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＜感覚＞作用、特に＜音＞に注目した環境教育と文学教育の横断的研究とその実践

ネイチャーゲームや環境評価ツールとして使用されていたサウンドマップを教育方法に適した形で改変した。サウンドマップを作成する活動により、現実と感性とを結び、人と自然のつながりを重要視する価値形成をしうるとの知見を得て、それに基づき、文学サウンドマップを新たな教育方法として提示した。それらの実践報告を行い、有効性を明らかとした。また、文学における<音>の機構についても、震災前後の雑誌の<音>調査などから新たな理論を組み立て、提示した。サウンドマップ(海中サウンドマップ)と文学サウンドマップを併用することで、主観・客観の二項対立をこえて内面でありながら外部とつながる方法の確立を期待できる。読書における<音>の機構については、毎月物語研究会を開催することを継続し、共同討議をおこなった。大國は文学における自然と芸術を<音>を基軸に、太宰治や山川方夫などいくつかの作品を対象として発表した。安藤は震災後に文学に響く<音>を芥川龍之介などのいくつかの作品を対象として検討し、遠藤祐氏に武者小路実篤などを作品分析していただき、当時の<音>の機構について研究を深めた。これらについては個々に論文化し、発表も行っているが、大國、安藤、小島、遠藤の四人で共同執筆も行い、「架橋としての桃源境思想ー関東大震災から現代ー」として発表した。震災と文学、およびそこに見出せる感性としては、昨年度、基礎的な作業をおこない、震災直後の雑誌の特徴をまとめたが、今年度はそれらに基づいて、そこから響く/響かない<音>について論ずべき作品群を収集した。教材研究については、サウンドマップを読書行為に展開できる方法を考え、読書においてサウンドマップをつくるという試みを行い始めている。大國は文学教材に現れる音に注目し、それをどのように教室で展開するかを見据えながら、「自己反省としての風景と音」を発表、また、黒坂みちる氏に協力を願い、教科書における教化目標やその実践の変遷を見るための資料も網羅的に収集し、そのひとつの成果として「感性と文学」をまとめ、教育に関する論文も発表した。環境教育については、10月に日光に於いて文学踏査の一環として、サウンドマップを実際に行ってもらうフィールドワークを開催した。その実践をふまえて、サウンドマップを利用した教育の新しい方法を提示していく準備が整った。その点について小島は「サウンドマップを用いた環境教育と文学教育の横断的研究」を口頭発表した。これらの研究内容を知らせるためにウェブサイトも開設した。音・感性に関する研究については、文献に基礎的なものから枝を広げてあたっている。特に佐々木健一『日本的感性ー触覚とずらしの構造ー(中公新書、2010)については、物語研究会の1月例会において共同討議を行い、2月例会において大國眞希が「走れメロス」を題材に、3月例会では安藤公美が「羅生門」を発表し、討論を行った。9月11日に教科書図書館で調査を行い、その調査の一部を、「<音>に注目した文学教育と環境教育の横断的研究序論」(「川口短期大学紀要」第26号2012・12)に発表した。内容は、文学教育についてのみならず、本研究に関しての全体の概観をつかみ、その方向性を示したものである。個々の作品と<音>とのかかわりについては、物語研究会11月例会において、大國が「太宰治『右大臣実朝』を読む」について発表をし、「小説に倍音はいかに響くのか、言葉はいかに生成するのか」を論文発表した。物語研究会12月例会においては大國が、宮部みゆき「本所深川ふしぎ草紙」について発表を行い、「耳から内在化される七不思議『本所深川ふしぎ草紙』」として論にまとめ、『宮部みゆき』(鼎書房、近日刊行予定)に投稿した。次に、震災と文学的感性に関する研究については、一九二三年四月から一九二四年三月の『中央公論』『改造』『新潮』などにあたり包括的な資料収集を行った。物語研究会6月例会において討議をおこない、10月例会では遠藤祐氏に武者小路実篤「桃源にて」についてのご発表をお願いし、震災と文学的感性についての議論を行った。最後に、環境教育については、小島が6月19日24日にサウンドマップ作成実践のための候補地の調査や研究協力者らとの協力体制構築のために沖縄を訪問し、現地調査および教育実践のための準備を整えた。また、大國、小島、安藤が9月3日に鎌倉でサウンドマップの作成を試み、より本研究に沿うかたちへと改良した。本研究は大きく研究の柱を3つに分けて立てている。1つめ、環境と音については、サウンドスケープや都市と音についてのフィールドワークや研究をなさっている方のワークショップに参加するなどして、研究をすすめている。2つめ、文学と音についての最も大きな実績は、関東大震災前後6か月(通年)に発行された「中央公論」「新小説」「女性」「新潮」に掲載された小説の中から<音>を抽出し、変化を分析する調査をおこなったことである。この結果報告については『福岡女学院大学紀要人文学部篇』25号に投稿し、世に問うことができた。また、その調査を踏まえて、調査にあたった安藤公美、乾英治郎、野本聡、大國で、日本文学協会第69回大会ラウンドテーブル「<音>に注目した読みの可能性ー関東大震災を機軸にー」に参加した。この時に発表した内容に基いて執筆された論文を「水月」創刊号に掲載した。

本研究における読みの妥当性を問う機構としての物語研究会も月に一度、開催し、研究の進捗状況を確認し、方向性を定めるために機能した。3つめ、教育と音に関しては、福岡女学院大学で研究会「<音>研究ー九州・教育篇」を開催した。その成果が「水月」創刊号に結実している。そして、最終的に環境教育と文学教育を結ぶための、新しい方法として、文学サウンドマップを提示することができた。それについては、小島・大國が日本環境教育学会にて口頭発表を行い、また、大國が「<文学サウンドマップ>をつかった教育方法の可能性」を論文としてまとめて「水月」創刊号に投稿した。文学における<音>の機構を考えるという過程を通じて生み出された理論をもとに作品の読解をおこなった。その成果を『太宰治調律された文学』にまとめた。いかにして小説空間を生成する磁場としての<音>を聴くことができるかを理論化し、作者が日記や手紙から、古伝説から過去の物語から、あるいは生の<声>から作品を生み出す際、光は幾何学としての線で示され、<声>は<文字>へと変換されている様相を示した。文学作品がどのように調律されているのか、その重層性、音響を小説の機構から明らかにした。震災にかかわる感覚の変容としては、「感覚の変容と記録/記憶」を特集とした「水月」の二号刊行に向けて動いている。今までの調査では各作家における<音>描写の特質、また<音>受容(感覚の変容)の兆しが雑誌調査によって明らかになった。文学教育と環境教育の交差としては<サウンドマップ>を活用し実践を重ねてきている。文学教育においては<文学サウンドマップ>を考案し、環境教育においては従来のサウンドマップを発展させる方法を提案している。本研究の<サウンドマップ>によって描き出される「音風景」は、人の〈感性〉と環境との相互作用によってつくりだされたものであり、人の奥底の意識にある自然とのつながりを抽出したものと解釈できる。さらに、この「かかわり」を明らかにすることによって、環境保全活動や地域再生、まちづくりへの応用へと視野に入れることが可能となる。また、新たな試みとして、海中で行なうサウンドマップ(=〈海中サウンドマップ〉)を行った。陸上で行なう場合と異なり、音の聞こえてくる方向が定位できないという点や主体の影響がより大きくなる点において〈文学サウンドマップ〉と類似・共通する部分が多いと考えられる。これらの成果から新たなサウンドスケープ議論が期待でき、地理学的な観点からの有効性についても論じられると期待している。ネイチャーゲームや環境評価ツールとして使用されていたサウンドマップを教育方法に適した形で改変した。サウンドマップを作成する活動により、現実と感性とを結び、人と自然のつながりを重要視する価値形成をしうるとの知見を得て、それに基づき、文学サウンドマップを新たな教育方法として提示した。それらの実践報告を行い、有効性を明らかとした。また、文学における<音>の機構についても、震災前後の雑誌の<音>調査などから新たな理論を組み立て、提示した。サウンドマップ(海中サウンドマップ)と文学サウンドマップを併用することで、主観・客観の二項対立をこえて内面でありながら外部とつながる方法の確立を期待できる。本研究の目的であった、新しい教育方法を提示することは出来、それに関する口頭発表も、論文発表もおこなった。
スズ系ペロブスカイト薄膜のトラップ分布解析

本研究課題は、次世代型太陽電池として期待されているぺロブスカイト太陽電池に関するものであり、鉛代替として有力なスズを使用したぺロブスカイト薄膜の結晶成長制御による欠陥分布の測定を行い太陽電池性能の向上を目指した。スズ系ペロブスカイト薄膜の、平坦均一膜を作製するためにヨウ化スズ錯体を合成し、高電流素子を作製することに成功した、さらに酸化チタンとヨウ化スズが化学結合し、欠陥を形成することが判明したため、酸化チタンを使用しない構造を導入した。スズ系ぺロブカイトの組成を変更し、金属空孔による欠陥をフッ化スズで補い、研究開始時に4.5%だった変換効率を15.9%まで引き上げることに成功した。本研究は、近年、新たな次世代太陽電池の有力候補として注目を集めているハロゲン化金属を用いるペロブスカイト薄膜の結晶成長制御を行い、光励起方式の熱刺激電流測定法(TSC)でキャリアトラップ分布解析を行う。比較的高効率であるが毒性の強い鉛の代替として有力な材料である、ハロゲン化スズを利用したペロブスカイト太陽電池は、光電変換効率が低い問題があるためスズ系ペロブスカイト結晶の粒界、欠陥などとトラップ分布が太陽電池の光電変換特性に及ぼす影響を明らかにすることを目的としている。本年度は、スズと鉛の混合比1:1にしたスズ・鉛複合ペロブスカイト太陽電池の結晶成長制御を行った、当初の計画ではペロブスカイトの原料を逐次に成膜する2ステッププロセスで行う予定であったが、結晶サイズを大きくすると、空孔が多く凹凸の激しい膜になるため短絡して発電しなくなる問題が発生した、太陽電池のような平坦均一膜が良いとされるデバイスには適していない成膜方法であった為、材料を全て混合し成膜する1ステッププロセスで、結晶成長制御を行った。従来のヨウ化スズ、ヨウ化鉛を混合する1ステッププロセスでは、結晶成長制御が困難で、結晶サイズが不均一な凹凸の激しい膜しか作製できなかったため、新たにペロブスカイトの材料を変更し検討を行った。従来のヨウ化スズに有機物を付加した、有機スズ錯体を使用し成膜中に化学反応を起こす有機溶剤を添加することで、結晶サイズが大きく平坦均一膜を作製することが可能となった。新しい原料とプロセスで作製したスズ系ペロブスカイト薄膜は、光音響分光測定の結果から、鉛100%のペロブスカイトと同程度でトラップが少なく、太陽電池として非常に高い起電流を発生すことが判明した。薄膜作製プロセスを計画時と変更したため、研究目的であるトラップ解析のデータ収集が遅れている。計画段階での薄膜作製プロセスは当初、鉛100%のペロブスカイトで太陽電池特性が高く世界的にメジャーな薄膜作製方法であったが、初夏頃に発表された新しいプロセスはそれまでを凌駕する太陽電池特性で、現段階では以前の方法に置き換わって主流となっている。その、薄膜作製プロセスをスズを使用したペロブスカイト薄膜作製に適用する為、時間を有している。しかし、最も困難な課題である、結晶成長制御が可能となったため遅れているトラップ解析を加速することができる。本研究課題は、近年急速に光電変換特性が向上し、低コスト高効率の塗布型太陽電池として注目されているペロブスカイト太陽電池に関するものである。従来のペロブスカイト太陽電池はハロゲン化金属材料に鉛化合物を使用しているが、本課題では鉛代替として有力なスズを用いたペロブスカイト薄膜の結晶成長制御と、熱刺激電流測定によるキャリアトラップ分布の相関を明らかにすることを目的とする。昨年度、高純度のヨウ化スズ錯体を合成し有機溶剤への溶解性を向上させた、スズ系ペロブスカイト前駆体溶液を使用し、スピンコート成膜中に貧溶媒滴下によって結晶核を形成する方法で、平坦で欠陥が少なく高い起電流を得る事に成功した、しかしながら光電変換効率は4.5%程度と鉛の20%に比べてまだ低い状態であった。前年までの課題に対して、ペロブスカイト結晶の光電変換ロスが電子輸送層(酸化チタン)からの電荷再結合が原因ではないかと推測された。そこで、ヨウ化スズとヨウ化鉛で表面処理した酸化チタンのキャリアトラップ分布を熱刺激電流で解析した結果、ヨウ化スズで表面処理すると酸化チタン表面の浅いトラップが増加していることが判明したため、酸化チタンを用いない積層構造を導入することで、光電変換特性は4%から7%へ改善した。また、スズ系ペロブスカイト薄膜の欠陥を、光音響分光測定や熱刺激電流測定で解析した結果、比較的深いエネルギーに結晶欠陥が判明し、この欠陥は金属スズの欠乏によるものが元素分析から推測された為、フッ化スズの添加による金属欠陥を補う手法を試みた結果、12%の光電変換効率が得られた。さらに、金属以外の添加材を耐久性の高い材料に変更しスズの含有量を60%に増加させて課題開始時に4.5%だった光電変換効率を15.9%まで引き上げる事に成功した。

スズ系ぺロブカイトの組成を変更し、金属空孔による欠陥をフッ化スズで補い、研究開始時に4.5%だった変換効率を15.9%まで引き上げることに成功した。今後の方策に関して、遅れているトラップ解析を加速する。最も困難な課題である、結晶成長制御が可能となった為、十分に解析検討できる。研究計画では、スズと鉛の混合比1:1のみの検討を行う予定であったが、スズ混合比の影響や非鉛の場合で、検討を行う予定である。一方で当初予定していたセシウムカチオンでは、薄膜作製が困難であるため、別の候補材料等に変更する。電気電子工学本研究が開始される前年度に、当初予定していた設備を他の助成金で前倒しで導入した。また、研究に必要な物品に関しても同様に前年度に導入している。サンプル作製、評価用の物品費に使用する。
化学変化を捉える顕微鏡法の開発と脂質代謝研究への応用

本研究は、脂質代謝を可視化する手法の開発と、肥満糖尿病を抑制するアクアポリン7 (AQP7)依存的脂質制御シグナリングの解明を目的とした。脂肪組織及び培養脂肪細胞において脂肪の合成と分解および脂質動態を無染色に高感度ライブイメージングでき、また、AQP7が白色脂肪細胞の脂質代謝制御蛋白質を制御し、脂肪の合成と分解の量を変えていることが分かった。当該の機能は脂肪細胞のカテコールアミン誘導脂肪分解においてもマウス個体においても確認された。脂肪細胞によるエネルギー代謝の恒常性の維持、および各種ホルモン放出で全身代謝を制御するにおいて関与すると示唆された。知見は薬剤開発に応用していく計画である。白色脂肪組織の脂肪細胞は、脂肪の合成蓄積と分解放出により全身のエネルギー代謝の恒常性を担保し、かつ各種ホルモンを放出することで全身の代謝制御に関与するから、そこでの細胞内情報伝達についての知見は、ヒトの健康増進に有用である。脂肪細胞は「脂肪滴」を内包し、脂肪滴を成長または縮小させることで脂肪の合成蓄積と分解放出を遂行する。脂肪蓄積量の調整に重要なのは合成蓄積と分解放出とのバランスであり、脂肪滴の表面に局在化している「脂肪滴関連蛋白質」の中にも、合成蓄積を促進する因子と、反対に脂肪分解を促進して脂肪滴を小さくする因子が存在する。2型糖尿病など代謝疾患の治療法開発の進歩に繋げていくことを意図し、脂肪滴の上で脂肪合成と分解の適切なバランスがどのように制御されているか明らかにしようと試みた。手段として選択したのが、増減する脂肪の可視化である。Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS)顕微鏡により、脂肪細胞モデル培養細胞やマウス脂肪組織白色脂肪細胞の脂肪滴の経時的変化を測定できるようになった。さらに蛍光イメージングと組み合わせることにより、細胞内蛋白質のダイナミックな挙動と脂肪の合成分解を同時に観察出来るようになった。脂肪の合成蓄積と分解放出の制御因子として重要だと判明したのが、aquaporin-7 (AQP7)である。AQP7は、水だけでなくグリセロールなど電気的中性小分子を透過させる膜蛋白質であり脂肪組織の白色脂肪細胞に発現することも判った。Nullマウスの、脂肪組織の肥大を伴う肥満、糖尿病様の表現型から、AQP7は脂肪代謝に関与すると考えられているがそのメカニズムは不明な部分が大きく、今後、AQP7と脂肪分解/蓄積を制御する蛋白質群との関係を明らかにし、より詳細な機能を記述していく。新イメージング手法の元になる顕微鏡の技術的トラブルに遭遇したが、解決して研究を進めている。本年度は、代謝をサブ細胞レベルで高感度に検出する手法を開発する。開発したイメージング手法は、体脂肪の蓄積および分解に関与していると考えられる蛋白質の機能解析に応用することで、代謝異常を伴う疾患(例えば2型糖尿病)の克服へ貢献し得る代謝メカニズム解明へ繋げていく。特に、aquaporin-7の関与する脂肪分解と蓄積合成の制御のメカニズム記述を行っていく。細胞生物学細胞イメージング装置のトラブルにより、一年目に組み込む部品の購入を2年目に延期したことが大きな理由である。生じたトラブルはレーザーの不安定化。装置の開発、改良のための部品購入と、細胞イメージング手法の開発に合わせた安定同位体各種の購入を行う。
前立腺癌骨転移巣の癌幹細胞に対するTGFβの分化誘導作用の検討

本研究の結果により、前立腺癌骨転移巣において癌幹細胞が存在する可能性を示した。またTGFbetaシグナル遮断作用を有する薬剤により前立腺癌細胞の増殖が抑制されることを培養細胞実験、動物実験で示し、TGFbetaシグナルの制御が前立腺癌治療に有用であることを明らかにした。2009年度の研究成果前立腺癌原発巣・骨転移巣における癌幹細胞マーカー発現検索ホルマリン固定ヒト前立腺癌原発巣9例・骨転移巣4例に対し、前立腺癌幹細胞マーカーの1つである抗CD44抗体(DAKO, DF1485)の免疫染色を行った。原発巣では9例中8例の癌細胞に陽性像が確認され、陽性細胞率は0%35.2%であった。一方骨転移巣は、CD44の内在性control(リンパ球)陽性で評価可能な標本は1例のみであったが、骨転移巣の癌細胞は強い陽性像が見られ、陽性細胞率は100%であった。次に凍結ヒト前立腺癌原発巣4例に対し、前立腺癌幹細胞マーカーの1つである抗CD133抗体(Miltenyi Biotec, AC133)の免疫染色を行った。前立腺癌細胞に明らかな陽性像は見られなかったが、一部の正常前立腺基底細胞に陽性像が観察された。前立腺癌細胞株を用いた癌幹細胞マーカーの発現検索ヒト前立腺癌細胞株であるLNCaP, PC3, DU145に対して、抗CD44抗体の免疫染色を行った。骨転移巣由来細胞株であるPC3、脳転移巣細胞株であるDU145は陽性像が確認され、PC3は48.8%、DU145は15.2%の陽性細胞率であった。一方リンパ節転移巣由来細胞株であるLNCaPは陰性であった。限界希釈法を用いた前立腺癌細胞株からの癌幹細胞候補の同定限界希釈法により癌細胞株から癌幹細胞の性質を有する亜株が得られるという報告がある事から、ヒト・ラット前立腺癌細胞株に対し限界希釈法を行い亜株を樹立した。亜株には高い細胞増殖能が見られた。次に癌幹細胞が有する薬剤耐性能、幹細胞関連遺伝子の発現上昇を検索した。抗癌剤Etoposideに対する薬剤耐性、幹細胞関連遺伝子であるSox2の発現をqRT-PCRで検討したが、薬剤耐性能、遺伝子発現は親株と比較して有意な高値は見られなかった。(1)前立腺癌幹細胞を単離する目的で、ラット前立腺癌細胞株PLS-10から限界希釈法により亜株SCC2, SCC3を樹立した。SCC3は親株と比較し細胞増殖能、抗癌剤エトポシドに対する薬剤耐性能が高かった。SCC2, SCC3とも前立腺癌幹細胞マーカーの1つCD44の発現状態は親株と有意な違いは無かった。以上よりSCC3は癌幹細胞の性質を一部有することが分かった。(2)前立腺癌原発巣および骨転移巣における癌幹細胞の存在・局在を検索する目的で、原発巣、骨転移巣の前立腺癌組織に前立腺癌幹細胞マーカーCD44、CD133の免疫染色を行った。原発巣にはCD44・CD133陽性所見を一部の癌細胞に認めた。CD44・CD133の陽性所見と癌の分化度の相関は明らかでなかった。骨転移巣ではCD44陽性所見を大部分の癌細胞に認めたがCD133は良い染色条件を得られず検索できなかった。CD44を高発現するヒト前立腺癌細胞株PC3にTGFbetaシグナル阻害剤であるSB431542を100μM曝露すると、有意な細胞増殖抑制作用を認めた。またCD44を高発現するラット前立腺癌組織PLS-Pを頭蓋骨上に移植して作成した前立腺癌骨浸潤モデルラットに、TGFbetaシグナル阻害作用が報告されている薬剤Tranilastを400mg/kg投与すると、対照群と比較して腫瘍体積が有意に減少した。本研究の結果により、前立腺癌骨転移巣において癌幹細胞が存在する可能性を示唆し得た。またTGFbetaシグナル遮断が将来の前立腺癌治療に用いられる可能性を示した。
エジプト・ローマ都市の盛衰について

本研究の中心に据えた中エジプト・アコリス遺跡に関して、その考古学上の編年研究と出土文字史料の解読を終了した。その結果、この都市の盛衰を精確に辿ることが可能となり、第3中間期に囲壁をそなえた都市が形成され、初期イスラム期の700年前後にそれが突然放棄されたことが、こうして判明した。また、エジプトがローマ属州に転じてほどなく大規模な整備事業がアコリスで実施され、隆盛の1・2世紀を閲したのち、3世紀に入ると、都市機能の著しく低下したことが知られた。そこで、1世紀におけるローマ都市化、3世紀の機能低下、4世紀の復興、7・8世紀における崩壊という一連の推移を「アコリス・モデル」と名付けて、その推移の要因解明につとめ、同時に、このモデルの普遍性をエジプトで追究した。3世紀の機能低下については、ファイユム地方の諸都市で軌を同じくするらしい現象がみとめられた。ただし、ナイル流域の諸都市での機能低下の有無は、あまり確かめられなかった。これは資料上の制約によるもので、今後の問題として残される。低下の原因について、本研究ではナイルの水位上昇の不良を強調した。7世紀における都市の崩壊は、エジプト内でかなり普遍的にみとめられた。アコリスの出土文字史料が7世紀後半における、イスラム教徒との軋轢、人頭税、コプト教儀の異端論争のことを生まなましく伝えており、都市のコプト社会が不安に充ちていたことをこれは想像させる。アコリスのばあい、放棄に至った直接の要因はおそらくイスラム教徒の焼きうちまたは地震による被害であったのであろうが、都市という多消費型社会を維持し、または再建する活力が、コプト社会のなかにもうすでに残されていなかったようである。他都市の崩壊についても、原因としてこの点が強調されてよいと思う。中エジプトからはじめたローマ時代都市遺跡に関する検索作業がほぼ終わり、現在は上・下エジプトに移っているところである。その結果によると、アシュムネイン(ヘルモポリス)、アンティノエ、オキシリンコスという中エジプトのローマ時代主要都市がコプト時代に継続して7・8世紀に衰滅し、アコリスの衰滅と期を同じくすることが知られた。それに対し、上・下エジプトでは少なくとも主要都市ではイスラム時代への存続したという結果が得られつつある。アコリス出土の多量のパピルス文書は整理、解読を終了した。その結果、3世紀の文書が欠けていることが注目されるに至った。3世紀はアコリスにおいて考古学上の遺物がきわめて乏しい時期であり、石碑が激減するときである。これはローマ帝国内の政治上の混乱が当地に鋭く波及したことを示唆している。またコプト教徒による宗教上のトラブルに関する内容が少なくない。イスラム教徒とのいさかいを述べたものも一部にはみられるが、それ以外の異教徒(pagan)との争いに関するものが少なくない。これが7世紀後半に集中してみられることは、終焉の原因がイスラム教徒の侵入だけにとどまらなかったことを示している。また、アシュムネインで地震によって大バシリカの崩壊したことが伝えられており、天災による原因も考えられる。交易については、オリーブ油をとりあげた。ファイユム地方に基盤をおくオリーブ油生産は、3世紀に衰退したことが知られた。アコリスで46世紀にオリーブ油生産が盛んになり、交易用として出荷されたことが搾油台が数多く出土していることから推知されるが、これは中エジプトではアコリスのみの現象である。ファイユムでの衰退をうけて当地でもオリーブ油生産が実施されたのである。
糖代謝活性とヒトパピローマウイルスを指標とした中咽頭癌の個別化治療に向けた研究

大阪大学、大阪国際がんセンターにおいて化学放射線療法で加療した局所進行中咽頭癌を対象とし、133例の解析を行った。133例のPET/CTデータより原発巣MTV、転移リパ節MTV、総MTV(原発巣MTVと転移リンパ節MTVの和)を求めた。化学放射線療法を施行した133例では、HPV陽性例において原発巣高MTV例と原発巣低MTV例で、粗生存率に有意差を認めた。また、HPV陽性例のCOX単変量解析では、T分類、化学療法の内容、原発巣MTV、総MTVにいおいて有意差を認めた。さらなる解析を行い、今秋ごろの投稿を予定している。大阪大学、大阪府立成人病センター、大阪府立急性期・総合医療センター、大阪労災病院、関西労災病院において化学放射線療法あるいは手術で加療した局所進行中咽頭癌を対象とし、現在、202例の解析を行っている。うちわけは化学放射線療法153例、手術症例は49例である。まず、各施設で性能の異なるPET/CT装置を用いていることから、各施設のPET/CTデータを大阪大学のデータに準拠して取り扱えるようにするために、ファントム試験を行い、補正係数を求めた。各施設でのPET/CTデータは大阪大学のデータとほぼ同等のものとして扱っていいものと考えられた。次に上記202例のPET/CTデータをDICOM化しPETSTAT Viewer version 2.2(株式会社アドイン研究所)を用い、原発巣MTV、転移リンパ節MTV、総MTV(原発巣MTVと転移リンパ節MTVの和)を求めた。また、各症例について、詳細や転帰についてついて確認を行った。また、HPV感染の有無についてそれぞれの症例について確認を行い、HPVの詳細がわからないものについては再検討を行った。当初の症例数より少ないが、ファントム試験、MTV測定、HPV感染の有無確認などおおむね順調に進展していると考える大阪大学、大阪国際がんセンターにおいて化学放射線療法あるいは手術でで加療した局所進行中咽頭癌を対象とし、182例の解析を行った。内訳は化学放射線療法133例、手術49例である。まず、各施設で性能の異なるPET/CT装置を用いていることから、各施設のPET/CTデータを大阪大学のデータに準拠して取り扱えるようにするため、ファントム試験を行い、補正係数を求めた。大阪国際がんセンターののPET/CTデータの中で一部取り扱えないものがあり、症例数が減少した。次に、182例のPET/CTデータをDICOM化しPETSTAT Viewer version 2.2(株式会社アドイン研究所)を用いて、原発巣MTV、転移リパ節MTV、総MTV(原発巣MTVと転移リンパ節MTVの和)を求めた。手術を施行した49例では、症例数が少ない影響もあると考えられるが、HPV陽性、陰性にかかわらず、MTVと予後について明らかな相関が認められなかった。また、総MTVにおいて高MTV例と低MTV例で粗生存率に有意差を認めた。一方、HPV陰性例ではいずれにおいても高MTV例、低MTV例の粗生存率の間に有意差を認めなかった。HPV陽性例のCOX単変量解析では、TNM分類のT分類、化学療法の内容、原発巣MTV、総MTVにいおいて有意差を認めた。今後、さらなる詳細な検討を行う予定である。対象をHPV陽性例とHPV陰性例に2分し、それぞれの群で原発巣MTV・転移リンパ節MTV・総MTVが独立した予後因子となるか、Cox比例ハザードモデルを用いた多変量解析により検証する。手術群と化学放射線療法群との間でMTVの有用性に明らかな差が認められる場合は、対象をHPV陽性手術例/HPV陰性手術例/HPV陽性化学放射線例/HPV陰性化学放射線例に4分した上で、同様の解析を行う。更に、原発巣MTVモデルがT分類モデルより、そして転移リンパ節MTVモデルがN分類モデルより予後予測モデルとして優れるかどうか、Akaike's information criterionを用いて統計学的に評価する。また、糖代謝関連分子の発現レベルがMTVと独立して相関するか、ロジスティック回帰モデルを用いた多変量解析により検証する。更に、各分子の発現レベルが予後と相関するかが、Cox比例ハザードモデルを用いた多変量解析で検証する。耳鼻咽喉科・頭頸部外科当初の予定より症例数が少なかった影響と考えられる。症例数は増えることが予想されるため、その増えた症例のP16免疫染色、HPV DNA解析、さらに平成29年度は糖代謝関連分子の免疫組織学的分析を予定しており、それに用いる予定である。
低配位高周期元素の配位子特性に基づく感応性金属錯体の創製と触媒機能

P=C二重結合を有するホスファアルケンは,極めてエネルギー準位の低いπ*軌道をもち,遷移金属に対して強いπ受容性を発揮する.我々は,この特異な配位子特性を用いて,(1)低酸化状態にある鉄,ニッケル,銅などの配位不飽和錯体を効果的に安定化できることを見出した.(2)前例のない平面四角形構造をもつ白金(0)錯体の合成単離に成功した.(3)ノンイノセントなPNPピンサー型ホスファアルケン配位子を開発し,金属ー配位子協同作用によるアンモニアのN-H結合やアセトニトリルのC-H結合の活性化に成功した.また,(4)常温常圧で二酸化炭素のヒドロシリル化を触媒する高活性錯体を開発した.1.昨年合成した脱芳香族化ピリジン骨格を含む非対称PNPピンサー型ホスファアルケン錯体[K(18-crown-6)][IrCl(PPEP*)](1)が,金属ー配位子協同作用によりアンモニアのN-H結合を室温で瞬時に切断し,対応するアミド錯体[Ir(NH2)(PPEP)](2)に変化することを見いだした.錯体(1)は,アニリンおよびヘキシルアミンとも速やかに反応し,対応するアミド錯体[Ir(NHR)(PPEP)](R = Ph(3), C6H13(4))を与えた.錯体(1)はアンモニアの活性化を起こす初めてのPNPピンサー錯体である.2.錯体(1)の反応について,反応速度論とDFT計算を用いて検討した.酸性度の低いアンモニア(pKa = 41)の反応では,ホスファアルケンの強いπ受容性によって大幅にLewis酸性が向上したイリジウムへの配位がまず起こり,これによってN-H結合の酸性度が向上し,不均一開裂が起こる.一方,比較的酸性度の高いアニリン(pKa = 30.6)の反応では,N-H結合が塩基性点であるPPEP*配位子に直接水素結合を起こし,脱プロトン化機構により切断されることが分かった.3. PNPピンサー型ホスファアルケン配位子(BPEP-Ph)を有するFe(I)錯体[Fe(Mes)(BPEP-Ph)]の1電子還元がイソニトリルの配位により誘発されることを見いだした.TEMPOを用いたラジカルトラップ実験とDFT計算により,この反応がBPEP-Ph配位子へのMes配位子の転位とP-C結合の均一開裂を経由して進行することを明らかにした.4. PNキレート型ホスファアルケン配位子を用いて特異な幾何構造をもつNi(I)錯体やNi(II)錯体を合成できることを見いだした.また,構造の特異性がホスファアルケンの強いπ受容性に起因することをDFT計算により示した.3.剛直な縮環構造を有するRind-BPEP配位子を合成した.また,Rind-BPEPのロジウムおよびイリジウム錯体を合成し,これらの錯体上でのC-H付加環化反応を利用して新規な非対称PNPピンサー型ホスファアルケン配位子(Rind-PPEP)を有する[RhCl(Rind-PPEP)]と[IrCl(Rind-PPEP)]を合成単離した.さらに,得られた錯体から塩基の作用によって誘導化される脱芳香族化ピリジン骨格をもつ[K(18-crown-6)][RhCl(Rind-PPEP*)]と[K(18-crown-6)][IrCl(Rind-PPEP*)]を単離して結晶構造を明らかにするとともに,それらが常温常圧下におけるCO2のヒドロシリル化反応に従来になく高い触媒活性を示すことを明らかにした.4.脱芳香族化ピリジン骨格を有する非対称PNP型ホスファアルケン配位子(PPEP*)をもつ[K(18-crown-6)][Ir(NH2)(PPEP*)]を用いて,二分子のアセトニトリルのC-H結合を連続的に活性化できることを示した.2.脱芳香族化ピンサー型ホスファアルケン配位子(PPEP*)を有する[Ir(L)(PPEP*)]を触媒として,アルコールによるアミンの脱水縮合型アルキル化反応が進行することを見出した.反応は中性条件で効率的に進行し,LがCOおよびtBuNCの場合にN-アルキル化アミンが,LがPPh3の場合にその脱水素体であるイミンが優先的に生成することを示した.触媒中間体モデルである[Ir(NHPh)(PPEP)]とLとの反応について検討し,Lによって反応選択性が逆転する理由を明らかにした.3.剛直な縮環構造を有するEind2-BPEP配位子を合成した.また,この配位子をもつ一連の10族金属錯体[M(PPh3)(Eind2-BPEP)](M = Ni, Pd, Pt)について検討し,金属の種類によって幾何構造とNMR化学シフトが大きく変化することを見出した.

特に白金錯体は,d10錯体としては特異な平面四角形構造を有し,また31P NMRシグナルがホスファアルケン錯体としては極めて高磁場領域(105.6 ppm)に現れた.DFT計算を用いてその理由を精査し,相対論効果に基づいてd軌道レベルの高い白金中心からホスファアルケンに,極めて効果的なπ逆供与が起こっていることが分かった.すなわち,ホスファアルケンが従来の予測を超えて極めて電子的に柔軟な配位子として機能することが明らかとなった.銅錯体を用いた結合切断反応やイリジウム錯体を用いた触媒反応,さらには10族錯体を用いた構造解析などを通してホスファアルケンの特異な配位子特性を明らかにした.また,昨年度に引き続いて非対称PNPピンサー型ホスファアルケン錯体を触媒とするCO2の固定化反応について検討し,前例のないカルボシリル化反応を見出している(未発表).Eind基を用いた錯体安定化の研究も順次進行しており,本研究は当初の計画に従い順調に進展している.1.昨年度,PNPピンサー型ホスファアルケン配位子Eind2-BPEPを有する四配位白金(0)錯体[Pt(L)(Eind2-BPEP)](1, L = PPh3)が形式d10錯体としては特異な平面四角形構造を有することを見出し,この構造特異性の要因が相対論効果に基づく白金の顕著なs-d混成にあることを示した.錯体(1)の構造特異性は31P NMRデータ(105.6 ppm)にも反映され,ホスファアルケン錯体としては異常な高磁場シフトが観測された.本年度は,種々の配位子Lを有する錯体を合成し,化学シフトと錯体構造に及ぼすLの効果を調べた.その結果,高磁場シフトはL = CO (127.3) < tBuNC (110.5) < PMe3 (101.2) < py (97.2) < DMAP (95.1)の順に大きくなることが分かった.配位子上の置換基による立体的影響を最小化したモデル錯体[Pt(L)(H2-BPEP)]を用いてDFT計算を行った結果,CO < PH3 < pyの順,すなわち31P NMRシグナルの高磁場シフトが大きくなる順に,錯体の平面構造が安定化する傾向が認められた.合成された全ての錯体は近赤外領域に強いπ-π*遷移を示し,錯体の平面性が高くなるほど吸収極大は長波長シフトした(nm):L = CO (776) < tBuNC (825) < PMe3 (845) < DMAP (924).吸収端波長から見積もられたHOMO-LUMOギャップは1.41.2 eVであり,極めて小さかった.2.ホスファアルケンの立体保護基(Ar)がEind基とMes*基である[Cu(BPEP)]X錯体(X = OTF, PF6)を用いて,錯体の構造と配位平衡に及ぼすAr基の影響を調べた.3. PNPピンサー型ホスファアルケン錯体の構造と機能について総合論文にまとめた.1. PNPピンサー型ホスファアルケン配位子(BPEP)を有するIr(I)錯体([IrCl(BPEP)])が,アルコールによる一級および二級アミンのN-アルキル化反応の触媒として高活性を示すことを見出した.一級アミンの反応は,水酸化セシウムを助触媒として進行し,芳香族および脂肪族のアルコールとアミンから対応するN-アルキル化生成物が高収率で得られた.一方,二級アミンの反応は,リン酸二水素カリウムを助触媒として高収率で進行した.従来,同様の触媒反応は,Ir(III)錯体を用いて検討されてきたが,本研究では,ホスファアルケンの特異な配位子効果を利用することにより,Ir(I)錯体を用いても高い触媒活性が発現することを見出した.2. PNPピンサー型ホスファアルケン配位子(BPEP)を有するルテニウム錯体から,ベンゾホスホランとホスファアルケン部位をもつ非対称型PNPピンサー錯体を合成できることを示した.また,この錯体のPNPピンサー配位子がベンジル位の脱プロトン化を伴ってピリジンの脱芳香族化を起こすnon-innocent配位子として挙動することを明らかにした.
A群レンサ球菌のフィブロネクチン結合タンパクの感染防御抗原としての可能性

A群レンサ球菌(GAS)は,皮膚や上気道における化膿性疾患の原因菌として,また近年では致死性の高い侵襲性および劇症型GAS感染症の起因菌として注目を集めている.その病原性に関与する因子が多岐にわたることから,病態発症のメカニズムは完全には解析されておらず,効果的な治療法あるいは予防法の確立を見ていない.申請研究では,GASの付着・侵入因子であるフィブロネクチン(Fn)結合タンパクの同定ならびに詳細な機能解析を行い,上皮細胞バリアを超えて組織内に侵入するメカニズムを解析し,予防法の基盤を築くことを試みた.はじめに,血清型M1およびM3のGASゲノムデータベースから,それぞれ黄色ブドウ球菌のフィブロネクチン(Fn)結合タンパクFnBPAと相同性を有するFbaA,およびGASのFn結合タンパクPrtF2と相同性を呈するFbaBを同定した.続いて,これらFn結合タンパクの組換え体(rFbaAおよびrFbaB)の発現プラスミドを構築し,宿主大腸菌内で発現させた.精製rFbaAおよびrFbaBは,ビオチン標識したFnを用いたリガンドブロット分析およびFnとの生体間分子相互作用解析の結果から,Fnと結合することが示された.さらに,fbaAおよびfbaB遺伝子を欠失させた変異株を作製した.M1野生株とfbaA欠失株,およびM3野生株とfbaB欠失株のそれぞれ組み合わせで,ヒト咽頭上皮由来のHEp-2細胞株に感染させ,GASの細胞付着・侵入率の差を計測した.その結果,M1およびM3型菌は,ともにFn結合タンパクの不活化により,有意に付着・侵入率が低下することが示された.最後に,FbaAおよびFbaBのマウスを用いた感染防御実験から,FbaAおよびFbaBの感染防御抗原としての有効性を示した.A群レンサ球菌(GAS)は,皮膚や上気道における化膿性疾患の原因菌として,また近年では致死性の高い侵襲性および劇症型GAS感染症の起因菌として注目を集めている.その病原性に関与する因子が多岐にわたることから,病態発症のメカニズムは完全には解析されておらず,効果的な治療法あるいは予防法の確立を見ていない.申請研究では,GASの付着・侵入因子であるフィブロネクチン(Fn)結合タンパクの同定ならびに詳細な機能解析を行い,上皮細胞バリアを超えて組織内に侵入するメカニズムを解析し,予防法の基盤を築くことを試みた.はじめに,血清型M1およびM3のGASゲノムデータベースから,それぞれ黄色ブドウ球菌のフィブロネクチン(Fn)結合タンパクFnBPAと相同性を有するFbaA,およびGASのFn結合タンパクPrtF2と相同性を呈するFbaBを同定した.続いて,これらFn結合タンパクの組換え体(rFbaAおよびrFbaB)の発現プラスミドを構築し,宿主大腸菌内で発現させた.精製rFbaAおよびrFbaBは,ビオチン標識したFnを用いたリガンドブロット分析およびFnとの生体間分子相互作用解析の結果から,Fnと結合することが示された.さらに,fbaAおよびfbaB遺伝子を欠失させた変異株を作製した.M1野生株とfbaA欠失株,およびM3野生株とfbaB欠失株のそれぞれ組み合わせで,ヒト咽頭上皮由来のHEp-2細胞株に感染させ,GASの細胞付着・侵入率の差を計測した.その結果,M1およびM3型菌は,ともにFn結合タンパクの不活化により,有意に付着・侵入率が低下することが示された.最後に,FbaAおよびFbaBのマウスを用いた感染防御実験から,FbaAおよびFbaBの感染防御抗原としての有効性を示した.本研究課題で使用するA群レンサ球菌(GAS)の臨床分離株を収集した.今年度は主として再発性咽頭炎患者からの分離株を収集し,DNAシークエンサーを用いてそれらのemm遺伝子型を決定した.次いでGASのゲノムデータベースから、レンサ球菌の菌体表層タンパクに共通のLPXTGモチーフを指標として,推定の菌体表層タンパクを13種類選出した.さらに,これらのタンパクの中で,N末端に推定シグナル配列を有するものを抽出し,さらに既報の宿主細胞付着・侵入因子と相同性を示す分子を選択した.血清型M1およびM3のGASゲノムデータベースからは,それぞれ黄色ブドウ球菌のフィブロネクチン(Fn)結合タンパクFnBPAと相同性を有するFbaA,およびGASのFn結合タンパクPrtF2と相同性を呈するFbaBが得られた.続いて,これらFn結合タンパクの組換え体(rFbaAおよびrFbaB)の発現プラスミドを構築し,宿主大腸菌内で発現させた.精製rFbaAおよびrFbaBは,ビオチン標識したFnを用いたリガンドブロット分析およびFnとの生体間分子相互作用解析の結果から,Fnと結合することが示された.また,rFbaAおよびrFbaBを家兎に免疫して,特異的抗血清を作製した.さらに,fbaA遺伝子およびfbaB遺伝子をシングルクロスオーバー法により破壊し,それぞれの標的タンパクの不活化を特異的抗血清を用いたウェスタンブロット法で確認した.M1野生株とfbaA欠失株,およびM3野生株とfbaB欠失株のそれぞれ組み合わせで,ヒト咽頭上皮由来のHEp-2細胞株に感染させ,GASの細胞付着・侵入率の差を計測した.

その結果,M1およびM3型菌は,ともにFn結合タンパクの不活化により,有意に付着・侵入率が低下することが示された.以上の結果は,ゲノムデータベースから同定したFbaAおよびFbaB分子が,GASの細胞付着・侵入因子であることを示唆している.A群レンサ球菌(GAS)は,皮膚や上気道における化膿性疾患の原因菌として,また近年では壊死性筋膜炎やショック症状を引き起こす致死性の高い侵襲性GAS感染症の起因菌として注目を集めている.その病原性に関与する因子が多種に及ぶことから,病態発症のメカニズムは完全には解析されておらず,効果的な治療法あるいは予防法の確立を見ていない.申請研究では,GASの付着・侵入因子であるフィブロネクチン(Fn)結合タンパクの詳細な機能解析を行い,上皮細胞バリアを超えて組織内に侵入するメカニズムを解析した.特に,未だ国内外ともに報告の無い,Fn非存在下での上皮細胞へのGAS付着・侵入機構についても検索し,GASの代表的な初感染部位である皮膚組織における感染成立機序を明らかにしようと取り組んだ.その結果,GAS菌体表層に2530°Cで発現する線毛が,表皮ケラチノサイト株へのFn非依存性付着に関与することを明らかにした.さらに,これらの分子生物学的所見に従って,侵襲性GAS感染発症株に有意に発現する検査マーカー候補としてFbaB分子を選択した.そして,FbaBの各領域のin Vitroならびにマウス動物実験モデルにおける感染防御抗原としての有効性を検証した.これらの実験から,N末端領域が受動免疫療法に適するオプソニン化効率に優れ,かつ,宿主組織との交叉反応性の認められない特異的抗体を誘導することを示した.
細胞老化関連遺伝子Tarshの肺癌における癌抑性機構の解明と臨床診断への応用

TARSH (Target of NESH-Sh3)/Abi3bpはE3B1/ArgBP/Avi2/NESHfamilyのNESHとSH3ドメインを介して結合する分子として見出された遺伝子であるがその生物学的機能はまだ明らかでない。我々はTARSHmRNA量がマウス胎児由来繊維芽細胞(MEFs)の細胞老化に伴って増大する事を見出した。細胞老化が生体において発癌抑制機構として機能している可能性を踏まえ、本研究では「細胞老化と癌化」に着目してTARSHの発現状況や機能解析を行った。1)TARSHmRNAがマウス・ヒト共通に肺で高発現していることを明らかにした。ヒト肺癌由来細胞株およびヒト肺癌腫瘍部位におけるTARSHの発現量をヒト正常肺由来cDNAや個々の症例における非腫瘍組織をコントロールとして定量PCR法にて解析した。その結果、これまでに調べた細胞株15種、肺癌手術検体80例すべてでTARSHmRNA量がコントロールに対して有意に低下していた。この結果からTARSHが肺癌と強い関連がある事が示唆された。2)レトロウイルスを利用してTARSHの3'UTRを標的としたshort hair-pin RNAを発現させ、TARSH遺伝子発現量の低下が細胞に及ぼす影響を調べた。TARSH遺伝子発現ノックダウンによって野生型MEFsで著しい細胞増殖抑制が認められた。この時S期細胞の減少、二核化やセントロソーム数の異常が認められ、TARSHが細胞周期に関連した機能を持つ可能性が示唆された。TARSH(Target of NESH-SH3)は、E3B1/ArgBP/Avi2/NESHfamilyのNESHとSH3 domainを介して結合するとされて見出された遺伝子であるが、その生物学的機能はまだ明らかでない。我々は、マウスの正常肺において特異的に高発現を示し、かつマウス胎児由来線維芽細胞の細胞老化に伴ってTARSH mRNAの発現量が増加することを見出し、細胞老化関連遺伝子として注目している。細胞老化が癌抑制機構として生体内で機能している可能性を踏まえて我々は今回、「細胞老化と癌化」の関連に着目し、ヒト肺癌におけるTARSH遺伝子の発現状況を解析した。Northern blot法によりヒト正常肺においてもTARSH mRNAが強く発現していることを確認した。ヒト肺癌細胞株15種類と手術で切除された原発性肺癌の臨床検体32例を対象として、個々の株細胞もしくは組織より抽出したRNAからcDNAを合成した。これよりreal-time reverse transcription PCR法にてTARSH mRNAの発現レベルを定量化した。肺癌細胞株の発現レベルは、正常肺polyA RNAから合成したcDNAの発現量との比で、肺癌手術検体においては個々の症例における非腫瘍部肺組織をコントロールとしてその発現比で定量数値化した。その結果、TARSH mRNAの発現レベルは我々の検索したヒト肺癌細胞株15種類および肺癌臨床検体32症例の全てにおいて、有意にかつ顕著に低下していたことを見出した。TARSHが肺癌との間に強い関連があることが示唆されたこの知見は全く新しいものであり、学術雑誌に発表した。今後さらなる解析を進めていく予定である。TARSH(Target of NESH-Sh3)/Abi3bpはE3B1/ArgBP/Avi2/NESHfamilyのNESHとSH3ドメインを介して結合する分子として見いだされた遺伝子であるがその生物学的機能はまだ明らかでない。我々はTARSH遺伝子発現についてマウス胎児由来繊維芽細胞(MEFs)の細胞老化に伴ってmRNA量が増大する事、マウスヒト共通に肺で高発現している事、ヒト肺癌臨床検体の解析から非腫瘍部位に対して腫瘍部位においては有意に発現量が低下している事を報告している。今年度はヒト肺癌臨床検体の解析を継続すると共に分子機能解明を目指す研究を行った。

1)定量RT-PCR法にてTARSHmRNA量を解析した結果、これまでに調べたヒト原発性肺癌臨床検体80例すべてについて、肺腫瘍部位におけるmRNA量が同一症例の非腫瘍部位よりも有意に低下している事が明らかとなった。2)TARSH分子の機能について検討するためにレトロウイルスを利用してTARSHの3'UTRを標的としたshort hair-pin RNAを発現させ、TARSH遺伝子発現量の低下が細胞に及ぼす影響を調べた。TARSH遺伝子発現ノックダウンによって野生型MEFsでは著しい細胞増殖抑制が認められた。この時S期細胞の減少、二核化やセントロソーム数の異常が認められ、TARSHが細胞周期に関連した機能を持つ可能性が示唆された。
プロテオミクスによる代謝調節機序の解明と糖尿病における異常

インスリンの作用には、IRS-1/2を介したPI3-kinase/Akt活性化が極めて重要な役割を果たしている。我々は、IRS-1に結合するタンパクを、免疫沈降からの複合体解析をLC/MS/MSのシステムを用いて網羅的に検索し、proryl isomerarse I(Pin1)を同定した。Pin1は、プロリンをtrans構造に変化させることでタンパクの構造変化をもたらし、機能を修飾する蛋白である。重要なことに、Pin1は高脂肪食負荷に伴って発現量が増加する。また、絶食で低下し、食事の再摂取によって発現が増加する。Pin1は、IRS-1に結合しインスリンによるシグナル伝達を顕著に亢進させることが判明した。Pin1のKOマウスでは、肝臓や筋肉におけるインスリン抵抗性が認められた。また、Pin1をob/obマウスの肝臓に過剰発現させると、低下していたインスリン依存性のPI3-kinase/Akt活性化が回復し、耐糖能を顕著に改善した。これらを総合的に判断すると、Pin1の発現を増加させたり、Pin1と結合する部位であるIRS-1のSer434周囲に結合する分子を探索することで、インスリン感受性を改善する新規糖尿病治療薬開発への可能性が考えられる。また、GLUT4及びGLUT1のC末端に、flag tagとmyc tagを逆に配置したMEFタグを取り付けた蛋白(GLUT4/1-flag-TEV-myc)をコードするcDNAを作成し、これらを発現させた細胞から、高純度のGLUT4/1含有小胞を精製する。得られたGLUT4/1含有小胞より蛋白を抽出し、2次元電気泳動を行い、GLUT4/1含有小胞それぞれについてプロテオームマップを作成した。1.インスリン作用や糖代謝に重要な蛋白の修飾や結合蛋白の同定インスリン受容体からのシグナル伝達は、IRS-1/2リン酸化→PI3-キナーゼ活性化→Aktリン酸化が主なる経路である。一方、c/EBPα、PPARα/γといった転写因子は詳細な機序は明らかでないが、インスリンシグナルや代謝の調節に大きく関わっている。また、calpain10は2型DMの原因遺伝子として同定されたが、その機序は明らかにされていない。インスリンシグナルに関連するタンパク群、代謝酵素群、エネルギー代謝調節に関わる転写因子群に対して、MEF法を適用し、蛋白複合体解析を行う。II GLUT4含有小胞特異的蛋白の構造及び機能の解析GLUT4及びGLUT1のC末端に、flag tagとmyc tagを逆に配置したMEFタグを取り付けた蛋白(GLUT4/1-flag-TEV-myc)をコードするcDNAを作成する。これを発現するアデノウイルスを作成し、3T3-L1脂肪細胞や培養筋肉細胞に発現させる。これらの培養細胞やマウス組織をhomogenizeした後、細胞膜分画と細胞質分画を除き、細胞内の膜分画(low density microsome分画)を遠心分離法によって採取する。これに、前述したMEF法の手順を、可溶化しない条件で用い、高純度のGLUT4/1含有小胞を精製する。得られたGLUT4/1含有小胞より蛋白を抽出し、2次元電気泳動を行い、GLUT4/1含有小胞それぞれについてプロテオームマップを作成する。また、LC-MS/MSを用いて各小胞構成蛋白を網羅的に同定すると共に、GLUT4/1含有小胞間の違いに関しては、同位体ラベル法を用い、詳細に検討する。これらから、パターン解析と各蛋白の同定結果を基に、筋肉と脂肪細胞の両方についてデータベース化を行う。インスリン受容体からのシグナル伝達は、IRS-1/2リン酸化→PI 3-キナーゼ活性化→Aktリン酸化が主なる経路である。

また、calpain 10は2型DMの原因遺伝子として同定されたが、その機序は明らかにされていない。インスリンシグナルに関連するタンパク群、代謝酵素群、エネルギー代謝調節に関わる転写因子群に対して、MEF法を適用し、蛋白複合体解析を行った。その結果、Pin1がIRS-1/2に結合すること、また、高脂肪食の負荷によって、この結合の増加が認められた。また、Pin1をbaitに用いて結合タンパクを同定することで、転写因子が同定され、この結合の病的意義についても検討中である。また、GLUT4及びGLUT1のC末端に、flag tagとmyc tagを逆に配置したMEFタグを取り付けた蛋白(GLUT4/1-flag-TEV-myc)をコードするcDNAを作成し、これを発現するアデノウイルスを作成た。これらを発現させた細胞から、高純度のGLUT4/1含有小胞を精製する。得られたGLUT4/1含有小胞より蛋白を抽出し、2次元電気泳動を行い、GLUT4/1含有小胞それぞれについてプロテオームマップを作成した。この結果についても病態との関連を検討中である。