hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
微粒子ピーニングの適用によるアルミニウム基材・硬質めっき界面密着性の向上

本研究の目的は,アルミニウム基材へ密着性良好なめっきを被覆するための簡便な前処理を,微粒子ピーニング(FPP)により実現することである.具体的には,銅めっきを施した炭素鋼粒子(複合粒子)を用いてFPPを施し,アルミニウム基材表面へ各種めっきの下地層として優れた性質を示す銅を移着させる.平成25年度までの成果によれば,FPP処理基材へめっきを施した場合,めっきのはく離は移着層内部で生じていた.研究最終年度に当たる平成26年度は,この点を詳しく検討した.移着層内部で鉄が酸化状態となっている点に着目し,より酸化を生じにくい工具鋼に銅めっきを施した複合粒子を新たに作製した.しかしながら,この粒子を用いてFPPを施したアルミニウム基材に施しためっきは,容易にはく離し,銅とともに移着した工具鋼がめっきの密着を妨げているものと推察された.結果的には密着性の改善には至らなかったが,複合粒子を作製する際の原料粒子の種類を適切に選定することの重要性が見出された.また,めっき密着性の定量化のために,めっきを施した部材を曲げ変形させた際に,めっきのはく離に伴う曲げ負荷の除荷を検出するシステムを試作したが,この評価法は引き続き改良の必要性が認められた.本研究期間(平成2426年)全体の成果は以下の通りである.1FPPによって銅を効果的に移着させるための複合粒子を開発し,その移着挙動について明らかにした.アルミニウム基材自体の化学組成を局所的に改質する表面処理技術として,一定の成果が得られた.2FPPにより銅を移着させたアルミニウム基材へのめっきでは,当初目標としたジンケート処理(アルミニウム基材へめっきをする際の従来前処理法)並みの密着性を実現するには至らなかったが,めっき被膜と親和性の高い成分をFPPによって移着させることで密着性の改善を図るという考え方の妥当性を,確かめることができた.材料加工学当初計画から方法の見直しは若干あったものの,前処理としてFPPを施したアルミニウム基材へ被覆しためっきの密着性評価を行う段階まで到達できた.この点においては計画と研究進捗との間に齟齬は無いと言える.しかしながら,現時点で得られている結果は,前述したように,提案する手法(銅を移着させることにより密着性向上を図る)ではめっき被膜の密着性が十分に得られていないとも判断できるものである.「今後の研究の推進方策」欄で後述するが,この点についてはまだ改善・検討の余地はあると考えており,本年度の結果を踏まえての継続研究が必要な状況である.当初計画では,このようなフィードバックの段階まで,H25年度中に実施できることを見込んでいたが,H24年度報告でも指摘した複合粒子作製を外注から内製に切り替えたこと,および密着性評価用装置の作製に予定よりも時間を要したことに起因して,計画に若干の遅れを生じていると自己評価する次第である.なお,このような事情も踏まえ,平成25年度末に補助事業期間の延長を申請し,認められた次第である.平成24年度には,微粒子ピーニング(FPP)によって生じる移着現象についての基礎的検討およびFPP条件がCu移着に及ぼす影響を解明することが目標であった.この目標に見合う成果が得られていると判断しており,研究の進捗は概ね順調であるといえる.ただし,研究計画のなかで想定していた実験のうち,基材硬さおよび粒子硬さが移着挙動に及ぼす影響について調べる実験に関しては,前者に重点を置いて取り組む結果となった.これは,研究計画立案の時点では,研究の効率的な推進を狙いとして銅/鋼複合粒子の作製を業者に外注することを予定していたが,本研究で用いるのに適当な粒子を作製するのは困難との旨が研究着手後になって当該業者から回答されたことによる.粒子の作製を外注できなかった分,独自に粒子を作製するために少なからぬ研究時間を費やさざるを得なかったことから,実用的観点も踏まえて優先順位をつけ,当初の研究計画のうち一部を割愛せざるを得なかった点が残念である.
Lactobacillus caseiのプラスミド複製阻害因子の研究

Lactobacillus casei菌体を塩類溶液(30mM Tris,pH8.6)で処理して得られる抽出液中にはプラスミドRP4の複製を阻害する因子が含まれている。この抽出液をpH4.8の条件でゲル濾過すると分子量500以下の低分子画分に阻害活性が見られる。この画分(Lu)は非常に不安定であり凍結保存中にも急速に失活する。Luは主要成分として核酸塩基を有する。その主要な塩基はウラシルであった。ウラシルそのものには阻害活性が無いことから、Luの有していた阻害活性はこの画分中の他の微量成分によると考えられる。一方上記の抽出液をpH7.0でゲル濾過すると分子量約1000の画分に阻害活性が見られた。Luが不安定なのに対し、この画分(Ls)の阻害活性は安定であった。LSには核酸塩基が含まれていないことから、上記LUとの間に関連性は無いものと考えられる。さらにこのLSをイオン交換クロマトグラフィーで精製を進め、その成分分析を行なった。その結果ペプチド、あるいはアミノ酸を主要成分として有していないことが明らかとなった。LSによるプラスミドの複製阻害の見られるプラスミドとしてRP4プラスミド以外にEntプラスミドがあった。従って大型でコピー数の少ないプラスミドがこの因子により複製阻害を受けるものに考えられる。一方複製様式の異なる小型でコピー数の多いpBR322プラスミドは阻害を受けなかった。複製阻害活性を調べる方法としてβ-ラクタマーゼ活性を指標にしたが、一般に受け入れられている概念であるところのコピー数と酵素活性との相関性というものは必ずしも認められない。このことをリンコマイシン添加の実験で明らかにした。さらに【^(32)P】-リン酸の方が【^3H】-チミジンよりもコピー数測定に適していることを明らかにした。
人びとの健康志向に関わる不確実性社会の横断的・経時的影響の解明

健康志向には不安感など主観的心理社会評価が関連する。しかし、経時的に変動する社会構造による健康志向への影響が不明である。現代社会は、所得格差や社会保障制度の不安定化などを特徴とする不確実性社会という社会構造と言える。本研究は、健康志向に関わる不確実性社会という社会構造の横断的・経時的影響を解明することを目的とする。まず経時的な不確実性社会指標データセットを作成する。つぎに、宮城県民対象の社会調査を実施する。申請者が2011年に実施した宮城県民社会調査データと結合し、2時点データセットを作成する。最後に、不確実性社会指標と2時点データセットを統合したデータセットを横断的・経時的に解析する。
歯周病細菌の病原性株に特異的な遺伝子群の解析

歯周病細菌の1つとして注目されているPorpbyromonas gingivalis(Pg)の菌株間における病原性は多様であり、病原性の強い株と弱い株が存在することは知られているが、これらめ病原性の違いを規定する遺伝子群は決定されていない。本研究では同細菌の菌株特異的な遺伝子領域とそれらの病原性の違いについて解析し、それらの遺伝子領域と病原性およびバイオフィルム形成能との関係を調べた。PgW83株に特異的な遺伝子領域をATCC33277株とsubtractive hybridization法を用いて比較することにより同定した。同法によって得られたW83株に特異的な遺伝子を薬剤耐性遺伝子で挿入失活した変異株を作製した。さらに変異株と親株について、ポリ塩化ビニルプレート上におけるバイオフィルム形成能の違いについて解析した。Subtractive hybridization法を用いて575個のコロニーが得られ、そのうち32個のPgW83株に特異的なDNA断片が得られた。そのうち3種類において変異株を作製した。変異株のうち、ヒスチジンキナーゼに関与する遺伝子のパイオフィルムの形成量が他の菌に比べて少ないことが明らかになった。さらにヒスチジンキナーゼ関連遺伝子を欠失した変異株をBALB/cマウスに接種したところ、W83株を接種した場合と比べて生存率が高くなった。このことからヒスチジンキナーゼ関連遺伝子のバイオフィルム形成能と病原性の間に関係があることが示唆された。歯周病細菌Pprphyromonasgingivaisは菌株間において、歯周病の病原性に違いがあることは以前から報告されているが、その病原性を決定づける遺伝子群の同定および解析は行われていない。各菌株間における特異領域を解析することにより、その菌株の病原性に関与する遺伝子を決定することは歯周病の病態を明らかにする上できわめて重要である。本研究では、P.gingivalisの病原性の強い菌株であるW83株と病原性があまり高くない菌株であるATCC 33277株の染色体DNA上の遺伝子領域の違いを調べ、W83株に特異的な領域を調べた。菌株間の染色体DNA上の遺伝子領域の差異については、subtractive hybridization法を用いて解析した。本法を用いて、P.gingivalis W83株に特異的な領域が32箇所同定された。同定された特異領域の中でも、莢膜様多糖合成に関与する遺伝子、リボヌクレオシドトリフォスフェートリダクターゼ、ヒスチジンキナーゼ等の遺伝子群についての変異株を作製した。変異株の確認は、それぞれの遺伝子についてのDNAプローブを用いて、サザンプロット法を用いて行った。これらの遺伝子が確実に挿入失活されたことを確認したのち、それらの病原性への関与について解析を行った。病原性の関与についてはBALB/cマウスの背部にW83株とその変異株を接種し、腹部に形成する潰瘍の大きさを比較することにより解析している。また、潰瘍部の組織像を比較検討し、P.gingivalis W83株に特異的な遺伝子群の病原性への関与を解析している。
量子数射影法を用いた原子核におけるエキゾチックな変形・回転状態の研究

原子核においてこれまで調べられてこなかった新しいいくつかの変形の存在が、平均場理論に基づく計算により示唆されている。それらのエキゾチック変形の一つである四面体変形をした状態は、特定の陽子数または中性子数の原子核の安定な変形状態となると考えられている。昨年度、原子核構造で広く使われており信頼性の高いGogny相互作用を用いた量子数射影計算の数値計算プログラムを作成した。そのプログラムを用いて四面体変形した状態が非常に大きな相関エネルギーを稼ぐことを調べていたが、本年度はその研究を更に進め、この大きな相関エネルギーが複数のZrの同位体で見られることや四面体変形に限らず他の八重極変形でも同程度の相関エネルギーがあることを新たに示した。これらの結果を論文としてまとめた。また、本年度は新たに、異なる角速度の状態を重ねあわせて量子数射影する計算を、共同研究として行っている。この計算手法では角運動量の高い状態において、系の内部状態が変化する効果を計算に取り入れることができ、一つの角速度の状態を量子数射影した場合に比べてより信頼性の高いエネルギースペクトルが得られると考えている。現在はエキゾチック変形ではなく、軸対称な回転楕円体変形でその有効性を確かめている段階であるが、手法が確立すればエキゾチック変形のエネルギースペクトルをより正確に計算することも可能となる。軸対称な回転楕円体変形の計算は現在論文にまとめて投稿中である。26年度が最終年度であるため、記入しない。これまで原子核構造であまり調べられてこなかった新しいエキゾチックな変形の存在が平均場理論による計算で示唆されている。その中でも正四面体型の四面体変形は、比較的多くの原子核の特に安定な励起状態か場合によっては基底状態となると予想されている非常に興味深い変形である。平成25年度においては以下のことを実行した。まず、現実的な有効相互作用であるGogny相互作用を用いた量子数射影計算のプログラムを作成した。その結果、内部状態の計算と量子数射影計算で同じ相互作用を用いた首尾一貫した計算が可能となった。Gogny相互作用を用いた場合にも四面体変形した状態が平均場計算で現れ、そのような状態に作成したプログラムで量子数射影を行うと非常に大きな相関エネルギーを得ることが新たにわかった。他のエキゾチック変形であるバナナ型の変形状態のスペクトルの計算と変形したハロー核のEO遷移の計算も行っており、現在それらの結果を解析している。これらに加えて、四面体変形した基底状態の偶偶核に一つ粒子がついた奇核の研究でも大きな進展があった。基底状態の偶偶核のスペクトルは変形度が大きな場合、一本の回転体的なスペクトルになるが、奇核においては変形度が大きくても複数にスプリットしたスペクトルが量子数射影による計算で得られていた。そのスプリットの様子は最後の一粒子が3種類ある軌道のどれに入るかで異なり、そのうち2種類の軌道ではスプリットの原因が粒子回転体模型におけるコリオリ相関であると解析的に示していた。しかし、残り1種類は解析的に計算する方法がわからなかったため、数値的に四面体変形した粒子回転体模型の計算を四面体変形が持つ対称性を考慮した上で行い、量子数射影と同様の結果を得た。これにより、奇核のスペクトルで見られたスプリットの原因がコリオリ相関であると結論づけた。本年度の目標のほとんどの部分を実行し、かつ計画の段階では見通しが立たず予定していなかった、四面体変形した粒子回転体模型の計算も行うことが出来たため。また、量子数射影の計算プログラムにおいて、内部状態の対称性を用いた高速化を可能とした結果、研究が予定よりも進んでいる。研究計画では今後変形したハロー核の計算をGogny相互作用で行う予定であったが、実際にGogny相互作用の計算プログラムを作成した上で、必要となるハローを正しく記述する模型空間とそれに対する計算時間を見積もった所、計算の実行に非現実的な時間がかかることがわかった。

これに対する対応策としては複数の振動子長を持った調和振動子基底を使うなどが考えられる。他の対応策としては、スペクトルは量子数射影で計算し、ハローが最も影響する遷移確率に関しては平均場計算と回転体模型から求める方法も考えられる。平均場計算にはハローの記述に有利なガウス関数基底を用いることができ、その計算プログラムは共同研究者によって既に作成されている。
ボリビアの女性がんの環境・宿主要因に関する民族疫学的研究

1.研究目的ボリピアの子宮頚がん発生率は先進国の5-10倍高いが、HPV感染の状況や環境・宿主要因は明らかでない。本研究ではボリピアの子宮頚がん患者の民族背景、生活環境、性生活状況、HPV感染の有無などの民族疫学的調査を行い、その環境・宿主要因を明らかにする。2.対象と方法1)症例・対象研究:ボリビアの協力病院に受診した子宮頚がん症例とコントロールから子宮頚部スメア細胞・血液検体を収集するとともに質問表による面接調査を行い、これまでに子宮頚がん症例(66例)とコントロール(26例)の検体を収集した。2)子宮頚部スメア細胞は、パパニコロ染色による細胞診とHPV-DNA検出を行う。血液検体はリンパ球と血漿に分離調製し、HLAアリルタイピングに用いた。3.研究の進捗状況1)HPV-DNA検出:平成11年度に子宮頚部スメア細胞からのDNA抽出とPCR-RFLP法によるHPV-DNA検出の技術指導を実施し、平成11年9月以降、HPV-DNA検出はラパスのボリビア国立衛生研究所で現地共同研究者が行った。悪性型HPV-DNA陽性率は26/49(53.1%)であった。HPV typeは31型が最も多いtypeであった。2)HLAタイピング:ボリビアのHPV DNA陽性子宮頚がん8例とHPV DNA陰性対照8例の子宮頚部スメア細胞検体からDNAを抽出しHLAタイピングを行った。4.まとめと展望1)HPV-DNA検出:子宮頚部スメア細胞検体での検察がフィルード調査に有用であることが判明した。ボリビアではHPV typeは31型が最も多く、鹿児島地区で16型が優位であることと比べ興味深い。2)HLAタイピング:子宮頚部スメア細胞検体から抽出したDNAを用いてもHLAタイピングが可能であることが明らかになった。鹿児島地区での子宮頚がん症での解析は子宮頚がんのリスク因子としてHLAクラスII DRB1^*0401およびDQB1^*0403、防御因子としてHLAクラスII DRB1^*1302およびDQB1^*0602が明らかになった。優位なHPV typeが鹿児島地区とボリビア症例では異なることから、それぞれのHLAクラスIIアリルが認識するエピトープが何か興味深く、これを特定することによりHPV抗原ペプチドの候補を決定することができる。【研究目的】ボリビアの子宮頸がん発生率は先進国の5-10倍高いが、HPV感染の状況や環境・宿主要因は明らかでない。本研究では、ボリビアの子宮頸がん患者の民族背景、生活環境、性生活状況、HPV感染の有無などの民族疫学的調査を行い、その環境・宿主要因を明らかにする。【対象と方法】1)症例・対象研究:ボリビアの協力病院に受診した子宮頸がんとコントロール(各々100例)を対象とする。子宮頚部スメア細胞はパパニコロ染色による細胞診とHPV-DNA検出を行う。血液検体はリンパ球と血漿に分離調整し、HLAタイピングとHPV抗体検査に用いる。2)子宮頸がん組織標本収集:ボリビアの協力病院に保存してある病理組織標本の切片を収集し、DNA抽出・HPV-DNA検出を行う。【進捗状況と展望】(1)検体収集体制:本年度はラパス、エルアルト、チュピサ、タリハ、スクレの5地区での協力体制を確立した。血液検体21例、子宮頚部スメア細胞検体21例、子宮頸がん組織標本5例を採取し、子宮頚部スメア細胞検体の細胞診結果はIII以上の悪性所見が6例、II以下が15例であった。次年度ではコチャバンバ、トリニダド、サンタクルスでの協力体制を確立しボリビア全体での検体収集体制を完成させ、子宮頸がん症例とコントロールの情報収集を完了する。(2)HPV-DNA険出:悪性型偶V-DNA陽性率は、子宮頚部スメア細胞検体ではPPPIII以上の6例中6例(100%)、PPPII以下の15例中1例(7%)であった。子宮頸がん組織標本では5例中2例(40%)であった。子宮頚部スメア細胞検体での細胞診結果と悪性型HPV-DNA検出結果が良く相関していた。(3)HLAタイピング:HLAクラスIおよびIIアリルタイピングは、それぞれ、ARMS法およびPCR-SSO法で解析中であり、鹿児島地区での子宮頸がん症例と比較する予定である。3.研究の進捗状況

1)HPV-DNA検出:平成11年度に子宮頚部スメア細胞からのDNA抽出とPCR-RFLP法によるHPV-DNA検出の技術指導を実施し、平成11年9月以降、HPV-DNA検出はラパスのボリビア国立衛生研究所で現地共同研究者が行った。悪性型HPV-DNA陽性率は26/49(53.1%)であった。HPV typeは31型が最も多いtypeであった。2)HLAタイピング:ボリビアのHPV DNA陽性子宮頚がん8例とHPV DNA陰性対照8例の子宮頚部スメア細胞検体からDNAを抽出しHLAタイピングを行った。4.まとめと展望1)HPV-DNA検出:子宮頚部スメア細胞検体での検察がフィルード調査に有用であることが判明した。ボリビアではHPV typeは31型が最も多く、鹿児島地区で16型が優位であることと比べ興味深い。2)HLAタイピング:子宮頚部スメア細胞検体から抽出したDNAを用いてもHLAタイピングが可能であることが明らかになった。鹿児島地区での子宮頚がん症での解析は子宮頚がんのリスク因子としてHLAクラスII DRB1^*0401およびDQB1^*0403、防御因子としてHLAクラスII DRB1^*1302およびDQB1^*0602が明らかになった。優位なHPV typeが鹿児島地区とボリビア症例では異なることから、それぞれのHLAクラスIIアリルが認識するエピトープが何か興味深く、これを特定することによりHPV抗原ペプチドの候補を決定することができる。
竹林は地球温暖化を緩和しうるのか？：モウソウチク林の炭素固定量の算定と将来予測

竹林の炭素固定量はどれくらいなのか?、それは将来の温暖化に伴ってどれくらい変化しうるのかという疑問に答えることを目標として、1)竹林における炭素吸収量および放出量の年々変動の測定と変動要因の解明、2)竹林の炭素吸収量および放出量の変動特性を再現する炭素固定量算定モデルの構築、を行う。また、3)そのモデルと広域メッシュ化情報を利用し、広域の竹林の炭素固定量の算定と将来予測を行う。
微生物の有する生合成機能解明による新規抗生物質の創製に関する研究

微生物が有している第2次代謝産物の生合成機能を基盤として、以下の生物活性物質の探索を行った。併せて、放線菌の生産する神経突起伸長作用物質ラクタシスチンの生合成研究を行った。2.昆虫のメラニン生合成機能を抑制する糸状菌由来の生物活性物質の探索を展開した。カイコ幼虫体液の黒色化を指標として探索を行った結果、既知抗カビ抗生物質Trichoviridinや新規物質ATF-606が見い出された。Trichoviridinのメラニン生合成阻害活性は初めての知見であり、in vivoでの評価が期待される。3.微生物変換による新規物質の創製の一環として、放線菌の生産する神経突起伸長作用物質ラクタシスチンの^<13>C標識化合物を用いる生合成研究を行った。その結果、ラクタシスチンはロイシン、イソ酪酸及びシステインより生合成されることを明らかにした。併せて、立体特異的に^<13>Cが標識されたL-ロイシンを初めて生合成研究に適用し、生合成経路の立体化学を解明した。以上、微生物の中にあってはより多彩な生合成経路を保有している糸状菌の第2次代謝産物に注目し、新規生物活性物質の探索を行い、2種の新規物質を見い出した。併せて、前駆体として^<13>C標識アミノ酸を用いる取り込み様式が立体化学を含めた生合成経路解明に有用な手段であることを立証した。1.微生物由来の新規生物活性物質の探索研究微生物第2次代謝産物由来の新規骨格を有する生物活性物質の探索を目的とし、真正細菌600株、糸状菌320株を分離した。真正細菌の培養液中からは緑膿菌などに対し特異な抗菌スペクトルを示す脂溶性物質に絞り株を選択した。一方、糸状菌についても脂溶性物質であること抗菌活性を示さずシリカゲルTLC上にて特長的なUV吸収を示す物質について探索(ケミカルスクリーニング)を行い、ATF-13、ATF-14、ATF-157の3株を選択した。これらについて培養を行い、目的物質の単離精製を行い、ATF-13及び-14を夫々黄色ならびに淡緑色結晶性物質として単離した。現在、NMR、Mass測定による新規性を検討中である。新規物質の場合には大量培養を行い、試料を取得し種々の生物活性を調べる予定である。2.ラクタシスチンの生合成研究放線菌の生産する神経突起伸長作用物質ラクタシスチンについて各種^<13>C標識化合物とNMRを用い、骨格炭素の生合成由来を調べた。〔2-^<13>C〕L-ロイシン、〔1-^<13>C〕イソ酪酸、〔1-^<13>C〕プロピオン酸、L,L-〔1,1′-^<13>C_2〕シスチンの取り込み実験の結果、L-ロイシン(C-4,5,9,10,11,12)とイソ酪酸(C-6,7,8,13)が縮合したC_<10>ユニットとN-アセチル-L-システイン(C-1,2,3)から生合成されることを明らかにした(第113年会日本薬学会発表)。現在、C-11,C-12の両メチル基の生合成経路の立体化学もあわせて検討中である。1.糸状菌由来の新規生物活性物質の探索糸状菌第2次代謝産物中から以下に示す2種の探索系より新規物質を見い出した。(1)TLC上でのUV吸収を指標としたケミカルスクリーニングより糸状菌由来の新規ポリケチド物質の探索を行った。マイコトキシンを除いた糸状菌15株の培養抽出液より数種の既知物質との同定を加え、5員環骨格を有する新規物質ATF-202を見い出した。本物質の生物活性を測定中である。(2)カイコ幼虫の体液の黒色化を指標として、メラニン生合成阻害物質の探索系を構築した。

本系に加えマッシュルーム由来チロシナーゼを用いる系を併用し、糸状菌700株の培養液について探索したところ、活性株の中に既知抗菌物質Trichoviridinを見い出した。本物質は既存のメラニン生合成阻害物質の中にあって極めて強い活性を有する。さらに同活性を有する新規物質ATF-606を見い出した。本物質は、ヘテロ環を有する低分子脂溶性物質で現在、各種生物活性を評価中である。2.放線菌の生産する神経突起伸長作用物質ラクタシスチンの生合成研究これまでの^<13>C標識化合物を用いる生合成研究においてラクタシスチンの骨格炭素の由来を明らかにした。今回、グルコースを資化するロイシン生産菌より、^<13>Cが立体特異的に標識されたL-ロイシンを取得し、この取り込み実験より、ラクタシスチンのC-11、C-12の両メチルを各々pro-R、pro-Sに帰属した。
大学入試センター試験の標準化の検討

大学入試センター試験の標準化に向けての以下の研究を行った。1.国立大学ハンドブックに記された、入試に際する選択科目のパタンに関する集計を行い、その多様性を明らかにした。国語、地歴、公民、数学、理科、外国語を課している大学は未だに多いが、それ以外の大学における選択科目のパタンは様々である。2.大学入試センター試験の標準化のひとつの方法として、ある特定集団においては学力が不変であるとの仮定の下に、その集団の平均点と標準偏差を毎年一定とする方法を検討した。特定集団としては、学力の高い集団が安定していると考えられるため、旧帝国大学系の大学の入学者集団、ならびに、進学率の高い高等学校集団を用いた。この方法の利点は、計算が簡単であることに尽きるが、どのような集団を用いればよいかという点で議論の余地が残る。3.共通第1次学力試験、ならびに大学入試センター試験の過去の問題の難易度を比較するために、大学1年生約400人を被験者とした実験を行った。過去の問題から、英語は25題、数学は18題の大問を抽出し、それらをバランスよくテスト冊子に配置することにより、古典的テスト理論に基づく難易度の比較を可能とするようなデータを収集した。結果として、試験問題の難易度は、毎年変動があるものの、経時的にシステマティックな変化は見られないこと、また、受験生の学力の経時的変化においても一定に傾向は存在しないという知見を得た。4.大学入試センター試験の標準化に関して、そのユーザーであるところの、高校生5448名高校教員232名大学教員578名の意見調査を行った。その結果、各層とも、試験得点の標準化、尺度化は必要であるという意見が多数を占めた。本年度に行った研究の主なものは以下の3つである。1)選択科目の分類国公立大学ガイドブックから、各募集単位が指定している受験科目の一覧を作成し、それらの分類を試みた。2)共通1次以来のテスト得点の標準化標準化を行うために、学力がこの20年間変わらないと考えられる集団を特定し、それらの集団の平均点の差異を元に全データの標準化を試みた。たとえば、旧帝大系の大学入学者の学力は不変であると仮定すれば、その集団の平均点と標準偏差を用いて全データを標準化すれば、20年分のテスト得点が比較可能となる。特定集団としては、旧帝大系大学入学者、旧帝大系大学へ多くの入学者を供給している高校、毎年の上位数パーセントの受験生、予備校関係者の勘による特定高校、等を用いたが、いま一歩決定的な集団を見いだすには至っていない。3)合計点を算出する重みの決定方式並びにその見かけ上の解釈に関して研究分担者(南風原)たとえば募集要項等にみられる「なお,学力試験の成績の判定は,大学入試センター試験の成績(総得点)と第2次学力試験の成績(総得点)とを総合して行う。この比率は,大学入試センター試験の成績を「1」,第2次学力試験の成績を「4」とする。」といった記述の解釈であるが、総合成績=センター試験の総得点×1+2次の総得点×4という解釈もできれば、満点を考慮した総合成績=センター試験の総得点/800×l+2次の総得点/2次の満点×4という解釈も可能となる。これらの記述と実際の算出方式との比較を行った。本年度は、過去の共通一次試験とセンター試験に含まれていた問題の難易度を比較するために、以下のような実験を行った。英語と数学に関して、20年分の冊子に含まれる大問を2群に分け、第1群には各年度からおよそ3題の大問が含まれるものとする。

第1群から新たな冊子を10冊作り、各冊子には3年分の大問がすべて含まれるようにする。また、任意の2冊子間で重複する年度を2とする。上記のデザインの下で作成された冊子を大学1年生約400名に実施し、大問単位で、古典的テスト理論の同族テストモデルに基づき分析を行った。また、その結果を利用して、第2群の問題の難易度の比較を検討中である。大学入試センター試験の標準化に向けて以下の研究を行った。1.国立大学ハンドブックに記された、入試に際する選択科目のパタンに関する集計を行い、その多様性を明らかにした。国語、地歴、公民、数学、理科、外国語を課している大学は未だに多いが、それ以外の大学における選択科目のパタンは様々である。2.大学入試センター試験の標準化のひとつの方法として、ある特定集団においては学力が不変であるとの仮定の下に、その集団の平均点と標準偏差を毎年一定とする方法を検討した。特定集団としては、学力の高い集団が安定していると考えられるため、旧帝国大学系の大学の入学者集団、ならびに、進学率の高い高等学校集団を用いた。この方法の利点は、計算が簡単であることに尽きるが、どのような集団を用いればよいかという点で議論の余地が残る。3.共通第1次学力試験、ならびに大学入試センター試験の過去の問題の難易度を比較するために、大学1年生約400人を被験者とした実験を行った。過去の問題から、英語は25題、数学は18題の大問を抽出し、それらをバランスよくテスト冊子に配置することにより、古典的テスト理論に基づく難易度の比較を可能とするようなデータを収集した。結果として、試験問題の難易度は、毎年変動があるものの、経時的にシステマティックな変化は見られないこと、また、受験生の学力の経時的変化においても一定に傾向は存在しないという知見を得た。4.大学入試センター試験の標準化に関して、そのユーザーであるところの、高校生5448名高校教員232名大学教員578名の意見調査を行った。その結果、各層とも、試験得点の標準化、尺度化は必要であるという意見が多数を占めた。
高次複合体系における蛋白質-蛋白質-DNA相互作用ネットワークの動的構造解析

亜鉛フィンガーは、DNA認識モチーフの1つであり、天然には配位子の種類により、C2H2型、C3H型、C4型、C6型が存在する。なかでも、C2H2型亜鉛フィンガーモチーフは特徴的な構造およびDNA認識様式を持つことから注目を集めている。そこで、我々は、ヒト由来転写因子Sp1のDNA認識部位を構成する亜鉛フィンガーのC2H2ドメインのうち、2つのCysをHisに置換した人工H4型亜鉛フィンガーを創製し、NMR立体構造解析により高次構造変化とその機能との関係について検討を行った。NMR測定の結果、H4Sp1f2は、亜鉛の添加により2次構造が安定化されていることが観測された。またNOESYの結果から、NOEsの連鎖パターンがH4Sp1f2とC2H2Sp1f2とで類似していたことから、2次構造の点では両者が類似していることが明らかになった。さらに、立体構造の変化を確認するために、NOEsから得られる距離情報に基づいて距離束縛分子動力学計算により、H4Sp1f2の3次構造モデルの構築を行った。立体構造モデルの比較から、H4Sp1f2はC2H2Sp1f2とは異なり、Pro2-Try7領域のストランドがねじれ、Asp18-Gln21付近のへリックス構造がほどけた構造となっていることが明らかになった。今回の実験では、単一の新規フィンガー構造モチーフのNMR構造解析を行ったが、今後は3フィンガーおよびDNAとの複合体構造解析を進める必要があるものと考えられる。
子宮内膜症の病因・病態に関する分子生物学的研究

子宮内膜症患者における骨盤腹膜病変では,1998年アメリカ不妊学会の分類により赤色,白色および黒色病変に細分類することが提唱されたが,それぞれの病変による違いが活動性に関与するのか,内膜症の自然史に関与するかは明らかではなかった.私どもは,骨盤腹膜病変の生検材料を用いて増殖因子の(proliferative cell nuclear antigen),および血管新生因子であるVEGF (vascular endothelial growth factor)を検討した結果,内膜症患者腹水中のVEGF濃度は非内膜症患者に比べ,有意に高値であり,さらに血管新生因子として微小血管の内皮に染色されるendoglinおよびCD68による免疫組織染色を行った結果,endoglinおよびCD68による染色は赤色>黒色>白色病変の順であった。その後もHGF (Hepatocyte Growth Factor)とそのレセプターであるc-Metに注目し,同様な検討を行ったところ、骨盤内膜症病変では色素性病変での活動性は同様な結果となった。さらに、内膜症患者腹水中のMφを分離培養し、MTT assay法により培養上清中のサイトカインをELISA法により測定した結果、無添加のMφの増殖は培養24時間でピーク値を示した。LPS添加後のMφはLPSのある濃度(5ng/ml)までは容量依存的に増殖した。また、内膜症患者腹水中では、LPS添加でMφを刺激した場合、無添加の場合に比べTNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、VEGFおよびHGFの産生は24倍上昇していた。従って、初期の活動性内膜症では豊富なMφが内膜症の増殖に関与している可能性が示唆された。次に、内膜症と不妊の機序に関して検討した。内膜症が不妊の原因となっていることが示されているが、特定の不妊因子が同定されている訳ではなく、様々な因子が関与していることが示唆されている。そこで、内膜症合併不妊症を対象とし、内膜症と不妊との関係をretrospectiveに検討した。その結果、内膜症のASMR進行期別では妊娠率に差はなく、またチョコレート嚢胞が存在するIII期およびIV期の重症例でも、卵管閉塞や癒着が少ない場合には、妊娠率を低下させないことが明らかとなった。子宮内膜症患者における骨盤腹膜では,肉眼的に様々な病変がみられるが,病変による活動性に差がみられるのか,増殖態度が異なっているのかについては十分検討されていない.今回これら色素性病変における増殖能について検討した.対象は当科で腹腔鏡下に内膜症病変を生検した51例および正常子宮内膜22検体を対象とした.検体をホルマリン固定後,パラフィン切片を用い,免疫組織学的に検討した.増殖能の指標として,後PCNA抗体,Ki-67抗体による免疫組織染色を行うとともに,AgNORsによる特殊染色をおこなった.その結果,PCNAは子宮内膜腺上皮および間質細胞の核内に強陽性となり,子宮内膜の月経周期による変動は増殖期に強く発現し,分泌期には低下していた.定型的内膜症ではPCNAは腺上皮の核内および間質細胞の核内に強陽性であったが,非定型的内膜症病変における発現は弱かった.

また,内膜症病変における色素別の変化をみると,赤色>黒色>白色病変の順となったが,月経周期による変動は認めなかった.Ki-67は子宮内膜腺上皮と間質細胞に陽性細胞が散見される程度であり,PCNAに比べ陽性細胞数は少なく,内膜症病巣では染色態度も弱く,色素別の変化は認めなかった.AgNORs染色では,子宮内膜腺上皮における陽性細胞は分泌期に比べ,増殖期にやや強い発現を示したが,推計学的な有意差は認めず,内膜症病巣における色素別の発現率にも差を認めなかった.内膜症の色素別の増殖能を比較したところ,PCNAを指標とした場合には,赤色病変がもっとも増殖能が高く,活動性も強いことが推察されたが,Ki-67およびAgNORs染色では明らかな違いを見いだせ得なかった.今後は,内膜症の消退に関する検討を,アポトーシスの面から検討する予定である.子宮内膜症患者における骨盤腹膜病変では,1998年アメリカ不妊学会の分類により赤色,白色および黒色病変に細分類することが提唱されたが,それぞれの病変による違いが活動性に関与するのか,内膜症の自然史に関与するかは明らかではなかった.私どもは,骨盤腹膜病変の生検材料を用いてPCNA(proliferative cell nuclear antigen),Ki-67による免疫組織染色,およびAgNORの特殊染色を行い,赤色病変における細胞増殖能が高いことを明らかにした.その後,血管新生因子に注目し,検討を加えた.まず,VEGF(vascular endothelial growth factor)を内膜症患者と非内膜症患者で腹水中濃度をELlSA方で測定した結果,内膜症患者腹水中のVEGF濃度は非内膜症患者に比ベ,有意に高値であり,周期別では分泌期に比べ増殖期に高かった.しかし,VEGFmonoclonal抗体を用いた免疫染色では各病変における違いを見いだせなかった.次に血管新生因子として微小血管の内皮に染色されるendoglinによる免疫組織染色を行った.その結果,endoglinによる染色は赤色>黒色>白色病変のの順であり,以前報告したPCNAの結果と同様な傾向が認められた.したがって,骨盤腹膜の内膜症病変でも,赤色などの初期病変では血管新生因子が細胞の増殖に関与し,その後次第に黒色および白色病変と変化していく可能性が示唆され,ことに骨盤内の増殖因子が関与している可能性が示唆された.子宮内膜症患者における骨盤腹膜病変では,1998年アメリカ不妊学会の分類により赤色,白色および黒色病変に細分類することが提唱されたが,それぞれの病変による違いが活動性に関与するのか,内膜症の自然史に関与するかは明らかではなかった.私どもは,骨盤腹膜病変の生検材料を用いて増殖因子の1つであるPCNA(proliferative cell nuclear antigen)による免疫組織染色,および血管新生因子であるVEGF(vascular endothelial growth factor)を検討した結果,内膜症患者腹水中のVEGF濃度は非内膜症患者に比べ,有意に高値であり,周期別では分泌期に比べ増殖期に高いことを報告した.さらに血管新生因子として微小血管の内皮に染色されるendoglinによる免疫組織染色を行った結果,endoglinによる染色は赤色>黒色>白色病変の順であり,以前報告したPCNAの結果と同様な傾向が認められた.
C型肝炎ウイルス複製に関与する宿主因子の同定および機能解析

当該年度において、PMLが感染性HCV粒子産生に関与していること、そしてPML関連タンパク質であるINI1とDDX5もHCVの生活環に関与していることを、感染性ウイルス粒子産生系であるJFH1感染細胞と異なったHCV株J6/JFH1を用いて明らかにし、この研究成果をBiochem. Biophys. Res. Commun.に発表した。またPMLとは別に、細胞質において形成される構造体P-bodyにも着目し、HCV複製との関係を明らかにした。当該年度はP-body因子であり、HIV-1複製を抑制するとの報告があるシチジンデアミナーゼAPOBEC3G/3FやRNAヘリケースMOV10のHCV複製への影響を調べた。先ず、HCV感染や複製により、APOBEC3GやMOV10のP-body局在が変化するのかについて、免疫蛍光染色法により観察した結果、これらの因子のP-body局在が撹乱され、HCV複製細胞中でHCVコアタンパク質と共局在することが分かった。一方でAPOBEC3G/3Fの強制発現細胞やMOV10のノックダウン細胞におけるHCV複製レベルがコントロール細胞と比べて同程度であったことから、これらの宿主因子はHCV複製の抑制因子とならないことを明らかにした。これはP-body因子の異なったRNAウイルスの複製機構における役割を示唆し、ウイルスの重複感染治療法の解明に役立つものと考えられる。以上の研究成果を現在、論文投稿中である。また、これらの研究成果は本研究の目的である「HCV複製に関与している宿主因子を同定すること」を達成しており、未だ成し遂げられていない遺伝子型1bのHCV粒子産生系の開発につながるため重要である。本研究の目的は、C型肝炎ウイルス(HCV)複製に関与している宿主側の因子を同定することと、その因子のHCV生活環における役割を明らかにすることである。当該年度においては、宿主因子であるpromyelocytic leukemia (PML)がHCV複製に必要であること、および、HCV生活環の中でRNA複製ではなくウイルス産生に関与していることをつきとめた。これらの研究により未だ明確になっていないHCVの生活環に関与している宿主因子が同定出来、この発見は新たな抗HCV剤のターゲットを見つける一助になると考えられる。PMLはがん抑制因子として知られており、HCVと発がんとの解明にも繋がる可能性がある。実際、HCV CoreがPMLと結合する結果、PMLの細胞増殖抑制効果やアポトーシス誘導能をキャンセルすることが報告されているため、大変重要な発見である。ESCRT小胞輸送経路が粒子産生に関与しているという発見は、未だ確立されていない遺伝子型1bの感染性HCV粒子産生系の研究にも寄与する可能性がある。他の研究課題としては、従来から汎用されているヒト肝がん細胞株HuH-7系とは異なる新しいLi23系の細胞から、感染性HCV-JFH1株の複製レベルが高いクローンの選択を試みている。複製レベルの高いクローンが得られれば、抗HCV剤のスクーリニングや宿主因子の解析に有用である。現在までにHuH-7系の細胞のHCV RNA複製レベルと同等の複製レベルが得られた細胞やHCVレセプターの発現量が異なる細胞を単離することに成功している。当該年度において、PMLがHCV複製の後期に関与していることと、PML関連タンパク質であるINI1とDDX5もHCVの生活環に関与していることを、感染性ウイルス粒子産生系であるJFH1感染細胞とJFH1のサブゲノムRNA複製細胞を用いて、PML、INI1、およびDDX5のノックダウン細胞におけるHCV RNA複製レベルをコントロール細胞と比較することで明らかにした。これらの結果は本研究の目的である「HCV複製に関与している宿主因子を同定すること」を達成しており、未だ成し遂げられていない遺伝子型1bのHCV粒子産生系の開発につながる可能性があり重要である。一方で、P-body因子とHCV複製の関係についてJFH1株を用いて明らかにした。JFH1株感染細胞ではHCVが細胞質スペックルであるP-body因子の形成を阻害し、P-body因子をHCVの複製の場である脂肪滴にハイジャックすることを見出した。また、JFH1感染36時間後にstress granuleが誘導されること、そしてstress granule因子であるG3BPI、Ataxin2やpoly(A)-binding protein 1(PABP1)がHCV感染に伴いP-body因子の一つであるDDX6及びHCV Coreと共局在していることも明らかにした。さらに、DDX6、Ataxin2或はPABP1のノックダウン細胞においてJFH1の複製レベルが減少したことから、P-body因子やstress granule因子はHCV複製に必要であることが分かった。HCV感染に伴い宿主細胞にストレス応答が起きており、HCV感染の発がんへの関与解明に繋がる成果が得られた。当該年度はP-body因子であり、HIV-1複製を抑制するとの報告があるシチジンデアミナーゼ

APOBEC3G/3FやRNAヘリケースMOV10のHCV複製への影響を調べた。先ず、HCV感染や複製により、APOBEC3GやMOV10のP-body局在が変化するのかについて、免疫蛍光染色法により観察した結果、これらの因子のP-body局在が撹乱され、HCV複製細胞中でHCVコアタンパク質と共局在することが分かった。一方でAPOBEC3G/3Fの強制発現細胞やMOV10のノックダウン細胞におけるHCV複製レベルがコントロール細胞と比べて同程度であったことから、これらの宿主因子はHCV複製の抑制因子とならないことを明らかにした。これはP-body因子の異なったRNAウイルスの複製機構における役割を示唆し、ウイルスの重複感染治療法の解明に役立つものと考えられる。以上の研究成果を現在、論文投稿中である。また、これらの研究成果は本研究の目的である「HCV複製に関与している宿主因子を同定すること」を達成しており、未だ成し遂げられていない遺伝子型1bのHCV粒子産生系の開発につながるため重要である。これまでに明らかとなっていないHCV複製に関与する宿主因子を複数同定し、その生活環における役割を明らかにしたことは、HCVの基礎研究において重要な意味を持ち、研究計画のうちの該当部分は達成出来たため。またLi23(多くのHCV研究に用いられているHuH-7系の細胞とは異なる肝がん細胞株)細胞からHCVJFH1株の複製効率が良いsubclone(L8c15)を同定出来たため。PML関連タンパク質とHCVについて論文にまとめるとともに、国際共同研究として他のP-body因子とウイルス複製について詳細に解析する。また、研究計画で予定していた異なる細胞間でのウイルス複製レベルの比較が単純には行えないため、JFH1株以外のHCV RNA(J6/JFH1やJRN/35B)を研究に用いることと、RNAウイルスの複製を制限する宿主因子についても解析することで、予定していた研究を遂行して行く。
ヘムエリトリン類似骨格を持つRu及びFe多核錯体の電子移動過程の制御と新機能開発

Ru二核錯体の電子移動過程の制御ならびに触媒活性能の発現を目的として、関連するFe(III)多核錯体と比較検討しながら新規錯体の構築及びそれらの電気化学的性質の解明を行った。1.フェノキソ架橋Ru二核錯体の合成と性質:N,N'-(2-ヒドロキシ-5-メチル-1,3-キシリレン)ビス(N-カルボキシメチルグリシン)(H_5-5-CH_3-hxta)を用いて、初めて(μ-フェノキソ)Ru(III)二核錯体Na[Ru_2(5-CH_3-hxta)(O_2CR)_2](R=(1)CH_3,(2)C_6H_5)を合成した。これらの電気化学的性質について詳細に検討し、同様の構造を持つアルコキソ架橋Ru二核錯体と比較、検討を行った。いずれの錯体も元素分析より、Ru:H_5-5-CH_3-hxta:カルボン酸の比が、2:1:2の組成ををもつことあ分かった。また、X線結晶構造解析から、C_2対称をもつ(μ-フェノキソ)ビス(μ-カルボキシラト)Ru二核錯体であることが明らかとなった。定電位電解により得られたIT吸収帯(Intervalence Transfer Band)の電子交換積分Hadの値(0.670.87x10^3cm^<-1>)が、代表的なClass II錯体の値(Had=0.4x10^3cm^<-1>)に近いことから本錯体系の一電子還元体は、Ruの不対電子がある程度局在化したClass IIの混合原子価錯体であると帰属された。2.鉄(III)多核錯体の構造と機能:多核形成配位子1,3-ジアミノ-2-ヒドロキシプロパンN,N,N',N'-四酢酸(H_5dhpta)を用い、一連の鉄(III)二核錯体[Fe_2(dhpta)(RCO_2)(H_2O)_2]及び四核錯体[Fe_4(dhpta)_2(O)(OH)(RCO_2)_2]^<3+>を合成し、それらの構造をX線結晶構造解析により明らかにするとともに電気化学的性質を調べた。四核錯体の構造解析の結果よりカタラーゼ類似活性があることが予想され、過酸化水素との反応について検討した。その結果一部の四核錯体がカタラーゼ類似活性を示すことが判明した。
養殖環境中の多剤耐性菌が利用する遺伝子伝達メカニズムとその多様性

細菌間における遺伝子伝達は薬剤耐性菌発生・拡大のリスクファクターとして重要である。本研究では養殖環境由来耐性菌が利用している遺伝子伝達機構の多様性を明らかにし、伝達性プラスミドが受容菌染色体上へ組み込まれる分子メカニズムを解明することを目的として、まず養殖場底泥から分離されたビブリオ属細菌(Vibrio ponticus)がもつ伝達性多剤耐性プラスミドpSEA1(約300kb)の全塩基配列決定により、pSEA1が7つの耐性遺伝子をコードし、伝達性プラスミド分類において新規のサブグループを形成することを明らかにした。また本プラスミドが大腸菌染色体へ組み込まれるメカニズムを以下のように提唱した。まずプラスミド上に存在する約12kbのトランスポゾンTn6283が、自身がコードするリコンビナーゼの働きにより切り出された後(copy-out-paste型)、大腸菌染色体上の特定の領域に組み込まれる。次いでTn6283と元のプラスミド上のTn6283の間で相同性組み換えが起こることによってpSEA1全長が大腸菌染色体へ取り込まれる、というものである。このようにTn6283は、既知の可動性因子と異なり、自身は伝達能力をもたないが、プラスミドの伝達能を利用する形で大腸菌へと伝播し、大腸菌内でプラスミドの染色体への組み込みをアシストするという非常にユニークな可動性因子であるといえる。Tn6283内のインテグラーゼのホモログはビブリオ科および腸内細菌科細菌に広く分布しており、今回我々が発見した上述の機構は種々の細菌間の耐性遺伝子伝達に寄与している可能性がある。一方、タイおよび台湾の養殖場から分離された薬剤耐性菌の解析によって、養殖場環境細菌には耐性遺伝子伝達能を有するものが多数存在し、複数種のプラスミドに加え未知のものも含めた多様な可動性因子を利用していることを明らかにした。1新規プラスミドpSEA1の受容菌クロモソームへの組み込み機構の解明養殖場より分離した多剤耐性菌Vibrio sp. 04Ya108株が保有する伝達性多剤耐性プラスミドpSEA1は伝達された後に受容菌クロモソーム上に挿入される。本年度はこの分子メカニズムを明らかにするために、pSEA1の全塩基配列を決定した(DDBJへ登録済)。pSEA1は全長約320kbであり、7つの薬剤耐性遺伝子および接合伝達を担うtra遺伝子群を有していた。traI遺伝子を用いて既知のプラスミドとの比較系統解析を行った結果、MOBHグループに分類される新しいプラスミドであることが明らかになった。さらにpSEA1上の13kbの領域は切り出されて環状化していることおよびインテグラーゼをコードしていることからトランスポゾンであることが示唆された(Tn6283として登録済)。Tn6283はpSEA1上では1コピーであったが、本プラスミドが受容菌の染色体上に組み込まれた際には2コピーに増え、さらにpSEA1の両端に配置されていたことから、pSEA1の染色体上への組み込みに重要な役割を果たしていると考えられた。2養殖場由来多剤耐性菌が利用する遺伝子伝達因子の多様性の解明愛媛県、台湾の養殖場およびタイの養豚場排水より分離した薬剤耐性菌についてtraI遺伝子を指標に伝達因子を調べたところ、既知の伝達性プラスミドやintegrative conjugative elementsとよばれる細菌クロモソーム上を遺伝子が移動する機構を利用していることが示唆された。一方、これらの伝達因子が検出されない株が1株あり、既知のものとは異なる遺伝子伝達因子を持つことが示唆された。1新規プラスミドpSEA1の受容菌クロモソームへの組み込み機構の解明プラスミドpSEA1の全塩基配列の決定および受容菌染色体上での挿入部位の特定を行うことができ、計画は予定通り進行している。2養殖場由来多剤耐性菌が利用する遺伝子伝達因子の多様性の解明計画していたすべての地域の養殖場あるいは養豚場排水から、耐性遺伝子を伝達する能力のある菌株を予想より短期間で分離することができた。そのため、平成28年度に行うことを予定していた分離株の遺伝子伝達性について、平成27年度内に結果を得ることが可能となった。さらに未知の伝達性因子をもつと予想される株が含まれていたことから、今後の解析により計画通り新規の遺伝子伝達機構の発見につなげることができると考えている。1新規プラスミドpSEA1の受容菌染色体の組み込み機構の解明:養殖場より分離したVibrio ponticus 04Ya108が保有する多剤耐性プラスミドpSEA1の大腸菌染色体への組み込みは、まずpSEA1が宿主から大腸菌へ接合伝達された後、pSEA1上のトランスポゾンTn6283の切り出しおよび大腸菌染色体上の特定の部位への挿入が自身がコードするインテグラーゼの働きにより行われ、続いて大腸菌に新たに供給されたpSEA1上のTn6283とすでに組み込まれている染色体上のTn6238の間で宿主の相同性組換えが生じ、pSEA1全長が大腸菌染色体上に取り込まれていることが示唆された。Tn6283が切り出された際のDNA末端同士の配列は非相補的であるもののheteroduplex構造の形成によりTn6283の環状化が達成されていることが示唆された。

環状化したTn6283の分子数に対して、本トランスポゾンを喪失した領域の修復が行われたプラスミド・染色体分子数の割合は極めて低く、一端Tn6823が挿入された後に、これを失ったプラスミドや染色体DNAでは再結合が達成されず、その結果Tn6283を保持するレプリコンのみが維持されることが示唆された。さらにTn6283は大腸菌染色体上のbcp遺伝子内に挿入されるためbcp遺伝子産物による抗酸化作用が弱まると考えられるが、Tn6283はbcpホモログをコードしており自身の挿入により喪失された遺伝子の機能を補っていることが示唆された。2養殖場由来多剤耐性菌が利用する遺伝子伝達因子多様性の解明:新規の遺伝子伝達因子をもつと予想された2株について接合体全ゲノム解析を行ったが、元のプラスミドに比して極めて短い領域しか検出できないあるいは挿入部位の予想がPCRの結果が一致しないことから再解析中である。「1新規プラスミドpSEA1の受容菌染色体の組み込み機構の解明」に関しては、トランスポゾンが切り出された後、プラスミドおよび染色体側のDNAは修復されず、結果的にトランスポゾンを保持するレプリコンだけが生き残るという仮説を証明するデーターが得られ、同時に論文投稿の準備も着実に進んでいるため、概ね順調に進行している。一方「2養殖場由来多剤耐性菌が利用する遺伝子伝達因子多様性の解明」に関しては、多剤耐性菌から大腸菌への遺伝子伝達により得られた接合体の全ゲノム配列を決定し解析を行った結果、レシピエントである大腸菌へ伝達されたと考えられる配列情報が極めて少なく、再解析が必要となった。したがって配列情報から予想される仮説を検証する実験に着手できておらず本項目の進行は遅れている。以上の状況より、全体としてはやや遅れているといえる。1伝達性多剤耐性プラスミドpSEA1上の新規トランスポゾンTn6283の染色体への挿入が大腸菌に与える影響を明らかにするために、Tn6283が染色体上のbcp遺伝子内に挿入された株(LN5)、bcp遺伝子破壊株(LN3)および大腸菌W3110を用いて、最大増殖速度、生菌数および集団内の死細胞率を比較した。LN5およびW3110の間では最大増殖速度や生菌数に有意差はなく、Tn6283の挿入が大腸菌の生理状態に与える影響は極めて低いと考えられた。一方、LN3はLN5およびW3110より有意に高い最大増殖速度を示したことからbcp遺伝子欠損により上昇した最大増殖速度はTn6238挿入により通常レベルに補正されていることが示唆された。Tn6283の挿入により破壊されるbcp遺伝子欠損のダメージ(最大増殖速度の上昇)はTn6238自身がコードするbcpホモログにより補填されている可能性がある。LN5の死細胞率はW3110に比べて有意に高かったが、LN5は非選択環境で10日間継代培養後も安定してTn6283を保持していた。これはTn6283の染色体への挿入は大腸菌増殖への負荷はないものの、細胞死を引き起こす、しかしTn6283は安定的に集団内に保たれているということを示している。Tn6283は新規チロシンリコンビナーゼをコードし、かつ既知のトランスポゾンで報告されているRDF因子を有しないことおよび前年度までに得られた実験結果を併せて考えるとTn6283の切り出し・組み込みの機構は新規であることが示唆された。またTn6283が切り出された際、切り出しによるプラスミドや染色体上の傷は修復されず細胞は死に至り、その結果Tn6283を保有する大腸菌のみが生き残っていくことが示唆された。