hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
NSAIDsによる自然免疫応答の抑制メカニズムの解明

尿酸塩結晶に応じて活性化する自然免疫機構であるNLRP3インフラマソームは、痛風発作に深く関与している。NLRP3インフラマソームは、コレステロール結晶や遊離脂肪酸などの栄養代謝物によっても活性化し、動脈硬化や糖尿病などの生活習慣病の発症要因となる。したがって、NLRP3インフラマソームは生活習慣病の治療・創薬標的として注目されている。我々は、痛風発作の際に使用される非ステロイド系抗炎症薬(NSAIDs)がNLRP3インフラマソームに及ぼす影響を検討し、NSAIDsが異なる機序でその薬理効果を発揮していることを見出した。自然免疫関連受容体であるNLRP3は、リソソームの損傷に応じて情報伝達因子ASCおよびプロテアーゼCaspase-1と共にNLRP3インフラマソームを形成し、サイトカインIL-1betaやIL-18の産生を介して炎症を惹起する。尿酸塩結晶などの刺激物によるNLRP3インフラマソームの過度の活性化は痛風などの炎症性疾患の発症要因となるため、NLRP3インフラマソームの活性化を阻害する化合物の同定、およびその作用機序の解明は重要な研究課題である。我々は、痛風治療薬として用いられるNSAIDsであるジクロフェナクが、尿酸塩結晶刺激に応じたマクロファージからのIL-1beta産生を抑制することを見出した。一方で、ジクロフェナクは尿酸塩結晶刺激によるIL-1alpha産生は抑制することは出来なかった。尿酸塩結晶によるIL-1betaの産生はNLRP3インフラマソーム依存的であり、IL-1alphaの産生はNLRP3インフラマソーム非依存的であることから、ジクロフェナクは尿酸塩結晶によるNLRP3インフラマソームの活性化を抑制すると考えられる。ジクロフェナクは、シクロオキシゲナーゼ-2に対しても強力な阻害効果を発揮する。よって、尿酸塩結晶刺激によるNLRP3インフラマソームを介したIL-1betaの産生とシクロオキシゲナーゼ-2を介したプロスタグランジンE2の産生の双方を抑えることにより、痛風の関節炎症状を緩和している可能性がある。NSAIDsであるジクロフェナクが、マウスマクロファージからの尿酸塩結晶によるNLRP3インフラマソームを介したIL-1betaの産生を抑制することを見出した。また、ジクロフェナクはIL-1alphaの産生を抑制しないことも明らかになった。自然免疫関連受容体であるNLRP3は、リソソームの損傷に応じてアダプター因子ASCおよびプロテアーゼCaspase-1と共にNLRP3インフラマソームを形成し、サイトカインIL-1betaやIL-18の産生を介して炎症を惹起する。尿酸塩結晶などの刺激物によるNLRP3インフラマソームの誤った活性化は痛風などの炎症性疾患の発症要因となるため、NLRP3インフラマソームを阻害する化合物の同定、およびその作用機序の解明は重要な研究課題である。我々は、H27度までに、痛風治療薬として用いられるNSAIDsであるジクロフェナクが、尿酸塩結晶刺激に応じたマウスマクロファージからのIL-1beta産生を抑制することを見出している。H28年度は、次の1.4.を明らかにした。1.ジクロフェナクに加えて、メフェナム酸やセレコキシブなどのNSAIDsが、尿酸塩結晶刺激に応じたマウスマクロファージからのIL-1beta産生を抑制する。2.ジクロフェナクは、マウスにおいて、腹腔に投与した尿酸塩結晶により誘導されるIL-1betaの産生を抑制する。3.痛風の治療に用いられるNSAIDsの中で、ロキソプロフェンは当該産生を抑制しない。4.ジクロフェナクおよびロキソプロフェンは、尿酸塩結晶によるプロスタグランジンE2の産生を抑制する。1、2は、ジクロフェナクがin vitroおよびin vivoでIL-1betaの産生を抑制することを示している。1、3、4は、ジクロフェナクなどの一部のNSAIDsがシクロオキシゲナーゼとは異なる標的に作用することで、IL-1betaの産生を抑制していることを示唆している。ロキソプロフェンと比べて、ジクロフェナクはより強力な抗炎症効果を発揮すると考えられているが、それはIL-1betaとプロスタグランジンE2の産生を同時に抑制することに起因する可能性がある。ジクロフェナクがNLRP3インフラマソームを抑制する機序を解明する。また、ジクロフェナクと同じく痛風の治療に用いられるロキソフロフェンがNLRP3インフラマソームに作用するか否かを検討する。

さらに、ジクロフェナクやロキソプロフェンが、マウス痛風モデルにおいて炎症症状を緩和するか否かを検討する。生物系薬学2015年4月に所属組織の異動があったため、本研究に関する遺伝子改変マウスの利用・維持を一旦停止した。現在では、新たな所属組織のマウス施設において遺伝子改変マウスのコロニーが増えてきており、2016年度にこれらを用いた解析を行う。
真珠腫形成におけるサイトケラチンとCSFの関与についての検討

本研究の目的は,真珠腫性中耳炎の発生機序の解明のために,ヒト真珠腫性中耳炎より採取した試料からサイトケラチンを抽出し生化学的ならびに免疫組織学的に分析し,さらにサイトケラチンの分解産物の生物学的活性についてCSFとの関連で検討するものである。今回の研究期間内では,以下の成績が得られた。対象とした試料は,健常皮膚,緊張部ならびに弛緩部タイプの真珠腫性中耳炎の上皮である。抽出したサイトケラチンを1次ならびに2次元電気永動にて解析した。また,皮膚ならびに真珠腫の上皮の連続切片を作成し,基底層から有棘層,角質層までのそれぞれの切片におけるサイトケラチンを分析した。全ての検体でサイトケラチン14/5,10/1のペア-が認められた。また,サイトケラチン16/6と19が緊張部ならびに弛緩部の真珠腫性中耳炎で認められたが,皮膚ではサイトケラチン16/6と19は認められなった。連続切片の解析で,サイトケラチン14/5,10/1の発現パターンは,皮膚,緊張部ならびに弛緩部タイプの真珠腫性中耳炎で差はみられなかった。しかし,真珠腫性中耳炎の上皮では表層に近づくに従って6840KDにわたる幅広いバックグラウンドが同定された。本研究では,全ての真珠腫性中耳炎の上皮にサイトケラチン16/6あるいは19が同定されたのではないが,過増殖のマーカーであるサイトケラチン16/6あるいは19が真珠腫の上皮に認められた点は興味深い。すなわち,真珠腫性中耳炎の上皮の一部には過増殖を示す細胞が存在することになる。また,真珠腫性中耳炎の上皮表層の6840KDにわたる幅広いバックグラウンドは,上皮に含まれる多くの蛋白分解酵素によって,サイトケラチンが分解されて分子量が小さくなった結果と想定した。以上の成績から真珠腫性中耳炎の上皮の過増殖性が示唆され,臨床的に観察される病変の進行性を示す基礎的データが示された。真珠腫瘍性中耳炎の発生機を検討するために、ヒトの真珠腫より採取した試料からのサイトケラチン抽出のみならず、実験動物としてミニブタを対象として、外耳道皮膚、鼓膜、中耳粘膜のサイトケラチンを抽出し、生化学的ならびに免疫組織学的に分析した。その結果、軟骨部外耳道と骨部外耳道のバンドの比較で69kDのバンドの比率が骨部では極めて少ないデータが得られた。さらに、Westernブロッティングでは、抗ヒトCK1,10/11抗体と56,53.5kDのサイトケラチンが交叉反応を示し、免疫染色では軟骨部表皮でより強い染色を示した。以上の実験から、外耳道皮膚、鼓膜、中耳粘膜のサイトラケチンの構成成分は類似しており、角化した上皮ほど大きい分子量のサイトケラチンが主体となり、軟骨部は骨部に比べてより角化した表皮であると結論された。また、ミニブタのサイドケラチンが抗ヒトサイトケラチン抗体と交叉反応を呈することが証明され、真珠腫性中耳炎の実験動物としての可能性が示唆された。明年度からは、今年度に採取したヒト真珠腫性中耳炎の真珠腫マトリックス内のG-COF,M-CSFの定量を実施する予定である。また、ミニブタを用いて、中耳内にG-CSF,M-CSFを注入した後の中耳粘膜の組織学的変化を検討する。

さらに、鼓膜の培養を施行し、培養細胞にG-CSF,M-COFを投与した際の細胞変化の検討を考慮している。健常皮膚,緊張部ならびに弛緩部タイプの真珠腫性中耳炎の上皮のサイトケラチンを1次ならびに2次元電気泳動にて解析した。また,皮膚ならびに真珠腫の上皮の連続切片を作成し,基底層から有棘層,角質層までのそれぞれの切片におけるサイトケラチンを分析した。全ての検体でサイトケラチン14/5,10/1のペア-が認められた。また,サイトケラチン16/6と19が緊張部ならびに弛緩部の真珠腫性中耳炎で認められたが,皮膚ではサイトケラチン16/6と19は認められなかった。連続切片の解析で,サイトケラチン14/5,10/1の発現パターンは,皮膚,緊張部ならびに弛緩部タイプの真珠腫性中耳炎で差はみられなかった。しかし,真珠腫性中耳炎の上皮では表層に近づくに従って6840KDにわたる幅広いバックグラウンドが同定された。本研究では,全ての真珠腫性中耳炎の上皮にサイトケラチン16/6あるいは19が同定されたのではないが,過増殖のマーカーであるサイトケラチン16/6あるいは19が真珠腫の上皮に認められた点は興味深い。すなわち,真珠腫性中耳炎の上皮の一部には過増殖を示す細胞が存在することになる。また,真珠腫性中耳炎の上皮表層の6840KDにわたる幅広いバックグラウンドは,上皮に含まれる多くの蛋白分解酵素によって,サイトケラチンが分解されて分子量が小さくなった結果と想定した。真珠腫性中耳炎の発生機序の解明のために,ヒト真珠腫性中耳炎より採取した試料からサイトケラチンを抽出し生化学的ならびに免疫組織化学的に分析した。対象とした試料は,健常皮膚,緊張部ならびに弛緩部タイプの真珠腫性中耳炎の上皮である。抽出したサイトケラチンは1次ならびに2次元電気泳動にて解析した。全ての検体でサイトケラチン14/5, 10/1のペア-が認められた。サイトケラチン16/6と19が緊張部ならびに弛緩部の真珠腫性中耳炎で認められたが,皮膚ではサイトケラチン16/6と19は認められなかった。連続切片の解析で,サイトケラチン14/5, 10/1の発現パターンは,皮膚,緊張部ならびに弛緩部タイプの真珠腫性中耳炎で差はみられなかった。しかし、真珠腫性中耳炎の上皮では表層に近づくに従って6840KDにわたる幅広いバックグラウンドが同定された。また,真珠腫性中耳炎の上皮表層の6840KDにわたる幅広いバックグラウンドは,上皮に含まれる多くの分解酵素によって,サイトケラチンが分解されて分子量が小さくなった結果と想定した。
酵素タンパク質におけるヌクレオチド結合部位の構造的特微(リジン残基とグリシン残基の役割を中心にして)

私どもは、これまでにヌクレオチドまたは糖ヌクレオチドの結合部位にあるリジン残基を特異的に標識する新しい型の試薬を開発するとともに、いわゆるグリシン・リッチ領域への変異導入を試みてきた。本研究課題のもとで、平成34年度で得た主な新しい知見は、以下の通りである。1)4種の異なった構造の試薬を用いて、ジャガイモ塊茎UDPGピロホスホリラーゼの比較親和標識を行うことにより、活性部位に結合するUDPGの周辺に5つのリジン残基(Lys-263、Lys-329、Lys-367、Lys-409、Lys-410)が存在することが明らかになった。部位特異的変異導入の実験結果とも合わせると、これら5つの残基のうちで、Lys-367が触媒活性に直接に関与するのに対して、Lys-329はピロリン酸の結合に、Lys-263はUDPGの結合による立体構造の変化に関与するものと考えられる。2)ニワトリ骨格筋アデニレートキナーゼにおいて、Lys-66を部位特異的変異導入により種々のアミノ酸に置換した変異型酵素を作成し、それらの性質を調べることにより、この残基がAMPのアデニン環を認識するのに重要な役割をもつことが明らかになった。3)ロイシン脱水素酵素のピリドキサールリン酸による修飾実験の結果から、Lys-80が活性部位に存在し、触媒反応に重要な役割を果たすものと結論した。4)アデノシン三リン酸ピリドキサールによる大腸菌F_1-ATPアーゼの親和標識の結果からαLys-201、βLys-155、及びβLys-201が触媒部位に結合するATPのγ-リン酸基の近くに位置し、Mgの添加により2つのβ残基がγ-リン酸により近接するものと考えられた。私どもは、これまでにヌクレオチド(または糖ヌクレオチド)の結合部位にあるリジン残基を特異的に標識する新しい型の試薬を開発すると共に、いわゆるグリシン・リッチ領域への変異導入を試みてきた。本研究課題のもとで平成3年度では、以下のような新しい知見を得た。1.ニワトリ骨格筋アデニレ-トキナ-ゼにおいてL66を種々のアミノ酸に置換した変異酵素を作成し、それらの酵素学的ならびに物活化学的性質を調べることにより、この残基がAMPのアデニン環を認識する役割をもつことを明らかにした。また、この残基の疎水性が基質結合の正の協同性に対して重要であることもわかった。2.ウリジンジ(トリ)リン酸ピリドキサ-ルによりジャガイモ塊茎UDPGピロホスホリラ-ゼを親和標識することにより、5このリジン残基がUDPG結合領域に存在することが明らかになり、さらに、この修飾は5このリジン残基に対して相互に排他的におこることがわかった。2種の試薬により、結果はあまり変らなかった。3.ジャガイモ塊茎UDPGピロホスホリラ-ゼcDNAの大腸菌体内発現系を利用して、上記の5このリジン残基を1こづつグルタミンに置換した変異酵素を作成した。それぞれの変異酵素の酵素学的性質から、K367がこの酵素の活性発現に必須であることを明らかにした。4.3種のUDPG関連反応性アナログによる比較親和標識の結果から、ジャガイモ塊茎UDPGピロホスホリラ-ゼの糖ヌクレオチド結合領域における5このリジン残基の配置を推定することができた。この配置は、先の変異酵素の酵素学的性質をうまく説明することができる。

本研究課題のもとで平成4年度では、以下のような新しい知見を得た。1)反応性ピロリン酸アナログであるピリドキサール5'-ニリン酸を用いて、ジャガイモ塊茎UDPGピロホスホリラーゼの親和標識を試みた。酵素1モルに対して1モルの試薬の取り込みにより、酵素は完全に失活した。失活はMgUTP、MgPPi、グリコース-1-リン酸の添加により阻止されたが、UDPGの添加により逆に促進された。UDPGの存在下で、試薬はLys-329を特異的に修飾することが分かった。これらの結果から、Lys-329がMgPPiの結合に関与するものと結論した。2)ロイシン脱水素酵素がピリドキサールリン酸で修飾させることによって、急速な失活を起こすことを見いだした。この失活はロイシンまたはNADの添加によって阻止され、失活と並行して酸素サブユニットあたり数個の試薬が取り込まれる。修飾される残基はLys-80、Lys-91、及びLys-206であったが、そのうちで基質添加によりLys-80の修飾のみが特異的にそしされることが判明した。これらの結果から、Lys-80が活性部位に存在し、触媒反応に重要な役割を果たすものと結論した。3)アデノシンミリン酸ピリドキサールによる大腸菌F_1-ATPアーゼの親和標識を試みた。Mgの非存在下ではαLys-201とβLys-155が主として標識されたが、Mgを添加するとβLys-155とβLys-201が主として標識されることが明らかになった。これら3つの残基が触媒部位に結合するATPのγ-リン酸基内近くに位置し、Mgの添加により2つのβ残基がγ-リン酸基により近接するものと考えられる。
第9染色体長腕に存在するヒト白血病関連癌抑制性遺伝子の検出

ヒト白血病の原因として(1)癌遺伝子の活性化に関与するもの(2)細胞の分化・増殖の因子もしくは受容体の活性に関与するもの(3)転写促進に関与するものなどが発見されている。本研究ではさらに(4)癌抑制性物質の欠失に関与する遺伝子の同定を目的として、急性骨髄性白血病の中でも第9染色体長腕(9p-)の欠失症例に注目し研究を行なった。研究の方法は、(1)おもにサザン法による多型性遺伝子を用いた欠失領域の同定(2)PCR法による欠失遺伝子の検出を行ない、検討し得た4例中の1例に極めて特異的な欠失遺伝子を同定した。また欠失遺伝子領域の単離を試みたが現在のところ完全な遺伝子は発見できていない。具体的な研究成果は以下のとおりである。(1)約200例の染色体解析が行なわれた急性骨髄性白血病症例のうち9q-を有する4症例からそれぞれ白血病細胞とEB virus変異リンパ芽球株を樹立し、サザン法によって多型性を指標として9q219q32領域が共通して欠損していることを見いだした。染色体9の長腕の欠失している症例よりDNAを抽出し、PFGEにて泳動を行ない欠失部位近傍のプローブを得た。当初より遺伝子の欠失部位が広範囲におよぶために数種類のプローブで検討した結果、サイズの異なるDNA断片を得た。これが遺伝子多型性と異なることを患者の寛解期のDNAで確認した。次に、サイズの異なるDNA断片をクローン化するためにgene walkingを行ったが、プローグより5'上流域には、GC含有の多い領域が存在する為にクローン化が困難であった。現在は、新らたな第9染色体上のプローブを使い欠失部位の範囲の同定を行っており、また、クローニングに備えてrodentとのhybridを作製している。第9染色体のみが残っているsomcctic cell hybridは単離されていないが、第9染色体を含む数個のヒト染色体のみが残存しているクローンは得られており、これらを材料としてヒトゲノムライブラリーを作製する予定である。また、同様な方法でのcDNAライブラリーの作製も予定しておりこの場合には患者検体からのmRNAをプローブとして用いて陽性クローンの検出に努める予定である。急性骨髄性白血病のうち、染色体異常の占める割合は高く、これがある白血病に特異的な共通遺伝子異常として認められているものの数は年々増加している。この中には既に遺伝子異常が白血病の原因として(1)癌遺伝子の活性化に関与するもの(2)細胞の分化・増殖の因子もしくは受容体の活性に関与するもの(3)転写促進に関与するものなどが発見されている。さらにこうした共通した遺伝子欠失を有する症例について臨床像や白血病の細胞学的特異性について検討した。FAB分類でM1が2例、M5が2例であり寛解後の予後は比較的良好である点が特徴的である他は特異的な徴候は認められなかった。今後、欠失遺伝子を完全な形で単離することに全力を挙げるとともに、他の欠失遺伝子領域の検出に努める予定である。
作用素環の手法による作用素と不変部分空間の研究

自己共役でない作用素環の構造研究は、現在までに、不変部分空間の問題や正規でない作用素の構造研究と関連して、多くの研究者によってなされてきた。作用素論における問題を解決させるために、自己共役でない作用素環の構造を調べることは重要であり、その研究に重点をおいて研究した。自己共役でない作用素環は、Arvesonにより作用素環の解析性の研究として知られるsubdiagonal環の構造に着目して、今までに知られている結果、例えば、不変部分空間の構造理論、分解定理、極大性などについて整理することから始めた。得られた結果として、Nest環とsubdiagonal環の関係、例えば、pureの概念を定義しsubdiagonal環がpureであることはある特殊なNest環になる為の必要十分条件になることを示した。また、subdiagonal環の極大性の問題において、すべてのσ-弱閉subdiagonal環はいつも極大か?という問題を考察し、modular自己同型群で不変という結果を示した。この結果の応用として多くの発展が今後期待される。また、L^2(T^2)の不変部分空間のzw-不変部分空間としての形の決定問題、及び、不変部分空間と自己共役な交換子との関係、L^2(T^2)におけるBourgain環についての結果、非可換積分論の構造についての結果などを得ている。更に、凸解析における最適化理論への応用及び4次元多様体の構造との関連などについて考察した。今後、作用素論の不変部分空間の理論と自己共役でないでない作用素環の構造の更なる発展が期待される。
パルス光照射法による組織内酸素濃度の超高速測定

1.フラッシュフォトリシスによる酸素化ヘモグロビン、酸素化ミオグロビンの光解離、再結合の動的過程の解析から、組織の限定された部位における酸素濃度を実時間で数十マイクロ秒から数ミリ秒で測定する方法を確立するために、基礎データの収集に必要な装置をまず製作した。即ち、高速ラピッドスキャン装置、ダブルフラッシュ分光装置、時間分解吸収分光装置の製作は、初期の予定を上回る成果を得て、基本データの収集のみならず、関連領域で未開拓な研究分野を開くことに成功した。その代表例は、酵母に存在するフラボヘモグロビンの、酸素センサースイッチ機能の発見である。しかし、組織内酸素濃度の高速測定に関して、筋肉ミオグロビンの酸素化過程におけるスペクトル変化を記録することに初めて成功したものの、酸素化ヘモグロビンの光解離、再結合過程の解析については、多くの問題点のあることが判明した。2.牛筋肉に含まれるミオグロビン酸素化過程の測定を高速ラピッドスキャン装置に光ファイバープローブを組み合わせて行った。肉塊を切断直後は、切断面に分布するミオグロビンは脱酸素化されているが、酸素化の進行につれて、591nmに等吸収点をもち、582、540nmの山、600、563の谷を示す良好な反射スペクトルが対数時間軸に対し、512本記録され、また吸光度変化に2相性のあることが確認された。3.時間分解吸収分光装置による酸素化ヘモグロビンの光解離・再結合過程の測定。酸素化ヘモグロビンの光解離は、サブナノ秒の時間領域で起こり、再結合はマイクロ秒の時間領域でほぼ終了する。従って、酸素化ヘモグロビンの再結合過程の速度解析に基づき、ヘモグロビンの存在する環境における酸素濃度を評価するために、酸素濃度と再結合の動力学的パラメーターとの関係を求めた。この解析結果に基づき、組織内酸素濃度の測定のための、解決すべき種々の問題点を明らかにした。1。窒素レ-ザ-(宇翔、HeーN24M)は337.1nmのパルス光を16mJ/pulseで出力する筈であったが、納入予定の装置では12mJの出力しか得られず、宇翔では2台目を製作することになり、工場において15mJ/pulseの出力を出すにいたった。現時点では納入を完了し、検査段階に入っている。2。その間、低出力の窒素レ-ザ-装置を用いて色素レ-ザ-の発振を試験し、440nmー590nmの波長範囲で各種色素での発振を確認した。3。高速スキャン分光器に関しては200nm/1msの速度でスペクトルデ-タの取り込みを可能にするために、イメジセンサ-駆動用のプリント基盤を新たに設計、製作した。この速度で512本のスペクトルを連続的に記録することが、原理的に可能となった。現在、log変換などのデ-タ処理、スペクトルのCRT display、デ-タファイルの作成などのソフトを製作中である.4。ナノ秒からのシグナル変化の記録に関しては、光電子倍増管制御用の回路を製作し、デジタルオッシロスコ-プへのデ-タの取り込み、コンピュ-タへのデ-タ転送などが可能になった。5。以上の試作装置を用いて、ミオグロビンの一酸化炭素複合体の光解離、再結合過程の記録に成功した。特に窒素レ-ザ-励起色素レ-ザ-の導入により、反復測定・積算が極めて容易になり、デ-タの質が飛躍的に上昇することの確証を得た。6。

測光装置の制御、デ-タの取り込みに加えて、デ-タ加工のためのソフトが必須であるが、後者を同時に開発することは、多大のエネルギ-を必要とするので、処理ソフトについては既成のソフトを極力利用することとし、その連携のための方式を確立することにした。1.200nm幅の吸収スペクトルを、1ミリ秒で連続512本記録可能な高速スキャン分光器の製作を完成させた。さらに1ミリ秒から50分迄、10^6の時間領域で、スペクトルを時間の対数軸に対して取り込みが可能である新機軸を導入した。この記録方式を不感時間2ミリ秒に短縮したストップドフロ-混合装置や、レ-ザ-フラッシュ照射装置と組み合わせることにより、波長(0.4nm分解能,200nm幅)、吸光度(12bit分解能)、時間(1ミリ秒50分)の三次元デ-タの収集と保存を行い、種々のデ-タ解析手法を導入してミリ秒領域における反応解析の基本設計を完了した。2.組織モデルとして牛肉を用い、光ファイバ-を介して、酸素化に伴うミオグロビンのスペクトル変化を、上記の高速スキャン分光器により高いS/N比で記録することが可能となった。3.窒素レ-ザ-は、(株)宇翔にとって、いわば試作機であるとの事情が判明した。低出力の装置は性能が安定しているとの評判であったが、今回の装置は高出力を意図したものの、多くの問題点が浮び上がった。その一つは、レ-ザ-発振のミスショット及びダブルショットの頻度が極めて高く、トリガ-トランス回路の改良により、ようやく1%程度に下げることができた。二つめは、レ-ザ-発振時における電磁ノイズレベルが高いことで、レ-ザ-放電回路の改良を試みたが、現在のところノイズレベルの低減は不十分である。4.サブマイクロからマイクロ秒領域で吸光度変化を測定するためのフオトマル回路は完成し、レ-ザ-照射用、モニタ-光入射用、反射光収集用の光ファイバ-を組合わせた光学プロ-ブを作成、その性能テストの段階に入った。
最適輸送理論と勾配流の幾何学的研究

本研究で主に取り組む課題は以下の2つです。(A)熱の伝わり方やその空間の曲がり方との関係、2つの画像の近さを測る量など、非常に幅広い有用性を持つ最適輸送理論のより深い理解と、その理論・実用両面での応用を目指します。(B)理論・実用双方で極めて基本的な道具である勾配流(ある量が最も減少する方向へと進む流れ)の、方向によって進みやすさが変わる(非等方的な)空間での研究を行い、そのような空間での幾何学・解析学への応用も研究します。
医療現場の倫理問題への制度的関与の検討

臨床倫理問題とその支援に対する考え方・問題意識について、臨床倫理問題の一つである宗教上の信条からの輸血拒否などの事例を取り上げて、わが国の医療現場の医師、弁護士、および米国の病院倫理委員会(Hospital Ethics Committee: HEC)委員長を対象に調査を行った。調査の対象は、東海地区の弁護士会会員である弁護士2484名、日本全国の臨床研修指定病院の病院倫理委員会委員長又は医療安全部署責任者である医師978名、東海地区(愛知県、三重県、岐阜県、静岡県)の病床200床以下の病院長332名、高度介護支援の老人保健施設の医師である施設長1159名の計4953名である。また、米国の病院ランキングであるBecker's Hospital Review, 100 great hospitals in America2)、およびU.S. News and World Report, Best Hospitals3)で州別ランキング上位5病院にてHEC委員長が公表されている病院のHEC委員長244名(以下「米国委員長」)を対象とした。主要な調査項目は1医療現場への関与(弁護士のみ)、2施設の臨床倫理支援体制(医療職のみ)、3ガイドラインの機能、4輸血拒否の制度、5相対的無輸血の是非などである。ガイドラインの運用が医療者の裁量を縮小させると弁護士の81名(31.2%)が「Yes」と回答したのに対し、医師では432名(54.4%)と高かった。相対的無輸血に関しては、弁護士は34名(13.0%)、医師は88名(18.6%)が患者の権利を侵害する可能性があると回答した一方、米国委員長は20名(57.1%)が回避するべきと回答した。以上述べたように、医と法のプロフェッションとの間、また日本と米国の専門家の間では、臨床倫理問題に関する事項に対する問題意識に若干の相違があった。医療現場の臨床倫理問題への制度的対応として、法、ガイドライン、倫理委員会の審査を検討の対象として取り上げ、臨床倫理問題が生じるケースとして、終末期における延命治療の中止・差控え、宗教的信条からの輸血の拒否,、生体臓器移植を調査の対象として、各種法令、内外の文献、実務の趨勢、学会レベルの議論などを調査し、この問題に関与する制度的対応が備えなければならない適合性条件について明らかにした。臨床倫理問題を規制する制度的対応は、患者と医師が協働して最善の治療を探求するものでなければならず、どうしても両者の対立関係が解消できないときには、透明性のある公正な決定手続を提示するものでなければならない。また、臨床倫理問題を私的な問題ではなく、医療に係る利害関係者が関わる議論によって解決すべき公共的問題と捉えなおし、患者と医師が協働して治療方針を決定できる環境を整え、医療の受益者である患者が最大限の利益を享受できる医療供給制度の一端を担う公共的決定を担うものでなければならない。以上の検討から、法やガイドラインなどの制度的対応の適合性条件とは以下の3点となる。すなわち、1患者と医師の協働する関係を構築するために適合的な環境を作出すること、2そのために一義化した行為指針および手続を定式化していること、3医療に関わる多様な利害関係を調整できるものでなければならないこと、である。本検討の成果は、飯島祥彦『医療における的決定』信山社(2016)にて公表している。上記の検討による成果を前提に、制度が備えるべき適合性条件をさらに明確にするために、医療および法の各専門家を対象に質問紙調査を計画した。まず、愛知県下法曹、病院、介護老人保健施設を対象に質問紙調査を行い、解析を行っている。臨床倫理問題に関する制度に求められる適合性条件についての検討は、概ね完了している。制度が備えるべき適合性条件をさらに明確にすることを目的とする質問紙調査を実施するにあたっては、調査対象の選定に課題が生じて予定より4ヶ月調査の開始が遅れが生じたものの、愛知県下の調査対象への質問紙の郵送は完了し、回収した調査資料の解析を開始している。上記の検討による成果を前提に、制度が備えるべき適合性条件をさらに明確にするために、医と法のプロフェッション(医師、弁護士各約2000名)に対する医療現場で発生する医療倫理上の職業倫理問題についての質問紙調査を実施した。現在解析中であり、それぞれのプロフェッション間での問題の捉え方の類似点と相違点を明らかにする予定である。本調査結果は、医事法関連学会で発表するとともに学術誌にて公表を予定している。さらに、米国、英国、豪州の臨床倫理に携わっている研究者約200名に対して同様の調査を進め比較検討することで、わが国との相違などを明らかにしていく。また、医療倫理問題の一例として、植込型補助人工心臓に関する倫理的課題に着目し、実施施設に対して調査を行い、調査結果を「臨床倫理」にて公表するとともに、第6回日本臨床倫理学会「臨床倫理コンサルテーション1」での教材提供を行った。

我が国においての医と法のプロフェッション(医師、弁護士各約2000名)に対する医療現場で発生する医療倫理上の職業倫理問題についての質問紙調査は回答の回収が終了し、解析作業段階に推移している。本結果は、医事法関連学会で発表予定である。本年度から、米国、英国、豪州の臨床倫理に携わっている研究者約200名に対して同様の調査を実施中である。また、医療倫理問題の一例として、植込型補助人工心臓に関する倫理的課題に着目し、補助人工心臓植込実施施設に対して調査を行い、調査結果を「臨床倫理」にて公表した。臨床倫理問題とその支援に対する考え方・問題意識について、臨床倫理問題の一つである宗教上の信条からの輸血拒否などの事例を取り上げて、わが国の医療現場の医師、弁護士、および米国の病院倫理委員会(Hospital Ethics Committee: HEC)委員長を対象に調査を行った。調査の対象は、東海地区の弁護士会会員である弁護士2484名、日本全国の臨床研修指定病院の病院倫理委員会委員長又は医療安全部署責任者である医師978名、東海地区(愛知県、三重県、岐阜県、静岡県)の病床200床以下の病院長332名、高度介護支援の老人保健施設の医師である施設長1159名の計4953名である。また、米国の病院ランキングであるBecker's Hospital Review, 100 great hospitals in America2)、およびU.S. News and World Report, Best Hospitals3)で州別ランキング上位5病院にてHEC委員長が公表されている病院のHEC委員長244名(以下「米国委員長」)を対象とした。主要な調査項目は1医療現場への関与(弁護士のみ)、2施設の臨床倫理支援体制(医療職のみ)、3ガイドラインの機能、4輸血拒否の制度、5相対的無輸血の是非などである。ガイドラインの運用が医療者の裁量を縮小させると弁護士の81名(31.2%)が「Yes」と回答したのに対し、医師では432名(54.4%)と高かった。相対的無輸血に関しては、弁護士は34名(13.0%)、医師は88名(18.6%)が患者の権利を侵害する可能性があると回答した一方、米国委員長は20名(57.1%)が回避するべきと回答した。以上述べたように、医と法のプロフェッションとの間、また日本と米国の専門家の間では、臨床倫理問題に関する事項に対する問題意識に若干の相違があった。新たに調査対象に老人保健施設を加える。調査の回答率が当初の想定よりやや低いので、対象地域を全国に拡大し、調査数を当初予定した計700機関から、約2500機関に増やす。主要国の医療職に対する調査を立案する。我が国においての医と法のプロフェッションに対する医療現場で発生する医療倫理上の職業倫理問題についての質問紙調査の解析を進め、調査結果を医事法関連学会及び学術雑誌にて公表を行う予定である。また、米国、英国、豪州の臨床倫理に携わっている研究者約200名に対して同様の調査を進め、調査結果を国際誌にて公表を行う。調査の回答・回収はすでに終了しているが、データの解析実施が予定より遅れ、未使用額が生じた。現在実施中の海外研究者の調査の解析に使用する予定である。
説明的文章の読みにおける論理的認識力の発達に関する実証的研究

以下の3段階の研究過程により、課題の追求を試みた。1,予備調査小学校3年6年の4学年分の調査を実施した。説明的文章の読み以前にどのような認識を有しているか(事前調査)を調べた上で、説明的文章の読みにおいてどのような反応をするか(事中調査)を把握し、最後に事前調査との対比が可能な認識形成の調査(事後調査)を行って、読みによってどのように認識が変容したか、及びその変容は読みにおけるどのような反応によってもたらされているのかを追求した。この一連の調査(2月3月)の分析に取り組んでおり、説明的文章における認識形成・変革の過程モデルとその発達モデルという形で成果を集約しつつある。2,実験授業3,発達モデルの構築説明的文章の読みの過程モデルに関しては、表意と推意という認知構造に基づいてモデルを構築しつつある。発達モデルに関しては、過程モデルの変容の段階を小学校5年生段階と想定し、具体化の能力と一般化の能力との緊密な発動関係から説明を試みている。上記二点とも、成果の集約を急ぎ、近々まとめて発表する予定である。4,今後の課題読みの過程モデル及び発達モデルを小・中一貫でとらえ、実験授業による検証を積み重ね、精密な統合モデルを完成し、教育課程編成の科学的基礎として提供したい。
鶏のエネルギー代謝効率に対する体蛋白質代謝回転の関与

1.鶏ヒナを絶食させ屠体分析法を用いて絶食時の熱発生量を求める一方、〔【^3H】〕標識アミノ酸の大量一回投与法によって蛋白質代謝回転を測定した。その結果、蛋白質合成に要するエネルギーは基礎代謝量の約14-17%に相当すると推定された。2.鶏ヒナの摂食時における蛋白質代謝回転は合成・分解ともに肉用種の方が卵用種よりやや低く、絶食時には両者がほぼ同じであった。これら肉用種及び卵用種ヒナの基礎代謝量に占める蛋白質合成に要するエネルギーの割合には差がみられなかった。3.飼料蛋白質を変化させた場合、鶏ヒナの体蛋白質合成は飼料蛋白質が0%から20%まで上昇し、それ以上ではほぼ等しいか低下した。4.飼料エネルギー含量を変化させた場合、自由摂取条件下では蛋白質代謝回転に影響はみられなかった。これはヒナが自発的に全摂取エネルギー量を調節したためである。そこでエネルギー摂取量自体を低下させたところ、自由摂取時の約90%以下でエネルギー摂取量の低下とともに蛋白質代謝回転はほぼ直線的に減少した。5.〔【^(15)N】〕標識アミノ酸を用いて産卵鶏における体全体ならびに組織における蛋白質代謝回転測定法を確立した。同法を用い、7日間の蛋白質飢餓によって産卵鶏の蛋白質代謝回転は減少し、7日間の蛋白質再給餌によって低下した値は元のレベルに戻った。6.産卵鶏の体全体の蛋白質合成は蛋白質飢餓の1日目にすでに減少し、7日目では蛋白質合成低下分の約半分が肝蔵及び卵管の低下分で説明された。7.以上の如く研究成果は充分にあがっているものの、蛋白質合成のエネルギーコストについては不明な部分が多く、これらの結果の応用には研究の継続が必要となろう。
アリル化合物の酸化的付加における異常立体化学経路発現の原理と応用

高選択的な触媒合成反応に達成には、触媒サイクルを組立てている各素反応毎の精緻な分子論的理解が必要不可欠な要請である。本研究では、塩化アリルとゼロ価パラジウム錯体とのパラジウム錯体との酸化的付加で起こる新奇な立体化学経路(シン付加)の合成化学的応用を展開するべく、反応論的解析を主たる研究方法とした。基質として、5ーメトキシカルボニルー2ーシクロヘキセニルクロリド(トランス体およびシス体)を用い、種々のパラジウム触媒存在下、トリブチルフェニルスズおよびトリブチルビニルスズとのクロスカップリングを行い、生成物の立体化学を高磁場NMRスペクトルの解析により決定した。反応の立体化学には、反応溶媒と助触媒として用いるオレフィン配位子の選択が重要な役割を果すことが判明した。すなわち、溶媒としてベンゼンや塩化メチレンを用い、助触媒として無水マレイン酸、ジメチルマレ-ト、ジメチルフマレ-ト、フマロニトリルなど電子吸引性の高いオレフィンを用いたときに、見かけ上、立体保持的求核置換反応を経てクロスカップリング生成物が高収率で得られる。これら溶媒、助触媒の組合せのバランスがとれなくなると反応は従来通りの立体反転的求核置換反応で進行した。例えば溶媒をアセトニトリルに変えたり、助触媒をスチレンに変えたりした場合である。基質としては、トランス異性体の方がシス異性体よりも高い立体保持率を示した。以上の結果はいずれも、上記塩化アリルとオレフィンパラジウム(0)錯体との化学量論的酸化的付加の立体化学におよぼす溶媒効果や配位子効果の傾向とほとんど一致している。本成果は反応論的基礎知見が、応用的触媒反応に巧みに生かされた例といえる。
舟橋聖一全資料作成に基づく〈戦前期〉文学の総合的研究

昭和戦前期に知識人の行動主義を唱えて「ダイヴイング」(昭9)を発表、戦後においてはNHK大河ドラマの第一作目「花の生涯」(昭27)などを執筆、丹羽文雄・石川達三とともに「戦後の流行作家三羽ガラス」と呼ばれた舟橋聖一の、戦前期活動の総てを網羅すべく調査・研究を行い、多くの新資料を発見した。そして彼の旧制高等学校時代から「外地」体験を経て終戦に至るまでの主要作品を分析し、国内外のシンポジウムで発表後、論文を雑誌または単行本として刊行させた。1.中村真一郎日記を用いて座談会を開き「『中村真一郎青春日記』と旧制高校」(パネルディスカッション:司会)『中村真一郎手帖第8号』(水声社)とした。その際、舟橋の未公開『戦前日記』を援用しながら司会をつとめつつ、旧制高校が日本にとってどのような役割を果たしたのかなど、竹内洋・鈴木貞美・依岡隆児氏らとともに考察、会場と活発なやり取りを行った。2.東北と文学というテーマにそって「舟橋聖一」(『東北近代文学事典』勉誠出版)を書いた。父と妻が仙台出身であり、平民首相とよばれた盛岡出身の原敬が殺された理由を東北を背景としながら解いていく作品を書いていることもわかった。3・井上章一編『性欲の研究』(平凡社)につき、関西性欲研究会にて講評。舟橋の作品が「みみず千匹」という語を初めて小説に描いたことなど、舟橋文学がもつ多様性を柱として講評を進めた。4.舟橋の「外地」経験の調査結果を、北京清華大学で開催された国際シンポジウムで発表後、「舟橋聖一の満鮮体験」(『解釈第五十九巻』)とし、日本ー中国大陸ー韓国という当時のツールズムに従った作家の動きとその作品を分析した。論文は、中国遼寧大学日本研究所において中国語訳され、大学の雑誌『日本研究』に「占前日本文学家下筆下的中国東北」として掲載された。1.これまで不明確だった戦前期の900近い舟橋作品(戯曲・小説・詩・評論随筆など)の作品発表年表の完成。その際、従軍も従軍記者もつとめなかったことから外地と関連のない作家だと思われていたが、実は外地に赴いており、その時の経験をもとに描いた作品もあることがわかった。その研究成果を、北京清華大学で開催された国際シンポジウムで発表した。また、昭和9年から10年に頂点を迎えた行動主義文学運動に関する作品および資料の発掘による研究成果を、台湾中央研究院で開催された国際シンポジウムで発表した。これにより舟橋作品が東アジア圏と大きな関わりと有意性をもっていることが証明された。また、上記の発表機会を得ることから、次年度予定していた旧「満洲国」におけるフィールドワークも行い、舟橋が関連した新京、奉天、大連の各ヤマトホテルや満鉄資料を収集することができた。その成果の一端は彦根市立図書館で公開中である。2.未公開の『戦前日記』(1923年から38年)の翻刻にとりかかり、約半分を完了。日記の発見は『読売新聞』(6月4日)に掲載された。現在注釈を入れる作業もはじめており、これが出版されれば、当時の文壇の動向のみならず、2・26事件などの歴史的事件に関する情報も一般に公開されることとなる。また、旧制水戸高校のことも記されてていたことから、日本における旧制高校の研究にも寄与できた。3.樺太関連パンフレットを発見。それによりツンドラ加工品の成分が日本で初めて明らかになったことが『読売新聞夕刊』(7月12日)に掲載された。4.戦時期上海で出版された『現代日本小説選集』の発見。これには舟橋聖一「木石」や太宰治「キリギリス」など、日本人作家20人の初めて中国語に翻訳された25作品が収録されていた。単行本に所収刊行。その他、多くの新資料の発掘および関連研究が、これまでの文学研究を大きく推し進める源となっている。想定していた以上の新資料が発掘され、その重要さが新聞2回(「舟橋聖一したたか戦中日記」、「樺太土産に見る独自生活」)、雑誌1回(「『中村真一郎青春日記』と旧制高校」)そして国際シンポジウム2回(北京清華大学、台湾中央研究院)などで認められた。また、海外へ招聘されたことにより、今年度計画の旧「満洲国」におけるフィールドワークも前倒しで進めることができ、『戦前日記』の注入れに反映できた。さらに、戦中日本で開催された大東亜文学者大会に関連して中国上海で刊行された日中の協力体制を示す翻訳書『現代日本小説選集』(これは今まで中国国家図書館に第一集・二集のそろいが保存されていること、そして日本では第二集のみ京都大学図書館に保存されていることがわかっていた)の第一集が今回発見されたことにより、日本でも実物二冊を見ることができるようになった。

なお、彦根市立図書館、京都大学図書館、国際日本文化研究センター図書館でその二冊のコピーを保存し、公開可能となっている。今年度は予定通り、戦後資料の整理として講演が記録されている音声テープのデジタル化など、一般公開のための準備などを行う。また、最終年度として、調査結果および論文発表を行うが、戦前期資料が想定してた以上の内容と分量だったため、さらなる発掘、分析に重きをおくことにする。そうすることが本科学研究費助成事業における有効な手段であるとともに、より価値の高い結果を導き出すことにつながると考えられるからである。その中でも『戦前日記』が文化資料として非常に重要なことが明らかになったため、出版計画を立てた。これに時間と予算を充てていきたい。さらに、調査の進み具合により、舟橋聖一宛てに出された600通におよぶ手紙・葉書の整理に着手し、一般に公開できる形にもっていく。1.資料調査のために、滋賀県彦根市立図書館調査(月2回)、東京都新宿区「舟橋聖一記念文篤館」(月1回)、国会図書館および近代文学館(月1回)。『戦前日記』の出版のために、東京の出版社(月1回)、舟橋聖一長女美香子氏宅(月1回)。上記の出張は、その都度日程を組み合わせて行う。2.資料公開のためのプロジェクターランプの購入。3.CDRなどのデータ保存のための備品購入。など。
Entamoebaの脱嚢関連遺伝子の同定およびプロテオーム解析

本研究では赤痢アメーバの脱嚢・発育の重要なモデルであるEntamoeba invadensの脱嚢・発育系を用い、脱嚢に関与する因子、関連する遺伝子を探求するとともに、脱嚢・発育過程のプロテオーム解析を試みた。Entamoebaの脱嚢に必須なアクチン細胞骨格再編成を制御するRho/Racの機能発現を担う酵素GGT-Iについて解析した。脱嚢促進因子であるcytochalasin Dの特異性についてその化学構造面から解析した。脱嚢時の嚢子壁の破壊にシステインプロテアーゼが深く関与していることを明らかにするとともに、脱嚢・発育にともないそれが嚢子型タイプから栄養型タイプへ変化することを示した。脱嚢前に暴露される胃液は脱嚢促進作用があるが、一方腸液中の胆汁には嚢子に対する毒性作用があることを明らかにした。タンパク質解析に適した様々な化学的性質を表面に持たせたProtein Chipに、様々の試料からアフィニティーを利用して目的タンパク質を捕捉し、その質量数を測定するシステムであるSELDI-TOF-MS Protein Chipシステムを用い、プロテオーム解析を行った。E.invadensの嚢子、脱嚢したアメーバ(metacystic amoebae)および栄養型虫体の細胞抽出液を調製し、これを弱陽イオン交換体の表面性質を持つProtein Chip CM10を用いて分子量2,000-20,000の範囲で調べた。その結果、三種発育型のタンパク質ピーク・プロファイルに明らかな違いが認められた。それ故、この方法により脱嚢・発育過程のタンパク質の発現の変化を捉えることができた。2次元電気泳動法(2-DPAGE)のシステムを用い、調製した嚢子、脱嚢したアメーバおよび栄養型虫体の試料をpH3-10の等電点電気泳動後、SDS-PAGEを行った。その結果、三種発育型に共通なタンパク質のスポットとともに、異なるスポットも認められた。それ故、この方法によっても、脱嚢・発育過程のタンパク質の発現の変化を捉えることができた。Entamoeba invadensのin vitro脱嚢系を用い、今年度は以下の研究を行った。1.cytochalasin Dの脱嚢・発育に及ぼす効果:アクチン重合阻害剤cytochalasin Dがアメーバの嚢子形成を抑制することは既に明らかにしたが、脱嚢・発育に対する効果を調べた結果、予想に反し両過程を促進することが判明した。即ち、脱嚢誘導後5hrという時間ですでに脱嚢した虫体数は対照に比し有意に増加しており、その後対照との差は著しく拡大した。また、この脱嚢促進効果は0.1μMという低い濃度でもみられた。一方、他のcytochalasin A、B、Eおよびdihydrocytochalasin B (dB)についてもその効果を調べた結果、A、B、dBによる促進効果はほとんど認められず、Eは10μMで抑制効果を示した。cytochalasinは化学構造上の基本骨格を共有し、とりわけcytochalasin DとBの違いはわずかである。それ故、その化学構造と機能の関連を明らかにするうえでも興味深い。現時点でこの促進機構は不明だが、cytochalasin Dによる脱嚢促進は脱嚢関連遺伝子を調べるうえで重要な系になりうると考えられた。2.システインプロテアーゼ阻害剤の脱嚢・発育に及ぼす効果:アメーバの嚢子壁はキチンとタンパク質から成り、脱嚢時嚢子壁に穴を開けるため、これらを破壊する必要がある。そこでまずシステインプロテアーゼ阻害剤の効果を検討した。

用いた6種の阻害剤のうちZ-Phe-Ala-DMKおよびEST(E-64d)が濃度に依存してアメーバ虫体数を減少させた。嚢子の生存率には影響を及ぼさず、発育に対してもこれらの阻害剤は阻害効果を示したことから脱嚢・発育への関与が示唆された。3.二次元電気泳動(2・D)による脱嚢のプロテオーム解析:嚢子および脱嚢直後のアメーバを可溶化し2-Dで比較した結果、それぞれに特有なスポットが認められた。Entamoeba invadensのin vitro脱嚢系を用い、今年度は以下の研究を行った。1.胃液および腸液のアメーバの脱嚢・発育に及ぼす影響:アメーバのヒトへの感染型である成熟嚢子は経口摂取され小腸で脱嚢する前に、胃液および腸液に曝される。これがその後の脱嚢・発育に及ぼす効果について調べた。人口胃液(artificial gastric fluid : AGF)として0.5%ペプシン塩酸(pH1.8)を、人口腸液(artificial intestinal fluid : AIF)として1% pancreatin/5% ox bile (pH8.0)を用いた。その結果、嚢子をAGFで37°C、30分あるいは60分前処理することにより、脱嚢が促進されることが判明した。26°Cで前処理したときには脱嚢促進効果は認められなかった。脱嚢後の発育に関してはわずかな促進効果が認められた。この結果から、AGF(37°C)は脱嚢を促進するが、AIFは逆に含有するbileにより抑制的に作用することが明らかになった。2.ProteinChip/SELDI-TOF MSによる脱嚢・発育の解析:ProteinChip/SELDI-TOF MSシステムは蛋白質解析に適した様々な化学的性質を表面に持たせたProteinChipと測定に用いられるReaderおよび測定・解析に使用されるソフトウエアから構成され、様々の試料から、ProteinChipに対するアフィニティーを利用して目的蛋白質を捕捉し、その質量数を測定するシステムである。Chip上で簡便に蛋白質の解析ができ、少量の試料から短時間に結果を得ることができる利点を有する。今回、E.invadensの嚢子、脱嚢したアメーバ(metacystic amoeba)および栄養型虫体の細胞抽出液を調製し、これを弱陽イオン交換体の表面性質を持つCM10をProteinChipとして用い、2,000-20,000Daの質量範囲で解析した。その結果、嚢子からmetacystic amoeba、さらに栄養型虫体への変化の過程が蛋白質ピークの変化として捉えられ、この方法の有用性が明らかになった。Entamoebaの脱嚢・発育にprotein kinaseC (PKC)及びphosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)の関与ならびにアクチン細胞骨格再構成が起こることを先に明らかにしたが、情報伝達系でこれらの分子の上流に位置し、機能制御するのがRasスーパーファミリー低分子量Gタンパク質(Ras small GTPase)である。
真正細菌SRP RNAのAluファミリー相同配列の構造・機能相関

蛋白質分泌過程の初期に関与する哺乳類シグナル認識粒子(SRP)の構成因子であるSRP RNAは、機能上4ドメイン(IIV)から成る特徴的な二次構造を持つ。また、これまで調べられたほぼ全ての生物においてSRP RNAは存在していることから、SRP-SR(SRP受容体)系は広く生物界に保存されている現象である。枯草菌SRP RNAのドメインIV領域にはSRP54の相同因子であるFfhや蛋白質伸張因子EF-Gがそれぞれ独立に結合することを見いだしているが、本研究において、枯草菌SRP RNAドメインI領域に対して高い結合特異性を持つ蛋白質としてヒストン様蛋白質HBsuを同定した。HBsuに対する抗体を用いた免疫沈降実験により、HBsuとFfhはSRP RNAを介して細胞内で複合体を形成していた。この複合体の沈降系数は約8Sであった。HBsuの蛋白質分泌系における機能を調べるため、HBsuをIPTGで発現誘導可能な条件欠損変異株を作成した。この変異株は,IPTG非存在下で培養した結果、培養開始後57時間で顕著な生育阻害を示した。変異株に枯草菌アルカリプロテアーゼ(AprE)、ペニシリン結合蛋白質5^*(PBP5^*),サイクロデキストリン合成酵素(CGTase)の各種シグナル配列と大腸菌β-lactamase(Bla)との融合蛋白質の発現プラスミドを導入、発現させ、Western blottingにより前駆体の蓄積の解析を行った。HBsu非存在下において培養開始後3時間ですでに、AprE-Bla、PBP5^*-Blaの約50%が前駆体として蓄積しており、CGTase-Blaでは約10%の前駆体の蓄積が観察された。これらの結果よりHBSuはFfh、scRNAと共にSRP様粒子を構成し、一群の蛋白質の分泌に関与していることが示された。真核生物以外にも、SRP様粒子が存在することを初めて証明することができた。今後、分泌過程におけるSRP RNAの動的な変化を解析する必要がある。
IL-12の破骨細胞形成抑制に関するメカニズムの解明

骨の吸収には、骨芽細胞等から産生されたRANKLによって誘導された破骨細胞による生理的骨吸収と、TNF-αによって誘導された破骨細胞によって引き起こされる病的骨吸収があると考えられている。また、その制御には、様々なサイトカインの関与が考えられている。近年、破骨細胞誘導に免疫担当細胞の関与が多く報告されている。しかしながら、免疫において重要な働きをしているIL-12と骨代謝に関しての報告はほとんどない。そこで本報告では、TNF-αによる破骨細胞誘導へのIL-12の影響の検討を行った。5週齢ddYマウスの大腿骨および脛骨から骨髄細胞を採取し、全骨髄細胞を,M-CSFおよびTNF-α存在下で培養し同時にIL-12を0.001100ng/mlの濃度で作用させた。また、骨髄細胞から得られたM-CSF依存性のマクロファージ(破骨細胞前駆細胞)をM-CSFおよびTNF-α存在下でIL-12を作用させた。それぞれ、TRAP陽性細胞の数を測定した。全骨髄細胞をM-CSF存在下でTNF-α単独で作用させた場合、破骨細胞様細胞が形成されたが、同時にIL-12を作用させた場合、用量依存的に付着細胞の数が減少した。全細胞を回収し、DNAのフラグメンテーションを解析したところ、約180bpごとのラダーが認められた。また、この作用は、破骨細胞前駆細胞を用いた場合には、起こらなかった。これらのことから、TNF-αとIL-12を同時に全骨髄細胞に作用させるとアポトーシスを誘導する事がわかった。また、その作用は、破骨細胞前駆細胞への直接作用ではないことが示唆された。このアポトーシスを起こす原因は、骨髄細胞の非付着細胞にIL-12が作用して、FasLを発現させ、付着細胞にTNF-αが作用してFasを発現することにより、付着細胞にFas-FasLの相互作用によることがわかった。5週齢ddYマウスの大腿骨および脛骨から骨髄細胞を採取し、全骨髄細胞をM-CSFおよびTNF-α存在下で培養し同時にIL-12を0.001100ng/mlの濃度で作用させた。現在、作用している成分およびIL-12が直接作用している細胞を検討している。

また、その作用は、破骨細胞前駆細胞への直接作用ではないことが示唆された。このアポトーシスを起こす原因は、骨髄細胞の非付着細胞にIL-12が作用して、FasLを発現させ、付着細胞にTNF-αが作用してFasを発現することにより、付着細胞にFas-FasLの相互作用によることがわかった。