hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大腸菌定常期におけるリボソームの構造と動態

今年度は定常期特異的に発現するリボソーム結合蛋白質YhbHとYfiAが100S形成に如何に寄与するかについて研究した。この両者は40%の相同性をもち、YfiAがC末18アミノ酸長いことを除けば非常に良く似ている。またYfiAは主として70Sに結合するが、YhbHは100Sに特異的に結合することをわれわれはすでに見出している。したがって特にYhbHの100S形成に対する寄与が注目される。われわれはYhbH, YfiAの欠損株と二重欠損株を作成し、各株のリボソームの態様を蔗糖密度勾配遠心法で調べた。二重欠損株はRMFのみが結合しているが、形成された70Sダイマーは90Sであった。これに対YfiA欠損株ではRMFとYhbHとが結合しているが、100Sが形成された。この100S形成は野生株よりも多かった。以上の結果はRMF単独では90Sが形成され、これにさらにYhbHが結合すると100Sに転化することを示唆している。かつてin vitroでリボソームにRMFを添加する実験で、定常期のリボソーム(予めYhbHを含んでいる)を用いると100Sが形成され、対数期のリボソーム(YhbHを持たない)を用いると90Sが形成されることとよく斉合する(Wada, BBRC, 1995)。また対数期が終了した直後の細胞で、短時間90Sが観察されることも、YhbHがRMFよりわずかに遅れて発現してくると仮定すれば説明できる。つまり100S形成は二段階であり、まずRMFによって未成熟の90Sが出来、ついでYhbHが結合すると100Sに成熟することが明らかになった。他方YfiAとRMFを持つYhbH欠損株では70Sダイマーが形成されなかった。これはYfiAが100S形成を阻害することを示している。構造が良く似たYhbHとYfiAが100S形成に対して逆の働きを持つことは極めて興味深い(投稿中)。今年度初めに、木村能章氏がcryo電顕使用不能のため研究分担者を退いた。代わって上田雅美さんが研究支援者として加わり、新たな三人のグループで研究を続けた。1.100Sリボソームの三次元構造解析京大理の藤吉好則教授の協力を得て、電顕による100Sリボソームの三次元構造を解析した。通常のネガテイブ染色で100Sの像を集め、それを統計的に処理することによって、二個の70Sリボソームが二回回転対称的に30Sを結合し合って,100Sを形成していることがわかった。これはかつて低イオン強度下で人為的に形成される100SをJ.Lakeが観察した結果とよく似ていた。次いで、より詳細に100S構造を解析するため、cryo電顕に取り掛かったが、その試料作成が予想を超えて困難で、試料を急冷する過程で100Sが70Sに解離してしまい、纏まった像を得ることが出来なかった。安定な100Sを多く含む試料の作成が今後の課題として残った。信州大繊維の内海利男助教授の協力を得て、ケミカルフットプリント法でRMFの23SrRNA上の位置決定を行った。DMS修飾をRMF結合で阻害した結果、9個の塩基が影響を受けたが、その大部分、7個がPTase centerとpeptide exittunnelの入り口付近に集中していた。しかもPTaseの活性中心と考えられている塩基2451Aがこの中に含まれていた。この結果は先に行ったRMFとリボソーム蛋白の架橋実験の結果ともよく一致しており、RMFがPTase centerないしはその近傍に結合することによって翻訳活性を休止させるとともに、100Sを形成することを強く示唆している。3.定常期特異的蛋白質の発現調節と作用機作の遺伝子解析定常期特異的にリボソームに結合する蛋白質のうちYFIAとYHBHに重点を置き、その欠損株の解析を始めた。実験はまだ途中の段階であり、次年度にまとめて報告する。

かつてin vitroでリボソームにRMFを添加する実験で、定常期のリボソーム(予めYhbHを含んでいる)を用いると100Sが形成され、対数期のリボソーム(YhbHを持たない)を用いると90Sが形成されることとよく斉合する(Wada, BBRC, 1995)。また対数期が終了した直後の細胞で、短時間90Sが観察されることも、YhbHがRMFよりわずかに遅れて発現してくると仮定すれば説明できる。つまり100S形成は二段階であり、まずRMFによって未成熟の90Sが出来、ついでYhbHが結合すると100Sに成熟することが明らかになった。他方YfiAとRMFを持つYhbH欠損株では70Sダイマーが形成されなかった。これはYfiAが100S形成を阻害することを示している。構造が良く似たYhbHとYfiAが100S形成に対して逆の働きを持つことは極めて興味深い(投稿中)。
癌浸潤における膜型マトリックスメタロプロテアーゼ活性制御分子の検索

MT1-MMPは、その発現が癌の悪性度と高い相関性を示すのみならず、ノックアウトマウスで深刻な骨形成異常を引き起こすことから病理的にも生理的にも生体内で重要な役割を果たしていると考えられる。本研究では平成15年度に細胞膜表面上でのMT1-MMP活性の分子制御機構の解明を目的とした発現クローニング法を新たに開発し、関連分子の検索を行った。本年度は平成15年度に同定したMT1-MMPの活性制御に関わると予測された膜型セリンプロテアーゼ(TTSPs)の一種であるモザイクセリンプロテアーゼおよび機能未知遺伝子を中心にMT1-MMP活性に及ぼす影響の検討を行った。モザイクセリンプロデアーゼは、スクリーニング結果から予測された膜貫通ドメイン近傍でのMT1-MMP切断活性のみならず、他に複数の部位での切断活性を有していた。これらの切断部位はMT1-MMP酵素活性に対して正あるいは負に作用することが予測されたが、MT1-MMPによるゼラチナーゼA活性化能・細胞運動・細胞浸潤活性の検討から全体としてMT1-MMPに対して正の制御活性を有していることが明らかとなった。また、モザイクセリンプロテアーゼはMT1-MMP活性化酵素として報告されているフューリンと類似した酵素活性を有していることからMT1-MMP活性化について冗長性がある可能性が考えられた。モザイクセリンプロテアーゼは他の膜型MMPの中でもMT4-MMPに対してのみ切断活性を有していたことからその基質特異性は何らかの生理的意義があるものと予測された。MT1-MMPの細胞膜表面上での活性制御機構としてはこれまでに自己分解、エンドサイトーシスによる取り込み・リサイクリングが知られていたが、膜型セリンプロテアーゼによるMT1-MMPの切断はMT1-MMP活性制御機構に新たなパラダイムを提唱するものと考えられた。機能未知遺伝子はそのアミノ酸配列から細胞膜4回貫通型のタンパク質であることが予測され、その活性としてはMT1-MMPによるレポータータンパクの切断を亢進することが明らかとなった。この遺伝子は直接レポータータンパクの切断を誘導しないことからMT1-MMP活性を調節することでこのような活性を発揮しているものと考えられた。細胞-細胞外マトリックスインタフェイスにおけるMT1-MMPの活性制御機構の解明は癌を始めとした病態のみならず形態形成機構を理解する上で重要である。そこで本研究では新たに発現クローニング法を開発し、細胞浸潤・運動に関連したMT1-MMP活性制御分子の同定を試みた。MT1-MMPの酵素活性としてはこれまでにPro-MMP2の活性化、細胞外マトリックスの分解および自己分解が知られている。近年これらの活性の上昇にはMT1-MMPの局在化とそれに伴うオリゴマー形成が重要であると考えられている。そこで我々はMT1-MMPの自己分解を指標とした。MT1-MMP活性検出系の確立を行った。方法としてはMT1-MMP触媒部位をMMP-9触媒部位に置換したキメラタンパク発現プラスミド(レポータープラスミド)を構築し、自己分解に伴う細胞外ドメインの培地中への放出をゼラチンザイモグラフィーによりモニターする系を確立した。このキメラタンパクは、1.MT1-MMP存在下において選択的に切断を受けること、2.この切断がTIMP-2,3により阻害されるがTIMP-1では阻害されないこと、3. MT1-MMP発現細胞であるHT1080細胞への導入により切断が起こること、4.レポータータンパク安定発現HT1080細胞に対するConA刺激やCollagen Iによる刺激により切断が促進されることから既知のMT1-MMP活性制御に関わる刺激により同様の制御を受けると考えられた。したがって本レポータータンパクはMT1-MMPのレポーターとして十分機能しうるものと考えられた。このレポーターを用いたスクリーニングにより、活性抑制因子としてTIMP-2,-3,機能未知遺伝子、レポーター遺伝子を直接切断するタンパクとしてCathepsin、MSPM、MT2-MMPなどを同定した。

MT1-MMPの細胞膜表面上での活性制御機構としてはこれまでに自己分解、エンドサイトーシスによる取り込み・リサイクリングが知られていたが、膜型セリンプロテアーゼによるMT1-MMPの切断はMT1-MMP活性制御機構に新たなパラダイムを提唱するものと考えられた。機能未知遺伝子はそのアミノ酸配列から細胞膜4回貫通型のタンパク質であることが予測され、その活性としてはMT1-MMPによるレポータータンパクの切断を亢進することが明らかとなった。この遺伝子は直接レポータータンパクの切断を誘導しないことからMT1-MMP活性を調節することでこのような活性を発揮しているものと考えられた。
バルク黒鉛材料の強度評価高精度化のためのX線応力測定技術の確立

黒鉛はその結晶構造であるグラファイトに結晶方位による機械的特性の異方性が大きいことから、黒鉛の機械的性質を理解するためには結晶の単一方向のみでなく、六角網平面の面内および面外方向など種々の結晶方向の応力測定が必要である。そこで面外方位の測定を実現するための側傾法用測定ステージの開発を行った。また、既存の並傾法装置を用いたX線応力測定においても可能な方位のX線応力測定を実施した。特性の評価には供試材に四点曲げジグおよび新たに開発した圧縮負荷試験機によって既知の応力を負荷し、その際の供試材表面の応力をX線応力測定法によって測定し、負荷応力とX線応力測定による測定結果の関係について明らかとした。原子力材料などとしても用いられるバルク状黒鉛材料を適正に利用するためには、その機械的性質や力学的状態を正確に把握することが欠かせない。しかし、同材料においては残留応力などの評価方法が未確立であり、その開発が望まれる。そこで本研究では適当な特性X線と回折指数の組合せを用いることによる、バルク状の黒鉛材料の応力評価法の確立を目指している。ところで、黒鉛は結晶方位による機械的特性の異方性が大きいことから、単一方向のでなく六角網平面の面内および面外方向など種々の結晶方向の応力測定が必要であると考えられる。その際、面外方位である004回折の測定では回折角が比較的低角度となるため、側傾法と呼ばれる測定法を用いることで並傾法と比べ高精度な測定が可能となると期待できる。初年度はこの側傾法用ステージの作製および既存装置を用いた並傾法によるX線応力測定を実施した。側傾法ステージは当該年度に完成したが、その制御部に不完全なところがあるため、引き続きその改善に取り組む。また、既存の並傾法装置を用いたX線応力測定においては特性X線を選択的に使用し、六角網面内および面外方向、またその混合方向のX線応力測定を実施した。具体的には供試材に四点曲げジグによって既知の応力を負荷し、その際の供試材表面の応力をX線応力測定法によって測定し、負荷応力とX線応力測定による測定結果の関係について明らかとした。この成果は本年度上期での学会発表を予定している。特性X線を選択的に使用し、六角網面内および面外方向、またその混合方向のX線応力測定を実施した。この成果については第51回X線材料強度に関するシンポジウム(日本材料学会主催)において「バルク状黒鉛のX線応力測定法の検討」と題して発表予定である。また、面外方向の測定に用いる予定である側傾法による側傾法用ステージの作製を行った。そこで本研究では適当な特性X線と回折指数の組合せを用いることによる、バルク状の黒鉛材料の応力評価法の確立を目指した。その、面外方位である004回折の測定では回折角が比較的低角度となるため、側傾法と呼ばれる測定法を用いることで並傾法と比べ高精度な測定が可能となると期待できる。側傾法ステージは当該年度に完成したが、その制御部に不完全なところがあったため、引き続きその改善に取り組んだ。具体的には供試材に四点曲げジグおよび新たに開発した圧縮負荷試験機によってによって既知の応力を負荷し、その際の供試材表面の応力をX線応力測定法によって測定し、負荷応力とX線応力測定による測定結果の関係について明らかとした。初年度に実施した測定結果の考察を進めるのと並行して、側傾法による測定を実施する。側傾法による測定については作製したステージの制御部に不完全な点が残ったが、早急に問題点の改善に取り組み実施計画に基づきH29年度の課題に予定通り取り組む予定である。H29年度は計画最終年度であり、年度後半で研究を総括し、その成果の学会発表・論文投稿などを予定している。機械材料
地域における育児サポートと育児行動のインターフェースに関する研究

宮城県黒川郡大和町(人口2万4千人)を対象に、地域に存在する育児支援資源やサービスと親の育児行動とを繋ぎ、「accessibility」を高めるための要因について検討した。1)第一子が04歳までの5年間の悉皆的縦断調査をまとめた結果、母親の養育意識・行動はアンビバレント性が保持されながらも、2、3歳へ向けて否定的側面が強まる傾向が示され、従来の乳幼児健診以外の総合的支援が望まれた。2)地域内にある育児資源のサポート機能の周知・利用について、第一子に1,2歳を持つ群と4歳を持つ群間の差異を比較した結果、4歳群は年少群より認知も活用も高いとはいえ、いずれの群も十分ではなかった。3)対象年齢を設定しない自由参加の「子育て相談教室」を焦点化し、平成11年4月13年3月の3年間の全利用者データを分類整理した。参加児には性差がなく、月齢的にも乳幼児全般に及び、内容的にも多様な相談ニーズの高さが窺われた。4)同教室の「利用者」と「非利用者」に調査を行なった。利用者は、知識・情報の獲得とともに、居場所として利用できることによって満足を感じているだけではなく、相談後に身近な人たちと「子育て相談教室」での子どもの様子を話題にしており、本事業は母親を取り巻く周囲の人々へ向けて間接的にも機能し得ることが示唆された。また利用者は、非利用者に比べて、「居住歴が浅い」、「第一子が年少児」、「身近なサポートが少ない」、「子どもを扱いにくい」と感じている母親が多いことから、よりリスクの高い集団に利用されていると推察され、概ね良好な成果を上げていることが示唆された。反面、非利用者は、利用者に比べて有職者や会場から離れた地区の母親が多く、生態学的な「accessibility」向上への配慮の余地が残された。総じて、利用者と支援プログラムを適合させる配慮としては、個人の内的水準から地域生態学的水準に至る多角的な視点からの配慮が必要であると考察される。1)焦点地域(宮城県黒川郡大和町・人口約2万4千人)において、(1)1歳半2歳半と(2)4歳を第一子にもつ全ての母親を対象に、町内に存在する育児に関する潜在資源(周知状況)と活用資源(活用状況)の全数調査を行なった。その結果、低年齢群は高年齢群に比べて、周知・活用のいずれについても少なく、また、町の中心部から離れた資源についての周知・活用度が低かった。就園前の低年齢児をもつ母親は、地域内での育児行動空間が狭く、資源への接近が少ないことが示された(東北心理学会第55回大会、日本発達心理学会第13回大会)。2)同町に住む母親を対象に、第子が0歳から4歳になるまでの5年間にわたって行なわれてきた、養育意識・行動の縦断的全数調査データを分析、考察した。その結果2、3歳へ向けて、肯定的育児感は有意に減少し、否定的育児行動は有意に増加していた(小児保健研究)。1)と2)により、1歳半健診と3歳半健診の狭間を補う積極的な、地域型育児支援の必要性が示された。これらの結果は、同町の母子保健計画策定会議での報告、平成14年度大和町母子保健計画への資料掲載により、地域保健事業にフィードバックされた。

3)このような育児初期の危機的時期に対応しうる育児支援プログラムとして、子ども年齢にかかわらず利用できる、同町の「子育て相談教室」を焦点化し、その概要と課題についての実践報告を行なった(小児保健学会第48回大会)4)「子育て相談教室」の過去3カ年の利用実態についての過去記録から、全利用者データの分類整理を行なった。(このデータ分析を通した利用趨勢の考察は次年度の課題とし、支援事業効果研究に向けた基礎的資料とする予定)。5)研究代表者は、この「子育て相談教室」をはじめとする当該地域の育児支援事業に、発達相談・育児相談員として参与することにより、地域住民との関わりと研究成果のフィードバックを続けている。本研究の対象地域、宮城県黒川郡大和町(人口2万4千人)において、1)前年度行なわれた育児資源調査結果をまとめた(家庭教育研究所紀要)。乳幼児をもつ母親にとっては資源認知も活用も十分ではないという結果を受け、同町は資源周知活用向上を目的とした育児マップを作成し、育児中の親に無料で配布中である。2)同町の「子育て相談教室」を焦点化し、平成11年4月13年3月の3年間の全利用者データを分類整理した。参加児には性差がなく月齢的にも乳幼児全般に及び、内容的にも多様な相談ニーズの高さが窺われ、既存の健診事業を補う相談の重要性が示された(小児保健学会第49回大会)。3)同教室の利用者全員を対象に、利用しやすさ、利用行動、相談後の社会的行動等に関する質問紙調査を行なった。その結果、「利用しやすさ」は各領域で概ね高得点であったが、「開催日」「開催時間」「参加者の雰囲気」が他と比べて低い傾向にあった。自由記述と併せて検討すると、土曜開催の要望、幼稚園の見送りや家事の時間との都合、既に仲の良いグループがあると入りにくいなどの声が反映されたと思われる。利用行動項目からは「知識・情報としての利用」「居場所としての利用」の2因子が抽出され、「知識・情報としての利用」の高低にかかわらず、「居場所としての利用」の高低が利用満足感に反映される傾向が認められた。本結果を受け、フロアに保健推進員が入る、保育士による遊び紹介の時間を設けるなど、場の緊張を和らげて「利用しやすさ」を高めるためのマイルドな介入を試行し始めている。また利用行動の高さは利用満足感を高めるだけでなく、利用後の身近な人たちへの社会的行動にも関わっていることが示された(日本発達心理学会第14大会)。4)同相談教室を利用していない母親への質問紙調査を乳幼児健診(3,4ヶ月、1歳半、3歳半)時に行い、本年度10ヶ月間で利用者調査と同等数を回収した(分析検討は次年度)。本研究の対象地域、宮城県黒川郡大和町(人口2万4千人)において行われている「子育て相談教室」を利用していない母親(以下、「非利用者」)に対する質問紙調査を行い、先に実施した利用者調査と同等数分を回収し、利用者調査とともに分析検討を行った。その結果、利用者の利用行動は「知識・情報としての利用」と「居場所としての利用」の2因子からなり、いずれの因子も利用満足感の高さに寄与していた。さらに利用者は、相談後に身近な人たちと「子育て相談教室」での子どもの様子を話題にしており、本事業の直接的援助効果とともに、母親を通じた周囲の人々への働きかけという間接的援助効果が示唆された。また「子育て相談教室」の利用者は、非利用者に比べて、「居住歴が浅い」、「第一子が年少児」、「身近なサポートが少ない」、「子どもを扱いにくい」と感じている母親が多いことから、よりリスクの高い集団に利用されている可能性が推察され、概ね良好な成果を上げていることが示唆された。しかし反面、非利用者は、利用への希望が認められるにもかかわらず、利用者に比べて有職者や会場から離れた地区の母親が多く、生態学的な「accessibility」向上への配慮の余地が残された。
解糖系亢進に関わる肺癌特異的スプライシング異常の臨床的意義と 診断・治療への展開

解糖系の亢進は、がんの主要な特性の一つである。本課題では、肺がんにおいて、この解糖系亢進に関わる"解糖系酵素ピルビン酸キナーゼM(PKM)の酵素型変換(PKMスイッチ)"と、その分子機構(スプライシング異常)に関する研究を行った。非小細胞肺癌のスプライシング異常と、FDG-PETシグナル強度の間に、一定の相関があることを見出した。また、PKMの酵素型変換を不可能としたマウスを、ES細胞を用いた遺伝子改変技術により、開発した。腫瘍細胞における異常な糖代謝(ワールブルグ効果)と関連する、肺がん特異的な解糖系酵素(PKM)遺伝子スプライシング異常の詳細を明らかにし、これを新たな診断指標として開発することを目的として研究を行った。1)独自に開発したスプライシングアイソフォーム特異的モノクローナル抗体を用い、免疫組織染色条件の最適化を行った。肺がん組織アレイを用いた解析から、このスプライシング異常が、肺がんの中でも、非小細胞がん特異的であることが示唆された。Noguchi A/Bに分類される症例の解析から、ごく初期の肺がんにおいても、この異常がおきていることが強く示唆された。血中腫瘍マーカーへの応用を視野に、ELISA系開発も行い、市販品との比較において、明らかな有利性を確認した。2)レポーター遺伝子由来の蛍光タンパク発現を指標としてスプライシングパターンをモニターできる独自のシステム(スプライシングパターン可視化系)を作製し、培養細胞を用いた一過性発現系において、その有用性を確認した。次いで、このシステムを染色体に安定的に組み込んだ培養細胞を作製し、現在その動作確認を行っている。また、肺がん組織レベルでの解析へと応用するため、可視化系トランスジェニックマウス作製に向けた予備的検討を行った。これら成果から、PKMスプライシング異常の診断標的としての有用性・作製したモノクローナル抗体の有用性が示された。スプライシング可視化系は、この異常解消を狙った分子標的同定や、異常の更なる意義解明のために、非常に有用なツールと考えられる。また、肺がんでの活性化が知られるErk経路の制御について、DUSP分子による制御機構を見出した。腫瘍細胞における異常な糖代謝(ワールブルグ効果)と関連する、肺がん特異的な解糖系酵素遺伝子スプライシング異常の意義と分子機構を明らかにすることを目的として、臨床検体の解析や、独自のシステム開発に取り組んだ。1)臨床サンプルを用いた解析を進め、スプライシング解析をほぼ完了した。現在スプライシング解析の結果と、臨床情報との照合解析を進めている。また、異常との関係が示唆されているスプライシング因子の発現異常についてもお解析を行っている。2)レポーター遺伝子由来の蛍光タンパク発現を指標としてスプライシングパターンをモニターできる独自のシステム(スプライシングパターン可現化系)の開発に取り組んだ。この系を染色体に組み込んだスプライシング可視化マウス作製に向けて多くの予備的検討を行い、BACトランスジェニック法の採用を決定した。トランスジェニックコンストラクトがほぼ完成した。3)ジーンターゲティングによるノックイン技術を用い、肺がんにおけるワールブルグ効果解消のin vivoモデル(ノックインマウス)構築に取り組んだ。相同組み換えES細胞を単離し、キメラマウスを作製し、ヘテロノックインマウス作出までを完了した。これら取組みにより、スプライシング異常・ワールブルグ効果を標的とした新規肺がん治療開発に向け、次年度以降の研究展開に重要な独自システムの開発が大きく前進した。ジーンターゲティングによるノックイン技術を用い、肺がんにおけるワールブルグ効果解消のin vivoモデル(ノックインマウス)構築に取り組んだ。本年度は、特に後者の課題について進捗がみられた。臨床サンプルの解析では、スプライシング異常への関与が疑われるスプライシング制御因子の、がんにおける発現上昇を見出した。解糖系酵素ピルビン酸キナーゼM(PKM)について、二つのスプライシングアイソフォーム(PKM1・PKM2)の切り替えを不可能としたマウスを作製・樹立した。前年度において樹立した、ヘテロPKM1ノックインマウス同士の交配から、ホモPKM1ノックインマウスを作製し、その性状を解析した。遺伝子改変(ノックイン)が期待通りに機能していることが確認できた。また、ホモPKM1ノックインマウスがほぼ正常に出生・生育することが判明し、肺がんモデルマウスとの交配による、肺発がん実験が可能であると判明した。交配予定の肺がんモデルマウスと、PKM1ノックインマウスとの遺伝的背景を合わせるため、マイクロサテライトマーカー解析を併用する“スピードコンジェニック法"による戻し交配をすすめた。

4世代の交配により、コンジェニック化が相当にすすんだ個体を得ることができた。東日本大震災において、研究分担者が所属する宮城県立がんセンター(研究所)が被災するなどして、遺伝子改変マウスの作製に遅れが生じたため。24年度が最終年度であるため、記入しない。動物モデル開発の遅れ等から、課題採択時に掲げた目標を予定研究期間内に完全に達成するのは難しい状況であるが、計画自体は着実に進展しており、引き続き、当初計画に準じて研究を推進する。
酵素欠損ラットを用いたジペプチジルペプチダーゼIV(DPP IV)の生理機能の解析

T細胞の活性化に重要な役割をもつと考えられている膜結合性分子CD26/dipeptidyl peptidaseIV(DPP IV)の真の役割を調べるために新しいモノクローナル抗体(MS-7)を作製した。今回の実験では、MS-7と、DPP IVが欠損しているラットを用いてCD26/DPP IVの機能等を調べた。MS-7はDPP IVの60kDaフラグメントを認識する抗体であることが明らかになった。60kDaフラグメントは、N末端から281番目の残基からはじまり,DPP IVの活性部位シークエンスGly-X-Ser^<631>-X-Glyを含むフラグメントである。しかし、MS-7はDPP IVの酵素活性を阻害しなかった。次に蛍光活性化セル・ソーターを用いた実験により、MS-7はマイトジェン刺激前・後ともにDPP IV陽性ラットの胸腺・脾臓・末梢血のT細胞上のCD26を認識していることが明らかとなった。CD26の発現量及びDPP IVの酵素活性は、マイトジェンによる活性化にしたがってT細胞上で増加した。しかし、DPP IV陰性ラットでは、すべての細胞において、マイトジェンで刺激してもしなくてもCD26は発現せず、また、DPP IV酵素活性は新たに現れることはなかった。さらに、MS-7はDPP IV陽性ラットT細胞のマイトジェン刺激による増殖を阻害したが、DPP IV陰性ラットで阻害しなかった。これらの結果は、CD26/DPP IVはDPP IV陽性ラットでは確かにT細胞の活性化を調節しているものの、DPP IV陰性ラットにおいては必ずしも必須な分子ではなく、DPP IV陰性ラットにはDPP IVに代わる別な情報伝達経路が活性化されることを示唆するものである。上記の研究結果についての論文は現在投稿審査中である。
Lewis酸-還元剤系を用いる新規Reformatsky反応の開発

これまでにLewis酸と還元剤であるホスフィン類を併せ持ちいると,ホスフィン単独では困難であったα-ブロモアミドの還元反応が温和な条件下,円滑に進行することを見いだしている。この反応では,中間体として金属エノラートを経由するため,アルデヒドを作用させると,Reformatsky型の反応が進行し,対応するβ-ヒドロキシアミドが立体選択的に得られることをすでに報告している。本研究では,この反応の一般性や適応範囲を見極めるとともに,より合成的に有用な反応へと展開してゆくことを目的とする。まずはじめに,α-ブロモアミドにかわり,α-ブロモケトンやチオエステルを用いるReformatsky反応を検討したところ,四塩化チタン-トリ-o-トリルホスフィンの組み合わせで,各種アルデヒドとの反応が円滑に進行し,高収率高選択的に目的とするReformatsky生成物を与えることを見いだした。ついで,アルデヒド以外の求電子剤に対して本反応を適用することを目的に,チオエステル,アセタール,イミンなどの求電子剤との反応を検討した。その結果,チオエステルとの反応ではこれまでにない還元的Claisen縮合とも呼ぶべき斬新な反応を見いだし,また,イミンとの反応では高立体選択的Mannich型の反応を見いだした。さらに,Lewis酸-ホスフィン複合系試薬の他の反応への応用を検討し,α-ジケトンの半還元や,スルホキシドの脱酸素化にも成功し,特に,後者の反応を利用して,ラセミ体のホスフィンの速度論的光学分割を試み,ある程度の分割に成功した。以上,本複合系試薬を用いるReformatsky反応の開発から始まり,統一的手法による各種新規炭素-炭素結合生成反応の開発や,各種還元的官能基変換反応の開発に成功した。本研究で開発した反応は,有機合成化学の分野においてその有用性は高いものである。まず,α-ブロモアミドにかわり,α-ブロモケトンを用いるReformatsky型反応の検討を行った。その結果,室温では逆反応が進行し,高収率で目的の生成物を得ることができなかったが,-78°Cでは,反応が円滑に進行することを見いだした。用いるLewis酸,ホスフィン等反応剤や反応条件の検討の結果,塩化メチレン中,四塩化チタン/トリo-トリルホスフィンの組み合わせを用いて反応を行うと,高収率,高立体選択性で目的とする付加物が得られることを見いだした。さらに,α-ブロモエステル類を用いて同様の反応を試みたところ,アリールチオエステルを用いると,高収率で反応が進行することが分かった。チオエステルの種類を検討の結果,新たに開発した嵩高いチオエステルである。2, 4, 6-トリイソプロピルベンゼンチオール由来のチオエステルを用いれば,極めて高い立体選択性を実現できることが分かった。α-ブロモケトンの場合と同様の反応剤を用いて,0°Cで反応を行えば,芳香族アルデヒドや各種の脂肪族アルデヒドとの反応が高収率,高立体選択的に進行することを明らかにした。

この反応では,中間体として金属エノラートを経由するため,アルデヒドを作用させると,Reformatsky型の反応が進行し,対応するβ-ヒドロキシアミドが立体選択的に得られることをすでに報告している。本研究では,この反応の一般性や適応範囲を見極めるとともに,より合成的に有用な反応へと展開してゆくことを目的とする。昨年度は,α-ブロモアミドにかわり,α-ブロモケトンやα-ブロモチオエステルを用いても,同様のReformatsky型の反応が進行することを明らかにした。本年度は,求電子種の適用範囲を探るために,アルデヒドに代わる種々の求電子剤との反応を試みた。まず,チオエステルそのものを求電子剤とすることで,チオエステル同士の2量化すなわち,Claisen縮合型の反応が進行することを明らかにした。本反応はLewis酸存在下で還元的に進行する新しいタイプのClaisen縮合であり,合成的な有用性は高い。さらに,アルデヒドに代わり,アセタールあるいはイミンを用いた場合でも反応が進行することを見いだした。いずれもこれまでのReformatsky型反応では用いられなかった新しい求電子種であり,本反応特有の反応条件を生かした反応であると言える。これらの求電子種との反応については,未だ収率や選択性,あるいは汎用性の上で解決すべき問題が残されているため,引き続き検討中である。これまでにLewis酸と還元剤であるホスフィン類を併せ持ちいると,ホスフィン単独では困難であったα-ブロモアミドの還元反応が温和な条件下,円滑に進行することを見いだしている。本年度は昨年度に引き続き,イミンとのMannich型の反応について詳細に検討を行った。その結果,アセトニトリル中,Lewis酸として四塩化チタンを用い,トリフェニルホスフィン存在下,(α-ブロモチオエステルに対してイミンを作用させることで,極めて高い立体選択性で,対応するβ-アミノチオエステルが得られることを見いだした。本反応は,β-ラクタム抗生物質の合成などに応用できる合成化学上有用な反応と考えられる。また,Lewis酸とホスフィン類との複合系試薬のさらなる応用を目指して種々の反応の検討を行った結果,この反応剤がα-ジケトンの還元にも有効に作用し,α-ヒドロキシケトンが得られることを見いだした。すなわち,アセトニトリル中1当量の水の存在下,α-ジケトンに対してトリフェニルホスフィンと臭化アルミニウムの複合系試薬を作用させることで,対応するα-ヒドロキシケトンが高収率で生成することを見いだした。これまでに同様の反応は低原子価の金属化合物が利用されてきたが,ホスフィンによる還元ははじめての例であり興味深い。
硬膜動静脈瘻モデルにおける血管新生関連因子発現と遺伝子治療

本研究の目的は、脳静脈血行障害の発展過程の解明と治療法の開発である。今回は、脳静脈圧亢進状態での微小循環と血管新生に関する基礎的研究、特に硬膜動静脈瘻(DAVF)の病因・病態の解明と遺伝子治療の可能性について検討した。雄SDラットを用い、Spetzlerらの方法に準じてDAVFモデルを作成し、1週間後に、10%ホルマリンにて還流固定を行い血管新生因子(VEGF)の発現を調べ、(また、他のグループで)モデル作成90日後に血管撮影を行った(実験1)。さらに、モデル作製の1週間後に硬膜を含めて脳を摘出しVEGFの発現を免疫染色により観察し、Western blotはmodel作製後1,2,3週間に脳を摘出して発現を比較した(実験2)。その結果、免疫化学組織染色では、硬膜の静脈洞近傍の硬膜血管の内皮細胞と間質に33%でVEGFの発現がみられ、脳の皮質および基底核の神経細胞に、73%にVEGFの発現がみられた。Sham群の硬膜と脳にはVEGFの発現は見られなかった。脳梗塞巣は認められなかった。血管撮影群で15匹中6匹(40%)で内頸動脈の髄膜枝からの動静脈シャントが確認された(実験1:結果)。免疫染色群では、硬膜の静脈洞近傍の血管内皮と結合組織に15匹中5匹(33%)で、脳の皮質、基底核の神経細胞に15匹中11匹(73%)にVEGFの発現がみられた。Westernplotでは1週間後に最もVEGFの発現がみられ、2週間後、3週間後と発現が減少した(実験2:結果)。本研究ではラットDAVFモデルを用いて、DAVF発現過程での脳および硬膜でVEGFの発現を確認した。以上の結果より、DAVFの発生には脳静脈灌流障害によって発現するVEGFが関与していると考えられ、遺伝子治療によりこれら血管新生因子を制御しDAVFの発現が予防される可能性が示唆された。今回は,ラット慢性脳静脈亢進モデルを作成し,慢性脳静脈亢進状態での微小循環動態・血管の形態に関する経時的変化・血管新生因子の発現について検討した.Wister ratを用いて,右総頚動脈-外頚静脈を手術用顕微鏡下に吻合した上で,続いて自発呼吸下に開頭を行い上矢状静脈洞を結紮し,頭蓋外への流出静脈を閉塞することによりラット慢性静脈圧亢進モデルを作成した.ラットは,吻合後60日以上の長期生存が得られた.ラットに蛍光血管撮影もしくは造影剤による血管撮影を施行し,血管の形態を観察したところ,吻合後早期では吻合および静脈洞結紮以外の変化は認められなかったが,吻合後60日以降の後期においては硬膜における動静脈に短絡の所見が認められた.すなわち,脳静脈亢進状態が慢性的に持続することにより,硬膜動静脈瘻が形成されたと考えられた.更に,硬膜動静脈瘻が形成されたラットにおける,血管新生因子の発現について検討した.硬膜動静脈瘻が形成された部分の硬膜血管内皮における血管新生因子の発現を,ラットVEGF抗体を用いた免疫染色を施行することにより確認した.また硬膜血管組織をホモジナイズして蛋白を抽出し,VEGF蛋白の発現をウエスタンブロット法で検出した.硬膜動静脈瘻が形成された部分より血液を採取し,血清中のVEGF蛋白の発現を同様に検出した.

今後,慢性脳静脈亢進モデルにおいて形成された硬膜動静脈瘻における血管新生因子のmRNAレベルでの発現を確認するため,RT-PCR法による解析を施行中である,また,血管新生因子をターゲットとした治療実験を行うため,ラットVEGFを発現するベクター(naked DNA,リポソーム,アデノウイルス)を現在構築中であり,硬膜動静脈瘻モデルに対する投与実験を予定している.今回,硬膜動静脈瘻モデルの成因および病態を検討するため,ラット慢性脳静脈亢進モデルを作成し,慢性脳静脈亢進状態から硬膜動静脈瘻が発生する際の,微小循環動態・血管の形態に関する経時的変化・血管新生因子,特にVEGFの発現について検討した.Wister ratを用いて,右総頚動脈-外頚静脈を手術用顕微鏡下に吻合した上で,続いて自発呼吸下に開頭を行い上矢状静脈洞を結紮し,頭蓋外への流出静脈を閉塞することによりラット慢性静脈圧亢進モデルを作成した.ラットは,吻合後60日以上の長期生存が得られた.ラットを血管撮影群と免疫染色群の2群にわけた.ラットに蛍光血管撮影もしくは造影剤による血管撮影を施行し,血管の形態を観察したところ,吻合後早期では吻合および静脈洞結紮以外の変化は認められなかったが,吻合後60日以降の後期においては硬膜における動静脈に短絡の所見が認められた.すなわち,脳静脈亢進状態が慢性的に持続することにより,硬膜動静瘻が形成されたと考えられた硬膜動静脈瘻が形成されたラットにおける,血管新生因子の発現について検討した.硬膜動静脈瘻が形成された部分の硬膜血管内皮における血管新生因子の発現を,抗VEGFモノクローナル抗体を用いた免疫染色を施行することにより確認した.また硬膜血管組織より蛋白を抽出し,VEGF蛋白の発現をウエスタンブロット法で検出した.硬膜動静脈瘻が形成された部分より血液を採取し,血清中のVEGF蛋白の発現を同様に検出した.今後,血管新生因子をターゲットとした治療実験を計画中である,血管新生因子もしくは抑制因子を発現する遺伝子を用い血管疾患を治療する場合,血管特異性のあるベクターを用い効率よく遺伝子を発現する必要があるため,現在血管内皮に特異性のあるプロモーターを用いた各種ベクターの構築,硬膜動静脈瘻に対する投与方法の検討などを行っており実験中である.昨年に引き続き、硬膜動静脈瘻の動物モデルにおける血管新生因子の関与について検討した。ラット慢性脳静脈亢進モデルを作成し慢性脳静脈亢進状態から硬膜動静脈瘻が発生する際の微小循環動態・血管の形態に関する経時的変化を検討するとともに血管新生因子の発現について調べ、硬膜動静脈瘻の成因病態について検討した。Wister ratを用いて、硬膜硬膜動静脈瘻モデルを作成した。Sham群には、静脈洞,横静脈洞からの流出静脈右総頚動脈-外頚静脈の露出のみを行った。外科的処置の後通常の飼育を行い免疫染色群と血管撮影群の2群にわけた免疫染色群に対し、10%ホルマリンにて還流固定を行い、硬膜を含めて脳を摘出し、閉塞した静脈洞より後方で切片を作成した。一次抗体として抗ラットVEGF抗体を使用し、DABで可視化した。硬膜血管組織をホモジナイズして蛋白を抽出し、VEGF蛋白の発現をウエスタンブロット法で検出した。また、血管撮影群に対し、蛍光血管撮影もしくは造影剤による血管撮影を施行した。その結果、ラットは吻合後60日以上の長期生存が得られた。血管撮影群において血管の形態を観察したところ、吻合後早期では吻合および静脈洞結紮以外の変化は認められなかったが、吻合後60日以降の後期においては硬膜における動静脈に短絡の所見が認められた。すなわち、静脈圧亢進状態が慢性的に持続することにより、硬膜動静脈瘻が形成されたと考えられた。
細胞分裂過程とリンクした標的分子の網羅的マッピング法の開発

電顕観察の中で空間分解能が理論的には試料の厚さに影響を与えないFIB-SEMを用いて最小限度の細胞小器官を有するシゾンを生命の基本である細胞分裂過程のモデル生物として選び、電子顕微鏡観察で苦手であった標的分子の同定を網羅的にマッピングしながら細胞丸ごとレベルで超微細構造解析を行った。具体的には電顕観察では多少苦手とされる標的分子の複数同時の標的分子同定やダイナミックスを確認するための相同性組換え体発現系を確立、連続2D画像と3次元再構築法から新たに150個以上の3D構造モデルを作成、細胞分裂の時系列にあわせたより正確な超微細構造モデルを得ることを可能とし、英文書籍にてその結果を報告した。電子顕微鏡観察は標的分子並びに細胞小器官だけでは無く、それを取り囲む環境を含めた超微細構造として可視化出来る利点がある。クライオ電子顕微鏡観察は化学固定すること無く、無染色で真の構造が観察出来る期待が持たれるが、TEM観察故、その分解能は試料の厚さに制限がある。そこで、空間分解能が理論的には試料の厚さに影響を与えないFIB-SEMを用いて最小限度の細胞小器官を有するシゾンを生命の基本である細胞分裂過程のモデル生物として選び、電子顕微鏡観察で苦手であった標的分子の同定を網羅的複数同時にマッピングしながら細胞丸ごとレベルで超微細構造解析を行う。平成26年度は先ず、シゾンの細胞分裂の母集団を保てるように光の明暗並びに二酸化炭素の培養液への添加の有無を調整する事で同調培養系の確立に挑戦し、8割以上の細胞の同調化に成功した。次に電子顕微鏡観察としては固定方法や染色方法など試料作製を工夫しながら、FIB-SEMに加え、超高圧TEMトモグラフィーを用い,それぞれの特性を活かしながら超微細構造解析する開発を行った。超高圧TEMトモグラフィーにより、TEM観察の分解能を十二分に活用したく、あえて0.5ミクロン程度の切片の観察を行った。FIB-SEMではその観察が多少難しい色素体内部のチラコイド膜上のフィコビリソーム複合体やミトコンドリア内部構造をはっきりと観察出来るようになった。FIB-SEMによりシゾン丸ごとをオルガネラの形状を、オルガネラ内部の超微細構造は超高圧TEMトモグラフィーで補填をしたいと考えている。しかし、蛍光顕微鏡のGFPに相当すると期待される新たな組換え体改良タグ(miniSOG誘導体やAPEX誘導体)の開発はシゾン内のペルオキシダーゼ活性が余りにも高く、一般的な動物細胞では可能である事が確認されたものの残念ながら現時点ではシゾンでは分子同定には使い難いと考えている。平成27年度は電子顕微鏡観察では多少苦手とされる、シゾンの細胞分裂に伴う、オルガネラに存在する標的分子の同定やダイナミックスを有効に確認するために当初、蛍光顕微鏡のGFPに相当すると期待される新たな組換え体改良タグ(miniSOG誘導体やAPEX誘導体)を用いた系の開発を行ってきたが、内在性ペルオキシダーゼ活性が余りにも高く、一般的な動物細胞では可能である事が確認されたものの残念ながらシゾンでは難しい。そこで、コピー数を調節し得る新たなstable組換え体発現系開発へと舵をきった。各オルガネラを特異的にイメージングするためにUMP合成酵素遺伝子をマーカーとする発現系が確立出来たことは有意義な結果である。今まで生きた状態で同一細胞の細胞分裂過程のダイナミックスを追うことは困難であり、報告は無い。この度、私達は特殊な基板上での1細胞毎のシゾン細胞のタイムラプス観察にも成功した。電子顕微鏡のための試料作製も概ね確立したこともあり、FIB-SEMと3次元再構築法から新たに3D構造モデルも80個以上となった。光学顕微鏡からの結果と比較しながら細胞分裂の時系列にあわせたより正確な超微細構造モデルを得ることも可能となってきた。電顕試料として母集団を保てる同調培養系の確立は予想以上に順調で、細胞分裂周期各ステージに相当する母集団を確実に得られる。電子顕微鏡観察に先立ち、生シゾン細胞のオルガネラや標的分子のダイナミックスが見れたと言う報告は無いが、適切な基盤の上での培養、観察出来る系も立ち上がり、電子顕微鏡観察で苦手とされた、同定、ダイナミックスを補填出来る重要な成果である。オルガネラの位置を確認するために市販のオルガネラ特異的識別蛍光試薬をいくつも試したが、使えるものがほとんど無かった。しかし、相同性組み換えによるゲノムターゲット発現系も立ち上がり、組換え体蛍光蛋白質タグを用いることでそれを解決し、オルガネラレベルに留まらず、標的分子の局在化までの情報を得ることが可能となった。汎用性のある動物細胞での発現系と比べ、標的分子のイメージングまでに1月程度と少し時間がかるが、培養液のPHに起因すると思われる薬剤耐性剤による選択が使えないこと等を考え合わせると研究遂行にあまり支障は無いと程度と考える。

顕微鏡観察は申請時からのFIB-SEMに加え、超高圧TEMトモグラフィー技術を用いると局所的ではあるがより詳細な構造情報が補填出来る事が解り、これも嬉しい成果である。一方、FIB-SEMと同様な連続二次元像が得られると期待されるSBF-SEMでは観察範囲は広げられるもののダイアモンドナイフによる切削間隔を30nm以下にすることは困難で有り、シゾンの様な小さな生物やオルガネラ内のベシクルなどの構造情報が飛ぶ危険性があり、得たい情報の視野範囲等も加味して、先端顕微鏡を選択すべきであろう。光学顕微鏡や電子顕微鏡観察に相応し、条件が立ち上がりつつある今、3Dモデル作製にはセグメンテーションのステップが律速段階となることも解り、現在、人力で行っている解析法を見直し、自動化へと進めていけることが今後の課題の一つと考える。電子顕微鏡観察は標的分子並びに細胞小器官だけでは無く、それを取り囲む環境を含めた超微細構造として可視化出来る利点がある。クライオ電子顕微鏡観察は化学固定すること無く、無染色で真の構造が観察出来る期待が持たれるが、TEM観察故、その分解能は試料の厚さに制限がある。そこで、空間分解能が理論的には試料の厚さに影響を与えないFIB-SEMを用いて最小限度の細胞小器官を有するシゾンを生命の基本である細胞分裂過程のモデル生物として選び、電子顕微鏡観察で苦手であった標的分子の同定を網羅的複数同時にマッピングしながら細胞丸ごとレベルで超微細構造解析を行う。平成28年度は電子顕微鏡観察では多少苦手とされる、シゾンの細胞分裂に伴う、オルガネラに存在する標的分子の同定やダイナミックスを有効に確認するためにコピー数を調節し得る新たな相同性組換え体発現系開発を行い、無事成功した。各オルガネラを特異的にイメージングするためにUMP合成酵素遺伝子をマーカーとする発現系が確立出来たことは有意義な結果である。また、シゾンは実験室に於いては振盪培養で生育するため、今まで生きた状態で同一細胞の細胞分裂過程のダイナミックスを追うことは困難であり、報告は無い。この度、私達は特殊な基板上での1細胞毎のシゾン細胞のタイムラプス観察にも成功し、電子顕微鏡のモデルを補填出来る情報が得られる可能性も広がった。電子顕微鏡のための試料作製も概ね確立し、FIB-SEMと3次元再構築法から新たに3D構造モデルも100個以上となった。光学顕微鏡からの結果並びに色素体内のチラコイド膜の推移と比較しながら細胞分裂の時系列にあわせたより正確な超微細構造モデルを得ることを可能となりつつあり、その結果を書籍にまとめる準備をしているところである。電顕試料として母集団を保てる同調培養系の確立は当初の計画見積もり以上に順調で、細胞分裂周期各ステージに相当する母集団を確実に得られてきた。電子顕微鏡観察に先立ち、シゾン細胞のオルガネラや標的分子のダイナミックスを見る光学顕微鏡観察での報告は無く、適切な基盤の上での培養、観察出来る系も立ち上がり、電子顕微鏡観察で苦手とされた、同定、ダイナミックスを補填出来る重要な成果である。また、相同性組み換えによるゲノムターゲット発現系も立ち上がり、組換え体蛍光蛋白質タグを用いることで標的分子の同定を解決し、オルガネラレベルに留まらず、標的分子の局在化までの情報を得ることが可能となった。
歯と歯周硬組織形成細胞の細胞内カルシウム局在性に関する研究

エナメル質石灰化機構の解明に向け、ラット切歯及び臼歯歯胚のエナメル器内のカルシウムの分布をグリオキサルビス(GBHA)による組織化学的カルシウム染色法で検索し、同時に歯随と歯周組織のカルシウムの分布も比較検討した。不安定な細胞内カルシウムを瞬時に不動化する目的で、試料は全て急速冷凍・凍結置換し、エポン樹脂包理した。この試料作製法により、細胞内カルシウムの集積部位をCa-GBHAの明瞭な赤色反応として光顕組織化学的に判別することが可能となった。その結果、切歯、臼歯を問わず、エナメル器ではエナメル芽細胞の細胞質内(ミトコンドリアと一部の管状胞状構造)に一貫して高濃度のカルシウムが局在し、その他のエナメル器細胞には特にカルシウムの集積がないことが明らかとなった。圧着凍結試料の電顕観察により、エナメル質形成端付近の細胞内小管状胞状構造内に、カルシウムを含有する小電子密顆粒と微細結晶構造の存在が確認され、形成期エナメル芽細胞の細胞内カルシウム輸送路と、これら小器官との関係が示唆された。一方歯随では、象牙芽細胞の細胞質にエナメル芽細胞同様の強いカルシウム反応が見られた。他の歯随細胞に反応は認められず、分化期以前の内エナメル上皮、及びそれに対応する歯乳頭細胞にもカルシウムの反応は見られなかった。歯根形成期の臼歯歯胚では、断裂した上皮鞘細胞間に侵入した結合組織細胞、及びセメント芽細胞が明瞭なカルシウム反応を呈し、歯槽骨の骨芽細胞と破骨細胞も同様な反応を示した。以上本研究では不安定な細胞内カルシウムの組織化学的検出法が確立され、その手法によって歯胚と歯周硬組織の形成細胞と吸収細胞が、細胞質に比較的高濃度のカルシウムを含有することが明らかにされた。これら細胞内カルシウムの局在性は、基質の石灰化機構との密接な相関を伺わせるが、その生理的意義の解明が今後推進すべき重要な研究課題として残されている。エナメル質の石灰化機構の解明に向けて、エナメル器におけるカルシウムの局在を光顕組織化学的に検討した。一般に細胞内カルシウムは不安定な状態で存在するため、試料作成操作中に人工的な移動や喪失がおこり易い。従ってその正確な局在を把握することは困難を極めるが、本年我々は急速凍結置換した試料をエポキシ樹脂に包理し、その切片上でカルシウムイオンの組織化学的染色を行なって興味ある知見を得た。材料にはラット切歯を用い、可溶性物質の移動や流失を最小限に留めることを目的として液体窒素で冷却した液化プロパンで急速凍結し、-80°Cで4日間アセトンと置換、更に室温に戻してからエポキシ樹脂に包理した。エナメル質形成期のエナメル器に関しては切歯を丸ごと凍結した試料を用い、成熟期のエナメル器に関しては、冷却効率を上げる目的でエナメル質が付着した状態でエナメル器を小片に切りだして凍結した。包理完了後23ミクロン厚切片を作成し、グリオキサルビス(GBHA)染色に供した。その結果、Ca-CBHAの強い赤色反応が形成期、成熟期を通じてエナメル芽細胞のミトコンドリアと細胞質に散在する一部の小管状胞状構造に一致して観察され、エナメル芽細胞が一貫して細胞内に高濃度のカルシウムを含有する可能性が示された。成熟期では刷子縁の有無にかかわらず、エナメル芽細胞の細胞内にいずれも強い反応が見られたが、しばしば刷子縁上にも顆粒状のGEHAを認めた。エナメル芽細胞以外にも成熟期の乳頭層細胞の一部に弱い反応を認めたが、中間層細胞その他にカルシウムの反応を見ることはなかった。

以上の結果は、エナメル器の細胞の中では、エナメル芽細胞に特に多量のカルシウムを貯留する機構が備わっている可能性を示唆するものと思われるが、その生理的な意義に関しては次年度の研究課題として引き継ぐこととする。我々はこれまでの研究で、ラット切歯エナメル器の細胞内カルシウムの組織化学的染色を試み、エナメル器ては形成期、成熟期を通じてエナメル芽細胞のみが細胞質に高濃度のカルシウムを含有することを明らかにしてきた。本年度は組織化学的カルシウム染色法で、ラットの切歯及び臼歯歯胚の細胞内カルシウムの分布を更に詳しく検索するとともに、隣接切片上で、細胞内カルシウム局在野の電顕観察とX腺微小部分析も試みた。その結果、ラット臼歯歯胚では、切歯と同様、エナメル器のカルシウム反応はエナメル芽細胞のミトコンドリアと一部の管状胞状構造に限局しており、中間層その他の細胞に特別なカルシウムの集積がないことが判った。エナメル芽細胞の電顕観察により、エナメル質形成端付近の細胞内小管状胞状構造内に、カルシウムを含有する小電子密顆粒と微細結晶状構造の存在が確認され、細胞内カルシウム輸送路とのこれら小器官との関係が示唆された。一方、歯髄では切歯、臼歯を問わず、象牙芽細胞の細胞質にエナメル芽細胞同様の強いカルシウム反応が見られた。しかし他の歯髄細胞に反応は認められず、分化期以前の内エナメル上皮、及びそれに対応する歯乳頭細胞にもカルシウムの反応は見られなかった。歯根形成期の歯胚では、断裂した上皮鞘細胞間に侵入した結合組織細胞、及びセメント芽細胞に明瞭なカルシウム反応が認められ、歯槽骨の骨芽細胞と破骨細胞にも強いカルシウム反応を認めた。以上のごとく本研究では、歯胚と歯周硬組織の形成細胞と吸収細胞が、細胞質に比較的高濃度のカルシウムを含有することが明らかとなり、その局在性と基質の石灰化に深い相関が示唆された。これらの細胞内カルシウムの生理的意義の解明が今後推進すべき重要な研究課題である。
結婚・子供・家計内の時間配分と賃金の関係に関する研究

研究の背景:本研究は、長時間労働が家庭生活や健康に影響を与えているのではないか、という問題意識から出発している。現在は、この研究の第1段階として、長時間労働、特にサービス残業が行なわれる理由を検証している。研究の目的:合理的な労働者を仮定すると、対価の支払いを受けずに労働をするということは説明できない。本研究は、サービス残業がボーナスや昇給により補償されているという仮説を立て、これを検証した。研究の概要:企業がすべての残業に対し支払いを行なうとするならば、労働者は、不必要であっても労働時間を延ばそうとする。これを防ぐために、企業は、成果に対して支払う形をとる。具体的には、サービス残業を行なうことにより、成果があがると、ボーナスが増加したり、昇給したりすることになる。これをインセンティブ契約とよぶ。本研究では、インセンティブ契約が結ばれているかを検証した。具体的には『消費生活に関するパネル調査』19942001年を用い、賃金関数を計測することにより、サービス残業によって、ボーナスによる補償や昇給が生じるかどうかを検証した。男性の場合、サービス残業の7割程度、女性の場合、2割程度がボーナスにより補償されている。また、男性でも女性でも、サービス残業は昇給をもたらしてはいなかった。今後の課題として、サービス残業の残りの部分は、どのような方法で補償されるのか、あるいは補償されていないのかを明らかにしていく必要がある。本研究は、企業と労働者の間にインセンティブ契約が結ばれているという仮説を立て、これを検証した。具体的には『消費生活に関するパネル調査』19942001年を用い、昇給関数を計測することにより、サービス残業によって、昇給が生じるかどうかを検証した。男性でも女性でも、サービス残業は昇給をもたらしており、1時間当たりのサービス残業は男性で0.7%、女性で0.9%の昇給をもたらす。また、サービス残業は、次の年の昇給をもたらすだけではなく、より長期間の影響をもたらす。過去3年間の平均サービス残業時間は男性で1.2%、女性で1.1%の昇給をもたらす。サービス残業の長期の影響の方が短期の影響よりも大きいということは、サービス残業は、昇給だけでなく、昇進にも影響を与えていると考えられる。よって、サービス残業におけるインセンティブ契約仮説が支持されたといえる。