hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
tRNAリボソームプロファイリングの開発と応用

精神・神経変性疾患モデルの神経細胞の翻訳について、平成30年度はさらなる翻訳解析を行った。その結果、精神障害に広く関わるDISC1が神経細胞の樹状突起における局所翻訳に関わることを見出した。また、その関与が、神経刺激に伴う神経活動に依存したことから、DISC1が神経活動に依存した(特に樹状突起での)翻訳を制御することを新たに見出した。また、その翻訳制御のメカニズムを調べたところ、40SリボソームサブユニットにDISC1が比較的多く存在し、各種翻訳開始因子とも結合すること、翻訳開始を促進させる役割を持つことをリコンビナントタンパク質で再構成したin vitro翻訳実験などから明らかにした。また、認知症や社会性の欠如などの表現型を示す前頭側頭葉変性症(FTLD)のモデルマウスを新たに構築し、そのマウスの翻訳解析を行った。その結果、FTLD原因タンパク質のTDP-43とDISC1が共凝集することによって局所翻訳の機能が低下し、社会性の欠如や過活動などの精神障害をもたらすことを明らかにした。さらにタンパク質の凝集化と精神障害の関係を調べる目的で、オートファジー機能を興奮性または抑制性の神経細胞のみで選択的に欠損させた二種類のマウスを構築した。その結果、両方のマウスが、社会性の欠如や巣作り行動の異常などを含む自閉症様の表現型を示すことを見出した。その分子メカニズムを新規に開発したプロテオミクス手法で調べたところ、翻訳レベルが低下すること、GABA受容体の輸送に関わるGABARAPタンパク質群がp62依存的に凝集することで、細胞表面のGABA受容体が減少し、興奮性・抑制性のバランスが崩れることを分子生物学実験、電気生理実験から見出した。以上から、タンパク質の凝集化は他のタンパク質との共凝集を通して幅広く、精神障害をもたらすことを明らかにした。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。mRNAの翻訳は全ての細胞において生命活動の中心をなすが、その分子レベルでの実体の詳細にはいまだ不明な点が多い。本年度は、mRNAの翻訳過程を一塩基の分解能で詳細に明らかにするための手法の開発を目指した。出芽酵母細胞の同一試料から、翻訳最中のリボソームに結合したRNAをスクロース勾配実験などによって単離、精製し、それらを増幅してライブラリーを作成するためのプラットフォームを確立させた。比較として、全く同じ酵母抽出液から、細胞質全体からのRNAも同じ試料から調製した。それらの配列を次世代シーケンサーで網羅的に読み、膨大な配列データのゲノム配列へのマッピングを行った。本年度はこれら一連の実験手順を確立させ、再現性の高いデータを取ることに成功した。これらのRNAの配列解析から、様々な転写後修飾の存在を明らかにするとともに、翻訳に使われるコドンを解析するためのデータ解析手法を確立させた。mRNA翻訳の阻害は様々な細胞の状態の変化や疾患とも関連している。しかし、翻訳阻害がどのようなメカニズムで起こっているのかの詳細はいまだ不明な点が多い。そこで、本年度は、翻訳阻害を起こすことが知られている様々なストレス条件下において本手法を用いて解析を行った。その結果、翻訳阻害のメカニズムを明らかにできる分子バイオマーカーを見出した。また、これらの実験手法に様々な改良を加え、出芽酵母だけでなく、哺乳動物細胞を用いた本技術のプラットフォームの確立も行った。本年度は、様々な環境ストレス存在下での出芽酵母の翻訳阻害メカニズムの解明を目指し研究を行った。特に、tRNAの修飾に関わると考えられるオルガネラや遺伝子に関する欠損酵母株などを用いた解析を行い、それがもたらす翻訳阻害の表現型の検討を行った。その結果、酸化ストレスを誘発する薬剤が直接的にではなく、酸化ストレスによる細胞内シグナリングの変化によって、tRNAが特異的に修飾されることを見出した。特に、細胞膜やオルガネラ膜の不安定化がtRNA修飾へ関わることが示唆された。一方で、翻訳における揺らぎ仮説を実験的に検証するため、特定の遺伝子の翻訳過程に注目し、そのmRNAの翻訳のみを特異的に取り出して調べるための手法を様々な角度から検討した。昨年度に作成し、特定の遺伝子に改変を行ったプラスミドからタンパク質発現を確認し、その翻訳解析を行う準備進めた。哺乳動物細胞に関しては、リボソームプロファイリング法の細かな部分を確立させ、神経細胞の異なる部位で、刺激前後での翻訳の違いを明らかにする実験系を培養神経細胞とマウス脳の両方で確立させた。さらに本年度は、様々な配列データの解析を行うためのバイオインフォマティックスのプラットフォームを構築した。また、神経細胞での翻訳解析を行うための蛍光イメージング手法を初代培養神経細胞などを用いて確立させ、リボソームプロファイリングとの相関を調べる実験系を構築してきた。出芽酵母におけるmRNA翻訳に関する様々な網羅的解析手法を確立させるとともに、それを用いて、環境ストレス存在下での出芽酵母の新たな翻訳阻害メカニズムを明らかにした。さらに、哺乳動物細胞を用いた網羅的翻訳解析の実験系もほぼ確立できたため。本年度は、様々な環境ストレス存在下での出芽酵母の翻訳阻害メカニズムの解明を目指した研究をさらに進めた。特に、tRNAの修飾に関わると考えられるオルガネラや遺伝子に関する欠損酵母株などを用いた解析を行い、それによって翻訳阻害の表現型や翻訳モードがどのように変化するかをリボソームプロファイリング法などから検討した。その結果、tRNA修飾がmRNA翻訳に与える影響に関して、翻訳阻害に関する新たな分子メカニズムに関する知見を得た。一方で、翻訳における揺らぎ仮説を実験的に検証するための技術開発を様々な角度から検討した。

哺乳動物細胞に関しては、リボソームプロファイリングのための各種ライブラリー作成、バイオインフォマティックスツールの開発にさらに改良を加え、網羅的な配列データに対して様々な深いレベルでの統計解析を行うための実験系を確立させ、それによって神経細胞に存在する特異的な翻訳モードを明らかにした。また、新生ポリペプチド鎖の蛍光イメージング手法の開発に関して神経細胞などを用いて検討し、ゲノミクスによる解析との相関を調べる実験系の構築を進めた。また、国際共同研究において、真核生物の新生鎖一分子に対して力学計測を行うために必要とされる翻訳因子試料やmRNAの作成および力学計測のための実験機器の調整を行った。その結果、真核生物のmRNA翻訳を実時間で追跡することができる光ピンセット一分子力学計測系を構築した。様々な細胞を用いてmRNA翻訳に関する網羅的解析手法を確立し、かつデータ解析のためのバイオインフォマッティクスのツール群もこれまでに独自に開発してきており、今後の研究のさらなる発展が期待できる、また、真核生物の新生鎖の構造を調べるための一分子力学計測に関する国際共同研究も順調に進んでいるため。平成29年度は、同時tRNA/mRNAリボソームプロファイリング手法のさらなる検証と応用実験を行った。ヒスチジン枯渇や翻訳開始抑制剤であるハリントーニン、翻訳伸長抑制剤であるピューロマイシンで処理した出芽酵母を用いて、同時tRNA/mRNAリボソームプロファイリングを行ったところ、それぞれ、実験前から予想した結果を得ることができ、tRNA/mRNAリボソームプロファイリング手法の有効性を示した。また、tRNAの修飾酵素の遺伝子欠損株を用いて同時tRNA/mRNAリボソームプロファイリングを行った。その結果、いくつかの遺伝子欠損株では、tRNAがリボソーム内に取りま込まれる頻度が減少したことから、それらの修飾はtRNAのリボソーム内への取り込みを促進させていることが明らかになった。また、翻訳の忠実性に関して、同時tRNA/mRNAリボソームプロファイリングを用いて各種遺伝子欠損株の解析を行ったところ、この手法から翻訳の忠実性に関する新たな知見が得られることが判明した。また、精神・神経変性疾患モデルの神経細胞について、平成29年度はさらなる翻訳解析を行った。その結果、精神障害に広く関わるDISC1が樹状突起や40Sリボソームサブユニットと同じ画分に多く存在すること、翻訳開始を促進させる役割を持つことを神経細胞や培養細胞を用いた翻訳実験などから明らかにした。また、その神経刺激に依存した翻訳開始促進機能は、DISC1が凝集することによって低下し、それは社会性の欠如などの精神障害をもたらすことを明らかにした。
超高圧処理が筋細胞小器官に及ぼす影響

本研究は、死後の筋肉タンパク質の、分子レベルでの変化を支配するCa^<2+>の主要な制御器官である筋小胞体やミトコンドリア、ならびにタンパク質分解酵素を内包しているライソソーム顆粒に及ぼす高圧処理の影響を形態学的および生化学的に研究し、通常の低温熟成(34°C)下でのこれらの細胞内小器官の変化と比較検討し、筋肉から食肉への合理的な変換方法およびその促進方法を確立するための基礎とするものである。1.筋小胞体やミトコンドリアの膜構造の破壊が、処理圧力の増加につれて拡大したが、Ca^<2+>イオンの膜内への取り込みと関連するATPase活性には、200MPaまでの処理圧力では、有意な低下が認められなかった。2.筋小胞体やミトコンドリアのCa^<2+>取り込み能力は、処理圧力の増加につれて低下し、200MPaの加圧でほとんどゼロとなった。3.筋小胞体やミトコンドリアの細胞内小器官に局在していたCa^<2+>イオンが、高圧処理により筋原線維内に拡散していくことが、電子顕微鏡による観察から明らかになった。4.高圧下、あるいは熟成中のコネクチン分子の開裂はカルパイン(Ca^<2+>イオンによって活性化される酵素,Calpain)によって引き起こされることを明らかにした。5.圧力によって引き起こされる筋肉中の総タンパク質分解活性の増大は、ライソソーム膜の破壊によって酵素タンパク質が膜外に溶出したことによる。また、筋肉内の総カルパイン活性も、圧力処理によって増加することを確認した。高圧処理によるCa^<2+>制御機構の脆弱化と筋肉構造の脆弱化が圧力処理によって引き起こされる食肉の軟化・熟成促進機構の主因である。本研究は、死後の筋肉タンパク質の、分子レベルでの変化を支配するCa^<2+>の主要な制御器官である筋小胞体やミトコンドリア、ならびに呈味物質生成の因となるタンパク質分解酵素を内包しているライソソーム顆粒、に及ぼす超高圧処理の影響を形態学的、組織化学的および生化学的に研究し、通常の低温熟成(牛肉の場合、24°Cで2週間程度)下でのこれら細胞内小器官の変化と比較検討し、筋肉から食肉への合理的な変換方法およびその促進方法を確立するための基礎とするものである。今年度は、細胞内小器官のなかの筋小胞体に対する高圧処理の影響を主に研究し、以下のような結果が得られた。1.高圧処理した筋肉から調製した筋小胞体の膜構造の崩壊は150MPa以上の処理圧力で、圧力の増加とともに促進された。2.筋小胞体の収量は、150MPa以上の処理圧力で減少した。3.ATPase活性への影響は、筋小胞体の標品(高密度画分と低密度画分)で異なる傾向が認められた。4.Ca^<2+>の取り込み能は、処理圧力の増加とともに減少し、200MPaの圧力処理でゼロとなった。5.屠殺直後の筋肉では筋小体領域に局在していたCa^<2+>が、圧力処理により筋原線維全体に拡散することが電子顕微鏡による観察で明らかになった。6.その他、ライソソーム内外に存在するタンパク質分解酵素に関する研究も進んでいる。特に、カンパインとその阻害物質(カルバスタチン)に及ぼす圧力処理の影響と肉の軟化との関係を考察した。高圧処理は短時間で、通常の低温熟成よりも大きな変化を筋細胞小器官にもたらすことが明らかになった。

本研究は、死後の筋肉タンパク質の、分子レベルでの変化を支配するCa^<2+>の主要な制御器官である筋小胞体やミトコンドリア、ならびに呈味物質生成の因となるタンパク質分解酵素を内包しているライソソーム顆粒、に及ぼす超高圧処理の影響を形態学的、組織化学的および生化学的に研究し、通常の低温熟成(牛肉の場合、24°Cで2週間程度)下でのこれら細胞内小器官の変化と比較検討し、筋肉から食肉への合理的な変換方法およびその促進方法を確立するための基礎とするものである。今年度は、細胞内小器官のなかライソソーム並びにミトコンドリアに対する高圧処理の影響を調べ次のような結果を得た。1.調製したライソソーム標品に高圧を加え、その微細構造の変化を電顕で観察した結果、200MPaの圧力で二重膜構造の崩壊が認められた。2.高圧処理を加えた筋肉からミトコンドリアを調製し、Ca^<2+>取り込み能を測定した結果処理圧力の増加につれて取り込み能は低下したが、その構成タンパク質のSDS-PAGE像には大きな変化は認められなかった。3.調製ミトコンドリア標品に圧力を加えた場合には、100MPa程度の低い圧力でCa^<2+>の取り込み能はほとんど、失われた。4.細胞小器官の外に存在する、筋肉内第三のタンパク質分解系として注目をあびているプロテアソームを部分精製し、食肉の軟化・熟成に関与する可能性を明らかにした。5.高圧処理牛肉より呈味物質、特にペプチドを分離し、その分子量分布やアミノ酸組成を分析した結果、通常の低温熟成とは異なる機構でペプチドが生成されること、これは、ライソソーム内に存在するカテプシン系酵素の耐圧性と密接な関係にあることを明らかにした。今年度は、細胞内小器官のなかのミトコンドリアに対する高圧処理の影響を形態学的および生化学的に調べ次のような結果を得た。1.調製したミトコンドリア標品に高圧を加え、その微細構造の変化を電顕で観察した結果、圧力の増加につれて膜構造の崩壊が観察され、300MPaの加圧で内容物がほぼ完全に膜外に漏出した。2.調製したミトコンドリアのca^<2+>取り込み能力に及ぼす圧力の影響は、高圧処理後に調製した場合に比べて低い圧力で大きく現れることが認められた。3.ミトコンドリアの構成タンパク質をSDS-PAGEで分析した結果、Ca^<2+>の取り組みに関連すATPaseへの影響は小さかった。4.その他、ライソソーム外に存在するタンパク質分解酵素プロテアソームの特性についても若干の知見を得た。高圧処理による筋小胞体やミトコンドリアから放出されたCa^<2+>イオンによるカルパインの活性化と筋原線維蛋白質の物理的脆弱化が、食肉の軟化・熟成の促進につながる。
臨床試験における適応型デザインの研究

今年度は最近出版されたChowらのテキスト(Chow、et. al.(2006))を中心に勉強会を行いながら、実地での臨床試験におけるデザイン検討を通じて適応型デザイン(Adaptive Design;AD)の問題点の検討ならびに実践適用の可能性を探った。主な活動として3点挙げる。(1)EUの新薬審査機関が適応型デザインに関するReflection Paperを2007年に最終板として公表したので、これを訳して紹介するとともに、上記の問題点の検討を踏まえた解説を加えた(森川、「薬理と治療」、36、3月号、pp.177-187(2008))。(2)10月にカナダのトロントで開催された「Putting Theory intoPractice:Adaptive Clinical Trial Designs」に森川が参加した。ADの方法論開発の担い手の一人であるJ.Shih自身がADの適用に関して極めて厳しい立場をとっている一方ではADのデザイン特性をうまく生かして効率的に医薬品開発を行おうとする積極的な製薬会社の姿勢が注目された。(3)がん臨床試験(治験)において、AD適用の可能性のあるケースについて、中間解析並びに適応型デザインの適用可能性を検討した。群逐次の枠組みの中で柔軟に適用できるCuiら(2000)の方法の適用を当局に提案したが、生存時間解析の場では予測可能性の観点から適用が極めて難しくなる可能性があることがわかり、今回の治験では断念せざるを得なかった。理論研究の観点からは、条件付き検出力の適切な評価法、治療効果の適切な推定法の2点が本研究のアウトプットとしての第3年度の研究目標と考えられた。また方法論の教育と普及の観点から中間解析及びADに関するテキストの作成も重要であると考えられた。臨床試験における適応型デザインの方法論と適用上の問題について、文献検索、学会・研究集会、関連ソフトのテスト使用、及び実地での臨床試験におけるデザイン検討を通じて調査ならびに問題点の検討を行った。具体的には(1)文献検索:生物統計学に関連する有力欧米誌の検索を行った。内有力な3誌では適応型デザインの特集を行っていた(いずれも2006年)。またEUの新薬審査機関であるCHMPがやはり同年に適応型デザインに関するreflection paperを公表していることは特筆される。当初渡米による調査も視野に入れていたが、これほどの夥しい文献情報により、海外調査は必須でないと判断した。(2)学会・研究集会:本デザインのニードを持つ日本製薬工業協会による統計関連学会連合大会の企画セッション(「臨床試験におけるAdaptive designsの活用」)の実現に協力し、本デザインを研究テーマとしている在米若手統計学者小山達樹氏の招聰に尽力、かつセッション座長を務めた。本セッションは大きな反響を呼び、その後適応型デザインに関連付けた多くの研究集会が開かれる引き金となった。(3)ソフトウェアの調査とテスト使用:代表的な適応型デザイン機能を組み込んだソフトウェアが既に存在することが、調査により判明した。その内最も充実していると考えられるソフトを購入(1年契約)してテストを行い、このソフトが極めて高度の機能を保有していることを知った。(4)臨床試験デザイン検討:報告者が直接間接に関係している臨床試験における検討を通じて、適応型デザインの必要性を実感した。以上を通じて本研究の基礎固めとしての調査を行う初年度の研究目的は達したといえる。2年度以降は具体的方法論及び臨床試験への実地応用の検討、それらを踏まえた研究論文の作成を目標としたい。本研究、あるいは本テーマに触発された他の研究が規制当局に対しても影響を持ちうるような成果を挙げることができれば意義があることと考える。
早期に癌化する白板症を生検時に確実に判定し見逃さない

本研究では、これまでに研究代表者が行ってきた口腔扁平上皮癌のバイオマーカーに関する研究を発展させて、口腔白板症の癌化メカニズムの解明を試みた。口腔白板症症例の生検時切除標本を口腔白板症の確定診断後、5年以上経過観察が可能で5年間癌化しなかった群(G1)と口腔白板症の確定診断後、5年以内に同部位から癌化が認められた群(G2)の2グループに分けて、前年度までにリストアップしてきた口腔白板症関連バイオマーカー候補のうちPDE5、SIRT1、HSP90、AMBP、SYK、ANXA2の6種類のターゲット分子について、モノクローナル抗体を用いた免疫組織化学染色を行い、タンパク質の発現量を解析した。正常口腔組織と比較して、G1群のPDE5とHSP90タンパク質発現量に著変は認められなかったが、G2群の発現量は高発現を示す症例が多い傾向であった。また、口腔扁平上皮癌組織のPDE5とHSP90発現量は高発現を示す症例が多かった。発現亢進と臨床指標との間に統計学的有意な相関は認められなかった。一方で、正常口腔組織と比較して、G1群およびG2群のSIRT1、AMBP、SYKタンパク質発現量に著変は認められなかったが、口腔扁平上皮癌組織におけるSIRT1とAMBP、SYKの発現量は低発現を示す症例が多かった。ANXA2のタンパク質発現状態は、正常口腔組織とG1群との間には、著変は認められなかったが、G2群の発現量は低下を示す症例が多い傾向であった。口腔扁平上皮癌組織におけるANXA2の発現量は低発現を示す症例が多かった。PDE5、SIRT1、HSP90、AMBP、SYK、ANXA2などのタンパク質の発現量の増減が口腔白板症の癌化と関連しており、その発現状態から口腔白板症の診断、予後の判定、治療方針の立案、治療法の開発等に貢献できる可能性が示唆された。検証実験に時間を要したことにより、学会発表、論文作成および論文投稿などの研究成果の発表が遅れているため。これまでに得られた研究成果について医学論文作成、各種関連学会にて発表を行い、成果の公表を行う。口腔白板症は、前癌病変であり、その癌化率は、わが国では3.1-16.3%とされる。癌化のメカニズムの詳細は不明である。本研究は、これまでに行ってきた口腔扁平上皮癌のバイオマーカーに関する研究を発展させて、白板症の癌化メカニズムを解明し、白板症の診断、予後の判定と治療方針の決定、治療方法の開発等、臨床へ応用することが目的であった。口腔白板症症例の生検時切除標本を口腔白板症の確定診断後、5年以上経過観察が可能で、5年間癌化しなかった群(第1グループ(G1))と口腔白板症の確定診断後、5年以内に同部位から癌化が認められた群(第2グループ(G2))の2グループに分けて、これまでに研究代表者がリストアップしてきた口腔扁平上皮癌関連バイオマーカー候補のうちPDE5とSIRT1の2種類のターゲット分子についてモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学染色を行い、口腔白板症における発現量を解析した。また、G1とG2群におけるそれぞれの発現量と、臨床指標を比較検討した。正常口腔組織と比較して、G1群のPDE5タンパク質発現量に著変は認められなかったが、G2群の発現量は高発現を示す症例が多い傾向であった。また、口腔扁平上皮癌組織のPDE5発現量は高発現を示す症例が多かった。一方で、正常口腔組織と比較して、G1群およびG2群のSIRT1発現量に著変は認められなかったが、口腔扁平上皮癌組織のPDE5発現量は低発現を示す症例が多かった。PDE5の解析結果からPDE5タンパク質高発現の白板症は癌化する可能性が示唆された。また、白板症のSIRT1発現低下と癌化との関連が示唆された。今後、候補分子を増やし、また、症例数を増やして継続して解析を行っていく予定である。平成28年度の研究では、これまでに科研費による研究で、研究代表者がリストアップしてきた口腔扁平上皮癌関連バイオマーカー候補についてモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学染色を行い、口腔白板症における発現量を解析することにより白板症の癌化メカニズムを解明することが目的であった。正常口腔組織(舌)、白板症組織(舌)、口腔扁平上皮癌組織(舌)についてPDE5とSIRT1の2種類の候補タンパク質について免疫組織化学染色法によりそれぞれの発現量と発現状態を解析できた。また、それぞれの組織における発現量と、臨床指標を比較検討し、口腔白板症の癌化に関するリスクファクターの検出を検討できた。口腔白板症は、前癌病変であり、口腔粘膜の角化亢進によって生じる白斑状の病変で、「他のいかなる疾患としても特徴づけられない著明な白色の口腔粘膜の病変」と定義されている。口腔白板症の癌化メカニズムは未だ不明である。本研究は、これまでに研究代表者が行ってきた口腔扁平上皮癌のバイオマーカーに関する研究を発展させて、白板症の癌化メカニズムを解明し、臨床へ応用することである。

口腔白板症症例の生検時切除標本を口腔白板症の確定診断後、5年以上経過観察が可能で5年間癌化しなかった群(第1グループ( G1))と口腔白板症の確定診断後、5年以内に同部位から癌化が認められた群(第2グループ(G2))の2グループに分けて、これまでにリストアップしてきた口腔扁平上皮癌関連バイオマーカー候補のうちPDE5、SIRT1、HSP90、AMBPの4種類のターゲット分子についてモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学染色を行い、口腔白板症における発現量を解析した。また、G1とG2群におけるそれぞれの発現量と、臨床指標を比較検討した。正常口腔組織と比較して、G1群のPDE5とHSP90タンパク質発現量に著変は認められなかったが、G2群の発現量は高発現を示す症例が多い傾向であった。また、口腔扁平上皮癌組織のPDE5とHSP90発現量は高発現を示す症例が多かった。発現亢進と臨床指標との間に統計学的有意な相関は認められなかった。一方で、正常口腔組織と比較して、G1群およびG2群のSIRT1とAMBPタンパク質の発現量に著変は認められなかったが、口腔扁平上皮癌組織のSIRT1とAMBP発現量は低発現を示す症例が多かった。PDE5、SIRT1、HSP90、AMBPなどのタンパク質の発現量の増減が白板症の癌化と関連しており、その発現状態から白板症の診断、予後の判定、治療方針の立案、治療法の開発等に貢献できる可能性が示唆された。平成29年度の研究は、前年度解析した実験内容に引き続き、これまでに研究代表者がリストアップしてきた口腔扁平上皮癌関連バイオマーカー候補タンパク質についてモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学染色を行い、口腔白板症における発現量を解析することにより白板症の癌化メカニズムを解明することが目的であった。正常口腔組織(舌)、白板症組織(舌)、口腔扁平上皮癌組織(舌)についてPDE5、SIRT1、HSP90、AMBPの4種類の候補タンパク質について免疫組織化学染色法によりそれぞれの発現量と発現状態を解析できた。また、それぞれの組織における発現量と、臨床指標を比較検討し、口腔白板症の癌化に関するリスクファクターを検出することができた。本研究では、これまでに研究代表者が行ってきた口腔扁平上皮癌のバイオマーカーに関する研究を発展させて、口腔白板症の癌化メカニズムの解明を試みた。口腔白板症症例の生検時切除標本を口腔白板症の確定診断後、5年以上経過観察が可能で5年間癌化しなかった群(G1)と口腔白板症の確定診断後、5年以内に同部位から癌化が認められた群(G2)の2グループに分けて、前年度までにリストアップしてきた口腔白板症関連バイオマーカー候補のうちPDE5、SIRT1、HSP90、AMBP、SYK、ANXA2の6種類のターゲット分子について、モノクローナル抗体を用いた免疫組織化学染色を行い、タンパク質の発現量を解析した。一方で、正常口腔組織と比較して、G1群およびG2群のSIRT1、AMBP、SYKタンパク質発現量に著変は認められなかったが、口腔扁平上皮癌組織におけるSIRT1とAMBP、SYKの発現量は低発現を示す症例が多かった。ANXA2のタンパク質発現状態は、正常口腔組織とG1群との間には、著変は認められなかったが、G2群の発現量は低下を示す症例が多い傾向であった。口腔扁平上皮癌組織におけるANXA2の発現量は低発現を示す症例が多かった。
ヘリカル磁場を利用したRFPのダイナミクス制御

逆磁場ピンチ(RFP)のダイナミクス制御はRFP閉じ込め実験の改善にとって非常に重要な課題である。本研究では、STE-2RFP(R/a=0.4m/0.1m)において抵抗性シェル(SS真空容器、磁場浸透時定数<0.15ms)の外部から内部共鳴(M/N=1/8)回転ヘリカル磁場を印加して、モード回転またはプラズマ回転を駆動することを試みた。M(N)は外部摂動磁場のポロイダル(トロイダル)モード数を表す。典型的なRFP放電(I_p【less thanor equal】60kA、放電時間γ_<RFP>0.7ms)では、RFP配位生成直後(t=0.25ms)からm/n=1/8を主な構造とする磁場揺動が支配的になり、放電期間中ほとんど回転しない。m/n=1/8モードはγ/a0.4付近に共鳴面をもつテアリングモードと考えられる。トーラス全周にわたって取り付けた2組のヘリカルコイルに位相差π/2の振動電流を流して回転磁場(f10-20kHz、V_<ph>4-7km/s)を生成した。本研究ではLC減衰振動電流を用いたため、実効的な振動磁場印加時間幅は0.3-0.4ms程度である。摂動磁場レベルを|B_<ra>|/B_<θa>(B_<[θa>は表面ポロイダル磁場)で定義する。0.4%以上の回転磁場を印加すると揺動振幅B_<ra>が減少し、さらに、B^^_<ra>が外部磁場の回転方向に回転する。0.4%以下では、B_<ra>の振幅減少と回転は観測されない。フーリエ変換を行なってm=1/m=7,8,9磁場揺動モードの振幅を見ると、回転磁場がない場合にはRFP配位形成直後からSS真空容器の時定数程度で増大し、放電終了まで増大し続ける。0.4%程度以上の回転磁場を印加すると、トランジェントではあるが0.2-0.3msの間、モードの振幅増大が抑制され、放電電流ピーク付近でもモード振幅が低下する。本研究では、減衰振動電流という制限された条件の下ではあるが、回転共鳴ヘリカル磁場とテアリングモードとの相互作用が生じうることを、RFPで初めて実証した。トーラスプラズマではプラズマの回転が安定性に深く関係している。RFPの抵抗性シェルモード(RSM)として重要なテアリングモードはプラズマのトロイダル回転により安定化できると考えられている。本研究では京都工芸繊維大学のSTE-2 RFP(R/a=0.4m/0.1m、I_P≦60kA、放電時間_r_<RFP><1ms)装置において、内部共鳴(m/n=1/8)回転ヘリカル磁場により共鳴層(磁気島)に電磁トルクを与えてプラズマ回転を制御できるかどうか、また、回転磁場を印加した場合の磁場揺動のダイナミクスがどう変化するかを明らかにする。従来のシェル(磁場浸透時間_r_S1.7ms)を取り外して放電容器(磁場浸透時間_r_ω<0.2ms)外側にモジュラー及び直交ヘリカルコイルを取り付け、LC減衰振動を利用して回転磁場を印加している。

シェルを取り外すとRFP放電の再現性が低下し、磁場揺動(B_r)レベルが3倍程度増加して放電抵抗が50%程度増加するが、I_P>50kA、_r_<RFP>0.4-0.6msのRFP放電を得ることができる。磁場反転時間はSS放電容器の磁場浸透時間の2-3倍である。トーラス方向半周(1/4周×2)にわたるコイルを用いて実効印加時間0.3-0.4ms、周波数10-15kHzで回転磁場を印加した場合、摂動レベル1%まででは巨視的な放電特性に顕著な変化は観測されないが、トロイダル磁束揺動の非軸対称成分の回転に効果が見られる。m=1のヘリカル摂動磁場に対してトロイダル磁束(m=0)の応答が観測される原因を調べるために、放電容器外壁に磁気プローブ列を取り付けてモードダイナミクス計測を進めている。さらに、静電プローブによるプラズマ回転速度測定、静電エネルギー分析器による熱外高速電子測定も進めている。外部摂動レベルを増加させ、さらに回転磁場の実効的印加時間を伸長するために現在、ヘリカルコイル系の一部改造を行なっている。逆磁場ピンチ(RFP)のダイナミクス制御はRFP閉じ込め実験の改善にとって非常に重要な課題である。本研究では、STE-2 RFP(R/a=0.4m/0.1m)において抵抗性シェル(SS真空容器、磁場浸透時定数<0.15ms)の外部から内部共鳴(M/N=1/8)回転ヘリカル磁場を印加して、モード回転またはプラズマ回転を駆動することを試みた。M(N)は外部摂動磁場のポロイダル(トロイダル)モード数を表す。典型的RFP放電(Ip【less than or equal】60kA、放電時間τ_<RFP>0.7ms)では、RFP配位生成直後(t=0.25ms)からm/n=1/8を主な構造とする磁場揺動が支配的になり、放電期間中ほとんど回転しない。m/n=1/8モードはr/a0.4付近に共鳴面をもつテアリングモードと考えられる。トーラス全周にわたって取り付けた2組のヘリカルコイルに位相差π/2の振動電流を流して回転磁場(f10-20kHz、V_<ph>4-7km/s)を生成した。本研究ではLC減衰振動電流を用いたため、実効的な振動磁場印加時間幅は0.3-0.4ms程度である。摂動磁場レベルを|B_<ra>|/B_<θa> (B_<θa>は表面ポロイダル磁場)で定義する。0.4%以上の回転磁場を印加すると揺動振動B^^_<ra>が減少し、さらに、B^^_<ra>が外部磁場の回転方向に回転する。0.4%以下では、B^^_<ra>の振幅減少と回転は観測されない。フーリエ変換を行なってm=1/n=7,8,9磁場揺動モードの振幅を見ると、回転磁場がない場合にはRFP配位形成直後からSS真空容器の時定数程度で増大し、放電終了まで増大し続ける。0.4%程度以上の回転磁場を印加すると、トランジェットではあるが0.2-0.3msの間、モードの振幅増大が制御され、放電電流ピーク付近でもモード振幅が低下する。本研究では、減衰振動電流という制限された条件の下ではあるが、回転共鳴ヘリカル磁場とテアリングモードとの相互作用が生じうることを、RFPで初めて実証した。
肢体不自由児・者用ワードプロセッサおよびその指導プログラム開発に関する研究

1.肢体不自由児・者用ワードプロセッサの試作について本試作に当たり、ワードプロセッサの学校教育への導入といった点を考慮して、安価で、しかも操作が容易なものを試作することとし、その原型を普及型の東芝TOSWORD-JW1に求めた。試作に先き立ち、上肢障害及び視知覚障害がワードプロセッサの操作にどう影響するかを動作分析等を通して把握し、その知見をもとにワードプロセッサ本体及びキーボード部の試作の主な観点を以下の通りとした。(1)ファンクションキーは、手指を身体の正中線を越えて機能させることの困難さを考慮し、キーボードの両サイドに設置する。(2)下肢で操作する者がいる点を考慮し、キーボード用ケーブルを長くする。(3)様々な姿勢からでもディスプレイが見やすいように、その可変角度を大きくする。(4)キーを捜す手がかりを容易にするため、シフトキーとそれに対応するキーボタン上の文字の色を同一にする。(5)手指をキーボード上に乗せて操作できるようにするためのアタッチメントについては、相当な力が加わる点を考慮し、キーボード自体に固定できるはめ込み式とする。(6)文字キーの配列は、学校教育との関連を考慮し、五十音順及びアルファベット順とする。(7)カーソルの移動の速さを障害の程度に合わせられるように、2種類のシステム・エーティリティのフロッピーディスクを用意する。以上の観点に即して試作したワードプロセッサは、TOSWORD JW-1PHという。2.指導プログラムの作成について指導プログラム(トレーニング・マニュアル)は、初級(キー打ちの練習,平仮名・漢字等の打ち方の習得,編集機能-挿入等-の習得)と上級(編集機能・補助機能及びエーティリティ機能の習得等)で構成されており、それぞれのねらいに即した課題が用意され、1回の指導ごとに印刷を行うよう指示されている。本年度は、研究の第2年次に当たり、次の研究活動を行なった。1.ワードプロセッサの試作について昨年度試作したキーボードをもとに、キーボードアタッチメント、補助台、システム・ユーティリティの試作を行ない、その過程で次のような知見が得られた。アタッチメントでは、【◯!1】キーボード上面へのはめ込み式とする、【◯!2】穴の大きさ及び配置は、キートップの1キーに合わせる、【◯!3】ファンクションキーの穴のまわりに色を付ける。補助台では、【◯!1】角度調節を9段階までできるようにする、【◯!2】操作する手を安定させるためのバーを取りつける。システム・ユーティリティでは、【◯!1】重・中度肢体不自由児・者用と中・軽度肢体不自由児・者用の2種類のシステム・コーティリティのフロッピーディスクを必要とする。以上の点を踏まえた製作を業者に発注し、昭和60年9月から昭和60年11月の間で製造された。2.指導プログラムについて昨年度に引き続き、指導プログラム作成のための資料を収集した。まず、ワードプロセッサを導入している養護学校等を訪問し、指導の実際を見学するとともに、指導方法・指導上の留意点等について、意見を聴取した。さらに、実地適用の面では、昨年度から継続している市販のものに加えて、昭和60年11月以降は、上記試作品による実地適用を開始しているが、その過程で、次のような問題点が生じてきている。【◯!1】試作品が2台しかないため、実地適用する児童・生徒の数が少ないこと。【◯!2】ワードプロセッサを学校教育へ導入する場合の教育的意義及び問題点を検討する必要があること。【◯!3】【◯!2】に関連して、どの程度の障害のある者にワードプロセッサを活用させるべきか。【◯!4】上記【◯!2】【◯!3】の問題点を指導プログラムの中でどのように考えていくべきか。

本年度は、研究の最終年度に当たり、指導プログラムの作成を中心に研究を進めた。まず昨年度試用した、肢体不自由児・者用ワードプロセッサ(以下、「ワープロ」という)2台を使用し、研究協力機関の協力を得て、指導プログラム(試案)の検討を行った。試案は、(1)平仮名五十音の入力、(2)濁音・半濁音の入力、(3)「を」・促音・拗音の入力、(4)句点・読点の入力、(5)英数字の入力、(6)片仮名の入力、(7)漢字の入力、(8)編集機能の活用、から構成されており、その指導手順を検討するための実地適用の結果から、次のような改善点が見い出された。(1)「平仮名五十音の入力」、「濁音の入力」といったような大きな項目だけを示すのではなく、具体的な教材(ワープロで打つべき内容)を用意する必要がある。(2)漢字を知っている児童生徒には、できるだけ早期に漢字入力の仕方を教えることが動機づけにもよい。(3)カーソルの働きについては、早期から教える必要がある。(4)動機づけを高める点から印刷の操作は早期から教えることがよい。以上の点を踏まえ、ワープロで打つべき内容を盛り込んだプログラムを、トレーニング・マニュアルという形式で作成した。トレーニング・マニュアルの構成は、【I】キーを打つ練習、【II】平仮名(五十音、濁音、促音、拗音)をマスターする、【III】漢字の打ち方・選択・訂正の仕方をマスターする、【IV】片仮名・アルファベット(大文字・小文字)・数字の打ち方並びに編集機能(挿入・削除・コピー・半角)をマスターする、【V】編集機能・補助機能をマスターする、【VI】ユーティリリティ機能をマスターする、(補)機器の操作をマスターする、である。なお、【I】【IV】は初初級、【V】【VI】は上級であり、(補項)は障害の程度、ワープロの習熟度等によって、適宜指導する内容とした。各項には、それぞれねらいに即した課題が用意されており、1回の指導が終了するごとに印刷を行い、以後の学習の動機づけとなるよう配慮されている。
大脳基底核間接路の神経回路ダイナミクスと脳深部電気刺激療法の機序の解明

・淡蒼球神経細胞のモデル構築とその応答性の解析:淡蒼球に存在する3タイプの細胞のうち、その主要なタイプ(>60%)であるtypeII(Nambu&Llinas,1997)あるいはtype A (Cooper&Stanford,2000)ニューロンをモデル化し、リズム活動時の応答特性を表す位相応答曲線(Phase Response Curve)を求めた。得られたPRCをもとに、これらのニューロンで構成される回路の安定活動パターンについて解析した。この解析ではニューロン間のシナプスとしてGABAAだけでなくGABAB結合も考慮し、GABAA結合とGABAB結合の比を変化させた時の、安定パターンの変化について調べた。その結果、GABABの強度が増すにつれ、同期活動の安定性が低下し、GABAA結合とGABAB結合のバランスが回路活動の安定性に対し重要な意味を持つことが示唆された。・視床下核-淡蒼球神経回路モデル計算機実験による間接路神経活動モードの解析:上述の淡蒼球ニューロンモデルとOtsukaら(2003)による視床下核ニューロンモデルから構成される視床下核-淡蒼球神経回路モデルを構築して計算機実験を行い、その神経活動モードを調べた。この系では、回路結合形態をはじめとして未知パラメータが多く存在するが、ここでは上述のGABAB結合の強度に加え、ドーパミン存在下(正常時)と枯渇下(病態時)における活動パターンの遷移に着目し、ドーパミンにより修飾されるとされるシナプスにおける伝達物質の放出確率をパラメータとして変化させ、活動パターンに対する影響を調べた。これら2つのパラメータの組合せにより、いくつかの活動モードが出現するが、ドーパミン枯渇時を想定したパラメータ値において、バースト活動が出現するなど、これらのパラメータが神経活動モードの遷移に寄与することが示された。大脳基底核内の視床下核と淡蒼球は相互に結合し基底核の活動を調節する役割を担っているとされているが、病変時には正常時とは異なるリズム活動や同期活動を示すことから、これらの神経活動の動的な特性が機能に関係していることが示唆されている。本研究では、視床下核-淡蒼球回路の数理モデルを用い、回路活動の動的特性を明らかにすることを目的とする。視床下核神経細胞と淡蒼球神経細胞の個々の細胞の応答特性、特に周期発火状態における同期・非同期発火活動の安定性について解析するため、各々の神経細胞モデルに対し、位相応答解析の手法(Kuramoto,2003)を適用した。視床下核神経細胞のモデル(Otsuka et al.,2004)、淡蒼球神経細胞モデル(Terman et al.,2002)に対する入力電流強度をパラメータにとり、入力強さに(周期あるいは発火率)対する安定位相差の変化に関する相図を得た。以上の解析により、1.視床下核神経細胞:入力強度が弱い範囲(発火率が数:Hz)においてのみ、位相差0の同期状態が不安定になるが、それ以外では安定して同期状態が実現される。2.淡蒼球神経細胞:調べた範囲の入力強度については安定して非同期状態が実現される。また、過分極入力に対しては、種々のカルシウムイオンチャネルの作用により、神経細胞の発火活動が周期的でない複雑なパターンを示すことも確認した。の結果を得た。以上から、各々の神経核を孤立させた条件での解析であるが、in vivoの環境で観測される発火率の範囲において、視床下核神経回路は同期活動、淡蒼球神経回路は非同期活動の傾向を示すことがわかった。また、視床下核-淡蒼球の動的モードの遷移には互いの相互作用が重要であり、正常時に観測される非同期活動には淡蒼球から視床核への投射が重要な役割を担っていることが示唆された。・淡蒼球神経細胞のモデル構築とその応答性の解析:淡蒼球に存在する3タイプの細胞のうち、その主要なタイプ(>60%)であるtype II (Nambu&Llinas,1997)あるいはtype A (Cooper&Stanford,2000)ニューロンをモデル化し、リズム活動時の応答特性を表す位相応答曲線(Phase Response Curve)を求めた。
微小領液高感度三次元分析法の研究

本研究は,収束イオンビームを用いた微小領域を対象とする高感度三次元現存分布解析手法を確率することを目的としている。ガリウム液体金属イオン源を用いることにより,直径0.1ミクロン,電流密度1A/cm^2程度の高感度収束イオンビームを得ることができる。このイオンビームは走査型イオン顕微鏡の観察用プローブ,高空間分解能二次元イオン質量分析法の一次ビームとして利用できるほか,ミクロン以下の微小な領域で試料を0.1ミクロン以下の精度で切削加工することにも用いることができ,これらの機能を組み合わせることにより,微小領域の高感度二次元元素分布測定,微粒子の切断加工と断面観察などが試みられてきた。本研究では安定度ならびに精度高い収束イオンビーム走査制御系を設計試作することにより、断面加工と断面の二次元高感度元素分布分析を繰り返し行うことを可能とし,二次元元素分布の積層としての3次元元素分布解析を実現した。安定度ならびに精度の高いビーム走査系は,走査波形をデジタル信号で発生させ,デジタル-アナログ変換を介してビーム偏向アンプに供給することにより実現した。デジタル制御のフレキシビリティーを十分に生かすことにより,1フレームあたり20分の1秒から18時間までの広い走査速度範囲と1フレームあたり1024から16777216ピクセルの広い画数範囲を任意に選択することができ,また,走査領域に一部をビーム偏向アンプの条件変更無しで拡大精密走査することも可能とした。さらに1画素ごとに二次イオン質量スペクトルが得られるように,マルチチャンネル高速信号計数回路を組み込むことにより,二次元情報を無駄なく速やかに取得し,分析全体のスループットを大幅に向上させることができた。これらの結果,高感度三次元元素分布解析を実用性の高い高性能分析手法として実現せしめた。
戦後家族の選択(昭和20年代後半の出生行動への生活構造論的接近)

昭和20年代後半の合計特殊出生率(TFR)の半減(4人台から2.1人前後)は.現代日本の家族さらには社会全体にとって、大きな画期をなす出来事であった。この現象は、TFRの低下の水準ならびにその後の推移からすれば、当時主張されていた「過剰人口圧力」や「生活の貧困」一般によっては説明不可能である。他方、現在議論されている「子供の養育費上昇」や「親とくに母親の自己実現欲求」論は、当時の生活状態や生活意識からすれば、あまりにも結果解釈的にすぎる。TFRの激減は、一般的な要因に還元するのではなく、当時の国際的な動向からしても、何よりもまず日本の経験に即して分析されねばならない。結論的に述べるなら、大正中期からの都市生活の展開によって形作られた生活枠組が、戦後の急速な生活変動(明治前期の水準への後退と戦前達成水準への復帰)に直面するとともに以降の将来見通しに際して、第3子以上を組み込むことを構造的な実担にほかならないと強く実感しはじめていた。このような生活環境と、優生保護法の実施という公的なインパクトとが相まって、わずか5年余りの間にTFRが2分の1以下に激減し、その減少部分の3分の2以上は、性急さ故に人工妊娠中絶によって行なわれたのである。この結果、日本社会の人口構成は一時的に生産年齢人口中心型(高度経済成長)となり、やがて急速な高齢社会をむかえることになる。なお、中絶行為そのものは、公的政策の介入によってではなく、家族という私的な領域における出来事であった。積極的にいえば、日本の家族が中絶をその内部で担う事態にこそ、家族の戦後性、あるいは現代性を見出すことができる。その特質を、地域、階層、世代、意識、新生活運動等の視点から明らかにすることは、今後の課題である。
虚血性脳血管障害に対するペマフィブラートの効果

まずは野生型マウスを用いて、急性局所脳虚血再灌流モデルでペマフィブラートが脳梗塞体積、脳出血の合併頻度、脳梗塞に伴う後遺症状に及ぼす影響を検証した。急性脳梗塞モデルとして、イソフルレン吸入麻酔下でマウスの頸部を正中切開し、頸動脈分岐部より6-0ナイロン糸を頭蓋内内頚動脈に進め前大脳動脈分岐部まで進めることにより中大脳動脈閉塞を作成し、45分後に血流を再開通させるモデルを使用した。中大脳動脈閉塞に際しては、虚血領域の脳血流量はレーザードプラ血流計を用いて継時的に計測した。C57bl6マウス20匹を用いて中大脳動脈閉塞開始直後にペマフィブラート(0.3 mg/kgまたは1.0 mg/kg)または偽薬を経口投与したところ、vehicle群に比べて、ペマフィブラート投与群では、48時間後の2,3,5-Triphenyl tetrazolium chloride(TTC)染色による脳梗塞体積が小さい傾向が見られた。ペマフィブラート低用量投与群と高用量投与群間では有意な差はなかった。神経学的スコアによる神経症状は、vehicle群に比べてペマフィブラート投与群ではより軽度な傾向がみられた。今後さらにサンプル数を増やして検証をを重ねる予定である。また、永久閉塞モデルやtPAの併用投与などにおいて同様の結果が得られるか検証を行う予定である。ペマフィブラート提供元との実験使用許可に関わる契約を結び、薬剤の提供に至るまでに予定よりも時間を要したことから、やや遅れている。ペマフィブラートの脳梗塞縮小効果が用量依存的であるか確認するとともに、最良の効果が得られるモデルを探索する。さらには血清脂質マーカーの動態や、炎症関連因子の関与を免疫組織学的に検証する。実験開始が遅れたため、当初購入予定であった電気泳動電源装置の購入などは次年度に持ち越すこととした。
(η^3-ベンジル)パラジウム錯体中間体を経由する新規有機合成反応の開拓

平成17年度までに、パラジウム触媒を利用することにより炭酸ベンジルエステル類と各種求核剤との求核置換反応を実現し、酢酸エステル類と有機ホウ素化合物との交差カップリングを実現した。そこで、平成18年度は以下の研究に着手し、成果を挙げた。まず、マロン酸エステル炭素アニオンの酢酸ベンジル類への求核置換反応を検討し、この反応が第三級アルコール溶媒中で円滑に進行することを見出した。これにより、ベンジルエステル類の求核置換反応において酢酸エステルを脱離基として利用することに成功した。従来、炭酸ベンジル類の求核置換反応ではα位に分岐をもつ基質の利用が不可能であった。そこで、この問題について検討したところ、二座ホスフィン配位子Cy-Xantphosのパラジウム錯体を用いることにより、ジフェニルメチルエスエルの求核置換反応が進行することを見出した。さらに、電子供与性の二座ホスフィン配位子D-i-PrPFを用いることにより、パラジウム触媒による炭酸ベンジル類の求核置換反応の反応速度が飛躍的に向上し、触媒量の低減を実現した。さらに、D-i-PrPF-パラジウム触媒を利用することにより室温での反応を実施できるようにした。最後に、D-i-PrPFが配位した0価パラジウム錯体と炭酸ベンジルとの反応をNMRで追跡し、パラジウム錯体がベンジル位炭素-酸素結合を切断し、(ベンジル)パラジウム錯体を与えることを証明した。また、この錯体のX線結晶構造解析を行い、その三次元構造を明らかにした。(η^3-ベンジル)パラジウム中間体は多くの有機合成反応の鍵中間体となり得ると期待されてきたが、効率良く発生させる方法が未知だったため、この分野の研究は大きく遅れていた。そのような状況下、申請者等は(η^3-ベンジル)パラジウム中間体を経由して進行すると考えられるベンジルエステル類のベンジル位置換反応の開発に世界で初めて成功した。そこで本研究では、申請者等によって開かれた(η^3-ベンジル)パラジウム中間体が関与する有機合成反応の分野をさらに発展させるべく、様々な求核反応剤によるベンジルエステル類のベンジル位置換反応について検討し、その基質適用範囲を調べた。1.中性条件下での活性メチン化合物のベンジル化反応活性メチン化合物のアルキル化にはエノラートを発生させるために塩基の添加が必須であった。そこで、本研究で塩基の添加を必要としないベンジル化の開発を試みたところ、炭酸ベンジルメチルをアルキル化剤として、(アリル)(シクロペンタジエニル)パラジウム、ビス(ジフェニルポスフィノ)フェロセン、1,5-シクロオクタジエンから反応系中で発生した触媒を用いることにより、反応が円滑に進行することを見出した。これにより、マロン酸エステル類、β-ケトエステル類、1,3-ジケトン類、アズラクトン類がベンジル化された。2.ベンジルエステルと有機ホウ素化合物との交差カップリング本研究において、パラジウム触媒によるベンジル化反応はハードな有機金属反応剤を求核反応剤とする置換反応にも有用であることを見出した。具体的には、(アリル)塩化パラジウム二量体と1,5-ビス(ジシクロヘキシルホスフィノ)ペンタンから発生したパラジウム錯体が炭酸ベンジル類とフェニルボロン酸との交差カップリングに高い触媒活性を示すことを見出した。本触媒により、広範囲のジアリールメタン類が自在に合成できる。申請者等は(η^3-ベンジル)パラジウム中間体を経由して進行すると考えられるベンジルエステル類のベンジル位置換反応の開発に世界で初めて成功した。そこで本研究では、申請者等によって開かれた(η^3-ベンジル)パラジウム中間体が関与する有機合成反応の分野をさらに発展させるべく、以下の研究を行った。1.スルフィン酸塩を求核剤とするベンジル位置換反応の開発これまでに開発したパラジウム触媒による炭酸ベンジル類への求核置換反応を基盤にして、スルフィン酸ナトリウム類を求核剤とするベンジルエステル類のベンジル位求核置換反応の開発を試みた。その結果、スルフィン酸塩の有機溶媒に対する溶解性からDMSOのような非プロトン性極性溶媒を用いる必要があったものの、二座ホスフィン配位子DPEphosと[Pd(η^3-C_3H_5)Cl]_2から反応系中で調製される触媒を用いることにより、目的とするスルフィン酸塩のベンジル化が効率よく進行し、様々なベンジルスルホン類が高収率で得られることを見いだした。本法は高度に官能基化された基質の反応にも有用であり、trienomycin類の合成中間体の合成に応用可能であることを示した。2.酢酸ベンジル類のベンジル位求核置換反応の開発前年度に開発した炭酸ベンジル類の鈴木-宮浦交差カップリングをよりユーザーフレンドリーなものに発展させるため、酢酸ベンジル類を基質として利用することに挑戦した。その結果、第三級アルコールを溶媒とすることにより、目的の反応が高収率で進行することを見いだした。この現象を利用して、様々な求核剤による酢酸ベンジル類の求核置換反応について検討し、反応を進行させることに成功した。

そこで、平成18年度は以下の研究に着手し、成果を挙げた。まず、マロン酸エステル炭素アニオンの酢酸ベンジル類への求核置換反応を検討し、この反応が第三級アルコール溶媒中で円滑に進行することを見出した。これにより、ベンジルエステル類の求核置換反応において酢酸エステルを脱離基として利用することに成功した。従来、炭酸ベンジル類の求核置換反応ではα位に分岐をもつ基質の利用が不可能であった。そこで、この問題について検討したところ、二座ホスフィン配位子Cy-Xantphosのパラジウム錯体を用いることにより、ジフェニルメチルエスエルの求核置換反応が進行することを見出した。さらに、電子供与性の二座ホスフィン配位子D-i-PrPFを用いることにより、パラジウム触媒による炭酸ベンジル類の求核置換反応の反応速度が飛躍的に向上し、触媒量の低減を実現した。さらに、D-i-PrPF-パラジウム触媒を利用することにより室温での反応を実施できるようにした。最後に、D-i-PrPFが配位した0価パラジウム錯体と炭酸ベンジルとの反応をNMRで追跡し、パラジウム錯体がベンジル位炭素-酸素結合を切断し、(ベンジル)パラジウム錯体を与えることを証明した。また、この錯体のX線結晶構造解析を行い、その三次元構造を明らかにした。