hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ビジネスに潜む社会的ジレンマとしての産業廃棄物ゲームとその教育評価―ディプリーフィング効果に着目して―

高等学校の現場で行われている環境問題は主として知識で理解させる教育が行われてきた。例えば、地球温暖化の原因の一つとして考えられている社会的ジレンマなど社会の仕組みの中にある複雑な構造の問題を自分の頭でしっかりと考えることができる教育がなされていない。こうした問題を解決する教育手法の一つとしてゲーミングがある。大学生を対象とした広瀬らの研究(2004)で教育効果は実証されている。そして、私は今まで仮想体験型のゲーミングによる環境教育と知識提供型のビデオによる環境教育と教育効果を比較し、教育効果(ゲーミングは教育効果が持続する)に違いがあるという研究を行った(大竹・広瀬, 2005)。また、ゲーミング後にディブリーフィングを行うことで、ゲーミングのみの環境教育と比べて教育効果(ディブリーフィングをすることで教育直後から教育効果がある)に違いがあるという研究を行った(大竹・広瀬, 2005)。さらに、ゲーミング後にディブリーフィングを行うことで、ゲーミングのみの環境教育と比べて教育効果(ディブリーフィングをすることで教育直後か、教育効果がある)に違いがあるのかを研究した(大竹・広瀬, 2007)。今回の研究でディブリーフィングは、ディスカッションする過程で、自分だけの経験だけでなく、他の人との協働で体験したことを共有し、ゲーミングで経験したこともグループ全体で客観視できるようになる有効な教育手法であることが分かった。加えて、高校生においては、教育直後は、ゲーミングによる仮想体験での罪悪感(自分の利益を優先してしまった仮想体験)が一時的に教育効果を妨げる要因になった。しかし、時の経過(本研究では3ヶ月後)によって環境問題を自分のこととして認識できるようになるという教育効果がみられたのである。
韓半島系土器の受容実態からみた古墳時代対外交流の時期的地域的展開

本研究の目的は、2000年代以降、豊富な発掘調査事例と研究の増加によって、再構築が必要となった古墳時代対外交流について、韓半島系土器の受容過程を実証し、その時期的・地域的展開から背後にある日韓交流の質的変化を探ることである。研究成果として、古墳時代対外交流を「物資入手型」と「技術(文化)導入型」にモデル化し、2つの対外交流戦略が前者から後者に移行する過程を考古資料に基づいて論じ、日韓交流の変化と渡来文化の戦略的受容が日本古代国家形成に大きな役割を果たしたと結論付けた。そして、こうした古墳時代対外交流の理解を、論文、国内外の口頭発表などを通じて発信した。本研究は、土器資料の分析をもとに日本列島から出土した韓半島系土器の器種構成の変遷およびその受容・浸透過程が、時期によって変化することを実証し、その背後にある日韓交流の質的変化を明らかにすることを目的としている。本年度は、当初の研究計画に従い、最新の調査・研究事例に基づく韓半島系土器の集成と変遷図の作成に重点をおいて研究を実施した。その過程において、情報収集に努めるとともに、得られた情報をもととして近畿、九州、山陽、四国、関東各地域において資料調査を実施し、現地遺跡踏査および資料熟覧および実測作業を行った。当初の目標であった5世紀の韓半島系土器分布、韓式系軟質土器の変遷と受容過程については、一部の内容を雑誌論文として公表した。また、資料調査のなかで従来あまり着目されてこなかった施文手法等、韓半島系土器にかんする分析視点も得ることができた。この研究成果についても一部を公表している。さらに研究を推進する過程において、新たな研究の展望も得ることができた。古墳時代の土器に関しては、アメリカ合衆国で発表する機会を得ることもでき、発表を通じて現地研究者との意見交換を行い、国際発信にかんするアプローチも検討できた。そして、研究目的としていた日韓交流の質的変化を明らかとすることに関しては、研究の深化により3・4世紀における対外交流と5世紀の対外交流は、戦略が異なるのではないかという着想を得るに至った。この論点については、次年度も継続して取り組むとともに、成果の一部を第79回アメリカ考古学会において公表する予定である。本研究は、出土土器資料の考古学的分析をもととした韓半島系土器の器種構成の変遷およびその受容過程を実証し、その時期的・地域的展開より背後にある日韓交流の質的変化を探ることを目的としている。本年度は、韓半島系土器受容過程をまとめつつ、日韓出土ハソウの集成およびその実物観察による系譜関係の把握を中心に研究を実施した。本年度における特筆すべき実績としては、古墳時代対外交流を2つのモデルとして捉え、その時期的変化を2014年4月に第79回アメリカ考古学会において口頭発表したこと、同年10月に韓半島南西部から出土した倭系土器の資料調査を実施し、その成果をもとに11月に倭系土器の年代とその意義について発表したこと、さらに同月に和歌山県立紀伊風土記の丘秋期特別展のシンポジウムにおいて古墳出土初期須恵器の諸問題について論じたことがあげられる。資料調査では韓国・萬樹里古墳群、鳳徳遺跡、東林洞遺跡出土土器など、平成27年度に資料調査を予定していた資料を前倒しにして熟覧する機会を得ることができ、資料を実見しつつ、韓国側研究者と議論できたことは計画の前向きな変更となった。また、日本国内では学会参加を通じて、最新の発掘調査情報や研究成果の公表機会を得るとともに、長崎県原の辻遺跡、双六古墳などの遺跡踏査、奈良県布留遺跡、四条大田中遺跡、行燈山古墳などの出土土器資料調査を行った。その成果として、対外交流の質的変化に伴う政治的な変化について考察を深めることができた。以上の研究成果は、国内外の学会・シンポジウムで発表するとともに、一部を論文として公表した。また、研究を通じて得られた成果は市民講座等のアウトリーチ活動に力をいれることによって還元できるように努めた。本研究は、日本列島出土韓半島系土器の変遷およびその受容過程を考古学的に実証し、その時期的・地域的展開から背後にある日韓交流の質的変化を探ることを目的とした。最終年度に実施した研究の成果は、次の通り。(1)韓半島における最新の調査・土器研究事例を基礎に、日本列島の須恵器に認められる変化を従来考えられてきたような内的要因ではなく、海外要素の受容といった側面から再評価した点、(2)須恵器・二重口縁壺という日本列島在来の意匠を有する土器資料を対象に、初期須恵器生産の日本列島的独自性についても研究を深めた点、(3)韓半島系土器出土集落および古墳の分析を基礎に、5世紀から6世紀にかけての日本列島近畿地域と韓半島栄山江流域地域の同調的社会変化を指摘した点である。研究期間を通じた成果は、1)古墳時代日韓交流の歴史的展開を新出土器資料の分析を通じ、再構築を試みたこと、2)近畿地域を中心に韓半島系土器出土遺跡分布図を作成し、土器使用痕跡の分析といった新たな土器観察視点とともに渡来文化受容実態を実証したこと、3)須恵器のハソウといった儀礼用土器に着目し、韓半島系土器の地域展開についてその広域性を評価したことがあげられる。以上、3つのテーマに加え、当初の研究計画より大きく進展した部分としては、古墳時代対外交流を2つのモデルとして捉え、その時期的変化をアメリカ考古学会で発表したことである。以上の研究成果は、専門書刊行によって公開する。

本研究の意義、重要性は、最新出土土器資料から古墳時代日韓交流の歴史的展開を再検討した点、英語圏での発表が少ない古代日韓交流について国際発信を試みたこと、日本古代国家形成における韓半島系渡来人の歴史的役割について、個別的に検討されることが多かった古墳、集落、生産遺跡を有機的に関連付けた考古学的分析によって考察した点にあると考える。本研究の目的は、2000年代以降、豊富な発掘調査事例と研究の増加によって、再構築が必要となった古墳時代対外交流について、韓半島系土器の受容過程を実証し、その時期的・地域的展開から背後にある日韓交流の質的変化を探ることである。研究成果として、古墳時代対外交流を「物資入手型」と「技術(文化)導入型」にモデル化し、2つの対外交流戦略が前者から後者に移行する過程を考古資料に基づいて論じ、日韓交流の変化と渡来文化の戦略的受容が日本古代国家形成に大きな役割を果たしたと結論付けた。そして、こうした古墳時代対外交流の理解を、論文、国内外の口頭発表などを通じて発信した。交付申請書に記した研究計画に従って、ほぼ計画通りに遂行できているが、アメリカ考古学会、韓国での国際シンポジウムで研究成果を公表できたことは成果公表という点で研究の発展的な前進となった。とりわけ、古墳時代日韓交流については英語圏での発表が極めて少ないために、日本考古学の国際発信に幾分貢献できたのではないかと考える。研究成果の公表は、申請書で掲げたテーマのそれぞれについて論文、学会等の口頭発表を通じて成果を着実に発信しており、また土器使用痕分析の分析結果をはじめとしてさらなる成果公表の準備も整えることができた。ただし、資料調査については予定していた資料を中心に実施したが、補足的な資料実見が必要な状況であり、継続的に行う予定である。大阪府野中古墳の出土品などを紹介するホームページ(英語)考古学当初計画に沿って研究の総括を平成27年度に実施する予定である。研究の成果は、韓半島系土器受容過程の時期的変遷、地域性、そしてハソウの系譜と波及の史的意義といった論点を中心に論文、学会発表を通じて公開する。アメリカ考古学会での発表と意見交換を通じ、海外の事例と比較可能なモデル構築の必要性を実感するとともに、着実な資料分析に基づく古墳時代の対外交流論は、海外でも通用すると考えるに至った。日本古代の渡来人研究を比較考古学的な観点から再構築し、その成果を公表とすることも念頭におきたい。交付申請書に記した研究計画に従って、ほぼ計画通りに遂行できている。申請書では、3つのテーマを掲げ、そのうち2つのテーマについて2013年度に取り組む計画であったが、その第1テーマである5世紀の韓半島系土器分布、韓式系軟質土器の変遷と受容過程について、一部ではあるが公表できたことは着実な実績となった。また、第2テーマ、第3テーマに関しても資料調査を通じ、着実にデータを得つつある。研究成果の公表については、論文、学会、図書など、様々な媒体を通じて、行うことができた。2013年度に米国にて口頭発表をおこなったこと、さらに2014年度春にアメリカ考古学会で発表する機会を得、その準備ができたことは、大きな成果と言える。なお、他の事業との連携という形ではあるが、古市古墳群の内実を示す良好な資料である大阪府野中古墳の展示会準備作業、展示解説を通じて、研究の深化およびアウトリーチ活動も積極的に実施することができた。
分化した隕石の岩石鉱物、同位体年代学研究

Yamato82202ユークライト中の衝撃溶融ガラスの成因について標記ユークライトは熱変成作用の影響を受けていない岩石であるにもかかわらず、失透していない比較的サイズの大きな衝撃溶融ガラスを含んでいる。ガラスのなかには微小オージャイトが結晶化している。ホストとなっているユークライトが熱変成作用を受けていないこと、ガラスから結晶があまり晶出していないことから、この岩石は深い場所において高温で長い時間埋もれていなかったことがあきらかになった。ホストとなっている岩石のAr-Ar年代は43億年よりも古く、おそらく隕石母天体の溶岩流が固結した年代をあらわしているものと考えられる。ガラスのAr-Ar年代は、3.90±0.04Gaとなり、溶融ガラスは母天体表層でおこったインパクトにより形成され、低い酸素分圧のもと急冷したと考えられる。この隕石の宇宙線照射年代は1300万年であることから、ガラスをつくったインパクトを経験した後、この隕石は母天体の表層に位置し、最近の衝撃イベントにより母天体から宇宙空間に放出されたと解釈された。ユークライト母天体における新しいタイプの変成作用の提案ユークライト母天体での変成作用については、溶岩流による熱変成作用、初期に活動的な母天体での温度勾配による熱変成作用がこれまでに提案されてきた。本研究では、接触変成作用が貫入岩によって引き起こされる可能性を角礫岩化ユークライトPetersburgについてモデルをもちいて検証した。それによると、この岩石では600-800°Cの接触変成作用がおよそ3000年続いたと仮定すると、輝石のゾーニングプロファイルを説明できることを示した。国立極地研究所の所有する南極隕石コレクションのホワルダイト、ユークライト、ダイオジェナイト(HED)について、光学顕微鏡をもちいて系統的な薄片観察をおこない、Y82202,Y980318,Y791834,Y86762隕石を研究対象候補試料として選び出した。これらの隕石について、岩石鉱物、宇宙化学、同位体年代学研究をおこなうために、研究申請書を作成し、南極隕石研究委員会に提出した。2002年10月、同委員会に置いて研究課題が採択され、試料の配分が許可された。Y82202は、衝撃溶融によって形成された1mm幅のガラスベインが認められた。ユークライト母天体表層の角礫岩化の時期をあきらかにするために、Ar-Ar年代測定用の衝撃溶融ガラスを分離した。Y980318ユークライトの構成鉱物とその化学組成から、この隕石はSerra de Mageと同じ種類の集積岩ユークライトであることが判明した。Y791834は、HEDのポリミクト角礫岩であり、CM炭素質コンドライトに類似した岩片が含まれていることをあきらかにした。Y86762ユークライト中に、熱変成を受けていないY75011タイプの非平衡岩片が存在していることをあきらかにした。各々の隕石試料について、中性子放射化分析による全岩化学組成あるいは軽元素同位体組成を求めるために、試料を準備した。あわせて、走査型電子顕微鏡による組織の観察、X線マイクロアナライザーによる構成鉱物の化学分析をおこなった。これらの南極隕石については、現在共同研究が進行中である。2002年7月21日に南アフリカに400個の岩石シャワー落下したThuathe隕石の初期分類をおこなった。岩石鉱物学的特徴等から、この隕石をH5コンドライトと分類した。
生体臓器の氷温貯蔵に関する細胞組織学的研究

氷温技術は鳥取県で二十世紀梨の貯蔵方法の一つとして開発された技術である。通常の冷蔵庫内では4°Cで保存されるが、氷結点にできるだけ近い氷温領域で貯蔵すると保存期間が延びることに加え、食物の場合はうま味が増すことが知られている。このような技術を生体臓器に応用し、氷温保存が生体に与える影響を走査型電子顕微鏡および透過型電子顕微鏡を用いて微細形態を観察した。また、臓器の保存時間を延長させることができるかどうかをラット角膜を用いて組織学的に検討した。氷温貯蔵を行ったヒラメは通常のものよりも、surface caveolaeが増加しており、氷温保存によって筋細胞が活性化されたものと考えられた。ラット角膜を4°Cと氷温下で、1週間にわたって保存し、微細形態を検討したところ、従来の4°C保存では細胞の微細形態は2日を過ぎると急速にこわれていったが、氷温に保存したものでは1週間を経ても微細形態の保存が良好であることが判明した。また、ラット角膜内皮細胞のhorseradish peroxidase type VI(HRP-VI)の取り込み能を37、4、0°Cで検討したところ、角膜内皮のHRP-VI取り込み能は低温条件下で著しく低下するが、0°Cでは4°Cよりもさらに低くなることが分かり氷温保存はこれまでの4°C保存よりも角膜内皮の細胞活動を抑える効果が強く、角膜保存に適していると考えられた。本研究によって角膜保存期間が延長できることが明らかになったことは、提供角膜の有効利用に道を開くものであると考えられる氷温技術は鳥取県で二十世紀梨の貯蔵方法の一つとして開発された技術である。本研究によって角膜保存期間が延長できることが明らかになったことは、提供角膜の有効利用に道を開くものであると考えられる氷温貯蔵下における生体組織の微細形態の変化を調べるため、本年度は、水産物の分野で広く応用がなされているヒラメの筋組織とラット角膜の微細形態について検討を行った。活ヒラメは氷温庫の中で-2°Cに保ちながら24時間眠らせて保存し、その後室温に戻して蘇生させた。対照として水槽で飼育している活ヒラメを用いた。ラット角膜は眼球を摘出し、一部は冷蔵庫、一部は氷温庫に保存し、主に角膜移植時に指標とされる角膜内皮の形態を検討した。ヒラメは体側筋の一部を切り出し、透過電顕用試料と走査電顕用試料を作製した。ラット角膜は走査電顕試料作製をおこなった。超薄切片法による透過電顕所見では対照群と氷温群とではさしたる相違は観察されなかったが、走査電顕で細胞膜に付着するsurface caveolaeの観察をおこなったところ、標温群のほうが対照群よりも数多くのsurface caveolaeが密に配列している様子が観察された。このことは氷温下におかれた筋組織が自己防衛機能として細胞の活性化をきたしたのではないかと考えられた。氷温下での微細形態を観察するため、急速凍結凍結置換法を用いて試料を作製したが、良好な凍結範囲が限られており、両群を比較検討するには至らなかった。今後、良好な凍結範囲をいかにして拡大するかの検討が必要である。ラット角膜の形態は冷蔵庫保存でも標温貯蔵でもさしたる相違は認められなかった。保存期間をもっと長くした場合には形態に相違が出てくるものと考えられ、移植角膜の氷温貯蔵の可能性が出てくるものと思われる。しかし、ヒラメの筋で示されたように生体臓器を氷温下においた場合、自己防衛反応が認められることが明らかになったので、角膜の場合も長期保存をおこなうことによって細胞の機能状態がこれまでの冷蔵庫貯蔵と異なることが予見された。

氷温貯蔵下における生体組織の微細形態の変化を調べるため,本年度は角膜移植への応用を考えて,ラットの角膜の氷温貯蔵を行い,微細形態の変化について検討を行った.角膜移植に用いられる角膜は,現在4°Cで保存されている.我々は,さらに優れた保存条件を求めて,0°Cでラット角膜を保存することを試み,従来の4°Cで保存した角膜との微細形態学的相違について,走査型電子顕微鏡と透過型電子顕微鏡を用いて検討した.ラットの全眼球および強角膜片を切り出し,眼球保存液として一般に用いられているEP・IIを用いて4°Cと0°Cで1,2,7日間にわたって氷温庫に保存した後,常法にしたがって試料を作製し,角膜内皮細胞の微細形態の変化を観察した.全眼球保存群と強角膜保存群を比較すると,いずれの条件においても全眼球保存群のほうが微細形態の保存に優れていた.これはE・PIIがもともと全眼球保存用として開発されたものなので,当然の結果かもしれない.全眼球保存群で4°Cで保存したものでは,保存期間が長くなるにつれて,細胞表面が凹凸不整になり,細胞の脱落や細胞膜の障害が認められた.これに対し,全眼球保存群で0°Cで保存したものでは細胞膜の障害は軽度であった.0°Cで7日間保存したものでは,細胞表面に長い微絨毛様の突起が出現したが,細胞膜は良く保存されており,細胞がまだ活性状態にあることが判明した.今回の研究は,眼球を氷温下で保存することにより,保存期間が延長できることを示したものであり,献眼不足を補う一方法となるものと考えられる.本年度は、これまで一番好成績をおさめた角膜の氷温貯蔵についてさらに詳細な検討を行った。角膜移植に用いられる角膜は、現在4°Cで保存されている。我々はさらに優れた保存条件をもとめて、角膜の0°C保存を試み、角膜内皮細胞の微細形態の保存に優れていることを明らかにしてきた。本年度は、37、4、0°Cにおける内皮細胞のhorseradish peroxidase type VI(HRP-VI)取り込み能を検討し、氷温条件下における内皮細胞の活動状態を明らかにすることを目的とした。ラット角膜を、37、4、0°CでHRP-VIに反応させ、ジアミノベンチジンでHRP-VIの染色を行い反応産物を透過型電子顕微鏡で観察した。37°Cで15分間HRP-VIと反応させた角膜では、反応産物は内皮細胞の細胞質中の小胞、細胞間隙、デスメ膜に観察された。4°Cで30分間HRP-VIと反応させた場合は、反応産物は主に細胞間隙に認められ、デスメ膜には軽度の反応がみられた。0°Cで30分間HRP-VI反応させた場合は、内皮やデスメ膜にほとんど反応産物はなく、わずかな反応が細胞間隙に見られるのみであった。隣接する内皮細胞の細胞間隙における反応産物の陽性率を比較すると、4°Cでは67%、0°Cでは25%で0°Cの方が低値であった。この結果より、角膜内皮のHRP-VI取り込み能は低温条件下で著しく低下するが、0°Cでは4°Cよりもさらに低くなることが示唆され、氷温保存はこれまでの4°C保存よりも角膜内皮の細胞活動を抑える効果が強く、角膜保存に適していると考えられた。
化学発生学によるホヤ脊索形成機構解析

細胞遊走阻害剤UTKO1はホヤの脊索管形成を阻害したことから,UTKO1の標的タンパク質を同定することで脊索管形成分子機構を明らかにすることにした.まず,ビオチン標識化したUTKO1と脊索管形成期におけるホヤ抽出液を混合しアビジンビーズでプルダウンすることでUTKO1標的タンパク質を同定し,そしてその直接結合を大腸菌より精製した同タンパク質を用い確認した.さらに同タンパク質をモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドによりノックダウンしたところ,脊索管形成がUTKO1同様に阻害されたことから,実際に同タンパク質がホヤ脊索管形成に関与していることを示した.細胞遊走阻害剤UTKO1はホヤの脊索管形成を阻害したことから,UTKO1の標的タンパク質を同定することで脊索管形成分子機構を明らかにすることにした.まず,ビオチン標識化したUTKO1と脊索管形成期におけるホヤ抽出液を混合しアビジンビーズでプルダウンすることでUTKO1標的タンパク質を同定し,そしてその直接結合を大腸菌より精製した同タンパク質を用い確認した.さらに同タンパク質をモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドによりノックダウンしたところ,脊索管形成がUTKO1同様に阻害されたことから,実際に同タンパク質がホヤ脊索管形成に関与していることを示した.我々はがん細胞遊走阻害物質UTKO1がホヤの脊索の管形成を阻害することを見出した.本研究ではUTKO1を用いたケミカルバイオロジーの研究手法でUTKO1の標的タンパク質である14-3-3の脊索の管形成への関与を明らかにするとともに,アダプタータンパク質である14-3-3のクライアントタンパク質を同定することでホヤの発生における脊策管形成の分子機構の一端を明らかにすることを目的とした.まず,UTKO1が14-3-3に直接結合しているのか調べることにした.大腸菌よりGST融合型タンパク質として精製した14-3-3タンパク質(ea, eb, r1, r2)をBiotin標識体UTKO1と混合し,Avidin Beadsを用いて結合してくるタンパク質をpull-downした.その結果,UTKO1は14-3-3eaと強く結合していることを確かめた.次に,このUTKO1の標的である14-3-3が本当に脊索管形成に寄与しているのか検証することにした.そこで,14-3-3 eaのMO(Morpholino antisense oligonucleotide)を用いて14-3-3 eaをノックダウンしたところ, UTKO1同様に脊索管形成が阻害されたことから脊索管形成には14-3-3eaが関わっていることが示唆された.次にUTKO1誘導体を用いた構造活性相関試験を行うことで,UTKO1のどの部位が脊索管形成の阻害活性に関与するのか調べることにした.その結果,UTKO1の4位の水酸基及び11位のメチレン基が脊索管形成の阻害活性に重要な役割を果たすことを見出した.1GST14-3-3アイソフォームを用いてホヤ破砕抽出液から結合タンパク質を探索したが,GST14-3-3分解物のバンドが多すぎる故なのかあらゆる条件において見出すことができなかった.そこでHis-14-3-3をクローニングして精製し同様のプルダウンアッセイを行ったところ,1つの14-3-3結合タンパク質を見出し,さらに架橋剤であるDSPやDTMEを用いることで2つの14-3-3結合タンパク質を見出し,これらをTOF-Massで同定した.2当初はモルフォリノを用いることを予定していたが,2014年にCRISPR/Cas 9を用いたノックアウト法が登場したためこちらを用いることにした.上記1で見出した3つのsgRNAベクターを作成しノックアウトの準備は整ったが,脊索管形成の評価はまだできていない.3上記1で見出した14ー3ー3結合タンパク質の抗体を購入したがいずれもホヤの抽出液において想定分子量のところにバンドを見出さなかったため,14-3-3との相互作用がUTKO1によって阻害されるかは確認が取れていない.また14-3-3アイソフォーム特異的抗体は作製が完了したが,14ー3ー3結合タンパク質は抗体がないため,両者の局在は評価できていない.したがって抗体の作製を外部に依頼するか, 14ー3ー3結合タンパク質とGFPを融合したコンストラクトをホヤ体内で発現させることで局在を評価することを計画している.ケミカルバイオロジー目標とした1UTKO1と14-3-3の結合,2脊索管形成における14-3-3の関与,3UTKO1誘導体を用いた構造活性相関試験については全て,極めて順調に研究が進行している.14-3-3はアダプタータンパク質であり,クライアントタンパク質に結合してその機能や細胞内局在などを調節する.そこで,14-3-3と結合してホヤ脊策の管形成を制御するクライアントタンパク質を同定する.1受精後16時間後のホヤの破砕抽出液にGST-14-3-3アイソフォームを添加し,GSHビーズを用いたプルダウン法で14-3-3結合クライアントタンパク質を回収する.それらをSDS-PAGEで分離し,TOF-Massで同定する.2つぎに,同定したタンパク質が実際に脊策の管形成に関わっていることを検証するために,同定したクライアントタンパク質のモルフォリノオリゴを用いてノックダウン実験を行い,受精21時間後の脊策の管形成を阻害することを確認する.

3UTKO1による脊策の管形成は,UTKO1が14-3-3に結合することで14-3-3とクライアントタンパク質の結合が阻害され,その結果クライアントタンパク質の活性化が抑制された結果と考えられる.そこで,受精後16時間後のホヤの破砕抽出液にホヤGST-14-3-3アイソフォームとUTKO1を加え,GSHビーズによるプルダウン法で14-3-3を回収し,クライアントタンパク質との結合が阻害されていることを確認する.必要に応じて,14-3-3以外のタンパク質についても同様の実験を行う.次にUTKO1結合タンパク質の局在評価を行なう.方法は免疫染色もしくはin situ hybridizationをおこなう.そのため脊索細胞内での局在まで特定できれば,脊索細胞の移動か,もしくは脊索細胞の極性にかかわるものか,などを示唆するデータとなると考えている.この研究を実施するためにホヤ14-3-3アイソフォーム特異的抗体が必要であるのでその作成を行う.本研究遂行のための消耗品が予定より安価で手に入ったため、次年度使用額が生じた。次年度の研究遂行に必要な消耗品の購入に使用する。
神経細胞生存制御機構におけるバソプレッシン受容体機能の解明と神経保護療法への応用

本研究では、バソプレッシン(AVP)の神経細胞死への関与を検討した。この過程で、脳内におけるAVPおよびAVP受容体発現を検討し、グリア細胞におけるバソプレッシンV1a受容体並びにAVP発現を明らかにした。また、AVPが海馬神経培養系におけるカイニン酸誘導性神経細胞死を抑制することを明らかにした。カイニン酸誘導性の海馬変性モデルによる検討では、V1a受容体欠損マウスおよびV1b受容体欠損マウスにおいて、野生型マウスと比べカイニン酸によるてんかん発作症状の増悪が認められた。また、V1a受容体欠損マウスおよびV1b受容体欠損マウス間ではV1b受容体欠損マウスにおいてカイニン酸によるてんかん症状がより増悪した。この結果はAVPが海馬神経培養系におけるカイニン酸誘導性神経細胞死を抑制することと一致し、AVPがV1a受容体およびV1b受容体を介して神経細胞保護作用を持つことを示している。また、AVPは直接的に神経細胞を保護する効果とともに、グリア細胞を介して神経細胞生存に寄与している可能性が考えられた。一方で、病理学的解析からカイニン酸による海馬神経細胞の脱落はV1b受容体欠損マウスに比べV1a受容体欠損マウスにおいて顕著であることが示された。これらの結果から、神経細胞保護におけるV1a受容体とV1b受容体の作用が異なることが示唆された。以上より、AVPを介したグリア細胞機能を明らかにすることにより、神経細胞並びにグリア細胞双方を標的としたAVPおよびそのアゴニスト等による神経細胞保護の可能性を示している。本研究では、近年の研究から脳内において広範な機能を有していると推測されるバソプレッシン(AVP)に着目し、特にこれまで注目されてこなかった神経変性疾患におけるAVP受容体の役割を解明し、神経変性疾患に対するAVP作用に基づいた予防・治療法の開発に繋がる成果を上げることを目的としている。本研究目的の達成のため、野生型マウス、V1a受容体欠損マウス、V1b受容体欠損マウス及びV1a/V1b受容体二重欠損マウスを用いて各種神経変性疾患モデルを作成し、その病態を検討することにより、AVPの神経細胞死への関与を検討する。また、初代神経細胞あるいはグリア細胞を単離・培養しin vitro系による検討も加え、AVPの神経変性疾患における機能と作用機序の解明を行う、本年度は脳内におけるAVPおよびAVP受容体発現を検討し、グリア細胞におけるバソプレッシンV1a受容体並びにAVP発現を明らかにした。また、V1a受容体遺伝子欠損マウスにおいては、トリメチルスズ誘導性の神経細胞死が亢進していることを見出した。加えてAVPが海馬神経培養系におけるカイニン酸誘導性神経細胞死を抑制することを明らかにした。これらの結果から、AVPは直接的に神経細胞を保護する効果とともに、グリア細胞を介して神経細胞生存に寄与している可能性が考えられた。このことは、AVPの脳内における広範な作用の機序を示す一端であり、AVPを介したグリア細胞機能を明らかにすることにより、神経細胞並びにグリア細胞双方を標的としたAVPおよびそのアゴニスト等による神経細胞保護の可能性を示している。本研究では、近年の研究から脳内において広範な機能を有していると推測されるバソプレッシン(AVP)に着目し、特にこれまで注目されてこなかった神経変性疾患におけるAVP受容体の役割を解明し、神経変性疾患に対するAVP作用に基づいた予防・治療法の開発に繋がる成果を上げることを目的とした。本研究目的の達成のため、野生型マウス、V1a受容体欠損マウス、V1b受容体欠損マウス及びV1a/V1b受容体二重欠損マウスを用いて各種神経変性疾患モデルを作成し、その病態を検討することにより、AVPの神経細胞死への関与の検討を試みた。

カイニン酸誘導性の海馬変性モデルによる検討では、V1a受容体欠損マウスおよびV1b受容体欠損マウスでおいて、野生型マウスと比べカイニン酸によるてんかん発作症状の増悪が認められた。また、V1a受容体欠損マウスおよびV1b受容体欠損マウス間ではV1b受容体欠損マウスにおいてカイニン酸によるてんかん症状がより増悪した。この結果はこれまでに観察したAVPが海馬神経培養系におけるカイニン酸誘導性神経細胞死を抑制することと一致し、AVPがV1a受容体およびV1b受容体を介して神経細胞保護作用を持つことを示している。一方で、病理学的解析からカイニン酸による海馬神経細胞の脱落はV1b受容体欠損マウスに比べV1a受容体欠損マウスにおいて顕著であることが示された。これらの結果から、神経細胞保護におけるV1a受容体とV1b受容体の作用が異なることが示唆された。
前頭連合野の作業記憶機構における視空間位置の表現に関する研究

遅延期間中に保持すべき位置の情報を複数にすると、ニューロンの記憶受容野はどのような影響をうけるのかに注目し、研究を実施した。2頭のサルに、注視と記憶誘導性眼球運動を組み合わせた2種類の遅延反応課題を学習させた。2種の課題とは、1カ所の目標位置の作業記憶を要求する遅延眼球運動課題、2カ所の目標位置とその呈示順序の作業記憶を要求する遅延連続眼球運動課題である。いずれの課題でも目標位置の呈示と反応の間に35秒の遅延期間を入れ、この間目標位置に関する情報が作業記憶として保持されるようにした。注視点や目標位置は大型テレビ画面上に呈示し、眼球運動は赤外線カメラを利用したモニター装置で検出した。まず、遅延眼球運動課題におけるニューロン活動を分析し、視覚受容野、遅延期間活動の位置選択性をもとにした記憶野、眼球運動の応答野など、各ニューロンの基本的な特徴を明らかにした。次に、遅延連続眼球運動課題におけるニューロン活動を分析し、作業記憶として保持すべき情報量の増加により遅延期間活動の位置選択性にどのような変化が生じるのか、情報の呈示順序や保持されている情報を利用する順序は遅延期間活動にどのような影響を与えるのか、を検討した。記憶野をもっていた26個のニューロンで調べたところ、大部分は、視覚刺激が記憶野内に最初の刺激として呈示された試行では遅延期間活動を示したが、記憶野外に呈示された視覚刺激と組み合わされ、記憶野内に二番目の刺激として呈示される試行では遅延期間活動が観察されなかった。このことは、記憶野を持つニューロンは、その記憶野の周辺部に記憶野をもつニューロンから抑制性の入力をうけていることを示唆する。この現象は、感覚皮質や運動皮質で見出されている側抑制と同一の現象と考えられる。このように、個々のニューロンは比較的単純な情報処理をしているが、側抑制をはじめとするニューロン間の相互作用により、複雑な情報表現が可能になっているのではないかと考えられる。今後、側抑制以外のどのような相互作用が存在するのか、それらによりどのような情報表現が可能になるのかを検討する計画である。
集中治療室（ICU,NICU）における薬剤性有害事象に関する臨床疫学研究

薬剤性有害事象(ADE)に関する多施設コホート研究をICU・NICU患者を対象に実施した。ICUでは100患者あたり21.6件、1000患者日あたり30.6件、NICUでは100患者あたり27.2件、1000患者日あたり10.9件のADEが発生していた。ICU入室後3日以内に死亡した38人を除外した場合、ICU死亡率はADEが発生した患者群は17%、ADEが発生しなかった患者群は7%であった(p=0.003)。ICU滞在日数はADEが発生した患者群で13日、ADEが発生しなかった患者群で2日であった(p<0.0001)。これらよりICUとNICUにおけるADEが重要であることを明らかにした。本邦の集中治療室における薬剤性有害事象および薬剤関連エラーの疫学を明らかにするために、研究実施計画通りに集中治療室入室患者を対象に多施設ヒストリカルコホート研究を実施した。今年度は当初の計画通り、研究期間中に対象施設に入院した全患者のカルテを経時的かつ網羅的に調査し、患者背景ならびに薬剤性有害事象や薬剤関連エラーの潜在的事象を全て抽出した先行研究(Morimoto T et al. J Gen Intern Med 2011)で作成した一次データを集中治療室入室患者のみを対象にして、新たに医師レビューを行い、本研究に必要なデータを再収集した。データ収集後は詳細なデータクリーニングを行い、データベースを作成した。現在、滞在日数と死亡率をメインアウトカムとした薬剤性有害事象と薬剤関連エラーの発生がそれらに及ぼす影響を検討すると共に、集中治療室入室時の患者の重症度や合併症と薬剤性有害事象の発生や、その重症度、薬剤関連エラーの発生、エラー発生のプロセスとの関連について検討している。459人のICU入室患者で検討し、70人の患者、99の薬剤性有害事象が発生していることが分かり、30.6/1000患者日、21.6/100患者の頻度であることが判明した。ICU入室患者459人の滞在日数は平均3日、死亡率は73人で16%であった。死亡患者を除いたICU患者で滞在日数を検討したところ、薬剤性有害事象の有無で13日と2日(p<0.0001)と滞在日数に有意差を認め、ICU入室3日以内の死亡患者を除いたICU患者が薬剤性有害事象の有無で12人(17%)と23人(7%)(p<0.003)とICU死亡率に有意差を認め、ICU滞在日数、死亡率と薬剤性有害事象が関連することを示した。本邦における集中治療室における薬剤性有害事象および薬剤関連エラーの疫学を明らかにするために、研究実施計画通りに集中治療室入室患者を対象に多施設ヒストリカルコホート研究を実施した。当初の計画通り、平成25年度に作成した集中治療室入室患者を対象にした患者背景ならびに薬剤性有害事象や薬剤関連エラーの潜在的事象を全て抽出した本研究用のデータベースを用いて平成26年度に解析した。459人、3231患者日のICU入室患者で検討し、70人の患者、99の薬剤性有害事象が発生していることが分かり、30.6/1000患者日、21.6/100患者の頻度であることが判明した。ICU入室患者459人の滞在日数は中央値3日、ICU死亡は73人で死亡率は16%であった。ICU入室後3日以内の38患者の死亡を除いたICU患者で滞在日数を検討したところ、ICU患者が薬剤性有害事象の有無で12人(17%)と23人(7%)(p=0.003)とICU死亡率に有意差を認めた。ICU滞在中の73患者の死亡を除外し、ICU滞在日数を検討したところ、薬剤性有害事象の有無で13日と2日(p<0.0001)と滞在日数に有意差を認め、死亡率、ICU滞在日数と薬剤性有害事象が関連することを示した。次に患者重症度を臓器別に検討し、薬剤性有害事象との関連を検討したところ、ICU滞在日数には関連したが、死亡率は関連していなかった。臓器障害と薬剤関連有害事象には関連が無いことも示した。本邦における小児集中治療領域での薬剤性有害事象と薬剤関連エラーの疫学を明らかにするために、研究実施計画通りにNICU,PICU,ICUを対象に多施設ヒストリカルコホート研究を実施した。平成25年度から26年度にかけて小児集中治療を要する患者を対象として薬剤性有害事象と薬剤関連エラーを抽出したデータベースを作成し、上記データベースを平成27年度に解析した。224人4478患者日の集中治療を受けた小児患者で検討した。低出生体重でNICUに入室した患者は69人、3270患者日、低出生体重ではないが、NICU入室を要した患者は100人、944患者日、PICUに入室した患者は18人、157患者日、ICUに入室した患者は37人、107患者日であった。投与されていた薬剤数の中央値(四分位)は、低出生体重でNICU入室患者は4(3,6)、低出生体重でないNICU入室患者は2(2,3)、PICU入室患者は6(5,7)、ICU入室患者は7(4,10)であった。

薬剤性有害事象と薬剤関連エラーの件数はそれぞれ、低出生体重でNICU入室患者は44件と112件、低出生体重でないNICU入室患者は2件と36件、PICU入室患者は2件と1件、ICU入室患者は9件と15件であった。このことから、それぞれの発生率は、低出生体重でNICU入室患者は13.5/1000患者日と34.3/1000患者日、低出生体重でないNICU入室患者は2.1/1000患者日と38.1/1000患者日、PICU入室患者は12.7/1000患者日と6.4/1000患者日、ICU入室患者は84.1/1000患者日と140.2/1000患者日であった。この発生率から、ICU入室患者は他の病棟と比較して発生率が高く、小児のICU入室時には、薬剤性有害事象や薬剤関連エラーを念頭においた診療が必要であることが明らかになった。薬剤性有害事象(ADE)に関する多施設コホート研究をICU・NICU患者を対象に実施した。ICUでは100患者あたり21.6件、1000患者日あたり30.6件、NICUでは100患者あたり27.2件、1000患者日あたり10.9件のADEが発生していた。ICU入室後3日以内に死亡した38人を除外した場合、ICU死亡率はADEが発生した患者群は17%、ADEが発生しなかった患者群は7%であった(p=0.003)。ICU滞在日数はADEが発生した患者群で13日、ADEが発生しなかった患者群で2日であった(p<0.0001)。これらよりICUとNICUにおけるADEが重要であることを明らかにした。研究計画通りに集中治療室入室患者を対象とした薬剤性有害事象に関する臨床研究は順調に経過している。現在、発生率とそれが影響を及ぼすICU死亡率、滞在日数、また薬剤性有害事象と患者重症度などの関連性の評価は終了しており、論文投稿も完了している。内科学、集中治療医学、麻酔科学、救急医学集中治療室における薬剤性有害事象のコホート研究をおおむね計画通りに実施できた。NICUを対象とした薬剤性有害事象に関する研究も引き続き行っていくと共に、今後は薬剤よりも侵襲の高い手術に関するコホート研究を進めていく予定である。研究計画通りに集中治療室入室患者のみを対象とした薬剤性有害事象や薬剤関連エラーのデータを収集し、データベースを作成でき順調に進行している。現在、学会発表は完了し、論文を投稿中である。NICUを対象とした薬剤有害事象に関して得られたデータ処理が途中であるため。集中治療室における薬剤性有害事象のコホート研究をおおむね計画通りに実施できているため、平成26年度は集中治療データベースの解析を行い、集中治療室滞在日数や死亡率の減少につながるように発生対応策を検討し、治療成績を向上させるという観点も含めて研究成果を発表していく予定である。また、薬剤性以外の原因についても研究を進めていく予定である。人件費及び、研究結果を広く公表するため、世界へ発信するための海外旅費に計上する予定である。今年度は情報収集における旅費やその他にかかる経費を削減できたため。次年度は研究課題に対する最新の知見の情報収集を積極的に行うための費用を計上し、上記の研究成果を世界に発信していく予定である。
液滴衝突法による微量タンパク質の反応追跡

いかなる生命現象も突き詰めるとタンパク質が駆動する化学反応がもとになっている。したがって、生命とは何か?という問いに答えるためには、タンパク質の機能メカニズムを明らかにする必要がある。この目的のためにはタンパク質の立体構造とダイナミクスの情報が不可欠である。本研究の目的は、タンパク質の構造ダイナミクスを研究するための微量高速混合装置の試作である。構想では、2つのインクジェットヘッドから高速(110 m/s)で吐出される微量(100 pL1 nL)の酵素および基質をそれぞれ含む液滴を衝突させることによって混合し、酵素反応を開始させて分光法により時間軸に沿って追跡する。2台のインクジェットヘッドをそれぞれxyzθ軸微動ステージに固定したミキサーを製作した。そして、2つの液滴の衝突・混合を行った。一方、微量試料(80 μl)用吸い上げ式ヘッドについては、電圧パルス印加前に試料溶液が流れ出さないよう保持するために±5 kPa程度の安定した微圧を発生する必要があり、そのための微圧発生装置を組立てた。それを用いて吸い上げ式ヘッドによる液滴の吐出に成功した。ここまでを平成27年度までに行った。平成28年度にはフェノールレッドの蛍光強度がpHにより変化する性質を用いて混合の時定数を求めた。すなわち、フェノールレッドのアルカリ性溶液と酸性緩衝液を衝突させ、最終pHを酸性にすることにより、蛍光光度が低下する性質を利用した。この測定結果より、液滴速度3.8 m/sのとき、混合の時定数は300マイクロ秒と決定した。この装置によりペルオキシダーゼ(西洋わさび由来)と過酸化水素を混合してCompound Iを生成する系を測定中である。2台のインクジェットヘッドから吐出される2つの液滴を衝突させて混合するミキサーを組み立てた。その混合時定数を測定したところ、300マイクロ秒であった。この装置を酵素タンパク質であるペルオキシダーゼに応用する実験に取りかかった。ペルオキシダーゼの系により、酵素タンパク質への応用の可能性を確かめる。次にシトクロムc酸化酵素に応用し、嫌気性を保った測定系に発展させる。また、合成タンパク質など微量しか得られない試料に対して応用していく。
治療効果向上と適応拡大を目指したBNCT用ナノ粒子

ホウ素中性子捕捉療法(BNCT)は、ホウ素と中性子の核反応を用いた放射線治療である。ホウ素は、ホウ素化合物として体内に投与されるが、この化合物の腫瘍への集積は必ずしも高くない。ドラッグデリバリーシステムを用いた安全性と有効性を併せ持つBNCT用ナノ粒子(BNP)を用いて、従来の治療対象の癌に対する既存のホウ素化合物への優位性やBNPの集積する新たな癌の探索を本研究の目的とした。平成29年度には、腫瘍内に10Bを集積させる高分子材料として、ポリエチレングリコール(PEG)とポリ乳酸からなるブロック共重合体(PEG-b-PLA)を合成し、そのPEGの末端にフェニルボロン酸(PBA)を導入した。得られた高分子(PBA-PEG-b-PLA)は、血清タンパク質との相互作用が抑えられ優れた安定性と、PBAのシアル酸への特異的親和性からシアル酸高発現の転移性の高いがん細胞を選択的に認識することが確認された。ヒト乳がん細胞やマウスメラノーマ細胞を用いたin vitro集積能の評価では、細胞膜を効率的かつ迅速に認識し、細胞質へ集積することを確認した。平成30年度には、皮膚がんモデルマウスへの尾静脈投与の48時間後において、腫瘍組織の切片を観察した結果、高分子ミセルの腫瘍組織への優れた集積能が確認できたが、BNCTの適応である脳腫瘍や頭頸部扁平上皮癌以外の乳癌(MDA-MB-231)、肝臓癌(HepG2)、膵臓癌(BxPC3)、前立腺癌(PC-3)、子宮頸癌(HeLa)を用いた比較は実施できなかった。また、がんモデルマウスへ中性子線を照射し、アネキシンV、血球濃度、CRP値を定量測定し、アポトーシスの程度や炎症反応の程度を評価したり、同様の実験をBPA、BSHで行い比較することも、中性子照射施設の利用が困難であったことから実施できなかった。今後、中性子照射施設の利用に伴い、BNP等の臨床実験が進むことを期待する。ホウ素中性子捕捉療法(BNCT)は、ホウ素(10B)と中性子の核反応を用いた放射線治療である。10Bは、ホウ素含有の化合物として体内に投与されるが、現在臨床で用いられているのはどれもが低分子であり、腎臓からの迅速な排出により、腫瘍への集積率は極めて低い。本研究では高分子材料を基盤として、腫瘍に選択的に集積し安全性と有効性を併せ持つ、新たなBNCT製剤の開発・評価を目標としている。腫瘍内に10Bを集積させる高分子材料として、ポリエチレングリコール(PEG)とポリ乳酸からなるブロック共重合体(PEG-b-PLA)を合成し、そのPEGの末端にフェニルボロン酸(PBA)を導入した。得られた高分子(PBA-PEG-b-PLA)は水中で自己組織化により直径100 nm以下かつ単分散の高分子ミセルを形成し、親水性のPEG鎖が表面を覆うコアーシェル構造をとり、負の表面電荷を示し、蛍光相関分光法(FCS)による血清中での安定性の評価実験では、血清タンパク質との相互作用が抑えられ、優れた安定性が確認されている。一方、この高分子ミセルはPEG鎖の末端のPBAにより、高分子ミセル自体がホウ素含有のBNCT製剤になるのはもちろん、PBAのシアル酸への特異的親和性から、シアル酸高発現の転移性の高いがん細胞を選択的に認識するスマートな設計となっている。続いてヒト乳がん細胞やマウスメラノーマ細胞を用いたin vitro集積能の評価では、細胞膜を効率的かつ迅速に認識し、細胞質へ集積することを確認した。さらに、皮膚がんモデルマウスへの尾静脈投与の48時間後において、腫瘍組織の切片を観察した結果、高分子ミセルの腫瘍組織への優れた集積能が確認できた。BNCT用ナノ粒子のin vitroでの解析から腫瘍組織への優れた集積能が示された。

また、がんモデルマウスへ中性子線を照射し、アネキシンV、血球濃度、CRP値を定量測定し、アポトーシスの程度や炎症反応の程度を評価したり、同様の実験をBPA、BSHで行い比較することも、中性子照射施設の利用が困難であったことから実施できなかった。今後、中性子照射施設の利用に伴い、BNP等の臨床実験が進むことを期待する。BNCT用ナノ粒子での実験を継続していき、今後、BNCTの対象になることが期待される癌細胞に集積するか否かを明らかにする。
細胞核の継承に重要な働きを担うセントロメアに特異的なクロマチン構造の解明

これまで試験管内で再構成させる手法および細胞生物学的解析法により細胞核の継承に必須なセントロメアクロマチン構造の実体解明に向けた研究を行ってきた。24年度は、試験管内再構成法よるCENP-T複合体とクロマチンとの相互作用の実態解明、および細胞生物学的解析法によるセントロメア誘導に関与する因子の同定を中心に実施した。1)試験管内再構成によるCENP-T複合体の実態解明試験管内でCENP-T-W-S-Xへテロ4両体を再構成し、同様に再構成したH3あるいはCENP-Aダイヌクレオソームとの相互作用をゲルシフト法により解析した。その結果、CENP-Tへテロ4量体は100bpサイズのリンカーDNAを有すダイヌクレオソームと優先的に相互作用したが、H3型とCENP-A型ダイヌクレオソーム間での有為な結合活性の違いは観察されなかった。再構成したCENP-Tへテロ4量体をDNAスーパーコイルアッセイに供したところ、一般的なヒストンが負のスーパーコイルを導入するのとは逆に、正のスーパーコイルを導入することを見いだした。CENP-Tへテロ4両体はヒストン様構造を持つが、一般的なヒストンと異なったDNA結合様式を有し、セントロメア特有なクロマチン構築に寄与する可能性が示唆された(投稿準備中)。2)セントロメアタンパク質の異所局在によるセントロメアの誘導染色体工学的手法により、セントロメアを含むゲノム断片を除去することで、ネオセントロメアを有す細胞株の取得に成功した(Dev. Cell, 2013)。このシステムとテザリング技術を用いてCCANタンパク質の異所局在を行い、23年度に明らかにしたCENP-T N末端に加えて、CENP-C、CENP-IおよびHJURPの異所局在によっても活性なセントロメアが誘導されることを見いだした(J.C.B., 2013)。24年度が最終年度であるため、記入しない。セントロメアのクロマチンを構成すると考えているCENP-AおよびCENP-T結合クロマチンの2種の主要構成要素の構造実体の解明を目指し、ニワトリDT40細胞から両クロマチンの独立精製を試みた。これまで高純度精製に成功したCENP-Aクロマチンと比較し、CENP-Tはセントロメアクロマチンの部分破壊による可溶化により、クロマチン構造から遊離しやすいことが明らかとなった。そこで23年度は、CENP-T結合クロマチンの性質解明を目指し、試験管内再構成法および細胞生物学的解析法により以下の2点を中心に実施した。1.試験管内再構成によるCENP-T複合体の実態解明CENP-Tタンパク質は、試験管内再構成によりCENP-T-W-S-Xヘテロ4両体を構築し、ヒストン様構造を形成することによりDNAと結合することを明らかにした(Cell,2012)。さらにこのCENP-T複合体は、約100bpのDNAと効率よく結合することを明らかにした。CENP-TのDNA結合領域を除いたCT(1-530)とLacIの融合タンパク質を作製し、染色体の任意の場所にLacO配列を挿入したDT40細胞へ導入を行った。さらにLacO配列を挿入した染色体のセントロメアをCre-lox実験系により除去を行った。その結果、LacO配列に結合したCT(1-530)-LacIの融合タンパク質により、ほぼ正常なセントロメア機能を置換出来ることが明らかとなった。さらに、このCT(1-530)-LacIセントロメアには通常のセントロメアには必須なCCANタンパク質が存在しないことも明らかとなった。これらの結果から、セントロメアクロマチンには位置を特定し継承する役割と、CENP-T複合体をその位置に安定にとどめる役割の2点を主に担うことが示唆された。

このシステムとテザリング技術を用いてCCANタンパク質の異所局在を行い、23年度に明らかにしたCENP-T N末端に加えて、CENP-C、CENP-IおよびHJURPの異所局在によっても活性なセントロメアが誘導されることを見いだした(J.C.B., 2013)。24年度が最終年度であるため、記入しない。試験管内再構成、細胞生物学的解析から、セントロメアクロマチン構造の分子レベルでの機能解明に寄与する重要な知見を得たことから、当初の計画以上に研究目標に向け進展したと考えている。CENPT複合体-DNAおよび2量体ヌクレオソームの試験管内再構築、およびこれら複合体の光ピンセットによる結合力解析実験を行い、セントロメアクロマチン構造の実体解明を行う。