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外国人留学生供給源の変動とその規定要因‐中国の大学の日本語教育と学習者を事例に

平成29年度では、中国14国公立大学で収集した日本語学習者質問紙調査のデータを分析し、日本教育学会第76回大会(2017年8月、桜美林大学主催)に原稿「外国人留学生供給源の変動とその規定要因-中国の大学の日本語教育と学習者を事例に」を提出し、研究報告をおこなった。分析結果の一部を挙げると、まず今世紀初頭の中国における日本語学習者の急増は、高等教育の拡大が背景にあり、職業大学における日本語科の新設、既存の日本語科の定員増、さらに第二外国語として日本語を履修する学生の増加に起因する。近年の日本語学習者の減少に関して、小学校段階での英語教育の早期導入の影響が無視できない。日本語専攻生の進路をみる限り、近年中国の労働市場における「日本語ができる、日本のことがわかる」ことの優位性が大幅に低下していると推測する。また、日本語学習者の留学志向は非常に高いものの、大学の専攻が日本語であっても、高い英語力を生かして英語圏へ留学する学生が少なくない。これは近年、在日中国人留学生数が停滞した要因の1つではないかと推し量る。日本に限らず、非英語圏の留学生受け入れは英語、英語圏の優位性とどのように向き合うか、依然として課題である。同じデータのなかの授業料負担、授業料を引き上げる場合の進路選択の設問を分析し、2018年3月に日本高等教育学会第21回大会へ発表要旨「大学授業料引き上げのシミュレーション-中国14国公立大学の学生調査から」を提出した。6月初旬に研究報告を行う予定である。そのほか、文科省と学生支援機構が実施した各種留学生調査のデータを二次分析し、学術論文「少子化日本の外国人留学生受け入れの最新動向」を執筆し、査読を経て、台湾社会学会2017年度研究大会で口頭発表した。この原稿では、廉価な労働力であり消費者でもある留学生の教育水準の質保証を課題として提起した。中国の日本語教育と日本の留学生受け入れに関するマクロの研究結果と、14国公立大学で収集した日本語学習者のデータを用いたミクロの分析結果をどのように統合し結論付け、理論化するかの課題がまだ残っている。研究成果を取りまとめるには、なお時間がかかる。本年度は引き続き、2016年初夏に収集したデータベースを分析し、1)投稿論文「中国の日本語学習者の学習状況と進路志向」(in Japaese)と「少子化日本の外国人留学生の受け入れ最新動向」(in Chinese)の加筆修正、2)日本高等教育学会第21回大会で「大学授業料引き上げのシミュレーション」を題目とした研究報告、3)「中国の大学生の日本社会・中日関係認識ー2016年日本語学習者調査から」を題目とする学会発表の申し込みをおこなった。2)の研究報告から、新たに以下の知見を得ている。50%の授業料値上げをしても、大学進学を断念する学生は3.7%に留まる。しかし、値上げ率が高くなると、「現在の大学より授業料の安い大学へ進学する」、「海外の大学へ進学する」の回答率が高くなる。中低所得家庭の状況を案じると、給付奨学金の拡充とセットにすれば、20%までの値上げは大きな混乱を起こすことはないだろう。50%値上げする場合、低所得層、すでに授業料基準の高い地方大学の学生の進路に大きな変化が生じうる。
ブラウン運動の相互作用を持つ汎関数の研究と対応する無限次元拡散過程の構成及び解析

舟木直久氏(東大数理),F. Hirsch氏(Evry),M. Yor氏(ParisVI)との共同研究で,Bessel過程及びそれを含む広いクラスの確率過程に対するWiener型積分の定義可能性についての研究を行った.いま特にBessel過程を原点から出発させよう.その半マルチンゲール分解には原点での特異性が現れるため,Wiener積分を定義するためには試験関数が2乗可積分という条件だけでは不十分である(これは例えばJeulin's conditionとして知られる条件からも覗える).舟木,Yor両氏との先行する共同研究"Wiener integrals forcentered powers of Bessel processes, I", Markov Processes and Related Fieldsに掲載決定)において我々は,原点から出発するBessel過程そのものについては試験関数が2乗可積分というだけではWiener積分を必ずしも定義出来ないが,平均値を引いた中心化過程については全ての2乗可積分な試験関数についてWiener積分が定義出来ることを確かめた.これは,中心化の操作により原点での特異性が除去された結果であると考えられるものの,そこで用いた方法は具体的計算に依っており,何故中心化を考えることでその様な現象が生じたのかというところまで理解出来たとは言えなかった.その現象のより深い理解を得るべく,擬Bessel過程と我々が呼ぶ,中心化Bessel過程を含むより広いクラスの確率過程の族を導入し,対象とする確率過程の分散とFourier解析に現れる正値関数との間の関係等を明らかにした.舟木直久氏(東大数理),F. Hirsch氏(Evry),M. Yor氏(ParisVI)との共同研究で,Bessel過程及びそれを含む広いクラスの確率過程に対するWiener型積分の定義可能性についての研究を行った.いま特にBessel過程を原点から出発させよう.その半マルチンゲール分解には原点での特異性が現れるため,Wiener積分を定義するためには試験関数が2乗可積分という条件だけでは不十分である(これは例えばJeulin's conditionとして知られる条件からも覗える).舟木,Yor両氏との先行する共同研究"Wiener integrals forcentered powers of Bessel processes, I", Markov Processes and Related Fieldsに掲載決定)において我々は,原点から出発するBessel過程そのものについては試験関数が2乗可積分というだけではWiener積分を必ずしも定義出来ないが,平均値を引いた中心化過程については全ての2乗可積分な試験関数についてWiener積分が定義出来ることを確かめた.これは,中心化の操作により原点での特異性が除去された結果であると考えられるものの,そこで用いた方法は具体的計算に依っており,何故中心化を考えることでその様な現象が生じたのかというところまで理解出来たとは言えなかった.その現象のより深い理解を得るべく,擬Bessel過程と我々が呼ぶ,中心化Bessel過程を含むより広いクラスの確率過程の族を導入し,対象とする確率過程の分散とFourier解析に現れる正値関数との間の関係等を明らかにした.
静電誘導の原理に基づく普通紙の2自由度搬送機構

本研究の目的は,静電誘導アクチュエータの原理に基づき,紙やフィルムなどのシート部材を自在に搬送するデバイスを実現することである.昨年度,3相電極構造における1自由度の静電誘導駆動に関して,駆動力と移動体抵抗値との関係などを明らかとし,駆動特性のモデル化,および,それに基づく最適化を行った.本年度は,引き続き駆動特性の検証を行ったことに加え,電極製作方法の検討と平面3自由度駆動の実現を試みた.電極製作手法としてはスクリーン印刷を用いた手法を検討した.本研究では,将来的に,オフィスデスク等の上を覆い尽くす大面積のアクチュエータを実現し,それによりデスク上で様々な紙のハンドリングを実現することをめざしている.そうした大面積のアクチュエータを製作する場合,大面積電極を安価に効率良く製作する手法が不可欠である.そこで,スクリーン印刷を用いて半透明なプラスチックシートに3相構造の電極を印刷することで静電アクチュエータを製作する技術を検討した.結果,装置の制約によりA4サイズより小さい程度の面積までしか実現できていないものの,紙の静電誘導搬送が可能な印刷電極を製作することに成功した.また,上記の印刷により製作した電極を市松模様に並べることで,3自由度での紙搬送を実現した.試作したシステムでは,4個の1自由度電極を市松模様に並べ,それぞれに印加する電圧を制御することで,上下左右といった平面2自由度の並進運動に加え,回転運動も可能であることを確認した.将来的には,より多くの電極を並べることで,平面内で様々な運動を実現させることが可能になると期待できる.本研究の目的は,静電誘導アクチュエータの原理に基づき,紙やフィルムなどのシート部材を自在に搬送するデバイスを実現することである.そのために,3相電極構造における1自由度の静電誘導駆動に関して,駆動力と移動体抵抗値との関係などを明らかとし,駆動特性のモデル化,および,それに基づく最適化を行うことを本年度の研究目標とした.静電誘導アクチュエータに関しては古くから知られているために過去にも様々なモデリングが行われている.しかし,過去の研究はいずれもバルク状の移動体を想定しており,本研究が対象とするシート状の移動体には,過去のモデルが適用できない.静電誘導アクチュエータでは,物体表面の導電性が性能に大きな影響を与えるが,シート状部材の場合,シートの表面・裏面の両者が駆動性能に寄与することから,両面の影響を加味したモデルを構築する必要がある.本研究では,試作した3相電極,ならびに,数種類の紙の電気的特性を等価回路モデルとして表し,シート表面に流れる微小電流が形成する電荷パターンや,シート内部の誘電分極の状態を定性的に解析できるモデルを構築した.モデルでは,発生力などを定量的に見積もることは難しいが,発生力の変化傾向を推測することが可能であり,最適な駆動周波数の解析が可能である.解析した最適駆動周波数を,実験的に確認した最適駆動周波数と比較したところ,解析と実験の傾向は概ね良い一致を見せており,解析モデルの妥当性が確認できた.今後は,実験サンプルを増やし,解析モデルの精度向上を行うとともに,実験装置や解析モデルの2自由度への拡張を行いたい.本研究の目的は,静電誘導アクチュエータの原理に基づき,紙やフィルムなどのシート部材を自在に搬送するデバイスを実現することである.昨年度,3相電極構造における1自由度の静電誘導駆動に関して,駆動力と移動体抵抗値との関係などを明らかとし,駆動特性のモデル化,および,それに基づく最適化を行った.本年度は,引き続き駆動特性の検証を行ったことに加え,電極製作方法の検討と平面3自由度駆動の実現を試みた.電極製作手法としてはスクリーン印刷を用いた手法を検討した.本研究では,将来的に,オフィスデスク等の上を覆い尽くす大面積のアクチュエータを実現し,それによりデスク上で様々な紙のハンドリングを実現することをめざしている.そうした大面積のアクチュエータを製作する場合,大面積電極を安価に効率良く製作する手法が不可欠である.そこで,スクリーン印刷を用いて半透明なプラスチックシートに3相構造の電極を印刷することで静電アクチュエータを製作する技術を検討した.結果,装置の制約によりA4サイズより小さい程度の面積までしか実現できていないものの,紙の静電誘導搬送が可能な印刷電極を製作することに成功した.また,上記の印刷により製作した電極を市松模様に並べることで,3自由度での紙搬送を実現した.試作したシステムでは,4個の1自由度電極を市松模様に並べ,それぞれに印加する電圧を制御することで,上下左右といった平面2自由度の並進運動に加え,回転運動も可能であることを確認した.将来的には,より多くの電極を並べることで,平面内で様々な運動を実現させることが可能になると期待できる.
心筋プロテイン・キナーゼA感受性フロライド・チャネル電流の調節機構

近年の細胞膜蛋白に対する遺伝子工学的な方法論の著しい発展により多くのイオン選択性を有する多種類のチャネルが存在することが明かとなりつつある。心筋においては臨床不整脈との関連から古くより電気生理学的な手法を用いて検索されてきたが、1980年代半ばから普及したパッチ・クランプ法により個々のイオン・チャネルの活性を直接観察することができるようになり、近年長足の進歩をとげた。ところが、ナトリウムやカルシウム電流が当初より注目を浴び詳しく調べられたのに対し、クロライド電流は、その生理的意義が非常に高いにも関わらず研究が遅れ、プロテイン・キナーゼA(PKA)によって制御されるクロライド電流が発見されたのは1989年であった。本研究課題では、このPKA感受性クロライド電流に注目してブロッカーの側面から、その調節機構について検討した。実験は単離モルモット心室筋細胞をパッチクランプ法に供し、全細胞からのクロライド電流として記録した。裏面の研究発表蘭にもあるように、今回、われわれは世界に先駆けて、このクロライド電流が、エンドセリンにより阻害されることを発見し、そのメカニズムを含めて報告した(Nature,370:297-300)。さらにクロライド電流の活性化の調節機構として膜のGTP結合蛋白のいわゆるbasal activityが重要であることを、クロライド電流のrebound現象から報告した。さらにこの関連で多くの研究がなされた。英文での発表論文に限り、裏面に報告する。
冬眠タンパク発現による肝臓長期保存に関する検討

【研究の目的】新たな臓器保存装置Keep Freshを用いた臓器保存における冬眠タンパクの発現と、臓器移植に対する有用性を解明することである。冬眠タンパク発現の解明のためまず、ラット肝臓グラフトをKeep Fresh内で保存し、冬眠タンパクの発現の有無を確認。さらに様々な保存温度設定のもとで、冬眠タンパクの発現量を比較して最も発現の多い温度設定を導き出す。その後、実際に保存した肝臓を同種移植し移植後の成績について検討する。【研究実施計画】平成25年度:Keep Freshを用いた冬眠タンパク発現の検討ー単純冷却(従来法)と新たな方法との比較ー平成26年度以降:肝移植モデルでの検討【研究実績と展開】1.冷却保存効果の比較:正常ラットの全肝を摘出し、通常の4°C氷上保存とKeep Fresh保存したものの保存状態について検討。それぞれ24時間、48時間、72時間保存し、保存後のグラフトの組織学的変化と冬眠タンパク発現について採取したサンプルを用いて解析する予定である。2.復温過程による加温傷害の比較:通常保存したラット肝臓グラフトとKeep Freshで保存したグラフトを冷却保存後復温し、復温障害について組織学的、冬眠タンパク発現、肝障害の程度について検討する予定である。3.肝移植モデルを用いた検討:通常方法およびKeep Freshで保存したラット肝臓グラフトを用いて同種移植を行い、移植後の生存率、肝機能、組織学的検討を行い、Keep Freshの有用性について検討する予定である。
交互積層新奇ナノハイブリッド型光触媒による可視光応答電荷分離

本研究課題では、異種の金属酸化物層をナノメートルスケールで交互に積層した新奇ナノハイブリッド型光触媒を創出した。具体的には、クリックケミストリーの手法を層状金属酸化物に適用し、層間距離やその層間へ色素分子を導入することにより、可視光応答型の光誘起電荷分離を制御した。光触媒への応用に向け、層状タンタル酸塩、層状ニオブ酸塩に着目し検討を進めた。これらの層状化合物は、その伝導帯電位に違いがあることにより、層間距離だけに依存しない電子移動制御が可能であった。ヘテロ積層体中における紫外光誘起電荷分離を、タングステン酸の伝導帯にたまった電子量を近赤外拡散反射分光法によって定量することで評価した。本研究課題では、異種の金属酸化物層をナノメートルスケールで交互に積層した新奇ナノハイブリッド型光触媒の創出を目的としている。具体的には、クリックケミストリーの手法を層状金属酸化物に適用し、層間距離やその層間へ色素分子を導入することにより、可視光応答型の光誘起電荷分離を制御する。この電荷分離制御を水の完全分解などの光触媒へ応用する。今年度は、酸化チタンナノシートのエッジに白金錯体を修飾し、酸化タングステンナノシートとの交互積層構造を合成し、層間にルテニウム錯体を導入した新奇ナノハイブリッドを創製した。可視光の照射によって酸化タングステンとルテニウム錯体が励起し、酸化タングステンの伝導帯から励起状態ルテニウム錯体の空のHOMOレベルへの電子移動と、励起状態のルテニウム錯体から酸化チタン伝導帯への電子注入が同時に起こり、電荷分離状態となる。この電荷分離プロセスを、近赤外分光法による酸化タングステン伝導帯電子の定量と、ルテニウム錯体の蛍光寿命測定によって詳細に調べた。また、酸化チタンの伝導帯に溜まった電子を白金錯体へ移動させ、水を還元して水素を発生させることに成功した。以上の検討は、太陽光を利用した再生可能なエネルギー製造への礎となるのに加え、新奇ナノ材料創製に向けた新機軸を付与する可能性がある。層状金属酸化物は、誘電性や光触媒活性など興味深い性質を示す化合物として、多様な組成・結晶構造が知られている。今年度は、その中でも、光触媒への応用に向け、層状タンタル酸塩、層状ニオブ酸塩に着目し検討を進めた。これらの層状化合物は、その伝導帯電位に違いがあるため、層間距離だけに依存しない電子移動制御が可能となる。その伝導帯電位の違いによる光誘起電荷分離を確認するため、層状タンタル酸と層状タングステン酸および層状ニオブ酸と層状タングステン酸の交互積層体を新たに合成した。さらに、導電性の高いRuO2ナノシートにプロトン導電性の高い酸化グラフェンを交互積層させると、RuO2と酸化グラフェンの接触面積が増加し、電気化学キャパシタなどの電気化学的応用に適した構造が構築できる予測した。本研究ではクリック反応を利用したRuO2/酸化グラファイト複合ナノシートの合成を目指し、その前段階としてチオール基を修飾したRuO2ナノシートの合成を行った。当初予定していた光触媒水素発生に加え、新規交互積層体の合成に着手している。次年度の計画まで進んでおり、当初計画以上に進展していると判断している。交互積層ナノ構造は、チオール修飾されたニオブ酸塩ナノシートまたはタンタル酸塩ナノシートおよびアルケン修飾されたタングステン酸塩ナノシートとのクリック反応によって合成された。クリック反応によって構築された交互積層ナノ構造の電子構造は、炭素数を変えることによって制御され、交互に積層されたナノ構造の積み重ね距離を変えることによって変更できることを発見した。一方で、交互積層ナノ構造を合成した結果、当初の予想と反し、積層体のバンドギャップ準位が層間に依存していることが明らかとなった。さらにチオール修飾したタンタル酸ナノシートとアルケン修飾したタングステン酸ナノシートのチオール-エンクリック反応により作製された交互積層構造における層間距離に依存して、タンタル酸ナノシートの伝導帯からタングステン酸ナノシートの伝導帯への電子移動を実証した。層間距離は、メチレン鎖数を変化させることによって、0.931.64nmに正確に制御された。電子移動の速度定数の対数は距離と共に直線的に減少することを見出した。当初予定していた光触媒水素発生(現在論文投稿中)に加え、新規交互積層体の合成に成功した。新奇

交互積層体の成果として、酸化タンタルと酸化タングステンの複合体化による光誘起電子移動を検討するとともに、層間距離の違いによる光吸収の影響を調査し、投稿済みである。以上の点から、当初計画以上に進展していると判断している。本研究課題では、異種の金属酸化物層をナノメートルスケールで交互に積層した新奇ナノハイブリッド型光触媒の創出を目的としている。具体的には、クリックケミストリーの手法を層状金属酸化物に適用し、層間距離やその層間へ色素分子を導入することにより、可視光応答型の光誘起電荷分離を制御する。この電荷分離制御を水の完全分解などの光触媒へ応用する。以上の検討は、太陽光を利用した再生可能なエネルギー製造への礎となるのに加え、新奇ナノ材料創製に向けた新機軸を付与する可能性がある。層状金属酸化物は、誘電性や光触媒活性など興味深い性質を示す化合物として、多様な組成・結晶構造が知られている。今年度は、その中でも、光触媒への応用に向け、層状タンタル酸塩、層状ニオブ酸塩に着目し検討を進めた。これらの層状化合物は、その伝導帯電位に違いがあるにより、層間距離だけに依存しない電子移動制御が可能となる。その伝導帯電位の違いによる光誘起電荷分離を確認するため、層状タンタル酸と層状タングステン酸および層状ニオブ酸と層状タングステン酸の交互積層体を新たに合成した。ヘテロ積層体中における紫外光誘起電荷分離を、タングステン酸の伝導帯にたまった電子量を近赤外拡散反射分光法によって定量することで評価した。光電荷分離はナノシートの積層間隔が広いほど起こりづらいことがわかる。したがって、積層間隔が広いほど、チタン酸もしくはタンタル酸の伝導帯からタングステン酸の伝導帯への電子移動が遅い。ヘテロ積層体の層間にRu(bpy)32+を導入し、Pt(terpy)を修飾したところ、可視光照射下において水の還元反応に対する光触媒能を発現した。本研究課題では、異種の金属酸化物層をナノメートルスケールで交互に積層した新奇ナノハイブリッド型光触媒を創出した。具体的には、クリックケミストリーの手法を層状金属酸化物に適用し、層間距離やその層間へ色素分子を導入することにより、可視光応答型の光誘起電荷分離を制御した。光触媒への応用に向け、層状タンタル酸塩、層状ニオブ酸塩に着目し検討を進めた。これらの層状化合物は、その伝導帯電位に違いがあることにより、層間距離だけに依存しない電子移動制御が可能であった。当初予定していたナノハイブリッドの創製に加え、次年度に予定している光触媒反応について、初期検討ではあるが進められている。次年度の計画にまで進められていることから、当初の計画以上に進展していると判断できる。本年度では、ヘテロ積層半導体と有機金属錯体との複合化により、二酸化炭素還元触媒へ応用する。二酸化炭素を効率よく有用な化合物に変換するために、二酸化炭素および還元エネルギーが迅速に供給できる反応場と精緻に設計された金属錯体活性中心を融合させた革新ナノ材料を提供する。層間に有機金属錯体をインターカレーションさせた後、二酸化炭素を吸着させ、層間内に二酸化炭素を濃縮させる。そこで濃縮された二酸化炭素が、超臨界状態の二酸化炭素と同様に、有機金属錯体と接触することで、二酸化炭素の還元反応が効果的に進行すると予測し、検討する。
酵素学的アプローチによる難分解性有機廃棄物のバイオリサイクル支援

新規な耐熱性コラーゲン分解酵素の生産菌の分類学的位置づけを明らかにし,本菌が,Alicyclobacillus属の新種であるものと結論した.本菌の培養液上清から、各種のカラムクロマトグラフィーにより分子量約46kDaの単量体の耐熱性コラーゲン分解酵素を均一状態に精製した.この酵素は、コラーゲンやゼラチン(コラーゲンの熱変性物)に高い特異性を示し、また反応の至適pHは酸性領域(pH3.9)にあった。亜鉛依存性のコラゲナーゼの反応最適pHは7-9にあり、また本酵素がEDTAなどのキレート剤で阻害されないことを考慮すると、本酵素はコラーゲンに高い特異性をもつ酸性プロテアーゼの一種であると考えられた。しかしながら本酵素は、酸性プロテアーゼの特異的阻害剤であるペプスタチンやジアゾアセチル-DL-ノルロイシンメチルエステルによって阻害されなかった。本酵素は高い耐熱性をもち、市販されているコラゲナーゼはどれも熱に不安定であるのに対して、本酵素は60°C,pH4.0で4時間の熱処理後も80%の残存活性を保持していた。この耐熱性コラーゲン分解酵素の部分アミノ酸配列を決定し,この配列情報をもとに本菌のゲノムDNAから本酵素遺伝子の一部をPCRで増幅し,コロニーハイブリダイゼーションによって目的遺伝子を単離した.本酵素の推定アミノ酸配列は,近年報告されている数種のペプスタチン非感受性酸性プロテアーゼのアミノ酸配列と相同性を示した.触媒残基と推定されるアミノ酸残基周辺の配列EXXLDならびにGTSは,本コラーゲン分解酵素についても保存されていた.よって本酵素もこれらと同様のファミリーに属すると考えられた.また,難分解性有機質のひとつである脂質を低温で分解しうる酵素生産菌,Acinetobactersp.No.6株を分離し,その脂質分解活性について解析した.コラーゲンは一般のプロテアーゼでは分解されにくく、その分解にはコラーゲンに特異性の高い特殊なプロテアーゼ(コラゲナーゼ)を必要とする。コラゲナーゼは一般に亜鉛依存性で熱に不安定なため、高温酸性条件下で進行するコンポスト化を支援する触媒としては不適当であった。そこでコンポスト化の高温環境下で長期間にわたって十分な活性を保ちうる耐熱性コラゲナーゼを自然界から幅広く探索した。その結果、コラーゲン分解活性の高い耐熱性プロテアーゼを生産する好熱性細菌NTAP-1株を得た.この菌は運動性を有し,芽胞を形成する好熱好気性桿菌であった。生化学的な特徴はBacillus属細菌とよく合致し、至適生育温度が6070°C、至適生育pHが45という好熱好酸性の菌であった。この菌の培養液上清から、各種のカラムクロマトグラフィーにより分子量約46kDaの単量体の耐熱性コラーゲン分解酵素を均一状態に精製した.この酵素は、コラーゲンやゼラチン(コラーゲンの熱変性物)に高い特異性を示し、また反応の至適pHは酸性領域(pH3.9)にあった。最近これらの阻害剤の影響を受けない酸性プロテアーゼの一群、ペプスタチン非感受性プロテアーゼが報告されており、本酵素もこのグループに属するものと推測している。この耐熱性コラーゲン分解酵素の部分アミノ酸配列を決定し,この配列情報をもとに本菌のゲノムDNAから本酵素遺伝子の一部をPCRで増幅し,コロニーハイブリダイゼーションによって目的遺伝子を単離した.本酵素の推定アミノ酸配列は,近年報告されている数種のペプスタチン非感受性酸性プロテアーゼのアミノ酸配列と相同性を示した.

触媒残基と推定されるアミノ酸残基周辺の配列EXXLDならびにGTSは,本コラーゲン分解酵素についても保存されていた.よって本酵素もこれらと同様のファミリーに属すると考えられた.また,難分解性有機質のひとつである脂質を低温で分解しうる酵素生産菌,Acinetobactersp.No.6株を分離し,その脂質分解活性について解析した.新規な耐熱性コラーゲン分解酵素の生産菌の分類学的位置づけを明らかにし,本菌が,Alicyclobacillus属の新種であるものと結論した.この耐熱性コラーゲン分解酵素の部分アミノ酸配列を決定し,この配列情報をもとに本菌のゲノムDNAから本酵素遺伝子の一部をPCRで増幅し,コロニーハイブリダイゼーションによって目的遺伝子を単離した.本酵素の推定アミノ酸配列は,近年報告されている数種のペプスタチン非感受性酸性プロテアーゼのアミノ酸配列と相同性を示した.これらの酵素は,昨年新しいタイプのセリンプロテアーゼであることが明らかにされたものであり,通常のセリンプロテアーゼが形成する触媒トライアード(His,Asp,Ser)とは異なり、これに対応する位置にGlu,Asp,Serが存在している.触媒残基と推定されるアミノ酸残基周辺の配列EXXLDならびにGTSは,本コラーゲン分解酵素についても保存されていた.よって本酵素もこれらと同様のファミリーに属すると考えられる.本酵素はコラーゲンに対して高い特異性を示し,本酵素処理によるコラーゲンの分解生成物は低分子のペプチド断片であった.また,生成した数種のペプチド断片のアミノ酸配列を解析した結果,N末端(P1'位)は全てGlyであることが分かった.これは本酵素が,コラーゲン分子に多数出現する特有の繰り返し配列(Gly-Xaa-Yaa)を認識することを示唆しているが,代表的なコラーゲン分解酵素の合成基質であるSuc-GPLGP-MCAは分解しない.そこで得られた数種の分解ペプチドのアミノ酸配列からコラーゲンの切断部位を特定し,その周辺のアミノ酸配列を基に合成ペプチドを作製して,本酵素を作用させた.現在までに2種のペプチド,FGPA-GPIG,DGVR-GLYGについて切断することを確認した(-部分で切断).
多元メディアによる遠隔日本語学習支援システムの研究

本研究の目的は,スクーリングなどのない完全な遠隔環境での日本語学習において,有効に機能する日本語学習支援システムの条件を明確にすることにある。遠隔環境での学習の場合,特に,学習動機・学習意欲の保持を支援する方策に工夫の力点を置く必要があり,本研究では,モノメディアからマルチメディアまでの多元メディアをどのように配置・利用するかを通して,有効な支援方策を求めようとしている。インターネット上には,日本語学習機会を提供するさまざまなサイトや教材が数多く存在するが,独力で日本語を学ぼうとする場合,自由にアクセスできる良質の教材は,まだ充分とは言いがたい。そこで,16年度には,どのレベルの学習者にとっても必要性のある発音学習モジュールのプロトタイプ開発を行い,初級の自己紹介教材に盛り込んでみた。学習者からはよい評価を得たが,新たに遠隔環境を意識して教材開発を行うのであれば,量的・質的にまだ貧しい,初級以降の,使用目的を絞った教材のほうが社会的貢献になると考え,17年度は,世界的な学習者こニーズも踏まえて,ビジネス場面を意識しながら,初級・中級・上級に対応するロールプレイ練習教材を開発した。この教材は,ウェブ上に置かれたビデオ映像を利用してロールプレイ練習を行うものである。とかく受身になりがちな遠隔日本語学習の機会を少しでも双方向的にするべく,ロールプレイの途中で学習者に2つの選択肢のどちらを選ぶかを尋ねる質問を組み込み,コースウェアに若干の双方向性を持たせた。初級者向けの学校環境での依頼の会話から,語彙も表現もビジネスに特化した中級後半から上級向けの交渉場面まで,難易度の異なるロールプレイをそろえ,花粉症をめぐる現代日本の文化情報も盛り込んだ。学習者の選択によって会話の流れが変化する本教材は,遠隔学習環境において,現実場面に近い練習機会を提供するものと言える。遠隔学習システム開発班では,どのレベルの学習者にとっても必要性のある発音学習モジュールの開発を行った。対面授業のない遠隔環境では,モデル音声を聞くことがはとんど唯一の学習の手立てになりがちであるが,耳からの情報だけで,十分に学べる学習者はそれほど多くない。そこで,男女1名ずつのモデル発話者の口元のクローズアップ映像を作成し,自然な速度とスローテンポの2つのモードを用意した。口元映像は,学習者が赤青眼鏡をかけて視聴すると,立体的に見えるように作成した。パイロット版には,異音が多く発音指導が必要な「ん」を取り上げ,たとえば「本を」の「ん」は「本の」の「ん」とは異なり,歯茎が調音点ではないことを視覚的にはっきり提示し,学習者・教授者から肯定的な評価を得た。日本語コース開発班では,ゼロスターターを対象に挨拶と自己紹介の課を作成した。学習への参加意識を高めるために授業場面のビデオクリップをコースウェアに組み込んだところ,よい評価を得ることができ,授業場面の視聴が動機や興味の維持機能を持つ可能性があることがわかった。全体として,1課の作成に必要なリソースの量が増大し経費が多くかかることが判明したため,世界的な学習者ニーズを踏まえ,ゼロから4級までという目標設定を変更し,ビジネス対応のコースに転換することにした。

遠隔環境での学習の場合,特に,学習動機・学習意欲の保持を支援する方策に工夫の力点を置く必要があり,本研究では,モノメディアからマルチメディアまでの多元メディアをどのように配置・利用するかを通して,有効な支援方策を求めようとしている。インターネット上には,日本語学習機会を提供するさまざまなサイトや教材が数多く存在するが,独力で日本語を学ぼうとする場合,自由にアクセスできる良質の教材は,まだ充分とは言いがたい。そこで,今年度は,このような制約を越える環境を目指し,かつ,世界的な学習者ニーズを踏まえて,特に,ビジネス場面を意識しながら,ウェブ上に置かれたビデオ映像を利用して行うロールプレイ練習を作成した。初級者向けの学校環境での依頼の会話から,語彙も表現もビジネス場面に特化した中級後半から上級向けの練習まで,難易度の異なるロールプレイをそろえただけでなく,花粉症をめぐる文化情報も盛り込んだ。本教材の特徴は,教材のタイトル「どうしますか。Make a Choice!」が示すように,とかく一方的になりがちな遠隔日本語学習の機会を少しでも双方向的にするべく,コースウェアに若干のインタラクティブ性を持たせた点にある。具体的には,ロールプレイの途中で学習者に2つの選択肢のどちらを選ぶかを尋ねる質問が表示され,学習者の選択にしたがって,会話の流れが変化する。同じ価格交渉の場面でも,相手の提案を呑むか断るかによって,その後の会話の展開が異なってくるので,臨機応変な対応のできる教師という生身の存在のない遠隔学習環境においては,わずかながらも,現実場面に近いコミュニケーションの機会を提供するものと言える。
胚細胞に特異的な細胞分裂機構の解析

アフリカツメガエルの戻し交配により得られた母系効果突然変異(af)雌が産む卵(af卵)では、卵割溝の収縮が阻害されているために細胞質分裂は起こらない。この突然変異を利用して、胚細胞に特異的な細胞質分裂機構の一端を明らかにすることが本研究の目的である。本研究により以下の成果が得られた。1.af卵細胞質中には野生型卵細胞質中に存在する、分子量78kDa、等電点7.6の蛋白が欠損している。二次元電気泳動ゲル上の78kDaのスポット100個分を集めて濃縮後、アミノ酸自動分析器でN末端の20のアミノ酸配列を調べたところ、相同な配列は既知の蛋白にはなく、この蛋白は新しい種類の蛋白であることがわかった。2.この蛋白に対するモノクローナル抗体を作製し、これを用いて卵構成蛋白のWestern blottingを行った。この抗体はaf卵では、78kDa付近の一本のバンドとしか反応しなかったが、野生型卵では、二本のバンドと反応するものと三本のバンドと反応するものが存在した。この蛋白の卵割溝収縮との直接的関係はまだ証明できていない。3.78kDa付近に分子量をもち、卵割に関係することが知られている、ezrin、radixin、およびmoesinは、78kDa蛋白とは別のものであることがWestern blottingにより明らかになった。4.小麦胚芽レクチンで処理した野生型卵は、af卵と極めてよく似た形態を呈したので、小麦胚芽レクチン結合蛋白の野生型卵とaf卵での違いを調べたところ、af卵では205kDaの蛋白が欠損しており、34kDa付近の蛋白にも差が見られた。今後、これらの蛋白についても解析する予定である。卵割と極体形成時の分裂溝の収縮が阻害されているために、細胞質分裂ができない卵を産む母系効果突然変異(af)のアフリカツメガエル雌を戻し交配により分離した(1991)ので、これを用いて細胞質分裂機構の研究を行った。af卵細胞質中には野生型に存在する、分子量78kDa、等電点7.6の蛋白が欠損している(胚細胞に特異的な分裂溝収縮蛋白。以下、af蛋白と略す。)。このaf蛋白の細胞質分裂における役割を明らかにすることにより、細胞質分裂の分子機構の一端を知ることが本研究の目的である。本年度の研究により以下の成果が得られた。1.野生型卵細胞質を種々の方法で分画し、af卵に顕微注入することでaf卵の分裂溝を収縮させる活性を調べると、活性はCa^<2+>、Mg^<2+>等の二価の陽イオンの有無に拘わらず安定であった。硫安沈澱では40-70%飽和の分画に活性が存在し、ゲル濾過を行うと70-80kDおよび150kDに相当する分画に活性が認められた。2.二次元電気泳動ゲル上の78kDのスポット100個分を集めて抗原としポリクローナル抗体を作成し、SDS-PAGEのWestern blottingを行うと、抗体は野生型卵細胞質では78kD付近の二本、af卵細胞質では一本と反応した。これは、野生型には抗原性が似ている二種類の蛋白が存在し、afではこの内の一つが欠損していることを意味する。3.二次元電気泳動ゲル上の78kDのスポット100個分を集めて濃縮後、アミノ酸自動分析器でN末端のアミノ酸配列を調べた。得られた20のアミノ酸配列と相同な配列は既知の蛋白には存在しないので、af蛋白は全く新しい種類の蛋白であることがわかった。

以上を踏まえて、af蛋白の更なる精製、af蛋白に対するモノクローナル抗体の作製、cDNAライブラリーからのaf遺伝子の単離を、残りの一年間で行う予定である。アフリカツメガエルの戻し交配により得られた母系効果突然変異(af)雌が産む卵(af卵)では、卵割溝の収縮が阻害されているめに、細胞質分裂は起こらない。この突然変異を利用して、胚細胞に特異的な細胞分裂機構の一端を明らかにすることが本研究の目的である。本年度の研究により以下の成果が得られた。1.af卵細胞質中には野生型卵細胞質中に存在する、分子量78kDa、等電点7.6の蛋白が欠損している。本研究ではこの蛋白に対するモノクローナル抗体を作製し、これを用いて卵細胞質構成蛋白のWestern blottingを行った。この抗体は、af卵細胞質中では78kDa付近の一本のバンドとしか反応しなかったが、野生型卵細胞質中では二本のバンドと反応するものと三本のバンドと反応するものが存在した。発生段階特異性や組織特異性は見られなかった。この蛋白の卵割溝収縮との直接的関係はまだ証明できていない。2.アクチンを細胞膜につなぎとめる役割を持っている、ezrin、radixin、およびmoesinは78kDa付近に分子量を持ち、卵割に関係することが知られているが、これらの蛋白は野生型とaf卵細胞質では違う分布を示したが、78kDa蛋白とは別のものであることがWestern blottingにより明らかになった。3.小麦胚芽レクチンで処理した野生型卵は、卵割溝が現れるが収縮できずaf卵と極めてよく似た形態を呈したので、この結合蛋白の野生型とaf卵細胞質での分布の違いを調べたところ、af卵では205kDaの蛋白が欠損しており、34kDa付近の蛋白にも差が見られた。今後、これらの蛋白についても解析する予定である。
唾液分泌神経におけるインパルス形成機構の解析

唾液腺を支配する分泌神経のインパルス形成機構を解析するため、ラットの脳幹部スライス標本を用いて電気生理学的に上唾液核と最後野の神経活動を分析した。これに並行して胃や食道の自律反応も分析して唾液腺活動と比較検討し、以下の研究成果を得た。1.ホールセルパッチクランプ法が適用しやすい幼若ラットを使用した。上唾液核細胞は唾液腺だけでなく舌の動脈にも分泌しているため、両者について比較した。その結果、唾液腺支配と舌支配の上唾液核細胞は延髄外側網様体に混在しており明確な局在は認められなかった。樹状突起を35本有する2030ミクロン程度の細胞であったが、樹状突起の長さは唾液腺支配のもの(200800ミクロン)が舌支配のもの(100500ミクロン)よりも長く、腹背側方向に伸びていた。2.細胞体から400ミクロン程度の距離で電気刺激を行うと、安定したシナプス後電流が記録された。この電流はグルタミン酸受容体、GABA_A受容体、グリシン受容体の拮抗薬で消失したため、興奮性シナプス入力はNMDA、non-NMDA受容体を介し、抑制性シナプス入力はGABA_A、グリシン受容体を介することが分かった。3.唾液腺支配細胞のシナプス後電流は、non-NMDAよりもNMDA受容体を介する成分が多く、グリシンよりGABA_A受容体介する成分が多かった。さらに唾液腺支配の神経は舌支配の神経よりも低頻度で興奮した。4.最後野の神経はリズミカルに興奮する性質(H電流)も有しており、ここから上唾液核への入力がリズム形成に関与する可能性が示唆された。5.嘔吐・悪心を誘発すると胃や食道運動と関連して唾液分泌の変調が認められた。以上の結果より、唾液分泌神経が上位中枢や脳幹部から広範囲に興奮と抑制の入力を受けていること、インパルス発射頻度は比較的低頻度であることが判明した。唾液腺を支配する分泌神経のインパルス形成機構を脳スライス標本を用いて、電気生理学的に解析した。とくに分泌量を司る副交感神経の中枢について、以下の研究実績を得た。1.実験にはホールセルパッチクランプ法が適用しやすい幼若ラットを使用した。顎下神経節に蛍光色素を注入して顎下腺支配の副交感神経(上唾液核細胞)を標識した。脳スライス標本を作成後、蛍光顕微鏡下で標識した細胞を確認しホールセルパツチクランプを行い細胞内通電による生物物理的膜特性を解析した。2.シナプス入力を解析する前段階として樹状突起の形態を観察した。記録電極を介したニューロバイオサイチンによる生体染色の結果、樹状突起は3-5本認められ100-800ミクロンの長さであった。樹状突起の形態は背腹側に長いものと放射状のものが認められた。3.細胞体から400ミクロン程度の距離で電気刺激を行うと、細胞体から安定したシナプス電流が記録された。この電流はグルタミン酸受容体とGABA受容体の阻害薬を投与すると完全に消失した。4.さらに興奮性シナプス後電流は、NMDA型とnon-NMDA型のグルタミン酸受容体を介する電流で構成されることが分かった。また抑制性シナプス後電流は、GABAAへとglycine受容体を介する電流で構成されていた。なお、樹状突起の形態(背腹側型と放射状型)とシナプス電流との間に差異は認められなかった。上記の成果を基に、15年度はインパルスの発射様式を分析する予定である。

当初の研究計画はおおむね達成することができた。唾液腺を支配する分泌神経のインパルス形成機構をラットの脳スライス標本を用いて、電気生理学的に解析した。とくに顎下腺の分泌量を司る副交感神経の中枢(上唾液核)について、以下の研究実績を得た。1.神経解剖学的特徴:ホールセルパッチクランプ法が適用しやすい幼若ラット(生後814日)を使用した。上唾液核細胞は唾液腺だけでなく舌の動脈に分泌しているため、両者について比較検討した。その結果、唾液腺支配と舌支配の上唾液核細胞は延髄外側網様体に混在しており明確な局在は認められなかった。樹状突起を35本有する2030ミクロン程度の細胞であったが、樹状突起の長さは唾液腺支配神経のもの(200800ミクロン>が舌支配神経のもの(100500ミクロン)よりも長く、腹背側方向に伸びていた。2.電気生理学的特徴:(1)細胞体から400ミクロン程度の距離で電気刺激を行うと、細胞体から安定したシナプス後電流が記録された。この電流はグルタミン酸受容体、GABA_A受容体、グリシン受容体の拮抗薬で消失したため、上唾液核細胞の興奮性シナプス入力はNMDA、non-NMDA受容体を介し、抑制性シナプス入力はGABA_A、グリシン受容体を介することが分かった。(2)唾液腺支配細胞のシナプス後電流は、non-NMDAよりもNMDA受容体を介する成分が多く、グリシンよりGABA_A受容体介する成分が多かった。さらに唾液腺支配の神経は舌支配の神経よりも低頻度で興奮した。(3)上唾液核細胞の中にはGABA_B受容体を介するシナプス前抑制が認められた。以上の成果は順次欧文誌に投稿しており、一部はすでに掲載された。
良質な教員採用試験(英語専門筆記)の研究開発及びその波及効果について

良質な英語専門筆記試験の研究開発には英語教員の知識・能力指標の構築が最重要課題である。韓国の採用試験は全国統一試験として国が実施内容を詳細に規定する。専門筆記試験もまた英語教員資格・能力基準や評価内容・方法等の指針に基づいて実施される。日本の教員採用試験ではまずそのような基準や評価についての基本合意が必要である。その上で、採用試験各段階の役割を明確にし、専門筆記試験では教授法、テスト・評価、教材分析・開発などの授業に関連した教科専門知識や応用力を問うべきである。優秀な英語教員を確保するためには、何よりも養成・採用・研修各段階の総合的な充実を図ることが喫緊の課題となる。とりわけ、教員採用試験のあり方は、教員志望者や教員養成課程の内容に大きな影響を与えるものであり、その改善は極めて重要だと考える。また、採用試験そのものは、教壇に立つ者の資質を選定する手段であり、その妥当性の検証は不可欠である。本研究は、日韓の比較に立って、包括的な試験制度のあり方について検討を加えつつ、とりわけ1次英語専門筆記試験に焦点化して、優秀な英語教員を担保するための良質な教員採用試験(英語専門筆記)の研究開発及び波及効果について探求することを目的とする。また、研究過程で問題になった英語教員に求められる資質能力とは何かについても併せて中心課題として考察を加える。(研究活動)本年度は日韓の教員採用試験に関する一般的情報収集及びその分析を行い、さらに日韓で実施するアンケート内容を最終的に確定した。その中で、これまでのパイロット・スタディとして行ったアンケート調査の再分析を行う中で、英語教員に求められる能力及び筆記試験での測定方法について深く検討する必要があった。詳細は以下の通りである。課題(1)全国英語教員採用に関わる改善状況等についての資料・情報収集及び分析課題(2)教員養成に関わる国内外の研究論文及び関連図書の収集課題(3)日韓の全国教員採用試験問題(英語)の収集及び観点別分析過去数年分の日韓教員採用試験問題を収集し、現在日韓それぞれを分析中。次年度に論文としてまとめる予定。課題(4)韓国の英語教員養成・採用システムの開発・改善等に関する現地調査韓国で情報収集を行う。特に現地韓国教員大学キム教授・ミン教授から研究協力者としての承諾を得る。ソウル教育庁、京畿大学、ソウル教員研修所からもアンケート実施に係わる協力を得られる。課題(5)日本の中・高等学校教員採用試験(英語)の妥当性及び波及効果に関して、現職中高英語教員を対象にした調査当初は日本に限定するものであったが、日韓比較調査が必要との結論に達し、日韓両方の現職教員を対象にアンケートを実施することとした。これに伴い、まず韓国版アンケートを最終確定した。平成19年5月下旬実施予定。またほぼ同時並行で日本版を作成中。(学会発表)2006年6月25日:第36回中部地区英語教育学会和歌山大会シンポジューム(於和歌山大学教育学部)発表者:脇田「英語教員に求められる能力とは何か-日韓英語教員採用試験に関する意識調査からの示唆-」本年度は、研究2年目に当たり、昨年度確定したアンケートの内容を踏まえて、以下のような研究調査を行い、一定の成果を挙げた。課題(1)全国英語教員採用に関わる改善状況等についての資料・情報収集及び分析課題(2)教員養成に関わる国内外の研究論文及び関連図書の収集:英語教員の養成や求められる能力理論に関する最新の論文を収集することができた。課題(3)日韓の全国教員採用試験問題(英語)の収集及び観点別分析:過去5年間の韓国教員採用試験問題を収集し、分析結果を論文としてまとめ、現在、投稿中。課題(4)韓国の英語教員養成・採用システムの開発・改善等に関する現地調査:韓国から韓国教員大学キム教授を招聰し、今後の研究内容や採用試験等に関する情報交換を行うと同時に、学内で韓国の英語教育政策等に関する講演をいただいた。課題(5)日本の中・高等学校教員採用試験(英語)の妥当性及び波及効果に関する現職中高英語教員を対象にした調査:韓国(韓国教育大学、啓明大学、ソウル教育庁、京畿大学、ソウル教員研修所等)を訪問しアンケートを依頼し、中学校・高等学校の英語教員約270名の協力を得た。データは翻訳をし、入力の上、現在分析中。一方、日本では、近畿地区の中学校・高等学校約1300校にアンケートを依頼し、約220を回収。現在データ入力をして、データ分析中。これらの結果については、6月下旬の香港でのALA学会、8月上旬のAsia TEFL学会で発表するとともに、論文としてまとめる予定。本年度は、研究3年目に当たり、以下のような研究調査を行い、一定の成果を挙げた。課題(1)全国英語教員採用に関わる改善状況等についての資料・情報収集及び分析課題(2)教員養成に関わる国内外の研究論文及び関連図書の収集:英語教員の養成や求められる能力理論に関する最新の論文を収集。課題

(3)韓国の教員採用試験制度の問題点及び新たな方向性についてまとめ、それを踏まえて5年分の韓国教員採用試験問題(英語)分析結果を行い、論文として明らかにした。併せて研究発表を行った。課題(4)韓国の新教員採用試験制度及び英語教員に求められる資質・能力基準についての研究報告。韓国教育評価院(KICE)から最新情報を入手。本年度から3段階の新採用試験制度が始まり、その際に英語教員に求められる資質能力基準、評価基準等の開発研究が行われた。韓国教育大学キム・ジュンリョル教授等の協力を得る。現在論文として投稿中。課題(5)日本の教員採用試験に関する分析。京都府総合教育センター研究主事等の協力を得て、論文としてまとめている途中である。課題(6)昨年度、中・高等学校教員採用試験(英語)の妥当性及び波及効果に関する調査を、韓国と日本の中・高英語教員に実施し、約500のサンプルを得て、データ整理・分析を行ってきた。この結果について、2008年6月下旬の香港でのALA学会、8月上旬のAsia TEFL学会で発表を行った。現在クライテリア等について見直し、再度分析を行っている。良質な英語専門筆記試験の研究開発のためには、同試験が採用試験全体の中でどのような機能を果たすのか、どのような能力を評価するのかを明確にする必要がある。このために、本研究の最終段階として、中・高等学校教員採用試験(英語)の妥当性及び波及効果に関する意識調査を日韓中・高英語教員を対象に実施した。本調査の前半は、現行の日韓教員採用試験各段階の現状と問題点を明らかにすること、後半は、5つの試験問題を使用して具体的な英語専門筆記試験も問題開発を行うことを目的とする。本年度は、まず前半部分に関わって、以下の成果と示唆を得た。(1)優秀な人材を確保するには、筆記試験だけでは不十分であり、それを補完するために、多元的な実技試験を実施することは妥当である。(2)英語教員の一般英語力の評価については、より試験として信頼性の高い標準テスト(TOEFL・TOEICなど)を積極的に活用する。(3)1次英語専門筆記試験では、英語力に偏った現行のような試験ではなく、英語教員に求められる専門的能力をより重視する。(4)1次英語専門筆記試験で最も改善すべき点は、英語教員が備えておくべき最低限の専門的知識や能力、特に外国語教授法、テスト・評価、教材分析・開発などについての理解と応用力を評価することが重要である。(5)1次英語専門筆記試験においては、教科専門試験としての内容的妥当性を一層高めるためには、テスト内容の構成概念として何が最低限必要なのか合意し、英語教員に求められる資質能力のガイドラインを策定する。その上で各都道府県市教育委員会が独自に有効な評価内容・方法・基準を決定することが重要である。なお、良質な英語筆記専門試験問題モデルの研究開発に関わって、現在、同調査の後半部分を分析・考察中であり、その成果は追って明らかにする。
In-Cell NMRによる生きた細胞への薬物輸送のリアルタイム定量解析

1.すでに本研究課題の実施によって、NMRによるリアルタイム定量解析の方法論を、アルツハイマー病関連のアミロイドβの研究に展開可能であることを見出した。そこで、平成30年度は、「アミロイドβを対象としたNMRリアルタイム定量解析」を前年度に引き続いて行った。まず、「アミロイドβ内のアミノ酸の異性化反応」をリアルタイムで計測した。異性化が起こりやすいアスパラギン酸(Asp)、グルタミン酸の自発的な異性化反応を、それぞれ同時に計測可能であることを明らかにするとともに、速度論解析の結果、(1)アミロイドβ中に含まれる3つのアスパラギン酸(Asp1, Asp7, Asp23)で異性化の速さが異なること、(2)グルタミン酸の異性化は、通常はAspよりも起こりにくいこと、(3)Aspの異性化は、それぞれ特定のヒスチジン残基によって抑えられていることが明らかとなった。(3)は、アミロイドーシス(線維化)を加速する可能性が示唆されるAspの異性化に対して、これを制御するヒスチジンの役割を明らかにしたものであり、アルツハイマー病など疾患のメカニズム解明と予防に向けた新たな知見として注目される。以上の成果は国内の学会で発表するとともに、論文として取りまとめ、国際誌に投稿した。また、この夏の国際会議で発表する予定である。2.さらに、「アミロイドβの凝集過程のNMRリアルタイム計測」を前年度に引き続き行った。アミロイドβの野生型と2種の変異体を用いて、NMRシグナルの変化から、ペプチドの凝集・線維化のメカニズム、特に、線維化を引き起こす引き金となる初期の凝集過程の相違に焦点を当てたメカニズム研究へと展開した。成果はすでに取りまとめて国内の学会で発表を行っており、この夏の国際会議で招待講演を行うことも決定している。また、論文を国際誌に投稿予定である。1.平成27年度は、薬物として、フッ素原子を含む抗がん剤を用いて、NMRによる生きた細胞への輸送解析を行った。ヒト白血病細胞株への輸送過程を分単位の時間分解でリアルタイム計測し、細胞への結合量、結合・解離速度、透過速度を決定した。2.ポリペプチドの輸送解析を行うにあたり、ペプチドの特定の部位でアミノ酸が異性化すること、特定のペプチド結合が切断されること、さらに、このプロセスをNMRでリアルタイム計測可能であることを見出した。たとえば、水晶体タンパク質αAクリスタリン、αBクリスタリンの模擬ペプチドでは、ともに、アスパラギン酸のC側で選択的にペプチド結合が加水分解される。このようなペプチド結合の分解切断は、酵素によることなく自発的に起こる反応であるが、天然型のL-α-アスパラギン酸がD-β-型に異性化すると反応が起こりにくくなることを、NMRリアルタイム計測に基づく速度論的解析によって、定量的に明らかにした。クリスタリン中では、L-α-アスパラギン酸が加齢とともに徐々に異性化し、最終的に異常なD-β-型が蓄積することが見出されているが、今回の結果は、ペプチド結合の切断が抑えられることで、異常なD-β-アスパラギン酸の蓄積を促進することを示唆する点で重要な知見であると考えられる。以上の成果は、2016年2月15日発行のScientific Reports電子版に掲載された。ポリペプチドについて、特定の部位でアミノ酸が異性化したり、ペプチド結合が切断することを見出した。そこで、その詳細について、リアルタイム計測に基づく速度論的検討を行った。そのため、当初予定していた細胞への透過過程の計測および速度論解析を進めることができなかった。平成28年度は、薬物として、親水性でありながら、疎水性の細胞膜を透過する機能性の膜透過ペプチド・オクタアルギニンについて、ヒト白血病細胞株への輸送過程を、in-cell NMRにより分単位でリアルタイム計測した。温度を変化させることで、エンドサイトーシスによる輸送と膜輸送タンパク質が関与しないエネルギー非依存的な物理的膜透過を識別することに成功した。また、物理的膜透過がどのようなプロセスを経て進行するのか、そのメカニズムについて検討した。ペプチドを細胞に添加すると、NMRシグナルが経時的に変化し、フリーの成分の他に新たに3種のコンポーネントが現れることを確認することができた。各コンポーネントの帰属は、それぞれ対応するモデル系についてのNMR計測と熱測定(Isothermal Titration Calorimetry)および細胞分画により確認した。NMRシグナルの分割を行い、各コンポーネントの強度を算出することで、それぞれの状態におけるペプチド濃度の推移を定量化した。その結果、正電荷を有するオクタアルギニンが、まず、(1)負に帯電した細胞表面のグリコサミノグリカンと静電相互作用した後、(2)疎水性の細胞膜を透過し、(3)細胞内のサイトゾルに入ることを、in situで明らかにすることができた。今回の結果は、エンドサイトーシスによらない物理的膜透過の進行の様子を、生きたままの状態でリアルタイムで捉えた点において画期的であると考えられる。以上の成果は、取りまとめて論文に投稿した。ペプチドをNMRで観測するためにフッ素標識を用いるが、年度内にNMR装置のフッ素観測の感度が不良となり、観測不能の状態が一定期間継続した。1.前年度末に、細胞膜を透過するペプチド・オクタアルギニンについて、ヒト白血病細胞株への輸送の過程をin-cell NMRでリアルタイム計測した。