hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ファーマコジェノミクスに基づくオーダーメイドのH.pylori除菌法の前向き検討

ヘリコバクター・ピロリ(H.pylori)に対する標準治療の3剤プロトンポンプ阻害薬(PPI)1アモキシシリン(AMPC)1クラリスロマイシン(CAM)療法の除菌の成否に関わる主な因子に、H.pyloriのCAM耐性とPPIの代謝酵素のCYP2C19の遺伝子多型がある。そこで、それを事前に検査してからのテーラメイドの除菌療法を行うこととした。CAM耐性の有無は、H.pyloriのCAM耐性遺伝子変異である23SrRANのA2142G, A2143G変異をインベーダー法で検査し、CYP2C19の遺伝子多型もインベーダー法で検査した。CAM感受性菌の場合では過去の検討でランソプラゾール(LPZ)60mg分2,AMPC1.5g分3、CAM0.6g分3にてCYP2C19のIMで高い除菌率が達成されたが、そのIMではLPZ30mgを1日2回投与による24時間平均胃内pHは5であり、このpHを達成するためのLPZの用量・投与方法をCYP2C19の多型別に検討すると、RMではLPZ30mgの3回、IMではLPZ15mgの3回、PMではLPZ15mgの2回投与であった。CAM耐性菌に対して、以前の検討でCYP2C19のPMではAMPCの500mg1日4回とomeprazole(OPZ)20mgの1回投与でCAM耐性に関わらず除菌成功したため、CYP2C19のPMでOPZ20mgを1週間内服した際の24時間平均胃内pHを検討したところ5.8程度であった。このpHを達成するためのLPZの用量・投与方法をCYP2C19の多型別に検討すると、RMではLPZ30mgの4回、IMではLPZ15mgの4回、PMではLPZ15mgの2回投与とした。そして、抗生剤はAMPCを用いるがAMPCの薬物動態やPAEが殆どないことを考慮して500mgの1日4回投与を2週間行った。H.pyloriが陽性患者300例のうち150例でテーラーメイドの治療を行い、残りの150例で標準治療を行った。テーラーメイド群で、まず、H.pyloriががCAM耐性か感受性かで振り分け、CAM感受性菌に対しては、抗生剤はCAM200mgとAMPC500mgの1日3回投与を1週間行い、PPIの用量はCYP2C19の多型に応じて上述の用量・投与方法をした。CAM耐性菌に関しては、AMPC2.Ogの4分割投与を行い、PPIの投与方法もCYP2C19の多型に応じた上述の投与方法で2週間の治療を行った。すると、テーラーメイド群の除菌率は全体として90%を超え、一方、標準化治療群では70%程度であり、個別化療法群での除菌率が有意に高まった。テーラーメイドのH.pyloriの除菌療法は初回から高い除菌成功率を達成でき、有用な治療戦略であると考えられた。

CAM耐性菌に関しては、AMPC2.Ogの4分割投与を行い、PPIの投与方法もCYP2C19の多型に応じた上述の投与方法で2週間の治療を行った。すると、テーラーメイド群の除菌率は全体として90%を超え、一方、標準化治療群では70%程度であり、個別化療法群での除菌率が有意に高まった。テーラーメイドのH.pyloriの除菌療法は初回から高い除菌成功率を達成でき、有用な治療戦略であると考えられた。CYP2C19の遺伝子多型とH.pyloriのクラリスロマイシン(CAM)耐性遺伝子多型に基づくテーラーメイドの除菌療法を確立するため、以下の検討を行ってきた。1.CYP2C19の遺伝子多型に応じたプロトンポンプ阻害剤の至適投与方法について検討した。健常ボランティアに対して、Lansoprazoleを投与し、24時間平均胃内pHを測定し、CYP2C19の多型別の至適投与方法を確立した。2.H.pylori陽性患者を無作為に標準治療群とテーラーメイド治療群の二群に振り分けた。迅速ウレアーゼテスト(RUT)の検体からDNAを抽出し、H.pyloriの23S rRNAの2142位、及び2143位のA-G変異を検出し、CAM耐性か否かを判定し、さらに患者のCYP2C19遺伝子多型も検査した。以上、CYP2C19に応じた至適なPPIの投与方法を確立したとともに、遺伝子多型に応じたH.pyloriのテーラーメイドの除菌方法を確立した。現在、新たなレジメンによる個別化療法を検討している。ヘリコバクター・ピロリ(H.pylori)に対する標準治療の3剤プロトンポンプ阻害薬(PPI)/アモキシシリン(AMPC)/クラリスロマイシン(CAM)療法の除菌の成否に関わる主な因子に、H.pyloriのCAM耐性とPPIの代謝酵素のCYP2C19の遺伝子多型がある。そこで、それを事前に検査してからのテーラメイドの除菌療法を行うこととした。CAM耐性の有無は、H.pyloriのCAM耐性遺伝子変異である23S rRANのA2142G, A2143G変異をインベーダー法で検査し、CYP2C19の遺伝子多型もインベーダー法で検査した。CAM感受性菌の場合では過去の検討でランソプラゾール(LPZ)60mg分2,AMPC1.5g分3、CAM0.6g分3にてCYP2C19のIMで高い除菌率が達成されたが、そのIMではLPZ30mgを1日2回投与による24時間平均胃内pHは5であり、このpHを達成するためのLPZの用量・投与方法をCYP2C19の多型別に検討すると、RMではLPZ30mgの3回、IMではLPZ15mgの3回、PMではLPZ15mgの2回投与であった。CAM耐性菌に対して、以前の検討でCYP2C19のPMではAMPCの500mg1日4回とomeprazole(OPZ)20mgの1回投与でCAM耐性に関わらず除菌成功したため、CYP2C19のPMでOPZ20mgを1週間内服した際の24時間平均胃内pHを検討したところ5.8程度であった。このpHを達成するためのLPZの用量・投与方法をCYP2C19の多型別に検討すると、RMではLPZ30mgの4回、IMではLPZ15mgの4回、PMではLPZ15mgの2回投与とした。そして、抗生剤はAMPCを用いるがAMPCの薬物動態やPAEが殆どないことを考慮して500mgの1日4回投与を2週間行った。H.pylori陽性患者300例のうち150例でテーラーメイドの治療を行い、残りの150例で標準治療を行った。テーラーメイド群で、まず、H.pyloriがCAM耐性か感受性かで振り分け、CAM感受性菌に対しては、抗生剤はCAM200mgとAMPC500mgの1日3回投与を1週間行い、PPIの用量はCYP2C19の多型に応じて上述の用量・投与方法をした。
人的支援と連動した在宅認知症高齢者への居住環境整備アセスメントシートの開発

介護支援専門員を対象として郵送調査を計画し、調査票作成、予備調査まで実施した。調査項目は、認知症高齢者への居住環境整備に関する対象者の意識と過年度の研究で抽出したアセスメントシートの項目が主な項目である。予備調査の結果、居住環境整備実施とアセスメント項目との関連を捉えられるような追加のインタビュー調査の必要性が示唆された。また、2019年度に建築士など主にハード面の専門家として認知症高齢者の居住環境整備に関わる専門職への調査を予定しており、調査項目の選定、調査対象の絞り込みなど調査実施のための準備を行った。2018年度に実施予定の郵送調査が、倫理委員会の承認、代表者の休業等により2019年度に繰り越しになったため。2019年度に実施できるよう準備を進めている。2018年度実施予定の介護支援専門員への郵送調査を速やかに実施するとともに、建築士などハード面の専門家への調査を実施する。調査結果を踏まえアセスメントシートの試案の改訂を行い、改訂版について実践現場の専門職へのインタビューや試用を経た上で、本研究課題の目的であるアセスメントシートの完成版を作成する。本研究の目的は、物理的な環境整備と人的支援を連動した居住環境整備の方法論の確立を目指すため、在宅認知症高齢者や家族のための物理的な環境整備(ハード面)と人の関わりやサービスなど人的支援(ソフト面)に着目したアセスメントシートを開発することである。3年間の研究期間のうち、1年目となる平成28年度は当該分野における国内外の文献レビュー及び既存のアセスメント項目の抽出を中心に取り組んだ。また、2年目以降に実施する調査の準備にも取り組んだ(平成29年度上半期にかけて実施)。具体的には以下の通りである。平成28年度は、当該研究分野における国内外のレビューを実施した。その結果、特に欧米において自宅で生活する認知症高齢者の居住環境に関する研究を例が存在することを確認し、詳細なレビューを行なった。レビューを行なった研究のうち、研究成果をデータベース形式で公開しているイギリスの研究例については翻訳し、我が国の研究知見や研究動向との詳細な比較検討を行うべく準備を進めている。既存のアセスメント項目やアセスメントシートについても収集したが、認知症に特化したものは限られているため、障害者等も含め幅広い分野から収集を行い、アセスメント項目の抽出を抽出している。また、平成29年度以降の調査の準備として、地域包括支援センターの介護支援専門員や福祉用具提供事業者を対象に、認知症高齢者の物理的な居住環境整備と人的支援の連動に関するヒアリングを実施中である。国外の文献レビューについて、想定した以上の時間を要しているため。さらに、本研究のオリジナリティを明確にするためにも、イギリスの研究例との比較を行う必要が生じたため、進捗が遅れている。また、プレ調査の結果、調査協力を予定している事業所の抽出方法に検討が必要であることが判明したため。本研究の目的は、在宅認知症高齢者や家族のための物理的な環境整備(ハード面)と人の関わりやサービスなど人的支援(ソフト面)が連動した支援を行なうためのアセスメントシートを開発することである。平成29年度は、アセスメントシートのシートの試案の作成を中心に取り組んだ。国内外の認知症介護のテキスト、居住環境整備の事例集や関連書籍、論文等で公表されている認知症高齢者への居住環境整備の事例の分析を行った。分析対象とした事例で取り挙げられている項目と本研究により抽出したアセスメント項目との一致状況を分析した。事例の分析を踏まえて、アセスメントシートの試案を作成した。アセスメントシートの試案作成に当たり、認知症高齢者への居住環境整備を行った事例を収集し、アセスメント項目を収集した上で試案作成を行う予定であった。しかしながら、プレ調査の結果を踏まえた結果、事例調査の前にアセスメントシートの試案を作成する方が望ましいという結論に達し、調査実施時期を変更した。これにより当初の研究計画の進行予定からはやや遅れている。(調査1)介護支援専門員、福祉用具専門相談員を中心に15名程度にインタビュー調査を実施し、認知症高齢者や家族に対する居住環境整備を実施する際のアセスメント項目、また新しい環境、新しい機器を導入する際どのような人的サポートを行っているか把握する。(調査2)調査1の結果を踏まえ、研究代表者らとの共同研究の実績のある介護支援専門員の職能団体である「東京都介護支援専門員研究協議会」の協力を得て、居住環境整備を行った事例収集約40事例を収集し、その事例の検討を行うと共に、ケアプランの記述内容の収集を行う。

その際、平成28年度の研究で抽出したアセスメント項目、調査1で把握したアセスメント項目について、実際の事例に落とし込み検討した場合、どの項目が認知症高齢者の居住環境整備に活用されている項目であるのか明らかにする。(調査1)介護支援専門員、福祉用具専門相談員を10名を対象に、インタビュー調査を実施し、認知症高齢者や家族に対する居住環境整備を実施する際のアセスメント項目の聞き取りおよび環境整備実施時に用いるスキル(ハード面、ソフト面)を把握する。(調査2)関東圏の居宅介護支援事業所の介護支援専門員および福祉用具専門相談員を対象に、アセスメントシートに含まれる項目の実施状況や重要性への認識を明らかにし、さらに居住環境整備に関する知識やスキルの有無に関する郵送調査を実施する。これらを踏まえアセスメントシート試案の改訂を行う。2018年度実施予定の介護支援専門員への郵送調査を速やかに実施するとともに、建築士などハード面の専門家への調査を実施する。調査結果を踏まえアセスメントシートの試案の改訂を行い、改訂版について実践現場の専門職へのインタビューや試用を経た上で、本研究課題の目的であるアセスメントシートの完成版を作成する。研究計画においては、平成28年度に調査を実施する予定であったため、調査実施のための予算を確保していた。しかしながら、調査の実施時期及び規模の見直しが必要となった。これにより、調査実施は平成29年度に行うため、平成29年度使用額が生じている。(理由)調査実施時期の見直しに伴い平成30年度使用額が生じている。(使用計画)予算の大部分は、インタビュー調査である調査1および郵送調査である調査2に係る関連費用に充てる。調査2に関する調査票郵送費およびデータ入力費用に多くの予算を充てる予定である。2018年度に予定していた郵送調査を2019年度に実施することになり、2018年度に計上していた調査に係る費用が次年度使用額になったため予算の大部分は、調査実施にかかる関連費用に充てる予定である。また、入力等の人件費についても支出する予定である。
標的指向性を付与したウイルス様超分子集合体によるアンチセンスDNAターゲティング

(1)標的指向性分子を導入可能な末端官能基を有するブロック共重合体への標的指向性分子の導入:昨年度合成法を確立したPEG末端に反応性可能基(アルデヒド基)を有するアルデヒド-PEG-ポリジメチルアミノエチルメタクリレートブロック共重合体へのラクトース誘導体の導入を検討した。このブロック共重合体末端のアルデヒド基とp-aminophenyl-β,D-lactopyranosideを還元アミノ化反応させることによって、末端アルデヒド基に標的指向性分子としてラクトース誘導体を共有結合を介して導入することに成功した。(2)標的指向性基を表層に提示したポリイオンコンプレックス(PIC)ミセルの調製とその遺伝子発現効率:(1)項でラクトースを導入したブロック共重合体を用い、プラスミドDNA(pGL3-Luc)と水溶液中で混合することによりPICミセルが調製された。この溶液について動的光散乱測定を行った結果、混合比を最適化することにより、100nm程度のPICミセルが形成されていることが確認された。このラクトース導入の効果を評価するために、レセプターが発現しているHep G2細胞での遺伝子発現効率を評価した。比較としてレセプターが存在しないマンノースを表層に提示したPICミセルについても評価を行った。ミセルに内包することによりDNAの安定性が向上するためにフリーのプラスミドDNAより著しく高い遺伝子発現効率を示すことが確認された。さらに、表層の分子(ラクトースとマンノース)の違いを比較するとラクトース導入PICミセルの方が高い遺伝子発現効率を示したことから、本研究において目的とした標的指向性を有するDNAベクターがPICミセルシステムを利用することにより構築可能であることが示唆された。
音声式点字タイプ教具の開発による盲学校低学年の点字学習環境の改善

点字学習を開始する就学前後の全盲児にとって、点字タイプライターによる「書き」だと機能上タイプミスを教師がすぐには判断出来ず、児童の点字理解に時間がかかるという問題があった。そこで、音声応答によって点字タイプ学習を支援する「音声式点字タイプ教具」を開発した。本教具は、点字タイプライターのキー配列を踏襲し、点字入力への即時音声読み上げによる正誤確認と録音・再生による入力文の確認機能をマイコンと音声合成モジュールによって実現している。シンプルな操作系かつ軽量で、キータッチを幼児向けに軽くする等、小学生低学年でもすぐに使えるようにした。製作では、大学生のものづくり技術教育の一環として8月に製作セミナーを開催し、14名の参加を得た。セミナー製作分も含めた教具計20台を西日本地域の盲学校等、視覚障害者教育機関へ1台ずつ無償貸与し、点字授業等での活用による点字学習効果を検証(教員によるアンケート評価)した。開発当初の目的は、全盲のみの単一障碍児を想定した点字導入時の上述問題の改善にあった。検証によると単一児の場合、本教具を1ヶ月程度使うだけで点字タイプに無理なく移行出来る事が分かり、長文入力の一人遊び、クイズ遊び等を他者と楽しむ交流活動での利用が中心となった。その一方、知的障碍を併せ有する重複障碍児の教育において、本教具の有用性が高い事が示された。具体的には、(1)幼児期における自立活動で指の分化を促進出来ること(2)自由な打鍵による「点字遊び」が出来るので、点字導入時の苦手意識を軽減出来ること(3)点字タイプを打鍵出来ない指で押す力の弱い重複児への点字導入の成功(4)自分の気持ちを発言出来ない児童の、録音・再生機能を用いた自己表現・コミュニケーション能力の伸長(5)即時の正誤確認による重複児の点字習得期間の明確な短縮化(6)広汎性発達障碍(ADHD)児の独自解釈による点字入力規則・リズムの修正等の事例、等が報告された。これらより、従来の指導方法だけでは改善が困難だった重複児の学習上の諸状況において、専門知識を有した教師が一人一人に合わせて本教具を活用することで児童の点字学習負担の軽減、学習効率の改善を実現することが出来た。各校に1台ずつ教具を貸与したが、授業で使用するのに複数台必要とするケースや、盲学校以外の視覚障碍支援機関からの使用希望など、教具普及の要望が多数寄せられている。教具改善と合わせて今後の課題とする。
プロテオミクスへの「ADP―リボシル化タンパク質同定法」の応用

タンパク質の"ADP-リボシル化"についての研究を進展させるために、モデルペプチドを用いた実験系でADP-リボシル化ペプチドの特異的選択法と、修飾ペプチドの修飾部位とアミノ酸配列の決定法の原理を確立し、論文発表した(Osago H, et al. Precursor ionscanning and sequencingof arginine-ADP-ribosylated peptide by mass spectrometry. Anal.Biochem., 393 : 248-254 (2009))。その原理を、実際のタンパク質へ応用するために、(1)(3)を計画し、それぞれ以下のような結果を得た。(1):LCの溶出、質量分析部への導入、イオン化時の電圧などの条件の検討新たに導入されたLC-ESI/MS/MSにおけるADP-リボシルモデルペプチドの測定最適条件を決定した。同時に導入されたナノLC-MALDI-TOF/MS/MSを用い、マトリックスの検討を行い、さらに高感度で特異的な選択・同定法を考案中である。(2):ADP-リボースに親和性をもつボロン酸カラムによるADP-リボシル化ペプチド濃縮法の確立リン酸部分に親和性を持つ樹脂により、ある程度の濃縮効果を認めたが、実サンプル向けのスケールダウンが今後の課題である。(3):タンパク質のゲル内の消化、LCによる消化廃物の分離、計算値による推定MSからのADP-リボシル化ペプチドの選択の検討通常のゲル内消化のpH条件では修飾部分の安定性に不適であることを明らかにし、これを回避する方法を検討中である。
脳深部刺激療法（DBS）でうつ病は治るのか？

視床下核などに対する深部脳電気刺激療法(DBS)は、パーキンソン病(PD)患者のwearing-offを改善し、ADL、QOLの向上をもたらすことが可能なため、重度のPD患者に対する有用な治療手段として確立している。近年、諸外国より、認知行動療法、薬物療法などのいかなる治療によっても十分な効果を得られなかった重度のうつ病患者に対してDBSが有効だったという報告が相次いで寄せられている。しかし、我々日本の脳外科医の立場からすると、動物実験に基づくscientificなデータの乏しさゆえ、DBSでうつ病を治療することが、医学的にも倫理的にも妥当なのか判断できないのが現状である。このような背景から、本研究ではうつ病に対するDBSの効果について、動物実験によるscientificな評価を行うことを目標に、まずはうつ病モデルの評価を行うことを目標とした。Wistar-Kyotoラットはそれ自体がうつ病モデルとして利用できるという方向がある。また、DBSでは電極を脳内に挿入する必要があるため、まずはWistar-Kyotoラットの脳内に微小シリンジを用いて6-OHDA注入してパーキンソン病モデルを作成し酸化ストレス度・抗酸化力を測定することとした。すると注入2週の段階で酸化ストレス度は軽度から中等度の上昇が認められたが、抗酸化力は適値を保った。DBSの侵襲度はパーキンソン病モデル作成に伴う侵襲度と比べると同じかもしくは軽いと推察されるが、酸化ストレス度と抗酸化力の観点からも十分実験に耐える侵襲度と推察された。視床下核などに対する深部脳電気刺激療法は、パーキンソン病(PD)患者のwearing-offを改善し、ADL、QOLの向上をもたらすことが可能なため、重度のPD患者に対する有用な治療手段として確立している。近年、諸外国より、認知行動療法、薬物療法などのいかなる治療によっても十分な効果を得られなかった重度のうつ病患者に対して電気刺激療法が有効だったという報告が相次いで寄せられている。しかし、我々日本の脳外科医の立場からすると、動物実験に基づくscientificなデータの乏しさゆえ、電気刺激療法でうつ病を治療することが、医学的にも倫理的にも妥当なのか判断できないのが現状である。このような背景から、本研究ではうつ病に対する電気刺激療法の効果について、動物実験によるscientificな評価を行うことを目標に、まずはうつ病モデルの評価を行うことを目標とした。Wistar-Kyotoラットはそれ自体がうつ病モデルとして利用できるという報告がある。また、電気刺激では電極を脳内に挿入する必要があるため、これまでにWistar-Kyotoラットの脳内に微小シリンジを用いて6-OHDA注入してパーキンソン病モデルを作成し、酸化ストレス度・抗酸化力を測定し評価を行ったところ、電気刺激の侵襲度はパーキンソン病モデル作成に伴う侵襲度と比べると同じかもしくは軽いと推察された。また、Wistar-Kyotoラットのneurogenesisとうつ病様行動の関連性に関してコントロールのWistar ratと比較検討を実施したところ、Wistar-Kyotoラットでは、Wistarラットと比べてforced swim testでの無動時間が多かった。一方で、Wistar-Kyotoラットにおけるforced swim testの有無は、海馬におけるneurogenesisの程度に影響を与えなかったため、うつ病モデルラットとしての妥当性が確認できた。Wistar-Kyotoラットの頭蓋内への電極挿入によりもたらす侵襲は、酸化ストレス度や抗酸化力といった指標で評価したところ、パーキンソン病モデル作成に伴う侵襲と同程度かそれ以下と判明していること、ならびにうつ病モデルに対する治療効果を行動学にて評価する際には、行動学評価それ自体が海馬のneurogenesisに影響を与えることはないと証明できたため、Wistar-Kyotoラットをうつ病モデルとして利用することの妥当性が証明できたから。一方で、我々脳神経外科医は日常診療の中で、脳卒中を扱うことが多く、脳卒中後のうつ症状をどう治療するかという問題に直面することも多い。脳卒中後のうつ症状を改善させることは、患者さんのQOLを向上させることにつながるため、極めて重要である。平成28年度は、脳梗塞治療に電気刺激を組み込み、神経新生を促すことで、脳卒中後のうつ症状の改善につなげることができるのではと考え、研究を進めた。Wistarラットの両側頸動脈を結紮し、片側のperformant pathwayを刺激してLong-term potentiation (LTP)を誘発させ、海馬歯状回におけるneurogenesisを評価した。すると、電気刺激を与えた側においては、与えない側よりneurogenesisがenhanceされた。さらに、電気刺激を与えた側については、LTPを誘発することができた群において最も効率的にneurogenesisを促進することができた。これまでに報告された多くの研究が示すように、本研究においても、虚血負荷はneurogenesisを促進させた。さらに本研究によって、脳深部刺激療法は、単純に虚血負荷を加える以上に治療介入手段として有用であること、さらに深部刺激の中でもLTPを誘発させるような刺激がより治療介入手段として有用であることが判明した。うつ病モデルであるWistar-Kyotoラットに対して、同様の実験系を実施することで、治療効果が得られるかを将来解明したい。うつ病モデルにはいくつかの作成方法があるが、どれを使うかに関しての評価方法として、酸化ストレス度や抗酸化力といった指標で評価できたため。Wistar-Kyotoラットを用いて、従来型の薬剤投与によるうつ病に対する治療効果を確認したうえで、酸化ストレス度や抗酸化力、海馬におけるneurogenesisの観点から電気刺激療法の治療効果を比較検討したい。

通常のSDラットで同じパーキンソン病モデルを作成して、酸化ストレス度や抗酸化力を評価し、うつ病モデルとで違いがあるか検討したい。また、実際にDBSで刺激する部分に電極を挿入することで、酸化ストレス度や抗酸化力にどのような影響を及ぼすのか検討したい。これを行うことで、DBSの電極挿入によるストレスや、DBSの刺激によるストレスといったものをパーキンソン病との比較の観点から評価したい。
PET薬剤によるDDS製剤のがん細胞内取込み増大機構の開発

PET核種由来のラジカルにより活性化される細胞膜透過性ペプチド(Activatable Cell Penetrating Peptide; ACPP)を開発し、PET薬剤を介したDDS製剤の細胞内取込み増大機構の構築を目指す。この目的を達成するために大きく(1)PET核種由来の放射線応答性に活性化されるACPPの作製、(2)PET薬剤の併用によるACPP修飾DDS製剤の腫瘍集積性の向上、および(3)PET薬剤の併用によるACPP修飾DDS製剤によるがん治療効果の増大、の3項目を実施する。
老年痴呆に関する伝達物質からみた実験的研究-ヒト剖検脳との比較

Iアルツハイマ-型痴呆(SDAT)およびnbM破壊ラット脳における神経伝達物質受容体の変化の比較、検討:SDAT患者脳におけるmuscarnicacetylcholine receptor(mAChR)は、海馬CA1領域で低下し、M2-RのみならずM1-Rも減少していることを証明した。一方、ラットではコリン起始核nbM破壊後1週間目の同側大脳皮質で^3H-QNB結合部位が上昇していたことから、SDATではpre^-のみでなくpostsynapticの変性が起こっていることが示唆された。somatostatin(SS)receptorもSDATにおいて減少が証明され、SS含有ニュ-ロンの変性との関係が考えられた。II fimbria-fornix切断後のbasal forebrainコリン作動性ニュ-ロンの生存への神経成長因子(NGF)の影響:fimbria-fornix切断側ではコリン作動性神経細胞数が減少するが、その程度はβNGF投与群では非投与群の1/4-1/5にとどまり、basal forebrainのコリン作動性神経細胞死が、外来性のβNGFによって防ぎうることが示された。III定量的in vitro ARGを用いたラット脳somatostatin受容体の局在:^<125>I-Try^<11>-SS-14を用いた結合実験で、大脳皮質ではV-VI層に高密度の、I-IV層に低密度の受容体が見いだされた。嗅内皮質は大脳皮質の中で最も高い受容体密度を示した。嗅系は高いSS受容体密度を示した。辺縁系ではCA1とsubiculum、錐体細胞層で低密度であった。基底核では尾状核被殻、黒質では低く、外障では最高の受容体密度を示した。IV NGF注入ラット脳でのmuscarinic receptorとsomatostatin receptorとの関係:生後2-8日のラット仔にβNGFを脳室内投与し、12日後の海馬のP_2分画を用いたoxotremorine/^3H-H-NMS阻害実験はK_i値0.46×10^<-6>Mの単一結合部位を示し、海馬のmAchR結合に対するNGF脳室内投与の効果はSSのin vitro投与の効果と同様であった。NGF注入ラットの海馬ホモジネ-トに対するSSの添加は阻害曲線を影響を与えなかった。(1)アルツハイマー病患者脳に関する神経伝達物質受容体からみた研究:アルツハイマー病患者3例の脳と中枢神経疾患を有しない患者2例の脳について,各種神経伝達物質,神経ペプタイドreceptorの定量的in vitro autoradiogtaphy法による比較,検討を行った.脳凍結標本からcryostat切片を作製し,in vitro receptor autoradiographyを施行した. ligandとしては,acecylcholine muscarinic receptorのうちM_1には^3Hーpirenzepine,M_1+M_2には^3HーQNB,dopamine receptorには^3Hーspiperone,GABA receptorには^3Hーmuscimol,somatostatin receptorには^<125>Iーsomatostatin,aspartate receptorには^3HーNーmethylーDーaspartate(NMDA)を用いた.現像されたフィルムはIBASーII画像解析装置(Zeiss社)により解析して,それぞれのreceptorの定量的局在を観察すると共に,Unnerstadtの式を用いてreceptorの絶対値を算出した.muscarinic receptorに関しては,アルツハイマー病患者脳では,正常脳に比較すると前頭葉,頭頂葉,側頭葉では差は認められなかったが,海馬CA_1領域では結合濃度が低下していた.somatostatin receptorについては,測頭葉において,特に深増で,結合濃度が低下していた.一方,興奮性アミノ酸receptorの一つであるNMDA receptorは若年発症のアルツハイマー病脳では海馬から側頭葉で増加しており,老年期発症のアルツハイマー病脳では同部位で減少していた.(2)ラット脳におけるbasal forebrain核の大脳皮質と海馬のコリン作働性支配:ラットにおいて,basal forebrain核破壊後の大脳皮質と海馬におけるacetylcholine esterase活性を組織化学的および^3HーQNBを用いたin vitro autoradiographyによって解析した.basal forebrainにカイニン酸注入後7日目には,傷害側の大脳支質と海馬でAchE活性は低下し,^3HーQNBは前頭葉,頭頂葉で結合濃度が増加していた.これらの変化は傷害後1年を経過した動物ではほとんど認められなかった.Iアルツハイマ-型痴呆(SDAT)およびnbM破壊ラット脳における神経伝達物質受容体の変化の比較、検討:SDAT患者脳におけるmuscarnicacetylcholine receptor(mAChR)は、海馬CA1領域で低下し、M2-RのみならずM1-Rも減少していることを証明した。II fimbria-fornix切断後のbasal forebrainコリン

作動性ニュ-ロンの生存への神経成長因子(NGF)の影響:fimbria-fornix切断側ではコリン作動性神経細胞数が減少するが、その程度はβNGF投与群では非投与群の1/4-1/5にとどまり、basal forebrainのコリン作動性神経細胞死が、外来性のβNGFによって防ぎうることが示された。III定量的in vitro ARGを用いたラット脳somatostatin受容体の局在:^<125>I-Try^<11>-SS-14を用いた結合実験で、大脳皮質ではV-VI層に高密度の、I-IV層に低密度の受容体が見いだされた。嗅内皮質は大脳皮質の中で最も高い受容体密度を示した。嗅系は高いSS受容体密度を示した。辺縁系ではCA1とsubiculum、錐体細胞層で低密度であった。基底核では尾状核被殻、黒質では低く、外障では最高の受容体密度を示した。IV NGF注入ラット脳でのmuscarinic receptorとsomatostatin receptorとの関係:生後2-8日のラット仔にβNGFを脳室内投与し、12日後の海馬のP_2分画を用いたoxotremorine/^3H-H-NMS阻害実験はK_i値0.46×10^<-6>Mの単一結合部位を示し、海馬のmAchR結合に対するNGF脳室内投与の効果はSSのin vitro投与の効果と同様であった。NGF注入ラットの海馬ホモジネ-トに対するSSの添加は阻害曲線を影響を与えなかった。実験にはWistar系ラット(雄、230g)10匹を用いた。動物をDavid-Koph定位装置に固定し、カニューレを側脳室に挿入し、注入液で満たしたArzet浸透圧ミニポンプ(Model 2002)に接続した。ポンプ内の溶液は5匹ではRinger液のみとし、他の5匹ではNGF(16ng/μ1)を含むRinger液とした。3日後カニューレ挿入と同側でfimbria-fornixを切断し、1-2週間後動物を灌流、固定した。basal forebrain nuclを含むクリオスタット切片を作成し、Nissl染色とcholineesterase(ChE)組織化学を施行し、medial septal nuclとdiagonal band of Brocaにおける総神経細胞数(Nissl標本)及びコリン作動性細胞数(ChE標本)をNGF注入群と非注入群につき、それぞれfimbria-fornix切断側と非切断側とで比較した。現在得られた結果ではNGF非注入群(n=1)のfimbria-fornix切断側でbasal forebrain nuclの総神経細胞数は対側に比して32%減少していたが、NGF注入群(n=1)ではその減少は17%にとどまった。残りの各群4匹づつの動物についての実験結果は近日中に判明する。Iラット脳におけるソマトスタチン受容体の局在:定量的in vitroautoradiography(ARG)を用いて^<125>
正中神経SEP P9成分の起源の解明:junctional potential理論の応用

昨年度までに、研究代表者望月は、健常者における正中神経SEP P9の体表分布を、多チャンネルSEPを用いて検討し、頭頚部にP9が、体幹部にそれと潜時を同じくする陰性電位tN9が分布しており、その境界は体幹と頚の移行部に一致することを明らかにした。その極性、分布とも、体幹という大きい容積導体から頭頚部という小さい容積導体に伝導性インパルスが移行するときに生ずるjunctional potentialに一致するため、P9/tN9は体幹頚への容積導体の大きさの変化に伴って生ずるjunctional potentialであるという新しい説を提唱した。以上の研究結果は、1998年度に雑誌Electroenceph.Clin.Neurophysiol.に掲載された。また、健常者において、上肢の内外転、肩の挙上などの姿勢変化を行なったときのP9/tN9の変化を詳細に検討し、従来信じられていたのとは異なり、P9/tN9は上肢の内外転によっては影響を受けず、肩の挙上によってP9/tN9の振幅が低下することを始めて明らかにした。上肢の内外転は神経走行の方向を変えるが体幹頚部の境界の形態には影響を与えないこと、肩の挙上は明らかに体幹頚部の境界の形態を変えることから、この結果は、P9が腕神経叢付近の神経走行の変化によるという従来説を否定し、体幹頚での容積導体の大きさの変化によって生ずるという上記の我々の説を支持する所見と考えられた。以上の結果については、J.Clin.Neurophysiol.に投稿中であり、また、プラハで開催された国際筋電図臨床神経生理学会に発表した。さらに、本年度には刺激対側頚部体幹部でのP9分布を詳細に検討し、P9とtN9の分布の境界が、頚部体幹部の移行部の形態に正確に一致することを明らかにし、国内学会に発表した。体性感覚誘発電位(SEP)は神経叢,神経根,頚髄,脳幹等の機能評価の手段として,広く臨床応用されているが各成分の起源については今だ議論されているのが現状である.早期成分の一つであるP9の起源についても様々な意見がある.我々はP9は体幹から頚部への容積導体の大きさの変化から生じるjunctional potentialと考えており,本研究はそれを証明しようというものである.本年度は,健常者約10人を対象とし体表面に広汎に電極を設置して多チャンネル同時記録によって各成分の分布を検討した.さらに少数の健常者を対象に上肢挙上・外転など様々な姿勢変化をさせたときのP9潜時や形状の変化を検討し,P9に対する上肢の内外転の影響を調べており,現在その結果を論文として準備中である.昨年度までに、研究代表者望月は、健常者における正中神経SEP P9の体表分布を、多チャンネルSEPを用いて検討し、頭頚部にP9が、体幹部にそれと潜時を同じくする陰性電位tN9が分布しており、その境界は体幹と頚の移行部に一致することを明らかにした。
smallGproteinを介した新たな癌転移機構の解明

small G蛋白質Rap1を負に調節するGAP蛋白SPA-1は慢性骨髄性白血病や自己免疫性疾患の発病への関与が報告されている。Rap1の機能は明らかにされていない点も多いが、細胞の増殖や接着と密接に関わっていることが報告されており、癌転移において重要な役割を担うものと考えられる。我々はヒト前立腺癌の転移機序におけるSPA-1の関与について検討した。転移を認める前立腺癌32症例、および転移を認めない前立腺癌37症例の針生検標本においてSPA-1の発現を免疫組織学的染色で検討したところ、転移を認める前立腺癌において有意にSPA-1の発現の上昇を認めた。ヒト前立腺癌細胞株PC3及びLNCaPにおいてSPA-1の発現をWB法にて解析したところ、PC3細胞ではSPA-1が高発現しており、マウス精巣に移植後45日で所属リンパ節に転移を認めた。一方、SPA-1の発現を認めないLNCaP細胞は、同様の実験にて転移を来さなかった。SPA-1の発現を認めず転移能の低いLNCaP細胞にSPA-1を安定発現させた細胞株ではRap1の活性が低下し、invasion assayで浸潤能の亢進を、マウス精巣移植モデルで転移巣の増大を認めた。SPA-1を高発現している転移能の高いPC3細胞においてSPA-1遺伝子発現をRNA阻害した細胞株ではRap1の活性が亢進し、invasion assayで浸潤能の低下を、マウス精巣移植モデルで転移巣の縮小を認めた。さらに、PC3細胞にGAPによる制御を受けないconstitutive active formのRap1(RapV12)を安定発現させた細胞株での解析も行ったところ、invasion assayで浸潤能の低下を、マウス精巣移植モデルで転移巣の縮小を認めた。今回の検討からSPA-1/Rap1シグナルが前立腺癌の浸潤・転移に関与している可能性が示唆された。
米由来抗菌タンパク質のプロテオーム解析とその歯周病菌に対する殺菌作用機構の解明

米由来タンパク質から歯周病菌Porphyromonas gingivalisに対して抗菌性を示すペプチドを見出した。このペプチドを構成するアルギニンやリジンなどの塩基性アミノ酸の抗菌性に対する寄与を検討した結果、C末端のアルギニンとリジンが重要であることが明かとなった。また、抗菌作用機構を細胞膜脱分極アッセイと単一ジャイアントベシクルの顕微鏡観察によって検討した結果、このペプチドは細胞膜を破壊することによって抗菌性を発揮することがわかった。したがって、この米由来ペプチドは歯周病を予防するための医薬品や食品の素材として有用であることが判明した。精白米および米ぬかの抗菌タンパク質・ペプチドの網羅的な解析と歯周病菌に対する抗菌活性の発現機構解明について検討し、本年度は以下の結果が得られた。1.歯周病菌(Porphyromonas gingivalis)に対する精白米および米ぬか由来抗菌タンパク質を、各種クロマトグラフィーや電気泳動を組み合わせて精製し、MALDI TOF-MS/MSを用いて網羅的に同定した。その結果、精白米からArg-ジンジパインに結合する14種類のタンパク質が得られた。また、米ぬかからは抗菌活性を有する画分に数種類のタンパク質を確認できた。2.歯周病菌の濃度が低い場合でも高感度に抗菌活性を測定するための方法を確立するために、DNA蛍光ラベル法またはATP化学発光法について測定条件を最適化し、従来の濁度法とその性能を比較検討した。その結果、ATP化学発光法は他の方法に比べて、比較的広い濃度範囲で再現性よく抗菌活性を測定できることがわかった。3.Arg-ジンジパインに結合する14種類の精白米由来タンパク質のアミノ酸配列を比較検討し、塩基性アミノ酸に富んだ12残基のアミノ酸から構成されるペプチドを選択した。このペプチドを化学合成(外注)し、歯周病菌に対する抗菌活性を、ATP化学発光法を用いて測定した。その結果、50%増殖を阻害する濃度は約200μg/mLであることがわかった。精白米の抗菌タンパク質・ペプチドの網羅的な解析と歯周病菌に対する抗菌活性の発現機構解明について検討し、本年度は以下の結果が得られた。1.Arg-ジンジパインに結合するCyanate hydrataseの配列中から見出したペプチドCH(14-25)は、Arg-ジンジパイン阻害活性を示すばかりでなく、歯周病菌(Porphyromonas gingivalis)に対して抗菌活性を示した。2.CH(14-25)を構成するアミノ酸の抗菌活性に対する寄与を明らかにするために、N末端アミノ酸1残基と2残基を除去したペプチドおよびC末端アミノ酸1残基と2残基を除去したペプチドをそれぞれ化学合成(外部委託)し、それらの抗菌活性を50%増殖阻害濃度(IC_<50>)を用いて比較した。その結果、N末端の2つのArg残基およびC末端のArgとLysの2残基を除去した場合に、それぞれの抗菌活性が大幅に低下した。したがって、N末端の2つのArg残基およびC末端のArgとLysの2残基はそれぞれ抗菌活性に大きく寄与していることを明らかにした。3.抗菌ペプチドを添加することによって、歯周病菌にいったん取り込ませた蛍光色素を放出させる細胞膜脱分極アッセイを行った。その結果、上記の5種類のペプチドを添加したときの蛍光色素放出量は、抗菌活性が高くなるにつれて増加した。すなわち、抗菌活性と蛍光色素放出量の間にほぼ比例関係があった。したがって、これらの抗菌ペプチドは、歯周病菌の細胞膜に作用して、抗菌活性を示すことがわかった。1.CH(14-25)を構成するアミノ酸の抗菌活性に対する寄与を明らかにするために、アルギニン(Arg)とリジン(Lys)の塩基性アミノ酸を1残基または2残基のアラニン(Ala)に置換した9種類のペプチドをそれぞれ化学合成(外部委託)し、それらの抗菌活性を比較した。その結果、C末端のArgとLysの2残基をAlaに置換した場合に、それぞれの抗菌活性が大幅に低下した。したがって、C末端のArgとLysの2残基が特に抗菌活性に大きく寄与していることを明らかにした。2.CH(14-25)の抗菌作用機構を明らかにするために、細菌の細胞膜を模倣した単一ジャイアントベシクル(GUV)を調製し、次にペプチドを添加することによってGUVの形態変化を直接顕微鏡を用いて観察した。その結果、GUVはCH(14-25)ペプチドによって破裂することが明らかとなった。したがって、CH(14-25)ペプチドは、細胞膜を破壊することによって、歯周病菌を殺菌することが示唆された。3.新たに緩衝液を用いて砕米から抽出したタンパク質溶液から各種クロマトグラフィーや電気泳動を用いて、歯周病菌に対して抗菌性を示す1種類のタンパク質成分を単一にまで精製できた。
運動による高血圧改善に血管作動性ペプチドが果たす役割

小動物用トレッドミルを用いウィスター系ラットに走行トレーニングを約8週間行わせた。トレーニング強度は徐々に増加させ、最終的には25m/min90分の走行トレーニングであった。最終トレーニング終了後、臓器を摘出し、受容体結合実験に用いた。また、一部は細胞内2次情報伝達物質の測定、ホルモンまたグルコース放出実験に用いた。初年度は粗細胞膜を調整し、実験を行ったが一部十分な結果を得るに至らなかった。2年目は遊離細胞を調整するなどし実験を行い以下のような結果を得た。SHRを用いても同様の実験を行ったが、十分な実験例数が得られなかった。実験の結果、次のことが分かった。1)トレーニングを行っても安静時の血圧に変化はなかった。2)腎臓のAVP受容体数、親和性には変化が見られなかったが、V1受容体刺激により合成されると考えられるIP_3量はトレーニングで有意に低下した。3)アンジオテンシンIIによって放出される副腎のアルドステロン量はトレーニングによって減少した。4)肝臓のエンドセリンA受容体の親和性はトレーニングにより増加した。5)エンドセリン刺激による遊離肝細胞からのグルコース放出量はトレーニングによって低下した。以上のことから血管作動性ペプチドの作用がトレーニングによって修飾されることが分かった。4週齢のウイスター系ラットを購入し、トレッドミルを用いて走行トレーニングを約9週間行わせた。ラットは最終トレーニング終了1日おいて実験に用いた。これは最終トレーニングによる一過性の影響をさけ、長期的な影響を見るためである。肺、腎臓、副腎を摘出し、肺は一部、腎臓、副腎は1個を-80度冷凍保存した。残りをホモジナイズし、粗細胞膜に調整した。緩衝液に懸濁し、10^<-6>Mのアンジオテンシイ2、エンドセリン、バソプレシンで30秒間刺激した。その後遠心分離し上清を冷凍保存した。検体が全て集まった時点で、これらのペプチドのセカンドメッセンジャーであるIP_3の濃度を一括してアッセイキットにより測定した。その結果測定可能限界以下の濃度であることが分かった。先行研究では粗細胞膜での実験も報告されていたが、多くの場合、細胞に単離したサンプルを用いていた。このため、単離細胞を用いて再実験する計画である。その際、単離細胞を調整するのに適する臓器に研究対象を絞って実験を進める予定である。運動によるアンジオテンシン2、エンドセリン、バソプレシン受容体に対する影響については冷凍保存した臓器を用いて実験を行っている。実験方法は、臓器をホモジナイズし、タンパク定量後、一定タンパク量のサンプルを、受容体のサブタイプに特異的に結合するリガンドと^<125>Iでラベルしたペプチドを競合的に結合させる方法である。結合したペプチドはγカウンターにより検出する。トレーニング強度は徐々増加させ、最終的には25m/min90分の走行トレーニングであった。3)アシジオテンシンIIによって放出される副腎のアルドステロン量はトレーニングによって減少した。
テンナンショウ属フデボテンナンショウ節の系統分類

種レベルの分類の再検討:キュー、ライデン、パリなど国外の主要なハ-バリウムから標本を借用し、東京大学ほか国内に所蔵する標本とあわせて比較検討して、各種について特徴と識別点を明らかにし異名を整理した。特に中国南部から記載された種類とタイ・インドシナから記載された種類を詳しく比較した。また、生植物については染色体も観察した。この結果、フデボテンナンショウ節(ここではMurata 1984の定義による)には25種があることが明らかとなったので、記載を伴う全種の集覧を作成し、検索表によりその区別点を明らかにした。rbcL遺伝子の塩基配列の決定と比較:東京大学理学部附属植物園で栽培する生植物および科学研究費海外学術研究の現地調査などにより収集した生材料を用いて、東京大学理学部附属植物園の実験設備により、rbcL遺伝子の塩基配列の決定を行った。フデボテンナンショウ節以外の核節から8種、フデボテンナンショウ節からA.filiforme,A.laminatum,A.roxburghii,A.calcareum,A.grapsospadix,A.prazeri,A.petelotiiの7種、外群としてPinellia temataおよびTyphonium blumeiなど多くの資料についての塩基配列を決定し、コンピュータープログラムにより系統樹を描いた。この結果、サトイモ科全体の進化を考察する上できわめて示唆に富む系統樹が得られた。テンナンショウ属を含むアルム亜科は単系統であることが高い確立で支持された。フデボテンナンショウ節は単系統群ではなく、側系統群であることが示唆された。種レベルの分類の再検討:キュー、ライデン、パリなど国外の主要なハーバリウムから標本を借用し、東京大学ほか国内に所蔵する標本とあわせて比較検討して、もっとも分類が困難と予想されるArisaemalaminatumグループとA.filiformeグループを除く各種について特徴と識別点を明らかにし異名を整理した。この仕事はFLORA MALESIANA地域については終了したのでチェックリストを作成しFLORA MALESIANA担当者に送付した。この結果は近い将来Blumeaに掲載される予定である。rbcL遺伝子の塩基配列の決定と比較:東京大学理学部附属植物園で裁培する生植物および科学研究費海外学術研究の現地調査などにより収集した生材料を用いて、フデボテンナンショウ節以外の各筋のうちTrisecta節をのぞく10節から1種づつ、フデボテンナンショウ節からA.filiforme,A.laminatum,A.inclusum,A.galetti,A.grapsospadix,A.prazeriの6種、外群としてPinellia ternataおよびTyphonium trilobatumより全DNAを抽出した。現在PCR法を用いてrbcL遺伝子を増幅した後、オートシークエンサーにより約500塩基対の塩基配列を決定する実験作業を継続中である。今年度中にフデボテンナンショウ節内については完了し、種間の予測的な系統樹が得られる予定であり、来年度はこれを仮説として材料を増やしていきたい。種レベルの分類の再検討:昨年度に引続き,キュー、ライデン、パリなど国外の主要なハ-バリウムから標本を借用し、東京大学ほか国内に所蔵する標本とあわせて比較検討して、各種について特徴と識別点を明らかにし異名を整理した。この結果、フデボテンナンショウ節(ここではMurata1984の定義による)には25種があることが明らかとなったので、記載を伴う全種の集覧を作成し、検索表にらりその区別点を明らかにした。rbcL遺伝子の塩基配列の決定と比較:昨年度に引続き,東京大学理学部附属植物園で栽培する生植物および科学研究費海外学術研究の現地調査などにより収集した生材料を用いて、東京大学理学部附属植物園の実験設備により、rbcL遺伝子の塩基配列の決定を行った。

フデボテンナンショウ節以外の各節から8種、フデボテンナンショウ節からA.filiforme,A.laminatum,A.roxburghii,A.calcareum,A.grapsospadix,A.prazeri,A.petelotiiの7種、外群としてPinellia ternataおよびTyphonium blumeiなど多くの資料についての塩基配列を決定し、コンピュータープログラムにより系統樹を描いた。この結果、サトイモ科全体の心窩を考察する上できわめて示唆に富む系統樹が得られた。テンナンショウ属を含むアルム亜科は単系統であることが高い確率で支持された。フデボテンナンショウ節は単系統群ではなく、側系統群であることが示唆された。
血栓組織化促進による大動脈瘤破裂の治療

動脈瘤破裂時に血栓組織化による状態の安定化をもたらす治療法の開発を目的として、ブタ腹部大動脈瘤モデルにおいて、内部の血栓にFGF、XIII因子を投与して血栓の組織化が促進されるかを評価した。FGF投与では瘤の縮小が促進され、α-SMA陽性細胞、マクロファージ、コラーゲン沈着量が増加した。XIII因子投与ではα-SMA陽性細胞、コラーゲン沈着量の増加がみられた。FGFはXIII因子よりも大きな組織化促進の効果が見られた。血栓の組織化促進にFGF投与は有効であった。大動脈瘤破裂モデルを作成し、生体吸収性ポリマー、及び、徐放化された線維芽細胞増殖因子(basic fibroblast growth factor : bFGF)を血腫内に投与し、血栓の組織化について検討した。1)ブタ腹部大動脈瘤破裂モデルの作成体重2030kgのブタを用い、頚静脈を長さ5cm採取し腹部大動脈に端側吻合(吻合長5mm)を行い、嚢状瘤モデルを作成した。後腹膜を密に閉鎖後、血栓が安定する約30分後に1mm径の破裂孔を瘤頂点に作成し、腹膜を速やかに閉鎖する。後腹膜血腫形成程度は固体によって異なり、出血が持続し死亡するブタが見られた。血腫が一定の大きさになった時にトロンビンを血腫に注入することで、それ以上の出血が無く安定したモデルとなることが判明した。すべての群でトロンビン注入を行い、モデルを作成することとした。2)ゼラチンハイドロゲル+bFGF剤の作成ゼラチンハイドロゲル(GSS)溶液1mlにbFGFを1μg、10μg、100μgを溶解し作成した。トロンビン投与後30分に後腹膜血腫内に24G針で注入し、注入孔を閉鎖した。4)非治療群、GSS単独群、GSS+bFGF群間の組織化の比較治療後3日目、7日目、に犠牲死させ、腹部大動脈、嚢状瘤モデル、後腹膜血腫部を摘出した。モデル作成に当たってトロンビンを使用するように変更したため、組織学的変化の評価にはいたっていない。トロンビン使用前で、血腫が安定していたブタでの比較では、非治療群に比べGSS、GSS+bFGF群では組織化が促進されていた。ブタ嚢状大動脈瘤血栓化モデルにおいて、トロンビン、ポリマーおよびbFGFを血腫内に投与し、血栓の組織化の程度を評価した。当初は動脈瘤に孔を開け後腹膜に血腫を作成し、ここに種々の物質を投与して組織化を検討する予定であったが、トロンビンを加えた条件でも出血により死亡するブタが約34割に達したため、破裂孔は作成せず、嚢状瘤内の血栓化を評価することにした。モデル作成当日には充実した血栓が形成されたが、3日目では線溶作用により血栓が減少している場合が見られ、フィブリン安定化が不十分であると考えられた。フィブリン安定化因子である血液凝固第XIII因子の組織内濃度を測定したところ、局所では第XIII因子が十分ではない可能性があった。血栓組織化に対する第XIII因子の局所投与の効果も検討する計画とした。血栓量は3日目、7日目でトロンビン単独<トロンビン+第XIII因子、トロンビン+ポリマー、トロンビン+ポリマー+bFGFでは有意差無であった。ポリマー自体の体積が影響しポリマー添加の有無では比較は困難であった。血栓内細胞密度は3日目では差は見られなかった。7日目でトロンビン単独<トロンビン+第XIII因子、トロンビン+ポリマー<トロンビン+ポリマー+bFGFであったが、ポリマーの注入位置と広がり方が組織像に与える影響が大きく、瘤の部位による差が顕著であった。第XIII因子投与の効果は確認できたが、ポリマーおよびbFGF投与の効果については14日目、30日目の評価が重要と考えられた。ブタ腹部大動脈に頸静脈を吻合し嚢状瘤モデルを作成、内部に形成された血栓の器質化について評価した。血栓にトロンビン、トロンビン+XIII因子、トロンビン+ゲラチンハイドロゲル+bFGFを投与し、3日目、7日目、14日目、30日目で動脈瘤容積と、筋線維芽細胞、マクロファージ、コラーゲン量を組織学的に評価した。動脈瘤容積は7日目から30日目までで、トロンビン>トロンビン+XIII因子、トロンビン+ゲラチンハイドロゲル+bFGFであった。トロンビン+XIII因子に比ベトロンビン+ゲラチンハイドロゲル+bFGFで容積が小さい傾向は見られたが、有意差は見られなかった。筋線維芽細胞、マクロファージ、コラーゲン量は7日目以降でFGFを添加した群で他の2群に比べ、有意に増加した。XIII因子添加群は14日目、30日目でトロンビン単独群に比べ筋線維芽細胞、マクロファージ浸潤が増加していた。