hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
網膜をモデル系としたヒストンメチル化による細胞系列特異的分化、維持機構の研究

Ezh2ノックアウト網膜は視細胞のみならず、他の神経細胞、グリア細胞も前倒しになっており、脱メチル化の意義はむしろ網膜の発生タイミングの制御にあることが示唆された。H3K27アセチレーションとH3K27me3の拮抗作用は観察されなかったが、ヒストンH3の別の位置のリジンのメチル化修飾に関与する酵素の網膜特異的ノックアウトマウスでは視細胞分化に異常があった。このメチル化の標的遺伝子座の一部はH3K27のメチル化を強く受ける遺伝子座で、H3K27のメチル化とこのメチル化の何らかの同期した作用という全く新しいメカニズムの可能性が示唆された。視細胞特異的に発現する遺伝子の遺伝子座におけるヒストンH3K27me3修飾の役割を検討した。H3K27me3のメチルトランスフェラーゼの網膜特異的ノックアウトマウスを用いて、網膜がどのように発生するか詳細に検討を加えた。さらに、Cd73表面抗原を用いて、網膜を視細胞とそれ以外の細胞に分離して、RNA-seqとH3K4me3, H3K27me3のChip-seqを行い、細胞系列特異的にヒストンメチル化が入るメカニズムと役割を検討した。H3K4me3は視細胞の分化にとって必須の遺伝子に、分化の時間軸に沿って修飾レベルが上がり、一方これらの遺伝子のH3K27me3のレベルが他の系列の細胞で抑制されるというこれまでの仮説が支持される結果が得られた。ヒストンアセチル化、他のヒストンメチル化などとの相互作用を検討していた過程で、ヒストンH3K36me3, me2の脱メチル化が視細胞の維持に必須であることが明らかになり、このメカニズムを明らかにするため、網膜特異的脱メチル化酵素のノックアウトマウスを作成し、このフェノタイプを検討した。このマウスは生後すぐまで網膜が正常に発生するが、その後、視細胞の分化がスタートすると急速に変性が起こることが明らかになった。視細胞分化関連の遺伝子の発現が多数抑制されていた。この脱メチル化酵素、および、H3K36me3, me2のChip-seqを行い、標的となる遺伝子座の同定を行うためのデータベースを作成した。当初の計画ではヒストンH3K27me3, H3K27ac, H3K4me3に着目して研究を展開する予定であった。しかし研究の過程でヒストンH3K36me2,3の重要性が明らかになりつつあり、一方で、H3K27ac, H3K4me3についてはこれまで明らかにしたこと以上の結果が出てこなかったため、研究の方向性の軌道修正が必要になった。このためやや遅れが生じたが、その後、H3K36me2,3の研究が順調に展開し、遅れを取り戻したと考えている。ヒストンメチル化の一種であるH3K36me3の網膜発生における役割について解析を行った。H3K36me3の脱メチル化を行う酵素の網膜特異的ノックアウトマウスはすでに作成し、このマウスが網膜発生中に視細胞分化に異常があることを明らかにしていた。このマウスについてさらに免疫染色を追加して視細胞の分化が特異的に障害されているというフェノタイプを確定した。その上で、メチル化の異常により遺伝子発現の異常が観察されるのかどうかについて、このマウスの網膜を用いて網膜特異的遺伝子について発現パターンをqPCRでコントロールと比較した。視細胞関連の複数の遺伝子について発現パターン異常が観察された。このため、これらの遺伝子の遺伝子座においてH3K36me2, H3K36me3の修飾の異常が観察されるかどうかChIP-qPCRで検討してみたところ、多数の遺伝子座で、H3K36me2, H3K36me3両者のメチル化レベルの大きな変動が観察された。より網羅的に検討する必要性が出たため、H3K36me2, H3K36me3の抗体を用いてChIP-seqを行った。同時に当該酵素の抗体によるChIP-seqを行い、酵素が結合する可能性があり、かつH3K36me2あるいはH3K27me3レベルの変動がある遺伝子座についてバイオインフォマティクスにより抜き出した。これらを総合し、この酵素の網膜発生における役割とその分子基盤について論文としてまとめることが可能になるレベルまで到達した。予想外の結果が出てきたため進捗が遅れたため翌年に繰り越して研究を続行することとなったが、ChIP-seqなどについて技術的な確立を行ったため、最終的にはほぼ計画どうり達成する見込みである。視細胞以外の細胞系列の遺伝子発現を視細胞においてヒストンH3K27メチル化により抑制しておくことの網膜発生における意義をより詳しく検討した。ヒストンH3K27メチル化酵素Ezh2の役割について:Ezh2ノックアウト網膜のフェノタイプについてタイムコースを詳しくとり検討を行った結果、網膜発生が視細胞のみならず、他の神経細胞、グリア細胞ともに前倒しになっていることが明らかになった。脱メチル化の意義はむしろ網膜の段階的なタイミングの制御にあることが示唆された。Ezh1の役割:Ezh2のホモログであるEzh1について、Ezh1のsh-RNAを通常マウスの網膜、あるいはEzh2-CKOの網膜に発現させ、視細胞維持への影響、関連遺伝子座のメチル化への影響を検討したが、Ezh2単独のノックアウトと比較してあまりフェノタイプの変化は観察されず、網膜発生においてはEzh2が主要な役割を果たしていることが示唆された。ヒストンH3K27脱メチル化酵素Jmjd3過剰発現よる検討:H3K27me3脱

メチル化酵素であるJmjd3を視細胞で過剰発現させたときの影響を網膜エクスプランと培養で検討したが、Jmjd3のノックアウトの時にフェノタイプが観察された双極細胞を含め発生時間、形態ともに顕著な影響は見出されなかった。Ezh2ノックアウト、Jmjd3ノックアウトを行った網膜で、発生中どの遺伝子発現が脱抑制、抑制をうけているのかRNAseqにより検討し、バイオインフォマティクスの手法により、標的となる遺伝子の絞り込みを行った。この時に、細胞系列特異的な遺伝子リスト、遺伝子機能による遺伝子のグルーピングの情報を盛り込むことにより、特定の細胞系列、あるいは機能を持つ遺伝子への影響が観察され、今後の研究の展開につながる結果となった。Ezh2ノックアウト網膜は視細胞のみならず、他の神経細胞、グリア細胞も前倒しになっており、脱メチル化の意義はむしろ網膜の発生タイミングの制御にあることが示唆された。H3K27アセチレーションとH3K27me3の拮抗作用は観察されなかったが、ヒストンH3の別の位置のリジンのメチル化修飾に関与する酵素の網膜特異的ノックアウトマウスでは視細胞分化に異常があった。このメチル化の標的遺伝子座の一部はH3K27のメチル化を強く受ける遺伝子座で、H3K27のメチル化とこのメチル化の何らかの同期した作用という全く新しいメカニズムの可能性が示唆された。今後H3K36me2,3と、これまで行ってきたヒストンH3K27me3との相互作用を中心に検討を行う。前年度までに、Chip-seqのデータベースを構築し、これを基盤に研究を展開する。網膜発生を制御する新しいヒストンメチル化のシステムとしてH3K36me3が明らかになってきたためこの役割についても解析し、当初より検討を進めていたH3K27me3と共に、ヒストンによる網膜発生をより多面的に明らかにすることを期待して研究を推進する。技術的なプラットフォームは共通であるため着実に進むことが期待される。29年度が最終年度であるため、記入しない。発生生物学29年度が最終年度であるため、記入しない。
火山爆発の理解に向けた自然電位の基礎実験

昨年度採取した火山岩の試料を用いて,流動電位法によるゼータ電位測定を行った.これまでに測定の終わったものは,十勝岳・利尻島・テネリフェ島から採取した7サンプルである.岩石サンプルは0.5mm直径に粉砕し,測定セルに装填した.セルに流動水を通過させたときに両端に生じる電位差を測定することにより,ゼータ電位が測定される.一般に,岩石のゼータ電位は流動水のpHに対して依存性を示す.今回の測定では,これまでHase(2004)等が示した実験結果と同じく,pH値が大きくなるにつれてゼータ電位が小さくなる傾向が示された.7サンプルのうち,4サンプルが,pH未調整状態の測定で正のゼータ電位を示した.正のゼータ電位を示すサンプルは,Hase(2004)により阿蘇火山でも見つかっているが,今回の測定は,その他の火山でも正のゼータ電位を示す岩石は希ではないことを示唆している.これまで,岩石-水の系では,ゼータ電位は負の値をとるという認識が一般的であったが,それは必ずしも正しくないことが本研究で示された.ゼータ電位の正負を決定している要因について調べるため,岩石の元素組成とゼータ電位の関係を吟味した.その結果は必ずしも明瞭ではなく,主要構成元素の組成だけでゼータ電位が決定されている訳ではないことが示唆された.今後,造岩鉱物組成まで考慮した検討が必要である.本研究課題でこれまでに得られた成果は,2005年1月に神戸で開かれた本特定領域研究主催の国際シンポジウム「火山爆発研究の基本戦略」で発表したほか,2005年3月に東京で開かれた本特定領域研究の成果報告シンポジウムで発表した.岩石の粉砕サンプルを用いたζ電位測定実験を行うため,必要な部材を購入し,流動電位方式による装置を構築した.現在までに,装置の性能を確認するため,花崗岩の粉砕サンプルを用いた予察的な実験を行い,正常に流動電位が測定できることを確認した.一方で,技術的な問題点として,サンプルホルダーの物理的強度が不十分であること,温度制御を行う必要があることなどが明らかになった.室内実験以外に,利尻火山,草津白根火山,テイデ火山(スペイン),ホワイト島火山(ニュージーランド)で自然電位分布の野外調査を行うと共に,上記のいくつかの火山で若干の岩石サンプルを採取した.利尻火山では,現在のところ,山頂部と中腹部をつなぐ1測線のみの情報しかないが,山頂部側が800mV程度の高電位を示すという結果を得た.また,草津白根火山では,地下に相当規模の熱水対流系が存在すると考えられているにも拘わらず,山頂側が低電位を示すことが明らかになった.これらのフィールド観測の結果は,実際のフィールドにおけるζ電位が,従来多くの火山において想定されてきたものとは異なり,正の符号をもつ可能性を示唆するものであり,室内実験による検証の必要性が再確認された.これまでの研究成果は,北海道大学紀要にまとめ,特定領域研究報告会(平成16年3月13日:東京大学)にて報告した.また,平成16年5月9日12日に開催予定の地球惑星圏合同学会(幕張)にて発表の予定である.昨年度採取した火山岩の試料を用いて,流動電位法によるゼータ電位測定を行った.これまでに測定の終わったものは,十勝岳・利尻島・テネリフェ島から採取した7サンプルである.岩石サンプルは0.5mm直径に粉砕し,測定セルに装填した.セルに流動水を通過させたときに両端に生じる電位差を測定することにより,ゼータ電位が測定される.一般に,岩石のゼータ電位は流動水のpHに対して依存性を示す.今回の測定では,これまでHase(2004)等が示した実験結果と同じく,pH値が大きくなるにつれてゼータ電位が小さくなる傾向が示された.7サンプルのうち,4サンプルが,pH未調整状態の測定で正のゼータ電位を示した.正のゼータ電位を示すサンプルは,Hase(2004)により阿蘇火山でも見つかっているが,今回の測定は,その他の火山でも正のゼータ電位を示す岩石は希ではないことを示唆している.これまで,岩石-水の系では,ゼータ電位は負の値をとるという認識が一般的であったが,それは必ずしも正しくないことが本研究で示された.ゼータ電位の正負を決定している要因について調べるため,岩石の元素組成とゼータ電位の関係を吟味した.その結果は必ずしも明瞭ではなく,主要構成元素の組成だけでゼータ電位が決定されている訳ではないことが示唆された.今後,造岩鉱物組成まで考慮した検討が必要である.本研究課題でこれまでに得られた成果は,2005年1月に神戸で開かれた本特定領域研究主催の国際シンポジウム「火山爆発研究の基本戦略」で発表したほか,2005年3月に東京で開かれた本特定領域研究の成果報告シンポジウムで発表した.
ティッシュエンジニアリングを応用した審美的・機能的インプラント周囲組織の構築

本研究は、歯の周囲に存在する組織構造をチタン製インプラントの周囲に構築し、機能だけでなく審美面でも歯周組織に近似させようとするものである。現在ではインプラントの研究は進み、インプラント周囲の組織構造が天然歯のそれに類似していることはすでに示している(Biomaterials;2005に掲載)。しかし、インプラント周囲付着上皮の低接着性(BiomaterialS;2005に掲載)、骨の非生理的な吸収などが認められ、これが特に審美性低下の原因と考えられるようになってきている(Campelo et al. 2002)。一方では、幹細胞や成長因子のような生理活性物質を人工材料に組み込み、特定の組織を再生させる技術であるティッシュ・エンジニアリング(組織工学)の研究も進み、歯周組織の再生もある程度確立されている。事実、口腔粘膜(Randal1 et al. 1998)や歯根膜の再生(Ueda et al. 1995)、また骨再生を目的としたBMP(Thies et al. 1992)やPRP添加(Namiki et al. 1997)などは既に試験的な臨床応用がなされている技術である。現在インプラント臨床の場で普及しつつある「プラットホームスイッチングシステム」を応用、より周囲組織にとって再生しやすい環境を作っている。実際にはプラットホームスイッチ部の深度や幅を組み合わせによる4群に分け、一番優れた形状を検索した。その結果は、2007年の第5回アジア補綴歯科学会(AAP)で発表した。また上皮接着を高めるであろうインシュリン様成長因子(IGF-1)を定期的に添加し、上皮封鎖性の向上および周囲組織の修復能の上昇を確認しており、この結果は2006年九州大学における再生シンポジウムにて発表している。今後はさらにそれぞれの組織再生のタイミングに着目し研究を続けこれらの研究を組み合わせ、上皮と骨の双方を適切なタイミングで、適切に再生させることで、患者の治癒能力だけに頼らない、術者側でコントロールできる審美的にも機能的にも優れたインプラント周囲組織の構築が期待できる。現在ではインプラントの研究は進み、1インプラント周囲の組織構造が天然歯のそれに類似していることはすでに示している(Biomaterials;2005に掲載)。しかし、インプラント周囲付着上皮の低接着性(Biomaterials;2005に掲載)、骨の非生理的な吸収などが認められ、これが特に審美性低下の原因と考えられるようになってきている(Campelo et al.2002)。事実、口腔粘膜(Randalletal.1998)や歯根膜の再生(Ueda et al.1995)、また骨再生を目的としたBMP(Thies et al.1992)やPRP添加(Namiki et al.1997)などは既に試験的な臨床応用がなされている技術である。現在その結果は、2007年の5回アジア補綴科学会(AAP)で発表予定である。今後は当初の予定通りそれぞれの組織再生のタイミングに着口し研究を続けこれらの研究を組み合わせ、上皮と骨の双方を適切なタイミングで、適切に再生させることで、患者の治癒能力だけに頼らない、術者側でコントロールできる審美的にも機能的にも優れたインプラント周囲組織の構築が期待できる。

その結果は、2007年の第5回アジア補綴歯科学会(AAP)で発表した。また上皮接着を高めるであろうインシュリン様成長因子(IGF-1)を定期的に添加し、上皮封鎖性の向上および周囲組織の修復能の上昇を確認しており、この結果は2006年九州大学における再生シンポジウムにて発表している。今後はさらにそれぞれの組織再生のタイミングに着目し研究を続けこれらの研究を組み合わせ、上皮と骨の双方を適切なタイミングで、適切に再生させることで、患者の治癒能力だけに頼らない、術者側でコントロールできる審美的にも機能的にも優れたインプラント周囲組織の構築が期待できる。
北太平洋におけるFREAK WAVEの解明と克服のための基礎研究

15名の共同研究者全員による、総合企画会議と、5分科会を設け、北太平洋におけるFREAX WAVEの解明と克服のための企画を行った。すなわち、1.リモートセンシングによる北太平洋での計測データの解析可能性調査:北太平洋海域におけるリモートセンシングデータからFREAK WEVEを解析出来るか調査を行った。2.発生メカニズムの解明と水槽における再現可能性の現状調査:発生メカニズムを文献と上記データを総合して発生に必要な基本因子とその組み合わせを特定し、水槽で再現するための実現性のある研究計画を作成した。3.シミュレーションコード開発と予測手法の開発計画の作成:風力・風向・気圧・潮流等により、FREAK WEVEの発生・頻度・大きさを予測できるコードを開発するための実現性のある研究計画を作成した。4.破壊力の解明と破損限界の定量化研究計画の作成:FREAK WEVE遭遇時の波面と船体運動、及び船体構造への衝撃荷重のかかり方とその大きさを明らかにし、損傷の形態と破損過程に基づいて、許容損傷と破損限界を定めるための実現性のある研究計画を作成した。5. FREAK WEVE遭遇回避システムの開発計画の作成:リモートセンシングによる波浪画像の分析、シミュレーションコードによる予測によって、ブリッジにおいて遭遇回避を判断できる「FREAE WAVE遭遇回避システム」を開発するための実現性のある研究計画を作成した。年度初期に、総合企画会議を開き研究の全体計画を討議、決定し、各分科会の研究企画を纏めた後、再度総合企画会議を開き、総合企画を纏めた。
神経障害性疼痛におけるエピジェネティックサイレンシングの統合的理解

本研究代表者は、神経損傷に起因する神経障害性疼痛の分子基盤において、転写抑制因子NRSFを介する遺伝子サイレンシングの重要性を見出してきた。本研究では、神経損傷後の脊髄後根神経節において発現増加する、NRSF転写共役因子およびエピジェネティクス修飾酵素を見出した。さらに、神経障害性疼痛における末梢性・全身性のモルヒネ鎮痛効果低下の分子基盤として、ヒストン脱アセチル化酵素の機能的関与を明らかにした。これまでに本研究代表者は、末梢神経損傷に伴う慢性疼痛(神経障害性疼痛)の分子基盤として、一次知覚神経での転写抑制因子NRSF(neuron-restrictive silencer factor)を介する疼痛関連遺伝子群のエピジェネティックサイレンシングを解明してきた。一方、最近の報告では、NRSFは多様な転写共役因子と複合体を形成することにより、化学的に安定なエピジェネティクス修飾を誘発し、長期的遺伝子サイレンシングを誘導することが示されている。そこで、本研究課題では、神経障害性疼痛におけるNRSFの転写共役因子を機能的に同定するとともに、転写抑制機構に基づいて標的遺伝子を分類化することにより、その分子実体の統合的理解を目指す。研究実施計画に基づき、当該年度では、NRSFの転写共役因子群について、神経損傷後の脊髄後根神経節(dorsal root ganglion; DRG)における遺伝子発現変化を定量的PCR法にて経時的に評価した。その結果、特定の転写共役因子のmRNA発現レベルが、神経損傷後において増加する傾向が認められた。この解析に加えて、当該年度では、研究実施計画に基づき、転写共役因子の標的遺伝子群を同定するために、次世代シークエンサーを用いたChIP-Seq法に着手した。次世代シークエンサー解析では、DRGサンプルから均一な断片化クロマチンを得ることが必要となるため、現在、複数の超音波処理器機を利用して、条件検討を行っている。これまでに本研究代表者は、末梢神経損傷に起因する慢性疼痛(神経障害性疼痛)の分子基盤として、一次知覚神経でのNRSFを介する疼痛関連遺伝子群のエピジェネティックサイレンシングを解明してきた。一方、最近の報告では、NRSFは多様な転写共役因子と複合体を形成することにより、化学的に安定なエピジェネティクス修飾を誘発し、長期的な遺伝子発現抑制を誘導することも分かってきた。そこで、本研究課題では、神経障害性疼痛におけるNRSFの転写共役因子を機能的に同定するとともに、転写抑制機構に基づく標的遺伝子の分類化を目指す。研究実施計画に基づいて、最終年度では、前年度計画の継続とともに、制御化合物を用いた機能解析を行った。具体的には、神経損傷後の脊髄後根神経節(DRG)では、特定のNRSF共役因子とともに、その因子と相互作用するヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)の発現が増加することを見出した。このHDACは、Muオピオイド受容体(MOP)のNRSF結合部位に結合することがすでに報告されている。HDAC阻害薬であるトリコスタチンA及びバルプロ酸を投与することにより、神経損傷後のDRGにおけるMOPの遺伝子発現低下が抑制された。また、これらの阻害薬処理は、神経損傷後の末梢性及び全身性のモルヒネ鎮痛効果の減弱を有意に改善した(Uchida et al., 2015, J Pharmacol Sci)。一方、神経損傷後のヒストンメチル化については、MOP遺伝子を含むNRSF結合部位において、転写抑制に関わるH3K9ジメチル化が亢進することを予備的に見出した。最近、ジメチル化酵素G9aが神経損傷後におけるMOP発現低下に寄与することが示された(Zhang et al., 2016, J Biol Chem)ことから、今後はG9aの関与の有無に基づく標的遺伝子の分類化が重要であると考えられる。本研究は、神経損傷に起因する神経障害性疼痛における疼痛関連遺伝子のサイレンシングの分子実体について、NRSFと共役因子の転写抑制複合体を介する化学的に安定なエピジェネティクス修飾を解明することを目的としている。初年度では、転写共役因子群の発現解析を通じて、発現増加を示す分子を見出しており、今後の解析の手がかりを得ることができた。また、サイレンシング機構に基づいて標的遺伝子を分類化するために、次世代シークエンサーを用いたChIP-Seq法に取り組んでおり、おおむね順調に進展していると考えられる。分子神経科学神経損傷に起因する神経障害性疼痛における疼痛関連遺伝子のサイレンシングの分子実体を明らかにするために、NRSF転写共役因子と連関するエピジェネティクス修飾酵素群に着目し、エピジェネティクス修飾異常、標的遺伝子群の発現変調、神経障害性疼痛への機能的関与を評価する。ここでは、エピジェネティクス修飾酵素に対する特異的阻害薬あるいはsiRNA等によるノックダウン手法を用いることを計画している。また、ChIP-Seq解析に必要となる均一な断片化クロマチンの取得について、超音波処理では条件設定が困難な場合には、マイクロコッカルヌクレアーゼの使用も検討する。ChIP-seq法を通じて、サイレンシング機構に基づいて標的遺伝子を分類化する。

2015年3月中において、国内での出張(1第88回日本薬理学会年会での参加・発表、2研究打ち合わせのための出張)があり、その支払いが2015年4月に行われたため。平成27年度の直接経費は、1400千円である。研究実施計画に基づき、解析に必要となる生化学・分子生物学試薬、抗体、一般試薬、実験動物等の物品費として1000千円を計上する。また、本年度は、成果報告のための学会発表に必要な旅費として200千円を計上する。さらに、論文投稿費等をその他の経費として200千円計上する。
「注視・傾聴」行動に着目した児童の積極的授業参加行動に関する研究

本研究では,小学校の児童の積極的授業参加行動のうち授業に集中して聴き,教師の指示に従うなどの授業の基本となる行動である「注視・傾聴」行動に注目し,その行動を促進する要因,阻害する要因を検討した。また,実際の小学校の授業観察の結果から,「注視・傾聴」行動の多い児童,少ない児童の行動の特徴を描き出した。これらの結果をもとに,「注視・傾聴」行動を促進するためのプログラムを検討したい。本究の目的は,「注視・傾聴」行動を中心とした児童の積極的授業参加行動の様相をより具体的に明らかにし,児童を授業に積極的に参加させるための介入プログラムを提案することである。そのため, 20年度の研究実施計画として, (1)授業場面の観察を通した「注視・傾聴」行動の分析, (2)「注視・傾聴」行動と動機づけに対する児童の認識の調査の2つの計画を立てた。(1)に関しては,公立小学校4年生の1学級を対象として,約半年間,週1回程度の授業観察を行い,積極的授業参加行動の変化についてビデオ録画による記録を取った。また,対象学級の児童の自己評定と担任教師による評定の対応を質問紙調査によって検討した。行動分析および質問紙調査の結果の分析から,児童の積極的参加行動の変化を明らかにすることにより,教育現場への提言ができると考えられる。また,特に「注視・傾聴」行動の多い児童と少ない児童の特徴を明らかにし,両者の比較を行うことにより,「注視・傾聴」行動を促進する要因・阻害する要因の検討を詳細に行っていく。(2)の計画については,小学3年生から6年生435名を対象とした質問紙調査を実施し,学年による積極的授業参加行動の変化,また,学習に対する目標や動機づけ,コンピテンスとの関連について検討を行った。その結果,加齢に伴って減少する行動,学年による差は顕著ではないが,男女差が見られる行動など,積極的授業参加行動に含まれる構成要素によって学年,性別の特徴があることが明らかとなった。さらに,学習目標やコンピテンスと積極的授業参加行動の関連についても,学年によって関連の仕方が異なることが得られた。これらの結果は,それぞれの学年の特徴を踏まえた指導の在り方を検討する上で有益な知見をもたらすことができると考えられる。そのため,21年度の研究実施計画として,(1)(1)授業場面の観察を通した「注視・傾聴」行動の分析,(2)注視・傾聴」行動と動機づけに対する児童の認識の調査の2つの計画を立てた。(1)に関しては,公立小学校4年生の1学級を対象として,新年度になり新しく学級を組織した1学期の最初から学級形成が落ち着いたと考えられる1学期の間,週1回程度の授業観察を行い,積極的授業参加行動の変化についてビデオ録画による記録を取った。また,観察者による対象学級の児童の行動評定を行った。行動分析および観察者の評定の対応を分析することにより,児童の積極的参加行動の変化を明らかにすることができると考えられる。また,「注視・傾聴」行動に変化が見られた児童の行動と詳細に分析し,「注視・傾聴」行動の変化の様相を明らかにしていく。また,計画(2)に関しては,観察対象とした4年生の学級の児童に,1学期の最初と終わり,また年度末の計3回積極的授業参加行動および学習に対する目標や動機づけ,コンピテンスを尋ねる質問紙調査を行った。縦断的調査を行うことにより,各自の積極的授業参加行動の変化,また,積極的授業参加行動と学習に対する目標や動機づけの関連の仕方の変化を検討した。その結果,積極的授業参加行動が1学期当初に比べ1学期末,年度末に低下している児童は,学習に対する目標も低下する傾向にあることが示唆された。さらに,授業中の行動分析との関連を検討していく予定である。本究の目的は,「注視・傾聴」行動を中心とした児童の積極的授業参加行動の様相をより具体的に明らかにし,児童を授業に積極的に参加させるための介入プログラムを提案することであった。22年度の研究実施計画は以下の2つであった。(1)児童の「注視・傾聴」行動を中心とした積極的授業参加行動を促進する介入プログラムの検討,(2)児童の積極的授業参加行動を促進する要因・阻害する要因の検討。(1)に関して,昨年度の研究で観察記録を取った公立小学校4年生の1学級のデータについて,「注視・傾聴」行動の多い児童と少ない児童を抽出し,主に国語の時間における行動を分析した。

その結果,「注視・傾聴」行動の多少にかかわらず,共通して見られる行動傾向がある一方で,「注視・傾聴」行動の多い児童に特徴的な行動と「注視・傾聴」行動の少ない児童に多く見られる行動があることが示された。また,計画(2)に関しては,昨年度行った積極的授業参加行動と達成目標・コンピテンスとの関連についてさらに詳細に検討を行い,学年が上がるにつれて積極的授業参加行動が低下する現象についての考察を行った。さらに,授業内容の理解や学業達成と積極的授業参加行動の関連について検討するため,公立小学校5,6年生を対象とした調査を実施した。同時に,担任教師に調査の対象とした授業について,一部の対象クラスについては,授業場面の観察記録を取ると共に,授業内容の中で特に児童に理解してほしいと考えることについて尋ね,児童の調査結果との対応を調べた。その結果,「注視・傾聴」行動の多い児童は,授業の内容について記述を求めた際,より多い文字数で表せることが示唆された。一方,学業達成として取り上げた課題との関連については,積極的授業参加行動の中で「注視・傾聴」行動との関連は得られなかったが,「準備・宿題」行動とは関連があることが示された。今後,さらに分析を進める予定である。
死細胞DNA分解システムの全容と、cfDNA生成メカニズムの解明

血液中には微量ながら分解を免れたDNAすなわちcell-free DNA(cfDNA)が存在し、疾患との関係が近年注目されている。特に腫瘍由来の循環血液中DNA(ctDNA)は癌の診断や、予後判定などに有効な、いわゆるリキッドバイオプシーのターゲットとして関心を集めている。しかしながら、cfDNAの生成のメカニズ関しては不明な点が多い。cfDNAは死細胞由来と考えられているが、それがアポトーシスなのかネクローシスなのか、またどのようなDNA切断酵素(DNase)が関与しているのかに関しては、情報が乏しいのが現状である。in vivoの細胞死誘導モデルとして、アセトアミノフェンによる薬剤性肝障害モデルと抗FAS抗体による肝細胞死があり、前者がネクローシス、後者がアポトーシス誘導モデルとして有名である。またDNaseγ(別名DNase1L3)はネクローシス、CADはアポトーシスの際のDNA切断酵素として知られている。そこで、30年度には上記遺伝子欠損マウスに細胞死を誘導し、cfDNAの産生を検討した。その結果、ネクローシスの場合はDNaseγが、アポトーシスの場合はCADとDNaseγの両方がcfDNAの生成には必須であることが明らかになった。この発見は、cfDNAの生化学の基盤となる発見であり、酵素の特異性をふまえたcfDNAの評価ならびに精製プロトコールの作製に寄与するものと期待される。当初予定していた3重遺伝子欠損マウスの作成が遅れている。3重遺伝子欠損マウスの作成は遅れているが、当初の主要な目的であるcfDNA生成メカニズムの解明に関しては、順調に進んでいるので、できるだけ早く論文発表する予定である。血液中には二つのDNA切断酵素DNaseγ、DNase1が存在し、死細胞DNAの分解を担っている。29年度にはこの二つの酵素が好中球細胞外トラップ(NET)の抑制に関与すること、さらには血中cell-free DNA (cfDNA)の生成または分解に関わる可能性を見出した。NETは炎症時に好中球から循環血液中へ放出される網目状の構造物である。細胞内顆粒成分と、クロマチンDNAからなり、病原微生物などを捕捉して中和する役割を有し、宿主防御の一端を担っている。しかし、時にはその過剰な放出が血栓症を誘発し、宿主を攻撃する結果となる。我々はこれまで、DNaseγが無いと、NETを形成しやすいことをin vitroの細胞培養実験で明らかにしていた。今年度、ハンブルグーエッペンドルフ・ユニバーシティーメディカルセンターとの共同研究で、循環血液中のDNase1およびDNaseγがNETを分解し、血栓形成を抑制することを見出した。好中球増多症や敗血症の際にはNET形成が亢進し、血管を閉塞させ、臓器損傷を引き起こすが、本研究成果により、DNase1およびDNaseγがその予防や治療に使える可能性が示唆された。cfDNAは血中に存在するDNAで、モノヌクレオソーム単位の断片が多いことから、アポトーシス由来で、CADがその生成酵素と考えられてきた。しかし最近我々は、ネクローシスの際にもモノヌクレオソーム単位のDNA断片が形成され、DNaseγがその生成に主要な役割を担っていることを見出した。またDNase1に関してはcfDNAの生成というよりも、むしろその分解に関与している可能性が示唆された。DNA切断酵素DNaseγ、DNase1が好中球細胞外トラップ(NET)の抑制に関与し、DICなどの治療に応用できることを見出したのは大きな進歩であるが、当初予定した新たな遺伝子改変マウスの作成が遅れている。新たな遺伝子遺伝子改変マウスの作成には多大な労力と資金が必要であり、現在の状況では作出が困難な状況にある。幸いcfDNA生成のメカニズム解明には現有の遺伝子改変マウスでも解析可能なので、こちらを優先していきたいと思っている。予定していたマウスを用いた実験を次年度に延期し、その費用として繰り越した。当初予定していた3重遺伝子欠損マウスの作成が遅れたことが理由であるが、次年度支出の予定である。
密度波状態におけるスライディングの量子効果

本研究の目的は,密度波の動的性質,特に,並進運動(スライディング)による非線形電気伝導および関連する現象に量子効果の特徴が明確に現れているかどうかを明らかにすることである.量子効果は電荷密度波に比較して有効質量の小さなスピン密度波に現れやすいと期待されるので,スピン密度波の典型物質であるベチガード塩(TMTSF)_2AsF_6を用いて非線形電気伝導度と過渡的電圧振動を測定した.常圧では試料の冷却時に微細クラックが発生し電流経路が乱れるため,高圧セルを用い,わずかに加圧した.密度波位相の垂直方向のゆらぎの影響を避けるため,位相相関長の垂直成分よりも細い試料(断面積が約200μm^2以下)を用いた.約0.6K以上の温度領域における非線形伝導度から,スライディングしきい電場は約100V/cmと,太い試料に比較して約1桁大きく,その温度依存性も転移温度付近まで温度によらず一定であり,太い試料とは著しく異なることを見いだした.電圧振動数から求めたピン止め波長は密度波の波長から期待される値に近く,断面にわたり一様にスライディングすることが明らかである.以上の結果から,量子効果の存在を判定するには,さらに低温が必要であると結論される.また,さらに細い試料を使用するのが有効であると判断されるが,扱うテクニックの開発が今後の課題として残された.新しい伝導性錯体(TMDSA)塩について同様の測定を行った.低温で非線形伝導を観測したが,定量的には試料依存性が強く,結晶成長条件の制御が今後の課題として残された.本研究の目的は,密度波の動的性質,特に,並進運動(スライディング)による非線形電気伝導および関連する現象に量子効果の特徴が明確に現れているかどうかを明らかにすることである.量子効果は電荷密度波に比較して有効質量の小さなスピン密度波に現れやすいと期待されるので,スピン密度波の典型物質であるベチガード塩(TMTSF)_2AsF_6を用いて非線形電気伝導度と過渡的電圧振動を測定した.常圧では試料の冷却時に微細クラックが発生し電流経路が乱れるため,高圧セルを用い,わずかに加圧した.密度波位相の垂直方向のゆらぎの影響を避けるため,位相相関長の垂直成分よりも細い試料(断面積が約200μm^2以下)を用いた.約0.6K以上の温度領域における非線形伝導度から,スライディングしきい電場は約100V/cmと,太い試料に比較して約1桁大きく,その温度依存性も転移温度付近まで温度によらず一定であり,太い試料とは著しく異なることを見いだした.電圧振動数から求めたピン止め波長は密度波の波長から期待される値に近く,断面にわたり一様にスライディングすることが明らかである.以上の結果から,量子効果の存在を判定するには,さらに低温が必要であると結論される.また,さらに細い試料を使用するのが有効であると判断されるが,扱うテクニックの開発が今後の課題として残された.新しい伝導性錯体(TMDSA)塩について同様の測定を行った.低温で非線形伝導を観測したが,定量的には試料依存性が強く,結晶成長条件の制御が今後の課題として残された.本研究の目的は,密度波の動的性質,特に,並進運動(スライディング)と関連する現象の中に,明確な量子効果があるかどうかを明らかにすることである.量子効果は有効質量の小さなスピン密度波に現れやすいと期待されるので,スピン密度波の典型物質(TMTSF)_2AsF_6の非線形電気伝導度を測定した.また,密度波位相の垂直方向の乱れの影響を避けるため,コヒーレンス長の垂直成分よりも細い試料を用いることとした.今年度は,電解法により(TMTSF)_2AsF_6単結晶を育成した.結晶の純度を高めるため,原料を再結晶し,溶媒を低温蒸留した.系統的に細い結晶を作ることができなかったので,断面積が約200μm^2以下のものを選び出し,非線形伝導度の測定に使用した.常圧では,試料の冷却時に微細クラックが発生し電流経路が乱れるため,高圧セルを用い,わずかに加圧した.その結果,オーミック伝導度の温度依存性には,微細クラックによる不連続な変化が検知されなかった.伝導度の電場依存性を約0.6K以上で測定した.スライディングの開始するしきい電場は約100V/cmと,太い試料に比較して約1桁大きいことを見いだした.また,その温度依存性も,太い試料と違い,転移温度付近まで温度によらず一定であることを見いだした.より細い試料を用い測定を試みたが,高圧セルに挿入する際に破損する.今後は,細い試料を安全に高圧セルに挿入できるような工夫を試みる計画である.本研究の目的は,密度波の動的性質,特に,並進運動(スライディング)と関連する現象の中に,明確な量子効果があるかどうかを明らかにすることである.量子効果は電荷密度波に比較して有効質量の小さなスピン密度波に現れやすいと期待される.そのため,スピン密度波の典型物質(TMTSF)_2AsF_6の非線形電気伝導度を測定した.特に,密度波位相の垂直方向のゆらぎの影響を避けるため,位相相関長の垂直成分よりも細い試料を用いることとした.電解法により(TMTSF)_2AsF_6単結晶を育成した.原料を再結晶し,溶媒を低温蒸留することで結晶の高純度を図った.断面積が約200μm^2以下のものを選び出し,非線形伝導度および過渡的電圧振動を測定した.

常圧では,試料の冷却時に微細クラックが発生し電流経路が乱れるため,高圧セルを用い,わずかに加圧した.約0.6K以上の温度領域における伝導度の非線形項からスライディングの開始するしきい電場は約100V/cmと,太い試料に比較して約1桁大きいことを見いだした.その温度依存性も,太い試料と違い,転移温度付近まで温度によらず一定であることを見いだした.過渡的電圧振動の振動数から求めたピン止め波長は密度波の波長から期待される値に近い結果を得た.また,新しい伝導性錯体(TMDSA)塩について同様の測定を行い,低温で非線形伝導を観測することに成功した.結晶成長条件の制御が今後の課題として残された.
脳磁場計測によるヒトの高次脳機能の研究

超伝導技術の進歩により、脳が発生する極めて微弱な磁場を検出することが可能となった。この方法は、時間分解能および空間分解能に優れており、非侵襲的にヒトの脳機能を計測する方法として注目を集めつつある。本研究では、ヒトに体性感覚及び視覚刺激を与えた場合の脳内反応および、単純な随意運動の脳内機序を、脳磁場計測によって検討した。(1)正中神経を電気刺激すると、潜時約20msと60msに、対側の一次体性感覚野上肢領野起源と思われる誘発脳磁場が観測された。第一の成分は、視床から一次体性感覚野深層へのシナプス入力を、第二の成分は、一次体性感覚野内の回路による皮質表層へのシナプス伝達を反映していると考えられる。また二次体性感覚野起源の反応も捉えられた。(2)視野の一点に光刺激を与えた場合の誘発脳磁場を、後頭部を中心に計測したところ、潜時約75、100、150msに反応が観測された。これらのうち、潜時約75msの成分は、一次視覚野由来と考えられ、視野局在性を示した。(3)光に応じて、指の屈曲を行うという課題を被験者に課すと、指の運動に際して運動側とは反対の頭蓋に、2つの成分の脳磁場が観測された。第一の成分は、頭蓋の内外側で極性が逆転しており、運動の開始に先行していた。第二の成分は、第一の成分と極性が逆で、運動の開始より遅れていた。第一の成分は、小脳から視床を経由した運動指令によって活性化された運動野上肢領野の活動に、第二の成分は、感覚性入力のフィードバックによって活性化された感覚野の活動に由来していると考えられる。以上の結果は、脳磁場計測がヒトの脳機能、特に高次脳機能の解明に有力な手段を提供することを示している。本研究において、知覚の基礎的な情報処理、あるいは単純な運動制御に係わる脳内機構についての基礎的な研究を行ったので、今後これらを発展させ、学習、記憶などの、更に高次な脳機能の解明にあたりたいと考えている。超伝導技術の進歩により、脳が発生する極めて微弱な磁界を検出することが可能となった。本年度は、単純な随意運動の脳内機序を探る目的で、光に応じて指の屈曲を行うという課題を遂行中のヒトから、脳磁界の計測を行ったところ以下のような結果を得た。指の運動に際して運動側とは反対の頭蓋に、次のふたつの成分の脳磁界が観測された。第一の成分は頭蓋の内外側方向に極性が逆転しており、運動の開始に先行していた。脳内電流源推定により、第一の成分は中心溝の周辺に存在する前向きの電流双極子に由来すると考えられた。サルなどの運動実験の結果より、これは、小脳から視床を経由した運動命令によって、活性化された運動野上肢領野の活動を反映しているものと推定される。第二の成分は感覚野の活動に由来し、主に運動することによる、感覚性入力のフィードバックを反映していると考えられる。

また手のかわりに、たとえば下肢や顔面の運動をさせると、それぞれに対応した運動野と感覚野の活動が、観測された。要約すると、小脳から視床を介した神経活動による運動野の活性化が、運動発現に際してヒトにおいても重要である。以上の結果は、脳磁界計測がヒトの脳機能解明に有力な手段を提供することを示すとともに、今後、認知、判断、記憶、言語などのヒトの高次脳機能解明への端緒になると考えられる。超伝導技術の進歩により、脳が発生する極めて微弱な磁場を検出することが可能となった。この方法は、時間分解能および空間分解能に優れており、非侵襲的にヒトの脳機能を計測する方法として注目を集めつつある。本年度は昨年度に引き続き、単純な反応時間運動に関する脳磁場を記録するとともに、ヒトに体性感覚及び視覚刺激を与えた場合の脳内反応を、脳磁場計測によって検討した。(1)正中神経を電気刺激すると、潜時約20msと60msに、対側の一次体性感覚野上肢領野起源と思われる誘発脳磁場が観測された。過去の動物実験の結果などにより、第一の成分は、視床から一次体性感覚野深層へのシナプス入力を、第二の成分は、一次体性感覚野内の回路による皮質表層へのシナプス伝達を反映していると考えられる。また両側の側頭部に潜時約60msと80msの反応が見られ、電流源がシルビウス溝周辺に推定されることから、これらは二次体性感覚野起源の反応であると考えられる。(2)視野の一点に光刺激を与えた場合の誘発脳磁場を、後頭部を中心に計測したところ、潜時約75、100、150msに反応が観察された。それぞれの潜時での等磁場曲線のパターンは、視野の中での刺激部位によって著しく変化した。これらのうち、潜時約75msの成分の電流源を推定すると、一次視覚野と思われる領野に位置した。視野内での刺激部位を変えると、この電流源は、過去の動物実験等で知られている一次視覚野の視野局在性に一致した挙動を示した。これらのことにより、潜時約75msの成分は、一次視覚野由来と考えられる。以上の研究は、脳磁場の由来について、明確な解釈を与えるとともに、知覚、認知といった高次脳機能計測の基礎になるものと考えられる。2年間にわたる本研究において、知覚の基礎的な情報処理、あるいは単純な運動制御に係わる脳内機構についての、基礎的な研究を行ったので、今後これらを発展させ、学習、記憶などの、更に高次な脳機能の解明にあたりたいと考えている。
ゼータ関数の平均化とその漸近的挙動

計画調書に記したフルビッツゼータ関数ζ(s,α)の虚軸方向への2乗平均の誤差項E(T,α)の漸近挙動に関しては、その出発点となるE(T,α)に対するAtkinson型漸近公式の確立が困難を極めており、残念ながら現在までのところ明確な結果を得るまでには至っていない。一方、ζ(s,α)自身のパラメタαに関する2乗平均の研究(本報告書項目11研究発表、論文[11-1]参照)の手法をレルヒゼータ関数の場合に応用して、ほとんど最良の形の漸近公式を得ることができた(論文[11-2]参照)。この漸近公式の導出においては、計画調書に記したMellin-Barnes型積分を通して、ガラスの超幾何関数の諸性質が有効に機能することも明らかにされた。今後は、本来の問題であるE(T,α)の漸近的挙動の研究を含め、これと密接に関連するζ(s,α)ζ(s,β)(α,β>o)やζ^<(h)>(s)ζ^<(k)>(s)(h,k=0,1,2...)に対する近似関数等式およびその残余項の研究も行いたいと考えている。
肥満やインスリン分泌異常を引き起こす新規分子の役割解明研究

我々は、PRIP分子を新規イノシトール1, 4, 5-三リン酸結合性タンパク質として見出し、PRIP-1/-2ダブルノックアウトマウス(DKOマウス)を作製しその表現型解析を行った。そして、DKOマウスが高インスリン血症を示すことを明らかにし、その原因がインスリン開口放出が亢進したことによることを見出した。さらに、これはPRIPとタンパク質脱リン酸化酵素複合体によるリン酸化制御異常によることを明らかにした。本研究で機能解析を行っている分子(PRIP)は、我々が新規Ins(1,4,5)P_3結合性蛋白質として見出し、名付けたものである。これまでに、この分子がGABA_A受容体の細胞内輸送を調節することをPRIPのノックアウトマウス(PRIP-KOマウス)を作製しそれを解析する事で明らかにしてきた。一方、それらの解析を進める中で、PRIP-KOマウスは、高インスリン血症かつ低血糖を示すことを見いだした。そして、インスリン抵抗性は野生型と同程度であったことから、PRIP-KOマウスにおけるラ氏島β細胞のインスリン分泌亢進を疑った。そこで、初代培養ラ氏島を調製し、生理的な高グルコース濃度で刺激したときのインスリン分泌量を測定してみると、有意にその分泌量が亢進していた。また、PRIP遺伝子をノックダウンした膵β細胞(MIN6細胞株)を作製してインスリン分泌量を測定した場合も有意にその分泌量は増加した。これらのことから、β細胞においてPRIPはインスリンの分泌過程を抑制的に制御する分子であることが明らかとなった。引き続きPRIPを介したインスリン分泌の分子基盤を検討した。グルコース刺激時のβ細胞のCa^<2+>濃度上昇変化は野生型と差はなく、また形質膜上にドッキングしているインスリン顆粒数(readily releasable pool : RRP)も野生型と同程度であった。しかし、KCIで形質膜の脱分極刺激をおこないRRPからの小胞分泌を優先的に促した場合、PRIP-KOマウスで有意にインスリン分泌量の増加が観察された。故にPRIP-KOマウスでは、インスリン顆粒の開口分泌の引き金であるカルシウム感受性が高くなっており、そのために分泌能が亢進していると考えられた。現在さらにその詳しい分子メカニズム解明に取り組んでいる。我々は、PRIP分子を新規イノシトール1,4,5-ニリン酸結合性タンパク質として見出し、その細胞内機能の解析を行ってきている。これまでに、PRIP遺伝子欠失がGABA_A受容体を介するシグナル伝達機構に異常をもたらすことを突き止めた。さて、哺乳類のPRIPには二つのサブタイプ(PRIP-1,PRIP-2)があり、その発現パターンには以下の特徴がある。PRIP-1は脳特異的に発見している。一方、PRIP-2は、脳を含めて様々な臓器に発現している。このことから、PRIPは中枢神経系において抑制性神経伝達機構を調節するという機能に加え、他にも何らかの全身的な調節機能に関わると我々は想定した。そこで、PRIP-1/-2ダブルノックアウトマウス(DKOマウス)を作製し、解析を行った。DKOマウスは、雌雄に関係なく過食であり、継時的な観察から雌では肥満傾向がみられた。また、自由摂食時及び絶食時に、DKOマウスは低血糖を示した。そこで、我々は、この低血糖が過食の一因であると考えその原因を探った。先ずグルコーストレランステストを行い、血糖値と血清インスリン濃度を測定し、対照野生型マウスと比較した。DKOマウスの血糖値変化は、野生型に比べて常に低い値を示し、その時の血清中のインスリン濃度は、野生型に比べて常に高い値を示した。これは雌雄共に同じ傾向であり、統計学的にも野生型に対して有意な差があった。また、マウスから調製したラ氏島においても高グルコース刺激により、インスリン分泌の亢進を確認した。以上より、DKOマウスではグルコース依存的なインスリン分泌促進作用があることが明らかとなった。さて、開口放出過程にはSNARE関連分子がかかわることが知られる。我々は、既にある複合体の制御分子の機能をPRIP分子が調節することを見いだしている。我々は、PRIP分子を新規イノシトール1,4,5-三リン酸結合性タンパク質として見出し、その細胞内機能の解析を行ってきている。PRIP-1は脳特異的に発現している。

そこで、PRIP-1/-2ダブルノックアウトマウス(DKOマウス)を作製し解析を行い、この変異マウスが肥満やインスリン分泌異常を引き起こすことを認めた。ここでは、その原因解明を行った。今年度は、単離膵ランゲルハンス島を用い2光子レーザー顕微鏡を用いて開口放出過程の可視化実験を行った。先ず、各種Ca2+インジケーターを用いて、インスリン開口放出時のβ細胞のCa^<2+>濃度変化解析の測定を野生型のコントロールと比較しながら行ったところ、グルコース刺激で誘導されるCa2切流入量には差がなかった。一方、高グルコース刺激・KCl刺激等を行なった時のインスリン開口放出頻度は、有意に増加していた。さらに、薬剤を使いPKAの誘導刺激や掬制を行った結果、PRIP KO細胞では、恒常的なリン酸化の促進があり、その結果開口放出頻度が昂進していることを明らかにすることができた。また、このマウスは、肥満傾向を示すが雌雄差を認めている。その雌雄差の原因に味覚に対する感受性の違いがないかを調べた結果、特に雌雄差は認められなかった。
遺伝子組み換えによる抗ヒトコリンアセチルトランスフェラーゼ・モノクローナル抗体作製

I.ヒトコリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)蛋白によるマウスの免疫ヒトChAT蛋白を発現するために開発した形質転換大腸菌の培養液にIsopropyl-β-D-thiogalactopyranosideを加え蛋白を誘導した後、電気泳動法により分離・精製した。ChAT蛋白0.1mgをアジュバンドとともにBALB/Cマウスの下肢に週1回注射した。合計20匹のマウスを6回ずつ免疫した後、屠殺して鼠径部の腫大したリンパ節を採取した。II.リコンビナントファージシステムを用いたモノクローナル抗体の作製(1)リンパ節からmRNAを抽出し、reverse transcriptaseによりcDNAを合成した。次いで、免疫グロブリンのL鎖V領域とH鎖V領域を各々PCRによって増幅した後、両者をリンカーで結合した。これを抗体産生のために開発されたファージミド(pCANTAB 5E)に挿入し、大腸菌(TG 1)に感染させた。(2)この大腸菌にヘルパーファージ(K07)を感染させて組換えファージミドを取り込ませた。次いで、ChAT蛋白を塗布したプレートにファージを接触させ、抗原と結合するファージを回収した。(3)このファージを再度大腸菌に感染させ、コロニーを形成しクローン化した。クローン1つ1つを分離し、これにヘルパーファージを感染させて組換えファージミドを取り込んだファージを回収した。(4)発現ChAT蛋白と抗ファージ抗体を用いたELISA法により、目的とする抗体を発現しているファージをスクリーニングしたところ、大腸菌コロニー約100個当たり1個の割合で陽性ファージクローンを含んでいた。合計80個の陽性クローンの中で抗体価の特に高い2個のクローンを選択し、このファージを別の大腸菌(HB2151)に感染させ、可溶性の抗体を産生した。その後、アフィニティカラムにより抗体を精製した。現在、得られた抗体が免疫組織化学及び免疫電顕に適用できるかどうか検討中である。