hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
肝幹細胞活性化機構の解明と肝組織工学への応用

肝前駆細胞としてoval細胞と小型肝細胞が知られている。我々はこれまでにThy1陽性oval細胞の一部がCD44陽性の小型肝細胞を介して肝細胞へ分化することを報告してきたが,詳細はわかっていない。本研究の結果,(1)未分化Thy1陽性oval細胞の小型肝細胞への分化誘導因子として, EGF, bFGF, HGFがKeyとなる誘導因子であった。(2) Thy1陽性細胞とCD44陽性細胞は肝細胞には分化するが,成熟化までは至らなかった。(3) Thy1陽性細胞とCD44陽性細胞,そして正常成熟肝細胞の移植実験における肝細胞置換能を比較検討したところ, Thy1陽性細胞とCD44陽性細胞の生存率は低かった。この生存率は細胞老化によるものと考えられた。肝幹・前駆細胞にはオーバル細胞と小型肝細胞が知られているが,その由来と分化機構についてよくわかっていない。特異マーカーとしてオーバル細胞はThy1,小型肝細胞はCD44が同定され,多くの小型肝細胞が成熟肝細胞に由来すること,オーバル細胞の一部も小型肝細胞に分化することを明らかにしてきた。本研究の目的は,オーバル細胞の由来と活性化・分化誘導機序について解析することであり,本年度は肝幹細胞の分化機構の解析を中心に行った。(1)肝幹細胞の分化方向に影響を与える増殖因子の候補をマイクロアレイの結果から,EGF, bFGF, HGF, LIF, TNFα, IFNγ, Oncostatin M, PDGF-BB, SCF, IL-6, TGF-β1及び2,以上12種類を抽出した。これらの因子を1種類ずつ培地に加え,未分化Thy1陽性オーバル細胞を培養したところ,EGF, bFGF, HGFを加えた場合のみ小型肝細胞コロニーを形成した。次にこれらの3種類の組み合わせを検討したところ,より大きい小型肝細胞コロニーを形成したことから,オーバル細胞が小型肝細胞に分化するための因子として,EGF, bFGF, HGFが重要であることが示唆された。現在,成熟化誘導の解析を進めている。(2)in vivoにおける肝幹細胞分化機構の解析を行うため,肝障害モデルラット肝臓から単離したThy1陽性とCD44陽性細胞,そして正常肝から単離した成熟肝細胞をRetrorsine/部分肝切除モデルに移植し,移植細胞巣(foci)を解析した。結果,CD44陽性細胞由来のfociは移植30日までは急速に増殖するが,全fociの約33%が細胞老化に陥り,60日以降減少した。一方,成熟肝細胞は徐々に増殖し,60日以降で最も移植効率が高く,細胞老化に陥ったfociは13%のみであった。現在,更なる解析を進めている。本研究の目的は,肝幹・前駆細胞の活性化・分化誘導機序について解析することであり,本年度は肝幹細胞の分化機構の解析を中心に行った。(1)昨年度では,肝幹細胞の分化方向に影響を与える増殖因子の検討を行ったところ,オーバル細胞が小型肝細胞に分化するための因子として,EGF, bFGF, HGFが重要であることがわかった。そこで本年度は,肝幹・前駆細胞の成熟化能を解析するため,障害肝由来のThy1陽性細胞及びCD44陽性細胞,及び正常肝由来の小型肝細胞コロニーを高密度で培養し,成熟化度を毛細胆管形成能とC/EBPαの発現率で評価した。結果,1コロニー当たりの毛細胆管長はThy1陽性細胞;1214.3±1175.6μm,CD44陽性細胞;987.0±747.7μm,小型肝細胞;3619.2±2367.7μm,C/EBPα陽性率はThy1陽性細胞;21.2±1.5%,CD44陽性細胞;18.9±1.5%,小型肝細胞;32.6±1.4%であった。小型肝細胞の方で有意に成熟化度が高く,障害肝由来の肝幹・前駆細胞では分化能が制限されている可能性が示唆された。

(2)in vivo移植実験において,多くのThy1陽性細胞はfociを形成せず,肝細胞置換率が低かったが、Thy1陽性細胞を移植したレシピエント肝において肝前駆細胞(Small hepatocites-like progenitor cells ; SHPCs)の出現率と増殖率が高まる,という新しい知見が得られ、現在解析を行っている
教育的介入を取り入れた歯学部生における学業成功のカリキュラムの開発

近年の歯学教育分野では、歯学部生の成績に影響する要因として入学前の成績のような認知的要因以外に、性格や行動的特性のような非認知的要因の重要性が注目されている。そこで、本研究では非認知的要因を動機づけにおける「先延ばし行動」「抑うつ・不安」「価値方略」の3領域に分けて捉え、これらがどのようなメカニズムによって歯学部生の成績に影響を及ぼすかを解明する。
摩擦押出しによる傾斜機能材料の製造法の開発研究

TiとAl粉末の混合粉末を用いて,圧密と熱処理によるTi-Al金属間化合物をTi基中あるいはAl基中に分散させた金属基複合材料の作製を試みた。また,混合粉末を圧密後,摩擦押出し成形により薄板を作製し,その薄板を熱処理してTi-Al基複合材料の成形プロセスを検討した。その結果傾斜機能材料の製造の可能性が以下のように明らかになった。1.圧密素材を熱処理した場合,400°Cでは焼なまし軟化するだけであるが,600°C×10hではTi-50at%AlではHV=80程度,Ti-10at%AlではHV=165程度まで硬さが上昇した。これはTiとAlが反応し,局所的にHV=550程度の硬質な金属間化合物が形成されたためである。2.圧密素材を熱処理したのち圧縮試験を行った結果,Ti-50at%Alでは熱処理温度が高く時間が長くなるほど廷性が減少するが,Ti-10at%Alでは800°C×1hの熱処理で最大圧縮応力900HPa,限界圧縮さずみ0.4まで達した。3.混合粉末をアルミニウムカップ内で圧密した素材を用いて摩擦押出しすることにより,Ti-50at%Alまじの薄板を成形することが可能になった。この摩擦押出ししたままの薄板は引張強さ200MPa以上の強度を示した。また硬さはTi-50at%AlでHV=65程度であるが,600°C×1hの熱処理でHV=200程度まで硬しなった。4.混合粉末を冷間で摩擦押出ししたままの薄板は,Ti粉末が多くなるなど引張強さが低下したが,Alで300HPa,Ti-10at%Alで200MPa,Ti-50at%Alで140HPaとなった。この薄板を熱処理すると温度上昇に伴い引張強さが低下するが,硬質脆性組織の生成によるものである。5.Ti-Al混合率を変えた層状圧密素材を作成し,摩擦押出しを試みた結果,混合粉末の配置を適当に行うことにより.傾斜機能材料薄板の作製の可能性が明らかになった。本研究では,新たに開発した薄板の摩擦押出し成形法を用いて,傾斜機能材料の自由な設計を効率の良い製造法の確立を目的として行われている。本年度の研究実績をまとめると次のようになる。1.高強度材料の摩擦押出し成形が可能となるように,成形工具の強度向上のための再設計・製作を行い,鉄系,チタニウム系,銅系材料の摩擦押出し成形にも適用可能になることを確認した。2.アルミニウムと銅及びチタニウム板の重ね合せ素板から,金属クラッド薄板の成形を試み,十分な接合強度を有する圧接接合が可能になることを明らかにした。3.新たに購入したV形混合器を用いて,アルミニウムとチタニウム粉末の混合条件について検討し,混合率を種々変更した混合粉末を作製した。4.上記混合粉末を圧密成形する場合の,金型潤滑条件,圧密面圧と圧密密度の関係を調べた。これにより,最適の圧密条件を確立した。

5.上記圧密成形体を,混合した金属の金属間化合物を生じる温度すなわち燃焼成合が生じるまでの温度範囲において,熱処理を行い,それらの硬さ,圧縮変形特性について調査した。6.圧密成形したままの成形体を用いて,摩擦押出し形成を試みた結果,混合粉成形体だけでは,工具面への凝着が激しいため,紙アルミニウム粉末層との復合体を作成し,摩擦押出しが可能になることを明らかにした。7.圧密成形体を空気中でそのまま摩擦押出し成形すると,薄板中にガス等が巻込まれて,熱処理時にブリスタ-(火ぶくれ)を発生するため,真空圧密等の工夫が必要になることが明らかになった。1.TiとAl粉末の混合率を変更して,V形混合器とボールミル混合器による混合特性を比較し,ボールミル混合によりTiとAl粉末の粉砕・接合が生じ,最適の混合条件が明らかになった。2.上記の最適混合条件で混合した粉末を,密閉金型内で面圧1000MPaまでの範囲で圧密し,その硬さ及び圧縮特性を調べたが,圧密だけでは十分な圧縮特性は得られないことがわかった。さらに,この圧密素材を4001000°Cの範囲で熱処理し,その硬さと圧縮特性を調べた結果,600°C×10hの熱処理によりTiとAlが反応し,きわめて硬い組織が形成されることがわかった。最大圧縮応力は,Ti-10at%Alを800°C×1h熱処理した条件で,900MPaが得られた。3.工具面への凝着を抑制して摩擦押出しするため,純Alカップに混合粉末を充填して圧密した素材を用いた結果,Ti-50at%Alの混合粉末まで,安定した摩擦押出しが可能となった。このような方法で摩擦押出しした薄板の硬さ及び引張試験を行った結果,引張強さ200MPa以上の強度が得られることが明らかになった。4.摩擦押出しにより作成した薄板を400650°C,110h熱処理した結果,摩擦押出しによりTiとAlの反応が促進され,Hv=200の硬さが得られた。しかし,引張強さはかえって低下した。これは,反応組織がAlのポーラス組織を残すためと考えられる。5.Ti-Alの混合率を変えた圧密素材を作成し,摩擦押出しを試みた結果,混合粉末の配置を適当に行うことにより,傾斜機能薄板の作製の可能性が明らかになった。
皮下脂肪厚測定法の比較検討

1.X線体軸断層撮影(CT)によって容易に腹部皮下脂肪厚および内臓周囲の蓄積脂肪量が測定できることを確認した。2.キャリパ-およびA,B両モードのエコーによる皮下脂肪厚の測定値とCTによる皮下脂肪厚の測定値との相互の関連性を検討したところ,CTとBモードエコーによる測定値,およびCTとキャリパ-の測定値との間の相関が高かった。3.Aモードエコーによる皮下脂肪厚測定法は簡便であるが,測定値の変動が大きく,精度が劣っていた。また,腹囲は他の諸計測値および血清生化学検査所見と有意な関連を示した。4.CT像からの内臓脂肪量は,デジタイザーを用いて測定した。内臓脂肪量は腹囲と非常に強く相関していた。5.簡易な身体計測,キャリパ-による皮下脂肪厚,Bモードエコーによる腹壁皮下脂肪厚の測定結果を用いて,内臓脂肪量を基準変数として重回帰分析を行った結果,体重,腹囲および皮下脂肪厚から容易に内臓脂肪量を推定することが可能となった。6.BMIと内臓脂肪量との組み合わせによって,I型からIII型の肥満と正常の4類型に分けることができた。I型肥満は過体重で内臓脂肪量が多く,減量治療の必要な肥満症に近い類型で,各検査の有所見率が最も高かった。II型肥満は過体重であるが内臓脂肪量の少ないスポーツマン的な体格の類型であり,III型肥満は過体重ではないが内臓脂肪量が多く,有所見率も高い内在性肥満の類型と考えられた。7.この内臓脂肪量を加味した肥満判定法は,BMI単独よりきめ細かな健康管理区分の設定が可能となり,健康なライフスタイルの確立のための有力な手がかりとなるものと考えられた。X線体軸断層撮影(CT)による腹部の皮下脂肪厚の測定法を検討し,容易に腹部皮下脂肪厚の測定が出来ることを確認した。そこで,CT撮影と同時に,キャリパーによる皮下脂肪厚,AB両モードの超音波式の皮下脂肪厚の測定を,当大学付属病院と関連病院の患者および健康者のボランテアを対象に開始し十分解析に耐えうる例数のデータが蓄積されつつある。これまでの結果において,CTによる皮下脂肪厚の測定値を基準として,各測定法による測定値との相互の関連性を検討したところ,CTによる測定値とBモードによる測定値,およびCTによる測定値とキャリパーによる測定値との間の相関が高いこと,Aモードの超音波式の皮下脂肪厚は測定値の変動が大きく,簡便な測定法ではあるが精度が劣るであろうことが予測された。なお,近赤外線半透過方式による体脂肪分の測定はインピーダンス法と同じ次元の生体情報であって,計測されたデータの検討をすすめるなかで,本研究にとって,本質的に意味のない測定法であることが明らかになったため,次年度からの測定法から削除することにした。一方,CT像からの内臓蓄積脂肪量の測定は,皮下脂肪厚とともに今後の検討に有意義な情報となるので,新たに測定項目に追加すべきであると考える。すでに数例のCTについて,デジタイザーを用いて内臓蓄積脂肪量の測定を試み,その評価が技術的に可能なことが明らかになった。平成5年度に引き続き皮下脂肪厚の測定データの蓄積をはかった。X線体軸断層撮影(CT)によって容易に腹部皮下脂肪厚が測定できることを確認し,同時に,キャリパ-による皮下脂肪厚,AB両モードの超音波エコーによる皮下脂肪厚を,当大学附属病院と関連病院の患者および健康者のボランティアを対象に測定し,十分解析に耐えうる40例をこえる例数のデータが得られた。

CTによる皮下脂肪厚の測定値を基準として,各測定法による測定値との相互の関連性を検討したところ,CTによる測定値とBモードによる測定値,およびCTによる測定とキャリパ-による測定値との間の相関が高いこと,Aモードの超音波式の皮下脂肪厚は測定値の変動が大きく,精度が劣ることが明らかになった。なお,近赤外線半透過方式による体脂肪分の測定はインピーダンス法と同じ次元の生活情報であって,計測されたデータの検討をすすめるなかで,本研究にとって,本質的に意味のない測定法であることが明らかになったため,測定法から削除することにした。一方,CT像からの内臓蓄積脂肪量の測定は,皮下脂肪厚とともに今後の検討に有意義な情報となるので,新たに測定項目に追加した。その結果,CT像から,デジタイザーを用いて測定された内臓蓄積脂肪量と同時に測定したウエスト囲との間に非常に強い相関が認められた。また,ウエスト囲は他の諸計測値および血清生化学検査所見との間に有意な関連を認めた。本年度は,47例の健常成人男子を対象に,簡易な身体計測(身長,体重,腹囲),栄研式キャリパ-による皮下脂肪厚,Bモードエコーによる腹壁皮下脂肪厚の測定結果を用いて,CT画像の内臓脂肪面積を内臓脂肪量とし,これを基準変数として重回帰分析を行った。その結果,体重,腹囲および皮下脂肪厚から容易に内臓脂肪量を推定することができた。この推定式を用いて1,014例の成人男子を対象に,推定した内臓脂肪量と一般定期健康診断時の医学的検査との関係を検討した。なお,内臓脂肪量のカットオフ値は中性脂肪,総コレステロール,HDLに対する内臓脂肪量の受診者動作特性曲線によって求めた結果34cm^2であった。汎用されているBMIによって24以上の過体重と24未満の正常体重に分けた上で,BMIで過体重と判定された者を内臓脂肪量34cm^2以上のI型肥満とそれ未満のII型肥満に分け,一方,BMIで正常体重と判定された者を内臓脂肪量34cm^2以上のIII型肥満とそれ未満の正常型の4類型に分けた。各類型の医学的検査の有所見率を比較してみると,I型では各検査とも有所見率が最も高く,正常型の有所見率が最も低かった。正常体重であるが内臓脂肪量の多いIII型肥満も有所見率が高った。このようにBMIと内臓脂肪を組み合わせて肥満を判定することにより,BMI単独よりよりきめ細かな健康管理区分の設定が可能となり,健康なライフスタイルの確立のための有力な手がかりとなるものと考えられた。
新しいホメオボックス遺伝子BHグル-プによる遺伝子転写制御と細胞分化

1)BarH2遺伝子の構造決定。BarH1遺伝子の全構造は既に決めている。BarH2の全genomic DNAとcDNAを単離し、それらの塩基配列を決定した。そ結果BarH2は、6kbと1kbの二つのイントロンを持ち、645アミノ酸からなるポリペチドをコ-ドする遺伝子である事が判明した。BarH2のホメオドメイン60アミノ酸のうち56はBarH1と全く同一であった。更に興味深い事に、両者で異なるアミノ酸は全て、トランスアクチベ-タ-の結合サイトと想定されるヘリックス2に局在していた。この事は、BarH2タンパクがBarH1タンパクとは異なるタンパクにより活性化されるにも拘らず、同一の塩基配列を認識しDNAに結合する事を示唆している。2)BarH1タンパクのftz結合部位への結合。BarH1のin vivoでのDNA結合部位は、まだ同定されていない。BarH1タンパクのDNAへの結合性を調べるために、ヘリックス3の9番目のアミノ酸がグルタミン残基である事に着目し、ftzタンパクの結合するNP配列へのBarH1タンパクの結合性を調べた。フィルタ-アッセイ、サウスウエンタンブロットにより、BarH1タンパクが、NP配列と強く結合する事が分かった。またこの結果は、footprintingでも確かめられた。3)抗BarH1抗体を用い光受容細胞R1,R6における特異的発現に対する他の遺伝子の影響を調べた。その結果、BarH1の発現開始には、R2,R5でのホメオボックス遺伝子roの発現が、またその維持には、glass遺伝子産物が必要な事が示唆された。またBarH1は、自分自身の遺伝子産物によっても正の調節を受けている事も示された。
腸管IgG Fc Binding Siteの基礎的研究と臨床応用の可能性

腸粘液は生体防御機構に極めて重要な役割を果たしているが、その機構については充分解明されていない。我々はヒト腸管の杯細胞粘液中にIgGのFc部分に対するBinding Site(FcIBS)が存在し、病原菌とそれに対するIgGの結合物にFcIBSが粘液と共に結合することが明らかにした。生体内でも同様機序が働き病原菌を捕捉している可能性が推測される。今回FcIBSの役割をさらに追及するとともにrecombinant FcIBSを作成し、その生理的意義を明らかにする。1)rFcIBSの作成:ヒト大腸粘膜上皮細胞を単離し、polv(A)RNAを精製し蔗糖密度勾配に重層しmRNAを含む各分画にまで分離した。これをアフリカツメガエルの卵母細胞で翻訳させ、FcIBS-mRNAの画分を得たものの、今回はcDNAを得る所までには至らなかった。2)病原菌の発育に対するFcIBSの影響:ヒト大腸粘膜より精製したFcIBSを含む分画をウサギ下痢原性大腸菌(RDEC-1)、ヒト病原性大腸菌(0111)、ネズミチフス菌(04)とそれぞれに対する特異抗体(IgG)およびコントロールとしての非特異抗体(IgG)と混合培養しコロニー数を数えることで病原菌の発育に対する影響を検討した。その結果ではRDEC-1ではコロニー数は細菌-特異抗体-FcIBS群<細菌-特異抗体-バッファー群<細菌-非特異抗体-FcIBS群<細菌-非特異抗体-バッファー群という傾向が見られた。0111と04でもほぼ同様の傾向が見られFcIBSはIgGと協力して病原菌の発育を抑制する可能性もしくはFcIBSを含む溶液中に制菌作用のある物質が含まれている可能性が示唆された。3)補体に体するFcIBSの影響:羊赤血球と抗羊赤血球ウサギIgGとFcIBSを混合し補体を加えると補体による溶血が阻害され補体と競合する可能性が示唆された。1)rFcIBSの作成ヒト大腸粘膜より大腸上皮細胞を単離し、それに含まれるmRNAを含むpolyRNAを精製し蔗糖密度勾配に重層しmRNAを含む各画分にまで分離した。これをアフリカツメガエルの卵細胞で翻訳させる段階までに至った。次にここよりFcIBSのmRNAを含む画分を精製する予定である。2)病原性大腸菌に対するFcIBSの影響ヒト大腸粘膜より精製したFcIBSをウサギ下痢原性大腸菌に対する特異的IgGとウサギ下痢原性大腸菌そのものとを混合した。この混合物をFcIBSに対するモノクローナル抗体を用いた酵素抗体法にて染色した、その結果では特異的IgGとウサギ下痢原性大腸菌は凝集塊を形成しFcIBSはさらにその凝集塊を覆い、特異的IgGとFcIBSは協力してその細菌を捕捉していることが免疫組織化学的に確認された。さらにこの細菌ー特異的IgG-FcIBS complexを培養すると細菌ー特異的IgG complexと細菌+非特異的IgG+FcIBSの混合物に比べ発育したコロニーの数は有意に少なくFcIBSは殺菌作用もしくは増殖抑制作用を持つ可能性が示唆された。腸粘液は生体防御機構において第一線のバリアーとして極めて重要な役割を果たしていると考えられているが、その機構については充分解明されていない。我々はヒト腸管の杯細胞の粘液中にIgGのFc部分に対するBinding Site(FcIBS)が存在することを発見し報告した。我々はこのFcIBSに対するモノクローナル抗体を作成した。

この抗体を用いた免疫抗体法では、病原菌とそれに特異的なIgGの結合物にFcIBSが粘液と共に結合することが明らかにした。生体内でも同様機序が働き病原菌をトラップしている可能性が推測される。今回FcIBSの役割をさらに追及するとともにrecombinant FcIBSを作成し、FcIBSの生理的意義を明らかにする。1)rFcIBSの作成:ヒト大腸粘膜より大腸上皮細胞を単離し、それに含まれるmRNAを含むpoly(A)RNAを精製し蔗糖密度勾配に重層しmRNAを含む各分画にまで分離した。これをアフリカツメガエルの卵母細胞で翻訳させ、FcIBS-mRNAの画分を得るところまでには至ったが、cDNAの合成がうまく行かず。今回はcDNAを得るところまでには至らなかった。今後さらに合成に全力を注ぐつもりである。2)病原菌に対するFcIBSの影響:ヒト大腸粘膜より精製したFcIBSを含む分画をウサギ下痢原性大腸菌(RDEC-1)、ヒト病原性大腸菌(0111)、ネズミチフス菌(04)とそれぞれに対する特異抗体(IgG)およびコントロールとしての非特異抗体(IgG)と混合培養しコロニー数を数えることで病原菌の発育における特異抗体とFcIBSの影響を検討した。その結果ではRDEC-1ではコロニー数は細菌-特異的IgG-FcIBS群<細菌-特異的IgG-バッファー群≦細菌-非特異的IgG-FcIBS<細菌-非特異的IgG-バッファー群という傾向が見られた。大腸菌とネズミチフス菌においてもほぼ同様の傾向が見られた。以上よりFcIBSはIgGと協力して病原菌の発育を抑制する可能性もしくはFcIBSを含む溶液中に制菌作用のある物質が含まれている可能性が示唆された。
ミズクラゲのモード選択的運動制御とクラゲ被害対策への応用

本研究ではミズクラゲの浮遊挙動を光で制御し、クラゲによる火力発電所の取水トラブルや漁業被害等の低減を目指して、以下の主な成果を得た。1)ビデオ画像の周波数解析に基づく浮遊挙動解析法を拍動や遊泳の速度が大きく異なるクラゲにも適応できることを示した。2)LEDパネル光源からの単色変調光照射に対するクラゲの拍動の引き込みや脱調現象について知見を得た。3)光ガルバノスキャナを用いたレーザー光走査照射システムを構築し、クラゲのモード選択的な運動制御について検討した。本研究課題では、クラゲの浮遊・遊泳挙動を解明し、これを制御することにより、大量発生したクラゲによる取水トラブルや水産・漁業被害の軽減を目指している。これを達成するために、外部刺激に対するミズクラゲの拍動や体軸の転回といった〈運動要素〉ごとの過渡的な応答変化を詳細に調べ、各種外部刺激の有効性やそれを用いるクラゲの運動制御可能性について検討する。研究初年度では、これまでの予備的な検討結果を踏まえて様々な検討を行い、以下の主要な成果を得た。1)固定光源を用いた拍動制御の試み;LEDパネルあるいは自作プログラムで輝度変調させたCRTを光源としてミズクラゲの光応答を検討した。照度3000ルクス程度までの定常光照射に対しては光色によらず再現性のある有意な応答は観察されなかった。しかし、暗状態で約0.4Hzの拍動をするクラゲ個体に対し0.34Hzあるいは0.45Hzといった僅かに周波数シフトした緑色光を照射すると、拍動周波数が変調光の周波数から「逃げる」方向に変化することが観察され、光による拍動制御の可能性が示唆された。2)ガルバノスキャナを利用したレーザー光照射システムの立ち上げ;ミズクラゲの8つの眼点に対する光刺激応答を検討するため、走査変調照射システムを構築した。制御プログラムを試作し走査系の基本性能を確認するとともに、現在、実験用の櫓を組み立て実照射に向けて調整を続けている。3)クラゲ浮遊挙動解析法の可能性の検討;本研究における主要な実験解析手法であるデジタルビデオ画像の周波数解析の適用範囲について、新江ノ島水族館にて撮影した高速に拍動するカラージェリーを含む種々のクラゲの拍動画像に対して検討した。4)以上の他に、実験水槽内と野外の自然環境下での挙動の違いについても検討した。特に、水面での光散乱に妨げられないデータ取得のために野外では偏光フィルターの利用が有効であった。本研究課題では、クラゲの浮遊挙動を解明し、これを制御することによって大量発生したクラゲによる取水トラブルや水産・漁業被害の軽減を目指している。そのため、ミズクラゲの拍動や体軸の転回といった〈運動要素〉ごとに外部刺激に対する過渡的な応答変化を詳細に調べる作業を行っており、研究2年目の実績概要は以下のとおりである。1)固定光源を用いた拍動制御の試み:研究初年度では主に固定定常光光源に対するクラゲの応答を検討し、変調光に対するミズクラゲの光応答の検討を始めたところであった。その中で、拍動の基本周波数からわずかに周波数を変えた変調光刺激に対しては「逃げる」方向に拍動の周波数シフトをするという予備的な結果を得た。しかし、対象が生物個体という事情もあり、応答再現性は必ずしも得られなかった。そこで研究2年目はこの挙動の再現性を確認することに多くの時間を当てた。結果、緑色変調光のみによる実験では一定程度の頻度で同じ傾向の挙動が観測され、さらにパラメータを具体的に絞り込んだ検討の必要性が明らかになった。2)ガルバノスキャナを利用したレーザー光走査照射システムによる運動制御の試み:研究初年度ではガルバノスキャナを利用する走査変調照射システムの構築を行った。当初、実験用の大掛かりな「櫓」を組み立てて実験水槽と反射鏡とを互いに固定したシステムとしていたが、試行錯誤を繰り返す中で反射固定鏡をシステムから切り離してシステムの作業自由度を高める仕様に変更しレーザー走査系を水槽等の〈水回り〉から出来るだけ離し、コンパクトにまとめる事ができた。これにより、作業性が向上し、ミズクラゲの8つの眼点に対する光刺激応答を検討することが容易になったと考えている。ただ、ガルバノミラー制御の自作プログラムの不調の修正や光学系の微調整等に時間がかかり、ミズクラゲに対する実照射は意図したレベルには至っていない。本研究課題では、ミズクラゲの浮遊挙動を光刺激により制御することを試みた。それにより、大量発生したクラゲによる火力発電所等の取水トラブルや水産・漁業被害の軽減を目指した。これを達成するため、光刺激に対するミズクラゲ個体の拍動や体軸変化といった運動要素ごとの過渡的な応答を詳細に調べ、今年度は以下の結果を得た。1)クラゲ遊泳挙動解析法の検討:ミズクラゲとは拍動速度や遊泳速度が大きく異なるタコクラゲ等の遊泳挙動をビデオ撮影し、拍動と遊泳速度等の関係について検討した。また、市販の3Dモデリングソフトを用いて拍動の3Dモデル化とアニメーション化を行い、クラゲの推進機構のシミュレーションを試みた。これにより、本研究における主要な実験解析手法であるデジタルビデオ画像周波数解析法の汎用性とクラゲの拍動・推進機構解明への可能性を明らかにした。2)固定パネル光源を用いたクラゲ拍動制御の試み:拍動周波数とは僅かに異なる周波数の外部変調光に対して拍動周波数が「逃げる」方向に変化する現象について、昨年度からさらに検討を進めた。

クラゲ個体の違い、水温や実験のタイミング、照射光の強度や波長、変調モードや周波数シフトの大きさなど、実験パラメータを様々に変えて検討した。有意な結果が観察される場合もあったが、クラゲ個体の違いによる影響が大きく、今後の統計的取扱いの必要性が示唆される結果となった。3)光ガルバノスキャナを用いたレーザー光走査照射システムによる運動制御の試み:昨年度に続き、システム制御プログラムの改良や光学系の微調整を行った。遊泳するクラゲおよびその周辺に局所的に、あるいは仮想的な壁状にレーザー光を空間走引照射してクラゲの応答や運動制御について検討することが当初の目論見であったが、クラゲに対して意図した精度での走引照射は現在未達成で、知見は予備的で引き続き検討が必要である。本研究ではミズクラゲの浮遊挙動を光で制御し、クラゲによる火力発電所の取水トラブルや漁業被害等の低減を目指して、以下の主な成果を得た。1)ビデオ画像の周波数解析に基づく浮遊挙動解析法を拍動や遊泳の速度が大きく異なるクラゲにも適応できることを示した。2)LEDパネル光源からの単色変調光照射に対するクラゲの拍動の引き込みや脱調現象について知見を得た。3)光ガルバノスキャナを用いたレーザー光走査照射システムを構築し、クラゲのモード選択的な運動制御について検討した。当初計画では、研究2年目には構築・完成した光ガルバノスキャンシステムを用いて様々な時間的・空間的パターンで各色のレーザー光をミズクラゲに照射し、クラゲの拍動あるいは体軸転回などモード選択的な運動制御について検討を行うとしていた。しかし、研究実績の概要でも述べたように、対象が生物個体という事情もあり、応答や挙動の再現性を確認することに多くの時間を当てざるをえなくなり、また実験の作業性の向上という観点から櫓に組込んだシステムの見直し、修正を行うこととなった。その結果、水槽サイズをビーカーサイズから順に60cm程度の実水槽まで大きくしながら精度の高い変調光走査を実現するという準備段階で計画の遅れが生じてしまった。従って、ミズクラゲの8つの眼点に対して様々な時間的・空間的パターンでレーザー光を打ち込み、モード選択的な運動制御の可能性を探るとした計画は、着手したもののやや遅れている。ただ、光ガルバノスキャンシステムの基本的な部分、特に光学系と制御プログラムについては着実に熟成しつつあるので、研究3年目には研究の進捗が十分に期待できる。また、水槽内で遊泳するクラゲに対して適切に光照射するために必要なクラゲ追尾システムの構築には多くの作業時間を要することは織り込み済みなので、研究のペース配分、残る課題へのリソース配分などに関して研究遂行上のリスク管理は出来ていると考えている。光電気化学まず、ほぼ完成に近づいたガルバノ光スキャン装置を用いて、ミズクラゲに対して様々な時間的・空間的パターンでレーザー光を打ち込み、モード選択的な運動制御の可能性を探る。その際、レーザー光照射パターンとしては当初計画に記したように、実験装置の特性を生かしてミズクラゲの8個の眼点あるいはマーカー点へ「同時に/右(左)回りに/左右非対称に/特定の眼点を追尾しながら」等のように行う。さらに、遊泳挙動のモード選択的制御検討では、照射光の照射方向(重力方向または水平方向)、光の波長や強度、変調と位相など、多くのパラメータについて検討を行う。
悪性脳腫瘍のヒエラルキーと可塑性の解析に基づくエピゲノム創薬

低悪性度神経膠腫(WHO grade II/III glioma)は頻度の高い脳原発悪性腫瘍である。進行は比較的ゆっくりだが、脳に染み込むように増殖するため完治させることが極めて困難な病気である。多くの患者さんでは初回治療の数年から数十年後に、より悪性度の高い腫瘍として再発し、死に至る病気であり新しい治療の開発が期待される病気である。そのため、低悪性度神経膠腫においてどのような遺伝子異常が生じているのか、これらの遺伝子異常が腫瘍の発生や悪性化に対してどのような役割をもっているか解明した。ユエピジェネティクスプロファイリングによるバイオマーカーの開発悪性脳腫瘍の分化制御に関わるエピジェネティクス機構の解明を行う際に、次世代シークエンサーを用いて、脳腫瘍の発生から悪性化に関わる遺伝子変化の解析を行った。MDAMマウスモデルで、腫瘍発生から腫瘍軽々までのエピゲノム・ゲノム異常を解析散発的なp53,NF1遺伝子欠損をもつGFP陽性細胞から悪性神経膠芽腫を自然発生するMADMマウスモデルを確立している。今回共同研究として正常細胞、腫瘍細胞に加えて腫瘍化する前の段階の細胞、すなわち将来的に腫瘍化する細胞においてエピジェネティクス異常の解析を行った。正常細胞と、腫瘍(生後150日}と生後8日、60日のGFP陽性細胞にクロマチン免疫沈降法(ChlP)を用いてピストンH3K4me3, H3K27me3の、発現の解析としてRNA polymerasell (pol ll)の結合部位をマイクロアレイにて解析する。またMIRA法とマイクロアレイを用いて網羅的なDNAのメチル化部位の同定を行った。予備実験では、生後150日目(P150)のMDAM脳腫瘍ではポリコームタンパク群(K27me3)によって制御されるだけでなく、H3K4メチル化によって制御される遺伝子群も多くあり、正常脳の発達の時間的変化も同時に検討しなくてはいけないことがわかった。これまでの我々の研究から、悪性脳腫瘍(膠芽腫)検体から樹立した幹細胞様がん細胞の網羅的エピジェネティクス解析により、脳腫瘍細胞にはヒエラルキーが存在し、かつ可塑性を有すること、またそれはポリコームタンパク群を介するヒストンメチル化が重要であることが分かってきた。本研究は、TP53とNF1の両アレル欠損が散発的に相同組換えで起こりGreen fluorescent protein (GFP)を発する悪性脳腫瘍が自然発生するマウスモデル(MDAM)と臨床検体を用いて、腫瘍発生から形成に至る経時的なゲノム・エピゲノムの変化を解析し、標的遺伝子を同定し、腫瘍細胞のヒエラルキー及び可塑性の鍵となるポリコーム群を標的とする創薬を目指している。本研究では腫瘍細胞における遺伝子変異やその進展の多様性が明らかとなった。ほとんどの腫瘍においてはある一連の変異をもったsubcloneが様々なセレクションをうけて生き残り増大する.それゆえ,悪性化・転移・再発はclonalに起こると考えられている.これらのsubcloneを解析することによって(特に治療前後の)再発のメカニズムや治療の成功性などが明らかになると考えられる。それを、二次性膠芽腫マウスモデルの解析をすることにより、臨床検体から得られた知見のproof of conceptをする。進行は比較的ゆっくりであるが、脳に染み込むように増殖するため完治させることが極めて困難な病気である。具体的には、1)700例以上の低悪性度神経膠腫における遺伝子異常の全貌を明らかにした。2)低悪性度神経膠腫は遺伝子異常に基づいて明確に3つのサブグループに分けられた。3)それぞれのサブグループにおいて起こりやすい遺伝子異常を同定した。4)それぞれの遺伝子異常に対し、腫瘍の発生から進展までどの段階で生じているか明らかにした。5)低悪性度神経膠腫は異なった遺伝子異常をもつ複数の腫瘍細胞群から構成され多様性に富んだ複雑な腫瘍であることが明らかとなった。26年度が最終年度であるため、記入しない。脳腫瘍学26年度が最終年度であるため、記入しない。解析に用いるinternalindexという手法に問題があることがわかり、やり直さないと220検体のラージスケールの変異の確定とアレル頻度がぬけてしまったためそこの部分をやり直している。

TP53とNF1の両アレル欠損が散発的に相同組換えで起こりGreen fluorescent protein (GFP)を発する悪性脳腫瘍が自然発生するマウスモデル(MDAM)と臨床検体を用いて、腫瘍発生から形成に至る経時的なゲノム・エピゲノムの変化を解析し、標的遺伝子を同定し、腫瘍細胞のヒエラルキー及び可塑性の鍵となるポリコーム群を標的とする創薬を目指しているが、有望な創薬まで完成している。26年度が最終年度であるため、記入しない。多数例の解析データ:IDH1 219検体のやり直しが必要であり、予後データの収集を行う。目指すところは、各変異・コピー数以上のアレル頻度の同定をし、それぞれの変異がどの順番で入っていくのかというところと臨床経過に及ぼす影響を検討する本研究では腫瘍細胞における遺伝子変異やその進展の多様性が明らかとなった。ほとんどの腫瘍においてはある一連の変異をもったsubcloneが様々なセレクションをうけて生き残り増大する.それゆえ,悪性化・転移・再発はclonalに起こると考えられている.これらのsubcloneを解析することによって(特に治療前後の)再発のメカニズムや治療の成功性などが明らかになると考えられる。それを、二次性膠芽腫マウスモデルの解析をすることにより、臨床検体から得られた知見のproof of conceptをする。コピー数補正に使用する。それが終了すればクラスター解析(もしくはpycloneという手法)を行う費用に充当する。平成25年10月までに分子科学創成のためのがん幹細胞での標的タンパクの確認を行う予定であったが、当初の予定に反し、標的タンパクが未知のものであった。有識者との議論の結果、未知の分子の発見であることがわかり、そのゲノムを調べるために次世代シークエンスなどの研究方法を模索することになったため。この未知のタンパクの同定のために、種々の抗体を作製する。MADMマウスの前腫瘍細胞を用いてEZH2の発現異常、遺伝子増幅異常の出現する時期を同定する。抗エピゲノム関連因子A抗体、抗転写因子B抗体を準備し、正常細胞と腫瘍細胞を用いてウエスタンブロッティング法を行いタンパク質レベルでの発現量を確認する。その後、ChIP-seqの次世代シークエンスを行い、この未知のタンパクを同定する予定である。
SHGによる固体表面系の相転移の研究

SHG(第二高調波発生)による固体表面系の秩序および相転移現象に伴う秩序の変化の研究をするために以下の準備および研究を行った。1)まず低温での表面系の秩序を探るため、試料冷却に使用する冷凍機を購入し、これに装着する試料ホルダ-を製作、またこれを収納する真空容器を設計した。これはまもなく完成する。これができれば広い温度範囲で表面系の秩序を探る実験ができる。2)ガラス上に蒸着したCuPc薄膜の配向状態をSHGを用いて調べた。CuPc薄膜は通常言われているような反転対称性のあるαー型結晶ではなく、基板の法線方向に対称性が崩れた配列をしていることがわかった。またCuPcの分子面は基板面とほとんど垂直であることがわかった。3)へき開InP(110)面の表面SHGを空気中で観測した。これを行うにあたっては、強いバルクのSHGおよび電気四重極子分極によるSHGを、偏光依存性を利用して取り除いた。へき開23時間以内のInP(110)表面の有効非線形感受率はx^<(2)>_<zzz>3×10^<ー15>esuであり、その他の成分は小さい。しかしまた数日たつとその他の成分が無視できなってくる事もわかった。これはInP表面の酸化による表面の対称性の変化が観測されている結果と考えられる。また同様の測定をGaAs(110)へき開面について行ったが、x^<(2)>_<zzz>の値は小さく、またSHG勉度の時間変化も観測されなかった。この違いは酸化により生ずる表面状態がInPでは基本光の光子エネルギ-と共鳴している為であると考えられる。4)秩序とSHG強度の関係についての理論計算をおこなった。乱れた系では秩序の保たれる距ξに依存して散乱SHG強度の散乱角依存性が変化することがわかった。またこのような計算の結果を実験的に検証する典型例としてSi_<1ーx>Ge_x混晶系での実験を進めている。
ヘリカル磁場によるRFPの抵抗性壁不安定性の安定化に関する研究

本研究では回転共鳴ヘリカル磁場を用いてRFPプラズマの回転を駆動し,抵抗性壁不安定性(RWM)を安定化できるかどうかを実験的に調べた.STE-2RFP装置においてSS放電容器のみでRFPプラズマを生成し,MHDモードの振る舞いを調べた.ピンチパラメータΘが低い(Θ<2)場合にはポロイダルモード数m=1,トロイダルモード数n=8,9モードの磁場揺動成分が真空容器の時定数程度で成長し,Θが高い(Θ>2)領域ではm=1,n=3,4モードが成長することが観測され,それぞれ抵抗性壁テアリングモード,抵抗性壁キンクモードと同定された.真空容器の外側に共鳴回転ヘリカル磁場発生用のヘリカルコイルを設置し,RFP放電中に振幅が一定の回転磁場を印加するために,これまでのLC減衰振動回路に替えてIGBTを用いてパルス発振器を製作した.臨界摂動磁場レベル(摂動磁場振幅/周辺ポロイダル磁場【approximately equal】0.4%)を越える回転磁場を印加するとm=1磁場揺動は外部回転磁場の方向に回転し,またm=0磁場揺動(トロイダル磁束揺動)の回転も外部回転磁場の方向に依存して影響を受けることが観測された.摂動磁場レベルが0.6%を越えると回転磁場の印加による共鳴揺動成分の振幅の減少,超高Θ領域(Θ>2.5)の出現など,放電特性への影響が観測された.特に,摂動レベルが1%程度になると共鳴揺動成分が外部磁場と同じ速度で回転し,振幅が30-50%程度減少することがわかった.以上,本研究により,外部回転共鳴ヘリカル磁場を用いて抵抗性壁テアリングモードを安定化できる可能性が示された.本研究では回転共鳴ヘリカル磁場を用いてRFPプラズマの回転を駆動し,抵抗性壁不安定性(RWM)を安定化できるかどうかを実験的に調べた.STE-2RFP装置においてSS放電容器のみでRFPプラズマを生成し,MHDモードの振る舞いを調べた.ピンチパラメータΘが低い(Θ<2)場合にはポロイダルモード数m=1,トロイダルモード数n=8,9モードの磁場揺動成分が真空容器の時定数程度で成長し,Θが高い(Θ>2)領域ではm=1,n=3,4モードが成長することが観測され,それぞれ抵抗性壁テアリングモード,抵抗性壁キンクモードと同定された.真空容器の外側に共鳴回転ヘリカル磁場発生用のヘリカルコイルを設置し,RFP放電中に振幅が一定の回転磁場を印加するために,これまでのLC減衰振動回路に替えてIGBTを用いてパルス発振器を製作した.臨界摂動磁場レベル(摂動磁場振幅/周辺ポロイダル磁場【approximately equal】0.4%)を越える回転磁場を印加するとm=1磁場揺動は外部回転磁場の方向に回転し,またm=0磁場揺動(トロイダル磁束揺動)の回転も外部回転磁場の方向に依存して影響を受けることが観測された.摂動磁場レベルが0.6%を越えると回転磁場の印加による共鳴揺動成分の振幅の減少,超高Θ領域(Θ>2.5)の出現など,放電特性への影響が観測された.特に,摂動レベルが1%程度になると共鳴揺動成分が外部磁場と同じ速度で回転し,振幅が30-50%程度減少することがわかった.以上,本研究により,外部回転共鳴ヘリカル磁場を用いて抵抗性壁テアリングモードを安定化できる可能性が示された.STE-2 RFP実験装置では、LC減衰振動電流を用いて回転共鳴ヘリカル磁場を印加し、MHDモードの回転、中心共鳴テアリングモードの抑制などが可能であることを示してきた。本研究補助金により、RFP放電期間中に一定振幅で回転共鳴ヘリカル磁場を印加できるように、半導体素子を用いてパルス発振器を製作した。周波数10-30kHz、パルス幅5ms、最大電圧と電流はそれぞれ1kV、1kAである。また、表面磁場揺動のトロイダルモード数を同定するために16チャンネルのディジタルスコープを導入した。回転磁場の摂動レベル(表面での摂動磁場振幅に対するポロイダル磁場の比)が0.3-0.6%の範囲で周波数を変化させてMHDモードの回転、放電特性への影響を調べた。摂動レベルが0.3-0.4%程度では、m=1磁場揺動が回転磁場の方向に回転すること、揺動の回転速度は外部磁場の回転速度以下であることが示された。摂動レベルを0.6%程度まで増加させると放電特性への影響が観測されるようになる。中心共鳴モードの振幅は抑制され、プラズマ電流値が増加する傾向にある。放電抵抗も低下する。トロイダル磁束の増加は顕著ではなく、したがってピンチパラメータΘが高くなる傾向にある。周回電圧が低下して放電抵抗が減少するが、磁場浸透時間2msの銅製シェルを装着した場合よりも放電抵抗は高い。RFP配位持続時間には顕著な改善は見られない。摂動レベルをさらに上げてその効果を調べる予定である。Θ>2.5の領域では低トロイダルモード数のモード(n=3-4)が成長することがある。これらは外部キンクモードの可能性があるため、磁気計測を充実させてモードの同定を行なう予定である。わせて、外部キンクモードのフィードバック制御モデルの検討を開始した。

本年度STE-2RFP装置では、昨年度導入したパルス発振器を用いて回転共鳴ヘリカル磁場を印加し、MHDモードの回転駆動、中心共鳴テアリングモードの成長抑制などの研究を進めた.MHDモード回転駆動の機構,テアリングモードの成長抑制の機構を詳しく調べるために16チャンネルのディジタルスコープを新たに導入した。本年度は回転磁場の摂動レベル(表面摂動磁場振幅に対するポロイダル磁場の比)>0.6%の領域で回転磁場周波数を変化させてMHDモードの回転、放電特性への影響を調べた。周波数が10kHzの場合,摂動レベルが1%程度になると,摂動磁場に共鳴するm=1/n=8モードを,回転磁場の方向に外部磁場と同じ速度で回転させ得る.隣接モードの回転も駆動されるが,回転速度は摂動磁場回転速度の1/4程度(約1km/s)である.回転磁場印加によりm=1モードの振幅が減少し,特に,共鳴モード(m=1/n=8)の振幅は50%以下に減少する.隣接m=1/n=9モードの振幅は回転磁場の影響をほとんど受けない.m=1モードとm=0モードとの非線形結合過程の解析を進めている.m=1/n=8共鳴モードの振幅が抑制されるとプラズマ電流値が増加し,放電抵抗が低下する。現在のところRFP配位持続時間に顕著な改善は見られない。ピンチパラメータΘ>2の領域で観測される低nモード(n=3-4)は抵抗性壁外部キンクモードと同定された.このモードと同じヘリシティーをもつm=1/n=-4回転ヘリカル磁場を印加する準備を進めている.以上,本研究により,回転共鳴ヘリカル磁場を用いて,(1)抵抗性壁容器内RFPプラズマのMHDモードの回転を駆動できること,(2)抵抗性壁テアリングモード振幅を抑制できること,が実証された.
我が国における鍼灸治療利用の実態と利用者の意識及び満足度に関する全国調査

本研究は,過去に実施した全国調査の結果を踏まえて,近年の我が国における鍼灸手技療法受療者の利用状況と意識,および非利用者の意識について詳細に調査し,その情報を業界にフィードバックすることによって,業界が国民に提供するサービスの質向上に資することを目的とする。具体的には,2003年以降に実施された鍼灸手技療法に関する国内の調査データと国内外の主要な関連文献の結果をレビュー・分析し調査項目の見直しを行った上で,新たに全国規模の調査を実施し,近年における鍼灸手技療法の実態と利用者の意識について詳細な解析を行うことによって,我が国における鍼灸手技療法受療者の状況と意識を明らかにする。
生物ナノ・モーター・プロトンポンプATPaseの作動機構

研究代表者らは生物ナノモーターであるプロトンポンプF-ATPaseとV-ATPaseに注目して研究を進めた。F-ATPaseはエネルギー通貨であるATPを合成しており、V-ATPaseはATPの加水分解との共役によってプロトンを輸送し、リソソーム、エンドソーム等のオルガネラの内腔を酸性にしている。いずれも反応に伴ってサブユニットの回転するナノモーターである。本研究ではF-ATPaseが膜内在という本来の局在場所でナノモーターとして作動していること、プロトン輸送路との共役が回転に必要であること、またV-ATPaseも同様の回転機構によってプロトンを輸送していることを解明した。さらに、金粒子をF-ATPaseに結合させ、ミリ秒時間分解能で解析すると、回転に確率的な揺らぎがあることが明らかになった。さらに、βサブユニットに変異を導入し、回転と揺らぎの機構を解析した。タンパク分子のレベルからの研究と同時にナノモーターの生理学/細胞生物学的な研究を進めた。成果として、膵臓のβ細胞からインスリンが分泌する為には分泌顆粒の内部がV-ATPaseによって酸性pHとなることが必須であること、近位尿細管の表層細胞ではV-ATPaseがエンドサイトーシスに関与していること、破骨細胞形質膜のV-ATPaseはリソソームが融合することにより局在化することをを示し、マウスのV-ATPaseを発生時期と組織に特異的に欠失させる為に新しい手法を確立した。本研究ではプロトンポンプとよびうる2つのATPase(F型ATPaseとV型ATPase)を、膜に存在するナノマシーンとしてとらえ、構造と作動機構を明らかにする。F型ATPaseとV型ATPaseにはサブユニットの一次構造のレベルで高い相同性があり、基本的に同じ機構によって駆動していると考えられる。平成13年度には以下の新しい結果が得られた。1)F型ATPaseは反応に伴ってサブユニットの回転がみられること。2)F型ATPaseのうちサブユニット複合体ab_2αβδが固定子、γεc_<1014>が回転子と考えられること。3)活性中心からβサブユニットのSer174部分までの反応に伴う運動が回転に重要であること。またV型ATPaseについて次のような新しい知見が得られた。1)V型ATPaseの膜内在性部分のサブユニットaに4種のイソフォームa1,a2,a3,a4膜表在性部分のEサブユニットにE1とE2,GサブユニットにG1,G2,G3のイソフォームがあること。2)これらのサブユニットがV型ATPaseの多様な細胞内局在を決めていると考えられること。3)特にa3をサブユニットとするV型ATPaseがランゲルハンス島β細胞のインスリン分泌顆粒に、a4を持つV型ATPaseが腎臓の集合管に局在することを明らかにした。動物細胞の細胞質には、内部が酸性の各種のオルガネラが存在し、細胞外からの物質のとりこみ、情報伝達などに関与し、多彩な機能を果たしている。これらの内部はpH6.54.5になっており、酸性オルガネラと呼ぶにふさわしい。酸性オルガネラの多彩な機能を理解すると共に、遺伝子からオルガネラの形成機構と、H^+ポンプ(V-ATPase)、イオン・チャネルなどによって、内部酸性環境が形成される機構を明らかにすることを本研究の目的としている。平成14年度は次のように研究を実施した。V-ATPaseは輸送路部分(V_0)および表在性部分(V_1)を持ち、それぞれ多数のサブユニットから構成されている。このV-ATPaseのモデルとなりうるF-ATPaseの反応機構を検討し、a/cサブユニットが膜中に互いに回転していることを示した。さらにマウスを用いて検討し、H^+の輸送に関与しているサブユニットには多彩なイソフォームが存在することを示した。これらのイソフォームは骨代謝、体液pHの調整、生殖機能、神経伝達等に重要であることを証明した。さらに、V-ATPaseがF-ATPaseとの構造上の類似点から、ナノモーターであることを予想し、実験的に初めて証明した。原核

生物・真核生物を問わず、普遍的に存在するプロトンポンプATPase、ATP合成酵素(F型ATPase)および液胞型ATPaseの一部のサブユニットは反応に伴って回転することを示してきた。本研究では大腸菌形質膜断片を用いて合成酵素の膜表在/膜内在サブユニットからなる複合体がATPの加水分解に伴い、回転子を形成することを実証した。これは先に可溶化精製酵素を用いて得た結果を支持するものであり、膜内在性サブユニット複合体間の相互作用によりプロトン輸送が行われることを実験的に証明できた。またV型ATPaseの回転軸を形成する部分と固定子に数多くのサブユニット・イソフォームを発見した。これらのサブユニット・イソフォームは、組織特異的に発現するもの、あるいは広範な組織に存在するものがあり、多彩な生体高次機能の実現において必要とされる酸性環境の形成と維持を担うものであると推論できる。そこで、個体での血中ホメオスタシス維持に特に着目し、膵臓、ランゲルハンス氏島ベータ細胞においてインスリン分泌顆粒に局在するV型ATPaseの役割について詳細に解析を進めた。V型ATPaseの機能に欠損があるマウスの表現型から、機能性のインスリンの産生には酸性環境が必要とされることが示された。これらの結果は、生物ナノモータの作動原理に迫る知見であるのみならず、個体レベルの生理機能におけるプロトン環境の本質的意義を解明する上で極めて重要なものである。研究代表者らは生物ナノモーターであるプロトンポンプF-ATPaseとV-ATPaseの作動機構に注目して研究を進めてきた。F-ATPaseは生体に於いてエネルギー通貨であるATPを合成しており、V-ATPaseはATPの加水分解との共役によってプロトンを輸送し、シナプス小胞、リソソーム、エンドソーム等のオルガネラの内腔を酸性にしている。いずれも反応に伴ってサブユニットの回転するナノモーターと定義できるプロトンを輸送するポンプである。本研究ではF-ATPaseが膜内在という本来の局在場所でナノモーターとして作動していること、プロトン輸送路との共役が回転に必要であること等を明らかにした。またV-ATPaseもF-ATPaseとほぼ同様の回転機構によってプロトンを輸送していることを解明した。さらに、金コロイド粒子をF-ATPaseおよびV-ATPaseに結合させ、詳しく回転機構を解析する実験系を確立した。これらのタンパク分子のレベルからの研究と同時にナノモーターの生理学/細胞生物学的な研究を進めた。成果として膵臓のβ細胞からインスリンが分泌する為には分泌顆粒の内部がV-ATPaseによって酸性pHとなることが必須であることを証明した。また、マウスのV-ATPaseを個体発生の時期と組織に特異的に欠失させる為の組換えプラスミドを迅速に調製する新しい手法を確立した。研究代表者らは生物ナノモーターであるプロトンポンプF-ATPaseとV-ATPaseに注目して研究を進めてきた。F-ATPaseはエネルギー通貨であるATPを合成しており、V-ATPaseはATPの加水分解との共役によってプロトンを輸送し、リソソーム、エンドソーム等のオルガネラの内腔を酸性にしている。
遺伝アルゴリズム的手法を用いたゲーム論的社会状況における協調戦略生成過程の分析

本研究では「繰り返し二人ハイパーゲーム」の枠組みを定式化し、不完全情報下の社会状況を記述した。この枠組みにより、問題状況に関与する各主体の認知の相違と、そこから生じるコンフリクトを表現することができる。またゲームを繰り返すことにより、コンフリクトの解消に焦点をあてたモデル化が可能となった。上述の定式化された枠組みを用いて、各主体の状況に対する認知の学習に遺伝的アルゴリズムを適用し、計算機を用いて実験を行った。ハイパーゲーム的社会状況に対し遺伝的アルゴリズムが使われた例はこれまでになく、本研究の特色である。本研究では、プレーヤの認知を改善し、正しい認知になるように学習を行わせることに成功した。本研究の結果により、目標となる相手の利得行列が未知であるとき、自己の持つ相手への認知をどのように評価すれば認知を状況に適応する方向へ改善できるのかという、ハイパーゲームの学習過程に関する規範的知見を得ることができた。具体的には、利得行列を学習するためには、状況に適応している行列ならば得られるであろう利得と実際に得られた利得との差だけではなく、ナッシュ解の個数などの行列の形に関する性質も必要である。本研究の結果は計測自動制御学会のシンポジウムで発表され、日本経営情報学会の論文誌に投稿され、掲載予定である。