hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超臨場感遠隔協働のためのインタラクティブ柔軟物シミュレーションと可視触化の研究

2.非一様柔軟物体のオンラインリメッシュ型インタラクティブシミュレーションの研究:マルチコアPCに柔軟物シミュレーションを実装し高速化を図った.さらに,連続体力学に基づくオンラインリメッシュ型変形シミュレーションモデルを各切断/穿刺/剥離シミュレーションの変形計算部に採用し,シミュレーションの高精度化を図り,警告情報を重畳して視触覚呈示するインタラクティブコンピュータ支援法を実装した.3.非一様柔軟物シミュレーションのリアルタイム可視化の研究:開発した可視化手法を複雑かつ大規模ボリュームデータへ適用を図り,軟組織上の腫瘍や血管などの微細構造を変形と連動させて正確に可視化する方法を開発した.4.パラメータ同期交信型の遠隔協働環境構築の研究:昨年までの4項目の研究成果を,ボリュームベース遠隔触覚協働環境構築に集約させ,遠隔3地点間で低侵襲胆嚢摘出手術と穿刺手術訓練が可能となるボリュームベース遠隔触覚協働環境システムのプロトタイプを実現し,検証実験により有効性を評価した.
エンジン曲り管内高周波脈動流の熱流動特性を用いた排気系の損失低減設計

今年度研究計画である曲り管内流動場の基礎的挙動特性を明らかにするため,エンジン運転条件を模擬出来る脈動流発生装置から,時間変動する脈動空気を二つの曲り部がある矩形管内に流し,ステレオPIVを用いて曲り部での剥離やDean渦・Lyne渦など曲り部で生じる特徴的な二次流れの非定常特性の検証・考察を行った.既往研究でよく知られている,第一曲り部における定常流でのDean渦,および第二曲り部でのLyne渦が,エンジンのモータリング運転条件を模擬した高周波脈動乱流においても生じることが分かった.また,10kHzで取得した時系列PIVによる断面内二次流れ場に主成分解析を適用することで,定常流で生じるSwirl Switchingが脈動流でも生じることが第一モードから分かった.排気系を模擬した短い管長では矩形管断面においても下流で第2種二次流れは生じず,実機の排気系で用いる円管での設計にも本知見が応用できる可能性を示した.もう一つの計画である管内気液二相流流動場について,矩形断面直管内の一様空気流動に対し,エンジン排気系で想定される薄水膜を模擬した管径の510%程度の水膜挙動を高速度カメラで観察し,液膜飛散発生条件・飛散液滴の分裂挙動形態を気相・液膜流速,液膜厚さで評価した.,気液界面上の流体不安定成長波から,一様流中に置かれた単一液滴で生じる様々な分裂形態と同様の飛散分裂が発生し,波長サイズベースのオンネゾルゲ数が非常に小さいことからウェーバー数で飛散発生・形態が整理できる.双曲型方程式解法のCIP法・WENO法と,界面捕獲手法のTHINC/WLIC法,表面張力モデルのCSF法をベースに気液二相流の基本的なコードを構築し,観測結果を基にした次年度以降の汎用的CFDモデルの実装準備を進めた.矩形管内流れ場の詳細な計測から,定常流で見られた二次流れの知見に対し,管内脈動乱流における時間・空間データから二次流れメカニズムの詳細が分かり,実機エンジン状況に応じた現象解明に向けての基礎的知見が得ることが出来た.また,室温における管内気液二相流の液膜飛散・分裂条件等の基礎的知見を取得,気液二相流の基本的なコードを構築・準備を行い,概ね計画通りの進捗ではあるが,乱流場への拡張・壁面境界モデリング,非定常流下などでの検証実験の準備が遅れており,今年度までの知見を基に次年度も継続課題となっており,区分は本評価とした.次年度に室温気流から高温気流へ拡張を行い,流動場の可視化計測および温度計測,数値解析結果から得られる流動場・温度場に対して主成分解析等を用いた時間・空間的評価を進め,エネルギー損失評価に繋がる知見を得ることを目指す.また,壁面粗さ・形状の管仕様,脈動周波数・平均流速等の気相仕様を変えて,流動場・熱伝達に及ぼす影響を調査する.数値シミュレーションにおいては,各液滴分裂モデルの適用可能性,モデル間の比較検証等を大規模並列計算も用いて効率的に進める必要があり,今年度まで並びに次年度実施予定の各計測結果との整合性評価を行っていく.今年度研究計画である曲り管内流動場の基礎的挙動特性を明らかにするため,エンジン運転条件を模擬出来る脈動流発生装置から,時間変動する脈動空気を二つの曲り部がある矩形管内に流し,ステレオPIVを用いて曲り部での剥離やDean渦・Lyne渦など曲り部で生じる特徴的な二次流れの非定常特性の検証・考察を行った.既往研究でよく知られている,第一曲り部における定常流でのDean渦,および第二曲り部でのLyne渦が,エンジンのモータリング運転条件を模擬した高周波脈動乱流においても生じることが分かった.また,10kHzで取得した時系列PIVによる断面内二次流れ場に主成分解析を適用することで,定常流で生じるSwirl Switchingが脈動流でも生じることが第一モードから分かった.排気系を模擬した短い管長では矩形管断面においても下流で第2種二次流れは生じず,実機の排気系で用いる円管での設計にも本知見が応用できる可能性を示した.もう一つの計画である管内気液二相流流動場について,矩形断面直管内の一様空気流動に対し,エンジン排気系で想定される薄水膜を模擬した管径の510%程度の水膜挙動を高速度カメラで観察し,液膜飛散発生条件・飛散液滴の分裂挙動形態を気相・液膜流速,液膜厚さで評価した.,気液界面上の流体不安定成長波から,一様流中に置かれた単一液滴で生じる様々な分裂形態と同様の飛散分裂が発生し,波長サイズベースのオンネゾルゲ数が非常に小さいことからウェーバー数で飛散発生・形態が整理できる.双曲型方程式解法のCIP法・WENO法と,界面捕獲手法のTHINC/WLIC法,表面張力モデルのCSF法をベースに気液二相流の基本的なコードを構築し,観測結果を基にした次年度以降の汎用的CFDモデルの実装準備を進めた.

矩形管内流れ場の詳細な計測から,定常流で見られた二次流れの知見に対し,管内脈動乱流における時間・空間データから二次流れメカニズムの詳細が分かり,実機エンジン状況に応じた現象解明に向けての基礎的知見が得ることが出来た.また,室温における管内気液二相流の液膜飛散・分裂条件等の基礎的知見を取得,気液二相流の基本的なコードを構築・準備を行い,概ね計画通りの進捗ではあるが,乱流場への拡張・壁面境界モデリング,非定常流下などでの検証実験の準備が遅れており,今年度までの知見を基に次年度も継続課題となっており,区分は本評価とした.次年度に室温気流から高温気流へ拡張を行い,流動場の可視化計測および温度計測,数値解析結果から得られる流動場・温度場に対して主成分解析等を用いた時間・空間的評価を進め,エネルギー損失評価に繋がる知見を得ることを目指す.また,壁面粗さ・形状の管仕様,脈動周波数・平均流速等の気相仕様を変えて,流動場・熱伝達に及ぼす影響を調査する.数値シミュレーションにおいては,各液滴分裂モデルの適用可能性,モデル間の比較検証等を大規模並列計算も用いて効率的に進める必要があり,今年度まで並びに次年度実施予定の各計測結果との整合性評価を行っていく.今年度計上していた熱流束・温度計測に必要な装置の発注目途が遅れたことに伴い,既往装置での流動場計測・シミュレーションコードの構築を進めたことが主な理由であるが,次年度以降の国内外学会発表,ならびに今年度予定から次年度にずれ込んだ論文掲載・校正等の研究成果発表に生じる費用も発生する予定であることから,実験・計測装置の改良費用と併せてこれらに予算を確保する必要が生じたため.次年度の国内外学会発表及び論文投稿等の研究成果発表,数値解析を進める際の膨大なサイズのデータを処理するための解析ソフト,大規模ワークステーションの導入,実験に必要な計測装置および材料などの消耗品,追加工等の発注費用に使用を計画している.
肝類洞壁細胞の動態に関する研究

肝類洞壁細胞の動態を知るため、肝臓を生きたま々位相差顕微鏡にセットしたビデオ装置を用いて類洞を撮影するとともに、類洞周囲の星細胞を分離培養しその動態を観察した。正常マウスの肝類洞腔にはKupffer細胞のほか、少数のリンパ球が内皮に接着する像が観察された。四塩化炭素を投与したマウスの肝臓では肝小葉の中心帯に脂肪変性がみられ、肝血流速度の低下がみられ、類洞内皮に多数のリンパ球や単球と思われる細胞が接着し、血液の流れを悪くしていた。これら接着した細胞の一部が血流に抗してアメーバ状に移動する。また生じた肉芽腫内では細胞が渦巻き状の運動をしていた。以上の結果は、炎症時における炎症細胞の運動を示すもので、肝の病態解析に示唆を与えるものである。培養星細胞は、2日後に線維芽細胞様の形態を呈するようになる。分離培養後2日以内では、樹枝状の突起をのばし、生体の形態に類似しているので、その変化がどうして起るのか、実験的に解析した。先づKupffer細胞の培養上清を加えると、線維芽細胞様の形態は樹枝状へ変化した。培養液にプロスタグランディンE_2を加えても同様の変化を示した。このことから、樹枝状の形態は、活性化したKupfferの細胞が放出するプロスタグランディンE_2によって維持されている可能性を示している。星細胞の樹枝状の突起には、多数の棘状突起が突出し、その先端は肝実質細胞に接着していることを報告した。星細胞は収縮することが知られているので、収縮に際して実質細胞の細胞膜が引張られ、肝細胞間の憩室が拡大し、陰圧になった類洞周囲腔へ血液の液性成分が流入し、逆に星細胞が弛緩すれば憩室は閉じ、液は類洞周囲腔から類洞腔内へ流入すると考えられる。このような液の交換機構によって活発な肝実質の代謝が行われていると推測される。1)類洞周囲星細胞に対するKupffer細胞の作用ビタミンAを貯蔵し、細胞外マトリックスを産生する星細胞を分離し、培養し、別に培養したKupffer細胞の培養上清を星細胞の培養基に加えると、星細胞の突起は、膜状から樹枝状に変化した。プロスタグランディンE_2を加えても同様な変化が起ったので、Kupffer細胞が放出するプロスタグランディンE_2によって類洞周囲の星細胞の形態が制御されていることが明らかとなった。生体内においては星細胞は特有な樹枝状を呈しているので、Kupffer細胞との機能的関係が存在することが示唆される。2)肝類洞腔内に存在するクラスII陽性細胞とその動態類洞腔内にはKupffer細胞とは別にクラスII抗原を発現している細胞が存在することを明らかにした。この細胞は類洞腔中のみならずDisse腔にも分布し、Disse腔中を移動し、グリソン鞘内のリンパ管に回収されることが示唆される所見をえた。この細胞の起源と清長について今後研究をすゝめたい。1.類洞周囲細胞(星細胞)の形態を制御する因子星細胞は培養48時時間後に線維芽細胞様の形態に変化するが、Kupffer細胞培養上清、或いはプロスタグラディンE_2を添加するとin vivoでみられるような樹枝状突起をもつ形態に変化した。この反応は可逆的で、生体において星細胞の形態はKupffer細胞が放出するプロスタグランディンE_2によって制御されていることを示唆する。

2.類洞血流-類洞周囲腔間の液性交換促進機構の仮説星細胞は類洞内皮の外側に長い突起で接着している一方、その突起から出る多数の棘状突起は類洞周囲腔中を斜に立ち上がりその先端を実質細胞に接着させている。星細胞は収縮することが明らかになったので、その収縮に際して棘状突起がさらに立ち上がり、肝細胞膜を引張り肝細胞間の憩室が拡大する。そのため類洞周囲腔は引圧になり類洞血流の液性成分は内皮の孔を通って周囲腔に流入する。星細胞が弛緩すると逆に周囲腔の液は類洞腔に流入する。代謝活動の激しい実質細胞に対して液性交換を促進する機構の存在を示唆する。3.炎症時の類洞内リンパ球・単球の動態位相差映画法で四塩化炭素障害肝における類洞内皮に多数のリンパ球や単球が接着している動態を観察した。
ミトコンドリアダイナミクスを指標とした次世代糖尿病治療薬開発の為の基盤研究

1)ミトコンドリアダイナミクスとインスリン分泌:DRP1βKOマウスはグルコース応答性インスリン分泌不全から耐糖能の悪化を認める。膵β細胞におけるグルコース刺激時の細胞内Ca^<2+>濃度について解析を行ったところ、DRP1βKOではグルコース刺激時の細胞内Ca^<2+>濃度の上昇遅延を認めた。DRP1βKOの膵β細胞の電気顕微鏡像では、膵β細胞内ミトコンドリアが細胞質内の一カ所に凝集している像が得られた。これらのことから、β細胞内でのミトコンドリア分布異常による細胞内Ca挙動の変化が、グルコース応答性インスリン分泌不全の原因の一つと考えられる。2)Drp1と膵ラ氏島過形成:組織学的検討を行った。通常食下では膵ラ氏島面積にDRP1βKOマウスと野生型マウス間で有意差は認めなかった。一方、高脂肪食下においては、野生型に比較してDRP1βKOマウス膵ラ氏島の著明な過形成を認めた。Drp1は膵ラ氏島サイズを規定する因子の一つであり、特に高エネルギー食下でみられる膵ラ氏島の代償性肥大に対し抑制的に働いていると考えられる。Drp1の増加、すなわちミトコンドリアダイナミクスの亢進は膵β細胞の疲弊につながる可能性を示唆している。3)遺伝子発現プロファイル:DRP1βKOならびに野生型マウスより膵ラ氏島を単離し、DNAマイクロアレイ法により膵β細胞の遺伝子発現変化を解析した。その結果、インスリンシグナルに関与するIRS,AKT,FOXO等の発現にKOと野生型で変化は見られなかったが、膵ラ氏島再生・増殖因子として知られるReg遺伝子群が10-20倍に増加していることが明らかになった。ミトコンドリアダイナミクスが細胞増殖に関連する遺伝子群を制御している可能性が示唆され、今後ミトコンドリアダイナミクスは膵β細胞の疲弊、減少がその一因である2型糖尿病の治療標的になることが強く示唆された。DRP1βKOのランゲルハンス島において、電気顕微鏡にてβ細胞内ミトコンドリアの分布異常を認めた。この、β細胞内でのミトコンドリア分布異常がランゲルハンス島における糖代謝機能に何らかの影響があることが示唆された。DRP1βKOの組織比較では、通常食の膵臓におけるランゲルハンス島の大きさを比較した場合、週齢を重ねてもコントロールマウスとの差違を認めなかった。一方で高脂肪食において比較した場合DRP1βKOでは、β細胞の肥大を認めた。以上の事から高脂肪食の場合、DRP1βKOにおいてはランゲルハンス島に代償性肥大を認めることを明らかにした。DRP1βKOのマウスの耐糖能について分析した結果、DRP1βKOマウスは0.4mg/kgのグルコースを腹腔内注射し血糖値の推移を比較すると、DRP1βKOにおいてはコントロールマウスに対して優位に血糖値の上昇を認めた。このことにより、DRP1βKOにおいて耐糖能異常を認めることを明らかにした。耐糖能異常の結果を受け、ランゲルハンス島におけるグルコース刺激時のCa^<2+>の流入について分析を行った。DRP1βKOではグルコース刺激時の細胞内Ca^<2+>流入遅延を認めた。2)マイクロアレイによる遺伝子発現ブロファイリング膵臓よりランゲルハンス島を単離し、DNAマイクロアレイ解析を行いDRP1遺伝子の候補標的遺伝子群を同定することに成功した。
Ti_3Al単結晶の破壊挙動に及ぼす塑性異方性の影響

軽量耐熱材料として期待されるTi-Al系金属間化合物のうち、Ti_3Alの破壊挙動について単結晶を用いて系統的な研究を行った。Ti_3Alは結晶構造に由来した結晶方位異方性に起因して、その力学特性はC軸と荷重軸とのなす角度に強く依存することが既に知られている。そこで本研究では異なる荷重軸とノッチ方位を持つ5種類のC-T試験片を用意し、破壊に及ぼす結晶方位依存性とともにクラック進展過程についてAEを用いた動的観察を行った。その結果、Ti_3Alの破壊挙動は、塑性変形挙動と同様に強い結晶方位依存性を示し、荷重軸方向ならびにノッチ方位に強く依存した。例えば、試料の[0001]を荷重軸ならびにノッチ進展方向に垂直に選択した場合、55MPam^<1/2>もの高い破壊靱性値(K_Q)を示したのに対し、荷重軸がC軸から030°Cの場合には約10MPam^<1/2>程度の低い値で容易に破断に至った。また、破壊後の破面観察によると、前者の主亀裂は広い塑性変形領域をともなって延性的に進展しているのに比べ、後者の主亀裂は発生直後に急速に進展した結果、脆性的な破面を呈していた。この主亀裂の発生、伝播過程の違いは、試験時に発生するAE波においても確認された。詳細な検討により、Ti_3Al結晶における破壊の異方性の原因は、(0001)面と(1012)面上でのへき開破壊であった。このことは、実用化が期待される層状TiAlにおいて、主亀裂がα_2相(Ti_3Al相)内の層界面に平行な(0001)面上で容易に進展することとも良い一致を示した。したがって、Ti_3Al系化合物の破壊靱性の改善には、特定のへき開面上でのクラックの進展の抑制が不可欠である。
温度感受性ナノ磁性体を用いたセンチネルリンパ節の診断と温熱療法の開発

MRIによるセンチネルリンパ節の同定は、空間分解能が高く、放射性物質が不要であることなど、RI法や色素法に比してさまざまな長所が期待される。温度感受性鉄磁性体(サーママックス)は加熱・冷却によって凝集・拡散が可逆性に変化する鉄磁性体であり、これを用いてMRIによるラットのセンチネルリンパ節の撮像が可能であった。凝集温度の設定によりセンチネルリンパ節を標的とすることが可能と考えられた。【目的】MRIによるセンチネルリンパ節の同定は、空間分解能が高く、放射性物質が不要であることなど、RI法や色素法に比してさまざまな長所が期待される。温度感受性鉄磁性体(サーママックス)は加熱・冷却によって凝集・拡散が可逆性に変化する鉄磁性体であり、これを用いてMRIによるセンチネルリンパ節の撮像を検討した。【方法】2種類のサーママックス(36°C凝集型および42°C凝集型)とフェリデックスを同濃度(0.6mg/mL)に調整し、それぞれをラット胸壁に0.5ml投与し、経時的に腋窩リンパ節をMRIにて撮像した。【結果】MRI画像では、42°C凝集型・フェリデックスを投与した群で腋窩リンパ節の信号低下を認めたが、36°C凝集型を投与した群では信号低下を認めなかった。信号低下のピークを比較すると、フェリデックスは1時間以内にピークを認め、24時間後には信号値が回復した一方で、42°C凝集型では24時間後に信号低下のピークを認めた。病理学的所見ではMRI所見に一致した磁性体の集積を認めた。36°C凝集型は投与局所にて体温によって凝集したためにリンパ管へ移行しなかったもめと考えられた。一方、42°C凝集型は投与部位で凝集せずにリンパ管に流入し、その後体温によって徐々に凝集して、センチネルリンパ節に停滞ずる大きさになったと考えられ、センチネルリンパ節を標的とする磁性体として有用と考えられた。病理学的所見ではフェリデックスも42°C凝集型と同様にセンチネルリンパ節への集積を認めたが、MRI上の信号低下のピークは42°C凝集型の方が顕著であった。【結論】サーママックスを用いて、MRIによる腋窩センチネルリンパ節の同定が可能であった。センチネルリンパ節を標的としうるのみならず、造影効果はフェリデックスよりも強力かつ緩徐であり、鉄剤による副作用の軽減への寄与や、投与からMRI撮像までに時間的余裕が生まれることが期待された。温度感受性ナノ磁性体(サーママックス)を用いて、センチネルリンパ節を選択的に造影しうることを平成20年度の研究によって示した。凝集した鉄磁性体は磁気応答性が良好であり、外部からの交流磁場による誘電加温が容易であることが期待できる。現時点で使用されている抗腫瘍薬に、リンパ指向性を有したものが存在しないことから、上述のごとくセンチネルリンパ節へ移行・凝集したサーママックスが、センチネルリンパ節での転移をターゲットとした次世代DDS (drug delivery system)になりうるかを調査した。交流磁場発生装置を用いて交流磁場下でのサーママックスの誘導加温を試みたところ、凝集したサーママックスは良好に加熱された。凝集していないサーママックスは加熱されず、温度感受性ナノ磁性体の特性が誘導加温においても認められた。ラットの皮下にサーママックスを注入し、これに交流磁場をかけることで局所の温熱療法が可能であることを期待したが、温度上昇は認められなかった。体内、とくに深部での交流磁場によるサーママックスの加温は、in vivoに比して困難であり、さまざまな交流磁場の出力・周波数・サーママックスの投与量を検討したが、いずれも温度上昇に至らなかった。局所での加温を行うには鉄含有量が不足していることが原因として考えられた。温熱療法については断念し、平成20年度に検討した、温度感受性ナノ磁性体のセンチネルリンパ節診断薬としての有効性を今後論文発表する予定である。
悪性黒色腫に対するRT-LAMP法を用いた超迅速センチネルリンパ節微小転移診断

皮膚悪性黒色腫は、化学療法や放射療法に対して抵抗性であり、予後不良の癌である。今回の研究では、黒色腫患者の微小リンパ節転移の超迅速術中診断を臨床応用できる安定した方法・技術論を確立させることを目的とした。その結果、この研究期間に新たに約30例のセンチネルリンパ節生検を行い、総計50例の症例となった。RT-PCRと病理が一致した症例は82%であり、一方一致しなかった症例は18%であった。この結果、RT-PCRを用いてセンチネルリンパ節生検は非常に有用であることがさらに確かめられた。さらに、RT-LAMP法について検討したところ、RT-PCR法と同程度の検出能力であり、さらに条件設定の検討が必要なことが明らかになった。黒色腫細胞とリンパ球を様々な比率で混じ,混合物からmRNAを抽出し,RT-LAMP法の検出限界を確認する。RT-LAMP法とすでに行ってきたRT-PCR法,組織診断の結果を照合し,特異性,感度を比較、確認する。さらに黒色腫患者に対し,現場で実践するに際し,リンパ節摘出からRT-LAMP法の結果がでるまでの行程時間がばらつきなく安定し,時間効率に優れていることを確認する。術中迅速診断をRT-LAMP法を用い,実践,その結果・問題点を検討する,の点を中心に研究を行っている。実験1)メラノーマ細胞内のメラニン合成酵素でメラノーマ特異抗原であるTyrosinase, gp100, MART-1, MITF, HER3らの遺伝子産物の検出における感受性,特異性の確認のためにヒトメラノーマ細胞株SKme128とヒト単球系細胞株JurKatを比率1対100,1対1000,1対10000,1対100000と比率を変更して、混合物によりRNAを抽出したRT-LAMP法を施行,遺伝子産物の検出限度を測定、検出限度が次第に判明しつつある。実験2)我々が施行した悪性黒色腫患者のセンチネルリンパ節生検でルーチンとなっている組織学的検査と、実験レベルでは,センチネルリンパ節の一部のサンプルからmRNAを抽出保存し,RT-PCR法で分子生物学的レベルでメラノーマ関連遺伝子の解析しているので、それらサンプルすべてにRT-LAMP法を施行し,組織学的検査,RT-PCR法で検索しているメラノーマ関連遺伝子Tyrosinase, gp100, MART-1, MITF, HER3の遺伝子の検出を行い,過去の結果と比較し,特異度,感度を検討中である。実験3)実験2)によって検討・決定された適切なリンパ節の試料サイズをもとに摘出したリンパ節の一部をサンプリングし,mRNAを抽出,それを標的としリアルタイム濁度測定装置LA-320Cを用いて,RT-LAMP法を施行し,遺伝子検出を行っている。この一連の作業をスムーズに1時間程度で完了させれなければ,術中迅速法には適用できないので,頻回によるシュミレーションを研究代表者が行い,安定して迅速な作業ができるかを確認中であるが、安定した時間内で作業できることがわかってきた。皮膚悪性黒色腫は、化学療法や放射療法に対して抵抗性であり、全領域の悪性腫瘍の中でも特に予後不良の癌である。その大きな理由ひとつは、早期にかつ容易に所属リンパ節に転移するからであり、現在、極微小な転移を確実に診断できる方法はない。したがって、この高率にリンパ行性に転移する皮膚悪性黒色腫において、患者の予後を改善し根治的な治療を行うためには早期の微小リンパ節転移の有無を正確に評価することが非常に重要であり、昨今、これらの微小リンパ節転移を組織学的に検索するセンチネルリンパ節生検が欧米から端をし、国内においても悪性黒色腫、乳癌などの癌腫を中心に積極的に取り組まれている。今回の研究では、最終的に、黒色腫患者の微小リンパ節転移の超迅速術中診断を臨床応用できる安定した方法・技術論を確立させることを目指あした。そのために、RT-PCR法でのセンチネルリンパ節生検を行い、病理診断とRT-PCR法の比較をさらに症例を増やして検討する。さらに、それらの症例を用いてRT-LAMP法の有用性を検討する予定であった。その結果、この研究期間に新たに多くののセンチネルリンパ節生検を行い、総計50例の症例となった。これらは、RT-PCRを用いてセンチネルリンパ節生検は非常に有用であることがさらに確かめられた。
弥生時代再葬墓造営過程の復元

本研究では、弥生時代の東日本を特徴づける墓制である壺棺再葬墓が造営される過程を追究するのが目的である。同種の研究は従来もあったが、それはもっぱら再葬墓自体に残された諸痕跡から再葬行為の過程を遡って復原するものであった。本研究の独自性は、そうした研究も一方では採用しながらも、再葬墓を営んだ集団の生活の場とのつき合わせから再葬墓造営の全体像を捉えようとする点にある。研究の方法は、新潟県北蒲原郡安田町にある大曲・山ノ下・横峰A・六野瀬の4遺跡を取り上げ、大曲遺跡で再葬墓自体の検討をし、隣接する山ノ下遺跡の発掘によって生活遺跡であることを定め、そのうえで再葬墓と生活遺跡の性格とを合わせもつ六野瀬遺跡の事例を参考としつつ、剥片剥離作業を鍵として両遺跡を結びつけたことを試みた。その結果、(1).大曲遺跡の再葬墓を検討した結果、土器の使用痕跡から再葬墓造営過程の一部が復原できること、また再葬墓造営過程に剥片剥離作業が伴うことが確認できた。(2).山ノ下遺跡の発掘によって、大曲遺跡と同時期の生活遺跡で、両者が墓と集落という一対となる関係の遺跡であることが判明した。(3).再葬墓遺跡で、しかも3種の遺物集中出土ブロックが検出された六野瀬遺跡のデータにより、大曲遺跡と山ノ下遺跡とを結び付けることが可能であることがつかめた。つまり生活遺跡での剥片剥離作業から再葬墓での剥片を用いた儀礼までの一連の過程を復原することで再葬墓遺跡と集落遺跡とを一括して理解することが可能となる見通しを得た。今後の課題としては、剥片剥離作業自体をより明確にすることで再葬行為の過程をより具体的に復原することと、集落遺跡自体の分析を進めることが必要であると考える。本研究は,(1)弥生時代中期前半の再葬墓=大曲遺跡(新潟県北蒲原郡安田町)発掘資料の整理・分析と,(2)その造営主体たる集落と考えられる山ノ下遺跡の発掘調査を主とし,これに(3)近接する六野瀬遺跡関連遺跡の調査データを加味して進める。2ケ年計画の初年度は,(1)と(2)を実施した。(1)は大曲遺跡第4号墓坑出土土器13個体の復元作業と製作技術の観察を実施した。容骨器である完形土器に,漆を用いた補修痕が認められる例があることは,土器の製作から墓坑への埋置までに長期間を経ていることを示す注目すべき事実である。一方,共伴した剥片には微細な刃こぼれがあって,これを軟部組織が残る遺骸の解体によるものとすれば,再葬墓造営過程のなかで,容骨器である土器の扱いと,死者の発生以後の遺骸の扱いがどのような関係にあるのかを考える必要が生じてくる。(2)は山ノ下遺跡の試掘調査を実施した。試掘区5か所のうち1か所で大曲遺跡と同時期の遺物集中区が検出された。数量は多くないが,土器では壷が少なく深鉢が多くて,再葬墓と全く異なる組成であること,石器でも石鏃・石錐が明瞭であるなど,生活址であることは明らかである。そして土器の細部の特徴が大曲遺跡と一致しており,150m隔てた両遺跡が墓地とその造営主体という関係であることが判明した。母集落と墓地とまでは断じえないものの,2つの遺跡を直結できたことは意義深い。土器はもちろん,剥片類を含めて両遺跡出土資料の比較分析が重要視される。

第2年次は,初年度の(1)大曲遺跡出土資料の整理作業が難航したため,これを継続して終了させるとともに,(2)山ノ下遺跡の発掘調査を小規模ながら実施して両遺跡をより具体的に関連付けるデータを得ることを主眼として研究を進める。今年度は、(1)昨年度実施した新潟県安田町山ノ下遺跡試掘調査の資料整理及び比較資料の収集・検討と、(2)同町大曲遺跡1989年発掘資料の復原・検討作業を行った。(1)は資料数は限られるが、土器と石器組成からみて生活址であり、土器細部の特徴も大曲再葬墓遺跡と一致することから、その造営母集落と判断できる。弥生時代の壺棺再葬墓に伴う生活址の検出例は、群馬県沖II遺跡と栃木県戸木内遺跡の2遺跡があるが、再葬墓と生活址とを結びつけて論議されてはいない。石器の接合関係は確認できないが、粗質の流紋岩を素材とする剥片がともに存在することから、生活址から再葬墓造営までの過程が追跡できる格好の資料である。また今年度は、同種の性格とみられる遺跡例を収集し、大曲遺跡周辺の山ノ下・小山崎・横峰A遺跡、福島県鳥内遺跡周辺の上森屋壇・源平C・背戸・七郎内C遺跡など、大形の再葬墓遺跡の周辺にある同時代遺跡はいずれも小規模な生活址であることが確認できた。このことは、壺棺再葬墓造営集団が初期稲作民であるにもかかわらず、頻繁な移動生活をしていることを示しており、従来の東日本初期弥生時代の理解を軌道修正する必要が生じることとなろう。(2)については、4号墓資料の復原をほぼ完了し、2・3・5号墓資料はなお復原作業を続行中である。4号墓資料復原により、新潟在地土器(未命名型式)・北陸系土器(プレ小松式)・中部高地系土器(仮称松節式)・東北南部系土器(今和泉式)の4型式の共存が確認され、東日本弥生中期前半の広域編年策定の重要基準資料であることが確実となった。また漆を膠着剤として用いたり、穿孔-綴じ合わせにより破損した土器を補修する事実も確認され、再葬墓造営過程を復原する資料となった。本研究の第3年次として次の3項目について作業を進めた。(1).新潟県安田町大曲再葬墓遺跡発掘資料の復原・検討。2か年をかけて実施した第4号墓坑に続いて、第2・3・5号墓坑の復原を進めた。細片化しており難渋したが、第2・3号については概要の把握まで達した。第4号と同様に漆を塗ったり、穿孔緊縛によって壊れた土器を補修した実例が明瞭である。また、形を復原し得ない小破片は、再葬過程の断片を示す可能性が考えられ、注目したい。(2).山ノ下遺跡と大曲遺跡出土土器の比較と周辺の同時代遺跡資料の検討。両遺跡は、生活跡と再葬墓というだけでなく、出土土器の系統構成に違いがある。大曲再葬墓では北陸・長野方面の資料が明瞭なのに、山ノ下遺跡は仙台平野方面という従来当地域では顕著でなかった系統の土器があり、その違いが顕著である。また、両遺跡と同時期の遺物は横峰A遺跡でも認められ、小山崎遺跡でも可能性ある資料がある。大曲遺跡と他の3遺跡は墓と生活遺跡として一連の遺跡群と考えられる。(3).再葬墓造営過程を復原するデータの集成。弥生時代再葬墓遺跡データと、同時期の生活跡遺跡の集成を行った。福島・栃木・群馬県内でも再葬墓と生活跡とを一連の遺跡群として理解できる実例がある。ただし、再葬墓の場合、造営過程の具体的な復原を可能とする調査例はきわめて少なく、好例も調査報告データに不備があるなど、かなりの困難を伴うことは確かである。
遷移金属配位圏でのシリル転位を引き金とする脱カルコゲン触媒反応の開発

遷移金属配位圏内でのシリル基転位が鍵反応となり、通常では切断の困難な結合の切断を触媒的に進行させる反応を行ってきた。今までに有機ニトリルのC-CN結合切断、シアナミドのN-CN結合切断、シアナーとのO-CN結合切断、シリルシアニドのSi-CN結合切断を達成してきた。また、鉄錯体触媒存在下での二級チオアミドとヒドロシランの反応においては、強いC=S結合切断に加えて水素移動反応も同時に進行することを報告している。本年度は鉄錯体触媒共存下、イミン(RN=CHPh)とヒドロシラン(HSiEt3)の反応を調べ、N-シリルアミン((R)(Et3Si)NCH2Ph)が生成することを見出した。我々は先に二級チオアミドとヒドロシランとの反応でイミンとアミンが生成することを報告したが、その反応機構は明らかではなかった。本研究成果を踏まえると、まずイミンが生成し、それがさらにヒドロシランと反応してN-シリルアミンが生成するという段階的反応で最終的にアミンが生成することが明らかとなった。これらの研究成果はHeteroatom Chemistry, 2014, 25, 607-611に掲載された。また、鉄錯体触媒を用いて、シランとアルコールからシリルエーテルが生成することも見出し、報告した。シリルエーテルは有用な化合物であり、専らクロロシランとアルコールから合成されている。しかしこの方法では塩が副生成物として生じる。これに対して本研究で見出した反応は脱水素縮合反応であるので、副生成物は水素分子のみであり、クリーンな反応である。また触媒として環境にやさしい鉄錯体を用いている。これらの研究成果はInorg. Chim. Acta, 2015に掲載が決定している。26年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、鉄シリル錯体(CpFe(CO)2Me)を触媒として、二級チオアミド(RHNC(S)R')とヒドロシラン(Et3SiH)との反応を検討した。その結果、主生成物としてイミン(RN=CHR')が生成することを見出した。この反応では二級チオアミドの脱硫反応に加えて、水素移動反応が進行していることが分かった。二級チオアミド(RHNC(S)Ph)とCpFe(CO)(py)(SiR'3)との当量反応により、鉄カルベン錯体であるCpFe(CO)(=CR(Ph))(SSiR'3)の単離およびX線構造解析に成功した。単離したこの鉄カルベン錯体を触媒として二級チオアミドとヒドロシランの反応を検討したところ、イミンが生成した。これより、鉄カルベン錯体が触媒反応の中間体であることが明らかとなった。これらの実験事実をもとに、以下の触媒反応機構を提案した。真の触媒活性種である16電子鉄錯体(CpFe(CO)(SiR'3)に二級チオアミドのC=S二重結合部位が鉄に&#61544;2-配位した後、鉄上のシリル基がチオアミドの硫黄原子に転位してFe-S-Cの三員環錯体が生成する。その後、S-C結合の鉄への酸化的付加が起こり、鉄カルベン錯体が生成する。これらの研究成果はOrganometallics, 2013, 32, 2889-2892に掲載された。また、鉄シリル錯体(CpFe(CO)2Me)を用いてチオ尿素(RHNC(S)NHR)とヒドロシラン(Et3SiH)との反応を検討したところ、カルボジイミドが生成することを見出した。この反応においては、チオ尿素の脱硫反応に加えて、脱水素反応も起こっている。反応機構に関する検討を行い、この反応においてもまずチオ尿素のC=S結合が鉄中心に&#61544;2-配位した後、鉄上のシリル基のチオ尿素の硫黄原子への転位、S-C結合の酸化的付加による鉄カルベン錯体が生成の経路により反応が進行することを明らかにした。この研究成果はDalton Trans., 2013, 42, 10271-10276に掲載された。

また、鉄錯体触媒を用いて、シランとアルコールからシリルエーテルが生成することも見出し、報告した。シリルエーテルは有用な化合物であり、専らクロロシランとアルコールから合成されている。しかしこの方法では塩が副生成物として生じる。これに対して本研究で見出した反応は脱水素縮合反応であるので、副生成物は水素分子のみであり、クリーンな反応である。また触媒として環境にやさしい鉄錯体を用いている。これらの研究成果はInorg. Chim. Acta, 2015に掲載が決定している。26年度が最終年度であるため、記入しない。我々の研究室では今までに遷移金属配位圏内でのシリル基転位反応を引き金とした、RC-CN, R2N-CN, RO-CN結合の触媒的切断反応、ならびにホルムアミドのC=O、チオホルムアミドのC=S結合の触媒的切断反応を開拓してきた。これらの結合は強い結合で、通常は切断が困難である。その強い結合を選択的に切断できるのは、遷移金属配位圏内で容易に起こるシリル基転位反応(Silyl-Migration-Induced Reaction;SiMI Reaction)に起因していることを明らかにしてきた。本研究では、この反応の一般性ならびに適応範囲を調べると共に、遷移金属配位圏という錯体化学、シリル基転位という典型元素化学、そして脱カルコゲン反応という有機化学の融合分野の新たな展開を図った。今年後は二級チオアミドとの反応においては、強いC=S結合の切断に加えて水素移動反応が同時に進行し、またチオ尿素との反応においては、強いC=S結合の切断に加えて脱水素反応が同時に進行するという新しい反応を見出した。後者の反応で生成するカルボジイミドは脱水剤として広く用いられている有用な化合物である。チオ尿素をカルボジイミドに変換する反応は、工業的には水銀や鉛といった環境負荷の大きい試薬を用いて行われているが、本研究で見出した反応では鉄錯体を用いているので、工業的にも有用な反応と言える。加えて、いずれの場合も遷移金属カルベン錯体が反応中間体となっていることを、錯体の単離、構造解析により示すことができた。従って、当初の目的は十分に達成したと言える。遷移金属配位圏内で容易に起こるシリル基転位反応(SiMI Reaction)は、通常では切断の困難な強い結合を効率的に切断できるので、有用な反応であり、さらなる展開が期待できる。今後はこのSiMI反応をイソシアネート(RNCO)のC=O結合切断、およびイソチオシアネート(RNCS)のC=S結合切断に応用する。現在までにイソシアネート(RNCO)やイソチオシアネート(RNCS)と種々の試薬との反応により、R-C結合の切断や、C=O結合あるいはC=S結合へ付加が進行する反応の報告はいくつかあるが、C=O結合およびC=S結合の切断に関する報告はほとんどなく、その報告例も化学量論反応が知られているのみである。シリル転位反応を引き金とした触媒的切断反応という我々が開発したコンセプトを用いて、遷移金属錯体を触媒とするイソシアネートのC=O結合切断反応ならびにイソチオシアネートのC=S結合切断反応の実現を目指す。さらに、エステル、エノン、酸無水物、酸塩化物、の脱酸素反応、およびそれらのチオ誘導体の脱硫反応の検討を行い、触媒反応への展開を試みる。含硫化合物の脱硫反応を、遷移金属を用いて実現することは通常は難しい。それは硫黄原子が遷移金属錯体活性種に容易に配位子、その触媒活性を低下あるいは停止させてしまうからである。つまり含硫化合物は多くの触媒反応に対して触媒毒として働くためである。
気孔孔辺細胞の青色光情報伝達成分の解明

葉面の熱画像測定により、青色光依存の気孔開口が阻害された変異株を選抜し、その原因遺伝子が細胞膜H+-ATPaseのイソ酵素AHA1であることを見いだした。さらに、リン酸化プロテオーム法により孔辺細胞においてフォトトロピンに依存してリン酸化される蛋白質の探索を行い、最も素早くリン酸化される蛋白質を特定した。この酵素はCBC1キナーゼと名付け、そのホモログCBC2と重複して気孔開口を促進する事を示した。この酵素はフォトトロピンによる陰イオンチャネルの阻害を仲介する事を示した。さらに、この酵素が低CO2に応答して、気孔を開口させる因子である事をも示した。リン酸化プロテオーム解析により、青色光によってリン酸化される複数のタンパク質を同定し、その中にキナーゼ1と仮に名付けたものが存在した。キナーゼ1の変異株の光による気孔開口はサーモグラフィーによってほとんど野生型と違いはなかった。そこで、キナーゼ1と近縁のキナーゼ2の変異株を取得した。キナーゼ2変異株はわずかに青色光による気孔開口が阻害されていた。次に、キナーゼ1と2の二重変異体を作出した。この変異株の光による気孔開口は大きく阻害されていた。そこで、気孔開口の駆動力を形成する細胞膜H+-ATPaseのリン酸化と孔辺細胞プロトプラストからのH+放出を測定した。意外なことに、二重変異株はいずれも野生型と違いがなかった。この二重変異株では、気孔開口に必須のK+チャネルが阻害されているか、あるいは、気孔閉鎖を駆動する陰イオンチャネルが促進されているかの、いずれかの可能性が考えられた。孔辺細胞には過剰量のK+チャネルの発現が知られるので、前者の可能性は低い。この研究過程で変異株の表皮の一旦開口した気孔が光の存在下でも閉じることに気がついた。これは、気孔閉鎖系が光条件でも働く事を示している。光条件では陰イオンチャネルはその働きを抑制されていることが必要で、その抑制過程に2つのキナーゼが関与すると考えた。そこで、閉じる傾向にある変異株に陰イオンチャネルの阻害剤を添加しておくと野生株同様に閉じなくなった。この事実は、陰イオンチャネルが青色光により阻害されることが必要で、この過程に上記2つのキナーゼの関与が考えられた。現在、より直接的証拠を得る実験を進めている。前年度の研究から、フォトトロピン(phot1, phot2)を介した気孔開口に陰イオンチャネルの阻害が必要で、その情報伝達に2つの新規蛋白質キナーゼが関与することが示唆された。また、この蛋白質キナーゼが欠失すると青色光による陰イオンチャネルの阻害が見られなくなる事を電気生理学的手法により示した。さらに、フォトトロピンがこのキナーゼと直接相互作用し、リン酸化する事を示した。その一方で、フォトトロピン直下にある基質として証明されたblus1変異株でもこのキナーゼが野生株と同様にリン酸化された。この事実はこの新規のキナーゼがBLUS1とは別経路で働くことを示している。さらに、このキナーゼがCO2による気孔開閉の制御にも関与することが明らかになった。野生株では高CO2にすると気孔が閉鎖し、低CO2では気孔が開口する。しかし、この2つのキナーゼを欠失した変異株では上記のCO2応答が消失した。この表現型はCO2による気孔開閉の制御因子として知られるHT1キナーゼの変異株と酷似しており、新規キナーゼがHT1の情報伝達系と同じ経路に働く可能性を示している。そこで、HT1変異体(ht1)とこのキナーゼ変異体を掛け合わせた3重変異体の表現型を調べた。この3重変異体の表現型はht1とほぼ同じで、新規キナーゼがHT1と同じ経路に存在する事を示している。さらに、この新規キナーゼはHT1キナーゼによりリン酸化され、HT1をリン酸化する事は出来なかった。また、HT1とこの新規キナーゼが相互作用する事が示された。以上から、この新規キナーゼはCO2とBlue lightの両方から情報を受容し、気孔開開閉を制御していると推定され、CO2 and Blue light Convergent Kinase)(CBC kinase)と命名し、投稿準備中である。前年度に引き続き、気孔の青色光情報伝達系の研究を進めた。サーモグラフィーによる気孔開口変異体の解析によって、当初、キナーゼの変異を想定していたものが詳細な研究によって細胞膜H+-ATPaseそのものである事が示された。また、この変異により青色光による気孔開口の阻害に加えて、赤色光による気孔開口も部分的に阻害されていた。これらの成果をまとめて、論文として報告した。しかし、当初期待したキナーゼの変異は見いだす事が出来なかった。一方、リン酸化プロテオームにより得られたキナーゼ1と2はその2重変異によって気孔開口が阻害された。その作用機序は、当初全く予測の着かなかった興味深いものであった。このキナーゼについては詳しく解析し、その成果を投稿準備中である。上記のように、当初期待した細胞膜H+-ATPaseを直接リン酸化するキナーゼを同定出来なかった、一方、新規のキナーゼが青色光情報伝達系に関与するという当初予測しなかった成果も得られた。そのため、研究期間の延長を行い詳細な解析を行った。現在、この新規キナーゼの生理的役割を公表すべく論文を準備している。

気孔の青色光依存の開口に関与する成分を同定する目的で研究を行った。まず、変異株葉面の熱画像を測定し、青色光に誘導される気孔開口が低下した株を選抜した。そのなかの一つを詳細に調べ、原因物質として孔辺細胞細胞膜H+-ATPaseのイソ酵素、AHA1を同定した。この変異株ではAHA1の蛋白質量が低下しており、それが気孔開口の低下を引き起こす原因である事を証明した。次に、リン酸化プロテオーム法を用いてフォトトロピンに依存してリン酸化される蛋白質を孔辺細胞中に見いだした。その中で、素早くリン酸化されるCBC1に着目した。CBC1のホモログCBC2との二重変異株cbc1cbc2では、光による気孔開口が阻害されていた。この事は、CBC1とCBC2が重複して光による気孔開口を引き起こす事を示している。その原因を調べると青色光による細胞膜H+-ATPaseの活性化は正常で、青色光による陰イオンチャネルの阻害が起きなくなっている事が分かった。phot1との関係を調べると、CBC1はphot1直接相互作用し、phot1にリン酸化されphot1の基質である事が分かった。さらに、二重変異株cbc1cbc2の気孔はCO2の濃度変化にも応答しないことが分かった。この表現型が以前報告されたHT1キナーゼの変異体と似ている事から、HT1との関係を調べた。その結果、CBC1とCBC2はHT1の下流にあり、HT1と相互作用しHT1に直接リン酸化され、HT1の基質である事が分かった。さらに、CO2濃度を下げるとcbc1とcbc2変異株の気孔が野生型の半分程度開口し、CBCsが低CO2に応答して気孔を開かせるのに必要である事が分かった。こうして、CBCsはBlue lightとCO2の両方の応答を仲介する事からConvergence of Blue light and CO2(CBC)と名付けた。葉面の熱画像測定により、青色光依存の気孔開口が阻害された変異株を選抜し、その原因遺伝子が細胞膜H+-ATPaseのイソ酵素AHA1であることを見いだした。さらに、リン酸化プロテオーム法により孔辺細胞においてフォトトロピンに依存してリン酸化される蛋白質の探索を行い、最も素早くリン酸化される蛋白質を特定した。この酵素はCBC1キナーゼと名付け、そのホモログCBC2と重複して気孔開口を促進する事を示した。この酵素はフォトトロピンによる陰イオンチャネルの阻害を仲介する事を示した。さらに、この酵素が低CO2に応答して、気孔を開口させる因子である事をも示した。青色光による気孔開口の変異株を選抜し、気孔開口の駆動力となる細胞膜H+-ATPaseに変異が見つかった。別の変異株では細胞膜H+-ATPaseは正常で、その情報伝達系が傷んでいるものが見つかった。現在、原因遺伝子の同定を進めている。リン酸化プロテオームにより2つの新規キナーゼが気孔開口に影響を及ぼす事が解明された。以上の事から、研究目標をほぼ達成できたと考える。現在、投稿準備中なので、審査員のコメントに従って、研究を完成したい。そのまま採択されれば問題はない。しかし、追加実験の必要が生じた場合は、共同研究者と共同で必要な実験を行う予定である。また、これらの成果を学会等で発表し、その議論を通して今後の研究の方針をきめる予定である。
自然免疫受容体ＮＬＲＰのインフラマソーム活性化機構の構造科学的解明

1. NLRP3の新たな発現コンストラクト作製NLRP3単量体のX線構造解析に向けて、新たな発現コンストラクトを作製した。SER変異は,表面に位置する比較的大きな側鎖を持つ残基をアラニンに変異させることで表面エントロピーを減少させ,結晶化の確率を向上させることを目的とした変異である。hNLRP3のホモロジーモデルを作製し,表面に位置すると予測された嵩高いアミノ酸のSER変異体を作製した。hNLRP3のNACHTドメイン(220-536)とLRRドメイン(742-1036)のホモロジーモデルを作製し、作製したhNLRP3ホモロジーモデルからタンパク質表面に位置すると推定され,かつ嵩高いアミノ酸を含む部位を24ヶ所(NODにおいて11ヶ所,LRRにおいて13ヶ所)選択し,その部位の配列が2 5残基の連続したアラニンになるような変異を導入する変異体を計72種類作製した。それぞれ培養,精製を行い,約30種類を結晶化スクリーニングまで進めた。その結果、複数条件で結晶を得ることができた。2.クライオプロテクタントの検討X線回折強度測定時に,クライオプロテクタントとしてglycerolまたはethylene glycolを用いていたが,他のクライオプロテクタントを用いることで回折能が改善することを期待して,再現性の高い八面体状結晶についてクライオプロテクタントの検討を行った。Cryo Pro (Hamilton)を用いて,クライオプロテクタントの種類,濃度,結晶の浸漬時間等を変化させた約200条件でX線回折強度測定を行ったところ,複数の条件において,クライオプロテクタントとしてglycerolまたはethylene glycolを用いた場合よりも回折点が鮮明になり,分解能が7オングストローム程度に向上した。NLRP3の構造解明に向けて、SER変異体を作製し、複数条件で結晶を得ることができた。また、現在得られている結晶について分解能を向上させることができた。これらのことより、当研究がおおむね順調に進展していると考える。ヒトNLRP3について、異なる結晶化条件、測定条件においてさらに分解能を向上させられる可能性があるため、検討していく。異なる動物種由来のNLRP3についても、同様のアプローチで、良い結晶化条件を探す。また、現在着目しているタンパク質として、自然免疫応答に関わることが知られているCochlinがある。Cochlinは長鎖糖鎖のグリコサミノグリカン(GAG)と結合することがわかっているが、詳細な機能は不明である。一方、NLRP3もGAGの一種であるヒアルロン酸と結合することが知られている。予備的な実験により、CochlinはNLRP3より比較的溶液中での安定性が高いことが分かり、結晶化溶液が調製しやすいと予想される。NLRPおよびCochlinとGAGとの相互作用様式を解明し比較することで、自然免疫における炎症応答の制御機構の新たな視点からの考察につながると考えられる。そこで、これまでの計画と並行して、Cochlinの結晶化及びX線構造解析も目指す。

一方、NLRP3もGAGの一種であるヒアルロン酸と結合することが知られている。予備的な実験により、CochlinはNLRP3より比較的溶液中での安定性が高いことが分かり、結晶化溶液が調製しやすいと予想される。NLRPおよびCochlinとGAGとの相互作用様式を解明し比較することで、自然免疫における炎症応答の制御機構の新たな視点からの考察につながると考えられる。そこで、これまでの計画と並行して、Cochlinの結晶化及びX線構造解析も目指す。
新しい酵母ストレス蛋白質SSE1の機能解析

1)出芽酵母ストレス蛋白質のSSEファミリーには、SSE1とSSE2の2つのホモログが存在する。これらの破壊によりその形質変化を調べた。SSE1の破壊により、細胞増殖速度の低下が認められた。また、SSE2を破壊しても細胞の増殖には影響が認められず、SSE1とSSE2を同時に破壊してもSSE1単独破壊のものと細胞増殖速度は同じであった。最近、SSEファミリーのコードする蛋白質は、哺乳動物で耐熱性に関係すると思われるHSP110と相同性を示すことが明らかにされたので、これらの破壊株の耐熱性を急性の高熱環境下(50°C、30分)において調べたところ、SSE1破壊細胞は、野生株に比してより耐熱性を示した。また、SSE2破壊細胞の耐熱性は、野生株とほぼ同等であり、SSE1とSSE2を同時に破壊した細胞は、SSE1破壊細胞とほぼ同様の耐熱性を示した。これらの逆説的な現象は、SSE1破壊により、他のHSPの発現が誘導されるためと考えられた。2)MAPキナーゼは、そのスレオニン残基とチロシン残基の燐酸化、脱燐酸化により活性が調節されている。ヒトCL100等のdual specificity phosphatase (DSP)は、出芽酵母から、ヒトまで広く存在するMAPキナーゼ特異的脱燐酸化酵素であり、熱、高浸透圧などのストレスにより発現が誘導される事が知られている。我々は、分裂酵母のDSPであるdsp^+遺伝子をクローニングし、増殖、高塩ストレスおよび細胞質分裂における役割を明らかにした。
ラット肝細胞中の蛋白質ヒスチジンリン酸化、脱リン酸化系の解析

ペルオキシソーム増殖薬による肝がん発生の機構として、従来のペルオキシソーム過多による過酸化説は、ペルオキシソームの増殖能と肝がん発生率に相関が見られないなどの理由により、認められなくなりつつある。我々はそれに変わるものとして、増殖薬のペルオキシソームとは独立の作用に、細胞の基本的機能の攪乱を仮定し、この変化が肝がん発生には重要であると主張している。そしてその仮説を織り込んだ最近のペルオキシソーム増殖薬の作用とのその生理的意義に関する総説を発表した(Cell Structure & Function誌)。増殖薬によって引き起こされるペルオキシソームとは独立の変化として、我々はラット肝臓中に蛋白質ヒスチジンリン酸化酵素が誘導されることを発見した。この酵素は状況証拠から、細胞内情報伝達系に関与している可能性が考えられる。このヒスチジンのリン酸化を含む新たな情報伝達経路が存在し、その活性化が、増殖薬による肝細胞の増殖、肝肥大、さらには肝がん発生に関わっている可能性を考えている。そのために新たに見いだした蛋白質ヒスチジンリン酸化反応が、細胞増殖とどう関わっているか明らかにすることを目指している。そうした解析結果の一環として、情報伝達系との関わりを示唆する論文(FEBSLett.誌)とヒスチジンリン酸化脱リン酸化反応を生化学的に解析した論文(J.Biol.Chem.誌、印刷中)を発表した。また、増殖薬による蛋白質リン酸化の変化に関する論文(J.Biochem.誌)も発表した。