hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
微小生物の骨格構造を理解するための放散虫拡大レプリカ作製実習系の開発

カンブリア紀に出現した放散虫は,多様性の高い珪質殻を有し,生層序学的に極めて有効なグループである.高等学校の地学でも示準化石の例として取り上げられており,学習教材としての重要性も高い.放散虫化石を実習に用いる場合,透過型光学顕微鏡や実体顕微鏡による観察やスケッチが主となる.しかし,透過像からの三次元形態の把握はある程度経験を要するものであるし,普及型実体顕微鏡の拡大倍率では放散虫の特徴である微細な骨格構造を観察することは難しい.そこで代表者は,放散虫の骨格構造を体験的に理解できる新しい学習材「放散虫拡大レプリカ作製実習」を開発した.この実習では,手に取れる大きさに拡大した放散虫模型の複製型を使って,樹脂製のレプリカを作製する.レプリカパーツの整形作業と完成物の観察を通して放散虫の骨格構造を学習でき,用いる化石種によって専門性の高い実習から教育普及活動まで展開可能なのが特色である.昨年度は大学3年次対象の約3時間の実習を実施したが,本研究では,対象者を高校生大学2年次に想定した短時間の実習の作成を目指した.作業時間短縮のため,今回の化石種は,整形の手間の少ない単純な円錐形で年代決定に重要なThalarna pulchra(オマーンの下部白亜系スヘイラ層産)を用いた.走査電子顕微鏡装着型マイクロフォーカスX線CTスキャナで撮像後再構成して得た化石の形状データを基に,約180倍に拡大造形した石膏模型を原型にシリコーンゴム型を12個作製した.実習は, 2015年1月に新潟大学Gコード地学実験C履修者(1年次, 15名)に対して実施した.型の数の制限から,実習者を2班に分け, 40分ずつの入れ替え制でレプリカ作製とThalarna pulchraを含む放散虫化石の実体顕微鏡観察を行った.整形作業を減らしても複製作業への関心と完成物に対する満足感から実習者の放散虫に対する興味を十分喚起できていた.今回作成した実習は,今後,教育普及活動にも利用が可能である.海生の珪質動物プランクトンである放散虫は,形態的な変化に富む多様性の高い珪質殻を有しているため示準化石としての価値も高く,地球科学分野における亟要な学習題材のひとつである.放散虫を扱う実習では,主に顕微鏡を用いた観察が行われるが,その小ささ(0.5mm)故に,特徴である微細骨格構造,特に内部構造を確認するのは難しい.研究代表者が昨年度に開発した「放散虫拡大レプリカ作製実習」は,マイクロX線CTスキャンによる形状計測と3D造形技術を利用して扱いやすい大きさに拡大した化石模型を原型とし,安価で丈夫なウレタン樹脂での複製と整形作業を通して,顕微鏡下で把握が難しい放散虫の骨格構造を体験的に理解できる新しい学習材である.この実習は扱う化石や作業難易度を変えることで, (A)専門性の高い実習にも(B)教養学的な普及活動にも展開可能であると考え,本研究ではこれら実習系の開発を目指した。まず, (A)に関して,昨年度に初めて実施した大学3年次対象の実習とそのアンケート集計結果を基に実,習内容を改良した.複製物の問題(殻の薄い模型で生じる反り,模型の組み立て要素の付加)の解決,複製道具・材料の検討,実習テキストの修正を行い,型を増産した後,平成25年10月に新潟大学理学部地質科学科の古無脊椎動物学実験履修生に本実習を実施した.実習時間の短縮にも関わらず作業効率は向上し,実習者からは放散虫の構造把握に効果的な作業と観察であったとの高評価を得た.さらに,新たに実習の主題とそれらに合わせた化石試料を設定した, (A)には,年代決定,形状の普遍性・収斂性に関連する化石種, (B)には複製後の整形作業時間が短い単純で明瞭な構造の種を選び,状態の良い試料を採取した.今後, 3Dデータの採取と加工, 3D造形,型取り作業を行い,各対象学年に実習を実施して,主題と対象化石の適当性,作業時間と難易度,学習効果,興味喚起性等を評価し,改善点を検討する.カンブリア紀に出現した放散虫は,多様性の高い珪質殻を有し,生層序学的に極めて有効なグループである.高等学校の地学でも示準化石の例として取り上げられており,学習教材としての重要性も高い.放散虫化石を実習に用いる場合,透過型光学顕微鏡や実体顕微鏡による観察やスケッチが主となる.しかし,透過像からの三次元形態の把握はある程度経験を要するものであるし,普及型実体顕微鏡の拡大倍率では放散虫の特徴である微細な骨格構造を観察することは難しい.そこで代表者は,放散虫の骨格構造を体験的に理解できる新しい学習材「放散虫拡大レプリカ作製実習」を開発した.この実習では,手に取れる大きさに拡大した放散虫模型の複製型を使って,樹脂製のレプリカを作製する.レプリカパーツの整形作業と完成物の観察を通して放散虫の骨格構造を学習でき,用いる化石種によって専門性の高い実習から教育普及活動まで展開可能なのが特色である.昨年度は大学3年次対象の約3時間の実習を実施したが,本研究では,対象者を高校生大学2年次に想定した短時間の実習の作成を目指した.作業時間短縮のため,今回の化石種は,整形の手間の少ない単純な円錐形で年代決定に重要なThalarna pulchra(オマーンの下部白亜系スヘイラ層産)を用いた.

走査電子顕微鏡装着型マイクロフォーカスX線CTスキャナで撮像後再構成して得た化石の形状データを基に,約180倍に拡大造形した石膏模型を原型にシリコーンゴム型を12個作製した.実習は, 2015年1月に新潟大学Gコード地学実験C履修者(1年次, 15名)に対して実施した.型の数の制限から,実習者を2班に分け, 40分ずつの入れ替え制でレプリカ作製とThalarna pulchraを含む放散虫化石の実体顕微鏡観察を行った.整形作業を減らしても複製作業への関心と完成物に対する満足感から実習者の放散虫に対する興味を十分喚起できていた.今回作成した実習は,今後,教育普及活動にも利用が可能である.
新しい半導体発光デバイスの理論研究

(1)研究の背景と目的:誘電率が周期的に変化する物質(フォトニック格子)中では、電磁モードの存在しない周波数領域(フォトニックバンドギャップ)の出現やこれに伴う自然放出の抑制、さらにはギャップ内局在モードの生成等、これまでに無い光学特性が予測され、その一部は実証されつつある。特に、局在モードを利用した単一モード発光ダイオードが低雑音、高効率、高コヒーレンスといった特徴を持つことが予測され、その実現が期待されているところである。本研究は、このような局在モードからの輻射過程を理論的に解析するため、(1)局在モードの固有周波数および固有関数の正確な導出と、(2)フォトニック格子中での発光過程を記述する理論的枠組みの構築を目的とする。(2)研究成果:そこで、本研究では、(1)格子欠陥を有するフォトニック格子中に置かれた振動双極子からの輻射過程を、ギャップ内局在モードを考慮してグリーン関数法により定式化した。次に、数値解析の一例として、2次元正方格子について、格子欠陥の近くに置かれた仮想的な振動双極子からの輻射電磁場を有限要素法で調べることにより、ギャツプ内局在モードの固有周波数と固有関数を求めた。さらに、(2)密度行列で記述される外来的分極を湧き口とする輻射場を、グリーン関数法で解くことにより、フォトニック格子中のコヒーレント光学過程を取り扱う理論的枠組みを構築した。
ニューロフィラメント蛋白質のリン酸化の意義

神経細胞において、ニューロフィラメント(NF)は細胞体、樹状突起では比較的少ないが、軸索ではよく発達し細胞質の大部分を占める。この分布極性に加えてNFの生化学的極性も存在する。即ち、NFサブユニット蛋白、特にNF-Hが細胞体、樹状突起ではあまりリン酸化されないが、軸索では極めてリン酸化されている。NF-HはNF間のクロスブリッジ形状に重要であり、更に私たちはこの蛋白のリン酸化はNFが規則的なクロスブリッジ形成延いては規則的なNFの構築に必要であろうと考えている。この私たちの考えを実証するために、本研究期間内に種々の実験を行い、以下のデータを得、NF-Hのリン酸化の必要性について考察した。1).有髄線維において軸索の大きさ(直径)とNFの構築及びNF-Hのリン酸化との関係を検索し、径の小さい軸索では微細管の存在割合が大きくNFの密度及びNF-Hのリン酸化の程度が比較的小さいが、大きい軸索ほどNFの密度が増加し、コアフィラメントの配列が規則的で、クロスブリッジがよく発達し、NF-Hのリン酸化の程度が強いことがわかった。2).ランビエ絞輪では軸索の径が小さくなるが、ここではコアフィラメント間の間隔は短くかつクロスブリッジが不規則になり、NF-Hのリン酸化の程度が減少した。3). NF-H蛋白を強制的に培養非神経細胞及び神経様細胞に注入すると、NF-HがNF以外の中間径フィラメントにも組み込まれことがわかると共に、リン酸化型NF-H(リン酸化の程度は本来の軸索に見られるほど強くない)が増加するにつれてフィラメントが束を作りかつフィラメント間の間隔が規則的になり、クロスブリッジが増加する傾向が見られた。4). in vitroでNFと微細管或いはミトコンドリア等の膜性小器官との相互作用にNF-Hがクロスブリッジを形成して貢献することがわかり、NF-Hのリン酸化の程度でどのように変化するか目下検索中である。5)現在ジンピー突然変異マウスを用いて、髄鞘とNFの構築及びNF-Hのリン酸化との関係を追求しているが、この髄鞘を欠く中枢神経の軸索では非リン酸化型MF-Hが極めて増加し、コアフィラメント間の距離が正常より小さいことがわかった。以上より、NF-Hのリン酸化という生化学的事象とNFの形態学的構築との間に密接な関係があることがわかり、コアフィラメントの規則的間隔をもつNFの構成が軸索では必要であり、細胞体、樹状突起では逆に非リン酸化NF-Hの存在が意味を持つことになると推察される。更にNF-Hのリン酸化延いては正常のNFの構築に髄鞘からのシグナルが必要なことが示唆される。私達の今までの所見から、ニューロフィラメント(NF)

サブユニット蛋白質のうちの最大分子量であるNF-Hのリン酸化がコアフィラメント間のクロスグリッジ形成に重要な役割を果たしていることが示唆された。即ち規則的な比較的長いクロスブリッジを形成するためには、NF-Hのリン酸化される必要が考えられこの説を確証するため、本年度の研究では以下の3種類のin vivo軸索の観察及び実験を行った。(1)まずNF-Hのリン酸化の程度が異なる軸索でNFの形態学的構築が異なるかどうかを比較検討した。その結果、リン酸化の程度が大きい有髄線維ではクロスブリッジがよく発達し、コアフィラメントの配列も規則的であったが、リン酸化の程度が小さい有髄線維や無髄線維ではクロスブリッジの発達は前者ほどではなく、かつコアフィラメントの配列が不規則な部位が多く見られた。更に興味深いことに、後者の軸索では微細管の出現頻度が大きく、NF-Hのリン酸化の程度が低くなると、NFと微細管の相互作用が活発になることが示唆され、これは私達の今までのデータ及び他の研究者の生化学的データと一致する所見である。(2)次に軸索において、普通の部位とランビエ絞輪の部位を比較すると、ランビエ絞輪でNF-Hのリン酸化の程度が低くなり、かつ非リン酸化の程度が高くなることが免疫細胞化学的にわかった。この部位のコアフィラメントの配列は比較的規則的はFあるが、その間隔が有意に減少し、クロスブリッジが短くかつ分岐しておりNF-Hのリン酸化の程度が同一軸索内においてもNF-Hの構築に影響を与えていることがわかった。(3)最後に免疫抑制剤のサイクロスポリンAの神経細胞内に存在するCa^<2+>/カルモジュリン依存生のフォスファターゼであるカルシニューリンの活性を抑制すると考えられているが、このサイクロスポリンAをラット脳内に投与することにより、中枢神経細胞、特にその軸索終末のNF-Hのリン酸化の程度を免疫細胞化学的に増加さすことができた。従って細胞体で形成されたNF-Hが軸索内でリン酸化され、更に軸索内輸送の後、終末で脱リン酸化され、分解されることが予想される。急速凍結ディープエッチ法で終末内のNF構築を観察すると、確かにクロスブリジの形成能が悪いことがわかり、微細管との連結もみられ、NF-Hのリン酸化/脱リ酸化によって、終末の延いては軸索のNFの構築が可逆的に維持されていると考えられる。ニューロフィラメント(NF)は3種類のサブユニット蛋白から構成されるが、この3種類のうち最大分子量のNF-Hは軸索で極めてリン酸化されているが、樹状突起ではほとんどリン酸化されない。私たちは今までこのリン酸化NF-Hが軸索でのNF間のコアフィラメント同士の架橋即ちクロスブッリジの形成に本質的役割を果たしている種々の証拠を提出してきた。本年度はこれを実証するため非神経培養細胞である線維芽細胞及び星状膠細胞と、神経細胞の性質を持つ培養細胞である分化したニューロブロストーマ細胞とPC12細胞を用いて、NF-Hサブユニット蛋白を直接細胞内に注入する方法とNF-HのcDNAを細胞に導入しNF-Hを過剰発現させることによって細胞骨格系、特に中間径フィラメント系がどのように変化するか免疫細胞化学的手法並びに急速凍結ディープエッチ法を用いて検索した。NF-H蛋白を注入すると、非神経細胞においては線維芽細胞ではビメンチンフィラメントに、星状膠細胞ではグリアフィラメントに組み込まれている所見を得、NF-HはNF以外の他の中間径フィラメント蛋白とも一緒に重合することが解かった。この場合、NF-Hがリン酸化していない方が、フィラメントには組み込まれやすいことも解かった。
DNA転写調節因子を介する小胞体膜合成制御機構の解明

本研究では、新たに開発した化学発光を用いた高感度定量組織化学法および計量形態法の2つの形態学的手法を主要な手段とし、これらを分子生物学的手法と組合せて肝細胞におけるCYP2B1/2分子種の発現調節機構およびPBによる小胞体膜増生の機構について個々の細胞レベルで解析した。薬物刺激に対する肝細胞の反応性は肝小葉内に占める細胞の位置によって異なっており、小胞体膜合成機構の解明には、細胞レベルでの解析が必須であった。本研究により、以下の事柄が明らかとなった。1)小胞体膜増生が膜蛋白誘導と独立した事象であることが明らかとなった。また、phenobarbital(PB)が膜増生と膜蛋白誘導の2つの機構に対して同一のtriggerとして作用すること、および、その場合の膜増生と膜蛋白誘導の2つの機構が類似性を有する可能性が示された。2)PBによる小胞体膜増生が膜分解の阻止でなく膜合成の亢進であり、PB投与により膜合成酵素であるGATが誘導されていることが明らかとなった。これらの結果から、GATがCYP2B1/2と同様の発現制御機構によって転写時調節を受けている可能性が示された。3)PB誘導型CYP2B1/2 genomic DNAの解析により、転写開始点から約2500塩基上流にPBに特異的な転写調節領域が存在し、そこにNF1結合部位を含むPBRE配列が認められた。また、PBREと近位プロモーターとの間には密接な関係があり、PBが作用するとPBREが近位プロモータにinteractし、転写が活性化すると考えられる。4)本研究を遂行するにあたり、in situにおける1)各CYP分子種含量測定法、2)DNA転写調節因子検出法(in situ Sowthwestern hybridization法)、および3)光子計測を用いた高感度反応検出法を開発した。5)本研究で開発した技法を用いて、XREを介するCYP1A1/2遺伝子転写制御機構の解明を試み、CYP1A1/2遺伝子の転写調節因子(XRE結合蛋白=AhR-ARNT複合体)が核で形成されることを明らかにした。また、AhRが薬物と結合して核に移行する際、それまで結合していたHSP90と細胞質において解離することが明らかとなり、その解離によってAhR分子の高次構造が変化し、AhRのN末端にある核移行シグナルが露出することによってAhRが核に移行する可能性が示された。2,ISH信号の強度を化学発光画像解析システムを用いて定量化するための適切な反応条件を我々が開発した定量組織化学法にしたがって決定した。さらに、定量組織化学法を用いてLISHの定量性を検定し,LISHの定量性がDIG-peroxidase法、DIG-Tyramide法、in situ PCR法と較べて良好であることを明かにした(研究実施計画の2および3項に対応)。これらの結果から、LISH法を用いて定量的高感度・高分解脳in situ hybridizationを行うことがはじめて可能となった。2)上記の実験結果を計量形態学的手法を用いて算出した小胞体膜表面積(小胞体量)と比較した。

中心部肝細胞におけるP-450 2B2の発現増加(約10倍)はと膜の増生(1.5倍程度)と単純に比例していなかった。現在、GAT mRNAの増加と小胞体膜増生との関係を細胞レベルで解析中である(交付申請書記載の研究実施計画6項に対応)。1)肝細胞glycerophosphate acyltransferase(GAT)c-DNA低ホモロジー領域nucleotideに相補的なprobeを人工合成し、このprobeを用いてphenobarbital(PB)80mg/kg投与ラット肝細胞におけるGATm-RNA発現量を測定した結果、PB投与によってGATの転写が活性化することが明らかとなった。この結果は計量形態学的手法を用いて算出した小胞体膜表面積(小胞体量)および小胞体マーカー蛋白GRP78の増加とほぼ比例しており、PBによるGAT転写の活性化と小胞体増生の間に密接な関係が存在することが明らかとなった。(交付申請書記載の研究実施計画5および6項に対応)2)肝細胞genomicDNAライブラリを用いたGAT DNA5'flanking領域のヌクレオチド配列を完全決定するには至らなかったが、判明したヌクレオチド断片を調べた限りでは、PBRE配列は検出されなかった(交付申請書記載の研究実施計画7および8項に対応)3)肝細胞におけるCYP1A1/2DNA転写調節因子の細胞内局在および薬物刺激後の核への移行経路を、本研究で開発した高感度免疫組織化学法および高感度ISH法を用いて調べ、CYP1A1/2の転写調節因子AhRとArntおよび細胞質におけるAhRのパートナー蛋白HSP90の細胞内動態を解明し、初年度に得られたAhRとArntの会合・解離部位が核であることに加えて、AhRとHSP90の解離部位が細胞質であることを明らかにした。(交付申請書記載の研究実施計画2,3,4,9および11項に対応)
ヘリコバクター・シネディの治療方針の策定および病原性解明に関する研究

ヘリコバクター・シネディは、近年分離報告が増加している感染症原因菌であり、国内の複数の医療施設で院内感染を引きおこしている注意すべき菌種である。本菌種感染症の特徴として、およそ35%の患者で再発が見られ、抗菌薬投与後、症状が寛解しても、しばらくすると再発する症例が数多く報告されている。本菌種の治療方針は未だ策定されておらず、抗菌薬治療におけるブレイクポイントが設定されていないため、治療に難渋している。ブレイクポイントは治療効果を予測できる基準値であるため、適切な抗菌薬の選択に重要である。平成30年度は、これまで国内外で分離されたヘリコバクター・シネディの薬剤感受性試験を行い、各薬剤に対する傾向を明らかにした。カルバペネム系、アミノグリコシド系、テトラサイクリン系抗菌薬に対して感受性を示した(MIC90≦1μg/ml)。ペニシリン系、セフェム系抗菌薬は臨床現場での使用報告が多い抗菌薬であるが、MIC値としてはやや高い値であった(MIC90≧8μg/mL)。日本分離株の多くはキノロン系およびマクロライド系抗菌薬に耐性であった。耐性を示す薬剤については、耐性関連遺伝子について解析し、マクロライド系抗菌薬の作用点である23SリボソームRNAの点変異や、GyrAのキノロン耐性決定領域の変異を確認した。また、薬剤排出システムの関与を調べるために、保有している国内分離株について薬剤排出システムの保有性およびアミノ酸配列を決定したところ、アミノ酸配列のある点変異が薬剤の高度耐性化に関与していることを見出した。薬剤排出システムが薬剤耐性のみならず、細菌病原性に関与している可能性を考えると、本菌種が保有する排出システムを理解することは、本菌種の感染対策にも有効であり、再発メカニズム解明にもつながると考えられる。平成30年度は、国内外分離株の薬剤感受性試験を行い、各薬剤に対する感受性を明らかにした。また、耐性傾向を示す薬剤については、薬剤耐性関連遺伝子の変異や薬剤排出ポンプの関与についても見出すことができた。より詳細に解析するため薬剤排出システムの欠損株を作製中であり、基質の同定や排出システムの構造変化と耐性化についても解析していく予定で、本研究はおおむね順調に進展していると考える。次年度は、臨床現場と協力してより多くの分離株について薬剤感受性試験を行い、ヘリコバクター・シネディの治療方針の基盤を築けるように感受性データを蓄積する。また、薬剤排出システム欠損株を作製し、薬剤排出システムの耐性化への寄与度を明確にする。ヘリコバクター・シネディの特異的遺伝子群の解析では、VI型分泌装置(T6SS)の構成タンパク質発現を抑制したT6SS欠損株を用いて、この分泌装置の機能とエフェクターの存在を明らかにしていく予定である。

平成30年度は、薬剤感受性試験および遺伝子工学を中心に研究を進めたため、物品の購入が予定よりも少なく、次年度使用額が発生した。遺伝子工学用試薬やマウス飼育用品、細胞培養用試薬等の購入に使用する予定である。
視放線刺激を用いた、人工視覚の試み

動物を用いた視放線、視覚野刺激、多点計測正常ラットの一次視覚野を含む大脳皮質に多極微小皮質内電極を定位的に設置し、まず光刺激で網膜を刺激し、マルチチャンネル電極神経信号収集システムで計測した。また同じ電極を用い、その一極からの単発刺激を行い、周辺電極からの反応を記録した。網膜光刺激での多点計測ではspikeの収率は約30%であった。Perievent histogramを用いたスパイク潜時の解析から、網膜光刺激では一次視覚野と高次視覚野の2種類のスパイクパターンを認めた。一方、一次視覚野への電気刺激では高次視覚野パターンのみを認め、一次視覚野のパターンは認めなかった。Joint PSTHを用いた解析では網膜光刺激、後頭葉電気刺激共に機能結合群を認め、その空間分布にはそれぞれ類似性を認めた。しかし、スパイクを誘発できる刺激条件が固体により一定していなかった。これらの結果から、後頭葉の単発パルス刺激は高次視覚野の神経活動を誘発するが、周辺の視覚野には皮質間連絡の分布を示すのみであると考えられた。さらに、空間分布を利用することで、多点刺激により視覚に近い感覚を誘発できると考えられる。また、より末梢に近い視放線を刺激することが、網膜刺激に近似すると考えらる。しかし、これに引き続きラット、ネコをもちいて視放線の電気刺激を行ったが、今のところ有意な誘発スパイクを得ることはできていない。今後、脳白質刺激の刺激条件や視放線電気刺激における刺激部位などの検討が必要であると考えられた。ラットを用いた視覚野刺激・多点計測実験正常ラットを用いて、麻酔下で脳表に多極微小皮質内電極を定位的に視覚野に設置した。まず光刺激で網膜を刺激し、マルチチャンネル電極神経信号収集システムで計測した。また同じ電極を用い、その一極からの単発刺激を行い、周辺電極からの反応を記録し、これらで得られるスパイクを比較検討した。網膜光刺激での多点計測ではspikeの収率は約30%と高い値が得られた。Perievent histogramを用いたスパイク潜時の解析から、網膜光刺激では一次視覚野と高次視覚野の2タイプの誘発スパイクパターンを認めたが、一次視覚野への双極電気刺激では高次視覚野パターンのみを認めた。Joint PSTHを用いた解析では網膜光刺激、後頭葉電気刺激共に複数の機能結合群を認め、その空間分布には部分的類似性を認めた。これらの結果から、後頭葉の単発パルス刺激は網膜光刺激とは部分的に類似した高次視覚野の神経活動を誘発するが、周辺の視覚野には皮質間連絡の分布を示すのみであると考えられ、単極刺激での限界がある。しかしながら、空間分布を利用することで、多点刺激により視覚に近い感覚を誘発できると考えられる。また、より末梢に近い視放線を刺激することが、網膜刺激に近似すると考えられる。次年度は視放線刺激をこれらの結果と比較し、刺激部位を検討し、さらに多点刺激を加えることで、人工視覚の実現に近づきたい。
タスマニア及びニュージーランドの菌類の分化と分布に関する研究ーー特に日本産ブナ科植物上の菌類との関連を中心として

1.各菌類分類群の研究結果(1)担子菌類ハラタケ目(本郷担当)では相当数の新産類や新種が発見され、その1部については目下報告を印刷中である。タスマニアのツキヨタケ近縁種とニュージーランドのシイタケ近縁種についてはさらに生化学的・遺伝学的研究を続けている。この他、日本産のソライロタケやムラサキフウセンタケにごく近縁の別種がニュージーランドに分布することが明らかになった。ヒダナシタケ目(Buchanan担当)では、汎分布種を除いて日本産種と関連のある種は殆ど発見されなかった。一方、当該地特産種には分類学上重要な種があり、その中には今回丸調査で発見された5新種が含まれる。腹菌亜綱(Beever担当)では、日本に産しない多数の種がみられた。日本に持ち帰ったそれらの標本は、科博における菌類分類学公開講座の実物教材としても大いに活用されている。ニュージーランド産のクラウスツラ科の1属1種のきのこは報告されて以来60年ぶりにタイプロカリティーから再発見され、現代の分類学的観点から詳細な研究が行われ、報告も準備されている。なお、カゴタケ属は太平洋西岸に沿って分布する菌類の1例であるが、本属あるいは同様の分布が知られる菌類が南米パタゴニアにも分布していないか確認する必要がある。(2)子嚢菌類(土居、阿部、Beever、Johnston担当)チャワンタケ綱ではナンキヨクブナのみに寄生するキッタリア目の分類学的位置の研究が倉石(東京農工大)によって行われた。目や科のレベルの分類に有用なユビキノンシステムの分析の結果について目下吟味検討中である。いずれはパタゴニア産のキッタリアについても追試を計画している。ファキジウム目(リチスマ目)については、日本に専門研究者がいないため、ニュージーランドの研究者Mr.Johnstonを日本に招へいし、日本産本目菌類の研究を依頼した。その結果、汎分布種を除くとニュジーランド産と日本産の種間には同種あるいは近縁別種と考えられる種は発見されなかった。地下生のツチダンゴ属では今回のニュージーランドの調査で2新種が発見された。それぞれナンキョクブナ及びレプトスペルムム(フトモモ科)に依存する。核菌綱では、クロサイワイタケ目のHypoxylon属やボタンタケ目のHypocrea pallida群、H.piluli fera群などに、ニュージーラント及びタスマニアと日本に近縁別種が分布する例が明らかになった。Hypocrea属やハラタケ目の例から、大陸間のような地理的スケールで近縁別種が地理的に分布する例が菌類にはあることが指摘された。H.pallida群についてはすでに報告し、H.pilulifera群については目下報告を準備中である。(3)その他の菌類酵母菌類(子嚢菌及び担子菌を含む、杉山担当)では、ニュージーランドの野生植物体から分離された野生酵母は1新種を含めて多彩であった。植物病原菌類(津田担当)ニュージーランド及び日本の導入作物や侵入植物を犯す糸状菌による病害相は、それぞれの地域の地史的特性を反映して対照的に異なり、今後さらに、両国間の糸状菌病害相を比較し、侵入を警戒すべき糸状菌に対し植物防疫上の対策を講じる必要があることが明らかになった。2.菌類の地理的種分化について。ニュージーランド及びタスマニアと日本に近縁別種が分布する例が相当数認められた。このような地理的規模での近縁菌類の分布と種分化は他の生物ではあまり認められない例であろう。3.今後の調査研究計画。これについては上記各項目でも多少記したが、さらに次のような調査研究も菌類の分化と分布を解明するために必要である。(1)ナンキョクブナの分布するオーストラリア本島、南米パタゴニアの菌類の分類学的、生物地理学的研究(2)タスマニアの一部地域にみられる、ナンキョクブナ(上部)とユーカリ林(下部)の隣接森林地域にみられる極めて豊富な菌類の分布と種分化の様相の調査研究(3)タスマニア及びニュージーランドの森林における有機物分解菌類の生態学的研究及び菌根形成菌の樹木生育への寄与の程度。

なお、カゴタケ属は太平洋西岸に沿って分布する菌類の1例であるが、本属あるいは同様の分布が知られる菌類が南米パタゴニアにも分布していないか確認する必要がある。(2)子嚢菌類(土居、阿部、Beever、Johnston担当)チャワンタケ綱ではナンキヨクブナのみに寄生するキッタリア目の分類学的位置の研究が倉石(東京農工大)によって行われた。目や科のレベルの分類に有用なユビキノンシステムの分析の結果について目下吟味検討中である。いずれはパタゴニア産のキッタリアについても追試を計画している。ファキジウム目(リチスマ目)については、日本に専門研究者がいないため、ニュージーランドの研究者Mr.Johnstonを日本に招へいし、日本産本目菌類の研究を依頼した。その結果、汎分布種を除くとニュジーランド産と日本産の種間には同種あるいは近縁別種と考えられる種は発見されなかった。地下生のツチダンゴ属では今回のニュージーランドの調査で2新種が発見された。それぞれナンキョクブナ及びレプトスペルムム(フトモモ科)に依存する。核菌綱では、クロサイワイタケ目のHypoxylon属やボタンタケ目のHypocrea pallida群、H.piluli fera群などに、ニュージーラント及びタスマニアと日本に近縁別種が分布する例が明らかになった。Hypocrea属やハラタケ目の例から、大陸間のような地理的スケールで近縁別種が地理的に分布する例が菌類にはあることが指摘された。H.pallida群についてはすでに報告し、H.pilulifera群については目下報告を準備中である。(3)その他の菌類酵母菌類(子嚢菌及び担子菌を含む、杉山担当)では、ニュージーランドの野生植物体から分離された野生酵母は1新種を含めて多彩であった。植物病原菌類(津田担当)ニュージーランド及び日本の導入作物や侵入植物を犯す糸状菌による病害相は、それぞれの地域の地史的特性を反映して対照的に異なり、今後さらに、両国間の糸状菌病害相を比較し、侵入を警戒すべき糸状菌に対し植物防疫上の対策を講じる必要があることが明らかになった。2.菌類の地理的種分化について。ニュージーランド及びタスマニアと日本に近縁別種が分布する例が相当数認められた。このような地理的規模での近縁菌類の分布と種分化は他の生物ではあまり認められない例であろう。3.今後の調査研究計画。これについては上記各項目でも多少記したが、さらに次のような調査研究も菌類の分化と分布を解明するために必要である。(1)ナンキョクブナの分布するオーストラリア本島、南米パタゴニアの菌類の分類学的、生物地理学的研究(2)タスマニアの一部地域にみられる、ナンキョクブナ(上部)とユーカリ林(下部)の隣接森林地域にみられる極めて豊富な菌類の分布と種分化の様相の調査研究(3)タスマニア及びニュージーランドの森林における有機物分解菌類の生態学的研究及び菌根形成菌の樹木生育への寄与の程度。
表現論,組合せ論とその周辺の総合的研究

小池は古典群の通常表現の中で,今まで扱っていなかったスピン表現及びSO(2n)の差の表現についてテンソル積の分解,表現の制限則について普遍指標の方法が有効であることを示し、ヤング図形的な方法が全ての古典群について有効なことを示し、Advances in Mathematicsに発表した。さらに古典群の表現論に関する今までの研究をまとめ、雑誌「数学」(日本数学会編集)に発表するとともにアメリカ数学会のtranslation seriesにその英訳敷延したものを発表した。谷口はワイル群不変な可換微分作用素環について、周期関数ポテンシャルをもつ場合に高階部分がその2階部分によって一意的に決定されることを示した。さらに有理関数ポテンシャルの場合にはDunkl作用素を用いた一般的な構成法を与えた。矢野は力学系の幾何学的な側面から見た解説書を出版した。その中で一次元及び二次元の相空間に絞って重要な課題、Morse-Smale系、構造安定性と分岐、拡大写像、Anosov系について概説を与えた。井上は一般型代数曲面の種数零となるものの構成法を二通り与えた。伊原は主として,計算数論に関り、「多倍精度整数計算用のパッケージ」の改良を前年度に続き、更に行った。またこれを用いて「楕円曲線の整数論」用ソフトの開発の研究を行った。小池は次の研究を実行し,出版した.(1)古典群の表現論に関する今までの小池の研究をまとめた雑誌「数学」(日本数学会編集)中の論説「古典群の表現について」を、敷衍、英訳してアメリカ数学会のtranslation seriesに発表した。(2)古典群の既約表現の次元とそのq-analogであるprincipalspecializationsをYoung図形上の組み合せ論(hookの長さ等)のみを用いて与え、Advances in Mathematicsに発表した。(3)古典群の通常表現の中で、今まで扱っていなかったスピン表現及びSO(2n)の差の表現についてテンソル積の分解,表現の制限則について普遍指標の方法が有効である事を示し、ヤング図形的な方法が全ての古典群について有効なことを示し、Advances in Mathematicsに発表した。(4)スピン表現についてBrauer中心化群の生成元と関係式についてのその候補に当たるものを構成した.井上は次の研究を実行し,出版した.(1)幾何種数0の一般型代数曲面の新しい実例の構成を行った。伊原は主として,計算数論に関わった。「多倍精度整数計算用のパッケージ」の改良を前年度に続き、更に行った。小池は古典群の表現論のなかで最後まで残っていたスピン表現及びSO(2n)の差の指標についてテンソル積の分解や表現の制限則等についてもヤング図形的な方法が有効であることを示した。さらに今までの小池の研究をまとめた雑誌「数学」(日本数学会編修)の中の論説「古典群の表現について」(1996)を、敷延、英訳し、アメリカ数学会のtranslation seriesに発表した。谷口はフィル群不変な可換微分作用素環について、周期関数ポテンシャルを持つ場合に高階部分がその2階部分によって一意に決定されることを示し、有理関数ポテンシャルの場合にDunkl作用素を用いた一般的な構成法を与えた。矢野は力学系の幾何学的な側面からの解説書を出版した。その中で一次元及び2次元の相空間に絞って重要な課題、Morse-Smale系、構造安定性と分岐、拡大写像,Anosov系等について概説を与えた。井上は一般代数曲面の新しい実例として幾何種数0の代数曲面及びBinartによる一般代数曲面の一例を与えた。伊原は主として計算数論に関わり、「多倍精度整数計算用のパッケージ」の改良を前年度に引き続いて行った。
教育現場における視覚障害幼児のための視力評価法の開発

本研究は、近年障害の重度化と重複化の著しい盲学校教育現場の現状を踏まえ、既存の視力検査が実施困難な視覚障害幼児のための視力評価法の開発を目的として行われた。今年度は、視力測定に用いる視標および、測定手続きが視力検査実施の成功率に与える効果について、精神発達遅滞をともなう視覚障害児を対象に検討した。視標は既存のランドルト環視標と絵視標、およびランドルト環と絵視標の見本視標を作成した。手続きは、(1)従来実施されてきた手続きと、(2)視標を提示して子どもの手元に並べた見本視標を選択する「見本合わせ法」を用いた。また、「見本合わせ法」では言語指示による検査課題の理解が困難な場合には、他者のモデル提示によって理解を促した。その結果、ランドルト環検査、絵指標による検査とも、見本合わせ法による手続きの方が、より発達レベルの未熟な対象児に実施可能であるこが検証された。特に、以下の2点、すなわち(1)従来の方法では全く測定が不能であった対象児にも実施できたこと、(2)従来の方法である程度測定できるものの結果が不安定であった対象児検査において確実に実施できた点において、本研究の検査手続きが有効であることが明かになった。しかしながら、検査の実施が困難な対象児も多く、測定可能な年齢の下限は2歳6ヶ月程度であると推定された。また、さらに低年齢の対象児への自覚検査実施の可能性を検討するための予備的実験として、健常幼児を対象に最小視認閾視標を用いた視覚-運動操作手続きによる視力検査を行った。その結果、1歳6ヶ月程度の対象児においても検査手続きの理解が可能であり、検査への子どもの意欲も良好であることが示唆され、(1)各検査の適用下限年齢を明かにすること、(2)視覚-運動操作手続きの有効性の検討が課題として残された。
C型肝炎ウイルスによる脂肪合成活性化と関連病態の解析

C型肝炎ウイルス(HCV)コア蛋白質は、細胞内のラフト様構造にも局在してるが、ウイルス感染環あるいは病原性における役割はわかっていない。本研究によって、膜内切断を受けたコア蛋白質はウイルス粒子形成に必要であることが示された。また、コア蛋白質とPA28γの発現によって脂質代謝が増強される現象は、インターフェロン抵抗性を示すC型肝炎患者で多く認められるコア蛋白質変異によって減弱していた。以上のことから、コア蛋白質を修飾する宿主蛋白質を標的にした薬剤が、抗HCV薬として期待出来ることが分かったC型肝炎ウイルス(HCV)コア蛋白質は、細胞内のラフト様構造にも局在してるが、ウイルス感染環あるいは病原性における役割はわかっていない。以上のことから、コア蛋白質を修飾する宿主蛋白質を標的にした薬剤が、抗HCV薬として期待出来ることが分かった1.HCV構造蛋白質のラフト局在と成熟過程への関連性HCVコア蛋白質は、細胞内のラフト構造にも局在してるが、ウイルス感染環あるいは病原性における役割はわかっていない。コア蛋白質はSPおよびSPPで切断されることによって成熟蛋白質になるが、どの過程がラフトへの局在に必要条件であるか分かっていない。本研究によって、コア蛋白質は成熟することでラフト構造への局在し、それがウイルス感染に有利に働いている事が分かった。SPP抑制剤およびSPP変異体発現によってウイルス増殖は抑制され、コア蛋白質のラフト画分への局在は抑制された。2.HCVによる脂肪合成経路活性化の経路解明コア蛋白質は核でPA28γと結合するとプロテアソームに依存して分解され、脂肪肝を発症する。PA28γがないと、コア蛋白質は核に集積し、脂肪肝は誘導されない。しかし、脂肪酸およびコレステロール合成経路のどの因子がコア蛋白質発現によって影響を受けるのかわかっていない。本研究によって、コア蛋白質による中性脂肪および脂肪酸合成が誘導されていることが、コア蛋白質発現マウスを使って明らかになった。脂肪酸および中性脂肪の合成促進は、転写因子核内受容体LXRおよびRXRαの活性化を介して行われており、コア蛋白質の発現はそれを活性化しており、それにはPA28γの発現が不可欠であった。1.HCV構造蛋白質のラフト局在と成熟過程への関連性HCVコア蛋白質は、細胞内のラフト様構造にも局在してるが、ウイルス感染環あるいは病原性における役割はわかっていない。コア蛋白質はシグナルペプチダーゼおよびSPPで切断されることによって成熟蛋白質になるが、どの過程がラフトへの局在に必要条件であるか分かっていない。本研究によって、SPPで切断を受けたコア蛋白質はラフト様膜画分への移行することが、ウイルス粒子形成に必要であることが示された。SPP抑制剤およびSPP変異体発現によってウイルス増殖は抑制され、また、SPP耐性変異をコア蛋白質コード領域に挿入したウイルスでは、ウイルス産生が著しく抑制されていた。以上のことから、SPPは抗ウイルス剤開発の標的候補になりうる事が示唆された。2.HCVによる脂肪合成経路活性化の経路解明コア蛋白質は核でPA28γと結合するとプロテアソームに依存して分解され、脂肪肝、インスリン抵抗性、肝細胞癌を発症する。PA28γ遺伝子の欠損によって、コア蛋白質は核に集積し、脂肪肝は誘導されない。本研究によって、LXRα/RXRαによってSREBP-1cプロモーターが活性がコア蛋白質とPA28γの発現によって増強されることが分かった。また、インターフェロン抵抗性を示すC型肝炎患者で多く認められるコア蛋白質変異を加えるとSREBP-1cプロモーター活性が低下することが認められた。以上のことから、PA28γ存在下で、コア蛋白質はLXRα/RXRαの転写活性を上げ、脂肪化を促し、それがインターフェロン抵抗性にも関連があることが示唆された。
代謝拮抗体1-アミノプロリンを活用した生体修飾アミノ酸の新規代謝機構の解明

メチル化修飾タンパク質の代謝回転に伴って体液中に遊離されるN^G, N^G-ジメチルアルギニン(DMA)及びN^G, N′^G-ジメチルアルギニン(DM′A)のラットにおける代謝機構を酵素レベルで解明した.1.DMA, DM′Aの代謝経路:ラットに投与した放射性DMA及びDM′Aの挙動を詳細に検討した. DMA, DM′Aは共にトランスアミナーゼの作用によりそれぞれのα-ケト酸に転換された後,これらα-ケト酸の酸化的脱炭酸化合物へと代謝される.一方, DMAは特異的に直接シトルリンへと転換された後,さらに尿素回路に関連した種々の化合物へと代謝される.これらに本研究者が既に明らかにしている, DMA, DM′AのN^α-アセチル体への転換経路と合わせて, DMA, DM′Aは3つの主要な経路より代謝されることを立証した.(1)ピルビン酸存在下DMA, DM′Aをそれぞれのα-ケト酸へ転換する新規酵素(ジメチルアルギニントランスアミナーゼ)をラットの腎臓より単離した.分子量は約20万であり,同一の分子量(約5万)をもつサブユニットの四量体である.各サブユニット当りPLP1分子を含む. DMA, DM′Aを良好なアミノ基供子体として,ピルビン酸,グリオキシル酸へのアミノ基転移を触媒する. α-ケトグルタール酸は基質にならない.至適pHは9.510.0にあり, DM′A,ピルビン酸に対するKm値は15.2mM及び2.3mMであった.(2)DMAを直接シトルリンに転換する新規酵素(DMAイミノヒドロラーゼ)をラット腎臓より単離した.本酵素は分子量約3.3万である.DMAに高い特異性を有し,メチル化されたグアニジノ基のC-N結合を不可逆的に加水分解してシトルリンとジメチルアミンを生成する.至適pHは6.5であり, DMAに対するKm値は0.18mMであった.本反応は補酵素を必要とせず, SH試薬(PCMB, HgCl2)や2価金属イオン(Cd^<2+>, Cu^<2+>)が強い阻害を示した.メチル化修飾タンパク質の代謝回転に伴って体液中に遊離されるN^G, N^G-ジメチルアルギニン(DMA)及びN^G, N′^G-ジメチルアルギニン(DM′A)のラットにおける代謝機構を酵素レベルで解明した.1.DMA, DM′Aの代謝経路:ラットに投与した放射性DMA及びDM′Aの挙動を詳細に検討した. DMA, DM′Aは共にトランスアミナーゼの作用によりそれぞれのα-ケト酸に転換された後,これらα-ケト酸の酸化的脱炭酸化合物へと代謝される.一方, DMAは特異的に直接シトルリンへと転換された後,さらに尿素回路に関連した種々の化合物へと代謝される.これらに本研究者が既に明らかにしている, DMA, DM′AのN^α-アセチル体への転換経路と合わせて, DMA, DM′Aは3つの主要な経路より代謝されることを立証した.(1)ピルビン酸存在下DMA, DM′Aをそれぞれのα-ケト酸へ転換する新規酵素(ジメチルアルギニントランスアミナーゼ)をラットの腎臓より単離した.分子量は約20万であり,同一の分子量(約5万)をもつサブユニットの四量体である.各サブユニット当りPLP1分子を含む. DMA, DM′Aを良好なアミノ基供子体として,ピルビン酸,グリオキシル酸へのアミノ基転移を触媒する. α-ケトグルタール酸は基質にならない.至適pHは9.510.0にあり, DM′A,ピルビン酸に対するKm値は15.2mM及び2.3mMであった.(2)DMAを直接シトルリンに転換する新規酵素(DMAイミノヒドロラーゼ)をラット腎臓より単離した.本酵素は分子量約3.3万である.DMAに高い特異性を有し,メチル化されたグアニジノ基のC-N結合を不可逆的に加水分解してシトルリンとジメチルアミンを生成する.至適pHは6.5であり, DMAに対するKm値は0.18mMであった.本反応は補酵素を必要とせず, SH試薬(PCMB, HgCl2)や2価金属イオン(Cd^<2+>, Cu^<2+>)が強い阻害を示した.1.【N^G】,【N^G】-及び【N^G】,【N^('G)】-ジメチルアルギニン(DMA及びDM'A)の代謝生成物:放射性DMA又はDM'Aを投与したラットの尿中より主要代謝物として【N^α】-アセチル-DMA及びDM'Aの他にそれぞれのα-ケト酸であるα-ケト-δ-N,N-(ジメチルグアニジノ及びα-ケト-δ-(N,N'-ジメチルグアニジノ)吉草酸(DMGV及びDM'GV)とそれらの酸化的脱炭酸化合物γ-(N,N-ジメチルグアニジノ)-及びγ-(N,N'ジメチルグアニジノ)酪酸を同定した。これらの化合物は従来生物界に報告のなかった新しい代謝物である。一方臓器においてDM'Aに関しては上記の代謝物のみが検出されたが、DMAに関してはシトルリンが主要代謝物として検出され、さらに代謝上シトルリンに関連のあるオルニチン,アルギニン,グルタミン酸に放射能が分布した。

さらにDMAを投与したラットの全ての臓器においてタンパク質中のアルギニン残基が標識された。これらの事実はDMA,DM'Aは共にα-ケト酸とその酸化的脱炭酸化合物を生成する共通の代謝経路(A)を経ることを示す一方、DMAに関してはシトルリンを経て、その代謝関連化合物へと転換される独立した経路(B)が存在することを示した。2.代謝経路(A)又は(B)に関与する酵素の分布と性質:経路(A)においてDMGV及びDM'GVの生成に関与する酵素は1-アミノプロリンによって阻害をうける。本酵素活性は肝臓及び腎臓に局在した。腎臓より部分精製した酵素はDMA及びDM'Aに高い基質特異性をもった今まで報告のない新規なアミノ基転移酵素であることを明らかにした。一方、経路(B)に関与する酵素の活性は種々の臓器に広く分布した。腎臓より得た酵素は最適pH6.5にてDMAのグアニジノ部よりジメチルアミンを加水分解的に切断しシトルリンを生成する反応を触媒する新しい酵素であることを明らかにした。両酵素の単離・精製、酵素化学的諸性質に関する検討は目下進行中であり、次年度の課題である。
アパタイトコートヒアルロン酸の骨誘導能について

アパタイトコートヒアルロン酸(ACH)の骨誘導能について、アテロコラーゲン(AS)とin vitroおよびin vivoにおいて比較検討した。その結果in vitroでALP活性、骨関連遺伝子の発現の増加が認められた。またin vivoでもACH群は他群より高い新生骨形成を示し、osteopontin免疫染色にて新生骨周囲に骨芽細胞が確認された。本材料は高い新生骨形成能を持つ事が示唆された。本研究の科研費(研究活動スタート支援)の採択通知をもって、アパタイトコートヒアルロン酸(ACH)が歯科診療に応用できるかどうか調べるために、主に犬を使って歯科臨床と同じように、抜歯窩モデルでその骨補填材としての効果を検証した。健常な体重約10kgのビーグル犬5匹を用いて、全身麻酔下にてビーグル犬の下顎骨に抜歯後欠損を作製後、抜歯窩にACHを充填後、抜歯窩の歯肉を縫合する。対照群は抜歯後何も補填せず、抜歯窩の歯肉を縫合した。6、8週目の骨形成状態をCTにて骨形成状態の評価と、H-E染色による組織標本によって骨形成状態の評価を行い、新生骨の誘導を証明することか・て・きた。本研究か・臨床的に注目される内容て・示あることか・示唆された。1,実験材料:健常な体重約10kgのビーグル犬10匹を用いる。動物飼育については九州歯科大学動物実験施設において行われ、同施設の規定を遵守した。2.実験方法:イヌの抜歯窩モデルを用いたin vivoによるACHによる骨補填後の骨形成の検討を行った。全身麻酔下にてビーグル犬の下顎骨に抜歯後欠損を作製後、抜歯窩にACHもしくはASを充填後、抜歯窩の歯肉を縫合する。6、8週目の骨形成状態をCTにて骨形成状態の評価と、組織標本による骨形成状態の評価を行う。実験は対照群(Sham群)、実験群(AS群、ACH群)の三群に分け、治癒期間を6週、8週群(各群:5匹)とした。3.評価方法:1)エックス線学的評価A.単純エックス線:人工骨と母骨の間隙に新生された骨の硬化度を判定した。B.マイクロフォーカスX線CT:新生骨部および人工骨内部の微細構造を評価し、定量的に評価した。2)組織学的評価→摘出標本をホルマリンにて7日間固定し、MMA樹脂包埋による脱灰、非脱灰標本を作製し約5μmに薄切。H-E染色を行い、組織学的評価した。4結果:マイクロフォーカスX線CT、HE染色にて骨形成状態の評価を行い、新生骨の誘導を証明することができた。本研究は骨移植に伴う採骨部の侵襲を回避することができ、さらに早期に抜歯窩治癒を獲得できることで、臨床的に注目される内容であることが示唆された。研究計画て・は初年度は動物実験における初期結果を得ることか・一つの到達点て・あり、初年度において抜歯窩の新生骨の獲得を確認て・きたことは満足いく結果といえる。しかしなか・ら、最終的な段階としては、評価の規格化がえられず、新生骨の定量化ができなかった。今回の初期研究て・の進展は、今後のアパタイトコートヒアルロン酸の応用への大きなステッフ・を踏むことか・て・きたと考えられる。今年度は実験計画を改め、再度今後の研究に関して新たね視点て・の研究計画または評価か・期待て・きるものて・ある。24年度が最終年度であるため、記入しない。今回のアパタイトコートヒアルロン酸の抜歯窩の新生骨の検討を行ったため、窩洞に対する新生骨の定量化か・不明て・あり、今後は実験の規格化を行えるように、歯槽骨、顎骨骨欠損のモデルでその骨補填材としての効果を検証することを目的とし、骨欠損部分を調整し、効率的な新生骨の定量化獲得に向けた要件を検討する。初年度と同様に動物実験にて獲得新生骨量を評価し、最適な要件を具備した実験の規格を開発する。本研究においては、各々の動物実験の結果を随時、国内外の関連学会て・発表を行うと共に、口腔外科またはインフ・ラント関連雑誌への投稿も並行して行う予定て・ある。これらの報告て・得られる他研究者からの意見、また査読員のコメントも今後の研究に反映させ、より臨床的意義の持つ研究に位置つ・けていく予定て・ある。
動物細胞オートファジーの栄養生理的・分子的調節機構の解析

本補助金による研究計画から得られた成果は以下の通りである。A.オートファジーの栄養生理的役割:肝臓のin vivoタンパク質分解速度に対する米タンパク質と小麦タンパク質(グルテン)の効果を大豆タンパク質と比較したところ、米タンパク質は大豆の約2倍となり、グルテンは大豆タンパク質とほぼ同等であった。従って、食品タンパク質の質の違いによる肝臓代謝回転の調節が認められた。B.アミノ酸によるオートファジー形成段階の調節機構の解析a)肝細胞膜上のアミノ酸'受容体'の検索:予想される'受容体'に対するリガンドとして、ロイシンの誘導体であるLeu-MAPに対してASA化とビオチン化を行い、ASA基と膜タンパク質とをPhotoaffinitylabelingにより結合させ、ビオチン基をアビジン処理樹脂と結合させて標的タンパク質を濃縮している。b)α-トキシン細胞実験系を用いたアミノ酸作用の細胞内伝達因子の検索:昨年作成のrecombinant α-トキシンの活性は、予想より若干小さなポアサイズ(ATP不透過)であったが、安定した成績を示し、かつ肝臓抽出物の効果を確認出来た。また、抽出物作成ステップのいくつかを改良した。肝臓抽出物は調節アミノ酸(8種)と非調節アミノ酸(12種)、また単独のアミノ酸としてはロイシンで刺激したものを作成し、比較した。調節アミノ酸群はタンパク質分解抑制作用を示し、その活性は抽出物を酢酸エチルで抽出した画分に認められた。c)アミノ酸の作用機構としてのリン酸化カスケードの可能性:昨年mTOR系の関与は否定されたが、最も下流に位置する候補として、オートファジー膜タンパク質LC3のアミノ酸に対する応答性を調べたところ、LC3のI型からII型への変換がアミノ酸により抑制された。C.オートファジー成熟段階測定法の開発と調節機樽の解析:ML画分を用いて、サイトゾル酵素BHMTのフラグメントp32をプローブとして、オートファゴソームとリソソームの膜融合反応の検出とサイトゾルタンパク質の効果を調べている。本研究は細胞内タンパク質の主要経路のひとつであるオートファジー(自食作用)について、その栄養生理的役割とともに細胞生物学的な解析を試みたものである。本年度の研究計画に基づいて得られた成果は以下の通りである。A.オートファジーの栄養生理的役割-肝臓のin vivoタンパク質分解速度に対する米タンパク質と大豆タンパク質の効果を調べた。カゼインと比べ、米では15%増加、大豆では20%減少と正反対の応答を示した。これは肝臓重量には有意な変化がないことから、分解速度のみではなく代謝回転として変化していることが推定された。B.アミノ酸によるオートファジー形成段階の調節機構の解析-a)肝細胞膜上のアミノ酸'受容体'の探索:ミニセファデックスカラム遠心法では肝細胞膜画分とアミノ酸との特異的結合を検出できなかった。TAsysを用いた生体成分相互作用解析法により、L-ロイシンに対する特異的結合が観察され.、かつL系トランスポーターのロイシンアナログBCHで阻害されない未知の結合部位の存在が認められた。b)アミノ酸作用の細胞内伝達因子の検索:本年度は東北大学神尾好是教授との共同研究でrecombinant α-toxinを作成した。c)アミノ酸の作用機構としてのリン酸化カスケードの可能性:インスリンのシグナリングに関わるp70S6Kがアミノ酸でも確かにリン酸化された。しかし、オートファジーに対するインスリン作用はこの経路であったが、アミノ酸による抑制作用はこの経路ではなく、別の未知の経路であることが示された(投稿準備中)。C.オートファジー成熟段階測定法の開発と調節機構の解析