hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
タンパク質立体構造情報に基づく発光プローブの開発

個々の生体分子の細胞内や動物個体内での「構造・機能・動態」を詳細に解明することは,現在の生命科学研究において最も重要な課題である.本研究は, (1)タンパク質のリン酸化,(2)ペプチド切断酵素活性を,低侵襲的に可視化するための新たなプローブ分子の開発原理を創案し,実際に生きた動物個体内で可視化できることを目的とした.(1)緑色を発するElucN-14-3-3/Bad-McLuc1プローブを開発し、内在性コントロールとして赤色光を発する鉄道虫由来の赤色ルシフェラーゼ(SLRLuc)を細胞に発現させ,同一の発光基質D-Luciferinを用いたマルチカラーイメージングを行った.2種類のバンドパスフィルターを利用したマウスイメージングシステムを組み上げ, Bad-14-3-3間相互作用を半定量的に評価することに成功した.ElucとSLRLucは、マウス個体における二色発光イメージングに有用なツールとして利用できることを実証した.(2)本年度は環状Flucが,生きたマウス体内のカスパーゼ-3活性の検出に応用可能であるか、さらなる検証を実施した.環状Flucを発現するHeLa細胞をマウス背中の右側に移植した.マウスにSTS(100μg/kg体重)を腹腔内(i.p.)注射した場合に行ったところ,コントロールに対し有意な増加が見られた.環状Flucを用いた発光イメージング法は,カスパーゼ活性をリアルタイムで高感度検出できることを実証した.アンドロゲンリセプター(AR)は,男性ホルモンDihydrotestosterone (DHT)と結合すると,核内に移行するとともに,細胞膜状のSrcと相互作用することが知られている.このARとSrcとの相互作用を,発光タンパク質luciferaseの再構成法により検出する新たな薬物スクリーニング法を開発した.二分割したluciferaseのN末側とC末側をそれぞれ,ARとSrcに連結した.培養細胞Cos-7細胞に発現させ,DHT刺激を加えた.その結果,発光強度が5倍程度上昇することがわかった.発光強度はDHT濃度依存的であり,女性ホルモンestrogenには全く応答しないことがわかった.様々な薬物や化学物質に対して,ARのgenomicな作用とnon-genomicな作用を調べ比較検討した.(ACSChem. Biol., 2, 484-492 (2007))生きた細胞内ミトコンドリアで機能するRNAを,塩基配列特異的に可視化する蛍光プローブを開発した.標的とするmRNAは,ミトコンドリアゲノムから合成されるNADH dehydrogenase subunit 6 (ND6)mRNAとした.ND6 mRNAの選択的な認識を目的として,RNA結合タンパク質Pumilioの変異体を作製した.ND6 mRNA配列選択的なプローブの認識を,ゲルシフトアッセイにより実証した.このプローブを用いて,生きた単一のミトコンドリア内におけるND6 mRNAの局在とその動態を,を蛍光顕微鏡により観察し明らかにした.細胞内在性のmRNAを可視化できる新たな原理に基づくプローブであり,細胞内RNAの機能解析の進展が期待できる.(Nature Methods, 4, 413-419 (2007))個々の生体分子の細胞内や動物個体内での「構造・機能・動態」を詳細に解明することは,現在の生命科学研究において最も重要な課題である.本研究は, (1)タンパク質のリン酸化,(2)ペプチド切断酵素活性を,低侵襲的に可視化するための新たなプローブ分子の開発原理を創案し,実際に生きた動物個体内で可視化できることを目的とした.(1)緑色を発するElucN-14-3-3/Bad-McLuc1プローブを開発し、内在性コントロールとして赤色光を発する鉄道虫由来の赤色ルシフェラーゼ(SLRLuc)を細胞に発現させ,同一の発光基質D-Luciferinを用いたマルチカラーイメージングを行った.2種類のバンドパスフィルターを利用したマウスイメージングシステムを組み上げ, Bad-14-3-3間相互作用を半定量的に評価することに成功した.ElucとSLRLucは、マウス個体における二色発光イメージングに有用なツールとして利用できることを実証した.(2)本年度は環状Flucが,生きたマウス体内のカスパーゼ-3活性の検出に応用可能であるか、さらなる検証を実施した.環状Flucを発現するHeLa細胞をマウス背中の右側に移植した.マウスにSTS(100μg/kg体重)を腹腔内(i.p.)注射した場合に行ったところ,コントロールに対し有意な増加が見られた.環状Flucを用いた発光イメージング法は,カスパーゼ活性をリアルタイムで高感度検出できることを実証した.
水田及び畑土壌における徴生物活動の徴細分布と“Active Site"

畑及び水田土壌の作物生産に深く関わる土壌中の物質代謝(養分循環)に果している土壌徴生物の役割をより深く洞察するためには、土壌をその構成要素に分け、どの部分が徴生物活動の拠点(Active Site)になっているのかを定量的に解明し、徴生物の活動拠点が似肥管理によりいかなる変動を示すかを解明する必要がある。そこで、我国の主食の米及び欧米の主食の小麦を生産する施肥管理を異にする水田及び畑土壌を選び、種々の粒径の植物遺体画分、シルト及び粘土画分等の各構成要素に、和田・金沢の土壌の物理的分画法により分離・分画した。供試土壌は、農水省農業センタ-の長期肥料運用水田圃場及びドイツのベルリン郊外の小麦連続裁培畑圃場を用いた。得られた諸画分につき、各種徴生物数及びバイオマス、及び炭素・窒素・燐化合物の分解に関与する酵素活性を測定した。得られた結果を要約すれば、次のごとくである。1)水田及び畑土壌ともに、植物遺体画分(〉37μm)の各種徴生物数、バイオマス量及び酵素活性はその粒径が細かくなるに伴って減少した。粘土画分の徴生物数量は、シルト画分よりも著しく高く、粒径の細かい植物遺体画分に相当するほど富化していた。無機質粒子画分の徴生物活動は極端に低かった。2)全土壌に占める植物遺体画分の割合は水田及び畑土壌ともにほんの数%にすぎないが、徴生物数は2579%、バイオマスは3968%、酵素活性は2968%もそれぞれ占めていた。これらの結果から、土壌の物質代謝の“Active Site"は植物遺体画分であることが明らかとなった。また、土壌の物質代謝の“Active Site"を担う植物遺体の量は、有機物施用(堆肥)区で最も多く、次いで化学肥料区、無肥料区で最も少なかった。
「混ぜない」，「集めない」をコンセプトとした資源回収型排水処理技術の開発と評価

「混ぜない」,「集めない」というコンセプトを適用した新しい資源回収型排水処理体系を提案し,3つのモデル(水・衛生問題解決と資源回収を同時に行う途上国農村モデル,途上国スラムモデル,自然共生型日本里山モデル)に必要な要素技術とその評価法を開発した.開発した主要な技術は1糞便をコンポス化するトイレ技術,2尿の濃縮技術,3尿中窒素とリンの回収技術,4回収資源の農業利用技術,5雑排水の再生利用技術,6バイオアッセイによる毒性評価技術,7病原微生物不活化評価技術である.窒素,リン,水フローの調査・解析により,ブルキナファソ農村とインドネシアのスラム街での新システムの導入可能性が示された.「混ぜない」,「集めない」というコンセプトを適用した新しい資源回収型排水処理体系を提案し,3つのモデル(水・衛生問題解決と資源回収を同時に行う途上国農村モデル,途上国スラムモデル,自然共生型日本里山モデル)に必要な要素技術とその評価法を開発した.開発した主要な技術は1糞便をコンポス化するトイレ技術,2尿の濃縮技術,3尿中窒素とリンの回収技術,4回収資源の農業利用技術,5雑排水の再生利用技術,6バイオアッセイによる毒性評価技術,7病原微生物不活化評価技術である.窒素,リン,水フローの調査・解析により,ブルキナファソ農村とインドネシアのスラム街での新システムの導入可能性が示された.2009年度はシステムを構成する要素技術に関する研究を主に実施した.以下にその概要を記す.(1)要素研究-1し尿処理:コンポストトイレの水分蒸発能力と供給空気の温度,湿度の関係を求める方法を開発し,供給水分量を基礎とした,コンポスト型トイレの設計法を確立した.次にコンポストトイレの低コスト化の方策として,手動撹拌,無加温型コンポストトイレの試作を行った.良好な糞便分解を確認した.ただし,撹拌翼の構造については,継続した研究が必要である.尿中医薬品の医薬品の低電圧電解処理の可能性を検討するため,リン酸バッファ中にて,の医薬品について電解処理特性をサイクリックボルタンメトリー(CV)により測定し,かつ医薬品の電解酸化特性を測定した.その結果,1.5V以下の電圧で医薬品の処理が可能であることが示された.(2)要素研究-2雑排水処理再利用技術:分散型システムでは,排水の流量と水質変動が著しいが,処理システムを簡略化するために流量調整槽を設けず,かつ,ポンプを用いない膜分離型生物反応層の処理特性を検討し,界面活性剤を含め,所定の処理水質が得られることが確認された.自然流下方式+流量調整槽無しで運転する傾斜土層法の処理特性を検討し,病原微生物除去,界面活性剤除去に必要な装置設計法開発に必要な基礎数値を得た.(3)要素研究-3微量汚染物質モニタリング:HSP47及びHSP90β遺伝子導入細胞作製の結果、それぞれ10Line以上の「HEK293-HSP47細胞」、「HEK293-HSP90β細胞」、「Caco-2-HSP47細胞」、「Caco-2HSP90β細胞」の作製に成功した。さらに、作製した各Line細胞においてLPS処理による細胞ストレス反応を確認した。微量汚染物質のモニタリングの可能性が示された.(4)要素研究-4衛生学的管理手法:コンポスト中での微生物の損傷レベルを異なる3種の培地にて測定した結果,膜損傷や特定酵素の損傷のみといった半致死的な不活化は生じておらず,全て致命的な損傷が与えられれていることが確認された.また,微生物の濃度減少を左右する因子として既に知られている温度と含水率以外の因子としてコンポスト中に共存する微生物の存在や,共存物質の影響について検討した.(5)実証実験:インドネシアにおいて,コンポスト型トイレを試作し,運転を開始した.(1)要素研究-1し尿処理:低コストコンポストトイレ(手動撹拌,無加温型コンポストトイレ)について,反応槽そのものを回転させる形の試作と連続運転を実施し,有機物分解特性,大腸菌数,撹拌必要トルクの測定を実施した.その結果,本試作機の妥当性が確認された.尿の濃縮法のうち,布に毛管力により尿を供給し,換気条件下での水分を蒸発させる方法について,特性の実験的評価とモデル化を実施した.水分蒸発を含めた水分移動モデルを構築し,物質移動係数について無次元実験式を得た.また,モデルを用いた,装置設計法を提案した.尿中窒素を緩効性肥料として回収する方法を考案し,特許の申請を行った.リンについては,回収結晶の構造同定を行った.医薬品の電解酸化特性については,電極枚数と分解速度の関係を測定した.(2)要素研究-2雑排水処理再利用技術:流量調整槽を設けず,かつ,ポンプを用いない膜分離型生物反応層の処理特性を検討し,界面活性剤を含め,所定の処理水質が得られること,膜ファウリング特性が通常の流量一定操作と同じであることが確認された.(3)要素研究-3微量汚染物質モニタリング:Hsp90・を指標とした評価系が汚染物質におけるストレス反応生の評価を行った.その結果,グラム陰性菌有来の毒性物質であるLPS,及び重金属であるPb、Niに有意に反応することを見出した.さらに,Caco-2細胞,HEK293細胞においてHsp47,Hsp90・のプロモーターを用いたレポーターベクターを安定に染色体内に導入した遺伝子導入細胞の作製も行った.(4)要素研究-

4衛生学的管理手法:コンポスト型トイレの担体中での病原細菌およびウイルスの損傷部位を把握することによって,より致命的な損傷を与える運転条件を検討した結果,(1)大腸菌は低含水率条件,および高pH条件(pH9.6以上)では,核酸や必須代謝機能の損傷といった致命的な損傷を受ける,(2)大腸菌ファージQβはカプシド損傷が主な機構であることが明らかとなった.(5)実証実験:途上国スラムモデル:インドネシアにおいて,コンポスト型トイレを試作し,運転を開始した.途上国農村モデル:農家における物質,value chainを調査し,適切なサニテーションシステムとその周辺システムの関係を明らかにした.(1)要素研究-1し尿処理:病原微生物の不活化に対するマルチバリアとしてコンポスト取り出し時の石灰添加を検討した結果,特定酵素や細胞外膜への損傷など致命的な損傷をおこすことでできることが分かった.尿だめに布を浸し,その布に自然換気にて通風する方法によって,水分を蒸発させ,尿を濃縮するシステムにおいて,濃縮された尿中では尿素の加水分解が抑制され,アンモニア態窒素成分の揮発も抑制できることが示された.尿中窒素から緩効性肥料を作成する研究では,反応条件と窒素回収率の関係を得た.リン回収では,Ca量により生成結晶のDCPDかHAPとなることが示された.(2)要素研究-2雑排水処理再利用技術:処理装置の必要長さを処理水の作物成長阻害性から求めることが可能となり,処理水LAS濃度目標値を得た.高速沈降性藻類池では藻類集積に必要なSRT値を得た.(3)要素研究-3微量汚染物質モニタリング:LASのヒト腸管上皮細胞であるCaco-2に及ぼす影響やLASに対するバイオマーカーの探索を行った結果10種のバイオマーカーを得た.これらはタイト結合の不可逆的な崩壊やバリアー機能促進,アポトーシス誘導,酸化ストレスに関わるタンパク質であった.バイオマーカーを細胞種,汚染源,バイオマーカー種による分類を行い,環境リスク評価に対するバイオマーカーのデータベース構築を行った.(4)要素研究-4衛生学的管理手法:核酸修飾剤のPMA(PropidiumMonoazide)を,従来の寒天培地培養法と組み合わせることによって,膜損傷細菌の検出感度を大幅に向上させると共に,定量的な評価が可能になった.病原細菌や病原ウイルスに致命的な損傷を与えつつ,不活化速度を促進させる方法としては,pHを高くすることが有効であることがより確認された.(5)実証実験:途上国スラムモデル:インドネシアにおいて,コンポスト型トイレを試作し,運転を開始した.途上国農村モデル:農家における物質,value chainを調査し,適切なサニテーションシステムとその周辺システムの関係を明らかにした.「集めない」,「混ぜない」を実現する資源回収型システムの要素技術とその導入に関わる実証実験を行った.1)し尿処理技術:尿から緩効性窒素肥料を作成する場合,尿を濃縮するほど窒素の回収効率が高くなることを見出し,この反応系を表現するモデルを構築した.リン回収では焼成した貝殻を用いる方法を検討し,結晶成長の過程で結晶構造が変化することを見出した.(2)雑排水処理再利用
原始星星周塵のケイ酸塩鉱物前駆物質の構造解明

最近の赤外線源の観測データがIRAS観測から集大成され,星周塵,星間塵そして原始太陽系の前駆段階に相当する原始星の塵の赤外線スペクトルの全容が明らかになった.その結果,銀河の塵は全て原子星塵に至まで10μmにブロードなピークをもち,少なくとも太陽系の結晶性の岩石とは異なる構造を有することが示唆さた.筆者らは,星間塵を酸化度の低いいわゆるサブオキサイド(低酸化物)の混合物と推定し,太陽系誕生初期に急激な変成を受け現在のケイ酸塩鉱物を形成したと考えている.その鉱物前駆物質の主要骨格を形成する物質としてSiO分子からの急冷固体に着目した.そのため,まずは安定なSiO分子流を製造すること,引き続きそれからの急冷固体の諸物性の測定および構造のちがいによる分類を行うことが必要である.本研究ではSiO_2+Siの当量混合物からSiOガス流が得られることを確定した.その急冷固体のX線回折測定からそれがSiO_2構造とは異なり非晶質の物質であり,電子スピン共鳴測定から不完全結合の電子をもつ物質であることを明らかにし,極めて反応性にとむ物質であることを示した.これらの急冷固体は基本的に2群に分類できた.即ち,密度の低いところで急冷固化したもの(Molecule Frost)およびガス密度の高いところで急冷固化したもの(Cluster Frast)がある.それらの赤外線スペクトルのなかで,星周塵の10μmブロードピークと低温の基板上で析出したCluster Frostとが良く似ていることを明らかにした.これらのSiO急冷固体は400°Cでその構造が変化しはじめ, H_2Oの共存下では200°Cで変化する.今回の研究でサブオキサイドダストの主要骨格をなすSiO急冷固体の製造に成功し,それらが活性な物質であることを明らかにできた.今後塵中に共存が推定されるFeO, MgOなどのサブオキサイドのSiO_2急冷固体への混入過程の検証およびそれら混合物の反応を明らかにしたい.最近の赤外線源の観測データがIRAS観測から集大成され,星周塵,星間塵そして原始太陽系の前駆段階に相当する原始星の塵の赤外線スペクトルの全容が明らかになった.その結果,銀河の塵は全て原子星塵に至まで10μmにブロードなピークをもち,少なくとも太陽系の結晶性の岩石とは異なる構造を有することが示唆さた.筆者らは,星間塵を酸化度の低いいわゆるサブオキサイド(低酸化物)の混合物と推定し,太陽系誕生初期に急激な変成を受け現在のケイ酸塩鉱物を形成したと考えている.その鉱物前駆物質の主要骨格を形成する物質としてSiO分子からの急冷固体に着目した.そのため,まずは安定なSiO分子流を製造すること,引き続きそれからの急冷固体の諸物性の測定および構造のちがいによる分類を行うことが必要である.本研究ではSiO_2+Siの当量混合物からSiOガス流が得られることを確定した.その急冷固体のX線回折測定からそれがSiO_2構造とは異なり非晶質の物質であり,電子スピン共鳴測定から不完全結合の電子をもつ物質であることを明らかにし,極めて反応性にとむ物質であることを示した.これらの急冷固体は基本的に2群に分類できた.即ち,密度の低いところで急冷固化したもの(Molecule Frost)およびガス密度の高いところで急冷固化したもの(Cluster Frast)がある.それらの赤外線スペクトルのなかで,星周塵の10μmブロードピークと低温の基板上で析出したCluster Frostとが良く似ていることを明らかにした.これらのSiO急冷固体は400°Cでその構造が変化しはじめ, H_2Oの共存下では200°Cで変化する.今回の研究でサブオキサイドダストの主要骨格をなすSiO急冷固体の製造に成功し,それらが活性な物質であることを明らかにできた.今後塵中に共存が推定されるFeO, MgOなどのサブオキサイドのSiO_2急冷固体への混入過程の検証およびそれら混合物の反応を明らかにしたい.
火星大気観測用二次元分光器の基礎開発

本研究では、冷凍機が不要で小型軽量化が実現できる「非冷却ボロメータカメラ」に、透過型ゲルマニウムレンズよりも高い光量を得られる反射光学系を適用した「宇宙用赤外二次元分光器」の実現に向けた基礎開発を行った。反射光学系には鏡の枚数を最小限にして最大の光量を得るために表面を凹面加工した回折格子を採用し、ボロメータ検出器(平面)に焦点を結ばせる(フラットフィールドタイプ)こととし、汎用のナノ切削加工機を用いて回折格子の試作品(焦点距離100mm、F1. 4)を製作して面精度を評価した。結果、目標である0. 5μm僅かに上回る0. 59μmであったが、これは加工用の刃先の損傷による傷であることが確認でき、汎用加工機によって安価に回折格子が製造できる見通しがついた。国内では火星探査計画「MELOS」の検討が進み、周回軌道から水蒸気、ダスト、大気(二酸化炭素)の二次元同時観測が提案されている。しかし二酸化炭素の15μm吸収帯を二次元で分光観測する観測装置の実用化には目処が立っていない。反射光学系には鏡の枚数を最小限にして最大の光量を得るために表面を凹面加工した回折格子を採用し、ボロメータ検出器(平面)に焦点を結ばせる(フラットフィールドタイプ)こととした。一般に、回折格子の溝を掘る加工手法は、(1)ルーリングエンジンと呼ばれる加工機で直接溝を掘るルールド方式、(2)鏡面に印紙を貼って感光させるホログラフィック方式(フォトレジスト法)が挙げられる。前者は平面に直線的な溝を掘る事に優れているが、検出器表面(平面)に焦点を結ぶために凹面鏡に曲線の溝を掘ることができないこと、後者も曲面に印紙を密着させて感光させることが困難であることがわかった。更に、回折格子は主に可視近赤外領域の製品が普及している一方、15μm帯では用途が限られて民生品の種類が限られているため、これらのうちいずれかの手法を改善して凹面の回折格子を製作していくとコストが大幅に増大してしまい、現実的ではなくなってしまうことがわかった。そこで汎用のナノ切削加工機を用いて安価に製作できる方策を検討したところ、(株)樹研工業が所有する加工機「AHN15-3D(5軸仕様)」を用いれば、試作品として焦点距離100mm、F1.4を実現できる見込みを得たので、面精度0.5μm以下を目標に回折格子を製作した。前年度に設計・製作したフラットフィールドタイプの反射型凹面回折格子(焦点距離100m、F1.4)の面精度を測定したところ、0.59μmであり、目標である0.5μm以下を達成できなかった。原因を調査すると以下の2点が判明した。(1)今回設計した凹面はX軸とY軸の曲率が異なるトロイダル面であり、溝を掘るにはバイト(刃)を平行移動させる必要があった。かつ、焦点距離100mを確保しつつ、より径が大きい鏡を実現するには、凹面の端部と刃先が干渉しないよう(逃げ角を確保するため)刃先を鋭利(従来は70-80°であるものを35°以下)にする必要があった。このバイトを特注したものの刃先角度が小さいために刃先稜線の剛性が落ちて刃先が欠けてしまい、その結果堀った溝に傷線が入って面精度が落ちてしまった。(2)バイトを平行移動させると曲率の異なる凹面の中心から端にかけての主分力と背分力が変化し、面精度を悪化させてしまった。(2)を改善するには加工機そのものと治具を改修する必要があるために費用が大掛かりとなってしまうが、(1)の刃先の改善が実現すれば面精度の向上が見込まれる。そこで刃先の剛性を保ちつつ(刃先を鋭角にせず)逃げ角を確保するため、スクイ面をネガティブにした形状の刃先を考案して設計を行った。これを製作して溝加工を行えば、面精度0.5μm以下の回折格子の製作が見込まれる。これにより汎用のナノ切削加工機による安価な回折格子の実現に見通しをつける事ができた。
緑内障性視神経障害の機能的障害と組織学的障害との関連の解明

正常雄性カニクイザル18頭36眼について、レーザー走査眼底断層計にて視神経乳頭の形態を計測し、視神経乳頭の12個パラメーターの性状につき検討した。その結果、正常カニクイザル眼において、視神経乳頭形態の経時的変化をモニターするのに最適なパラメーターは、乳頭辺縁部面積と乳頭縁高低差であると結論できた。雄性カニクイザル11頭を用い、レーザー隅角照射法により実験的高眼圧モデルを作成し、視神経乳頭陥凹形態の変化を経時的に観察後、組織学的検索を行った。その結果、レーザー照射後眼圧は有意に上昇しそれに相関して、視神経乳頭のすべてのパラメーター(乳頭面積値は除く)は経時的に悪化していった。その傾向は、眼圧上昇後4週間でピークに達した。また、組織標本より計測した網膜神経線維層厚は、生体計測による計測値と有意に相関した(p<0.0002)。家兎とサルを用いて、水溶性カルシウム拮抗薬であるイガニジピン点眼後の視神経乳頭部組織血流の変化をレーザースペックル法を用いて調べたところ、同薬点眼は、乳頭組織血流を1回点眼で約10%、1週間連続点眼で約30%増加させた。サル眼においても、1週間連続点眼にて約40%の組織血流の増加がみられた。Leber遺伝性視神経萎縮症の視神経乳頭陥凹の三次元解析結果から、同症と正常眼圧緑内障のそれとの間に、一部共通する病因のある可能性が示唆された。緑内障線維柱帯切除術後に良好な濾過胞形成がなされている症例について経過観察した。その結果、濾過胞部のマッサージ後に房水流出の頻度は有意に上昇し、特に1象限近くに拡大した無血管性の濾過胞にその傾向が強かった。多施設オープン試験にて、正常眼圧緑内障に対し無作為にチモロールとラタノプロスト点眼に割付け、3年間経過観察した。その結果、3年間眼圧は有意に下降し、視神経乳頭陥凹の悪化や視野の悪化はいずれの点眼群においてもみられなかった。体重3Kg以上の雄性カニクイザル11頭を用い、ケタミン麻酔下にて、それぞれの個体の両眼眼圧、角膜曲率半径測定およびステレオ眼底撮影を行い、さらに視神経乳頭の三次元的変化をレーザー走査検眼鏡(ハイデルベルグレチナトモグラフ、ハイデルベルグエンジニアリング社製、ドイツ)にて立体測定した。ついで、左眼に対しレーザー隅角照射法により、実験的に高眼圧モデルを作成し、上記の計測を1、3、4、5、6、8、10、12、14、16週に行い、視神経乳頭陥凹形態の変化を観察した。最終観察後に、全身麻酔下にて組織固定液の静脈内投与による灌流固定にて屠殺し、眼球を摘出後、組織検索を行った。全ての実験は、米国視覚と眼科研究会議(ARVO)で定められた実験動物取り扱い規約にのっとって施行された。レーザー隅角照射後、眼圧は実験終了まで、平均30ミリメーター水銀柱まで常時上昇した。この眼圧は、コントロールとし、た右眼に比し全ての期間において有意に高い値であった。

立体計測では、視神経乳頭面積を除いたすべてパラメーター(乳頭陥凹面積および体積、乳頭辺縁面積および体積、陥凹深度、陥凹傾斜度)は経時的に悪化していった。しかし、その変化は眼圧上昇後4週までに急速にピークに達し、その後は比較的ゆるやかに変化した。また、組織標本より計測した網膜神経線維層厚は、立体計測による乳頭パラメーター値と有意な相関を示した(P<0.0002)。これらのことから、高眼圧による視神経乳頭陥凹の緑内障性変化は、猿眼においては眼圧上昇後4週という短い期間で速やかに成立することが確認された。緑内障線維柱帯切除術後に良好な濾過胞形成がなされている症例について経過観察し、濾過胞からの房水流出の頻度を濾過胞の形態別に比較検討した。その結果、濾過胞部のマッサージ後に房水流出の頻度は有意に上昇し、特に1象限近くに拡大した、無血管性の濾過胞を持つ症例にその傾向が強かった。Leber遺伝性視神経萎縮症(以下、LHON)は視神経萎縮と視力障害を伴う遺伝性疾患であるが、同疾患の中には視神経乳頭陥凹の拡大を認めるものもあり、正常眼圧緑内障による視神経乳頭障害との鑑別が重要な意味を持つ。走査レーザー検眼鏡を用いて、LHON患者15人、正常眼圧緑内障患者15人、および正常人25人の視神経乳頭部を三次元解析したところ、LHON患者の視神経乳頭は正常人に比し、明らかに大きな視神経乳頭陥凹の拡大を認めた。しかしながら、正常眼圧緑内障患者と比較すると、陥凹の深さは有意に浅かった。このことは、LHONの視神経乳頭陥凹と正常眼圧緑内障眼のそれとの間に、一部共通する病因のある可能性が示唆された。狭隅角眼は、急性の隅角閉塞を起こし易く、前房深度が浅い、眼軸長が短い傾向にあるなどの特徴を有することが多い。しかしながら、視神経乳頭形態の特徴については不明な点も多い。全周Shaffer分類で2度以下、視野正常かつ周辺虹彩前癒着をみとめない狭隅角眼20眼と、隅角は広隅角かつ年齢、屈折をマッチしたコントコール12眼を対象として視神経乳頭形態を走査レーザー検眼鏡にて三次元解析した。眼圧は狭隅角眼とコントロール眼で差はなかった。視神経乳頭形態については、狭隅角眼は、正常コントロール眼に比しリム面積とリム体積が有意に大きかった(p<0.02)。このことから、狭隅角眼と広隅角眼では、乳頭形態も潜在的に異なる可能性がある。正常の雄のカニクイザル18頭36眼について、レーザー走査眼底断層計にて視神経乳頭の形態を計測し、正常サル視神経乳頭の12個パラメーターの性状につき検討した。形態計測は一頭につき1週間以内に3回行い、その平均値を解析の対象とした。その上で、各パラメーターの平均と標準偏差、左右眼における各パラメーターの差、および各パラメーター間の相関性を検索した。その結果、12の視神経乳頭パラメーターにおいては、左右眼に差は存在しなかった。中でも、視神経乳頭面積、乳頭辺縁部面積、乳頭縁の高低差の左右差は他のパラメーターの中でもより差が少なかった。3回計測した際の各パラメーターの測定変動係数は、乳頭辺縁部面積、乳頭縁高低差、乳頭辺縁体積、平均陥凹深度、最大陥凹深度、平均網膜神経線維層厚、網膜神経線維層断面面積で10%以下であり、特に乳頭辺縁部面積は5%以下の変動係数であった。乳頭辺縁部面積と乳頭縁高低差の間には、関連性は薄く、乳頭面積との相関も見られなかった。以上のことから、カニクイザル眼において、視神経乳頭形態の経時的変化をモニターするのに最適なパラメーターは、乳頭辺縁部面積と乳頭線高低差であると結論できた。家兎とサルを用いて、水溶性カルシウム拮抗薬であるイガニジピン点眼後の視神経乳頭部組織血流の変化をレーザースペックル法を用いて調べたところ、同薬点眼は、乳頭組織血流を1回点眼で約10%、1週間連続点眼で約30%増加させた。サル眼においても、1週間連続点眼にて約40%の組織血流の増加がみられた。
悪性黒色腫の臓器特異的転移とサイトカイン、特に肺転移とGM-CSF産生との関連

当初の研究計画にもとずき、まずヒト由来悪性黒色腫(以下MMと略す)9株のサイトカインのうちGM-CSF,IL-1,IL-6の産生能を調べた。その結果、これらのサイトカイン産生を認めないものが3株、GM-CSFのみ産生するもの2株、IL-1を産生するもの1株、IL-6を産生するもの2株、IL-1,IL-6ともに産生するもの1株であった。GM-CSFとIL-1または6をともに産生する細胞株はなかった。GM-CSFを産生する2株の細胞のうち1株ではCD-44の発現が細胞膜表面に認められたが、他の1株にはCD-44の発現は認められなかった。またGM-CSFを産生しない細胞株でもCD-44の発現は認められなかった。GM-CSFを産生する2株について、IFN-βがGM-CSF産生に及ぼす影響を調べるため、細胞培養上清中に、IFN-βをそれぞれ、10^2IU/ml,10^3IU/ml,10^4IU/ml加え、3日間培養し、上清中のGM-CSFの濃度を調べたところ、濃度に依存して、GM-CSFの産生が抑制されていた。培養細胞自体の分裂、生存は肉眼的にはコントロール群と差はなく、従ってIFN-βによる直接的な細胞毒性ではなく、GM-CSFの産生のみが選択的に抑制されていると考えられた。さらにGM-CSF産生がmRNAレベルでどうなっているかを調べるため、同様の実験系(IFN-βを加えて培養する系)で、培養した細胞からmRNAを抽出し、RT-PCR法を用いて、GM-CSFのmRNA発現を調べた。mRNAレベルでは、はっきりとした濃度依存的な、抑制は確認できなかった。またヌードマウス尾静脈から培養細胞を接種し、人工的に転移巣を作る系では、GM-CSF産生、CD-44陽性細胞では、肺に転移巣を確認できたが、GM-CSF産生細胞でも、CD-44陰性の細胞は転移巣を形成しなかった。
硬軟交互粒子積層によるナノ・ミルフィーユ創出とその物性増強起源の解明

ミルフィーユを"ナノ粒子"で創る.硬・軟二種類の,共に粒子径5 nmの『ナノ粒子集積化・単粒子層』を用い,シングルナノサブミクロンサイズの自在な厚み周期で交互積層されたナノ・ミルフィーユ構造と,そのキンク化組織を創出し,構造/機能相関(粒子層配列と力学物性増強の相関)の解明に挑む.その結果,本領域の主題でもあるLPSO構造のMg合金で確認されたミルフィーユ構造・キンク強化現象の起源を明らかにし,それを新規有機/無機ナノ複合体の創出にフィードバックする.ミルフィーユを"ナノ粒子"で創る.硬・軟二種類の,共に粒子径5 nmの『ナノ粒子集積化・単粒子層』を用い,シングルナノサブミクロンサイズの自在な厚み周期で交互積層されたナノ・ミルフィーユ構造と,そのキンク化組織を創出し,構造/機能相関(粒子層配列と力学物性増強の相関)の解明に挑む.その結果,本領域の主題でもあるLPSO構造のMg合金で確認されたミルフィーユ構造・キンク強化現象の起源を明らかにし,それを新規有機/無機ナノ複合体の創出にフィードバックする.
家禽におけるカルシュウム依存性中性プロテアーゼ遺伝子の発現制御に関する研究

本研究では、家禽におけるカルシュウム依存性プロテアーゼ遺伝子の発現システムについて、育種学的観点から分析を行った。その結果つぎの研究成果を得た。1体重大小選抜ウズラの筋肉におけるCANP活性値は、明瞭な系統間差が存在し、成長速度の高いLL系統は、成長速度の遅いSS系統に比較してCANP活性値が高いことが判明した。このことは、CANP活性値は発育速度と深い関係があり、選抜に伴いその発現に違いが生じていることを示すものである。2肉用鶏と産卵鶏の筋肉におけるCANP活性値を比較すると、ウズラの選抜結果と同じ傾向を示した。また、CANPのインヒビター活性値は、肉用鶏で高く、逆に産卵鶏で低かった。このことは、品種改良に伴って、CANP活性値のみならず、そのインヒビター活性値も変化していることを示すものである。3 CANPのcDNAをプローブとして、in situハイブリダイゼーション法により、CANP遺伝子の染色体上の物理的位置を検討した結果、CANP遺伝子はニワトリの場合、第1染色体上の短腕に位置することが判明した。4体重大小選抜ウズラにおけるCANP遺伝子の発現について、転写レベルおよびアミノ酸転移レベルで分析した。ノーザンブロットハイブリダイゼーションの結果、各系統のmRNAの発現量は、LL>RR>SSの順に高く、CANP遺伝子のmRNA量は酵素としての活性値とは逆の関係にあった。これらmRNA量の系統差と酵素活性値の系統差の逆転現象は、選抜に伴って、細胞内での遺伝子発現のシステムに変化が生じていることを示すものである。
電子付着による有機ハロゲン化合物の解離動力学

今研究の目的は、これまで、断面積計測や共鳴状態(形状共鳴、Feshbachk共鳴等)の探索が主だった有機ハロゲン分子の電子付着解離について、より動力学的面を明らかにすること(および動力学計測のための装置開発を含む)です。これまでに低速光電子源(当該研究に使用する)を備えた飛行時間質量分析装置を製作し、小サイズの分子(CH_3I,CHBrClI等)についてアニオンフラグメントの検出共鳴状態の寿命計測(解離の異方性計測)に取り組んでいます。装置開発に時間がかかり、現在までに動力学の解析までには至っておりませんが、スピンを含めたより詳細な動力学的情報を得るため研究途中で構想したスピン偏極源の要素技術の確立に成功しました。このスピン偏極源は、3重項状態の光イオン化により、スピン偏極光電子と電子スピン偏極光イオンを同時に発生するものです。電子付着の研究のみならず磁性薄膜等の材料表面分析等に広く利用できると考え、下記の工業所有権を出願しました。現在、研究用光スピン偏極電子銃を共同開発中です。解離性付着における電子スピン偏極の効果については全く研究例がありません。解離の配向(orientation)・カイラリティ制御に発展する可能性のある興味深いテーマであるので、今後も研究を継続していきたいと考えています。本研究の目的はフラグメントアニオンの速度・角度分布を同時計測可能な2次元イオン画像観測法を用い、電子付着解離動力学を明らかにすることである。平成14年度の実施内容は以下の通りである。、1.電子付着解離画像観測装置の製作と性能試験既設の連続分子線-電子線散乱観測装置に、連続分子線源・電子銃・イオン検出器・電極を組み込んだ。補助金を元に、アバランシェフォトダイオード(APD)、CCDカメラ、小型分光器を購入した。揮発性ハロゲン化炭化水素、及びハロゲン化ベンゼンについて、その分子線と電子銃電子線の衝突により生成する、励起種からの発光(主としてH balmer線、CHA-X発光)を分光器とAPDで光子計数険出し、分子線強度の最適化した。Zrディスクのレーザー照射による光電子源を用いて、アニオン種のイオン信号検出を試験した。残留電子・レーザーアブレーションで生成したZrアニオン性クラスタ・微粒子由来と、思われるバックグラウンドが強く、困難であった。現在、ハロゲン化有機物の分視線にアルカリ金属蒸気を混合し、アルカリ金属の多光子イオン化による低速電子発生を検討している。また、自作の位置敏感検出器と購入したCCDカメラによる、イオン画像の観測試験も行った。2.レーザー多光子励起によるスピン偏極光電子発生の検討金属原子のレーザー多光子励起によるスピン偏極電子の発生の理論的解析を行った。スピン偏極電子の解離性付着の研究は皆無であり、分子解離の角度分布にスピンに依存した異方性が生じると期待される。光電子のスピン偏極度がイオンコアのLIF観測により測定できるアルカリ土類の3重項からのイオン化によれば60-90%のスピン偏極度が得られることがわかった。1.ハロゲン有機物の電子付着解離の動力学:揮発性ハロゲン化炭化水素、及びハロゲン化ベンゼンについて、その分子線と電子銃電子線の衝突により生成する、イオン種の質量分析を行った。カチオン種については良質な信号が得られるが、アニオンの計測については、バックグラウンド(迷走電子・レーザーアブレーションで生成したアニオン性クラスターと考えられる)が高く、試料ガスのOn時とOff時の信号の差をとれば検出可能であることが分かった。また、イメージプレート射影された蛍光像の一部をアバランシェフォトダイオードでカウンティングしても、アニオンの信号を得ることができた。しかし、画像全体像については現有のCCDカメラはダイナミックレンジが小さいため積算時間を長く設定できず、画像の差をとることでアニオン空間分布の射影像を得るのは困難であった。現在イメージインテンシファイアの導入を検討している。2.スピン偏極電子源の開発と解離性分子付着の動力学的研究の検討:スピン偏極電子の付着による解離異方性の研究のために、ストロンチウム原子のレーザー多光子励起によるスピン偏極電子源の開発も行っている。この開発研究についてはかなり展開があった。この方法によれば、光イオン化で生成したイオンのスピン偏極度をレーザー計測すれば、対応する光電子のスピン偏極度も推定できることがわかった。この研究で論文2報を公表することができた。現在は、収率の向上を目指した新しい光イオン化スキームによる実験と、部分波選別による光電子のスピン偏極度の向上を検討している。

電子付着の研究のみならず磁性薄膜等の材料表面分析等に広く利用できると考え、下記の工業所有権を出願しました。現在、研究用光スピン偏極電子銃を共同開発中です。解離性付着における電子スピン偏極の効果については全く研究例がありません。解離の配向(orientation)・カイラリティ制御に発展する可能性のある興味深いテーマであるので、今後も研究を継続していきたいと考えています。
歯槽骨吸収の機序解明を目指した破骨細胞分化因子の信号伝達経路の解析

骨は常に吸収と形成を繰り返している動的組織である。骨形成を司る骨芽細胞は、実は破骨細胞の分化と骨吸収機能にも重要な役割を果たしていることは既に述べた。一方、破骨細胞によって骨吸収が行われた部位には新規に骨芽細胞が誘導され、新生骨が形成されることが形態学的に観察されてきた。これを骨のカップリング(共役)機構とよんでいる。このカップリング機構に直接関与する因子としては、骨基質中に多量に存在しているTGF-β、アクチビン、骨誘導因子(BMP)などのサイトカインがその候補者として考えられてきた。我々は、骨代謝共役因子(カップリングファクター)の存在様式を明らかにすることを目的に、破骨細胞と骨芽細胞の両者の活性が亢進している動物モデル(OPG遺伝子欠損マウス)を用いて実験を行った。前述のように、破骨細胞の分化と機能を制御するRANKLのデコイ受容体であるOPGの遺伝子欠損マウスは、破骨細胞の形成が促進し骨吸収が亢進することにより、骨粗鬆症の症状を呈する。さらに興味深いことに、OPG欠損マウスは骨吸収の亢進と共に血清中のアルカリフォスファターゼ(ALP)活性が上昇し、長管骨において骨形成のパラメーター(骨芽細胞面:ObS%BS)も増加していることが明らかとなった。この実験結果は骨吸収と骨形成の共役因子の存在を意味している。そこで、骨吸収阻害薬であるビスフォスフォネートを投与することにより、骨吸収を強力に阻害した際に、OPG欠損マウスにおける骨形成マーカーがどのような挙動を示すかについて解析した。14週齢雄のOPG遺伝子欠損マウスおよび正常マウス(C57BL/6J)にビスフォスフォネート(リセドロネート)を毎日皮下投与(30日間)した。と殺前にテトラサイクリン標識を行い、血清および骨を採取した。これらのマウスの血清中のALP酵素活性および骨の形態学的観察と骨形態計測を行った。その結果、OPG欠損マウスにおける骨形成促進(ALP活性および各種骨形態計測マーカーの亢進)は、ビスフォスフォネートの投与によって完全に抑制された。また、大腿骨成長板直下において、OPG欠損マウスでは立方形のふっくらと厚みを増した大型の活性化された骨芽細胞が多数認められたが、これらの立方形を呈する骨芽細胞は、ビスフォスフォネートの投与によって消失し扁平な形態を示すようになった。つまり、OPG欠損マウスにおいて認められた骨芽細胞の活性化が抑制される様子が観察された。以上の実験結果は、骨吸収の亢進と骨形成の促進はカップリング(共役)していることを示しており、骨組織においては何らかの骨代謝共役因子が存在している可能性が立証できた。

以上の実験結果は、骨吸収の亢進と骨形成の促進はカップリング(共役)していることを示しており、骨組織においては何らかの骨代謝共役因子が存在している可能性が立証できた。破骨細胞におけるLPSの受容体の発現について検討した。その結果、TLR4およびCD14mRNAsの発現は骨芽細胞、骨髄マクロファージのみならず、破骨細胞においても確認できた。そこではじめに、LPSの破骨細胞分化に対する効果を検討した。LPSは共存培養系における破骨細胞形成を促進し、それはOPGの添加により完全に抑制された。また、LPSは骨芽細胞におけるRANKL mRNA発現を時間依存的に上昇させた。この発現上昇はNS398(COX2阻害剤)により抑制され、共存培養における破骨細胞分化も完全に阻害された。このLPSによる破骨細胞の延命効果がTLR4を介しているかを検討するために、TLR4に点変異を有するLPS低反応性のC3H/HeJマウスを用いて実験を行った。C3H/HeJマウスおよびコントロールマウスとしてC3H/HeNマウス由来の骨髄細胞から誘導した各々の破骨細胞におけるIL-1、LPSの延命効果について検討した。その結果、IL-1処理による延命効果はHeJ、HeN両マウスにおいて効果が認められたが、LPSの延命効果はHeJマウスでは全く認められなかった。また、LPSによる破骨細胞の延命効果は、OPGまたはIL-1中和抗体の添加によっても抑制されず、TNF受容体欠損マウスから誘導した破骨細胞を用いた実験でもLPSはRANKL同様延命効果を示さなかった。破骨細胞の分化に対して、LPSはRANKL発現を介する促進作用を示すことが明らかとなった。また、成熟破骨細胞においてもLPS受容体が認められ、LPSが破骨細胞のTLR4を介して直接その延命を促進していることが示された。一方、マクロファージに見られるLPS刺激によるサイトカイン産生誘導は破骨細胞では全く認められなかった。このように破骨細胞はマクロファージ由来の細胞でありながら、サイトカイン産生能を有さない非炎症性細胞に分類されると考えられる。このLPSに対する両細胞の反応性の差異は、p38 MAP kinaseのシグナル伝達の差異に起因する可能性も考えられる。骨は常に吸収と形成を繰り返している動的組織である。骨形成を司る骨芽細胞は、実は破骨細胞の分化と骨吸収機能にも重要な役割を果たしていることは既に述べた。一方、破骨細胞によって骨吸収が行われた部位には新規に骨芽細胞が誘導され、新生骨が形成されることが形態学的に観察されてきた。これを骨のカップリング(共役)機構とよんでいる。このカップリング機構に直接関与する因子としては、骨基質中に多量に存在しているTGF-β、アクチビン、骨誘導因子(BMP)などのサイトカインがその候補者として考えられてきた。我々は、骨代謝共役因子(カップリングファクター)の存在様式を明らかにすることを目的に、破骨細胞と骨芽細胞の両者の活性が亢進している動物モデル(OPG遺伝子欠損マウス)を用いて実験を行った。前述のように、破骨細胞の分化と機能を制御するRANKLのデコイ受容体であるOPGの遺伝子欠損マウスは、破骨細胞の形成が促進し骨吸収が亢進することにより、骨粗鬆症の症状を呈する。さらに興味深いことに、OPG欠損マウスは骨吸収の亢進と共に血清中のアルカリフォスファターゼ(ALP)活性が上昇し、長管骨において骨形成のパラメーター(骨芽細胞面:ObS%BS)も増加していることが明らかとなった。この実験結果は骨吸収と骨形成の共役因子の存在を意味している。
代謝および転写機構改変によるメタノールを原料にした高物性ＰＨＡ生産菌の育種

次世代資源として有用なメタノールを原料に微生物産生の生分解性ポリエステルであるポリヒドロキシアルカン酸(PHA)の高物性共重合体を効率的に生合成する菌株を作製することを目的として、代表的なメタノール資化性菌を用い従来の代謝工学的手法とσ70をコードするrpoD遺伝子をランダム変異させることで包括的に転写機構を改変する革新的な手法を用いた分子育種を行った。代謝工学的手法を用いた育種では、第二モノマー分率が増加した菌株を取得した。包括的転写機構改変では、メタノール資化性菌ではじめて本法を確立し高濃度メタノール存在下でPHA蓄積率が増加した菌株を得た。本研究はメタノールを単一炭素源として生育できるメタノール資化性細菌に対して、(1)従来の遺伝子工学的手法を用いた代謝改変と(2)転写制御因子であるσ70にランダム変異を加える包括的な転写機構の改変を実施することで次世代資源であるメタノールを原料にして高物性を有する共重合ポリヒドロキシアルカン酸(PHA)を効率的に生産するための微生物育種を目的としている。(1)モデルメタノール資化性細菌であるMethylobacteriumextorquensはメタノールを原料として炭素数4のモノマーのみからなるホモポリマーを蓄積する。共重合PHAを合成するために、第二モノマーとして着目したC6モノマーの前駆体であるブチリル-CoAを生成する酵素遺伝子の高発現を試みたが、いずれの株についてもC6モノマーの増加は認められなかった。(2)PHA生産能が向上した株の取得を目指し、σ70をコードするrpoDのランダム変異導入ライブラリーをエラープローンPCRおよびmegaprimer PCR of whole plasmid (MEGA-WHOP)法により作製した。rpoDランダム変異ライブラリーでM. extorquensを形質転換し、PHA染色色素を含む固体培地を用いてスクリーニングを行った結果、コントロール株と比較してPHA蓄積率が150%程度向上した株を複数取得した。このような包括的転写バランスの改変をPHA生産菌やメタノール資化性菌の育種に利用した例はこれまでなく、本実験はその有用性を示すことでこれらの新しい育種法を提案したといえる。また今後、得られた変異株の詳細な解析により、遺伝子配列から予想し得ないPHA生産やメタノール代謝に関する有用な知見が得られることが期待される。本研究は、次世代資源であるメタノールを原料にして高物性を有する共重合ポリヒドロキシアルカン酸(PHA)を効率的に生産するための微生物育種を目的として、1)代謝工学的手法を用いた代謝改変と2)転写制御因子であるσ70のランダム変異を加える包括的な転写機構の改変を実施している。まず、代謝工学的手法を用いた代謝改変として、本年度は炭素数6の第二モノマーを供給することが期待出来るエノイル-CoAレダクターゼ(Ter)に着目して、そのクローニングとTer導入用宿主の構築を行った。すでに報告されているTerと相同なMethylobacillusflagellatus由来遺伝子をクローニング後、大腸菌組換え型酵素を調整して活性測定を行った結果、FADを添加したときにクロトニル-CoAを基質とする活性を検出した。またTerと競合する反応を遮断するために、育種の宿主として用いているMethylobacterium extorquensのクロトニル-CoAレダクターゼ/カルボキシラーゼ遺伝子を相同組換えにより破壊した株を取得した。次に、σ70ランダム変異による包括的な転写機構改変では、エラープローンPCRの条件検討を行うとともに、制限酵素処理やライゲーションなど回収率低下の原因となる操作を回避出来るMEGA primer WHOLe Plasmid (MEGA-WHOP)法の確立を目的とした研究を行った。MEGA-WHOPに用いるMEGAプライマーをエラープローンPCRによって調整し、プラスミド合成のためのPCRの最適化を行った結果、大腸菌を宿主にした形質転換では良好にコロニーが出現した。一方で、M. extorquensを宿主にした形質転換では大腸菌を用いたときに比べて形質転換効率が低く、コンピテントセルの調整法などの改善が必要であることが示された。次世代資源として有用なメタノールを原料に微生物産系の生分解性ポリエステルであるポリヒドロキシアルカン酸(PHA)の高物性共重合体を効率的に生合成する菌株を作製することを目的として、従来の代謝工学的手法とσ70をコードするrpoD遺伝子をランダム変異させることで包括的に転写機構を改変する革新的な手法を用いた分子育種を行った。分子育種の宿主には代表的なメタノール資化性菌であるMethylobacterium extorquensを用いた。代謝工学的手法を用いた育種では、第二モノマー前駆体供給酵素遺伝子の高発現と前駆体がPHA合成以外に使われる経路の遮断を行った。その結果、前者では第二モノマー分率が増加したが、後者ではメタノール生育能を失った。

これはモノマー前駆体がメタノール生育に必須な代謝経路上の化合物であることに起因している。そこで、経路遮断株をコハク酸培養した後にメタノール培養する二段培養を行った結果、第二モノマー分率がメタノール培養時に著しく増加した。また、育種の過程で、本菌はコバルトイオン欠乏時に生育の低下に伴い、第二モノマー分率が増加することを明らかにした。包括的転写機構改変では、ランダム変異やスクリーニングの方法を検討し、メタノール資化性菌ではじめて本法を確立した。エラープローンPCRとMEGAprimer WHOLe Plasmid (MEGA-WHOP)法により取得したrpoD変異ライブラリーでM. extorquensを形質転換し表現型に基づくスクリーニングによりPHA蓄積率やメタノール生育能が向上した菌株を取得した。さらに、取得したプラスミドを鋳型にしたランダム変異を行い、高濃度メタノール存在下でPHA蓄積率が増加した菌株を得た。現在、トランスクリプトーム解析のための条件検討を行っている。応用微生物学本研究ではメタノール資化性菌の代謝改変手法として、1)遺伝子工学的手法を用いた代謝改変、2)転写制御因子であるσ70のランダム変異を加える包括的な転写機構改変の2つの方法をとっている。遺伝子組換えによる株の取得は順調に進んだが、取得した株の培養の結果は予想と違い、コントロール株と差が見られなかった。今後、ターゲット遺伝子の変更が必要であると考えられる。平成24年度までにライブラリー構築のための条件検討が大旨終了していた。平成25年度には表現型を指標にした変異株のスクリーニング条件を決定し、目的の表現型をもつ変異株の取得に成功した。進行状況は申請書の内容とほぼ一致しており、予定通り研究が進行しているといえる。本研究では目標達成のために、二つの方針1)代謝工学的手法を用いた代謝改変、2)転写制御因子であるσ70のランダム変異を加える包括的な転写機構の改変をとっている。1)では代謝改変に用いるための候補遺伝子についてクローニングおよび活性の確認に成功し、2)ではライブラリー構築のための条件検討が大旨終了したことから、本研究は順調に進行しているといえる。一方で、本研究では代謝改変の宿主として複数の微生物種を用いる予定であったが、現段階では1種類の微生物のみ用いている。この点では当初の計画通りには進めておらず、今後の検討課題である。遺伝子工学的手法による代謝改変では、新しいターゲット遺伝子の高発現を試みることでメタノールから共重合PHAを生合成する代謝経路の強化をはかる。また、これまでに構築した遺伝子破壊株のいくつかはメタノール生育能を欠失している。代謝バランスを変化させることでメタノール生育能が回復する可能性があることから、これら遺伝子破壊株を宿主にしたσ70のランダム変異を試みる。包括的な転写機構改変では、これまでに取得した変異株を新たな宿主として2nd・3rdラウンドスクリーニングを実施することで、より優れた変異株の取得を目指す。