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教職における「新しい職」の確立過程に関する実証的研究

本研究は、2007年の学教法改正によって、学校に新たに設置できるようになった、とりわけ法的な職務規定が広範な「主幹教諭」に着目し、他職との関係の下で固有の職として確立していく過程を実証的に明らかにした。その制度導入間もない高知県の事例を主軸に、それらと諸外国(アメリカ、イギリス、カナダ、ニュージーランド)の実践事例や背景理論を比較検討することを通して、諸外国ではいわゆる「ミドル層」をラインに位置づけるのではなく、「教員リーダー」概念を用いながら、学校におけるリーダーシップを階層化して捉え、教授的リーダーシップを校長の垂直的リーダーシップの延長上に捉えない転換が見られることを明らかにした。計画書に基づき、国内外の事例調査と研究進捗報告を中心とした研究会を実施した。国内調査については、昨年度に引き続き高知県における主幹教諭の職務実態調査を行った。さらに高知県の主幹教諭らが組織する研究グループとともに研究会を実施しながら、同県における主幹教諭が抱えている課題について教員自身の視点からとらえると共に、役割認識の向上・明確化に向けたワークショップを企画・実施した。海外調査については、昨年度同様、ニュージーランドを訪問し、同国におけるスクールソーシャルワーカーの職務実態についてインタビュー調査を実施した。特に、今回は、ニュージーランドのスクールソーシャルワーカーがSocial Workers in Schools(略称:SWiS)と称せられることに着目して、初等・中等学校におけるソーシャルワーカーの位置づけとその役割を明らかにする目的で、昨年度の調査結果を基にして、福祉系と教育系の2つの政府機関と、2つのプロバイダー、ソーシャルワーカーが配置されている3つの学校に訪問し、それぞれの機関の役割や学校でのSWiSの位置づけをインタビューした。研究会は、昨年度中に4回実施した。各回とも、研究メンバーに進捗状況を報告し合い、各担当事例の特徴について情報共有を進め、研究テーマにかかわる課題の明確化を図ることができた。また、2013年6月の日本教育経営学会での自由研究発表を踏まえて、新たに英国を比較検討対象として設定し、研究を進めた。この間の研究成果については、学会発表のほか、研究論文として代表者所属機関の紀要に投稿し、掲載に至った。本年度は、以下の点について研究を進めた。1.高知県における主幹教諭の職務実態調査:高知県では、県教育委員会が、平成20年12月、研究モデル校を募集する形で、「新しい職」の設置が始まった。すなわち、既存の研究データが整っており、また導入からまだ日は浅く、しかも全県での総数も平成24年度で30名程度と少ない。この条件を活かして、公立小中学校の主幹教諭を事例に、4年間、「新しい職」の確立に向けて、どのような位置づけのもとでいかに職務を模索してきたのかについて調査を進めてきた。2.外国調査:今年度は、ニュージーランド(NZ)で調査を行った。NZは、比較的困難な状況を抱えている地域にある学校に、1999年からソーシャルワーカー(Social Workers in Schools;SWiS)を配置している。ただし、その所轄庁は、教育省ではなく社会開発省である。つまり、教員とは異なる職種を配置し、行政的にも協働的な保護施策展開を試みているニュージーランドの先行事例を調査し、日本でも近年、文部科学省のもとで進められているスクール・ソーシャルワーカーの場合と比較検討してきている。3.文献・資料の取集と分析、研究会の開催:研究メンバーそれぞれが「新しい職」に関する国内の先行研究、教員リーダーの養成に関する国内外の文献・資料の収集をすすめ、研究打ち合わせ会を実施した。研究打ち合わせ会では、研究代表者が高知県の現職教員らとこれまで進めてきた実践について意見交換を行った。また海外の動向については、日本における「新しい職」と関連した役割を担う人物と想定される「教師リーダー(teacher leader)」に着目し、アメリカとカナダにおける理論的・政策的動向について検討した。本年度も研究計画通りに、国内調査・海外調査・文献調査に取り組み、研究進捗報告を中心とした研究会を実施した。国内調査については、引き続き高知県を中心的なフィールドとして調査研究を実施した。主幹教諭だけでなく、校長をはじめとする管理職への聞き取り調査も実施し、主幹教諭の職の確立について、学校組織マネジメント全体から検討した。海外調査については、9月7日14日の日程でカナダ・オンタリオ州を訪問し、同州の教員リーダー(teacher leader)をめぐる政策展開と力量形成について、州教育当局、地方学区当局、学校現場においてインタビュー調査を実施した。研究会については、3度実施した。各回とも、研究メンバーの研究進捗報告をもとに、日本、アメリカ、カナダ、イギリスの動向を俯瞰的に整理し、教員のリーダーシップ開発をめぐる国際的潮流と日本的特徴について検討した。研究の成果は、2014年6月の日本教育経営学会において共同研究発表を行った。また、研究代表者所属機関の研究紀要に研究論文として投稿し、掲載に至った。高知県での継続的なアクションリサーチと多国間比較を重視した本研究を通じて、日本における「新しい職」の確立に関わって次の点を明らかにすることができた。

すなわち、日本において主幹教諭は学校組織におけるライン機能の強化(垂直的リーダーシップの発揮)として意識されてきたが、実際には校長のビジョンとの関わりの中で、創造的な業務を担う傾向も見られ、そうした指向性の中には、水平的リーダーシップを発揮するよう期待する「教員リーダー」的な方向も示唆された。このような指向性は、学校におけるリーダーシップ論の見直しを図る可能性を有していると受け止め、引き続き研究を進めていく必要がある。教育学・公教育経営学今年度は、1「新しい職」に関する国内外の理論および政策動向に関する資料収集と分析、2海外における「新しい職」の確立過程に関する訪問調査の実施、3高知県における調査研究の継続と、他自治体における「新しい職」の展開状況および特徴の把握と訪問調査の実施、4全国学会での研究発表を通じた、積極的な研究成果の公表を目標に研究を進めてきた。1については、国内外の関連文献の収集を進めるとともに、研究メンバー間で大枠としての分担を行い、研究課題について理論と政策の両面において研究知見を蓄積することができた。2については、カナダでの訪問調査を予定していたが、実現することができなかった。これについては、来年度実施する予定で準備を進めている。3については、昨年度中に複数回にわたって高知県を訪問し、充実した調査研究を行うことができた。また現地教員の協力を広く得られていることも特筆すべき成果である。ただし、他自治体への訪問調査は実現することができなかった。4については、日本教育経営学会において研究成果発表を行った。学会発表では、多数の聴衆を集めることに成功し、本課題に対する関心の高さを改めて実感することができた。また、本会での議論を踏まえ、新たな調査対象として英国を設定することができたことも、重要な成果であったと考える。本研究グループは、遠隔地に居住する者で組織されているが、年度内に複数回にわたって研究会を設定することができた。このことが計画的に研究をすすめ、時宜を得た情報共有を促したものと考える。以上から、本研究は「おおむね順調に進展している」と評価しうる。初年度にあたる今年度は、1研究代表者がこれまでに収集してきた事例に関する資料の内容を研究メンバーで共有すること、2次年度以降、本格的な実施を予定している海外の事例について基礎的な資料を収集し、理解を深めることを主たる目標としていた。研究会は年3回と当初予定していたよりも少ない回数しか実施できなかったが、これらの目標については、十分に達成できたものと判断できる。国内外の文献調査を通じて、「教員リーダー」や「マネジメント・サイクル」に関する新たな概念などの重要性も確認されてきており、今後の発展を期待しうる。
ゲノムでの遺伝子出現機構の解明

申請者は、ゲノム中の遺伝子をコードしていない領域に遺伝子が作られてくる機構を見出し解析してきた。このような隠れ遺伝子が生まれたり、あるいは、欠失したりする領域がゲノムの中にどのくらい存在するのかを探索するソフトウエアーを作成した。検索の結果、検索したすべての生物にそのような隠れ遺伝子が存在し、人では、数万箇所に及ぶことを明らかにした。検索された配列をランダムに選択し、それらの配列で遺伝子が生まれる反応が起こるか確認したところ、ランダムに選抜したすべての配列で、遺伝子が生まれる反応が起こった。さらに、人為的に、作成した配列でも同反応が起きることも確認した。抗生物質の多用により、薬の効かない多剤耐性菌の出現が大きな社会問題となっている。申請者は、これまで細菌の抗生物質耐性化のプロセスを解析、抑制することで、耐性菌の出現を限りなく抑制する手法と薬剤の開発を目指し、研究を進めてきた。昨年度までに、ゲノムの特定領域での欠失によって、フレームシフトが生じ、隠れ遺伝子が出現することによって、多くの抗生物質に耐性化する現象(細菌の抗生物質の適応進化に関わる)と、そのキー因子を見出すことに成功した。しかし、そのキーとなる因子を見つけただけで、その隠れ遺伝子出現機構についての詳細は明らにできていない。そこで、この特定の欠失による隠れ遺伝子出現機構について詳細に解析し、新規細菌制御法の確立を目指すとともに、多くの生物でのこの機構の存在を確認することとした。当初の計画に従い、本年度は、まず1・欠失し遺伝子が消失したり、現れたりする部位を検索するソフトを作成した。その結果、検討した生物全てのゲノムに、そのような配列が存在していることが確認された。なんとヒトでは、数万に及んでいた。次に2・本ソフトで検索した配列で本当に欠失が起きるか否か検討した。しかし、検索された配列の内幾つかは、その予想される欠失塩基数が、6 bpや9 bpであり、(1)欠失後もフレームのシフトが起きず、欠失の可否および効率をクロラムフェニコール含有プレートでアッセイすることができない。また、(2)配列ごとに付加されるアミノ酸配列が異なってしまうため、クロラムフェニコール耐性遺伝子の活性に影響を与えることも考えられる。そこで、translational fusion assayのようにフレームシフトによるアッセイ以外のツールの構築も必要であると思考え、申請者は、翻訳にカップリングしないtranscriptional assayを構築し、確かにアッセイに利用可能であることを示した。昨年度、ゲノムの特定領域での欠失によって、フレームシフトが生じ、隠れ遺伝子が出現することによって、多くの抗生物質に耐性化する現象(細菌の抗生物質の適応進化に関わる)と、そのキー因子を見出すことに成功した。そこで、この特定の欠失による隠れ遺伝子出現機構について詳細に解析し、新規細菌制御法の確立を目指すとともに、多くの生物でのこの機構の存在を確認する。本目的を達成するために、当初目的通り、本現象の独自のアッセイ系をさらに高め、フレームシフトに伴わない、遺伝子の欠失現象のアッセイプラスミド(transcriptional assay vector)を開発し、様々な生物での欠失現象の確認を行った。その結果、行った生物すべてで、欠失が意図したように起こっていることを、そして、その欠失にはゆらぎがないことを、電気泳動および、塩基配列決定により確認した。また、様々な配列でも同実験を行い、配列に依存しないで緑膿菌以外の他の種でも起きることを確認した。また、抗生物質耐性遺伝子のほか、GFPタンパク質をコードする遺伝子で、現在、本現象が確認できるものか、検討を進めている。研究実績に明記したように、当初の目的を幸運にも100%達成しているため。すでにゲノムの特定領域での欠失によって、フレームシフトが生じ、隠れ遺伝子が出現することによって、多くの抗生物質に耐性化する現象(細菌の抗生物質の適応進化に関わる)と、そのキー因子を見出すことに成功した。そこで、この特定の欠失による隠れ遺伝子出現機構について詳細に解析し、新規細菌制御法の確立を目指すとともに、多くの生物でのこの機構の存在を確認を試みた。

まず、重なりあったダイレクトリピートを検索するソフトGemone Scanを作成し、すべての生物のゲノムに重なりあったダイレクトリピートが存在することを確認した。人工的に重なり有ったダイレクトリピートを作成し、配列に依存なく、構造依存的に重なり有ったダイレクトリピートが正確に欠失することを確認した。この現象は、バクテリアだけではなく、動物細胞においても起きることが示され、生物に共通して存在する機構であることが強く示唆された。そして検索ソフトウエアーの解析から、人では、遺伝子数2000に対して、重なりあったダイレクトリピートが60000箇所をも存在することが明らかとなり、様々な疾病に関わる可能性が強く示唆された。当初、予定したいた内容すべてをクリアーすることができた。そのため"概ね順調に進展している"と判断した。今後の方針については、現状、当初の目的通りにスケジュールをこなし、幸運にもポジティブな結果がでていることから、申請時のスケジュールで確実に成果を積み重ねていきたいと考えている。つまり、本現象が、一部の細菌にもならず、種を超えて、動物細胞でもおこることなどを確認していこうと考えている。微生物制御学(1)様々な生物での検索したサイトの欠失の可否それぞれの生物で複製可能なプラスミドに、昨年度作成したtranslational fusion assayシステムを乗せることにより、他の生物でも重なり合ったダイレクトリピート配列で意図した欠失が起こることを確認する。場合によっては、薬剤感受性の問題やcodon usageの問題から上述の薬剤耐性マーカーが利用できない場合も考えられる。その場合は、異なる薬剤耐性マーカーを利用して対応していく。(2)GFPのような、全ての細胞に利用可能なアッセイシステムを構築し、ヒト細胞での適用し、その欠失がヒト細胞で起きることを示していく。本年度、計画が順調に進み、簡易的な解析を行わず、次年度にまとめたより詳細な解析を行うことにしたため、本年のその分の予算が次年度に持ち越す必要がでたため。初年度ということもあり、研究成果が学会発表の水準にまでは達しなかった部分があり、学会などへの出張や打ち合わせ・情報収集を控えたため、旅費が発生しなかったことがあげられる。次年度は、当初の目的通り、動物細胞でのアッセイを行う。そのためには、NGS解析を行う必要があり、簡易的な本年度のアッセイを次年度のそれと合わせて行う予定である。これらの金額と次年度以降に請求する研究費を合わせた使用計画としては、学会や情報収集への参加のための旅費に使用すること、文献・論文の校閲、翻訳のための謝金として使用すること、などを計画している。
ヘムオキシゲナーゼ1誘導の拡酸化作用による動脈硬化抑制の検出

HO-1ノックアウトマウスを動脈硬化感受性のあるC57BL/6Jに戻し交配を重ねると高率に胎生期に死亡することが判明した。したがって、十分数の個体をそろえての直接的な高脂肪食負荷による動脈硬化巣の形成の解析はまだ途上であり、今後継続していく必要がある。HO-1ノックアウトマウスの死亡の原因はHO-1が幅広く酸化ストレスへの適応等に寄与していることやヘム代謝への不可欠性をを推定させる。しかしながら、現在までの表現型の観察ではHO-1ノックアウトマウスでは普通食下でも軽度の動脈硬化のみならず、激しい血管炎を大動脈や冠動脈に起こしてくることが判明してきている。また、血中脂質組成への影響も観察しえた。HO2ノックアウトマウスに関してはLDL-receptorノックアウトマウスおよびApoEノックアウトマウスとHOのダブルノックアウトを作成したので、動脈硬化巣の形成への影響の解析を行っている。また、LDLレセプターノックアウトマウスを用いた実験では動脈硬化巣にHO-1が初期から著明に誘導を受け、抗動脈硬化的に作用することが個体数を増やした実験で明らかになり、その分子機構についても新たな知見を得ている。さらに、マウス以外の動物でのHO-1の動脈硬化への関わりを検証するためにWHHLウサギを用いてHOの動脈硬化への影響を検討し、やはり同様に動脈硬化に対し、抑制的に機能する結果を得たので報告を予定している。同時にHOの機能を明らかにするためのin vitroの実験を各ノックアウトマウス由来のマクロファージを用いた実験により検討している。あらかじめ血管内皮や平滑筋細胞においてヘムオキシゲナーゼ1(HO-1)を誘導や阻害しておくと酸化LDLによる単球の遊走能がそれぞれ抑制、亢進されることを報告した。この単球の遊走能の変化を引き起こす分子としてMCP-1が関与することがさらに明らかになった。生体内で実際にHO-1が動脈硬化の発生と進展とに関わっているかどうかを調べるためにマウスモデルを使用している。高脂肪食後に形成された大動脈の動脈硬化巣を免疫組織染色したところ、硬化巣内の血管内皮細胞、平滑筋細胞、マクロファージにおいてHO-1が発現されていることが明らかになった。いくつかの代表的なマウスモデルのいづれにおいてもHO-1の発現が観察されたことから、HO-1が動脈硬化の形成に何らかの役割を有している可能性が高い。現在、LDL-Rノツクアウトマウスでの動脈硬化巣形成の過程においてHO-1の活性を亢進あるいは、阻害した場合に動脈硬化の形成が抑制や促進を受けるかどうかを観察している。現在のところ、HO-1が抗動賑硬化的に働くデータを得ている。また、HO-1とHO-2ノックアウトマウスをC57/BL6にb1ackcrossさせ、野生型と動脈硬化への感受性を検討している。現在、高脂肪食負荷を実施中であり、来年度中に解析を行える予定である。また、HO-1とHO-2のノックアウトマウスとLDLレセプターノックアウトマウスおよびApoEノックアウトマウスとのダブルノックアウトマウスを作成している。これらのモデルはより容易に脂質代謝を含めた動脈硬化へのHOの影響の観察を可能にすると想定している。
腸内共生細菌が有する免疫修飾因子の解析

腸内細菌叢と宿主粘膜免疫系に関連する近年の報告から、主要な腸内細菌群の一つであるクロストリジウム目細菌群が、アレルギーや炎症性腸疾患などの抑制に重要な役割を担う制御性T細胞(Treg細胞)の分化・誘導を促すことが報告されたが、その分子機構は不明であった。そこでクロストリジウム目細菌群定着マウスに、高繊維食または低繊維食を与えることで腸内環境に摂動を与え、その変化を統合オミクスにより解析した。その結果、腸管内でクロストリジウム目細菌群が食物繊維の発酵代謝により産生する酪酸が、大腸粘膜におけるナイーブT細胞からのTreg細胞への分化をエピジェネティックに誘導することを明らかにした。われわれの腸管内には1,000種類以上で100兆個もの細菌が生息しており、それら腸内共生細菌は宿主腸管上皮細胞や粘膜免疫担当細胞などと複雑に相互作用することで、腸管内における複雑な生態系、すなわち「腸内エコシステム」を形成している。腸内エコシステムは通常はこれら異種細胞間の絶妙なバランスの元に恒常性を維持しているが、そのバランスが一度破綻すると、自己免疫疾患やアレルギー、炎症性腸疾患や大腸癌といった種々の疾患につながることが知られている。本研究では、粘膜免疫系の恒常性維持やその破綻に深く関与すると考えられる制御性T細胞(Treg細胞)の分化・誘導を促す腸内共生細菌由来の「免疫修飾因子」について、独自に構築した統合オミクス解析技術を駆使して同定し、その作用メカニズムを明らかにすることで、腸内エコシステムの調節に伴う粘膜免疫システムの新たな制御基盤を創出する。本年度はマウスNaiveCD4+T細胞を用いたin vitro培養モデルを用いて、腸内細菌が産生する代謝産物によるTreg細胞誘導能を評価した。Treg細胞誘導能を有する腸内細菌因子についてはその分子機構を明らかにするため、Treg細胞誘導時のエピゲノムやトランスクリプトーム解析を行ったところ、腸内細菌因子がTreg細胞のマスター転写因子であるFoxp3遺伝子の発現量を変動させることが明らかとなった。ヒトの腸管内には多種多様な腸内共生細菌群が棲息しており、腸管上皮細胞群や粘膜免疫細胞群と複雑に相互作用することで、腸内環境生態系、すなわち「腸内エコシステム」を形成している。近年、Clostridium目細菌群などの腸内共生細菌群が、アレルギーや自己免疫疾患、炎症性腸疾患の抑制に重要な役割を担う制御性T細胞(Treg細胞)の分化・誘導を促すことが報告されたが、それらの腸内共生細菌群が有する免疫修飾因子の詳細については不明のままであった。本研究では、われわれが独自に構築した統合オミクス解析手法を駆使して、粘膜免疫系の恒常性維持やその破綻に深く関与すると考えられるTreg細胞の分化・誘導を促す腸内共生細菌由来の「免疫修飾因子」について解析し、その作用メカニズムを明らかにすることで、腸内エコシステムの調節に伴う粘膜免疫システムの新たな制御基盤創出を目指す。本年度は、高繊維食または低繊維食摂食マウスの大腸におけるTreg細胞の解析および盲腸内容物中のメタボローム解析から、腸内共生細菌が食物繊維代謝により産生する酪酸が、大腸粘膜におけるTreg細胞の分化を促すことを明らかにした。さらに酪酸により誘導されるTreg細胞の機能を評価するため、Rag2 KOマウスへのCD45RBhighCD4陽性T細胞移入大腸炎モデルマウスを用いて酪酸化デンプン摂食試験を行ったところ、腸管内での酪酸濃度の増加に伴って大腸粘膜におけるTreg細胞数が増加し、大腸炎症状を軽減できることが明らかとなった。これらのことから、腸内共生細菌が食物繊維代謝により腸管内で産生する短鎖脂肪酸の一つである酪酸が、大腸粘膜におけるTreg細胞の分化誘導を介した粘膜免疫系の恒常性維持に寄与する免疫修飾因子であることが明らかとなった。地球環境上のあらゆる場所には微生物生態系が存在しているが、とりわけわれわれの腸管内には数百種類でおよそ100兆個にもおよぶ腸内細菌群(腸内細菌叢)が高密度に生息している。これら腸内細菌叢は細菌同士あるいは宿主の腸管細胞群と相互作用することで、複雑で洗練された腸内生態系、すなわち「腸内エコシステム」を形成している。腸内エコシステムは通常はこれらの同種あるいは異種細胞間の絶妙なバランスの元に恒常性を維持しているが、過度の遺伝的要因あるいは外環境由来の要因によりその恒常性が破綻してしまうと、最終的には粘膜免疫系や神経系、内分泌系の過剰変動に起因すると考えられる炎症性腸疾患や大腸癌などの腸そのものの疾患に加えて、自己免疫疾患や代謝疾患、細菌感染症といった全身性の疾患に繋がることが報告されている。従って、腸内エコシステムの破綻に起因するこれらの疾患を正しく理解し制御するためには、その構成要素のひとつである腸内細菌叢の機能やそれらと腸管細胞群とのクロストークについて統合的な観点からアプローチする必要がある。

これまでの研究で、われわれが独自に構築したメタボロゲノミクスに基づく統合オミクス解析により、腸内細菌叢による食物繊維の代謝発酵により産生される短鎖脂肪酸の一つである酪酸が、大腸粘膜におけるナイーブT細胞から制御性T細胞への分化をエピジェネティックに誘導し、最終的には大腸炎を抑制できることを明らかにした。本年度は腸内細菌叢由来代謝産物が有する生理学的機能についてさらに検討するため、慢性腎臓病モデルマウスへの腸内環境改善試験を実施し、便秘薬摂取による腸内環境改善が、慢性腎臓病の病態悪化抑制に寄与することを明らかにした。26年度が最終年度であるため、記入しない。腸内環境システム学26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は研究計画書のスケジュール通りに、マウスNaive CD4+T細胞を用いたin vitro培養モデルを用いて、腸内細菌が産生する代謝産物によるTreg細胞誘導能を評価した。また、次年度以降に予定していた免疫疾患マウスモデルへの腸内細菌由来代謝産物の投与による制御性T細胞誘導システムについても解析を始めている。本年度は研究計画書のスケジュール通りに、マウス大腸粘膜におけるTreg細胞の分化を誘導する腸内細菌因子についてメタボローム解析を行った。また、次年度以降に予定していた大腸炎マウスモデルへの腸内細菌由来代謝産物の摂取による病態改善効果についても検討を行い、一定の成果を得た。本研究課題の今後の方針は、当初の研究計画通りに統合オミクス解析技術を駆使して、通常マウスおよび種々の免疫疾患モデルマウスへの腸内細菌由来代謝産物の投与効果について検討し、誘導されたTreg細胞の機能を評価する。本研究課題の今後の方針は、当初の研究計画通りに統合オミクス解析技術を駆使して同定した腸内細菌由来代謝物を用いて、通常マウスおよび種々の疾患モデルマウスへの摂取試験を実施し、病態改善効果の評価を行う。研究計画当初は技術員の雇用を予定していたが、研究代表者の所属変更により次年度以降に繰り越した。次年度は研究計画書通りに、通常マウスへの腸内細菌由来代謝産物の投与によるTreg細胞の分化・誘導機構の分子メカニズムの詳細について解析を行う予定である。研究計画当初は技術員の雇用を予定していたが、実験の進捗に合わせて次年度以降に繰り越した。次年度は研究計画書通りに、疾患モデルマウスを用いた腸内細菌由来代謝産物の摂取によるTreg細胞誘導を介した病態の改善効果の評価を行う。
マクロファージの活性化制御におけるスカベンジャー受容体の役割と診断・治療への応用

クラスAスカベンジャー受容体(SR-A,CD204)欠損マクロファージ(Mφ)を用いた検討で、SR-AはTLR4のLPSとの結合を競合的に阻害し、M2 Mφの抗炎症性機能の一翼を担うことを明らかにした。急性冠症候群では、血中単球にSR-Aが誘導され診断マーカーとなり得ることがわかった。ヒト腫瘍組織の検討では、CD163陽性M2Mφの浸潤度と膠細胞腫や卵巣癌の悪性度に相関がみられ、M2 Mφと腫瘍細胞がSTAT3を介して相互作用を示すことを明らかにした。天然化合物のcorosolicacidはMφのM2分化を抑制し、MφのM2機能を抑制することで治療効果を示す可能性が示唆された。マクロファージの活性化には、古典的活性化(M1経路)とオルタナティブ活性化(M2経路)が存在し、スカベンジャー受容体ファミリー分子はそれぞれの活性化過程において特異な発現動態を示す。本年度の検討で、急性心筋梗塞をはじめとする急性冠症候群では血中単球においてオルタナティブ活性化(M2)マクロファージのマーカーであるクラスAスカベンジャー受容体(CD204)の発現が誘導されることが明らかになった。このことから単球におけるCD204の発現状態を検討することによって、急性冠症候群の診断と経過のモニターのために有用な診断法となる可能性が示された。次年度は、血清のELISAあるいは単球のフローサイトメトリーによるCD204の発現解析法の確立を計画している。次に、膠芽腫では悪性度(グレード)の増加に伴ってCD204陽性のM2マクロファージの浸潤が増強し、腫瘍の増殖に密接に関連することが明らかとなった。今後、薬剤による腫瘍内浸潤マクロファージの活性化を制御することにより、腫瘍増殖を抑制するという新しい治療戦略を検討したい。クラスEスカベンジャー受容体であるLectin-likeOxidized Low-Density LipoproteinReceptor-1(LOX-1)は、種々の臓器の中で胎盤において最も強い発現が見られる。これまで胎盤におけるLOX-1の機能は不明であったが、マウスおよびヒト胎盤での検討から、LOX-1は妊娠経過中のトロホブラストにおける酸化ストレスの制御に重要な役割を果たすことが明らかとなった。マクロファージ(Mφ)の活性化には、古典的活性化(M1経路)とオルタナティブ活性化(M2経路)が存在し、クラスAスカベンジャー受容体(CD204)は後者の活性化過程において重要な役割を果たす。昨年度の検討から、膠芽腫では悪性度の増加に伴ってオルタナティブ活性化(M2)Mφの腫瘍内浸潤が増強し、腫瘍の増殖と密接に関連することが明らかとなった。本年度は、解析疾患の範囲を広げると共に、オルタナティブ活性化に伴って発現が増強するCD204がM2Mφの機能に果たす役割について解析を加えた。まず、線維化病巣が形成される自己免疫性慢性炎症性疾患である強皮症の検討では、炎症の強度に比例してM2Mφの浸潤がみられ、その後の線維化に関与する可能性が示唆された。卵巣癌の検討では、膠芽腫と同様に悪性度に比例してM2Mφの浸潤密度が増強し、M2Mφが腫瘍増殖に対し促進的に作用する可能性が考えられた。マウスリンパ腫を用いた移植モデルの解析では、CD204欠損マウスの移植腫瘍内への浸潤マクロファージ数は野生型と同程度であったが、腫瘍増殖が有意に抑制されていた。続いてサイトカン分泌との関連を検討すると、CD204はTLR4を介したNOやIFN-γの産生を抑制することが明らかとなり、このことによって腫瘍増殖に促進的に作用している可能性が考えられた。次に、CD204と破骨細胞分化の検討では、CD204欠損マウスでは骨のリモデリングが抑制され、破骨細胞の分化過程にもCD204が関与することが明らかになった。この様な検討から、CD204は単にオルタナティブ活性化に伴って発現が増強するだけでなく、M2Mφの機能そのものにも影響を及ぼしていることが明らかとなった。次年度は、様々な病態の解析を継続すると共に、マクロファージの活性化を制御する化合物の探索を進め、Mφの活性化制御による治療法開発に発展させたい。マクロファージの活性化には、古典的活性化(M1経路)とオルタナティブ活性化(M2経路)が存在し、前者は炎症促進性に機能し、後者は炎症抑制性に機能するともに血管新生を誘導し腫瘍増殖を促進することがわかってきた。

本研究では、オルタナティブ活性化マクロファージ(M2Mφ)のマーカーであるヘモグロビンスカベンジャー受容体(CD163)やクラスAスカベンジャー受容体(CD204)を指標として用いてヒト病理組織検体を解析し、これまで神経膠腫や卵巣癌においてM2Mφの腫瘍内浸潤が腫瘍の増殖と密接に関連することを明らかにした。本年度は解析疾患の範囲を広げ、肝内胆管癌ではM2Mφの浸潤度と非再発生存率に負の相関があること、また血管免疫芽球型T細胞リンパ腫や腎淡明細胞癌ではM2Mφの浸潤と予後に密接な関連があることを見いだした。さらに卵巣癌患者の腹水中の細胞や培養細胞を用いて、腹腔内のM2Mφが腹膜播種を促進することを示すとともに、M2Mφによる腫瘍細胞の増殖誘導にsignal transducer and activator of transcription-3 (STAT3)の活性化が関与することを明らかにした。このような解析結果に基づき、マクロファージの活性化を制御することによって腫瘍増殖を抑制することが可能であると考え、マクロファージのオルタナティブ活性化を抑制する天然化合物のスクリーニングを行った。その結果、バナバやビワに含まれるcorosolic acidが膠芽腫細胞のSTAT3の活性化を阻害し、腫瘍細胞増殖を抑制する事を明らかにした。さらにタマネギの成分であるonionin Aにもマクロファージのオルタナティブ活性化を抑制する作用があることを見いだした。今後、これらの化合物を用いて移植腫瘍を用いたin vivoの解析を加えて、Mφの活性化制御による治療法開発に発展させたい。
超高分解能気相イオン移動能法の開発とナノ炭素物質の構造制御

イオン移動度測定はエアロゾル粒子やクラスターなどの構造測定に用いられているが、分解能と感度そして何よりも同一粒子を長時間測定することができなかったため、ナノ物質の構造制御などには活用できなかった。ナノ物質の成長、特にナノチューブの工業的生産には数時間以上の成長過程を継続的に観測する必要があるため、従来のイオン移動度測定は適用できない。このプロジェクトでは、イオントラップを活用した超高分解能イオン移動能装置を開発し、新たな活用法への足がかりを得た。今回開発したシステムはイオントラップを複数個用いており、電極間に20kHz,600Vppの高周波電場(RF)と数Hz,10Vppの低周波電場(LF)を印加する。RF電場の周波数はイオンの移動に比較して十分に高速のため、イオンは電場の絶対値が小さい電極中央部分に収束される。収束したイオンをLFにより大気中を移動させ移動速度や振幅を測定し、イオンの移動度および構造を推測する。これまで真空中で用いられることが多い、イオントラップを大気中など高圧ガス中で活用したことが特徴である。直径10μm、比電荷m/z=2×10^8程度の粒子である食塩水荷電微粒子を用いて装置の動作確認をしたところ、食塩水微粒子が大気への水の蒸発や大気からの水分の凝縮に対応して、サイズが数十分の時間範囲で大きくなったり、小さくなったりすることを確認した。さらに、その変化が食塩水濃度に大きく依存することが分かった。トラップされる寿命が2時間以上であることも示され、ナノ物質の成長を十分に観測できることがわかった。さらに、このトラップ長と移動距離が500mmの装置を開発し、微粒子の重力による落下を組み合わせ、電荷と大きさを独立に測定することが可能になり、更なる高精度測定と構造分離を実現した。この装置は質量分析器にトラップした粒子を導入できるように、イオンファンネルを備え、ナノ物質の高度測定が可能である。平成20年度は、第1段階として超高分解能イオン移動能装置を開発しつつある。この装置は、ナノ炭素物質や触媒金属微粒子のイオン源とイオン移動度選別部、およびイオン移動・収束システムと飛行時間型質量分析器で構成されている。今年度は名古屋大学で開発を終えた、イオン源および飛行時間型質量分析器の東邦大学への移設を終え、稼働を確認した。現在移動度選別部の製作も終了し、簡単なイオン移動・収束システムでC60,70の移動度測定を行った。既報とほぼ同様なデータが得られ、装置として動くことを確認した。しかし検出効率が悪く、このまま未知のナノ物質測定を行うことは難しい。この理由は気相移動度選別部から質量分析機への輸送効率が悪いためであり、現在この問題を解決するためのイオン移動収束システムの改良を行っている。イオントラップなど高周波高圧電源を用いた収束・輸送システムの活用により、現在の信号強度を100倍以上改善し、測定システムの飛躍的感度向上を図ることを目標に現在装置開発を行っている。これらの結果は学会発表1の第89回春期年会に発表した。これまでの測定結果を活用して得られた、ナノ炭素構造制御法を用いて生成した2層ナノチューブの特性も現在測定しており、論文三報にまとめた。

まず、2層ナノチューブの酸化特性が単層ナノチューブよりも優れていることを、直径依存性と層数依存性を詳細に検討した論文を論文1に、電気特性に関して論文2に、構造と電子状態のSTMによる詳細観察を基盤に、層間相互作用がモアレ状パターンとして現れ、2層ナノチューブの単層ナノチューブには存在しない電子状態の存在とSTMによる多層チューブの構造決定に関して論文3にまとめた。今後は、装置の改良に努めることと同時に、ナノ物質の構造測定の時間変化を測定できるように、システムの発展および金属微粒子、巨大ナノ物質、高温気相移動度測定などか可能になるように周辺機器開発も行う予定である。平成21年度は、超高分解能イオン移動能装置開発の第2段階としてイオントラップを用いた気相移動度測定システムを開発した。この新しいシステムでは積層リング型構造を持ち、電極間に20kHz,600Vppの高周波電場(RF)と数Hz,10Vppの低周波電場(LF)を印加する。RF電場の周波数はイオンの移動に比較して十分に早いため、イオンは電場の絶対値が小さい電極中央部分に収束される。収束したイオンをLFにより大気中を移動させ移動速度とLF電場の大きさから、イオンの移動度および構造を推測する。今回はイオントラップ気相移動度システムの挙動を詳細に観察するために、10kVの高電圧を印加した霧吹きにより食塩水荷電微粒子を用いた。これらを半導体レーザーにより照射し光散乱を観測する。LFの電圧変化を20V程度に、周波数変化を数Hz程度にすることにより、荷電微粒子の振幅変化を調べ、直径20μm、比電荷m/z=2×10^8程度の粒子であることを明らかにした。さらに、トラップされる寿命が2時間以上であり、十分な移動度測定において感度と精度が実現された。今後は荷電微粒子ではなくナノ物質イオンへ適用し、構造測定と構造制御を実現する。平成22年度は、最終年度として超高分解能イオン移動能装置を開発した。このシステムはイオントラップを複数個用いており、電極間に20kHz,600Vppの高周波電場(RF)と数Hz,10Vppの低周波電場(LF)を印加する。収束したイオンをLFにより大気中を移動させ移動速度や振幅を測定し、イオンの移動度および構造を推測する。これまで真空中で用いられることが多い、イオントラップを大気中など高圧ガス中で用いることができることが特徴である。直径20μm、比電荷m/z=2×10^8程度の粒子である食塩水荷電微粒子を用いて装置の動作確認をしたところ、食塩水微粒子が大気への水の蒸発および水分の凝縮な対応し、サイズが数十分の時間範囲で大きくなったり、小さくなったりしたことを確認した。さらに、その変化が食塩水濃度に大きく依存することが分かった。トラップされる寿命が2時間以上であるため、ナノ物質の成長を十分に観測できる。さらに、このトラップ長と移動距離が500mmの装置を開発し、微粒子の重力による落下を組み合わせ、電荷と大きさを独立に測定すると画可能になり、更なる高精度測定と構造分離を実現した。この装置は組み込み計算機システムとそれらを通信によって制御するWindows PCによりRFとLFの動作が制御され、任意のサイズの粒子の選別と保持が可能である。その上質量分析器にトラップした粒子を導入できるように、イオンファンネルを備え、ナノ物質の高度測定が可能である。
磁気アシスト型静電閉じ込め核融合を用いた汎用小型中性子源の開発

本研究で提案する磁気アシスト型静電閉じ込め(MEC)核融合装置に関して,計算機シミュレーションと試作機による実験との両面から,その基礎特性および可能性を評価した。数値計算では,モンテカルロ衝突機構を考慮した粒子シミュレーションコードを作成し,MEC装置の動作条件依存性を計算した。その結果,ガス圧力の低下とともに閉じ込め性能が改善することを示した。しかしながら,空間電荷制限によりイオン密度が制限されることがわかった。装置内で起こる核融合反応は,ビームー陰極反応が支配的であるという結果を得た。ビームーバックグラウンド反応とビームー陽極反応は同程度であり,ビームー陰極反応の10分の1程度であった。ビームービーム反応はこれらよりもずっと小さかった。また,中性子生成率の電圧,電流,ガス圧力,磁束密度依存性について明らかにした。実証実験では,100mTまで発生可能な小規模実験装置を試作し,放電特性および中性子生成率の動作条件依存性を調べた。従来の装置よりも動作圧力を10倍以上低減することが可能となった。中性子生成率に対する電流およびガス圧力依存性は,シミュレーションで仮定した電極内の重水素密度を修正することで,実験値と計算値が比較的よく一致した。一方,磁束密度依存性については明確な傾向が得られなかったが,これはイオン源プラズマにおけるイオンの構成比に起因するものであることが示唆された。得られた最大の中性子生成率は,-15kV,2mAの動作において2.6x10^3s^<-1>であった。従来のIEC装置と比較した結果,MEC装置はIEC装置と同等以上の性能を有することがわかった。現実的な可能性として,-100kV,10mAの動作に置いて1.6x10^8s^<-1>の中性子生成率が得られる見込みを得た。
水稲登熟期における高温ストレスバイオマーカーの開発とその機構の化学的解明

本研究では,水稲の登熟期における高温ストレスバイオマーカーになる化合物を見出すために,高温登熟した玄米において蓄積する化合物を単離・同定し,高温登熟および常温登熟した玄米においてその含有率を明らかにしようとした.高温登熟した「ふさおとめ」,「コシヒカリ」,および「初星」の玄米の低極性成分を見ると,常温登熟した玄米に比べ,3品種の平均でcycloartenyl ferulate (5)の含有率が0.5倍に低下するが,24-methylenecycloartanyl ferulate (6)およびγ-oryzanolの含有率がそれぞれ1.6倍および1.2倍に増加した.化合物5および6はγ-oryzanolの主成分であり,玄米におけるその含有率は,登熟期の高温により増加するが,その組成は大きく変化することが示唆された.以上より,化合物2,3,5,および6およびγ-oryzanolは,水稲の登熟期における高温ストレスバイオマーカーの候補物質になると考えられた.25年度が最終年度であるため、記入しない。25年度が最終年度であるため、記入しない。
染色体脆弱部位の研究

末稍血リンパ球のPHA添加による短期培養の末期にaphidicolinを加えると脆弱部位が高頻度に発現し,これがethanolの添加により増強することは前年度発表した.從来,脆弱部位の研究に用いられている組織は末稍血リンパ球が主で,他の組織は殆ど研究されていない.皮膚線維芽細胞の脆弱部位を調査した.方法:健康な成人5人(男2人,女2人)の末稍血リンパ球短期培養,皮膚線維芽細胞の培養に0, 2μM aphidicolinを26時間添加し,染色体標本を作製,脆弱部位の頻度を求めた.線維芽細胞にのみ認められたのは7g11.2,10g11.2である.両者に認められるが,線芽細胞に圧倒的に多いのは1p31,3g26.2,16g23だった.他方,リンパ球に多い3p14,2g32,11g14,6g26は線維芽細胞では殆ど観察されなかった.脆弱部位全体としてはリンパ球は100細胞あたり3.12,線維芽細胞は22で,ほゞ1/14だった.考案:上記の所見から,組織により脆弱部位の発現頻度,部位の異なることが判明した.細胞のDNA構成は組織の如何にかかわらず同じだから,脆弱部位はDNA構成そのものを反映していないと結論できよう.aphidicolin以外の条件で皮膚線維芽細胞に脆弱部位を多数発現させることは困難なので,種々の条件を比較することは難しい.また,骨髄細胞,羊水細胞,羊膜の上皮細胞についても將来検討の必要があろう.未稍血リンパ球の短期培養にaphidicolinを添加すると脆弱部位が発現することが知られている。Aphidicolinを溶解するためにethanolを使用するが、ethanolはaphidiwlinと相乗的に作用して脆弱部位の頻度を増加させることを発見した。Ethanolが0.02%で296%、201%だが、1%で765%と823%に増加する。この条件で35カ所のcommon fragile sitesを固定した(文献参照)。Aphidicolin添加によりtriradials,quadriradials,end-to-end associationの発現を認めた。前記の異常の発現頻度の最大となる条件を求め、健康成人女子2人の未稍血リンパ球;計2000の中期核板について分析した。End-to-end associationについては分析、集計を完了したが、その分布はrandomである。従来、この異常を実験的に作製した報告はないから、有用と思われる。End-to-endassociationは染色体末端部に誘発した脆弱部位と考えることができる。末稍血リンパ球のPHA添加による短期培養の末期にaphidicolinを加えると脆弱部位が高頻度に発現し,これがethanolの添加により増強することは前年度発表した.從来,脆弱部位の研究に用いられている組織は末稍血リンパ球が主で,他の組織は殆ど研究されていない.皮膚線維芽細胞の脆弱部位を調査した.方法:健康な成人5人(男2人,女2人)の末稍血リンパ球短期培養,皮膚線維芽細胞の培養に0, 2μM aphidicolinを26時間添加し,染色体標本を作製,脆弱部位の頻度を求めた.線維芽細胞にのみ認められたのは7g11.2,10g11.2である.両者に認められるが,線芽細胞に圧倒的に多いのは1p31,3g26.2,16g23だった.他方,リンパ球に多い3p14,2g32,11g14,6g26は線維芽細胞では殆ど観察されなかった.脆弱部位全体としてはリンパ球は100細胞あたり3.12,線維芽細胞は22で,ほゞ1/14だった.考案:上記の所見から,組織により脆弱部位の発現頻度,部位の異なることが判明した.細胞のDNA構成は組織の如何にかかわらず同じだから,脆弱部位はDNA構成そのものを反映していないと結論できよう.aphidicolin以外の条件で皮膚線維芽細胞に脆弱部位を多数発現させることは困難なので,種々の条件を比較することは難しい.また,骨髄細胞,羊水細胞,羊膜の上皮細胞についても將来検討の必要があろう.
ファイトプラズマ感染植物の糖輸送制御機構の解明による防除技術確立に関する研究

ファイトプラズマは世界各地で甚大な被害を引き起こす病原細菌であり、植物の篩部細胞内に寄生し、多様でユニークな病徴を引き起こすと共にしばしば枯死に至らしめる。また近年、枯死の前段階には糖の異常蓄積が起こることが明らかになりつつある。そこで本研究では、未だ有効な防除手段が打ち立てられていないファイトプラズマ病に対し、糖蓄積メカニズムを明らかにすることで防除技術につながる知見を得ることを目的とした。具体的には、ファイトプラズマが宿主の糖類トランスポーターを介した糖輸送システムを攪乱することによって糖類の異常蓄積を起こすという推測のもと、感染時に攪乱されるトランスポーター遺伝子の特定および、攪乱を誘導するエフェクターの同定を進め、ファイトプラズマがどのように宿主植物の栄養源をハイジャックして感染成立させ枯死に至る病徴を発現させるのか、その全容解明を目的とした。当該年度はまず、ファイトプラズマ感染によってどの糖トランスポーター遺伝子が攪乱され、異常な発現制御を受けるのかを特定する目的で、シロイヌナズナに健全ヨコバイ、およびファイトプラズマ感染ヨコバイを吸汁させ、それぞれのサンプルから経時的にRNAを抽出し、リアルタイムRT-PCR法を用いて、遺伝子の発現解析を行った。その結果、発現が有意に上昇した遺伝子の特定に成功し、仮説通り、感染により特定の糖トランスポーター遺伝子が発現制御されることが明らかになった。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
運動ニューロン発生の空間的・時間的調節機構の解析

脳運動神経核が現れる後脳レベルにおけるMNR2ホメオボックス遺伝子の発現様式を、他の脳運動神経核に発現されることが知られている遺伝子群と比較した。運動ニューロンは、古典的な解剖学的研究により、体性(somatic)構造の支配に関与しているか、内臓性(visceral)構造の支配に関与しているかにより、二つのカテゴリーに区分できる事が知られている。MNR2の発現を、それに対する特異的な抗体で解析した結果、後脳においては、MNR2は体性脳運動神経核に発現されるが、内臓性脳運動神経核には発現されないことが示された。この結果は、後脳レベルにおいては、脊髄レベルとは異なり、MNR2は体性脳運動神経核の発生に主に関与することを示唆する。MNR2が、後脳レベルにおいても、果たして、脊髄レベルにおいて示されたのと同様な運動ニューロンの発生のプログラムを開始させることができるのかどうか、電気穿孔法を用いて、発生初期のニワトリ胚の後脳領域にMNR2を異所性に発現させた。内臓性脳運動神経核が発生してくる菱脳(r4)に焦点を当て、Isl1、Lim3、HB9、Isl2等のホメオボックス遺伝子群の発現がMNR2により異所性に誘導されるかどうかを解析した。r4においては、MNR2の異所的発現により、Isl1の異所的発現が高率に認められた。MNR2により運動ニューロンの細胞特異性の一つが誘導されたことは、MNR2の運動ニューロン誘導活性能が、脊髄以外の領域においても部分的にではあるが、活性を示すことを示唆するものである。また、r4においては、上記のホメオボックス遺伝子のうちIsl1のみが内臓性運動ニューロン(r4)に発現されることを考え合わせると、MNR2の異所性作用により、その菱脳(r4)に適した運動ニューロンの発生のプログラムを開始させたと解釈できる。
e-Learning非同期学習に対応した学習支援・評価システムの開発

e-Learningが学校教育機関、特に低学年で利用する一斉個別学習(同期学習)でなく、非同期学習として利用した場合、継続的な学習を支援する手立て、教師による指導機能、自主的な学習を支援するための手立てが必要となる。本研究においては、学習者自身が自ら学習計画を立て、常に集団における自分の状況を把握して学習を継続させる手立てとして、学習者自身の学習状況(進捗度、正解率)や他の学習者の学習状況を視覚的に提示し、個別指導や質問、状況把握を可能にしたe-Learning学習環境の開発を目的としている。本研究は2年計画で進められ、次のような作業を行ってきた。(1)学習データの収集と学習結果のフィードバック機能の開発学習データをネットワーク経由で学習履歴サーバに格納し、解析処理結果を学習者クライアントにフィードバックする一連の処理系。(2)学習履歴データベースの構築学習データの格納と処理結果の格納データベースの構築。(3)学習データの視覚表示機能の開発学習者クライアント端末における各種表示機能による学習データの表示。(4)教師端末、学習者端末、データベースサーバーとのインターフェースの構築。最終的に、各機能を統合し、簡単な学習画面を作成し、システムとして機能することを確認した。本研究においては、学習者自身が自ら学習計画を立て、常に集団における自分の状況を把握して学習を継続させる手立てとして、学習者自身の学習状況(進捗度や正解率)や他の学習者の学習状況を視覚的に提示し、個別指導や質問、状況把握を可能にしたe-Learning学習環境の開発を目的としている。本研究は2年計画で進められているが、初年度である本年は次のような作業を行ってきた。1)学習データの収集と学習結果のフィードバック機能の開発学習データをネットワーク経由で学習履歴サーバに格納し、解析処理結果を学習者クライアントにフィードバックする一連の処理系。2)学習履歴データベースの構築学習データの格納と処理結果の格納データベースの構築。3)学習データの視覚表示機能の開発学習者クライアント端末における各種表示機能による学習データの表示。次年度においては、次の2項目の作業を完了することによって、目的とする研究開発を終了する予定である。1)教師端末、学習者端末、データベースサーバーとのインターフェースの構築を行う。2)実用化に向けての総合的な評価試験を行う。4)教師端末、学習者端末、データベースサーバーとのインターフェースの構築。各機能を統合し、システムとして機能することを確認。
内分泌細胞としての脂肪細胞-その個体における役割-(PPARγ2ノックアウトマウスの作製

脂肪細胞がただ単なる脂肪を蓄積する細胞でなく、各種の物質を産生、分泌している能動的な細胞であるという概念が提唱されて久しい。この脂肪細胞の個体レベルでの働きを明らかにするには、脂肪細胞のないモデル動物を作製するのが最適と考えられた。そこで脂肪細胞の分化に重要な働きをしているPPARγ遺伝子のノックアウトマウスの作製を試みた。しかしながら、このマウスの作製途中において、PPARγ遺伝子のノックアウトにより胎児の時期に死亡することが他の研究室により明らかにされた。そこで、他の方法を検討した。PPARγの各種変異体を作製したところ、C端側の16個のアミノ酸を欠除した変異体をアデノウイルスベクターを用いて3T3-Ll前駆脂肪細胞に発現すると、その分化が有意に抑制されることを見出した。今後、この変異体を脂肪細胞特異的プロモーターaP2を用いて発現するトランスジェニックマウスを作製すれば、脂肪細胞の欠除したマウスが得られる可能性があると考えられた。一方、このPPARγ遺伝子の変異により各種の疾患が発症する可能性が考えられた。そこで、まず脂肪細胞がほとんど認められない脂肪萎縮性糖尿病患者におけるPPARγ遺伝子のコーディング部分の異常についてPCR-SSCP法について検討した。その結果、PPARγ遺伝子には異常はなく、脂肪萎縮性糖尿病の重要な責任遺伝子とは考えられなかった。次に2型糖尿病者25名についても,同様の検討を行い12番目のProのAlaへの変異を見出した。この変異の頻度について、303名の2型糖尿病者と230名の健常対照者を比較検討したが、両群でその頻度に有意差を認めなかった。PPARγ2の個体における役割を明らかにする目的で実験を行っているが、そのノックアウトマウス作製に関しては各種の技術的問題で予定通りの進行はみられていない。また、各種の情報を結合すると、PPARγノックアウトマウスのホモは致死性とのことで、ノックアウトマウスの作製により初期の目的が達せられるか疑問である。こそで我々はPPARγ2遺伝子をアデノウィルスベクターを用いて培養細胞あるいは個体レベルで発現することとした。正常のPPARγ2、N端側のアミノ酸を100以上欠失したΔN PPARγ2(constitutive activeに働く)、C端側のアミノ酸を10欠失したΔC PPARγ2(dominant negativeに働くと考えられる)の3種類のconstructを作製し、アデノウィルスベクターに組み込み、現在その発現を検討中である。一方、このPPARγ2遺伝子の異常についてlipoatrohic diabetes並びにNIDDMで検討した。まず、ヒトのPPARγ2遺伝子をクローニングし、その結果、ヒトPPARγ2遺伝子は7つのエクソン6つのイントロンから成立していた。各エクソンをPCR法にて増幅し、SSCPにてその変異の有無を検討した。その結果、我々は3種類の遺伝子変異を見い出したが、いずれもコードするアミノ酸には影響を与えなかった。すなわち、PPARγ2遺伝子の変異がlipoatroohic diabbetesの原因とは考えにくいことが明らかとなった。またPPARγ2遺伝子の変異はNIDDMの発症にも大きな役割を果たしている可能性は低いことが明らかとなった。PPARγ遺伝子のノックアウトマウス作製のために、マウスPPARγ遺伝子をクローニングし、その第一エクソンを中心に構造解析を行った。その結果を基に、ターゲッティングベクターを構築した。しかしながら、この時点でPPARγ遺伝子のノックアウトにより、胎児の時期に死亡することが他の研究室の成績から明らかにされた。従って、このような方法により、PPARγの機能を低下させるのは無理と考えた。そこでPPARγのdominant-negative型の変異体をアデノウィルスベクターを用いて発現する方法を考えた。

すなわち、PPARγのN端側を欠落したΔN,C端側をごく僅か欠落したΔC、リガンド結合部位を削除したΔLの3つの変異体を作製して、3T3ーL1preadipocyteヘアデノウィルスベクターを用いて発現し、分化への影響を検討した。その結果、ΔNPPARγは3T3ーL1脂肪細胞への分化に関しほとんど影響を与えないこと、ΔCPPARγは3T3-L1脂肪細胞への分化を軽度ではあるが阻害すること、ΔLPPARγは3T3ーL1脂肪細胞への分化を軽度ではあるが阻害することを見い出した。ΔCPPARγとΔLPPARγのいずれもリガンドとの結合能を持たないこと、ΔCPPARγはDNAとの結合能を持つがΔLPPARγはDNAとの結合能も持たないことが明らかとなった。従って、ΔCPPARγが、dominant-negative型の変異体として働きうる可能性が示唆された。PPARγは脂肪細胞の分化以外にも各種の機能を持つことが知られているが、それらの作用にもΔCPPARγがdominant-negativeに働きうるか、あるいはアデノウィルスベクターを使用してこれらの変異体を個体の各臓器に発現して、個体のレベルでのインスリン感受性あるいはチアゾリジン系薬剤の効果を今後検討する予定である。