hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
環境省絶減危惧種IA(CR)アベサンショウウオの生物地理学研究

アベサンショウウオ(Hynobius abei)は,日本産両棲類中,最も絶滅の危機に瀕しており,「種の保存法」で保護すべき生物に指定されている。既知の生息域は,京都府,兵庫県,石川県,福井県嶺北及び嶺南東部の日本海沿岸に限られていたが,北陸と京都府を結ぶ地域での調査はなかった。そこで,分布の空白地帯である福井県若狭地域から京都府丹後地方の間で調査を行い,本種の生息域を生物地理学的に確定して,保護増殖に有効な施策を提言することを目的とした。調査は,福井県嶺南,滋賀県及び京都府の約90kmの区域で,標高250m以下の里地里山の山麓周辺湿地で行った。既知の本種の生活史から,幼生出現期の春季と成体出現・産卵期の冬季に調査を行った。本年度新たに108地点で行った追加調査では,産卵可能な止水環境が標高5160mの23地点で確認されたが,本種の幼生・卵嚢は新たに確認されなかった。他方,レッドデータブックに掲載されている稀少な野生動植物13種が若狭町,小浜市,高浜町及び京都府舞鶴市で確認され,これらの地域が,動植物の生息に良好な環境を残していることを改めて認識した。特に,舞鶴市の谷津田で圃場整備を免れた地域が確認されたことは,注目に値する。生物地理学的観点から,過去嶺南若狭地方から丹後地方にもアベサンショウウオの生息地が数多く存在していたと考えられる。しかし,現在の分布状況は,本種が生息地の連続性を失い,隔離された環境に追いやられていることを示している。嶺南若狭地方にも確実に分布すると考えられるが,生息地域は福井県嶺北や嶺南東部と異なり,石川県南加賀地方のような非常に限られた狭い地域に違いない。今後も,稀少な野生動植物が多く棲む2市2町と,里山でサンショウウオの情報が得られた小浜市で,数多くの地点を虱潰しにする生息地確認の継続調査が必要である。
血管障害における細胞接着分子セレクチンとリガンド糖鎖の関与についての研究

動脈硬化性病変の発生に、セレクチンと糖鎖を介する細胞接着が関与することが示唆されている。我々は昨年、ヒトリンパ節高血管内皮細静脈HEV血管内皮細胞上のL-セレクチンリガンドが、6-スルホシアリルルイスxであることを、特異抗体の作成を通じて証明した。6-スルホシアリルルイスx糖鎖は、その構造から見て、フコシルトランスフエラーゼとスルホトランスフェラーゼによって合成されると考えられる。そこで今回、この両酵素の遺伝子をリガンド活性のない培養血管内皮細胞株に導入して、L-セレクチンリガンドの再構成を試みた。すなわち、以前YT細胞から得られたフコシルトランスフェラーゼVII(Fuc-TVII)と今回新たにクローニングされたGlcNAcβ:6-スルホトランスフェラーゼ(6-Sul-T)を、ヒトHUVEC由来のヒト血管内皮細胞株ECV304に単独または二重に導入して、フローサイトメトリーと細胞接着実験にてシアリル6-スルホルイスxの発現とL-セレクチン陽性細胞の接着能を検索した。フローサイトメトリーの結果、ECV304細胞の糖転移酵素トランスフェクタントのうち、シアリルルイスxは、Fuc-TVII強制発現クローンおよびFuc-TVII・6-Sul-Tの二重強制発現細胞に検出された。シアリル6-スルホラクトサミンは、6-Sul-T強制発現細胞およびFuc-TVII・6-Sml-Tの二重強制発現細胞に検出されたシアリル6-スルホルイスxは、Fuc-TVII・6-Sul-Tの二重強制発現細胞にのみ検出された。細胞接着実験の結果、L-セレクチン発現細胞は、この4種の細胞のうち、Fuc-TVII・6-Sul-Tの二重強制発現細胞にのみ接着した。この接着は、抗L-セレクチン抗体で完全に阻害され、抗シアリル6-スルホルイスx抗体で強く阻害された。これにより、リンパ節の高血管内皮細胞に発現されるL-セレクチンリガンド糖鎖6-スルホシアリルルイスxは、フコシルトランスフェラーゼ(Fuc一TVII)と6-スルホトランスフエラーゼ(6-Sul-T)を二重にトランスフェクトすることによって再構成できることが証明された。
変形性関節症における軟骨分化マスター因子SOX9の病態関与と新規治療への基盤研究

関節軟骨にSox9遺伝子を過剰発現させたマウスでは明らかな変形性関節症変化の遅延が認められた。また、関節軟骨および、Sox9-EGFPマウスおよびSox9-EGFP null chimeraの軟骨細胞を用いたマイクロアレイ解析から、変形性関節症関連遺伝子として1つ、Sox9による発現誘導される遺伝子1つを絞り込んだ。さらに、Sox9-EGFPマウス由来軟骨細胞を用いてSox9発現誘導活性を有する化合物のスクリーニングを実施した。約10000種類以上の化合物スクリーニングにより7種類の候補が得られた。平成21年度はSox9-EGFPマウスを用いて関節軟骨におけるSox9遺伝子の発現を解析した。Sox9遺伝子は生後マウス関節軟骨において恒常性に発現していた。半月板および側副靭帯・前十字靭帯損傷による外傷性変形性膝関節症マウスモデルをSox9-EGFPマウスを用いて作成したところ、手術後1週間目でEGFPの発現強度が有意に増強し、その後低下することが確認された。実際、Sox9遺伝子の発現の推移をリアルタイムPCRで確認したところ、やはり手術後1週間目でSox9遺伝子の発現は亢進し、その後低下することが明らかとなった。組織学的解析では、手術後1週間では関節軟骨の明らかな変性所見は認められなかったが、術後2週間目より関節軟骨表層のフィブリレーションをきたし、術後4週で関節軟骨の変性および骨棘形成が認められた。以上の結果から、変形性関節症の病態の初期では、関節軟骨においてSox9遺伝子の発現が一過性に亢進することが明らかとなった。Sox9遺伝子は、軟骨細胞外基質蛋白質であるII型コラーゲン、IX型コラーゲン、アグリカンなどの遺伝子の発現を直接誘導することが知られている。よって、変形性関節症発症初期のSox9遺伝子の発現亢進は、軟骨細胞による細胞外基質蛋白質の発現誘導による病態の抑止がなされていると考えられる。よって、関節軟骨にSox9遺伝子を過剰発現させたトランスジェニックマウスをCre/loxPリコンビネーションシステムを用いて作成し(CAG/floxmRFP1/Sox9/IRESEGFP ; Sox9-Cre)、生後、膝関節の靭帯および半月板切離により変形性膝関節症を惹起させ、病態の進行をSham手術群と比較検討した。組織学的解析では、Sham群と比べ、Sox9過剰発現群では明らかな変形性関節症変化の遅延が認められた。以上のin vivo解析より、Sox9遺伝子の関節軟骨における発現誘導は、変形性関節症の病態を改善し、また、発症を抑止することが可能であることが明らかとなった。平成22年度はマウスの正常膝関節および変形性関節症モデルマウスの膝関節軟骨の凍結切片を作製し、Laser Capture Microdissection法で関節軟骨のみを切り出し、RNAをQIAGEN社RNeasy kitで抽出後、Affymetrix社のプロトコールに準じてそれぞれのRNAからラベルしたcRNAを作製後、Affymetrix社GeneChipによるマイクロアレイ解析を行い、それぞれの遺伝子発現プロファイリングを比較した。また、Sox9により発現誘導される遺伝子解析は、Sox9-EGFPマウスの軟骨およびSox9-EGFP null chimeraからEGFP陽性細胞をFACSで単離し、上述と同様にAffymetrix社GeneChipによるマイクロアレイ解析を施行した。それぞれのデータから2倍以上の遺伝子発現量の相違が見られる遺伝子をin situ hybridization法を用いて関節軟骨でのin vivoの発現を確認した。変形性関節症モデルマウスで発現亢進する遺伝子はMMP9,MMP13などがpositive controlとして確認され、その他に変形性関節症での役割が分かっていない遺伝子も同定された。また軟骨においてSox9で発現誘導される遺伝子は、Col2a1,Col11a2,Matrillin-1などがpositive controlして確認され、その他にもいくつかの遺伝子が同定されている。これら遺伝子の軟骨細胞での機能を確認するために、マウス軟骨細胞株ATDC5細胞およびマウス胎性間葉系細胞株C3H10T1/2細胞にそれぞれの発現ベクターをlipofectionで導入し、Alcian blue染色による軟骨結節形成能およびCol2a1、Aggrecan、Col10a1遺伝子発現に対する効果を検討した。その結果、現在、変形性関節症関連遺伝子として1つ、Sox9による発現誘導される遺伝子1つに絞り込み、in vitroおよびノックアウトマウスを用いたin vivoでの機能解析を実施しているところである。平成23年度は、Sox9-EGFPマウス由来初代軟骨細胞を用いてSox9発現誘導活性を有する化合物のスクリーニングを実施した。生後1-2日目のSox9-EGFPマウスの肋骨を採取し、トリプシンおよびコラゲナーゼ処理にて軟骨細胞初代培養系を作製した。96穴プレートに1穴あたり10000個の細胞を播種し2日間培養後、Prestwick社およびSigma-Aldrich社から購入したChemical libraryの化合物を添加した。24時間後蛍光マイクロ

プレートリーダーにてEGFPの蛍光強度を測定し、コントロールの3倍以上の蛍光強度を誘導する化合物のリストを作成した。この方法にて約7000種類以上の化合物スクリーニングを実施し終了した。この結果、12種類の低分子化合物が得られた。2次スクリーニングとして、EGFP誘導活性を有する化合物をマウス初代軟骨培養細胞に添加後、48時間でのCol2a1およびアグリカン遺伝子発現上昇をリアルタイムPCRで解析し、最終的に3種類の化合物が獲得された。これら3種類の化合物は、Sox9-EGFPマウスの膝関節を摘出し実体顕微鏡下に関節内投与しEGFP蛍光強度を蛍光実体顕微鏡で観察したところ、組織においてもEGFP発現誘導活性を有していることを確認した。よってこの3種類の低分子合成化合物は、関節軟骨においてSox9遺伝子発現を誘導し、関節症治療薬のシード化合物で有ると期待できる。平成24年度は、Sox9-EGFPマウス由来初代軟骨細胞を用いてSox9発現誘導活性を有する化合物のスクリーニングを引き続き実施した。生後12日目のSox9-EGFPマウスの肋骨を採取し、トリプシンおよびコラゲナーゼ処理にて軟骨細胞初代培養系を作製した。96穴プレートに1穴あたり10000個の細胞を播種し2日間培養後、購入および入手したしたChemical libraryの化合物を添加した。24時間後蛍光マイクロプレートリーダーにてEGFPの蛍光強度を測定し、コントロールの3倍以上の蛍光強度を誘導する化合物のリストを作成した。この方法にて現在まで約10000種類以上の化合物スクリーニングを実施し終了した。この結果、17種類の低分子化合物が得られた。2次スクリーニングとして、EGFP誘導活性を有する化合物をマウス初代軟骨培養細胞に添加後、48時間でのCol2a1およびアグリカン遺伝子発現上昇をリアルタイムPCRで解析し、最終的に7種類の化合物が獲得された。これら7種類の化合物は、Sox9-EGFPマウスの膝関節を摘出し実体顕微鏡下に関節内投与しEGFP蛍光強度を蛍光実体顕微鏡で観察したところ、組織においてもEGFP発現誘導活性を有していることを確認した。よってこの7種類の低分子合成化合物は、関節軟骨においてSox9, Col2a1およびアグリカン遺伝子発現を誘導し、関節症治療薬のシード化合物で有ると期待できた。次に3.5kg日本白色家兎部分半月板切除による変形性関節症モデルを作成し、上述の低分子化合物を連日関節内に4週間注射投与した。現在、関節軟骨修復効果をマイクロCTおよび組織学的解析にて検討を行い、至適投与濃度および投与量を検討中である。低分子化合物の一次および二次スクリーニングにより、軟骨細胞においてSox9遺伝子発現を誘導する可能性のある3種類の低分子化合物を獲得できた。
侵襲性歯周炎の網羅的ゲノム解析-エクソームシークエンスとNOD2変異の機能解明-

侵襲性歯周炎は、早期に発症し急速な歯槽骨破壊を引き起こす特殊な歯周炎である。家族内集積性という特徴から遺伝要因の関与が示唆されており、侵襲性歯周炎患者を含む2家系のゲノムDNAを用いたエクソーム解析を実施し、NOD2遺伝子内に新規遺伝子変異を同定した。本研究では、新規同定したNOD2遺伝子変異がもたらす生体内での機能異常をin vitroな研究により検討し、疾患発症の分子メカニズムの解明を目的とする。また、NOD2遺伝子のみで遺伝要因の全てを説明できないため、新たな家系内罹患者の遺伝子解析による新たな遺伝子変異の同定を行い、遺伝学的診断のための新規バイオマーカーの樹立を目指す。
モルヒネの微生物生産システム構築のためのベルベリン炭素骨格開裂機構の解明

Rhodococcus sp. BD7100株におけるBCE候補遺伝子の選抜を目的に、トランスポゾン挿入BBR分解能欠損株のひとつであるTB537株のドラフトゲノムシーケンスを行った。その結果、トランスポゾンがORF6192とORF6193の遺伝子間領域に挿入されていることが明らかになった。さらに、新たにBBR資化性菌として単離したArthrobacter sp. GBD-1株のBBR分解能を解析した結果、BD7100株と類似したBBR分解経路(分解産物としてD-BBRおよびseco-D-BBRを検出)を有している可能性が示唆された。そこで、ドラフトゲノム情報から特定したBBR脱メチレン遺伝子brdA(ORF4430)の近傍に存在し、BD7100株のbrdAの近傍に存在する遺伝子と相同性を示す遺伝子の破壊株を作製した。各破壊株の休止菌体を用いてseco-D-BBR産生能を評価した結果、ORF4420破壊株においてseco-D-BBRの生産能が消失していた。以上の結果からBD7100株由来遺伝子ORF6191,6192およびGBD-1株由来ORF4420をBCE候補遺伝子とした。Step 1で選抜した候補遺伝子のBBR骨格開裂反応への関与を検証するために、各遺伝子をRhodococcus sp.発現用ベクターpTip-QC1にbrdAと共に導入したベクターを作製した。これらをRhodococcus sp. PR4株にそれぞれ導入し、得られた形質転換体の休止菌体のBBR分解能を検証した。その結果、形質転換体の休止菌体によるD-BBRへの変換は確認できたが、seco-D-BBRの産生は確認できなかった。そのため、現段階ではBCEの特定には至っていない。
自己完結型膵ベータ細胞移植システム創生への試み

今回我々は成熟個体から幹細胞を採取し膵β細胞へ分化誘導した後、自家移植する"自己完結型膵β細胞移植"という新たな治療法を確立すべく基礎実験として本研究を行った。ラットの門脈遮断葉から培養・増殖可能な前駆細胞である肝上皮細胞(liver epitherial cell : LEC)を分離した。LECは肝細胞・胆管細胞のどちらにも分化可能な細胞である。肝胆膵は分化の過程で最も近いため、肝由来のLECは膵β細胞へ分化可能ではないかと考えた。まず、LECにおける膵関連遺伝子である、PDX-1,Isl-1,Nkx6.1,Ngn3,NeuroD, GLP-1R, Insulin I, II, Glucagon, K-ATPのmRNA発現を検索した結果Isl-1のみ発現を認めた。次に移植後早期に遭遇する虚血・低酸素に対する耐性能を検討した。2%O2,5%CO2下に培養した結果、ラット成熟肝細胞は時間とともにviabilityが低下したがLECは18時間経過しても98%生存し、低酸素下でも増殖した。β細胞への分化にはPDX-1とIsl-1の共発現が必要であるため、PDX-1遺伝子のtransfectionを行った。FuGENE6を用いリポフェクション法でマウスPDX-1遺伝子をtransfectさせ、transient expressionにおける形質転換の有無を検討した。導入の有無はPDX-1およびplasmidが共搭載しているFLAGに対する蛍光免疫染色で確認した。PDX-1陽性細胞はFLAG陽性でありtransfectionによるPDX-1の発現を確認できた。PDX-1はmRNA, Westernblottingでも確認できた。インスリン抗体による免疫染色ではFLAG陽性細胞に一致してインスリン陽性であったが、残念ながらWesternblottingやELISAでは確認できなかた。Transient expressionによる蛋白発現は非常にわずかであるため、今後はstable expressionを作製し検討することが必要と考えられた。
高速精密加工の実現へ向けたＧＨｚ光周波数コムの開発

本研究は次世代精密加工技術として期待されるパルスレーザー加工の問題点「加工速度の遅さ」の解決を目的としている。解決策の一つとしてパルスの繰り返し周波数を超高繰り返し(1GHz超)にすることで、熱影響を除去しつつ高速に加工を行うことが期待されている。しかし3GHzを超える繰り返し周波数では、レーザー加工機が存在しないため未知の領域となっており、この領域の探索が求められている。そのため繰り返し周波数が可変な超高繰り返しレーザー光源の開発を行う。本年度はレーザー加工機で最も重要な、レーザー発振器の作成を行った。熱影響の少ない精密なレーザー加工には、パルスの時間幅がフェムト秒オーダーが適していることが知られている。そこで本研究ではフェムト秒パルスが生成可能な「カーレンズモード同期レーザー」の作成を試みた。しかし従来の高繰り返しカーレンズモード同期レーザーは繰り返し周波数の変更が難しく、また繰り返し周波数も15GHzに留まっていた。この問題点を解決するために新しい共振器構造を考案し、1824GHzの周波数可変なカーレンズモード同期レーザーの開発に成功した。この繰り返し周波数はカーレンズモード同期レーザーとして世界最高の周波数である。繰り返し周波数が24GHzのときのパルス幅は140fsであり、熱影響の少ないレーザー加工に十分な短さのパルス幅である。初年度は共振器の作製とその出力を増幅し、光周波数コムとすることを予定していた。増幅には至らなかったものの、世界に類を見ない共振器の開発には成功した。特に繰り返し周波数を可変にできたこと、カーレンズモード同期レーザーとして世界最高の繰り返し周波数を実現したことは意義深い。予期していなかった問題点として共振器の不安定性が上げられる。共振器が不安定だとその後の増幅器が破損する恐れがある。そのため共振器を設置する堅牢な箱を設計して共振器の安定化を試みたが、現在のところ必要な安定性は得られていない。安定性を高めるためには温度制御や共振器構造の再検討が必要となると考えている。実際に増幅は行っていないものの、増幅のシミュレーションを行った。今回作製したレーザーの出力は20mWであり、増幅前の出力パワーとしては十分である。シミュレーションの結果、非常にシンプルな構成の増幅器で10W程度の出力が実現できることが確認できている。これらの結果から、レーザーの安定性という問題が残るものの研究はおおむね順調に進展していると考えている。今後の方策としてはまずレーザー共振器の安定化が挙げられる。まずは最も簡単に試せる温度安定化を試みる。これが良い解決策とならなかった場合には、新しい共振器構造を考える。具体的には共振器を構成する光学素子を少なくして、レーザー共振器を不安定にする要素を極力減らすことで安定性を確保する。共振器長を電気的に制御することで安定性を確保することも考えている。安定性が確保された後にはすでに行ったシミュレーション結果をもとに光強度の増幅を行う。増幅された光をテーパードフォトニック結晶ファイバに入射し、スペクトルを1オクターブ超に拡大、最終的に自己参照型光周波数コムとする。また加工に必要なパルスエネルギーを確保するために、音響光学素子を用いてパルスを間引く。間引かれたパルス列は平均エネルギーとしては小さくなっているため、これをさらに増幅することで、実際に加工が可能なパルスエネルギーまで増幅する。ここまでが今年度の方策であり、一番の肝は共振器の安定性確保である。

今回作製したレーザーの出力は20mWであり、増幅前の出力パワーとしては十分である。シミュレーションの結果、非常にシンプルな構成の増幅器で10W程度の出力が実現できることが確認できている。これらの結果から、レーザーの安定性という問題が残るものの研究はおおむね順調に進展していると考えている。今後の方策としてはまずレーザー共振器の安定化が挙げられる。まずは最も簡単に試せる温度安定化を試みる。これが良い解決策とならなかった場合には、新しい共振器構造を考える。具体的には共振器を構成する光学素子を少なくして、レーザー共振器を不安定にする要素を極力減らすことで安定性を確保する。共振器長を電気的に制御することで安定性を確保することも考えている。安定性が確保された後にはすでに行ったシミュレーション結果をもとに光強度の増幅を行う。増幅された光をテーパードフォトニック結晶ファイバに入射し、スペクトルを1オクターブ超に拡大、最終的に自己参照型光周波数コムとする。また加工に必要なパルスエネルギーを確保するために、音響光学素子を用いてパルスを間引く。間引かれたパルス列は平均エネルギーとしては小さくなっているため、これをさらに増幅することで、実際に加工が可能なパルスエネルギーまで増幅する。ここまでが今年度の方策であり、一番の肝は共振器の安定性確保である。
可溶性CD14サブタイプによる感染症迅速診断キットの開発

イムノクロマトグラフィーを応用して簡易キット(Point of Care test :以下POCテストと略す)を開発した。本法は、血清と血漿でデータの差異は殆ど生ぜず、どちらでも約15分で敗血症診断が可能となった。敗血症診断としてのカットオフ値を1+とすると、感度100%、特異度56%、有効度73%、カットオフ値を2+とすると、感度73%、特異度84%、有効度80%、カットオフ値を3+とすると感度47%、特異度96%、有効度78%であった。敗血症の早期診断及び本疾患の重症度のモニタリングに有用なキットを開発した。今後、このような簡便な敗血症診断キットが普及すれば敗血症治療成績の向上に寄与するものと思われる。イムノクロマトグラフィーを応用して簡易キット(Point of Care test:以下POCテストと略す)を開発した。POCテストはsCD14-STに特異的な抗体を金コロイドに結合したものを標識物として使用しており、メンブレンには異なる抗CD14-ST抗体が固相化する。また、コントロールライン用として抗ウサギγグロブリン抗体が固相化されている。測定方法は、検体を希釈液により4倍希釈し、100μLをサンプルパットに滴下する。検体中のsCD14-STは金コロイド標識抗体と反応後、キャプチャー抗体によりトラップされ、さらに余った標識抗体がコントロールライン用抗体によりトラップされる。過剰な標識抗体はさらに検体により洗い流される。反応開始15分後、判定を行う。コントロールラインのバンドを確認することにより、反応が正しく行われているかを判定する。SCD14-STの量は、キャプチャー用抗体の部分に現れるバンドの強度を見本と比較することにより判定する簡易キットである。POCテストによる、敗血症診断としてのカットオフ値を1+とすると、感度100%、特異度56%、有効度73%、カットオフ値を2+とすると、感度73%、特異度84%、有効度80%、カットオフ値を3+とすると感度47%、特異度96%、有効度78%であった。このことからPOCテストによる敗血症としては、POCテストで2+とするのがもっとも有効であることが示された。今後種々の感染症において本法を用いて特異度、感度,有効度等について検討する。敗血症の診断マーカーとしてsCD14-STを用いた場合、ROC曲線下面積は0.817であり、血中で上昇するsCD14-STが他のマーカーに比較して敗血症の診断マーカーとしてより優れていることが示された。詑D14-STはまたプロカルシトニン(PCT)、敗血症に関連する組織傷害アセスメントスコアであるSOFAスコアと相関し、さらに、sCD14-ST濃度の変動は敗血症の重傷度と相関した。以上まとめると、これらの結果よりsCD14-STは敗血症の早期診断及び本疾患の重症度のモニタリングに有用であることが示唆された。
コアシェル構造を有するナノロッドの組織化とプラズモン制御

金ナノロッドは棒状の金ナノ粒子であり、その均一な形状故に特徴的な表面プラズモンバンドを有しており、その強度やピーク波長はナノロッドの形状に依存することが知られている。異方的な形状を有するナノ粒子は形状の均一性が必ずしも高くないものがほとんどであり、金ナノロッドの形状均一性は特筆すべきレベルである。本研究では金ナノロッド表面に銀のシェルを形成し、その厚みを精密に制御する調製法を確立した。2層シェルなど複雑な構造を有する金属ナノ粒子、さらにその凝集体がどのようなプラズモンを有するかを定量的に実験・解析した例はこれまでにない。これらの定量的な調製方法を確立した。本研究で得られた金一銀コアシェルナノロッドはほぼ完全な銀ナノロッドとしての分光特性を有し、そのTEM像や分光特性から極めて形状均一性に優れていることを明らかにできた。シェルの厚みに依存して表面プラズモンの特性は連続的に変化し、プラズモンの制御が可能であることがわかった。一連のスペクトルを解析することにより、コアシェル構造とプラズモンの相関を定量的に理解した。さらに、金ナノロッドの凝集状態を水溶性高分子と金ナノロッドとの混合によって制御し、プラズモンバンドの変化との相関を検討した。凝集体形成の制御性が必ずしも高くなく、定量的な議論は実現できなかったが、一連の実験の条件の中で特異な分光特性を示すものがあり、異方性粒子の凝集状態の異方性制御が実現できることを明らかにできた。
p62によるNASH制御の分子機構の解明―脂肪酸エネルギー代謝からのアプローチ

p62-KOマウスに高脂肪食(HFD)を摂餌させ,血液,肝,白色(内臓)脂肪(WAT),褐色脂肪(BAT)を回収し解析を行った.脂肪酸代謝は,肝および脂肪組織の重量と重量当りの遊離脂肪酸(FFA)量および中性脂肪(TG)量を計測し,更に各組織のp62の発現をimmunoblotで解析した.肝組織の脂肪酸代謝の関連因子を定量的PCRで解析した.野生型マウス(WT)肝では,HFD16週間で脂肪滴と軽度炎症を認めたが線維化は殆ど認められなかった.一方,p62-KOではHFD4週間から脂肪滴が出現し,8週間からは炎症細胞浸潤が認められ,16週間では高度の線維化を伴う脂肪性肝炎像を示した.p62-KOでは肝病理の変化と平行して強い肝障害と炎症・線維化シグナルの活性化が認められた.p62-KOでは,HFDにより肝,WAT,BATの組織重量がWTと比較して有意に増加した.p62-KO肝では,HFD摂餌によって単位重量当りのFFA,TG量の有意な増加を認めた.一方,WATおよびBATにおいては,単位重量当りのFFA,TG量に差は認められなかった.WTにおけるp62タンパク発現は,肝では変化がない一方,WAT,BATのいずれもHFDにより増加していた.qPCRではp62のmRNA発現は,肝とWATでは変化がなく,BATでは低下しており,特にWATではautophagyもしくはlipophagyの障害によるp62の蓄積が示唆された.p62-KO肝では,FFAをacyl-CoAに代謝するAcsl1のmRNA発現が低下し,acyl-CoAをFFAに代謝するThem2の発現が増加しており,FFAとacyl-CoA代謝バランスの異常が示唆された.以上の結果より,p62はFFA代謝を介して脂肪性肝炎に対して防御的な機能を果たすものと推測された.非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)は肥満を基盤に単純性脂肪肝から発症し,肝硬変,肝癌へ進行する慢性肝疾患である.その発症には,脂肪酸エネルギー代謝異常による肝細胞への脂肪沈着や酸化ストレス負荷に加え,腸内細菌叢異常,内臓脂肪からの炎症シグナルなど,肝に加え全身の多様な因子が関与する.肥満を基盤とする全身病,すなわちメタボリック症候群の一表現型と認識されている.NASHの原因である肥満やメタボリック症候群には,全身の脂肪酸エネルギー代謝バランスの異常が関わっている.生体において脂肪酸はエネルギー源として好気的に代謝される(ミトコンドリアbeta酸化).肝臓では糖新生としてエネルギーの変換が行われ,白色脂肪組織ではエネルギー源として中性脂肪の形で蓄積される.そして褐色脂肪組織は,脂肪酸beta酸化によって熱を産生しエネルギー消費を行い,全身の脂肪酸エネルギー代謝バランスを摂っている.申請者らが作製した“ストレス応答タンパクp62遺伝子欠失マウス"(p62-KO)マウスに60%高脂肪食を摂餌させると脂肪肝は高度の炎症・線維化を伴うNASHを発症した.そのメカニズムとして,p62が肝内の遊離脂肪酸(FFA)エネルギー代謝に関わり,p62遺伝子欠失マウスの肝臓では細胞内のFFAとfatty acyl-CoAの不均衡が生じている可能性が示唆された.その原因としてp62欠失によるlipophagyが関わっていることも推測されている.今後において,肝細胞特異的p62遺伝子レスキューマウスの表現型を比較解析し,脂肪酸エネルギー代謝における白色脂肪組織,褐色脂肪組織との臓器連関を解析しながら,p62とFFA,lipophagyの関連について探求していく予定である.さらに,最新の細胞外フラックスアナライザーを用いて、初代培養細胞(肝,褐色脂肪,白色脂肪)について、p62の脂肪酸酸化における機能を探索し,独自のアプローチによるNASHの発症と進展の病態解明を目指していく.p62-KOマウスに高脂肪食(HFD)を摂餌させ,血液,肝,白色(内臓)脂肪(WAT),褐色脂肪(BAT)を回収し解析を行った.脂肪酸代謝は,肝および脂肪組織の重量と重量当りの遊離脂肪酸(FFA)量および中性脂肪(TG)量を計測し,更に各組織のp62の発現をimmunoblotで解析した.肝組織の脂肪酸代謝の関連因子を定量的PCRで解析した.野生型マウス(WT)肝では,HFD16週間で脂肪滴と軽度炎症を認めたが線維化は殆ど認められなかった.一方,p62-KOではHFD4週間から脂肪滴が出現し,8週間からは炎症細胞浸潤が認められ,16週間では高度の線維化を伴う脂肪性肝炎像を示した.p62-KOでは肝病理の変化と平行して強い肝障害と炎症・線維化シグナルの活性化が認められた.p62-KOでは,HFDにより肝,WAT,BATの組織重量がWTと比較して有意に増加した.p62-KO肝では,HFD摂餌によって単位重量当りのFFA,TG量の有意な増加を認めた.一方,WATおよびBATにおいては,単位重量当りのFFA,TG量に差は認められなかった.WTにおけるp62タンパク発現は,肝では変化がない一方,WAT,BATのいずれもHFDにより増加していた.qPCRでは

p62のmRNA発現は,肝とWATでは変化がなく,BATでは低下しており,特にWATではautophagyもしくはlipophagyの障害によるp62の蓄積が示唆された.p62-KO肝では,FFAをacyl-CoAに代謝するAcsl1のmRNA発現が低下し,acyl-CoAをFFAに代謝するThem2の発現が増加しており,FFAとacyl-CoA代謝バランスの異常が示唆された.以上の結果より,p62はFFA代謝を介して脂肪性肝炎に対して防御的な機能を果たすものと推測された.肝細胞特異的p62レスキューマウスの表現型を比較解析し,脂肪酸エネルギー代謝における白色脂肪組織,褐色脂肪組織との臓器連関を解析しながら,p62とFFA,lipophagyの関連を探求していく予定である.研究試薬の発注が遅れたこと,海外から輸入になってしまったことより,納品の時期が4月以降になってしまった.納品された研究試薬については,今年度の実験に要する.
サンゴ白化現象に伴う骨格記録の解析と過去の高水温イベントに関する研究

1998年夏,琉球列島など国内のサンゴ礁の広い範囲において観察史上もっとも大規模なサンゴの白化現象が発生した。本研究では,サンゴの白化に際して骨格にはどのような記録が残るか,また,1997-98年のような大規模な白化現象は過去にも起きていたかどうか,を明らかにする.初年度にあたる平成16年度は,「白化現象の骨格記録パターンの解明」と「長尺サンゴ試料に過去の白化記録が存在するかどうか」を中心に検討した。まず、1997-98年に白化を呈したサンゴ群体(Porites属)について,骨格中にどのような白化現象の記録を留めているかどうかを検討した.試料として,この白化現象直後に琉球列島石垣島およびその他の海域にて採取された複数のサンゴ群体を用いた.骨格について成長軸方向に0.2mm間隔で微小サンプリングを行い、得られた骨格粉末の酸素,炭素同位体比を測定した。その結果、酸素同位体比には白化イベントに対応して大きなシフトが認められた。このシフトは骨格の成長が一定期間停止していたことを示すものと考えられる。また、1997年以前に,サンゴの成長に何らかの異常を伴うイベントがあったかどうかを検討するために,大型ハマサンゴ群体より採取された柱状試料を分析した.石垣島東岸の安良崎沖のチャンネル部には,3つのハマサンゴ属の群体が融合した複合コロニーが存在し,1998年の大規模白化イベントに際し,一つの群体は白化を呈し,隣接する2つの群体は白化を起こさなかったことが確認されている.この白化を呈した群体および白化しなかった群体の双方より採取された試料について、過去20年間の記録を分析したところ、1998年以前に白化起源と思われるような酸素同位体比プロファイルの変形は見られなかった。

1998年夏,琉球列島など国内のサンゴ礁の広い範囲において観察史上もっとも大規模なサンゴの白化現象が発生した。本研究では,サンゴの白化に際して骨格にはどのような記録が残るか,また,1997-98年のような大規模な白化現象は過去にも起きていたかどうか,を明らかにする.研究開始後2年目にあたる平成17年度は,引き続き「長尺サンゴ柱状試料を用いた過去の白化記録の解析」を進めるとともに,「サンゴ骨格の酸素・炭素同位体比にみられる代謝の影響と速度論的効果」について検討した。まず、1997年以前に,サンゴの成長に何らかの異常を伴うイベントがあったかどうかの検討を、石垣島東岸の安良崎沖の大型ハマサンゴ群体に加え、沖縄本島中部瀬底島のサンゴ礁から採取した複数のハマサンゴ群体について行った。これらについて、過去30年間以上の記録を分析したところ、1998年以前に白化起源と思われるような酸素同位体比プロファイルの変形は認められなかった。このことからも1998年の白化イベントの特殊性が伺える。通常,サンゴ骨格の酸素・炭素同位体比はそれぞれ水温および日射量の指標と解釈されているが,年間の骨格成長速度が2mm/yrを下回るような状況では,炭酸カルシウム生成の際に生じる速度論的同位体効果が卓越し,酸素・炭素同位体比ともに平衡値に向かって増加する傾向を持つことが指摘されている.1998年の白化現象で骨格成長が減退したハマサンゴの場合,石垣島の試料では、光合成の効果消失現象が認められたのに対し、オーストラリアの試料については速度論的同位体効果の変化にによると思われる値の増加が認められた。これらの反応の違いは、サンゴの生息環境や履歴の違いに依存していると考察された。
高効率メカノケミカルプロセスによる高密着性DLC皮膜の迅速創製

本研究では,通常プラズマCVD(chemical vapor deposition)法など高エネルギー・高コストプロセスによって作られるDLC(diamond like carbon)皮膜を,加速されたボールの衝突によって常温・常圧条件下で誘起される瞬間的な高温・高圧反応場(メカノケミカル効果)を利用して迅速に形成することを目的とする。そのために鉛直方向に高速振動加速したボールによって繰り返しインパクト処理を行う新規のメカノケミカル法(ボールインパクト法)を提案し,密着性の高いDLC皮膜の創製を目指すと共に,離散要素法を基づく数値シミュレーションによってプロセス条件の最適化を図っている。本年度はまず,電気モーターによる機械的な回転を鉛直方向振動に変換し,ボールが装入された振動チャンバーが任意の周波数および振幅で振動するようにした,ボールインパクト法実験装置の作製を行った。周波数は最大100Hz,振幅は最大50mmまで上げられる。処理雰囲気を変えることができるよう,振動チャンバー全体をアクリルカバーで多い,騒音防止のためにカバー内部に吸音材を貼り付けた。予備実験として,粒子皮膜を作ることが困難なヒドロキシアパタイト粉末を利用し,空気雰囲気下で周波数および振幅を変更させて実験を行い,迅速に緻密かつ密着性の高い粒子皮膜の形成を確認した。また高速振動に基づく装置の負荷を計算し,安全な運転範囲を求めた。また同時に,ボールインパクト法の数値シミュレーションモデルの構築も行った。離散要素法に基づき,各ボールにかかる全ての力を時々刻々計算することで,全ボールの挙動が解析できる環境を整えた。
水圏環境汚染物質のフェイトアナリシスにおけるフミン物質の役割

環境汚染物質とフミン物質との相互作用を調べ、汚染物質のフェイトアナリシスのための基礎的プロセスを明らかにしようと試みた。先ず、凍結保存海底体積物よりフミン酸を抽出し試料とした。フルボ酸も一部抽出したが試料量が少なく一連の実験には使用できなかった。本年度得られた研究結果を次に挙げる。1.フミン酸の^<13>CNMRによるキャラクタリゼ-ション:2種のフミン酸について固体試料のNMRスペクトルを測定し、芳香族性ファクタ-を求めた。海洋フミン酸BS-14はfaromaticity=0.17、市販Aldrichフミン酸はfa=0.20で市販フミン酸の芳香族性が高かった。2.フミン酸の会合状態:フミン酸の0.02%の水溶液について光散乱法によりその形状の推定を行った。強い光吸収のため正確な値を得るのは難しいが、海洋性フミン酸で直径300Å、Aldrich 490Åのやや糸のほぐれた糸まり状であることがわかった。塩を加えると海洋フミン酸の直径は、200Åになりコンパクトな形状に変ることが明らかになった。3.有機化合物との相互作用:フミン酸の低濃度培液(0.01%)についてピレン、イコサンとの相互作用を主として蛍光および吸収スペクトルにより調べた。多環芳香族化合物との相互作用は市販フミン酸の方が海洋フミン酸より強く、直鎖炭化水素ではその逆であった。これらの系に塩を加えるとピレンとフミン酸との相互作用はより強くなった。蛍光スペクトルからAldrichフミン酸と結合したピレンは芳香族性の強い環境に存在することがわかった。アントラキノン系分散染料とフミン酸との相互作用においても、芳香族性の高いAldrichフミン酸との結合性が強く、海洋性フミン酸との作用が強くなるのはフミン酸の高濃度領域だけであった。これらの結果から、フミン酸の化学構造と培液中での形状が汚染物質との相互作用に大きく影響することが明らかになった。
「失われた２０年」における生産性低迷と税・財政政策の有効性

1990年代以降、日本経済が長く低迷した背景には、経済環境の変化が企業行動に変化をもたらしたことがあると考え、日本企業の設備投資・研究開発投資の変化とその要因を分析した。その結果、11990年代以降、日本企業は、企業価値への貢献は考えずキャッシュフローがあれば設備投資するという行動から、企業価値を高める投資を選んで行うようになった。21の変化には、海外投資家の日本企業株式保有の増加が影響を与えている。3研究開発投資も、減税によるインセンティブ効果は小さく、むしろ企業の経営状況に左右されることも明らかとなった。本研究の目的である「1990年代以降の企業の生産非効率と政策との関係」を明らかにするため、本年度は、日本企業の設備投資行動が1990年代から2010年の間にどう変化してきたのかについて実証分析を行った。設備投資行動に注目したのは、それが企業活動の効率性の変化も反映していると考えたためである。企業の設備投資に関する経済理論では、qと呼ばれる投資の限界収益が設備投資の決定要因であるとされている。つまり、qは設備投資による生産の効率性を表しているとも解釈できることから、設備投資がqによって決まっているのであれば、それは企業が設備投資による企業価値への貢献度(すなわち効率性)を重視していることを示している。しかしながら、多くの実証分析においては、qの設備投資に対する説明力は弱く、キャッシュフローの説明力が強いとの結果が示されてきた。そうした中、1990年代後半以降になると、企業の保有するキャッシュフローは増加傾向にあるにも関わらず設備投資が伸び悩むという状況が観察されている。そこで、本研究では、1990年代以降は、キャッシュフローの設備投資に対する説明力が低下するとともに、qの説明力が出てきているのではないか、と考え、時系列データを用いて投資関数の推定を行った。その結果、1998年以降になると、キャッシュフローよりもqが設備投資を左右する影響の方が大きくなっていることが明らかとなった。このことは、1990年代後半以降、日本企業が、キャッシュフローという調達コストの低い資金が手元にあっても、それが企業価値の増大につながらない限り設備投資に踏み切らない、という傾向が出てきていることを示唆していると言える。すなわち、「失われた20年」を経験する中で、日本企業は、企業価値に貢献できるかどうかという効率性を考慮しながら設備投資の判断をするように変化してきていると考えられる。研究の目的である「1990年代以降の企業の生産非効率と政策(特に税財政政策)との関係」を明らかにするため、政策投資銀行の『企業財務データバンク』を入手して、企業データを整理するとともに、それと平行して、本年度は、以下に説明する企業の研究開発投資と税制との関係についての実証分析を行った。日本では2003年度以降、研究開発支援の一環として、試験研究に係る税額控除制度が大幅に変更されてきたが、果たして、税額控除の拡張は研究開発の促進に効果があるのだろうか。この間、税率の引き下げも行われてきたが、税率引き下げの影響はどうだったのだろうか。このような問題意識に基づき、研究開発支援政策として、法人税制における税額控除拡大と税率引き下げのどちらの方が効果的なのかについて、19802009年の資本金階級別のデータを用いて分析した。その結果、税額控除は期待されるような効果を持たず、税率引き下げの方が研究開発増加に対して有意に影響を及ぼすこと、ただし、資本金100億円以上の巨大企業については、税率も税額控除も研究開発費に対して有意な影響を与えないことが明らかとなった。2003年度以降の試験研究費に係る税額控除制度の変更も、資本金10億円以上100億円未満の企業の研究開発費のみ、プラスで有意に効いているという結果も得られた。この結果については、2012年度の日本財政学会第69回大会(2012年10月28日)で報告を行った。この分析によって、それまで明確には扱われてこなかった、資本金階級によって税制の影響が異なることを示すことができた。しかしながら、利用したデータは階級別に集計されたデータであるため、個別企業データと比較するとまだ限界がある。集計されたデータと同じ結果が個別データでも得られるのかどうか、分析をさらに拡張・発展させていくことが次の課題である。本研究の目的は、1990年代以降の企業の設備投資行動が効率的であったかどうかを検証することにある。2013年度に行った分析の結果、1990年代以降、日本企業が企業価値への効果を重視して設備投資を行うように変わりつつあることが明らかとなった。そこで最終年度である2014年度では、このような変化の背景をさぐるため、さらに詳しく日本企業の設備投資行動の要因を分析することを試みた。設備投資に関する実証分析では、企業価値よりもキャッシュフローの方が設備投資を左右するとの既存研究が多い。

キャッシュフローの方が影響力を持つ背景として、理論的には、企業経営者と外部資本家との間で設備投資プロジェクトに対する情報に差があること(情報の非対称性)や、そのような情報の差を利用した経営者側のモラルハザード(エージェンシー問題)の存在が指摘されている。一方、1990年代以降、経済活動のグローバル化が進展し、国際競争で生き残るため日本企業は企業情報の開示や効率的な経営に取り組むことに迫られている。言い換えると、上述した情報の非対称性やエージェンシー問題の解消につながっているとも解釈できる。したがって、日本企業が企業価値を重視して設備投資を行うようになった背景に、国際化の影響があるのではないかと考えられる。以上の問題意識に基づき、近年の海外投資家による日本企業の持株割合上昇が国際化の1つの現れであるとして、2015年度は、株主構成の変化と企業設備投資行動との関係についての分析を行った。その結果、(1)海外投資家の持株比率が40%超の企業では、設備投資はキャッシュフローには左右されず、企業価値の影響のみを受けること、(2)海外投資家の持株比率が40%以下の企業では、キャッシュフローも企業価値も設備投資に対して影響力を持つが、その影響はキャッシュフローの方が大きいことが明らかとなった。公共経済学日本企業の設備投資の決定要因が、キャッシュフロー重視からq(企業価値)重視へと変化していることを明らかにすることによって、1990年代以降、日本企業の生産非効率が改善されつつあることまでは分析することができた。この点で、目的に沿った研究はおおむね順調に行われていると言える。しかしながら、その非効率改善の背景には何があるのか、1990年代以降の政策・税制はその改善に何らかの効果をもたらしたのかどうかまでは分析ができていない。次年度はこれらの観点からさらに研究を進めていく。遅れ気味になっている主要な理由は2つ。(1)個別企業データの整理に時間がかかったため。(2)企業の生産性を測る指標として、既存研究で用いられているTFP(全要素生産性)を使った生産性指標をそのまま利用するのでは無く、そこに独自の視点を盛り込んだ新たな指標にしたいと考え、その指標モデルを構築するのに時間がかかっているため。企業の設備投資が企業価値への貢献度(効率性)を重視して行われるように変化してきたことまでは明らかになったため、今後は、その変化が何によってもたらされたのか、について分析する。とりわけ、政府が「失われた20年」の間に講じた政策は、日本企業の効率性重視という変化に対して効力があったのか、無かったのかを実証的に明らかにする。平成26年度の研究計画の概要は以下の通りである。2014年48月にかけて分析を行って暫定的な結果を出し、それを912月にかけて学会・研究会等で報告する。2015年12月は、報告時の議論・指摘を踏まえて研究の改訂を行い、2015年3月までに確定した研究成果を出す。平成25年度前半(49月)は生産性の推計と非効率性の要因分析を行う。46月にかけて遅れの出ている生産性の計測を終わらせ、その計測結果を利用しながら、79月にかけて生産性低迷(非効率)の要因分析を行う。分析結果は秋の財政学会か応用経済政策学会で報告を行う。
バキュロウイルス増殖戦略研究の新展開：非必須遺伝子群に秘められた必須性の解明

本研究では非必須遺伝子群に潜む必須性を指標に抽出した非必須遺伝子セットを対象に、非必須遺伝子の相互作用と重要性について解析を進め、それらの集合体としての重要性を確認すると共に、遺伝子間相互作用に関する新たな知見を得た。さらに、ウイルス増殖機構の理解に不可欠な遺伝子間相互作用の詳細な解析進めると共に、ここで得られた知見を基にした論理的デザインに基づくBmNPVベクターの再構築を行うために、ギブソンアッセンブリ法を利用してBmNPVゲノム人工合成(再構築)システムを確立した。バキュロウイルスは、特定宿主に対して高度に進化してきたウイルスと考えられている。カイコのバキュロウイルス(BmNPV)は、カイコ細胞で効率よく増殖し、感染末期にはウイルスタンパク質が細胞タンパク質の約50%を占める。我々は単独変異ではBmNPV増殖に影響せず、BmNPVの増殖に不必要に見える非必須遺伝子を一度に複数欠失するとウイルスは増殖能を失うことを見出した。本研究では、ウイルスの増殖能を崩壊させる非必須遺伝子の組み合わせを逆遺伝学的手法で絞込み、それら遣伝子および相互作用の作用点とその定量的な制御を解明することで、BmNPV増殖システムのロバストネスを生み出す機構を理解し、BmNPVベクターの論理的なデザイン基盤を構築することを目的とする。H27年度においては、非必須遺伝子組み合わせKOウイルスライブラリーの構築を行った。即ち、ORF31-38の領域にある7遺伝子について、それらの半数以上の遺伝子をカバーするように4遺伝子についての4重変異体の組み合わせを作製し、野生型、7重変異体をコントロールとして欠損した4遺伝子による増殖能を評価したところ、ORF32およびORF36-38の4遺伝子欠損がウイルス増殖能(多角体遺伝子発現を指標としている)を顕著に低下させることが判明した。そこで、ウイルス増殖のロバストネスを支えるこれらの4遺伝子について全ての多重変異体ウイルス(組み合わせノックアウトウイルスセット:計16遺伝子型)を作製している。一方、これら7遺伝子の解析過程でウイルス増殖のロバストネスにさらに強く関わると考えられる新たな3遺伝子の発見(同定)があった。H27年度においては、予定通り組み合わせ4遺伝子KOウイルスライブラリーの構築を行い、野生型、7重変異体をコントロールとして欠損した4遺伝子による増殖能を評価することで、目標としていた「ロバストなウイルス増殖に必要な4遺伝子の絞り込み」に成功した。一方、それらの4遺伝子の組み合わせKOウイルス(16遺伝子型)の全ての構築には至って居らず、多角体遺伝子の制御下に組み込んだGFP遺伝子の発現を指標にした増殖効率から、遺伝子単独及び遺伝子間相互作用の貢献度解析を終了できなかった。しかし、これら7遺伝子の解析過程でウイルス増殖のロバストネスにさらに強く関わると考えられる新たな3遺伝子の発見があり、解析に新たな展開が予想される。我々はBmNPVのこのタンパク質高発現能を利用し、タンパク質発現ベクターとして改良を進めるため、遺伝学的なBmNPV改変及び解析を進めている。多角体遺伝子プロモーターからレポーター遺伝子を発現する改変ウイルスを使うことによって、ウイルス増殖量測定を簡便化し(以後、レポーター遺伝子発現測定から推定されたウイルス増殖量を「増殖表現型」と呼ぶ)、この改変ウイルスから遺伝子欠失ウイルスライブラリーを構築し、その増殖表現型を解析してきた。これまでに、ウイルス遺伝子を単一遺伝子を欠失させた際に増殖表現型に壊滅的な影響を与える遺伝子(必須遺伝子)と与えない遺伝子(非必須遺伝子)に分類した。本研究では複数の遺伝子の組み合わせによって制御されているウイルス増殖機構を理解し、バキュロウイルスの増殖機構についての研究でこれまで解析されてこなかった機構を明らかにすること、そして、BmNPV組換タンパク質発現ベクター改変方法の新規知見を得ることを目的に研究を進めている。H28年度においては(1)H27年度に同定した、同時に欠失させた場合にのみ、ウイルス増殖量を大きく低下させる3遺伝子の組み合わせについて、全ての1遺伝子、2遺伝子、3遺伝子欠失ウイルス(組み合わせウイルス)を作製し、遺伝子間の相互作用等を定量的に解析するための材料が整った。また、(2)ウイルス遺伝子を網羅的に測定する方法を新規に開発し、ウイルス増殖表現型やその他の表現型だけではなく、表現型発揮に至る間のウイルス遺伝子の発現をモニターし、表現型の違いの原因となるウイルス遺伝子発現変化を推定する手法を確立した。これらにより、ウイルス遺伝子発現・ウイルス増殖等の様々な階層について解析を進める基盤が整い、非必須遺伝子間の組み合わせによるロバストな増殖機構を定量的に解析することが可能となった。H28年度においてはH27年度に同定した3遺伝子について単遺伝子・多重遺伝子欠失ウイルスの構築を予定通り行うことができた。これらの組み合わせウイルスの詳細な表現型としてウイルストランスクリプトームデータを取得するためにqPCRを元にしたウイルストランスクリプトーム解析方法を確立した。当初、本解析はRNA-seq等の汎用されているシークエンス技術の利用を計画していた。しかし、本研究では増殖性の低い遺伝子欠失ウイルスについて解析するため、ウイルスDNAクローン(バクミド)を用いている。バクミドをトランスフェクションした細胞からのRNA-seqではBmNPVの遺伝子に由来するリードを十分数取得することが困難で、独自にBmNPVトランスクリプトームデータ取得手法を開発することが必要であることがわかった。H28年度にこの問題を解決することに成功し、組み合わせウイルスのトランスクリプトーム解析を行える技術的基盤を確立できた。我々は、BmNPVのタンパク質高発現ベクターとしての機能改良を進めるため、ウイルスゲノムの遺伝学的な改変指針と改変技術の確立を目指して研究を進めている。本研究では、(1)複数の非必須

遺伝子の組み合わせによって制御されているウイルス増殖機構を理解し、BmNPVの増殖機構についての研究でこれまで解析されてこなかった機構を明らかにすること、そして、(2)BmNPVベクター改変方法の新たな知見を得ることを目的に研究を進めた。H29年度までに、ORF32とORF36-38の4遺伝子同時欠損ウイルスにおいて増殖能が顕著に低下することを見出し、これら非必須遺伝子群にウイルス増殖を支える重要な相互作用の存在が示唆された。そこで、まず連続するORF36-38の3遺伝子について1遺伝子、2遺伝子、3遺伝子欠損ウイルス(組み合わせ欠損ウイルス)を作製した。また、本ウイルスの遺伝子発現を網羅的に測定し、遺伝子間の相互作用を定量的に解析する定量PCRシステムを確立した。本年度は、これら3遺伝子の相互作用についてさらに解析を進め、ORF36とORF37の間にsuppressive interactionが存在することを発見した。また、ORF32を加えた4遺伝子間での組み合わせ欠損ウイルスを作製するために、これまで開発を進めてきた酵母内でのBmNPVゲノムの再構築システムの利用を試みたところ、構築過程でウイルスゲノムの一部が欠損するという現象を見出した。そこで、本法の改良を試み、Gibson assemblyによる安定した再構築システムの構築に成功した。本研究では非必須遺伝子群に潜む必須性を指標に抽出した非必須遺伝子セットを対象に、非必須遺伝子の相互作用と重要性について解析を進め、それらの集合体としての重要性を確認すると共に、遺伝子間相互作用に関する新たな知見を得た。さらに、ウイルス増殖機構の理解に不可欠な遺伝子間相互作用の詳細な解析進めると共に、ここで得られた知見を基にした論理的デザインに基づくBmNPVベクターの再構築を行うために、ギブソンアッセンブリ法を利用してBmNPVゲノム人工合成(再構築)システムを確立した。H27年度における発見、観察結果を踏まえ、H28年度はウイルス増殖のロバストネスへの関与が強い3遺伝子を中心に、非必須遺伝子組み合わせノックアウトウイルスのセットを作製し、その表現型解析データ取得、統計モデリングを行う。この解析からウイルス増殖に対する各遺伝子および相互作用の貢献度を定量すると共に、それらが関わるメカニズムについて分子レベルの情報を得るためにトランスクリプトーム解析を行う。これらの解析を通じ、組み合わせノックアウトによって解析する遺伝子の作用点(DNA複製やウイルス粒子生産過程など)の同定、それら作用点のウイルス増殖におけるシステムレベルでの役割の理解を目指す。H29年度は組み合わせウイルスのトランスクリプトーム解析を行い、特定のウイルス遺伝子が組み合わさった場合、つまり特定遺伝子間の相互作用がある場合にのみ、発現量が変化するウイルス遺伝子の同定を行う。