hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
不飽和地盤のせん断特性に関する研究

早急に改良機を製作しなければならない。1.地盤内サクション等の現場測定:神戸市灘区青谷地区の崩壊歴のある山腹において、地盤内サクション、含水比、地下水位、降水量を継続的に測定した。サクションの測定は、地表から25cm、50cm、100cmに埋設したテンシオメ-タ-とサイクロメ-タ-によって行った。現地のサクションの値は0.2kgf/cm^2以内であったため、テンシオメ-タ-の方が安定した値を示した。含水比は誘電式のものによった。サクション,含水比とも降雨に反応したが、サクションの方が敏感であった。2.サイクロメ-タを用いた室内試験:現地のサクションがサイクロメ-タ-の測定限界以下であったため、高さ30cm直径20cmのモ-ルドに現地の土を入れ、3つの深さにサイクロメ-タ-とテンシオメ-タを埋設して、上面からの水の蒸発に伴うサクションの増分を測定し、また別途含水比も測定して水分特性曲線を求めた。ただし、テンシオメ-タ-については、測定上限(約0.8kgf/cm^2)以後は、器体からの水の流出を避けるために取り外した。また、テンシオメ-タ-の検定や少量の試料のサクションを測定するためのサンプルチャンバ-を自作し、性能を検討した。3.三軸圧縮試験:スラリ-状とした飽和カオリン粘土を試料作製用大型圧密容器で圧密して飽和試料を作った。これをひずみ制御法でCD三軸試験(サクション制御)した。圧密過程で、一部の供試体にサクション履歴を与え、軸圧縮過程に及ぼす影響を調べた。従来の締固め供試体についても同様に試験した。4.安定計算:現在、現地の試料の三軸圧縮試験を準備中である。この結果を得てから、すでに開発した理論式を用いて降雨に伴う現地の安定性の変化を算定する予定である。
火山灰土壌におけるマンガン/鉄酸化物と重金属動態

平成23年度では、既存のMn酸化物中重金属の選択的抽出法(Chao法)の日本土壌への適用性について検討を行ない、日本に広く分布する火山灰土壌では、Mn酸化物の溶解性が非常に低く、適用不可能であることを示した(Geodema.第163巻,pp.291-295に掲載済)。この結果を踏まえ、今年度はChao法よりもMn酸化物に対する溶解力が大きく(特に火山灰土壌)、かつMn酸化物への選択性がChao法と同程度である改良法を開発した。Chao法と同様に、抽出中の再吸着や沈殿などの問題がなくCd, Co, Ni, Znを抽出可能である。また、主に平成23年度に得られたデータから、世界的に広く用いられる0.5mol L^<-1>NH_2OH-HCl(pH1.5)を用いたMn/Fe酸化物溶解法(Modified BCR化学形態別逐次抽出法の一画分;Mn/Fe酸化物中の重金属を抽出する方法)は、火山灰土壌ではFe酸化物のごく一部しか溶解できないため不適当であること、およびFe酸化物の溶解率は、活性Al(短周期型Al鉱物やAl-腐植複合体)の含量と強い負の相関が認められ、火山灰土壌に豊富に含まれるこれらの成分が、酸化物の還元溶解を阻害していることを示した論文が受理・掲載された(Soil Science and Plant Nutrition.第58巻,pp.684-695)。また、平成23年度には、世界的に広く用いられる0,04molL^<-1>NH_2OH-HCl(25%酢酸中)を用いたMn/Fe酸化物溶解法(Tessier(1979)の化学形態別逐次抽出法の一画分)では、火山灰土壌を含む日本の土壌中のFe酸化物の溶解が不十分であることを示し、溶解力を大幅に改善しつつ、原法と同程度の高い溶解選択性を維持した改良法を開発した。今年度は、この方法にさらに改良を重ね、成果を国際誌SoilScience and Plant Nutritionに投稿した。このように、研究実施計画にあるMn酸化物選択溶解法およびMn/Fe酸化物溶解法の改良は達成された。また、それらの成果は国際誌に掲載済み、または投稿・審査中であるなど、研究に大きな進展があった。これらの方法を組み込んだ逐次抽出法の提示は、今後の課題として残された。既存のMn酸化物中重金属の選択的抽出法の日本土壌への適用性について検討を行ない、日本に広く分布する火山灰土壌では、Mn酸化物の溶解性が非常に低く、適用不可能だった。この成果は、Geoderma.(第163巻,pp.291-295)として国際誌に掲載された。上記の研究により、火山灰土壌では、Fe酸化物の溶解性も低いこともわかり、(1)欧州で広く適用されるFe/Mn酸化物の溶解法(0.5M酸性NH_2OH-HCI法)の日本土壌への適用性の検討(2)火山灰土壌でFe/Mn酸化物の溶解性が低い原因の解明を行った。(1)については、火山灰土壌であるアロフェン質黒ボク土では、非晶質Fe酸化物の溶解率が平均して10%にも満たないことを示した。よって、これらの土壌では、0.5M酸性NH_2OH-HCl法の適用はできないと結論付けた。(2)では、非晶質のAl鉱物やAl-腐植複合体が酸化物表面を被覆し、還元剤と酸化物の反応を阻害しているということを示す結果を得た。(1)および(2)の成果は国際誌に投稿・審査中である。上記の方法と同様に広く普及している0.04M NH_2OH-HCl in25%酢酸法の検討を試みた。その結果、本方法は結晶質Fe酸化物(非晶質Fe酸化物よりも難溶性)まで溶解する方法であるが、アロフェン質黒ボク土では、非晶質Fe酸化物さえ平均で30パーセント近くが溶解していないとわかった。そこで、実験条件の改良を行い、結晶質Fe酸化物も大部分を溶解し、酸化物中重金属の抽出量も大幅に改善される方法を開発した。上記のように、研究の最終目的である「火山灰土壌にも適用可能な化学形態別逐次抽出法の開発」に向けて、進展があった。なお、Fe/Mn酸化物溶解法に関しては、研究実施計画には含まれていなかったが、研究の目的の達成に必須であったために、研究項目として追加した。

また、主に平成23年度に得られたデータから、世界的に広く用いられる0.5mol L^<-1>NH_2OH-HCl(pH1.5)を用いたMn/Fe酸化物溶解法(Modified BCR化学形態別逐次抽出法の一画分;Mn/Fe酸化物中の重金属を抽出する方法)は、火山灰土壌ではFe酸化物のごく一部しか溶解できないため不適当であること、およびFe酸化物の溶解率は、活性Al(短周期型Al鉱物やAl-腐植複合体)の含量と強い負の相関が認められ、火山灰土壌に豊富に含まれるこれらの成分が、酸化物の還元溶解を阻害していることを示した論文が受理・掲載された(Soil Science and Plant Nutrition.第58巻,pp.684-695)。また、平成23年度には、世界的に広く用いられる0,04molL^<-1>NH_2OH-HCl(25%酢酸中)を用いたMn/Fe酸化物溶解法(Tessier(1979)の化学形態別逐次抽出法の一画分)では、火山灰土壌を含む日本の土壌中のFe酸化物の溶解が不十分であることを示し、溶解力を大幅に改善しつつ、原法と同程度の高い溶解選択性を維持した改良法を開発した。今年度は、この方法にさらに改良を重ね、成果を国際誌SoilScience and Plant Nutritionに投稿した。このように、研究実施計画にあるMn酸化物選択溶解法およびMn/Fe酸化物溶解法の改良は達成された。また、それらの成果は国際誌に掲載済み、または投稿・審査中であるなど、研究に大きな進展があった。これらの方法を組み込んだ逐次抽出法の提示は、今後の課題として残された。本年度は「火山灰土壌における,酸性NH_2OH-HCl法によるMn/Fe酸化物の低い溶解性の原因解明」としているが、「火山灰土壌やその他の土壌の特性とMn/Fe酸化物の溶解性との関係の統計学的な解析」「異なる溶解メカニズムに基づく既存のMn/Fe酸化物溶解法によるMn/Feの抽出効率の比較」から、その原因が高いpH緩衝能に加えて、Mn/Fe酸化物表面に存在する非晶質Al鉱物やAl-腐植複合体による酸化還元反応の阻害であるという仮説を強く支持する結果を得たため。今後は、火山灰土壌にも適用可能なMn酸化物選択溶解法(Mn酸化物中の重金属のみを選択的に土壌から抽出する方法)を開発する。最終的に、今年度の成果も含めたこれらの成果を組み込んだ逐次抽出法を提案して、火山灰土壌中の重金属の適切な化学形態別分析を可能にする。
ウイルス増殖阻害活性を有する新たな宿主因子群の解析

ヒト免疫不全ウイルス-1(HIV-1)とマウス白血病ウイルス(MLV)は、それぞれヒトにおける後天性免疫不全症候群とマウスにおける癌の発症要因となる病原体である。自然免疫機構は、HIV-1やMLVの感染から宿主の身を守る役割を果たす。本研究では、これらのレトロウイルスに対して誘導される自然免疫応答の分子機序を明らかにした。宿主の細胞はRNAウイルスの特徴的なRNAをパターン認識受容体により感知し、自然免疫応答を誘導する。マウス白血病ウイルス(MLV)は、宿主であるマウスに感染して腫瘍形成を引き起こすレトロウイルスである。一本鎖RNAを感知するパターン認識受容体であるToll-like receptor 7 (TLR7)は細胞外部のMLVのゲノムRNAを認識して自然免疫応答を誘導することが、近年明らかになっている。しかしながら、細胞質内に進入したMLVゲノムRNAを感知するパターン認識受容体に関しては不明な点が多かった。二本鎖RNAを感知するパターン認識受容体であるRig-I-like receptors (RLR)は細胞質内に進入したRNAウイルスを認識してI型インターフェロンを介した抗ウイルス応答を促進するが、細胞質内に進入したMLVに対する感染防御には関わっていなかった。そこで他のRNAセンサーについて解析を進め、Zinc finger Antiviral Protein (ZAP)が細胞質内に進入したMLVゲノムを感知し、RNA分解機構であるエキソソームを介してMLVゲノムの分解を誘導することを見出した。ZAPを欠損したマウス繊維芽細胞においてはMLVの増殖が亢進し、一方でZAPを過剰発現した細胞においてはMLVの増殖が抑制された。ZAPは、自身のCCCH型Zinc fingerドメインを介して、P-bodyやストレス顆粒のマーカータンパク質が集まるRNA顆粒に局在した。ZAPは、MLVゲノムRNAやエキソソーム構成因子をこのRNA顆粒へ引き寄せることで、MLVゲノムの分解を誘導すると考えられた。以上から、ZAPは細胞質内に進入したRNAウイルスを感知するパターン認識受容体であり、TLRやRLRの認識から逃れたウイルスの排除を行う役割を担うことが明らかとなった(投稿準備中)。宿主細胞内に侵入したRNAウイルスは、ウイルスゲノムを認識する自然免疫機構により排除される。インフルエンザウイルスやC型肝炎ウイルスなど様々なRNAウイルスに対しては、Rig-like receptor (RLR)がI型インターフェロンやインターフェロン誘導性遺伝子の発現を誘導することで深く関わっている。しかしながら、ガンマレトロウイルスであるMurine leukemia virus (MLV)の感染時に、どのような核酸認識機構が感染防御に関わっているのかについては不明な点が多い。我々は、Zinc finger antiviral protein (ZAP)がガンマレトロウイルスに対する感染防御応答に重要な役割を果たしていることを見出したので、ここに報告する。他のRNAウイルスとは大きく異なり、MLVやXMRVはI型インターフェロンの産生を全く誘導しない。また、I型インターフェロン産生に必須の転写因子IRF3/IRF7は、マウス繊維芽細胞においてMLVの増殖に影響を与えない。一方で、RNA結合因子であるZAPの過剰発現はMLVとXMRVの増殖を強力に抑制し、さらにZAPの減少はこれらのウイルスの増殖を促進する。ZAPは、抗ウイルス活性に必須のRNA結合領域を介して顆粒状のP-bodies様構造体に存在しており、この構造体がガンマレトロウイルスの増殖に関わっていることが示唆される。マウスZAPの欠損はRLRを含めた核酸認識受容体を介したI型インターフェロンの産生に影響を与えず、またRLRの欠損はマウス繊維芽細胞におけるMLVの増殖に影響を与えない。これらの研究結果から、ガンマレトロウイルスに対する感染防御応答は、RLRやI型インターフェロンとは全く異なる機構を介して、RNA結合因子であるZAPにより制御されていることが明らかとなった。(1)多種のRNAウイルスに対する感染防御を担っていることで知られるRLRが、ガンマレトロウイルスであるMLVに対する感染防御には関わっていないことを明らかにした。(2)ガンマレトロウイルスに対する感染防御には、ZAPが重要な役割を果たしていることを明らかにした。(3)ZAPは、RNA顆粒であるストレス顆粒やP-bodyに存在する因子と共局在することから、これらの構造体がMLVに対する感染防御に関わっていることを明らかにした。(4)ZAPは、RLRを介したインターフェロン応答には関わっていないことを明らかにした。(1)ZAPとよく似たドメインを有するTIPARPとPARP12が、MLVやAlphavirusに対する感染防御応答において果たしている役割を解明する。(2)TIPARPとPARP12の細胞内局在を同定する。(3)現在までに同定されていないZAP, TIPARP, PARP12の標的ウイルスを同定する。(4)ZAP, TIPARP, PARP12が、ウイルスの複製を抑制するメカニズムを解明する。(5)遺伝子改変マウスを用いて、ZAP, TIPARP, PARP12の感染防御応答における役割を生体レベルで解析する。研究を進めていく上で必要に応じて研究費を執行したため、当初の使用見込み額と実際の執行額が異なった。

未使用額が比較的大きくなったのは、研究計画の中で実験を行う順序を入れ替えたために、作製する予定であった抗体の発注が次年度にずれ込んだことによる。しかしながら、実験を行う順序は変更されたものの解析する研究項目に変更はなく、当初予定していた研究課題の解明を引き続き目指していく。
閉眼時瞬目の基礎特性の解明とその入眠推定への応用に関する研究

画像処理を用いた閉眼時瞬目の抽出方式を提案した.聴覚課題に基づく実験を実施した.第1に,刺激呈示後の特定の時点で閉眼時瞬目が集中する.第2に,閉眼時瞬目は弁別結果回答用のキー押下の直前に生じる.この現象は,閉眼時瞬目がキー押下という運動反応要因を反映せず,聴覚刺激に対して為された情報処理の終了などの認知的要因を反映することを示唆する.更に,仮眠中には経過時間による眼瞼の動き回数の変動が見られた.画像処理を用いた閉眼時瞬目の抽出方式を提案した.聴覚課題に基づく実験を実施した.第1に,刺激呈示後の特定の時点で閉眼時瞬目が集中する.第2に,閉眼時瞬目は弁別結果回答用のキー押下の直前に生じる.この現象は,閉眼時瞬目がキー押下という運動反応要因を反映せず,聴覚刺激に対して為された情報処理の終了などの認知的要因を反映することを示唆する.更に,仮眠中には経過時間による眼瞼の動き回数の変動が見られた.閉眼時(自発性)瞬目の基礎特性を解明するための第1段階として,本年度は,閉眼時瞬目を検出するための二種類の方法について検討した。(1)筋電図法:通常の瞬目では眼輪筋の収縮と上眼瞼挙筋の弛緩という相反性支配により瞼が閉じることから,眼輪筋の収縮電位を計測することにより,瞬目は容易に検出できる.閉眼時瞬目を対象にした筋電図の計測事例はこれまで見られないが,閉眼時瞬目においても眼輪筋はある程度収縮するであろうとの予測の下に,安静閉眼条件下における眼輪筋筋電図を記録した.このとき,2個の小型電極を下眼瞼上に15mmの間隔を空けて並置した.4名の実験協力者について計測したが,いずれの実験協力者も,瞬目時の明確な電位変化は見られなかった.これより,筋電図による閉眼時瞬目の検出は困難であることが判明した。(2)画像処理法:筋電図の代替策として,閉眼時瞬目の際に生じる瞼の微小な動きを画像処理により検出する方法を考案した.瞼の動きは睫毛の動きと連動することから,睫毛の動きを検出する方法を設計した.まず,二値化により睫毛領域を切り出し,抽出された領域の輪郭点列を求める.各フレームで抽出された輪郭点列をフレーム間で照合することにより,睫毛領域の移動量を算出する.2名の実験協力者に対して,本手法を適用したところ,微細な動きを呈する瞬目の検出漏れはあるものの,ある程度の動き量があれば,睫毛の動きが検出可能であることが確認できた.来年度は,本手法をベースとして,更に検出確度を向上させる方式を考案する予定である。本年度は画像処理による閉眼時瞬目の検出方法を確立した.また,閉眼時瞬目の基礎特性を把握するための聴覚課題を用いた実験を計画・実施し,新たな知見を得た.得られた成果は以下の通りである.(1)閉眼時瞬目の検出:昨年度に提案した,まつ毛領域の輪郭をフレーム間で照合する検出方式は,検出精度と処理時間に問題のあることが判明した.そこで,上眼瞼とまつ毛領域の境界線の動きをフレーム間で検出する方法を考案した.本手法では,まず,上眼瞼とまつげ領域の境界部分を両領域における濃度分布の特徴を利用し,上眼瞼境界点列として生成する.次に,得られた上眼瞼境界点列に対して4次の多項式を最小二乗近似で当てはめ,上眼瞼境界線を得る.この上眼瞼境界線のフレーム間における動き量を求めることにより閉眼時瞬目を抽出する.12名の実験協力者に対して本手法を適用した結果,上眼瞼の微小な動きが良好に抽出できていることが確認された.上眼瞼の移動パターンを調べたところ,閉眼時瞬目は通常の瞬目のように上眼瞼が鉛直方向に単純に下降するのではなく,目頭斜め方向に,水平移動成分を伴い下降することが分かった.(2)基礎特性の把握:閉眼時瞬目の基礎特性を把握するため,開眼安静条件,閉眼安静条件,開眼聴覚課題条件,閉眼聴覚課題条件の,都合4条件下で瞬目を採取した.聴覚課題は,一定の時間間隔で短時間提示される二種類の音刺激を弁別する課題であった.実験協力者は,呈示された音刺激の種類に応じて,指定されたマウスボタンを押下した.分析の結果,閉眼時瞬目も通常の瞬目と同様に,聴覚刺激呈示後のある特定の時点で集中して生じる傾向が確認された.この結果は,閉眼時瞬目も人の認知過程を反映する指標であることを示す.本年度は,閉眼時の眼瞼運動から閉眼時瞬目のみを切り出す方法を考案し,主として閉眼時瞬目の基礎特性を明らかにした.得られた成果は以下の通りである.(1)閉眼時瞬目の選出方法の考案:閉眼時の眼瞼運動は鉛直方向に単純に上下動するのではなく目頭斜め方向に移動することから,隣接フレーム間における上眼瞼の移動方向と大きさをベクトルで記述する方法を導入した.次に数十フレーム間(約300400msに相当)を1区間として,区間内のベクトルの動きパターンに着目し,通常の瞬目と類似の動きパターンを呈している区間を閉眼時瞬目生起区間として選出する方法を考案した.これにより,閉眼時の眼瞼運動のうち,閉眼時瞬目のみを対象にした分析を適用することが可能となった.

(2)基礎特性の解明1(認知過程との関係):高音と低音の純音刺激を弁別する課題を用いて,安静条件下と聴覚課題条件下の基礎特性を比較した.得られた知見は次の3点である.第1に,聴覚課題条件下の閉眼時瞬目の生起頻度は安静条件下よりも高い.第2に,聴覚課題条件下では刺激呈示直後の特定の時点で閉眼時瞬目が集中する.その時点は通常の瞬目(開眼時の瞬目)よりも早い.第3に,通常の瞬目は弁別結果を回答するためのマウスボタン押下の直後に生じるが,閉眼時瞬目はボタン押下の直前に生じるとの違いがある.この現象は,閉眼時瞬目がマウスボタン押下という運動反応要因を反映せず,聴覚刺激に対して為された情報処理の終了などの認知的要因を反映することを示唆する.(3)基礎特性の解明2(睡眠との関係):予備的検討として,3名の実験協力者について,1時間程度の仮眠をとっているときの閉眼時眼瞼運動を記録した.5分間隔で閉眼時瞬目の生起頻度を算出したところ,時間経過により生起頻度が変動する傾向が認められた.これより,覚醒水準の高低が閉眼時瞬目の生起頻度に影響を及ぼすことが示唆される.計画当初は,瞬目計測の標準的な手法として筋電図法を利用する予定であったが,研究の過程で本手法の適用が困難であることが判明した.そこで,代替案として,最終年度に開発を予定していた画像処理による検出手法を前倒しで開発することにした.そのため,研究目的(1)「基礎特性の解明」についての実験計画・実施がやや遅れる状況となっている.24年度が最終年度であるため、記入しない。本年度で閉眼時瞬目の計測方法は確立できた.次年度は,主として,研究目的(1)「基礎特性の解明」を達成するための実験の実施と分析に注力する.時間的な制約から,研究目的(3)「入眠推定法の提案」の達成については努力目標に留め,目的の達成に必要とされる基礎的な知見の集積に努める.24年度が最終年度であるため、記入しない。
RAFTによる環境応答型イオン性両親媒性ブロックコポリマーの合成とその自己組織化

カチオン性ポリマー鎖であるPDMCの重合度を60と一定に保ったまま疎水鎖の重合度を,8,25,50,75と変えた4種のポリマーを合成し,その水溶液の界面活性/不活性の検討を行った.純水系では,重合度8のポリマーは界面活性であるが,その他3種は,界面不活性であった.よって,疎水鎖は重合度20以上が界面不活性性発現の必須条件であることがわかった.また,水溶液中では,界面不活性性を示す3種のポリマーは,ミセル会合体を形成しているのに対し,界面活性なポリマーは,ミセル会合体を形成していなかったことから,鏡像電荷効果に加え,「ミセル形成」が界面不活性となる第2の要因であることが判明した.さらに,温度に応答して,界面不活性/界面活性の転移を示すことを昨年確認した,PNIPAmとカチオン性親水鎖からなるジブロックポリマーの転移温度に対するブロック鎖長と添加塩の影響を調査した.カチオン鎖とPNIPAm鎖の長さが同等の場合は,ホモポリマーと同様の結果が得られたが,カチオン鎖が長くなると,転移温度は上昇し,さらに長くなると,転移が起こりにくくなることが判明した.これは,PNIPAm鎖をカチオン鎖が取り囲んでしまうためと考えられる.また,PNIPAmホモポリマーと同様に,転移温度が塩の添加により低下することを確認することが出来た.さらに,添加塩の種類を様々に変えたところ,水の構造を破壊するいわゆる「構造破壊イオン」の性質が強いイオンほど転移温度の低下が大きいことが判明した.これは転移現象がPNIPAm鎖の水和構造とその変化によるものであることを示唆している.以上のように,PNIPAm鎖とイオン鎖からなるジブロックコポリマーは,温度により界面活性/不活性の転移を示すこと,その転移温度は,ブロック鎖長や塩の添加,そして添加する塩の種類により制御できることが明らかとなった.当初予定の温度による界面活性/界面不活性の転移とその制御はほぼ達成できた.さらには,ポリイオンコンプレックスのナノ構造の温度転移にも成功し,光照射による転移の可能性も検討することができ,さらなる発展研究の礎を築くことが出来た.本研究は,今年度で終了するが,ポリイオンコンプレックスに関する成果から,温度に応答して反転するミセル系の構築が可能であることが判明し,薬物輸送系を想定した,さらなる機能材料開発研究に発展可能であることが判明した.さらには,界面不活性高分子への光応答基の導入法が確立できたため,光照射による界面不活性/界面活性の転移制御が可能と考えられ,新規機能材料開発に結びつく可能性がある.温度に応答して,界面活性/不活性の転移,またはミセル/ユニマーの転移を示す系の構築を目指した.カチオン性の親水鎖を有し,第2ブロックが,温度に応答して(臨界温度34°C附近)低温では親水性,高温では,疎水性として振る舞うポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)(PNIPAm)からなるジブロックコポリマーをRAFT法により合成した.このポリマーは,室温(25°C附近)では,容易に水に溶解し,透明な溶液となった.光散乱測定や蛍光分光測定により,溶液内にはミセルは存在せず,分子はバラバラに溶解していることが確認できた.また,表面張力測定と起泡性の観察から,この温度では,界面活性であることを確認した.これは,PNIPAmそのものが界面活性であることに起因すると考えられる.溶液温度を44°C附近まで上げると,青みがかった溶液となり,ミセルの存在が確認された.さらに,この温度では,界面不活性となることを確認した.温度変化により,イオン鎖部分は何ら変化せず,PNIPAMが親水鎖から疎水鎖に転移したことにより,界面活性から不活性へ転移が達成された.この現象は,鏡像電荷効果が主因ではあるが,それだけでは,不十分であり,「安定な」ミセルを形成することが,気水界面に吸着しない界面不活性性発現に寄与していることを意味している.界面不活性性は,高分子のみの特性であり,低分子系では見いだされていないが,これは高分子系では電荷の数が多く,鏡像電荷効果が強いことに加え,高分子ミセルが極めて安定であることも重要な因子であることを示唆している.さらに,薬物輸送・放出システムへの応用の為,蛍光プローブを用いて,高分子ミセルコア内部の極性とミクロな粘度特性を定量的に評価した.今後,これらの特性と薬物の包含・放出特性の相関を探る予定である.さらには,光による制御もめざし,現在,分子設計と合成法の検討を行っている.カチオン性ポリマー鎖であるPDMCの重合度を60と一定に保ったまま疎水鎖の重合度を,8,25,50,75と変えた4種のポリマーを合成し,その水溶液の界面活性/不活性の検討を行った.純水系では,重合度8のポリマーは界面活性であるが,その他3種は,界面不活性であった.よって,疎水鎖は重合度20以上が界面不活性性発現の必須条件であることがわかった.また,水溶液中では,界面不活性性を示す3種のポリマーは,ミセル会合体を形成しているのに対し,界面活性なポリマーは,ミセル会合体を形成していなかったことから,鏡像電荷効果に加え,「ミセル形成」が界面不活性となる第2の要因であることが判明した.さらに,温度に応答して,界面不活性/界面活性の転移を示すことを昨年確認した,PNIPAmとカチオン性親水鎖からなるジブロックポリマーの転移温度に対するブロック鎖長と添加塩の影響を調査した.

カチオン鎖とPNIPAm鎖の長さが同等の場合は,ホモポリマーと同様の結果が得られたが,カチオン鎖が長くなると,転移温度は上昇し,さらに長くなると,転移が起こりにくくなることが判明した.これは,PNIPAm鎖をカチオン鎖が取り囲んでしまうためと考えられる.また,PNIPAmホモポリマーと同様に,転移温度が塩の添加により低下することを確認することが出来た.さらに,添加塩の種類を様々に変えたところ,水の構造を破壊するいわゆる「構造破壊イオン」の性質が強いイオンほど転移温度の低下が大きいことが判明した.これは転移現象がPNIPAm鎖の水和構造とその変化によるものであることを示唆している.以上のように,PNIPAm鎖とイオン鎖からなるジブロックコポリマーは,温度により界面活性/不活性の転移を示すこと,その転移温度は,ブロック鎖長や塩の添加,そして添加する塩の種類により制御できることが明らかとなった.当初予定の温度による界面活性/界面不活性の転移とその制御はほぼ達成できた.さらには,ポリイオンコンプレックスのナノ構造の温度転移にも成功し,光照射による転移の可能性も検討することができ,さらなる発展研究の礎を築くことが出来た.本研究は,今年度で終了するが,ポリイオンコンプレックスに関する成果から,温度に応答して反転するミセル系の構築が可能であることが判明し,薬物輸送系を想定した,さらなる機能材料開発研究に発展可能であることが判明した.さらには,界面不活性高分子への光応答基の導入法が確立できたため,光照射による界面不活性/界面活性の転移制御が可能と考えられ,新規機能材料開発に結びつく可能性がある.
イオンビームを用いた傾斜機能cBN薄膜合成の研究

初年度の成果をもとに、平成8年度においては、cBN薄膜の実用化にむけた総合的検討を行い、イオンビーム支援蒸着法を用いた界面制御による密着性の改善効果ならびに実用特性に関する研究を行った。具体的には、1)界面制御による応力制御、2)薄膜の機械的の評価、3)実用基材上でのcBN薄膜合成ならびに実用特性の評価、の3点をサブテーマとしてとりあげ、実験的研究を遂行し、以下のような結果を得た。まず、1)のサブテーマに関して、立方晶相を高い割合で含有するcBN薄膜と基材との間に10keVの高エネルギー窒素イオン照射を併用してBN中間層を形成し、その組成ならびに厚さに対する薄膜全体の応力変化を計測した。その結果、B/N組成比が10程度のボロン過多の中間層を用いることにより、cBN層単体の場合に比べて圧縮応力が1/5以下に低減され、剥離・破砕を生じない良好な薄膜形成が可能となることを明らかにした。次いで、2)のサブテーマに関し、cBN層単体の場合と多層膜について薄膜の密着性と硬度の関係に着目して実験的に調べ、上記の中間層を挿入することにより、単層膜では剥離・破砕が生じてしまうような硬度においても高い密着性を保った薄膜形成が可能であることが明らかとなった。さらに3)に関して、これらの知見をもとに高速度工具鋼あるいは超硬材料上においても、中間層を挿入することにより剥離・破砕のないcBN薄膜が合成可能であることを示すと共に、酸化腐蝕試験、各種硝子材料に対する化学的安定性、さらに高温での安定性等について実用試験を行い、中間層を挿入したcBN薄膜形成により良好な表面改質が可能であることが示された。平成7年度においては、1)基板清浄化と界面制御、2)IBAD法による薄膜合成とイオン照射効果、3)試料の分析と評価、の3つのサブテーマにおいて実験研究を遂行した。そして以下のような結果を得た。まず1)のサブテーマの内基板清浄化については、本研究費の一部で「ラジカル励起プローブ」を導入し、成膜に先立っての基板処理を行った。これを使用する事による界面制御については、使用しない場合と顕著な差を見出せなかった。その原因は付属の電源の容量が不足していて、十分にボロンならびに窒素ラジカルを励起出来ないためである事が判明した。但し界面制御という点では、基板上にまずボロンの多い層を作り、10KeVの高エネルギー窒素イオンを照射し、その上に1KeVの低エネルギーイオン照射で、化学量論的BN薄膜を合成するという傾斜機能化を行い、はがれのないBN膜が合成出来るようになった。2)のサブテーマにおいては、イオンビームのパラメータを選択し、1)の界面制御のもとでcBNの薄膜を再現性よく合成出来るようになった。又イオン照射効果については、窒素イオン照射量の増加によって、hBNからcBNへの相変換がおこる事を明らかにした。又特に照射イオンの質量効果がcBN合成に大きな効果を持つことが明らかになった。3)の試料の分析と評価においては、まずhBNからcBNへの相変換を明らかにするため、高精度のTEM法により結晶構造の変化を調べ、相変換の実態を明らかにすることが出来た。さらに機械的特性との関連では、FTIRによりイオン照射量の変化に伴ってcBN合成の割合が変化する事を明瞭にすると共に、硬度測定から、硬度の変化とcBN量の変化の間の相関を明らかにした。又密着性に関してはスクラッチテストにより、先の界面制御が重要である事を明らかにした。

具体的には、1)界面制御による応力制御、2)薄膜の機械的の評価、3)実用基材上でのcBN薄膜合成ならびに実用特性の評価、の3点をサブテーマとしてとりあげ、実験的研究を遂行し、以下のような結果を得た。まず、1)のサブテーマに関して、立方晶相を高い割合で含有するcBN薄膜と基材との間に10keVの高エネルギー窒素イオン照射を併用してBN中間層を形成し、その組成ならびに厚さに対する薄膜全体の応力変化を計測した。その結果、B/N組成比が10程度のボロン過多の中間層を用いることにより、cBN層単体の場合に比べて圧縮応力が1/5以下に低減され、剥離・破砕を生じない良好な薄膜形成が可能となることを明らかにした。次いで、2)のサブテーマに関し、cBN層単体の場合と多層膜について薄膜の密着性と硬度の関係に着目して実験的に調べ、上記の中間層を挿入することにより、単層膜では剥離・破砕が生じてしまうような硬度においても高い密着性を保った薄膜形成が可能であることが明らかとなった。さらに3)に関して、これらの知見をもとに高速度工具鋼あるいは超硬材料上においても、中間層を挿入することにより剥離・破砕のないcBN薄膜が合成可能であることを示すと共に、酸化腐蝕試験、各種硝子材料に対する化学的安定性、さらに高温での安定性等について実用試験を行い、中間層を挿入したcBN薄膜形成により良好な表面改質が可能であることが示された。
カイコの消化・吸収の分子機構

カイコの中腸組織における消化・吸収の分子機構を解明するためのモデルシステムとして蔗糖の分解と吸収系をとりあげ,特に中腸組織の蔗解分解酵素に着目して研究を行った。中腸組織の蔗糖分解酵素の活性測定条件の検討の結果,5齢幼虫期と蛹期では反応の至適条件が異なることを明らかにした。ここで明らかにした至適条件を用いて4齢幼虫期から5齢幼虫期,蛹期を経て蛾になるまでの発育時期の酵素活性の調査から5齢中後期にかけて活性の極大が認められることを明らかにした。4齢幼虫の始めから蛾になるまでの可溶画分の酵素を電気泳動した後,活性バンドのパターンを調査したところ,5齢幼虫と蛹では異なったパターンが認められること,その切り替え時点は蛹化脱皮時であることを明らかにした。酵素の細胞内局在性は可溶画分に90%の活性が,残り10%の活性が膜結合画分に存在し,この傾向は5齢幼虫期間中ならびにそれ以降蛹中期まで変化しないことを明らかにした。5齢中期の中腸組織の可溶型と膜結合型酵素の反応動力学的性質はかなり異なっていることを明らかにした。分離中腸の系を用いて膜結合型酵素が蔗糖の分解に関与していること,ならびに中腸組織中に存在する胃腔膜が蔗糖が分解されて産生されたブドウ糖と果糖を中腸細胞外つまり体腔中へ輸送する段階を促進していることを明らかにした。5齢幼虫の中腸組織の可溶画分より可溶型のβ-フラクトフラノシダーゼをほぼ均一なタンパク質にまで精製する方法を確立した。精製は40-80%の硫安分画,DEAE-セルロース,ハイドロキシルアパタイト,セファクリルを担体とするカラムクロマトグラフィーによって行った。一方膜結合型の酵素の単離のための膜からの可溶化方法を確立した。可溶化された酵素の部分精製標品は可溶型のβ-フラクトフラノシダーゼとは明らかに反応動力学的性質が異なっていた。1.カイコの5齢幼虫の中腸組織の膜結合型蔗糖分解酵素の機能様式を明らかにするために、(1)膜結合型蔗糖分解酵素の活性化剤と阻害剤を探索したところ、二糖分解酵素に効果が認められている試薬のうち、トリス、トリシンならびにデオキシノジリマイシンが活性阻害作用を示すことが分かった。活性化剤は未だ見つかっていない。種々の金属イオンの効果を次に調査したところ、調査したほとんどすべての金属イオンが阻害作用を示すことが明らかになった。(2)絶食したカイコに一定濃度の蔗糖液のみを経口投与する、あるいは蔗糖液と活性阻害剤としての金属イオンを同時に経口投与し、それ以後経時的に脂肪体中のグリコ-ゲン含量を測定したところ、活性阻害剤の共存により脂肪体のグリコ-ゲン含量が有意に減少することが明かとなった。従って膜結合型酵素は経口投与した蔗糖の中腸内腔での分解に関与しているものと推察された。(3)カイコ5齢幼虫より中腸組織を解剖して取り出し、中腸内腔に蔗糖液を入れた後に両端を縛ったものを、緩衝液中に一定時間保温し、中腸内腔と中腸外液中の遊離糖をインスタント薄層クロマトグラフィ-によって展開

分離した後、各糖部分を定量したところ、中腸内腔には蔗糖に加えてブドウ糖と果糖が同定された。中腸外液にはブドウ糖と果糖が同定された。また予想外のことであったが、蔗糖の存在が確認された。この試験管内の実験に於ける観察が生体内の現象を反映しているか否かを今後見きわめる実験を行なう必要がある。2.カイコの5齢幼虫の中腸細胞中の3種類の可溶型蔗糖分解酵素の生理学的役割を明かにする実験は現在実施中である。3.カイコの5齢幼虫の中腸細胞中の3種類の可溶型蔗糖分解酵素のうち、主要な活性を示すPeakII酵素を完全精製する方法を確立した。現在精製の規模を拡大して精製酵素をmgオ-ダ-で集め抗体を作製し、遺伝子をクロ-ニングするための準備を行なっている。1.可溶型蔗糖分解酵素の精製すでに家蚕の中腸組織の可溶画分をDEAE-セルロースイオン交換カラムクロマトグラフィーにかけることによって3つの蔗糖分解酵素の活性画分が分離され、Peak I,Peak II,Peak IIIと名付けられている。今回Peak II画分を精製の出発材料として可溶型の蔗糖分解酵素をほぼ均一なタンパク質として精製する方法を確立した。精製は40-80%の硫安分画、DEAE-セルロース、ハイドロキシアパタイト、セファセルを担体としたカラムクロマトグラフィーによって行った。精製標品の反応動力学的性質から蔗糖とラフィノースをβ型の果糖を認識して加水分解するβ-フラクトフラノシダーゼであることが明らかとなった。2.膜結合型酵素の界面活性剤による可溶化膜結合型の蔗糖分解酵素を膜から界面活性剤のTritonX-100を終濃度1%にて可溶化する方法を確立した。3.家蚕の中腸組織の可溶画分に存在する蔗糖分解酵素の種類家蚕の中腸組織の可溶画分に蔗糖分解酵素としてβ-フラクトフラノシダーゼが存在することを1において明らかにした。これ以外の蔗糖分解酵素つまり、α-グルコースを認識してこちらから蔗糖を加水分解する酵素の存在の有無を検討した。その結果Peak II画分に小量ではあるがα-グルコシダーゼが存在することを明らかにした。Peak I画分には現在までに得られた実験事実からはβ-フラクトフラノシダーゼのみから成り立っているようである。Peak III画分については今後検討する必要がある。
若年性歯周炎起因菌から発見された、呼吸鎖依存性の新規ペルオキシダーゼの生理的意義

近年私達は若年性歯周炎起因菌であるAggregatibacter actinomycetemcomitansから呼吸鎖中のキノールを基質とするペルオキシダーゼを発見し、キノールペルオキシダーゼ(QPO)と名付けた。本研究では、QPOの生理的機能について検討をおこなった。その結果、QPO変異株において種々の内在性酸化ストレスの増加を認めると共に、本菌の主な病原因子である白血球毒(ロイコトキシン)産生量の大幅な減少を観察した。また、QPO阻害剤としてアスコフラノンを見いだし、本菌のロイコトキシンの産生を濃度依存性に減少させることを示した。近年申請者らは、若年性歯周炎起因菌であるAggregatibacter actinomycetemcomitansの細胞膜画分から呼吸鎖中のキノールを生理的基質として用いる新規ペルオキシダーゼを発見し、キノールペルオキシダーゼ(QPO)と名付けた。QPOはヘムcを三つ持つペルオキシダーゼとして初めての例であり、真正細菌における膜結合型ペルオキシダーゼとしても初めての例である。したがって、QPOに関する研究は、生命科学的にも、医学歯学的にも大変意義深いものと考えられる。本研究では、QPOが本菌にとってどのような生理的機能を有するかについて、QPO変異株を用いて検討をおこなった。その結果、QPO変異株では抗DNP抗体で検出される酸化修飾タンパク質量の増加、アルカリ変性ゲルによって検出される酸化DNAの量の増加、そしてカタラーゼ(KatA)活性の亢進を認めた。これらの結果により、QPO変異株は酸化ストレス下にあることを結論づけることができた。しかしながら過酸化脂質の量は亢進しないことから、本菌に於ける過酸化脂質は、Thioperoxidaseのような他の抗酸化酵素によって処理されているものと予想された。また、QPO変異株は、本菌の主な病原因子である白血球毒、ロイコトキシンを分泌することができないという特筆すべき表現型を有することが明らかとなった。このことはQPOが本菌の病態発現に大きく関与していることを示唆するものであり、さらにQPOの研究を続けることによって本菌の惹起する若年性歯周炎に対する新規な予防治療法の開発に貢献できるものと考えられた。このことはQPOが本菌の病態発現に大きく関与していることを示唆するものであった。申請者はさらに、QPO特異的な阻害剤の検討を行い、非常に低濃度でQPO活性を強く阻害する阻害剤(アスコフラノン)を見いだした。続いて、アスコフラノンが濃度依存性に本菌のロイコトキシンの分泌を抑えることを認めた。これらの事実から、QPOとアスコフラノンを新機軸とした若年性歯周炎の新規な予防・治療法の開発に大きく貢献できるものと考えられた。
急性腎不全回復過程における間質細胞の役割に関する検討

1.酢酸ウラニウム誘発急性腎不全における一過性の間貧ミオフィブロブラストおよびマクロファージ浸潤はmycophenolate mofetil投与によるこれら間質細胞浸潤の抑制実験にて、さらなる腎機能の増悪と尿細管再生の減少を認めたことより、急性賢不全の尿細管細胞回復に関与する重要因子であることが明かとなった。2.一過性に出現する間質ミオフィブロブラスは、傷害尿細管の形態保持、細胞性フィブロネクチン分泌による細胞回復へのシグナル伝達、増殖促進に関与するサイトカイン産生による細胞回復促進などの作用が考えられた。同モデルでの間質ミオフィブロラストは、フィブロラスト様細胞が一過性にα平滑筋アクチン形質を獲得したものであり、この機序に傷害尿細管基底膜の機械的伸張の関与が示唆された.これらの刺激を伝達する経路として細胞外基質とそのリガンドやTGF-βシグナル伝達経路が考えられ、α平滑筋アクチン形質発現制御の解明に繋がることが期待される.3.浸潤マクロファージは細胞回復期では増殖促進に関与するサイトカインの供給や傷害尿細管細胞貧食処理、傷害尿細管から進入する異物からの防御に関与する可能性が示唆された。4.同モデルでの間質ミオフィブロブラストおよびマクロファージの役割は、いづれも細胞回復促進に関与し、創傷治癒に類似の役割を有している可能性がある。これまで腎疾患においてこれら間質細胞は間質線維化の進展に関与する細胞性因子として捉えられてきたが、新たな観点からこれら間質細胞の役割を再検討することにより、組織修復と線維化の調節機構の解明にも役立つと考えられる。酢酸ウラニウム誘発急性腎不全ラットの尿細管細胞回復過程での間質に出現するミィオフィブロブラスト(MF)あるいはマクロファージ(Mφ)の役割をmycophenolate mofetil(MMF)投与によるMF及びMφの間質浸潤抑制効果を用いて検討した。雄SDラットに酢酸ウラニウム5mg/kgを静注し急性腎不全を作成し、mycophenolate mofetil(MMF)投与群とvehicle投与群に分け酢酸ウラニウム静注後、連日MMFあるいはvehicleを経口投与し2、5、7日後に屠殺した。屠殺前にブロモデオキシウリジン(BrdU)を投与しS期の細胞をラベルした。vehiclel群では近位尿細管障害は2日より出現し、5日以降に免疫染色にてα平滑筋アクチン陽性MF、ED1陽性Mφ、CD43陽性リンパ球、BrdU陽性増殖細胞の有意な出現と血清クレアチニン値の上昇を認めた。MMF群では、7日目の近位尿細管障害スコアー、血清クレアチニン値はvehicle群に比べ高値で、5、7日の増殖細胞数は著明に減少した。またCD43陽性リンパ球の減少も認めたが、7日目のみであり細胞回復との関係は少ないと考えられた。vehicle群では増殖のピークである5日目にMMF群では免疫染色にてのMφ、MF、TGF-β1またmRNAレベルでのα平滑筋アクチンとTGF-β1の有意な減少が尿細管細胞増殖抑制所見と関連して認められた。これらの結果は、一過性に出現する間質MFおよびMφが本モデルでの細胞回復に重要であることを示唆している。1.酢酸ウラニウム誘発急性腎不全における一過性の間質ミオフィブロブラストおよびマクロファージ浸潤は、mycophenolate mofetil投与によるこれら間質細胞浸潤の抑制実験にて、さらなる腎機能の憎悪と尿細管再生の減少を認めたことにより、急性腎不全の尿細管細胞回復に関与する重要因子であることが明かとなった。2.一過性に出現する間質ミオフィブロブラストは、傷害尿細管の形態保持、細胞性フィブロネクチン分泌による細胞回復へのシグナル伝達、増殖促進に関与するサイトカイン産生による細胞回復促進などの作用が考えられた。

同モデルでの間質ミオフィブロブラストは、フィブロブラスト様細胞が一過性にα平滑筋アクチン形質を獲得したものであり、この機序に傷害尿細管基底膜の機械的伸張の関与が示唆された。これらの刺激を伝達する経路として細胞外気質とそのリガンドやTGF-βシグナル伝達経路が考えられ、α平滑筋アクチン形質発現制御の解明につながることが期待される。3.浸潤マクロファージは細胞回復期では増殖促進に関与するサイトカインの供給や傷害尿細管細胞貪食処理、傷害尿細管から進入する異物からの防御に関与する可能性が示唆された。4.同モデルでの間質ミオフィブロブラストおよびマクロファージの役割は、いづれも細胞回復促進に関与し、創傷治癒に類似の役割を有している可能性がある。これまで腎疾患においてこれら間質細胞は間質線維化の進展に関与する細胞性因子として捉えられてきたが、新たな観点からこれら間質細胞の役割を再検討することにより、組織修復と線維化の調節機構の解明にも役立つと考えられる。
動脈硬化性疾患の早期診断を可能にする分子イメージング・リピドーム解析技術の構築

B2-glycoprotein Iは、止血・血栓、血管新生を制御する多機能血漿タンパク質である。本タンパク質は、plasminによる限定分解を受けることで、特定のリン脂質、酸化脂質、タンパク質との結合能を制御し自らの生理活性を調節する。本研究では、plasminによる限定分解部位を新規に特定すると共に、plasmin抵抗性のドメインI、Vの組換えタンパク質を作製した。また、本タンパク質のPETによる血管新生部位への局在や生理機能を解析すると共に、アフィニティーカラムとLC-MS/MSの組み合わせにより動脈硬化関連の酸化脂質を網羅的に解析できるメタボロミックス技術の構築を試みた。β2GPIがスカベンジする酸化脂質のプロファイルの構築のため、酸化脂質の検出方法の確立が重要である。我々は、高脂血症マウスのリポタンパク質から、コレステロールとその酸化体である7-ケトコレステロール、およびそれらのエステルや、ヒドロキシル基あるいはカルボキシル基をもつ酸化体等の検出に成功した。さらに、動脈硬化モデル動物であるWHHLウサギの動脈硬化病変部の切片から、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法を導入したMALDI-TOF-MSにより上述の酸化脂質を検出および同定し、質量顕微鏡を用いて病変部における各種酸化脂質の分布を明らかにした。また、LC-MS/MSによる当該脂質群の分離、解析条件の検討を開始した。Intact β2GPI (iβ2GPI)、nicked β2GPI(nβ2GPI)及びリン脂質結合部位を保護したiβ2GPIをキレート剤で修飾した後、Cu-64により標識し、膵臓がん細胞(CFPAC-1)皮下移植マウスを用いてPET/CT画像解析、および解剖による臓器放射能分布解析を行った。その結果、腫瘍への各β2GPI標識体の集積を確認した。β2GPIによる腫瘍のイメージング診断の可能性およびマイクロキャリアによる治療への応用可能性に一歩近づいた。本研究では、β2-グリコプロテインI(β2GPI)の機能ドメインを用いた閉塞性血管病変の新規標的医療(Theranostics)技術の確立をめざしている。β2GPIのドメインV(DV)のアミノ酸配列を基に、2つのリジン残基の置換による、3種類の変異型遺伝子組換えタンパク質を発現・精製し、それらの機能を検討した。2個のリジン残基を疎水性および酸性アミノ酸残基に置換することで、自己融解しなくなることが分かった。また、3種類の変異タンパク質His-DVの脂質への結合能をELISA法にて測定し、nativeリコンビナントDVと同様にリン脂質に結合能を有することを確認した。β2GPIがスカベンジする酸化脂質のプロファイルを構築し、「脂質メタボロームによる体外診断法を確立する」という本研究のもう一つの目的のためには、酸化脂質の検出方法の確立が非常に重要である。我々は、血漿をHPLC法により分画した各リポタンパク質から酸化リポタンパク質に特異的結合性を示すβ2GPIに対する抗体(変性脂質関連の特異抗体)を用いて酸化リポタンパク質の検出を試み、血液中の病態特異的な酸化リポタンパク質の検出を確立した。現在までに、LC-MS/MSにより、β2GPIがスカベンジする酸化変性脂質のデータファイルが複数得られている。以上のように研究の進行状況は順調である。今年度は、LC-MS/MSにより検出される酸化脂質の種類を増やし、多種の酸化変性脂質(リピドーム)の一斉検出を目指す。β2GPIの3種類の変異タンパク質は、2つのアミノ酸(リジン)残基の置換により、自己融解しなくなることが分かったので、大腸菌による大量発現および精製を続けている。突然変異を入れても、リン脂質への結合能は保持されていたので、DVの血管新生や線溶系に及ぼす生理機能の精査につながる可能性が高まった。酸化脂質の検出方法が確立された。変性脂質関連の特異抗体を用いた血中酸化脂質の分画ができ、リポタンパク質のダイナミックな代謝動態の解析手段の一つになることが期待される。LC-MS/MS、MALDI-TOF-MSによる酸化脂質のデータベースを作り、β2GPIがスカベンジする酸化脂質のプロファイリングの構築に向かって解析を進めている。β2GPIの欠失タンパク質であるドメインI(DI)を大量調製した。また、intact DVと3種類のプラスミン抵抗性DV変異体を発現し、アフィニティーカラムにて精製した。DV変異体の内皮細胞への標的性、侵襲性、in vitroでの内皮細胞の増殖等への影響を、β2GPI、nicked β2GPI(プラスミン限定分解物)と比較のもとで評価した。また、ヒト血管内皮細胞による管腔形成におよぼす効果を評価した。VEGF依存的なHUVEC増殖実験において、すべてのDV変異体とDIは対照群と比べて18-30%の抑制が認められたが、管腔形成抑制についてはDIとnicked β2GPIのみで有意であった。β2GPIが捕捉する病態生理学的な酸化脂質のLC/MS/MSによるプロファイルを作成するためのモデル実験として、カルジオリピン含有リポソームをβ2GPI結合Sepharose 4BカラムおよびHPLCにより分離し、MS/MSによる定性・定量を行った。一方、β2GPIの捕捉する病態生理学的な酸化脂質のプロファイル・リピドーム解析の技術基盤を確立した。更に、Cu2+酸化LDLに含まれる脂質の病理組織における分布をイメージング質量顕微鏡により解析した。

血管病変に対するβ2GPIの機能ドメインを用いるイメージング法を確立するために、DIおよびDV変異体にキレート化合物を介して89Zrを標識し、担がんマウス、動脈硬化モデル動物における体内動態をPETにて解析した。また、病理組織学的解析により当該指向性プローブの局在と病態の重症度を比較し、小・中動物における分子イメージングを実現する上での基礎的知見を得た。今後、本研究によって得られた知見と基盤技術により、VEGF受容体に対する指向性β2GPI-DIを坦持するsiRNA保持DDSキャリアをモデル動物に静脈投与し、治療法を探る新規事業を計画する。B2-glycoprotein Iは、止血・血栓、血管新生を制御する多機能血漿タンパク質である。本タンパク質は、plasminによる限定分解を受けることで、特定のリン脂質、酸化脂質、タンパク質との結合能を制御し自らの生理活性を調節する。本研究では、plasminによる限定分解部位を新規に特定すると共に、plasmin抵抗性のドメインI、Vの組換えタンパク質を作製した。また、本タンパク質のPETによる血管新生部位への局在や生理機能を解析すると共に、アフィニティーカラムとLC-MS/MSの組み合わせにより動脈硬化関連の酸化脂質を網羅的に解析できるメタボロミックス技術の構築を試みた。β2GPI-DVのプラスミン非感受性配列を想定し、3種類のDV-変異タンパク質を大腸菌により発現させ、精製を始めた。β2GPIがスカベンジする酸化脂質のプロファイルの構築において、鍵を握るとも言える酸化脂質の検出方法が確立された。また、LC-MS/MSによる当該脂質群の分離、解析条件の検討を開始した。今後は、アフィニティカラムによる血中酸化脂質の分画およびその検出を試み、酸化脂質のパネルを作る予定である。メタボロミクス(代謝物解析)は、質量分析技術の発展により、国内外の多くのグループから着目されている最先端技術であるが、その中でも、脂質代謝物(リピドーム)解析は必ずしも容易ではなく、当該研究者らの役割が極めて重要である。これまでの検討で、β2GPIのDVに突然変異を入れても、リン脂質への結合能は保持されることが分かり、DVの機能である血管新生や線溶系の生理機能の精査を進める予定である。PETイメージングによる病態学的血管新生(癌、動脈硬化等)の診断への応用を可能にするための検討を行う予定である。一方、特異抗体を用いることで脂質代謝異常を検出(診断)できる新規バイオマーカーの測定法をすでに確立しており、更に現在、当該抗体と、HPLCによる精製および検出との組み合わせにより、病態に関連するリポタンパク質を選択的に分画し、動脈硬化特異的な酸化脂質のプロファイルの作成を行っている。これらの成果に基づく新規の診断技術を確立する。LC-MS/MSによる一斎解析技術の開発は、「theranostics」のテーラメード化にも必須である。病態に関わる酸化脂質の特定は、一般的には容易ではないが、当該研究者らの確立したバイオマーカー情報をもとに鑑別・標的認識が可能であると考えている。β2GPIがスカベンジ(捕捉)する酸化脂質のプロファイリングを行い、血中酸化脂質の解析する脂質代謝異常診断ツールの開発を目指す。28年度が最終年度であるため、記入しない。
遺伝子調節機構の立体構造とダイナミクスの研究調査

1,核内原がん遺伝子産物MybのDNA結合ドメインは3個のリピート構造からなり、N末から順にR1,R2,R3と呼ばれている。各リピートの立体構造と機能に関して以下の事がわかった。(1)R1の立体構造をNMRにより解析し、R3と類似した立体構造で、同じく3個のヘリックスからなっていた。保存性の高い3個のトリプトファンは他の脂肪族アミノ酸とともに疎水性コアを形成していたが、ヒスチジンは関与していなかった。(2)R2とR3の両方を含をR23,DNA結合ドメイン全体のR123のNMRの解析からR3単独の立体構造はR23やR123中に保存されていた。(3)特異的なDNAとの相互作用の結果、DNAとの特異的な結合にはR23が必須であることがわかった。(4)DNAの一連の変異実験から、特異的な配列としてAACXGX(C/T/A)配列が同定できた。またDNA側のデリーションの実験と組み合わせることにより、R3がAAC配列をR2がGX(C/T/A)配列を認識していることが示された。(5)MybのDNA結合ドメインとDNAの複合体の結晶化を行った。3.タンパク質高次構造に関する調査・研究を行った結果、「タンパク質の高次構造に基づくシグナル認識機構の解明」のための重点領域研究を、本総合研究班員を中心として組織すべきであるということになり、平成6年度発足重点領域申請を行った。