hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大学と臨床が共有する看護手順電子マニュアルによるシームレス・プログラム開発

看護学生と臨床看護師が共有できるシームレスな電子学習教材を開発するために、看護電子マニュアルの看護技術項目の精選、共有した電子教材の開発及び評価を行った。その結果、看護学生は日常生活援助の技術項目、新人看護師は、治療処置技術の利用が高かった。共通して利用率が高い項目は静脈血採血や導尿などであった。看護学生はeラーニングで処置の流れを把握し、新人看護師は手順を印刷・確認するなど活用方法は異なっていた。対象に合わせたeラーニングシステムの構築の必要性が明らかとなった。第1段階として電子教材のニーズ調査により、看護師の教育背景や看護情報力、病院のネットワーク環境背景によって電子教材に対するニーズが異なることが分かった。電子教材開発に向けての背景の検討は順調に進んでいるが、共同研究者や研究協力者の所属変更により教材開発後の効果検証に関する方向性および計画の修正が必要である。今年度は、1教育と臨床が共有した電子教材の活用による評価2本研究で得られた成果を学会や論文にて発表し、広く意見や評価を得る。また、3これまでの研究成果を公表するためのWebコンテンツの開発、システム作りの整備を進める予定である。看護教育学今後は、看護基礎教育と臨床現場の解離を軽減するための電子教材の開発に必要とされる教材のコンテンツの選定、評価方法の再検討を行う。その際、電子教材を活用する対象者の看護情報リテラシーや、web環境をふまえ、看護学生と臨床スタッフが共有できる電子教材開発を臨床と協力し進める。教材開発の補助者として人件費を計上していたが、既存のデータの改変でプログラム開発・検証を進めているため次年度へ予算を繰り越すこととなった。平成26年度は、実態調査中心に行ったため必要機材の購入費が予算より減額したため差額が生じた。ホームページ開設など、広く成果を広めるために経費を活用する。また、論文投稿や学会発表で成果の報告に使用したいと考えている。平成27年度は教材開発計画を進めるための経費として使用する。
イオン導電性コヒーレント傾斜機能化薄膜の作製とイオンダイナミクス

ABO_3であらわされるペロブスカイト型のプロトン導電体はその高い電気的特性のためにセンサや燃料電池などのイオニクスデバイスへの応用が期待されている.イオニクスデバイスへ応用するためには薄くかつ高い電気伝導特性が必要である.そこで本研究では高い酸素分圧下でしかもターゲット材と同じ組成の薄膜が選られるという特徴を持つレーザアブレーション法を用いてプロトン導電性薄膜を作成した.格子形状を変化させ,電気的特性を向上させるために2種類のペロブスカイト型プロトン導電体を使用して組織を変調させたコヒーレント傾斜機能(FGM)化超格子薄膜を作成した.そしてその構造解析を行い超格子周期に対する電気伝導特性の変化を測定した.その結果、以下のことがわかった。(1)Mgo(110)基板上に作製される薄膜は,基板にエピタキシャル成長する事により結晶の対称性が向上し正方晶に近くなる.(2)積層周期が10nm以下では結晶構造が周期に依存して大きく変化している.(3)短周期の超格子の結晶構造の変化に合わせて電気伝導度が低下している.(4)活性化エネルギーは組成に依存するが、超格子周期に依存しない.これらの結果からペロブスカイト型プロトン導電体において、超格子形成による内部応力により異種界面での応力が有効に働くのは積層周期が10nm以下である事が分った。今後の課題としては短周期に置ける結晶構造の解析,超格子界面でのプロトン導入の機構の解明があげられる.ABO_3であらわされるペロブスカイト型のプロトン導電体はその高い電気的特性のためにセンサや燃料電池などのイオニクスデバイスへの応用が期待されている.イオニクスデバイスへ応用するためには薄くかつ高い電気伝導特性が必要である.そこで本研究では高い酸素分圧下でしかもターゲット材と同じ組成の薄膜が選られるという特徴を持つレーザアブレーション法を用いてプロトン導電性薄膜を作成した.格子形状を変化させ,電気的特性を向上させるために2種類のペロブスカイト型プロトン導電体を使用して組織を変調させたコヒーレント傾斜機能(FGM)化超格子薄膜を作成した.そしてその構造解析を行い超格子周期に対する電気伝導特性の変化を測定した.その結果、以下のことがわかった。今後の課題としては短周期に置ける結晶構造の解析,超格子界面でのプロトン導入の機構の解明があげられる.
シェイクスピア受容史再考--翻訳・ナショナリズム・ジェンダー

日本におけるシェイクスピア作品の翻案・翻訳受容について、フェミニズム理論を用い、またナショナリズムの観点から分析した。フェミニズム分析としては、日本で初めて女性としてシェイクスピア作品の全訳に取り組んでいる松岡和子の翻訳について、その功績と問題点を指摘した。ナショナリズムの観点からは、『オセロー』の翻案小説である宇田川文海『阪東武者』を、日本が「西洋化」することの不安を反映するテクストとして分析した。本年度は、研究初年度として、シェイクスピア受容に関連する資料を広範に収集することを、その中心的作業とした。具体的には、『シェイクスピア翻訳文学書全集』を購入し、同全集に所収されたシェイクスピア翻訳受容資料の分析・検討を行った。ここでの分析・検討は、来年度以降の研究の基礎となるものである。さらに、そうした歴史的資料の分析と平行して、現時点における最新のシェイクスピア翻訳である、松岡和子の翻訳業績について、それをフェミニズム・ジェンダー研究の視点から批判的分析を行った。松岡氏、実質的に日本で最初の女性のシェイクスピア翻訳者であり、本人もそのことに自覚的である。また、公的な席で、「自身はフェミニストである」旨の発言もしている。近藤は、オーストラリアのブリスベンで開催されたシェイクスピア国際学会大会Shakespeare Congressにおけるセミナー「World Feminisms and Shakespearean Studies」に参加し、松岡の翻訳の日本におけるシェイクスピア受容史上の重要性を指摘するとともに、その限界を指摘する研究発表を行い、世界の研究者(アジアの研究者を含む)との批評的対話を通して分析の妥当性を検証した。さらに近藤は、東北学院大学で開催された日本シェイクスピア協会年次大会におけるセミナー「シェイクスピアと異文化プロダクション」に参加し、日本の研究者との批評的対話を通して松岡の翻訳に関する自己の分析の妥当性を検証するとともに、考察を深化させた。同セミナーにおいて、近藤は、「異文化プロダクション」を考察する上で、ジェンダーを考慮に入れることの重要性、および上演の実際的制約を考慮に入れることの必要性を指摘した。本年度は、昨年度の成果を受け、引き続きシェイクスピア受容史関連資料の収集および分析をおこなった。とりわけ、明治日本における『オセロー』受容た関する考察をおこなった。明治日本における『オセロー』受容た関しては、条野採菊の『痘痕伝七郎』や川上音二郎一座による『正劇オセロー』公演が広く知られており、これらに関しては、先行研究も存在する。しかし、これまで受容史においてまったく語られなかった作品として、宇田川文海が『大阪毎日新聞』に連載した『坂東武者』が存在する。本年度は、同作品を発掘し、『痘痕伝七郎』と比較・検討・分析をおこなった。さらにその結果を日本英文学会関東支部一月例会におけるシンポジウム「シリーズ名作を読む(2)-『オセロー』」において発表し、シンポジウム・メンバーおよび聴衆と討議・検討をおこなった。初期の翻案受容において、オセローの「黒さ」は、「美醜」の問題に置き換えられているが、それが「翻訳上演」へ移行する場合、「黒塗り上演」(リアリズム路線)を選択すれば、それは人種的ステレオタイプの反復となり、「黒塗り上演」を拒否(非リアリズム路線)すれば、それは「黒さ」の否定へとつながってしまうと指摘し、日本における『オセロー』の「翻訳上演」は可能なのか?という問題提起をおこなった。とりわけ、昨年度の研究において新たに発掘した明治日本における『オセロー』受容に関する新資料のさらなる分析をおこなった。明治日本における『オセロー』受容に関しては、条野採菊の『痘痕伝七郎』や川上音二郎一座による『正劇オセロー』公演が広く知られており、これらに関しては、先行研究も存在する。しかし、これまで受容史においてまったく語られなかった作品として、宇田川文海が『大阪毎日新聞』に連載した『阪東武者』が存在する。本年度は、昨年度に発掘した同作品について、当時の関連資料を参照しつつ、考察を深めた。『阪東武者』をはじめとする当時の翻案受容において、オセローの「黒さ」は、「美醜」の問題に置き換えられている。これには、『籠釣瓶花街酔醒』のような歌舞伎作品の存在の影響が考えられる。また、「人種」問題の「美醜」への置き換えは、一見すると『オセロー』という作品の持っていた政治性を喪失させる行為に見えるが、当時の「異人」表象、とりわけペリー総督の肖像画を考慮すると、その政治性が明らかとなる。『阪東武者』は、女性(=日本)が、「異人」性を帯びた男性によって「西洋化」されることへの不安の政治学をあぶりだすテクストなのである。
非晶質薄膜中の希土類イオンの配位子場制御に関する研究

平成6年度までに、固体中の希土類イオンのf-f遷移を利用した材料の理論的設計を目指し、非輻射遷移の抑制とともに特定遷移確率の向上の重要性に着目し、配位子場との関係に関する一連の研究を行った。4f準位間の電気双極子遷移確率は、遷移前後の電子状態と配位子場の強度や対称性に依存するので局所構造の支配因子を明らかにするとともに、新規ガラスを作製しその組成と配位子場構造の関連を得、f軌道励起状態のダイナミクスも明らかにした。非輻射損失を支配する多フォノン緩和については、これまでにフォノンサイドバンド測定により局所構造と希土類イオンと結合したフォノンエネルギーとの関係を多くのガラス系について導き、高効率ホストの選択に必要な因子を明らかにした。さらに高い遷移確率を有する固体で共鳴波長領域においてEr、Tmの励起状態吸収を実現することにより示した。また高速緩和機構を時間分解分光を用いてダイナミクスを解析することにより、輻射および非輻射緩和の寄与を明らかにしながら調べ、ガラス中の希土類イオンの局所構造を明らかにするために、Eu-メスバウアー効果の測定を行い、配位子場を規定し、各準位の遷移確率や相対的なブランチ比を支配する強度パラメータを吸収スペクトルからJudd-Ofelt理論により算出し、その決定因子とガラス構造の関係について調べた。またその結果を応用して、Tm^3イオンの紫外、青色発光の強度比を制御することに成功した。これらの知見を基にTm^3,Er^<3+>イオンで赤外可視変換(アップコンバージョン)レーザガラスの設計に成功している(平成6年度光科学技術研究振興財団研究表彰受賞「4f電子遷移を利用した赤外可視変換希土類含有ガラス材料の設計」)。
地方自治体会計・監査と政策評価システムの関係に関する国際比較研究

本研究は、従来専ら行政学の立場から行われてきた政策評価システムの研究を、地方自治体会計、監査との関連から検討したものである。このために、日本、オーストラリアの事例(ニューサウスウェールズ、北海道および札幌市)をとりあげ、国際的な比較研究を行っている。オーストラリアの事例は、世界においてもこの分野の先進事例として考えられ、日本は、現在これらを取りあげっっある状況である。この中で、日本においては、必ずしも会計監査システムと連携が十分でない政策評価システムとの連関を図る者要性が確認され、監査論的視点から見た政策評価システムモデルの構築が試みられた。さらに、我が国においては、地方自治体における会計・監査システムの研究、特にこれらに企業会計的手法を導入した場合の効果、問題点等の研究が未だ不十分であるため、地方自治体会計・監査に重要な影響を与える企業会計的手法についても広く検討を加え、また公的部門の会計・監査にかかる問題についても広く検討を行っている。本研究においては、海外共同研究者であるマーク・クリステンセン・サザンクロス大学(オーストラリア)講師との共同研究成果が重要な位置を占めており、公表された成果としてもこれら共同研究によるものが公表されているところである。本年は、研究初年度として、日本及びオーストラリアの比較研究を行うための研究計画の策定から開始した。そのため、海外共同研究者であるマーク・クリステンセン・サザンクロス大学(オーストラリア)講師と電子メール等により連絡を取り合い、本年度はまずここまでの関連研究についてまとめ、必要に応じて論文として刊行すること、さらに、本研究の目的に沿って、比較研究対象となるオーストラリアの地方自治体につきまず中心に研究活動を行い、日本については次年度に中心的に行うこととした。このための資料収集として、まず、オーストラリアにおいて海外共同研究者マーク・クリステンセンと現地研究打ち合わせおよび資料収集を行い、ここでニューサウスウェールズ州と札幌市を中心に行政評価の会計的比較研究を行うこととした。なお、これらを中心とするが、それに関連する自治体についても検討を加える。具体的には、北海道、三重県、サウス・オーストラリア州等がその対象となる。また、オーストラリア現地においては、資料収集とともに専門家の意見聴取を行っている。日本においても関連する資料等の収集、専門家の意見聴取を各所に赴き行った。本年度後期においては、これらの資料整理を行っている。なお、前述の、本研究の目的に関連するここまでの研究の成果の整理につき、研究成果としての論文の刊行も行っている。本年は、研究最終年度であり、前年度の研究を引き継いで、追加調査の必要性についてまず検討、整理を行った。この結果、日本においては北海道に加えて札幌市の事例についても検討に加えることとし、オーストラリアとの比較対照のために、海外共同研究者であるマーク・クリステンセン・サザンクロス大学(オーストラリア)講師と電子メール等により連絡を取っている。さらには、同氏が日本(札幌)を訪問し、最終的な研究の集成、発表に向けた打ち合わせを行うと共に、札幌市に対しては共同で聞き取り調査を行った。また、補足的な資料収集を共同で行っている。さらに、ここまでの研究成果についてアイルランド・ダブリンで開催されたEIASM公的部門会計カンファレンスにおいて研究報告を行った。以上および前年度の研究成果に基づき、日本及びオーストラリアの比較検討から、日本において必ずしも会計監査システムと連携が十分でない政策評価システムとの連関を図る必要性が確認され、監査論的視点から見た政策評価システムモデルの構築を行った。以上により、研究代表者である吉見は研究成果の総括および報告書の執筆を行うと共に、その一部についてはクリステンセンとの共著によってこれを行った。なお、これ以外にも、本研究に関連した論文を研究成果として研究雑誌等に発表している。
翻訳系複素環ペプチド生合成遺伝子群の覚醒と新奇抗生物質生産システムへの適応

本研究は、これまで放線菌ゲノム内に眠ったままであるチオペプチド生合成遺伝子群をゲノムマイニングで探し出し、遺伝子組換え技術を用いて実験室環境下で強制的に発現させるシステムを構築し、生産が確認されていない新規化合物の強制発現を行うことを目指した。当初計画していたGUSによる発現可視化ベクターの構築を行ったが、GUSレポーターの発現が弱いため、放線菌では上手く機能しないことが明らかとなった。そこで、レポーター遺伝子をChromobacterium violaceum由来のビオラセイン生合成遺伝子とすることにした。ビオラセインはTrpを前駆体とした青色色素である。生合成遺伝子は5個、7 kbからなるが、本遺伝子群をレポーターとして用いた発現可視化ベクターを構築したところ、遺伝子発現の可視化に成功した。そこで、Streptomyces griseus IFO13350のチオヘプチド生合成遺伝子群(SGR4408SGR4423)及びFrankia sp CcI3のチオペプチド生合成遺伝子群(Francci4193Francci4207)に加え、放線菌Streptomyces sp. TP-A058のゲノム中に新たに見出されたランチペプチド生合成遺伝子等についてプロモーター発現条件を本可視化ベクターを用いて解析した。その結果、Streptomyces griseus IFO13350のチオヘプチド生合成遺伝子群(SGR4408SGR4423)及びFrankia sp CcI3のチオペプチド生合成遺伝子群(Francci4193Francci4207)については各種培地を試したが、発現が確認できなかった。Streptomyces sp. TP-A0584由来ランチペプチドに関しては発現が確認できたために、化合物の取得を行っている。26年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、これまで放線菌ゲノム内に眠ったままであるチオペプチド生合成遺伝子群をゲノムマイニングで探し出し、遺伝子組換え技術を用いて実験室環境下で強制的に発現させるシステムを構築し、実際にゲノム解読によって存在が明らかになっているが、生産が確認されていない新規チオペプチドの強制発現を行うことを目指した。放線菌Streptomyces lactacystinaeusのゲノム解読の結果、本ゲノム中に6個の遺伝子だけからなる、これまでに類を見ない最小単位のチオペプチド生合成遺伝子クラスーを見出した。S. lactacystinaeusがチオペプチド系化合物を生産しているという報告はこれまで無かったため、本チオペプチド生合成遺伝子群は、通常は発現していないサイレント遺伝子であることが予想された。そこで、異種発現法を用いて、本遺伝子群を別種の放線菌であるStreptomyces lividansで異種発現させ、新規チオペプチド化合物ラクタゾール類のの化学構造を決定した。ラクタゾール類は14、16、17個のアミノ酸残基をベースにした3種の類縁体lactazole A、lactazole B、lactazole Cからなる化合物群で、チオペプチド化合物の典型的な特徴であるピリジン環を要とする大員環を形成しアゾール環やデヒドロアラニンなどが分子内に存在する構造を有していた。しかしながら、大員環のサイズや構成アミノ酸の種類、ピリジン環の置換基構成が既知のチオペプチドとは異なっており、新しいタイプのチオペプチドであることが明らかとなりました。大員環のサイズについては従来のチオペプチドは9、10、12個のアミノ酸で大員環を形成するチオペプチドが知られていましたが、11個のアミノ酸で構成される32員環を有するチオペプチドはラクタゾールが初めての例であった。

本年度は放線菌ゲノム内で眠っているチオペプチド生合成遺伝子を覚醒し、その産物であるラクタゾールの同定に成功し、その結果をChemistry & Biology誌にて発表することができたため。本年度はチオペプチド生合成遺伝子群発現活性化変異株の作製に力を入れたい。発現していないチオペプチド生合成遺伝子群を実験室の培養条件においても発現が可能になるような変異株の作出もしくは、発現が可能になる培地条件を見出す戦略で、眠っているチオペプチド生合成遺伝子を覚醒させることを目指す。そこで、これら発現が抑えられている生合成遺伝子のプロモーター領域をクローニングする。次にビオラセイン生合成遺伝子をレポーター遺伝子としてそのプロモーター下流につないだ発現可視化プラスミドを構築し、生産菌及びS. lividansに導入する。プロモーターからの転写があれば、青色色素であるビオラセインが生産され青色のコロニーを形成する。形質転換した株を紫外線もしくはNTG等で変異処理し、青色色素を生産する株を選択すれば、その変異株はチオペプチドの生産が期待できる。
自然保護思想の展開過程並びに自然保護法制の比較研究

1.われわれの共同研究は,主として森林,都市近郊緑地,河川,湖沼を対象とする自然保護法制の歴史的かつ比較的研究を目的とする。研究の視点は,(1)各国の自然保護法制の歴史的変遷を自然保護思想の展開過程との関連において明らかにすること,(2)各国の現行自然保護法制の特徴とそれを規定する要因を明らかにすること,(3)各国における自然保護法の運用の実態,(4)各国の自然保護法制における自然保護団体および個人の役割を明らかにすること,におかれている。研究されるべき事項は,時間的にも空間的にも広い範囲に及ぶため,研究メンバーは,それぞれが実行可能な領域から研究を進めてきた。われわれの共同研究は現在も続けられており,その目標を達成するためにはさらに長い時間を必要とする。2.諸外国に関する研究。イギリスについては,産業革命後,一般市民の市民生活享受にとって必要な,戸外活動やリクリエーションのために,自然に親しみ,土地を利用することを可能にするためにとられてきた法的措置が明らかにされた。ドイツについては,ドイツ連邦自然保護法(1976)に至る法制度の歴史的変遷とその中に実現された思想が解明された。ソビエト連邦およびロシヤ連邦共和国については,ペレストロイカの政治的動向を背景として現れた措置および自然保護立法(1991)の内容が明らかにされた。日本法についての研究成果は,多くの研究者によって蓄積されているので,比較研究の成果を作成するための条件ができつつある。3.日本については,いくつかの地域を対象として,自然保護の現状と課題を調査した。中央政府の法令と並んで,地方政府の条例および環境保全を目的とする,事業者を一方当事者とする協定の重要性を強調する理論的フレームワークを提唱した。1.研究テ-マに関連する内外の図書資料の収集,実態調査(岩手県葛根田原生林の調査及び森林生態系保護地域設定に関するヒアリング,東伊豆地域におけるリゾ-ト開発の現状と地方公共団体の環境保全対策の調査,朝日連峰における林道開発・林業施業と自然保護行政の調査,その他栃木県・埼玉県・福島県等のリゾ-ト開発に関する調査)及び学会等における研究成果の発表を実行した.2.研究成果の発表については,下記の通りである(裏面参照),研究・調査は途上にある.比較研究の方法については,共同討議により,(1)自然保護の対象としての自然の素材(概念),(2)自然保護の思想(認識と価値観),(3)保護の手法(対象の所有形態,規制・復元・創造の法的メカニズム・費用負担・参加手続の保障),(4)中央政府の法律・行政,地方公共団体(地方政府)の条例・行政,及び自治規範を要素とする枠組を構成し,この仮説に基づいて研究を進めている.3.日本の自然保護については,現時点の問題から出発して,遡及的に発展過程を辿る手法を採用している.法思想のレベルでは,人格権・環境権・自然享有権の位置づけ,法制度のレベルでは多元的構造の可能性について牛山が新たな知見を提示した.ドイツについては,1935年のライヒ自然保護法の成立に至る自然保護思想と法制度の歴史的発展を北山が解明し,現在に至るまでの歴史的研究の端緒を開いた.ソビエトについては,ペレストロイカと結合して登場した「国の環境的健全化の緊急措置に関するソ連最高ソビエト決定」(1989年)の分析を直川が行ない,歴史的に遡及するソ連邦の法制度の研究と共和国レベルの法制度の研究を今後の課題としている.

イギリス及びアメリカを対象とする研究成果は1991年度にとりまとめの予定である.1わが国については,文献の収集・分析,山形県小国町ほか近隣地方公共団体において地域開発と自然保護に関するヒアリング,福島県磐梯町におけるリゾ-ト開発に関する地方公共団体と住民に対するヒアリング,自然保護の集会に参加して全国的な自然保護上の問題の把握を行った。その結果,地域における環境管理計画の重要性,その実現のために法律ー条例ー協定という多元的手法(構造)の有効性,地域を超えた市民及び団体の異議申立の必要制,その根拠づけとしての自然享有権の意義を確認した。「多元的構造」の分析道具としての有効性が認められたと考える。環境管理計画については,生態系保護の概念の明確化が重要課題となってきた。2アメリカ及びイギリスについて.収集した文献資料の検討中である。イギリスについては,これまでに辿ってきた,イギリスの自然保護制度の歴史的展開を,1990年制定の環境保護法に結びつける作業が進行中である。3ドイツについて.自然保護思想と法制度の歴史的発展過程を概歓したうえ,法と思想(文化)との関係という点から注目に値する「ライヒ自然保護法(1935年)」と、ロマン主義思想及びナチズムとの関連について検討した。さらに,現行の連邦自然保護法をエコロジ-思想に立つものと規定したうえで、そうした性格が同法の具体的な保護手法と現実の保護行政にどのように現われているかの検討に移りつつある。4ソビエト連邦の自然保護法制については,ペレストロイカを背景とした自然保護制度の動きまで分析を行ったが、政変後の激動から生じる動向について資料を収集中である。5われわれの研究の中間報告を昨年5月に比較法研究所主催の講演会で行った。研究計画達成のためにはさらに年月を必要とする。
レアメタル代謝細菌における生物気化メカニズムの解明と気化回収開発

レアメタルは小型デジタル家電や、電気自動車のモーターや電池の材料として不可欠な元素であり、ハイテク産業での需要が急速に伸びている。レアメタルの中でも可採年数が短く、近い将来に枯渇が予想される鉱種は、急激な価格の乱高下が起こりやすい。さらにレアメタルは特定国に偏在し、囲い込みが起きている。このために資源が乏しく、世界でも有数のレアメタル消費大国である日本では安定供給に向けた対策が望まれている。申請者は廃水や廃棄物からのレアメタル回収を可能とするアプローチとして、微生物による金属代謝(メタルバイオテクノロジー)の活用を提案している。生物のもつ高選択性を活かすことで、メタルバイオテクノロジーは廃水・廃棄物から金属を浄化・回収する技術になる。これまでに本技術を活用して廃水中からセレン(Se)を回収する技術開発に成功している。微生物によるメタルバイオテクノロジーの中でも生物気化(バイオボラタリゼーション)は、レアメタル回収技術への活用が期待されている機能の一つである。バイオボラタリゼーション能を保有する微生物の分離やその応用に成功すれば、レアメタルを温和な反応条件で容易に回収するプロセスの開発が可能となる。本研究期間ではバイオボラタリゼーションを利用したレアメタルの1種であるSeの気化メカニズムを明らかにし、それを応用した回収技術を開発する。具体的には申請者等が単離したセレン酸還元細菌Pseudomonasstutzeri NT-I株の保有するSeをメチル化能や気化能に関するメカニズムを解明し、実廃水・廃棄物、汚染土壌からのSe気化回収試験と再資源化技術の構築を行う。これら一連の研究を通じて、既存技術では困難、または不可能とされている廃水・廃棄物、汚染土壌からのレアメタルのリサイクルを可能とし、本技術を広く他のメタルに汎用できる技術にすることを目指すものである。培養工学的アプローチによる気化Se回収液からのSe再資源化を検討した。申請者はこれまでにセレン酸もしくは亜セレン酸を培養液に添加したものを模擬廃水として、NT-I株のバイオボラタリゼーションを利用したSe気化回収試験を行ってきた。セレン酸還元細菌Pseudomonasstutzeri NT-I株が生合成したジメチルジセレニド(DMDSe)を硝酸中で溶解し捕集することに成功している。硝酸中のDMDSeは不揮発性のメチルセレニン酸となる。メチルセレニン酸は工業利用されにくいので、資源価値のある元素態Seや二酸化セレンに変換することを試みた。メチルセレニン酸含有硝酸溶液を苛性ソーダで中和した。そこに過酸化水素を添加し70度で60分間保温して酸化し、セレン酸に変換した。続いて亜硫酸ナトリウムを添加して亜セレン酸に還元・変換した。最後にアスコルビン酸を添加して元素態セレンに還元・変換した。以上の結果、メチルセレニン酸から99%以上の純度のある元素態セレンの回収に成功した。遺伝子工学的アプローチによりまずはDMDSeを生合成するための基質の特定を試みた。NT-I株を用いてセレン酸から以前確立した実験方法により微生物が合成した元素態Se(バイオセレン)を精錬した。NT-I株やDMDSe合成酵素遺伝子を導入した組換え大腸菌にバイオセレンを基質として添加、培養した。培養気化物をガスクロマト質量分析装置(GC-MS)により分析したところ、12時間後に組換え大腸菌はNT-I株と同量のDMDSeだけを生成した。DMDSe以外の不純物は認められなかった。以上の事から、DMDSe合成遺伝子組換え大腸菌はバイオセレンからDNDSeを合成することが分かった。

レアメタルの中でも可採年数が短く、近い将来に枯渇が予想される鉱種は、急激な価格の乱高下が起こりやすい。さらにレアメタルは特定国に偏在し、囲い込みが起きている。このために資源が乏しく、世界でも有数のレアメタル消費大国である日本では安定供給に向けた対策が望まれている。申請者は廃水や廃棄物からのレアメタル回収を可能とするアプローチとして、微生物による金属代謝(メタルバイオテクノロジー)の活用を提案している。生物のもつ高選択性を活かすことで、メタルバイオテクノロジーは廃水・廃棄物から金属を浄化・回収する技術になる。これまでに本技術を活用して廃水中からセレン(Se)を回収する技術開発に成功している。微生物によるメタルバイオテクノロジーの中でも生物気化(バイオボラタリゼーション)は、レアメタル回収技術への活用が期待されている機能の一つである。バイオボラタリゼーション能を保有する微生物の分離やその応用に成功すれば、レアメタルを温和な反応条件で容易に回収するプロセスの開発が可能となる。本研究期間ではバイオボラタリゼーションを利用したレアメタルの1種であるSeの気化メカニズムを明らかにし、それを応用した回収技術を開発する。具体的には申請者等が単離したセレン酸還元細菌Pseudomonasstutzeri NT-I株の保有するSeをメチル化能や気化能に関するメカニズムを解明し、実廃水・廃棄物、汚染土壌からのSe気化回収試験と再資源化技術の構築を行う。これら一連の研究を通じて、既存技術では困難、または不可能とされている廃水・廃棄物、汚染土壌からのレアメタルのリサイクルを可能とし、本技術を広く他のメタルに汎用できる技術にすることを目指すものである。培養工学による気化セレン回収の検討においては、NT-I株やDMDSe合成酵素遺伝子組換え大腸菌株をNT-I由来の元素態セレン(赤バイオセレン)を基質にして1000 ppm添加して培養したところ、12時間後にNT-I株では100%、DMDSe合成酵素遺伝子組換え大腸菌株では123%、ベクターDNA組換え大腸菌では7%の還元能を示した。GC-MS分析を行ったところ、NT-I株では主としてDMDSeを合成し、副産物としてDMDSeS, DMSe, DMDSが混合していたが、DMDSe合成酵素遺伝子組換え大腸菌株では主としてDMDSeを合成し、極少量DMDSeSが混在していた。以上のことから組換え大腸菌株を用いた方が高純度のDMDSeが回収できると思われる。遺伝子工学によるメチル化セレン(気化セレン)合成遺伝子は昨年度の成果からクローニングに成功した。今年度は当該遺伝子を親株であるNT-I株に形質転換を試みた。大腸菌で常用されている塩化カルシウム法やエレクロトポレーション法では形質転換できなかった。細菌で形質転換実績のあるクリソタイル法による形質転換系の構築を試みたが、形質転換体を得ることはできなかった。並行してセレン還元メカニズムを調べるためにDMDSe合成酵素を大量精製するために組換え合成することを試みた。
新たな脂肪細胞由来因子の同定と臨床的意義の解明

私共はDifferential display法を用いて、皮下脂肪に比し内臓脂肪で10倍多く発現する遺伝子としてvisfatinを同定した。ビスファチン発現ベクターを用いてCOS細胞で発現させると培養上清への分泌が確認された。また前駆脂肪細胞から成熟脂肪細胞の分化に伴ってビスファチンmRNAの上昇がみられた。ビスファチン-リコンビナント蛋白を添加すると脂肪細胞の分化誘導作用がみられた。さらに、シグナル伝達機構を解析したところ、ビスファチンはインスリン受容体、IRS-1、IRS-2のリン酸化を誘導することを見出した。さらにL6細胞、H4II細胞、初代培養脂肪細胞でも同様にインスリン受容体下流の経路の活性化、リン酸化が見られた。次に精製したビスファチン蛋白をヨード標識し、HEK293細胞への結合と、HEK293細胞へインスリン受容体を過剰発現することで、ビスファチン蛋白の結合が増加することを見出した。HEK293細胞に発現させたインスリン受容体を免疫精製し、ビスファチン蛋白との結合を調べたところ、インスリン受容体とビスファチンは直接結合することがわかった。ビスファチン-リコンビナント蛋白を各種細胞に添加し、生理作用を調べたところ、3T3-L1細胞、L6細胞で糖取り込みの上昇が、H4II細胞で糖新生の抑制が見られた。この時ビスファチンの作用は用量依存的であり、インスリンとほぼ同程度の力価を示した。生体内でのビスファチン作用を明らかにするためにc57コントロールマウス、KKAy(二型糖尿病モデルマウス、STZ処理したc57マウス(一型糖尿病マウス)に対してビスファチン蛋白を静脈注射したところ、血糖低下作用を認めた。またインスリンが結合しないインスリン受容体変異体に体してもビスファチンの結合、リン酸化誘導作用がみられた。以上のことから、ビスファチンはインスリンとは異なる機序でインスリン受容体リガンドとして作用し、脂肪細胞分化誘導作用、血糖低下作用を示す分子であることが明らかとなった。1.栄養により調節される新たなアディポサイトカインの同定:生活習慣病の病態に関連する因子となるような新たなアディポサイトカインを同定するために、絶食マウス、絶食後の再摂食マウス、過食を呈する肥満マウスの脂肪組織を試料として、signal sequence trap(SST)法を用いて内分泌因子を網羅的にスクリーニングを行った。今後は得られたcDNAクローンの組織分布や栄養調節による発現制御を解明していく予定である。2.内臓脂肪型肥満と関連する新たなアディポサイトカイン・ビスファチンの生理病態的意義私共はDifferential Display法を用いて、皮下脂肪に比し内臓脂肪で約10倍多く発現する遺伝子としてビスファチン(Visfatin : Visceral fat-derived factor)を同定した。ビスファチンの発現ベクターを作成してCOS-1細胞にトランスフェクションしたところ、培養液中への分泌が確認され、ビスファチンが分泌因子であることが明らかになった。また培養前駆脂肪細胞を分化誘導させると、脂肪細胞への分化に伴って、ビスファチンのmRNA発現量が増加し、培養液中へのビスファチン分泌が増加することを明らかにした。さらに、前駆脂肪細胞にリコンビナント-ビスファチンを添加することで、脂肪細胞への分化が誘導され、ビスファチンが脂肪細胞への分化誘導因子であることを明らかにした。生体においてもコントロールマウスに対して、肥満マウスでは、内臓脂肪におけるビスファチン発現が増加していた。しかし、褐色脂肪組織や皮下脂肪においてはビスファチンの発現は増加しなかった。

以上のことからビスファチンは内臓脂肪型肥満に関連する新たなアディポサイトカインであり、内臓脂肪蓄積を促進する因子である可能性が示唆された。今後はビスファチンの脂肪細胞分化に関わるメカニズムや、マウス生体への投与による効果を解明していく予定である。私共がDifferential display法を用いて、皮下脂肪に対して内臓脂肪で約10倍多く発現する遺伝子として同定したビスファチンの解析を進めた。ビスファチンは脂肪細胞の分化誘導作用をもつことから、シグナル伝達機構を解析した。ビスファチン蛋白を培養3T3-L1細胞へ添加し、各種シグナル因子のリン酸化レベルを測定した。その結果インスリン受容体と下流のシグナル因子が活性化されることを見出した。さらにL6細胞、H4II細胞、初代培養脂肪細胞でも同様にインスリン受容体下流の経路の活性化が見られた。精製したビスファチン蛋白をヨード標識し、細胞への結合を確認した。HEK293細胞ヘインスリン受容体を過剰発現することで、ビスファチン蛋白の結合が増加することを見出した。HEK293細胞に発現させたインスジン受容体を免疫精製し、ビスファチン蛋白との結合を調べたところ、インスリン受容体とビスファチンは直接結合することがわかった。以上のことからビスファチンはインスリン受容体リガンドであることが明らかになった。ビスファチン蛋白を各種細胞に添加し、インスリン様の生理作用を有することを確認した。インスリンに反応して糖取り込みが上昇する3T3-L1細胞、L6細胞、糖新生が抑制されるH4II細胞に対してビスファチンを添加したところ、3T3-L1細胞、L6細胞で糖取り込みの上昇が、H4II細胞で糖新生の抑制が見られた。生体内でのビスファチン作用を明らかにするためにc57コントロールマウス、KKAy(二型糖尿病モデルマウス、STZ処理したc57マウス(一型糖尿病マウス)に対してビスファチン蛋白を静脈注射したところ、血糖低下作用を認めた。また、ビスファチンを発現するアデノウイルスを作成し、マウスに感染させたところ血糖低下作用を示した。以上のことからビスファチンはインスリン受容体を活性化し、脂肪細胞分化誘導作用、血糖低下作用を示すことが明らかとなった。
物理シミュレーションを用いたアニメ制作を効率化するディレクタブル制作支援システム

申請者は「アニメや漫画のような個性豊かな映像作品を効率的に制作するため、専門的なスキルを持たないユーザ(デザイナ)の直観的な操作で作品を制作するために,前年度に引き続き「アーティスト(アニメータ)の感覚的なスキルの定量化の技術」「3Dモデリングシステム」の改善に加えて,複数のプロジェクトに従事した.一つ目は、原作となる漫画作品のコマを基にアニメ作品のキャラクタの動きやカメラワーク演出を決定する事に着目し,「あらゆる動作にはキメとなる瞬間(フレーム)が存在する」を立てた.その仮定を基に,原作漫画のコマ割りとアニメ作品との相関関係の分析を行った.この結果を用いて,任意の動画から漫画を制作することが可能となった.更に言語学や心理学の分野で議論されていた「音象徴」の理論を利用し、アニメ作品の擬音語を数値化することで,任意のシーンに最適な擬音語を決定する手法も同時に開発した.二つ目は「3Dモデルを作るための新たなモデリング方法」である。従来のスケッチ(輪郭線ベース)、画像をトレースするモデリングと異なり,提案する操作方法は画像上に複数の点群を配置するだけのものである.プロのデザイナ(3DCGの専門知識なし)やCGモデラ(3DCG作品の制作経験有)を対象としたユーザテストを行った.ユーザテストの内容としては,(1)提案システムの使いやすさの検証,(2)生成結果に要する時間、満足度を調査するものである。その結果、提案するモデリング手法は、特に簡易的な3Dモデルの制作に対して有効性を示した.更に、申請者は共同研究として「キャラクタの二次動作を生成する手法」「衣服モデリング」「イラストを実写の人物に変換する手法」にも着手した.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。申請者は「日本アニメ作品を効率的に制作するため、ユーザ演出を簡単に反映できるシステム」を実現するにあたり,(1)ペンタブレットで描いたイラストからアニメーションを自動生成する研究,(2)イラストから3Dキャラクタを生成する研究に従事した.一つ目はLineの「動く」スタンプのようなアニメーションを効率的に作成するために,〝ユーザが描いたイラスト間を滑らかにつなぐ中割画像の生成′′と〝一度作成した動き情報を別のイラストへ転写する手法′′を提案した.事前データを用いることなく,ユーザが描いたイラストから得られる情報のみで生成可能である上,従来手法では扱えなかったストロークに特化したアルゴリズムを提案した.二つ目に提案した技術は「ペイントアーティスト(専門知識のない人)のための3Dモデリングツール」である.3Dモデルを制作するためには主に(1)ペイントアーティストがキャラクタをデザインし,(2) 3Dモデラがイラストを基に作品を作る二つの工程からなる.このような委託作業が行われる主な理由として「ペイントアーティストは3Dモデリング等の専門的な知識がないこと」が挙げられる.アーティストのこだわりをくみ取ることは非常に困難であり,忠実に再現できない問題が生じている.従来手法は(1)球体や円柱への近似する手法,(2)事前データを用意する方法,(3)統計データに基づく手法が挙げられるが,いずれもアーティストの「精巧でかつ任意の形状の3Dモデル」を実現する手法にはなりえない.これらを調査した結果,本目的を達成するための技術やソフトウェアは提案されてこなかったことが分かった.本研究の独創的な点は1直感的な操作方法,2高速なモデリング手法及び,高速なフィードバックを得ることができる点などが挙げられる.本システムを用いることで,全ての被験者が30分程度で,3Dモデルを制作することを実現した.本年度はアニメーション制作を行うアーティスト(素人及びプロ)を対象としたユーザインターフェースを開発した.まず手描きのイラストをペンタブレットから数枚入力して、それらの内挿によってアニメーションを自動生成するツールを完成させた。これは人間の入力した制約のない描写から、自然なアニメーションを生成することが可能であり、特に人物の顔の回転に関しては秀逸な性能を示している。機械学習や事前知識も必要なく、高速にレスポンスするインターフェースの設計と実装を実現した。またAdobe社にて、これまでの研究で得た知識を活かしプロのイラストレータ向けの3次元キャラクタ生成ツールを構築した。この技術は「絵を描くだけだったアーティスト」がアニメーションや3DCG作品を作ることが可能となる拡張技術としての可能性を秘めている.さらに共同研究として「実写画像をペイント画風に置換する手法」「体型の異なるモデルにフィットした衣装モデルの生成」などといったアーティストの3DCG作成を支援するための技術を多数提案した.その成果を国際・国内学会にて発表を活発に行った。これらの技術は今年度も引き続き,Adobe社といった研究機関との研究討論をしつつ研究を続けていく予定である.申請者は「アニメや漫画のような個性豊かな映像作品を効率的に制作するため、専門的なスキルを持たないユーザ(デザイナ)の直観的な操作で作品を制作するために,前年度に引き続き「アーティスト(アニメータ)の感覚的なスキルの定量化の技術」「3Dモデリングシステム」の改善に加えて,複数のプロジェクトに従事した.一つ目は、原作となる漫画作品のコマを基にアニメ作品のキャラクタの動きやカメラワーク演出を決定する事に着目し,「あらゆる動作にはキメとなる瞬間(フレーム)が存在する」を立てた.その仮定を基に,原作漫画のコマ割りとアニメ作品との相関関係の分析を行った.この結果を用いて,任意の動画から漫画を制作することが可能となった.

更に言語学や心理学の分野で議論されていた「音象徴」の理論を利用し、アニメ作品の擬音語を数値化することで,任意のシーンに最適な擬音語を決定する手法も同時に開発した.二つ目は「3Dモデルを作るための新たなモデリング方法」である。従来のスケッチ(輪郭線ベース)、画像をトレースするモデリングと異なり,提案する操作方法は画像上に複数の点群を配置するだけのものである.プロのデザイナ(3DCGの専門知識なし)やCGモデラ(3DCG作品の制作経験有)を対象としたユーザテストを行った.ユーザテストの内容としては,(1)提案システムの使いやすさの検証,(2)生成結果に要する時間、満足度を調査するものである。その結果、提案するモデリング手法は、特に簡易的な3Dモデルの制作に対して有効性を示した.更に、申請者は共同研究として「キャラクタの二次動作を生成する手法」「衣服モデリング」「イラストを実写の人物に変換する手法」にも着手した.今後の方針として,前年度に着手した技術は,アーティストを対象とした新たな分野の開拓であったことから,さらなる技術開発のためにも共同研究を予定している.今年はこれらの成果を,より多くの研究者やアニメータに向けて周知してもらえるように努める.議論や考察を繰り返し,研究の質を向上させる.さらに,アニメ制作会社の現場スタッフ(申請者の所属する研究室にて,以前に共同研究・技術提供しているアニメ制作会社などによる実使用によって本研究の実用性を検討し,研究成果を結実させる.28年度が最終年度であるため、記入しない。28年度が最終年度であるため、記入しない。
オボアルブミンへの生物機能の付与に関するタンパク質工学的研究

オボアルブミンは、セリンプロテアーゼ阻害能をもつセルピンと祖先を共通にするが、阻害機能をもたない。そこでロジカルな設計に基づく変異を加え、本タンパク質に阻害活性を付与するための研究を行った。申請者らは、オボアルブミン変異体R339Tでは、この部位がヒンジとして働きelastaseによる活性サイトの切断後、阻害活性に不可欠のステップであるループ挿入を起こすことを結晶構造解析により証明した。この発見は、オボアルブミンに阻害機能を付与するための一つの到達点となったが、活性セルピンでみられるような酵素との1:1の化学量論的な阻害活性は未だ認められない。そこで、さらなる変異をロジカルに設計するために、proteinaseにより切断を受ける活性サイトをtrypsin感受性にしたオボアルブミン変異体(A352R/R339T)を調製し、ループ挿入の速度をHPLCを用いて高精度に分析する手法を確立した。ループ挿入速度の高速化が、proteinaseの阻害活性の獲得に直接つながるため、ループ挿入速度を速めるための更なる変異実験を行った。オボアルブミン変異体R339Tの結晶構造を、阻害活性をもつセルピンの構造と比較すると、ループ挿入に必要なストランド3Aと5Aの間の開放に必要な、β-シートAの柔軟性に対し、抑制要因となる構造が見つかる。そこで、これらの抑制要因を除くためさらなる変異体として、K290T/R339T/A352RとR104A/R339T/A352R、及びS-S結合を切断したR339T/A352R(SH-R339T/A352R)を調製した。上記のHPLC法を使ってループ挿入速度を測定した結果、ループ挿入速度はA352R/R339Tに比べ、K290T/A352R/R339T、R104A/A352R/R339T、SH-A352R/R339Tで、それぞれ1.5、3.7、および6.7倍も上昇することが分った。これらの結果は、ループ挿入反応の遷移状態では、β-シートAが開いた構造をとるモデルに一致した。これにより、オボアルブミンにセリンプロテアーゼ阻害能を付与するための論理基盤が確立された。セルピンによる阻害活性の発現には、分子表面に存在するReactive Center Loop (RCL)のproteinase切断後に起こる熱安定化型への構造変換(分子内ループ挿入)が中心的な役割を果たす。セルピンスーパーファミリーに属する卵白オボアルブミンでは、RCLの切断後のループ挿入能を本来持たないが、構造変換のヒンジ部分を置換した変異体OVA (R339T)では、典型的なセルピン・ループ挿入機構を有する。そこで、proteinase阻害活性に必要なループ挿入速度の高速化に向けた、さらなる変異を導入した。まずRCLをtrypsin感受性にしたOVA (A352R/R339T)を調製し、ループ挿入速度を高精度に測定するためのHPLCによる新規の方法を確立した。

本法を使ってRCL切断後のループ挿入速度を解析したところ、pH8、25°Cにおいて、t_<1/2>約80分の一次反応曲線を描いた。反応条件を変えて解析すると、ループ挿入はpHが低いと速いことがわかり、速度定数kは酸性側に変曲点を持つシグモイド曲線を示し、オボアルブミンのループ挿入は酸性側鎖の解離状態により制御されることが分った。さらに、反応温度を変えて速度定数の測定を行ったところ、速度定数の対数プロットは、1/Tに対して傾きが負の直線となり、ループ挿入過程はアレニウス式に従う温度依存性の反応で、その活性化エネルギーは約30kcal/molと算出できた。この値は、10個程度の水素結合による熱安定化に相当するが、結晶構造においてs3Aとs5A間に10個の水素結合が水素結合が存在することと符号しており、ループ挿入反応の遷移状中間体は、両ストランド間の相互作用が失われた構造をとることが明らかにされた。オボアルブミンは、セリンプロテアーゼ阻害能をもつセルピンと祖先を共通にするが、阻害機能をもたない。そこでロジカルな設計に基づく変異を加え、本タンパク質に阻害活性を付与するための研究を行った。申請者らは、オボアルブミン変異体R339Tでは、この部位がヒンジとして働きelastaseによる活性サイトの切断後、阻害活性に不可欠のステップであるループ挿入を起こすことを結晶構造解析により証明した。この発見は、オボアルブミンに阻害機能を付与するための一つの到達点となったが、活性セルピンでみられるような酵素との1:1の化学量論的な阻害活性は未だ認められない。そこで、さらなる変異をロジカルに設計するために、平成15年度の本課題研究でproteinaseにより切断を受ける活性サイトをtrypsin感受性にしたオボアルブミン変異体(A352R/R339T)を調製し、ループ挿入の速度をHPLCを用いて高精度に分析する手法を確立した。ループ挿入速度の高速化が、proteinaseの阻害活性の獲得に直接つながるため、ループ挿入速度を速めるための更なる変異実験を行った。オボアルブミン変異体R339Tの結晶構造を、阻害活性をもつセルピンの構造と比較すると、ループ挿入に必要なストランド3Aと5Aの間の開放に必要な、β-シートAの柔軟性に対し、抑制要因となる構造が見つかる。そこで、これらの抑制要因を除くためさらなる変異体として、K290T/R339T/A352RとR104A/A339T/A352R、及びS-S結合を切断したR339T/A352R(SH-R339T/A352R)を調製した。上記のHPLC法を使ってループ挿入速度を測定した結果、ループ挿入速度はA352/R339Tに比べ、K290T/A352R/R339T、R104A/A352R/R339T、SH-A352R/R339Tで、それぞれ1.5、3.7、および6.7倍も上昇することが分った。これらの結果は、ループ挿入反応の遷移状態では、β-シートAが開いた構造をとるモデルに一致した。これにより、オボアルブミンにセリンプロテアーゼ阻害能を付与するための論理基盤が確立された。
Ｍｒｐ４の網膜血管新生における役割の解明

本研究では、排出型トランスポーターであるMrp4が細胞内cAMP濃度の調節を介して生理的網膜血管新生に複雑に関与していることが示された。また、酸素誘発網膜症において無血管領域の形成と網膜外血管新生がMrp4ノックアウトマウスで増悪したことから、Mrp4が病的網膜血管新生に対して抑制的に働いていると考えられた。これらの結果から、Mrp4が網膜血管増殖疾患の治療ターゲットとなる可能性を見出した。平成24年度の研究結果からMultidrug resistance protein 4 (Mrp4)が生理的網膜血管新生に重要な役割を果たしていることが示唆された。従って、平成25年度は病的血管新生モデルにおけるMrp4の役割につきMrp4ノックアウトマウスを用いて調べることとした。1.研究内容:病的網膜血管新生モデルとして酸素誘発網膜症モデルを用いた。生後7日の新生仔マウスを5日間75%酸素濃度のチャンバーで飼育し、その後、通常空気下で5日間飼育した。生後17日目で眼球を摘出したところ、Mrp4ノックアウトマウスでは野生型マウスに比較して有意な頻度と程度で硝子体出血が生じていた。免疫組織染色では、野生型に比べてMrp4ノックアウトマウスで有意な異常網膜血管新生が認められた。なお、もう一つの病的網膜血管新生モデルとしてレーザー誘発網膜静脈閉塞モデルを評価中である。2.研究の意義:本研究結果からMrp4は眼における病的血管新生を抑制する働きがあると推測される。3.研究の重要性:酸素誘発網膜症モデルは主要な我が国の主要な失明原因疾患である未熟児網膜症、増殖糖尿病網膜症、網膜静脈閉塞症、と類似するメカニズムをもつことから、Mrp4機能不全に注目した診断的・治療的アプローチが失明の予防につながる可能性がある。Multidrug resistance protein 4 (MRP4)は膜タンパク質であり、環状ヌクレオチドを含む様々な生理物質の能動輸送を介してそれらの恒常性維持に貢献している。そこで我々は網膜血管形成過程でのMRP4の役割をin vivoで調べた。1.研究内容: Mrp4ノックアウト(KO)マウスと細胞内環状アデノシン一リン酸(cAMP)の誘導物質であるフォルスコリン(FSK)を用いた実験を行い以下の結果が得られた。(1)新生仔マウスの網膜血管形成を免疫染色で調べたところ、Mrp4KOマウスは正常な網膜血管形成を示した。(2) FSK腹腔内注射後、Mrp4-/-マウス網膜における総血管長、血管分岐数、血管密度、tip細胞数はWTマウスと比較して有意に減少していた。(3) Mrp4-/-マウスでは網膜血管先端部でKi67陽性血管内皮細胞数は、WTマウスと比較して有意に増加していた。また、cleaved caspase3陽性血管内皮細胞数は中心網膜で有意に増加していた。(4) FSK投与後のMrp4-/-マウスでは中心網膜において周皮細胞の被覆率低下とempty sleeve数の増加が共に認められた。(5)酸素誘発血管閉塞モデルでは、Mrp4-/-マウスではWTと比較して非血管領域の範囲は有意に増加していた。(6) FSK投与後のMrp4-/-マウスではα-SMA陽性血管内皮細胞は動脈と静脈の両方に分布していた。2.研究の意義:実験結果からMrp4は細胞内cAMP濃度上昇に伴う網膜血管の増殖・アポトーシス、不安定化、動脈化を制御することにより正常な網膜血管形成に関与していると推測される。3.研究の重要性:生後の生理的網膜血管形成と病的血管新生は類似するメカニズムをもつことから、Mrp4機能不全を防ぐことが網膜血管障害に対する治療的アプローチとなるかもしれない。平成26年度は昨年度に引き続き病的血管新生モデルにおけるMrp4の役割につきMrp4ノックアウトマウスを用いて解析を進めた。1.研究内容:病的網膜血管新生モデルとして酸素誘発網膜症モデルを用いて解析を行った。生後17日目での網膜血管を評価した。Mrp4ノックアウトマウスでは野生型マウスに比較して無血管領域が有意に拡大していた。また、Retinopathy Scoring System (Higgins RD, et al. 1999)を用いた評価では、Blood vessel tuftsとCentral vasoconstrictionのスコアがMrp4ノックアウトマウスで有意に高かった。もう一つの病的網膜血管新生モデルとしてレーザー誘発網膜静脈閉塞モデルを作成して網膜異常血管の評価を行った。Mrp4ノックアウトマウスでの網膜静脈閉塞モデルの作成には成功したものの、レーザーによる神経網膜の組織損傷が強く、網膜損傷に伴う2次的な網膜血管異常の要素が混在する傾向にあったことから、レーザー誘発網膜静脈閉塞モデルでの解析については断念することとした。なお、現在、ストレプトゾトシン誘発糖尿病マウスモデルを用いて、Mrp4と糖尿病網膜症の関連についての研究が進行中である。2.研究の意義:本研究結果からMrp4は網膜を病的血管新生から保護する働きがあると推測される。