hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
トンネル走査顕微鏡によるビスマス系高温超伝導体の新規電荷秩序の研究

本研究では、低バイアスSTMとSTS実験から、Bi系高温超伝導体における非分散性の2次元電荷秩序の性質と擬ギャップ及び超伝導ギャップとの関連性を詳細に調べた。その結果、アンタイノード領域の電子が関与する2次元電荷秩序が空間的に不均一な擬ギャップの起源であること、また、擬ギャップ領域にある試料では、ノード付近の電子(ホール)対ギャップが超伝導のエネルギースケールを決めていることを見出した。今年度は、ビスマス系高温超伝導体(Bi2212)の超伝導相で見つかった非分散性の電荷秩序の性質を極低温型STM/STS装置を用いて詳しく調べ、電荷秩序の性質と超伝導ギャップとの関連性を検討した。その結果、1)非分散性の電荷秩序は本来動的であり、有効なピン止めポテンシャルがある領域で静的となってSTM実験で観測できるようになること、2)非分散性の動的電荷秩序の発達の程度は擬ギャップが形成されるフェルミ面の大きさに依存すること、3)STM実験と同時に測定したSTSスペクトルの結果から、動的電荷秩序のピン止めと超伝導ギャップの空間的不均一性とが強く相関していることを明らかにした。また、擬ギャップ状態(T>Tc)における非分散性の電荷秩序の測定を行った結果、その性質は擬ギャップの空間的不均一性との関係も含めて超伝導相における非分散性の電荷秩序とほぼ同じものであることを見出した。今後、超伝導相と擬ギャップ相における非分散性の電荷秩序を詳細に調べ、この電荷秩序が高温超伝導の発現とどう関係しているかを明らかにする予定である。さらに、非分散性の電荷秩序に対する不純物効果(Zn不純物)について予備的な実験を行った結果、非分散性の電荷秩序の周期がZn不純物によって影響を受けることが明らかになってきた。不純物の非分散性の電荷秩序に与える影響は、電荷秩序の起源を考える上で大変興味深いものであり、次年度以降の研究において不純物効果の詳細を明らかにしたい。本年度の研究では、Bi2212系高温超伝導体のSTM/STS測定から超伝導状態(T<Tc)と擬ギャップ状態(T>Tc)で非分散性のチェッカーボード型電荷秩序とフェルミ準位でのギャップ構造を詳しく調べた。その結果、非分散性の電荷秩序の周期はTcの上下で同じであり、ともにギャップ構造の空間的な不均一性と密接に関連していることから、電荷秩序はTcの上下で変化しないことを確認した。また、Bi2201系高温超伝導体め超伝導状態における非分散性のチェッカーボード型電荷秩序とギャップ構造の特徴を調べ、非分散性の電荷秩序がピン止めされて静的なものになると、空間平均した擬ギャップの大きさが著しく増加し、角度分解光電子分光(ARPES)実験のアンティノードにおける擬ギャップの大きさと一致することが分かった。また、STSスペクトルに、ARPES実験から報告されているアンティノードでの超伝導ギャップに対応する位置にショルダー状の異常が現れることから、非分散性の電荷秩序がピン止めされると超伝導ギャップと擬ギャップの大きさが著しく異なってくることが明らかとなった。また、超伝導ギャップは、擬ギャップと違って非分散性の電荷秩序がピン止めされても空間的に均一のままであり、大きさもほとんど変化しない。このことは、非分散性の電荷秩序のピン止めとアンティノード付近の擬ギャップの増大とが密接に関係していることを示す興味深い結果である。現在、不純物を添加して非分散性の電荷秩序を積極的にピン止めしたときの擬ギャップの振る舞いや、超伝導に与える影響を調べている。本年度の研究では、非分散性のチェッカーボード型電荷秩序が現れるBi系高温超伝導体の擬ギャップと超伝導ギャップをSTM/STS実験から詳しく調べた。角度分解電子分光(ARPES)実験から擬ギャップはアンティノードを中心に発逹することが知られているが、空間分解能の高いSTM/STS実験からは、擬ギャップは空間的に非常に不均一であり、その不均一性と非分散性のチェッカーボード型電荷秩序の発達が密接に関係していることが分かった。また、空間的に平均した擬ギャップの大きさは、角度分解光電子分光(ARPES)実験の結果と一致する。一方、チェッカーボード型電荷秩序が現れて擬ギャップが空間的に非常に不均一となる場合でも、STSスペクトルのギャップ構造の底部は非常に均一である。ギャップ構造の底部は、k空間のノード近傍のフェルミアーク上に形成される超伝導ギャップ構造を反映しているが、フェルミアーク上の準粒子は大きな易動度をもっており、そこでの準粒子がクーパー対を作ると超伝導が起こるという可能性が考えられる。そこで、STSスペクトルで見られるフェルミアーク上の均一なギャップからアークの外側に形成される不均一で大きな擬ギャップへ移り変わるバイアス電圧から、フェルミアーク端での超伝導ギャップの大きさ△Sを見積もり、△SとT CがBCSの関係で結ばれると仮定してTcとの相関を調べた。その結果、両者はホール濃度依存性まで含めて良く一致することが分かった。
濃淡包絡面の推定にもとづく医用X線画像の画質改善に関する研究

本研究は,応用上重要な医用X線画像(具体的には胃X線二重造影像)を対象として,複雑な背景が透過重畳した投影画像から背景変動成分(トレンド)を推定して補正することによる画質の定量性向上を目的とした.その効果として,臓器構造と濃淡情報との対応付けがより明確となり,病変部の検出と計量,ひいては画像診断支援・自動化にも有用であることが期待される.本研究では,とくに画像形成の物理的原理に着目し,画像中でX線吸収が極小である画素の濃淡値を補間する濃淡包路面をもって背景変動分の推定とする基本概念を構築することができた.本手法によれば,観察対象の臓器や組織構造に適応したスケールで複雑な背景構造を織別することが可能になる.本研究の主要な成果は(1)加法的に重畳した背景変動成分を濃淡包絡面として推定するために,弾性ネットを自由落下させることによる力学的アナロジーにもとづく方法を提案したこと,(2)濃淡包絡面を大域的に適応したものとするために平面三角形パッチおよび曲面パッチを用いた補間法の導入を提案したこと,(3)以上により背景変動推定の枠組みを与えるとともに,それを用いた濃淡補正の効果を検証したこと,(4)濃淡包絡面の精度を向上させるための画素サンプリングによる方法を提案したこと,(5)X線画像の透過重畳性に適合した他の方法である数学的モルフォロジーにもとづく方法に対する本方法の優位性を検証したこと,(6)一般的な画像信号処理手法である空間周波数領域フィルタリングに対する本方法の優位性を検証したこと,(7)X線画像の定量性向上の効果として,濃淡情報による立体構造の推定の有能性を実験的に示唆したこと,などである.本研究は,応用上重要な医用X線画像(具体的には胃X線二重造影像)を対象として,複雑な背景が透過重畳した投影画像から背景変動成分(トレンド)を推定して補正することによる画質の定量性向上を目的とした.その効果として,臓器構造と濃淡情報との対応付けがより明確となり,病変部の検出と計量,ひいては画像診断支援・自動化にも有用であることが期待される.本研究では,とくに画像形成の物理的原理に着目し,画像中でX線吸収が極小である画素の濃淡値を補間する濃淡包路面をもって背景変動分の推定とする基本概念を構築することができた.本手法によれば,観察対象の臓器や組織構造に適応したスケールで複雑な背景構造を織別することが可能になる.本研究の主要な成果は(1)加法的に重畳した背景変動成分を濃淡包絡面として推定するために,弾性ネットを自由落下させることによる力学的アナロジーにもとづく方法を提案したこと,(2)濃淡包絡面を大域的に適応したものとするために平面三角形パッチおよび曲面パッチを用いた補間法の導入を提案したこと,(3)以上により背景変動推定の枠組みを与えるとともに,それを用いた濃淡補正の効果を検証したこと,(4)濃淡包絡面の精度を向上させるための画素サンプリングによる方法を提案したこと,(5)X線画像の透過重畳性に適合した他の方法である数学的モルフォロジーにもとづく方法に対する本方法の優位性を検証したこと,(6)一般的な画像信号処理手法である空間周波数領域フィルタリングに対する本方法の優位性を検証したこと,(7)X線画像の定量性向上の効果として,濃淡情報による立体構造の推定の有能性を実験的に示唆したこと,などである.医用X線画像にはX線透過吸収量の積分値が投影されている.そして,CTアルゴリズムによれば,その濃淡情報から対象臓器の奥行きや物理的特性を定量的に測ることができる.一方,重畳臓器の濃淡構造があまり複雑でない場合には,CTアルゴリズムによらずともX線画像から臓器構造を理解することが可能と考えられる.本研究はこのような作業を機械的に実現するための一課題として,背景の濃淡変動成分(トレンド,シェーディング)の推定・除去の手法を開発することを目的としている.トレンド推定の手法としては従来から局所平均や準同形フィルタが知られているが,本研究ではそうした一般的手法ではなく,画像生成の物理であるX線の透過重畳性に着目し,画像中でX線吸収が極小である画素の濃淡値を補間する濃淡包絡面をもって背景変動分の推定とする基本概念を構築していくことを構想している.こうした作業は人間の視覚では自然に行われていると考えられるが,機械化を可能とすることによって,臓器構造と濃淡情報との対応付けがより明確となり,がん病巣などの病変部の検出と計量,ひいては画像診断支援・自動化にも有用であることが期待される.そのための作業として,X線吸収極小点の抽出,濃淡分布の補間,評価,および,応用による有用性の実証等の諸課題について研究していく必要がある。本年度は,X線吸収極小点の抽出のために,微細な濃淡変動の影響を受けにくい,ある力学的モデルを構築した.濃淡分布を補間するためには,平面の三角分割による方法を検討した.今後さらに評価・応用等の実験を進めていくために作業環境の充実を図る必要があり,そのためにコンピュータと数値計算ソフトウェアを導入し,現在整備を進めているところである.

医用X線画像にはX線透過吸収量の積分値が投影されているので,重畳臓器の濃淡構造があまり複雑でない場合には,CTアルゴリズムによらずともX線画像から臓器構造を理解することが可能であると考えられる.本研究はこのような作業を機械的に実現するため,背景の濃淡変動(トレンド,シェーディング)の推定・除去の手法を開発することを目的としている.本年度は,画像中でX線吸収が極小である画素の濃淡値を補間する濃淡包絡面をもって背景変動分の推定とする方針のもとに,画像格子上に弾性ネットを自由落下させ,その整定状態を濃淡包絡面とする方法を開発し,電子情報通信学会医用画像研究会等で報告した.また,一般サイズ画像への対応を可能とし,また,局所的な位置ずれを解消するため,ソフトウェアを改良した.さらに,一応用として,胃X線二重造影像からの胃壁表面構造の鳥瞰表示の可能性を検討した結果,陥凹型ひだ集中病変は良好に表示できたが,隆起性病変に対しては効果が不十分であり,その原因は濃淡包絡面の懸垂によるものと考察され,改善の必要を認めた.また,対照のため,他の方法によるトレンド補正についても実験により検討した.空間周波数領域フィルタリングは高速な実行が可能であるが,縁・線強調の効果が出てしまい,また,トレンド補正によって濃淡が負値をとることがX線画像の生成原理と不整合であり,定量化への接近をも損なう.準同形フィルタリングは原画像の濃淡値がフィルムの光学濃度に対応している場合には不適合であり,また,濃淡変化を過剰に強調してしまう.線形予測による方法を含め,従来から信号処理に用いられている包絡線検出手法では包絡線が原信号の下部に潜り込むことがあるのに対して,本研究の手法では必ず上部に被ることが特長である.今後さらに,大域的な構造の改善および応用可能性について研究していく予定である.医用X線画像にはX線透過吸収量の積分値が投影されているので,重畳臓器の濃淡構造があまり複雑で・ない場合には,X線画像から臓器構造を理解することがある程度は可能であると考えられる.本研究はこのような作業を機械的に実現するため,背景の濃淡変動(トレンド)の推定・除去の方法を開発することを日的としている.これまで,画像格子上に弾性ネットを自由落下させ,その整定状態を濃淡包絡面とする力学的モデルに基づく方法を開発してきたが,本年度は本研究課題の取りまとめに向け,第一の作業裸題として,濃淡包絡面に生ずる局所的な濃淡値最大点を尖点とする懸垂への対策を検討した.まず,それらの尖点を濃淡包絡面の濃淡値と原画像の濃淡値との一致によって検出する.そのような尖点では,背景要素によるX線吸収がよく反映されていると考えられるので,尖点を用いて濃淡値を補間する.まず尖点の集合にもとづいて画像平面のデローネー三角分割を求め,各三角形領域において平面三角形パッチを用いた補間,および,最小ノルムネットワークを用いた補間を試みた.濃淡包絡面の導出において用いる弾性ネットのバネ定数が大きいほど尖点の個数は少なく,濃淡値の大きい点が選択される.したがって,パッチ補間の結果は,バネ定数が大きいほど大域的な構造が,また逆の場合には,比較的局所的な構造までもが背景成分として識別される.つまり,バネ定数を調整することによって観察対象臓器・組織等の構造に適したスケールでの背景職別が可能になる.第二の作業課題は濃淡包絡面による方法よりも計算負荷が小さい他のトレンド推定法との比較である.空間周波数フィルタや局所平均フィルタでは,トレンド補正によって濃淡が負値をとることがX線画像の生成原理と不整合であり,また,濃淡分布の凹凸形状が保存されないことがある.
顎骨における静脈系の観察

1.血管鋳型法の応用について従来の肉眼解剖では静脈系の検索は充分にできなかったが、今回実験に用いた血管鋳型法により、静脈系全体の血流方向は血管鋳型標本を実体顕微鏡下で、また微細な部分は走査型電顕下で検索することによって可能になった。同様に血管鋳型上に印記された静脈弁は容易に確認することができ、その存在から血流方向が正しく示すことができた。2.ヒト上顎における静脈系について1).互いに対応する動脈と静脈の走向系路は伴行することなく、また必ずしも分布した動脈と対応する静脈に血液が集められるとは限らなかった。2).口腔領域の静脈系において、従来の顔面静脈の合流範囲に加えて、歯周組織の静脈も顔面静脈に合流することが分かった。3).歯肉、歯根膜など歯牙周囲に分布する動脈は、骨の外表面を走行する骨外経路と骨中を走向する骨内経路をとるが、これに対し静脈は主に骨外経路をとることが判明した。4).骨髄の静脈は根尖および歯根部歯根膜(歯槽骨に囲まれた部分)の静脈網と交通し、続いてこの静脈網は歯頸部歯根膜(歯槽頂より上の骨のない部分)の静脈網を介して、歯肉内縁上皮(歯冠側歯肉)直下の静脈へと続き、3)の骨外経路、2)の顔面静脈へと合流する経路をとる。5).静脈弁は歯肉頬移行部などの非可動部と可動部の境界部、ならびに軟口蓋部に分布するが、硬口蓋ならびに顎骨内の静脈には存在したかった。イヌ硬口蓋においては多数の静脈弁が存在したことから種差があることがわかった。6).軟口蓋後縁では鼻腔から下降してきた静脈と軟口蓋を後方に進んだ静脈とが合流して主幹(外口蓋静脈)となり、咽頭扁桃の後方で鼻腔粘膜からの静脈を受け、咽頭側壁に沿って下降し、最終的には舌骨の高さで顔面静脈に流入する。現在のところ上顎骨について、次の様な結論を得ている。すなわち、上顎骨中では互いに対応する動脈と静脈の走向経路は伴奏せず、また必ずしも分布した動脈と対応する静脈に血液が集められるとは限らないことが明らかとなった。口腔領域の静脈系において、従来の顔面静脈の合流範囲に加えて、歯周組織の静脈も顔面静脈に合流する。すなわち、歯根膜の静脈網は歯頸部歯根膜の静脈網を介して、歯肉内縁上皮直下の静脈へと続いている。そして付着歯肉のなかを下行する静脈と合流する。要するに上顎骨の骨髄の静脈(骨内系と名づける)は、歯根膜の血管網を経て歯槽頂を越えて歯肉に入り、ここで付着歯肉のなかの静脈(骨外系と名づける)と合流し、歯根頬移行部から顔面静脈へと流入するル-トをもっている。一方、口蓋側の歯肉に達した静脈は骨外系静脈と合流し、大口蓋静脈となり後方へと向かい、一部は大口蓋動脈に沿った非常に細い枝を大口蓋管に進入させ、残りの大部分は後方の軟口蓋の血管と合流して、外口蓋静脈となって顔面静脈に入る。細い静脈系を立体的に検索する場合、血管鋳型法は適当な方法であり、特に血管鋳型上の静脈弁の存在、観察は静脈の血流方向を形態学的に決定する場合、大変重要なものであった。

静脈弁は口径100μm前後以上の骨外系の静脈に存在し、骨内系には存在しなかった。このことは顎骨の静脈系を考えるとき、大変重要な点である。ヒト屍体は諸条件が難しく、現在のところ例数を殖やすことが困難であるが、営為努力していく。1.血管鋳型法の応用について従来の肉眼解剖では静脈系の検索は充分にできなかったが、今回実験に用いた血管鋳型法により、静脈系全体の血流方向は血管鋳型標本を実体顕微鏡下で、また微細な部分は走査型電顕下で検索することによって可能になった。同様に血管鋳型上に印記された静脈弁は容易に確認することができ、その存在から血流方向が正しく示すことができた。2.ヒト上顎における静脈系について1).互いに対応する動脈と静脈の走向系路は伴行することなく、また必ずしも分布した動脈と対応する静脈に血液が集められるとは限らなかった。2).口腔領域の静脈系において、従来の顔面静脈の合流範囲に加えて、歯周組織の静脈も顔面静脈に合流することが分かった。3).歯肉、歯根膜など歯牙周囲に分布する動脈は、骨の外表面を走行する骨外経路と骨中を走向する骨内経路をとるが、これに対し静脈は主に骨外経路をとることが伴明した。4).骨髄の静脈は根尖および歯根部歯根膜(歯槽骨に囲まれた部分)の静脈網と交通し、続いてこの静脈網は歯頸部歯根膜(歯槽頂より上の骨のない部分)の静脈網を介して、歯肉内縁上皮(歯冠側歯肉)直下の静脈へと続き、3)の骨外経路、2)の顔面静脈へと合流する経路をとる。5).静脈弁は歯肉頬移行部などの非可動部と可動部の境堺部、ならびに軟口蓋部に分布するが、硬口蓋ならびに顎骨内の静脈には存在したかった。イヌ硬口蓋においては多数の静脈弁が存在したことから種差があることがわかった。6).軟口蓋後縁では鼻腔から下降してきた静脈と軟口蓋を後方に進んだ静脈とが合流して主幹(外口蓋静脈)となり、咽頭扁桃の後方で鼻腔粘膜からの静脈を受け、咽頭側壁に沿って下降し、最終的には舌骨の高さで顔面静脈に流入する。
mRNAに核外輸送系における熱ショック応答の分子機構

mRNAの核から細胞質への輸送は、真核生物における遺伝子発現の重要な一段階である。我々は、oligo dTをプローブに用いたin situ hybridization解析により、分裂酵母Schizosaccharomyces pombeにおいて熱ショックストレスがmRNA核外輸送系に及ぼす影響を解析した。その結果、42°Cでの急激な熱ショックストレスを与えた細胞においては、細胞質のpoly(A)+RNAが減少すると同時に、大量のpoly(A)+RNAが核に蓄積することが明かとなった。このことは、mRNA核外輸送経路が急激な熱ショック処理により阻害されることを示唆している。熱ショック蛋白の発現を誘導する37°Cでの緩やかな熱処理を、42°Cでの熱ショック処理の前に行うと、mRNA核外輸送機構の阻害は見られなかった。熱ショックを与えた酵母においては、核小体領域が23個の凝縮した構造体に変化することが観察された。興味深いことに、oligo dTプローブと核小体の蛋白であるフィブリラリンに対する抗体を用いて2重染色を行った結果、poly(A)+RNAは熱ショック処理細胞において、凝縮した核小体領域内に蓄積していることが示された。電子顕微鏡を用いた高解像度のin situ hybridization解析によっても、熱ショック処理細胞においては、核小体領域にpoly(A)+RNAが蓄積していることが証明されたこのことは、酵母の核小体がrRNA合成のみでなく、mRNAの核外輸送系にも関与している可能性を示唆している。今後、急激な熱ショックストレスからのmRNA核外輸送系の保護に関与するhsp遺伝子の同定を行う予定である。
胸腺上皮細胞の機能と遺伝子発現の解析

免疫系の中心的役割を担うT細胞は、胸腺において分化・成熟する。造血幹細胞からリンパ球系にコミットした前駆細胞は、胸腺に入りT細胞へと分化する。この分化のプロセスは詳細に研究されており、CD4-/CD8-のdouble negative (DN)胸腺細胞はCD4+/CD8+を経てCD4+/CD8-あるいはCD4-/CD8+のT細胞へと分化・成熟する。この間に、T細胞受容体(TCR)遺伝子の再構成が起こり、自己MHCを認識しないTCRを持つクローンおよび自己抗原に強いaffinityをもつクローンは排除される。しかし、通常の胸腺には細胞死を起こした細胞は頻繁には認められないことから、排除された胸腺細胞を迅速に処理する細胞の存在が考えられる。本研究では、胸腺内にCD4陽性のマクロファージが存在することを認め、この細胞集団について検討を重ねた。CD4陽性マクロファージは蛍光ビーズあるいはアポトーシスを誘導した胸腺細胞を効率良く貪食する活性があり、その活性は胸腺内あるいは腹腔内の通常のCD4陰性マクロファージに比べてはるかに高いことが明らかになった。さらに、CD4陽性マクロファージは胸腺の発達とともに肥大化するが、Rag1欠損マウスではT細胞分化が起らず、したがって死細胞も生じないためにCD4陽性細胞の肥大化も認められなかった。これらの結果から、胸腺内のCD4陽性マクロファージはprofessionalなスカベンジャーであることが強く示唆させた。このD4陽性マクロファージはT細胞の選択が起る髄質と皮質の境界領域に存在していた。この領域にはOncostatin M受容体が発現しており、胸腺細胞をOSM存在下に培養すると、OSM応答性の胸腺上皮細胞が得られた。この上皮細胞を未分化胸腺細胞と共培養すると、CD4陽性マクロファージが出現するとの結果が得られ、上皮細胞がCD4マクロファージ分化に重要であることが示された。OSMは生体内においてTECに直接作用し、胸腺構造の構築に寄与している可能性が変異マウスの解析から示された。胸腺上皮細胞の機能と遺伝子発現の解析我々は胸腺細胞をOncostatin M (OSM)存在下で培養すると上皮細胞がOSM依存的に増殖することを見いだしている。OSM受容体の抗体で胸腺を染色すると、皮質と髄質の境目が特異的に染色されることから、OSM依存的に増殖する細胞はこの皮質と髄質の境界に存在する上皮細胞に由来するものと考えられる。さらに、OSM受容体欠損マウスやgp130変異マウスでは胸腺の皮質と髄質の構造に変化が認められたので、OSMあるいはその類縁サイトカインが胸腺の形成に重要であることが示唆された。未分化胸腺前駆細胞は、この培養上皮細胞との共培養によりマクロファージへと分化し、上皮細胞の培養浄清によって樹状細胞へと分化する。そこで、この胸腺前駆細胞由来のマクロファージと樹状細胞との機能を調べた。このマクロファージはアポトーシスを起こしたT細胞を効率よく貪食することから、T細胞分化の過程で排除されたT細胞を素早く処理するスカベンジャーであることが示唆された。一方、樹状細胞はMLRにて強い抗原提示能を示したことから、自己反応性のT細胞の排除に関与する可能性が示唆された。

胸腺前駆細胞の分化に関わる分子の同定を目指して、胸腺上皮細胞株の遺伝子発現プロファイルを調べたところ、いくつかのサイトカインやその受容体の発現が認められたので、現在それらが胸腺前駆細胞の分化に関与するかどうか検討を行っている。我々は胸腺にはCD4を発現するマクロファージが存在しており、アポトーシスを起こした胸腺細胞を極めて効率良く貪食することを見いだしており、このCD4陽性のマクロファージがT細胞分化の過程で排除されたT細胞を素早く処理するプロフェッショナルなスカベンジャーであると考えている。この細胞が未分化胸腺前駆細胞から発生することをin vitroの培養系にて示した。すなわち、胸腺上皮細胞と未分化胸腺前駆細胞(FcR+, CD25-, CD44+)とを共培養するとIL-7依存的にCD4陽性マクロファージが出現し、強い貪食能を示した。一方、胸腺上皮細胞の培養上清を未分化胸腺細胞に加えると、樹状細胞が出現した。この樹状細胞はMLRにて強い抗原提示能を示した。さらに、この培養系に用いた胸腺上皮細胞株ではIL-3, IL-4, TNFa, GM-CSF, Flt3Lなどの樹状細胞を誘導することが知られているサイトカインの発現は認められないことから新たな樹状細胞誘導因子の存在が示唆された。
BNCTのための放射化法による血液中ホウ素同位体非破壊分析法の開発

ホウ素中性子捕捉療法(BNCT)においては、投与された血液中のB-10濃度を迅速に、精度よく決める必要がある。現在一般的に使われている誘導結合プラズマ(ICP)法とは別に、我々は陽子放射化法の適用性を調べた。迅速定量のためにはバックグラウンドである511 keV消滅ガンマ線の低減が必須であることから、放射線シミュレーションによる複数の検出器体系による定量精度を評価し、設計を行った。この測定系を整備し、ビーム実験を行った結果、消滅ガンマ線を1/291/41まで低減比させることができた。その結果、これまで20時間程度かかった定量が4時間程度まで短縮でき、定量精度13%を達成することができた。ホウ素中性子捕捉療法(Boron Neutron Capture Therapy, BNCT)において、がん細胞に吸収されやすいホウ素入り薬剤が使用されている。安全で効果的なBNCT治療を行うためには、正確なホウ素濃度測定による照射線量、照射時間管理が必要である。BNCT治療時に必要な血液中濃度は20-30ppmであり、現状では主にICP-AES, ICP-MS分析が行われているが、複数の方法で精度を担保する必要がある。原子炉施設では即発ガンマ線分析が行われてきたが、加速器施設では困難である。よって、本研究では、新たに荷電粒子放射化分析(CPAA)を開発し、ICP法と併せてB-10濃度分析の高精度化に貢献する。今年度はまず、放射線シミュレーションによる検出器デザインを決定した。1台のGe検出器からなる測定場を放射線シミュレーションコードGEANT 4.9.3に入力し、Co-60の1次元スペクトルを求め、測定スペクトルが再現されることを確認した。次に、最大4台までのGe検出器とBGO, NaIシンチレーション検出器各1台を用いる6つの体系の候補を考案し、GEANTコードにより、線源からB-10およびバックグラウンドのガンマ線を発生させて、これらの体系により得られる1次元スペクトルを生成した。得られたスペクトル中で、B-10に起因するピークとバックグラウンドカウントの解析により、定量精度を導出し、最も優れた性能を有する検出器デザインを決定した。次に、ガンマ線測定装置の整備を行った。1台のADCモジュールを購入して、既存のデータ収集システムに付加することで、ガンマ線測定システムの改造を行った。上記シミュレーション計算結果を基に、同時計数・反同時計数によるデータ収集条件を設定し、既存の汎用NIMモジュールを用いて構成できることが分かった。放射線シミュレーションコードGEANT 4.9.3を用いた計算により、最も優れた定量精度を与える検出器体系として、ゲルマニウム検出器、BGOおよびNaIシンチレーション検出器各1台を使用するデザインを決定した。申請時には4台のGe検出器に対応する4台のADCモジュールを整備する予定であったが、予算減額により、1台のADCのみを購入することとした。これは既存のデータ収集システムに組み込むことで、上記検出器体系に対応することを確認した。安全で効果的なBNCT治療を行うためには、正確な血液中ホウ素濃度測定による照射線量、照射時間管理が必要である。本研究では、新たに荷電粒子放射化分析(CPAA)を開発し、ICP法と併せてB-10濃度分析の高精度化に貢献する。H27年度においては、放射線シミュレーションGEANT 4.9.3により検出器デザインを決定した。これにより、4台のGe検出器を用いるデザインAとBGO, NaI, Ge検出器各1台を用いるデザインBを選定した。H28年度においては、A案に必要な4台のGe検出器の入手・借用が可能かどうか検討したが、最終的に困難なことが判明し、B案を採用することとした。B案では、Ge検出器ー線源ーBGO検出器(NaI検出器内蔵)という構成を取る。最終的に分析センター所有のBGO, Ge検出器と新潟大学のNaI検出器を使用することとした。これらの検出器を茨城県東海村のBNCT施設において、セットアップを行った。データ収集回路については、既存のNIMモジュールを用いて、Ge検出器に対して、BGO検出器、NaI検出器による反同時計数回路を構成した。データ収集装置としては、シングルMCA装置を使用した。Na-22線源を用いたオフライン試験を行った結果、バックグラウンド低減率約10を実現することができた。H28年度においては、H27年度に実施した放射線シミュレーションコードGEANT 4.9.3を用いた計算により決定した検出器体系を実現し、その性能試験を行った。22Na標準線源を購入して、オフラインでの試験を行った。申請時には検出器用架台を製作する予定であったが、既存のブロック等を使用することで、セットアップが可能であることが判明した。その後、NaIより高効率のBGO検出器を借用できることが判明したので、今後その性能評価を実施し、これまでの体系と比較する。その結果によってはその体系を採用する可能性もあるので、積極的に検討したい。以上の成果は、H29年1月5ー6日に、茨城県東海村において開催された「東海・重イオン科学シンポジウムータンデム加速器成果報告会ー」においてポスター発表を行った。

また、JAEA REVIEW 2014に投稿すると同時に、AppliedRadiation and Isotopes誌に投稿中である。ホウ素中性子捕捉療法(Boron Neutron Capture Therapy, BNCT)においては、がん細胞に吸収されやすいホウ素入り薬剤を血液中に投与する。安全で効果的なBNCT治療を行うためには、正確な血液中ホウ素濃度測定による照射線量、照射時間管理が必要である。BNCT治療時に必要な血液中濃度は20-30ppmであり、その濃度分析には現状では主にICP-AESあるいはICP-MS分析が行われているが、別の方法で精度を担保する必要がある。本研究では、新たに荷電粒子放射化分析(CPAA)を適用し、ICP法と併せてB-10濃度分析の高精度化に貢献する。H27年度においては、放射線シミュレーションGEANT 4.10.2により検出器デザインを決定した。これにより、4台のGe検出器を用いるデザインAとBGO, NaI, Ge検出器各1台を用いるデザインB,BGO, Ge検出器各1台を用いるデザインCを選定した。H28,29年度においては、A,B,C案のうち、実現が可能で性能が優れたC案を採用した。日本原子力研究開発機構(原子力機構)所有のBGO検出器と日本分析センター所有のGe検出器を用い、鉛ブロック等の実験用消耗品を購入し、測定器系を完成させた。データ収集回路については、既存のNIMモジュールを用い、Ge検出器に対するBGO検出器による反同時計数回路を構成した。データ収集装置としては、シングルMCA装置を使用した。Na-22線源を用いたオフライン試験を行った結果、511keV消滅γ線のバックグラウンド低減率1/83を実現することができた。この結果を基に、原子力機構タンデム加速器施設において、8MeV陽子ビームを用いたオンライン実験を行った結果、バックグラウンド低減率約1/40を実現することができ、1時間オーダーでの血液中B-10濃度の迅速分析が可能であることを示した。ホウ素中性子捕捉療法(BNCT)においては、投与された血液中のB-10濃度を迅速に、精度よく決める必要がある。現在一般的に使われている誘導結合プラズマ(ICP)法とは別に、我々は陽子放射化法の適用性を調べた。迅速定量のためにはバックグラウンドである511 keV消滅ガンマ線の低減が必須であることから、放射線シミュレーションによる複数の検出器体系による定量精度を評価し、設計を行った。この測定系を整備し、ビーム実験を行った結果、消滅ガンマ線を1/291/41まで低減比させることができた。その結果、これまで20時間程度かかった定量が4時間程度まで短縮でき、定量精度13%を達成することができた。H27年度に放射線シミュレーション計算で決めた、ゲルマニウム検出器、BGOおよびNaIシンチレーション検出器各1台を使用する体系を実現するべく、検出器架台を設計し、製作する。実際に、以上の3台の検出器からなる体系を組み上げ、データ収集システムに接続して、ガンマ線測定システムを完成させる。
8-キノリノール誘導体と希土類金属イオンの反応特異性の解明とその分析化学的応用

希土類金属イオンを広いpH領域で抽出しない「5,7-ジメチル-8-キノリノール」の特異性の解析とその応用に関して、以下に記す成果を得た。1.特異性の解析:上記の機能は単純な立体障害ではなく、塩基性の増大による抽出pH領域の塩基性側へのシフト、および、その領域での金属イオンの加水分解反応に起因する抽出領域の更なる塩基性側へのシフト、の非線形現象として発現した。今後、酸塩基特性の制御を用いた新しい特異試薬の設計法に研究の展開が期待される。また、混合溶媒系では5,7-ジメチル誘導体と希土類金属イオンは、他の8-キノリノール誘導体と比較して反応性は乏しいものの錯体を生成することから、二相間分配の環境下で上記の機能が発現する。2.応用:500倍モル量の希土類金属イオンの存在下での微量の遷移金属イオン類を、逆相分配高速液体クロマトグラフィーにより定量することが可能であった。特にコバルトイオンに対して感度が高く、ppbレベルの定量が可能であった。得られたクラマトグラム上には希土類金属錯体に由来するシグナルは検出されず、抽出系との相関(二相間分配系での特異性)が得られた。3.コバルトの高倍率濃縮-HPLC定量法:コバルトイオンに対する高感度測定法を目的として、高沸点溶媒を用いる濃縮法(濃縮率1000倍)を開発した。4:機能試薬の界面配向:表面増強赤外吸収測定法により、界面配向挙動を調べる測定法を確立した。界面における配向特性を利用した高機能分離のための試薬設計に関する研究は現在進行中であり、新たな展開が見込まれる。
わが国で発見された遺伝性運動感覚ニューロパチーの海外学術調査とその病態解明

米国ウイスコンシン州のウイスコンシン医科大学神経内科Collins准教授よりHMSN-P類似の家系があるとの連絡を受け、Collins准教授と現地調査(附属病院での診察および在宅訪問)を行い、HMSN-P類似の臨床症状を示すドイツ系家系(発症者は少なくとも4世代10名以上)を見いだした。この家系の発症者は、それまで「Charcot-Marie-Tooth病」あるいは「Friedreich ataxia」と診断されていたが、詳細な検討は全く行われていなかった。現在、遺伝子解析を含む詳細な調査を継続している。今回の調査にて、ブラジルの神経内科学グループに加えて、新たにウイスコンシン医科大学神経内科学グループとの共同研究を進めることが出来たことは、HMSN-Pを含む遺伝性ニューロパチーの研究発展に大いに寄与したと考える。韓国においてもHMSN-P類似家系があるとの情報を得ているが詳細な調査は行われていない。今後、韓国における調査を予定している。国内においてはHMSN-Pの新たな剖検例を共同研究者が報告し、家族性ALS類似の病態を明らかにした。HMSN-P原因遺伝子は第3染色体セントロメア近傍にマッピングしているが現時点では特定できていない。本研究は、われわれが発見したhereditary motor and sensory neuropathy with proximal dominancy (HMSN-P)の国際的な広がりについて共同研究を行い、1)ブラジルを中心に南米諸国の神経内科医を対象として、HMSN-Pの臨床病態についての啓発活動を行い、他の類似疾患との異同を明らかにし、2)ブラジルなどの海外のHMSN-P患者の神経組織の分子病理学的検討を行い、3)海外とわが国のHMSN-Pとの分子生物学的比較検討を行い、原因遺伝子を明らかにし、4)モデル動物の作成および治療法の開発を目指すものである。2009年8月2日8日にかけて、HMSN-Pに罹患した日系ブラジル人家系2家系の計10名に関して、サンパウロ大学Clinicas病院において神経内科のPaulo Euripedes Marchiori教授、Maria Teresa Alves Hirata医師らの研究チームと問診と神経学的診察を行った。更に、サンパウロ大学神経内科で本症に関するレクチャーを行い、今後の研究の方向性について意見交換を行った。また、ポルトアレグレ市Clinicas病院神経内科、ブラジル沖縄県人会、サンパウロ新聞社、日伯援護協会などと意見交換を行い、ブラジルにおける医療事情について理解を深めるとともに、日系人150万人が住むブラジルにおいて同様の症状を示す患者いた場合、連絡頂くように依頼した。2010年2月にはHMSN-P発症地区である沖縄県に多いHTLV-1感染者が高率に見られているイラン国マシュハド大学神経内科グループとの研究打ち合わせを行った。今年度の調査研究を通じて、ブラジルの神経内科医グループおよびイランマシュハド大学神経内科グループとの共同研究を行っていく上での基盤を作った。米国ウイスコンシン州のウイスコンシン医科大学神経内科Collins准教授よりHMSN-P類似の家系がいるとの連絡を受け、Collins准教授と現地調査(附属病院での診察および在宅訪問)を行い、HMSN-P類似の臨床症状を示すドイツ系家系(発症者は少なくとも4世代10名以上)を見いだした。
骨髄播種癌細胞の休眠を担う自律的特性の解明と治療への展開

これまでに確立してきた条件にて、マウス骨髄で休眠を呈するヒト頭頚部扁平上皮癌細胞株をDNAバーコードライブラリーで標識した後に、マウスに移植した。一定期間経過後に、移植部位や骨髄、肺、末梢血からゲノムDNAを採取し、クローナリティを明らかにするために、次世代シーケンサーによって各部位におけるバーコード配列を網羅的に解読した。その結果、骨髄や肺、循環腫瘍細胞(CTC)では、それぞれ異なる優位な細胞クローン群が存在することが明らかとなった。特に、骨髄で最も優勢であったクローンは、原発巣やCTC、肺では稀少であった。この結果は、特定の細胞集団が優先的に骨髄に播種して休眠している可能性を示している。そのようなクローンの特性や起源を明らかにするために、バーコード標識シングルクローンを複数樹立した。それらを等量で混合してマウスに移植し、上記同様にクローナリティ解析を実施した結果、休眠BM-DTCの多くを占めるクローンを一つ(クローンX)同定することができた。現在は、クローンXの骨髄での潜伏を支える分子メカニズムの解析に取り組んでいる。現時点で、過去に報告されている骨髄播種に関連する分子が、親株や他のクローンに比べ、クローンXでは高発現していることを確認している。また並行して、クローンXにCRISPR/Cas9遺伝的スクリーニングを適応することで、BM-DTCの休眠や停留に必須の遺伝子を同定することを試みている。まず我々は、休眠BM-DTCという亜集団にクローナリティが存在するかどうかを検証するために、DNAバーコーディング法を採用し、各種基礎検討を行った。まず、DNAバーコードレンチウイルスベクターをヒト頭頸部癌細胞をはじめいくつかの癌細胞株に感染させ、個々の細胞の追跡に適した感染効率を定めた。実際に、感染後に抗生剤で選別し、シングルクローン化した細胞に組み込まれているバーコード配列をサンガーシーケンス法で解読したところ、ほぼすべてのクローンがそれぞれ1種類のバーコード配列をもつという想定通りの結果が得られた。したがって、個々の細胞標識と追跡が十分可能であることが示唆された。さらに、バーコード標識癌細胞のDNAから良好なクオリティの次世代シーケンサー(NGS)解析用ライブラリが調製可能であることも確認することができた。以上の基礎検討結果から、DNAバーコーディング法による休眠BM-DTCのクローナリティの検証は十分可能であると考えられた。並行して、休眠BM-DTCの起源を辿ることができるよう、バーコード標識シングルセルクローンの樹立とバンキングを進めている。一方で、CRISPR/Cas9遺伝的スクリーニングによって、BM-DTCの休眠や停留に必須の遺伝子を同定することを試みている。現在、Cas9安定発現癌細胞株の樹立過程にある。想定以上にDNAバーコーディングに関する基礎検討が進み、NGS解析に十分なクオリティのライブラリも作製することができた。当初、初年度に検討を予定していた「休眠BM-DTCの特性解明」については、まだ十分な知見は得られていないが、クローナリティの検討の際に、同時に詳細な解析が可能であると考えている。また、今後行う予定であるCRISPR/Cas9スクリーニングに向けた準備も並行して進めることができている。前年度に確立した条件にて、マウス骨髄で休眠を呈するヒト頭頚部扁平上皮癌細胞株をDNAバーコードライブラリーで標識した後に、マウスに移植した。一定期間経過後に、移植部位や骨髄、肺、末梢血からゲノムDNAを採取し、次世代シーケンサー(NGS)によって各部位におけるバーコード配列を網羅的に解読した。その結果、骨髄や肺、循環癌細胞では、それぞれ異なる優位な細胞クローン群が存在することが明らかとなった。この結果は、申請者の仮説を支持するように、特定の細胞集団が優先的に骨髄に播種して休眠している可能性を示している。並行して、そのようなクローンの存在や特性を明らかにするために、バーコード標識シングルクローンを複数樹立する作業を進めている。一方、CRISPR/Cas9遺伝的スクリーニングによって、BM-DTCの休眠や停留に必須の遺伝子を同定することを試みている。いくつかの頭頚部癌細胞株を用いて、Cas9-ルシフェラーゼ安定発現株を作製した。それらにsgRNAライブラリーを導入してマウスに移植し、ルシフェラーゼ活性を指標に生体モニタリングを行っている。現時点で、骨での明らかな転移巣の出現を認めていないが、一部のマウスにおいて、当該細胞株では通常見られないような転移パターンが認められている。初年度と今年度で主に計画していた、DNAバーコード標識シングルクローンの樹立については、やや遅れをとっているものの、混合集団を用いたBM-DTCのクローナリティに関する検討については、一度目のNGS解析が終了した。一方、本年度と次年度で計画していた、CRISPR/Cas9遺伝的スクリーニングについては、既にマウスに移植して転移の評価を行うことができており、当初の予定通りの進捗と考える。

そのようなクローンの特性や起源を明らかにするために、バーコード標識シングルクローンを複数樹立した。それらを等量で混合してマウスに移植し、上記同様にクローナリティ解析を実施した結果、休眠BM-DTCの多くを占めるクローンを一つ(クローンX)同定することができた。現在は、クローンXの骨髄での潜伏を支える分子メカニズムの解析に取り組んでいる。現時点で、過去に報告されている骨髄播種に関連する分子が、親株や他のクローンに比べ、クローンXでは高発現していることを確認している。また並行して、クローンXにCRISPR/Cas9遺伝的スクリーニングを適応することで、BM-DTCの休眠や停留に必須の遺伝子を同定することを試みている。基本的には、当初の研究計画を基盤として以下のように検討を進める。バーコードライブラリ感染癌細胞をマウスに移植し、移植部位や骨髄をはじめ各臓器から癌細胞を採取し、NGSによりバーコード配列の網羅的解析を行う。これにより、休眠BM-DTCや転移巣の均一性・不均一性を検証する。同時に、休眠BM-DTCサブクローンを樹立し、その特性(遺伝子発現プロファイルなど)を解析するこで、機能的な面でのクローナリティの検証も行う。CRISPR/Cas9スクリーニングについては、sgRNAライブラリウイルスベクターを作製し、Cas9安定発現細胞株に感染させる。これにより遺伝子をランダムにノックアウトし、骨病巣が出現した場合には、同転移細胞集団由来DNAをNGSで解析し、骨髄での癌細胞の休眠や滞留に必須の遺伝子の同定を試みる予定である。以上の検討で得られた知見を随時統合することで、休眠BM-DTCの特性解明と転移・再発機構の理解を目指す。当初の研究計画をわずかに修正し、以下のように研究を進める。バーコードライブラリー標識細胞を用いた、休眠BM-DTCのクローナリティに関する検討については、再現性を確認する。バーコード標識シングルクローンの樹立は継続し、休眠BM-DTCの起源に関する解析に供する。休眠BM-DTC由来クローンの遺伝子発現プロファイルの追加解析結果から、コピー数異常が関連していることが示唆されたため、当初計画していたエピゲノム解析に優先してコピー数解析を実施する予定である。
癌細胞選択的アポトーシス活性化小分子化合物を用いた新規胃癌治療の確立

腹膜播種を伴う胃癌は未だ不治の病であり、その分子機構解明及び新規薬剤開発は急務である。PPLGMは、正常細胞へ低毒性でありながら胃癌においても抗腫瘍作用を充分に発揮することが期待できる。今回の研究において、小分子化合物PPLGMは胃癌細胞株においてアポトーシスを誘導し、腫瘍抑制効果を示したことより、PPLGMが新規胃癌治療薬の一つとなる可能性が示唆された。代表者らは、化合物スクリーニングにより癌細胞選択的にアポトーシスを誘導する小分子化合物PPLGMを同定し、乳癌モデルにおいて著明な腫瘍抑制効果を示すことを論文発表した。野生型及び変異型p53をそれぞれ持つ胃癌細胞株にPPLGMを添加すると、crystal violet staining、trypan blue stainingにおいて、濃度依存的・時間依存的に細胞死が誘導される。またFACS及びWestern blot解析において、その細胞死がアポトーシスであることを確認した。これらの結果よりPPLGMは、胃癌細胞において抗腫瘍効果を示す可能性が示唆された。野生型及び変異型p53をそれぞれ持つ胃癌細胞株に小分子化合物PPLGMを添加すると、crystal violet staining、trypan blue stainingを用いて、濃度依存的・時間依存的に細胞死が誘導される。またFACS及びWestern blotを用いた解析において、その細胞死がアポトーシスであることを確認できた。これらの結果よりPPLGMは、胃癌細胞においてアポトーシス誘導経路を介した抗腫瘍効果を示す可能性が示唆された。既存の抗悪性腫瘍薬は正常細胞へも毒性が生じやすく、がん細胞特異的に作用する薬剤の開発が望まれている。PPLGMは、正常細胞へ低毒性でありながら胃癌においても抗腫瘍作用を発揮することが期待される。野生型及び変異型p53をそれぞれ持つ胃癌細胞株にPPLGM(050μM)を添加すると、crystal violet staining、trypan blue stainingにおいて、濃度依存的・時間依存的に細胞死が誘導された。またPI stainingによるFACS解析において、PPLGM投与により胃癌細胞株にアポトーシスが誘導された。一方、Western blottingではアポトーシス関連遺伝子であるPuma及びCaspase 3、cleaved-PARPのタンパク発現上昇を認めた。代表者によって研究計画が立てられ、実際の研究を研究協力者とともに行っている。研究協力者(大学院生)からの更なる実験の支援とともに定期的なdiscussionが必要である。共同研究者との定期的なdiscussionを行い、研究の方向性を確認するとともに、研究協力者(大学院生)からの更なる実験の支援が必要である。正常胃粘膜細胞において、PPLGM投与が与える影響を解析する。ヌードマウスを用いた胃癌細胞株異所性移植モデル、転移腫瘍モデルを樹立する。その後PPLGM投与による抗腫瘍効果を解析する。正常胃粘膜細胞において、PPLGM投与が細胞死及びアポトーシスを誘導するか解析が必要である。その後、ヌードマウスを用いた胃癌細胞株異所性移植モデル、転移腫瘍モデルにおいて、PPLGM投与による抗腫瘍効果を示す。さらに、マウス腫瘍組織標本を用いた免疫組織化学染色及び定量PCRにて、各種遺伝子の発現変化を解析する。異所性移植モデルにおいては、PPLGMが正常組織に与える影響についても検討する。細胞培養液、FBS等の細胞株maintenance費用。マウス購入費用。マウス購入費用。免疫組織染色備品及びWestern blotting、免疫染色用抗体購入費用。
未知の広範囲遺伝子欠失断端の簡単な同定法の開発、および本法による疾患多様性の解明

平成16年度に広範囲欠失の詳細な欠失断端を、定量的PCR (LightCycler)と新たに開発したJunction PCRを用いて比較的簡単に同定出来る方法を開発した。そして、日本人には発見されていなかったεγδβ-サラセミアの4例3家系(39,46,118kb欠失)の同定に成功した。本年度はさらに発展して、εγδβ-サラセミア2家系(各1.41,1.4Mbの欠失)、βサラセミア1家系(116kb欠失)、δβサラセミア6家系(27kb欠失)、逆位のδβサラセミア1家系の同定に成功した。最後のケース以外は全て報告のない新しい変異であった。本法によって、従来FISHが効力を発揮していた1Mbを越える広汎欠失の症例も簡単に同定可能であり、しかも厳密な欠失段端をも決定することが可能であることが証明された。本法が遺伝子分析上、画期的な方法であることが分かる。一方、成功していなかったαグロビン遺伝子群の分析の検討を行い、欠失断端近辺に高度の繰り返し配列があるとreal-time PCRが困難であることが明確となった。このような配列の攻略は今後の課題として残る。これらの広範囲欠失はいずれも相同組み換えではないことも明らかとなった。上記の5種類のεγδβ-サラセミアに関しては、ゲノムプロジェクトのデーターベースより、多数のolfactory domainがβグロビン遺伝子群とともに欠失していることが判明しているが、その他に有意な遺伝子が少なく、一見表現型の差は見出されなかった。「嗅覚」の微妙な違いに関しては検査法がない。一方、εγδβ-サラセミアで見られる出生時の貧血の重篤化は症例による差が観察された。1)広範囲欠失が確定しているHb Leporeで条件設定を行い、その後確定していないδβサラセミアおよびγδβサラセミア症例を用いて、LightCycler^<TM>(日本Roche)を用いた定量的PCRで、欠失部位の推定を行った。定量的・PCRによる遺伝子量の定量がかなり満足のゆくものであった。2)一方のみの欠失断端をさらに詳しく追いつめて、5kb以内までに絞った。その範囲内に約10セット(入れ子PCR用のプライマーも含めて20個)を作成した。8種類の制限酵素の何れか消化されたゲノムDNAおよび同じ酵素で消化されたpUC18ベクターをDNAリガーゼで結合させた。pUCベクターのcommonプライマーと前述の5kb内に設定されたプライマー間でjunction PCRを行った。PCRプロダクトを電気泳動用にかけ、異常なバンドを拾って、その塩基配列をシーケンサーで決定した。3)その塩基配列と高い相同性を有する配列をゲノムプロジェクトのdatabaseから探し出し、欠失断端を決定した。5)本法を同じく広範囲欠失が疑われるαサラセミアに適用すべく、基礎的検討を行ったが、βグロビン遺伝子群と異なり、反復配列の多いαグロビン遺伝子群(第16染色体短腕末端)では満足な結果が今のところ得られていない。検討を重ねている。以上より、少なくともβグロビン遺伝子群を含む第11染色体短腕では、定量的PCRとjunction PCRを組み合わせた本法が有効であることが確立された。5)他の症例への応用:現在のところ、本法を用いて、数種類のβサラセミアの広範囲欠失の同定を行いつつある。申請書に記載した予定通りの結果が出つつある。