hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
クルマエビの初期発生段階・雌雄別発現解析による性決定機構の解明

クルマエビの性差(雌>雄)に着目し,性統御・全雌生産の可能性を検討するために性決定機構および性分化機構について解析する.これまでに開発した性連鎖マーカーを利用し,初期発生段階を継時的にサンプリングし,性連鎖マーカーにより各個体の性別を判定する.性別判定をした雌雄個体のRNAをそれぞれまとめ,RNA-seq解析を実施し,ごく初期に遺伝子発現の雌雄差が現れる遺伝子を性決定候補遺伝子として単離する.これらの候補遺伝子について,解析済みの家系における性連鎖解析を行い,性決定遺伝子の探索を行う.また,この継時的なサンプルによるRNA-seq解析により性分化機構に関与する遺伝子群も明らかにする.クルマエビの性差(雌>雄)に着目し,性統御・全雌生産の可能性を検討するために性決定機構および性分化機構について解析する.これまでに開発した性連鎖マーカーを利用し,初期発生段階を継時的にサンプリングし,性連鎖マーカーにより各個体の性別を判定する.性別判定をした雌雄個体のRNAをそれぞれまとめ,RNA-seq解析を実施し,ごく初期に遺伝子発現の雌雄差が現れる遺伝子を性決定候補遺伝子として単離する.これらの候補遺伝子について,解析済みの家系における性連鎖解析を行い,性決定遺伝子の探索を行う.また,この継時的なサンプルによるRNA-seq解析により性分化機構に関与する遺伝子群も明らかにする.
狩猟採集民サンの再定住に伴う社会再編とポスト狩猟採集社会への移行に関する研究

研究は、ポスト猟採集社会が形成される過程に注目し、そのなかでサンの文化の独自性がいかに保たれているのかを検討するものである。長年、狩猟採集生活を持続させてきたサン社会は、近年、主流社会への統合をはかる再定住政策によって、その生活の基盤を失いつつある。その一方で再定住地には、それまで各地に散在していた小規模な集団が結集し、かつてない大規模なサンのコミュニティが誕生している。本研究ではこの点に注目し、再定住によってはじめて可能となったサンの政治、経済、文化活動について検討し、再定住地におけるサンの文化や社会的秩序の再編の過程を検討することを目的としている。この目的のもと、本年度は、まず昨年度2月に開催されたワークショップ"「土地」から展望する南部アフリカ"で発表した内容をまとめて、「アフリカレポート」において発表した。これは、再定住地における混住状態のなかで出身域や出自ごとの帰属意識がうまれ、それが土地利用にも反映されていることを論じたものである。また、昨年度の現地調査の成果を踏まえて、再定住地に生まれた新しいコミュニティにおける政治的代表者、とくにヘッドマンの選出過程を分析し、「アジア・アフリカ地域研究」に投稿する論文を執筆し、掲載された。この内容は、研究会およびワークショップでも口頭発表した。11月に開催された国際シンポジウムでは、サンの再定住問題を、アジア、アフリカの他地域における「移動と故郷」に関する事例と比較検討することで、より広い文脈に再定置した。さらにサンの故地をめぐる先住民運動の動向や、再定住地における伝統的なダンスの活発化に関する小論なども執筆した。これらの内容については、今後より分析を発展させて、論文としてまとめる予定である。本研究は、ポスト狩猟採集民社会が形成される過程に注目し、そのなかでサンの文化の独自性がいかに保たれているのかを検討するものである。一方で再定住地には、それまで各地に散在していた小規模な集団が結集し、かつてない大規模なサンのコミュニティが誕生している。この目的のもと、本年度はまず5月に「南部アフリカ狩猟採集民サンの再定住にともなう社会関係の再編」(日本アフリカ学会)を発表し、これまでの研究成果を整理した。これをうけて8月から11月までは現地調査を実施した。ボツワナ共和国の再定住地において、住民間の社会関係に注目して、土地利用あり方や政治的代表者の選出過程などを調査した。また大学やNGOのスタッフと再定住地における開発プロジェクトに関して議論した。さらに南東部アフリカにおいて再定住政策が住民に与える影響についての広域調査を実施するとともに、文献資料を収集した。1月には、調査成果をまとめて「開発政策と先住民運動のはざまで」(国立民族学博物館共同研究会)として発表し、近年高まりつつある先住民運動のもと、再定住地の政治的代表者の選出に際しても「先住性」や「系譜」が重要な意味を持ち始めていることを指摘した。また2月には京都大学大学院アジア・アフリカ地域研究研究科のメンバーとともにワークショップ"「土地」から展望する南部アフリカ"を企画し、再定住地における混住状態のなかで出身域や出自ごとの帰属意識がうまれ、それが土地利用にも反映されていることを発表した。これらの成果については現在論文を執筆中である。
ヒトへの適用を目指した最新自動制御システムを有するハイブリッド型人工肝臓の開発

1.ヒトへの適用を目指した人工肝臓を開発するための前臨床段階の性能評価を行うために、肝不全イヌへの適用を目指したハイブリッド型人工肝臓の試作を行った。昨年度の肝不全ラットへの本人工肝臓の適用実験から、本人工肝臓内に生体肝の約10%の肝細胞を固定化することで肝不全病態からの回復に有効であることが示唆されたので、イヌの場合では細胞量で約30g、装置体積で約300cm^3の装置の試作を行った。また装置本体の多細管型PUF充填層の細管径は2mm、細管間ピッチは4mmとした。2.このスケールアップに先だって、小スケールの人工肝臓を用いて人工肝臓の機能発現を最大にするための最適な培地流量についても知見を得、上記装置の場合約400ml/minの培地または血漿流量が必要であることが示された。そこでこの装置内に初代イヌ肝細胞を播種しスフェロイドを形成させたハイブリッド型人工肝臓を作製し、昨年度開発した双方向型の培養システムに組み込んで、400ml/minの最適流量で、pH;7.2,D0;6.5ppmの運転操作条件で機能発現について検討を行った。その結果、肝機能の指標としてタンパク質合成活性(アルブミン分泌活性)を調べたが、単位細胞当りの活性はスケールアップしても良好に維持されていた。3.前臨床段階の性能評価を行うために、本人工肝臓を温虚血性肝不全イヌモデルへ適用し、血中の肝機能補助の指標となる生化学成分の分析を行った。その結果本人工肝臓によって、肝不全時に低下する血糖値やケトン体比の維持がはかられ、また血中アンモニアやビリルビンの上昇が抑制された。これらの結果から、本人工肝臓が肝不全病態の回復や悪化の抑制に効果が期待できることが示唆された。1.人工肝臓として5cm^3の装置を作製し、肝不全ラットの体外循環システムにつないで性能を評価したところ、ラットの全肝細胞数の約6.7%の細胞数で肝不全病態の回復に対して有効であることが示された。今後種々の肝不全病態に対して細胞量を変えて同様な実験を繰り返す必要があるが、この結果をもとに計算すると、ヒトの場合、細胞数で8.9×10^9cells、装置容積で1075cm^3と試算された。また今後前臨床段階の実験を予定しているイヌの場合、肝臓重量が約300gであったので細胞数で2.0×10^9cells、装置容積で243cm^3と試算された。2.双方向フローシステムとガス圧送送液システムを有する現有の動物細胞高密度培養装置((株)鈴木商館製BioPro-SR)に、装置体積約17cm^3の人工肝臓(多細管型ポリウレタンフォーム充填層)を組み込み、ガス圧力と流量の関係を検定して無血清培地を用いて培養実験を行った結果、人工肝臓内の細胞の生存率と固定保持率を最大にする最適流量は、細管内線流速で65.1cm/min、体積流量で45.0ml/minであった。今後これらの値をもとに装置のスケールアップをはかることが可能となった。また今年度購入した血液ポンプを本装置システムに組み込むことで、体外循環ラインとの接続が可能となった。3.装置のスケールアップをはかる際に重要となるスフェロイド化(組織化)した肝細胞の酸素消費速度を測定した結果、133266nmol/10^6cells/minという値が得られ、これは懸濁肝細胞の約511倍高い値であった。本人工肝臓のような充填層型培養装置では、装置人口出口で酸素濃度勾配が生じ易いため、この濃度勾配を解消する双方向フローシステムが人工肝臓の装置化には有効であることが示された。

1.ヒトへの適用を目指した人工肝臓を開発するための前臨床段階の性能評価を行うために、肝不全イヌへの適用を目指したハイブリッド型人工肝臓の試作を行った。昨年度の肝不全ラットへの本人工肝臓の適用実験から、本人工肝臓内に生体肝の約10%の肝細胞を固定化することで肝不全病態からの回復に有効であることが示唆されたので、イヌの場合では細胞量で約30g、装置体積で約300cm^3の装置の試作を行った。また装置本体の多細管型PUF充填層の細管径は2mm、細管間ピッチは4mmとした。2.このスケールアップに先だって、小スケールの人工肝臓を用いて人工肝臓の機能発現を最大にするための最適な培地流量についても知見を得、上記装置の場合約400ml/minの培地または血漿流量が必要であることが示された。そこでこの装置内に初代イヌ肝細胞を播種しスフェロイドを形成させたハイブリッド型人工肝臓を作製し、昨年度開発した双方向型の培養システムに組み込んで、400ml/minの最適流量で、pH;7.2、DO;6.5ppmの運転操作条件で機能発現について検討を行った。その結果、肝機能の指標としてタンパク質合成活性(アルブミン分泌活性)を調べたが、単位細胞数当りの活性はスケールアップしても良好に維持されていた。3.前臨床段階の性能評価を行うために、本人工肝臓を温虚血性肝不全イヌモデルへ適用し、血中の肝機能補助の指標となる生化学成分の分析を行った。その結果本人工肝臓によって、肝不全時に低下する血糖値やケトン体比の維持がはかられ、また血中アンモニアやビリルビンの上昇が抑制された。これらの結果から、本人工肝臓が肝不全病態の回復や悪化の抑制に効果が期待できることが示唆された。
組織内活性型ビタミンKの内分泌調節作用とその機構解析

ビタミンKは肝臓における血液凝固因子の産生や骨代謝に必須の微量栄養素である。ビタミンKの生体内分布を見ると、肝臓や骨以外にも、膵臓、脳、生殖線に大量に存在する。しかし、それらの臓器でのビタミンKの役割については未だ不明な点が多い。本研究では、膵臓からのインスリン分泌に及ぼすビタミンKの影響について解析を行い、ビタミンKが膵β細胞からのグルコースに依存したインスリン分泌の増強作用を有していることを見出した。また、その作用機序について細胞内cAMP量の増加、EPACの活性化によることを示した。ラット膵臓から、常法(コラゲナーゼ灌流法)によって調製した膵ランゲルハンス島を用いて、グルコース応答性インスリン分泌にビタミンKが与える影響について解析を行った。バッチインキュベーションで、培地中に分泌されるインスリン量を即詠した。比較的低濃度のグルコースで刺激した場合、メナキノンー4はインスリンの分泌量を上昇させた。一方、高濃度のグルコース刺激では分泌量に変化は見られなかった。また、メナキノンー4の側鎖類縁体であるゲラニルゲラニオールやファルネソールで処理した場合、インスリン分泌量の上昇が観察された。このことから、ビタミンKによるグルコース応答性インスリン分泌の上昇には、側鎖であるイソプレン構造が重要であると推定された。cAMPーAキナーゼ(PKA)経路は膵β細胞において、インクレチンによって活性化され、グルコース応答性インスリン分泌量を増加させる。ビタミンKは、PKAを活性化させることが報告されているが、その作用機序について明確になっていない。そこで、ビタミンKによりPKAの活性化が見られるマウス精巣由来I-10細胞を用いて解析を行った。I-10細胞をメナキノンー4で処理すると、細胞内cAMP量が増加した。また、アデニル酸シクラーゼ阻害剤の存在下において、PKA活性化が観察されなかったことから、ビタミンKはアデニル酸シクラーゼを活性化させ、cAMP量を上昇させることが示唆された。ラット膵臓由来INS-1細胞を用いて、グルコース依存性インスリン分泌にビタミンKが与える影響について解析を行った。低濃度のグルコース溶液での刺激と同時にメナキノン-4で刺激した場合、一定時間後に培地中に分泌されるインスリン量は、メナキノン-4によって増加し、濃度依存性も観察された。一方、高濃度のグルコース溶液で刺激した場合、メナキノン-4の影響は見られなかった。このことは、前年度の膵臓より調製した膵ランゲルハンス島を用いた同様の試験と類似した結果であった。また、メナキノン-4で処理した場合、細胞内cAMP量の増加が観察された。Aキナーゼの阻害剤であるH89で処理した場合、メナキノン-4によるインスリン分泌増強作用は消失した。cAMP応答配列結合タンパク質の結合配列をプロモーターにもつレポーター遺伝子をINS-1細胞にトランスフェクションし、メナキノン-4処理後に細胞抽出液中のレポーター活性を測定したが、メナキノン-4の影響は観察されなかった。以上の結果より、メナキノン-4は細胞内のcAMPレベルを増加させ、グルコース依存性のインスリン分泌を増強することが明らかになった。メナキノン-4の側鎖類縁体である、ゲラニルゲラニオールを用いて同様の試験を行ったが、インスリン分泌増強作用や細胞内cAMP量の上昇が観察されなかった。このことから、ゲラニルゲラニオールは、精巣由来細胞と膵臓由来細胞で作用が異なることが示唆された。今回、ラット膵臓由来不死化β細胞を使用したが、他の不死化β細胞においても、同様の試験を行い、再現性を見る必要がある。前年度までに、分離ランゲルハンス島、および株化β細胞において、ビタミンKはグルコース依存性インスリン分泌を増強することを明らかにした。本年度も引き続き、ビタミンKによる増強作用の機構解析を行った。株化β細胞(ラット膵臓由来INS-1)にcAMP応答配列(CRE)をもつレポーター遺伝子を細胞にトランスフェクションして、低濃度のグルコースで刺激し、レポーター活性を測定した。その結果、レポーター活性の上昇は見られなかった。このことは前年度、異なるCREを複数持つレポーター遺伝子を用いた場合と同様の結果であったことから、ビタミンKによるインスリン分泌の増強作用は、PKAの活性化を介さないことが示唆された。続いて、cAMPのもうひとつの下流経路のEPACについて解析を行った。EPAC阻害剤で処理した場合、ビタミンKによるインスリン分泌増強が阻害された。このことから、ビタミンKによるグルコース刺激インスリン分泌の増強作用はcAMPーEPAC経路を活性化することによると推定された。ビタミンKにより細胞内cAMP量の増加が見られる精巣ライディッヒ細胞由来I-10細胞においては、PKAの活性化が見られることから、細胞種によってcAMPの下流経路の活性が異なることが示唆された。さらに、マクロファージ、肝臓由来細胞において、cAMP量、PKAの活性化が見られなかったことから、ビタミンKの作用は、アデニル酸シクラーゼを直接活性化させるのではなく、細胞表面に存在する受容体を介する可能性が示唆された。

本研究では、膵臓からのインスリン分泌に及ぼすビタミンKの影響について解析を行い、ビタミンKが膵β細胞からのグルコースに依存したインスリン分泌の増強作用を有していることを見出した。また、その作用機序について細胞内cAMP量の増加、EPACの活性化によることを示した。膵β細胞におけるアデニル酸シクラーゼアイソザイムの発現量の測定が完了しておらず、GIP、およびGLP-1受容体に共役しているアデニル酸シクラーゼをはやめに確定させる必要がある。単離膵ランゲルハンス島、および複数種の不死化したβ細胞を用いて、ビタミンKによるインスリン分泌増強の作用機構を解析する。特に、ミトコンドリアでのATP産生増加も、インスリン分泌増強の一要因となることから、メナキノン-4によるATP産生系への影響を解析する。また、メナキノン-4以外のビタミンKアナログも増強作用を有しているのか、否かの解析を行う。28年度が最終年度であるため、記入しない。栄養化学単離膵ランゲルハンス島、および不死化したβ細胞を用いて、ビタミンKによるインスリン分泌促進の作用機序の解析を行う。脳スライス培養系にビタミンK1を添加して、生成するメナキノンー4やメナキノン-4エポキシド、中間体として生成することが予想されるメナジオン、メナジオンエポキシド、フィチル側鎖の測定系を構築し、定量する。実験動物(ラット)を使用した試験を年度内に行う予定であったが、試薬などのロット差により、次年度に繰り越しになった。動物飼育用ケージ(特注品)の納期が年度末までに間に合わなかった。4月に予備試験を行い、5月中に執行予定である。動物飼育用ケージの購入28年度が最終年度であるため、記入しない。
ホッブズにおける機械論的自然像の成立と政治哲学の近代的転換

本研究は、17世紀英国の哲学者トマス・ホッブズの政治哲学を、同時代の科学革命によって生じた学問のパラダイム転換、つまりアリストテレス-スコラ的伝統から近代科学への知の総体的転換、の中に位置づけ、それを通じて近代的な政治哲学の成立過程とその特質を明らかにしようとするものである。とくにそのため、ホッブズにおける近代的学問の理念の成立過程を、人文主義的政治学の伝統の変容過程およびそれをもたらした科学革命における近代的な学知の理念の形成というコンテクストのなかで明らかにしようとした。この研究の過程で、まず、ホッブズにおける人文主義的伝統の意味について再検討するために、Q・スキナーの研究が提起した問題を受け止めながら、ホッブズ政治哲学におけるレトリックの意義について考察した。つぎに、ホッブズの機械論的自然像それ自体についても再検討するために、同時代の科学革命における学問の理念とかれのそれとの比較研究を多角的に行うことを目指した。とりわけ、光学に関するホッブズとデカルトの論争に関してR・タックの研究が提起した問題、および空気ポンプをめぐるホッブズとボイルの論争の分析を通じて、近代の経験科学の理念の成立過程におけるホッブズの科学方法論の特質を明らかにしたS・シェイピンとS・シェイファーの研究が提起した問題を受け止めて、ホッブズの機械論的哲学体系と科学の理念の近代性を考察した。最後に、ホッブズの政治哲学の主題を、初期近代における政治思想の変容のなかで明らかにするため、ホッブズにおける「社会契約」の概念の成立を、かれの機械論的自然像との関係で明らかにした。以上の研究を通じて、ホッブズにおける政治哲学の近代的転換の意味を再検討し、改めてホッブズ政治哲学の特質を、かれの機械論的自然像にもとづく哲学体系との関わりで明らかにした。本研究の目的は、17世紀英国の哲学者トマス・ホッブズの政治哲学を、同時代の科学革命による学のパラダイム転換ーアリストテレスースコラ的伝統から近代科学への知の総体的転換ーの中で捉え、近代的な政治哲学の成立過程とその特質を明らかにすることである。そこで本年度は、研究計画に基づいて、ホッブズ政治哲学における近代的学問の理念の物質を、人文主義的政治学の伝統の変容過程およびそれをもたらした科学革命における近代的な学知の理念の形成というコンテクストのなかで明らかにすべく研究を進めた。具体的には第一に、Quentin Skinnerのホッブズにおけるレトリックの意義についての研究が提起した問題を受け止めながら、ホッブズにおける人文主義的伝統の意味について再検討した。第二に、ホッブズと科学革命の関係について、Steven ShapinとSimon Schafferのホッブズーボイル論争と経験科学の成立過程の分析の問題提起を受け止めつつ再検討した。第三に、ホッブズの政治哲学の主題を、初期近代における政治思想の変容のなかで明らかにするための研究を進めた。とくに「社会契約」の概念がホッブズにおいて成立したことを、そのような思想史的文脈のなかで明らかにしようとした。また、ホッブズ研究の現在についてのサーヴェイを行い、近年のホッブズの哲学体系の形成・展開過程についての綿密な研究と独創的な解釈を十分にふまえるために、文献についてのデータの収集と整理、およびそれらの分析を進めた。本年度は、まずホッブズの機械論的自然像それ自体について新たな光をあてるべく、同時代の科学革命における学問の理念とかれのそれとの比較研究を多角的に行うことを目指した。なかでも光学に関するデカルトとの論争に関するRichard Tuckの研究が提起した問題、および空気ポンプをめぐるボイルとの論争の分析を通じて近代の経験科学の理念の成立過程におけるホッブズの科学方法論の特質を明らかにしたSteven ShapinとSimon Schafferの研究の再検討を中心として、ホッブズの機械論的哲学体系と科学の理念の近代性を考察した。

また、ホッブズの政治哲学の主題を、初期近代における政治思想の変容のなかで明らかにするための研究を昨年度から進め、とくに「社会契約」の概念がホッブズにおいて成立したことを、かれにおける機械論的自然像の成立との関係で明らかにしてきたが、この知見を核として、ホッブズにおける政治哲学の近代的転換について総括的に明らかにしようと試みた。とくに、近代初期の政治思想の中心テーマであった懐疑主義と宗教的寛容の主題とホッブズとの関わりを明らかにしつつ、改めてかれの機械論的自然像にもとづく哲学体系との関わりでそれについてのホッブズの議論の特質を解明し、かれの政治哲学にとっての意味を考察した。最後に、ホッブズ研究の現在についてのサーヴェイを引き続き行い、近年のホッブズの哲学体系の形成・展開過程についての綿密な研究と独創的な解釈を十分にふまえるために、文献についてのデータの収集と整理、およびそれらの分析を進めた。以上の研究成果を、『ホッブズの政治哲学-機械論的自然像と近代国家-』として一巻にとりまとめて刊行すべく準備を進めている。
漢語アクセントの解明と資料の発掘

本研究の目的は、歴史的な文献資料と現代の方言資料に基づいて古代から現代へと連続する「漢語アクセント史」を解明することである。古く学習音として受け入れられた漢字音が定着していく過程で、どのように漢語アクセントが形成されていくか、それが和語のアクセントと関係してどのような史的変遷をたどるかを検討した。その結果、「基本アクセント型」の形成、「中低形」(HLHなど)回避、前後に接続する自立語や助詞の影響などが漢語アクセント史解明のポイントになることが明らかになってきた。本年度は、漢語アクセント史の資料を発掘することに重点をおいた。研究代表者上野和昭は、声点の差された伊勢物語(とくに金刀比羅本)・源氏物語(とくに河内本)の諸本を調べ、中世の故実書である『名目抄』の未調査声点本(とくに京大平松文庫本)を確認した。研究分担者加藤大鶴は、主に『尾張国郡司百姓等解文』(早大本・東大本・真福寺本)に差された声点から漢語アクセントを抽出することに努めた。同じく鈴木豊は『日本書紀』の被訓注字に差された声点を分析した。同じく坂本清恵は和歌関係書を調べる一方で、現代漢語アクセントの実態にも目を配り、その量的構造を明らかにしようとした。さらに佐藤栄作は古辞書を中心に調査を進め、次年度以降データをまとめる際のフォーマットを考案した。以上のような作業の中から漢語アクセント認定の作業も進んだ。そのいくつかを挙げれば、たとえば加藤大鶴は、『尾張国郡司百姓等解文』にあらわれる声点について、そこに漢語アクセントが反映しているものと認定し、それらが鎌倉中後期の言語的特徴を有し、字音の特徴としては正格漢文と和文の中間に位置することを明らかにした。また鈴木豊は、『日本書紀』声点本諸本の音読漢字に着目し、そこに差された声点の注記時期や差声方式を考察したうえで、声点本そのものの成立過程にも言及した。さらに坂本清恵は、語構成・音節構造とアクセントとの関係という観点から、秋永一枝編『新明解日本語アクセント辞典』所載の現代漢語を分析した。本年度は、前年度に引き続き漢語アクセント史資料の発掘に努めるとともに、データの入力と整理を重点的に行なった。鎌倉期の漢語アクセント資料として高い価値を持つ『色葉字類抄』三巻本を研究代表者・分担者で入力し、分析・検索のために推定語形を付してデータの整理を行った。このほか、研究分担者加藤大鶴は中世説話集『宝物集』古写本二種、『熱田本平家物語』に差された声点から漢語アクセントを抽出することを試みた。坂本清恵は秋永一枝編『古今和歌集声点本』に収録された漢語声点を入力・整理した。前年度のデータに以上のデータを加えることで、中世から近世にかけての漢語アクセントの認定と分析作業も進んだ。研究代表者上野和昭は、『平家正節』の譜記によって漢語サ変動詞のアクセントを分析し、漢語部分とサ変動詞部分が完全に一語化し和語動詞なみになっているものと、それぞれのアクセント型を生かした接合段階にあるものとがあることを明らかにした。鈴木豊は弘仁と承和の講書による「日本書紀声点」が後代への伝承を通じて古態を残しつつも時に日本語音韻史の影響を受け、また差声への無理解のために誤写されていく様を概観した。加藤大鶴は『宝物集』の漢語声点を分析し、語の由来や性格によって反映される字音系統が異なることを明らかにするとともに、一語として不安定な去声+去声または上声+去声の連接が『将門記』(楊守敬旧蔵本、真福寺本)〉『三巻本色葉字類抄』〉『平家物語』(延慶本、熱田本)〉『宝物集』(古写本)の順に減少していくことを素描した。また『平家物語』『宝物集』などの和漢混淆文と『平家正節』の漢語アクセントとを比較すると、整然とした対応は見られないものの、単語個別では対応が見られるものがあることも分かった。坂本清恵は浄瑠璃本における清濁の分析を行い、中近世における漢語の語形を推定した。最終年度は、古代から現代にわたる14種類の文献から収集してきた漢語アクセントデータを整理し、検索用の推定語形などを加えて分析に耐えうる形にまとめ、データベースをほぼ完成させた(担当文献は次の通り;上野和昭は名目抄・平家正節・補忘記元禄版、坂本清恵は古今和歌集声点本・近松浄瑠璃本、佐藤栄作は京阪系アクセント方言資料、加藤大鶴は稲名類聚抄諸本・類聚名義抄諸本・将門記諸本・元禄版四座講式(涅槃講式)、尾張国解文諸本、宝物集諸本、平家物語諸本。前田本色葉字類抄は上野・坂本・佐藤・鈴木・加藤の全員で分担担当した)。

加藤大鶴はこのデータベースを利用することで、和漢混淆文や和化漢文のような従来は字音研究の立場からは規範性が低いと見られていた資料が、いわゆるアクセントの体系変化以後の資料と比較することで、漢語アクセント研究の俎上に乗る可能性があることを指摘した。この他、漢語アクセント研究の成果を利用した論考もある。上野和昭は契沖自筆本『和字正濫通妨抄』の読解によって、契沖が定家仮名遣を理解する上で四声における軽重と「音の軽重」との関係において、アクセント仮名遣いの原理を理解していることを明らかにした。また坂本清恵は「源氏物語」の注釈、「仙源抄」、「河海抄」「紫明抄」の声点調査を通じ、長慶天皇の差声法には、自らのアクセントを差したものと、出典があつて移声したものがあることは分かったが、その判断はむずかしく、注の中には明らかにアクセント体系変化後のアクセントを差したものがみられ、天皇自身の差声と認められる新しい差声法のもあることを考察した。このほか、鈴木豊はライマンの法則と呼ばれる日本語の連濁現象上との特徴から、中国語を話す帰化人が習得した日本語の影響を受けて日本語の「清濁」が生じたのだろうという仮説を提出した。
組織培養法による桑の栄養繁殖および人工種子作出に関する研究

桑のバイオテクノロジー技術の開発とその技術の裁桑分野への導入をはかり、人工種子作出に関する検討を行なった。そして、以下のように、首題の研究目的に対して意義深い研究が行なわれた。大西はカルスからの不定胚およびシュートの誘導に成功した。ついで種子カプセル中に含める栄養分および播種培地の種類が種子の発芽・生長に及ぼす影響について検した。そして、上記に基ずいて人工種子を作り、その貯蔵方法を検討開発した。本間は桑カルスの生長に対するCd,Cu,Zn,Ni,の耐性並びにCdの生長阻害にたいするMn共存の影響について実験した。そして、継代培養中に重金属耐性のカルスが得られた。また、吸収された重金属濃度は処理濃度と相関関係が認められた。Cdによるカルスの生長阻害に対してMnの共存は生長阻害を高め、両者の吸収量が増大することが明らかになった。久野は雌性品種において生育後半の皮部中により多くのFeが集積する傾向を認め、また、FeおよびCoの添加が雌器官である仁の生長を促進することを認めた。押金はカルス増殖と再分化について品種的な比較調査と不定芽形成に関与する窒素源の影響について実験した。柳沢は桑腋芽の発芽を抑制し、また促進する物質の含量および桑種子の発芽中のサイトカイニン含量の変化を調べた。これらの結果に基ずき、人工種子用カルスの生長を促進する桑抽出物の添加量をある程度推定することができた。現在、添加量と発芽速度との関係を検討中である。岡は芽生え茎頂を4PUを含む液体培地で垂直回転培養することにより、多芽体を誘導した。そして、組織構造を明らかにした。多芽体は誘導用培地と同じ培地で継代が可能であり、固形培地に移すとシュートを再生し、発根した。桑のバイオテクノロジー技術の一つである人工種子の作出に関する基礎的事項の検討を行なった。初年度の研究実績の概要は次の通りである。大西は冷蔵したカルスの出庫後の増殖促進について検討し、供試した5種類の化学物質に冷蔵によるカルスの休眠打破効果のあることを認めた。本間は重金属が植物カルスの成長に対する影響を調査し、各種金属元素の阻害順位はCa>Ni>Cu>Znの順であることを認めた。久野はFe,Co,Mnが桑の生殖器官の形成に及ぼす影響を検討し、雄性器官には影響は無かったが、雌性器官ではFe,Coが発育を促進すること、そして、Mnは雌性器官の着色を促進することを観察した。押金は桑カルスの増殖と再分化について、培地へ添加のNH_4とホルモンの関連を検討した。そして、LS培地の場合は現われなかったが、MS培地では品種間の差異はあるが不定芽形成が認められた。柳沢は桑夏芽の発芽成長に及ぼす鱗葉抽出物の影響について検討し、発芽成長に抑制的に働くこと、そして、その程度はABAの0.10.5ppmの抑制と同程度であることを認めた。岡は桑芽生え茎頂部を含サイトカイニン液体培地に入れ垂直回転培養を行なった。その結果、小葉を持つ多芽体が4puを含む培地で形成され、静地培養に移すと正常にシュートが形成されることを認めた。以上の研究は本研究課題に基づいて当初より計画的に行なった分担研究であって、それぞれの分担分野では主題の研究目的に対して意義深い実験を進めており、概ね所期の成果をあげうる研究経過をたどっている。そして、実用面への応用の可能性が濃くなったと考えられる。

したがって、第2年次には個々についての研究に加えて、総合的な検討にも主点をおき、課題について研究の完結に近づけるよう進展させる予定である。桑のバイオテクノロジー技術の一つである人工種子の作出に関する基礎的事項の検討を行なった。2年度の研究実績の概要は次の通りである。大西は156種類の培地とBAおよび2・4-Dの植物ホルモンを採択して試験した結果、カルスからの不定胚およびシュートの誘導に成功した。ついで、種子カプセル中に含める栄養分および播種培地の種類が種子の発芽・生長に及ぼす影響について検した。そして、人工種子を作り、その貯蔵方法を検討した。本間は、桑カルスの生長にはCdが抑制に働くのであるが、Mnを共存すると生長抑制は更に大きくなり、一方Feの吸収量は減少することを明らかにした。久野は生殖器官の形成に対するFe,MnおよびCoの影響を調べ雌性品種において生育後半の皮部中により多くのFeが集積する傾向を認め、またFeおよびCoの添加が雌器官である仁の生長を促進することを認めた。柳沢は発芽中の桑種子と冬期間中の桑腋芽のサイトカイニンなどの含量の変化を調べた結果、種子では発根時にZ、子葉展開時にIPA、第一本葉展開時にZRの含量が最も多くなる。そして、冬期間では休眠中にABA、ZA、ZG、IPAなどの含量が多く、その後はABAを除いて他の含量が増加し、一旦減少した他のサイトカイニンもZと同様に増加した。岡は前年度に誘導した多芽体の増殖条件を更に詳しく検討した。そして、誘導時のみならず継代時においても4PUが有効であり、多芽体中心部の組織の周囲に多数の芽を組織学的に観察した。また、冬芽からの多芽体形成も試みた。
女性への暴力加害者プログラムの実践に関わる実証的研究

今回の調査研究では、DVをやめる方策としてのDV加害者プログラムについて考察した。DV加害者プログラム参加者の一定はプログラムを肯定的に捉え、妻等との関係修復を目指したり、自分の生活等に活用するなどして継続して参加していた。参加者は「DVの話や離婚等の話は他ではどこでも話せることではない」という意見を述べていた。プログラムでは同じ仲間からアドバイスや指摘を受けていた。また自身の怒りのコントロールをしあう唯一の場としていることが伺えた。自分自身の怒りの感情を招いてしまいやすい価値観や考え方、思い込み、場面等について気づいて意識し、怒りの感情を回避する方法を学習する場としていることが伺えた。従来のDV加害者の調査、研究について、例えばDV加害者プログラムに関して、概観したものや、筆者らによる実践を通してのプログラムに対する検討や考察は複数見られる。しかしながら、プログラムに参加している当事者の意識や、プログラムを通しての変化のありよう等について調査、研究したものは、ことに日本においては渉猟する限り見られない。そこで今回の研究では、加害者のインタビューを通して、暴力をふるう原因となるものを追及し、暴力をやめるための方策について考察した。あわせて、DVプログラム内容の検討や効果的なあり方についても考察を行った。調査対象としては5か所ほどのDV加害者プログラムに通う男性10名程度である。これらDV加害者へのインタビュー調査だけでなく、プログラムの見学も積極的に行なった。またプログラムを実施しているスタッフに対してもお話を聞かせていただいた。調査の結果として、次のことが明らかになった。今回、分析に際してプログラムに頻繁に参加している人とそうでない人とを比較検討した。両方に共通していたことが、過去にパートナーに対して行った暴力である。身体的暴力はその頻度には差があるが、全員が何らかの形で行っていた。また皮肉を言う、気分をコロコロ変えて相手を不安にさせる、物を壊して怖がらせる、見下すようなことを言う、子どものしつけについてパートナーに責任を押し付けるといった精神的暴力についても同様、全員が行っていた。そしてパートナーに対する一方的な期待や希望、甘え、思い込みは全員が思っていた。例えば「男性を立ててほしい」「自分の実家と上手くつきあってほしい」「子どもへのしつけについて、自分(加害者)の思った価値観や方法でやってほしい」「イライラさせないでほしい」「自分の思いをわかってほしい」「よかれと思ってやってあげたことは感謝してほしい」といったことがあった。初年度の研究計画としては、DV加害者更生プログラムに通う人に対するインタビュー調査を実施することであった。これに対して複数の団体への調査協力を得ることができ、複数名の参加者にインタビュー調査に協力いただけた。平成28年度はDV加害者プログラム参加者へのインタビュー調査を多く実施した。調査結果を研究論文にまとめている。1つの調査研究結果としては以下のようになっている。ここではDV加害者プログラムに継続して通っている人と、同プログラムを中断した人の意識を比較したものである。グループにおおよそ週1回定期的に1年以上参加している人(以下継続群と表記する)と30回以下でプログラムを中断した人(以下中断群と表記する)との比較を行い、考察した。まず、「家族との関係」であるが、継続群は「子どもとの面会を続けたい。遠い将来になると思うがパートナーとも笑って話ができるようになりたい」「パートナーと同居したい」「家族円満に暮らしていきたい」「自分を変えたい」といった希望を持っている人が全員であった。そして中断群は現在の状況について満足していたり、現状にあきらめがあったり、あるいは「自分だけが悪いわけではない、妻もとても反撃的」「継続することでDV加害者とみなされ、関係修復も望めない」という意見が見られた。そしてグループメンバー等に対しての意見として、継続群は「同じDV問題に立ち向かう仲間、という意識がある」「色々なところでDV等家族の話をすることは難しいが、ここではそういった話ができる」「男性ファシリテーターのコメントは参考になる」などという意見が聞かれた。中断群は「同じ問題に立ち向かうメンバーではあると思うが、自分が一番しんどい状況にあるように思う。そう思うと自分だけ違うように思える」「パートナーの気が強いのは自分の家庭だけのように思える」といったように、仲間意識を感じづらいようであった。平成28年度は特にDV加害者プログラムを実施している人へのインタビュー調査を多く実施することを予定していた。しかし、平成27年度の続きのDV加害者プログラムに参加している人へのインタビュー調査を継続して行ったため、進捗状況としては遅れぎみである。また、平成28度は海外のDV加害者プログラムの見学や実施者へのインタビュー調査を計画していたが、調査対象者との交渉が上手くいかず、実施には至らなかった。最終年度の研究では、主にDV加害者対応やプログラムを実施している実践者に対してインタビュー調査を行ったものを分析・考察した。今回は、DV加害者への対応を週4日以上実施している実践者に絞ってインタビュー調査を分析することとした。その理由としては、先駆的にDV加害者対応を実践している方々であること、将来的にDV加害者プログラムを実施する際のモデルケースとなる可能性があること、という理由である。その結果、DV加害者への直接的対応に際して、様々な課題と困難性を抱えていた。具体的な例としては、自身の加害行為について十分考察することを避ける当事者への対応があった。また、DV加害者プログラムを欧米諸国等の対応のように裁判所命令等とし、強制的に受講させるべきか否かについて、様々な意見があがっていた。

そのうちの一つとして、DV加害行為の課題がある人には強制的にでもDV加害者プログラムにつなげるべきである、というものである。その際には危機対応を含むものであってほしい、という意見があった。そして、DV加害者プログラムそのものに対する批判を受けていることも明らかになった。さらにはDV加害者対応実践者同士の連携の必要性を実感する結果となった。現在はDV加害者対応のあり方が様々で、それぞれの実施団体で暗中模索の状態で実践にあたっている。例えば個別対応、グループワーク、カップル面談等、その効果や配慮が必要な点等、整理の必要性が見える結果となった。全体を通して、DV加害者プログラムに通う人、プログラムを途中でやめた人、プログラムにパートナーが通っている人、またDV加害者対応を様々な形で実践している方々に多くの意見をいただく機会が得られた。今後、引き続き、インタビュー調査、アンケート調査等を実施するなどして、研究、考察を行っていきたい。そしてDV加害者対応の重要性と必要性をより明確にしていきたい。今回の調査研究では、DVをやめる方策としてのDV加害者プログラムについて考察した。DV加害者プログラム参加者の一定はプログラムを肯定的に捉え、妻等との関係修復を目指したり、自分の生活等に活用するなどして継続して参加していた。参加者は「DVの話や離婚等の話は他ではどこでも話せることではない」という意見を述べていた。プログラムでは同じ仲間からアドバイスや指摘を受けていた。また自身の怒りのコントロールをしあう唯一の場としていることが伺えた。自分自身の怒りの感情を招いてしまいやすい価値観や考え方、思い込み、場面等について気づいて意識し、怒りの感情を回避する方法を学習する場としていることが伺えた。2016年度については引き続きDV加害者更生プログラムに通う人に対してのインタビュー調査を数名実施していきたい。また今年度は特にDV加害者プログラムを実施している団体にインタビュー調査、また可能であればアンケート調査を実施していきたい。そこではプログラムの実施状況、課題等を明確にしていきたい。そして米国のロサンゼルス州に渡り、プログラムを実施している団体への訪問、参加者へのインタビュー調査等を計画している。平成29年度は特にDV加害者プログラムを実施している人へのインタビュー調査を多く実施していきたい。また、平成29年度は海外のDV加害者プログラムの見学や実施者へのインタビュー調査を計画している。加えて当初からの計画にあった、DV加害者へ更生プログラムの具体的な内容について作成し、その効果測定を行いたい。社会福祉学平成28度は海外のDV加害者プログラムの見学や実施者へのインタビュー調査を計画していた。しかし調査対象者との交渉が上手くいかず、実施には至らなかった。そのため、旅費や調査協力の謝金、翻訳依頼の謝金等を中心として未使用額が生じた。
タンパク質分解による複製のライセンス化制御

ほ乳動物細胞において、染色体複製のライセンス化因子Cdt1は、再複製を抑制するためS期開始以降はユビキチン化を受け分解される。一方、我々は、Cdt1はM期中期に安定に存在することを見出した。この安定化は、次の細胞周期のためのライセンス化がM期終期からG1期初期に素早く確立するために重要であると考えている。M期では、Cdt1は高度にリン酸化されており、Cdt1のM期における安定化に関わると考え解析を行なった。Cdt1-FLAGを安定に発現するHeLa細胞を同調して、M期とS期よりCdt1タンパク質を精製した。質量分析によりリン酸化部位の決定を行ない、M期に特異的に見られる、あるいはS期に比べてM期に顕著にリン酸化が起こっていると思われる部位をCdt1タンパク質全体にわたって検出した。しかしながら、ユビキチンリガーゼSCF-SKp2の認識に必要な29番目のT(スレオニン)および31番目のS(セリン)のリン酸化は検出されなかった。また、M期においてサイクリンA-cdkとCdt1の結合が低下していることを考え合わせ、サイクリンA-cdkの結合部位(Cy部位)近傍のリン酸化が、安定化に関与していると予想した。そこで、Cy部位近傍で検出された4カ所のTあるいはSをアラニン(A)に変異させ安定化を調べた。また、リン酸化部位の配列から、Plk1によるリン酸化が予想された。そこで、リン酸化部位のアラニン変異とsiRNAによるPlk1のサイレンシングを組み合わせて解析を行なったところ、Cdt1のM期安定化の低下が見られた。よって、いくつかのキナーゼによるリン酸化が、Cdt1の安定化に関わると結論した。ほ乳動物細胞において、フイセンス化因子Cdt1は、S期において2種類のユビキチンリガーセ(SCF^<skp2>とCu14-DDBl^<cdt2>)により分解される。一方、染色体のライセンス化は、M期終期からG1期初期に確立する。我々は、Cdt1はM期前中期に安定に存在することを見出した.この時、同様にSCF^<skp2>によって分解されるCDKインヒビターp27は、分解されるので、Cdt1を安定化する機構が存在し、これによ棚期が終るとすぐにライセンス化を確立できると考えている。そこで、M期におけるCdt1の安定化機構に注目し研究を行ない次のような結果を得た。1) Cdt1タンパク質を細胞から分離できるようCdt1-FLAG安定発現細胞を構築した。内在性Cdt1と同様に細胞周期でのタンパク質量の変動が確認され、分解系が正常に機能していた。2)この細胞をノコダゾール処理によりM期前中期に同調したのち、Cdt1-FLAGタンパク質をFLAGレジンで免疫沈降したところ、S期の場合と異なり、サイクリンA及びユビキチンリガーゼのCdt1認識サブユニットSkp2の結合が低下していることを明らかにした。3) SCF^<skp2>が機能しているかどうか確かめるため、Skp2をサイレンシングしてノコダゾール処理したのち、p27タンパク質量を調べたところ,安定に存在していたので、SCF^<skp2>は機能していることを確認した。4)ノコロダゾール処理細胞よりCdt1-FLAGタンパク質を精製し.マススペクトロメトリーによりリン酸化部位を確認したところ、Skp2により認識される29番目丁及び31番目Sのリン酸が検出されなかった.以上の結果より、Cdt1は、SCF^<skp2>から保護される機構があると結論した。
Ｉｎ‐Ｃｅｌｌ　ＮＭＲ法の一般化に向けたデータ解析アルゴリズムと信号処理法の開発

本課題では,細胞内蛋白質の立体構造解析(in-cell NMR)を,より汎用的な手法に拡張するために,新規計算手法開発の観点から,NMR法の改良を進めていくことを目標とした.主に,NMRスペクトルの質向上のための信号処理法の開発と,立体構造計算手法の開発を行った.信号処理法の開発では,QME法の開発に成功し,実際のin-cell NMRスペクトルの質を大きく向上させた.構造計算手法の開発では,立体構造計算プログラムCYANAを改良し,ベイズ推定に基づいた新規手法の開発に成功した.また,Pseudo-Contact Shift(PCS)の解析をCYANAの中で再帰的に計算可能な手法も開発した.本年度は,昨年度より開発を進めてきたベイズ推定を利用したNMR立体構造計算手法をさらに改良し,NOE解析と構造計算を再帰的に実行可能なプログラムの開発に成功した.これにより,本最適化計算により修正された構造に基づいて,NOE帰属も同時に修正することが可能となった.加えて,本手法の有用性を検証するために,立体構造とNMR緩和データからNOESYスペクトルを逆計算するシミュレーションアルゴリズムを開発した.このシミュレーションにより,実験データに含まれるような曖昧さを完全に排除したスペクトルを立体構造から作成できるようになったため,シミュレーションデータを利用した本構造最適化手法のより厳密な性能評価も可能となった.実際に,GB1蛋白質の構造を元に13C/15N-NOESYスペクトルをシミュレーションし,ここで得られたグナルのうち,95%を消失させたデータを作成し,従来法と本手法の両方に適用させて,手法の評価を行った.ここから,従来法では正解構造からのRMSD値が4.3Åと収束した構造が得られなかったが,本手法では2.4Åと大幅な改善が確認できた.また,実際の実験データに対する適用可能性も検証するため,in-cell NMR法により測定された生細胞内のGB1蛋白質のスペクトルデータに対して本手法を適応した.解析の結果,従来法では,in-vitroの構造とのRMSD値が1.8Åであったのに対し,ベイズ推定を利用した本手法では,0.7Åと大幅な改善が確認できた.以上により,ベイズ推定を利用した新規立体構造計算手法は,シミュレーションされたスペクトルに対しても,実際の実験データ対しても,従来法と比較して非常に高精度の解析が可能であることを示すことができた.本課題では,細胞内蛋白質の立体構造解析(in-cell NMR)を,より汎用的な手法に拡張するために,新規計算手法開発の観点から,NMR法の改良を進めていくことを目標とした.主に,NMRスペクトルの質向上のための信号処理法の開発と,立体構造計算手法の開発を行った.信号処理法の開発では,QME法の開発に成功し,実際のin-cell NMRスペクトルの質を大きく向上させた.構造計算手法の開発では,立体構造計算プログラムCYANAを改良し,ベイズ推定に基づいた新規手法の開発に成功した.また,Pseudo-Contact Shift(PCS)の解析をCYANAの中で再帰的に計算可能な手法も開発した.本年度は,Sf9細胞を用いたin-cell NMR計測において,3次元NMRスペクトルの測定に成功し,78%の蛋白質主鎖原子の化学シフト帰属を達成した.本成果は,真核細胞を用いたin-cell NMRで,3次元スペクトル測定を可能にした世界初の事例として,学術論文誌上に発表した(J.Am.Chem.Soc., 135(5), 1688-1691).これにより,本課題の1つの大きな目標である,生きた真核細胞内での蛋白質立体構造決定への大きな足掛かりとなった.大腸菌を用いたin-cell測定では,特に蛋白質分子のダイナミクスに関して新しい知見を得た.これまでの予備的実験では,大腸菌を用いたin-cell NMRによるT1, T2緩和実験のデータが,理論カーブから大きく外れるという疑問が残されていた.そこで,本年度,この疑問点の解析のためにDEST法と呼ばれる新しい緩和実験を行った.現在暫定的な結果として,標的分子が細胞内で何らかの巨大分子と相互作用している可能性が示唆された.今後はこのデータの質を上げるための測定法の改良と伴に,新たなデータモデリング手法を適用することにより,より詳細な解析を進める.NMR立体構造計算アルゴリズムの開発では,ベイズモデリングを用いた新規立体構造計算手法の実装に成功し,物理ポテンシャルを用いた2面角系分子動力学計算と組み合わせることで,従来よりも少ない実験データにおいても高精度に立体構造決定が可能なことを示した.現在,この成果を学術論文に発表するための準備を進めている.新規信号処理アルゴリズム開発では,内点法を用いた圧縮センシングのプログラムの初期バージョンの開発に成功した.生物物理学会誌にin-cell NMRから分かる蛋白質の細胞内動態に関するレビューを報告した(生物物理53, 76-81).NMR信号処理法の開発では,これまで開発を進めてきたQuantitative Maximum Entropy(QME)を4D NOESYスペクトル等に応用し性能評価を行った.また,近年活発に応用が進んでいる圧縮センシング法との性能比較の結果,QMEはこれら手法と比較しても同等かむしろより正確にスペクトルを再構成可能であることを示した.これらの成果は,2015年のBiochem. Biophys. Res. Commun.誌に報告した.NMR立体構造計算手法の開発では,本年度は特に常磁性金属を用いたNMRの手法に関していくつか研究が進展した.

常磁性金属は,最も標準的なNOEを用いた手法に比べて,遠距離の距離情報,角度情報を得ることができるため近年研究が活発化している.本年度は,常磁性金属を蛋白質に結合させるために新たに設計したキレートタグDOTA-M8の合成に成功し,モデル蛋白質にこれを簡便かつ安定的に結合させられることを示した.この蛋白質試料を用いたNMR実験では,in-vitro環境下で,PRE(Paramagnetic Relaxation Enhancement)やPCS(PseudoContact Shift)の観測にも成功した.今後はこのスペクトルの帰属を行い,化学シフトやピーク強度変化から,距離,角度情報を抽出予定である.計算手法開発の観点では,磁化率テンソルを計算する新規手法を,我々が開発を進めているNMR立体構造計算プログラムCYANAに実装することに成功した.これにより,構造の最適化と磁化率テンソルの計算を再帰的に行うことが可能なため,より高精度の構造情報を習得可能となる.シミュレーションデータを用いた計算実験では,良好な結果を示したことから,今後はDOTA-M8を用いた実際の実験データを用いて,本手法の有用性を検証する.構造生物学新規蛋白質立体構造計算手法の開発では,ベイズ推定を用いた計算手法を複数のデータに適用して検証を行ったが,いずれのデータに対しても来従法に比べて構造計算の精度を大幅に改良できており,期待通りの性能を発揮している.一方で,本手法を一般ユーザが使用可能な形に整備する作業は,まだ不十分であり,次年度にはプログラムの一般公開に向けた作業を進める必要がある.また,専門誌への研究成果の発表も合わせて進める.新規信号処理法の開発では,圧縮センシングを用いたプログラムは完成したが,従来の最大エントロピー法を用いた手法と比べ,明確な改善がみられておらず,問題の検証が必要である.本課題の目標である「計算機による新しい信号処理法と自動解析法を開発し,計算機アルゴリズムの観点からin-cell NMR法を客観・定量計測可能な汎用手法へ改良すること」達成に向けて,現在主に,(1)立体構造計算アルゴリズムの改良,(2)新規信号処理手法の開発,(3)様々な細胞へのin-cell NMR測定の応用,という3つのプロジェクトを進行中である.(1)の立体構造計算アルゴリズムの改良では,現在我々が開発している立体構造計算ソフトウェアCYANAの2面角系分子動力学計算(MD)にカルテジアンMDの物理ポテンシャルを導入し,レプリカ交換,ベイズモデリングの実装にも成功している.これらのアルゴリズムをデータを,人為的に劣化させたシミュレーションデータに適応させたところ,質の悪い実験データであっても従来よりも堅牢に構造決定可能な事を示すことができた.これにより十分な信号を得られないin-cellデータに対しても高精度の構造決定が達成される可能性が高まった.この結果は現在,学術論文への発表の準備を進めている.(2)の新規信号処理アルゴリズム開発では,内点法を用いた圧縮センシングのプログラム開発に取り組んだ.すでに,プログラムの初期バージョンの開発には成功しており,実際のNMRスペクトルに適用してさらなる改良を進めていく段階にある.(3)の様々な細胞へのin-
頭頸部癌の神経周囲浸潤における細胞外マトリックス、接着因子の意義に関する研究

舌扁平上皮癌および頭頸部腺様嚢胞癌の浸潤・転移における細胞外マトリックス(ラミニン、コラーゲン)の意義について以下の結果と結論を得た。1.舌扁平上皮癌におけるラミニン発現手術切除した患者舌扁平上皮癌組織におけるラミニンγ2鎖の発現は、癌細胞どうしが密に接着しながら増殖している場合(胞巣状増殖)の胞巣辺縁細胞における発現(辺縁性発現)と、癌細胞がばらばらに分散し舌筋層や結合組織内に深く浸潤している場合(分散性浸潤)の癌細胞一つ一つの発現(びまん性発現)に大別された。びまん性発現型の癌細胞は高率に神経周囲浸潤や脈管浸潤をきたしており、辺縁性発現型より予後不良であった。胞巣状増殖はある程度正常扁平上皮の形質を保持した状態であり、マトリックス体存性の増殖形態と思われる。これに対し、分散性浸潤では癌細胞自らがラミニンγ2鎖を発現することにより細胞遊走能とともに脈管内の浮遊状態での増殖というマトリックス非依存性の増殖能を獲得し、転移能という高悪性度形質を獲得していることが示唆された。2.腺様嚢胞癌におけるラミニン、コラーゲンの発現手術切除した患者腺様嚢胞癌組織におけるラミニンγ2鎖、IV型コラーゲンの発現を検討した。cribriform typeでは大きな癌胞巣の周辺に加えpseudocyst内腔に沿った発現がみられた。tubular typeでは癌胞巣周辺にのみ発現がみられた。間質や神経周囲への浸潤部では癌胞巣が小さくなり伸長しているが、その小さな癌胞巣でも周辺とpseudocyst内腔に沿って発現がみられた。腺様嚢胞癌では癌胞巣周辺とpseudocyst辺縁には筋上皮由来の癌細胞が存在することが報告されていることから、筋上皮由来癌細胞を裏打ちするようにラミニンγ2鎖、IV型コラーゲンが発現していると考えられる。従って腺様嚢胞癌では、筋上皮由来癌細胞がラミニン・コラーゲンを含む基底膜様のマトリックスを利用しながら浸潤していることが示唆された。本研究課題での研究を始めるにあたり、まず九州大学医学部耳鼻咽喉科研究棟内に動物飼育用のアニマルアイソレーターケージを設置し、ヌードマウスを中心に飼育を開始した.コンタミネーションなどの飼育上の問題を生じることなく、ヌードマウスの飼育が可能となった。この施設を用い、頭頸部癌の神経周囲浸潤モデルの作成を目指している。癌細胞として、頭頸部癌のうち神経周囲浸潤が高率にみられ、長期的な再発率が極めて高いヒト腺様嚢胞癌由来培養細胞を入手した。本細胞ををヌードマウス皮下に移植、in vivoで腺様嚢胞癌の神経周囲浸潤モデルを作成中である。腺様嚢胞癌細胞のみの移植では腫瘍が形成されないことがわかり、現在、細胞外マトリックスを豊富に含んだマトリゲルを同時移植し、腫瘍形成を図っている。一方、患者から手術摘出した腺様嚢胞癌組織のパラフィン切片を用いて、細胞外マトリックスの発現を免疫組織化学的に検討した。まず基底膜の主要構成蛋白の一つであるIV型コラーゲンの発現を検討したところ、比較的少数の腺様嚢胞癌細胞の周囲にみられる豊富な間質内にIV型コラーゲンが強く発現していることが分かった。