hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
精原細胞の減数分裂と精子形成パキテン期通過に必須の核内因子Dmrt7の機能解明

Dmrt7タンパク質は生後12日から精巣内に発現し始め、精母細胞の核内に局在することを確認した。核内では、染色体様の構造と、XY bodyの両方に存在していることを、Scp3抗体とDmrt7抗体、γH2AX抗体とDmrt7抗体を用いた二重染色により明らかにした。Dmrt7欠損マウスの解析では、HE染色により、精母細胞の脱落、多核巨細胞の出現を確認した。PAS染色からは、Dmrt7欠損マウスの精子形成異常が形態的に観察され始めるのは生後14日目からであることが明らかとなった。マーカー解析の結果、Dmrt7が欠損した精巣では、パキテン期中期のマーカー(Hoxa4)が若干発現低下しており、パキテン期後期のマーカー(Cdc25c)の発現は完全に低下していた。以上の結果より、Dmrt7はパキテシ期の通過に必須であり、減数分裂特異的なイベントに関与していると考えられる。第一減数分裂前期には、減数分裂を特徴付ける様々なイベントが観察される。それらのイベントは減数分裂に必須であり、正常に機能しない場合は精子形成停止の主な原因となりうるp免疫染色と遺伝子発現解析の結果、Dmrt7欠損マウスの精巣では、相同染色体の対合、XYbody形成、MSCIは何れも正常である可能性が高いことが示唆された。しかし、MSCIのバックアップとして発現する遺伝子の一つであるPgk2の発現は野生型マウスと比較して約18%に低下していた。また、非LTR型のレトロトランスポゾンであるLINE1と、LTR型のLAPの発現が約2倍に上昇していることがqRT-PCRの結果明らかとなった。バックアップ遺伝子の発現低下とレトロトランスポゾンの活性化がどの様な関係にあるのかは明らかではないが、これらの発現変化がDmrt7欠損マウスの精子形成を停止させた原因である可能性は高いと思われる。Dmrt7の転写物はマウスの両生殖腺で検出されるが、Dmrt7 KOマウス解析よりDmrt7は精子形成にのみ必須である事が判っている。このDmrt7mRNAは、long formとshort formが存在することが確かめられている。Dmrt7のintron1途中からコード領域が始まりエキソン2へとアミノ酸配列が繋がるタイプをlong formタンパクと、エキソン2からコード領域が始まるタイプをshort formと通称する。この2種類のタンパク質はlong formタンパクがN末で31アミノ酸長い配列を持つ。これらを区別する為、long formとshort formに共通のエピトープを認識するラビット由来抗体(エキソン抗体)を作製した。また、long formにのみ特異的の存在する31アミノ酸を化学合成し、これに対するギニアピッグ由来の抗血清(イントロン抗体)を調製した。これらは、それぞれ該当する抗原部位(大腸菌由来)を組み替え抗原として合成し、担体に結合後抗血清の精製を行った。精製したそれぞれの抗体で生殖巣に発現するDmrt7の抗原のフォームと局在を解析した。精巣では両formのmRNAともに見出され、また両抗体に反応するシグナルが得られたことから、short formタンパクも、またlong formタンパクも翻訳され存在することが示唆された。一方、卵巣では両抗血清共にこれに反応する抗原は見出されず、卵巣ではshort form mRNAは転写されているものの、タンパク質にまで翻訳はされていない可能性が示唆された。これらの結果は、精巣内のDmrt7の発現には、少なくとも通常型(エキソン抗体とイントロン抗体の両方に反応するタンパク)とバリアント(イントロン抗体にのみ反応するタンパク)の2種類が存在していることが示された。また正常個体の精巣病理切片を対象とした免疫化学染色では、エキソン抗体での染色が染色体の境界に強いシグナルを示し、雄由来の生殖細胞に特異的な構造体であるXY体類似の外観を示したことから、Dmrt7の雄特異的な機能が示唆された。

また、非LTR型のレトロトランスポゾンであるLINE1と、LTR型のLAPの発現が約2倍に上昇していることがqRT-PCRの結果明らかとなった。バックアップ遺伝子の発現低下とレトロトランスポゾンの活性化がどの様な関係にあるのかは明らかではないが、これらの発現変化がDmrt7欠損マウスの精子形成を停止させた原因である可能性は高いと思われる。
バリと沖縄の楽園観光地に生きる観光サバルタンの事例考察を通した観光リスク論の探究

本研究は、人類学的な民族誌研究と社会学理論研究とを組み合わせ、観光リスク論の発展に寄与しようとするものである。観光地化は、ひとつの支配の浸潤と捉えうる一面をもつと考えられる。この支配に取り込まれ従属する人々を、ここでは「観光サバルタン」と暫定的に呼ぶ。彼らに着目しつつ、インドネシアのバリ島と日本の奄美・沖縄の事例をもとに、現代の観光の発展が孕むリスクとその顕在化について、観光の「中心」ではなく「周縁」的事象といいうるところにあえて着目しつつ、考察しようとするのである。
T細胞リンパ腫に於ける多様性発現の細胞生物学的背景

T細胞性悪性リンパ腫は構成腫瘍細胞の細胞性格の多様性を反映してその組織像、細胞像及び臨床像が極めて多彩多様であり、その系統的理解はB細胞リンパ腫に比して未だ極めて不完全な状態にある。本研究はT細胞性腫瘍全般の免疫細胞学的性格の検索、染色体異常の検索、腫瘍細胞の分子遺伝学的解析を行い、その結果をもとに、それらの示す細胞病理学的所見や病態を対応させ、その系統的理解、ひいては合理的な分類法の確立を目的とするもので、本年度に得られた知見は以下の如くである。1.AILD(血管免疫芽球性リンパ節症)型病変多数症例につき協力研究を行い、次の結果を得た。(1)染色体分析及びDNA再編成の検索により、一部に確実にT細胞腫瘍性格が証明された(鎌田、上田)。(2)増殖細胞性格は多くはヘルパー(須知、本告)、一部はサプレッサー(菊池、三方)であることを示した。(3)瀘胞樹枝状細胞の増生巣の存在を指摘した(難波)。(4)一例よりIL-2依存性ヘルパーT細胞株を樹立した(若狭)。2.びまん性大細胞型Tリンパ腫の中で、ホジキン病増殖細胞と共通の性格(Ki-【1^+】,【Ia^+】,【Tac^+】)を示すものが特に小児非ホジキンリンパ腫大細胞型の優位を占め特徴的組織像を呈することを明らかにした(須知)。4.ATLL細胞に反応する非抗Tac、非抗HTLV-1特異モノクローナル抗体を作製(花岡)、また胸腺T細胞を区別する2抗体即ちL6(OKT6に一致)及びL9(髄質細胞に強陽性の新しい抗体)を開発した(菊地)。5.増殖細胞の指標としてDNAポリメラーゼα(pol-α)掫ABC法で染色、リンパ球の各種分化抗原をAPAAP法で染色する免疫二重染色法を確立し、pol-α陽性細胞の集簇は腫瘍性増殖を強く示唆することを示した(上田)。
クリプトコックス・ガッティ感染症における高病原性の免疫機序の解明

Cryptococcus gattiiは、C. neoformansと異なり健常人でも髄膜脳炎を発症し高い致死率を示す。C. gattiiの高病原性機序を解明する目的で、両真菌種に対する宿主免疫応答性の違いについて解析した。C.gattii感染マウスでは肺でのTh1免疫応答が低下し、リンパ節におけるTh1細胞の分化障害がみられた。さらに、C. gattiiのDNA及び莢膜多糖では、TLR9、Dectin-2との応答性が低下していた。これらの結果から、C. gattiiとC. neoformansではTh1免疫応答に重要なPAMPsの構造が異なり病原性の違いにつながる可能性が示唆された。2種類のトランスジェニックマウスを用いたin vivoの実験で、当初予定していた高病原性クリプトコックス感染の免疫病態の一端に迫ることができ、その機序の可能性を示唆する知見も得られつつある。クリプトコックス抗原特異的T細胞受容体を発現するトランスジェニックマウス(CnT-II)を用いることで高病原性クリプトコックスに対する免疫応答性を解析し以下の結果を得た。1)CnT-IIマウスの肺内にクリプトコックスを感染させたところ、Cryptococcus gattii(CG)ではC. neoformans(CN)に比べ感染14日後の肺内でのIFN-γ産生が低下したが、IL-4、IL-5、IL-13、IL-17産生は不変または軽度の低下にとどまった。2)肺及び所属リンパ節でのTh1細胞はCNに比べCGで減少していた。3)Th1細胞のマイグレーションに重要なCXCL9及びCXCL10の肺内での発現は両菌種で差はみられなかった。4)CnT-IIマウスの脾臓T細胞を抗原ペプチドで刺激する際に両菌種の菌体破砕物を添加したところCGにおいてTh1細胞への分化が低下していた。5)クリプトコックス感染でのTh1免疫応答にTLR9を介した真菌DNAの認識が重要なことから、両菌種のDNA刺激による樹状細胞からのIL-12産生を比較したところ、CGにおいて低下していた。6)TLR9を介した刺激に重要なCpGモチーフの全ゲノムにおける頻度を比較したところ両菌種で差はみられなかった。7)CpGモチーフのメチル化がTLR9刺激活性を低下させることから、いくつかのCpGモチーフにおけるメチル化の有無を調べたところ両菌種ともに検出されなかった。8)宿主免疫応答の抑制が知られている莢膜多糖グルクロノキシロマンナンを両菌種から精製し、樹状細胞からのサイトカイン産生、レポーターアッセイによるDectin-2刺激活性を調べたところ、CGで顕著な低下が観察された。これらの結果から、CGとCNによるTh1免疫応答の相違に真菌からのPAMPsとその認識受容体との相互作用の違いが関係する可能性が示唆され、今後PAMPsの構造との関連性についてさらに解析を進めていきたい。2種類のトランスジェニックマウスを用いたin vivo及びin vitroの実験で、C. gattii感染ではTh1細胞への分化が低下していること、その機序にはDNAやGXMのようなPAMPsが関与する可能性があることを示唆する興味深い結果が得られつつある。本研究は、Cryptococcus gattii(CG)の高病原性の免疫機序を解明することを目的としている。我々が開発したクリプトコックス抗原特異的T細胞受容体(TCR)を高発現するトランスジェニック(Tg)マウス(CnT-II)を用いることで、免疫応答性についてC. neoformans(CN)と比較検討し以下のことが明らかになった。1.CnT-IIマウスの肺内に本真菌を感染させたところ、CGではCNに比べ肉芽腫反応に乏しく、菌体が肺胞腔内を充満していた。2.CGでは感染後のTh1応答が低下した。3.CGでは所属リンパ節におけるTh1細胞の分化が低下した。4.CGの菌体成分が本真菌特異的なTh1細胞の分化誘導を抑制した。5.所属リンパ節で分化したTh1細胞の感染局所へのマイグレーションは両者で差異を認めなかった。6.CGでは感染後の肺内での好中球集積が増加し、好中球集積に関与するケモカインKC、MIP-2の産生が増加した。7.抗Gr-1抗体により好中球を除去してもCGによる感染の悪化には影響がなかった。8.本真菌の病原性に重要な莢膜多糖からCTAB非結合分画を採取し、さらにConA-sepharose 4Bカラムに結合する成分を精製したところ、CN由来ではDectin-2への結合性、Dectin-2レポーター細胞の活性化、骨髄由来樹状細胞の活性化を示したのに対して、CG由来ではいずれの活性も低下していた。9.ConAに結合する莢膜多糖成分としてgalactoxylomannan(GalXM)、mannoprotein(MP)が知られているが、抗GalXM抗血清、精製GalXMを用いた解析から目的の活性はGalXMとは異なる可能性が示唆された。10.本真菌の主要なMPであるchitin deacetylase(MP98)によってDectin-2レポーター細胞の活性化が観察された。これらの結果から、CGとCNによるTh1免疫応答性が両真菌種の病原性の相違に寄与するものと考えられ、その機序としてMPなど莢膜多糖成分のDectin-2への刺激活性の違いが関与する可能性が示唆された。

C. gattiiの高病原性機序を解明する目的で、両真菌種に対する宿主免疫応答性の違いについて解析した。C.gattii感染マウスでは肺でのTh1免疫応答が低下し、リンパ節におけるTh1細胞の分化障害がみられた。さらに、C. gattiiのDNA及び莢膜多糖では、TLR9、Dectin-2との応答性が低下していた。これらの結果から、C. gattiiとC. neoformansではTh1免疫応答に重要なPAMPsの構造が異なり病原性の違いにつながる可能性が示唆された。平成27年度に得られた知見をもとに、病原性クリプトコックス感染でTh1応答が低下し感染が悪化する免疫機序について、トランスジェニックマウスの利点を活かし、特にin vitroでの各種T細胞サブセットへの分化に及ぼす影響に焦点を当てることでさらなる解析を進めたい。平成28年度に得られた知見をもとに、高病原性クリプトコックス感染でTh1免疫応答が低下し感染が悪化する機序について、PAMPsと認識受容体との相互作用の観点からアプローチするとともに、PAMPsの構造の違いと病原性との関連性についてさらなる解析を進める予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。感染免疫学29年度が最終年度であるため、記入しない。
ヘルメットの頭部保護性能とその評価法に関する研究

まず乗車用ヘルメットの安全性を規定している日本工業規格(JlS)および衝撃カをうける頭部耐性曲線(WSTC)を参考にしながら、現在までに提案されている頭部耐性に対する評価指標を調査した。それらの内から有力と思われる指標について、様々な衡撃力波形を創成し、それらを入力加速度波形として演算を行い取り上げた指標が持つ特性について調査した。その結果、自動車の安全基準などに使用されているHlC(Head Injury Cniterion)指標が、衝撃波形の特徴をよく代表しており、安全基準に使用すべき指標として最も有力であることが明らかになった。そこで、市販されている乗車用ヘルメットから、代表的なモデルを取り上げ、このヘルメットのシェル形状と落下試験に用いるヘッド・フオーム形状をそれぞれ計測し、これらの三次元形状データからシェルとライナーで構成されるヘルメットおよびヘッド・フォームの三次元有限要素デルを作成した。そして、シェルとライナーについては、衝撃試験結果に基づき、これらが線形弾性応答を示す範囲内の材料特性を求め、これを材料特性として用いた。これらのモデルを用いて、ヘッド・フォームにヘルメットを装着させ、二種類の剛体としたアンビル上に落下させるシミュレーションを行った。シミュレーションでf得られたヘッド・フオームの加速度応答に基づき、HlCなどの指標を計算することにより対象ヘルメットの頭部保護性能の評価を行っと。以上による本研究の成果をまとめると、次のようになる。1)JlSで定められたヘルメットの落下衝撃試験をシミュレーションできる実際のヘルメットに基づいた三次元有限要素法モデルの作成に成功した。2)材料特性が線形弾性の範囲内に限定されるが、実験とシミュレーションによるヘッド・フォーム内の加速度応答波形ならびにこれらから求められる頭部保護性能評価指標は、ともに良好な一致をみた。3)落下サーフェスに関しては、半球形の場合の方が平形の場合よりも応答加速度および評価指標ともに小さくなった。この原因としては、半球形のアンビルに対する衡突では、応力の集中により変形が大きくなり、その結果として応答加速度が、小さくなったと思われる。しかし、、これはヘルメットに損傷がない範囲内における現象で、ヘルメットのシェルあるいはライナーに不可逆的な損傷が生じる場合は、破壊とその破懐による頭部保護性能について、別途評価する必要がある。スポーツあるいはレジャー用のヘルメットでは、一部を除いて安全基準が制定されていないため、様々なレベルの性能のヘルメットが市場に出回っている。本研究では、まず乗車用ヘルメットの安全性を規定しているJISおよび衝撃力をうける頭部耐性曲線(WSTC)を参考にしながら、現在までに提案されている頭部耐性に対する評価指標を調査した。それらの内から有力と思われる指標について、様々な衝撃力波形を創成し、それらを入力加速度波形として演算をおこない取り上げた指標が持つ特性について調査した。その結果、自動車の安全基準などに使用されているHIC指標が、衝撃波形の特徴をよく代表しており、安全基準に使用すべき指標として最も有力であることが明らかになった。この評価指標調査と併行して、現在市販されている多数のヘルメットを対象として、落錘式衝撃試験機により様々な衝撃条件のもとで試験を行い、人頭模型内に発生した加速度波形を計測した。そして、その結果に対して各種指標による評価を行い、ヘルメットの損傷のパターンや規模と加速度応答波形および指標との関係について調査した。その結果、安全性能として十分でない製品もあり、安全基準の必要性が改めて指摘された。

今後の課題は安全基準において採用すべき指標の絞り込みとスポーツ用・レジャー用ヘルメットの安全性のレベルに対する考え方を確立することにある。本年度は、日本工業規格(JIS)で採用されている乗車用ヘルメットに対する落下衝撃試験をコンピュータ・シミュレーションにより再現する方法を確立するための基礎研究に重点を置いた。解析対象とするヘルメットの三次元形状を計測する方法と計測した座標データから有限要素法(FEM)による解析に適した要素を創成する方法を開発した。このヘルメットに対するFEM用形状モデルを基にして、落下衝撃試験に供するシェルとライナーおよびヘッド・フォームのFEMモデルを作成した。FEM解析コードには、ABAQUS/Explicitを使用した。シェルの材料特性取得については、同じ種類の繊維強化プラスチンク(FRP)に対して静的引張り試験を行い、ライナーの材料特性取得については、発泡性高分子材料に対して衝撃圧縮試験を行い、それぞれ必要なデータを計測した。これらの取得したデータから、シェルに関しては線形等方弾性平面要素、ライナーに関しては三次元形状の発泡材料とし、ヘッド・フォームについては、剛体と仮定した。これらのシェル・ライナー・ヘッドフォームからなる三体モデルの剛な床への落下衝撃試験について、FEMを用いたシミュレーションを行い、床反力・シェルおよびライナーの応力・ヘッドフォーム内部の加速度応答などを求めた。これらを実際のヘルメットを用いた落下衝撃試験結果と比較したところ、まだ精度は十分でないものの、定性的には良好なシミュレーション結果であることが明らかになった。今後は、さらにヘルメットの材料特性を正確に計測することとその特性を忠実に表現するモデルの設定が課題であるが、これが達成されればヘルメットの設計と安全基準の立案へ向けた道筋が示されることになる。市販されている乗車用ヘルメットから、代表的なモデルを取り上げ、このヘルメットのシェル形状と落下試験に用いるヘッド・フォーム形状をそれぞれ計測し、これらの三次元形状データからシェルとライナーで構成されるヘルメットおよびヘッド・フォームの三次元有限要素(FE)モデルを作成した。そして、シェルとライナーについては、衝撃試験結果に基づき、これらが線形弾性応答を示す範囲内の材料特性を求め、これをモデルの材料特性とした。ヘッド・フォームおよび落下対象の平形および半球形のアンビルについては剛体とした。これらのモデルを用いて、ヘッド・フォームにヘルメットを装着させ、二種類のアンビル上に落下させるシミュレーションを行った。シミュレーションで得られたヘッド・フォームの加速度応答に基づき、HIC(Head Injury Criterion)などの指標を計算することにより対象ヘルメットの頭部保護性能の評価を行った。
アジア人に重要な新しいネフローゼ遺伝子座からの疾患遺伝子探査

ステロイド抵抗性ネフローゼ症候群SRNSは、巣状分節糸球体硬化の組織像を特徴とし、小児腎不全の主因である。SRNSの疾患遺伝子には民族差があり、わが国の多くの症例の原因は不明である。申請研究では、小児期発症・劣性遺伝SRNS17家系(日本12、韓国5)を収集し、連鎖解析マッピングにより染色体の1か所に新しい疾患遺伝子座位を同定した(多点ロット値5.8)。候補領域の疾患遺伝子は50個程度であるが、ゲノムデータベースや糸球体発現解析によって絞り込み、変異の有無を確認中である。背景ステロイド抵抗性ネフローゼ症候群SRNSは、巣状分節糸球体硬化の組織像を特徴とし、とくに小児においては腎不全の主因である。患者QOL改善の観点から、病態の解明が待たれている。研究者らは、すでにアジア人家族性SRNS16家系(日本11、韓国5)、病理組織はFSGS/微少変化群の一次ゲノムワイド連鎖解析スクリーニングを行いで新規陽性候補領域(ロット値2.11)を得た。目的遺伝子座の確認と狭小化を試み、アジア人固有の糸球体硬化症遺伝子を探索する。バイオインフォーマティクスを活用し、候補絞り込みを行う必要がある(positional candidate approach)。方法Linkage mapping set (high density、Applied Biosystems)を用いて5cM間隔でスキャンするとともに、MarshfieldやdeCode GeneticsのHuman genome mapを参考にしてさらに密に配置することが可能である。100K、500Kマッピングアレイを用いると、マイクロサテライト(100-200kb間隔)より高解像度(5.8-23.8kb間隔)でのマッピングが可能。結果新たなSRNS弧発8例(両親、健常同胞を含む)の症例DNAを収集し、マイクロサテライトマーカーを高密度に配置し、ハプロタイプ解析と、GeneHunterプログラムによる連鎖解析をおこなった。候補領域は15cM程度あり、現在約50種類以上の候補遺伝子が存在している。マウス糸球体から全RNAを抽出し、マウス発現チップとのハイブリダイゼーションを行い、組織発現を解析した。現在これらの、糸球体特異的遺伝子に焦点をあて、候補遺伝子のシークエンス解析を予定している。例えば、糸球体発現パターン(GlomChip、Takemoto, et al., www.ebi.ac.uk/)や機能・相互作用、生物学pathway、組織発現の情報を参考にして候補を絞る(Genecards、ww、genecards.org/)。目的ステロイド抵抗性ネフローゼ症候群は、組織学的に巣状分節性糸球体硬化像(FSGS)を呈し、進行性に腎不全に到る難治性疾患である。FSGSは小児期末期腎不全の主因疾患であり、また糖尿病や高血圧等成人の進行性腎障害にも共通する病変である。FSGSの発症機序を分子レベルで明らかにするため、家族性FSGSの疾患遺伝子をマップし、疾患遺伝子を同定する。背景近年家族性FSGS症例の遺伝子解析により、遺伝素因の重要性が指摘されている。欧州の家族性FSGSの解析では、NPHS 1-3までの3つの遺伝子が同定されており、特に小児の家族性ステロイド抵抗性ネフローゼ症候群の半数以上は、これらの遺伝子変異が原因である。しかし我が国においては、これらの遺伝子変異はなく、欧米とは異なる疾患遺伝子の存在が疑われる。成果研究代表者は平成20年4月に現所属機関に転入した。残り1年に成果を上げるために、徳島大学・土井教授と作業を分担し研究を継続した。家族性FSGS16症例+孤発FSGS例8例のマイクロサテライトマーカーを用いたパラメトリック連鎖解析により、多点ロット値がLOD>5-6と有意なスコアを得た。ハプロタイプ解析により候補領域は、約5-8 Mbに絞られた。さらに症例を増やして疾患遺伝子の位置確認を行い、論文作成中である。意義・重要性進行性腎障害により腎不全に至る予備軍を慢性腎臓病という新しい疾患概念で取りまとめ、早期治療を講じる対策が進められている。本研究成果で、本邦の固有の疾患因子が明らかになり、治療薬開発や予防方策の確立に繋がると期待される。
高分解能RBS法を用いたエピタキシャル成長初期過程の研究

高分解能RBS法に使用しているゴニオメーターを、通電加熱法によりシリコンの清浄表面が散乱槽内で得られるように改良した。RHEED用電源を作製し、散乱層内でその場でRHEED法による清浄表面の観察が行えるようにした。このように改良した高分解能RBS装置を用いて、Si(001)表面上に真空蒸着法により銀を成長させて、成長の初期過程を観察した。その結果、シリコンの温度が760Kでは、銀は蒸着量が0.5原子層(ML)までは2次元成長をして、それ以上蒸着量を増加させても銀の吸着量は増加しない事が分かった。またRHEED観察では、銀の蒸着により2X1パターンが殆ど変化しない事が分かった。これらの事実と、銀原子で散乱されたイオンのエネルギー損失の測定から、銀原子の吸着位置を決定する事ができた。また、シリコンの温度が520Kでは、銀の成長様式は2次元膜形成の後島状成長に変化するS-Kモードである事が分かった。また、2次元成長の臨界膜厚は0.5MLである事も見いだした。高分解能RBS法を用いて、SnTe(111)表面上にエピタキシャル成長したPbSe(111)結晶の表面観察も行った。その結果、表面原子層は鉛原子のみを含んだ(111)原子面であり、その原子密度がバルクの密度の約1/3である事を見いだした。これらの結果は、他の分析法で得る事は困難であり、原子層ごとの分析が可能な高分解能RBS法の有用性を示す事ができた。
中間径フィラメント結合蛋白質の同定とその機能解析

1.タイプ3の中間径フィラメントであるビメンチン、GFAP、デスミンを用いて、Aurora Bキナーゼが分裂溝キナーゼであることを見出した。Aurora Bキナーゼによるリン酸化部位は細胞内において分裂後期の分裂溝で特異的にリン酸化されており、Aurora Bキナーゼは分裂溝キナーゼの特徴を有していた。次に、これらのリン酸化部位に変異を導入した中間径フィラメント蛋白質を細胞に発現させ、Aurora Bキナーゼが分裂溝における中間径フィラメントの局所的な断裂に重要であることを明らかにした。さらに、二つの分裂溝キナーゼであるAurora BキナーゼとRho-キナーゼのリン酸化部位に変異を導入することによって、これらのキナーゼがお互いに協調的に働いていることが明らかになった。2.TNF receptor 1-associated death domain protein(TRADD)は、TNF刺激によりTNF receptor 1の細胞内ドメインに結合する蛋白質であるが、ケラチン18が発現している単層上皮細胞では、TRADDがケラチン18と結合していることを見出した。そして、単層上皮細胞では、TRADDがケラチン18と結合しているために、TNF receptor 1活性化によるアポトーシスが減弱していることを認めた。3.DENSIN-180のPDZドメインと結合しうる蛋白質としてアルマジロ蛋白質のp120カテニン・サブファミリーに属するデルタ・カテニンを同定した。そして、DENSIN-180は、デルタ・カテニン及びN-カドヘリンと複合体を形成しており、海馬神経細胞初代培養の神経シナプスでデルタ・カテニン及びN-カドヘリンと共局在することを見出した。中間径フィラメント結合蛋白質の同定を行い、それらが果たしている機能を以下の項目について解析した。(1)中間径フィラメント構築の制御:ビメンチンおよびデスミンがaurora Bキナーゼによってリン酸化されることを見出した。現在、そのリン酸化部位の同定と部位特異的抗リン酸化抗体の作製を行っている。(2)細胞内情報伝達経路とのクロストーク:TNF receptor 1-associated death domain protein(TRADD)は、TNF刺激によりTNF receptor 1の細胞内ドメインに結合する蛋白質であるが、ケラチン18が発現している単層上皮細胞では、TRADDがケラチン18と結合していることを見出した。(3)核膜へのアンカリング蛋白質:nuclear pore complexの構成蛋白質であるnucleoporin p62とケラチン8・18が、結合しうることを確認した。(4)神経シナプスと中間径フィラメント:神経特異的中間径フィラメントであるGFAP及びalpha-internecineと結合しうる蛋白質として同定しているDensin-180が、そのC末端のPDZドメインを介して、armadillo蛋白質delta-cateninと結合し、シナプスの形成に関与している可能性があることを明らかにした。1.これまでに私共は、中間径フィラメントは細胞質分裂期に分裂溝で特異的にリン酸化を受けていることを報告し、そして、細胞質分裂期に中間径フィラメントをリン酸化する分裂溝キナーゼとして、Rho-キナーゼを同定していた。本研究において、タイプ3の中間径フィラメントであるビメンチン、GEAP、デスミンを用いて、Aurora Bキナーゼがもうひとつの分裂溝キナーゼであることを見出した。Aurora Bキナーゼはin vitroにおいてこれらの中間径フィラメント構成蛋白質をリン酸化することができた。これらのリン酸化部位は細胞内において分裂後期の分裂溝で特異的にリン酸化されており、Aurora Bキナーゼは分裂溝キナーゼの特徴を有していた。

次に、これらのリン酸化部位に変異を導入した中間径フィラメント蛋白質を細胞に発現させ、Aurora Bキナーゼが分裂溝における中間径フィラメントの局所的な断裂に重要であることを明らかにした。さらに、二つの分裂溝キナーゼであるAurora BキナーゼとRho-キナーゼのリン酸化部位に変異を導入することによって、これらのキナーゼがお互いに協調的に働いていることが明らかになった。これらの結果から、Aurora BキナーゼとRho-キナーゼは、細胞質分裂時に中間径フィラメントをリン酸化し、その構築制御を行っているという分子機構が考えられた。2.DENSIN-180のPDZドメインと結合しうる蛋白質としてアルマジロ蛋白質のp120カテニン・サブファミリーに属するデルタ・カテニンを同定した。そして、DENSIN-180は、デルタ・カテニン及びN-カドヘリンと複合体を形成しており、海馬神経細胞初代培養の神経シナプスでデルタ・カテニン及びN-カドヘリンと共局在することを見出した。また、DENSIN-180と結合する蛋白質として、MAGUIN-1も同定した。
睡眠及び食事リズムが肥満に与える影響の検討

1減量モデルマウスを用いた解析により、エネルギー制限によって体重や脂肪組織が減少しても血中因子は同様に変動しない可能性が示された。食事のタイミングや期間のさらなる検討が必要である。2女性3世代研究における高齢女性のデータを用いた解析により、睡眠パターンと食事摂取量の関連は年代によって異なることが示唆された。また、夜型傾向と身体機能に関するスコアの関連が示された。3東京大学社会科学研究所附属社会調査・データアーカイブ研究センターSSJデータアーカイブから〔「第2回子ども生活実態基本調査,2009」(ベネッセ教育総合研究所)〕の個票データの提供を受け、睡眠と食事に関するデータの二次分析を行った。肥満誘導後にエネルギー制限により体重減少させた減量モデルマウスを作成し、食餌リズムが減量の効果及び予後に与える影響について検討することを目的とした。肥満やメタボリックシンドロームの病態では、脂肪細胞からのアディポカイン産生や脂肪組織に浸潤した免疫系細胞からの炎症性因子の産生が亢進し、全身性に軽い炎症が惹起されている。しかしながら、食事制限によって体重が減少した場合、肥満によって変化した血中の炎症性因子がどのように変動するのか明らかではない。また、朝型・夜型の生活が減量に及ぼす影響も明らかではない。そこで本年度は、高脂肪食によってマウスに肥満を誘導した後に普通食に切り替えることよって体重を減量させ、肥満の病態や血中因子における変化について基礎的な検討を行った。6週齢のC57BL/6マウスをHF群とN群の2群に分け、HF群には高脂肪食(HFD-60)、N群には普通食(AIN-93G)を与えた。飼育16週間目にHF群をHF群とHF-N群の2群に分け、HF-N群は高脂肪食から普通食に切り替えた。飼育25週目に解剖を行い、脂肪組織、肝臓、及び脾臓重量を測定した。また血液から血清を採取し、レプチン、インスリン、及びMCP-1の測定を行った。HF群はN群と比較して有意に最終体重が増加したが、HF-N群はN群と比較して有意な差を示さなかった。脂肪組織及び脾臓重量についても同様の傾向が認められた。また、血中レプチン値も体重と同様の傾向を示したが、血中インスリン値はHF-N群が最も高い値を示した。MCP-1については3群間に有意な差は認められなかった。エネルギー制限によって体重や脂肪組織が減少しても血中因子は同様に変動しない可能性がある。エネルギー制限のタイミングや期間について、その他の肥満によって変化する血中因子についてもさらなる検討が必要である。1昨年度に実施した動物実験の検体整理、データ解析を行い、論文執筆準備を行った。2人を対象とした睡眠と食事及び健康に関する研究を実施するための研究準備として、国内外の文献検索・講読を行い、資料を整理した。3女性3世代研究における高齢女性のデータを用いて、睡眠と健康に関するデータ解析を行った。65歳以上の高齢女性を対象とした解析では、睡眠中央時間の夜型による食事摂取量の変化は、過去の若年女性を対象とした研究結果と比較して少なかった。これらのことから、クロノタイプと食事摂取量の関連は、年代によって異なることが示唆された。BMIには有意な差は認められなかった。また高齢女性では夜型傾向であるほど睡眠時間が短く、睡眠の質が悪かった。Center for epidemiologic studies depression (CES-D)scaleによるうつの有無の検討では、睡眠中央時間が遅い夜型傾向であるほどうつの人の割合が高かった。さらにSF-36による健康関連QOLの評価では、夜型であるほど身体機能及び全体的健康観に関するスコアが低かった。各年代に特徴的な食習慣や健康問題と睡眠及び」クロノタイプの関連について、さらに検討が必要である。所属機関を異動したため、新たな所属先での研究の立ち上げに時間がかかった。本年度は昨年度までに実施した動物実験及び高齢女性を対象としたデータの解析・論文執筆準備を進めた。さらに、新たに実施する予定である人を対象とした睡眠と食事に関する調査研究のための研究準備として引き続き国内外の文献検索・講読及び資料整理、睡眠に関わる調査項目の検討、必要機器の検討を行った。過去に申請者が行った研究結果から、年齢によって食事と睡眠との関連性が異なる可能性があるため、新たな研究における対象者の性別・年齢の設定の検討が必要である。また近年Roennebergらにより、平日と休日の睡眠パターンの違いによる健康への影響が報告されてる。生理的な時計型と社会的生活パターンに影響された睡眠パターンの違いが食事摂取量にどのような影響を与えるかについては明らかになっておらす、検討が必要である。対象設定の検討に時間を要したため、新たに実施する予定である人を対象とした睡眠と食事に関する調査研究の実施ができなかった。1肥満誘導後にエネルギー制限により体重減少させた減量モデルマウスを用いて、食餌リズムが減量の効果及び予後に与える影響について検討することを目的とした解析を行った。高脂肪食によってマウスに肥満を誘導した後に普通食に切り替えることよって体重を減量させ、肥満の病態やレプチン、インスリン及びMCP-1等の血中因子における変化について基礎的な検討を行った。本研究によりエネルギー制限によって体重や脂肪組織が減少しても血中因子は同様に変動しない可能性が示された。エネルギー制限のタイミングや期間について、またその他の肥満によって変化する血中因子についてもさらなる検討が必要である。

2睡眠パターン(クロノタイプ)の朝型・夜型と食事摂取量及び健康の関連を解析することを目的として、「食習慣と健康に関する女性3世代研究」の高齢女性のデータを用いた解析を行った。高齢女性では、朝型と夜型の食事摂取量の違いは過去に行った若年女性の結果と比較して少なかった。このことから、睡眠パターンと食事摂取量の関連は年代によって異なることが示唆された。また、夜型傾向であるほどうつの割合が高く、全体的健康観に関するスコアが低かった。各年代に特徴的な食習慣や健康問題と睡眠及びクロノタイプの関連についてさらなる検討が必要である。3今年度は研究最終年度としてこれまでの研究の取りまとめと論文執筆を行った。また睡眠パターンと食事摂取量について、子どもにおけるデータの検討を行った。東京大学社会科学研究所附属社会調査・データアーカイブ研究センターSSJデータアーカイブから〔「第2回子ども生活実態基本調査,2009」(ベネッセ教育総合研究所)〕の個票データの提供を受け、睡眠と食事に関するデータの二次分析を行った。さらに、睡眠と健康指標の関連を解析する目的でマルチ周波数体組成計及び運動機能分析装置の基礎的検討を行った。1減量モデルマウスを用いた解析により、エネルギー制限によって体重や脂肪組織が減少しても血中因子は同様に変動しない可能性が示された。食事のタイミングや期間のさらなる検討が必要である。2女性3世代研究における高齢女性のデータを用いた解析により、睡眠パターンと食事摂取量の関連は年代によって異なることが示唆された。また、夜型傾向と身体機能に関するスコアの関連が示された。3東京大学社会科学研究所附属社会調査・データアーカイブ研究センターSSJデータアーカイブから〔「第2回子ども生活実態基本調査,2009」(ベネッセ教育総合研究所)〕の個票データの提供を受け、睡眠と食事に関するデータの二次分析を行った。生活習慣病の発症には栄養素の過不足だけでなく、食事時間や食行動・食習慣など含む様々な食生活リズムが密接に関与することが示唆されている。しかしながら、現代社会における人の睡眠及び食生活リズムは多様であり肥満との関連には未解明な部分が多い。そこで本年度の研究では、食餌誘導性肥満モデルマウスを用いてエネルギー制限が肥満の病態及び血中因子の変動に及ぼす影響について基礎的な検討を行った。解析を行ったデータの論文執筆と人を対象とした睡眠と健康に関する研究を次年度も引き続き実施する。昨年度までの結果を踏まえ、調査対象者の設定及び依頼・調査の実施を行う。また、申請者が今までに検討してきた睡眠時間や睡眠中央時間だけでなく、日中の「眠気」など新たな睡眠指標と食事との関連についても検討する。栄養学現代社会における人の睡眠及び食生活リズムは多様であり、肥満との関連には未解明な部分が多い。そこで本研究では、肥満のモデルマウスを用いた実験的な解析と人を対象とした食事及び睡眠関連調査を行い、肥満における「睡眠及び食事リズム」の関与を科学的に明らかにする予定である。今後は人における睡眠と食事に関する検討を行う予定である。
溶接接合部の材料不均一性を考慮した非線形破壊力学解析

本研究は,溶接の過程で溶接金属と母材,あるいは被接合材どうしが溶融・混ざり合い,溶接部材料の機械的性質が連続/不連続に変化する材料に対する計算力学手法や破壊力学解析の高度化を目指すものである.このような構造の破壊力学的評価では,材料の不均一性に対して特に配慮する必要がある.本研究では,計算破壊力学的立場からの基礎的研究を行い,破壊力学パラメータの計算手法について,厳密な定式化と高精度計算を可能にするプログラム実装法,さらに,ボイド等の溶接欠陥の高速なモデル化のための重合メッシュ法ベースのマルチスケール解析手法の提案を行ってきた.「J積分解析手法の高度化研究」では,溶接残留応力や熱ひずみの存在とそれらの連続的な変化や材料の機械的性質が連続変化する場合の定式化を終了している.さらに,ひずみエネルギ密度の空間に関する微係数の解析手法についても研究を行ってきた.これらの検討に基づき,弾塑性変形を受ける傾斜機能材料(材料の機械的性質が空間的に変化する問題)の解析に必要なプログラム実装を行い,CT試験片の弾塑性有限要素法解析とJ積分計算を行った.さらに,これらのアイディアから繰返し荷重下でも経路独立な,新しいJ積分とJ積分範囲ΔJの提案をした.材料の機械的性質が空間的に変化場合に対しての「相互積分法解析手法の高度化研究」では,定式化,プログラム実装,検証計算を行うことができた.これらの研究成果について国内/国際学会での発表や国内外の学術誌に投稿し発表を行ってきた.反復型重合メッシュ法の高度化研究」では,複数のローカルメッシュ領域を有する場合や弾塑性問題の解析を可能にすることができた.これらの研究成果を国内/国際学会での発表や国内外の学術誌に投稿を行うことで広く周知をした.本研究の成果として溶接接合部損傷シミュレータ構築のために十分な基盤技術の構築ができた.平成28年度は,「J積分解析手法の高度化研究」と「反復型重合メッシュ法の高度化研究」が主な課題であり,ほぼ予定どおりに研究が進んでいる.「J積分解析手法の高度化研究」では,溶接残留応力や熱ひずみの存在とそれらの連続的な変化や材料の機械的性質が連続変化する場合のJ積分解析手法の定式化を終了している.さらに,ひずみエネルギ密度の空間に関する微係数の解析手法についても研究を行ってきた.これらの検討に基づき,弾塑性変形を受ける傾斜機能材料(材料の機械的性質が空間的に変化する問題)の解析に必要なプログラム実装を行った.非線形有限要素法解析は商用有限要素法プログラムを用い,J積分計算はポスト処理プログラムとして実施するものである.数値解析例として,降伏応力や弾性定数が試験片内部で変化するCT試験片の弾塑性有限要素法解析とJ積分計算を行った.提案手法によるJ積分計算の結果,J積分値の積分領域の大きさへの依存はなく,いわゆる「J積分の経路独立性」が保証されたと考えられる.これらの研究成果について国内学会で口頭発表を行ってきた.「反復型重合メッシュ法の高度化研究」では,予備研究として行っていた二次元問題解析を三次元問題にスケールアップすることに成功している.また,三次元問題へのスケールアップに先立ち,二次元問題により解析精度向上手法の再検討を行い,Mechanical Engineering Journalに投稿,掲載された.さらに,複数のローカルメッシュ領域を有する問題の解析が可能になった.また,反復法による連立一次方程式の解法に関する調査研究を行い,各種反復型解放を提案している反復型重合メッシュ法に実装し,それらの性能評価を収束までの反復回数などにより調査した.これらの研究成果を国際学術誌に投稿した.研究計画では,「J積分解析手法の高度化研究」についての平成28年度研究計画の概要は以下の通りであった.溶接残留応力や熱ひずみの存在とそれらの連続的・不連続な変化の取り扱い,さらに,材料の機械的性質の連続または不連続な空間的変化をなるべく統一的に取り扱うための定式化に関する研究,J積分計算式の第二積分に含まれるひずみエネルギ密度の微係数の計算手法に関する研究である.それらの計画に対して,溶接残留応力や熱ひずみの存在とそれらの連続的な変化や材料の機械的性質が連続変化する場合のJ積分解析手法の定式化を終了し,ひずみエネルギ密度の空間に関する微係数の解析手法の提案を行った.全てではないが,プログラム実装と数値解析を行い,J積分計算の経路独立性の確認も行った.また,学会発表も行うなど,「J積分解析手法の高度化研究」については概ね順調に進捗していると思われる.「反復型重合メッシュ法の高度化研究」では,研究計画で策定した,(1)三次元問題への展開,(2)複数のローカルメッシュ領域を有する問題への適用ともに完了している.さらに,反復法による連立一次方程式の解法に関する調査研究も実施することができ,順調に進捗していると言える.よって全体としては,「(2)概ね順調に進展している」と言える.本研究は,金属材料からなる構造物の多くが溶接接合によって組立てられる.溶接の過程で溶接金属と母材,あるいは被接合材どうしが溶融・混ざり合い,溶接部材料の機械的性質が連続/不連続に変化する材料に対する計算力学手法や破壊力学解析の高度化を目指すものである.このような構造の破壊力学的評価では,材料の不均一性に対して特に配慮する必要がある.本研究では,計算破壊力学的立場からの基礎的研究を行い,破壊力学パラメータの計算手法について,厳密な定式化と高精度計算を可能にするプログラム実装法,さらに,ボイド等の溶接欠陥の高速なモデル化のための重合メッシュ法ベースのマルチスケール解析手法の提案を行ってきた.

平成29年度は「相互積分法解析手法の高度化研究」と「重合メッシュ法の高度化研究」を研究計画に基づき実施し,ほぼ予定通りに研究を進めることができた.「相互積分法解析手法の高度化研究」では,定式化に基づくプログラム実装を行い,経路独立性に関する評価を行った.さらに,「重合メッシュ法の高度化研究」では,反復型重合メッシュ法の材料非線形問題(弾塑性問題)への展開を行ってきた.プログラム実装は完成し,現在テストを行っているところである.非線形解析の収束性にやや難があるという状況で改良を重ねている.前年度の成果に基づき,平成29年度に実施された国際会議で発表した.さらに,英文学術誌への投稿準備をしているところである.研究計画では,平成29年度は「相互積分法解析手法の高度化研究」と「重合メッシュ法の高度化研究」を行うとしている.平成29年度,「相互積分法解析手法の高度化研究」に関する研究では、弾性定数が材料内で連続変化する場合の定式化を四通り行い,実装の簡便さや数値解析誤差の混入可能性について検討をした.さらに,そのうち最も実装が簡単と思われるものをプログラム実装した.表面き裂や貫通き裂問題について解析を実施し,相互積分法の経路独立性について検討した.さらに,研究代表者らが以前から提案してきた相互積分法の補助場に対する補正項が純粋モードI,IIやIIIとなるか検討をしたところ,純粋な変形モードとはならないため誤差混入の要因となることがわかった.現在,補正項の取り扱いについて検討を行っているが,平成29年度実施予定であった相互積分法の実装は終了したと言える.「重合メッシュ法の高度化研究」では,J2弾塑性問題についてプログラム実装が完了している.現在,その精度検証を重ねているところであるが,非線形問題を解く際に使われるニュートンラフソンアルゴリズムの収束にやや難のあることがわかってきた.しかしながら,J2弾塑性問題についてプログラム実装自体は完了しており,概ね順調に進展している.よって以上より,全体としては「(2)概ね順調に進展している」と言える.本研究は,溶接の過程で溶接金属と母材,あるいは被接合材どうしが溶融・混ざり合い,溶接部材料の機械的性質が連続/不連続に変化する材料に対する計算力学手法や破壊力学解析の高度化を目指すものである.このような構造の破壊力学的評価では,材料の不均一性に対して特に配慮する必要がある.本研究では,計算破壊力学的立場からの基礎的研究を行い,破壊力学パラメータの計算手法について,厳密な定式化と高精度計算を可能にするプログラム実装法,さらに,ボイド等の溶接欠陥の高速なモデル化のための重合メッシュ法ベースのマルチスケール解析手法の提案を行ってきた.「J積分解析手法の高度化研究」では,溶接残留応力や熱ひずみの存在とそれらの連続的な変化や材料の機械的性質が連続変化する場合の定式化を終了している.さらに,ひずみエネルギ密度の空間に関する微係数の解析手法についても研究を行ってきた.これらの検討に基づき,弾塑性変形を受ける傾斜機能材料(材料の機械的性質が空間的に変化する問題)の解析に必要なプログラム実装を行い,CT試験片の弾塑性有限要素法解析とJ積分計算を行った.
酵素蛋白質の構造変化過程からみた生物測時機構

「時間生物学」や「生体リズム学」については,特に,体内時計の所在とメカニズムに関する多くの論議がある.しかし,「生物時計」がどのような物質や仕組みによっているのかは不明のままである.本研究は,生物測時機構について,時計機能をもつと考えられるタンパク質を中心にして分子論的に解明しようとするものである.時計機能をもつタンパク質は,カイコ休眠卵から針状結晶として得られたある種のエステラーゼ(エステーラゼA_4:EaseA_4)である.休眠は一定の持続期間があり,インターバルタイマー型の生物測時現象である.カイコ卵の場合,一定期間の低温(5°C)によってEaseA_4が活性化され,この活性化が休眠終了の引き金になっている.卵を産下2日後から5°Cに冷蔵すると,休眠は約2週間で終了し,この直前にEaseA_4が最大活性を示した.産下2日後卵のEaseA_4をin vitro冷蔵しても,約12日後に活性のピークが現れた.卵を産下2日後から12日後まで冷蔵し,この10日冷蔵卵のEaseA_4をin vitro冷蔵すると, 2日前後すなわち, in vivoとの合計で約12日後にピークが現れた. 24日間の冷蔵によって完全に失活したEaseA_4を6M塩酸グアニジン(GuHCl)処理したところ,約12日後にピークが出現した.再びGuHCl処理しても,再々冷蔵12日後に活性が出現した.活性発現前,すなわち冷蔵8日後にG_uHCl処理しても,処理12日後に活性が現れた.EaseA_4タンパク質の構造中にタイマー機構が組み込まれている可能性がある.カイコ休眠卵の活性化は,真核生物の遺伝子発現・代謝調節機構に関する生化学的実験系の有効なモデルである.本研究により,測時機構と遺伝子発現スイッチングとの接点が求められれば幸いである.「時間生物学」や「生体リズム学」については,特に,体内時計の所在とメカニズムに関する多くの論議がある.しかし,「生物時計」がどのような物質や仕組みによっているのかは不明のままである.本研究は,生物測時機構について,時計機能をもつと考えられるタンパク質を中心にして分子論的に解明しようとするものである.時計機能をもつタンパク質は,カイコ休眠卵から針状結晶として得られたある種のエステラーゼ(エステーラゼA_4:EaseA_4)である.休眠は一定の持続期間があり,インターバルタイマー型の生物測時現象である.カイコ卵の場合,一定期間の低温(5°C)によってEaseA_4が活性化され,この活性化が休眠終了の引き金になっている.卵を産下2日後から5°Cに冷蔵すると,休眠は約2週間で終了し,この直前にEaseA_4が最大活性を示した.産下2日後卵のEaseA_4をin vitro冷蔵しても,約12日後に活性のピークが現れた.卵を産下2日後から12日後まで冷蔵し,この10日冷蔵卵のEaseA_4をin vitro冷蔵すると, 2日前後すなわち, in vivoとの合計で約12日後にピークが現れた. 24日間の冷蔵によって完全に失活したEaseA_4を6M塩酸グアニジン(GuHCl)処理したところ,約12日後にピークが出現した.再びGuHCl処理しても,再々冷蔵12日後に活性が出現した.活性発現前,すなわち冷蔵8日後にG_uHCl処理しても,処理12日後に活性が現れた.EaseA_4タンパク質の構造中にタイマー機構が組み込まれている可能性がある.カイコ休眠卵の活性化は,真核生物の遺伝子発現・代謝調節機構に関する生化学的実験系の有効なモデルである.本研究により,測時機構と遺伝子発現スイッチングとの接点が求められれば幸いである.休眠は、一定の持続期間があり、タイマ型生物測時現象である。カイコ卵の休眠は、低温によって打破される。タンパク質が時間をはかり得る可能性を、カイコ卵の休眠期間と低温によるエステラーゼ【A_4】(Ease【A_4】の活性化との関係から検討した。材料と方法:カイコ支108号休眠卵のEase【A_4】を、アセトン粉末・熱処理・ゲル濾過およびFPLCで精製し、精製Ease【A_4】を滅菌プラスチックチューブに5°Cでin vitro冷蔵した。また、6M塩酸グアニジン(GuHcl)で処理したEase【A_4】を、5mM還元型グルタチオンおよびシステイン共存下でも冷蔵した。酵素活性はβ-ナフチル酢酸の分解量から求めた。結果および考察:卵を産下2日後から5°Cに冷蔵すると、休眠は約2週間で終了し、この直前にEase【A_4】が最大活性を示した。産下2日後卵のEase【A_4】をin vitro冷蔵しても、約12日後に活性のピークが現われた。卵を産下2日後から12日後まで冷蔵し、この10日冷蔵卵のEase【A_4】をin vitro冷蔵すると、2日前後、すなわちin vitroとの合計で約12日後にピークが現われた。1ヵ月間の長期冷蔵によって完全に失活したEase【A_4】をGuHcl処理したところ、約12日後にピークが出現した。再びGuHcl処理しても、再々冷蔵12日後に活性が出現した。活性発現前、すなわち冷蔵8日後にGuHcl処理しても、処理12日後に活性が現われた。Ease【A_4】
磁性ナノ構造の形成と新機能創出

本研究では、自己組織的手法によって磁性ナノドットを数十nmの間隔で高密度に形成する適切な材料および作製条件を探索すると共に、10nm程度のドットの磁化を、隣接ドットの磁化は乱すことなく、検出・制御する手法の確立を目指している。具体的には、走査トンネル顕微鏡(STM)を利用し、スピン偏極電子を探針から磁性ドットへトンネル注入することでドットの磁化制御を試みる。スピン偏極電子をトンネル注入するには、STM探針が磁性材料から構成される必要がある。その一方で、探針から生ずる巨視的磁場がドットの磁化方向を乱すことは避けなければならない。以上2つの要請を両立するため、非磁性のタングステン探針に磁性物質を数-十数原子層だけ蒸着した探針を用いる方式を採ることとした。昨年度は、探針先端を2300K以上に加熱できる加熱機構を作製/導入した。更に、蒸着材料としてFe、Co、及びCrを備えた蒸着装置を作製し、蒸着中の真空度の劣化を5×10-10 Torr以下に抑制できることを確認した。以上を踏まえて平成15年度は次のことを行った。(1)磁化探針の性能評価の標準試料として、Cr(001)の薄膜をMgO基板上に作製した。清浄なCr(001)表面は単原子層ステップを跨ぐごとにテラスの磁化方向が反転する層状反強磁性表面であることが知られている。作製した薄膜に清浄Cr(001)表面に特徴的な表面準位が観察されることを確認した。ただし現状では、蒸着中に取り込まれる微量の不純物炭素のため、所望の1x1ではない複雑な長周期構造を表面の一部が呈している。尚一層の清浄化を図るため、蒸着装置の脱ガスを徹底するとともにイオン衝撃加熱設備の導入を予定している。(2)GaA(001)を磁性微細構造作製の基板として利用するには、通常よりも低い成長温度に設定する必要がある。こうした特殊な成長条件化における表面のラフニングが成長開始前の表面構造に強く依存していることを明らかにした。(3)スピン偏極率が100%であると理論計算から予言されている閃亜鉛鉱型MnAsをGaAs(001)基板上に作製することを目指して、初期成長過程の観察を行い、その構造モデルを提示した。具体的には、走査トンネル顕微鏡(STM)を利用し、スピン偏極電子を探針から磁性ドットへ(あるいはその反対方向に)トンネル注入することでドットの磁化の制御を試みる。これに向けて、平成14年度は以下のことを準備した。スピン偏極電子をトンネル注入するには、STM探針が磁性材料を構成要素として持つ必要がある。以上2つの要請を両立するため、非磁性のタングステン探針に磁性物質を数-十数原子層だけ蒸着した探針を用いる事とした。再現性のあるデータを得るには、磁性薄膜の表面を超高真空中で長時間清浄に保持することが必須である。蒸着中の真空度の劣化を5×10^<-10>Torr以下に抑制できる電子衝撃加熱型の蒸着装置を作製/導入した。蒸着材料として、強磁性のFeとCo、及び反強磁性のCrを装備した。スピン偏極電子のトンネル注入によってドットの磁化反転を再現性良く行うには、探針の形状、及びそこに蒸着した薄膜の磁気特性の再現性向上は必須である。そのため、探針作製と走査電子顕微鏡(SEM)による探針形状の評価を繰り返し行い、電解研磨の条件と探針形状の相関の理解に努めた。また、加熱による探針の清浄化と結晶粒径の増大によって、蒸着膜の特性の再現性が向上することを意図した。超高真空中において、探針先端を2300K以上に加熱でき、同時に光学的温度測定も行える加熱機構を作製/導入した。