hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血管新生抑制因子を用いた癌性腹膜炎の治療薬の開発

またその治療開始時期と治療効果の関係について検討したところ、腫瘍血管の新生が開始される時期よりも以前に治療を開始すれば治療効果が著しいが、血管新生が確立した後に治療を開始したものでは、どの癌の癌性腹膜炎でも治療効果は乏しいことが分かった。以上の結果、マイクロスフェア化された血管新生抑制因子製剤は、癌性腹膜炎に対して、その病巣の腫瘍血管の新生を抑制することにより、治療効果をあらわすことが明らかとなった。[検討1]新しい種類の抗癌剤として臨床応用が期待されている血管新生抑制因子TNP-470は、癌性腹膜炎に対する治療薬剤としては、治療効果が確認されないでいた。このTNP-470をもちいて、マウスの癌性腹膜炎の治療を行う試みを行った。癌性腹膜炎の初期である7日目以内にTNP-470を水溶液の剤形で投与した場合には、癌性腹膜炎に対する延命効果を示したが、それよりも癌性腹膜炎が進行した時期に投与された場合には、治療効果を示さなかった。このようにTNP-470は部分的な効果を示したのみであった。またその副作用は、水溶液化する際の乳化剤のため、浸透圧による腹水の貯留が見られ、多量に腹腔内に投与されると致死的毒性を示すことが明かとなった。[検討2]TNP-470をマイクロスフェア化した剤形(TNP-MS)について検討した。動物実験によって、TNP-MSは腹腔内に投与された場合でも、作用成分であるTNP-470が不活性化されない剤形であることが証明された。またそればかりでなく、動物実験で腹腔内に投与されたTNP-MSは徐放性に作用成分を放出する性質を持つことが示された。このTNP-MSについて治療効果を検討した。TNP-MSは腹腔内で安定であるため、治療効果が強く、癌性腹膜炎が比較的進行した状態でも、延命効果があることが明らかとなった。
ジフテリア毒素による有髄Aδ線維ターゲティングと高解像度アレイによる機能分子同定

神経因性疼痛は、疼痛過敏やアロディニアと呼ばれる異常痛を誘発する難治性疾患である。また、その痛みには有髄A線維の機能亢進が深く関わっていることを明らかにしている。本研究は、有髄A線維の病態における役割を決定づけるために、特に、有髄Aδ線維の新規分子マーカー、Aδ-fiberspecific(ADS;仮称)受容体を手がかりとして、神経因性疼痛に関連する分子を同定することを目的としたものである。脊髄後根神経節において、ADS受容体はN52陽性の有髄A線維に高発現している。詳細な解析によりこれらは各種C線維マーカーと共存せず、特に中型のN52陽性細胞に多いことを見いだした。また、ADS受容体リガンドをマウス後肢に皮下投与すると、用量依存的な侵害性応答が観察された。これらの応答は、Gα_sに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド処置、またはPKA阻害剤の前処置によって有意に抑制された。一方、坐骨神経部分結紮による神経傷害性神経因性疼痛モデルでは、ADSリガンドによる侵害性応答が顕著に増強していた。このマウスにおいて、ADS受容体の発現増加あるいは異所性発現が認められなかったことから、ADS受容体下流のメカニズムが関連すると推測された。実際に、神経因性疼痛モデルで観察されるADSリガンド誘発性過敏応答はPKA阻害剤の前処置によりほぼ完全に抑制され、逆にPKA活性化剤である8-Br-cAMP単独投与により侵害性応答の増強が再現された。さらに、PKAの標的分子として知られるTRPV1が、神経傷害後、ADS受容体陽性細胞に新たに発現することが明らかになった。以上の結果から、G_s-cAMP-PKA経路が、有髄Aδ線維の機能亢進に関わる細胞内応答であることが証明された。また、その下流分子であるTRPV1は疼痛過敏に関与する候補分子と考えられる。現在、この研究成果について投稿中である。
高分散分光観測による星・惑星形成過程の解明

星や惑星は、分子雲と呼ばれるガスの塊から誕生する。生まれた星の周りを取り囲むように原始惑星系円盤が作られ、ここで惑星が生まれるが、その詳しい過程はまだ明らかになっていないことが多い。これまでの研究で、原始惑星系円盤の進化時間が、分子雲ごとに異なることがわかっている。本研究では、星のスペクトルから温度・重力・年齢を求め、分子雲ごとに星や惑星の進化過程が異なる原因を解明する。また、FU Ori型星と呼ばれる、原始惑星系円盤から中心星に向かってガスが大量に流れ込み増光している天体の高分散分光観測を行い、大規模な変動が起こっている若い星で、光球や原始惑星系円盤がどのように進化しているかを明らかにする。
前向きコホート、医療情報、個人の疾患感受性多型情報を統合するオントロジーの開発

東北メディカル・メガバンク事業では、前向きゲノムコホート研究と、バイオバンク開発を行い、生活環境、健康情報、ゲノム情報を統合したデータベースを構築する。本研究では、これらの収集情報の概念化を行い、オントロジーを構築する。平成30年度は、平成29年度までの成果を踏まえ、前向きゲノムコホート研究を構成する概念整理を行い、環境因子と遺伝因子の相互作用から発症に至るプロセスおよび因果関係の概念化を行った。ゲノムコホート調査データは、これらのプロセスの観測であると位置づけ、その概念世界はfunctionとdisorderの概念階層と各階層概念の観測手段と観測結果(データ)であるとモデル化しオントロジーを構築した。オントロジーエディタである法造を利用して、ロール概念を深く考察したフレームベースの表現に基づきオントロジーを構築した。具体的には、発症に関連する機能を定義し、それ機能の正常/異常を判断する手段、根拠、原理を定義し、疾患ゲノムコホート研究が必要とする概念の多層的な関係を明確化できた。更に、米国FDAが提唱するゲノム疾患研究におけるアノテーション標準が求める要項と照合し、両者の適合性を考察した。本研究で設定した問いについては、以下に結論した。ア)アンケートは、医療領域の表現と連続した形式化が可能である。イ)アンケート(表現)、対象者の表現型(質)、および個人ゲノムの多型(もの)の関係はロール概念を用いて形式化可能である。ウ)未病から発症に至る過程の定義には、axiomベースのOBO表現に加えてロール概念が必要となる。エ)未病から発症に至る過程と、疾患感受性多型および発症リスクの関係性について明確化するには、ファクトが不足している状況である。東北メディカル・メガバンク事業では、15万人の健常人を対象としてゲノムコホート研究を行い、提供された試料を管理するバイオバンクを構築し、生活環境、健康情報、ゲノム情報を統合したデータベースを構築する。本研究では、これらの収集情報の概念化を行いオントロジーを構築することにより、本事業で収集する情報を横断する意味検索を可能とし、情報の効率的利用を支援する。続いて、被災が発症原因となるPTSD(Post Traumatic Stress Disorder)、および緑内障、歯周炎を対象として、未病から発症に至るプロセスの概念化を行った。疾患の表現モデルは、SmithおよびMizoguchiの定義を基本とし、コホート研究で収集する質問票や検査データ、および生体分子の機能との関係を追加した。DiseaseはDisease Courseにより具現され、DiseaseはAbnormal Stateから構成され、Disease CourseはBiological Processから構成される。続いてPTSD、緑内障、歯周炎を対象として、Abnormal Stateである概念クラス、およびBiological Processである概念クラスについて、既存のオントロジーであるMPおよびGO-BPに対してマッピングを行い、ほぼ全ての概念クラスがマップされることが分かった。MPおよびGO-BPは遺伝子のアノテーションが充実しており、遺伝子の実験データ解析に頻用される。本結果は、遺伝子の解析データからMPおよびBO-BPの推定を介して、疾患の推定が可能となることを示した。コホート構築に当たり掲げた以下の課題については、ア、イ、ウについて、概ね解決できた。ゲノム情報に関する考察ができなかったため、エとイの一部については平成28年度に解決を目指す。ア.アンケート(表現)は、医療領域の表現である所見や診断等と連続した形式化が可能であるか。イ.アンケート(表現)、対象者の表現型(質)、および個人ゲノムの多型(もの)との関係はどう形式化されるのか。ウ.未病から発症に至る過程の形式化について、OGMSで定義される疾患関連プロセス概念の構造は十分であるか。エ.未病から発症に至る過程と、疾患感受性多型および発症リスクについて、関係性を明確化できるか。平成28年度は、平成27年度に構築したオントロジーの拡張を行った。平成27年度は、PTSD、緑内障、歯周炎を対象として、未病から発症に至るプロセスの概念化を行った。平成28年度は、東北メディカル・メガバンク事業で収集する多様な中間形質(生活環境)、および上記疾患以外の疾患関連情報をオントロジーに追加し、本オントロジーが本事業で収集する情報を網羅的にカバーするよう拡張した。更にバイオバンク・オントロジーとして先行するOMIABISおよびOBIBを精査して、本オントロジーに不足する概念を補強した。東北メディカル・メガバンク事業で収集する中間形質は、社会人工学的因子、生活環境、生化学検査、生理機能検査、臨床心理検査、認知心理検査、がある。これらの概念の多くは、Experimental Factor Ontology (EFO)より取り入れ、EFOにない概念は新設した。東北メディカル・メガバンク事業において、先天的・後天的要因による疾患発症リスクの予測手法の確と、個別化予防の実用化を目指す対象疾患は、動脈硬化、高血圧、脂質異常症、糖尿病、呼吸器疾患、感覚器疾患(眼、耳等)、アレルギー、精神疾患(PTSD、うつ、発達障害等)、認知症、周産期疾患である。これらの疾患概念を本オントロジーに取り入れた。

疾患概念についても、EFOからの取り入れを基本とし、疾患モデルは平成27年度に構築した構造を利用した。平成28年度においては、平成27年度に構築したオントロジーと、既存のバイオバンク・オントロジーであるOMIABISおよびOBIBの比較調査に注力し、本オントロジーが本事業で収集する情報を網羅的にカバーし、横断的意味検索を可能とするための準備を進めた。本オントロジー構築に当たり掲げた、ゲノム医療研究におけるオントロジー研究の課題として考えられる、個人のゲノム多型と疾患との関係の明確な形式化、および疾患感受性を発症リスクの概念化が達成できなかった。東北メディカル・メガバンク事業では、15万人の健常人を対象としてゲノムコホート研究を行い、提供された試料を管理するバイオバンクを構築し、生活環境、健康情報、ゲノム情報を統合したデータベースを構築する。本研究では、これらの収集情報の概念化を行い、オントロジーを構築することにより、本事業で収集する情報を横断する意味検索を可能とし、情報の効率的利用を支援する。平成29年度は、平成28年度までの成果を踏まえ、個別化予防の基礎となる概念整理を目標とし、環境因子と遺伝因子の相互作用から発症に至るプロセスおよび因果関係の概念化を行った。ゲノムコホート調査データは、これらのプロセスの観測であると位置づけ、その概念世界はfunctionとdisorderの概念階層と各階層概念の観測手段と観測結果(データ)であるとモデル化しオントロジーを構築した。この構築において、現在世界標準となっているOBO上位オントロジーモデル(axiomベースモデル)では、意味のあるプロセスのインスタンス生成ができないことが分かり、ロール概念を深く考察したフレームベースの表現が必要と判断した。この表現のオントロジーエディタである法造を利用して昨年度までに構築したオントロジーを再構築した。具体的には、発症に関連する機能を定義し、それ機能の正常/異常の程度を測定するための手段を定義し、その手段によって観測されるデータを定義した。このモデルでは、異なる手段で測定されたデータが、発症に関する機能ごとに関連づけて表現される。東北メディカル・メガバンク事業のゲノムコホート調査で収集するデータの全てについて、このモデルで表現できることを示した結果、疾患リスクごとに関係する測定データの種類と関係を明示化することができた。平成29年度までに構築したオントロジーについて論文にまとめて発表する予定であったが、構築にとどまり論文発表に至っていない。東北メディカル・メガバンク事業では、前向きゲノムコホート研究と、バイオバンク開発を行い、生活環境、健康情報、ゲノム情報を統合したデータベースを構築する。本研究では、これらの収集情報の概念化を行い、オントロジーを構築する。平成30年度は、平成29年度までの成果を踏まえ、前向きゲノムコホート研究を構成する概念整理を行い、環境因子と遺伝因子の相互作用から発症に至るプロセスおよび因果関係の概念化を行った。
文化行動の生物学的起源：行動伝播の集団内実験による比較認知科学的検討

本研究では、ヒト以外のさまざまな霊長類種を対象として、彼らの行動がどのように効率的に伝搬しうるかについて、比較認知科学的な手法を用いてさまざまな側面から実験分析した。主に、個体ベースの認知実験と集団ベースの行動実験を実施し、彼らの認知特性を測定した。得られた結論として、生存戦略に直接関与する脅威を理解したり発見する認知能力や、養育行動を維持するための認知能力については、比較的学習が進みやすい認知傾向があることが明らかとなった。そのうえで、母子間であったり社会ネットワークに応じた行動伝播の様式があることが示唆された。本研究の目的は、ニホンザルなどを代表とした社会性の高いとされるヒト以外の霊長類での社会認知能力に焦点を当てて、社会学習能力などの様相を比較認知科学的アプローチにより明らかにすることである。おもに、オペラント条件付けを基本とした比較認知、比較心理課題を中心として、サルに訓練を施し、その学習過程を検討することが基本としている。今年度は、各種社会的な刺激を手掛かりとなる、象徴見本合わせ課題を実施していた。これは、その象徴見本合わせが形成される過程を知ることが基本的分析要素となりながら、次年度以降に続く個体間の学習伝播の検討に関して必要なステップと位置づけた。複数のニホンザルに見本合わせ課題を訓練し、単純な図形刺激に関しては学習が素早く進んだ半面、やはり社会的な要素が手掛かりになる刺激(サルの老齢の区別など)は、見本合わせはなかなか進まなかった。見本合わせの過程では、社会的刺激などの非物理的なラベルをもとに認知判断をすることがむつかしいことは、先行研究でもわかっており、それを支持する結果となった。すなわち、この手続きをベースとする課題では、物理的な手掛かり(色や形など)を複合要素とした訓練が、次年度以降の手掛かりの伝播過程を検討するうえでは重要と推察された。また、それと並行して訓練を要しない社会的な刺激の判断をさせる実験系として、視聴覚選好注視法を実施して、今後の実験に利用できる可能性についても探った。社会学習を考慮しない単純な実験条件で、サルの警戒音声と捕食者に対する自発的なマッチングを検討したが、どうやらそれは確認できるようだった。今後、社会的な経験の有無を検討して、その音声ー視覚刺激が示す表象のマッチングが引き起こされるかどうかなどを検証するような、新たなプロジェクトに対しての見通しを立てることも可能となった。1999年にWhiten教授らにより、チンパンジーの行動の地域差がNature誌に発表されて以来(Cultures in chimpanzees, 1999, Nature)、動物にも文化と呼べる行動の地域差があることは、コンセンサスとなった。一方で、行動が集団内に伝播するメカニズムについては、驚くほど分かっていない。サルは「模倣」できない。そのため、サルの文化的行動は、低次の観察学習の過程(社会的促進・局所的増強)が貢献していることは分かっている。しかし、新規の行動の何が・いつ・どこで・誰から・どのように、伝わるかは依然ブラックボックスのままである。また、近年の研究によれば、動物における観察学習の成否は模倣のような高次な過程を必要とするよりも、情動の伝染などといった従来とは異なった観点での議論が増えている。さらに、個体ベースでの学習過程でも学習がスムーズに進むような社会的刺激の存在や、それを引き出すための運動動作の基盤が存在することが認識されつつあった。本研究では、ヒト以外の霊長類で、観察学習が進むプロセスと、観察学習が引き起こしやすい行動学的な要因について、明らかにすることを目的とした。取り組みの結果、主に4つの成果をまとめた。1)捕食者学習における認知機構、2)養育行動をベースとした母子間の社会学習の基盤となる認知機能、3)音声コミュニケーションにおける発声学習の根幹にある情動情報のやり取りについての実験的知見、4)集団ベースとした系列操作運動の伝播効率に関する研究、である。これらの研究やそれに派生した研究をまとめ、前年度から合わせて合計6編の論文としてまとめ、積極的に成果を発信した。比較認知科学すべてが計画通りではないが、他のサブテーマの発見や進展もあった。論文生産という意味では、ぬかりなく達成できている点からして、順調であると言ってよいと自己評価する。手段を問わず、社会学習にかかわる実験を適宜取り組む。昨年度は、個体ベースの社会刺激判断や、プロトコール確立に時間を費やしたのもあり、今年度は社会学習が分析キーワードとなるような実験を速やかに講じていく。今年度は大規模な社会学習実験のための装置を開発する以前に、個別個体の訓練に時間をかけたため、予算が必要となる計画を26年度に大部分回す決断をした。したがって、予算が次年度に引き継がれた。今年度は計画通り大規模な実験や実験装置を購入していく予定であり、予算は計画通り消化されることとなる。
上皮間葉相互転換システムを利用した細胞極性の形成と消失の可逆的制御機構の解析（国際共同研究強化）

欧米の乳がん罹患率が低下している一方で、日本の乳がん患者数は増加を続けている。乳がんの最大の問題は転移であるため、転移能を司る分子の機能解析は抗がん剤の標的分子を考える上でも重要なポイントである。申請者が所属した米国Vanderbilt大学Lannigan研究室では、乳腺上皮細胞の運動を促進するRSK2を対象とした研究を行なっている。本年度、米国から帰国して行なった研究は以下の2点である。(1) RSK2の機能を解析するため、RSK2のC末にGFPをノックインした乳腺上皮細胞MCF10Aを樹立し、細胞内局在の変化を解析した。RSK2は血清飢餓状態の細胞では細胞質に存在するが、増殖因子刺激によって核に移行することが知られている。そこで、増殖因子刺激後にさらに核外排出の阻害剤を添加したところ、RSK2の核局在がさらに強まることが分かった。このことはRSK2が核移行するとともに、同時並行で、積極的に核から排出されていることを示唆した。引き続き、核外輸送シグナル候補配列に変異を導入した発現ベクターを構築し、増殖因子刺激による細胞内局在への影響を解析している。(2)愛媛大学乳腺センターとの共同研究として、乳がん患者さんの摘出組織から正常部位を頂き、日本人由来のオルガノイド培養系の確立を始めた(倫理委員会審査済み)。まずは正常部位の単離と凍結ストックの作製を行なっている、順調に進んでいる。今後は保存したストックから実際に3次元培養を行い、脂肪の少ない日本人組織に適したプロトコールを確立する予定である。ノックイン細胞の樹立に時間を要したため。RSK2の解析については、レンチウイルスベクターを作製し、免疫染色へと進める。オルガノイド培養については、早急に培養を開始し、酵素処理の時間などを最適化する。内定年度:2015乳がんの研究は、その罹患率の高さから、欧米が圧倒的に進んでいる。しかし、欧米の乳がん罹患率及び死亡率が低下している一方で、日本の患者数は現在も増加し続けている。本研究では、Vanderbilt大学との共同研究によって、ヒト乳腺組織由来のオルガノイド培養技術を習得するとともに、乳がんとの関連が示唆されているリン酸化酵素Ribosomal S6kinase (RSK)を阻害する化合物を解析することで、乳がん治療薬開発への基盤構築を目指す。Vanderbilt大学の共同研究者は、植物由来化合物SL0101が、RSKファミリーに属するリン酸化酵素の活性を特異的に抑制することを見出している。ただし本化合物は細胞浸透性やその阻害活性の強さなど、改良が必要である。現在、米国内の有機化学合成の専門家と共同研究を行い、類似構造を持つ派生化合物の解析を行なっている。申請者は、昆虫細胞培養系によって活性型RSK2を大量精製し、合成した化合物がRSK2の活性をどの程度抑制しうるか、また抑制効果の作用機序の解析を進めている。現在、一部の化合物について、RSK2との結合が遅い、かつ解離が遅い、という特性を持つものを同定し、さらなる解析を進めている。ヒト乳腺細胞の初代培養については、共同研究先から送られてくる凍結組織を解凍し、in vitro培養によって、乳腺オルガノイドを形成させる培養系を習得しつつある。本件については、組織の入手が困難なこともあり、さらなる経験が必要と思われる。リン酸化酵素阻害剤の解析は順調であるが、米国といえども、ヒト乳腺組織の入手が困難であった。これは、組織を採取する乳がん患者の数とタイミングという予測不能の状況に左右されるためであり、やむを得ない。欧米の乳がん罹患率、死亡率が低下している一方で、日本の乳がん患者数は現在も増加し続けている。最大の問題は転移であるため、転移能に直結する乳腺細胞の上皮間葉特性の研究は重要な課題である。Vanderbilt大学の所属研究室は乳腺細胞の上皮間葉特性の制御に関わるリン酸化酵素RSK2の研究を行っており、RSK阻害剤であるSL0101、及びヒト乳腺細胞のオルガノイド培養技術を開発した。本研究では、SL0101に由来する化合物の効果を調べると共に、RSK2を可視化できる細胞の樹立、及びヒト乳腺オルガノイド培養系の習得に取り組んだ。昨年度は昆虫細胞発現系を用いて、恒常活性化型RSK2のタンパク質を精製したが、今年は阻害剤が野生型RSK2にも効果をもつことを確認するため、野生型RSK2、RSK1、RSK4の精製を行った。合わせて、阻害剤が効果をもたらすドメインを決定するため、N末、C末、RSK1RSK2キメラタンパク質も作製した。これらを用いた研究から、SL0101派生化合物はRSK2, RSK1の両方に対して、ゆっくりと結合すること、その責任領域はN末キナーゼドメインであることを明らかにした。また解離が遅い化合物を同定することができた。並行して、遺伝子組み換え技術であるCRISPR-Cas9システムを習得した。RSK2の末にGFP遺伝子を組み込んだ乳がん細胞株MCF7を樹立した。現在、この細胞を用いてRSK2と相互作用するタンパク質の同定を試みており、RSK2が関与する上皮間葉細胞特性を制御する分子ネットワークの解析へと進めている。2018年2月に帰国し、愛媛大学乳腺センターとの共同研究を本格的に開始、現在は日本人由来の乳腺オルガノイド培養系の構築を進めつつある。上皮間葉特性を制御するRSK2ネットワークを明らかにするため、質量分析によるRSK2結合因子の探索を行った。

しかし、キナーゼと結合因子の結合が一過的、あるいは弱いため、未だ有力な結合因子の同定に至っていない。現在、単純な免疫沈降からRSK2と近距離にあるタンパク質をラベルできる手法に切り替え、結合因子やリン酸化基質などの同定を試みている。欧米の乳がん罹患率が低下している一方で、日本の乳がん患者数は増加を続けている。乳がんの最大の問題は転移であるため、転移能を司る分子の機能解析は抗がん剤の標的分子を考える上でも重要なポイントである。申請者が所属した米国Vanderbilt大学Lannigan研究室では、乳腺上皮細胞の運動を促進するRSK2を対象とした研究を行なっている。本年度、米国から帰国して行なった研究は以下の2点である。(1) RSK2の機能を解析するため、RSK2のC末にGFPをノックインした乳腺上皮細胞MCF10Aを樹立し、細胞内局在の変化を解析した。RSK2は血清飢餓状態の細胞では細胞質に存在するが、増殖因子刺激によって核に移行することが知られている。そこで、増殖因子刺激後にさらに核外排出の阻害剤を添加したところ、RSK2の核局在がさらに強まることが分かった。このことはRSK2が核移行するとともに、同時並行で、積極的に核から排出されていることを示唆した。引き続き、核外輸送シグナル候補配列に変異を導入した発現ベクターを構築し、増殖因子刺激による細胞内局在への影響を解析している。(2)愛媛大学乳腺センターとの共同研究として、乳がん患者さんの摘出組織から正常部位を頂き、日本人由来のオルガノイド培養系の確立を始めた(倫理委員会審査済み)。まずは正常部位の単離と凍結ストックの作製を行なっている、順調に進んでいる。今後は保存したストックから実際に3次元培養を行い、脂肪の少ない日本人組織に適したプロトコールを確立する予定である。ノックイン細胞の樹立に時間を要したため。リン酸化酵素阻害剤については、米国内の共同研究先から類似化合物の提供を受け、さらなる解析を進める。ヒト乳腺組織の初代培養については、組織採取の機会があるたびに調製に関わる予定である。RSK2阻害剤については論文発表に向けてデータ整理を進めている。RSK結合因子の同定はBirA, APEX2という比較的新しい技術を取り入れ、条件検討を行っている。愛媛大学乳腺外科とは本格的な共同研究を始め、日本での乳腺オルガノイドの培養系の構築を進めつつある。RSK2の解析については、レンチウイルスベクターを作製し、免疫染色へと進める。オルガノイド培養については、早急に培養を開始し、酵素処理の時間などを最適化する。
bZip型転写抑制因子ATF3の細胞増殖と細胞死デコードシステムの解析

ATF3は、ATF/CREBファミリーに属するbZip型転写因子でありp53、c-Mycの下流で誘導されるストレス応答遺伝子であることを報告している。本研究年度においては、細胞増殖、細胞死などの運命決定に関わるATF3の機能について以下の点を明らかにした。1)これまで知られているATF3のプロモーターのおよそ40 kb上流に新たなプロモーターを見出し、このAlternate promoterはヒト、マウス間で保存されていること(転写開始点などDDBJにデータdeposit)、2)上流のプロモーターがストレス刺激応答性を持っており機能していること、3)ATF3の発現が高いヒト前立腺がん細胞、ホジキン病細胞では、新規上流プロモーターからの転写が選択的に活性化されていること、4)これらの細胞では、上流プロモーター近傍のH3K4トリメチル化、アセチル化のクロマチン構造の固定化を伴っており、さらに、5)RNA polymerase IIの高い結合を認め、伸長型Pol II結合因子PAF1の結合も転写鎖に広範囲に結合していた。6)一方、発がん遺伝子HRASによる細胞老化やTGFβによる細胞抑制においては、これらRas、TGFβシグナルの下流でP2からの転写が優位に活性化されていた。以上のことから、ATF3は、新規上位プロモーターを有しており、特にがん細胞の増殖に関わると報告されているATF3の発現は、上位プロモーターからの転写活性化が選択的に固定していることが明らかになった。7)一方、ATF3の生物機能をより詳細に解析する目的でatf3 floxedマウスを作成し、デザイン通りCreにより遺伝子組み換えが起こることを確認した。転写因子ATF3は、細胞増殖と細胞死に関わっておりそのdualな細胞運命の決定機構は、遺伝情報の発現制御と生物機能のデコードシステムの点で興味深い。本研究期間において、次の点を明らかにした。1)強いストレス刺激に反応して誘導されるスプライシングバリアントZip2が、NF-kB, p65(Re1A)と直接結合すること、2)その結合は、co-regulator bindingmotifにホモロジーを持つC-末の19アミノ酸配列ガ関与すること、3)p65結合の結果、コアクチベーターCBP/p300との結合を弦弱すること、4)Zip2はNF-kB依存性転写を抑制し抗アポトーシス遺伝子を阻害すること、を見出した。この結果は、ATF3の細胞抑制機能がそのスプライシングによっても制御されていることを始めて見出したものである。抗がん剤はじめDNA傷害時にもZip2が誘導されることから、in vivoにおいてもZip2がATF3による細胞死に深く関わっている可能性がある。一方、PI3キナーゼ阻害剤は、細胞増殖や細胞生存を阻害することにより、抗がん剤として期待されている。そのひとつLY294002の大腸がん細胞死のマイクロアレイ発現解析により、本阻害剤が、ATF3を誘導することを見出した。その作用機序を解析したところ、1)LY294002は、本来のPI3 kinase阻害剤としての機能と非依存性にEgr1を誘導し、それがATF3プロモーターを活性化することを明らかにした。以上の結果は、ATF3の遺伝情報発現の一部を明らかにしたものである。さらに、DNA傷害剤によるATF3の標的遺伝子をChIP-chip解析により網羅的に解析しており、興味深い候補遺伝子を得ておりその詳細な解析を進めている、また、ATF3の生物機能をさらに解析するために組織特異的ATF3ノックアウトマウスを作成しており、本研究期間で順調に進んでいる。
種々の分子間力を用いる自己集合単分子膜の構造制御

1.LB法で作製したグラシーカーボン電極上の長鎖アルキルシトシン誘導体のレセプター単分子膜は,グアノシンーリン酸(GMP^<2->)と多点水素結合により相補的塩基対を形成する.その際,GMP^<2->により膜の表面電荷が変わるので,溶液中に加えられたマーカー陰イオン[Fe(CN)_6]^<3-/4->の膜透過性が減少する.この単分子膜はGMP^<2->を選択的に認識識別できた.2.トリカルボン酸トリチオアミドを合成した.この分子の自己集合膜形成後の脱プロトン化によって得られるトリカルボキシレートレセプターがゲスト分子を認識することをマーカー陰イオン[Fe(CN)_6]^<3-/4->の膜透過性の変化から電気化学的に確認した.この際,1,4,7,10,13,16-hexaazacyclooctadecaneに対して10^<-7>Mの濃度から応答するが,単純なalkylamineに対しては10^<-2>Mまでほとんど応答しないことが確認された.3.分子内内孔を持ち剛直な骨格を有するβ-,γ-cyclodextrinチオール誘導体を合成し,これらの分子の自己集合膜を吊下げ水銀滴電極表面上に形成させ,分子内内孔における物質の透過を,内孔に選択的に結合するゲスト分子により制御可能なことを確認した.4.化学修飾探針に基づくSTMを用いてHOPG基板上のoctadecanol単分子膜の観測を,未修飾のSTM探針ではoctadecanolの水酸基とアルキル基部位は区別できないが,水素結合部位を持つp-mercaptopyridineの自己集合膜で化学修飾した探針では,octadecanol水酸基に相当する部分が明るく観測された.5.チオエーテル基を持つシラン化合物に基づく自己集合膜をAFMおよび基板に化学修飾し,この官能基と強く相互作用する銀イオンを含む水溶液中でのAFM探針と基板間の吸着力を測定した.その結果,銀イオンの濃度の増加に伴う吸着力の増加が観測された.1.LB法で作製したグラシーカーボン電極上の長鎖アルキルシトシン誘導体のレセプター単分子膜は,グアノシンーリン酸(GMP^<2->)と多点水素結合により相補的塩基対を形成する.その際,GMP^<2->により膜の表面電荷が変わるので,溶液中に加えられたマーカー陰イオン[Fe(CN)_6]^<3-/4->の膜透過性が減少する.この単分子膜はGMP^<2->を選択的に認識識別できた.2.トリカルボン酸トリチオアミドを合成した.この分子の自己集合膜形成後の脱プロトン化によって得られるトリカルボキシレートレセプターがゲスト分子を認識することをマーカー陰イオン[Fe(CN)_6]^<3-/4->の膜透過性の変化から電気化学的に確認した.この際,1,4,7,10,13,16-hexaazacyclooctadecaneに対して10^<-7>Mの濃度から応答するが,単純なalkylamineに対しては10^<-2>Mまでほとんど応答しないことが確認された.3.分子内内孔を持ち剛直な骨格を有するβ-,γ-cyclodextrinチオール誘導体を合成し,これらの分子の自己集合膜を吊下げ水銀滴電極表面上に形成させ,分子内内孔における物質の透過を,内孔に選択的に結合するゲスト分子により制御可能なことを確認した.4.化学修飾探針に基づくSTMを用いてHOPG基板上のoctadecanol単分子膜の観測を,未修飾のSTM探針ではoctadecanolの水酸基とアルキル基部位は区別できないが,水素結合部位を持つp-mercaptopyridineの自己集合膜で化学修飾した探針では,octadecanol水酸基に相当する部分が明るく観測された.5.チオエーテル基を持つシラン化合物に基づく自己集合膜をAFMおよび基板に化学修飾し,この官能基と強く相互作用する銀イオンを含む水溶液中でのAFM探針と基板間の吸着力を測定した.その結果,銀イオンの濃度の増加に伴う吸着力の増加が観測された.
探索計画の生成にもとづく医用X線画像の領域分割

本研究は、複雑な構造をもつが画質が比較的良好な胃X線二重造影像と、逆に構造は比較的単純であるが画質が劣る顎関節X線画像を対象として、画像認識・理解のための領域分割の方法を開発した。その場合、「大局から詳細へ」の探索方式をとることとし、まず探索計画を生成し、それにもとづいて詳細化を図る方法を中心にして検討した。そして、個々の領域の特性に合わせた問題解決の中から具体的に領域分割の方法を開発した。胃X線二重造影像の領域分割については、まず胃領域について、特徴要素を抽出した案内画像を参照する線追跡にもとづく方法、および、動的輪郭モデルとダイナミックプログラミングを用いた最適化にもとづく方法を開発し、いずれも良好な認識性能を得ることができた。また、バリウム溜り領域について、零交差を用いた縁検出にもとづく方法(この場合、探索計画は用いない)、および、濃淡の凹点の群化と領域成長にもとづく方法を開発し、いずれも良好な認識性能を得ることができた。さらに、脊柱領域について、バリウム溜り領域の認識結果を用いて、そこからの妨害情報を排除することにより、ハフ変換による粗抽出にもとづいて良好な認識性能を得ることができた。そして、これらの個別の臓器領域の認識方式を統合した画像理解システムとしての一応の完成を見た。つぎに、顎関節X線画像の領域分割については、例えば「モデルにもとづく強引な縁強調」などといったように、前処理から縁強調、ダイナミックプログラミングを用いた目的関数最適化へと進む処理過程の初期段階からモデルを活用することにより、関心領域について良好なトレースを得ることができることを示した。さらに、関心領域の計量についても指針を与えることができた。本年度は研究の大枠を構築することをめざし,複数の対象領域の自動識別方式の開発と改善を試みた.1.胃X線二重造影像の領域分割(1)胃領域の識別-方法1-:胃輪郭線候補領域の粗抽出の後,木探索によって詳細化(補完および精度の向上)を図る方式を開発し,改善することができた.18症例中15例について十分な識別ができた.(2)胃領域の識別-方法2-:複数の動的輪郭スネ-クを用いることによる自動的な胃領域画像の後,ダイナミックプログラミングによって詳細化を図る方式を開発することができた.18症例中17例についてほぼ十分な識別ができた.(3)脊柱領域の識別:ハフ変換を用いた粗抽出の後,ダイナミックプログラミングによって詳細化を図る方式を開発した.18例中9例についてはほぼ十分な識別ができた.(4)バリウム溜り領域の識別:零交差による候補領域の抽出の方式を開発した.18症例中12例について十分な識別ができた.(5)画像理解システムの構築:個別の方式開発に加えて、画像理解システムの構築を開始した.2.顎関節X線画像の領域分割下顎窩,下顎頭,錐体鼓室裂,干渉像といった要素領域の抽出方式を検討し,個別の形状特徴を目的関数に反映して最適化を行う方式を開発することができた.各要素領域についての識別率はそれぞれ20/24,17/21,10/14,23/24であった.さらに,関心領域の抽出と特徴の計量についても実験した.前年度までに研究の大枠を構築したのに引き続き,本年度は,胃X線二重造影像の領域分割について,個々の対象領域の自動識別方式の改善,および,システムの構築を試みた.(1)胃領域の識別-方法1-:胃輪郭線候補領域の粗抽出の後,木探索によって詳細化(補完および精度の向上)を図る方式について,プログラムをさらに改善した.それによって,18症例中15例について十分な識別ができ,その他の3例についても良好な結果を得た.

(2)胃領域の識別-方法2-:複数の動的輪郭スネ-クを用いた自動的な胃領域画定の後,ダイナミックプログラミングによって詳細化を図る方式について,プログラムをさらに改善した.それによって,18症例中16例についてほぼ十分な識別ができ,その他の2例についても良好な結果を得た.(3)脊柱領域の識別:ハフ変換を用いた粗抽出の後,ダイナミックプログラミングによって詳細化を図る方式について,バリウム溜り領域の識別結果を見て,偽直線要素を抑圧する方法を導入した.さらに,候補点抽出方式を変更した結果,18例中10例についてはほぼ十分な識別ができ,その他の6例についても良好な結果を得た.(4)バリウム溜り領域の識別:群化と領域成長による候補領域の抽出の方式を開発した.この方式では18症例中10例について十分な識別ができ,他の6例についてもほぼ良好な識別ができた.前年度に開発した零交差法に較べ,質的な違いが明らかになった.(5)画像理解システムの構築:個別の方式開発に加えて,画像理解システムを構築して,認識性能と処理時間を評価した,総合的に見て,18例中12例についてはきわめて良好な認識ができた.本年度は本研究課題の最終年度であるため、研究のとりまとめを主目標として作業を行った。とくに、システムの構築、チューニング、改善の作業を継続し、完成度の向上を図った。胃X線二重造影像の領域分割については、胃、バリウム溜り、脊柱といった個別の臓器領域の認織方式を統合した画像理解システムとしての一応の完成を見た。胃領域については線追跡にもとづく方法と動的輪郭モデルにもとづく方法を開発し、いずれも良好な認識性能を得ることができた。バリウム溜り領域については零交差による縁検出にもとづく方法と凹点の群化と領域成長にもとづく方法を開発し、いずれも良好な認識性能を得ることができた。脊柱領域についてはバリウム溜り領域の認識結果を用いて、そこからの妨害情報を排除することにより、画像上部の水平走査線上の濃淡プロファイルから脊柱の両側を検出し、それらのハフ変換によって辺縁を直線として粗抽出した。これによって良好な認識性能を得た。また、これまでに積み残した問題として、差分マスクによる縁強調にもとづく方法についても再検討し、バリウム溜り領域の認識結果を用い、また、マスクサイズを見直すなどの詳細な実験と改善を行った。しかし、これによって性能の向上は認められたものの、十分な認識性能を達成することはできないことが分かった。また、顎関節X線画像の領域分割については、画質が劣るにもかかわらず、前処理、モデルにもとづく縁強調と目的関数最適化によって関心領域のトレースを得ることができるようになった。さらに、関心領域の計量についても指針を与えることができた。最後に研究成果報告書のとりまとめを行い、方法を詳細に述べるとともに、処理の結果を認識の失敗例も含めてすべて示した。
変形性膝関節症の関節軟骨におけるmiRNA-146の発現

炎症反応に関連があるmicroRNA(miR)-146の変形性関節症(OA)軟骨における発現を解析した。OA軟骨の変性程度とmiR-146の発現の関連を検討したところ、変性の低い軟骨では発現が高く、変性が進行すると発現が低下していた。またmiR-146は軟骨組織表層に強く発現していた。また、正常軟骨細胞において、炎症性サイトカインによりmiR-146の発現は誘導された。miR-146は、OAにおける初期の軟骨変性に関与している可能性があることが示唆された。目的近年、ゲノム遺伝子の転写後発現調節に蛋白質をコードしないRNAが関与することが新たに示され、ヒトの様々な疾患に関与していることがわかってきた。本研究の目的は、炎症性サイトカインにより発現が誘導されるmicroRNA(miR)-146の変形性関節症(OA)軟骨における発現を解析することである。結果miR-146aの発現はMankin scoreの発現の低い軟骨で、高値を示した。Col2a1の発現も高値である軟骨では、miR-146aの発現も高く、MMP13の発現の高い軟骨では、miR-146aの発現は低い傾向にあった。またmiR-146は軟骨組織表層に強く発現しており、変性の軽度な部位で発現していた。IL-1βで刺激した軟骨細胞ではmiRNA-146の発現量は有意に増加した。考察本研究結果から、miR-146は、IL-1βによりその発現が誘導され、変性の進行している初期のOA軟骨で強く発現していることが示された。目的近年、ゲノム遺伝子の転写後発現調節にマイクロRNAが関与することが新たに示され、ヒトの様々な疾患に関与していることがわかってきた。我々の研究結果から、miR-146は、IL-1βによりその発現が誘導され、変性の進行している初期の変形性関節症(OA)軟骨で強く発現していることが示され、miR-146は、OAにおける初期の軟骨変性に関与している可能性があることが示唆された。miR-146は、炎症反応の抑制するといわれており、OA軟骨にmiR-146を過剰発現することで、軟骨変性の進行を抑制できるか検討した。方法8週齢のマウスの膝関節における内側側副靭帯、内側半月板、前十字靭帯靭帯を切離し、OAモデルマウスを作製した。靭帯を切離し、2週間後に合成2本鎖miRNA-146(10μg)をアテロコラーゲン10μ1に溶解し、関節注射した。対照群として、非機能性の合成2本鎖siRNAを同量関節注射した。2週間後、膝関節を摘出し治療効果を検討した。結果OAモデルマウスに合成2本鎖miRNA-146を関節注射したが、明らかにOA進行が抑制されることはなく、対照群と同程度のOA変化を認めた。考察本研究結果から、合成2本鎖miRNA-146の関節注射では明らかな効果を認めなかったが、投与量、回数など、さらなる投与方法の検討等を行っていく必要があると思われた。
現代イスラーム圏におけるユマニスムの再構築

本研究課題は、アラブ=ベルベル世界を中心に、現代イスラーム圏における知的営為、とりわけその思想と文学を「ユマニスム」(人文主義)の観点から再検討することによって、宗教学や国際政治学のグランドセオリーに埋没しがちな「人間という尺度」を取り戻し、「社会からの疎外」や「人道危機」の現場でサバルタン化された「民衆」を一個の人間として主体性を回復させながら議論するための研究領域を構築する。とりわけ「個としての人間」について語ることに優れた文学の強みを活かしながら、学際的研究の基盤としてユマニスム概念を再構築し、国際政治上の重要アクターになることのできない市井の人々の当事者性を前景化させる契機としたい。
マルチスケール化を実現するハイブリッド電気化学バイオイメージングシステム

前年度までに、複数の対象物を同時に計測できる「電気化学カラーイメージング法」を開発した。この手法では多数の電極が配置されたチップデバイスを用いており、個別の電圧制御とデータ解析により達成されている。これにより、本課題で挙げたマルチスケール化を実現する電気化学バイオイメージングシステムが達成されている。本年度は、開発した測定法を用いてハイドロゲル内の胚性幹細胞の呼吸活性と分化活性の同時の電気化学イメージングを達成した(Analytical Sciences, 35(1), (2019), 39-43)。また、電極修飾に基づくマルチスケール化も達成した。具体的には酸化還元ポリマーを特定の電極に修飾することで、ドーパミンとグルタミン酸の同時の電気化学イメージングを達成した(Electroanalysis, 30, (2018), 2841-2846)。本成果は学術雑誌のカバーに選ばれた。また、プローブデバイスと電極アレイデバイスを組み合わせた測定により、細胞塊(スフェロイド)の呼吸活性(チップデバイス)と形状評価(プローブ電極)を達成した(未報告)。特に3次元的な細胞塊の表面の形状評価はほとんど報告例がないため、該当分野の金字塔である。これらの研究から派生した研究として、電極アレイデバイスを用いた3次元的なハイドロゲル作製を実現した(Biofabrication, 2019, 10.1088/1758-5090/ab166e)。本研究課題はバイオ計測を目指していたが、バイオファブリケーションへの応用展開が可能であり、3次元培養組織構築といった組織工学や再生医療の分野への貢献が期待できる。このように、本研究ではマルチスケール化を実現するハイブリッド電気化学バイオイメージングシステムの開発に成功した。さらに発展させ、イメージングデバイスとしてだけでなくバイオファブリケーションへの展開も示しており、今後の展開に期待ができる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、電気化学イメージングのマルチスケール化という新しい概念に基づく計測システムを開発した。本研究で提案するマルチスケール化とは、シグナルと空間分解能に関する複数のスケールを電気化学イメージに組み込むことである。該当年度では、同時に複数の物質を計測できる電気化学デバイスを開発して、シグナルのマルチスケール化に関する研究を実施した。これは、従来の1種類の物質を電気化学イメージングするのとは異なり、多くの情報を取得できる優れた電気化学イメージングであり、細胞機能計測を含めた様々なバイオ計測への応用が可能である。本研究ではまずデバイスの機能評価を実施した。この結果、開発したデバイス・システムがリアルタイム計測への応用が可能であることを示した(Angew. Chem. Int. Ed., 56, 6818, 2017)。この研究では、微生物の動体観察を電気化学的に計測しており、水質検査などへの応用が可能である。また、測定プログラムの改良やデータ集録ボードの組み換えを行い、1フレームが1 ms以下で取得できる高速化した計測システムを完成させた。高速化での電気計測に関する特性評価は未実施であるため、2018年度に評価する予定である。また、胚性幹細胞の呼吸活性と分化活性の同時の電気化学イメージングに関する論文を報告した(Anal. Chem., 89, 12778, 2017)。さらに神経様細胞の呼吸活性とドーパミン放出計測の同時計測も達成した。この計測法により、これらの細胞機能の相関性を観察することや、細胞の品質評価が可能である。これらの細胞以外にも、間葉系幹細胞の計測にも成功しており(Electrochim. Acta, 268, 554, 2018)、計測システムの汎用性を示した。センサの局所修飾法の開発に成功しており(Chem. Lett., 47, 204, 2018)、さらに汎用性が高い計測が期待できる。該当年度に13報の学術論文を報告した。したがって、学術的な点において大きく研究が進んだと言える。申請書に記載したシグナルのマルチスケール化に関するシステム・デバイス開発が順調に進んでおり、ほぼ完了した。また、開発したシステムを用いて、単純な酵素活性の計測に成功した。さらに、酵素よりも複雑な細胞機能の計測にも成功した。このことからも、本研究が順調に進んでいると言える。

特に3次元的な細胞塊の表面の形状評価はほとんど報告例がないため、該当分野の金字塔である。これらの研究から派生した研究として、電極アレイデバイスを用いた3次元的なハイドロゲル作製を実現した(Biofabrication, 2019, 10.1088/1758-5090/ab166e)。本研究課題はバイオ計測を目指していたが、バイオファブリケーションへの応用展開が可能であり、3次元培養組織構築といった組織工学や再生医療の分野への貢献が期待できる。このように、本研究ではマルチスケール化を実現するハイブリッド電気化学バイオイメージングシステムの開発に成功した。さらに発展させ、イメージングデバイスとしてだけでなくバイオファブリケーションへの展開も示しており、今後の展開に期待ができる。初年度で、複数の対象物を同時に計測できる「電気化学カラーイメージング法」を開発した。この手法ではComplementary metal-oxide-semiconductor(CMOS)技術を用いて作製したチップデバイスを用いている。このデバイスには多数の電気化学センサが配置されており、個別の電圧制御とデータ取得が可能である。これにより、本課題で挙げたマルチスケール化が実現している。該当年度と繰越年度では、引き続きマルチカラー化した電気化学イメージング法の開発とその応用を実施した。さらに多くの種類の化学物質を計測できるシステムとして、差分電気化学カラーイメージング法(differential electrochemicolor imaging)を開発した(Sensors and Materials, 31(1), (2019), 13-22)。この手法では、印加電圧が異なる2種類の電気化学イメージの差分を計算することで、埋もれていた情報を可視化できる手法である。これにより、上述した目的な達成しており幅広い応用が可能になった。この報告は学術雑誌のカバーに選ばれた。また、CMOSデバイスを用いてハイドロゲルの局所電解析出を実現し、これにより酵素電極アレイを作製した(Sensors and Actuators B: Chemical, 277, (2018), 95-101.)。この電極アレイを用いることで、酵素を介して複数の化学物質(グルコースと過酸化水素)の同時の電気化学イメージング(マルチスケール化)を達成しており、今後の細胞解析への応用が期待できる。また副次的な成果として、デザインした3次元ハイドロゲル作製を可能にしており、生体様組織培養への展開が期待できる。これ以外にも、プローブ電極を用いた電気化学イメージングによる材料表面特性評価を報告しており(Surface and Interface Analysis, 51, (2019), 27-30)、開発したシステムのエネルギー材料開発への貢献が期待できる。該当年度に10報以上の学術論文を報告した。したがって、学術的な点において大きく研究が進んだと言える。また本研究課題を含む分野のreviewを報告しており、これは学術雑誌のcover featureを飾った。
新規核蛋白H2RSPの機能解析と消化管粘膜上皮の再生修復における役割

Hepatocyte growthfactor activator inhibitor (HAI)type 2-Related Small Peptide (H2RSP)は、肝細胞増殖因子(HGF)の特異的活性化因子HGF activator (HGFA)の調節因子であるHAI-2のSplicing variantを検索する過程で我々が発見したアミノ酸106個からなる新規ペプチドで、EGFP癒合蛋白によるin vitroの解析で核移行シグナルを持っている。本研究では、正常および炎症、腫瘍性消化管組織でのH2RSP遺伝子の発現を、免疫組織学的、およびIn situ hybridization法によって検討した。正常消化管上皮細胞ではH2RSP蛋白はCryptでは主に細胞質に染色されるのに対し、Foveolarでは核のみに染色された。炎症性腸疾患である潰瘍性大腸炎や胃潰瘍の症例では、潰瘍辺縁の再生粘膜で、まさに上皮細胞が増殖、遊走している部位でH2RSP蛋白は核ではなく細胞質に留まったまま高発現していた。大腸癌組織ではこのような部位による局在の変化は認められず細胞質に不規則な発現をしていた。In situ hybridization法においては、H2RSP mRNAは正常消化管上皮では部位に関係なく一定の発現をしていたが、再生組織では正常粘膜にくらべて明らかに高発現しており、癌組織では不規則に局在していた。また、マウスH2RSP遺伝子をクローニングし、マウス大腸炎モデルを用いて、炎症の前後での消化管粘膜でのH2RSP遺伝子の発現をMicrodissection法を用いて検討し、上記と同様の所見が得られた。In vitroの解析では、H2RSP遺伝子をCHO細胞に強制発現させると増殖能が優位に低下し、H2RSPが細胞質から核内へ移動していることが確認できた。また、リコンビナントH2RSPには既知の蛋白ではなく、1本鎖RNA (poly G)がbindすることが明らかとなった。以上のことから、H2RSPは消化管上皮細胞の増殖分化に関連するシグナルの一部を担っており、核内へ移行することによって細胞の増殖能をストップさせることが推測された。したがって再生中の組織や癌組織ではH2RSPの発現やその核移行が阻害され、増殖能を維持していることが考えられた。Hepatocyte growthfactor activator inhibitor (HAI)type 2-Related Small Peptide (H2RSP)は、肝細胞増殖因子(HGF)の特異的活性化因子HGF activator (HGFA)の調節因子であるHAI-2のSplicing variantを検索する過程で我々が発見したアミノ酸106個からなる新規ペプチドで、EGFP癒合蛋白によるin vitroの解析で核移行シグナルを持っていることをこれまで報告してきた。今年度はまず、このH2RSP遺伝子の消化管上皮細胞における発現を免疫組織学的、およびIn situ hybridization法によって検討した。ヒトH2RSP全長とGSTとの癒合蛋白を作製し、アフィニティーカラムによってリコンビナントH2RSPを精製、ウサギに免疫して抗ヒトH2RSPポリクローナル抗体を作製した。消化管上皮細胞ではH2RSP蛋白はCryptでは主に細胞質に染色されるのに対し、Foveolarでは核のみに染色された。炎症性腸疾患である潰瘍性大腸炎や胃潰瘍の症例では、潰瘍辺縁の再生粘膜で、まさに上皮細胞が増殖、遊走している部位ではH2RSP蛋白は核ではなく細胞質に留まったまま高発現していた。大腸癌組織ではこのような部位による局在の変化は認められず不規則な発現をしており、また症例によって発現量の差が認められた。