hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
犬の実験的副腎皮質機能抑制モデルにおける下垂体前葉構造ならびに機能の変化

犬のCushing病患者に対してはop'-DDD(Mitotane製剤)を使用した治療が一般的に普及している。視床下部-下垂体-副腎皮質軸の生理学的相互関係を考慮した場合、Gushing病患者に対して副腎皮質機能を抑制することは下垂体線腫の機能を亢進させる危険性が危惧される。そこで、健常ビーグル犬に対して30日間op'-DDDを投与することにより副腎皮質機能抑制モデル犬を作成し、これが下垂体ACTH産生細胞に及ぼす影響について形態的(頭部MRI検査、下垂体ホルモン・転写因子を指標とした免疫組織化学)そして機能的(CRH刺激試験、下垂体におけるPOMC, CRHR, GR, MRの各mRNAの発現強度)に検討した。健常ビーグル犬を対照として使用した。副腎皮質機能抑制モデル犬では対照群と比較して有意なPBRの増大、CRH試験時のACTH濃度の上昇が認められた。また対照群と比較してモデル犬の下垂体Corticotrophは顕著に肥大しており、さらにPOMC mRNA転写活性は有意に亢進していた。同様にモデル動物の視床下部・室傍核においては対照群と比較してCRH産生細胞数の有意な増加が認められた。今回、作成した副腎皮質機能低下症モデル動物では、Cortisolの産生低下、すなわちNegative-feedbackの減弱に起因すると考えられる視床下部・室傍核におけるCRH産生細胞数の増加、そして下垂体Corticotrophの機能亢進を示唆する多くの所見が確認された。今回の成績は犬のCushing病患者に対してop'-DDD(Mitotane製剤)を使用することは本疾患の原因ともなるACTH産生性下垂体腺腫の機能亢進を促す危険性があることを示唆しているかもしれない。健常なビーグル犬に対してop'-DDD〔1,1-Dichloro-2-(2-chlorophenyl)-2-(4-chlorophenyl)ethane〕50mg/kgを一定期間継続投与することにより、副腎皮質機能抑制モデル動物(副腎抑制動物)を作成。この動物に対して、CRH刺激試験、頭部MRI検査、組織学的検査(免疫組織化学による調査を含む)を行い、op'-DDDが視床下部-下垂体-副腎軸に対して与える影響について調査。実験の結果、以下のような成績が得られた。(1)副腎抑制動物作成のための投薬中の血清cortisol濃度測定およびACTH刺激試験の結果、十分な副腎皮質の抑制をかけていると示唆される血中cortisol濃度の低下が確認された。(2)CRH刺激試験の結果、副腎抑制動物において、op'-DDD投与による副腎抑制前に比較して、基礎値および刺激後の値でともに有意に高い血中ACTH濃度を示した。(3)副腎抑制動物における頭部MRI撮影の結果、副腎抑制後の撮影にて、副腎抑制前に比較して有意に腫大した下垂体を認めた。(4)副腎抑制動物の安楽死後、採材した臓器の重量を測定した結果、対照動物に比較して、両側の副腎重量は有意に低値を示した。一方で、副腎抑制動物の下垂体重量は、対照動物に比較して有意に高値を示した。(5)組織学的な調査では、HE染色にて副腎皮質の球状層および束状層の顕著な萎縮が認められ、op'-DDDによる副腎皮質の破壊作用が再確認された。免疫組織化学による調査では、副腎抑制動物の下垂体において有意に面積の増大したACTH陽性細胞を認めた。今回の検討により、op'-DDDを継続投与することにより作成した副腎抑制動物の下垂体において、副腎抑制前および対照動物と比較して、形態的に有意な腫大と、機能的に有意な亢進を示す所見が得られた。

研究の背景:犬のCushing病患者に対してはop^-DDD(mitotane製剤)を使用した治療が一般的に普及している。視床下部-下垂体前葉-副腎皮質系の生理学を考慮した場合、Cushing病患者に対して副腎皮質機能を抑制することは下垂体腺腫の機能を亢進させる危険性が危惧される。目的:健常ビーグル犬を使用して副腎皮質機能抑制モデルを作製し、これが下垂体corticotrophに及ぼす影響を形態的そして機能的に検討すること。材料と方法:健常ビーグル犬において30日間op^-DDD(mitotane製剤)を使用して副腎皮質を化学的に破壊することにより、犬の副腎皮質機能低下症モデルを作成した。対照として健常ビーグル犬を使用した。この作成過程における下垂体の形態的変化を頭部MRI撮影による下垂体/脳比(PBR)を算出することにより測定した。また機能的変化についてはCRH刺激試験で評価した。また安楽死後に採取した下垂体組織上のcorticotrophについて免疫組織化学染色を施し、その細胞面積、および全下垂体前葉細胞に対する割合を測定した。同様に視床下部・室傍核におけるCRH産生細胞数を測定した。下垂体のホルモン産生細胞の分化に関わる下垂体に特異的な転写因子(Pit-1およびT-pit)についても、免疫組織化学染色を施し、これら転写因子を発現している細胞の割合を測定した。さらに、下垂体から抽出したmRNAを材料として、POMC, CRHR, GR, MRの発現強度をReal Time RT-PCR法により検討した。成績:op^-DDDを投与した副腎皮質機能低下症モデル動物では、対照犬と比較して有意なPBRの増大とCRH刺激試験時の有意に高い血漿ACTH濃度が確認された。また、このモデル動物から採取された下垂体組織においては、対照犬と比較してcorticotrophの有意な肥大が認められ、さらにモデル動物の下垂体ではPOMC-mRNA転写活性は対照犬と比較して有意に亢進していた。同様にモデル動物の視床下部・室傍核においては、対照犬と比較してCRH産生細胞数の有意な増加が認められた。考察:今回作成した副腎皮質機能低下症モデル動物では、Cortisolの産生低下、すなわちNegative feedbackの減弱に起因すると考えられる、視床下部・室傍核におけるCRH産生細胞数の増加、下垂体corticotrophの機能亢進を示唆する多くの所見が確認された。今回の成績は、犬のCushing病患者に対してop^-DDD(mitotane製剤)を使用することは、本疾患の原因ともなるACTH産生性下垂体腺腫の機能亢進を促す危険性があることを示唆しているかもしれない。
ゲノムDNAのナノテンプレートによる構造と機能の制御

本研究では、様々なナノテンプレート(ナノメーターサイズ物質)を用いて、DNAとの相互作用および形成されるコンプレックスの形態をプログラミングすることに、DNA高次構造と機能の制御を目的としたものである。本年度、球状テンプレート(シリカナノ粒子)および棒状テンプレート(金ナノロッド)はDNA二次構造と高次構造に与える影響について研究した。(1) DNAの溶液中安定性およびDNA二次構造(二重らせん)の安定性に対するナノ粒子の影響を調べた。アニオン性ナノ粒子の影響はなかったが、カチオン性ナノ粒子はDNAの溶液中安定性を乱し、DNAの沈殿を起こし、更に、DNAを沈殿させないナノ粒子の濃度においても、DNAの二重らせんが高くなると連れて、DNA二重らせんの溶解は大きく抑制された。この結果から、自然界で起こるDNAの二重らせん溶解が必要な過程(転写、複製)では、カチオン性ナノ粒子がこのような過程を妨げると考えられる。(2)次は、DNAとナノ粒子の間の相互作用における生物学的に重要な一価と二価カチオンの影響について研究した。その結果は、全てのカチオンがナノ粒子によってDNA凝縮を促進し、Na^+とK^+またはMg^<2+>とCa^<2+>の間は大直径のカチオンの効果が高かった。(3)最後に、DNAとカチオン性ナノロッドの間相互作用を徹底的に調べ、ナノロッド濃度によって様々なDNA-ナノロッド複合体のナノ構造を観察行った。カチオン性ナノロッドはDNA凝縮を誘起することにより、DNA鎖上のナノロッドが自己組織化する。DNA対ナノロッドの割合によって、DNA鋳型に沿うって並んでおり、ナノロードの高濃度においてはDNAが凝縮しながら、DNAとコンプレックスしたナノロッドが高秩序構造(結晶状の構造)に組織化することを明らかにした。本研究では、様々なナノテンプレート(ナノメーターサイズ物質)を用いて、DNAとの相互作用および形成されるコンプレックスの性質をプログラミングすることで、DNAバイオ活性制御を目的とするものである。本年度は、主として量子ドットおよび金属粒子を用い、DNA分子構造および高次構造に対する影響をについて研究した。(1) DNA・量子ドット反応および量子ドットによるDNA可視化ゲノムDNA溶液に量子ドットを付加し、DNAとの相互作用を研究した。量子ドットの表面状況によって反応モードが異なっており、表面上には陽電荷機能基がない場合は、DNAが量子ドットとイオンコンプレックスしない。量子ドットの表面がアミノ基を有する場合は、DNAと量子ドットの静電的複合体が形成する。量子ドットは蛍光強度の強い物質であり、本研究では、DNA標識化により蛍光顕微鏡において単一DNA分子観察に成功をした。さらに、DNAと量子ドットの反応は非特異性の相互作用と考え、DNA二重らせんだけでなく、様々な高分子(一本鎖DNA、タンパク質および人工高分子等)の観察が可能であると考えられる。今後の予定は、DNA・量子ドットコンプレックスの性質検討及びDNAバイオ活性への影響について研究を行う。(2) DNA鎖上の金属ナノ粒子成長によるゲノムDNA高次構造制御ゲノムDNAをテンプレートとして用い、銀イオンを還元することによりDNA鎖上において金属ナノ粒子が形成することを蛍光顕微鏡において観察した。長鎖DNA上の銀ナノ粒子成長と伴って、DNA高次構造は変化し、広がったコイル状DNAがコンパクト状態へ転移し、200nm大きさ程度のDNA・金属ナノコンポジットへ凝縮する。この金属化方法におり、サイズの多様性のあるDNA・金属ナノメタルコンポジットを合成が可能である。一方は、ナノワイヤー作製の際、長いDNAが金属化するとつれて、ナノワイヤーが凝縮することも考慮すべきである。
雌の多回交尾とそれに伴う交配後の性選択による進化-マメゾウムシ類を用いた実証研究

1.性的二型と遺伝子座内性的対立交配相手の獲得に貢献する形質は、オスが持つと適応的であるが、メスが持つと非適応的である。そのようなオスの形質の進化は、メスの適応進化を妨げるために、遺伝子座内性的対立を生じさせる可能性がある。従来、この対立は形質の性的二型の進化によって解消されると考えられてきた。しかし、甲虫のオスの形質において実験的な進化を起こすことによって、従来の考え方が誤っており、性的二型が進化していても遺伝子座内性的対立は存在するということを明らかにした。2.メスの多回交尾と性的対立に対する抵抗の進化の解明飼育下のアズキゾウムシにおいて、一方では多回交尾したメスを選択して繁殖させ、もう一方では多回交尾しなかったメスを選択して繁殖させることをくり返し、多回交尾を受け入れる、あるいは多回交尾を拒否するというメスの行動を実験的に進化させた。メスは交尾拒否行動を進化させることによって、オスからもたらされるコストを軽減できる可能性があるので、この可能性を検証した。3。活動を制御する体内時計と発育時間を支配する時計との関係交尾行動を含む生物のさまざまな活動は、体内時計によって制御されている。アズキゾウムシの体内時計の周期に遺伝的変異が存在することを発見し、この周期が常染色体上に位置し、相加的効果を持つメジャージーンによって支配されていることを明らかにした。また、体内時計は、発育のような時間の経過に伴って進行する現象にも関与することがある。しかし、アズキゾウムシでは活動時間を支配する体内時計と発育のタイミングを関与する時計とは、独立に作動していることを明らかにした。1.メスの多回交尾に対する人為選択飼育下のアズキゾウムシにおいて、一方では多回交尾したメスを選択して繁殖させ、もう一方では、多回交尾しなかったメスを選択して繁殖させることを繰り返し、遺伝的にメスが多回交尾しやすい系統としにくい系統を確立した。このメスが多回交尾を行うかどうかの違いは、1回交尾を行った後のメスの交尾の受容性に違いが生じているという可能性と、交尾後にメスが他のオスと交尾するのを抑制するオスの形質に違いが生じているという可能性の両方がある。そこで、この2つの可能性をそれぞれ検証し、選択系統間でのメスの多回交尾における遺伝的違いが、メスの交尾受容性の違いに基づくものであることを明らかにした。このことは、選択が働けば、それに応じて多回交尾を受け入れる、あるいは多回交尾を拒否するというメスの行動が進化することを示している。2.近交弱勢と近親交配の回避血縁の近い個体と交配すると、子の生存や繁殖に有害な影響が現れることがあり、この現象は近交弱勢として知られている。アズキゾウムシにおいて、卵、幼虫および蛹期の生存率と成長速度、成虫期のメスの繁殖能力において近交弱勢が現れることを明らかにし、その程度を定量化した。近交弱勢が存在するならば、生物は近親交配を避けるために、交配相手の血縁に応じて交尾行動を変える可能性がある。そこで、アズキゾウムシのメスの交尾行動に対する交配相手の血縁の影響を検証した。その結果、メスは、交配相手が血縁個体かどうかを識別することなく交尾を受け入れたが、血縁個体と交尾した場合には、その後に他のオスと交尾しやすかった。このことから、メスが交尾後に交配相手の血縁を認識しており、メスの多回交尾は近親交配を回避する手段として機能していると考えられる。1.メスの多回交尾の進化実験飼育下のアズキゾウムシにおいて、一方では多回交尾したメスを選択して繁殖させ、もう一方では多回交尾しなかったメスを選択して繁殖させることを繰り返し、多回交尾を受け入れる、あるいは多回交尾を拒否するというメスの行動を実験的に進化させることに成功した。この系を用いて、メスの多回交尾の進化に伴って、メスの体サイズ、産卵数および生存力などの他形質にどのような進化的変化が起こるのかを検証した。2.近交弱勢と近親交配の回避血縁個体と交配すると、子の生存や繁殖に有害な影響が現れることがあり、この現象は近交弱勢として知られている。アズキゾウムシにおいて、成長期の生存率と成長速度および成虫による子の産出能力に近交弱勢が現れることを明らかにした。このことを検証した結果、アズキゾウムシのメスは、血縁個体と交尾した場合には、その後に他のオスと交尾しやすかった。このことは、メスが交尾後に交配相手の血縁を認識していること、そしてメスの多回交尾は近親交配を回避する手段として機能していることを示唆する結果である。3.活動を制御する体内時計の遺伝的基礎交尾行動を含む生物のさまざまな活動は、体内時計によって制御されている。アズキゾウムシにおいて、体内時計の周期に遺伝的変異が存在することを発見した。この周期が常染色体上に位置し、相加的効果を持つメジャージーンによって支配されていることを明らかにした。このような体内時計の遺伝的基礎は、ハエ目以外の昆虫ではほとんど解明されていない。

そのようなオスの形質の進化は、メスの適応進化を妨げるために、遺伝子座内性的対立を生じさせる可能性がある。従来、この対立は形質の性的二型の進化によって解消されると考えられてきた。しかし、甲虫のオスの形質において実験的な進化を起こすことによって、従来の考え方が誤っており、性的二型が進化していても遺伝子座内性的対立は存在するということを明らかにした。2.メスの多回交尾と性的対立に対する抵抗の進化の解明飼育下のアズキゾウムシにおいて、一方では多回交尾したメスを選択して繁殖させ、もう一方では多回交尾しなかったメスを選択して繁殖させることをくり返し、多回交尾を受け入れる、あるいは多回交尾を拒否するというメスの行動を実験的に進化させた。メスは交尾拒否行動を進化させることによって、オスからもたらされるコストを軽減できる可能性があるので、この可能性を検証した。3。活動を制御する体内時計と発育時間を支配する時計との関係交尾行動を含む生物のさまざまな活動は、体内時計によって制御されている。アズキゾウムシの体内時計の周期に遺伝的変異が存在することを発見し、この周期が常染色体上に位置し、相加的効果を持つメジャージーンによって支配されていることを明らかにした。また、体内時計は、発育のような時間の経過に伴って進行する現象にも関与することがある。しかし、アズキゾウムシでは活動時間を支配する体内時計と発育のタイミングを関与する時計とは、独立に作動していることを明らかにした。
新規経口抗凝固薬の血中薬物濃度を指標とした個別投与設計法の構築

直接作用型経口抗凝固薬は、治験データに基づき血液凝固能検査が不要として市販されたが、大出血による死亡例の発生により安全性への懸念が高まり、安全性・有効性の指標としての血中薬物濃度の活用が模索されている。そこで、本研究では実臨床における患者背景を踏まえた上で直接作用型経口抗凝固薬ダビガトランエテキシラート(DABE)の血中薬物濃度に基づいた個別投与設計法を構築することを目的とした。実臨床における使用実態を明らかにするために、DABE服用患者の背景や有効性、出血などの有害事象の発現を後方視的に調査した。添付文書において、中等度腎機能障害又はP-糖蛋白阻害薬併用患者では1日300mgから220mgに減量することが推奨されているが、両因子を保有している患者ではDABEの抗凝固作用が過剰に現れる可能性があり、さらなる減量を考慮する必要性があると推察された。上記のような腎機能障害患者におけるP-糖蛋白を介した薬物相互作用を明らかにするためには臨床試験の実施が必要であるが、腎機能障害患者を対象とした薬物相互作用試験は通常行われない。そこで、腎機能障害患者におけるバーチャル臨床試験を実施するために、DABEおよびその活性代謝物のダビガトラン(DAB)の生理学的薬物速度論(PBPK)モデルを構築した。このPBPKモデルで予測された血中DAB濃度推移は、過去に報告された臨床試験における血中濃度推移と一致していた。本モデルを用いて、腎機能障害患者におけるP-糖蛋白阻害薬ベラパミルとの薬物相互作用試験を実施した。その結果、ベラパミルを併用した際のDABE減量の必要性は腎機能障害の程度によって異なり、中等度腎機能障害患者では1日150mgに減量する必要があると考えられた。本研究で明らかになった投与設計のための情報を用いることで出血リスクが低減できる可能性がある。新規経口抗凝固薬は、治験データに基づき血液凝固能検査が不要として市販されたが、大出血による死亡例の発生により安全性への懸念が高まり、安全性・有効性の指標としての血中薬物濃度の活用が模索されている。そこで、本研究では実臨床における患者背景を踏まえた上で新規経口抗凝固薬の血中薬物濃度を指標とした個別投与設計法を構築することを目的とした。実臨床における使用実態を明らかにするために、新規経口抗凝固薬を服用している患者の患者背景や有効性、出血などの有害事象の発現を後方視的に調査した。その結果、腎機能低下またはP-糖蛋白阻害薬の併用のどちらかに当てはまる患者では一段階減量することが添付文書において推奨されているが、両因子をどちらも保有する患者では凝固能が低下して出血等の有害事象の発現が多い傾向がみられ、このような患者ではさらなる減量を考慮する必要があると推察された。心房細動に適応を有する新規経口抗凝固薬は、P-糖蛋白阻害薬である抗不整脈薬のアミオダロンやベラパミルを併用する機会が多いため、P-糖蛋白阻害薬併用の影響を定量的に把握する必要がある。そこで、新規経口抗凝固薬の生理学的薬物速度論(PBPK)モデルを用いた解析を開始し、モデルを構築するために必要となる化合物の物理学的、生化学的特性情報などについて論文情報を収集して化合物の基礎ファイルを作成した。新規経口抗凝固薬のPBPKモデルが確立されれば、患者背景を考慮した上で血中薬物濃度をシミュレートすることができ、個別投与設計法の構築が可能となると考える。実臨床における使用実態調査は順調に進捗している。新規経口抗凝固薬の血中薬物濃度の評価については、実患者の血中濃度を測定していないが、生理学的薬物速度論モデルを構築することにより個別投与設計法の構築が進捗すると考える。そこで、本研究では実臨床における患者背景を踏まえた上で直接作用型経口抗凝固薬の血中薬物濃度を指標とした個別投与設計法を構築することを目的とした。実臨床における使用実態を明らかにするために、昨年度からさらに症例数を増やし、直接作用型経口抗凝固薬服用患者の背景や有効性、出血などの有害事象の発現を後方視的に調査した。添付文書においては、腎機能低下又はP-糖蛋白阻害薬併用患者では一段階減量することが推奨されているが、両因子を保有している患者ではさらなる減量を考慮する必要性があると推察された。上記のような腎機能障害患者におけるP-糖蛋白を介した薬物相互作用を明らかにするためには臨床試験が必要とされるが、腎機能障害患者を対象とした臨床試験は通常行われない。そこで、腎機能患者におけるバーチャル臨床試験を実施するために、直接作用型経口抗凝固薬の生理学的薬物速度論(PBPK)モデルを構築した。このPBPKモデルで予測された直接作用型経口抗凝固薬の血中薬物濃度推移は、過去に報告された臨床試験における血中濃度推移と一致していた。本モデルを用いることで腎機能障害患者のような特殊集団における個別投与設計法の構築が可能となると考える。実臨床における使用実態調査はほぼ終了した。直接作用型経口抗凝固薬の個別投与設計法の構築は、実患者の血中濃度ではなく生理学的薬物速度論モデルを用いることで達成できると考える。

直接作用型経口抗凝固薬は、治験データに基づき血液凝固能検査が不要として市販されたが、大出血による死亡例の発生により安全性への懸念が高まり、安全性・有効性の指標としての血中薬物濃度の活用が模索されている。そこで、本研究では実臨床における患者背景を踏まえた上で直接作用型経口抗凝固薬ダビガトランエテキシラート(DABE)の血中薬物濃度に基づいた個別投与設計法を構築することを目的とした。実臨床における使用実態を明らかにするために、DABE服用患者の背景や有効性、出血などの有害事象の発現を後方視的に調査した。添付文書において、中等度腎機能障害又はP-糖蛋白阻害薬併用患者では1日300mgから220mgに減量することが推奨されているが、両因子を保有している患者ではDABEの抗凝固作用が過剰に現れる可能性があり、さらなる減量を考慮する必要性があると推察された。上記のような腎機能障害患者におけるP-糖蛋白を介した薬物相互作用を明らかにするためには臨床試験の実施が必要であるが、腎機能障害患者を対象とした薬物相互作用試験は通常行われない。そこで、腎機能障害患者におけるバーチャル臨床試験を実施するために、DABEおよびその活性代謝物のダビガトラン(DAB)の生理学的薬物速度論(PBPK)モデルを構築した。このPBPKモデルで予測された血中DAB濃度推移は、過去に報告された臨床試験における血中濃度推移と一致していた。本モデルを用いて、腎機能障害患者におけるP-糖蛋白阻害薬ベラパミルとの薬物相互作用試験を実施した。その結果、ベラパミルを併用した際のDABE減量の必要性は腎機能障害の程度によって異なり、中等度腎機能障害患者では1日150mgに減量する必要があると考えられた。本研究で明らかになった投与設計のための情報を用いることで出血リスクが低減できる可能性がある。新規経口抗凝固薬の血中薬物濃度を指標とした個別投与設計法を構築するためには、実臨床における患者背景を把握することが重要であるため、今後も実臨床における使用実態調査を継続する。新規経口抗凝固薬の生理学的薬物速度論(PBPK)モデルを用いた解析を発展させることにより、実臨床における幅広い患者背景に対応した個別投与設計法を構築することが可能となると考える。直接作用型経口抗凝固薬の生理学的薬物速度論モデルが構築されたため、腎機能障害患者も含めた特殊集団における血中薬物濃度推移やそれらの患者における薬物相互作用について検討し、個別投与設計法を構築する。研究成果発表のために必要な統計解析ソフトを購入するためには、助成金の残額が不足していたため。翌年度の助成金と合わせて、統計解析ソフトを購入する予定である。
遺伝子組換え動物を用いた哺乳類生殖細胞特異的GPIアンカータンパク質の機能解析

計画最終の今年度は、本課題の主プロジェクトの精子GPIアンカータンパク質LYPD4の機能を解析し、共通の表現型を持つ遺伝子(タンパク質)との関連を調べ、CRISPR/Cas9システムを用いたノックイン(KI)マウスを作製し検討を行った。その結果、前年度に論文発表(JCS. 2018)した精子膜タンパク質CMTM2A/BのKOマウスを用いてLYPD4との関連を調べたところ、LYPD4の発現に特に変化が見られなかったことから、LYPD4が既知の必須因子群とは別経路を介して精子受精能を制御している可能性を示唆する結果が得られた。また、これまで最も重要視されてきた精子膜タンパク質ADAM3(Exp Anim. 2018)との関連についても解析を行ったが、こちらもLypd4-KOマウスにおけるADAM3発現、及びAdam3-KOマウスにおけるLYPD4発現にも大きな影響が見られなかった。以上のことから、LYPD4が未知の経路を介して精子受精能を制御する新規タンパク質であることが明らかになった。これらの分子メカニズムを解明するために、LYPD4タンパク質のN末端側にFLAGタグを挿入したKIマウスの作製を試みた。その結果、作製には成功したが、残念ながらFLAG抗体を用いたWB及びIP-WB解析では目的タンパク質を検出することができなかった。現在、これまでの解析結果をまとめてLYPD4に関する論文として鋭意作成しており、準備ができ次第投稿する予定である。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。初年度は、予定していた新たに発見した精子上に存在するGPIアンカータンパク質XのKOマウスの表現型解析(精巣重量、精巣切片、精子形態、精子運動性、体外受精など)を概ね遂行することができた。さらに、このGPIアンカータンパク質Xは、精子受精能に必須の膜タンパク質として知られているADAM3と相互作用することも分かった。今後は、申請者が以前報告したADAM3関連因子で、かつGPIアンカータンパク質であるTEX101やLY6Kとの関連を調べていく。それらと並行して、ADAM3, TEX101, LY6KそしてACEのKOマウスにおけるGPIアンカータンパク質Xの局在と、XのKOマウスにおけるこれらの因子の存在についても調べたい。また、このGPIアンカータンパク質Xと相互作用する新たな分子を同定するために、CRISPR/Casシステムによりタグをノックイン(KI)したマウスを作製した。このKIマウス精子を用いて免疫染色を行ったところ、抗X抗体で調べた局在とほぼ同様のパターンを示したことから、狙い通りのKIマウスが作製できたことを確認した。今後は、このKIマウス精子タンパク質を用いて、免疫沈降からのLC/MS/MS解析を行い、新規分子の同定を試みる。このKIマウスを使えば、GPIアンカータンパク質Xの精巣上体での修飾メカニズムにも迫ることができるかもしれない。予定していた研究計画を概ね遂行し、本課題に関連する学術論文を発表することができたため。今年度は、申請者が見つけた精子GPIアンカータンパク質Xと相互作用する精子膜タンパク質複合体2A/2BのKOマウスを作製し表現型解析(精巣重量、精巣切片、精子形態、精子運動性、体外受精など)を概ね遂行することができた。驚くべきことに、これら精子膜タンパク質のKOマウス精子も、精子受精能に必須の精子膜タンパク質ADAM3と関連することが明らかになった。また、以前報告した精子受精能に必須のGPIアンカータンパク質複合体TEX101/LY6KのKOマウスにおける2A/2Bタンパク質の動態を調べたところ、野生型との差は見られなかったことから、TEX101/LY6Kは精子形成過程に、2A/2Bは精子完成後において、ADAM3と共役して精子受精能を成立させていることが示唆された。今後は、その他のADAM3関連因子のKOマウスおよび2A/2BのKOマウスを用いて、これらの因子の存在や局在変化を調べたい。また、従来のCRISPR/Cas9システムでは、点変異やノックイン導入効率が単純KOに比べて低かった。そこで、ES細胞を用いることで、これらの変異導入効率を飛躍的に向上させることに成功した(Sci Rep. 2016)。これにより、複雑な遺伝子改変にも対応できるようになり、今後の研究計画の進捗にも良い影響を与えるだろう。そして、これまではFLAGタグをノックインしたマウスを作製し解析に用いてきたが、複数因子の相互作用を調べるためにはFLAG以外のタグが必要になるため、新たなタグを持つノックインマウス作製が急務である。今年度予定していた研究計画を概ね遂行し、本課題に関連する学術論文を発表することができたため。今年度は、精子GPIアンカータンパク質X以外の生殖細胞特異的な発現を示す膜タンパク質のKOマウスを作製し解析を行った。CRISPR/Cas9の登場により、迅速な遺伝子組換えマウスの作製が可能になり、交配試験などの生殖に関する表現型解析を短期間で完了させることができた。現在、これらの解析結果も含めて、精子GPIアンカータンパク質Xに関する学術論文の作成に取り掛かっている。その他には、前年度見つけた精子受精能に必須の精子膜タンパク質ADAM3に関与する精子膜タンパク質複合体2A/2BのKOマウスを用いた機能解析が完了し、現在論文投稿へ向けて準備を進めている。また、副プロジェクト「CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集マウス作製法の開発」の一環として、

男性不妊の原因遺伝子SPATA16の点変異(R283Q)を解析対象とし、相同なアミノ酸に対する点変異(R284Q)マウスを作製し生殖能力を評価したところ、予想に反して点変異マウスと野生型マウスとの間に大きな違いは見られなかった。しかし、インフレーム変異により機能ドメインの一部(781塩基)を欠損させたマウスは、精子形成不全により不妊になることが明らかになった。以上の事から、マウスSpata16遺伝子もヒトの報告と同様に、精子形成に必須であることが分かった。このようにマウスを用いたゲノム編集技術は、従来法(ES細胞を用いた相同組換え)に比べ確実性だけでなく導入効率も非常に高いことから、機能ドメインや他タンパク質との推定結合ドメインに対して変異をピンポイントで導入することも可能である。次年度は、この技術を用いてアミノ酸レベルでの機能ドメインの探索を行う予定である。2017年度に予定していた研究計画を概ね遂行し、本課題に関連する学術論文を発表することができたため。計画最終の今年度は、本課題の主プロジェクトの精子GPIアンカータンパク質LYPD4の機能を解析し、共通の表現型を持つ遺伝子(タンパク質)との関連を調べ、CRISPR/Cas9システムを用いたノックイン(KI)マウスを作製し検討を行った。その結果、前年度に論文発表(JCS. 2018)した精子膜タンパク質CMTM2A/BのKOマウスを用いてLYPD4との関連を調べたところ、LYPD4の発現に特に変化が見られなかったことから、LYPD4が既知の必須因子群とは別経路を介して精子受精能を制御している可能性を示唆する結果が得られた。また、これまで最も重要視されてきた精子膜タンパク質ADAM3(Exp Anim. 2018)との関連についても解析を行ったが、こちらもLypd4-KOマウスにおけるADAM3発現、及びAdam3-KOマウスにおけるLYPD4発現にも大きな影響が見られなかった。以上のことから、LYPD4が未知の経路を介して精子受精能を制御する新規タンパク質であることが明らかになった。これらの分子メカニズムを解明するために、LYPD4タンパク質のN末端側にFLAGタグを挿入したKIマウスの作製を試みた。その結果、作製には成功したが、残念ながらFLAG抗体を用いたWB及びIP-WB解析では目的タンパク質を検出することができなかった。現在、これまでの解析結果をまとめてLYPD4に関する論文として鋭意作成しており、準備ができ次第投稿する予定である。初年度に計画していた新たに発見した精子上に存在するGPIアンカータンパク質のKOマウスを用いた表現型解析は、概ね遂行することができた。今年度は、CRISPR/Casシステムにより作製したノックイン(KI)マウスを用いて、相互作用する因子の同定を試みる。今年度、申請者が発見した精子GPIアンカータンパク質と相互作用する精子膜タンパク質複合体2A/2BのKOマウスを作製し、表現型解析を概ね遂行することができた。そして、ES細胞とCRISPR/Cas9システムを組み合わせた遺伝子改変法も確立したので、次年度はこれらタンパク質に対するタグノックインマウス作製して、相互作用する因子の同定を試みる。
蒸気圧縮式ヒートポンプシステムの混合冷媒による高性能化

作動培養として地球環境の破壊に関与しない代替冷媒を用いて、従来型に比してエネルギー消費の少ない高性能な蒸気圧縮式でヒートポンプ・冷凍システムを開発することは、昨今の地球環境問題の解決並びに我国の将来のエネルギービジョンの構築の上で極めて重要な課題である。そこで、本研究では、圧縮機、プレートフィン凝縮器、膨張弁、プレートフィン蒸発器からなる蒸気圧縮式ヒートポンプ実験装置を用いてHFC134a/HCFC123系混合冷媒サイクルの実験およびプレートフィン熱交換器の電熱特性に関する実験を行い、以下の成果を得た。(1)混合冷媒の組成比及び熱源温度条件がサイクルの成績系数に及ぼす影響を検討し、高性能な熱交換器を用い、熱源条件に対して適切に組成比を選択すればロレンツサイクルにより近づけられること(現有装置では、HFC134aの質量分率が0.9で成績係数比の最大値(=0.69)が得られた)を示した。(2)プレートフィン熱交換器での冷媒蒸気および熱源水の単相熱伝達特性、冷媒の凝縮および蒸発熱伝達特性に関する実験式を作成した。ここに、純冷媒の凝縮および蒸発熱伝達係数はいずれも平滑面の熱伝達係数の約10倍高い値を示した。また、混合冷媒の場合、凝縮熱伝達係数は純冷媒に比して低下したが、蒸発熱伝達係数は純冷媒の値とほぼ一致した。(3)得られたプレートフィン蒸発器および凝縮器の熱伝達特性に関する実験式を用いて純冷媒の伝達特性の予測計算を試みた。予測計算結果は、実験結果と比較的よく一致した。
潰瘍治癒過程におけるアミノ酸トランスポーターと遺伝子発現に関する検討

潰瘍治癒過程での、アミノ酸輸送系トランスポーターおよびシクロオキシゲナーゼ(COX1、COX2)との相互関係について検討した。ラット酢酸胃潰瘍治癒過程において、COX2の免疫組織化学的発現は、潰瘍底の肉芽組織の部位や潰瘍辺縁の上皮などにCOX2の発現が増加していた。COX阻害剤であるindomethacinを潰瘍形成後投与すると、潰瘍治癒過程の抑制がみられたが、中性アミノ酸トランスポーターLAT1の発現は、対照群に比較して、より増加する傾向が認められた。LAT1は、PG系に依存せず発現が増加し細胞増殖に関与し潰瘍治癒に関与する可能性も示唆された。人消化管原発カルチノイド(胃、小腸、結腸、直腸)およびそれらの転移巣(肝、リンパ節など)において、COX-1、COX-2の免疫組織化学的な発現を検討した。COX-2は、消化管カルチノイドおよびその転移巣において発現がみられた。COX-2は腫瘍細胞の細胞質にdiffuseに染色され、間質浸潤部の腫瘍細胞にも発現がみられる傾向にあった。一方、COX-1は一部のカルチノイドにおいて軽度の発現を認めるのみであった。また、LAT1の発現も、腫瘍部において中等度以上の発現が認められ、人カルチノイドにおいても、COX-2やLAT1が腫瘍の発育や増殖に対し重要な役割を果たしている可能性が示唆された。また、ラットの大腸癌肝転移モデルで免疫組織化学的にLATIの発現も確認しており、LAT1は大腸腫瘍の進展に関与し、進行大腸癌の有用な予後因子になりうる可能性が示唆された。一方、ヒトの食道癌手術症例での免疫組織学的検討では、扁平上皮癌部で、非癌部に比べて、腫瘍部全体にLAT1の発現が有意に高く、癌の浸潤が深くなるほど、また腫瘍が大きくなるほどLAT1の発現が強くなり、食道癌の増殖、分化、浸潤にもLAT1が重要な役割を果たしている可能性が示唆された。GeneChipを用いたストレス負荷短時間における遺伝子解析において、ラット胃粘膜で熱ショックタンパク質遺伝子や、c-fosなどのprotooncogeneの遺伝子に発現の亢進が認められ、細胞周期に関連した遺伝子群の発現の一過性の誘導や、転写因子活性化や細胞情報伝達などに関与するP-38 mitogen-activated protein kinase(MARK)の発現の亢進もみられた。ラット酢酸潰瘍治癒過程における、アミノ酸輸送系トランスポーターLAT1およびシクロオキシゲナーゼ(COX1、2)との相互関係について検討した。潰瘍治癒過程で、COX2は、免疫組織化学的に、潰瘍底の肉芽組織の部位や潰瘍辺縁の上皮などにその発現が増加していた。COX阻害剤であるindomethacinを潰瘍形成後1週間投与すると、治癒過程の抑制がみられたが、LAT1の発現はより増加する傾向が認められた。System Lの選択的阻害剤であるBCHによるアミノ酸輸送系の阻害は潰瘍治癒を遅延させ、その際、LAT1の発現は抑制されているので、LAT1は、Prostglandin系に依存せず発現が増加する可能性も示唆された。

次に、TaqMan RT-PCR法により、LAT1およびその機能発現に必要なシャペロンタンパクである4F2hcの発現を検討した。潰瘍部全体では、LAT1 m-RNAおよび4F2hc m-RNAの発現の増加は明らかではなかったが、潰瘍部以外の正常胃壁部分では、LAT1 m-RNAの発現が、潰瘍形成0日と比較し治癒過程で増加していた。潰瘍部でのLAT1の発現は免疫組織上、COX2と異なり、再生上皮など一部に限局しており、潰瘍組織全体でのm-RNAを検討したため、局所での発現の増強をうまくとらえきれなかった可能性がある。しかし、潰瘍以外の正常部で、LAT1および4F2hc m-RNAの発現が増加していたことより、潰瘍修復に対するトランスポーター発現を介したアミノ酸輸送の関与が示唆された。また、人の直腸カルチノイドの外科手術、内視鏡摘出症例でCOX-2は中等度から強い発現が認められ、特にカルチノイドの間質浸潤部でCOX-2の強い発現が観察された。一方、COX-1は腫瘍部・非腫瘍部上皮の両方で低レベルで構成的に発現していた。一部の症例で、LAT1の発現を検討したが、強い発現が認められ、腫瘍性病変における増殖にLAT1、COX-2が関与する可能性が考えられた。人消化管原発カルチノイド(胃、小腸、結腸、直腸)およびそれらの転移巣(肝、リンパ節など)において、COX-1、COX-2の免疫組織化学的な発現を検討した。COX-2は、消化管カルチノイドおよびその転移巣において発現がみられた。COX-2は腫瘍細胞の細胞質にdiffuseに染色され、間質浸潤部の腫瘍細胞にも発現がみられる傾向にあった。一方、COX-1は一部のカルチノイドにおいて軽度の発現を認めるのみであった。また、アミノ酸トランスポーターLAT1の発現を検討中であるが、腫瘍部において、中等度以上の発現がみとめられた。すでに、人大腸癌やラット大腸癌肝転移モデルでのLAT1の発現も確認しているが、人カルチノイドにおいても、COX-2やLAT1が腫瘍の発育や増殖に対し何らかの重要な役割を果たしている可能性が示唆された。胃潰瘍の病態における遺伝子発現の包括的解析を、Affymetrix社製Gene chipを用いて行った。Rat Toxicology U34アレイを用いて、ラットでの水浸拘束ストレス負荷30分、1および2時間後の胃粘膜の遺伝子発現の変化を検討した。約850の毒性関連遺伝子のオリゴヌクレオチドプローブを用いた解析では、ストレス負荷30分で、対照群に比較して、約7%の遺伝子に発現の亢進が認められた。ストレス負荷1時間、2時間と、発現亢進がみられる遺伝子数はすみやかに減少した。ストレス負荷短時間において、熱ショックタンパク質遺伝子のみならず、c-fosなどのprotooncogeneの遺伝子に発現の亢進が認められ、薬物代謝酵素や細胞周期に関連した遺伝子群での発現の一過性の誘導も認められた。現在、RT-PCRも加えて、これらの発現遺伝子のうちの一部についてさらに検討を加えている。ラット酢酸潰瘍治癒過程における消化性潰瘍の治癒過程での、アミノ酸輸送系トランスポーターおよびシクロオキシゲナーゼ(COX1、COX2)との相互関係について検討した。ラット酢酸潰瘍治癒過程において、COX2の免疫組織化学的発現は、潰瘍底の肉芽組織の部位や潰瘍辺縁の上皮などにCOX2の発現が増加していた。
線虫の塩走性行動を制御する神経ネットワークのシステム生物学的解析

線虫の塩走性行動においては、感覚神経が検出する塩濃度の時間変化から、進行方向およびそれに垂直な方向への塩濃度の勾配を区別して、質的に異なるふたつの走性機構を使い分けていると考えられる。神経活動を正確かつ定量的に測定できる実験系を確立したところ、感覚神経においては濃度勾配の方向の情報が区別されていないことが示唆された。また数理モデルの解析から、濃度勾配の情報を明確に分離できなくなると塩走性行動に異常が生じることがわかった。これらの結果から、感覚神経より下流の神経ネットワークにおいて、濃度勾配の方向の情報が分離されていることが示唆された。線虫は特定の塩濃度の領域へ向かう性質があり、進行方向および垂直方向の塩濃度勾配に対してそれぞれピルエット機構と風見鶏機構という異なる行動戦略を用いている。その際神経ネットワークにおいては塩濃度勾配の方向の情報が時間的に多重にコードされていると考えられる。本研究では、多重にコードされた情報を分離・抽出する機構を同定し、その動作原理の解明を目指して、<1.カルシウムイメージングによる神経細胞の活性測定>と<2.実験データに基づいた数理モデルの作成>、<3.数理モデルの解析と動的特性の検証>を行っている。本年度は、1.と2.について研究を進めた。1.では、塩濃度が繰返し変化する刺激を線虫に与えて、神経細胞の応答を正確に測定できる実験系を確立した。この系を用いて感覚神経の応答を測定したところ、感覚神経は塩濃度変化の周期が長いほど応答が強くなることや、蛇行の周期と一致するような振動刺激にも応答することが明らかになった。この結果は、進行方向および垂直方向の濃度勾配の情報は感覚神経の段階では区別されておらず多重化されていることを示唆していた。あわせて、運動中の線虫を追跡しながら神経細胞の応答を測定するためのプログラムや、4Dイメージング観察技術によって得られた画像データを解析するためのプログラムを作成した。2.では、風見鶏機構の数理モデルを作成するにあたって、先行研究の数理モデルをCUDA環境上に実装し、遺伝的プログラミング法を利用して追試を行った。その結果、神経細胞ネットワークの一部でバンドパスフィルタ特性を持ち、垂直方向の濃度勾配の情報だけが抽出されるようなモデルが選ばれることがわかった。このバンドパス特性が発揮できないよう改変したモデルでは風見鶏機構が正しく働かなくなることが明らかになり、風見鶏機構にとってバンドパス特性のような情報抽出機構が必要不可欠であることが示唆された。本研究では、多重にコードされた情報を分離・抽出する機構を同定し、その動作原理の解明を目指して、<1.カルシウムイメージングによる神経細胞の活性測定>と<2.実験データに基づいた数理モデルの作成>、<3.数理モデルの解析と動的特性の検証>を行った。1.について、線虫の神経ではCa2+レベルの緩やかな変化によって信号を伝えているが、改良型の微小流路デバイスを導入した結果、感覚神経のCa2+レベルの下限は既存のプローブの検出下限を下回っており、緩やかなCa2+レベルの変化を正しく測定できていないことがわかった。そこで、親和性を改良したプローブや、近年開発が進んでいる膜電位感受性蛍光プローブの導入を進めている。また、ある神経細胞についてはプローブの特異的な発現を誘導することが困難だと判明したので、4Dイメージング観察技術によりこの神経を測定できるよう、得られた画像データを解析するためのプログラムの作成を更に進めた。2.および3.では、塩濃度感覚神経の数理モデルについて、先行研究を元にMatlab上の微分方程式モデルとして実装し、実験データを再現できるようパラメータ推定を行った。その結果、既存の反応経路だけでは、実験結果に現れる一過性の応答を再現できない可能性が示唆された。別の感覚神経の数理モデルでは一過性応答が再現できたとの既報がある。そこで、一過性応答などモデルの動的特徴が、モデルのどの経路に依存しているかを解析する枠組みを実装した。この枠組みを既報のモデルに適用し、得られた経路を塩濃度感覚神経の数理モデルに追加して、一過性応答を再現できるよう改良した。研究計画の<1.カルシウムイメージングによる神経細胞の活動測定>に際して、当初想定していなかったトラブルが2点生じ、解決に時間を要したため、感覚神経以外の神経細胞の測定が遅れているが、全体としては概ね順調に進展している。1点目として、10分という比較的短時間かつ静的な撮影条件にもかかわらず、撮影中に経時的な焦点ズレが生じ、正しく測定ができないという問題が生じた。そこで、Ca2+感受性蛍光プローブの比較対象として別の蛍光分子を同じ細胞へ発現させ、同時に撮影して補正することで、この問題を解決した。

2点目は、Ca2+感受性蛍光プローブの応答速度が個体間で異なるという問題であった。振動的な刺激を与えた際の応答の振幅は、対象の神経細胞系の内在的特性だけでなく、蛍光プローブの応答速度にも影響を受ける。蛍光プローブの応答速度は個体間で最大10倍程度異なっていたため、振動的な刺激を与えた際の応答の振幅を個体間で直接比較できない場合があることがわかった。そこで、蛍光プローブの応答速度を個体ごとに予め測定し、参照用データと同程度の応答速度を示した個体について、振動的な刺激を与えて応答を測定することで、この問題に対応している。あわせて、このような影響の少ない別の改良型蛍光プローブの導入も検討している。これらはいずれも実験の結果に大きく影響する重要な問題であり、これらの問題を解決し神経細胞の活動を正確に測定できるようになったことで、今後の研究の着実な進展が期待できるようになった。25年度が最終年度であるため、記入しない。研究計画に従い、今後も引き続き<1.カルシウムイメージングによる神経細胞の活性測定>と<2.実験データに基づいた数理モデルの作成>を行い、加えて<3.数理モデルの解析と動的特性の検証>を行う予定である。1.に関しては、今年度までに神経細胞の応答を正確に測定できる実験系を確立したので、これを利用して感覚神経以外の神経細胞の応答の測定を進める。あわせて、応答速度の速い改良型蛍光プローブの導入を進める。また、全神経細胞の応答を一度に測定するための4Dイメージング観察技術と画像解析基盤の整備が進みつつあるため、これを積極的に活用して研究のさらなる進展を図りたい。2.に関しては、感覚神経以外の神経細胞の応答の測定の進捗に合わせて、実験データを再現できるような数理モデルの作成を進める。また4Dイメージングにより全神経細胞の応答を一度に測定できるようになれば、応答のうち平均化すると消えてしまうような小さな部分の寄与も数理モデルへ反映できるようになり、数理モデルの正確さの向上が期待できる。3.では、解析すべき数理モデルは今年度の課題であるが、【研究実績の概要】で示したように、数理モデルの解析から有用な知見が得られることが明らかとなったので、2.で実験データを再現できる数理モデルが得られ次第、当初計画の通り解析を進める。
汚水の高度処理法の開発に関する研究

私達の周辺の水環境は著しく悪化してきた。この問題を解決するには排水を処理して公共用水域に放流する事が必要である。しかし、現在の汚水処理技術はでは有機物の除去はほぼ完璧に出来るが、窒素やリンの除去には改良の余地がある。今、問題となっている、湖沼の富栄養化問題を解決するには脱リン、脱窒の処理技術の開発が不可欠である.そこで、ここでは、従来の擬集沈殿法よりも、経済的で、運転も容易な嫌気・好気法、あるいは従来、海水を淡水化するために用いられる逆浸透膜を応用して水中の窒素やリンの除去に関する研究を行った.前者は浮遊生物法であれば、処理工程中に嫌気状態を作る事によって、窒素やリンの除去が可能になった.後者は脱窒や脱リンの機能に問題のある既説の処理場に、膜装置を単に付加するだけで脱リン、脱窒素が可能な事が分かった.また、脱窒・脱リンの能力は前者よりも効率であるが、膜分離装置に汚水を導入する前の前処理と、濃縮水の取り扱いにやや問題が残されている.私達の周辺の水環境は著しく悪化してきた。今、問題となっている、湖沼の富栄養化問題を解決するには脱リン、脱窒の処理技術の開発が不可欠である.そこで、ここでは、従来の擬集沈殿法よりも、経済的で、運転も容易な嫌気・好気法、あるいは従来、海水を淡水化するために用いられる逆浸透膜を応用して水中の窒素やリンの除去に関する研究を行った.前者は浮遊生物法であれば、処理工程中に嫌気状態を作る事によって、窒素やリンの除去が可能になった.後者は脱窒や脱リンの機能に問題のある既説の処理場に、膜装置を単に付加するだけで脱リン、脱窒素が可能な事が分かった.また、脱窒・脱リンの能力は前者よりも効率であるが、膜分離装置に汚水を導入する前の前処理と、濃縮水の取り扱いにやや問題が残されている.今年度は曝気槽の模型として100cm×30cm×50cmの透明塩ビ水槽を3個、嫌気槽の模型として50cm×30cm×50cmの透明塩ビ水槽を2個、大型タンクなどから構成される実験装置を作成し早速実験を開始した。この装置を鳥取大学の汚水処理場に設置し、原水はそこから取り、一日一定量の汚水を連続的あるいは間欠的に供給し、放流水のBOD,COD,T-N,T-P透視度,pH,電気伝導度、処理に役立つ微生物、汚水に含まれる重金属などを定期的に観測および測定し、本装置の脱窒率、脱燐率を把握することに勤めた。その結果、次の事が分かった。(1)嫌気・好気法による運転では燐酸イオンの放出、過剰摂取減少が見られた。即ち、今までの活性汚泥法の中に嫌気状態を作ってやれば、生物学的に燐が除去される事が確認された。(2)全リンの平均除去率は標準法では37.6%であるのに対し、嫌気・好気法では71.8%と高く、これは嫌気・好気法が脱燐に有効であることを示すものである。(3)沈殿槽では燐酸イオンが汚泥から溶出する減少が見られた。これを防ぐには従来よりも早めに汚泥を沈殿槽から排除する必要があることが分かった。下記の流れずのような模型装置を製作し、鳥取大学の下水処理場の原水を用いて嫌気槽-好気-嫌気槽-好気槽を連続させ、この装置の脱窒素、脱リン効果を検討した。汚水タンク-嫌気槽-曝気槽-脱窒槽-再曝気槽-沈殿槽-放流本実験をまとめると次のようになる。1)本実験での平均除去率はCOD98%、T-N31%、T-P70%であった。即ちCODとリンの除去率は高いが、窒素の除去率は低かった。これは曝気槽で硝化作用が不十分であったことによる。2)嫌気状態によるリンの放出、それに続く曝気槽でのリン過剰摂取現象が見られ脱リン効果は良かった。本年度は、既設の処理場の窒素やリン除去能力の向上のために鳥取県気高郡鹿野町閉野集落排水処理場に逆浸透膜装置を取り付け二次処理水の高度処理実験を試みた。閉野集落排水処理施設はモデル事業でJARUS V型を平成5年に建設したもので、処理人口は190人で、その処理水量は50トン/日である。しかし、ここの放流水質基準はBODが20ppm、SS50ppmとなっているものの、窒素やリンについては何等規制されていない.そこで、ここの処理水質(二次処理水)をさらに高度処理するために逆浸透膜をもちいて高度処理を試みた。その結果、二次処理水のCOD11ppmは逆浸透膜を透過後、0.18ppmに減少した.窒素については27ppmから2.78ppmへ、リンは3.96ppmから0.01ppmへと減少した.特にリンの除去はほぼ完璧といえる.膜分離法の研究は始まったばかりであり、未知の点が多く残されているが、汚水処理に付き物の熟練を要しないで高度処理が簡単にできるという長所がある。
ヒト科における「妊娠しにくさ」の進化～野生チンパンジーのメスの過剰な性行動の研究

ヒトに最も系統的に近いチンパンジーにみられる「妊娠しにくい」形質の進化の解明のため、ウガンダ共和国カリンズ森林保護区に生息する野生チンパンジーを対象に、直接観察によるメスの性行動のデータと、ヒト用妊娠検査キットを用いた妊娠時期の判定とをあわせて分析した。さらに、妊娠検査キットによる妊娠判定を一歩進め、2009年度より尿や糞試料によるホルモン分析の予備調査を行った。これまでの研究により、チンパンジーが1回の出産のために数百回から千回以上の交尾を行うことがわかっている。なぜこれほどまで多くの回数の交尾を行うかという理由としては、これまで様々な仮説が提唱されてきているが、未だ解決はみていない。本研究では、メスのチンパンジーの性行動、遊動・採食行動、生まれた子どもの生存率を調べて、1)1回の出産のために要する月経サイクル数と交尾の回数、2)早期流産の頻度と妊娠しにくさの関係、3)交尾行動や生涯産子数にかかわるコスト、4)不妊期間中の多数回交尾によってもたらされるベネフィットについて明らかにするものである。平成19年度においては、4月から現地調査員による調査を開始した。メスの性的状態をモニターするために、発情の指標となる性皮の状態をチェックし、尿を採取しヒト用の妊娠検査キットで妊娠の有無を確認した。また、GPSを用いて遊動を記録し、1 hour party法によって一緒にいる個体を記録した。さらに、メスが発情をした場合には、調査対象メスの行った交尾すべてについて、時間と相手個体名、交尾に先立つ誘いかけや接近などの行動、交尾後の毛づくろい、どちらが先に立ち去ったかなどについて記録した。平成19年12月および平成20年2月には,橋本が現地に行き、調査を行うとともに、日本人研究者が不在の間に現地調査員がとったデータを確認し、彼らの調査方法についてもチェックした。データはすべて持ち帰り、古市が分析を行った。平成20年度においては、前年度に引き続き4月から現地調査員による調査を開始した。平成19年6月には,橋本が現地に行き、調査を行うとともに、日本人研究者が不在の間に現地調査員がとったデータを確認し、彼らの調査方法についてもチェックした。平成21年度においては、前年度に引き続き4月から現地調査員による調査を開始した。