hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
女性被災者の実感を活かした被災者支援の方法再構築

東日本大震災の被災地にて、女性被災者への個別インタビュー及びグループインタビューを計4回、述べ12名について行なった。インタビューでは「被災後8年を経て、改めて発災後の支援について振り返る」をテーマとして、半構成法による自由な発話を求めた。発災後8年を経て、初めて被災経験を振り返り、証言できたという方もいるなど、被災者にとっては「被災はなお継続中」であり、インタビューは客観的事情についての証言と言うより、「主観的な思い」を語る内容となった。インタビュー内容はテープ起こしをして、本人に内容を確認してもらい、その後にインタビュイーのプライバシーを守るために必要な加工を施して、データ化した。そのデータの内容を深め、インタビュイーの証言を解釈するために再度のインタビューが必要であることも判明した。発災直後の避難所での支援は、総じて「良好」と証言されたが、そのことが直ちに「良い支援」であったと評価することはできず、むしろ「被災者なのでわがままを言うべきではない」という「判断」が先行していると思われた。また、避難所から自立的な生活に移行する過程での「出来事」と当事者の「思い」の間にはある種の「距離」があることも分かった。ここでも、「わがままを言えない」という判断があるように推察された。研究協力者は被災地で「町づくりワークショップ」を行なった(2019年3月。参加者16名、うち女性5名)。本研究は女性被災者の「実感」をあぶりだすことを課題としており、インタビュイーの証言を解釈する際に、研究協力者による背景(地域事情)を捉える活動は有効であることも分かった。2018年度には、東日本大震災の被災地に居住する女性被災者、女性外国人へのインタビューを行う予定であった。女性被災者へのインタビューの当初計画分は実施できたが、被災地の女性外国人を対象としたインタビューは未実施となった。調査対象となることを内諾していた女性外国人(複数)の日程調整が不調におわったためである。結果として、女性外国人へのインタビューは次年度に回さざるを得なくなり、やむをえないことと判断している。他方、女性被災者(調査対象地在住の日本人女性)へのインタビューは順調に進み、女性被災者の「ニーズ」と「ウオンツ」の間にある当事者の「胸の内(思い)」を聞くことができ、「遠慮」の中身や「心の動き」を人間の関係性の問題として検討の俎上に上げることが可能になった。研究当初計画では、女性被災者と女性外国人被災者のインタビューは各々別個のものとしていたが、両者を関連付けてインタビュー調査を設定しなおすこととした。このことにより、研究遂行の遅れが、翻って、望ましい成果を上げることにつながると期待する。被災地に居住する女性外国人被災者へのインタビュー調査を最優先事項として実施したい。その際に2018年度に実施した女性被災者へのインタビュー結果を受けて、インタビュー内容について新たに検討しなおしたい。すなわち、女性被災者が感じていた「思い」の中身を女性外国人被災者にも同様であったかを尋ねる項目を加えたい。研究初年度の女性被災者へのインタビュー調査の成果は「被災者による支援者への遠慮」の存在とそれら両者の間にある「人と人の関係性(心の動き)」を捉えることができたことである。研究2年目の2019年度には、漁業に従事している女性被災者を対象として、同様の調査を実施する計画である。調査対象者にはすでに内諾を得ており、現地の漁業の閑散期に実施する。女性漁業者への調査の後に、震災後に起業した女性グループへの調査も企画している。東日本大震災後には行政も関わって女性被災者の復興策の一つとして「起業」が奨励された経緯がある。本研究では既存の地場産業(漁業)従事者との比較検討を予定している。なお、女性漁業者、女性起業者へのインタビュー調査は当初には予定していなかったことであり、2018年度の女性被災者調査の結果から新たに企画した内容である。

本研究は女性被災者の「実感」をあぶりだすことを課題としており、インタビュイーの証言を解釈する際に、研究協力者による背景(地域事情)を捉える活動は有効であることも分かった。2018年度には、東日本大震災の被災地に居住する女性被災者、女性外国人へのインタビューを行う予定であった。女性被災者へのインタビューの当初計画分は実施できたが、被災地の女性外国人を対象としたインタビューは未実施となった。調査対象となることを内諾していた女性外国人(複数)の日程調整が不調におわったためである。結果として、女性外国人へのインタビューは次年度に回さざるを得なくなり、やむをえないことと判断している。他方、女性被災者(調査対象地在住の日本人女性)へのインタビューは順調に進み、女性被災者の「ニーズ」と「ウオンツ」の間にある当事者の「胸の内(思い)」を聞くことができ、「遠慮」の中身や「心の動き」を人間の関係性の問題として検討の俎上に上げることが可能になった。研究当初計画では、女性被災者と女性外国人被災者のインタビューは各々別個のものとしていたが、両者を関連付けてインタビュー調査を設定しなおすこととした。このことにより、研究遂行の遅れが、翻って、望ましい成果を上げることにつながると期待する。被災地に居住する女性外国人被災者へのインタビュー調査を最優先事項として実施したい。その際に2018年度に実施した女性被災者へのインタビュー結果を受けて、インタビュー内容について新たに検討しなおしたい。すなわち、女性被災者が感じていた「思い」の中身を女性外国人被災者にも同様であったかを尋ねる項目を加えたい。研究初年度の女性被災者へのインタビュー調査の成果は「被災者による支援者への遠慮」の存在とそれら両者の間にある「人と人の関係性(心の動き)」を捉えることができたことである。研究2年目の2019年度には、漁業に従事している女性被災者を対象として、同様の調査を実施する計画である。調査対象者にはすでに内諾を得ており、現地の漁業の閑散期に実施する。女性漁業者への調査の後に、震災後に起業した女性グループへの調査も企画している。東日本大震災後には行政も関わって女性被災者の復興策の一つとして「起業」が奨励された経緯がある。本研究では既存の地場産業(漁業)従事者との比較検討を予定している。なお、女性漁業者、女性起業者へのインタビュー調査は当初には予定していなかったことであり、2018年度の女性被災者調査の結果から新たに企画した内容である。被災地に居住する女性外国人へのインタビュー調査を行なうことができなかったため、予定していた旅費、謝金等の支出が不能になった。女性外国人による自生的なコミュニティのリーダー格の女性が体調不良となり、インタビュー対象者をまとめ、日程調整することができなかった。2019年度には女性外国人へのインタビュー調査(1回)、女性漁業者対象のインタビュー調査(2回)、女性起業者へのインタビュー調査(2回)、及び研究協力者による当該地でのワークショップ開催(3名、2回)、計7回分の旅費とインタビュー関連の謝金、学会参加費が主な支出となる。
ループス腎炎発症・進展におけるInterleukin-4(IL-4)の役割

3.マウスに対し各ベクター100-200μgを尾静脈より投与する方法で遺伝子導入を行い、血中のIL-4濃度の上昇をELISA法で確認、遺伝子導入効率、および発現効果に、非常にバラツキがあり、高い導入効率、発現効果を得るため、それぞれを発現するadenovirus vectorを作成した。尾静脈より各々をcodeするadenovirus vector 1x10^9 pfu静注することで安定した遺伝子導入を行うことができた。現在、脾臓より分離したリンパ球のsub setをflowcytometryで解析である。今後はSLEモデルマウスに対しIL-4遺伝子(野生型、変異型)導入を行い、病態への影響の検討を行っていく。2.マウスの血管内皮細胞、腹腔マクロファージ、抹消血リンパ球を分離培養し、上記の発現ベクターをtransfectし、生物学的効果を下記の方法で検討した。内皮細胞:MCP-1、IL-6の発現(ELISA法)、VCAM-1の発現(flowcytometry).マクロファージ:LPS刺激下のTNF産生(ELISA法).T cell:増殖能(BrdU uptake).Bcell:分化(CD19、CD23発現).3.マウスに対し各ベクター100-200μgを尾静脈より投与する方法で遺伝子導入を行い、血中のIL-4濃度の上昇をELISA法で確認中である。(遺伝子導入効率、および発現効果に、非常にバラツキがあり、高い導入効率、発現効果を得るため、現在adenovirus vectorを作成中である。)3.マウスに対し各ベクター100-200μgを尾静脈より投与する方法で遺伝子導入を行い、血中のIL-4濃度の上昇をELISA法で確認、遺伝子導入効率、および発現効果に、非常にバラツキがあり、高い導入効率、発現効果を得るため、それぞれを発現するadenovirus vectorを作成した。
ヒトとチンパンジーの対象操作行動と社会的関係性の発達

乳児期の行動発達の比較研究が示唆された、(1)生後4カ月以降の体幹の直立性と両手使用性の発達連関、(2)生後10カ月以降の定位的操作の獲得という、ヒトの個体発達の対象操作行動に関する種独自性を踏まえて、この時期のヒト乳児を対象とした、末端投射活動系(対象認知と対象操作)の発達過程の詳細な記述(研究I)と、ヒトに最も近縁な霊長類であるチンパンジーとボノボを対象とした、対象操作行動の比較研究(研究II)を行った。研究Iでは、生後4カ月と生後10カ月という、生後第1と生後第2の新しい発達の原動力の発生の際のいずれもに、新しい制御に一側先行がみられ、やがて左右の機能的対称性に獲得され、それが前後の対称性の成立へ向かい、そのレベルで、転倒しても対称性が保持されるという「対称性原理」への転換が行われて、新たな発達的自由が増大していくとともに、そこに新しい交流の手段が発生してくる様子が確認された。研究IIでは、ヒト乳児の対象操作行動の発達において種独自性をもっとも表すと考えられる、(1)体幹直立性と両手使用性および(2)定位的操作に関して、チンパンジーとボノボの対象操作行動に種差のあることが示唆された。複数の物体を両手で使用したり、環境表面への定位に限定されない、より自由度の高い定位的操作を対象操作におけるボノボ性だとするならば、ボノボの対象操作行動はヒトのそれに近い特性を持つといえる。
昆虫の羽化翅に見られる三次元的な折れたたみの形成機構とその意義

発生過程における器官形成は、上皮シートが決まった形へ変形すると同時に狭い体腔内で折れたたみ、収納されることにより実現する。しかし、組織自律的な「変形」と、周辺環境との相互作用による「収納」は同時進行することが多いため、切り分けて解析することが難しく、規則的な折れたたみを生む時空間的制御は明らかでない。そこで本研究では、モデル生物であるショウジョウバエを用いた実験(分子遺伝学的実験、ライブイメージング)と数理モデル(3Dシミュレーション)を組み合わせた解析により、折れたたみを制御する分子的基盤と力学的基盤を明らかにし、その折れたたみ制御の機能的意義を検証する。
G-CSF刺激による増殖制御に関与する因子の検索

申請者らが同定したG-CSF受容体細胞質領域のG-CSF刺激による増殖抑制、分化に必須な部位と相互作用する種々のタンパク質の同定をおこない、細胞分化のシグナル伝達機構を解明する目的で、G-CSF受容体の細胞質領域のうちG-CSFによる刺激で特異的に分化にともなう増殖抑制を誘導する部位に対するペプチド、すなわち、細胞膜貫通領域に最も近いチロシン残基を含む15アミノ酸からなるペプチドを、G-CSF受容体の活性型であるリン酸化チロシン残基を含むものと不活性型である非リン酸化チロシン残基を含むものとを合成し、これらをAF-アミノトヨパール650担体に共有結合し活性型および不活性型G-CSF受容体にそれぞれ対応するアフィニティーカラムを調製した。次に、G-CSFで刺激したDC62-4細胞から抽出液を調製し、そのなかに含まれるタンパク質のうち活性型アフィニティーカラムに結合し不活性型アフィニティーカラムに結合しないタンパク質を分画した。細胞抽出液中、少なくとも3種類のタンパク質がリン酸化チロシン残基含有アフィニティーカラムに特異的に結合し、かつ、G-CSF刺激でそのチロシン残基がリン酸化され、IL-3刺激ではリン酸化されないことが判明した。したがって、これら3種類のタンパク質はG-CSFによるシグナル伝達系に特異的に関与し、G-CSF受容体と相互作用する因子であることが明らかになった。さらに、得られた3種類のタンパク質のうちのひとつがSTAT3であることが、特異抗体を用いた免疫沈降法およびイムノブロット法により、確認された。
高温超伝導を用いたSQUID磁気顕微鏡システムの開発

本研究では液体窒素温度で動作する高性能SQUID磁気センサ、及び本センサを用いた磁気顕微鏡システムを開発しバイオ計測に応用することを目的としている。具体的にはナノメータサイズの磁気微粒子を磁気マーカーとして用い、バイオ計測の基本となる免疫反応を磁気的に検出するシステムを開発した。本研究で得られた成果の概要は以下の通りである。(1)傾角30度のバイクリスタル接合を用いて高性能SQUIDを再現性良く作製する技術を確立した。本技術は世界の多くの研究機関で採用されており大きな評価を得ている。(2)SQUIDセンサの低周波雑音を大幅に改善し、白色雑音と同じレベルにまで減少させることに成功した。センサを構成するジョセフソン接合と磁界検出コイルから発生する低周波ノイズの発生原因を明らかにし、これらを防止する方法を開発しその有効性をを実証した。(3)ナノメータサイズの磁気微粒子から発生する磁界を高感度に測定する顕微鏡システムを開発した。すなわち、センサと試料の間隔をミリメーター以下に近接させるためのセンサ冷却方法や磁気微粒子を磁化するための磁界印加法を開発した。(4)本システムを用いて免疫反応(抗原-抗体の結合反応)を磁気的に検出する実験を行った。このシステムでは抗体を磁気微粒子で標識(マーキング)し、磁気マーカーからの磁界をSQUIDにより測定し、抗原-抗体の結合反応を検出する。測定の結果、本システムにより従来の光学的方法に比べて10倍高感度に反応の検出が可能であることを世界で始めて実証した。今後、本システムを改良することにより従来に比べて100倍高感度なシステムを開発することは可能である。本研究を契機として世界各国でSQUID免疫診断システムの開発が開始されており、今後の急速な進展が期待できる。本研究は液体窒素温度(T=77K)で動作するSQUID磁気センサを用いた磁気顕微鏡の開発を目的としている。今年度は液体窒素温度でのSQUID磁気センサの高性能化を中心に研究を行った。このため、レーザ蒸着法を用いた高温超伝導薄膜(YBaCuO薄膜)の高品質化プロセスを確立した。このプロセスにより最高レベルの品質(臨界温度Tc=93K、臨界電流密度j_c=4x10^6A/cm^2(atT=77K))を持つYBaCuO薄膜を安定的に得ることが可能となった。また、SQUIDの高性能化に必要な高性能ジョセフソン接合の開発を行った。SQUIDの高性能化のためには臨界電流I=20μA、接合抵抗R=10Ωを持つジョセフソン接合が必要となるが、これまで上述の要求を満たす高性能ジョセフソン接合は開発されていない。このため本研究ではバイクリスタル形のジョセフソン接合の接合特性に及ぼす傾角の影響を定量的に調べ、傾角30度のバイクリスタル接合を新たに開発した。この傾角30度の接合により上述の要求を満たすことに世界で初めて成功した。また同接合を用いることにより、設計から期待されるように、液体窒素温度でのSQUID性能を飛躍的に改善することに成功した。本研究で開発した傾角30度のバイクリスタル接合は高性能SQUIDに必須なものとして高い評価を得ている。さらに、1cm角の基板の上に磁界検出用のコイルとSQUIDを集積化したいわゆる直接結合型の磁気センサを開発した。本磁気センサの磁界検出感度はT=77KでB_n=30fT/Hz^<1/2>であることを示し、この種のセンサとしては世界最高の性能を持つことを実証した。本研究は液体量素温度(T=77K)で動作する高感度SQUID磁気センサを開発するとともに、これを用いた磁気顕微鏡システムを試作することを目的としている。本年度はシステム開発に必要な以下の課題を解決した。

(1)まず、傾角30度のバイクリスタル形ジョセフソン接合の作製技術を確立するとともに、接合における電流輸送の機構を定量的に調べ、接合パラメータ(臨界電流と抵抗)の関係や接合の雑音特性を明らかにした。この結果を用いることにより高品質な接合を再現性良く作製することが可能となり、SQUIDの性能を大きく改善することが出来た。(2)また、作製したSQUIDセンサの基本性能(磁束-電圧変換効率と磁束ノイズ)の評価を行った。測定結果は設計値と定量的に一致しており、設計の妥当性及び作製プロセスの高さを実証した。ただし雑音特性については若干の相違が見られ改善の余地を残している。なお、磁界検出コイルが6mm角と小さい場合にもセンサの磁界分解能としてB_n<100fT/Hz^<2/1>が得られており、高感度磁気センサの開発が可能であることを示した。(3)次に、システム開発に必要なセンサ駆動用の低雑音電子回路を開発した。センサの低周波雑音を改善するためのいわゆるac-bias法の有効性を示すとともに、センサの耐環境雑音性を高めるための広帯域化を検討した。(4)さらに、顕微鏡システムでは試料とセンサの間隔を狭めることが必要になるため、センサ冷却用の容器(デュワ)を開発した。これまでに比べて間隔を1/5程度に狭めており、その結果測定感度を数10倍高めることが可能となった。今後はこれらの成果を発展させてシステム開発を進めていく予定である。昨年度までの研究により高性能なSQUID磁気センサの開発が可能となった。今年度は本センサを用いて磁気顕微鏡システムを試作しバイオ計測に応用した。具体的にはナノメータサイズの磁気微粒子を磁気マーカーとして用い、バイオ計測の基本となる免疫反応を磁気的に検出するシステムを開発した。このシステムでは免疫反応(抗原-抗体の結合反応)を検出するため抗体を磁気微粒子で標識(マーキング)し、磁気マーカーからの磁界をSQUIDにより測定する。この応用においてはSQUIDセンサの低周波ノイズが重要となるため、最初に低周波ノイズの改善を行った。センサを構成するジョセフソン接合と磁界検出コイルから発生する低周波ノイズの発生原因を明らかにし、これらを防止する方法を開発した。次にナノメータサイズの磁気微粒子から発生する磁界を高感度に測定する顕微鏡システムを開発した。最後に、本システムを用いて抗原-抗体の結合反応を磁気的に検出する実験を行った結果、従来の光学的方法に比べて10倍高感度に反応の検出が可能であることを世界で始めて実証した。今後、本システムを改良することにより従来に比べて100倍高感度なシステムを開発することは可能である。
ソフトウェアプロジェクトのオンライン制御システムの研究

まず,プロジェクトデータの一覧表,及び,プロジェクト開始時点からのデータの時間変化を示すグラフを開発者が使用する端末上に表示するツールを作成し,プロジェクトデータ計測システムGINGERに組み込んだ.端末上への図表の表示には,X-Window上の図表描画ツールgnuplotを利用している.作成した表示ツールの起動は,端末上から開発者自身が行うことが出来る.また,表示するデータの選択等は,簡単なマウス操作によって行うことが出来る.従って,開発者は,参照したいプロジェクトデータをいつでも簡単に参照することができる.次に,大阪大学基礎工学部情報工学科の学部生80名を対象とした学生実験においてGINGERシステムを適用して,開発者による情報の利用状況のデータ,及び,ソフトウェアの生産性や品質の変化に関するデータを収集した.実験の結果,開発者(学生)の多くは,自らが開発中のプログラムのサイズ(行数)を頻繁に参照しており,逆に,プログラムのコンパイル回数や実行回数といった作業量を表すデータは参照していないことが分かった.プロジェクト制御に有効な情報を明らかにするため,データの参照回数の多少によって,開発者をグループに分け,プログラム完成までに要した作業時間をグループ間で比較した.その結果,プログラムサイズ,及び,プログラム変更量(デバッグ等の目的で修正,削除されたプログラムの行数)の情報を頻繁に参照したグループの作業時間の平均値は,それらをほとんど参照しなかったグループの作業時間の平均値よりも小さく,開発者間でのばらつき(分散)も小さいことがわかった.以上のように,プロジェクトデータを開発者にオンラインでフィードバックすることが,プロジェクト制御を効率良く行う手法として有効であることを明らかにすることが出来た.まず,プロジェクトデータの一覧表,及び,プロジェクト開始時点からのデータの時間変化を示すグラフを開発者が使用する端末上に表示するツールを作成し,プロジェクトデータ計測システムGINGERに組み込んだ.端末上への図表の表示には,X-Window上の図表描画ツールgnuplotを利用している.作成した表示ツールの起動は,端末上から開発者自身が行うことが出来る.また,表示するデータの選択等は,簡単なマウス操作によって行うことが出来る.従って,開発者は,参照したいプロジェクトデータをいつでも簡単に参照することができる.次に,大阪大学基礎工学部情報工学科の学部生80名を対象とした学生実験においてGINGERシステムを適用して,開発者による情報の利用状況のデータ,及び,ソフトウェアの生産性や品質の変化に関するデータを収集した.実験の結果,開発者(学生)の多くは,自らが開発中のプログラムのサイズ(行数)を頻繁に参照しており,逆に,プログラムのコンパイル回数や実行回数といった作業量を表すデータは参照していないことが分かった.プロジェクト制御に有効な情報を明らかにするため,データの参照回数の多少によって,開発者をグループに分け,プログラム完成までに要した作業時間をグループ間で比較した.その結果,プログラムサイズ,及び,プログラム変更量(デバッグ等の目的で修正,削除されたプログラムの行数)の情報を頻繁に参照したグループの作業時間の平均値は,それらをほとんど参照しなかったグループの作業時間の平均値よりも小さく,開発者間でのばらつき(分散)も小さいことがわかった.以上のように,プロジェクトデータを開発者にオンラインでフィードバックすることが,プロジェクト制御を効率良く行う手法として有効であることを明らかにすることが出来た.
改良型二次元インゲルホスファターゼアッセイの確立とホスファターゼ研究の新展開

本研究では、以下の2つの課題:(1)ユニークな二次元インゲルホスファターゼアッセイ法の確立とその応用、ならびに(2)CaMキナーゼホスファターゼ(CaMKP)を始めとしてPPMファミリーホスファターゼの活性制御メカニズムの解明、を中心にして研究を進めた。まず、蛍光発生基質を用いた新しい二次元インゲルホスファターゼアッセイ法を確立し、実用化までこぎつけることができた。また、これまではCaMKPと核局在型のCaMKP-Nに関して、細胞内での活性制御機構や局在変化について不明の点が多かったが、本研究課題を通してこれらのホスファターゼの活性制御機構に関する多くの知見を得ることができた。本課題では、以下の2点に焦点を絞って研究を実施した。(1)多様なホスファターゼをまとめて検出する改良型二次元インゲルアッセイ法を確立する。(2) CaMKPをはじめとして様々なホスファターゼの活性制御メカニズムに関する研究を発展させる。まず、(1)に関しては、なるべく多くのホスファターゼを検出する最適条件の確立と、その応用を試みた。蛍光発生基質として、MUP以外にも、DiFMUPなどの基質を使ってみたが、バックグラウンドが少ないこと、またシグナルが強いことなどからMUPが最も優れていることが判明した。また、中性バッファーで反応させてホスファターゼ活性を検出した後に、同じゲルをpH3のクエン酸バッファーに浸すことにより、酸性ホスファターゼの活性を検出できることを見出した。この二次元インゲルホスファターゼアッセイ法を用いて、ゼブラフィッシュ胚発生過程におけるホスファターゼの発現パターンの変化を観察してみた。24hpf、48hpf、96hpfと胚発生が進むにしたがって、検出されるホスファターゼの種類と活性が顕著に増大する傾向がみられた。(2)に関しては、CaMKPが酸化・還元によりその活性が制御されることが、インゲルアッセイで確認されており、その酸化還元制御に関わるCys残基もアミノ酸変異体を作製することにより決定することができた。また、CaMKP(PPM1F)以外のPPMファミリーのホスファターゼを取得して、それらの活性制御メカニズムを比較解析することにした。25年度は、まず大腸菌を用いて、PPM1A、B、D、E、G、J、K、L、Mの10種類のホスファターゼの発現を試みたところ、これらすべてのアイソフォームを発現し精製酵素を取得することができた。今後、これらのPPMアイソフォームを用いて、これらの酵素の活性制御メカニズムの解析を行う予定である。本研究課題は、以下の2点に焦点を絞って研究を実施してきた。(1)ホスファターゼ活性をゲル内で検出するインゲルホスファターゼアッセイ法を確立し、ホスファターゼ研究に応用する。(2)CaMKホスファターゼ(CaMKP)をはじめとして様々なホスファターゼの活性制御メカニズムに関する研究を発展させる。(1)の手法の確立に関しては昨年度ほぼ完了しているので、その手法を用いてPPMファミリーのホスファターゼの研究を進めた。また、CaMKPとCaMKP-N以外のPPMホスファターゼに関しても並行して研究を進めた。まず、インゲルホスファターゼアッセイ法を用いることにより、PPM1A、B、D、E(CaMKP-N)、F(CaMKP)、G、Hの各アイソフォームの活性を検出できることを明らかにした。まずこれらPPMファミリーの各アイソフォームについて酸化、還元処理に対する感受性をインゲルホスファターゼアッセイ法を用いて、分析を行った。PPM1DとHが酸化還元処理に非感受性であるのに対し、それ以外のホスファターゼは酸化還元処理に感受性を示す、つまり酸化処理により活性が低下し、還元処理で活性の増大が見られることがわかった。これらのホスファターゼのアミノ酸変異体を作製し解析を行ったところ、PPM1A、B、E、F、Gにおいては、金属イオン配位部位に存在するAsp残基のN末端側に存在するCys残基の酸化還元によって活性が制御されることが明らかになった。また、インゲルアッセイによりCaMKPの解析を行ったところ、モノマー酵素と考えられていたCaMKPが、モノマー、ダイマーだけでなくオリゴマーを形成することが明らかになった。このようにCaMKPは、酸化還元だけでなくモノマー・オリゴマー転換によっても活性の制御が行われている可能性が示されたので、今後はそのメカニズムの詳細についても解析を進める予定である。インゲルホスファターゼアッセイ法の確立に関しては昨年度までにほぼ完了しているので、本年度は2番目の課題に取り組み以下の成果を上げることができた。CaMKPは、多機能性CaMキナーゼを特異的に脱リン酸化してCaMキナーゼカスケードを負に制御する酵素である。このCaMKPのN末端領域にはポリリシンなどの人工的なポリカチオンが結合して、CaMKP活性を増大させることが知られていた。しかし、細胞内にこのようなポリカチオンに代わる活性化因子が存在するのか、またその正体は何かについてはこれまで不明であった。今回、大腸菌ツーハイブリッドスクリーニング法を用いて、CaMKPの結合タンパク質のスクリーニングを行ったところ、Pcdh-γC5がCaMKP結合タンパク質であることを見出した。

このPcdh-γC5は、GSTプルダウン実験からCaMKPのN末端領域に結合すること、またこのタンパク質の結合によりリン酸化CaMKIの脱リン酸化を促進することを明らかにした。また、細胞内でもCaMKPとPcdh-γC5とCaMKIが3者複合体を形成し、リン酸化CaMKIの脱リン酸化を補助することが示された。これらの研究からPcdh-γC5がCaMKPとその基質であるCaMKを同時に結合することにより、内在性の"positive regulator"として機能する可能性が強く示唆された。本研究では、以下の2つの課題:(1)ユニークな二次元インゲルホスファターゼアッセイ法の確立とその応用、ならびに(2)CaMキナーゼホスファターゼ(CaMKP)を始めとしてPPMファミリーホスファターゼの活性制御メカニズムの解明、を中心にして研究を進めた。まず、蛍光発生基質を用いた新しい二次元インゲルホスファターゼアッセイ法を確立し、実用化までこぎつけることができた。また、これまではCaMKPと核局在型のCaMKP-Nに関して、細胞内での活性制御機構や局在変化について不明の点が多かったが、本研究課題を通してこれらのホスファターゼの活性制御機構に関する多くの知見を得ることができた。本研究課題においては、ほぼ当初の年次計画に沿って研究を進めることができた。初年度にインゲルホスファターゼアッセイ法を確立し、その手法を用いることにより様々なホスファターゼの活性を電気泳動後に検出することを可能にした。年次計画通りに、PPMファミリーの各アイソフォームを大腸菌で発現し精製酵素を取得し、それらの解析を進めた。これらのアイソフォームは酸化還元処理を行った際、その感受性がアイソフォームにより異なることを見出した。また、その感受性の原因を明らかにする目的で、様々なアミノ酸変異体酵素を作製し、それらの酸化還元処理に対する感受性を分析した結果、その感受性の差がホスファターゼ活性に重要なメタル配位部位近辺のCys残基の有無に起因することなどを明らかにした。さらにネイティブゲル電気泳動を用いた解析により、CaMKPがモノマーからオリゴマーまで様々な会合状態で存在することを見出し、インゲルアッセイによる分析により、オリゴマーを形成したCaMKPには活性がなく、モノマー酵素がホスファターゼ活性を示すことを明らかにした。これらの発見は、インゲルホスファターゼアッセイを確立したことにより、初めて見出すことができた新事実であり、このような新しい知見が得られた点は、PPMファミリーホスファターゼ研究の流れの中での新展開と考えられる。このような研究成果を総合的に判断すると、本研究課題はおおむね順調に進展していると思われる。研究室のホームページに最近の研究業績が記載されている。生物化学これまでの研究において、CaMKPがオリゴマーの形成により活性制御を受ける可能性が示された。特に、モノマー(活性型酵素)とオリゴマー(不活性型酵素)の可逆的な変換がどのようなメカニズムで制御されているかについては、非常に興味深い課題であり今後その解析を進める予定である。
低酸素応答遺伝子HIF2のエピジェネティック異常と子宮筋腫発症への関与の検討

子宮筋腫発症のマスター遺伝子を探すべく、網羅的発現データでネットワーク解析を行い更にDNAメチル化異常を有する遺伝子を絞り込み、筋腫低発現のHIF2と高発現のNRG1を得た。子宮平滑筋細胞(UtSMC)においてHIF2のノックダウン、NRG1の強制発現を行いこれら遺伝子の作用を検討した。HIF2はUtSMCでの発現が低く検討が困難であった。NRG1を強制発現した細胞では、TGFβシグナリングやWnt/βカテニンシグナリングなどの子宮筋腫で活性化されているpathwayが活性化されていた。これらpathwayは細胞増殖に関与しており、子宮筋腫の発症や進展におけるNRG1の関与を示唆している。子宮筋腫において発症の鍵となるマスター遺伝子を検索するため、ゲノムワイド発現解析で得られた発現異常遺伝子において相互的ネットワーク解析を行って、76のネットワークと上流遺伝子が検出された。これら76の上流遺伝子のうち、DNAメチル化異常を有する5遺伝子に着目している。その中で、転写因子であるHypoxia Inducible Factor 2(HIF2)を上流遺伝子とした遺伝子群に特に着目して研究を進めている。この遺伝子群は低酸素応答や酸化ストレスへの反応に関与する遺伝子である。HIF2はDNA高メチル化・mRNA低発現であり、下流遺伝子も低発現傾向を呈していた。このHIF2は月経中の子宮収縮により子宮筋層が低酸素に晒されると活性酸素の蓄積を招き、この活性酸素の増加がEGF pathwayを活性化させて筋腫の増殖に関与している可能性がある。現在、HIF2発現を恒常的に抑制した子宮平滑筋細胞をウイルスベクターを用いて作成を継続しており、作成後に、1. mRNA発現マイクロアレイ解析、2.免疫不全マウスへの移植を行う。尚、ともに5つの上流遺伝子に含まれていたNRG1(Newreglin1)はEGF receptorのリガンドとして働いていることが報告されており、NRG1が低メチル化・高発現である子宮筋腫では、NRG1がHIF2とともにEGF pathwayを活性化させて筋腫の増殖に関与している可能性が有る。そのため、我々はNRG1もHIF2と同様にNRG1を恒常的に強制発現させた子宮平滑筋細胞を作成している。NRG1の強制発現細胞の作成にはすでに成功しており、マイクロアレイ解析にて細胞外器質を構成する遺伝子の発現が上昇していることが明らかとなってきた。子宮筋腫でも同様の遺伝子群が高発現を呈しており、HIF2とNRG1がともに筋腫の増殖に関与している可能性がある。子宮筋腫において発症の鍵となるマスター遺伝子を検索するため、ゲノムワイド発現解析で得られた発現異常遺伝子において相互的ネットワーク解析を行って上流遺伝子を検出し、これらのうちDNAメチル化異常を有する5遺伝子に着目した。特に、転写因子であるHypoxia Inducible Factor 2(HIF2)とNeureglin 1(NRG1)に着目した。HIF2は低酸素応答や酸化ストレスへの反応に関与する遺伝子群の上流に位置し、子宮筋腫においてDNA高メチル化、mRNA低発現であった。HIF2の発現低下は月経中の子宮収縮により子宮筋層が低酸素に晒されると活性酸素の蓄積を招き、EGF pathwayを活性化させて筋腫の増殖に関与している可能性がある。NRG1はEGF receptor(EGFR)のリガンドとして機能しており、EFGRはTGFβと密接に関与して細胞増殖に関与することが知られる。NRG1が低メチル化、高発現である子宮筋腫ではNRG1がHIF2とともに筋腫の増殖に関与している可能性がある。そこでHIF2をノックダウンし、NRG1を強制発現させた子宮平滑筋細胞を作成し、細胞での発現変化を観察した。NRG1をヒト不死化子宮平滑筋細胞において強制発現させ、ゲノムワイドにトランスクリプトーム解析を行って、活性化された遺伝子群やpathwayを観察した。その結果、子宮筋腫において活性化されていたTGFβシグナリングやWnt/βカテニンシグナリングなどの活性化が観察された。これらのシグナリングは細胞増殖に関与することが知られており、これらの結果は、子宮筋腫の発症や進展におけるNRG1の関与を説明したものと考えられる。一方、HIF2のノックダウンは、導入するヒト不死化子宮平滑筋細胞におけるHIF2の発現が極めて低いため、ノックダウンの影響を確認することが困難であった。HIF2の強制発現ベクターの作成にはやや難航しているが、HIF2と共にEGF pathwayを活性化させて筋腫の増殖に関与していると考えられるNRG1の強制発現ベクターの作成には成功しており、すでに発現解析も行っている。概ね順調な進行である。医歯薬学今後、HIF2の強制発現ベクターの作成とHIF2の発現を低下させた子宮平滑筋細胞の作成を継続する。

作成したのち、mRNAのゲノムワイド発現解析を行い、HIF2の発現低下が平滑筋細胞へどのように影響するかを検討する。特に低酸素環境下での影響について検討を行う。また、HIF2を強制発現させた子宮筋腫細胞についても作成を試み、HIF2の強制発現が子宮筋腫細胞の増殖へ与える影響について検討する。HIF2とNRG1の強制発現ベクター作成後に免疫不全マウスへの移植実験が控えており、この移植実験において比較的多くの費用を要する予定である。平成26年度の使用計画にはこの費用も含まれていたが、この強制発現ベクターの作成にやや難航していたため、移植実験にやや遅れが生じ、平成26年度で見込んだ計画の費用を使用できなかった。これまでにHIF2とNRG1の強制発現ベクターの作成を行ってきた。上述のごとく平成26年度では発現ベクターの作成にやや難航していたが、方法を改良してすでにNRG1の強制発現ベクターの作成に成功した。今後HIF2の作成も完了する見込みであり、順調に免疫不全マウスへの移植実験を行える予定である。
MSCsを用いたオートファジー系を介する高度骨吸収治療法の開発研究

高度顎堤吸収症例の補綴治療は困難である場合が多い。歯牙喪失後は、時間経過とともに高度顎堤吸収を呈することが多く、その場合従来の補綴治療での機能回復は困難である。そのため、歯槽骨・歯周組織の組織再生治療が重要となってくる。幹細胞の中で間葉系幹細胞(mesenchymal stem cells;MSCs)は、顎骨再生治療における有力な細胞ソースの一つである。しかし、MSCsの臨床応用実現のためには改善すべき問題点もあり、例えば高齢ドナー由来MSCsでは、分化能低下や細胞増殖の減退がある。現在の日本では、移植後の拒絶反応・感染症の面から考慮すると、他人からの他家移植は受け入れられにくく、免疫反応や感染等の危険性が少ない自己細胞のニーズが高い。よって高齢ドナーから採取された少量のMSCsを、安全にかつ更に劣化・老化させることなく増殖させて移植に持ち込むことが必要であるにもかかわらず、未だその手法は開発途上である。最近、オートファジー系の刺激により幹細胞老化の抑制が可能であると提唱されており注目を集めている。筋幹細胞を用いた研究や、ヒト腎由来MSCsでオートファジー亢進をさせると組織分化能が長期間保つことが出来るという報告があるが、高齢ドナー骨由来MSCsに関しては、動物実験レベルでマウスからの採取成功例があるものの、動物実験レベルでの骨再生研究が行われた論文報告はない。本研究は、オートファジー系制御による高齢ドナー由来MSCsの組織再生能の回復を目的とした研究である。高齢マウスよりMSCsを調整し、in vitroでラパマイシン刺激による幹細胞性の品質向上できる条件を決定する。現在、高齢マウス顎骨からの細胞採取に成功し、順調に実験が進んでいる。顎骨からの間葉系幹細胞の採取に成功し、in vitroの実験に取り組んでいる。長管骨骨髄由来幹細胞については、手技が安定せず採取しづらい状況にあるが、万が一の場合若年マウス骨髄由来MSCは購入にて入手可能なので、入手してコントロールとして使用して研究を進めていく。予定よりも動物購入や試薬を安く購入できたため。
内分泌攪乱物質の2型糖尿病発症に及ぼす影響(核内受容体ファミリーレセプターの活性化による遺伝子転写能の研究)

【目的】2型糖尿病発症に関与する遺伝子は明らかにされつつあるが、これと対応する環境因子は明らかではない.核内ホルモン受容体を作用点とする内分泌攪乱物質dioxinがPPARγを標的として糖脂質代謝に影響を及ぼしているか否かを知るため、マウス前脂肪細胞にdioxinを作用させて分化とPPARγ遺伝子発現、及び変異型Pro12Alaの反応性の相違につき検討した.【方法】1)DEX、IBMX、INSにより3T3-L1の分化を誘導、dioxin(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin)50nMを培地に添加、対照群としてDMSO 50nMを添加した.2、7、14日目にOil Red O染色した.2)14日目にPPARγmRNA発現をノーザン解析を行った.3)PPARγ2遺伝子のcodon 12がProである野生型とAlaである変異型をpCMVベクターに組み込み、L1細胞で強制発現させた.更に分化の誘導とdioxin暴露を行い、14日目にPPARγのmRNA発現をノーザン解析を行った.【結果】1)Oil Red Oによる染色性は2、7日目では差を認めなかったが、14日目ではdioxin群は対照群と比較して染色性が低く、中性脂肪合成の阻害効果を示した.2)PPARγmRNA発現量はdioxin群において対照群に比較して30%抑制し、PPARγの転写抑制を介した脂肪合成の抑制であることを示唆した.3)PPARγ2遺伝子のalleleタイプによっても反応性に差を認めなかった.【考察】dioxinはPPARγ遺伝子発現の抑制を介してL1における脂肪合成を抑制し、脂肪細胞への分化も抑制した.脂肪細胞における主なインスリン作用である脂肪合成を低下させ、インスリン感受性の高まる分化を抑制したことから、dioxinはインスリン抵抗性を来す環境因子であると推定された.環境因子の中で内分泌攪乱物質が糖代謝の中心的調節因子であるPPAR遺伝子に直接的な親和性があるかどうか,そしてこれを活性化,あるいは抑制することで糖代謝異常や脂質代謝異常の発症因子として働いているかどうかを明らかにする.このために,PPARγ遺伝子の変異体(Pro 12 Ala)に対して親和性を持つ内分泌攪乱物質を同定し,さらにその作用機序を解明することを目的とする.1)野生型であるPro-PPARγ遺伝子とAla-PPARγ遺伝子の作成.5'側のプライマーを遺伝子変異部分を含むようにデザインし、脂肪細胞からグアニジン法により抽出したtotal RNAを用いてRT-PCR法により.Pro-PPARγ遺伝子とAla-PPARγ遺伝子を合成した.これらをpCMVベクターにライゲーションしプラスミドを作成した.インサート部分のシークエンスを行い、塩基配列の誤りがないか否か検討中である.2) PPAR遺伝子を発現する樹立培養細胞株の作成.脂肪細胞の樹立培養細胞株であるNIH3T3-L1細胞にデキサメサゾン250μM,インスリン1μg/ml,メチルイソブチルキサンチン500μMを投与し、NIH3T3-L1細胞の分化誘導を行った.2日後にに上記方法で得られたプラスミドをリポフェクション法によりトランスフェクションを行った.5日後に内分泌攪乱物質2,3,7,8-tetrachlorodibenzo p-dioxin(TCDD)10nMで投与した.コントロール系はDMSO 50nMを投与した.現在、細胞培養し観察中である.オイルレッドO染色により、脂肪細胞の分化の程度を比較し,標的遺伝子であるリポ蛋白リパーゼやPEPCK遺伝子のmRNAの発現をPro-PPARγ遺伝子とAla-PPARγ遺伝子の間で比較検討する予定である.【目的】2型糖尿病発症に関与する遺伝子は明らかにされつつあるが、これと対応する環境因子は明らかではない.核内ホルモン受容体を作用点とする内分泌攪乱物質dioxinがPPARγを標的として糖脂質代謝に影響を及ぼしているか否かを知るため、マウス前脂肪細胞にdioxinを作用させて分化とPPARγ遺伝子発現、及び変異型Pro12Alaの反応性の相違につき検討した.【方法】1)DEX、IBMX、INSにより3T3-L1の分化を誘導、dioxin(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin)50nMを培地に添加、対照群としてDMSO 50nMを添加した.2、7、14日目にOil Red O染色した.2)14日目にPPARγmRNA発現をノーザン解析を行った.3)PPARγ2遺伝子のcodon 12がProである野生型とAlaである変異型をpCMVベクターに組み込み、L1細胞で強制発現させた.更に分化の誘導とdioxin暴露を行い、14日目にPPARγのmRNA発現をノーザン解析を行った.【結果】1)Oil Red Oによる染色性は2、7日目では差を認めなかったが、14日目ではdioxin群は対照群と比較して染色性が低く、中性脂肪合成の阻害効果を示した.2)PPARγmRNA発現量はdioxin群において対照群に比較して30%抑制し、PPARγの転写抑制を介した脂肪合成の抑制であることを示唆した.3)PPARγ2遺伝子のalleleタイプによっても反応性に差を認めなかった.【考察】

dioxinはPPARγ遺伝子発現の抑制を介してL1における脂肪合成を抑制し、脂肪細胞への分化も抑制した.脂肪細胞における主なインスリン作用である脂肪合成を低下させ、インスリン感受性の高まる分化を抑制したことから、dioxinはインスリン抵抗性を来す環境因子であると推定された.
ヒストン関連血管内皮障害に着目した移植後肺機能不全の機序解明

外因性ヒストンを直接静脈投与することで、肺障害を生じる動物モデルを今回確立した。ヒストン関連肺障害を生じたドナー肺を摘出し、同系ラットに移植し、移植後肺障害、とくに血管内皮障害、微小循環障害の観点から検討した。ヒストン関連肺障害に関しては炎症マーカー(CXCL-1など)や低酸素障害マーカー(HIF-1,2など)で評価した。ヒストン投与後、移植早期の段階で(1時間程度)非常に強い組織障害と血管抵抗増大が起こっていることを観察し得た。微小循環改善に重要な因子であるトロンボモジュリンを投与したところ抗炎症効果より線溶系活性により働くことが示唆された。核内蛋白のヒストンは脳梗塞発症後に血中に遊離・上昇する事が知られており、マウス脳梗塞モデルでは遊離ヒストンによる血管内皮障害、肺障害が報告されている。脳死ドナーでも同様の事象が推測される事から、我々は肺移植後グラフト機能不全の要因として遊離ヒストンによる肺血管内皮障害の関与を仮説し、ヒストン肺障害モデルを作成した。さらに本研究では微小循環維持に重要な因子であるトロンボモジュリンを投与することで、ヒストン関連血管内皮障害、及びフィブリン分解抑制を軽減できるかその機序を含めて今後検討する。また、ヒストン障害後虚血再灌流により生じる血管内皮障害、NETs形成の機序を解明する。今年度はヒストン関連肺障害モデルの作成(ラット)を行い、免疫学的、組織学的評価を行った。具体的にはLewisラット(オス、8週齢)にcalf thymus histoneを30, 50, 80mg/kg、PBS(コントロール)をそれぞれ静脈内投与し、投与後2時間、24時間で摘出肺のwet/dry ratioを測定した。肺障害を反映するサイトカインであるC-X-Cmotif chemokine 1(CXCL1)の血清濃度はヒストン投与後2時間で50, 80/mg/kg両群で有意に高値を示す一方、24時間後にはコントロール群と差を認めなかった。肺傷害スコアはヒストン投与2時間後において50、80mg/kg群で高値を示し、かつ投与24時間後でも30、50mg/kg群でコントロール群に比較し有意に高値であった。以上より血中投与ヒストンは一過性のサイトカイン上昇と、引き続く肺組織障害惹起し、ドナー肺障害モデルとして有用であることが示唆された。ドナー肺の受ける障害を時相別で考えると、A.ドナーより摘出する前、B.肺摘出・体外保存中、C.肺移植再灌流後、の大きく3つに分けられる。3時相のうちB,Cのドナー肺摘出後の虚血肺組織障害をいかに軽減できるかは移植術後の予後を考える上で重要であり、申請者らは虚血後再灌流障害ラットモデルを用いて取り組んでいる。本研究では1ヒストン関連肺障害を生じた脳死ドナーモデルをラットで確立すること、2ヒストン関連肺障害を生じた肺を用いて肺移植を行う、術後のprimary graft dysfunctionモデルを確立すること、3さらにprimary graft dysfuctionを、ヒストンによる血管内皮障害と仮説し、障害軽減を図る方法についてトロンボモジュリンを用いて検討すること、を目的としている。現在1に関しては至適投与量を決定して安定した障害肺モデルを確立した。2、3について現在研究中である。重篤な脳血管障害後の肺水腫(neurogenic lung edema)の原因に、炎症性サイトカインの血中放出が挙げられるが、ヒストンに暴露されるとヒストンの濃度依存性に炎症性サイトカイン、また肺障害のマーカーとしてもで有用とされるinterleukin-8 (IL-8)が上昇していることが確かめられた。また組織学的検索にて、肺障害スコアが投与ヒストンの濃度依存性に上昇することも確認できた。さらに現在ではヒストン障害肺を用いた肺移植のパイロット実験を行っている。・ラットのモデルにおいて、ヒストンを経静脈で投与することで、肺血管内皮障害を誘発できることを投与量依存性に観察できた。具体的には血清中IL-8量(肺障害と関連)、組織学的評価(肺障害スコアを用いた検定)、肺コンプライアンスの低下などでコントロール群との違いを検討することが可能であった。・致死量に至るヒストン投与量を確認した。・ヒストン障害を生じた肺ををグラフトとしてラット肺移植も開始している。・ドナーラットが、致死量より少ないヒストンで肺障害を受けた場合でも、その肺をグラフトとして肺移植を行った場合急速な肺障害をきたすことでレシピエントラットが生存しえないことを確認した。外因性ヒストンを直接静脈内に投与することで、肺障害を生じる動物モデル(ラット)を確立した。ヒストン関連肺障害を生じたドナー肺を摘出し、同系ラットに移植し移植後肺障害を特に血管内皮障害、微小循環障害の観点から検討した。特にドナー肺におけるヒストン関連障害について炎症マーカー、低酸素誘導マーカー(虚血、血栓形成による組織潅流障害)を中心に測定し、ヒストン投与量依存性に障害が増強することが確認できた。本研究では微小循環維持に重要な因子であるトロンボモジュリンを投与することで、ヒストン関連血管内皮障害、及びフィブリン分解抑制を軽減できるか検討した。ラットでの片肺移植と、移植後グラフトの評価方法(分肺コンプライアンス測定、移植グラフト肺静脈からの採血によるガス交換能測定)を確立した。虚血再灌流障害(ischemia-reperfusion injury)の程度は、先行するヒストン関連血管内皮障害に影響されることを、移植モデルで検討した。

実際にはドナーに投与したヒストンによる肺障害により、移植後早期(1時間程度)で非常に強い再潅流障害とそれに引き続く血管抵抗増大が起こることを観察し得た。現在高用量リコンビナントトロンボモジュリンをドナーに使用し、ヒストン関連肺障害の軽減にどのような機序で働くのかを詳細に検討中である。具体的にはヒトに投与する3倍量換算のトロンボモジュリン投与により、炎症反応軽減は得られない(これは齧歯類で使用した場合ヒトとの代謝の違いにより説明される)一方で、低酸素障害時に発現する低マーカー(HIF)は低下することを確認した。これは血栓溶解、血栓形成の抑制機序の結果生じている現象と解釈している。今後ドナーにおける使用方法、また移植後レシピエントに投与するなど、タイミングも含めてさらに検討する予定である。外因性ヒストンを直接静脈投与することで、肺障害を生じる動物モデルを今回確立した。ヒストン関連肺障害を生じたドナー肺を摘出し、同系ラットに移植し、移植後肺障害、とくに血管内皮障害、微小循環障害の観点から検討した。ヒストン関連肺障害に関しては炎症マーカー(CXCL-1など)や低酸素障害マーカー(HIF-1,2など)で評価した。ヒストン投与後、移植早期の段階で(1時間程度)非常に強い組織障害と血管抵抗増大が起こっていることを観察し得た。微小循環改善に重要な因子であるトロンボモジュリンを投与したところ抗炎症効果より線溶系活性により働くことが示唆された。ヒストン関連肺障害の程度を免疫学的、組織学的に評価し、ラットにおける肺障害モデルを作成し得た。またヒストン関連肺障害を惹起したドナー肺を移植することで、ヒトにおけるprimary graft dysfunctionに類似する病態を作成することが可能になった。ドナーラットへのヒストン投与量については、単に投与後に摘出して肺障害の程度を観察するだけの場合と、実際にヒストン障害を生じた肺を用いで移植を行う場合では、その量を調整する必要があることが分かったため、現在その至適投与量を検討しているところである。Primary graft dysfucntionを移植後に生じるラット肺移植モデルの確立を今後早期に行う。さらにこの肺移植モデルを使用して、ヒストン関連肺障害の機序(血管内皮障害を仮説)解明と、その軽減(トロンボモジュリンによる)を試みる予定である。肺移植本研究では作成したヒストン関連肺障害モデルを用いて、微小循環維持に重要な因子であるトロンボモジュリンを投与によりヒストン関連血管内皮障害、及びフィブリン分解抑制を軽減できるかその機序を含めて今後検討する。また、ヒストン障害後虚血再灌流により生じる血管内皮障害、NETs形成の機序を解明することが到達目標である。引き続き研究協力者、大学院生との綿密な研究計画作成、定期的カンファレンスを通じて研究目的が達成できるよう努める。ヒストン障害モデルの確立と、その肺を移植した場合の肺移植モデルにおいて、ドナーラットへのして至適ヒストン投与量が同じではないことが判明し、その部分で想定実験期間が延びたことによる。ほぼ予定通り予算を使用したが、動物実験施行上スケジュールの関連で次年度使用額が生じた。