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胎児頻脈性不整脈に対する経胎盤的抗不整脈薬投与の薬物血中濃度による評価

胎児頻脈性不整脈の治療によるDXおよびSTの経胎盤的投与を導入された入院対象患者32例を解析した。臍帯血/母体血の平均薬剤移行率はDX(16例)67.6%、ST(7例)73.9%であった。DX濃度(26例)は推定クレアチニンクリアランス(Ccr)と相関を示さず(P=0.18)、血清クレアチニン(Scr)とは相関傾向(P=0.06)、投与量と相関を示した(P<0.001)。ST濃度(12例)はCcr、Scrと相関を示さず、投与量と相関を示した(P=0.04)。胎児心拍数は薬物療法導入から対数近似的に速やかに低下した。対象症例をさらに集積し、胎児頻脈性不整脈治療の保険診療の承認申請を予定している。初年度の研究統括者の所属変更や事務局担当者変更などとともに、平成24年6月に胎児頻脈性不整脈に対する経胎盤的胎児治療の臨床試験において有害事象の発生を受けて、倫理委員会にて研究計画の変更によって研究継続が平成24年8月に承認された。倫理委員会に諮る事案の発生を受けて、経胎盤的抗不整脈薬投与の薬物血中濃度評価対象者のエントリーが遅延し、当初の研究計画どおりの研究対象者の登録数を満たすことは出来ていないが、2年目において8例の登録が完了している。現在のところ、ジゴキシン投与により、ジゴキシン血中薬物濃度は最小血中濃度0.6ng/mL最大血中濃度2.7ng/mLの範囲でモニタリングされ、倫理委員会へ報告された1例を除き、ジゴキシン濃度の2ng/mLを超える症例においても胎児頻脈性不整脈に対する経胎盤的胎児治療の有用性が示されていると考えられる。ソタロール投与症例においては、投与範囲が大きく、20mg160mg/日で投与されており、投与量決定因子となる血中濃度との関連性が現在のところ明確でないため、さらに精査する必要がある。患者間でジゴキシン血中濃度の範囲は広く、症例集積とともに投与量決定に影響する変動要因を精査することが、非常に重要である。過去2年間で研究協力者の所属変更や重篤な有害事象の発生など倫理委員会へ諮る必要事項が多く、研究の進捗状況は遅れていた。平成25年度は研究開始から3年目に至り、症例収集がある程度順調に進み、14例が集積されてた。母体のジゴキシン血中濃度は、血清クレアチニンからの腎機能と母体のジゴキシンクリアランスの解析シュミレーションの検討を実施している。投与量は初回導入プロトコールよりも血中濃度による調整によって、若干減量されることが通常であり、0.75mg/dayから0.25mg/dayの投与量まで投与量の範囲が広く認められたが、通常の患者よりはクリアランスは高い結果となると思われる。ソタロール投与は7症例集積され、母体血および臍帯血のソタロール血中濃度を測定し、胎児移行率を検討した。蛍光検出器によるHPLC法測定で、LC/MS/MSよりも感度は劣るが、治療域濃度と思われる範囲においては十分に検出可能であった。平均母体ソタロール血中濃度538±422 ng/mL,平均臍帯血ソタロール血中濃度322±270 ng/mL,平均ソタロール血中濃度移行率0.61±0.35 %であり、投与量の高低に一致して母体ソタロール血中濃度の高低も得られていたが、心電図のQT、HRとの相関および生化学検査値との相関は認められていなかった。当初の研究計画における症例収集予定数よりは少なく、さらに症例の集積が必要である。胎児不整脈における抗不整脈薬の血中濃度の解析指標として医療薬学系学会へ発信することを模索中である。高度医療として認められた胎児頻脈性不整脈に対する経胎盤的胎児治療の臨床試験に沿って、経胎盤的投与における抗不整脈薬の胎児頻脈性不整脈に対する有効性、安全性を母体の薬物血中濃度の指標から薬力学的、薬物動態学的評価分析を実施するための研究実施計画内容を共同施設に周知することを平成23年4月より準備した。しかし、同5月に研究事務局の担当者変更があり、同8月にフレカイニド投与における安全性評価による指摘によってフレカイニド投与プロトコールの変更が必要となった。同9月に研究打ち合わせを実施し、薬物血中濃度の測定環境の準備を実施することとなった。経胎盤的胎児治療の統括研究者が国立循環器研究センター周産期科から三重大学医学部附属病院産科婦人科教授へ所属変更となり、経胎盤的胎児治療について倫理委員会へ再度、諮ることとなった。薬物血中濃度測定実施施設である近畿大学薬学部においては、同12月に研究計画変更の倫理委員会の承認を得た。しかし、統括研究者の変更だけでなく薬物療法安全性管理担当である薬剤部長も異動となったため、経胎盤的胎児治療臨床研究事務局である国立循環器研究センターでの倫理委員会の承認が平成24年6月となる見通しである。以上の事由により、経胎盤的抗不整脈薬投与の薬物血中濃度評価対象者のエントリーが遅延し、当初の10例を満たすことはできなかったが、これらの手続きが完了し、数症例のエントリーデータを整理することは平成24年6月より可能である。

平成24年6月から通常通りの研究対象者のエントリーが実施され、薬物血中濃度の指標から薬力学的、薬物動態学的評価分析を実施するためのデータ収集が可能である。平成26年度までで症例収集は32例となった。ジゴキシン単独で効果が認められた症例は15例であり、14例がソタロールとジゴキシンが併用投与されており、その中で1例がフレカイニドとジゴキシンの併用投与へ移行した。ソタロール単独投与患者は3例であったが、その中で1例がフレカイニドへ変更投与となった。昨年度から症例集積は順調であるが、平成27年度で最終目標である50症例の収集のために、対象患者のエントリー漏れのないように留意が必要である。ジゴキシン血中濃度は1ng/mL以上およびソタロール血中濃度は1001000ng/mLで概ね推移していた。臍帯血への移行率もバラつきが有り、胎児移行性の個体間変動と有効性との関連および安全性についても検討が必要である。フレカイニドの投与症例は有効性が認められているが、症例数がまだ、2例と少ないことから、有効薬物血中濃度を母集団として解析することは現段階では難しいため、該当症例が集積されることを期待する。ジゴキシン単独およびソタロールの併用およびフレカイニドの投与を必要とするさまざまな事例が混在することから、投与薬剤の種別のみならず、薬物血中濃度、母体、胎児の状態との相関関係に現在、著明な関連性は認められていないが、投与経過日数とともに胎児頻拍数の減少が認められていることから、ある一定の薬物血中濃度を維持することによって有効性が高まる可能性が示唆される。胎児頻脈性不整脈をジゴキシンの追加適応症として検討する予定があるが、詳細な症例の比較検討が重要である。高度医療として認められた胎児頻脈性不整脈に対する経胎盤的胎児治療の臨床試験に沿って、経胎盤的投与における抗不整脈薬の胎児頻脈性不整脈における母体の薬物血中濃度の指標から薬力学的、薬物動態学的評価を集積された登録症例32例において解析を実施した。頻脈性不整脈は上室性頻拍short VA type11例、long VA type3例および心房粗動18例であった。ジゴキシンによる胎児治療導入後、速やかに胎児心拍数低下を認めている症例(上室性頻拍short VA type30%、心房細動56%)と頻脈改善反応が認められない症例は第2,3選択薬のソタロールあるいはフレカイニドの使用へ移行した。ジゴキシンによる頻脈改善反応の有無の2群におけるジゴキシントラフ血中濃度に有意差は認められなかった(P=0.84)。F=0.7としてPEDA-VBで解析したジゴキシンパラメータは解析可能症例26例において、解析時投与量0.52±0.23mg/day、解析時トラフ血中濃度1.39±0.55ng/mL、半減期37.4±8.9 hr、クリアランス0.166±0.037 L/kg/hrであり、トラフ値との有意な相関は、投与量(p<0.001)と血清クレアチニン(p=0.058)であった。ソタロールは投与量(p=0.043)のみ有意な相関が認められた。臍帯血と分娩時母体血中濃度から推定胎児移行率はジゴキシン73.1±27.5%、ソタロール74.0±31.2%であった。最終目標として適応拡大および禁忌取り扱いの見直しを学会から申請する予定であり、最終研究計画年次は超えるが、高度医療申請時における50症例を集積して、その解析データをもとに最終的に有効性・安全性評価を実施する。胎児頻脈性不整脈の治療によるDXおよびSTの経胎盤的投与を導入された入院対象患者32例を解析した。臍帯血/母体血の平均薬剤移行率はDX(16例)67.6%、ST(7例)73.9%であった。
貴金属‐磁性金属ナノ構造体の創製と触媒への応用

一般に還元電位差の大きい金属同士の合金化や、還元されにくい磁性金属の異方成長は困難であるが、形状異方性をもつニッケルナノ粒子、スズ-鉄ナノ粒子、スズ-ニッケルナノ粒子を創製した。さらに、機能材料への応用として、スズ-鉄ナノ粒子をリチウムイオン二次電池の負極活物質に応用した。その結果、鉄マトリックスとの複合化、および空隙やくぼみをもつ構造体が、充放電における微粉化によるサイクル劣化を防止できることを見出した。これまでにPdナノ粒子の触媒作用により、Ni錯体単独では熱分解されない温和な条件で還元され、PdNi合金ナノ粒子が生成することを見出した。温和な反応条件下では、特定の結晶面に結合する保護層存在下で結晶成長速度の差が顕著になり、異方成長が促進される。そこで、形状異方性ナノ結晶表面には保護層の疎な角や稜線が存在すること、磁性金属と貴金属との還元電位差が大きいことを利用して、形状異方性磁性金属ナノ結晶をテンプレートとして、結晶面選択的なガルバニ置換反応で、窪みや突起、内部に空孔を持つ貴金属ー磁性金属ナノ構造体を創製する。本年度は、コアとなる形状異方性をもつ磁性金属ナノ結晶を合成することを目的とした。具体的には、特定の結晶面を保護し成長を抑制する保護剤存在下、Pdナノ粒子の触媒作用により磁性金属錯体を温和な条件で還元させた。前駆体としてNi錯体のみを用いた場合は、熱還元温度が210°C以上必要であったが、Ni錯体とPd錯体を共存させた場合、160180°Cの温和な反応条件下で還元反応が進行した。異方成長を促進することが期待される配位子として、アルキルアミン、アルキルカルボン酸、トリオクチルホスフィンオキシド、トリアルキルホスフィン等の組み合わせや比率を検討した。その結果、粒子径10 nmで突起をもつポッド状粒子やコアの粒子径が100-300 nmで突起(直径10nm、長さ50-100 nm)をもついがぐり状粒子が生成する反応系を見出した。形状異方性ナノ結晶表面には保護層の疎な角や稜線が存在すること、および2種類の金属の還元電位差があることを利用して、形状異方性ナノ結晶をテンプレートとして、結晶面選択的なガルバニ置換反応で、窪みや突起、内部に空孔を持つ二元金属ナノ構造体を創製することを目的としている。本年度は、化学還元法によりポリマーで保護された球状および立方体の形状を有するスズナノ粒子を合成した。そこへ、鉄塩を加えて反応させることによりスズナノ粒子へ鉄が拡散し、鉄-スズ合金ナノ粒子(FeSn2)が得られた。鉄とスズの仕込み比を変化させても、FeSn2が形成されたことから、熱力学的に安定な結晶構造であることが示唆された。透過型電子顕微鏡像より、鉄-スズ合金ナノ粒子(FeSn2)は、立方体やロッド状であり、内部に空孔を有する粒子も含まれていた。スズナノ粒子にニッケル塩を加えて同様に反応させたところ、立方体やロッド状、球状のナノ粒子(10-100 nm)が得られた。粉末X線回折より、スズと種々の金属間化合物(Ni3Sn4, Ni3Sn, Ni3Sn2)を含有しており、仕込み比を変化させても、同様の結果となった。これらの二元金属ナノ粒子を負極活物質として、液系のリチウムイオン二次電池へ応用するため、スラリー分散のための溶媒やバインダー選定、導電助剤の選定、分散方法の検討、塗工するための固形分濃度の調整を行い、Al箔上に塗膜が形成できることを確認した。また、本負極シートを用いてコインセルを作製し、充放電可能であることを確認した。棒状や立方体、空孔など形状異方性をもつスズ-ニッケル、スズ-鉄複合ナノ構造体を創製し、リチウムイオン二次電池の負極活物質としての応用を検討することを目的とした。リチウムイオン二次電池用の負極活物質として高容量をもつスズは、体積膨張・収縮が激しくスズが微粉化されることでサイクル劣化起こる。本研究課題で創製したスズ-鉄二元金属ナノ構造体は空孔など形状異方性をもち、充放電に寄与しない鉄が骨格となるナノ構造体を活物質とすれば、膨張・収縮を緩和することができ、サイクル特性の向上が期待される。そこで、スズ-鉄二元金属ナノ構造体、および、比較としてスズナノ粒子をリチウムイオン電池の負極活物質として評価した。スズナノ粒子を負極活物質として用いた場合、35サイクル目で放電容量が急激に低下したが、スズ-鉄二元金属ナノ構造体を用いると、35サイクル目でも高い放電容量を示した。初期充電で形成される鉄マトリックスによって微粉化が防止されたと推察される。一方、初期クーロン効率(CE)と初期放電容量は、スズナノ粒子を用いた方が良好であった。初期クーロン効率の低下は、ナノ粒子表面の酸化被膜の還元に起因すると考えられ、スズ-鉄ナノ構造体の方が、比表面積が高く酸化被膜の割合が高いことが原因と考えられる。以上のように、鉄マトリックスとの複合化、および空孔やくぼみをもつ構造体にすることで、充放電における微粉化によるサイクル劣化を防止できることを見出した。

一般に還元電位差の大きい金属同士の合金化や、還元されにくい磁性金属の異方成長は困難であるが、形状異方性をもつニッケルナノ粒子、スズ-鉄ナノ粒子、スズ-ニッケルナノ粒子を創製した。さらに、機能材料への応用として、スズ-鉄ナノ粒子をリチウムイオン二次電池の負極活物質に応用した。その結果、鉄マトリックスとの複合化、および空隙やくぼみをもつ構造体が、充放電における微粉化によるサイクル劣化を防止できることを見出した。スズナノ粒子へ鉄が拡散することで、内部に空孔をもつFeSn2二元金属ナノ構造体を合成した。同様にニッケルを反応させることで、スズ-ニッケル合金ナノ粒子が得られたが、様々な組成の金属間化合物が混在する結果となった。リチウムイオン二次電池の負極活物質として知られるスズ系合金をナノサイズ化し、かつ空隙をもつ構造体は、充放電時の体積膨張・収縮を緩和して微粉化を防止できると期待される。そこで、本ナノ構造体がリチウムイオン二次電池の活物質として機能するかを確認するため、集電体へのナノ構造体の塗膜形成方法の検討、およびコインセル作製方法を検討し、充放電測定を行った。その結果、充放電可能であることを確認できたことから、今後の触媒応用への道筋をつけることができた。ナノ粒子、電気化学FeSn2二元金属ナノ構造体のサイズ制御や空孔率の向上を目指す。サイズ制御は、反応温度、反応時間、保護剤となるポリマーの添加量や分子量について検討する。また、空隙率は、鉄塩の滴下速度、滴下時の温度、反応時間について検討する。得られたFeSn2二元金属ナノ構造体は、リチウムイオン二次電池用の負極活物質として放電容量やサイクル特性、レート特性を評価し、形状、サイズ、空孔率の影響を調べる。本年度は、コアとなる形状異方性をもつNiナノ結晶を合成することを目的とした。種々、検討の結果、突起をもつポッド状Niナノ粒子やいがぐり状Ni粒子が生成する反応系を見出した。突起をもつことから比表面積が高く、触媒への応用が期待できる。次年度使用額(残金)が少なく、必要物品を購入できなかったため。H26年度は、形状異方性ナノ結晶をテンプレートとして、ガルバニ置換反応でPtを析出させることを計画している。テンプレート表面に保護層が疎な部位(角、稜線)と密な部位(平面)を明確に作り分ける。1本鎖の保護剤を選択すると、アルキル鎖間のファンデルワールス力によりテンプレート表面に緻密にパッキングして角が疎となるため、角で優先的にガルバニ置換反応が進行する。還元電位差が大きいPtとNiの組合せを選択することで、速やかに置換反応が進行する。比表面積の大きいNiナノ結晶は、酸化されやすく、酸化被膜を有する。そこで、保護層が疎な部位で選択的に酸化被膜が除去されるよう、適切な酸強度の有機酸を選択する。ガルバニ置換反応によってテンプレートから溶出するNiイオンと錯形成して安定化させる配位子を選択することで、速やかに反応が進行する。以上を検討することにより、窪みや突起、内部に空孔を持つPtーNiナノ構造体を創製する。上記の方法で合成できない場合は、先に異方成長させたPt-Ni合金ナノ結晶を合成後に、酸化還元電位の低いNiイオンを溶出させ、表面にPtを露出させる方法で、PtーNiナノ構造体の合成を検討する。学会出張費と消耗品で使用予定。触媒活性評価のための装置を購入する予定であるが、初年度(H25年度)は形状異方性をもつ磁性金属ナノ粒子を合成することを目的としており、その触媒活性評価はH27年度を計画していることから、まだ装置の選定基準が定まっていないため。H26年度後半に装置選定を行い、H27年度に購入を進める。
化学修飾によるグラフェン―有機超分子複合体の創製

外周部分に反応活性な三重結合を多数導入したナノグラフェン(GQD-1)を用い,ナノグラフェンのポリマー化と発光性有機化合物の導入による発光特性への影響について検討を行った。主要な研究成果は以下の通りである。1.グラフェン量子ドットの溶解性は置換基により大きく変化することがわかった。2.有機塩基・酸との相互作用により,グラフェン量子ドットの発光色や発光強度が変化することがわかった。これは外部応答性の発光材料につながる成果である。3.ナノグラフェンに複数の異なる機能性有機化合物の導入する手法を開発し、ナノグラフェンのポリマー状集合体の形成に成功した。三種類の形状が異なる有機置換基(第三世代デンドリマー(GQD-2),長鎖アルキル基(GQD-3),POSS(GQD-4))をGQD-1の外周部分に導入し,その影響を調べた。GQD-2-4の合成はGQD-1と有機置換基を5 mol%の[CuBr(PPh3)3]触媒存在下,クロロホルム中室温で攪拌することで行った。精製はアセトン(GQD-2)もしくはヘキサン(GQD-3,4)を展開溶媒に用い,シリカゲルカラムで行った。GQD-3とGQD-4の蛍光スペクトルを測定した。その結果,360 nmの単色光で励起した場合,GQD-3とGQD-4はいずれもGQD-2と同様に白色に発光した。ナノグラフェンが水溶液中で青色に発光することはこれまで報告されてきたが,本研究の様に白色に発光するナノグラフェンの例は殆ど知られていない。次に白色発光の起源を調べるためサイズ分配クロマトグラフィーを用いてナノグラフェンの分画を試みた。その結果,白色発光は発光色が異なるナノグラフェンが混合していることが原因であることを明らかにした。GQD-1-4のLUMO準位3.9 eV程度であることが分かった。n型の有機半導体のPCBMのLUMOが3.7 eV程度であることから,本研究で開発したGQD-1-4は有用な材料へと応用ができる可能性がある。この可能性について現在研究を進めている。HOMO準位はPYSAにより求めた。その結果,おおよそ6 eV程度であることが分かった。またHOMO-LUMOのバンドギャップは2 eVより小さいことも判明した。紫外可視吸収スペクトルの測定からもこのバンドギャップの値が正しいことが支持された。1.ナノグラフェンに様々な有機置換基を導入することができることを明らかにすることができ、当初の目的はおおよそ達成できたため。3.研究成果を学術論文として公表することができたため。グフェンの研究は,主として理論・物性の観点から研究が推進されているが,有機化学及び超分子化学の観点からグラフェンを扱う研究は殆どなされていない。これはグラフェンが有機溶媒に不溶であることが一つの原因である。そのため,グラフェンと有機化合物を有機溶媒中で反応させることが困難である。しかし,グラフェンの表面あるいは外周部分に有機置換基を導入することができれば,グラフェンの持つ電子物性・光学特性に摂動を与えることができるばかりか,グラフェンにはない新しい機能性を付与することが可能である。外周部分に反応活性な三重結合を多数導入したナノグラフェン(GQD-1)を用いることで様々な機能性有機化合物を外周部分に導入することができる。本研究ではこのGQD-1を用い,ナノグラフェンのポリマー化と発光性有機化合物の導入による発光特性への影響について検討を行い,以下の成果を得た。1.ナノグラフェンに異なる機能性有機化合物の導入する手法を開発した。2.芳香環を有する有機化合物を合成し,ナノグラフェンの外周部分の導入することで発光量子収率の向上が期待できることを明らかにした。3.ナノグラフェンの外周部分に超分子的な相互作用が可能な機能性有機化合物を導入することで,ナノグラフェンのポリマー状集合体の形成に成功した。今回の研究の結果,ナノグラフェンのポリマー化の実現に向けて有用な研究成果が得られた。また,外周部分に有機化合物を導入することで,量子収率が変化することを見出した。今年度はこれらの研究をさらに推進していく予定である。有機溶媒に対して親和性の高い有機化合物をGQD-1の外周部分に導入した。これにより得られたナノグラフェン(GQD-2)に有機化合物が導入されたことは核磁気共鳴分光法や赤外線分光法などを用いることで確認した。有機化合物の導入量は,反応に用いる原料の量を調整することで制御できることがわかった。GQD-2の合成と並行して,2-ureido-4(1H)pyrimidinonを合成した。この有機化合物をHuisgen環化反応を行うことによりGQD-2に存在する未反応部分の反応活性部位に導入した。得られたナノグラフェン(GQD-3)中の長鎖アルキル基とureidopyrimidinon誘導体の比率は,合成の際に用いたそれらの比率とほぼ同じであることがわかった。この結果は,一段階の反応で二種類の有機化合物をナノグラフェンの外周部分に同時に導入でき,かつそれらの比率を制御できることを示すものである。GQD-3はureidopyrimidinon同士の水素結合により連結され,その結果重量平均分子量(Mw)が増大するはずである。そこで,GPCによりMwの算出を試みた。

その結果,ureidopyrimidinon誘導体の導入率が最も高いGQDで大きな増加が見られた。これは導入率が高くなると,それだけナノグラフェン同士が連結される可能性が高まったためであると考えられる。上記研究と並行して,様々な有機化合物を合成し,これらをナノグラフェンの外周部分に導入した。Huisgen環化反応を用いて外周部分に導入するのではなく,GQD-1の前駆体である外周部分が酸化されたナノグラフェンと直接反応させることで,これらの有機化合物を導入した。その結果,導入した有機化合物の種類によっては量子収率が変化することがわかった。現在これらのGQDの発光挙動を調査している。グフェンの研究は,主として理論・物性の観点から研究が推進されているが,有機化学及び超分子化学の観点からグラフェンを扱う研究は殆どなされていない。これはグラフェンが有機溶媒に不溶であることが一つの原因である。そのため,グラフェンと有機化合物を有機溶媒中で反応させることが困難である。しかし,グラフェンの表面あるいは外周部分に有機置換基を導入することができれば,グラフェンの持つ電子物性・光学特性に摂動を与えることができるばかりか,グラフェンにはない新しい機能性を付与することが可能である。外周部分に反応活性な三重結合を多数導入したナノグラフェン(GQD-1)を用いることで様々な機能性有機化合物を外周部分に導入することができる。本研究ではこのGQD-1を用い,ナノグフェンのポリマー化と発光性有機化合物の導入による発光特性への影響について検討を行い,以下の成果を得た。1.導入した置換基の種類を変えることでポリマー化とゲル化能の制御を行なった。その結果,導入した置換基によりゲル化能が大きく変化することがわかった。この結果は,ナノグラフェンを基盤とするポリマー開発に役立つものである。2.ナノグラフェンの分割を行い、ナノグラフェンの発光の起原に関する検討を行った。その結果,発光挙動の違いは主としてナノグラフェンのサイズの違いに起因している可能性が高いことが判明した。3.これまでの研究をまとめ、学術論文の執筆および投稿を行った。外周部分に反応活性な三重結合を多数導入したナノグラフェン(GQD-1)を用い,ナノグラフェンのポリマー化と発光性有機化合物の導入による発光特性への影響について検討を行った。主要な研究成果は以下の通りである。1.グラフェン量子ドットの溶解性は置換基により大きく変化することがわかった。2.有機塩基・酸との相互作用により,グラフェン量子ドットの発光色や発光強度が変化することがわかった。これは外部応答性の発光材料につながる成果である。3.ナノグラフェンに複数の異なる機能性有機化合物の導入する手法を開発し、ナノグラフェンのポリマー状集合体の形成に成功した。GQD-1の外周部分には多数の反応部位が存在する。そこで,二種類の有機置換基を導入し,ナノグラフェンを基盤としたポリマー材料の開発を試みる予定である。反応は二段階で行い,第一段階目で有機溶媒に可溶化させるための有機置換基を導入し,第二段階目の反応でナノグラフェン同士を分子間相互作用で連結することができる有機置換基を導入する。一連の反応で得られたナノグラフェンの物性を各種測定で評価し,ポリマーとしての性質を有することを確認する予定である。
『三国志演義』および明清期の「三国志物語」作品の出版システムについての研究

本年度は、研究を進めていく中で『三国志演義』の簡本系テキストである『三国英雄志伝』が清代の出版文化・出版システムについてきわめて重要な問題を持っていることが次第に明らかになってきたため、主としてこれらを中心に研究を進めた。従来知られていなかった『三国英雄志伝』が上海図書館に四種(うち、六巻本二種、残本二種)、東京大学東洋文化研究所に一種、蔵されていることが分かった。これらの『三国英雄志伝』について複写を取り、精密に比較検討を行い、これら五種の版本の特徴・性質、その他の『三国志演義』諸本との相互関係について考察した。その結果、"偽毛宗崗本"とでもいうべき六巻本は数種類現存しているが、それらは必ずしも覆刻を繰り返して成立した関係にはないこと、東洋文化研究所蔵の継志堂本は楊美生本と比較的近い関係にあること、上海図書館蔵の残本二種は楊美生本・魏某本と近い関係にあるけれども、必ずしもそれらを直接の底本にしているのではないことが明らかとなった。本年度の研究における大きな成果は、次の点を明らかにしたことにある。『三国英雄志伝』系統の諸本は、多くが清代になってから、それも康煕年間以降、すなわち毛宗崗本が成立して以降の刊行である。毛宗崗本の流行は道光・咸豊年間以降であるならば、清代初・中期にもっとも流行していた『三国志演義』は『三国英雄志伝』なのである。そして清代以降成立した「三国志物語」作品は、多かれ少なかれ『三国志演義』からの影響を受けているのであるが、それら通俗文学作品に影響を与えた『三国志演義』の版本は必ずしも嘉靖本・余象斗本などの旧来の版本、あるいは毛宗崗本なのではなく、『三国英雄志伝』の系統に属する版本であった。本年度はまず『三国志平話』と『三分事略』を詳細に比較検討することを通して、『三国志平話』の出版システムについての研究を行った。この2つのテキストは同内容ながらも少なからず文字の異同が存在する。そこには『三国志平話』の方が優れている例、『三分事略』の方が優れている例の両様が存在する。よって『三分事略』は時代が下がってからの覆刻本ではあるが、直接『三国志平話』を底本にしたものではない。また『三国志平話』には北方方言の音韻の影響によって文字を誤っていると思われる例が多数存在する。よって『三国志平話』の本文は、北方地域の文化の影響を受けて成立したものである。そして『三国志平話』のような文章をしたテキストは多数存在していて、その中で現存しているものが『三国志平話』と『三分事略』なのであろう。以上のことを「『三国志平話』と『三分事略』」と題する論文において論じた。次に『鼎鐫按鑑演義古本全像三国英雄志伝』(以下、「継志堂本」と称する)と題する『三国志演義』の一版本について検討を行った。この継志堂本は簡本系の英雄志伝グループに属する版本であり、『新刻按鑑演義全像三国英雄志伝』(楊美生本)や六巻本『三国英雄志伝』と比較的近い関係にある。またこの本は清の雍正十二年(1734)に出版されている。雍正十二年といえば、通行本である毛宗崗本がすでに成立している時期である。にもかかわらず継志堂本のような本が出版されていたということは、毛宗崗本の普及は清代の末期になってからなのであり、それまでは『三国英雄志伝』など明代以来の版本が依然として出版され続けていたということを示すものである。以上のことを、「関於継志堂刊《三国英雄志伝》-兼論清代的《三国演義》出版状況-」と題して口頭発表を行った。また論文と執筆し公表する予定である。

そして清代以降成立した「三国志物語」作品は、多かれ少なかれ『三国志演義』からの影響を受けているのであるが、それら通俗文学作品に影響を与えた『三国志演義』の版本は必ずしも嘉靖本・余象斗本などの旧来の版本、あるいは毛宗崗本なのではなく、『三国英雄志伝』の系統に属する版本であった。
標的遺伝子組換えによる血管収縮ペプチド遺伝子欠損マウスの確立と病態解析への応用

本研究においてわれわれは、ジーンターゲティングによるET-1遺伝子欠損マウスの樹立と解析を通して、ET-1の新しい発生学的役割や血圧調節における意義を明らかにしてきた。即ち、鰓弓や心血管系の形成に主要な役割を示す神経堤細胞の発生分化機構において、ET-1が形態形成に重要な上皮-間葉相互作用の介在因子として働いているという仮説を提示し、ホモ接合体の表現型(頭頚部の形成不全+大血管形成不全+心室中隔欠損)とCATCH22やvelo-cardio-facial症候群などの先天性疾患との類似性から、本研究がこれらの疾患の原因遺伝子解明や新しい治療法の開発への手掛かりとなる可能性を示してきた。それとともに、ET-1遺伝子欠損マウスヘテロ接合体において血圧がむしろ上昇することを明らかにし、循環調節機構においてはET-1が単に昇圧因子としてではなく、降圧系も含めて複雑に関与していることを示唆した。これに続き、血圧上昇に加えて呼吸調節やストレス反応性の異常をET-1欠損マウスに見いだし、ET-1の中枢神経機能における役割がクローズアップされてきた。ET-1の病態生理的意義を解明していく上では、これらの解析と同時に、動脈硬化や高血圧などのモデル作成による解析が有用であり、ET-1欠損マウスを用いたこれらの病態モデル作成も現在進行中である。、さらに我々は、ET-1遺伝子プロモーター領域を用いた血管壁選択的遺伝子発現系の確立とこれを用いたET-1過剰発現マウスの樹立に最近成功し、現在その病態解析を進めている。ET-1遺伝子欠損マウスとET-1過剰発現マウスを併せた総合的解析により、ET-1の病態生理的意義をさらに明らかにできることが期待される。我々はマウス胚幹細胞における相同組み換えによりET-1遺伝子に変異を導入し、ET-1遺伝子欠損マウスを樹立した。遺伝子完全欠損型(ホモ接合体)は生下時致死的であったので、対立遺伝子の一方に変異を持つヘテロ接合体における血圧測定からET-1の血圧調節における意義の解析を試み、ホモ接合体の解析からその形態形成における役割を明らかにした。ヘテロ接合体の動脈圧は野生型に比べて約10mmHgほどの高値を示した。この結果は、ET-1が生体内で単純に昇圧因子としてのみ働いているのではなく、生理的な血圧調節においてはむしろ降圧系における働きが大きいのではないかと予想させる。この血圧上昇の解析からET-1の高血圧の病態への関与に関して検討を進めている。一方、ホモ接合体は全例呼吸ができずに死亡し、下顎・耳介・舌など頭頚部に明らかな形成異常を認め、器官形成初期の解析や骨格系の解析などからこれらの異常が鰓弓形成の異常に基づくことが明らかになった。さらに、ET-1は下顎弓の器官培養において舌上皮の発達亢進作用を示し、かつ胎生中期においてET-1 mRNAの発現は鰓弓の上皮細胞に最も著明に認められた。胎生期の発現をさらに詳しく見ると、ET-1は大血管や心流出路の内皮細胞にも発現している。そこでホモ接合体の心血管系を解析すると、特にET受容体拮抗薬や抗ET-1抗体の母体への投与により大動脈弓の異常や心室中隔欠損などの心血管系の形成異常が起こることも明らかになった。ET-1は鰓弓に由来する頭頚部の組織・器官や心血管系の発達において、おそらくはその主要な構成細胞である神経堤由来の上皮性間葉細胞を標的としてその増殖または遊走・分化を促進していると考えられる。これまでET-1は血管作動性物質としてとらえられてきたが、本研究により形態形成因子としての新しい側面が明らかになり、ET-1欠損マウスは先天性心疾患の動物モデルとして、その発症機序の解析に有用と考えられた。平成7年度の研究において、研究代表者らが既に樹立したET-

1欠損マウスのホモ接合体が胎生期の鰓弓・心血管系の形態形成に異常をきたすこと、ヘテロ接合体ではET-1産生の低下に伴って血圧が上昇することから、ET-1の形態形成・循環器疾患の病態における役割について解析してきたが、(1)形態形成に関する研究ではET-1遺伝子欠損マウス胎仔の各種形態形成関連遺伝子のin situ hybridizationによりET-1の下流にある遺伝子の存在が明らかにされ、鰓弓や心血管発生における遺伝子間の相互作用の研究へと大きな展望が開けたこと、(2)血圧上昇に加えて呼吸調節やストレス反応性の異常がET-1欠損マウスに見いだされ、ET-1の中枢神経機能における役割がクローズアップされてきたこと、の2点が大きな進展であった。特に、本研究を通して、鰓弓や心血管系の形成に主要な役割を示す神経堤細胞の発生分化機構において、ET-1が形態形成に重要な上皮-間葉相互作用の介在因子として働いている可能性が明らかにされ、されに、ホモ接合体の表現型とCATCH22などの先天性疾患との類似性から、本研究がこれらの疾患の原因遺伝子解明や新しい治療法の開発への手掛かりとなる可能性がせ示唆された。さらに我々は、ET-1遺伝子プロモーター領域を用いた血管壁選択的遺伝子発現系の確立とこれを用いたET-1過剰発現マウスの樹立に最近成功し、現在その病態解析を進めている。ET-1遺伝子欠損マウスとET-1過剰発現マウスを併せた総合的解析により、ET-1の病態生理的意義をさらに明らかにできることが期待される。
抗原受容体シグナルの空間的制御分子機構

B細胞活性化に必須のアダプター分子BLNKの活性化機構を分子遺伝学的・生化学的・細胞生物学的に詳細に検討することにより、B細胞レセプター(BCR)刺激により、シグナル分子がいかに空間的・時間的に制御されているのかメカニズムを明らかにした。BLNKはリン酸化されることが、より下流のシグナル、特にPLC-γ/カルシウムシグナルの活性化に必須であるが、リン酸化される以前に細胞膜の特殊な領域(GEM分画)にリクルートされることが必須であることを生化学的実験、GFP-タグをしたBLNKを形態学的に追跡する実験により明らかにした。又、この実験系を用いてBLNKのSH2ドメインがGEM分画移行に必須な領域であること更にBLNKにSH2ドメインがリン酸化されたIgαをターゲットにしていることを明らかにした。即ち、BCR→Igαリン酸化→BLNKのリクルートメントにより、初めてBCRシグナルがオンになる。
DR6による末梢免疫細胞制御における分子メカニズムの解明

昨年度、DR6が関与するとされる喘息モデル等に有用なBalb/cマウス遺伝子背景に、CRISPR/Cas9法によりDR6遺伝子単純欠損を導入し、DR6欠損Balb/cマウスの産仔を複数得るに至った。本年度はこれらDR6遺伝子欠損マウスの表現系を解析した。得られた産仔それぞれのゲノム上のDR6遺伝子領域を対象に、DNAシーケンス解析を行った結果、DR6遺伝子の機能的欠損アリルが複数見出された。これらのうち、比較的大きな領域が欠損されていたアリルを2つ、一塩基欠損アリルを1つ選択し、その後の解析に供した。これらのアリルは同一個体において互いにヘテロであったため、次に、それぞれのアリルの分離を試みた。野生型Balb/cマウスとヘテロDR6遺伝子欠損マウスとの交配を行い、各欠損アリルと野生型アリルをもつヘテロ産仔を得た。各欠損アリルにつき兄妹交配を行い、各欠損アリルのホモ個体を得るに至った。得られたホモ個体はいずれも既報の通り、外見的な異常および繁殖能等に異常は認められなかった。次に、各アリルにつきホモ個体同士の兄妹交配をおこない、3つのアリルについて、それぞれを独立にもつ系統として確立した。系統保存を目的に、各系統の一部の個体から受精卵および精子を採取し、凍結保存を行った。一方で、また一部の個体から免疫細胞を採取し、各免疫細胞ポピュレーションにおけるDR6タンパク質発現量をフローサイトメトリー法により行い、それぞれ3つのアリル上の機能欠損によりDR6タンパク質発現が欠損されていることを確認した。当初予定では本年度内にDR6欠損マウスを作成し、解析を終える予定であったが、本学動物実験施設の改修に伴う一時閉鎖のため、DR6遺伝子欠損マウス系統の作成および保存にとどまった。また、本年度末に研究代表者の異動にともない、進捗の遅れが生じた。研究期間を延長し、引き続き計画を進める。計画遂行に当たって必要なすべての研究試料の移動を無事終えており、遂行に支障はない。本研究では、リンパ球の活性化に対して、抑制的な制御を担うと考えられているDeath receptor 6(DR6)が異常活性化T細胞に発現され、異常活性化T細胞を抑制することにより、疾患発症抑制に重要な機能を担う事を明らかにしつつ有る。さらに、DR6により誘導される細胞内シグナルの分子メカニズムと、その是正される作用点を明らかにし、どのようなメカニズムで異常活性化T細胞が形成されるのか、そして、どうすればこれを制御できるのかを明らかにする。本年度においては、ヒトの自己免疫疾患の一つである全身性エリテマトーデスとT細胞上におけるDR6の発現レベルとの相関を、上記疾患自然発症動物モデルを用いて明らかにした。さらに、ゲノムワイドなスクリーニング系を用いて、DR6に特異的に結合する因子としてSyndecan-1を同定し、さらに、Syndecan-1はDR6の機能的シグナル因子として働くことを見出した。また、上記疾患発症におけるSyndecan-1の発現と発症との相関を見出した。さらに、人為的にDR6シグナルを誘導することができる機能性抗体を作出し、上記抗体の投与により、疾患発症を抑制することができる可能性を見い出した。以上の研究成果をまとめ、国際学術雑誌に公表した。また、DR6シグナルの解析に供するin vitro解析用培養細胞株を数種作成、樹立した。平成29年3月より、旭川医科大学へ異動したため、研究環境の立ち上げに若干の進捗に遅れが生じることが想定される。研究実績の概要に記載した通り、DR6と自己免疫疾患との関与を見いだし、機能性抗体を作出し、さらに、DR6シグナルを人為的に操作することにより当該免疫疾患の治療効果を得られる可能性を見出し、上記の内容を国際学術雑誌にて公表したため、当初の計画より大幅に進展した。一方で、平成29年3月より旭川医科大学に異動したため、実験系の立ち上げのために計画の遂行に若干の遅れが生じた。本年度においては、DR6シグナルの解析に供するin vitro解析用培養細胞株を数種作成、樹立した。具体的に、昨年度CRISPR/Cas9法によるゲノム編集により作成したDR6遺伝子欠損DO11.10T細胞ハイブリドーマ株に、FLAGエピトープを付加したDR6野生型(FLAG-DR6_WT)、DR6の細胞内領域を全欠損させた変異体(FLAG-DR6_dT)および、細胞内領域を部分欠損させた変異体(FLAG-DR6_dDD、FLAG-DR6_dC、FLAG-DR6_dCLR)をそれぞれ再び安定導入した細胞株を樹立した。次に、DR6シグナルのT細胞シグナル関連遺伝子発現への影響を観察するために、FLAG-DR6_WT発現DO11.10-T細胞株あるいはFLAG-DR6_dT発現DO11.10-T細胞株を、抗DR6抗体あるいはコントロール抗体で刺激したのちに、これら細胞株から得られたRNAに含まれる数十種の遺伝子発現量を、定量PCR(qPCR)法により検出した。各刺激条件において、FLAG-DR6_WT発現DO11.10-T細胞株の遺伝子発現量を、FLAG-DR6_dT発現DO11.10-T細胞株の遺伝子発現量と比較した。上記一時解析の結果から、変動のあった解析候補遺伝子について、mRNAレベル(qPCR法)およびタンパク質レベル(ウエスタンブロット法あるいはELISA法)における再現性の確認を現在進めている。また、来年度に予定しているin vivo解析にあたり、CRISPR/Cas9法によるDR6遺伝子欠損マウスの作製を開始し、DR6遺伝子欠損マウスを数系統得ることができた。

来年度の解析に向けて、現在、これらマウスのライン化を進めている。当初予定では、本年度内にin vitro解析がタンパク質レベルまで進む予定であったが、代表者の異動等により遺伝子レベルでの解析を終えるにとどまった。これについては引き続き来年度に施行する。一方で、当初、時間を要すると思われたDR6遺伝子欠損マウス系統の作製について、CRISPR/Cas9法の導入により、本年度内に、産仔を得ることができ、また、DR6発現欠損の確認を終えることができたことから、当初計画より早く進んでおり、研究計画全体としては概ね予定通りと言える。昨年度、DR6が関与するとされる喘息モデル等に有用なBalb/cマウス遺伝子背景に、CRISPR/Cas9法によりDR6遺伝子単純欠損を導入し、DR6欠損Balb/cマウスの産仔を複数得るに至った。本年度はこれらDR6遺伝子欠損マウスの表現系を解析した。得られた産仔それぞれのゲノム上のDR6遺伝子領域を対象に、DNAシーケンス解析を行った結果、DR6遺伝子の機能的欠損アリルが複数見出された。これらのうち、比較的大きな領域が欠損されていたアリルを2つ、一塩基欠損アリルを1つ選択し、その後の解析に供した。これらのアリルは同一個体において互いにヘテロであったため、次に、それぞれのアリルの分離を試みた。野生型Balb/cマウスとヘテロDR6遺伝子欠損マウスとの交配を行い、各欠損アリルと野生型アリルをもつヘテロ産仔を得た。各欠損アリルにつき兄妹交配を行い、各欠損アリルのホモ個体を得るに至った。得られたホモ個体はいずれも既報の通り、外見的な異常および繁殖能等に異常は認められなかった。次に、各アリルにつきホモ個体同士の兄妹交配をおこない、3つのアリルについて、それぞれを独立にもつ系統として確立した。系統保存を目的に、各系統の一部の個体から受精卵および精子を採取し、凍結保存を行った。一方で、また一部の個体から免疫細胞を採取し、各免疫細胞ポピュレーションにおけるDR6タンパク質発現量をフローサイトメトリー法により行い、それぞれ3つのアリル上の機能欠損によりDR6タンパク質発現が欠損されていることを確認した。当初予定では本年度内にDR6欠損マウスを作成し、解析を終える予定であったが、本学動物実験施設の改修に伴う一時閉鎖のため、DR6遺伝子欠損マウス系統の作成および保存にとどまった。また、本年度末に研究代表者の異動にともない、進捗の遅れが生じた。概要に示した通り、研究環境の立ち上げのため、計画遂行において、今後若干の遅れが想定される。可能な限り早期にこれを解決し、速やかに、前年度に構築したin vitro実験を用いて詳細な解析を行う。概ね当初計画の通りに遂行する。本年度残予算については予定より早く作製された遺伝子欠損マウスの飼育経費および解析試薬等の消耗品費に充当する。研究期間を延長し、引き続き計画を進める。計画遂行に当たって必要なすべての研究試料の移動を無事終えており、遂行に支障はない。経費削減努力による。
二枚貝特異的斃死を引き起こす瀬戸内海産赤潮プランクトンの未解明鍵化学物質

ヘテロカプサ・サーキュラリスカーマは,二枚貝を生物群特異的に斃死させる赤潮プランクトンである。このプランクトンに含まれる殺二枚貝活性物質を単離するため,培養したプランクトン藻体を1-ブタノールで抽出した。得られた粗抽出物は,酢酸エチル可溶部と水可溶部に分画した。二枚貝斃死物質を単離するため,カキの心臓から調製した細胞に対する致死および溶解活性を指標とし,酢酸エチル可溶部をシリカゲルカラムクロマトで分画した。その結果,糖脂質画分に細胞溶解活性が認められた。さらに、この画分を逆相シリカゲルカラムクロマトおよび逆相HPLCによる精製を行なった結果,新たに1種の新規糖脂質を単離した。今回単離した糖脂質の他,昨年度までに3種の類縁糖脂質を単離しているが,これらはいずれもガラクトースを構成糖としていることから,ヘテロカプサ藻体の葉緑体のチラコイド膜の構成成分と考えられた。一方で,上記の糖脂質の1位の脂肪酸がリパーゼによって加水分解されることによって生成するリゾ体も合わせて単離した。現在,これらの詳細な化学構造および生物活性を検討するとともに,二枚貝斃死との関連を調べている。このプランクトンをIwasaki II培地で大量培養した。培養したプランクトンは,その藻体を遠心分離で集めた。これを1-ブタノールで抽出した。二枚貝斃死物質を単離するため,カキの心臓から調製した細胞に対する致死および溶解活性を指標とし,酢酸エチル可溶部の分画を行なった。シリカゲルカラムクロマトを用いて分画した結果,糖脂質画分に細胞溶解活性が認められた。そこで,この画分を逆相シリカゲルカラムクロマトおよび逆相HPLCによる精製を行なった。その結果,1種の新規糖脂質を含む3種の糖脂質を単離した。これら3種の糖脂質化合物はいずれも濃度0.13mg/mLでカキの心臓細胞に対して溶解活性を示した。
グリシン受容体欠損によるレム睡眠行動異常症にかかわる神経回路の解明

哺乳類動物の睡眠は、ノンレム睡眠とレム睡眠に分けられる。レム睡眠時の大脳皮質は覚醒に近い状態で活動しており、夢を見ていることが知られている。このレム睡眠時に、大声で叫んだり、何かを殴るような素振りをしたりと夢の内容に一致した行動が出現するレム睡眠行動異常症(REM sleep behavior disorder, RBD)と呼ばれる睡眠障害がある。興味深いことに、RBDと診断後の10年で7割の患者がパーキンソン病様症状をきたし、レビー小体型認知症患者の9割以上は過去にRBDと診断されている。このように、RBDは神経変性疾患の初期症状であることが近年明らかとなってきた。しかし、RBDの正確な発症部位は疎か、レム睡眠時における筋弛緩(レム脱力)の神経メカニズムも未だに明らかになっていない。これらを明らかにするためには、脳がレム睡眠時にどのように運動出力信号を遮断しているかという基本的な問題を解明することが必要とされる。本研究は申請者が作成したRBD症状を示す条件付きグリシン受容体欠損マウスを基に、責任部位の同定、神経回路の抽出、関連するグリシンニューロンの活動の記録と操作など多角的なアプローチを駆使し、グリシンニューロンとレム睡眠時の筋弛緩との因果関係を解く。昨年度は、申請者が作成したRBD症状を示す条件付きグリシン受容体欠損マウスを基に、アデノ随伴ウイルスによる責任部位の同定を行った。その結果、局所的なグリシン受容体の欠損によるRBDが観察され、RBDの責任部位を同定することができた。当初計画はおおむね予定通り進み、当該研究の論文投稿を行ったが、より詳細な研究結果を求められた為、現在追加実験を行っている。論文投稿のための追加実験は順調に進んでいるが、2点程実験に時間を要している。患者を利用した臨床実験において睡眠データを取得するまでに1年程要したが、本年5月までに実験終了を見込んでいる。また、マウス運動ニューロンの電気生理学的な解析も、本年7月までに実験終了を見込んでいる。その後、論文再投稿を行う。哺乳動物の睡眠は、ノンレム睡眠とレム睡眠に分けられる。これらを明らかにするためには、脳がレム睡眠中にどのように運動出力信号を遮断しているかという基本的な問題を解明することが必要とされる。本研究は申請者が作製したRBD症状を示す条件付きグリシン受容体欠損マウスを基に、責任部位の同定、神経回路の抽出、関連するグリシンニューロンの活動の記録と操作など多角的なアプローチを駆使し、グリシンニューロンとレム睡眠中の筋弛緩との因果関係を解く。本年度は、申請者が作製したRBD症状を示す条件付きグリシン受容体欠損マウスを基に、アデノ随伴ウイルスによる責任部位の同定を行った。また次年度に向けてレム睡眠時筋弛緩作用を担うグリシンニューロンのシナプス接続関係を特定するための予備実験も行った。初年度の計画通り、アデノ随伴ウイルスによる局所的なグリシン受容体の機能的欠損によるRBDの発現および部位を同定することができた。

その結果、局所的なグリシン受容体の欠損によるRBDが観察され、RBDの責任部位を同定することができた。本年度はレム睡眠時筋弛緩作用を担うグリシンニューロンのシナプス接続関係を特定するため、逆行性アデノ随伴ウイルスおよび狂犬病ウイルスを用いて、昨年度同定したRBDの責任部位へ投射するグリシンニューロンを明らかにした。当初の計画通り、逆行性アデノ随伴ウイルスや改変型狂犬病ウイルスによる逆行性トレーシングを用いて、初年度に同定したRBD責任部位に投射するグリシンニューロンを同定することができた。哺乳類動物の睡眠は、ノンレム睡眠とレム睡眠に分けられる。レム睡眠時の大脳皮質は覚醒に近い状態で活動しており、夢を見ていることが知られている。このレム睡眠時に、大声で叫んだり、何かを殴るような素振りをしたりと夢の内容に一致した行動が出現するレム睡眠行動異常症(REM sleep behavior disorder, RBD)と呼ばれる睡眠障害がある。興味深いことに、RBDと診断後の10年で7割の患者がパーキンソン病様症状をきたし、レビー小体型認知症患者の9割以上は過去にRBDと診断されている。このように、RBDは神経変性疾患の初期症状であることが近年明らかとなってきた。しかし、RBDの正確な発症部位は疎か、レム睡眠時における筋弛緩(レム脱力)の神経メカニズムも未だに明らかになっていない。これらを明らかにするためには、脳がレム睡眠時にどのように運動出力信号を遮断しているかという基本的な問題を解明することが必要とされる。本研究は申請者が作成したRBD症状を示す条件付きグリシン受容体欠損マウスを基に、責任部位の同定、神経回路の抽出、関連するグリシンニューロンの活動の記録と操作など多角的なアプローチを駆使し、グリシンニューロンとレム睡眠時の筋弛緩との因果関係を解く。昨年度は、申請者が作成したRBD症状を示す条件付きグリシン受容体欠損マウスを基に、アデノ随伴ウイルスによる責任部位の同定を行った。当初計画はおおむね予定通り進み、当該研究の論文投稿を行ったが、より詳細な研究結果を求められた為、現在追加実験を行っている。次年度からは、改変型狂犬病ウイルスベクターによる単シナプスかつ経シナプス性の逆行性トレーシングを行う。次年度は、当初の計画通り、本年度に同定したグリシンニューロンの内、どのグリシンニューロンがRBDの発現に関与しているのかを光遺伝学的な手法を用いて検討を行う。論文投稿のための追加実験は順調に進んでいるが、2点程実験に時間を要している。患者を利用した臨床実験において睡眠データを取得するまでに1年程要したが、本年5月までに実験終了を見込んでいる。また、マウス運動ニューロンの電気生理学的な解析も、本年7月までに実験終了を見込んでいる。その後、論文再投稿を行う。当初購入することを考えていた励起レーザーでは十分に当該研究の目的を達成できないことが示唆され、見直しを行う必要が生じた。本研究計画で購入を考えていた励起レーザーは他の研究経費で購入することができた為、次年度使用額が生じた。翌年度分として請求した助成金と合わせて、オプトジェネテックス用設備に合わせた睡眠測定装置および解析機器をさらに充実させていく。