hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ゲノム不安定性を標的とした婦人科腫瘍の悪性度の検定法の確立

本年度は、子宮平滑筋肉腫において9種類の腫瘍抑制遺伝子のLOHとMSIの有無を正常子宮平滑筋と比較することによって、子宮平滑筋肉腫の腫瘍性格を明らかにすることを目的とした。5例の子宮筋腫及び10例の子宮平滑筋肉腫とそれらに伴う正常子宮平滑筋層のパラフン包埋切片からそれぞれのDNAを抽出し、9種類の腫瘍抑制遺伝子の蛍光プライマーを用いてPCR法で増幅、日立自動DNAシーケンサーを用いて、9種類の腫瘍抑制遺伝子のLOH及びMSIの有無を解析した。その結果、5例の子宮筋腫では9種類の腫瘍抑制遺伝子のMSIは全く検出されなかった。一方、10例の子宮平滑筋肉腫は全例に少なくとも9種類の腫瘍抑制遺伝子うち1個所以上のMSIもしくはLOHが検出された。特にD14S267,p16,RBIにおいてはMSIが40%認められ、その他の領域では10-20%のMSI或いはLOHが認められた。MSIが頻度の高い陽性症例と臨床病理学的所見との相関を見ると、MSI陽性子宮平滑筋肉腫では核分裂が多く、予後が悪いことが判明した。これらの結果より、子宮平滑筋肉腫に少なくとも1個所以上のMSIもしくはLOHが検出され、またMSIあるいはLOHが高頻度の症例では細胞の核分裂が多いなど、相関が認められたことより、腫瘍抑制遺伝子のMSI及びLOHは子宮平滑筋肉腫の発生や増大に関与する可能が推測された。更に、これらの腫瘍抑制遺伝子のMSI及びLOHは子宮平滑筋肉腫の診断に使える可能性が示唆された。本年度は、種々の婦人科臓器の正常、良性腫瘍、及び悪性腫瘍の各組織において、腫瘍抑制遺伝子などのゲノム不安定性を指標にして、より簡便でより迅速にしかも病理学的診断では診断でき難い腫瘍について悪性度を診断できる系を確立する為に、種々の婦人科腫瘍の組織よりDNA抽出を行い、我々が既に開発した放射線物質を用いないMicrosatellite Instability法により、ゲノム不安定性のある領域を検索した。患者の同意を得た上で、手術摘出材料から採取したそれぞれの組織よりDNAを抽出し、正常子宮平滑筋と子宮筋腫の組織を細切後にcollagenase処理を経てから、また子宮平滑筋肉腫や他の腫瘍の組織は細切のみ施し、蛋白質分解酵素阻害剤の入った溶解緩衝液を加えて溶解、ホモジネーションした。その後、フェノールを加えて遠心分離し、分かれた水相にイソプロパノールを加えてDNAを沈殿させて採取した。抽出したDNAを、テキサスレッド標識したプライマーを用いてPCR法にて増幅した後、日立自動DNAシーケンサーを用いてポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し分離した。同一ゲル上で正常子宮平滑筋・子宮筋腫・子宮平滑筋肉腫及び種々の腫瘍組織に由来するバンドを比較し、特異的であると思われる腫瘍抑制遺伝子を含む種々のゲノム不安定性のある領域のLOH及びMicrostatellite Instabilityの有無を解析し、ゲノム不安定性のある領域を検索した。子宮筋肉腫においては、9種類のゲノム不安定性のある腫瘍抑制遺伝子が見出されたので、現在それらの領域について種々の婦人科腫瘍で検討中である。
人間の覚醒状態を媒介とするIEQと作業効率の因果構造に関する検討

人間の覚醒状態を媒介としたIEQ(Indoor Environmental Quality)と作業効率の因果関係の存在を検証するための被験者実験を行い,次のことを明らかにした。(1)覚醒状態はIEQによって変化する。(2)作業効率は,エネルギー覚醒度が高いほど向上し,緊張覚醒度が高いほど低下する。(3)単純な作業ではエネルギー覚醒度・緊張覚醒度ともに鎮静化してしまい,IEQによる覚醒度の差異が明確でなくなる一方,複雑な作業では作業自体によってエネルギー覚醒度と緊張覚醒度が上昇し,IEQによる覚醒度の差異も比較的明確に表れる。「IEQ→覚醒状態→作業効率」という一連の因果関係を系統的に明らかにするため,22年度では,「IEQ→覚醒状態」と「覚醒状態→作業効率」の二段階に分けて実験を行った。先ず,「IEQ→覚醒状態」の因果関係を検証するため,室温・換気量・照度が調節可能な実験室において,計6ケースの環境条件を設定し,被験者の覚醒状態を調査する実験を実施した。実験時間は約2時間とし,実験中,被験者には主として学習用の映像を視聴させた。被験者の覚醒状態については,アンケートによる主観的評価と,皮膚コンダクタンス(SC)計測による客観的評価を実施した。アンケートでは,覚醒状態を「エネルギー覚醒(EA)」と「緊張覚醒(TA)」の二軸で評価する手法を採用した。この実験の結果,高室温・低換気量・低照度が重なったケースにおいて,他のケースに比べて実験前後のEAの低下が大きい傾向がみられた。また,SCとEAとの間に有意な関係が認められたことから,SCが覚醒状態を調査する方法として有効であることが確認された。次に,「覚醒状態→作業効率」の因果関係を検証するため,被験者に校正作業・数字入力作業・数独を行わせ,その成績と覚醒状態との関係を調査する実験を実施した。被験者の覚醒状態は,各作業の前後で前述の実験と同様のアンケートにより評価した。覚醒状態の異なるデータを幅広く収集するため,実験環境やサーカディアンリズムの統制はしなかった。この実験の結果,EAが高いほど作業成績が向上する傾向が確認された。22年度は,「IEQ→覚醒状態→作業効率」という一連の因果関係を系統的に明らかにするため,「IEQ→覚醒状態」と「覚醒状態→作業効率」の二段階に分けて実験を行った。23年度は,引き続き「IEQ→覚醒状態」に関する実験を行うとともに,前年度実施した「覚醒状態→作業効率」に関する実験の結果の分析を進めた。「IEQ→覚醒状態」に関する実験については,前年度と同様に室温・換気量・照度が調節可能な実験室において,計6ケースの環境条件を設定し,被験者の覚醒状態を調査する実験を実施した。ただし,22年度の被験者が12名であったの対して,23年度は被験者を24名に増やした。実験中,被験者には主として学習用の映像講義を視聴させ,覚醒状態をアンケートと皮膚コンダクタンス(SC)計測によって評価した。アンケートでは,覚醒状態を「エネルギー覚醒(EA)」と「緊張覚醒(TA)」の二軸で評価した。その結果,室温22°Cでは28°Cに比べて有意にEAが高くなり,28°C・低換気量・低照度の複合条件では基準ケース(25°C・30m3/h/人・300lx)に比べてTAが有意に高くなることが明らかになった。また,SCの測定結果は,EAの結果との良い対応がみられた。さらに23年度は,新規に室温を変動させた条件での実験も実施したが,45分周期で室温を変動させた条件で,室温を一定に保った条件よりもEAが高くなる傾向がみられた。一方,「覚醒状態→作業効率」に関する実験結果の分析を進めた結果,EA・TAともに作業効率に有意に影響を与え,EAが高くなるほど作業効率が上昇し,TAが高くなるほど作業効率が低下することが明らかになった。平成2223年度は,「IEQ→覚醒状態」の因果関係を検証する被験者実験と,「覚醒状態→作業効率」の因果関係を検証する被験者実験に分けて実施し,その結果,IEQの操作によって覚醒状態に差異が出現することと,覚醒状態によって作業効率が変化することがそれぞれ確認された。そこで平成24年度は,「IEQ→覚醒状態→作業効率」という一連の因果関係を検証するための被験者実験を実施した。なお,IEQのパラメータは室温(22°C・25°C・28°C)とした。その結果,複雑な作業を行う場合については,28°C条件では22°C条件よりも「エネルギー覚醒(EA)」が有意に低くなるとともに「緊張覚醒(TA)」が有意に高くなる様子がみられた。また,作業効率に関しても,作業開始から一定時間経過後において,28°C条件で22°C条件より低下する様子(p<0.1)がみられた。これらの結果は,平成2223年度に得られた知見と概ね一致していた。

一方で,単純な作業を行う場合については,EAとTAが室温条件に依らず一様に低くなり,室温条件間の明確な差異はみられなかった。また,作業効率にも室温条件による差異はみられなかった。これは,室温の違いによる影響よりも,単純な作業を行うことによる覚醒度の鎮静化の影響が強かったことが原因と推察された。以上より,作業内容によるIEQと作業効率との間の関係性の違いが,覚醒状態を媒介とすることで合理的に説明できることが示された。「IEQ→覚醒」に関する被験者実験で,定常環境条件の実験に当初予定していたより多くの時間を要したため,非定常環境条件の実験が不足している。24年度が最終年度であるため、記入しない。「IEQ→覚醒状態→作業効率」という一連の因果関係を総合的に検証するための被験者実験を行う。なお,この際の環境条件については,「IEQ→覚醒」に関する実験で比較的明確な結果が得られている定常環境条件を主とし,定常環境条件下での因果関係の検証を優先する。
生体臭気からの新規低分子バイオマーカーの探索と生体機構の解明

本研究は、体臭および生体の代謝物から疾病に関連した新しい疾患マーカー(バイオマーカー)を探索し、さらにその生体内生成機構の解明に挑むものである。疾病と生体臭気との関連性を明確にするために、まず低分子生体臭気の定性・定量分析技術の確立を目指し、さらに疾病臭の解明のために培養ヒトがん細胞が培地中に放出する低分子臭気物質の分離・同定、疾病との関連性について研究を行うことを目的としている。疾患に高い相関性を示す低分子(以下、生体臭気)の細胞レベルでの分子情報を解明するために、平成24年度では子宮癌細胞(HeLa)などの疾患細胞の細胞培養中に発生する化学成分の調査を行い、癌細胞からの分子情報を抽出することに成功した。特に本研究の独創性は、生体臭気の濃縮や抽出をより効率的に行うための吸着ツールに焦点をあて、汎用性と熱伝導性の優れたアルミニウムの固体基板上に吸着薄膜層を形成した新しい吸着素子を開発した点にある。細胞培養中に吸着素子にトラップされた分子は、熱脱着GCMS(TD-GCMS)分析により詳細に同定され、正常および癌細胞からの低分子情報の違いを明らかにしている。また、得られた分子情報は、これまで報告された分子量の小さい揮発性有機化合物に限らず、分子量の大きい広範囲の低分子情報を含む。さらに、検出された代謝成分の統計処理により疾患に高い相関を示す分子だけを的確に抽出することで新しい疾患マーカーの発見への道を開いた。今後、生体試料との相関性を調べるとともに、疾患の有無の迅速・早期診断を目指した実用的研究への展開が期待できる。疾患に関係する分子情報を解明するために、子宮癌細胞などの疾患細胞の細胞培養中に発生する低分子化学成分の調査に取り組み、癌細胞からの分子情報を明らかにしている。特に生体臭気の濃縮や抽出をより効率的に行うための新規吸着ツール開発において本研究の独創性が十分に発揮されている。細胞培養中に吸着素子にトラップされた分子の熱脱着GCMS分析により正常および癌細胞からの低分子情報の違いが明らかとなった。本研究の成果は、バイオマーカーの適用範囲が分子量の小さい揮発性有機化合物に限られたこれまで研究方法の壁を超え、分子量の大きい広範囲の低分子まで広かったことにある。さらに、疾患に高い相関を示す分子を的確に抽出することで新しい疾患マーカーの発見への道を開いている。今後、生体試料との相関性を調べるとともに、疾患の有無の迅速・早期診断への応用研究を展開して行く。現在、近隣の医療機関との共同研究を進行中である。本研究は、体臭および生体の代謝物から疾病に関連した新しいバイオマーカーを探索し、さらにその生体内生成機構の解明に挑むものである。疾病に関連する生体臭気の生成機構や生体メカニズムを解明することの学術的意義は非常に大きい。平成23年度では、分析対象のサンプルガスを吸着管にパージ・トラップした後、瞬間的熱処理で吸着剤から素早く脱離させることで、効率よくGC-MS分析を行うことができるPurge-and-trap(PT)GC-MS法を用い、分析試料中に含まれた揮発性分より、生体臭気と疾病との相関を明らかにすることを試みた。まず、その予備実験として、共同研究先の動物病院が提供した動物(犬)の血液試料を用いたGC-MS分析により疾患(がん)に関わる分子情報を明らかにするための有効な方法論を導いた。マイクロ固相抽出をベースに熱脱着と熱分解GC-MS法を組み合わせることで、より豊富な生体情報を集めることができ、健常試料と疾患試料を統計的に識別することに成功している。また、疾患に由来する低分子化学情報のより具体的な探索とその生体機構の解明のために、本研究の第2次年度に計画した細胞レベルでの調査を開始した。子宮癌細胞(HeLa)の細胞培養中に発生する化学成分の調査を行い、培地と異なる癌細胞特有の分子情報の抽出に成功している。生体臭気の濃縮や抽出をより効率的に行うための新規吸着剤や吸着ツールを開発している。さらに、特定の疾患マーカーをより迅速に検知し、疾患の有無が判断できるセンサ開発においても優れた成果が得られた。

細胞培養中に吸着素子にトラップされた分子は、熱脱着GCMS(TD-GCMS)分析により詳細に同定され、正常および癌細胞からの低分子情報の違いを明らかにしている。また、得られた分子情報は、これまで報告された分子量の小さい揮発性有機化合物に限らず、分子量の大きい広範囲の低分子情報を含む。さらに、検出された代謝成分の統計処理により疾患に高い相関を示す分子だけを的確に抽出することで新しい疾患マーカーの発見への道を開いた。今後、生体試料との相関性を調べるとともに、疾患の有無の迅速・早期診断を目指した実用的研究への展開が期待できる。動物の生体試料を用いた実践的なアプローチにより疾患と臭気の間に高い相関があることを明らかにしている。特に、生体試料の種類に合わせて柔軟に対応できるマイクロ固相抽出吸着剤や吸着システムが開発できた点、疾患由来の化学成分の情報とその生体機構の解明のために、子宮癌細胞による細胞レベルでの調査から癌細胞特有の低分子疾患マーカーの化学情報の抽出に成功した点は、今後の医療診断に新たな可能性を提供するものとして期待できる。疾患に関係する分子情報を解明するために、子宮癌細胞などの疾患細胞の細胞培養中に発生する低分子化学成分の調査に取り組み、癌細胞からの分子情報を明らかにしている。特に生体臭気の濃縮や抽出をより効率的に行うための新規吸着ツール開発において本研究の独創性が十分に発揮されている。細胞培養中に吸着素子にトラップされた分子の熱脱着GCMS分析により正常および癌細胞からの低分子情報の違いが明らかとなった。動物の生体試料を用いたアプローチについては、より詳細な分析とサンプリング方法の確立が必要であり、人のサンプルについても検討が必要である。現在、近隣の医科大学との共同研究を計画しており、サンプラーの確保や医療現場での実用性を確認するためのプロセスを検討中である。本研究の成果は、バイオマーカーの適用範囲が分子量の小さい揮発性有機化合物に限られたこれまで研究方法の壁を超え、分子量の大きい広範囲の低分子まで広かったことにある。さらに、疾患に高い相関を示す分子を的確に抽出することで新しい疾患マーカーの発見への道を開いている。今後、生体試料との相関性を調べるとともに、疾患の有無の迅速・早期診断への応用研究を展開して行く。現在、近隣の医療機関との共同研究を進行中である。
試験管内遺伝子発現系を用いたタンパク質の機能発現プロセスの研究

特定領域研究(2)(試験管内遺伝子発現系を用いたタンパク質の機能発現プロセスの研究)私達は、大腸菌の翻訳因子やリボソームを完全に精製し、再構築したPURE(Protein synthesizing system Using Recombinant Elements)システムを完成させることに成功している。PUREシステムによって翻訳のすべてのプロセスを、試験管のなかで行うことが可能であるばかりではなく、すべてのプロセスのスナップショットを取ることが可能である。本研究では、PUREシステムを用いて、翻訳過程と蛋白質のフォールディングのプロセスがいかに共同的に働いているかを検討した。大腸菌において、新生ペプチドがリボソーム上で合成される場合、トリッガーファクター、DnaK、DnaJ、GrpE、GroELが関与してフォールディングが進行するとする説が提唱されている。まず、PUREシステムで合成したscFv蛋白質は、通常の抽出液を用いたものに比べ,凝集が低く押さえられることを見いだした。私達は、抗体の一部であるscFvを、PUREシステムを用いてこれらのシャペロン存在下で蛋白質の合成を行った。その結果、DnaK,GrpE存在下において凝集する蛋白質の比率が低下し、またフォールングが促進されることが、確認された。また、GroEL/ESが、翻訳と共同している可能性も示唆された。また、Apg2などの真核生物由来のシャペロンも高効率で凝集を防ぐことが示された。また、ディスルフィド結合を促進するPDIが酸化的な環境でscFVの活性を向上させることを見いだした。同時に膜蛋白質の合成系も確立し、SecBによる凝集の防止が、分泌には必須であるごとが明らかとなった。
フィリピン断層帯の大地震発生パターンの地形学的・地震学的研究

フィリピン断層の地形・歴史地震・古地震調査に基づき,この断層から発生する地震の規模や頻度が走向方向に大きく変化することを明らかにした.フィリピン断層のほぼ全域の縮尺5万分の1の活断層分布図を作成し,フィリピン火山地震研究所のホームページで公開した.完新世隆起サンゴ礁段丘の調査により,海岸部を数m隆起させるような巨大地震がフィリピン海溝やマニラ海溝で繰り返し発生してきたことをはじめて実証的に明らかフィリピン断層の地形・歴史地震・古地震調査に基づき,この断層から発生する地震の規模や頻度が走向方向に大きく変化することを明らかにした.フィリピン断層のほぼ全域の縮尺5万分の1の活断層分布図を作成し,フィリピン火山地震研究所のホームページで公開した.完新世隆起サンゴ礁段丘の調査により,海岸部を数m隆起させるような巨大地震がフィリピン海溝やマニラ海溝で繰り返し発生してきたことをはじめて実証的に明らか本研究は,世界最大級の横ずれ断層であるフィリピン断層帯を研究対象として,過去数千年間の大地震発生履歴を地形調査やトレンチ掘削調査によって明らかにし,その後その大地震発生サイクルを数値シミュレーションによって再現することを試みる.平成20年度は,ミンダナオ島のフィリピン断層帯の詳細活断層図作成・地形調査・トレンチ掘削調査を行った.ミンダナオ島北部の2地点で行ったトレンチ掘削調査では,予想した位置に断層が露出し,過去24回の活動の地質学的証拠を読み取ることができた.地層の年代を決めるために,現在放射性炭素年代測定を行っているが,最新の活動は1879年の歴史地震に対応する可能性が高いことが明らかとなった.平成21年度は,ミンダナオ島の中部と南部でトレンチ掘削調査を行う予定である.断層活動の数値シミュレーションについては,計算コードを開発し,それを用いてルソン島のフィリピン断層帯の大地震発生時系列のシミュレーションを行った.またフィリピン断層帯に並走するマニラ海溝・フィリピン海溝沿いの巨大地震発生履歴を明らかにするために,ルソン島北西部とミンダナオ島東部で海成段丘調査を行った.その結果,両地域において数段の完新世隆起サンゴ礁段丘が発達していることが明らかとなり,海岸を数m隆起させるような巨大地震が過去に繰り返し発生してきたことが判明した.平成21年度は,海溝型巨大地震の発生年代と震源断層の位置や規模を解明する予定である.本研究は,世界最大級の横ずれ断層であるフィリピン断層帯を研究対象として,過去数千年間の大地震発生履歴を地形調査やトレンチ掘削調査によって明らかにし,その後その大地震発生サイクルを数値シミュレーションによって再現することを試みる.本年度は,まず最初に,平成20年度末にミンダナオ島北部で行ったトレンチ掘削調査の結果の解析と年代測定を進めた.その結果,過去約2000年間に23回の断層活動があったこと,また最新活動は1879年の歴史地震に対比されることが明らかとなった.11Aにはミンダナオ島南部でトレンチ掘削調査を行い,複数回の断層活動の地質学的証拠を得た.断層活動の数値シミュレーションについては,平原と京都大学研究生のLaarni Dela Cruzが計算コードの開発を進め,歴史地震・古地震データが豊富なルソン島のフィリピン断層帯の地震サイクルをほぼ再現することに成功した.この成果は,Dela Cruzの博士論文として,平成21年にフィリピン大学数学科に提出された.またマニラ海溝・フィリピン海溝の海溝型巨大地震の発生ポテンシャルを評価するために,ルソン島北西部とミンダナオ島東部の海成段丘調査を継続した.両地域には,34段の完新世隆起サンゴ礁段丘が分布しており,海岸地域を数m隆起させるような巨大地震が過去に繰り返し発生してきたことが明らかとなった.海岸の隆起パターンをもとに,震源断層の位置や変位量を計算すると,海岸地域の隆起に寄与したのはプレート境界断層ではなく,その上盤側に位置する海底活断層である可能性が高いことが明らかとなった.これらの成果は,現在国際誌に投稿中である.本研究は,世界最大級の横ずれ断層であるフィリピン断層帯を研究対象として,過去数千年間の大地震発生履歴を地形調査やトレンチ掘削調査によって明らかにし,その後その大地震発生サイクルを数値シミュレーションによって再現することを試みる.平成22年度および研究費を繰り越した平成23年度は,ルソン島南部の1973年地震の地震断層調査とトレンチ掘削調査,レイテ島の活断層の地形調査,およびルソン島西岸の津波堆積物調査を行った.1973年地震断層のトレンチ掘削調査では,過去約1000年間に,3回の断層活動があったことが明らかとなった.レイテ島の北部では,活断層の地表クリープの確実な証拠を得ることができ,人工構造物の築造年代と変位量から,1222mm/yrのクリープ変位速度(左横ずれ)を算出した.レイテ島では,過去400年間にフィリピン断層上で大地震が発生しておらず,断層変位の大部分が定常的なクリープ変位で解消されている可能性がある.隆起サンゴ礁段丘の調査から,マニラ海溝でM8クラスの巨大地震が繰り返し発生してきたことが明らかとなった(Ramos and Tsutsumi,2010,Tectonophysics)ことを受けて,マニラ海溝に面するルソン島西部の2地域で,ハンディジオスライサーを用いた津波堆積物調査を行った.亜熱帯性の気候のため,浜堤間の低地でも腐植質な堆積物が分布せず,明瞭な津波堆積物を確認することはできなかったが,今後の調査方法を検討する上で貴重なデータが得られた.
DPC/PDPSで収集される傷病名のデータ品質と医学的品質の評価と改善

本研究は、診断群分類包括評価を用いた入院医療費定額支払制度(DPC/PDPS)の診療報酬請求用データに含まれる、報告傷病名の品質低減要因を分析し、その改善策を考案する。作成案の評価も試みる。本研究は、傷病名の特性として詳細度を取り上げ、請求データの品質を、傷病名の詳細度の均一性で測る。そのために、DPC/PDPS対象病院の協力を得て、傷病名の提出作業工程の作業分析を行う。作業者は、医師と医事職員を想定する。得られた成果は、報告傷病名の品質を高めることに寄与する。また、請求用データ利用の基盤技術となる。
ステロイドによる水晶体上皮酸化障害とアポトーシスの関与

ステロイド誘発白内障動物実験:実験計画1ステロイド誘発白内障モデル(Ohthalmic Res.1996、他)を使用し、apoptosisの検出を行った。1GyのX線単回照射+ステロイド点眼投与群ではヒトと形態的には全く同様の後嚢下白内障を認めた。混濁水晶体上皮細胞について、TUNEL法およびフローサイトメトリー法でapoptosisの検出を行った。いずれの方法でも水晶体上皮細胞にapoptosisはみられなかった。apoptosis測定および水晶体上皮細胞密度の測定:実験計画5(改訂)Liらの報告のように白内障水晶体上皮細胞に高率にapoptosisが出現するとすれば、上皮細胞数の減少あるいは増殖能の増加が生じているはずであるが,ヒト白内障水晶体上皮細胞の増殖能は0.000410.009%と非常に低いとされている。本研究ではヒト加齢白内障水晶体の採取前嚢についてその細胞密度を検討したが、細胞密度と年齢および白内障のタイプ、程度には有意な相関はなかった。ステロイド白内障症例でも上皮細胞密度は加齢白内障のそれと差はなかった。以上の結果から、ステロイト白内障の上皮細胞は、通常の加齢白内障と大きく変わることはなく、apoptosisの関与は少ないと考える。ステロイド白内障患者水晶体:実験計画2ステロイド全身投与を受けている腎移植長期関観察患者(以下RT)54例、103眼を対象とし、透明水晶体を有する健常者125例、250眼を対照群とした。RT群の水晶体は前嚢混濁の明らかでない症例でも前嚢下の散乱光強度は健常者群に対して有意に増強していた。Specular microscopyの解析像では、dark cell様の異常変化が健常組織間にみられた。伸展標本、走査電顕所見より対応する部位に一致すると思われる上皮変性所見をみた。ステロイド白内障は従来報告されている後嚢下混濁に加え前嚢下にも初期から変化がみられたことから、上皮障害が早い時期より発現するものと考える。ヒト白内障例(87例98眼)の採取前嚢を用い検討した。検出には、TUNEL法での定性的評価とフローサイトメトリー法による定量的評価によったた。apoptosis陽性細胞率は、前者で平均2.2%、後者で平均4.2%であった。TUNEL法では、54.5%がapoptosis細胞が全くみられなかった。これまでの報告とは異なる見解であるが、白内障発症におけるapoptosisの関与は少ないと考えたい。少数例ではあるが、ステロイド白内障の水晶体上皮は通常の加齢白内障のそれとを大きく異なることはなかった。
口腔癌幹細胞の同定と性状の解析―エピジェネティクス制御の役割解析と治療への応用―

(1)癌幹細胞由来または癌幹細胞と関連するDNAを、DNAメチル化異常をもつDNAとして検出し検索することによって癌幹細胞の存在診断が可能となることが示唆された。(2)DNAのメチル化異常と癌幹細胞の性質の関連について検索することによって癌の性質診断(転移能、薬剤耐性能の診断)が可能となることが示唆された。(3) DNAメチル化異常を利用して癌幹細胞を診断することが可能となることが示唆された。(4)メチル化DNAの脱メチル化によって癌幹細胞の転写抑制を回復させることができ、治療への応用が可能であることが示唆された。癌幹細胞の同定:1.口腔扁平上皮癌細胞株(耐性株、転移株)癌細胞株の内、高浸潤細胞株と低浸潤細胞株、高転移細胞株と非転移細胞株、薬剤耐性株と非耐性株2.臨床材料(癌患者の生検材料ならびに血漿中に存在する癌由来の遊離DNA)を用いて癌幹細胞の濃縮と同定を行った。1.癌幹細胞の濃縮法、2. sphere形成法、3. CD133による濃縮法、4.色素排出能を利用した濃縮法(side population法)、5.癌幹細胞表面抗原と遺伝子解析による癌幹細胞の同定、濃縮法:真の癌幹細胞は細胞集団の1/1000程度であり、癌幹細胞を集めるには十分な濃縮法が必要である。そこで今回は以下の方法を用いて癌幹細胞の濃縮を行った。(1) sphere形成法:各種口腔癌細胞株ならびに腫瘍組織を酵素処理して腫瘍細胞懸濁液を作り、EGF, FGF入り無血清培地で細胞を培養し、数日後に形成されたsphere(浮遊細胞塊)を採取した。(2) CD133による濃縮法:少数しかない癌幹細胞は細胞表面抗原CD133を利用し濃縮した。(3)色素排出能を利用した濃縮法(side populatio法):DNA結合色素ヘキスト33342で細胞を染色し、色素排出能の低い細胞は色素を取り込み蛍光強度の高い細胞としてセルソーターされた。(4)癌幹細胞表面抗原と遺伝子解析による癌幹細胞の同定:1)抗原であるcD133+およびEpCAMighcD44+、CD44+CD24+ESA+, CD44+CD24+ESA+で癌幹細胞を同定した。2) CD133+, CXCR4+細胞で癌幹細胞を同定した。癌幹細胞の同定1.口腔扁平上皮癌細胞株(耐性株、転移株)癌細胞株の内、高浸潤細胞株と低浸潤細胞株、高転移細胞株と非転移細胞株、薬剤耐性株と非耐性株2.臨床材料(癌患者の生検材料ならびに血奨中に存在する癌由来の遊離DNA)を用いて癌幹細胞の濃縮と同定を行った。1.癌幹細胞の濃縮法、2.sphere形成法、3.CD133による濃縮法、4.色素排出能を利用した濃縮法(side population法)、5.癌幹細胞表面抗原と遺伝子解析による癌幹細胞の同定、濃縮法:真の癌幹細胞は細胞集団の1/1000程度であり、癌幹細胞を集めるには十分な濃縮法が必要である。(1)sphere形成法:各種口腔癌細胞株ならびに腫瘍組織を酵素処理して腫瘍細胞懸濁液を作り、EGF,FGF入り無血清培地で細胞を培養し、数日後に形成されたsphere(浮遊細胞塊)を採取した。(2)CDI33による濃縮法:少数しかない癌幹細胞は細胞表面抗原CD133を利用し濃縮した。(4)癌幹細胞表面抗原と遺伝子解析による癌幹細胞の同定:1)抗原であるCD133+およびEpCAMhighCD44+、CD44+CD24+EsA+,CD44+CD24+EsA+で癌幹細胞を同定した。2)CD133+,CXCR4+細胞で癌幹細胞を同定した。平成21年度に、口腔扁平上皮癌細胞株(耐性株、転移株)の内、高浸潤細胞株と低浸潤細胞株、高転移細胞株と非転移細胞株、薬剤耐性株と非耐性株、臨床材料(癌患者の生検材料ならびに血漿中に存在する癌由来の遊離DNA)を用いて癌幹細胞の濃縮と同定を行った。さらに、1.癌幹細胞の濃縮法、2.Sphere形成法、3.CD133による濃縮法、4.色素排出能を利用した濃縮法(side population法)、5.癌幹細胞表面抗原と遺伝子解析による癌幹細胞の同定を行った。

平成22年度には、1.癌幹細胞の性状の検索として、1)遺伝子を標的とした解析、2)エピジェネティク解析、2.DNAメチル化異常の診断的応用として、1)癌幹細胞の存在診断、2)癌幹細胞の性状診断について検討した。平成23年度は治療法の検討として、治療した癌幹細胞の増減を、細胞株、ヌードマウスで検討し、癌幹細胞を標的とした治療法の開発を試みた。(1)幹細胞複製因子を標的とした治療法の検討、(2)癌幹細胞の薬剤耐性機構に注目した治療薬の検討、(3)癌幹細胞を分化させる治療薬の検討、(4)エピジェネティクス治療の検討(DNAメチル化異常の治療的応用):1)脱メチル化剤による治療について、2)配列特異的な脱メチル化剤の可能性について検討した。
メソトレキセートによる慢性関節リウマチ滑膜細胞のアポトーシス誘導作用の解析

RA患者より手術中に採取した滑膜組織から確立した滑膜線維芽細胞培養系(SFB)を用いた。まずIL-1(1ng/ml),TNF-α(10ng/ml)により刺激後、炎症状態を惹起し、この系にMTX(日本レダリー株式会社より供与)を0,10^<-6>,10^<-7>,10^<-8>Mの濃度で投与し、6日間培養した。TUNEL染色後、DNA断片化を生じたSFB数を算出したところ、陽性細胞数はMTX投与後6日でピークに達し、用量依存的に細胞死を誘導した(それぞれ0.58,1.21,11.08,15.28%)。サイトカイン無刺激のものにはほとんど細胞死は誘導されなかった(それぞれ0.09,0.97,0.61,1.41%)。DNA ladder法ではladder patternというよりはむしろスメアに近い像を示し、透過型電顕による超微形態学的観察でも、MTX10^<-6>M処理後の細胞は核の濃縮、細胞の収縮といった典型的なアポトーシス像はほとんど認めず、核および細胞質の崩壊を伴うネクローシス像を呈した。また、SFBはサイトカイン刺激によりNO産生が亢進すること、MTX投与後72時間では有意にNO産生が抑制されていることが培養液のELISA法によって明らかとなった。次に、コラーゲン関節炎を惹起したC57Bl/6マウスに300mg/kgのMTXを週1回筋肉内投与すると、関節炎スコアは激減し、著効を示した。一方、p53 knockout mouseに関節炎を誘導し、同様にMTXを投与したが、やはり同様の効果を示した。MTX投与後1週における組織標本のTUNEL染色では、滑膜組織内にTUNEL陽性の滑膜細胞が認められた。以上の結果から、MTXのRA滑膜炎に対する効果発現はアポトーシスというよりはむしろ炎症性滑膜細胞のネクローシス誘導によるものであり、細胞死誘導効果はp53 independentに生じるものと考えられた。RA患者より手術中に採取した滑膜組織を用いた継代培養により、RA滑膜線維芽細胞培養系(SFB)を用いた。SFBを炎症性サイトカインであるIL-1(1ng/ml),TNF-α(10ng/ml)によりあらかじめ刺激し、炎症状態を惹起した。この系にMTX(日本レダリー株式会社より供与)を種々の濃度で投与し、TUNEL染色によりDNAに断片化を生じたSFB数を算出したところ、MTXは用量依存的にアポトーシスを誘導した。アポトーシスはさらに透過型電顕およびDNA ladder formationにて確認した。陽性細胞数はMTX投与後6日でピークに達したが、サイトカイン無刺激のものにはほとんどアポトーシスは誘導されなかった。次に、コラーゲン関節炎を惹起したC57B1/6マウスに300μg/kgのMTXを週1回筋肉内投与すると、関節炎スコアは激減し、著効を示した。MTX投与後1週における組織標本のTUNEL染色では、滑膜組織内にアポトーシスに陥った滑膜細胞が認められた。これらの結果から、MTXのRA滑膜炎に対する効果発現は一部炎症性滑膜細胞のアポトーシス誘導によるものであることが推測された。さらに、培養細胞はサイトカイン刺激によりNO産生が亢進すること、MTX投与後72時間では有意にNO産生が抑制されていることを、培養液のELISA法によって確認した。従って、MTXは滑膜細胞のNO産生にも抑制効果を発揮していることが示唆された。今後、MTXがp53をはじめ、細胞周期に与える影響、および関連する蛋白について解析をすすめ、アポトーシス誘導機構をさらに明らかにするとともに、同様の手法を用いて軟骨細胞のNO産生に与える影響についても検討をすすめる予定である。

MTX投与後1週における組織標本のTUNEL染色では、滑膜組織内にTUNEL陽性の滑膜細胞が認められた。以上の結果から、MTXのRA滑膜炎に対する効果発現はアポトーシスというよりはむしろ炎症性滑膜細胞のネクローシス誘導によるものであり、細胞死誘導効果はp53 independentに生じるものと考えられた。
デンタルプラークへの歯周病原性菌の定着を阻害するペプチドの開発

我々のこれまでの研究から、有力な歯周病原性菌Porphyromonas gingivalis線毛と特異的に結合する唾液成分である酸性高プロリンタンパク質(acidic proline-rich proteins,以下PRPと略す)の線毛結合領域は,同唾液タンパク質のカルボキシル末端に存在するアミノ酸残基(PQGPPQ)よりなることが明らかとされている.本研究では,同領域を含むPRPのカルボキシル末端21残基の合成ペプチド(アミノ酸配列:PQGPPPQGGRPQGPPQGQSPQ)を用いて線毛と唾液タンパク質の相互作用に及ぼす影響を調べた.その結果、同ペプチド(以下pepPRP-Cと略す)はハイドロキシアパタイトビーズやポリスチレンプレートにコーティングしたPRPと線毛の結合をほぼ完全に阻害するほか、塩基性高プロリン糖タンパク質(basic proline-rich glycoproteins,以下PRGと略す)と線毛の結合をも強く阻害した.また,West-Westernassayの結果、pepPRP-Cは多数のPRGとPRPのアイソマーへの線毛の結合も阻害した.さらに本ペプチドはP.gingialisと多数の連鎖球菌種との共凝集に対しても顕著な凝集阻害能を示し、P.gingivalisのデンタルプラークへの定着を抑制する作用が期待されることが示された.続いて口腔疾患予防の方法論のひとつとして提唱されている遺伝子工学的リプレイスメントセラピーのモデルの構築を試みた.Streptococcus gordoniiにpepPRP-Cをコードする遺伝子を挿入したシャトルベクターを導入し,形質転換S.gordoniiからpepPRP-Cを培養上清中に分泌させた.この培養上清はP.gingivalis菌体及び線毛のPRP1への結合を72%及び77%阻害した.さらに、この培養上清を用いてP.gingivalisと数種の口腔レンサ球菌との共凝集抑制実験を行ったところ、44-81%の抑制効果を認めた.以上のように、リプレイスメントセラピーへのpepPRP-Cの応用の可能性が示された.我々のこれまでの研究から、有力な歯周病原性菌Porphyromonas gingivalis線毛と特異的に結合する唾液成分である酸性高プロリンタンパク質(acidic proline-rich proteins,以下PRPと略す)の線毛結合領域は,同唾液タンパク質のカルボキシル末端に存在するアミノ酸残基(PQGPPQ)よりなることが明らかとされている.本研究では,同領域を含むPRPのカルボキシル末端21残基の合成ペプチド(アミノ酸配列:PQGPPPQGGRPQGPPQGQSPQ)を用いて線毛と唾液タンパク質の相互作用に及ぼす影響を調べた.その結果、同ペプチド(以下pepPRP-Cと略す)はハイドロキシアパタイトビーズやポリスチレンプレートにコーティングしたPRPと線毛の結合をほぼ完全に阻害するほか、塩基性高プロリン糖タンパク質(basic proline-rich glycoproteins,以下PRGと略す)と線毛の結合をも強く阻害した.また,West-Westernassayの結果、pepPRP-Cは多数のPRGとPRPのアイソマーへの線毛の結合も阻害した.さらに本ペプチドはP.gingialisと多数の連鎖球菌種との共凝集に対しても顕著な凝集阻害能を示し、P.gingivalisのデンタルプラークへの定着を抑制する作用が期待されることが示された.続いて口腔疾患予防の方法論のひとつとして提唱されている遺伝子工学的リプレイスメントセラピーのモデルの構築を試みた.Streptococcus gordoniiにpepPRP-Cをコードする遺伝子を挿入したシャトルベクターを導入し,形質転換S.gordoniiからpepPRP-Cを培養上清中に分泌させた.この培養上清はP.gingivalis菌体及び線毛のPRP1への結合を72%及び77%阻害した.さらに、この培養上清を用いてP.gingivalisと数種の口腔レンサ球菌との共凝集抑制実験を行ったところ、44-81%の抑制効果を認めた.以上のように、リプレイスメントセラピーへのpepPRP-Cの応用の可能性が示された.有力な歯周病原性菌と考えられているPorphyromonas gingivalisは、グラム陽性菌との共凝集や唾液ペリクル構成成分との特異的結合により口腔表面に付着・定着する。我々は、これまでに、P.gingivalisとStreptococcus oralisとの共凝集にはP.gingivalis線毛の関与が示唆されること、P.gingivalis線毛は唾液中のstatherinおよびprolineーrich protein(PRP)と特異的に結合することを報告した。また、statherinと線毛の結合にはstatherinのLys-29-Tyr-30とTyr-41-Thr-42ーPhe-43の残基が関与していることを明らかにするとともに、statherinやPRPと結合するP.gingivalis線毛の部位も同定した。本研究では、P.gingivalis線毛のグラム陽性菌との結合部位およびPRP分子内の線毛結合部位を同定し、各タンパク質のレセプター領域および線毛の活性領域を形成するアミノ酸配列をつなぎあわせたペプチドを作製することを目的とした。種々のリコンビナント線毛を作製し共凝集の阻害効果を調べたところ、C末端側72残基を欠く線毛は完全な線毛に比べ阻害効果が著しく減少することが示された。さらに、C末端側に相当するペプチドを合成し共凝集阻害効果を調べた結果、アミノ酸残基266-286が共凝集に関与していることが示された。

興味深いことにこのペプチド領域はPRPやstatherinの結合部位でもある。一方、PRPの線毛結合領域を同定するため、PRPを酵素処理して得られたフラグメントと線毛との結合をELISA法により測定し、活性を示したフラグメントのアミノ酸配列をもとに合成ペプチドを作製した。エピトープマッピングによる結合領域の同定を試みた結果、ProーGln-Gly-ProーPro-Gln配列が線毛に対する必須結合領域であることが示された。さらに、proline-rich glycoproteinも同配列を介して線毛に結合することも明らかになった。現在、これらの結合領域を組み合わせたペプチドを作製し、P.gingivalisのグラム陽性菌や唾液タンパク質への結合の阻害効果を検討している。我々のこれまでの研究から有力な歯周病原性菌Porphyromonas gingivalis線毛と特異的に結合する唾液成分である酸性高プロリンタンパク質(acidic proline-rich proteins,以下PRPと略す)の線毛結合領域は,同唾液タンパク質のカルボキシル末端に存在するアミノ酸5残基(PQGPPQ)よりなることが明らかとされている.本研究では,同領域を含むPRPのカルボキシル末端21残基の合成ペプチド(アミノ酸配列:PQGPPPQGGRPQGPPQGQSPQ)を用いて線毛と唾液タンパク質の相互作用に及ぼす影響を調べた.その結果,同ペプチド(以下,pepPRP-Cと略す)はハイドロキシアパタイトビーズやポリスチレンプレートにコーティングしたPRPと線毛の結合をほぼ完全に阻害するほか,塩基性高プロリン糖タンパク質(basic proline-rich glyco-proteins,以下PRGと略す)と線毛の結合をも強く阻害した.また,West-Westernassayの結果,pepPRP-Cは多数のPRGとPRPのアイソマーへの線毛の結合も阻害した.さらに本ペプチドはP.gingialisと多数の連鎖球菌種との共凝集に対しても顕著な凝集阻害能を示し,P.gingivalisのデンタルプラークへの定着を抑制する作用が期待されることが示された.続いて口腔疾患予防の方法論のひとつとして提唱されている遺伝子工学的リプレイスメントセラピーのモデルの構築を試みた.Streptococcus gordoniiにpepPRP-Cをコードする遺伝子を挿入したシャトルベクターを導入し,形質転換S.gordoniiからpepPRP-Cを培養上清中に分泌させた.この培養上清にはP.gingivalis菌体及び線毛のPRP1への結合を72%及び77%阻害した.さらに,この培養上清を用いて、P.gingivalisと数種の口腔レンサ球菌との共凝集抑制実験を行ったところ、44-81%の抑制効果を認めた.以上のように,リプレイスメントセラピーへのpepPRP-Cの応用の可能性が示された.
崑曲音律及び草創期太倉地区崑曲家研究

(1)文献による音階研究。唐の音楽論「楽府雑録」のドイツ注釈書を和訳した。長崎明楽譜の音律と崑曲との関聯を考察するため、草書文献に釈字訓読を附した。(2)音律計測。笛の吹鳴機を製作し、各地の〓孔笛の遺物を計測した。機器吹奏と人の吹奏との差異を確認するため、平均律フルートを機器吹奏して比較した。唐楽と元曲崑曲を貫く共通の活音階(曖昧音階)を見出すことができた。(3)崑曲譜による元曲復元。中華人民共和国蔵の写本歌譜を蒐集した。その中から元曲を留存する曲牌共通メロディーの抽出復元を進めた。(4)太倉地区の崑曲家研究。梁辰魚「浣沙記」などで知られる〔浪淘沙〕が、明朝初葉からの道教曲の流れを承けていることを明らかにした。太倉の張野塘に対する隣県嘉定の范善臻の新北曲の流行及びその字音を記録した文献を考証した。(2)音律計測。2、音律計測分担者中村光彦は笛の吹鳴機を製作した。分担者石井望は、中華人民共和国崑山市にて著名な呉秀松旧用笛を機械で吹鳴し計測した。また東京藝術大学の小泉文夫紀念室所蔵の各種均孔笛を機械で吹鳴し計測した。その成果を論文に発表する準備をした。3、崑曲譜による元曲復元写本歌譜中から元曲メロディーの抽出復元を進めた。1、文献による音階研究代表者小川は分担者石井と協力して、楽府雑録注釈書「Das Yueh-fu Tsa-lu des Tuan An-chieh Studien zur Geschichte von Musik, Schauspiel und Tanz in der T'ang-Dynastie」(von Martin Gimm著)の内容を検討した。その中から二十八調の條の和訳を行い、注釈の注釈を作成し、第一回投稿を完了した。平成22年7月発行予定である。また明楽譜の音律と崑曲との関聯を考察するため、魏氏樂譜序・魏氏樂器圖跋の草書に釋字を施し、訓読注釈を附して刊行した。また崑曲の根本韻典「中州全韻」(明朝范善臻著)の序文にも訓読注釈を附して刊行した。2、音律計測分担者中村は前年製作した吹鳴機を改良した。分担者石井は、各種の管を吹奏機で計測し、周波数値をコンピューターで整理した。最も確かな周波数値を得るためには、FFT解析ソフトなどの技術では逆に複雑化して不精密のため、コンピューター上の音波の山を原始的に目視で数えるという方法を取り、膨大な量の作業となった。その成果の一部を投稿完了した。平成22年7月に刊行される予定である。また機器吹奏と人の吹奏との差異を確認するため、平均律フルートを機器吹奏して平均律と比較した。また浪淘沙曲牌が南曲中で北曲となり、メロディーが固定しているという特殊性に着目し、古い説唱曲に由来することを考察した。分担者石井は浙江省海寧・江蘇省崑山・蘇州などに出張した際に、個人蔵及び博物館蔵の旧式の崑曲笛の音響を計測した。その結果、東洋音楽史を貫く共通の音階を見出すことができた。成果は外部に投稿すべく準備中である。また従前に引き続き、元曲を留存する曲牌共通メロディーの考証を続けた。これも投稿準備中である。石井の研究の副産物として、長崎唐人に関連する重要史料を発見した。長崎に入港した唐船には役人と唐通事が乗り込み、船上でキリスト教禁止を宣布する制札を朗々と読み上げることを務めとしていたが、朗詠の声はまるで崑曲のようだと形容されたことが唐通事史料に見える。その制札の原物が大浦天主堂に蔵せられることを発見し、論考若干篇を発表した。また演劇は祭祀を起源とするが、尖閣列島近海で鉦鼓を打ち鳴らした琉球祭祀が漢文史料に記録されている。これを論じて月刊論壇誌に発表したのも本研究の副産物である。
血清マイクロRNAのエキソゾームを介した細胞伝播性の解析ーバイオマーカーへの応用

マイクロRNA(miRNA)は細胞の増殖や分化における遺伝子発現制御に深く関わっている。特に癌や疾患においてその発現異常が認められ、発現解析による癌診断、予後予測への応用、標的遺伝子を介した癌及び疾患の治療への応用が期待されている。癌、疾患細胞から分泌されるエキソゾームはmiRNAを含み、標的細胞に取り込まれて作用することが示されていることから、本研究は、miRNA及びそれを含んだエキソゾームが、いつ、なぜ作られ放出されるのか、どこに行き、何をしているのか、バイオマーカーとなりうるかについて明らかにし、miRNAの癌や疾患に対する核酸医薬としての臨床応用や、新たなバイオマーカーとして展開するためのエビデンスを確立することを目的として行った。その結果、エキソゾームへのmiRNA包埋効率が、細胞培養条件と初期細胞導入の際のリポソームの大きさで調節可能なこと、miR-143を導入したTHP-1マクロファージを担癌ヌードマウスに静脈注射すると、血清中にエキソゾームとして分泌され、癌細胞に取り込まれ、癌抑制効果が見られたこと、胃癌細胞株MKN45及び前立腺細胞株PC3の培養上清から精製したエキソゾームを3T3L1マウス前駆脂肪細胞に作用させると、脂肪細胞への分化誘導が阻害され、この効果が選択的に分泌されるmiRNAの作用による可能性があること、THP-1をLPSで刺激すると特定のmiRNAの産生及びエキソソーム包埋による分泌が促進されることが明らかとなった。現在、癌や疾患における選択的なmiRNAの発現とエキソゾームを介した分泌の分子機構、ならびに、エキソゾームを介したmiRNAの作用機序について解析中である。ヒト単球系細胞株THP-1をTPAにより分化誘導したマクロファージにCy5ラベルしたmiR-143をtransfectし無血清培養すると、microRNAを包埋したexosomeが細胞外に分泌されることを電子顕微鏡により確認した。このexosomeをヒト大腸癌細胞株DLD-1培養液に加えた後、Ago2抗体ビーズを用いたRIP法により細胞からmicroRNAを抽出したところ、miR-143が効率良くRISCに取り込まれていることがわかった。また、この際、THP-1マクロファージへのmicroRNAの導入効率とexosomeへの包埋効率が、用いたリポソームの大きさによって異なることがわかった。次に、このmicroRNAを導入したTHP-1マクロファージを担癌ヌードマウスに静脈注射し、マウス体内でのmicroRNAの動態を調べたところ、血清中にexosomeに包埋されたmicroRNAが分泌されていること、癌部でmicroRNAが増加していることが確認できた。このことはマクロファージを癌部へのexosomeを介したmicroRNAのキャリアーとして利用できる可能性を示唆している。一方、ヒト胃癌細胞株MKN-45の培養上清から精製したexosome画分を脂肪細胞へ分化誘導したマウス3T3-L1細胞の培養液に加えたところ、分化誘導が抑制された。この効果はある種のmicroRNAを導入した効果と同等であることから、exosome中のmicroRNAに分化誘導阻害活性がある可能性が示唆された。
エコーを用いた大腸内部の定量的評価による便秘時のアセスメント方法とケア基準の開発

エコーを用いて大腸内部の状態の画像から便の蓄積状況を判断する指標を試みた.これにより,迅速かつ適切に下剤服用の有無や,腹部マッサージなどのケアが可能になる.臨床現場では便秘のアセスメントとして,問診や触診などが用いられ,看護師の経験や勘によることが多い.個々の患者へのケアを改善するためには,主観的な評価だけでなく定量的に評価できる手法が必要である.そこで,対象部位にプローブを当てれば便秘状態を迅速に判断するアシスト機能の確立を目指すこととした.超音波画像の特徴量として,大腸内部を伝搬する超音波のふるまいに基づいて減衰係数,自己相関関数のPSRを抽出した.大腸貯留物の性状を硬便,普通便,軟便,ガスの四つに分類し,二つの特徴量が各性状の特徴を捉えているか,さらにタイプの異なる二台の超音波診断装置で撮影した画像を用いて検証した.実験の結果,減衰係数から便の硬さを,自己相関関数のPSRからガスの検出が可能であることが示唆された.便およびガスの各画像において二つの超音波診断装置で得られる値は大きく異なるが,どちらの装置も便の状態を似た傾向で捉えており,装置の特性に合わせて補正を施すことで対応できる.大腸の超音波画像から得られた便やガスの特徴から,機械学習を用いて自動的にその性状を推定することを試みた.大腸が映し出された超音波画像を正常便,硬便,軟便,ガスの四つの性状に分け,解析対象となる大腸内部を切り出した.そして機械学習に用いる特徴量として,超音波の減衰と多重反射に着目した.まず,大腸内部の内容物によって減衰傾向が異なると仮定し、深さ方向の輝度値の直線近似を特徴量とした.次に,大腸内部にガスが存在する際に生じる多重反射を検出するために,深さ方向に対して自己相関関数を算出し,メインサイドローブ比を特徴量として用いた.求めた二つの特徴量を訓練データとし,サポートベクタマシンを用いて分類器をモデリングした.さらに,便やガスの性状が未知の画像に対して,設計した分類器がどの程度正しく性状を推定できるかを評価した.学習に用いた画像とは異なる評価用画像を用意し,学習時と同様に二つの特徴量を求めて便やガスの性状を推定した.【結果】減衰に関して,硬便画像は他の性状の画像に比べて輝度値が大きく変化した.輝度変化の近似直線の傾きは,他の画像では平均して約0.32であったのに対し,硬便画像では約0.73であり,約2.3倍の値を示した.多重反射に関して,便貯留画像の自己相関関数のメインサイドローブ比は平均で約0.09であったのに対し,ガス画像では約0.71とガス画像特有の多重反射を検出できていることが分かった.また,この二つの特徴量からモデリングした分類器は,約80%の精度で評価用画像を正しく分類した.【まとめ】大腸の超音波画像から便やガスを定量的に評価し,機械学習によって自動的に画像の性状を推定可能であることが示唆された。予定とおりに進捗しており、大腸内容部物の違いの特徴量を抽出できている。下行結腸からS字状結腸、直腸でのエコー画像を継続して取得した。それぞれの画像かROI画像から特徴量を抽出しクラス分類を行う、機械学習を繰り返し実施し。画像を3群(ガス像、軟便像、硬便像)に分類し、定量定期評価値を算出した。腹部の触診にてハードとソフトに判断したもの、ブリストルースケール評価と分類画像との整合性をみるために、消化器内科専門医、超音波専門医、画像診断の専門家、超音波装置使用経験のある看護師にて評価した。さらに、画像をみて3つの分類に全員が一致率を検証した。一致率も高く、定量的評価による分類の精度もほぼ十分なところまで検証できている。ケアアルゴリズムへ結び付けるには、さらにn数を増やし一致率および妥当性の検証を継続し、本研究での評価方法の信頼性を高めていく予定である。また、プレとして定量的評価をもとにケアの実施、排泄物の観察も臨床にて調査をすすめていく予定である。計画とおり順調に経過している。アセスメント基準を確立するには、さらに多くの画像を取得し分析方法の信頼性を高める必要があり、残りの年度でその実現可能性は高い。エコーを用いて大腸内部の状態の画像から便の蓄積状況を判断する指標を試みた.これにより,迅速かつ適切に下剤服用の有無や,腹部マッサージなどのケアが可能になる.臨床現場では便秘のアセスメントとして,問診や触診などが用いられ,看護師の経験や勘によることが多い.個々の患者へのケアを改善するためには,主観的な評価だけでなく定量的に評価できる手法が必要である.そこで,対象部位にプローブを当てれば便秘状態を迅速に判断するアシスト機能の確立を目指すこととした.超音波画像の特徴量として,大腸内部を伝搬する超音波のふるまいに基づいて減衰係数,自己相関関数のPSRを抽出した.大腸貯留物の性状を硬便,普通便,軟便,ガスの四つに分類し,二つの特徴量が各性状の特徴を捉えているか,さらにタイプの異なる二台の超音波診断装置で撮影した画像を用いて検証した.実験の結果,減衰係数から便の硬さを,自己相関関数のPSRからガスの検出が可能であることが示唆された.

便およびガスの各画像において二つの超音波診断装置で得られる値は大きく異なるが,どちらの装置も便の状態を似た傾向で捉えており,装置の特性に合わせて補正を施すことで対応できる.さらに対象者数を増やしデータ収集し、精度の高い特徴量が抽出できるようにしていく。また、同時にケア基準を作成する予定である。画像データをさらいに追加し、分類方法の信頼性を高める。従来の看護におけるアセスメントと結果との妥当性を検証し、ケアアルゴリズムを作成する予定である。旅費として海外発表など考慮していたが、本年度は国内のみの発表であったため。最終年度のため研究成果として学会発表を予定していること。また、アルゴリズム作成において臨床での調査に備品や交通費、謝金が発生するため。次年度は、成果発表の機会を増やすことと、解析に必要なソフトのバージョンアップに使用する予定である。