hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ストレス脆弱性を左右するエピジェネティック制御因子の同定とその分子機構

非コードRNAやクロマチン結合蛋白質などのエピジェネテイック制御因子は、ストレス耐性を制御することが示唆されている。本研究では、これらの制御因子とストレス脆弱性及びストレス関連疾患患者との関連性を調べた。まず、EIF2シグナル関連遺伝子群は、慢性心理的ストレス及び過敏性腸症候群患者のストレスマーカーであることを見出し、社会格差による健康障害や慢性疲労症候群に関連するマイクロRNAの同定に成功した。さらに、TRA2βRNAは酸化ストレスによる増殖異常を引き起こす新規長鎖非コードRNAであること、HIPK2はDNAの修復に関わる新規のクロマチン結合蛋白質であることなどを発見した。平成26年度は研究計画に沿って以下の研究項目を実施した。1.健常コホート集団における気分障害の発症とその要因並びにエピジェネテイック機序の解明:民間病院職員180名を対象に、高不安と高度の抑うつを訴えるハイリスクグループを対象に、気分障害と関連する末梢血マイクロRNAとしてmiR-144を同定した。さらに、miR-144の標的遺伝子のなかから不安・うつ状態と関連する遺伝子の同定に成功した(現在論文作成中)。さらに、DNAメチル化アレイを用いて健常人ハイリスクグループと健常コントロールそれぞれ10名を対象に解析し、検出したDNAメチル化のなかでNF-kappaB関連遺伝子のメチル化の変化をビスルファイト・シークエンス法により確認した(現在論文作成中)。2.慢性疲労症候群の自然免疫関連遺伝子発現亢進のエピジェネテイック機序の解明:マイクロRNAアレイを用いて関連候補マイクロRNAと標的遺伝子の探索を行い、CFS群で特徴的な6種類の炎症関連マイクロRNAの発現変化とCFS群において、タンパク質合成・分解系の遺伝子が顕著に亢進することを確認した。現在、CFS患者28名とコントロール28名を対象に、リアルタイムRT-PCRによる確認作業を行っており、平成27年度位に誌上発表する。3.自閉症スペクトラム(ASD)関連遺伝子の発現異常のエピジェネテイック機序の解明:ASDについては20名のASD患者を対象に解析を進めている。マイクロRNAアレイで48マイクロRNAの発現異常を見出し、現在リアルタイムRT-PCRを用いた確認作業を行っている。現時点で4つのマイクロRNAの発現異常を確認した。さらに末梢血を用いて、次世代シークエンサー解析を行った。個人差が大きく費用対効果の問題から、平成26年度は予備的な解析にとどめた。平成27年度は、平成26年度に変更した研究計画に沿って研究を進めた。具体的に行った研究は、1.健常コホート集団における気分障害の発症とその要因並びにエピジェネテイック機序:民間病院職員129名を対象に、社会経済的要因による気分障害と遺伝子発現異常の解析を行い、エピジェネテイックス制御候補遺伝子を探索した。High-SSSの11名とLow-SSSのl1名のマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析を行い、SSSスコアーに関連した522を抽出した。その中から、PPBPとSLC7A1を候補遺伝子として同定した(論文投稿中)2.健常人の慢性ストレスとエピジェネテイック制御因子:慢性ストレスによるエピジェネテイックス制御に関しては、他の民間病院職員107名を対象に、高ストレス群12名と正常群24名のマイクロRNAアレイと遺伝子発現アレイの両方を行った。その結果、6つのマイクロRNAと330遺伝子の有意な発現異常を認めた。マイクロアレイ解析で見出したマイクロRNAは炎症に関連するマイクロRNAで全て発現が低下していた。6個のうち4個のマイクロRNAの変化はリアルタイムRT-PCRで確認した。一方、IPAを用いて発現が変化していた330遺伝子のパスウエイ解析を行うと、炎症ネットワークに関わる遺伝子の発現が亢進しトップリストに挙げられた。これらの結果は現在論文作成中である。3.RNA結合タンパク質によるクロマチン修飾の研究:この研究は順調に進み、RNA結合タンパク質であるtransformer 2β(Tra2β)がBCL2 mRNAの発現を調節してがん細胞死を調節する事(Cell Death Differ 2015)、及び、TRA2B遺伝子から転写されるスプライシングバリアントが機能性RNAとして働くことを発見し、その機能について報告した(Oncogenesis 2106)。平成27年度は健常者の解析とin vitroの解析で順調に成果をあげた。特に、社会経済的な要因とエピジェネテイック制御ならびに慢性ストレスとエピジェネテイック制御に関しては先駆的な研究成果であり、論文化を急いでいる。平成26年度の経過報告書に記載したように、うつ病については、メランコニー型と新型うつ病では全くエピジェネテイック変化が異なり、また、あまりにもヘテロな集団のため断念した。自閉症スペクトラムについてはマイクロRNA解析を進めている。慢性疲労症候群については、28例のマイクロRNAと遺伝子発現解析を終了させた。慢性疲労症候群で有意に発現変化する7個のマイクロRNAを同定した。さらに、この28例の遺伝子発現解析により変化する遺伝子を同定し、IPAによりEIF2関連遺伝子と炎症に関わる遺伝子が変化することを確認し、現在バリデーション中である。平成26年度の目標に挙げた4編の論文の誌上発表については平成28年度に達成できる。一方、in vitroのエピジェネテイック制御機構の研究でも着実に研究成果をあげた。RNA結合タンパク質であるtransformer 2β(Tra2β)の新たな機能を発見し誌上発表した(Cell Death Differ 2015)。Tra2βをコードするTA2B

遺伝子から産生されるスプライスバリアントが、超保存領域を含む新たな機能性RNAであり、癌細胞の老化を調節する機能を持つことを報告した(Oncogenesis 2106)。さらに、DNA障害反応キナーゼとして知られるHIPK2が、HP1-γと相互作用してDNA修復に重要な役割を果たすことも報告した(Oncogene 2105)。このように、研究計画の一部の変更はあったものの、平成27年度も予想以上の成果をあげたと自己評価する。研究項目のなかで、ストレスとストレス関連疾患のジェネテイックス・エピジェネテイックスについては、1.社会経済的格差と健康障害に注目し、社会格差の指標SSSと関連するPPBPとSLC7A1の発現低下を明らかにした(論文リバイス中)。2.高不安・高うつを訴える病院職員で特異的に発現が低下する4つのマイクロRNAとその標的遺伝子を標的mRNAを同定した(論文作成中)。3.38名の慢性疲労症候群と性年齢をマッチさせた健常者の末梢血のマイクロRNAの発現をマイクロRNAアレイで解析した結果、慢性疲労症候群患者で有意に発現が低下している7つのマイクロRNAを同定し、それらの標的mRNAはEIF2シグナル関連遺伝子群であることを明らかにした(論文作成中)。4.健常者の慢性心理的ストレス及び過敏性大腸症候群患者において特徴的な遺伝子発現としてEIF2シグナル関連遺伝子群の低下を報告した(J Appl Microbiol. 2016, J Funct Foods. 2016)。5.運動習慣に関連するDNAメチル化として、インターバル速歩によりNFKB遺伝子のメチル化が生じることを報告した(PLoS ONE.印刷中)。RNA結合タンパク質の機能解析については、6.TRA2B遺伝子から産生されるスプライスバリアント(TRA2β4)は、癌細胞の細胞老化を制御する新規のnon-coding RNAであることを報告した(Oncogenesis 2017)。7.スプライシング調節因子SRSF3は、ヒストンと相互作用する新たなエピジェネテイックス制御因子であることを報告した(Int J Mol Sci. 2016)。8.上記TRA2β4は、nucleolinと相互作用することで核内に局在し癌細胞の異常増殖を誘導する経路を明らかにした(論文作成中)。このように、最終年度も多くの研究成果を挙げた。非コードRNAやクロマチン結合蛋白質などのエピジェネテイック制御因子は、ストレス耐性を制御することが示唆されている。本研究では、これらの制御因子とストレス脆弱性及びストレス関連疾患患者との関連性を調べた。まず、EIF2シグナル関連遺伝子群は、慢性心理的ストレス及び過敏性腸症候群患者のストレスマーカーであることを見出し、社会格差による健康障害や慢性疲労症候群に関連するマイクロRNAの同定に成功した。
フォトクロミックジアリールエテンを用いたスピン状態の制御

ニトロニルニトロキシドを2個,ジベンゾチエニルエテンに配したジラジカル1aを合成した。酢酸エチル溶液中で開環体1aは紫外光により閉環体1bに,1bは可視光により1aにそれぞれ変換率100%で可逆に相互変換された。可視域に吸収を持つニトリニルニトロキシドが存在してもジアリールエテンの閉,開環反応は進行することが分かった。閉環反応,開環反応の量子収率はラジカル置換基の無い場合と比べてそれぞれ1/8,1/280に減少した。閉環体1bではキノイド構造との共鳴安定化があるために開環反応の量子収率が小さくなったと考えられる。1aは濃青色結晶,1bは黒色結晶として得られた。両異性体の構造と磁性をX線結晶構造解析,磁化率測定,ESR測定によりキャラクタリゼーションした。室温,ベンゼン溶液中のESRスペクトルは両異性体とも9本線であった。開環体1aではベンゾチエニル環とシクロペンテン環が86.1°と直交しており,分子内磁気的相互作用は2J/k_B=-2.2Kとほとんどなかったのに対して閉環体1bでは分子は平面であり,分子内磁気的相互作用は2J/k_B=-11.6Kと大きくなった。高分子フィルム中での磁気測定では閉環体の分子内磁気的相互作用は2J/k_B=-12.5Kとなり,相互作用の増加が分子内由来であることが確認できた。開環体1aでは,ねじれ構造,芳香族性,disjoint型のトポロジーを持つことから相互作用がOFF状態を取る条件を満たしているのに対して,閉環体1bでは,平面構造,非芳香族性,non-disjoint型のトポロジーを持つことから相互作用がON状態を取る条件を満たしている。磁気的相互作用の変化はこれらの変化を反映したものであると考えられる。
2段階ゾルゲル法による広波長帯域の光導電性複合薄膜

[1]機能性分子のゾルゲルガラスへの導入17年度の成果に引き続き、有機色素、可溶な導電性高分子を出発溶液に混合してゾルゲルシリカガラスを作製した。出発組成の試行により、いずれの場合もガラス薄膜、及びファイバー形状を得ることができた。基板への付着性は作製条件に依存することがわかった。得られた有機色素導入試料は、励起光照射によりガラス全面からの蛍光を示した。[2]外部封止層の導入珪素系樹脂材料の急速な進展に鑑み、組み合わせ対象を当初より拡大した。上記の結果を基に、ファイバー部の封止を、ゾルゲルシリカガラス、シリコーン系樹脂及び接着剤を用いて実施した。シリカガラス封止の場合に比べて、シリコーン系の場合は封止性に多少難点はあるが、調合が容易で処理時間も短縮可能であることがわかった。以上総括して、透明かつ光機能性を持ちながら、用途に応じた封止性を備えたゾルゲル複合薄膜を作製可能であることが示された。[3]ZnO薄膜の試作と積層化の試みウェットプロセスによるZnO薄膜化において、従来のホウ酸ではなく活性アルミナを用いてZnOの前躯体(ZnOHF)のX線回折パターンを、また前駆体の500°Cの熱処理で明瞭なZnOの回折パターンを得た。さらに条件を探索し、熱処理なしでも微弱なZnOの解説ピークを観測することができた。この結果は、ウエットプロセスでの透明導電薄膜の可能性を拡大するものである。(1)2段階ゾルゲルプロセス用延伸装置の整備2枚の電極を真空チャックで固定し、工作顕微鏡で観察しながら延伸操作を行うための2段階ゾルゲルプロセス用延伸装置の整備を進めた。Z軸ステージ、工作顕微鏡筒ユニット等の手持ち部品を組み合わせてプロトタイプを作製し、試験的にプロセスを進めることとした。(2)ゾルゲル溶液からのファイバーガラスの作製ITO付ガラス基板を前記の2段階ゾルゲルプロセス用延伸装置の下部、金属板を上部に固定し、曳糸性発現領域のゾルゲル出発溶液を両電極間に塗布した。重縮合反応を進めた後に粘性ゾルに延伸操作を繰り返して、乾燥によりシリカガラスファイバーを形成することに成功した。今後はプロセス条件とファイバー直径、密度等の関係を調べ、さらに第二のバルク用出発溶液を調合しファイバー間隙を埋める予定である。(3)ウエットプロセスによるZnO薄膜の作製上記(1)、(2)と並行して、液相析出法により透明導電膜として有望なZnOの作製を試みた。水溶液中の金属フルオロ錯体の加水分解平衡反応を利用するという基本原理において、フッ素補足剤や反応条件を工夫し、ガラス基板上にZnO前駆体を析出させた。この膜を500°Cで2時間熱処理したところZnOのX線回折パターンが得られ、この方法での成膜の可能性が示された。今後さらに条件の最適化を進める予定である。
自然免疫システムの制御による感音難聴の予防と治療

ウイルス感染が原因と考えられる突発性難聴、メニエール病、先天性難聴などの感音難聴の発症メカニズムに関し、蝸牛感覚上皮の器官培養系を用いて解析を行った。ウイルス感染時に支持細胞において発現が誘導されるI型インターフェロンが蝸牛感覚上皮に与える影響に関して検討するため、I型インターフェロンの受容体であるIFNAR1の遺伝子を欠損させたマウスを用いた。突発性難聴などウイルス感染症の関与が示唆される内耳性難聴の病態はいまだ明らかではなく、ゆえに決定的な治療法もない。内耳はこれまで免疫租界とされてきたが、我々はマウス蝸牛感覚上皮の器官培養系を用いて、ウイルス感染に対し、支持細胞であるヘンゼン・クラウディウス細胞において自然免疫を司るmoleculeであるRIG-I、MDA5、IRF3を介して、I型IFNの発現が誘導されることを突き止めた。この結果を受け、本研究ではヘンゼン・クラウディウス細胞において発現が誘導されるIFNがウイルス感染から有毛細胞を保護するだけでなく、獲得免疫へと橋渡しをする過程で炎症細胞の遊走を惹起し、これらの貪食能により有毛細胞を含む蝸牛を逆に障害する方向に働くのではないかという仮説を立て、証明することを企図している。これにより突発性難聴などの病態の一端が明らかとなり、新たな治療法の確立へとつながることが期待される。昨年度は研究のスタートとして、ウイルス感染により蝸牛支持細胞(ヘンゼン・クラウディウス細胞)において発現が誘導されるI型IFNが及ぼす影響を検討するため、蝸牛感覚上皮におけるIFN受容体の発現について、qRT-PCR法、Western Blotting法、免疫化学染色法により検討を開始した。中でも免疫化学染色法による発現部位の同定(どの細胞に発現しているかの同定)は今後の研究を進める上で極めて重要であると考えている。内耳はこれまで免疫租界とされてきたが、我々はマウス蝸牛感覚上皮の器官培養系を用いて、ウイルス感染に対し、支持細胞であるヘンゼン細胞・クラウディウス細胞において自然免疫を司る分子であるretinoic acid inducible gene-I (RIG-I), melanoma differentiation-associated gene 5 (MDA5), interferon regulatory factor 3 (IRF3)を介して、I型interferon (IFN)の発現が誘導されることを突き止めた。この結果を受け、本研究ではウイルス感染時に支持細胞において発現が誘導されるIFNが蝸牛感覚上皮に及ぼす影響について検討を行った。IFNは分泌された後、周囲の細胞の細胞膜に発現するIFN受容体に結合してJAK-STAT経路を活性化、さらにウイルスゲノムの複製を阻害するRNaseLを活性化して抗ウイルス作用を発揮する。この事実よりまずIFNがウイルス感染から有毛細胞を保護しているか否か検討するために、IFNの受容体であるIFNAR1の発現パターンを検討し、さらにIFNAR1ノックアウトマウスの蝸牛感覚上皮を用いて有毛細胞にウイルス感染が生じるか否か検討を行った。また逆に、IFN刺激によりp53依存性のapoptosisの増強が見出されていることから、IFNが有毛細胞を障害する可能性についても検討を行った。ウイルス感染させた蝸牛感覚上皮よりRNAを抽出し、RT-PCR法にてapoptosis関連遺伝子の発現量の増加が見られるか否か検討した。本研究により突発性難聴などの病態の一端が明らかとなり、新たな治療法の確立へとつながることが期待される。26年度が最終年度であるため、記入しない。耳科学・内耳基礎・免疫学26年度が最終年度であるため、記入しない。現在、蝸牛感覚上皮におけるIFN受容体の発現について、qRT-PCR法、Western Blotting法、免疫化学染色法により検討している段階であるが、条件検討に時間を要している。今後、自然免疫から獲得免疫への橋渡しによる感音難聴の病態形成を検討するために、蝸牛感覚上皮を様々な種類の白血球と共培養する実験系の確立を目指す方針である。
北海道風蓮湖岸における塩湿地植物群落の分布調査及び立地環境についての研究

調査地区の1つでもある春国岱では、砂嘴の先端部の付け根に当たる部分が地盤沈下、風波・侵食等の影響により予想より幅広く大きく亀裂して決壊をしていた。今回先端部分へは海水の中に入ってかろうじて対岸へ渡れたが、予想より潮流も速く、今後さらに侵食されることが予想される。護岸工事等の修復についても地理的に工事の難しい場所でもあった。今回、研究目的である風蓮湖岸の塩湿地植物群落の分布や立地環境について湖岸踏査により調査を行った。特に塩湿地植物群落の指標となるアッケシソウ群落を中心に分布状況の把握に努めた。調査地については、ヤリムカシ川、ソウサンベツ川、アッコンベツ川、厚床川、別当賀川、風蓮川等の大きな河川河口部を中心した湖岸を含め、根室海峡から海水が入り込む海の近い湖岸から湖の深部湖岸まで歩いて調査を行った。風蓮湖岸調査を通して海水の入り込む海に近い場所にアッケシソウ群落が多く見られた。また、湖の深部湖岸では、川からの真水流入と塩分濃度が下がるため、アッケシソウ群落は多く見られなかった。アッケシソウ群落は、走古丹付近の砂嘴部の湖側に数多く確認された。また春国岱の第1砂丘、第2砂丘、第3砂丘ともに先端部までアッケシソウ群落が数多く見られた。湖岸のすぐそばまでヨシが来ている地形や潮干満潮での流れの速い湖岸については、特に風蓮湖深部となる風連川左岸やヤウシュベツ川河口域左岸や木村川左岸域についてはアッケシソウ群落を確認することができなかった。その他の主な塩湿地植物群落として別当賀川左岸域はシカギクの大群落、アッコンベツ川右岸ハマシオンの大群落を確認することができた。
極限材料の創製をめざした超高速液体セラミックジェット発生法の開発

極限材料の創製をめざすために超高速液体セラミックジェットの発生法を開発することを目的に、導電性高融点セラミック粉体をノズルを装着した特殊な容器に充填し、大電流放電による短時間のジュール加熱と爆発によりジェットの発生とその観測を行った。2基の閃光軟エックス線により時刻が異なるジェットの瞬間レントゲン写真を撮影した。エックス線吸収率が高く、また、比重が大きく比較的重い炭化タングステン粉体を用いた。期待されるノズルの効果は、セラミックジェットを加速するガスジェットの流れを方向付けることにより効率よくセラミックジェットの流量を増加することである。測定の結果、期待通りにジェットの速度の増加(秒速850m)と密度増加が確認され、相乗的に流量の増加が得られることがわかった。昨年度において見いだされたホウ化ジルコニウムのジェットの速度とほぼ同じであることから、2,5倍の密度を有する重い炭化タングステンを効率よく加速できたことは期待以上の成果である。流量を増力比た炭化タングステンジェットを鉄母材上に溶射することにより、深さ100μmに渡りセラミックスと鉄が緻密に混合した層が形成できることを見いだした。この現象は他の溶射法では得られないものであり、この超高速セラミックジェットにより発現する特有のものである。この現象を利用すれば極めて高い接合力を有するセラミックコーティングの合成が期待できる。同様の現象が、4000Kの融点をもつ炭化タンタルにおいても見いだされ、正に超高速・高温液体セラミックジェットの発生を実証することができた。秒速10kmを目標に研究を遂行し、目標値に達するには至らなかったが、ジェットの高速化に有効な知見を得るとともに、新しいセラミック傾斜コーティングの合成への道筋を見いだすことができた。極限材料の創製をめざすために、超高速液体セラミックジェットの発生法を開発することを目的に導電性高融点セラミックスの粉体を高電圧、大電流の放電により短時間に加熱、爆発させてジェットの発生を行った。試料としてホウ化ジルコニウム粉体を用いて、あらかじめ特別に設計、製作した容器内に充填して上記の電熱爆発を行った。粉体の加熱と爆発に要した電気エネルギーを計測した電圧と電流波形より算出し、粉体の溶融のみに要するエネルギーの3倍に相当するものであった。ジェットの前方に設置した金属板上に形成した堆積物を詳細に電子顕微鏡により観察した結果、セラミックスの出発粉体が溶融していた形跡を確認した。また、堆積物の表面からのX線回析を調査した結果、ホウ化ジルコニウムが化学分解した形跡は見いだされなかった。ジェットの形状と速度を観測するために短パルスの軟X線を用いてシャドウグラフ撮影を行った。この際、2台のX線源を用いてジェットの飛行時間を観測した。その結果、ジェットを形成する微細な液滴群の先端速度が秒速1000mに達することを見いだした。そして、先頭部分は時間の経過に伴い希薄になることを確認した。また、ジェットの初期の形状がジェット噴出口の形状に依存することを確認した。以上の研究により、高速の液体セラミックジェットの形成を確認した。また、種々の知見をもとにジェットの形状と速度の制御の可能性を見いだした。
長期持続条件を考慮した企業立地原理―個別企業データの定量的分析を通じて―

本年は研究の最終年度として、課題に対応した研究成果をまとめ、アウトプットを出すことを目指した。具体的には、地方圏に立地する企業の社史の分析を、二年目までの研究成果を踏まえたうえで、定量・定性の両面から展開した。結果、アンケート調査を実施しなかった点など、途中の分析の結果を踏まえた手法面での変更は生じたものの、三年間を通して、当初の意図通りの研究成果を挙げることに成功したといえよう。計画時に提示した要因に加え、企業の立地を促進する要因として、イノベーションへの着目を行い、それとの関連において企業立地が検証された。研究課題開始時に想定していた物的環境よりも、ソフトなつながりの重要性が示された。以下に詳述する。まず実際の企業行動のプロセスにおいて、二年目までの研究で明らかになっていた取引関係や金融関係(以下、明示的な紐帯と称する)・コミュニケーションの場(以下、暗黙的紐帯と称する)が作用していることを確認した。そのうえで明示的な紐帯と暗黙的な紐帯を統合的に分析することを目指した。具体的には、創業時に各企業が引き起こすイノベーションに着目し、どういった紐帯がこれに寄与しているかを分析した。刊行されている企業の社史を用い、そこで提供されている豊富な情報をもとに議論を展開した。この分析を通じて、人的資本に限らず、社会関係資本が創業時のイノベーションに大きく貢献していることが確認された。また、明示的な紐帯と暗黙的な紐帯、臨時的と安定的、地域内と地域外といった紐帯を複合して持つことの強みが示され、これを併せ持つUターンによる創業が地方においてはイノベーションを進める重要な役割を果たしていることが明らかになった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成28年度は三年間の計画の初年度として、理論の整理と定量的な分析に取り組んだ。具体的には制度経済学的側面と空間経済学的側面からの理論を中心に検討を行った。これに加えて、イノベーションにも着目し経営学的観点・地理学的観点からの議論を参照した。具体的分析としては特に地域内で発生するイノベーションに着目した。これは積極的な企業の流入、成長期における立地の変更についての理解を意図したものである。特許の取得、新業種への進出、新規取引関係の構築といった形で客観的に分析可能な形で定義を行い、その発生と立地の関係について分析を行った。地域の側からは、フォーマル/インフォーマルのネットワークを担保するような多様なインフラについて評価した。従来の研究と比較して、都市内での中心市街地との位置関係等に着目した点が新規である。また、インフラの内容に関しては、飲食店などにも注目した点が新規である。またこれと並行して、マクロ的な視点に立ち、企業間の取引・金融ネットワークが指し示す都市システムに関する分析を行った。この分析を通し、旧来型のヒエラルキカルなネットワーク(上に示した分析の第一項目に対応)、とイノベーションに対応した水平的なネットワーク(上に示した分析の第二項目に対応)の包括的理解が期待される。結果、金融ネットワークの垂直的な構造と取引ネットワークの相対的に水平的な構造を示すことができた。特に中小企業の取引ネットワークの水平的な形態が明らかになり、今後はイノベーションの発生源としてこのネットワークに着目していきたいと考えている。当初計画より進捗している部分と、計画した水準に達していない部分があり、総合的に見て当初計画と同水準の進捗状況であると結論付けることができる。当初の計画と異なる点として、株式会社帝国データバンクのデータが利用になったため、これを利用した研究を実施している。このデータは我が国の企業のデータを網羅的かつ詳細に把握しており、本研究の目的に鑑みて利用可能性が高いと考えられる。これに加えて、企業・金融機関の実態把握として、島根県・鳥取県にまたがる地域でインタビュー調査を行った。金融機関の融資や起業支援の実務とデータを通して行っている議論の整合性を確認することができた。。本年度の研究を通じ長期の企業の状況を説明しうる多くの変数は発見できたものの、現代部分の議論に重きを置いた代わりにこの部分は当初の計画よりはかばかしくない。理論面では、地理学や経済学の観点から、本研究で問題にしている、長期継続諸要因が企業の活動に影響する経路を整理した。企業の外部要因/内部要因、紐帯の強さ、継続性など様々な比較軸でまとめている。これに加えて、都市計画・産業政策の観点からの企業行動への影響もまとめ、以下の実証分析の礎を整備した。実証面では、前年度に引き続き、日本企業の個別データを用いた分析を行い、主として以の三つの成果を得た。第一に、前年度から取り組んでいた、イノベーションと企業パフォーマンスの関係について、さらなる精緻化を進めた。様々な地域の環境、特にインフォーマルなコミュニケーションを支えるような場所が、特に低次なイノベーションを促進する傾向にあることを示した。イノベーションの実証の観点からも、知的スピルオーバーの観測の点で、従来にない実証になっており、価値がある。第二に、人材の地域的流動が企業のパフォーマンスに及ぼす影響として、代表者の出身地を用いた分析を行った。外部から流入する人材によって確保される人材の多様性が、企業の生産性向上につながることを示した。また、地域全体で見ても、少なくとも産業の多様性を高めることは明らかになっている。この成果は、人口の地域外からの流入が、数十年単位で影響を及ぼすことを示すものである。

上の二つと並行して、これも前年度からの継続であるが、マクロスケールからの分析として、企業間ネットワークを通じた国土構造の把握に努めた。結果は、依然として旧来からのヒエラルキー構造が卓越していることを示すものであった。しかし小企業では相対的に水平的なネットワーク構造があることが明らかになっており、地域経済の振興・イノベーションの観点からこれらの企業へ着目することを正当化するものとなっている。当初の計画と比較して、想定通り進んでいる箇所、計画にはないが状況の変化により進捗した箇所、計画通りには進んでいない箇所がある。第一に、平成29年度における研究の主要な部分の一つである、理論的な整理とイノベーションと企業パフォーマンスの関係については、上記の業績報告にも記したように、概ね当初の予定通りの成果を得ることができた。これに対し、「研究実績の概要」の実証分析における第二点目・第三点目の「人材の地域的流動が企業のパフォーマンスに及ぼす影響」および「企業間ネットワークを通じた国土構造の把握」は、企業データベースを用いて実施しており、当初の平成29年度の計画では存在しなかった分析である。理論的な整理を行う中で、より企業内部要因について、あるいは全体的な国土構造について理解を深める必要があると判断したため、追加したものである。加えて、当初の想定以上に潤沢な企業データベースが得られたために、アンケートや社史で実施予定であった一部分析を代替することも可能になった。その結果、上述の通り、一定の成果を上げることに成功した。半面、アンケートの実施や社史の分析は当初の予定通りの進捗は得られなかった。しかしながら、社史資料の収集や基礎的なヒアリングは実施しており、成果としてまとめるには至っていないものの、材料は蓄積されている。平成30年度において、当初計画した実証を行うための環境は十分に整っている。以上の経過に基づいて総合的に判断すれば、進捗度にむらがあり、必ずしも計画通りとは言えないものの、進捗度としては十分なものであるといえる。平成30年度に課題が達成できると予見しうる基礎も整っており、おおむね順調であると判断することができる。本年は研究の最終年度として、課題に対応した研究成果をまとめ、アウトプットを出すことを目指した。具体的には、地方圏に立地する企業の社史の分析を、二年目までの研究成果を踏まえたうえで、定量・定性の両面から展開した。結果、アンケート調査を実施しなかった点など、途中の分析の結果を踏まえた手法面での変更は生じたものの、三年間を通して、当初の意図通りの研究成果を挙げることに成功したといえよう。計画時に提示した要因に加え、企業の立地を促進する要因として、イノベーションへの着目を行い、それとの関連において企業立地が検証された。研究課題開始時に想定していた物的環境よりも、ソフトなつながりの重要性が示された。以下に詳述する。まず実際の企業行動のプロセスにおいて、二年目までの研究で明らかになっていた取引関係や金融関係(以下、明示的な紐帯と称する)・コミュニケーションの場(以下、暗黙的紐帯と称する)が作用していることを確認した。
血管内造血発生に関わる新規血液幹細胞因子のスクリーニング

造血幹細胞の自己複製を選択的に誘導する因子の同定は臨床的、生物学的な発展に貢献度が高いとされるものの、現在のところ未だ同定されていない。マウスでは造血幹細胞、血管内皮細胞の共通祖先細胞であるヘマンジオブラストは胎生6.5日目、側板中胚葉領域で発生し、傍大動脈臓側板中胚葉領域(以下P-Sp領域と略す)に移動し造血幹細胞、血管内皮細胞に分化すると仮説されてきた。本研究において胎生9.5日目にチロシンキナーゼ受容体であるc-KitおよびTIE2陽性の造血幹細胞がP-Sp領域の近傍の臍腸間膜動脈内で血管内皮細胞に接着、増殖することを明らかにした。そこで本領域から造血幹細胞の自己複製を誘導する因子の単離を試みるべく、マウス胎生9.5日目の臍腸間膜動脈からpolyA RNAを抽出後cDNAライブラリーを作製した。cDNAの中で細胞外に分泌される可能性のある遺伝子酵母を用いたsignal sequence trap法により選択する。現在までに解析した酵母クローン200万個中、signal sequenceを持つものが90クローン得られ、その中で新規の遺伝子を25クローン同定した。そこで得られたクローンのうち新規のものを中心にin situ hybridizationによりmRNAの発現する細胞を確認し、造血組織特異的にmRNAの発現の認められるクローンに関しては、遺伝子全長をクローニングする。現在までにCD34と類似した新しいsialomucin分子、kunitz inhibitor domainを有するproteinaseinhibitor-like分子、新規LDL受容体などを同定している。クローニングされた遺伝子は発現ベクターに組み換え、OP9ストロマ細胞に導入し、このOP9細胞上で造血幹細胞の自己複製を誘導する因子を探索する予定である。マウスでは出生後の骨髄造血を構築する多能性造血幹細胞は胎生期9-11日のP-Sp(para-aortic splanchnopleural mesoderm)あるいはAGM(aorta-gonad-mesonephros)と呼ばれる領域から発生してくることが証明されている。しかしこの領域は造血幹細胞の中胚葉細胞がらの誘導の場であってその増殖の場ではないことを造血幹細胞表面に発現するレセプター型チロシンキナーゼc-Kit,TIE2の発現解析にょり明らかにした。P-SpあるいはAGM頃域で発生した造血幹細胞は胎児肝で造血が営まれる胎生11日までの間分化することなく増殖することが予測される。胎生9日においてc-Kit,TIE2をともに発現する細胞が胎児と卵黄嚢を結ぶ唯一の動脈である臍腸間膜動脈・卵黄動脈内に血管内皮に接着し集団として存在し、このc-Kit,TIE2陽性細胞はin vitroのコロニー形成能は持ちあわせていないが、ストロマ細胞株OP9上で共培養した後ではコロニー形成能を有する血液前駆細胞が極めて高頻度に検出され、すべての細胞系列の血液の出現が一つの細胞から誘導されることを明らかにした。これらのことは臍腸間膜動脈・卵黄動脈内に存在するc-Kit,TIE2陽性細胞は多分化能を持つとともに分化することなく増殖していることを示唆した。そこでこの臍腸間膜動脈・卵黄動脈の環境において造血幹細胞の自己複製因子が豊富に存在すると考え、臍腸間膜動脈、卵黄動脈のcDNAライブラリーを作成しsignal sequence trap法を用いて同定する方法を試みている。現在までに5つの新規の遺伝子が本法により同定され、これらが造血幹細胞の自己複製に関わるものか否かを検討している。
配送計画問題に対する制約指向メタ戦略システムの開発

地元企業との共同研究でこの会社で必要な配送業務の最適化を行うシステムを構築した.具体的には徳島県内の配送業務に携わる企業のインタビューに基づき行った.問題のモデル化は時間枠付き車両配送問題(VRP with Time Window, VRPTW)をベースに必要な制約を加えて行った.また,ベンチマーク問題として徳島県内100個所の公共施設を配送先とする問題例を作成した.さらに,実際の2地点間の移動時間や移動距離などの情報はゼンリン社のデジタル地図情報から取得して,現実に近い状況を反映した問題を作成した.モデリングした実制約付き車両配送問題の解法として,本研究ではタブー探索とIterated local searchを基本とした探索手法を考案した.さらに,配達途中に注文される追加配送に対して対処するための動的スケジューリングシステムを構築した.開発したシステムに関する論文を学会誌に投稿して受理された.上述のシステムをより現実的なものとするために,配送荷物の3Dパッキングを考慮した最適化問題(3L-CVRP)として問題の定式化を行った.これまでに,パッキングする際の容器の空き空間(Free Space)に着目した手法を提案し3Dパッキングを高速に行うための高速アルゴリズムを考案して,ベンチマーク問題で有効性を確認した.車両配送問題の解法としては単純なタブ探索を利用し,考案したパッキングアルゴリズムと組み合わせて解法を構築した.従来3Dパッキングを考慮した車両配送問題はパッキングと配送経路の最適化を分離するものが多かったが,現在は両者を同時に進める方式に開発を行っている.ある一企業で必要とされる配送計画問題を最適化問題として定式化し,これに対する近似解(ユーザーに提案する推薦経路)を地図上に表示するまでの一連のシステムが完成した.この内容に関する論文を学会誌に投稿して受理された.現状では,必要とされる配送経路問題に対して,人手で必要な制約や目的関数をアルゴリズムに組み込み,さらに適切なアルゴリズム(メタ戦略)を設計する必要がある.今後はモデリング言語を用いてユーザーが解きたい配送計画問題をモデル化し,システムは定式化された問題をメタ戦略が適用可能な形式に自動的に再定式化する.具体的にはモデリング言語で入力した配送計画問題に矛盾がないかチェックした後,問題の実行可能解を表現するのに適した「型」を自動生成する方式を開発する.また,型のインスタンスとして表現される解候補に対して目的関数値を自動計算する方式を開発する.メタ戦略が適用可能な形式に再定式化された任意の配送問題に対して,その問題を効率的に解くためのメタ戦略アルゴリズムを自動構成する.これまで,与えられた問題に対して,メタ戦略アルゴリズムを自動構成する研究は行われていたが,今回の研究では定式化される問題ごとにメタ戦略アルゴリズムを自動構成する.地元企業との共同研究でこの会社で必要な配送業務の最適化を行うシステムのプロトタイプを構築した.具体的には,1企業で必要とされる配送計画を立案するために,時間枠付き車両配送問題(VRP with Time Window, VRPTW)をベースに必要な制約を加えた実制約付き車両配送問題のモデリング,およびその最適化手法を構築した.VRPTWは顧客ごとにサービス開始時間が設定されている配送計画問題である.また,実際の配送現場では,配送中に受けた追加注文に対応するための動的スケジューリングが必要とされる場合が多い.本研究ではこの問題に対する動的スケジューリングのモデリングも行い,動的スケジューリングに対応した最適化手法も提案した.実制約付き車両配送問題のモデリングは,徳島県内の配送業務に携わる企業のインタビューに基づき行った.また,ベンチマーク問題として徳島県内100個所の公共施設を配送先とする問題例を作成した.さらに,実際の2地点間の移動時間や移動距離などの情報はゼンリン社のデジタル地図情報から取得して,現実に近い状況を反映した問題を作成した.モデリングした実制約付き車両配送問題の解法として,本研究ではタブー探索とIterated local searchを基本とした探索手法を考案した.開発した手法に関する論文を現在論文誌に投稿中である.上記の研究とは別に,配送計画問題に車両への荷物の3次元的な詰め込み制約を追加した問題の定式化と解法の構築も行っている.ある一企業で必要とされる配送計画問題を定式化し,実際に最適化経路を地図上に表示することができた.探索精度の改善の余地はまだまだあるが,基本的なシステムの雛形を構築できた.地元企業との共同研究でこの会社で必要な配送業務の最適化を行うシステムを構築した.具体的には徳島県内の配送業務に携わる企業のインタビューに基づき行った.問題のモデル化は時間枠付き車両配送問題(VRP with Time Window, VRPTW)をベースに必要な制約を加えて行った.また,ベンチマーク問題として徳島県内100個所の公共施設を配送先とする問題例を作成した.さらに,実際の2地点間の移動時間や移動距離などの情報はゼンリン社のデジタル地図情報から取得して,現実に近い状況を反映した問題を作成した.モデリングした実制約付き車両配送問題の解法として,本研究ではタブー探索とIterated local searchを基本とした探索手法を考案した.さらに,配達途中に注文される追加配送に対して対処するための動的スケジューリングシステムを構築した.開発したシステムに関する論文を学会誌に投稿して受理された.上述のシステムをより現実的なものとするために,配送荷物の3Dパッキングを考慮した最適化問題(3L-CVRP)として問題の定式化を行った.

これまでに,パッキングする際の容器の空き空間(Free Space)に着目した手法を提案し3Dパッキングを高速に行うための高速アルゴリズムを考案して,ベンチマーク問題で有効性を確認した.車両配送問題の解法としては単純なタブ探索を利用し,考案したパッキングアルゴリズムと組み合わせて解法を構築した.従来3Dパッキングを考慮した車両配送問題はパッキングと配送経路の最適化を分離するものが多かったが,現在は両者を同時に進める方式に開発を行っている.ある一企業で必要とされる配送計画問題を最適化問題として定式化し,これに対する近似解(ユーザーに提案する推薦経路)を地図上に表示するまでの一連のシステムが完成した.この内容に関する論文を学会誌に投稿して受理された.現状では,考慮すべき制約や目的関数を個別にプログラミングする必要がある.多様な要求に対応するために,解きたい問題に課されている制約と目的関数を「宣言的」に入力することで問題を定式化するモデリング言語を開発する.すなわち,問題に課される制約と目的関数をユーザーが(モデリング言語の記述能力の範囲内で)自由に記述して問題を定式化することが可能となる.さらに,定式化される任意の配送計画問題に対して,その問題を効率的に解決するメタ戦略アルゴリズムを自動的に構成する汎用的な近似最適化法を構築する.現状では,必要とされる配送経路問題に対して,人手で必要な制約や目的関数をアルゴリズムに組み込み,さらに適切なアルゴリズム(メタ戦略)を設計する必要がある.今後はモデリング言語を用いてユーザーが解きたい配送計画問題をモデル化し,システムは定式化された問題をメタ戦略が適用可能な形式に自動的に再定式化する.具体的にはモデリング言語で入力した配送計画問題に矛盾がないかチェックした後,問題の実行可能解を表現するのに適した「型」を自動生成する方式を開発する.また,型のインスタンスとして表現される解候補に対して目的関数値を自動計算する方式を開発する.メタ戦略が適用可能な形式に再定式化された任意の配送問題に対して,その問題を効率的に解くためのメタ戦略アルゴリズムを自動構成する.これまで,与えられた問題に対して,メタ戦略アルゴリズムを自動構成する研究は行われていたが,今回の研究では定式化される問題ごとにメタ戦略アルゴリズムを自動構成する.該当年度は国際学会に参加することが出来なかったので,その分の旅費を次年度に回すこととなった.次年度の国際会議に現在論文を投稿しているところである.また,該当年度に購入予定であった計算機を購入することを見送った.これは,これまでに使用している計算機特にトラブルが無かったためであるが,計算能力を増強するために,今年度は計算機を購入する予定である.予定していた国際学会に参加しなかったため次年度使用額が生じた.その分の予算は翌年度の物品購入に充てる予定である.具体的には構築する最適化システムの実行をGPU化するため,高性能GPUを搭載したPCを購入する.
アダプタータンパク質ＡＳＣ下流シグナルを標的とした新規大腸がん治療標的分子の同定

大腸がんは致死人口が高く、がん死の原因としては2番目となっている。本研究では、大腸がんを含む種々のがんの悪性化に伴い発現量の低下がみられるASCの下流シグナル分子の同定を試み、ASCを介したがん細胞増殖抑制の分子機構の解明と、新規大腸がん治療標的分子の同定を試みた。ASCを過剰発現させると増殖抑制が見られるがん細胞株で、種々の分子のノッダウンを行い、ASCを介した細胞増殖抑制に関与する分子の解析を行った。また、同じがん細胞株でASC結合分子の網羅的解析を行い、ASC結合候補分子を得た。その結果、ASCは細胞死誘導やシグナル伝達の調節等の方法で、がん細胞の増殖抑制を行っている可能性が示唆された。大腸がんは致死人口が高く、本邦では肺がんに次いで2番目となっている。本研究課題では、大腸がんを含む種々のがんの悪性化に伴い遺伝子発現量の低下が見られるASCの下流シグナル分子の同定を試み、ASCを介したがん細胞増殖抑制の分子メカニズムの解明と、新規大腸がん治療標的分子を同定することを目的とした。昨年度までに、ASCを過剰発現させると増殖抑制が見られるヒト大腸がん細胞株DLD-1、およびヒト線維肉腫細胞株HT-1080でのASC結合分子の包括的解析をプロテオミクスの手法を用いて行い、ASC結合候補分子を得た。そこで、今年度は、このうちのいくつかの分子について、ASCとの結合および機能解析を試みた。ASC結合候補分子のうち、チロシンキナーゼシグナル伝達の足場タンパク質、アクチン結合分子、2種のRNAヘリカーゼとの結合を293T細胞での過剰発現系で免疫沈降法を用いて解析した。その結果、前者とASCとの結合が認められた。また、RNAヘリカーゼとASCとの結合については、予備的検討の段階であるが、2種のうち1種は293T細胞での過剰発現系での結合が認められた。さらに、チロシンキナーゼシグナル伝達の足場タンパク質およびアクチン結合タンパク質とASCとの結合を、種々のがん細胞株を用いて免疫沈降法により解析したところ、内在性のタンパク質同士の結合が見られた。また、ASCノックダウン細胞では、MAPキナーゼのリン酸化が亢進していた。以上の結果から、ASCが、ある種のがん細胞においては、シグナル伝達の足場タンパク質に結合してMAPキナーゼシグナル伝達を阻害している可能性が示唆された。この足場タンパク質は、大腸がんにおいて高発現しているという報告があることから、今後、ASCとの結合部位を詳細に解析することにより、新規大腸がん治療法の開発に繋がる可能性が考えられた。大腸がんは、がん死の原因としては肺がんに次いで2番目に多く、致死人口が多い。本研究の目的は、大腸がんの悪性化に伴い遺伝子発現量の低下が見られるapoptosis-associated speck-like protein containinga CARD(以下ASC)の下流シグナル分子の同定を試み、ASCを介した大腸がん細胞増殖抑制の分子メカニズムを解明することにより、新規大腸がん治療標的分子を同定することである。我々の研究グループでは、これまでに、ASCの発現抑制が認められるヒト大腸がん細胞株DLD-1およびヒト線維肉腫細胞株HT-1080にASCを過剰発現させると、細胞増殖能やコロニー形成能が低下することを見出した。さらに、ASCはN末端側のPyrinドメイン(以下PYD)とC末端側のCARDドメインから成るタンパク質であるが、PYDのみのASC変異体をDLD-1またはHT-1080に過剰発現させた際には、野生型以上の細胞増殖抑制効果を示した。そこで、本年度は、この細胞増殖抑制の分子メカニズムについてさらに詳細に解析するため、細胞増殖、細胞死に関与する分子であるp53、p21、カスパーゼ等のノックダウン細胞株を作製し、ASCによる細胞増殖抑制への関与を解析した。また、ASCのPYDを介した下流シグナル分子が新たな大腸がん治療の標的分子となりうることから、ASCのPYD結合タンパク質が大腸がんの治療標的分子の候補であると考え、本年度はその網羅的解析も試みた。DLD-1およびHT-1080にASCおよび種々の変異体とFlagタグとの融合タンパク質を発現させ、LC-QTOF-MSおよびMALDI-TOF-MSによる包括的解析を行い、これまでにPYD結合候補分子を得た。本年度は、ASCのPYD結合候補分子のスクリーニングに終始した。DLD-1細胞に、レトロウイルスベクターを用いてASC-Flag、PYD-FlagまたはΔPYD-Flag(細胞増殖抑抑制効果が見られないPYDの一部欠損体)融合タンパク質を発現させ、細胞抽出物のanti-Flagビーズによる免疫沈降を行った。得られた生成物のLC-QTOF-

MSによる包括的解析を行い、ASC-Flag、PYD-Flagには結合するがΔPYD-Flagには結合しないタンパク質を選択し、PYDと特異的に結合する分子を同定した。その結果、約100種のタンパク質が得られた。これらの中には細胞増殖、シグナル伝達、タンパク質合成、細胞骨格の形成に関わるものが含まれていた。また、がん細胞で特異的に発現が亢進することが報告されているタンパク質も含まれていた。一方、HT-1080細胞での包括的解析の結果では、約50種のPYD結合候補タンパク質が得られた。両細胞間で共通の結合タンパク質が、ASCによる細胞増殖抑制に重要であると考え、得られた分子群を両者で比較したところ、共通のタンパク質が約10種含まれていた。これらには、細胞増殖への関与が報告されている分子、タンパク質合成に関与する分子、タンパク質分解過程に関与する分子、細胞骨格の形成に関与する分子が含まれていた。これらのタンパク質は、ASCのPYDと特異的に結合していると考えられる。また、上記包括的解析とは別に、HT-1080細胞においてp53、p21、および種々のカスパーゼのノックダウン株を作成し、解析を行ったところ、ASCによる細胞増殖抑制は、p53、p21、カスパーゼ1、カスパーゼ7には非依存的であることが示唆された。以上の結果を得たことより、おおむね順調に進展していると判断した。24年度の研究で得られたタンパク質のうち、細胞増殖およびタンパク質合成に関与することが報告されている分子を選択し、解析を行う。結合候補分子とASCまたはその変異体とを共発現させ、双方の免疫沈降により結合の確認を行う。また、結合候補分子の種々の変異体を用いてASCとの結合部位を同定する。さらに、結合候補分子のDLD-1細胞、HT-1080細胞細胞での過剰発現、ノックダウンにより、細胞増殖過程への影響を解析する。また、本年度はASCを発現していない細胞株にASCを過剰発現させる実験系を用いたが、逆に、ASCを発現している大腸がん細胞株を中心に、種々のがん細胞株においてASCをノックダウンし、リン酸化等のシグナルが変化する分子の解析も試みる。以上の方法で、ASCの下流シグナル分子を同定し、大腸がん治療標的分子の同定を試みる。次年度使用額が生じた理由としては、LC-QTOF-MSによる網羅的解析を外注せず、本学に設置の機器を用いて行ったため、当初計画よりも安価に完了したことが挙げられる。また、次年度に、リン酸化シグナルの網羅的解析を行う予定のため、外注費用等が必要となる。さらに次年度は、細胞培養、動物実験による機能解析を行う。使用予定額は以下の通りである(概算値)。試薬、キット等の消耗品と外注費1,950千円。動物購入、飼育費用500千円。成果発表のための国内旅費100千円。論文投稿・掲載費用150千円。共通機器使用料200千円。
胆肝癌とその幹細胞の悪性分化に関わる新規糖鎖修飾蛋白質の同定と構造機能の解析

胆肝癌(CCA)は、最も予後が悪い悪性腫瘍である。近年、がん幹細胞の概念が導入され、CCAにおいてもこれらの存在が示唆され、これを用いたCCA悪性化メカニズムの解明が期待されている。本研究では、CCAとCCA幹細胞を中心に、悪性腫瘍分化に関わる特異的糖蛋白質の同定と、その修飾構造の詳細な構造解析、およびその生物学的意義を解析した。まず、患者組織から確立されたCCA培養細胞の脱分化モデルの樹立を行った。幹細胞培地にてCCA細胞を長期培養したところ、最も未分化とされるM055CCA細胞においてsphere状の幹細胞様変化が観察され、FCSを添加することによって、再分化することが判明した。sphere状態で培養を続け、20回目の継代培養を経た細胞において各種マーカー類の解析を行ったところ、sphere状態のCCAにはSox2をはじめとする幹細胞マーカー群、およびo-GlcNacylation修飾タンパク質(OGP)の発現が亢進する事が判明した。同時進行で樹立を行ったGlioma幹細胞についても同様にo-GlcNacylationの顕著な増加が観察された。そこで、o-GlcNacylationに関わる酵素GFAT阻害剤6-Diazo-5-oxo-L-norleucineおよび活性化剤Glutamine/N-Acetyl Glucosamineの処理をおこなったところ、前者においては幹細胞形成阻害が、また後者においては分化誘導阻害が顕著であることが判明した。さらに、修飾分子の同定をClick-IT&#174;-GlcNAz法を用いた質量分析によって行い、現在までに幹細胞形成に重要な23種のOGPの同定に成功している。興味深いことにこれらには転写や染色体リモデリングの関連分子が多く含まれており、現在詳細な検証実験を行っている。がん幹細胞モデルにおいて、o-GlcNacylationが悪性分化に関わる分子発現の調節に関わっており、修飾タンパク質や責任酵素の阻害剤ががん幹細胞による悪性分化の阻害に有効である可能性が示唆された。27年度が最終年度であるため、記入しない。コランジオカルチノーマ(胆肝癌:CCA)は、タイでは最も予後が悪く頻度の高い悪性腫瘍であるが、日本や海外においてもその増加傾向が注目される様になっている。本研究では、CCAとCCA幹細胞を中心に、悪性腫瘍分化に関わる特異的糖蛋白質の同定と、その修飾構造の詳細な構造解析、およびその生物学的意義を解明する。患者組織から確立されたCCA培養細胞と、これらの幹細胞への脱分化細胞モデルにおいて、悪性分化による分子発現パターンの変化を明らかにし、これらのコア蛋白質や糖鎖修飾責任酵素の阻害効果、これによる抗がん剤感受性の変化、これら分子に対する抗体の医薬品としての開発の可能性を検証し、腫瘍化メカニズム解明と標的分子群の臨床応用を目標とした。本年は、CCA培養細胞の脱分化による幹細胞作製と、細胞内蛋白質の翻訳後修飾の変動、特にo-GlcNacylationに注目した。幹細胞培地にてCCA細胞を培養したところ、最も未分化とされるM055細胞において一週間で徐々にsphere状に形態変化し、これらはFCSを添加することによって、再分化することが判明した。この細胞においてはsphere状態で培養を続け、現在17回目の継代培養を経た細胞において、幹細胞マーカーおよびo-GlcNacylationの特異抗体を用いて解析したところ、shere状態のCCAには幹細胞マーカーであるCD44等、およびOGPの発現が亢進する事がわかった。同時進行で行っている、Glioma癌細胞についても同様にo-GlcNacylationの顕著な増加が観察された。現在、o-GlcNacylation修飾分子および責任遺伝子の同定と、癌幹細胞の分化・脱分化との関連性について詳細な解析を行っている。さらに、修飾分子の同定をClick-IT&#174;-