hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
β型チタン合金の水素脆性挙動

平成1ー2年度の2年間において、β型チタン合金の(1)水素脆性感受性の改善、(2)水素を利用した破壊靭性の向上法に関する研究を実施した。冷間加工性に優れるβ型チタン合金は最も使用されているα+β型チタン合金のTiー6A1ー4V合金と比べ、水素脆性感受性が極めて高い。そこで、水素脆性感受性の改善するための研究を実施した。時効時間を変化させた実験より、析出α相の量を減少させることにより本合金の水素脆性感受性の低下をもたらすことが判明した。しかし、析出α相の分布状態を制御することにより、強度低下を伴わず、水素脆性感受性を低下させる方法を検討した。β粒界近傍にα相の無析出帯を存在させる熱処理を施すことにより、実用的に十分な強度(σ_B=約125kg/mm^2)を有し、水素脆性感受性の改善が可能となった。この無析出帯は低強度、高靭性であることから、き裂進展の阻止物として作用した思われる。具体的には、比較的高温の950°Cで溶体化処理後、510°Cで4時間の時効処理を施し、β粒界付近へのα相の析出を抑制し、β粒内にα相を均一に析出させるために最初の時効温度より低温の440°Cで3時間の時効を行った。上記のように水素はチタン合金において有害なものである。次に、この水素を有効利用し破壊靭性の向上を試みた。セラミックス、複合材料などで用いられているZone shieldingを本合金について適用する。陰極電解法により水素添加し、その後真空中で比較的高温に保持することにより、析出α相中に水素化物を残しながら、β相中の固溶水素を放出した。この材料を負荷すると、析出α相中の水素化物の微細な割れによる応力緩和が生じ、破壊靭性は約20%増加した。本年度はTiー17合金を中心に研究を実施し、以下の事を明らかにした。最初に、本合金をβ単相域から炉冷を行い、平衡組織を作製し、平衡状態におけるα相とβ相の量の推定を試みた。その結果、880°C材では時効により、α相を50%まで析出可能で、810°C材では初析α相を約30%、析出α相は20%まで析出可能であり、母相のβ相はそれぞれ約50%であることが分かった。水素添加後の固溶水素の放出温度としては、時効組織を変化させないこと、及び析出α相内の水素化合物の分解を防止するために400°Cを上限とした。880°C材、810°C材の普通の状態での5%オフセット値K_Qはそれぞれ32MPa√<m>、28MPa√<m>となった。両者のK_Qの差は強度と破壊形態の差によるものと思われる。この材料に陰極電解法により水素を添加すると、K_Qは約20%低下し、それぞれ26MPa√<m>、20MPa√<m>となった。この水素添加状態でX線回折を実施した。母相に固溶した思われる水素により、β相のピ-クの位置は低角側に移動した。一方、α相のピ-クの位置は殆ど変化なかった。β単相で水素脆性を起こしていることから、この水素脆化は主にβ相の格子脆化によるものと思われる。次に真空中で高音に保持することにより、析出α相中に水素化物を残しながら、β相中の固溶水素を放出した。

このような状態を、水素量の分析、X線回折等より確認している。β相である母相内にα相が微細に析出している880°C材では、固溶水素の放出により普通の状態より、K_<IC>は約20%上昇した。これは析出α相中の水素化物の微細な割れによる応力緩和、すなわちZone ShieldingによるK_<IC>の増加と思われる。来年度は、このZone Shieldingの存在を検討すべく、AEの測定、き裂進展途中の断面観察等を行い、次に810°C材、15ー3合金についても同様な実験を行う予定である。本年度はβ型チタン合金の水素脆性感受性を低減する研究を実施した。代表的β型チタン合金であるTiー15Vー3Crー3Snー3Alを用いて、横型の定荷重装置により一定負荷し、室温の50mol/m^3硫酸水溶液において、白金板を対極とし、電流密度200A/m^2で陰極電解により水素吸蔵を行い、き裂進展速度を測定した。最初に、析出α相の水素脆性感受性に与える影響を検討するために、溶体化処理850°C、時効温度510°Cで時効時間を変化させた。その結果、時効時間の減少、すなわち析出α相量の減少に伴い、き裂進展速度da/dtは低下した。よって、析出α相の量を減少させることがβ型チタン合金の水素脆性感受性の低下をもたらすと期待される。しかし、析出α相量の減少は強度低下をもたらし、実用上問題となりうる。そこで、析出α相の分布状態を制御することにより、強度低下を伴わず、水素脆性感受性を低下させる方法を検討した。短時間の時効処理材では、β粒界部においてき裂進展が抑制させているこが破面観察より認められており、さらにβ粒界近傍にα相の無析出帯が観察された。この無析出帯は低強度、高靭性であることから、き裂進展の阻止物として作用した思われる。よって、この無析出帯を適切に分布させ、β粒内にはα相を均一に析出することが可能ならば、本研究の目的に合致した合金が作製されたことになる。そこで、比較的高温の950°Cで溶体化処理後、510°Cで4時間の時効処理を施し、β粒界付近へのα相の析出を抑制し、β粒内にα相を均一に析出させるために最初の時効温度より低温の440°Cで3時間の時効を行った。この材料ではβ粒界にはα相のほぼ無析出帯が生成され、β粒内には比較的均一にα相が析出した組織となった。そのda/dtは十分低下し、実用的に十分な強度(σ_B=約125kg/mm^2)も有しており、ほぼ目標のβ型チタン合金が作製された。
動的および静的状態におけるマラリア原虫感染赤血球の血管内皮細胞への接着の解析

1)動的状態での種々の培養熱帯熱マラリア原虫感染赤血球の接着の動態の解析我々の樹立した血流モデルを用いて、毛細管内面をヒト血管内皮細胞あるいはE-セレクチン、P-セレクチン蛋白で被覆し、熱帯熱マラリア原虫感染赤血球の接着初期の動態、またその際の接着分子の役割を解析した。特に流速を変化させ、それに応じて接着の状態がどのように変化するか、またどのような接着分子が関与するかを検討した。ItG-C32株感染赤血球は、1.5dyne/cm^2の流速において、P-セレクチン、E-セレクチン蛋白をコートした毛細管に対して接着することが観察された。接着の動態はRollingであり、Rollingの速度は、流速が早くなるにつれ増加した。2)ロゼット形成熱帯熱マラリア原虫感染赤血球の動的状態における動態の解析ロゼット形成している267株感染赤血球は、本血流モデルにおいて、セレクチン蛋白を付着させた毛細管および血管内皮細胞被覆毛細管に対し、接着しなかった。3)マラリア原虫感染赤血球上に発現するロゼット形成を担うリガンドの解析熱帯熱マラリア原虫感染赤血球上に発現する、正常赤血球のロゼット形成を担うリガンドをコードするマラリアの遺伝子を解析するために、PfEMP-1に存在するDBL-3ドメインと相同性を示す蛋白をコードする遺伝子を取り出し、解析を始めた。熱帯熱マラリア原虫感染赤血球によって、宿主血管が閉塞されるに至る過程において、マラリア原虫感染赤血球の宿主接着分子への接着が重要な役割を果たしていると考えられるが、少なくともP-およびE-セレクチンはその初期接着を担っている。その初期接着に続く二次的な接着が、最終的な血管の閉塞に至る過程において、重要な役割を果たすと考えられる。また、マラリア原虫感染赤血球によるロゼット形成が、血管の閉塞に何らかの役割を果たすのか、果たすとすればどのような機構かをさらに検討したい。
肝細胞に対するアセチルサリチル酸の作用-ライ症候群発生に関する基礎的研究-

ライ症候群の発症にアスピリンが関与するという報告や、ライ症候群の肝臓の病理組織像が、アスピリン中毒の像と類似しているという報告がある。今回、Hepatocartinoma cell lineのHepG2細胞を用いてアスピリンやその他の薬剤の肝細胞障害について検討した。又、ラットに経口的にアスピリンを投与し、肝の組織学的変化、ミトコンドリアの形態ならびに機能障害について検討した。in vitroで、アスピリンによる形態変化は、ライ症候群の肝障害像に類似しており、アルファフェトプロテインが鋭敏な指標となることが判明した。又、in vivoでアスピリン投与すると、あらゆる変化に先がけて胆管内に層状構造物が出現することが判明した。Hepatocarcinomacell lineのHepG2にアスピリン(Asp)を終濃度がそれぞれ、0、10、30、90mg/dlとなるように添加し、増殖、アルファフェトプロテイン(AFP)の産生をみたところ、増殖はAspの濃度依存性に減弱し、90mg/dl添加では増殖は見られなくなった。増殖と相関してAFPの産生も抑制されることが判明した。Aspの作用でミトコンドリアの電子伝達系は脱共役反応を起こし、この過程で活性酸素の発生が確認できた。Aspによる肝細胞障害の発生機序の一つに、この活性酸素の毒性が考えられたが、活性酸素の消去酵素であるsuperoxide dismutase(SOD)の発現をmRNAレベルで検討した。Cu、Zn-SODはAsp濃度を0、10、30mg/dlと増加させても発現量はほぼ一定であり、90mg/dlで、ほとんど発現はみられなくなった。これに対し、Mn-SODはAsp濃度が0、10、30mg/dlと上がるのに対し濃度依存性に誘導されることが判明した。しかしAsp濃度が90mg/dlになるとMn-SODの発現は見られなくなった。これはAspの直接の毒性により肝細胞が障害を受けた結果であることも否定できないが、肝細胞にAspを作用させると組織障害性の活性酸素が発生し、その刺激に対応して、消去酵素の一つであるMn-SODが誘導され、反応していたが、活性酸素の増加に対応しきれなくなり、枯渇したと考えられた。以上からAspによる肝障害発生の原因の一つとして活性酸素の発生が考えられ、このAsp依存性活性酸素からの主な防御はMn-SODが担っていると考えられた。我々は、過去アセチルサリチル酸(以下ASA)の肝細胞に対する影響について検討してきた。今回は、ラットに経口的に、通常使用量(50150mg/kg/day)のASAを1週間投与し、種々の変化を正常ラットと比較検討した。肝機能のマーカーや、電子顕微鏡による組織像に変化は認めなかった。単離したミトコンドリアの形態にも変化はなかったが、ミトコンドリア呼吸は濃度依存性に障害を受けた。この時、電顕的検討で、毛細胆管内に層状構造物が50mg/kg/day1週間投与群から認められた。この変化は、ASAによる肝障害のごく初期にミトコンドリアの呼吸障害とともに認められる変化と考えられた。次に、ASAによる肝障害のメカニズムを解明するため、培養肝細胞のcell lineであるHepG2にASAを添加して検討した。ASAによる肝障害の最も早期の変化は、ミトコンドリア呼吸の障害で、その時、free radicalが発生することが知られている。一方、細胞にはradicalの消去酵素であるSODが存在し、特に活性酸素が発生しやすいミトコンドリアには、Mn-SODが存在することが知られている。そこで我々はASAの作用による活性酸素の発生およびSODの誘導と、肝細胞障害について検討を行った。培養液中のASA濃度に相関して、肝の逸脱酵素の値は上昇し、形態学的にも組織障害像が顕著にみられた。又、逆にHepG2細胞が産生するアルファフェトプロテイン(AFP)は減少し、増殖速度もそれに比例して減衰した。この過程で、細胞内の活性酸素の発生はASAを加えない細胞と比べて増大することが判明した。この時に細胞質に存在するといわれるCu,Zn-SODはASA濃度に関係なく一定であったが、ミトコンドリアに局在するMn-SODは、ASA濃度に比例して誘導され、細胞障害が高度になると、誘導されなくなった。以上のことから、ASAの肺細胞障害には活性酸素が関与し、Mn-SODはその障害を防ぐように働いていることが示唆された。
脚式車両の傾斜不整地における適正歩容と制御機構の開発

急傾斜不整林地における森林作業,特に下刈などの育林作業を機械化するためのベースマシンとして脚式車両を開発している。平成3年度に製作した機体は,前2脚はナックルブーム機構,後4脚はパンタグラフ機構の全部で6本の脚を持ち,油圧によって動作する。また6本の脚各々が独立したCPUによって制御され,さらに別のCPUで統合制御を行うマルチCPUシステムを採用している。機体の改良実験を遂行する上で,強度が不足していると考えられた各部を補強した。制御システムの検討小型模型を作成してシミュレーション実験を行い,6本の脚を同調させて歩行させるための制御システムを再検討した。制御ソフトウェアの改良前2脚はナックルブーム式,後4脚は側倒パンタグラフ式という,形式の異なる複数の脚を同期させて歩行動作を行うためのアルゴリズムと通信プロトコルについて検討した。このアルゴリズムに基づいて作成した制御ソフトウェアを組み込んで動作実験を行い,予定通りの結果を得た。実作業への適用可能性車両に搭乗する操作者の車両の挙動に対する反応について検討した結果,従来の車両の操作者は,路面状態の悪化によって緊張感が高まることがわかった。したがって,脚式車両が地表状態に無関係に歩行可能であれば,実作業において操作者の負担を軽減できると考えられる。急傾斜森林における育林作業の機械化に資する脚式車両の、適正な脚機構と制御機構について検討した。車両は、傾斜地においても高い機動性を有する脚機構足廻りとしたが、一般研究(c)(No.63480060)の研究成果を基に、脚数は制御が極端に複雑ではなく、安定性も得易い六脚とした。しかし、下刈などの育林作業を行うために、前端の2脚を作業機も装着可能なナックルブ-ム機構とした。後方の4脚はパンタグラフ機構である。この機構の試作車両はエンジン発電機とユニポンプによる油圧駆動であり、全部で17の自由度がある(仁多見俊夫他1991、田坂聡明他1991)。将来的には操作者を搭乗させるが、現段階では遠隔操作で操縦することとした。六脚の制御は、統合制御機構によって1つのレバ-で1本の前端脚を操作しするものであり、計2本のレバ-によって前端の2脚を歩行又は作業するように操作する。この前端2脚は、現在平行して検討を進めている半脚式車両の脚制御方法と同様の手法で制御することが、制御の容易さと装置の簡便さ及び動作の精度、安定性の面において適切であると考えられた。後方の4脚は、操作者によって制御されて位置決めされた先端脚の位置に追随するように動作する(田坂聡明他1992)。前端脚で作業する際の後脚の制御について、検討を進めている。また、車両に搭乗する操作者の、車両の挙動に対する反応についても検討を行っている(岩岡正博他1992)。平成4年度は、後方2脚の動作を前端脚の動作から追随制御することを検討する。また、林内作業での当該車両の使用を想定して、下刈作業などの作業モ-ドにおける車両の動作、制御方法、アルゴリズムについて検討を進める。さらに、車両重量と動作に必要な駆動力とについて検討を進め、駆動機構の改善点についても明らかにしていく。急傾斜不整林地における森林作業,特に下刈などの育林作業を機械化するためのベースマシンとして脚式車両を発開している。また6本の脚の統合制御はCPUによって行う。機体の改良後4脚の取付部分が強度不足と考えられたため,シャフト径の拡大,シャフト材質の変更,などの強化を行った。前2脚の下方への力を増強するため,油圧シリンダの取付位置を変更した。前脚の2ケ所の関節の角度のセンシング方法を,エンコーダを用いて直接角度を読み取る方法からリニアポテンショメータを用いて油圧シリンダの長さを読み取る方法に変更し,後脚の制御と統一的に制御できるようにした。制御ソフトウェアの開発本試験機は油圧弁にon/off弁を採用していることから,その制御にはPWM(Pulse Width Modulation)制御を採用している。

このPWM波の生成をソフトウェアで行っているため,複数脚を同時に動作させる場合に,各脚の動作速度が低下する。そこで,各脚毎に1つのCPUを割当て,さらに別のCPUでこれらの統轄を行うマルチCPUシステムを採用した(田坂聡明他1992)。全体を統轄するメインCPU1,各脚を制御するサブCPU6の計7つのCPUを持つマルチCPUシステムに関して,その実現方法,CPU間の通信方法,脚間の同期方法,各CPUで行う処理などを検討した(岩岡正博他1993)。このマルチCPUシステムを試験機に組み込んで動作試験を行った結果,期待通りの動作が得られ,本制御システムの有効性を確認できた。平成5年度の予定傾斜不整地における走破性を確保するための脚の動かし方とその制御方法について,制御機構の改良を行いつつ実証的に検討する。また作業機アームを兼ねる前端脚の作業相における適切な動作と,その実現に必要な制御アルゴリズムについても検討する。急傾斜不整林地における森林作業,特に下刈などの育林作業を機械化するためのベースマシンとして脚式車両を開発している。平成3年度に製作した機体は,前2脚はナックルブーム機構,後4脚はパンタグラフ機構の全部で6本の脚を持ち、油圧によって動作する。また6本の脚各々が独立したCPUによって制御され,さらに別のCPUで統合制御を行うマルチCPUシステムを採用している。機体の改良実験を遂行する上で,強度が不足していると考えられた各部を補強した。制御システムの検討小型模型を作成してシミュレーション実験を行い,6本の脚を同調させて歩行させるための制御システムを再検討した。制御ソフトウェアの改良前2脚はナックルブーム式,後4脚は側倒パンタグラフ式という,形式の異る複数の脚を同期させて歩行動作を行うためのアルゴリズムと通信プロトコルについて検討した。このアルゴリズムに基いて作成した制御ソフトウェアを組み込んで動作実験を行い,予定通りの結果を得た。実作業への適用可能性車両に搭乗する操作者の車両の挙動に対する反応について検討した結果,従来の車両の操作者は,路面状態の悪化によって緊張感が高まることがわかった。したがって,脚式車両が地表状態に無関係に歩行可能であれば,実作業において操作者の負担を軽減できると考えられる。
「有効性」と「持続性」を持つ包括的な学校安全プログラムの開発

本研究では、児童生徒の安全に資する(それは児童生徒の命に直結する)、「有効性」と「持続性」を持つ「包括的な学校安全」のプログラムを開発するために、以下の4点を明らかにすることによって、本研究の目的を達成する。I「包括的な学校安全」の要素と内容における妥当性の検証と修正及び確定II「有効性」と「持続性」を持つ「包括的な学校安全」の成立要件の明確化IIIIIに基づいた「包括的な学校安全プログラム」のモデルプランの作成と実践、検証IV「有効性」と「持続性」を持つ「包括的な学校安全プログラム」の開発本研究では、児童生徒の安全に資する(それは児童生徒の命に直結する)、「有効性」と「持続性」を持つ「包括的な学校安全」のプログラムを開発するために、以下の4点を明らかにすることによって、本研究の目的を達成する。I「包括的な学校安全」の要素と内容における妥当性の検証と修正及び確定II「有効性」と「持続性」を持つ「包括的な学校安全」の成立要件の明確化IIIIIに基づいた「包括的な学校安全プログラム」のモデルプランの作成と実践、検証IV「有効性」と「持続性」を持つ「包括的な学校安全プログラム」の開発
ニジマスＩＦＮγの機能解明と治療・評価法への応用

本研究は、細胞障害性T細胞やマクロファージの分化や活性化など細胞性免疫機能向上効果を有するIFNγに着目し、水産養殖において重要なニジマスを用いてIFNγを指標とした抗病性評価法の確立を目的としたものである。昨年度は、伝染性造血器壊死症(IHN)に対する抗病性の向上効果が確認されている高濃度アスコルビン酸(AsA)を添着した餌料をニジマスに与えた結果、血中のIFNγ濃度が上昇することを確認した。しかし、IFNγのアイソフォーム毎の違いは判断できなかったため、本年度は、ニジマスを用いてIFNγ各アイソフォームおよび関連遺伝子の発現動態を解析した。昨年度と同様に高濃度AsAを与え、経時的に各臓器を摘出してqPCR法により発現解析を行った結果、脾臓組織ではIFNγ1の発現がAsA投与4日後に有意に上昇した。また、体腎組織においても投与4日後にIFNγ1および2の発現上昇が認められたものの、投与7日後には減少した。一方、比較対象として測定したtype I IFNでは、アイソフォーム毎に異なる増減がみられ、IFN-eおよび-fでは複数の臓器で発現の上昇が認められたのに対して、脾臓におけるIFN-eや-fの発現は有意に減少した。なお、AsAを投与した魚体では投与1日後から有意なAsAの組織蓄積性が認められた。また、IFNγの発現は炎症時にも増加することが報告されているが、炎症性サイトカインのTNFαやIL-1βは実験期間を通じて減少傾向を示し、AsAを投与した魚体では体内の炎症反応も抑制された状態であったと判断された。これらの結果は、IFNγはAsA投与により発現し、血中含有量も増加するものの、遺伝子の発現解析では経時的に変化するため評価が難しいことを示している。以上のことから、IFNγを指標とした抗病性評価法は、ELISAなどによる血中濃度測定評価が最適であると判断された。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、細胞障害性T細胞(CTL)やマクロファージの分化・活性化など細胞性免疫機能向上効果を有するIFNγに着目し、重要養殖魚種であるニジマスのIFNγ遺伝子組換体を作出し、同組換体を用いて魚類における機能を明らかにすることを目的としている。その成果は、細胞性免疫の増強によりワクチンの効果を促進するアジュバントとしての利用や魚体の抗病性(特に細胞性免疫機能)評価法への応用につながることが期待される。本年度は、次年度の先行試験として、モデル魚であり既に作出に成功していたギンブナのIFNγ遺伝子組換体を用いて魚体への接種投与実験を行い、細胞寄生性細菌であるエドワジエラ症原因細菌を用いた人為感染に対して有意な生残向上効果をもたらすことを明らかにした。また、ニジマスIFNγ遺伝子組換体(rIFNγ)を作出し、rIFNγを抗原として抗ニジマスIFNγ抗体の作製および精製後、ELISA法によるIFNγの測定系を構築した。すなわち、まず既知塩基配列を基にプライマーを設計し、YolyI : Cで刺激したRTG-2細胞から抽出したmRNAを鋳型としてPCRを行い、全塩基配列を決定した。次に同配列をpET-16bベクターに導入して大腸菌に形質転換し、最適誘導条件を検討することでrIFNγを得た。得られた組換体を精製し、電気泳動およびLC-MS/MSまたはN-末端アミノ酸配列解析の組み合わせにより目的タンパク質であることを確認した。そして、抗原タンパク質としてウサギに接種し、得られた抗rlFNγポリクローナル抗体を得た。更に、次年度より解析を予定している、ニジマスを供試魚とした伝染性造血器壊死症(IHN)に対する免疫賦活剤の有効性の論文を発表した。次年度は、作出した抗体を用いたIFNγの測定系を構築し、免疫賦活剤によるIHNの予防効果とIFNγ産生の関連性解析を進めるとともに、rIFNγを用いた機能試験を行う。以上のことから、今年度は「研究実施計画」に沿って全て遂行し、更に次年度以降における予備実験も実施することができた。本研究は、魚類IFNγを指標とした抗病性評価法の確立および同因子の機能解析を目的としている。抗病性評価法については、血漿等の測定試料を固相化し、ニジマス由来rIFNγを抗原として作出したIFNγ特異的抗体を1次抗体とする間接ELISA法を確立した。そこで複数の感染症に対して有効性を確認したアスコルビン酸展着飼料を給餌させたニジマスより得られた血漿試料を用いて上記ELISA法で測定を行った結果、投与魚は対照魚に比べ血漿中のIFNγ濃度が有意に上昇することを確認した。ニジマスのrIFNγの魚体投与試験による機能解析については、前年度に確立した組換えタンパク質の発現系で得られるrIFNγの収量が少なく、実験の遂行が困難であったため、新規のrIFNγ発現系を構築中である。なお、魚類のIFNはIFNタイプ毎に複数のアイソフォームが確認されており、ニジマスのIFNγについても、どのアイソフォームが抗病性向上の役割を果たしているか明らかではない。

そこで、所属研究室で既にIFNγの遺伝子発現解析系が確立されているギンブナにニジマスと同一の条件でアスコルビン酸展着飼料を与え、IFNγの遺伝子発現解析を行ったところ、同飼料を与えた魚体では対照魚と比べ鰓組織においてIFNγ2遺伝子の発現上昇が確認された。現在、ニジマスにおいてもIFNγやIFNγ誘導因子の遺伝子発現解析を進めており、発現上昇が確認されたIFNγアイソフォームを新規のrIFNγ発現系に組み込むことで、平成27年度では、ニジマスでの投与実験を実施する予定である。以上のことから、rIFNγの魚体投与試験による機能解析を除き、平成26年度の「研究実施計画」の主要実験は全て遂行することができた。最終年度には、これまでに確立した飼育や測定系を用いて、IFNγを指標とした抗病性評価法の確立や抗病性向上に関わる同因子の機能解明を目指す。本研究は、細胞障害性T細胞やマクロファージの分化や活性化など細胞性免疫機能向上効果を有するIFNγに着目し、水産養殖において重要なニジマスを用いてIFNγを指標とした抗病性評価法の確立を目的としたものである。昨年度は、伝染性造血器壊死症(IHN)に対する抗病性の向上効果が確認されている高濃度アスコルビン酸(AsA)を添着した餌料をニジマスに与えた結果、血中のIFNγ濃度が上昇することを確認した。しかし、IFNγのアイソフォーム毎の違いは判断できなかったため、本年度は、ニジマスを用いてIFNγ各アイソフォームおよび関連遺伝子の発現動態を解析した。昨年度と同様に高濃度AsAを与え、経時的に各臓器を摘出してqPCR法により発現解析を行った結果、脾臓組織ではIFNγ1の発現がAsA投与4日後に有意に上昇した。また、体腎組織においても投与4日後にIFNγ1および2の発現上昇が認められたものの、投与7日後には減少した。一方、比較対象として測定したtype I IFNでは、アイソフォーム毎に異なる増減がみられ、IFN-eおよび-fでは複数の臓器で発現の上昇が認められたのに対して、脾臓におけるIFN-eや-fの発現は有意に減少した。なお、AsAを投与した魚体では投与1日後から有意なAsAの組織蓄積性が認められた。また、IFNγの発現は炎症時にも増加することが報告されているが、炎症性サイトカインのTNFαやIL-1βは実験期間を通じて減少傾向を示し、AsAを投与した魚体では体内の炎症反応も抑制された状態であったと判断された。これらの結果は、IFNγはAsA投与により発現し、血中含有量も増加するものの、遺伝子の発現解析では経時的に変化するため評価が難しいことを示している。以上のことから、IFNγを指標とした抗病性評価法は、ELISAなどによる血中濃度測定評価が最適であると判断された。平成26年度の「研究実施計画」予定であったELISA法によるIFNγの測定系を確立した。また、複数の感染症に対して有効性を確認したアスコルビン酸展着飼料を給餌させたニジマスより得られた血漿試料を用いて確立したELISA法で測定を行った結果、投与魚は対照魚に比べ血漿中のIFNγ濃度が有意に上昇した。以上のことから、「研究実施計画」予定であった主要実験を実施できたとして、達成度の区分を2とした。27年度が最終年度であるため、記入しない。次年度は、平成25年度に構築した免疫賦活剤投与による抗病性を向上させた飼育系、ならびに平成26年度に構築したELISA法によるIFNγの測定系を基にIFNγ量を指標とした魚類の抗病性評価法を確立する。また、遺伝子発現解析や投与試験法により、魚類IFNγの機能解析を進める。「研究実施計画」予定であったニジマスのIFNγ遺伝子組換体の作出に成功し、同組換体を抗原タンパク質として抗ニジマスIFNγ抗体を得た。
ハプトグロビン-ジェノタイピングによる脳血管疾患予防/予後予測法の確立

これまでに採取したサンプル中、ハプトグロビン(HP)の表現型(HP1-1、2-1、2-2)、遺伝型(rs2000999)、血中濃度の解析ができたのは、頭部外傷60例、脳内出血56例、くも膜下出血94例、未破裂脳動脈瘤77例、脳動静脈奇形11例、虚血性脳卒中25例、もやもや病12例の全335例となった。統計学的解析を行ったところ、脳動静脈奇形・虚血性脳卒中・もやもや病においては、症例が少なくHPと予後との関連は認めなかった。頭部外傷および脳内出血もまた有意な相関は得られなかった。くも膜下出血においては、発症時の血中濃度が予後不良群で有意に低値を示してした。予後との関連性は、単変量解析では年齢、発症時の重症度(HHG;Hunt&Hess Grade)、脳内出血の有無(Fg;Fisher group)、発症時のHP血中濃度に有意差を認めた(p<0.05)。多変量解析を行うと、HPの血中濃度に有意な相関がみられ、HHGおよび脳内出血の有無に強い傾向がみられた。rs2000999単独での予後予測因子としての有用性を検討したところ、単変量解析ではp=0.047と有意差が得られたが、多変量解析ではp=0.28単独因子とはならなかった。結合能が低く、血中濃度が低いHP2-2かつrs2000999がGG以外であることは、多変量解析でp=0.06と強い傾向がみられ、予後予測因子となりうる可能性が示唆された。これらについては、第77回日本脳神経外科学会、第48回日本脳卒中の外科学会にて報告した。平成28年度29年度の研究目標は、脳血管疾患症例より同意を得て、血清Sampleを集めること、そしてSampleのHaptoglobinのCommon多型の解析、血中濃度およびそれに影響を与えるSNP rs2000999の解析を行うことを主な目的としている。これまでに慢性期の症例約160例、急性期約130例のSampleが集まっている。これまでに計測できている症例のうち、特にくも膜下出血に着目して統計学的解析を行っている。症例が少なく、今後も検討が必要であるが、HaptoglobinのGenotypingによりくも膜下出血の予後予測になりうる可能性が示唆されている。本研究内容は、2016年の脳神経外科学会総会、2017年の脳卒中の外科学会で発表した。引き続きSample収集に努めていきたいと考えている。Sample収集に於いて、同意を取る際の問題もほとんどなく、患者も協力的である。これまでに研究の障害となるような大きな問題はなく、引き続きSample収集をすすめて来たいと考えている。これまでに同意取得後に採取できたサンプルは、脳血管疾患の急性期の症例217例、慢性期の症例164例で、全部で381例となった。採取されたサンプルの内訳は、脳動脈瘤およびくも膜下出血190例、脳動静脈奇形13例、虚血性疾患(出血性梗塞など) 31例、脳出血69例、頭部外傷66例、もやもや病12例である。現在、これらのサンプルの表現型(Hp 1-1, Hp 2-1, Hp 2-2)、遺伝型(SNP-rs2000999)、血中濃度の解析を進めている。随時、疾患別に統計学的解析を行っている。くも膜下出血では、予後とハプトグロビンの血中濃度に関連がみられており、ハプトグロビンの表現型や遺伝型により、予後との関連性にトレンドが得られており、サンプルの結果が全部終了すれば、有意な結果が得られる可能性が出てきている。これについては、第76回脳神経外科学会総会において報告した。また、ハプトグロビンを脳血管攣縮とには、有意な相関は今のところ得られなかった、これについては、第34回スパズム・シンポジウムにて報告した。今のところ、脳出血の予後とハプトグロビンとの間に、これまでの報告のような独立因子としてのバイオマーカーとなりうる可能性は否定的な結果が得られている。さらに、頭部外傷、とくに急性硬膜下血腫においては、ハプトグロビンの血中濃度と予後の関係性がくも膜下出血と正反対の結果が得られており、さらに統計学的解析が必要と考えている。脳動静脈奇形や、もやもや病、虚血性疾患については、採取されたサンプルの数も少なく、特にHp 1-1のタイプは日本人にそもそも少ないため統計学的に有意な結果を出すのは困難と思われ、平成29年度は、くも膜下出血、脳出血、頭部外傷に絞ってサンプル採取に取り組んだ。平成29年度までは、サンプルの収集が主な目的としており400例近くのサンプルが集まった。随時、統計学的解析を行っており、くも膜下出血においては意義のある結果が得られている。年度末にアンプル収集が増え、解析に時間を要しているが、次年度には解析できる予定であり、おおむね順調に進行していると考えている。

これまでに採取したサンプル中、ハプトグロビン(HP)の表現型(HP1-1、2-1、2-2)、遺伝型(rs2000999)、血中濃度の解析ができたのは、頭部外傷60例、脳内出血56例、くも膜下出血94例、未破裂脳動脈瘤77例、脳動静脈奇形11例、虚血性脳卒中25例、もやもや病12例の全335例となった。統計学的解析を行ったところ、脳動静脈奇形・虚血性脳卒中・もやもや病においては、症例が少なくHPと予後との関連は認めなかった。頭部外傷および脳内出血もまた有意な相関は得られなかった。くも膜下出血においては、発症時の血中濃度が予後不良群で有意に低値を示してした。予後との関連性は、単変量解析では年齢、発症時の重症度(HHG;Hunt&Hess Grade)、脳内出血の有無(Fg;Fisher group)、発症時のHP血中濃度に有意差を認めた(p<0.05)。多変量解析を行うと、HPの血中濃度に有意な相関がみられ、HHGおよび脳内出血の有無に強い傾向がみられた。rs2000999単独での予後予測因子としての有用性を検討したところ、単変量解析ではp=0.047と有意差が得られたが、多変量解析ではp=0.28単独因子とはならなかった。結合能が低く、血中濃度が低いHP2-2かつrs2000999がGG以外であることは、多変量解析でp=0.06と強い傾向がみられ、予後予測因子となりうる可能性が示唆された。これらについては、第77回日本脳神経外科学会、第48回日本脳卒中の外科学会にて報告した。Haptoglobinは、アジア人はPhenotypeの発現に偏りがあり、HP1-1タイプが全体の6-7%程度と少ない。急性期Sample中のHP 1-1タイプが未だ少なくデータに偏りが出てしまったり、統計学的計算をするにはSample量が足りない状況である。引き続き、Sample収集に尽力し、脳血管疾患症例をまんべんなく収集できるようにしていく必要がある。これまでに採取したサンプルの表現型や遺伝型、血中濃度解析の終了後に統計学的解析を行う予定である。脳出血、くも膜下出血、外傷などのそれぞれの疾患の予後と表現型、遺伝型、血中濃度との関連性を統計学的手法により解析する。研究自体はおおむね順調に進行しているが、年度末のSample量が少なく年度末だったので解析依頼を延期している。(理由)研究自体は概ね順調に進行しているが、年度末に症例が集中し、サンプル量も増えており、エフォートの問題もあり表現型や遺伝型、血中濃度の解析を延期している。(使用計画)ある程度サンプルが集まったので、残りの解析と統計学的分析を行っていく予定であり、それらにかかる諸経費として使用する予定である。今後もSample収集を行い解析を行っていく予定であり、必要なキットやSRLへの費用負担などもあり、そういった諸経費として使用する予定である。
真核生物におけるエンドソームを介した情報伝達機構の普遍性と多様性についての研究

低分子量GTPaseであるRAB5は,活性型時に,エフェクターとよばれる分子群と相互作用することにより,細胞内輸送において多様な現象を制御すると考えられている.RAB5は真核生物に広く保存されているが,陸上植物には保存型RAB5に加え,ユニークな一次構造を有するRAB5ホモログをもつ.モデル植物であるシロイヌナズナには,保存型RAB5であるARA7・RHA1と,植物固有型RAB5であるARA6が存在し,この2種類のRAB5が異なる輸送経路を制御することにより,花成や細胞分化,根の形態形成などの現象を制御することを明らかにしてきた.このようなRAB5の機能は,さまざまなエフェクターとの相互作用を介して発現していると考えられるが,植物にはこれまで報告されている動物RAB5エフェクターのホモログは見いだされず,その仕組みは全く明らかになっていない.そこで,申請者は,植物固有型RAB5であるARA6がどのような機能を持つかを明らかにすることを目的とし,ARA6のエフェクターの同定と機能解析を試みた.本研究では,独自のRAB5を持つ陸上植物を対象とすることにより,真核生物におけるエンドソームを介した情報伝達経路の普遍性と多様性について総括的な知見が得られると考えている.昨年度までに,7つのエフェクター候補を得,Plant-unique RAB5 Effector(PUF17)と名付けた.本年度は,PUF3とPUF2が活性型ARA6と特異的に相互作用し,植物個体中でARA6エンドソームに局在することを明らかにした.また,PUF3について,不活性型固定変具型ARA6を発現する個体中で,核での局在のシグナルが上昇する現象を見いだし,PUF3が,ARA6エンドソームをシャトルするシグナル分子として機能する可能性を示した.さらに,PUF2について,RAB5活性化因子やPUF3と相互作用することや,保存型RAB5と同じ遺伝学的相互作用を示すこと,保存型RAB5とARA6の両方が局在するエンドソームに特異的に局在することを明らかにし,PUF2が,植物の2種類のRAB5をエンドソーム上で統御する因子である可能性を示した.陸上植物には,保存型RAB5に加え,植物固有型RAB5であるARA6グループも保存されており,シロイヌナズナにおいて保存型RAB5とARA6の二種類のRAB5が協調し,植物の形態形成や細胞分化などの現象を制御することが明らかとなっている(Ebineら未発表).そこで,私は,ARA6が機能するメカニズムを明らかにすることを目的とし,ARA6のエフェクタースクリーニングと機能解析に着手した.これまで,酵母2ハイブリッド法を用いたスクリーニングにより7つのエフェクター候補を得ており,これらをp_-lant-u_-nique RAB5 ef_-fector(PUF17)と名付けた.平成20年度は,PUF3とPUF2に注目し,解析を進めた.PUF3は,plekstrin-homologyドメインを持ち,PI4Pに親和性があることが分った.また,PUF3は,核,サイトソル,エンドソームに局在し,ARA6の活性化状態依存的にエンドソームに局在するが,ARA6に非依存的にエンドソームに局在化することが分った.以上の内容を第50回植物生理学会年会で報告した.一方,PUF2は,4つのcoiled-coilドメインを持ち,C末端側はARA6と,N末端側はシロイヌナズナのRAB5 GEFであるVPS9aとの相互作用することが明らかとなったことから,PUF2がGEFとARA6を架橋する分子リンカーとして機能する可能性が示唆された.PUF2はエンドソームに局在し,puf2変異体とエンドソーム/液胞局在型QaSNAREであるvam3の変異体と二重変異体を作成すると,vam3の表現型を昂進することが明らかとなった.平成20年度はさらに,奈良先端技術大学院大学深尾助教との共同研究により,LC-MS/MS解析を用いたARA6エフェクターの網羅的単離にも着手した.低分子量GTPaseであるRAB5は,活性型時に,エフェクターとよばれる分子群と相互作用することにより,細胞内輸送において多様な現象を制御すると考えられている.RAB5は真核生物に広く保存されているが,陸上植物には保存型RAB5に加え,ユニークな一次構造を有するRAB5ホモログをもつ.モデル植物であるシロイヌナズナには,保存型RAB5であるARA7・RHA1と,植物固有型RAB5であるARA6が存在し,この2種類のRAB5が異なる輸送経路を制御することにより,花成や細胞分化,根の形態形成などの現象を制御することを明らかにしてきた.このようなRAB5の機能は,さまざまなエフェクターとの相互作用を介して発現していると考えられるが,植物にはこれまで報告されている動物RAB5エフェクターのホモログは見いだされず,その仕組みは全く明らかになっていない.

そこで,申請者は,植物固有型RAB5であるARA6がどのような機能を持つかを明らかにすることを目的とし,ARA6のエフェクターの同定と機能解析を試みた.本研究では,独自のRAB5を持つ陸上植物を対象とすることにより,真核生物におけるエンドソームを介した情報伝達経路の普遍性と多様性について総括的な知見が得られると考えている.昨年度までに,7つのエフェクター候補を得,Plant-unique RAB5 Effector(PUF17)と名付けた.本年度は,PUF3とPUF2が活性型ARA6と特異的に相互作用し,植物個体中でARA6エンドソームに局在することを明らかにした.また,PUF3について,不活性型固定変具型ARA6を発現する個体中で,核での局在のシグナルが上昇する現象を見いだし,PUF3が,ARA6エンドソームをシャトルするシグナル分子として機能する可能性を示した.さらに,PUF2について,RAB5活性化因子やPUF3と相互作用することや,保存型RAB5と同じ遺伝学的相互作用を示すこと,保存型RAB5とARA6の両方が局在するエンドソームに特異的に局在することを明らかにし,PUF2が,植物の2種類のRAB5をエンドソーム上で統御する因子である可能性を示した.
エストロゲン関連遺伝子と喫煙との交互作用に関する肺がんのゲノム疫学研究

検討したエストロゲン関連遺伝子多型のうち肺がんとの有意な関連性が認められたのはCYP1A1 rs464690、CYP1A1 rs1048943、GSTP1 rs1695、NQO1 rs1800566、COMT rs4680、CYP2A6欠損多型、CYP19A1 rs3764221及びGSTM1欠損多型であり、それぞれの調整オッズ比は1.72、1.40、1.48、0.62、1.65、1.53、1.46及び1.38であった。rs1048943あるいはGSTM1欠損多型と喫煙との間に有意な相乗的交互作用が認められた。さらに、rs1048943と喫煙との間に有意な相加作用も観察された。本研究は2004年より開始されたInternational Lung Cancer Consortium (ILCCO)国際共同研究の一環として、日本人肺がんにおける性ホルモン関連遺伝子の役割と喫煙と性ホルモン関連遺伝子多型の交互作用を明らかにすることを目的として行った。本年度はエストロゲンの代謝に関連する遺伝子の多型であるCYP1A1rs464690、rs1048943とGSTP1 rs1695およびNQO1 rs1800566の遺伝子多型と肺がんとの関連性について解析した。これらの遺伝子多型は全て機能的であると報告されている。検討したすべて遺伝子多型は、対照群において、Hardy-Weinberg平衡からのずれは認められなかった。majorアレル/majorアレル型、majorアレル/minorアレル型およびminorアレル/minorアレル型の間に有意な傾向性はいずれの遺伝子多型でも認められた。性、年齢、喫煙、飲酒および教育歴を調整した少なくとも1つのminorアレルを持つ場合のmajorアレル/majorアレル型に対するオッズ比とその95%信頼区間はCYP1A1 rs464690、rs1048943とGSTP1 rs1695およびNQO1 rs1800566においてそれぞれ1.72 (1.25 - 2.38)、1.40 (1.02 - 1.92)、1.48 (1.04 - 2.11)および0.62 (0.45 - 0.86)であった。喫煙とCYP1A1 rs1048943遺伝子多型(P = 0.056)の交互作用のみが有意であった(交互作用のPは検出力が低いのでP<0.1を統計学的に有意であるとした)。プレグネノロンは体内であらゆるホルモンに変換されるプロホルモンである。CYP1A1はコレステロールからプレグネノロンへの合成に関与する重要な酵素である。この遺伝子の多型は肺がん発症において重要な役割を果たしていることが示唆された。本年度はエストロゲンの代謝に関連する遺伝子の多型であるCYP1A2rs762551、CYP19A1rs10046、SULT1A1 rs9282861、COMT rs4680遺伝子多型およびCYP2A6欠損多型と肺がんとの関連性について解析した。CYP2A6は直接的にはエストロゲンの代謝には関与していないが、エストロゲンによって活性されたエストロゲン受容体がCYP2A6の転写を活性化してその発現を誘導する(CYP2A6活性の上昇は肺がんリスクに関連している)ことから、今回の解析対象に加えた。これらの遺伝子多型は全て機能的(rs10046以外)あるいは他の機能的な遺伝子多型と連鎖不平衡にある(rs10046)と報告されている。検討したすべて遺伝子多型は、対照群においてはHardy-Weinberg平衡からのずれは認められなかった。性、年齢、喫煙、飲酒および教育歴を調整した少なくとも1つのminorアレルを持つ場合のmajorアレル/majorアレル型に対するオッズ比とその95%信頼区間はCYP1A2 rs762551、CYP2A6欠損多型、CYP19A1rs10046、SULT1A1 rs9282861およびCOMT rs4680遺伝子多型においてそれぞれ0.99 (0.71 - 1.38)、1.53 (1.05 - 2.25)、0.95 (0.68 - 1.35)、0.99 (0.72 - 1.35)および1.65 (1.18 - 2.30)であった。喫煙といずれかの遺伝子多型と間には有意な交互作用は認められなかった。SULT1A1rs9282861とCYP2A6欠損多型とが肺がんリスクと有意に関連していた。

本年度はエストロゲンの代謝に関連する遺伝子の多型であるCYP1A2rs2069514、CYP17A1 rs743572、CYP19A1 rs3764221、GSTM1欠損多型およびGSTT1欠損多型と肺がんとの関連性について解析した。これらの遺伝子多型は全て機能的と報告されている。検討したすべて遺伝子多型は、対照群においてはHardy-Weinberg平衡からのずれは認められなかった。肺がんリスクの上昇に関連しているアレルをリスクアレルと定義する。性、年齢、喫煙、飲酒および教育歴を調整した、リスクアレルがない場合に対するリスクアレルが1つ以上ある場合のオッズ比とその95%信頼区間はCYP1A2 rs2069514、CYP17A1 rs743572およびCYP19A1rs3764221においてそれぞれ1.35 (0.68 - 2.68)、1.21 (0.85 - 1.72)および1.46 (1.06 - 2.00)であった。また、GSTM1欠損多型およびGSTT1欠損多型における非欠損型に対する欠損型のオッズ比はそれぞれ1.38 (1.01 - 1.89)および1.17 (0.86 - 1.61)であった。喫煙とGSTM1欠損多型の間には有意な交互作用が認められた(P = 0.039)が、他の遺伝子多型と喫煙の間には有意な交互作用は認められなかった。性による層別解析においてもほぼ同様な結果が得られた。CYP19A1 rs3764221とGSTM1欠損多型が肺がんリスクと有意に関連していた。また、喫煙とGSTM1欠損多型の間には有意な交互作用が認められた。ほぼ400名ずつの肺がん症例と対照について、機能的でかつ日本人においてminorアレルの頻度が0.1以上ある遺伝子多型について文献検索を行い、5つの遺伝子多型についての解析を終えた。本研究は2004年より開始されたInternational Lung Cancer Consortium (ILCCO)国際共同研究の一環として、日本人肺がんにおける性ホルモン関連遺伝子の役割と喫煙と性ホルモン関連遺伝子多型の交互作用を明らかにすることを目的として行った。本年度はエストロゲンの代謝に関連する遺伝子の多型であるhydroxysteroid 17-beta dehydrogenase 1 rs605059、cytochrome P450family 19subfamily A member1 rs700519、phospholipase C eta1 rs181696、estrogen receptor 2 (ESR2) rs1256049およびER2 rs4986938と肺がんとの関連性について解析した。性、年齢、喫煙、飲酒および教育歴を調整した、リスクアレルがない場合に対するリスクアレルが1つ以上ある場合のオッズ比とその95%信頼区間はrs605059、rs700519、rs181696、rs1256049およびrs4986938においてそれぞれ1.00 (0.71 - 1.39)、093 (0.68 - 1.27)、1.26 (0.91 - 1.76)、1.11 (0.81 - 1.53)および1.22 (0.87 - 1.70)であった。性や組織型による層別解析の結果も同様であった。
蛋白質機能の合成化学的シミュレ-ション

プロタミン,RNAポリメラ-ゼII等のDNA結合蛋白質をタ-ゲットに選び、これらの機能の合成化学的シミュレ-ションを行った。1.魚類精子核中のDNA結合蛋白質プロタミンの分子中央部付近は、DNA結合時に折れ曲り構造をとっていると推測された。この折れ曲り構造と機能発現メカニズムの関係を調べるため、この折れ曲り構造と思われる付近の化学構造を強調あるいは消去したより単純なペプチドを3種類合成した。2.上記のペプチド類のコンホメ-ションをCD及び二次元NMRで調べ、またDNA安定化能,DNA凝集能等のプロタミン様機能を比較し、この折れ曲り構造部分に含まれるプロリン残基の役割につき考察した。3.プロタミン分子中の折れ曲り構造と思われる部分には、多くの魚類種のプロタミンにつき大変保存性よくーSーRーPーVーというアミノ酸配列が存在している。この部分のコンホメ-ションやDNA結合時における役割に関する知見を得るため、この配列を含む3種類のペプチド(SーRーPーV,SーSーRーPーV,SーSーSーRーPーV)を合成した。4.上記3種類のペプチドの水溶液中及び有機溶媒中でのコンホメ-ションをCD及び^1HNMRで調べた。その結果,ある条件下ではタ-ン構造の存在が示され、これはDNAに結合しているプロタミン中のこの部分がタ-ン構造をとっている事を示唆する一つの現象と考えられる。5.DNAよりRNAを転写する際の主役であるRNAポリメラ-ゼII分子中にはSーPーTーSーPーSーYのアミノ酸配列が繰り返し現れる部分があり、この部分の役割が不明である。この点に関する知見を得るためこの部分の化学合成を進め、最終目的物のPoly(SーPーTーSーPーSーY)の合成に成功した。現在これのコンホメ-ションやDNAとの相互作用につき調べるとともに、このポリペプチドの大量合成を行っている。蛋白質構造の特徴的な面を強調あるいは消去したような蛋白質類似物質(プロテノイド)を化学的に合成し、これらの構造や機能を調べる方法論で主としてDNA結合蛋白質をタ-ゲットにその構造-機能関係の研究を進めてきた。1.魚類精子核中の塩基性蛋白質プロタミンは、その特徴的なアミノ酸配列でDNAに結合し遺伝情報を保護・保存する役割を果している。この蛋白質の分子中央部付近の折れ曲り構造と機能発現メカニズムとの関連を調べるため、この折れ曲り構造付近の化学構造を強調あるいは消去したより単純な(ポリ)ペプチドを数種類合成した。2.上記(ポリ)ペプチド類のコンホメ-ションをCD及び2次元NMRで調べ、この折れ曲り構造部分に含まれるプロリン残基の意味や役割につき考察した。さらに、これらの(ポリ)ペプチド類のDNA安定化能、DNA凝集能等プロタミン様機能を比較し、プロタミン機能発現機構に関して興味ある知見を得た。3.DNAからmーRNAへの転写を行うRNAポリメラ-ゼIIの分子中にはーSerーProーThrーSerーProーSerーTyrーのアミノ酸配列が繰り返し現れる部分があり、これの役割やDNAとのかかわり合いが不明である。この点に関する知見を得る事を目的に、このアミノ酸配列を繰り返しもつ、ポリ(SerーProーThrーSerーProーSerーTyr)を合成した。また、この規則配列ポリペプチドのコンホメ-ションに関してもCDを用いて調べ若干の予備的な結果を得た。

当核年度に購入した備品のうちトランスイルミネ-タ-及び電気泳動ゲル撮影やセットはDNAの純度や分子量検定に、また、ミニSDSーPAGE用ミニプロテアンIIスラブセルはペプチド類の純度を調べるのに役立っている。合成化学的シミュレ-ションを行うタ-ゲットの蛋白質としては、プロタミン,RNAポリメラ-ゼII等のDNA結合蛋白質を選び、そのアミノ酸配列の特徴的な面を強調あるいは消去したような蛋白質類似物質(プロテノイド)を合成し、その構造や機能を調べてきた。1.プロタミンは魚類精子核中でDNAに固く結合し、これをコンパクトに保護・保存する役割を果しているが、その結合様式等の詳細は不明である。多くの魚類種のプロタミン中に保存性よくSーRーPーVというアミノ酸配列があり、分子中の折れ曲り部分ではないかと推測される。一方、プロタミン機能発現機構に関する我々の含成化学的なアプロ-チにより折れ曲り構造がその機能発現に大変重要である事が示唆された。そこでまず、この折れ曲り構造付近の3種類のペプチド(SーRーPーV,SーSーRーPーV,SーSーSーRーPーV)を液相法により化学合成した。2.上記3種類のペプチドにつき、水溶液や有機溶媒中でCD及び^1HNMRを測定した。その結果、水溶液中ではいずれのペプチドもランダム構造である事がわかったが、トリフロロエタノ-ル等の有機溶媒中では、特にSーSーSーRーPーVの場合,タ-ン構造の存在が示唆された。これは、DNAに結合しているプロタミン中のこの部分がタ-ン構造をとっている事を示唆する一つの現象と考えられる。3.転写の際の主役を演ずるRNAポリメラ-ゼII分子中にはーSーPーTーSーPーSーYのアミノ酸配列が繰り返し現れる部分があり、この部分の役割が不明である。この点に関する知見を得るため平成2年度からこの部分の合成を進めてきたが、多くの副反応等のため合成は困難を極めた。平成3年度もこの部分の合成をさらに大規模に進め、目的のポリペプチドを得る事ができた。現在これのコンホメ-ションやDNAとの相互作用を調べている。