hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
求核付加・解離平衡に基づく多色・多機能な超解像蛍光イメージングプローブ群の開発

1.タンパク質タグを利用したSiP650の生細胞応用:標識手段としてタンパク質タグ、特にHaloTagを用いた系において、SiP650の生細胞応用を達成した。CP550に続いての本色素の生細胞応用により、本研究独自の明滅原理および分子設計指針の汎用性と拡張性が実証された。また、SiP650は、所属研究室が以前に開発したHMSiRと同等の波長域でありながら、明滅特性にバリエーションを加えることで、この波長域のSMLM用色素の適用範囲を拡大させたという意義がある。2.キサンテン系色素のオルガネラ局在性に関する検討:キサンテン系色素のoff-target染色の傾向や原因を探るべく、また特定のオルガネラへの局在化戦略を検討するべく、種々のキサンテン系色素を生細胞に適用し、その局在性等を調査した。色素の求電子能および正味電荷と局在性との間の大まかな傾向を掴んだ一方で、SiP650等の局在制御の難しさをも認識した。本検討は、今後のキサンテン系色素の設計・開発や応用の際に参照されるべき知見を与えた。3.photoactivatable型色素に関する検討:可視光刺激によりグルタチオンの解離を促進(activation)できる色素分子の開発を試みている。キサンテン環を拡大した候補色素骨格に関し、誘導体を合成して光応答性および光耐久性を評価した結果、この種の色素骨格の開発展開を試みる方針の妥当性が支持された。本研究では、細胞内グルタチオンの求核付加・解離平衡という新規明滅原理を提案し、これに基づく多色・多機能なSMLM用色素の開発を進めている。分子設計・合成と明滅特性の評価の結果、2種の候補色素骨格CP550およびSiP650を見出した後に、まず昨年度内に早くもCP550の生細胞応用を達成した。これは、所属研究室が先行研究において開発した赤色蛍光色素HMSiRに続く2色目のSMLM用蛍光色素となった。2色目の色素は、多色観察により生物学的事象を解析するために必須であり、その開発が強く求められながらも、HMSiRの設計戦略を踏襲するだけでは実現されなかった。本研究において、新たな設計原理に基づきこれを開発したことは、化学的にも実使用上の観点からも非常に重要であり、高く評価されうる。さらに、本年度はSiP650の生細胞応用も達成した。昨年度までの基礎検討からは、標的特異的な標識と超解像画像構築に難しさを感じていたが、本年度は条件検討と試行錯誤を経て、これを達成するに至った。CP550, SiP650の両色素で生細胞応用を達成したことで、本研究独自の明滅原理および分子設計指針の汎用性と拡張性が示された。SiP650は、赤色蛍光領域に明滅特性のバリエーションを提供し、この波長域のSMLM用色素の適用範囲を拡張するという実用上の意義も持つ。さらに、特に本年度において、多機能化展開に向けた検討等も進展させた。1つには、キサンテン系色素の局在性の検討を行い、色素の局在性に関する大まかな傾向を掴むとともに、その制御の難しさや論点を見出した。これらは、今後色素を取り扱う際に参照されるべき知見となった。2つ目に、photoactivatable化に向けた検討も進めた。
半導体レ-ザ-を用いた赤外天文観測のための高分解能分光システムの開発

天体観測においては遥か遠方の天体から届く極くわずかな光の中から、電磁波としての全ての情報を余すことなく引き出すことが要求される。今までの赤外線以上の光領域では電磁波を最終的には光量子として検出してきた。一方、ヘテロダイン検出法は電磁波の波としての性質を利用した検出法であり、マイクロ波領域の電波天文学で広く用いられている。この手法を近赤外領域の微弱なインコヒ-レント光に対して適用し、天体観測用の高分解能分光検出法の可能性を試みた。光領域のヘテロダイン分光法に必要な高出力で安定な周波数可変の局部発振器としては、単一モ-ド発振する1.3μm分布帰還型(DFB)半導体レ-ザ-を用いた。また、この領域のミキサ-としては高速のGeアバランシェフォトダイオ-ドを用いた。インコヒ-レント光に対するヘテロダイン分光検出を確認するために、被測定光としては近赤外の広帯域LEDを連続背景光源としたAr原子の吸収線を用いた。観測光と半導体レ-ザ-光をハ-フミラ-で重ねレンズで集光して光ミキサ-に導入し、両者のビ-ト成分を電気信号として取り出した。広い範囲のスペクトルを得るために、局部発振器を周波数掃引しながら中間周波(IF)出力の特定帯域成分を取りだし、その二乗検波信号を記録することでスペクトルを得た。スペクトルの分解能は電気的に設定する帯域幅で決まるため、観測対象の吸収線の固有の幅に最適な分解能を設定することができることを示した。また、周波数の絶対確度が30MHzと高い(Doppler Shift=40m/sに対応)ので、新しい天体観測の可能性を提示した。
唾液腺におけるアクアポリン5蛋白質の発現と分解の調節機構の解明

アクアポリン(AQP)5蛋白質は合成された後、細胞膜へ移動して機能する蛋白質であるが、どの過程で発現・分解調節を受けているのかを検討するために全長のAQP5遺伝子のN末またはC末にGFP融合蛋白を発現するVectorを作成しstableに発現する細胞株を樹立した。この細胞株でのAQP5の細胞膜への移動調節能を検討したところ、未刺激下ではAQP5のN末にGFPを融合させた場合(GFP-AQP5)は細胞質内で発現するが、C末に融合させた場合(AQP5-GFP)は細胞膜で発現しており、発現の局在が異なることを見いだした。これは同じAQP familyであるAQP2でも同様の報告がされており、これらの蛋白はC末領域に結合する蛋白により細胞膜への移動調節を受けている可能性がさらに強く示唆された。また、GFP-AQP5はdbcAMP刺激により細胞質内から細胞膜への移動が認められ、さらにPKA阻害剤であるH-89によりその移動が阻害されたことから、AQP5の細胞膜への移動にはPKAが関与していることを明らかにした。自然発生的に顎下腺細胞膜特異的にAQP5蛋白質の発現量が低いラットおよび正常な発現量のラット顎下腺から抽出したRNAを用いて2つの組織間で異なる発現をする遺伝子のスクリーニングをRepresentational Difference Analysis法により行ったところ、既知のセリンプロテアーゼ系酵素が同定された。このAQP5の発現量が低い顎下腺細胞膜蛋白抽出物と正常な発現量の膜蛋白抽出物を混合してインキュベートした際に総AQP5蛋白質量が減少すること、またAQP5のmRNAの発現量は同程度であることから、AQP5蛋白発現量の低い顎下腺では、今回検出した酵素がAQP5蛋白質の分解に関与している可能性が考えられた。1.ラット顎下腺におけるAQP5蛋白質の分解に関与する遺伝子のスクリーニング本研究に至る独自の研究において自然発生的に顎下腺細胞膜特異的に水チャネル蛋白質AQP5蛋白質の発現量が極めて低いがAQPSmRNAの発現量は正常ラットと同程度であるラットを見いだしており、本ラットにおいてはAQP5のmRNAから蛋白質への翻訳以降の過程において何らかの異常が関与していることが考えられた。そこで、顎下腺におけるAQP5の発現・分解に関与する遺伝子を単離するために、自然発生的に顎下腺細胞膜特異的にAQP5蛋白質の発現量が極めて低いラットおよび正常な発現量のラットの顎下腺よりRNAを抽出し、cDNAを作成した。TesterにはAQP5蛋白質の発現量が極めて低いラット由来のcDNAを、Driverには正常なAQP5蛋白質発現量のラット由来のcDNAを用いてRepresentational Difference Analysis法によりスクリーニングを行った。得られたクローンの塩基配列決定を行ったところ、AQP5の発現・分解に関与するのではないかと推測される4つの候補遺伝子が認められた。現在、単離された遺伝子の2種組織間での発現量の差についてRT-PCR法により検討中である。AQP5蛋白質は合成された後、細胞膜へ移動して機能する蛋白質であるが、どの過程で発現・分解調節を受けているのかを検討するために、全長のAQP5遺伝子とGreen fluorescent protein融合蛋白質発現ベクターに組み込み、AQP5-GFP融合蛋白質発現ベクターを作成した。これを腎尿細管由来の培養上皮細胞であるMDCK細胞株に導入後、G418を添加した培地で培養し、stableなAQP5-GFP融合蛋白発現細胞株を樹立した。今後この細胞株を用い、上述のRDA法により単離された遺伝子を発現させ、AQP5蛋白質の発現・分解に関与する遺伝子について検討する予定である。
頭頸部癌放射線療法後の有害事象の体系化:正常組織障害予測モデルを用いて

放射線治療前後の定期的な開口測定を行う。132例中で30例が開口径が35mmを下回る。3次元治療計画CTで開口障害にかかわる筋肉や関節を描出し線量因子と臨床因子を用いて多変量解析を行い開口障害に関係する臨床、線量因子を割り出した。重要因子は放射線治療前の開口径と対側顎関節の平均線量であった。開口障害が何%で起こるかを示した簡便な開口障害予測早見表を作ることができ日常臨床に非常に役だてることができた。頭頸部癌放射線療法後の有害事象の体系化を進める過程で、専用の開口測定器を用いて、放射線療法前と放射線療法後の定期的な開口測定を開始した。症例の集積を進めている。全体として、放射線療法後は放射線療法前より開口径が小さくなる印象を受けた。中には、開口がほとんど難しくなり、食事が困難になる症例もみとめられた。症例の三次元治療計画を見直し、極端な分布を示していないことを確認した。しかし、開口をつかさどる筋肉や関節に放射線は照射されており、放射線療法との因果関係はないとは言えないと考えられた。正常組織障害予測モデルを用いて、翼突筋、顎関節、側頭筋、咬筋などのコンツールを3次元治療計画CT上で行い、線量容積曲線を描出する。V20,V40,平均線量などのパラメータを抽出してどのパラメータが、開口障害に関与しているか、調べる。予備調査では、開口障害には、顎関節の平均線量と放射線療法前の開口径が、開口障害の発生にはもっとも関与しているのではないかと考えられた。顎関節の線量を抑えて、強度変調放射線治療を行えば、開口障害の発生を抑えられる可能性があり、また、線量を抑えることが難しくても、開口障害の発生のハイリスクグループを割り出して、効果的なリハビリテーションや薬物治療などの介入をなどの提案を早めにしていくことで、患者の利益につながる可能性があると考えられた。今後も引き続き、研究を進めていく予定である。症例の集積をすすめているがペースがやや遅い。積極的な症例の集積を図っていく。頭頸部癌放射線療法後の有害事象の体系化を進める過程で、専用の開口測定器を用いて、放射線療法前と放射線療法後の定期的な開口測定の結果を自施設で行っている。頭頸部癌26例に対して、照射前の開口径の平均値は48mmに対して、放射線療法後6か月の開口径の平均値は41mmであった。平均値は低下しており、中には参照文献でしばしば引用される35mmを下回るものもあった。今後は、3次元治療計画CTにおいて、開口障害にかかわると予想される、筋肉や関節のコンツールを行い、線量体積曲線を描出して、線量因子と臨床因子を用いて多変量解析を行い、開口障害に関係する臨床因子、線量因子を割り出して頭頸部癌放射線療法後の開口障害の発生予測モデルを作成する予定である。学会発表、論文作成も進めていく予定である。また、症例数は集まってきてはいるが、他病院との連携を進めて、症例数の増加に努める予定である。他施設のデータでは、頭頚部癌放射療法後に、132例中で30例が開口系が35mmを下回っており、自施設のデータより開口障害が深刻である印象を受けている。施設間の差異なども検討していくことができればと考えている。他施設データでは、放射線治療前の開口径と対側の顎関節の平均線量が開口障害の発生に関与する可能性がでてきている。症例の集積を引き続き、積極的にすすめて、重要因子の割り出しの精度をさらに高めていく予定である。国内の他施設にも、協力を依頼していきたいと考えている。自施設の症例の集積がある程度進んできて、解析も進んできている。他施設との連携も検討できているため。頭頸部癌放射線療法後の有害事象の体系化を進める過程で、専用の開口測定器を用いて、放射線療法前と放射線療法後の定期的な開口測定を自施設で行ってきた。頭頸部癌26例において、照射前の開口径の平均値は48 mmに対して、放射線療法後6か月の開口径の平均値は41 mmであった。平均値は低下しており、中には参照文献でしばしば引用される35 mmを下回るものもあった。他施設のデータでは、頭頚部癌放射療法後に、132例中で30例で開口径が35 mmを下回っており、自施設のデータより開口障害が深刻であった。他施設データで、3次元治療計画CTにおいて、開口障害にかかわると予想される、筋肉や関節のコンツールを行い、線量体積曲線を描出して、線量因子と臨床因子を用いて多変量解析を行い、開口障害に関係する臨床因子、線量因子を割り出して頭頸部癌放射線療法後の開口障害の発生予測モデルを作成した。最も関与している臨床因子は放射線治療前の開口径(ベースライン)であった。また、最も関与している線量因子は対側の顎関節の平均線量であった。この2因子で正常組織障害予測モデルの作成が可能であった。ベースラインの開口径が50 mmで対側顎関節に平均で60 Gyの放射線が当たると、76%で開口障害が起こる。ベースラインの開口径が55 mmで対側の顎関節に平均で20 Gyの放射線が当たると17%で開口障害が起こる。

これを5 Gy刻みで横軸を(幅0-60 Gy)、5 mm刻みで縦軸をとり(幅5-70 mm)、開口障害が何%で起こるかを示した、簡便な開口障害予測早見表を作ることができ、日常臨床に非常に役だてることができるようになった。放射線治療前後の定期的な開口測定を行う。132例中で30例が開口径が35mmを下回る。3次元治療計画CTで開口障害にかかわる筋肉や関節を描出し線量因子と臨床因子を用いて多変量解析を行い開口障害に関係する臨床、線量因子を割り出した。重要因子は放射線治療前の開口径と対側顎関節の平均線量であった。開口障害が何%で起こるかを示した簡便な開口障害予測早見表を作ることができ日常臨床に非常に役だてることができた。今後も症例集積をすすめていく。結果の解析もすすめていく。自施設の頭頸部癌放射線療法後の開口障害の研究結果の解析と他施設データの解析をすすめていく。学会発表や論文作成の準備をすすめていく。放射線治療機材購入が、当初予定よりもやや少なく済んだことがあげられる。学術会参加費用が少なかった。次年度使用額が生じた理由は、次年度に必要な物品購入のためである。機材不足の場合に購入をすすめていく。学会発表や出席、論文の校正、投稿をすすめていく。研究に必要な物品を購入していく予定である。
大学入試(数学)による大学理系学生の学力および選抜効果の研究

本年度は,昨年度に引き続き記述形式数学試験の分析を行うための基礎研究およびマークシート形式数学試験との比較を行う手法の開発を行い,その成果に基づいて昨年度実施したモニター試験の結果の分析を行った。この結果,問題作成・モニター調査実施方法などでその前の年度より改善が見られ,質の高いデータが得られたこと,ほぼ例外なく記述形式の得点がマークシート形式のそれを上回ることはないこと,両者で差が付くのは解答方針を立てる部分,複数ステップにわたる計算が必要となる部分で大きいことが分かった。記述形式の方が解答の方法に自由度が大きいので,得点が取りやすい可能性はあるが,その影響は見られなかった。したがって原則的に記述形式の方が広範な学力を見ていることが実証された。しかしステップ数が大きくなると殆どが途中までしか行かないという床効果が現れ,弁別力はかえって低下する場合のあることも観察された。また記述形式とマークシート形式との得点の散布図を取ると,対角線を境にマークシート形式高得点側のみに分布するといういわゆる「森田の観察」は,マークシート形式の得点の優位さとマークシート形式得点の天井効果との相乗作用であることも分かった。なお大学入試成績との相関についてはいずれの場合も特に高い相関は認められなかった。一方大学入試の改善のため,高等学校との意思疎通を図る集まりとして,名古屋大学数学教育セミナーを開催し,大学院生をも含む形で交流の場を持った。平成17年度は,記述式数学試験の分析を行うための基礎的な研究を主として行った。すなわち今年度名古屋大学が他の3大学とともに「受験生の思考力、表現力等の判定やアドミッションポリシーを踏まえた入試の個性化に関する調査研究」で文部科学省からの研究委託を受けたので,これに協力する形で,その基礎的・理論的部分の研究を受け持った。すなわち,その委託研究で同一問題をマーク式・記述式で出題し,その答案を比較検討する調査を行ったが,それに先立って記述式問題の採点方法,分析方法の検討を数学の立場から行った。また両者を比較するための統計的手法について研究し,サンプルについて試験的分析を行った。特にこの分析では,解答が読む者を意識して,説明をきちんと行おうとしているか否かの差が明瞭になることを意識した。上記委託研究では同時に数学観,数学学習態度についても被験者にアンケートを行っており,このアンケートに現れた特性が,上記の解答の特徴と深く関係していることが明らかになった。この分析はさらに次年度詳細に行う。これらの研究を支援するため,1名のRAを採用した。また本研究と並行して,他大学での状況の調査を行い,特に入試業務に経験の深い数学関係者との意見交換を行った。これらの予備的な研究は,次年度本研究計画に基づく入試答案の調査分析,入学後の成績の追跡調査に生かせると期待している。なお今年度の個別入試答案はすでに廃棄されていたため,これについて直接調査を行うことはできなかった。平成18年度は,昨年度に引き続き記述形式数学試験の分析を行うための基礎研究を行うとともに,マークシート形式数学試験との比較を行う手法の開発を行った。今年度も名古屋大学は引き続いて「受験生の思考力、表現力等の判定やアドミッションポリシーを踏まえた入試の個性化に関する調査研究」で文部科学省からの研究委託を受けたので,数学教育研究の立場からこれに協力する形で,その基礎的・理論的部分の研究を受け持った。特に委託研究費の利用可能となるのが12月となるため,それまで研究が中断しないよう,この期間の研究経費を担った。この委託研究は同一問題をマークシート形式・記述形式で出題し,その答案を比較検討することで両者の特性を明らかにすることを目的としている。今年度はまず昨年度実施した記述形式試験についてその結果の分析方法の検討を数学の立場から行った。すなわち解答プロセスを分析し,配点の検討,解答パターンや誤答の可能性といった検討を行い,また問題内容による結果の特徴をもつかむこととした。こうした検討結果を踏まえて,本年1月に委託研究としての本調査が行われ,その結果の分析を現在進めている。これは次年度の研究課題である。上記委託研究では同時に数学観,数学学習態度についても被験者にアンケートを行っており,このアンケートに現れた特性と試験結果との関連の分析も次年度の課題である。この委託研究における問題作成,採点基準作成,結果分析などのあらゆる点において,本萌芽研究の成果が生かされ,質の高い調査を行うことができ,有益な分析結果も得られつつある。この研究にあたっては,国立教育政策研究所研究員の協力を仰いだ他,他大学の入試担当経験のある数学者との交流を行い,このためかなりの部分を旅費として用いた。またこれらの研究を支援するため,1名のRAを採用した。

しかしステップ数が大きくなると殆どが途中までしか行かないという床効果が現れ,弁別力はかえって低下する場合のあることも観察された。また記述形式とマークシート形式との得点の散布図を取ると,対角線を境にマークシート形式高得点側のみに分布するといういわゆる「森田の観察」は,マークシート形式の得点の優位さとマークシート形式得点の天井効果との相乗作用であることも分かった。なお大学入試成績との相関についてはいずれの場合も特に高い相関は認められなかった。一方大学入試の改善のため,高等学校との意思疎通を図る集まりとして,名古屋大学数学教育セミナーを開催し,大学院生をも含む形で交流の場を持った。
傾斜都市域の洪水・土砂氾濫災害の予測と軽減・復興対策に関する研究

1.傾斜都市域の洪水・土砂災害の実態と社会経済的インパクトの分析に関して、神戸地区等の災害の分析により、浸水面積が減少していること、死者・行方不明者の原因として土砂災害が増大していることを明らかにした。また、洪水に伴う都市域の土砂氾濫は、平坦地でも生じていることを実証した。被害の社会経済的影響度の一般的計量化の手法について検討し、計量経済学的なアプロ-チを見出した。2.洪水・土砂流出の極値と生起頻度に関して、任意の降雨条件で発生する土石流の規模予測とその氾濫・堆積の理論を構築し、実例の解析によって検証した。天然ダムの決壊による大規模洪水の発生機構を実験によって調べ、計算モデルを組立てた。3.洪水・土砂氾濫の発生予測と対策の効果に関して、山間の河道での土砂、流木を含んだ洪水の形成と、平野部での氾濫・堆積を一貫して取り扱う実験水路を作成して、実験を進めた。中小河川の護岸被災に関する実験的研究も進めた。自動計測法を考案して使用している。4.市街地における氾濫水の流動、土砂堆積および被害予測に関して、流木の家屋間隙での堰止め機構の実験的研究を行い、堰止め量変化予測式を得た。現地での土砂堆積域の計測のための簡易計測システムを開発した。氾濫流実験用の中立浮遊粒子の開発、高速ビデオシステムによる計測の研究も行った。5.都市災害の時系列的展開と災害復旧の戦略に関して、都市施設の応急復旧、本復旧の経過と方法を実例によって詳細に検討した。6.水害に強い都市システムのあり方と評価に関して、避難シミュレ-ション法を開発し、避難路の設定法を示した。また、土地利用や都市活動の規制・誘導といった長期的かつソフトな対応策を検討するためのリスク分析的アプロ-チを検討した。
ナノ粒子を利用した特異的温度制御による口腔癌治療

HSC3細胞の増殖は37°Cおよび42°Cと比較して、44°C処理で有意に抑制された。温熱処理後12時間における細胞死は、42°Cで5.0%、44°Cで17.4%であった。遺伝子解析の結果では、42°Cの処理において多数の熱ショックタンパク質(HSPs)を含む転写後修飾および蛋白質フォールディングに関した遺伝子ネットワークが存在していた。一方、44°C処理では、細胞周期および細胞死に関連した遺伝子ネットワークが存在した。マイルドハイパーサーミア(MT:40.042.0°C)はアポトーシスを誘導しないが、薬剤併用時には有意にアポトーシスを増強する。またハイパーサーミア(HT:43.045.0°C)は単独でもアポトーシスを誘導する。本研究では、異なる生物学的効果を有するMTとHTにより誘発されるアポトーシス関連因子や遺伝子発現について比較検討を行なった。MT処置では3種類の遺伝子ネットワーク(a.熱ショック蛋白質を含む転写後修飾および蛋白質フォールディングに関する遺伝子群、b.癌、細胞形態、免疫学的疾患に関係する遺伝子群、c.細胞死、肝疾患および遺伝子発現に関係する遺伝子群)を作成することが可能であった。一方、HT処置ではDNAJA1, HSPAIB, HSPA6, HSPH1, HO-1等の熱ショック蛋白質に関連した遺伝子群の変動が著明であった。現在、口腔癌細胞HSC2, 3, 4を用い、アポトーシス誘導は認められるが、細胞死の機序が異なる、42.5°C(low-HT (LHT))による遺伝子発現変化について研究を進めている。HSC3、HSC2細胞の温熱感受性(フローサイトメトリー法)を調べた結果、44°C90分間の温熱ストレスにより約20%の細胞にアポトーシスを誘導することが可能であった。また細胞増殖は48時間で有意に抑制されていた。一方、42°C90分間の温熱ストレスでは、アポトーシス誘導および細胞増殖抑制は著名ではなかった。遣伝子発現状況をDNAマイクロアレイ法により調べた。44°Cでは細胞周期および分子シャペロンにかかわる遺伝子の発現変動が認められた。一方、42°Cでは分子シャペロン、特にHSP70、40を中心とした多数の遺伝子発現の変動が確認された。次年度は、これらのデーターにパスウエー解析ソフトを適用し、各細胞種における温熱感受性に関する遺伝子ネットワータの推定を行う。さらに細胞死に関連したKeyとなる遺伝子に関しては、定量的リアルタイムPCR法を用い本実験系の妥当性を明らかにする予定である。HSC3の細胞増殖は37°Cおよび42°Cと比較して、44°C処理で有意に抑制された。K-means法を用いたクラスター解析では、42°C処理で有意な発現変動を示す遺伝子は9クラスター(cluster 42-IIX)に分類された。cluster 42-Iに属する遺伝子群において多数の熱ショックタンパク質(HSPs)を含む転写後修飾および蛋白質フォールディングに関した遺伝子ネットワークが存在し、これらの働きで温熱による細胞障害が抑制されていると考えられた。一方、44°C処理で有意な発現変動を示す遺伝子は9クラスター(cluster 44-IIX)に分類された。cluster 44-IIIにおいてCDK6(cyclin-dependent kinase 6)を含む細胞周期、およびcluster 44-VにおいてJUN (jun oncogene)やBAG1(BCL2-associated athanogene)を含む細胞死に関連した遺伝子ネットワークが存在した。42°Cでは観察されないこれらの遺伝子ネットワークが機能することにより、細胞障害が誘導されると考えられた。今後、各ネットワークに属する遺伝子の機能や相互作用を詳細に解析し、口腔がん細胞の温熱耐性機序や細胞死誘導機構が明らかにする。また、口腔扁平上皮由来のSAS、HSC2、HSC4においても上記の遺伝子発現パターンの有無を検索中である。
Ｎｏｔｃｈリガンド分子阻害による関節炎抑制機序の解明

関節リウマチ(RA)モデルマウスにおいて、発生に重要なNotchリガンド分子のDelta-like 1(DLL1)を阻害すると関節炎が抑制された。そのメカニズムとして破骨細胞の分化を制御することによる骨破壊の抑制を報告した。この骨破壊抑制機構に加え、DLL1阻害はRA関連の炎症性メディエーターの産生も抑制する可能性を見出した。そこで、DLL1阻害による関節炎抑制機序の全容を解明しDLL1がRA治療の新たな標的分子として有用であるか明確にすることを目的とした。RAモデルマウスおよびRA患者由来の滑膜線維芽細胞においても、マクロファージ上のDLL1が滑膜線維芽細胞上のNotch2を活性化することによりIL-6とMMP-3の産生を増強させること、滑膜組織においてマクロファージと滑膜線維芽細胞は隣接しており実際に相互作用していること、を明らかにした。また、RAモデルマウスにおいて、DLL1阻害によりGM-CSFの産生も抑制された。マウス滑膜線維芽細胞によるGM-CSF産生は検出されなかったが、RA滑膜線維芽細胞によるGM-CSF産生にはDLL1が関与していた。T細胞によるGM-CSF産生とDLL1の関係を明らかにする必要はあるが、DLL1はRA治療の新たな標的分子として有用であると考えられた。関節リウマチ(RA)モデルマウスにおいて、発生において重要なNotch分子のリガンド分子であるDelta-like 1 (Dll1)を阻害すると関節炎が抑制され、そのメカニズムとしてDll1がRA関連炎症性メディエーターの産生に関与している可能性を見出した。そこで、Dll1阻害による関節炎抑制機序の全容を解明しDll1がRA治療の新たな標的分子として有用であるかを明らかにすることを目的とし、RA関連炎症性メディエーターの産生におけるDll1の役割を解析した。RAモデルマウスについては、KxB/Nマウス血清移入による関節炎に加えコラーゲン誘発性関節炎においてもDll1阻害により関節炎が抑制されること、滑膜線維芽細胞はDll1を発現していないがレセプターのNotch1とNotch2を発現し、関節組織マクロファージ上に発現するDll1が滑膜線維芽細胞のNotch2を活性化することによりIL-6とMMP-3の産生を増強させることを確証した。さらに、ヒトの細胞においてもマウス同様Dll1が滑膜線維芽細胞によるIL-6とMMP-3産生に関わっているか検討を行った。RAおよびコントロールとしての変形性関節症(OA)患者由来滑膜線維芽細胞を用いた解析を行ったところ、RA滑膜線維芽細胞のNotch1発現は認められずNotch2のみ発現していた。OA滑膜線維芽細胞においてはNotch2の発現も非常に低かった。またマウス同様Dll1ーNotch2相互作用によりIL-6とMMP-3産生が増強すると考えられた。まず、マウス細胞において詳細な解析を行い、その後ヒトで相同性の確認を行う計画だった。しかしながら、他の研究の都合で、まずこれまでの結果をヒトで確認することにした。計画順序の変更はあったが、ヒトとマウスの解析結果はほぼ同様であり、Dll1がRAにおいてもRA関連炎症性メディエーター産生に関与していると考えられる結果により学会発表に至ったことから、おおむね順調に進展していると評価した。平成27年度は、RAモデルマウスにおいてGM-CSFやプロスタグランジンの産生にNotchリガンドのDelta-like 1 (Dll1)が関与しているかを明らかにする。GM-CSFは主にT細胞やマクロファージから産生される。したがって、脾臓や関節に所在するT細胞やマクロファージを分離し、これらの細胞からのGM-CSF産生にDll1が関与しているか明らかにする。関与が認められない場合は、他の細胞からのGM-CSF産生にDll1が関与しているのかについても検討を行い、関節炎におけるGM-CSF産生とDll1の関係を明確にする。さらに、RAモデルマウス

関節および脾臓より細胞を分離し、Dll1阻害抗体によりプロスタグランジンE2等の産生が抑制されるか解析。抑制が認められれば産生細胞を特定し、プロスタグランジン産生へのDll1の関与を明確にしていく。平成28年度は、RA患者由来細胞においてGM-CSFやプロスタグランジンの産生へのDll1の関与を解析し、マウスとの相同性を確認する。また、RAモデルマウスにおいて、Dll1阻害による辺縁帯B細胞の消失により自己抗体産生が抑制され治療効果に繋がっているか明らかにする。まず、マウス細胞において詳細な解析を行い、その後ヒトで相同性の確認を行う計画だった。しかしながら、他の研究の都合で、まずこれまでの結果をヒトで確認することにした。この実験内容の入れ替えにより助成金の使用額が平成26年度と27年度で入れ替わった。その結果、平成27年度が平成26年度の交付金額より少ないものだったため、次年度に予算が移行した。RAモデルマウスにおいてGM-CSFやプロスタグランジンの産生にNotchリガンドDelta-like 1 (Dll1)が関与しているか明確にする。したがって、RAモデルマウスから種々細胞を分離するために必要な試薬等を購入し、Notch分子の刺激や阻害がGM-CSFやプロスタグランジン産生にどのような影響を及ぼすか解析を行う。
抗腫瘍性物質セスバニミドAの不斉全合成研究

本研究の目的は,新しい反応の開発を通して抗腫瘍物質セスバニミドAの全合成を達成することであったが,その目的をほぼ達成することが出来た.以下に概説する.セスバニミドAの特徴のひとつであるグルタルイミド環を構築するには, α,β-不飽和エステルへのアセトニトリルアニオンの1,4付加反応,ニトリル基のアミド基への選択的加水分解,そして閉環反応の3ステップが最も単刀直入な経路と考えられた.トリメチルシリル化したアセトニトリルのリチル化体を用いると,アセトニトリルの1,2-付加反応性を1,4-付加反応性に転換出来ることを見つけ,短段階グルタルイミド環合成法を開発することに成功した.本反応を用い, D-グルコースから21ステップで天然型セスバニミドAの全合成を達成できた.また,有効なC環形成の単位を光学活性体として不斉合成できる新しい不斉補助剤の設計合成に成功した.すなわち, 5員環ラクタムのγ位にトリチルオキシメチル基を有する光学活性ラクタムから導かれるα,β-不飽和イミドに対する1,4-付加反応, Diels-Alder反応はともに高選択的に進行し,不斉補助剤を除去すると高い光学純度の生成物が得られた.以上概説したように,本研究の当初の目的であったセスパニミドAの合成に成功するとともに新たな位置および立体選択的反応の開発にも成功した.今後,本研究で得られた成果を益々発展させることが楽しみである.本研究の目的は,新しい反応の開発を通して抗腫瘍物質セスバニミドAの全合成を達成することであったが,その目的をほぼ達成することが出来た.以下に概説する.セスバニミドAの特徴のひとつであるグルタルイミド環を構築するには, α,β-不飽和エステルへのアセトニトリルアニオンの1,4付加反応,ニトリル基のアミド基への選択的加水分解,そして閉環反応の3ステップが最も単刀直入な経路と考えられた.トリメチルシリル化したアセトニトリルのリチル化体を用いると,アセトニトリルの1,2-付加反応性を1,4-付加反応性に転換出来ることを見つけ,短段階グルタルイミド環合成法を開発することに成功した.本反応を用い, D-グルコースから21ステップで天然型セスバニミドAの全合成を達成できた.また,有効なC環形成の単位を光学活性体として不斉合成できる新しい不斉補助剤の設計合成に成功した.すなわち, 5員環ラクタムのγ位にトリチルオキシメチル基を有する光学活性ラクタムから導かれるα,β-不飽和イミドに対する1,4-付加反応, Diels-Alder反応はともに高選択的に進行し,不斉補助剤を除去すると高い光学純度の生成物が得られた.以上概説したように,本研究の当初の目的であったセスパニミドAの合成に成功するとともに新たな位置および立体選択的反応の開発にも成功した.今後,本研究で得られた成果を益々発展させることが楽しみである.セスバニイミド1の合成単位4および8を光学的に純粋に新規反応を用いて合成できた。すなわち、分子内軌道相互作用を立体配座固定能の主要因とする2へのビニルグリニヤール反応剤の1,4-付加反応は立体選択的に進行し、3を高い光学純度で与えた。3は合成単位4に能率よく変換できた。また、新規不斉反応剤2は、共役1,4-付加反応ばかりでなく不斉デイールスアルダー反応においても極めて高い不斉誘起能を示すことが分かった。一方、合成単位7の合成も新規1,4-付加反応剤6を組み込んで成功した。すなわち、酒石酸から合成した5に6を反応させると、高収率、高選択的に共役1,4-付加が進行し、7が得られた。トリメチルシリル基による6のHOMO準位上昇効果が有効に実現されたはじめての例である。7は効率よく合成単位8に誘導できた。次に、、8と4の結合形成のモデルとして、8とジチアンリチウム塩との反応を検討した。8とジチアンリチウム塩の反応は通常の条件下では進行せず、8のアルデヒドα位の脱プロトン化が優先した。アルデヒドカルボニル基のLUMO準位低下効果および生成するアルコキシドアニオンの捕捉効果を期待してトリメチルクロロシランの共存下反応を行うと、予想通り目的とする9を得ることに成功した。62年度に8と4による1の基本骨格構築を計画している。
介護予防にむけた社会疫学研究-健康寿命をエンドポイントとする大規模コホート研究

本研究の目的は,介護予防に向けて,心理的因子や社会経済的因子の影響を明らかにする社会疫学の重要性を検討することである.(1)理論研究では,多くの文献をもとに社会疫学の重要性を検討した.(2)大規模調査(回収数39,765,回収率60.8%)を実施した.(3)横断分析では,健診や医療受診,うつなどと,社会経済的因子の関連が見られること,(4)コホート(追跡)研究では,社会経済的因子が,認知症発症や要介護認定,死亡の予測因子であることを明らかにした.本研究により,社会疫学研究が,介護予防においても重要であることを明らかにした.本研究は,健康の社会的決定要因に着目して高齢者の介護予防に向けた科学的な知見を明らかにするものである.社会経済的な格差による「健康格差」が日本にも見られること,生活習慣だけでなく心理的・社会的因子も不健康の危険因子であることを報告してきた.具体的には,高齢者約4万人の大規模データを活用し,コホート研究や国際比較研究などを通じて, (1)生活習慣のみならず,「うつ」など心理的因子,「閉じこもり」や「家族関係・社会ネットワーク」「所得」「教育歴」など社会経済的因子が「健康寿命の喪失(要介護状態+死亡)」の危険因子であることを明らかにすること,(2)その影響プロセスの解明に迫ること,(3)個人レベルの社会経済的因子だけでなく社会関係資本(ソーシャル・キャピタル:地域における信頼感・互助性の規範,ネットワークの豊かさ)など,コミュニティレベルの因子も関連していることを検証することを目指すものである.本研究は,「健康な社会」や「ポピュレーション・ストラテジーに基づく介護予防政策」の開発を志向した社会疫学的な基礎研究である.本研究の目的は,介護予防に向けて,心理的因子や社会経済的因子の影響を明らかにする社会疫学の重要性を検討することである.(1)理論研究では,多くの文献をもとに社会疫学の重要性を検討した.(2)大規模調査(回収数39,765,回収率60.8%)を実施した.(3)横断分析では,健診や医療受診,うつなどと,社会経済的因子の関連が見られること,(4)コホート(追跡)研究では,社会経済的因子が,認知症発症や要介護認定,死亡の予測因子であることを明らかにした.本研究により,社会疫学研究が,介護予防においても重要であることを明らかにした.2006年度は,主に4つの面で研究を推進した.1.2000年がベースラインのA町コホート研究2000年にA町で行った一般高齢者調査をベースラインデータとするコホート(2340人)を対象に,認知症の発症(予防)をエンドポイントとした縦断分析を行い発表した.その結果,歩行や健診受診などより,心理・社会的因子の方が,認知症発症(予防)のオッズ比が大きいことが判明した.2.3.3万人の大規模調査のベースラインデ-タの横断分析2003年に15自治体で実施した一般高齢者調査の3.3万人のデータを横断分析し,「検証『健康格差社会』-介護予防に向けた社会疫学的大規模調査」(医学書院,2007)を出版した.検討した多くの心理・社会的因子において,健康格差があることが明らかとなった.その知見に基づき,介護予防政策への示唆を論じた.3.約3万人の大規模コホート追跡調査上記2の調査に参加した自治体に対し調査結果の報告会を開催するとともに,2006年度調査への協力を求めた.協力を得られた10自治体を対象に,追跡調査を実施した.また,2003年度以降の要介護認定データの提供を受けた.現在,これらのデータの整理中である.4.文献研究社会経済的因子の影響を踏まえた介護予防政策の手がかりについて,海外の文献を中心にレビューを進めた.その成果は「保健師ジャーナル」誌(医学書院)において現在連載中である.なお,年度当初に計画していた日韓比較研究については,別の研究費(COEプログラム)が得られることになったため,そちらで実施した.本研究の目的は,介護予防において,喫煙,飲酒,運動などの生活習慣だけでなく,心理的因子や社会経済的因子が「健康寿命の喪失(要介護状態+死亡)」の危険因子として重要であることを明らかにし,社会階層間に見られる健康格差への対策の手がかりを探ることである.(1)データベースの整備本科研費によって2006年度調査を実施できたことによって,1999年度および2003-2004年度調査データと一部結合可能な大規模なデータ(4万弱)が収集できた.本年度は,データクリーニングとコードブックの作成,調査データ並びに追跡データ(保険者から提供を受ける要介護認定・死亡データ)結合作業を進め,コホート研究などの本格的な分析の準備を整えた.(2)データの分析・発表研究協力者を増やし,ほぼ月に1回の研究会で分析結果を報告し,集団的に検討し,国内外の学会発表や論文執筆を進めた.アメリカ公衆衛生学会では,2年連続で学術賞を受賞した.査読つき論文を6本(うち英語論文1本)発表した.それらの中で,社会経済的階層が低い層でうつ,認知症,閉じこもり状態,要介護状態や死亡が多いことなどを,(一部はコホート研究によって)明らかにした.(3)地域レベルの因子の研究地域レベルの因子に関わる分析として,主にソーシャルキャピタルについての研究を進め,その蓄積には地域の歴史が関与していることを明らかにした.

(4)政策への応用に向けた理論研究主にヨーロッパなどでの政策動向や韓国の敬老堂について紹介し理論研究を進めた.それらによって,社会疫学の政策への応用可能性を明らかにした.平成20年度も,ほぼ月1回の研究会を行い,下記の研究を進めた.(1)「コホート分析ある一時点の所得など社会経済的因子と要介護状態認定割合などの関連を分析する横断分析では,低所得が要介護状態の原因なのか,もともと障害などがあったので低所得に留まったのか,因果関係の方向が分離できない.そこで2003年度と2006年度に実施した大規模調査のデータと,その後の追跡データを結合したデータベースを作成し縦断分析を進めた.その結果,介護保険料区分で所得段階を分け,約2.8万人の4年間の死亡と要介護認定について追跡した。このコホート分析によって,男性の最低所得層では,最高所得層に比べ死亡率や要介護認定を受ける割合が2-3倍も高い健康格差があることなどを明らかにした.学会発表したこの内容は注目を集め,マスコミ等でも取り上げられた.その他,閉じこもり状態やうつ,ストレス対処能力,歯科保健,認知症などに関する分析結果を国内外の学会・雑誌に発表した.このうち学会報告した4演題について,優秀ポスター賞や若手研究者賞を受賞した.(2)地域レベルの因子の研究地域レベルの因子に関わる分析として,人口密度が低い地域に「閉じこもり」が多いこと,ソーシャル・キャピタル(社会関係資本)が乏しい地域に暮らす高齢者に健康状態が良くない者が多いこと,相対的な社会的な位置が低い人で健康指標が悪い傾向があることなどについて報告した.個人レベルの因子だけでなく,地域レベルの因子も,健康指標と関連していること,つまり個人を対象とした支援策だけでなく,地域レベルの対策があり得ることなどを実証的に明らかにした.(3)政策への応用に向けた理論研究疾患や要介護リスクと社会経済的因子との関連に関する文献レビューを進めた他,ヨーロッパ諸国の政策動向を紹介しながら「社会政策研究」誌に格差論に関する論文を公表した.本研究の目的は,介護予防に向けて「健康の社会的決定要因」を明らかにすることであった.1.横断分析:最長職業が管理職であった者に比べ販売サービス職で合った者では,退職後2.5倍も状態が多いことなどを明らかにし学会報告した.その成果は新聞報道された.2.コホート研究:2003年調査データをベースラインとし,9702人を3年間追跡した.その結果,多くの健康の社会的決定要因の要介護認定のオッズ比が有意に高いことが判明した。例えば,男性の要介護認定のオッズ比を見ると,教育年数が6年未満で2.62,友人に会う頻度が月に一回未満で1.45などであった.認知症をエンドポイントとした分析では,趣味の中でも園芸やスポーツ的な趣味が,有意に認知症予防に良いことが明らかとなった.3.コミュニティレベル因子の研究:個人の社会経済的な要因を考慮しても,地域レベルのソーシャル・キャピタルやGini係数がそこに暮らす高齢者の健康に関連をしていることを日本で初めて実証した.また,ソーシャル・キャピタルやその構成要素である社会的ネットワークの垂直型と水平型の二つのタイプのうち,水平型が残歯数と有意な関連を示すことを検証した.また,所得が同じでも,同年齢同学歴など似たグループ内における相対的な位置が低い者ほど,要介護認定を受けやすいことも検証した.介護予防を志向したソーシャル・キャピタル理論を基礎とした介入研究を進め,その効果が中間アウトカム指標において見られることを検証した.
皮膚癌におけるヒト乳頭腫ウイルスと癌抑制遺伝子変異との関係の解析

皮膚悪性腫瘍の生組織あるいはパラフィン切片よりDNAを抽出し、HPVについてはコンセンサスプライマーを用いたpolymerase chain reaction(PCR)法によりDNAを増幅し、RsaI・DseI・HaeIIIの各制限酵素による切断パターンによりHPVのtypingを決定した。またin situ hybridization法によりタイプ別のHPV-probeを用いてその組織内でのHPV-DNAの局在を検討した。p53については生組織あるいはパラフィン切片よりDNAを抽出し、PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism)法によりp53のExon 4,5,6,7,8の各領域についてそのmutationの有無を検討し、またp53のポリクローナル抗体(DO-7)を用いて免疫組織学的染色を施行した。
水素処理法による生体用チタン合金の粉末作製および高機能化プロセスの開発

申請者らは種々の金属材料が水素雰囲気中に保持することにより自己崩壊的に粉末化する現象を粉末作製プロセスに応用することを提案してきた。本プロセスにより得られる粉末は、粉末粒径が微細となること、不純物濃度の低いこと、低エネルギーかつ低コストであることなどの様々な優位性をもち、生体用TiもしくはTa粉末製造プロセスとして理想的なものの一つと期待できる。本年度では、水素処理を利用した粉末作製プロセスの確立を目指し、種々の水素処理プロセスにともなうTaの破壊挙動、および組織変化を調査する。さらに、得られた結果をもとに水素処理プロセスを利用した微細Ta粉末の作製を試みる。再結晶等軸粒組織を有するφ5mmx1mmのディスク状Ta試験片(純度99.996%)を4種類の水素処理プロセスに供した。粉末形態および組織変化を調査するため、水素処理後の試料について、光学顕微鏡、走査型電子顕微鏡による観察を行なった。また水素処理前後での構造変化を調べるため、X線回折解析による構造解析を行った。破砕性を評価するために、水素処理粉末をボールミリングに供し、レーザー式粒度分布測定器により粉末粒径を測定した。水素雰囲気中で1473Kに保持後、室温まで冷却するプロセスではTa試験片に結晶粒界に依存しない円周状のクラックがみとめられる。一方、水素雰囲気中で1473Kで保持後、冷却時の雰囲気をArに置換したプロセスでは組織変化および破壊は起こらないことから、水素雰囲気中での冷却過程でクラックが導入されると考えられる。Taは低温ほど多量の水素を固溶し、334K以下で水素化合物を形成するが、水素化合物を形成させないプロセスでは破壊は起こらない。これから、クラック導入は水素化合物の形成が関与すると考察される。高温保持後の低温保持温度T_Dを変化させたプロセスでは、T_Dが低温ほどクラックの発生頻度が顕著となり、破砕性も向上する。また、Taは低温ほど多量の水素を吸収し、それにともない格子膨張および水素化合物の形成が顕著になる。これらは試料内部にひずみを導入させ、破壊を促進させる。以上より、水素処理プロセスを最適化することにより、Taの自己崩壊性、粉砕性を向上させることが可能となる。水素処理したTaは数分のミリングでサブミクロンオーダーの微細粉末となり、脱水素処理により極めて不純物濃度の低い粉末となる。水素処理による粉末化現象はTaのみならず、Ti、Nb、およびそれらの合金でも認められる。また粉末化機構もほぼ同様であることを確認した。本年度に得られた知見より、生体用材料として期待されている各種合金の原料粉末を高品質に作製できる可能性が見出された。
ミトコンドリア遺伝子異常症の細胞学的な病態解析

ミトコンドリア遺伝子異常症では組織内に変異遺伝子がヘテロプラスミ-に存在し、その割合が発症発現に関わる因子である。疾患スペクトラムが拡がった本疾患において変異mtDNAが増幅して患者を形成する機構の解明が重要である。これまでの解析にはすべて細胞集団が用いられてきたが、すべての細胞が同じ動態をとるとは考えられず、1細胞レベルでの解析が重要と考えられる。本研究はミトコンドリア遺伝子異常症であるLeber病(LHON)患者の末梢リンパ球をSingle-cell PCR法で検討した。その結果、本患者においてはリンパ球25細胞中21細胞は変異mtDNAのホモプラスミ-または正常mtDNAのホモプラスミ-にmtDNAが分配されていた。したがってこの患者の末梢リンパ球におけるヘテロプラスミ-はそのほとんどが細胞内ホモプラスミ-、細胞間ヘテロプラスミ-に由来し、リンパ球においては正常、変異両方向への細胞内ホモプラスミ-になるようにmtDNAが分配されていると考えられた。またMELAS(Mitochondrial encephalopathy,myopathy,lactic acidosis and stroke-like episodes)患者の末梢リンパ球においてはすべての細胞がヘテロプラスミ-に変異遺伝子を有していた。しかし、その割合は細胞毎に異なり幅広く分布し、segregationはされていなかった。SV-40でトランスフォームし、クローン化した培養筋細胞では細胞集団としてほとんどが(95%以上)正常遺伝子あるいは変異遺伝子とホモプラスミ-に近い状態になっていた。培養期間の異なる各クローン化細胞を50細胞ずつ1細胞解析したがヘテロプラスミ-を示す細胞や、細胞集団と異なる遺伝子をホモプラスミ-に持つ細胞は見いだせなかった。95%の正常遺伝子をもつクローン化細胞を培養を継続するとほぼ変異遺伝子のホモプラスミ-を示す細胞集団へと急激に変化した。以上の研究よりミトコンドリア遺伝子異常症の患者のリンパ球では細胞内ヘテロプラスミ-であるが、クローン化した培養細胞では細胞内ホモプラスミ-に近い状態にsegregationされており、正常ホモプラスミ-に近い状態を示すクローン化細胞内にわずかに残る変異遺伝子は培養を継続することで複製されやすいと考えられた。細胞内ヘテロプラスミ-を示すMELAS患者リンパ球は細胞培養にてクローン化することができなかった。今後は、ミトコンドリアに直接遺伝子を導入する方法(遺伝子銃)を用いて細胞内ヘテロプラスミ-を示すリンパ球の作成が必要と考えられたミトコンドリア遺伝子異常症では組織内に変異遺伝子がヘテロプラスミ-に存在し、その割合が発症発現に関わる因子である。今後は、ミトコンドリアに直接遺伝子を導入する方法(遺伝子銃)を用いて細胞内ヘテロプラスミ-を示すリンパ球の作成が必要と考えられたリンパ球、及びクローン化筋細胞についてmicromanipulation法で1細胞を単離し、1細胞のmtDNA解析を行う方法を確率し、3243変異をもつMELAS患者の1細胞の変異mtDNAを定量した。リンパ球ではいずれの細胞も細胞内へテロプラスミ-を示したが、変異mtDNA割合は一定ではなかった。これはLeber病の患者リンパ球での結果と異なっており、mtDNA変異の細胞障害性の程度の差による可能性が考えられた。クローン化した筋細胞はクローン化した時点で細胞集団としてほぼ正常あるいは変異mtDNAのホモプラスミ-となっていた。1細胞解析では僅かな割合で含まれる他の一方のmtDNAのホモプラスミ-とする細胞は見だせなっかった。

正常mtDNAを圧倒的に多く含むクローン化細胞は通常の培養条件下で継代を繰り返すことで変異mtDNAのほぼホモプラスミ-へと変化した。変異mtDNAが選択的に増幅されていると考えられるが、どのような経過をたどって変化したかは不明で、今後解析する細胞数を増やし、また影響を及ぼす因子についても検討する予定である。ミトコンドリア遺伝子異常症では組織内に変異遺伝子がヘテロプラスミ-に存在し、その割合が症状発現に関わる因子である。疾患スペクトラムが拡がった本疾患において変異mtDNAが増幅して患者を形成する機構の解明が重要である。これまでの解析にはすべて細胞集団が用いられてきたが、すべての細胞が同じ動態をとるとは考えられず、1細胞レベルでの解析を行うことを目的とした。MELAS患者のリンパ球を1細胞に分取し、PCR法によりmtDNAを増幅し制限酵素で切断後、変異遺伝子の定量を行った。リンパ球においてはすべての細胞がヘテロプラスミ-に変異遺伝子を有していたが、その割合は細胞毎に異なり幅広く分布し、segregationはされていなかった。SV-40でトランスフォームし、クローン化した培養筋細胞では細胞集団としてほとんどが(95%以上)正常遺伝子あるいは変異遺伝子とホモプラスミ-に近い状態になっており、培養期間の異なる各クローン化細胞を50細胞ずつ1細胞解析したがヘテロプラスミ-を示す細胞や、細胞集団と異なる遺伝子をホモプラスミ-に持つ細胞は見いだせなかった。95%の正常遺伝子をもつクローン化細胞を培養を継続するとほぼ変異遺伝子のホモプラスミ-を示す細胞集団へと急激に変化した。以上よりMELAS患者のリンパ球ではintracellular heteroplasmyであるが、クローン化した培養細胞ではintracellular homoplasmyに近い状態にsegregationされており、正常ホモプラスミ-に近い状態を示すクローン化細胞内にわずかに残る変異遺伝子は培養を継続することで複製されやすいと考えられた。変化が急激であったので、培養の過程で正常及び変異遺伝子をほぼ半々に持つクローン化細胞を得られず変化の過程を1細胞レベルで解析することは出来ず今後の課題である。
光受容関連分子と光受容膜の構造と機能の研究

1.光化学系II複合体の構成成分で、葉緑体ゲノムにコードされている新しいタンパク質を精製し、その性質をしらべた。またその遺伝子をpsbkと命名した。2.光化学系II複合体において反応中心を形成するタンパク質成分Dlタンパク質は、カルボキシ末端側でプロセスされて前駆体から成熟タンパク質になる。本研究によってこのプロセシング部位が決定され、またこのプロセシングに関与する酵素の部分精製と、その性格つけもおこなわれた。3.光化学系II複合体の表存性33KDaタンパク質をプロテアーゼによって限定分解し、得られたタンパク質断片の性質を調べた。その結果、アミノ末端の約15個のアミノ酸残基が複合体との結合のドメインを形成していることがわかった。またこの33KDaタンパク質は極めて容易に可逆的な変性をうけるタンパク質であることがわかった。4.紅藻類の光補集性色素タンパク質複合体を結晶化し、そのX線回析法による構造解析を開始した。また光合成細菌の光補集性バクテリオクロロフィルータンパク質複合体の形成には、カロチノイドの存在が必須であることを明らかにした。5.エンドウおよびアベナの膜ノィトクロム画分を化学架橋剤で処理すると、高分子量の架橋複合体が生成することを明らかにした。6.ニワトリの色覚タンパク質のアィオドプシンを精製した。さらにそのモノクロナル抗体を調製した。