hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
状況内評価における評価表出行動自動収集分析システムの研究

本研究は新しい形成的教育評価の方法の開発を目的として、学習者が無自覚に他者に対して表出する評価行動の自動記録システムの開発を行った。具体的には学習者の頭部にとりつけたモーションセンサーとマイクから、学習者の肯定的な反応と否定的な反応を認識し、誰が誰に対して肯定的/否定的な発言を行ったかを自動的に記録し、それをほぼリアルタイムで集計して学習の場にフィードバックすることができるシステムを目標とした。つぶやき認識、ジェスチャ認識ともに認識率が低かったが、両者には強い共起関係があるので、その両方を組み合わせることで認識率の向上を図った。しかし、結果として実用に十分な認識率には至らなかった。本研究の目的は、活動の現場で相互行為的に可視化される社会構築物としての「実践能力」に基づいた、新しい形成的教育評価の方法を開発することである。この目的を達成するため、(1)学習者が無自覚に他者に対して表出する評価の自動記録システムの開発、および(2)このシステムを協調学習の場に導入し実践を考察することで、教育現場での活用モデルの開発を実施する必要がある。平成25年度は、上記のうち(1)に関する研究開発を実施した。システムが満たすべき要件は,能力が発揮されたその場その時において,その場にいる人々が他者の行為に対して行った評価を記録・蓄積することである。「評価」の方法は様々であるが、この研究では「頷き」と「つぶやき」から、実践中に学習者が自然に表出する行為を「評価」行動と定義しているため、実際に行われた数時間分の議論からこの条件に合致する評価行為を抽出し、行為として分類した後、この評価を自動的に認識するためのシステム設計と実装を行った。また、「頷き」と「つぶやき」を自動検出するシステムの開発を行った。先行研究を参考に認識システムの選定を行った結果、頷きについては神戸大学の塚本・寺田研究室で開発されているジェスチャ認識システム、音声認識については京都大学で開発され、フリーソフトとして一般に公開されているJuliusを用いることにした。ただし、Juliusについては本来の目的が会話認識であり、「つぶやき」で用いられるような単語、例えば「なるほど」などの感嘆詞に相当する単語の認識に特化していないため、本研究の要件に合うよう、認識辞書などの新規作成を行った。年度末にかけては、「頷き」の推定結果と「つぶやき」の推定結果を総合して、尤もらしい評価を推定するために、ベイズ推定を用いた評価推定システムの設計と実装を行っている。本研究の目的は,教育活動の現場で相互行為的に可視化される社会構築物としての「実践能力」に基づいた,新しい形成的教育評価の方法を開発することであるが、そのために本年度は、うなずきなどの意味をもつジェスチャーを認識する技術,学習者が発する相づちや間投詞を認識する技術,などの要素技術開発を行った。うなずき動作検出は、頭部に加速度センサを搭載しデータ処理することで、様々な頭部動作からうなずき検出を試みた。具体的には、頭部にiPod Touchを搭載し、内蔵加速度センサで計測されたデータを無線LAN経由でデータ収集サーバに送信し、サーバでうなずき動作の認識を行った。認識手法については、神戸大学の村尾助教よりうなずきに特化した認識モデルの提供を受けた。結果として、単純に首を前後に振る程度のうなずきはある程度認識できるものの、周期の長い、あるいは短周期のうなずき(やや否定的なうなずきや大いに賛同するときにこのようなうなずきが現れやすい)の認識や、首かしげなど、うなずき以外の意味を持つジェスチャーの認識については十分な認識結果を得られておらず、今後の課題となっている。音声認識については、日本語音声認識エンジンJuliusを用いて、評価に関する短い発話を認識するシステムの開発と評価実験、および複数人が自然な会話をしているときに出てくる評価発話の認識実験等を行った。本来Juliusは膨大な語彙数から構成されている辞書を用いて認識しているが、間投詞などは誤った単語として認識される傾向にある。そこでこの研究ではあえて間投詞や同意、否定などの語彙だけに絞った厳選辞書を作成し、それを認識辞書として利用することを試みた。実験の結果、統制された状態では標準辞書74%、厳選辞書94%と認識精度の向上が見られたが、話しことばを含む日常会話では、認識率は厳選辞書においても32%程度に留まった。

平成26年度は、能力が発揮されたその場その時において,その場にいる人々が他者の行為に対して行った評価を記録・蓄積することを目標に、表出行動のうちの「頷き」と「つぶやき」から行為者の行為の種類を自動的に認識する方法についてシステム設計と実装を行った。頷きについては神戸大学の塚本・寺田研究室で開発されているジェスチャ認識システム、音声認識については京都大学で開発され、フリーソフトとして一般に公開されているJuliusを用い、その両方を組み合わせることで認識の精度を上げる方法を試みた。具体的には、学生4名があるテーマについてディスカッションしている様子をビデオにとり、それを分析して、「発話(はい、なるほど、うん等)」と「頭部動作(頷き、首振り)」との共起関係を調査した。その結果、両者には強い連関が認められた。そこで、共起関係から条件付き確率を求め、それと頭部動作の認識結果の信頼度から導いた頭部動作の確率分布から音声認識結果の確率分布を推定した。そして、その推定値を重みとして、実際のJuliusの認識結果の単語信頼度に掛け合わせることで、最終的な認識結果を得た。この方法を用い、実データ287個を10等分して1:9に分け、1をテストデータ、9を学習データとして、10通りの分け方でそれぞれ交差検証法を行った。結果として、認識率は37%であり、認識率はあまり向上せず、実用に供する水準にはまだ達していない。教育工学システムの中核部分である「評価の自動認識」、すなわち「頷き」の認識と「つぶやき」の認識システムの開発において、ほぼ当初の計画通り進捗している。本研究は「ジェスチャ認識」と「音声認識」という、各々の分野そのものが発展途上である技術を取り入れた、挑戦的な研究である。そのためには、各分野の専門となる研究の調査や研究者へのヒアリングなども必要と認識し、平成25年度の初めにヒアリング等を実施し研究実施内容の再検討を実施した。検討の結果、ジェスチャ認識については、従来からジェスチャ認識技術において多くの成果を挙げている神戸大学の寺田准教授から技術指導を受けた上、平成26年度は研究協力者として本格的に参画して頂くことで、ジェスチャ認識技術の向上が見込めることになった。音声認識については、筑波大学ほか各大学で音声認識システムを利用したシステムを開発している研究者の意見を参考に、音声認識技術の実践的な利用方法のほか、周辺技術に関して意見を頂くことで、研究方針がより明確となった。音声認識の分野においては、新たな研究分担者や協力者の追加はないものの、本研究の参画者らは音声認識技術に関する研究者らから常に技術協力を受けることでできる体制にあり、また随時アドバイスを受けているため、今後の開発においても研究開発に支障が出るような問題が発生することは無いと考えられる。今年度の計画にあった、うなずき動作検出技術、評価のつぶやき認識技術、話者特定技術全般において、その認識精度があまり高くないという問題がある。原因としては、各認識システム開発におけるアルゴリズム等に対する理解が不十分であった点、および、評価実験手法の準備不足が挙げられる。さらに、その根本的原因には持てる人材、時間、技術などの研究リソースに対して、研究課題が当初の想定以上に困難であり、計画が過大だったという反省がある。
音声知覚の発達と大脳半球の機能側性化

ヒト成人の大脳左半球に局在する言語機能が生後どのように発達するのかという知見は、言語の進化という観点からも意義深いにも係わらず、ほとんど明らかにされていない。本研究は多チャンネル近赤外分光法(NIRS)を用いて、各種音韻や音声言語の獲得に伴う大脳側頭部の左右半球機能差の発達的変化を明らかにし、モデル化することを目的としている。母語、非母語音声に対する脳活動や行動反応を0-1歳の乳児(日本人、フランス人)について計測し、その結果を「音声言語獲得の大脳半球側性化モデル」として提案し、論文に発表した。・乳幼児研究実施環境の立ち上げ:三田キャンパスでの乳幼児研究の装置や環境を整え、乳幼児のリクルートシステムを構築した。実験参加スタッフを雇用し,研究のための方法,倫理等の教育を行った。データを保存するためのシステムを構築した。慶應大学病院小児科との協力体制を整え,病院に脳機能計測実験環境を整えた。・フランスにおいて新しいNIRSデータ解析システムを構築し、日本からもオンラインでデータ解析を可能にした。・申請書計画中の1)音響特性と左右半球優位性の実験,2)音素の種類と側性化の発達研究について新生児で予備実験を実施した。新生児の段階ですでに音響特性による左右半球の機能側性化が行われていることを示す予備データが得られた。・音韻配列(phonotactics)と長・短母音のNIRS実験を日本とフランスにて8-14ヶ月児について行った。引き続きデータを収集中。・乳児の文中から単語を切り出す能力についてのNIRSおよび行動実験を実施した。乳児は6ヶ月ですでに単語切り出しが可能で、その脳内メカニズムは音韻短期記憶に関する背側経路が関与していることが示唆された。6ヶ月児にそのようなネットワーク形成がされている報告はなく極めて貴重なデータである。・ミスマッチ反応についての脳波とNIRSの同時計測の予備実験を成人で行った。本研究は「音声言語獲得の大脳半球側性化モデル」を海外研究機関および大学病院小児科と提携して検証することを目的としている。このモデルは生後半年辺りまでは、音声言語の音響特徴にそった刺激音声駆動型の左右半球優位性を示すが(例、ゆっくりしたピッチ変化は右半球優位)、言語の獲得という音声特徴の統計的学習により母語の音声特徴はカテゴリー化され、それと共に左側頭部を中心として音声処理回路が構築された結果、音声言語処理の左半球優位性が見られる、と仮定する。このモデルを検証するための実験、具体的には実施計画中の1)音響特性と左右半球優位性の実験,2)音素の種類と側性化の発達研究の一部の結果を得たが概ね仮説を支持する結果となった。例えば新生児においては母音対立に対しては両側性の脳反応、抑揚対立においては右半球優位な脳反応がみられた。この右半球優位性はゆっくりしたピッチ変化は右半球優位であるという刺激駆動型の脳反応として説明ができる。一方で非言語音を使用したNIRS実験では新生児は必ずしも刺激の音響特性に応じた左右半球側性化が見られなかった。これについては、言語音と非言語音の音声特徴の違いが関与している可能性がある。これら新生児や6-10ヶ月児のその他の研究結果について論文化を進めている。またこれらの結果をあわせて、「音声言語獲得の大脳半球側性化モデル」についてのレビュー論文をフランスENSの共同研究者と執筆していたが、昨年12月に投稿し、3月末に受託された。今後はこの論文でのレビューをもとに導きだした今後の研究課題について取り組み、このモデルの検証を行っていく予定である。更には脳領野のコネクティビティの発達変化についても解析ができるようになってきたので、この方法を応用し、左右半球側性化と両側の結び付きの発達変化についても検討する。生後2年間,乳児が母語の音韻,韻律,語彙を獲得する過程に伴って,大脳は大規模な脳内回路の再編成を行い、言語機能は主に左半球に側性化する。本研究はその発達過程の仮説的モデル「音声言語獲得の大脳半球側性化モデル」を海外機関と連携して検証するものである。このために新生児から2歳までの乳幼児に対して,様々な音声刺激に対する脳反応を近赤外分光法で計測する。併せて音声言語の行動学的実験も行い,脳反応データとの関係から検討する。3年間の研究の結果、研究の目的通りに仮説的モデルであった「音声言語獲得の大脳半球側性化モデル」を、日本人乳児、フランス語圏乳児についてNIRSによる脳機能計測を行うことで客観的に検証することができた。例えば、音韻や韻律処理における新生児の脳活動は音韻については充分に側性化が行われておらず、韻律処理については右半球の優位性が確認された。

このことは仮説モデルで示した通り、発達初期の機能側性化は音声の音響的性質に大きく依存し、ゆっくりした韻律処理は右側頭で処理され、音韻の中でも比較的遅いスペクトル変化を持つ母音は両側頭部で処理されるという仮説と一致していた。但し、素早いスペクトル変化を新生児は必ずしも左側頭部優位に処理しないことも別の新生児実験で示され、仮説の修正が必要となった。以上の研究を含む我々の研究結果とこれまでの脳機能研究をメタ解析し、レビューした上で、「音声言語獲得の大脳半球側性化モデル」を提起する論文を研究統括として出版した。
マラリア原虫生殖母体の成熟を制御する転写因子の研究

マラリア原虫ガメトサイトにおいて成熟過程を制御する2種類の転写因子AP2-G1およびAP2-G2を同定した。さらに雄ガメトサイト特異的なクロマチンリモデリング複合体SWI/SNF complexのsubunitが成熟制御に関与していることを見い出した。これらの3分子のChIP-seqを行い各分子の全標的遺伝子を同定した。同定した標的遺伝子についてガメトサイト期における発現・機能解析を行った。本研究の結果、これら3つの分子が単独または協調して、マラリア原虫ガメトサイト形成過程の遺伝子発現を制御していることが示唆された。マラリア原虫雌雄成熟ガメトサイト(生殖母体)は、ヒトから媒介蚊への伝播を担う唯一のステージであり、その成熟過程で発現されるタンパク質は薬剤開発や伝播阻止戦略の重要な標的である。しかしながら血液中でマラリア原虫ガメトサイトが如何にして感染性の雌雄ガメトサイトへと成熟していくのか、その機構はこれまで全くわかっていなかった。申請者はネズミマラリア原虫Plasmodium bergheiガメトサイトにおいて、AP2 family転写因子であるAP2-G1(APETALA2 in gametocyte 1)およびAP2-G2(APETALA2 in gametocyte 2)がこの成熟過程を制御していることを見出した。さらに雄ガメトサイトにおいても、雄特異的なクロマチンリモデリング複合体SWI/SNF (mating-type swiching / sucrose non-fermenting) complexのsubunitが成熟制御に関与していることを見い出した。AP2-G1およびAP2-G2について、ChIP-seq(chromatin immunoprecipitation and sequencing)を行い、各転写因子の全標的遺伝子を同定した。そして、それら遺伝子のガメトサイト期における発現・機能解析を行った。また人工染色体を用いたレポーターアッセイを行い各転写因子のシス配列を同定した。本研究による成果は、ヒトから媒介蚊へのマラリア伝播阻止戦略のための強力な情報を提供するとともに、ライフサイクルを通したマラリア原虫遺伝子発現制御機構解明へ大きく貢献するものである。すなわちAP2-G1は雌雄ガメトサイトの遺伝子群を、AP2-G2は雌ガメトサイトの遺伝子群を特異的に制御して雌雄それぞれのガメトサイトに成熟させている。AP2-G1およびAP2-G2について、クロマチン免疫沈降法(ChIP)により得られたAP2-G1およびG2結合配列に関してChIP-seq法を行い全標的遺伝子を同定し、cis配列の予測を行っている。ChIP-seq (chromatin immunoprecipitaion-sequencing)法等行い計画した実験についておおむね順調に進んでいる。ひき続きAP2-G1およびAP2-G2のChIP-seq法による解析およびcis配列解析等を行う。さらに、予測した各転写因子cis配列についてゲルシフトアッセイおよびレポーターアッセイを行いcis-acting elementとしての証明を行う。さらに各因子間の相互作用をFRETにより解析し、構築したモデルの妥当性の検証を行う。さらに各標的遺伝子について遺伝子欠損原虫を用いた機能解析およびGFP融合タンパク質発現原虫を用いた発現解析を行う。遺伝子解析用試薬、通常試薬、実験動物・飼料、プラスチック器具などの実験に必要な物品の購入、また再現性確認のためにChIP-seq法を行う。
環地中海における農業生産と「地中海連合」域内の食料貿易に関する研究

本研究は、地中海に面する北アフリカの諸国とヨーロッパの諸国との間で、どのような食料貿易が行われており、それが地元の食料生産にどのような影響を与えているかを明らかにした。アフリカではモロッコとチュニジアを選んだ。調査の結果、チュニジアでは、食用作物の小麦を増産するのではなく、輸出作物のオリーブを増産することで、小麦輸入を上回る輸出高を獲得していた。これは「環地中海」貿易圏を超えた小麦の輸入が旧東欧諸国との貿易で獲得できていた為である。モロッコではヨーロッパやアメリカとのFTAによって貿易を結び、不利な貿易状況にあった。いずれの場合も「環地中海連合」域圏の弱体化がみられた。本年度は、環地中海貿易と食料生産について、チュニジアを中心に調査を実施した。北アフリカ側の対象国としては、前年度のモロッコに続く研究である。ポルトガルで行なわれた第13回世界農村社会学会で、食料貿易の自由化がもたらす影響と結び付けて、日本農業と比較した研究発表を行ない、環地中海諸国の研究者と討論を行なった。チュニジアでの実態調査は、末原と坂梨により、三つの側面から行なった。第一は、チュニジアでの食料品を中心とした物価の変動、農業生産の変動、食料品の輸出入の変動に関する基本統計情報と資料の収集、およびその分析である。第二は、チュニジア全土を対象としたエクステンシブな農業調査により、気候、植生の関係と、農業生産との関係を明らかにした。チュニジアは、地中海性気候、ステップ気候、砂漠気候と大きく分かれており、それぞれの気候の違いが植生や農業生産にも影響を及ぼしている。エクステンシブな調査により、自然環境の農業生産に与えている影響が明らかになった。さらに独立以降の時代に基づき、どのような変化が起こってきたかを記録した。第三は、食料生産と食料貿易との関係が、近年どのように変化してきているかを、市場と農業生産現場への聞き取りと文献調査から行なった。北部チュニジアでは、小麦と野菜の生産が行なわれているが、小麦の生産は一定程度に限られ、そのために小麦の輸入量は増大していた。一方、北部やボン岬では、野菜の生産が拡大していた。野菜生産の増加は都市住民の食料に対して、栄養学的にも極めて重要な役割を果たしていることが明らかになった。一方、中部ではオリーブ農業が拡大しており、オリーブ油の加工品の輸出が増大し、これによって小麦の食料輸入額を補てんしていることが明らかになった。さらに南部のデーツも、広く食用となる一方で、最近は海外への輸出品となって外貨を稼いでいることが明らかになった。地中海における農業生産に関する研究においては、特に、北アフリカの諸国として、モロッコとチュニジアを選択し、調査を実施した。最終年度においては、モロッコにおける調査を実施した。この地域においては農業生産の研究と食料貿易の研究がリンクされてこなかったのに対し、本研究では両者の関係を明らかにすることができた。しかし、当初想定していた「環地中海連合」域内の食料貿易に関しては、2010年以降は、むしろ貿易構造が変わってきていることが明らかになった。モロッコでは、フランス元大統領サルコジの提言する「環地中海連合」の概念に依存せずに、むしろFTA協定をアメリカをはじめとする諸国と締結しており、サルコジ的外交路線には反する方向で、自由貿易協定をすすめていることがわかった。一方で、チュニジアと比較すると、輸出品目であるオリーブの輸出額は少なく、小麦の輸入額を補える金額にはなっていない。このため、食料貿易における赤字が増加する傾向にあることが明らかになった。さらに、小麦生産の増加を試みる農業政策も継続しているとみることができる。地中海農業における北アフリカ側の諸国では、小麦生産が天候の影響、特に降水量の影響を受けて、生産量の変化が特に大きくなるという特色を持っている。この点が改善できない限り、小麦生産に安定性は取り戻せない。輸入小麦を購入するためには、環地中海連合に関係がない諸国とのFTAが有効であるが、それでも、農産物輸出の点からみれば、輸出額を支えるトマトやマンダリン・みかんの生産額は少ないと判断される。また、モロッコにおける水産物に関する生産と貿易の分析を試みた。ここでは、EU諸国の側のモロッコでの漁業援助の価格の変動が見られた。当初、地中海のアフリカ側諸国としてチュニジアを想定していたが、チュニジアでジャスミン革命が起こり政情が不安定になったため、本年度はモロッコのみを訪れて、食料貿易の実地調査と食物の市場調査を行なった。地中海のヨーロッパ側諸国につては、予定通り、スペインとイタリアにおける食料生産と食料貿易の調査を実施した。スペインにおいては、(1)地中海連合の全体構造に関する基本的な資料の収集行なった。(2)スペインにおける、国家を単位とした農業生産と食料貿易に関する統計的資料の収集を行なった。(3)バレンシア州における食料生産の調査を行なった。この中には、アルブフェラ湖周辺農村におけるスペイン産米生産の調査も含まれる。

イタリアにおいては、(1)イタリアにおける、国家を単位とした農業生産と食料貿易に関する統計資料の収集と資料分析を行なった。(2)ピエモンテ州において、小麦生産、トウモロコシ生産、畜産加工、果樹栽培に関する農村調査と聞き取り調査を実施した。ピエモンテ州における食品流通と農産物販売に関する調査を行なった。(3)ヴェルチェリ村周辺におけるスペイン産米生産の実態調査を行なった。モロッコにおいては、(1)乾燥地帯における農業生産と食料輸入に関して、基本的な資料収集を行なった。(2)カサブランカ、ラバト、メクネス周辺において食料生産と市場調査を行なった。本研究は、ヨーロッパ南部と北アフリカが、食料貿易を通してどのように結びつき、それが各国の農業生産にどのような影響を与えているのか、また、地中海連合の枠組みがどのような変化を与えたかを明らかにするのが目的である。本年度は、それぞれの調査国での基本的な統計資料と情報の基礎を収集することができた。また、農業生産の実態調査を、イタリア、スペイン、モロッコにおいて開始することができた。最初に想定していた北アフリカの2国の両方での調査を2年にわたって行ない、そのデータと分析を行なっており、研究は予定以上に進展していると考えられる。特に、ジャスミン革命が起こって以降のチュニジアにおける食料生産と食料供給の実情を明らかにでき、研究報告できたことは大きな成果であった。一方で、ジャスミン革命後も経済情勢の回復は見られず、都市部における食料品の上昇は継続しており、チュニジアの都市生活者に多くの不満と問題が継続していることも明らかになった。また、チュニジアの小麦の輸入に関しては、環地中海という枠組みを超えて、世界を単位とした貿易が、2002年以降行なわれていることが明らかになった。しかし、オリーブ・オイルの輸出に関しては、依然として地中海貿易、特にイタリアへの輸出に依存していた。ここには、単なる食品貿易という枠組みを超えて、食品のブランド力や海外展開力、質的差異の問題が残されているように考えられる。この点に関しては、次年以降の研究の中心的な課題となる。ヨーロッパ諸国における北アフリカとの食料貿易に関する研究は、北アフリカ諸国の研究の進行状況に比べると、まだ研究蓄積が少ない。特に、イタリア、スペインに関する分析と資料収集は、最終年度の研究調査の中心的な課題であると考える。全体として評価した場合、北アフリカにおける研究は想定された以上に研究目標を達成していると考えられ、地中海のヨーロッパ側諸国の食料貿易に関する研究は、当初の想定の範囲内であるが、さらに研究の追加が必要であると考える。本研究の目的である地中海を中心とした最近の食料貿易の構造に関しては、予定通り研究は進展し、最終段階に進んでいると考える。ヨーロッパ側の調査に関しては、スペインおよびイタリア両国において食料貿易に関する基本的な統計情報の確保することが可能になった。
魚類における高度不飽和脂肪酸からプロスタグランジンへの代謝とその活性

本研究課題下にコイ,ニジマスおよびマダイの洗浄栓球画分におけるプロスタグランジン(PG)合成能を検討するとともに,全血凝集能測定装置を用いて各種凝集惹起物質による栓球凝集能についても測定した.しかし,栓球凝集能の測定用に1mlを必要とするために凝集惹起物質の種類とその濃度について,広範囲に,しかも同時に検討できない点が問題点として残されていた.そこで魚類の洗浄栓球浮遊液を用い,各種凝集惹起物質による栓球凝集能を顕微鏡下で観察する方法によって測定した.供試魚としてコイ,ニジマスおよびマダイを用い,採血後,血液1mlよりFicoll-Hypaque溶液を用いて多栓球血漿を分離し,洗浄して洗浄栓球浮遊液を調整した.凝集惹起物質としてアラキドン酸(AA),エイコサペンタエン酸(EPA)およびドコサヘキサエン酸(DHA)のNa塩溶液, ADP,コラーゲン,トロンヒン,イオノフォアA_<23187>,血小板活性化因子(PAF), PGF_<2α>, PGE_2およびPGD_2標品の段階希釈液を調整し, FALCON Assay Plate(96wells)の各wellへそれぞれ25μlずつ添加した後,各wellへ洗浄栓球浮遊液を25μlずつ加え, 15秒間インキュベートした後, 3μlをスライドグラスに取り,カバーグラスをのせて位相差顕微鏡下(×200)で栓球の凝集の有無を観察した.コラーゲン,トロンビンおよびイオノフォアA_<23187>を添加した場合, 3魚種とも栓球の凝集塊が認められた.AA添加の場合はニジマスおよびマダイ栓球において凝集塊が観察されたが, EPAおよびDHA添加の場合には3魚種とも栓球の凝集塊は認められなかった.PG類添加の場合,マダイ栓球においてはPGE_2添加により凝集塊を生じたが, PGF_<2α>およびPGD_2添加においては凝集塊が認められなかった.一方,コイおよびニジマス栓球ではいずれのPG類を添加した場合でも,凝集塊は観察されなかった.さらにヒト血小板の凝集能とこれら淡・海水産魚3魚種の栓球凝集能の相違をPG合成能から比較検討した.本研究課題下にコイ,ニジマスおよびマダイの洗浄栓球画分におけるプロスタグランジン(PG)合成能を検討するとともに,全血凝集能測定装置を用いて各種凝集惹起物質による栓球凝集能についても測定した.しかし,栓球凝集能の測定用に1mlを必要とするために凝集惹起物質の種類とその濃度について,広範囲に,しかも同時に検討できない点が問題点として残されていた.そこで魚類の洗浄栓球浮遊液を用い,各種凝集惹起物質による栓球凝集能を顕微鏡下で観察する方法によって測定した.供試魚としてコイ,ニジマスおよびマダイを用い,採血後,血液1mlよりFicoll-Hypaque溶液を用いて多栓球血漿を分離し,洗浄して洗浄栓球浮遊液を調整した.凝集惹起物質としてアラキドン酸(AA),エイコサペンタエン酸(EPA)およびドコサヘキサエン酸(DHA)のNa塩溶液, ADP,コラーゲン,トロンヒン,イオノフォアA_<23187>,血小板活性化因子(PAF), PGF_<2α>, PGE_2およびPGD_2標品の段階希釈液を調整し, FALCON Assay Plate(96wells)の各wellへそれぞれ25μlずつ添加した後,各wellへ洗浄栓球浮遊液を25μlずつ加え, 15秒間インキュベートした後, 3μlをスライドグラスに取り,カバーグラスをのせて位相差顕微鏡下(×200)で栓球の凝集の有無を観察した.コラーゲン,トロンビンおよびイオノフォアA_<23187>を添加した場合, 3魚種とも栓球の凝集塊が認められた.AA添加の場合はニジマスおよびマダイ栓球において凝集塊が観察されたが, EPAおよびDHA添加の場合には3魚種とも栓球の凝集塊は認められなかった.PG類添加の場合,マダイ栓球においてはPGE_2添加により凝集塊を生じたが, PGF_<2α>およびPGD_2添加においては凝集塊が認められなかった.一方,コイおよびニジマス栓球ではいずれのPG類を添加した場合でも,凝集塊は観察されなかった.さらにヒト血小板の凝集能とこれら淡・海水産魚3魚種の栓球凝集能の相違をPG合成能から比較検討した.陸界と水界における動物の必須脂肪酸として、前者では主としてアラキドン酸(AA)が、また後者ではエイコサペンタエン酸(EPA)とドコサヘキサエン酸(DHA)がより重要な役割を果たしている。それら高度不飽和脂肪酸から変換されて生ずるプロスタグランジン(PG)について、ニジマスの多栓球血漿の分離洗浄栓球の調整法を検討し、[1-【^(14)C】]AA,[1-【^(14)C】]EPAおよび[1-【^(14)C】]DHAを基質としてニジマス洗浄栓球によるPG合成能を検討するとともに血小板凝集測定装置を用いてニジマス栓球の凝集測定を行い、ヒト,コイの血液凝固と比較検討した。ヒト洗浄血小板と[1-【^(14)C】]AAをインキュベートすると主にTX

【B_2】が合成されるが、[1-【^(14)C】]EPAからは少しく、[1-【^(14)C】]DHAからは殆んど生成されなかった。ニジマス栓球画分ではヒト血小板同様にAAから主にTX【B_2】が合成され、さらにEPAからもわずかではあるが明瞭にTX【B_2】が合成されたが、DHAからのPG合成は殆んど認められなかった。昨年度のコイ栓球画分を用いた実験ではAAよりPG【E_2】、PG【F_(2x)】およびPG【D_2】の合成を認め、TX【B_3】への変換は殆んど認められず、EPAおよびDHAからのPG合成も殆んど認められなかった。したがって、ニジマス栓球画分においては、ヒト血小板同様にAAから主にTX【B_2】を合成するが、コイではAAからTX【B_2】への変換は殆んど認められず、栓球画分におけるPG合成は魚種によって異なることが示唆される。全血凝集能測定装置によるニジマス栓球の凝集測定は、ニジマス背大動脈より採取した全血にコラーゲン,AA,EPAおよびDHAを添加し、インピーダンス法により栓球の凝集能を測定した。コラーゲン添加により二次凝集を認めるとともに、AA添加においてもかなり強固な二次凝集が認められ、EPA,DHA添加では凝集が認められなかった。
開心術後の肝および腸管循環に関する研究

開心術後の肝および腸肝循環に関して,肝静脈血酸素飽和度(S_<HV>O_2)と胃粘膜pH(pHi)を用いて検討した.胃粘膜pH(pHi)の測定はトノメーター(Tonometrics社)を胃内に挿入して行い,肝静脈血酸素飽和度(S_<HV>O_2)の測定はカテーテルを右または中肝静脈に留置して行った.集中治療室(ICU)入室時の心係数(CI)および混合静脈血酸素飽和度(S_VO_2)は良好に維持されていたが,S_<HV>O_2は50%以下と低く,pHiも平均7.2とアシドーシスの状態にあった.入室12時間後には,pHiは有意に上昇し,S_<HV>O_2も50%以上となった.入室24時間後ではpHiは正常範囲となった.体外循環後の消化管粘膜の血流は,心拍出量が維持されていても低下しており,この血流異常分布は術後24時間以内に改善した.また,術後低心拍出量(LOS)症候群を呈した症例では,心拍出量の低下が肝血流低下で代償されており,予後も不良であった.LOS症例では長時間の消化管領域の血流低下が合併症の誘因となり得ると考えられた.以上より,開心術後症例における肝静脈血の分析は消化管領域の血流評価に加えて,予後を反映する指標として有用と考えられた.開心術後は体外循環に伴う血流のmaldistributionが残存し,心拍出量が良好であっても,消化管領域の血流低下の改善には12から24時間を要する.S_<HV>O_2及びpHiは消化管領域の血流の評価に有用な指標と考えられた.開心術後の肝および腸肝循環に関して,肝静脈血酸素飽和度(S_<HV>O_2)と胃粘膜pH(pHi)を用いて検討した.胃粘膜pH(pHi)の測定はトノメーター(Tonometrics社)を胃内に挿入して行い,肝静脈血酸素飽和度(S_<HV>O_2)の測定はカテーテルを右または中肝静脈に留置して行った.集中治療室(ICU)入室時の心係数(CI)および混合静脈血酸素飽和度(S_VO_2)は良好に維持されていたが,S_<HV>O_2は50%以下と低く,pHiも平均7.2とアシドーシスの状態にあった.入室12時間後には,pHiは有意に上昇し,S_<HV>O_2も50%以上となった.入室24時間後ではpHiは正常範囲となった.体外循環後の消化管粘膜の血流は,心拍出量が維持されていても低下しており,この血流異常分布は術後24時間以内に改善した.また,術後低心拍出量(LOS)症候群を呈した症例では,心拍出量の低下が肝血流低下で代償されており,予後も不良であった.LOS症例では長時間の消化管領域の血流低下が合併症の誘因となり得ると考えられた.以上より,開心術後症例における肝静脈血の分析は消化管領域の血流評価に加えて,予後を反映する指標として有用と考えられた.開心術後は体外循環に伴う血流のmaldistributionが残存し,心拍出量が良好であっても,消化管領域の血流低下の改善には12から24時間を要する.S_<HV>O_2及びpHiは消化管領域の血流の評価に有用な指標と考えられた.開心術後の患者11例で検討を行った。内訳は、僧帽弁置換術4例、大動脈弁置換術4例、2弁置換術3例であった。平均年齢は56歳、男女比は8対3であった。体外循環時間は174±22分、大動脈遮断時間は104±17分、術中最低直腸温は24.7±1.8°Cであった。胃粘膜pH (pHi)の測定はトノメーター(Tonometrics社)を胃内に挿入して行い、肝静脈血酸素飽和度(S_<HV>O_2)測定のためには術前日透視下にカテーテルを右または中肝静脈に留置した。集中治療室(ICU)入室後の心係数(Cl)は4.8±1.6L/min/m^2、混合静脈血酸素飽和度(SvO_2)は75.3±7.9%と心機能は両校に維持されていた。ICU入室時のS_<HV>O_2は7.19±0.08と低く、pHiも50%以下であった。入室12時間後では、pHiは7.31±0.05と有意に(p<0.01)上昇し、S_<HV>O_2は56.7±13.7%と上昇傾向にあった。入室24時間後では心機能には変化がなかったが、pHiは7.38±0.05と有意に(p<0.05)改善して正常範囲となり、S_<HV>O_2は63.2±5.2%となった。SvO_2とS_<HV>O_2の差は、ICU入室時は17.0±5.5%、24時間後は、8.9±8.1%と縮小傾向にあった。開心術後は心拍出量、SvO_2が良好に維持されていたが、S_<HV>O_2及びpHiは低値であった。このことから、開心術後には体外循環の影響による消化

管領域の血流の低下が続いており、血流のmaldistributionが予想される。その改善には12から24時間を要すると思われた。S_<HV>O_2及びpHiは消化管領域の血流の評価に有用と考えられた。体外循環後の消化管領域の循環動態に関して26症例で検討した。症例を術後低心拍出量(LOS)群5例と非LOS群21例に分けた.疾患の内訳は、LOS群で大動脈弁置換(AVR)2例,僧帽弁置換術(MVR)1例、AVR+MVR2例,非LOS群でCABG9例,MVR6例,AVR3例,AVR+MVR3例であった.平均年齢はLOS群が65歳,非LOS群が57歳であった.体外循環時間は各々252±43分,189±9分,大動脈遮断時間は各々150±22分、105±6分であった。胃粘膜pH(pHi)の測定はトノメーター(Tonometrics社)を胃内に挿入して行い、肝静脈血酸素飽和度(S_<HV>O_2)測定のためには術前日透視下にカテーテルを右または中肝静脈に留置した。集中治療室(ICU)入室後の心係数(CI)はLOS群が3.3±0.4L/min/m^2と非LOS群の4.6±0.4と低い傾向にあり,術後24時間においても同様であった.S_<HV>O_2は入室24時間後までの間,LOS群が非LOS群と比べて有意に低値をとった.pHiは両群ともに術後24時間までに正常域まで回復した.体外循環後の消化管粘膜の血流は,心拍出量が維持されていても低下しており,この血流異常分布は術後24時間以内に改善した.肝血流はLOS群で低く低心拍出状態は肝血流低下で代償されていた.LOS群では5例中4例が死亡しており、肝静脈血分析は消化管領域の血流評価のみならず予後を反映する指標となりうると考えられた.開心術後の肝および腸肝循環に関して,肝静脈血酸素飽和度(S_<HV>O_2)と胃粘膜pH(pHi)を用いて検討した.胃粘膜pH(pHi)の測定はトノメーター(Tonometrics社)を胃内に挿入して行い,肝静脈血酸素飽和度(S_<HV>O_2)の測定はカテーテルを右または中肝静脈に留置して行った.集中治療室(ICU)入室時の心係数(CI)および混合静脈血酸素飽和度(SvO_2)は良好に維持されていたが,S_<HV>O_2は50%以下と低く,pHiも平均7.2とアシドーシスの状態にあった.入室12時間後には,pHiは有意に上昇し,S_<HV>O_2も50%以上となった.入室24時間後ではpHiは正常範囲となった.体外循環後の消化管粘膜の血流は,心拍出量が維持されていても低下しており,この血流異常分布は術後24時間以内に改善した.また,術後低心拍出量(LOS)症候群を呈した症例では,心拍出量の低下が肝血流低下で代償されており,予後も不良であった.LOS症例では長時間の消化管領域の血流低下が合併症の誘因となり得ると考えられた.以上より,開心術後症例における肝静脈血の分析は消化管領域の血流評価に加えて,予後を反映する指標として有用と考えられた.開心術後は体外循環に伴う血流のmaldistributionが残存し,心拍出量が良好であっても,消化管領域の血流低下の改善には12から24時間を要する。S_<HV>O_2及びpHiは消化管領域の血流の評価に有用な指標と考えられた。
精神疾患の特徴的脳変化と関連する脳脊髄液中蛋白の同定

本研究は最新の脳画像医学および脳脊髄液蛋白バイオマーカーとの関連を解析し、精神疾患の病態解明、疾患鑑別といった技法の開発を行う。さらにヒトで明らかになったバイオマーカーを実験動物に導入し、精神疾患モデル動物における中間表現系の変化を検討することを目的に行われた。近年、拡散尖度画像(DKI)と、神経突起密度(NDI)や神経突起方向散乱・密度イメージング(NODDI)が生体組織の微細構造変化を鋭敏に捉えうるとして注目されており、我々は平成28年度から30年度にかけてDKIを用いて精神疾患における疾患特異的な変化を検討した。平成28年度にはDKIとNODDIにおける各パラメーター同士の関連を明らかにした他、健常者を対象とした各パラメーターの正常加齢性変化を明らかにした。平成29年度にはDKIやNODDIを用いて大うつ病性障害患者における疾患特異的、および臨床症状と関連した局所脳構造の変化を明らかにした。平成30年度にはDKIやNODDIを用いて双極性障害患者における疾患特異的変化の検討を行った。双極性障害患者31名と健常被験者28名を対象に3次元T1強調画像とDKIを撮影し比較を行った結果、健常者と比較して双極性障害患者群ではMK valueが右下前頭後頭束部分、右後部帯状回で低下していることを明らかにした。NDI valueでは右後部帯状回での低下、ODI valueでは左海馬での低下を双極性障害患者群で認めた。以上の点より、今後精神疾患の鑑別や症状評価へDKI, NODDIが応用されることが期待される。精神疾患モデルマウスを用いた研究では、平成29年度にlipopolysaccharide (LPS)の投与による大うつ病性障害モデルラットを対象に[11C]PK11195を用いた検査を行い、うつ病モデル化前後での脳内炎症の差異をPETにより明らかにした。水分子の拡散現象を利用して生体組織の性質を画像化する拡散強調画像は、超急性期脳梗塞を従来のMRIの撮像法やCTより敏感に描出できることから1990年代後半に急速に臨床応用が進んだ。拡散強調画像では分子拡散の遷移確率密度分布を正規分布と仮定して得られたmean diffusivity (MD)や水分子の動きをテンソルとして表示するfractional anisotropy (FA)が主な指標として使用されてきた。しかし拡散強調画像が元来有する豊富な生体情報をまだ十分に生かしきれているとはいえない。近年、非正規分布に従う遷移確率密度分布用いた解析方法が生体組織の微細構造による制限拡散を強く反映するものとして注目されている。拡散MRI(dMRI)のうち拡散尖度画像(diffusional kurtosis imaging; DKI)では空間方向の平均値としてmean kurtosis (MK)という指標が用いられており、これはMDやFAと比較して微細構造変化を鋭敏に捉えることが可能であると考えられている。一方、FAやMKの変化は非特異的であり、この変化は神経突起密度の変化なのか神経突起散乱の変化なのかはわからなかった。そこで拡散MRIで得られた元画像から神経突起密度や神経突起散乱を算出する再構成法、Neurite Orientation Dispersion and Density Imaging (NODDI)が開発された。今年度はこのDKIとNODDIの撮影および解析が可能となる環境整備を行ない、各パラメーター同士の関連を明らかにした他、健常者を対象とした各パラメーターの正常加齢性変化について検討を行った。今後、この新規検査法を精神疾患に用いることで、これまで明らかにできなかった微細な構造変化を見つけることが可能となるものと期待される。近年、拡散テンソル画像を発展させた拡散尖度画像(DKI)と、神経突起密度(NDI)や神経突起散乱(ODI)を算出する再構成法、神経突起方向散乱・密度イメージング(NODDI)が生体組織の微細構造変化を鋭敏に捉えうるとして注目されている。今回我々はDKIやNODDIを用いた指標と従来の測定法との関連を検証した。また正常加齢性変化について各dMRI metricsで検討した。健常被験者23名を対象にPhilips社製3T MRsystemにより3次元T1強調画像とdMRIを撮影した。ODIとNDI valueは各々意味合いの異なる指標であるが、これらは共にFA valueと関連して変化することが明らかになった。このためODIとNDI value間でも軽度の相関が確認されたものと推測された。またMKおよびNDI valueと年齢との間に正の相関が認められた。基底核などの神経線維走行が複雑に絡み合う領域では神経線維の密度が軽度に疎になることで神経線維走行方向が整い、逆にMKおよびNDI valueが上昇したものと推測された。従来の拡散強調画像では分子拡散の遷移確率密度分布を正規分布と仮定して得られたmean diffusivity (MD)や水分子の動きをテンソルとして表示するfractional anisotropy (FA)が主な指標として使用されてきた。

一方、FAやMKの変化は非特異的であり、この変化は神経突起密度の変化なのか神経突起散乱の変化なのかはわからなかった。そこで拡散MRIで得られた元画像から神経突起密度や神経突起散乱を算出する再構成法、Neurite Orientation Dispersion and Density Imaging (NODDI)が開発された。今年度はこのDKIとNODDIの撮影および解析法を用いて精神疾患の一つである大うつ病性障害における局所脳形態変化を明らかにした。今後、この新規検査法を精神疾患に用いることで、これまで明らかにできなかった微細な構造変化を見つけることが可能となるものと期待される。また精神疾患モデルマウスを用いた研究では、lipopolysaccharide (LPS)の投与による大うつ病性障害モデルラットを対象に[11C]PK11195を用いた検査を行い、うつ病モデル化前後での脳内炎症の差異をPETにより明らかにした。近年、拡散尖度画像(DKI)と、神経突起密度(NDI)や神経突起方向散乱・密度イメージング(NODDI)が生体組織の微細構造変化を鋭敏に捉えうるとして注目されている。今回我々はDKIやNODDIを用いて大うつ病性障害患者における疾患特異的、および臨床症状と関連した局所脳構造の変化について検討を行った。大うつ病制障害患者23名と精神神経科既往歴のない健常被験者26名を対象にMRIを撮影した。結果、健常者と比較して大うつ病性障害患者群は、MK valueによる解析ではMDD群で上縦束、下前頭後頭束部分の低下を認めた。NDI valueではMDDで小脳半球、中小脳脚、海馬、両側島、下前頭前野、右上側頭回の低下を認めた。ODI valueではMDDにおける左後頭葉皮質下白質、両側上縦束、左下前頭後頭束の上昇を認めた。なお臨床症状との相関に関してはHAM-D 21の点数と右前頭前野との有意な正の相関を認めた。MDD患者群では上縦束領域や後前頭後頭束領域における変化が確認されており、過去のDTIを用いた報告に合致した結果であった。その他、前頭葉や頭頂葉皮質領域、島、小脳などの変化が認められた。MDD患者群ではMDDの重症度と前頭葉部分のODIとの間に正の相関を認めた。これまでに、経頭蓋磁気刺激装置(TMS)による前頭葉部分の刺激によりMDDの改善効果が得られることが既に知られており、今回の結果はこの点に矛盾のないものであった。以上の点より、今後精神疾患の鑑別や症状評価へDKI, NODDIが応用されることが期待される。本研究は最新の脳画像医学および脳脊髄液蛋白バイオマーカーとの関連を解析し、精神疾患の病態解明、疾患鑑別といった技法の開発を行う。
大腸菌走化性レセプタへの好塩菌走光性サブシステムの組み込み

サルモネラ菌の走化性レセプタと、好塩菌Natronobacterium pharaonisの光シグナルトランスデューサの遺伝子とその産物は、後者におけるリガンド結合部位の欠如を除けば、まったく同じドメイン構造を有することが分かっている。本研究では、1)サルモネラ菌の走化性レセプタのリガンド結合部位を、好塩菌の光シグナルトランスデューサ膜貫通部分の短いループ部への融合、2)(1)の産物の下流に、サルモネラ菌走化性レセプタのシグナリング部位を融合、という第二段階のステップを踏む予定であったが、本年度に予定どおりには遂行できなかった。理由として、作製した融合タンパク質について、大腸菌ホストにおける、比較的大量の発現と、膜内での安定性を確認できたにもかかわらず、界面活性剤による可溶化、単離・精製過程を経ることによりタンパク質試料として不安定になり、ITC測定などに必要な透析作業などによりリガンドへの結合活性が著しく低下してしまうことが判明したからである。また、作成した融合タンパク質とのITC測定値等定量性の比較に用いるため、サルモネラ菌の走化性レセプタをリガンド結合部と膜貫通部分のみを有するタンパク質断片を発現して得ようとしたが、これもうまくゆかなかった。そこで本年度は、サルモネラに代えて、ホストである大腸菌由来の走化性レセプタ遺伝子を用い、まったく同じ融合タンパク、および、比較用の断片タンパク質を作ることができないかを試みた。同時に、大腸菌の走化性レセプタの断片タンパク質の発現も試み、これらに成功した。ITC測定を通じて、この断片タンパク質および作成した融合タンパク質のリガンドおよび走化性レセプタタンパク質との結合サイト数および結合定数は、それぞれ無傷な走化性レセプタとリガンド、走光性トランスデューサとレセプタとの文献値と一致することを確認することができた。一部の好塩菌が有する光シグナル伝達システムは、バクテリオロドプシンによく似た光受容サブユニットと、バクテリア一般に分布する走化性レセプタとよく似た構造を持つトランスデューサタタンパク質からなる。このシステム内でのシグナル伝達メカニズムの解明には、トランスデューサの解析が必須だが、同タンパク質は大腸菌で全体を発現させられない。本研究では、このような解析に役立つ、扱いの容易なモデルタンパク質を開発することを目指す。具体的には、真正細菌の走化性レセプタタンパク質に走光性トランスデューサの一部を組み込んだキメラを作製して用いる。本年度は、まず、すでにサルモネラ菌走化性レセプタのシグナリング部位を欠いた部分タンパク質について、その膜貫通部分をトランスデューサのそれと置き換え、大腸菌内で安定に発現可能であることを確認した。具体的には発現株の膜画分に多く含まれること、吸着クロマトグラフィを使った精製が容易で、精製後も安定であることについて、主に電気泳動像からの裏付けを得た。また、作成した同キメラタンパク質が、走化性レセプタの機能であるリガンドとの結合能を失っていないかについて、等温滴定型カロリメトリ(ITC)を用い、リガンドであるアスパラギン酸を滴定したときの結合熱を測定することで確認した。他方で、トランスデューサの一部を新しく組み込むことにより新たに付加されることが期待される機能として、光受容サブユニットとの結合能が生じているかどうかを確認した。具体的には、キメラと光受容サブユニットの混合物について、トランスデューサのみを特異的に吸着するカラムクロマトグラフィーを行ない、光受容サブユニットのみが有する吸光特性をプローブに溶出物の解析し、両者が結合して溶出する結果を得ることができた。
ｃＰＬＡ２α制御による糖尿病腎症の進展抑制効果の解明と新規腎症治療法開発

研究の目的:糖尿病腎症の発症・進展阻止は、我が国の重要な命題である。近年申請者は、阻害剤やノックアウト(KO)マウスを用いた検討で、細胞内アラキドン酸カスケードに関与する分子であるcPLA2の発現抑制が、マクロファージや大動脈において抗炎症作用・抗動脈硬化作用を発揮することを見出した。一方、糖尿病腎症の発症にはPKCとその下流に位置するcPLA2の関与が示唆されているが、糖尿病腎症に対して、このcPLA2抑制の治療的効果や有用性は確立していない。本研究では、STZを用いて糖尿病を導入したWTマウスとcPLA2欠損マウスを用い、糖尿病腎症発症・進展に対するcPLA2阻害療法の有用性を検討することで、糖尿病腎症発症・進展の新規機序の解明と新たな治療法開発の可能性を見出すことを目的とする。研究の成果:18週齢のcPLA2α欠損マウスにSTZの腹腔内投与を行い糖尿病化した。2糖尿病(DM-)cPLA2α欠損マウスでは、STZ投与後4週、12週、24週時に回収した腎の組織切片において、メサンギウム領域の減少を認めた。3また免疫組織学検討では、DM-cPLA2αの糸球体内及び腎間質へのマクロファージ浸潤度の低下を認めた。4糸球体内皮細胞、腎メサンギウム細胞、糸球体上皮細胞、マクロファージ共培養時のメディウム中のてTNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1、TGF-β産生量は、AACOCF3前処置により有意に減少していた。以上の結果より、STZ誘導糖尿病モデルマウスにおける腎症発症進展及び腎構成細胞における炎症惹起応答に対するcPLA2阻害の有効性が確認された。平成29年度では、cPLA2ホモ欠損マウスの準備に予想外に時間がかかったため、cPLA2欠損マウスを用いた実験にまでは行きつかなかった。平成30年度には実験を行える形でのcPLA2ホモ・ヘテロ欠損マウスの作製が終了し、解析を行っている。同時に細胞実験もスタートしており、現在サンプル作製とその測定を行っているところである。次年度は、STZ誘発糖尿病cPLA2 KOマウスでのモ腎症発症進展への影響をさらに細かく観察する予定である。また、同時にヒト腎糸球体内皮細胞、ヒト腎メサンギウム細胞、マウス若しくはラット腎糸球体上皮細胞およびマウス腹腔から回収したマクロファージの培養を継続し、メディウム、蛋白やmRNAサンプルの準備とその解析を行う予定である。研究の成果:18週齢のC57BL/6マウスにSTZの腹腔内投与を行い、その2週間後(10週齢)の血糖測定で糖尿病化したことを確認した。2糖尿病化したC57BL/6マウスにAACOCF3(5 mg/kg/日或いはplacebo)を経口投与開始したところ、体重や食餌摂取量、空腹時血糖値、血清脂質値には有意な差を認めなかった。STZ投与後4週、12週、24週時に回収した腎の組織切片において、AACOCF3投与群ではplacebo投与群に比し、メサンギウム領域の減少を認めた。3Iba-1抗体を用いた免疫組織学的検討の結果、糸球体内及び腎間質へのマクロファージ浸潤度の低下を認めた。4同組織におけるTNF-α、IL-1β、MCP-1のmRNA発現はAACOCF3投与群で有意に減少していた。5AACOCF3投与群では、尿中アルブミン排泄量の有意な低下を認めた。以上の結果より、STZ誘導糖尿病モデルマウスにおける腎症発症進展に対するcPLA2阻害薬の有効性が確認された。cPLA2阻害薬使用による糖尿病性腎症発症・進展予防効果を確認したが、cPLA2ホモ欠損マウスの準備に予想外に時間がかかったため、cPLA2欠損マウスを用いた実験にまでは行きつかなかった。平成30年度には実験開始予定であり、現在cPLA2ホモ・ヘテロ欠損マウスを準備中であり、研究の目的:糖尿病腎症の発症・進展阻止は、我が国の重要な命題である。

本研究では、STZを用いて糖尿病を導入したWTマウスとcPLA2欠損マウスを用い、糖尿病腎症発症・進展に対するcPLA2阻害療法の有用性を検討することで、糖尿病腎症発症・進展の新規機序の解明と新たな治療法開発の可能性を見出すことを目的とする。研究の成果:18週齢のcPLA2α欠損マウスにSTZの腹腔内投与を行い糖尿病化した。2糖尿病(DM-)cPLA2α欠損マウスでは、STZ投与後4週、12週、24週時に回収した腎の組織切片において、メサンギウム領域の減少を認めた。3また免疫組織学検討では、DM-cPLA2αの糸球体内及び腎間質へのマクロファージ浸潤度の低下を認めた。4糸球体内皮細胞、腎メサンギウム細胞、糸球体上皮細胞、マクロファージ共培養時のメディウム中のてTNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1、TGF-β産生量は、AACOCF3前処置により有意に減少していた。以上の結果より、STZ誘導糖尿病モデルマウスにおける腎症発症進展及び腎構成細胞における炎症惹起応答に対するcPLA2阻害の有効性が確認された。平成29年度では、cPLA2ホモ欠損マウスの準備に予想外に時間がかかったため、cPLA2欠損マウスを用いた実験にまでは行きつかなかった。平成30年度には実験を行える形でのcPLA2ホモ・ヘテロ欠損マウスの作製が終了し、解析を行っている。同時に細胞実験もスタートしており、現在サンプル作製とその測定を行っているところである。次年度は、cPLA2 KOマウスを用いて、STZ誘発糖尿病モデル下での腎症発症進展恵の影響を観察する予定である。方法は、平成29年度で行ったAACOCF3を用いた検討と同様の実験及びその結果の解析を予定している。また、同時にヒト腎糸球体内皮細胞、ヒト腎メサンギウム細胞、マウス若しくはラット腎糸球体上皮細胞およびマウス腹腔から回収したマクロファージの培養を開始し、平成31年度のin vitro実験に使用可能な細胞の準備を行う予定である。次年度は、STZ誘発糖尿病cPLA2 KOマウスでのモ腎症発症進展への影響をさらに細かく観察する予定である。また、同時にヒト腎糸球体内皮細胞、ヒト腎メサンギウム細胞、マウス若しくはラット腎糸球体上皮細胞およびマウス腹腔から回収したマクロファージの培養を継続し、メディウム、蛋白やmRNAサンプルの準備とその解析を行う予定である。直接経費支払額1,100,000円に対し,1,098,443円を使用.残金1,557円は次年度の助成金と合わせて物品購入費に使用する予定.直接経費支払額1,100,000円と前年度未使用額1,557円を合わせた本年度使用額1,101,557円に対し,1,100,598円を使用.残金959円は次年度の助成金と合わせて物品購入費に使用する予定.