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転写補助因子Ncoa6のエストロゲン感受性調節を介した子宮体癌発症抑制機序の解明

我々は、山形大学医学部倫理委員会の承認の下、良性疾患にて摘出された子宮からヒト子宮内膜間質細胞(HESCs)の単離培養を行った。免疫化学染色によりHESCsでのNcoa6の発現を確認した後、siRNAを用いてNcoa6をknock down(KD)した。また、medroxyprogesteroneとcAMPを用いてin vitroで脱落膜化を誘導し、Ncoa6の発現の有無が脱落膜化に与える影響を検討した。その結果、脱落膜化刺激により、Ncoa6存在下では細胞形態が紡錘形から敷石状に変化するのに対し、Ncoa6 KD細胞では紡錘形の細胞形態が保たれたまま変化を認めなかった。他方、脱落膜化のマーカーとされるIGF-BP1とPRLのmRNA発現は、コントロールに対してNcoa6 KD細胞にて優位に増加しており、形態学的な結果とは相反する状態だった。それを説明するメカニズムの一端としてNcoa6 KDされたHESCsではエストロゲン受容体αのタンパク発現上昇とその下流のターゲット遺伝子であるFOXO1とWNT4のmRNA過剰発現を確認し、それによる生化学的なマーカー遺伝子の上昇を認めると考えた。また、mRNAseqを用いた網羅的解析でNcoa6 KDに伴い発現が低下する遺伝子群において、GO解析でactin bindingに関与する遺伝子群が豊富であること、また実際に、脱落膜化刺激に伴う細胞内のactin分布の変化がNcoa6 KDでは阻害されていることを明らかにし、このことがNcoa6 KDによる形態学的な脱落膜化阻害の原因であると考えた。以上の結果より、Ncoa6はヒト子宮内膜においても、その脱落膜化調節機序に重要な役割を果たすことを明らかにした。エストロゲンは核内受容体であるエストロゲン受容体(ER)に結合し、標的遺伝子の転写を介してその作用を発揮する。子宮内膜では、エストロゲンは内膜間質細胞のERを介し、子宮内膜上皮細胞の増殖を促進する。ERの転写活性は、更に転写補助因子により調節を受ける。我々は転写補助因子の一つNuclear receptor coactivator-6 (Ncoa6)に注目し、その子宮内における分子生物学的機能について検討を行ってきた。Ncoa6は培養細胞の研究ではERの転写活性を促進する因子と報告された。しかし、我々は、子宮内膜上皮および間質細胞のNcoa6発現を抑制したマウスを作成し、Ncoa6のマウス子宮における機能を解析したところ、子宮におけるNcoa6の機能喪失は逆にエストロゲンの感受性を増加させることを明らかにした。我々は、Ncoa6が、1)子宮内膜間質細胞のERのユビキチン化を介しERの過剰発現を抑制すること、2)子宮内膜上皮細胞のERのリン酸化を抑制すること、および3)子宮内膜上皮細胞のERの転写活性化因子であるSRC-3の発現を抑制すること、により子宮内膜間質細胞および上皮細胞の両面におけるエストロゲン感受性の抑制機能があることを明らかにした。さらに、Ncoa6の機能喪失は、エストロゲン感受性増加に伴うエストロゲン活性の亢進により妊娠初期における子宮内膜の分化を阻害し、胚着床障害及び子宮内膜の脱落膜化障害により女性不妊症となることも明らかにした。そこで、Ncoa6の発現低下が、エストロゲン感受性の上昇に伴って子宮内膜癌の発症に関与するのではないかと考える。また、Ncoa6は細胞老化に関わるp53やRbの共役因子であり、Ncoa6の機能低下は、それら因子の機能低下による細胞老化により、子宮内膜癌の発症に関与すると考える。臨床検体を用いて、正常子宮内膜および子宮内膜癌におけるNcoa6の発現についての検討では、当初の予想通り、正常子宮内膜上皮ではNcoa6の強い発現を認め、子宮体癌症例では多くの症例でNcoa6の発現低下を認めている。特に発現陰性例では一部臨床所見との相関を認め、癌の悪性度と関連している可能性が示唆されている。しかし、その一方で、cell lineを用いたNcoa6の細胞増殖や癌化に関する機能に関する検討では、当初使用を予定していたcell lineのauthenticityに嫌疑が生じ、まだ具体的な成果を得られていない。核内受容体転写補助因子であるNcoa6はエストロゲン受容体(ER)の転写活性化因子であるとともに、ERのユビキチン化を促しプロテアソーム経路による分解を促すことで発現抑制的にも作用する。この機能を介して、Ncoa6はエストロゲン受容体の機能調節に重要な機能を持つと考えられる。実際にマウスの研究では、Ncoa6の内膜特異的発現抑制により、エストロゲン活性は亢進し、それにより胚着床障害による不妊症や、子宮体癌の発症が促されることを、我々は明らかにしてきた。本研究では、実際のヒト臨床検体を用いて、Ncoa6の子宮内膜における機能の検討を行っている。現在のところ、ヒト臨床検体を用いた解析で、正常子宮内膜上皮では、Ncoa6が発現するのに対して、子宮体癌の検体では、多くの症例の癌細胞でNcoa6の発現低下を認めた。さらに、ヒト子宮内膜間質では分泌期においてERαの発現が低下するのに対し、Ncoa6の発現は変化しないことを突き止め、単離培養したヒト子宮内膜間質細胞ではNcoa6はERαの発現抑制に関与することを確認した。また、間質細胞の脱落膜化も、Ncoa6発現抑制により部分的に抑制されることがわかった。

このことから、Ncoa6はヒト子宮内膜においても細胞増殖や分化に重要な機能を持つことが明らかであり、その機能不全は不妊症や流産への関与、また子宮体癌発症への関与が考えられる。現在、その分子生物学的機序について、研究を進めている。臨床検体を用いて、子宮内膜癌におけるNcoa6の発現について検討を行い、当初の予想通りの結果を得ている。また、正常子宮内膜上皮細胞ではNcoa6の発現を認めることを確認している。特に、子宮内膜の類内膜腺癌においては、Ncoa6の発現消失は低分化型で悪性度の高いもので有意に高頻度に認めることを明らかにしており、Ncoa6は癌抑制的に働くと考えられる。その分子生物学的メカニズムの検討を進めるため、ヒト正常子宮内膜上皮細胞のprimary cellを用いて、Ncoa6の発現抑制実験を試みたが、細胞獲得とその後の維持が非常に困難なため、現在は内膜間質を用いた検討を進めている。月経周期において、分泌期には内膜の機能層においてERαの発現は低下するのに対し、Ncoa6の発現は高く維持される。マウスの検討ではNcoa6は内膜間質細胞のERαの発現抑制に働くため、ヒトにおいても同様の機能があるかどうかを検討し、Ncoa6の発現を抑制するとERαの発現は抑制されないことがわかった。また、Ncoa6の発現抑制は内膜間質細胞の脱落膜化を部分的に抑制することがわかった。このことから、Ncoa6の発現は内膜の機能に対して重要な機能を持つことは明らかであり、現在その機能がエストロゲン活性感受性調節にあるのか、または他の機序を介することによるのか、分子生物学的に検討を進めている。我々は、山形大学医学部倫理委員会の承認の下、良性疾患にて摘出された子宮からヒト子宮内膜間質細胞(HESCs)の単離培養を行った。免疫化学染色によりHESCsでのNcoa6の発現を確認した後、siRNAを用いてNcoa6をknock down(KD)した。また、medroxyprogesteroneとcAMPを用いてin vitroで脱落膜化を誘導し、Ncoa6の発現の有無が脱落膜化に与える影響を検討した。その結果、脱落膜化刺激により、Ncoa6存在下では細胞形態が紡錘形から敷石状に変化するのに対し、Ncoa6 KD細胞では紡錘形の細胞形態が保たれたまま変化を認めなかった。他方、脱落膜化のマーカーとされるIGF-BP1とPRLのmRNA発現は、コントロールに対してNcoa6 KD細胞にて優位に増加しており、形態学的な結果とは相反する状態だった。それを説明するメカニズムの一端としてNcoa6 KDされたHESCsではエストロゲン受容体αのタンパク発現上昇とその下流のターゲット遺伝子であるFOXO1とWNT4のmRNA過剰発現を確認し、それによる生化学的なマーカー遺伝子の上昇を認めると考えた。また、mRNAseqを用いた網羅的解析でNcoa6 KDに伴い発現が低下する遺伝子群において、GO解析でactin bindingに関与する遺伝子群が豊富であること、また実際に、脱落膜化刺激に伴う細胞内のactin分布の変化がNcoa6 KDでは阻害されていることを明らかにし、このことがNcoa6 KDによる形態学的な脱落膜化阻害の原因であると考えた。以上の結果より、Ncoa6はヒト子宮内膜においても、その脱落膜化調節機序に重要な役割を果たすことを明らかにした。良性疾患にて子宮摘出を行った検体より子宮内膜
ダイオキシンが老齢ラットの行動・記憶・学習におよぼす影響についての研究

ダイオキシン(TCDD)は内分泌撹乱作用を持った化学物質として知られ,ヒトを含む生物の多方面への影響が懸念されている.そこで,TCDDの妊娠・出産期への曝露と老化・寿命,さらには,老化期での行動との関係を明らかにする目的で,外部からの刺激に一番敏感だと考えられている周生期のみにTCDDを曝露したラットを継続飼育し,寿命について検討した.また,迷路実験と脳組織の形態学的変化の観察を組み合わせて行い,TCDDの周生期曝露が老化期での認識や学習,情動といった行動に与える影響についても解析した.TCDD曝露により,ラットでは雄雌ともに約10%の平均寿命の短縮が認められ,また,外部形態の異常も頻出した.このことは,TCDDの周生期での微細な影響がそのままずっと維持され,成長,成熟期を経て,多くの防御機構が弱体化する老化期になって表面化したと考えられる.また,TCDDの周生期曝露ラットでは,老化すると脳の線条体,海馬,扁桃体において,神経細胞数の減少や神経細胞の配列の不規則化といった形態学的変異が認められた.一方,ラットのオープンフィールド実験や迷路実験において,認識や学習機能の低下,および,情動異常といった行動変化も確認され,脳構造の変異が行動異常と関連しているかもしれないという知見が得られた.以上の結果より,TCDDは動物に明らかな障害を与えるような重篤な量でなくとも,動物の一生の中で最も脆弱な発生期においては,体内の細胞に作用し正常な組織や器官の形成を妨げ,その微少な影響が成長,成熟期から老化期までずっと維持し続け,そのため,平均寿命の短縮や老化期での行動異常を引き起こしている可能性が示唆される.周生期ダイオキシン曝露による老齢期の行動・記憶への影響を探る目的で,妊娠後期のラットに微量のダイオキシン(TCDD:体重1kgあたり100ng)を投与し,生まれた新生仔をダイオキシン曝露ラットとして実験に用いた.その結果,TCDD投与により雄の平均寿命は92.5±36.9週齢,雌は119.9±15.4週齢となり,雄は20%,雌は9%の寿命短縮が認められた.また,TCDD処理群では雌の体重低下が見られたが,雄では増減は認められなかった.さらに,投与群では下痢等の消化器系の異常,皮膚異常,腫瘍等の外部形態的異常もあらわれた.TCDD曝露による新生仔期でのラット脳の形態学的変化ついて調べてみると,処理により線条体および分界条床核領域でアポトーシス数の増加と細胞の変性が見られたが,神経細胞数の増減は認められなかった.さらに,TCDD曝露後,成熟期に達したラットの脳は,線条体および海馬領域で新生仔期とは異なって神経細胞数が増加するのに対し,細胞の大きさは縮小することがわかった.また,オープンフィールド実験により,運動機能異常や情動面での異常,雌雄のにおいへの反応についての行動異常が観察された.これらの実験結果は,周生期に曝露したダイオキシンがその後のラットの成長,成熟および老化に影響をあたえ,寿命の短縮に関与していることを示している.さらに,このダイオキシンの影響により脳の構造異常を引き起こし,その結果,脳の機能異常を誘発し,最終的に運動調節機能や感覚,情動,記憶機能の異常といった行動面での変異を惹起する可能性が示唆される.今後,このTCDD曝露動物の加齢に伴う行動・記憶変化について解析を進める予定である.周生期ダイオキシン曝露による老齢期の行動・情緒・記憶への影響を探る目的で,妊娠後期のラットに微量のダイオキシン(TCDD:体重1kgあたり100ng)を投与し,生まれた新生仔をダイオキシン曝露ラットとして,出生から死亡まで継続飼育した.その結果,TCDD投与により雄の平均寿命は750.0±205.5(対照群:784.8±113.2日齢),雌は808.9±211.8日齢(対照群:852.4±125.4日齢)となり,雄雌ともに5%の寿命短縮が認められた.しかし,最長寿命は雄では1008日(対照群:1008日),雌では980日(対照群:1008日)であり,大きな差は認められなかった.加齢に伴う体重変化は,TCDD処理群では雌の低下が見られたが,雄では顕著な増減は認められず,性による違いが明らかになった.また,投与群では下痢等の消化器系の異常や皮膚の異常があらわれ,腫瘍の発生率も対照群に比べ高く,周生期曝露の影響が成長期以降にも残っていることが示された.TCDD曝露後,中齢期(12-14ヶ月齢)に達したラットの脳は,線条体および海馬,扁桃体領域で,面積当たりの神経細胞数と神経細胞の大きさに違いが認められた.また,行動解析のためのオープンフィールド,十字型迷路,プール迷路実験により,運動機能や情動行動,学習反応について異常が観察された.これらの結果は,脳構築期でのTCDD曝露の影響によるものと考えられる.今後,老齢期(24-28ヶ月齢)に達したTCDD曝露動物の行動・記憶と脳神経の変化について比較・検討し,ヒトへの影響について考察する.ダイオキシン(TCDD)は内分泌撹乱作用を持った化学物質として知られ,ヒトを含む生物の多方面への影響が懸念されている.

そこで,TCDDの妊娠・出産期への曝露と老化・寿命,さらには,老化期での行動との関係を明らかにする目的で,外部からの刺激に一番敏感だと考えられている周生期のみにTCDDを曝露したラットを継続飼育し,寿命について検討した.また,迷路実験と脳組織の形態学的変化の観察を組み合わせて行い,TCDDの周生期曝露が老化期での認識や学習,情動といった行動に与える影響についても解析した.TCDD曝露により,ラットでは雄雌ともに約10%の平均寿命の短縮が認められ,また,外部形態の異常も頻出した.このことは,TCDDの周生期での微細な影響がそのままずっと維持され,成長,成熟期を経て,多くの防御機構が弱体化する老化期になって表面化したと考えられる.また,TCDDの周生期曝露ラットでは,老化すると脳の線条体,海馬,扁桃体において,神経細胞数の減少や神経細胞の配列の不規則化といった形態学的変異が認められた.一方,ラットのオープンフィールド実験や迷路実験において,認識や学習機能の低下,および,情動異常といった行動変化も確認され,脳構造の変異が行動異常と関連しているかもしれないという知見が得られた.以上の結果より,TCDDは動物に明らかな障害を与えるような重篤な量でなくとも,動物の一生の中で最も脆弱な発生期においては,体内の細胞に作用し正常な組織や器官の形成を妨げ,その微少な影響が成長,成熟期から老化期までずっと維持し続け,そのため,平均寿命の短縮や老化期での行動異常を引き起こしている可能性が示唆される.
網膜色素変性に対する新規視細胞保護療法の展開

ミトコンドリアカルパインー1のlarge fragmentには分子シャペロンと特異的に結合する部位があり、この部位の10個のアミノ酸配列からなるペプチドには視細胞保護作用があることが、以前の申請者の研究室で明らかとなった。本研究ではこのペプチドがウサギなどの中型動物でも点眼により網膜まで送達できるかどうかを調べた。その結果、濃度依存性に点眼にて網膜への送達が可能である事が明らかとなった。その他、ヒト皮膚細胞からiPS細胞を作製することに成功したとともに、ヒト由来細胞へのラットカルパイン阻害ペプチドの効果も検討した。網膜色素変性は遺伝子異常に端を発する網膜視細胞の進行性変性を基盤とする遺伝性網膜変性疾患である。申請者の研究グループは最近、網膜色素変性モデルラット(RCSラット)における網膜変性の進行にカルシウム依存性プロテアーゼであるカルパインが重要な働きをしており(Exp Eye Res 2010)、ミトコンドリアカルパインを抑制する新規ペプチド(カルパイン抑制ペプチド)投与により視細胞死を抑制できることを見いだした(Biochem Biophys Acta 2012)。本研究は、この新規視細胞保護治療法をウサギなどの中型動物にも応用し、その効果の普遍性を確認することを目的とする。カルパイン抑制ペプチドはラットにおいて、硝子体内に直接投与しても、また点眼によっても後眼部網膜に到達し、視細胞変性を抑制することが他の研究課題によって明らかとなったが、本研究課題においては最終的にヒトへの臨床応用を念頭に置いてウサギという中動物を対象とした実験を行うこととした。とくに点眼によって後眼部網膜にカルパインペプチドが送達されるとなれば、臨床応用への可能性が高まる。まず初年度においてカルパインペプチド点眼をラットに用いた濃度より5倍程度高濃度にしたところ、免疫組織化学的手法によりウサギ後眼部網膜に十分到達していることが示された。次年度においてはこのペプチドがウサギ網膜変性モデルにおいて変性抑制効果を示すかどうかが目標となる。申請者の研究グループは、最近、網膜色素変性モデルラット(RCSラット)における網膜変性の進行にカルシウム依存性プロテアーゼであるカルパインが重要な働きをしており(Mizukoshi S, et al. Exp Eye Res 2010)、ミトコンドリアカルパインー1を特異的に抑制する新規ペプチド(カルパインペプチド)投与により子細雄牛を抑制できることを見いだした(Ozaki T, et al. BBA 2012)。カルパインペプチドはラットにおいて、点眼によっても後部網膜に到達し、視細胞変性を抑制することが明らかにされた(Ozaki T, et al. PLoS One 2013)が、本研究課題に於いては最終的にヒトへの臨床応用を念頭に置いてまずはウサギなどの中型動物において点眼によって網膜まで到達できるかどうかを明らかにすることとした。カルパインペプチドの至適点眼濃度を決定するため1, 5, 10, 20 mMの濃度を設定してウサギ眼球に1滴点眼し、その1時間後にウサギを安楽死させて眼球摘出し、免疫組織学的にペプチドの網膜内分布を検討した。その結果、ラット1mM点眼後の網膜内分布とほぼ同程度の反応強度はウサギにおいては20mMにて達成しうることが明らかになった。次年度は研究計画通りに進めば、iPS細胞研究にも進むことを予定している。申請者のグループは、網膜色素変性モデルラット(RCSラット)における網膜変性の進行にカルシウム依存プロテアーゼであるカルパインが重要な働きをしており(Mizukoshi S, et al. Exp Eye Res 2010)、ミトコンドリアカルパインー1を特異的に阻害する新規ペプチド(カルパインペプチド)投与により視細胞死を抑制できることを見いだした(Ozaki T, et al. BBA 2012)。本研究は、この新規視細胞保護治療法をウサギなどの中型動物にも応用し、その効果の普遍性を確認することを目的とした。前年度までの研究により、ウサギにおいてカルパインペプチドの濃度を調整することによって、点眼にて後眼部までペプチドを移行させうることを明らかにした。このことは将来このペプチドを点眼による視細胞保護治療薬として臨床応用できる可能性を示唆している。そこで、当該年度においては研究の将来の発展性を鑑みてまず、ヒト皮膚細胞からiPS細胞の作製に挑戦した。これは臨床試験に代わってiPS細胞にて人工的に網膜細胞を作成してその細胞の変性に対してペプチドが保護的に働くことを確認することを目的とする。その結果、とりあえず本年度においてはヒトiPS細胞の作製に成功した。これは次年度以降の研究に応用することとした。また、ヒト由来細胞の変性に対してラット用ペプチドが効果を示すかどうかをヒト網膜色素上皮細胞を用いて培養下に検討したところ、その効果はみられず、ヒト由来細胞にはヒト特異的なカルパインペプチドの合成が必要であることが新たに判明した。

その結果、濃度依存性に点眼にて網膜への送達が可能である事が明らかとなった。その他、ヒト皮膚細胞からiPS細胞を作製することに成功したとともに、ヒト由来細胞へのラットカルパイン阻害ペプチドの効果も検討した。網膜変性ウサギの入手に時間がかかっている。本研究と対をなすラットの研究でカルパインペプチド点眼の網膜への送達をまとめた論文の公表に現在時間がかかっているため、本研究が影響を受けて遅れている。眼科学ウサギでの点眼実験を可及的速やかに開始する。iPS細胞実験に着手する。この両面での研究の進行により現段階での遅れは解決できると見込んでいる。野生型ウサギに対するカルパインペプチド点眼の網膜への送達が証明されたことで初年度の目標はほぼ達成されたと考えられる。網膜変性ウサギ(ロドプシンP347Lトランスジェニックラビット)に対し、カルパインペプチドを点眼して網膜変性の進行が抑制されるか否かを、電気生理学的、形態的および免疫組織学的に明らかにしたい。当初の計画より支出額が少なかったため物品費に上乗せして研究に必要な器具などの購入に充てる
心不全進展過程における心臓交感神経活動と心筋エネルギー代謝

心筋のエネルギー代謝異常は心不全の病態準行を助長する。ダール高血圧性心不全ラットでは、心不全発症前の代償性心肥大期に主なエネルギー基質は脂肪酸からグルコースへ移行する。しかし、この時期では既に脂肪酸のβ酸化が障害され、インスリンクランプ法によるグルコース取り込み予備能も著しく低下した。本モデルにアンジオテンシン変換酵素阻害薬エナラプリル(4mg/kg/day)を長期間投与すると、血圧の低下がないにもかかわらず心不全の進展は抑制された。エネラプリルのこの効果をエネルギー代謝の観点から検討すると、(1)エラナプリル非投与群では脂肪酸取り込みは代償性心肥大期には増加し、心不全期にはむしろ低下したが、エナラプリルによって心不全期の取り込み低下が抑制された。(2)グルコース取り込みは代償性肥大期、心不全期に著しく増加したが、エネラプリルは心不全期のグルコース取り込み量をさらに増加した。(3)代償性心肥大期においてインスリンクランプ法によるグルコース取り込み予備能低下は、ナラプリルによって改善した。以上の結果から、エネラプリルは心不全発症前の代償性心肥大期においてグルコース取り込み予備能を改善し、心不全進展の抑制に寄与したと考えられる。マイクロダイアリシス法による予備検討において、心筋間隙のノルエピネフリン量はエナラプリル投与によって有意に抑制されることから、エナラプリルが心筋細胞のAT1受容体を介してインスリンシグナル伝達を改善したと同時に、交感神経終末のAT1受容体を介するノルエピネフリン放出抑制もグルコース代謝の促進に関与したと考えられる。このようにアンジオテンシン変換酵素阻害薬の心不全進展抑制効果の一部にこの心筋代謝が関与すると考えられる。今後は心不全治療において心筋代謝からのアプローチも重要と考えられる。また、虚血再灌流時の脂肪酸代謝に及ぼす交感神経の影響について検討した。虚血時に生じる心筋細胞への脂肪酸蓄積は心筋に悪影響を及ぼす。カルベジロールを投与すると、心筋への脂肪酸取り込みは抑制され、かつ取り込まれた脂肪酸のクリアランスも改善した。このようにβ遮断薬による交感神経抑制は虚血時の心筋脂肪酸蓄積を抑制することによっても心筋保護に働くことが示唆された。心筋のエネルギー代謝異常は心不全の病態進行を助長する。ダール高血圧性心不全ラットでは、心不全発症前の代償性心肥大期に主なエネルギー基質は脂肪酸からグルコースヘ移行する。高血圧性肥大心では、心筋のATP含量が低下しており、心不全発症前の代償期におけるエネルギー産生予備能低下がその後の心不全進展に関与している可能性が示唆された。本モデルにアンジオテンシン変換酵素阻害薬(ACEI)を長期間投与すると心不全の進展は抑制されたが、グルコース取り込み予備能は改善しなかった。しかし、ACEIによって脂肪酸取り込み能の改善が認められた。アンジオテンシンII受容体拮抗薬(ARB)でも同様な結果が得られ、この脂肪酸の取り込み能改善が脂肪酸β酸化の改善を伴うかについて現在検討を進めている。また、マイクロダイアリシス法を用いて、心筋間質のノルエピネフリン濃度を測定しており、ACEIやARBによる交感神経抑制がどのように心筋代謝に影響するか検討中である。

カルベジロールを投与すると、心筋への脂肪酸取り込みは抑制され、かつ取り込まれた脂肪酸のクリアランスも改善した。このようにβ遮断薬による交感神経抑制は虚血時の心筋脂肪酸蓄積を抑制することによっても心筋保護に働くことが示唆された。心筋のエネルギー代謝異常は心不全の病態進行を助長する。ダール高血庄性心不全ラットでは、心不全発症前の代償性心肥大期に主なエネルギー基質は脂肪酸からグルコースヘ移行する。しかし、この時期では既に脂肪酸のβ酸化が障害され、インスリンクランプ法によるグルコース取り込み予備能も著しく低下した。本モデルにアンジオテンシン変換酵素阻害薬エナラプリルを長期間投与すると、血圧の低下がないにもかかわらず心不全の進展は抑制された。エネラプリルのこの効果をエネルギー代謝の観点から検討すると、(1)エラナプリル非投与群では脂肪酸取り込みは代償性心肥大期には増加し、心不全期にはむしろ低下したが、エナラプリルによって心不全期の取り込み低下が抑制された。(2)グルコース取り込みは代償性肥大期、心不全期に著しく増加したが、エネラプリルは心不全期のグルコース取り込み量をさらに増加した。(3)代償性心肥大期においてインスリンクランプ法によるグルコース取り込み予備能低下は、エナラプリノレによって改善した。以上の結果から、エネラプリルは心不全発症前の代償性心肥大期においてグルコース取り込み予備能を改善し、心不全進展の抑制に寄与したと考えられるマイクロダイアリシス法により心筋間隙のノルエピネフリン量を測定すると、エナラプリル投与によって細胞間隙のノルエピネフリン量が有意に抑制されることから、エナラプリルが心筋細胞のAT1受容体を介してインスリンのシグナル伝達を改善したと同時に、交感神経終末のAT1受容体を介するノルエピネフリン放出抑制もグルコース代謝の促進に関与したと考えられる。このようにアンギオテンシン変換酵素阻害薬の心不全進展抑制効果の一部にこの心筋代謝が関与すると考えられる。今後は心不全治療において心筋代謝からのアプローチも重要と考えられる。
前駆内臓脂肪細胞の同定とそれを用いたメタボリックシンドローム治療薬の創出

脂肪組織は内臓脂肪と皮下脂肪に大別され,各脂肪組織に特異的な前駆脂肪細胞が存在することが示唆されている。しかし現在までに前駆内臓脂肪細胞は同定されていない。そこで私共は前駆内臓脂肪細胞を同定することと、それらを用いてメタボリックシンドローム治療薬を創出することを目指して検討を行った。その結果、in vitroスクリーニングおよびin vivoでの移植実験を経て前駆内臓脂肪細胞を同定した。しかも各前駆脂肪細胞からin vitroで得られる各成熟脂肪細胞が異なる性質を有していることを確認した。また各前駆脂肪細胞を用いてin vitroの汎用的な実験系を構築できた。現在までに前駆内臓脂肪細胞および前駆皮下脂肪細胞を同定することに成功している。これらの細胞は初代培養下では全ての細胞が脂肪細胞へと分化することを確認している。しかし、継代を行うと著しく分化効率が低下するため、実験的に各種の検討をこの細胞で行うことは不可能である。そこでこの課題を解決するため、前駆脂肪細胞を培養する過程で種々の添加物を加えるあるいは培養基面に加工を施すことで脂肪細胞への分化効率が向上するかを検討した。分化効率の検討はOil Red O染色を定量化することと培養上清中のアディポネクチン濃度を測定することで行った。まず、培養中の細胞に種々の添加物を加えることで継代培養が可能になるかを検討した。その結果、添加物存在下では前駆皮下脂肪細胞において2回の継代であればOil Red O染色の定量値およびアディポネクチン濃度が初代培養の80%以内に収まっていることが分かった。ところがその条件下でも、前駆内臓脂肪細胞では十分な分化効率を得られず、継代培養法としては不十分であった。次に培養基面に加工を施し、前駆内臓脂肪細胞および前駆皮下脂肪細胞が継代可能になるかを検討した。その結果、前駆皮下脂肪細胞においては培養基面の加工の効果はそれほど見られなかった。一方、前駆内臓脂肪細胞においては加工された培養基面で培養することにより分化効率の上昇がみられた。以上より、前駆皮下脂肪細胞の継代培養はある程度可能であることが示されたが、前駆内臓脂肪細胞においては更なる検討が必要であることが分かった。内臓脂肪である腸間膜肪組織および鼠蹊部の皮下脂肪組織から間質ー血管画分細胞を単離し,その分画の細胞に対して100種類以上の幹細胞関連表面抗原の発現をフローサイトメトリーにて半網羅的に検討した。次に有意に発現が確認された表面抗原に関して,その発現の有無で細胞をセルソーターによって分取,さらに培養を行った。そして分取・培養した細胞が前駆脂肪細胞であるかを判定するため,複数の方法で脂肪細胞へと分化誘導処理を施すことにより分化効率を検討した。分化効率の評価は,細胞内の油滴形成を検討した。生化学的指標として,当教室で同定した脂肪細胞特異的分泌蛋白質,アディポネクチンの培養上清濃度を測定した。その結果,前駆内臓脂肪細胞分画および前駆皮下脂肪細胞分画を同定することができた。各分画の細胞すべてが脂肪細胞に分化することを確認した。さらに,in vitroで得られる各前駆脂肪細胞由来成熟脂肪細胞がin vivoでの脂肪細胞の形質を維持していることも確認できた。次に同定した各前駆脂肪細胞を継代培養するための方法を検討した。まず培養中の細胞に種々の添加物を加えることで継代培養が可能になるかを検討した。その結果,ある添加物存在下では分化効率をある程度維持できることを見出した。次に培養基面に加工を施し,前駆内臓脂肪細胞および前駆皮下脂肪細胞が継代可能になるかを検討した。その結果,前駆皮下脂肪細胞においては培養基面の加工の効果はそれほど見られなかった。一方,前駆内臓脂肪細胞においては加工された培養基面で培養することにより分化効率の上昇がみられた。以上より,いくつかの培養方法を組み合わせることによって各前駆脂肪細胞の継代培養はある程度可能であることが分かった。分生物学現在、前駆皮下脂肪細胞の継代培養法の確立にはおおむね目途が立っている。前駆内臓脂肪細胞の継代培養法の確立に関しても大まかな方向性は示されており、本研究課題はおおむね順調に進展している。まず前駆内臓脂肪細胞の継代培養法の確立を目指す。そのため、培養基面の加工法に関して詳細な検討を行う。また前駆内臓脂肪細胞の継代培養を可能にする液性因子の検討も行う。さらに継代を行った細胞が元の形質を維持しているかをリポリシス能やアディポサイトカイン分泌能で確認する。以上が確認されれば悪玉内臓脂肪細胞を善玉化する因子のスクリーニングを行う。

前駆内臓脂肪の継代培養法確立に課題が出たため、実験が限定されてしまったことによる。前駆内臓脂肪細胞の継代培養法の確立にも大まかな方針が決まったので、今年度は培養機材および実験動物を多く購入予定である。
キラリティーを多点で識別する人工素子の分子設計

鍵中間体である2,12-ビス(ブロモメチル)-2,12-ジメチル-18-クラウン-6(1a)は、著者らの方法に準拠してcis、trans異性体の混合物として合成した。この両立体異性体をカラムにより分離後、オキシキノリン側鎖を導入し、KIとの錯体について結晶解析を行ったところ、側鎖のヘテロ原子が錯形成に関与していることが明かとなった。これはC-ピボットラリアートエーテルで側鎖が実際にカチオンに配位していることが確かめられた最初の結晶解析例である。次にtrans-1aをアセチル化後、加水分解することにより、trans-2,12-ビス(ヒドロキシメチル)-2,12-ジメチル-18-クラウン-6(1b)をラセミ混合物として合成した。同様の方法により、trans-2,6-ビス(ヒドロキシメチル)-2,6-ジメチル-18-クラウン-6(2b)をラセミ混合物として合成した。リパーゼ存在下で1bのアセチル化反応を行うと、モノアセチル体(1c)をへてジアセチル体(1d)を与えた。反応には5種類のリパーゼを用いた。1bと1dがほぼ等量になった時点で反応を停止し、その混合物からジアセチル体を単離した後、シフト試薬として(R)-(+)-(1-ナフチル)エチルアミンの塩酸塩を添加して^1H-NMRを測定することにより%eeを決定した。酵素の種類により反応速度、選択性に明らかな差が認められ、現段階では、33%の化学収率で、75%eeが最高である。同様の条件下、2bについては29%の化学収率で、48%eeであり、置換基の位置により選択性に差が見られた。当該化合物は、諸種修飾可能な置換基を二つ有するため多様なキラルホスト分子開発の鍵化合物として重要と考えられる。
脱細胞化と再細胞化で子宮を造る

ラットを用いて脱細胞化・再細胞化による子宮再建技術の開発を行った。その結果、界面活性剤を用いることで、細胞外マトリックスや微小血管構造骨格を維持したままラット子宮から細胞を除去する(脱細胞化)技術を開発した。また、この脱細胞化骨格に、子宮細胞などを注入することにより、子宮様組織を再構築し得た(再細胞化)。さらに、in vivoでの再細胞化として,ラット子宮の一部を切除して脱細胞化マトリックスに置換した結果、プロゲステロン受容体や脱落膜化マーカーの発現を伴う子宮組織が再生されただけでなく、この子宮において自然妊娠が成立した。本法がヒト子宮再建に向けての有用な基盤技術になる可能性が示唆された。【1】脱細胞化技術の開発と確立:ラット子宮を下大静脈と大動脈付きで摘出した後、潅流装置を用いて大動脈経由でドデシル硫酸ナトリウムにより灌流し、子宮を脱細胞化することに成功した。この脱細胞化マトリックス(decellularized scaffold, DS)を免疫組織化学及び透過型電子顕微鏡にて解析したところ、コラーゲンなどの細胞外基質とともに血管構造などの組織三次元構造が保持されていた。さらに、大動脈経由でのAllura Red染色色素の注入により、微細な血管構造まで染め分けることが可能であった。このことは、単に形態的な血管構造が保持されているだけでなく、液性成分の漏出などが容易に起きない血管構造の強度も保持されていることが判明した。【2】再細胞化技術の開発と確立:In vitro再細胞化実験として、ラット子宮より単離した細胞、子宮細胞、骨髄間葉系幹細胞などを、単独あるいは組み合わせてDSに注入し、酸素化した培地を大動脈より灌流して細胞注入DSを培養した。その結果、HE染色および免疫組織化学により腺上皮および間質の組織構造の復元が確認されるとともに、最大10日間までその再細胞化組織を培養することが可能であった。ただし、平滑筋構造については十分な再構築は得られなかった。In vivo再細胞化実験として、ラット子宮角の一部を切除した後DSの一部を欠損部に移植した。移植4週間後に移植部位をHE染色および免疫組織化学により検討したところ、腺管・腺上皮・間質・平滑筋構造がほぼ正常に再構築されていた。一方、DSを移植しなかったラットでは、組織は菲薄化しており、上記の一連の子宮構造は十分に再構築されなかった。昨年度は脱細胞化子宮マトリックス(DUM)が同種同系ラット間で子宮組織再構成の足場としてin vivoで機能することを明らかにした.本年度は,将来の臨床への応用を念頭において、DUMを異系統ラットに同種移植しても機能的な子宮再生が可能か検証した.Sprague-Dawleyラット(SD)子宮に界面活性剤を灌流しDUMを作成した.Wistar系統のレシピエントラットの子宮角を部分切除し,SD由来DUM或いは子宮同種移植片(Uterine allograft;UtA)を欠損部に移植した.5週後に移植部位の再生組織を切除し,リアルタイムPCRを用いてCasp3,Esr1,Esr2,Pgr各遺伝子発現の定量解析を行った.移植5週後,DUM移植部位には子宮内膜と筋層を含む子宮組織が再生しており,免疫拒絶を疑う所見は認められなかった.一方,UtA移植部位には線維化が認められ,系統立った子宮再生に至らなかった.アポトーシスマーカーであるCasp3遺伝子発現量はUtAと比較してDUMにおいて有意に低値であった(p<0.01).ホルモン受容体であるEsr1,Esr2,Pgr各遺伝子発現量はUtAと比較してDUMにおいて有意に高値であった(p<0.01).DUMを同種移植すると,免疫拒絶を受けずにホルモン応答性を持った子宮組織の再生を促進する事が判明した.この結果は,将来的な臨床応用に際して,子宮性不妊患者に別個体由来のDUMを移植し機能的な子宮再生を行う事ができる可能性を示唆している.産婦人科学、生殖生理学、幹細胞学、再生医学脱細胞化および再細胞化については、至適な条件設定に加えて、技術開発に一定の成果が得られているので、「(2)おおむね順調に進展している。」とした。引き続き、脱細胞化および再細胞化技術の改良を重ねていくとともに、今後は以下を行う。【1】幹細胞あるいはその関連細胞のトラッキングとbioluminescence imaging(BLI):再細胞化の前に、注入予定の子宮幹細胞、間葉系幹細胞、あるいはそれらの関連細胞に対して、発光蛋白あるいは蛍光蛋白を発現する遺伝子が搭載されたレンチウイルスを感染させて、発光蛋白あるいは蛍光蛋白を恒常的に発現するように操作する。これらの発光細胞・蛍光細胞とマジョリティを占める非標識の細胞と混合して注入し、子宮の再建・再構築を図る。

それらの発光・蛍光細胞が、再構築過程でどの場所にどのように寄与しうるかを、BLIでリアルタイム並びに非侵襲的にモニタリングするとともに、免疫組織化学などを用いて、詳細な局在・系譜解析を行う。【2】In vitro構築子宮の構造・機能解析:上記のin vitroで再細胞化した子宮に対して、ラット胚を子宮腔内に注入し、着床および引き続いての初期胎盤形成の過程を観察する。上記のBLIを用いて、幹細胞を追跡(トラッキング)することにより、その振る舞いと各細胞系譜への貢献を検討する。【3】In vivo構築子宮の構造・機能解析:In vivoで再細胞化した子宮を有するラットを、自然交配により妊娠させて、着床および引き続いての初期中・後期の胎児発育および胎盤形成の過程を観察する。In vivo BLIを施行し、非侵襲的リアルタイムに、再構成子宮における幹細胞の振る舞いをモニタリングすることにより、幹細胞のin vivoにおける役割と振る舞いを明らかにする。以上の研究において、丸山哲夫は研究の企画・統括に加えてデータ解析・論文作成を、内田浩は脱細胞化・再細胞化技術の開発と確立を、升田博隆は移植・発光イメージング、免疫組織化学などによる解析を行う。未使用額の発生は効率的な物品調達を行った結果である。次年度の研究費と併せて消耗品購入に充てる予定である。
ダイナミカルな動作を用いた転倒状態から直立姿勢への起き上がりに関する研究

本研究では,仰向け状態から直立状態への脚の振り降ろしを利用した起き上がり運動について考察した.運動は脚を振り降ろして腰回りで回転を起こししゃがんだ姿勢になるまでのフェーズとしゃがんだ姿勢から立ち上がり直立状態になるまでのフェーズに分けて考えた.前者においては,運動の成否は脚の振り降ろし時の角速度で決まると考え,その値を角運動量に基づいて見積る方法を提案した.この方法は,位相面を用いた解析と角運動量の保存に基づいている.このとき問題になるのは,腰まわりの回転中に角運動量がどれだけ変化するかであり,これは系全体の重心の軌道と密接な関係がある.そこで,腰まわり回転の初期位置・終了位置を用いて腰まわり回転時に重力によって変化する角運動量を概算する方法をとった.これによりダイナミクスを解くことなく必要な角速度を見積もることができるようになった.提案した手法の有効性・妥当性を,シミュレーションおよびロボット実験により確認した.一方,後者では前年度に提案した床反力に基づいた直立姿勢の制御法を応用した.その方法では,腰関節・膝関節に軌道を与えて伸展させた際に生じるバランスの乱れを足関節の出力で補償する.このとき足部の形状が前後に非対称な場合,床反力の中心をどこに制御すべきかが問題となり,同じように前後非対称な足部をもつ人間がどのようにしているかめ計測を行った.人間の場合は床反力の中心を足部中央に制御しているとはいいきれないが,足関節の出力を小さくなるような直立姿勢の制御法はとってはいないことがわかった.今後これらの知見を活用し再現性の高い起き上がり運動を目指す.起き上がりロボットを設計する上で,自由度とモータの配置および機構の検討を行った.目標とする動作は,仰向け状態から脚を振り下ろし,その勢いを利用して起き上がるものである.振り下ろし時には脚を伸ばしたほうが運動量を稼げ,一方,起き上がり時には脚を縮め回転を起こす足関節まわりの慣性モーメントを小さくしたほうが有利である.これは膝関節の重要性を示唆し,これを考慮して自由度は腰関節・膝関節・足関節の3つとした.モータは胴部2つと脛部に配置し,膝関節はプーリーを用いて駆動するものとした.平衡維持に重要な床反力の作用中心を計測するため,ロードセルを足部4箇所に配置した.制御方法に関しては,起き上がり運動を仰向け状態からじゃがんだ状態への運動としゃがんだ状態から直立状態への運動の2つに分けて考えた.前者では,足関節周りの運動を中心に考察した.角運動量を制御量とし,鞍状平衡点(倒立状態)の安定多様体に相当するエネルギーレベルから各瞬間での角運動量の目標値を算出する方法を提案した.シミュレーションでは重心を足関節の上で静止されることができたが,ダイナミクスの初期状態等の影響を強く受け,また特異点を通過するといった問題点も明らかになった.一方,後者の運動では,床反力の作用中心を足関節のトルクで制御する方法を考案し,それを応用する.製作したロボットを用いて動作の確認を行った.差し詰め,従来のように目標軌道を試行錯誤的に求めることにより,仰向け状態からしゃがんだ状態へ移行できることを確認した.また,床反力の作用中心を制御する方法を実験に採用し,直立状態への移行を実現した.今後は,足関節まわりの運動制御について再考し,実験的な検証を含めて研究を進めていく.本研究では,仰向け状態から直立状態への脚の振り降ろしを利用した起き上がり運動について考察した.運動は脚を振り降ろして腰回りで回転を起こししゃがんだ姿勢になるまでのフェーズとしゃがんだ姿勢から立ち上がり直立状態になるまでのフェーズに分けて考えた.前者においては,運動の成否は脚の振り降ろし時の角速度で決まると考え,その値を角運動量に基づいて見積る方法を提案した.この方法は,位相面を用いた解析と角運動量の保存に基づいている.このとき問題になるのは,腰まわりの回転中に角運動量がどれだけ変化するかであり,これは系全体の重心の軌道と密接な関係がある.そこで,腰まわり回転の初期位置・終了位置を用いて腰まわり回転時に重力によって変化する角運動量を概算する方法をとった.これによりダイナミクスを解くことなく必要な角速度を見積もることができるようになった.提案した手法の有効性・妥当性を,シミュレーションおよびロボット実験により確認した.一方,後者では前年度に提案した床反力に基づいた直立姿勢の制御法を応用した.その方法では,腰関節・膝関節に軌道を与えて伸展させた際に生じるバランスの乱れを足関節の出力で補償する.このとき足部の形状が前後に非対称な場合,床反力の中心をどこに制御すべきかが問題となり,同じように前後非対称な足部をもつ人間がどのようにしているかめ計測を行った.人間の場合は床反力の中心を足部中央に制御しているとはいいきれないが,足関節の出力を小さくなるような直立姿勢の制御法はとってはいないことがわかった.今後これらの知見を活用し再現性の高い起き上がり運動を目指す.
外熱急冷式外熱式ガス圧装置による火山噴火過程の解明

流体を圧媒体としたガス圧装置は、固体圧の高圧装置に比べ、中・上部地殻の比較的低い圧力を圧倒的に精密に再現できる。特にTZM(Ti-Zr-Mo)合金を用いた外熱式装置は,内熱式と比べて同程度の高温高圧(1200°C,500MPa)が発生できる上、1)はるかに安価(容器価格は1/10以下)のため複数の高圧容器を接続でき、複数の実験条件で同時に長時間(数ヶ月以上)の実験が可能2)圧媒体組成を変えることで精密かつ長時間の酸素分圧制御が可能3)緩やかなガス放出が可能なので減圧実験に適する4)水を主圧媒体とするため高圧ガス規制法の特認対象とならないので、装置の自由な設計・改良が可能で、また膨大な費用が必要な保安検査の対象とならないなど数々の利点がある。本研究ではこれらの特徴に着目し、火山噴火機構解明に適したダブルリアクター式による外熱急冷式TZMガス圧装置を設計・製作した。その結果、外熱式装置の基本的な特性、特にフィラーロッドにNiを用いることで、実験時間にかかわらず酸素分圧をほぼNNOバッファーに緩衝できることが確認された。一方で、900°Cを超える高温では、不活性ガスを圧媒体に用いる内熱式ガス圧装置に比べ、試料カプセルに用いる白金などの貴金属が再結晶作用を起こしリークが起こりやすいという問題点があることも判明し、CO2などを混入することによって圧媒体中の水の活動度を下げる工夫が必要であることがわかった。北海道駒ケ岳のデイサイト質試料を用いた発泡実験では、磁鉄鉱と気泡の分布の空間相関が高く、磁鉄鉱の結晶面と気泡との"濡れ"性が高い可能性が見出された。これによって、噴火のトリガーとなるマグマ溜りの過剰圧蓄積過程(脱ガス過程)において、結晶の種類と量が気泡のネットワーク形成に大きく影響を与える可能性があることが明らかになった。これまでに、急冷用2次圧力容器等の主要な注文製作部品はすべて完成・納入され、試験機による比較的低温(925°C)での実験を100MPaで行い、外熱式ガス圧装置の基礎性能の整備と評価を行った。まず温度は、電力フィードバック型温度調節器とサイリスタ(シマデン製)とを用いることで、25×25×60cm程度の断熱槽を持つ加熱容器で、室温変化等の影響を受けずに非常に安定して(±1°C以内)制御できることがわかった。また圧力は、共和電業製のデジタル圧力計を用いることで、200MPaまで低価格で高精度に測定でき、自動制御のための出力が得られる見込みが立った。また、キャピラリ管を用いることで、塞止弁を手動で制御してもある程度の減圧率のコントロールができることがわかった。試料の酸素分圧は、金属ニッケル製のfiller rodを用いることによって、NNO-bufferに近い値に緩衝できることがわかった。急冷機構については、強力な固体磁石を用いると、6mlの圧力容器であればニッケル製filler rodを固定できることがわかったので、圧力容器は操作性にすぐれる上方設置の状態で、磁石を用いたfiller rod位置の制御を行うことで試料の急冷を行うことを検討中である。これまでに明らかになった問題点としては、900°C程度の高温になると、試料を封入する白金カプセルの再結晶化が進み、カプセルのリークや、カプセル内部と圧媒体の水の交換が起こってしまうことである。これは、不活性ガスを圧媒体に用いた内熱式ガス圧装置には見られなかった問題で、おそらく圧媒体の水(水素)が、白金の再結晶に対して触媒作用を持つことが原因と考えられる。TZM合金を用いる高温の実験の特性上、これは大きな問題であり、次年度は異なるカプセル素材の検討や、カプセル肉圧の増加などの対策を検討する必要がある。

北海道駒ケ岳のデイサイト質試料を用いた発泡実験では、磁鉄鉱と気泡の分布の空間相関が高く、磁鉄鉱の結晶面と気泡との"濡れ"性が高い可能性が見出された。これによって、噴火のトリガーとなるマグマ溜りの過剰圧蓄積過程(脱ガス過程)において、結晶の種類と量が気泡のネットワーク形成に大きく影響を与える可能性があることが明らかになった。
時間分解分光法によるミクロからマクロにおよぶタンパク質の反応ダイナミクスの理解

本年度は平成22年度において実施されたSensory Rhodopsin I (SrSRI)について過渡回折格子法や、過渡吸収法などを用いた時間分解測定を行い、そのダイナミクスや拡散運動についてさらなる知見を得た。そしてこれらの成果をJ. Phys. Chem. B誌に発表した。またさらに新たな対象として海洋性細菌の持つプロテオロドプシン(PR)とその変異体についても研究を行い、アミノ酸変異によるプロトンポンプ活性の変化が分子間のプロトン移動効率の変化によって引き起こされることを明らかにした。これらについては既に学会誌への論文投稿を済ませており、現在印刷中である。その他の研究成果としてA03班須藤チームとの共同研究により、新たに多波長の励起光を用いた過渡吸収測定を行うことで、Middle Rhodopsin (MR)のフォトサイクルについて研究を行った。MRは複数の発色団の異性体を持つことが知られているが、通常の単一励起波長による測定では各異性体からの信号を分離することが出来ない。しかし本研究では励起波長依存性をもとめることで、異性体間の信号の分離を実現し、それをもとにしたフォトサイクルの解明に成功した。その結果異性体ごとにフォトサイクルの時間スケールがサブミリ秒から数十ミリ秒までの幅広い範囲に分布するという知見を得、これまで報告例がなかった11-cisレチナールを持つ微生物型ロドプシンの反応ダイナミクスの観測を初めて行うことができた。これらの成果についても現在学会誌へ論文として投稿中である。また階層的な理解を目指すため、現在新規ロドプシンについて時間分解赤外分光を行っており、これらについても成果がまとまりしだい、学会発表や学術誌への論文投稿などを通して発表を行う予定である。予定通りの分光実験の結果が得られており、それに基づいた学会発表や学術誌への論文発表を達成したため。本研究課題は本年度をもって終了するが、今後はこれらの成果や本研究課題で確立した測定法を元に、さらなる光受容タンパク質の理解に向けた研究を行っていく予定である。研究初年度となる平成22年度はマクロな構造変化を時間分解分光を使って調べるため、研究実施計画に示した、光電子増管を使った単一プローブ波長での過渡吸収測定系の構築を行った。装置は当初の計画通り10ナノ秒以下の時間分解能を有し、10^<-4>程度の検出感度を持つシステムの構築に成功し、ロドプシンの吸収変化の信号を良いS/N比で捉えることに成功した。そしてそのシステムと過渡回折格子法測定系を使い、本領域AO3班の須藤グループとの共同研究としてSalinibacter Sensory Rhodopsin I(SrSRI)の反応ダイナミクスの研究を行った。その結果SrSRIには吸収スペクトルが同一で、マクロな構造(部分モル体積)が異なる中間体が3つ存在することが明らかになった。またそれらを含めたSrSRIの各中間体のエンタルピーは塩化物イオンの結合に伴い変化することが明らかになり、分子全体の構造エネルギーが小さなイオンの結合によって大きく左右されることを発見した。これらの結果は平成22年12月に米国・ホノルルで行われた国際会Pacifichemで成果を発表し、また物理化学において重要な雑誌であるJ.Phys.Chem.B誌に論文として発表した。またインド・Annamalai大学で行われたICORFAS-2010では、これらの結果について招待講演を行った。今後残り一年の研究期間内に、研究目的であるよりミクロな領域の構造変化を調べるため、全反射赤外分光法や時間分解赤外分光法を用いた研究をすでに行っている。そしてそれ以外にもProteorhodopsinやGloeobacter rhodopsinなど他のロドプシンについてもその反応ダイナミクスを調べ、ロドプシンごとの分子的な性質を比較することで、より網羅的な研究を行っていく予定である。

予定通りの分光実験の結果が得られており、それに基づいた学会発表や学術誌への論文発表を達成したため。本研究課題は本年度をもって終了するが、今後はこれらの成果や本研究課題で確立した測定法を元に、さらなる光受容タンパク質の理解に向けた研究を行っていく予定である。