hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ミクロとマクロのシミュレーション線量評価を結合した究極の粒子線治療計画技術の研究

細胞レベルのマイクロドシメトリ技術と放射線治療の治療計画技術(マクロドシメトリ技術)を結合し、粒子線治療の等価線量を計算のみで求めることのできる技術の研究開発を行った。この結果、確立した技術に関する特許出願を行った。さらに確立した技術の検証を実施し、モンテカルロコード:PHITSに開発した技術を組み合わせた治療計画システムを構築することで等価線量を計算で評価できる見通しを得た。本研究は、モンテカルロ法による細胞レベル、DNAレベルの放射線影響解析技術(マイクロドシメトリ技術)と放射線治療の治療計画技術(マクロドシメトリ技術)を結合し、粒子線治療における等価線量を数値シミュレーションのみで求め、統一の指標で表現可能な治療計画手法の基盤技術の開発を行うものである。本研究によって、モンテカルロシミュレーションによって放射線場のLET分布より個々の細胞核線量の確率密度分布を計算する手法を確立した。また、細胞核線量の確率密度分布を考慮して細胞生存率及び生物学的効果比(RBE)を算出する技術を開発した。これにより、従来の計算で求める吸収線量(物理線量)に新計算手法で求めたRBEを乗じることによって、等価線量を数値シミュレーションのみで評価できる技術基盤を確立した。この確立した技術について特許出願を行った(特願2012-124674)。確立した技術を実際の放射線治療の治療計画/線量評価に応用する研究を行った。本研究ではモンテカルロ法による治療計画技術が先行的に実用化されているBNCT分野の線量評価に当技術を適用することを検討した。BNCT用治療計画システム:JCDSのモンテカルロ計算コードをマイクロドシメトリ計算が可能なPHITSに置き換えた。まず、PHITSによる線量評価の妥当性を検証するため、同じ計算条件下でMCNPとPHITSでの線量計算を実行し、PHITSがMCNPと同等の吸収線量分布を算出できることを確認した。これによりPHITSを組み合わせた治療計画システムを構築することで物理線量とRBEを算出して等価線量までを導出できる見通しを得た。この研究成果を踏まえて、等価線量評価が可能な治療計画システムを開発するため、平成25年度の科学研究費補助金、基盤研究(C)に応募し、採択された。本研究の目的は、モンテカルロ法による細胞レベル、DNAレベルの放射線影響解析技術(マイクロドシメトリ技術)と放射線治療の治療計画技術(マクロドシメトリ技術)を結合し、陽子線、重粒子線および中性子線を用いる中性子補足療法(BNCT)等の現存する全ての粒子線照射における等価線量を数値シミュレーションによる計算のみで求め、統一の指標で表現可能な治療計画手法の基盤技術の開発を目指す。研究期間内に生体内での変化を考慮した生物学的効果比(RBE)と物理線量分布を同時に評価可能なモンテカルロ線量計算手法を確立し、治療時の等価線量を客観的に評価することを可能にする。またこの手法を応用し、特に施設毎に線質が異なるBNCT分野において、異施設間の線量と治療効果の直接比較を実現し、さらにビームの生物学的効果を予測した新施設の最適設計も可能にする技術基盤の確立を目指す。本研究のキーテクノロジーとなる放射線照射によって生体に付与される線量を個々の細胞レベルで起こる反応をシミュレーションして評価する技術(マイクロドシメトリ技術)については、基本的なアルゴリズムが完成し検証計算も実施して適切な評価を実施できることが確認できた。これに基づいて本手法に関する特許を取得するための手続きを進めており平成24年5月中にも出願する予定である。また、本手法については論文投稿も行い、査読付き英文誌:Radiation Research誌にアクセプトされ、5月末に出版されることとなった。またこの計算アルゴリズムを組み合せるモンテカルロ計算コードの開発と、さらにこの計算コードを実装する治療計画システムについても順調に開発を進めている。平成23年度に開発した計算アルゴリズムを汎用モンテカルロ計算コードPHITSに組み込んでマイクロドシメトリに基づいて線量を計算する計算コードを整備する。さらにこの計算コードPHITSを、別途研究開発中の治療計画システムのツクバプラン(仮称)に実装し、マイクロドシメトリによって治療計画立案を行うシステムのプロトタイプを構築する。ここで治療計画システムとは患者のCT画像を基に3次元モデルを作成し、このモデルに対して放射線照射のシミュレーションを実行して最適な照射条件を導くソフトウェアである。新しい線量計算アルゴリズムを組み合わせたツクバプランの検証を行う。検証方法は、人体のCT画像データを準備してツクバプランに読み込ませて計算モデルを作成し、マイクロドシメトリ技術による線量計算を実行する。この計算結果と、従来の手法による線量計算結果を比較し、新しい計算手法による線量評価の妥当性、計算精度及び実用性などの評価を行う。平成23年度に繰り越した研究費:48,180円については、当初、発明したマイクロドシメトリ技術の研究成果を平成24年3月に開催される国内の関連する学会で発表する計画であったが、学会の参加締切(平成23年11月)までに研究成果がまとまらなかったため、平成24年度に関連する学会で発表することとして、繰り越した。平成24年度の研究費の使用計画を以下に示す。●開発した計算アルゴリズムを実装したPHITSを治療計画

システム:ツクバプランに組み合わせるためのコーディング作業を役務発注する(800千円)●開発した計算コードを検証するための実験治具消耗品を整備する(100千円)●治療計画システムの検証に用いるPCワークステーションを整備する(300千円)●発明したマイクロドシメトリ技術の研究成果を発表する(550千円)
複数の計測系(マルチモダリティ)統合による3次元術後顔貌予測法の開発

1.複数の計測系(マルチモダリティ)の統合CT3次元再構築画像、レンジファインダー(SURFRACER)より採取した歯列模型の3次元座標を、2方向セファログラムにより構築した座標系に統合し、総合的に計測可能なシステムを構築した。また、液晶レンジファインダーから得られた顔面軟組織の3次元情報をこの座標系に追加して評価するシステムをシリコングラフィックスワークステーション上で開発した。さらに、歯列石膏模型の3次元データ(サーフェスデータ)をCTの表示データ上に直接表示することが可能であることを明らかにした。2.顔貌予測の基準となる硬・軟組織の特徴点の決定と定義顔面および顎骨の特徴点は正中付近に集中しており、側方部に特徴点を定義しこれを採取することは困難であった。このため、顔面側方は水平断のスライス上で中心点を決定し、一定角度で放射状に補助線を設定して硬・軟組織の計測点を決定した。1.の計測システム上に、下顎前突症患者(顔面非対称をもたない)9例の術前および術後のCTデータを構築した。術前3D-CTの硬組織を手術による歯列の移動をもとに座標変換で移動させ、対応する軟組織の移動量を測定した。3.術中に基準となる特徴点に対する、予測点の移動様態の検討定義した特徴点のうち、手術の際に移動させる組織の基準点に対してその他の定義点がどの様な動きをとるかを観察した。重回帰分析で軟組織の術前後の移動様相を解析したところ、対応する硬組織特徴点の移動量と単回帰式で表現されることが明らかとなった。平成10年度はセファログラム、CT、歯列模型の3次元データを同一座標系に統合する方法を開発し、この方法を用いて顎矯正手術における術前後の硬・軟組織の3次元的計測・評価法を検討した。従来接触型3次元形状計測装置を用いて手動で行ってきた歯列模型計測が、非接触・高速3次元形状計測装置を用いることにより自動化され、かつより多くのデータを採取することが可能となった。顎顔面は明瞭に特定できる点は少ないため以下の方法で計測点を定義した。また、患者データを用いるためその収集と管理は煩雑であるが、既設のネットワークシステムに通信制御装置を付加することにより、その労力を大幅に軽減することが可能となった。予測データを求めるためのデータはCT、セファログラム、歯列模型とし、セファログラムはステレオグラムの原理を応用して3次元計測.を可能にした。CTは3次元再構築を行った。CT再構築にはボクセルモデルとソリッドモデルの2方法が存在するが、補正により高精度の計測が可能なソリッドモデルを採用した。歯列模型も計測後ソリッドモデルに構築した。セファログラムのデータおよび座標を基準として歯列模型は三角形の重ね合わせでCTは下顎骨輪郭線の重ね合わせで統合し、これらのデータを1つの統合データとして取り扱えるようにした。さらに、手術による顔貌変化計測の方法を検討した。顔面は求めやすい特徴点が少ないため、新たに計測用平面を水平断で約3mm間隔で設定し、各平面でx軸を中心に一定角で放射状に直線を引き、これと硬組織および軟組織との交点の座標を求めて、計測点を得た。現在これらの計測点の再現性を検討しているが、高い再現性が得られる可能性が示唆されている。1.複数の計測系(マルチモダリティ)の統合私たちがすでに開発しているCT3次元再構築画像、セファログラムおよび歯列模型の3次元座標統合・計測システムに、液晶レンジファインダーから得られた顔面軟組織の3次元情報を追加し、同一座標系で評価可能にするシステムをシリコングラフィックスワークステーション上で開発した。MRIについては現在までに統合されておらず、検討中である。また、サーフレーサーで採取した歯列石膏模型の3次元データをCTの表示データ上に直接表示を試みており、次年度には完成予定である。2.術前後の計測データの収集

1.で作製された計測系を用いて顎変形症患者20例以上の術前・後のデータ(3次元セファログラム、CT、歯列石膏模型)の収集を完了している。来年度1年で、最終解析に必要なデータの収集が可能と考えられる。3.顔貌予測の基準となる硬・軟組織の特徴点の決定と定義顔面および顎骨の特徴点は正中付近に集中しており、側方部に特徴点を定義しこれを採取することは困難であった。このため、顔面側方は水平断のスライス上で中心点を決定し、一定角度で放射状に補助線を設定して硬・軟組織の計測点を決定した。4.術中に基準となる特徴点に対する、予測点の移動様態の検討3.で定義した特徴点のうち、手術の際に移動させる組織の基準点に対してその他の定義点がどの様な動きをとるかを観察した。多変量解析で予備解析を行い、術前後の移動様相が数式で表される可能性があることを明らかにした。1.複数の計測系(マルチモダリティ)の統合CT3次元再構築画像、レンジファインダー(SURFRACER)より採取した歯列模型の3次元座標を、2方向セファログラムにより構築した座標系に統合し、総合的に計測可能なシステムを構築した。また、液晶レンジファインダーから得られた顔面軟組織の3次元情報をこの座標系II追加して評価するシステムをシリコングラフィックスワークステーション上で開発した。さらに、歯列石膏模型の3次元データ(サーフェスデータ)をCTの表示データ上に直接表示することが可能であることを明らかにした。2.顔貌予測の基準となる硬・軟組織の特徴点の決定と定義顔面および顎骨の特徴点は正中付近に集中しており、側方部に特徴点を定義しこれを採取することは困難であった。1.の計測システム上で、下顎前突症患者(顔面非対称をもたない)9例のCTデータを歯列の手術による移動をもとに座標変換で移動させ、対応する軟組織の移動量を測定した。3.術中に基準となる特徴点に対する、予測点の移動様態の検討定義した特徴点のうち、手術の際に移動させる組織の基準点に対してその他の定義点がどの様な動きをとるかを観察した。重回帰分析で軟組織の術前後の移動様相を解析したところ、対応する硬組織特徴点の移動量と単回帰式で表現されることが明らかとなった。
新規シグナル伝達分子Casの多角的機能解析

インテグリン刺激に際しては,FAKが自己リン酸化し,そこから,シグナルカスケードが開始され,Casがチロシンリン酸化される.3Y1細胞やNIH3T3細胞などを通常の接着状態で培養しているときには,Casはその大部分が細胞質に存在するが,接着刺激を加えた時や,v-Crkや活性型Srcで形質転換された細胞では,Casの細胞骨格分画への局在が増加した.蛍光免疫染色でみた場合も,v-CrkやSrcで形質転換した細胞では,接着斑(またはpodosome)の染色が増大していた.Casの接着斑への局在のためには,CasのSH3領域が必須であり,これには,FAKあるいはCAKβが関与していると予想される.一方で,接着刺激や形質転換にともなうCasの接着斑局在の増大に対しては,Srcキナーゼが重要な役割を果たしていることが示されている.我々は,Casの個体形成における役割を解析する目的でCasのノックアウトマウスを作成した。Casのノックアウトマウスは胎性期11.5から12.5日で著明なうっ血と成長障害を来して死亡した。病理学的解析では心臓の低形成及び全身の血管の拡張が認められたが、これ同時期の正常個体におけるCasの組織分布にほぼ一致した。電子顕微鏡による解析ではCasのノックアウトマウスの心筋細胞において筋線維およびZバンドの形成不全が認められた。またCasのノックアウトマウスの胎児から樹立した線維芽細胞においてアクチン線維の構造異常が認められ、この異常はCasの再導入により正常化した。以上の結果は、Casの生物学的作用はアクチン線維の束状形成であり、Casを欠いたマウスは心筋および血管平滑筋の収縮機能不全によりうっ血および全身の循環不全を来して死亡すると考えられた。新規シグナル伝達分子Casはv-Crkおよびv-Srcによる細胞の癌化において強くチロシ、リン酸化を受ける分子として同定され、我々がcDNAが単離し、Casと命名した分子である。CasはSH3領域と15個のSH2結合モチーフの集積する領域を持ち、シグナルを集めて下流に伝える新しいタイプのシグナル伝達分子と考えられる。Cas遺伝子を単離し、抗体を作製した結果、Casはv-Crkおよびv-Srcによる細胞の癌化の他、細胞接着や低分子量G蛋白質であるRhoを介する接着斑の形成、さらにはc-AblやSrc familyチロシンキナーゼのシグナル伝達にも重要な役割を果たしていることが明らかになった。我々はインテグリン刺激のシグナル伝達系におけるCasのリン酸化とその役割を明らかにした。また、Casノックアウトマウスを作製し、Casノックアウトマウスは胎生期11.5-12.5日に全身うっ血で死亡し、その原因は心筋や血管の筋細胞におけるアクチン束状形成の不全によることを見出した。さらに最近我々は、Casに会合する分子のcDNAの単離に成功し、この分子は核へ移行して転写に関与することを見出した。これらのことから、Cas family蛋白質は細胞接着から転写に到る一連のシグナル系に重要な機能を果たすと推測される。共同研究者であるGriffin博士は我々との共同研究により、BCR/ABLのシグナルによってCasはCRKLと結合してシグナルを伝達することを明らかにした。Vuori博士は共同研究により、Casはインテグリン刺激によってSrcなどと複合体を形成してシグナルを伝達することを明らかにした。

インテグリン刺激に際しては,FAKが自己リン酸化し,そこから,シグナルカスケードが開始され,casがチロシンリン酸化される.3Y1細胞やNIH3T3細胞などを通常の接着状態で培養しているときには,Casはその大部分が細胞質に存在するが,接着刺激を加えた時や,v-Crkや活性型Srcで形質転換された細胞では,Casの細胞骨格分画への局在が増加した.蛍光免疫染色でみた場合も,v-CrkやSrcで形質転換した細胞では,接着斑(またはpodosome)の染色が増大していた.Casの接着斑への局在のためには,CasのSH3領域が必須であり,これには,FAKあるいはCAKβが関与していると予想される.一方で,接着刺激や形質転換にともなうCasの接着斑局在の増大に対しては,Srcキナーゼが重要な役割を果たしていることが示されている.我々は,Casの個体形成における役割を解析する目的でCasのノックアウトマウスを作成した。Casのノックアウトマウスは胎性期11.5から12.5日で著明なうっ血と成長障害を来して死亡した。病理学的解析では心臓の低形成及び全身の血管の拡張が認められたが、これは同時期の正常個体におけるCasの組織分布にほぼ一致した。電子顕微鏡による解析ではCasのノックアウトマウスの心筋細胞において筋線維およびZバンドの形成不全が認められた。またCasのノックアウトマウスの胎児から樹立した線維芽細胞においてアクチン線維の構造異常が認められ、この異常はCasの再導入により正常化した。以上の結果は、Casの生物学的作用はアクチン線維の束状形成であり、Casを欠いたマウスは心筋および血管平滑筋の収縮機能不全によりうっ血および全身の循環不全を来して死亡すると考えられた。
Hmx-1ホメオボックス遺伝子の外耳発生・中耳骨形成に対する役割の解明

我々は、Hmx1遺伝子の発現がマウスの胎生10-12日において第二鰓弓に由来する神経冠細胞(neural crest cell)、神経網膜、三叉神経節、背側神経根、及び胸部交感神経節にあることをこれまでに報告し、ホメオボックス遺伝子の重要性から推察してHmx1遺伝子がこれらの神経由来細胞の発生に寄与しているのではないかと思わせるデータを示してきた。本研究の目的は、Hmx1遺伝子の機能を総合的に解析することである。ヘテロ接合体どうしを交配しホモ接合体が発生してくるか、どのような異常表現型を示すかを観察した。第一世代のヘテロ接合体F1(C57BL/6x(129Svx129/SvJ))同士の交配の結果、誕生した子孫の数の割合は野生型:ヘテロ接合体:ホモ接合体=61:111:12であり明らかに期待される数よりホモ接合体が少ない。生後に死亡したマウスは観察できないので、ホモ接合体が減少しているのは明らかに子宮内死亡によると考えられる。胎生8.5,9.5,10.5日には子宮内には明らかに発育遅延し、吸収されている胎児が見られ、吸収されている胎児はホモ接合体と考えられる。これらの死亡胎児がどの細胞の発生異常によるのかは現在検討中である。マウスはC57BL/6系統と交配し維持している。F2(遺伝的背景は1/4が129/Sv系統、3/4がC57BL/6系統)ヘテロ接合体どうしを交配した場合にはホモ接合体の出現する割合が明らかに高くなり、母親か、または胎児の遺伝的背景の差によりHmx1遺伝子のホモ接合体の胎児期の死亡は回避され、全く正常でる。これらの何ら異常を示さないマウスにおいてもRNase protection assay法によりhmx1遺伝子の発現はなくなっていることが示されている。キメラマウスを正常C57BL/6マウスと交配しヘテロ接合体及びホモ接合体を得ることができた。ヘテロ接合体どうしの交配から得られたマウス約300匹より抽出したDNAを用いジェノタイプを決定したろころ、野生型/テロ接合体/ホモ接合体=3/6/1であり、ホモ接合体の約60%が致死的であると考えられた。受精後8.5日ですでに吸収されている(死んでいる)胎児が確認された。Hmx-1遺伝子が受精後8.5日以前に胎児組織にて発現している可能性があり現在、5.58.5日の胎児組織切片上にて非アイソトープ性のin situ hybridization法及びアイソトープ性のin situ hybridization法にてmRNAの発現を確認しているが、いずれの方法にても発現確認が困難である。誕生したホモ接合体マウスに関しては、形態的に奇形がなく、繁殖能力においても何ら問題ない。現在、我々は受精後8.5日にて吸収されている胎児の組織切片を作製し、異常の見られる細胞系が何か?また吸収されている胎児が全てホモ接合体か?を決定する予定である。またHmx-2のノックアウトマウスを譲り受けダブルノックアウトマウアウの作製を試みて表現型の重症度が増すかの検討を行う予定である。その後論文作成にとりかかる。我々は、Hmx1遺伝子がこれらの神経由来細胞の発生に寄与しているのではないかと思わせる証拠を示した。本研究の目的は、hmx1遺伝子の機能を総合的に解析することである。第一世代のへテロ接合体F1(C57BL/6 x(129Sv x 129/SvJ))

同士の交配の結果、誕生した子孫の数の割合は野生型:ヘテロ接合体:ホモ接合体=61:111:12であり明らかに期待される数よりホモ接合体が少ない。生後に死亡したマウスは観察できないので、ホモ接合体が減少しているのは明らかに子宮内死亡によると考えられる。胎生8.5,9.5,10.5日には子宮内には明らかに発育遅延し、吸収されている胎児が見られ、吸収されている胎児はホモ接合体と考えられる。これらの死亡胎児がどの細胞の発生異常によるのかは現在検討中である。マウスはC57BL/6系統と交配し維持している。F2(遺伝的背景は1/4が129/Sv系統、3/4がC57BL/6系統)へテロ接合体どうしを交配した場合にはホモ接合体の出現する割合が明らかに高くなり、母親か、または胎児の遺伝的背景の差によりHmx1遺伝子のホモ接合体の胎児期の死亡は回避される。一旦、胎生期6.5日を正常に発生し、誕生したマウスは全く正常であり顔面部の奇形などは見られなかった。
腰椎椎間板ヘルニアの疾患感受性遺伝子の同定と分子病態の解明

国内の主要な脊椎外科の専門医と協力し、椎間板ヘルニア患者の検体、約1, 600を収集した。それらの患者の臨床的、X線学的表現型を詳細に分析し、椎間板ヘルニア疾患関連因子に関する臨床データをデータベース化した。検体からゲノムDNAを抽出し、椎間板遺伝子発現プロファイル、コンピュータ解析による知識発見システムなどに基づき決定された候補遺伝子に対する症例-対照相関解析、約55万のSNPマーカーによる全ゲノムスクリーニング等のゲノム解析を行った。その結果、いくつかの非常に高い相関を示すSNPマーカーを発見した。それらの中には、椎間板の発生やプロテオグリカンの代謝に関係するものが見られた。研究代表者(池川)は、研究協力施設(慶應大学、富山大学、京都府立医科大学、熊本大学の整形外科、及びその関連病院と函館中央病院脊椎センター)の脊椎外科の専門医と協力して、腰椎椎間板ヘルニア患者の検体(血液、組織など)を収集し、これらの患者における疾患の臨床的、X線学的表現型を分析し、椎間板ヘルニアの疾患関連因子に関する臨床データのデータ・ベース化を進めた。また、腰椎椎間板ヘルニアの疾患感受性遺伝子同定に向けての症例-対照相関解析(case-control association study)に用いるサンプル、約1,200サンプルを収集した。収集したサンプルを整理、保存、管理し、核酸(DNA, RAN)、タンパクを抽出するなど実験室での分子遺伝学的、分子生物学的実験が可能な状態にした。研究分担者(古市、稲葉)は、研究代表者の指導、管理の下に、分子遺伝学的実験を実行した。椎間板遺伝子発現プロファイル、コンピュータ解析による知識発見システムなどに基づき決定された椎間板ヘルニアの候補遺伝子に対する症例-対照相関解析、Hapmapのデーターをもとにした約55万のSNPマーカーによる全ゲノムスクリーニングを行った。その結果、いくつかの椎間板ヘルニアに非常に高い相関を示すSNPマーカーを発見した。これらベンチでの解析結果を下に、研究代表者は上記の脊椎外科専門医、及び遺伝統計学の研究者と協力して、疾患の表現型と遺伝子型の関連を分析している。研究代表者(池川)は、研究協力施設(慶應大学、富山大学、京都府立医科大学、熊本大学の整形外科、及びその関連病院と函館中央病院脊椎センター)の脊椎外科の専門医と協力して、腰椎椎間板ヘルニア患者の検体(血液、組織など)を収集し、これらの患者における疾患の臨床的、X線学的表現型を分析し、椎間板ヘルニアの疾患関連因子に関する臨床データをデータベース化した。また、腰椎椎間板ヘルニアの疾患感受性遺伝子同定に向けての症例-対照相関解析(case-control association study)に用いるサンプル、約1,500サンプルを収集した。収集したサンプルを整理、保存、管理し、核酸(DNA,RAN)、タンパクを抽出するなど実験室での分子遺伝学的、分子生物学的実験が可能な状態にした。研究分担者(稲葉)は、研究代表者の指導、管理の下に、分子遺伝学的実験を実行した。椎間板遺伝子発現プロファイル、コンピュータ解析による知識発見システムなどに基づき決定された椎間板ヘルニアの候補遺伝子に対する症例-対照相関解析、HapMapのデータをもとにした約55万のSNPマーカーによる全ゲノムスクリーニングを行った。これらベンチでの解析結果をもとに、研究代表者は上記の脊椎外科専門医、及び遺伝統計学の研究者と協力して、表現型と遺伝子型の関連を分析し、椎間板ヘルニアの分子病態を解明しようとしている。また、腰椎椎間板ヘルニアの疾患感受性遺伝子同定に向けての症例-対照相関解析(case-control association study)に用いるサンプル、約1,600サンプルを収集した。椎間板遺伝子発現プロファイル、コンピュータ解析による知識発見システムなどに基づき決定された椎間板ヘルニアの候補遺伝子に対する症例-対照相関解析、HapMapのデータをもとにした約55万のSNPマーカーによる全ゲノムスクリーニング:GWAS(genome-wide association study)を行った。

これらベンチでの解析結果をもとに、研究代表者は上記の脊椎外科専門医、及び遺伝統計学の研究者と協力して、表現型と遺伝子型の関連を分析し、椎間板ヘルニアの分子病態に関する機能解析を行っている。
受精機構におけるユビキチン-プロテアソームシステム

1.マボヤ卵黄膜蛋白質VC70のユビキチンリガーゼの探索:すでに、マボヤ精子放出液からVC70蛋白質をユビキチン化する分子量700kDaのユビキチン化酵素を単離し、さらに、そのユビキチン化活性を促進するユビキチンリガーゼE3様酵素を、ユビキチン化サイトLys234を含むVC70ペプチドを固定化したカラムを用いたクロマトグラフィーにより単離した。しかし、得られた蛋白質量が微量のために生化学的解析が不可能であったので、上記のVC70ペプチドをベイトに用いて酵母two-hybridスクリーニングを行い、2つのVC70ペプチド結合蛋白質を得た。一つは、UBAドメイン含有蛋白質で、これはVC70蛋白質が酵母内でユビキチン化され、そのポリユビキチン鎖を介して結合蛋白質として得られたと考えられる。一方、マボヤの近縁種であるカタユウレイボヤのESTデータベース検索の結果、もうひとつのクローンは全長ではなく、N末端配列を欠失したものであると推測される。この全長をクローニングし、VC70蛋白質のE3酵素である可能性や受精における役割を明らかにすることが今後の課題である。2.胚特異的ユビキチンレセプターの機能解析:アフリカツメガエルの胚特異的ユビキチンレセプターRpn10cが抗アポトーシス因子Scytheと特異的に結合する。Rpn10cとの結合に関与するScytheのN末端領域を解析し、それがタンデムに連結した4つのユビキチン様ドメインからなり、少なくとも2つのドメインの存在がRpn10cとの結合に必要であることを明らかにした。また、そのドメインがアポトーシス制御に必要であることを明らかにした。Rpn10cを含む胚特異的プロテアソームがScytheを介してどのように発生過程におけるアポトーシスを制御しているかを明らかにすることが今後の課題である。1.マボヤ卵黄膜のユビキチン化の解析:マボヤ未受精卵から卵黄膜を可溶化し、それを基質として用い、一方、ユビキチン化酵素群として、マボヤ精子抽出液、マボヤ精子の活性化反応(精子反応)で精子から放出される放出液、および、マボヤ卵抽出液を用いて、ATP、I・125で放射能標識したユビキチンおよびプロテアソーム阻害剤存在下に、ユビキチン化反応を行った。その結果、マボヤ精子の抽出液と放出液によってユビキチン化が観察された。2.マボヤ卵黄膜VC70蛋白質のユビキチン化:VC70蛋白質(648アミノ酸残基)は、12回のEGFドメインからなり、2つのLys残基は、第3ドメインと第4ドメインのリンカー部分(Lys214)と第12ドメインの中間部分(Lys616)に存在する。前者のLys214残基を含む45アミノ酸、および、Lys214残基をArgに置換した変異蛋白質をGSTに融合させた融合蛋白質を作成し、それを基質に用い、上記(1)の条件下で、マボヤ精子放出液によるユビキチン化反応を行った。その結果、Lys214残基を含むGST融合蛋白質はポリユビキチン化されるが、Lys214残基をArgに置換したGST融合蛋白質はポリユビキチン化されないことが明らかになった。即ち、ユビキチン化酵素群が精子反応に伴って放出され、VC70蛋白質をポリユビキチン化すると考えられる。現在、精子反応に伴って放出されるユビキチン化酵素群の解析を行っている。3.カエルにおけるユビキチンレセプターの多様性の解析:カエル初期胚cDNAライブラリーからのクローニングと初期胚での発現パターンの解析結果から、マウス胚の場合と同様に、組織普遍的タイプに加えて、胚特異的タイプのユビキチンレセプターの存在が明らかになった。現在、後者のタイプの機能解析を行っている。1.マボヤ卵黄膜VC70蛋白質の機能とin vivoユビキチン化:VC70蛋白質を固定化したアガロースビーズへの精子の結合を解析し、VC70蛋白質が精子レセプターとして機能していることを明らかにした。また、精子添加前の未受精卵と添加後の受精卵から卵黄膜を調製し、SDS-PAGEと抗VC70蛋白質抗体を用いたウエスタンブロティングを行い、受精後にVC70蛋白質がユビキチン化されることを明らかにした。2.VC70蛋白質のユビキチン化を触媒する酵素群の解析:ユビキチン化サイトのLys214を含むペプチドを基質に用いて、in vitroユビキチン化反応を触媒する精子由来の酵素群の解析を試みているが、まだ単離に至っていない。3.マボヤ精子プロテアソームの解析:マボヤ精子から、抗20Sプロテアソーム抗体を固定化したカラムを用いたクロマトグラフィを活用し、膜結合性プロテアソームを単離した。そして、SDS-PAGEの結果から、そのサブユニット組成が哺乳類由来26Sプロテアソームの場合と類似していることが明らかになった。また、特異的基質を用いた組織化学から、プロテアソームが精子頭部に存在し、その活性が精子反応に伴って顕著に活性化されることを明らかにした。

4.カエルにおけるユビキチンレセプターの多様性の解析:アフリカツメカエルに存在する胚特異的ユビキチンレセプターXRpn10cの機能を明らかにするために、それと結合する蛋白質の探索を行い、組織普遍的ユビキチンレセプターXRpn10aの場合と比較した。そして、XRpn10cに特異的に結合するアポトーシス関連蛋白質を見出した。現在、胚発生におけるアポトーシス関連蛋白質の役割を解析中である。1.マボヤ卵黄膜成分VC70蛋白質のユビキチン化酵素群の特徴づけ:VC70蛋白質をユビキチン化する活性が、精子をpH9.6の海水で処理して活性化させた時に得られる上清画分(精子放出液)に存在することを明らかにした。次に、その精子放出液を出発材料に用いて、DEAEセルロースクロマトグラフィー、ユビキチン固定化アガロースクロマトグラフイー(ジチオスレイトール溶出画分)およびグリセロール密度勾配遠心分離を行い、HrVC70をユビキチン化する酵素を精製した。本酵素の分子量は700kDaで、その活性発現にATP、マグネシウムイオンおよびカルシウムイオンの存在を必要とし、活性の至適pHは海水のpH8付近であり、チオエステル結合形成阻害剤ジチオスレイトールやATP分解酵素アピラーゼの添加によって活性が阻害されることを明らかにした。また、本酵素がHrVC70のみをユビキチン化し、熱変性リゾチームをユビキチン化できないことを明らかにした。2.カエルにおける胚特異的ユビキチンレセプターRpn10cの機能解析:哺乳類培養細胞系での発現実験から、カエル抗アポトーシス因子Scytheがカエル組織普遍的タイプRpn10aには結合できず、カエル胚特異的タイプRpn10cに結合できることが明らかになっている。そこで、カエル胚内でも特異的相互作用が検出できるかを調べるために、それぞれに対応するmRNAをカエル胚に顕微注入して免疫沈降実験を行い、カエル胚内でもRpn10cとScytheが特異的に相互作用することを明らかにした。また、Scytheとの結合に関与するRpn10cのC末端領域の過剰発現によりカエル胚発生が異常を引き起こすことを明らかにした。1.マボヤ卵黄膜蛋白質HrVC70がユビキチン化され分解されることをすでに明らかにし、また、マボヤ精子放出液からHrVC70蛋白質をユビキチン化する高分子量(700kDa)のユビキチン化酵素をすでに単離した。そこで、このユビキチン化活性を促進するユビキチンリガーゼE3が存在するか否かを明らかにするために、ユビキチン固定化カラムから700kDa酵素を還元剤により溶出した後に、アルカリ条件下で溶出して得られた溶出液を用いて、HrVC70ペプチド(HrVC70のユビキチン化サイトLys234を含むペプチド)を固定化したカラムによるクロマトグラフィーを行った。その結果、ペプチド固定化カラムからの溶出液中に、700kDa酵素のユビキチン化活性を促進する活性が検出された。ユビキチン化サイトを含むペプチドに特異的に結合することから、この活性はE3酵素に由来すると考えられる。この酵素の特徴づけを行うことが今後の課題である。2.アフリカツメガエル由来の胚特異的ユビキチンレセプターRpn10cが抗アポトーシス因子Scytheと特異的に結合することをすでに明らかにした。そこで、両者の結合に必要なそれぞれの最小領域を決定した。Rpn10cの場合、そのC末端配列の中で他の生物のRpn10cでも保存されているアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換すると、Scytheとの結合が減少したことから、その部位がScythe結合部位と考えられる。
19世紀アメリカ合衆国における黒人選挙権の総合的研究

今年度は、南北戦争以降の黒人選挙権問題の展開を検討した。特に報告者が注目したのは、南北戦争直後に成立した合衆国憲法修正第15条である。なぜなら本条項は「黒人選挙権保障条項」として知られるように選挙権における人種差別を禁止したにもかかわらず、結局のところ19世紀末の南部に展開した黒人選挙権剥奪運動を阻止しえなかったからである。そこで報告者は、本条項の成立過程を追跡することにより、同条項の意義を再検討できると考えた。考察から明らかになったのは、合衆国の国制的特質および当時の黒人選挙権観が本条項の成立に大きな制約を与えたということである。すなわち前者についていえば、そもそも建国期から選挙権授権権限は州に帰属していたのであり、連邦政府が選挙権問題に干渉する余地はなかったのである。こうした「選挙権におけるフェデラリズム体制」が既に確立していたために、連邦が直接黒人に選挙権を付与することは国制上不可能であったわけである。さらに後者についていえば、世論の反黒人選挙権感情は戦前から一貫して強固であり、奴隷制の存在しない北部においても大半の州が黒人選挙権を拒絶していた。しかしながら、憲法修正条項が成立するためには四分の三以上の州で承認を得る必要があったため、黒人に対象を限定した選挙権保障条項案は各州から否決されるおそれがあった。以上の国制的制約および世論的背景のために、合衆国憲法修正第15条は選挙権授権にあたって各州に人種資格の設定のみを禁止するという内容にならざるをえなかったといえる。以上のことから、合衆国憲法修正第15条は消極的かつ間接的な「黒人選挙権保障条項」であったといえ、本条項においても「選挙権のフェデラリズム体制」を根本的に変革し得なかったことが後の南部黒人選挙権剥奪運動を招来する一因であったといえる。本研究は二年間にわたって、19世紀アメリカ合衆国における黒人選挙権問題の展開を追跡することにより、南北戦争を画期とする同国の黒人間題の歴史的展開を考察しようとするものである。今年度はその研究計画の前半部として、南北戦争以前期における非奴隷身分の黒人(自由黒人)の選挙権問題について検討した。その結果、この時期の黒人選挙権問題は白人選挙権問題と密接な関連を有しつつ展開していたことが明らかになった。すなわち、周知のように合衆国においては19世紀前半期に大半の州において白人男子普通選挙権が実現したのであるが、自由州においても、奴隷州においても黒人選挙権はこれに連動して拒絶される傾向にあったのである。つまり、東部の旧州においては財産資格および納税資格の撤廃によって選挙資格が緩和されると同時に従来容認されていた黒人選挙権が多くの州で拒絶されたのであり、西部の新州においては当初から白人男子普通選挙権と黒人選挙権の拒絶とがセットになって規定されていたのである。報告者はこうした現象を、選挙権の階級性を解消すると同時に選挙権に人種性を構築することによってこの権利を白人の特権たらしめようとした白人民衆の人種意識を反映したものと考え、上記の過程を「選挙権における白人性の確立過程」と把握した。したがって、かかる人種意識が濃厚である限り黒人選拳権は奴隷州、自由州を問わず総じて否定されざるを得なかったのである。それでは、南北戦争後の1870年に選挙権における人種差別を全面的に禁止した合衆国憲法修正第15粂はいかなる過程を経て成立したのであろうか。また、この条項の「実効性」はいかなるものであったのか。来年度はこれらの問題を中心に考察する。
格子ボルツマン法による次世代津波シミュレーション手法の開発と大規模並列化

本年度は,格子ボルツマン法による津波の発生から市街地氾濫に至るまでの統一的かつ効率的な流体シミュレーション手法の構築に向けて,浅水長波理論に基づく平面2次元モデルと3次元自由表面流れモデルの弱連成スキームの開発および精度検証を実施した.具体的な研究成果は以下の通りである.格子ボルツマン法は,流体の弱圧縮を許容する陽解法の流体シミュレーション手法である.よって,平面2次元モデルから3次元モデルへの接続の際に,流速に加えて密度接続を行う必要がある.この密度圧縮を無視して接続を行うと,接続境界付近で水位が不連続となり,精度よく3次元モデルへの接続を行うことができないことが明らかとなった.そこで,本研究では昨年度提案した格子ボルツマン法による3次元自由表面流れモデルの弱圧縮の指標を用いて,格子ボルツマン法の2次元-3次元弱連成スキームを新たに開発した.本接続スキームを用いて,角柱まわりのゲート急開流れの再現シミュレーションを実行したところ,本研究で開発した弱連成スキームは,津波のシミュレーションを実行する上で求められる,大流量の流体が断続的に流入し続ける流れをシームレスに接続することが可能であることが明らかとなった.また,さらに,本スキームを用いて,実地形を想定した実験室規模の津波浸水シミュレーションを実行したところ,本シミュレーション手法は,非圧縮流れを仮定した従来の手法と比較して,3次元津波浸水シミュレーションを効率的に実行できることが明らかとなった.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本年度では,高効率かつ高精度な大規模3次元津波シミュレーション手法の構築を目指し,解析プログラムの開発・検討を行った.具体的には,支配方程式として非圧縮流れに対するNavier-Stokes方程式を用いるのではなく,格子ボルツマン方程式を採用した.格子ボルツマン法は,圧力のポアソン方程式の求解が不要な,完全陽解法で流体の数値解析が可能な手法である上,並列計算に優れる.この特長を活かしつつ,津波数値解析を実行する上で要求される計算精度を満足するよう,モデル改良を行った.具体的な成果は以下の通りである.自由表面流れ解析の計算精度の向上に向け,PLIC-VOF法を界面捕捉手法として採用し,一検証としてゲート急開流れの解析を実行した.その結果,本モデルは自由界面の数値攪乱を抑え,従来の格子ボルツマン法の自由表面流れで問題となっていた,界面の非物理的な挙動をよく改善することが分かった.次に,格子ボルツマン法の計算精度の向上に向け,Multiple-Relaxation-Timeモデルを衝突則として本モデルに適用した.本モデルを用いて矩形容器内定在波の数値実験を行ったところ,本モデルは格子BGKモデルで問題となる,圧力場の攪乱を抑え,計算過程における流体の圧力分布が滑かとなり,自然な流体の挙動を,よく再現できることが分かった.また,流れ場のマッハ数から適切に時間刻み幅を設定することで,格子ボルツマン法の弱圧縮を抑制することが可能であることを明らかにした.今年度は,自由表面流れ解析モデルとしての格子ボルツマン法の高度化に取り組み,研究計画で挙げた技術課題,(1)PLIC-VOF法による界面捕捉手法の高度化,(2)Multiple-Relaxation-Timeモデルによる圧力場の計算精度の向上に成功したため,計画通りに進展していると判断した.本年度は,格子ボルツマン法による津波の発生から市街地氾濫に至るまでの統一的かつ効率的な流体シミュレーション手法の構築に向けて,浅水長波理論に基づく平面2次元モデルと3次元自由表面流れモデルの弱連成スキームの開発および精度検証を実施した.具体的な研究成果は以下の通りである.格子ボルツマン法は,流体の弱圧縮を許容する陽解法の流体シミュレーション手法である.よって,平面2次元モデルから3次元モデルへの接続の際に,流速に加えて密度接続を行う必要がある.この密度圧縮を無視して接続を行うと,接続境界付近で水位が不連続となり,精度よく3次元モデルへの接続を行うことができないことが明らかとなった.そこで,本研究では昨年度提案した格子ボルツマン法による3次元自由表面流れモデルの弱圧縮の指標を用いて,格子ボルツマン法の2次元-3次元弱連成スキームを新たに開発した.本接続スキームを用いて,角柱まわりのゲート急開流れの再現シミュレーションを実行したところ,本研究で開発した弱連成スキームは,津波のシミュレーションを実行する上で求められる,大流量の流体が断続的に流入し続ける流れをシームレスに接続することが可能であることが明らかとなった.また,さらに,本スキームを用いて,実地形を想定した実験室規模の津波浸水シミュレーションを実行したところ,本シミュレーション手法は,非圧縮流れを仮定した従来の手法と比較して,3次元津波浸水シミュレーションを効率的に実行できることが明らかとなった.津波の発生から市街地氾濫に至るまでの,統一的な解析を可能にするため,2D-3Dハイブリッド・シミュレーション手法に関する数値的検討を実施する.具体的には,津波解析を実施する上で許容される弱圧縮性を明らかにし,その弱圧縮を考慮した接続スキームを構築する.その上で,実スケールの大規模市街地氾濫解析を実施し,2D-3D間の接続地点についての検討を行う.平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
風波気液界面を通しての運動量，熱，物質移動に及ぼすうねりおよび高風速の影響

地球の表面積の約7割を占める海洋と大気の間の運動量,熱および物質の移動量を正確に評価するモデルを構築することは,地球温暖化予測や台風の発生・進路予測を行ううえで,極めて重要である.しかしながら,現在一般的に用いられているモデルにはいくつかの間題があり,その信頼性は低いままである.一つ目の問題点は,現在のモデルは海洋観測により得られた各種移動量を無理やり風速のみで相関したものであり,うねりなどの風以外の要因の影響がまったく考慮されていないことである.二つ目の問題点は,高風速域において,低風速域のデータを外挿補完した信頼性に著しく欠けるモデルが使用されていることである.そこで,本研究では,高精度な測定が可能な風洞水槽を用いた室内実験により,風波気液界面を通しての運動量,熱および物質の移動量を直接測定し,うねりと高風速が移動量にいかなる影響を及ぼすかについての問題を解決することを目的とする.本年度は以下に示す内容の研究を実施した.【うねり】うねりが風波気液界面を通しての熱移動に及ぼす影響を精密に評価するために,液側温度の時間変化から風波気液界面を通しての潜熱と顕熱の移動量を評価することが可能な新たな測定方法を考案した.これにより波高の大きなうねりに対しても高い精度で熱移動係数を測定できるようになった.【高風速】液側バルク二酸化炭素濃度の時間変化より風波気液界面から放散される二酸化炭素量を算出する全体マスバランス法により,高風速域における二酸化炭素の液側物質移動係数の測定を行った.その結果,風速が20m/s程度までは液側物質移動係数は風速に対して単調に増加するものの,それ以上の風速に対しては激しい砕波の影響により,その値が急激に大きくなることが明らかとなった.風洞水槽において,うねりおよび高風速の影響を調べるために測定技術の開発を行った.さらに,その測定技術を用いて台風直下のような高風速域における風波気液界面を通しての二酸化炭素の移動量の測定を行い,液側物質移動係数の風速に対する増加傾向が激しい砕波が発生し始める風速20m/s程度以上から急激に強まるという大変興味深い知見を得た.これらの研究成果を論文にまとめるに至ったことは,ほぼ期待通り研究が進展したと評価できる.(抄録なし)地球の表面積の約7割を占める海洋と大気の間の運動量、熱および物質の移動量を正確に評価するモデルを構築することは、地球温暖化予測や台風の発生・進路予測を行ううえで、極めて重要である。しかしながら、現在一般的に用いられているモデルにはいくつかの問題があり、その信頼性は低いままである。一つ目の問題点は、現在のモデルは海洋観測により得られた各種移動量を無理やり風速のみで相関したものであり、うねりなどの風以外の要因の影響がまったく考慮されていないことである。二つ目の問題点は、高風速領域において、低風速域のデータを外挿補完した信頼性に著しく欠けるモデルが使用されていることである。そこで、本研究では、高精度な測定が可能な風洞水槽を用いた室内実験により、風波気液界面を通しての運動量、熱および物質の移動量を直接測定し、うねりと高風速の問題を解決することを目的とする。本年度は以下に示す内容を実施した。【うねり】うねりが風波気液界面を通しての物質移動に及ぼす影響を精密に評価するために、マスバランス法における速度測定手法を改善した。具体的には、マスバランス法において必要となる測定体積の前後断面の速度を、2台のレーザドップラ流速計を用いて同時に測定できるように測定システムを改良した。これにより、マスバランス法の精度が向上した。【高風速】飛散液滴が大量に存在する高風速域における風速の測定を可能にするために、水槽ガラス壁面に設置する液滴付着防止装置を開発した。さらに、位相ドップラ式粒子流速計を用い、風速40m/sまでの風速域に対して風波気液界面近傍のレイノルズ応力を直接測定し抗力係数を算出した。その結果、抗力係数は風速20m/s程度までは風速に対して単調に増加するものの、それ以上の風速に対しては一定値をとることが明らかになった。地球の表面積の約7割を占める海洋と大気の間の運動量、熱および物質の移動量を正確に評価するモデルを構築することは、地球温暖化予測や台風の発生・進路予測を行ううえで、極めて重要である。二つ目の問題点は、高風速域において、低風速域のデータを外挿補完した信頼性に著しく欠けるモデルが使用されていることである。【うねり】うねりが風波気液界面を通しての物質移動に及ぼす影響を精密に評価するために、液側バルク二酸化炭素濃度の時間変化を調べることにより風波気液界面から放散される二酸化炭素量を調べる手法を確立した。これにより、波高の大きなうねりに対しても物質輸送係数を精度よく測定できるようになった。【高風速】

大量の飛散液滴が発生する状況においても精度よく水位変動を測定する技術を確立した。この測定技術を用い、風速40m/sまでの風速域に対して水位変動の測定を行った。また、抵抗式波高計を2台同時に用いることにより、風波の波速および波形勾配の測定を行った。その結果、波高、波周期、波形勾配、波速ともには風速20m/s程度までは風速に対して単調に増加するものの、それ以上の風速に対しては増加傾向が変化することが明らかになった。また、風波界面形状と界面における抗力係数との間には強い相関があることが明らかになった。地球の表面積の約7割を占める海洋と大気の間の運動量,熱および物質の移動量を正確に評価するモデルを構築することは,地球温暖化予測や台風の発生・進路予測を行ううえで,極めて重要である.しかしながら,現在一般的に用いられているモデルにはいくつかの間題があり,その信頼性は低いままである.一つ目の問題点は,現在のモデルは海洋観測により得られた各種移動量を無理やり風速のみで相関したものであり,うねりなどの風以外の要因の影響がまったく考慮されていないことである.二つ目の問題点は,高風速域において,低風速域のデータを外挿補完した信頼性に著しく欠けるモデルが使用されていることである.そこで,本研究では,高精度な測定が可能な風洞水槽を用いた室内実験により,風波気液界面を通しての運動量,熱および物質の移動量を直接測定し,うねりと高風速が移動量にいかなる影響を及ぼすかについての問題を解決することを目的とする.本年度は以下に示す内容の研究を実施した.【うねり】うねりが風波気液界面を通しての熱移動に及ぼす影響を精密に評価するために,液側温度の時間変化から風波気液界面を通しての潜熱と顕熱の移動量を評価することが可能な新たな測定方法を考案した.これにより波高の大きなうねりに対しても高い精度で熱移動係数を測定できるようになった.【高風速】液側バルク二酸化炭素濃度の時間変化より風波気液界面から放散される二酸化炭素量を算出する全体マスバランス法により,高風速域における二酸化炭素の液側物質移動係数の測定を行った.その結果,風速が20m/s程度までは液側物質移動係数は風速に対して単調に増加するものの,それ以上の風速に対しては激しい砕波の影響により,その値が急激に大きくなることが明らかとなった.マスバランス法の改良や液滴付着防止装置の開発は、本研究を進めていくうえで技術的土台となるため、その意義は大きなものである。また、高風速域における運動量移動量に関しては、抗力係数を測定し学会発表を行っている。これらのことから、研究はおおむね順調に進展しているといえる。風洞水槽において、うねりおよび高風速の影響を調べるために測定技術の改善・開発を行った。さらに、その測定技術を用いて台風直下のような高風速域における水位変動を測定し、風波界面形状と抗力係数には強い関係があるとるということを明らかにした。これらの研究成果を論文にまとめるに至ったことから、研究はおおむね順調に進展しているといえる。風洞水槽において,うねりおよび高風速の影響を調べるために測定技術の開発を行った.さらに,その測定技術を用いて台風直下のような高風速域における風波気液界面を通しての二酸化炭素の移動量の測定を行い,液側物質移動係数の風速に対する増加傾向が激しい砕波が発生し始める