hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
日本語研究用オントロジーの設計と開発

1.データベースを構成するデータのうちの1つである古辞書のデータについては,『二十巻本和名類聚抄』の和訓に対して形態素解析用辞書のUniDicから,語彙素,語彙素読み,品詞,語種,語彙素IDの情報を付与した。形態論情報を付与する際の問題点として,以下の未登録語の問題がある。(1)UniDicに類似の語形の語がある場合。和名抄で「箒星(ハハキボシ)」だが,UniDicでは「箒星(ホウキボシ)」の場合,同一の語彙素の範囲にあるとして扱った。(2)和訓を分解すればUniDicに登録がある場合。和名抄「野分の風(ノワキノカゼ)」はこのままの形ではUniDicに登録がないが,「野分」「の」「風」に分解すれば登録されているため,分解してそれぞれの形態論情報を付与した。(3)和名抄の「奴(ツブネ)」(召使いの意味)は,UniDicになく,要素への分解も不可能のため,形態論情報が付与できなかった。和訓があっても形態論情報が付与できなかった例は,全5731レコード中約1200箇所であった(和訓の一部である場合も含む)。言語地図DBは,2019年1月時点「言語地図画像データベース」で公開している19冊の言語地図集の項目に対して形態論情報を付与した。レコード数は1654である。言語記事DBは,『読売新聞』大正2,6年,及び『文藝春秋』大正12昭和20年に現れた言に関する記事をデータベースとしてまとめた。2.佐藤喜代治編『語彙研究文献語別目録』(1983年明治書院刊)を著作権継承者の承諾を得て,データベース化した。今後,ウェブ上で公開する予定である。3.上記1で整備したデータと「日本語歴史コーパス」「現代日本語書き言葉均衡コーパス」からの統計情報も検索できるようにした語誌データベースのサイトを3月に内部公開した。(https://goshidb.ninjal.ac.jp/goshidb/)当初の目的の1つである学術用語のオントロジー化が送れているため。内部公開した語誌データベースのサイトのコンテンツを充実させるとともに,学術用語のオントロジー化のための基礎作業を急ぐ。1.まず,国立国語研究所の「日本語研究・日本語教育文献データベース」(224,207件)の提供を受けることができたので,その分析を始めた。その中には185,983件の雑誌論文が含まれているが,そのうち,キーワードが付けられているのは,68,229件(約36.7%)にとどまることが分かった。このデータを使って,日本語教育の研究動向をキーワードから分析したものを日本語教育世界大会2018に投稿した(結果は不採択)。2.データベースを構成するデータのうちの1つである,古辞書のデータについては,『哲学字彙』のデータの提供をうけることができたため,それを使って後述の語彙素への分割を試みた。また,『和名類聚抄』の和名のデータを整備している。言語地図のデータは,6冊の言語地図集をジオタグ付きの画像が表示される形で公開した。言語記事についてはサンプリングにより記事を取得する方針を決め,大正期の読売新聞,大正昭和初期の『文芸春秋』を対象とすることにした。3.各データベースの連携は形態素解析用辞書UniDicの語彙素を利用する。UniDicは現代語も古語にも対応し収録語も多く最適と考えられる。ただし,長い複合語が含まれていないため,そのような場合は短く分割して語彙素を充てていくことになる。また,『哲学字彙』に含まれている訳語などはその語定着しなかったものもあり,UniDicには登録されていない,これらをどのように扱うかが課題である。4.データベースを表示するツールとしてトピックマップの利用を検討したが,技術的な問題があることが分かり,断念した。科研費の採択決定が7月で,そこから作業者を探したが適任な人が見つからず,採用を断念した。そのため,情報整理,情報付与の作業が遅れたため。

レコード数は1654である。言語記事DBは,『読売新聞』大正2,6年,及び『文藝春秋』大正12昭和20年に現れた言に関する記事をデータベースとしてまとめた。2.佐藤喜代治編『語彙研究文献語別目録』(1983年明治書院刊)を著作権継承者の承諾を得て,データベース化した。今後,ウェブ上で公開する予定である。3.上記1で整備したデータと「日本語歴史コーパス」「現代日本語書き言葉均衡コーパス」からの統計情報も検索できるようにした語誌データベースのサイトを3月に内部公開した。(https://goshidb.ninjal.ac.jp/goshidb/)当初の目的の1つである学術用語のオントロジー化が送れているため。データベースのプロトタイプを年度の前半には作成し,試験公開を目指す。内部公開した語誌データベースのサイトのコンテンツを充実させるとともに,学術用語のオントロジー化のための基礎作業を急ぐ。平成29年度に作業者を雇用する予定であったが,科研費の採択が7月であったため,適任の人が見つからず雇用を見送った。そのため,人件費として予定していた分を次年度に回すことにした。学術用語のオントロジー化が予定よりかなりに遅れているため,その分に予定していた作業にかかる費用が未使用になった。2019年度はその費用および試験公開を始めた語誌データベースのサイトのコンテンツの充実を図る。
プラネタリー・バウンダリーズを考慮した持続可能性経済指標の研究

本研究では特にリスク・不確実性の扱いに焦点を置きつつ、プラネタリー・バウンダリーズ概念と資本アプローチに基づく持続可能指標の統合を検討することを目的とし、リスク分析を応用した概念的な経済数学モデルの構築及び数値計算を実施することとしている。これについて一般的な概念の検討を進めるとともに、具体的な事例の分析を通じつつ理論・方法論上の洞察を得ること等を目的として以下を実施した。(1)自然資本の価値定量の事例として、エチオピアの森林の自然資本としての貨幣換算価値の定量化を行い、論文にまとめた。論文では、自然資本を通常の金融投資と同様に「配当」相当分と「キャピタルゲイン」相当分に分解し価値定量化するFenichel et al. (2016)の枠組みを応用している。(2)不確実な気候変動を前提とした気候変動適応対策の経済価値評価をケニアの灌漑プロジェクトを事例に実施した。分析においては、不確実性下における経済的意思決定を評価するための位置手法であるRDM法(Lempert and Collins, 2007)を応用している。(3)プラネタリー・バウンダリーズの一要素であるエアロゾル問題について、タイを事例として科学的・政策的知見をまとめた論文を執筆した。(4)プラネタリー・バウンダリーズのまた別の一要素である海洋酸性化に関するリスク評価を含める経済評価について、ドイツ・キール大学の研究者(Prof. K. Rehdanz)ら共に研究を進めた。事業開始直後に研究代表者(実質上唯一のプロジェクトメンバー)の他大学への転任があり、転任に直接関係する業務への対応、また新ポスト着任後に新たに実施することとなった教育・学内管理業務への対応のため本事業に時間が割けず、進捗が大幅に遅れることとなっている。もう一年度分の事業の延長も選択肢として考慮しつつ、なるべく所期の目的を速やかに達成するため研究を進めていく予定。本研究では、経済・環境の持続可能性の解釈に関して新しい見方を提供することを目的として、リスク・不確実性の要素を盛り込んだ自然資本の価値の定量化を経済学的な観点から研究することを目指している。具体的には、財・サービスを提供する環境要素のストックを資本とみなしつつそのような広義の資本の増減を評価することによって持続可能性を評価するアプローチ(資本アプローチ)と、人間活動の持続可能性は地球環境の様々な要素に関する臨界点を超えない程度にあるかどうかにより判断されるべきという考え方(プラネタリー・バウンダリーズ)の持続可能性評価の二つのアプローチに関して、後者の要素を前者に取り込んだ経済的価値評価の手法について検討することを計画している。平成29年度における研究成果についてであるが、まず、下の「現在までの進捗状況」にも記す通り、平成29年度に研究代表者(本プロジェクトの事実上唯一のメンバー)の予期しない形での転任があり、当該年度中において本研究の実施にほとんど時間を割くことができない、すなわち研究の進展がほとんど図られない状況にあった。その上で、平成29年度において本プロジェクトのの関連で実施した研究は以下の通り。(1)不確実性下における意思決定を分析するための手法の一つであるRobust Decision Makingフレームワークについて、具体的な環境経済評価に簡便な形で応用できるかどうかについて検討した(実施中)。(2)プラネタリー・バウンダリーズの一構成要素である海洋の酸性化について、既存文献(特に経済評価の既存研究)をレビューしつつリスク分析の観点から新たな分析が可能かどうかについて検討した(実施中)。申請時に予期していなかった事情として、平成29年度に研究代表者(事実上の唯一のプロジェクトメンバー)の転任があり、その前後における本研究以外の業務等の遂行に多大な時間を要したため、当該年度中はほとんど本研究に時間を割くことができなかった。

上記の通り研究は当初の予定から大幅に遅れている状況であるが、まずは当初の計画において第一及び第二年度目に行うことになっていた研究(分析的な経済数学モデル及び数値シミュレーションモデルの構築)について、平成30年度にできる限り進展させていくこととしたい。もう一年度分の事業の延長も選択肢として考慮しつつ、なるべく所期の目的を速やかに達成するため研究を進めていく予定。研究実施が遅れ、平成29年度に当初予定していた活動が行われなかったため(旅費)。平成30年度以降に遅延していた研究活動の実施とともに経費を使用する予定。別欄に記載した理由による事業全体の進捗の遅れを反映して支出についても遅れが生じている。事業期間の延長も選択肢として視野に入れつつも、研究についてなるべく速やかに実施を図るとともにそれに伴う支出も行っていく予定。
多成分バクテリオシンを介した乳酸菌の生き残り戦略の解明とその利用に関する研究

多成分のバクテリオシンを同時に生産する珍しい乳酸菌が見出されており、それぞれの抗菌スペクトルや諸特性が多様性に富むことから、それらバクテリオシンあるいは乳酸菌自体を利用した、より高度な微生物制御の実現が期待されている。本研究では、多成分バクテリオシン生産乳酸菌の生き残り戦略の解明を通して、高度な微生物制御を実現する足掛かりとするだけでなく、微生物生態学への新たな知見を提供することを目的としている。本年度は、多成分バクテリオシン生産乳酸菌のモデル生物であるEnterococcus faecium NKR-5-3(エンテロシンンNKR-5-3A、B、C、D、Z (Ent53A、B、C、D、Z)生産菌)を用いて、1.バクテリオシンの生産制御機構の解明、2.マルチプルトランスポーターの分泌能解析、および3.多成分バクテリオシン生産乳酸菌の生き残り戦略の解明を試みた。1.では、バクテリオシン生合成遺伝子群の転写解析を行ったところ、培養条件により変化するバクテリオシンの生産性は、転写レベルで制御されていた。特に、誘導ペプチド(Ent53D)による転写誘導が本株のバクテリオシン生産に必須であることが明らかとなった。2,では、バクテリオシン前駆体が有するリーダーペプチドに注目し、Ent53A、C、D、Zの分泌を担う本株のトランスポーター(Ent53T)の分泌能を解析した。結果として、Ent53Tはリーダーペプチドの配列や長さ、およびバクテリオシンの構造に対して非常に寛容な基質認識機構を有することが明らかとなった。よって、この特性により本株は構造の異なる種々のバクテリオシンを分泌することが可能であると推察された。3,では、本株と他の多成分バクテリオシン生産菌(エンテロシンA、B生産菌)であるEnterococctts faecium JCM 5804^T (5084株)を用いて、交差耐性能試験や交差バクテリオシン生産誘導試験を試みた。その結果、両株とも交差耐性能を示さず、5804株のバクテリオシン生産はEnt53Dにより誘導されなかった。(抄録なし)多成分のバクテリオシンを同時に生産する珍しい乳酸菌が見出されており、それぞれの抗菌スペクトルや諸特性が多様性に富むことから、それらバクテリオシンあるいは乳酸菌自体を利用した、より高度な微生物制御の実現が期待されている。本年度は、多成分バクテリオシン生産乳酸菌のモデル生物であるEnlerococcus faecium NKR-5-3を用いて、1.多成分バクテリオシン生産乳酸菌のバクテリオシン生合成遺伝子群の解明、および2.マルチプルトランスポーターの分泌能解析を試みた。1.では、本菌株の生合成遺伝子群のうち生合成や自己耐性、生産制御に関与すると予想される遺伝子について機能解析を行った。異種発現および遺伝子破壊の結果、ABCトランスポーターと相同性を有するEnt53Tは、本菌株が生産する5つのバクテリオシンうち4つ(エンテロシンンNKR-5-3A、C、D、Z)を菌体外に分泌することが明らかになった。また、エンテロシンNKR-5-3AおよびZ、エンテロシンNKR-5-3Cのそれぞれに対する自己耐性遺伝子も特定された。一方、誘導ペプチド(エンテロシンンNKR-5-3D)をシグナルとしたバクテリオシンの生産誘導に重要な転写因子やヒスチジンキナーゼをコードする遺伝子(ent53R、enl53K)も本生合成遺伝子群内に発見され、それら遺伝子破壊によりバクテリオシン生産誘導に関与することが明らかになった。2.では、バクテリオシン前駆体が有するリーダーペプチドに注目し、Ent53Tの基質認識におけるその重要性について解析した。Ent53Cのリーダーペプチドを変異させた構造遺伝子とent537を共発現させた株のバクテリオシン分泌能を評価した結果、リーダーペプチドの配列自体はEnt53Tの基質認識に大きな影響を与えないことが示唆された。

2,では、バクテリオシン前駆体が有するリーダーペプチドに注目し、Ent53A、C、D、Zの分泌を担う本株のトランスポーター(Ent53T)の分泌能を解析した。結果として、Ent53Tはリーダーペプチドの配列や長さ、およびバクテリオシンの構造に対して非常に寛容な基質認識機構を有することが明らかとなった。よって、この特性により本株は構造の異なる種々のバクテリオシンを分泌することが可能であると推察された。3,では、本株と他の多成分バクテリオシン生産菌(エンテロシンA、B生産菌)であるEnterococctts faecium JCM 5804^T (5084株)を用いて、交差耐性能試験や交差バクテリオシン生産誘導試験を試みた。その結果、両株とも交差耐性能を示さず、5804株のバクテリオシン生産はEnt53Dにより誘導されなかった。E. faecrum NKR-5-3が生産する多成分バクテリオシンの生産機構がおおむね明らかになったことで、研究目的である多成分バクテリオシン生産乳酸菌の生き残り戦略の一端を解明することに成功した。一方、多成分のバクテリオシンを分泌するマルチプルトランスポーターの詳細な分子機構については計画よりもやや遅れてはいるが準備は進んでおり、次年度に研究の進展が期待される。当初の計画通り、多成分バクテリオシン生産乳酸菌が有するバクテリオシン生産制御機構の解明を行うのと共に、それら乳酸菌間における生き残り戦略について解析していく予定である。また、マルチプルトランスポーターの分泌能解析については、今後も継続して行っていく。(抄録なし)
クラウドソーシングによるコスト削減のため機械学習法

本研究は,クラウドソーシングサービスを利用した大規模データへの高精度ラベル付与タスクにおいて,ラベル付与が必要なデータとワーカーの特質に着目することにより,サービス利用時のコストを抑えることが可能な機械学習法を提案する.本研究は,大規模データと多数のラベルを対象としたラベル付与においてトレードオフの関係にあるコスト削減と品質向上を同時に目指す点が挑戦的であり,独自性がある.本研究の成果は,近年脚光を浴びている深層学習などの教師付き機械学習において本質的な問題である学習データの作成に直接貢献することから,産業界における多様な分野での人工知能技術の実用化と進展が期待できる.本研究は,クラウドソーシングサービスを利用した大規模データへの高精度ラベル付与タスクにおいて,ラベル付与が必要なデータとワーカーの特質に着目することにより,サービス利用時のコストを抑えることが可能な機械学習法を提案する.本研究は,大規模データと多数のラベルを対象としたラベル付与においてトレードオフの関係にあるコスト削減と品質向上を同時に目指す点が挑戦的であり,独自性がある.本研究の成果は,近年脚光を浴びている深層学習などの教師付き機械学習において本質的な問題である学習データの作成に直接貢献することから,産業界における多様な分野での人工知能技術の実用化と進展が期待できる.
インプラント周囲組織に対するアーチファクトフリー評価法を用いた縦断研究

インプラント体埋入術前と術後についてCBCT画像の重ね合わせを行い、インプラント体周囲組織の変化を観察した。従来までの方法では、インプラント体埋入が終了した術後においては、基準となるインプラント体が存在するためにインプラント体周囲組織の変化を観察することが可能であったが、術前においては基準となるインプラント体が存在しないため、その評価は困難であった。本研究の手法を用いることで、額骨同士の重ね合わせが可能になったため、重ね合わせ後に計測断面を決定することで術前から術後に至るまでの同一平面上での表示が可能となり、より詳細なインプラント体周囲組織の経時的の変化に対する評価を行うことに成功した。平成27年度はインプラント体埋入術前と術後についてCBCT画像の重ねあわせを行い、インプラント体周囲組織の経時的な変化を観察した。従来までの方法では、インプラント体埋入が終了した術後においては基準となるインプラント体が存在するためにインプラント体周囲組織の変化を詳細に観察することが可能であったが、術前においては基準となるインプラント体が存在しないため、その評価は困難であった。本研究の手法を用いることで、顎骨どうしの重ねあわせが可能となったため、重ねあわせを行った後に計測断面を決定することで術前から術後に至るまでの同一平面上での表示が可能となり、より詳細なインプラント体周囲組織の変化に対する評価を行うことに成功した。また、複数の対象患者の歯列模型とCBCT画像との重ねあわせについても検証を行い、模型のSTLファイルとCBCTのDICOMデータの重ねあわせの精度が十分に高いことが明らかとなった。この機能を使用することでよりインプラント体周囲の軟組織の状態の評価が可能となると考えられる。さらには、現在までは概念的であった患者のバイオタイプについて視診とCBCT画像の関連性を検討し、今までは術者の主観的な診断項目であったバイオタイプを定量的に分析し、新たな知見を得た。以上の研究結果の一部について平成27年9月の日本口腔インプラント学会総会学術大会、12月の日本口腔インプラント学会近畿北陸支部大会にて研究発表を行い研究成果の広い普及に努めた。予定よりも対象患者が少ないため、やや研究が遅れている。順調に患者が集まるかについては見通しは立っているものの、確実性はないと考えられる。ただし、予定になかったバイオタイプの評価について研究を行うことができているため、その点については予定よりも進行している。平成28年度はインプラント体埋入術前と埋入術後についてCBCT画像の重ね合わせを行い、インプラント体周囲組織の経時的な変化を観察した。従来までの方法では、インプラント体埋入が終了した術後においては、基準となるインプラント体が存在するためにインプラント体周囲組織の経時的な変化を詳細に観察することが可能であったが、埋入術前においては基準となるインプラント体が存在しないため、その評価は困難であった。本研究の手法を用いることで、顎骨どうしの重ねあわせが可能となったため、重ねあわせを行った後に計測断面を決定することで埋入術前から埋入術後に至るまでの同一平面上での表示が可能となり、より詳細なインプラント体周囲組織の経時的な変化に対する評価を行うことに成功した。また、複数の対象患者の歯列模型とCBCT画像との重ねあわせについても検証を行い、歯列模型のSLTファイルとCBCTのDICOMデータの重ねあわせの精度が十分に高いことが明らかとなった。さらには、現在までは概念的であった患者の歯肉のバイオタイプについて視診とCBCT画像の関連性を検討し、今までは術者の主観的な診断項目であった歯肉のバイオタイプを定量的に分析し、新たな知見を得た。以上の研究結果の一部について平成28年7月の日本補綴歯科学会学術大会や平成28年9月の日本口腔インプラント学会学術大会、平成29年3月のAcademy of osseointegrationにて研究発表を行い研究成果の広い普及に努めた。引き続き対象患者について追跡調査を行い、インプラント周囲組織の変化を検討する。データが揃うまでに、どの点に注目して分析を行うかについても詳細に検討する。平成28年度には研究の成果を広く発信していき、歯科インプラント学の発展に貢献できるように努める。28年度が最終年度であるため、記入しない。口腔インプラント学28年度が最終年度であるため、記入しない。
動脈塞栓術に関する実験的研究ー塞栓物質の組成が血行動態に及ぼす影響について

平成13年度は実際の実験を行い以下の結果を得た.ラット約50匹用い,各種塞物質の小腸動脈内での動態を生体顕微鏡で観察後,壁障害と検討し,さらに血管鋳型標本を作成検討することによって,安全な小腸動脈塞栓術の開発を試みた.コントロールとして用いたマイクロスフェアーは、球形で血管内でも形状が変化せず、サイズが均一であるという特徴を持ち、直動脈を塞栓するサイズのものが実験で用いた試料の中では塞栓物質として理想に近かった。ゲルフォームは、不整形で血管内で形状が変化し断片化する特性がある。このため塞栓レベルが限局されにくく、塞栓効果も一定ではなかった。また十分に塞栓した際には障害が強かった。ポリビニルアルコールは、不整形で血管内で形状が変化しにくく塞栓レベルは比較的限局していたが、個々のサイズにばらつきがありマイクロスフェアーと比較し塞栓レベルには幅があった。このため直動脈径より大きなサイズの際には障害が強かった。塞栓を目的とする血管の近位より(可能ならばその遠位も)閉塞させ、かつ末梢の血行が側副路で維持され、結果として腸管壁に明らかな壊死を惹起しない塞栓術が最適と考えられる.そのため塞栓を目的とする血管径に近いサイズで均一な塞栓物質が理想であり、また出血部位の遠位までカテーテルをすすめることができれば遠位および近位でのコイリングも有効と考えられた。今後同様の実験を肝動脈,門脈に対して施行し,有用な肝塞栓術の開発を行う予定である.平成12年度は、観察装置として生体顕微鏡は主にキーエンス社製高精細デジタルマイクロスコープVH-6300を使用、観察記録はSONY社製ビデオ装置WV-D9000を用い、評価にはアップル社製パーソナルコンピュータMacintosh G3を使用し、対象動物として月齢3ヶ月程度のオスのウイスター系ラットを用い、まず比較的血管確保等の手技が容易な腸間膜の血管を対象にして実験系の確立に努めた。具体的には小腸腸間膜の上腸間膜動脈回腸枝の分枝を穿刺し、逆行性に塞栓物質を注入することにより穿刺動脈分枝に隣接する動脈分枝領域に対して、血行動態を変化させることなく塞栓が可能となる実験モデルの作成に成功した。また、VH-6300を使用してこの実験モデルを観察することにより、血管内の塞栓物質の動態を直視下に観察可能であることを確認し得た。今後は具体的に液体塞栓物質である油性造影剤のリピオドールと抗癌剤、水溶性造影剤を種々の比率で混合したものをこの実験モデルの腸間膜動脈に注入し、塞栓物質の組成の違いが腸間膜血管の血行動態に及ぼす影響をVH-6300使用下で観察する予定である。また、予備実験によりVH-6300使用によるラット肝類洞の観察の可否を検討したところ、光源強度の問題によりVH-6300でのラット肝類洞レベルの血行動態観察が困難であることが判明したため肝内血行動態の検討は代替的手段を用いて行うこととした。具体的には腸間膜血管の血行動態の検討で使用する種々の塞栓物質をVH-6300観察下でラット肝動脈及び門脈に動注し、これらの血管及び肝類洞レベルに生じる組織学的変化を光顕的に観察、肝類洞血の血行動態の変化を検討し、動脈塞栓術時の塞栓物質の至適条件を推定する予定である。今後同様の実験を肝動脈,門脈に対して施行し,有用な肝塞栓術の開発を行う予定である.
脂肪細胞の熱産生機能覚醒を目指した細胞応答不均一性の解析と分化転換に関する検討

褐色脂肪細胞を標的とした従来の研究では、生体全体のエネルギーバランスを操作する事象が重要視され、褐色脂肪組織丸ごとのエネルギー消費容量を測定することができれば十分な成果が得られたものと判断されてきた。一方で、組織を構成する脂肪細胞の不均一性があるため、これらの研究では生体のエネルギー状態に応じて変化する脂肪細胞の適応過程の本質を捉えるには不十分である。本研究では、褐色脂肪組織に含まれる脂肪細胞について個々に測定し、その細胞の多様性を詳細に検討することにより、脂肪組織全体の機能変化を細胞レベルで明らかにすることを試みた。褐色脂肪細胞は貯蔵された中性脂肪を酸化分解し熱として散逸する。この褐色脂肪細胞による熱産生は細胞内に豊富に存在するミトコンドリアの機能に由来するが、細胞内のミトコンドリアの数は個々の細胞の成熟度などの違いによって異なることが報告されている。そこで、単一褐色脂肪細胞におけるミトコンドリア数のカウントを目的とした、マイクロ流体デバイスによる測定法の確立を目指した。ミトコンドリアの擬似試料として、外径1μmの蛍光粒子を内径2μmのキャピラリーを利用し泳動することで、その個数を計測することに成功した。また、細胞一個を捕獲・培養・破砕するマイクロ流体デバイスを開発した。さらに、これらの技術を組み合わせ、細胞一個のミトコンドリア数の測定を試みた。この単一脂肪細胞測定法を用いた解析から、従来の細胞集団実験や固定された組織の観察では得られなかった情報が得られることが期待される。褐色脂肪細胞を標的とした肥満予防効果に関する研究は、ヒトの知見を含めて多くのデータが集積され始めている。これらの研究は、多くの場合、生体全体のエネルギーバランスを操作する事象が重要視され、褐色脂肪組織丸ごとのエネルギー消費容量を測定することができれば十分な成果が得られたものと推定される。しかし、組織を構成する脂肪細胞の不均一性があるため、生体のエネルギー状態に応じて変化する脂肪細胞の適応過程の本質を捉えるには不十分である。本研究では、褐色脂肪組織に含まれる脂肪細胞の細胞性応答について個々に検討し、その細胞の多様性を詳細に検討することにより、脂肪組織全体の機能変化を分子レベルで明らかにすることを試みる。脂肪組織には成熟した脂肪細胞の他に前駆脂肪細胞が含まれている。前駆脂肪細胞はある程度の継代培養が可能であるとともに、培地に分化誘導因子(甲状腺ホルモン、グルココルチコイド、インシュリンなど)を添加することによって成熟脂肪細胞を得ることができる。本研究ではまず、調製が容易でしかも集団内での細胞機能の均一性が一定に保たれている培養脂肪細胞を用いてβAR刺激に対する熱産生を測定した。単一培養脂肪細胞の熱産生応答を解析するため、早稲田大学理工学術院で新たに開発されたミクロ温度計測法を用い、βAR作動薬添加後に変化する細胞の温度をリアルタイムで計測した。また、褐色脂肪細胞による熱産生を担うミトコンドリア脱共役タンパク質1(Uncoupling protein 1, UCP1)の活性を同時にモニターするため、膜電位感受性のミトコンドリア色素を細胞に前処理し、βAR刺激によるUCP1活性の変化を観察した。褐色脂肪細胞を標的とした肥満予防効果に関する研究は、多くのデータが集積され始めている。しかし従来の研究では、生体全体のエネルギーバランスを操作する事象が重要視され、褐色脂肪組織丸ごとのエネルギー消費容量を測定することができれば十分な成果が得られたものと判断されてきた。本研究では、褐色脂肪組織に含まれる脂肪細胞について個々に解析し、細胞の多様性を詳細に検討することを目指す。この褐色脂肪細胞による熱産生は細胞内に豊富に存在するミトコンドリアの機能に由来する。

しかし、細胞内に存在するミトコンドリアの数は個々の細胞の成熟度などの違いによって異なる。したがって本年度は、単一褐色脂肪細胞のミトコンドリア数に焦点を絞り、マイクロ流体デバイスを利用した測定法の確立を目指した。ミトコンドリアの擬似試料として、外径1μmの蛍光粒子を内径2μmのキャピラリーを利用し泳動することで、その個数を計測することに成功した。また、細胞一個を捕獲・培養・破砕するマイクロ流体デバイスを開発した。さらに、これらの技術を組み合わせ、細胞一個のミトコンドリア数の測定を試みた。この単一脂肪細胞測定法を用いた解析から、従来の細胞集団実験や固定された組織の観察では得られなかった情報が得られることが期待される。
抑制性マイクロクラスターによるT細胞活性化制御機構の研究

負の補助刺激受容体CTLA-4のイメージング解析を行うことよって、CTLA-4がクラスターを形成し、免疫シナプスに中心にある正の補助刺激受容体CD28とその下流のキナーゼと足場蛋白から構成される活性中心を破壊、T細胞活性化シグナルを遮断する分子機構を明らかにした。T細胞活性化を担うT細胞受容体-CD28マイクロクラスターに対し、活性化を弱める抑制性マイクロクラスターの存在が示された。T細胞の活性化は、T細胞受容体(TCR)からと副刺激受容体からの二つのシグナルによって制御される。前者はT細胞活性化のオン・オフを、後者は、細胞分裂・サイトカイン産生・エフェクター細胞への分化など、活性化の方向性を決定する。T細胞の副刺激受容体には、活性型と抑制型が存在し、それぞれCD28とCTLA-4が知られている。両者は同じリガンドCD80/86を共有するため、CTLA-4はCD28とリガンドとの結合を拮抗阻害することで抑制効果を誘導すると考えられている。一方、T細胞活性化の場として、T細胞と抗原提示細胞との境界面に形成される「免疫シナプス」という二次元構造が知られている。我々は、免疫シナプスが、TCR数十個から成るシグナル分子の集合体「TCRマイクロクラスター」の集まりであり、中心部の受容体凝集体central supramolecular activation cluster(cSMAC)を構築していることを明らかにした(Nat Immunol, 2005)。また、近年、CD28もTCRと共にマイクロクラスターを形成し、特異的なプロテインキナーゼPKCθをcSMACヘリクルートし、T細胞の活性化を正に制御していることを明らかにした(Immunity, 2008)。更には、CTLA-4が強力なリガンド結合能力を有することで、CD28とPKCθのcSMACへの局在を阻害し、T細胞活性化を抑制していることを明らかにし、画像化に成功した(論文投稿中)。副刺激受容体シグナルの臨床応用は、既に癌免疫療法やアレルギー・自己免疫疾患などで進んでいる。副刺激受容体を介するT細胞活性化の制御メカニズムは、これまでのシグナル研究だけでは混沌としていたが、新たな視点から解明を進めることで、今後より効果的な副刺激受容体の利用法が期待できる。T細胞シグナル伝達系の一分子イメージングというアプローチから、申請者は、T細胞と抗原提示細胞との境界面に形成されT細胞活性化の場として働く「免疫シナプス」が数十個T細胞受容体と下流のシグナル伝達分子の集合体「TCRマイクロクラスター」によって形成され、これらマイクロクラスターがT細胞の活性化を制御していることを明らかにしてきた(Nat,Immunol.,2005)。また、正の補助刺激受容価CD28が、特殊なプロテインキナーゼCθと共に、免疫シナプスの中央にできる中心部超分子クラスターで新たな活性中心を作り、T細胞の活性化を増強・遷延させていることを明らかにした(Immunity,2008)。今年度、申請者は、CD28とリガンドを共有する負の補助刺激受容体CTLA-4が、CD28とプロテインキナーゼCθとの中心部超分子クラスターへの局在を阻害し、T細胞活性化を抑制していることを明らかにした((Immunity,2010)。また.CTLA-4の抑制機構が自身の分子の高さに起因すること、また、この抑制メカニズムが制御T細胞の不応答のメカニズムにも寄与していることを明らかにした。細菌やウイルスなどの異物を排除するため、T細胞はこれら外来抗原を認識し活性化するが、免疫系全体の司令塔として働くT細胞の過剰な活性化は、自己免疫疾患などを誘発する司能性があり、生体にとって非常に危険である。これを回避するため、T細胞にはさまざまな負のフィードバック機構が備わっており、その中でもCTLA-4の抑制御は重要である。副刺激受容体シグナルの臨床応用は、既に癌免疫療法やアレルギー・自己免疫疾患などで進んでおり、イメージングという新たな視点から解明を進めることで、今後より効果的な利用法が期待できる。T細胞シグナルのイメージング解析から、当研究代表者は、T細胞受容体(TCR)数十個とその下流のシグナル伝達分子から成る、T細胞の活性化を司る最小ユニット「TCRマイクロクラスター」を発見した(Nat.Immunol.,2005)。また、正の補助刺激受容体CD28が、新たな活性中心を作り、TCR近傍のシグナル伝達経路と協調的に、T細胞の活性化を増強・遷延させていることを明らかにした(Immunity,2008)。更に、昨年度、CD28とリガンドを共有する負の補助刺激受容体CTLA-4が、抑制性マイクロクラスターを形成し、CD28シグナルを阻害、T細胞を不活性化させる分子機構を、イメージング解析にて明らかにした(Immunity,2010)。もう一つの負の補助刺激受容体PD-1は、その抗体療法が担癌状態における免疫賦活化効果や慢性ウイルス感染症根治に対して有効とされ、臨床的にも重要な分子である。

本年度当研究課題において研究代表者は、PD-1クラスターの分子イメージングに成功し、TCRマイクロクラスターと同じ部位に抑制性マイクロクラスターを形成、フォスファターゼSHP2を特異的にリクルートし、TCRマイクロクラスターに凝集するTCR近傍のシグナル伝達分子を広範に脱リン酸化することを明らかにした。さらに、近年慢性ウイルス感染に重要であると注目されている消耗性T細胞においても、PD-1マイクロクラスターが形成されること、PD-1マイクロクラスターの形成阻害が消耗性T細胞の不応答の解除に関連していることを明らかにした。T細胞が持つ多様な負のフィードバック機構、特にCTLA-4やPD-1を介する抑制制御を、イメージングという新たな視点から解明することで、今後,上記免疫療法への応用も期待できる。
糖鎖集積バイオインターフェースによる幹細胞分化マテリアルセラピー

【研究目的】生理活性糖キトヘキサオース(βGlcNAc6)をnmオーダーで密度制御可能な糖鎖ラフトを多数有した新規糖鎖集積バイオインターフェースを創出し、糖鎖基板刺激による神経幹細胞マテリアルセラピーに挑戦する。幹細胞を用いた再生医療の実現に向けて幹細胞の生育・分化に必要な他生物由来成分サイトカイン・血清・他細胞無添加条件下における新規再生医療技術の開発が期待される。【2年目の研究進捗状況】現在、進捗は芳しくない。また、学会発表やアウトリーチ等も行えていない状況である。昨年の10月から博士2年生として復帰しているが、長鎖糖鎖からセロヘキサオース(βGlc6)およびβGlcNAc6を調製する材料作りに数ヶ月費やしている。また、産休前に行ってきた実験の再現性が取れず、執筆中の論文も手が止まっている状況である。1年目の目標である3種糖鎖基板の調製にも着手できていない。材料は少しずつ調製できているので、あと半年を使って論文投稿及び1年目の3種糖鎖基板調製・基板解析方法の確立、2年目の目標である神経幹細胞を用いた分化誘導反応を引き起こす基板の調製を達成したいと考えている。1バイオインターフェース基板の検討本年度後期より研究活動を再開したが、育休産休以前までの実験すら再現性を取れない状況である。糖鎖の材料作りも遅れており、1年目目標の3種{βGlcNAc6・βGlc6・セロビオース(βGlc2)}糖鎖ハイブリッド自己集積膜(SAM)の調製・表面解析までも至らなかった。2マウス由来神経幹細胞の検討2一面金コートした基板上に2種の糖鎖を固定した糖鎖自己集積基板上にてマウス神経幹細胞を培養した。基板の状態に問題がみられ、産休以前に得られていたような配合する糖鎖比率の違いで神経幹細胞の分化に変化が見られるという結果は得られなかった。しかし、基板上の金コートが剥がれた部位で神経幹細胞の分化に差が見られるという結果を得た。平成28年度の後期から復帰したため、本進捗状況は半年分の成果である。また、βGlcNAc6・βGlc6の材料作りを一から行っており、材料作りに数ヶ月要していた。また、材料が少しずつ得られても、1.5年のブランク後、産休以前に行っていた実験の再現性が取れず、同じ試験を何度も行い、新しい実験を始めることができなかった。βGlc2は前々から準備しており、神経幹細胞や遺伝子解析に必要な試薬等もすでに準備できているため、いち早く産休以前のデータの再現性を取り、目標に近づけるよう実験を進めていきたい。1バイオインターフェース基板の検討引き続き、2種糖鎖を用いたハイブリッドSAMを用いた研究の検討及び論文化と、βGlcNAc6・βGlc6・βGlc2のハイブリッドSAMの界面ナノ構造の解明と各スペーサー分子を上手く利用した新規ハイブリッド3種糖鎖SAMの調製を速やかに行う予定である。2マウス由来神経幹細胞の検討2種糖鎖ハイブリッドSAM上にてマウス神経幹細胞を培養したところ、基板上の金コートが剥がれた部位で神経幹細胞の分化に差が見られるという結果を得た。本研究室において、スリット基板を用いてライン状にデザインした金コート基板上に糖鎖を修飾後、基板上で培養した筋芽細胞の分化・成長の方向性を一部制御するという成果を挙げていた。これまでの研究と今回の実験結果を踏まえ、神経幹細胞培養時の分化状況の差も金コートデザインによって効果的に引き起こしうると考えたため、今後はハイブリッド糖鎖基板及びライン状デザイン金コート基板を用いて神経幹細胞の分化誘導について検討していく予定である。具体的にはリアルタイムPCRや免疫染色を用いた遺伝子発現挙動解析を行う。また、界面ナノ構造と細胞の分化状態の相関性についても検討を進めていきたい。【1年目の研究進捗状況】βGlcNAc6・セロヘキサオース(βGlc6)、βGlcNAc6・βGlc2(セロビオース)の各2種糖鎖における基板検討を行った。βGlcNAc6・βGlc2ハイブリッドSAMにおいてGlcNAcの非還元末端を認識するWGAレクチンアッセイを行った結果、βGlcNAc6・βGlc6ではβGlcNAc6の配合率が0%から100%に至るまでWGAによる基板認識を示す蛍光が徐々に強く表れたが、βGlcNAc6・βGlc2ハイブリッドSAMではβGlcNAc6の配合率が50%を超えないとWGAの蛍光は発現しなかった。このことからβGlc6とβGlc2ではβGlcNAc6とのSAM調製時に異なる働きを持ったスペーサーとして機能することが示唆された。マウス由来神経幹細胞を用いて、幹細胞の分化応答を検討した。βGlcNAc6-SAM上で培養した際、培養3日目には神経への分化にスイッチが入ったことを示す神経細胞様の突起伸長が確認された。βGlcNAc6とβGlc6の2種糖鎖ハイブリッドSAMs上でマウス由来神経幹細胞を培養したところ、糖鎖密度の違いで分化誘導に変化が見られた。

市販の細胞培養基板TCPSでは細胞増殖のみが観察される培養条件において、βGlcNAc6の密度が高くなるにつれて神経幹細胞塊ニューロスフィアの約40%(200 μm以上のニューロスフィアではほぼ100%)で神経細胞様の突起伸長が認められた。【研究目的】生理活性糖キトヘキサオース(βGlcNAc6)をnmオーダーで密度制御可能な糖鎖ラフトを多数有した新規糖鎖集積バイオインターフェースを創出し、糖鎖基板刺激による神経幹細胞マテリアルセラピーに挑戦する。幹細胞を用いた再生医療の実現に向けて幹細胞の生育・分化に必要な他生物由来成分サイトカイン・血清・他細胞無添加条件下における新規再生医療技術の開発が期待される。【2年目の研究進捗状況】現在、進捗は芳しくない。また、学会発表やアウトリーチ等も行えていない状況である。昨年の10月から博士2年生として復帰しているが、長鎖糖鎖からセロヘキサオース(βGlc6)およびβGlcNAc6を調製する材料作りに数ヶ月費やしている。また、産休前に行ってきた実験の再現性が取れず、執筆中の論文も手が止まっている状況である。1年目の目標である3種糖鎖基板の調製にも着手できていない。材料は少しずつ調製できているので、あと半年を使って論文投稿及び1年目の3種糖鎖基板調製・基板解析方法の確立、2年目の目標である神経幹細胞を用いた分化誘導反応を引き起こす基板の調製を達成したいと考えている。1バイオインターフェース基板の検討本年度後期より研究活動を再開したが、育休産休以前までの実験すら再現性を取れない状況である。糖鎖の材料作りも遅れており、1年目目標の3種{βGlcNAc6・βGlc6・セロビオース(βGlc2)}糖鎖ハイブリッド自己集積膜(SAM)の調製・表面解析までも至らなかった。2マウス由来神経幹細胞の検討2一面金コートした基板上に2種の糖鎖を固定した糖鎖自己集積基板上にてマウス神経幹細胞を培養した。基板の状態に問題がみられ、産休以前に得られていたような配合する糖鎖比率の違いで神経幹細胞の分化に変化が見られるという結果は得られなかった。しかし、基板上の金コートが剥がれた部位で神経幹細胞の分化に差が見られるという結果を得た。平成28年度の後期から復帰したため、本進捗状況は半年分の成果である。また、βGlcNAc6・βGlc6の材料作りを一から行っており、材料作りに数ヶ月要していた。また、材料が少しずつ得られても、1.5年のブランク後、産休以前に行っていた実験の再現性が取れず、同じ試験を何度も行い、新しい実験を始めることができなかった。βGlc2は前々から準備しており、神経幹細胞や遺伝子解析に必要な試薬等もすでに準備できているため、いち早く産休以前のデータの再現性を取り、目標に近づけるよう実験を進めていきたい。年度前半は国内学会・国際学会における発表に力を尽くしていた。しかし、目標を達成すべく研究に勢力を出すべき年度後半に妊娠が発覚、体調が思うようにコントロールできず、研究の進捗が滞った。結果として、1年目の目標は達成できていない。しかし、2年目以降に行う予定であったマウス神経幹細胞を用いた研究を始めることができたので、次年度以降はスムーズに研究に取り組めると考えている。1バイオインターフェース基板の検討
γ-ブチロラクトン型信号物質による放線菌二次代謝制御カスケードの解明

多種多様な二次代謝産物を生産する放線菌は、微生物由来の薬理活性物質の約3分の2以上を生産することから医薬品開発にとり重要な菌群である。そこで、生産性向上などにつながる二次代謝を改変できるツールとして、γ-butyrolactone型信号伝達物質(autoregulator)の存在が注目されている。放線菌に広く分布するautoregulatorは、対応する個々のレセプタータンパク質と協調して、二次代謝産物の生合成遺伝子群を転写制御するなど一部メカニズムが明らかになりつつあるが、その詳細についてはブラックボックスのままであった。本研究は、さまざまな放線菌のautoregulator制御系の解明・比較解析にもとづき、工業放線菌を対象とした一般放線菌に適用しうる普遍的な二次代謝制御モデルを構築、二次代謝の人為的活性化法に利用しようとするものである。研究期間中、Streptomyces virginiaeが生産するvirginiamycinの生合成遺伝子群とその制御因子を新たに発見、その機能を同定した。これらは各々virginiamycinの生産初期段階、後期段階を司る重要な因子であることを明らかにした。また、モデル放線菌S.coelicolor A3(2)では、レセプターと二次代謝生合成遺伝子群の間に機能する新たな制御因子を見いだした。次に、実用工業放線菌4種よりも同様のレセプターを取得したことから、工業生産菌におけるレセプターの重要性を示すことにも成功した。以上より、放線菌におけるautoregulatorを中心とした二次代謝制御モデルの構築が可能となり、二次代謝の人為的活性化法に必要な情報を提供できると考えられる。本研究では、放線菌二次代謝制御カスケードの模範例とみなせるγ-ブチロラクトン型信号物質(autoregulator)とそのレセプタータンパク質を介した制御系について、各々タイプが異なるautoregulator支配下にある3種の放線菌[Streptomyces virginiae, Streptomyces lavendulae、および放線菌の遺伝学的基準菌Streptomyces coelicolor A3(2)]などを対象とし、特異的レセプタータンパク質へのautoregulator結合にはじまり、最終的には抗生物質生合成遺伝子クラスターの転写誘導にいたる多段階の情報伝達経路に関して、各段階を司る制御因子の単離、制御機構の確定、情報伝達全経路の把握を経て、3菌株間での制御カスケードの比較・解析に基づき、一般放線菌に適用可能な普遍的二次代謝制御モデルを確立し、二次代謝遺伝子群の人為的活性化法を見いだす事を目的とする。本年は、Streptomyces virginiaeのレセプター依存制御経路に属する制御因子BarBとBarZについて解析を行った。S.virginiaeのbarB遺伝子について、大腸菌よりの接合伝達により遺伝子破壊プラスミッドを導入し、ゲノム上のbarB遺伝子との間での相同組み換えによりbarB破壊株を作成後、種々の表現形質について解析した結果、BarBは、胞子形成などの形態分化には全く関与しないが、抗生物質virginiamycinの生産誘導の初期過程を制御する因子であることが判明した。同様にBarZについても破壊株作成、表現型解析を行った結果、BarZは、逆にvirginiamycin生産後期の制御に係わる制御因子であることが明白となった。

本研究では、放線菌二次代謝制御カスケードの模範例とみなせるγ-ブチロラクトン型信号物質(autoregulator)とそのレセプタータンパク質を介した制御系について、各々タイプが異なるautoregulator支配下にある3種の放線菌[Streptomyces virginiae, Streptomyces lavendulae、および放線菌の遺伝学的基準菌Streptomyces coelicolor A3(2)]などを対象とし、特異的レセプタータンパク質へのautoregulator結合にはじまり、最終的には抗生物質生合成遺伝子クラスターの転写誘導にいたる多段階の情報伝達経路に関して、各段階を司る制御因子の単離、制御機構の確定、情報伝達全経路の把握を経て、3菌株間での制御カスケードの比較・解析に基づき、一般放線菌に適用可能な普遍的二次代謝制御モデルを確立し、二次代謝遺伝子群の人為的活性化法を見いだす事を目的とする。多種多様な二次代謝産物を生産する放線菌は、微生物由来の薬理活性物質の約3分の2以上を生産することから医薬品開発にとり重要な菌群である。生産性向上などに結びつく二次代謝の人為的な改変できるツールとして、γ-butyrolactone型信号物質(autoregulator)の存在がここ近年の研究で浮かび上がってきた。放線菌に広く分布するautoregulatorは、対応する個々のレセプタータンパク質と協調して、二次代謝産物の生合成クラスターを転写制御することなどが明らかとなりつつあるが、その詳細な制御カスケードについてはブラックボックスのままであった。本研究は、さまざまな放線菌のautoregulator制御系の解明・比較解析に基づき、一般放線菌に適用しうる普遍的な二次代謝制御モデルを構築、二次代謝の人為的活性化法に利用しようとするものである。本研究では、モデル放線菌Streptomyces coelicolor A3(2)におけるautoregulator制御系を詳細に解明するため、マイクロアレイ解析を行った結果、レセプタータンパク質と二次代謝生合成遺伝子群の間で機能する新たな転写制御因子を見いだし、in vivoまたはin vitro両面からの解析から当該因子の機能を導き出した。また、S.virginiaeにおいてはレセプター遺伝子の隣に位置する約50kbpの塩基配列を決定したところ、新規制御因子を含む二次代謝生合成遺伝子クラスターを発見、in vivo解析からその機能の同定をおこない、制御カスケードの最終段階にあたることを決定した。また、実用工業放線菌2種よりのレセプター遺伝子の取得・解析から、autoregulatorレセプターの重要性を示すことに成功したことも踏まえ、autoregulatorを中心とした二次代謝制御モデルの構築が可能となった。
生態系の窒素過剰によるスギ花粉生産量の増大

日本の森林生態系は、都市近郊で窒素過剰な状態となっており、窒素過剰なスギ林は、余剰な窒素を窒素含量の高いスギ花粉で排出している可能性がある。したがって、都市近郊のスギ林ではスギ花粉の生産量が多いことが予想される。そこで、愛知県豊田市のスギ林内に3プロットに50kg、25kg、0kgの硫酸アンモニウムを散布し操作実験を行った。そして、リタートラップから花粉形態の違いや落葉・雄花・種子・球果の量や窒素濃度等を分析した。その結果、各トラップ間で落下雄花一個あたりの重さ、単位面積あたり雄花落下量、落下雄花の単位面積あたり個数、花粉形態に違いが見られなかった。さらに落葉・種子・球果の分析については現在分析中である。群馬、埼玉、東京、神奈川、静岡、愛知、京都、高知の合計約70地点でスギの開花直前の雄花、種子、生葉を採取し、窒素濃度と花粉形態を調べた。花粉を走査電子顕微鏡で形態観察を行ったが、地域による違いは全くなく、花粉粒の大きさや表面構造に変動はないと考えられる。関東地方では、雄花と生葉の窒素濃度が高い傾向があったが、種子窒素濃度は低い傾向であった。雄花の窒素濃度は生葉の窒素濃度と有意な正の相関(r=0.54,P<0.01)があったが、種子の窒素濃度は雄花および生葉の窒素濃度との間に関係はみられなかった。種子窒素濃度は平均気温および降水量と有意な正の相関があった。愛知県東部の豊田市に、試験地を設定し操作実験を開始した。スギ林内に窒素肥料を施用し、25kg、50kgの窒素肥料施用区と、無施用区の3プロットを設定した。平成17年の6月までに2回にわけて硫酸アンモニウムを施用し、その後を観察すると同時に、リタートラップを設置し、落葉や花粉飛散後の雄花の量や窒素濃度を比較するためサンプルを回収し、現在分析中である。平成18年1月には、大気の窒素汚染が激しく窒素過剰な生態系と考えられる群馬県、埼玉県、東京都、神奈川県および、窒素不足の生態系と考えられる静岡県、愛知県のスギ林を回り、雄花の着花量を観察すると同時に、雄花、雌花、生葉を回収し、窒素濃度の比較を行っている。また、花粉を顕微鏡で観察し、その形態の違いを観察した。花粉の形態については、これまでのところ場所による違いは小さく、変動は認められない。また、雄花、雌花、葉の窒素濃度については、場所による違いがあるものの、系統的な違いは認められなかった。今後、すべてのデータが出揃った段階で、詳細な解析を行う予定である。また、本年度の調査では、観察によって雄花の着花量の把握が困難だったため、来年度は調査時期を再考し、再度調査を行う予定である。また、同時期に調査を行っても、緯度や標高が異なり生物季節が異なると言う問題があった。未成熟の雄花と成熟した雄花を比較することになり、手法上の問題点となっており、この点も来年度の調査では改善策を練る予定である。昨年度に引き続き、愛知県豊田市の実験地にて操作実験を行った、スギ林内に3プロットに50kg、25kg、0kg硫酸アシモニウムを散布し、さらにリタートーラップの回収を行い、花粉形態の違いや落葉・雄花・種子・球果の量や窒素濃度等を分析した.その結果、落下雄花一個あたりの重さ、面積あたり雄花落下量、落下雄花の面積あたり個数、花粉形態にトラップ間の違いが見られなかった。落葉・種子・球果の分析については現在分析中である。花粉を走査電子顕微鏡で形態観察を行ったが、地域による違いは全くなく、変動はないと考えられる。雄花の窒素濃度は生葉の窒素濃度と有意な正の相関(r=0.54,P<0.01)があったが、種子の窒素濃度は雄花および生葉の窒素濃度どの間に関係はみられなかった。種子窒素濃度は平均気温および降水量と有意な正の相関があった.採取した種子は豊作年、雄花は凶作年と異なる年のものであるが、雄花と種子の生産に対して、資源投資が異なることが推察された。今後、全ての分析を行い、そのデータから詳細な解析を行う予定である。

群馬、埼玉、東京、神奈川、静岡、愛知、京都、高知の合計約70地点でスギの開花直前の雄花、種子、生葉を採取し、窒素濃度と花粉形態を調べた。花粉を走査電子顕微鏡で形態観察を行ったが、地域による違いは全くなく、花粉粒の大きさや表面構造に変動はないと考えられる。関東地方では、雄花と生葉の窒素濃度が高い傾向があったが、種子窒素濃度は低い傾向であった。雄花の窒素濃度は生葉の窒素濃度と有意な正の相関(r=0.54,P<0.01)があったが、種子の窒素濃度は雄花および生葉の窒素濃度との間に関係はみられなかった。種子窒素濃度は平均気温および降水量と有意な正の相関があった。