hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
動物卵におけるDNA複製開始の分子機構

ヒトデの未受精卵に存在するDNA複製抑制活性は、連続的に合成される蛋白質と(その下流の)MAPキナーゼ活性に依存していることから、まずヒトデ卵成熟過程におけるMAPキナーゼの活性の変動を調べた。その結果、ヒトデの卵成熟開始に際してのMAPキナーゼの活性化には蛋白質合成は必要でないが、卵成熟後、すなわち減数分裂を完了した後ではMAPキナーゼの活性を保つためには蛋白質合成が必須であることがあきらかとなった。このことはMAPキナーゼの活性化に必要な蛋白質はすでに卵母細胞では合成されて母性蛋白質として存在しているが不活性であり、卵成熟誘起ホルモン(1-methyadenine)の刺激で活性化するものと考えられる。現在これらのMAPキナーゼの活性調節の解析から、どの様な経路でS因子が活性化されるかを、MAPキナーゼの上流にさかのぼって追求しているところである。さらに、未受精卵でのMAPキナーゼの不活性化はDNA複製の開始を招くので、ここでのMAPキナーゼの不活性化の機構を知ることは重要である。ここでもまたMAPキナーゼの活性をコントロールしているのは、MEK(MAPキナーゼキナーゼ)より上流の因子であり、その因子の同定を試みている。この因子を精製していったところ、約55kDaの蛋白質がMEKを活性化する活性を持っていることが明らかになった。現在、この酵素の完全精製とアミノ酸配列の決定を急いでいるところである。
大学生のボランティア学習の評価に関する実証的研究

15年度は本研究の最終年度にあたり、大学生のボランティア学習の評価の妥当性を実習報告の分析及びヒアリング調査によって明らかにした。「授業」で「ボランティア」を課すことに対する学生の戸惑いもあったようだが、実際に彼らは体験することによって成長したと振り返る。また授業として設定されていなければ自らボランティアとして活動をしていなかっただろうとも語っている。彼らの学びに共通する点は、社会教育施設等で実際に子どもと関わり、施設の専門職員と関わったことにある。中学、高校時代の部活動などを除き、異年齢での活動体験が極めて少ない彼らにとって、子どもと活動をともにするのは新鮮に映っていたようだ。おぼろげな子どものイメージから、多様な子どもの実態把握へと認識が高まった。施設職員の多くは義務教育学校の教員であるため、子どもとの関わりや子ども対象の事業に慣れている。それら職員との関わりは学生たちの進路を考える上でも重要であったようだ。現在、「学習ボランテイア基礎」及び「学習ボランテイア実習」はボランテイア体験レポートをもとに評価を行っているが、体験相互の関連性や経験の蓄積を重視した評価システムとしては十分ではなかった。その点で、経験のファイリングをしながら学生の自己主導的な学習を支援するポートフォリオ評価は参考となる。今後、島根大学教育学部では4年間の学部教育の中に1,000時間体験を位置づけることになるが、その基礎としても本研究の意義は大きかった。本年度は概ねふたつの研究成果が得られた。ひとつは、社会教育コース当該研究室で開設している「学習ボランティア基礎」(1単位:第1セメスター)及び「学習ボランティア実習」(1単位:第2セメスター以降に取得)の受講者を対象とした、ボランティア活動体験とその内面化のプロセスを明らかにするための調査法の開発である。「学習ボランティア基礎」では、青少年社会教育施設との緊密な連携によるプログラム開発を行い、そのプログラムに参加した学生に対し、活動の記録を取ったり、学生自身に活動記録や感想を記述させた。「学習ボランティア実習」では、社会教育施設から申し入れのあったボランティア活動のメニューから学生が選択参加し、その成果を報告書としてまとめさせた。それらの記述を分析すると、少年期の体験不足が鮮明となる方で、ボランティア活動への参加にはその穴を埋める可能性があることが明らかとなった。もうひとつは、経験学習やポートフォリオ評価に関する国内外の書籍を収集し、理論的枠組みを構築する文献基礎研究である。国内の文献については原則過去3年間の収集が終わり、分析に入ったところである。国内ではポートフォリオ評価の理論は学校教育、とりわけ「総合的な学習の時間」の中で使用されており、社会教育における学習成果の評価への援用は限られていた。これは学校教育と社会教育の評価観の相違によるものと考えられる。海外の動向を調査するための文献収集を行ったが、学外経験の単位認定に係る各大学への指導的役割を果たす「成人及び経験学習協議会(CAEL : Council for Adult and Experiential Learning)」等の調査研究書等に始まり、教師教育への導入、新しい教育方法へと多様な用いられ方をしている。十分な分析は次年度の課題となるが、ポートフォリオ評価の重層構造を明らかにしたい。ひとつは、昨年度に引き続き当該研究室で開設している「学習ボランティア基礎」(1単位:第1セメスター)及び「学習ボランティア実習」(1単位:第2セメスター以降に取得)の受講者を対象とした、ボランティア活動体験とその活動記録の収集と分析である。今年度は夏期休暇中に実施した中山間地域の小規模小学校での児童との交流学習を記録し、学生への聞き取り調査を行った。その結果、交流学習に向けた準備の過程が教育実習のそれとは質の異なる学びとして内面化されていった様子が明らかとなった。もうひとつは、ミシガン州立大学での現地調査である。サービスラーニングヘの取り組みの状況とポートフォリオ評価の活用の仕方について、担当教官、事務官、学生それぞれにインタビューを実施した。ミシガン州立大学でのボランティア学習はサービスラーニングセンターを中心に行われていた。公的機関から民間企業まで地域のさまざまな組織・団体と連携協力しつつ、数百に及ぶ活動メニューを学生に提供している。地域課題の解決に関するプログラム、障害者支援に関するプログラム、インターンシップに近いプログラム、海外での活動プログラム等多種多彩である。このようなボランティア学習は学生自身がポートフォリオと呼ばれるファイルに綴りながら学習の内面化を図っていた。学生にとってサービスラーニングとは、地域課題への強い関心と真摯な態度を喚起する重要な学習であることが明らかとなった。

現在、「学習ボランテイア基礎」及び「学習ボランテイア実習」はボランテイア体験レポートをもとに評価を行っているが、体験相互の関連性や経験の蓄積を重視した評価システムとしては十分ではなかった。その点で、経験のファイリングをしながら学生の自己主導的な学習を支援するポートフォリオ評価は参考となる。今後、島根大学教育学部では4年間の学部教育の中に1,000時間体験を位置づけることになるが、その基礎としても本研究の意義は大きかった。
広島原爆の中性子とガンマ線量の実験的評価に関する研究

広島長崎の原爆線量評価システム(DS86)は放射線影響研究所と広島大学原爆放射能医学研究所で使用されてきた.しかしながら墓石やかわらなどの測定で、DS86には測定結果との間に矛盾があることが分かり、研究代表者らはその原因を1987年頃より追求してきた.最大の問題は広島の中性子の測定データがDS86に基づいた計算と比べて、大きく違うことであり、たとえば1.5kmでは、5-10倍もデータのほうが大きいことである.そのため(1)データの中で誤差が大きかったり、データ同士の矛盾があるところでの再測定を進め、(2)中性子の輸送計算が間違っている可能性を検討するためのベンチマークテストを行い、(3)日米の共同研究による実測の比較検証、などを進めてきた.新たなデータにより、広島ではデータの正しさがよりはっきりしたし、長崎でのデータ同士の矛盾は、長崎ではDS86が正しいことでほぼ決着した.しかしながら広島では、データとDS86との間にある矛盾の原因については、いまだにコンセンサスは得られていない.しかしながら本研究の代表者は新たに、原爆の底が抜けるように割れ、その結果水平に細く割れ目が出来て、そこから裸の中性子が漏れ出したという考え方を出した.そうすると今まである測定データが、すべて誤差の範囲で矛盾なくあってくることが示せる.この問題は本年1月にあった日米の研究会でアイデアを示したが、一部の実際に計算を担当してきた研究者からの反対はあったが、全体的にはこれで決着であるという雰囲気となった.本研究代表者の主張は、(1)原爆の底が3cmぐらいの薄い幅で水平に割れたこと、(2)中性子の発生高度を100mぐらい引き上げること、(3)原爆出力を20%ぐらい引き上げること、である.アメリカ側の今後の更なる検討を見守りたい.広島長崎の原爆線量評価システム(DS86)は放射線影響研究所と広島大学原爆放射能医学研究所で使用されてきた.しかしながら墓石やかわらなどの測定で、DS86には測定結果との間に矛盾があることが分かり、研究代表者らはその原因を1987年頃より追求してきた.最大の問題は広島の中性子の測定データがDS86に基づいた計算と比べて、大きく違うことであり、たとえば1.5kmでは、5-10倍もデータのほうが大きいことである.そのため(1)データの中で誤差が大きかったり、データ同士の矛盾があるところでの再測定を進め、(2)中性子の輸送計算が間違っている可能性を検討するためのベンチマークテストを行い、(3)日米の共同研究による実測の比較検証、などを進めてきた.新たなデータにより、広島ではデータの正しさがよりはっきりしたし、長崎でのデータ同士の矛盾は、長崎ではDS86が正しいことでほぼ決着した.しかしながら広島では、データとDS86との間にある矛盾の原因については、いまだにコンセンサスは得られていない.しかしながら本研究の代表者は新たに、原爆の底が抜けるように割れ、その結果水平に細く割れ目が出来て、そこから裸の中性子が漏れ出したという考え方を出した.そうすると今まである測定データが、すべて誤差の範囲で矛盾なくあってくることが示せる.この問題は本年1月にあった日米の研究会でアイデアを示したが、一部の実際に計算を担当してきた研究者からの反対はあったが、全体的にはこれで決着であるという雰囲気となった.本研究代表者の主張は、(1)原爆の底が3cmぐらいの薄い幅で水平に割れたこと、(2)中性子の発生高度を100mぐらい引き上げること、(3)原爆出力を20%ぐらい引き上げること、である.アメリカ側の今後の更なる検討を見守りたい.広島長崎の原爆線量の評価体系はDosimetry System1986(DS86)と呼ばれ1986年に日米の共同研究の結果定められた。この線量評価体系DS86は放射線影響研究所で使われ、その後広島大学や長崎大学でもそれをもとにした線量評価体系(ABS93D)が使われている。DS86が決められてまもなく、我々の研究グループが初めて広島の中性子線量についての疑問-すなわち広島原爆から放出された中性子により放射化された放射能の測定値とDS86に基づいた放射能の量を比較したところ大きなずれがあること指摘した。その後新たなデータが追加される毎にその疑問が確信され、アメリカ側もついに矛盾が存在することを認知するに至った。昨年(1996年5月)日米の会議が開かれ、日米の共同研究が再開されることになった。本研究の目的はこの日米会議の前から提案されていたものであり、日米の会議ではそっくり認知された。その主な内容は以下のとうりである、(1)広島の遠距離の被爆資料を集めDS86とのずれが本当かどうか確認する、(2)被曝した銅を集め速中性子線の実測を試みる、(3)長崎の被曝岩石や鉄試料を集め長崎では実測値とDS86とが合っているのか違っているのか確認する。(1)については広島商業高校(約2km)や、糧秣廠(約3km)などの試料を集めた。まださらに1件ほど収集の必要があると考える。(2)については原爆資料館にその試料があるので交渉中である。(3)は一部測定が終了したが研究グループとの間に矛盾があり、今後相互比較が必要である。そのほかこれらの問題を解決するために、原爆の爆発過程をを考慮に入れて原因を究明する努力をしている。そのために測定を続けると同時に、そのデータとモンテカルロコードMCNPを使って計算した値とを比較している。

我々は広島長崎の線量評価システム(DS86)に基づく計算と広島で集めた試料から得た実証データからの推定線量との比較を行い、その間の違いを検証した。1)爆心から1Km以遠での資料から測定した152Eu/Eu,60Co/Coデータについて、信頼性確保のため、資料の中に含まれるバックグランドの存在について検討した。その結果、バックグランドとなる60Coは、コントロール試料中に含まれていないことを確認し、データの正しいことを立証した。(60Co-静間、152Eu-中西)2)速中性子の核反応63Cu(n,p)63Niで生成される63Niは、元安橋橋柱の中にあった被爆銅線からは殆ど検出されず、速中性子の影響が少なかったことを示した。(柴田)3)測定からは中性子の影響は近距離で少なく遠距離では計算値より大きいことを示すので、2成分に分けて考えることを提案し、爆発過程での新しい仮説を提案した。(星)4)深度分布の測定は試料が近距離で測定精度がよいため計算と比較するのに大切である、計算との違いを再度検討するため、岩石中の水分の含有量を再測定した。(岩谷)これらの結果を、平成9年10月広島で開いた研究会(葉佐井ほか分担者一同)に持ち寄り、検討をくわえた。その結果、測定には特に疑問点は見つからず、DS86の計算を担当した米国側に我々のデータを示し、中性子の輸送計算を含め再検討するよう要請することとした。11月には岡山で2度目の研究会を持ち、さらに検討を重ねた結果、63Niについては広島の原爆資料館にある避雷針の銅の試料についても測定する(柴田)、深度分布については計算見直しを行う(星、岩谷,岡)長崎の中性子の振る舞いも視野に入れ長崎の試料採取も含め即定数を増やし改めて検討することとした(静間、中西)。広島原爆の中性子とガンマ線量の実験的再評価を行ってきたが中性子線量についてはDS86と比較して系統的な違いがだんだんと明らかになってきた。再確認の作業と検証結果を次に示す。1.広島の中性子の系統的なずれについては、すでに確認されているが、近距離で測定値が小さく遠距離では大きい値を示す。近距離についてはデータも多くまた残留放射能も多いので疑う余地はない。遠距離は極微量放射能の測定になるため、天然中性子による影響について静間らが実験的に検証した。また誤差の扱いについては問題ないことを遠藤が多くのデータを整理して確認した。2.測定の信頼性を高めるための、各測定グループごとの測定の相互比較は、Euについては静間と中西で相互に行った。またその資料をアメリカに送りStraumeに加速器質量分析法での測定を依頼しClのデータを得た。その結果相互に同じ傾向が見られた。3.銅のサンプルの測定Cu(n,p)Niから速中性子の線量が直接測れる可能性がある。今年度広島平和資料館から新たに銅の資料が得られたので(避雷針-800m)現在柴田らが測定中で結果について期待している。4.長崎と広島では原爆の構造も違うので長崎のデータも重要となる。そこでわれわれで測定し直すことにし、資料収集から初め今年度藤田らにより収集が終了した。現在化学処理を行っている。5.日本側から原爆が割れたとき、その隙間から核分裂中性子が漏れたのではないかと星らが具体的に提案した。アメリカ側は否定したが計算について検討することを約束した。
新しい”待ち伏せ”照射法の開発～複数箇所で狙い撃つ～

動体追跡(RTRT)装置を用いて体幹部定位放射線照射を行った肺癌患者において、治療前の四次元CT(4DCT)の有用性を評価した。4DCTで計測した腫瘍移動長とRTRT装置で計測した腫瘍移動長の差異を算出した。結果、上中葉では、左右平均1.3 ±1.1 mm,頭尾平均0.6 ±3.1 mm,腹背平均1.1 ±1.7 mmであった。下葉では、左右平均5.7 ±8.0 mm,頭尾平均12.5 ±16.7 mm,腹背平均6.8 ±8.5mmであり、下葉の方が差異は大きいことが明らかとなった。肺下葉症例では4DCT計測で動きが過小評価されていることに注意が必要である。(1)マーカー移動のデータの検証北大病院における肺癌動体追跡放射線治療(RTRT)患者で呼吸同期CT(4DCT)を撮像した18名について、肺内に留置したマーカー移動の照射中とCT撮像時の比較・検討を行い、口頭発表した(Can 4DCT Imaging Predict Lung Motion During Stereotactic Body Radiation Therapy?2013年9月24日アトランタ)。マーカーの最大振幅の平均は、4DCT MIPで左右3.6±1.3mm,頭尾6.8±4.5mm,前後5.4±2.6mmであった一方、RTRTログで左右5.7±2.9mm,頭尾14.4±16.3mm,前後8.1±4.3mmであり、左右・頭尾・前後の三方向いずれでも統計学的有意差(左右p =0.0011,頭尾p =0.0391,前後p =0.0263)を認めた。腫瘍の存在部位ごとに同様の比較検討を行った。以上の結果から肺内留置マーカーの動きを最大振幅で比較すると、4DCTで測定した振幅は定位放射線治療中のRTRTシステムで得た追跡ログデータで観察された振幅よりも過小評価されていることが分かった。今後、さらに症例数を追加したうえで論文投稿に向けて準備中である。また、肺癌に対するRTRT施行を行った患者の治療成績に関しても解析し、同学会で発表した。(2)各呼吸位相における動きの解析と予測モデル作成(1)の結果をもとに、腫瘍中心の動きと各マーカーの動きが、呼吸位相の中のどの部分で適合し、どの部分で適合しないのかを320列CTで検討すべく準備中である。(1)マーカー移動のデータの検証北大病院における肺癌動体追跡放射線治療(RTRT)患者で呼吸同期CTを撮像した11名について、肺内に留置したマーカー移動の照射中とCT撮像時の比較・検討を行い、発表した(照射中と4DCT撮像時の肺内マーカー移動の比較第26回日本高精度放射線外部照射研究会2013年2月23日京都)。年齢69-89歳で中央値80歳、肺葉(上葉5,中葉1,下葉5)であった。データ取得時間は4DCTでは平均108秒(88-140)、RTRT時では1回照射あたり平均1014秒(395-1786)であった。4DCT画像での振幅は、左右方向(LR)平均3.9mm(1.9-6.4)、頭尾方向(CC)平均7.2mm (1.9-18.5)、腹背方向(AP)平均5.3mm(3.4-8.4)。RTRT中における振幅は、LR平均6.6mm(1.7-12.6)、CC平均18.5mm(2.4-52.3)、AP平均9.5mm(2.3-17.9)。3方向のいずれも統計学的有意差(LR: P=0.0060, CC: P=0.0420, AP: P=0.0227)を認めた。さらに症例数を追加し、20名程度の症例数で学会発表準備中である。また、当該年度の前半においては肺腫瘍の動きにも影響をあたえる胃についても、胃粘膜下に留置した金マーカーの動きについて解析し、発表した。(2)各呼吸位相における動きの解析と予測モデル作成(1)の結果をもとに、腫瘍中心の動きと各マーカーの動きが、呼吸位相の中のどの部分で適合し、どの部分で適合しないのかを検討すべく準備中である。(1)マーカー移動のデータの検証

肺腫瘍と同様の呼吸性移動対策を行った腎・副腎腫瘍に対する体幹部定位放射線治療の全国多施設研究の解析結果を、米国放射線腫瘍学会(Japanese Multi-institutional Study of Stereotactic Body Radiation Therapy For Renal and Adrenal Tumors. 2014年9月14日サンフランシスコ)で発表した。昨年度発表した、肺内に留置したマーカー移動の照射中とCT撮像時の比較・検討に内容に症例を追加し、医学統計学分野部門の協力のもと分散成分の解析などをすすめた結果、"CT計測での移動距離10mm以上"と"肺下葉"が、照射中とCT撮像時のマーカー移動距離の差に寄与したことがわかり、現在論文作成中である。肺腫瘍の動きにも影響をあたえる胃についても、胃粘膜下に留置した金マーカーの動きについての解析内容(2012年米国放射線腫瘍学会発表済み)について論文完成し、現在国際誌に投稿準備中である。(2)各呼吸位相における動きの解析と予測モデル作成16列CTでは機器性能の限界のため腫瘍中心の動きと各マーカーの動きの詳細な検討が困難であった。より高速かつ高画質で撮像できる320列CTを用いることとし、肺腫瘍の動きを評価するための準備として、ファントム実験を行った。実験では、各サイズの模擬腫瘍を用いた上で、多様な呼吸性移動のパターンを想定して320列CTでの撮像を行い、CT画像の画質を保持し被ばく線量を低減するための撮像プロトコルを検討した。結果は学会発表予定である。今回の研究目的である、複数箇所での"待ち伏せ"照射を可能にする新たな放射線治療方法の概念を実現するための特許出願を行った(放射線治療システムおよび放射線治療プログラム、2015-008434)。医歯薬学照射中と4DCT撮像時の肺内マーカー移動の比較に関しては、症例を追加し論文投稿準備中である。遅れている点としては、平成25年度中に北海道大学病院に複数マーカーが追跡可能となる新しいRTRTシステムが導入され、新しい装置で得られた放射線治療中の各マーカーの移動データを解析し、呼吸位相の動きの解析等を行う予定であったが、平成25年度中には臨床使用が開始されなかったため。当初の予想よりも動体追跡照射を行う患者数が少なかったが、概ね順調と評価する。照射中と4DCT撮像時の肺内マーカー移動の比較に関しては、予備的な結果を発表し、症例を追加した結果を学会発表準備中であるため。予備的な結果を得ることができたので、各呼吸位相の動きの解析に関してはこれから準備し検討する予定であるため。呼吸同期CTで得られる動きのデータの検証については、平成25年9月の米国放射線腫瘍学会の発表でも注目された内容であり、平成26年度中に論文完成し投稿予定である。また、現在使用している16列CTと比べて時間分解能および空間分解能に優れる320列CTを用いて各呼吸位相における動きの解析と予測モデル作成をすすめていき、新しい放射線治療計画方法の確立を目指す。呼吸同期CTで得られる動きのデータの検証については、症例を蓄積し、平成25年度中に学会発表を行った後、論文作成に着手するとともに、各呼吸位相における動きの解析と予測モデル作成をすすめていく。また、現在の照射法での問題点を明らかにしていくために、これまでの肺癌動体追跡放射線治療の成績についても検証を行っていく。平成25年度は、年度途中の8月から11月初旬までの3ヶ月間、米国に短期留学する機会があったため、当初の予想よりも旅費において未使用分が発生した。平成26年度では、旅費の他に英文校正など論文投稿にともなう費用やハードディスクの追加購入など物品購入費に使用する予定である。平成24年度は、物品の購入費が安価であったため、未使用分が発生した。また当初の予想よりも患者数が少なかったため、ノートパソコンの性能でも十分に処理できるようなデータ量であった。平成25年度では、物品購入費に使用する予定である。
ドーパミンシグナリングと内因性カンナビノイドシステムの関連性の検討

中枢神経系において内因性カンナビノイドはシナプス逆行性に作用し、プレシナプスからの神経伝達物質の遊離を抑制することが知られている。本研究で、我々は、グリア細胞が長期間、高濃度のドーパミンに曝露されることにより、PLCβ4(2-AG合成酵素)の発現上昇と、MGLL(2-AG代謝酵素)の発現低下を介して、2-AGシグナリングを上昇させることを明らかにした。これらの結果から、シナプスにおけるドーパミン濃度が長期にわたり上昇するような状況下では、グリア細胞由来の内因性カンナビノイドがドーパミンシグナリングの調節に積極的に関与している可能性が示唆される。本研究は、様々な依存性薬物の薬理作用や薬物依存形成に関与していることが示唆されている内因性カンナビノイドシステムとドーパミンシグナリングとの関連性を、ドーパミン神経モデルであるPC12細胞を用いた実験系により明らかにすることを目的としたものである。今年度は、PC12細胞における内因性カンナビノイドシステム関連遺伝子発現に対するドーパミンの作用を中心に検討した。対象遺伝子は、カンナビノイド受容体(CB1、CB2、TRPV1)、内因性カンナビノイド合成酵素(NAPE-PLD、PLCβ4、DAGLα)、内因性カンナビノイド代謝酵素(FAAH、MGLL)とし、内部標準遺伝子はHPRTとした。次に、PC12細胞における対象遺伝子の発現状態に対するドーパミン単回曝露の影響について、その刺激時間依存性ならびに刺激濃度依存性についての検討を行った。PC12細胞を10μMあるいは100μMのドーパミンで0.5、1.5、3、6、12、24時間刺激し、各刺激時間における対象遺伝子の発現量をRT-PCR法で確認した。その結果、対象遺伝子のうち、MGLLにドーパミンの刺激時間依存性ならびに刺激濃度依存性の発現変化が認められ、100μMのドーパミンで6時間以上刺激することにより有意に発現が低下することが認められた。本研究は、様々な生理機能に関与している内因性カンナビノイドシステムとドーパミンシグナリングとの関連性を解明することを目的としており、今年度は、中枢神経系において最も多く存在するグリア細胞における内因性カンナビノイドシステムとドーパミンシグナリングの関連性について検討した。培養ラットグリオーマ細胞(C6)をドーパミン等で刺激した。刺激は3日間行い、1日毎にサンプルを回収し、RNAを抽出後、RT-PCR法によりECS関連遺伝子の発現を比較した。対象遺伝子は、CB1、NAPE-PLD、FAAH、DAGLα、PLCβ4、MGLLとし、内部標準遺伝子としてHPRTを用いた。ドーパミン刺激によりPLCβ4の発現上昇とMGLLの発現低下を認めた。これらはそれぞれ、内因性カンナビノイドの一つである2-AGの合成と代謝に関与する酵素である。次にC6におけるドーパミン受容体の発現状況を確認した結果、D1様受容体としてD1の発現を認め、D2様受容体としてD3およびD4の発現を認めた。さらにD1様およびD2様受容体アゴニストを用いて刺激した結果、D1様受容体アゴニスト刺激により、ドーパミン刺激と同様の発現変動を認めた。以上の結果から、グリア細胞はドーパミンレベルの上昇をD1受容体を介して感知し、2-AGの合成を高めるとともに、その代謝を抑制することで、2-AGを介したシグナル伝達を増強させることが示唆された。中枢神経系において、内因性カンナビノイドはシナプス逆行性に作用することにより、各種神経伝達物質の放出を抑制することが知られていることから、グリア細胞は内因性カンナビノイドシステムを介してドーパミンシグナリングを抑制的に調節している可能性が示唆される。C6を比較的高濃度のドーパミンで長期間処理することにより、2-AGの産生酵素であるPLCβ4の発現上昇と代謝酵素であるMGLLの発現低下がmRNAレベルで確認された。また、これらの発現変化はドーパミン受容体選択的アゴニストを用いた検討より、D1様受容体を介する作用により生じていることが示唆された。本研究は、様々な生理機能に関与している内因性カンナビノイドシステム(ECS)とドーパミン(DA)シグナリングとの関連性を解明する事を目的としている。まず、培養ラットグリオーマ細胞(C6)におけるECS関連遺伝子に対するDA曝露の影響について検討したところ、DA処理によりPLCβ4の転写レベルの上昇とMGLLの転写レベルの低下が認められた。次に、DA処理により生じる変化が、DA受容体を介した作用か否かを確認することとした。C6にはD1様受容体としてD1が、D2様受容体としてD3とD4を認められ、それぞれの受容体に対するアゴニストを用いてC6を処理した結果、D1様受容体アゴニスト処理によって、DA処理と同様の変化を認めた。DA処理により転写レベルが変化するPLCβ4とMGLLはそれぞれ、内因性カンナビノイドの一つである2-AGの合成と代謝に関与する酵素である。そのためDA曝露によりC6における2-AGの代謝回転に変化が生じている可能性が示唆される。そこで、C6をDAで前処理した後、カルシウムイオノフォアによって培養上清中に誘導される2-AGを定量した。その結果、2-AGはコントロール群に比しドーパミン前処理群において、その前処理時間依存的に有意に高くなった。内因性カンナビノイドはシナプス逆行性に作用することで、プレシナプスからの神経伝達物質の遊離を抑制することが知られている。

また本研究結果より、長期間高濃度のDAで処理することにより、C6における2-AG産生能が上昇することが確認された。以上のことから、シナプスにおいてDAが長期にわたり上昇するような状況下では、グリア細胞の2-AGシグナリングが強化され、シナプス間におけるDAシグナリングの調節に対し、グリア細胞由来のECSが積極的に関与している可能性が示唆される。中枢神経系において内因性カンナビノイドはシナプス逆行性に作用し、プレシナプスからの神経伝達物質の遊離を抑制することが知られている。本研究で、我々は、グリア細胞が長期間、高濃度のドーパミンに曝露されることにより、PLCβ4(2-AG合成酵素)の発現上昇と、MGLL(2-AG代謝酵素)の発現低下を介して、2-AGシグナリングを上昇させることを明らかにした。これらの結果から、シナプスにおけるドーパミン濃度が長期にわたり上昇するような状況下では、グリア細胞由来の内因性カンナビノイドがドーパミンシグナリングの調節に積極的に関与している可能性が示唆される。平常状態のPC12細胞における内因性カンナビノイドシステム関連遺伝子のうちCB1、NAPE-PLD、DAGLα、FAAH、MGLLについてはRT-PCR法により検出可能であり、さらにMGLLの発現量が、ドーパミン単回曝露により、その刺激時間ならびに刺激濃度依存的に低下することが認められた。今年度の結果から、C6をドーパミンで長期間処理することにより2-AGの代謝回転に変化を生じている可能性が示唆される。これまでは、遺伝子発現の変化に着目し、検討を行ってきたが、次年度は内因性カンナビノイドの代謝回転が実際に変化しているのかについて、質量分析の手法を用いて詳細に検討する予定である。法医学今年度の結果を踏まえ、NGFによりPC12細胞を分化誘導させた場合において、平常状態のPC12細胞と比し、検討対象遺伝子群の発現状態に変化が認められるか検討する予定である。また、ドーパミン単回曝露により認められたMGLLの発現低下の詳細なメカニズムについて解析するとともに、ドーパミンの内因性カンナビノイドシステム関連遺伝子の発現に対する作用について、単回曝露だけでなく長期曝露することで生じる変化について確認する予定である。研究計画書に基づき、研究活動遂行に必要な物品を購入してきたつもりではあるが、細かいところまで調整することができなかった。研究計画書に基づき、研究に必要な試薬、物品等を購入してきたつもりであるが、今年度は数百円単位までは調整することができなかった。研究計画書に基づき研究活動遂行に必要な物品購入に使用する予定である。また次年度は最終年度にあたるため、これまで以上に計画的に使用する。研究計画書に基づき、研究活動に必要な試薬や物品等の購入に使用する予定である。
ナノ薄膜触媒の開発と省貴金属触媒への応用

これまでアークプラズマ法によってRhナノ薄膜を形成した耐熱性SUS箔を高密度ハニカム形状に加工した触媒が実用的な三元触媒反応の条件下において粉末触媒を用いた従来型ハニカムと同等以上の高い自動車排ガス浄化性能を発現することを実証した。しかし本触媒は実用環境を想定した高温雰囲気において著しい劣化を引き起こした。従って本年度は耐熱性SUS箔とRhナノ薄膜の間に新たに金属の中間層を構成することで熱劣化を抑制する手法を検討した。この結果、中間層にZrを用いた場合に劣化要因となるSUS内部からのAl2O3の析出をとどめる効果が認められ、Rh薄膜構造の安定性を高めることで熱劣化を抑制できた。またこれまでの研究で本触媒の高い性能はRhナノ薄膜のCO-NO反応に対する活性点当たりの触媒回転速度がRhナノ粒子と比較して2桁近く高いという特異な現象に起因することを実証した。しかしその具体的な発現要因は明らかでなかった。そこで本年度はRh薄膜上でのCO-NO反応の反応機構を速度解析や計算化学的な手法を用いて推測しRhナノ粒子と比較した。これらの解析によりRh上でのCO-NO反応において反応の律速となると推測されるN原子の再結合のステップにRhナノ薄膜がRhナノ粒子より有利であることがRhナノ薄膜がCO-NO反応に対して高い触媒回転速度を発現する要因であると結論した。以上の成果を学術論文3編として公表した。本研究では不均一な表面が対象となるため反応機構の解析に不向きな従来のナノ粒子(粉末)でなく、金属のナノ薄膜という表面科学の研究対象に近い素材でありながら高い性能を持つ材料に着目したことで実用性能と反応機構の両立に近づくことができた。これらの成果は省貴金属で高性能な次世代触媒の画期的な合成法を開拓するための足掛かりとして期待できるものである。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。当年度は、自動車排気浄化のための新規な三元触媒の開発を目的とし「きわめて高い触媒回転速度(TOF)を発現するナノ薄膜触媒」に着目して1種々の金属を用いたナノ薄膜触媒の調製2マグネトロンスパッタ(SP)などで調製した参照試料とアークプラズマ(AP)法試料との性能比較3新規なメタルハニカム触媒への応用展開の三点について研究を進めた。1ではAP法を用いて耐熱性SUS箔上に種々の貴金属および遷移金属のナノ薄膜を析出させ、その構造と触媒特性を評価した。遷移金属のナノ薄膜はほとんど活性を示さなかったが、貴金属を用いたナノ薄膜はRhのNO-CO反応やPtのCO、HCの酸化反応等で高TOFが認められ、部分的に従来触媒と同等以上の浄化性能を示した。この結果ナノ薄膜化による高TOFの発現は金属元素だけでなく反応の種類にも依存することが明らかとなった。2では、AP調製したRhナノ薄膜触媒の活性および安定性をSP調製試料と比較した。調製直後の両試料は三元触媒反応にほぼ同等の活性を示したが、昇降温を繰り返した後、SP試料のみ活性失活がみられた。XPS等を用いた分析よりSP試料の失活挙動はRh表面濃度の減少が要因とみられ、APによって形成するRhナノ薄膜はSUS箔表面への強い蒸着に由来し、SPと比較して熱的に安定であることが判明した。3では、超高密度メタルハニカムの作成を行った。ナノ薄膜触媒は多孔性を有さず粉体と比べ表面積が低いという欠点を有する。そこでSUS箔を高度に集積したハニカムを設計し、体積あたりの幾何学表面積を大幅に増加させハニカムトータルの浄化性能の底上げを目指した。作成したセル密度10000cell/in2のメタルハニカムは、三元触媒模擬反応(SV=76000 h-1)において、実用されているセル密度(900 cell/in2)のものと比べ反応温度が各成分2030 °C低温となった。本研究は、厚さ数ナノメートルの貴金属薄膜表面で発現するきわめて高い触媒回転速度(TOF)に着目し、その機能-構造相関および触媒反応機構を解明するとともに、新規なメタルハニカム触媒への応用展開を図り、次世代自動車触媒の基盤技術を創生することを最終目的としている。本目的の達成には第一に、ナノ薄膜化することで特定の反応に対し高いTOFを発現する金属種を特定する必要がある。該当年度の研究により、RhおよびPtの一部の反応では従来粉末(ナノ粒子)よりナノ薄膜がはるかに高いTOFを示すことが分かった。とりわけRhがNOに関与する反応で顕著であり、粉末より高い浄化性能を達成する最も有望な系であることが明らかとなった。また、ナノ薄膜の厚さおよび均一性の制御、材料の熱安定性といった観点からアークプラズマ法による調製がナノ薄膜触媒に有用であることがマグネトロンスパッタ調製試料との比較より分かった。表面積が小さいというナノ薄膜触媒の欠点をカバーするための手法として、超高密度メタルハニカムの作成を試みた。10000 cell/in2というセル密度は粉体の厚いウォッシュコート層(約40 μm)を有する従来のハニカム触媒では不可能であり、触媒層がわずか数ナノメートルという本材料の利点を生かした独自のアプローチである。本手法とナノ薄膜の高TOFの相乗効果により実車環境を想定した三元触媒模擬反応の浄化試験(SV=76000 h-1)においてより高効率な排気浄化を達成できた。

本研究は触媒材料の構造、調製法、ハニカム設計に至るまで全てが従来触媒と大きく異なり、様々な手法による独自性の高い成果を創出できる。今後は異種金属の複合化など続くナノ薄膜材料の開発に加え、高TOFが認められた系に対しナノ薄膜の構造物性相関を明らかにするとともに反応分子や反応速度にも着目して高TOFの発現機構に関する知見を深める必要がある。これまでアークプラズマ法によってRhナノ薄膜を形成した耐熱性SUS箔を高密度ハニカム形状に加工した触媒が実用的な三元触媒反応の条件下において粉末触媒を用いた従来型ハニカムと同等以上の高い自動車排ガス浄化性能を発現することを実証した。しかし本触媒は実用環境を想定した高温雰囲気において著しい劣化を引き起こした。従って本年度は耐熱性SUS箔とRhナノ薄膜の間に新たに金属の中間層を構成することで熱劣化を抑制する手法を検討した。この結果、中間層にZrを用いた場合に劣化要因となるSUS内部からのAl2O3の析出をとどめる効果が認められ、Rh薄膜構造の安定性を高めることで熱劣化を抑制できた。またこれまでの研究で本触媒の高い性能はRhナノ薄膜のCO-NO反応に対する活性点当たりの触媒回転速度がRhナノ粒子と比較して2桁近く高いという特異な現象に起因することを実証した。しかしその具体的な発現要因は明らかでなかった。そこで本年度はRh薄膜上でのCO-NO反応の反応機構を速度解析や計算化学的な手法を用いて推測しRhナノ粒子と比較した。これらの解析によりRh上でのCO-NO反応において反応の律速となると推測されるN原子の再結合のステップにRhナノ薄膜がRhナノ粒子より有利であることがRhナノ薄膜がCO-NO反応に対して高い触媒回転速度を発現する要因であると結論した。以上の成果を学術論文3編として公表した。本研究では不均一な表面が対象となるため反応機構の解析に不向きな従来のナノ粒子(粉末)でなく、金属のナノ薄膜という表面科学の研究対象に近い素材でありながら高い性能を持つ材料に着目したことで実用性能と反応機構の両立に近づくことができた。これらの成果は省貴金属で高性能な次世代触媒の画期的な合成法を開拓するための足掛かりとして期待できるものである。当初の研究計画に従い主に以下の三項目に沿って研究を進める。1AP法によるナノ薄膜触媒の調製:複数のAP源を組み合わせて複合膜、積層膜、傾斜組成膜など多様な組成・構造制御を検討する。2構造解析および状態:1)1で調製した材料およびこれまでの研究で高TOFを発現した材料に関して、XPS、薄膜XRD等を用いた構造解析を行い、単結晶やナノ粒子(粉末)と異なる二次元構造の特徴を明らかにする。2)解析結果をもとに第一原理計算によりモデル構造を構築し、界面構造および電子状態に関する知見を得る。3触媒反応および機構解析:1)種々の反応に対して、速度解析により触媒回転速度、活性化エネルギー、反応次数などを求める。2)触媒反応状態のin situ赤外反射分光、X線光電子分光などを用いて吸着種および反応機構を解明する。上記を主な方針とし、未だ明確となっていない「ナノ薄膜上での高TOF反応の発現メカニズム」に関する知見をより深化することを最終的な目的とする。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
マルチスケール操作による三次元血管化組織の形成と再生医療への応用

生体組織内部における毛細血管網は、組織が生存するために必須のパイプラインである、一方、培養細胞を用いて生体外で構築する細胞組織体の内部において、毛細血管網を構築させることは未だ達成されていない、本研究では血管内皮細胞に被覆された細胞組織体を高密度に集積し、再組織化を誘導することにより、毛細血管網を有する細胞組織体を構築することを目的として検討を行った、肝細胞と内皮細胞を用いて検討を行った結果、種々の培養デバイス内において、内部に網目状の内皮細胞のネットワークを有する肝・内皮細胞複合組織体の形成誘導が可能であった、またこの手法によって形成された細胞組織体は、細胞生存率ならびに機能の向上が示され、細胞間の相互作用や組織構造の効果が示唆された。以上の結果、本手法は再生医療において有望視される血管化組織を構築する基盤技術として有望であると考えられる生体組織内部における毛細血管網は、組織が生存するために必須のパイプラインである、一方、培養細胞を用いて生体外で構築する細胞組織体の内部において、毛細血管網を構築させることは未だ達成されていない、本研究では血管内皮細胞に被覆された細胞組織体を高密度に集積し、再組織化を誘導することにより、毛細血管網を有する細胞組織体を構築することを目的として検討を行った、肝細胞と内皮細胞を用いて検討を行った結果、種々の培養デバイス内において、内部に網目状の内皮細胞のネットワークを有する肝・内皮細胞複合組織体の形成誘導が可能であった、またこの手法によって形成された細胞組織体は、細胞生存率ならびに機能の向上が示され、細胞間の相互作用や組織構造の効果が示唆された。以上の結果、本手法は再生医療において有望視される血管化組織を構築する基盤技術として有望であると考えられる1.スフェロイド集積培養用チャンバーの開発内皮細胞に被覆された肝細胞スフェロイドを高密度に集積し、再組織化を行う培養チャンバーの開発を行った。まず再組織化の過程における流れの影響を評価するために、チャンバー内を培地が循環する灌流型チャンバーの開発を目標とした。そして、高密度にスフェロイドが充填された空間内に破綻なく培地を送液する方法として静水圧に着目し、静水圧駆動型の灌流チャンバーの試作を行った。チャンバーは内径2mmのシリコンチューブによって作製し、静水圧による培地流動を得るために落差1mの間隔で2つのリザーバーを配置した。チャンバー内にあらかじめ作製した正常ヒト膀帯静脈内皮細胞(HUVEC)によって被覆された初代肝細胞スフェロイドを集積後、灌流培養を開始した。培養48時間後に組織学的評価によって培養細胞組織内部での肝細胞とHUVECの分布状態や生存状態の評価を行った。培養48時間後において、チャンバー内では、スフェロイドが集積した培養肝組織が形成された。内部では、HUVECが一定間隔で網目状に配置されている様子が観察された。この結果、静水圧を利用することにより灌流培養条件下においてスフェロイド集積による培養肝組織の形成誘導が可能な培養チャンバーを開発した。一方、充填するスフェロイド数によって組織の形成状況は異なり、条件によってはスフェロイドの球状形態が残ったまま接着している様子も観察された。今後はより長期に培養を行うと共に、充填スフェロイド数や流量との関係について検討を行う必要がある。1.肝-内皮細胞複合組織作製用の肝細胞スフェロイドの大量調製本研究では、内皮細胞に被覆化されたスフェロイド集積することによって肝-内皮細胞複合組織の形成誘導を行うため、肝細胞スフェロイドを大量に調製可能な手法について検討を行った。方法として、培養ディッシュ内での浮遊旋回培養を採用し、細胞密度と旋回速度について検討を行った結果、培養4日間で直径100μm150μmのスフェロイドを大量に調製可能な条件を見出すことができた。さらに、スピナーフラスコを用いた浮遊培養法への応用について検討中である。2.中空糸内で形成された肝-内皮細胞複合組織の機能評価肝-内皮細胞複合組織について、細胞生存率と肝機能評価を行うことによって培養組織としての特徴付けを行った。培養組織の誘導は、血漿分離用中空糸の内部で行い、誘導条件として、(1)内皮細胞に被覆された肝細胞スフェロイドを集積して誘導した培養組織、(2)内皮細胞と肝細胞を分散状態で混合し、集積して誘導した培養組織、(3)肝細胞スフェロイドのみを集積して誘導した培養組織、(4)分散肝細胞のみを集積して誘導した培養組織、の4条件間での比較を行った。この結果、まず肝機能発現について、肝細胞を内皮細胞と共培養することによって肝細胞のみの場合と比較して高い肝機能が示された。次に、細胞維持率の経時変化について、内皮細胞に被覆された肝細胞スフェロイドを集積して誘導した培養組織において高い細胞維持率が示された。この細胞維持率の改善は、分散状態の細胞の共培養では示されなかったことから、培養組織内部に内皮細胞を規則的に配置することにより組織構造が変化し、細胞維持率が改善されたことが示唆された。現在、組織構造と機能発現の関連について検討中である。種々の条件で形成した肝-内皮細胞複合組織の機能評価と構造解析前年度に引き続き、初代肝細胞と血管内皮細胞からなる肝-内皮細胞複合組織を中空糸内で種々の条件で作製し、機能並びに組織構造の詳細な比較を行った。

組織の作製条件として、(1)内皮細胞に被覆された肝細胞スフェロイドを集積、(2)内皮細胞と肝細胞を分散状態で混合し、集積、(3)肝細胞スフェロイドのみを集積、(4)分散肝細胞のみを集積、の4条件を用いて中空糸内部での組織形成誘導を行った。この結果、まずスフェロイドを集積する条件(1)、(3)との比較において、内皮細胞と共培養することにより細胞維持率の向上が示された。また、肝特異的機能として、アルブミン分泌能、アンモニア除去能の評価を行った。この結果、組織形成条件を問わず内皮細胞と共培養することにより肝細胞のアルブミン分泌能の向上が示された。さらに、スフェロイドを集積する条件(1)、(3)との比較においてのみ、内皮細胞との共培養によって肝細胞のアンモニア除去能の向上が示された。以上の結果、中空糸内部で形成された肝細胞組織は、内皮細胞を混合した複合肝組織とすることによりアルブミン分泌能が向上し、さらに、組織形成条件として、内皮細胞に被覆化された肝細胞スフェロイドを集積して複合肝組織を形成することにより、細胞維持率とアンモニア除去能も向上することが示された。それぞれの条件で形成された組織内部の構造については十分に解析するには至らなかったが、肝細胞と内皮細胞を分散状態で集積した系と比較して、内皮細胞に被覆された肝細胞スフェロイドを集積して誘導した培養組織内部では、肝細胞組織内部に内皮細胞が網目状に発達したネットワークを形成する傾向が示された。以上の結果、内皮細胞の発達したネットワーク構造が肝細胞の生存率や機能発現に効果的に作用したことが示唆された。本年度は前年度の検討によって得られた細胞の空間配置手法や培養デバイスを用いて、種々の培養環境下における組織構造や機能との関連を明らかにすることを目的としていた。当初は酸素濃度やpH環境などの影響について検討する予定であったが、まずは同じ培養環境下において細胞の空間配置手法による違いを明確にする必要があり、その検討を行った。その結果、機能発現や細胞維持率、組織構造の違いが見出され、本手法が血管化組織構築の基盤技術として有望であることが示唆されている。従って、本研究は当初の計画と比較しておおむね順調に進展していると考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。本年度までの検討は、主に機能面からの評価であった。一方、本研究の目標は血管化組織の構築であり、今後は形成された組織内部の細胞の分布について解析を行い、組織構造としての評価を行う必要がある。まずは現在の条件下において組織内部での肝細胞と内皮細胞の分布を評価し、どのような組織構造が構築されているかを明らかにする必要がある。次に、流動環境や栄養環境が組織構造変化に与える影響を明らかにすることによって、本手法の血管化組織構築の基盤技術としての有用性を評価してゆく予定である。
脂質代謝異常症の病態制御におけるセラミドキナーゼの役割解析と創薬への応用

セラミドキナーゼはセラミドをリン酸化してセラミド-1-リン酸を産生する酵素である。本研究では今年度、脂質代謝異常症の原因遺伝子を欠損した病態モデルマウスのセラミドキナーゼを欠損させ、病態発症におけるセラミドキナーゼの関与を検証した。まず、病態モデルマウスとセラミドキナーゼ欠損マウスを交配し、2重欠損(DKO)マウスを作製した。病態モデルマウスは生後、中枢神経系障害に伴い振戦を発症し、その後、体重が減少し、死亡する。本研究では病態モデルマウスとDKOマウスにおけるこれら表現型を比較した。マウスの脳組織切片を作製し、脂質蓄積の程度を観察したところ、病態モデルマウスに比べてDKOマウスでは脂質蓄積が軽減されていた。また、脳組織切片の神経を染色したところ、病態モデルマウスでは顕著に神経脱落が観察されたが、DKOマウスでは神経脱落が抑制されていた。これに伴い、DKOマウスでは病態モデルマウスに比べて振戦の発症が遅延した。体重を比較したところ、DKOマウスでは病態モデルマウスに比べて最大体重が高かった。また、DKOマウスでは病態モデルマウスに比べて体重が減少するタイミングが遅延した。体重減少が観察された後の体重減少ペースは病態モデルマウスとDKOマウスの間で大きな差は見られなかった。興味深い事に、DKOマウスは病態モデルマウスに比べて生存期間が延長した。これらの結果から、脂質代謝異常症の発症にセラミドキナーゼが関与する事が明らかになった。脂質代謝異常症の発症にセラミドキナーゼが関与する事が明らかになったため。脂質代謝異常症の発症におけるセラミドキナーゼの役割を詳細に解析する。また、セラミドキナーゼを標的とした創薬研究も推進する。本研究では脂質代謝異常症の原因遺伝子を欠損した細胞や、患者さんに由来する皮膚線維芽細胞を用いて、病態細胞と対照細胞におけるセラミド代謝を解析した。蛍光標識セラミド(NBD-セラミドまたはBODIPY-セラミド)を細胞に取り込ませてインキュベートし、脂質抽出後、薄層クロマトグラフィーで分離し、NBDまたはBODIPYの蛍光をイメージアナライザーにて検出した。その結果、対照細胞に比べて病態細胞においてセラミド-1-リン酸の産生が上昇していることが判明した。その他セラミド代謝物の産生に大きな違いは見られなかった。セラミド-1-リン酸の産生が上昇するメカニズムを解明することを試みたところ、対照細胞と病態細胞との間にセラミドキナーゼのmRNA量や細胞内局在に違いは見られなかったが、蛍光標識セラミドの細胞内局在に違いがあることが明らかになった。具体的には、正常細胞において蛍光標識セラミドは主にゴルジ体に局在していたが、病態細胞においてはエンドソームに局在する様子が観察された。また、セラミドキナーゼは両細胞において主にプラズマメンブレやエンドソームに局在しており、病態細胞においては蛍光標識セラミドとセラミドキナーゼがエンドソームで共局在する様子が観察された。従って、病態細胞においてセラミドキナーゼとセラミドが共局在することでセラミド-1-リン酸の産生が上昇していることが示唆された。脂質代謝異常症において、セラミド-1-リン酸の産生が上昇するメカニズムの一端が明らかになったため。病態細胞におけるセラミドキナーゼのmRNA量は対照細胞と比べて大きな違いはなかったが、蛋白質発現量については解析できていない。現在、セラミドキナーゼの抗体を作製しているため、抗体が作製でき次第、検討する予定である。また、病態マウスにおけるセラミドキナーゼの役割についても解析を進める。
TIMP-1による細胞増殖活性の濃度依存性スイッチ機構の解明

私たちは、TIMP-1およびTIMP-2による細胞増殖活性がベル型の濃度依存性を示すことを明らかにしてきた。このTIMP濃度による細胞増殖のオン・オフ調節機構を解明するために、1.ヒトTIMP-1遺伝子を導入したヒト線維肉腫(HT1080)細胞を培養したところ、培養液中のTIMP-1濃度が40ng/ml近傍に達すると、細胞増殖が抑制され、さらに、100ng/ml近傍に達すると、TIMP-1の産生が抑制されることが明らかになった。2.TIMP-1遺伝子を導入したHT1080細胞を最初から160ng/mlのTIMP-1を含む培養液中で培養したところ、細胞はTIMP-1も産生しないし、増殖も示さなかった。しかし、培養液をTIMP-1を含まないD-MEM培地に交換すると、TIMP-1の発現開始に呼応して細胞増殖が見られた。これらの結果は、培養液中のTIMP-1濃度がTIMP-1の産生とそれによる細胞増殖を調節していることを強く示唆してしいる。3.さらに、MEK3/6およびp38はともに低濃度(25ng/ml)のTIMP-1によって強く活性化されたが、高濃度(100ng/ml以上)のTIMP-1によっては抑制された。これに対し、ERKは調べた限りの濃度範囲(25150ng/ml)のTIMP-1によって濃度に無関係に活性化された。4.以上、HT1080細胞自らが産生したTIMP-1がオートクリン機構によって増殖を促進していること、そして、このTIMP-1の産生と細胞増殖活性は、細胞辺縁のTIMP-1濃度によって調節されていること、そして、TIMP-1はERKの活性化を介して細胞増殖を促進しているが、高濃度(>100ng/ml)になると、MEK3/6およびp38が活性化されて、増殖を抑制する可能性が明らかとなった。申請時の研究計画・方法に従い、ヒトTIMP-1遺伝子および空ベクターを安定導入したヒト線維肉腫(HT1080細胞)を作成した。1.空ベクター導入HT1080細胞をコントロールとして、TIMP-1遺伝子導入細胞をFCS非含有DMEM培養液中で培養したところ、TIMP-1遺伝子導入細胞では、培養液中のTIMP-1濃度が40ng/ml近傍を越えると、細胞増殖が抑制され、さらに、TIMP-1濃度が100ng/ml近傍に達すると、TIMP-1の発現が抑制されることを明らかにした。これまでTIMP-1遺伝子の導入が腫瘍細胞の増殖・浸潤を抑制するという報告と、逆に促進するという報告があるが、この矛盾した結果は腫瘍細胞の辺縁に存在するTIMP-1濃度の違いに基づく可能性が示唆された。2.TIMP-1をほとんど発現しないHT1080細胞にTIMP-1遺伝子を導入したところ、細胞はTIMP-1を産生するとともに顕著な増殖を示した。しかも、この細胞増殖は少量の抗TIMP-1モノクロナール抗体によって完全に抑制されることから、細胞自らが産生したTIMP-1がオートクリン機構によって増殖を促進したことを強く示唆している。3.HT1080細胞が細胞辺縁のTIMP-