hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
間欠的低酸素曝露によるがん細胞の放射線抵抗性獲得の分子メカニズムの解明

近年、その生物学的作用が注目されている間欠的低酸素について、以下の成果を得た。間欠的低酸素前処理を行うことで、腫瘍細胞の放射線抵抗性が上昇した。間欠的低酸素に曝露することで、活性酸素種ROSの産生と低酸素誘導因子HIF-αの発現誘導が増強され、細胞内レドックス状態の変化と低酸素適応応答シグナル経路が活性化していることが示唆された。間欠的低酸素処理によって、放射線感受性の高いS期初期に分布する細胞数の減少と感受性の低いG2期細胞の増加が起こっていることを明らかにした。近年、放射線感受性の低い腫瘍内には、周期的に低酸素-再酸素化サイクルを繰り返す間欠的低酸素領域が存在し、治療抵抗性や浸潤・転移など腫瘍悪性化に強く寄与している事が明らかとなってきた。本研究の目的は、間欠的低酸素が腫瘍細胞の放射線感受性に与える影響を明らかにし、その原因を探索することである。平成23年度では、1時間の低酸素と30分の再酸素化を6回繰り返すことで、最も腫瘍細胞の放射線抵抗性が増強した。また再酸素化の回数を増やす毎に、活性酸素種ROSの産生と低酸素誘導因子HIF-1alphaの発現誘導が増強され、細胞内レドックス状態の変化と低酸素適応応答シグナル経路が活性化していることが示唆された。平成24年度では、実際のC6グリオーマ細胞内に間欠的低酸素が存在するか否かを免疫組織化学にて検討した。pimonidazoleおよびEF5という二種類の低酸素マーカーを間隔をあけて投与することで、6時間に変化した低酸素領域を描出することに成功した。加えて、間欠的処理後の細胞の細胞周期をPI染色およびリン酸化ヒストンH3に対する免疫染色を行うことで、間欠的低酸素処理によって、放射線感受性の高いS期初期に分布する細胞数の減少と感受性の低いG2期細胞の増加が起こっていることを明らかにした。以上、本研究実施期間を通じて、実際の腫瘍において起こりうる間欠的低酸素は、再酸素化に伴う活性酸素種の増加と腫瘍細胞の細胞周期調節を介して放射線抵抗性を高めていることが明らかとなった。これらの結果は、間欠的低酸素の治療標的としての重要性を意味するだけでなく、今まで一括りに考えられてきた低酸素のより複雑な生物学的作用を示唆するものである。これまで一般的に治療抵抗性に関わっているとされる腫瘍内低酸素は、慢性的な低酸素であったが、近年、未成熟な血管が原因で起こる血流の鬱滞や閉塞による短時間で変動する間欠的な低酸素領域が存在することが明らかとなってきた。本課題の目的は、間欠的低酸素が腫瘍細胞の放射線抵抗性に及ぼす影響とその機構についてin vitroおよびin vivoの両面から明らかにすることである。23年度では、低酸素の長さ、頻度ならびに回数を精査することで、最も細胞の放射線抵抗性を増強する条件を検討した。その結果、1時間の低酸素と30分の再酸素化を6回繰り返すことで最も放射線照射後の生存率は向上し、良い再現性も得られた。また間欠的低酸素に特徴的な現象として、再酸素化に伴う活性酸素種(ROS)生成が考えられるため、各サイクルで回収した細胞におけるROS産生量をその特異的プローブである2,7-dichlorodihydro flurescein diacetateにより定量した。その結果、再酸素化の曝露回数が増える毎に、細胞内ROS量の増加が観察された。このROS産生の上昇によって抗酸化関連因子の活性化が起こっている可能性が考えられたため、細胞内のスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)の活性を検討した。間欠的低酸素に曝された細胞でSODの活性が上昇している傾向が明らかとなった。これまでの実験により、間欠的低酸素による放射線感受性制御機構を明らかにする上で重要なin vitroでの実験条件が整備され、ROSの産生とそれに伴う細胞内レドックス状態の変化が起こっていることが示唆された。この目的の達成のため、二ヶ年を通して、(1)様々な程度・頻度の間欠的低酸素による獲得される放射線抵抗性の比較、(2) in vitro実験系における放射線抵抗性関連遺伝子の発現解析と活性酸素種(ROS)による制御機構の検討、(3) in vivo実験系における放射線抵抗性関連遺伝子の発現解析を行う。従って、(1)に掲げた目標が達成された。

次に、(2)の目的に関して、各再酸素化サイクルで回収した細胞におけるROS産生量をその特異的プローブである2,7-dichlorodihydro flurescein diacetateにより定量した。その結果、再酸素化の曝露回数が増える毎に、細胞内ROS量の増加が観察された。加えて、このROS産生の上昇によって抗酸化関連因子の活性化が起こっている可能性が考えられたため、細胞内のスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)の活性を検討した。間欠的低酸素に曝された細胞でSODの活性が上昇している傾向が明らかとなった。従って、(2)に掲げた目的のうち、ROSによる制御機構の関連が示唆され、一部その目標を達成できたと考えられる。24年度の実験については、本課題の目的に沿って、まずin vitro実験系における放射線抵抗性獲得に関する制御機構に対するレドックス状態の寄与についてより詳細に明らかにし、また関連遺伝子の発現解析を行う。さらに、in vivo実験系における放射線抵抗性関連遺伝子の発現解析と各種治療後の応答について検討する。23年度の実験結果から、間欠的低酸素の暴露により、活性酸素種(ROS)の上昇が観察された。この現象が、細胞の放射線感受性に関与しているかを明らかにするため、N-acethyl cysteineなどの各種抗酸化剤で処理した際の影響について明らかにする。また、ROSの産生により、細胞内グルタチオンレベルが変化している可能性が示唆されるため、処理後の細胞について解析を行う。またPCRアレイを用いて、細胞内レドックス機構に関連するたんぱく質の遺伝子発現を網羅的に明らかにする。大気条件および慢性低酸素条件に比較して、有意に変化する遺伝子を明らかにできれば、そのたんぱく質発現の検討および特異的阻害剤/siRNAによる阻害実験を行い、その標的たんぱく質の関与を明らかにする。またこの応答が、実際の腫瘍内で起こっているかを明らかにするために、ラットグリオーマおよびマウス扁平上皮がんの移植腫瘍を作成し、間欠的低酸素の組織上での可視化と標的たんぱく質の発現分布の重ね合わせを行う。具体的には、低酸素プローブであるPimonidazoleとEF5を時間差で投与することで間欠的低酸素領域を同定した上で、連続切片上で標的たんぱく質の発現を免疫染色により確認する。その相関関係を明らかにすることで、標的たんぱく質の阻害治療が放射線や制癌剤の治療効果を向上できうるかを検討する。当初23年度に実施予定であったPCRアレイを用いた遺伝子発現評価に関して、その解析に必要となるリアルタイムPCR装置の導入が遅れたために遂行できなかった。そのため、予算計画に計上していたPCRアレイキットの購入を先送りし、相当する額の研究費を24年度の研究に使用する。この次年度使用研究費の使途としては、未検討であるin vitroの実験におけるPCRアレイキットの購入と、得られた結果を裏付けするためのたんぱく質発現評価のための抗体の購入費として使用する。
NOによる内耳障害機構の解明と治療法の開発に関する分子生物学的研究

本研究は今回の研究は内耳障害の発現機構をフリーラジカル(NO、活性酸素)との関連から分子生物学的レベルで解明すると供に、内耳感覚細胞の障害過程の各々の段階を阻害、修飾することで、めまい、難聴の新たな治療法の開発を行う目的とした。内耳障害の発現に際しては、内耳障害性の刺激により内耳でNOやROSというフリーラジカルが産生され、内耳が障害を受けること、それに引き続き感覚細胞がアポトーシスを起こし死んでいくこと、その時にアポトーシス関連因子であるカルパイン、カスパーゼが感覚細胞で発現するというメカニズムが解明された。これらの機構は広く内耳障害全般に共通するものであることが明らかとなった。このことを基礎にして、内耳障害軽減方法の開発のために、フリーラジカル、ニューロトロフィン、アポトーシス関連酵素の阻害などによる内耳障害の軽減作用について検討した結果、フリーラジカルの制御、アポトーシスの制御、ニューロトロフィンの投与、いずれもが内耳障害軽減効果を有し、その程度はほぼ同等であることが明らかとなった。さらに、各種薬剤の併用効果を検討した結果、フリーラジカルの制御+ニューロトロフィンの投与、フリーラジカルの制御+アポトーシスの抑制といった作用機序の異なる組み合わせで併用効果が上がることがわかった。これらの結果を基にコントロール不良のメニエール病の治療に抗酸化剤(ビタミンC、グルタチオン、レバミピド)を応用した結果、めまいの制御は84%、聴力の改善は44%と良好な結果を得ることができた。これらの成果は第23回日本炎症再生医学会、第10、11、12回日本耳科学会、第59,60,61回日本めまい平衡医学会、37th Workshop on Inner Ear Biology、第20回日本耳鼻咽喉科免疫アレルギー学会、第64回耳鼻咽喉科臨床学会で発表されると共に19編の論文にまとめられた。本年度は内耳障害とフリーラジカル、特にNOとの関連について検討し、DAF-2DAを用いたin vitroの実験で正常動物でもGM、LPSの刺激により内耳でNOが産生されること、内耳障害動物では正常動物に比べて有意に大量のNOが産生されることが確認された。さらにこれらのNOの産生はNOS阻害剤、MK801で阻害され、内耳障害の発症にはNOに加えて、グルタミン酸を介したexcitotoxicityが強く関係していることが明らかとなった。続いて、内耳障害の治療と薬剤投与時期に関する検討で一旦生じた内耳障害に関しても障害発生後早期の段階でNOS阻害剤を投与することにより内耳障害を回復させることができることを証明した。また、内耳でのNO産生部位のより詳細な検討のため、DAF-2DAとアルデヒド固定を併用した新しい組織学的手法を開発した。さらに、臨床的にメニエール病患者12名にフリーラジカル消去剤を投与し、治療効果を検討した。その結果、めまい、聴力に関して有意な治療効果をあげることができ、内耳障害の発現にはフリーラジカルが強く関連しており、フリーラジカルを制御することで内耳障害の新しい法の開発が可能なことが強く示唆された。これらの結果は37th Workshop on Inner Ear Biology、第10回日本耳科学会、第59回日本平衡神経科学会で報告するとともに、4編の論文、1編の著書にまとめられた。本年度は内耳障害軽減方法の開発のために、各種薬剤による内耳障害の軽減作用とその機序について検討した。末梢前庭器でのNO、ROSの産生と各種薬剤による影響をin vitroの系で検討した結果、GM刺激により感覚紳胞、血管でNO、感覚細胞でROSが産生された。

各種薬剤の効果について、L-NAMEはNOの産生をほぼ完全に阻害したが、ROSの産生には変化は認められなかった。これに対して、D-methionineやBDNFは、ROSの産生を半分程度に抑制したが、NOの産生は増加した。また、leupeptinの投与ではNO、ROSの産生に変化は認められなかった。また、LIVE/DEADsystemを使用し、GMによる感覚細胞生存率の低下に及ぼす各種薬剤の影響を比較した結果、GM投与4時間後で19±22.9%に低下した生存率が、L-NAMEを添加することで56±12.0%、D-methionineで56±24.6%、BDNFで63±20.4%、leupeptinで61±9.9%と有意に軽減されたが、各種薬剤間での差は認められなかった。薬剤の併用効果ではL-NAMEとBDNFの同時併用では生存率は92±4.1%、L-NAME+leupeptinで80±18.5%、D-methionine+BDNFでは80±11.1%と相乗効果が認められ単独投与群より優れた結果であった。これに対してL-NAME+D-methionineでは53±25.4%、BDNF+leupeptinで61±14.9%と相乗効果は認められなかった。以上のことより、内耳障害の軽減にはフリーラジカルの制御に加えてアポトーシスの制御も必要なことが明らかとなった。これらの結果は第11回日本耳科学会、第60回日本めまい平衡医学会、第20回日本耳鼻咽喉科免疫アレルギー学会で報告するとともに6編の論文、1編の著書にまとめられた。本年度は内耳障害軽減方法の開発のために、フリーラジカル、ニューロトロフィン、アポトーシスと内耳障害との関連について検討した。その結果、内耳障害の発現には内耳障害性刺激により内耳から、フリーラジカルが産生され、感覚細胞がアポトーシスを起こし死んでいくこと、その時にアポトーシス関連因子であるカルパイン、カスパーゼが感覚細胞で発現することが明らかとなり、フリーラジカルの制御やカルパイン、カスパーゼを阻害することで内耳障害が軽減されることが明らかとなった。また、ニューロトロフィンの作用の一部はフリーラジカルの産生を抑えて感覚細胞の障害を軽減することが明らかとなった。これらの結果をもとに各種薬剤の感覚細胞障害軽減効果を検討した結果、フリーラジカル(NO、活性駿素)の制御、アポトーシスの制御、ニューロトロフィンの投与、いずれもが内耳障害軽減効果を有し、その程度はいずれも同等であることが明らかとなった。さらに、各種薬剤の併用効果を検討した結果、フリーラジカルの制御+ニューロトロフィンの投与、フリーラジカルの制御+アポトーシスの抑制といった作用機序の異なる紀み合わせで併用効果が上がることがわかった。これらの結果を基にコントロール不良のメニエール病の治癒に抗酸化剤(ビタミンC、グルタチオン、レバミピド)を応用した結果、めまいの制御は84%、聴力の改善は44%と良好な結果を得ることができた。これらの成果は第23回日本炎症再生医学会、第12回日本耳科学会、第61回日本めまい平衡医学会で発表されると共に6編の論文にまとめられた。
三元金属集積体の合理的合成と分子磁性体への展開

本研究は研究計画に記載していた以下の2つの内容に沿って行った。1.有効イオン半径認識能を利用した3d-4f混合金属錯体の合理的合成法の確立2.ランタノイドイオンを含む分子磁性体の磁気光学効果の研究1については当初予定していた二種類の新規二核化配位子の合成に成功し、戦略通り一段階反応で3d-4f異種金属錯体を得ることができた。この結果からβ-ジケトンおよび2,6-ジアシルピリジンサイトはそれぞれ3d金属イオンと4fイオンの有効イオン半径を認識することができる配位サイトとして有用であることが分かった。また、これらの錯体の磁気測定から3d-4fイオン間の磁気的相互作用についての知見を得ることができた。2についてはf-f遷移を持たない[Ni_2La(L)_2][Fe(CN)_6]二次元磁性体と鋭いf-f遷移を持つ[Ni_2La(L)_2][Fe(CN)_6]二次元磁性体について極低温域でのMCDの測定を行ったところCN基からFeへのLMCTに起因する吸収帯が観測されたが、f-f遷移由来の吸収帯はほとんど見られないことが分かった。これはf-f遷移の振動子強度が非常に小さいためだと考えられる。f-f遷移由来の磁気光学効果を観測するにはLMCTのない磁性系で観測することが必要であると予想された。現在、LMCTが比較的弱いと予想される[Co_2Ln(L)_2][Cr(CN)_6]三次元磁性体が得られ、系統的に磁気特性評価を行った。今後、この系において磁気光学効果の測定を行う予定である。また、研究課題である分子磁性体への展開という点においては、様々な化合物の合成に成功した。特に[Ni_2Ln(L)_2][Fe(CN)_6]二次元磁性体および[Co_2Ln(L)_2][Cr(CN)_6]三次元磁性体の系においては、Lnイオンの系統的変換を行うことができ、Lnイオンの種類によって磁気構造が変化することが明らかとなった。また、Lnイオンの種類に応じて磁気相転移温度や保磁力を制御することができた。[Co_2Ln(L)_2][Cr(CN)_6]三次元磁性体においては15.4Kの磁気相転移温度を持っており、PrussianBlue類縁体の値を上回っており、3d-4f系の分子磁性体としては世界最高の値を持っていた。これらの研究結果は、6月10日6月13日にストラスブール(フランス)で開催されたE-MRS2003、7月27日8月1日にローマ(イタリア)で開催されたICM、9月24日26日に山形大学(山形市)で開催された錯体化学討論会において成果報告し、海外でも高い評価を得た。

これらの研究結果は、6月10日6月13日にストラスブール(フランス)で開催されたE-MRS2003、7月27日8月1日にローマ(イタリア)で開催されたICM、9月24日26日に山形大学(山形市)で開催された錯体化学討論会において成果報告し、海外でも高い評価を得た。
骨粗鬆症の成因に関する性ホルモンとインターロイキン(lL)の相互作用

骨粗鬆症の発生に及ぼす性ホルモンサイトカンの相互作用の研究成果について報告する。2.IL-4投与時の骨組織学的計測;上記1-(2)の実験系で大腿骨の骨組織学的計測を行なってみると、IL-4は破骨細胞(TRAP陽性細胞)の数と表面積を有意(p<0.05)抑制した。この結果、IL-4の骨吸収抑制作用は破骨細胞形成抑制によるものである。3.IL-4に骨芽細胞(HC3T3-E_1)に対する作用;IL-4は容量依存的に骨芽細胞のDNA生合成、培養液中のIGF-1産生を増加した。IL-4はPTHで刺激した骨芽細胞中のAI-Pの活性の上昇を完全に抑制した。このことはIL-4は骨芽糾胞の増殖に対して促進的に、分化に対しては抑制的に作用している。またIL-4はPTHによるcAMPの産生を抑制し、IL-4はPTHによる骨芽細胞の分化および作用に抑制的に作用する。4.骨芽細胞(MC3T3-E_1)のアンドロゲンレセプター(AR);MC3T-E_1組織のARを酵素抗体法、Northernblot,Western blotで証明した。またアンドロゲンとの結合は核分画、サイドゾール分画の両方にみられた。エストロゲンレセプターについては現在検討中である。1.IL-4の骨汲収抑制作用(in vivo);lL-4ミニポンプでマウスに注入し血清Caを測定。(1)正常マウス:IL-4(5μg/日)3日間投与は血清Ca値に変動は与えなかった。(2)PTH-rP(1-34)、2.4μg,3日間投与による高Ca血症をIL-4は容量依存的に低下させ,IL-4(5μg/日投与)はPTH-rPの高Ca血症を完全に抑制した。(3)IL-1,PTH-rP産生癌細胞(EC-G1)担癌ヌードマウスの高Ca血症(19.6±2.7mg/dl,SD)は,IL-4(7μg/日)投与5日目に12.9±2.5mg/dlと低下した。この結果,IL-4はin vivoでも骨吸収刺激因子の作用を抑制し骨吸収に対し抑制的に作用する。1.ILー4のマウス骨芽細胞(MT3T3ーE_1)への作用:(1)DNA生合成( ^3HTd取り込み)、培養液中へのIGFー1産生はILー4により容量依存性に増加。(2)ILー4はPTHにより増加する細胞のAlーP活性および培養液中のcーAMP産生を容量依存性に抑制した。以上より、ILー4はMT3T3ーE_1細胞の増殖に対しては促進的に、細胞の分化に対しては抑制的に作用する。2:マウス器官培養系での骨吸収活性(Raiszの方法)に及ぼすILー4の影響。(1)同assay系での^<45>Ca放出はILー1で促進、ILー4で抑制された。(2)ILー1、IFNーγ、PTH_rP、PGーE_1、PGーE_2、1、25(OH)_2 D_3で促進した^<45>Caの放出はILー4で容量依存性に抑制された。この事は、種々のサイトカインが骨吸収促進的に作用するのに対し、ILー4は骨吸収抑制に作用する。3:In vivoでのILー4の作用:(1)ILー4(0ー5μg/日投与)は正常マウスは血中Caに変化は与えなかったが、PTH_γP投上マウスの高Ca血症を容量依存性に抑制した。(2)ヌ-ドマウスに高Ca血症発症癌を移植し、高Ca血症モデルマウスに作製(血清Ca19.2±2.7mg/dl,n=7)。

このマウスに浸透圧ミニポンプでILー4を7μg/日投与すると血清Caは有意に低下し、3日目に13.9±2.9mg/dl,5日目12.9±2.5mg/dlと低下した。(3)同マウスの骨吸収の組織学的計測では破骨細胞の数、osteoclastic surfaceはILー4の投与で減少した。以上よりin vivoにおいてもILー4は骨吸収を抑制することが判明した。4:マウス骨芽細胞(MT3T3ーE_1)のアンドロゲンレセプタ-の証明:(1)同細胞アンドロゲンレセプタ-のmRNAの発現が証明された。同細胞のアンドロゲンレセプタ-の証明は初めての事である。以上のデ-タを現在論文として発表準備中1.IL-4の骨芽細胞(MC3T3-E_1)への作用平成2年に引き続きIL-4の骨芽細胞への作用を検討した。骨芽細胞はマウス頭蓋骨より樹立された骨芽細胞様細胞株(MC3T3E_1)を使用した。IL-4は培養MC3T3-E_1細胞の^3HTd摂取を容量依存的(0.04,0.2,1.0,5.0ng/ml)に亢進した。また、同細胞からのIGF-1産生を刺激した。PTHはIGF-1産生を増加するが、IL-4とPTHと同時投与ではIGF-1の産生は相加的であった。IL-4はPTHで刺激した骨芽細胞中のAI-Pの活性の上昇を完全に抑制した。このことはIL-4は骨芽細胞の増殖に対して促進的に、分化に対しては抑制的に作用している。またIL-4はPTHによるcAMPの産生を抑制し、PTHによる骨芽細胞の分化および作用に抑制的に作用する。2.骨芽細胞(MC3T3-E_1)のアンドロゲンレセプター(AR)についての検討(1)免疫組織化学的検討:ARのポククロナールレセプター抗体を用いた。AR核を中心に顆粒状に染色された。分裂期には核内の染色消失した。
量子包絡代数と量子包絡超代数の表現論

山根はアフィン超リー代数をシュバレー生成元と定義関係式で書き下すセール型の定理を与えた。そのアフイン量子超代数についても同様のことを行った。さらにA型アフイン超リー代数についてはそれをドリンフェルド生成元と定義関係式でも書き下した。アフィンリー代数のときとは違ってアフイン超リー代数の定義関係式はかなり複雑である。しかしながらアフィン超リー代数とアフィン量子超代数の定義関係式をくらべることによってアフィン超リー代数とアフィン量子超代数のヴァーマ加群のウェイト空間の次元が同じであることがわかる。R=C[s^<±1>,t^<±1>]を2変数ローラン多項式環とする。Dをsl(2|2)の普遍中心拡大とする。dimD/sl(2|2)=2である。D(R)=D【cross product】R【symmetry】Ω_R/dRがsl(2|2)【cross product】Rの普遍中心拡大である。D(R)有限個の生成元{E_<±α>, E_<±α^*>|α∈П'}と有限個の定義関係式で書きくだすことが出来た。このことをおこなった過程においてD型アファインスーパーリー代数D^<(1)>=D【cross product】C[t^<±1>]+Ccを有限個の生成元{E_<±α>|α∈П'}と有限個の定義関係式で書きくだすことが出来た。自然な写像D(R)→sl(212)(R)の核の基底を生成元{E_<±α>,E_<±α>士。*|α∈II'}で記述するのは容易でありこのことよりsl(2|2)(R)を有限個の生成元{E_<±α>, E_<±α^*>|α∈П'}と無限個の定義関係式で書きくだすことが出来る。永友は頂点作用素代数の表現論を展開し,その応用として共形場理論に関わる問題の研究をおこなった.研究成果の一つである共役電荷オービフォールド模型の既約表現の分類は,中心電荷が1以上の共形場理論の発展に重要な寄与をする.また,そのほかの研究成果である保型形式,あるいは擬保型形式を構成する相関関数の方法は,保型形式の専門家からの注目を集めている.山根はアフィン超リー代数をシュバレー生成元と定義関係式で書き下すセール型の定理を与えた。永友は頂点作用素代数の表現論を展開し,その応用として共形場理論に関わる問題の研究をおこなった.研究成果の一つである共役電荷オービフォールド模型の既約表現の分類は,中心電荷が1以上の共形場理論の発展に重要な寄与をする.また,そのほかの研究成果である保型形式,あるいは擬保型形式を構成する相関関数の方法は,保型形式の専門家からの注目を集めている.A型岩堀Hecke代数H_n(q)は各q∈Cに対して定義されているn!次元C-代数である。q=1のときH_n(1)はn次対称群S_nの群環CS_nとなる。qが0でないか1の巾根でないとき(このようなqをgeneric元とよぶ)、H_n(q)はCS_nと同型なC-代数である。qがgenericでないときは一般にはH_n(q)の表現論はCS_nのそれとは全く違ったものになる。

H_n(q)の表現論は数理物理や低次元トポロジー等への応用があり、そのためにもH_n(q)の既約表現の指標(以下、既約指標と呼ぶ)を計算することが重要である。CS_nの既約指標を得る方法として、中山-Murnaghan公式が知られている。qがgenericのとき、H_n(q)の既約指標に対する中山-MUrnaghan型公式はRamによって得られている。今年度の主結果はqが1のべき根のときのA型岩堀-Hecke代数Hn(q)の(k,r)-図形表現の中山-Murnaghan型公式を構成したことである。任意の複素数qにたいしてn次元の複素代数Hn(q)が定義されていて、qは連続パラメターである。Hn(1)はn次対称Snの複素群環CSnである。この意味でHn(q)はCSnのqアナログーである。Hn(q)がCSnと複素代数として同型となる必要十分条件はqが1であるか2【less than or equal】r【less than or equal】nにたいしてq^r≠1であることが知られている。本来の中山-Murnaghan公式はCSnの既約表現の共役類の指標値を計算する為の公式である。CSnの既約表現達はn個の箱のYoung図形達と1対1に対応する。このとき中山-Murnaghan公式は共役類にあらわれる巡回置換の位数と同じ数からなるYoung図形の連結な縁をある重みをつけながら巡回置換の個数だけYoung図形がなくなるまで引き抜いてその重み達をかけ合わせて全ての引き抜き方についてそれを実行しかけ合わせた重みを足しあげれば共役類の指標値が得られるというものである。qが0でもなく1のべき根でもないときはHn(q)の中山-Murnaghan型公式は上記の「連結な縁」を「連結とは限らない縁」に変えて重みも変えればよいきとがRamによって示された。今年度の主結果はqが1の原始r乗根のときに(k,r)-条件と呼ばれる条件をみたすYoung図形に対応してWenzlの構成したHn(q)の既約表現の中山-Murnaghan型公式が上記の「連結とは限らない縁」を「連結とは限らない縁にいくつかの1個の箱の連結な縁達をくっつけたもの」に変え重みも変えればよいことが示したことである。Hn(q)の表現論はA型量子包絡超代数Uqの自然表現のテンソル積表現の分解に役に立つことが期待されるので今後はそのことについて研究を進めたい。またB型についても同様の研究を進めていきたい。私の本年度の主な研究結果は私が以前行った研究に少し間違いが見つかった為にそれを修正した事です。それは以下のとおりです。(A(1,1)^<(1)>)^HをA(1,1)型超リー代数に対応するアフィン超リー代数とします。A(1,1)の自然な中心拡大としてsl(2,2)があります。しかしsl(2,2)にも中心拡大が存在し、そのなかでも最大の中心拡大はD(2,1;-1)です。この様な事情により(A(1,1)^<(1)>)^Hの自然な中心拡大として(sl(2,2)^<(1)>)^Hがあり、(sl(2,2)^<(1)>)^Hの最大の中心拡大はD(2,1;-1)^<(1)>です。この結果、(sl(2,2)^<(1)>)^Hについても無限個の定義関係式が必要です。これを有限個でよいとしてしまったのが私の間違いです。本年度に私は以前とは別の方法で(sl(2,2)^<(1)>)^H及び(A(1,1)^<(1)>)^Hの定義関係式を求め直し、それを論文にまとめ投稿しました。その内容は以下のとおりです。(A(1,1)^<(1)>)^Hには2つのDynkyn図形があります。私は両方のDynkyn図形に対する定義関係式を求め直しました。
非小細胞性肺癌におけるRB遺伝子の発現異常とプロモーター領域のメチル化

【目的】非小細胞性肺癌におけるRB異常を知るために、RB遺伝子のLOH、点突然変異に加えて、RB蛋白の過剰リン酸化やRB遺伝子のプロモーター領域のメチル化によるRB遺伝子の異常発現の有無を検索した。【方法】1.RBのイントロン1、17、25の3カ所の個人多型とイントロン21領域のミニサテライトを検索してLOHの有無を判定した。2.RB遺伝子のエクソン12-23領域の塩基配列をオートシークエンサーで決定した。2.E2E1、リン酸化RB蛋白を免疫染色で検討した。4.ゲノムDNAをbisulfite modificationにより化学修飾し、PCRで増幅した後COBRA法によりメチル化の有無を検索した。また、増幅産物のシークエンスによりメチル化の有無を確認した。【結果】1.E2F1の過剰発現:RB異常の指標として免疫染色により、E2F1の過剰発現の有無を検索した。33例の非小細胞性肺癌のうち14例(42%)がE2F1陽性であった。2.RB遺伝子のLOH:33例中30例(91%)がinformative caseで、そのうち13例(43%)がLOHを示した。LOH陽性例はE2F1過剰発現例に多かった(P<0.05)。3.RB遺伝子の変異:33例中21例を検索したが、変異は認められなかった。4.リン酸化RB蛋白の過剰発現:リン酸化RBの免疫染色では33例中9例(27%)が陽性であり、この過剰発現例は、E2F1の過剰発現例と相関した(P<0.05)。5.RB遺伝子のCpGアイランドのメチル化LK-2、Calu-1の2種の非小細胞性肺癌株を用いて検索したが、いずれの培養細胞でもメチル化は認められなかった。【考察】非小細胞性肺癌の発生において、RB遺伝子の点突然変異やプロモーター領域のDNAのメチル化は関係なく、RB異常はRB遺伝子のLOHとリン酸化RB蛋白の異常発現によると考えられる。【目的】非小細胞性肺癌の発生におけるRB遺伝子のLOH、点突然変異に加えて、遺伝子の発現を抑制するプロモーター領域のDNAのメチル化によるRB遺伝子の異常発現の有無を明らかにすることである。今回、33症例の非小細胞性肺癌(扁平上皮癌17例、腺癌16例)について、正常肺組織と肺癌組織から抽出したゲノムDNAを用いて、RB遺伝子のLOHと変異の解析を行った。【方法】1.RB遺伝子のLOHの検索:(1)PCR-RFLP : RBのイントロン1,17,25のpolymorphismを含む領域をPCRで増幅し、それぞれBamHI, XbaI, DraI制限酵素を作用させ、アガロース電気泳動後正常組織と癌組織とのパターンを比較してLOHの有無を判定した。(2)PCR-VNTR:(CTTT)nの繰り返し配列を有するRBのイントロン21領域をPCRで増幅し、アガロース電気泳動後正常組織と癌組織とのパターンを比較してLOHの有無を判定した。2.RB遺伝子の変異の検索:RB遺伝子のエクソン12-23領域の塩基配列をオートシークエンサーで決定し、変異の有無を判定した。【結果】1.RB遺伝子のLOH:ゲノムDNAがheterozygosityを示すinformative caseは30例(91%)で、扁平上皮癌が15例(88%)、腺癌が15例(94%)であった。Informative caseのうち13例(43%)がLOHを示し、扁平上皮癌は7例(47%)、腺癌は16例(40%)であった。2.RB遺伝子の変異:33症例中21例(扁平上皮癌11例、腺癌10例)を検索したが、変異は認められなかった。

5.RB遺伝子のCpGアイランドのメチル化LK-2、Calu-1の2種の非小細胞性肺癌株を用いて検索したが、いずれの培養細胞でもメチル化は認められなかった。【考察】非小細胞性肺癌の発生において、RB遺伝子の点突然変異やプロモーター領域のDNAのメチル化は関係なく、RB異常はRB遺伝子のLOHとリン酸化RB蛋白の異常発現によると考えられる。
結晶水が形成する二水素結合の挙動に関する高温高圧中性子回折による解析

本研究では、高圧中性子回折を用いて二水素結合物質の精密構造解析を行い、高圧下における二水素結合の挙動や、それが構造や反応性に与える影響を明らかにすることを目的としている。NH3BH3とNaBH4・2H2Oの二種類の二水素結合物質について、予めダイヤモンド・アンビル・セル(DAC)を用いた粉末X線回折(XRD)実験で予備実験を行った後、パリ-エジンバラ・セルを用いJ-PARC BL11で中性子回折実験を行った。NH3BH3は約30 GPaまでのXRD実験で、従来報告されていた圧力誘起相転移(1.5 GPaと8 GPa)のほかにも相転移(約13 GPa)を確認し、さらに高圧でのアモルファス化(約25 GPa)を初めて観測した。ND3BD3も同様の挙動を示し同位体効果は認められなかった。ND3BD3の中性子回折実験を約7 GPaまで行い、常圧の水素間距離(約2.2A)が1 GPaで約2.0Aにまで縮むことが分かった。また、1.5 GPaでの最初の圧力誘起相転移では、ND3BD3分子の配列する角度が変化し、一部の水素間結合距離が約2.2Aに広がることが確認された。これらは、二水素結合を有する物質の水素間距離が2.0Aを限界値とし、分子の圧力誘起再配列が起きたことを示唆している。一方NaBH4・2H2Oは、約11 GPaまでのXRDでは約4.5 GPaでNaBH4とH2O(ice-VII)に分解した。分解生成したNaBH4は、ice-VIIの存在とは無関係に6 GPaと7 GPaで従来報告されている圧力誘起相転移を起こした。除圧課程では逆反応が起こり、約3 GPaで再びNaBH4・2H2Oが生成した。一度分解した結晶水含有物質が圧力依存で再合成されることは興味深い。近くNaBD4・2D2Oの中性子回折実験を行い、その詳細を明らかにする予定である。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、J-PARCの高温高圧中性子回折ビームラインを用いて、構造中の結晶水が二水素結合を形成する水素化物や比較物質の精密構造解析を行い、高温高圧下における結晶水と二水素結合の挙動、それが物質の構造や反応性に与える影響を明らかにし、水素が生み出す未知なる物質ダイナミクスの解明に寄与することを目的としている。しかし、2011年3月11日に発生した東日本大震災の影響により、J-PARCでの高圧中性子回折実験が全くできなかった。そのため予備実験として、高エネルギー加速器研究機構放射光科学研究施設(KEK-PF)の高圧ビームラインで、結晶水を持たない二水素結合物質であるNH_3BH_3およびND_3BD_3の高圧X線回折実験を行った。NH_3BH_3は約50GPaまで室温高圧実験を行った。従来報告されていた圧力誘起相転移のほかにも相転移と思われる構造変化を確認し、さらに高圧でのアモルファス化を初めて観測した。これは、高温高圧下で未知の新たな構造があることを示唆している。中性子回折実験で使用するND_3BD_3も同様の実験を行い、基本的に同じ結果を得た。水素や水の高圧相図は同位体効果があり相転移の温度・圧力条件が異なるが、NH_3BH_3についてはその影響は考慮する必要がないことが明らかになった。実験手法上の知見としては、NH_3BH_3は微細試料を得るのが簡単ではなく、リードベルト解析に耐え得る回折リングターンを得ることが困難だった。これは、試料の量がはるかに多くなるとはいえ、中性子回折実験に際しても起こりうる問題であり、十分な試料調整が重要であることが示唆された。

一方NaBH4・2H2Oは、約11 GPaまでのXRDでは約4.5 GPaでNaBH4とH2O(ice-VII)に分解した。分解生成したNaBH4は、ice-VIIの存在とは無関係に6 GPaと7 GPaで従来報告されている圧力誘起相転移を起こした。除圧課程では逆反応が起こり、約3 GPaで再びNaBH4・2H2Oが生成した。一度分解した結晶水含有物質が圧力依存で再合成されることは興味深い。近くNaBD4・2D2Oの中性子回折実験を行い、その詳細を明らかにする予定である。24年度が最終年度であるため、記入しない。中性子回折実験に全く着手できなかったことにより、全体の進行が遅れている。しかし、X線回折による予備実験は順調に進んでいる。J-PARCでの中性子回折実験が可能になるまでに、X線回折による予備実験を完了させるとともに、結晶水を持つ二水素結合物質NaBH_4・2H_2Oの実験を優先する。高圧中性子回折ビームライン「PLANET」以外での高圧中性子回折実験の可能性を探る。
歯周病原細菌の感染と歯科インプラントの安全性に関するコホート研究

口腔細菌感染症への配慮が少ない中で口腔インプラント治療が行われている状況が多い。そのため,潜在性の口腔感染(歯周病等)が口腔インプラント治療の予後に与える影響は大きいものと考えられる。このことを明らかにするための臨床研究案を策定した。「歯周病原性菌に対する血漿IgG抗体価検査を取り入れた口腔インプラント施術前後10年間にわたる感染評価」という研究案を作成し,口腔細菌叢変化の包括的検討法も樹立した。口腔細菌の感染症への配慮が少ない中で,口腔インプラント治療が行われている状況である。したがって,この感染によってもたらされるインプラント周囲炎を予防するために,インプラント周囲を含む口腔全体の細菌叢の管理が重要な因子となる。この検証のために多施設参加型マルチセンター型コホート研究を計画し,昨年度には「口腔インプラント施術予定患者を対象とした,歯周病原細菌に対する血漿IgG抗体価検査を取り入れたインプラント施術前後10年間にわたるインプラント評価」という研究デザイン企画案を作成した。今年度は,これを元にして研究デザインを具現化するために,種々の観点から臨床研究プロトコールとして完成させるために,幅広く情報を収集してきた。その際には,健康医療評価研究機構での「臨床研究の道標」に沿った検討を重ねた。この検討によって理想的な臨床研究デザインを構築した一方で,研究期間,調査対象者数,費用と労力,さらには導き出される効果に関しても,歯周病および口腔インプラントの治療に関係する者との間で検討を重ねた。その結果,パイロットスタディでの結果を示すことによって,研究賛同者を得るために説得するデータを必要とすることがわかった。一方で,この観点から小規模な調査研究を実施している若手研究者と交流を重ねた。歯周病が原因で歯を喪失した患者で,口腔インプラント治療を勧められたあるいは口腔インプラント治療を受けた患者では,歯周病原細菌の感染の'検査に興味ある者が存在することが分かった。特に,口腔インプラント周囲炎を起こしている患者では,その希望が強かった。以上のことから,比較的少数の機関によるマルチセンター研究であっても,口腔インプラントの予後に関する安全性を知るために,歯周病原細菌の検査に興味がある患者を集め易いことが分かった。今後は,研究デザインを変更して,臨床研究を実施することになる。近年,口腔インプラント治療が著しく増加している。一方で,歯周病罹患の自覚がない患者が多い中で,歯周病専門医等の歯周病の診断と治療に精通した歯科医師の割合が少ない状況である。そのため,歯周病原細菌をはじめとする口腔細菌の感染症への配慮が少ない中で口腔インプラント治療が行われているといっても過言ではない。口腔インプラントの予後を左右するインプラント周囲炎を予防するためには,インプラントを含む口腔内の細菌学的管理が重要である。そこで我々は,日本歯周病学会が主導して周囲の関連学会(公益社団法人日本口腔インプラント学会および日本口腔検査学会)と連携した多施設参加型マルチセンター研究を構築するための研究計画を企画した。平成23年の1年間,日本歯周病学会の研究委員会委員が日本口腔インプラント学会の学術委員会委員長と,今後の両学会間での研究連携のあり方について協議し検討した。現在の口腔インプラント術前検査とメインテナンス期における検査指標には,一般的に歯周組織検査とエックス線画像検査が用いられる。そこで,インプラント周囲炎を予防するために,さらに,歯周病原細菌感染度検査が必要と考えた。従って,インプラント施術前後の歯周病原細菌感染度を指標にした長期間追跡調査が必要である。今年度,「口腔インプラント施術予定患者を対象とした,歯周病原細菌に対する血漿IgG抗体価検査を取り入れたインプラント施術前後10年間にわたるインプラント評価」のコホート研究デザイン企画案を提案できた。「口腔インプラント施術予定患者を対象とした,歯周病原細菌に対する血漿IgG抗体価検査を取り入れたインプラント施術前後10年間にわたるインプラント評価」のコホート研究デザイン企画案を提案できた。これを,日本歯周病学会と岡山歯学会で発表し,関連する歯科学研究者の意見を得た。今後は,提案した「口腔インプラント施術予定患者を対象とした,歯周病原細菌に対する血漿IgG抗体価検査を取り入れたインプラント施術前後10年間にわたるインプラント評価」のコホート研究デザイン企画を元に,日本歯周病学会と日本口腔インプラント学会が連携する計画案として完成する。さらに,パイロット研究を開始する。日本歯周病学会と日本口腔インプラント学会が連携する計画案として完成する。さらに,両学会および岡山大学内でパイロット研究を開始する。
EBウイルス潜伏感染の維持における膜蛋白質LMP2Aの機能

EBウイルス(EBV)がコードする膜蛋白質LMP2Aは生体内の潜伏感染Bリンパ球で発現が確認された唯一のウイルス遺伝子産物であり、EBV潜伏感染の維持に機能している可能性が考えられる。Bリンパ球は特異抗原刺激(=膜免疫グロブリン架橋)により活性化され抗体産生細胞に分化する。この活性化刺激に伴いBリンパ球に潜伏したEBVも活性化されることがバーキットリンパ腫細胞を用いた実験により明らかとなっている。LMP2AはこのBリンパ球の活性化を阻害することが実験的に示され、その結果EBVの潜伏状態維持に働いている可能性が示唆されている。EBVの潜伏感染維持におけるLMP2Aの機能を明らかにするために、昨年までの研究でLMP2AをノックアウトしたEBVを作製して、主にバーキットリンパ腫由来Akata細胞を用いて解析をおこなってきた。今年度は、末梢血Bリンパ球へのEBV感染系を用いて解析を行った。EBVによるBリンパ球不死化効率は野生株EBVとLMP2AノックアウトEBVで差が無かった。野生株EBVで不死化したリンパ球ではLMP2Aが強く発現していたが、LMP2AノックアウトEBV不死化リンパ球ではLMP2Aの発現を認めなかった。野生株で不死化したリンパ球では膜免疫グロブリン架橋によるEBV産生がほとんど起こらなかったが、LMP2AノックアウトEBV不死化リンパ球では15%の細胞にEBV産生が誘導された。以上の結果はLongneckerのグループと同様で、EBV不死化リンパ球においては、LMP2Aが潜伏EBV活性化阻止に働いていることを示している。次いで、EBV株間でのLMP2Aの違いを明らかにするために、AkataEBVのLMP2A部分の塩基配列を決定し、すでに報告されているB95-8EBVのLMP2Aと比較した。B95-8株と比べて3ヶ所の塩基に違いがあり、その結果3ヶのアミノ酸に違いを生じていた。しかし、膜免疫グロブリン架橋によるシグナルをブロックするのに重要とされている2ケ所のITAMモチーフは両ウイルス株で保存されていた。従って、LMP2Aの機能については両EBVで違いが無いことが明らかとなった。EBウイルス(EBV)潜伏感染細胞に普遍的に発現しているEBV膜蛋白質LMP2Aについての解析を行った。Bリンパ球に潜伏感染しているEBVは膜免疫グロブリンを抗Ig抗体で架橋することにより活性化され、EBV複製が誘導される。LMP2Aはこの活性化を阻止することが報告されているが、今回の検討でB95-8株、Akata株の両EBV共に、LMP2Aを強発現させた時にはこの活性を有していることを明らかにした。さらに相同組換えによりLMP2AノックアウトEBVを作製し検討した。LMP2AノックアウトEBVを感染させたAkata細胞において、SIg架橋によるカルシウム動員、ウイルス産生の程度は野生型EBVを感染させた時と同程度で、LMP2Aを強発現したときのようなカルシウム動員阻止、EBV誘導阻止は認められなかった。LMP2AはEBV感染細胞に普遍的に発現するが、その発現レベルには細胞毎に違いがある。一般にin vivoでは発現レベルはAkata細胞と同様低レベルで、一方in vitroでトランスフォームしたリンパ球では高レベルである。

LMP2AがEBVの活性化を阻止するひとはLMP2Aを高発現しているトランスフォームリンパ球を用いて得られた知見で、今回の我々の結果は、in vivoで見られる程度のLMP2Aの発現ではEBVの活性化を阻止しないことを示している。EBウイルス(EBV)がコードする膜蛋白質LMP2Aは生体内の潜伏感染Bリンパ球で発現が確認された唯一のウイルス遺伝子産物であり、EBV潜伏感染の維持に機能している可能性が考えられる。Bリンパ球は特異抗原刺激(=膜免疫グロブリン架橋)により活性化され抗体産生細胞に分化する。この活性化刺激に伴いBリンパ球に潜伏したEBVも活性化されることがバーキットリンパ腫細胞を用いた実験により明らかとなっている。LMP2AはこのBリンパ球の活性化を阻害することが実験的に示され、その結果EBVの潜伏状態維持に働いている可能性が示唆されている。EBVの潜伏感染維持におけるLMP2Aの機能を明らかにするために、昨年までの研究でLMP2AをノックアウトしたEBVを作製して、主にバーキットリンパ腫由来Akata細胞を用いて解析をおこなってきた。今年度は、末梢血Bリンパ球へのEBV感染系を用いて解析を行った。EBVによるBリンパ球不死化効率は野生株EBVとLMP2AノックアウトEBVで差が無かった。野生株EBVで不死化したリンパ球ではLMP2Aが強く発現していたが、LMP2AノックアウトEBV不死化リンパ球ではLMP2Aの発現を認めなかった。野生株で不死化したリンパ球では膜免疫グロブリン架橋によるEBV産生がほとんど起こらなかったが、LMP2AノックアウトEBV不死化リンパ球では15%の細胞にEBV産生が誘導された。以上の結果はLongneckerのグループと同様で、EBV不死化リンパ球においては、LMP2Aが潜伏EBV活性化阻止に働いていることを示している。次いで、EBV株間でのLMP2Aの違いを明らかにするために、Akata EBVのLMP2A部分の塩基配列を決定し、すでに報告されているB95-8 EBVのLMP2Aと比較した。B95-8株と比べて3ヶ所の塩基に違いがあり、その結果3ヶのアミノ酸に違いを生じていた。しかし、膜免疫グロブリン架橋によるシグナルをブロックするのに重要とされている2ヶ所のITAMモチーフは両ウイルス株で保存されていた。従って、LMP2Aの機能については両EBVで違いが無いことが明らかとなった。
自己免疫疾患関連遺伝子ZFAT及びZFATに制御される免疫疾患関連遺伝子群の解明

ZFAT遺伝子は魚類からヒトに至るまで高度に保存された遺伝子であり、発生初期に不可欠な遺伝子であることが明らかとなった。ZFATは正常T,B細胞および白血病細胞株で発現しており、ZFAT機能解析からアポトーシス制御機構に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。ZFAT-DNA相互作用解析では、網羅的な基礎データの創出を行い、ZFATの転写制御に関するネットワーク解明への基盤を構築した。I.ZFAT・TR-ZFATの機能解析:ZFATは1243アミノ酸からなる18個のC2H2タイプのZn-fingerモチーフを有し、N末側にAT-hookを持つ転写制御因子であると推定され、ZFATのスプライシングバリアントであるtruncated form(TR-ZFAT)は11個のZn-fingerモチーフを有し846アミノ酸からなる蛋白をコードする。(1)ZFATに対する抗体作製:モノクローナル抗体作製系を構築し、ZFAT, TR-ZFATに共通なモノクロナール抗体を複数クローン樹立した。それらがウェスタンブロット、免疫沈降法などで抗原を認識することを確認した。またポリクローナル抗体も作製した。(2)TGマウス、KOマウスの樹立・解析:ZFAT, TR-ZFATのトランスジェニックマウスを樹立し、コロニーを拡大させている。KOマウスに関しては、KOコンストラクトの作製、ES細胞へのトランスフェクションを経て、相同組換えクローンを取得した。(3)ZFATに制御される遺伝子群の同定:B細胞株にZFAT, TR-ZFATを強制発現するクローンを複数個樹立し、発現アレイ解析を行った。ZFAT、TR-ZFATにより発現制御される遺伝子として興味深い免疫系遺伝子群が同定された。そのうちの約20個の遺伝子についてZFAT強制発現による発現レベルの変動を定量PCRで確認した。更にZFATに直接的に制御される遺伝子群の同定の試みとして(i)PCR-assisted bindingselection法を行い、ZFATの候補標的配列を同定し、(ii)更に(2)で作製した抗体を使用してのクロマチン免疫沈降実験を開始した。ZFAT(18個のC_2H^2型zinc-finger motifと1個のAT-hook motifを含む)は自己免疫性甲状腺疾患(AITD)の感受性に関与する分子として同定されたものであり、その構造から転写因子と考えられる。ZFATネットワークの解明のために、発現アレイ解析とZFAT-DNA相互作用解析を柱とする解析を実施し、以下のような研究成果を得た。I.発現アレイ解析の確立とZFAT候補標的遺伝子群の同定:発現アレイ解析を、Affymetrix GeneChipシステムで稼働させ、発現アレイ解析システムを確立させた。ZFATを過剰発現させたマウスpro-B細胞株(BaF3)とコントロール細胞(BaF3)と比較した結果、発現差1.5倍以上(P<0.1)を示す遺伝子を、ZFAT過剰発現株で221個同定した。Gene ontology解析により、これらの遺伝子群には免疫関連遺伝子が高頻度に含まれることを見出した。(1)ZFATのDNA結合性:PCR-assisted bindingselection法で、マウスZFATのN末端側断片でのDNA結合活性を見出し、T配列に富む6種類の候補標的配列を同定し、更にうち2つの配列は上記ZFATタンパク断片と相互作用することを、レポーターアッセイ系で確認した。(2)ZFAT標的ゲノム部位同定のためのChIP法の条件検討:独自に樹立した抗ZFATモノクローナル抗体(11クローン)について、ChIP法でのクロマチン変性処理後の抗原認識能についてIP-western法で評価し、ChIP法に利用できると考えられるモノクロナール抗体を同定し、BaF3細胞を材料にChIP法を行い沈降DNAを得ることに成功した。ZFAT(18個のC_2H_2型zinc-finger motifと1個のAT-hook motifを含む)は魚類からヒトに至るまで高度に保存された遺伝子であり,自己免疫性甲状腺疾愚(AITD)の感受性に関与する遺伝子として同定されたものであり,ZFATは,その構造から転写因子と考えられる。本研究は,培養細胞レベルおよび正常マウス、遺伝子改変マウス由来の免疫担当細胞レベルにおいて,ZFATにより発現制御される遺伝子群を同定し,さらに,ZFATが結合するDNA領域をゲノム上より同定することにより,ZFAT-ネットワークを解明することを目的とする。本年度は以下のような研究成果を得た。(1)ZFATタンパクはマウス組織においては,胸腺,脾臓,リンパ節の免疫組織において特異的に発現し(骨髄に発現は認められない),その発現はmRNAのパターンとは異なり,主にB,T細胞に観察され,単球系にはほとんど認められないこと,胸腺ではDP-T細胞以降の分化段階で強発現することを,樹立したポリクローナル抗体で明らかにした。(2)ZFATトランスジェニックマウス個体由来の免疫担当細胞を対象とした発現アレイ解析を行い,発現変動遺伝子群を対象にしたパスウェイ解析を実施した結果,ZFATは免疫系においてはTCR,BCR,サイトカインシグナリング等に関連する分子の発現変動を誘導すること,および,DNA複製、DNA修復、細胞周期に関連する遺伝子群の発現を変化させることが示唆された。

(3)樹立した抗モノクロナールZFAT抗体について,ChlP法でのクロマチン変性処理後の抗原認識能についてIP-western法で評価し,最も好成績を収めた抗体を使用して,ChIP-chip解析を開始した。また,より効率的にChIPできる抗体取得のために新たに抗ZFAT抗体の作成を開始した。ZFAT遺伝子は18個のC2H2型zinc-finger motifと1個のAT-hook motifを含む1237アミノ酸残基の転写関連因子様タンパクをコードし、魚類からヒトに至るまで高度に保存された遺伝子である。ZFATを軸とした免疫系転写ネットワークの解明のために、ZFAT機能解析およびZFAT-DNA相互作用解析を柱とするネットワーク解析を開始し、以下のような研究成果を得た。(1)ZFAT機能解析:ZFATが発現している白血病細胞株MOLT4の系においてZFATの機能解析を進めた。siRNAによるZFAT発現抑制時では細胞増殖率の低下、Sub-G1期の増加およびアポトーシス陽性細胞数の増加(アネキシンV染色)が認められた。さらにcaspase3の亢進が認められ、caspase阻害剤Z-VADにより細胞増加率の低下は完全に解消されたことから、ZFATのアポトーシス制御分子としての機能が示唆された。(2)ZFAT-DNA相互作用解析:C57BL/6由来CD4^+T細胞のin vitroTCR刺激により、T細胞の芽球化に一致してZFAT発現量が一過性に亢進することを見出した。また、変性ZFAT蛋白をよりよく免疫沈降させる抗ZFAT抗体の樹立を試みた結果、M16抗体を樹立することに成功した。この免疫沈降能の優れたM16抗体を用いて、マウスCD4^+T細胞のin vitroTCR刺激後のZFAT発現量亢進時のChIP-chip解析によりZFAT-DNA相互作用部位の同定を試みた。複数回のChIP-chip解析を行い、候補領域(候補領域近傍遺伝子)を同定した。ZFAT相互作用標的遺伝子として、アポトーシス、転写関連遺伝子等を含む候補遺伝子を取得した。