hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ラテンアメリカ開発政策における「第三の道」に関する研究

その遂行において、現在の世界最先端の研究成果を習得するため、2009年6月22日から11月20日まで、チリの首都サンチャゴにある国連ラテンアメリカ・カリブ経済委員会(Economic Commission for Latin America and the Caribbean、以下略称ECLAC)のInternational Trade and Integration部門においてインターヒとして、同部門の研究プロジェクト"Poverty, Trade Policy and Complementary Policies"に参加し、ECLACのスタッフから貴重かつ的確な指導および、チリ全国を対象とした家計調査データの供与を受けた。この研究の成果は、現在"TradePolicy and Wage Inequality in Chile"というタイトルにて論文として執筆中であり、同論文では、同政権期の持続された経済開放政策を特徴づけるものとして、特恵貿易協定に着目し、その発効の結果適用される実行関税率の減少は、同期間において、平均としては労働者の賃金を増加させ、低学歴労働者の賃金を増加させ、高学歴労働者の賃金を減少させた、という結果が得られた。さらに産業セクターごとの分析を行ったところ、より実行関税率の下がった産業においてより高学歴労働者の技能プレミアムが減少する傾向にある、という結果も得られた。これらから、同政権期のチリにおいて、持続された経済開放政策における特恵貿易協定の発効による実行関税率の減少は、他のラテンアメリカ諸国と異なり、賃金格差を縮小させたことを重要な研究成果として得た。
ES細胞由来の培養心筋細胞の樹立と心筋の発生、分化、再生の研究

本研究は、心筋系列(cardiac lineage)がいかに決定され、どのようなメカニズムで成熟した心筋に分化し、さらにいかなる機構で終末分化して増殖を停止するのか、これらの点について解明していくことを目的としている。このような心筋細胞の分化の連続的な流れを解析するにはin vitroのシステムの構築が不可欠である。そこで本研究ではまず、胎生初期から心筋に強く発現しているミオシン軽鎖2Vの遺伝子座に相同組み換えによりGFPをノックインしたES細胞ラインを樹立した。このES細胞ライン由来の心筋細胞を用いて我々は心筋系列の決定機構の解明に取り組んできた。ホメオボックス遺伝子Nkx2.5は心臓の初期発生に不可欠な遺伝子であり、その上流に心筋系列を決定する因子があるものと考えられている。しかし、上流10kb,イントロン、下流8kbの検索にも関わらず、major cardiac enhancerはまだ同定されていない。そこで、我々は複数のBACクローンより、現在までに上流50kbまでカバーする約100種のレポーターコンストラクトを作製し、ES細胞由来の培養心筋細胞にトランスフェクションしてその活性を調べた。その結果、in vitroで心筋細胞に強い活性のある領域を6箇所同定した。各フラグメントは既に約100bpまで絞り込まれており、現在トランスジェニックマウスを作製しin vivoでの活性を確認しているところである。(うち3種類については既にFoを得ている。)これらの結果は、ES細胞由来心筋細胞がプロモーター解析のツールとしてたいへん有用であることを示すとともに、心筋系列の決定機構の解明に向けて大きく前進したことを示すものであり、今後さらに、同定したフラグメントの重要箇所をベイトとしたyeast one-hybrid法にて結合する上流蛋白の同定、解析を進めていく予定である。本研究の目的は、ES細胞由来のin vitroの心筋分化系を構築することにより、心筋系列(cardiac lineage)の決定機構や、心筋の分化、増殖、終末分化のメカニズムを解明することである。当初、Nkx2.5の心筋エンハンサーにGFPを連結したコンストラクトを用いて、ES細胞から初期の分化段階の培養心筋細胞を樹立を目指したが、このエンハンサーはin vitroにおいても初期から活性化されるものの、GFPの発現が弱く、ソーティングの効率が悪いなど、不都合な点があることが判明した。そこで、作戦を変更し、胎生初期から心筋に強く発現しているミオシン軽鎖2Vの遺伝子座に、相同組み換えによりGFPをノックインするターゲティングコンストラクトを作成した。サザン解析にて確認した相同組み換え体をin vitroで分化させると、早い時期からGFPを強く発現し、ソーティングを効率よく行えることが判明した。今後、構築したこのin vitroの系を用いて、培養心筋細胞よりRNAを採取し、各段階で特異的に発現している遺伝子のクローニングを行う。また、Nkx2.5のプロモーター解析を行うため、Nkx2.5周辺のゲノムDNAを含むBACクローンを複数クローニングし、上流40kbまでカバーする5種類のレポーターコンストラクトを作製した。今後、これらのコンストラクトを構築した培養細胞系で用いて、Nkx2.5の上流遺伝子の解析を行う.。Nkx2.5の下流遺伝子の検索については、培養細胞系の確立に時間がかかったため、ダブルノックアウト細胞を用いる実験と並行してホモ変異体と野生型胚の心臓より採取したRNAを増幅してDNAチップなどに用いる実験を行った。今までに、ホモの心臓で発現がない遺伝子、ホモの心臓で発現が異常に増加している遺伝子を数種ずつ単離しており、現在発現パターンや機能について解析中である。

このような心筋細胞の分化の連続的な流れを解析するにはin vitroのシステムの構築が不可欠である。そこで本研究ではまず、胎生初期から心筋に強く発現しているミオシン軽鎖2Vの遺伝子座に相同組み換えによりGFPをノックインしたES細胞ラインを樹立した。このES細胞ライン由来の心筋細胞を用いて我々は心筋系列の決定機構の解明に取り組んできた。ホメオボックス遺伝子Nkx2.5は心臓の初期発生に不可欠な遺伝子であり、その上流に心筋系列を決定する因子があるものと考えられている。しかし、上流10kb,イントロン、下流8kbの検索にも関わらず、major cardiac enhancerはまだ同定されていない。そこで、我々は複数のBACクローンより、現在までに上流50kbまでカバーする約100種のレポーターコンストラクトを作製し、ES細胞由来の培養心筋細胞にトランスフェクションしてその活性を調べた。その結果、in vitroで心筋細胞に強い活性のある領域を6箇所同定した。各フラグメントは既に約100bpまで絞り込まれており、現在トランスジェニックマウスを作製しin vivoでの活性を確認しているところである。(うち3種類については既にFoを得ている。)これらの結果は、ES細胞由来心筋細胞がプロモーター解析のツールとしてたいへん有用であることを示すとともに、心筋系列の決定機構の解明に向けて大きく前進したことを示すものであり、今後さらに、同定したフラグメントの重要箇所をベイトとしたyeast one-hybrid法にて結合する上流蛋白の同定、解析を進めていく予定である。
分裂酵母における減数分裂の細胞周期制御に関わる新規Cdc7/Dbf4様キナーゼ複合体の解析

1,Spo4の細胞内局在の決定Spo4タンパク質のC末端にHAタグをつけ、染色体に組み込み間接蛍光抗体法により観察した。その結果、Spo4の発現は減数分裂時のみに見られ、他のCdc7キナーゼ同様核に局在した。調節サブユニットDbf4はCdc7を複製起点周辺にリクルートすると考えられているが、Spo4の調節サブユニットSpo6破壊株でSpo4の局在を見たところ大きな変化は見られなかった。以上のことからSpo6はSpo4の局在に必要ではないか、あるいは核内の特定の場所への局在に必要ではないかと考えられる。以上の結果はMolecular and Cellular Biology誌に掲載された。2,spo4+の周辺で働く遺伝子の取得Two-hybrid法を用いてSpo4と物理的に相互作用する遺伝子の取得を試みた。その結果、22のポジティブクローンを取得した。これらすべての塩基配列を決定したところ、6種類の遺伝子が取得された。それはもう一つのCdc7キナーゼHsk1の調節サブユニットHim1,Spo4の調節サブユニットSpo6、セントロメアの構造維持に関わるCbf1ホモログやtranslinなど非常に興味深い遺伝子が含まれていた。またHim1とSpo4の分裂酵母細胞内での相互作用を確認した。このことから、分裂酵母には少なくともHsk1/Him1,Spo4/Spo6,Spo4/Him1の3つのCdc7-Dbf4キナーゼ複合体が存在することが明らかになった。
非線形界面動電現象の基礎と設計基盤の確立

平成30年度において、一流紙であるJournal Fluid Mechanics (JFM)誌1本を含む4本の関連論文を掲載することができた。これにより、3年間でPhysical Review誌2本、JFM誌1本、他11本(合計14本)の論文掲載実績を得、本研究の目的である「非線形界面動電現象の基礎及びその設計基盤を確立すること」を着実に遂行・発展させることができた。特に、交付申請書に記載した「研究の目的」「研究実施計画」に照らし、次の結果を得た。1非線形界面動電現象の基本問題を解明する目的に関し、イオンの立体効果を考慮したイオン濃度依存性の直接シミュレーションを初めて行い、高濃度での流速の減少はイオンの立体効果によるものではない可能性が高いことを明らかにし、目的を完了した[投稿中]。2拡散イオン系の基礎基盤を確立する目的に関し、すでに当初の課題を完了している。3非線形界面動電現象に影響する複雑な溶液/電極反応の解明に関して、Frumkin-Butler-Volmer(FBV)の式を用いた1次元系解析を経て、2次元系では電流モードで非線形界面動電現象が起こること予測してきた。この予測の展開として、静電遮蔽が不完全となるような高電圧下の拡散とFBV式を組み合わせた基礎式の確立が重要と考え、まず、静電遮蔽が不完全となるような高電圧の解析解を明らかにした[投稿中]。以上より、当初の目的は、ほぼ完了できたと考えているが、JFM誌で明らかにしたように非線形界面動電現象には、熱流や温度勾配と関係した複雑な現象があり、さらなる展開が必要と考えている。当該年度において、Physical Review誌1本を含む8本の関連論文を掲載することができ、本研究の目的である「非線形界面動電現象の基礎及びその設計基盤を確立すること」に関する研究群を前倒しに遂行できている。具体的には、大規模な直接シミュレーションができる環境を構築し(課題0)、(1)直接シミュレーション法による非線形界面動電現象の基本問題の解明を進め、印可電圧とイオン応答の位相ずれにより流速が減少する問題を解明することができた(課題1A)。これにより、非線形界面動電現象を利用したデバイスの性能を完全に設計予測できる道が開かれその意義は大きい。(2)また、非線形界面動電現象の基礎解明の前提となる“拡散イオン系の基本問題の解明"を進め、イオンの立体効果を考慮したイオン保存型ポアソン・ボルツマン理論を構築すること(課題2A)、及び、直接シミュレーション法により平行電極のエッジ部に流れが発生する現象を解明すること(課題2B)を達成できた。特に、2Aにより、全濃度領域をカバーできる設計手法を確立できる道が開かれた。また、2Bにより、開放系電極におけるイオンの取り込み問題を明らかにできた意義は大きい。(3)さらに、大目的である「基礎と設計基盤の確立」の強化と発展のため、非線形界面動電現象を用いたマイクロ流体素子(ポンプ、キャチャー、セパレータ)の提案と理論検証を進めるとともに、非線形界面動電現象に由来する自己組織化問題やナノホール問題について基礎的な解明を進めることができた。以上、今年度の成果は、本研究の進展が将来の革新的な小型血液診断システムや小型遺伝子診断システム等の実現に、ますます重要となることを明確に示している。研究実績の概要で記載したように、当該年度において、一流紙であるPhysical Review誌1本を含む8本の関連論文(Physical Review誌1件、Journal of Physical Society of Japan誌6件、他1件)を掲載することができ、本研究の目的である「非線形界面動電現象の基礎及びその設計基盤を確立すること」に関する研究群を前倒しに遂行できている。詳しくは、3年間で達成を目指している目標3項目6要素課題(1A3B)について、以下の3要素課題(1A,2A,2B)について論文掲載まで完了しており、当初の平成28年度目標「2つの要素課題完了」に対して、150%の達成度の進捗状況である他、さらに大目的である「基礎と設計基盤の確立」の強化と発展のために5論文が論文掲載まで完了し、進捗は極めて良好な状態にあり、さらなる発展が期待される状況にある。当該年度において、一流紙であるPhysical Review誌1本を含む2本の関連論文を掲載することができた。これにより、2年間でPhysical Review誌2本、他8本(合計10本)の論文掲載実績を得、本研究の目的である「非線形界面動電現象の基礎及びその設計基盤を確立すること」を着実に遂行できている。特に、当該年度の論文で示したように、理論予測した「非線形界面動電現象による粒子配列」や「非線形界面動電現象による人工繊毛の動き」が初めて実験的に検証された意義は大きい。ただし、新しい知見は、さらに興味深い基本課題と応用課題に関する展開が重要であることを示しており、このことを意識した研究を展開している。例えば、当初課題(3)「非線形界面現象の観察に影響する"複雑な溶液/電極反応の解明"については、広く「電流注入過程を含む非線形界面動電現象の解明」の問題と捉え、理論及び実験面での検討を行っている状況にある。また、1A,2A,2Bの課題は完遂されているため、当初課題(1)「直接シミュレーション法による非線形界面動電現象の基本問題の解明」及び(2)「前提となる拡散基本系の基本問題の解明」はほぼ達成されているが、残課題1aの「イオン濃度の増加による流速の現象の解明」については、さらに広い視点に立った解明が必要である可能性があり、検討を進めている。

以上、これまでの成果は、本研究の進展が将来の革新的な小型血液診断システムや小型遺伝子診断システム等の実現に、ますます重要となることを明確に示している。また同時に、さらなる展開と飛躍のための、基礎固めと技術の芽を獲得することがますます重要な時期に来ている。研究実績の概要で記載したように、これまでに、一流紙であるPhysical Review誌2本を含む10本の関連論文(Physical Review誌2件、Journal of Physical Society of Japan誌7件、他1件)を掲載することができ、本研究の目的である「非線形界面動電現象の基礎及びその設計基盤を確立すること」を着実に遂行し、大きな成果を得ている。ただし、当初課題より重要な課題が増えているため、1A,2A,2Bを完遂しているものの、課題1B、3A、3Bについては、さらなる価値を生み出すために、より先進的な視点に立った検討を進めている段階にあり、論文として掲載されるレベルまでにはあと1年が必要と考えている。この意味で、当初課題についてはおおむね順調な状況考えているが、研究としては、実験検証を成功させるなど、先進的な研究を着実にかつ順調に展開し、更なる発展が期待できる良好な状況にあると考えている。平成30年度において、一流紙であるJournal Fluid Mechanics (JFM)誌1本を含む4本の関連論文を掲載することができた。これにより、3年間でPhysical Review誌2本、JFM誌1本、他11本(合計14本)の論文掲載実績を得、本研究の目的である「非線形界面動電現象の基礎及びその設計基盤を確立すること」を着実に遂行・発展させることができた。特に、交付申請書に記載した「研究の目的」「研究実施計画」に照らし、次の結果を得た。1非線形界面動電現象の基本問題を解明する目的に関し、イオンの立体効果を考慮したイオン濃度依存性の直接シミュレーションを初めて行い、高濃度での流速の減少はイオンの立体効果によるものではない可能性が高いことを明らかにし、目的を完了した[投稿中]。2拡散イオン系の基礎基盤を確立する目的に関し、すでに当初の課題を完了している。3非線形界面動電現象に影響する複雑な溶液/電極反応の解明に関して、Frumkin-Butler-Volmer(FBV)の式を用いた1次元系解析を経て、2次元系では電流モードで非線形界面動電現象が起こること予測してきた。この予測の展開として、静電遮蔽が不完全となるような高電圧下の拡散とFBV式を組み合わせた基礎式の確立が重要と考え、まず、静電遮蔽が不完全となるような高電圧の解析解を明らかにした[投稿中]。以上より、当初の目的は、ほぼ完了できたと考えているが、JFM誌で明らかにしたように非線形界面動電現象には、熱流や温度勾配と関係した複雑な現象があり、さらなる展開が必要と考えている。残りの主要な3要素課題、すなわち、(1B)
水圏生物からの抗腫瘍リ-ド化合物の開発と創製

伊豆半島産群体ホヤRitterella tokioka Kott,1992からは強い細胞毒性を示した新規ステロイド二量体のritterazine類26種を単離した。沖縄産紅藻Laurenciabrongniartiiからは、新規インドールを単離・構造決定した(P388に対する細胞毒性IC_<50>>10および2.5μg/mL)。海藻イチイズタから3種の新規化合物を得た(HL-60に対する細胞毒性IC_<50>0.1-1.5μg/mL)。海藻ヨレモク、アメフラシ、ダイダイイソカイメン、マフグ、およびムラサキウニ由来真菌と海生菌の抗腫瘍性代謝産物の探索を行い、37の化合物を得た。これらのうちアメフラシ由来真菌Periconia byssoidesから得たpericosine AはP388 in vivo試験で延命効果(T/C121%)が認められた。
新たに同定した肥満関連遺伝子の機能解析と新規肥満関連遺伝子の検索

セクレトグラニン3(SCG3)と結合するタンパク質としてセクレトグラニン2(SCG2)を同定した。SCG2は視床下部に高発現し、特にオレキシン、MCH、NPY、POMCニューロンに発現していた。また、SCG2は食欲調整ペプチドのオレキシン、MCH、NPY、POMCと結合した。SCG2はオレキシン、MCH、NPY、POMCの自己凝集を促進する作用があることを明らかにした。以上の結果からSCG3はSCG2を介して、オレキシン、MCH、NPYと結合し、分泌顆粒を構成することが示唆された。SCG3とSCG2の視床下部における発現は絶食にて増加した。しかし、高脂肪食負荷による肥満や遺伝性肥満であるob/obマウスでは発現に変化を認めなかった。このことから、SCG2、SCG3は急激な体重減少や代謝の変化(インスリン、血糖値、レプチンの低下)に伴いその発現量が変化し、食欲調節に関与していることが示唆された。一方、海外から新たに肥満関連遺伝子が報告されたので、日本人において肥満との関連性を検討した。すでに報告しているFTOに加えて、SEC16B、TMEM18、BDNFが日本人でも有意に肥満と相関することが明らかとなった。TMEM18、BDNFは視床下部に多く発現している。また、SEC16BはSCG2やSCG3と同様に分泌に関わるタンパク質である。BDNFは食欲調整ペプチドそのものである。以上から、視床下部における食欲調整ペプチドとその分泌機構が肥満発症に重要であることがわかってきた。肥満には糖尿病、脂質代謝異常、高血圧、脂肪肝などの合併症が生じる。肥満に合併症が生じた状態は肥満症と称し治療の対象になる。平成22年度は肥満症発症の重要な因子である内臓脂肪蓄積に関連する遺伝子について検討した。ゲノムワイド相関解析により同定されたウエスト径に関連しているFT0、NRXN3、TFAP2B、MSRA,LYPLAL1、MC4Rの遺伝子上や近傍のSNPについて日本人で検討した。NRXN3のSNPは日本人では多型ではなく、人種により異なることが示唆された。FT0遺伝子上のSNPのみが、CTで測定した内臓脂肪面積に関連していた。このSNPは皮下脂肪面積にも関連していた。他のSNPでは内臓脂肪面積、皮下脂肪面積ともに相関が認めらなかった。人種差、検出力の問題、ウエスト径と内臓脂肪面積の関連性などいくつかの理由が考えられた。肥満の合併症で最も頻度の高いのは非アルコール性脂肪肝障害(NAFLD)である。NAFLDのなかには単純性脂肪肝と非アルコール性脂肪肝炎(NASH)が含まれる。NAFLDでNASHまで進行しているかどうかは最終的には肝生検による組織診断が必要である。これまでNAFLDの遺伝子検索を行ってきて、遺伝素因が重要であることを示唆してきた。脂肪肝に関連すると報告されたPNPLA3遺伝子のrs738409について検討した。このSNPはNAFLDと強い相関を示した(P=9.4×10^<-10>)。年齢、性別、BMIを考慮したアレル特異的オッズ比は1.73 (1.25-2.38)と他の生活習慣病に比較し高かった。AST、ALT、線維化指数とも関連しており、PNPLA3はNAFLDの発症、進展に関連していることが示唆された。このSNPは内臓脂肪面積や肥満との関連性は認められず、肥満でNAFLDになる人とならない人では遺伝素因が重要であることが示唆された。これまでに同定した肥満関連遺伝子SCG3とMTMR9に加えて、海外で報告された肥満関連遺伝子がメタボリックシンドローム発症に関連しているか検討を行った。メタボリックシンドローム患者1096人と代謝異常を持たないコントロール581人で相関解析を行った。その結果、SCG3、MTMR9とFTOの遺伝子多型がメタボリックシンドロームに有意な相関を示した。3個の遺伝子は脂質代謝異常、糖代謝異常、高血圧すべてに関連していた。メタボリックシンドローム発症に中心的役割を果たすのは、内臓脂肪蓄積である。すでに、肥満、2型糖尿病、脂質代謝異常、高血圧に関連する遺伝子多型が報告されてきているので、これらの遺伝子多型が内臓脂肪蓄積に関連しているかを検討した。CTで測定した内臓脂肪面積と皮下脂肪面積のデータのある1279人を対象に10個の肥満関連遺伝子について検討し、SH2B1 rs7498665が内臓脂肪面積と有意に相関することを見出した。SH2B1 rs7498665はメタボリックシンドロームにも強い相関を示し、メタボリックシンドローム発症に重要な遺伝子であることを見出した。また、11個の高血圧関連遺伝子について検討し、CYPI7A1 rs1004467とNT5C2 rs11191548が女性で内臓脂肪面積と皮下脂肪面積の減少に関連することを見出した。高血圧発症に関する遺伝子多型は内臓脂肪を減少させることが示され、高血圧関連遺伝子は内臓脂肪蓄積と関係ないことを報告した。糖尿病関連遺伝子ではFTOのみが皮下脂肪面積と相関し、ほとんどの2型糖尿病発症関連遺伝子は内臓脂肪蓄積とは無関係であることを報告した。
単純形状の組合せにより桁違いの高精度を実現するナノ精度凹曲面原器の開発

機械装置には凹形の複雑な幾何曲面形状を有する部品が多く用いられる。このような部品の測定機には高い測定精度を保証することが求められるが、現状の校正用アーティファクトの精度は低い。本研究では、凹曲面形状を高精度に精度保証するための検査・校正用凹曲面アーティファクトを開発し、それを用いた測定機精度検査・校正法を構築した。アーティファクトを製作し、測定機検査・校正法の検証実験を行ない、提案した方法が有効であることを確認した。このような部品は、部品表面の微細な凹凸形状が性能・品質に大きく影響する。このため、製品の検査工程において、曲面形状専用測定機や三次元測定機による形状測定が行われる。機械部品に要求される精度がマイクロメートルレベルであるため、これらの測定機にはより高い測定精度を保証することが求められる。このような測定機は、より精度の高い原器を用いて検査・校正がなされる。測定機の精度は原器の精度以上のものとはなり得ないため、原器には極めて高い精度が要求される。しかしながら、現状の原器の精度はマイクロメートルレベルしかないため、検査・校正された測定機の精度は産業界の要求を満足するものとはなっていない。このような状況を鑑み、本研究では、凹曲面形状を高精度に精度保証するための検査・校正用原器を開発し、それを用いた測定機精度検査・校正法を構築することを目的とする。これまでに、提案した凹曲面原器の測定状況を分析し、有効性を理論的に検証した。凹曲面の測定方式には種々の方式があるため、その調査を行った。凹曲面原器により曲面形状測定機を検査・校正する状況について、シミュレーションを行い、検査・校正方法を構築した。そして、凹曲面原器の設計を行った。また、原器に適した材料・加工法を調査した。それに基づき、凹曲面原器の製作を行った。つぎに、製作した凹曲面原器の精度評価を行った。精度評価測定には三次元測定機を用い、これにより、製作した凹曲面原器が有する精度を明らかにした。製作した凹曲面原器を用いて、測定機検査・校正法の検証実験を行なった。これにより、提案した方法が有効であることを確認した。

平成23年度は、提案した凹曲面原器の測定状況を分析し、有効性を理論的に検証した。また、凹曲面原器の設計を行い、それに基づいて製作した。1凹曲面の測定方式には種々の方式があるため、その調査を行った。2凹曲面原器により曲面形状測定機を検査・校正する状況について、シミュレーションを行い、検査・校正方法を構築した。3凹曲面原器の設計を行った。原器に適した材料・加工法を調査した。それに基づき、凹曲面原器の製作を行った。当初の研究実施計画で平成24年度に実施を予定していた、製作した凹曲面原器の精度評価については完了した。一方、測定機の検査・校正法の検証実験は次年度に実施することとした。このことから、やや遅れていると判断する。当初の研究実施計画の通りに実施できていることから、おおむね順調に進展していると判断する。平成25年度は、製作した凹曲面原器を用いて、測定機検査・校正法の検証実験を行なう。これにより、提案した方法が有効であることを確認するとともに、問題点を明らかにする。平成24年度は、製作した凹曲面原器を用いて、測定機検査・校正法の検証実験を行い、提案した方法が有効であることを確認するとともに、問題点を明らかにする。検査・校正のプロセスを詳細に解析した結果、購入を予定していた駆動装置、位置姿勢調整機器、移動運搬機器の構造を変更する必要が生じた。このため、計画を変更し、これらの機器の購入と検査・校正法の検証実験を次年度に行うこととした。このため、未使用額はこれらの機器の購入と検査・校正法の検証実験にかかる経費に充てる。平成23年度に購入を予定していた、駆動装置や位置姿勢調整機器、移動運搬機器を平成24年度に購入することとしたため、次年度(平成24年度)に使用する予定の研究費が発生する状況となった。平成24年度に請求する研究費と合わせて、測定機検査・校正法の検証実験の実施費用と実施に必要となる機器の購入費用、ならびに、実験のための人件費と旅費として使用する予定である。
細胞分裂期に作用する抗がん剤に対する耐性克服のための基礎的研究

本研究では、抗がん剤により細胞周期停止が持続した後に起こる細胞死に関与する分子を同定することを目的とした。我々が発見した新規分子CAMPをノックダウンした細胞を微小管阻害剤で処理したところ、がん細胞特異的に細胞周期停止持続後の細胞死の促進が観察された。がん細胞株ではCAMPの発現が高い傾向が見られ、がん細胞の生存がCAMPに依存している可能性が考えられた。またCAMPをノックダウンした細胞ではアポトーシスを抑制する機能をもつBcl-2ファミリー分子であるMcl-1およびBcl-xLの発現が低下していることがわかり、CAMPが抗がん剤治療のターゲットとなる可能性が考えられた。本研究は、抗がん剤により細胞周期停止が持続した後に細胞死が起こる機構を明らかにし、細胞死が起きるタイミングに関与する分子を同定することを目的とする。このような分子は、個々のがん症例での抗がん剤感受性の予測や、より有効な抗がん剤治療のターゲットとなるものと考えられる。平成25年度は、以下のような解析を行った。1.細胞周期停止による細胞死とCAMPとの関係の検討多種類のがん細胞株を複数の分裂期にはたらく抗がん剤(タキソール、ビンクリスチン)で処理し、ライブ観察に代わる簡便な方法としてMTTアッセイにより評価した。その結果ほとんどのがん細胞株でCAMPノックダウンによる細胞死の促進が観察された。一方多くの正常線維芽細胞では、CAMPノックダウンによる細胞死の促進は見られなかった。検討した細胞株についてCAMPの発現量を調べたところ、がん細胞株で発現が高い傾向が見られ、がん細胞の生存がCAMPに依存している可能性が考えられた。また個体および細胞レベルでのCAMPの機能を明らかにするためにCAMPノックアウトマウスの作製を試みたところ、胎生致死であることが判明し、現在致死となる原因を解析している。2.細胞周期停止による細胞死に関与する分子ネットワークの解析CAMPと結合する分子としてHP1 (heterochromatin protein 1)が同定され、現在その意義について解析している。3.細胞死のタイミングを決定するしくみの解析HeLa細胞とMCF-7細胞でCAMPをノックダウンした細胞でのBcl-2ファミリーの発現を調べたところ、Mcl-1とBcl-xLの発現の低下が認められた。4.CAMPノックダウンによる抗がん剤の増強効果の解析HeLa細胞とA549細胞を用いてヌードマウスでの造腫瘍効果を調べる条件を確立し、CAMPノックダウンの効果を検討中である。平成24年度は、アポトーシスの制御に関係するBcl-2ファミリー分子Mcl-1と新規分子CAMPの関係の解析を行った。1.細胞周期停止による細胞死とCAMPとの関係の検討CAMPノックダウン細胞を微小管阻害剤であるtaxolで処理し、ライブセルイメージングで観察したところ、細胞周期停止持続後の細胞死の促進が観察された。染色体分配に関与するch-TOGなど他の分子のノックダウンでは、細胞死の促進は観察されなかった。またWI-38などの正常線維芽細胞では、CAMPノックダウンによる細胞死の促進は見られなかった。これらのことから、CAMPの抑制は、がん細胞特異的に細胞周期停止持続後の細胞死を促進することがわかった。また個体および細胞レベルでのCAMPの機能を明らかにするために、CAMPノックアウトマウスの作製を進め、ヘテロノックアウトマウスが得られた。CAMPのどの領域が細胞死と関連しているかを調べるために、CAMPの種々の欠失変異体を発現させてtaxolによる細胞死を観察したところ、N末端側の領域で細胞死の遅延が認められた。2.CAMPとMcl-1の関係の検討CAMPをノックダウンした細胞でMcl-1の発現を調べたところ、著明な発現の低下が認められた。またほかのBcl-2ファミリー分子であるBcl-xLについても発現が低下していた。CAMPの抑制が、細胞周期停止持続後の細胞死を促進することを確認した。またこの効果ががん細胞特異的に見られることを明らかにした。この細胞死の促進にはCAMPのN末端側の領域が関係していることがわかった。CAMPノックアウトマウスの作製は順調に進んでいる。またCAMPをノックダウンした細胞では、Bcl-2ファミリー分子であるMcl-1およびBcl-xLの発現の低下が認められた。このように、平成24年度の計画をほぼ達成しており、研究はおおむね順調に進展していると考えられる。当初の計画通り、CAMPおよびMcl-1と結合する分子を探索し、その中から細胞死のタイミングに関係するものを同定する。

これらの分子間の関係を明らかにすることにより、どのようにして細胞死のタイミングが制御されているのかを明らかにする。本研究の成果は、抗がん剤への感受性の予測や、耐性の起こりにくいがん治療の開発につながると考えられるため、臨床への応用に向けた基礎検討を行う。まず種々のがん細胞株でのCAMPの発現量を調べ、抗がん剤への感受性との相関を調べる。またCAMPの抑制による細胞死の促進を多数のがん細胞株で検討し、その効果の一般性・特異性を調べる。さらにCAMPをノックダウンしたがん細胞をマウスに移植し、その増殖や抗がん剤に対する感受性を検討する。一方CAMPノックアウトマウスを作製し、個体レベルおよび細胞レベルでのCAMPノックアウトの影響を調べる。当初の予定より効率よく実験を進めることができたため、物品費を計画より少なく抑えることができた。また本研究の成果を特許として申請することを検討しているため、学会発表の予定をとりやめた結果、旅費の支出がなかった。以上の理由により生じた平成25年度に使用する予定の研究費は、平成25年度に請求する研究費と合わせて、細胞死のタイミングを制御する分子の探索に使用する。CAMPやMcl-1等と結合する分子を質量分析によって解析するのに多額の費用を要することが予想されるため、当該研究費をその費用に充当する。
転写因子C/EBPファミリーによる軟骨代謝調節メカニズムの解析

C/EBPδホモ欠損マウスおよびC/EBPε欠損マウスにおいては明らかな骨格形成異常は認められなかったが、C/EBPβホモ欠損(-/-)マウスは同胞野生型(+/+)マウスに比べて胎生期より成長障害が見られ、肢芽でのCOL10、MMP13の発現が低下していた。またC/EBPβヘテロ欠損(+/-)マウス(8週齢)の膝関節に実験的OAモデルを作成した場合でも、+/+マウスに比べて関節軟骨でのCOL10、MMP13の発現の低下と共に軟骨変性が抑制された。C/EBPβはRunx2のco-factorとして知られているため、C/EBPβとRunx2の複合遺伝子欠損マウス(C/EBPβ-/-; Runx2+/-)を作成したところ、同胞C/EBPβ-/-マウスよりも強い成長障害を認めた。組織学的検討には、軟骨内骨化の遅延および一次海綿骨量の低下を認め(alcian blue/von Kossa二重染色)、COL10の発現はC/EBPβ-/-と同程度であったがMMP13の発現が著明に低下していた。このメカニズム解明のため、ヒト軟骨系細胞株SW1353にC/EBPβとRunx2を共導入すると、増殖能(CCK-8 assay)は単独導入と同程度であったが、各種軟骨分化マーカーの中でMMP13の発現(real-time RT-PCR)が相乗的に上昇した。一方、C/EBPβとRunx2の発現は相互の強制発現によって変化はなく、独立した制御が示された。MMP13 promoter-luciferase gene construct導入SW1353にC/EBPβとRunx2を過剰発現させたところ、協調して転写活性を促進することが示され、更に段階的deletion、mutagenesis、tandem-repeat constructを用いた検討によって、MMP13遺伝子の転写開始点上流-144-89 bpの部位にOSE2に加えC/EBPモチーフを含む応答領域を同定した。C/EBPβはRunx2と協調してMMP13を転写誘導し、骨格成長やOAの軟骨変性を制御していることが示された。C/EBPβ、Runx2の相互作用は成長障害およびOAなどの軟骨変性疾患などの治療ターゲットとなりうることが示唆された。初年度の研究の結果、以下の成果を得ることが出来た。1)生理的条件下でのC/EBPβ,δ,ε単独遺伝子欠損マウスの軟骨組織解析C/EBPβ,δ,ε単独遺伝子欠損マウスについて骨格系における表現型の解析を行った。C/EBPβ遺伝子欠損マウスでは、胎生期より軟骨内骨化の遅延を伴う成長障害を認めるものの生後その障害は徐々に解消された。このマウスにおいては各種免疫化学染色やin situ hybridizationではX型コラーゲンやMMP13の発現の低下を確認することが出来た。C/EBPδ,εそれぞれの遺伝子欠損マウスは胎生期、生後を通じて明らかな骨格系の異常は確認できなかった。

2)病的条件下でのC/EBPβ,δ,ε単独遺伝子欠損マウスの軟骨組織解析変形性関節症モデルにつき検討を行った結果、C/EBPβ遺伝子欠損マウスでは軟骨変性の進行が抑制され、同マウスにおける変性軟骨部でのX型コラーゲン、MMP13の発現量は低下していた。C/EBPδ,εそれぞれの単独遺伝子欠損マウスではこのような明らかな差は認められなかった。3)軟骨細胞におけるC/EBPファミリーの上流・下流のシグナル分子の同定1)、2)の結果から軟骨細胞における作用はC/EBPβが最も強い作用を持っていることが示唆されたため、主にC/EBPβにつき下流シグナル分子の同定を行った。具体的にはマウス間葉系細胞株C3H10T1/2にC/EBPβおよびコントロールベクターを強制発現させ、DNAマイクロアレイによる下流分子の網羅的解析を行った。その結果、肥大分化において促進的な作用を有している転写因子X(解析中のため公表は控える)をその標的候補分子の一つとして同定した。2年目となる本年は以下の成果を得ることができた。1)生理的条件下でのC/EBPβ,δ,ε単独遺伝子欠損マウスの軟骨組織解析(後半):C/EBPβ,δ,ε遺伝子欠損マウスとWTの新生仔肋軟骨から軟骨細胞を採取して以下の検討を行った。軟骨細胞の増殖を評価した結果、特にC/EBPβ遺伝子欠損により軟骨細胞の増殖能が更新していること、およびその下流で細胞周期関連因子としてCDKインヒビターの一つであるp57の発現が関与していることが明らかとなった。また、軟骨細胞分化についてはC/EBPβ、δ、εいずれにおいても遺伝子欠損により肥大分化以降にかかわる各種マーカーの発現の低下を確認することができた。2)病的条件下でのC/EBPβ,δ,ε単独遺伝子欠損マウスの軟骨組織解析(後半):OAモデルについての解析を引き続き行った。外科的手術を行い膝の不安定性を惹起するモデルのみならず、自然経過例におけるOAの進行についての検討を行い、C/EBPβ遺伝子欠損マウスでのOAの進行が抑制される傾向を確認した。3)軟骨細胞におけるC/EBPファミリーの上流・下流のシグナル分子の同定(後半):これまでの解析結果から軟骨細胞においては最も強い作用を持っていることが示唆されるC/EBPβの上流シグナルについてそのプロモーターを用いた検討を行った。軟骨分化にかかわる各種転写因子を作用させ、このプロモーター領域を組み込んだレポーターベクターと共導入したところ、HIF2αが最も強い転写活性を有していることが判明した。さらに、プロモーター領域の段階的欠失、変異コンストラクトにより、その応答領域としてC/EBPβプロモーター上にhypoxia responsive element (HRE)motifを同定し、同部へのHIF2αの結合性も確認することができた。最終年度である本年は以下の成果を得ることができた。4)C/EBPβ,δ,εの複合遺伝子欠損マウスの作成と生理的・病的条件下での軟骨組織の解析これらの遺伝子欠損マウスを交配させ、C/EBPβ;C/EBPε遺伝子欠損マウスならびにC/EBPδ;C/EBPε遺伝子欠損マウスを作製した。C/EBPδ;C/EBPε遺伝子欠損マウスにおいては生理的な骨格成長を経時的におって解析したものの明らかな骨格形成の異常は確認できなかった。
学部向け計算科学教育におけるニーズ型教材の開発

計算科学教育の多くは大学院向けであり、学部学生向けに計算科学の必要性や計算科学の考え方を教える教材は少ない。本プログラムは学部学生向けの計算科学教材、とくに、数値計算技法や計算機技術などの知識「シーズ」から出発するのでなく、具体的な物理の問題を解決する必要性「ニーズ」から出発する計算科学教材の開発を目指した。プログラミングや数値計算技法を知らなくても、エクセルなどの既存のソフトウェアを使うことで計算科学の考え方を学べる教材を目指す。力学・電磁気学・統計力学・熱力学・量子力学の幾つかのトピックについてパイロット教材を作成した。本研究の目的は、大学学部向けの計算科学教育用の教材開発をおこなうものである。3年間で、従来の数値計算や計算機技術から出発するシーズ(seeds)型計算科学教育ではなく、計算科学の必要性から出発するニーズ(needs)型の計算科学教育教材の開発を行い、新しい計算科学教育の体系化に向けた検証を行う。そのため、初年度は研究目標は、(1)教材開発ためのツールの調査を行うこと及び(2)パイロットプログラムとして幾つかのトピックスに限定したモデル教材のコンテンツを作成することを計画した。しかし、教材開発ためのツールの調査については対話型教材にするためのツールが決まらなかった。また、量子力学のモデル教材である「エネルギー固有値問題」と統計力学のモデル教材である「ブラウン運動」に関してはコンテンツのプランはできたが、ビデオ撮りなどのパッケージ化には至っていない。力学と電磁気学についてのコンテンツのプランも含めて具体的な教材開発は次年度に持ち越すことになった。本研究の目的は、大学学部向けの計算科学教育用の教材開発を行うものである。3年間で、従来の数値計算や計算機技術から出発するシーズ(seeds)型計算科学教育ではなく、計算科学の必要性から出発するニーズ(needs)型計算科学教育の開発を行い、新しい計算科学教育の体系化に向けた検証を行う。そのため、27年度の研究目標は初年度に引き続き、パイロットプログラムとして幾つかのトピックスに限定したモデル教材のコンテンツを作成することである。実績はとしては予定より遅れている。「エネルギー固有値問題」「ブラウン運動」などのコンテンツは依然作成中である。作成の上で、(1)双方向性をコンテンツにどう組み込むか、(2)コンテンツ毎の難易度が大きくばらついていること、が作成の上で困難となっている。(1)双方向性をコンテンツにどう組み込めないでいる。これは主にアプリケーションの選択という技術的な問題である。(2)コンテンツ毎の難易度が大きくばらついていること、例えば、「ブラウン運動」はサイコロを振る、エクセルを操作するといった、高校生でも参加できる内容であるが、「エネルギー固有値」は量子力学の題材であり、使用するシーズも拡散方程式の解法と全体に難度が高い。その差が大きく統一感の書いた教材になっているのが問題である。本研究の目的は、大学学部向けの新しい計算科学教育用の教材の検証である。従来の数値計算や計算機技術から出発するシーズ(seeds)型計算科学教育ではなく、物理や化学などの現場で発生する計算科学の必要性から出発して数値計算や計算機技術を扱うニーズ(needs)型計算科学教育を行い、新しい計算科学教育の体系化に向けた検証を行う。そのために幾つかのモデル教材でコンテンツを作成し、教育効果を検証することが28年度の研究目標はパイロットプログラムとしての幾つかのトピックスに限定したモデル教材のコンテンツを作成することであるが、実績としては予定より遅れている。モデル教材として固有値問題(量子力学)、ブラウン運動(統計力学)、微分方程式(力学)、波動現象(電磁気学)、をあつかっているが、以下の問題が解決できないでいる。(1)モデル教材に使われるプログラムの難易度の差が大きく、これがコンテンツ自体の難易度のばらつきにつながっている。(2)ニーズ型を標榜している以上、コンテンツの物語性が大事なのだが、物語性を意識したコンテンツの作成が難しく、講義をコンテンツに落とし込む作業が停滞している。(3)一部の教材ではプログラムが完成していない。現状では十分な実績をあげているとは言えない。今後はモデル教材の完成に集中し、すべての教材でプログラムを作り、一部に限って映像コンテンツを作るなど、「ニーズ型教材」の検証ができるようにしていきたい。例えば、「ブラウン運動」ではサイコロを振る、エクセルを操作するといった、高校生でも参加できる内容で確率変数や拡散現象を学べるが、エネルギー固有値は量子力学の問題であり、計算機でシュレディンガー方程式の固有値問題を解くために拡散方程式を使うなど、ニーズもシーズも共に難易度が高い。その差が大きく、「ニーズ型教材」コンテンツの統一性がない。作成の物語性が大事なのだが、物語性を意識したコンテンツの作成が難しく、講義をコンテンツに落とし込む作業が停滞している。数値計算技法や計算機技術などの知識「シーズ」から出発するのでなく、具体的な物理の問題を解決する必要性「ニーズ」から出発する計算科学教材、すなわち、プログラミングや数値計算技法を知らなくてもエクセルなどの既存のソフトウェアを使うことで計算科学の考え方を学べる教材、「ニーズ型計算科学教材」の開発を目指した。力学・電磁気学・統計力学・量子力学の幾つかのトピックについてモデルとなるパイロット教材の作成を行い、評価を行うことを目的とした。

統計力学の教材である「ブラウン運動を学ぶ」では顕微鏡でブラウン運動を観察したあと、サイコロ等の具体的な乱数に関する実験を行った後、エクセルを使って分散・平均などの統計量を計算してランダムな乱数の統計量に現れる規則性を体感し、更にエクセルを使って乱数の軌跡がブラウン粒子の運動とおなじになることを示し計算機の必要性を実感させた。さらにブラウン粒子と分子の衝突シミュレーションプログラム(本プログラムの資金によりJava系言語で作成したもの)を用いて、分子不可視のまま粒子の運動がランダムであることを確認させたあと、分子を可視化してブラウン運動の原因が分子の衝突にあることを理解させて、更にアインシュタインの理論を紹介した。以上のコンテンツを高校一年生向けの一日講義のために開発し、後に大学一年の演習にも使用した。この講義は非常に好評であり計算科学の必要性を理解させるものであった。このコンテンツはWEBにて公開する予定である。その他の教材も開発したが、計算機の知識のない受講生にソルバーを容易に自作させるのは難しく、この方法の開発がこの研究の今後の課題になると思われる。計算科学教育の多くは大学院向けであり、学部学生向けに計算科学の必要性や計算科学の考え方を教える教材は少ない。本プログラムは学部学生向けの計算科学教材、とくに、数値計算技法や計算機技術などの知識「シーズ」から出発するのでなく、具体的な物理の問題を解決する必要性「ニーズ」から出発する計算科学教材の開発を目指した。プログラミングや数値計算技法を知らなくても、エクセルなどの既存のソフトウェアを使うことで計算科学の考え方を学べる教材を目指す。力学・電磁気学・統計力学・熱力学・量子力学の幾つかのトピックについてパイロット教材を作成した。教材開発ためのツールの調査に関しては、Flash、Python (Numpy/Scipy)などのアプリケーションを検討した。しかし、対話型の教材をつくるためのアプリケーションはまだ決まっていない。モデル教材の作成は初年度に2本の教材を作る計画であった。コンテンツに関しては既に出来上がっており、実際の学部向け講義や初学者向け講義で検証を行っている。しかし、ビデオ撮りなどの教材化・パッケージ化まではできなかった。現状では、講義の様子をビデオにとった教材という双方向性を欠いたものを作成するしかなく、また、難度や演習対座学の比に偏りがある、統一感がないパッケージ群しか作れない。しかし、それらを「たたき台」として、作成における問題点を洗い出すことを今後の研究目的とする。モデル教材の双方向性・映像などの高機能や完成度には頓着せず、すべてのモデル教材でコンテンツを作成することを目標とする。「ニーズ型教材」の検証ができるようにしていきたいし、それができない場合は、その理由となる問題点を洗い出すことを今後の研究目的とする。計算流体力学、液体論今年度はモデル教材の開発を中心行う。特に、量子力学の比較的難度の高いモデル教材である「エネルギー固有値問題」と統計力学の入門的教材である「ブラウン運動」に関してはビデオ撮りまで含めた具現化を行う。
高温超伝導薄膜の構造と基礎特性

本研究は、新超伝導エレクトロニクスの基礎となる酸化物高温超伝導膜の作成とその物性評価を目標としている。本年度は、とくにYBa_2Cu_3O_7(YBCO)およびBi_2Sr_2CaCu_2O_8(BSCCO)膜の表面観察と磁化特性に重点をおいて研究した。スパッタ-成膜において、基板の選択(SrTiO_3とMgO),温度と雰囲気の通正化により、C軸配向性のよいYBCO膜とBSCCO膜が得られるようになった。この膜の構造は通常、X線で観測するが、原子スケ-ルで超伝導状態の表面を観察するため、STM技術を低温に拡張し、液体ヘリウム濃度で、少なくともBSCCOの長固期格子変調構造を把えることに成功した。(裏面リストの第2,第4論文)一方、高温超伝導膜のC軸に平行に磁場を印加して、磁化曲線を測定したところ、そのヒステリシス特性が、適当なスケ-リングにより、物項(YBCOかBSCCO)や温度に依存しないユニバ-サル挙動を示すことを見つけた。さらに、このユニバ-サリティは、磁東クリ-プの立場から一般的に説明可能なことを簡単な仮定のもとで示した。(第3,第6論文)。このユニバ-サリティは、複雑で解釈が混乱している高温超伝導体の混合状態における磁東の挙動を整理する上で、重要な物と考える。YBCOの銅元素の一部を鉄でおきかえた系におけるメスバウア効果の解釈をめぐって、多数の説が公表されている。われわれは、試料の熱処理時の雰囲気により生じるスペクトルの差を利用して、新しい解析方法を提案し、メスパウア分光のデ-タ解析に一つの方向を示すことができた(第1論文)。ミクロな観点から高温超伝導体を評価するアプロ-チの一つとなろう。その他、超伝導デバイスのフィ-ジビリティに関する考察も進めている。(第5論文)本研究は、新超伝導エレクトロニクスの基礎となる酸化物高温超伝導膜の作成とその物性評価を目標としている。(第3,第6論文)。(第5論文)
シナプスにおけるエンドサイトーシス機能タンパク-膜リン脂質相互作用の解析

Amphiphysin 1によるDynamin GTPase活性の上昇Dynamin1GTPアーゼ活性に対するAmphiphysin1と膜脂質の影響を調べ、Amphiphysin 1が、大型リポゾームの存在下にDynamin 1のGTPアーゼ活性を上昇することを明らかにした。リポゾームにフォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール2リン酸などの酸性リン脂質を含まれる場合、特にGTPアーゼ活性の増強効果が高かった。ミュータントAmphiphysin1を用いた解析により、Dynamin 1GTPアーゼ活性の増強には膜脂質への結合を担うBARドメインと、dynaminとの結合ドメインであるSH3ドメインが必要でであることを明らかにした。また、クラスリン結合部位、AP2結合部位を含む中間部は、Dynamin 1GTPアーゼ活性に対して抑制的に働くことが示唆された。リポゾームを用いた結合実験により、Amphiphysin 1がDynamin 1と膜脂質の結合を増加させることを明らかにした。この結合増加の一因は、Amphiphysin 1のBARドメインとSH3ドメインを介した間接的結合によるものであることを、ミュータントAmphiphysin 1を用いた解析により明らかにした。ミュータントAmphiphysin 1を用いた解析により,Amphiphysin 1とDynamin 1のリング形成にはBARドメインとSH3ドメインが必要であることを明らかにした。また、リング形成とDynamin 1 GTPアーゼ活性の上昇が、Dynamin 1と膜結合性にある程度相関することを示唆した。以上の成果を論文にまとめ発表した。シナプス小胞膜のエンドサイトーシスにおいて、Dynamin IはAmphiphysin Iとともにクラスリン被覆ピット頚部にリング状に重合し、小胞形成に機能する。また、その足場としてPhosphatidylinositol 4,5-bisphosphate[PI(4,5)P_2]が重要である。今年度は以下のことを明らかにした。1.脳抽出脂質を用いて作製した単層大型のリポソームを、ヌクレオチド存在下で脳細胞質と反応させると、多数の小胞(直径200nm以下)が形成され、その小胞形成を動的光散乱測定法により定性・定量化する実験系を確立した(Kinuta et al.,PNAS,2002;Kinuta and Takei, Cell Struc.Funct.,2002)。2.Dynamin IとAmphiphysin Iはシナプス脱分極刺激により脱リン酸化され、サイクリン依存性キナーゼ5(Cdk5/P35)によりリン酸化されることを明らかにした。また、これらのリン酸化-脱リン酸化によるエンドサイトーシス調節の機構を調べた結果、脱リン酸化状態ではリング状に共重合し、リン酸化状態ではリング状共重合がほとんどみられなかった。さらに、リポソームからの小胞形成は脱リン酸化状態でおこり、リン酸化状態では起こらないことから、脱リン酸化状態で小胞形成に機能することが示唆された(Tomizawa et al.,Neuron,2003,in press)。シナプス小胞膜はクラスリン依存性エンドサイトーシスによって回収される。Dynamin1はAmphiphysinとともにクラスリン被覆ピット頚部に集積し、Daynamin GTPase活性によって頚部切断を行なう。また、その足場として膜リン脂質が重要である。1.エンドサイトーシスにおいて、Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphateはシナプス膜リン脂質として重要である。このリン脂質の合成をおこなう酵素PI(4)P 5-kinase IγがADP-Ribosylation factor 6によって直接活性化されること、また、クラスリン/AP-2の集積が増加することを明らかにした(Krauss, Kinuta et al.,J.Cell.Biol.,2003;Kinuta & Takei,生化学(ミニレビュー),2003)2.Cdk5/p35によるDynaminおよびAmphiphysinのリン酸化部位を明らかにした。また、これらタンパク質のリン酸化-脱リン酸化によるエンドサイトーシス調節機構を明らかにした(Tomizawa et al.,J.Cell.Biol.,2003)Amphiphysin1によるDynamin GTPase活性の上昇Dynamin1GTPアーゼ活性に対するAmphiphysin1と膜脂質の影響を調べ、Amphiphysin 1が、大型リポゾームの存在下にDynamin 1のGTPアーゼ活性を上昇することを明らかにした。

また、リング形成とDynamin 1 GTPアーゼ活性の上昇が、Dynamin 1と膜結合性にある程度相関することを示唆した。以上の成果を論文にまとめ発表した。