団、一般財団法人高度情報科学技術研究機構、企業ではエーザイ株式会社、コンフレックス株式会社と積極的に当該テーマに係わる共同研究を行っている。また、その他の研究での原著論文の掲載が1報有り、高エネルギー加速器研究機構とも別件での共同研究を行っている。研究実績の概要で述べたように、8種の食用油及びそれに含まれるビタミンE類の一重項酸素消去速度を測定して、SOAC値を得た。これは、食用油に含まれる脂肪酸などの別の成分が一重項酸素消去に貢献しているためと考えられるので、食用油の成分を分析して、その成分の一重項酸素消去速度を求め、食用油のトータルな一重項酸素消去反応速度が食用油の成分濃度とそれぞれの反応速度の積の和で説明できるかどうかを検討する。ヒトの生体内環境に近い条件下での測定を行って均一溶媒などと比べて抗酸化能力がどのように変化するか、また多くの食品のように抗酸化剤が共存した場合はどうか、抗酸化能力にもいわゆる食べ合わせがあるのかなどのデータを収集する。得られたデータを用いて、ARAC,SOAC,ATREC値のデータベースを構築する。「京」の利用を振興している研究協力者(長嶋雲兵博士)とともに計算化学を用いたARAC, SOAC, ATREC値の解釈と予測について研究を実施し、評価方法の確立を目指す。研究実績の概要で述べたように、計算化学での予想は実用化促進に有用である。得られた結果を用いて、ARAC法、SOAC法、ATREC法を統合して総合的な食品の抗酸化活性評価方法の確立を目指す。これらの結果に基づいて、老化防止に貢献する食品への付与情報としてニーズのある抗酸化能の分析・測定技術の整備を行う。

パーム油を精製してビタミンE類の濃度を高めると、一重項酸素消去反応速度は含まれるビタミンE類の濃度にそれぞれの反応速度を掛けた値の和とほぼ等しくなった。カテキン類のような柔らかい分子構造を持った分子について、密度汎関数法などを用いて構造最適化を行って、妥当なイオン化エネルギーを得る方法を開発した。得られたカテキン類のイオン化エネルギーは、酸化電位と良い相関を示した。また、ARAC,SOAC値との相関について議論した。本研究成果などに基づき、仙台で開催された第30回ビタミンE研究会にて研究代表者が第31回ビタミンE研究会の代表世話人に選ばれ、本年度の2020年1月10ー11日に愛媛大学城北キャンパスで開催することが決定したので、関連研究者たちからは当初の計画以上に進展していると評価されているものと思われる。第30回の代表世話人のご協力を得て、仙台にて松山開催を積極的に広報し、現在精力的に準備中である。また、城西大学で招待講演を行った。その他にも、国際学会誌に5報の原著論文を掲載・印刷中であり、公的研究機関では東北大学、城西大学、公益財団法人計算科学振興財団、一般財団法人高度情報科学技術研究機構、企業ではエーザイ株式会社、コンフレックス株式会社と積極的に当該テーマに係わる共同研究を行っている。また、その他の研究での原著論文の掲載が1報有り、高エネルギー加速器研究機構とも別件での共同研究を行っている。研究実績の概要で述べたように、8種の食用油及びそれに含まれるビタミンE類の一重項酸素消去速度を測定して、SOAC値を得た。ラジカル消去反応と異なり、一重項酸素消去反応速度は、含まれるビタミンE類の濃度にそれぞれの反応速度を掛けた値の和よりも大きくなった。これは、食用油に含まれる脂肪酸などの別の成分が一重項酸素消去に貢献しているためと考えられるので、食用油の成分を分析して、その成分の一重項酸素消去速度を求め、食用油のトータルな一重項酸素消去反応速度が食用油の成分濃度とそれぞれの反応速度の積の和で説明できるかどうかを検討する。ヒトの生体内環境に近い条件下での測定を行って均一溶媒などと比べて抗酸化能力がどのように変化するか、また多くの食品のように抗酸化剤が共存した場合はどうか、抗酸化能力にもいわゆる食べ合わせがあるのかなどのデータを収集する。得られたデータを用いて、ARAC,SOAC,ATREC値のデータベースを構築する。「京」の利用を振興している研究協力者(長嶋雲兵博士)とともに計算化学を用いたARAC, SOAC, ATREC値の解釈と予測について研究を実施し、評価方法の確立を目指す。研究実績の概要で述べたように、計算化学での予想は実用化促進に有用である。得られた結果を用いて、ARAC法、SOAC法、ATREC法を統合して総合的な食品の抗酸化活性評価方法の確立を目指す。これらの結果に基づいて、老化防止に貢献する食品への付与情報としてニーズのある抗酸化能の分析・測定技術の整備を行う。
高度IT人材育成を目的とした取り組みの相互関係に関する調査研究

本研究では,高度なIT人材の育成を目的とするカリキュラム標準,スキル標準,資格制度(情報処理技術者試験,技術士),情報分野の知識体系および職種が求める能力の相互関係を明確化する.明確化の際には,IPA等が策定したiコンピテンシ・ディクショナリ(iCD)を活用した.ただし,iCDの知識項目は互いに排他的な関係ではないため,我々が開発した知識体系ICTBOKとの対応付けを行い,分析結果の妥当性を確保した.さらに,分析結果を現役のIT技術者や情報系の学生等に迅速にフィードバックするため,Web上で動作するアンケート収集分析システムcresieを拡張し自己点検機能等を実装した.本研究では、情報系の様々な資格制度やスキル標準が求める能力および、高度IT人材の育成を目的とする様々な取組みの達成度の間の相互関係を明確にするための研究を行っている。平成25年度は、こうした研究を推進するための基盤を整備した。情報処理学会では、ITスキル標準レベル4以上の人材に認定情報技術者の資格を付与することで、情報処理技術者試験、ITベンダー企業の社内資格制度、および技術士(情報工学)の相互連携を推進している。研究代表者は、この取り組みに参画し、共通の能力評価基盤を整備している。ISO/IEC JTC1/SC7/WG20では、ソフトウェア工学およびシステム工学分野における資格制度に関する国際標準(ISO/IEC 24773)の策定が進められている。研究代表者は、この取り組みにも参画し、情報分野における様々な資格制度の相互関係を明確にするための知識体系(BOK)および業務遂行能力に求められる要件の策定を推進した。また、情報処理学会の情報専門教育カリキュラム標準J07を構成する5領域の知識体系と情報処理技術者試験の各試験区分のシラバスを、共通の知識体系を用いて分析することで、それぞれが要求する内容およびレベルの違いを明確化した。この研究成果はJournal of Information Processingに採録され、特選論文にも選定された。さらに、研究成果を迅速にフィードバックするため、先行研究で構築したWebベースの情報システムcresieを拡張した。具体的な拡張内容としては、(1) 155の調査項目毎に要求や達成度のレベル別度数分布を表示する機能、(2)調査項目毎に重要度の平均値を求め、ランキングを表示する機能、(3)情報処理学会J07の各領域および情報処理技術者試験の各試験区分の要求レベルと回答者の達成度レベルや要求レベルを比較する機能等が挙げられる。情報社会が進展する中で,高度なIT人材の重要性はますます高まっている.高度なIT人材を育成するためには,大学での情報専門教育を始めとする情報教育と,産業界におけるIT人材育成の取り組みや情報系資格を始めとするIT人材の評価制度の間で整合性を確保する必要がある.本研究では,情報処理学会が策定した情報分野のカリキュラム標準J07を構成する5領域(CS,CE,IS,SE,IT),IT業界等で標準的に参照されている情報系のスキル標準(ITスキル標準,組み込みスキル標準,情報システムユーザースキル標準),共通キャリア・スキルフレームワーク(CCSF),情報分野の資格制度(情報処理技術者試験,技術士(情報工学),認定情報技術者制度等)の相互関係を明確化することを目的としている.平成26年7月末に,IPA(情報処理推進機構)はiコンピテンシ・ディクショナリ(iCD)を発表した.iCDは3つの情報系スキル標準や,それらを統合するために策定されたCCSFに,新たな人材像を盛り込み,国際標準との整合性にも配慮したモデルである.iCDはタスク,スキル(423個),知識(8255個)という相互に関連する3種類の要素を用いて情報系人材の能力を定義している.iCDでは,知識体系等の網羅性は確保されているものの,相互に排他的でない知識等が多く含まれているため,系統的な整理を行う必要がある.平成26年度の研究では,iCDの知識体系と,先に我々が提案したICTBOK(知識項目数155)の対応づけに関する研究に取り組み,レーベンシュタイン距離等を活用した自動対応づけアルゴリズムを開発した.これを通じてiCDのタスク,スキル,知識間の関連を明確化した.また,iCDが提供しているJ07や情報処理技術者試験との対応関係を参照して,これらの関係を明確化するためのツールを開発した.本研究では,高度なIT人材の育成を目的とする様々なカリキュラム標準,スキル標準,情報系の資格制度(情報処理技術者試験,技術士など),情報分野の様々な知識体系,情報系の様々な職種に求められる能力の相互関係を明確化した.明確化に当たっては,研究代表者(掛下)もアイデアを出し,IPAおよびスキル標準ユーザー協会が開発したiコンピテンシ・ディクショナリ(iCD)によって定義された知識,スキル,タスク間の関連を活用した.ただし,iCDの知識項目は互いに独立ではなかったため,研究代表者らが開発した知識体系ICTBOKとの対応付けを通じてMECEの関係を確保し,分析結果の妥当性を確保した.以下に示す各種の取り組みの要求事項を分析しICTBOKの領域・知識項目毎に重要度,要求レベル(知識,スキル)を具体的に示した.(1)情報処理学会が提案しているカリキュラム標準J07を構成する6領域,(2)情報処理技術者試験の12の試験区分,(3)技術士(情報工学)

一次試験および二次試験,(4) iCDに収録されている17種類の知識体系,(5) iCDに収録されている61種類のタスクプロフィール.上記の分析結果を現役のIT技術者や情報系の学生等に迅速にフィードバックするため,Web上で動作するアンケート収集分析システムcresieを拡張し,セルフアセスメント機能および収集したデータの分析機能を実装した.本研究の成果をまとめた論文は情報処理学会英文論文誌JIPの特選論文に選定され,EUが策定しているIT分野の知識体系の構築に当たっても参照された.情報処理学会では,認定情報技術者制度を推進しているが,その制度設計に当たっても,本研究の成果が活用されている.また,知識体系を通じて各種の資格制度の関連を明確化するアプローチは,ISO/IEC 24773の改訂に当たっても採用されている.本研究では,高度なIT人材の育成を目的とするカリキュラム標準,スキル標準,資格制度(情報処理技術者試験,技術士),情報分野の知識体系および職種が求める能力の相互関係を明確化する.明確化の際には,IPA等が策定したiコンピテンシ・ディクショナリ(iCD)を活用した.ただし,iCDの知識項目は互いに排他的な関係ではないため,我々が開発した知識体系ICTBOKとの対応付けを行い,分析結果の妥当性を確保した.さらに,分析結果を現役のIT技術者や情報系の学生等に迅速にフィードバックするため,Web上で動作するアンケート収集分析システムcresieを拡張し自己点検機能等を実装した.平成26年7月末にiCDが発表されたことを受けて研究計画を修正した.また,IEEE Computer Societyは資格制度(CSDP,CSDA)の運用を停止したことから,それに関する調査・分析は行っていない.しかし,国際標準ISO/IEC 24773の策定に向けた作業が,研究代表者も参画して進んでおり,その中で,情報分野の知識,スキル,タスクを相互参照する枠組みが形成されつつある.平成26年度には,EUが策定を進めているIT分野の知識体系の原案において,本研究の昨年度までの成果をまとめた論文が引用された.IFIP IP3に対するプレゼンテーションや,ACM Learning Center Bulletinに掲載されたインタビュー記事等を通じて,本研究の成果を世界に発信することもできた.情報工学平成26年度には,iCDの他に技術士(情報工学)の知識体系の整備が進行した.我々は,同知識体系の原案を入手しているため,本年度はその分析を行う.日本学術会議は情報分野の参照基準を策定しているが,研究代表者は情報処理学会・情報処理教育委員会を通じて同参照基準の策定にも参画しているため,参照基準の最新版に対する分析作業を進める.また,先の基盤研究(課題番号22500858、平成2224年度)の中で開発したWeb情報システムcresieを活用して,得られた知見の普及活動に取り組む.これらの取り組みに基づいて最終年度の成果をとりまとめる.当初計画では、ITスキル標準の分析を通じて情報系の技術者が持つべき能力を明らかにする予定だった。しかし、ITスキル標準を策定している情報処理推進機構(IPA)が、次世代IT人材(融合IT人材)が持つべき能力に関する検討を主に進めることとし、ITスキル標準の改訂作業を凍結したことから、検討結果を待って分析作業を進めることにした。研究代表者は、融合IT人材に関する検討にも協力しているが、当初の研究計画と比較すると遅れが出ている。
連続時間L_1制御問題の設計法に関する研究

研究課題である連続時間のL_1制御問題について、研究代表者が従来から提案していた上界列と下界列を用いて最適解を構成する補間点拡大法とよばれる手法について、次のことが新しく分かった。まず、拡大するブロックの構成方法を従来の結果よりも制約を緩くすることができた。つまりスカラーの伝達関数ではなく、多入力多出力の伝達関数として不安定零点を増加するように選べば、下界列と上界列がともに汎弱位相の意味で最適解に収束することを示すことができた。次に、H_∞の場合、下界列のノルムはHankel-Toeplitz作用素のノルムを漸近的に計算していることがわかった。これは、L_1制御問題に対しては直接の意味をもたないが、補間点を拡大することと作用素のノルムを計算することの密接な関係を示している。さらに、L_1制御に補間点拡大法を適用したときの上界列の収束性に関して、従来の条件よりも緩い条件のもとで汎弱位相の収束よりも強い結果を与えることができた。この結果により拡大の次数を途中で打ち切ったときに上界列が最適ノルムを任意の精度で近似できると言う意味で準最適になることが示され、この設計法の根拠を明らかにした。最後に、計算機に実装する場合に必要となる補間条件の線形拘束式への変換方法を与えた。補間条件はそのままの形で、行列のJordan形を求める計算が必要となり数値的に信頼性が低い。離散時間l_1制御で用いられていたnull chainという概念を用いて数値的に信頼できる計算を得る方法を連続時間の場合にも適用できることを明らかにした。
サイクリックAMPが関節軟骨細胞分化に与える影響とその機序解明

本研究の目的は、サイクリックAMP(cAMP)が、関節軟骨、特に表層に存在する永久軟骨細胞に与える影響とその機序を解明することである。関節軟骨の変性が主な病態である変形性関節症の患者数は、超高齢社会を迎えて急速に増加している。これら運動器疾患の進行予防は、健康寿命延伸に直結する。これまで、EP2受容体選択的アゴニストによる軟骨欠損修復作用やPTH(1-34)の関節内投与による軟骨変性抑制効果の報告がされてきたが、これらの薬剤には細胞内cAMP濃度を上昇させるという共通の作用がある。そこで、本研究では永久軟骨細胞に対するcAMPシグナルの効果に着目し、研究を遂行する予定である。
樹状細胞を介した腸管免疫寛容におけるマクロファージ由来ＴＧＦβの重要性

単球は骨髄中の造血系幹細胞(HCS)にその起源があり、前駆細胞の連続的な分化を介して供給されている。近年、マウスにおいてLy6chi単球とLy6clo単球を生み出す共通単球前駆細胞(cMoP)が同定された。マウスcMoPはDCと単球を供給する前駆細胞である単球ーDC前駆細胞(MDP)から生み出されることが証明されている。一方、ヒトにおいてミエロイド系細胞の前駆細胞としては共通ミエロイド前駆細胞(CMP)、赤芽球系前駆細胞(MEP)、そして顆粒球ー単球前駆細胞(GMP)などがIL-3受容体(CD123)、Flt3(CD135)、CD45RAなどの表面マーカーを用いて同定されてきた。そして近年、ヒトMDPが同定され、この発見によって単球への分化能をもつヒトcMoPの存在が示唆された。ヒトcMoPを同定するために、我々は単球ーマクロファージに発現するCD64とCLEC12Aに着目し、この二つのマーカーを用いて古典的顆粒球-単球前駆細胞(conventional granulocyte-monocyte progenitors; cGMP)を四つの亜集団に分類した。そしてこの亜集団中の、CLEC12AhiCD64hi分画にヒトcMoPを発見した。重要なことに、ヒトcMoPとMDPはGMP中に確かに存在しており、これはGMPが真のGMPと他の前駆細胞によって構成されていることを示唆していた。そして、これらのことにより、我々はCLEC12AhiCD64int分画に単球と顆粒球のみを産生する真のGMP(revised GMP; rGMP)を発見するに至った。以上、ヒトcMoPとrGMPの発見はヒトミエロイド系細胞の分化系譜に新たな視点を与えるものである。27年度が最終年度であるため、記入しない。申請者は、大腸粘膜固有層においてCD11c-/loCD11b+マクロファージ(MΦ)がTGFβ1を産生し、さらに、大腸絨毛先端部においてCD11c+CD11b-樹状細胞(DC)と近接することを見出した(未発表)。また、DC特異的II型TGFβ受容体欠損(TGFβRIIDC-KO)マウスが重度の自己免疫疾患様病態を示すことから、MΦが産生するTGFβ1がDCの機能を制御し免疫寛容誘導の構築に寄与するという仮説を立て、以下に示す実験を行った。はじめに、MΦ特異的TGF-β1欠損(TGF-β1MΦ-KO)マウスの作製を行い定常状態におけるTGF-β1MΦ-KOマウスの体重・生存率を確認したが、TGF-β1MΦ-KOマウスとコントロール群の間に有意な差異は見られなかった。また、TGFβRIIDC-KOマウスにおいて重度の自己免疫疾患様病態を示した大腸・小腸の他に骨髄・胸腺・脾臓・腸間膜リンパ節・末梢リンパ節・パイエル板・における定常状態でのTreg細胞の割合を解析した。しかしながら、いずれの臓器においてもTreg細胞の存在比に変化は見受けられなかった。次に、炎症モデルを用いてTGF-β1MΦ-KOマウスの解析を行った。TGFβRIIDC-KOマウスでは消化器系に顕著な自己免疫疾患用症状を呈する。ゆえに、炎症性腸疾患誘発モデルとして最もよく用いられるDSS腸炎モデルを用い、TGF-β1MΦ-KOマウスに腸炎を誘発してコントロール群との体重減少率を比較した。この結果、現段階ではコントロール群との間で炎症誘発期、上皮傷害回復期いずれの段階においても有意な差は認められてないが、回復期において、TGF-β1MΦ-KOマウスで体重の回復がコントロール群に比べて遅れる傾向が見られている。DSS腸炎モデルはDSSのロット差により結果が大きく左右されるため、今後同様の実験を繰り返し行う必要がある。

そして、これらのことにより、我々はCLEC12AhiCD64int分画に単球と顆粒球のみを産生する真のGMP(revised GMP; rGMP)を発見するに至った。以上、ヒトcMoPとrGMPの発見はヒトミエロイド系細胞の分化系譜に新たな視点を与えるものである。MΦ特異的TGF-β1欠損(TGF-β1MΦ-KO)マウスの作製には予想以上に時間を要したが、表現型を体重測定、生存率、病理学的解析にて同マウスを評価することができた。しかしながら、いずれの解析においても同マウスにおいて発症が予想された自発的自己免疫疾患様病態を示す所見を得ることができなかったため、DSSを用いた腸炎誘導モデルを同マウスに適用し、解析を行った。この実験は1年目の年間目標に挙げていなかった実験であるが、この検討より腸炎回復期におけるMΦ由来TGF-β1の重要性を示唆する結果を得ることができた。一方で、DSSを用いた腸炎誘導モデルではDSSのロット差により実験結果が大きく異なるという問題を抱え、これにより他の解析に必要なマウスを消費してしまう結果となった。これにより、以降で実験を予定していた『腸管樹状細胞の機能発現におけるマクロファージ由来TGF-β1の役割』を検討する実験に未だ着手できておらず遅れが出ている。27年度が最終年度であるため、記入しない。TGF-β1MΦ-KOマウスにDSSを用いた腸炎誘導モデルを適用し、コントロールと比較すると同マウスでは腸炎からの回復(体重の回復)が遅れる傾向にある。この原因としては、1MΦ由来TGF-β1の欠損により腸炎誘導期における炎症が増大している、2MΦ由来TGF-β1の欠損により上皮の回復が遅延している、の二つが考えられる。いずれの仮説が正しいかを確かめるために、DSS腸炎誘導モデルを適用したTGF-β1MΦ-KOマウスを継時的に解析する必要がある。すなわち、腸炎誘導期と回復期においてFCMや切片を用いた免疫染色を行い、腸管の各免疫細胞、特に樹状細胞サブセットの存在比や腸管の損傷をスコア化し精査する必要がある。また、ヒト免疫寛容構築システムを包括的に理解する上で、ヒトDC、MΦ前駆細胞を同定しその分化や機能の解析を行うことは非常に重要である。この観点から、本研究のヒトへの応用を踏まえた実験系の確立のため、申請者はヒトMΦとDC前駆細胞の同定を試みている。申請者は現在、ヒトDC、MΦ前駆細胞を多く含む分画をヒト臍帯血中に同定しており、特にMΦ前駆細胞に関しては非常に興味深い結果を得ている。この実験により同定された各分画をより詳細に精査する予定である。
体細胞の細胞周期とその制御機構

細胞複製を遺伝子のレベルで研究する目的で、欠損のため細胞周期進行が停止する、またはアポトーシスが起る遺伝子群とその機能を次の三つの柱を立てて研究を行なっている。柱1。細胞複製温度感受性変異の分離。柱2。変異遺伝子の分離と同定。柱3。分離された遺伝子機能の解明。柱1:ハムスター由来BHK21細胞からの常染色体に変異を持つ細胞複製温度感受性変異株の分離。申請者が考案した方法は世界的に認知されMethod in Enzymologyの283版、1997に掲載された。本研究で新たに24株の変異株をハムスター由来BHK21細胞株より分離し、新規な二つの相補群に属する変異株が2株得られた。柱2。変異を相補するヒト遺伝子の分離。本研究機関において論文としてまとめ受理された変異遺伝子:HCF遺伝子、ヒスチジルtRNA合成酵素遺伝子、リシルtRNA合成酵素遺伝子。柱3。分離された遺伝子のコードする蛋白質機能の解明。1。HCFが、ウイルスの複製のみでなく細胞周期のG0からG1期にかけて働く遺伝子であることが判明し細胞周期初期の研究に手掛かりが得られた。2。DAD1は酵母oligosaccharyltransferase構成因子Ost2pと相同であり、tsBN7はN-Linked glycosylationに欠損がある。また、DAD1遺伝子破壊マウスは早期に細胞死を起こして死亡する事が判明した。2)tsBN2変異と未成熟染色体凝縮。Ccc25Bが半減期の短い代謝回転の早い蛋白質であり、蛋白質合成阻害剤添加によって消失する事を発見した。柱1。柱2。柱3。柱2。柱3。1。2。細胞複製を遺伝子のレベルで研究する目的で、欠損のため細胞周期進行が停止する、またはアポトーシスが起る遺伝子群を明らかにしその機能を解明すると言う目的のために次の三つの柱を立てて研究を行なっている。柱1。柱2。柱3。柱1については、新たな方法で温度感受性変異珠が分離された。柱2についてはtsBN250とtsBN269を相補するヒト遺伝子が分離され、変異遺伝子であることが同定された。これらは、それぞれhistydyl tRNA synthetaseとlysyl tRNA synthetaseをコードしている。二つの変異体ともに制限温度でアポプトーシスを起こし、アミノ酸なしのtRNAが毒性を持っていることが示唆された。そして、また、両者とも高温でサイクリンDの合成が阻害されている。柱3ではRCC1タンパクの機能ドメインの解析からRCC1-repeatのC端にあるヒスチヂンがRCC1のGEF活性に重要であること、またN端はRanとの結合に関与していることが示唆された。RCC1-Ran経路と相互作用する因子として新たなGTPase GTR1が分離され、この欠損がすべてのrcc1欠損、rna1欠損を相補することが判明した。その、相同体がヒトより分離され、我々は酵母のgtr1変異を相補することを見つけている。さらに、フォスファターゼ制御因子のDIS3がRan結合タンパクとして分離された。Dis3のRCC1-Ran経路への関与はこれからの興味ある課題である。RanのエフェクターとしてはGTP-RANと結合する因子が考えられるが、我々はYPB1についでYRB2もGTP-Ranと特異的結合することを発見した。YRB2の欠損はタンパクやRNA分子の核-細胞質間輸送に影響を与えない。

柱1。細胞複製温度感受性変異の分離。柱2。変異遺伝子の分離と同定。柱3。分離された遺伝子機能の解明。柱1については、今年度は新たな進展はなかった。柱2についてはtsBN821の温度感受性変異を相補するヒト遺伝子の分離を精力的に行ったが、自然突然変異復帰株が多くて分離できなかった。新たな効率の良いヒトDNAによる形質転換法の開発を行う必要がある。柱3では、分離した遺伝子の解析で大きな進展があった。1)Rcclpのモノクローナル抗体を分離しそのエピトープが先に酵素化学反応の解析から推測したRanとの結合領域にあることを確定した。2)酵母Gtrlpに相当するヒトRagAが酵母のGtrlp欠損を相補し、さらにRagAがGTPまたはGDP結合型に応じて細胞内の分布が変化することを発見した。3)出芽酵母のRan相同体Gsplpの温度感受性変異株を分離した。その結果、タンパク質の核移行は全ての変異株で欠損していたが、mRNAの核外移行は欠損しているものとそうでないものがあった。Ranのエフェクターに色々な因子があることが推測された。3)YRB2遺伝子の破壊は酵母を殺さないが、タンパク質の核外移行に欠損があり、Crmlpの発現により相補された。4)MTOC(Microtubule Organizing Center)の形成にRanが関与していることが示唆された。5)長年の課題であったRCClが欠損したときに見られる未成熟染色体凝縮に必須なタンパク質としてCdc25Bが同定された。細胞複製を遺伝子のレベルで研究する目的で、欠損のため細胞周期進行が停止する、またはアポトーシスが起る遺伝子群とその機能を次の三つの柱を立てて研究を行なっている。柱1。柱2。柱3。これまでに次の事が明らかとなった。柱1ハムスター由来BHK21株から新たな方法で温度感受性変異株が分離された。柱2昨年度までにハムスター由来BHK21株の温度感受性変異tsBN250とtsBN269の変異遺伝子としてhistydyl tRNA synthetaseとlysyl tRNAsynthetaseが分離された。さらに、今年度は本研究課題のもと新たに分離された温度感受性変異株を相補するヒト遺伝子の分離をすすめた。1。A.Wittinghofferとの共同研究によりRCC1とRanの結合部位を明らかにした。2。rcc1欠損とma1欠損を抑圧する変異遺伝子GTR1と相互作用する第二の遺伝子GTR2を発見した。3。出芽酵母Ran相同遺伝子GSP1と相互作用するYRB2遺伝子の表原型(タンパク質核外移行欠損があり、Crmlpの発現により相補される)を論文としてまとめた。4。新たに発見したRan結合タンパクRanBPM