hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
魚類聴覚器形成における組織間相互作用の解明

魚類の側線感覚器(感丘)は、神経プラコード由来の感覚細胞(有毛細胞)が、皮膚の様々な組織に取り囲まれて存在している。このとき、組織間相互作用が重要な役割を持っていると考えられる。これまで、rspo2突然変異体の解析から、感丘細胞の細胞増殖が(1)感丘に投射する神経軸索と(2)顎軟骨(hyomandibular)の2つの組織から独立に分泌されるRspo2によって、制御されている可能性を示した。当該年度において、rspo2突然体の顎軟骨と、それに付随する鰓蓋骨の発生の解析を行った。顎軟骨は頭骨と連結しており、それぞれに開いた2つの孔を神経軸索(顔面神経軸索束)が通っている。顎軟骨の孔(facial foramen)から外に出た顔面神経軸索は、運動神経・感覚神経・側線神経の3つに分岐する。さらに、側線神経の一部(hyomandibular branch)が、顎軟骨に付随する2つの感丘(Hm1, Hm2)に投射している。Rspo2突然変異体では、これらの2つの感丘が特異的に欠損する。鰓蓋骨(皮骨)は骨芽細胞・神経軸索でGFPを発現するトランスジェニック系統と抗体染色を用い、軟骨・硬骨・神経軸索の発生過程を調べ、2つの感丘を取り囲む組織の発生過程を記載した。当初の研究計画では、分子生物学的手法によって、神経系の解析を中心に進める予定であった。しかし、突然変異体の解析から、軟骨と硬骨にも異常があることが分かり、Rspo2には多くの機能があることが分かった。そのため、神経系以外の発生の記載を組織学・細胞学的手法によって進めた。その間、rspo2変異体とGFPトランスジェニック系統を掛け合わせ、実験に用いる系統を準備した。同時に、Rspo2機能獲得実験(レスキュー実験)の準備として、Rspo2-RFP融合遺伝子を作成した。rspo2の突然変異体の解析から(1)感丘に投射する神経軸索と(2)顎軟骨(hyomandibular)の2つの組織から独立に分泌されるRspo2によって、制御されている可能性を示した。次年度は、この結果を確かめるために、機能獲得実験(レスキュー実験)を行う。すでに得ているRspo2-RFP遺伝子を、組織特異的に発現し、感丘細胞の増殖を調べる。具体的には、(1)HuC:rspo2-RFP(2)Col1a:rspo2-RFP(3)Krt4:rspo2-RFPの3つのコンストラクトを作成し、それぞれ神経細胞、軟骨細胞、表皮細胞においてrspo2-RFPを発現させ、これらの組織に接している側線プラコード(感丘細胞)の動態を調べる。魚類の感覚器である側線器官は、神経プラコード由来の有毛細胞が皮膚中のさまざまな組織に取り囲まれて存在している。これらの組織間の相互作用を細胞レベルで調べることによって、器官形成に関わる新たな分子メカニズムを明らかにできる。ゼブラフィッシュの尾部の側線器官の形成には、神経軸索の投射が必要であること、またWntシグナルの活性化が必要であることから、Wntシグナル活性化因子(分泌因子)であるRspo2に着目し解析を行った。Rspo2突然変異体では尾部の側線器官の形成が著しく阻害された。さらに、頭部の一部の側線器官も欠損した。これらの頭部の側線器官は、神経軸索の投射は必要でないことが分かった。つまり、頭部の側線器官は神経軸索以外の別の組織から分泌されるRspo2によって形成されると考えられた。そこで、頭部の側線器官について、周囲の他の組織との位置関係を記載した。孵化胚(4日胚)の段階で、頭部には14対の側線器官が存在する。これらの側線器官は3つのプラコードに由来し、その中の最も腹側に位置するプラコードが分離して4つの枝(maxillary, hyosymplectic, mandibular, opercular)を形成する。Rspo2で欠損する側線器官は、hyosymplecticプラコード由来であることを見出した。細胞標識による実験からこの側線器官は軟骨の近くに位置すること、軟骨原基の組織でRspo2が発現していることを示した。以上の結果、頭部の感覚器の形成は、軟骨組織によって制御されている可能性が示唆された。孵化後2週間では、側線器官は27対に増加する。それぞれの側線器官の由来と形成過程、軸索投射についても記載を行った。昨年4月に現所属に異動したため、動物実験・組換え実験の手続き等で、魚の搬入を行ったのは8月、実際に採卵可能となったのは10月である。そのため、当初の分子生物学的手法を用いる予定を変更し、組織学・細胞生物学的手法による頭部の側線器官の形成過程の記載を中心に実験を行った。魚類の側線感覚器(感丘)は、神経プラコード由来の有毛細胞が、皮膚中の様々な組織に取り囲まれて存在している。これらの感丘の形成には組織間相互作用が重要な役割を担うと考えられる。前年度、まず、頭部にある感丘の発生過程を記載し、それぞれの感丘と周辺組織との位置関係を明らかにした。次に、hyosympleticプラコード由来の2つの感丘(Hm1, Hm2)が、軟骨組織に付随していること、また、これらの感丘形成にはWnt activatorであるrspo2遺伝子が必要であることを示した。

当該年度において、まずはじめに、rspo2遺伝子が感丘以外の組織の発生に寄与するかどうかを調べた。(1)Alucianblueによる軟骨組織の染色(2)Calceinによる硬骨組織の染色(3)tubulin抗体染色による神経組織の染色を行ったが、いずれも異常は見られなかった。次に、rspo2が軟骨組織で働いていることを示す実験を行った。まず、鰓弓に発現する遺伝子の発現を解析し、rspo2発現細胞は、dlx2の発現する神経堤由来細胞に隣接して、すぐ腹側に存在することから、第2鰓弓(hyoid)に相当すると考えられた。つぎに、rspo2遺伝子にgal4遺伝子がトラップしたエンハンサートラップ系統を用い、Wnt inhibitorであるdkk1aを異所的に発現した。その結果、2つの感丘(Hm,1 Hm2)が特異的に欠損し、rspo2突然変異体と全く同じ表現型を示した。これらの結果から、第2鰓弓由来の軟骨(またはその前駆体)がRspo2を分泌し、隣接する感丘前駆細胞のWnt signalを活性化することにより、2つの感丘を形成することが示された。当初の研究計画では、ゲノム編集法などの分子生物学的手法で解析(例えば新たな突然変異体の作成)を進める予定であったが、現時点では、ゼブラフィッシュの飼育スペースの問題で遂行が難しい。そのため、主として、組織学・細胞生物学的手法によって解析を進めた。頭部側線神経系の発生を記載する過程で、鰓弓(軟骨)と感丘の関係を見出し、その相互作用に焦点を当て解析を進めることができた。魚類の側線感覚器(感丘)は、神経プラコード由来の感覚細胞(有毛細胞)が、皮膚の様々な組織に取り囲まれて存在している。このとき、組織間相互作用が重要な役割を持っていると考えられる。これまで、rspo2突然変異体の解析から、感丘細胞の細胞増殖が(1)感丘に投射する神経軸索と(2)顎軟骨(hyomandibular)の2つの組織から独立に分泌されるRspo2によって、制御されている可能性を示した。当該年度において、rspo2突然体の顎軟骨と、それに付随する鰓蓋骨の発生の解析を行った。顎軟骨は頭骨と連結しており、それぞれに開いた2つの孔を神経軸索(顔面神経軸索束)が通っている。顎軟骨の孔(facial foramen)から外に出た顔面神経軸索は、運動神経・感覚神経・側線神経の3つに分岐する。さらに、側線神経の一部(hyomandibular branch)が、顎軟骨に付随する2つの感丘(Hm1, Hm2)に投射している。Rspo2突然変異体では、これらの2つの感丘が特異的に欠損する。鰓蓋骨(皮骨)は骨芽細胞・神経軸索でGFPを発現するトランスジェニック系統と抗体染色を用い、軟骨・硬骨・神経軸索の発生過程を調べ、2つの感丘を取り囲む組織の発生過程を記載した。当初の研究計画では、分子生物学的手法によって、神経系の解析を中心に進める予定であった。しかし、突然変異体の解析から、軟骨と硬骨にも異常があることが分かり、Rspo2には多くの機能があることが分かった。そのため、神経系以外の発生の記載を組織学・細胞学的手法によって進めた。その間、rspo2変異体とGFPトランスジェニック系統を掛け合わせ、実験に用いる系統を準備した。同時に、Rspo2機能獲得実験(レスキュー実験)の準備として、Rspo2-RFP融合遺伝子を作成した。
レンチオニンの血小板凝集抑制作用機序とそのシクロデキストリン包接物の生理活性

シイタケ中の環状硫黄フレーバー成分であるレンチオニンの血小板凝集抑制作用機序の解明を行った。また、レンチオニンをα-シクロデキストリンに包接することにより、そのにおいの低減化と水溶性化を試みた。レンチオニンは、血小板内のタリンのリン酸化、形態変化およびインテグリンα_<IIb>β_3の活性化を抑制した。また、レンチオニンをα-シクロデキストリンに包接することにより、においが低減化し、水への溶解性が高まった。さらに、α-シクロデキストリン包接レンチオニンは、ex vivoで血小板凝集を抑制した。これまでの研究において、シイタケフレーバーの鍵化合物であるレンチオニンが血小板凝集抑制作用を有することを明らかにし、その作用機序の検討を行ってきた。本年度は、血小板凝集に伴う血小板タンパク質のリン酸化に対するレンチオニンの影響について検討を行った。洗浄血小板に、レンチオニン存在下および非存在下でアラキドン酸を添加することにより血小板凝集を惹起し、抗リン酸化チロシン抗体によるウェスタンブロッティングにより血小板タンパク質のリン酸化の程度を観察した。血小板中にはもともとリン酸化しているタンパク質が多く存在したが、55kDa付近のタンパク質はアラキドン酸添加後、時間経過とともにリン酸化の程度が強まった。しかし、レンチオニンを添加した血小板では55kDa付近のタンパク質リン酸化が抑制された。そこで、55kDa付近に存在する2つのタンパク質についてN末端側アミノ酸シークエンシングを行ったところ、1つはTubulinb_1と95%の相同性を示し、もう1つはTalinと93%の相同性を示した。このため、これらのタンパク質の抗体を固定し、抗リン酸化チロシン抗体用いたELISAにより、リン酸化の程度を定量した。その結果、Tubulinb、およびTalin共に、アラキドン酸での血小板凝集惹起によりリン酸化の程度が低くなったが、レンチオニンの添加により、この低下が抑制された。今後は、アラキドン酸惹起によりリン酸化が促進されるタンパク質を同定し、これに対するレンチオニンの影響について検討する。既に、シイタケフレーバー成分である環状硫黄化合物のレンチオニンが、ex vivoにおいても血小板凝集抑制作用を有し、その作用部位がニンニクフレーバー成分のスルフィド類や薬剤のアスピリンとは異なることを示している。このことから、レンチオニンは、アスピリンジレンマのような問題を持たない新たな機能性成分としての利用が期待できるが、その独特のフレーバーが、食品への幅広い利用を制限している。そこで、本年度は、その利用用途を広げるための試みとして、レンチオニンのシクロデキストリンへの包接を行った。まず、レンチオニンとシクロデキストリンを混合後、遠心分離により包接物を沈殿させ、上清に残存しているフリーのシクロデキストリン量を測定した。全シクロデキストリン添加量から残存しているフリーのシクロデキストリン量を差し引くことにより、レンチオニンのシクロデキストリンへの包接割合を調べたところ、シクロデキストリン2分子に対し、レンチオニン1分子は包接されていた。次に、このレンチオニン-シクロデキストリン包接物をラットに経口胃内投与し、経時的に採血を行い、その血小板凝集割合を測定した。その結果、レンチオニン-シクロデキストリン包接物を投与した場合には、投与後48時間で血小板凝集を抑制した。一方、フリーのレンチオニンのみを経口胃内投与した場合には、投与後810時間で最も血小板凝集を抑制した。このことから、レンチオニンをシクロデキストリンに包接した方が、腸管からの吸収が早く、効果が発揮されやすいと考えられる。これまでの研究において、シイタケフレーバー成分である環状硫黄化合物のレンチオニンが、in vitroにおいても、経口摂取後の採血によるex vivoにおいても血小板凝集を抑制することを明らかにしている。また、種々の惹起物質を用いた実験から、レンチオニンの作用部位が、アラキドン酸カスケード内のシクロオキシゲナーゼを阻害するニンニクフレーバー成分のスルフィド類や薬剤のアスピリンとは異なり、血小板内でのタンパク質のリン酸化以降であることも示唆している。そこで本年度は、レンチオニンが血小板の形態変化および接着に及ぼす影響について検討した。血小板は、惹起物質の刺激により活性化すると、形態変化を起こし、細胞内のフィブリノーゲン、フォン・ウィルブランド因子、P-セレクチンなどを貯蔵しているα顆粒細胞表面に移動し、内容物が放出される。さらに、インテグリンα_<IIb>β_3が活性化し、フィブリノーゲンやフォン・ウィルブランド因子を介して、血小板同士を接着させる。

そこで、細胞表面のP-セレクチンと結合する抗体(CD62P)、活性化したインテグリンα_<IIb>β_3と結合する抗体(PAC-1)を用い、ADPおよびトロンボキサンA2の安定アナログであるU-46619を惹起物質として、レンチオニン添加および無添加の場合の形態変化とインテグリンα_<IIb>β_3の活性化の有無について調べた。その結果、血小板にレンチオニンを添加した場合は、ADPで惹起してもトロンボキサンA2で惹起しても、レンチオニン無添加の場合に比べ、抗P-セレクチン抗体との結合も、抗活性化インテグリンα_<IIb>β_3抗体との結合も、著しく低下した。これらのことから、レンチオニンは、タンパク質のリン酸化以降、血小板の形態変化以前の部位を阻害していることが示唆された。
高知県における小規模校間の遠隔合同授業を支援する授業研究環境の開発と実践

平成30年度には,昨年度,先行して提案した教師教育を指向した研究授業レビュー支援システムの基本設計にもとづき,マルチアングルによる複数台のカメラによる授業風景の収録・再生を行うためのシステム設計を行うとともに,これを実現するため必要となる実装用のライブラリの一部を試作した。また,それに併せてこれまで提案し,その内容で特許申請を行った俯瞰撮影のためのバルーン型ドローンの試作を継続的に進め改良を行い,これらをまとめてフィリピンで開催された国際会議ICCCE 2018にて発表した。さらに,研究授業レビュー支援システムの実現に向け,昨年度に提案した,電子化された学習指導案の作成・提示方法の提案,設計と一部試作を行った。なお,本支援システムのコンセプトと基本設計を特許として申請して受理された。学習指導案の設計においては,複数の県の学習指導案を入手して精査の上,記載項目を決定し,授業者による作成を支援する電子化学習指導案のオーサリングツールを試作して,複数の作成経験者を対象とした予備的な評価実験を行った。これらをまとめて香川大学で開催された教育システム情報学会の研究会にて報告した。また,昨年度までに試作した遠隔授業システムにおける電子黒板へのシルエット表示機能のプロトタイプシステムの改良を行い,不自然な視点移動の軽減に関して,研究協力学校における評価実験を行い,その結果をまとめて国際会議ICCCE 2018にて発表した。平成30年度においては,これまでの関連研究を踏まえ,概ね当初計画していた通り電子化指導案を中心とした研究授業支援システムの設計と一部試作を行うことができた。本研究の遂行にあたりシステムの核となる撮影装置や撮影プログラムは他に類を見ないものであり,全てフルスクラッチによる開発となるため技術的な困難さが伴うが日々精力的に取り組んでいる。平成31年度は,これまでに行った撮影装置と電子化指導案の作成・提示技術の改良を進めるとともに,これらを統合した研究授業レビュー支援システムの試作を中心として研究を進める。また,中間成果報告のために国内研究会等への論文投稿・参加を積極的に行う予定である。平成29年度には,これまでの県教育委員会による調査研究の成果を分析すると共に,研究授業経験のある教員への聞き取りを行い,システムの全体設計と研究授業レビューシステムのフレームワークの提案を行った。また授業の臨場感を伝える授業収録方法を検討し,既存の遠隔合同授業システムの問題を解決するための支援方法の検討と,それに必要な技術開発を行った。(1)教師教育のための研究授業レビュー支援システムの提案:本研究課題では,授業研究を通じた教師教育を視野に入れ,遠隔合同授業を円滑に行いながら,授業研究を対象とした教員相互による授業研究のための統合的なレビュー支援環境の実現を目的としている。平成29度は研究授業のピアレビュー支援システムの基本設計とフレームワーク提案およびシステムの一部の試作を行った。(2)遠隔授業システムにおける電子黒板へのシルエット表示機能の試作:昨年度,研究協力校で実施された遠隔授業の視察により,受信側の生徒が,電子黒板と教師を映したカメラ映像を交互に見なければならない問題があることが分かった。H29年度はジェスチャ認識デバイスを用いて電子黒板に教師のシルエットを表示するシステムを試作し,本学や県立高等学校の電子黒板上にて動作の検証を行った。(3)遠隔合同授業を支援する俯瞰撮影装置の設計・特許出願と試作:現状の遠隔合同授業システムの課題として,授業者による遠隔教室における生徒の状態把握が困難なことが挙げられる。これは遠隔教室には生徒の様子を捉えるカメラが生徒正面の1台のみであり,机間巡視など生徒の手元を確認する手段がないことに起因している。よって平成29年度は遠隔教室における生徒の様子を遠隔もしくは自動制御により俯瞰撮影して授業者が必要とする情報を提示するバルーン型ドローンによる撮影装置の発案と設計・試作を行い,これを特許として出願して受領された。平成29年度においては,これまでの関連研究を踏まえ,概ね当初計画していた通り遠隔合同授業を支援する機能の提供に必要となる要素技術の開発を行うことができた。また,主に平成30年度に進める予定であった,遠隔合同授業を支援する授業研究環境の設計についても着手し,一部,開発を進めることができた。

平成30年度においては,これまでの関連研究を踏まえ,概ね当初計画していた通り電子化指導案を中心とした研究授業支援システムの設計と一部試作を行うことができた。本研究の遂行にあたりシステムの核となる撮影装置や撮影プログラムは他に類を見ないものであり,全てフルスクラッチによる開発となるため技術的な困難さが伴うが日々精力的に取り組んでいる。平成30年度は,前年度に行った要素技術の開発と授業研究支援環境の基本設計にもとづき,各種支援系の詳細設計と試作を進めシステム全体の試作を行う。また,中間成果報告のために国内研究会等への論文投稿・参加を積極的に行う予定である。平成31年度は,これまでに行った撮影装置と電子化指導案の作成・提示技術の改良を進めるとともに,これらを統合した研究授業レビュー支援システムの試作を中心として研究を進める。評価実験用ノートPCの購入を予定していたが残高不足により翌年に繰越すこととした.
腹膜播種発生に関わる腹膜中皮細胞の間葉系形質転換と造腫瘍性についての実験的検討

我々は微小環境下において、がん細胞が分泌するTGF-βが腹膜中皮細胞(HPMC)におよぼす影響を検討した。TGF-βによって活性化したHPMC (a-HPMC)は間葉系細胞様に形質転換し(EMT)、浸潤能や増殖能を獲得することを明らかにした。TGF-βによって誘導されるEMT様変化は増殖抑制を来さない低濃度paclitaxelによって阻害可能であり、そのメカニズムとしてSmad2のリン酸化を抑制することを明らかにした。さらに、マウス背部にMKN45とa-HPMCを共に培養したものを移植したところ、腫瘍の線維化をも誘導することを証明した。(1)中皮細胞のTGF-βによる間葉系細胞への形質転換腹膜播種を有しない腹腔内洗浄細胞診陰性である胃癌切除標本(主に早期胃癌)から得られた正常大網から分離した腹膜中皮細胞を培養し、正常腹膜モデルの作成に成功した。この培養系にTGF-βを5ng/ml添加したところ、中皮細胞が形態的に敷石状から紡錘状に変化することを確認した。次いで、TGF-β添加後の中皮細胞は間葉系細胞マーカーであるvimentin,N-カドヘリン、αSMAを発現し、上皮系マーカーであるE-カドヘリンの減弱を確認した。また、invasionアッセイでは、正常中皮細胞は全く浸潤能を示さないがTGF-βで刺激した活性化中皮細胞においては浸潤能を獲得したことも確認した。(2)活性化中皮細胞と胃癌細胞株との共培養における相互作用TGF-βによって活性化した中皮細胞と胃癌細胞株MKN45を分離チャンバーにて共培養(細胞上清のみ共有)したところ、MKN45単独培養と増殖能は同じであった。しかし、両者を同一チャンバー内で接触培養したところ、MKN45の増殖能は賦活化されていた。混合培養された両細胞群を抗体ビーズ法で再度分離し、それぞれからウェスタンブロット法でEMT関連タンパクの発現を確認した。さらに3次元ゲル内でコロニー形成能を検討したところ、MKN45単独や成城中皮細胞+MKN45ではコロニーを形成できなかったが、TGF-βによる活性化中皮細胞との混合細胞群ではコロニーを形成し、造腫瘍能があることが証明された。(1)ヌードマウス皮下への胃癌細胞株と中皮細胞の混合移植は腫瘍増殖性が亢進する(2)低濃度paclitaxelによる中皮細胞の間葉系形質転換の阻止実験MTTアッセイにて中皮細胞の増殖に影響を与えないpaclitaxelの濃度を1-5nMに設定した(50nM以上で殺細胞効果出現)。TGFβ5ng1mlを添加したHPMC(a-HPMC)は紡錘型に形態を変化させ、E-cadの発現低下やα-SMAの発現亢進などのEMT様変化を呈した。これにpaclitaxel-5nMを添加したところ、敷石様に形態は変化し、α-SMAの発現は低下した。この際にsmad2のリン酸化がpaclitaxelの濃度依存性に低下した。以上より、低濃度paclitaxelはsmad2のリン酸化を阻害することでTGFβのシグナル伝達系をブロックし、組織の線維化を抑制する可能性が示唆された。骨髄由来fibrocyteは癌微小環境下ではmyofibrocyteに形質転換し、造腫瘍性に働くことを証明した。すなわち、健常ボランティアから採取した末梢血からFicoll法にて単球を分離し、フラスコ接着細胞を培養したのち、抗体ビーズ法にて純度90%以上のfibrocyteを回収した。このfibrocyteと胃癌細胞株MKN45を供培養することで、fibrocyteはαSMA強発現するmyofibroblast様に形質転換した。さらに、これをヌードマウス背部皮下へ移植すると、胃癌細胞株単独移植に比較し、腫瘍サイズは有意に大きかった。また、皮下腫瘍を病理組織学的に検討すると、単独移植した腫瘍では髄様癌であったが、混合移植した腫瘍では腫瘍内に間質の増生を認め、Azan染色にて線維化が誘導されたことが証明された。また、間質内の細胞成分は混合移植したヒト由来fibrocyteと宿主(ヌードマウス)由来細胞から構成されていることが蛍光免疫染色にて証明しえた。実験系が確立し、手技が安定したため。24年度が最終年度であるため、記入しない。腫瘍内線維化にヌードマウス由来のfibrocyteが関わっているか否かを検討したいが、マウス骨髄を照射後、蛍光標識した骨髄細胞を移植できるかどうかが問題となる。
障害者差別禁止法における「合理的配慮」規定の実効性に関する比較社会学的研究

本研究では、各国の障害者差別禁止法と国連・障害者権利条約を分析し、その中で「合理的配慮」の意義と実効性を検討した。第一に、2006年12月、国連第61回総会において、障害者権利条約全50条と選択議定書が採択されたが、障害者権利条約の内容と採択の意義を示し、「合理的配慮」概念について「平等と非差別」、「労働」、「教育」などの条項に関する議論を把握した。第二に、国連・障害者権利条約特別委員会に提出された「合理的配慮」に関する文書などをもとに、各国障害者差別禁止法における「合理的配慮」の概念を比較社会学的に検討した。この「合理的配慮」の概念は、アメリカの「障害をもつアメリカ人法」において本格的に障害者法制の中に導入された概念であり、その後、各国で成立していった障害者差別禁止法のなかにも導入されていった。「合理的配慮」の概念は、非差別原理のもとで、通常の教育や労働環境の中で障害者の権利を保障するための概念として意味をもつが、そこには、環境の修正に「過度の困難」が生ずるところでは免除されるという限定がつけられていた。したがって、「合理的配慮」の概念は、各国の障害者施策の歴史的到達や限界を反映するという性格をもっている。第三に、各国の障害者差別禁止法を収集しその特徴を分析した。2003年のスペイン、フランス、イタリアなどで障害者差別禁止法を収集・分析を行うとともに、アジア・太平洋地域では韓国の動向に注目して、障害者運動と政府の障害者差別禁止法の内容の比較検討を行った。以上をまとめて研究成果報告書を作成した。障害者権利条約の採択されたことを受け、世界各国で国内法の見直しと障害者差別禁止法などの成立が促されていくと考えられ、今後の障害者法制の動向の分析が課題として重要になるといえる。国際的な動向として、2005年、オランダ、イタリアなどで障害者差別禁止法が成立している。アジアでは、韓国において障害者差別禁止法が国会に上程され、審議されている。このような各国の障害者差別禁止法を収集し、その特徴を分析した。今後も、障害者差別禁止法は、障害者法制の中で注目される位置にあることが明らかとなった。また、障害者差別禁止法において規定される「合理的配慮(reasonable accommodation)」の概念を検討するために、その初出である「障害をもつアメリカ人法(Americans with Disabilties Act(ADA))」の「合理的配慮」に関する検討を行った。1990年代末、アメリカ合衆国最高裁の判決以降、障害の概念が狭められる解釈がなされるようになり、「合理的配慮」についても狭められる傾向にあることが明らかになった。アメリカ合衆国に置いては「合理的配慮」の実効性が揺らいでいる実態があることがわかった。国連では、「障害者権利条約」の審議が行われており、その中でも「合理的配慮」の概念が注目された。第6回障害者権利条約特別委員会に出席し、「平等と非差別」「労働」「教育」などの条項における「合理的配慮」に関する議論を把握することができた。各国の障害者差別禁止法の成立とその特徴を把握するとともに、国連・障害者の権利条約の審議を分析し、その中で「合理的配慮」の意義と実効性を検証することが課題である。

第一に、2006年12月、国連第61回総会において、障害者権利条約全50条と選択議定書が採択されたが、障害者権利条約の内容と採択の意義を示し、「合理的配慮」概念について「平等と非差別」、「労働」、「教育」などの条項に関する議論を把握した。第二に、国連・障害者権利条約特別委員会に提出された「合理的配慮」に関する文書などをもとに、各国障害者差別禁止法における「合理的配慮」の概念を比較社会学的に検討した。この「合理的配慮」の概念は、アメリカの「障害をもつアメリカ人法」において本格的に障害者法制の中に導入された概念であり、その後、各国で成立していった障害者差別禁止法のなかにも導入されていった。「合理的配慮」の概念は、非差別原理のもとで、通常の教育や労働環境の中で障害者の権利を保障するための概念として意味をもつが、そこには、環境の修正に「過度の困難」が生ずるところでは免除されるという限定がつけられていた。したがって、「合理的配慮」の概念は、各国の障害者施策の歴史的到達や限界を反映するという性格をもっている。第三に、各国の障害者差別禁止法を収集し、その特徴を分析した。2003年のスペイン、フランス、イタリアなどの障害者差別禁止法を収集・分析を行うとともに、アジア・太平洋地域では韓国の動向に注目して、障害者運動と政府の障害者差別禁止法の内容の比較検討を行った。以上をまとめて研究成果報告書を作成した。障害者権利条約の採択されたことを受け、世界各国で国内法の見直しと障害者差別禁止法などの成立が促されていくと考えられ、今後の障害者法制の動向の分析が課題として重要になるといえる。
中近世の駿河における日蓮教団の展開：西山本門寺史料悉皆調査に基づいて

本研究は、静岡県富士宮市に所在する日蓮系単立寺院西山本門寺所蔵の寺院史料に関する調査研究である。従来、全容が明らかでなかった同寺所蔵の寺院史料を対象とした初の悉皆調査を実施して史料目録を作成し、その全容を明らかにすることを第一の課題とする。そして、悉皆調査による研究成果を踏まえ、特に中世および近世成立の史料を手掛かりにこれまで多くの課題を残していた西山本門寺史について考察し、駿河における日本仏教史の一端を解明することを第二の課題としている。研究実施計画においては、本研究の基幹作業にあたる史料調査を平成30令和2年度中旬までの約2年半実施することを想定している。平成30年度はその初年度ということで、研究のすべてを史料調査に費やした。したがって、平成30年度における研究実績は特にない。なお、平成30年度に実施した史料調査において得た記録を元に、令和元年度ではその成果を国内学会における口頭発表および研究論文での公表を計画している。平成30年度は、一年間通して本研究の基幹作業である史料調査を実施した。特に、西山本門寺庫裡に保管されている史料と、末寺にあたる鳥並代世寺に所蔵される史料を中心に調査を実施した。その結果、約400点の史料の記録を採取した。ただ、所蔵量が多いことと各史料の記録採取に想定以上に時間がかかったことにより、全体的に見て若干遅れ気味であると判断した。平成30年度における研究の反省を生かし、本研究の2年目にあたる令和元年度は、調査作業をより効率的に行わなければならない。そのため、研究協力者の助勢を有効的に加えながら、史料調査の進捗を図りたい。平成30年度は、当初予定していた物品費は消化できたが、調査日程や研究協力者の調整が不調に終わり、旅費・人件費が予定していた通りに消化することができなかった。その結果、次年度使用額が若干生じてしまった。令和元年度は、次年度使用額も含め、助成金の計画的な使用に努めたい。
海洋天然物由来の抗寄生虫薬リードの創出

海洋天然物由来の抗寄生虫薬リード化合物の創出を目指す本研究に関し、本年度は以下の実績を上げた。(1) nMオーダーで抗寄生虫活性を示す環状リポペプチド、ジャナドライドについて、その全合成を達成した。確立した合成ルートを元に、各アミノ酸残基に改変を加えた11種類の類縁体群を合成した。現在、これらの分子の抗寄生虫活性の評価を行っている。(2) nMオーダーで抗寄生虫活性を示すラクタム、ホシノラクタムについて、脂肪酸部末端に改変を加えた2種の類縁体群を合成した。さらに天然より、新規類縁体2種を新たに単離、構造決定し、それらの全合成を達成した。(3)沖縄、奄美地方に生息する海洋シアノバクテリアより、抗寄生虫活性を示す以下の新規化合物群を新たに単離し、その構造を決定した。ホシノアミドAおよびB:特徴的な長鎖アミノ酸部を持つ鎖状ペプチド化合物であり、10 μMの濃度でもヒト細胞に毒性を示さない一方で、マラリア原虫に対して0.51 μMの濃度で増殖を阻害する。イコアミド:2個のメトキシ基を含む脂肪酸鎖を持つ鎖状リポペプチドであり、ヒト由来細胞に毒性を示すよりも10倍薄い濃度で、マラリア原虫の増殖を阻害する(IC50: 0.14 μM)。マブニアミド:N末端にブタン酸部を持つ鎖状リポペプチドであり、40 μMの濃度でもヒト細胞に毒性を示さない一方で、マラリア原虫に対して1.4 μMの濃度で増殖を阻害する。本化合物の全合成も達成した。(4)所属研究室でこれまでに単離してきた天然物およびその合成類縁体およそ70種について、マラリア原虫、赤痢アメーバ、ジアルジアに対する増殖阻害活性を評価した。その結果、いくつかの有望な活性を示す化合物が見つかった。研究開始当初にすでに発見していた有望な活性を示す3つの化合物(ホシノラクタム、ジャナドライド、マエダミド)については、すべての全合成を達成し、供給ルートの確立がなされた。また、このルートを用いて、ジャナドライドについては11種、ホシノラクタムについては2種の人工類縁体の合成を完了した。さらに、天然より新規ホシノラクタム類縁体2種を新たに見出し、その全合成を達成した。現在、これらの化合物の抗寄生虫活性の評価を行っている。これらの化合物の評価にあたっては、東京大学医学部と国立感染症研究所にそれぞれ新たな協力者を見出し、彼らの評価系を利用している。その結果、研究開始当初に予定していたよりも多くの種類の寄生虫(アメーバ赤痢やジアルジア)に対して抗寄生虫活性の評価が可能となった。活性の評価にやや時間がかかる傾向にあり、次年度以降の改善が望まれる。上記に加え、新たに天然より4種の抗寄生虫活性を示す天然物を発見することに成功し、一部については全合成を達成した。これらの化合物はいずれも、前述の3種の化合物ほど強力な抗寄生虫活性は示さないものの、ヒト由来細胞に対する毒性が非常に低い。全合成研究にも着手しており、合成類縁体を用いた構造活性相関の解明につなげていきたい。次年度も新規抗寄生虫物質の探索を継続しておこなう。現在、抗寄生虫活性の評価を行っているホシノラクタムおよびジャナドライド類縁体については、評価結果をもとに研究の方針を決定する。今回評価を行っている化合物の中には、ビオチンリンカーをもつプローブが複数含まれている。こうしたプローブが抗寄生虫活性を保持していた場合は、それらを用いて原虫内結合タンパク質の同定を行う。前述の東大医学部の協力者の研究室で原虫のライセートを調製し、このものに対するアフィニティー精製を行うことで、原虫内結合タンパク質を吊り上げる。得られたタンパク質は、ペプチドマスフィンガープリンティング法によって同定を行い、化合物の示す抗寄生虫活性との関連性の検証を行う。一方、評価の結果、活性を保持したプローブが得られなかった場合は、新たな類縁体をデザイン、合成し、このものの抗寄生虫活性を評価する。上記と平行して、自然界からの新たな抗寄生虫活性を示す化合物の発見を目指す。海洋シアノバクテリアの代謝産物には地域差があることが知られている。そこで、従来の採集地域である沖縄、奄美地方に加え、中華人民共和国、海南省のHainan Institute of Science and Technologyに籍を置く研究協力者の協力のもと、当地で採集を行い、新たな活性物質の発見を目指す。海南島に生息する海洋シアノバクテリアからの天然物探索研究は報告が無く、新しい骨格の抗寄生虫活性化合物の発見が期待される。

(3)沖縄、奄美地方に生息する海洋シアノバクテリアより、抗寄生虫活性を示す以下の新規化合物群を新たに単離し、その構造を決定した。ホシノアミドAおよびB:特徴的な長鎖アミノ酸部を持つ鎖状ペプチド化合物であり、10 μMの濃度でもヒト細胞に毒性を示さない一方で、マラリア原虫に対して0.51 μMの濃度で増殖を阻害する。イコアミド:2個のメトキシ基を含む脂肪酸鎖を持つ鎖状リポペプチドであり、ヒト由来細胞に毒性を示すよりも10倍薄い濃度で、マラリア原虫の増殖を阻害する(IC50: 0.14 μM)。マブニアミド:N末端にブタン酸部を持つ鎖状リポペプチドであり、40 μMの濃度でもヒト細胞に毒性を示さない一方で、マラリア原虫に対して1.4 μMの濃度で増殖を阻害する。本化合物の全合成も達成した。(4)所属研究室でこれまでに単離してきた天然物およびその合成類縁体およそ70種について、マラリア原虫、赤痢アメーバ、ジアルジアに対する増殖阻害活性を評価した。その結果、いくつかの有望な活性を示す化合物が見つかった。研究開始当初にすでに発見していた有望な活性を示す3つの化合物(ホシノラクタム、ジャナドライド、マエダミド)については、すべての全合成を達成し、供給ルートの確立がなされた。また、このルートを用いて、ジャナドライドについては11種、ホシノラクタムについては2種の人工類縁体の合成を完了した。さらに、天然より新規ホシノラクタム類縁体2種を新たに見出し、その全合成を達成した。現在、これらの化合物の抗寄生虫活性の評価を行っている。これらの化合物の評価にあたっては、東京大学医学部と国立感染症研究所にそれぞれ新たな協力者を見出し、彼らの評価系を利用している。その結果、研究開始当初に予定していたよりも多くの種類の寄生虫(アメーバ赤痢やジアルジア)に対して抗寄生虫活性の評価が可能となった。活性の評価にやや時間がかかる傾向にあり、次年度以降の改善が望まれる。上記に加え、新たに天然より4種の抗寄生虫活性を示す天然物を発見することに成功し、一部については全合成を達成した。これらの化合物はいずれも、前述の3種の化合物ほど強力な抗寄生虫活性は示さないものの、ヒト由来細胞に対する毒性が非常に低い。全合成研究にも着手しており、合成類縁体を用いた構造活性相関の解明につなげていきたい。次年度も新規抗寄生虫物質の探索を継続しておこなう。現在、抗寄生虫活性の評価を行っているホシノラクタムおよびジャナドライド類縁体については、評価結果をもとに研究の方針を決定する。今回評価を行っている化合物の中には、ビオチンリンカーをもつプローブが複数含まれている。こうしたプローブが抗寄生虫活性を保持していた場合は、それらを用いて原虫内結合タンパク質の同定を行う。前述の東大医学部の協力者の研究室で原虫のライセートを調製し、このものに対するアフィニティー精製を行うことで、原虫内結合タンパク質を吊り上げる。得られたタンパク質は、ペプチドマスフィンガープリンティング法によって同定を行い、化合物の示す抗寄生虫活性との関連性の検証を行う。一方、評価の結果、活性を保持したプローブが得られなかった場合は、新たな類縁体をデザイン、合成し、このものの抗寄生虫活性を評価する。上記と平行して、自然界からの新たな抗寄生虫活性を示す化合物の発見を目指す。
ケアとしての妊娠・出産とノーマライゼーション

日本では、妊娠・出産育児と企業での仕事の両立は困難で、両立を期して起業した場合にもやはり困難である(インタビュイー26人)。子どもは新たな関係形成となるが、女性が従来有していた職業的なネットワークの途絶とともに経験される。スウェーデンでは、妊娠・出産・育児は転職や起業の契機となって新たな社会的ネットワーク形成をもたらし、社会的ネットワーク喪失の契機とはならない(インタビュイー19人)。日本では妊娠・出産・育児が私領域化されており、スウェーデンでは社会保障によって公領域化されていることから、両国はケアの社会的位置づけについて対極的である。しかし、それらは女性の起業に対してともに抑制的に作用する。この詳細は2014年の世界社会学会で報告する予定である。本研究は、日本の妊産婦の置かれた現状について、E.F.Kittay(Love's Labor. Routledge, 1999)のケアの理論を参照することによって、「ケアを中心とした社会」という視点からラディガルに考え直す。H22年度には研究代表者が前年に奈良県で実施した調査結果について、地域別・世代別、またインフォームドコンセントのあり方別等の角度から分析を行い、『「安心な出産のための奈良県アンケート」調査報告書データ編改訂版』および『「安心な出産のための奈良県アンケート」調査報告書分析編』を製本・刊行した。また、回答者と協力者への利益還元のため、市民対象の報告会を行った。学会等においては、2010年世界社会学会大会(スウェーデン)においてdistributed paperのほか、2つの研究会で報告を行った。調査結果概要は、最近10年間の出産において、それ以前と比較して(1)夫立会いが6割以上を占め、夫や実母・友人との相談が増える等、妊娠・出産までのネットワークが増えてきた。(2)ほとんどの産婦が出産経験を良かったと評価している。(3)WHOガイドラインを参照すると、浣腸は減っているものの、「十分な説明を受けた」浣腸や剃毛は減っておらず、加えて「十分な説明を受けた」分娩監視装置や会陰切開等が増加している。(4)超音波検査による診断と内診は大半経験されているが、その約4割で「十分な説明を受けなかった」と回答されている。(5)助産師の存在は認知される傾向にあるが、病院・診療所内で分娩を中心としたサービス提供者としてのみである。(6)医師を中心とした妊娠・出産の体制の充実が女性たちによって望まれている。(7)自由記述には、医療および保健行政に対する非常に多くの要望が寄せられた、というものであった。国内調査については、諸事情から予定が遅れ、とりかかることができなかった。しかし、比較調査のため、世界社会学会大会への参加を兼ねてスウェーデンを訪問し、予備的調査を行い、H23年度の両国でのインタビュー調査のために調査項目の作成と、調査対象の選定を行った。(1)国内調査インタビュー調査は、奈良県内および県外の女性にインタビュー調査を実施した。対象者の選定にあたっては、当初予定していた市町村保健担当課を通しての依頼が困難であったため、個人的なルートによって、スノーボール式に行っている。平成23年度には特に母子家庭や起業している女性たちへのインタビューが可能となった。これらの女性の属性はマイノリティであるため、研究目的の仮説(2)社会的排除の側面に関する貴重なインタビュー内容となっている。また、11月にはスウェーデンから研究者を招へいし、日本で共同でインタビュー調査を行った。(2)海外調査研究目的の仮説(3)に関連して、6月下旬にスウェーデンを訪問し、合計11件のインタビュー調査を実施した。以上の(1)(2)の結果から、妊娠・出産・育児を支える社会制度の相違が、女性の就労および妊娠・出産・育児経験に非常に大きな影響を与えていることが分かってきた。相違はあまりにも大きいため、スウェーデンでの共同調査と国内でのスウェーデン研究者との共同調査において、質問の意図や回答を互いに理解できない場面がいくつか発生した。これは非常に興味深い現象で、比較調査を今後も重ねることの重要性が確認できた。(3)理論的研究として、特にケアと公領域・私領域に関連する先行研究をレビューした。経費執行については、インタビューについて謝金を予定していたが不要となったため、インタビュー起稿等に利用した。11月に過疎地における妊産婦支援体制について、国内研究協力者とともに岩手県で研究報告を行うとともに、今後の研究協力の継続について計画を立てた。また同研究報告会で、岩手県で妊産婦支援に携わる大学研究者・NGO等と懇談して研究ネットワークを広げた。12月には奈良県庁および奈良県市町村保健師連絡協議会でインタビューを実施し、奈良県過疎地区における妊産婦支援の取組について知見を得た。

1月に神戸大学主催の研究会で、平時過疎地の妊産婦支援に関する知見を含む研究報告を行った。1月から2月にスウェーデン・カールスタッド大学の研究協力者とスウェーデンでインタビュー調査を実施し、公的保障と企業による補完関係について知見を得た(調査対象:ワークライフバランス支援企業・家事育児サービス企業・保育園スタッフ・移民女性)。また、2014年の国際学会報告と論文執筆のため、細かな打合せを行った。3月末に、『女性史学』(7月刊行予定)に災害時および平時の妊産婦支援にかかわるレポートを執筆した。そのほか、関係資料収集および、科研成果報告の英語HP用ファイルを作成した。なお、年度末の3月に上記研究協力者と日本で調査および研究打合せをする予定だったが、先方の急病により中止せざるを得なかったため、先から必要を感じていた家族社会学関係と女性雇用関連(妊産婦取扱い資料を含む)資料を購入した。本務校の組織改編業務の関係で非常に多忙な職務となり、国内ではインタビューを行う時間を予定どおり取ることができず(3)やや遅れている。しかし、それ以外の研究面については(2)おおむね順調に進展した。また、年度途中でリプロダクションに関する他国比較の研究チームの発足や、年度末には災害関連の研究との関連も生じたことによって、ケアと妊娠・出産・育児を支える社会に関する知見が深まり、(3)当初の計画以上に発展した面もある。なお、前者では奈良県の状況を日本の一つの典型として含めて考察し、チームとして学会からのConroy Awardを獲得した。下記業績の図書所収の論文には、妊娠・出産にかかわるケアの研究の成果を活かした。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度には、このカテゴリーによってインタビューを重ねるとともに、.マジョリティを占める専業主婦、あるいは共稼ぎ主婦に予定のルート(国内調査2)と4))で募集を行い、インタビューを重ねる。他に、あらたに奈良県立医科大学助産学専攻科教員の協力を得て、助産師・保健師への調査を進めることを計画中である。スウェーデンとの比較調査は引き続き実施する。データの分析は、さらにケース数を増やしてから行う予定である。研究成果は下記のほか、論文として平成24年度内に出版予定(勉誠出版)で、現在、共著者と原稿を出し合い、調整中である。スウェーデンとの比較調査は、平成26年度の世界社会学会大会で報告する予定で共同研究を進めることになった。
筋圧痛計測定システムによる顎機能異常患者の治療効果の判定に関する研究

顎機能異常患者の筋痛に対する客観的評価法を確立すべく健常者男女計340名の咬筋、側頭筋の圧痛閾値から正常範囲を決定した。さらに筋圧痛測定システムを用いて顎機能異常患者の治療前、オクル-ザルスプリント治療や咬合調整などの術中、術後を測定し、この結果と正常範囲を比較検討した。すなわち、筋圧痛計を用いて健常被験者男女計340名の側頭筋前部、側頭筋後部、咬筋浅層上方、中央、下方、咬筋深層の6部位、両側で12部位について圧痛閾値を測定した。その結果、両側の同名部位では左右差がなく、また各部位間では圧痛閾値に一定の傾向がみられることがわかった。そこで、この健常者の結果を基に各部位の左右差からみた正常範囲および各部位間の閾値の関係からみた正常範囲を決定した。さらに平成2年度および平成3年度奨励研究Aの補助によって完成した筋圧痛計測定システムに顎機能異常患者の術前、術中、術後の圧痛閾値を入力し、システムに入力されている2種の正常範囲と比較検討した。今年度は、顎機能異常患者の症例を増し、顎機能異常患者男女計75名の術前の圧痛閾値と正常範囲を比較したところ、2種の正常範囲ともに異常範囲に位置した者、どちらか一方の正常範囲のみ異常範囲に位置した者の3パターンに分類された(第8回国際顎頭蓋機能学会学術大会にて発表)。またオクル-ザルスプリント治療から咬合調整までの術中、術後を正常範囲と比較したところ、スプリント装着2週後から1カ月後にかけて圧痛閾値に変化がみられ、咬合調整後に閾値が上昇し、すべての測定部位が正常範囲内となった。
動的速度論的分割過程を経由した含窒素複素環化合物の新規触媒的不斉合成法の開発

申請者らが開発したニッケル触媒による1,3-ジエンとアルデヒドとの分子内環化反応が含窒素複素環構築に適用可能かを確認すべく、先ず始めにピロリチジン、インドリチジン骨格合成への応用を検討した。(S)-ピログルタミン酸から容易に光学活性体として合成できる(5S)-5-formyl-1-[(2E)-2,4-pentadienyl]-2-pyrrolidinone(1)を基質とし、20mol%のNi(cod)_2、40mol%のPPh_3を触媒として用い、5当量のEt_3SiHをヒドリド源としてtoluene中、室温にて反応を行ったところ、(3R,4R,5S)-1-aza-3-[(E)-1-propenyl]-4-triethylsilyloxybucyclo[3.3.0]-octane-8-one(2)を49%、2のジアステレオマ-の(3S,4S,5S)体(3)を15%の収率で得た。2、3を対応するbenzoateへと導きHPLCにてその鏡像異性体過剰率を求めたところ、それぞれ97% ee、96% eeを示し、本閉環反応において基質の光学純度を保持して反応が進行していることがわかった。また、ヒドリド源としてPh_3SiHを用いたところ閉環反応の立体選択性は向上し、2が73%、3が8%の収率で得られた。次にインドリチジン骨格の合成への応用を検討した。基質として(5S)-5-(1,3-butadienyl)-1-(3-formylethyl)-2-pyrrolidinone(4)を用い、同様の条件下反応を行ったところ(7R,8S,8aS)1-8-[(E)-1-propenyl]-7- triethylsilyloxyindolizidin-3-one(5)を40%、5のジアステレオマ-の(7S,8S,8aS)体(6)を38%の収率で得た。4を一炭素増炭した(5S)-1-(2-formylethyl)-5-(1,3-pentadienyl)-2-pyrrolizidinone (7)を基質とした反応では、(7R,8S,8aS)-8-[(E)-1-butenyl]-7-triethylsilyloxyindolizidin-3-one(8)及び(7S,8S,8aS)体(9)をそれぞれ36%、37%の収率で与えた。9は光延反応により8へと収率良く変換でき、8からインドリチジンアルカロイドの一種、(-)-Elaeokanine Cの形式的全合成に成功した。本結果から申請者らは天然型の(-)-Elaeokanine Cを合成できる経路を初めて開発できたことになる。これらの成果を基に現在、最終目的である動的速度論的分割によるピロリチジン及びインドリチジン骨格の触媒的不斉合成を検討中である。4を一炭素増炭した(5S)-1-(2-formylethyl)-5-(1,3-pentadienyl)-2-pyrrolizidinone (7)を基質とした反応では、(7R,8S,8aS)-8-[(E)-1-butenyl]-7-triethylsilyloxyindolizidin-3-one(8)及び(7S,8S,8aS)体

(9)をそれぞれ36%、37%の収率で与えた。9は光延反応により8へと収率良く変換でき、8からインドリチジンアルカロイドの一種、(-)-Elaeokanine Cの形式的全合成に成功した。本結果から申請者らは天然型の(-)-Elaeokanine Cを合成できる経路を初めて開発できたことになる。これらの成果を基に現在、最終目的である動的速度論的分割によるピロリチジン及びインドリチジン骨格の触媒的不斉合成を検討中である。
個人識別のためのDNAフィンガ-プリントの簡便法の開発

本研究では、アイソト-プを使用せずにDNAフィンガ-プリントを作成する方法(コ-ルド法)を確立するため、市販されている4種類のキットを用いてプロ-ブの標識とDNAの検出を行い、その実用性を検討した。方法は、ヒト末梢血から抽出したDNAを制限酵素(HalIII)で切断し、アガロ-スゲル電気泳動を行った後、DNAをナイロンメンブランに転写した。次に各々のキットの方法でプロ-ブ(おもにmyo)を標識し、メンブラン上のDNAにハイブリさせバンドパタ-ンを検出した。その結果、1)スルフオン化標識(宝酒造)、2)ビオチン標識(コスモ)、3)ジゴキシゲニン標識(ベ-リンガ-)、4)パ-オキシタ-セ標識(アマシャム)のいずれの標識法からもDNAフィンガ-プリントを作成することができた。1)3)の方法はいずれも免疫学的手法を利用し、検出の手技はやや煩雑で、デ-タ保存の爲には写真撮影が必要であった。4)の方法はエンハンスドケミルミネツセンス(ECL)を発生させるもので、他のキットに比ベ価格は高いものの、(1)アイソト-プ法とほぼ同程度の感度でDNAフィンガ-プリントが得られる。(2)デ-タをフィルム上に記録できる。(3)脱プロ-ブしないでフィルタ-を再利用できる。(4)検出操作が容易である、などの利点を有しておりDNAフィンガ-プリントの作成に利用価値の高いことが分かった。ECLキットによるコ-ルド法を、実際の親子鑑定、双生児の卵性診断、および骨髄移植の生着確認に応用したところ、そのバンドパタ-ンはいずれも鑑定や診断を行うに十分な資料となることが分った。DNAフィンガ-プリント法は、十分なゲノムDNAを確保できる場合、個人識別に極めて有用であり、コ-ルドプロ-ブを採用することで一般の研究室でも比較的容易に作成でき、その手技を確立しえた。DNAフィンガープリント法は、法医学の分野において、個人識別や親子鑑定に極めて有用であることが知られ、注目を集めている。しかし、本法はまだ一般的に広く利用されるにいたっておらず、一般化されない大きな理由としてアイソトープの使用があげられている。本研究では今年度、アイソトープ使用に係る問題を解消すべく、非放射性DNAプローブを用いたDNAフィンガープリント法の検討を行った。方法は、ヒト末梢血から抽出したDNAを制限酵素(HaeIII)で切断し、1.3%アガロースゲルで電気泳動を行ったのち、ナイロンメンブランに転写した。以後、DNAの標識と検出にはTakaraのCHMIPROBEキットおよびBoehringerのDNALabelling & Detectionキットを用いてスルフォン化標識のMyoプローブ、Boehringerのキットではジゴキシゲニン標識のMyoプローブを用いハイブリダイゼーションを行ったのち、両キットともに免疫学的手法によりバンドを検出した。その結果、スルフャン化標識プローブを使用した場合、2.5μgのDNAからフィンガープリントを作成することが可能であった。これはアイソトープを用いたDNAフィンガープリント法に匹敵する感度を示している。ジゴキシゲニン標識のMyoプローブを用いプローグを使用した場合では、2.5μgのDNAからは明確なフィンガープリントが得られなかった。以上の結果から、スルフォン化標識プローブは長期間保存可能であり、これまでの放射性プローブに換わりうると考えられる。本研究はDNAフィンガ-プリンティングの一般化を目指し、アイソト-プを使用しない方法(コ-ルド法)を確立するため、数種類のキットを用いてコ-ルド法を検討している。