hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
化合物半導体結晶成長安定化のためのダイナミクスに関する研究

GaAs単結晶成長の安定成長を目的として,融液の複雑な流動現象を明らかにするために,可視化実験装置を用いて成長装置を模擬したるつぼ内の融液の流動観察ならびに数値シミュレーションによるモデリングを行った.可視化実験により,融液の量が変化した際の複雑な流動場の挙動を概ね明らかにすることできた.一方,数値シミュレーションによるモデリングでは,自然対流を含む複雑な流れ場のモデリングに加えて,回転による強制対流のモデリングを実施した.その結果,可視化実験による流れ場を良好に再現できるモデルが完成した.本研究により,複雑な流れ場とそれに大きく関わる結晶成長のメカニズムを明らかにすることができた.GaAs単結晶成長における非常に複雑な熱・物質移動現象の解明を目的として,実機を模擬した結晶成長実験装置を用いた可視化実験ならびに数値シミュレーションを実施した.結晶成長時には粘性が大きく異なる2つの流体が互いに逆方向に回転する相対運動を行っているため強制対流と自然対流が共存する場であることのほか,結晶の成長に伴いGaAs融液が減少することにより両対流が競い合うことで一層複雑な挙動を示す.そのため長い時間軸上では非定常な結晶成長の様相を示すことになる.昨年度概ね確立できた可視化手法を用いて,今年度は結晶成長に伴う融液の量の減少の際の強制対流と自然対流の競合場についての詳細な可視化実験を行った.その結果,結晶成長初期の融液が多い場合には双方の回転による強制対流よりも自然対流による大きな循環流が結晶成長界面に与える影響が大きく,結晶成長中期,後期では融液の減少に伴い自然対流よりも強制対流が支配的な場となり,結晶成長界面に与える影響が大きいことが明らかになった.一方,数値シミュレーションでは,実験の検証を行うためのモデリングを行った.粘性の異なる2流体を模擬可能としたほか,自然対流の影響を確認できるようになった.結晶と融液が入ったるつぼの双方の回転のモデリングに困難を極めており,強制対流を組み入れた計算がまだできない状況にある.次年度にはモデリングを完成し,実験結果の検証を実施予定である.以上本年度の可視化実験により,結晶成長に伴う融液の量の違いによる結晶成長界面での強制対流と自然対流の影響を確認できた.GaAs単結晶成長の安定成長を目的として,融液の複雑な流動現象を明らかにするために,可視化実験装置を用いて成長装置を模擬したるつぼ内の融液の流動観察ならびに数値シミュレーションによるモデリングを行った.可視化実験により,融液の量が変化した際の複雑な流動場の挙動を概ね明らかにすることできた.一方,数値シミュレーションによるモデリングでは,自然対流を含む複雑な流れ場のモデリングに加えて,回転による強制対流のモデリングを実施した.その結果,可視化実験による流れ場を良好に再現できるモデルが完成した.本研究により,複雑な流れ場とそれに大きく関わる結晶成長のメカニズムを明らかにすることができた.GaAs単結晶成長における熱・物質移動現象の解明を目的として,融液の複雑な流動現象を明らかにするために,可視化実験装置を用いて成長装置を模擬したるつぼ内の融液の流動観察を行った.可視化実験は,るつぼを模擬したビーカー内にGaAsを模擬した水と封止材である酸化ホウ素を模擬した機械油を用いて行なった.トレーサー粒子にはGlass Hollow Spheresを用いた.実験装置は成長装置と同様に加熱ができ,模擬結晶とビーカーがそれぞれ独立して回転する構造となっている.今年度は可視化観察に重点を置き,るつぼや結晶の回転数を変えたほか,融液の量も変化させて詳細な可視化実験を行った.融液は,結晶とるつぼのそれぞれの回転により生じた遠心力による強制対流と加熱による自然対流が共存する場となる.それに加えて固体の結晶が融液中に存在し,そこに大きく粘性の異なる封止剤が融液にふたをしているため,極めて複雑な挙動を示す.実験では,融液の量を変化させた時に,回転による強制対流と回転を止め熱のみを加えた自然対流のそれぞれの影響について詳細に可視化した.その結果,融液の量の違いによるそれぞれの流動について確認することができた.また,それぞれの流れ場において,固体の結晶が存在することによる違いや結晶がるつぼと同方向に回転する場合と逆方向に回転する場合の流動の違いも明らかにすることができた.以上,本年度の研究により可視化手法を確立できたほか,融液の流動特性をある程度明らかにすることができたと考えている.GaAs単結晶成長における熱・物質移動現象の解明を目的として,融液の複雑な流動現象を明らかにするために,可視化実験装置を用いて成長装置を模擬したるつぼ内の融液の流動観察ならびに数値シミュレーションによるモデリングを行った.結晶成長時には,GaAs融液が加熱されているほか粘性が大きく異なる2つの流体が互いに反対方向に回転する相対運動を行っているため,自然対流と強制対流とが共存する複雑な流動場となっている.また,結晶の成長に伴い融液が減少することにより,両対流が競い合うことで流れ場をより複雑なものにしている.昨年度までの可視化実験により,融液の量が変化した際の複雑な流動場の挙動を概ね明らかにすることできた.今年度は可視化技術を向上させ,結晶近傍の流れや粘性の高い封止材と融液との界面の流れなど,局所における流れを可視化したことで結晶成長のメカニズムをある程度明らかにすることができたと考えている.一方,数値シミュレーションによるモデリングでは,昨年度までに完成できた自然対流を含む複雑な流れ場のモデリングに加えて,回転による強制対流のモデリングを実施した.

その結果,可視化実験による流れ場を良好に再現できるモデルが完成した.これまでの研究により,複雑な流れ場とそれに大きく関わる結晶成長のメカニズムをある程度明らかにすることができた.結晶成長のモデリングでは,熱移動に関わる凝縮熱のモデルをさらに組み込む必要があり,今後の課題である.熱工学昨年度概ね確立できた可視化手法を用いて,GaAs融液の量の違いによるるつぼ内での融液の非常に複雑な流れを捉えることができ,結晶成長界面での強制対流と自然対流の影響を明らかにすることができた.結晶成長時には,この2つの対流が大きく影響して成長界面の状態を決定することになるため,今年度の研究成果はとても意義のあるものとなった.また,数値シミュレーションの方でも実験結果を検証するまでには至らなかったものの,着実にモデリングは進んでおり,有効なツールになりつつある.これらの成果から,おおむね本研究は順調に進展しているものと評価する.非常に複雑な挙動を示す流動場において,精度の高い可視化手法を確立できたことは今後の展開に欠かせないものとなった.速度の定量化を行う際にも,無次元数を揃えるに際にも精度の高い可視化手法が必要だからである.本年度の大半の時間は精度の高い可視化手法の確立に費やしており,多くのノウハウを取得することができた.また,数多くあるパラメータのいくつかを固定し,個別の影響を確認することができたのは,それぞれの因子が複雑に絡み合う系での結果を検討する場合に,非常に重要な結果であると考えている.これらのことを概ね達成できたので,順調に進展しているものと評価する.これまでの研究により,可視化実験からは融液の複雑な挙動が明らかになってきた.それを数値シミュレーションにより再現することにより,非常に複雑な結晶成長のメカニズムを明らかにして行く.そのためには数値シミュレーションの精度を上げて行く必要があり,回転による強制対流の影響を加えて行くことを初めとして,凝固潜熱を加えるほか結晶成長界面形状をある程度予測できるようなモデルにまで発展させる必要がある.次年度はこのモデリングを完成させ,結晶成長メカニズムを明らかにするほか成長界面制御手法の提案を行う予定である.今後はこの確立できた可視化手法とこれによる結果を基に,結晶成長に関わる諸因子の影響を特定する.そのためには,流速ならびに温度の定量化を試みる.また,回転レイノルズなどの無次元数の違いによる流動場の可視化観察を行う.該当なし
MCMヘリカーゼ機能発現調節機構の解明

真核細胞のDNA複製ヘリカーゼであるMCM複合体に関して、次の点を明らかにした.(1)細胞周期やチェックポイント依存的なMCM4のリン酸化、(2) MCM4/6/7ヘリカーゼを抑制するMCM2タンパク質の一本鎖DNA結合能の同定、(3) MCMと相互作用する因子とMCM2-7間の結合様式、および(4) MCM4/6/7を特異的に阻害する抗生物質であるヘリキノマイシンの同定、である.真核細胞のDNA複製ヘリカーゼであるMCM複合体に関して、次の点を明らかにした.(1)細胞周期やチェックポイント依存的なMCM4のリン酸化、(2) MCM4/6/7ヘリカーゼを抑制するMCM2タンパク質の一本鎖DNA結合能の同定、(3) MCMと相互作用する因子とMCM2-7間の結合様式、および(4) MCM4/6/7を特異的に阻害する抗生物質であるヘリキノマイシンの同定、である.主要な3課題の本年度における進展について述べる。1.MCM4のリン酸化の生理的な意味の解明ヒトMCM4のリン酸化の細胞周期での変動を、6種類のリン酸特異抗体を用いて明らかにした。7,19,32,54と110位のリン酸化については細胞周期のG2からM期にかけて最大となり、3位については、間期で漸次増加するがM期では減少するパターンを示した。前者のグループのM期での脱リン酸化のタイミングについては、サイクリンキナーゼの活性変動と対応する7や32位リン酸化とともに対応を示さないものも存在した。M期でのリン酸化を担うタンパク質キナーゼについては、CDK1が7,19,32,110位リン酸化の主な酵素であり、54位に関しては他のキナーゼの関与が示唆された。間期HeLa細胞のクロマチンに対するリン酸化MCM4の結合性については、3と54位リン酸化MCM4が主にクロマチンから離れた状態で存在し、7と32位リン酸化MCM4はクロマチンに対する優先的な結合性を示した。また32位リン酸化MCM4は間期で核小体に濃縮されていた。以上の結果は、細胞周期での変動やクロマチン結合性そして担当するキナーゼの種類から、部位特異的MCM4リン酸化が多様な機能を果たす可能性を示唆する。また、クロマチン上のリン酸化MCM4とDNA複製の場とが共局在性を示さないという結果は、MCM4リン酸化のMCM機能に対する抑制的な役割と矛盾しない。2.MCM467DNAヘリカーゼに対するMCM2タンパク質の阻害効果ヒトMCM2をタンパク質分解酵素で処理することにより、アミノ末端断片、ATP結合部位を含む中央断片とカルボキシ末端断片とに分断された。全長のMCM2に加え、上記3領域を含むMCM2などを試験管内のタンパク質合成実験により作成し、親和精製を行った。MCM2を主要なリン酸化基質とするCDC7/Dbf4キナーゼは、アミノ末端領域のみを効率よくリン酸化した。3.他の複製制御因子とMCM467ヘリカーゼの関係およびMCM467ヘリカーゼの構造と機能の解明MCMと相互作用すると考えられる、チェックポイント因子のClaspinと細胞周期制御因子のRbタンパク質のアミノ末端側断片を、バキュロウイルス発現系を用いた大量発現に成功し、現在それぞれのタンパク質の精製を行っている。主要な2課題の本年度における進展について述べる。1.MCM4のリン酸化の生理的な意味の解明ヒトMCM4のアミノ末端領域の、7、19、32、54と110位のリン酸化について、DNA複製進行障害時に作動するチェックポイント制御における挙動を調べた。MCM4のリン酸化反応が、DNA複製チェックポイント制御下で亢進することを明らかにしていたが、これら6部位すべてでリン酸化が亢進することと、リンMCM4を含むクロマチンがDNA分解酵素に抵抗性を増すように変化することを明らかにした。このことは、チェックポイント制御とMCM4リン酸化反応との関係性を裏付けるとともに、チェックポイント制御下で、MCM4リン酸化と関連したクロマチン構造の変化(ヘテロクロマチン化)が起こる可能性を示唆する。2.MCM467DNAヘリカーゼに対するMCM2タンパク質の阻害効果ヒトMCM2の限定トリプシン分解によって、1-147,148-676,677-895という3領域(ドメイン)に分けられることが判明した。この結果に基づき、全長MCM2とともに、148-676,148-441,442-676,677-895の4つのMCM2断片を、小麦胚粗抽出液中で合成し、タグ精製を行った。精製したタンパク質とMCM4/6/7複合体との関係を調べた結果、MCM467複合体のMCM2467複合体への変換能をもつものは全長のMCM2のみであったが、MCM467のヘリカーゼを抑制する活性については、全長のもの以外に677-895の断片がその活性を有することが分かった。677-895断片の阻害機構については、以下のように、その断片の一本鎖DNA結合能が要因であることが示唆された。まず、我々は全長のMCM2がMCM4やMCM7と同等程度の本鎖DNA結合活性をもち、さらにMCM2内ではカルボキシ末端領域(677-895)が、その活性に必要であることを明らかにした。

また、この領域を含む断片が、SV4oT抗原ヘリカーゼ活性も抑制するという結果は、上記結論の妥当性を支持する。これまでの結果を総合すると、アミノ末端から順に、リン酸化制御領域、ATP結合領域そして一本鎖DNA結合領域という、機能分化があると考えられる。今後さらにMCM2タンパク質を細分化し、各機能の最小責任領域を明らかにする予定である。主要な2課題について、本年度の進展を以下に述べる。1.MCM2によるMCM467ヘリカーゼ阻害機構の解明無細胞タンパク質合成系を用いて作成した、様々なヒトMCM2タンパク質断片をMCM467ヘリカーゼ反応系に加え、それらのヘリカーゼ阻害活性を調べた。その結果、全長のMCM2タンパク質とともにカルボキシ末端断片が活性を阻害することが分かった。その阻害機構については、全長のものの場合、MCM467複合体をMCM2467へ変換することが要因であるのに対し、カルボキシ末端断片の場合は、基質DNAの一本鎖部分に結合することが、活性を阻害する原因であることが分かった。見方を換えると、ヒトMCM2のカルボキシ末端領域に、新規の一本鎖DNA結合活性を同定することができた。一方で、MCM2内のMCM4と相互作用する領域は、MCMドメインを含むMCM2の中央部であることも明らかになった。これまでに我々は、MCM2のアミノ末端領域にヒストンH3との結合部位を同定しているが、このことと今回の結果から、MCM2タンパク質はDNA複製フォークにおいて、一本鎖DNAと結合しつつ、鋳型上のヒストンの複製後DNAへの再結合に機能することが示唆される。2.クラスピンなどのMCM相互作用因子のMCM467ヘリカーゼに対する効果MCM機能に影響を与えると予想される、チェックポイント因子のクラスピンや細胞周期制御因子のRbタンパク質の働きを明らかにするために、それらのタンパク質(断片)とMCM2-7タンパク質間相互作用を昆虫細胞内共発現系と引き続く免疫沈降実験より調べた。その結果、クラスピンがMCM6と特異的に結合すること、また、Rbのアミノ末端領域断片がMCM3,5,6,7と結合することが分かった。機能的には、クラスピンはDNA複製に対し正の効果をもつことが予想されるのに対し、Rbタンパク質は負の効果を示すと考えられる。今回の我々の結果から、特にMCM7との結合が、Rbの負の効果を生み出す要因である可能性が考えられる。1. MCM相互作用因子のMCM2-7複合体との相互作用および、そのMCM467ヘリカーゼに対する効果DNA複製停止時にMCMヘリカーゼ機能を抑制すると考えられるTIMとTIPINタンパク質とMCM2-7タンパクとの直接的な結合を明らかにした。TIMとTIPINタンパク質が、MCM2を除くMCM3-7各タンパク質と結合性をもつことを定量的に示すことができた。このような結合の特異性から本複合体は、細胞内でMCMに作用する際に、MCM2-7の複合体の構造形成に影響を与える可能性が考えられる。MCM467のATP分解活性に対するTIM-TIPIN複合体の効果を調べたが、現在までに、有意にその活性に影響を与えるという結果が得られていない。2.ヘリキノマイシンの作用機構ヘリキノマイシンのDNA複製阻害における標的を明らかにする目的で、様々なヘリカーゼやDM合成酵素の活性に対する本抗生物質の効果を比較した。その結果、MCM467ヘリカーゼが最も感受性が高く、その阻害濃度は細胞DNA複製の阻害濃度とほぼ一致した。
慢性腎疾患における冠動脈血管内超音波を用いた網羅的探索

今回の研究を行った結果、昨年度に既に報告したように、スタチンを内服していた患者では、PCIを行う病変のプラーク性状について関連性を発見した。具体的には、スタチンを継続投与されていた患者では、冠動脈形成術(percutaneous coronary intervention : PCI)を行うような狭窄度の厳しい冠動脈内プラークにおいて、lipidの割合が少なく、fibrousが多いということであった。これは、元々スタチンを内服している患者がPCI中の事故が少ないということがかねがね報告されていたが、その機序を説明するものと考えられる。本年度で、更に本来の目的である腎障害今回の研究成果を論文で報告した。腎機能の指標である糸球体ろ過量と、冠動脈プラークの性状に関して関連があり、糸球体ろ過量が低下するにつれて、lipidの割合が多く、fibrousが少ないということである。一般的にそのような冠動脈プラークは急性冠症候群を発症させる可能性がある不安定プラークと関連することが知られており、腎障害患者における心血管イベントの増加と関連性があるのではないかとのことで、注目されている研究結果が出た今回の研究を行った結果、昨年度に既に報告したように、スタチンを内服していた患者では、PCIを行う病変のプラーク性状について関連性を発見した。一般的にそのような冠動脈プラークは急性冠症候群を発症させる可能性がある不安定プラークと関連することが知られており、腎障害患者における心血管イベントの増加と関連性があるのではないかとのことで、注目されている研究結果が出たこの度の研究は、腎機能あるいは生化学的マーカーなどと、冠動脈疾患におけるプラークの性状を主にintegrated-backscatter intravascular ultrasound(IB-IVUS)を用いて検討することである。今回の研究で、本年度には約100人の患者に対して冠動脈形成術(percutaneous coronary intervention : PCI)を行う際に、血管内超音波検査を行った。既に行っている解析で、腎機能の指標である糸球体ろ過量と、プラークの性状に関しての関連があることが徐々に分かってきた。今後、このデーターに加えて、生化学的マーカーをあわせて解析し、さらに予後を組み合わせた解析を今後引き続いて行うこととなっている。平成21年度には論文を作成、発表できる予定である。これまでのところ、今回の研究について行った解析では本来の腎機能とプラークの関連のみならず、いくつかの成果が出ている。一つ目は、内服薬、特にスタチンとPCIを行う病変のプラーク性状について関連が発見された。その結果は次ページに示す論文に発表した。具体的には、スタチンを継続投与されていた患者では、PCIを行うような狭窄度の厳しい冠動脈内プラークにおいて、lipidの割合が少ないということであった。これは、元々スタチンを内服している患者がPCI中の事故が少ないということがかねがね報告されていたが、その機序を説明するものとして注目されている。二つ目は、メタボリック症候群のある患者が、冠動脈左主幹部のプラークでlipidが多いことを発見した。メタボリック症候群は、心血管イベントと深い関連があることが既にわかっているため、こちらに関しても国際学会(AHA)で発表時に多くの参加者から注目を集めた演題となった。このように、今回の研究は順調に経過しており、多くの成果を挙げている。一般的にそのような冠動脈プラークは急性冠症候群を発症させる可能性がある不安定プラークと関連することが知られており、腎障害患者における心血管イベントの増加と関連性があるのではないかとのことで、注目されている研究結果が出た。
植物微生物相互作用の包括的解析

マメ科植物と根粒菌の相互作用による共生窒素固定に着目し、分子遺伝学的およびゲノム科学的手法を駆使して関連遺伝子の同定、機能解析を行った。その結果、共生の成立、根粒の形成およびその制御、窒素固定に関与する多数の遺伝子が明らかになった。ミヤコグサより単離されたHAR1受容体型キナーゼは、根とシュートの遠距離シグナル伝達を介して根粒菌との共生系を安定化させる。HAR1はシロイヌナズナの茎頂分裂組織を制御するCLV1と高い相同性を有し、CLV1はCLV3ペプチドを認識することから、HAR1のリガンド候補としてミヤコグサCLV3様ペプチドを候補としてミヤコグサのゲノム情報から探索した。現在までに13種類のCLV3様ペプチド遺伝子を特定し、発現解析を進めた。またhar1変異体と同様、シュート由来の共生抑制物質(オートレギュレーションシグナル)を失った新たなミヤコグサ根粒過剰着生変異体を単離し、原因遺伝子の候補を特定した。狭域宿主型ミヤコグサ根粒菌であるMAFF303099株について、3型分泌系の構造体遺伝子群または制御遺伝子ttsIの破壊株を作製したところ、いずれの破壊株もミヤコグサとの共生能力に変化は無かったが、野生株が根粒すら形成できないマメ科の木本ギンネムと共生可能となった。このことから、ギンネムでは3型分泌系構造体自体か分泌されるタンパク質のいずれかが宿主防御を惹起することによって共生が阻害されるものと考えられる。共生関連遺伝子の機能解析の一環として、酵母のTwo-hybrid法による遺伝子産物の相互作用解析を大規模に展開した。2005年度中に1150の遺伝子産物についてのスクリーニングが終了し1291の遺伝子産物からなる1960の相互作用候補を検出している。さらに、相互作用解析過程で作成した遺伝子完全長を個別にクローニングしたENTRYクローンについて、根粒菌研究者の共通リソースとして保存、配布できる体制が整えられつつある。ミヤコグサ根粒菌における大規模タンパク質相互作用解析が、予定していた遺伝子(1560個)ついて全て終了し,最終的に1801タンパク質からなる3075の相互作用の候補を同定することができた。相互作用解析から,共生窒素固定に関わるタンパク質や機能未知遺伝子が関わる多くの相互作用の候補を同定した(60の共生関連遺伝子と相互作用を示した136の遺伝子を同定)。一方、宿主であるミヤコグサからもYTH解析用のライブラリーを作製し,根粒菌のタンパク質と組み合わせて、あるいはミヤコグサ遺伝子どうしのスクリーニングが可能となった。宿主側因子については、HAR1のリガンド候補として解析を進めているミヤコグサCLV3様ペプチドに関してミヤコグサのゲノム情報を精査した結果、新たに12種類のCLV3様ペプチド遺伝子を同定した。これらの発現解析を行った結果、根粒菌の感染により発現が顕著に上昇するものが3種同定され現在これらのペプチドの機能解析を進めている。また、har1-と同じ根粒過剰着生の表現型を示す変異体をC^<6+>イオンビーム照射処理を行った集団から単離した。この新規変異体ではhar1やklavierと異なり根の遺伝子型が根粒数を制御することが示され、オートレギュレーションの分子機構を解析する上で重要な材料となることが期待される。根粒菌共生系とは別に、アーバスキュラー菌根共生系に関する変異体を単離する目的で、安定して菌根菌を感染させることができる系を確立し、C^<6+>イオンビーム照射処理を行った集団に対して大規模なスクリーニングを実施した。その結果、菌根共生に特異的な変異体の候補が3ライン得られ、現在次世代での形質確認を行っている。マメ科植物ミヤコグサのHAR1タンパク質は、根粒菌の分泌するNod factorによる根粒着生の負の制御系に必須な受容体型キナーゼである。今年度は、ミヤコグサのゲノム情報を活用することによって、そのリガンド候補として40の遺伝子を検出し、その中からHAR1依存的に根粒形成を抑制する2つのペプチドコード遺伝子LjCLE1,LjCLE2を同定することに成功した。LjCLE1,LjCLE2を過剰発現すると強い根粒抑制効果がみられ、この効果は形質転換した根のみならず、それ以外の根にも伝達された。また、LjCLE1,LjCLE2の発現誘導には、Nod factorが必須であることを明らかにした。一方、これまで進めてきた酵母2-ハイブリッド法による根粒菌タンパク質相互作用の大規模解析の結果、1804種類のタンパク質(根粒菌全タンパク質の24%)を含む3121の相互作用候補を同定することができた。そして、遺伝子発現やオペロン構造、タンパク質の機能ドメインなどの情報を指標として、本研究で得られた相互作用情報を精査することにより、新規な共生窒素固定関連遺伝子の候補を多数同定した。上記タンパク質相互作用解析によって同定した新規共生関連遺伝子候補の機能解析を効率化する目的で、トランスポゾンを利用したミヤコグサ根粒菌の大規模遺伝子破壊系の構築を行った。これまでに約3万クローンの変異株を収集しており、そのうち9千クローンの挿入位置を解析した結果、3156種類の遺伝子への挿入変異が確認された。

この挿入変異株を用いた遺伝子機能解析を進めるとともに、この遺伝子破壊系をリソースとして活用するためのデータベースの構築も行った。ミヤコグサのゲノム情報より根粒形成の全身的な負の制御に関わる可能性があるCLEペプチド遺伝子LjCLE-RS1, LjCLE-RS2を同定した。そして、根粒菌の感染した根の皮層及び表皮を含む組織で発現が誘導されること、その発現誘導には根粒形成の正の制御因子であるNod factorとそのシグナル伝達系の構成因子が必要であることが明らかにした。また、イオンビーム照射で単離した新規根粒過剰着生変異体too much love(tml)は、これまでに単離されていたharlやklavier変異体と異なり、根で根粒数を制御する新規変異体であることが分かった。遺伝子座は第一染色体長腕にマップされ、ダイズゲノムとのシンテニー解析によって遺伝子候補を特定した。ミヤコグサ根粒菌で構築した挿入変異体ライブラリーの9千クローンについてトランスポゾンの挿入位置を決定し、3680種類の遺伝子への挿入変異が確認された。接種実験の結果、根粒数の増加や減少、根粒形成の遅延、無効根粒の形成などの表現型を示す27種類の変異株が得られた。ミヤコグサ根粒菌のTypeIII分泌系関連遺伝子の解析から、ミヤコグサ近縁の宿主L. halophilusとの共生成立に負の影響を与える原因遺伝子mlr6361を同定し、この上に既知のエフェクター候補と共通する構造上の特徴(4045アミノ酸残基の共通モチーフを1225回繰り返すこと)を見いだした。圃場ないし環境中においてマメ科植物との共生成立に働く根粒菌の遺伝基盤を解明する目的で、M. lotiの同定済み挿入変異株ライブラリーから、ミヤコグサに対する競合的根粒形成能が低下した変異株の探索を行った。現在までに、探索済み780変異株の中から目的変異株候補27株の検出に至っている。マメ科植物-根粒菌の根粒形成のオートレギュレーションに関わる遺伝子のうち、地上部から根へのシグナル伝達能が失われたklavier(klv)の遺伝子をミヤコグサから単離した。構造分析の結果、KLVグは、細胞外に22個のLRRと1つのislandを持つ受容体型キナーゼをコードしており、シロイヌナの雄性不稔や胚発生に関わるRPK2/TOAD2と最も高い相同性を示すことがわかった。しかし、klv変異体とrpk2/toad2変異体の表現型は大きくことなっており、シロイヌナズナ(アブラナ科)とミヤコグサ(マメ科)で遺伝子機能が大きくことなることが示唆された。ミヤコグサ根粒菌で作製したトランスポゾン挿入変異株ライブラリーを用いて、新規共生窒素固定関連の候補127遺伝子のうち108遺伝子について挿入変異株が得られた。これらを宿主植物ミヤコグサに接種した結果,解析が終了している98遺伝子の挿入変異株のうち22変異株で共生過程における表現型の変化が認められた。検出された表現型を分類すると、根粒数の減少:7株、根粒数の増加:3株、根粒形成の遅延:4株、根粒形成の早期化:1株、根粒形成の遅延と減少:2株、根粒形成の遅延と増加:1株、窒素固定活性の低下:6株(根粒数の減少や根粒形成の遅延)のようになった。
分子と連続体のマルチスケール法による固液接触現象のミクロ流体解析

単層カーボンナノチューブ(Single-Walled Carbon Nanotubes, SWNT)の熱問題SWNTと水の接触現象及びSWNTの輸送現象を対象に研究を行った.まず,熱問題に関して,SWNTの応用上非常に重要となる熱伝導の長さ依存性の詳細を幅広い長さ範囲に渡り検証した.非平衡古典分子動力学シミュレーションを用いて,室温下における,有限長SWNTの熱伝導率の長さ依存性を計算することによって,弾道的熱伝導から拡散・弾道的熱伝導への遷移過程を捉えることに成功した.また,SWNTと曲率のないグラフェンシートの熱伝導率の長さ依存性を比較することにより,フォノン状態密度の弾道的熱伝導及び拡散熱伝導への寄与を明らかにした,さらに,SWNT熱伝導率のチューブ直径依存性を計算することで,異なる直径におけるフォノン散乱による拡散効果の役割を議論した.SWNTsと水との接触を含む系の一例として,SWNTに水が内包された場合を考えた.SWNT内の水の動力学は,液体の輸送デバイスとしてのSWNTの応用を目的として,又は擬一次元領域内での液体の相変化の現実系として,近年注目されている.また,低次元空間内の流動現象及び相変化は,MEMSやバイオエンジニアリング等に関わる基礎的な物理の理解のためにも重要である.SWNTのような,直径数ナノメートルの流路を想定した場合,その流動特性は固液界面の特性に大きく依存する.SWNT内の水の流動を考えた場合,炭素面の撥水効果により,流れは壁面で著しく滑ることが予想され,それを活かしたデバイスの開発も考えられる.本研究では,分子動力学シミュレーションを用いて,SWNT内での水の流動及び相変化の解析を行った.まず,温度勾配によってSWNT内の水クラスターを能動的に輸送できることを濁し,その駆動力を水クラスターのポテンシャルエネルギーの温度依存性によって説明した.次に,SWNT内での氷ナノチューブの生成に関して,融点のナノチューブ径への依存性を計算した結果,以前報告されている実験結果と定量的に一致した.また,氷ナノチューブは断面形状が5角形の時に最安定構造を取ることによって,融点が室温付近で最大値をとることを明らかにした.生成後のSWNT束中には一般に金属と半導体SWNTが混合しており,電気的特性を用いた応用を念頭に置いた場合,それらを分離する方法の開発が急がれる.そこで,本研究では非均一交流電場中での誘電泳動によるSWNTの分離法に着目し,非均一交流電場によって発生する誘電泳導力,ブラウン運動,対流及びSWNT同士干渉等を考慮し,SWNTの軌跡をラグランジュ的な手法を用いて解析した.その結果,電気加熱によって起こされる対流の効果が従来の予想以上に大きく効くことが明らかになった.この結果に基づき,SWNTの誘電泳動分離装置を設計する際の新たな注意点を提唱した.分子と連続体のマルチスケール法を角いた界面物理の解析を視野に入れ,分子動力学シミュレーションを用いた伝熱および物質輸送に関する研究を行った.分子スケールシステムとして,近年注目されている単層カーボンナノチューブ(single-walled carbon nanotubes, SWNT)を含む系を用いて,伝熱及び物質輸送現象と取り扱った.まず,SWNTに同位体が混入した場合の熱伝導への影響を検証した.^<12>Cと^<13>Cで超格子構造を形成したところ,熱伝導率が最小値をとる周期幅が存在することがわかった.フォノンの分散関係を求めることにより,この傾向を境界でのフォノン散乱効果とゾーンフォールディング効果の周期幅への依存性によって説明した.さらに,SWNTの非平衡熱伝導の計算を,フェムトレーザーによる加熱を想定して行った.フェムトからピコ秒程度の局所パルス加熱を行った結果,波動的熱伝導が観測された.この熱波に寄与するSWNTの振動モードを、ウェーブレット解析を用いて明らかにした.次に,SWNTと周囲の物質の界面熱抵抗を,SWNTと水,SWNTとSWNT, SWNTとLennard-Jones分子等の界面に関して求めた.SWNTをパルス加熱し,周囲の物質との温度差の時系列を観察することによって熱抵抗を計算し,さらに周囲の物質の相変化の影響を考察した.最後に,SWNTに吸着した液体の輸送現象に関して計算を行った.水クラスターがSWNTに内包された場合と,SWNTバンドルの外面の谷間に吸着した場合の2つの系に対し,SWNTの軸方向に温度勾配を与えると,水分子同士及び水とSWNTの間のポテンシャルの温度依存性により,水クラスターは温度の勾配に沿って温度の低い方向へ輸送されることを示した.2つの系を比較した結果,後者の方がポテンシャルの温度に対する感度が大きく,輸送効率が高いことを明らかにした.マルチスケール解析が応用上重要である系として,単層カーボンナノチューブ(Single-walled carbonnanotube, SWNT)とそれに関連する系の研究を行った.分子スケール現象として,SWNTの伝熱特性及び内包物質の輸送特性を,又マクロスケール現象として,SWNTの誘電泳動を取り扱った.実用上のSWNTの多くは長さがフォノンの平均自由行程より短いため,その熱伝導率はチューブ長さに依存する.そこで,有限長SWNTの熱伝導率の長さ依存性及び境界条件がそれに与える影響を,非平衡分子動力学を用いてフォノンの視点より説明した.一方,想定する系によっては,欠陥や構造の異なるチューブの接続面,又は周囲材料との接触によってフォノン伝播が妨害され,熱伝導が抑制されることを定量的に示した.

さらに,内部熱抵抗を有するSWNTの非定常熱伝導問題を取り扱い,フォノンの拡散及び弾道輸送の熱伝導特性への影響を体系的に評価した.生態系に多く見られる低次元領域内での液体の一般系として,SWNTに内包された水の分子動力学解析を行った.まず,SWNT内で水を氷らせた際に起こる氷ナノチューブへの相変化を解析し,その融点,氷の結晶構造のSWNT径への依存性を求め,構造安定性を考慮して説明した.さらに,SWNTに温度勾配を与えると,内包された水が温度勾配に沿って輸送されることを示した.水は,主に水-水間のポテンシャルエネルギーの温度依存性よって生じる自由エネルギー勾配によって駆動されると考えられる.生成後のSWNT束中には一般に金属と半導体SWNTが混合しており,電気特性を用いた応用を念頭に置いた場合,それらを分離する方法の開発が急がれる.そこで,非均一交流電場によって発生する誘電泳導力,ブラウン運動,流れ場,及びSWNT同士干渉等を考慮し,SWNTの軌跡をラグランジュ的な手法を用いて解析した.単層カーボンナノチューブ(Single-Walled Carbon Nanotubes, SWNT)の熱問題SWNTと水の接触現象及びSWNTの輸送現象を対象に研究を行った.まず,熱問題に関して,SWNTの応用上非常に重要となる熱伝導の長さ依存性の詳細を幅広い長さ範囲に渡り検証した.非平衡古典分子動力学シミュレーションを用いて,室温下における,有限長SWNTの熱伝導率の長さ依存性を計算することによって,弾道的熱伝導から拡散・弾道的熱伝導への遷移過程を捉えることに成功した.また,SWNTと曲率のないグラフェンシートの熱伝導率の長さ依存性を比較することにより,フォノン状態密度の弾道的熱伝導及び拡散熱伝導への寄与を明らかにした,さらに,SWNT熱伝導率のチューブ直径依存性を計算することで,異なる直径におけるフォノン散乱による拡散効果の役割を議論した.SWNTsと水との接触を含む系の一例として,SWNTに水が内包された場合を考えた.SWNT内の水の動力学は,液体の輸送デバイスとしてのSWNTの応用を目的として,又は擬一次元領域内での液体の相変化の現実系として,近年注目されている.また,低次元空間内の流動現象及び相変化は,MEMSやバイオエンジニアリング等に関わる基礎的な物理の理解のためにも重要である.SWNTのような,直径数ナノメートルの流路を想定した場合,その流動特性は固液界面の特性に大きく依存する.SWNT内の水の流動を考えた場合,炭素面の撥水効果により,流れは壁面で著しく滑ることが予想され,それを活かしたデバイスの開発も考えられる.本研究では,分子動力学シミュレーションを用いて,SWNT内での水の流動及び相変化の解析を行った.まず,温度勾配によってSWNT内の水クラスターを能動的に輸送できることを濁し,その駆動力を水クラスターのポテンシャルエネルギーの温度依存性によって説明した.次に,SWNT内での氷ナノチューブの生成に関して,融点のナノチューブ径への依存性を計算した結果,以前報告されている実験結果と定量的に一致した.
新規中性子用シンチレータの開発

本研究ではLiF単結晶中性子シンチレーターの開発を行った。LiFはガンマ線感度と6Li密度の点で理想的な化合物だったが、これまでシンチレーターとして利用可能な発光特性の付与に成功した例はなかった。本研究では汎用の光電子増倍管による波高分布スペクトルでノイズレベルを超えて検出ピークが得られる新規LiFシンチレーターの開発に成功した。本研究ではフッ化リチウム(LiF)を母材とした中性子シンチレータの開発を目指している。LiFに蛍光特性を付与するためのドーパントの候補としては、一部の酸化物原料が知られてはいるものの、高い量子効率を有するEu、Ceなどの希土類元素は固溶できない。そのため実現の難易度は高いが、LiFは非潮解性かつ高濃度にLi-6を含有する理想的な化学組成であるため、検出可能な発光量の材料が得られれば革新的な固体中性子シンチレータになる。平成28年度の検討として1価元素、希土類元素等の各種不純物元素を添加したLiF単結晶の試作、酸化物原料を添加した既知組成のLiF単結晶の評価、放電プラズマ焼結法によるLiFセラミックスの作製条件の検討を実施した。各種不純物元素を添加したLiF単結晶については多数のサンプルを試作、評価した結果、ほとんどの添加物は発光が得られない結果に終わったが、一部の添加物では、蛍光特性が得られた上、波高分布スペクトルにおいて中性子検出ピークが得られた。現在、結果を精査しているところであるが、高エネルギーフォトンの照射により特性が向上する可能性を示唆する結果も得られており、非常に興味深く、今後検討を進めたい。既知組成の酸化物添加LiF単結晶の評価としては酸化タングステンを添加したLiFを評価し、種々の特性を調べた。波高分布スペクトルにおいて中性子検出ピークを得る事には成功したが、その発光量は90 photons/neutronと極めて微弱で、現時点では独自開発した不純物添加サンプルの方が高い発光量が得られている。また、放電プラズマ焼結法によるLiFセラミックスの作製条件を検討し、透明セラミックスサンプルの試作に成功した。今後、特性の評価を進めていくが、LiFの透明セラミックスは世界でも合成された例がほとんどなく、平成29年度に実施予定の評価結果が非常に興味深い。平成28年度の検討として1価元素、希土類元素等の各種不純物元素を添加したLiF単結晶の試作、酸化物原料を添加したLiF単結晶の評価、放電プラズマ焼結法によるLiFセラミックスの作製条件の検討を実施したが、各種不純物元素を添加したLiF単結晶については多数のサンプルを試作、評価した結果、一部の添加物では蛍光特性の付与に成功した上に、波高分布スペクトルにおいて中性子検出ピークの取得に成功した。また、現在、結果を精査しているところであるが、高エネルギーフォトンの照射により特性が向上する可能性を示唆する結果も得られており、非常に興味深い。波高分布スペクトルにおいて中性子検出ピークを得る事には成功したが、その発光量は90 photons/neutronと極めて微弱で、現時点では独自開発した不純物添加サンプルの方が高い発光量が得られていることがわかった。ただし、そもそもLiF:Wの中性子照射かでの発光量を定量的に明らかにしたのは今回の研究が初めてで、極めて興味深い結果のため、現在論文誌に投稿中である。また、放電プラズマ焼結法によるLiFセラミックスについては、作製条件を検討し、結果として透明セラミックスサンプルの試作に成功した。今後、特性の評価を進めていくが、LiF透明セラミックスは世界でも合成された例がほとんどなく、単純に固体化学の観点から見ても非常に興味深い成果で、今後の評価結果が非常に楽しみなところである。以上述べた通り、現時点で新規で興味深い研究成果が得られているため、本研究課題の進捗としては、おおむね順調に進展していると言える。LiFは非潮解性かつ高濃度にLi-6を含有する理想的な化学組成であるため、汎用の光検出器で検出可能な発光量のLiF系材料得られれば革新的な固体中性子シンチレータになる。LiFに蛍光特性を付与するためのドーパントの候補としては、一部の酸化物原料が知られており、高い量子効率を有する希土類元素等の発光中心元素を固溶させるのは困難であると考えられているものの、本研究では系統的に評価するため、1価元素、2価元素、希土類元素等の各種不純物元素を添加したLiF単結晶を試作し、酸化物原料を添加した既知組成のLiF単結晶の評価、放電プラズマ焼結法によるLiFセラミックス、キャスト法によるLiF単結晶の作製条件の検討についても実施した。発光原理については欠陥中心による励起子発光であると推定される。

従来LiF単結晶系材料の中で最も高い性能を有すると考えられていた酸化タングステンを添加したLiFを評価したが、その発光量は約100 photons/neutronで、今回の研究で開発した不純物添加LiFは約3倍の発光量が得られており、現時点で世界最高性能のLiF系材料の開発に成功したと言える。また、作製手法の検討として、放電プラズマ焼結法によるLiFセラミックス、キャスト法によるLiF単結晶の作製を検討し、それぞれ試作に成功したが、LiFセラミックスは高いシンチレーション特性は得られなかった。キャスト法によるサンプルは高い性能が得られ、作製手法として確立できたものと考えられる。LiF中性子シンチレーターの性能の最大化を目指し、下記方法により、新規組成及び新規形態のLiFサンプルを鋭意開発し、研究を継続する。(1)サンプルの合成:単結晶の合成は申請者が開発してきたマイクロブリッジマン法、透明セラミックスの開発は放電プラズマ焼結(SPS)法を用いる。前者は融液成長法であり、後者は固相反応法であるが、どちらも部材はカーボン材料を用い、また得られる材料の主として欠陥特性に差が生じるために、比較検討を行う事で効率の良い開発が可能である。(2)組成・相分析:粉末X線回折法により、サンプルの組成が単相になっているか否かの確認を行う。透明セラミックスに関しては電子顕微鏡を用いた測定も行う。BEI (Back Scattered Electron Image)法では粒界での不純物分布の有無等を精査し、同時に粒径の均一性の評価も行う。(3)光物性評価:透過・反射率、ラマンスペクトル、真空紫外から近赤外域までの広い波長域におけるPhotoluminescence (PL)、PL蛍光減衰時定数評価を行い、基礎物性を把握する。少なくともPLで発光が見いだせないものは、シンチレータとしても期待できない。(4)シンチレーション特性評価:研究室の保有する252Cf中性子線源を用い、中性子照射時の発光量及び蛍光減衰時定数を詳細に評価する。合わせてガンマ線やX線と言った高エネルギー光子に対しても同様の評価を行い、137Cs線源や60Co線源を用いバックグラウンドガンマ線に対する感度も評価する。更に輝尽・熱蛍光特性を評価する事で、欠陥準位や量を把握する。特性の良い材料を見出した場合には、微量添加元素の最適値探索、もしくは共添加等を試行する事で更なる発光の高特性化を行う。29年度が最終年度であるため、記入しない。研究成果に関するwebページ29年度が最終年度であるため、記入しない。研究成果を報告するホームページ。
ゲノムインプリンティング制御によるCYP3A4発現・機能の個人間変動解析

本年度は、CYP3A4に注目して以下の検討を行った。1.代謝活性が既知のヒト肝サンプルを使用し、CYP3A4遺伝子全領域、3'下流域、50kbに渡り、多型解析を実施した。その結果、50箇所以上の変異を同定したが、いずれも活性との関連は見られなかった。しかし、その中より日本人、白人、黒人、いずれの人種にも共通の頻度の高い3種類の変異を選択し以下を検討した。2.培養リンパ芽球より抽出したRNAサンプルを使用し、CYP3A4遺伝子の発現状況を確認したところ、片側アレルの発現を確認した。しかし、両親の情報より、インプリンティング制御による発現制御を直接受けるものではないことが示唆された。3.上記変異をマーカーに、ヒト肝サンプルでのアレル発現パターンとmRNA量、および活性との関連を評価した。その結果、両者には良好な相関を認めた。以上の検討より、CYP3A4遺伝子はインプリンティング制御を受けないものの、エピジェネティクな制御を受け、その程度により活性が異なることが示唆された。CYP3A4活性の個人差の原因が明らかにされる可能性があり、早急な臨床応用を行うべきである。本研究はCYP3A4活性の個人差を解明することを目的とするが、近年、CYP3A5などの同族分子種の関与も指摘されていることから、解析対象とする遺伝子をCYP3A4に加え、3A5、3A7、pseudo geneまでに拡大した。また、インプリント制御を考慮する場合、周辺の遺伝子の構造も明らかにすることが必要となるため、同じ7番染色体に位置し、CYP3A分子種と基質特異性が類似する薬物輸送タンパクであるp-糖タンパク(MDR1)も標的遺伝子に加えた。ヒト胎盤、肝臓よりゲノムDNAおよびmRNAを抽出し、試料とした。インプリント制御の有無を評価するためには、マーカーとなる変異の特定が必要であることから、上記対象遺伝子の多型解析をゲノムDNAを用い行った。その結果、CYP3A5、MDR1には適当なSNPsの存在が確認され、本SNPsをマーカーに両試料を用い、インプリント制御の有無を確認したところ、少なくとも肝臓ではbi-allelicな発現を認め、制御を受けないことが確認された。一方、CYP3A4については、適当なSNPsが認められなかったことから、核内RNAの発現を指標とした。しかし、PCRが不安定なため、一定の傾向が得られなかった。核内RNAが極微量なこと、DNAの混入がその原因と考えられた。現在、RNAとDNAを判別可能なPCR条件を検討中である。今後は、臓器特異性等を考慮した制御の有無についても検討する予定である。
扁平上皮癌特異的癌関連遺伝子DKK3による腫瘍制御

研究代表者はこれまでに頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)における特異的ながん関連遺伝子の検索を行い、DKK3遺伝子に着目して研究を進めてきた。DKK3は細胞のがん化に関わるWnt signalの抑制因子であるDKKfamilyに属し、種々の腫瘍で発現が低下していることから、REIC(Reduced expression in immortalized cells)の別名でも知られている。DKKファミリーはcycteine rich domainを2つ有する分泌型タンパクをコードし、Wnt受容体に競合的に結合することでWnt signalを抑制することから、がん抑制遺伝子と考えられている。DKK3だけはこのWntへの競合作用がないが、腫瘍細胞に過剰発現させると腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することから、やはりがん抑制遺伝子として機能すると考えられている。代表者はこれまでに、HNSCCではDKK3が特異的に高率に発現しており、かつDKK3発現群は予後不良であることを報告、DKK3がHNSCC特異的にがんの発生と進展に関与するとの仮説を提唱し、検証を重ねている。本研究ではHNSCC細胞にDKK3を過剰発現させると腫瘍細胞の増殖・浸潤・遊走が有意に増大するという、上記仮説を裏付ける結果が得られている。平成30年度は平成29年度に続いて、shRNAでDKK3を安定的にノックダウンする実験を継続した。DKK3のノックダウンでは、DKK3過剰発現系とは逆に腫瘍細胞の増殖・浸潤・遊走は全て有意に低下するとともに、Aktのリン酸化が低下していた。これらから、DKK3がAktの活性化を介して腫瘍細胞の悪性度を左右することが明らかとなった。本結果は英文誌「International Journal of Oncology」に掲載された。当初の予定ではDKK3がなんらかの受容体を介して腫瘍細胞の悪性度を調節していると考えており、DKK3によって変動するシグナルの同定と、そのシグナルの阻害剤の導入による治療効果の検討を計画していた。本研究では、DKK3によって活性化され、細胞の悪性度を規定するシグナルがAktであることを明らかにした。Aktの阻害剤によって、DKK3発現による腫瘍細胞の増殖・浸潤・遊走の増加は打ち消されることも確認しており、当初の予定通りである。平成30年度までの研究で、DKK3はAktを活性化することが明らかになったが、Aktの阻害剤は既に複数が開発されており、治験が行われている状況である。そこで今後の方針としては、いまだ知られていないDKK3受容体を同定し、これを阻害する物質を開発することが考えられる。また一方で、DKK3には分泌型ではない別のisoform(DKK3b)が存在しており、細胞外に分泌されて各種のシグナルを調節する可能性に加え、細胞内からシグナルを調節する可能性が示唆されている。ここから、DKK3そのものを阻害する物質ないしペプチドの開発を行うことも必要である。申請者はこれまでに頭頸部/口腔扁平上皮癌(HNSCC/OSCC)ではDKK3発現が特異的に高くDKK3発現群は予後不良であること、OSCC由来細胞株でDKK3をノックダウンすると細胞の浸潤や遊走が低下することを報告してきた。さらにOSCC細胞でDKK3を過剰発現させると腫瘍の浸潤、遊走、増殖、in vivoでの腫瘍径がいずれも増加したことから、DKK3はOSCCの発育のキーとなる遺伝子であると考え、その機序を詳細に検討してきた。平成28年度の計画では、(1)DKK3遺伝子の過剰発現で変動するシグナルの検索と、(2)低分子化合物(阻害剤)によるDKK3を介したシグナルの抑制とその影響の評価を行った。(1)については、これまでの解析でDKK3過剰発現群では細胞の癌化に寄与するcyclin D1、c-mycなどのWnt/beta-cateninシグナルのターゲット遺伝子の発現が増加することが示され、本来はWnt signalの抑制因子とされるDKK3が、逆にWnt signalを逆に活性化しているかのような結果であった。今回reporter assayを行ったところ、Wnt signalの活性化は検出できなかった。一方で、western blottingによる検索ではAkt,c-junのリン酸化の亢進が認められた。ここから、DKK3がPI3K/Aktを介して腫瘍を活性化すると考え、(2)でPI3K/Aktの阻害剤をDKK3過剰発現OSCC細胞に作用させたところ、細胞の増殖、浸潤、遊走が有意に抑制された。これらの結果から、DKK3がAkt signalを介してHNSCC/OSCC特異的に癌細胞の悪性度を増加させることが明らかになり、DKK3をターゲットとした腫瘍制御に向けた重要な根拠が得られた。これまでの研究成果は英文雑誌に投稿、受理された。当初計画では、平成28年度はDKK3過剰発現系でのシグナルの影響を詳細に検討し、その結果をもとに平成29年度以降にキナーゼ阻害剤などを用いてDKK3を介したシグナルを抑制可能かどうかを検討する予定であった。DKK3過剰発現細胞での細胞内シグナルへの影響の検索では、DKK3過剰発現OSCC細胞でcyclin D1, c-mycなどの細胞の癌化に関わるWnt/beta-catenin signalのターゲット遺伝子の発現が増加することが明らかとなった。本来DKK3の属するDKK

familyはWnt signalの抑制因子として機能するものの、DKK3はこの機能がないとされていたが、結果からはDKK3がWnt inhibitorではなく寧ろWnt activatorとして機能する可能性が考えられた。その検証として、2種類のReporter assayを行なったがいずれの実験でもWnt signalの活性化は検出できなかった。そこで、複数の関連シグナル分子のリン酸化の状態をwestern blottingで検索し、Akt, c-junのリン酸化が亢進することを明らかにした。これにより当初計画は全て遂行され、平成29年度以降の計画に着手できた。Akt signalの阻害剤をDKK3過剰発現OSCC細胞に作用させると、DKK3過剰発現によって増加した細胞の増殖、浸潤、遊走はすべて有意に低下した。平成28年度の成果で、DKK3を介した腫瘍の悪性度上昇のメカニズムの一端が明らかとなり、これまでの研究成果と合わせて英文雑誌に発表することができた。以上から、当初の計画以上に進展していると考えられる。本研究では、頭頸部扁平上皮癌において特異的に発現するDKK3遺伝子について機能解析を行っている。申請者はこれまでに頭頸部/口腔扁平上皮癌(HNSCC/OSCC)ではDKK3発現が特異的に高くDKK3発現群は予後不良であること、OSCC由来細胞株でDKK3をノックダウンすると細胞の浸潤や遊走が低下することを報告してきた。本計画では、OSCC細胞でDKK3を過剰発現させると腫瘍の浸潤、遊走、増殖、in vivoでの腫瘍形成能が増加したことから、DKK3はOSCCの発育のキーとなる遺伝子であると考え、その機序を詳細に検討してきた。その結果、前年度にDKK3はAktとc-junのリン酸化を増加させてこれらを活性化し、HNSCC/OSCC特異的に癌細胞の悪性度を増加させていることを明らかにし、英文誌に論文発表している。平成29年度計画では前年度のDKK3過剰発現によるgain-of-functionの実験に対し、その逆の実験としてshRNAでDKK3遺伝子をstable knockdownした細胞での、loss-of-function実験の解析を行なった。DKK3のgain-of-functionではAkt signalが活性化して腫瘍細胞の悪性度が増加したことから、DKK3ノックダウン系でも同様にAkt signalに変化が認められ、腫瘍細胞の悪性度にも何らかの変化を及ぼすと予想された。結果は予想どおりDKK3ノックダウンでは腫瘍細胞の増殖・遊走・浸潤およびin vivoでの腫瘍形成能が全て有意に低下した。この現象の背景にある分子基盤を明らかにするため、Microaray解析とpathway解析を組み合わせて実施したところ、Aktを含む複数のsignaling pathwayの関与が示唆された。最終的にはDKK3が細胞の内外からAktを中心としたsignalに働きかけ、腫瘍細胞の動態を規定している可能性が示唆された。本成果はDKK3をターゲットとした頭頸部扁平上皮癌抑制の創薬実現に向けて価値が高いと考えられる。現在は英文誌に論文投稿中である。