hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ＡＤＭＡ化タンパク質代謝系を標的とする脳神経疾患関連因子の探索と作用機構の解明

平成23年度においては、(1)ラット脳組織におけるADMA代謝系の存在を立証すること、ならびに(2)脳組織におけるADMA化タンパク質を同定し、in vitroにおけるアルギニンメチル化を実証することの二課題を計画・実施した。得られた結果を以下に報告する。まず、一つ目の課題では、中枢神経系におけるADMA代謝関連酵素(PRMT1およびDDAH1)の発現細胞を同定し,NO産生細胞との組織学的連関について解析した。ウエスタンブロット法により、両酵素は中枢神経系において広く発現していることが明らかとなった。この情報をもとに,脊髄,大脳皮質,海馬,視床,視床下部について詳細な免疫組織化学的観察を行い,神経型NOS(nNOS)との組織学的連関についても解析した。脊髄において,PRMT1およびDDAH1は灰白質に広く分布し,両酵素は脊髄運動ニューロンならびに介在ニューロンにおいても共存が認められた。脳における免疫組織化学的解析では,これら酵素は脳の神経細胞に広く発現し,特に大脳皮質や視床下部においては,nNOSと高い割合で共存した。以上の結果は,中枢神経系でのPRMTとDDAHの共存を初めて明らかにし,nNOSとの形態学的連関性からADMAの代謝系がnNOS調節に重要であることを裏づけるものである。二つ目の課題では、全脳組織抽出液の二次元電気泳動/ウエスタンブロット解析において特定されたスポットをMALDI-TOF MS分析によりPMF解析した結果、中枢神経系において重要な役割を果たしている2種のタンパク質が同定され、今後の研究のターゲットを定めることができた。平成24年度の目的の達成度は80%と評価する。研究実績の概要のところでも述べたように、当初の実験計画を大きく変更したため、平成24年度の当初の目的は全く達成できなかった。しかし、実験方法の改善により、ADMA化タンパク質として、中枢神経系機能にとって重要なタンパク質が同定されたことにより、本研究課題全体の目標達成に大きく近づくことができた。目的の達成度は80%と自己評価する。一番目の課題については、問題なく達成できたが、(2)の課題において同定されたADMA化タンパク質の組換え型タンパク質の大腸菌における発現系構築に時間を費やし、まだ組換えタンパク質を精製できていない。したがって、in vitroでのアルギニンメチル化反応による解析結果が得られていない。平成24年度の実験において、本研究課題の目的を達成するためのターゲットタンパク質が明確になった。一つ(RPS2)は、40Sリボソームを構成するペプチドの一つであり、タンパク質の翻訳過程に係る因子であり、他の一つ(COXII)は、ミトコンドリアにおける呼吸鎖に関与する酵素である。いずれも、生命の根幹に係るタンンパク質ゆえに、そのアルギニンメチル化とそれら分子の中枢神経系における機能性との関係を明らかにすることは、老化に伴う脳機能減衰の原因解明さらには脳機能改善への道につながるものと期待される。したがって、最終年度は以下に列記した項目を順番に遂行する予定である。1.COXIIのアルギニンメチル化システムの解析:RPS2については、そのN末端にあるGARモチーフのアルギニン残基がPRMT3によりメチル化されることが分かっているが、COXIIについては全く情報がない。
農業排水路の改修が生態系に与えた影響

改修後の農業排水路内魚類相は中長期に変化し,生物量としては大きな差が見られないものの,構成種には明確な違いが見られた.環境配慮工法には魚類維持に一定の効果が見られ,種毎の変動は産卵形態が強い影響を持っていた.食物連鎖を支える有機物は人為起源のものと推察され,都市を流下する排水路の特異な環境が示唆された.排水路内では脱窒などにより顕著な水質浄化現象が見られることも確認できた.これら生物維持,水質浄化は農業用排水路の機能の一部として考えることが可能である.得られた知見によるモデルはシナリオベースで依然改善の余地があるが,魚類相がわずかな環境変化で失われる可能性を示唆するものとなった.改修後の農業排水路内魚類相は中長期に変化し,生物量としては大きな差が見られないものの,構成種には明確な違いが見られた.環境配慮工法には魚類維持に一定の効果が見られ,種毎の変動は産卵形態が強い影響を持っていた.食物連鎖を支える有機物は人為起源のものと推察され,都市を流下する排水路の特異な環境が示唆された.排水路内では脱窒などにより顕著な水質浄化現象が見られることも確認できた.これら生物維持,水質浄化は農業用排水路の機能の一部として考えることが可能である.得られた知見によるモデルはシナリオベースで依然改善の余地があるが,魚類相がわずかな環境変化で失われる可能性を示唆するものとなった.食料・農業・農村基本法が施行されて以降,農業用排水路が改修される場合においても,それ以前のように通水機能のみを対象とするのではなく,生態系にも配慮した工法が導入されるようになってきた。一方で,これら工法を用いた改修の効果は設置された箇所毎の特性の違いや効果自体の抽出の困難さから依然として十分に評価がなされているとはいえず,さらに改修による中長期の生物相の遷移については,これまで全くといって良いほど調査事例がない.そのため,本研究では,平成10年度よりコンクリートライニングによる改修が行われてきている大江排水路を取り上げ,その改修が生態系にどのような影響を及ぼしてきたのかを多角的な視座から調査・解析することを目指している.本年度は,年間20回程度の調査を行い,魚種相の変化,食物網の実態,水質の状況を明らかにしてきた.魚種相は10年経過した水路ではほぼ安定に近づきつつも,メダカなどの減少していた魚種が再度増加するなどの変化が見られた.食物網は一般的な水路や河川と異なり,生活排水あるいは農業廃水に含まれる有機物に依存していることが明らかになりつつあり,水質も生活排水の影響が非常に強いことが指標にも現れていることを示した.食料・農業・農村基本法が施行されて以降,農業用排水路が改修される場合においても,それ以前のように通水機能のみを対象とするのではなく,生態系にも配慮した工法が導入されるようになってきた.一方で,これら工法を用いた改修の効果は設置された箇所毎の特性の違いや効果自体の抽出の困難さから依然として十分に評価がなされているとはいえず,さらに改修による中長期の生物相の遷移については,これまで全くといって良いほど調査事例がない.そのため,本研究では,平成10年度よりコンクリートライニングによる改修が行われてきている大江排水路を取り上げ,その改修が生態系にどのような影響を及ぼしてきたのかを多角的な視座から調査・解析することを目指している.本年度は,年間20回をこえる調査を行い,排水路内の魚種相の変化,安定同位体比分析による食物網の実態,数値水質モデルを組み合わせた水質の実態調査と予測,特定魚種の移動分散の解明を進めてきた.その中でも,大江排水路内のメダカは,その多くが支線排水路から流入であることをサテライトマーカー分析により明らかにしたことは興味深い知見であるといえる.すなわち,排水路内の魚種相は,下流河川と上流側の支線排水路からの流入に支えられており,栄養としては十分なものを持つが,独立したものではないということが明確になってきた.今後の幹線農業用排水路の生態系管理を考える上では有益な情報であると考えている.食料・農業・農村基本法が施行されて以降,農業用排水路が改修される場合においても,それ以前のように通水機能のみを対象とするのではなく,生態系にも配慮した工法が導入されるようになってきた.一方で,これら工法を用いた改修の効果は設置された箇所毎の特性の違いや効果自体の抽出の困難さから依然として十分に評価がなされているとはいえず,さらに改修による中長期の生物相の遷移については,これまで全くといって良いほど調査事例がない.そのため,本研究では,平成10年度よりコンクリートライニングによる改修が行われてきている大江排水路を取り上げ,その改修が生態系にどのような影響を及ぼしてきたのかを多角的な視座から調査・解析することを目指している.本年度は,データがかなり揃ってきたことから,調査は地点を絞り,毎月1回とした上で,排水路内の魚種相の変化,安定同位体比分析による食物網に関するデータ解析,及び硝化脱窒菌に注目した水路内の水質形成機構の解明に重点を置いて研究を進めた.安定同位体比分析では他地域との比較により,大江排水路の特異性がより明確となった.また,昨年度に引き続き,微生物群集解析を行うとともに,亜酸化窒素での脱窒を確認した.さらにはデジタルPCRによる定量化を試みている.これらの成果は依然初歩の段階ではあるが,今後の幹線農業用排水路の水質および生態系管理を考える上では有益な情報であると考えている.

食料・農業・農村基本法が施行されて以降,農業用排水路が改修される場合においても,それ以前のように通水機能のみを対象とするのではなく,生態系にも配慮した工法が導入されるようになってきた.一方で,これら工法を用いた改修の効果は設置された箇所毎の特性の違いや効果自体の抽出の困難さから依然として十分に評価がなされているとはいえず,さらに改修による中長期の生物相の遷移については,これまで全くといって良いほど調査事例がない.そのため,本研究では,平成10年度よりコンクリートライニングによる改修が行われてきている大江排水路を取り上げ,その改修が生態系にどのような影響を及ぼしてきたのかを多角的な視座から調査・解析することを目指している.本年度は,年間15回をこえる調査を行い,排水路内の魚種相の変化,安定同位体比分析による食物網の実態,水質の実態調査と硝化脱窒菌に注目した水路内の水質形成機構の解明を進めてきた.安定同位体比分析ではデータの蓄積が進み,大江排水路の特異性がより明確となった.また,新たに導入した微生物群集解析では,大江排水路内での脱窒および硝化の活性度が場所により変化していることを示し,クローズドチャンバーでは亜酸化窒素での脱窒を確認できた.これらの成果は依然初歩の段階ではあるが,今後の幹線農業用排水路の水質および生態系管理を考える上では有益な情報であると考えている.食料・農業・農村基本法が施行されて以降,農業用排水路が改修される場合においても,それ以前のように通水機能のみを対象とするのではなく,生態系にも配慮した工法が導入されるようになってきた.一方で,これら工法を用いた改修の効果は設置された箇所毎の特性の違いや効果自体の抽出の困難さから依然として十分に評価がなされているとはいえず,さらに改修による中長期の生物相の遷移については,これまで全くといって良いほど調査事例がない.そのため,本研究では,平成10年度よりコンクリートライニングによる改修が行われてきている大江排水路を取り上げ,その改修が生態系にどのような影響を及ぼしてきたのかを多角的な視座から調査・解析することを目指している.本年度は,現地調査は6月までとして,排水路内の魚種相の変化,安定同位体比分析による食物網に関するデータの分析に重点を置いた.また,脱窒菌に注目した水路内の水質形成機構の解明について昨年度に引き続き研究を進めた.安定同位体比分析では魚類が農業・生活排水を起源とする有機物に強く依存していることが明らかとなり,魚類相に関しては,産卵が困難となった魚種が,減少,増加,減少と不安定に推移していることが確認された.脱窒に関しては,アセチレン阻害法を用いて脱窒速度を計測した結果,水路内の脱窒は干潟などと同程度の大きさになることが判明した.これらの成果は依然初歩の段階ではあるが,今後の幹線農業用排水路の水質および生態系管理を考える上では有益な情報であると考えている.26年度が最終年度であるため、記入しない。水資源環境学26年度が最終年度であるため、記入しない。改修された農業用排水路の水環境を多角的な視座から調査を行っており,生物相や食物網,あるいは魚類の移動については知見が蓄積されつつある.水質については当初あまり検討していなかった微生物の影響についても含める方向で研究が進んでおり,申請時の目的とは必ずしも一致しない内容も含んでいる.改修された農業用排水路の水環境を多角的な視座から調査を行っており,生物相や食物網,あるいは魚類の移動については知見が蓄積されつつあり,現在,論文投稿の準備が進んでいる.
ホウ素系化合物における新しい熱電材料の開発-強磁性熱電材料の可能性-

研究代表者はこれまでに,CaB_6,SrB_6,BaB_6などの二価の金属六ホウ化物がn型の高い熱電特性を示すことを明らかにしてきた.これらの熱電特性は,従来報告されていたn型ホウ化物の中で最も高く,p型ホウ化物と同程度である.更なる特性向上のために,熱伝導率の低減の試みた.また,電子状態計算により,n型キャリアの起源について調べた.1.熱伝導率低減二価の金属六ホウ化物は,電気的特性は共通点が多く,特にキャリアの易動度は金属の種類によらない.この性質を利用し,原子量の最も異なるCaB_6とBaB_6の混合相(体積比で3:1,1:1,1:3の三種類)を作製し,電気的な特性を大きく変えず,熱伝導率の低減を試みた.その結果,ゼーベック係数,電気伝導率は各CaB_6,BaB_6単相の値の間をとり,混合による電気的特性の低下は見られなかった.一方,熱伝導率は,いずれの混合比においても単相より低い値を示し,原子量の異なる相の混合により格子熱伝導率が低減したと考えられる.この熱伝導率の低減により,熱電性能は単相に比べて1.22.2倍向上した.2.電子状態計算によるキャリアの起源解明二価の金属六ホウ化物は理論的には半導体であると考えられている.しかし,本研究で作製した試料は金属的な電気伝導を示し,さらに,作製方法によりキャリア濃度が変化することがわかっている.この原因を明らかにするために,ホウ素もしくは金属元素の欠損が電子状態に及ぼす影響を調べた.その結果,ホウ素の欠損によりバンドギャップ内に準位が形成されることが明らかになった.作成条件により,ホウ素の欠損量(主に雰囲気中の酸素によるものと考えられる)が変わり,その結果としてキャリア濃度に変化が生じたものと考えられる.これまでにCaB_6相が高い熱電特性を有することを報告したが,今年度は同じアルカリ土類金属であるSr, Baについて六ホウ化物の作製および熱電特性の評価を行った.SrB_6,BaB_6についてもCaB_6と同様に金属酸化物の還元反応を利用して粉末試料を作製した後,放電プラズマ焼結機にてバルク状試料を得た.ゼーベック係数は測定した室温から800°Cの範囲で負の値であり,この材料がn型であることを示している.ゼーベック係数の絶対値は約50150μV/Kであり,CaB_6に比べると小さいが,電気伝導率は逆にCaB_6より1桁以上大きい値であった.ゼーベック係数,電気伝導率から算出される出力因子は,BaB_6でCaB_6と同程度,SrB_6はそれらの2倍程度高い値で,700°Cにおいて最大値約3×10^<-3>W/mK^2を示した.これらの出力因子は現在実用化されている熱電材料と同程度である.また,SrB_6の無次元性能指数は800°Cにおいて約0.3であり,これまでに知られているn型のホウ素系材料では最高の値であることがわかった.これら金属六ホウ化物の更なる熱電特性向上のための基礎として,ホール効果測定よりキャリア濃度を見積り,熱電特性との関係を調べた.室温におけるキャリア濃度はCaB_6,SrB_6,BaB_6の順に大きくなり,それに伴って電気伝導率は増加しゼーベック係数の絶対値は減少した.キャリアの移動度は各試料でほぼ同じであり,この金属六ホウ化物の熱電特性がキャリア濃度に依存していることがわかった.さらに,金属元素の一部を他の金属で置換し,キャリア濃度を変えることにより熱電特性を制御できることが明らかになった.これにより,最適キャリア濃度の実現と,熱伝導率の低減の指針を得ることが出来た.研究代表者はこれまでに,CaB_6,SrB_6,BaB_6などの二価の金属六ホウ化物がn型の高い熱電特性を示すことを明らかにしてきた.これらの熱電特性は,従来報告されていたn型ホウ化物の中で最も高く,p型ホウ化物と同程度である.更なる特性向上のために,熱伝導率の低減の試みた.また,電子状態計算により,n型キャリアの起源について調べた.1.熱伝導率低減二価の金属六ホウ化物は,電気的特性は共通点が多く,特にキャリアの易動度は金属の種類によらない.この性質を利用し,原子量の最も異なるCaB_6とBaB_6の混合相(体積比で3:1,1:1,1:3の三種類)を作製し,電気的な特性を大きく変えず,熱伝導率の低減を試みた.その結果,ゼーベック係数,電気伝導率は各CaB_6,BaB_6単相の値の間をとり,混合による電気的特性の低下は見られなかった.一方,熱伝導率は,いずれの混合比においても単相より低い値を示し,原子量の異なる相の混合により格子熱伝導率が低減したと考えられる.この熱伝導率の低減により,熱電性能は単相に比べて1.22.2倍向上した.2.電子状態計算によるキャリアの起源解明二価の金属六ホウ化物は理論的には半導体であると考えられている.しかし,本研究で作製した試料は金属的な電気伝導を示し,さらに,作製方法によりキャリア濃度が変化することがわかっている.この原因を明らかにするために,ホウ素もしくは金属元素の欠損が電子状態に及ぼす影響を調べた.その結果,ホウ素の欠損によりバンドギャップ内に準位が形成されることが明らかになった.

作成条件により,ホウ素の欠損量(主に雰囲気中の酸素によるものと考えられる)が変わり,その結果としてキャリア濃度に変化が生じたものと考えられる.
非ニュートン流体特性に着目した高濃度土砂流の流動機構の解明

粘土やシルトを高濃度に含有する高濃度土砂流は,有明海湾奥部の感潮域や黄河下流域の河川,土石流や泥流として観察されている.土砂濃度の高い流れの動力学特性は,清水流とは大きく異なり,粘性や密度が増大すると同時に,乱れの強さ,土砂の濃度分布,流れの抵抗特性および土砂輸送能力が変質することが予想されるが,その流動機構については不明な点が多い.高濃度土砂流の解釈は研究者により異なる.Bradley & McCutcheon(1985)は,体積濃度が20%以下では密度や粘性への影響が小さい標準的な水流とし,20%以上でその特徴が現れ,特に,粘土やシルトの体積濃度が5%以下の土砂流では非ニュートン流体特性を示すことが指摘されている.土砂濃度以外に粒子の大きさ,形状,粒度分布,土粒子中のミネラル含有量も,高濃度流を特徴付けるパラメータとなる.ミネラルを多く含んだ土砂が流れ込む黄河においては,濃度200kg/m3,体積濃度が約8%以上を高濃度と定義されている.高濃度土砂流の抵抗について,滑面開水路流れでは,中央粒径d50が0.026mmのシルトを用いた実験では土砂濃度の増大に伴って抵抗が減少傾向を示す場合や,逆に粘土を用いたWang(1993)の実験では体積濃度が約9%で若干増大することが報告され,現在の所,粘土やシルトを高濃度に含む土砂流に関しては,体系的な実測データは得られておらず,開水路流れおよび管路流れの何れにおいても濃度の増大に伴って抵抗が増大するか否かについての統一的見解は得られていない.更に,高濃度土砂流においては流れの詳細な実測データを捉えた研究例は少なく,その内部構造については不明な点が多く残されている.そこで本研究は,高濃度土砂流の粘性特性を明らかにした上で,管路,滑面開水路,球状粗度河床開水路,砂堆河床開水路など異なる境界条件における高濃度土砂流の抵抗特性を把握し,PIV(Particle Image Velocimetry)法を用いてその流れ構造の解明を行った.具体的には、高濃度土砂流は非ニュートン流体の粘性特性を有することを明らかにした上で,高濃度土砂流と近似する粘性特性及び抵抗特性を有する高分子剤のPSA水溶液を用いて,滑面,完全粗面及び砂堆河床開水路における高濃度土砂流の抵抗特性とその流動機構について論じた.これらの研究成果は,高分子剤水溶液という模擬流体を用いることにより,従来の土砂を用いた実験などで困難とした計測に対してPIV計測を可能にし,今後の高濃度土砂流の研究に新しい研究手法を提供するとともに,今後の高濃度土砂流を伴う自然災害の予測と防止に大いに活用されることが期待できる.粘土やシルトを高濃度に含有する高濃度土砂流は,有明海湾奥部の感潮域や黄河下流域の河川,土石流や泥流として観察されている.土砂濃度の高い流れの動力学特性は,清水流とは大きく異なり,粘性や密度が増大すると同時に,乱れの強さ,土砂の濃度分布,流れの抵抗特性および土砂輸送能力が変質することが予想されるが,その流動機構については不明な点が多い.高濃度土砂流の解釈は研究者により異なる.Bradley & McCutcheon(1985)は,体積濃度が20%以下では密度や粘性への影響が小さい標準的な水流とし,20%以上でその特徴が現れ,特に,粘土やシルトの体積濃度が5%以下の土砂流では非ニュートン流体特性を示すことが指摘されている.土砂濃度以外に粒子の大きさ,形状,粒度分布,土粒子中のミネラル含有量も,高濃度流を特徴付けるパラメータとなる.ミネラルを多く含んだ土砂が流れ込む黄河においては,濃度200kg/m3,体積濃度が約8%以上を高濃度と定義されている.高濃度土砂流の抵抗について,滑面開水路流れでは,中央粒径d50が0.026mmのシルトを用いた実験では土砂濃度の増大に伴って抵抗が減少傾向を示す場合や,逆に粘土を用いたWang(1993)の実験では体積濃度が約9%で若干増大することが報告され,現在の所,粘土やシルトを高濃度に含む土砂流に関しては,体系的な実測データは得られておらず,開水路流れおよび管路流れの何れにおいても濃度の増大に伴って抵抗が増大するか否かについての統一的見解は得られていない.更に,高濃度土砂流においては流れの詳細な実測データを捉えた研究例は少なく,その内部構造については不明な点が多く残されている.そこで本研究は,高濃度土砂流の粘性特性を明らかにした上で,管路,滑面開水路,球状粗度河床開水路,砂堆河床開水路など異なる境界条件における高濃度土砂流の抵抗特性を把握し,PIV(Particle Image Velocimetry)法を用いてその流れ構造の解明を行った.具体的には、高濃度土砂流は非ニュートン流体の粘性特性を有することを明らかにした上で,高濃度土砂流と近似する粘性特性及び抵抗特性を有する高分子剤のPSA水溶液を用いて,滑面,完全粗面及び砂堆河床開水路における高濃度土砂流の抵抗特性とその流動機構について論じた.これらの研究成果は,高分子剤水溶液という模擬流体を用いることにより,従来の土砂を用いた実験などで困難とした計測に対してPIV計測を可能にし,今後の高濃度土砂流の研究に新しい研究手法を提供するとともに,今後の高濃度土砂流を伴う自然災害の予測と防止に大いに活用されることが期待できる.粘土やシルトを高濃度に含有する高濃度

土砂流は,有明海湾奥部の感潮域や黄河流域の河川,泥流などで観察されている.土砂濃度の高い流れの動力学特性は,清水流とは大きく異なり,粘性や密度が増大すると同時に,乱れの強さ,土砂の濃度分布,流れの抵抗特性および土砂輸送能力が変質することが予想され,その流動機構については不明な点が多い.本研究では,高濃度土砂流における非ニュートン流体特性に着目し,黄河下流域の済南市で採取した河床材料と市販の粘土を用いて高濃度土砂流を管路に発生させ,その抵抗特性を検討した.実験では,黄河土砂とカオリンの何れも土砂濃度の増大に伴って摩擦損失係数は増大し,体積濃度が10%で清水に比べて黄河土砂で1.30倍,カオリンで1.28倍であり,若干黄河土砂の方で大きな値を示す.また,低せん断速度においては高濃度土砂流の粘性係数は清水に較べて102103に達することが見出された.高濃度土砂を伴う非ニュートン流体の流れの構造は,実験では高濃度土砂流と類似の粘性特性を有する高分子溶液を用い,流速計にPIV(Particle Image Velocimetry)を適用し,数値計算では直接数値シミュレーション(DNS)を基に検討している.具体的には、乱泥流の特色を有する高濃度土砂流の実態解明を図るために高濁度流れを室内実験水路に再現し,高濁度且つ高粘性の流動機構,濃度分布特性および抵抗則を明らかにすることを主目的に、以下の項目を検討した.1粘土やシルトを高濃度に含有する土砂流体の非ニュートン流体の物理特性2高濃度土砂流の抵抗則の解明3高粘性流体における各種河床波上の開水路流れの流動機構4非ニュートン流体開水路乱流に対する直接数値シミュレーション(DNS)手法の開発粘土やシルトを高濃度に含有する高濃度土砂流は,有明海湾奥部の感潮域や黄河流域の河川,泥流などで観察されている.土砂濃度の高い流れの動力学特性は,清水流とは大きく異なり,粘性や密度が増大すると同時に,乱れの強さ,土砂の濃度分布,流れの抵抗特性および土砂輸送能力が変質することが予想され,その流動機構については不明な点が多い.本研究では,高濃度土砂流における非ニュートン流体特性に着目し,黄河下流域の済南市で採取した河床材料と市販の粘土を用いて高濃度土砂流を管路に発生させ,その抵抗特性を検討した.実験では,黄河土砂とカオリンの何れも土砂濃度の増大に伴って摩擦損失係数は増大し,体積濃度が10%で清水に比べて黄河土砂で1.30倍,カオリンで1.28倍であり,若干黄河土砂の方で大きな値を示す.また,低せん断速度においては高濃度土砂流の粘性係数は清水に較べて102103に達することが見出された.高濃度土砂を伴う非ニュートン流体の流れの構造は,実験では高濃度土砂流と類似の粘性特性を有する高分子溶液を用い,流速計にPIV (Particle Image Velocimetry)を適用し,数値計算では直接数値シミュレーション(DNS)を基に検討している.具体的には、乱泥流の特色を有する高濃度土砂流の実態解明を図るために高濁度流れを室内実験水路に再現し,高濁度且つ高粘性の流動機構,濃度分布特性および抵抗則を明らかにすることを主目的に、以下の項目を検討した.1粘土やシルトを高濃度に含有する土砂流体の非ニュートン流体の物理特性2高濃度土砂流の抵抗則の解明3高粘性流体における各種河床波上の開水路流れの流動機構4非ニュートン流体開水路乱流に対する直接数値シミュレーション(DNS)手法の開発
アラキドン酸12-リポキシゲナーゼ遺伝子の発現調節機構に関する研究

アラキドン酸12-リポキシゲナーゼは、アラキドン酸などの炭素20個の不飽和脂肪酸の12番目の炭素に分子状酸素を導入して、12-ヒドロペルオキシエイコサテトラエン酸を生成する酸素添加酵素である。これまで私達は、ヒトを含めたいくつかの動物種の12-リポキシゲナーゼの酵素学的・免疫学的研究ならびに分子生物学的研究によって、12-リポキシゲナーゼには『血小板型』および『白血球型』の2種類のアイソフォームが存在することを明らかにした。さらに最近になって、ヒトおよびブタの12-リポキシゲナーゼの遺伝子を単離し、遺伝子の長さはそれぞれ約15Kbと8Kbで、いずれも14個のエクソンから構成されていることを示した。ヒトの12-リポキシゲナーゼ遺伝子のプロモーター領域の配列や、この遺伝子がクロモソーム17番の短腕に存在していることなども明らかにした。今回ヒトの12-リポキシゲナーゼの遺伝子の転写調節機構を調べるために、酵素遺伝子の5'-上流領域をルシフェラーゼ遺伝子の上流に組み込んだプラスミドを構築した。これを12-リポキシゲナーゼを発現しているヒト赤白血病(HEL)細胞にリポフェクション法で導入し、ルシフェラーゼの酵素活性を化学発光によって測定することによって、12-リポキシゲナーゼ遺伝子の発現調節機構を解析した結果、AP-2結合配列領域に遺伝子の発現を抑制する可能性があることが示唆された。今後この因子が、実際に酵素遺伝子の転写調節に関与しているかを調べるために、ゲルシフト法やDNaseIフットプリント法を用いて解析して行く予定である。
新しい選択的ラジカルプロセスによる有機合成法の開発に関する研究

1.アルコキシルラジカルのベータ開裂を利用するマクロリドの合成アルコキシルラジカルの遠隔付加-ベータ開裂反応をキ-ステップとするマクロリド類の新合成法を開発し、この手法により、天然マクロリドである(±)-ルシフエイオリド、エキザルトリドなど1117員環ラクトンを多数、高効率で合成した。2.生物活性を有する18-ならびに19-ノルステロイドの高効率合成アルコキシルラジカルの位置選択的ベータ開裂を利用するステロイドの18-ならびに19-ノルステロイドへの変換の新手法を見出し、この手法により、エストロン、19-ノルテストステロン、19-ノルコレスタン系天然物、12-デオキソフクジュソノロン、18-ノルプレグネノロン等を合成した。3.〔2+3〕光付加反応による複素環を含むキノン類の合成2-ヒドロキシ-または2-アミノナフトキノンとオレフィン類の新しい〔2+3〕光付加反応を開発し、この新手法により、天然生理活性キノンであるマチュリノンを含む多数のフロナフトキノン、ベンズインドールキノンを合成した。4.各種生理活性ヘテロステロイドの合成ステロイドケトンを相当するラクトールに導き、ラクトールから発生せしめたアルコキシルラジカルのベータ開裂をキ-ステップとして、O,S,Se,Te,Nを環内に有する生理活性ステロイドを多数合成した。5.電極反応による含窒素ヘテロ環の合成電極反応で発生せしめた窒素ラジカルの環化による1,4-ジ置換ピロリジンの新合成法を確立した。6.その他アルコキシルラジカルによる遠隔官能化、リグナン合成の新手法の開発、新アネレ-シヨン法の開発等、所期の成果を得た。交付申請書記載の各項目順に成果を記す。1.アルコキシルラジカルを利用するマクロリドの合成アルコキシルラジカルの遠隔付加-ベ-タ開裂をキ-ステップとする環状ケトンの環拡大によるマクロリドの新合成法を開発し、この手法を用いて多数の11-17員環ラクトンを合成した。2.生物活性を有する18ならびに19-ノルステロイド類の高効率合成ラクト-ルから発生せしめたアルコキシルラジカルの位置選択的ベ-タ開裂反応をキ-ステップとしてエストロン、19-ノルテストステロン19-ノルコレスタン系天然物、12-デオキソフクジュソノロン、18-ノルプレグネノロン等を合成した。3.アルコキシルラジカルのβ-開裂による新アネレ-ション法の開発励起エノンとアルケンの〔2+2〕シクロ付加により種々のシクロブタノ-ルを合成し、アルコキシルラジカルを発生せしめ、ベ-タ開裂によりウイッドロ-ル骨格を含む種々のビシクロ環を合成した。4.各種生理活性ヘテロステロイドの合成ステロイドケトンを相当するラクト-ルに導き、これらから発生せしめたアルコキシルラジカルのベ-タ開裂をキ-ステップとして、O.S.Se.Te.Nを有するヘテロステロイドを合成した。5.電極反応によるヘテロ環の合成電極酸化で発生せしめた窒素ラジカルの環化による1、4-ジ置換eロリジンの新合成法を確立した。6.アルコキシルラジカルによる遠隔官能化の新手法の開発ステロイドの不活性部位へのアルコキシルラジカルを利用する遠隔反応によるカルボニル基、二重結合、水酸基等の一段階導入の新手法を開発した。1・生物活性を有する18ーならびに19ーノルステロイドの高効率合成昨年度にひきつゞき、ステロイド系ラクト-ルから発生せしめたアルコキシルラジカルの位置選択的ベ-タ開裂反応をキ-ステップとして種々の18ーノルアンドロスタン系ステロイドを合成した。

2・〔2+3〕光付加反応によるフロナフトキノンおよびベンズインド-ルキノン類の合成2ーヒドロキシナフトキノンとオレフインならびに2ーアミノナフトキノンとオレフインの新しい〔2+3〕光付加反応を見出し、これらの付加反応をキ-ステップとして天然フロナフトキノンであるマチュリノンを含む多数のフロナフトキノンを合成した。また、天然ベンズインド-ルキノンであるキナマイシンの骨格を含む多数のベンズインド-ルキノンを合成した。3・アルコキシルラジカルの位置選択的ベ-タ開裂反応を利用するリグナン類の合成アルコキシルラジカルの位置選択的ベ-タ開裂反応をキ-ステップとするリグナン合成の新しい一般法を確立し、同法により(±)セサシンの新合成を行った。4・電極反応による含窒素複素環の合成電極酸化応で生成する窒素原子ラジカルの分子内二重結合への付加を利用して種々のピロリジン環を合成する新方法を確立した。5・マクロリドの新合成法の開発アルコキシルラジカルの遠隔ラジカル付加ー位置選択的ベ-タ開裂反応を利用して天然マクロリドである(±)ルシフエイオリドを含む多数の11ー16員環マクロリドを合成した。
イソップ風動物寓話に偏差として表現された挿絵画像の示す寓話の変容と可塑的本質

イソップ風動物寓話には東西を問わず多くの挿絵が施されてきている。その理由は何かを,「挿絵付与」と「仮面という語をキーに研究を行った。研究に当たって,まず「人間」を描き出す挿絵に注目した。19世紀版ラ・フォンテーヌ『寓話詩』,『万治版伊曽保物語』,中国の『伊索寓言』等の中には,動物の代わりに人間が描かれている挿絵がある。横の関連なく東西挿絵に共通に表れ出たこの類似点は,動物寓話の本質を隠しているものと考えなければならない。次に,しばしば動物寓話が,動物の仮面を被って展開される<仮面劇>と言われてきている点に着目した。仮面は素顔を封印する。しかし仮面はただ隠すのではない。仮面はそれが仮面と意識されるまさにそのときに,仮面として立ち表われて来る。このことを考慮に入れるならば動物でなく人間を直接描き出す挿絵は,裏側によって支えられているという寓話の修辞的本性を炙り出していると考えられる。それゆえジロドゥー,テーヌ,アンヌ=マリ・バシィ,クートン,ガイヤール等の修辞的論述を参照しながら,16世紀から19世紀の挿絵の具体例を仮面劇と見て分析した。こうした作業を通して,動物寓話を演劇的修辞の実践とみなすという一定の結論を引き出した。すなわち,見る者をしてそこに仮面があることを積極的に見せる動物寓話の挿絵の意味は,演劇,特に取り違えを操る<喜劇>の手法であり,このことを明解に提示するために人間を登場させる挿絵が採用された。動物寓話の登場人物は,動物の役柄を演じる人間であることを透かし見せ,用意された被りものをどこかで読み手にちらつかせる。この演劇的設定の明示を挿絵が可能にくれているのであり,そしてこのことが洋の東西を問わず,動物寓話に挿絵を施し続けてきた理由の大きな一つとなっている。挿絵つきイソップ風動物寓話集の豊かな変遷史は,ヨーロッパだけのものではない。日本や中国といったアジア諸国における伝播の上にも,興味深い跡が残こされている。ただし両者の変遷の質は同じではない。その差異に注目することは,東西の「譬え」に対する考え方の相違を露わにするとともに,テクストという言語手段と挿絵という視覚的・造形的な表現媒体の底にある美的・修辞的本質を明らかにしてくれる。今年度取り上げたのは,ヨーロッパの寓話集としては,16・17世紀エンブレム本型の動物寓話集・ボードワン版動物寓話集・ラ・フォンテーヌの挿絵付き『寓話詩』集,日本のものとしては,『万治本伊曽保物語』・ゲラールツ原本の『動物図譜』,中国のものとしては,イソップ動物寓話『伊索寓言』である。とくにそれらのテクスト内容と挿絵の表現手法の相違を,<現実>表現という点に的を当て,おたがいに引き比べながら考察した。より具体的には,種々の動物に与えられる役割の分担・性格付与という点に的を絞った。今年度の考察を通して,ラ・フォンテーヌの『寓話詩』集の動物のもつ役割の意義変化と,寓話の根本的変革を浮き彫りにすることができた。アレゴリーの精神は西洋思想において本質的なものであって,動物寓話にも顕著に見られるが,動物寓話の修辞的な図式的なアレゴリー構造は,ラ・フォンテーヌ以降の近代動物寓話においては乗り越えられた。ヨーロッパに起こったこのような変化は,少なくとも日本と中国においては認められない。東洋におけるイソップ風動物寓話の中の動物の性格

づけ・役割付与には昔話や民話の影響が強く,ラ・フォンテーヌのような形の境界線は引かれないように見える。イソップ風動物寓話には東西を問わず多くの挿絵が施されてきている。その理由は何かを,「挿絵付与」と「仮面」という語をキーに研究を行った。研究に当たって,まず「人間」を描き出す挿絵に注目した。19世紀版ラ・フォンテーヌ『寓話詩』,『万治版伊曽保物語』,中国の『伊索寓言』等の中には,動物の代わりに人間が描かれている挿絵がある。横の関連なく東西挿絵に共通に表れ出たこの類似点は,動物寓話の本質を隠しているものと考えなければならない。次に,しばしば動物寓話が,動物の仮面を被って展開される<仮面劇>と言われてきている点に着目した。仮面は素顔を封印する。しかし仮面はただ隠すのではない。仮面はそれが仮面と意識されるまさにそのときに,仮面として立ち表われて来る、、このことを考慮に入れるならば,動物でなく人間を直接描き出す挿絵は,裏側によって支えられているという寓話の修辞的本性を炙り出していると考えられる。それゆえジロドゥー,テーヌ,アンヌ=マリ・バシィ,クートン,ガイヤール等の修辞学的論述を参照しながら,16世紀から19世紀の挿絵の具体例を仮面劇と見て分析した。こうした作業を通して,動物寓話を演劇的修辞の実践とみなすという一定の結論を引き出した。すなわち,見る者をしてそこに仮面があることを積極的に見せる動物寓話の挿絵の意味は,演劇,特に取り違えを操る<喜劇>の手法であり,このことを明解に提示するために人間を登場させる挿絵が採用された。動物寓話の登場人物は,動物の役柄を演じる人間であることを透かし見せ,用意された被りものをどこかで読み手にちらつかせる。この演劇的設定の明示を挿絵が可能にくれているのであり,そしてこのことが洋の東西を問わず,動物寓話に挿絵を施し続けてきた理由の大きな一つとなっている。
毛髪の角化機構の解明

毛髪の角化機構については不明な部分も多いが、毛髪の主要な構成成分である毛ケラチンと毛ケラチン関連蛋白の密接な相互作用が重要な役割を担っていると考えられている。本研究では、毛ケラチンを安定に発現する細胞系を樹立し、細胞内での毛ケラチン中間径フィラメント形成や、毛ケラチンと毛ケラチン関連蛋白との相互作用を可視化することを目的とした。初めに、毛ケラチンや毛ケラチン関連蛋白を発現するベクターを作製した。続いて培養細胞内でそれぞれの蛋白を発現させ、蛍光標識を行ことで中間径フィラメント形成や相互作用について観察を行った。毛髪の角化機構については不明な部分も多いが、毛髪の主要な構成成分である毛ケラチンと毛ケラチン関連蛋白(hair keratin-associated protein:KAPまたはKRTAP)の密接な相互作用が重要な役割を担っていると考えられてる。我々は、KAPが毛ケラチン蛋白のhead domainと特異的に結合することを生化学的な実験によって明らかにした。しかしながら、in vivoレベルでの毛ケラチンとKAPの具体的な動態についてはほとんどわかっていない。また、毛ケラチンK85のhead domain内のミスセンス変異によって重篤な毛髪疾患を発症することが知られているが、変異がケラチン中間径線維の形成やKAPとの相互作用に及ぼす影響については、これまでに全く解析されていない。本研究の目的は、毛ケラチンを安定に発現する細胞系を樹立し、毛ケラチンとKAPに蛍光標識を行うことで、細胞内での毛ケラチンとKAPとの相互作用を可視化することである。また、変異型K85蛋白の解析を通じ、毛ケラチンのhead domainの役割・重要性をさらに明らかにすることも目的とする。平成27年度は、K85とC末端にEGFP-tagのついた毛ケラチンK34(K34-GFP)を同時に発現するベクター(pIRES-K85/K34-EGFP)を作製した。また、N末端にGST-tagが導入されたK85のhead domainを発現するベクター(pGEX-5X-3-K85-head vector)や、N末端にCherry-tagが導入されたKAP蛋白を発現するベクター(pmCherry-C1-KAP vectors)の作製も行った。さらに、pIRES-K85/34-EGFP vectorおよびpGEX-5X-3-K85-head vectorを鋳型にして、K85のミスセンス変異を導入した。平成27年度の研究計画は、研究に必要な蛋白を発現するベクターを作製することであった。ベクターは予定通り全て作製できたため、研究は順調に進展していると考えられる。平成28年度は、前年度に作成したmammalian expression vectorsをHEK293T細胞にトランスフェクションし、一過性に過剰発現させ、その後、cell lysateを抽出し、目的の蛋白が予想通りに発現しているかどうかをSDS-PAGE→western blotで確認した。平成28年の研究計画は、前年に作製したベクターをHEK293T細胞にトランスフェクションし一過性に過剰発現させ、目的の蛋白が予想通りに発現しているかどうかをSDS-PAGE→western blotで確認することと、pIRES-K85/K34-EGFP vectorをHaCaT, HeLa,PtK2 cellsにそれぞれトランスフェクションし、一過性に過剰発現させた後に、間接蛍光抗体法を行い、K85とK34の中間径線維の形成を観察することであった。さらに、K85が変異型のpIRES-K85/K34-EGFP vectorも同様にトランスフェクションし間接蛍光抗体法を行い、中間径線維の形成に異常を来すかどうかも検討する予定であった。目的の蛋白が発現することはwestern blotで確認できたが、HaCaT細胞などにそれぞれの蛋白を過剰発現させた場合の蛍光抗体法での中間径線維形成の観察が不良であった。よって研究はやや遅れていると考える。毛髪の角化機構については不明な部分も多いが、毛髪の主要な構成成分である毛ケラチンと毛ケラチン関連蛋白(hair keratin-associated protein:KAPまたはKRTAP)の密接な相互作用が重要な役割を担っていると考えられている。我々は、KAPが毛ケラチン蛋白のhead domainと特異的に結合することを生化学的な実験によって明らかにしたが、in vivoレベルでの毛ケラチンとKAPの具体的な動態についてはほとんどわかっていない。

本研究の目的は、毛ケラチンを安定に発現する細胞系を樹立し、毛ケラチンとKAPに蛍光標識を行うことで、細胞内での毛ケラチンとKAPとの相互作用を可視化することである。初めに、毛ケラチンやKAPなどの蛋白を発現するベクターの作製を行った。具体的には、毛ケラチン85(K85)とC末端にEGFP-tagのついた毛ケラチン34(K34-GFP)を同時に発現するベクター(pIRES-K85/K34-EGFP vector)や、N末端にGST-tagが導入されたK85のhead domainを発現するベクター(pGEX-5X-3-K85-head vector)、N末端にCherry-tagが導入されたKAP2-1蛋白を発現するベクター(pmCherry-C1-KAP2-1 vector)を作製した。次にこれらのベクターをHEK293T細胞にトランスフェクションし、一過性に過剰発現させてからcell lysateを抽出して、SDS-PAGE→western blotを行うことで目的の蛋白が発現していることを確認した。続いて、pIRES-K85/K34-EGFP vectorをHaCaT, HeLa, PtK2などの培養細胞にそれぞれトランスフェクションし、一過性に過剰発現させた後に間接蛍光抗体法を行い、K85とK34の中間径線維形成の観察を行った。毛髪の角化機構については不明な部分も多いが、毛髪の主要な構成成分である毛ケラチンと毛ケラチン関連蛋白の密接な相互作用が重要な役割を担っていると考えられている。本研究では、毛ケラチンを安定に発現する細胞系を樹立し、細胞内での毛ケラチン中間径フィラメント形成や、毛ケラチンと毛ケラチン関連蛋白との相互作用を可視化することを目的とした。初めに、毛ケラチンや毛ケラチン関連蛋白を発現するベクターを作製した。続いて培養細胞内でそれぞれの蛋白を発現させ、蛍光標識を行ことで中間径フィラメント形成や相互作用について観察を行った。平成27年度に作成したpIRES-K85/K34-EGFP vector(K85は野生型)を各種培養細胞にそれぞれトランスフェクションし、一過性に過剰発現させた後に、抗K85抗体を用いた間接蛍光抗体法を行う。その結果、K34-EGFPとK85が共発現し、最も効率良く中間径線維を形成する細胞株を選択する。その後、選択した細胞株にK85の変異型のpIRES-K85/K34-EGFP vectorをトランスフェクションし、同様に抗K85抗体を用いた間接蛍光抗体法を行い、中間径線維の形成に異常を来すかどうかを検討する。上記で選択した細胞株に改めてpIRES-K85/K34-EGFP vectors (K85の野生型および変異型)をトランスフェクションし、G418を用いてselectionを行うことで、K85/K34-EGFPを安定に発現する細胞系を樹立する。樹立した細胞株にpmCherry-KAP vectorsをトランスフェクションし、Cherry-KAPとK85/K34-EGFPによって形成された中間径線維の発現パターンの経時的変化を共焦点顕微鏡下で観察する。
ヒルシュスプルング病無神経節腸管における外来神経増生に関する研究

本研究の目的はヒルシュスプルング病無神経節腸管における外来神経の増生の原因をHPC-1をマーカーとして探究することにある。HPC-1は神経特異的蛋白質として発見され、神経発芽(文技形成)を制御すると考えられている。しかし腸管神経系での局在に関する報告は極めて少なく、まず、基礎実験として腸管神経系での存在を詳細に検討し報告した(第32回日本小児外科学会総会で発表)。さらに発生過程での発現様式をラット胎児を用いて検索した(第33回日本小児外科学会で発表、JSmooth Muscle Res,33:61-66,1997)。その後の研究でHPC-1は神経のみではなく、exocytosis(開口放出)を示す組織に広範に分布していることが判明し、exocytosis関連蛋白として神経系での神経伝達物質の放出もコントロールしていることが明らかとなった。そこでこれら放出関連蛋白質の正常およびヒルシュスプルング病での腸管神経系での局在を検討したところ、正常腸管神経系では検索した6種類の蛋白質すべてが明瞭に認識されたのに対し、ヒルシュスプルング病無神経節腸管ではHPC-1の染色性は正常部に比較し著しく低下していた(第40回日本平滑筋学会総会で発表)。HPC-1は神経の発芽(分枝形成)を制御していると考えられており、この蛋白質が無神経節部で低下していることは、すなわち、分枝形成が促進している状態にあるとも考えられ今後も検討を進める予定である。本研究の目的はヒルシュスプルング病無神経節部腸管における外来神経の増生を神経発芽(分枝形成)を制御すると考えられている神経特異的蛋白質HPC-1をマーカーとして検索することにある。生体におけるHPC-1の局在は中枢神経系を中心に研究されてきたが腸管神経系に関する報告は極めて少ないため、まず、成熟ラットの腸管を用いてHPC-1抗体を使用した免疫組織学的色法の確立を行った。その結果、腸管にも中枢神経系と同様にHPC-1陽性神経線維が存在することを形態学的に証明した。さらにWestern blot法にて生化学的にもその存在を確認した。(第32回日本小児外科学会総会にて発表、平成7年6月29日、横浜、現在投稿準備中)以上の結果をふまえ、腸管壁内HPC-1陽性神経線維の正常発生を検索するためラット胎仔を用いて腸管神経系の発生過程をHPC-1をマーカーとして検索した。その結果Ach-E陽性神経線維は比較的早期から出現するのに対しHPC-1陽性神経は胎生の後期になり始めて出現することが明らかとなった。今後は手術的に採取したヒルシュスプルング病腸管を検索材料として実験を進める予定である。本研究の目的はヒルシュスプルング病無神経節腸管における外来神経の増生を神経発芽(分枝形成)を制御すると考えられている神経特異的蛋白質HPC-1をマーカーとして検索することにある。HPC-1は中枢神経系で発見されたため腸管神経系での検索の報告はこれまで極めて少なく、まず、基礎的実験として腸管神経系での局在を確認した(平成6年度・第32回日本小児外科学会総会で発表)。さらに発生過程での発現様式をラット胎児を用いて検索した(平成7年度・第33回日本小児外科学会総会で発表・現在投中)。これらの研究およびHPC-1に関する更なる検討から、HPC-1は単に神経発芽に関与するのみではなくexocytosis(神経伝達物質の放出)に関係する他の放出関連蛋白質とともに神経末端での神経伝達物質の放出をコントロールしていることが明らかとなり、これらの蛋白質の腸管神経系での局在を証明し第34回日本小児外科学会総会で発表予定である。今後はこれらの放出関連蛋白質の発生期腸管での発現様式に関する実験を進め、放出関連蛋白質とヒルシュスプルング病との関連を検討したい。HPC

-1は神経特異的蛋白質として発見され、神経発芽(文枝形成)を制御すると考えられている。しかし腸管神経系での局在に関する報告は極めて少なく、まず、基礎実験として腸管神経系での存在を詳細に検討し報告した(第32回日本小児外科学会総会で発表)。さらに発生過程での発現様式をラット胎児を用いて検索した(第33回日本小児外科学会総会で発表、J Smooth Muscle Res,33:61-66,1997)。その後の研究でHPC-1は神経のみではなく、exocytosis(開口放出)を示す組織に広範に分布していることが判明し、exocytosis関連蛋白として神経系での神経伝達物質の放出もコントロールしていることが明らかとなった。そこでこれら放出関連蛋白質の正常およびヒルシュスプルング病での腸管神経系での局在を検討したところ、正常腸管神経系では検索した6種類の蛋白質すべてが明瞭に認識されたのに対し、ヒルシュスプルング病無神経節腸管ではHPC-1の染色性は正常部に比較し著しく低下していた(第40回日本平滑筋学会総会で発表)。HPC-1は神経の発芽(分枝形成)を制御していると考えられており、この蛋白質が無神経節部で低下していることは、すなわち、分枝形成が促進している状態にあるとも考えられ今後も検討を進める予定である。
新しいアポトーシス関連癌抑制遺伝子p19^<ARF>の泌尿器科癌における研究

p19^<ARF>(ヒトではp14^<ARF>)はp53の分解を促進的するMDM2に結合し,機能を阻害するためp53遺伝子が正常の場合でもp14^<ARF>に異常があればp53は機能を発現できない.本研究では泌尿器科癌でのp14^<ARF>の遺伝子異常の有無とその意義について研究を行った.1.膀胱癌細胞株についてのp14^<ARF>mRNAの発現の検討T24およびHT1376では発現を認めたが,RT4では認められず,homozygous deletion(HD)によると思われた.2.腎細胞癌細胞株についてのp14^<ARF>mRNAの発現の検討ACHN, KRC/YではmRNAの発現を見たが,他の細胞株では発現は見られなかった.3.腎細胞癌細胞株についての定量的PCR定量的PCRにより,Exon1beta, Exon2の各領域について5組のプライマーで検討したとろ,3株でHDが示唆された.4.腎細胞癌切除検体での免疫組織学的検討.3種類の,抗p14^<ARF>抗体を用いた検討で,腎細胞癌にはp14^<ARF>の発現は見られなかった.5.腎細胞癌切除検体のDNAによる検討.定量的PCRにより34例中8例がHDとおもわれ,これら症例では,臨床的にも予後不良であった.発現ベクターpBabepuroにp14^<ARF>をクローニングし,p14^<ARF>欠失細胞株に導入したが,いずれの細胞株でもp14^<ARF>のstable transfectantはえられず,Caki-1にのみ,p14^<ARF>のmRNA陽性クローンがえられた.しかし,蛋白レベルでの発現はみられなかった.以上,P53の遺伝子異常が認められない腎細胞癌においてはp14^<ARF>の遺伝子,あるいは転写以降の遺伝子制御の異常が癌細胞の一層の生物学的悪性度獲得に寄与しているものと思われた.p19^<ARF>(ヒトではp14^<ARF>なので以下p14^<ARF>)はp53分子分解に促進的に働くMDM2に結合し,その機能を阻害する.その結果,p53遺伝子が正常である場合にもp14^<ARF>遺伝子に異常があればMDM2によりp53が分解されその機能が発現できないことになる.本研究では泌尿器科癌でのp14^<ARF>の遺伝子異常の有無,mRNAの発現について検討を行った.1.膀胱癌細胞株についてのRT-PCRによるp14^<ARF> mRNAの発現の検討T24およびHT1376では発現を認めたが,RT4では認められず,homozygous deletionによると思われた.2.腎細胞癌細胞株についてのRT-PCRによるp14^<ARF> mRNAの発現の検討ACHN,KRC/YではmRNAの発現を見たが,他の細胞株では発現は見られなかった.3.腎細胞癌細胞株についてのDNAを鋳型としたPCR次にhomozygous deletionを含めた遺伝子異常の検討のためにDNAを鋳型としたPCRにより,Exon1beta,Exon2の各領域について5組のプライマーにて検討した.この結果,3株で双方の遺伝子領域に欠失があることが示唆された.4.定量的PCRを用いたhomozygous deletionの検討臨床検体についてhomozygous deletionを定量的PCRにより検討するために,2ステップPCRで増幅可能なプライマーの作成をExon2について行った.この結果,preliminaryな結果ではあるが,臨床検体の中にもhomozygous deletionが示唆されるものが見いだされた.発現ベクターpBabepuroにp14^<ARF>をサブクローニングしたものをp14^<ARF>欠失細胞株に同遺伝子を導入した.p19^<ARF>(ヒトではp14^<ARF>)はp53の分解を促進的するMDM2に結合し,機能を阻害するためp53遺伝子が正常の場合でもp14^<ARF>に異常があればp53は機能を発現できない.本研究では泌尿器科癌でのp14^<ARF>の遺伝子異常の有無とその意義について研究を行った.1.膀胱癌細胞株についてのp14^<ARF>mRNAの発現の検討T24およびHT1376では発現を認めたが,RT4では認められず,homozygous deletion(HD)によると思われた.2.腎細胞癌細胞株についてのp14^<ARF>mRNAの発現の検討ACHN, KRC/YではmRNAの発現を見たが,他の細胞株では発現は見られなかった.3.腎細胞癌細胞株についての定量的PCR定量的PCRにより,Exon1beta, Exon2の各領域について5組のプライマーで検討したとろ,3株でHDが示唆された.4.腎細胞癌切除検体での免疫組織学的検討.3種類の,抗p14^<ARF>抗体を用いた検討で,腎細胞癌にはp14^<ARF>の発現は見られなかった.5.腎細胞癌切除検体のDNAによる検討.定量的