hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
関係節の聴解過程における「戻り訳」習慣の阻害効果

本研究の目的は、後置修飾、特に関係節文に焦点をあて、「戻り訳」の習慣が当該文の聴解過程を阻害するかどうかを検証することである。大学生101人を英語聴解力テストにより統制・実験群に分け、両群に関係節文の翻訳演習を行った。統制群には、関係節を文尾より前に戻りつつ訳す「戻り訳」の演習を課した。実験群には、戻り訳の習慣を矯正するため、文頭から文尾に向かって訳す「分割訳」演習を課した。分割訳は、関係節文の前半を訳し、その後後半を訳すという翻訳方法である。6週の演習後ポストテスト(関係節文の聴解テスト)を行い、両群の差を検定した。その結果、両群には統計的な有意差が見られなかった。この結果に対する解釈は、たとえ関係節文の「戻り訳」の習慣は、当該文の聴解には必ずしも阻害効果はないということである。しかし本研究で採った実験方法だけでは、この解釈の普遍性を断言することはできず、今後発展的研究を続ける必要がある。発展的研究の方向性としては、以下の点が考えられる。第1に、関係節文を学習したての時期の学習者に戻り訳と分割訳の習慣をそれぞれ教示し、聴解に影響が出ないかどうかを確かめることである。本研究の被験者(大学生)は、約6年間も「戻り訳」を中心に翻訳の習慣を続けてきたと考えられ、たとえ本研究の実験群の如く戻り訳習慣を払拭する演習をしても、その習慣を取り去れなかった可能性がある。第2に、関係節文の文頭から理解するための、翻訳以外の方法(例:TPR)で演習した被験者と、戻り訳の習慣のある被験者を比較することである。本研究の翻訳を用いた演習方法では、関係節文を後戻りせずに理解するストラテジーを習得させることが難しい可能性がある。第3に、実験群と統制群に対するポストテストに聴解テストではなく、読解テストを使うことである。つまり戻り訳の習慣が関係節文の聴解よりも読解(特に速読)に影響がある可能性がある。
フロックのポーラス構造に起因する沈降速度変動が成層海域の栄養塩循環に及ぼす影響

本研究では,沿岸域における凝集性懸濁物質の動態把握を目的とした沈降・自重圧密に関する実験,ならびに浅海域における構造物築造が凝集性懸濁物質動態に与える影響に着目した数値計算を行った。その結果,九州西岸の主要内湾に供給される細粒土砂の沈降・自重圧密に関連する基本的な特性とその地域性が確認された。また,フロックを形成する基本粒子に作用する浮力のみでは説明できないような著しい沈降速度低下が,密度躍層において生じる可能性が示された。平成26年度には、九州西岸の沿岸域に供給される細粒土砂の沈降・圧密特性に関する実験と分析を行った。これにより、平成27年度以降に実施予定の実験に用いる試料の基本特性を把握した。本研究では、九州西岸の主要内湾に流入する12河川の感潮域で採取した試料を対象とした。実験結果より、試料のフラクタル次元は、全試料で2.65前後であったが、有明海湾奥西部の本明川、塩田川で相対的に大きいことが確認された。また、試料のゲル化濃度は、白川で特に大きく、その南北に位置する菊池川、緑川でも他の河川より大きな値を示すことが確認された。さらに、試料の自重圧密に係わるパラメータ(透水特性や応力発現特性)についても河川によって大きな違いがみられた。これらの特徴の地域的傾向性を調べるために、実験で得られた沈降・圧密に係わるパラメータを独立変数として主成分分析を行い、得られた主成分得点を用いたクラスター分析を行ったところ、1本明川、塩田川、氷川、2六角川、嘉瀬川、筑後川、多々良川、瑞梅寺川、菊池川、緑川、球磨川、3白川の3グループに分けられた。このような地域的な差異の要因を探るために、各試料の顕微鏡画像に対して画像解析を行い、円形度、平均フェレ径、および円周相当径を評価した。その結果、白川、菊池川、緑川で採取した試料の粒子形状が、前述の特徴に影響していることが示唆された。しかし、粒子形状のみで全てを説明することはできず、結晶構造などが大きく影響していると考えられる。平成27年度は、画像解析によってフロック径と沈降速度を計測する実験体制を整備し、沈降試験を実施した。具体的には、デジタルマイクロスコープを併設した沈降実験水槽を用いて懸濁物粒子の沈降状況を撮影し、本研究で作成した画像解析プログラムによって沈降速度とフロック径の評価、およびフラクタル次元の推定までを行った。用いた試料は、九州西岸の沿岸域および河川感潮域で採取し、ふるいによって粗粒成分を除去した堆積物である。沈降試験によって推定された懸濁物のフラクタル次元を、平成26年度に実施した自重圧密試験に基づくフラクタル次元の評価結果と比較したところ、沈降試験に基づいて推定されたフラクタル次元の値は1.61.9程度、圧密試験に基づく値は2.6程度であり、試験方法によって大きく値が異なる結果となった。加えて、凝集性懸濁物の動態を解析するために、フロキュレーションプロセス(懸濁物の凝集とフロックの崩壊現象)を考慮した凝集性懸濁物輸送数値モデルを構築した。構築した数値モデルに前述の実験で得られたモデルパラメータを適用して数値計算を実施し、干潟域への海岸構造物の築造が凝集性懸濁物の挙動に与える影響に関する基礎的な検討を行った。その結果、干潟域への護岸建設によって懸濁物フラックスが大きく変化すること、懸濁物フラックスの変化の程度は護岸建設位置に強く依存すること、懸濁物フラックスの変化にはフロキュレーションプロセスの変化に伴う懸濁物の沈殿傾向の強化が影響していることなどが示唆された。遅れていた実験装置の製作作業が完了し、フロックの沈降特性に係る実験データの取得が順調に進行していることから、おおむね順調に進展していると判断した。平成28年度は,九州各地(8箇所)で採取した細粒土砂を用いて沈降試験を中心に実施した.実験では,凝集粒子の沈降状況を朝日光学社製デジタルマイクロスコープで撮影し,画像解析によってフロック径と沈降速度を計測した.さらに,フロック径と沈降速度の計測データから各試料のフラクタル次元を評価し,平成28年度に実施した自重圧密試験に基づくフラクタル次元の評価結果との比較を行った.

その結果,沈降試験によるフラクタル次元は1.251.95であり,自重圧密実験によるフラクタル次元の推定結果(2.622.67)と比較して,全体的に小さな値となった.河口域・沿岸域における凝集性懸濁物のフラクタル次元は1.72.2程度とされており,沈降試験では,むしろそれに近い値が得られた.密度成層形成下におけるフロックの沈降試験においては,密度の急変部で沈降速度が低下する粒子の検出頻度が高くなることが確認された.フロック内部に上層の低塩分水を含んだフロックが密度躍層に侵入したことによって通常よりも大きな浮力を受けたことによる沈降速度低下と推察される.一方で,形成されたフロックの粒径がそれほど大きくなかったこと,試料によっては基本粒径が大きく凝集性が弱いこと,有機物を除去したことでフロックが極めて脆弱であったことなどから,大部分の粒子は非成層条件での実験と同様の挙動を示す結果となった.実験条件の設定方法などを改善した上で,さらなるデータの蓄積が必要と考えられる.実験は順調に進行しているが,目標達成に向けてフロックの沈降特性に係る実験手法の改善や実験データのさらなる蓄積が必要ではあることから,やや遅れていると判断した.沿岸域におけるフロキュレーションによる懸濁物質の粒径変化に対しては乱流が強く影響する。そこで,平成29年度は,浅海域における乱流特性量の把握を目的として,大分県中津市の中津干潟ならびに福岡市西区の江ノ口川感潮域における現地観測を中心に研究を推進した。中津干潟における観測期間は2017年9月22日9月23日(中潮)の2潮汐間,江ノ口川感潮域における観測期間は2017年11月18日11月19日(大潮)の2潮汐間である。観測では,超音波流速計(ADV)による流速測定および濁度計による濁度測定を実施した。また,測定機器設置地点近傍における底質採取を行った。超音波流速計によって15分毎に測定された16,384個の流速データを用いてスペクトル解析を行ったところ,水面変動のスペクトルにおいてピークが見られた0.11.0Hzの周波数帯で流速変動のスペクトルが-5/3乗の傾きから大幅に外れているのが確認された。これについては波浪による海水流動の影響と判断されることから,流速変動のスペクトルにおける波浪の影響を考慮しつつ,スペクトルの勾配が-5/3に従っていると考えられる周波数帯と低周波数側で勾配が-5/3から外れている領域との境界を推定した.その結果,上げ潮時と下げ潮時には0.61.1Hz付近,満潮時には0.080.4Hz付近であり,諫早湾の底層で観測された既往の研究結果と比較して,同程度か本研究の観測結果のほうが1オーダ高い値を示した。一方,現地の底質を用いたキャリブレーションによって濁度計の測定値からSS濃度を推定した結果から,冠水直後にSS濃度が高くなり,満潮下げ潮にかけてSS濃度が減少する特徴的な変動が確認された。本研究では,沿岸域における凝集性懸濁物質の動態把握を目的とした沈降・自重圧密に関する実験,ならびに浅海域における構造物築造が凝集性懸濁物質動態に与える影響に着目した数値計算を行った。その結果,九州西岸の主要内湾に供給される細粒土砂の沈降・自重圧密に関連する基本的な特性とその地域性が確認された。また,フロックを形成する基本粒子に作用する浮力のみでは説明できないような著しい沈降速度低下が,密度躍層において生じる可能性が示された。本研究では、成層流体におけるフロックの沈降特性を実験的に評価し、海域物理場の変動に対する水質の応答を予測するための数値モデルを構築する計画である。しかし、実験装置の製作に若干の遅れが生じたため、フロックの沈降特性に係る実験データを平成26年度中に取得することができなかった。ただし、九州各地で採取した実験用試料の基本特性の評価、ならびに実験装置の製作作業は概ね完了した。凝集した懸濁物の沈降特性を実験的に評価するための体制が整ったことから、平成28年度は、九州各地の主要な沿岸域で採取したサンプルを用いた凝集懸濁物の沈降特性の評価、ならびに成層流体中での凝集濁物の沈降特性の評価を中心に実施する。特に、これまでに実施した実験において、異なる方法で推定されたフラクタル次元の値に大きな乖離が見られていることから、フラクタル次元の評価方法の改善を図り、沿岸域における懸濁物の凝集特性を明確にする。異なる実験方法によるフラクタル次元推定値の乖離は、主にフラクタル次元を推定する際に用いる仮定に起因するものであり、異なる値を示すことに問題はないが、数値モデルを併用してより確度の高い評価方法を確立する予定である。加えて、成層条件下での沈降試験によって、成層強度、フロック径と沈降速度の関係を定式化する。以上の実験で得られる成果については、随時数値モデルに反映させ、感度解析・数値実験を実施する計画である。
脳電気刺激による神経保護効果のメカニズムの解明と臨床応用への基礎的研究

小脳室頂核電気刺激による神経保護のメカニズム解明のためラットで研究を行い、1時間の刺激後72時間において:(1)中大脳動脈閉塞後24時間の脳梗塞巣体積が22%縮小(神経保護効果)し;(2)ミトコンドリア蛋白であるUncoupling Protein 4(UCP4)の脳内発現(蛋白とmRNAレベル)が増加;(3)UCP4を抑制するsiRNA脳室内投与で刺激後のUCP4の発現が抑制され、虚血耐性が消去傾向にあり、UCP4が神経保護効果をもたらしていると結論づけた。【目的】ラット小脳室頂核(FN)の電気刺激(1h)を中大脳動脈(MCA)閉塞後に行うとcontrolに比べて脳梗塞が約50%縮小する。そのメカニズムを生体内イメージング法により明らかにし、さらにその結果を臨床応用するためのtranslational researchを行う。今年度は、FN電気刺激によるUCP-4の発現を証明し、UCP-4の発現が虚血耐性獲得の原因であることを検証するために、光学的イメージング設備の準備と生体内イメージング法の確立、ウエスタンブロットによるUCP-4の蛋白レベルでの発現確認、SiRNAによるUCP-4発現の抑制実験の準備を行う。【成果】1.光学的イメージング設備の準備と生体内イメージング法の確立:工業用顕微鏡のAxiotech Vario FL(Zeiss)を購入し、生体内イメージングに適用できるよう改良を加えた(光量子医学研究センターに設置)。UCP-4は活性酸素の発生と強く関連するので、脳内に発生する活性酸素の蛍光イメージングの手法を確立した。また、対象とするラット脳梗塞モデルについては、SD、Wistar、SHRの3種のラットでMCA閉塞を行い、標準偏差が小さく一定の梗塞巣ができるSHRを採用することにした。2.ウエスタンブロットによるUCP-4の蛋白レベルでの発現確認:UCP4(N-16):sc-17582を購入し、摘出脳および培養細胞でウエスタンブロットを行ったが、非特異的なバンドが得られ検出法としては不十分であった。適切な抗体の入手がカギであり、入手可能のものを選定し検討中である。3. SiRNAによるUCP-4発現の抑制実験の準備:上記に記載したように、適切な抗体の選定ができていないので、この点に関しては今年度内に進めることができなかった。【研究目的】ラット小脳室頂核(FN)の電気刺激(1h)を中大脳動脈(MCA)閉塞後に行うとcontrolに比べて脳梗塞が縮小する。今年度は、FN電気刺激でUCP-4が刺激に依存して発現しているか否かを明らかにし、UCP-4の発現が虚血耐性獲得の原因であることを検証するために、ウエスタンブロットによるUCP-4の蛋白レベルでの発現確認、SiRNAによるUCP-4発現の抑制実験を行うことを目標とした。【今年度の成果】1)MCA閉塞を行いFN電気刺激の効果を確認:SD、Wistar、SHRの3種のラットいずれでも虚血耐性を獲得するが、標準偏差が小さく一定の梗塞巣ができるSHRでの評価において、1h-FN電気刺激後72時間で中大脳動脈閉塞を行い、24時間後にニッスル染色によって計測した梗塞巣は、非電気刺激群に比べて約30%縮小し、虚血耐性を獲得することを我々の実験系で確認した。2)1h-FN電気刺激後72時間でUCP-4発現を蛋白レベルとmRNAレベルで確認:UCP-4のmRNAはFN電気刺激により上昇、虚血(中大脳動脈閉塞)側の大脳半球でも上昇していた。UCP-4は蛋白レベルでも上昇していたが、一部再現性の問題で再検の必要性がありと思われた。3)SiRNAによるUCP-4発現の抑制実験を開始:SiRNA作成に着手した。また、ラットの左側脳室内に留置カテーテルを設置し、plasmid DNA(DsRed-Mito)を注入し48時間後に左右の大脳に蛍光蛋白がdiffuseに発現させうることを確認した。この手技によりSiRNAを投与し平成22年度に行う予定。平成20・21年度に得られた当該研究に関する知見は:(1)小脳室頂核(FN)電気刺激(1h)72h後にMCA永久閉塞を行い、閉塞後24h後にNissl染色で計測した脳梗塞は、sham刺激群:190.57±5.12mm^2 vs FN刺激群:150.30±11.13mm^2と有意(p=0.000634)にFN群で梗塞巣は小さい(神経保護効果が見られる);(2)UCP-4は、FN電気刺激後72h(神経保護効果が最大の時期)に脳内発現が蛋白レベルとmRNAレベルで増加している;である。平成22年度は上記の知見を基に、仮説

1「FN電気刺激によりミトコンドリアKATP-channelが開き活性酸素が発生し、その結果UCP-4が発現、それにより虚血耐性を獲得する」と、仮説2「より臨床応用可能な方法であり同様に一種のdiving responseを引き起こす三叉神経第一枝の電気刺激は、同様のメカニズムをもたらし神経保護的に働く」を検証することを目的とした。【結果】(1) FN電気刺激後72hで作製したラット脳スライスでは、chemical hypoxiaに対するミトコンドリアの膜電位(蛍光色素で評価)は有意に変化しにくい→FN電気刺激によりミトコンドリアの機能が強化(3) UCP-4に対するSiRNAを脳室内投与することにより、FN電気刺激によるUCP-4の発現が抑制(knock down)され、虚血耐性が消去(詳細は解析・検討中)される。以上より、仮設1が正しいことが検証できた。なお、仮設2の検証に関しては、発現ベクターのデザインの有効性が決定できず、個体レベルでのUCP-4発現の観察のためのtransgenic rat作製がでなかった。そのため今年度は実施できなかったので、今後検討すべき研究課題とした。
河川環境保全の視点で捉えた付着藻が魚の生態に与える影響の定量評価スキームの作成と応用

15年度は、付着藻類と魚の関係を定量的に評価するためのモデル開発をも意識して、付着藻類が生育する環境条件、およびそれぞれ異なった藻類生育密度に対して捕食性魚(インディアンカープ)3種の成長がどのように変化するかを調べるための屋外実験を実施し、その結果をまとめた。付着藻類の生育条件として、(i)レファレンスとして実験池内になにもベースを設けない場合、(ii)実験池面積の半分に相当する表面積のベース(竹)を設置した場合、(iii)そのベースの表面積75%を占める場合、および(iv)ベース表面積が実験池面積に等しい場合、を比較対象とした。水温は17°Cから28°Cであり、セッキ水深やアンモニア濃度は(i)のレファレンスの条件が最も高く記録された。(ii)から(iv)のすべてのケースにおいて、溶存酸素濃度の平均値は5mg/lを下回ることはなく、魚の生息条件として限界値に達することはなかった。付着藻類の乾燥重量の値は(ii)のケースがより低く、付着藻類マットからは32種類が同定され、動物プランクトンも10種類認められた。捕食性魚の成長には付着藻類の存在が大きく寄与しており、付着藻類の生育密度が高いほど成長が良くなる傾向にあった。両者の関係には明確な比例関係が見出された(R^2=0.93)。付着藻類のベース面積が池の表面積の50%、75%、および100%と増加するにつれて、魚の生産もレファレンスと比較すると114%、168%、および209%増となった。以上、付着藻類の生息面積の増加は魚の生産力増強に役に立ち、定量的に評価することができた。
レトロマーを標的としたパーキンソン病治療戦略

初年度の研究期間中に以下の研究を行った。1)健常群,疾患群として,健常由来iPS細胞およびPARK17患者由来iPS細胞からそれぞれ2症例,計3lineよりCiRAの標準的なプロトコルを用いてドパミンニューロンを分化誘導した.培養皿に展開し約14日間培養後に固定,免疫染色しニューロンマーカーMAP2陽性細胞におけるドパミンニューロンマーカーTH陽性率を測定したところ,疾患群で優位にドパミンニューロンの陽性率は低下していた.疾患群では優位にアポトーシスが誘導されているのではないかと想定し,アポトーシスのマーカーcleaved caspase-3(以下CC3)陽性率を測定したところ,疾患群で優位にCC3陽性ドパミンニューロンの%は上昇していた.このことから疾患群のドパミンニューロンではアポトーシスが誘導されやすい傾向にあると明らかになった.2)レトロマーはエンドソーム上でRab5やRab7と共に働き小胞を分離する役割を担うことが明らかになっている(Abubakar 2017).エンドソームに関わる各種細胞内小器官のうちlate endosomeのマーカーであるRab7aのライブイメージングをiPS細胞由来ニューロン(以下iNeuron)で行った.iNeuron上でRab7a-RFPを発現させ1分間観察したところ,neurite上をRab7aの小胞が細胞体から両方向に移動する様子が観察され,疾患iNeuronでは健常群に比しRab7aの最高および平均移動速度が低下していた.上記結果よりPARK17患者由来iNeuronではドパミンニューロンの脆弱性を裏付ける結果が示された.またVPS35遺伝子変異によりレトロマーの機能障害が生じ,エンドソームリソソーム系の機能に影響を及ぼしている可能性が示唆される.疾患および健常iPS細胞由来ドパミンニューロンも安定して分化誘導,培養できる手法を獲得し,アポトーシスの評価,細胞内小器官のライブイメージングなどを順調に実施できている.iPS細胞の各lineの神経分化誘導に時間がかかるためにひとつひとつの実験に時間を要しているが,概ね順調に進展しておりこのまま当初の研究計画を残りの年次で進める.今後は引き続き以下の研究計画を実施する予定である.1)疾患および健常iPS細胞から分化誘導したドパミンニューロンを用い,エンドソームリソソーム系の機能評価として各種細胞内小器官マーカーを用いたライブイメージングを継続して行い,レトロマーの機能評価やエンドソーム系への影響について病態評価してゆく.2)疾患由来iNeuronでパーキンソン病の病因タンパク質であるαシヌクレインおよびリン酸化αシヌクレインの蓄積が亢進しているか,免疫染色やWestern blottingで評価する.最終的にはレトロマー機能障害モデルにおけるαシヌクレイン凝集過程の調査を目標としており,疾患群ニューロンで細胞内にαシヌクレイン凝集が亢進しているか,可能な限りライブイメージングの系で可視化しその過程も調査する.観察に至適なαシヌクレインプローブを作成し,HeLa細胞を用いてライブイメージングに適したプローブの種類,培養および観察条件を選定する.条件選定後に健常,疾患,両群由来iNeuronを培養し,αシヌクレインの凝集過程をイメージングする.3)上記2)の研究計画で疾患群においてドパミンニューロン内のαシヌクレイン凝集亢進が示唆される結果が得られた場合には,パーキンソン病の治療戦略として疾患群においてレトロマー機能を安定化させるin vitroの実験系を選定し,疾患群での異常が是正されるか検証する.レトロマー安定化の方法として正常VPS35(WT)強制発現や,遺伝子変異改変等の手法を候補とし最適な実験系を選定する.初年度の研究期間中に以下の研究を行った。1)健常群,疾患群として,健常由来iPS細胞およびPARK17患者由来iPS細胞からそれぞれ2症例,計3lineよりCiRAの標準的なプロトコルを用いてドパミンニューロンを分化誘導した.培養皿に展開し約14日間培養後に固定,免疫染色しニューロンマーカーMAP2陽性細胞におけるドパミンニューロンマーカーTH陽性率を測定したところ,疾患群で優位にドパミンニューロンの陽性率は低下していた.疾患群では優位にアポトーシスが誘導されているのではないかと想定し,アポトーシスのマーカーcleaved caspase-3(以下CC3)陽性率を測定したところ,疾患群で優位にCC3陽性ドパミンニューロンの%は上昇していた.このことから疾患群のドパミンニューロンではアポトーシスが誘導されやすい傾向にあると明らかになった.2)レトロマーはエンドソーム上でRab5やRab7と共に働き小胞を分離する役割を担うことが明らかになっている(Abubakar 2017).エンドソームに関わる各種細胞内小器官のうちlate endosomeのマーカーであるRab7aのライブイメージングをiPS細胞由来ニューロン(以下iNeuron)で行った.

iNeuron上でRab7a-RFPを発現させ1分間観察したところ,neurite上をRab7aの小胞が細胞体から両方向に移動する様子が観察され,疾患iNeuronでは健常群に比しRab7aの最高および平均移動速度が低下していた.上記結果よりPARK17患者由来iNeuronではドパミンニューロンの脆弱性を裏付ける結果が示された.またVPS35遺伝子変異によりレトロマーの機能障害が生じ,エンドソームリソソーム系の機能に影響を及ぼしている可能性が示唆される.疾患および健常iPS細胞由来ドパミンニューロンも安定して分化誘導,培養できる手法を獲得し,アポトーシスの評価,細胞内小器官のライブイメージングなどを順調に実施できている.iPS細胞の各lineの神経分化誘導に時間がかかるためにひとつひとつの実験に時間を要しているが,概ね順調に進展しておりこのまま当初の研究計画を残りの年次で進める.今後は引き続き以下の研究計画を実施する予定である.1)疾患および健常iPS細胞から分化誘導したドパミンニューロンを用い,エンドソームリソソーム系の機能評価として各種細胞内小器官マーカーを用いたライブイメージングを継続して行い,レトロマーの機能評価やエンドソーム系への影響について病態評価してゆく.2)疾患由来iNeuronでパーキンソン病の病因タンパク質であるαシヌクレインおよびリン酸化αシヌクレインの蓄積が亢進しているか,免疫染色やWestern blottingで評価する.最終的にはレトロマー機能障害モデルにおけるαシヌクレイン凝集過程の調査を目標としており,疾患群ニューロンで細胞内にαシヌクレイン凝集が亢進しているか,可能な限りライブイメージングの系で可視化しその過程も調査する.観察に至適なαシヌクレインプローブを作成し,HeLa細胞を用いてライブイメージングに適したプローブの種類,培養および観察条件を選定する.条件選定後に健常,疾患,両群由来iNeuronを培養し,αシヌクレインの凝集過程をイメージングする.3)上記2)の研究計画で疾患群においてドパミンニューロン内のαシヌクレイン凝集亢進が示唆される結果が得られた場合には,パーキンソン病の治療戦略として疾患群においてレトロマー機能を安定化させるin vitroの実験系を選定し,疾患群での異常が是正されるか検証する.レトロマー安定化の方法として正常VPS35(WT)強制発現や,遺伝子変異改変等の手法を候補とし最適な実験系を選定する.初年度に産前産後および育児休暇を計8ヶ月取得したため,研究計画がずれており,その分次年度使用が生じている.当初の予定どおりの研究計画を今後も進め,主に培養試薬や抗体などの物品費に使用する予定である.
細胞培養により作製したハイブリッド人工血管の組織構造に及ぼす液体力学的因子の影響

自家静脈や人工血管を用いて閉塞した血管の血行再建を行う場合には,血栓形成や内膜肥厚により再閉塞が起こるという問題がある.この問題は,特に小口径の血管において深刻であり,そのため,臨床的には内径6mm以下の人工血管は使用されていないのが現状である.本研究ではこの問題を解決するために,まず,内径3mmの水透過性人工血管に血管平滑筋細胞および内皮細胞を懸濁液として直接圧注播種・共培養することにより抗血栓性の小口径ハイブリッドグラフトを作製する技術を開発・完成した.続いて,これを用いて体外循環培養実験を行い,細胞層の組織構造および厚さに及ぼす物理的・流体力学的諸因子の影響について検討することにより内膜肥厚の発症機序を解明することを目指した.その結果,血管壁の水透過性に起因する一種のろ過作用により,内皮細胞表面におけるLDLの濃度(壁面濃度)が流速の増減により変化し,流速が小さいほど高く,そして細胞層に取り込まれるLDLの量も多く,細胞層が厚くなることが判った,局所的に渦が存在する場合には,流れが遅い(壁せんだん応力の値が0 dyne/cm^2)淀み点および渦の最先端にあたる再付着点で厚くなることが判った.また,細胞層へのヒト単核細胞(THP-1細胞)およびLDLのモデルとして用いたポリスチレン微粒子の付着および浸潤も,流れが遅い淀み点および再付着点で最も多く,流れが速い渦の中心部近傍で最も少ないことが判った.これらの結果より,流れが遅い領域でLDLや単核細胞が内皮細胞と長時間接触することにより内皮細胞へのこれらの物質の取り込みが促進され,平滑筋細胞の増殖および細胞外結合組織の産生が起こるために内膜肥厚が局所的に発症することが示唆された.本研究で開発したハイブリッド人工血管は,今後,生体血管の代用として,大いに活用が期待される.自家静脈や人工血管を用いて閉塞した血管の血行再建を行う場合には,血栓形成や内膜肥厚により再閉塞が起こるという問題がある.この問題は,特に小口径の血管において深刻であり,そのため,臨床的には内径6mm以下の人工血管は使用されていないのが現状である.本研究ではこの問題を解決するために,まず,内径3mmの水透過性人工血管に血管平滑筋細胞および内皮細胞を懸濁液として直接圧注播種・共培養することにより抗血栓性の小口径ハイブリッドグラフトを作製する技術を開発・完成した.続いて,これを用いて体外循環培養実験を行い,細胞層の組織構造および厚さに及ぼす物理的・流体力学的諸因子の影響について検討することにより内膜肥厚の発症機序を解明することを目指した.その結果,血管壁の水透過性に起因する一種のろ過作用により,内皮細胞表面におけるLDLの濃度(壁面濃度)が流速の増減により変化し,流速が小さいほど高く,そして細胞層に取り込まれるLDLの量も多く,細胞層が厚くなることが判った,局所的に渦が存在する場合には,流れが遅い(壁せんだん応力の値が0 dyne/cm^2)淀み点および渦の最先端にあたる再付着点で厚くなることが判った.また,細胞層へのヒト単核細胞(THP-1細胞)およびLDLのモデルとして用いたポリスチレン微粒子の付着および浸潤も,流れが遅い淀み点および再付着点で最も多く,流れが速い渦の中心部近傍で最も少ないことが判った.これらの結果より,流れが遅い領域でLDLや単核細胞が内皮細胞と長時間接触することにより内皮細胞へのこれらの物質の取り込みが促進され,平滑筋細胞の増殖および細胞外結合組織の産生が起こるために内膜肥厚が局所的に発症することが示唆された.本研究で開発したハイブリッド人工血管は,今後,生体血管の代用として,大いに活用が期待される.本研究の目的は、人工血管の移植後の遠隔期に起こる閉塞の原因となる内膜肥厚を阻止し、長期にわたり開存しうる人工血管を作成するための最適条件を見出すことである。そこで、先ず初めに多孔質膜上にウシ大動脈由来平滑筋細胞および内皮細胞を重層播種共培養して血管壁のモデルを作製し、これを用いて流れのない条件下で動脈硬化や内膜肥厚を引き起こすコレステロールの担体である低密度リポ蛋白(LDL)の取り込み実験を行い、LDLの培養液中における濃度と血管壁モデルの細胞により取り込まれる量との間の関係について検討した。その結果、LDLの濃度が1から20%の範囲では、濃度が高いほど、その細胞層内に取り込まれる量も多く、また、時間の経過と共にその量が増大する事が判った。続いて、市販のePTFEグラフトに同上の二種類の血管細胞を直接重層播種共培養することにより、移植された人工血管に形成される疑内膜と同様の壁構造を持ったハイブリッド人工血管を作成し、これを静置培養および循環灌流システムに組み込み、種々の血清濃度、流速(壁ずり応力)および管壁における水透過速度の条件下で培養し、細胞層(ほとんどが平滑筋細胞から成っている)の組織構造、細胞数、および厚みに及ぼすこれらの諸因子の影響について検討を行った。その結果、静置培養した場合のハイブリッド人工血管の細胞層は、培養日数の増大と共に肥厚し、血清濃度が1から20%の範囲では、濃度が高いほどその肥厚の程度が大きいことが判った。

また、流速(壁ずり応力)および管壁における水透過速度の影響に関しては、これまで行った予備実験からは流れが遅いほど、そして水透過速度が大きいほど細胞層が厚く、細胞数も多くなるという結果が得られているが、これらに関しては、さらに実験を重ねて確認する予定である。本研究の目的は、人工血管の移植後の遠隔期に起こる閉塞の原因となる内膜肥厚を阻止し、長期にわたり開存しうる人工血管を作成するための最適条件を見出すことである。そこで、前年度の研究において独自に開発した組織工学的方法を用いて市販のePTFEグラフトにウシ大動脈由来平滑筋細胞および内皮細胞を直接重層播種共培養することにより、移植された人工血管に形成される疑内膜と同様の壁構造を持ったハイブリッド人工血管を作成し、これを静置培養および循環灌流システムに組み込み、細胞層(ほとんどが平滑筋細胞から成っている)の組織構造および厚みに及ぼす静水圧、流速(壁ずり応力)および管壁における水透過速度の影響について検討を行った。まず、最初に、内膜肥厚や動脈硬化が血圧の高い人に起こりやすいことから、血圧の影響について調べるために、ハイブリッド人工血管を作製する際にヘッドタンクシステムを用いて水透過が無い(濃縮現象が起こらない)条件下で0,80,100,120,140mmHgの5つの異なった静水圧(生体血管における血圧に相当する)を負荷して7日間培養した。その結果、圧力が高いほど細胞層が厚くなるが、140mmHg以上高くなると逆に薄くなるという事が判った。また、この実験から、細胞層が厚いほどコラーゲンも多く産生されていることが判った。次に、流速(壁ずり応力)および管壁における水透過の影響に関して検討するために、ハイブリッド人工血管の内腔面を一層になって覆っているところの内皮細胞に負荷されるせん断応力の値が2,14,30dynes/cm^2となるような3つの流れの条件下で生理的な範囲の水透過がある場合および無い場合について、28日間培養を行った。その結果、我々が提唱している理論的仮説より予測された通りに、流れが遅いほど、そして水透過がある場合の方が、細胞層が有意に厚くなることが判った。(1)市販の内径3.0mmのePTFEグラフトにウシ大動脈由来平滑筋細胞および内皮細胞を重層播種共培養することにより作成したハイブリッド人工血管を用いて0.92mmから3.00mmへの急激な拡大管を形成し、これを循環灌流システムに組み込み細胞培養液を定常流で1週間循環還流して培養し、細胞増殖に及ぼす渦流れの影響について検討した。その結果、細胞増殖の指針であるところの細胞層の厚さは、流れが遅く壁せん断応力が小さい拡大管入口近傍の淀み点および環状渦の最先端にあたる再付着点近傍で最も厚くなっていることがわかった。この結果は、動脈硬化や内膜肥厚が流れが遅く壁せん断応力の小さい領域に起こりやすいという臨床学的データと一致するものである。(2)イヌの総頚動脈に内径3mmで、水透過速度が大きく異なる3種類の人工血管、即ち、組織固定して作製したイヌの総頚動脈(GAグラフト)、市販のePTFEグラフト、自作のポリエステル布製グラフト(PEグラフト)を端端吻合により間置移植し、それらを1週から1年後に採取し、管壁における水透過速度の測定、走査電顕による内表面の観察、および細胞層の厚さの測定を行った。その結果、GAグラフトの内面は、12ヶ月後でもフィブリン膜で覆われており、内皮細胞は全く見られなかった。ePTFEグラフトに関しては、6ヶ月後ではフィブリン膜の部分と内皮細胞で覆われている部分が混在していたが、13ヶ月では全面が不規則な形状をした内皮細胞の単層で覆われていた。PEグラフトは、2ヵ月後でも整った形状の内皮細胞の単層で覆われていた。
ジストニアに対する脳深部刺激療法の至適刺激部位の検討:脳深部神経活動解析との比較

【緒言】ジストニアに対する脳深部刺激療法(DBS)の至適刺激部位と脳深部神経活動との比較をおこなうために、研究初年度は、術中に記録された淡蒼球ニューロン活動の分析をおこなった。【対象・方法】両側の淡蒼球内節刺激(GPi-DBS)を施行した突発性全身性ジストニア症例を対象として、術中に記録された淡蒼球ニューロンの自発発火瀕度、発火パターンを分析した。【結果および総括】今年度の研究により以下の結果が得られた。1、GPiニューロンの自発発火は低頻度であった。2、発火パターン分析ではpausingを多く示す。3、罹患筋に対する受容野が拡大している初見をとらえた。こうしたジストニアの淡蒼球ニューロン活動の特徴を基底核回路のモデルにあてはめてジストニアの病態を考えてみる。1、発火頻度の低下:ジストニアのGPiニューロンの自発発火頻度は低下している。しかしGPiの凝固によってジストニアがある程度軽減することが知られている。このことはGPiの自発発火頻度の低下、すなわちGPiの活動が低下していることと一致しない。つまり、GPiの発火頻度低下のみではジストニアの病態を説明できない。2、pausingパターン:pausingを示す傾向が高い。こうしたpausingパターンが視床-皮質間の信号伝達を障害し、皮質の活動の時間的な混乱が生じることで運動制御が傷害され、その結果ジストニアが出現するのではないかと推測される。3、感覚受容野の変化:淡蒼球内での罹患筋に対する受容野の変化は、発火パターンによる「時間的」異常のみならず、基底核-視床-皮質間の信号伝達の「空間的」変化が、ジストニアの病態には重要な役割を果たしていることを示唆している。今後、こうしたニューロン活動の分析結果を更に集積するとともに、至適刺激部位との比較、検討をおこなっていく予定である。
電子スピン制御能を有する電子輸送型アモルファス分子材料の開発と薄膜デバイス応用

電子輸送性アモルファス有機薄膜中での電子スピン状態を制御するため,tert-ブチルニトロキシドラジカルを2,4,6-tri-phenyl-1,3,5-triazineにm-phenylene連結型に導入した新規安定有機ラジカル導入型電子輸送性分子群を合成開発した.CVと溶液CW-ESRスペクトルの同時測定(電解ESR法)により,triazine上のアニオンラジカルと局在電子スピンであるニトロキシドラジカル間に強磁性的な交換相互作用(J > 0)が働くことを確認した.また,スピンコート法による基板上への塗布薄膜の作製を行い,得られた薄膜がアモルファス性を保持することを確認した.本年度は,研究計画に示した安定有機ラジカル種を置換基として導入した電子輸送型アモルファス分子材料の合成を行った.電子輸送性アモルファス薄膜内のホッピング伝導電子のスピン状態を制御する手法として,電子アクセプター分子ユニットに安定有機ラジカルを導入し,アクセプターユニット間をホッピングする伝導電子と有機ラジカルの局在電子との間に働く電子-電子間交換相互作用を利用する.具体的には,強い電子親和性を有する電子アクセプター分子に安定有機ラジカルであるtert-ブチルニトロキシド(t-BuNO●)をm-phenylene型連結の形で導入した.電子アクセプター分子には強い電子親和性を有し,電子輸送性材料として実績のあるトリフェニルトリアジンを用いた.3つのフェニル基にt-BuNO●をm-phenylene連結型に導入した安定ラジカル導入型電子輸送性分子を合成した.また,薄膜形成後のアモルファス性(ガラス状態)を維持するために,フェニル基に種々の嵩高い置換基を導入することで分子の凝集を抑制し,ガラス転移温度が高くなるように分子骨格をチューニングした.電解還元によりアクセプターユニットであるトリアジン上に生成するラジカルアニオン(TRZ●ー)とt-BuNO●間に働く交換相互作用を実験的に検証するために,サイクリックボルタンメトリー(CV)と電子スピン共鳴法(ESR: Electron Spin Resonance)のin-situ測定(電解ESR法)を行った.CV測定によって合成サンプルの電解還元波を検出し,トリアジン上に生成するラジカルアニオンTRZ●ーの安定性とt-BuNO●との電子間交換相互作用に与える影響を調べた.また,電解ESRスペクトルの測定結果のスペクトルシミュレーションより,TRZ●ーとt-BuNO●との間に働く電子間交換相互作用(J)を現在,解析中である.本研究課題の要となるスピン偏極電子を創製するための分子材料の合成開発を行った.電子スピン状態の制御手法として,強い電子親和性を有する電子アクセプター分子に安定有機ラジカルであるtert-ブチルニトロキシド(t-BuNOラジカル)を導入し,ホッピング伝導電子と有機ラジカルの局在電子との間に働く強磁性的交換相互作用を利用する.具体的には,電子輸送性材料として実績のある2,4,6-tri-phenyl-1,3,5-triazineにt-BuNOラジカルをm-phenylene連結の形で導入した.磁気的相互作用の増強として,3つのフェニル基にC3構造対称となる様にt-BuNOラジカルを導入した安定ラジカル導入型電子輸送性分子を合成した.また,薄膜形成後のアモルファス性を保持するために,フェニル基に種々の嵩高い置換基を導入することで分子の凝集を抑制し,ガラス転移温度が高くなるように分子骨格をチューニングした.電解還元によりtriazine上に生成するアニオンラジカル(TRZアニオンラジカル)とt-BuNOラジカル間に働く交換相互作用を実験的に検証するために,サイクリックボルタンメトリー(CV)および溶液CW-ESRスペクトルの測定を行った.CV測定により化合物の電解還元波を検出し,TRZアニオンラジカルの安定性を確認した.更に,CVとCW-ESRの同時測定(電解ESR法)を行った.スペクトルシミュレーションの結果より,TRZアニオンラジカルとt-BuNOラジカルの間に期待通りの強磁性的交換相互作用が働くことを確認した.続いて,塗布方式による基板上へのアモルファス薄膜の作製を行った.具体的には,スピンコート装置を用いて化合物の溶液を基板上に塗布した.成膜後の薄膜状態とアモルファス性の評価は,原子間力顕微鏡による表面観察やX-ray回折法などにより行った.種々の測定結果より,作製した薄膜がアモルファス性を保持していることを確認した.電子輸送性アモルファス有機薄膜中での電子スピン状態を制御するため,tert-ブチルニトロキシドラジカルを2,4,6-tri-phenyl-1,3,5-triazineにm-phenylene連結型に導入した新規安定有機ラジカル導入型電子輸送性分子群を合成開発した.CVと溶液CW-ESRスペクトルの同時測定(電解ESR法)により,triazine上のアニオンラジカルと局在電子スピンであるニトロキシドラジカル間に強磁性的な交換相互作用(J > 0)が働くことを確認した.また,スピンコート法による基板上への塗布薄膜の作製を行い,得られた薄膜がアモルファス性を保持することを確認した.本研究の要となる安定ラジカル導入型電子輸送性分子とその類縁体の合成は行えたが,測定環境の不備(当初,研究実施を予定していた研究機関からの異動による)により各種特性評価(DSCやXRDによる薄膜解析や電解ESR測定)の進捗が遅れているのが実状である.電子スピン制御能の評価は,本研究にとって非常に重要な課題であり,早急に進める必要がある.機能材料

化学今後の推進方策として,速やかにESRスペクトルの解析を進めてt-BuNO●とTRZ●ー間の電子-電子間交換相互作用Jを見積り,合成開発した安定ラジカル導入型電子輸送性分子の電子スピン制御能を明らかにする.また,スピンコート法によるアモルファス薄膜の作製とDSCやXRDなどによる薄膜評価を進める.さらに,真空蒸着装置を用いた薄膜積層型デバイスの作製を試み,スピントロニクス機能(スピン偏極電子の生成や磁気抵抗効果)の発現を外部研究機関研究者の協力を得て検証する.本研究計画は1材料合成と2デバイス作製・特性評価の2部から構成される.本年度は,材料合成とその基礎特性評価に関して研究を実施した.そのため,本年度の支出額は研究助成金全体の半分以下に留まった.次年度は,デバイス作製・特性評価を予定しており,高額な備品などの購入を予定している.必要に応じて,外部研究機関への出張も予定しており,当初の予定通りに予算執行を行っている.本年度に引き続き,デバイス作製・特性評価に必要となる材料の合成を行うため,合成試薬・薬品の購入を行う.基礎特性評価において,所属研究機関外での実験を予定しているため,その際の出張費も予定している.次年度は,デバイス作製・特性評価を予定しており,高額な備品(パターンITO基板や蒸着用分子材料)などの購入を予定している.デバイス特性評価において,必要に応じて,外部研究機関への出張も予定している.また,次年度は本研究の最終年度となるため,学術論文執筆の際の英文校正費や国内外での学会発表のための出張費も予定している.
多元的医療行動の民族誌的記述とその活用に関する実証的・理論的研究

2年間の調査期間中、アフリカ各地における多元的医療状況とコミュニティーヘルスの関係に関する具体的資料を手に入れることができた。対象地域では数多くの保健プログラムが導入されているが、とりわけ村落部において土着の「医療」的知識と観念が人々の生活と深く結びついていることが改めて確認された。多元的医療状況においては近代医学も選択肢のひとつに過ぎず、保健介入において多元的医療状況の質的把握は不可欠である。平成24年度には2名の研究協力者をアフリカに派遣した。和田直美(長崎大学)は本プロジェクトの一環として西アフリカのブルキナファソに渡航し、マラリア治療希求における医療多元性の調査を行い、修士論文を執筆した。また上村知春(長崎大学)と増田は、エチオピア・アムハラ州における伝統的医療と住民の多元的医療行動、とりわけ聖水の利用に関する追調査を行った。ブルキナファソ中西部ナノロ近郊では、マラリアワクチンのプロジェクトによる介入の有無、都市部からのアクセスなどの基準により、住民の治療希求行動が対照的な2村を選択して世帯調査ならびにインデプスインタビューを実施した。発熱時の医療機関への受診はヘルスポストの有無やアクセスによって大きく左右されることが判明したが、より重要なのはマラリアの重症度に応じて住民の医療行動が変化することである。本調査の結果によれば、医療側による軽症マラリア/重症マラリアの区分が住民によって流用され、住民が重症と判断した発熱疾患については医療機関への治療希求を選択しないばかりか、その病因論として呪術が説明原理として参照されることが判明した。エチオピア・アムハラ州においては、前年度に実施した民俗的病いと伝統治療に関する調査の追調査を実施した。西ゴッジャムの農村部において、特定の父系出自集団において実践されてきた儀礼「ヤベット・リゲッド」が実施されなくなったプロセスにおいて、近郊の教会であるテケステ教会とその聖水の出現が契機となったことはすでに明らかとなっていたが、それが1990年代末という比較的近年の出来事であることを突き止め、伝統医療の衰退が近年になって急速に進んだことが明らかとなった。このことはまた、エチオピアにおける保健プロジェクトとそれによる啓発活動の浸透、さらには行政による「有害な伝統的慣習の禁止」政策の進展と期を一にしている。平成26年度は当初の計画通り成果報告を行った。増田は日本国際保健医療学会において「多元的医療状況に対する民族誌的アプローチ:長崎大学国際健康開発研究科における医療人類学的調査の取り組みから」と題する報告をおこない、また波佐間は『アフリカ研究』に原著論文を発表した。本研究の成果は、以下の5点に要約される。(1)住民の医療知識と行動が多元的であるということを、個々の住民の医療行動の把握を通してモデル化することができる。たとえばKleinmanが示した3セクターモデルを援用することで、治療希求行動の多様性と地域特性を容易に理解できるようになるだろう。(2)住民の健康知識を、より広い文化的脈絡のなかで理解することができる。とりわけ現地の宗教や信仰は医療行動に対して強い影響力を持っており、こうしたコスモロジーの理解に民族誌は向いている。(3)保健医療施設へのアクセスが改善されていない場所(とりわけ農村部)においては、自家治療、自己投薬、様子見、自宅分娩、伝統的治療師の訪問といった行動が、第一治療希求となる。そのため医療セクターへのアプローチは遅れ、民間セクターの影響力が強くなる。医療セクターとは異なる次元における行動を民族誌的に捉えていく必要がある。(4)民族誌における質的アプローチは多くのサンプル数を稼げないかわりに、豊富な変数を拾い上げることを可能にする。そうした変数の多くは医学的な語り口には出現しないたぐいのものである。(5)民族誌的アプローチによって得られた知見は、適切な量的研究によって補完されることが望ましい。平成23年度の主な活動は文献調査および研究協力者のアフリカ派遣である。代表者の増田は主として文献調査を行い、文化人類学的な国際保健へのアプローチと量的研究アプローチの融合による多元的医療行動の把握について、理論的検討を行った。その成果の一部は公衆衛生分野の学術誌に掲載される予定である。また東京外国語大学において「人類学と公衆衛生」と題する国際集会を開催し、同分野における研究動向の最先端に関する理解を深めた。研究分担者の宮地は、ケニアにおいて長崎大学が実施している人口動態調査(HDSS)の成果と人類学的知見を組み合わせる試みを行っている。とりわけ妊産婦の出産行動に見られる多元的医療状況の把握に努めた。また研究協力者として長谷直美がブルキナファソに渡航し、マラリア(よおび熱病)罹患時の住民の治療希求行動の詳細を調査している。この調査はH24年度にかけて継続される。本研究課題では、当初エチオピアとケニアにおいて調査を実施する予定であったが、コミュニティーヘルスと伝統医療の関連において多元的医療状況を観察するという目的のために、ケニアからブルキナファソへと調査対象地を変更した。そのため東アフリカの2国の比較ではなく、東アフリカと西アフリカの特定地域を比較することに軌道修正を行った。

本研究課題の中心的なテーマである、多元的医療状況とコミュニティーヘルスとの関連については平成24年度の調査を持って一応の成果を見たと考えている。最終年度である平成25年度はその成果の公開を行う。本研究課題はフィールドワークによる実証的検討と、文献調査を通した理論的検討によって遂行されるよう計画されているが、平成23年度は理論的な枠組みとアプローチに関する理論的検討が主たる作業となった。研究代表者と分担者はすでに収集されているデータの分析をしながら、多元的医療行動に関する文献との照らし合わせによって、その分析枠組みを整理する作業を行った。多元的医療行動に関しては主として文化人類学・医療人類学的アプローチによる成果が多数見られるものの、国際保健や公衆衛生といった分野において、文化的・社会的要因に重きを置いた分析はきわめて少ない。こうしたディシプリン間の断絶を明確に確認し、文化人類学的および民族誌的アプローチの導入の手法について具体的な検討を加えることが出来た点は意義深い。代表者である増田はH23年度に計画されていたフィールドワークを次年度に行うこととし、その計画について慎重に検討を加えた。また西アフリカにおける多元的医療状況の把握を目的とし、研究協力者(長谷直美)をブルキナファソに派遣することができた。すでに検討されている調査手法および分析枠組みを適用することを目論んでおり、その成果が期待される。本研究課題において計画された調査はすでに終わっており、最終年度である平成25年度はその成果公開を行う予定である。成果は日本ナイル・エチオピア学会の学術誌であるNilo-EthiopianStudiesに投稿するほか、日本アフリカ学会の『アフリカ研究』への投稿も計画している。H24年度には、分担者を宮地から波佐間逸博に交代する。これは宮地の退職による措置であるが、研究課題とこれまでの成果はそのまま波佐間に引き継がれる。波佐間はウガンダ東部において牧畜民カリモジョンの生態調査に従事しており、当地における開発プログラムKIDDPによる現地の開発プログラムの実施について、その検討を行う予定である。増田はエチオピアにおける保健普及員の活動と住民への啓発に関する調査を実施する。またブルキナファソにおいてマラリア治療希求行動の調査を行っている研究協力者はその成果を論文として執筆し公開する。平成25年度は成果公開およびその準備のために研究費を使用する。具体的には参照資料や文献の収集ならびに校閲に用いる。H24年度の主たる経費支出は旅費である。本研究課題における一方の重要な軸である実証的作業を行うため、エチオピアおよびウガンダにおける現地調査、およびそのデータの分析のために経費を支出する予定である。
ヒト型糖鎖を持つ抗体生産を可能にする大腸菌宿主の開発

Campylobacter属細菌10種の糖鎖転移酵素PglBの一次構造、転移糖鎖構造の多様性、タンパク質三次構造に関する報告を元に、変異型pglBを設計し発現ベクターに挿入した。転移活性効率は低下した。大腸菌のペリプラズム画分にて抗体を可溶性かつ活性型で生産させるためペリプラズム移行シグナルPelBを付加したH鎖、L鎖をコードする遺伝子を持つ発現ベクターを構築した。H鎖は可溶性タンパク質画分としての生産性は低く、L鎖の発現そのものが低かった。PglBの代わりにDesulfovibrio菌由来DsPglを、Truncated型抗体を用いた転移活性評価へと計画変更し実験に着手した。1.Campylobacter由来糖鎖転移酵素CjPglBの変異操作と機能改良1)バクテリア、特に、Campylobacter属細菌10種の糖鎖転移酵素について、一次構造および転移する糖鎖構造の多様性について報告されている(Nothaft et al, 2012)。さらに、真核生物(ヒト・酵母)に由来する糖鎖転移酵素のうち、実質的糖鎖転移酵素サブユニットStt3の一次構造情報を加えて、比較検討した。C. jejuni由来糖鎖転移酵素CjPglBのタンパク質三次構造(Maita et al, 2011)などの情報を活用し、糖鎖転移部位認識に関連する部位と、ヒト型糖鎖認識に対する親和性に関連する部位を推定し、いつくかの重要なアミノ酸残基を改変対象として選抜した。2)糖鎖修飾検証用モデルタンパク質として、これまでC. jejuni由来CmeAタンパク質を用いてきた(Srichaisupakit, Ohashi, Fujiyama, 2014)。平成28年度はCmeAを糖鎖修飾検証用モデルタンパク質として用い、精製後、糖鎖付加を確認した。2.抗体など医療用モデルタンパク質の大腸菌ペリプラズム画分での生産系開発抗体を、大腸菌のペリプラズム画分にて可溶性かつ活性型で生産する技術が開発されている(Lee et al., 2014)。糖鎖付加もペリプラズム画分で行われると考え、抗体遺伝子にペリプラズム移行シグナルPelBを付加した発現ベクターを構築した。また、ペリプラズム画分でのフォールディングを促進させて、可溶性かつ活性型抗体の生産を促進するため、シャペロンDsbCを共発現させるベクターも構築している。大腸菌での生産の検証段階まで進んでいる。大腸菌でのタンパク質の生産誘導条件の検討に時間を要した。また、生産組換えモデルタンパク質のペリプラズムからの調製の効率化を検討したが、従来通りの方法が現在最良であることが判明し、その方法を用いることにした。1.Campylobacter由来糖鎖転移酵素CjPglBの変異操作と機能改良;Campylobacter属細菌10種の糖鎖転移酵素PglBの一次構造および転移する糖鎖構造の多様性に関する報告(Nothaft et al, 2012)およびC. jejuni由来CjPglBのタンパク質三次構造(Maita et al, 2011)情報を活用し、糖鎖転移部位認識関連部位と、ヒト型糖鎖認識に対する親和性関連部位を推定し、改変対象アミノ酸残基を選抜した。候補変異pglBを、他の修飾酵素遺伝子を持つベクターに挿入した。H28年度転移活性を確認した糖鎖修飾検証用モデルタンパク質C. jejuni由来CmeAタンパク質を用いて、変異酵素PglBの転移活性を確認したが、その転移効率は低下した。2.抗体など医療用モデルタンパク質の大腸菌ペリプラズム画分での生産系開発;抗体のH鎖、L鎖をコードする遺伝子を持つ発現ベクターを構築した。大腸菌のペリプラズム画分にて可溶性かつ活性型で生産させるためペリプラズム移行シグナルPelBを付加した。大腸菌でH鎖の発現を確認できたが、L鎖の発現は低かった。発現確認できたH鎖は可溶性タンパク質画分としての生産性は低かった。3. Desulfovibrio gigas由来糖転移酵素DsPglに関して発表論文(Ollis et al, 2015)を元に実験を計画を改変した。これまで、当該論文では、全長型H鎖、L鎖を大腸菌で発現させて糖転移活性を調査するのではなく、Truncated型抗体を用いて転移活性を評価していたので、本研究でもモデル抗体タンパク質を発現が期待できるTruncated型に変更した。また、DsPglは、抗体が本来糖鎖修飾され認識配列を、低効率ながら認識するためDsPglを用いることにした。両遺伝子を構築し、発現バクターを作成に着手した。可溶性かつ活性型抗体の生産を促進するため、シャペロンDsbCなどを共発現させるベクターも構築しているが、大腸菌を用いた抗体タンパク質の可溶性型での生産が順調に進むとDsbC共発現ベクターを適用する必要がない。