hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
南極に生息する細菌の低温環境への適応と進化に関する研究

南極の低温環境に生息する細菌のゲノム研究は少なく、未開拓の研究分野といえます。本研究は南極に生息する細菌が低温環境に適応して生存を可能としているメカニズムを進化の観点からゲノムレベルでの解明を試みたものです。南極大陸東部の湖沼で日本の南極観測隊により発見され、コケを中心とした多くの微生物との共生構造体である「コケ坊主」から好冷性のPseudomonas属細菌MP1株を分離し、そのゲノム解析を行いました。これまでに他の大陸で分離された近縁のPseudomonas属細菌のゲノム情報と比較した結果、MP1株ゲノム上の全遺伝子のレベルで低温環境に適応してきたことが世界で初めて明らかにされました。本研究は、約3000万年前に現在のような氷の大陸となった南極の極限環境下(極低温、貧栄養、白夜/極夜の特殊な日照条件)に生息する細菌の低温環境への適応と進化の解明を目的として、南極湖沼で発見された水生のコケを中心とした微生物共生体「コケ坊主」から微生物(細菌)を単離し、その生命機能の解析への基盤構築を試みた。1、南極微生物(細菌)の分離と同定南極湖沼の微生物共生体「コケ坊主」試料(共生体の外縁部、内部、含有水)から、広範な分離条件(温度:4°C15°C、培地条件:栄養培地、グルコース最小培地、糖源欠失完全合成培地)での微生物(細菌)の分離を試みた。その結果、82株の微生物コロニーの単離に成功した。これらから、PCR法でのリボゾーム遺伝子の増幅を試み、71株で細菌の16Sリボゾーム遺伝子の増幅に成功した。さらに、このうちの63株で16Sリボゾーム遺伝子の部分配列の解読に成功し、DNAデータベースとの検索から30株は既知細菌の近縁種であることが示唆されたが、33株は新規の未同定菌の可能性が示唆された。2、南極微生物(細菌)のゲノミック・クローン・ライブラリーの作製分離・同定された南極微生物(細菌)の中から、遺伝子機能解析および将来的なゲノム解析に向けてフォスミド・ベクターを用いたゲノミック・クローン・ライブラリーを、Pseudomonas属細菌について構築した。パルスフィールド電気泳動解析で推定されたゲノムサイズ約4.7Mbに対して約98%のカバー率のライブラリー構築に成功した。3、機能遺伝子解析のためのスクリーニング条件の検討構築したフォスミド・ベクターを用いたゲノミック・クローン・ライブラリー用いて、低温環境に適応する遺伝子のスクリーニングを試みた。いくつかの候補クローンを選別し、その解析手法の検討に着手した。本研究は、約3000万年前に現在のような氷の大陸となった南極の極限環境下(極低温、貧栄養、白夜/極夜の特殊な日照条件)に生息する細菌の低温環境への適応と進化の解明を目的として、南極湖沼で発見された水生のコケを中心とした微生物共生体「コケ坊主」から微生物(細菌)を単離し、その生命機能の解析への基盤を構築するために以下の実験を行った。(1)分離した南極の好冷性Pseudomonas属細菌のゲノム解析南極湖沼の微生物共生体「コケ坊主」試料から分離した好冷性のPseudomonas属細菌MP1株のゲノム解析を行った。パルスフィールド電気泳動で推定されたゲノムサイズ約6.4Mbに対して、新型DNAシーケンサーRoche 454で22倍となる冗長度のWhole Genome Shotgunシーケンスを行い、6.332Mbの塩基配列を決定した。BLAST解析などでゲノム・アノテーションを行った結果、5,954遺伝子(ORFs)の存在が示唆された。代謝経路遺伝子などで既知のPseudomonas属細菌との差異が示唆された他、既知のPseudomonas属細菌のゲノムには無い新規な遺伝子が多いことも示唆された。これらは水平伝播により獲得された遺伝子群である可能性が高く、現在、その詳細について検討中である。(2)南極の好冷性Pseudomonas属細菌MP1株からの変異株の分離南極の好冷性Pseudomonas属細菌MP1株から生育温度の異なる変異株の分離に成功し、その中には低温から中温まで生育可能となった株、低温では生育できなくなった株などがあり、これらの変異株のゲノム比較解析を通じて、このPseudomonas属細菌の低温環境への適応メカニズムの解明を進めている。(3)南極の窒素固定細菌の分離南極湖沼の微生物共生体「コケ坊主」試料から窒素固定に関与するニトロゲナーゼ遺伝子を持つ細菌を多数分離し、それらのゲノム解析の検討に着手した。

本研究は、南極の極限環境下に生息する細菌の低温環境への適応と進化の解明を目的として、南極の限られた湖沼に生息する水生のコケを中心とした微生物との共生体「コケ坊主」から分離した微生物(細菌)のゲノム解析を通じて、その生命機能解明への基盤を構築するために以下の実験を行った。(1)分離した南極の好冷性Pseudomonas属細菌のゲノム解析と生育温度変異株の解析南極の好冷性Pseudomonas属細菌MP1株から得られた生育温度の異なる変異株には低温から中温まで生育可能となった株、低温では生育できなくなった株などがあり、これら変異株のゲノム比較解析を通じて、このPseudomonas属細菌の低温環境への適応メカニズムの解明を進めるために、ゲノム解析情報の精緻化を検討した。具体的には、野生株であるPseudomonas属細菌MP1株のゲノム塩基配列情報でリピート配列など解像度の低い箇所の再解析、アノテーション(ゲノムの注釈情報)の高精度化および他のPseudomonas属細菌ゲノム情報との比較を行った。(2)低温環境への適応に必要な遺伝子群の探索南極の好冷性Pseudomonas属細菌MP1株のゲノム情報の詳細な解析、特に既存の中温性のPseudomonas属細菌のゲノム情報との比較から、低温環境への適応に関与する遺伝子群の候補が得られた。さらに、ゲノム全体に渡ってコードされる構造遺伝子のアミノ酸組成比の特性が示唆された。現在、これらの知見をまとめ、研究成果としての投稿論文を準備中である。(3)大腸菌の網羅的-代謝遺伝子欠失株を用いた代謝機能遺伝子のスクリーニング・システムの構築南極の好冷性Pseudomonas属細菌MP1株のフォスミド・ベクターを用いたゲノミック・クローン・ライブラリーを活用として、大腸菌の代謝遺伝子を欠失した株を用いた代謝機能遺伝子解析の条件検討を行い、いくつかの代謝遺伝子において有効性を確認した。
マクロファージの運動及び貪食に関わる遺伝子の検索および解析

マクロファージは血管内皮への浸潤、主として酸化LDLの取り込み、泡沫化といった一連の動態を示し、粥状動脈硬化の初期病変成立過程に深く関与することが知られている。これらの動態は、細胞運動・貪食・エンドサイトーシス等においてみられる分子機構を利用していると考えられる。本研究では、細胞運動・貪食・エンドサイトーシスに関与する可能性のある分子を網羅的に検索し、それらのマクロファージの動態への関与を調べることで、免疫、動脈硬化等の理解への新しい知見を与え、医学に貢献することを目的とする。細胞運動・貪食・エンドサイトーシス過程は、細胞骨格・膜輸送等がコーディネイトされることにより成り立つと考えられる。パキシリンは、このような細胞骨格・膜輸送の多数の制御分子と結合し、マクロファージの動態に関与すると考えられているインテグリンの裏打ちアダプター分子である。我々はパキシリンと結合し、マクロファージの動態に関与すると予想される、ARFGAP蛋白質(膜輸送の制御低分子量G蛋白質ARFに対するGAPドメインをもつ蛋白質)に着目した。ARFGAPドメインの存在を指標にデータベース検索したところ、多数のARFGAP蛋白質の存在が明らかとなった。これらのマクロファージの動態への関与の可能性について検討したところ、パキシリン結合性ARFGAP蛋白質のうち、PAG2およびPAG3は細胞運動、マクロファージの貪食、エンドサイトーシスのいずれにも関与することが明らかとなった。さらに、PAG2及びPAG3に結合する分子をスクリーニングし、細胞骨格・膜輸送等の制御に関与することが予想される、多数の分子が結合することが明らかとなった。従って、ARFGAP蛋白質のうち、少なくともPAG2とPAG3は、細胞骨格、膜輸送過等の制御関連分子とネットワークを形成し、マクロファージの動態に関与していると思われる。
スーパーハイパフォーマンスグラウトの開発と性能評価方法の提案

本研究は,150N/mm^2以上の圧縮強度を有する超高強度グラウト(スーパーハイパフォーマンスグラウト)の製造を可能にするための手法を提案することを目的にしている.超高強度グラウトを実現するために,水セメント比が12%20%の非常に小さい条件で練り混ぜ実験を行った.実験から目標とする強度を達成するためには,低水セメント比のみならず練り混ぜ方法が強度に影響を及ぼすことを明らかにした.また,研究では,スーパーハイパフォーマンスグラウトの流動性を確保するために,水セメント比,砂の配合から流動性の指標となるフロー値を推定するための式を提案し,実験結果との精度が良いことを確認している.本研究は,150N/mm^2以上の圧縮強度を有する超高強度グラウト(スーパーハイパフォーマンスグラウト)の製造を可能にするための手法を提案することを目的にしている.超高強度グラウトを実現するために,水セメント比が12%20%の非常に小さい条件で練り混ぜ実験を行った.実験から目標とする強度を達成するためには,低水セメント比のみならず練り混ぜ方法が強度に影響を及ぼすことを明らかにした.また,研究では,スーパーハイパフォーマンスグラウトの流動性を確保するために,水セメント比,砂の配合から流動性の指標となるフロー値を推定するための式を提案し,実験結果との精度が良いことを確認している.本年度は,150N/mm^2以上の超高強度グラウトの製造を可能とするための配合設計に関する基礎データを蓄積のための検討を行った。最初に、グラウトの練混ぜ方法が、グラウト強度に及ぼす影響を調べるために、練混ぜに用いる撹拌機の羽の形状、大きさ、回転数による煙の拡散状況の可視化を行い、その攪拌機による撹拌の特徴を2通りに分類することができることを明らかにした。150N/mm^2以上の強度のグラウトの製造を可能とするための材料として、シリカフュームセメント、高性能減水剤、硅砂5号を用い、W/C=12%の配合で練混ぜることにより、目標とする強度のグラウトを製造することが可能となることを確認した。しかし、問題点として、この水セメント比では、フロー値の計測による流動性が悪い点が挙げられる。また、攪拌機の羽の形状、回転数が同じ配合であっても、強度に影響を及ぼすことを明らかにした。本年度の研究成果に基づき、流動性確保のために、W/C、攪拌機の回転数の検討を今後行う予定である。また、高強度の製造を実現するためには、グラウトの内部欠陥も影響を及ぼすことが考えられるために、硬化したグラウトの内部空隙についても来年度以降検討を行う予定にしている。今年度は,グラウトの高強度化を実現するための配合について実験を試行しながら検討を行った.150N/mm^2以上のグラウト強度を実現させるために,水セメント比(W/C)を12%20%に設定し,砂セメント比(S/C)を030%,高性能減水剤をセメント量に対して1%2%変化させた場合の配合の違いがグラウト強度ならびに流動性(フロー値)に及ぼす影響について調べた.グラウトの流動性を表す指標であるフロー値に, S/Cの変化はあまり影響を及ぼさないが, W/Cおよび高性能減水剤は影響を及ぼすことを実験により明らかにした.さらに,フロー値の推定を配合設計に反映させるために, W/Cおよび高性能減水剤の要因を考慮してフロー値の予測式を導き,実験結果との整合性も良いことを確認した.その結果,グラウトの配合設計において,フロー値を設定しながら,目的とするグラウトを製造することが可能になった.強度に関しては,今回実施したW/Cの範囲において,150N/mm^2以上のグラウト強度を製造することが可能であることを確認するとともに,強度発現に従来のW/C則が適用できないことが明らかになった.これは,練混ぜの極限に近い低水セメント比領域において,150N/mm^2以上のグラウト強度を実現するためには,水セメント比のみならず,練混ぜ方法がグラウト強度に影響を及ぼしているものと考えられるためで,今後は練混ぜ方法および練上ったグラウトの品質評価方法について検討を行う予定である.超高強度グラウト(スーパーハイパフォーマンスグラウト)を製造するための配合方法について実験を行い,150N/mm^2以上の強度を実現するための配合設計に影響を及ぼす要因についてこれまでの研究で明らかにしてきた.水粉体比が12%20%の非常に小さい配合条件では,強度は水セメント比のみならず練り混ぜ方法によっても影響を受けることが実験より確認されたので,今年度は練り混ぜに用いる羽の形状,ならびに粉体に占める砂の割合が強度に及ぼす影響について検討を行った.羽の形状の違いによる強度差は実験からある程度確認されたが,定量的に明らかにするまでには至っていない.しかし,グラウトの練り混ぜ性能を改善することにより,グラウト強度のバラツキを小さくすることができるために,低水セメント比のグラウト製造のためのミキサーを開発した.低水セメント比のグラウトの練り混ぜにおいて,砂が混在することにより砂が粉体と水とをせん断する効果があるために強度の発現も良くなることが実験により確認された.しかし,粉体に占める砂の割合が増加すると,強度の増加に影響を与え,セメント量の10%程度を目安にするのが良いことが確認された.低水セメント比におけるグラウトの流動性を確保するために,フロー値に影響を及ぼす因子を試験結果から整理し,配合からフロー値を予測する方法について検討を行った.

フロー値は水セメント比との相関性はよく,また高性能減水剤の添加量もフロー値に影響を与えるが,砂の添加量の影響はほとんど認められなかった.これらの要因を考慮して,フロー値の予測式を定式化した.さらに,定式されたフロー値の予測式は,実験結果を良く表していることが検証された.グラウトに要求される流動性を設定し,定式された予測式を用いることにより,水セメント比,高性能減水剤の添加量を配合設計時に決めることができるために,超高強度グラウトの製造を容易にすることができるようになった.本結果は工学的に有益であると考えている.
歯周組織細胞を用いた歯周組織再生療法の確立と臨床応用

現在行われている歯周治療では歯周炎の進行を阻止することにとどまり、歯周炎により破壊された組織を健常な状態に戻す再生治療には至っていない。歯周組織の再生研究は3段階の過程として示すことができる。第1段階は組織再生誘導法と呼ばれる処置で、破壊された歯周組織への上皮の侵入を阻止し、周囲の組織からのその部位への細胞増殖を待ち、定着させる方法である。これに対して第2段階の進歩は単に待つのみではなく、成長因子等を加えることにより積極的に再生を導き出そうとするものである。本研究班では川浪らはBMP-2を、和泉らはGDF-5を、村上らはβ-FGFを用いて研究を進め、それぞれの成果を示しているが、いずれも期待させる成果を得ている。第3段階の進歩は再生を導く歯周組織細胞を欠損部に直接用い、更に確実に再生を導こうとする研究である。即ち自己細胞移植を軸とした組織工学を応用した新しい歯周組織再生治療法を世界に発信することである。栗原らは骨髄からの間葉系細胞を用いて、吉江らは骨膜間葉細胞を用い、五味らは歯髄細胞を用い、大石らはヘルトビッヒ上皮鞘細胞を用い、太田らは自己増殖細胞歯根膜組織を用いてその再生機構を追求した。石川らは岡野の開発した温度応答性培養皿を用い、ヒト歯根膜細胞のシートを用いた歯周組織の再生を試みた。この結果、自己歯根膜シートを歯周組織欠損部に移植することにより、ほぼ完全なセメント質とシャーピー線維を伴う歯周組織の再生が得られることを見出した。渡辺はその臨床応用を可能にするCPCを構築した。基礎研究として小方らは石灰化機構に重要な役割を果す骨シアロタンパク質の転写促進機構を明らかにし、西原らはムコ多糖類のコンドロイチン硫酸の破骨細胞分化抑制機構を明らかにした。これらの研究は2回にわたって研究成果報告会として発表され、公開された場で充分な討議を行い、真の再生治療への可能性が高まった。本プロジェクトでは、歯周疾患により失われた歯周組織再生に自己細胞移植を軸とした組織工学の概念を導入し、世界に先駆けての新しい治療法の開発をめざし研究を継続中である。その細胞ソースとしては、骨髄間葉系幹細胞、歯根膜細胞、セメント芽細胞、歯肉線維芽細胞が候補にあがっている。本年度は以下の研究成果を得ることができた。1.ヒト歯根膜由来細胞を温度応答性培養皿上で培養し、細胞間接着分子、細胞外マトリックスを保持したintactな細胞を回収し、歯根膜細胞シートの作製に成功した。この歯根膜シートを免疫不全マウスおよびビーグル犬に応用し、歯周組織の再生を認めた。2.自己再生歯根膜組織はVEGF,ALP,VGFの遺伝子発現を示し、またALPおよびOCN蛋白の高い発現を示した。3.歯根膜細胞におけるPLAP-1の発現はFGF-2の刺激によって抑制され、BMP-2,BMP-4刺激により亢進することを確認した。4.培養ヘルトビッヒ上皮鞘細胞は数種のエナメル基質蛋白を発現し、また、歯根膜由来細胞と共存培養するとその重層化を促進した。5.多血小板血漿(PRP)は骨芽細胞の骨関連マーカー発現を促進した。PRPゲルと細胞の組織工学的併用によりSCIDマウス背皮下で異所性骨形成を誘導した。

また、ヒアルロン酸は分子量の違いにより骨吸収を巧妙に制御していることを認めた。6.歯髄細胞および骨髄細胞をb-FGFにて刺激し培養した後、アテロコラーゲンゲルに懸濁させ、これをヌードマウス皮下に注入移植すると骨髄形成を伴った骨形成を認めた。7.ヒト骨髄間葉系幹細胞の培養に自己血清が有用であることを確認した。8.自家歯肉線維芽細胞のシート化に成功し、歯肉退縮の症例に臨床研究を開始した。本研究では、自己細胞を組織工学的に増殖、加工し、臨床に応用し得る歯周組織再生材及び術式の確立を試みている。細胞源として歯根膜細胞、歯肉繊維芽細胞、骨髄間葉系幹細胞、セメント芽細胞を用いた。本年度は以下の研究成果を上げた。ヒト歯根膜細胞を温度応答性培養皿中で培養し、石灰化因子を導入して、一部石灰化した培養シートを得た。これをヌードラット皮下に象牙質片上に静置して移植し、シャーピー繊維を含むセメント質と歯根膜繊維を認めた。ラットの歯槽骨欠損モデルで移植された骨髄間葉系幹細胞はIL-10を発現し、炎症抑制に関与した。象牙質付近に移植された幹細胞は早期に象牙質面に遊走、増殖し、セメント芽細胞、線維芽細胞に分化し、コラーゲンを埋入したセメント質を再生した。多血小板血漿(PRP)と骨芽細胞の併用移植実験を行い、蛍光標識細胞をSCIDマウスの背皮下に注入した。移植部位のみに石灰化組織の形成と標識細胞を認め、また、オステオカルシン、type Iコラーゲンの発現を認め、細胞の分化を促進し異所性骨形成を誘導した。自家歯肉線維芽細胞を培養増殖させ、コラーゲン・ヒアルロン酸シートに播種し、培養したものを、歯肉退縮歯周炎患者に臨床応用した。その結果、垂直的にも水平的にも角化歯肉幅及び付着歯肉幅の増加が得られた。ビーグル犬の裂開状骨欠損でBMP-2とコラーゲンハイドロゲルの塗布は,歯周組織再生を高めた。歯根膜に発現するPLAP-1の発現は、FGF-2刺激で抑制、BMP-2刺激により亢進されることが明らかとなった。低分子量ヒアロルン酸がCD44受容体を介して破骨細胞前駆細胞のRANKタンパク発現を上昇させ,RANKL-RANKのシグナル伝達を増強し,破骨細胞の分化および骨吸収を活性化した.ヒトへの臨床研究を実施するための書類の作成と細胞培養室の確立に向けて準備を進めた.本研究では歯周組織由来の細胞を用いてその性質や採取方法を最適化し、また最適な細胞外環境を再構成するために各種マトリックスタンパクの機能を同定し、最終的な臨床応用を実現した。具体的には以下の研究成果を上げた。細胞採取に関して1.ヒト歯髄細胞を酵素消化法にて採取すると、多分化能を有し、安定した細胞集団を確保出来ることを示した。2.歯根形成に重要な働きをしているヘルトビッヒ上皮鞘由来細胞の初代培養を行い各種成長因子の影響を検索した。歯周組織由来の細胞外基質に関して3.骨芽細胞様細胞株を用いてアンドロゲン受容体およびケルセチンが骨シアロタンパク質の転写を促進する機構を明らかにした。4.歯根膜細胞由来の液性因子が間葉系幹細胞の増殖を刺激することを明らかにした。5.グリコサミノグリカンが破骨細胞の分化および吸収活性に与える影響を検索した。6.マウス歯根膜由来細胞株を用いてオステオポンチンの発現機構の解析を行った。動物実験7.ラットおよびマウスの骨欠損の治癒にGDF5/I型コラーゲン担体が有効であることを示した。8.イヌの一壁性骨欠損モデルにおいてBMP2を根面に塗布することが歯周組織再生に有効であることが示唆された。
算数の学習に困難を示す子どもの特性に即した支援方法の開発

1.研究目的:特性が学び方に影響しているケースの中でも、特に不器用さやイメージ化に苦手さが大きい子ども達にとっての、算数科における効果的な学習方法を明らかにしていきたいと考えた。2.研究方法:算数の学習に困難を示している子どもを対象に、以下の手順で取り組みを進めた。1事前の状況を記録、分析する。2そうした困難が起こっている背景についての仮説を立てる。3個別の特性に応じた教材や支援方法を開発する。4苦手さに応じた支援方法を学習場面に取り入れる。51の状況との比較をして、効果を検証する。また、どの場面においても、iPadの積極的な活用を試みた。3.研究成果:(1)対象児童の姿から○不器用さが操作を伴う思考の壁になっているケース→従来の方法では、数図ブロックや色板などの操作そのもので混乱し、思考の助けになっていかなかった。操作の負担については、実際に「動かす」ことに関する部分と、操作しているものと課題の関連性を明確にするための情報量の調整が必要ではないかと推察された。そこで、操作のエリアを明確にする操作盤やカードがばらけない工夫をした上で数の順番に並び方が固定されている数図カードなどを使うことで、操作性の困難を補いながら考える手だてを持つことが出来た。○イメージ化に課題が大きいケース→文字情報からだけでは、数の関係性や動きがイメージできず、図化したり立式したりすることができなかった。キーワードになってくる言葉について、イメージ化を助ける絵カードや動画を作成し、確認の手だてを持てるようにした。具体的な数の動きや関係を確認できるようになったことで、1人で課題をつかむところから解決に向かうところまで、取り組めるようになってきている。(2)iPadを活用した学習の有効性について<不器用さに関して>・細かな操作が苦手でも、タップやドラッグだけで操作ができることや、注目すべきものだけが表示される提示の明確さなどが、不器用さのある子達にとっての助けになっていた。「やり直すことが容易」ということも、不器用さのある子達の失敗体験を強化することなく、意欲を支えて学習の継続を支える点で有効だった。(3)iPadを活用した学習の有効性について<イメージ化に関して>・キーワードになる言葉について動画で示した「算数事典」を作成し、確認の手だてとして活用した。実際に数の動きが動画で見れるというのは、アナログではできない良さであり、よりスムーズに課題の理解につながった。Ibooksの形でタイトルをつけて保存しておくことで、自分で必要な情報を選んで視聴し、解決の手だてとして活用することもできており、自己解決の手だてとしても有効であった。
長鎖ノンコーディングRNAを基軸としたC型慢性肝疾患の病態制御

長鎖ノンコーディングRNAのC型肝炎ウイルス(HCV)感染における役割を明らかにするため研究を実施した。HCV感染培養細胞のRNAを次世代シークエンサーで解析した所、長鎖ノンコーディングRNAの一つHULCの発現がHCV感染により増加することが明らかになった。HCV感染によるHULCの増加は、HCV感染チンパンジー、HCV感染マウスモデルでも認められた。またHCV感染培養肝細胞でHULCの発現を抑制したところHCV複製の低下を認め、この効果はHCVの翻訳過程の抑制を介していると考えられた。HULCは肝発癌の関与が示唆されており、HCVはHULCの発現を増加し肝発癌を誘発していると考えられた。研究代表者はこれまでのC型肝炎ウイルス(以下HCV)感染培養細胞を用いた検討から長鎖ノンコーディングRNAの一つであるhighly up-regulated in liver cancer(以下HULC)の発現が,HCV感染により増強することを見出した.さらにHCV感染細胞においてHULCの発現を抑制したところHCV複製が低下し,インターフェロン治療抵抗性患者の肝臓ではHULCの発現が亢進していることも見出した.HULCは肝発癌に関与することが報告されている.本研究課題では,HCVによるHULC発現誘導機序,HULCによるHCV複製制御機序,インターフェロン治療抵抗性におけるHULCの役割,さらにHULCによる肝発癌促進機序を解明する.本研究より,HULCを標的とした肝発癌抑制可能な新規抗ウイルス治療の開発が期待される.初年度の解析から以下のことが明らかになった.1HCV感染によるHULC発現誘導機序の解明:全長型のHCVおよび非構造領域のみのサブゲノムHCV共にHULC増強能を有した.そのため非構造蛋白をそれぞれ発現させたところNS5A蛋白のみHULC発現誘導能を有した.この結果からNS5A蛋白がHULC発現誘導能を有することが明らかとなった.2HULCによるHCV複製抑制機序の解明:HCVの生活環別によるHULC発現抑制の影響を検討した.その結果,HULCはHCV蛋白の翻訳過程を調整していることが明らかになった.3インターフェロン治療抵抗性におけるHULCの役割:外因性のインターフェロン投与によるHULCの発現誘導の有無を検討した.外因性インターフェロンの投与により既知のインターフェロン誘導遺伝子の発現増強を認めたが,HULCの発現誘導は認めなかった.この結果から,HULCはインターフェロン誘導遺伝子ではない可能性が示唆された.当初の予定どおり,HCV感染によるHULC発現増強の必須ウイルス蛋白を同定したこと,HCV生活環における翻訳過程がHULCにより調整をうけていること,さらにHULCがインターフェロン誘導遺伝子ではないことを明らかなにしており,おおむね順調に進展していると判断した.前年度までの解析からlong-noncoding RNAの一つであるHULCが、C型肝炎ウイルス(HCV)の感染により発現増強されること、さらにHULCの発現抑制によりHCVの複製が抑制されることを明らかにした。平成28年度は、HCV感染によるHULCの発現増強機序の解明及びHULCによるHCV複製制御機序の解明を行った。HCVの培養細胞系を用いた解析から、HULCはHCVのウイルス蛋白の蛋白翻訳過程を特異的に抑制している可能性が示唆された。HCVの蛋白翻訳には数多くのホスト蛋白が関わっていることが知られている。それらのホスト因子の中でもRNA結合蛋白であるhnRNPA1とHULCとの関連を解析した。hnRNPA1は核内に多く局在していることが知らされているが、HULCの過剰発現によりhnRNPA1の核内から細胞質への移行が観察された。これらの結果は、HULCは、HCVの蛋白翻訳に必須なホスト蛋白の一つであるhnRNPA1のHCV蛋白翻訳サイトである細胞質への移行を促進することで、HCVの蛋白翻訳過程を促進している可能性が示唆された。またHCV感染によるHULCの発現増強機序の解明を、培養細胞系を用いて行った。試験管内で合成した一本鎖HCVRNAさらにdouble strand RNAであるpolyICではHULCの発現増強を認めなかった。次に、HCVのウイルス蛋白質は、構造蛋白質と非構造蛋白質に大別される。非構造蛋白質の発現によりHULCの発現が誘導されたことから、次に代表的な非構造蛋白の一つであるNS5A、NS5B蛋白を個別に発現させた。その結果NS5AのみによりHULCの発現が誘導された。さらにいくつかのNS5Aの変異体を用いた解析からNS5Aの中央部がHULCの誘導に必須であることが明らかになった。これらの結果から、HCVのNS5A蛋白がHULCの誘導に重要な役割を果たしていることを強く示唆された。当初、HULCのプロモーター領域をクローニングし、HCV感染によるHULC発現増強過程の詳細な解析を行う予定であった。しかし、HULCのプロモーター領域のクローニングが平成28年度中には完了しなかった。2本の既報がHULCのプロモーター領域のクローニングに成功しており同報告を参考にHULCのプロモーター領域のクローニングをすすめる。また臨床検体を用いた解析が平成28年度は進行しなかった。しかし約200名のC型慢性肝疾患患者の抗ウイルス療法前後の血清及び血清由来のRNAをすでに収集済みである。今後、これらの献体を用いて血中HULCの測定をすすめる予定である。近年、長さ200塩基以上の長鎖型のノンコーディングRNAが様々な疾患に深く関わることが報告されている。本研究では、C型肝炎ウイルス感染における長鎖ノンコーディングRNAの役割を解析した。

これまでの解析から、長鎖ノンコーディングの一つであるHULCに着目して解析を進めた。ヒト、チンパンジー、マウス、培養細胞を用いた解析から以下の事が明らかになった。1)HCVのヒト肝臓キメラマウス、チンパンジー、培養細胞への感染によりHULCの発現量が増加した。2)C型慢性肝疾患患者で、HCV駆除前後でのHULCの肝臓における発現量を比較したところ、HCVの駆除によりHULCの発現量は低下した。3)培養細胞においてHCV感染のHULCプロモーター活性に与える影響を解析したところ、HCV感染によりHULCのプロモーター活性が増加した。4)HCV感染細胞においてHULCの発現抑制をしたところ、HCV複製の抑制を認めた。5)HULCの発現抑制によりHCVの蛋白翻訳が抑制された。今回の研究により、HCV感染がin vivoおよびin vitroでHULCの発現レベルを増加させることを明らかにした。また、HCV感染培養細胞において、HULCの発現を低下させることによりHCVの複製が低下することも明らかにした。近年HULCは肝発癌や肝癌の進展に関与することが報告されている。したがって、HCV感染によってHULCの発現が誘導されることを示した今回の研究結果は、HCV感染による肝発癌や肝癌の進展機序の解明やHULCを標的とした新規の肝発癌予防法や肝癌治療法の開発へと発展することが期待される。長鎖ノンコーディングRNAのC型肝炎ウイルス(HCV)感染における役割を明らかにするため研究を実施した。HCV感染培養細胞のRNAを次世代シークエンサーで解析した所、長鎖ノンコーディングRNAの一つHULCの発現がHCV感染により増加することが明らかになった。HCV感染によるHULCの増加は、HCV感染チンパンジー、HCV感染マウスモデルでも認められた。またHCV感染培養肝細胞でHULCの発現を抑制したところHCV複製の低下を認め、この効果はHCVの翻訳過程の抑制を介していると考えられた。HULCは肝発癌の関与が示唆されており、HCVはHULCの発現を増加し肝発癌を誘発していると考えられた。1HCVによるHULC誘導機序の解明:初年度における解析からHCVのNS5A蛋白がHULC発現誘導能を有することを見出した.今後はNS5A蛋白の各種変異体を作成し,NS5A内のHULC発現誘導領域を明らかにする.またHULCのプロモーター領域をレポータープラスミドにサブクローニングし,HCV感染後レポーターアッセイを行い,HCV感染によるHULCの転写活性に与える影響を検討する.
随意的運動が困難な重度・重複障害児に対するボディイメージ形成のための体育教材開発

本研究では、重度・重複障害児の体育指導に関する教師の意識とそれに影響する要因を明らかにし、体育教材開発に向けた基礎的資料を得ることを目的に、A県内の特別支援学校(肢体不自由)の教師に調査を行った。その結果、教師に対する聞き取り調査では、体育指導の目標の重要度や日々の体育指導に関わる悩み、体育授業実施にあたっての配慮点や取り組みの困難さなどが明らかになった。また、教員に対する質問紙調査では、体育の授業を行う上で大切と思われることについての因子分析の結果「卒業後を意識した長期的な指導の必要性」「体育指導の有効性と指導の展望」「子どもの実態に応じた体育指導の悩み」の3因子解、日々の体育指導において感じていることについての因子分析の結果「日々の体育指導内容に対する悩み」「将来を見通した体育指導実践」の2因子解、体育指導の目標及び内容の設定において、普段、感じていることについての因子分析の結果、「体育指導における個別の指導計画作成上の不安」の1因子構造が確認された。また、本研究において、対象者の所属学部と担当する教育課程を独立変数、体育の授業を行う上で大切と思われることについての各因子(「卒業後を意識した長期的な指導の必要性」「体育指導の有効性と指導の展望」「子どもの実態に応じた体育指導の悩み」)の3得点を従属変数とした2要因の分散分析を行った。その結果、いずれも主効果、交互作用は認められなかった。このことは、所属学部と教育課程の類型に関係なく共通して体育指導に困難を感じる現状が示され、学部間相互の連携と学部内への連携といった連続したカリキュラムの整合性の理解と複数の障害種に対応した指導についてのとらえの難しさが、体育の指導において悩み感や困難感を生む要因になっていると考えられた。今後、重度・重複障害児の体育教材を開発していくためには、教師間で情報交換できるような障害児体育に対する知識と相互扶助を充実するための研修会や勉強会が求められる。さらには、個人の状況に応じたプログラム、児童のボディイメージ形成を目指したプログラムをどのように展開するのか等その方法論がさらに検討される必要があろう。
結晶ライン近傍の局所応力誘起および緩和を利用した変調構造形成と機能評価

光学機能を発現する材料開発を目的として、近赤外レーザー光のガラス表面への集光照射局所加熱によるパターン形成技術に関する研究を実施した。半導体レーザー、顕微鏡および自動ステージによるシステムを構築し、その動作性能をステイン着色パターン形成により確認した。本システムを用いたレーザー照射で結晶化挙動を調査し基板ガラスとしての最適組成を決定した。また、レーザー照射点近傍の温度プロファイルをモデル計算により予測した。能動的機能を有する光学素子開発を視野に入れ、近赤外レーザー集光加熱によるガラス表面への結晶ラインパターン形成技術にはさらなる高度化が必要とされている。本研究では、非線形光学機能を有する析出結晶近傍の応力誘起と緩和を制御することで、局所的な応力に起因する結晶ラインの機能向上とその制御に関する技術開発を目的とし、研究初年度においては、装置の新規導入と応力誘起と緩和の数値モデル構築に必要となる基礎情報の収集として下記項目を実施した。1.レーザー集光照射パターニング装置の導入半導体レーザー(波長808nm、最大出力1.2W)をシステム偏光顕微鏡の落射照明光学系に導入する光学系を構築し、顕微鏡ステージ上のガラス表面に集光照射による焦点加熱パターニング装置を新たに導入した。モデルガラスとしてレーザー波長域に吸収帯を有するDy3+を含有するビスマスホウ酸塩ガラスを選択し、結晶化に対する安定性をはじめとするガラスの基礎物性を評価し、続いてレーザー集光照射による局所加熱および結晶生成の条件を探索した。本ガラス系においては、レーザー強度の不足による熱エネルギーへの変換効率が悪いなどの等に問題が指摘されたが、組成探索を行い最適ガラス組成の絞り込みを完了する段階にある。2.偏光顕微鏡観察による局所応力の半定量的評価レーザー照射点近傍の偏光顕微鏡観察により、異質相形成による周辺不均一領域の形成とそれに伴う応力の誘起が確認された。現時点では、異質相の立体的な形状計測と誘起応力の定量的な評価には至っていない。また、局所的な応力に起因する結晶相の非線形光学特性の変化については、同じく近赤外レーザー集光加熱法を用いて局所的にガラスの徐冷条件を変化させた試料を作製することを予定している。本研究では、非線形光学機能を有する析出結晶近傍の局所応力制御による機能向上と制御に関する技術開発を目的として、以下の基礎的研究および技術開発を実施した。1.レーザー集光照射異質相パターニングシステムの開発近赤外レーザー(波長808nm)を使用したレーザー集光照射光学系を研究初年度に導入したが、本年度においては、レーザー出力および試料ステージの自動制御により任意パターンを形成するシステム開発を実施した。システムの動作、操作性等の確認のために、銀ステインを塗布したガラス表面に対する局所加熱実験を行った。レーザー集光領域における銀イオン拡散とコロイド形成による微視的着色を確認し、本システムが結晶化以外の異質相パターニングにも適用できることを示した。また、ステージ動作や制御操作性についての性能を確認した。2.ビスマスホウ酸塩系の結晶化挙動調査非線形光学結晶化ガラスのモデル系として、希土類イオン含有ビスマスホウ酸塩系を選択し、加熱光源波長808nmに対する吸収帯を有するDy^<3+>含有ガラスを作製し結晶化挙動を調査した。Dy^<3+>含有系では、研究報告のあるSm^<3+>含有系と比較して、(1)結晶化に対する不安定性、(2)低い吸収係数で特徴づけられ、レーザー集光点の結晶化温度到達には、Dy^<3+>を含有させた安定なガラス組成開発が不可欠であった。材料科学的な解決として、第3成分の添加による結晶化挙動を調査した結果、少量の酸化亜鉛を添加した安定なガラスにおいて、目的結晶相BiBO_3の析出優位性を確認した。最適化組成で結晶ライン形成と応力誘起を試みたが、現時点で良好なパターン形成には至っていない。レーザー光源の強度および品質改善が不可欠であると判断した。
LESのための接地境界条件の提案

気象モデルが高解像度化し、乱流渦の一部が解像されるラージ・エディ・シミュレーションとみなされる場合、従来の接地境界層過程のパラメタリゼーションの適用は不適切になる。そのような場合におけるパラメタリゼーションの在り方を、ラージ・エディ・シミュレーションによる感度実験、乱流の直接計算、および風洞実験結果をもとに検討した。また関連して、高解像度化した気象モデルの接地境界層過程(特に強安定成層または強不安定成層)に顕在化する課題にも取り組んだ。乱流変動をある程度高精度に表現可能なラージ・エディ・シミュレーション(LES)が普及し、微細気象の解析等に利用される。しかし、LESのための適切な接地境界条件は依然として未解決である。不確定性を排した乱流の直接計算(DNS)の数値実験結果や室内実験・屋外観測をもとに、従来の接地境界条件の問題点を具体化し、接地境界条件を決定づけるダイナミクスの理解を通して、適切な接地境界条件の改良に着手し、LESの信頼性の向上へつなげる。以下、平成26年度の計算実績を述べる。1.並列計算機用のためのDNSプログラムを整備し、レイノルズ数が数100程度と中程度の計算規模である中立乱流エクマン層のDNSを、大型並列計算機において実施した。壁面付近の流速など基本的な物理量とともに、高次相関など様々な統計量も確認し、計算結果な詳細な検証を行った。先行研究と十分整合する乱流エクマン層が再現されていることがわかった。2.なるべく壁面粗度を小さくした中立接地境界層の風洞実験を実施した。実際の接地境界層でみられるように鉛直運動量フラックスがほぼ一定になる壁面高さを確認した。この壁面高さにおいて、1時間を超す十分長時間の時系列データの取得に成功した。時系列データの解析プログラムを開発し、特にLESの接地境界条件に相当する短い時間フィルターでの、風速と運動量フラックスの関係について考察した。3.接地境界層の乱流構造の屋外観測について成果を発表した。以下、平成27年度の研究実績を述べる。1.平成26年度実施した中立乱流エクマン層のDNSの解析を行った。別のDNSによる計算結果データベースと比較したところ、壁面付近の流速など基本的な特性がおおむね整合することを確認した。DNSの計算結果をもとに、接地境界条件を与える地表面摩擦モデルの空間フィルタサイズ依存性を調べた。2.なるべく壁面粗度を小さくした中立境界層の風洞実験を引き続き行った。今年度は測定手法を変更した実験を実施した。得られた時系列データの解析を行い、基本的な特性を調べ、慣性小領域が実現していることを確かめた。この時系列データを利用し、流速と運動量フラックスの関係の時間フィルタ依存性を調べた。さらにDNSと風洞実験結果を規格化したところ、普遍曲線を見出すことができた。3.実際の顕著現象を想定した状況のLESやDNSを行い、接地境界条件に対する感度実験を行い、モデル化の指針を得た。4.台風のLESで再現された突風に対する接地境界条件の影響について調べた成果を発表した。本研究の目標である接地境界条件の改良の指針となるようなLES、DNSと風洞実験それぞれのデータが得られている。大気を想定したラージ・エディ・シミュレーション(LES)の下部境界条件として必須である接地境界層のパラメタリゼーションについて、LESによる感度実験を行いインパクトを評価する一方、乱流の直接計算(DNS)や気象研究所の大型風洞で計測した境界層乱流の時系列データをもとに、何らかの平均操作を含む定式化を行う必要性を確かめた。本研究の成果を日本流体力学会年会や米国気象学会の境界層と乱流に関するシンポジウムで発表するとともに、学術誌へ投稿した。以下に述べる最終年度の研究結果を反映させながら、今後も原稿の改訂を行い、論文発表する。境界層の渦サイズに依存した時間スケールをダイナミックに決定しながら時間平均を行った風速を求める。平均化された風速により運動量フラックスを与える新たな接地境界層のパラメタリゼーションを、LESに組み込んだモデル計算を試行した。接地境界層のパラメタリゼーションを空間平均で与えた場合と同様の速度分散の大きさをもつようになった。気象モデルが高解像度化し、LESとみなせるようになった場合のインパクトも調べた。顕著気象を再現のために利用される領域気象モデルのひとつである、気象庁非静力学モデル(JMA-NHM)の接地境界層のパラメタリゼーションに対し、上述の時間平均を伴った風速に依存するように変更したバージョンを作成した。Mashiko(2015)を参考に、JMA-NHMにより2012年のつくば竜巻を再現し比較した。新たなパラメタリゼーションを導入した場合、最大風速は1割程度増加するとともに、竜巻渦がマルチセル構造を持つように変化した。

そのような場合におけるパラメタリゼーションの在り方を、ラージ・エディ・シミュレーションによる感度実験、乱流の直接計算、および風洞実験結果をもとに検討した。また関連して、高解像度化した気象モデルの接地境界層過程(特に強安定成層または強不安定成層)に顕在化する課題にも取り組んだ。現状の接地境界条件の問題点の定性的な指摘のためには、十分な品質である風洞実験の時系列データが取得できており、現在成果発表のため準備を行っている。またDNSプログラムの準備・検証も完了している。平成27年度のLESの研究成果の短報が受理済みである。LES、DNSと風洞実験結果をまとめたフルペーパー論文の投稿準備中である。また国際学会等での発表も行う。今後はDNSでレイノルズ数を変えた実験や成層を加えた実験、台風のLESでの接地境界条件の感度実験を行う。気象学時系列データ取得サブルーチンを実装したDNSを本格実施し、接地境界条件の定式化に活用するため、より高いレイノルズ数の計算結果を得る。風洞実験については結果のまとめを行う一方、DNSを実施しにくい粗度が大きい場合について追加の風洞実験を予定している。風洞実験の研究手法を変更したことと、粗度を大きくした実験は時系列データがうまく得られなかったため、風洞実験の取りまとめの方針を変更し、DNSとLESと合わせた内容として、翌年度の学会発表や論文執筆を行うようにした。平成28年度は当初予定していた事項に追加して、昨年度までの研究成果に関する学会発表や論文発表を行う予定である。
台湾集集・イランバム地震により被災した公共構造物の耐震性能詳細調査

台湾集集およびイランバム地震における詳細調査と詳細分析の結果,得られた知見を以下にまとめる.(1)台湾集集地震で,特に桁同士の衝突により被災したと考えられる長庚大橋を対象に,現地測量調査や詳細図面を用いて被害分析を行った.現地調査結果を反映した橋台部のモデル化と,桁衝突を考慮した非線形動的解析の結果,実際の被害と同様に,上部工慣性力によって,支承が破壊後,桁同士が玉突き衝突を起こし,桁が橋台パラペットを押し抜き,橋台背面土に1m程度めり込む現象をシミュレーションにより再現できた.(2)台湾集集地震で被災したPC斜張橋を対象に詳細な被害分析と耐震性能評価を実施した.まず,非線形動的解析による分析の結果,RC主塔基部の損傷原因は,主塔部に高次モードの変形状態が表れることによることを明らかにした.ついで,パラメータ分析により,PC斜張橋のような長周期構造物に対しては,長周期成分の卓越する地震波の影響で応答が極めて大きくなる可能性があることを示唆した.(3)2003年12月に発生したイラン・バム地震で被害を受けた公共構造物の被害調査と,特に橋梁に着目した被害分析を行った.対象橋梁の非線形時刻歴応答解析による被害分析の結果,地震時慣性力により支承部が最大摩擦力に達した後,RC桁同士が接触を起こしながらRC橋脚上を移動し,桁間の隙間や残留変位を生じた現象を再現できた.台湾集集およびイランバム地震における詳細調査と詳細分析の結果,得られた知見を以下にまとめる.(1)台湾集集地震で,特に桁同士の衝突により被災したと考えられる長庚大橋を対象に,現地測量調査や詳細図面を用いて被害分析を行った.現地調査結果を反映した橋台部のモデル化と,桁衝突を考慮した非線形動的解析の結果,実際の被害と同様に,上部工慣性力によって,支承が破壊後,桁同士が玉突き衝突を起こし,桁が橋台パラペットを押し抜き,橋台背面土に1m程度めり込む現象をシミュレーションにより再現できた.(2)台湾集集地震で被災したPC斜張橋を対象に詳細な被害分析と耐震性能評価を実施した.まず,非線形動的解析による分析の結果,RC主塔基部の損傷原因は,主塔部に高次モードの変形状態が表れることによることを明らかにした.ついで,パラメータ分析により,PC斜張橋のような長周期構造物に対しては,長周期成分の卓越する地震波の影響で応答が極めて大きくなる可能性があることを示唆した.(3)2003年12月に発生したイラン・バム地震で被害を受けた公共構造物の被害調査と,特に橋梁に着目した被害分析を行った.対象橋梁の非線形時刻歴応答解析による被害分析の結果,地震時慣性力により支承部が最大摩擦力に達した後,RC桁同士が接触を起こしながらRC橋脚上を移動し,桁間の隙間や残留変位を生じた現象を再現できた.1.台湾調査集鹿大橋の補修・補強手法についてのヒヤリングを実施し,現地調査計画を作成した2.イラン調査1)調査概要バム市内を拠点とし,損傷構造物ごとに,損傷度調査を実施した.また,構造物管理者からヒヤリング調査を実施した.具体的には,申請者のうち2名(幸左・宮島)を中心とした8名の調査団を形成し,10日間の調査を実施した.2)調査結果調査した構造物は,橋梁(3箇所),給水塔,モスク(3箇所),BHRC,電話局,アフラトニアン病院の10箇所である.調査した構造物はいずれもBもCランクであったが,その内2箇所については,撤去・再構築が実施されていた.また,周辺地域の建物は5699%の非常に高い被害度であった.3)解析概要入手した資料を基に,開発した非線形動的解析手法を用いて,構造物の損傷度を評価した.そのうち,橋梁No.1に対して,動的解析により,その損傷度を評価した.その結果,地震慣性力により,桁の橋脚接触面が接触を起こしながらRC橋脚上を移動し,桁間の間隙や残留変位を生じた現象を再現できた.調査した3橋梁はいずれも支承が無いため,RC桁とRC橋脚の摩擦力以上の慣性力が橋脚に伝わらなかったこと,また桁遊間量が小さく,両端部の橋台による変位拘束効果が高かったことから,耐震性に優れた構造であったと考えられる.1.台湾調査1)データ収集集鹿大橋の補修・補強手法について,施工担当者からヒヤリング調査を実施し,構造物の詳細な損傷状況を明らかとした.2)動的解析比較的大規模な補強が集鹿大橋において実施されている.そこで,その補強効果を評価するために,同程度の地震が新たに発生した場合の構造物の応答を評価し,補強方法の有効性を評価した.2.イラン調査1)調査結果調査した構造物は,橋梁(3箇所),給水塔,モスク(3箇所),BHRC,電話局,アフラトニアン病院の10箇所である.調査した構造物はいずれもBもCランクであったが,その内2箇所については,撤去・再構築が実施されていた.また,周辺地域の建物は5699%の非常に高い被害度であった.3)解析概要入手した資料を基に,開発した非線形動的解析手法を用いて,構造物の損傷度を評価した.そのうち,橋梁NO.1に対しては特に損傷度が極めて小さい原因を現地入力波形を用いて解析的に評価した.

その結果,入力波形は大きいものの,桁遊間距離が小さいことによる橋台一桁間の変位拘束効果により,損傷が極めて軽微となることを明らかにした.本解析の適用性を明らかにするために,中越地震により同様の損傷が認められた橋梁についての解析も実施した.その結果,桁衝突が発生し橋台が損傷するものの,桁移動が拘束されることによって,橋梁全体系としてみた場合には,橋脚損傷が軽減されることが明らかとなった.平成19年度には、以下に示す台湾関係の検討を行った。1)データ収集2径間連続PC斜張橋である集鹿大橋の補修・補強方法について、施工担当者からヒヤリング調査を実施し、構造物の詳細な損傷状況および詳細復旧手法を明らかにした。例えば、主塔基部では、基部から23mの範囲のひび割れに樹脂を注入し、その後コンクリートの剥離、剥落の生じた範囲に対して2層の炭素繊維シート巻きたて工法によりじん性補強を実施した。2)動的解析じん性補強をした集鹿大橋をプロトタイプモデルとして、同規模の地震が繰り返し発生した場合の耐震性能を評価した。非線形動的解析の結果、初期損傷で主塔部や橋脚基部が終局曲率に対して0.1-0.6φu程度の損傷であるならば、今回のようなじん性補強を行うことで、2波目による損傷度はほとんど変化しないことが明らかとなった。また、2波目の応答が1波目に対して大きく異なるケースに対しても履歴ループ特性から照査を行った。3)類似橋梁の分析中越地震により橋脚損傷が発生した3径間連続PC橋梁の被害分析を実施した。まず、橋梁の損傷状況を詳細に調査・分析した後、非線形動的解析により橋脚の損傷状態を再現した。さらに、段落とし部の照査位置や上部構造形式、入力地震動が段落し部の損傷に与える影響を把握するために、それらをパラメータとした検討を行った。
疾患特異的iPS細胞を用いたイヌ変性性脊髄症の病態解明と治療研究

本研究では変性性脊髄症(DM)症例の皮膚線維芽細胞からiPS細胞を樹立し、神経細胞およびグリア細胞に分化させることにより,発症例の遺伝的背景を持ち合わせたDMのin vitroモデルの構築を行なう事を目的とした。本モデルを用いて、ミグログリアの活性化制御やSOD1タンパクミスフォールディングの安定化など新規治療薬候補のスクリーニングやDMの病態発生の解明を目指した。まず初期化因子の導入法について、複数の導入方法および異なるベクターの比較検討を行ったが、安定したiPS細胞の樹立には至らなかった。DMのin vitroモデルとして小胞体ストレスに着目し、犬変異型SOD遺伝子導入細胞を用いたモデル構築に着手した。DMの病態と小胞体ストレスの関連を証明するために、DMの脊髄における小胞体ストレスマーカー(BiP)の発現解析とBiP陽性細胞の同定を行った。また、E40K遺伝子導入培養神経細胞を用いてE40Kによる小胞体ストレス誘導を解析した。IHCによりDM群の脊髄白質において、BiP陽性グリア細胞の増加を認めた。脊髄灰白質の神経細胞では両群でBiPの発現を認めた。DM群において増加を認めたBiP陽性グリア細胞はミクログリアおよびアストロサイトであった。Non-DM群のアストロサイトはBiP陰性であった。また、WBにより、ツニカマイシンを処置したE40K導入細胞は野生型SOD1導入細胞に比べBiPを高発現していることが明らかとなった。以上の結果から、E40Kによって小胞体ストレスが誘導され、それに対する応答としてBiP陽性ミクログリアの増加およびアストロサイトのBiP発現が引き起こされていると考えられた。ミクログリアおよびアストロサイトは小胞体ストレスにより炎症を惹起することが知られており、脊髄白質における小胞体ストレス誘導性炎症がDMの病態に関与していることが示唆された。本研究では、DM症例の皮膚線維芽細胞からiPS細胞を樹立し、神経細胞およびグリア細胞に分化させることにより、発症例の遺伝的背景を持ち合わせたDMのin vitro病態モデルの構築を行う。このモデルを用い、ミクログリア活性化制御による新規治療候補の神経保護効果を明らかにし、DMの治療法の開発を目指す。本年度はDM疾患特異的iPS細胞を用いたin vitro病態モデルの構築に取り組んだ。DM症例犬(変異型SOD1)および健常犬(野生型SOD1)から皮膚片を採取し、線維芽細胞を分離培養した。線維芽細胞への初期化因子の導入は、ウイルスベクター(レンチウイルス、センダイウイルス)またはエレクトロポレーションにより実施し、遺伝子導入効率および細胞初期化状態の検討を行った。エピソーマルベクターを用いたエレクトロポレーションにによる初期化因子の導入効率と細胞生存率の相関を明らかにし、最適な遺伝子導入条件を検討した。ウイルスベクターによる遺伝子導入実験では、複数のウイルスベクターを用いて、初期化因子の発現期間と細胞凝集体の形成効率の相関を明らかにした。以上の実験はH29年度も引き続き行なう予定である。他の手法によるDMのin vitroモデルの作製にも着手した。変異型犬SOD1遺伝子導入細胞に対し様々な細胞ストレスを負荷し、細胞生存率、ストレスマーカーの発現、SOD1凝集体の形成率を評価した。本モデルにおいては、変異型SOD1遺伝子導入細胞では、正常型SOD1遺伝子導入細胞と比較してSOD1蛋白凝集体の形成が促進され、細胞ストレスマーカーの発現が上昇していることが明らかとなった。以上より治療薬候補のスクリーニングやDMにおける神経細胞死のメカニズムの解明に本モデルが有用なツールとなる可能性が示された。犬由来細胞の初期化条件の最適化が完了していない。本研究では変性性脊髄症(DM)症例の皮膚線維芽細胞からiPS細胞を樹立し、神経細胞およびグリア細胞に分化させることにより,発症例の遺伝的背景を持ち合わせたDMのin vitroモデルの構築を行なう事を目的としている。本モデルと用いて、ミグログリアの活性化制御やSOD1タンパクミスフォールディングの安定化など新規治療薬候補のスクリーニングやDMの病態発生の解明を目指している。H29年度はH28年度に引き続き、初期化因子の導入法について、複数の導入方法および異なるベクターの比較検討を行った。また、小胞体ストレスに着目し、犬変異型SOD遺伝子導入細胞を用いたin vitroモデルの構築に着手し、一定の成果を得た。本研究では変性性脊髄症(DM)症例の皮膚線維