hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
生体機能を範とする水中物質変換反応の開発

本研究は、「水中・常温・常圧での水素分子の活性化」という新しい分野を開拓し、クリーンエネルギー変換システム実現への新しい道筋を提示した。本研究の業績は、化学、環境、エネルギーの分野において基礎的研究を実用的応用への発展に結びつける上で多彩な貢献を果たすものである。具体的には、ニッケル・鉄ヒドロゲナーゼを範としたニッケル・ルテニウムモデル錯体を用いて、「水中・常温・常圧で水素分子のヘテロリティックな活性化を経由する触媒的な電子抽出」に初めて成功した。21世紀の最重要課題であるエネルギー・資源・環境問題を解決するために、生命の機能原理を抽出・応用し、生命機能を凌駕する生体模倣機能触媒化学の創成は重要である。生体模倣機能触媒の創成は、分子触媒や固体機能触媒の開発に多大に影響を与えるだけでなく、多金属機能触媒における金属の役割・作用機構の解析にも強く関連することから協奏機能触媒化学の共通学術基盤の確立に必要不可欠である。本研究の目的は、「将来のエネルギー源としての水素を、温和な条件で活性化し、電子を取り出す生体模倣機能触媒の開発」である。本研究において、自然界で水素を活性化する酵素であるヒドロゲナーゼの活性化状態のモデル化合物の合成に成功しました。ヒドロゲナーゼは分子量88万という大きなタンパク質で、大きく2種類に分類できます。活性中心にニッケル(Ni)イオンと鉄(Fe)イオンを含む[NiFe]ヒドロゲナーゼと、2つのFeイオンを含む[FeFe]ヒドロゲナーゼです。1995年にFontecilla-Camps(フランス)らによって、[NiFe]ヒドロゲナーゼ(D.gigas)の結晶構造が明らかにされました。その活性中心の構造はシステイン由来の2つのイオウ(S)配位子と、1つの謎の配位子(X)がニッケルと鉄を架橋していることが示されました。しかし、謎のX配位子は水素を活性化する前は水(H_2O)又は水に由来したイオン(OH^-またはO_2^-)であり、水素を活性化した後は、ヒドリドイオン(H^-)になると推測されましたが、その詳細は今日まで不明であり、ヒドロゲナーゼによる水素活性化の作動原理は謎に包まれていました。本研究では、鉄の代わりに同族元素であるルテニウム(Ru)を用い、X配位子として水を有する[NiRu]アクア錯体を合成しました。そして、その[NiRu]アクア錯体と水素を水中・常温・常圧で反応させ、ヒドロゲナーゼの活性化状態のモデルとなる、X配位子にヒドリドイオンを有する[NiRu]ヒドリド錯体の合成に初めて成功しました。今回の成果は、今後の水素活性化の基礎研究の発展に寄与するとともに、次期エネルギー源としての水素の研究開発につながるものと期待されます。21世紀の最重要課題であるエネルギー・資源・環境問題を解決するためには、生命の機能原理を抽出・応用し、生命機能を凌駕する「生体模倣機能触媒化学」を創成することが必要不可欠である。本研究は、「選択性に優れかつ環境負荷の少ない触媒反応の開発」を命題とし、次世代の「協奏機能触媒」を創製する。具体的には、「水素分子のヘテロリティックな活性化」、「水素/重水同位体交換」、「窒素からアンモニアへの変換」、「ケト酸・アミノ酸の選択的合成」、「二酸化炭素からメタノール・メタンへの選択的変換」を水中・常温・常圧下で可能にする「生体模倣機能触媒(水中で触媒として機能するヒドリド錯体やアクア錯体)」の開発を行ってきた。その結果、「水素分子のヘテロリティツクな活性化」は、「水素活性化酵素である[NiFe]ヒドロゲナーゼの水素活性化状態のモデルとなる化合物の合成と、その構造解析」に成功した(Science,2007,316,585-587)。本研究成果は、今後の水素活性化の基礎研究の発展に寄与するとともに、次期エネルギー源としての水素の研究開発につながるとの高い評価を得た(平成19年4月25日にプレスリリース、Science誌のPerspectiveで紹介、C&EN NEWS(ACS)で紹介、Chemistry World(RSC)で紹介、平成19年4月27日、西日本新聞と日刊工業新聞に掲載された)。「水素/重水同位体交換」は、架橋ヒドリド配位子を持つ水溶性ルテニウムヒドリド錯体を触媒とする「水中でpHに依存したカルボニル化合物の水素化と水素/重水同位体交換反応」に成功した(Proc.Natl.Acad.Sci.,USAに平成20年3月8日投稿)。本研究の目的は、「選択性に優れかつ環境負荷の少ない触媒反応の開発」を命題とし、次世代の「バイオインスパイアード触媒」を創製することである。

本年度は、水溶性ニッケル・ルテニウムアクア錯体を用いて「水素のヘテロリティックな活性化を2回経由する水素からの触媒的な電子抽出(Chem. Lett. 2008, 37, 970-971)」と「HDと重水素が同時に生成する同位体交換(Dalton Trans. 2008, 4747-4755)」に水中・常温・常圧で成功した。さらに、反応で生成する低原子価錯体等の中間体を単離し構造を決定することにより、水中での触媒の関与した水素分子の活性化機構を解明した。このように、本研究は、「水中・常温・常圧での水素分子の活性化」というクリーンエネルギー変換システム実現への新しい道筋を提示し、化学、環境、エネルギーの分野において、基礎的研究を実用的応用に結びつける上で極めて重要な貢献を果たすものとして期待できる。本研究成果は、平成20年8月5日にプレスリリースし(場所:九州大学伊都キャンパス、説明者:小江誠司)、英国王立化学会Chemical Scienceと日本化学会のホームページで紹介され、毎日新聞、日経新聞、西日本新聞、読売新聞に掲載された。また、英国王立化学会Dalton TransactionsのHot ArticlesおよびTop 10 Most-Accessed Articlesに選ばれた。21世紀の最重要課題であるエネルギー・資源・環境問題を解決するためには、生命の機能原理を抽出・応用し、生命機能を凌駕する「生体模倣機能触媒化学」を創成することが必要不可欠である。本研究の目的は、「選択性に優れかつ環境負荷の少ない触媒反応の開発」を命題とし、次世代の「バイオインスパイアード触媒」を創製することである。最終年度である本年度は、これまでに二度プレスリリースした研究成果:(1)平成19年4月25日、場所:九州大学伊都キャンパス、説明者:小江誠司(九州大学教授)、解禁時間:平成19年4月27日午前3時、新聞平成19年4月27日付朝刊。タイトル:「水素活性化酵素のモデル化に成功(水素エネルギー研究開発へ応用)」と(2)平成20年8月7日、場所:九州大学伊都キャンパスビッグオレンジ、説明者:小江誠司(九州大学教授)、解禁時間:平成20年8月9日午前10時、新聞平成20年8月9日付朝刊。タイトル:「水中・常温・常圧で水素から電子を取り出すニッケル系触媒の開発に成功(誰も想像しなかった電子取り出しのメカニズム)」をまとめ、Chemical CommunicationsのFeature Articleとして発表した。本研究成果は、文部科学省、科研費NEWS2009VOL.1p.9に取り上げられた。また、本特定領域研究の研究項目AO4「生体模倣機能触媒化学」で研究してきた研究テーマ「Bioinspired Catalysis」を小江がゲストエディターとして、英国王立化学会Dalton Transactions誌より、特集号「Bioinspired Catalysis」を刊行した。
大動脈弁狭窄症発症におけるCircular RNA ITCHの機能解明

新生仔ラット心筋細胞において、ユビキチン転移酵素ITCHを過剰発現すると、標的たんぱく質であるDvlのタンパク質発現が低下することを発見した。Angiotension刺激やエンドセリン1刺激では、予想に反して、Dvlの発現量に変化を認めなかった。他方、Wnt3aで刺激するとDvlが増加し、βカテニン経路が活性化し、心筋細胞は肥大した。ユビキチン転移酵素ITCHをsiRNAでノックダウンすると、Dvlが増加しβカテニン経路が活性化し、最終的に心筋細胞肥大を認めた。他方、ユビキチン転移酵素ITCHを過剰発現した際には、Dvlが低下するものの心筋形態に変化はなかったが、Wnt3aで刺激すると心筋細胞肥大を抑制した。ITCHの阻害剤が同定されたので、ITCH阻害剤を心筋細胞に投与したところ、心筋細胞は細胞死を来した。また、Wnt3aとITCH阻害剤を用いた実験系では、心筋細胞は肥大と細胞死が同時に認められ、心筋細胞における細胞形態や細胞死におけるITCHの重要性が示された。同様の実験を豚大動脈弁間質細胞を施行することを計画している。心臓特異的ITCH過剰発現マウスに対して、大動脈縮窄手術を行い心肥大を誘導した。ITCH過剰マウスでは、心肥大を抑制することを発見した。また、心肥大を誘導した際に、Dvlのisoforomである1-3が経時的に発現量が変化しており、特にITCHはDVL3の分解を誘導することを発見した。DVLは循環器疾患においては過去にDVL1やDVL2の報告がいくつか報告されているが、DVL3に関しては検討されていない。そのため、DVL3の心疾患における役割を同時に検討していく必要性が示唆された。大動脈弁特異的CircularITCH過剰発現マウスの作成に難渋している。新生仔ラット心筋細胞における実験系は概ね順調に経過している。他方、新たなリサーチクエッションとして、ユビキチン転移酵素ITCHとDVLの相互作用を心筋細胞でも確認し、病的心におけるITCHとDVL3相互作用の重要性を発見した。循環器領域において、DVL1やDVL2がWntシグナルや心肥大に与える影響は報告されているが、DVL3に関しては皆無である。DVL1-3は構造的に類似しているものの、DVL3はC末端のHis single amino acid repeatを特徴的な構造としてもち、non-canonical WNT signalを誘導することが報告されている。ITCHがcanonical Wnt signalを調整するデータは得たが、追加でnon-canonical Wnt signalへの影響を検討する必要性が示唆された。DVL3のプラスミドを購入し、心筋細胞においてco-transfectionし免疫沈降法で評価したところ、非常によく結合しており、心筋細胞においてITCHとDVLの相互作用が強いことが示された。腫瘍細胞においては、Dvl1-3が腫瘍の進展に与える影響はDVL3>DVL1>DVL2とも報告されており、DVLのアイソフォームによる違いを検討する必要性が示唆された。心筋特異的Circular ITCHを作成しているところであるが、心筋特異的ITCH過剰発現マウスにおいてもCircular ITCHの発現が上昇していることを認めた。そのため、心筋特異的Circular ITCHより大動脈弁特異的Circular ITCH過剰発現マウス作成が重要と判断しそちらの作成にとりかかっているが、大動脈弁特異的CircularITCH過剰発現マウスの作成に難渋している。新生仔ラット心筋細胞におけるCircular ITCHの機能をin vitroで検討する。

他方、新たなリサーチクエッションとして、ユビキチン転移酵素ITCHとDVLの相互作用を心筋細胞でも確認し、病的心におけるITCHとDVL3相互作用の重要性を発見した。循環器領域において、DVL1やDVL2がWntシグナルや心肥大に与える影響は報告されているが、DVL3に関しては皆無である。DVL1-3は構造的に類似しているものの、DVL3はC末端のHis single amino acid repeatを特徴的な構造としてもち、non-canonical WNT signalを誘導することが報告されている。ITCHがcanonical Wnt signalを調整するデータは得たが、追加でnon-canonical Wnt signalへの影響を検討する必要性が示唆された。DVL3のプラスミドを購入し、心筋細胞においてco-transfectionし免疫沈降法で評価したところ、非常によく結合しており、心筋細胞においてITCHとDVLの相互作用が強いことが示された。腫瘍細胞においては、Dvl1-3が腫瘍の進展に与える影響はDVL3>DVL1>DVL2とも報告されており、DVLのアイソフォームによる違いを検討する必要性が示唆された。心筋特異的Circular ITCHを作成しているところであるが、心筋特異的ITCH過剰発現マウスにおいてもCircular ITCHの発現が上昇していることを認めた。そのため、心筋特異的Circular ITCHより大動脈弁特異的Circular ITCH過剰発現マウス作成が重要と判断しそちらの作成にとりかかっているが、大動脈弁特異的CircularITCH過剰発現マウスの作成に難渋している。新生仔ラット心筋細胞におけるCircular ITCHの機能をin vitroで検討する。(理由)予定されていた予算はほぼ使用したが880円わずかに残金が生じた。(使用計画)来年度に消耗品購入に使用する予定である
液相中レーザー溶融法による酸化チタン真球粒子の合成と光学特性評価

本研究では、従来の液相レーザーアブレーション法よりも弱い強度(数100 mJ cm^<-2>pulse^<-1>)のレーザー光を液相中に分散させた原料粉体に照射することによって、原料粉体が溶融するプロセスを利用した新しい真球粒子の合成技術開発に取り組んだ。サブマイクロナノメートルの真球酸化チタン粒子の合成や、酸化亜鉛の合成とそのサイズ制御を試み、その光学応用を試みた。本研究では、従来の液相レーザーアブレーション法よりも弱い強度(十分の一程度)のレーザー光を液相中に分散させた原料粉体に照射することによって、原料粉体が溶融するプロセスを利用した新しい真球粒子の合成技術開発(液中レーザー溶融法)に取り組んだ。平成24年度は、酸化チタンに並んで蛍光体や光触媒として有用である酸化亜鉛も扱った。酸化亜鉛のサブミクロンオーダーの球状粒子は特に研究的、産業的にもニーズが高く、これまでにも複数の研究グループによって酸化亜鉛に対する液中レーザー溶融法が試みられてきた。しかし同様なレーザー条件であるにもかかわらず、研究グループによって生成する粒子サイズがナノサブマイクロメートルと広い領域に渡って異なる結果が得られることが明らかとなりつつあった。そこで異なる品番の試薬の酸化亜鉛原料粒子を用い、それらの凝集・分散特性が生成物サイズに及ぼす影響を明らかにした。さらに当初の平成24年度の計画に挙げた「分散媒の化学的および物理的特性が粒子の真球性や粒子サイズに及ぼす影響の調査」の項目の一つである「分散液の影響」の調査として、分散液への電解質添加によりイオン強度を変化させ、原料粒子の凝集性を制御することによってこれまでサブマイクロメートルサイズの球状粒子の生成が困難であった酸化亜鉛原料粒子に対しても、サブマイクロメートルサイズの粒子合成が可能であることが明らかとなった。また当初、主に平成23年度の計画に挙げていた「レーザー条件や原料粒子サイズが真球性や粒子サイズに及ぼす影響の調査」の更なる検討として、2つに分岐したレーザービームの光路長の違いにより一方を時間遅延させたビームを重ね合わせることにより擬似的にパルス幅を変化させ、生成物に及ぼす影響の調査も行ったが、現時点では顕著な影響は確認出来なかった。本研究では、従来の液相レーザーアブレーション法よりも弱い強度(十分の一程度)のレーザー光を液相中に分散させた原料粉体に照射することによって、原料粉体が溶融するプロセスを利用した新しい真球粒子の合成技術開発に取り組む。本研究ではサブマイクロナノメートルの真球ルチル型酸化チタン粒子の合成を試み、真球性やサイズ分散性の制御技術の開発や、真球性が散乱特性に及ぼす影響の検証を行う。ルチル型酸化チタンは高い屈折率を有しており、粒子の高度な真球化およびサイズ制御が可能になれば、高い精度で性能制御が可能な顔料や化粧品、フラットパネルディスプレイなどへの光散乱体としての応用が期待できる。具体的に本研究では、サブマイクロナノメートルの真球ルチル型酸化チタン粒子の合成におけるレーザー照射条件が生成粒子の真球性やサイズ分散性に及ぼす影響を検証し、さらに得られた粒子の真球性が光散乱特性に及ぼす影響の検証を行う予定である。その中で、平成23年度は主にレーザー条件や原料粒子サイズに着目し、真球性の向上や粒子サイズの制御に重要な因子の解明を行った。上記の検討の中で、得られる生成粒子の平均粒子サイズは、照射フルエンスが大きくなるに従い、サブマイクロメートルのオーダーに大きくなるが、あるフルエンスを超えると数10ナノメートルの球状粒子の割合が増加していく傾向があることが明らかになった。この時、照射フルエンスの増加に従い、酸化チタンと分散媒との化学反応によって生成すると考えられるTiO2・nH2Oの量も増加していることが明らかとなった。生成したTiO2・nH2Oを化学的溶解によって除去し、精製単離された数10ナノメートル酸化チタン粒子は、これまで我々が報告してきた液中レーザー溶融法によって生成するサブマイクロメートル球状粒子よりも真球性に優れていることが明らかとなった。計画では、平成23年度は、主にレーザー条件や原料粒子サイズに着目し、真球性の向上や粒子サイズの制御に重要な因子の解明を行う予定であった。具体的には「レーザー条件や原料粒子サイズが真球性や粒子サイズに及ぼす影響の調査」として以下の2項目、i)レーザーフルエンスの影響,ii)照射時間の影響を、さらに「散乱特性評価試験用の試料薄膜作製のための予備実験」としてiii)散乱特性評価試料用のTiO2粒子分散樹脂膜の作製の検討を行う予定であった。このうち、i)とii)に関してはほぼ達成できたと考えられるが、iii)の項目にまで検討が及んでいない。その理由として、照射後の酸化チタン粒子が還元状態であるために青紫色を呈しており、散乱体として適さない状態であると考えられることから、粒子合成過程の再検討を新たに行う必要性が出てきたため、現時点ではiii)に関する検討を行っていない。これまでの研究で、照射後の酸化チタン粒子が還元状態であるために青紫色を呈しており、散乱体として適さない状態であることが明らかとなりつつある。

そこで平成24年度より、照射後に得られた粒子に対する後処理(熱処理、または化学的処理など)による還元状態の解消や、レーザー照射時の粒子の分散液の成分による還元反応の制御を試みる予定である。特に後者の照射時の粒子分散液の成分による反応の制御方法の開拓は、本液中レーザー溶融法を他の材料に適用する際にも重要な知見となることから、将来的に本手法に関する研究にとって大変重要である。これらによって酸化チタン粒子の還元状態の抑制を実現し、散乱体への応用の可能性を検証していく予定である。平成23年度予算から次年度に使用する金額では、主に生成した酸化チタン球状粒子の還元状態の抑制や、還元状態の生成を抑制するための分散液を検討する際の試薬として使用予定である。また、粒子の精製や回収の際に使用する消耗品等に使用する予定である。
タンパク質品質管理を担うシャペロン依存型ユビキチンリガーゼの遺伝学的解析

昨年度にすでにタンパク質品質管理ユビキチンリガーゼと想定されるCHIPのノックアウトマウスの作製に成功しており、このマウスについて解析を行った。このマウスは、外見上野生型の同腹仔に比して、体重が1/22/3しかなく、多くが生後1週程度で死亡した。一部生き残ったものも、およそ生後5ヶ月ころからあきらかな筋力低下症状を示すようになった。またオス、メスとも生殖可能ではあるが、妊娠能力が低かった。現在この原因を解析するために詳細に組織学的検索を行っているところである。タンパク質品質管理の破綻と神経変性疾患の関連が現在非常に注目されているが、このCHIPノックアウトマウスにおいて特筆すべき表現型は、生後数ヶ月で小脳失調様の歩行を呈することである。しかし、現在のところ組織学的に異常タンパク質の蓄積や神経細胞死などは観察されていない。これはマウスの寿命が短いためにタンパク質の凝集が観察されにくいためかもしれない。この表現型をさらに観察しやすくするために、変性タンパク質に対する生体応答にどのように関わるかを個体で観察する目的で、ハンチントン舞踏病モデルマウスであるHDQ150(ポリグルタミン繰り返し配列を150含むhuntingtin)ノックインマウスおよび小脳失調モデルマウスであるLurcherマウス(GRID2 mutation)と、CHIP欠損マウスとの交配を進めており、現在CHIP欠損がマウスハンチントン舞踏病や小脳失調発症に及ぼす影響を観察中である。また今年度は新たにCHIPと物理的、機能的に協調してはたらくHsj-1という分子を見いだした。Hsj-1はDnaJドメインとともにユビキチン結合モチーフであるUIMを併せ持ち、CHIPによる変性タンパク質のユビキチン化を促進するとともに、ユビキチン化タンパク質を受け取る機能を持つ。さらに興味深いことにHsj-1もCHIPと同様に神経細胞特異的な発現を示す。このことからCHIPとHsj-1が神経細胞における品質管理に連携して働いていることが示唆される。現在さらにHsj-1ノックアウトマウスを作製中であり、このマウスとCHIPノックアウトマウスの交配によりさらに神経細胞におけるタンパク質品質管理の重要性が明らかになることが期待される。本年度はタンパク質品質管理ユビキチンリガーゼと想定されるCHIPのノックアウトマウスの作製に成功した。また様々な生体ストレスにCHIP欠損がどのように影響するかを調査中である。タンパク質品質管理の破綻と神経変性疾患の関連が現在非常に注目されているが、変性タンパク質に対する生体応答にどのように関わるかを個体で観察するために、ハンチントン舞踏病モデルマウスであるHDQ150(ポリグルタミン繰り返し配列を150含むhuntingtin)ノックインマウスと、CHIP欠損マウスとの交配を進めており、現在CHIP欠損がマウスハンチントン舞踏病発症に及ぼす影響を観察中である。また、CHIPの新たな機能を探索する目的で、酵母においてCHIPの過剰発現がその変異を抑制する酵母の変異体を多数同定したところ、リボソーム機能や膜輸送などこれまで予想していなかった分子が多数同定され、CHIPの機能が多岐にわたる可能性が示された。現在これらの分子についてさらにCHIPとの関連を調べている。

現在さらにHsj-1ノックアウトマウスを作製中であり、このマウスとCHIPノックアウトマウスの交配によりさらに神経細胞におけるタンパク質品質管理の重要性が明らかになることが期待される。
シミュレーションと実験とを併用したヒト骨格筋内の局所応力ならびに局所変形の解明

Spin tagging MRI, Phase contrast MRI, Diffusion tensor MRI等を応用し筋組織の生体情報(e.g.局所変形,筋線維走行)の新たな取得法を確立した.また,この新規手法で得られた実測値を入力と妥当性検証に用いることで,筋線維の3次元配置をもち,収縮ダイナミクスによる内力発揮と変形が生じる実形状骨格筋有限要素シミュレーションモデルを開発した.運動時の組織ひずみの不均一性,ひずみ集中の挙動,腱膜の機能的意義,腱組織の力学的特性と組織損傷の関係等が明らかとなった.Spin tagging MRI, Phase contrast MRI, Diffusion tensor MRI等を応用し筋組織の生体情報(e.g.局所変形,筋線維走行)の新たな取得法を確立した.また,この新規手法で得られた実測値を入力と妥当性検証に用いることで,筋線維の3次元配置をもち,収縮ダイナミクスによる内力発揮と変形が生じる実形状骨格筋有限要素シミュレーションモデルを開発した.運動時の組織ひずみの不均一性,ひずみ集中の挙動,腱膜の機能的意義,腱組織の力学的特性と組織損傷の関係等が明らかとなった.本研究は,有限要素法を用いたコンピュータシミュレーションとin vivo実験とを併用することで,実験的に計測することが困難であるヒト骨格筋の運動やトレーニング時の局所応力や局所変形の状況を明らかにし,これらのスポーツ障害との関連性,ならびに,その後に生じる適応による筋形状や筋機能の変化との関連を検討することを目的としている.当該年度においては,まず,MRIから得た形状情報を基に下腿三頭筋の線形,ならびに非線形の筋腱複合体3次元有限要素モデルを作製し,モデルにおける計算結果とin vivo実験より得られた全体形状の変化や組織の長さ変化との比較を行うことでモデルの妥当性を確認した.次に,受動的なストレッチング時に組織に生じる応力とひずみを算出することで,腱膜組織が存在することの機能的意義を明らかにした.また,同モデルを用いることで伸張性収縮時の筋腱複合体の応力とひずみ分布に1)個体差や適応による腱組織の物性の変化が与える影響,ならびに,2)収縮強度による筋組織の物性の変化が与える影響を検討した.その結果,1)では,腱組織が柔らかいことで筋・腱組織への損傷が減少する程度を定量的に検討できた.2)では異なるトレーニング強度を組み合わせることでトレーニング効果が変化する原因を力学的な観点から示唆することができた.現在,開発中である筋線維の収縮により内力を発揮し短縮を生じることが可能なモデルについても方法論は確立できつつある.上記既発表のいずれの成果も,これまでの実験計測のみを主体とした方法論では得ることが非常に困難なものであり,これらの成果は高い独自性をもつ.本研究は,有限要素法を用いたコンピュータシミュレーションとin vivo実験とを併用することで,実験的に計測することが困難であるヒト骨格筋の運動やトレーニング時の局所応力や局所変形の状況を明らかにし,これらのスポーツ障害との関連性,ならびに,その後に生じる適応による筋形状や筋機能の変化との関連を検討することを目的としている.当該年度においては,昨年度から進めてきた,筋線維がHill type modelに従った収縮ダイナミクスをもち筋張力による組織変形が可能な有限要素モデルの第一世代が開発できた.このモデルは単一筋ではなく,協同筋を持つものであり,実施計画に挙げた筋間のlateral force transmittionについての検討を行なうことが可能である.また,個人のMR画像から得た形状データから計算安定性の高いメッシュモデル作製を迅速に行なうことが可能なシステムを利用できたことで,個人差を検討する解析が可能となった.加えて,実験については,筋線維の筋内における配列をDiffusion tensor MRにより計測すること,ならびにPhasecontrast MRにより収縮に伴う組織の変形を高空間分解能で計測することを可能とし,これらのデータを用いることで,有限要素モデルのパラメータの調整を進めている.昨年までの成果を論文と複数の学会で研究発表し,内外の研究者と意見交換を行うことで,シミュレーション,実験ともに優先的に取り組むポイントが明確化できた.上記のいずれの成果も,これまでの実験計測のみを主体とした方法論では得ることが非常に困難なものであり,これらの成果は高い独自性をもつと考える.本研究は,有限要素法を用いたコンピュータシミュレーションとin vivo実験とを併用することで,実験的な計測が困難であるヒト骨格筋の運動やトレーニング時の局所応力・局所変形の状況を明らかにし,これらのスポーツ障害との関連性,ならびに,その後に生じる適応による筋形状や筋機能の変化との関連を検討することを目的としている.当該年度においては,初年度より開発を行ってきた1)筋線維が収縮ダイナミクスに従う内力(筋張力)を発揮し,2)筋内に線維性の組織の3次元配置をもつ,変形・応力解析の可能な骨格筋有限要素モデルについて国内外での発表を行った.開発に伴い必要なin vivo実験パラメータについては,MR,超音波等の高機能医療機器を用いて人体から計測し実装した.また,昨年度実用化したPhase contrast MRを用いて収縮に伴う組織の変形を高空間分解能で計測する技術を発展させ,これまで報告が少ない筋,腱の運動時局所変形を詳細に実測し,国内外で発表を行った.これらは実験データとしても優れたものであるが,この新技術による実験データをシミュレーションに併用することで,有限要素シミュレーションによる解析も更に精度・信頼性の高いものとなりつつある.

研究の進捗の中で,実験・シミュレーションの両分野共にスポーツ障害に関する多くの示唆を得ることができており,今後も研究の大きな発展が期待できる.本研究で得られた成果はいずれも,これまでの実験計測,あるいは数値解析のみを主体とした方法論では得ることが非常に困難であった知見がほとんどであることを強調しておく.
ICE1を中心とした低温シグナル伝達ネットワークの解析

低温シグナル伝達因子ICE1の転写活性化様式を明らかにする目的で、ICE1に点変異を導入したところ、ICE1(S403A)では分解が抑制され、タンパク質ェ安定化することで低温耐性を促進していることを明らかにした。また、ICE1の相互作用因子の単離を行い、MYC型転写因子、キナーゼの他にカルモジュリン様タンパク質を同定した。カルモジュリン様タンパク質については、低温応答及び低温シグナル伝達に関わることが示唆された。1、植物における低温シグナル伝達を明らかにする目的で転写因子ICE1と相互作用する因子の単離、および機能解析を行っている。相互作用因子であるカルモジュリン様タンパク質およびMYC型転写因子は低温シグナルに関わることが示唆された。今後は結合の機能的な意義を明らかにする予定である。2、ICE1(S403A)の転写活性化様式を調べたところ、ICE1(S403A)は低温においても分解されにくいことから、低温応答性遺伝子の発現を促進して、低温耐性になることが示唆された。またICE1(S403A)に対するユビキチン化をICE1(WT)と比較したところ、ICE1(S403A)ではin vivoにおいてユビキチン化がほとんどされていないことが明らかになった。実際にS403にユビキチンが結合するかどうかを、現在実験によって確かめているところである。3、翻訳後修飾因子であるSUMO化とICE1の関係を明らかにする目的でSUMOE3リガーゼ変異株siz1を用いた研究から、ICE1のSUMO化を介したシグナル伝達経路には植物ホルモンの1つサリチル酸の制御が含まれていることが示唆された。1、植物における低温シグナル伝達因子ICE1と相互作用するタンパク質カルモジュリン様タンパク質の過剰発現体では低温耐性を示し、低温応答性遺伝子の発現上昇が見られた。また、カルモジュリン様タンパク質とICE1との相互作用様式を調べたところ、in vitroにおけるpull-downアッセイにより両者の相互作用はカルシウム添加によって促進されることが明らかとなった。またin vivoにおける相互作用を調べたところ、これらの相互作用は低温によって促進されることが明らかとなった。このことから、カルモジュリン様タンパク質は低温耐性の調節に関わっていることが示唆された。現在、カルモジュリン様タンパク質との相互作用に関して特異性を調べている。またカルモジュリン様タンパク質のRNAi株を作製しており、knock-down株における低温応答についても調べる予定である。2、403番目のセリン残基をアラニンに置換したICE1(S403A)は低温耐性を増強することが昨年度の研究から示唆された。ICE1及びICE1(S403A)のタンパク質の安定化を調べたところ、ICE1(S403A)でタンパク質が安定化することが明らかとなった。さらにin vivoにおいてICE1はユビキチンかされるのに対し、ICE1(S403A)はユビキチン化されていないことが明らかとなった。ところが、in vitroにおけるユビキチン化アッセイを行ったところ、in vitroの系ではユビキチン化されていることが明らかとなった。このことから、S403は主要なユビキチン化部位ではないことが示唆された。S403がユビキチン化の主要な部位ではないことから、ICE1(S403A)はin vivoにおいて何らかの修飾によりユビキチン化を抑制する役割があることが示唆された。植物における低温シグナル伝達因子ICE1と相互作用するタンパク質であるカルモジュリン様タンパク質の機能解析を行った。カルモジュリン様タンパク質の過剰発現体では低温耐性を示し、RNAiによる発現抑制体では低温感受性を示した。また、これらの植物体において、低温誘導性遺伝子(CBF/DのREB1,COR47,P5CS2)の発現解析を行ったところ、過剰発現体ではこれらの遺伝子の発現が上昇し、RNAi抑制体では発現の低下が見られた。これらのことから、カルモジュリン様タンパク質が低温シグナル調節及び低温応答に関わっていることが示唆された。シロイヌナズナにおいてカルモジュリンタンパク質は7種類、カルモジュリン様タンパク質は50種類存在する。今回単離されたカルモジュリン様タンパク質はグループ2に属するが、グループ2内の他のカルモジュリン様タンパク質及び、近縁のグループ1およびカルモジュリンに対する相互作用を調べたが、ICE1との相互作用は見られなかった。このことから、今回単離したカルモジュリン様タンパク質は特異的にICE1と相互作用する可能性が考えられる。このことは、低温における細胞質、核中へのカルシウムの一過的放出をデコードする因子としてカルモジュリン様タンパク質が働き、そのシグナルをICE1から始まる低温シグナル伝達経路に伝えている可能性が示唆された。尚、低温におけるカルシウムの一過的放出を司る因子としてカルシウムチャネルが考えられ、予備的実験では、カルシウムチャネルの変異株において、低温応答に異常が見られることが明らかとなった。
非定型歯痛の分類と治療に関する研究

慢性疼痛を主症状とする「非定型歯痛」と診断された患者を対象として、(1)残髄、歯根膜感染、根尖周囲歯周組織炎症が無いことの確認、(2)水酸化カルシウムペースト根管貼薬を施し、その後の頻回の根管洗浄を極力避けることによる患歯歯根膜の安静確保、(3)精神科における何種類かの抗うつ剤の服用、を治療方針として主に三環系抗うつ剤の効果を検討した。その結果患者は3か月後には根管充填を行うまでになり、補綴処置を行って予後の経過が良好である場合が多かった。本研究によって非定型疼痛の成立機序と典型的症状がわかり、精神科の協力による三環系抗うつ剤の服用が患者の慢性疼痛の軽減に劇的に効果を表すことがわかった。非定型的な歯痛として認識される症例を分類し、初診時にいわゆる非定型歯痛が疑われたものの中から非定型歯痛ではない明確な歯科的原因を持っていた疾患を鑑別抽出する方法を考案した。具体的には、通常の根管治療で治癒しない症例のうち慢性的な疼痛愁訴が認められる症例を抽出した。その後歯牙の器質的欠陥あるいは医原生の創傷が無い症例を分別するために、歯科用実体顕微鏡と接続するDVDモニターで記録した画像を用いて髄床底(根管口を含む)の状態を観察した。エックス線写真を用いて明確な根尖部歯槽骨の吸収が認められる症例は除外して、残った症例を非定型歯痛の候補として残した。一方、歯髄炎の温度診断に関する研究を行った。これは研究を始めるにあたり予定に入れていなかったものだが、正常な歯髄の温度反応の特徴を知った上で、上記費定型歯痛を持つと疑われる患者の健全生活歯で差異がでるかどうかを確認するためである。この枝分かれ研究については20年度中に論文にして公表した。後ろ向き統計研究を実行中である。これは当研究者が勤務する大学付属病院の歯内治療科にて過去2年間に非定型歯痛を疑う症例を抽出する作業である。これについてはまだ完結していない。ダマスカス大学アル・ティナウィ教授に委託しているダマスカス大学における後ろ向き研究については、同様にカルテから抽出している途中であるが、国際的な新型インフルエンザ蔓延とアラブ地域の政治的緊張のため木下が17回シリア歯学会に参加しなかったため、少々頓挫しているが、メール交換を主な連絡方法として鋭意研究成果を収集している。21年度の研究予定は、上記の計画のうち遅れている後ろ向き研究を急ぎ、その上で非定型歯痛と精神疾患の関連を考察する。その上で非定型歯痛のタイプ分けができると想定し、性別・年齢・職業(もしくは有閑度)、居住地域などの基本的事項をプロファイリングする。本研究を申請した段階から約2年半の時日が経過したが国際政治情勢の変化があったため、この研究の一方の主要部分として予定していたシリア国立歯学部小児歯科の協力が得にくい状況となった。そこで、当初の研究内容を修正する必要が生じたため、新たにin-vitro実験を追加した。生活に支障をきたす不明痛を訴える歯牙を抜去して健全歯との間に物理的な差異がないかを調べる(特に根尖口の形態、側枝の有無、歯根膜の性状と形態)ために、t-ブタノール凍結乾燥器を購入する必要が生じた。この計画変更を前提として以下の実験を行った。すなわちin-vivo実験として、抜去歯に人工的な垂直性歯根破折をつくり、メチレンブルー溶解液を塗布したものとしないもの、各種濃度のアルコール溶液で希釈したものを合計10グループとして編成し、DIAGNOdentを用いてレーザー光の吸収率を測定した。その結果をMann-Whitney Utestで統計学的に文益した。その結果、メチレンブルー溶解液が0.1%または1.0%ポリエチレン・オクチルフェニル・エーテルを用いた場合に、メチレンブルーだけのグループに比べて有意にレーザー光の吸収率が上昇していることがわかった。この実験のあと、非定型歯痛の原因の一つとして考えられる根管治療後の不完全破折または垂直性亀裂の存在と慢性疹痛との関連について、治療例をデータベースとして検討を行う予定である。(本研究にて試みる非定型歯痛の治療方法の妥当性を評価する調査的研究方法)歯痛を主訴として当科を受診し、6か月以上痛みが続いており慢性疼痛と診断された40名の担当医(歯内療法を専門とする)に対し痛みの持続時間・痛みの性状や客観的症状に加え、慢性疼痛と身体的要因、環境的要因、心理的要因との関連について、さらに精神科・心療内科への通院歴について調査を行った。

(その結果)患者の65%が女性で、そのうちの約38%が中年層(4059歳)の主婦であり、男性は35%でほとんどが無職であった。患者が訴える痛みの強さをVRS(Verbal Rating Scale:カテゴリースケール)により評価したところ、中程度の痛みを訴える患者が75%であった。精神科・心療内科への通院歴が全体の30%にみられた。一般的に慢性疼痛は過去に被った損傷の後遺症をベースとしそこに身体的、環境的、心理的要因が加わり痛みを増強させていると言われているので、患者の要求にひきづられた頻回の根管貼薬は医原性の疼痛増幅をきたし、かつ精神科による治療の併用が効果的である可能性が認められた。(上記仮説に基づいた治療方法の実践)慢性疼痛を主症状とする「非定型歯痛」と診断された46歳女性を本研究の典型的な対象として、(1)残髄、歯根膜感染、根尖周囲歯周組織炎症が無いことの確認、(2)水酸化カルシウムペースト根管貼薬を施し、その後の頻回の根管洗浄を極力避けることによる患歯歯根膜の安静確保、(3)精神科における何種類かの抗うつ剤の服用、を治療方針とした。(その結果)患者は3か月後には根管充填を受け入れるまでになり、補綴処置を行って予後の経過が良好であった。本研究によって非定型疼痛の成立機序と典型的症状がわかり、精神科の協力による三環系抗うつ剤の服用が患者の慢性疼痛の軽減に劇的に効果を表すことがわかった。
生殖巣の初期形成を支える細胞ダイナミズム

脊椎動物の初期発生過程において、腎臓(中腎)と生殖巣は隣接して形成される。このとき、腎臓を覆う上皮(「腎体腔上皮」とよぶ)と生殖巣は、共に体腔上皮とよばれる同じ上皮組織に由来する。腎体腔上皮が形成される際、上皮細胞としての極性を維持し続けるのに対し、生殖巣の形成過程においては、体腔上皮からの脱上皮化がみられる。本研究では、生殖巣の形成機構を、細胞の上皮-脱上皮(Epithehal-mesenchymal-transition ; EMT)という観点から理解することを目的として解析を進めてきた。具体的には、まず腎体腔上皮に作用させた際にEMTを誘導する遺伝子群を探索し、次にそれらの候補遺伝子に注目して、本来の生殖巣形成のしくみに迫ろうというものである。得られた結果を以下に示す。1)腎体腔上皮に作用させた際にEMTを誘導する能力を有する分子として、Shh,Gli,Ras-MAPキナーゼ因子群などを見いだした。逆に、カドヘリンやCdc42は、上皮極性の維持に必須であった。2)本来の生殖巣の形成過程において、上記分子に注目してその発現や活性化を解析した。その結果、形成初期の生殖巣は、隣接組織(内胚葉)に発現するShhを受け取ることによって、MAPキナーゼ経路を活性化きせることがわかった。これらの分子カスケードが生殖巣細胞にみられるEMTを惹起すると考えられる。3)腎体腔上皮を支持する組織を人工的に除去すると積極的な脱上皮化がみられたことから、正常発生における腎体腔上皮と生殖巣にみられる上皮化の違いは、隣接する支持組織の違い(細胞外マトリックスなど)に起因すると考えられた。本研究により、初期生殖巣の形成機構について、組織間相互作用、細胞の極性変化、そしてそれらを制御する分子カスケードなどの視点から解明することができた。脊椎動物の初期発生過程において、生殖巣と腎臓(中腎)は隣接して形成される。このとき、体腔上皮とよばれる組織に由来する細胞は、このどちらの組織にも参画する。生殖巣には上皮から脱上皮をおこした細胞が、また中腎を取り巻く組織には上皮のままの細胞が参画する。そこで本年度は、細胞の上皮化一脱上皮化という観点から生殖巣の成り立ちを解析した。具体的には、中腎をとりまく上皮(腎体腔上皮とよぶ)から人工的にEMTをおこす条件を探し、EMTをおこした細胞が生殖細胞としての分化形質を発現するかについて調べた。腎体腔上皮からEMTを誘導する能力を有する分子として、これまでにRhoA、Snail2,Shh,Gliなどを見いだしている。カドヘリンやCdc42については、機能阻害をした場合にEMTがみられたことから、上皮細胞の維持に重要であると思われる。そこで今年度は、これらの分子を中心としたシグナルカスケードの解析を行った。RhoAの下流では大きく3種類のシグナル経路が知られているが、特にMAPキナーゼを介する経路がEMT誘導に関わっている知見を得た。次に、腎体腔上皮とそれを裏打ちする基質との相互作用に注目した。この場合の基質とは、異なる組織(中間中胚葉)に由来する組織であり、そこには腎細管などの構造が詰まっている。そこで腎細管を含む中間中胚葉由来の組織をトリ胚操作により除去したところ、腎体腔上皮の構造が不安定になった。加えて、先述のSnailによるEMT誘導効率が有意に上昇した。これらのことから、上皮の維持には、それを裏打ちする基質が重要な役割をもつことがわかった。このような相互作用を実際の生体内で示した例はほとんどなく、新規の知見である。

3)腎体腔上皮を支持する組織を人工的に除去すると積極的な脱上皮化がみられたことから、正常発生における腎体腔上皮と生殖巣にみられる上皮化の違いは、隣接する支持組織の違い(細胞外マトリックスなど)に起因すると考えられた。本研究により、初期生殖巣の形成機構について、組織間相互作用、細胞の極性変化、そしてそれらを制御する分子カスケードなどの視点から解明することができた。
児童の理科離れ対策としての電子工作教材によるものづくり体験学習の試み

科学技術立国日本の将来を担う児童たちにとって、家庭や学校でのものづくり体験の機会が減少し、理科離れ、理工系離れの社会現象に少なからず影響を及ぼしていると考える。そこで、中・長期的展望に立ち、児童向けの自作体験形の電子工作教材を用いてものづくり体験学習の場を提供することにより、科学技術および電子技術への興味と探究心を培って、児童・生徒の理科離れ対策に寄与することを研究目的としている。上記目的から、長年にわたり本学の公開講座やオープンキャンパス、一日遊学、出前講座等で小・中・高生を対象に電子工作によるものづくり体験企画で活動してきた。この経験を活かし、初心者が楽しくハンダ付け技能を体感しながら、簡単にものづくりの達成感や電子部品の知識を学習できるオリジナルの電子工作教材を更に改良を加え、多種、多量に設計・製作した。今回の設計でも、乾電池駆動で回路動作が光や音で理解できる回路構成と使用半導体部品にはトランジスタやロジックICなどの基本回路部品を使用して基礎的知識が学べるよう努めた。さらに、プリント回路基板の設計では、隣接する銅箔パターン間隔を広くして初心者のハンダ付けトラブルを解消する工夫をした。また、使用するハンダや電子部品はRoHS対応とし、環境対策にも配慮した教材を完成した。例えば、フルカラーLEDで光の3原色と光ファイバー通信を学習する光ファイバー・イルミネーション回路やデジタルICと発振回路を組合せてLED表示する電子サイコロと電子ルーレット回路等、一種類あたり50100組のキットを準備することができた。これら試作・開発した電子工作教材は、今年、本学で実施される一日遊学や『ふくいサイエンス寺小屋』事業などにおいて、児童を対象としたものづくり体験学習で試用し、総合評価を受ける予定である。
トリブチルスズを含む海底堆積汚泥中の地層処分に関する実用化研究

神野・広城は各処理材の阻止率を用いて処理濃度と処理材にかかるコストを評価する手法を検討し、処理量・処理時間が与えられるときTBT処理目標濃度が達成可能な最適組み合わせ手法を開発した。また室内実験により、固液分離を容易にする膜シート効果を検討した。膜シート・砂濾過・活性炭濾過により1,2001,450ng/Lの上澄水中のTBTが3ng/L程度まで除去された。本城・大嶋は海産カイアシ類の線虫を用い16日間のTBT暴露試験を行い、本種を用いた試験法の実用性を検討し、化学物質の海産動物プランクトンの繁殖への影響を評価する手法を検討した。この試験法はノープリウスコペポダイト成体の化学物質に対して異なる耐性を持つライフステージ全体に対する影響、性決定、繁殖など次世代への影響が短い期間で観察できた。佐伯は堆積汚泥に対し、太陽光・紫外線照射・遮光(暗所)の3つの光条件に対して、堆積物中BTsの光分解の可能性を検討した。また、風乾状態・水分飽和状態下での堆積物中のBTs分解、熱処理の影響を検討した。堆積物の脱水・天日乾燥処理は、若干のTBT分解を促す可能性が期待できた。善は固化材混合及び高圧脱水処理の効果を見るため、重金属、TBT、TPTの溶出抑止効果について検討した。固化処理土のTBTとTPTの溶出は、pHの影響を受け、中性域に近づくにつれ低減した。従ってTBTとTPTの溶出抑制では、強度面では低アルカリ型固化材が有効であると考察された。多田は剥層浚渫装置の開発に試み、現地実証実験において除去底質面積700800m^2を浚渫した。本田は凝集沈殿により分離された汚染泥土に対し、無害化処理・同水溶物処理を行い、5重量%の薬剤を添加することで底質中のダイオキシン類を約20%低減することができた。また、TBTを約30%、TPTを約40%低減できた。これは薬剤の添加量を上回って分解できた。最後に、一連の処理システムの構築に関して総括し、本研究によるTBT除去処理システムの可能性や課題などを議論した。神野は北九州沿岸海域における海底下30cm程度まで数10μg/gのトリブチルスズ(以下TBT)が存在する底質に対し、室内における凝集沈殿の上澄水には数1000ng/Lの濃度でTBTがコロイド状粒子に付着していた。この予備実験を基に、凝集沈殿後の試料に対し一連の凝集沈降・ポリシート吸着・砂濾過・活性炭吸着濾過の各メカニズムを想定した実証実験を行った。その結果、固液分離後のおよそ1,2001,450ng/Lが上記一連の水処理によって3ng/L程度まで除去されることが可能であることを確認した。大嶋は生態リスク評価手法として珪藻食性線虫Prochromadorella sp.1を用い、分解の前後でその毒性の変化を調べた。結果、分解処理により毒性の低下が確認できた。しかし、対照区に対して有意に成長が悪く、TBTの濃度は約半分にしか減少しておらず分解が不完全がもしくは分解剤自体の毒性が現れたと考えられた。

実証実験で分離された汚染泥土に対し、本田は無害化処理・同水溶物処理の研究・工法提案実施を行った。本処理技術により、底質中のダイオキシン類は環境基準値150pg-TEQ/g dry以下に低減するととができた。また、有機スズ化合物についてもTBTを40%以上低減することができた。善は、汚染泥土に固化材を混合し高圧脱水した固化処理土の溶出特性について検討を行った。高圧脱水処理を施すことで、重金属の溶出に関して環境基準値を達成したが、TBTに関しては減衰しているものの環境基準には達していない。結果、汚染泥土が減容化かつ高強度化し有効利用の可能性が確認された。多田は剥層竣諜装置の開発に試み、現地実証実験において除去底質面積700800m^2を竣洪した。佐伯は堆積物中の状態変化の挙動について基礎的知見を得るため、3過程の処理後、紫外線照射、太陽光照射、ダークコンロトールの3条件で放置し、TBTの減少量を調べた。その結果、すべての処理において太陽光、紫外線照射では減少した。また、微生物による分解の可能性も確認された。実施実験の結果、実際のプラント設置時には、処理水量、処理目標値、施設配置用地、処理コスト、管理技術などのシステム計画を適正に行うためのモデルを構築すれば現地での処理が十分可能であることが推察された。神野は各処理材の阻止率を用いて処理濃度と処理材にかかるコストを評価するプログラムによって処理量・処理時間が与えられるときTBT処理目標濃度が達成可能で最適と考えられる処理システムのパラメータ(処理装置断面積,シート・砂・活性炭の必要量),コストを算出できた。また,実証実験の結果、固液分離後のおよそ1,2001,450ng/Lが上記一連の水処理によって3ng/L程度まで除去されることが可能であることを確認した。大嶋は海産カイアシ類ハルパクチクス目Tigriopus Japonicusを用い16日間のtributyltin(TBT)暴露試験を行いて、本種を用いた試験法の実用性を検討し、化学物質の海産動物プランクトンの繁殖への影響を評価する手法の確立を目的とした。結果、16日間という比較的短い期間でT.japonicusを用いた繁殖試験を行うことができた。この試験法はノープリウスからコペポダイト、そして成体という化学物質に対して異なる耐性を持つライフステージ全体に対する影響や、性決定、繁殖など次世代への影響が短い期間で観察できる優れた試験法となりうることが示唆された。佐伯は堆積物中の状態変化の挙動について基礎的知見を得るため、光条件を、太陽光・紫外線照射・ダークコントロールの3つに設定し、堆積物中BTsの光分解の可能性を見た。また、風乾状態・水分飽和状態の堆積物中BTs濃度変化を調べ、堆積物の水分状態によるBTs分解への影響、熱処理を加えることによる堆積物中BTs分解への影響を検討した。堆積物の脱水・天日乾燥処理は、若干のTBT分解を促す可能性が期待できるが、堆積物粒子が飛散しやすくなるなど不安定になるため、処理の際には周辺環境への影響を十分に考慮する必要があるとされた。善は固化材混合ならびに高圧脱水による処理の付加価値を高めるため、重金属、トリブチルスズ化合物(TBT)、トリフェニル化合物(TPT)の溶出抑止効果について検討を行った。固化処理土のTBTとTPTの溶出は、pHの影響を受け、中性域に近づくにつれ低減する。従ってTBTとTPTの溶出抑制では、強度面を考慮すると低アルカリ型固化材の使用が有効であると考察された。多田は剥層浚渫装置の開発に試み、現地実証実験において除去底質面積700800m^2を浚渫した。
神経細胞における蛋白質リン酸化反応イメージング法の開発

海馬あるいは発達脳視覚野において、シナプス長期増強や長期抑圧は学習・記憶あるいは生後初期入力による神経回路網改編の素過程であろうとの想定のもとに多数の研究がなされてきた。その結果、長期増強あるいは長期抑圧の誘発には入力によるシナプス後部のCa^<2+>/カルモデュリン依存性蛋白質キナーゼII(CaMキナーゼ)あるいは蛋白質ホスファターゼIIb(カルシニューリン)の活性化によるリン酸化反応あるいは脱リン酸化反応が関与しているとの仮説が提唱された。この仮説の根拠はそれぞれの阻害薬や遺伝子欠失マウスを使った実験結果に基づいていた。しかしながら、これらの実験では、実際にシナプスのどの部位でどのような時間経過でそれぞれの反応が生じるのかという空間的・時間的動態に関する情報が全く欠如していた。これらの空間的・時間的動態の解明なくしては、長期増強や長期抑圧のメカニズムの理解は進まないと思われた。本研究では、このように従来の研究で欠如していた情報を得るため、皮質ニューロンにおいてリン酸化/脱リン酸化反応の動態をオンラインで画像化する技術開発をめざした。そのため、以下のような実験を行いいくつかの新知見を得た。1)ラット視覚野スライス標本において、皮質IV層刺激に対するII/III層ニューロンの反応をシナプス電流変化として測定すると同時に樹状突起内Ca^<2+>濃度変化をオンラインで画像化できる事を見出した。2)CaMキナーゼのリン酸化反応によって蛍光強度を変えるプローブ(LEAS2)を開発した。それをパッチ電極を通じてII/III層ニューロン内に注入すれば、長期増強を起こす条件のIV層刺激によって樹状突起内の蛍光強度に変化が生ずる事を見出した。3)カルシニューリンの脱リン酸化反応によって蛍光強度を変えるプローブ(P-ARII)を開発した。上記と同様の方法でII/III層ニューロン内に注入したところ、長期抑圧を起こす条件のIV層刺激によって蛍光強度が増加することを観察した。この変化は数分の潜時で細胞体及び樹状突起幹に20-30分間持続した。4)このP-ARIIの蛍光強度変化はカルシニューリンの特異的阻害薬であるFK506の投与によって阻止された。したがって、カルシニューリン活性を反映しているものと判断された。シナプス長期増強や長期抑圧の誘発には入力によるシナプス後部のカルシウム濃度上昇及びそれに続くカルシウム/カルモデュリン依存性蛋白質キナーゼII(CaMキナーゼ)あるいはカルシウム/カルモデュリン依存性蛋白質ホスファターゼIIb(カルシニューリン)の活性化が重要だと考えられている。しかしながら、現在のところ、生きた大脳皮質ニューロンのシナプス後部で蛋白質リン酸化あるいは脱リン酸化反応がどのように生じるのかについての実験的データは全くない。本研究では、皮質ニューロンにおいてこのリン酸化/脱リン酸化反応の動態をオンラインで画像化する技術開発をめざした。結果1)ラット視覚野スライスパッチ標本において、II/III層ニューロンからシナプス電流の測定と同時に樹状突起内カルシウム増加の動態をオンラインで画像化できることが明らかとなった。2)CaMキナーゼのリン酸化あるいはカルシニューリンの脱リン酸化によって蛍光強度あるいは波長を変えるプローブを上記の方法で細胞内注入し、シナプス入力によって蛍光変化がどの程度生じるかを現在解析中である。