hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
癌転移の骨破壊に対するIL-18の抑制作用の検討および臨床応用

この骨転移モデルを用いて、IL-18の骨破壊性転移に及ぼす影響を検討し、IL-18は乳癌、肺癌、多発性骨髄腫株の骨破壊性転移を抑制する事を明らかにした。現在、IL-18の骨破壊性転移抑制の機構を明らかにするために、IL-18の破骨細胞数、腫瘍のアポトーシス、細胞分裂に及ぼす影響を検討中である。1)IL-18による破骨細胞活性抑制の機序に関する研究我々はIL-18が、破骨細胞活性を抑制するin vivoの成績を報告した。本研究では、IL-18が破骨細胞活性の抑制機序に関して、IL-18単独及びIL-12併用による影響をin vitroで検討した。その結果より、以下のことが明らかとなった。1)IL-18単独では、1000mg/ml以上でのみ破骨細胞活性を抑制する。一方、IL-12を10ng/ml添加することで、10ng/mlのIL-18でも破骨細胞活性を約80%抑制する。2)IL-18とIL-12との併用による破骨細胞活性に対する抑制効果は、培養液中のIFN-γ中和抗体で完全に消失する。しかし、IFN-γを培養液へ添加しても破骨細胞活性は抑制されない。3)IL-18受容体、そのシグナル伝達に関与するMyD88蛋白が破骨細胞に存在する。以上より、IL-18はIL-12と協調して破骨細胞活性を抑制する。その詳細な機序に、IFN-γのみならず、未同定因子の協調が関与していると考えた。2)IL-18による多発性骨髄腫の治療に関する研究IL-18は、転移性骨腫瘍の骨破壊を抑制すると共に、幾つかの腫瘍に対して抗腫瘍作用を有する。多発性骨髄腫は、骨破壊を来たす造血器悪性腫瘍であり。我々は、スキッドマウスの尾静脈からヒト多発性骨髄腫細胞株(ARH-77)を注射し、脊椎椎体に転移させる実験系を確立した。このモデルを用いて、IL-18は多発性骨髄腫の骨破壊を抑制すると共に、その腫瘍浸潤に対しても抑制的に作用することを事を明らかにした。以上より、IL-18による多発性骨髄腫の治療に発展できる成果を得た。
高校生に対するグラフィックオーガナイザーを活用した英文要約指導の効果

本研究では、高校3年生を対象としてグラフィックオーガナイザーを活用した英文要約指導を行った。先行研究より、要約文作成には、要点の把握、要旨の理解、情報の整理と表現という3つの過程が含まれることを確認した後、対象生徒(105名)の躓きを明らかにすべく、調査Iとして、要約文に対する読解力、テキストの難易度、使用される読解方略の影響について分析した。難易度の設定は日本英語検定協会が公開している準1級と準2級の問題文を使用することで行い、要約文での使用言語は日本語とした。分析結果より、1)高校段階における要約文作成ではボトムアップ処理が順調に進むかが大きく影響しており、生徒の読解力が低い場合、また生徒にとってテキストが難しすぎる場合には要点の読み取りや要旨の理解が困難となる、2)個々の情報の読み取りはできても、要旨を踏まえた上での取捨選択に失敗する生徒もあるため、文章の全体像を意識させる指導が必要である、の2点が明らかとなった。調査IIでは、このうちの1クラス(27名)を対象としてさらに英文での要約文作成を求め、その結果、上記の課題に加えて、本文の表現をつなぎ合わせた不自然な要約文になるという課題を確認した。これらの課題に対処すべく、グラフィックオーガナイザーの1つであるコンセプトマッピングを使用して文章の全体像を掴んでから要約文を作成すること、言い換え表現を用いて情報を圧縮することの2点に焦点化した授業を行った。授業の前後で書かれた英文要約をYamanishi, Hijikata and Ono(2013)により作成されたルーブリックを用いて採点したところ、要約文の全体的な得点に上昇が見られた。さらに、評価項目ごとの得点変化では「言い換え」において上昇が見られた。高校生の英文要約における課題を明らかにし、短期間の指導でも要約文の質を上げられる可能性を示したことが本研究の意義である。
生体部分肝移植の予後決定因子の解明と予後予測モデルの構築についての研究

成人生体肝移植における予後予測因子の検討について・・・MELD scoreは米国での脳死肝移植のwaiting listの登録に用いられて、脳死肝移植後の成績と相関すると報告されている。一方、成人生体肝移植においては、まだ、議論の別れるところであり、その有用性の検討が待たれている。今回、成人生体肝移植症例でのMELD scoreおよび、その他の術前因子と術後90日の移植成績について検討を行った。以上の結果よりMELD score 25未満では、上記危険因子は術前もしくは術中に改善可能であり、25【less than or equal】MELD Scoreでは、術前に改善できないレシピエントの状態自体が危険因子であることから移植時期がもっとも重要であると考えられた。
ジェンダークオータの政治学ーー制度化と抵抗

本研究は、議会のジェンダー公平な代表性を確保するために導入されたジェンダー・クオータ(女性候補者割当制)の効果と女性の政治的代表性に及ぼす影響を韓国の事例により分析する。韓国は、2000年代前半から女性議員を増やすために政党の候補者の一定割合を女性に当てるクオータ制度を導入したが、15年が経た現在も女性議員は20%に至らず、現行クオータ制度に疑問が呈されている。本研究は、過去15年間の政党別選挙データ及び政党関係者や女性議員への聞き取りを通じて、クオータの実施状況、クオータで当選した女性議員のキャリアパス、政党の公認過程を分析し、クオータ導入後に現れたクオータ・バッシングの諸相を明らかにする。
神経細胞死におけるグリア細胞関与の分子病理機構の解明

本研究ではグリア細胞の神経細胞死への関与を明らかにするためにヒト神経変性疾患の患者剖検脳を対象に免疫組織化学的手法を用いて異常タンパク蓄積と組織障害との関連について検討を行った。対象は進行性核上性麻痺(PSP)、大脳基底核変性症(CBD)、嗜銀球を伴うピック病(PiD)、多系統萎縮症(MSA)である。結果:1)PSP7例において、PHF-tauとMAP-2、EAAT-1の免疫産物密度は負の、また、CD68、GFAPは正の相関を示した。PSPの神経細胞傷害はタウの蓄積用量依存性ではないと考えられた。2)PSP6例、CBD4例、加齢老人3例の海馬において、PSPと加齢老人では内嗅領と錐体細胞層に神経原線維変化とthreadsを、CBDでは白板と網状層にthreadsを認めた。さらに歯状回分子層にtau陽性grainを認めた。PSPの海馬タウ病変は加齢変化に類似していたが、CBDでは疾患特異的であると考えられた。3)PiD5例でcatalyzed reporter deposition法を用いてタウ病変を検討した。灰白質のタウ沈着に加え、皮質下白質にタウ陽性のthreads様構造とオリゴデンドロサイト内の嗜銀球様の封入体が観察された。PiDでは細胞体に加え皮質白質の軸索内のタウ沈着の可能性が考えられた。4)MSA13例において、活性型ミクログロアと錐体外路系と小脳出力系の組織障害との相関が高くGCIとの相関も認められた。活性型ミクログロアは神経路変性に関与している可能性が示唆された。5)MSA6例において、GCIに14-3-3とαsynucleinの共存が認められ、14-3-3の陽性率は40から90%の陽性率であった。14-3-3標識率と神経組織の障害スコアーの間には負の相関が認められた。14-3-3がαsynucleinの封入体内凝集に関与している可能性が示唆された。[目的]進行性核上性麻痺(PSP)における異常タウの組織蓄積と神経グリアの組織傷害の関連を推察するために、免疫組織化学により神経グリアと神経組織傷害のマーカーを用いて、タウ蓄積との相関を検討した。[対象と方法]対象は大脳に老人斑が存在しないことを確認した臨床病理学的に典型的なPSP剖検脳7例(死亡時年齢73.7歳;男3例、女4例)である。ホルマリン固定後、標本は型のごとく作成し,次の部位を含む標本を選定した。上前頭回皮質、皮質下白質、島回、被殻、淡蒼球内節、内包後脚、視床下核、視床内側核、小脳皮質、皮質下白質、小脳歯状核。次いで一般染色に加え以下の一次抗体による免疫組織化学染色を行った。CD68,excitatory amino acidtransporter 1(EAAT-1)、GFAP、MAP-2、myelin basic protein(MBP)、neurofilament protein、PHF-tau。なお、MAP-2は皮質樹状突起および胞体、NFPは白質軸索、EAAT-1、GFAPはastrocyte、CD68はmicroglia、MBPはoligodendrocyteのマーカーとして用いた。

画像解析には対物20倍のレンズを使用、CCDカメラを介して対象領域の各10視野をコンピューターに取り込み,画像解析ソフト(MacScope)により免疫反応産物の密度を算出した。ついで対象領域ごとに得られた数値について推計学的検定を行った。[結果および考察]PHF-tau免疫産物密度とMAP-2、EAAT-1の免疫産物密度は、負の相関を、また、CD68、GFAP免疫産物密度は正の相関を示したが、相関係数は低かった。特に、淡蒼球内節、視床下核、小脳歯状核においてはPHF-tau免疫産物密度と組織傷害のマーカーの間にはほとんど相関がなかった。以上より、PSPの神経細胞傷害は異常タウの蓄積用量依存性ではない可能性が示唆され、神経細胞死の機構に異常タウ蓄積以外の要因を考慮する必要が考えられた。進行性核上性麻痺(PSP)および大脳基底核変性症(CBD)は、近年類縁のタウオパチーと考えられているが、一般的には臨床病理像は大きく異なる。両疾患の海馬におけるタウ病変の相違を明らかとするために、免疫組織化学的検討を行った。[対象と方法]対象は、海馬にタウ病変を認め、かつ老人斑を欠いた臨床病理学的に典型的なPSP6例、CBD4例である。対照として加齢老人脳3例を用いた。ホルマリン固定パラフィン包埋切片に一般染色およびGallyas染色と、以下の一次抗体を用いてLSAB法により免疫組織化学染色を行った。PHF-tau(AT-8)、synaptophysin、alpha-synuclein、ubiquitin、MAP-2。[結果]PSPにおいては、1)内嗅領と海馬CA1錐体細胞層に少量から中等量の神経原線維変化とthreadsを認めた。2)2例で海馬白板に少量のcoiledbodyとthreadsを認めた。3)歯状回顆粒細胞層および多型細胞層にごく少数のtau陽性細胞を認めた。4)以上の所見は対照例の所見とほぼ合致していた。CBDにおいては、1)内嗅領に少量の、CA1錐体細胞層に多量のthreadsを認め、さらに両部位で少量から中等量のpretangleを認めた。2)海馬白板と網状層に多量のcoiledbodyとthreadsを認めた。3)顆粒細胞層および多型細胞層に中等量のtau陽性細胞とthreadsを認めた。4)歯状回内側分子層に中等量のtau陽性で一部ubiquitin陽性のgrain様顆粒を認めた。この領域にはthreadsは少なかった。5)顆粒細胞層および多型細胞層のMAP-2染色性が高度に低下していた。6)両疾患においてsynaptophysinとalpha-synucleinの染色態度は対照例と差がなかった。[考案]PSPの海馬においては、タウ病変は加齢変化に類似していると考えられたが、CBDの海馬においては、グリア病変を含めタウの沈着様式が加齢変化とは異なり、CBDに特徴的である可能性が考えられた。[目的]ビオチン化タイラマイドによる高感度増感法(catalyzed reporter deposition ; CARD法)を用いて、ピック病のグリア細胞のタウ病変について免疫組織化学的に再検討を行った。[対象と方法]嗜銀球を有するピック病の5剖検例を用いた。前頭葉、側頭葉、海馬のホルマリン固定パラフィン包埋切片を型のごとく作成、一般染色および抗PHFタウ抗体(AT8)による免疫組織化学染色を行った。さらに、アストロサイトを同定するために、CARD法(DAB発色)とアルカリフォスファターゼ
Web上の活動を再現する学習プロセス共有型e-learningシステム

本研究の目的は、"Web上の活動を再現する学習プロセス共有"というWeb教材化の新しいアプローチを採用するe-learningシステムを開発し、その効果を検証することである。本年度は、Web上の活動を再考し、これまでに実装したサブシステムを改良した.そして、サブシステムを統合したe-learningシステムを構成するための基盤整備を行うとともに、効果を検証するためにサブシステムめ評価を行った。(1)サブシステムの改良これまでのサブシステムの試用を通じてWeb上の学習活動を再考し、Webページの"比較"と"適用"が高い学習効果をもたらすと結論付けた。この比較と適用を"多観点思考(Multiperspective Thinking)"と呼ぶ。多観点思考を支援・促進するよう、学習プロセス共有サブシステムと検索支援サブシステムを改良した。(2)統合e-learningシステムの基盤整備サブシステムを統合するための基盤整備として、統一的な認証機能、XMLによるデータの蓄積・共有機能を実装した。(3)サブシステムの評価学習プロセス共有サブシステムの試用実験を行い、比較と適用を促進・支援することが理解の深化や興味の拡大につながるというデータを得た。検索支援サブシステムの試用実験を行い、実現した検索方式ならびに検索結果表示方式が比較と適用を支援・促進するというデータを得た。(4)成果報告国際会議、論文誌等で成果報告を発表した。平成16年度は,学習プロセス共有型e-learningシステムの設計と実装を中心に研究を進めた.(1)学習プロセス共有に向けたシステムの機能分析と設計開発済み情報共有型e-learningシステムを拡張して学習プロセス共有型e-learningシステムを開発するために,前システムからの機能継承を考慮して新システムの機能分析と設計を行った.具体的には,(1)他学習者の学習プロセスを吟味してその吟味内容から知識を構成することが重要であると考え,他学習者のアノテーションに対してアノテーションを加えることができる機能を設計した.(2)Web閲覧を起点とした電子メールコミュニケーションの内容から知識を構成することが重要であると考え,電子メールの関係(構造)を整理しやすくする機能(Webメーラ)を設計した.(3)学習者が学習プロセスを振り返って知識を再構成することが重要であると考え,学習プロセスを可視化・修正できる機能を設計した.(4)学習プロセスをWeb教材として利用することを検討し,オーサリング機能を設計した.(2)学習プロセスデータ形式の検討と決定SCORMやLOMといった教材の標準規格を参考にして,他システムとの親和性の高いデータ形式を決定した.(3)資料収集のために国内研究会等へ参加国内研究会に参加して研究に関する資料を収集した.(4)クライアントツールの開発(1)で設計した各機能のクライアント部分を実装した.(5)サーバ処理機構の開発Web上の活動を再現するサーバ処理機構(活動履歴の蓄積等)を開発し,クライアントツールと連携させた.(6)中間成果報告のために国内研究会等へ論文投稿・参加国際会議(2件),国内研究会(3件)において研究の中間成果を発表した.平成17年度は,学習プロセス共有型e-learningシステムの実装を中心に研究を進めた.(1)学習プロセス共有型e-learningシステムの実装平成16年度に設計した学習プロセス共有型e-learningシステムを実装した.(1)他学習者の学習プロセスを吟味してその吟味内容から知識を構成することが重要であると考え,他学習者のアノテーションに対してアノテーションを加えることができる機能を実装した.(2)Web閲覧を起点とした電子メールコミュニケーションの内容から知識を構成することが重要であると考え,電子メールの関係(構造)を整理しやすくする機能(Webメーラ)を実装した.(3)学習者が学習プロセスを振り返って知識を再構成することが重要であると考え,学習プロセスを可視化・修正できる機能を実装した.(4)学習プロセスをWeb教材として利用することを検討し,オーサリング機能を実装した.(5)Web閲覧を支援するWeb検索システムを実装した。(2)学習プロセスデータ形式のLOM・SCORMへの準拠学習プロセス,学習プロセスを組み込んだWeb教材をSCORMやLOMといった教材の標準規格で表現した.(3)資料収集のために国内研究会等へ参加国内研究会に参加して研究に関する資料を収集した.(4)プロトタイプシステムの評価実装したシステムの評価を行った.(5)中間成果報告のために論文誌,国内研究会等へ論文投稿・参加論文誌(1件),国際会議(4件),国内研究会(1件)において研究の中間成果を発表した.本研究の目的は、"Web上の活動を再現する学習プロセス共有"というWeb教材化の新しいアプローチを採用するe-learningシステムを開発し、その効果を検証することである。(3)サブシステムの評価

学習プロセス共有サブシステムの試用実験を行い、比較と適用を促進・支援することが理解の深化や興味の拡大につながるというデータを得た。検索支援サブシステムの試用実験を行い、実現した検索方式ならびに検索結果表示方式が比較と適用を支援・促進するというデータを得た。(4)成果報告国際会議、論文誌等で成果報告を発表した。
植物の抵抗性系統のスタッキングによるカビ毒産生菌に対する防除戦略の確立

植物病原糸状菌であるムギ類赤かび病菌は、作物に減収だけでなくかび毒汚染による質的な被害をもたらす。本研究では、本菌に罹病性のシロイヌナズナを用いて、植物の抵抗性やかび毒解毒に関わる候補遺伝子の発現を改変させた形質転換体を解析し、抵抗性を顕著に向上させる2遺伝子、かび毒を低減化させる2遺伝子を同定した。これらの遺伝子を効果的に組合せることで、赤かび病による病徴とかび毒蓄積を共に低減化し得る植物の作出が期待された。シロイヌナズナの赤かび病抵抗性植物のスタック系統の作出:赤かび病抵抗性に関わる代謝物を同定する過程で、ニコチンアミドモノヌクレオチド(NMN)が植物の抵抗性誘導性に関与することを新たに見出した。また、NMNの生合成に関わるNMNAT遺伝子の過剰発現株が、赤かび病菌に対して、葉及び花で非常に強い抵抗性を示すことを明らかにした。新たに進展抵抗性に示すNMNAT過剰発現株を加えて、同じく抵抗性を示すubq6/6*変異体と侵入抵抗性を示すTHI2.4遺伝子の過剰発現株の間での2重スタック系統の作出を進めている。かび毒低減化遺伝子の解析:赤かび病菌が産生するトリコテセン系かび毒を低減化の候補遺伝子として、かび毒の細胞外排出に関わるGST13遺伝子の高発現株を作製した。GST13過剰発現株は、トリコテセン系かび毒であるデオキシニバレノール(DON)に低感受性を示し、赤かび病菌接種時にはDON蓄積量が野生株に比べて顕著に低下することを明らかにした。また、還元型グルタチオン供給に関わるGR2遺伝子についても過剰発現株を作成中である。さらに、GST13過剰発現株と上記の抵抗性系統とのスタック系統を作成を進めている。UBQ6/6*による赤かび病抵抗性の制御機構の解析:UBQ6/6*は、ユビキチンドメインを有するリボソームタンパク質であるが、これらの二重変異体が、非常に強い侵入抵抗性を示すことを明らかにした。また、うどんこ病菌等の侵入抵抗性に関わるPEN1(SYP121)タンパク質と相同性の高いSYP122と相互作用する可能性が報告され、実際にUBQ6*タンパク質がSYP122と相互作用することを酵母2ハイブリットにより確認した。さらに、赤かび病菌を接種した野生株とubq6/6*変異体からユビキチンタンパク質の濃縮に成功しており、現在、発現差のあるタンパク質を同定を試みている。シロイヌナズナの赤かび病抵抗性植物のスタック系統の作出:赤かび病抵抗性及びかび毒低減化を示す下記の形質転換体について、スタック系統の作出を行った。侵入抵抗性が向上したThi2.4遺伝子の過剰発現株(Thi2.4ox)、侵入抵抗性及び進展抵抗性が向上したUBQ6/6*遺伝子のノックアウト株(ubq6/6*)、進展抵抗性が向上したNMNAT遺伝子の過剰発現株(NMNATox)、化学修飾により、かび毒蓄積が減少したTri101遺伝子の過剰発現株について、新たに2重スタック系統を作出し、赤かび病抵抗性及びかび毒蓄積についての評価を行い、NMNATox及びubq6/6*が、Thi2.4oxに比べて抵抗性向上への寄与が大きいことを明らかにした。かび毒低減化遺伝子の機能解析:かび毒解毒への関与が示唆されたHvGST13遺伝子について、大腸菌でHvGST13タンパク質を発現させ、現在精製を進めている。また、かび毒解毒に還元型グルタチオンの生成に関わるHvGR2の過剰発現株をシロイヌナズナ及びオオムギで作成し、導入遺伝子を確認した。UBQ6/6*遺伝子による赤かび病抵抗性の制御機構の解析:ubq6/6*(2重変異体)と相互作用が示唆されるSYP122あるいはSYP121の変異体との交配により、3重変異体の作製を行った。赤かび病抵抗性に関わる遺伝子の中から、NMNAT及びUBQ6/6*が特に有用であることが示されたため、これらの2重スタック系統と既に作出済みのかび毒低減化を示す形質転換株と組み合わせた3重スタック系統の作出により、本研究の目標を達成できる可能性が高まったため植物における赤かび病抵抗性及びかび毒低減化に関わる遺伝子の発現を改変させた形質転換シロイヌナズナを効果的に組合せて、赤かび病菌に対する病徴とかび毒蓄積を共に低減化できる植物の作出を目指した。赤かび病に対する侵入抵抗性に関わる遺伝子として単離した分泌性の抗菌タンパク質チオニンをコードするシロイヌナズナのThi2.4遺伝子の過剰発現株、また赤かび病に対する植物の誘導抵抗性に関わるNAD合成に関わるシロイヌナズナのNMNAT遺伝子の過剰発現株、リボソーム小サブユニットを構成するRPS27aドメインとユビキチンドメインの両方を有し、侵入抵抗性及び進展抵抗性を負に制御するシロイヌナズナのUBQ6及びUBQ6*タンパク質をコードする2つの遺伝子のノックアウト株、これらについて比較解析したところ、ubq6/6*の二重変異体が赤かび病菌に対する侵入抵抗性及び進展抵抗性ともに最も強い抵抗性を示した。赤かび病が産生するトリコテセン系かび毒を低減化する植物の候補遺伝子として、オオムギから同定したかび毒とグルタチオンのコンジュゲート産生に関わると期待される

HvGST13遺伝子、また還元型グルタチオンの産生に関わるHvGR2遺伝子について、共にシロイヌナズナを用いて過剰発現株を作製した。HvGST13過剰発現株及びHvGR2過剰発現株は、共に複数系統で野生型に比べて、かび毒(デオキシニバレノール)耐性を示すことを明らかにした。また、赤かび病菌接種すると、これらの過剰発現株では野生型に比べてかび毒が減少していた。以上の結果から、ubq6/6*の二重変異体とHvGST13過剰発現株、あるいはHvGR2過剰発現株の交配を試みており、これらの解析を進めることで赤かび病による病徴とかび毒蓄積を共に顕著に低減化し得る植物の作出が期待される。植物病原糸状菌であるムギ類赤かび病菌は、作物に減収だけでなくかび毒汚染による質的な被害をもたらす。本研究では、本菌に罹病性のシロイヌナズナを用いて、植物の抵抗性やかび毒解毒に関わる候補遺伝子の発現を改変させた形質転換体を解析し、抵抗性を顕著に向上させる2遺伝子、かび毒を低減化させる2遺伝子を同定した。これらの遺伝子を効果的に組合せることで、赤かび病による病徴とかび毒蓄積を共に低減化し得る植物の作出が期待された。スタック系統の作出は遅れているものの赤かび病抵抗性に関わる、より有用な新規遺伝子を複数同定しており、これらの遺伝子を有効に活用することで、少数の遺伝子の発現を改変するだけで、本研究の目的である赤かび病による感染とかび毒蓄積の両方を顕著に低減化した植物の作出が可能になると期待される。今後は、NMNATox及びubq6/6*変異体を中心にスタック系統の作出を進めたい。さらに、作製済みのHvGST13oxとのスタック系統の作出を進めることにより、赤かび病による病徴とかび毒蓄積を共に著しく減少させた植物の作出を試みる。植物病理学赤かび病菌に対して侵入抵抗性を示すTHI2.4過剰発現株、赤かび病菌に対して進展抵抗性を示すNMNAT過剰発現株、侵入抵抗性及び進展抵抗性を示すubq6/6*変異体の間での2重スタック系統の作出を進める。また、かび毒を低減化するGST13遺伝子の高発現株とubq6/6*変異体の間での2重スタック系統を作出し、赤かび病による感染とかび毒蓄積の両方を顕著に低減化した植物の作出を目指す。次年度に、一連のスタック系統における評価をマイクロアレイ解析を行うこととしたため、消耗品等の経費を次年度に繰り越すこととなった。抵抗性系統における表現型の解析が中心となり、形質転換体間の交配を行う技術補佐員の雇用を次年度以降としたため一連のスタック系統における評価をマイクロアレイ解析に解析するため、関連消耗品等を経費として執行する。当初の予定通り、形質転換体間の交配を行う技術補佐員の雇用するため、平成27年度は予定通り執行する。
順序運動学習における視床-線条体投射の機能的意義

ある特定の順序からなる視覚誘導型のボタン押し課題を学習中のサルの線条体からは、筋活動と相関を持った活動を示す細胞(実行型)と特定のボタン押しや順序などの運動手続きに相関を持つ細胞(手続き型)が記録され、学習が進み次第にスムースなボタン押しが獲得されるにつれて後者の細胞群が増加してくることを昨年報告した。素早くかつスムースなボタン押し運動を行うには、運動を予測的に行う必要があり、本年度は手続き型の細胞の活動と運動の予測性との関係を調べる実験を行った。同じボタン押しであっても予測性を変えることが可能なボタン押し課題をサルに学習させた。すなわち、動物はまず最初に光の点灯に従ってボタン押しを行い(VIS課題)、次の試行では同じ順序のボタン押しを記憶に従って遂行する(REM課題)。REM課題では次のボタンがどれであるかがあらかじめわかっているため、反応時間は次のボタンが予測不能なVIS課題と比べて有意に短縮する傾向にあった。このときREM課題で強く活動する細胞についてその活動の大きさと反応時間の関係を調べると、REM課題で大きく反応時間が短縮するボタン押しの組み合わせでは強い活動を示し、わずかな短縮しか示さないボタン押しの組み合わせでは活動が減弱した。各試行毎の反応時間と、そのときの細胞の発火頻度との相関を調べると、様々なボタン押しの組み合わせ全てを用いて相関を求めると両者には負の相関が見られたが、同じ組み合わせのボタン押しにおける反応時間のばらつきと細胞の活動の大きさには相関は見られなかった。このような細胞の活動は反応時間そのものと直接関係しているのではなく、動物がどの程度の予測性を持って運動を遂行しているかという予測性の大きさを反映していると考えられる。したがって、線条体で運動の予測性を反映していると考えられる細胞を初めとする運動手続きに関与する細胞が次第に増加してくることが、予測的でスムースな運動を獲得することに必須の関与をしていることが示唆された。本年度は、線条体が順序運動の学習にどのように関与するのかを明らかにするために、その出力を担う投射細胞(PANs)および介在細胞(TANs)の活動を、複数のボタン押しからなる順序運動課題を用いて調べた。動物にはある特定の順序からなる視覚誘導型の3回のボタン押し課題(Learned sequence;LS)を学習させ、細胞の活動を記録する場合には、このLSと新たな順序からなる課題(New sequence;NS)を行わせた。LSにおけるボタン押しの反応時間は学習3週目までに大きく短縮し、その後数週間を通してそのばらつきも収束した。LSを遂行中のPANsの活動はボタン押しや報酬の水をなめる口の運動と相関のある活動を示すもの(実行型,24.1%)と、ある特定のボタンを押すときにのみ強い放電を示すものや、"2番目"など特定の順序のボタン押しに限って強く放電するものなど、いわば運動の手続きに強く関係するもの(手続き型,41.6%)が記録された。またこれら2つのタイプの細胞が記録される割合は学習の進行に伴って変化した。実行型の細胞は、学習第1週は53.3%であったものが次第に減少し、第18週では25.0%であった。それに対し、手続き型の細胞は第1週の33.3%から次第に増加し、18週目では50.0%を占めるようになった。一方TANsは、第1週目では課題の最初の手がかり刺激であるLEDの点灯に対して応答を示すものが48.1%存在し、第3週目までに84.2%まで増加したあと18週目までこの傾向は維持された。このような線条体の細胞の数週間にわたる活動の変容は、運動手続きの学習過程を反映していると考えれられ、運動の制御に関わる細胞と順序の制御に関わる細胞の両者が、学習した順序運動を予測的にスムースに行うことを可能にすることを強く示唆している。

したがって、線条体で運動の予測性を反映していると考えられる細胞を初めとする運動手続きに関与する細胞が次第に増加してくることが、予測的でスムースな運動を獲得することに必須の関与をしていることが示唆された。
日本経済の生産性分析

本特別研究員はこれまで日本経済の1990年代の停滞、いわゆる「失われた10年」の分析を進めてきた。Hayashi and Prescott(2002)(以下HP)によると、TFP成長率の低下が失われた10年の主因であるとされている。そこで「TFPと資本稼働率」テーマに注目してきた。HPが計測したTFPに関しては、その過小推計の可能性が指摘されてきた。深尾・権(2003)やKawamoto(2005)は資本稼働率の低下の影響を考慮すると、90年代のTFP成長率は高くなると主張している。申請者は宮澤(2006)においてBasu et al.(2006)の手法を用いて稼働率を考慮したTFPを推計した。次に、深尾・権(2003)などで用いられた経済産業省の稼働率指数について、宮澤(2008)でそのサンプルの問題を指摘し、それを調整する方法を提示し、製造業の稼働率を再推計している。しかし、これらの稼働率に関する研究は稼働率低下の原因を分析していなかった。そこで、Miyazawa(2008)においてHPモデルに資本稼働率を導入し、資本稼働率を考慮したTFPを計測し、そのTFPを用いてシミュレーションを行った。その結果、上記のTFPは先行研究と整合的なものになる一方で、シミュレーションも現実のGNP等と整合的になることが分かった。この研究でTFP成長率の低下が資本稼働率の低下の原因である可能性が示唆された。大きな研究目的は日本の長期不況の実物的な要因の解明であり、そのために(1)生産性の分析(2)高齢化と貯蓄の影響の分析、この2つを大きな柱として研究を進めてきた。まず1つ目の生産性の分析について。日本の長期不況の原因としてTFP成長率の低下が議論されるが、実証上の最大の問題は稼働率の効果をいかに除去するかである。統計が不十分なこともあって通常のTFPの推計では稼働率が考慮されないことが多く、その場合にはTFPに誤差が生じることになる。特に日本の90年代には稼働率の水準が中長期的に低下したといわれており、もしこの効果を無視するとTFPの推計値が実際の値より低くなってしまう。そこで稼働率の統計である経済産業省の稼働率指数の詳細を調べ、その問題点を示した。その上で、先行研究の手法を取り入れながら独自の稼働率推計方法を提示し、実際に稼働率とTFPを推計した。その結果、90年代のTFP成長率低下の一定部分は稼働率低下の効果が混入した結果であり、稼働率を考慮しない推計結果に比べて90年代のTFP成長率が高くなることが分かった。2つ目の高齢化と貯蓄の影響について。ここでは当初の方針をやや変更し、貯蓄の中でも特に外国貯蓄、つまり経常収支に焦点を当てた。日本は過去30年近く経常収支を計上し続けているが、これは将来の高齢化と貯蓄率の低下に備えた行動だと思われる。しかし90年代に経常収支のGDP比率が低下するという事態が生じた。高齢化の影響とも考えられたが、ここ数年は中国経済の躍進もありまた経常収支は再び上昇傾向にある。国際貿易に関する議論で地域統合やFTAの貿易置換効果が注目されているが、NAFTAやEUの単一市場が日本の貿易(特に輸出)に負の影響を与えたと考えられ、実際に地域別の数量・価格データも整合的になっている。そこで国際モデルを構築し、モデルと整合的な「貿易ショック」を計算し、それがマクロ経済に与えた影響をシミュレーションした。その結果、90年代後半から02年頃までの日本経済の停滞のかなりの部分が貿易ショックによるものだと分かった。
椎間板の変性が椎間内水分子の動態と粘弾性特性に与える影響-椎間板圧迫条件下のMRI画像による非破壊的研究-

[目的]椎間板に外力が加わると椎間板内の水分子は基質を構成する高分子の間を移動する。この過程において椎間板は加えられたエネルギーを水分子の運動エネルギーに変換しつつ粘弾性変形し外力を吸収する。本研究ではこの点に着目し、MRIを用いてヒト正常および変性椎間板の粘弾性特性と水分子の動態の関係を明らかにした.[実験材料]剖検時に得られた種々の変性度を有するヒト腰椎椎間板を上下椎体を含めて摘出して試料とした.実験終了後、椎間板を横切してLewinの分類により変性度を分類した.[方法]MRI装置としてGyroscan 1.5tesla(Philips)を使用した・MRIマグネット内にプラスチック製圧迫試験器を設置し、椎間板の垂直方向に100kgの静荷重を加え経時的にspinecho法,inversion recovery法により矢状断の画像を得た。spin echo像から椎間板高を計測し、Tl計算画像から水分子の動態を観察した。椎間板高から得られた時間-ひずみ曲線を用いて椎間板の粘性、弾性係数を求めた。
地球温暖化ガス、メタンの発生源における生物的酸化除去技術の創生

炭酸ガスに次ぐ強力な温室効果ガスであるメタンの大気中濃度が近年急速に上昇しており、またその発生源として水田などが大きな割合を占めているため、国際的に注目されている。メタンは大気中へ放出されると比較的安定な化合物であるが、水田や自然湿地の土壌中にはメタン酸化能を有する微生物の存在が確認された。しかしこの微生物の生態や活性の発現、維持機構については未解明の部分が多い。そこでこの微生物の水稲根圏での活動を確認し、この菌を利用してメタンをその放出経路となる水稲根圏や水稲体内で酸化し生物的に除去する技術を創生することを目標として、メタン酸化細菌の持つ酸化酵素の遺伝子を手がかりに、メタン酸化菌の生態を解明し、その活性強化をねらうための知見を集積することを試みた。千葉県内の代表的水田土壌3種(グライ土・砂質土・泥炭土)を供試しポット実験を行い以下の結果を得た。1)メタン酸化菌の生息部位、活性変動、その支配要因等について検討するため、水田土壌におけるメタン酸化能を、メタン:空気=1:1で気相置換した室内培養系でメタン減少量から経時的に測定した。その結果、水田土壌はいずれの採取時期においてもメタン酸化能を示した。2)水稲体経由の大気中へのメタン放出量をチャンバー法により調査するとともに、水稲や湿性植物体(キカシグサRotala、ヒンジガヤツリLipocarpha、チョウジタデLudwigia)を根、茎基部、根+土壌に分け、各部分の酸化能も測定した。水稲(特に茎基部)および湿性植物もメタン酸化能を示した。またメタン酸化能と呼吸活性(αナフチルアミン活性)との間には正の相関関係が認められた。3)メタン酸化菌のもつメタン酸化酵素をコードする遺伝子mmoXをた-ゲットにプライマーを作成した。
液体内を移動する小形機械のための3次元移動用アクチュエータの研究

本研究では,液体内を移動する小形機械を実現するための基礎研究として,摺動部を持たない簡単な構造で小形化が容易な,容器内の気体の温度変化に伴う体積変化と相変化を利用して浮力を変化させ,液体内での垂直水平移動を実現する移動用小形アクチュエータの提案と試作を行い,小形化の諸特性を検討した.本研究で実施した内容と,得られた知見は以下の通りである.1.浮力変化と垂直移動特性の検討小形円筒容器内の熱線に間欠的に電力を供給し,その時の容器の浮力変化を測定した.実験は,相似形で大きさの異なる容器について行い,液体内(水中)における浮力変化や実際の移動特性を比較した.また,内部気体の種類を変えた場合や,沸点の低い液体を容器内部に充填した場合について同様の実験を行い,浮力や移動速度変化の比較検討を行った.その結果,本方式は小形化に有利であり,充填する気体の種類を工夫することにより,小形機械の液体内移動用アクチュエータとして十分に利用できることを確認した.2.モデル化と水平移動方式の検討内部気体の温度変化,体積変化および伝熱量を実験結果をもとにモデル化し,浮力作用や移動速度の数学モデルを作成し,小形化における諸特性の検討を行った.その結果,本方式の小形化に対する一定の限界を予想することができ,本方式は数ミリ程度の小形機械の移動原理として適していることを指摘した.なお今後の課題として,水平移動に関して,気体の体積変化を利用して進行方向から液体を吸い込んで,後方へと液体を噴射する,いわゆる噴射ポンプ作用を利用することを提案した.しかしこのポンプ方式を実験的に確認するに至らなかった.また熱線の代わりにペルチェ素子を用いて,素子の発熱吸熱にともなう能動的な熱移動を促進させることにより,より応答性の良い移動機構の実現も期待できる.本研究では,液体内を移動する小形機械を実現するための基礎研究として,摺動部を持たない簡単な構造で小形化が容易な,容器内の気体の温度変化に伴う体積変化と相変化を利用して浮力を変化させ,液体内での垂直水平移動を実現する移動用小形アクチュエータの提案と試作を行い,小形化の諸特性を検討した.本研究で実施した内容と,得られた知見は以下の通りである.1.浮力変化と垂直移動特性の検討小形円筒容器内の熱線に間欠的に電力を供給し,その時の容器の浮力変化を測定した.実験は,相似形で大きさの異なる容器について行い,液体内(水中)における浮力変化や実際の移動特性を比較した.また,内部気体の種類を変えた場合や,沸点の低い液体を容器内部に充填した場合について同様の実験を行い,浮力や移動速度変化の比較検討を行った.その結果,本方式は小形化に有利であり,充填する気体の種類を工夫することにより,小形機械の液体内移動用アクチュエータとして十分に利用できることを確認した.2.モデル化と水平移動方式の検討内部気体の温度変化,体積変化および伝熱量を実験結果をもとにモデル化し,浮力作用や移動速度の数学モデルを作成し,小形化における諸特性の検討を行った.その結果,本方式の小形化に対する一定の限界を予想することができ,本方式は数ミリ程度の小形機械の移動原理として適していることを指摘した.なお今後の課題として,水平移動に関して,気体の体積変化を利用して進行方向から液体を吸い込んで,後方へと液体を噴射する,いわゆる噴射ポンプ作用を利用することを提案した.しかしこのポンプ方式を実験的に確認するに至らなかった.また熱線の代わりにペルチェ素子を用いて,素子の発熱吸熱にともなう能動的な熱移動を促進させることにより,より応答性の良い移動機構の実現も期待できる.
日本における国有鉄道の歴史分析-貨物業務の制度設計と運営を中心に-

採用第3年目(最終年)である2014年度は、(1)旧日本国有鉄道・JR関係の史料整理・公開活動、(2)国鉄に関する学術論文の投稿と博士学位取得論文の執筆、(3)研究成果のアウトリーチ活動、の3点を中心に研究活動を行った。(1)前年度に引き続き、旧国鉄・JR関係史料の整理・公開活動に取り組んだ。特に、関東地方で発見した戦前戦後にかけての鉄道貨物輸送関係史料(段ボール約240箱)について、所蔵法人から寄託を受けた上で整理作業を開始した。また、調査を海外でも展開し、米国国立公文書記録管理局および東日本旅客鉄道株式会社ニューヨーク事務所において関係史料を収集した。加えて、最高幹部クラスおよび実務者を中心とするオーラル・ヒストリーも27回実施し、その都度成果報告書を刊行した(非公開のものも含む)。(2)192040年代にかけての国鉄貨物輸送業務に関する論文2本を学術雑誌『鉄道史学』『経営史学』に投稿、掲載された。これらは当該期の国鉄を事例に、大企業組織が外部環境変化に適応しつつ、組織形態や業務運営システムを変容させる過程を描写したものである。また、この枠組みを1970年代まで拡張し、ミドル・マネジメントの機能と役割を中心に整理した論文『日本における鉄道運輸システムの展開一国有鉄道貨物部門のミドル・マネジメントと情報構造一』を東京大学へ提出し、2015年3月に博士(経済学)の学位を取得した。(3)過去3年間に農業史・アーカイブズ学の研究者と共同で実施してきた旧国鉄OB所蔵の史料調査活動を総括し、その成果について所在地自治体(鳥取県)に報告するとともに、現地放送メディアを通じて意義を紹介した。また、この過程で発見された東海道新幹線計画に関する内部史料は、開業50周年を機に実施された江戸東京博物館での企画展示へ出品し、史料の歴史的意義について一般向けに解説を執筆した。本研究課題は平成26年度が最終年度のため、記入しない。採用初年度である2012年度は、(1)戦時・復興期を中心とする国有鉄道貨物輸送に関する研究、(2)旧国鉄関係機関における基礎史料の収集、(3)旧日本国有鉄道OB諸氏へのオーラル・ヒストリー実施、の3点を中心に研究活動を行った。(1)戦時・復興期(1930年代末1950年代前半)の国鉄貨物輸送業務運営について研究を深め、その成果を刊行した。戦時期に特有な輸送システムへの制度移行過程と、その機能・運営を支える貨車集配システムの存在を実証し、それらの形成に担当部局内の分権的な意思決定構造が大きく影響していたという視角を提示した。また、その視角を鉄道国有化から国鉄分割民営化に至る長期の業務運営へも適用し、その有効性を主張した試論によって、第5回住田物流奨励賞(交通研究協会、2012年11月)を受賞した。(2)JR各社および関係団体の支援の下、国鉄関係史料所蔵状況の概要を解明すべく、史料調査活動を体系的に開始した。経済史および鉄道技術史研究者と共同で、関係者所蔵の史料群を閲覧するとともに、旧国鉄・運輸省OBの所蔵史料目録作成も並行させた。また、鉄道企業への株式投資の実態を明らかにすべく、地方旧家所蔵文書の出張調査も実施した。それら調査活動の成果の一部を学会(日本技術史教育学会、2013年3月)で報告した。(3)旧国鉄OBの4名に対して、のべ22回にわたりオーラル・ヒストリーを実施した。調査が完了した1名分の報告書(近刊)には、194080年代の国鉄業務運営・運輸政策上重要なトピックを多く含んでおり、基礎史料として将来の研究にも貢献する。その他3名は来年度以降も継続して聞き取りを実施する予定であり、新規候補者数名からも内諾を得ている。採用第2年目である2013年度は、(1)国有鉄道貨物輸送に関する研究発表および論文投稿、(2)JR各社における史料調査、(3)旧日本国有鉄道OB諸氏へのオーラル・ヒストリー、の3点を中心に研究活動を行った。(1)1900年代1920年代前半にかけての国鉄貨物輸送業務運営について考察を深め、鉄道国有化(1908年)以降、部内において貨物輸送業務が確立されていく過程について、1地方と中央における担当業務の差異という視点、2ライン的業務とスタッフ的業務の組織内分化という視点、3各貨物輸送担当者のキャリア形成という視点、から検討し、単著(ディスカッション・ペーパー)および関係学会における報告により公表した。その成果を記した論文2本を現在学術雑誌へ投稿中である。(2)前年度に引き続き、JR各社および関係法人の支援の下、国鉄関係史料所蔵状況の概要を解明すべく、調査活動を継続した。今年度はJR各社およびその関連機関における調査を重点的に行い、日本貨物鉄道株式会社(JR貨物)、四国旅客鉄道株式会社(JR四国)、九州旅客鉄道株式会社(JR九州)で内部資料を数多く閲覧した。旧国鉄OB所蔵の関係史料調査も並行したほか、地方に所在する国鉄OB宅への出張調査を農業史・アーカイプズ学の研究者と共同で行いその成果を現地放送メディアを通じて公開した。(3)最高幹部クラス、および貨物担当部局内の実務者クラスを中心に、のべ40回(今年度実施分のみ)にわたるオーラル・ヒストリーを実施、その都度成果報告書を刊行した(ただし非公開のみのも含む)。

具体的には、194080年代の国鉄業務運営・運輸政策上重要なトピック(国鉄労使関係、労働基本権問題の経過、貨物コンテナ営業開始、貨物担当部局内における運用・輸送業務の変遷、幹部人事の決定、車両設計と車両計画、国鉄改革の過程など)を中心に、本人の経歴に沿い詳細な聞き取りを行った。なお、新規候補者数名からも内諾を得ている。採用第3年目(最終年)である2014年度は、(1)旧日本国有鉄道・JR関係の史料整理・公開活動、(2)国鉄に関する学術論文の投稿と博士学位取得論文の執筆、(3)研究成果のアウトリーチ活動、の3点を中心に研究活動を行った。(1)前年度に引き続き、旧国鉄・JR関係史料の整理・公開活動に取り組んだ。特に、関東地方で発見した戦前戦後にかけての鉄道貨物輸送関係史料(段ボール約240箱)について、所蔵法人から寄託を受けた上で整理作業を開始した。また、調査を海外でも展開し、米国国立公文書記録管理局および東日本旅客鉄道株式会社ニューヨーク事務所において関係史料を収集した。加えて、最高幹部クラスおよび実務者を中心とするオーラル・ヒストリーも27回実施し、その都度成果報告書を刊行した(非公開のものも含む)。(2)192040年代にかけての国鉄貨物輸送業務に関する論文2本を学術雑誌『鉄道史学』『経営史学』に投稿、掲載された。これらは当該期の国鉄を事例に、大企業組織が外部環境変化に適応しつつ、組織形態や業務運営システムを変容させる過程を描写したものである。また、この枠組みを1970年代まで拡張し、ミドル・マネジメントの機能と役割を中心に整理した論文『日本における鉄道運輸システムの展開一国有鉄道貨物部門のミドル・マネジメントと情報構造一』を東京大学へ提出し、2015年3月に博士(経済学)の学位を取得した。(3)過去3年間に農業史・アーカイブズ学の研究者と共同で実施してきた旧国鉄OB所蔵の史料調査活動を総括し、その成果について所在地自治体(鳥取県)に報告するとともに、現地放送メディアを通じて意義を紹介した。また、この過程で発見された東海道新幹線計画に関する内部史料は、開業50周年を機に実施された江戸東京博物館での企画展示へ出品し、史料の歴史的意義について一般向けに解説を執筆した。本研究課題は平成26年度が最終年度のため、記入しない。史料調査およびオーラル・ヒストリーの進展により、単に貨物業務の実態を解明することにとどまらず、戦後の日本国有鉄道経営をの内実を総体的に明らかにするための基盤をつくりつつある。歴史研究に不可欠な部内資料の閲覧、および実務経験者との人脈形成が、JR各社および外郭団体関係者の協力によって、当初の計画以上に進展している。また、研究成果の公表については当初の計画通りに進展している。今後の推進方策としては、史料調査およびオーラル・ヒストリーを継続するとともに、それを用いた分析にも注力する。また、データと収集史料の公開を積極的にすすめ、当課題の成果を広く学問研究および一般の検証に資するよう努める。史料調査およびオーラル・ヒストリーを継続するとともに、研究成果の公開を進めるべく論文投稿を積極的に行い、あわせて海外における資料調査も並行させる。なお、研究遂行上の問題点として、個人情報保護あるいは企業秘密保護の観点から、現時点では非公開にせざるを得ない資料や証言記録が存在することが挙げられる。
リポ多糖を認識する蛋白質MD-2およびTLR4受容体のX線結晶構造解析

グラム陰性細菌感染症に起因するエンドトキシンショックは生命を脅かす非常に重篤な症状であり,その治療薬の開発が待望されている。この症状を引き起こす原因物質であるリポ多糖を認識して,過剰な免疫応答を惹起する自然免疫系の蛋白質としてMD-2とTLR4受容体が同定されているが,リボ多糖認識およびシグナル伝達の分子機構は明らかになっていない。研究代表者は、MD-2およびTLR4蛋白質がリポ多糖を認識して免疫応答を引き起こす機構を三次元構造から明らかにするため,これらの蛋白質の大量発現系の構築、精製、性状解析、結晶化と結晶構造解析を進めた。酵母で発現させたヒトMD-2を酵素により短鎖化した試料を用い,ネーティブ体と阻害剤lipid IVaとの複合体について正方晶系の同型の結晶を得た。ネーティブ体結晶について重原子同型置換法により,初期位相を決定し三次元構造モデルを構築した。ネーティブ体とlipid IVa複合体について,それぞれ分解能2.0Åと2.2Åまでの反射を用いて構造を精密化した。MD-2は2つの逆平行βシートから成る単一のドメイン構造を有する。2つのβシートの間には体積約1,700Å^3の大きな疎水的なポケットが存在する。このポケット内に,ネーティブ体構造では3分子のミリスチン酸に相当する電子密度が,lipid IVa複合体ではlipid IVaの4本の脂肪酸鎖の電子密度が確認された。Lipid IVaのリン酸基とグルコサミンの部分は,ポケットの入口に存在し,MD-2との間に3本の水素結合を形成する。研究代表者は、MD-2およびTLR4蛋白質がリポ多糖を認識して免疫応答を引き起こす機構を三次元構造から明らかにするため,X線結晶構造解析に向けてこれらの蛋白質の大量発現系の構築を進めてきた。MD-2蛋白質については,ヒトMD-2およびマウスMD-2を酵母Pichia Pastorisを用いて培養液上清に発現させた。ヒトMD-2については,発現させた蛋白質に付加した糖鎖を短鎖化し,カラムクロマトグラフィーにより精製して,結晶化に適した高純度の蛋白質試料を得ることができた。精製したMD-2は大腸菌由来LPS, Lipid AやLipid IVaなどの各リガンドとの結合能を有することを示した。蒸気拡散平衡法による結晶化条件のスクリーニングの結果,ポリエチレングリコールを沈殿剤として微小結晶を得ることができた。TLR4蛋白質については,ヒトTLR4およびマウスTLR4の細胞外ドメインの遺伝子を組み込んだベクターを作成し,酵母P.Pastorisに導入して発現を試みたが培養液上清に目的蛋白質を得ることができなかった。そこで原因を明らかにするために,N末端およびC末端にタグを付加したヒトTLR4のC末端の欠損体3種類を作成した。この症状を引き起こす原因物質であるリポ多糖を認識して,過剰な免疫応答を惹起する自然免疫系の蛋白質としてMD-2とTLR4受容体が同定されているが,リポ多糖認識およびシグナル伝達の分子機構は明らかになっていない。研究代表者は,MD-2およびTLR4蛋白質がリポ多糖を認識して免疫応答を引き起こす機構を三次元構造から明らかにするため,X線結晶構造解析に向けてこれらの蛋白質の大量発現系の構築、精製、性状解析、結晶化を進めてきた。ヒトMD-2については,結晶化に適した高純度の蛋白質試料を得ることができた。蒸気拡散平衡法による結晶化条件のスクリーニングの結果,ポリエチレングリコールを沈殿剤としてヒトMD-2単体の結晶を得ることができた。実験室でのX線回折像測定の結果,この結晶は正方晶系に属し,3.0Å程度の反射を与えることがわかった。また斜方晶系のLipid IVa複合体結晶も得ることができた。そこで原因を明らかにするために,N末端およびC末端にタグを付加した,異なる長さのC末端の欠損体を複数作成し,発現を試みた。その結果,ヒトTLR4のN末端3分の1までの発現が確認できた。

酵母で発現させたヒトMD-2を酵素により短鎖化した試料を用い,ネーティブ体と阻害剤lipid IVaとの複合体について正方晶系の同型の結晶を得た。ネーティブ体結晶について重原子同型置換法により,初期位相を決定し三次元構造モデルを構築した。ネーティブ体とlipid IVa複合体について,それぞれ分解能2.0Åと2.2Åまでの反射を用いて構造を精密化した。MD-2は2つの逆平行βシートから成る単一のドメイン構造を有する。2つのβシートの間には体積約1,700Å^3の大きな疎水的なポケットが存在する。このポケット内に,ネーティブ体構造では3分子のミリスチン酸に相当する電子密度が,lipid IVa複合体ではlipid IVaの4本の脂肪酸鎖の電子密度が確認された。Lipid IVaのリン酸基とグルコサミンの部分は,ポケットの入口に存在し,MD-2との間に3本の水素結合を形成する。
ヒトMSH3蛋白質の機能解析

私達は昨年バキュロウイルス系で発現したhMSH3を含むヘテロ二量体(hMSH2/hMSH3)がループを持つミスマッチに選択的に結合することを示した(Curr.Biol.,6:1181-1184,1996)。塩基置換ミスマッチに結合するヘテロ二量体(hMSH2/hMSH6)がhMutSαとすでに名付けられていることから、この二量体をhMutSβと命名した。3種のMutSホモログ(hMSH2,hMSH6,hMSH3)から成る2種のヘテロ二量体(hMutSα,hMutSβ)によるミスマッチ結合モデルは真核生物における共通の分子機構と考えられている。本年は2種のヘテロ二量体(hMutSα,hMutSβ)がヒト細胞抽出液に存在することをゲルシフト法で確かめた。さらに3種のMutSホモログの細胞における発現量をNorthern blotにより比べると、hMSH2:hMSH6:hMSH3=1:0.6:0.2であった。hMSH3遺伝子が約100倍に増幅しているメソトレキセート(MTX)耐性細胞ではhMSH2:hMSH6:hMSH3=1:0.6:15.6であり、ヘテロ二量体の形成がhMutSβに片寄っていることが予想された。実際MTX耐性細胞ではゲルシフト法を行うとhMutSαの複合体の形成が抑えられており、塩基置換ミスマッチであるG/Gミスマッチの修復活性が低下していることが観察された。次にhMSH3の発癌への関与を変異解析により検討した。79例の孤発性大腸癌患者のゲノム不安定性を5箇所のマイクロサテライトを用いて検討すると5例が不安定性を示し、それらはTGF-βRIIのAリピートの欠失変異あるいは塩基置換変異を伴っていた。そのうちの1例においてはhMSH3の(A)8部位でのAの挿入と欠失が認められた。これらのことより、ゲノム不安定性を呈する弧発性大腸癌の一部は、ゲノム不安定性の結果TGF-βRIIの不活化に至ったと考えられ、不安定性の増強にhMSH3遺伝子の変異が寄与したと推測された。