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ブドウ球菌スーパー抗原毒素の新規病原機構の解明と次世代ワクチンへの応用

黄色ブドウ球菌が産生するブドウ球菌エンテロトキシン(SEs)はスーパー抗原活性および嘔吐誘導活性を有する毒素として広く知られている。我々はこれまでの研究においてSEsが鶏マクロファージ由来細胞株に対して増殖活性を有することを見出した。本年度では、SEAを用いて、細胞のSEAと結合する分子、細胞内でのSEAの動態および関連分子の変化と局在について検討した。まずはSEAを添加した鶏マクロファージ由来細胞株HD11細胞の増殖能およびSEAとの結合性を検証した。次に、質量分析によりSEAと結合するタンパク質を検索・同定した。また、HD11細胞内におけるSEAと結合タンパク質の動態を経時的に観察した。SEAは鶏マクロファージ由来細胞株HD11細胞に対し顕著な細胞増殖活性を有することが明らかとなった。質量分析によりSEAと結合するタンパク質はピルビン酸キナーゼ(PK)である可能性を示し、また、SEA添加細胞では時間の経過とともに細胞質内のPKは有意に細胞核内へと移行することが観察された。これらの結果から、SEAはPKと結合し、PKの核内移行を誘起することで、細胞増殖を引き起こすと考えられる。さらに、SEs病原性についてin vivoで解析した。鶏にSEA接種後、偽好酸球およびリンパ球が多量に真皮、皮下組織に浸潤していることが観察された。また、SEA接種後12および24時間において好酸球と好塩基球が出現し、接種後48時間で形質細胞が出現した。SEA接種によりメタクロマジー陽性細胞数が有意に減少し、肥満細胞脱顆粒の誘起が示唆された。さらに、SEA接種皮膚片において炎症性サイトカイン(TNF-α, IFN-γ, IL-6)とケモカイン(CXCLi2)の発現量が有意に上昇した。これらの結果から、SEAは鶏皮膚組織に炎症反応およびアレルギー様反応を惹起することが示唆された。概ね予定計画の通りに進んでおり,また、予想外の新たな生物活性も観察・検証された。今後,確認・検証された新たな生物活性について,詳細を調べると同時に,この生物活性が病原性との関連性及びその分子病原機構について解析し、ワクチンへの応用可能性を検討する。黄色ブドウ球菌が産生するスーパー抗原毒素(SAg)は耐熱性スーパー抗原であり,食中毒の原因毒素として広く知られている。我々は黄色ブドウ球菌が鶏の浮腫性皮膚炎、化膿性関節炎・骨髄炎,趾瘤症,敗血症などの重要な病原菌であることから、SAgが本菌感染において役割を果たすか否かを検討した。SAgと鶏細胞株への作用を調べたところ、SAgが細胞空胞化を引き起すことを見いだした。また、SAgによる空胞形成時における細胞の応答を解析した。鶏マクロファージ由来株(HD11)、鶏肝細胞由来株(LMH2A)及びマウスマクロファージ由来株(J774A1)に、それぞれSAg遺伝子保有菌の培養上清、加熱後の培養上清、またはリコンビナントSAgを細胞に添加し細胞変化を観察した。細胞の空胞形成をneutral red uptake法により定量した。さらに、毒素によるHD11細胞のサイトカイン産生誘導活性をqPCR法により測定した。その結果,培養上清,加熱後培養上清およびリコンビナントSAgを添加した鶏由来HD11細胞とLMH2A細胞内には多数の空胞が観察された。しかし、マウス由来J774A1細胞では空胞が観察されなかった。次に,neutral red uptake法により空胞形成を定量的に測定した。毒素が添加した鶏HD11細胞の空胞形成はコントロールと比べ有意に高かった。さらに、毒素によるHD11細胞のサイトカイン産生誘導活性を調べた。毒素添加群ではIL-1β、IL-8、TNF-αの産生が有意に高く、炎症性免疫応答が誘導されたことが示唆された。これらの結果から,ブドウ球菌スーパー抗原毒素は新たな生物活性:細胞空胞化作用を有することが初めて明らかとなった。今後,さらに,空胞化作用と臨床における病原性との関連性,及びその分子病原機構について解析する.本研究は,概ね当初の予定計画の通り進んでおり,また,当初予期していた新たな生物活性が再現性実験により検証され,本研究の推進のため,大きな一歩を踏み出すことができた.本年度ではブドウ球菌スーパー抗原毒素SEAを用い、鶏由来マクロファージに対する影響および空胞形成機序の解析を行った。また、SEsの鶏に対する病原性と病態形成への関与についてin vivoで検討した。まずは、SEsおよび嘔吐活性またはスーパー抗原活性を欠損したSEAの変異体毒素を、それぞれ鶏由来マクロファージ細胞株HD11細胞に添加し、培養24時間後にいずれの毒素も細胞内に空胞が形成された。SEsの空胞形成は嘔吐活性およびスーパー抗原活性とは異なる新規な生物活性であることが示唆された。細胞空胞形成機序を解明するため、免疫蛍光染色によってSEAの細胞内での動態および局在を観察した。SEAは添加後直ちに細胞内に取り込まれ、初期エンドソームから小胞体へと移行することが明らかとなった。さらに、SEAが鶏のブドウ球菌感染症における病態形成に関与するか検討した。SEAの鶏の皮下または皮内接種により、皮膚組織の炎症を誘導し、偽好酸球の浸潤およびサイトカイン発現が上昇することが明らかとなった。SEsは鶏の黄色ブドウ球菌感染症における病態形成へ関与することが示唆された。

これらの結果から、SEsは鶏培養細胞株に取り込まれた後、エンドソームから小胞体へ移行し空胞を形成する。また、in vivoにおいてSEAは鶏の皮膚炎症を惹起することが示された。今後、さらにSEsの細胞空胞化作用と感染症における病態形成との関連性を解明することにより、鶏ブドウ球菌感染症の防御に新たな知見が期待される。ブドウ球菌スーパー抗原毒素の新たの生物活性を見出し,さらに野生型と変異型毒素を用いて確認できた。また,当該生物活性についての解析も進んでおり解明しつつある。黄色ブドウ球菌が産生するブドウ球菌エンテロトキシン(SEs)はスーパー抗原活性および嘔吐誘導活性を有する毒素として広く知られている。我々はこれまでの研究においてSEsが鶏マクロファージ由来細胞株に対して増殖活性を有することを見出した。本年度では、SEAを用いて、細胞のSEAと結合する分子、細胞内でのSEAの動態および関連分子の変化と局在について検討した。まずはSEAを添加した鶏マクロファージ由来細胞株HD11細胞の増殖能およびSEAとの結合性を検証した。次に、質量分析によりSEAと結合するタンパク質を検索・同定した。また、HD11細胞内におけるSEAと結合タンパク質の動態を経時的に観察した。SEAは鶏マクロファージ由来細胞株HD11細胞に対し顕著な細胞増殖活性を有することが明らかとなった。質量分析によりSEAと結合するタンパク質はピルビン酸キナーゼ(PK)である可能性を示し、また、SEA添加細胞では時間の経過とともに細胞質内のPKは有意に細胞核内へと移行することが観察された。これらの結果から、SEAはPKと結合し、PKの核内移行を誘起することで、細胞増殖を引き起こすと考えられる。さらに、SEs病原性についてin vivoで解析した。鶏にSEA接種後、偽好酸球およびリンパ球が多量に真皮、皮下組織に浸潤していることが観察された。また、SEA接種後12および24時間において好酸球と好塩基球が出現し、接種後48時間で形質細胞が出現した。SEA接種によりメタクロマジー陽性細胞数が有意に減少し、肥満細胞脱顆粒の誘起が示唆された。さらに、SEA接種皮膚片において炎症性サイトカイン(TNF-α, IFN-γ, IL-6)とケモカイン(CXCLi2)の発現量が有意に上昇した。これらの結果から、SEAは鶏皮膚組織に炎症反応およびアレルギー様反応を惹起することが示唆された。概ね予定計画の通りに進んでおり,また、予想外の新たな生物活性も観察・検証された。今後,さらに,これまで確認された新たな生物活性:特に空胞化作用について,詳細を調べると同時に,この生物活性が臨床における病原性との関連性,及びその分子病原機構について解析する.今後,HD11細胞とSEAとの結合タンパク質を詳細に検索するため、Far Western blottingおよび質量分析を行い、宿主細胞と毒素と結合するレセプター分子を解析し,同定する予定。今後,確認・検証された新たな生物活性について,詳細を調べると同時に,この生物活性が病原性との関連性及びその分子病原機構について解析し、ワクチンへの応用可能性を検討する。
アトムプローブによる金属間化合物中の添加元素の合金挙動の解明

金属間化合物に種々の合金元素を加えることにより、機械的ならびに化学的特性を改善する試みが盛んに行なわれているが、これらの元素が諸特性をどのように変化させるのかを理解するためには金属間化合物の規則格子中での第三次素の占有サイトを決定することと,これらの元素の粒界での偏析挙動を理解することが重要である。そこで我々はアトムプローブというユニークな手法を用いて幾つかの金属間化合物中の第三元素のサイト占有率を決定した.またアトムプローブは極めて高い分析の空間分解能を有するので、粒界を解析すれば他の手法では成しえない高度な定量分析を行なうことが出来る。そこでアトムプローブにより粒界偏析の検証も試みた.本年度は種々の第三元素を加えたNi_3Al,Ni_3Ge,Ni_3(Si,Ti)中の金属間化合物中の置換型添加元素の占有サイト、粒界での組成変化ならびに侵入型添加元素の粒界での偏析をアトムプローブFIMを用いて原子レベルで解析した。装置は一昨年我々が金研において開発したエネルギー補償型飛行時間型アトムプローブFIMを用いた。この装置は針状に調製した試料表面でイオン化される原子を質量分析するもので、個々の原子を観察することが出来るのと同時にこれらの原子種を同定出来るという究極的な空間解能を有する超微細領域分析装置である。この装置を用いて金属間化合物の任意の結晶面において一原子層毎の組成せ決定することにより金属間化合物中に加えられた置換型第三元素の占有位置を定量的に決定することができた。さらにNi_3(Si,Ti)合金中の粒界を解析し,0.1ppm程度ドープされたBが粒界に偏析していることを確認した.金属間化合物に種々の合金元素を加えることにより、機械的ならびに化学的特性を改善する試みが盛んに行なわれているが、これらの元素が諸特性をどのように変化させるのかを理解するためには金属間化合物の規則格子中での第三次素の占有サイトを決定することと,これらの元素の粒界での偏析挙動を理解することが重要である。さらにNi_3(Si,Ti)合金中の粒界を解析し,0.1ppm程度ドープされたBが粒界に偏析していることを確認した.
ヒト消化器癌転移株を用いた転移制御の基礎的研究

胃癌・膵癌の同一の親株よりそれぞれ、血行性転移、腹膜播種、リンパ節転移を高率に生ずる高転移細胞株を樹立した.これまでに樹立した、胃癌AZ-521 line、膵癌HPC-3、HPC-4 lineに加え、胃癌NUGC-3、TMK-1 line、膵癌HPC-1、Panc-1、Capan-1 lineの胃癌、計3 line、膵癌、計5 lineからなるcell bankが完成した.これらの親株とそれぞれの高転移株を用い、転移関連する様々な細胞生物学因子を比較検討した.胃癌・膵癌細胞株ともに肝転移には血管新生因子が、腹膜播種には運動能の増強が重要な転移関連因子であると思われた.膵癌では著明な接着能の増強も認めた.Cross injectionの結果より血行性転移と腹膜播種のメカニズムが異なることが実験的に確かめられた.さらに膵癌株でDNAマクロアレイを用いて、分子生物学的側面からも転移関連因子を検索したところ、膵癌の肝転移、腹膜播種成立に多数の遺伝子の発現上昇、低下が関連していることが示唆された.さらに解析する遺伝子数を増やすために、DNA chipを用いて、包括的な転移関連遺伝子解析を行った結果、各転移形式に関連が示唆される多数の遺伝子が同定された.さらに転移形式の違いを規定すると推察される遺伝子が、胃癌ではIntergrin3やcadherinなど24種類、膵癌ではmatrilysinやFGFなど22種類が同定された.しかしこれらの候補遺伝子の詳細な機能解明にはさらなる実験が必要であり、現在、数種類の候補遺伝子の親株あるいは高転移株への遺伝子導入あるいは遺伝子抑制によりそれらの転移形成に関わる詳細な機能を解析中である.2年間にわたる研究によって、複数の消化器癌の高転移細胞株を集めたcell bankを設立し得たことが最大の成果であった.本実験にて同定された転移関連因子あるいは遺伝子を抑制・増強させることにより、転移抑制が可能であるか否か、その可能性の検討を今後の最重要課題と考えている.同一の親株より血行性転移、リンパ行性転移、腹膜播種の3系統の細胞シリーズを引き続き樹立し、転移株のcell bankを設立する:転移株樹立の手法は、ヌードマウス脾内注入法、腹腔内注入法および同所移植法を併用する。この手法を用いてこれまでに完成したものは、胃癌AZ521シリーズと膵癌HPC-3シリーズ、HPC-4シリーズの3シリーズであり、普遍性の高い結果を得るために、さらに胃癌3シリーズと膵癌3シリーズが進行中であり、これを完成させつつあるところである。下記項目について親株および3系統の転移細胞株を比較し、細胞生物学的手法を用いて転移関連因子を検索しつつ、その結果を報告している。(1)肉眼的所見と病理組織像で親株と転移株との形態学的、組織学的な比較を行う.(2)In vivoとIn vitroでの細胞増殖能:親株と転移株をそれぞれヌードマウスの皮下に接種し、経時的な腫瘍容積の変化を比較する。(3)運動能:トランスウェルチャンバーを用い、親株と転移株を上室チャンバーに振り分け、下室チャンバーにはRPMIとケモアトラクタントとしてのフィブロネクチンをコートし、20時間後に下室に移動した細胞数をエタノール固定後ギムザ染色のもとで、100倍視野の検鏡下で1視野あたりにて算出する。(4)細胞接着能:細胞外基質の主要構成成分であるフィブロネクチン、コラーゲンIV、ラミニンで覆われた96穴トランスウェルチャンバーを使用し、1×10^4個の細胞の1時間後の接着細胞数をMTT法で測定する。(5)細胞表面抗原とFACS解析:転移に関連すると報告されている接着分子の発現をモノクローナル抗体を用いたFACSにて解析し、発現陽性の細胞の割合で求める。(6)血管新生因子:血管内皮細胞増殖因子VEGFと血管新生作用を有するといわれるIL-8など転移に関係するとされるサイトカインをELISA法にて解析する。胃癌・膵癌の同一の親株よりそれぞれ、血行性転移、腹膜播種、リンパ節転移を高率に生ずる高転移細胞株を樹立した.これまでに樹立した、胃癌AZ-521 line、膵癌HPC-3、HPC-4 lineに加え、胃癌NUGC-3、TMK-1 line、膵癌HPC-1、Panc-1、Capan-1 lineの胃癌、計3 line、膵癌、計5 lineからなるcell bankが完成した.これらの親株とそれぞれの高転移株を用い、転移関連する様々な細胞生物学因子を比較検討した.胃癌・膵癌細胞株ともに肝転移には血管新生因子が、腹膜播種には運動能の増強が重要な転移関連因子であると思われた.膵癌では著明な接着能の増強も認めた.Cross injectionの結果より血行性転移と腹膜播種のメカニズムが異なることが実験的に確かめられた.さらに膵癌株でDNAマクロアレイを用いて、分子生物学的側面からも転移関連因子を検索したところ、膵癌の肝転移、腹膜播種成立に多数の遺伝子の発現上昇、低下が関連していることが示唆された.さらに解析する遺伝子数を増やすために、DNA chipを用いて、包括的な転移関連遺伝子解析を行った結果、各転移形式に関連が示唆される多数の遺伝子が同定された.さらに転移形式の違いを規定すると推察される遺伝子が、胃癌ではIntergrin3やcadherinなど24種類、膵癌ではmatrilysinやFGFなど22種類が同定された.

しかしこれらの候補遺伝子の詳細な機能解明にはさらなる実験が必要であり、現在、数種類の候補遺伝子の親株あるいは高転移株への遺伝子導入あるいは遺伝子抑制によりそれらの転移形成に関わる詳細な機能を解析中である.2年間にわたる研究によって、複数の消化器癌の高転移細胞株を集めたcell bankを設立し得たことが最大の成果であった.本実験にて同定された転移関連因子あるいは遺伝子を抑制・増強させることにより、転移抑制が可能であるか否か、その可能性の検討を今後の最重要課題と考えている.昨年に引き続き胃癌・膵癌の同一の親株よりそれぞれ、血行性転移、腹膜播種、リンパ節転移を高率に生ずる高転移細胞株を樹立し、cell bank設立を目指す.転移株の樹立法として、ヌードマウスを用いた脾臓内接種法、腹腔内接種法および同所移植法を併用した.この手法によりこれまでに樹立した、胃癌AZ-521 line、膵癌HPC-3、HPC-4 lineに加え、胃癌NUGC-3 line、膵癌HPC-1、Panc-1 lineの樹立に成功した.さらに癌腫に特異的な転移形質の同定のため、cell bankを充実すべく、胃癌2 line、膵癌2 lineの樹立を継続中である.これまでに樹立した細胞株および新たに樹立し得た株を用い、親株とそれぞれの高転移株の細胞生物学転移関連因子を比較検討した.さらに膵癌株でDMマクロアレイを用いて、分子生物学的側面からも比較を行い、転移関連因子を検索し、報告した検討項目として、1)転移巣の肉眼的所見および病理組織学所見、2)in vivoおよびin vitroでの腫瘍増殖能、3)運動能、4)細胞外マトリックスの主要構成物質であるfibronectin、collagen IV、lamininに対する接着能、5)integrin、CD44 family等の細胞表面の接着分子発現、6)血管新生に関するサイトカイン産生、7)DNA ploidy pattern、8)Cross injection:肝転移株の腹腔内接種により腹膜播種が、または腹膜播種株の脾臓内接種により肝転移が生ずるかの検討、8)DNAマクロアレイを用いた転移関連遺伝子の検討を行った.胃癌・膵癌細胞株ともに肝転移には血管新生因子が、腹膜播種には運動能の増強が重要な転移関連因子であると思われた.膵癌では著明な接着能の増強も認めた.Cross injectionの結果より血行性転移と腹膜播種のメカニズムが異なることが実験的に確かめられた.さらにマクロアレイの結果から、膵癌の肝転移、腹膜播種成立に多数の遺伝子の発現上昇、低下が関連していることが示唆された.今回同定された転移関連因子を抑制あるいは増強させることにより、転移抑制が可能であるか否か、その可能性を現在検討中である.昨年に引き続き胃癌・膵癌の同一の親株よりそれぞれ、血行性転移、腹膜播種、リンパ節転移を高率に生ずる高転移細胞株を樹立した.転移株の樹立法として、ヌードマウスを用いた脾臓内接種法、腹腔内接種法に加え胃癌細胞株においては同所移植法を併用した.この手法によりこれまでに樹立した、胃癌AZ-521 line、膵癌HPC-3、HPC-4 lineに加え、胃癌NUGC-3、TMK-1 line、膵癌HPC-1、Panc-1、Capan-1 lineの胃癌、計3 line、膵癌、計5 lineからなるcell bankが完成した.
相変化記録膜材料におけるコヒーレントフォノン誘起相変化に関する研究

前年度までの研究では超格子Ge-Te-Sb(GST)に対してdisorder相からorder相への超高速相変化手法の開発を行い、そのダイナミクスを観測してきた。しかし、この逆過程の誘起には成功していない。一般に結晶化に比ベアモルファス化にはより大きなエネルギーが必要とされることから、逆過程の実現にはさらに強い励起強度が必要であると考えられる。我々はさらに大きなフルエンスを用いてコヒーレントフォノン分光を行い、励起密度を高めた場合の基礎的な知識を得るため、フェムト秒再生増幅アンプシステムを用いた計測を行った。コヒーレントフォノン分光には反射型ポンプープローブ法を用い、時間分解の反射率変化を測定することによりコヒーレントフォノンの時間発展を測定した。ポンプ光の励起密度は0.672.67mJ/cm^2の範囲で変化させ、コヒーレントフォノンの励起強度依存性を調べた。得られた結果を、すでに行なっている低いフルエンスでの測定の結果を比較し、高密度励起の場合の基礎的な知識を得ることを目的とした。特に相変化に関与するGeTe局所構造におけるA_1光学モードに着目することで相変化制御を前提とした知識を得られると期待される。GeTe_4のA_1モードについては、励起フルエンスの増加に伴い大きな周波数の低下が見られた。過去のGeTeのA_1モードにおける研究結果と比較すると、シフト量のフルエンス依存性が大きく、低いフルエンスで大きなシフトが誘起されることが明らかとなった。これはGST-SLが相変化記録材料として優れている事実を裏付けるものである。その他、1.01.3mJ/cm^2での測定において1.1THz付近と1.7THz付近にピークが出現する。このことからこの程度のフルエンスによる励起の結果、何らかの構造変化が生じ、フォノンスペクトルに影響を与えた可能性が考えられる。このように、高強度のフェムト秒パルスレーザーを照射した際の超格子GSTのフォノンの振る舞いを観測ることに成功している。平成23年度では主にフェムト秒コヒーレントフォノン分光法を用いた超格子Ge-Sb-Te相変化記録膜(GST)における相変化の励起パルスの偏光依存性に関しての研究を行い、データの書き込みに相当するアモルファス相から結晶相への相変化の効率が偏光に大きく依存することを明らかにした。この結果はGSTにおける我々の研究グループが構築した相変化モデルを支持するものであり、相変化原理の解明や光記録メディアとして性能向上に寄与するものである。我々が作製した超格子GSTサンプルではGe原子がサンプル面方向に変位することにより光学・電気的特性が変化すると考えられている。そのため、Ge原子の移動方向に平行な電場を与える事により相変化を効率良く誘起する事ができると予想され、またGe原子とTe原子から構成される局所構造の光学フォノンは励起パルスの偏光方向に依存すると考えられる。本研究では、直線偏向を持つフェムト秒光パルスの偏向方向を変化させ、先述のフォノンをコヒーレントフォノン分光法により測定した。その結果、Ge原子の移動方向に対して平行方向にパルス電場を与えた場合(p偏光)は、垂直方向に励起した場合(s偏光)に比べて周波数が低下することが明らかとなった。これはp偏光パルスによりGe原子が変移し、相変化が誘起されたことによるものであると考えられる。上記に加えて、今後の研究で使用する予定のアンプシステムを使用した光学系の構築や、ダブルパルス発生用の光学系の設計を研究グループで行った。

このように、高強度のフェムト秒パルスレーザーを照射した際の超格子GSTのフォノンの振る舞いを観測ることに成功している。23年度の研究対象とした相変化記録膜の偏光依存性に関しては想定していた測定条件での測定を行なっており、概ね順調である。その他の課題に関する光学系の構築が遅れており、来年度以降の研究に遅れが見込まれるため。今後は消去過程の実現を目指してアンプシステムを使用した測定を行う。まず高強度パルスを用いたコヒーレントフォノン分光を行う。その後、2発のパルス、4発のパルスを使用したフォノンのコヒーレントフォノンの制御を行い、これまでと同様の解析を行うことによりその影響を評価する。
密封小線源治療システムを利用した前立腺がん磁気温熱治療法の確立

前立腺がん治療に用いられる密封小線源を磁気温熱療法における発熱体としても用いることで、副作用が低く治療効果の高いとされる局所放射線治療と局所温熱治療の併用療法を実現させるための基礎的研究を行った。1 MHz、50 Oe-rmsの交流磁場を印加すれば、密封小線源のコールドダミーとして用いたTi針は、磁気温熱療法の発熱体として十分機能した。また、免疫効果を高めると言われている熱ショックタンパク質の血中濃度が優位に高くなり、放射線、温熱のみならず免疫治療効果も期待できることがわかった。本申請は前立腺がんの密封小線源療法に供せられる線源およびシステムを温熱療法へ転用し、新たな前立腺がんの治療法を確立することを最終目標としている。最終目標を達成するために、本年度は大きく分けて、マウス実験用磁気温熱療法システムの構築、ヌードマウスに発症させたヒト前立腺がんの加温特性評価、磁気温熱療法用発熱素子の開発の3つの研究課題に取り組んだ。マウス実験用磁気温熱療法システムの構築では、マウス全体に1001000kHzの高周波磁場が照射できるよう直径7cmのコイルおよび電源を作製し、次に示す生体内での前立腺がん治療用密封小線源の高周波磁場照射加温実験を可能にした。ヌードマウスに発症させたヒト前立腺がんの加温特性評価では、ヒト前立腺がんを皮下に発症させたマウスの腫瘍部に、前立腺がん治療用密封小線源を模擬した純Ti針を挿入し、血流による放熱挙動の高い生体内でも治療効果の得られる43°Cまで加温できるかどうかの評価を行った。この結果、腫瘍部1ccあたり1本のTiを挿入し、990kHz, 50 Oeの高周波磁場を印加すると、腫瘍部をハイパーサーミア治療温度まで加温できることを明らかにした。また、この結果は実際にヒトの治療を行う場合の磁場発生装置の設計の指針ともなる。磁気温熱療法用発熱素子の開発では、患部をある一定の温度に保つために、磁場を印加し続けても一定の温度以上に発熱しなくなる自己温度制御発熱体を開発した。この発熱体を用いると、温度のモニタリングなしに患部を一定の温度に保つことが可能である。また、磁場強度の分布がある状況でも、自己温度制御発熱体は温度分布を狭くすることができ、磁気温熱療法用発熱体として非常に有望であることを見いだした。最終目標を達成するために、本年度は大きく分けて、ヌードマウスに発症させたヒト前立腺がんの加温特性評価、磁気温熱療法用発熱素子の開発、交流磁場発生用大型コイルの設計の3つの研究課題に取り組んだ。ヌードマウスに発症させたヒト前立腺がんの加温特性評価では、ヒト前立腺がんを皮下に発症させたマウスの腫瘍部に、前立腺がん治療用密封小線源を模擬した純Ti針を挿入し、血流による放熱挙動の高い生体内でも治療効果の得られる43°Cまで局所的に加温できるかどうかの評価を行った。サーモグラフィーでマウス体表の温度をモニタリングした結果、990kHz, 500eの高周波磁場を印加し続けると、Ti針を入れた腫瘍部のみがハイパーサーミア治療温度まで加温されることを明らかにした。この発熱体の磁化ヒステリシス測定の結果から、印加磁場の強さ、周波数で一定となる温度を評価することができ、磁場強度の分布がある状況でも、自己温度制御発熱体は温度分布を狭くすることができることが理論的にも明らかになった。交流磁場発生用大型コイルの設計では、磁場シミュレーションソフトを用いて、様々な形状のコイルを模擬し、広範囲で磁場強度が一定になるヘルムホルツ配置のコイルが実際に臨床応用する上で適しているとの設計指針が得られた。ヒト前立腺がんを皮下に発症させたヌードマウスに密封小線源のコールドダミーとして純Ti針を挿入し、990kHz,500e-rmsの交流磁場を印加した場合の腫瘍部および直腸温度を光ファイバー温度計でモニタリングし、体表温度を赤外線サーモカメラで測定した。また、加温により生じる熱ショックタンパク質の血中量も測定した。その結果、磁場を30分印加した場合と60分印加した場合を比較すると、60分印加した場合の方が血中の熱ショックタンパク質量が優位に多くなり、さらに印加直後よりも24時間後に採血した血液中の方がより熱ショックタンパク質の量が増えることがわかった。このことから、純Ti針を磁気ハイパーサーミア用発熱体と使用した場合でも、温熱療法だけでなく自己免疫療法的治療効果が得られることが明らかとなった。

したがって、密封小線源を発熱体として用いれば、放射線治療、温熱治療、免疫治療を同時に行うことができる優れた治療法となる可能性が非常に高いことを示せた。また、体内の広域にほぼ均一な強度の交流磁場を発生させる装置として、直径60cmの空芯コイルの作製と、磁性体をコアとしてそのギャップ間に磁場を発生させる磁気回路の作製を試みた。60cmコイルについては問題となるコイル間の近接効果を三つ編み式に巻いていくことで大幅に低減できることがわかった。また、ギャップ間の距離が3cmである小型の磁場発生装置で得られた磁場分布と磁界シミュレータから計算された磁場分布はよく一致し、この結果をもとにしギャップ間が30cmの磁気回路の設計を行った。さらに、自己温度制御発熱体として開発した(La,Sr)(Mn,Cu)O_3を発熱体として行ったマウス実験においても、治療効果のある43°C以上に腫瘍部の温度を上げることができた。
ゲージ理論における指数定理の役割

位相演算子の時に重要であった量子変形のパラメタがq=exp[iθ]の形の場合の考察の一環として,Fock空間の計量と量子変形の問題を考察した.すなわち、上記の変形のパラメタの場合には一般にFock空間に負の計量が現れることが知られているが、振動子代数の変形において適切なCasimir演算子を導入することにより、この負の計量が除き得ることをまず指摘した.次いで,この負の計量が現れない振動子代数を2個用意し,J.Schwingerの処方箋に従いq-変形したsu(2)代数を構成すると,q-変形したsu(2)代数に更にある種のSchwinger項が加わることを見いだした.この余分な項は,上記のq-変形のパラメタの場合に負の計量が出ないと言う要請から必然的に現れたものであり、何らかの物理的な(および,あるいは数学的な)意味があるものと思われる.とりあえず,論文ではこの余分な項が物性物理学の可解模型の一つであるBloch電子問題の分析で,例えば,Hamiltonianの選択等に明快な意味付けを与えることを指摘した.この余分な項を含む拡大されたq-変形したsu(2)代数がHopf構造を持つか否かを現在研究中である.その他では,ゲージ場の量子化におけるGribovの問題と呼ばれるものをゲージ場の配位の大局的な振る舞いに基づいて考察した.これも一種の指数概念の応用と考えられる.位相演算子の時に重要であった量子変形のパラメタがq=exp[iθ]の形の場合の考察の一環として,Fock空間の計量と量子変形の問題を考察した.すなわち、上記の変形のパラメタの場合には一般にFock空間に負の計量が現れることが知られているが、振動子代数の変形において適切なCasimir演算子を導入することにより、この負の計量が除き得ることをまず指摘した.次いで,この負の計量が現れない振動子代数を2個用意し,J.Schwingerの処方箋に従いq-変形したsu(2)代数を構成すると,q-変形したsu(2)代数に更にある種のSchwinger項が加わることを見いだした.この余分な項は,上記のq-変形のパラメタの場合に負の計量が出ないと言う要請から必然的に現れたものであり、何らかの物理的な(および,あるいは数学的な)意味があるものと思われる.とりあえず,論文ではこの余分な項が物性物理学の可解模型の一つであるBloch電子問題の分析で,例えば,Hamiltonianの選択等に明快な意味付けを与えることを指摘した.この余分な項を含む拡大されたq-変形したsu(2)代数がHopf構造を持つか否かを現在研究中である.その他では,ゲージ場の量子化におけるGribovの問題と呼ばれるものをゲージ場の配位の大局的な振る舞いに基づいて考察した.これも一種の指数概念の応用と考えられる.
圧縮性全体安定性解析による極超音速3次元渦ダイナミクスの解明

本研究の目的は、圧縮性流体に対する全体安定性解析法の確立及びその有効性を示すことと極超音速流れに生じる縦渦の性質を解明することである。本年度は次の2点を重点的に研究した。(1)渦の安定性に対する圧縮性の影響の解析渦の安定性に対する圧縮性の影響の解明は、燃料混合の高効率化などの様々な目的において非常に重要となるテーマの一つである。本研究ではキャビティ流を対象とした圧縮性渦流れの全体安定性解析を行った。その結果、非圧縮流において支配的となる渦の不安定モードは、圧縮性流ではマッハ数が増加するほど安定化することがわかった。さらに、この安定化は圧縮性によって生じるバロクリニックトルクが主な要因であることが示唆された。これらの結果は圧縮性全体安定性解析によって初めて得られるものであり、提案した手法の有効性を実証できたと考えている。(2)衝撃波を含む流れ場の全体安定性解析法の開発昨年度までの研究によって、これまで多く用いられてきた全体安定性解析法(千葉の方法)を単純に圧縮性流れに拡張すると、衝撃波を含む流れを解析した際に衝撃波を数値的に捉えることによる数値的不安定性の影響を大きく受けてしまうことがわかった。そこで本年度は、衝撃波の影響を抑えるために線形化ナビエ・ストークス方程式を用いた全体安定性解析法を開発した。そして、開発した手法が衝撃波を含む流れの物理的な安定性を解析可能であることを確認した。今後は、本手法を用いることによって衝撃波・境界層干渉などの衝撃波を含む流れの全体安定性解析を実施可能であるため、本研究の意義は大きいと考えられる。(抄録なし)本研究の目的は、圧縮性流体に対する全体安定性解析法を確立しその有効性を示すこと及び、本手法を用いて極超音速流れ中の縦渦現象の性質を解明することである。平成24年度は、主に圧縮性全体安定性解析コードの開発を実施した。まず、これまで非圧縮性流体に対して適用されてきた千葉の方法(Time_stepping法)による全体安定性解析法を圧縮性粘性流体に適用した。2次元円柱背後に生じるカルマン渦を誘起する不安定モードの解析を実施し、流れ場が不安定へと遷移する臨界レイノルズ数や、そのときのストローハル数が過去の実験および数値的研究と一致することを確かめた。次に、本手法を円柱前方に衝撃波を形成する超音速流れに適用し、本手法の衝撃波不連続を含む流れ場への適用可能性を調べた。その結果、本手法が既存の衝撃波捕獲スキームの有する衝撃波面における数値的な不安定を捉えることが明らかとなった。したがって今後衝撃波を含む流れ場の物理的な不安定性の理解を目的とした全体安定性解析を行うためには、衝撃波面における数値的な不安定性を取り除くことが重要と考えられる。以上の研究から、衝撃波不連続を含まない流れ場に対する圧縮性全体安定性解析法は確立されたと考えられる.また、極超音速流中に縦渦を生じる流れ場の数値解析例として、マッハ7の圧縮ランプ流れにおけるゲルトラー渦の数値シミュレーションを行った。計算スキームには5次精度WCNSおよび保存形の4次精度中心差分法、3段階TVDルンゲクッタ法を用いた。その結果、本計算法によって実際にゲルトラー渦生成のシミュレーションが可能であることを確認した。本年度は、主に圧縮性流体に対する全体安定性解析コードの開発を行った。開発したコードを用いて過去の実験・数値的な研究結果と比較し、同様の結果が得られることを確認できた。また、縦渦現象の全体安定性解析の前段階として、圧縮ランプ流れに生じる縦渦の3次元数値シミュレーションを行い、実際に縦渦が発生することを確認した。これらの結果から本年度は交付申請書に記載した通りの達成度を得られたと考えている。本研究の目的の1つは、極超音速流中の縦渦の性質を全体安定性解析を用いて明らかにすることである。

しかしながら平成24年度の研究において、既存手法及び我々が開発した全体安定性解析法では衝撃波不連続を含む流れ場の物理的不安定性を解析することは困難であることがわかった。従って平成25年度は、圧縮性流中の渦現象を扱うものの衝撃波不連続を含まない流れ場について圧縮性全体安定性解析を行う。これにより、これまで研究が十分でない渦現象の安定性に対する圧縮性や粘性の影響を明らかにする。(抄録なし)
液体ヘリウム冷却型分子線源を用いたクラスターからのイオン対生成過程の研究

本研究では、真空紫外光を吸収してイオン対解離した正イオンと負イオンを同時計測することによってクラスターからのイオン対生成過程を明らかにし、クラスターの超励起状態の生成および崩壊過程を解明することを目的としている。そこで、高強度のクラスタービームを生成するために、液体ヘリウム冷却型分子線源を用いた。試料ガスとしては、主に二酸化炭素(CO_2)を用いた。分子科学研究所の極端紫外光実験施設(UVSOR)のストレイジリングからのシンクロトロン放射を励起光源として用いて、まず初めに生成したクラスターの正イオンの検出を四重極型質量分析器で行った。しかしながら、励起光強度が弱いことから、クラスターの正イオンはほとんど検出されなかった。そこで、クラスターの生成を確認するために、電子線を用いた電子衝撃によるクラスターのイオン化の実験を試みた。その結果、従来の分子線源と比較して高強度のクラスターが生成していることが確認された。今後、クラスターからのイオン対生成過程を研究するためには、励起光の強度を強くすることと生成したイオンの検出効率を上げることが必要である。現在、前者としては分光器を含めたビームライン光学系の大幅な見直しを検討中であり、後者としては飛行時間型質量分析器の改良を行っている。これらの問題が解決されることによって、クラスターからのイオン対生成過程を観測することが可能になると考えられる。
リハビリテーションアプローチの筋力増強に与える効果についての研究

本研究は、リハビリテーションアプローチによる筋力増強効果を分子生物学的手法を用いて転写因子・成長因子の解析を行い、動物モデルおよび臨床においてより効果的な筋力増強法を開発しようとするものである。ラットの筋に運動負荷、電気刺激、ストレッチなどのリハビリテーションアプローチを行い、リアルタイムRT-PCR法を用いて筋組織における転写因子・成長因子mRNAの発現を測定し検討する。刺激前後の筋張力、断面積、転写因子などの測定を行う。ラット脳梗塞モデルおよび廃用性筋萎縮モデルを用い疾患モデルでの検討を行う。本年度は、筋を肥大させる作用を持つ筋関連の転写因子および筋組織の成長因子・筋構成タンパク遺伝子発現を解析するため定量遺伝子増幅装置を用いたリアルタイムRT-PCR法を用いMGF、IGF、FGFなどの筋成長因子、myogenin、MyoDなどの筋特異的転写因子のmPNA発現につき解析の可能な条件設定をおこなった。また、他動的ストレッチ刺激を加え、腓腹筋を摘出し、RNAの抽出を行い、リアルタイムRT-PCR法にて各mRNAの発現定量を行った。この結果他動的反復ストレッチ刺激および他動的持続ストレッチ刺激を加えると骨格筋における成長因子のMGF/Myogenin/MyoD/MHCのmRNA発現増加が見られ、これは1日15分のストレッチを週4回行うことにより誘発することができた。また、持続伸長より反復伸長がより効果的であることが判明した。このことは臨床リハビリテーションにおける筋力維持訓練として施行可能な内容であり、意識障害などのある患者の筋力維持に筋の他動的ストレッチが有効である可能性を示唆しており、今後の臨床応用が期待される本研究は、リハビリテーションアプローチによる筋力増強効果を分子生物学的手法を用いて転写因子・成長因子の解析を行い、動物モデルおよび臨床においてより効果的な筋力増強法を開発しようとするものである。本年度は、筋を肥大させる作用を持つ筋関連の転写因子および筋組織の成長因子・筋構成タンパク遺伝子発現を解析するため定量遺伝子増幅装置を用いたリアルタイムRT-PCR法を用いMGF、IGF、FGFなどの筋成長因子、myogenin、MyoDなどの筋特異的転写因子のmRNA発現につき解析の可能な条件設定をおこなった。また、他動的ストレッチ刺激を加え、腓腹筋を摘出し、RNAの抽出を行い、リアルタイムRT-PCR法にて各mRNAの発現を行った。この結果他動的反復ストレッチ刺激および他動的持続ストレッチ刺激を加えると骨格筋における成長因子のMGFmRNA発現の増加が見られ、これは1日15分のストレッチを週4回行うことにより誘発することができた。このことは臨床リハビリテーションにおける筋力維持訓練として施行可能な内容であり、意識障害などのある患者の筋力維持に筋の他動的ストレッチが有効である可能性を示唆しており、今後の臨床応用が期待される。本年度は筋を肥大させる作用を持つ筋関連の転写因子および筋組織の成長因子・筋構成タンパク遺伝子発現を解析するため定量遺伝子増幅装置を用いたリアルタイムRT-PCR法を用いMGF、IGF、FGFなどの筋成長因子、myogenin、MyoDなどの筋特異的転写因子のmRNA発現につき解析の可能な条件設定をおこなった。

また、他動的ストレッチ刺激を加え、腓腹筋を摘出し、RNAの抽出を行い、リアルタイムRT-PCR法にて各mRNAの発現を行った。この結果他動的反復ストレッチ刺激および他動的持続ストレッチ刺激を加えると骨格筋における成長因子のMGF/Myogenin/MyoD/MHCのmRNA発現増加が見られ、これは1日15分のストレッチを週4回行うことにより誘発することができた。また、持続伸長より反復伸長がより効果的であることが判明した。このことは臨床リハビリテーションにおける筋力維持訓練として施行可能な内容であり、意識障害などのある患者の筋力維持に筋の他動的ストレッチが有効である可能性を示唆しており、今後の臨床応用が期待される
ホルトセラピーに関する認知科学的解析

本研究は、栽培行為による療法や植物による心身の癒しをホルトセラピーとし、その効果を認知科学的に解析した。高齢者の園芸活動の実態調査によって、心身の健康維持や人間関係の活発化など大きな役割を果たしていることが明らかとなったが、園芸療法としては栽培行為と効果の関係を踏まえたプログラム設定が課題となっていた。そこで、栽培行為の効果を実験的に検討した。プランターでハツカダイコンを育てる被験者とその結果を見るだけの被験者について、感情プロフィールテストと脳波・心拍を計測した結果、植物を育てることで負の感情が減り、正の感情が増す傾向のあること、またα波が増加する傾向のあることがわかった。しかし、心拍変動係数には明確な違いはみられなかった。つまり、栽培行為は生理・心理的にプラスの効果をもたらすことが示唆されたが、自律神経系の反応にまでは及ばなかった。次に、植物を繰り返し見たり触れたりすることによる心理・行動への影響を、小学校の校庭が芝生に覆われている場合と地面の場合の生徒の行動・意識の比較を通して検討した。芝生の学校では地面の学校の生徒に比べて、15種以上の植物で有意に高い割合で見たことがあるという結果となり、日常的に見たり触れたりすることが認識に大きな差をもたらすことが明らかとなった。同様の影響を、要因を限定して検討するため、小学校4-6年生の稲作作業体験時の行動・発話について調査・分析した。5月の田植えから11月の収穫まで6回の作業を体験する過程で、発話内容は感嘆や感覚、感情に関わるものから観察や愛情へと変化した。各体験後の質問紙調査では、気づきや嫌悪から、認知、観察、さらに愛護や共感へと変化する過程が捉えられた。これらの結果から、作業をしながらイネの成長過程をつぶさに見ることによって観察力が増すとともに、愛護や共感などの慈愛の感情が培われる過程の一端を捉えることができた。本研究は、栽培行為による療法や植物による心身の癒しをホルトセラピーとし、その効果を認知科学的に解析するもので、平成12年度は、植物を見ているときの眼球運動と脳波の関係解析、栽培行為に伴う生理心理的反応の解析、高齢者の園芸活動や園芸療法の実態調査を実施した。植物を見ているときの眼球運動と脳波の関係を解析した結果、眼球運動、脳波ともに男女差が明確であり、男女を分けて検討すべきことが確認された。花色の異なるペチュニアを視覚対象にした実験では、男性の場合、視点の分布範囲が広く移動速度も速い場合にはβ波発生量が多くなるのに対して、視点の移動速度は速いが分布範囲が狭い場合にはα波発生量が多くなる傾向が見られた。一方、女性では視点の分布範囲と移動速度に視覚対象間の差がみられないにもかかわらず、β波発生量が多くなる場合とα波発生量が多くなる場合とがみられた。したがって、眼球運動と脳波の間に何らかの関係があることは確認できたが、その関係は男女によって異なり、また眼球運動が速ければβ波発生量が多くなるというような単純な関係でもないことから、眼球運動、脳波ともにさらに細かな解析を行い対応関係を検討することが課題となった。栽培行為に伴う生理心理的反応の変化について試行的実験を行った結果、植物を単に見た場合に比べて栽培区では男女ともポジティブな感情が増加することが明らかとなった。また、心拍変動係数では男女とも差が見られなかったが、α波割合では男性において栽培区で有意に高くなった。つまり、栽培行為は単に視覚対象とする以上に生理心理的な効果をもたらす可能性が示唆された。

高齢者の園芸活動の実態調査では、心身の健康維持や人間関係の活発化など大きな役割を果たしていることが明らかとなったが、園芸療法としては栽培行為と効果の関係を踏まえたプログラム設定が課題となっていた。栽培行為に伴う生理心理的反応を、栽培段階ごとに結果だけを見る被験者の反応と比較する実験と、地表面構成の違いによる生理・心理的反応の違いについて検討する実験を実施した。プランターでハツカダイコンを育てる被験者とその結果を見るだけの被験者について、感情プロフィールテストと脳波・心拍の計測を実施した結果、植物を育てることによって負の感情が減り、正の感情が増す傾向のあること、またα波が増加する傾向のあることがわかった。しかし、自律神経系の反応指標とされる心拍変動係数には明確な違いはみられなかった。つまり、栽培行為は生理・心理的にプラスの効果をもたらすことが示唆されたが、自律神経系の反応にまでは及ばなかった。視覚対象としての植物の生理・心理的効果については、これまで一定の研究成果が積み上がってきたが、視覚的背景となったり、空間の基本を形作る壁面や床面を構成する植物の効果についてはほとんど検討されていない。壁面を構成する植物の生理・心理的効果については、わずかに筆者らの報告があるので、本研究では床面としての地表面構成と生理・心理的反応との関係について実験的に検討した。生垣でコの字型に囲った屋外空間の地表面を芝生、地面、ブロックとし、各々でした被験者の生理・心理反応を計測した結果、感情プロフィールテストと意味微分法では快適な地表面は芝であり、ブロックは不快、土はそれらの中間という評価となった。脳波の反応は、α波割合が芝で最も低くなるグループと、逆に最も高くなるグループ、土で最も高くなるグループの3つに類型化された。そして、芝で最も高くなるグループでは芝で正の感情が高くなり、負の感情が抑制されていた。つまり、芝生でα波割合が最も高いグループでは言語を介した芝の評価も高いが、芝生でα波割合が最も低いグループと土で最も高いグループでは言語を介した評価との対応関係はみられなかった。植物を繰り返し見たり触れたりすることによる心理や行動に及ぼす影響を、実験的な手続きがもたらす違和感を避け自然な状態で捉えるため、小学校の校庭が芝生に覆われている場合と地面の場合の生徒の行動や意識について比較調査した。芝生の学校では地面の学校の生徒に比べて、15種以上の植物で有意に高い割合で見たことがあるという結果となり、日常的に見たり触れたりすることが認識に大きな差をもたらすことが明らかとなった。同様の影響を、要因を限定して検討するため、小学校4-6年生の稲作作業体験時の行動や発話について調査・分析した。5月の田植えから11月の収穫まで6回の作業を体験する過程で、発話内容は感嘆や感覚、感情に関わるものから観察や愛情へと変化した。各体験後の質問紙調査では、気づきや嫌悪から、認知、観察、さらに愛護や共感へと変化する過程が捉えられた。これらの結果から、作業をしながらイネの成長過程をつぶさに見ることによって観察力が増すとともに、愛護や共感などの慈愛の感情が培われる過程の一端を捉えることができた。
循環型社会形成に向けての地域イノベーション

本研究の目的は、循環型社会への法制度が整備されるなかで明らかとなりつつある従来型の地域公共政策の限界を打破し、新たに構築すべき公共政策の内実を、地域イノベーションという視点から検討することにより、地域での持続的循環モデルの具体像を明らかにすることにあった。具体的には、第1に企業・産業セクター、第2に住民・生活セクター、第3に行政・政策セクターという3つの各セクターに求められているイノベーションの可能性と条件を分析調査し、その結果を「地域公共経営」として明らかにする手法を採った。第1の企業・産業セクター面では、全国各地域自治体における環境イノベーションの実例調査と地域に存立する企業の現境経営の実態調査を行い、両者の比較検討から、従来型の地域環境政策の転換に資する企業・産業セクターの役割について検討した。第2の住民・生活セクター面では、廃棄物の排出抑制に結びつくような消費者のライフスタイルへの転換方途の探求をめざし、エコ商店街、オフィス町内会やグリーン調達など各主体の自主的な取り組み手法について、実例を調査し検討した第3の行政・政策セクター面では、廃棄物の資源化・リサイクルのための産業間・地域間リンクの地域モデル開発をめざして、自治体と産業界の地域リンクの構築を促す公共政策について検討するとともに、地域における公・民間の連携を促進するためのごみ管理組織自体のあり方の探求をめざし、民間委託やPFIへの取り組みの現状と会計・財務情報の標準化、処理コストと税・手数料との政策的評価の進展方向を検討した。本研究の目的は、循環型社会への法制度が整備されるなかで明らかとなりつつある従来型の地域公共政策の限界を打破し、新たに構築すべき公共政策の内実を、地域イノベーションという視点から検討することにより、地域での持続的循環モデルの具体像を明らかにすることにある。具体的には、第1に行政・政策セクター、第2に企業・産業セクター、第3に住民・生活セクターという3つの各セクターに求められているイノベーションの可能性と条件を分析調査し、その結果を「地域公共経営」として明らかにする手法を採った。本年度は、各セクターごとの研究の現状をフォローし、地域イノベーションとして総合的に纏め上げるために先ず国内外の文献等の解析による論点整理を行い、企業・産業セクターは井手、行政・政策は小野、消費者・住民サイドは谷村が中心となって整理した。その上で、廃棄物の資源化・リサイクルのための産業間・地域間リンクの地域モデル開発をめざして、古紙、廃プラスチック、廃家電のリサイクルにおける自治体と産業界の地域リンクの構築を促す公共政策について検討した。次いで、廃棄物の排出抑制に結びつくような消費者のライフスタイルへの転換方途の探求をめざし、エコ商店街、オフィス町内会やグリーン調達など各主体の自主的な取り組み手法について、実例を調査し検討した。さらに、地域における公・民間の連携を促進するためのごみ管理組織自体のあり方の探求をめざし、民間委託やPFIへの取り組みの現状と会計・財務情報の標準化、処理コストと税・手数料との政策的評価の進展方向を検討した。第1の企業・産業セクター面では、全国各地域自治体における環境イノベーションの実例調査と地域に存立する企業の環境経営の実態調査を行い、両者の比較検討から、従来型の地域環境政策の転換に資する企業・産業セクターの役割について検討した。

第2の住民・生活セクター面では、廃棄物の排出抑制に結びつくような消費者のライフスタイルへの転換方途の探求をめざし、エコ商店街、オフィス町内会やグリーン調達など各主体の自主的な取り組み手法について、実例を調査し検討した第3の行政・政策セクター面では、廃棄物の資源化・リサイクルのための産業間・地域間リンクの地域モデル開発をめざして、自治体と産業界の地域リンクの構築を促す公共政策について検討するとともに、地域における公・民間の連携を促進するためのごみ管理組織自体のあり方の探求をめざし、民間委託やPFIへの取り組みの現状と会計・財務情報の標準化、処理コストと税・手数料との政策的評価の進展方向を検討した。
C_1微生物に特異な代謝系の酵素の構造と機能に関する研究

C_1化合物質化性微生物(メチロトローフ)の資化経路の一つとしてセリン経路が知られている。今までに、酸化経路のメタノールデヒドロゲナーゼおよびセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ(SHMT)の2つの連続した酵素反応に着目してメタノールとグリシンからのL-セリン生産が検討されてきた。このセリン経路を構成する酵素に関しては、高活性で安定な酵素を有するメチロトローフがこれまでに見い出されておらず、系統的な酵素化学的研究や分子遺伝学的研究さらには蛋白工学的研究についてはまったく行われていなかった。そこで本研究ではC_1化合物の微生物代謝に特異的な質化系であるセリン経路の酵素、SHMT、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ(HPR)、について構造と機能についての解析を行った。特にセリン経路のマーカー酵素であるについては酵素遺伝子のクローニングと酵素蛋白質の一次構造の推定、ならびにX線結晶解析による立体構造の解明を行った。SHMTはすべての動植物、微生物に存在し、生体内でグリシンとL-セリンの相互変換とこれにともなうC_1ユニットの供給に必須の役割を担っている。セリン経路上のSHMTはC_1資化に関与する点で生理的意義が異なっている。また、L-セリン生産への利用という観点からも重要な酵素である。このことから、セリン生産菌Hyphomicrobium methylovorum GM2のSHMT遺伝子のクローニングを行い、SHMTの一次構造の解析とEscherichia coliでの発現を行った。H.methylovorumSHMTのペプチド断片のアミノ酸配列がE.coliSHMTの一部に類似してるいることに着目して、E.coliのSHMT遺伝子の一部をプローブとして用いてH.methylovorumのSHMT遺伝子をクローニングし、塩基配列から一次構造を推定した。これはメチロトローフの資化系酵素として初めての例である。SHMTは434のアミノ酸残基(分子量46、068Da)からない、活性中心のリジン残基近傍にはすべてのSHMTに特徴的なThr(Ser)の連続する配列が認められた。他の微生物起源のSHMTとはアミノ酸レベルで52-66%、ウサギ肝のSHMTとは44%の相同性を有していた。SHMTが欠損したE.coli変異株においてH.methylovorumのSHMTを高発現させた。精製FHPRのペプチド断片のアミノ酸配列をもとにPCR用プライマーを作成し、PCRでの増幅断片をプローブとしてHPR遺伝子のクローニングを行い、塩基配列から一次構造を推定した。このHPRは322アミノ酸残基(分子量35726Da)からなり、キュウリHPRと30%と相同性を示した。また、3-ホスホ-D-グリンセリン酸デヒドロゲナーゼやD-乳酸デヒドロゲナーゼ(D-LDH)などと23-31%の相同性が認められ、D体特異的2-ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼファミリーに属することが示された。NAD結合モチーフであるGXGXXG(17X)Dは一次構造のほぼ中央に位置しており、これまでに触媒残基として推定されてきたHis,Asp,Arg残基は保存されていた。硫酸アンモニウムを沈殿材としてアポ型HPRの単結晶を調製し、X線結晶解析(解像度2.4A)によってHPRの立体構造を得た。HPRのサブユニットはNAD結合ドメインとこれにトポロジーが近似な触媒ドメインとから構成され、この2つのドメインは2回軸対称によって関係づけられた。四次構造を形成する2つのサブユニット間においても2回軸対称が認められた。HPR(His,Glu,Arg)の立体配置はL-LDHとほぼ同一であったが、3つのアミノ酸残基とNADHの三次元的な位置関係が異なっていることが推定された。すなわち、L-LDHではヒドロキシピルビン酸のre面側にNADHが存在するのに対して、HPRではs1両側にNADHが位置することによってNADHのpro-R水素がヒドロキシピルビン酸の2位の炭素にs1面から付加してD-グリセリンが生成するものと。H.methylovorum