hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多量の銀を含むカルコゲナイド非晶質半導体の光・電子線誘起現象に関する研究

銀の光ドーピングによる2層膜の可視光透過スペクトルの変化を詳細に調べた結果、光ドーピングを起しても透過率の変化しない特異な波長が存在することを見い出した。この等過率点をisotransmission point(【λ^*】)と名付け、その出現理由を考察した。(【i】)光ドープした領域の銀濃度が一定であること。(【ii】)2層膜の厚さが十分に薄くて、可視光透過スペクトルに干渉の影響がみられないこと。この2つが【λ^*】の出現条件である。さらに、ドープした銀量が透過率の変化から定量的に求められることが明らかになった。一方、2層膜の銀層側およびGe-S層側から光照射を行ない、両者のドーピング速度の違いから、光ドーピングに有効な光の吸収はカルコゲナイド層とドープ層で起ることを明らかにした。(3)光析出現象(PSD現象)の機構を探るため、【As_(15)】【S_(40)】【Ag_(45)】バルクガラスを用いて種々の実験を行なった。光照射を行なうと、まず、ガラス表面に析出銀粒子の核が発生する。光照射領域の電位が負になることから、ガラス内部の【Ag^+】イオンが光照射領域に集まることが考えられる。さらに、核の表面で【Ag^+】は金属銀になり、析出銀粒子の成長が起るものと考えられる。その他、(4)Ge-S系およびGe-S-Ag系薄膜のESCA分析、(5)PSD現象(Ge-S-Ag薄膜)の金添加効果、(6)Ge-S-Ag薄膜の電子線構造変化、(7)光起電力効果などの実験を行なった。
タンパク質間相互作用を調節する小分子有機化合物の論理的開発研究

本研究はタンパク質間相互作用を阻害する小分子有機化合物を設計する方法論の確立を目指して、高立体選択的β-C-リボシル化反応の適用範囲拡大と、本反応を用いて新規タンパク質間相互作用阻害剤を開発するものである。申請者はオキソカルベニウムイオンに対する極めて稀な求核剤のoutside attackを積極的に活用して、高立体選択的なβ-C-リボシル化反応を開発した。得られたアリル-β-C-リボシドから、オキサビシクロ[n.2.1]系化合物を得ることができた。これまで申請者はオキソカルベニウムイオンに対する極めて稀な求核剤のoutside attackを積極的に活用して、高立体選択的なβ-O-リボシル化反応を開発し、天然物合成に利用してきた。タンパク質間相互作用を阻害する小分子有機化合物の合成法を確立すべく、まず本年度は高立体選択的β-C-リボシル化反応の開発を行った。アリルトリメチルシランを求核剤、5-O-ベンジル-2, 3-O-ペンチリデン-D-リボシルフルオリドを糖供与体としたC-リボシル化反応を検討したところ、用いるルイス酸の種類によらず、β/α=>98/2で高立体選択にアリル-β-C-リボシド体が得られた。このことから本反応における立体選択性は、活性中間体であるオキソカルベニウムイオンに対する求核剤の面選択的な攻撃に大きく支配されることが示唆された。さらに求核剤として各種1, 2または3置換アリルトリメチルシランを用いた場合でも、良好な収率・立体選択性で対応するβ-C-リボシドを与えることがわかった。本反応は、向山アルドール型反応やシアノ化、Friedel-Crafts型反応にも適用でき、汎用性の高い直接的かつ高立体選択的なβ-C-リボシル化反応を開発することができた(Org.Lett, 2008, 10, 5107-5110.)。また得られたアリル-β-C-リボシドの5位にアリル基を導入後、閉環メタセシスを行うことで、オキサビシクロ[n.2.1]系化合物を得ることができ、タンパク質間相互作用を阻害する小分子有機化合物の合成を確立することができた。酵素阻害剤と比較して、タンパク質間相互作用を調節する少分子の設計は難しく、ゲノム創薬のボトルネックの一つである。本研究はタンパク質間相互作用を阻害する小分子有機化合物を設計する方法論の確立を目指して、高立体選択的β-C-リボシル化反応の適用範囲拡大と、本反応を用いてBcl-2/Bak相互作用を標的とした新規タンパク質間相互作用阻害剤を開発するものである。昨年度、申請者はオキソカルベニウムイオンに対する極めて稀な求核剤のoutside attackを積極的に活用して、高立体選択的なβ-C-リボシル化反応を開発した(Org. Lett.,2008,10,5107-5110.)。本年度はこの反応を用いて、タンパク質間相互作用を阻害する小分子有機化合物の合成法を確立すべく検討を行った。β-C-リボシル化反応の適用範囲を拡大すべく、向山アルドール型反応やシアノ化、Friedel-Crafts型反応についても検討を行ったところ、いずれの場合でも、良好な収率・立体選択性で対応するβ-C-リボシドを与えることがわかった。また、用いるルイス酸の種類によらず、β/α=>98/2で高立体選択にアリル-β-C-リボシド体が得られることもわかった。得られたアリル-β-C-リボシドの5位にアリル基を導入後、閉環メタセシスを行うことで、オキサビシクロ[n.2.1]系化合物を得ることができた。各種官能基変換、脱保護を行うことで、目的とするオキサビシクロ[5.2.1]化合物を合成することが出来た。市販のBcl-2と蛍光標識Bakペプチドを用いた蛍光偏光による、本化合物のBcl-2/Bak複合体形成阻害活性の評価を検討中である。
膜脂質の疎水性部分を可視化する逆転凍結レプリカ法の開発

生体膜の基盤を形成する燐脂質は親水性頭部と疎水性尾部からなり、後者を作るアシル基は多種多様であることが知られている。しかしそれらのアシル基が生体膜中でどのような分布をとるのかはほとんど分かっていない。今回の研究ではアルキン基を付加した脂肪酸を取りこませた細胞を用い、急速凍結・凍結割断レプリカ法と組み合わせて、特定のアシル基の分布をナノレベルで明らかにする方法の開発を行った。凍結割断レプリカ上でクリック反応を行うことにより、特定のアシル基が細胞内のオルガネラ膜で観察され、またその膜中の限られた部分でクラスターを形成することが明らかになった。数千種類にのぼる生体膜脂質の分布を可視化する方法として、我々は急速凍結・凍結割断レプリカ(QF-FRL)法を確立し、GM1, PI(4,5)P2, PI3Pなどについて結果を報告してきた。しかしながらQF-FRLが識別するのは糖鎖、イノシトール環など、膜脂質の親水性頭部の違いであり、膜脂質の多様性のもう一つの要因である疎水性尾部の違いを明らかにすることは原理的に困難であった。今回の研究では生体膜分子の二次元的分布を物理的に固定し、安定に保持するという凍結割断レプリカ法の利点を活用し、コレステロールや疎水性尾部の違いを可視化する方法、すなわち従来のQF-FRL法とは逆に親水性頭部に蒸着を行って物理的に固定し、疎水性部分を標識するという方法を開発する。また露出された疎水性部分は水溶液中では本来の構造を維持できず、標識分子との結合が起こらない可能性があるため、有機溶媒を含む環境でも特異的な結合が可能なクリック反応を応用する。本年度は親水性頭部に蒸着を行うための急速凍結法などの条件検討を行い、構造保持については問題がないことを確認した。一方、クリック反応に必要なアルキン基を持つ脂質アナログの開発に着手し、一部については合成を終え、さらにそのアナログが本来の内在性脂質と同様の性質を持つことを確認した。次年度は脂質アナログを予め取り込ませた細胞を材料として、レプリカを作製し、標識、電顕観察を行う予定である。形態学的方法、脂質アナログ合成と性質の確認の両方について予定していた検討を行うことができた。アラキドン酸のアシル基末端にアルキン基を付加したアラキドン酸(アルキンアラキドン酸)によって膜脂質を代謝ラベルした細胞を用いて、凍結割断レプリカ上でアラキドン酸を標識する方法の開発を試みた。通常の凍結割断レプリカでは可視化できない脂質二重層の疎水性部分を露出させた状態の凍結レプリカを作製するための新たな方法として、1)凍結割断することなく膜の真表面に白金・炭素を蒸着してレプリカを作製する、2)凍結割断後にエッチングで膜の真表面を露出させてからレプリカを作製する、の2つの方法を比較し、収率の高い後者を選択した。この方法で作製したレプリカを用いて、アルキンアラキドン酸にアジドビオチンをクリック反応で結合させ、抗ビオチン抗体、プロテインA・金コロイドで標識を行ったが、特異的な反応を得ることができなかった。一方、脂質二重層の親水性部分だけが露出しているはずの通常の凍結割断レプリカでは、上記のクリック反応で特異的な標識が認められた。標識は特定のオルガネラ膜にあり、そのうちの一部の膜では顕著な標識のクラスターが存在した。またそのオルガネラへのアルキンアラキドン酸の分布は、クリック反応による標識を蛍光顕微鏡で観察することによっても確かめられた。これらの結果は多価不飽和脂肪酸であるアラキドン酸が脂質層内で大きく折れ曲がり、アシル基末端は膜の親水性表面近くに分布する確率が高いという予測と一致する。今後、オレイン酸、パルミチン酸など他の脂肪酸についても検討を進め、膜脂質のアシル基が細胞内の異なるコンパートメントでどちら側の膜葉にあるのか、またその中でどのように分布するのかなど、従来の方法では難しい解析を順次、進める予定である。脂質アナログを取り込ませた細胞を新たな標識法で標識、観察し、結果を吟味して方法の確立を進める。細胞生物学クリック反応に必要なアルキン基を持つ脂質アナログの一部についての合成を終え、性質を確認したが、レプリカ標識に応用する実験には着手できなかったため。早急にレプリカ標識の実験を開始する予定である。
複雑液体と複雑プラズマのシミュレーションによる比較研究

本年度は、これまで行ってきたプラズマの自己組織化の研究をさらに深化させる研究を進めながら、クーロン遠距離相互作用と異なる相互作用によって支配される自己組織化現象を研究対象として拡大し、相互作用の形態と構造形成の関連を明らかにし、自己組織化の普遍的なシナリオの存在を追求する手がかりを得ることを目的とした。その結果、次のような成果を得た。1.高分子鎖の配向秩序構造の形成過程を調べるために、前年度の共有結合効果、非共有結合効果を取り入れた1鎖高分子に対するシミュレーションを発展させ、多重鎖高分子の分子動力学シミュレーションを行った。その結果、高温でランダムコイル状態にある高分子鎖を急速に冷却することにより、六角柱状配向秩序構造が次第に形成されること、しかも配向秩序構造は滑らかに形成されるのではなくステップ状に形成されていくという興味深い現象を見出した。2.ダストプラズマにおけるダストの動的な振る舞いを解析することを目的として、ダストの帯電過程を考慮にいれたダストプラズマの粒子シミュレーションコードを開発し、前年度にはフリップフロップ的帯電による凝集過程を見出した。本年度はシミュレーションコードをより精度の高いものとすることによって微粒子帯電過程のダイナミクスを明らかにし、微粒子の大きさ、密度などが凝集過程や秩序構造の形成、維持、崩壊に及ぼす影響を明らかにした。
糖尿病患者における水中運動プログラム継続が心腎連関に及ぼす影響

本研究は、水の物理的特性を用いた水中運動の利点を生かし、糖尿病患者に対して水中運動プログラムを行うことが糖尿病合併症と深く関連する心腎連関にどのような影響を与えるかについて検討することを目的とした。平成30年度は、4週間の水中トレッドミル歩行運動が尿中アルブミン(U-Alb)排泄量および尿中肝臓型脂肪酸結合蛋白(尿中L-FABP)に及ぼす影響について明らかにした。2型糖尿病患者4名(男性3名、女性1名、平均年齢55.5歳、CKDステージG2A1G3aA3)を対象とし、40%VO2max強度のトレッドミル歩行を1回30分間、週2回、4週間、計8回実施した。歩行プログラムは、水中(W)および陸上(C)条件の2条件をウォッシュ期間を設け、ランダムに実施した。水中運動は、水位剣状突起レベル、水温30°Cに設定した。介入前後のU-Alb排泄量および尿中L-FABPを検討した。U-Alb排泄量は介入前後の差において、W条件で平均0.28 mg/gCr(低下2名、増加2名)、C条件で平均50.9 mg/gCr(低下1名、増加3名)であった。尿中L-FABPは介入前後の差において、W条件で平均-0.53μg/gCr(低下2名、増加2名)、C条件で平均3.35μg/gCr(全員増加)であった。水中歩行プログラムは、同一強度の陸上歩行プログラムと比較してU-Alb排泄量および尿中L-FABPを増やさない可能性が考えられた。今後は、サンプルサイズ、CKD stageの幅、介入期間を増やし、さらに腎負担の少ない運動を検討する必要がある。本研究は、2型糖尿病患者に対して水中運動プログラムを行うことが糖尿病合併症と深く関連する心腎連関にどのような影響を与えるかについて検討することを目的としている。研究内容に関してすでに本学保健学研究科倫理委員会において承認済みであり、現在下記の通り遂行中である。研究課題遂行に先立ち、2型糖尿病患者(47歳男性、HbA1c9.0%)を対象に、水中トレッドミル歩行継続が循環指標に及ぼす影響について検討した。運動療法として、水位腰部(身長の約65%)、水温31°C、静止水、歩速4km/hの水中トレッドミル歩行(4Mets相当)を週1回、30分間、3ヶ月間実施した。介入前後に同歩行における漸増負荷運動によって循環指標を評価した。陸上から浸水による変化量は、介入後、心臓副交感神経系活動の指標であるHFで増大し、心拍数で低下した。介入後、4km/h歩行時の収縮期血圧は低下し、二重積は低下した。運動後の尿中アルブミン排泄量は、介入後も悪化を認めなかった。水中トレッドミル歩行運動を継続した本症例を通じて、心臓副交感神経系活動、心拍数、血圧などの循環指標を改善し、腎血流を悪化させることなく運動療法を実施できることが明らかになった。続いて、研究課題1として、水中運動が糖尿病患者の循環および腎機能に及ぼす影響について、安静期運動後回復期の血圧および腎機能変化について陸上運動時と比較して水中運動時にどのように影響するかについて運動前後の血糖値・血管内皮機能(FMD)・腎機能指標(UAE、β2-MG)を検討している。対象者を6名リクルートし、現在2名測定終了、他4名は遂行中である。研究課題2として、縦断的介入が及ぼす影響について検討している。対象者4名をリクルートし、現在2名介入終了、他2名は遂行中である。研究課題1・2共にさらに対象者を増やす予定としている。本研究は、糖尿病患者に対して水中運動プログラムを行うことが糖尿病合併症と深く関連する心腎連関にどのような影響を与えるかについて検討することを目的としている。研究課題1として、水中運動が糖尿病患者の循環および腎機能に及ぼす影響について、血圧および腎機能について陸上運動時と比較して水中運動時にどのように影響するかについて検討した。対象は顕性アルブミン尿を認めない2型糖尿病患者6名(病歴515年、HbA1c 7.5±0.9%、動脈硬化指標CAVI 8.6±1.9)であった。対象者には書面による同意を得て実施し、本学保健学倫理委員会の承認を得た。対象者は14km/hの漸増負荷トレッドミル歩行を各負荷7分間、計28分間実施し、運動時の酸素摂取量(VO2)、心拍数(HR)および血圧、運動前後の尿中アルブミン排泄量(UAE)を測定した。運動は水中(W)および陸上(C)条件を設定した。対象者のCAVIは境界域である8.0を4名が上回っていた。13km/h歩行時のVO2はC条件と比較してW条件が有意に低値を示したが、4km/h時は条件間で有意差を認めなかった。4km/h時のHRはC条件107.9±18.3bpmと比較してW条件105.3±7.9bpmで低値を示したが有意な差ではなかった。収縮期血圧は、漸増負荷に伴い有意に高値を示し、4km/h時にW条件145.0±14.9mmHg、C条件136.0±6.6mmHgであったが、条件間に有意差を認めなかった。UAEは、運動前後ならびに条件間に有意差を認めなかった。

平成27年度までに対象者5名の測定を終了しているが、平成27年度は産休・育休取得に伴い、1ヶ月余りしか研究を遂行することができなかったことから、平成28年度はさらに対象者を増やして研究を遂行する予定としている。平成27年5月初旬より平成28年3月まで産前産後休暇および育児休業を取得していたことから、昨年度は1ヶ月余りしか研究に着手できておらず、現在遅れている状況にある。本研究は、糖尿病患者に対して水中運動プログラムを行うことが糖尿病合併症と深く関連する心腎連関にどのような影響を与えるかについて検討することを目的としている。平成28年度の研究実績として、まず、4km/hまでの漸増負荷水中歩行運動が2型糖尿病患者の心拍数、血圧および尿中アルブミン排泄量に及ぼす影響を明らかにした。対象は顕性アルブミン尿を認めない2型糖尿病患者6名であった。14km/hの水中および陸上漸増負荷トレッドミル歩行を28分間実施し、心拍数、血圧、運動前後の尿中アルブミン排泄量(UAE)を測定した。心拍数は陸上と比較して水中で低値を示したが有意な差ではなかった。収縮期血圧は、漸増負荷に伴い有意に高値を示したが、条件間に有意差を認めなかった。UAEは、運動前後ならびに条件間に有意差を認めなかった。陸上における運動と同様に、2型糖尿病患者における4km/hまでの水中トレッドミル歩行は循環指標および腎機能の観点から安全に遂行できる運動であることが明らかになった。次に、水中トレッドミル歩行が2型糖尿病患者の尿中電解質に及ぼす影響について明らかにした。対象は2型糖尿病患者8名であった。14km/hの水中および陸上漸増負荷トレッドミル歩行を28分間実施し、心拍数、血圧、運動前後の尿中電解質排泄量(Na, K, K/Cr)および尿量を測定した。心拍数、収縮期血圧は段階毎に有意に変化したが、2条件間に有意差は認められなかった。運動後の尿中Na, K排泄量および尿量は陸上と比較して水中条件で有意に高値を示した。条件間の尿中K/Cr排泄量に有意差はなかった。合併症として腎症に至る糖尿病患者にとって、水中運動は有益になりうることが示唆された。約11ヶ月の育児休業のち検査測定手技再獲得に時間を要したこと、研究協力者であった大学院生がすでに修了していたことから協力者を新たに募って研究をスタートさせたこと、新たな対象者リクルートに難渋したこと、これら3点の理由で研究の進捗状況としてはやや遅れている。平成29年度の研究実績として、2型糖尿病患者における水中および陸上トレッドミル歩行が腎機能および心負担に及ぼす影響について明らかにした。対象は2型糖尿病患者6名であった。対象者の腎症の病期は12期5名、3期1名であった。運動介入は、40%VO2maxにおけるトレッドミル歩行を、1回30分間、週2回、4週間、計8回実施し、水中および陸上条件の2条件で、ウォッシュアウト期間を設け、ランダムに実施した。介入前後には、安静時の尿中アルブミン排泄量(U-Alb)およびヒトL型脂肪酸結合蛋白(L- FABP)、40%VO2maxでの歩行時の二重積(DP)を算出し、U-AlbおよびL-FABPとDPとの関係について相関分析を行った。
腫瘍型糖鎖構造を保持する膜タンパク質の糖鎖構造解析と抗体医薬開発

腎糸球体の上皮細胞で発見されたI型膜貫通タンパク質ポドカリキシン(PODXL)は、乳がん、前立腺がん、大腸がん、膵がん、精巣腫瘍、卵巣がん、脳腫瘍などにおいて高発現しており、悪性度や予後不良のマーカーである。一方、全身の血管内皮細胞などの正常組織にも比較的高発現しているため、抗体医薬の標的としては不適切とされていた。本研究の背景として、研究代表者らが開発したCasMab法を用い、PODXLに対し腫瘍特異的な反応性を示す抗体を取得した。本研究においては、これらの抗体を利用して、腫瘍型PODXLの実態を解明し、さらに腫瘍型PODXLのがん細胞形質への関与を解析すること、また、腫瘍型PODXL認識抗体の抗体医薬開発の可能性を検証することを目的とした。本年度は、腫瘍型糖鎖付加ポドカリキシンのがん細胞におけるの性質への関与を解明するため、種々の口腔扁平上皮癌細胞株において、PODXLノックアウト細胞を作成し、PODXL分子のがん細胞における機能的関与(運動能(migration assay),浸潤能(invasion assay),増殖能(growth assay),腫瘍形成能(in vivo assay))の解析を行った。その結果、運動能、浸潤能においては親株とノックアウト細胞で差は確認されなかったが、増殖能と腫瘍形成能で差が確認された。また、マウスモデルで抗PODXL抗体の抗腫瘍効果を確認するため、mG2aタイプの抗PODXLキメラ抗体、さらに、コアフコース欠損mG2aタイプ抗PODXLキメラ抗体を産生した。それぞれの抗体について、in vitroの系におけるADCC/CDC活性を測定したところ、両抗体ともADCC活性のみが確認され、コアフコース欠損抗体の方が活性は強かった。さらにin vivoの系における抗腫瘍効果を確認した。本年度は、種々の口腔扁平上皮癌細胞株を用いてPODXLノックアウト細胞の作成と、抗PODXL抗体の遺伝子改変抗体の作成を実施した。いずれも非常に速やかに樹立、産生することができた。これらの研究材料を用いて、PODXLの腫瘍における機能解析と抗PODXL抗体の抗体医薬としての有用性を示すことができた。本年度に実施したPODXLノックアウト細胞株樹立のノウハウを応用し、腫瘍特異的糖鎖構造に着目したPODXLのがんの機能的関与の解析を引き続き遂行する。また、腫瘍特異的抗PODXL抗体についても、同様のキメラ型抗体を作成し、抗体依存性細胞障害活性や補体依存性細胞障害活性、抗腫瘍効果などを調べる。本年度は、瘍型糖鎖構造付加部位決定実験と腫瘍型糖鎖付加PODXL分子の大量精製を遂行した。腫瘍型糖鎖構造付加を解明するため、まずは目的の糖鎖付加部位を特定する実験を行った。N末端側もしくはC末端側から削り込んだdeletion型PODXL分子を腫瘍細胞株に強制発現し、腫瘍型PODXL抗体の反応性からPODXL分子のどの領域に糖鎖構造が付加されているかを解析した。また、代表者らがTalenを用いて作成したN結合型糖鎖不全細胞株に、最小単位のPODXL分子を大量発現するための発現細胞樹立に取り組んだ。さらに腫瘍型糖鎖構造の生合成に関与する糖転移酵素遺伝子群の特定に取り組んだ。方法は、腫瘍細胞株を用い、腫瘍型PODXL抗体の反応性プロファイルを調べた。抗体反応性プロファイルと遺伝子発現プロファイル、両方の結果を比較検討して抗体の認識する腫瘍型糖鎖構造付加に関与する糖転移酵素遺伝子候補を調べた。本年度は、(1)瘍型糖鎖構造付加部位決定実験と(2)腫瘍型糖鎖付加PODXL分子の大量精製を遂行した。(3)さらに腫瘍型糖鎖構造の生合成に関与する糖転移酵素遺伝子群の特定に取り組んだ。(1)については、N末端側もしくはC末端側から削り込んだdeletion型PODXL分子を腫瘍細胞株に強制発現株の樹立を実施し、出来上がった強制発現株の腫瘍型PODXL抗体の反応性からPODXL分子のどの領域に糖鎖構造が付加されているかを解析した。(2)については、糖鎖構造決定のためには高分子量の糖鎖がついていない方が望ましいので、申請者らがTalenを用いて作成したN結合型糖鎖不全細胞株に、最小単位のPODXL分子を大量発現するための発現細胞樹立に取り組んだ。(3)については、種々の腫瘍細胞株を用い、腫瘍型PODXL抗体の反応性プロファイルを調べた。申請者がこれまでの研究で蓄積してきた腫瘍細胞株に対する糖転移酵素関連遺伝子発現プロファイル結果と、新規細胞株については、糖転移酵素関連遺伝子発現プロファイル作成を実施して、遺伝子発現プロファイルを作成。

抗体反応性プロファイルとの比較により、抗体の認識する腫瘍型糖鎖構造付加に関与する糖転移酵素遺伝子候補が見出された。腎糸球体の上皮細胞で発見されたI型膜貫通タンパク質ポドカリキシン(PODXL)は、乳がん、前立腺がん、大腸がん、膵がん、精巣腫瘍、卵巣がん、脳腫瘍などにおいて高発現しており、悪性度や予後不良のマーカーである。一方、全身の血管内皮細胞などの正常組織にも比較的高発現しているため、抗体医薬の標的としては不適切とされていた。本研究の背景として、研究代表者らが開発したCasMab法を用い、PODXLに対し腫瘍特異的な反応性を示す抗体を取得した。本研究においては、これらの抗体を利用して、腫瘍型PODXLの実態を解明し、さらに腫瘍型PODXLのがん細胞形質への関与を解析すること、また、腫瘍型PODXL認識抗体の抗体医薬開発の可能性を検証することを目的とした。本年度は、腫瘍型糖鎖付加ポドカリキシンのがん細胞におけるの性質への関与を解明するため、種々の口腔扁平上皮癌細胞株において、PODXLノックアウト細胞を作成し、PODXL分子のがん細胞における機能的関与(運動能(migration assay),浸潤能(invasion assay),増殖能(growth assay),腫瘍形成能(in vivo assay))の解析を行った。その結果、運動能、浸潤能においては親株とノックアウト細胞で差は確認されなかったが、増殖能と腫瘍形成能で差が確認された。また、マウスモデルで抗PODXL抗体の抗腫瘍効果を確認するため、mG2aタイプの抗PODXLキメラ抗体、さらに、コアフコース欠損mG2aタイプ抗PODXLキメラ抗体を産生した。それぞれの抗体について、in vitroの系におけるADCC/CDC活性を測定したところ、両抗体ともADCC活性のみが確認され、コアフコース欠損抗体の方が活性は強かった。さらにin vivoの系における抗腫瘍効果を確認した。本年度は、種々の口腔扁平上皮癌細胞株を用いてPODXLノックアウト細胞の作成と、抗PODXL抗体の遺伝子改変抗体の作成を実施した。いずれも非常に速やかに樹立、産生することができた。これらの研究材料を用いて、PODXLの腫瘍における機能解析と抗PODXL抗体の抗体医薬としての有用性を示すことができた。当初の計画通り、候補遺伝子のノックアウトまたはノックダウン細胞作製による抗体反応性の消失、または、プロファイルの比較結果から推定された糖鎖構造を持たない細胞株に候補遺伝子を単数または複数導入する強制発現細胞で抗体反応性が出現する、などの細胞工学的実験により腫瘍型糖鎖構造を解明する。また、PODXL発現糖転移酵素遺伝子ノックアウト細胞株やPODXLノックアウト細胞株などを用い、対象とした糖鎖構造改変型PODXL分子の種々のがんの機能的関与(多分化能・自己複製能や浸潤能・運動能など)の解析を行う。本年度に実施したPODXLノックアウト細胞株樹立のノウハウを応用し、腫瘍特異的糖鎖構造に着目したPODXLのがんの機能的関与の解析を引き続き遂行する。また、腫瘍特異的抗PODXL抗体についても、同様のキメラ型抗体を作成し、抗体依存性細胞障害活性や補体依存性細胞障害活性、抗腫瘍効果などを調べる。
ヒストンアセチル化と放射線感受性とのクロストークの分子機構解析

1.ヒストンアセチル化が及ぼすDNA損傷への影響ヒストンアセチル化過剰により多種類の癌細胞において放射線照射後のアポトーシスが増強されることを証明した。その機序は不明な点が多かったが、アセチル化亢進により放射線照射後のDNA障害(DSB)が増強することを明らかにした。これにより放射線増強効果《アポトーシス誘導》が発揮されるものと思われた(Apoptosis,2006)。さらにヒトのリンパ球を含めた正常細胞への影響を考慮し、リンパ球への放射線照射後の変異原性への影響を詳細に調べた結果、ヒストンアセチル化亢進によって、2重鎖切断の増加、と核型異常の増加が生じることが判明し、癌治療応用の際に、十分配慮されるべき問題点を示した(晴山)。2.ヒストンアセチル化が及ぼすアポトーシス関連蛋白の役割ヒストンの過剰アセチル化によって、誘導される蛋白質の同定とそれによって生じる様々な生物学的現象との関連性を調べた。すなわち、HDAC阻害剤FK228またはCBHA添加後にpro-apoptoticBR3-only蛋白(BimやBmf)が誘導され、それが阻害剤自体によるアポトーシス誘導能に極めて重要であること、またさらに放射線照射後のアポトーシス増強効果にも重要であることを証明した(Cell Death Diff.2006;Int J Radiat Oncol Biol Phys.2006)。(坂田、安達)3.JNK活性化と放射線照射後のDNA損傷JNKが放射線照射後に活性化されることが知られていたが、本研究によって、JNK活性化を惹起する薬剤を添加することによって、放射線照射後のDNA傷害が増強することが判明した。このことは、放射線感受性亢進療法の開発に極めて重要な発見といえる。(小井戸)1.ヒストンアセチル化が及ぼすDNA損傷への影響ヒストンアセチル化過剰により多種類の癌細胞において放射線照射後のアポトーシスが増強されることを証明した。(小井戸)癌治療において放射線治療は極めて重要な治療法として用いられているが、胃癌や大腸癌などの腺癌では放射線低感受性が低く有効性に制限されている。ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤(HDAC inhibitor)はヒストンのアセチル化過剰を誘発し、アポトーシスと関連する遺伝子を活性化する。一方、クロマチン構造を変化させることが示唆されている。このことはHDAC inhibitorが放射線感受性を高めアポトーシスを生じやすくすることを期待させる。放射線低感受性癌である胃癌・大腸癌細胞殊に対して、HDAC inhibitorを放射線照射前に処置することによって、細胞死を増加することができるか否か、そして、この増感動果の機序を検討した。3種類のHDAC inhibitorsであるFK228、MS275、CBHAを用い、新たな放射線増強剤となるか否かを検討した。放射線とよく併用される5-FUには、MKN45細胞において放射線増強効果は認められなかった.この点からはHDAC inhibitorはより優れた放射線増強剤として期待された。HDAC inhibitorにより放射線感受性を高めるメカニズムはまだ十分解明されていないが、HDAC inhibitorがヒストンを過アセチル化状態にし、ある遺伝子の転写を活性化、発現を亢進することがメカニズムに重要だと思われる。3つのHDAC inhibitorによりBimが増加し、放射線との併用によりさらに増加した。これまでに、放射線によりJNKが持続的に活性化し、それによりBimがリン酸化されproapoptosisの活性を来たすことが報告されていることからBimの活性化が併用効果のメカニズムにある程度貢献していると思われる。1.ヒストン修飾蛋白のアセチル化へ与える影響ヒストンはアセチル化のみならず、様々な修飾を受けその総合的な変化がDNA修復に影響を与えるものと思われる。そこで、ヒストンのリン酸化がアセチル化にどのような影響を与えるかを調べた。アセチル化を起こすHDAC阻害剤、リン酸化を起こすG-2/Marrest誘導剤を駆使し、両者のクロストークを解析中である。

また、変異型ヒストンの作製も行っており、これらの解析から、今後極めて重要な情報を提供してくれるものと期待している。2.ヒストンアセチル化が及ぼすアポトーシス関連蛋白の役割ヒストンの過剰アセチル化によって、誘導される蛋白質の同定とそれによって生じる様々な生物学的現象との関連性を調べた。すなわち、HDAC阻害剤FK228またはCBHA添加後にpro-apoptotic BH3-only蛋白(BimやBmf)が誘導され、それが阻害剤自体によるアポトーシス誘導能に極めて重要であること、またさらに放射線照射後のアポトーシス増強効果にも重要であることを証明した。(Cell Death Diff.2006 ; Int J Radiat Oncol Biol Phys.in press)3.ヒストンアセチル化が及ぼすDNA損傷への影響とアポトーシスの関連性申請者らは、ヒストンアセチル化過剰により放射線照射後のアポトーシスが増強されることを既に明らかにしているが、その機序は不明な点が多かった。そこで、本研究において、アセチル化亢進により放射線照射後のDNA障害(DSB)が増強することを明らかにした。これにより放射線増強効果《アポトーシス誘導》が発揮されるものと思われた(Apoptosis, in press)。1.ヒストンアセチル化が及ぼす正常リンパ球におけるDNA損傷時のアポトーシスの関連性申請者らは、ヒストンアセチル化過剰により放射線照射後のアポトーシスが増強されることを既に明らかにしているが、その機序は不明な点が多かった。本研究では、アセチル化亢進により放射線照射後のDNA障害(DSB)が増強することを明らかにした。これにより放射線増強効果《アポトーシス誘導》が発揮されるものと思われた(Apoptosis, 2006)。ヒトのリンパ球を含めた正常細胞への影響を考慮し、リンパ球への放射線照射後の変異原性への影響を詳細に調べた結果、ヒストンアセチル化亢進によって、2重鎖切断の増加、と核型異常の増加が生じることが判明し、癌治療応用の際に、十分配慮されるべき問題点を示した(晴山)。すなわち、HDAC阻害剤FK228またはCBHA添加後にpro-apoptotic BH3-only蛋白(BimやBmf)が誘導され、それが阻害剤自体によるアポトーシス誘導能に極めて重要であること、またさらに放射線照射後のアポトーシス増強効果にも重要であることを証明した(Cell Death Diff.2006 ; Int J Radiat Oncol Biol Phys.2006)(坂田、安達)。3.ヒストンアセチル化が及ぼすDNA損傷時のアレイ解析各試料からRNAを分離し、cDNAプローブを作製し、DNAアレイにより、修復遺伝子発現を主とする発現プロファイリングを行っており、アセチル化に伴って変化する、いくつかの候補者が得られた。
シロイヌナズナにおけるＶＩＰ１介在性浸透圧応答経路の全容解明

前年度までの解析により、転写抑制ドメインSRDXと融合した形のVIP1(VIP1-SRDX)をシロイヌナズナに過剰発現させると根の接触屈性が増大することが明らかになっていた。細胞壁と細胞膜に物理的な刺激を与えるという点で浸透圧ストレスと接触ストレスは互いに類似したストレスであると考えられている。本年度は、VIP-SRDXの過剰発現体について解析を進めた。根の屈性の制御には、PINと呼ばれる一群のオーキシン(植物ホルモン)輸送体が関わることが知られている。それらについて解析したところ、VIP1-SRDX過剰発現体においてはPIN2の存在量が野生型よりも大きいことが示唆された。また、VIP1-SRDX過剰発現体と野生型の間で根冠細胞の剥離の仕方が異なることも見出した。VIP1-SRDXの過剰発現体においては、VIP1の標的と考えられる遺伝子の発現量が低下しており、それらは、細胞壁の性質ひいては細胞の剥離の制御に関わる可能性があるものも含んでいた。また前年度までの解析により、VIP1の細胞内局在の制御には、カルシウム信号伝達とリン酸化が関与することが明らかになっていた。本年度は、VIP1のリン酸化についても解析を進め、ヒトLATSキナーゼのホモログとカルシウム依存性タンパク質キナーゼがin vitroでVIP1をリン酸化しうることを確認した。また、リン酸化される可能性のあるアミノ酸に変異を持つVIP1は非変異型のVIP1よりも核に局在しやすいことも確認した。本年度は、以上の結果を基に2件の学会発表を行い、2本の論文を発表した。VIP1は浸透圧応答というよりは接触など機械的な刺激に対する応答を制御するのかもしれないとが現在では考えているが、本研究を通してVIP1の機能制御に関わる因子を複数見出すことができ、VIP1介在性信号伝達の全容解明には近付けたのではないかと考えている。27年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は以下の四項目の解析を行った。(1) VIP1とAGB1との相互作用に関する解析AGB1はシロイヌナズナのヘテロ三量体Gタンパク質βサブユニットであり、形態や種々の刺激応答性を制御するタンパク質である。酵母ツーハイブリッド法によるスクリーニングによりVIP1とAGB1が酵母細胞内で相互作用することが示唆されたため、これらの因子間の相互作用について追究した。その結果、VIP1とAGB1がin vitro及び植物細胞内においても物理的に相互作用し、植物細胞においては、浸透圧の変化に応じてVIP1-AGB1複合体の細胞内局在が変化することが明らかになった。一方、AGB1を欠損した変異体においてもVIP1の細胞内局在の変化のパターンや生理的機能は維持されており、VIP1-AGB1相互作用の持つ意義(互いの機能に与える影響)は不明であった。(2) VIP1と遷移金属との相互作用に関する解析(1)において、精製したVIP1を用いて解析を行っていたところ、VIP1がニッケルに対する結合能を持っことを見出した。金属は一般にタンパク質の補因子として機能しうることから、VIP1の金属結合性について更に評価した。その結果、VIP1はニッケルに加えて亜鉛とコバルトにも結合し、コバルトはVIP1のDNA結合能に影響しうることが示唆された。(3) VIP1相同因子の機能解析シロイヌナズナにはVIP1に似たアミノ酸配列を持つ因子が十以上存在する。これら(をコードする遺伝子)の機能について解析を行った結果、これらがVIP1と同程度に発現しており、VIP1と同様の細胞内局在の変化のパターンを示し、VIP1と同様に転写活性化能を持つことが示唆された。(4) VIP1結合配列の同定CYP707A1、CYP707A3なる低浸透圧応答性遺伝子のプロモーターにVIP1は結合するが、それがAGCTGT又はAGCTGG (AGCTGT/G)を介したものであることを明らかにした。先行研究においてマイクロアレイ解析により低張液処理で発現が上昇する遺伝子が調べられていたが、それら遺伝子のプロモーターにおけるAGCTGT/Gの出現頻度はゲノム上の全遺伝子のプロモ一ターにおけるAGCTGT/Gの出現頻度より高く、AGCTGT/Gが低張液応答性遺伝子の発現に関与することが示唆された。VIP1とそれに相同なタンパク質であるbZIP29、bZIP52、PosF21、bZIP69を組換えタンパク質として大腸菌に発現させ、精製し、ゲルシフト解析に供した。この解析により、既知のVIP1結合配列を持つDNAに対して上のタンパク質はいずれも結合しうることが示唆された。酵母ツーハイブリッド法とBimolecular fluorescence complementationにより、それらのタンパク質が物理的に相互作用することも示唆された。SRDXという転写抑制ドメインとVIP1とのキメラタンパク質を過剰に発現する形質転換シロイヌナズナ(VIP1-SRDXox)を作製して成育試験を行い、VIP1-SRDXoxの根が野性型のものに比べて大きく波打つことを見出した。これは、VIP1-SRDXの過剰発現に伴う根の重力屈性の低下又は接触屈性の増大に起因すると考えられる。VIP1-SRDXoxの根においては接触刺激応答性遺伝子の発現量が増大していた。根の屈曲には植物ホルモン・オーキシンが関与することが知られているが、根におけるオーキシン応答のレポーターであるDR5rev::GFPの発現は野性型とVIP1-SRDXoxとの間で異なっていた。

VIP1は核と細胞質を往復するが、これに対する種々の生理活性物質の効果を検討したところ、1型及び2A型のプロテインホスファターゼの阻害剤(オカダ酸、カンタリジン)がVIP1の核内移行を阻害し、プロテインキナーゼの阻害剤(スタウロスポリン、K252a)がVIP1の核外移行を阻害することが明らかになった。また、二価イオンキレーター(EDTA、EGTA)とカルモジュリン阻害剤(クロルプロマジン、フルフェナジン)はVIP1の核内移行と核外移行の両者を阻害することも明かになった。これらのことから、カルシウム信号伝達とそれに伴うVIP1のリン酸化状態の変化がVIP1の細胞内局在の制御に重要な役割を果たすことが示唆された。前年度までの成果と以上の結果をもとに、一報の論文を著し、四件の学会発表を行った。前年度までの解析により、転写抑制ドメインSRDXと融合した形のVIP1(VIP1-SRDX)をシロイヌナズナに過剰発現させると根の接触屈性が増大することが明らかになっていた。細胞壁と細胞膜に物理的な刺激を与えるという点で浸透圧ストレスと接触ストレスは互いに類似したストレスであると考えられている。本年度は、VIP-SRDXの過剰発現体について解析を進めた。根の屈性の制御には、PINと呼ばれる一群のオーキシン(植物ホルモン)輸送体が関わることが知られている。それらについて解析したところ、VIP1-SRDX過剰発現体においてはPIN2の存在量が野生型よりも大きいことが示唆された。また、VIP1-SRDX過剰発現体と野生型の間で根冠細胞の剥離の仕方が異なることも見出した。VIP1-SRDXの過剰発現体においては、VIP1の標的と考えられる遺伝子の発現量が低下しており、それらは、細胞壁の性質ひいては細胞の剥離の制御に関わる可能性があるものも含んでいた。また前年度までの解析により、VIP1の細胞内局在の制御には、カルシウム信号伝達とリン酸化が関与することが明らかになっていた。本年度は、VIP1のリン酸化についても解析を進め、ヒトLATSキナーゼのホモログとカルシウム依存性タンパク質キナーゼがin vitroでVIP1をリン酸化しうることを確認した。また、リン酸化される可能性のあるアミノ酸に変異を持つVIP1は非変異型のVIP1よりも核に局在しやすいことも確認した。本年度は、以上の結果を基に2件の学会発表を行い、2本の論文を発表した。VIP1は浸透圧応答というよりは接触など機械的な刺激に対する応答を制御するのかもしれないとが現在では考えているが、本研究を通してVIP1の機能制御に関わる因子を複数見出すことができ、VIP1介在性信号伝達の全容解明には近付けたのではないかと考えている。当初の研究目的に適う結果が得られているため。27年度が最終年度であるため、記入しない。現在行っている解析を今後も引き続き行う。ほぼ当初の計画通りに解析を進めることができたため。現在まで本研究は順調に進んでおり、特記すべき推進方策はない。今後も予定通り研究が進むよう努めたい。
パラメターの空間的変異に適応する空間的相互作用モデリング技法の開発

空間分析の近年のトレンドとして、地理的に局所的な分布特性を把握しようとする地理的ローカル分析への関心の高まりをあげることができる。本研究では、空間的流動量ないし空間的な選択肢の選択確率をモデル化する空間的相互作用モデルに着目し、モデルのパラメターに潜む地理的な変異を推計する方法論を提案した。空間的相互作用モデルについては、パラメターを発地ごとに推計するOrigin specificな推計により大幅な適合度の改善がみられ、かつそのorigin-pecificなパラメターは流動現象が発生する地域的な差異、空間的意思決定者の選好の地理的差異を示唆することが知られていた。しかし、従来のアプローチは空間的相互作用モデルのパラメターに潜むパラメター変異を部分的にしか捉えていない。なぜなら、空間的相互作用は発地とともに着地の空間的次元によって定義され、発地と着地の組み合わせによってもパラメターの変異が生じうるからである。かかる問題点を解決するために、本研究では地理的なパラメター変異を推計するノンパラメトリック技法であるGWR(地理的加重回帰法)を、空間選択モデル(発地制約型空間的相互作用モデル)に適用し、発地のみならず着地の空間的位置に依存したパラメター変異を推計する方法論を提案した。さらに、この課題を達成するために、ポアソン回帰モデルにおけるGWRの推計方法、空間的相互作用に適当な重み付けカーネル、over dispersionを考慮した適当なカーネルサイズ(バンド幅)の決定法、結果の視覚化にっいて、新たな方法論を整理した。本研究で提案した方法を、日本の人口移動データに適用し、経験的にも発地および着地の組み合わせに依存するパラメターの空間的変異を確認、および、その人口移動研究上の解釈を行った。また、他の空間的相互作用モデルにおける同様な拡張において議論・整理した。回帰モデルを代表とする統計モデルを空間的に拡張する場合、従来は観測の空間的従属性を問題として空間回帰モデルが提案されてきた。これに対し近年では、空間的異質性すなわち、確率的過程の空間的な位置による違いを検出する方法論が、重要な研究課題となっている。その中でも、地理的加重回帰法GWR(Geographically Weighted Regreesion)は、先見的な条件をできる限り少なく抑え、効率よくパラメターの空間的変異を検出する技法として有用である。本研究の目的は、このGWRの方法論を空間的な流動を扱うモデリングに拡張し、経験的なデータによりその有効性を確かめることにある。さらに、本研究では、(1)空間的流動を扱うモデル-空間的相互作用モデル-を直接適用する場合として、発生制約型の空間的相互作」用モデルを、(2)Gravity型の空間的相互作用モデルをサブモデルとして、いわば空間的相互作用モデルを間接的に利用する場合として、空間的拡散モデルをとりあげ、GWRの方法論を検討した。空間的拡散現象に関しては、日本におけるAIDSの空間的拡散を事例として、都道府県別報告者数の時系列推移をモデル化・予測を行った。AIDS感染の空間的移動(居住地と感染地の関係)は不明のため、Gravity型モデルによりその関係をモデル化し、モデルに必要なパラメターをGWRを利用して推定した。適合状況は良好であり、その概要を国際学会ASIA GIS 2001にて報告した。空間的流動現象に関しては、日本における市区町村間人口移動を事例として、これにGWRを適用する方法論を整理した。空間的相互作用モデルの場合、空間的な次元は発地と着地がそれぞれ2次元座標をもつ関係で、合計4次元となってしまい、分析が高度に複雑化するため、その結果を整理し視覚化する手法を検討した。
臨床ソーシャルワークをおこなう私的相談機関の社会的役割研究とその実践の効果分析

1取り上げた私的相談機関は、他の専門機関が対応しにくい問題、あまり対応できていない問題である嗜癖および思春期問題行動などを対象として、多様な援助プログラムを組み積極的に援助をおこなっている。他の専門機関が十分になしえていない問題への援助をおこなっていることが、この機関の第一の社会的役割と言える。2とくに、そうした問題で悩む家族にたいして相談の場を提供し、家族がその認知や行動パターンを変容さえていく援助をおこなう。それによって家族が苦悩から解放され、適切な対応行動をとっていけるようになる。この家族介入の実施が援助の第一の内容である。この援助過程は、家族システム内の相互作用パターンの変化によって、IPが治療や相談の場に登場しIP自身の回復過程が始まるという、初期介入の機能もはたしている。3嗜癖問題のなかでも、医療機関や保健の専門機関でも比較的対応しにくい摂食障害やギャンブル依存症などの行動嗜癖、また、あたらしく嗜癖問題としてとらえられるようになってきた人間関係嗜癖(共依存症)、さらに嗜癖のIPのもので育ってきたACの問題や、児童虐待、性的虐待のサバイバーの問題などにたいして、プログラムを柔軟に改変するなどして積極的に援助している。こうした既存の専門機関がまだ対象としにくい現象としてはマイナ-な問題、あたらしく問題として取り上げれるようになった問題などに取り組んでいくこと、これも私的相談機関の社会的役割と言える。4実践の蓄積の過程で洗練させていった問題把握の視点や援助技法などを、医療や保健、福祉などの専門職に伝達、教育する活動もまた多様におこなっており、これもまた重要な社会的役割をはたしていると言える。5初期介入や家族介入の効果はかなり高いと言える。1文献研究「ソーシャルワーカーによるプライベット・プラクティスの実態、論点、意義」を執筆し、社会福祉実戦理論学会の紀要に掲載が決定している。嗜癖問題にたいする臨床ソーシャルワークの援助方法、その効果にかんする文献研究については、現在、論文を執筆中である。2実態調査研究(1)X相談室のクライエント・データの収集相談室のパーソナル・コンピュータで管理されているクライエントにかんするデータ・ベースから情報を収集する予定であったが、そこに入力されていない情報がかなりあったので、各ケースファイルをもとに、担当のソーシャルワーカーに確認する作業をおこないながら、基本的属性、相談経路、主訴、問題のアセスメント結果、処遇プログラム、関係機関、相談期間などの情報を入力していく作業をおこなった。その結果、1992、1993年のケース約620にかんしては、その作業を終えることができた。引き続き、1994年に来室したケースの情報入力をおこなっている。その作業を終えた後、分析に入る。(2)X咀嚼問題相談室のグループ・セラピーにかんするデータ収集ソーシャルスキル・トレーニング(SST)という若年アルコール依存症者・薬物依存症者たちのグループ・セラピーの実際をヴィデオに録画し分析を試みたが、定期的、かつ、継続的なグループ主席者が少なかったため、分析が困難となった。1995年度は、ワイフ・グループ(WG)について試みるつもりである。1 X相談室のクライエント・データの収集本年度は1994年の新規クライエント309例のデータにかんして、ケースファイルをもとにデータの確認、整理作業をおこない、40以上の項目にかんするデータをコード化して入力する作業を実施した。2クライエント・データの分析1992年、1993年、1994年の新規クライエントにかんするデータについて、各項目にかんする単純集計、項目間のクロス集計などをおこない、3年間のクライエント・データをもとにした私的相談機関の社会的役割と、臨床ソーシャルワーク実践の効果を、種々の角度からあきらかにすることを試みた。

3事例分析による臨床ソーシャルワークの援助方法・援助技法と効果事例分析にあたっては、プライバシーの保護に留意して以下のような手続きをとって事例を作成し、それをもとに援助方法・技法の整理分析と、援助効果の分析をおこなった。中心的問題が「家族関係問題」(家族の情緒的葛藤関係、夫婦関係、ACOA/ACOD)であるケースで、クライエントがIP以外の家族員であるケースまず選び、そのなかから比較的類似の問題をかかえ、かつ類似の援助過程を経ているケースを複数選択する。そして、それらをもとに転帰内容が終結、継続、オープンエンド、中断のケース事例を複数作成する。ただし、援助開始後の面接相談回数やその内容、その他プログラム活用過程については、基本的にあるケースをもとに作成し、その内容にかんしては最小限の情報のみを入れる。
甲状腺組織特異的転写調節因子の作用機構の研究

甲状腺組織特異的転写調節因子として同定されたTTF-1、Pax-8はそれぞれhomeobox遺伝子群、paired box遺伝子群に属するDNA結合蛋白であり、甲状腺組織特異的蛋白の1つであるサイログロブリン(TG)遺伝子の転写調節領域に結合することが知られている。甲状腺刺激ホルモン(TSH)およびインスリンによるTG遺伝子発現調節にTTF-1、Pax-8がどのように関わっているのか検討した。初めに、PCR法により単離したラットTG遺伝子の転写調節領域(-178から-3)をレポーター遺伝子ルシフェラーゼの上流に組み込み、これをラット培養甲状腺細胞株FRTL-5に導入した。この細胞にTSHおよびインスリンを添加したところ、ルシフェラーゼ活性の上昇が認められた。また、これらのホルモンにより内因性のTGmRNAも増加し、単離した調節領域はTG遺伝子にTSH、インスリン応答性を賦与する領域であることが判明した。次に、これら転写因子のTG遺伝子調節領域DNAへの結合活性をelectrophoretic mobility shift assay法を用いて検討した。その結果、TSHおよびインスリン添加により、FRTL-5細胞のTTF-1、Pax-8の結合活性は単位細胞当たりで増加した。しかしながら、FRTL-5細胞のTTF-1、Pax-8 mRNA量はTSH、インスリンで変化がなかった。以上の結果から、TSH、インスリンによるTG遺伝子の転写活性の増加にTTF-1、Pax-8の転写調節領域への結合の増加が重要であることが示唆された。またこれら甲状腺組織特異的転写調節因子の結合活性の増加は翻訳後の蛋白の修飾によることが示唆された。