hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
“無蛍光”蛍光タンパク質で実現する組織深部分子活性化イメージング

今年度は、赤色蛍光タンパク質であるmCherryと色素タンパク質であるUltramarineのキメラを作製し、これを鋳型にして、Error-prone PCRによるランダム変異導入により、吸収はあるが量子収率がほぼ0の無蛍光赤色蛍光タンパク質(ShadowR)の開発を進めて来た。作製したキメラ分子は凝集しやすく、また大腸菌内でも封入体に入り易かったため、まずは、キメラ分子の親水性を高くすることでダイマー化や凝集が起こりにくくなるようにすることを目指した。具体的には、キメラ分子のアミノ酸の内、側鎖が外側を向いているアミノ酸をターゲットにして飽和変異導入を行った。変異体の内、吸収の大きいものを大腸菌ライブラリーよりピックアップし、これらのシークエンスを調べた。シークエンスを行った変異体の内、アミノ酸が元のよりもより親水性のアミノ酸に置換されているものをピックアップした。このような操作を数十か所のアミノ酸について行うことにより親水性の高い変異体(ShadowR)を作製することに成功した。29年度が最終年度であるため、記入しない。組織浸透性の高い長波長に最適化された新規“無蛍光"赤色蛍光タンパク質を開発し、組織内神経細胞イメージングに応用することが本研究の目的である。特に、これを個体マウスに応用することで、運動学習過程における大脳皮質運動野の細胞内シグナル分子の活性化イメージングとCa2+イメージング(脱分極)を同時に行う。このようにして、運動学習過程における回路活動パターン遷移のメカニズムを明らかにする。赤色蛍光タンパク質であるmmCherryを鋳型にし、Error-prone PCRによるランダム変異導入により、吸収はあるが量子収率が2%の暗い赤色蛍光タンパク質(dark mCherry)を開発することに成功した。dark mCherryの吸収・発光スペクトルや各種パラメータを計測し性能評価を行った。また、mRuby2(FRETのドナー)とdark mCherry(アクセプター)のペアを既出のFRETプローブに応用することで性能を評価した。当初の目的であった無蛍光蛍光タンパク質の開発に向けて、量子収率が0とはいかないまでも、2%にするこに成功した。また実際に、生細胞でFRET観察が行えることが確認できた。今後は、さらに量子収率を低下させた赤色蛍光タンパク質の開発を行う。
ＥＲｐ４４によるジスルフィド結合形成酵素Ｅｒｏ１αの小胞体局在機構の解明

高等生物細胞の小胞体において正常な高次構造を獲得した新生タンパク質は、分泌経路に従い細胞外へと輸送される。この時、構造未成熟なタンパク質や小胞体局在配列をもたない小胞体タンパク質は、PDIファミリータンパク質の1つであり小胞体局在配列をもつERp44と結合することによって小胞体へと逆行輸送を受けることが過去の研究から明らかにされている。本研究はERp44の立体構造変化機構やその立体構造変化に基づく機能制御機構の解明を目的として行っている。三年目である今年度はERp44による未成熟タンパク質の小胞体へのリテンション機構に小胞体ーゴルジ体間に存在するpH勾配以外の要因も関与するという観点から研究を展開した。ERp44はa, b, b'の3種類のチオレドキシン様ドメインとC末のtail (C-tail)から構成される。aドメイン上には基質との結合に必要な疎水性表面やシステインが存在するが、これら結合サイトはC-tailによって覆われている。ERp44が基質を小胞体にリテンションする為には、このC-tailが開き基質との複合体を作ることが必要である。また、興味深いことにERp44 C-tailの根元にはERp44ホモログ間で高度に保存されているヒスチジンリッチな領域が存在する。ヒスチジンのpKaは中性付近であることからpH依存的な構造変化に関与することが考えられ、昨年度に続きこの領域に着目して研究を行った。系統的に様々な生化学解析を行った結果、ヒスチジンリッチな領域が亜鉛イオンと結合しC-tailの開閉を行うことや、pH依存的な構造変化とは別に働く可能性があること、亜鉛イオン依存的な構造変化とpH依存的な構造変化で結合する基質が違うことなどが示された。これらの成果はERp44が小胞体品質管理のために行う構造変化機序の詳細をさらに明らかにするものである。26年度が最終年度であるため、記入しない。我々はこれまで、細胞内でのタンパク質品質管理機構について、新生ポリペプチド鎖へのジスルフィド結合の形成という観点から研究を展開してきた。高等生物細胞の小胞体において、ジスルフィド結合の形成を介した酸化的フォールディングを行う蛋白質Ero1αは小胞体におけるタンパク質ジスルフィド形成において中心的役割を担う酸化酵素である。しかしながら興味深いことにEro1αは小胞体内在のためのリテンションシグナルをもたない。そこでEro1αは、ゴルジ体においてPDIファミリータンパク質の一つであるERp44と結合することで、小胞体へと逆行輸送されることが報告されている。本研究は小胞体-ゴルジ体間に存在するpH勾配に着目し、ERp44のpH依存的な構造変化機構やその構造変化に基づく機能制御機構の解明を目的として行っている。初年度である今年度はERp44の様々な変異体を作製し、Ero1αとの相互作用解析やANS蛍光プローブを用いた疎水性領域の変化を調べた。その結果として、ERp44のC末端に存在するtai1がpH依存的に開閉していることやERp44のN末端側に存在するaドメイン上のCysを中心とした水素結合ネットワークがpH依存的なtailの開閉制御を行っていることを明らかにした。また、in vivoでの実験結果からこのpH依存的な構造の変化がEro1αのみならず、ERp44自身のリテンションにとっても必須であることを示した。この成果はERp44が小胞体品質管理のためにpH依存的な構造変化を行うことを明らかにし、ERp44サイクルという概念を確立するための第1歩となりうる。高等生物細胞の小胞体において、ジスルフィド結合の形成を介した酸化的フォールディングを行うタンパク質Erolαは、小胞体におけるタンパク質ジスルフィド結合導入において中心的役割を担う酸化酵素である。しかしながら興味深いことに、Erolαは小胞体内在のためのリテンションシグナルをもたない。Erolαは、ゴルジ体においてPDエファミリータンパク質の一つであり小胞体リテンションシグナルをもつERp44と結合することで、COPI被覆ベシクルによって小胞体へと逆行輸送されることが過去の研究から明らかにされている。二年目である今年度は細胞内でのタンパク質品質管理機構についてERp44による未成熟タンパク質の小胞体へのリテンション機構という観点から研究を展開した。ERp44が基質を小胞体にリテンションする為には、基質との複合体を作ることが必要である。そこで、どのような複合体を形成するのかX線結晶構造とX線小角散乱法を用いて解析を試みた。結果、X線小角散乱法における複合体の解析の為の条件検討を終え、複合体の結晶も得られるようになった。さらに、ERp44のヒスチジンを多く含むループ領域がpH依存的なtailの開閉制御に補助的に関わることを明らかにした。in vivoでの実験結果から、このヒスチジンを多く含むループ領域が欠失するとpH依存的なERp44の構造変化が十分に起こらず、ERp44自身が小胞体へリテンションされなくなることが示された。これらの成果はERp44が小胞体品質管理のために行うpH依存的な構造変化を明らかにするために欠かすことのできないものである。

高等生物細胞の小胞体において正常な高次構造を獲得した新生タンパク質は、分泌経路に従い細胞外へと輸送される。この時、構造未成熟なタンパク質や小胞体局在配列をもたない小胞体タンパク質は、PDIファミリータンパク質の1つであり小胞体局在配列をもつERp44と結合することによって小胞体へと逆行輸送を受けることが過去の研究から明らかにされている。本研究はERp44の立体構造変化機構やその立体構造変化に基づく機能制御機構の解明を目的として行っている。三年目である今年度はERp44による未成熟タンパク質の小胞体へのリテンション機構に小胞体ーゴルジ体間に存在するpH勾配以外の要因も関与するという観点から研究を展開した。ERp44はa, b, b'の3種類のチオレドキシン様ドメインとC末のtail (C-tail)から構成される。aドメイン上には基質との結合に必要な疎水性表面やシステインが存在するが、これら結合サイトはC-tailによって覆われている。ERp44が基質を小胞体にリテンションする為には、このC-tailが開き基質との複合体を作ることが必要である。また、興味深いことにERp44 C-tailの根元にはERp44ホモログ間で高度に保存されているヒスチジンリッチな領域が存在する。ヒスチジンのpKaは中性付近であることからpH依存的な構造変化に関与することが考えられ、昨年度に続きこの領域に着目して研究を行った。系統的に様々な生化学解析を行った結果、ヒスチジンリッチな領域が亜鉛イオンと結合しC-tailの開閉を行うことや、pH依存的な構造変化とは別に働く可能性があること、亜鉛イオン依存的な構造変化とpH依存的な構造変化で結合する基質が違うことなどが示された。これらの成果はERp44が小胞体品質管理のために行う構造変化機序の詳細をさらに明らかにするものである。26年度が最終年度であるため、記入しない。ERp44変異体の作製、その後のErolαとの相互作用解析やANS蛍光プローブによる疎水性領域の変化など交付申請書に記載した今年度の研究予定はおおむね達成された。また今年度までに行った内容をまとめた論文をMolecular Cellに投稿し、現在in pressである。今年度は精力的にX線結晶構造解析やX線小角散乱によるERp44-基質複合体のデータ収集・解析に取り組んだ。位相決定はできなかったが、ERp44-基質複合体の結晶の作製などERp44のpH依存的な構造変化機構の更なる解析は達成できた。現在、ERp44-Ero1αの複合体を用いた結晶構造解析に挑んでいるが、結晶が上手く得られていない。そこで来年度は複合体の結晶作製と平行して結晶の必要ないX線小角散乱によるデータの収集・解析を行う。また、ERp44をそのモデル基質との複合体の状態で結晶化スクリーニングを並行して行い、複合体作製に関わるERp44のアミノ酸を特定する。さらに細胞内にトランスフェンクションしたERp44(タグ付き)について免疫沈降を行い、ERp44結合蛋白質をプロテオミクス的手法により同定する。その後、同定した基質についてパルスチェイス実験を行い、ERp44に依存した高次構造形成の経時変化を観測する。これにより基質蛋白質の成熟化におけるERp44の関与を検証する。
磁性めっき線の開発と渦電流形変位センサへの適用に関する研究

渦電流形変位センサの直線範囲の拡大のために、高透磁率と高抵抗率の両者をもつパーマロイ薄膜(80% Ni)を銅線の外周にめっきした磁性めっき線を製作した。このパーマロイ薄膜の初透磁率は200程度であり、Fe薄膜よりも2倍も初透磁率が大きいことが分かった。また、銅線コイルの温度ドリフトの実測値と理論計算値との差は0.5%/FS程度であり、実用上十分な解析精度があった。さらにFe薄膜をもつ磁性めっき線コイルの温度ドリフト特性は銅線コイルとほぼ同程度であった渦電流形変位センサの直線範囲の拡大のために、高透磁率と高抵抗率の両者をもつパーマロイ薄膜(80% Ni)を銅線の外周にめっきした磁性めっき線を製作した。さらにFe薄膜をもつ磁性めっき線コイルの温度ドリフト特性は銅線コイルとほぼ同程度であった従来の渦電流形変位センサ(EC変位センサ)のコイルの外径Dに対する直線範囲Lの比は,L/D=0.48程度であり,直線範囲を拡大するためにはコイルの外径を大きくする必要があった。L/Dの拡大のために銅線(COW)の外周に磁性薄膜をめっきした磁性めっき線(MPW)を用いたコイル(MPWコイル)を提案して,COWコイルと比較して1.5倍以上の直線範囲の拡大を実現してきた。MPWは磁性薄膜の磁気シールド効果によって近接効果に起因する交流抵抗の増加を抑制でき,かつインダクタンスを増加,さらに測定対象により多くの磁束を作用させることができる。さらなるL/Dの拡大のためには,従来の磁性薄膜に用いていたFeよりも高透磁率で,かつ高抵抗率の両者をもつパーマロイ薄膜をめっきしたMPWを開発する必要がある。そして,EC変位センサの変位測定感度をさらに向上させて,L/Dを従来技術の2倍以上に拡大することを目的としている。コイル形状に巻くためにMPWには応力が作用する。したがって,応力が作用しても,その磁気特性が劣化しないことも必要である。このためには磁歪定数がゼロであることが必要であり,80%Niのパーマロイ薄膜をめっきした。このパーマロイ薄膜の初透磁率は400程度であり,Fe薄膜よりも4倍も初透磁率が大きいことが分かった。また,磁性薄膜の初透磁率と抵抗率および厚さが近接効果に与える影響を理論的に解明した。さらに,Fe薄膜をもつMPWコイルの温度ドリフト特性をセンサの励振周波数を調整することで改善する方法を理論と実験の両面から実証した。従来の渦電流形変位センサ(EC変位センサ)のコイルの外径Dに対する直線範囲Lの比は,L/D=0.48程度であり,直線範囲を拡大するためにはコイルの外径を大きくする必要があった。MPWにはコイル形状に巻くために応力が作用しても,その磁気特性が劣化しないことも必要である。このためには磁歪定数がゼロであることが必要であり,80% Niのパーマロイ薄膜をめっきした。このパーマロイ薄膜の初透磁率は200程度であり,Fe薄膜よりも2倍も初透磁率が大きいことが分かった。また,COWコイルの温度ドリフトを理論計算によって求めた。実測値と理論計算との温度ドリフトの差は0.5%/FS程度であり,実用上十分な解析精度があった。さらにFe薄膜をもつMPWコイルの温度ドリフト特性を磁性薄膜と励振周波数の両者の観点から検討して,COWとほぼ同程度の温度ドリフト特性が得られた。
椎間板変性におけるWnｔシグナルとアラキドン酸カスケードとの分子メカニズムの解析

腰痛患者における医療費は膨大であり、腰痛に伴うADL障害は社会問題となっている。これまで炎症性サイトカインによる椎間板変性のメカニズムが報告されていたが、今回の解析からTNFーαーPGE2/EP受容体を介したpathwayがWntシグナルを活性化させ、椎間板細胞分化を誘導した可能性が示唆された。これらのシグナルは炎症誘導に関与する重要な転写シグナルであり、椎間板細胞におけるWntシグナルの分子スイッチとして働く可能性が考えられた。今後はTNFαーPGE2シグナルによるWntシグナルの活性化をレセプター部位で抑制できれば、椎間板変性における新たな分子標的治療薬に繋がる可能性が考えられた。【目的】プロスタノイドのうちプロスタグランジン(PG)E2は炎症や疼痛など多彩かつ、時に相反する作用を有する。近年、その受容体であるEP受容体のアイソフォームが、軟骨分化や軟骨代謝の特異的シグナル伝達に関与しており、軟骨変性過程において重要な役割をはたす事が報告されている。しかしながら椎間板細胞におけるその機能や発現については未知である。そこで平成26年度は、椎間板細胞におけるEP受容体の発現と椎間板細胞分化に関わるWntシグナルとPGE2による発現制御を解析した。実験はSprague-Dawleyラット(n=24、11週齢)から採取した椎間板細胞を用いた。【実験】実験1:椎間板細胞中のEP受容体のアイソフォーム(EP-1、-2、-3、-4)の遺伝子発現について解析した。実験2: Tcf bindingmotifをもつレポータープラズミドであるTopflashを遺伝子導入しPGE2刺激後の転写活性を評価した。実験3: PGE2刺激後のWnt関連遺伝子の遺伝子発現について解析した。【結果】1:髄核細胞、線維輪細胞ともにEP受容体(EP-1、-2、-3、-4)の遺伝子発現を認めた。EP-2、-3、-4の遺伝子発現は髄核細胞よりも線維輪細胞で発現が強かった。髄核細胞中ではEP-1、EP-4、EP-3、EP-2の順に遺伝子発現が高かった。2:髄核細胞、線維輪細胞ともにPGE2 (50μM、24時間)刺激後においてTopflashの転写活性の上昇を認めた。3: PGE2刺激後Wnt関連遺伝子の発現上昇を認めた。【考察】椎間板細胞中におけるEP受容体の発現を認めた。平成26年度の解析から、PGE2/EP受容他を介したpathwayがWntシグナルを活性化させ、椎間板細胞分化を誘導した可能性が示唆された。昨年度の解析から椎間板細胞中におけるEP受容体の発現を認めた。さらにPGE2/EP受容体を介したシグナル経路が、椎間板細胞分化を誘導する可能性が示唆された。そこで本研究では引き続き炎症性サイトカインTNFαによるWntシグナルの伝達経路についてin vitroで解析することを目的とした。TNFα刺激によりCOX-2(-1432/+59)reporterの転写活性は上昇したにもかかわらずNFκβのbinding siteが欠失したCOX-2 (-220/+59) reporterではTNFα刺激による発現が誘導されなかった。またNFκβやCOX-2のinhibitor (MG132やCelecoxib)を用いた発現解析の結果から、椎間板細胞におけるTNFαによるWntシグナルの活性化はNFκβシグナルによる直接的作用とCOX-2/PGE2シグナルを介した間接的作用がそれぞれシグナル調整に関与している可能性が示唆された。今後はこれらのシグナルを制御することが可能となれば椎間板変性における新たな分子標的治療薬に繋がる可能性が示唆された。当初は平成27年度を大型動物椎間板変性モデルを用いたカスケードの解析を検討していたが予算の関係上難しくなった。昨年度の解析からTNFα刺激によりCOX-2(-1432/+59)reporterの転写活性は上昇したにもかかわらずNFκβのbinding siteが欠失したCOX-2 (-220/+59) reporterではTNFα刺激による発現が誘導されなかった。平成28年度は、引き続きPGE2によるWntシグナルの発現について解析をおこなった。その結果PGE2刺激によりWnt関連遺伝子の発現は上昇した。この過程においてはgain-of-functionやloss-of-functionによる検討から、椎間板細胞におけるEP受容体のうちEP3の関与が示唆された。平成26年度から28年度にかけ椎間板変性におけるWntシグナルとアラキドン酸カスケードについての分子学的解析をおこなったが、これらのシグナルは炎症誘導に関与する重要な転写シグナルであり、椎間板細胞におけるWntシグナルの分子スイッチとして働く可能性が考えられた。今後はTNFα-PGE2シグナルによるWntシグナルの活性化をレセプター部位で抑制できれば、椎間板変性における新たな分子標的治療薬に繋がる可能性が考えられた。

これまで炎症性サイトカインによる椎間板変性のメカニズムが報告されていたが、今回の解析からTNFーαーPGE2/EP受容体を介したpathwayがWntシグナルを活性化させ、椎間板細胞分化を誘導した可能性が示唆された。これらのシグナルは炎症誘導に関与する重要な転写シグナルであり、椎間板細胞におけるWntシグナルの分子スイッチとして働く可能性が考えられた。今後はTNFαーPGE2シグナルによるWntシグナルの活性化をレセプター部位で抑制できれば、椎間板変性における新たな分子標的治療薬に繋がる可能性が考えられた。当初の研究計画に準じて実験が遂行できていると考える。平成28年度は、大型動物変性モデルを用いたWntシグナルの分子メカニズムを明らかにすることを目的として実験を遂行する。脊椎脊髄病学平成27年度は大型動物椎間板変性モデルやTop-galトランスジェニックマウスにおけるWntシグナルとアラキドン酸カスケードとの分子メカニズムを明らかにすることを目的として実験を遂行する。論文校正や論文投稿料として約200,000円の予算が必要であり、当該年度の残額98,962円ではまかないきれなかったため、翌年の予算を使用し投稿料にあてることとした。本年度旅費の使用分がなかったため論文校正や論文投稿料に当該年度の残額98,962円を合算して使用する。平成27年度は研究成果を国内外で発表する予定であり、適切な研究費使用を行う。
青少年期における身体組成および骨密度に及ぼす身体活動および食生活行動の影響(日本の中規模市および近隣在住の小・中学生の場合)

小・中学生期は、形態的発育の顕著な身体充実期であり、この時期の体力、身体組成ならびに骨密度の発達は、その時期の健康のみならず、その後の健康状態に大きく関係する。そこで、本研究では、中規模都市及びその近隣在住の小・中学校児童・生徒を対象に、身体組成、骨密度(以下Stiffness Indexを骨強度とした)や体力の測定並びに身体活動状況や栄養調査結果を通して、青少年期の身体組成や骨強度の特徴とその性差、これらの発育・発達と体力の関係、日常のスポーツ活動参加とのかかわり、身体組成及び骨強度と身体活動・栄養摂取状況等について明らかし、今日の生活環境に応じた望ましい身体活動や食生活行動を提案することである。なお、小中学校の児童・生徒でインピーダンス法を用いた身体組成測定者は、男子1242名であり、女子1175名であった。このうち、超音波法を用いた骨強度の測定者は、男子で430名であり、女子415名であった。本研究で得られた主な結論を要約すると次の通りである。1.青少年期の身体組成は、小学6年生を境に、男子では除脂肪体重が、女子では体脂肪が増加して性差の拡大傾向がみられた。2.男女ともに、除脂肪体重と骨強度との間には、高い関連がみられた。3.除脂肪体重と体力、骨強度と体力との間には、高い関連がみられた。4.運動による骨強度の発達効果が、男子では中学1年頃から、女子では小学6年頃から顕著にみられた。5.運動習慣は、筋力、持久力及び筋パワー等の体力向上に大きくかかわっていた。6.中学生期では、菓子類や嗜好飲料の過剰摂取、種実類や海草類の拒食などアンバランスな食行動がみられた。これらのことから、地方都市といえども食生活の乱れが浸透し、食と運動の連携が十分に機能していない状況がみられる。青少年の健全な成長を促すためには、栄養教育と運動の一体化を図ることが緊要であると示唆された。近年、小・中学生の体力の低下、肥満もしくは極度の痩身ならびに骨折の増加が指摘されている。しかし、小・中学生期は、形態的発育の顕著な身体充実期であり、この時期の体力、身体組成ならびに骨密度の発達は、その時期だけの問題ではなく、その後の健康状態に大きく関係する。こうした観点から13年度は中規模市の諌早市で協力を得られた小学校、また本学所在地および周辺市町の長崎市、長与町および時津町等の地域運動サークルに参加している児童・生徒を対象に、身体組成(協力校はインピーダンス法のみ)、骨密度体力測定を実施した。また、これらの測定に合わせて質問紙による身体活動状況や食生活行動調査等を実施した。なお、骨密度測定に時間を要するため、協力小学校の測定は授業の支障のない範囲の各学年1クラスを対象とした。協力小学校で得られた2年生から6年生までの161名のデータ(骨密度測定者)については、第56回日本体力医学会大会において、体脂肪率では男子児童は16%18%で推移したが、女子児童では学年進行とともに上昇傾向がみられ、2、3、5年生の男女間に有意な差がみられたこと、除脂肪体重は男女とも体重増加のおよそ70%80%占めていたこと。骨密度は男女とのほぼ同等値で緩やかな増加傾向がみられことなどを報告した。

地域運動サークル参加者については、これまで小学生高学年生から中学生までの男女173名を測定し、データの蓄積に努めているが、一般児童・生徒との身体組成や骨密度の発達差異、身体組成や骨密度と体力、食事摂取状況との関連、身体組成測定手法の違い(インピーダンス法、空気置換法および皮下脂肪厚法)による体脂肪率の比較・関連などについて検討を試みている。近年、・小・中学生の体力の低下、肥満もしくは極度の痩身ならびに骨折の増加が指摘されている。しかし、小・中学生期は、形態的発育の顕著な身体充実期であり、この時期の体力、身体組成ならびに骨密度の発達は、その時期だけの問題ではなく、その後の健康状態に大きく関係する。こうした観点から13年度は中規模市の諌早市で協力を得られた小学校、また本学所在地および周辺市町の長崎市、長与町および時津町等の地域運動サークルに参加している児童・生徒を、14年度は前年度の協力小学校および運動サークル参加児童・生徒を継続対象とするともに、さらに長与町内の協力を得られた中学校生徒を対象に、身体組成(協力校はインピーダンス法のみ)、骨密度体力測定を実施した。また、これらの測定に合わせて質問紙による身体活動状況や食生活行動調査等を実施した。なお、骨密度測定に時間を要するため、小中学校では授業の支障のない範囲の各学年1クラス程度を対象とした。協力小学校で得られた測定データについては、第56回日本体力医学会大会では、身体組成、骨密度及び体力の男女学年別の特徴や関連を、第57回日本体力医学会大会では、2ヵ年間のデータをもとに身体活動状況、つまりスポーツクラブ参加の有無から身体組成、骨密度及び体力の違いを報告した。特に、スポーツクラブ参加、つまり継続した運動の実践の違いが高学年になるに伴って参加者の顕著な伸びがみられたが、一方、非参加者の伸びは緩やかであり、骨密度では停滞する傾向までみられた。これらの解析結果をもとに、健全な発育発達を促すための運動の習慣の重要性を報告した。これまで、骨密度測定者人数で換算すると、測定者は協力小学校で延べ380名、協力中学校で185名(インピーダンス法による体脂肪率及び体力含む)、地域運動サークル参加者については、2年間で小学生高学年生から中学生までの男女372名を測定してデータの蓄積に努め、一般児童・生徒との身体組成や骨密度の発達差異、身体組成や骨密度と体力、身体活動状況や食事摂取状況との関連、身体組成測定手法の違い(インピーダンス法、空気置換法および皮下脂肪厚法)。による体脂肪率の比較・関連などについで検討を試みている。小・中学生期は、形態的発育の顕著な身体充実期であり、この時期の体力、身体組成ならびに骨密度の発達は、その時期の健康のみならず、その後の健康状態に大きく関係する。本研究では、13年度は中規模市の諌早市で協力を得られた小学校、また本学所在地および周辺市町の長崎市、長与町および時津町等の地域運動サークルに参加している児童・生徒を、14、15年度はさらに長与町内で協力が得られた中学校生徒を対象に、身体組成(協力校はインピーダンス法のみ)、骨密度及び体力測定を実施した。また、これらの測定に合わせて質問紙による身体活動状況や食生活行動調査等も実施している。これまでに得られた測定データを基に、第56回、第57回日本体力医学会大会あるいは長崎県健康科学研究会において、身体組成、骨密度及び体力の男女学年別の特徴や関連や身体活動状況、つまり、スポーツクラブ参加の有無からの身体組成、骨密度及び体力の違いなどを報告した。
足底圧分布パターンの定量化から発育に伴う歩行・走行動作の発達を評価する試み

本研究は、発育発達に伴う歩行・走行動作中の足底圧分布データから幼児・児童の足底圧分布パターンの定量化を行うことを目的とした。参加者は、幼児と児童および成人男女を対象とし、歩行および疾走動作中の足底圧分布データから足底を11部位に分割し、接地時間、接地面積、最大反力、最大圧力、力積量および圧力力積量を算出した。幼児の児童の足底圧分布データにおける、中足骨部位の圧力は、25mタイムに有意な負の相関関係を示した。また、発育に伴い、中足骨外側部位の圧力値が増加し、6歳前には、成人に近い足底圧分布パターンを獲得していることが示された。足底の圧力分布変化は,ヒトの動作の原因を探る情報として歩行・走行動作の評価に用いられている.地面反力ではなく,足底の圧力値を評価する理由には,素材など構造を変形または歪に関係し,ヒトの足底の感覚受容器は,圧力を「痛み」として感じられるため,病理歩行においてはその重要性はより高まる指標となる.スポーツでは,動きの巧みさに「スペーシング,グレーディング,タイミング」といった要素を,足底圧分布の色の変化による視覚的情報から動作の映像情報にはない力の地面への伝達、または力感を伝えることが可能となり,選手や指導の対象者にフィードバックする際に有効的な手段となる.本研究の目的は、発育発達に伴う歩行・走行動作中の足底圧分布データから幼児・児童の標準的な足底圧分布パターンを定量化し,歩行,走行動作を評価することを試みる.本年度は,足底圧分布パターンから動作を推定するための方法や,データの再現性,妥当性についての検討を行ってきた.特に歩行動作においては、評価軸を決定するために,「推進効率」を一つの評価指標として用いた.走行動作に特化したトレーニングを行っている陸上短距離選手と同年代の一般成人男性を歩行立脚期中の足底圧分布パターンと足圧中心軌跡の比較を行った.歩行立脚中は,4つのフェイズに区分し,各フェイズの絶対時間と相対時間を算出した.その結果,陸上短距離選手は,歩行立脚期中に前足部位の接地時間が明らかに長い時間を示し,更にこの時の足圧中心軌跡は,前足部位において,一般成人に比べて内側に位置していることがみられた.陸上短距離選手の足圧中心の前後速度は,一般成人より高い値を示し,より推進効率が優れていることが示された.歩行中の時空間パラメータには,両群には有意な差がみられないことから,陸上短距離選手は,身体合成重心位置と踵接地位置との前後距離を短くした歩行パターンであることが示された.本研究を遂行するための方法の確立や,再現性,妥当性の検討は十分に進んでおり,足底圧分布データから動作の推定を簡易的に行うこと可能である.この足底圧分布データから動きの推定に関して更なる検討が必要であるが,現時点においては,十分な成果を得られている。幼児,児童の計測に関しては,既に第1次時測定を男女園児60名を対象に終えており,更に,発育発達の影響を検討するために縦断的測定の調整も既に協力が得られている.現在はそのデータの分析段階である.今後,データ数を増やしていく予定であり,更に協力の得られる幼稚園,小学校とスケジュールを調整している.今後のデータ数を増やすことによって,発育発達に伴う足底圧分布パターンの定量化から幼児・児童の歩行,走行動作の評価を行うデータベースの構築が期待される.足底圧分布データはこれまで,主に足部中足骨の障害や疾病(糖尿病,リウマチ)などによる足底部位の変形や損傷の診断に用いられてきた.しかし,一方で足底圧分布データは,地面からの力の伝達や圧力情報を色のコンターに表して定性的に捉えることが可能となるため,動作の改善のために運動実施者の力感「力発揮の感じ」を捉えたフィードバック方法として,スポーツの指導現場や臨床現場において有効的な手段となっている.またそのデータの足圧中心(COP)位置情報は,身体合成重心と関係し,動きを推測する手段ともなりえる.しかし,この足底圧分布データの活用は,上述するように定性的な評価や診断に留まっていることが現状であり,足底圧分布データと動作の関係性は明らかではない.本研究は,歩行・疾走中の足底圧分布データと全身の運動学データおよび足部の運動学データを同時に収集し,足底圧分布データの変化から運動学データの推定の検討を行った.その結果,足底圧分布データの量的な大きさは,歩行速度や疾走速度に関係し,さらに,踵部位と前足部位の荷重・圧力値は,歩行・疾走速度のストライドや踵の接地角度および足関節の角度に関係する傾向を示したが,一方で足底圧分布の内側、外側の荷重・圧力値と運動学データの関係には個人差がみられた.これは足部機能より個人のアーチや足部構造の個人差が影響していると推察された.このような情報をもとに幼児・児童の足底圧分布データから運動学の推定を試みた.幼児・児童の足底圧分布パターン変化は,足部や身長の発育発達および動作の習熟度によって個人差が大きい傾向を示した.特に幼児・児童は,身長が関係するストライドなどが足底圧分布データの違いに関係することが考えられた.本研究は、発育発達に伴う歩行・走行動作中の足底圧分布データから幼児・児童の足底圧分布パターンの定量化を行うことを目的とした。

幼児の児童の足底圧分布データにおける、中足骨部位の圧力は、25mタイムに有意な負の相関関係を示した。また、発育に伴い、中足骨外側部位の圧力値が増加し、6歳前には、成人に近い足底圧分布パターンを獲得していることが示された。本年度の研究の課題は,幼児および児童のデータ数の蓄積を増やし,データベース化をしていくことが最大の課題となる.現在は,既に計測データ収集を終えている幼児のデータを分析している段階であるが,このデータに関して,非常に個人差,ばらつきが大きいことが足底圧分布データから定性的にみられている.成人では,足底の前後方向へ関係する圧変化の大きさから動作の推定に至ったが,幼児においては,足底の外側と内側の圧力変動が大きくことがみられるため,回内・外動作の検討を新たに取り入れる必要性がある.更に足部のアーチ機能の形成は6歳ぐらいに完成するがそれ以前の幼児においては,アーチ機能が有効的に機能ことが考えられ,これは,歩行・走行時の歩幅,歩隔などの基本パラメーターに影響することが大いに予想される.従って今後の取り組みとしては,足底圧分布データと幼児・児童の足部形状データの収集を同時に行っていく予定である.スポーツバイオメカニクス初年度は,研究活動がおおむね順調に進んでおり,研究費に関しても予定通りの使用ができたが,消耗品の購入などで差額が生じた.今年度の研究費の繰り越し金に関しては,計測時に必要な消耗品(アルコール綿など)など少額な経費に充てる予定である.また,前年度の繰り越し金は今年度の研究費に大きな影響はないため,当初計画通りに,解析ソフトウエアの修正、依頼費用と研究成果を国内外の学会費用と論文投稿への費用として使用する予定である.
ヒト癌抑制遺伝子候補101F6によるレドックス擾乱細胞死誘導機構の解明

ヒト染色体3p21.3領域に存在する101F6遺伝子は顕著な癌抑制作用を示す事が知られているが、その分子機構については不明である。101F6遺伝子産物は2個のヘムbを含有する膜貫通型タンパク質でb561ファミリーの一員であることから、アスコルビン酸(AsA)あるいはモノデヒドロアスコルビン酸(MDA)ラジカルが関与する生体膜貫通レドックス反応がその生理機能発現に深く関与していると思われる。本研究ではAsA/MDAラジカルによる生体膜内外でのレドックス擾乱をプログラム細胞死へと導く細胞内メッセージとして捉え、その細胞死シグナルを生体膜(ER膜)において発生・制御する素子としての101F6タンパク質の役割と分子機構を解明することを目的としている。我々はメタノール資化性酵母Pichia pastorisによる101F6タンパク質発現系を用い、大量発現と高純度精製方法を確立した。並行して、ヒト癌組織由来のA549細胞を培養し、界面活性剤DDMあるいはβ-OGにより細胞抽出液を調製・回収した。細胞抽出液と精製101F6タンパク質を充分に混和した後、101F6タンパク質を特異的に認識・結合する抗体を用いた磁気beads抗体法により、101F6タンパク質と相互作用すると思われるいくつかのタンパク質をSDS-PAGEと銀染色法で解析した。この解析方法によって再現性のある結果を得るためには、101F6タンパク質と界面活性剤とのミセル状態のままでは、たとえ精製したタンパク質を使用しても必ずしも生体膜中でのタンパク質間相互作用を反映していない可能性がある。そこで生体膜の非常に良いモデルであるナノディスク環境中に101F6タンパク質を再構成させた状態で免疫沈降・解析する計画を進めている。101F6タンパク質も他のb561ファミリーメンバーと同様に生体膜(おそらくはER膜)貫通構造を保持していることから、膜貫通電子伝達反応を利用した分子生理機能を持つと推定される。このことが癌抑制遺伝子としての生理機能発現に必須であるならば、101F6はこれまでの癌抑制遺伝子のものとは非常に異なる機構に基づいて機能していることになる。神経型あるいは植物型b561の場合、AsAとの結合部位を構成する細胞質側ヘムのHis配位子近傍には保存性Tyr残基やLys残基が存在するが、101F6の場合、それらはPheとAla残基に置換されている。これら残基をそれぞれTyrとLysに戻してやると、神経型あるは植物型b561に特徴的な生化学的性質(電子伝達のpH依存性、DEPCとの反応性の復活とそれによるAsAからの電子伝達阻害)を示すようになる。この結果はAsA/MDAラジカルのと反応性がヘム周辺・基質結合部位の微細な分子構造の変化により制御可能であることを示してる。現在、ヒト由来培養細胞中における101F6遺伝子の機能についての細胞生物学的解析、特に101F6タンパク質との相互作用に重点をおいたプロテオーム解析を行っている。これらの解析には再現性の問題など、いろいろ困難を伴う。具体的には101F6タンパク質を界面活性剤で可溶化したミセル状態のままでは、いくら高純度に精製した状態であっても、本来の生体膜中でのタンパク質間相互作用を反映していない可能性がある。そこで、生体膜の非常に良いモデル系であると考えられるナノディスク環境中に101F6タンパク質を再構成させた状態で免疫沈降をする計画を進めている。既にナノディスク作成に必要な2種類のMSPタンパク質の発現・精製を終え、101F6タンパク質との再構成とFPLCによるゲルろ過クロマトグラフィーによる精製にも成功している。101F6はb561ファミリー中のTSF型に属するが、非常に特異な性質を持っている。1TSF型サブファミリー中でのアミノ酸配列の保存性が下等動物から高等動物に渡って非常に高いこと、2神経系型や植物型b561にはAsA/MDAラジカルとの結合及び電子伝達に関与すると思われる保存配列が存在するが、TSF型ではこれらの配列は保存されておらず、替わって別の非常に良く保存された配列が存在する。これは101F6がAsA/MDAラジカル以外の酸化還元基質との間で電子伝達反応を行っているか、あるいはAsA/MDAラジカルと電子伝達反応を行う場合であっても、その分子機構が非常に異なっている事を示唆している。b561ファミリー内で独自の進化を遂げた101F6は膜貫通レドックスセンサーとして機能することにより細胞内外でのシグナル伝達機構に深く関わっている可能性が高い。既に野生型101F6タンパク質はb561ファミリーメンバーとしての基本的性質を保持していること(2個のヘムを含有し、AsAからの早い電子受容反応を行いうること)を明らかにしているが、3MDAラジカルへの電子供与が非常に速い、4電子伝達反応のpH依存性が他のb561とは異なる、等が異なっている。これらの特異な性質の原因として、上に挙げた特異な保存配列の寄与が考えられる。よって保存性部位に対する部位特異的変異体を作成し、その影響を可視吸収、EPR、Stopped-flow、酸化還元電位測定により解析する。さらに生体膜の非常に良いモデルであるナノディスク環境中に1分子の101F6タンパク質を再構成させた状態でのこれらの測定・解析を行う予定である。同時により詳細な分子機構を理解するためには高分解能X線結晶構造の情報が不可欠である。このため、Lipidic Cubic Phase(LCP)法を用いた高純度結晶の作成に挑む。ヒト

第3染色体3p21.3領域に存在する101F6遺伝子の持つ顕著な癌増殖抑制作用の分子機構は分かっていない。101F6遺伝子産物(以下101F6と略記)はヘム含有膜貫通型タンパク質cytochrome b561ファミリーの一員であり,アスコルビン酸(AsA)あるいはモノデヒドロアスコルビン酸(MDA)ラジカルが関与する細胞膜貫通レドックス反応がその生理機能発現に関与していると思われる。本研究ではAsA/MDAラジカルによる細胞膜内外でのレドックス擾乱をプログラム細胞死へと導く新規細胞内メッセージとして捉え,その細胞死シグナルを細胞膜・ER膜において発生させあるいは制御する細胞膜素子としての101F6タンパク質の役割と分子機構を解明することを目的としている。メタノール資化性酵母Pichia pastoris GS115株を利用した異種発現系を利用し101F6タンパク質を発現させた。ミクロソーム膜可溶化後、101F6タンパク質のC末端に導入したHis-tag配列を利用したNi-Sepharoseクロマトグラフィによって101F6タンパク質を精製した。並行して、ヒト癌組織由来のA549細胞を培養した。十分量の培養細胞を用いて界面活性剤により細胞膜を溶かして細胞抽出液として回収した。細胞抽出液と101F6タンパク質をエッペンチューブ中4 °Cで混和して相互作用させた後、101F6タンパク質を特異的に認識する抗体を用いた磁気beads抗体法により101F6タンパク質と共沈するタンパク質の解析結果から相互作用分子の特定を目指した。SDS-PAGE銀染色で、共沈する多くのタンパク質バンドを確認した。今後、洗浄溶出条件を検討し、再現性のあるタンパク質バンドについてMassスペクトル解析と同定を行い、相互作用タンパク質の解析を進める予定である。101F6も神経系型b561と同様に生体膜(おそらくはER膜)貫通構造を保持していることから,膜貫通酸化還元反応を利用した生理活性を持つことは確実である。このことが癌抑制遺伝子としての機能発現に必須であるならば, 101F6はこれまでの癌抑制遺伝子のメカニズムとは全く異なる機構に基づくことになる。AsA/MDAラジカルによる細胞膜内外におけるレドックス擾乱を細胞死に導くメッセージとしてとらえるという点は全く独創的・新規的なものであり,101F6の分子生理機構の研究は癌抑制遺伝子研究だけで無く,生体制御ネットワークの解明において新規な研究領域を開拓することになる。神経型あるいは植物型b561の場合,AsAとの結合部位を構成する細胞質側ヘムのHis配位子近傍には保存性Tyr70とLys81が存在するが,101F6の場合それらはPheとAla残基に置換されている。これらをそれぞれTyrとLysに戻してやると,神経型あるいは植物型b561に特徴的な生化学的性質(電子伝達のpH依存性,DEPCとの反応による電子伝達阻害)を示すようになる。この知見はAsA/MDAラジカルとの反応性が微細な分子構造の変化により制御可能であることを示している。現在、培養細胞中における101F6遺伝子の機能についての細胞生物学的解析,プロテオーム解析(及びメタボローム解析)を行っているが、これらの解析はいろいろな困難を伴う。
ADAM10による腸管腫瘍形成機構の解明

我々は,ADAM10 floxマウスとvillin-CreERマウスを交配させ,上皮特異的なADAM10ノックアウトマウスを作製した.タモキシフェンによるノックアウト誘導により,腸管上皮の著名な胚細胞の数の上昇と幹細胞の減少を観察しえた.ADAM10ノックアウト上皮は幹細胞機能分化および分化亢進のため,継時的な消失を示した.ADAM10はNotchリガンドの細胞内ドメインの切断によるシグナル活性化に関与しており,本ノックアウトマウスではNotchシグナル活性の低下を認めたことから,Notchシグナル制御異常が幹細胞消失を誘導したと考えられた.我々は,ADAM10 floxマウスとvillin-CreERマウスを交配させ,上皮特異的なADAM10ノックアウトマウスを作製した。タモキシフェンによるADAM10ノックアウト誘導により,腸管上皮の著明な杯細胞の数の上昇と幹細胞の減少を観察しえた。ADAM10ノックアウト上皮は幹細胞機能分化および分化亢進のため,継時的な消失を示した。同様な形質はオルガノイドによる腸管上皮幹細胞培養でも確認できた。ADAM10はNotchリガンドの細胞内ドメインの切断によるシグナル活性化に関与しており,本ノックアウトマウスではNotchシグナル活性の低下を認めたことから,Notchシグナル制御異常が幹細胞消失を誘導したと考えられた。我々は,さらにADAM10阻害薬であるGI 254023Xをオルガノイドまたは野生型マウスに投与し,Notch活性の阻害と杯細胞分化亢進,幹細胞消失が確認できた。次に,ADAM10阻害薬の治療効果を検証するため,ヒト大腸がんより樹立した大腸がんオルガノイドに対し,GI 254023Xの投与を行った。残念ながら大腸がんオルガノイドに対しては杯細胞分化作用および幹細胞抑制作用を示さず,ADAM10阻害単剤による治療効果は低いことが示唆された。大腸がんではADAM10のオルソログであるADAM17を発現しており,抵抗性の原因となったと考えられた。今後,他剤との併用により,ADAM10阻害薬を用いた抗癌治療開発のさらなる検討が必要である。我々は,ADAM10 floxマウスとvillin-CreERマウスを交配させ,上皮特異的なADAM10ノックアウトマウスを作製した.タモキシフェンによるノックアウト誘導により,腸管上皮の著名な胚細胞の数の上昇と幹細胞の減少を観察しえた.ADAM10ノックアウト上皮は幹細胞機能分化および分化亢進のため,継時的な消失を示した.ADAM10はNotchリガンドの細胞内ドメインの切断によるシグナル活性化に関与しており,本ノックアウトマウスではNotchシグナル活性の低下を認めたことから,Notchシグナル制御異常が幹細胞消失を誘導したと考えられた.現在までの研究は計画通り進んでいる.ADAM10 flマウスとVillin-CreERならびにMx1Creマウスとの交配によりコンディショナルアウトマウスの作製を行った.腸管特異的なADAM10ノックアウトマウスは杯細胞の数の上昇と幹細胞の低下を認めた.本形質はMX1-Cre+ knockoutマウスでは認められなかった.一方,MX1-Cre+ knockoutマウスでは血管内皮細胞マーカーであるCD31を発現するポリープ形成を認めた.現在本ポリープの細胞生物学的な解析を行っている.消化器内科学Villin-CreERとMx1CreマウスのCre発現形質の変化に注目して研究を進展させていく.CD31発現を認める腸管ポリープは臨床的に稀であり,疾患モデルとしての可能性を病理学教室とともに模索していきたい.
ロボットビジョンによるシネ表示CT動画像からの腫瘍性病変自動診断

CT画像の診断では、生成した横断像を連続的に表示して動画として映写し(シネ表示)、医師が3次元イメージを読影することによって病巣の有無を判断することが有効である。本研究の目的は、シネ表示動画像から腫瘍性病変部を認識するために必要な前処理を実時間で実行するハードウエアシステムを開発し、これを既存のデジタル画像処理ワ腫瘍性病変部はシネ表示動画像ではほぼ同位置で膨らんで消えるので、シリコン網膜によって時間差分をとった画像を利用することを考える。ークベンチと接続することによって、知的診断用ロボットビジョンを構築することにある。本課題で開発する画像診断ロボットビジョンは、主として前処理用のアナログ人工網膜、中間処理回路ボード(USBインターフェイス内臓)、診断用PCの3部から構成されている。中間処理は、書き換え可能な集積論理回路であるFPGA(Field Programable Gate Array)を用いている。本年度は、このFPGA中間処理ボードの製作とアナログ人工網膜出力から実時間情報抽出を実行するFPGAアルゴリズムの実装を行った。中間処理では、アナログ人工網膜によって実時間ラプラシアンガウシアン前処理した画像から、対象物のエッジ、形状、中心座標を計算し、さらにこれら特徴量の時間連続性(奥行き方向の連続性に対応)などを計算した。また腫瘍性病変部はシネ表示動画像ではほぼ同位置で膨らんで消えるので、シリコン網膜によって時間差分をとった画像に対しても同様の処理を行えるようにした。このアルゴリズムにより、シネ表示画像のエッジを実時間抽出することはできた。
近縮退四光波混合による光パルスの整形もしくは圧縮に関する研究

本研究では、非線形分散性媒質と広帯域の近縮退四光波混合が可能な位相共役波発生器を組み合わせた系における光パルス波形の挙動を調べ、これによって光パルスを整形/圧縮する新しい手法を研究することが目的である。研究成果を以下に記す。(1)非線形分散性媒質を伝搬したガウス形光パルスが、帯域が無限大で電力反射率が1の位相共役波鏡で反射されて、再び同じ媒質を逆方向に伝搬する場合の光パルス波形の変化を数値解析した。媒質に非線形性が存在する場合も、入射端では元のパルス波形が再現できることがわかった。(2)上記と同様な系で位相共役鏡に利得あるいは損失がある場合について波形の変化を数値解析した。利得がある場合は入射端に戻ってきたパルス幅は入射時より大きく、損失がある場合は入射時より小さくなることがわかった。したがって損失のある位相共役鏡はパルス圧縮に利用できることがわかった。(3)波長分散と長さの積が等しい二つの光ファイバ伝送路の中間に帯域が無限大で電力利得が1の位相共役波発生器を置いて光信号の波形歪みを補正する方法における、光ファイバの非線形性の効果について検討した。分散が小さい光ファイバを伝送路として用いた場合はピーク電力が数mW以下ならば、受信端で元の波形がほぼ復元できることがわかった。ことに分散が負の場合は、パルスは常に広がるために光ファイバの非線形効果が小さくなり、前半と後半の光ファイバの分散が大きく異なる場合でも波形の復元が良好に行えることがわかった。(3)上記の理論の検証のための実験を、光パルス発生器・光ファイバ・位相共役波発生器(半導体レーザ)により試みた。光パルスの電力が小さく、位相共役波発生器の効率が悪いため、波形歪みとその補正効果を観測するには至らなかった。より効率の良い、光ファイバによる位相共役波発生器の構成について検討中である。
油脂酵母の油脂合成・分解・蓄積機構の解明とその応用

油脂酵母Lipomyces starkeyiは、様々な糖を資化して、細胞内に油脂を蓄積するユニークで産業価値の高い酵母である。近年、油脂の安定供給問題や再生利用可能資源利用の観点から、微生物による油脂生産が注目を浴びている。しかしながら、油脂酵母の特徴的な油脂生産(合成・分解・蓄積)については分子レベルで明確にされていない。本年度は油脂生産メカニズム解明の糸口となる油脂蓄積変異株を取得し、油脂蓄積性の解析を行った。油脂蓄積変異株を取得するために、L. starkeyi CBS1807株に変異原物質エチルメタンスルホン酸を処理して変異を誘発させた変異株群を培養し、Percoll密度勾配遠心法により、油脂蓄積画分を分取した。水と油の密度の違いにより、Percollに菌体を混合し遠心すると油脂を高蓄積した細胞は上層に、油脂を低蓄積した細胞は下層に分画できるため、この画分を分取・培養・分画を繰り返すことにより、油脂蓄積変異候補株を含むと考えられる画分を獲得した。得られた画分溶液をプレートに撒き、シングルコロニー単離を行い、油脂染色蛍光試薬Nile redで油脂蓄積性を評価するスクリーニングを実施した結果、油脂高蓄積変異株3株(HA1,HA 2, HA3)、油脂低蓄積変異株2株(LA1, LA2)を獲得した。野生株、油脂蓄積変異株、油脂低蓄積変異株の細胞濃度、糖濃度、油脂生産量の経時的変化を解析した。野生株と油脂高蓄積変異株の比較培養において、1日目では全ての株の油脂生産量は変わらなかったが、3日目では全ての油脂高蓄積変異株の油脂生産量が野生株の1.4-1.7倍に増加していた。しかしながら、高蓄積変異株の細胞濃度は野生株よりも低くなっていた。また、野生株と油脂低蓄積変異株の比較培養においては、1日目の油脂生産量は変わらなかったが、3日目の油脂低蓄積変異株の油脂生産量は野生株の0.6倍であった。平成30年度は、油脂高蓄積及び低蓄積の有用な情報を有する油脂高蓄積変異株を3株、油脂低蓄積変異株を2株取得し、その油脂蓄積性の解析を行った。油脂蓄積の解析により、表現型がはっきりした変異株が取得できた。初年度の目的であった油脂高蓄積及び低蓄積変異株の取得と解析が実施でき、2年目以降に実施する「野生株と変異株の油脂生産関連遺伝子発現の比較解析」を実施する体制が整ったことにより、順調に進展していると判断した。1.野生株と変異株の油脂生産関連遺伝子発現の比較解析及び標的遺伝子の機能解析野生株と平成30年度に取得した油脂高蓄積変異株3株、油脂低蓄積変異株2株におけるL. starkeyiの油脂合成・分解経路のリアルタイムPCRによる遺伝子発現比較解析を行う事により、遺伝子発現パターンがことなる遺伝子を同定する。2.油脂蓄積変異株の変異遺伝子同定及び機能解析野生株と平成30年度に取得した油脂高蓄積変異株3株、油脂低蓄積変異株2株のゲノム比較解析を行うことにより、変異遺伝子を同定する。

1.野生株と変異株の油脂生産関連遺伝子発現の比較解析及び標的遺伝子の機能解析野生株と平成30年度に取得した油脂高蓄積変異株3株、油脂低蓄積変異株2株におけるL. starkeyiの油脂合成・分解経路のリアルタイムPCRによる遺伝子発現比較解析を行う事により、遺伝子発現パターンがことなる遺伝子を同定する。2.油脂蓄積変異株の変異遺伝子同定及び機能解析野生株と平成30年度に取得した油脂高蓄積変異株3株、油脂低蓄積変異株2株のゲノム比較解析を行うことにより、変異遺伝子を同定する。計画していた油脂蓄積変異株の取得のためのスクリーニングが、Percoll密度勾配遠心法による蓄積変異株の濃縮の効果による効率化で1回で済んだためである。本年度は、取得できた油脂蓄積変異株が予想よりも多く5株もあったので、ゲノム配列解読を助成金が許す限り実施し、多くの情報を集積する。
３Dプリント仕口を用いたセルフビルド実験住宅

本研究は、実用化が進む金属の3Dプリント技術を用いて住宅の仕口(ジョイント)を製作し、大部分の工程をセルフビルド可能な住宅のプロトタイプを建設する。学術的には、プロトタイプの建設を通して、3Dプリンタの建材(特に構造材)への応用の可能性を明らかにし、「複雑」な造形がデジタルに施されたジョイントによって、どこまで人間の手による建設を「単純」化できるかを明らかにする。そして、建設した住宅に対してプラニングの自由度・構造的合理性・建設可能性・環境的性能・移動可能性(再建築・運搬)などの観点で性能を評価し、最終的に移動可能で自由なライフスタイルを可能にする安価な住宅サービスへの適用方法を研究する。