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乳幼児期の喘息をもつ子どもを養育する親の情報利用の実際

本研究の目的は、母親がどのように情報を利用しているのか明らかにすることで、母親の対処行動の獲得に向けた看護援助への示唆を得ることである。対象者はA子どもクリニックに通院中の23歳の喘息をもつ子どもを養育する母親3名で、半構成的インタビューを行った。その結果、母親は自分が調べた情報のうち、役に立つ情報とそうでない情報を選別し、調べて不安なことは頼れる人に相談し、自分自身が決めた対処行動を行うようにしていた。看護師は、母親が身近なデータベースを活用できるように、支援を行う必要があることが示唆された。1.研究の目的本研究の目的は、乳幼児期の喘息児を養育する母親が、どのように情報を利用しているのか、乳幼児期の喘息児を養育する母親が経験する判断の迷いや不安や恐怖はどのようなものか、これらを踏まえ、乳幼児期の喘息児を養育する母親の対処行動の獲得に向けた看護援助方法を検討することである。2.研究実施状況(1)H20年4月から10月:喘息児を養育する親の対処行動、最近の情報利用の実際について文献検討を行った。(2)H20年10月からH21年1月:文献検討を踏まえ研究計画書を作成した。(3)H20年12月:プレテストの実施のため名古屋にてフィールド調整を行った。(4)H20年12月H21年2月:研究計画書を所属研究機関の倫理委員会に提出し、研究方法の妥当性について検討した。(5)H21年2月3月:研究協力施設にて、インタビューを実施し、データ収集を行った。3.今後の展望インタビューの結果、親は全然知らない専門家にアクセスしようとするのではなく、育児関連の情報をやりとりしているネット上のコミュニティや、子どものかかりつけ医に質問して疑問を解決していた。対処行動は、なにより親自身が継続できる項目を選択しており、子どもの症状と自分自身のライフスタイルとのバランスを考えて行動していることが考えられた。プレテストにおいては、ほとんどが軽症の子どもを養育する母親であり、子どもの喘息発作がそれほど生活に影響していないことも考えられ、今後は、中等症や重症の対象者にインタビューを行うことが出来るように調整する必要があることが考えられた。I.研究の目的幼い子どもを育児中の親は制約された時間の中で生活しており、家から出掛けて喘息教室に参加するのは困難で、子どもの受診時には時間が限られでしまうため、医療者から十分に説明や教育を受けることは難しい状況にある。それゆえ、時間を気にせずに利用できるインターネットなどを情報源にしている場合が多いが、玉石混合の情報源に翻弄されている場合もある。本研究の目的は、親がどのように情報を利用しているのかを理解することで、効果的に不安や恐怖を緩和し、対処行動の獲得に向けた看護援助への示唆を得ることである。II.研究方法乳幼児期の喘息児を養育する母親3名に60分程度のインタビューを行い、質的分析を行った。III.倫理面への配慮以下の権利を保障することを明記した説明文を用いて口頭で説明し、同意が得られた場合にインタビューを行った。1.研究に自主的に参加する権利2.研究についての情報を知る権利3.プライバシーを保護される権利4.研究に参加した際の利益、不利益IV.結果・考察親は、自分が身近に感じる情報源(インターネット、近所の友人、かかりつけ医)を利用して、情報を得ていた。情報によっては、全く逆だと感じる情報もあり、最終的に何を信じるかは自分の価値観によるところが大きいと感じていた。看護師は、個々の親の価値観をよく知り、親が子どもの喘息治療にとってベストな治療を選択できるように援助する必要がある。
国内外から収集した在来稲遺伝資源の多面的評価と特性表の公刊

在来種を中心としたイネ500品種を比較栽培し,出穂期・成熟期・草丈・全重・籾重・玄米形状,さらに玄米タンパク質含量,アミロース含量等を分析した。紫黒米品種の色素発現は栽培環境の影響を受けた。玄米の抗酸化活性は,赤米>紫黒米>緑米=白米であり,ポリフェノール含量も同様であった。大腸菌および枯草菌に対して,有色米抽出成分の抗菌性を確認した。報告書多様なイネで日本の水田を守る-県立広島大学で収集してきた国内外の稲遺伝資源の栽培特性と活用事例-を発行した。平成22年度は、大学研究水田において、在来種を中心としたイネ200余の品種・系統を均一条件下で栽培し、また飼料イネを異なるNレベルで栽培し、出穂期・生育・収量・倒伏性などの諸特性を調査した。さらに、収穫・調製した玄米を対象に、外観品質(サタケ穀粒判別器)、アミロース含量(ヨード・ヨードカリ法)、タンパク質含量(CNコーダー)などを分析し、また、有色米(赤米・紫黒米)の一部品種・系統についてはORAC法による抗酸化活性とアントシアニン含量の定量を行った。その結果、抗酸化活性は、品種間差異があるものの、赤米〉紫黒米〉白米の順に高いことが明らかになった。飼料イネとして、籾(米)の収量は低いが、ワラ収量の高い有望な品種が選抜された。水田で調査する諸特性には気象条件の影響が大きいことが知られており、23年度も継続して実験を行うが、中間報告として、以下の研究成果を日本作物学会全国大会の講演会において発表した。「県立広島大学で保存する在来種を中心としたイネ品種群の分類と利用例」ならびに「登熟期間中の温度条件が紫黒米の着色及びアントシアニン含量に与える影響」の2課題である。前者の課題では、本学が収集してきた500の品種・系統を、主として利用面の観点から分類整理し、とくに有色米の利用例を整理・紹介した。また、品種選択の指針と栽培上の注意点を説明した。後者の課題では、紫黒米の11品種・系統を水田およびポットで、ビニール屋根下・人工気象室(低温20/20°C、高温35/30°C)の4条件下で栽培し、高温条件下では玄米の着色が不良でアントシアニン含量も低いこと、また高温耐性に品種間差異があることなどを示した。平成23年度は、大学研究水田において、在来種を中心としたイネ250余の品種・系統を均一条件下で、また飼料イネを中心として異なるNレベルで栽培し、出穂期・成熟期・稈長/穂長・穂数・収量・倒伏性などの諸特性を調査した。さらに、収穫・調製した玄米を対象に、外観品質(サタケ穀粒判別器)、アミロース含量(ヨード・ヨードカリ法)、タンパク質含量(CNコーダー)などを分析した。紫黒米の一部品種・系統についてはポット栽培で窒素・リン酸・カリの施用量試験を行い、アントシアニン含量の定量を行った。直播適性を判定するために、わが国の代表的な直播向き品種とアメリカの奨励品種を栽培し、その形態的特性を比較するとともに、シャーレを用いたストレス下の発芽試験を行った。その結果、飼料イネの地上部収量はNl4g/m^2のレベルで頭打ちとなり、また乳牛による消化性の低い籾の収量が低く、ワラ収量が高く、ホールクロップサイレージに向いた品種を明らかにし、さらに栽植密度により、籾の割合すなわち収穫指数が大きく変わることなどを明らかにできた。紫黒米のアントシアニン含量に対しては、肥料の影響は明確ではなかった。発芽試験では、低温条件下での発芽性に大きな品種間差異があることなどを明らかにした。また、平成23年度農業生産技術管理学会全国大会において、「赤米および紫黒米の醸造試験」を発表し、利用面の事例を紹介した。その他、江戸時代の諸資料から陸稲、赤米などイネに関わる歴史を整理し発表した。また、DNAレベルの解析により在来の赤米や香り米の遺伝的解析を進めており、来年度中に成果をまとめることができるように進めている。平成24年度は、(1)イネ250品種・系統の比較栽培を実施し栽培特性を調査した。(2)紫黒米9・赤米9・緑米1・白米(しろまい)3の計22品種について、そのDPPHラジカル消去活性とポリフェノール含量、アントシアニン含量等を分析した。玄米色は色彩色差計で4品種群を明確に区別でき、品種間差異も明らかにした。抗酸化活性は赤米>紫黒米>緑米=白米であり、ポリフェノール含量も同様であった。

紫黒米1品種は赤米と同等の強い抗酸化活性を示したことから、有望遺伝資源としてさらに分析を進める。(3)紫黒米品種の色素発現に及ぼす登熟期間中の変化と気温の影響を検討した。(4)赤米・紫黒米の抽出成分の抗菌性を白米と比較した。比濁法および寒天拡散法により、大腸菌Escherichia coliおよび枯草菌Bacillus subtilisに対して、白米は全く抗菌性を示さなかったのに対して、両有色米では抽出溶媒の種類にもより程度に差はあるが、明確に抗菌性を確認できた。今後食品などへの応用性を検討する。平成2224年度科学研究費補助金報告書「多様なイネで日本の水田を守るー県立広島大学で収集してきた国内外の稲遺伝資源の栽培特性と活用事例ー」を発行した。内容は、第1章多様性に富むイネ、第2章本研究の背景と目的、第2章有色米および香り米等に関する研究、第4章イネ品種特性表、第5章巻末カラー写真、発表論文リスト、あとがき、囲み記事からなる。第4章では、約500品種・系統について、出穂期、成熟期、稈長、穂長、穂数、止葉(長・幅・着生角度)、ぼう性、着色、倒伏程度、脱粒性、全重、籾重、玄米形状、色(色彩色差値)、約50%の品種については、さらに玄米タンパク質含量、アミロース含量、外観品質を整理した。第2章では、収集系統を諸特性によって分類し、その利用例について説明した。極めて多数の品種を比較栽培しているので調査・分析に手間がかかるが、実験内容によっては過年度からのデータを参照して品種を絞りながら研究をすすめており、おおむね予定通りに進んでいる。24年度が最終年度であるため、記入しない。在来イネ品種の多面的評価の項目として研究が遅れているのは、健康機能性に関わる成分すなわちポリフェノールやフィチン酸の定量および抗酸化活性の測定である。平成24年度に集中して実施する。また、国内外から収集した香り米品種群の種子更新と香気成分の分析を行う。12月までに諸データを整理し、多様なイネの活用法の整理も行ない、農家に役立つ情報を載せた特性表を公刊する。
呼吸と気管支収縮の検討

部分体外循環を行い、胸郭の呼吸運動がない状態で気管支の収縮活動を測定すると、気管支の収縮活動は横隔神経活動と同期して認められました。胸腔内圧の影響を受けない場合、気管支の収縮は、横隔神経活動の吸気相中期から始まり、呼気相早期に最大値をとり、その後は指数関数的に弛緩していました。この気管支の収縮活動と、気管支の支配神経である迷走神経肺枝の神経活動の相関について検討を行いました。迷走神経肺枝は胸郭内にあるため、開胸手術を行い、迷走神経肺枝を同定する必要がありました。迷走神経から分枝する迷走神経肺枝は非常に細く、同定は可能でしたが、神経活動を測定するためのprepalationが技術的に非常に困難でした。また、開胸手術による侵襲のため、部分体外循環を行うとイヌのvitalを安定させるのが難しく、多くのイヌで測定が困難でした。そのため、測定可能であった数頭での結果ですが、迷走神経肺枝では、その神経活動が横隔神経活動より遅れて出現していました。このことは気管支の収縮が吸気相中期から始まること肯定していると考えられますが、迷走神経肺枝の活動がどのくらい横隔神経活動より遅れているのか、定量的な検討は、測定可能な頭数が少なかったためできませんでした。また、同様に迷走神経肺枝の活動と気管支の収縮とのtime delayについての定量的な検討もできませんでした。今回の実験では体重10kg程度の中型犬を使用しましたが、prepalationが困難なことからは、当研究を継続するには大型犬の使用も考慮せざるを得ないと思われます。本年度は、まず気道の収縮について検討しました。運動誘発喘息では、乾燥冷気の吸入が気道収縮を生じる誘因の一つと考えられていますが、実際に冷気の吸入により、どの程度気道内が冷却されているかは、あまり検討されていません。特に、気道内の温度変化を連続的に測定した研究はありません。そこで、イヌに2°C程度の冷気を吸入させ、気管内の温度変化を連続的に測定しました。冷気により気管内の温度が低下するのは比較的短い時間であり、冷気の吸入に対して、気管は低抗性を持っていることが明らかとなりました。この結果を論文とし、日本呼吸器学会雑誌へ投稿し、現在は査読結果を待っています。次に、気道の収縮と迷走神経の相関を検討しました。迷走神経の分枝である傍反回神経の活動を検討することにより、気管の収縮が傍反回神経の活動により、呼吸に同期して生じていることが見出されてきました。次に、胸郭内の迷走神経肺枝の活動と気管支の収縮について検討を行いましたが、prepalationが技術的に非常に困難であり、次年度の課題となりました。
流域コモンプールを再生する社会起業家のビジネス・モデル

本研究の目的は、流域社のコモンズを再生するための資金調達方法として社会起業家の非営利ビジネスの可能性を検討することであった。そのため、非営利事業の商品に対する市場アンケート調査、非営利組織の管理費用、および運営主体の社会起業家の概念を構築するとともにそのインセンテイブ分析を行った。さらに、日本の流域社会のコモンズ保全に関する歴史モデルを構築し、我が国の流域社会が果たしてきた世界史的な意義を明らかにした。研究によって得られた主要な知見は以下の通りである:1.エコ商品事業の代表的なモデルとしてペットボトル水販売事業、エコタウン事業、自然体験教育事業を取り上げ、アンケート調査と数値分析によって事業化の条件を明らかにできた。2.社会的ミッションを持つ起業家という従来の社会起業家概念は、組織化機能と管理機能を担う際のコスト要因を無視しており、また私的利益と社会的利益を同時に追求する社会起業家の行動を合理的に説明できなかったが、NeurobiologyとCase-Based Decision理論に基づいて社会起業家の動機分析を体系的に説明した。3.以上の研究に基づいて消耗戦ゲームモデルの分析枠組みのなかでコモンズの再生を目指す非営利ビジネス事業を引き受ける社会起業家が現れる条件を導出した。同時に、非営利組織が選択される合理的な根拠を導出した。4.日本の流域ネットワーク社会の歴史研究によって、弥生時代以降我が国においては流域コモンズを保全するための経済社会システムが形成されていたことを確認した。また我が国の国家建設が流域社会の建設と流域コモンズの保全問題と深くかかわっていたことを明にした。本研究によって得られた知見を、社会起業家の教育プログラムに活かし、流域社会ネットワークによってコモンズを保全するという我が国の伝統的な知恵を現代的に再活用することは今後に残された課題である。流域コモンプールの非営利ビジネス・モデルを開発することを目指して、本年度は、以下の準備作業を行った:1.流域コモンプールを民間ビジネスによって保全しようとする全国データの収集し、さらに代表的な成功モデル地域の現地調査とアンケート調査を実施した。このデータ整理と調査研究により、流域社会における流域自然資源の保全が、民間非営利ビジネスによって可能になる条件が明らかになった。特に、矢作川と賀茂川流域社会では、上流森林を自然水販売収益で保全するための条件が明らかになった。また、岩手県では、木質バイオマス事業によって、県内の森林資源が保全できる条件が明らかになった。2.非営利ビジネスの担い手である社会起業家の理論研究の整理とモデル開発を行い、代表的な研究成果をヨーロッパ進化経済学会、日本公共選択学会、アメリカ公共選択学会で研究発表し、高い評価をえた。とりわけ、組織化能力と管理能力が社会起業家の必須要件であること、それらのコスト負担に対する報酬として社会的ミッションの実現による満足だけでなく、然るべき金銭的報酬が必要であることを、消耗戦ゲームモデルの分析フレームワークで明らかにすることによって、当該分野の研究に新しい知見を提供することができた。これらの理論研究成果は次年度以降の研究の重要な礎石になることを確認できた。3.シミュレーション分析を行うため、人工知能意思決定プログラムを開発した。本年度の研究成果をふまえ第二年度となる来年度では、社会起業家の理論モデルと日本各地の実験的なビジネスモデルを結合し、流域コモンプールを社会企業家の非営利ビジネスによって保全するためのビジネス・モデルを開発し、その有効性を検証する予定である。本年度は、昨年度に収集した全国データとアンケート調査に基づき、社会起業家の非営利エコ商品ビジネス・モデルを複数個設計し、それらに対する数理的定性分析を行った。とりわけ本年度は「ペットボトル水販売事業モデル」と「エコ・タウン建設モデル」の有効性を確認した。

前者は上流域森林の自然植生を再生するための資金調達モデルであり、後者は、未だ事業化段階に到達していない様々な自然エネルギー技術を総合的,体系的に利用することによって自然エネルギーの事業化を推し進めることを目指す非営利ビジネス・モデルである。本年度の研究によって得られた主要な知見は以下のとおりである。1.「ペットボトル水事業モデル」と「エコ・タウン建設モデル」の定性分析から次の結果を導出した。(1)民間主導で流域コモンズを再生するには、非営利事業による資金調達が必要である。(2)非営利ビジネスが有効であるためには、社会起業家の管理能力のみならず組織化能力が重要である。(3)社会起業家のミッションが強いほど、流域コモンズの再生事業はヨリ良好な結果を得る。(4)上記の3条件を満たす時、非営利ビジネス事業は徴税や寄付金による資金調達よりも有効である。2.アンケート調査に基づく数値分析によれば、100万人の流域人口をもつ流域社会を対象にしてペットボトル水事業を行えば一年当たり1億円から9億円の純収入を期待できる。実際の収益額は流通コストの大きさに依存する。従って、流通コストを小さくできる配達システムの開発が不可欠である。上記の研究成果の一部はヨーロッパ公共選択学会と日本公共選択学会で発表された。(報告論文は2編の論文としてまとめ投稿準備中である。)最終年度の今年度は、全国的データを整理したうえで流域の農業再生モデルとして「エコ農業モデル」を設計し、それに基づいて定性分析、数値分析、シミュレーション分析を行いたい。本年度は、昨年度に設計した「ペットボトル水事業」と「エコ・タウン事業」のビジネス・モデルの有効性をふまえて、新たに「自然体験教育事業のビジネス・モデルの有効性を検討した。また、日本の流域社会のコモンズ保全に関する歴史モデルを構築し、本研究の歴史的な意義を明らかにした。さらに、従来の研究において明確な定義を与えられていなかった社会起業家の概念を合理的仮説に基づいて定義することで、従来の理論研究の補足を行った。本年度の研究によって得られた主要な知見は以下の通りである。1.「自然体験教育事業」モデルの定性的分析と数値分析により次の結果をえた:流域住民と流域農林魚業が協力して非営利自然体験事業を推進することで流域の第一次産業を資金的にサポートでき、その付随的な結果として流域コモンズの保全が可能である。とりわけ、平成20年度から教育費助成が始まり非営利ビジネスとしてそのリーダーシップを発揮するべき社会起業家人材の育成が急務である。2.社会起業家の理論研究によって、社会起業家が「長期的な利益を追求する起業家」として定義することができ、経済合理性に基づいて明確に定義することのできる概念であることが明らかとなった。3.日本の流域ネットワーク社会の歴史研究によって、縄文・弥生時代以降我が国においては流域コモンズを保全するための経済社会システムが形成されていたことを確認した。
カリキュラムマネジメントの基礎を育成するための教員養成段階のカリキュラム等の開発

本研究は、大学の教員養成段階においてカリキュラムマネジメントができる力の基礎を確実に身に付けるためのカリキュラムと効果的な指導方法や教材の開発を行うことを目的としている。研究2年目となる平成30年度においては、6月29日、3月8日に研究代表者と研究分担者の間で研究会議を行い、研究計画の確認、進捗状況の報告、今後の取組方針の検討を行った。また、6月30日及び7月1日には、日本カリキュラム学会(於:北海道教育大学旭川校)に研究代表者と研究分担者とで出席し、7月1日に研究発表を行うとともに情報収集を行った。研究代表者と研究分担者においては、研究会議を踏まえ、大学学部の教員養成段階における「教育課程の意義及び編成の方法(カリキュラム・マネジメントを含む。)」相当科目のカリキュラムの開発と試行を前年度に引き続き行った。開発するカリキュラムについては、「教職課程コアカリキュラム」を踏まえ、学生がカリキュラムマネジメントの考え方や主な要素をおおよそ理解し、それらを教員になったときにどのように生かすことができるかを考えることができることを重視している。このため、「教育課程論」等の科目の中にカリキュラムマネジメントを集中して取り扱う機会を設定し、学生がカリキュラムマネジメントの考え方を理解できるようにするとともに、教育課程に関する諸要素と具体的事例などを関連付けながら効果的に学習を進められるようにカリキュラムや教材等の工夫を進めている。教材については、パワーポイントを用いた説明資料とともに学生が作業を行うワークシートを開発している。一般的に「教育課程論」等の科目の授業形式は大人数の講義が多いと考えられるが、一方的な教え込みにとどまらないよう、学生自身が考え書く活動や相互に話し合う活動などを行えるようにしている。これらの開発したカリキュラムや教材について、授業での試行を行ってきた。当初の研究計画のとおり、開発するカリキュラムの目標、内容、指導方法、教材等について研究代表者及び研究分担者間で打ち合わせを行い、カリキュラム等の開発と試行に取り組んでいる。令和元年度においては、各研究者の連携を図りながら、引き続き、カリキュラム等の開発と試行を行うこととしている。平成30年度の研究を踏まえ、カリキュラムの開発と展開に当たって必要となる、学生がカリキュラムマネジメントを考えながら学修するための本質的な問いとそれを支える作業課題を明らかにすることに取り組む。さらに、令和元年度においては、特にテキストの開発に注力することとしている。テキストについては、令和2年度から使用できるよう令和元年度中の編集・刊行を目指す。テキストについては、およそ20講で構成し、学生の実態等に即して弾力的に活用できるものを開発する予定である。研究初年度である平成29年度においては、8月29日、10月9日、2月26日に研究代表者と研究分担者の間で研究打ち合わせを行い、研究計画の確認、進捗状況の報告、今後の取組方針の検討を行った。これらの打ち合わせを踏まえ、各研究者において、大学学部の教員養成段階における「教育課程の意義及び編成の方法(カリキュラム・マネジメントを含む。)」相当科目のカリキュラムの開発等に着手した。開発するカリキュラムについては、学生がカリキュラムマネジメントの考え方や主な要素をおおよそ理解し、それらを教員になったときにどのように生かすことができるかを考えることができることを目標として設定した。研究代表者が試作し研究分担者に研究の出発点として提供したカリキュラム案においては、「教育課程論」等の科目の中にカリキュラムマネジメントを集中して取り扱う機会を設定し、新学習指導要領の基本的な考え方やカリキュラムマネジメントの考え方を説明するとともに具体的事例を取り上げるようにしている。この授業を中心として当該科目で扱うその他の内容との関連を図りながら効果的な指導を行うこととしている。一般的に「教育課程論」等の科目の授業形式は大人数の講義が多いと考えられるが、一方的な教え込みにとどまらないよう、学生自身が考え書く活動を行えるようにしている。これらの開発したカリキュラムや教材について、授業での試行にも着手している。当初の研究計画のとおり、開発するカリキュラムの目標、内容、指導方法、教材等について研究代表者及び研究分担者間で打ち合わせを行い、カリキュラム等の開発と一部の試行に着手できている。

このため、「教育課程論」等の科目の中にカリキュラムマネジメントを集中して取り扱う機会を設定し、学生がカリキュラムマネジメントの考え方を理解できるようにするとともに、教育課程に関する諸要素と具体的事例などを関連付けながら効果的に学習を進められるようにカリキュラムや教材等の工夫を進めている。教材については、パワーポイントを用いた説明資料とともに学生が作業を行うワークシートを開発している。一般的に「教育課程論」等の科目の授業形式は大人数の講義が多いと考えられるが、一方的な教え込みにとどまらないよう、学生自身が考え書く活動や相互に話し合う活動などを行えるようにしている。これらの開発したカリキュラムや教材について、授業での試行を行ってきた。当初の研究計画のとおり、開発するカリキュラムの目標、内容、指導方法、教材等について研究代表者及び研究分担者間で打ち合わせを行い、カリキュラム等の開発と試行に取り組んでいる。平成30年度においては、各研究者の連携を図りながら、平成29年度に開発したカリキュラム等について試行を行い、その過程や結果を踏まえて改善を行う。教材開発についても注力する予定である。また、平成30年度の日本カリキュラム学会において本研究についての発表を行うこととしている。参会のカリキュラム研究者に対して研究の進捗状況について広く情報提供を行うとともに、意見を聴取する。年度内に研究代表者と研究分担者による研究打ち合わせを開催し、平成31年度の研究に向けて方向を明確にすることとしている。令和元年度においては、各研究者の連携を図りながら、引き続き、カリキュラム等の開発と試行を行うこととしている。平成30年度の研究を踏まえ、カリキュラムの開発と展開に当たって必要となる、学生がカリキュラムマネジメントを考えながら学修するための本質的な問いとそれを支える作業課題を明らかにすることに取り組む。さらに、令和元年度においては、特にテキストの開発に注力することとしている。テキストについては、令和2年度から使用できるよう令和元年度中の編集・刊行を目指す。テキストについては、およそ20講で構成し、学生の実態等に即して弾力的に活用できるものを開発する予定である。研究代表及び研究分担者による研究打ち合わせを行うに際して、全員が集まりやすい地域で開催するよう配慮するとともに会合で顔を合わせる機会を活用したため、旅費を中心に次年度使用額が生じた。平成30年度以降、研究打ち合わせや研究の過程や結果の分析に係る経費として効果的に使用していく予定である。研究代表及び研究分担者による研究会議を行うに際して、会合で顔を合わせる機会を活用したり、全員が集まりやすい地域で開催するよう配慮した。このため、旅費を中心に次年度使用額が生じた。令和元年度以降、研究会議や研究の過程や結果の分析に係る経費として効果的に使用していく予定である。
吸着剤微粒子を内包した高分子モノリスの開発と水処理フィルターとしての応用

水処理の高速化を可能にする吸着剤微粒子を包埋した高分子モノリスフィルターを開発することを目的として、ヒ素の高性能吸着剤である酸化チタン微粒子を内包した高分子モノリスを作製する方法を確立するとともに、高分子モノリスを水処理フィルター用成形体に加工する技術を開発した。また、ヒ素の吸着等温実験および吸着速度実験を行い吸着分離性能の評価を行った。加えて、吸着後のヒ素を定量的に溶離する手法も確立した。また、水中からのヒ素の吸着分離装置を用いて、ヒ素の吸着分離特性と吸着速度について定量的に明らかにし、最適な吸着性能を得られる条件を確立した。水処理の高速化を可能にする吸着剤微粒子を包埋した高分子モノリスフィルターを開発することを目的として、無機吸着体の特異的吸着選択性に焦点を当てて、ヒ素の高性能吸着剤である酸化チタン微粒子を用いて、酸化チタン微粒子を内包した高分子モノリスを作製する方法を確立するとともに、高分子モノリスを水処理フィルター用成形体に加工する技術を開発するものである。本年度は、応用的研究として以下の研究を行った。(1)酸化チタン微粒子内包高分子モノリスによるヒ素の吸着分離性能の評価種々の条件下で作製した酸化チタン微粒子内包高分子モノリスのヒ素の吸着特性を評価し、酸化チタン微粒子本来のヒ素吸着特性との比較検討を行った。ここでは、ヒ素のみを含有する水溶液を供給溶液とし、吸着のpH依存性について検討すると共に、吸着等温実験および吸着速度実験を行い吸着特性の評価を行った。(2)吸着分離装置によるヒ素廃水の浄化性能の評価以上の結果を基に、自作の吸着分離装置とポンプなどを組み合わせ、ヒ素廃水中からのヒ素の吸着分離装置を設計・製作した。水処理カートリッジは、カラム用高分子モノリス成形体を用いて作製した。まず初めに、ヒ素のみを含有する水溶液を供給溶液としてヒ素の流通式分離除去実験を行い、ヒ素の吸着分離特性と吸着速度について定量的に明らかにし、最適な吸着性能を得られる条件を確立した。続いて、ヒ素を含有する実地下水を供給溶液としての実証試験も行い、ヒ素の吸着挙動について実験条件の影響について詳細に調べ、ヒ素の高速吸着除去プロセスへの適用性について検討した。水処理の高速化を可能にする吸着剤微粒子を包埋した高分子モノリスフィルターを開発することを目的として、無機吸着体の特異的吸着選択性に焦点を当てて、当研究室で開発しているヒ素の高性能吸着剤である酸化チタン微粒子を用いて、酸化チタン微粒子を内包した高分子モノリスを作製する方法を確立するとともに、高分子モノリスを水処理フィルター用成形体に加工する技術を開発する。本年度は、基礎的研究として以下の研究を行った。(1)酸化チタン微粒子を内包した高分子モノリスの作製酸化チタン微粒子の合成は、四塩化チタンとアルカリ源を混合して調製した水酸化チタンを、過酸化水素にてアモルファス酸化チタンへと変換した後に、水熱合成法にてアナタース酸化チタン微粒子を調製した。種々の条件で調製した酸化チタン微粒子とPMMAを80%エタノールに懸濁させ、60°Cに温めてPMMAを溶解させ、その後冷却することによって相分離を誘発させ微粒子を内包したモノリス体を作製し、PMMAの分子量や冷却温度(40°C、4°C、-29°C)に対する多孔体中の細孔径と空隙率、酸化チタン微粒子の内包量との関係を明らかにした。また、酸化チタン微粒子内包高分子モノリスの形態観察と結晶構造は走査型電子顕微鏡および粉末X線回折装置を用いて行った。(2)酸化チタン微粒子内包高分子モノリスによるヒ素の吸着分離性能の評価種々の条件下で作製した酸化チタン微粒子内包高分子モノリスのヒ素の吸着特性を評価し、酸化チタン微粒子本来のヒ素吸着特性との比較検討を行った。本研究は2年計画であり、初年度の基盤的研究、2年度の応用的研究を予定している。平成24年度は、ヒ素の高性能吸着体である酸化チタン微粒子を内包した高分子モノリスの作製法の確立とヒ素の吸着分離性能の評価について研究を行うなど、ほぼ基礎的研究は完了することができた。平成25年度は、平成24年度に引き続き、(1)(2)の吸着剤微粒子内包高分子モノリスの作製の研究は継続して行うが、それに加えて、以下のような水処理フィルター成形体への加工および廃水浄化性能の評価研究も行い、フィルターの作製条件の最適化へフィードバックする。

これに続いて、ヒ素を含有する実地下水を供給溶液としての実証試験も行い、ヒ素の吸着挙動について実験条件の影響について詳細に調べ、ヒ素の高速吸着除去プロセスへの適用性について検討する。該当なし
ミクロスケール化学実験教材の開発

1.高校化学のミクロスケールの実験教材の開発培養用のミクロプレートを使うミクロスケール実験を次の(1)(5)のテーマについて開発し,マニュアルを作成した。(1)金属および金属イオンの性質についての実験:金属と酸の反応,イオン化傾向などの金属の性質,金属イオンと種々の試薬の反応などをさまざまな組み合せで調べる。(2)酸,塩基および塩の性質についての実験:酸性,アルカリ性と中性,強酸と弱酸,溶液のpHなどの概念の理解に有効なマニュアルを開発した。(3)中和滴定:中和滴定における滴定曲線の作成を通じて,そのいくつかの型,指示薬の選択について理解させる。(4)化学平衡についての実験:酸塩基平衡,錯体の生成平衡などについて,ルシャトリエの法則を検証する。(5)反応速度の実験:ヨウ素時計反応をさまざまな条件で実験し,速度に対する濃度,温度および触媒の影響を調べる。(1)(5)の実験マニュアルはいずれも実験に生徒実験あるいはクラブ活動として実施したが,その結果次のメリットがあることがわかった。(1)生徒の興味を引き,探求心育成に役立つ,(2)基本概念の理解に効果的である,(3)実験時間の短縮,また,その結果,授業時間中に実施できる内容を豊かにできる,(4)実験廃棄物を少量化しその処理に要する作業,経費が節約できる,(5)試薬と経費の節減,省資源となり,また環境問題への関心の啓発ができる,(6)安全性が増し,事故発生の防止に役立つ,(7)準備,片付けに要する労力,時間の節減,(8)手軽に簡単に実施でき,生徒実験のわずらわしさに対する教師の心理的障壁を小さくする。これらについては,本年12月に開催される1995環太平洋国際化学会議で発表することを計画している。2.大学・短大基礎教育化学実験のミクロ化(1)化学反応速度についての実験:スピロピランのフォトクロミズムを利用した反応速度の実験教材を開発した(発表:次頁の雑誌論文及び図書参照)。(2)半定量実験:ソフトドリンク中の鉄についての実験(発表:次頁の雑誌論文参照),ミクロ中のカルシウムの実験(日本化学会第69春季年会発表予定;講演番号3F108)1.高校化学のミクロスケールの実験教材の開発培養用のミクロプレートを使うミクロスケール実験を次の(1)(5)のテーマについて開発し,マニュアルを作成した。(2)半定量実験:ソフトドリンク中の鉄についての実験(発表:次頁の雑誌論文参照),ミクロ中のカルシウムの実験(日本化学会第69春季年会発表予定;講演番号3F108)
リプログラミングを促進するＲＮＡ結合タンパク質ＰｐＣＳＰの分子機能の解明

RNA結合タンパク質PpCSPによるリプログラミング促進の分子機構を解明することが本研究の目的である。そのために、PpCSPの標的RNAおよび相互作用タンパク質の同定を試みた。RNA免疫沈降ーシーケンシング法を行った結果、PpCSPがほぼ全てのmRNAと結合することを示す結果を得た。また、PpCSP過剰発現株で顕著に高く発現する遺伝子群について、過剰発現株を作出した結果、複数の株で形態異常を観察した。さらに、免疫沈降法および液体クロマトグラフィー質量分析法によって、PpCSPの相互作用相手を複数同定した。これら相互作用タンパク質の細胞内局在は、おおむねPpCSPと一致した。RNA結合タンパク質PpCSPの(A)標的RNAおよび(B)相互作用タンパク質を同定することで、PpCSPによるリプログラミング促進の分子機構を解明することが本研究の目的である。(A)昨年度までに、RNA免疫沈降ーシーケンシング法によって、PpCSPがほぼ全てのmRNAと結合するという結果が得られた。この結果をさらに検証するため、現在最も精度よく結合RNAを単離できるとされているRNA crosslinking immunoprecipitation-sequencing (CLIP-seq)を進めている。CLIP-seqは動物の培養細胞以外を試料として用いた実験例が存在しない。そのため、ヒメツリガネゴケを用いた実験の条件検討を行い、クロスリンク条件の最適化や放射性同位体を用いない手法の開発を行った。また、mRNA結合タンパク質は一般にmRNAの成熟や安定性、翻訳の制御に機能する。PpCSPがmRNAの安定性に機能するのであれば、PpCSPの標的mRNAはPpCSP過剰発現株で高発現を示すと考えられる。野生型と比較してPpCSP過剰発現株で顕著に高く発現する遺伝子群について、遺伝子欠失株や過剰発現株の作出と表現型解析を行った。その結果、過剰発現によって形態異常を示す複数の遺伝子を同定した。今後、これらの株を用いたリプログラミングの表現型解析とCLIP-seqを行うことで、PpCSPの標的mRNAの候補を同定できると期待される。(B)昨年度までに、免疫沈降法および液体クロマトグラフィー質量分析法により、PpCSPと相互作用するタンパク質を複数同定した。これらと蛍光タンパク質の融合タンパク質をヒメツリガネゴケに発現させたところ、細胞質基質においてPpCSPタンパク質との共局在が観察された。以上の結果から、PpCSPの相互作用タンパク質を複数同定することに成功した。これまでに我々は、ヒメツリガネゴケにおいて幹細胞に強く発現するPpCSPがリプログラミングの促進に機能することを明らかにした。さらに、PpCSPは動物における誘導多能性幹細胞化因子の一つLin28のホモログであることを発見した。PpCSPおよびLin28は細胞質に局在するRNA結合タンパク質であることが共通している。しかしながら、リプログラミングを制御するLin28の代表的な標的RNAは植物に保存されておらず、PpCSP/Lin28によるリプログラミング促進の分子機構は動植物間で異なると考えられる。本研究では、PpCSPの(A)標的RNAおよび(B)相互作用タンパク質を同定することで、PpCSPによるリプログラミング促進の分子機能を解明することを目的とする。(A) PpCSP1-YFPノックイン株と抗GFP抗体を用いてRNA免疫沈降法を行い、得られたRNA分子を大規模シーケンスするRNA免疫沈降ーシーケンス法(RIP-seq)により、PpCSPに結合するRNA分子を網羅的に同定することを試みた。まず、免疫沈降の前にpoly A tail精製を行ってmRNAのみを濃縮したmRIP-seqを行ったところ、ネガティブコントロールと比べて明らかに高いmRNAの濃縮が観察された。PpCSPの標的RNAの一部はmRNAであることが示された。また、そのmRNAのパターンはポジティブコントロールであるInputとほぼ同じであった。この結果は、PpCSPがほぼ全てのmRNAと結合していることを示唆している。(B) PpCSP1-YFP株と抗GFP抗体を用いた免疫沈降法によりPpCSPを含むタンパク質複合体を単離したのち、高速液体クロマトグラフィー質量分析法(LC/MS)により複合体に含まれるタンパク質のアミノ酸配列を決定し、PpCSPの相互作用相手を網羅的に同定した。平成24年度の当初の研究目的は(A)植物を用いたRIP手法の確立とPpCSPが標的とするRNA分子の種類の同定、野生株とPpCSP遺伝子欠失株を用いたトランスクリプトーム比較、および(B) PpCSPと相互作用するタンパク質の網羅的な同定であった。(A)については、現在トランスクリプトーム解析の実験中で当初計画よりやや遅れているが、RIPについてはmRIP-seqに成功するなど当初の計画以上に実験が進展している。

また、(B)については、PpCSPに結合するタンパク質を複数同定することに成功しており、計画通り順調に実験が進展している。以上の状況から、「(2)おおむね順調に進展している。」とした。PpCSPはRNAの成熟、分解、輸送、翻訳などを制御していると考えられる。野生株とPpCSP遺伝子欠失株におけるmRNA、ncRNA、低分子RNAのトランスクリプトーム比較を行うことで、PpCSPが成熟と分解に関与するRNA分子を網羅的に同定する。以上の解析で同定したPpCSPの標的RNAや相互作用タンパク質がリプログラミングに機能しているか調べるため、標的RNAや相互作用タンパク質をコードする遺伝子の欠失株および誘導過剰発現株を作出し、リプログラミングの表現型を観察する。リプログラミングの遅延や促進の表現型を示した遺伝子については、tagRFP遺伝子のノックイン株を作出し、PpCSP1-YFPと一緒にその発現を観察することで、PpCSPとどのように相互作用しながらリプログラミングを制御しているのかを解明する。以上の実験によって、PpCSPによるリプログラミング促進の分子機構を解明する。RIP-seqやトランスクリプトーム解析などのオミクス解析のためには、ヒメツリガネゴケの大量培養と、そうした大量の組織からのRNA抽出が必要となる。また、LC/MSによって得られたPpCSPの相互作用タンパク質は数多く、さらにHITS-CLIPによってPpCSPの標的RNAも複数得られると考えられる。こうしたPpCSPの相互作用タンパク質や標的RNAをコードする数多くの遺伝子について欠失株・過剰発現株の作出を行う予定である。以上の実験を効率的に行うため、ヒメツリガネゴケの大量培養とRNA抽出、また形質転換用DNAの調整を主に行う研究補助員を雇用する。また、消耗品費として主に次世代シーケンサーの試薬代、ヒメツリガネゴケ培養器具代、形質転換用DNA調整試薬代を計上する。さらに、研究協力者との年数回の研究打合せ、国内学会と海外学会への参加と成果発表を各1回ずつ計画している。そのための旅費を計上した。こうした打合せや成果発表を通じて、本研究へのフィードバックを得ると同時に、積極的に研究成果の発信に努める。
概日リズムと発がん制御とのクロストークの研究

本研究課題は、概日リズムと発がん制御とのクロストークの研究である。これまでの研究で、時計遺伝子mPer2のノックアウトマウスにおいてリンパ腫が発生することが知られている。本研究課題では、哺乳類時計タンパクmPER2について、細胞内でどのような因子と複合体を形成しているのかを、複合体タンパク精製とそれに引き続く質量分析による解析で明らかにする。我々は、Tet-Offシステムを用いて薬剤依存性にflag-mPer2遺伝子の発現が制御できる安定細胞株を作成した。このTet-Off / flag-mPer2細胞株を大量培養し、得られた細胞抽出液をまずグリセロール濃度勾配遠心分離によって文画し、抗flag抗体を固定したアフィニティーカラムを用いてflag-mPER2を含むタンパク複合体を精製した。得られたタンパク複合体をSDS-PAGEにて展開し、タンパクを分離した。特異的なバンドを切り出し、トリプシンでゲル内消化したのち、MALDI-TOF MS/MS法にて質量分析を行った。その結果、いくつかのタンパクが同定されたが、そのうち細胞分裂などに関連する可能性のある一つのタンパクについて詳細な検討を加えた。得られたタンパクのcDNAを取得し、NIH3T3細胞にmPer2と共に一過性に発現させ、実際にこのタンパクとmPER2が細胞内で相互作用することを免疫沈降法で確認した。現在、このタンパクの概日リズムにおよぼす機能と、発がん制御につながる機能との両面から詳細に検討している。今後、mPer2以外の時計遺伝子についても同様に安定発現細胞株を樹立し、タンパク質複合体の解析を行っていく予定である。また、細胞レベルでの研究の他に個体レベルでmPER2発現と発がん制御との関連を解析するために、Tetシステムを利用した時間的な発現調節が可能な遺伝子導入マウスの作製を行っている。現在、遺伝子導入マウスが複数ライン取得できており、導入遺伝子の発現が適切に認められるかを検討している段階である。
キンギョにおけるグレリンの生理的意義の解明

グレリンは、哺乳類の胃より発見された成長ホルモン放出促進作用を有するペプチドホルモンであり、摂食調節にも関与する。グレリンは脂肪酸修飾という特徴を有しており、哺乳類以外にも鳥類、爬虫類、両生類及び魚類において同定されている。しかしながら、魚類で初めてグレリンの遺伝子情報が示されたキンギョは明確な胃を持たず、グレリンの同定は行われていなかった。そこで我々は、キンギョグレリンの分子構造を明らかにするために、グレリンの単離、精製を行った。遺伝子情報に基づくRT-PCR法により、キンギョの腸において最もグレリンmRNA発現量が多いことを明らかにし、1540匹のキンギョから約200gの腸を摘出した。採集した腸よりタンパク質を抽出し、高速液体クロマトグラフィー法により分画した。グレリン活性を示す画分からグレリンを単離・精製し、シークエンサーによりグレリンペプチドを構成するアシノ酸を明らかにし、マススペクトル解析より分子量を測定した結果、11種類のキンギョグレリンを同定した。キンギョグレリンが複数存在するは修飾する脂肪酸の違い及びアミノ酸残基数の違いによるものであり、キンギョグレリンを同定することによって初めて明らかになった事実である。次にキンギョにおけるグレリンの生理的役割を探るために、キンギョ由来のグレリンを合成した。合成キンギョグレリンの投与はキンギョの摂食量を増加し、グレリンはキンギョの摂食調節機構に関与することを明らかにした。これは同種由来のグレリンを用いて得られた初めての実験結果であり、キンギョにおけるグレリン研究の基本的かつ重要な基盤を形成する第一歩である。以上の結果を踏まえ、キンギョにおけるグレリンの生理的役割についてさらに解析を進める必要がある。
心筋保護液間欠投与の最終保護液温がエネルギ-代謝と心機能に与える影響に関する研究

関心術時の虚血心筋に対し、従来通りの灌流液で再灌流した場合に比し、再灌流時に加温心筋保護液を投与した後通常の灌流を行なった場合いかなる効果が得られるかを知る目的で実験、研究を行なった。対象と方法:成熟動物として生後2ヵ月のモルモットを、また新生仔として生後5ー7日のモルモットを用いた。これらより摘出した心臓を15分間のLangendorff灌流の後20分間working modeとし、心筋保護液(酸素化した20°CのSt.Thomas液)を20ml/kg、1回投与し虚血心停止とした。全虚血時間は180分とし、心筋温は20°Cに維持した。対照群は再灌流時に一貫して37°CのKrebsーHenselite液で灌流した群とし、処置群は再灌流時初めの3分間に37°Cに加温した酸素化心筋保護液を同じ灌流圧で投与した後KrebsーHenselite液に切り替え灌流した群で、この2群間でworking modeの最終段階の大動脈流量回復率、心筋組織高エネルギ-燐酸化合物含量、心筋細胞内カルシウム含量について比較検討した。結果:大動脈流量は成熟モルモット、新生仔ともに対照群に比し処置群で有意に良好な回復率を示した。高エネルギ-燐酸化合物は対照群と処置群との間に有意差は認めなかった。心筋細胞内カルシウム含量は新生仔、成熟モルモットともに有意差を認めなかったが処置群で低い傾向であった。結論:心筋保護法において再灌流時に加温酸素化心筋保護液を投与するwarm terminal cardioplegia法は再灌流後の心機能回復に良好な結果をもたらした。この結果は心筋の高エネルギ-燐酸化合物の代謝産生によるものではなく細胞膜の機能(イオン環境維持)に関連している可能性が示唆された。
一官能基型金ナノラベル剤の開発およびクライオ電子顕微鏡による生体分子相互作用解析

本研究の目標は,高性能の無機・有機複合材料の調製法を確立すれば達成できると考え,平成26年度は,金ナノ粒子とともに無機材料と蛍光色素が併存する複合材料からのアプローチも遂行した.第一の課題については,昨年度,ペプチド固相合成によって所期の官能基を保持した金ナノ粒子の調製が確かめられたことに基づき,液相合成によるペプチドの大量合成を実施した.このとき,系統的な構造をもったペプチドを得るため,リンカー長を種々変化させ,また,グリシンを挿入して官能基の方向を揃えることを試みた.その結果,良好な相互作用を得るためには,安定性とともにペプチドの配向性の自由度を制限することが効果的であることが分かった.次に,生体適合性の高いナノ粒子を獲得するため,無機セラミックス材料である緑色長残光蛍光体を母体として選択した.実験は緑色長残光蛍光体を粉砕し均一なナノ粒子を得る条件検討から始まった.続いて,その表面に疎水鎖を導入した後,両親媒性ポリマーで被覆することで,必要とされる耐水性および分散性をもったナノ粒子を作成するプロトコールを確立した.次に,被覆する両親媒性ポリマーの両末端に有機蛍光色素を共有結合で連結することを試みたが,得られた試料には有機蛍光色素は残存していなかった.そこで,疎水性相互作用で粒子表面に有機蛍光色素を挿入する手法を検討し,その結果,良好な特性を有する試料を得ることに成功した.続いて,無機材料と蛍光色素との相互作用がスイッチングする工夫として酢酸エステルのエステラーゼによる加水分解を試みた.その結果,長残光蛍光体から蛍光色素へのエネルギー移動が観測され,所期の目的を達成した.本研究の中心的課題は,いかにして金ナノ粒子の1粒子に確実に一つの官能基を導入するかにある.固相合成用の樹脂上での高効率クリック反応が実現できればこの課題は達成できると考え,平成25年度は,次の二方面からのアプローチを遂行した.第一はクリック反応の高効率化である.クリック反応は銅イオンによって触媒されるが,このとき配位子を必要とする.現在実用化されている配位子は大量合成に不向きであるため,本研究の目標達成には不適当である.そこで,入手容易なピコリルアミンと骨格とする配位子の設計と合成を実施した.合成した配位子のいくつかは良好な活性を有していたものの,反応中に分解するという欠点があった.次に,配位子構造の一部を安定なアセトアミドに置き換えた.その結果,安定で高活性な新規配位子を得ることができた.さらに,本配位子はあらかじめ銅塩と混合することで固体の錯体を調製することが可能であった.従来の配位子は銅塩とともに,それぞれ反応液に添加しなければならない事実に比較して,この点も大きな進歩であり,ここに本研究課題達成に適したクリック反応が確立できたといえる.次にペプチド固相と組み合わせた金ナノ粒子の調製である.この合成では,N末端を金ナノ粒子の配位子とし,C末端を必要とする官能基の連結部とすることを考えた.それらの間がリンカーとなり,ここに適切なアミノ酸を選択できるのが,この設計のメリットである.N末端として金ナノ粒子に配位するリポ酸を用い,C末端の官能基のモデルとして,フッ素NMRによる検出を想定して,ベンゼン環をフッ素原子で置換されたフェニルアラニンを用いて合成を実施した.リンカー部を酵素によって加水分解することによって,NMRスペクトルにおいて明確なシグナルの変化が観測された.この事実は所期の官能基を保持した金ナノ粒子が調製できたことを示している.本研究の目標は,高性能の無機・有機複合材料の調製法を確立すれば達成できると考え,平成26年度は,金ナノ粒子とともに無機材料と蛍光色素が併存する複合材料からのアプローチも遂行した.第一の課題については,昨年度,ペプチド固相合成によって所期の官能基を保持した金ナノ粒子の調製が確かめられたことに基づき,液相合成によるペプチドの大量合成を実施した.このとき,系統的な構造をもったペプチドを得るため,リンカー長を種々変化させ,また,グリシンを挿入して官能基の方向を揃えることを試みた.その結果,良好な相互作用を得るためには,安定性とともにペプチドの配向性の自由度を制限することが効果的であることが分かった.次に,生体適合性の高いナノ粒子を獲得するため,無機セラミックス材料である緑色長残光蛍光体を母体として選択した.実験は緑色長残光蛍光体を粉砕し均一なナノ粒子を得る条件検討から始まった.続いて,その表面に疎水鎖を導入した後,両親媒性ポリマーで被覆することで,必要とされる耐水性および分散性をもったナノ粒子を作成するプロトコールを確立した.次に,被覆する両親媒性ポリマーの両末端に有機蛍光色素を共有結合で連結することを試みたが,得られた試料には有機蛍光色素は残存していなかった.そこで,疎水性相互作用で粒子表面に有機蛍光色素を挿入する手法を検討し,その結果,良好な特性を有する試料を得ることに成功した.続いて,無機材料と蛍光色素との相互作用がスイッチングする工夫として酢酸エステルのエステラーゼによる加水分解を試みた.

その結果,長残光蛍光体から蛍光色素へのエネルギー移動が観測され,所期の目的を達成した.目標の30%程度の達成点にあると考える.目標とする一官能型金ナノラベル剤はいまだ手にしていないが,その合成を実現するためのクリック反応の高効率化とペプチド固相と組み合わせた金ナノ粒子の調製に関する基礎データは着実に得られ,また,必要とする技術も蓄積されてきた.本年度,固相合成用の樹脂上でのクリック反応を実施して,一官能型金ナノラベル剤を調製する.反応の進行は,樹脂上への金コロイドの着色によって確認する.続いて,ペプチドを樹脂から切り出し,ニッケルイオンを作用させた後,ゲルろ過によって精製する.
AP-PCRを用いたDNAフィンガープリント法によるトリパノソーマ原虫株の分類

シャーガス病は、中南米に広く流行しその病型も様々である。本疾病の病原体であるトリパノソーマ原虫は、これまでアイソエンザイムやモノクロナル抗体などを使って分類されてきたが、今回、Arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR)によるDNAフィンガープリント法による分類法を試みた。用いたトリパノソーマ原虫株は、中南米各地のTrypanosona cruziおよびT.rangeliのリファレンス株と、パラグアイの人および媒介昆虫であるサシガメから分離された株である。これらの株のエピマステゴ-ト型原虫をシュナイダー培地にて培養し、SEバッファーを加え、プロテナーゼKとザルコシールで処理した後、超遠心機でキネトプラスト(k)DNAと核(n)DNAに分離した。これらを精製しAP-PCRのテンプレートとした。AP-PCRのプログラムはアニーリング温度を最初10cycleを37°Cで次の30cycleを60°Cでセットした。プライマーは検討した結果、21merのLS-3が、差をみるのに最適なDNAフィンガープリントのバンドパターンを出現させることができた。同一株においてkDNAとnDNAによる差はあまりはっきりしなかった。これは少しでもテンプレートが存在するとPCRで増幅されてしまうため、遠心法で完全にDNAを分けることは不可能であると考えられる。逆にAP-PCR法の場合、kDNAとnDNAを分ける必要もないと思われた。株間の違いは、T.rangeliが著しく異なっていた。リファレンス株はそれぞれ特有なバンドパターンを示したが、Sao FelipeとY strainがよく類似した。また、パラグアイ2株がTulahuen株と、別の2株がBerenice株と類似した。これらの結果は、kDNAの制限酵素切断パターンの結果(Mimori et al,1992)と同様のパターンを示しておりこの方法も分類同定に利用できるものである。現在、これらのDNAバンドのなかから特異なものを選び出しそのDNAを解析中である。