hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アンチジーン発現ベクターを用いた悪性グリオーマに対する遺伝子療法

この方法においては代謝、毒性に関して顕著な問題はないとされているが、腫瘍性疾患に対してはどのようにして効率良く発現させるかについてさらに工夫が必要であった。ウイルスベクターにより発現されるアンチジーンRNAの転写阻害効果については従来報告がなく、その効果を検討するため、組み換えレトロウイルスベクターを構築しin vitroでの転写阻害について検討した。CMVプロモーターによりc-erbBアンチジーンを発現するウイルスベクターゲノムpLNCAを構築し、パッケージング細胞psi-CREを用いてアンチジーンレトロウイルスベクターLNCAを得た。一方、EGFRプロモーターにてルシフェラーゼ遺伝子を発現するベクターゲノムpLNELをマウス繊維芽細胞NIH3T3に導入し、この遺伝子組換え体細胞にウイルスベクターLNCAの反復感染を行い経時的にルシフェラーゼ酵素活性の測定を行った。LNCA感染後48時間で量依存性に酵素活性が減少し、MOI=10の条件下にて約50%のルシフェラーゼ発現阻害効果が認められた。レトロウイルスベクターにより発現されるアンチジーンRNAにより、オリゴヌクレオチドと同様に転写阻害効果が得られることが示唆された。転写阻害に必要な力価やウイルスの投与時期などの条件についてさらに検討中である。
内部分泌撹乱化学物質の免疫測定法の開発に関する企画調査

近年、内分泌撹乱化学物質に対して生物学的、医学的見地からのみならず社会的にも大きな関心がよせられ、種々の試料よりの、検出、定量が必要とされている。測定法としてはgaschromatography/mass spectrometry(GC/MS)が主体であり、数段階の前処理と高額の機器を必要とするため、測定可能な検体数の制限が大きい。このため、特殊な実験区画や高額の機器を必要とせず、多検体の同時測定の可能な免疫測定法の開発について検討した。これまで、生体中のホルモンである、thyroxineやestrogenについては、monoiodothyroxine,diiodothyroxine,triiodothyroxine,tetraiodothyroxineのようにヨードー原子の違いやestron,estradiol,estriolのように水素一原子の違いを認識する抗体が開発されており、estradiolについては無抽出で生体試料中のホルモンをpMレベルで検出する免疫測定法が開発されている。更に、超高感度免疫測定法では理論的にはzmolレベルの抗原の測定が可能であることが報告されている(Ann Clin Biochem 19:379,1982)。従って、内分泌撹乱化学物質についても特異性の高い高力価の抗体の開発により、様々な試料からの種々の撹乱物質の測定が可能な免疫測定法の開発が可能であると考えられる。ところで、内分泌撹乱物質にはestrogenと同程度の低分子が多く、このため、抗体の作製にはキャリアプロテインが必要である。キャリアプロテインとしては、BSA、サイログロブリン、などが汎用されてきたが、哺乳動物用のアッセイ系を開発するには貝類より得られる蛋白質であり、近年、合成ペプチドの抗体作製に適することの知られているKLHが、一方、内分泌撹乱物質による雄の雌化等で知られる貝類などの試料のdirect assay法の開発にはBSAが適すると考えられる。また、最適の抗体を得るためには、撹乱物質とキャリアプロテインの結合法についても検討が必要である。現在までのところ、bisphenol Aについては、ELISAが開発されており、フェノール類を中心に開発が進展するものと考える。
酸素還元電極触媒としての銅イオン担持共有結合性有機構造体の開発

本年度で行った研究は、(1)金属担持共有結合性有機構造体からなる高活性な酸素還元反応(ORR)電極触媒の設計指針の提唱、と(2)これまで得られた知見の新規二酸化炭素還元反応(CRR)電極触媒への展開、の二点である。まず、上記(1)について述べる。ORRは、種々の燃料電池のカソード反応として重要であり、安価な非貴金属のみからなる触媒の開発が強く望まれる。近年の第一原理計算による研究からORR中間体の吸着エネルギーの適切な制御がORRの高活性化に重要であることが提唱されている。そこで本研究では、種々の構造、及び金属種を有する金属担持共有結合性有機構造体のモデル構造を設計し、第一原理計算により種々のORR中間体の吸着エネルギーを見積もった。その結果、金属活性中心の配位環境及びその金属種の適切な選択が、ORR中間体の吸着エネルギー、ひいてはORR活性の高活性化に重要であることが明らかになった。次に、(2)に関して述べる。これまで本研究課題遂行者の岩瀬は、金属担持共有結合性有機構造体を用いて、金属中心の配位環境がCRR活性の反応選択性を決める重要な要素であることを実験的に見出してきた。そこで本研究ではこの研究を更に発展させ、この知見を無機炭素材料に展開した。様々な合成条件で金属ドープ炭素材料を合成し、その二酸化炭素還元活性を測定したところ、合成条件の選択による金属活性中心の配位環境及び形態の制御が、CRR活性の制御に重要であることがわかった。この研究は日本学術振興会の若手研究者交流事業(スイス枠)の採用期間中に、スイスのポール・シェラー研究所にて行った。現在合成した触媒のより詳細な構造解析、及び合成した触媒のCRRのメカニズムについての検討を行っている。現在、上述の2つの研究はそれぞれ結果を取りまとめ、学術論文として投稿準備中である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。先行研究ではCu(I)が酸素還元反応を進行させると報告されてきたことから、酸素還元活性の高活性化にはCu(II/I)の酸化還元電位の静電位側へのシフトが必要である。そこで、新規に銅担持共有結合性有機構造体電極触媒を合成し、Cu(II/I)を正電位側にシフトさせることで酸素還元活性の向上を試みた。既報により、硫黄が銅イオンに配位することで、Cu(II/I)が正電位側に大きくシフトすることが知られていることから、硫黄を孔内に持つ硫黄架橋型共有結合性有機構造体を合成し、銅イオンを含浸担持して触媒を合成した。また本年は、高い酸素還元活性を持つマルチ銅酵素が活性中心に複核構造の銅イオンを有していることから、予備的検討として銅イオンの担持量、及び担持条件を検討することで、活性中心に複核の銅イオンを導入することを試みた。本年の研究結果は大きく分けて以下の二点である。1)硫黄架橋型共有結合性有機構造体を合成し、銅イオンを担持することで、Cu(II/I)が従来の銅-窒素錯体と比較して大きく正電位側にシフトした。また、その高いCu(II/I)に伴い、酸素還元開始電位が正電位側にシフトしたことを確認した。2)複核の活性中心の構築を目的として、銅イオンの担持量、含浸担持の条件を詳細に検討したところ、銅の担持量に依存する電流電位曲線の挙動の変化が確認された。しかし、酸素還元開始電位の向上は見られなかった。今後は、有機構造体の構造の詳細な解析や、反応メカニズムの詳細について解析を行い、この銅担持硫黄架橋型共有結合性有機構造体の高活性の要因、及びさらなる高活性化のための指針を得る。また、合成条件の最適化によりさらなる高活性化を試みる。まず本年までの成果としては、硫黄を含む共有結合性有機構造体を新規に合成することで、酸素還元活性の高活性化に成功したことが挙げられる。この結果は、共有結合性有機構造体により銅イオンの電子状態を制御し、Cu(II/I)を正電位側にシフトさせたことが要因であると考えられる。また、この結果は有機構造体の構造を制御することで、金属中心の電子状態を自在に制御できることを示すものである。また、銅イオンの担持方法の検討や種々の共有結合性有機構造体合成といった、高活性化のための予備的検討も行った。以上の結果から、本年までの研究は概ね順調に進展しているといえる。研究課題である酸素還元活性の高活性化に向けて、Cu(II/I)の正電位側へのシフトによる酸素還元開始電位の向上に取り組んだ。特に、本年度は銅を担持した硫黄架橋型共有結合性有機構造体の構造を赤外分光法、固体NMRを用いて、酸素還元のメカニズムの詳細をin-situ XAFSにより解析した。この結果は論文としてとりまとめ、査読付きの英文学術誌に受理された。さらに本年はこれまでの研究で得られた知見をもとに、第一遷移金属を担持した共有結合性有機構造体電極触媒を他の有用反応に展開した。具体的には、(1)ニトロベンゼンからアニリンへの選択的電気化学還元反応、(2)二酸化炭素から一酸化炭素への中性水溶液中での選択的電気化学還元反応の2つの反応へと展開した。そして、(1)銅担持共有結合性トリアジン構造体が、ニトロベンゼンを中性水溶液中で60%以上の高いファラデー効率でアニリンへと変換することを見出した。

(2)特にNi担持CTF(Ni-CTF)が中性領域で-0.9V(vs. RHE)において、95%以上の高いファラデー効率で二酸化炭素を一酸化炭素へと選択的に還元することを明らかにした。広域X線吸収微細構造と第一原理計算により、Ni中心の配位構造がCTFの構造により制御され、配位不飽和な構造を持つことがこの高い一酸化炭素の生成効率の起源であることを見出した。これらの(1),(2)の結果は論文としてとりまとめ、いずれも査読付きの英文学術誌に受理された。この結果は金属担持共有結合性有機構造体からなる電極触媒が多くの有用な電気化学反応に対し特異な反応選択性を発現できることを示すものである。本年度は、共有結合性有機構造体電極触媒の酸素還元反応の高活性化に向けて、新規に合成した銅担持硫黄架橋型共有結合性有機構造体の構造解析と反応メカニズム解析を行った。一連の結果は査読付き英文学術誌に投稿し、受理された。特に、本年は構造解析から金属中心の配位構造と酸素還元活性の相関を明らかにしており、この構造解析で得られた知見を用いて、より詳細な活性中心の構造制御を行うことでさらなる高活性化が期待できる。それに加え、本年はこれまで得られた知見を用いて、共有結合性有機構造体電極触媒をニトロベンゼンや二酸化炭素の電気化学還元へと展開し、それぞれの反応において特異な反応選択性が発現することを見出した。このように、研究課題の酸素還元活性の高活性化に向けて、高活性化の重要な知見が得られたこと、及び酸素還元反応及び他の有用反応において、共有結合性有機構造体電極触媒が高活性な触媒として機能することを見出したことから、本研究は概ね順調に進展したといえる。本年度で行った研究は、(1)金属担持共有結合性有機構造体からなる高活性な酸素還元反応(ORR)電極触媒の設計指針の提唱、と(2)これまで得られた知見の新規二酸化炭素還元反応(CRR)電極触媒への展開、の二点である。まず、上記(1)について述べる。ORRは、種々の燃料電池のカソード反応として重要であり、安価な非貴金属のみからなる触媒の開発が強く望まれる。近年の第一原理計算による研究からORR中間体の吸着エネルギーの適切な制御がORRの高活性化に重要であることが提唱されている。そこで本研究では、種々の構造、及び金属種を有する金属担持共有結合性有機構造体のモデル構造を設計し、第一原理計算により種々のORR中間体の吸着エネルギーを見積もった。その結果、金属活性中心の配位環境及びその金属種の適切な選択が、ORR中間体の吸着エネルギー、ひいてはORR活性の高活性化に重要であることが明らかになった。次に、(2)に関して述べる。これまで本研究課題遂行者の岩瀬は、金属担持共有結合性有機構造体を用いて、金属中心の配位環境がCRR活性の反応選択性を決める重要な要素であることを実験的に見出してきた。そこで本研究ではこの研究を更に発展させ、この知見を無機炭素材料に展開した。様々な合成条件で金属ドープ炭素材料を合成し、その二酸化炭素還元活性を測定したところ、合成条件の選択による金属活性中心の配位環境及び形態の制御が、CRR活性の制御に重要であることがわかった。この研究は日本学術振興会の若手研究者交流事業(スイス枠)の採用期間中に、スイスのポール・シェラー研究所にて行った。現在合成した触媒のより詳細な構造解析、及び合成した触媒のCRRのメカニズムについての検討を行っている。
光学三角測量法による三次元人体計測法の試みと人体形状評価のへの対応

本研究の第一の着眼点は、被験者に非接触で人体計測を行うことが可能な3次元人体計測装置を開発し、人体計測法に対して新しい視点を提供することであった。さらに単に身体計測にとどまらず、時系列に伴う人体の形状の縦断的変化(たとえば、加齢に伴う姿勢の変化など)や安静時代謝と関係から体表面積測定やビデオ分析時の基礎的基準点となる各体節の体積や重心や慣性モーメントの推定を行い、生体のかたちと機能を関連付けることを目的とした。本研究では以下の2点に関する研究を実施した。(1)三次元人体計測データの健康医・科学およびスポーツ科学への応用三次元データにカラー情報のマッピングを実行して表示するとともに、自動認識された頭頂点などにランドマークを自動配置した。また、被計測者に貼り付けた外付けランドマーク位置を自動検出し、これらのマークを関節中心点として人体計測法に基づく計測部位の正確な位置決めを行い、各四肢の長さや周囲計の計測を自動で行った。その際各周径囲の計測では、各体節長の相対的部位地点を自動認識し、かつその部位での体分節の長軸に直行する面の外周とした。さらに体表面積の算出(基礎代謝や安静時代謝との関連、健康科学)や各身体セグメントの体積、部分重心点や関係モーメントなどの算出(スポーツバイオメカニクスへの応用)、スポーツ特異的な姿勢分析(例えば競泳のストリームライン姿勢での揚力、抗力推定などの流体力学的応用)などをもとめた。(2)発育発達による"体のかたち"の変化を三次元的に提示(健康医・科学的研究成果)子どもかたら年寄りまでのからだの形状変化を捉えることにより、発育や加齢に伴う人体の形の変化を定量化することを可能とした。さらに脊柱の湾曲形状なども計測可能となり、今後は、姿勢と発育・加齢研究あるいは臨床的には腰痛、糖尿病あるいは肥満に関する人体形状のより客観的評価が可能になると考えられる。光学式3次元人体計測装置を応用して人体の形状,体表面積および各体節の体積の計測を行うために基礎的な研究を行った。1「測定装置の人体計測への応用と正確性の検討」では,計測入体を囲む形で,頭部上から足先まで光学式三角測定手法を採用して三次元データを取得した。今回はCCDカメラの代わりにインテリジェントビジョンチップを用いて,三次元人体計測装置を開発した。2「測定値の再現性と妥当性の検討」では,被検者は6個のスキャナーヘッドの中央部の踏み台に上がり,直立静止姿勢を維持した。計測装置は,この被計測者を囲む形で6本の支柱を配置しており,各支柱内には,スキャナヘッドが内臓され,計測時に被計測者の頭上より足先まで,平行移動させてスキャンした。計測高は2.3mで,この領域をスライスピッチ2.5mmの高分解で計測し,計測時間は10秒以内とした。計測値については,四肢や全身を含めた人体計測の正確性を検討した。また人体に添付したランドマークから自動的に測定部位が同定でき,その部位での長軸に直交する面での周径囲や横断面積の計測などが可能となるようにソフトウエアを開発した。本年度は子ども男女合計30名および競技スポーツ選手約100名について計測を実施し,長育,周育,体表面積および体分節体積について正確性と妥当性を検討した。またソフトウエアの改良のため,工学的専門知識の提供や製作者とも連携して研究を進めた。またアメリカスポーツ医学会に参加し,学術的情報交換を行った。本研究の第一の目的は、被験者に非接触で人体計測を行うことが可能な3次元人体計測装置を開発し、人体計測法に対して新しい視点を提供することである。レーザーシートビーム光を用いた形状測定装置を人体の三次元計測をスポーツ科学に応用し、従来からの人体計測に加えて、体表面積、体節体積も計測対象とした。光学式三次元人体形状測定装置(浜松ホトニクス社製)を用いてスキャンした画像からClauser(1969)に従い、身体を14体分節に区分しそれぞれの体積を算出し、身体密度の値を乗じて体分節質量(SM)及び相対質量(%SM)をそれぞれ算出した。被験者は体操競技男子全日本ジュニアトップレベル選手(以下GM群:身長149.9±11.2cm,体重43.8±6.9kg)と同年代の標準的な中学生男子(以下NM群:身長153.5±12.3cm,体重42.2±7.7kg)とした。SMではすべての部位で両群に大きな差がみられなかったが、%SMではそれぞれ上腕部で7.7%、前腕部では19.3%GM群が大きな値を示した。また、体幹部全体の体積は両群に差はみられないが、体幹の上部ではGM群が大きな値を示した。以上のことから、GM群は特に上肢部及び体幹上部の発達が特徴的であることが示唆された。

(1)三次元人体計測データの健康医・科学およびスポーツ科学への応用三次元データにカラー情報のマッピングを実行して表示するとともに、自動認識された頭頂点などにランドマークを自動配置した。また、被計測者に貼り付けた外付けランドマーク位置を自動検出し、これらのマークを関節中心点として人体計測法に基づく計測部位の正確な位置決めを行い、各四肢の長さや周囲計の計測を自動で行った。その際各周径囲の計測では、各体節長の相対的部位地点を自動認識し、かつその部位での体分節の長軸に直行する面の外周とした。さらに体表面積の算出(基礎代謝や安静時代謝との関連、健康科学)や各身体セグメントの体積、部分重心点や関係モーメントなどの算出(スポーツバイオメカニクスへの応用)、スポーツ特異的な姿勢分析(例えば競泳のストリームライン姿勢での揚力、抗力推定などの流体力学的応用)などをもとめた。(2)発育発達による"体のかたち"の変化を三次元的に提示(健康医・科学的研究成果)子どもかたら年寄りまでのからだの形状変化を捉えることにより、発育や加齢に伴う人体の形の変化を定量化することを可能とした。さらに脊柱の湾曲形状なども計測可能となり、今後は、姿勢と発育・加齢研究あるいは臨床的には腰痛、糖尿病あるいは肥満に関する人体形状のより客観的評価が可能になると考えられる。
無限群作用付きゲージ理論の構成

離散力学系からオートマトンへ、スケール変換でつなぐトロピカル幾何学を用いて、互いに相異なる有理力学系や偏微分方程式の間の比較定理を導いた。応用としてオートマタ群の理論におけるBurnside群に適用することで、擬再帰的な有理力学系の初めての例を与えた。高い対称性を持つ無限次元概ケーラー多様体上で正則曲線のモジュライ理論の構成を行い、モジュライ空間のコンパクト性に関わる結果を得た。その応用として、樹木に作用する群のハミルトン変形理論の構成を行い、対応する群の非有限性を示した。今年度は、普遍被覆空間上での非線形偏微分方程式の研究を行うために、2つの基本的な解析的手法の構成を発展させた。一つ目は、双曲系非線形偏微分方程式を離散群のスケール極限として与え、特に力学系のスケール変換の立場から研究を行った。オートマトンを幾何学的に扱う手法としてもっとも活発に研究されているものの一つが,無限樹木に作用する離散群である.そこに現れる代表的なオートマトンのクラスとしてMealy automatonがあり,それから無限樹木へ作用するオートマタ群が構成される.オートマタ群は非常に特徴的な群をいくつも構成することに成功しているが,そのうち特に無限トーション群について,対応する双曲系偏微分方程式の解がある種の条件のもとで無限個の周期を持つ擬再帰的な振る舞いをすることがわかった.またMealy automatonにクラスを制限すると,誘導される偏微分方程式系は,Griffithらによる微分形式の理論で典型的に現れる双曲型偏微分方程式系であることがわかった.トロピカル幾何学にあらわれる同値関係と,微分形式の理論に現れるそれとは全く性質が違い,前者は大域解析的なもので後者は局所的であるが,その間の関係を現在調べている.二つ目は、ある種の無限次元空間への概正則曲線のモジュライ空間のコンパクト性に関わる結果を得た。これは線形化方程式をヒルベルト空間に値を取るものに拡張することで、関数解析的な取り扱いを行うことで得られる。普遍被覆空間上のベクトル束はpush forwardを施すことにより、もとのコンパクト多様体上のファイバーが無限次元であるようなベクトル束が与えられるが、それにより前者の上の非線形偏微分方程式を後者の上のものと見なくことができ、逆に後者での解析の結果を元の問題である普遍被覆空間上の大域解析へ応用することが目標となる。今年度までの研究結果において、無限次元多様体をターゲットとした非コンパクト空間への正則曲線に関する、非線形偏微分方程式のモジュライ理論の構成を行った。特にターゲットの空間に高い対称性を仮定することで、モジュライ空間のフレドホルム理論とそのコンパクト性、さらに構造の微小変形に関する安定性を導くことができた。それは関数解析的な枠組みにおけるアイデアに基づいており、この手法はモジュライ理論の一般的な枠組みでなされてなされているため、そこでの構成の一部はサイバーグウイッテン理論などのゲージ理論に非コンパクト空間上でも適用できる。今後はモジュライ理論の構成の続きとして、非コンパクト空間上のモジュライ空間を構成する解の構成を行う。さらにモジュライ空間への群作用の大域的な性質を研究する。線形の場合、アティヤの$\Gamma$指数定理を用いることで調和L^2微分形式の存在を示すことができるが、ここでもその考え方を用いる。そのために非線形偏微分方程式のモジュライ理論での$¥Gamma$指数定理を構成する。基本的には無限個の点の群作用に関する平均に相当する量を導くことを行う。それを達成するためには点列が集積しないことが必要であるが、それは一般には成立しない可能性がある。一方で解の存在のみを示す場合、等式の意味での$¥Gamma$指数定理そのものは必要なく、$¥Gamma$指数不等式のようなある種の評価のみを示せば良い。またさらに、群作用の変形に関する研究を行う。一般に離散的な対象である基本群の変形理論はまだほとんど構成されていないが、ここではモジュライ空間への作用に限定することで偏微分方程式の解構造が変形によってどのように変化するか研究を行う。無限次元多様体をターゲットとする概正則曲線のモジュライ空間の構成を行った.具体的には,その多様体が高い対称性,可積分性を持つ場合に,モジュライ空間の線形化写像のフレドホルム性,モジュライ空間のコンパクト性を示すことで,局所コンパクト性を持たない無限次元多様体上でも,モジュライ空間の理論のメカニズムが成り立つことを示した.さらにそのような多様体を摂動することで対称性や可積分性を崩しても,その性質が成り立つことを示した.樹木に作用する離散群は,無限次元射影空間の自己同型部分群として実現できる.一方でその上のハミルトン微分同相写像と合成することで,それら離散群の変形が得られる.無限次元多様体上でのモジュライ空間の構成の応用として,その変形に関する性質を調べた.

樹木に作用する離散群のなかでも,オートマタ群は極めて重要なクラスであり,特に有限生成無限トーション群を含む.さらに状態数が小さい場合には有限群を多数持つ.このことから指数が有限であるような群の変形を持つか調べることは非常に重要であるが,特にある種のハミルトン関数のクラスによる変形については,非自明に変形したものは常に無限群になることが分かった.より詳細な解析的評価を行うことで,変形した群の元の繰り返しについて,微分ノルムが少なくとも線形増大度を持つことが示された.一方で,モジュライ空間のコボルディスムが,境界の近傍でどれだけ直積に近いかを計る,コボルディスムのエネルギーに相当する量と,上で述べた微分ノルムとの積を下から一様に押さえた,新しい一様評価を得ることができた.無限次元空間をターゲットとするモジュライ空間の解析を行った。24年度が最終年度であるため、記入しない。非コンパクト空間をターゲットとするモジュライ空間の解の構成を行う。
ハムスター実験膵癌における化学予防の検索-プログレッション機構制御の追究

膵癌を化学予防しうる物質を検索する目的で,ハムスター短期膵発癌モデルにおいて膵管上皮過形成の出現する時期より,被験物質としてα-カロチン,β-カロチン,パームカロチン,緑茶ポリフェノール(GTP)を実験終了まで投与し,膵の病理学的検索を行い,被験物質の膵発癌抑制効果を評価した。【実験1,材料と方法】6週齢雌シリアンゴールデンハムスターを用い,短期膵発癌モデルに従い,BOP70mg/kg s.c.のイニシエーション後,エチオニン・メチオニンi.p.・BOP20mg/kg s.c.・choline deficient dietより成る促進圧力操作(augmentation pressure)を3回行った。実験開始50日目より55日間被験物質を飲水中に混じて投与した。被験物質として25ppm,50ppm α-カロチン,25ppm,50ppm βカロチン,100ppm GTP,複合投与群として25ppm α及びβ-カロチン+100ppm GTPを投与した。実験開始後105日目に膵臓を摘出し,病理組織学的検索を行った。【実験1,結果】1匹あたりの膵管病変の発生個数は25ppm β-カロチン群のみ有意に減少していた。この結果を確認するため実験2を行った。【実験2,材料と方法】発癌処置は実験1と同様で,実験開始50日目より被験物質を飲水中に混じて45日間投与した。投与した被験物質は2ppm,25ppm β-カロチン,40ppmパームカロチン,50ppm,500ppm,5000ppm GTP,そして40ppmパームカロチン+50ppm GTPである。実験開始後95日目に膵臓を摘出し,病理組織学的検索を行った。【実験2,結果】1匹あたりの膵管病変の発生個数は,コントロール群に比べ,25ppm β-カロチン群,40ppmパームカロチン群,500ppm及び5000ppm GTP群で有意に減少していた。【結論】β-カロチン,パームカロチン,GTPの膵管癌発生(プログレッション期)に対する抑制効果の可能性が示唆された。膵癌を化学予防しうる物質を検索する目的で、ハムスター短期膵発癌モデルにおいて膵管上皮過形成の出現する時期より、被験物質としてαカロチン、βカロチン、パームカロチン、緑茶ポリフェノールを実験終了まで投与し、膵の病理学的検索を行い、被験物質の膵発癌抑制効果を評価した。【材料と方法】6週齢雌シリアンゴールデンハムスターを用い,短期膵発癌モデルに従い、BOP70mg/kg s.c.のイニシエーション後、エチオニン・メチオニンi.p.・BOP20mg/kg s.c.・choline deficient dietより成る促進圧力操作(augmentation pressure)を3回行った。(実験1)実験開始50日目より55日間被験物質を飲水中に混じて投与した。被験物質として0.0025%・0.005%

α-カロチン、0.0025%・0.005%β-カロチン、0.01%緑茶ポリフェノール(GTP)、そして複合群として0.0025%α及びβカロチン+0.01%GTPを投与した。実験開始後105日目に膵臓を摘出し,病理組織学的検索を行った。(実験2)実験開始50日目より被験物質を飲水中に混じて45日間投与した。投与した被験物質は0.0002%・0.0025%β-カロチン、0.004%パームカロチン、0.005%・0.05%・0.5%GTP、そして0.004%パームカロチン+0.005%GTPである。実験開始後95日目に膵臓を摘出し,病理組織学的検索を行った。【結果】(実験1)1匹あたりの膵管病変の発生個数は,0.0025%β-カロチン群のみ有意に減少していた。(実験2)1匹あたりの膵管病変の発生個数は,コントロール群に比べ,0.0025%β-カロチン群,0.004%パームカロチン群、0.05%及び0.5%GTP群で有意に減少していた。以上の結果より,β-カロチン,パームカロチン,GTPの膵管癌発生(プログレッション期)に対する抑制効果の可能性が示唆された。膵癌を予防しうる物質を検索する目的で,6週齢雌シリアンゴールデンハムスターを用いた短期膵発癌モデルにおいて,膵管上皮過形成の出現する時期より,被検物質としてα-カロチン,β-カロチン,パームカロチン,緑茶ポリフェノールを投与した。膵の病理学的検索を行い,被験物質の膵発癌抑制効果を評価すべく,本年は昨年報告した実験結果を数量的に再評価した。短期膵発癌モデルに従い発癌操作を行った。(実験1)実験開始50日目より55日間,25ppm,50ppm α-カロチン,25ppm,50ppm β-カロチン,100ppm緑茶ポリフェノール(GTP),複合投与群として,225ppm α及びβカロチン+100ppmGTPを飲水中に混じて投与した。1匹あたりの膵管病変の発生個数はコントロール群28.0±3.9に対し,25ppmβ-カロチン群においてのみ14.8±6.6と,有意に減少していた。(実験2)実験開始50日目より45日間2ppm,25ppmβ-カロチン,40ppmパームカロチン,50ppm,500ppm,5000ppm GTP,そして40ppmパームカロチン+50ppm GTPを飲水中に混じ投与した。一匹あたりの膵管病変の発生個数は,コントロール群27.3±6.2に比べ,25ppmβ-カロチン群14.4±5.0,40ppmパームカロチン群17.0±8.3,40ppmパームカロチン+50ppmGTP群で19.4±4.4と有意に減少していた。500ppm及び5000ppmGTP群においてもコントロール群と比較し、有意な減少が認められた。以上も結果より,β-カロチン-ムカロチン,GTPの4.膵管癌発生(プログレッション期)に対する抑制効果の可能性が示唆された。上記研究のまとめを行い,Pancreasに発表した。
微細珪砂を用いた高機能砂ろ過法の開発

今後の水供給を支える小規模分散型施設に適応するため、設計指針値を下回る微細珪砂を用いた新しい砂ろ過法を考案した。まず、操作諸元と基本性能を調べたところ、(1)微細珪砂のろ層厚を10cmとすれば従来のろ過法と同等の除濁効果が得られること、(2)微細珪砂を用いると、突発的な原水濁度変動が生じても、安定したろ過水質が得られることがわかった。次に、沈降速度の遅い微細珪砂の流動化手法としてパドル撹拌洗浄法を考案し、適用条件と洗浄効果を調べたところ、(3)抑留物の剥離と微細化は砂上水の撹拌G値に依存すること、(4)洗浄条件を最適化すれば、従来の約1/4の水量で95%以上の濁質が排出されることがわかった。簡易水道、専用水道、プールなどに適用される小規模水処理施設では、設置スペース、コスト、維持管理の面で制約を受けることが多い。しかし、現在の砂ろ過装置は、主に水道施設設計指針に基づいて設計されており、一定規模のろ過器や逆洗設備が必要となる。そこで、ろ材として設計指針で規定される最小径を下回る珪砂(以下、微細珪砂)を採用し、ろ層の比表面積(表面積/充填体積)を著しく高め、ろ層の浅層化を図ることで、ろ過器の深さ方向のダウンサイジングや逆洗設備を含むろ過システム全体の小型化を実現する新たな砂ろ過法を考案した。本年度は、本ろ過法の適正運用に必要な諸元と基本性能を明確にするため、まず、設計指針の規定範囲内で調整されたろ層と同等の濁質除去効果を得るために必要な微細珪砂の充填層厚について検討した後、そのろ層が持つ基本的なろ過性能および濁度負荷変動に対する緩衝特性について検討した。その結果、(1)微細珪砂のろ層厚を10 cmとすることで、従来の急速ろ過ろ層と同等の濁質除去効果が得られること、(2)微細珪砂を採用すると、ろ層の早期熟成が可能となり、膨大な捨水量が必要となる低濁度水への適用に有利であること、(3)微細珪砂を採用すると、突発的な原水濁度変動による凝集不良が生じても、ろ過速度を低く設定しておけば、従来のろ層より安定した処理水質が得られ、薬注管理の省力化に貢献することが明らかとなった。本研究では、低コストで維持管理の容易な水処理技術が求められる小規模施設への適用を想定し、洗浄設備を含めたシステム全体の簡素化を実現する砂ろ過法として、設計指針の規定範囲を下回る珪砂(以下、微細珪砂)を採用した浅層・小型砂ろ過システムの開発を行っている。今年度は、考案した砂ろ過システムによる水処理の安定性を評価するため、一定薬注率で操作された砂ろ過層に対し、流入濁度またはpHを一時的に変動させる一連の負荷変動ろ過実験を行った。微細珪砂をろ層厚10 cmに充填したろ層および一般的な急速ろ過砂をろ層厚60 cmに充填したろ層において、粒径別微粒子数が各々どのように推移するかについて比較検討した。その結果、(1) 0.51μmの微粒子レベルは、いずれの珪砂を用いても流入レベルに連動して速やかに変動し、砂ろ過プロセスによって緩衝されないこと、(2) 15 μmの微粒子レベルは、一般的な急速ろ過砂では流入変動に伴って速やかに変動したのに対し、微細珪砂では緩やかに変動し、後者においては流入変動に対する高い緩衝能を有していること、(3)微細珪砂の場合、ろ層熟成後は極力低いろ過速度(120m/d以下)で運用することが、5 μm以上の微粒子レベルの漏出を抑制し、水質安定性を保持する上で重要であること、(4)流入pH変動に対しては珪砂の種類にかかわらずほぼ同等の緩衝効果が得られることが明らかとなった。前年度は、理想的な条件下でろ過性能を評価し、ろ層厚やろ過速度などの基本的な設計諸元を明らかにした。その上で、今年度は、理想的な諸元で設計されたろ層を用いて流入負荷を一時的に変動させた一連の実験を行い、突発的に凝集不良が生じた際の本ろ過法の水質安定性、ひいては本ろ過法における維持管理上の優位性を示すことができた。本研究では、まず、一般的な急速ろ過層と同等の除濁効果を得るために必要な微細珪砂充填層厚を決定し、そのろ層が持つ基本的なろ過性能を評価した。その結果、充填層厚を10 cmとすると、低い薬注率でも小径粒子(0.53 μm)に対して高い除去効果が得られるとともに、初期漏出が収束するまでに必要な累積Al供給量が一般的な急速ろ過層より30%程度少ない(ろ層の早期熟成に有利である)こと、高ろ速(ろ速120 m/d以上)でろ層熟成後に流入濁度が変動すると大径粒子(5 μm以上)が漏出する傾向が見られるが、小径粒子(5 μm未満)に対しては凝集不良時でも安定した除去効果が得られることを明らかにした。最終年度は、前年度までに構築した砂層諸元に対する効果的な洗浄法として、表層部の集中的な洗浄が期待されるパドル撹拌洗浄法を提案し、適用条件とその洗浄効果について検討した。

パドル撹拌工程においては、砂層からの濁質剥離効果および剥離した濁質の微細化効果はパドルによる砂上水の撹拌G値に依存し、G値= 300 s-1以上で必要十分な剥離効果が、G値= 500 s-1以上で最大の微細化効果がそれぞれ得られることがわかった。また、洗浄工程の進行に伴う残留濁質のろ層内分布の動きを調べたところ、高い強度でパドル撹拌を行うほどろ層下部の清浄度が損なわれるが、G値を500 s-1程度に設定すれば影響範囲は表層5 cm程度に止まり、その後の水逆洗工程では、わずか0.2 m/minの逆洗速度でろ層深さ30 cm相当の洗浄水を通水するだけで、残留率が5 %程度にまで低下すること、水逆洗工程におけるろ層の静置・排水回数を増加させると流動状態におけるろ層からの濁質の分離・排出が促進され、最終的にはろ層深さ20 cm相当の洗浄水量で残留率が4 %以下にまで低下するなど、大幅な節水効果が期待されることを明らかにした。今後の水供給を支える小規模分散型施設に適応するため、設計指針値を下回る微細珪砂を用いた新しい砂ろ過法を考案した。まず、操作諸元と基本性能を調べたところ、(1)微細珪砂のろ層厚を10cmとすれば従来のろ過法と同等の除濁効果が得られること、(2)微細珪砂を用いると、突発的な原水濁度変動が生じても、安定したろ過水質が得られることがわかった。次に、沈降速度の遅い微細珪砂の流動化手法としてパドル撹拌洗浄法を考案し、適用条件と洗浄効果を調べたところ、(3)抑留物の剥離と微細化は砂上水の撹拌G値に依存すること、(4)洗浄条件を最適化すれば、従来の約1/4の水量で95%以上の濁質が排出されることがわかった。設計諸元を明確にするという当初の目標に対し、従来のろ過法と同等の性能を発揮するために必要なろ層厚が明確となり、今後、基本性能や洗浄効果の検討をすすめるうえで、基本となる設計操作諸元を提示することができた。ろ層の洗浄・再生方法についての検討を本格的に開始する。予備的に検討した結果をふまえ、水逆洗および機械撹拌併用洗浄に重点を置き、効果的な洗浄手法の構築と洗浄メカニズムの解明を行っていく。水環境工学当初の予定通り、ろ層の洗浄・再生方法についての検討を行う。応募時には、「空気・水同時併用洗浄方式」の適用のみを想定していたが、その後の検討の結果、さらに構造的にシンプルとなることが予想される「機械撹拌洗浄方式」についても検討対象に加えることとした。両洗浄方式に対応する装置を構築し、当初の予定通り、物質収支に基づく洗浄効果の評価を実施する予定である。年度末(3月中旬)に学会出張があり、その旅費金額が確定しなかったため。実験資材または器具購入のための消耗品費に充当する。
TGF-βによるヒト造血細胞株の分化誘導と細胞周期調節に関する研究

本研究の目的は造血細胞株の細胞周期調節におけるTGF-βの作用の解析をつうじて、造血幹細胞の細胞周期調節機構を理解し、ひいては造血幹細胞の臨床応用を行うための基礎知識を提供することである。まず始めに、赤芽球系細胞株YN-1細胞をTGF-βで赤芽球系分化誘導し、造血細胞株におけるTGF-βの細胞周期調節関連遺伝子発現に及ぼす作用を解析した。細胞周期関連因子の発現について検討した。Western blot法を用い検討を行い、pRB、cyclin D,EのTGF-βで分化誘導後6日後を最低値とした減少が認められた。pRBは非リン酸化型の増加が認められた。cdk2,cdk4発現は培養10日目まで明らかな変化は認めなかった。一方、CDK inhibitorのP27はTGF-β処理後2日目より発現が認められ、6日後にピークに達した。p21発現は8日目以降にわずかに認められた。RT-PCRを用いた検討でもp21,p27mRNAの発現誘導が認められた。p15,p16の発現はwestern blot法およびRT-PCR法で検出できなかった。考察:赤芽球系細胞株YN-1をTGF-βで分化誘導すると赤芽球系分化が誘導された。この時、pRBは全体の発現量は減少するが、非リン酸化型は増加した。これとほぼ時期を一致して細胞増殖の抑制が見られ始めている。このpRBのリン酸化を阻害する因子としてCDK inhibitorの誘導が知られているが、YN-1ではp27、ついでわずかにp21の誘導が確認された。特にp27は、赤芽球系形質の誘導とほぼ同じ時期に発現が増加しており、分化誘導にも何らかの役割を果たしている可能性が示唆された。線維芽細胞をTGF-βで処理したときにp27が誘導されることが知られているが、TGF-βによる赤芽球系細胞分化においてp27発現が誘導されることはこれまで知られていない。今後の課題は、p27の発現が細胞周期停止のみに関わるのか、あるいは分化形質発現にも積極的に関わるのかを検討することである。我々はすでにp27を発現を誘導できる発現ベクターを導入したYN-1細胞株を得ており、今後p27の過剰発現とあるいはanti-sense oligonucleotideなどを用い抑制した場合の赤芽球分化及び細胞周期調節に及ぼす影響を明らかにする予定である。本研究の目的は造血細胞株に対するTGF-βの多彩な作用を理解し、それにより得られた知識を造血幹細胞の細胞周期調節に生かし、ひいては造血幹細胞の臨床応用を行うための基礎知識を提供することである。方法;本年度はまず始めに、各遺伝子プローブの作成を行った。Erythroid-specific δ-aminolevulinate synthase(ALAS-E), αand β-globin, p53, cyclin dependent kinase inhibitor(CDKI)p15, p16, p21,p27, bcl-2, bcl-XLおよびβ-actinの各cDNA断片の増幅のためのPCR primerを合成した。ヒトの赤芽球系細胞株YN-1、ヒト骨髄細胞よりmRNAを抽出し、RT-PCR法によりcDNAを増幅しprobeとした。YN-1、Y1-KおよびK562細胞はTGF-β存在下で培養するとALAS-E, globin遺伝子発現は増加し、これら遺伝子の発現はTGF-β濃度依存性であった。YN-1細胞増殖は1ng/ml TGF-β濃度下で増殖は抑制され、5ng/mlではより高度に抑制された。CDKIのp21, p27mRNAはYN-1細胞の定常増殖状態で発現が見られ、TGF-β分化誘導後の変化は見られなかった。bcl-XLは、TGF-β処理前に発現を認め、TGF-β処理後72時間まで変化を認めなかった。Western blot法によりTGF-β処理後のp27蛋白発現の検討したが明らかな変化は認めなかった。考察; TGF-βは造血幹細胞抑制因子として知られ、また、造血幹細胞はTGF-βをautocrine分泌し自己をG1期に停止させているとの仮説が提唱された。TGF-βはCDKIのp.15やp27を誘導し細胞周期停止をもたらすと報告された。さらに骨髄系細胞株で分化誘導後、p27はp21発現が増加し細胞周期停止に関わるとともに直接分化誘導をもたらすと報告された。赤芽球系細胞株のTGF-βによる分化誘導においてもp27が関与している可能性が考えられたが、本研究ではp27mRNAおよび蛋白発現に変化は見られず、その関与は明らかにできなかった。CDKIの関与については特異的なCDKと結合するCDKI量の変化およびCyclin/CDK complexのkinase activityの変化をさらに検討する必要がある。また、p21およびp27遺伝子の強制発現あるいはアンチセンス法などによる発現抑制の影響を検討することも有用と考えられる。p21、p27などのCDKIは細胞周期制御のみならずG0期での停止や老化にも関与するとされ、その作用は多岐にわたっており赤芽球系細胞分化へ関与している可能性も十分あり検討をさらに進めたい。

まず始めに、赤芽球系細胞株YN-1細胞をTGF-βで赤芽球系分化誘導し、造血細胞株におけるTGF-βの細胞周期調節関連遺伝子発現に及ぼす作用を解析した。細胞周期関連因子の発現について検討した。Western blot法を用い検討を行い、pRB、cyclin D,EのTGF-βで分化誘導後6日後を最低値とした減少が認められた。pRBは非リン酸化型の増加が認められた。cdk2,cdk4発現は培養10日目まで明らかな変化は認めなかった。一方、CDK inhibitorのP27はTGF-β処理後2日目より発現が認められ、6日後にピークに達した。p21発現は8日目以降にわずかに認められた。RT-PCRを用いた検討でもp21,p27mRNAの発現誘導が認められた。p15,p16の発現はwestern blot法およびRT-PCR法で検出できなかった。考察:赤芽球系細胞株YN-1をTGF-βで分化誘導すると赤芽球系分化が誘導された。この時、pRBは全体の発現量は減少するが、非リン酸化型は増加した。これとほぼ時期を一致して細胞増殖の抑制が見られ始めている。このpRBのリン酸化を阻害する因子としてCDK inhibitorの誘導が知られているが、YN-1ではp27、ついでわずかにp21の誘導が確認された。特にp27は、赤芽球系形質の誘導とほぼ同じ時期に発現が増加しており、分化誘導にも何らかの役割を果たしている可能性が示唆された。線維芽細胞をTGF-βで処理したときにp27が誘導されることが知られているが、TGF-βによる赤芽球系細胞分化においてp27発現が誘導されることはこれまで知られていない。今後の課題は、p27の発現が細胞周期停止のみに関わるのか、あるいは分化形質発現にも積極的に関わるのかを検討することである。我々はすでにp27を発現を誘導できる発現ベクターを導入したYN-1細胞株を得ており、今後p27の過剰発現とあるいはanti-sense oligonucleotideなどを用い抑制した場合の赤芽球分化及び細胞周期調節に及ぼす影響を明らかにする予定である。
重複したゲノム由来のcDNAクローンをマッピングする手法の開発

CDNAマーカーはQTL解析、連鎖地図の基づく遺伝子の単離、シンテニー解析のために極めて重要である。特にダイズやコムギのようにゲノムが重複している植物種では遺伝子座特異的なcDNAマーカーが必要である。本研究ではダイズのcDNAクローンの5`および3'末端領域部分塩基配列を用いて、遺伝子座特異的なPCR産物を得る手法を開発し、PCR産物の多型を解析して連鎖地図上に位置づけることを目標とする。本年度はダイズのcDNAの両末端領域の塩基配列を用いて、遺伝子の大部分を含む領域を増幅して、増幅産物の多型を解析する手法を検討することが目的である。5`末端、3'末端領域の部分塩基を決定したダイズ登熟種子由来のクローンについて、遺伝子の大部分を増幅できるようにプライマーを設計した。増幅産物を2つの制限酵素のセット、(AluI, HaeIII)、(HhoI, SspI)、(ApaI, RsaI)、(DraI, XbaI)、(EcoRV, XhoI)、(HindIII, MspI)で二重消化した。消化したDNA断片を1.5%アガロースゲルまたは濃縮層を持った13%非変性ポリアクリルアミドゲルで泳動して断片長多型を解析した。断片長多型が得られない場合は、消化したDNA断片を熱変性した後、4°Cで5%グリセロールを含む8%非変性ポリアクリルアミドゲルで泳動して、SSCPを解析した。両親で多型が得られた場合はF2集団92個体を用いて連鎖解析を行なった。解析した70のプライマーペアのうち、両親間で断片長多型が得られたものは、アガロースゲルで3、ポリアクリルアミドゲルで3、SSCPが確認できたものが2であった。そのうち6つのcDNAクローンを連鎖地図上に位置づけた。今後は多型検出感度を高めるために、MDEゲル等を用いる必要があると考えられる。
労働紛争解決制度の企業行動に与える影響の基礎的研究―沖縄の労働環境の改善を念頭に

本研究の概要は、沖縄地域における雇用・労働環境の改善を図るため、経済や雇用環境の動態が、労働環境整備など企業側の経営行動につながる影響を明らかにするための基礎研究とすることにあり、そのために、日本とイギリスにおける個別労働紛争解決制度の実効性と企業行動への影響について比較研究から明らかにする。日本全国でも非正規雇用率の高さ、低賃金、細切れの雇用契約などから多くの労働問題が生じている。本研究ではイギリス社会におけるACASの機能、役割とその意義を丹念に解明するとともに、日本とイギリスにおける労働紛争解決方法・実態の比較を行い、日本社会にとっておけるACAS機能がどのように役割を果たしうるか展望する。
翻訳後修飾による光合成装置の量的制御

これまでに当研究室で行われた生化学的解析により、野生種スイカの葉緑体ATP合成酵素εサブユニットはアセチル基修飾の有無により2分子種存在し、さらに強光・乾燥ストレス下において、非アセチル化εが優先的に分解されることが明らかになった。そこで本研究では、εの蓄積量に関与する因子について解析することで、葉緑体ATP合成酵素εの量的制御メカニズムについて新規な知見を得ることを目的とした。MetalloaminopeptidaseはN末端にアセチル基をもつ基質を分解しにくいことが報告されていることから、強光・乾燥ストレス下で見られるεの減少に関与する因子の一つとして、metalloaminopeptidaseが考えられた。そこで、metalloaminopeptidaseに対する2分子種εの感受性をin vitroで比較した結果、アセチル化されたεよりも非アセチル化εが有意に速く分解することが確認された。さらに、野生種スイカの次世代シーケンス解析により得られたmetalloaminopeptidaseと思われる20種類の部分配列を用いて、定量的RTPCR解析を行った。その結果、乾燥ストレス下において、17種類のmetalloaminopeptidaseの遺伝子発現量が有意に増大していた。以上のことから、metalloaminopeptidaseがεの蓄積量の制御に関与している可能性が示唆された。乾燥ストレス下におけるεの量的制御メカニズムについて理解を深めるために、εのアセチル化の有無を認識するプロテアーゼの特徴について解析を行った。分解活性測定により、εの分解に関与する因子はメタロプロテアーゼであることが判明した。さらに、メタロプロテアーゼの一つであるメタロアミノペプチダーゼを用いて、2分子種εの感受性試験を行った。その結果、アセチル化εに比べ、非アセチル化εはメタロアミノペプチダーゼに対して高い感受性を示し、メタロアミノペプチダーゼがεのアセチル化の有無を認識することを示唆するデータを得ることに成功した。これまでに、シロイヌナズナにおいて、いくつかの光合成タンパク質においてN末端のアセチル化修飾が見出されているが、葉緑体に存在するアセチル化酵素(N-terminal acetyltransferase ; NAT)についての研究は行われていない。今後、εの量的制御を担うNATを解析することにより、N末端アセチル基とストレス耐性との関係について新たな知見が得られると考えられる。そこで、遺伝的解析が容易なシロイヌナズナを用いて、εのNATの探索を行った。まず、これまでに明らかになっている酵母と大腸菌のNATのアミノ酸配列を用いて、BLAST検索を行い、さらに、細胞内局在予測プログラム等を用いて、葉緑体に局在すると予測される6種類のNATホモログの候補タンパク質(AtNAT)を選抜した。そして、AtNAT遺伝子と蛍光性タンパク質であるYFPの融合遺伝子をシロイヌナズナのプロトプラストに一過的に導入し、発現局在を観察した結果、6つのうち4つのAtNATが葉緑体に局在することが判明した。今後は、これら4種類のAtNAT遺伝子に変異が挿入されたT-DNAラインを用いて、アセチル化されたεの蓄積量の減少が見られるのか検討する予定である。εの量的制御メカニズムに関与するプロテアーゼやεのアセチル化酵素の候補因子を見出すことに成功したため。εのアセチル化酵素の同定については、4種類のAtNAT候補遺伝子に変異が挿入されたT-DNAラインを用いて、アセチル化きれたεの蓄積量の減少が見られるのか検討する予定である。さらに、表現型や乾燥ストレス耐性能について評価する。また、交付申請書に記載した2分子種のεの生化学的特性(アセチル化修飾が酵素反応に及ぼす影響)についても行う予定である。
哺乳類の減数分裂における相同染色体の対合とそのチェックポイントの分子機構

減数分裂は卵子や精子を産生するための特殊な細胞分裂であり、その過程で生じる異常は、不妊症や不育症の原因となる。そのような異常を回避する手段として、減数分裂チェックポイントと呼ばれるメカニズムが存在すると考えられているが、その分子機構はこれまで全く不明であった。本研究では、生殖細胞に発現する機能未知遺伝子HORMAD1の遺伝子改変マウスを作製し、HORMAD1が減数分裂チェックポイントに必要な遺伝子であることを明らかにした。本研究では、ヒトの不妊症、不育症の原因遺伝子を探索する基礎的知識として、哺乳類の減数分裂時の染色体動態やそのチェック機構に関与する新規遺伝子の同定とその分子機構の解明を目指している。候補遺伝子のひとつとして、酵母の減数分裂に必須なHop1遺伝子の哺乳類ホモログと考えられる機能未知遺伝子HORMAD1についてノックアウトマウスを作製し機能解析を行った。その結果HORMAD1は減数分裂の相同染色体の対合に必須であることが明らかになった。また興味深い結果として対合不全を生じた減数分裂細胞のその後の運命には雌雄で大きな違いが見られ、雄ではすべての精母細胞が細胞死を起こして無精子になるのに対し、雌では卵母細胞の減少は見られなかった。そしてこれらの卵は細胞分裂時に染色体の不分離を生じ、受精しても正常に発生できないため不妊となっていた。以上の結果はHORMAD1の機能欠損により雄では無精子症、雌では習慣流産が引き起こされる可能性を示唆し非常に興味深い。またHORMAD1欠損雌の卵母細胞が対合不全にもかかわらず細胞死を起こさないことから、HORMAD1が雌の減数分裂チェックポイントに必須の分子である可能性が示唆された。この結果は哺乳類の減数分裂チェックポイントには分子機構自体に雌雄の違いがあることを示すとともに、HORMAD1がこれまで未解明だった哺乳類の減数分裂チェックポイントの分子機構を解明する有力な手がかりになることを意味する。HORMAD1が関与するチェックポイントの分子機構1を解明する上では、HORMAD1のリン酸化部位の同定や分子複合体の構成成分の同定が重要であり、今後さらに解析を進める必要がある。本研究の長期的目標は、ヒトの不妊症、不育症の原因遺伝子の探索であり、その短期的目標として、哺乳類の減数分裂時の染色体動態(特に相同染色体の対合)やそのチェック機構に関与する新規遺伝子の同定とその分子機構の解明を目指した。前年度の研究により、酵母の減数分裂に必須なHop1の哺乳類ホモログであるHORMAD1が、相同染色体の対合に必須なだけでなく、減数分裂チェックポイントにも必須である可能性が示唆された。本年度はHORMAD1のチェックポイント機能への関与をさらに確実に証明するため、Spoll遺伝子とのダブルノックアウトマウスを作製し解析を行った。Spollノックアウトで生じる対合不全により卵母細胞は細胞死を起こすが、HORMAD1を追加的に欠損するとこれが起こらなくなったため、HORMAD1が対合チェックポイントに必須の機能を持つことが明らかになった。これまで哺乳類の減数分裂チェックポイントの分子機構は全く不明であったため、これに必須の分子を初めて同定したことは非常に大きな成果である。またSpollノックアウトの精母細胞や卵母細胞ではHORMAD1のリン酸化が顕著に亢進することを見いだした。この結果はHORMAD1のリン酸化がチェックポイント機能に重要なことを示し、その分子機構を解明する端緒として重要な発見である。本年度は、このリン酸化部位の同定には至らなかったが、近い将来このリン酸化部位を同定し、そのリン酸化に依存して結合する分子を同定することにより、減数分裂チェックポイントの分子機構が明らかになることが期待できる。