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室町時代やまと絵屏風の金・銀・雲母技法研究

一部、計画していた室町時代やまと絵屏風の熟覧調査が実施できなかったものの、該当作品の展覧会出陳による閲覧や、平成29年度での展覧会閲覧、あるいは熟覧調査の機会が模索できる。金箔を製造してる工房の調査や、文献等の調査によって前近代の金箔の状態を多少なりとも想定できたことと、料紙装飾技術者(切箔装飾、唐紙師など)から直接技法についての議論が行えたことによって、室町時代に「磨き付け」と呼んでいた装飾技法そのものについて確証が得られたわけではないが、その表現技法を実現するための手段については少しずつ解明に近づいているものと考える。雲母地は唐紙師とその他文献による取材から、従来フノリを基本として雲母地を作成していたものから、こんにゃく糊に主体を変え、絵刷毛引きではなく糊刷毛のように毛の厚みのある刷毛に変更したことで、より均質かつ光沢ある雲母地を作ることができた。室町時代やまと絵屏風の雲母地は厚く引かれて、なおかつ粗く輝く状態をよく観てきており、よりその状態に近い下地層を構築できたのではないだろうか。材料の検討として、室町時代の金箔がどのようなものだったのか検討を試みた。戦国時代以降には、金碧障壁画でよく見られる「継ぎ重ね」のある箔が主流となるが、この製法を再検証することで、それ以前の金箔がどのようなものであったか伺える可能性がある。野口康氏の先行研究で継ぎ重ねる金箔の提唱がなされたが、その意見に賛同しつつ、およそ10cm四方の四角形を形成するために「継ぎ重ねる必然性」があったと推察し、打ち延ばされた金箔の厚みも10cm四方にとどかないくらいのものであるとの検討に至った。29年12月に別の調査でミャンマーに派遣された際に当地の金箔製法を閲覧できたが、やはり継ぎ重ねた箔を用いていたため、その手法が確認できた点で成果があった。上記を踏まえ、協力業者に現代金箔の完全に仕上げとなる前段階のやや厚めな金箔と、文献から中世は現代の510倍厚い可能性も示唆されているため、その厚みに相当しそうな「澄」と呼ばれる状態の金箔も入手して、磨き付け技法の試作を行った。これまでの検討から、細かく切った切箔を撒き潰す「磨き付け」と、素地かあるいは分厚い胡粉下地に適度な大きさの金箔を敷き詰めて磨く「磨き付け」の双方のやり方があると結論付け、主に後者の手法を実証した。結果的には、澄ほどに厚みがあるとうまく磨き付けの効果が発揮できないが、やや厚みのある金箔では、参考にした「日吉山王・祇園祭礼図屏風」のような光沢感が再現できた。その他、中世後期から近世にかけて作例が確認できる「刷り箔」技法も検証して、使用される正麩糊の効果や雲母刷りの再現をした。また「浜松図屏風」(東博)の括りのある金雲表現に着目し、磨き付けによる金銀雲と、赤・青・白の三色が確認できる括り雲を再現した。さらに依頼のあったワークショップで雲母地と金銀箔を用いた室町時代のやまと絵屏風の表現技法を主題とし、「浜松図屏風」を部分再現を試みた。中世やまと絵屏風の多くには金・銀・雲母による加飾が見られる。なかでも金銀箔の小片を撒きつぶしたものを、室町時代古文書に現れる「金磨き付け屏風」とする見解が定着しつつあり、現代ではあまり知られない「金磨き付け」による表現を技法の観点から捉え直そうと試みた。様々な試作の結果、金が光沢感を持ち輝きが増すのは、下地が平滑であることと、金箔に多少の厚みがあることが重要と分かった。下塗りの雲母は粒子が粗いため、予め雲母地を磨いて平滑にしておき金箔を撒くか、撒いた金箔と一緒に磨きこむことで金に光沢感が出た。「金磨き付け」技法は金箔の撒き方や厚みに留まらず、雲母地の作用も含めて捉えるものではないかと考える。28年度は、これまでの研究で実技的な課題となっている「磨く」効果についての検証をより進めていく。具体的には、箔足のない室町時代の「金扇」に着目している。
オリゴケミストリーサイクル構築のための超臨界水中反応による糖からの化学原料合成

超臨界水を反応場とし、糖を出発原料とした化学原料回収法について、検討を行った。特にターゲットとして、乳酸ポリマーに代わる生分解性高分子原料としてグリコール酸をターゲットとし、糖からグリコールアルデヒドの高収率回収条件の策定を行った。マイクロリアクターを用いた実験により、グルコースの分解を逐一追跡し、その結果から、グルコースの主分解経路を解明した。グルコースは、レトロアルドール反応により、エリスロースさらにグリコールアルデヒドへと分解する。また、互変異性によりフルクトースへと転移した後レトロアルドール反応により、グリセルアルデヒド、ピルブアルデヒドへと分解する。これらの反応中、脱水反応も生じる。それぞれの反応経路について速度論的検討を行い、反応速度の温度圧力依存性を評価した。その結果、レトロアルドール反応を脱水反応や互変異性反応よりも、支配的とするには、高温、低水密度とすることが好ましいことが明らかとなった。450°C、密度0.1g/cm^3としたところ、89%の高収率でグリコールアルデヒドを回収できることを明らかにした。さらに、グリコールアルデヒドからグリコール酸へは、カニツァロ反応が考えられ、アルデヒドを導入する実験を行ったところ、十分とはいえないがグリコール酸への転移も確認できた。反応速度は、数10msec程度であり、極めて小さな反応装置でよい。実プロセス化に向けて、グリコール酸への高選択的転移条件の検討、さらにプロセス化のための高濃度条件下での反応、他産業廃熱の利用等が課題であることも本研究を通して明らかにした。糖類はバイオマスの主要物質であり水と二酸化炭素の光合成により形成するため、大気中の炭素循環を崩すことがなく、地球温暖化物質の排出を軽減し得る貴重な資源であると言える。また、糖類を出発物質とした場合、従来の石油化学工業により合成される大部分の物質を誘導可能である。これらの観点から、これまでにない環境適合型の化学原料合成プロセスの構築が期待できる。さらに、超臨界水の「反応の制御性」、「クリーンな溶媒」といった特長を利用することで、よりグリーンなプロセスとなる可能性が高い。本年度は、そのための基礎研究として、超臨界水中での糖類の主分解反応経路及びその反応特性を明らかにするとともに、超臨界水の有機合成場としての可能性を評価することを目的とした。まず、グルコース及びフルクトースの2種類の糖を用いた超臨界水中での分解実験、及び分解速度の温度圧力依存性を評価した。その結果、超臨界水中でのグルコースの主分解反応はレトロアルドール縮合とフルクトースへの異性化反応であり分子内脱水反応は進行しにくいこと、また、反応の温度圧力依存性に関し、レトロアルドール縮合は高温低圧ほど促進され、逆に高圧ほど脱水反応が促進されることを明らかとした。次に、糖の修飾法のとして、アンモニアによるアミノ化、アミド化を想定し、無触媒反応の可能性を検討した。従来の有機合成反応では知られていなかった超臨界水中でのアミド基と水酸基間の無触媒脱水反応に関して、モデル物質として1-ヘキサノールとアセトアミドを用いた回分式反応器によるN-ヘキシルアセトアミド合成ならびにヘキシルアミン合成を検討した。その結果、温度400°C、反応時間60分、水密度0.3g/mLではヘキサノールとアセトアミドの脱水反応(アミド化)によりN-ヘキシルアセトアミドを合成し得ることを明らかとした。以上、超臨界水中での糖類の「制御された分解」による化学原料合成、及びOne-pot反応による有機合成の高い可能性が示唆された。セルロースをケンダクさせ、それを高圧注入記によりフィードし、反応時間、反応温度、反応圧力を変えた実験を行なうことで、生成物の変化を評価した。反応圧力が高いほど、超臨界領域でも比較的温度が低いほど、セルロースの加水分解が支配的に生じ、副反応であるレトロアルドール反応を抑制できることを明らかにした。

すなわち、超臨界であっても比較的低温、高圧領域(380-400°C、30MPa以上)に設定することで、オリゴ糖を主生成物として生成させうることを明らかにした。次に、糖の分解による選択的化学原料回収について、糖をモデル物質として検討を行なった。まず、糖の超臨界水中での分解反応経路について、流通式反応器を用いて実験的検討を行なった。反応生成物の経時変化、反応速度の評価は、反応管長さを様々に変えた実験値より行なった。その結果、超臨界条件において、より高温、より低圧下では、糖は、レトロアルドール反応を介してグリコールアルデヒドし、エリスロースさらにグリコールアルデヒドを生成することがわかった。亜臨界条件、あるいは超臨界でもより高圧領域では、脱水反応による1,6アンハイドログルコース生成等が生成することがわかった。グリコールアルデヒドは、次世代の生分解性ポリマーとして期待されている。しかし、本手法により、滞在時間と反応温度のみをパラメータとすることで、期待される成果が得られる手法について検討を行なった。その結果、90数%の収率、98%の選択率でグルコースからグリコールアルデヒドを生成しうることを明らかにした。超臨界水を反応場とし、糖を出発原料とした化学原料回収法について、検討を行った。特にターゲットとして、乳酸ポリマーに代わる生分解性高分子原料としてグリコール酸をターゲットとし、糖からグリコールアルデヒドの高収率回収条件の策定を行った。マイクロリアクターを用いた実験により、グルコースの分解を逐一追跡し、その結果から、グルコースの主分解経路を解明した。グルコースは、レトロアルドール反応により、エリスロースさらにグリコールアルデヒドへと分解する。また、互変異性によりフルクトースヘと転移した後レトロアルドール反応により、グリセルアルデヒド、ピルブアルデヒドへと分解する。これらの反応中、脱水反応も生じる。それぞれの反応経路について速度論的検討を行い、反応速度の温度圧力依存性を評価した。その結果、レトロアルドール反応を脱水反応や互変異性反応よりも、支配的とするには、高温、低水密度とすることが好ましいことが明らかとなった。450°C、密度0.1g/cm^3としたところ、89%の高収率でグリコールアルデヒドを回収できることを明らかにした。さらに、グリコールアルデヒドからグリコール酸へは、カニツァロ反応が考えられ、アルデヒドを導入する実験を行ったところ、十分とはいえないがグリコール酸への転移も確認できた。反応速度は、数10msec程度であり、極めて小さな反応装置でよい。実プロセス化に向けて、グリコール酸への高選択的転移条件の検討、さらにプロセス化のための高濃度条件下での反応、他産業廃熱の利用等が課題であることも本研究を通して明らかにした。
PACAP高発現マウスを用いたPTSD脆弱性のマイクロエンドフェノタイプ

ヒトにおけるストレス感受性には個人差があることが分かっており、その背景には環境要因に加えて遺伝的要因も強く関わっていると考えられている。日本産野生マウス系統であるMSMは、実験用系統であるC57BL/6J (B6)と比較して、極度に高い不安様行動と恐怖反応を示すことから、その遺伝的基盤を解明することで、ヒトのストレス感受性や不安の個人差に関わる遺伝的基盤の理解に結びつけられるのではないかと期待される。詳細な遺伝学的解析により、その責任遺伝子が、動物のストレス応答に重要な役割を果たす下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド(PACAP)をコードするAdcyap1遺伝子であることを見出した。MSMとB6系統由来のPACAP遺伝子は、タンパク質コード領域には多型が無いが、視床下部領域における発現量はMSMに由来する遺伝子で有意に高く、またPACAP遺伝子転写産物のスプライシングパターンにもMSMに特徴的なスプライシングバリアントの増加がみられた。バリアントの5'非翻訳領域にレポーター遺伝子であるルシフェラーゼ遺伝子をつないで行った発現解析の結果、MSMタイプのバリアントが最も高い翻訳効率を示すことが分かった。更にこのPACAPの高発現とスプライシングパターンには遺伝子イントロン内の2塩基繰り返し配列多型が関与していることが分かった。そこで、ゲノム編集によりB6にMSM型の変異を導入すると、遺伝子発現パターンがMSM様に変化することが分かった。このことから、PACAP遺伝子内の2塩基繰り返し配列多型により高発現とスプライシングの変化が生じ、それによりPACAPの増加が生じることで不安様行動が増加することが分かった。また、このPACAP髙発現マウスでは、恐怖条件付け学習後の恐怖記憶の消去が効率よくできないことから、PACAPの高発現とPTSDとの関連を指示する結果が得られた。28年度が最終年度であるため、記入しない。日本産野生マウス系統であるMSMは、実験用系統であるC57BL/6J (B6)と比較して、極度に高い不安様行動と恐怖反応を示す。染色体を置換したコンソミックマウス系統を用いた解析により、この高い情動反応性に関わる遺伝子の1つが17番染色体にあることが分かった(Takahashi et al 2008, Genes Brain Behav)。さらに詳細な遺伝学的解析により、その責任遺伝子が、動物のストレス応答に重要な役割を果たす下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド(PACAP)をコードするAdcyap1遺伝子であることを見出した。MSMとB6系統由来のPACAP遺伝子は、タンパク質コード領域には多型が無いが、視床下部領域における発現量はMSMに由来する遺伝子で有意に高く、実際にPACAP量も多いことが分かった。また、PACAP遺伝子の転写産物には主に3つのスプライシングバリアントがあるが、そのバリアントタイプにMSMとB6間での系統差があることが分かった。バリアントの5'非翻訳領域にレポーター遺伝子であるルシフェラーゼ遺伝子をつないだ発現ベクターを作製して、細胞へのトランスフェクションを行うことで翻訳効率を比較した結果、あるバリアントが最も高い翻訳効率を示すことが分かった。これまでに独立のトランスジェニックラインを複数系統作製することに成功し、遺伝子の発現や行動表現型の解析を進め、その結果について現在検討を進めている。今年度は、MSM由来のAdcyap1遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの解析に多くの時間を費やした。解析した結果、遺伝子の発現はトランスジェニックマウスで上昇しており、導入した遺伝子が発現していることが示された。スプライシングバリアントのタイプの系統差がトランスジェニックマウスで再現されているか否かについては、現在解析を進めている。行動表現型に関して、トランスジェニックマウスを用いた解析を進めているが、これについては、少なくとも雌では高い不安様行動がみられており、導入した遺伝子の効果により、マウスの不安様行動が影響を受けていることが示唆されている。ストレス応答ホルモンの定量を進めた結果、コンジェニック系統ではストレスからの回復が遅れていることが示された。

また、このPACAP髙発現マウスでは、恐怖条件付け学習後の恐怖記憶の消去が効率よくできないことから、PACAPの高発現とPTSDとの関連を指示する結果が得られた。MSM系統由来の遺伝子を導入したコンジェニック系統やトランスジェニック系統を用いた実験を進め、高い情動反応の一因はAdcyap1遺伝子の高発現にあることを示してきた。これらの系統は、Adcyap1遺伝子の高発現に起因する高い情動性を示すマウスであり、ストレス脆弱性を示す人の良いモデルになると期待できる。今後は、Adcyap1遺伝子の高発現マウスでどのような神経系の微細な変化が生じているのか解析を進めていく予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。
準結晶のPhason歪と近似結晶の関係

準結晶のブラッグ反射のピークプロファイルとピークシフトの観察は、準結晶の安定性やフェイゾン歪みによる準結晶ー結晶相変態の機構の研究において大変興味深い。Al-Ni-Co合金では、最近、温度と成分により、少なくとも8つの異なるタイプのD相準結晶の存在が示された。従って、Al-Ni-CoD相準結晶の異なるタイプの安定性と、それらの間の相変態を調べることは重要である。そこで、本研究は、シンクロトロン放射光SPring-8のビームラインBLO2Blによる高分解能単結晶X線回折実験から、Al_<70>Ni_<10>Co_<20>D相準結晶のブラッグ反射の位置変化とピーク形の精密な測定を行い、フェイゾン歪みに関する情報を得ることを目的とした。実験では、波長0.6888Åを持つX線を使用し、単結晶試料の10回軸が回折平面に垂直になるよう取り付け、2種類の2回軸上のブラッグ反射のピーク形と位置を測定した。最初、L方向(準周期面内の動径方向)に沿った回折パターンの測定を行い、それから、L方向に垂直で回折面内のT1方向を測定した。各々のブラッグ反射の理想位置からの有為なシフトは観測できなかった。一方、L方向に対する半値幅はQ_⊥?線形依存性を示し、T1方向のモザイク幅デコンボリューション後の半値幅も同様なQ_⊥線形依存性を示した。X線回折では、フェイゾン歪みの効果は、2つの異なった効果に分けられるが、Al_<70>Ni_<10>Co_<20>D相準結晶では、半値幅のQ_⊥依存性から、ランダムフェイゾンが存在すること、一方、ピークの位置変化は無いので、リニアフェイゾンは混在していないことが明らかになった。
1900-1920年代日本におけるフランス芸術の受容―総合芸術誌「明星」を中心に

「明星」全148巻、「スバル」全60巻の精読、およびこの二誌にかかわった詩人や作家--与謝野鉄幹、上田敏、北原白秋、石川啄木、堀口大学ほか--の作品研究と渡仏体験の検証によって、明治大正期、ことに1900年代-1920年代の日本文学にフランス文学が大きな影響をあたえたことを認識した。また、このようなフランスの影響は絵画の領域においても同様で、この時代は「洋画家」の誕生の時代でもあり、文学と美術の間の緊密な交流があったことを認識した。1900-1920年代日本におけるフランス芸術の受容について、まず雑誌「明星」を精読・分析した結果、文学界に多大な影響をあたえた最大のものは、上田敏によるフランス象徴詩の翻訳であると認識した。しかも、この事実がほとんど研究の対象とされたことがないという研究の欠落をも痛感した。この研究につづいて、従来は与謝野晶子の短歌の初出雑誌としてしか知られていない「明星」のイメージ全体を刷新すべきであると考え、後に『海潮音』に収められる上田敏のフランス詩訳の大部分が「明星」掲載のものであり、同誌がいかにフランス文学の翻訳紹介につとめたかを論じ、さらには誕生したばかりの洋画の紹介にも紙幅を費やしていることを実証的明らかにした。上記の問題認識は、「明星」のみならず、事実上その延長ともいうべき「スバル」についてもいえるので、「スバル」を対象にフランス象徴詩の影響を論じた。キーパーソンは上田敏に圧倒的影響をうけた北原白秋である。白秋のフランスかぶれをとりあげるため、対比項として琢木をも論じた。二人を共にみることで、「若き明治の子」たちの言語芸術革命がうかびあがってきた。こうした言語芸術の革命は、日本画から洋画への革命と時期を同じくしており、フランス印象派の影響を大いにうけて洋画が確立された1900年代はまれにみる豊かな画文交響の時代であることを、「方寸」や「屋上庭園」などの雑誌研究とともに改めて認識した。上記の研究成果を、雑誌「環」(藤原書店)に連載発表した。前年度の計画どおり、永井荷風、島崎藤村、与謝野鉄幹のフランス憧憬と渡仏体験について、かれらの著作(『あめりか物語』、『ふらんす物語』、『新生』、『巴里より』『リラの花』など)の綿密な読みをすすめ、同時に「明星」や「スバル」への彼らの寄稿や消息も読みこんだ。そうして得られた認識を9月に行った現地のフィールドワークによって検証し、それぞれ論にまとめて雑誌「環」に連載した。藤村と鉄幹については別個に論をまとめる計画だったが、研究の進展とともに、二人の渡仏体験とその成果があまりに対照的なので、その対比を明らかにするためにあえて一つの論にまとめた。また、文人より早く渡仏したのは画家たちであり、明治・大正時代はかれらの絵画と文学が結ばれた「画文交響」の時代でもあったという認識が深まったので、黒田清輝はじめ洋画家たちのフランス滞在のフィールドワークも行い、画家たちと文学者たちの交友と相互扶助の様相も詳しく知ることができた。たとえば画家たちはアトリエを同じ宿にとって助け合って暮らしており、文学者との交流も深かった。与謝野鉄幹の宿を世話したのは梅原龍三郎であり、そのアパルトマンらしきものを当時の番地に見ることができたのは大きな収穫の一つであった。続けて、「明星」と「スバル」への寄稿者ではないが、大正という時代相を広い視座にたって認識するために、予定にはなかった大杉栄をとりあげることにした。彼もまたきわめて特殊な動機による渡仏体験者であり、フランス語に堪能でさまざまな翻訳書を出しているので、大杉栄の研究によって本研究の幅を広げることができたと思う。これまでの研究成果報告に記したとおり、フランス芸術・文学の影響をうけてきた詩人・作家たちの研究を、7回にわたる『環』連載として遂行した。連載最終回の予定であった堀口大学論を描き下ろしのかたちで書き終えたあと、自分の論考を通して再読し、全体をとおして何が問題であるのかを考察して、「日本語の近代」という問題に一つの焦点があることを認識した。上記のとおり、明治の上田敏にはじまって、上田敏の影響下にあった永井荷風たちのフランス象徴派の詩の翻訳、さらには大正時代の堀口大学にいたるフランス詩の翻訳は、品格と憂いのある文語から、エスプリの効いたモダンな口語体の日本語まで、近代の日本語の形成に大きな影響をあたえたことを改めて認識し、さらにはそれらの翻訳に絶大な影響をうけて育った北原白秋や西条八十らによる象徴詩をはじめ、かれらの創作した童謡や歌謡が広くその影響力をマスカルチャーにまで及ぼしたことを痛感した。「日本語の近代」を考えるとき、これは避けることのできない事実であるにもかかわらず、これまで日本近代文学史研究上で見落とされてきた研究の欠落を痛感した。それ以上に見落とされてきたことは、上記のようなフランス文学の翻訳を勧めた原動力が雑誌『明星』であることだ。実際に読まれることがはなはだ少なく、『明星』といえば与謝野晶子の短歌の初出誌であるという"常識"は覆されねばならないことを痛感した。上記の認識に到達するために、『明星』全148巻と『スバル』全60巻を精読するという自分の執った方法が、予想以上に実り豊かなものであったことを改めて認識した。以上の成果をまとめた『「フランスかぶれ」の誕生---

「明星の時代」』の刊行によって、近代日本文学史研究に「フランス文学とその翻訳」がどれほど大きな位置を占めているか、研究者の認識が改まることを期待したい。「明星」全148巻、「スバル」全60巻の精読、およびこの二誌にかかわった詩人や作家--与謝野鉄幹、上田敏、北原白秋、石川啄木、堀口大学ほか--の作品研究と渡仏体験の検証によって、明治大正期、ことに1900年代-1920年代の日本文学にフランス文学が大きな影響をあたえたことを認識した。また、このようなフランスの影響は絵画の領域においても同様で、この時代は「洋画家」の誕生の時代でもあり、文学と美術の間の緊密な交流があったことを認識した。連載8回の予定ですすめてきた論考の最終回の一校をほぼ書き終えることができた。ここでとりあげる対象は堀口大学だが、彼の「スバル」寄稿と第二次「明星」寄稿のほぼすべてを読むことができた。ならびに『堀口大学全集』8巻・補巻3巻をすべて読了した。上記の研究をふまえて、論にまとめたが、これまで連載してきた雑誌「環」が休刊となったので、締切にも枚数にもとらわれずに論を書きすすめることができた。ただ、枚数制限がなくなったので、長大な論になってしまったが、再読・再々読してどこを削るかを考えることがすなわち本のメッセージの検討になると思う。フランス文学・文化堀口大学論を完成させることがまず第一である。それと並行して、本年度は全連載を一著にまとめる予定なので、本としての一貫したメッセージを明瞭にしたい。明治大正におけるフランス文学の翻訳が日本語に何をもたらし、日本語をどう変えたのか。そして、それが現代に生きるわたしたちに何を問いかけているのかー個々の作家論をとおして、この問題を深めたい。それと並んで、最終的なフランスでのフィールドワークを行う。これまでの現地研修でとりこぼした箇所を検証するためである。あわせて、明治大正の翻訳をリードした森鴎外の記念館(ベルリン)と、当時の文壇の雄であった夏目漱石記念館(ロンドン)の視察もおこないたい。その都度新たに立ち現われてくる問題設定をどこまで追求し、どこでひとまずの達成とするかは難しいが、季刊雑誌への連載という発表形態が、締切と枚数という外的拘束力によって、はからずもその都度の決定を助けてくれた。反面、20枚といった、半端な枚数で完結しそうな論点については、「今後の課題」として残した。まず雑誌に連載し、それを一著にまとめるという研究の遂行形態に恵まれたと思う。また、作家の記念館やゆかりの地を検証するフィールドワークもほぼ計画どおりすすみ、「晶子記念館」や「白秋記念館」「琢木記念館」視察で多くを得た。渡仏した作家やパリはじめフランス各地でのフィールドワークは本年度は一回だったが、藤村の疎開先の確認や荷風の過ごしたリヨンの風光の観察など、収穫は多かった。学内研究助成金が25年度と26年度の二年間にわたり、それぞれ50万円、計100万円支給されたので、書籍代、旅費などをこれでまかなうことができた。その分、科研費の支出をおさえることができた。本年度も連載遂行のかたちをとって、永井荷風、島崎藤村、与謝野鉄幹・晶子ほか、作家・歌人、画家たちの渡仏体験を検証し、論じてゆく。そのための文献研究と並行して、かれらのフランス・ヨーロッパ体験を検証する海外でのフィールドワークを時間と予算のゆるすかぎり果たしたいと思う。また、並行して、藤村記念館や木下杢太郎記念館、津和野の鴎外記念館はじめ、キーパソンのゆかりの地や記念館を視察するフィールドワークも果たしたい。
肝障害発症解析の鍵モデル物質としての胆汁酸と核内レセプター相互作用

核内受容体FXRを欠損するマウスに肝障害モデル薬物としてリトコール酸(LCA)等の胆汁酸を処置し、肝障害の防御機構と核内受容体相互作用の関係を解析した。FXR欠損マウスはLCA誘発肝障害に対して抵抗性を示し、その原因として肝臓からのLCAの排泄能力の亢進が考えられた。胆汁酸代謝酵素の発現レベルの解析により欠損マウスにおけるhydroxysteroid sulfotransferase(St2a)とCyp3aの肝含量の亢進が認められた。St2aは胆汁酸の硫酸抱合を触媒するが、欠損マウスでは胆汁中や糞中への硫酸抱合型胆汁酸の排泄量が増加し、St2aの肝内での発現の亢進が、肝内LCAレベルの上昇を抑え肝障害を軽減させていることが示唆された。Cyp3aはLCAの6位水酸化を触媒し、体外排泄を促進させる。Cyp3aとSt2aはLCAによる肝障害の防御因子と考えられ、発現における核内受容体の関与について解析した。St2aの肝含量はFXRリガンドのchenodeoxycholic acid(CDCA)処置において野性型マウスで減少し、欠損型マウスで増加した。Cyp3aのLCAやpregnenolone 16α-carbonitrileによる発現誘導(pregnane X receptor(PXR)シグナル)においてもCDCAは野性型マウスでのみ抑制的に作用し、St2aとCyp3aの発現はFXRシグナルにより抑制的に調節されていることが示唆された。LCAによる肝障害はPXR等のシグナルにより抑制されていると考えられているが、FXRシグナルはそれら核内受容体シグナルを抑制することでLCAによる肝障害をむしろ増強させている可能性が示唆された。一方コール酸(CA)処置により欠損マウスは重篤な肝障害を誘発する。この原因として欠損マウスは胆汁酸の胆汁中への排泄能に問題があると考えられた。欠損マウスでは肝内胆汁酸濃度の上昇においても胆汁酸排泄トランスポーター(Bsep)の発現が亢進せず、肝内胆汁酸濃度の増加を抑制出来ないことからこの機能が肝障害の原因と考えられた。BsepはFXRにより促進的に調節されていることよりFXRシグナルが一次胆汁酸のCAによる肝障害を抑制していると考えられた。以上のように胆汁酸の中でもCAとLCAでは肝障害に対する防御系が異なり、核内受容体の作用も異なることが示唆された。肝障害時の高い血中胆汁酸レベルが肝障害の鍵物質として注目されている。肝内の胆汁酸レベルは肝臓の胆汁酸合成酵素や胆汁酸トランスポーターの機能に依存し、これらの遺伝子の発現は核内受容体farnesoid X receptor(FXR)やpregnane X receptor(PXR)等によって調節されている。そこでFXR欠損とその野性型マウスにモデル化合物としてlithocholic acid(LCA)を摂取させ、肝障害誘発の機序を動態の面から解析した。

雌性マウスに1%LCAを摂取させるとトランスポーター(Ntcp, Oatp, Mrp)のうちMrpファミリー以外のmRNAレベルは、野性型、欠損型共に減少した。また肝障害のレベルは欠損マウスよりも野性型マウスで強く現れ、肝内tauroLCAレベルと相関した。欠損マウス肝臓に野性型マウスと比べて5倍以上高いLCA硫酸抱合酵素であるsulfotransferase2A(St2a)の発現が認められた。さらに欠損マウス胆嚢胆汁中に高い硫酸抱合型胆汁酸が検出された。この結果は再吸収されにくい硫酸抱合型胆汁酸が肝内のLCAレベルを低下させ、肝障害を軽減させていると考えられた。またLCAとPXRのリガンドであるpregnenolone 16α-carbonitrileを併用したところ、野性型マウスの肝内St2aタンパク含量、LCA硫酸抱合活性、糞中の硫酸抱合型胆汁酸の増加が認められ、LCAによる肝障害は軽減され肝内LCAレベルも減少した。ヒト肝可溶性画分にも高いLCA硫酸抱合活性が認められ、ヒトの対応する分子種と考えられるST2A3分子種にヒト肝可溶性画分と同様にLCAやtauroLCAに対して高い硫酸抱合活性が認められた。以上の結果よりPXRとFXRはST発現を正負に調節することによって胆汁酸によって誘発される肝障害の防御に重要な役割をはたしていることが示唆された。胆汁酸をリガンドとする核内受容体FXRを欠損するマウスに肝障害モデル薬物としてリトコール酸(LCA)等の胆汁酸を処置し、肝障害の防御機構と核内受容体相互作用の関係を解析した。FXR欠損マウスはLCAにより誘発される肝障害に対して抵抗性を示し、その原因として肝臓からのLCAの排泄能力の亢進が考えられた。胆汁酸代謝酵素の発現レベルの解析により欠損マウスにおけるsulfotransferase(St2a)とCyp3aの肝含量の亢進が認められた。St2aはLCA等の胆汁酸の硫酸抱合を触媒するが、欠損マウスでは胆汁中や糞中への硫酸抱合型胆汁酸の排泄量が増加していた。これらの結果からSt2aの肝内での発現の亢進が、肝内LCAレベルの上昇を抑え肝障害を軽減させていることが示唆された。Cyp3aはLCAの6位水酸化を触媒し、体外排泄を促進させる。Cyp3aも肝障害の防御因子と考え、本酵素の発現への核内受容体の関与を解析した。St2aの肝含量はLCA処置により野性型、欠損マウス共に上昇したが、野性型マウスのFXRリガンドCDCA処置で減少し、欠損型マウスで増加した。Cyp3aのLCAやpregnenolone 16α-carbonitrileによる発現誘導(pregnane X receptor (PXR)シグナル)においてもCDCAは野性型マウスでのみ抑制的に作用し、St2aとCyp3aの発現はFXRシグナルにより抑制的に調節されていることが示唆された。LCAによる肝障害はPXR等のシグナルにより抑制されていると考えられているが、FXRシグナルはそれら核内受容体シグナルを抑制することでLCAによる肝障害をむしろ増強させている可能性が示唆された。欠損マウスのコール酸(CA)処置は重篤な肝障害を誘発する。この原因として欠損マウスは胆汁酸の胆汁中への排泄能に問題があると考えられた。欠損マウスでは肝内胆汁酸濃度の上昇においても胆汁酸排泄トランスポーター(Bsep)の発現が亢進せず、肝内胆汁酸濃度の増加を抑制出来ないことからこの機能障害が原因と考えられた。
ベトナム北部における安全・高品質な特産茶葉生産を支える土壌要因の解明

最終年度である平成30年度は,これまでに採取した試料を用いて,土壌溶液中の各種イオン濃度,土壌中微量元素の形態別存在量,茶葉熱水抽出物中のカテキン類,テアニン濃度を分析し,以下の結果を得た。1.土壌溶液中の主要なカチオンは,AlまたはCaイオンであった。アニオンは,硝酸イオン濃度が最も高く,酸性条件下でも硝酸化成が制限されていないと考えられた。土壌溶液中のカチオン・アニオン総濃度を乾季と雨季で比較した結果,雨季である栽培前期に,施肥成分の多くが流亡していると推察された。2.土壌中微量元素(Cu,Zn,Fe,Mn)の交換態,酸可溶態,Mn酸化物吸蔵態画分の存在量は,ほぼすべてのサイトで表層ほど多く,特にTan Cuong村の河川沿いの茶園でその傾向が顕著であった。一方,Song Cau村の茶園では,Mnを除き,これら3つの画分の存在量は,Tan Cuong村の場合より低かった。特に交換態Znの存在量が著しく低く,茶葉の品質低下の原因となっている可能性がある。3.同一品種(Trung Du)の茶葉熱水抽出物中のカテキン類,テアニン濃度をHPLC法で分析した結果,Tan Cuong村では,河川に近い茶園のものほど総カテキン類濃度が高い傾向が認められた。また,テアニン濃度は,有機物を積極的に施用しているB2茶園のものが最も高かった。一方,Song Cau村で採取した茶葉の熱水抽出物は,カテキン総濃度がTan Cuong村の場合よりも有意に高く,逆に,テアニン濃度が有意に低かったことから,これらが茶葉の品質に影響していると考えられた。上記および前年度までの結果を取りまとめ,土壌環境と茶葉の品質・機能性との関係について総合的に考察を加えた。また,平成31年3月にベトナム・タイグエン大学から研究協力者であるProf. Minhを高知大学に招聘し,研究報告会を開催した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では,ベトナム・タイグエン省の特産茶葉生産地およびその周辺の茶園において土壌及び茶葉の調査を実施し,安全・高品質な茶葉生産を支える土壌要因,生産物の品質および機能性等の付加価値を科学的に明らかにすることを目的としている.平成28年度は,7月に,研究代表者と分担者1名がTan Cuong村を訪問し,茶園の状況と生産物の品質等に関する聞き取り調査を実施した.その結果,Tan Cuong村のなかでも,Cong川沿いに位置するHong Thai 1地区,Hong Thai 2地区,Soi Vang地区で生産される茶葉の品質が特に良いとの情報を得た.これらの地区の土壌は,沖積土壌であるのに対し,Cong川から離れるにつれて,土壌の粘土含量・酸化物含量が高い傾向にあると推察された.そこで,Cong川を起点とする3本のトランセクトを引き,各トランセクト上で川からの距離が異なる4つの茶園を選定し,重点的に調査を行う茶園とした.また,いくつかの茶園で試験的に土壌溶液採取装置を埋設し,土壌溶液の採取が可能であることを確認した.一方,対照として,タイグエン市の北約10 kmに位置するSong Cau村でも予備的な調査を行い,重点的に調査を行う3つの茶園を選定した.平成29年2月に,研究代表者,分担者2名,協力者4名がTan Cuong村およびSon Cau村を訪問し,予備調査で選定した重点的に調査を行う茶園において,土壌断面調査,土壌・茶葉試料の採取並びに土壌溶液採取装置の埋設等を行った.また,現地研究協力者に土壌溶液の継続的な採取を依頼するとともに,pH, EC,アンモニア態窒素濃度,硝酸態窒素濃度の測定方法を指導し,採取直後の土壌溶液の分析を依頼した.採取した土壌・茶葉試料を日本に輸出し,現在,各種分析にとりかかっている.当初の研究計画では,「ベトナム・タイグエン省の特産茶葉生産地およびその周辺で品質・生産性が劣るとされる地域において,それぞれ栽培年数が約10, 25, 40年の茶園を選び,調査を実施する」ことを計画していた.異なる栽培年数の茶園について生産物の比較を行うためには,同一の茶樹品種を対象とする必要がある.予備調査実施にあたり,現地研究協力者を通じて,同一品種について栽培年数が異なる茶園を選定する協力を依頼したが,現地では,伝統的な茶樹品種であるTrung Duが新しい品種に改植されつつあり,同一品種について栽培年数の異なる茶園を設定することは困難であることが分かった.このため,当初の研究計画を修正し,地形と土壌・茶葉の品質の間の関係に焦点を当てることとした.具体的には,Cong川からの距離が異なる地点に位置し,Trung Du(栽培年数1520年以上)を栽培している茶園について,土壌及び茶葉の品質等の比較を行うこととした.また,一部の茶園では,同一区画内に複数の品種の茶樹が栽培されていたため,これらの茶園で採取した茶葉については,品種間の比較を行うこととした.以上のような事情から,重点的に調査を実施する茶園を選定するまでに時間を要したため,土壌・茶葉試料の採取時期が遅くなり,分析が進んでおらず,研究の進捗は,当初計画よりもやや遅れている.前年度に選定した各圃場で採取した土壌および茶葉試料について各種分析を行い,以下の結果を得た.

1.土壌試料Tan Cuong土壌の土性は砂壌土軽埴土であった.pHは表層土3.24.4,下層3.45.0とSong Cau土壌に比ベ酸性が強かった.川から遠い圃場の多くは粘土含量が高く,交換性Alが高い傾向があった.強酸性の条件にも関わらず表層土,下層土ともに交換性塩基,可給態Pは比較的多く,過剰施肥による下方への養分流亡が懸念された.全炭素・全窒素は栽培年数が増えるほど高く,剪定枝葉由来の有機物の経年蓄積によると推察された.一方,粘土含量と聞き取りに基づく茶葉の生産者価格の間に負の相関がみられ,川に近い粗粒質土壌では,物理性の面で茶樹の生育環境は良好であったと考えられた.川から遠い圃場では,強い酸性条件のため過剰のAlが茶樹へ悪影響を及ぼしている可能性が示唆された.2.茶葉試料同一品種(Trung Du)の養分含有率(新芽)を地点間で比較すると,洪水の影響を受ける川沿いの圃場では,N, P, Zn, Cu等の含有率が川から遠い地点よりも高い傾向にあった.一方,Al含有率は川から離れるにつれて高くなる傾向が認められた.同一圃場で栽培されていた3品種(LDP1, Trung Du, TR777)の養分含有率(新芽)を比較したところ,LDP1のN, P, Cu含有率は,他の品種よりも有意に低く,Ca, Zn含有率は高い傾向が認められた.一方,茶葉の熱水可溶性養分含有率と全含有率の間の関係を調べたところ,P, Mg, Mn, Zn, Alで有意な相関が認められた.熱水抽出物の抗酸化活性は,Son Cauの茶葉のほうがTan Cuongよりもやや高い傾向が認められた.また,総ポリフェノール量・抗酸化活性と熱水可溶性P含有率との間に負の相関が認められた.本研究では,ベトナム・タイグエン省の特産茶葉生産地およびその周辺の茶園において土壌及び茶葉の調査を実施し,安全・高品質な茶葉生産を支える土壌要因,生産物の品質および機能性等の付加価値を科学的に明らかにすることを目的としている.平成29年度は,前年度に選定したTan Cuong村のCong川を起点とする3本のトランセクト上で川からの距離が異なる各4圃場ならびに茶葉の品質が劣るとされる山間部のSong Cau村で選定した3圃場で採取した土壌および茶葉試料について各種分析を進め,土壌の一般理化学性,茶葉の養分含有率,茶葉の熱水抽出物の総ポリフェノール量,抗酸化活性の分析を終了した.しかし,平成28年度,重点的に調査を実施する茶園を選定するまでに時間を要したため,全体的に研究の進捗に遅れがみられ,現地圃場で採取した土壌溶液中の各種イオン濃度の分析,微量元素の形態別存在量の分析が未完了となっている.今後,総力を挙げて分析を完了させ,得られた結果を取りまとめる予定である.最終年度である平成30年度は,これまでに採取した試料を用いて,土壌溶液中の各種イオン濃度,土壌中微量元素の形態別存在量,茶葉熱水抽出物中のカテキン類,テアニン濃度を分析し,以下の結果を得た。1.土壌溶液中の主要なカチオンは,AlまたはCaイオンであった。アニオンは,硝酸イオン濃度が最も高く,酸性条件下でも硝酸化成が制限されていないと考えられた。土壌溶液中のカチオン・アニオン総濃度を乾季と雨季で比較した結果,雨季である栽培前期に,施肥成分の多くが流亡していると推察された。2.土壌中微量元素(Cu,Zn,Fe,Mn)の交換態,酸可溶態,Mn酸化物吸蔵態画分の存在量は,ほぼすべてのサイトで表層ほど多く,特にTan Cuong村の河川沿いの茶園でその傾向が顕著であった。
核内レセプターHNF4Aの変異による肝癌発症および悪性化のメカニズム解明

日本人の肝臓患者のゲノムシークエンスを行った結果、肝臓がんにおいて転写因子であるHNF4Aに複数の変異が認められることが明らかになった。機能解析を行った結果、これらの変異はZnフィンガー領域に多く認められ、タンパク発現レベルを変化させることなしに変異が誘導されるとDNA結合能が著しく失われることが明らかになった。これらのことからHNF4Aの発現が低下する、もしくはZnフィンガー領域に変異が誘導することでHNF4Aの機能が失われ、肝臓がんの発症が誘導される可能性が示唆された。今後は、通常の細胞に内在性の変異を誘導することでHNF4Aに誘導される変異の重要性をさらに明らかにしていく必要がある。日本人肝臓がん患者のゲノムシークエンスを行った結果、肝臓がんにおいて一般的にがん抑制因子として働く核内レセプターHNF4Aの変異体が多数検出された。よって本研究においては、これらHNF4A突然変異体の機能解析および他の変異遺伝子との遺伝学的相互作用解析を行うことを目的とした。その結果、これら変異体の機能不全は特定の結合領域に対する結合親和性の低下が原因であることが明らかになった。また、その変異体がそのタンパク発現、核内局在に関係なく転写活性能を減少させることを明らかにした。さらに、HNF4AのZn fingerドメインおよびリガンド結合ドメインに顕著に変異が認められることが明らかになった。すでに申請者はHNF4A結合配列を有するリポーターを作成し、配列依存的にHNF4A突然変異体の機能が変化するかについての検討を開始している。これまでに6種類のHNF4A突然変異体を作成し、特に3つの変異体においてはHNF4Aの転写活性が著しく低下することを明らかにしている。非常に興味深いことに、これらのアミノ酸配列は3次元構造上非常に近接した位置関係にあることがin silicoの構造解析により明らかになっており、タンパク質の高次構造と変異のポジショニングの関係の重要性が示唆された。さらに、申請者はHLE、HLFといった非分化型の肝癌細胞株においてはHNF4Aの発現が高分化型の肝癌と比較して低いことを明らかにしている。これまでに前年度予定していた実験はほぼ終了しており、作成した変異体のLoss-of-Function作用が認められている。核内局在、発現等には全く問題がないことから、おそらくZnフィンガー領域に近接した変異が何らかの形でタンパクの高次構造を妨げ、それによりHNF4Aの機能が失われている可能性が考えられる。以上より、得られた結果について本年度中の論文投稿に向けて本申請で予定されている追加実験を行っている。機能解析を行った結果、これらの変異はZnフィンガー領域に多く認められ、核内における局在を変化させることなく、タンパク発現レベルも変化させることなしに変異が誘導されるとDNA結合能が著しく失われることが前年度の研究で明らかになっていた。前年度に引き続き、論文投稿にむけてさらなる追加解析を行ない、Znフィンガー領域以外の変異に関しても解析を進めた。Znフィンガー領域の変異と比較するとその転写活性が完全に失われることはなかったが、転写活性に減少傾向が認められた。おそらく変異が、他の因子との結合領域に認められることから、DNAへの結合よりも他の因子との結合に影響を及ぼすことが推察される。また、他の国際プロジェクトのデータを解析し、本研究以外にも肝癌においてHNF4Aの変異が存在することが明らかになった。以上のデータを含めた論文を執筆するとともに来年度中には投稿を予定している。今後は、通常の細胞に内在性の変異を誘導することでHNF4Aに誘導される変異の重要性をさらに明らかにしていく必要があると考えている。本年度中に得られた結果を学会発表するとともに投稿論文としてまとめ、発表することを目的とする。さらに遺伝子編集を行うことで人工的に遺伝子配列を変換したHNF4Aを発現する細胞を作成し、機能的な解析を行う予定である。また、臨床サンプルの解析からHNF4Aの遺伝子変異が認められるサンプルにはp53やb-cateninなどのドライバー遺伝子にも変異があることが明らかになっている。そこでHNF4Aおよびこれらドライバー遺伝子の両方に変異があった場合肝癌細胞にどのような変化が起こるかを検証する。分子生物学
東南アジアにおける吸血節足動物媒介性ウイルスの網羅的探索とリスクマップ作製

東南アジアにおける節足動物媒介性ウイルスのリスクマップ作製に向けて、それらが保有するウイルスを網羅的に探索した。フィリピンの捕集蚊からnegevirusグループに属する新規ウイルスを2株分離し、1株をBustos virusと命名した。哺乳類細胞に強いCPEを認めた蚊プールからNGS法により、ピコルナウイルス様、Tanay virusおよびソベモウイルス様配列を得た。マレーシア捕集のマダニ3属をウイルス分離に供し、ベトナム捕集のオオサシガメから、哺乳類細胞で増殖性を示す新規フレボウイルスを分離した。ベトナム捕集蚊と保有ウイルスの情報をもとに、リスクマップ作製に向けたウイルスマップを試作した。東南アジアにおける節足動物媒介性ウイルスの自然界での多様性の実態把握を目標とし,フィリピン・ベトナム・韓国から得られる,蚊・ダニ類が保有する未知の病原ウイルスをRDV法および次世代・第三世代シーケンサーを使用して網羅的かつ総合的に探索し,東南アジア地域からの蚊・ダニ媒介性ウイルス感染症の日本への侵入監視,アウトブレークに対応する危機管理体制構築に貢献することを目指した.2010年フィリピンのルソン島の各地で捕集されたネッタイシマカ,ヒトスジシマカ,クロヤブカ属蚊をウイルス分離に供した.合計44プールの蚊乳剤をC6/36細胞に接種し,続く2回の盲継代を行った結果,クロヤブカ属蚊の5プールにおいて強い細胞変性効果が観察された.既知ウイルス(フラビウイルス,トガウイルス,ブニヤウイルス,レオウイルス)の遺伝子検出を試みたが全て陰性であったが,新規ウイルスの存在が予想されため,引き続きこれらの培養上清から抽出したRNAをもとに,次世代シークエンサーによる解析を行い,ウイルス種の同定を目指している.一方,国内で捕集されたマダニ類のプール乳剤をBHKあるいはVero細胞に接種し,培養上清よりRNAを抽出した.CPEが観察された1プールに関しては,Nextera XTシステムを用いてアンプリコンを作成し,50サイクル用のreagent kitを用いてMiSeqで2回の解析を行った.1回目は8検体で約1,600万リード,2回目は3検体で約1,600万リードのデータが得られた.PCによる解析ではローカルブラストとマッピングを行った.フィリピンでのマダニ調査は,ロスバーニョス市内の植物園・大学構内および郊外の牧場・林道等でフランネル法の指導を行なったが,オウシマダニ幼虫が少数採集されただけであった.今後の調査に関してフィリピン大学マニラ校のBertuso准教授と打ち合わせた.2010年フィリピンのルソン島各地において捕集されたクロヤブカ属雌成虫を用いてC6/36細胞に接種しウイルス分離を行った結果、強い細胞変性効果(CPE)が観察された。しかし、既知のアルボウイルスプライマーを用いたRT-PCRではウイルス種同定には至らなかったため、次世代シークエンサーを用いた網羅的な配列解析を行った。CPEが観察された細胞の培養上清を回収し、濃縮および精製を行った後にヌクレアーゼによる細胞由来核酸の除去を行った。さらにヌクレアーゼ処理後の溶液からRNAを抽出し、cDNAの合成ならびに増幅を行い、Miseqによるde novoシークエンスを行った。その結果、ピコルナウイルス様の配列が見出され、総リード数の過半数を占めていた。その他に、Tanay virusやソベモウイルス様の配列が見出された。現在は、得られた配列をもとにウイルスゲノム全長の決定し、分子系統解析や電子顕微鏡による観察を試みており、分離されたウイルス種の同定を目指している。ロンドン自然史博物館およびオックスフォード大学自然史博物館において、東南アジア産吸血性双翅目昆虫の標本調査を実施した。本件により、東南アジア産の節足動物の分類が可能になった。フィリピンルソン島南西部のLaguna省、Cavite省、Quezon省においてフランネル法によりマダニの採集を行った。草地、落ち葉のつもった林内、牧場等、持ち主の許可が得られた場合のみ家畜より直接採集を行った。1ヵ所あたり4もしくは5名で30分間行った。計11ヵ所で採集し、採集個体はラボに持ち帰り同定した。結果、少なくとも7箇所でオウシマダニが採集され、旗摺り法では幼虫のみ採集された。家畜(牛)からは若虫及び成虫が採集された。採集個体はウイルス分離に供した。国内では、サシチョウバエが十数匹しか得られず、ウイルス分離も結果が出なかった。東南アジアにおける節足動物媒介性ウイルスの自然界での多様性の実態把握を目標とし、蚊、ダニ類が保有する未知の病原ウイルスを網羅的・総合的に探索した。人獣に対する感染リスクを評価するためのリスクマップ作製に資する情報をできるだけ多く収集することが最終目的である。2015年度は、疾病媒介節足動物から分離された病原ウイルスを迅速に同定するために、培養上清からウイルスゲノム以外の核酸を効率よく除去し、ウイルス核酸のみを抽出する方法を開発した。この純化されたウイルス核酸を次世代シーケンス解析に用いることで、迅速かつ網羅的にウイルスゲノムの配列情報を大量に得ることが可能となった。フィリピン捕集蚊より、蚊由来培養細胞C6/36細胞で強いCPEを示す2種類のウイルスを分離した。上記次世代シーケンス解析により約9kbの全ゲノム配列が決定され、未帰属の新規+鎖RNAウイルスグループであるNegevirusに属することが判明した。

1種類は2013年に初めて報告されたNegev virus(フィリピンでは初検出、PL17株と命名)と同定され、もう1種類はNegev virusに比較的近縁な新規Negevirus(Bustos virusと命名)と推定された。Bustos virusのC6/36細胞における増殖は極めて速く、感染後6時間からウイルス粒子が培養上清中に放出され、16時間後にはプラークを形成した。遺伝子構造解析から3つのORFを有すること、ウイルス粒子構成タンパク質の解析からORF3に主要コートタンパク質がコードされていること、ウイルスRNAの解析から感染細胞ではORFをコードするsubgenomic RNAが合成されていることが明らかになった。2015年4月にフィリピン・ルソン島及びミンドロ島においてマダニの分布に関する調査を行った。同地域内に生息している動物の体表にオウシマダニ及びクリイロコイタマダニの咬着を確認した。採取したマダニから、上記実験系によるウイルス分離を試みたが、ウイルスは分離されなかった。疾病媒介節足動物から分離された病原ウイルスの迅速に同定することを目的とし、分離ウイルスサンプルからウイルスゲノム以外の核酸を効率よく除去し、ウイルス核酸のみを抽出する方法を開発した。この純化されたウイルス核酸を次世代シーケンサーを用いて解析することにより、迅速かつ網羅的に分離ウイルスゲノムの配列情報を大量に得ることが可能となった。次世代シーケンス解析において、ウイルスゲノムは昆虫のゲノムと比較すると非常に短いため、リード数が得られ難いという問題点があるが、今年度は、ヒトなどゲノム解析が進んでいる検体からゲノム情報を除去する操作を確立することができた。フィリピンにおけるマダニ調査に関しては、調査地でマダニの咬着が確認された動物はわずかに2種類と非常に少なく、得られたマダニの種類も2種類に留まった。調査地、時期も含めてさらに検討する必要がある。東南アジアにおける節足動物媒介性ウイルスの自然界での多様性の実態把握を目標とし、特に蚊、マダニ、サシガメが保有する未知の病原ウイルスを網羅的・総合的に探索することを目的とした。マダニ:2016年12月にマレーシア(クアラルンプール、ウル・ゴンバック、キャメロンハイランド、フラザーヒル周辺)22地点において、フランネル法により植生マダニを採集し、さらに動物体表に咬着しているマダニを直接採取した。植生マダニはキャメロンハイランド近傍エアパナスの1地点およびフラザーヒルの4地点で採集された。動物体表からは、ゴンバック近傍の2地点において、ヤギ、七面鳥、ネコからマダニが採取された。得られたマダニはキララマダニ属、カクマダニ属、チマダニ属であり、種同定後にウイルス分離に供した。蚊:フィリピンブラカン州において捕集された蚊からNegevirusに属す新規ウイルス2株を分離し、全ゲノム配列を決定した。Culex vishnui由来プールより分離されたウイルスはNegev virusの新規株であり、ヌマカ属より分離されたウイルスはNegevirusグループに属す新規の1本鎖RNAウイルス(Bustos virusと命名)であることを明らかにした。塩基配列解析、電子顕微鏡的観察、ウイルス粒子中タンパク質の配列解析により性状を把握した。
蛋白質におけるガラス転移と水和クラスター構造の相関

本研究では、低温下での蛋白質の内部振動状態と水和構造の相関を調べることを目的として、立体構造が異なる複数の蛋白質の水和構造解析を、低温X線回折実験データを元にして行った。測定対象としては、高分解能での結晶構造解析が可能なトリプシン、リゾチーム、抗体Fvフラグメントを取り上げ、100200Kの間の複数の温度点で回折強度データを収集した。何れの結晶での1.51.4Å分解能までの高精度回折強度データに基づいて構造精密化および水和構造解析を行った。今回測定した温度範囲では、何れの蛋白質でも周辺の水和構造に大きな変化はなく、水和水のネットワーク構造も劇的に変化することはなかった。一方で220K以上の温度での測定では、精度が不十分ではあるものの観測される水和構造が著しく矮小化する傾向にあるという結果が得られており、蛋白質内部振動が水和構造の影響を大きく受けているらしいことが強く示唆された。低温冷却方法における結晶冷却速度を高めるため、従来の低温窒素ガスを用いたフラッシュ冷却法に加えて、液体エタンを利用した急速冷却用装置の開発を行い、上記蛋白質結晶の低温回折実験に適用した。興味あることに、エタン冷却では、蛋白質の熱振動が、フラッシュ冷却よりも見かけ上抑制されることが判明した。これら研究の他に、低温結晶構造解析実験技術を駆使して、シタロン脱水酵素と阻害剤複合体、光応答性ニトリルヒドラターゼの結晶構造解析を行った。