hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アポトーシス様細胞死においてレドックス制御されるヌクレアーゼの単離・同定

植物細胞は、分化全能性があり単細胞から植物体を再生できる。ところが、単細胞として細胞を単離すると全能性を失い、アポトーシス様プログラム細胞死に至る。本研究は、単細胞(プロトプラスト)を単離する段階で、葉緑体に活性酸素が蓄積していく原因の解明に取り組んだ。前年度までに、プロトプラスト単離時に、葉緑体で活性酸素が蓄積する原因は、葉緑体型NADPHオキシダーゼが活性化するためであることを示した。この知見は、他に報告が無く、Plant Cell and Physiology誌に投稿したところ、一定の評価を得た。実験を付け加えて再投稿するために、準備中である。葉緑体に起こったレドックス状態の変化が、その後の培養時における細胞死のシグナルになって、アポトーシスを実行することが示唆された。本研究は、葉緑体に起こるレドックス状態の変化がアポトーシスのシグナルと成り得ることを世界で初めて示した研究である。次に、アポトーシスの実行過程に関与するヌクレアーゼについて検討した。その結果、候補となるヌクレアーゼは2つ(I,II)存在し、どちらも至適pHは7.8、IはMg,Mnで活性化され、Znで阻害された。IIは、Mnで活性化され、Znで阻害された。還元剤存在下で活性化されるヌクレアーゼが検出されたが、これがI型と同じものかについては、現在検討を重ねている。本研究は、単細胞(プロトプラスト)を単離する段階で、葉緑体に活性酸素が蓄積していく原因を解明した。プロトプラストを単離すると、最初に、葉緑体に活性酸素が蓄積した。その後、細胞培養すると、活性酸素は細胞質に拡散し、培養後2日目に最大となり、その後、細胞の崩壊と共に減少した。活性酸素の消去に関与するアスコルビン酸ペルオキシダーゼ(APX)とスーパーオキサイドディスムターゼ(SOD)活性を葉緑体と細胞質に分けて、測定した。その結果、APXの酵素活性は、葉緑体で増加していたにもかかわらず、細胞質型の酵素活性が減少した。SODの酵素活性は、葉緑体で減少したが、細胞質型の酵素活性は増加した。プロトプラストにおけるこれらの酵素活性は、いずれも減少した。NADPHオキシダーゼの活性は、プロトプラストの葉緑体で減少していた。以上の結果から、プロトプラスト単離時に、葉緑体で活性酸素が蓄積する原因は、葉緑体型NADPHオキシダーゼが活性化するため、APXおよびSODが活性化するにもかかわらず、トータルの活性が減少しているため消去できず、葉緑体内で活性酸素が蓄積してくると考えられる。葉緑体に起こったレドックス状態の変化が、その後の培養時における細胞死のシグナルになって、プログラム細胞死の実行過程につながっていく。これまで、植物細胞のプログラム細胞死のシグナル伝達では、動物細胞と同様にミトコンドリアに最初に、レドックス状態の変化が起こり、細胞死に至ると報告されていた。本研究は、葉緑体に起こるレドックス状態の変化がプログラム細胞死のシグナルと成り得ることを世界で初めて示した研究である。

葉緑体に起こったレドックス状態の変化が、その後の培養時における細胞死のシグナルになって、アポトーシスを実行することが示唆された。本研究は、葉緑体に起こるレドックス状態の変化がアポトーシスのシグナルと成り得ることを世界で初めて示した研究である。次に、アポトーシスの実行過程に関与するヌクレアーゼについて検討した。その結果、候補となるヌクレアーゼは2つ(I,II)存在し、どちらも至適pHは7.8、IはMg,Mnで活性化され、Znで阻害された。IIは、Mnで活性化され、Znで阻害された。還元剤存在下で活性化されるヌクレアーゼが検出されたが、これがI型と同じものかについては、現在検討を重ねている。
ヒト肝細胞増殖因子の臨床応用に関する基礎的研究

我々は劇症肝炎患者血中にヒト肝細胞増殖因子(hHGF)を見いだし、本因子を精製した。hHGFはヒトにおける生理的な肝再生因子である可能性が高いことから、肝再生におけるhHGFのin vivoでの効果を明らかにすることを目的とした。予備実験として既知の細胞増殖因子であるEGFの効果を正常および部分肝切除ラットを用いて経静脈的あるいはAlzetのミニポンプにより持続的に腹腔内に投与して、肝再生に及ぼす影響を検討した。EGFの投与量を50Mg/ラットまで増加させたが、肝DNA合成の促進効果はみられなかった。部分肝切除ラット(40%切除)に術後4時間目に精製hHGF約0.56Mg/100g体重腹腔内投与し、その20時間後に肝DNA合成を〔^3H〕チミジンのとりこみで測定した。対照ラット(生理食塩水投与)の肝DNA合成活性は117.4±24.7dpm/MgDNAであるのに対して、hHGF投与ラットでは222.4±33.3dpm/MgDNAと約2倍に増加した(p<〇.05)。胃や脾におけるDNA合成活性には有意の変動はみられなかった。しかしこのhHGFのin vivoでの肝再生促進効果は正常および四塩化炭素肝障害ラットを用いた実験ではその傾向はみられるものの、統計学的には確認できなかった。我々は関西医大喜多村教授と共同して、最近hHGFのcDNAのクロ-ニングに成功し、現在recommbinant hHGFを得つつある。したがって、今後にhHGFを得ることにより、このhHGFのin vivoにおける肝再生促進効果をさらに明確にしたいと考えている。
ARFとRab11に結合するFIP3とFIP4の細胞内小胞輸送における役割

細胞内の各オルガネラ間のタンパク質の輸送は、あるオルガネラからタンパク質を含む輸送小胞が出芽し、次のオルガネラ膜と融合することにより行われる。低分子量GTPaseの一種ARFには6種類のアイソフォームが存在し、オルガネラ膜上のグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)の働きにより活性型となり、輸送小胞形成を開始させる。一方、Rabは哺乳類には60種類以上が存在し、個々のRabは別個のオルガネラで機能する。特定のオルガネラ膜に結合したRabは、膜上に存在するGEFの作用で活性化し、小胞の特異的な繋留、ドッキング、融合などに働く因子を集合させる。近年、Family of Rab11-interacting protein (FIP)が同定され、そのC末端に相同性の高い20アミノ酸からなるRab11結合ドメインがあることが示された。FIPファミリーのうちFIP3/Arfophilin-1とFIP4/Arfophilin-2はRab11だけでなくARF5やARF6とも活性型特異的に結合することが明らかとなった。このことから、FIP3とFIP4は二つの低分子量GTPaseを介した経路を結びつけ、小胞輸送を調節する重要なタンパク質であると考えられるが、その生理的役割は不明である。本研究では、FIP3とFIP4の機能、さらにはARF5/ARF6とRab11の間のクロストークを解明するために、まずFIP3とARF5およびRab11との相互作用について検討した。その結果、FIP3とFIP4のC末端領域にはARF結合ドメインとRab11結合ドメインが別個に存在し、さらにFIP3とFIP4がARFやRab11と同時に結合できることが明らかとなった。細胞中でFIP3/4はRab11依存的にリサイクリングエンドソームに局在し、ARF5/6はFIP3/4に依存してリサイクリングエンドソーム膜上にリクルートされることが判明した。これらのことから、FIP3/4はRab11とARF5/6の機能を仲介することにより、リサイクリングエンドソームを介した輸送を調節すると考えられる。最近、FIP3/Arfophilin-1とFIP4/Arfophilin-2がそのC末端領域を介してRabllと結合する因子として同定された。さらにFIP3とFIP4はRabllだけでなくARF5、ARF6とも活性型特異的に結合することが明らかとなった。本研究では、FIP3とFIP4の機能、さらにはARF5/ARF6とRabllの間のクロストークを解明するために、まずFIP3とARF5およびRabllとの相互作用について検討した。その結果、FIP3はARF5およびRabllと異なる領域で結合し、FIP3はARF5およびRabllと同時に結合することを明らかにした。さらにCHO-K1細胞でFIP3はRabll依存的に核近傍のリサイクリング・エンドソームに局在し、ARF5/ARF6をリクルートすることを明らかにした。これらのことから、FIP3はARFとRabllと同時に結合することでリサイクリング・エンドソームを介した小胞輸送を制御すると考えられる。

本研究では、FIP3とFIP4の機能、さらにはARF5/ARF6とRab11の間のクロストークを解明するために、まずFIP3とARF5およびRab11との相互作用について検討した。その結果、FIP3とFIP4のC末端領域にはARF結合ドメインとRab11結合ドメインが別個に存在し、さらにFIP3とFIP4がARFやRab11と同時に結合できることが明らかとなった。細胞中でFIP3/4はRab11依存的にリサイクリングエンドソームに局在し、ARF5/6はFIP3/4に依存してリサイクリングエンドソーム膜上にリクルートされることが判明した。これらのことから、FIP3/4はRab11とARF5/6の機能を仲介することにより、リサイクリングエンドソームを介した輸送を調節すると考えられる。
歯からのDNA分析による個人識別への応用

1.歯からのDNA抽出:歯髄からは3-40mg程度のDNAが得られ抜歯後約1年経過した歯髄からでも高分子DNAが回収可能であった。また約1年の間では抽出DNA量と抜去歯の経過日数との間に相関は認められず、歯髄重量が5mg以上の場合に10μg以上のDNAが得られた。歯牙硬組織では0.5M EDTA溶液による1週間程度の脱灰でDNAの効率的な回収が行えたが、殆どの試料で低分子化したDNAのみが得られた。2.歯牙抽出DNAによる多型分析:DNAフィンガープリント法は、歯髄のように高分子DNAが得られるものについては有効な方法であり血液抽出DNAと同様のパターンを示したが、1回の検索に3-5mgの高分子DNAを必要とするため歯牙硬組織試料には適しておらず、歯髄の場合でも繰り返しの検索が困難であるため、歯牙抽出DNAによる多型検索にはPCR法を用いることが適当であると考えられた。3.D4S43 locusのVNTRの変異について:歯牙抽出DNAのPCR法を用いた多型検索を行う上で、PCR産物の比較的小さいD4S43 locusを対象とし、先ず血液より抽出したDNAを試料としてVNTRの変異について日本人の分布を調べたところ、184bpのバンドのallele頻度が最も高く約60%を示し、ヘテロ接合度は約59%であった。さらに繰り返し数1と思われる184%bpの位置のバンドにも由来の異なる4種の変異があることが判明した。4.歯牙抽出DNAからの性別判定:ASF領域を対象としたWitt&Ericksonの方法に基づき歯牙抽出DNAより性別判定を試みたところ、増幅効率が良く制限酵素切断やDual PCR法の併用により正確な性別判定が可能であったが、歯牙硬組織男性試料の約14%に判定不能なものが存在した。1.歯髄からのDNA抽出について:歯髄においては340mug程度のDNAが得られ、抜歯後約1年経過した歯髄からでも、20Kbp以上の高分子DNAが回収可能であった。また得られるDNA量は、約1年間の範囲内において、抜去歯の経過日数との間には相関が認められず、得られる歯髄量が多い程、DNA回収量も多くなる傾向にあった。2.歯牙硬組織からのDNA抽出について:歯牙硬組織よりDNAを効率良く回収するためには、充分な脱灰が必要である。本研究から0.5M EDTA溶液による1週間程度の脱灰が好ましく、EDTA溶液の脱灰能の低下を考慮した溶液の頻繁な交換は、かえってDNAのロスを生じるという結果が得られた。また得られるDNAは、殆どの試料において低分子化したDNAであった。3.DNAフィンガープリントについて:歯髄より得られたDNAでは、Myoプローブを用いたDNAフィンガープリント像を作成することが充分可能であり、多くのバンドが検出された。歯牙硬組織を試料とした場合でも、高分子DNAが得られた場合についてはDNAフィンガープリント像の作成が可能であり、同一人由来の歯髄および歯牙硬組織では両者同様のパターンが示された。しかしながらDNAフィンガープリント法は、高分子DNAを35mug必要とすることから、歯牙硬組織については必ずしも適当な方法とは言えなかった。4.PCR法によるD4S43LocusのVNTRの変異について:日本人131名の血液より得られたDNAを用い、D4S43 LocusのVNTRの変異について分布を調べたところ、184bpのバンドのallele頻度が最も高く約60%を示し、ヘテロ接合度は約59%であった。

更にいまだ少数例ではあるが、歯髄および歯牙硬組織より得られたDNAの両者共にターゲットバンドの検出が可能であり、同一人においては、血痕、歯髄、歯牙硬組織で同様のパターンを示した。1.歯牙をサンプルとした場合には十分な抽出DNA量が得られないため、PCR法による分析が適切であり、前年度の研究においてD4S43領域にPCR法によりVNTRの新たな変異があることが見出された。今年度この変異のシークエンスを試みたところ、GCrich領域であるために全体の塩基配列の決定は極めて困難であったが、制限酵素切断により変異の位置については範囲を狭める事ができた(DNA多型2:64-68,1994)。2.歯牙抽出DNAと血液抽出DNAの両者をサンプルとし、D4S43、D1S80、D12S67、DYS19のそれぞれの領域における多型の比較を行ったところ、高い一致率を示したものの、サンプルによっては過剰なバンドが出現したりターゲットバンドが欠落するものも存在した(日法医誌48:241、1994)。3.個人識別における基本的事項である性別判定に歯からのDNA分析を応用すべく、Alphoid Sa-tellite FamilyをPCR法により増幅して性別判定に応用するWitt & Ericksonの方法を試みた。歯髄および歯牙硬組織のいずれを試料とした場合でも増幅効率が良く、制限酵素切断やDual PCR法を併用する事により正確な性別判定が可能であったが、歯牙硬組織男性試料の約14%に判定不能なものが存在した(歯基礎医会誌36:160、1994)。
Translesion synthesisの分子機構と発がん

研究代表者および研究分担者は、損傷乗り越え複製(translesion synthesis)機構全般を総合的に理解し、発がんおよび発がん防御における役割を明らかにすることを目的として、以下に述べる研究を行った。1)色素性乾皮症バリアント群(XP-V)原因遺伝子の産物であるDNAポリメラーゼη(Polη)が損傷のない鋳型に対して複製の忠実度が著しく低いこと、TTダイマーだけでなく様々な損傷を乗り越えられること、また多くの場合、損傷の反対側に正しい塩基を重合することが分った。2)ヒトPolη遺伝子のゲノムDNAをクローニングしてその構造を決定したところ、終止コドンまでが約40kbにわたる領域にコードされ、11のエキソンに分断されていた。5種類のXP-V細胞におけるゲノムDNA上の変異を検出した。3)Polηが鋳型・プライマー型DNAに対して強い結合活性を示し、鋳型にTTダイマーを含んでいても、含んでいない場合と同程度の結合活性を示した。またTTダイマーの最初のTの反対側に正しい塩基であるAが存在する場合に安定に結合し、間違った塩基の場合には不安定であった。更にプライマーがTTダイマーの手前までのものとダイマーの一つ先までのものには安定に結合したが、もう一つ先まで伸びたプライマー・鋳型DNAに対しては、結合力が低下した。4)XP-V患者のモデルマウスを作成するため、Polηの必須領域を含むエキソン8へNeo発現カセットを挿入したターゲティングベクターを構築し、ヘテロノックアウトマウスを作成した。その交配によりホモノックアウトマウスがほぼメンデル則にしたがって誕生した。8週齢頃から週1回背中の毛を剃り、毎日、2,000J/m2のUVBを照射したところ、照射開始後13週目あたりから腫瘍が観察され、22週では100%のマウスに腫瘍が発生した。一方、野生型およびヘテロマウスにおいては、同じ週齢で腫瘍の発生は見られなかった。1)色素性乾皮症バリアント群原因遺伝子の産物であるXPVポリメラーゼの性質を詳細に調べた。その結果、このポリメラーゼがシクロブタン型ピリミジンダイマー(CPD)だけでなく、AAF-G、シスプラチン-GG、APサイトなどの損傷も乗り越えることが出来ること、またAAF-G、シスプラチン-GGを乗り越える場合にはCPDの場合と同様、損傷の反対側に正しい塩基を挿入することが明らかになった。そこで何故損傷に対して正しい塩基を挿入できるかを検討した結果、損傷があっても正しくない塩基に比べ、正しい塩基を取り込む割合が高いこと、そして万が一正しくない塩基が取り込まれた場合には、それを伸長することができないこと、という2つのメカニズムによって、比較的正確な損傷乗り越え複製が保証されていることが示唆された。2)XPV遺伝子ノックアウトマウスを作成するため、マウスのXPV遺伝子を分離し、その発現パターンなどを調べた。マウスの各組織におけるノーザンブロット解析により、マウスXPV遺伝子は普遍的に発現していること、しかし精巣、肝臓、皮膚、胸腺など、増殖している細胞を含む組織において高い発現がみられることを観察した。細胞周期を同調させたSwiss3T3細胞においても、静止期に比べ増殖期に高い発現が見られた。3)ヒトXPV遺伝子のゲノムDNAをクローニングしてその構造を決定した。XPV遺伝子は、終止コドンまでが約40kbにわたる領域にコードされ、11のエキソンに分断されていた。

XP-V細胞におけるゲノムDNA上の変異を検出し、スプライス部位の変異を含む点突然変異または数塩基の欠失がcDNAの解析とマッチする形で見い出された。研究代表者および研究分担者は、損傷乗り越え複製(translesion Syhthesis)機構全般を総合的に理解し、発がんおよび発がん防御における役割明らかにすることを目的として、以下に述べる研究を行った。1)色素性乾皮症バリアント群原因遺伝子の産物であるXPVポリメラーゼの性質を詳細に調べた。その結果、このポリメラーゼが活性酸素による腫瘍なDNA損傷の一つであるチミングリコールの二つの光学異性体のうち、5R体を効率よく乗り越えること、またその際、損傷の反対側に正しい塩基であるアデニシを重合しやすいことが明らかになった。また別の酸化的DNA損傷であるシクロデオキシアデノシンについても調べたところ、XPVポリメラーゼはやはり、5R体を効率よく乗り越え、正しい塩基であるチミンを損傷の反対側に重合した。2)XPVポリメラーゼを含むYファミリーDNAポリメラーゼに保存されているAからGまでの7つの領域のうち、FおよびG領域に点突然変異を導入し、ポリメラーゼ活性、損傷乗り越え活性、DNAとの結合能、ヌクレオチドとの親和性などを検討した。その結果、1例ではヌクレオチドとの親和性に顕著な低下が、また2例ではDNAとの結合能の低下が見い出された。3)XPV遺伝子ノックアウトマウスを作成するため、タンパク質の翻訳開始コドンを含むエキソン2から8までをネオマイシン発現カセットと置換したターゲッティングベクターを構築した。このベクターをマウスES細胞に導入し、ネオマイシン耐性クローンを単離、相同組換え体であることを確認したクローンを用い、XPV遺伝子のヘテロ変異体を作出した。引き続きヘテロ変異体の交配によりホモ変異体の作出を試みている。研究代表者らは、損傷乗り越え複製(translesion synthesis)機構全般を総合的に理解し、発がんおよび発がん防御における役割を明らかにすることを目的として、以下に述べる研究を行った。1)色素性乾皮症バリアント群原因遺伝子の産物であるDNAポリメラーゼ・イータ(polイータ)の性質を詳細に調べた。その結果、このポリメラーゼがCPDを含む鋳型・プライマー型DNAと損傷を含まない鋳型・プライマー型DNAに対して同程度の結合活性を示した。一方、損傷乗り越えDNA合成を行えない大腸菌のKlenowやT4 DNAポリメラーゼはCPDを含むDNAより、損傷を含まないDNAに強く結合した。これらのことから、鋳型DNAにCPDが存在しても、損傷がないときと同様の強さで結合する性質はpolイータに特有のものであると考えられる。2)損傷乗り越え複製に関与するYファミリーDNAポリメラーゼには、AからGまでの7つの領域が保存されている。ヒトpolイータのこれらの保存領域に点突然変異を導入し、ポリメラーゼ活性に重要なアミノ酸の同定を試みた。
進行泌尿器癌における血中ゲノムマーカーの縦断的解析に基づくプレシジョン医療の実現

我々は血中遊離DNA(cfDNA)および血中循環腫瘍細胞(CTC)に着目し、digital PCRを用いて遺伝子異常を同定する方法を確立した。本研究では治療中の患者から継時的にcfDNAやCTCを採取し解析することでCRPCや腎細胞癌における薬剤感受性や病勢を予測するシステムを構築し、各病態に最も適した治療を選択する“プレシジョン医療"を実現することを目標とする。CRPC102症例のcfDNAのアンドロゲン受容体遺伝子(AR)のコピー数および変異をdigital PCRや次世代シーケンサーを用いて解析し、増幅を46例に、変異を24例に同定した。そして新規のAR経路阻害剤アビラテロンではARの異常が効果予測因子になりうることを確認した。また一部の症例ではcfDNAを継時的に採取し、病勢に応じてARの状態が変化することも確認した。またCRPC症例からCTCを抽出し、スプライスバリアントであるAR-V7を定量化する方法も確立した。腎細胞癌症例においても、cfDNA中のVHL遺伝子変異をtargeted amplicon sequencingにて同定する解析手法を確立し、臨床情報との統合を進めている。上記の通り、概ね順調に研究成果を得ている。腎細胞癌症例で、cfDNAにおけるVHL遺伝子変異と病態・薬剤効果との関連を評価する。去勢抵抗性前立腺癌(CRPC)や腎細胞癌において分子機構に基づく多くの薬剤が使用可能になった。当教室ではこれまで患者検体から複数のゼノグラフトモデルを作成し、癌の薬剤抵抗性機序解明を行ってきた。しかし、臨床において組織検体の継時的採取はしばしば困難で、個別化医療のためには遺伝子情報に基づいて薬剤の感受性を予測できる血中ゲノムマーカーが強く求められている。昨年度に引き続きCRPC症例のcfDNA中のARの異常やCTC中のAR-V7の発現を調べ、病態や薬剤効果との関連を評価する。cfDNA中のVHL遺伝子解析の方法を確立し、腎細胞癌症例で検証する。
芳香族ポリアミドのらせん及びシート構造に基づく人工ポリペプチドの創製

本研究は、らせん構造を形成するN-アルキル芳香族ポリアミドとシート構造を形成するN-H芳香族ポリアミドを我々が開発した連鎖重縮合によって自在につなぎ合わせ、天然ポリペプチドのように機能的で明確な三次元構造を持つ芳香族ポリペプチドを創製することを目的とした。これらの人工ポリペプチドは主鎖に芳香環を有し、水素結合や疎水相互作用のほかにπ-πあるいはCH-π相互作用を利用できるため、芳香族化合物に対して特異的な分子認識が行えるホスト分子として期待される。本年度は昨年度合成したらせん構造とポリアミドシート構造ポリアミドとのブロック共重合体N-H芳香族ポリアミドの分子内水素結合によって折りたたまれてシート構造に変換できるか検討した。さらにブロック共重合体の2つのユニットの間にスペーサーを入れた共重合体を合成し、この構造変換が容易に行なわれるか検討した。まず、水素結合が働きやすい溶媒中でこのブロック共重合体のらせん構造が分子内水素結合によってシート構造へと変換されるかCDスペクトルを用いて検討したが、分子間水素結合が優先し、らせん構造の変化はほとんど見られなかった。そこでブロック共重合体の2つのポリアミドユニットが水素結合しやすいように柔軟なスペーサーを2つのブロック単位の間に導入したものを合成した。その溶液状態をCDスペクトルによって検討した結果、2つのポリアミドユニットがアンチ-パラレル型に水素結合できるスペーサーを入れた共重合体ではTHF中CDスペクトルの吸収が非常に小さくなり、らせん構造が減少することを観察した。またスペーサーがパラレル型に水素結合できる共重合体の合成も試みたが最終生成物まで到達しなかった。上記CDスペクトルの吸収が減少したことは分子内のポリアミド間の水素結合に基づく現象であるか今後モデル反応によって明らかにする予定である。本年度はらせん構造とポリアミドシート構造ポリアミドとのブロック共重合体の合成を検討した。まずポリアミドのらせん構造が容易に円二色性(CD)スペクトルで識別できるように光学活性側鎖を持つモノマー1の合成を検討した。光学活性物質として乳酸エチルを出発物質として9段階で目的とするモノマーが合成できた。次のこのモノマーの単独重合を行い、生成ポリマーがらせん構造を有することをCDスペクトルから確認した。シート構造を形成するN-H芳香族ポリアミドはアミノ基に保護基を有するモノマー2を合成し、重合後脱保護して目的とするポリアミドが得られることを確認した。ブロック共重合体は開始剤からpoly2、poly1の順に重合すると副反応なく合成できた。ただし、poly2は溶解性が低いため10量体までしか導入できなかった。一方、逆に同一条件で開始剤からpoly1、poly2の順に重合すると1段階目の1の重合において成長末端が一部失活するためブロック共重合体とpoly1の混合物が生成した。種々条件を検討し、1段階目の1の重合において1が残存している状態で反応を止め、いったん単離したpoly1から2の重合を行なうと目的とするブロック共重合体だけが得られることを見出した。これらの重合条件をもとに種々の重合度を有するブロック共重合体を合成し、保護基を脱離してN-光学活性アルキル芳香族ポリアミドとN-H芳香族ポリアミドのブロック共重合体を合成した。現在これらのポリマーの種々溶媒中でのCDスペクトルを測定中である。
緩和モード分布解析による水素結合性拡散現象の解明

当初の計画は3年計画であったが、廃止により初年度のみの実施となっており、その初年度で得られた成果について述べる。初年度は、室温ガス物質実験環境整備を行う計画であった。具体的には、トップローディング型クライオスタットのセンタースティックの製作により、室温気体物質の液体での中性子準弾性散乱測定を行う予定になっていた。しかしながら、整備に向けて検討を行った結果、実際の製作にはより多くの資金が必要となることがわかった。その代わりに、ガスを封入するタンクを接続した試料セルを用いることで十分に実験可能であることがわかった。また、具体的な設計についても検討を行った。検討に時間がかかったため、予算の多くについて初年度の執行をあきらめ、翌年度に実施することにしていた。1つめの成果は、実施可能な計画を構築したことである。実験環境の整備計画を立てるとともに、水素結合性液体の拡散現象の解明に向けて、整備前に可能な実験と緩和モード分布解析による解析を行った。実験の1つに、水の温度変化の測定である。これまでの研究から、液体の特徴を表す運動として、中間的な緩和時間を持つ中間モードが重要であると考えられる。水素結合を持たないベンゼンでは中間モードは分子回転であること、水の中間モードは強度が非常に弱く、単純な分子回転で記述できないことが分かっている。今回の実験から、水の中間モードの強度がほとんど温度変化しないことが分かった。分子液体でも、分子回転は制限され中間モードの強度が低くなることがあることが分かっているが、その場合は中間モードの強度が温度変化する。水の中間モードは、強度が弱く、温度変化もしないことから、根源的に分子回転と異なる可能性があることが示唆される。この結果は水素結合性液体の拡散現象の解明に非常に重要である。これが2つめの成果になる。他にも実験は行ったが現時点では解析が終わっていない。
耳下腺導管を対象としたバーチャルCT-Sialographyの確立

本研究の目的は造影剤を使用していない単純CTの画像データを基に、簡便性、汎用性、臨床的有用性に優れた耳下腺導管の3次元描出プログラム(バーチャルCT-Sialography)を開発することである。平成30年度は主に臨床的有用性の検討に取り組んだ。バーチャルCT-Sialographyを耳下腺の導管炎患者に適用し、導管の幅と形態を冠状断像や3次元画像から分析し、健常例と比較した。分析には、汎用性を考慮して無料のDICOM Viewer(以後、ソフト)を利用した。分析を進めていく中で、導管形態が極端な楕円形を呈している症例が多いことに気付き、ソフトの測定精度を詳細に検証してみた。その結果、無料のソフトでは、冠状断像での形態が大きく歪み、距離測定の誤差が約30%となった。また、3次元画像上での距離測定では、誤差がさらに拡大した。高額なソフトを利用した距離測定でも誤差は少ないものの、同様の結果となった。以上のことは、バーチャルCT-Sialographyで導管を分析しても、実長とは異なるデータを提示する可能性が高いことが示唆された。これまで、同様のソフトで研究を行った論文や臨床データは膨大な数にのぼると考えられるが、それらのデータにも当てはまる可能性が高く、CTによる形態分析研究に対する衝撃的な結論が得られた。当該課題の3年間の研究成果に関しては、汎用性や臨床的有用性の確保が困難であるため、バーチャルCT-Sialographyの初歩的なプログラム開発に留めるが、シード・フィルアルゴリズムを利用することでバーチャルCT-Sialographyが実行可能であることを示した。さらに、無料ソフトの測定精度が低いことを世界に先駆けて実証した。以上のことは、将来のCT研究に大きく貢献できる成果であると考える。本研究の目的は造影剤を使用していない単純CTの画像データを基に、画像処理技術を利用し、耳下腺導管の走行を三次元的に描出する手法(バーチャルCT-Sialography)を確立し、その臨床的有用性を明らかにすることである。平成28年度はCT-Sialographyによる耳下腺導管の良好な描出方法についての基礎的検討を行った。特に耳下腺腺体内の導管描出は、従来のボリュームレンダリングテクニックでは困難であったため、シード・フィルアルゴリズムを併用した描出方法を検討した。これは導管と同等のCT値を有し、導管と連続している組織を強調する画像処理法であり、これにより腺体内導管の描出能は向上すると考えられた。しかしながら、耳下腺の腺実質や導管と隣接する咬筋の一部に導管と同等のCT値を有している症例が多く、良好な導管描出は困難であった。そこで、導管を強調するのではなく、耳下腺の腺体組織を検出、消去し、導管のみを残すという新たな手法を考案し、これまでの手法では良好に描出できなかった症例の導管を把握することに成功した。ところが、本手法を用いても、腺体組織と導管を充分に分離できない症例も存在したため、耳下腺導管と腺体組織のCT値に差を分析した。CT患者のデータベースから6歳から77歳までの男女100名を無作為に抽出し分析した結果、CT値の差が大きいほど、良好に導管が描出できた。さらに、スライス厚との関係を分析した結果、CT値の差が大きくなくても、より薄いスライス厚(1mmスライスや0.5mmスライス)では、導管の描出が良好であった。以上の結果は、良好な耳下腺導管の三次元像を得るためには重要な情報であると考えられ、今後の研究を遂行するにあたり、有益な基礎データが得られたと思われる。平成28年度中にバーチャルCT-Sialographyの技法を確立する予定であったが、まだまだ改善の余地があり、平成29年度の中旬までさらに検討を継続する。本研究の目的は造影剤を使用していない単純CTの画像データを基に、簡便性、汎用性、臨床的有用性に優れた耳下腺導管の3次元描出プログラム(バーチャルCT-Sialography)を開発することにある。プログラムは、簡便性、汎用性、臨床的有用性のそれぞれについて、フィードバックを行いながらの開発する必要があり、平成29年度は主に汎用性に関する検討を行った。バーチャルCT-Sialographyのプログラムは、実際に耳下腺造影を行った症例の3次元像を参照し、世界的に広く使用されているプログラミング言語であるPythonで作成した。まず、開発環境をmacOS SierraとWindows 10で構築し、バーチャルCT-Sialographyに必要なプログラムが実行可能かどうか検討した。次に、造影されていない導管の3次元描出能について、高度の画像処理機能を有する市販のソフトと、バーチャルCT-Sialographyを比較し、耳下腺導管が良好に認識できるかどうかを評価した。バーチャルCT-Sialographyの3次元表示は無料で利用できるDICOM viewerソフト、OsiriX Lite(Macintosh用)とRadiAnt(Windows用)を利用した。検討の結果、バーチャルCT-Sialographyは、MacintoshとWindowsの両OS上で実行可能であり、高額な市販のソフトによるボリュームレンダリングと比較しても、より明瞭に導管を描出できた。また、単純CTの画像データを使用したにもかかわらず、実際に耳下腺造影を行った症例と比較しても遜色がない3次元像が得られた。以上のことから、開発中のバーチャルCT-Sialographyは、汎用性が高く、臨床的な価値をもつプログラムであることが示唆された。

本研究課題のプログラムは、これまで世界的に例をみないものであり、しかも、汎用性の高いプログラムを構築するために、想定以上の時間を要した。本研究の目的は造影剤を使用していない単純CTの画像データを基に、簡便性、汎用性、臨床的有用性に優れた耳下腺導管の3次元描出プログラム(バーチャルCT-Sialography)を開発することである。平成30年度は主に臨床的有用性の検討に取り組んだ。バーチャルCT-Sialographyを耳下腺の導管炎患者に適用し、導管の幅と形態を冠状断像や3次元画像から分析し、健常例と比較した。分析には、汎用性を考慮して無料のDICOM Viewer(以後、ソフト)を利用した。分析を進めていく中で、導管形態が極端な楕円形を呈している症例が多いことに気付き、ソフトの測定精度を詳細に検証してみた。その結果、無料のソフトでは、冠状断像での形態が大きく歪み、距離測定の誤差が約30%となった。また、3次元画像上での距離測定では、誤差がさらに拡大した。高額なソフトを利用した距離測定でも誤差は少ないものの、同様の結果となった。以上のことは、バーチャルCT-Sialographyで導管を分析しても、実長とは異なるデータを提示する可能性が高いことが示唆された。これまで、同様のソフトで研究を行った論文や臨床データは膨大な数にのぼると考えられるが、それらのデータにも当てはまる可能性が高く、CTによる形態分析研究に対する衝撃的な結論が得られた。当該課題の3年間の研究成果に関しては、汎用性や臨床的有用性の確保が困難であるため、バーチャルCT-Sialographyの初歩的なプログラム開発に留めるが、シード・フィルアルゴリズムを利用することでバーチャルCT-Sialographyが実行可能であることを示した。さらに、無料ソフトの測定精度が低いことを世界に先駆けて実証した。以上のことは、将来のCT研究に大きく貢献できる成果であると考える。当初の予定通り、平成29年度はバーチャルCT-Sialographyの臨床的有用性を検討するが、現時点での手法で導管が良好に描出できない症例は、年度後半に分析を先延ばしにして、研究計画通りに推進していく予定である。臨床的有用性に関しては、1)健常者の導管形態、2)閉塞性耳下腺患者の導管形態、3)唾石症例における導管と唾石の位置関係について検討を行う。平成30年度は様々な耳下腺疾患を有する患者に対しバーチャルCT-Sialographyを施行し、臨床的有用性のさらなる検証とプログラムの改良を行い、多くの医療機関での耳下腺導管に関連する疾患のCT診断に貢献できるプログラム開発を目指す。物品等を予定価格より安価に購入できたため本研究課題の採択時、研究に必要な物品(申請書類に記載していた物品)が高額であったため購入を断念していたが、年々、価格が大きく低下してきており、翌年度は購入可能な金額になると推測された。そのため、当該年度は可能な限り支出を控え、当該年度の残金と翌年度の助成金と合わせて購入する予定である。生じた次年度使用額は少額であり、消耗品の購入に充てる。
麹醗酵を利用した血圧降下物質の調製　～効率的な生産法の開発～

麹醗酵は、日本の伝統的な食品加工技術であり、大豆(きなこも含めて)は、日本人の重要な栄養源かつ機能性物質の供給源である。本研究では、これらを組み合わせて、効率的に機能性食品を創製することを目的とした。通常の麹醗酵では、麹菌の最適生育・増殖条件を考え、1525°Cで数か月の培養条件をとっているが、本研究では、醗酵は微生物による酵素反応と捉え、酵素の熱失活が起こらない範囲で最高の温度をとるようにした。その結果、40°C、50°Cで2030日間の培養が、血圧降下作用の指標としたアンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害活性が高く、それ以上醗酵時間を延長しても阻害活性は増加しなかった。つまり、阻害物質は一定の反応で蓄積され、その後分解などは起こらなかった。また、25°Cで90日以上の長期培養しても、ACE阻害活性は、高温条件の場合と同様のレベルに達した。また、高焙煎処理(190°C、13分)きなこの醗酵エキスは、低焙煎処理(150°C、2分)きなこのそれに比べ、ACE阻害活性は低く、焙煎によりきなこ中のたんぱく質が強く変性し、阻害活性を持つペプチドの生成が抑えられたと考えられた。そこで、低焙煎処理きなこを用いて、40°Cで20日間培養した培養液を調製型等電点電気泳動(Autofocusing)にかけると、pH3.5、pH4.0、pH7.0、pH9.0の4つの画分にACE阻害活性が回収され、これらは、たんぱく質から生じたペプチドと考えられた。pH4.0画分には、既にACE阻害活性が報告されているニコチアナミンが存在することから、活性の一部はこれが担っているものと考えられた。これら画分を濃縮し、810週齢の雄性脳卒中易発症性高血圧自然発症ラット(SHRSP)に経口投与したところ、各画分に分離する前のきなこ醗酵エキスのような高い血圧降下作用は示さず、各成分が相乗的に効いていると考えられた。これまで、(株)向井珍味堂から提供されたきなこ醗酵エキス(きなこを醤油麹で室温、90日間醗酵させたもの)をエタノールで脱塩し、これを脳卒中易発症性高血圧自然発症ラット(SHRSP)に経口投与したところ、強い血圧降下作用を示した。但し、本醗酵エキスは、生成に長期間(90日)かかること、その間の醗酵が充分制御されていないこと、このためコンタミネーション防止を目的に多量のNaClを使用し、醗酵終了後に脱塩の必要があることなどから、機能性食品素材として応用するには、解決すべき課題が多い。また、麹醗酵を用いた同様の研究が数多くされているが、同様の課題があり、実用化には至っていない。麹醗酵は、日本の伝統的な技術であり、大手企業や中小企業においても高い技術を有している。そこで、この技術を用いた生理活性物質の製造法が実用化できれば、日本の食品産業の発展のみならず、地方産業の活性化にも繋がると考えた。本研究では、「醗酵」を麹菌が分泌する各種の酵素が行う化学反応と捉えた。すなわち、化学反応であれば、(酵素が失活しない範囲で)温度が10°C上昇すれば、反応速度は2倍になり、生理活性物質の生成も効率的に行われる。反応期間が短縮できれば、その制御もしやすくなり、NaCl量の減少や不使用も可能と考えられる。本醗酵エキスは、原料が大豆であるため、得られる生理活性物質は、たんぱく質が麹菌の酵素により分解されたペプチドであることも考えられる。そこで、焙煎度が違えば、大豆たんぱく質の熱変性度合いが変わり、既存のものとは違うペプチドが生成すると考え、2種類のきなこ(低焙煎;150°C、2分間、高焙煎;190°C、13分間)を用いた。まず、低焙煎きなこを50°Cで32日間醗酵させた。その結果、醗酵開始当初(3日目)には、きなこ醗酵エキスのACE阻害活性は70%を超えたが、5日目以降32日目までほぼ5060%で推移した(25°Cの醗酵では32日目で、阻害活性は35%)。この結果から、醗酵当初に血圧降下作用を有する生理活性物質が産生され、その後、一定量を保持していると考えられた。次に、高焙煎きなこを40°Cと50°Cで10日間醗酵したところ、共に、ACE阻害活性2040%の醗酵エキスが得られた。一方、低焙煎きなこは、40°Cの醗酵で38日で、阻害活性が80%以上であり、9、10日目ではやや低値を示した(阻害活性60%程度)。50°Cの醗酵では、阻害活性は、40°Cの時よりも10%程度低値で推移した。したがって、きなこは、低焙煎のものを用いることとした。そこで、低焙煎きなこを30°C、40°C、50°C、60°Cで10日間の醗酵を行った。

30°Cの醗酵では、得られた醗酵エキスのACE阻害活性は、2050%で推移し、40°Cでは、38日で阻害活性が80%以上であった。50°Cでは、40°Cの時よりも阻害活性では10%程度低値で推移し、60°Cでも50°Cの時と同様であった。したがって、低焙煎きなこを40°Cで38日間醗酵させた時に、ACE阻害活性が80%以上であることが明らかとなった。そこで、この条件で大量に仕込み、得られた醗酵エキス1000 mLをAutofocusing装置(調製型等電点電気泳動)で分画した。泳動後の画分No5(pH3.5)、画分No6(pH4.0)、画分No7(pH8.0)、画分No8(pH9.0)のACE阻害活性は、それぞれ70%、75%、90%、50%であった。阻害活性の高かった画分No7を濃縮し、810週齢の雄性SHRSPに経口投与して、血圧降下作用を確認する予定である。これまで、(株)向井珍味堂から提供されたきなこ醗酵エキス(きなこを醤油麹で室温、90日間醗酵させたもの)をエタノールで脱塩し、これを脳卒中易発症性高血圧自然発症ラット(SHRSP)に経口投与したところ、強い血圧降下作用を示した。但し、本醗酵エキスは、生成に長期間(90日)かかること、その間の醗酵が充分制御されていないこと、このためコンタミネーション防止を目的に多量のNaClを使用し、醗酵終了後に脱塩の必要があることなどから、機能性食品素材として応用するには、解決すべき課題が多い。また、麹醗酵を用いた同様の研究が数多くされているが、同様の課題があり、実用化には至っていない。麹醗酵は、日本の伝統的な技術であり、大手企業や中小企業においても高い技術を有している。そこで、この技術を用いた生理活性物質の製造法が実用化できれば、日本の食品産業の発展のみならず、地方産業の活性化にも繋がると考えた。本研究では、「醗酵」を麹菌が分泌する各種の酵素が行う化学反応と捉え、(酵素が失活しない範囲で)温度が10°C上昇すれば、反応速度は2倍になり、生理活性物質の生成も効率的に行われる。反応期間が短縮できれば、その制御もしやすくなり、NaCl量の減少や不使用も可能となる。きなこの麹醗酵を例として、機能性物質が効率的に生成し、Autofocusing(調製型電気泳動)法で、動物試験に対応できる多量のサンプルを調製できる手法を確立すれば、日本独自の機能性研究が進展すると考えている。本研究では、in vitroで目標通り高い活性(angiotensinIconverting enzyme;ACEの阻害活性)を示すサンプルが獲得できたが、in vivoでは、有意な活性を確認できなかった。醗酵時間を延長し、in vitroでは再度期待通りの結果を得ているので、次に、in vivoの検討を実施する。Autofocusing(調製型等電点電気泳動)を用いたきなこ醗酵液の分画により得られた阻害活性画分No7(pH8.0)を濃縮し、8週齢の雄性脳卒中易発症性高血圧自然発症ラット(SHRSP)に経口投与して、投与前の血圧、投与後の経時的な血圧(0.5、1、2、4、8、24時間後)測定した。その結果、有意差が得られなかったので、10週齢で再度SHRSPに経口投与したが、これも有意差を得ることはできなかった。また、画分No6(pH4.0)の経口投与も同様の結果であった。指標としたangiotensinIconverting enzyme(ACE)阻害活性は、各画分で高い値が得られていた。この時、醗酵温度40°Cと高く維持したため、阻害物質の生成は進んだが、効率を重視して醗酵を38日間と短く切り上げたため、阻害物質と想定しているきなこタンパク質からのペプチドが充分低分子化されず、SHRSPの消化酵素により別な部位でペプチド結合が切断されて、異なる構造のペプチドが生成された可能性が考えられた。そこで、再度、40°Cできなこの醗酵を行い、醗酵開始3日目、25日目、45日目、87日目で特に高いACE阻害活性が得られた。
顎関節内障の長期経過にともなう骨のリモデリングが顎顔面形態に与える影響.

顎変形症患者群における顎関節の観察円板と下顎頭骨変形の程度を,磁気共鳴映像法(MRI)と同時多層断層X線写真によって診断分類し,頭部X線規格写真によって計測した顎顔面形態(下顎非対称性)との関連を検討することで,顎関節内障による下顎成長障害が顔面成長に与える影響を検討した.その結果,片側性顎関節内障群において,顎関節病態の重篤度とオトガイ部(メントン;Me)の偏位量との間に有意な正の相関(ρ=0.288,p=0.020,n=66)を認めた.また,下顎骨の大きさと下顎枝高ならびに下顎骨体長の2成分に分け,顎関節病態の重篤度との相関を検討した結果,下顎枝高と顎関節病態の重篤度との間に有意な負の相関(ρ=0.327,p=0.011,n=66)が認められたが,下顎骨体長との相関は示されなかった.さらに,無症状ボランティア41名を対象として,MRIによる集団検診を行い,一般集団における顎関節内障発現率についても調査を行った.その結果,17名(41%)の左右いずれかの顎関節に円板転位が明らかとなり,病態の有無と臨床症状との関連は明確でないことも示された.以上より,顎関節内障が下顎の成長発育に影響していることが強く示唆されたが,今後はさらに症例数を増やし,罹患年齢(若年期,成人)・病態程度・罹患期間などと関連づけ,より詳細な検討を要すると考えられた.さらに,骨吸収に先立つ下顎頭軟骨の破壊メカニズムを各個体の素因,性差,負荷などの因子と関連づけ,分子細胞レベルで解明することが必要である.顎変形症患者群における顎関節の観察円板と下顎頭骨変形の程度を,磁気共鳴映像法(MRI)と同時多層断層X線写真によって診断分類し,頭部X線規格写真によって計測した顎顔面形態(下顎非対称性)との関連を検討することで,顎関節内障による下顎成長障害が顔面成長に与える影響を検討した.その結果,片側性顎関節内障群において,顎関節病態の重篤度とオトガイ部(メントン;Me)の偏位量との間に有意な正の相関(ρ=0.288,p=0.020,n=66)を認めた.また,下顎骨の大きさと下顎枝高ならびに下顎骨体長の2成分に分け,顎関節病態の重篤度との相関を検討した結果,下顎枝高と顎関節病態の重篤度との間に有意な負の相関(ρ=0.327,p=0.011,n=66)が認められたが,下顎骨体長との相関は示されなかった.さらに,無症状ボランティア41名を対象として,MRIによる集団検診を行い,一般集団における顎関節内障発現率についても調査を行った.その結果,17名(41%)の左右いずれかの顎関節に円板転位が明らかとなり,病態の有無と臨床症状との関連は明確でないことも示された.以上より,顎関節内障が下顎の成長発育に影響していることが強く示唆されたが,今後はさらに症例数を増やし,罹患年齢(若年期,成人)・病態程度・罹患期間などと関連づけ,より詳細な検討を要すると考えられた.さらに,骨吸収に先立つ下顎頭軟骨の破壊メカニズムを各個体の素因,性差,負荷などの因子と関連づけ,分子細胞レベルで解明することが必要である.
ゼブラフィッシュを用いたリゾホスファチジン酸による血管形成メカニズムの解析

新生する血管には性質、動態の異なる2種類の内皮細胞が存在することが報告されている。伸長血管の先端に位置する内皮細胞(Tip cell)とTip cellを追随する内皮細胞(Stalk cell)である。Tip cellは糸状仮足を伸ばしてVEGFなどの血管新生因子を探索し、血管が伸長する方向を決定する。一方、Stalk cellはTip cellの後方で活発に増殖し新しい血管を形成する。Tip cellは活発に動くために細胞間接着が弱まっており、Stalk cellは血管を安定化するために強固な接着をしていることがわかっている。このstalk cellの分化にはNotch signalによる遺伝子発現変動が非常に重要であることが知られている。しかし、Notch target geneの中でどの遺伝子の発現制御がstalk cellへの分化に重要かまでは明らかとなっていない。今回の研究では、生理活性脂質であるリゾホスファチジン酸(LPA)の分解酵素であるLipid phosphate phosphatase 3 (LPP3)の発現がNotch signalによって制御されるかを調べたところ、Notch signalによってLPP3の発現量が有意に上昇することがわかった。これまでの解析からLPP3は内皮細胞においてLPA signalを抑制し、血管内皮細胞同士の接着を強めることがわかっている。このことからNotch signalはstalk cellでLPP3の発現を高めることで、stalk cellの安定で強固な接着を保っていることが示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。現在までに生理活性脂質であるLysophosphatidic acid(LPA)分解酵素であるLipid phosphate phosphatase 3(LPP3)をゼブラフィッシュでノックダウンすると体節間血管が退縮すること、その異常がLPA受容体であるLPA6をノックダウンすることでレスキューされることがわかっていた。またLPP3ノックダウンによる血管の退縮という異常は血管内皮細胞間の接着が弱まった結果であることが予想されていた。今回、内皮細胞間の接着に非常に重要なVE-cadherinをノックダウンし、内皮細胞間接着を弱めた結果、LPP3ノックダウン時と同様の血管異常を示すことを明らかにした。このことによりLPP3ノックダウンにより内皮細胞間接着が弱まっていることが強く示唆された。上記したゼブラフィッシュの知見から、今回LPAシグナルが内皮細胞間接着を制御しているのかをHUVEC(正常ヒト臍帯静脈内皮細胞)を用いて解析した。結果、LPAがhPA6を介してROCKを活性化し、アクチンストレスファイバー形成を促進させることでVE-cadherinの局在を変化させ、内皮細胞間接着を弱めることがわかった。さらにLPP3をノックダウンすることによりhPAに対する反応性が高まることが明らかとなった。これらの結果は、ゼブラフィッシュでのLPP3ノックダウン時に内皮細胞間接着を弱めるということを示唆する非常に重要な結果であると考えている。新生する血管には性質の異なる2種類の内皮細胞が存在することが報告されている。これまでの解析から、LPAシグナルはTip cellには作用するが、Stalk cellにはあまり作用しないことが示唆されていた。そのメカニズムを解析するためにHUVEC(正常ヒト臍帯静脈内皮細胞)を用いて解析を行った。まずHUVECをコンフルエントまで培養し、チップを用いてScratchし、細胞のシートに傷をつけた。こうすることで一部の細胞は非接着部位を持つことになり、接着している細胞(stalk cell様)と接着面が一部ない細胞(Tip cell様)を作り出すことができる。この状態でLPA刺激をすると、接着面が一部ない細胞(Tip cell様)の特に非接着面でのみアクチンストレスファイバー形成が生じた。詳細に解析した結果、この現象は細胞膜タンパクでありLPA分解酵素であるLPP3の局在によって制御されていることがわかった。この結果からLPAがTip cellでのみ作用していたメカニズムを一部説明することができたと考えている。次に時期特異的にATXをKOし、詳細な血管形成を観察可能な新生仔網膜血管を単離し、解析を行った。その結果、ATXをKOするとTip cellの数が減少し、血管伸長が抑制にされた。マウスを用いた解析からもLPAがTip cellの挙動に重要な影響を与えていることが明らかとなった。

今回の研究では、生理活性脂質であるリゾホスファチジン酸(LPA)の分解酵素であるLipid phosphate phosphatase 3 (LPP3)の発現がNotch signalによって制御されるかを調べたところ、Notch signalによってLPP3の発現量が有意に上昇することがわかった。これまでの解析からLPP3は内皮細胞においてLPA signalを抑制し、血管内皮細胞同士の接着を強めることがわかっている。このことからNotch signalはstalk cellでLPP3の発現を高めることで、stalk cellの安定で強固な接着を保っていることが示唆された。26年度が最終年度であるため、記入しない。これまでにLPA分解酵素であるLPP3をゼブラフィッシュでノックダウンによる血管形成異常がLPA受容体であるLPAsをノックダウンすることでレスキューされることがわかっていた。おそらくLPP3ノックダウンによる血管の退縮という異常はLPAの過剰なシグナルにより、血管内皮細胞間の接着が弱まった結果であることが予想されていたが、内皮細胞を用いた詳細な解析からこの予想を支持する非常に興味深い結果が出ていることからも概ね順調に進展していると考えている。ヒト内皮細胞を用いた解析から、LPAは一つの細胞でも作用する部位が異なっていることがわかった。LPAは細胞接着面ではほとんど作用がなく、細胞非接着面でのみ作用を発揮するが、これはLPA分解酵素であるLPP3の局在に制御されていることが明らかとなった。上記したように新たに血管形成におけるLPAシグナルの役割が明らかになっていることから、本年度の研究結果については期待通り研究が進展していると考えている。現在までにゼブラフィッシュにおいて血管形成に関与するLPA受容体を複数同定している。今後はその受容体の機能を、マウスを用いて解析し、ゼブラフィッシュでの血管形成に関わるLPA受容体の機能がマウスに保存されているか調べる。方法としてはマウス網膜血管の観察、がん血管新生モデル、下肢虚血モデルを行う予定である。現在までにLPAの血管形成における詳細な機能がわかりつつある。今後はこのLPAシグナルと他の血管形成因子との関連を探っていく予定である。LPA産生酵素, LPA受容体, LPA分解酵素がどういった因子により発現誘導・発現抑制が制御されているのか調べる。