hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
難治性精巣腫瘍におけるＣｙｃｌｉｎ／Ｒｂ経路の活性化の意義とその制御機構

ヒトの正常精巣と精巣腫瘍におけるgankyrinとpRbの発現を免疫染色にて検討した。gankyrinの発現抑制がpRbの発現や増殖にあたえる影響を精巣腫瘍細胞株を用いて解析した。精巣腫瘍においては、セミノーマと胎児性癌においてgankyrinとpRbの高発現をみとめたが、他の非セミノーマではこれらの発現は弱かった。growing teratomaや奇形腫悪性転化の症例においては、pRbは高発現を示したが、gankyrinは低発現であった。gankyrinはは正常精巣におけるspermatocyteやセミノーマ、胎児性癌に発現しており、その発現はpRbと相関していた。セミノーマは胚細胞腫の前駆病変であり最も未分化とされ、そこから胎児性癌を介してその他の組織型に分化していくと考えられている。近年のepigeneticsの研究から、セミノーマではDNAが高度に脱メチル化されており、胎児性癌になるとDNMT3L(DNA methyltransferase 3-like)蛋白が特異的に発現することが報告されている。最近我々は、血清AFPが高値を示す単一型セミノーマの症例を経験し、まず予備実験として免疫組織化学染色を行ったところ、各種マーカーの発現はセミノーマと一致したが、DNMT3Lは陽性を示した。この症例から、「セミノーマの中に、胎児性癌に特異的なDNMT3Lを発現している症例群があり、そのような症例は非セミノーマに分化する傾向がある。」という仮説を着想した。本研究の目的は、単一型セミノーマおよび非セミノーマ中のセミノーマ成分におけるDNMT3L発現頻度を明らかにし、その症例の臨床的特徴を検討することである。すでに作成した精巣腫瘍tissue-microarray(71例)とAFP高値のセミノーマ3例で、DNMT3L、及び既存の胎児性癌マーカーCD30・SOX2、セミノーママーカーであるc-kitの発現を免疫染色にて検討した。まず、単一型セミノーマと診断された23例は全例でckit陽性、CD30陰性、SOX2陰性であり、形態学的、免疫組織化学的にセミノーマとして矛盾しなかった。しかし、DNMT3Lの免疫組織化学染色では、セミノーマの6/23例(26%)でDNMT3L陽性を示した。単一型セミノーマの診断であったが血清AFP高値を示した症例は、3例全例でDNMT3L陽性を示した。一方、非セミノーマにおけるセミノーマ成分におけるDNMT3L陽性率は36%であった。興味深い事に、単一型セミノーマ(DNMT3L陽性)6例は、全例転移巣を有していた。本研究は精巣腫瘍の発生とその難治化に関与しているCyclin/Rb経路の制御機構を明らかにし、新規分子標的治療のターゲットとなりえる分子生物学的機序の同定を目的とした。Cyclin/Rb経路に関与する蛋白質としてRbタンパクに結合することで過剰なリン酸化を引き起こし、Rb経路の阻害をしているGankyrinという蛋白に注目した。精巣腫瘍の発生・分化については諸説あり、精子形成過程の精母細胞からセミノーマやembryocarcinomaが発生し、Embryocarcinomaが更に他のnon-seminomaに分化し、非常に多様な組織型を示すと言われている。今回の結果は、Gankyrin及び下流のリン酸化Rbが精母細胞での減数分裂やそこから発生した精巣腫瘍の細胞増殖に関係している可能性を示した。作成した組織アレイを用いて、gankyrinの制御分子のひとつであるp53とCDK4の発現を検討した。精巣腫瘍においては、p53が10%以上の腫瘍細胞陽性を示す検体はみとめられなかった。CDK4は一部の絨毛癌のみに陽性であった。これらの結果から、p53の変異は精巣腫瘍において頻度は高くないと考えられたが、gankyrinの発現との関連は検討が困難であった。Gankyrin抑制の精巣腫瘍細胞への影響を検討するため、siRNAを用いて発現を抑制し、細胞増殖への影響をWST8にて検討した。またwestern-blottingにてpRBの発現への影響も検討した。gankyrinの抑制により、NEC-8(胎児性癌株),JEG-3(絨毛癌株)ともに細胞増殖が抑制された。また、western-blotにてpRBの抑制も確認した。以上からgankyrinの精巣腫瘍において細胞増殖に寄与していることが示唆された。gankyrinの精巣腫瘍と精巣の発生に役割については、すでに論文投稿済みである。現在は、新たな取り組みをはじめており、実験計画は順調に進んでいる。

ガンキリンはCDK4に結合しp16を競合的に阻害し、Rbのリン酸化を促進させることや、Rbをユビキチン化しプロテアソーム分解を加速させる。両者の機序によりガンキリンはRbを不安定化し、転写因子であるE2Fの放出を増加させ、細胞増殖や発がん性形質転換を制御する。正常組織では、肺、脳、脾臓、心臓、筋肉においてガンキリンmRNAが発現していることが報告されているが、その機能は不明である。本研究では、まずGankyrinの発現を、免疫染色法を用いて検討し、正常精巣では精子形成過程の精母細胞から円形精子細胞にかけての減数分裂時期に強く発現することを明らかにした。先攻研究では、ヒト正常精巣のセルトリ細胞や精原細胞、精母細胞、円形精子細胞、伸長精子細胞でRb蛋白は発現しており、そのうち特に精原細胞においてリン酸化Rb Ser795が発現していることが報告されており、この結果は我々の結果とも一致していた。これらの結果から、ガンキリンは精子形成段階、特に減数分裂と関連している可能性が考えられたが、精原細胞の体細胞分裂においてはGankyrin以外の経路でRbリン酸化が亢進しているものと考えられた。さらに我々は、正常精巣、及び臨床検体から得た精巣腫瘍の各組織型、抗癌剤抵抗例の手術検体、剖検検体を含むTissue microarrayを作成することで、他の分子についても素早く検討できる体制を築いた。本年度はCyclin/Rb経路に関連する蛋白であるガンキリンとリン酸化Rbの発現に関して、免疫組織化学的に検討し、上記の結果を得た。その知見については投稿準備中である。Gankyrin発現、mRNAの発現、蛋白の局在について解明されたが、今後そのほかの経路、特にVEGF経路についての検討も行う予定である。これまでの研究でセミノーマでのDNMT3Lの発現は転移例にのみ存在していることが明らかとなった。そこでDNMT3Lの発現が癌の浸潤、転移に関連しているか調べるため、胚細胞腫瘍株にDNMT3Lを発現抑制、あるいは過剰発現させ、細胞の増殖、遊走・浸潤能に影響するかどうかを指標とした機能解析を予定している。また、臨床検体における免疫組織化学染色では、DNMT3Lの発現と実際のメチル化の関連を調べるため5mc, 5hmcの発現の検討を行う。これらの研究により、精巣腫瘍の組織分化におけるエピジェネテイクス制御機構とその臨床的意義を明らかにすることにつながると考えている。本年度の結果では癌促進因子としてはたらくガンキリンはGrowing teratomaやTeratoma with malignant transformationでは抑制されていた。精巣腫瘍の化学療法抵抗性、悪性転化など難治化に関わる要因を解明するために、今後ガンキリン以外の細胞増殖を促進させる因子についてさらに検討する必要があり、上流経路分子を推測し明らかにしていく予定である。また、新たな試みとして、本年度作成したTissue microarrayを利用して原発巣がPure seminomaでAFPが高値の場合、転移先での非セミの存在を考え非セミとして治療することの正当性を検討することも考えている。この場合、理論的には1)転移先でセミノーマが非セミノーマに分化した、2)原発巣のセミノーマの診断が間違っていた(特にセミノーマと胎児性がんの鑑別は難しい場合がある)などが考えられるが、この点に関する知見はほとんどない。
底泥生態系が湖沼の富栄養制御に果たす役割の研究

本研究は琵琶湖を研究フィールドに、底泥微生物代謝が環境浄化に果たす役割を明らかにし、湖沼環境改善に必要な知見提供を目的とする。平成8年度予備調査では、富栄養化度の低い北湖でも脱窒、メタン生成代謝活性の高い事が示された。この内容確認とともに、支配機構を明らかにするため、平成9年度調査では、北、南湖を通じ水深の異なる100点の調査を実行した。底泥浄化能力の定量的把握のため、コアサンプラーで底泥を採取、炭素・窒素の分布プロファイルを作成した。北湖底泥表層の有機物含量は湖岸がら湖心に向かって漸増する傾向が認められた。炭素・窒素とも表層0-2cmに集中して分布しており、4cm以深15cmの層の有機物含量変化はほとんどなかった。有機物含量の縦方向減少が無機化過程の反映とすると、湖心付近では湖底に供給された有機物の80%以上が表層4cmにおいて分解されたと判断された。この傾向は湖心に近いほど顕著であり、湖岸に近づくにつれて表層有機物分解は低下する傾向にあった。南湖底泥のプロファイルは湖岸部に類似していた。底泥有機物C/N比の表層0-4cmの変化が湖心に比べて湖岸で緩やかで、湖心と湖岸では供給有機物に質的な差があると推察された。外来、内生的有機物指標の窒素安定同位体比を測定したところ、湖心部(7-8‰)より湖岸部で低く(5-6‰)、湖心部は内生有機物供給が相対的に大きいことが示唆された。このことは、富栄養化の鍵過程である内部生産有機物は、湖心部底泥で8割近くが浄化されることを示す。酸化的表層以深は還元的であり、上記の有機物分解に伴い、脱窒による窒素浄化がおきていると判断される。この浄化能力把握のため、採取試料の亜酸化窒素生成能力を検討したところ、有機物分解とカップルした脱窒素活性がみられ、富栄養化制御におけるその能力の量的評価をすすめている。本研究で目ざす底泥生態系の富栄養化制御に果たす役割について基礎知見を得るため、琵琶湖の南湖盆、北湖盆、および内湖の曽根沼を主研究地域として、平成8年度に1-2カ月置きに3回の調査を行い、コアサンプラーで成層構造を破壊しないように静かに採取した底泥資料について、脱窒とメタン生成に関わる微生物と有機物について、それらの変動と相互の関係を調べた。底泥試料の炭素、窒素含量は、曽根沼、北湖盆、南湖盆の順に高かった。富栄養化度が低く有機物の一次生産活性の低い北湖盆底泥試料が、富栄養化度の高い南湖盆より有機物含量が約2倍高い事は、両湖盆における浄化能力の差異を伺わせる。脱窒とメタン生成に関わる上層の酸化層と下層の還元層の発達は北湖盆で明瞭で、酸化層で有機物含量が高かった。これは、生産の低い北湖盆でも常に上層よりの有機物供給が活発である事を示唆する。各地点とも、冬期に炭素、窒素含量が増加し、C/N比が下がる傾向が明瞭であり脱窒とメタン生成に関わる微生物活性の活発な事を伺わせた。底泥の浄化能力に大きな役割を演ずる酸化層の微生物量についての調査では、とくに還元的代謝を促進する能力のある繊毛虫類が10-10000ind./gdryの範囲で検出され、とくに表層で密度が大きく、直上水と比較してもその密度は高かった。底泥の有機物と繊毛虫類の密度の間には、非常に高い正の相関があり、有機物含量の高い底泥表層が微生物代謝活動による浄化活性の高い事を伺わせた。現在、これらの基礎知見をもとに、現地調査と室内実験により、脱窒とメタン生成活性がこれらの微生物要因とどのように結びついているかの解析を進めている。

外来、内生的有機物指標の窒素安定同位体比を測定したところ、湖心部(7-8‰)より湖岸部で低く(5-6‰)、湖心部は内生有機物供給が相対的に大きいことが示唆された。このことは、富栄養化の鍵過程である内部生産有機物は、湖心部底泥で8割近くが浄化されることを示す。酸化的表層以深は還元的であり、上記の有機物分解に伴い、脱窒による窒素浄化がおきていると判断される。この浄化能力把握のため、採取試料の亜酸化窒素生成能力を検討したところ、有機物分解とカップルした脱窒素活性がみられ、富栄養化制御におけるその能力の量的評価をすすめている。
電界結合と磁界結合を考慮した結合共振型無線電力伝送理論の体系化

無線電力伝送技術の学問的背景にはパワーエレクトロニクスを基盤としたものと、マイクロ波技術を基盤としたものに大別できる。前者は分布定数の扱いは範疇外であること、後者は電力伝送を目的としたもので無いため負荷インピーダンスや伝送効率に対する考え方が実用的ではないという問題がある。無線電力伝送技術のさらなる発達のためには、これらの学問領域を統合する必要がある。前年度までの研究で、「無線電力伝送システムとは、電力の周波数とインピーダンス(実部・虚部)とモードを変換するシステムである」という考えを提唱し、これに基づく理論的モデルを作成してきた。今年度の研究では、この考え方に基づき、結合器(無線電力伝送のために電磁界を空間に発生させるデバイス。コイル・アンテナ・共振器など)を、モード変換の機能のみをもつ「非共振結合器(コイルなど)」と、モード変換・インピーダンス虚部変換の機能を持つ「準共振結合器(自己共振アンテナなど)」と、モード変換・インピーダンス虚部変換・インピーダンス実部変換の機能を持つ「完全共振結合器(間接給電された自己共振アンテナなど)」に分類し、電界結合・磁界結合の観点から、無線電力伝送の結合器を説明する理論を構築した。これにより、結合コイルと共振コンデンサを用い、力率補償の考え方を用いるパワーエレクトロニクスに基づく無線電力伝送システムも、自己共振アンテナを用い、複素共役整合の考え方を用いるマイクロ波工学に基づく無線電力伝送システムも、統一的に説明することができる。2018年度の研究では、これらの成果を体系化して、IETから出版された英語の書籍(共著)として出版した。結合共振型無線電力伝送技術の実用化が期待され、多くの研究成果が発表されているが、その多くは従来からのパラーエレクトロニクス技術かマイクロ波技術のどちらかを学問的な基礎としている。本研究は、今後のさらなる技術の発展のために、それらの両方を包含する理論体系を確立することを最終的な目標としている。そのために、本研究課題においては、電力伝送を電界結合と磁界結合に切り分け、さらにそれらを伝送距離に依存するパラメータと依存しないパラメータに切り分ける。その上で、それらを等価回路で表現し、そのパラメータを決定する方法を明確にすることが本研究の目標である。初年度の研究では、共振方式としては、単体で共振を発生させる自己共振型とキャパシタ装荷によって共振が起こるLC共振型について、電界と磁界の比を示す空間インピーダンスと等価回路パラメータの関係について定量的検討を行った。また、共振器の結合における電界結合と磁界結合を制御する方法として、フォールデッドダイポール型共振器、2層スパライラル型共振器、シールデッドループ型共振器などを提案し、電界・磁界結合係数と空間インピーダンス分布の関係について議論を行い、電界結合と磁界結合が伝送効率に与える影響について検討を行った。さらに、応用上の観点から、自己共振型が磁界だけでなく電界も結合に寄与することを積極的に利用し、単一導体を伝送路として電力伝送を行う方法を提案した。当該研究に関し、解説論文1報と、国際会議3回の発表を行った。また学会におけるワークショップなどで、研究成果を発表した。近傍界を用いた無線電力伝送技術の実用化が期待されている。無線電力伝送技術は、電力を扱うという点では、インバーターの延長線上ととらえると、パワーエレクトロニクス工学の領域である。一方、波長が無視できない高周波領域を扱うという点では、マイクロ波工学の領域である。現時点における無線電力伝送の研究開発は、そのどちらかの技術の応用として無線電力伝送技術に取り組んでいる。パワーエレクトロニクス工学・マイクロ波工学はそれぞれ、長い歴史の中で独自の体系を構築してきた学問であるが、どちらも、それぞれ単体では無線電力伝送の実用化に取り組むには不十分である。無線電力伝送の実用化のためには、技術開発のみならず、その基盤となる、高周波で電力の伝送を目的とした学問体系の構築が不可欠である。平成28年度の研究では、近傍界型無線電力伝送システムの統一モデルを構築した。近傍界型無線電力伝送システムが(1)周波数変換(2)インピーダンス実部変換(3)インピーダンス虚部変換(4)電磁界モード変換の4個の機能を持つことを明確にした上で、システムの要素技術がこれらの機能の実現にどのように関わっているかを明らかにした。このモデルにより、例えばパワーエレクトロニクスによる力率最大化の考え方、マイクロ波による反射係数最小化の考え方を統一的に説明でき、また、パワーエレクトロニクスによる「トランスのk値・Q値」とマイクロ波による「共振器のk値・Q値」との違いを明確に説明することができる。さらに、提案したモデルを具体的な無線電力伝送用アンテナに適用することにより、より高効率なアンテナの開発を行い、提案モデルの有用性を示した。当該研究に関し、国際学会発表4件(うち1件は招待発表)、国内学会発表3件、著書(共著)1編の発表を行った。

今年度の研究では、この考え方に基づき、結合器(無線電力伝送のために電磁界を空間に発生させるデバイス。コイル・アンテナ・共振器など)を、モード変換の機能のみをもつ「非共振結合器(コイルなど)」と、モード変換・インピーダンス虚部変換の機能を持つ「準共振結合器(自己共振アンテナなど)」と、モード変換・インピーダンス虚部変換・インピーダンス実部変換の機能を持つ「完全共振結合器(間接給電された自己共振アンテナなど)」に分類し、電界結合・磁界結合の観点から、無線電力伝送の結合器を説明する理論を構築した。これにより、結合コイルと共振コンデンサを用い、力率補償の考え方を用いるパワーエレクトロニクスに基づく無線電力伝送システムも、自己共振アンテナを用い、複素共役整合の考え方を用いるマイクロ波工学に基づく無線電力伝送システムも、統一的に説明することができる。研究の実施のために、電子計算機による電磁界シミュレーションが必要となるが、シミュレーションの実行に想定以上に時間を要しており、シミュレーション結果を得られるのが予定より遅くなった。このため、シミュレーション結果に基づく検証実験・学会発表・論文投稿も予定より遅れている。1年間の期間延長により、当初の目的を遂行できる見込みのため、期間延長の申請を行った。無線電力伝送技術の学問的背景にはパワーエレクトロニクスを基盤としたものと、マイクロ波技術を基盤としたものに大別できる。前者は分布定数の扱いは範疇外であること、後者は電力伝送を目的としたもので無いため負荷インピーダンスや伝送効率に対する考え方が実用的ではないという問題がある。無線電力伝送技術のさらなる発達のためには、これらの学問領域を統合する必要がある。前年度までの研究で、「無線電力伝送システムとは、電力の周波数とインピーダンス(実部・虚部)とモードを変換するシステムである」という考えを提唱し、これに基づく理論的モデルを作成してきた。2018年度の研究では、これらの成果を体系化して、IETから出版された英語の書籍(共著)として出版した。初年度の研究では、電界・磁界結合を積極的に制御する方法として、多様な共振器形状について検討を行った。
トリメトキシシリルエノールエーテルを用いた新規不斉合成反応の開発

1.第四級不斉炭素中心を含む付加体を与えるアルドール反応の開発を行った。前年度までに得られていた結果を基に、不斉収率の向上を期して検討を行った。レトロアルドール反応の抑制により高い収率・選択性で付加体を得ることに成功した。本反応により、第四級不斉炭素中心を含むさまざまなアルドール付加体の高収率かつ高選択的な合成が可能になった。これは従前のアルドール反応においては達成された例がほとんどなく、トリメトキシシリルエノールエーテルを塩基触媒により活性化するという本反応系の有用性を示すものである。2.触媒的不斉マイケル反応の開発を行った。トリメトキシシリルエノールエーテルの新たな反応として、マイケル反応について検討した。マイケル反応は重要な炭素炭素結合形成反応であるが、これまでにシリルエノールエーテルの活性化により進行する例は全く知られていなかった。そこで、アルドール反応において成功をみた本反応系を適用したところ、共役エステルにおいて中程度の収率ながら高いエナンチオ選択性で反応が進行することを見出した。3.トリメトキシシリルアルキンを用いる不斉アルキニル化反応の開発を行った。シリルエノールエーテルと同様にシリルアルキンを本触媒系で活性化できるのではないかと考えて検討を行ったところ、高い収率かつ良好な選択性で付加体が得られることがわかった。本反応はシリルアルキンを用いた塩基触媒不斉アルキニル化として初めての例であり、不斉触媒による有機ケイ素化合物の活性化という概念がシリルエノールエーテル以外にも広く適用可能であることを示すものである。1.様々な基質に適用可能なトリメトキシシリルエノールエーテルの新規合成法を開発した。これまでに用いていたトリメトキシシリルエノールエーテル合成法は適用可能な基質が限られていたり、単離・精製が難しいなどの間題を抱えていた。そこで、トリメトキシシリルトリフラートを用いた新規合成法を開発した。トリメトキシシリルトリフラートは、0°C下ジクロロメタン中アリルトリクロロメタンとトリフルオロメタンスルホン酸より容易に調製可能であり、これを用時調製しアミンとカルポニル化合物の混合溶液に滴下することで高い非常に変換効率で対応するシリルエノールエーテルを得ることができた。2.不斉な四級炭素中心を構築するアルドール反応を検討した。上記の成果により様々なシリルエノールエーテルの供給が容易となったので、4置換のシリルエノールエーテルを用いた反応を行った。この反応の生成物は不斉な四級炭素中心を含むことから、これをエナンチオ選択的に構築することが可能になれぱ様々な化合物の合成に応用可能と考えられるが、これまで報告例は多くなかった。本基質を適用したところ、反応速度の低下することなく良好な収率・選択性で付加体が得られた。3.トリメトキシシリルエノールエーテルの塩基触媒マンニッヒ型反応を検討した。イミンに対するマンニッヒ型付加反応はアミンを合成する重要な手法であるが、イミンが酸性条件下で分解してしまうためルイス酸を用いる一般的な触媒的不斉反応の条件の適用は難しいとされる。しかし、本基質は塩基性条件下で反応するためこれを克服することができるのではないかと考え検討を行った。その結果、N-トシルイミンについて反応は進行し、収率よく付加体であるアミンを与えることが分かった。現在選択性の向上を目指し条件の最適化を行っている。
若年女性に増加している子宮内膜症は閉経後骨粗鬆症の危険因子か？

近年,若年女性に増加している子宮内膜症女性ではIL-1,IL-6,TNF-αなどの炎症性サイトカインが増加しており,慢性関節リウマチ,重症熱傷などの慢性炎症性疾患患者で見られるように骨吸収が亢進し,最大骨量が減少することにより閉経後骨粗鬆症の危険因子となる可能性がある。本研究では子宮内膜症が骨代謝に及ぼす影響について基礎的,臨床的観点から検討し,慢性炎症性疾患である子宮内膜症の骨粗鬆症リスクを明らかにする。それにより子宮内膜症女性の管理指針を確立し,中高年女性の健康寿命の改善を目指す。
衛星データおよびGISを用いた湖沼水質分布予測システムの開発

本研究では、河川、湖沼の流域を対象として、流域の土地被覆パターンの違いより汚濁負荷の移動がどのように変動するか、その動態を評価することを目的としている。昨年までの研究成果として、対象流域における植生の面積比率が多く覆われている場合には、湖沼に流入する汚濁負荷量が少ないことを示した。本年度では、衛星リモートセンシングにより、精度良く植生の面積を推定する手法の開発を行った。現在までに空間およびスペクトル分解能の異なった人工衛星の画像データを用いて数多くの植生分布図が作成されている。しかしながら、植生の現状およびその変化を高精度に評価しているとは言い難い。現在の衛星の中では、比較的空間分解能が高いLANDSAT TMでも国土の狭い日本においては、充分な分解能とは言えない。グローバルな観測に有効とされているNOAAAVHRRに関しては、さらに空間分解能が低い。したがって、植生域の面積を精度良く評価するためには、低空間分解能画像の一画素に含まれている様々なカテゴリーが混在したミクセルを分解しなければならない。本研究では、一画素内における植生の被覆率を推定することを目的に、勾配法とマッチドフィルタ法の二手法を提案した。提案した各手法の大きな特徴は、(1)画素内におけるカテゴリー数決定の問題を解決するために、評価対象の植生の分光放射輝度だけを既知情報とし、対象植生の画素内比率を推定すること、さらに、(2)評価対象の植生が画素内に混在しているかを見分ける性能を上げるために、対象植生の分光特性を細かく観測できるハイパースペクトルデータを用いたことである。さらに、従来から植生被覆率の推定に有効とされている植生指標NDVIについても比較、検討した。その結果として、提案した勾配法やマッチドフィルタ法は、新たな画素内植生被覆率推定法としての有効性があることを示せた。本研究は、河川、湖沼の流域を対象として、流域の土地被覆分布パターンの違いより汚濁負荷(全窒素)の移動がどのように変動するか、その動態を評価することを目的としている。具体的には、霞ヶ浦流域および日本全域の河川流域を対象として、土地被覆単位の水域への汚濁負荷流出原単位の推定、水域への汚濁負荷流入量の推定を試みた。霞ヶ浦流域では、森林、農地、市街地ごとの全窒素流出原単位、ならびに流域全体における全窒素流入量を推定し、1970,80,90年代ごとの土地被覆変化に基づく窒素収支の変化を評価した。各土地被覆カテゴリーごとの全窒素流出原単位、ならびに流域全体における全窒素流入量を推定する際には、流域の土地被覆変化を精度良く評価することが要求される。霞ヶ浦流域では土地被覆およびその変化を評価するために人工衛星LANDSAT,MSSデータを用い、その有用性を示した。一方、日本全域においても、広域観測に適している人工衛星NOAA,AVHRRデータから算出された月別NDVIを用いて、日本全域における河川、湖沼流域の土地被覆分布パターンを評価し、土地被覆単位の水域への全窒素負荷流出原単位の推定をおこない、土地被覆分布パターンをパラメータとした水域へ流入する年間全窒素負荷量の推定モデルの作成をおこなった。その結果、各流域において河川流量および土地被覆パターンが計測できれば、提案したモデルにより流入年間全窒素負荷量を推定することが可能であることを示した。なお、本研究では、日本全域における河川流域を国土数値データの流域情報(KS-609)により決定した。また、土地被覆分布の評価には、霞ヶ浦流域では、1979年、1984年、1990年の人工衛星LANDSAT,MSSデータを用い、日本全域では、1996年1月から12月の月別植生指数(NDVI)画像(12データ)を用いた。
酸化的遺伝子損傷を生成する環境因子の同定とその制御に関する研究

(1)SoxRSはスーパーオキサイドに応答して特定の遺伝子群の発現を調節している。MillerのCC101106株を用いてsoxSを欠損させた変異株とその親株とで塩基置換スペクトルの違いを比較した。CC101106株はそれぞれ特定の塩基置換を起こした時にβ-ガラクトシダーゼ活性が回復するように設計されている。Spontaneous mutationではsoxS欠損変異株とその親株について、AT-TAトランスバ-ジョンに大きな差がみられたがその他ははとんど大きな差はみられなかった。しかしmenadioneでこれらの株を処理して細胞内スーパーオキサイド濃度を増大させるとGC-CGおよびAT-TAトランスバ-ジョンの頻度が有意に増大した。このことはSoxRSの制御を受ける遺伝子産物がGC-CGおよびAT-TAのトランスバ-ジョン生成を抑制していることを示唆するものである。(2)電離放射線で大腸菌を処理するとGC-CGトランスバ-ジョンが高い頻度で誘発される。GC-CGトランスバ-ジョンを起こす原因を知るため、まずその自然突然変異頻度を特異的に増大させる新しいタイプのミユ-テーター株を大腸菌から分離する試みを行った。大腸菌のCC103を材料に用いたが、この株ではGC-CGの変化が起こった場合でのみLac^十に復帰するからである。得られた株はLac^十への復帰突然変異およびリファンピシン抵抗性への自然突然変異の頻度が親株に比べ顕著に増大した。このミユ-テーター株はトランスバ-ジョン特異的であったが、GC-CGの頻度はもっとも高い特徴を示した。この遺伝子は大腸菌染色体の約67分に位置した。
生徒のリスニング力向上のための教室における指導法についての研究と開発

今回の研究は、高校生にリスニングのストラテジーを明示的に指示することで、リスニング力向上に寄与することを目標とした。指示したストラテジーは、次の3つである:(1)聞こえてきた音声を頭の中で繰り返しながら聞く、(2)聞こえてきた音で強く読まれている部分に注意しながら聞き取る、(3)聞こえてきた音声をよく聞く。(1)は、意味処理のために、英語を頭に長く残すストラテジーである。(2)は、英語の音声の強形は内容語であることが多いため、強く発話される語に注意を向け、意味理解を促すストラテジーである。(3)は(1)、(2)に対する統制群としての指示である。事前にこのような指示を与え、注意を向けて生徒に聞かせることは大切なことである。この実験は公立高校3校で行った。測定は、日本英語検定協会の英語能力判定テストのリスニングテストの得点で行った。異なる問題で事前テスト、事後テストを行い、その差を分析した。指導には、生徒の習熟度に応じて英検2級と英検3級のリスニングテストの問題を使用した。指導前の各グループ間の差がないことは、事前テストの結果を分散分析することにより証明した。各グループの結果は二元配置分散分析により分析した。全体的には、3つの指示の間に有意な差は見られなかった。次にトラテジーを指示した各グループの内で、事前テストにより上位者、中位者、下位者のグループに分け、対応のあるt検定により分析を行ったところ、特に下位群について、どの指示でもテストの得点に有意な伸長が見られた。上位者、中位者の得点の伸長については学校によって異なった。現時点での分析から言えることは、英語の聞き方のストラテジーをあまり使用していないと考えられる成績下位者は、明示的な指示を教師が与えることで得点が伸長したと考えられる。成績上位者については、すでにストラテジーを持っているので、教員の指示が邪魔になり、結果がまちまちになった可能性がある。
農業農村の洪水緩和機能の強化を志向したハード・ソフトベストミックスの構築

本研究は,農村地域から都市部に至る流域を対象とした洪水予測モデルを構築し,農村が有する洪水緩和機能を定量的に評価することを目的とする.まず複数の水利施設が存在する河川を対象に,個々の水利施設の操作による影響を考慮した1次不定流モデルを構築した.本モデルを用いて都市部と農村部が混在する範囲を対象とした内水氾濫シミュレーションを行った.洪水発生のメカニズムを視覚的に表現する手法として,解析結果にVR技術を導入した.洪水発生時における農業水利施設の適切な管理を持続するためには対象者に洪水発生のメカニズムを適切に認識してもらうことが洪水緩和機能を強化するうえで重要であることを明らかにした.筑後川流域の千代田地区をモデル地区に選定し,地形および土地利用条件の把握を行った.当該地区に関連する国営事業当時の事業計画資料,出来形図面,標高メッシュデータ,航空写真を用いてデータベース化を行った.これら地形条件の他に現在当該地区で実施されているクリーク改修計画に関する情報を収集することで,流出,氾濫解析シミュレーションのシナリオ条件を整理した.さらに当該地区で近年発生した豪雨被害に関する水文データを収集し,洪水発生要因及び溢水,浸水過程の分析を行った.土地利用状況の分析結果と水文データをもとに,対象地域における降雨流出モデルを構築した.当該地区を対象としたシミュレーションモデルの検証の結果,平成24年度の九州北部豪雨時の洪水状況を再現することに成功した.さらに解析結果を詳細に分析した結果,クリークの改修進度とポンプやゲートといった水利施設の操作条件が洪水抑制に密接に関係していることを解明した.洪水発生のメカニズムを視覚的に表現,視認する手法として,対象地区のうち,洪水被害が著しい区域となっている下流部を対象として、3次元化を試みた.地形モデル構築には国土地理院のサイトから入手可能な5mメッシュ標高を用い,主要な河川,クリーク,車道および住宅等の建物については現地状況及びオルソ画像を参考にして,3次元VRソフトウェア上でモデルを個別に配置した.これらの地形地物モデルに氾濫解析結果を重ね合わせることで,洪水による被害状況の把握および防災意識の醸成に有効な表現手法を構築した.採択決定後,速やかに研究対象地区の検討に関する予備調査および選定を行った.対象地区として水文観測データが既存する地区を対象地区として選定したことで,短期間で十分なデータを収集することができた.このため,予定していたモデル構築,検証まで到達することができている.さらに,対象地区を包括する筑後川下流右岸地区において,地元の行政機関や水利施設の整備を担当する技術者と連携してワークショップを開催し,豪雨被害発生時の水管理体制の現状を把握することができた.筑後川下流地区をモデル地区に選定し,現地踏査及び既存資料収集により地形および土地利用条件の把握を行った.当該地区に関連する国営事業当時の事業計画資料,出来形図面,標高メッシュデータ,航空写真データについてGISを用いてオーバーレイ解析を行った.さらに当該地区で近年発生した豪雨被害に関する水文データとして解析雨量を用いることで,洪水発生要因及び溢水,浸水過程について土地利用と降雨の二つの側面からから要因分析を行った.これらのデータと分析結果をもとに,当該地区における内水氾濫モデルを構築し,過去に発生した洪水を再現した.またシミュレーション条件として,異なる土地利用状況であれば果たして氾濫しなかったのか,土地改良事業の実施されたことで洪水がどの程度緩和されたのか,農村地域において耕作放棄地や農地転用が進んだことで下流の都市部において氾濫の危険性が増しているのか,といった複数のシナリオを構築し,農村の洪水緩和機能を定量化した.またこれらのシミュレーション結果より,当該地区においてはクリークの劣化に加えて降雨の局所性と土地利用の変化が湛水発生の要因であることを明らかにし,農業水利施設の機能を再確認することができた.洪水発生のメカニズムを視覚的に表現,視認する手法として,解析結果はVR技術を用いて時空間的(4次元)に可視化した.湛水被害発生の経時変化をVRで表現したことで,クリークの水位管理が被害軽減に大きく寄与することを明示した.農業水利施設の水位管理は維持管理者の裁量によるものであり,適切な管理を持続するためには対象者に洪水発生のメカニズムを適切に認識してもらうことが洪水緩和機能を強化するうえで重要であることを明らかにした.本研究は,農村地域から都市部に至る流域を対象とした洪水予測モデルを構築し,農村が有する洪水緩和機能を定量的に評価することを目的とする.まず複数の水利施設が存在する河川を対象に,個々の水利施設の操作による影響を考慮した1次不定流モデルを構築した.本モデルを用いて都市部と農村部が混在する範囲を対象とした内水氾濫シミュレーションを行った.洪水発生のメカニズムを視覚的に表現する手法として,解析結果にVR技術を導入した.洪水発生時における農業水利施設の適切な管理を持続するためには対象者に洪水発生のメカニズムを適切に認識してもらうことが洪水緩和機能を強化するうえで重要であることを明らかにした.平成28年度に構築したモデルを用いて,対象地区における複数の洪水時の状況の再現を行うことで,氾濫のプロセスと要因解明を行う.解析結果はVR技術を用いて時空間的(4次元)に視覚化するなど,社会・国民への発信方法を考慮する.土地利用の変化が洪水発生の確率と規模に与える影響を検証する.

具体的には,過去に発生した洪水の再現結果に対して,戦後の高度経済成長前の土地利用状況であれば果たして氾濫しなかったのか,土地改良事業が実施されたことで洪水がどの程度緩和されたのか,農村地域において耕作放棄地や農地転用が進んだことで,下流の都市部において氾濫の危険性が増しているのか,下流域での急速な開発,インフラ整備の充実は上流域に影響を及ぼしていないか,といった複数のシナリオを構築し,農村の洪水緩和機能を定量化する.研究成果を実用化するための具体的手法として,氾濫シミュレーション結果についてGISを用いたデータベース化を行うことで対象地域における豪雨災害ハザードマップを作成する.ハザードマップには降雨の状況に応じて氾濫の危険性が高まる地域を表示することに加えて,避難を要する指標,避難場所,避難ルートを示す.29年度が最終年度であるため、記入しない。灌漑排水,水理学29年度が最終年度であるため、記入しない。
γ-secretase Assay系の構築とプレセニリンの機能解析

γ-secretaseの直接の基質になると考えらるアミロイドβ-タンパク質前駆体のβ-secretase切断部位からC-末端までの領域(APPC100)やNOTCHの下流にHAやFRAGなどのタグ、あるいは大腸菌のリーダーペプチダーゼの一部を融合したタンパク質をコードする遺伝子を作製した。これら基質を利用して、γ-secretaseの活性を検知することは未だに成功していないが、γ-secretaseにより産生される産物の検出感度は様々な検証により十分と考えられることより、γ-secretase活性を検出できるような更なるAssay条件の検討を試みている。プレセニリンの機能解析には本系の確立が必須であり本系の確立によりこの分野の飛躍的な進歩が期待できる。プレセニリン複合体の解析プレセニリンは細胞内で巨大なタンパク質複合体を形成していることが報告されている、私たちは種々の界面活性剤でラット肝臓のミクロソーム画分を可溶化し、Blue Native Electrophoresis並びにグリセロール密度勾配遠心法によりプレセニリン複合体の大きさ、並びに複合体を形成している因子について解析出来る系を確立することが出来た。またジギトニンで可溶化したプレセニリン複合体の分子量がこれまで報告されてきた250kDaより明らかに大きことを明らかにした。1.Assay系に用いる基質の作製(三浦)APPのβ-secretase切断部位からC末端までの領域(APPC100)の下流にHatag配列あるいは大腸菌のLeadePeptidaseの一部の配列を融合したタンパク質(APPC100-HA及びAPPC100-LP)をコードする遺伝子をp c DNA3.1(+)ベクターに組み込み、T7RNApolymeraseでmRNAを作製した。2.プレセニリン複合体の調製(三浦、中井)プレセニリン複合体はラット肝、培養細胞より細胞分画法によりミクロソーム画分を調製後,さまざまな界面活性剤で可溶化し、1991年に報告されたBlue Native Electrophoresisで解析した結果、γ-secretase活性を保持したまま複合体が調製出来ることが報告されているCHAPSOとほぼ同サイズの複合体がジギトニン処理によっても得られることを明らかにした。3.Assay系の構築(三浦)1で作製したベクターよりmRNAを作製後、ウサギ網状赤血球ライセートを用いた蛋白質合成系で基質を35Sメチオニンで標識し、2で調製したプレセニリン複合体と保温後SDS-PAGEで展開し、解析したが現在の所、processed formを確認するには至っていない。γ-secretase活性を検出するための最適条件を検討中である。γ-secretaseの直接の基質になると考えらるアミロイドβ-タンパク質前駆体のβ-secretase切断部位からC-末端までの領域(APPC100)やNOTCHの下流にHAやFRAGなどのタグ、あるいは大腸菌のリーダーペプチダーゼの一部を融合したタンパク質をコードする遺伝子を作製し、これらタンパク質を試験管内で翻訳または大腸菌で発現させた人工基質を用いて、一方γ-secretaseとしてはラット肝臓・脳またはHEK培養細胞よりプレセニリンが局在していることが明らかになっているミクロソーム画分または全膜画分を調製し、様々な条件下でγ-secretaseの活性検出を試みたが活性を検出することは出来なかった.私たちが用いたAssay系ではγ-secretaseにより産生される産物の検出感度は十分と考えられることより、γ-secretase活性を検出できるような更なる条件の検討が必要と判断される。プレセニリン複合体の解析プレセニリンは細胞内で巨大なタンパク質複合体を形成していることが報告されているが系統立てた解析がなされていないのが現状である。私たちは種々の界面活性剤でラット肝臓のミクロソーム画分を可溶化し、Blue Native Electrophoresis並びにグリセロール密度勾配遠心法によりプレセニリン複合体の大きさ、並びに複合体を形成している因子について解析出来る系を確立することが出来た。
電気泳動するデザイナーポリエステルの創出と骨再生材料への応用

逐次重合の新展開を念頭に、高度に発達した高分子化学(クリック重合)を駆使して電気泳動するポリエステルの創出を提案する。電荷をもたない高分子の電場での泳動挙動が研究者の学術的興味を駆り立て、期間内に構造の普遍性を提示する。近年、再生医療材料の高度化が求められており、このポリエステルは、電気泳動コーティング法によるバイオガラス(ヒドロキシアパタイトの形成を促す物質)など無機化合物の金属基盤への集中集積を可能にする。高分子化学的手法を積極的に用いた新しい再生医療材料の創製が本研究のもう一つの目的となる。<目的>本研究では、骨(ヒドロキシアパタイト)の形成を促す生物活性ガラス(バイオガラス)を金属基盤に効率よくコーティングする手法の確立し、次世代の再生医療材料への展開を目指した。バイオガラスは、一般的なガラスよりも、SiO2の割合が少なく、NaやCaの割合が高くP2O5が新たに含まれている。一方、電気泳動コーティング(EPD)法は電場存在下での荷電粒子の沈着現象で、懸濁液に浸した基板上にナノからマイクロメートルのスケールで膜を形成することが可能な手法である。今年度は、ポリ(エステルースルホン)の構造がEPDに及ぼす影響、その表面におけるヒドロキシアパタイトの再石灰化を検討した。<結果>ポリ(エステルースルホン)(Mn=28000, Mw/Mn=1.9)を用いてEPDを行った結果、バイオガラスとの安定な複合膜をアノード選択的に形成することができた。メチレン鎖長の異なるモノマーや芳香族環を導入することでEPDの挙動が変化したことから、メチレン鎖長や結晶性が影響することが分かった。1H NMRおよび走査型電子顕微鏡(SEM)観察により、EPDの前後でポリマーの構造が保持されていること、バイオガラスとポリマーが均一に複合化していることもわかった。さらに、得られた複合膜上でのヒドロキシアパタイトの再石灰化も確認できた。24年度の研究結果を踏まえて、太陽光照射下において有機物の分解・浄化を行う光触媒効果を有する酸化チタンとの複合膜表面の特性解析も行った。結果、酸化チタンとのとの安定な複合膜もアノード選択的に形成することができた。得られた複合膜上での光触媒効果が確認できたことから、酸化チタン由来の機能性を保持したフレキシブル材料の創成に成功した。次年度は、骨再生材料以外への応用を図る。<緒言>本研究では、骨(ヒドロキシアパタイト)の形成を促す生物活性ガラス(バイオガラス)を金属基盤に効率よくコーティングする手法の確立し、次世代の再生医療材料への展開を目指した。<実験>チオール・エン反応を利用して、ポリ(エステルースルフィド)の合成を行った。クリック重合はモノマーに光開始剤を加え、UVを照射することで開始・進行した。続いて、ポリマーを酸化させることでポリ(エステルースルホン)を得た。ポリ(エステルースルホン)とバイオガラスでコロイド分散液を調製し、EPDを行うことでバイオガラス/ポリ(エステルースルホン)の複合膜を得た。複合膜形成後、擬似体液に浸し、静置することによって、ヒドロキシアパタイトの再石灰化を試みた。<考察>ポリ(エステルースルホン)(Mn=28000, Mw/Mn=1.9)を用いてEPDを行った結果、バイオガラスとの安定な複合膜をアノード選択的に形成することができた。最終年度には、モノマーとなるエステル基を有するジアルキン化合物が、2回のチオール・エンクリック重合に関与することを利用してスルフィド含有ポリエステルゲルを調製した。続くオキソン酸化により骨格にスルホニル基を有するポリ(エステル-スルホン)ゲルを合成した。本研究では、これを電気泳動堆積(EPD)法によって陽極(+)側に選択的に堆積させることまで確認できている(高須ら、Polym. J. 2014)。

ポリ(2-オキサゾリン)類も、低毒性の生体材料として注目されている。以下の図式に従い、二重結合を有する2-オキサゾリンの開環重合とクリック反応を組み合わせて側鎖にスルホニル基を有するポリ(2-オキサゾリン)が合成できた。得られたスルホニル基を有するポリ(2-オキサゾリン)と生体活性ガラス(バイオガラス45S5)を用いてコロイド分散液を調製し、EPDを行うことでバイオガラスとポリ(エステルースルホン)の複合膜を作製し、物性、材料表面の組成などを評価した。EPDを行った結果、バイオガラスとの安定な複合膜を陽極(+)選択的に形成することができた。さらに、疑似体液中でヒドロキシアパタイトの再石灰化も確認することができた。さらに、ヒト血管内皮細胞の接着挙動を評価した結果、細胞への生体親和性が確認できた(高須ら,Biomacromolecules 2015)。高分子化学24年度の研究結果も踏まえて、この技術を光触媒と共に用いれば、光触媒(TiO2)とポリエステルとの複合膜形成による革新的コーティング技術に発展することが期待出来る。本研究結果は、光触媒作用を活用した、環境汚染物質の分解以外にも、色素増感型太陽電池、電子ペーパーなどにも応用が期待できる。我々独自の『非イオン性高分子の電気泳動挙動』と『ポリエステルと無機物質からなる複合材料』を念頭に、骨再生材料以外にも研究者の学術的興味と日本の産業の発展を同時に満たす将来を見据えた研究に発展する兆しが見えた(研究が2014年4月9日に日刊工業新聞に掲載された。)。逐次重合の新展開を念頭に、高度に発達した高分子化学(クリック重合)を駆使して電気泳動するポリ(エステルースルホン)の創出を提案できた。メチレン鎖長の異なるモノマーや芳香族環を導入することで電気泳動堆積(EPD)の挙動が変化したことから、メチレン鎖長や結晶性が影響することが分かった。EPDの前後でポリマーの構造が保持されていること、バイオガラスとポリマーが均一に複合化できることもわかった。さらに、得られた複合膜上でのヒドロキシアパタイトの再石灰化も確認できた。電荷をもたない高分子の電場での泳動挙動が研究者の学術的興味を駆り立て、期間内に構造の普遍性を提示する。電気泳動コーティング法によるバイオガラス(ヒドロキシアパタイトの形成を促す物質)のほか各種無機化合物(光触媒)の金属基盤への集中集積も検討する。高分子化学的手法を積極的に用いた新しい複合材料の創製が本研究のもう一つの目的となる。成果発表を次年度の国際会議に持ち越したため。8月にアメリカ化学会国際会議での成果発表を行う。引き続き、高分子合成用の有機・無機試薬、ガラス器具などの消耗品、成果発表や情報収集のための旅費、論文別刷り代やホームページの更新などの費用を計上する。効率よく研究を遂行するために必要に応じて設備投資や特許出願を行う。
β-lactoglobulin抗原に対するミルクアレルギー患者T細胞応答の解析

1) β-lactoglobilinペプチドの合成:β-lactoglobilinのアミノ酸配列に従い、オーバーラッピングペプチドを合成した.合成は,Fmoc-strategyに基づきシステムPSSM-8(Shimazu)によって施行した。4)抗原特異的T細胞により認識されるT細胞エピトーブの解析: T細胞の抗原特異的増殖反応は培養72時問後の[^3H]TdRの取り込みにより定★した.β-lactoglobilin特異的T細胞株に関して合計7つペプチド上にT細胞エピトーブが認められたが,各細胞株が認識認するエピトーブはそれぞれ異なるパターンを示した.IR lineはp142-162のみ、AH lineはp14-29,p47-67,p77-97,p97-117を,TK lineはp1-21,p47-67を,MT lineはp1-21,p30-47,p97-117を認識していた.このうちp1-21,p47-67,p97-117の3つのペプチドは異なるタイプのHLAクラスH分子に拘束された複数のT細胞によって認識された.T細胞クローンIR1.9はp142-162を認識していた.MT2.9はp97-117を認識し,このうちp101-115が抗原決定基と考えられた.5)抗HLAクラスIIモノクローナル抗体を用いた抗原提示分子の検討:抗原特異的T細胞株およびクローンの抗原堤示分子を同定するために,抗HLAクラスIIモノクローナル抗体を培養系に添加してT細胞応答への影響を調べた.T細胞株では4株のうち3株で抗DR抗体により著明な増殖阻止反応が認められ,1株では抗DQ抗体によって増殖の阻止が認められた.T細胞クローンでは2クローン共に抗DR抗体により増殖阻止が認められた.β-lactoglobilinの抗原提示にはDR分子の関与が強く示された.6)T細胞受容体の遺伝子解析:樹立した抗原特異的T細胞のRNAからcDNAを合成し、RT-PCR法によりT細胞受容体(Vα,Vβ,Jα,Jβ)の解析を行った.ペプチド142-162を認織するIR1.9はVα5 Vβ13.1,Jα11 Jβ1.4を,ペプチド97-117を認識するMT2.9はVα8 Vβ2 Jα130 Jβ2.7を有していた.β-lactoglobilinのアミノ酸配列に従い、オーバーラッピングペプチドを合成した。合成は、Fmoc-strategyに基づきシステムPSSM-8(Shimazu)によって施行した。全ての合成ペプチドは、C18カラムを使用した逆相HPLC(Millipore)により精製した。2)HLAタイピング3)ミルクアレルギー患者における免疫学的検討10名のミルクアレルギー患者について免疫学的検討を行った。ミルクアレルギーの診断は、詳細な病歴聴取、臨床症状、皮内テスト、抗原除去試験、抗原負荷試験、および抗原特異的lgE抗体価を参考にした。血清免疫グロブリン値の測定と共に、ヒスタミン遊離試験、リンパ球幼若化反応、各種サイトカイン産生能などに関する検討を行った。4)抗原特異的T細胞株の樹立ミルクアレルギー患者より末梢血単核球(PBMC)を分離して、β-lactoglobilin特異的T細胞クローンを樹立した。PBMC(1×10^5/well)をオーバーラッピングβ-lactoglobilin粗抗原と共に96穴プレートで培養し、7日後にリンパ芽球を認めるwellにX線照射(3,000cGy)した自己のPBMC(1.5×10^5/well)とβ-lactoglobilinペプチド混合物(0.1μM),rhlL-2(50U/ml),rhlL-4(10U/ml)を加え、更に7日間培養してβ-lactoglobilin特異的T細胞株を得た。これまでに樹立できた細胞株は3株であった。これらのT細胞株をTerasakiプレートを用いた限界希釈法によりクローン化した。患者2名から各々1クローンづつ樹立した。7日後に、増殖良好なwellの細胞を96穴プレートへ、更にその後24穴プレートへと移して培養した。5)T細胞の抗原特異的増殖反応T細胞の抗原特異的増殖反応は96穴プレートを用いて、T細胞(3×10^4/well)、放射線照射PBMC(1×10^5/well)及びβ-lactoglobilinペプチド(0.1μM)を共培養し、72時間後の(^3H)TdRの取り込みで定量した。合計5つのT細胞エピトープが認められたが、各細胞株では別々のパターンが認められた。T細胞およびクローンの抗原提示HLA分子を同定するために、抗HLAモノクローナル抗体を培養系に添加してT細胞応答への影響を調べたところ、HLA DR分子の関与がより強く認められた。4)抗原特異的T細胞により認識されるT細胞エピトーブの解析: T細胞の抗原特異的増殖反応は培養72時問後の[^3H]

TdRの取り込みにより定★した.β-lactoglobilin特異的T細胞株に関して合計7つペプチド上にT細胞エピトーブが認められたが,各細胞株が認識認するエピトーブはそれぞれ異なるパターンを示した.IR lineはp142-162のみ、AH lineはp14-29,p47-67,p77-97,p97-117を,TK lineはp1-21,p47-67を,MT lineはp1-21,p30-47,p97-117を認識していた.このうちp1-21,p47-67,p97-117の3つのペプチドは異なるタイプのHLAクラスH分子に拘束された複数のT細胞によって認識された.T細胞クローンIR1.9はp142-162を認識していた.MT2.9はp97-117を認識し,このうちp101-115が抗原決定基と考えられた.5)抗HLAクラスIIモノクローナル抗体を用いた抗原提示分子の検討:抗原特異的T細胞株およびクローンの抗原堤示分子を同定するために,抗HLAクラスIIモノクローナル抗体を培養系に添加してT細胞応答への影響を調べた.T細胞株では4株のうち3株で抗DR抗体により著明な増殖阻止反応が認められ,1株では抗DQ抗体によって増殖の阻止が認められた.T細胞クローンでは2クローン共に抗DR抗体により増殖阻止が認められた.β-lactoglobilinの抗原提示にはDR分子の関与が強く示された.6)T細胞受容体の遺伝子解析:樹立した抗原特異的T細胞のRNAからcDNAを合成し、RT-PCR法によりT細胞受容体(Vα,Vβ,Jα,Jβ)の解析を行った.ペプチド142-162を認織するIR1.9はVα5 Vβ13.1,Jα11 Jβ1.4を,ペプチド97-117を認識するMT2.9はVα8 Vβ2 Jα130 Jβ2.7を有していた.