hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Myb転写因子による植物の発生依存的な細胞増殖制御

植物のG2/M期特異的遺伝子の上流域には共通のシスエレメント(MSAエレメント)が存在し、そこにR1R2R3-Myb転写因子が結合する。このうちMYB3R1とMYB3R4は転写活性化因子として、MYB3R1, MYB3R3, MYB3R5の3個の因子は転写抑制因子として機能することを明らかにしている。本年度は転写抑制因子として働くMybの機能解析を進めたほか、myb3r4破壊株のエンハンサー変異体の一つ(gig1変異体)について研究を行った。具体的には以下のことが明らかになった。・myb3r1/3/5三重破壊株におけるG 2/M期遺伝子のレポーター発現の解析から、が分裂を停止してエンドリプリケーションを起こした細胞にも異所的に見られることから、MSAエレメントの機能の1つは増殖を停止した細胞においてプロモーターの抑制状態を維持することであり、この働きMYB3R1/3/5の結合により実現しているということが示唆された。・myb3r1/3/5三重破壊株では、胚柄における過剰な細胞分裂が生じる。この表現型はCYCB1;1遺伝子の破壊を組み合わせることにより部分的に回復することから、CYCB1;1遺伝子の過剰な発現が細胞分裂の異常を引き起こしていると考えられた。・gig1表現型はAPCの活性化因子であるCDC20.1の過剰発現によって促進されるほか、cycb2 ; 2変異によって促進された。これらの結果から、GlG1は細胞周期中でAPCの活性を抑制する調節因子であり、CYCB2などのAPC標的タンパク質の量を適切にコントロールすることにより、M期の進行および終了を制御していると考えられた。植物のG2/M期特異的遺伝子の上流域には共通のシスエレメント(MSAエレメント)が存在し、そこにR1R2R3-Myb転写因子が結合することをすでに明らかにしている。シロイヌナズナにはR1R2R3-Mybをコードする遺伝子が5個存在しており、このうち3個が転写抑制因子としての働きを持っている。これらR1R2R3-Myb転写抑制因子の遺伝子破壊株を用いた解析の結果、R1R2R3-Myb転写抑制因子は、増殖の停止した細胞においてMSAエレメントに結合することによりG2/M期遺伝子のプロモーター活性を積極的に抑制するアクティブリプレッサーとして働いていることが示唆された。また、G2/M期遺伝子として知られるPLEやEDE1には部分的な機能欠損による弱い変異アリル(ple-2およびede1-1)が知られているが、これらの変異アリルによるサイトキネシスの異常が、Myb転写抑制因子の三重変異により抑圧されることがわかった。この結果は、Myb転写抑制因子が細胞周期を回転させている細胞においてもG2/M期遺伝子の転写を抑制していることを示唆するものであった。また、CYCB1;1-GUSやCYCB1;2-GUSのG2/M期特異的転写によるGUSのパッチ状の発現が、三重変異体では、周期依存性が失われて若い葉や根端において一様に発現するようになることから、増殖中の細胞におけるMyb転写抑制因子の機能は、G2/M期以外の細胞周期の時期に標的遺伝子の転写を抑制することであると考えられた。すでに明らかにしているG2/M期特異的なMyb転写活性化因子の働きと、このような転写抑制の組み合わせによりG2/M期に特異的な転写が実現しているという仮説が考えられた。
ＦＭ－ＡＦＭおよびＭＥＭＳ創成技術を用いた極限流体潤滑の実現と評価

流体潤滑状態とは油膜を介して非接触摺動を実現している状態を指し、機械摺動面において最も望ましい潤滑形態とされている。そこで本研究では、ナノメートルオーダのすきまを有する流体潤滑状態に焦点を当て、その油膜状態と潤滑特性を調査することとした。はじめに、コロイドプローブAFMを用いて流体潤滑状態での動圧発生効果を調べたところ、接触面積が小さく、動圧発生効果がほとんど見られなかった。よって、相手面を軸受用鋼球に換え、特に、スクイーズ運動下におけるナノメートルオーダの油膜形成状態に着目して試験を行った結果、振動数の増加に伴って厚い油膜領域の面積が広くなる傾向が見られた。しかしながら、油膜の厚さが極限まで薄くなったときの流体潤滑特性およびそのような極薄すきまにおける動圧発生の可能性に関しては、これまで検討された事例がない。本研究では、ナノメートルオーダのすきまを有する流体潤滑状態を『極限流体潤滑状態』と定義し、コロイドプローブ式周波数変調原子間力顕微鏡を用いてその摺動特性を調査することとした。本研究では、初めに、京都大学ナノテクノロジーハブ拠点に設置されているMEMS製造装置を用いて、ナノメートル深さのテクスチャ基板を作製した。はじめに、シリコンウエハの表面の汚れを落とすためにウエハスピン剥離・洗浄装置により洗浄した。その後、スピンコーティング装置を用いてHMDSおよびポジ型フォトレジストを塗布し、高速マスクレス露光装置によってパターンを露光した。その後、レジスト現像装置によって現像した後、ドライエッチング装置を用いてウエハ上のパターン部のエッチングを行い、最後にレジストを剥離し、ダイヤモンドカッターにてカットして試料基板とした。本研究では、ヘリングボーン型のテクスチャリングパターンを幾種類か用いた。コロイドプローブAFMを用いてパターン中央部をなぞることによって、その摩擦特性を評価した。なお、コロイドプローブには、直径約8umの金粒子を用いた。コロイドプローブAFMを用いて摩擦係数を測定した結果、現時点では、テクスチャパターンの差異に伴う摩擦特性の違いは見られなかった。今後、テクスチャパターンや潤滑剤等を変更することにより、極限流体潤滑状態での摩擦特性がどのようなパラメータに影響を受けるのか、引き続き定量的な評価を行っていく。摩擦特性を把握する実験ではテクスチャパターンの差異に伴う結果の違いは見られなかったものの、京大ナノハブ拠点におけるテクスチャ創成法の習得やAFMによる摺動試験方法の確立など、実験に要する技術は十分に確立できたと考えるため。しかしながら、油膜の厚さが極限まで薄くなったときの流体潤滑特性に関しては、あまり多くの研究事例がない。対象とするテクスチャ形状の創成には、京大ナノハブ拠点のMEMS製造装置を用いた。よって、相手面を直径3/8インチの軸受用鋼球に換え、特に、スクイーズ運動下におけるナノメートルオーダの油膜形成状態に着目して試験を行うこととした。テクスチャ形状はマイクロディンプルとし、ディンプル径40um、ディンプル間ピッチ80um、ディンプル深さ500nmとした。ディンプルありディスクを用いて試験を行った場合、接触円中心近傍に閉じ込め油膜は確認されなかったが、振動数の増加に伴って厚い油膜領域の面積が大きくなる傾向が見られた。また、閉じ込め油膜が形成される条件を除けば、ディンプルがない場合に比べてディンプルがある場合のほうが油膜体積が大きくなることが分かった。これは接触円のちょうど外側に存在するディンプルの影響であると考えられる。ディンプル近傍においては、ディンプルが油溜まりの役割を果たすため除荷工程における負圧が現れにくく、気泡が発生しにくくなる。よって、ディンプル付近の油膜が一様に厚くなることが分かった。テクスチャパターン、潤滑剤の種類や粘度等をパラメータとして、極限流体潤滑状態での摩擦特性に差異が見られる条件を引き続き模索して行く。トライボロジーほぼ計画通りの予算執行を行ったが、納品業者による値引きなどにより3万円弱の繰越金が生じた。本繰越金は次年度の試料作成費に充てる予定である。
骨盤臓器におこる疼痛が交感神経反射により膀胱過活動を発生する機序

骨盤臓器(膀胱、子宮、直腸)からの下腹神経求心性神経は交感神経シナプス伝達を修飾した。蓄尿によって下腹神経求心性線維の活動が活発していくと下腹神経節のシナプス伝達を抑制して蓄尿活動が弱めることが明らかとなった。過活動膀胱の成因として、子宮の炎症性反応が交感神経節での神経活動を弱める機構がある可能性がある。下腹神経求心性神経を活性化させてこれが下腹神経節を介して反射を起こし膀胱活動を増強するかを検討した。昨年度は子宮からの信号を活性化させるために酢酸刺激、カプサイシン刺激、プロスタグランジンE2刺激を行い排尿反射の促進すなわち時間あたりの排尿回数の増加をみとめたことから、子宮の炎症性物質の増加は排尿反射を誘発する可能性があることを報告した。この問題を発展させるため、子宮ではなく、膣部よりバルーンを挿入し、内圧が10cmH2Oから30cmH2Oまで変化させたところ、排尿反射は増加傾向ではなく、逆に抑制された。特に30cmH2Oでは完全抑制がおきた。これは会陰神経の切断で消失したころから、尿道膀胱反射と同様に会陰神経を介して仙髄部で骨盤神経の遠心路を抑制されると考えた。ところが膣部へのカプサイシン(10-5M)の注入、プロスタグランジン(10-5M)の注入はいずれも排尿反射の間隔の短縮(20%, 35%)を認め、会陰神経の切断でも排尿反射の増強は持続したので交反射の可能性が示された。直腸へのバルーン挿入による拡張は予定していたより大きな内圧で排尿反射の影響を与えた。60cmH2Oまでその変化が認められず、また抑制を示し、会陰神経の切断で消失したことから、これも仙髄反射である可能性を示した。一方この部位へのカプサイシンやプロスタグランジンの投与は排尿反射間隔を短縮した。下腹神経反射に基づいた交感神経活動が排尿反射を増強するかの検討を実施した。麻酔したラットの子宮に0.1%酢酸を0.1ml注入し、また膀胱底よりPEチューブ(PE50)を設置した。覚醒後ボールマンケージに拘束し、生理手的食塩水2.4ml/h排尿反射を測定し、排尿間隔、排尿閾値圧、最大排尿圧を検討した。この急性実験ではいずれのパラメータも優位な変化を認められなかった。次に同様の処置を実験3日前に実施し、排尿反射を検討したところ、排尿間隔の短縮(19%)がみられたが、排尿閾値圧、最大排尿圧には変化が認められなかった。この時の骨盤神経節後線維からの放電には大きな変化が認められなかった。また、ラット子宮内にカプサイシン10-6Mを注入し同様に検討を実施したところ、同日に実施した排尿反射の3つのパラメータに変化がなかったが、3日後に実施した実験では排尿間隔の短縮(25%)がみられたが、排尿閾値圧、最大排尿圧には変化が認められなかった。カプサイシンの濃度を10倍にしたところ、同日では排尿間隔が30%短縮、排尿閾値圧が10%低下、最大排尿圧が40%低下した。3日後では排尿間隔が20%短縮したが、排尿閾値圧と最大排尿圧に変化を認められなかった。プロスタグランジンE2 10-5Mでは同日も3日後も排尿間隔が14%と20%短縮したが、排尿閾値圧と最大排尿圧に変化を認められなかった。以上の検討より、子宮への炎症は膀胱は排尿機構に影響を及ぼし、排尿反射を増大させ、いわゆる頻尿を起こしうる可能性を示し、その影響は急性期より子宮の炎症が終了してからも頻尿状態を呈し過活動膀胱のなることがあきらかとなった。下腹神経節で腰部交感神経の節前線維は遠心性のシナプス(アセチルコリン性)を形成し、下腹神経を介して膀胱に終末している。膀胱底部の平滑筋にはβ受容体を介して弛緩を、内尿道部の平滑筋のα受容体を介して収縮をさせる。下腹神経には膀胱のほか、子宮や直腸からの求心性線維が含まれるがHRPによる逆行性標識によるシナプスを検討したところ、腰部の脊髄神経節細胞や脊髄には標識されず、両側の下腹神経節細胞が標識された(同側100%、反対側75%)。下腹神経を剥離し電気刺激すると反対側の下腹神経に放電が認められた(ソコウニン反射)。一方この電気刺激は下腹神経節の交感神経によるシナプス伝達を抑制した。仙髄の脊髄神経(S1-S3)を両側性に切断し、膀胱内にカテーテルを挿入し生理食塩水注入と内圧測定を実施した。一側の下腹神経を中央で切断してそれぞれの段端から放電の変化を記録した。膀胱内圧の上昇は20cmH2O以上になると末梢端で放電頻度が上昇した。また、中枢端では自発放電は記録されず、通常と同様なシナプス伝達が記録された。

膀胱内に酢酸(0.1%)を注入し拡張させると、末梢端での放電上昇閾値は10cmH2Oに低下し、放電数の上昇も顕著であった。中枢端ではシナプス伝達の大きさの抑制が長期に認められた。子宮への電気刺激(30V、30Hz、2分)でも子宮内にPGE2(10-5M)を注入しても同様の変化が記録された。一方、直腸の拡張(60cmH2O)やPGE2(10-5M)の注入では神経放電の変化が認められなかった。したがって、下腹神経による膀胱の蓄尿活動は下腹神経求心性線維の活動が活発になると、下腹神経節のシナプス伝達を抑制し、蓄尿活動が弱まることが明らかとなった。自律神経科学、生理学、神経生理学本年度の研究によって骨盤臓器の反射は会陰神経を介して仙髄の骨盤神経機構を修飾する主に排尿を抑制する機構があり、膣や直腸を進展させることに誘発することが明らかとなった。これは尿道刺激で排尿反射が抑制されるのとほぼ同じ機構と考えられる。予想外であったのはこの部位へのカプサイシンやプロスタグランジンの投与が排尿を促進し、膣では会陰神経切除でも変化がなかったことである。これは会陰神経ではない神経が関与していることを示している。猫による神経放電実験は2例ではあるが実施し、下腹神経からの求心性神経活動が子宮・直腸・膣の拡張刺激で発火頻度が上昇することを確認し、一側の下腹神経を切断して下腹神経節側(中枢断端)からの放電記録を試み、放電数の増加を認めた。下腹神経節の中枢側は切断していなかったので、これが下腹神経ー下腹神経による反射すなわちソコウニン反射によるものなのかは証明できなかったが可能性を示した。膀胱の活動状況を子宮の炎症性刺激が影響することがあきらかとなった。これは、骨盤臓器の状況が排尿という指標で評価できるきっかけとなる。子宮の状態を刺激直後と3日後とで検討したことにより、急性期における変化と刺激終了後におこる可塑性とを比較検討できた。その結果、排尿間隔は急性期よりこの後におこる変化が強く影響を及ぼしていると考えられた。この後の検討では3日後に引き続いておきる可塑性が、交感神経のどの機構で起こるのかを検討する。基本的計画は今年度同様にラットでは子宮・直腸・膣への炎症性物質の刺激による排尿反射への影響を検討する。また、猫においては下腹神経での神経放電を計測し、子宮・直腸・膣の拡張と炎症性物質の刺激による放電の変化を測定する。また、下腹神経ー下腹神経の反射を測定し、これは膀胱・子宮・膣のどの部位からどの部位に連絡しているのかを検討する。その結果とし骨盤臓器にはいっている交感神経求心性線維の果たす役割を解明していく。古くは骨盤臓器の痛みは交感神経の求心路が機能するといわれたが、Morgan他の研究により骨盤神経が主な求心路と書き直された。しかし交感神経求心性線維は存在することから下腹神経節が反射起点として膀胱の活動性を高めていく機構を明らかとするための神経放電記録実験を実施する。直腸へのバルーン刺激(20cmH2Oと60cmH2O)を急性期と3日後で実施し排尿間隔、排尿閾値圧と最大排尿圧の変化を検討する。子宮への刺激による排尿反射時間短縮について3日後だけでなくより長期の検討を実施する。また3日後の変化に関して交感神経幹の切除や下腹神経切除を実施し検討する。下腹神経からの神経放電を記録する為、ラットだけでなく猫を用いて放電頻度の違い、子宮刺激や直腸刺激による放電発火の違いを検討する。実験動物をH25年度はネコも使用することになり、その準備等のため予定したラットに匹数や薬品量が当初の計画より下回ったため次年度に研究費を繰り越した。H25年度は実験動物としてラットの購入とネコの購入、その他試薬・麻酔薬(セボフルレン)、消耗品費に充てる予定です。
細胞接着分子を標的とした動脈硬化治療戦略開発のための基盤構築

動脈硬化における細胞接着分子の機能と作用機構について解析し、以下の知見を得た。(1) Necl-5は、平滑筋細胞の収縮型から合成型への脱分化、運動と増殖を促進して、総頸動脈結紮後の内膜肥厚を促進した。(2) Necl-4は、血管内皮細胞がコンフルエントになると発現が増加し、PTPN13を介して血管内皮増殖因子受容体の自己リン酸化を抑制して、運動と増殖の接触阻害を誘導した。(3) FAM5Cは、血管内皮細胞において、炎症性刺激で増加し、活性酸素の産生亢進とNF-κBの活性化を介して、単球接着分子の発現を促進した。細胞接着分子Necl-4とNecl-5の生理的・病態生理的機能を解析した。まず、動脈硬化の初期病変である内膜肥厚形成におけるNecl-5の機能を解析した。Necl-5はマウス総頸動脈結紮後の肥厚した新生内膜の平滑筋細胞で発現が増加しており、Necl-5ノックアウトマウスでは内膜肥厚の形成が減弱し、血管壁でのDNA合成も減少していた。Necl-5ノックアウトマウス大動脈の初代培養平滑筋細胞では、野生型マウス平滑筋細胞と比べて、MAPキナーゼの活性化が抑制されており、血管平滑筋細胞の収縮型マーカー分子の発現が増加して合成型マーカー分子の発現が減少し、細胞の運動と増殖が減弱していた。以上の結果より、Necl-5は収縮型から合成型への脱分化を促進することにより、平滑筋細胞の運動と増殖を促進して、総頸動脈結紮後の内膜肥厚を促進することが明らかになった。次に、血管内皮細胞におけるNecl-4の機能を解析した。Necl-4は血管内皮増殖因子(VEGF)の受容体と細胞外領域を介して結合した。VEGFに応答して運動しているヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)では、Necl-4は運動先導端に集積した。siRNAによりNecl-4をノックダウンすると、ROCKが活性化され、VEGFに応答した細胞運動やマトリゲル上でのネットワーク形成、Rac1の活性化は抑制された。Necl-4ノックダウンによる細胞運動やネットワーク形成、Rac1の活性化の抑制はROCK阻害剤により回復した。また、Necl-4ノックダウンによるROCKの活性化は、Necl-4と結合するPTPN13をノックダウンすることにより抑制され、これに伴い、運動やネットワーク形成、Rac1の活性化の抑制も回復した。以上の結果より、Necl-4はPTPN13によるROCKの活性化を阻害することにより、VEGFに応答したRac1の活性化を促進して、細胞運動やマトリゲル上でのネットワーク形成を促進することが明らかになった。本年度は、血管内皮細胞における細胞接着分子Necl-4とFAM5Cの機能と作用機構を解析した。昨年度に引き続き、血管内皮細胞におけるNecl-4の機能を解析し、本年度はNecl-4がヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の運動と増殖の接触阻害に重要な働きをしていることを見出した。Necl-4はHUVECがコンフルエントになると細胞間接着部位に局在し、蛋白レベルでの発現が増加した。Necl-4を過剰発現させると、血管内皮増殖因子(VEGF)に応答したVEGF受容体の自己リン酸化は抑制され、Rac1とERKの活性化は抑制された。その結果、HUVECの運動と増殖は抑制された。反対に、siRNAによりNecl-4をノックダウンすると、VEGFに応答したVEGF受容体の自己リン酸化は亢進した。Necl-4と結合するPTPN13をノックダウンしても、同様にVEGFに応答したVEGF受容体の自己リン酸化は亢進し、Necl-4とPTPN13を同時にノックダウンしても、VEGFに応答したVEGF受容体の自己リン酸化はそれ以上には亢進しなかった。以上の結果より、Necl-4はコンフルエントになると発現が増加して、PTPN13を介してVEGF受容体の自己リン酸化を抑制し、Rac1とERKの活性化を抑制して、運動と増殖の接触阻害を誘導することが明らかになった。さらに、動脈硬化巣の血管内皮細胞に高発現しているFAM5Cの発現調節機構と機能を解析した。HUVECにFAM5Cを過剰発現させると、活性酸素の産生が亢進し、NF-κBの活性化が生じた。その結果、単球接着分子のICAM-1やVCAM-1、E-selectinの発現が増加し、単球接着が増加した。HUVECを炎症性サイトカインのTNF-αで刺激するとFAM5Cの発現は上昇し、FAM5Cのノックダウンにより、TNF-αによる単球接着分子の発現増加は抑制された。以上の結果より、FAM5Cは炎症性刺激で増加し、活性酸素の産生亢進とNF-κBの活性化を介して、単球接着分子の発現に関与していることが明らかになった。最終年度に当たる本年度は、血管内皮細胞における細胞接着分子Necl-4と動脈硬化巣の血管内皮細胞に高発現しているFAM5Cの機能と作用機構を解析した。Necl-4はヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の運動と増殖を制御しているが、HUVECを疎に培養した場合は、siRNAを用いてNecl-4をノックダウンしても、血管内皮増殖因子(VEGF)に応答したVEGF受容体の自己リン酸化は抑制されずに、ERKの活性化と細胞増殖は抑制された。

VEGFに応答したVEGF受容体は細胞内へ移行(internalization)するが、Necl-4をノックダウンしても、VEGFに応答したVEGF受容体の細胞内移行は影響されなかった。しかし、ERKの上流にあるRafやMEKのリン酸化は抑制された。Raf/MEK/ERKシグナル伝達経路の抑制は、Necl-4と同時にPTPN13をノックダウンしても回復せず、ROCK阻害剤によっても回復しなかった。以上の結果より、疎に培養した場合は、Necl-4はVEGFに応答したVEGF受容体の自己リン酸化と引き続き生じる細胞内移行には影響せずに、Raf/MEK/ERKシグナル伝達経路の活性化と細胞増殖を促進することが明らかになった。一方、FAM5Cの作用機構を明らかにするため、GFP tagの付いたFAM5Cを恒常的に発現したHEK293細胞を作製した。その細胞溶解液を用いて抗GFP抗体による免疫沈降物を解析し、FAM5CにUDP-glucose:glycoprotein glucosyltransferase (UGGT1)が結合していることを見出した。UGGT1は小胞体でグリコシル化されていない蛋白質に結合し、蛋白質の品質管理を担う酵素である。阻害剤を用いた検討から、FAM5CはN-グリコシル化されて分泌されることが初めて明らかになった。動脈硬化における細胞接着分子の機能と作用機構について解析し、以下の知見を得た。(1) Necl-5は、平滑筋細胞の収縮型から合成型への脱分化、運動と増殖を促進して、総頸動脈結紮後の内膜肥厚を促進した。(2) Necl-4は、血管内皮細胞がコンフルエントになると発現が増加し、PTPN13を介して血管内皮増殖因子受容体の自己リン酸化を抑制して、運動と増殖の接触阻害を誘導した。(3) FAM5Cは、血管内皮細胞において、炎症性刺激で増加し、活性酸素の産生亢進とNF-κBの活性化を介して、単球接着分子の発現を促進した。本年度に実施計画していた『血管内皮細胞におけるNecl-4の機能』と『FAM5Cの機能と作用機構』については解析が進み、その成果を論文発表することができた。『粥状動脈硬化形成におけるNecl-5の機能』を検討するため、現在、Necl-5ノックアウトマウスとLDL受容体ノックアウトマウスを交配してダブルノックアウトマウスを作成する必要があるが、ようやくNecl-5ノックアウトマウスの純系化が終了しつつある。血管細胞生物学『血管内皮細胞におけるNecl-4の機能』については論文発表できたが、計画時に予想していなかった展開が見られ、研究を発展させてさらに解析を進める予定である。これと並行して、『粥状動脈硬化形成におけるNecl-5の機能』を検討するため、Necl-5:LDL受容体ダブルノックアウトマウスの作成ができ次第、8-12週間高脂肪食負荷を与え、粥状動脈硬化巣の形成を組織染色により評価するとともに、血管内皮における単球接着分子の発現や動脈硬化病変へのマクロファージの浸潤を免疫染色により評価する。さらに、real time-PCR法、ウエスタンブロット法などにより、Necl-5:LDL受容体ダブルノックアウトマウスの表現型を詳細に解析する予定である。本年度に実施計画していた『内膜肥厚形成におけるNecl-5の機能』についてはすでにその成果を論文発表することができた。さらに、『血管内皮細胞におけるNecl-4の機能』については数回学会発表することができ、論文投稿準備中である。
多元計算解剖モデルを核とした国際共同研究基盤の創成

当該年度も昨年度と同様に新たに設置した運営委員会の下、主に4つの新たな国際活動拠点群を形成し、国際活動支援を実施した。これに基づき、国際連携多元計算解剖学の国際ネットワークを構築し、国際水準の若手育成と一流論文誌での国際共著論文発表を促進した。また、当該年度も引き続き、国際連携運営委員会を開催し、昨年度と同様に海外の連携拠点の主要研究者もメンバーに加えた。具体的な国際的な共同研究活動としては、4月には、九州大学の大内田、岩本、進藤らを米国ボルティモアのJohns Hopkins大学の米国一の膵臓癌研究施設であるProf. Jun Yuらの研究グループとともに、データベース化した実際の患者術前CT画像とMR画像を、術後病理組織から取得したmicro CT画像と比較し、その診断能を含めた実臨床における実現可能性と有用性に関して討論した。6月には橋爪誠がベルリンに、8月には溝口岳らをニューヨークのRiverside Researchに、9月には鈴木直樹らをソルトレイクシティのMayo Clinicに、11月にドイツ・ハンブルグに、11月から12月にかけて宗﨑良太がドバイに、12月には宮内翔子らをロンドンのImperial College Londonに、1月から2月にかけておよび3月に小林聡、CHO BYUNGHYUNらを韓国ソウルの大邱に派遣し、共同国際研究に関しての打合せをおこなった。また、4月から6月にかけてMANESCO CLARA MARILYNを京都を中心に招聘し、同様に国際共同研究の打ち合わせを行った。平成27年度は当初計画の国際連携WGを拡充し、新たに設置する運営委員会の下、主に4つの新たな国際活動拠点群を形成し、国際活動支援を実施した。これにより、国際連携多元計算解剖学の国際ネットワークを構築し、国際水準の若手育成と一流論文誌での国際共著論文発表を促進していく。また、平成27年度中に国際連携運営委員会を開催し、研究テーマの基本方針を決定した。本運営委員会は、海外の連携拠点の主要研究者もメンバーに加わり定期的に開催していく。企画案に従い、各担当者は、連携機関と遠隔会議システムも利用しながら、議論を進めて具体的な共同研究テーマを設定した。各連携テーマの拠点研究機関において、テーマを詳細化するための「キックオフミーティング」を開催した。各テーマの日本側担当者と海外連携機関側の研究者が研究計画を立案した。また、トップレベルの国際会議において本領域名を冠するオーガナイズドセッションを企画した。国際連携支援WGを強化するため、総括班内にあらたに国際活動支援班を立ち上げた。各国研究機関との連携や国際学会におけるセッション開催等、国内外連携活動を支援してきている。当該年度の前年度までに当初計画の国際連携WGを拡充し、新たに設置する運営委員会の下、主に4つの新たな国際活動拠点群を形成し、国際活動支援を実施した。また、当該年度の前年度中に国際連携運営委員会を開催し、研究テーマの基本方針を決定しており、これに基づき研究計画を推進した。本運営委員会は、海外の連携拠点の主要研究者もメンバーに加わえ定期的に開催した。具体的には、拠点1-Aの形成のために名古屋工業大学情報工学科教授本谷秀堅と東京農工大学大学院工学研究院教授清水昭伸、奈良先端大学教授佐藤嘉伸、山口大学創成科学研究科教授木戸尚治などをアメリカ・ハーバード大学国立小児医療センターあるいはイリノイ工科大学等に派遣して医用画像に関する基礎数理チームとの連携計画を立ち上げ、キックオフミーティングを開催した。また、拠点1-B,1-Cの形成のために九州大学講師Bano Jordanや名古屋大学の中村彰太をフランスMediCIS、IRCADやオーストリアのウィーン医科大学に派遣しそれぞれのデータ、ソフトの共有をすすめ、共同研究をすすめた。また、企画案に従い、各担当者は、連携機関と遠隔会議システムも利用しながら、議論を進めて具体的な共同研究テーマを設定した。各テーマの日本側担当者と海外連携機関側の研究者が立案した研究計画に基づき研究を遂行した。総括班内にあらたに立ち上げた国際活動支援班として各国研究機関との連携や国際学会におけるセッション開催等、国内外連携活動を支援してきている。また、当該年度も引き続き、国際連携運営委員会を開催し、昨年度と同様に海外の連携拠点の主要研究者もメンバーに加わえた。具体的な国際的な共同研究活動としては、5月には、岐阜大学の原らを中国の上海健康医学院および東北大学に派遣し、統計データや学習済みデータの共有などの方法に関して、7月には名古屋大学大学院情報学研究科・知能システム学専攻のRoth Holger ReinhardをイギリスのKing's College Londonに派遣し、多元計算解剖モデルを核とした国際共同研究基盤の創成に関して、9月にはニュジーランドのオタゴ大学に東京農工大の久保らを派遣し、MARS Spectral CT像に対するセグメンテーション手法の開発に関して、平成30年2月には、藤田保健衛生大学医療科学部放射線学科の寺本らを米国のNIH:Imaging Biomarkersand Computer-Aided Diagnosis Laboratoryに派遣し、人工知能を用いた肺癌診断支援に関してなど多くの共同研究を推進した。

その他にもカナダ、スイスなど多くの海外の拠点施設と連携を深め、協力に国際活動を推し進めた。総括班内にあらたに立ち上げた国際活動支援班として各国研究機関との連携や国際学会におけるセッション開催等、国内外連携活動を支援してきている。当該年度も昨年度と同様に新たに設置した運営委員会の下、主に4つの新たな国際活動拠点群を形成し、国際活動支援を実施した。これに基づき、国際連携多元計算解剖学の国際ネットワークを構築し、国際水準の若手育成と一流論文誌での国際共著論文発表を促進した。また、当該年度も引き続き、国際連携運営委員会を開催し、昨年度と同様に海外の連携拠点の主要研究者もメンバーに加えた。具体的な国際的な共同研究活動としては、4月には、九州大学の大内田、岩本、進藤らを米国ボルティモアのJohns Hopkins大学の米国一の膵臓癌研究施設であるProf. Jun Yuらの研究グループとともに、データベース化した実際の患者術前CT画像とMR画像を、術後病理組織から取得したmicro CT画像と比較し、その診断能を含めた実臨床における実現可能性と有用性に関して討論した。6月には橋爪誠がベルリンに、8月には溝口岳らをニューヨークのRiverside Researchに、9月には鈴木直樹らをソルトレイクシティのMayo Clinicに、11月にドイツ・ハンブルグに、11月から12月にかけて宗﨑良太がドバイに、12月には宮内翔子らをロンドンのImperial College Londonに、1月から2月にかけておよび3月に小林聡、CHO BYUNGHYUNらを韓国ソウルの大邱に派遣し、共同国際研究に関しての打合せをおこなった。また、4月から6月にかけてMANESCO CLARA MARILYNを京都を中心に招聘し、同様に国際共同研究の打ち合わせを行った。今後も国際活動支援班の活動を積極的にすすめていく。また、若手を中心とした海外派遣もより一層推進し、引き続き人材育成を十分に考慮した活動を展開していく。これにより領域全体のプロジェクトをさらに推進していく。平成27年度は、国際活動支援班の設置、班内の各委員会の立ち上げに関する会議を頻繁におこなったが、できるだけTV会議を取り入れて、旅費による出費を削減することができた。当該年度は、国際活動支援班に設置された各委員会の会議を頻繁に行ったが、ほとんどの会議をTV会議併用でおこなったため、旅費による支出を削減することができた。
機能性複素環N-オキシドによる生体物質及び外来物質の光酸化反応

本研究者等は特異な構造環境を有する複素環N-オキシド、ピリミド-[5.4-g]プテリジンテトロンN-オキシド(PPO),が従来研究されてきたN-オキシド類とは異なる機構で効率良く基質を光酸化することを示してきた。本研究では主に生体物質としてヌクレオシド及びDNAを対象とし、PPOによる光酸化反応を詳細に検討した。脂溶性PPOによるヌクレオシドの光酸化反応における置換基効果や溶媒効果を調べ、特にプリンヌクレオシドから生ずるプリンラジカルカチオンの化学的性質に知見を得ると同時にアルコール溶媒中でのPPOの光分解は水酸ラジカルを発生し、ヌクレオシドを酸化することを見い出した。この結果は、水溶性PPOを合成して水中での光分解を行えば効率の良い水酸ラジカル発生法となり得ることを示唆している。脂溶性PPOの合成法を用いて水溶性PPOを合成し、水中での光分解を詳細に検討した結果、予期した通り、一分子の水溶性PPOから二分子の水酸ラジカルがほぼ定量的に発生することがESRスピントラッピング法及びBabb'sの定量法で確かめることができた。この光化学的水酸ラジカル発生法を用いてヌクレオシドとの反応、さらにDNA鎖切断反応を調べたところ、水溶性PPOを用いるスーパーユイルDNAの切断は極めて効率良く惹起し、2μMのPPO濃度でほぼ完全なFormIからFormIIへの変換が見られた。この知見に基づく水溶性PPOを用いる放射線あるいは光力学的癌療法の開発研究は今後に大きな期待がかけられる。また、蛋白、脂質あるいは医薬品に対する脂溶性及び水溶性PPOを用いる光酸化反応の研究も続行中で、PPOの光化学を活性酸素種のモデルと促えて展開している。
上皮細胞の過形成とがん化の分子機構

PKCαノックアウトマウスの皮膚では、表皮基底細胞の増殖に必須なEGFレセプターのリン酸化が減少し、発がんプロモーター処理や創傷治癒時の表皮過形成が抑制される。また、EGFレセプターリガンドの中では、TGFαとHB-EGFの発現が顕著に減少した。PKCα欠損角化細胞では、EGFレセプターシグナル経路に野性型との違いはみられなかったが、IKKα/βのリン酸化が減少した。酵母two-hybrid法で遺伝子発現に関与する因子を探索し、PKCαと相互作用する新たな分子としてDrosophilaがん抑制遺伝子tumorous imaginal disks 1のホモログTid1を見いだした。Tid1との結合は、PKCαと直接結合するPICK1やRAcK1と同程度であった。Tid1は他のPKC分子種とは結合しなかった。Tid1はIKKα/βとも結合するが、PKCαとの結合領域はそれらとは異なっていた。PKCαは特異的にTid1と結合してIKKα/βの活性を制御し、NFκB経路を介して、TGFαとHB-EGF遺伝子の発現に関与する可能性が考えられた。PKCζのキナーゼドメインのみのPKMζ相互作用分子としてWWドメインタンパク質KIBRAを取得した。KIBRAはPKCζと結合し、非競合的に酵素活性を抑制した。細胞極性との関連をMDCK細胞を用いて調べたところ、KIBRAの免疫沈降物にはaPKCとともにPAR6を検出したが、PAR3はみとめられなかった。PAR3の免疫沈降したところ、aPKCとPAR6を検出したが、KIBRAはみとめられなかった。KIBRAを過剰発現すると細胞同士の接着面におけるZO-1が減少した。KIBRAはPAR3と競合的にaPKCに結合し、タイトジャンクションの機能に関与する新たな細胞極性分子と考えられる。ホルボールエステル発がんプロモーターはマウス表皮の過形成を誘導する。この際、基底細胞の増殖が同調的に3回誘導されるが、この機構については不明である。発がんプロモーターの標的分子PKCの中で、基底細胞で高発現するPKCαのノックアウトマウスを用いて過形成を調べた。ホモ型では、表皮過形成が顕著に低下した。基底細胞の同調的DNA合成の誘導は、1回目は野性型と変わらなかったが、それ以降が顕著に低下した。過形成誘導直後に、角化細胞のEGFレセプターとERKが活性化されるが、ホモ型と野性型に違いはみられなかった。しかし、ホモ型ではTGF-αとHB-EGFの発現が顕著に減少した。皮膚ではEGFは検出されず、TGF-αとHB-EGFがEGFレセプターリガンドとして働く可能性が高い。これらEGFレセプターリガンドは角化細胞でプロ体として発現し、プロテアーゼによるシェディングを受けて遊離、レセプターに結合する。PKCαがEGFレセプターリガンドを誘導し、表皮基底細胞の同調的増殖を誘導することを明らかにした。しかし、皮膚二段階発がん実験を行なったところ、ホモ型マウスにパピローマが顕著に発生した。このことは、上皮組織の過形成が発がんの下地となるという説に疑問を投げかける結果である。マウス胎児由来繊維芽細胞を用いてアポトーシスを検討した。PKCα欠損細胞では、UV照射によるDNA断片化が顕著に抑制された。その際、JNK2の活性化が野性型に比べて高かった。しかしJNK1の活性化に差はなかった。また、DNAミスマッチ修復分子MutSαの核移行にも差はなかった。PKCαがJNK2を介して、アポトーシスに抑制的に働くことを明らかにした。このことは、上皮組織の過形成と発がんを、上皮細胞のアポトーシスと関連させて検討する必要性を示している。繊維芽細胞をコラーゲンゲル内に封じ、その上に角化細胞を培養するマウス皮膚モデルを確立した。この三次元培養は角化細胞層を空気暴露することで重層化を誘導できる。角化細胞の重層化は繊維芽細胞の存在に依存する。空気暴露は角化細胞のIL-1αおよびIL-1βの誘導を促進した。また、繊維芽細胞のKGF1およびKGF2発現を促進した。とりわけ、IL-1βとKGF1の発現と角化細胞層の厚さとの間に良い相関がみとめられた。IL-1α/βは繊維芽細胞のKGF1/2を誘導する。また、KGF1/2は角化細胞の増殖を誘導する。PKCηノックアウトマウスの角化細胞はIL-1α/βの発現が高く、とりわけIL-1βは顕著である。この角化細胞を皮膚モデルで培養したところ、過度に重層化した。アデノウイルスを用いてPKCηを強制発現させると重層化は抑制された。これまでに、PKCηが表皮過形成と腫瘍発生に抑制的に働くことを明らかにしている。表皮顆粒層で発現するPKCηがIL-1α/β等の発現を制御し、サイトカインを介した上皮と間質の細胞間相互作用によって扁平上皮細胞の重層化が制御されると考えられる。表皮基底細胞の増殖にはEGFレセプターの活性化が必須である。しかし皮膚ではEGFは発現せず、EGFレセプターリガンドとしてTGFα、HB-EGF、amphiregulinとepiregulinが角化細胞で発現している。

表皮過形成が抑制されるPKCαノックアウトマウスの角化細胞は、フォルボールエステル発がんプロモーター処理するとこれらリガンドの発現が低下した。しかし、TGFαやHB-EGF処理によるこれらEGFレセプターリガンドの発現誘導は、野性型と変わらなかった。PKCαはEGFレセプターシグナル経路とは異なる機構でEGFレセプターリガンドの発現制御に関わる可能性を示している。PKCαノックアウトマウスの皮膚では、表皮基底細胞の増殖に必須なEGFレセプターのリン酸化が減少し、発がんプロモーター処理や創傷治癒時の表皮過形成が抑制される。また、EGFレセプターリガンドの中では、TGFαとHB-EGFの発現が顕著に減少した。PKCα欠損角化細胞では、EGFレセプターシグナル経路に野性型との違いはみられなかったが、IKKα/βのリン酸化が減少した。酵母two-hybrid法で遺伝子発現に関与する因子を探索し、PKCαと相互作用する新たな分子としてDrosophilaがん抑制遺伝子tumorous imaginal disks 1のホモログTid1を見いだした。Tid1との結合は、PKCαと直接結合するPICK1やRAcK1と同程度であった。Tid1は他のPKC分子種とは結合しなかった。Tid1はIKKα/βとも結合するが、PKCαとの結合領域はそれらとは異なっていた。PKCαは特異的にTid1と結合してIKKα/βの活性を制御し、NFκB経路を介して、TGFαとHB-EGF遺伝子の発現に関与する可能性が考えられた。PKCζのキナーゼドメインのみのPKMζ相互作用分子としてWWドメインタンパク質KIBRAを取得した。KIBRAはPKCζと結合し、非競合的に酵素活性を抑制した。細胞極性との関連をMDCK細胞を用いて調べたところ、KIBRAの免疫沈降物にはaPKCとともにPAR6を検出したが、PAR3はみとめられなかった。PAR3の免疫沈降したところ、aPKCとPAR6を検出したが、KIBRAはみとめられなかった。KIBRAを過剰発現すると細胞同士の接着面におけるZO-1が減少した。KIBRAはPAR3と競合的にaPKCに結合し、タイトジャンクションの機能に関与する新たな細胞極性分子と考えられる。
造血異常とリボソームタンパク質遺伝子の変異:ゼブラフィッシュを用いたアプローチ

ゼブラフィッシュにおいて、アンチセンスオリゴによりリボソームタンパク質rps19遺伝子の発現を抑制し、ダイヤモンド・ブラックファン貧血モデルを作製した。S19タンパク質の発現が抑制されても、個体の全タンパク質の量やリボソームの翻訳効率は大きく変化しなかった。しかし、受精後23日で血球の成熟が停止し血球数が顕著に減少した。これらのことから、造血に関与する因子の翻訳が特異的に阻害されている可能性が考えられた。先天性の赤芽球形成不全であるダイヤモンド・ブラックファン貧血(DBA)の患者において、6種類のリボソームタンパク質(RP)遺伝子の変異が報告された。これらは、すべての細胞において翻訳活動を担うリボソームの構成成分をコードする。それらの変異がなぜ造血系に強い影響を及ぼすのかを解明し、治療法の開発へと発展させるためには、モデル動物を用いた解析が必須である。そこで、ヒトと同様の造血プロセスを有するゼブラフィッシュを用いて、DBAモデルの作成を試みた。DBAの責任候補遺伝子の一つであるRPS19に対するアンチセンスオリゴを用いてS19タンパク質の発現を抑制すると、受精後48時間までに著しい赤血球数の低下がみられた。血管形成、単球、顆粒球の形成は阻害されないことを確認した。赤血球数は合成RPS19mRNAの注入により回復した。また、患者型の変異を挿入した合成mRNAでは血球数の回復はみられなかった。これらのことから、RPS19が造血に重要な役割を果たすことが示唆された。また、S19抑制胚の赤血球は完全に成熟していなかった。この成熟過程に関わる因子の翻訳が特異的に影響を受ける可能性がある。これを明らかにするためには、リボソームと結合しているmRNAの頻度を解析することが有効であると考えた。そこで、酵母などに用いられるポリソーム解析手法のゼブラフィッシュへの応用を試みた。ショ糖密度勾配遠心法によりポリソーム(複数のリボソームがmRNAを翻訳している状態)を分画し、そこからmRNAを精製した。今後は、これらmRNAを用いてマイクロアレイまたは次世代シーケンサーによる発現頻度の解析を進めていく。ゼブラフィッシュを用いることで、初めて脊椎動物のDBAモデルを作成することができ、さらに、リボソームの翻訳制御の変化による疾患群「リボソーム病」発症機序を探求するための基盤技術を確立することができた。先天性の赤芽球形成不全であるダイヤモンド・ブラックファン貧血(DBA)の患者において、これまでに10種類以上のリボソームタンパク質(RP)遺伝子の変異が報告された。これらの変異がなぜ造血系に強い影響を及ぼすのかを解明するために、ゼブラフィッシュのDBAモデル(rps19発現抑制胚)を用いて解析を行った。1.ポリソーム解析モルフォリノアンチセンスオリゴによりrps19発現抑制胚を作製し、ショ糖密度勾配遠心法によりポリソーム(複数のリボソームがmRNAを翻訳している状態)を分画し、そこからmRNAを精製した。このmRNAを鋳型にcDNAを合成し、造血に関わる遺伝子(sptb,tubb5,mpo)と、アポトーシスに関わる遺伝子(p53,p21,bax)について半定量的PCRを行った。表現型の解析によって赤血球の減少やアポトーシスの亢進が確認されたことと一致して、sptb、tubb5、mpoの発現は減少し、p53の発現は顕著に増加することが示唆された。2.赤血球の成熟度の解析受精後24、48、72時間のrps19発現抑制胚から血球を採集してギムザ染色後、形態観察により赤血球の成熟度を判定した。正常胚と比較して血球の成熟は遅延し、48時間までにほとんどの血球でアポトーシスの亢進が見られた。合成したmRNAの注入により血球の成熟は回復した。また、rps19とp53遺伝子を同時に抑制しても、血球数の回復は顕著ではなかった。このことから、アポトーシスの亢進が貧血の直接の原因ではないと考えた。rps19遺伝子の発現量の低下に伴って、ポリソーム画分に含まれる量が変動するmRNAは貧血発症に関与する可能性が高い。それを明らかにするための解析技術を確立することができた。
コンポストの発酵過程における窒素成分の散逸防止に関する研究

本研究では,まず,コンポスト化過程における酸とアンモニアの生成について考察を行い,発酵初期,反応が急激に立上がる期において低級脂肪酸が発生すること,この期において極端なpH低下があると発酵が停止すること,アンモニアの発生はこの期の後に起こり,アンモニアの発生するようなpHの高い時期においては,発酵速度が大きいことを明らかにした.アンモニア生成期においては, pHも高いため,窒素分がアンモニアガスとして揮散する.窒素分の揮散量は材料のC/N比によっても変わるが,原料中の窒素分の50%にも達することが確かめられた.窒素分の揮散量は,材料のC/N比を高めれば,減らすことができる.しかし, C/N比を高くすると,発酵速度が低くなるため,実用的にC/N比をあまり高くすることはできず,発酵過程でのアンモニアの揮散は避けられない.そこで,アンモニアをコンポスト自身に吸着・回収することを考えた.コンポストが吸収できるアンモニア量は,コンポストの含水比および酸の量と直線的な関係があり,この両者が多いとアンモニアが多量に吸収される.コンポスト重鎮層によるアンモニアガスの吸着装置に関しては,流入アンモニアガス濃度が数百ppm以下であれば,吸収アンモニア量はガス濃度に関係なく一定であること,また,同じ量のアンモニアを処理する場合,濃度は処理効果に影響しないことが分った.一方,コンポストに吸着されたアンモニアは,一次発酵過程では,ほとんど硝化されないことが分った.このことは,コンポスト中の硝化菌の数からも確かめられた.硝化の起きない原因は,材料中のアンモニア濃度が非常に高いことにあると考えられた.本研究では,まず,コンポスト化過程における酸とアンモニアの生成について考察を行い,発酵初期,反応が急激に立上がる期において低級脂肪酸が発生すること,この期において極端なpH低下があると発酵が停止すること,アンモニアの発生はこの期の後に起こり,アンモニアの発生するようなpHの高い時期においては,発酵速度が大きいことを明らかにした.アンモニア生成期においては, pHも高いため,窒素分がアンモニアガスとして揮散する.窒素分の揮散量は材料のC/N比によっても変わるが,原料中の窒素分の50%にも達することが確かめられた.窒素分の揮散量は,材料のC/N比を高めれば,減らすことができる.しかし, C/N比を高くすると,発酵速度が低くなるため,実用的にC/N比をあまり高くすることはできず,発酵過程でのアンモニアの揮散は避けられない.そこで,アンモニアをコンポスト自身に吸着・回収することを考えた.コンポストが吸収できるアンモニア量は,コンポストの含水比および酸の量と直線的な関係があり,この両者が多いとアンモニアが多量に吸収される.コンポスト重鎮層によるアンモニアガスの吸着装置に関しては,流入アンモニアガス濃度が数百ppm以下であれば,吸収アンモニア量はガス濃度に関係なく一定であること,また,同じ量のアンモニアを処理する場合,濃度は処理効果に影響しないことが分った.一方,コンポストに吸着されたアンモニアは,一次発酵過程では,ほとんど硝化されないことが分った.このことは,コンポスト中の硝化菌の数からも確かめられた.硝化の起きない原因は,材料中のアンモニア濃度が非常に高いことにあると考えられた.コンポストの一次発酵過程においては、易分解性有機物の分解と同時に、有機態窒素の無機化すなわちアンモニア態窒素の生成が起こる。一次発酵過程では、発酵槽内が高温になり、また通気を行っているため、生成したアンモニア態窒素がアンモニアガスとして気化する。このことは臭気の発生と同時に、肥料成分としての窒素の損失を招く。本研究では、本年度、実験室規模の発酵実験を行い、窒素成分の挙動について調べると同時に、揮散するアンモニアをコンポスト自身に吸収させて回収する方法について検討するため、コンポストのアンモニア吸収能について実験的に検討した。発酵実験に用いた原料には約24mg/gの窒素が含まれており、その殆どが有機態であった。窒素は、発酵の進行に伴って無機化し、最大時には10mg/g以上のアンモニア性窒素が検出された。しかし、発酵終了時にはアンモニア態窒素は数mg/gまで低下し、全窒素も原料の約1/2になっていた。また、この過程において、亜硝酸態窒素ならびに硝酸態窒素の増加は殆ど認められなかった。このことから、無機化した窒素の大部分がアンモニアガスとして散逸してしまうことが明らかとなった。コンポストのアンモニア吸収態は、ビン内にコンポストとアンモニアガスを封入し、平衡に達した後のコンポスト中のアンモニア態窒素濃度と気相中のアンモニア濃度を測定することにより調べた。その結果、コンポストの水分が多い程、また、コンポスト中の酸の量が多い程、コンポストのアンモニア吸収能が高くなることが確認された。次年度においては、発酵実験を継続してアンモニア態窒素の硝化について検討すると同時に、コンポストを充てんしたカラムにアンモニアガスを通気する方法を用いてアンモニア回収の効率について検討する予定である。
目的とする治療作用と副作用を分離できる創薬技術の開拓とサイトカイン療法の最適化

目的とする治療作用と副作用を分離できる創薬技術の開拓とサイトカイン療法の最適化に関する検討を行い、以下の結論を得た。1)IL-6(インターロイキン-6)を至適条件でPEG(ポリエチレングリコール)バイオコンジュゲート化することで、in vivoにおいて血小板増加作用を500倍にも増強することに成功した。また、その効果は血中滞留性、組織移行性、安定性、比活性をはじめとする、諸因子の有機的バランスに依存していることが明らかとなった。2)PEGバイオコンジュゲーションにより、サイトカインの投与量の大幅削減、および副作用発現に関わる組織への分布を抑制するという、体内動態制御が可能となり、その結果、サイトカインの多様なin vivo生理作用の中から目的とする治療作用をより選択的に増強し得ることが示唆された。3)PEGよりもさらに緻密な動態制御、および機能付与が可能な新規修飾高分子としてPVPが有用であることを見出した。In vivoにおいてPVP(ポリビニルピロリドン)はPEGと少なくとも同等のバイオコンジュゲート効果を有したことから、新規機能付与を行うための幹高分子としてのPVPを提示し得たものと思われる。サイトカインは、次世代の治療薬として期待されつつも、その生体内安定性の乏しさとin vivo生理作用の多様性ゆえに、臨床応用が断念され続けてきた。我々が独自に開発を試みている水溶性高分子ハイブリッド化は、サイトカインの生体内安定性を飛躍的に向上できるうえ、さらに目的とする治療作用と副作用とを選択分離し得るため、上述の問題を同時に克服可能な新規創薬法として期待されている。本研究では、血小板造血製剤として注目されているIL-6を臨床に適用可能な医薬品として開発していくことを念頭に、生体内安定性に優れ、かつ多様なin vivo生理活性の中で目的とする治療作用(血小板産生促進作用)のみを有するハイブリッドIL-6を分子設計しようとするものである。以上の観点から本年度は、まずPEGを修飾高分子として用い、IL-6の最適ハイブリッド化条件を追求した。その結果、in vitroにおけるPEG-IL-6の比活性は、PEG修飾率の増大と共に減少し、この比活性低下の程度は、ハイブリッド化に用いたPEG分子量の増大に伴って著しいものとなった。これは、単に活性発現に関与するアミノ酸残基をPEG修飾してしまうことのみならず、IL-6に結合しているPEG鎖長の増大により生じる立体障害によっても、比活性が著しく損なわれてしまうことを意味している。一方、in vivoにおける血小板産生作用・副作用を評価したところ、分子量5,000のPEGで約50%のPEG修飾率に制御したPEG-IL-6(MPEG-IL-6)が最も有効性・安全性に優れていることが判明した。体内動態を検討した結果、MPEG-IL-6は血中滞留性、組織移行性、プロテアーゼ抵抗性などのバランスに優れていることが明らかとなった。以上、当初計画通りの成果が得られたものと考えられた。以上の観点から昨年度は、まずPEGを修飾高分子として用い、IL-6の最適ハイブリッド化条件を追求した。その結果、最適条件でハイブリッド化したPEG-IL-6のin vivoにおける血小板産生作用・副作用を評価したところ、IL-6の多様なin vivo生理作用の中から目的とする治療作用(血小板増加作用)が選択的に500倍にも増強されていること、副作用である発熱・急性期蛋白質誘導・抗体産生が顕著に抑制されていることが判明した。以上の事実は、最適のハイブリッド化により、IL-6に作用の選択性を付与し得ることを示している。またPEGに代わる機能導入可能な修飾高分子として、ポリビニルピロリドンの有用性が判明した。