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サルヘルペスBウイルス検査システム確立とウイルスの病原性に関わる進化生態学的研究

1.検査システムの確立サルのBウイルス(αヘルペスウイルス)のin house(自家)検疫の一環として、各施設における簡便で特異性の高いBウイルス抗体検出用キットの開発が求められてきている。しかし、国内ではBウイルスの大量培養(安全度分類がクラス4になる)による抗原作製が不可能であることから、Bウイルスに近縁のヒヒヘルペスウイルス(HVP2)抗原を使用したELISA抗体検出キットの技術開発と確立を目的とした。ウイルス抗原の作製法、イミュノプレートへの貼付法と保存性、発色系並びに特異性などを吟味して、キット作製を行った。本研究期間である4年間に、希望する国内(国立大学法人、公立大学法人、私立大学ならびに企業等)に頒布した。なお、キットの安定性の調査および操作性の向上を図るため、頒布先の機関よりキットを用いた検査結果と検査血清の送付を依頼し、我々の検査結果と比較した。平成18年のBウイルス抗体検出用ELISAキットの頒布実績は、延べ13機関、94キットであった。頒布先でのキットを用いた検査結果と本研究室で行った再検査の結果はよく一致したことから、キットの安定性については解決できたと考えられた。また、キットは富山大学で行われた平成18年度実験動物関係教職員高度技術者研修の実習に利用したほか、ベトナム・ホーチミン市近郊のサル繁殖施設へ持参し、現地での検査に使用した。2.Bウイルスの進化生態学的研究秋田県北部の白神山地において捕獲された野生ニホンザルの血清26検体を検査した結果、約27%の抗体保有率が認められた。わが国固有の野生ニホンザルでもBウイルス感染が広がっていることが推測された。国内医学研究用のマカカ属サルにおいて、Bウイルス(Cercopithecine herpesvirus 1)抗体保有率が約40%に及ぶことがわれわれの調査で判明している。このことから、検疫の一環としての各施設における自家検査可能な簡便な抗体検出用キットの開発が求められている。国内ではBウイルスの大量培養による抗原作製は不可能であることから、Bウイルスと近縁のヒヒヘルペスウイルス(HVP2)抗原を使用した抗体検出系を開発するに至った。今年度、HVP2抗原を用いたBウイルス抗体検出用ELISAキットを試作し、希望する研究機関に頒布すると共に、キットの安定性の調査および操作性の向上を図るため、頒布先の機関よりキットを用いた検査結果と検査血清の送付を依頼した。なお、送付されてきた検査血清を研究代表者の機関において非乾燥抗原プレートを用いて再検査したところ、各研究機関での検査結果と異なる結果が少なからず認められた。そこで、今回、検査結果のばらつきの原因を探るため、長期保存が乾燥プレートの安定性に与える影響について検討したところ、プレート保存後14日、100日、200日の乾燥抗原プレートを用いた検査結果を比較すると、保存期間の長期化に伴って非感染細胞に対する値がやや高くなる傾向が認められた。しかし、検体の陽性・陰性の判定に影響を与えるほどのものではなかった。したがって、乾燥プレートを4°Cで保存した場合、少なくとも200日間は安定であり、信頼性の高い検査が可能であるという結果が得られた。キット頒布先との検査結果の相違については、各研究機関でのキットの保存状態、検査手技、キット添付溶液の変性等の問題が考えられるが、今後さらに検討を重ね、より安定したELISAキットの提供を行う予定である。一方、ウイルスのゲノム解析も一部行い興味ある結果が得られており、さらに解析を続行する予定である。1.検査システムの確立各施設におけるin house(自家)検疫の一環として、各施設における自家検査用の簡便なBウイルス抗体検出用キットの開発が求められているが、国内ではBウイルスの大量培養(安全度分類がクラス4になる)による抗原作製は不可能であることから、Bウイルスに近縁のヒヒヘルペスウイルス(HVP2)抗原を使用した抗体検出系を開発することを着眼した。

今年度もHVP2抗原を用いたBウイルス抗体検出用ELISAキットを試作し、希望する国内および海外研究機関(米国ウイスコンシン霊長類センター)に頒布すると共に、キットの安定性の調査および操作性の向上を図るため、頒布先の機関よりキットを用いた検査結果と検査血清の送付を依頼した。この中で、特に海外へのキット送付と信頼性の検討を行ったところ、米国内でのBウイルス検査機関による検査結果と本キット使用による検査結果とが良く一致した成績が得られたことは特筆に値するものであった。なお、昨年度の成績から、われわれが使用している乾燥抗原プレートキットは4°Cで保存した場合、少なくとも200日間は安定であり、信頼性の高い検査が可能であるという結果が得られている。2.Bウイルスの進化生態学的研究一方、Bウイルスゲノムの解析をタイワンザルや中国生息のアカゲザルでも行うため、両国に赴き、Bウイルス抗体検出用ELISAキットの原理や信頼性の保証、さらに使用説明を行うとともに、血清採集も行った。その結果、台湾における保護動物であるタイワンザルでも約40%の抗体保有率が認められ、台湾の自然生息タイワンザルにおいてもBウイルスが広く感染していることが推測された。タイワンザル感染Bウイルスの進化生態学的研究における興味ある成績が得られたので、次年度以降も解析を続行する予定である。1.検査システムの確立各動物実験施設におけるin house(自家)検疫の一環として、各施設における自家検査用の簡便なBウイルス抗体検出用キットの開発が求められているが、国内ではBウイルスの大量培養(安全度分類がクラス4になる)による抗原作製は不可能であることから、Bウイルスに近縁のヒヒヘルペスウイルス(HVP2)抗原を使用した抗体検出系の技術開発と樹立を着眼した。今年度も昨年度に引き続きHVP2抗原を用いたBウイルス抗体検出用ELISAキットを試作し、希望する国内(国立大学法人ならびに企業等)および海外研究機関(米国ウイスコンシン霊長類センター)に頒布すると共に、キットの安定性の調査および操作性の向上を図るため、頒布先の機関よりキットを用いた検査結果と検査血清の送付を依頼した。昨年に続き海外へのキット送付と信頼性の検討も行ったところ、米国内での検査機関によるBウイルス抗体検査結果と本キット使用による結果とが良く一致した成績が得られた。なお、これまでの検討結果から、われわれが使用している乾燥抗原プレートキットは低温(4°C)で保存する限り、少なくとも200日間は安定であって、高い信頼性を保有する検査キットであることが証明されている。2.Bウイルスの進化生態学的研究一昨年の研究結果から、台湾における保護動物であるタイワンザルでも約40%の抗体保有率が認められ、台湾の自然生息タイワンザルにおいてもBウイルスが広く感染していることが推測されている。タイワンザル感染Bウイルスの進化生態学的研究における興味ある成績が得られていることから、Bウイルスのゲノム解析を外国生息のマカカ属サルやわが国生息固有のニホンザルでも継続的に行うべく準備を行っている。1.検査システムの確立
「イベリア系文化圏」における農村共同体の再編と都市の変容

本研究では、ラテンアメリカとスペイン・ポルトガルをひとつの「イベリア系文化圏」としてとらえ、都市エスニシティ-の形成と変容の問題について、農村共同体をはじめとする周縁的諸社会の側から検討することが、主たる目的であった。比較対象地域としてわれわれは、都市形成過程における歴史的特徴にしたがって、以下の4地域を選んだ。すなわち、原住民村落と密接な関連のあるメキシコ地方都市、その影響の少ないチリの都市黒人系住民の影響の強いブラジルの都市、そして、スペインでは首都マドリ-ドに常に対抗してきた地方都市バルセロ-ナである。予算上の制約から当初の計画はいくぶん縮小し、また、国外研究分担者の都合により一部メンバ-の交替もあったが、初年度より海外調査、国内研究会ともに順調に進展し、また、国外研究分担者はもとより、国外研究諸機関との関係も大幅に拡大した。ちなみにメキシコでは、CIES(南東部エコロジ-研究所)、INI(原住民局)に加えて、CIESAS(社会人類学高等研究院)、チアパス自治大学と、ブラジルでは、サンパウロ大学に加えて、サンパウロ州黒人コミュニティ-社会参加開発局、州立カンピナス大学、フルミネンセ連邦大学、リオデジャネイロ州立大学、カンディド・メンデス大学アフロ・アジア研究センタ-との関係を新たに確立することができ、共同研究の国際的な協力体制をさらに強化することができた。清水・坂井は主として、メキシコの地方都市サン・クリストバル市と周辺原住民諸社会との地域的社会関係、とくにインディオ共同体との分裂と都市における離村インディオ・コロニ-の調査にあたり高橋はチリの首都サンディアゴ市のスラム住民の意識と運動の分析、鈴木は主としてサンパウロ市における黒人系住民の歴史的意味と社会的結合形態について、初谷はメキシコ・ユカタン半島のインディオ村落におけるアイデンティティの再編について、落合はバルセロ-ナにて、およびラテンアメリカ地方都市とスペインの地方都市との比較研究にあたった。また最終年度には、国外研究分担者のジャン・デ・ボス(メキシコ)とマヌエル・デルガ-ド(バルセロ-ナ)を招請し、国内にて総括的研究報告会を開催した。その報告会の成果は、スペイン語・ポルトガル語の報告書としてまとめたが、3年間にわたる共同研究をつうじて明らかとなった要点を集約するなら、以下のとおりである。(1)都市=農村・周縁社会関係が、1970年代を境に、構造的・現象的に変化を遂げはじめ、その変化が、都市の文化・社会関係はもとより、国政レベルの政治構造をも根底から揺り動かしつつあること。(2)こうした変化は、恐らくラテンアメリカの特殊性をはらみながらも、世界各地で顕在化しつつある「小数民族問題」や「外国人労働者問題」にみられるように、世界的な現象の一環として把握されるべき問題であろうこと。(3)その変化の過程は、従来の都市側からの価値の普遍化の力が限界に達しつつあり、構造的にも現象的にも、周縁的社会の側が都市のありかたを規定しつつあることを意味する。例えばメキシコのサン・クリストバル市の〈インディオ化〉。(4)その変化の過程は、歴史的には都市側からの圧力の結果といえようが、直接的な原因としては、宗教問題、とりわけプロテスタントへの改宗問題と新宗教の台頭が、メキシコ・ブラジルでは、きわめて重要であること。従来のラテンアメリカの都市研究では、都市対農村という二項対立的発想、あるいは「都市的近代」を単線的経済発展の基軸に据えた経済主義的・近代化論的発想にもとづくものが多く、基本的には都市側からの視点が主流をなしていた。本研究をつうじてわれわれは、都市性の問題を周縁諸社会を含むエスニシティ-の再編過程の一環として捉えることの重要性を改めて確認した。もうひとつの目的であった「イベリア文化圏」の特徴を抽出する点については、今後の課題として残さざるをえなかった。

また最終年度には、国外研究分担者のジャン・デ・ボス(メキシコ)とマヌエル・デルガ-ド(バルセロ-ナ)を招請し、国内にて総括的研究報告会を開催した。その報告会の成果は、スペイン語・ポルトガル語の報告書としてまとめたが、3年間にわたる共同研究をつうじて明らかとなった要点を集約するなら、以下のとおりである。(1)都市=農村・周縁社会関係が、1970年代を境に、構造的・現象的に変化を遂げはじめ、その変化が、都市の文化・社会関係はもとより、国政レベルの政治構造をも根底から揺り動かしつつあること。(2)こうした変化は、恐らくラテンアメリカの特殊性をはらみながらも、世界各地で顕在化しつつある「小数民族問題」や「外国人労働者問題」にみられるように、世界的な現象の一環として把握されるべき問題であろうこと。(3)その変化の過程は、従来の都市側からの価値の普遍化の力が限界に達しつつあり、構造的にも現象的にも、周縁的社会の側が都市のありかたを規定しつつあることを意味する。例えばメキシコのサン・クリストバル市の〈インディオ化〉。(4)その変化の過程は、歴史的には都市側からの圧力の結果といえようが、直接的な原因としては、宗教問題、とりわけプロテスタントへの改宗問題と新宗教の台頭が、メキシコ・ブラジルでは、きわめて重要であること。従来のラテンアメリカの都市研究では、都市対農村という二項対立的発想、あるいは「都市的近代」を単線的経済発展の基軸に据えた経済主義的・近代化論的発想にもとづくものが多く、基本的には都市側からの視点が主流をなしていた。本研究をつうじてわれわれは、都市性の問題を周縁諸社会を含むエスニシティ-の再編過程の一環として捉えることの重要性を改めて確認した。もうひとつの目的であった「イベリア文化圏」の特徴を抽出する点については、今後の課題として残さざるをえなかった。プロジェクト第2年目にあたる今年度は、初年度派遣者の研究実績が別表のとおり徐々に公刊されはじめ、今年度派遣者により調査も、一部、派遣者の変更、派遣日程の変更等があったとはいえ、全体としては、予定どおりの成果をあげたと考えられる。清水は、ロンドン近郊・グラナダ市・マドリ-ド市における外国系移住労働者、およびバルセロ-ナ市近郊農村からの移住労働者居住区の実態調査にあったり、高橋は、チリ・サンティアゴ市およびコンセプシオン市における都市スラム居住区の調査を、また、鈴木は、サンパウロ・レシ-フェ・サルヴァド-ル市において、近郊農村からの住居の移動を中心に実態調査を実施した。この間に、外国人共同研究者・研究協力者との情報交換も、前年度にまして活発となり、2度にわたる国内研究会においても、活発な議論が展開した。以下に、今年度の調査をつうじて明らかになった論点を呈示しておきたい。(1)従来、本プロジェクトの構成員もそうであったように、ラテンアメリカ研究の視点は、多くの場合、同地域の特殊性のみに注目する傾向にあり、そこに孕まれている普遍的な問題に目を向けることが少なかった。
細胞積層技術を用いた三次元膵島組織の構築

重症I型糖尿病患者に対する膵島細胞移植は、膵臓移植に比して手術侵襲は低いものの、生着率の低さとドナー不足が課題であり、再生医療、組織工学技術の発展が期待される。我々は、膵島移植に代わる再生医療のための組織工学技術のうち、汎用性が高いスフェロイド技術の臨床応用に向け、組織強度の強化、早期構築、機能向上の観点から交互積層法(layer-by-layer; LbL法)に着目した。これは2種類の細胞外マトリックスであるフィブロネクチンとゼラチンから成るナノ薄膜を単細胞レベルで細胞表面へ形成させ、細胞間接着を促し、三次元組織構築を可能にする技術である。本研究ではこの技術を用いて作成した膵β細胞スフェロイドの有用性について検討した。初年度では、マウス由来膵β細胞株を用いて、LbL法併用群(LbL併用群)と非併用群で、膵β細胞スフェロイドのin vitroでの形態的、機能的な違い、および同種同系の糖尿病マウスモデルを用いた移植実験で生体内での機能的な違いを比較検討した。その結果、LbL併用群でより早期から密な細胞凝集を認め、高いインスリン感受性を示した。また、ギャップジャンクションに関わるコネキシン36の発現がLbL併用群で高く、機能向上の一要因と考えられた。移植実験では、LbL併用群で早期より血糖値の低下を認め、腹腔内グルコース刺激試験では有意に血糖値の上昇を抑えた。最終年度では、臨床応用を目指して、インスリン分泌細胞としてヒトのiPS由来膵β細胞を用いて、膵β細胞株と同様の実験を行った。その結果、in vitroにおいて、LbL法を併用することで、高密度で高いインスリン分泌能を示す膵β細胞スフェロイドが作成できた。細胞外マトリックスによる交互積層法は、形態的、機能的に優れた膵島類似組織を構築する新たな技術として有用であると考えられた。重症I型糖尿病患者に対する膵島細胞移植は、膵臓移植に比して手術侵襲は低いものの、その生着率の低さとドナー不足が課題であり、再生医療、組織工学技術の発展が期待されている。我々は膵β細胞のスフェロイド構築過程における組織強度の強化、早期構築、機能向上を目指して、2種類の細胞外マトリックス(フィブロネクチンとゼラチン)による交互積層技術(Layer by Layer ; LbL法)に着目した。同時に、膵島組織の生着率向上を目指して抗炎症作用を有する脂肪由来幹細胞の併用も考慮しているが、本年度は膵β細胞単独でのスフェロイド構築におけるLbL法併用の有効性を検証した。膵β細胞としてMIN6(C57BL/6Jマウス由来β細胞株)を用いて、in vitroにおいて、スフェロイド単独とLbL法併用での形態的、機能的な違いについて検討し、機能解析も行った。In vivoでは、ストレプトゾシン誘導1型糖尿病マウスへの同種同系腎被膜下移植において、スフェロイド単独との血糖降下作用、グルコース刺激への反応の違いを検証した。結果、LbL法の併用により、培養1日目から高い細胞凝集を認め、機能面においては、併用群で培養1日目から高いインスリン分泌を認め、グルコース刺激への感受性も良好な結果であった。更に、併用群において、インスリン1/2およびグルコーストランスポーター2のmRNAの発現上昇(qRT-PCR)を確認するとともに、ギャップジャンクションに関わるコネキシン36(Cx36)のmRNAおよび蛋白発現(qRT-PCR, WB)上昇が、LbL法併用による機能向上の一因となることを示した。In vivoでは、LbL法併用により早期から血糖降下を認め、移植7日目での腹腔内グルコース刺激試験への反応が有意に良好であった。また、移植7日目において、移植組織内Cx36発現がLbL併用群で高値を維持していた。MIN6単独でのLbL法の有効性は検討できたが、当初、脂肪由来幹細胞(ADSC)との併用を考慮していた点においては十分な検証ができておらず課題が残っている。原因として、膵β細胞株であるMIN6との併用において、ADSCがMIN6へ細胞障害(アポトーシス助長)を与える可能性を示唆する結果が得られたため、細胞ソースとしてMIN6ではなく、iPS由来の膵β細胞を用いてADSCの有効性を検証することを考慮している。

移植実験では、LbL併用群で早期より血糖値の低下を認め、腹腔内グルコース刺激試験では有意に血糖値の上昇を抑えた。最終年度では、臨床応用を目指して、インスリン分泌細胞としてヒトのiPS由来膵β細胞を用いて、膵β細胞株と同様の実験を行った。その結果、in vitroにおいて、LbL法を併用することで、高密度で高いインスリン分泌能を示す膵β細胞スフェロイドが作成できた。細胞外マトリックスによる交互積層法は、形態的、機能的に優れた膵島類似組織を構築する新たな技術として有用であると考えられた。MIN6でのLbL法の有効性は検討できたため、続いて臨床応用への次のステップとして、iPS由来のβ細胞を用いて、スフェロイド作成過程におけるLbL併用の有効性を検証する。in vitroでは、MIN6を用いて検証した形態面、機能面での相違をiPS由来のβ細胞で検証するとともに、MafA、PDX1、Fltp、Ucn3といった転写因子の発現が、LbL併用の有無によって影響を受けるかどうかについても評価する。In vivoにおいてはNOD SCIDマウスにストレプトゾシンを誘導することで1型糖尿病マウスモデルを作成し、LbL法の併用による作成スフェロイド組織の生着率の違いについて検証する。また、ADSC併用によるiPS由来のβ細胞の機能への影響を検討し、in vivoにおいてはADSC併用によって更に組織生着の向上が得られるかどうかについて検証する。
ダカルバジンの副作用に対する新規対応法についての検討

研究目的抗がん剤を使用して治療する患者はますます多くなることが予想されるが、その一方で抗がん剤による副作用を抑えることに関してはまだまだ不十分な点が多く、今後の課題である。また、抗がん剤の中には特異的な副作用を持つ薬剤があり、ダカルバジンもそのひとつである。その副作用としては血管痛が知られている。これによる痛みはかなり強い場合があり、投与中止にしなくてはならないような場合もある。この原因としては光分解による発痛物質生成であることが知られており、実際の投与の際にはルート全体の遮光や調製時の遮光が行われている。ただし、これには手間がかかることが多く、より簡潔に行える方法があると有用である。この研究ではその方法を検討していくことを目的とした。研究方法まずはこれまでのダカルバジンに関してのデータを収集し、その解析や対応法について検討する。そして、実際の投与方法と共に検討して、何か新しい方法を検討するための手がかりを見つける。可能であれば、実際のデータを収集していく。研究結果文献を検索した結果、ダカルバジンの分解ルートは解明されており、その発生は光の存在下、濃度が低い場合、pHなどに影響を受けることが分かっている。pHに関しては生理食塩水、5%ブドウ糖などに溶解した場合は約3.5であるが、これを中和することは安定性から困難である。濃度に関しても実際の投与時にはそれほど希釈はされていなかった。光に関しては遮光することでの安定性は24時間後でも保たれることがわかっているが、実際にはそれでも痛みを感じる場合がある。これらの結果だけから判断すると、新しい方法を考えるためには、これまでとは違った視点から考える必要があるが、今回の研究では試薬を用いて検討するところまでは行うことができなかった。
ウイルスを用いたin vivoでの神経細胞への遺伝子導入法の開発とその応用

α-herpes virusの一種であるpseudorabies virus(PrV)Ka株のmutantを作製し、トランスニューロナル・トレーサーとしての特徴と限界について検討した。ウィルスの検出には、ウィルスのglycoproteinの一つであるgG(gX)をcodeする領域のBamHI siteにlacZを挿入し、β-Galの酵素反応を用いた。本法は、将来別の遺伝子を挿入し、in vivoで遺伝子導入を行う際に活かすことができる。PrV-β-Galをラットの咬筋に注入し、34日後に潅流固定した。ウィルス濃度は1.0×10^7p.f.u./mlが最適と思われ、1.4×10^7p.f.u./ml以上の濃度では全例2日以内に死亡し、5.0×10^6p.f.u./ml以下では、ラットは死亡しないが脳への感染が認められなかった。1.0×10^7p.f.u./mlの濃度のウィルスを10μl注入したラット12匹中5匹が死亡し(死亡率42%)、生存例7匹中4匹で脳に感染ニューロンが認められた(成功率は33%)。全例で三叉神経運動核に陽性ニューロンが見られたが、三叉神経中脳路核に感染細胞が見られたのは2例だけで、その数も少なかった。また、一例で三叉神経節に多数の標識ニューロンが認められ、脊髄路核背側に二次ニューロンの標識が見られたが、視床には陽性構造は認められなかったので、順行性の輸送はないと思われる。中枢においてはPrVは主として逆行性に輸送され、縫線核群、青斑核、延髄の網様体、Edinger-Westphal核、視床下部のtuberal magnocellular n.(TM核)・外側核・室傍核などにβ-Gal陽性ニューロンが認められた。その他、胃・十二指腸や眼球にもPrVを注入して検討した結果、PrV(Ka株)のgG欠損mutantは体性および内臓性運動ニューロンにほぼ選択的に取り込まれ、その後はtransneuronalに移行して逆行性に運ばれ、二次あるいは三次ニューロンを標識するということが明らかになった。我々の当初の目的では、感覚ニューロンへの遺伝子導入に用いるということであったが、PrVはそれには適さないことがわかったので、現在他のウィルスについての検討を開始している。まず、ゲノミックPrVよりSphI-fragment(gX,gp50,gp63,gIなどの糖蛋白をコードする領域)を切断し、pFBI-1に導入。gXのBamHI siteにE.Coliのbeta-Gal geneのBamHI fragmnetを接続した(plasmid DNA)。PrVはpig kidney cell(PK cell)に接続して増殖させ、型どおりviral DNAを抽出した。

PrV DNA(2-5ug)と、plasmid DNA(10-15ug)の混合液に2M CaCl_2と2xHBSを加えて沈澱を形成させ、その液を37°Cで4時間培養した。Glycerol shockを行った後、更に完全なCPEが形成されるまで37°Cで培養した。ウイルスを含む上清をVEROcell上に撒き、Bluo-Galにて青染するプラークをクローニングし、gX-beta-Gal fusion geneを取り込んだPrVを得ることに成功した。この様なco-transfectionによるmutant virusはPK cellよりもVEROcellにおいてよく増殖することが明らかになり、mutant virusの精製をより効果的に行うことができた。次にこのmutant virusをラットの皮膚に接種し、後根神経節でのbeta-Galの発現を観察することができた。今後これをトレーサーとして用いることにより、従来のトレーサー法では明らかにされていなかった神経回路網の解明を行う。また、各種ペプチド前駆体の遺伝子や細胞性癌遺伝子、あるいはそれらのアンチセンス遺伝子の導入を行い、知覚伝達系におけるこれらのペプチドや細胞性癌遺伝子の役割について検討を加える予定である。昨年度に引続き、ウィルス遺伝子の外来遺伝子の組み込みを行った。まず、genomicPrVよりSphI-fragment(gX,gp50,gp63,gIなどの糖蛋白をコードする)を切取り、pFBI-Iに導入。gXのBamHI siteに、E.Coliのβ-Gal遺伝子のBamHI fragmentを接続した。β-Gal遺伝子を組み込んだプラスミドをVEROcellにトランスフェクションさせる諸条件につき検討を行った。VEROcellへのトランスフェクションの効率は、Pig kidney cellの場合の約10倍であった。しかし、トランスフェクションの効率は毎回異なり、安定した効率でトランスフェクションできる条件について更に検討中である。更に今年度は、得られたβ-Gal-PrVをトランスニューロナルなトレーサーとして実用化し、特定の臓器や組織を支配する神経系に遺伝子導入を行うための諸条件、すなわち接種するウィルスの濃度や投与量、接種後の動物の生存期間(2日10日)などについて検討を加えた。接種部位として、皮膚・眼球・咬筋を選んだ。皮膚・後根神経節・感触伝導路、網膜・視覚伝導路、咬筋・三叉神経中脳路核については遺伝子発現を含め解剖学的検討の基礎データをを蓄積しているからである(研究発表の項参照)。得られたβ-Gal-PrVの量が十分出ないため、論文としてまとめるには至っていないが、投与するウィルスは13×10^6pfu/mlの濃度で3060nlが適当であると思われる。量が多過ぎるとleakが増えnon-specificな標識の原因となるようである。生存期間は4日が最も適当であった。来年度はこれらの基礎データをもとに、神経系への外来遺伝子の導入に取り組んでいきたい。まずは皮膚に接種し、後根神経節を経て体性感覚伝導路における遺伝子発現を操作することにより、痛覚などに関連した行動の変化を明らかにすることを目指している。最近、ウイルスベクターを用いた遺伝子治療が注目を集めており、レトロウイルスやアデノウイルスなどがその目的でよく研究され用いられている。
暑熱・寒冷下における高齢者の生活活動パターンと食行動の分析

1、健康な高齢者の生活活動パターンと食行動の実態を把握し、身体状況や体力との関連性について明らかにするために調査を行った。日常生活を自由に営む健康な60歳以上の男性について身長、体重、体脂肪率、BMI(ボディマスインデックス)、血圧、最大酸素摂取量などの身体状況に関する項目の測定を行った。また、夏季と冬季に3日間の生活時間調査と食事調査を行った。運動習慣のある高齢者においては、年齢に関係なく、エネルギーおよびほとんどの栄養素の充足率(%)が高い傾向にあった。高齢者の生活活動状況や身体状況、体力、食事については個人差が大きいが、個人内では、生活活動パターンは規則正しく、食事内容やスタイルに繰り返しがみられた。さらに、身体状況は比較的食事調査の結果を反映していることが伺えた。今後、充足率を算出するにあたって基準とする値について再検討すること、夏季および冬季のデータについて統計処理を含めた詳しい分析を行って比較検討することを予定している。2、ところで、生活活動パターンと食行動の関係を明らかにして行くために、モデル実験としてラットを用いて、1日の活動リズムの中枢である視交差上核が1日の食行動のパターンに関係があるかどうかを調べた。そして、視交差上核の神経伝達物質であるニューロペプタイドYの濃度が糖質の摂食量の変化にも関連していることを証明した。そこで、生活活動のリズムが食行動に影響していることが推測され、高齢者の生活活動のリズムが1日の食行動のパターンにどのように影響しているのかについても、朝、昼、夜の食事量や栄養素の摂取量を分析して明らかにして行く予定である。1、加齢によって生ずる基礎体力の低下と生活活動ならびに食事との関係を明らかにするために、夏季と冬季において高齢者の生活活動パターンと食行動を分析し、比較検討を行うことを目的とした。運動習慣のある健康な高齢者7名について、身長、体重、体脂肪率(インピーダンス)、BMI(ボデイマスインデックス)、血圧、最大酸素摂取量などの身体状況に関する項目の測定および調査を行った。さらに、日常3日間の生活時間調査と食事調査、万歩計による歩行数の調査を行った。冬季の調査からは、運動習慣のある高齢者においては、年齢に関係なく、エネルギーおよびほとんどの栄養素の充足率が高く、特に、蛋白質、脂質、食塩はかなり過剰の傾向にあった。また、生活時間調査からは、全体的に起床時間と就寝時間は早く、生活活動パターンは規削正しく、3日間の変化は少なかった。このグループでは身体状況は比較的食事調査の結果を反映していることが伺えた。今後、被験者を増やして、夏季および冬季に同様の調査を実施する予定である。2、生活活動パターンと食行動との関連性を明らかにして行くために、モデル実験としてラットを用いて、1日の活動のリズムの中枢である視交差上核が食行動にも関係があるかどうかを検討した。その結果、視交差上核の神経伝達物質が栄養素の摂取量に関連していることを証明し、光の同調機構とも関連があることを示唆した。そこで、今後は高齢者の夏季および冬季における生活習慣や生活活動パターンと朝、昼、夜の食事量ならびに栄養摂取量との関係について、詳しく検討して行きたい。
シロイヌナズナvan突然変異体を用いた維管束の連続性を制御する小胞輸送機構の研究

これまでにオーキシンの細胞間における極性輸送により,維管束パターンが制御されることが示されてきたもののその過程で機能する分子機構は不明な点が多かった.そこで私は維管束パターン,特に連続1生構築機構の解明を目的に,葉脈の不連続性を示すシロイヌナズナvan3の解析を行った.VAN3は小胞輸送の制御因子であるARF-GAPをコードすることから,細胞生物学的解析を行った.VAN3は一部のTGNに局在するという,特殊な細胞内局在を示すにも関わらず,その局在化機構は不明であったことから,VAN3の各ドメインにGFPを融合させたタンパク質の細胞内局在を解析した.その結果,BAR, PHの両方のドメインを含む領域がVAN3の細胞内局在に重要な役割を担うことが明らかとなった.また,VAN3が有するPHドメインはPI4-Pと顕著に相互作用することが明らかとなっており,VAN3のPHドメインは,TGN膜中のPI4-Pに富んだ領域にVAN3を局在化させる機能を有する可能性が考えられた.そこでこのことを明らかにするために,PI4-Pの生産に関与する5-PaseであるCVP2,とVAN3との関係を解析した.まず,cvp2においてVAN3の細胞内局在を調べた所,顕著な異常は観察されずCol下と同様にTGNに局在していた.一方,van3-2変異を有する変異型VAN3は,Col下においては顕著な局在の異常は観察されないにも関わらず,興味深いことにcvp2ではTGN膜へ局在不能となり,細胞質に局在が観察された.私は遺伝学的解析からも,cvp2変異がvan3-2の表現型を亢進する実験結果を得ており,以上の結果からCVP2が生産するPI4-PがVAN3の有するPHドメインに作用し,VAN3のTGN膜への局在を規定する分子機構が存在することを明らかにした.維管束の連続性構築機構を解明する目的で、葉脈が不連続となるvan3変異体の解析を行った。VAN3は小胞輸送を制御するARF-GAPをコードしており、培養細胞においてTGNに局在することが明らかとなった。遺伝学的解析よりVAN3はPIN1、GNOMとは独立に機能すると予想され、以上の結果は、エンドソームを介したPIN1の局在化に伴うオーキシンの極性輸送とは異なる機構により維管束の連続性は制御されていることを示唆している。葉脈形成にはPIN1の局在化の関与が広く受け入れられているのに対し、それとは異なるTGNを介した新規の小胞輸送機構の存在を示唆したことからこの結果は高く評価され、Development Vol.132及びその号のIn this issueに掲載された。またVAN3の相互作用因子としてDRP1Aを単離し、それがVAN3と協調的に機能することを示し、Plant physiology Vol.138において掲載された。さらにVAN3が真に機能する状態での細胞内局在を知るために、van3変異を相補した植物体を用いた解析を行った。興味深いことに、VAN3とSYP41は一つのTGN上で部分的に別れて局在していた。エンドソーム膜におけるドメイン構造の存在が動物の研究より報告されているが、この結果は植物のTGNにおいても同様の構造が存在することを始めて示す結果となった。TGNにおける局在に加え、VAN3は根の細胞膜において極性をもって局在した。以上の局在解析から、VAN3は極性をもったエンド/エキソサイトーシスを制御すると考えられた。また、オーキシンの極性輸送に関与するAUX1、PIN1の局在を実際にvan3変異体において解析したところ、野生型と同様の局在が観察された。これらの結果より、VAN3はAUX1、PIN1とは異なる積み荷を輸送し維管束の連続性を制御すると考えられた。これまでにオーキシンの細胞間における極性輸送により,維管束パターンが制御されることが示されてきたもののその過程で機能する分子機構は不明な点が多かった.そこで私は維管束パターン,特に連続1生構築機構の解明を目的に,葉脈の不連続性を示すシロイヌナズナvan3の解析を行った.VAN3は小胞輸送の制御因子であるARF-GAPをコードすることから,細胞生物学的解析を行った.VAN3は一部のTGNに局在するという,特殊な細胞内局在を示すにも関わらず,その局在化機構は不明であったことから,VAN3の各ドメインにGFPを融合させたタンパク質の細胞内局在を解析した.その結果,BAR, PHの両方のドメインを含む領域がVAN3の細胞内局在に重要な役割を担うことが明らかとなった.また,VAN3が有するPHドメインはPI4-Pと顕著に相互作用することが明らかとなっており,VAN3のPHドメインは,TGN膜中のPI4-Pに富んだ領域にVAN3を局在化させる機能を有する可能性が考えられた.そこでこのことを明らかにするために,PI4-Pの生産に関与する5-PaseであるCVP2,とVAN3との関係を解析した.まず,cvp2においてVAN3の細胞内局在を調べた所,顕著な異常は観察されずCol下と同様にTGNに局在していた.一方,van3-2変異を有する変異型VAN3は,Col下においては顕著な局在の異常は観察されないにも関わらず,興味深いことにcvp2ではTGN膜へ局在不能となり,細胞質に局在が観察された.

私は遺伝学的解析からも,cvp2変異がvan3-2の表現型を亢進する実験結果を得ており,以上の結果からCVP2が生産するPI4-PがVAN3の有するPHドメインに作用し,VAN3のTGN膜への局在を規定する分子機構が存在することを明らかにした.
光電融合に向けたＩＶ族多元混晶ヘテロ構造の結晶成長制御に基づくレーザー素子の開発

光電融合技術に向けて、直接遷移型のIV族半導体を用いた室温動作レーザーの実現が望まれている。本研究では、GeSn/GeSiSnヘテロ構造に注目している。しかし、発光層であるGeSnにおいては、圧縮歪による間接遷移化、高密度の点欠陥や貫通転位による発光強度の減少が問題となる。本研究では、これらの問題の解決を結晶成長技術の開発により目指す。さらに、発光デバイスを試作し、室温動作レーザーの基盤技術構築を目指す。
ＧｎＲＨニューロンの鼻から脳への移動におけるＧＡＢＡ興奮性作用の役割

生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)ニューロンは嗅板に由来し、胎生期に脳に入り、視床下部まで移動し定着する。性成熟後、GnRHニューロンは周期的なGnRHの大量分泌を起こし、排卵を引き起こす。GnRHニューロンは視床下部に散在しているが、鼻から移動を開始し、適切な場所に配置されて回路を形成し、下垂体に軸索をのばしてGnRHを分泌するメカニズムは明らかにされていない。そこで、成熟動物の脳内において主要な抑制性伝達物質であるGABAが成熟動物においても興奮性に作用しているというGnRHニューロンに特有な性質に注目し、GnRHニューロンへのGABA入力を興奮性から抑制性に変化させることができる遺伝子改変マウスを使用して、GnRHニューロンの移動における興奮性GABA入力の役割について個体レベルで検討を行った。GnRHニューロンでGABA作用を興奮性から抑制性に変化させるために、Tet-offシステムを用いて独自に作製したGnRHニューロンのみでGABAの抑制性を維持する分子であるカリウム-クロライド共役担体(K+-Cl- cotransporter (KCC2))を時期特異的可逆的に過剰発現させることができる遺伝子改変マウス(GnRH-tTA::KCC2-tetOマウス)を用いた。GnRHニューロンの移動中である胎生期にGnRHニューロンでKCC2を過剰発現させ、性成熟後のGnRHニューロンの分布の変化を調べた。その結果、内側中隔核や視索前野においてGnRHニューロンの数が減少していた。また、性成熟後に野生型雄マウスと交配テストを行ったところ、妊娠率が低下するという結果を得たことから、GnRHニューロンが正常に機能していないことが考えられた。以上の結果から、胎生期のGnRHニューロンの移動においてGABA興奮性入力は重要な役割を持つことが示唆された。24年度が最終年度であるため、記入しない。性周期を制御しているGnRHニューロンは嗅粘膜と鋤鼻期に由来し、胎生期に脳に入り、視床下部まで移動する。視床下部に移動したGnRHニューロンは性成熟後、周期的なGnRHの大量分泌を起こし、排卵を引き起こす。これまでに、GnRHニューロンでは成熟動物においてもGABAが興奮性に作用していることを明らかにしており、GnRHニューロンの移動における興奮性GABA入力の役割を個体レベルで明らかにするために、GnRHニューロンで時期特異的可逆的にGABA入力の興奮/抑制を決定する主要な分子であるKCC2を過剰発現(GnRH-tTA/KCC2-tetOマウス)およびNKCC1を発現抑制(GnRH-tTS/NKCC1-tetOマウス)させることにより、GnRHニューロンへのGABA入力が抑制性になる遺伝子改変マウスの作成を行った。GnRH-tTA/KCC2-tetOマウスでは、GnRHニューロンでドキシサイクリン依存的にKCC2を過剰発現させることができた。発現誘導されたKCC2は機能していること、内因性のKCC2と同じ蛋白サイズであることを確認した。さらに、ニューロンの移動と活動性の関連を明らかにするために、胎生期の鼻組織を培養し、GnRHニューロンの移動とカルシウムオシレーションをin vitroで解析できる技術を確立した。発達期の内側基底核原基から大脳皮質への抑制性ニューロンの移動をin vivoで観察するとGABAA受容体やNKCC1阻害剤を作用させるとGABAニューロンの移動速度が遅くなることを明らかにした。そこで、発達期のGABAニューロンの移動におけるGABA興奮性入力の役割を明らかにするために、GABAニューロンへのGABA入力を抑制性に操作することができる遺伝子改変マウス(GAD-tTA/KCC2-tetOマウス)の作成を行った。

また、性成熟後に野生型雄マウスと交配テストを行ったところ、妊娠率が低下するという結果を得たことから、GnRHニューロンが正常に機能していないことが考えられた。以上の結果から、胎生期のGnRHニューロンの移動においてGABA興奮性入力は重要な役割を持つことが示唆された。24年度が最終年度であるため、記入しない。今年度の計画であったGnRHニューロンでGABA入力を時期特異的可逆的に興奮性から抑制性に操作することができる遺伝子改変マウスの作成を行うことができた。さらに、抑制性ニューロン特異的にGABA入力を抑制性に操作することができる遺伝子改変マウスを作出することができた。胎生期にGABA入力を抑制性に変化させた時にGnRHニューロンおよびGABAニューロンの移動に異常がみられるかについて、GnRHおよびGADのin situ hybridizationを行い検討している。GnRHニューロンの活動性をカルシウムイメージングにより記録し、GnRHニューロンの移動の異常とGnRHニューロンの活動性の関連について検討する。胎生期のGnRHニューロンの移動の際にGABAを抑制性に変化させたGnRHニューロンが、視床下部で適切に回路を形成し、機能することができるか調べる。排卵を引き起こすGnRHの周期的大量分泌、性周期がみられるか確認する。
超電導機器及びケ-ブルの極低温電気絶縁に関する研究

(1)超高延伸ポリエチレン、ポリプロピレンの極低温絶縁材料としての性質を調べ下記の様な知見を得た。電気伝導、誘電体損、絶縁破壊強度を含めてこれら超高延伸高分子の電気的性質は優れているが、特にポリエチレン、ポリ船ロピレン共に機械的破断強度、弾性率等は室温、液体窒素温度いずれにおいても超高延伸によって飛躍的に上昇する。靱性はプロピレンに於ても5倍程度のロ-ル延伸で極めて小さくなり、超電導材料、金属材料等との寸法変化を延伸比を制御する事によりマッチングさせる事がでる。超高延伸ポリエチレン、ポリプロピレン等の延伸方向の機械的特性が極めて良くなるのに対し、垂直方向の強度等は逆に少し低下するので、異方向に延伸した超高延伸フィルムの複合化を行った。複合化は融点以下の温度でのホットプレスで行ったが、その温度が特性に大きく影響を与える。温度を適切に設定すれば、末延伸フィルムに比べて、いずれの方向の機械ストレスに対しても高い破壊強度、弾性可能である事がわかった。(2)共役系高分子の極低温絶縁材料としての応用を検討した。高分子主鎖がπ結合からなる共役系高分子のうち禁止帯幅が2eV以上あるポリチオフェン、ポリパラフェニレンビニレン及びそれらの誘導体も禁止帯幅は2eV以上であり、液体窒素温度で充分な絶縁抵抗と破壊電界を有している。機械的強度も優れているが、特に延伸により著しく上昇する。延伸による改善は冷却による収縮率の低下にも現れるが、もともと高い熱拡散係数も更に高くなる。ポリβ-アルキルチオフェン、ポリパラジメトキシフェニレンビニレン、ポリアルキルフルオレン等も極低温絶縁特性が良好で、成膜性、成形性等からも期待できる。
液体キセノンを用いた136Xe2重β崩壊検出器開発のための基礎研究

2相型キセノン検出器を2重β崩壊深索実験に応用するための基礎研究を中心に行った。この検出器の特徴は電場方向に対する位置分解能が数100μmと非常に優れていることである。キセノン136の2重ベータ崩壊のQ値2.48MeV近辺のエネルギーを持つガンマ線バックグラウンドのキセノン中での反応の大部分(99.9%)はコンプトン散乱或いは電子対生成によるものであり、2本以上の離れた電子線に起因した信号となる。それに対して2重β崩壊による信号は2つのβ線が繋がった1本のトラックになるため、バックグラウンドのガンマ線によるものと実際の信号とを非常に高い確率で識別出来るはずであり、これを実際のガンマ線の信号を観測することにより確認した。-方、神岡の地下実験施設に設置した1kgテスト検出器を用いてバックグラウンドの線量測定を行った。エネルギー2.5MeV近辺のバックグラウンドは0.01counts/kg/keV/day程度であることが分かった。検出器周辺に使用している物質の放射線不純物濃度を測定しそれらが検出器におよぼす影響をコンピューターシミュレーションにより求め、それと実際の測定値とを比較し、その発生の起源を解明した。その結果、使用材質を選別することにより、さらなる低バックグラウンド化が可能であることを示した。2相型キセノン検出器を2重β崩壊探索実験に利用した場合、バックグラウンドを0.0001counts/kg/keV/day以下に抑えることが出来、世界でもトップクラスの探索実験が可能であることが分かった。さらに、この検出器は暗黒物質探索実験、太陽ニュートリノの検出も同時に行える多目的大型検出器として利用することを提案した。神岡地下実験施設のクリーンルーム内に放射線遮蔽を含むテスト用1kg検出器を設置し、バックグラウンドの測定を開始した。まず、キセノン中の放射性不純物の含有に関しては、2種穎の純化装置をテストした。その結果、大きな差がみられた。従来使用していたOxisorbからは多量のウラン、トリウム系列の放射性不純物が認められたが、SAESゲッターからは殆ど認められなかった。さらに、ラドンを含有しない空気による検出器周辺のベンチレーションを行った結果、バックグラウンドを全エネルギー領域で約5分の1に下げることに成功した。低バックグラウンドゲルマニウム検出器や質量分析器を用いて検出器自身および検出器周辺の物質の放射性不純物濃度を測定し、使用物質の選定を行った。これらの放射性不純物濃度の測定結果を基に詳細なシミュレーションを行い、それとテスト検出器によるバックグランド測定の結果を比較検討した。その結果、光電子増倍管と検出器を断熱するためのステンレス製の真空容器が大きなバックグランド源であることを突き止めた。以上、測定結果は、目標の値よりも1桁程度悪かったが、原因は究明されており、改良を加えることにより世界のトップレベルに到達できることが分かった。それと同時に、現在開発中の暗黒物質探索用検出器において、MeV領域専用の信号読み出しラインを作り、暗黒物質探索と2重β崩壊の異なる領域のバックグランドを、同時にしかも詳細に測定する準備を進めている。
ヒト由来生理活性ペプチドホルモン末端Cアミド化酵素の構造と反応機構の全容解明

多くの生理活性ペプチドの活性発現に必要とされるC末端アミド構造はPHMドメインおよびPALドメインをもつ酵素PAMの触媒作用によって生成される。本研究では、酵素PAMに含まれる金属イオンの役割を明確にすることによる酵素反応機構の解明をめざした。金属を除去したアポ型酵素および一連の金属再構成酵素を作製し、それらの酵素活性の測定を行った。その結果、Apo-PAM/PALでは酵素活性が消失したが、再構成Cu-PAMではPHM活性が、再構成Zn-PALではPAL活性が認められ、また、再構成Cu, Zn-PAMではPAM活性が認められた。さらに他の金属再構成酵素についても検討を行い、PAMの酵素反応機構について考察を行った。約半数の生理活性ペプチドの生物活性の発現に必須であるC末端アミド基は、C末にGly残基をもつペプチド前駆体に酵素PAM^*が作用して生成される。PAMは、PHM^<**>ドメインおよびPAL^<***>ドメインからなる2頭酵素であるが、近年の酵素反応解析や結晶構造解析の進展にも関わらず、PHMおよびPALの反応機構には未解明な点が多く残っている。我々を含めいくつかの研究グループは、PALにはZnおよびFeイオンが含まれることを報告しているが、これらの金属イオンの役割は明確ではない。本研究では、PALに含まれる金属イオンの役割について詳細な知見を得るため、金属除去PAM(Apo-PAM)および金属再構成PAM(Metal-PAM)を作製し、それらの活性について検討を行った。PAMに含まれる金属イオンの量は、ICP-MS分析により確認した。また、PAMには、560nmにアミノ酸からFeへのLMCTバンドが確認されているが、Apo-PAMにはこのFeイオン由来の吸収が消失した。活性測定の結果、再構成Cu-PAMには水酸化中間体の生成がみられ、PHM活性が回復された。さらに、再構成Cu,Zn-PAMにはアミド化ペプチドの生成がみられ、PAM活性が回復された。一方、再構成Cu,Fe-PAMには水酸化中間体のみが生成し、アミド化ペプチドの生成活性は確認されなかった。このことから、PAL活性の発現にはFeイオンを必要としない事が明らかとなった。多くの生理活性ペプチドの活性発現に必要とされるC末端アミド構造は、酵素PAM^*の触媒作用によって生成される。PAM^*は、PHM^<**>ドメインおよびPAL^<***>ドメインを有する二頭酵素である。まず第1酵素であるPHMによってグリシン残基の水素の脱離と水酸化が起こり、ついで生じた水酸化グリシン中間体は第2酵素であるPALによってアミド化ペプチドとグリオキシル酸に解裂される。昨年度は、二頭酵素PAMを用いてペプチドホルモンC末端アミド化反応におけるPAM中に含まれる金属イオンの役割について検討し、PHM活性の発現にはCuイオンのみ、PAL活性の発現にはZnイオンのみが必要であることを明らかにした。本年度では、更に金属を組み合わせて詳細に反応解析を行う事で、いくつかの金属イオンがその活性を促進または阻害することを突き止めた。複数の金属サイトが存在する二頭酵素PAMではそれ以上の解析が困難であるため、各ドメインを用いた反応解析を行う必要がある。そこで、PHMドメインおよびPALドメインの発現系の構築について検討した。既存のPAM発現ベクターからPHMおよびPAL遺伝子それぞれのサブクローニングを行い、CHO細胞にそれらの遺伝子を導入した。限界希釈法で希釈して96穴プレート上で培養した結果、各ドメインの高発現細胞を樹立することができた。オキシトシンなど約半数の生理活性ペプチドの活性発現に必要とされるC末端アミド構造は、酵素PAM^*の触媒作用によって生成される。PAMは、PHM^<**>ドメインおよびPAL^<***>ドメインからなる2頭酵素であり、この酵素の機能不全は致死的である。本研究ではこれらの反応機構を明らかにするため、酵素中に含まれる金属イオンの役割について検討を行った。昨年度までに、キレート剤や還元剤の種類や濃度の検討を行う事で2頭酵素PAMからほぼ全ての金属を除去することに成功し、さらに金属除去PAMおよび金属再構成PAMを用いて反応解析を行うことで、酵素活性の発現に必要な金属イオンを明らかにした。複数の金属サイトが存在する2頭酵素PAMではそれ以上の解析が困難であったため、本年度はアミド化反応の後半の触媒作用を担うPALを用いて詳細に検討を行った。今回新たに樹立したPAL発現細胞からPALを精製し、得られたPALから含まれる金属イオンの除去を行った。この金属除去PALおよび金属再構成PALを用いて反応解析を行うことで、PAL活性の発現に必要な金属イオンを明らかにした。

さらに金属除去PALに添加する金属イオンの種類によってPAL活性を促進または阻害することを突き止めた。これら一連の研究によって2頭酵素PAMに含まれる全ての金属イオンの役割が明らかにされた。また、本研究で得られた金属除去および金属再構成酵素は2頭酵素PAMの機能解明につながるのみでなく、結晶構造解析や新規な酵素反応の発現などに大きな可能性を見いだした。
アルカリ土類金属介在分子線エピタキシ法の開拓とⅣ族新規低次元構造の構築

本研究課題では、シリコンCMOSテクノロジと高親和性元素であるゲルマニウムの機能向上を目指して、アルカリ土類金属(カルシウム)介在ゲルマニム分子線エピタキシ法とトポタクティック変換を融合したゲルマニウムトポロジー変換による(1)ゲルマニウム原子層・低次元構造作製方法の確立、(2)ゲルマニウム低次元構造における電気・光学物性評価による電子移動度増大・発光機能発現、に関する研究を進めた。本年度はSi(111)基板上においてカルシウムとゲルマニウム原子層の交互蒸着とポスト溶液処理によるカルシウムフッ素修飾により、フッ化カルシウム絶縁層に保護されたゲルマニウム低次元構造構築に関する成長条件の最適化を行い、真空中ポストアニール処理によるカルシウム残渣除去と溶液処理後の表面平坦化に成功した。一方、格子不整合によるSi基板上成長結晶への伸引歪も顕在化しており、歪みの影響の精査が必要となった。そこで低温光学測定においてボイスコイルモータを用いたその場歪印加装置を作製し、ゲルマニウムの電子ラマン遷移を参照に一軸伸張歪を0.3 %まで可変で制御可能なことを実証した。またGe基板上に成長した水素終端ゲルマニウム原子多層膜の電気二重層電界効果トランジスタを作製し、明瞭な両極性動作を初めて観測した。またホール効果測定から低温ゲートバイアス電圧印加下において6500 cm2/Vsを超える電子移動度を示した。従来フェルミ準位ピン止め効果により正孔伝導が支配的であったゲルマニウムにおいて、電子伝導利用への足がかりとなる重要な結果である。一方接触抵抗増大により低温電子伝導計測が困難なため、試料へのドーピング、コンタクト電極材質探索などが新たな課題として浮き彫りになった。本研究課題の目的の一つであるゲルマニウム低次元構造における電子移動度増大を、初年度において高品質結晶を作製し電気二重層トランジスタ構造にすることで、非常に高い電子移動度を計測することで達成することができた。シリコン基板上への直接成長や電極材料を含めたデバイス構造最適化にはまだ十分ではないが、重要な進捗である。低次元構造における光学特性においても、従来室温領域が支配的であったin-situ歪印加計測を10-K以下の低温領域まで拡張することに成功し、ゲルマニウム低次元構造における精密物性評価が可能となった。一方、分子線エピタキシにより作製したゲルマニウム原子層・低次元構造評価においては、RHEED、X線回折、原子間力顕微鏡の表面観測とまだ限定的であり、透過電子顕微鏡による断面原子像観測などより直接的な結晶構造評価が課題である。ゲルマニウム原子層・低次元構造の(1)結晶成長・評価と(2)光学・伝導物性評価が本研究課題の主柱である。結晶成長と伝導評価においてはある程度の指標が得られたため、次年度は結晶評価と光学物性評価に関する研究を推進する。結晶評価においてはSi(111)基板上に層数制御されたゲルマニウム原子層を作製し、断面透過電子顕微鏡観測による原子構造直接観測を目指す。光学物性評価においては作製したゲルマニウム低次元構造における発光評価を行う。ゲルマニウムの直接遷移端応用は電子・光学用途双方に期待されているが、低次元化による直接遷移端発光観測は限定的である。また薄膜化による熱による安定性も課題となっている。そこでまずは低温環境下でゲルマニウム低次元構造由来の発光の青方シフトの観測、円偏光発光による精密物性追跡とスピン機能関連に関する研究を推進する。