hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
糖タンパク質溶液の糖性挙動における糖鎖部分の意義

糖タンパク質の糖鎖部分は、生体における情報伝達機構や、タンパク質分解酵素からの防御機構に関わっていることが明らかになりつつある。しかし、生体内に無数にある、活性を持たない、非特異的糖タンパク質の糖鎖部分の生理的意義については、未だ不明な点が多い。本研においては、生体内に無数にある、活性を持たない、非特異的糖タンパク質の糖鎖部分の生連的意義を明らかにすることを目的として行なわれたものである。糖タンパク質としては卵白アルブミンを用いた。まず、糖鎖のみを酵素的に除去した卵白アルブミンを調製し、その脱糖鎖卵白アルブミンの性質を調ベた。熱感受性、プロテア-ゼ感受性に変化が生じたのみならず、糖タンパク質溶液の糖鎖部分が粘性挙動に影響を与えていることが判明した。すなわち脱糖鎖卵白アルブミン溶液の粘度は低せん断速度域において通常の卵白アルブミン溶液より低い値を示した。このことは生体内においてもタンパク質の分泌、移動、流動に糖鎖が関与することを示唆するものである。と同時に食品タンパク質の物性や性質にも大きく影響を与えているものと思われる。この性質をより詳細に検討し、かつ確認するために、ツニカマイシンを用いて、in vivoで糖鎖未付加の卵白アルブミンの調製を試みたところ、多量の糖鎖未付加の卵白アルブミンを得ることに成功した。この糖鎖未付加の卵白アルブミンの精製を行なったのち、そのタンパク質の粘性、および流動性を調べ、非特異的糖タンパク質の糖鎖部分の生理的意義を検討した。結果は、先に酵素を用いて得られた事実を支持するものであった。本研究過程において、糖タンパク質における糖鎖に新たな生理的、生化学的意義が提示されたが、これを普遍化するための実験、および生体内において実際にかかる機能が発現していることを示す研究が今後望まれる。各種糖タンパク質に、Flavobacterium spのendo-β-N-acetyl glucosaminidaseを作用させて末変性状態の調整、および糖鎖を有しないタンパク質に、化学修飾の手法によりポリエチレングリコ-ルや多糖類の導入し、人工の糖タンパク質の調整は、ほぼ達成されたが、組織培養法による糖鎖未付加の糖タンパク質の調整は、充分な結果を得るに至っていない。得られた人工糖タンパク質や脱糖鎖糖タンパク質溶液の粘度を回転粘度計を用いて測定したところ、非ニュ-トン挙動を示し、流れの状態(剪断亜度、回転速度)に依存して特徴的な粘性挙動を示した。つまり低剪断亜度領域に於いて、見かけの粘性係数が上昇する傾向を示し、糖鎖がpr糖タンパク質の粘性挙動に影響を与えていることが示された。現在さらに、これら人工糖タンパク質が、糖鎖導入に伴うタンパク質構造への影響についても検討を進めており、現在のところ、人工的に糖鎖導入することによる大きな構造変化は認めていない。しかしながら電荷その他、タンパク質本体の微少な変化に伴う影響も考慮する必要があり、化学修飾等の実験などによる対照実験が重要である。現在この点に関しても検討を行っている。組織培養を用いる方法での糖鎖未付加の糖タンパク質の調整は、多くの困難を残している。これは、糖鎖付加阻害剤が期待した効果をもたらさないこと、生合成後のタンパク質の精製、収率に困難を極めるためである。これらについては、さらに検討を進め、問題の解決に向けて研究を進めている。糖タンパク質にFlavobactrium sp.のendoーβーNーacetylglucosaminidaseを作用させ、未変性状態の脱糖鎖糖タンパク質の調製を行ない、このタンパク質の特性を分析したところ、糖鎖部分を除去することにより、熱安定性の低下、タンパク質加水分解酵素の受け

易さに顕著な相違が認められる一方で、粘性挙動においても変化が認められた。すなわち低剪断速度域において脱糖鎖糖タンパク質の方が低い見かけの粘度値を示し、糖鎖部分が低剪断速度域においてそのタンパク質の流動性を増しているとの結果を得た。つまり流れ易くする機能を有している。本実験は主に卵白アルブミンについて行なった。上記の事実を確認するために、異なった方法で未変性で、しかも糖鎖部分を有しない糖タンパク質の調製を試みた。すなわちタンパク質部分へ糖鎖部分の結合を阻害するツニカマイシンの存在下で、卵白アルブミンの生産の生産系である輸卵管の培養を行った。しかし、粘度測定を行なうことができる程の糖鎖部分を有しない卵白アルブミンは得られなかった。そこで次に、ツニカマイシンを直接、産卵期の鶏に注射投与し、糖鎖部分を有しない卵白アルブミンの生成を試みた。その結果、適当量のツニカマイシン投与により、輸卵管から糖鎖部分を有しない卵白アルブミンが侵出することを見出した。精製は卵白アルブミンの場合と同様の結晶法を繰り返した後、レクチンカラムを用いて、糖鎖部分を有しない卵白アルブミンのみを得た。精製標品はSDS電気泳動で単一バンドを示した。さらに、この標品をイオン交換クロマトグラフィ-によってリン酸残基を一つ含む分子種のみを集め、物性テストに供した。その結果、先に酵素で調製した脱糖鎖卵白アルブミン同様、糖鎖を持たない卵白アルブミンは通常の卵白アルブミンに比べ、熱安定性が低下し、タンパク質加水分解酵素の作用を受け易くなった。粘性挙動においては、糖鎖部分が低剪断速度域においてそのタンパク質の流動性を増しているとの結果を得、先の結果と一致した。
しらす斜面崩壊の発生機構に関する研究

鹿児島市内及び周辺のしらす斜面を対象として現地調査を行った.斜面では層序の同定,硬度測定,土壌層厚の測定などを行った.採取した試料を用い,比重などの物理試験,および, pF試験,一次元鉛直浸透試験,三軸試験を行った.しらす斜面の崩壊には斜面の層序,各層の力学特性の差異が重要な役割を果たしていることを従来より明らかにしてきたが,本研究では,保水特性,浸透特性に焦点をあてている.そして,一次元鉛直浸透試験結果より,斜面を構成している各層間の透水係数の差異が土中水の挙動に影響を及ぼすことが明らかにされた.土中水の挙動を定量的に評価するため,間隙のモデルを提案し,保水,浸透特性について考察を加えた.また,浸透力を考慮した斜面安定解析手法についても考察を加えている.一方,鹿児島市内のしらす急崖において斜面崩壊の履歴と斜面表層に形成された土層厚を調査・計測した.その結果,次のような点が明らかになった.調査地における斜面の崩壊は表層崩落,表層滑落,表層剥離の三つに分類される.斜面には古い崩壊跡地と新しい崩壊跡地が複雑に入り混じって形成されている.斜面を縦断的にみると,土層厚は斜面上部で2mと厚く,斜面中腹部では, 3-100cmと斜面上部と比較すると薄く,しかも,広範囲な分布を示し,斜面下部では30-100cmとなっている.斜面上部で土層厚が厚いのは,新期火山灰や降下軽石,風化しらすによって斜面が構成されているためである.斜面中腹部の急斜面では,新旧の崩壊が入り乱れ,土層厚もそれに対応して広範囲の値を示している.土層厚は崩壊の履歴と対応しており,土層厚が30cm程度以下の比較的新しい崩壊跡地の斜面では新たに崩壊は発生していない.すなわち,崩壊の発生が予想される斜面は,土層厚が30cm程度以上の比較的古い崩壊跡地の斜面である.こうした斜面を抽出することによって危険斜面の予想が可能である.鹿児島市内及び周辺のしらす斜面を対象として現地調査を行った.斜面では層序の同定,硬度測定,土壌層厚の測定などを行った.採取した試料を用い,比重などの物理試験,および, pF試験,一次元鉛直浸透試験,三軸試験を行った.しらす斜面の崩壊には斜面の層序,各層の力学特性の差異が重要な役割を果たしていることを従来より明らかにしてきたが,本研究では,保水特性,浸透特性に焦点をあてている.そして,一次元鉛直浸透試験結果より,斜面を構成している各層間の透水係数の差異が土中水の挙動に影響を及ぼすことが明らかにされた.土中水の挙動を定量的に評価するため,間隙のモデルを提案し,保水,浸透特性について考察を加えた.また,浸透力を考慮した斜面安定解析手法についても考察を加えている.一方,鹿児島市内のしらす急崖において斜面崩壊の履歴と斜面表層に形成された土層厚を調査・計測した.その結果,次のような点が明らかになった.調査地における斜面の崩壊は表層崩落,表層滑落,表層剥離の三つに分類される.斜面には古い崩壊跡地と新しい崩壊跡地が複雑に入り混じって形成されている.斜面を縦断的にみると,土層厚は斜面上部で2mと厚く,斜面中腹部では, 3-100cmと斜面上部と比較すると薄く,しかも,広範囲な分布を示し,斜面下部では30-100cmとなっている.斜面上部で土層厚が厚いのは,新期火山灰や降下軽石,風化しらすによって斜面が構成されているためである.斜面中腹部の急斜面では,新旧の崩壊が入り乱れ,土層厚もそれに対応して広範囲の値を示している.土層厚は崩壊の履歴と対応しており,土層厚が30cm程度以下の比較的新しい崩壊跡地の斜面では新たに崩壊は発生していない.すなわち,崩壊の発生が予想される斜面は,土層厚が30cm程度以上の比較的古い崩壊跡地の斜面である.こうした斜面を抽出することによって危険斜面の予想が可能である.
ヒストンH3リン酸化の可視化による染色体構造構築メカニズムの解明

本研究ではヒストンH3リン酸化の可視化により、染色体構造構築メカニズムの解明を目指したが、平成20年度は植物におけるヒストンH3 Thr3をリン酸化するHaspinのシロイヌナズナホモログの細胞分裂期における機能解析、またヒストンH3 Ser10およびSer28をリン酸化するAtAUR3について植物体における機能解析を行った。昨年度までにAtHaspinがvitroにおいてH3 Thr3およびThr11をリン酸化することを明らかにしていたが、タバコ培養細胞BY-2において、AtHaspinを過剰発現したところ、分裂期にH3 Thr3のリン酸化パターンがより広がることが明らかになった。このことはAtHaspinが少なくとも細胞内においてもH3 Thr3をリン酸化することを示唆している。またAtAUR3の機能を明らかにするために、RNAi法を用いてAtAUR3を発現抑制したシロイヌナズナ形質転換体を確立し解析したところ、野生型と比べて根の伸長速度が遅くなっていた。また根の細胞を顕微鏡観察したところ、細胞分布が野生型とは異なっていた。また、AtAUR3は胚においても発現が見られることが予想されたため、胚において染色体が可視化できるH2B-tdTomato形質転換体を構築し、Auroraキナーゼ阻害剤によってAtAUR3を機能阻害したところ、全ての染色体が正常に赤道面に整列する前に染色体が分離するという染色体分離異常が認められた。このように本研究では、遺伝情報を均等に分配するという,生命の根幹をなす過程である細胞分裂において重要な染色体動態に、ヒストンH3をリン酸化するAtAUR3およびAtHaspinが植物において重要な役割を担っていることを明らかにした。本研究ではピストンH3リン酸化の可視化により、染色体構造構築メカニズムの解明を目指しているが、平成18年度はピストンH3をリン酸化するAuroraキナーゼの植物における機能の解析と、ヒトにおいてピストンH3 Thr3をリン酸化するHaspinのシロイヌナズナホモログの同定および解析を行った。Auroraキナーゼの解析には、Auroraキナーゼ特異的阻害剤ヘスペラジンを用いて解析を行った。タバコ培養細胞BY-2において、ヘスペラジンによりAuroraキナーゼの機能を阻害すると、ヒストンH3 Ser10と28のリン酸化が阻害された。細胞分裂期においては、ヘスペラジン処理により分裂中期細胞の割合が増加し、後期および終期細胞の割合が減少しており、さらに微小核の増加やラギング染色体が観察された。以上の結果より、植物Auroraキナーゼが染色体分離に関与していることを明らかにした。この成果を"Aurora kinase is required for chromosome segregation in tobacco BY-2 cells"という題名で、国際学術雑誌The Plant Journal誌に発表した。また、シロイヌナズナAuroraキナーゼであるAtAUR2にスプライシングバリアントがあり、そのバリアントにより細胞分裂を制御しているのではないか、ということを明らかにして、その成果を"Characterization of a splicing variant of plant Aurora kinase."という題名で国際学術雑誌Plant Cell and Physiology誌に発表した。これら植物におけるAuroraキナーゼとヒストンH3リン酸化といったピストン翻訳後修飾についての総説を、雑誌化学と生物に発表した。Haspinの解析に?いては、現在in vitroにおいてピストンH3のリン酸化能を持っていることが確認できていることより、植物においてもピストンH3キナーゼである可能性は高いことが分かった。また、蛍光タンパク質GFPを融合させて、蛍光顕微鏡下でタイムラプス観察を行ったところ、細胞分裂期において核内に局在したことより、in vivoにおいてもピストンH3をリン酸化していることが示唆された。本研究ではヒストンH3リン酸化の可視化により、染色体構造構築メカニズムの解明を目指しているが、平成19年度は植物におけるヒストンH3と動原体特異的ヒストンH3であるCenH3による動原体の可視化および動態解析と、ヒトにおいてヒストンH3 Thr3をリン酸化するHaspinのシロイヌナズナホモログの細胞分裂期における機能解析を行った。タバコ培養細胞BY-2において、シロイヌナズナヒストンH3動原体特異的バリアントであるCenH3に蛍光タンパク質tdTomatoを融合することにより、動原体の可視化に成功した。また微小管および動原体を別々の蛍光タンパク質に融合し、同時に可視化することにより、植物においてAuroraキナーゼを阻害すると、動原体整列および分離に異常が起こり、ラギング染色体および微小核形成が引き起こされていることを明らかにした。微小核形成はヒトにおいてはガン化にも繋がる異常であり、植物においてAuroraキナーゼまたヒストンH3リン酸化がその異常を抑制している可能性が示唆された。この成果を国際会議16th International Chromosome Conferenceを含め、8件学会発表を行った。AtHaspinの解析については、微小管との二色同時可視化によりほぼ共局在することが明らかとなり、細胞質分離に機能を持っていることが示唆された。以上のように、タバコ培養細胞BY-2において、二色の蛍光タンパク質を用いることによって、ヒストンH3バリアントを含めたいくつかのタンパク質について、FRET解析に必要な二色同時可視化に成功した。

昨年度までにAtHaspinがvitroにおいてH3 Thr3およびThr11をリン酸化することを明らかにしていたが、タバコ培養細胞BY-2において、AtHaspinを過剰発現したところ、分裂期にH3 Thr3のリン酸化パターンがより広がることが明らかになった。このことはAtHaspinが少なくとも細胞内においてもH3 Thr3をリン酸化することを示唆している。またAtAUR3の機能を明らかにするために、RNAi法を用いてAtAUR3を発現抑制したシロイヌナズナ形質転換体を確立し解析したところ、野生型と比べて根の伸長速度が遅くなっていた。また根の細胞を顕微鏡観察したところ、細胞分布が野生型とは異なっていた。また、AtAUR3は胚においても発現が見られることが予想されたため、胚において染色体が可視化できるH2B-tdTomato形質転換体を構築し、Auroraキナーゼ阻害剤によってAtAUR3を機能阻害したところ、全ての染色体が正常に赤道面に整列する前に染色体が分離するという染色体分離異常が認められた。このように本研究では、遺伝情報を均等に分配するという,生命の根幹をなす過程である細胞分裂において重要な染色体動態に、ヒストンH3をリン酸化するAtAUR3およびAtHaspinが植物において重要な役割を担っていることを明らかにした。
糖を付加した切り花の花色発現機構の解明

生け水への糖添加が,切花の花色を改善することは広く認められている。本課題では,糖付加による花色変化,花色素の構成・量的変化およびアントシアニン生合成関連遺伝子の発現の変化を明らかにし,実用的糖付加方法の開発を試みた.カーネーションでは,貯蔵中の処理糖濃度が高いほど早く開花し,花径も大きくなった. 5%スクロース3週間の貯蔵で,切り花中の糖濃度が上昇しエチレン生産のピークが2-3日遅れた. 5%スクロースで4-8週間貯蔵した切り花は,いずれも3週間程度の品質保持を示した.低温貯蔵中に主要な2つのアントシアニンは,スクロース処理区でより多く蓄積した.カーネーション花弁から糖誘導型と想定される転写因子遺伝子DcAN2を得たが,外生のスクロースに反応しなかった.CHS,CHI,DFR,ANSの発現量がスクロース液貯蔵中に増加し,生けた後でもCHS,DFR,ANSおよびDcAN2の発現量はスクロース処理区でより多くなった.グロリオサ切り花の第1,2花では,生け水中の糖の有無による花色の差は認められなかったが,それより上位の花では,スクロースを含む生け水に生けた花は, L値が低くC値が高くなった.また中位の花で花色発現が不良となる現象が認められた.水で生けた切り花では第1花に比べて上位の小花でアントシアニン含量が急激に減少したが,生け水にスクロースがあると,第4及び第5花で第1花と同等までアントシアニン含量が回復した.水の場合は第1花の糖含量が最も高く上位の花ほど低くなった.一方生け水にスクロースがあると,上位の花ほど糖含量が増加する傾向を示した.以上より花弁における糖の不足が発色不良の原因とは言えなかった.第3から5花のGsDFRとGsANSの発現はいずれも高く,第3花を中心とする発現不良はより下流のアントシアニン生合成関連遺伝子の発現が関与していると推察された.生け水への糖添加が,切花の花色を改善することは広く認められている。本課題では,糖付加による花色変化,花色素の構成・量的変化およびアントシアニン生合成関連遺伝子の発現の変化を明らかにし,実用的糖付加方法の開発を試みた.カーネーションでは,貯蔵中の処理糖濃度が高いほど早く開花し,花径も大きくなった. 5%スクロース3週間の貯蔵で,切り花中の糖濃度が上昇しエチレン生産のピークが2-3日遅れた. 5%スクロースで4-8週間貯蔵した切り花は,いずれも3週間程度の品質保持を示した.低温貯蔵中に主要な2つのアントシアニンは,スクロース処理区でより多く蓄積した.カーネーション花弁から糖誘導型と想定される転写因子遺伝子DcAN2を得たが,外生のスクロースに反応しなかった.CHS,CHI,DFR,ANSの発現量がスクロース液貯蔵中に増加し,生けた後でもCHS,DFR,ANSおよびDcAN2の発現量はスクロース処理区でより多くなった.グロリオサ切り花の第1,2花では,生け水中の糖の有無による花色の差は認められなかったが,それより上位の花では,スクロースを含む生け水に生けた花は, L値が低くC値が高くなった.また中位の花で花色発現が不良となる現象が認められた.水で生けた切り花では第1花に比べて上位の小花でアントシアニン含量が急激に減少したが,生け水にスクロースがあると,第4及び第5花で第1花と同等までアントシアニン含量が回復した.水の場合は第1花の糖含量が最も高く上位の花ほど低くなった.一方生け水にスクロースがあると,上位の花ほど糖含量が増加する傾向を示した.以上より花弁における糖の不足が発色不良の原因とは言えなかった.第3から5花のGsDFRとGsANSの発現はいずれも高く,第3花を中心とする発現不良はより下流のアントシアニン生合成関連遺伝子の発現が関与していると推察された.3品種のカーネーション切り花'エクセリア','ゼバ','マーロ'を0または5%スクロースと殺菌剤(レジェンドMK)を含む溶液に生けて,4°C暗黒下で,0, 14日, 28日間貯蔵した.貯蔵終了直後に最外側の花弁を採取し,色調と新鮮重を測定し,HPLCによるアントシアニン量の分析に供した.同時に採取した花弁から抽出したtotal RNAを用いてRT-PCRにより,カーネーションのPAL,CHS,CHI,F3H,DFR,ANSについて遺伝子発現解析を行った.'エクセリア'では,スクロース処理区においてPg3G量が14日目に増加,その後減少した.未処理区では貯蔵中に減少した.Pg3MGは両処理区において,貯蔵期間が長くなるにつれて増加した.'ゼバ'ではPg3Gが貯蔵中に増加し,スクロース処理区でより多く蓄積したが,Pg3MGは検出されなかった.'マーロ'ではPg3Gが検出されず,Pg3MGはスクロース処理14日目から増加し,未処理区では遅れて増加した.アントシアニン生合成関連遺伝子の発現解析では,'エクセリア'は解析した中でPAL以外の発現がスクロース処理区で未処理区より多くなっていた.'ゼバ'では,ほとんどの遺伝子で14日目に増加し,その後減少するような傾向がみられ,スクロース処理区ではF3H下流のDFRおよびANSの発現が多くなっていた.'マーロ'ではスクロース処理区でANSの発現量が多くなっていた.

グロリオサの切り花ショ糖0または5%を含む生け水に生け,各小花の開葯時採取して花弁の糖含量を測定した.ショ糖を含まない生け水の場合は第1小花の花弁の糖含量が最も高く上位の花ほど低くなった.一方,ショ糖5%を含む生け水に生けた場合は上位の小花ほど糖含量が高くなった.グロリオサ切花をショ糖を含まない生け水に生けた場合,各小花の開葯時の花被片の糖含量は上位節の花ほど低くなる傾向があった.一方ショ糖5%を含む生け水で生けた場合,各小花の開葯時の花被片の糖含量は上位節の花ほど増加する傾向を示した.以上のことから花被の糖蓄積量の不足が発色不良の原因とは言えなかった.次にグロリオサの花被に含まれる主要な色素であるシアニジン-3-グルコシド(Cy3G)とペラルゴニジン-3-グルコシド(Pg3G)の2種類のアントシアニン含量を分析した.ショ糖を含まない生け水に生けた切花とショ糖5%を含む生け水に生けた切花のアントシアニン含量を比較すると,第3花及び第5花の両方で,ショ糖5%を含む生け水に生けた切花の方が高いアントシアニン含量を示した.次にアントシアニンの生合成関連遺伝子の発現動態を明らかにするため,他の単子葉植物のアントシアニン関連遺伝子の配列を参考にしながら,グロリオサ由来のアントシアニン関連遺伝子の単離を試み,GsCHS1,2,3,GsDFR1,2,GsANSをそれぞれ単離した.カーネーション品種エクセリア切り花の貯蔵液の糖が花被片におけるPAL,CHS,CHI,F3H,DFR,ANSの遺伝子発現に及ぼす影響を解析したところ,ショ糖存在下では上記アントシアニン生合成関連遺伝子の発現がショ糖を含まない貯蔵液に保存された切り花に比べて多くなっていることが明らかになった.またカーネーション品種ミラクルルージュの花弁からtotal RNAを抽出し,シロイヌナズナAtMYB75/PAP1様の糖誘導型転写因子の単離を行った.得られた2つのフラグメントはPAP1と同じサブグループ10に属するペチュニアのアントシアニン生合成に関連しているMYB遺伝子An2と相同性が高いことが明らかとなった.2週間スクロース5%の貯蔵液に生けたカーネーション切り花を用い,AtMYB75/PAP1が属するサブグループ10の遺伝子を参考に,糖誘導型R2R3MYB転写因子の単離を試みた.得られた遺伝子のアミノ酸配列はR2R3保存領域がPetunia×hybridaのAN2と77%の相同性を持っており,単離した遺伝子をDcAN2とした.DcAN2にはR2R3保存領域が確認され,サブグループ10およびフラボノイド生合成系に関与するサブグループのアミノ酸配列とDcAN2を比較した分子系統樹から,DcAN2はサブグループ10に近いことが確認された.このことより,サブグループ10と類似した機能を有するR2R3MYB転写因子であることが考えられた.花弁にスクロースを与えてDcAN2の糖誘導性を確認したが,外生のスクロースによる影響は確認できなかった.材料として用いた花弁は,切り前で収穫した切り花に由来し,花弁伸長が盛んな時期であったと考えられ,DcAN2がAN2と同様に花冠の細胞の成長や伸長による内生のシグナルを受けて発現するMYB転写因子である可能性を示唆していた.4週間低温貯蔵中にスクロース処理を行い,その後常温に移し2週間生けた切り花の色素量分析の結果,Pg3Gは低温貯蔵中にスクロース5%処理区のほうがスクロース無処理区よりも多く蓄積していた.Pg3MGは常温へ移動後,スクロース5%処理区で徐々に増加していた.アントシアニン生合成関連遺伝子発現解析の結果,CHS,CHI,DFR,ANSの発現量がスクロース処理を行っている期間で増加していた.6週目において,CHIの発現量はスクロース処理の有無にかかわらず発現がほとんど確認されなかった.
多発性内分泌腫瘍症2型で見られる多様な病態の発症機構の解析

多発性内分泌腫瘍症(MEN)2型の原因遺伝子としてret遺伝子が同定され、MEN2A型変異はリガンド非依存性の2量体形成を誘導してRet蛋白を活性化すること、MEN2B型変異は単量体のままでRet蛋白を活性化することを示してきた。変異Ret蛋白は活性化され細胞のトランスフォームを引き起こすことから、MEN2A及び2B型変異がMEN2型における甲状腺髄様癌などの腫瘍発生の第一義的な要因であると考えられる。Ret蛋白はレセプター型チロシンキナーゼのひとつで活性化されたシグナル伝達におけるShcアダプター蛋白の役割、すなわちRet-Shc-Grb2の複合体がRas-MAPKの経路の活性化へつながり、Shc-Grb2-SOSの複合体がRas-MAPKシグナル経路に関わることを明らかにした。さらに細胞内シグナル伝達の1つとして重要なPhosphatidylinositol3-kinase(PI3-k)の活性化との関連をMEN2B型変異Retにおいて解明した。GDNF刺激でRetを発現する神経芽細胞腫細胞とMEN2A型、2B型変異Retを発現させた線維芽細胞を可溶化し、抗PI3-k(p85)で免疫沈降すると、PI3-k(p85)とRetの直接結合は認められなかったがGab1とPI3-k(p85)の強い結合がみられた。GDNF刺激に伴いGab1のチロシンリン酸化の増加がみられ、MEN2B型変異でGab1の強いリン酸化を認めた。MEN2A、MEN2B型変異細胞でPI3-k活性を測定するとMEN2B型変異細胞においてMEN2A型変異細胞と比較して明らかな活性の上昇をみた。以上からRetを介するPI3-kの活性化はGab1を介することが明らかで、MEN2B型RetにおけるPI3-k活性の上昇がMEN2A型とのphenotypeの違いに関与している可能性が示唆された。多発性内分泌腫瘍症2型の原因遺伝子としてret遺伝子が同定されたが、MEN2A及び2B型変異を導入したret遺伝子をNIH3T3細胞に発現させると、変異Ret蛋白は活性化され細胞のトランスフォームを引き起こすことからも、MEN2A及び2B型変異が多発性内分泌腫瘍症2型において甲状腺髄様癌などの腫瘍発生に第一義的な要因であると考えられている。MEN2A型変異はリガンド非依存性の2量体形成を誘導することによりRet蛋白を活性化し、MEN2B型変異は単量体のままでRet蛋白の活性化を誘導することを示してきた。Ret蛋白はレセプター型チロシンキナーゼであるが、活性化されたシグナル伝達が細胞内でどのような経路で伝わっていくのかは明らかではなかった。レセプター型チロシンキナーゼのシグナル伝達に重要な役割を担っているRas-MAPキナーゼ系のアダプター蛋白であるShcに着目し、Ret蛋白との結合性について検討したところ、ShcはMEN2A,2B型変異Ret蛋白と結合することを示した。Shcはリン酸化チロシン残基を認識するPTB,SH2の2つのドメインを有するが、どちらのドメインが変異Ret蛋白と結合するかを、GST融合蛋白を作製しin vitro binding assayで解析した。その結果、Shcは主にPTPドメインで変異Ret蛋白と結合することが判明した。次にHA tagを付加したShc PTB及びSH2ドメインのみをコードするDNAをそれぞれ作製し、これを変異Ret蛋白を発現する細胞系に導入しin vivoでの結合も確認した。これらの結果からShcアダプター蛋白はMEN2A,2B型Ret蛋白からのシグナル伝達に関与し、PTBドメインがその結合に関わっていることが示唆された。

多発性内分泌腫瘍症(MEN)2型の原因遺伝子としてret遺伝子が同定されたのち、MEN2A型変異はリガンド非依存性の2量体形成を誘導することによりRet蛋白を活性化すること、MEN2B型変異は単量体のままでRet蛋白の活性化を誘導することを示してきた。変異Ret蛋白は活性化され細胞のトランスフォームを引き起こすことから、MEN2A及び2B型変異がMEN2型において甲状腺髄様癌などの腫瘍発生に第一義的な要因であると考えられる。Ret蛋白はレセプター型チロシンキナーゼのひとつで、活性化されたシグナル伝達におけるShcアダプター蛋白の役割を明らかにしてきた。さらに細胞内シグナル伝達の1つとして重要なPhosphatidylinositol 3-kinase(PI3-K)の活性化との関連をMEN2B型変異Retにおいて検討した。GDNFで刺激したRetを発現する神経芽細胞腫細胞株とMEN2A型、2B型変異Retを発現させた線維芽細胞を可溶化し、抗PI3-k(p85)で免疫沈降したところ、PI3-k(p85)とRetとの直接の結合は認められなかったが、Gab1とPI3-k(p85)との強い結合がみられた。GDNF刺激に伴いGab1のチロシンリン酸化の増加がみられ、MEN2型変異特にMEN2B型変異においてGab1の強いリン酸化を認めた。MEN2AおよびMEN2B型変異細胞におけるPI3-k活性を測定したところMEN2B型変異細胞においてMEN2A型変異細胞と比較して明らかな活性の上昇をみた。以上からRetを介するPI3-kの活性化は、Gab1を介することが明らかと考えられる。MEN2B型RetにおけるPI3-k活性の上昇がMEN2A型とのphenotypeの違いに関与している可能性が示唆された。神経芽細胞腫のCell lineにおいてGDNF刺激をするとRetが発現誘導される。本来ret遺伝子が発現していない線維芽細胞腫にMEN2A型変異RetとMEN2B型変異Retを発現させて神経芽細胞腫と比較した。それぞれの細胞を可溶化し、抗PI3-k(p85)で免疫沈降すると、PI3-k(p85)とRetの直接結合は認められなかったがGab1とPI3-k(p85)の強い結合がみられた。GDNF刺激に伴いGab1のチロシンリン酸化の増加がみられ、MEN2B型変異でGab1の強いリン酸化を認めた。MEN2A、MEN2B型変異細胞でPI3-k活性を測定するとMEN2B型変異細胞においてMEN2A型変異細胞と比較して明らかな活性の上昇をみた。以上の結果および過去のデータからRet蛋白はレセプター型チロシンキナーゼのひとつで活性化されたシグナル伝達においてShcアダプター蛋白が重要な役割をはたしていること、すなわちRet-Shc-Grb2の複合体がRas-MAPKの経路の活性化へつながり、Shc-Grb2-SOSの複合体がRas-MAPKシグナル経路に関わることを明らかとなった。さらに細胞内シグナル伝達の1つとして重要なPhosphatidylinositol 3-kinase(PI3-k)の活性化が関わっていることをMEN2B型変異Retにおいて明らかにした。
植物の繁殖投資と資源分配機構

1.常緑多年草(半低木)のフッキソウは3年分の地上部を保有するが、その新旧交代は2.5年の間にゆっくりと進行する。全N量は成長の活発な春に高く、夏に低下するという消長を繰り返す。水溶性N、F-1タンパクも同様な動態を示す。この植物のNプールは、林床が暗くなる夏に葉、茎、根ともにアスパラギンの形態で大量に貯えられることが明らかになった。2.常緑多年草のオウレンでは、地上部の新旧交代は1年間で完了する。葉では全N、水溶性N共に早春と冬に高く、根茎では転流によって夏期に大量に貯えられる。遊離アミノ酸は葉、茎、根茎ともに圧倒的にアスパラギンn型で大量にプールされる。3.春植物のカタクリ、半陰地植物のギョウジャニンニクでは、地上部展開直後の45月には鱗茎中の貯蔵物資は消費しつくされ、全N,水溶性N、遊離アミノ酸ともに著しく減少する。早春カタクリ鱗茎中にはグルタミンが多く、その逆に夏にはアルギニンが多い。ショウジャニンニクでは、冬にアスパラギンが多く、夏にはアンモニア態Nの形でプールされる。4.ノビルのC、Nの動態は、上述した林床植物とは対照的である。特に鱗茎内のN動態は他の植物とは極めて異なった働きを示した。1.当初計画した研究対象の内、ユリ科のノビル、ギョウジャノニンニク、フッキソウに関してはC,Nの分配パタ-ンの分析を終了した。特にフッキソウについては総N,タンパク態N,可溶性N,遊離アミノ酸の各器官別の動態に関する分析を終了し、その結果、生育環境内における光環境の変動に対応した著しい代謝機能の変化と、Nの分配パタ-ンの存在が明らかにされた。最も注目に値する発見の一つは、光資源などの乏しい夏期においては、内生的代謝機能の低下と対応したアマイドであるアスパラギン酸の著しい地上器官の葉、茎などの大量の蓄積が見いだされたことである。その結果はすでに学会誌(Yoshie et al.,1990参照)に発表された。2.ノビル、ギョウジャノニンニク、カタクリに関しては、各器官へのNの分配パタ-ンと季節消長はほぼ完全に分析された。同じく林床植物のカタクリ、オウレンの2種に関してもNの分配パタ-ンと季節消長は分析された。目下、それらの結果の取りまとめが行われている。ギョウジャノニンニク、カタクリなどの鱗茎をもった林床からは、冬期間の低温期に貯蔵期間である鱗茎内に遊離アミノ酸γーメチレンアミノ酸の形態で大量のNがプ-ルされている事実が明らかにされた。3.ミソソバ、タネツケバナ、カタバミ、ナタネなどの一年草を用いた施肥レベル、光量、日長などを変化させた制御環境下における予備実験はすべて予定どおり終了した。目下、C・Nなどの分配パタ-ン分析のための実験の準備を鋭意進めている。1.ユリ科のノビルに関しては、新個体,ラメット個体ごとにC.Nの季節的分配パタ-ンの分析を完了した。ノビルは葉状の鱗片葉が重ね合わさった鱗茎を形成するが、成長の開始と共に(56)ケ月間ですべての鱗茎内のC.Nは地上部の展開と共にすべて消費し、新たに形成された同化器官によって生産された同化産物を鱗茎内に急速に集積する。併せて、娘鱗茎が形成される。2.林床性ユリ科多年草ギョウジャノニンニク,カタクリに関しては、総N,タンパク態N,可溶性N,遊離アミノ酸の各器官別の動態に関する分析を行い、同時に測定された光合成速度の季節的変化とも合わせて、生育環境内の光要因の変動に対応した代謝機能の変化と、Nの分配パタ-ンとの関係が解析された。これらの林床性多年草は、冬期間の低温期に鱗茎内にrーメチレンアミノ酸の形態で大量の遊離アミノ酸をプ-ルしている。

その生理的役割に関しては、さらに検討が必要である。3.ミゾソバ,タネツケバナ,カタバミ,ナタネなどの一年草を用いたさまざまな環境regimeの下における裁植実験は終了し、目下C.Nの分析に着手しつつある。上述した多年草とのC.N分配パタ-ンの相違点をさらに明らかにする必要がある。1.常緑多年草(半低木)のフッキソウは3年分の地上部を保有するが、その新旧交代は2.5年の間にゆっくりと進行する。全N量は成長の活発な春に高く、夏に低下するという消長を繰り返す。水容性N、F-1タンパクも同様な動態を示す。この植物のNプールは、林床が暗くなる夏に葉、茎、根ともにアスパラギンの形態で大量に貯えられることが明らかになった。2.常緑多年草のオウレンでは、地上部の新旧交代は1年間で完了する。葉では全N、水容性N共に早春と冬に高く、根茎では転流によって夏期に大量に貯えられる。遊離アミノ酸は葉、茎、根茎ともに圧倒的にアスパラギンn型で大量プールされる。3.春植物のカタクリ、半陰地植物のギョウジャニンニクでは、地上部展開直後の45月には鱗茎中の貯臓物資は消費しつくされ、全N,水,容性N、遊離アミノ酸ともに著しく減少する。早春カタクリ鱗茎中にはグルタミンが多く、その逆に夏にはアルギニンが多い。ショウジャニンニクでは、冬にアスパラギンが多く、夏にはアンモニア態Nの形でプールされる。4.ノビルのC、Nの動態は、上述した林床植物とは対照的である。特に鱗茎内のN動態は他の植物とは極めて異なった動きを示した。
変分原理に基づくＤｉｒａｃ方程式の解法の開発とその相対論的平均場計算への応用

本研究では、3次元実空間表示を用いた相対論的平均場計算の方法の確立を目指している。これを実現するには、Dirac方程式を3次元の実空間表示で解く必要があるが、そのために解決するべき困難が2つ存在する。一つがvariational collapse,もう一つがfemion doublingと呼ばれる問題である。前年度までに、これらの2つの困難を解決して、空間対称性を仮定しない実空間での相対論的な自己無撞着計算を世界で初めて実現した。これは、不安定核の構造や励起モードの、柔軟で効率の良い記述に向けた大きな進歩である。当該年度に実施した研究内容は以下に挙げる通りである。1.前年度に開発した基底状態の計算コードを改良し、原子核の四重極変形に拘束条件を課した計算を行えるようにした。このような計算は、核の変形や核分裂に関する性質の議論において、また、平均場近似を越えた計算のインプットとして重要なものである。2.上記1と並行して、陽子ー中性子対相関に関する研究も行った。同種核子同士の場合とは異なり、陽子ー中性子間の対相関にはアイソスピンー重項(T=0)と三重項(T=1)チャンネルの競合が起こることが議論されている。本研究では、sd殻及びpf殻のN=Z奇々核に対して芯核+陽子+中性子の構造を仮定し. T=0, T=1両方の対相関を含んだ3体模型計算を行った。J^π=0^+状態とJ^π=1+状態のエネルギー、磁気双極子遷移、ガモフ・テラー遷移確率について、3体模型が定性的または定量的に観測を再現することと、2種類の対相関の競合が原子核のこれらの性質に与える影響を示した。(抄録なし)本研究では、3次元座標空間表示を用いた相対論的平均場計算の方法の確立を目指している。これを実現するに当たり、解決するべき困難が2つ存在する。一つがvariational collapse,もう一つがfermion doublingと呼ばれる問題である。当該年度の研究成果は以下の通りである。1.逆ハミルトニアン法とWilson fermionの方法を組み合わせることにより上述の2つの問題を回避し、有限核に対し空間対称性を仮定することなく、座標表示で自己無撞着計算を行う計算コードを開発した。これを使って、変形核を含むいくつかの原子核に対して、3次元座標表示の相対論的な計算を世界で初めて実現した。逆ハミルトニアン法を用いた計算を実用化するには、巨大な疎行列の逆行列をいかに効率良く計算するかが重要な鍵となる。我々は、Krylov部分空間法とよばれる線形方程式の反復解法により、座標表示のDiracハミルトニアンの逆を高速に計算できることを見出した。2.Hartree-Fock-Bogohubov(HFB)方程式にも逆ハミルトニアン法を適用し、ポテンシャルが球対称である場合にエネルギー固有値・固有関数ともに正確に求められることを確かめた。Krylov部分空間法による1/Hの計算は、Diracハミルトニアンの場合より数十倍から数百倍収束が遅いことがわかった。3.陽子・中性子対相関に関する研究を行い、N=Z核においてアイソスピン一重項チャネルと三重項チャネルの対相関の競合がpf殻核のエネルギースペクトルに与える影響を議論した。またハイパー核_Λ^<19>FにおけるA粒子の不純物効果を芯核+陽子+中性子3体模型を用いて調べ、^<18>F核の励起エネルギーと電磁遷移確率がA粒子の付加によりどう変化するかを予言し、その変化のメカニズムにおけるp殻ハイパー核_Λ^9Be,_Λ^7Liとの相違点を指摘した。当初は認識していなかったfermion doublingの問題に直面し、その解決に時間を割いたにもかかわらず、ほぼ計画通りに研究が進んでいる。

さらに、陽子-中性子対相関に関する研究も並行して行っており、当初の計画以上に進展しているといえる。逆ハミルトニアン法を用いた3次元自己無撞着計算を更に進め実用化するために、まずは原子核の変形度に拘束条件をつけた計算の実現を目指す。また、Fermion doubling問題をより確実に避けるために、自己無撞着解への収束を速くすることも重要である。そのために量子化学の分野で広く用いられているBroyden法とよばれる方法を試すことを検討している。さらに、計算時間のほとんどがハミルトニアンの逆行列を計算する部分に占められているので、これを高速化するためにKrylov部分空間法を改良することも、実用化のために取り組むべき重要な課題である。(抄録なし)
超臨界雰囲気下における噴霧燃焼に関する研究

液体燃料の臨界点を越える高温、高圧雰囲気(超臨界雰囲気)中での噴霧燃焼機構に関する基礎的知見を得るため、(1)光学的な測定が容易な矩形断面の二次元燃焼器による不輝炎燃焼の研究、(2)新たに開発した計測法による臨界雰囲気中の噴霧内の燃料蒸気濃度や平均粒径の測定、(3)超臨界雰囲気中の単一液滴の蒸発と燃焼過程の高速度ビデオ観察を行った。研究実績の概要は以下の通りである。(1)矩形断面の二次元燃焼器中の火炎状態の観察、火炎内の温度分布の測定およびガスクロマトグラフによる成分分析を行った。その結果、不輝炎燃焼の場合には火炎上流側での酸素濃度、温度が高いこと、輝炎の発生は熱分解された燃料中のアセチレン濃度と関係のあることがわかった。(2)燃料の臨界点を越える高温、高圧雰囲気中に噴射した噴霧の燃料蒸気濃度の測定を、パルスルビ-レ-ザを光源としたホログラフィ法により撮影した噴霧の再生像の画像濃度を解析することにより行った。この結果、噴霧内の燃料蒸気濃度の分布は、噴霧中心部で小さく、ある半径位置で極大値をとり、外縁で急激に小さくなるという、鞍形分布をしていることがわかった。また、噴霧の平均粒径の測定を、パルスルビ-レ-ザを光源としたフランホ-ヘル回折法による測定法を用いて行った。この結果、雰囲気温度の増加にともない噴霧の平均粒径は初め増加し、最大値をとった後、減少することがわかった。(3)噴霧の構成要素である単一液滴の超臨界雰囲気中での蒸発と燃焼の過程を、高圧容器中の高温壁面上につくった高温、高圧雰囲気中に液滴を落下させて高速度ビデオで観察した。この実験の結果、雰囲気が空気の場合の方が窒素の場合に比べて液滴の蒸発寿命時間が短くなること、また液滴の燃焼終了時間の圧力依存性が、壁面温度が臨界温度付近とそれ以上の温度範囲で逆になることがわかった。昭和63年度は研究を連続燃焼と間欠燃焼の2グループに分け、連続燃焼グループは高圧下での不輝炎燃焼の研究、間欠燃焼グループでは高温高圧下で蒸発が進行する際の噴霧の粒径計測と蒸気濃度の新しい計測法の確立を行った。1)連続燃焼グループでは、超臨界雰囲気中でも燃料と燃焼用空気の良好な混合状態を維持するため、噴流混合形の燃焼器を新たに開発した。この燃焼器は大気圧下では噴霧の不輝炎燃焼を行わせることができるほど混合の促進された燃焼器であり、この燃焼器を使用して高圧下での燃焼実験を行った。高圧下では不輝炎は得られなかったが、火炎の短縮化が顕著に観察され、また混合状態を改善することにより高圧下でもNOの排出レベルが低下できることがわかった。2)間欠燃焼グループは超臨界雰囲気を作りだすため、高温高圧の試験容器を製作し、そこでの燃料噴霧の蒸気実験を行った。蒸発中の雰囲気のゆらぎと無関係に計測のできるフランホーヘル回折光の直接計測法を開発して測定を行った結果、蒸発の途中で平均粒径が一度増加する現象が高温高圧下でも確認された。3)パルスレーザ・ホログラフィーによる噴霧画像の取り込みを行い、ホムグラフィ再生像に対するシュリーレン解析剪ら燃料蒸気濃度を解析する方法を開発した。

この方法では現在の所、蒸気濃度の純対値の計測には問題があるが、噴霧内蒸気濃度の相対比較を行うことができた。これにより、噴霧先端部に比較的高濃度の蒸気が存在すること、雰囲気の温度と圧力が燃料自身の臨界条件をこえている場合でも、燃料自身は液体状態から温度上昇にともなって徐々に蒸発していくため、急げきな変化は発生しにくいことなどがあきらかになった。液体燃料の臨界点を越える高温、高圧雰囲気(超臨界雰囲気)中での噴霧燃焼機構に関する基礎的知見を得るため、(1)光学的な測定が容易な短形断面の二次元燃焼器による不輝炎燃焼の研究、(2)新たに開発した計測法による臨界雰囲気中の噴霧内の燃料蒸気濃度や平均粒径の測定、(3)超臨界雰囲気中の単一液滴の蒸発と燃焼過程の高速度ビデオ観察を行った。研究実績の概要は以下の通りである。(1)矩形断面の二次元燃焼器中の火炎状態の観察、火炎内の温度分布の測定およびガスクロマトグラフによる成分分析を行った。その結果、不輝炎燃焼の場合には火炎上流側での酸素濃度、温度が高いこと、輝炎の発生は熱分解された燃料中のアセチレン濃度と関係のあることがわかった。(2)燃料の臨界点を越える高温、高圧雰囲気中に噴射した噴霧の燃料蒸気濃度の測定を、パルスルビ-レ-ザを光源としたホログラフィ法により撮影した噴霧の再生像の画像濃度を解析することにより行った。この結果、噴霧内の燃料蒸気濃度の分布は、噴霧中心部で小さく、ある半径位置で極大値をとり、外縁で急激に小さくなるという、鞍形分布をしていることがわかった。また、噴霧の平均粒径の測定を、パルスルビ-レ-ザを光源としたフランホ-ヘル回折法による測定法を用いて行った。この結果、雰囲気温度の増加にともない噴霧の平均粒径は初め増加し、最大値をとった後、減少することがわかった。(3)噴霧の構成要素である単一液滴の超臨界雰囲気中での蒸発と燃焼の過程を、高圧容器中の高温壁面上につくった高温、高圧雰囲気中に液滴を落下させて高速度ビデオで観察した。この実験の結果、雰囲気が空気の場合の方が窒素の場合に比べて液滴の蒸発寿命時間が短くなること、また液滴の燃焼終了時間の圧力依存性が、壁面温度が臨界温度付近とそれ以上の温度範囲で逆になることがわかった。
恐怖を抱かせるような学習が脳内カテコ-ルアミン濃度に及ぼす影響

恐怖などの情動に関与すると考えられている視床下部内の防衛領域を刺激して、三叉神経領域の刺激で誘発される自律神経反射に対する影響を、成熟ネコを用いて検索した。刺激を加えた視床下部領域は解剖学的には脳弓周囲領域に相当し、慢性実験では同部位の刺激によって防衛反応と呼ばれる特有な行動パタ-ンが出現することで知られている。これは動物が緊急事態に遭遇した際に逃避や闘争などの行動と直結して起こす全身的生体反応のことで、瞳孔の散大、血圧上昇、心拍数の増加などがみられる。一方、三叉神経領域である下歯槽神経神経の刺激によって、頸部迷走神経からは潜時約10msecの、また迷走神経心臓枝からは潜時約100msecの誘発電位が得られるが、前者は副交感神経による電位であり、後者は同枝に混入する交感神経の電位であることが判明している。これらの自律神経反射は上位中枢の制御を受けているが、特に、視床下部は自律神経および内分泌器官の最高位中枢として知られている。視床下部防衛領域に連続的電気刺激を加えると、下歯槽神経電気刺激によって頸部迷走神経に誘発される副交感神経性の電位、すなわち三叉ー迷走神経反射が減弱を受けることが観察された。これに対して、下歯槽神経電気刺激によって迷走神経心臓枝に誘発される交感神経性の電位、すなわち三叉ー交感神経反射は著明な変化を受けなかった。また、視床下部防衛領域に加えた電気刺激を条件刺激とすると、下歯槽神経電気刺激を試験刺激として誘発された三叉ー迷走神経反射に対して、条件ー試験刺激間隔約40msecにピ-クをもつ減弱効果を確認できた。以上より、三叉ー自律神経反射は視床下部防衛領域によって選択的に制御されると考えられる。これは恐怖などの情動によって、体性ー自律神経反射が影響を受けることを示唆している。今年度(初年度)はラットに溺水の恐怖を学習させ、溺水した後に断頭して、大脳、下垂体ならびに視床下部のドパミン、ノルエピネフリンおよびエピネフリン3種の各濃度を測定した。同様に、溺水の恐怖を学習させ、断頭直前に四肢を浸水させるのみで、溺水の恐怖を惹起させて上記の脳内の3種のカテコルアミン濃度を測定した。また、対照として恐怖を学習していないラットを同じ条件で断頭し、脳を分離してドパミン、ノルエピネフリンおよびエピネフリン濃度を定量した。以上の3群の間の差を検討したが、まず、同じ条件でも各個体の差が大きく、脳内の同じ部位でも値は大きく異っていた。したがって、実際に溺水させた群、溺水の恐怖を惹起させた群および対照群の3群間の差は明らかとはならなかった。このような結果の原因としては、溺水の時間、回数が十分ではなかった、溺水という刺激自体が適切な恐怖を学習させる刺激とはなり得なかった、各群のラットの個体数が十分ではなかった、酵素アイソトープ法を用いた測定方法が正確ではなかったなどが考えられる。これらの原因のうち、酵素アイソトープ法によるドパミン、ノルエピネフリンおよびエピネフリンのカテコルアミン濃度は、研究代表者ならびに研究分担者がこれまでに報告してあるとおり、極めて正確で信頼がおけると考えられる。したがって、以上の実験方法のうち、ラットに学習をさせる方法と個体数が結果に一定の傾向が生じなかった原因と思われる。来年度には、以上の結果を踏まえ、さらに実験個体数をふやすとともに、予定しているホットプレートによる刺激や尾部をはさむ刺激で脳内カテコルアミン濃度が変動するかを検討する。

平成元年度は、ストレスを軽減させる笑気の吸入により、ラットの脳内カテコ-ルアミン濃度がどのように変化するかを調べた。すなわち、ラットに70%笑気・30%酸素を吸入させ断頭し、直ちに脳組織を分離した。分離した脳組織中のド-パミン、ノルエピネフリンおよびエピネフリンの各濃度を測定し、圧縮空気を吸入させた対照群と比較した。その結果、各個体の差は著しく明らかな変化はみられなかったが、笑気吸入群の視床下部ド-パミン、ノルエピネフリンおよびエピネフリンが対照群と比べ減少する傾向がみられた。昭和63年度および平成元年度とも、脳内カテコ-ルアミン濃度は非常に個体差が大きく、明らかな差は認められない傾向がうかがわれる。これは、やはりラットのストレスに対する個体差は非常に大きく、また、それによる脳内カテコ-ルアミン濃度の変動も個体差が大きいためだと考える。平成2年度は、平成元年度の実験結果で、笑気の吸入により各種カテコ-ルアミン濃度が対照群と比べ、減少する傾向が見られた視床下部に注目して実験を行う。自律神経反射の調節に深く関与していると考えられている視床下部に、電気刺激を与え、三叉・迷走神経反射がどのように影響をうけるかを検索する。本年度(平成2年度)は、恐怖などの情動に関与すると考えられている視床下部内の防御領域を刺激して、三叉神経領域の刺激で誘発される自律神経反射に対する影響を、成熟ネコを用いて検索した。刺激を加えた視床下部領域は解剖学的には脳弓周囲領域に相当し、慢性実験では同部位の刺激によって防御反応と呼ばれる特有な行動パタ-ンが出現することで知られている。これは動物が緊急事態に遭遇した際に逃避や闘争などの行動と直結して起こす全身的生体反応のことで、瞳孔の散大、血圧上昇、心拍数の増加などがみられる。一方、三叉神経領域である下歯槽神経の刺激によって、頸部迷走神経からは潜時約10msの、また迷走神経心臓枝からは潜時約100msの誘発電位が得られるが、前者は副交感神経による電位であり、後者は同枝に混入する交感神経の電位であることが判明している。これらの自律神経反射は上位中枢の制御をうけているが特に、視床下部は自律神経および内分泌器官の最高位中枢として知られている。視床下部防御領域の連続的電気刺激を加えると、下歯槽神経電気刺激によって頸部迷走神経に誘発される副交感神経性の電位、すなわち三叉ー迷走神経反射が減弱をうけることが観察された。これに対して、下歯槽神経電気刺激によって迷走神経心臓枝に誘発される交感神経性の電位、ななわち三叉ー交感神経反射は著明な変化をうけなかった。また、視床下部防御領域に加えた電気刺激を条件刺激とすると、下歯槽神経電気刺激を試験刺激として誘発された三叉ー迷走神経反射に対して、条件ー試験刺激間隔約40msにピ-クをもつ減弱効果を確認できた。以上より、三叉ー自律神経反射は視床下部防御領域によって選択的に制御されると考えられる。これは恐怖などの情動によって、体性ー自律神経反射が影響をうけることを示唆している。