hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マイクロ・ナノテクノロジーを用いた生体機能マイクロデバイスの開発

化学システムをマイクロチップ上に集積化する「化学反応の集積化」の応用として、細胞を利用したシステムについて研究を進めている。マイクロ・ナノデバイスを用いた新規培養・分化制御技術を開発することにより、複数種の細胞をマイクロ空間に高度に組織化させ、微細な組織構造を持った複雑なマイクロ臓器デバイスを実現することを目的としている。本年度は、マイクロチップ内で培養した細胞の分析・観察手法に重点を置いて研究を進めた。具体的には、スウェーデン・ウプサラ大学のMats Nilsson助教授のグループで開発されたパドロックプローブとRolling Circle Amplification(RCA)法を組み合わせた手法を応用し、細胞内の遺伝子解析や遺伝子発現状態を可視化する実験を行った。この方法は個々の細胞内のDNA単一分子や転写産物のその場解析が可能であることから、単一細胞の挙動や刺激をコントロールできるマイクロチップと組み合わせることで、従来不可能であった実験が可能になる。具体的には、マイクロチップ内に、DNAの塩基配列が1塩基異なる2種類のミトコンドリアDNAを持つ細胞(ヘテロプラズミック細胞)を培養し、パドロックプローブとRCA法を用いて細胞内の2種のミトコンドリアの分布を観察した。また、マイクロチップ内に細胞を培養し、DNA損傷を引き起こす薬物を流路の片側にのみ作用させ、その後パドロックプローブとRCA法でミトコンドリアDNAを可視化すると、薬剤が作用した部分のミトコンドリアDNAは検出されなくなるという結果を得た。この部分も通常のミトコンドリア検出色素では染色されることから、DNAの塩基配列の損傷を検出できていると考えられる。この結果はマイクロチップ分野の最大規模の学会「microTAS2006にて」口頭発表に採択された。この一環として、今年度は臓器の重要な構成要素である、血管内皮細胞について培養条件の最適化を行った。マイクロチップ内で細胞を健全な状態で培養する際に問題となると予想され、検討すべき点として、閉じた微小空間であるためぺ培地の供給が必要であること、が挙げられる。すなわち、マイクロチップ空間は、マイクロチャネルを血管とみなすと、微細流路からなる生体類似環境であるため、組織の細胞が血液の供給を受けるのと同様に、マイクロチャネルを通じて新しい培地や酸素等を絶えず供給することが、マイクロチャネル全体で長期間にわたって良好な細胞培養を実現するために不可欠であると言える。しかしながら、マイクロチャネル内の流体は層流となって流れているため、壁面付近に生じた速度勾配により勇断応力が生じる。この勇断応力は、マイクロチャネル底面に接着して生存している細胞に対して引き剥がすような力を加えることとなるため、細胞そのものが剥がれる、あるいは細胞に対してストレスとなることが推測される。マイクロチャネル内の剪断応力は、マイクロ流体制御技術により、精密に制御できるという特長を活かし、この勇断応力がマイクロチャネル中の細胞に対して与える影響を調べた。具体的には、勇断応カストレス下での細胞の形態変化と、産生する物質の変化を調べた。今年度は、昨年度得た血管内皮細胞の培養の最適条件を活用して、さらに、血管疾患の研究への展開も模索した。すなわち、高血圧や糖尿病などが、心筋梗塞その他の血管障害の原因となっているということをモデルとして明らかにするために、血管内皮細胞を培養したマイクロチップに剪断応力や圧力の負荷をかける実験(高血圧モデル)、血液にみたてた培地の成分を変化させ、グルコースを添加した培地(糖尿病モデル)や中性脂肪を添加した培地(高脂血症モデル)を流す実験などを行い、血管内皮細胞の形態や活性状態の変化を観察した。実際、剪断応力を高くした培養条件、高血糖状態の培養条件で、一酸化窒素(NO)の放出の増減が観察でき、生体内で示唆されている血管疾患の発生機構(一酸化窒素の産生が減少して血管の病態が進行する)を裏付ける結果を得ることが出来た。また、その他、血管内皮の細胞が示す変化(放出する物質など)、血管内皮細胞の外側を覆っている平滑筋細胞などとの相互の影響についての研究動向、また、放出する物質の高感度測定などの手法についても調査し、検討した。

具体的には、マイクロチップ内に、DNAの塩基配列が1塩基異なる2種類のミトコンドリアDNAを持つ細胞(ヘテロプラズミック細胞)を培養し、パドロックプローブとRCA法を用いて細胞内の2種のミトコンドリアの分布を観察した。また、マイクロチップ内に細胞を培養し、DNA損傷を引き起こす薬物を流路の片側にのみ作用させ、その後パドロックプローブとRCA法でミトコンドリアDNAを可視化すると、薬剤が作用した部分のミトコンドリアDNAは検出されなくなるという結果を得た。この部分も通常のミトコンドリア検出色素では染色されることから、DNAの塩基配列の損傷を検出できていると考えられる。この結果はマイクロチップ分野の最大規模の学会「microTAS2006にて」口頭発表に採択された。
談話資料から見る北琉球奄美喜界島方言の地域変種の多様性

本研究は、喜界島諸方言の談話資料を収集し、これを研究者及び地域コミュニティが学術研究及び方言の継承活動に利用できる形でアーカイブ化、公開すること、及び、談話資料からの知見をもとに、喜界島方言の方言差について明らかにすることを目的としている。以上の目的のため、上嘉鉄方言、志戸桶方言、小野津方言、荒木方言、中里方言を対象に、自然会話、場面設定会話、童謡の方言訳などの一次資料の収録と、人称代名詞、呼称名詞、指示詞、疑問詞、複文、助詞、文末詞、敬語における方言差を明らかにするための質問調査を行った。また、言語資料の作成を効率化するために、テキストの形態素分析及び意味注釈付与を半自動的に生成するためのツールを作成した。加えて、言語資料を公開するためのホームページを作成しており、近日中にデータを公開する予定である。詳細として、まず、理由を問う疑問詞を用いた疑問文について、他の疑問詞を用いた場合と異なる形態統語的特徴を持つこと、さらに、その特徴に方言差があることが明らかになった。例として、理由疑問文に特有の文末接辞を用い、疑問文末助詞を用いないタイプの方言、理由疑問詞を用いた文でも文末接辞を用いず疑問文末助詞を用いるタイプの方言、文末接辞と疑問文末助詞が共起するタイプの方言が見られた。このうち、理由疑問詞と他の疑問詞との違いが顕著に観察された上嘉鉄方言について、理由疑問詞を含む疑問詞の形態統語的特徴の違いの詳細を論文としてまとめた。今後、方言差の詳細についても報告する計画である。この他、呼称名詞(親族呼称、人名)について、1モーラ助詞が付くか否かで語末の母音長の交替を起こす方言とそうでない方言、人称代名詞の属格形と指示詞が複合した形式を用いる方言とそうでない方言など、様々な方言差を確認しており、一部はすでに学会・研究会などで報告しているが、今後論文にまとめる計画である。本研究の目的は、喜界島(鹿児島県大島郡喜界町)の複数地点の談話資料を収集(録音/録画)し、これを研究者および地域コミュニティが学術研究及び方言の継承活動に利用できる形でアーカイブ化、公開することと、談話資料の分析による知見を踏まえて、喜界島方言の形態統語面(格標示、人称代名詞、文末助詞など)の方言差を明らかにすることの2点である。初年度である平成28年度は、以上の目的のための調査・研究を円滑に行うために、(1)談話資料収集のための具体的方策(ロールプレイ、刺激材料など)の検討、(2)調査地点の選定、及び、(3)談話資料を多目的に利用可能にするための環境整備を行った。(3)に関して、特に、テキストの形態素分析及びグロス(意味注釈)付与を半自動的に生成するためのツールのコア部分を作成した。談話資料の言語学的な利用価値を高めるためには、文字化したテキストを形態素分析し、各形態素のグロスを付記する作業が不可欠である。上記のツールは、予め辞書に登録した語彙情報(形式、意報、語幹と接辞の共起関係、異形態とその条件など)をもとに、テキストをパースし、形態素分析の候補を示すことでグロス付与を補助するものである。平成28年度に作成したコア部分では、対象言語の特性に合わせて、形態音韻的条件によって生じる種々の異形態を適切に処理できるようにした。このツール作成により、今後、談話資料作成と分析を円滑に行う環境整備を進めた。本研究が概ね順調に進展していると判断した根拠は、以下の通りである。(1)初年度としての計画通り、談話資料収集のための具体的方策の検討を行えたため。(2)初年度としての計画通り、調査地点の選定を行えたため。(3)初年度としての計画通り、談話資料を多目的に利用可能にするための環境整備を順調に進めることができたため。特に、(3)に関しては今後の談話資料の作成・分析を円滑に進めるためのグロス付与ツールの作成を順調に行っている。2年度目にあたる平成29年度は、以上の目的のために、(1)喜界島の形態統語面における方言差の質問調査(共通語から方言への翻訳調査)を行い、(2)言語資料を円滑に作成するためのツールの実用化に取り組んだ。(1)について、人称詞/疑問詞/指示詞を中心に調査・分析を行った。特に指示詞の方言差については、喜界島祖語に溯るhuri/ari/uriの三系列を保持している方言(例上嘉鉄集落)とhuri/ariまたはuri/ariの二系列へと変化しさらに人称代名詞との複合形を発展させた方言(例小野津集落、荒木集落)、及びこれらの中間段階の方言(例佐手久集落)があることを報告した。また、以上により、平成30年度において調査研究とする方言差の一部を洗い出し、方言差を観察するための談話資料収集の準備を整えた。(2)に関して、平成28年度にコア部分を作成していたツール(テキストの形態素分析及び意味注釈付与を半自動的に生成するためのツール)に実装化のための機能を追加した。

以上により、平成30年度においてさらに機能を追加して多目的に利用可能な言語資料作成に活用するための準備を整えた。本研究が概ね順調に進展していると判断した根拠は、以下の通りである。(1)本研究の目的である形態統語面における方言差の調査研究について、質問調査を行いその一部について成果報告に至ったため。(2) (1)により、本研究の主眼である談話資料収集・分析に際してターゲットとなる項目の洗い出しを行えたため。(3)前年度に引き続き、談話資料を多目的に利用可能にする形態素分析・意味注釈付与の作業を円滑に行うためのツールの実用化を進めることができたため。本研究は、喜界島諸方言の談話資料を収集し、これを研究者及び地域コミュニティが学術研究及び方言の継承活動に利用できる形でアーカイブ化、公開すること、及び、談話資料からの知見をもとに、喜界島方言の方言差について明らかにすることを目的としている。以上の目的のため、上嘉鉄方言、志戸桶方言、小野津方言、荒木方言、中里方言を対象に、自然会話、場面設定会話、童謡の方言訳などの一次資料の収録と、人称代名詞、呼称名詞、指示詞、疑問詞、複文、助詞、文末詞、敬語における方言差を明らかにするための質問調査を行った。また、言語資料の作成を効率化するために、テキストの形態素分析及び意味注釈付与を半自動的に生成するためのツールを作成した。加えて、言語資料を公開するためのホームページを作成しており、近日中にデータを公開する予定である。詳細として、まず、理由を問う疑問詞を用いた疑問文について、他の疑問詞を用いた場合と異なる形態統語的特徴を持つこと、さらに、その特徴に方言差があることが明らかになった。例として、理由疑問文に特有の文末接辞を用い、疑問文末助詞を用いないタイプの方言、理由疑問詞を用いた文でも文末接辞を用いず疑問文末助詞を用いるタイプの方言、文末接辞と疑問文末助詞が共起するタイプの方言が見られた。このうち、理由疑問詞と他の疑問詞との違いが顕著に観察された上嘉鉄方言について、理由疑問詞を含む疑問詞の形態統語的特徴の違いの詳細を論文としてまとめた。今後、方言差の詳細についても報告する計画である。この他、呼称名詞(親族呼称、人名)について、1モーラ助詞が付くか否かで語末の母音長の交替を起こす方言とそうでない方言、人称代名詞の属格形と指示詞が複合した形式を用いる方言とそうでない方言など、様々な方言差を確認しており、一部はすでに学会・研究会などで報告しているが、今後論文にまとめる計画である。今後の推進方策は、以下の3点である。(1)談話資料の収集と分析ー平成28年度に検討・選定した方法により、談話を収集(録音/録画)し、録音した音声を話者とともに聞きながら発話と意味の確認作業を行う。必要に応じて適宜補完的に質問調査を行い形式と機能を確認する。(2)談話資料作分析の円滑化ー平成28年度にコア部分を作成したグロス付与ツールを補完することで、談話資料の分析の円滑化を行う。(3)談話資料の分析による各方言の形態統語的特徴の把握ー談話資料からの知見を踏まえ、各地域ごとに、形態統語的特徴のリストを作成する。並行して、形態統語面の方言差を包括的に記述するために必要なデータの不足部分を洗い出す。特に、談話資料だけでは特定の形式/構文が(特定の文脈で)当該方言において用いられないという否定的な証拠は得られないため、質問調査で確認すべき項目をリストアップする。今後の推進方策は以下4点である。
インビトロ血液脳関門システム構築による虚血性脳細胞傷害の病態解析

骨髄間葉系幹細胞(MSC)の血液脳関門(BBB)通過機構を明らかにするために、脳微小血管内皮細胞(BMEC)よりなるインビトロBBBモデルを用いて検討を行った。その結果、MSCがBMEC層の細胞間隙を通過する「現場」をリアルタイムイメージングにより捉えることに成功した。また、MSC通過中のBMECでのタイトジャンクション構成タンパクClaudin-5の動態と細胞内カルシウム動態を同時にリアルタイム観察するための実験系の構築に成功した。骨髄間葉系幹細胞(MSC)の静脈内投与が、脳梗塞などによる脳障害を改善することが報告されているが、MSCによる脳保護作用、特に、静脈内投与されたMSCが血液脳関門(BBB)を通過し脳傷害部位に集積するメカニズムについては不明のままである。そこで本研究では、インビトロBBBモデルと培養脳スライスを活用することにより、MSCのBBB通過機構と脳傷害部位集積機構を解明することを目的としている。平成23年度は、脳微小血管内皮細胞(BMEC)よりなるインビトロBBBモデルを用いて、MSCのBMEC層通過メカニズム解析のための実験系を構築した。さらに、MSCとBMECを蛍光標識することにより、MSCがBMEC層の細胞間隙を通過する「現場」をリアルタイムで捉えることに成功し、論文として報告した。一方、培養脳スライスを用いた脳傷害部位集積機構の解析系構築は当初計画通りには進まなかった。MSC-BMECリアルタイムイメージング系を活用し、種々の蛍光標識タンパク質および蛍光イメージングプローブタンパク質を用いることにより、MSCのBBB通過機構に関して先端的かつ独創的な研究成果が得られることが期待されたため、平成24年度の研究では本イメージング系を用いたBBB通過機構の解析に焦点を絞り研究を進めた。蛍光タンパク質で標識したクロージン-5とカルシウムイメージング用蛍光プローブ分子を用いて、MSC通過中のBMECでのタイトジャンクション分子動態と細胞内カルシウム動態をリアルタイム観察するための実験系構築に取り組み、それらタンパク質をBMECに共発現させリアルタイムイメージングを行う実験系の構築に成功した。多分化能を有する骨髄間葉系幹細胞(MSC)は、その採取が容易であり、かつ培養技術が確立している。また、自家移植が可能なことから拒絶反応を考慮する必要もないため臨床への応用が期待されている。実験動物を用いた研究から脳梗塞後の神経障害に対する有用性が示されており、ヒトにおいてもその有用性が報告されている。静脈内に投与されたMSCの脳保護作用機構の全容を解明するためには、MSCの1)血液脳関門(BBB)通過機構、2)脳傷害部位集積機構について、その分子メカニズムが明らかにされることが必要である。。本研究では、MSCのBBB通過機構と脳傷害部位集積機構の解明を目的として、研究期間内に、(1)インビトロBBBモデルを応用したリアルタイムイメージング系の構築と、それを用いたMSCおよびBMECの細胞動態解析、(2)BMECにおけるタイトジャンクション構成タンパクClaudin-5の動態と細胞内カルシウム動態の同時イメージング系の構築、(3)MSCの脳障害部位遊走の評価系構築、を行うことを計画したが、初年度の研究において、(1)の研究に比べ、(3)の研究に遅れが生じた。(1)のリアルタイムイメージング系を活用し、種々の蛍光標識タンパク質および蛍光イメージングプローブタンパク質を用いることにより、MSCのBBB通過機構に関して先端的かつ独創的な研究成果が得られることが期待できたため、以後の研究では、(1)および(2)の研究に注力した。その結果、MSCが脳微小血管内皮細胞(BMEC)層の細胞間隙を通過する「現場」をリアルタイムイメージングにより捉えることに成功した。細胞治療を行う際に利用が期待されている細胞の一つとして骨髄幹細胞が挙げられる。しかし骨髄幹細胞の血液脳関門での挙動については未だ詳細は不明である。このため、本年度はインビトロ血液脳関門モデルを用いて血液脳関門における骨髄幹細胞の分子・細胞動態の解析を行った。まず、これまでに作製したインビトロ血液脳関門モデルが生体での血液脳関門のモデルとして適切であるか検証した。血液脳関門のバリア機能を評価するための方法として多孔質膜を介した電気抵抗値ならびに蛍光物質の透過性を指標とした。高いバリアー機能を有していることを確認し、この系が血液脳関門の機能を評価するために適したモデルであると考えられた。このインビトロ血液脳関門モデルに骨髄幹細胞を導入し、血管内皮細胞層を移動する骨髄幹細胞を視覚化した。骨髄幹細胞を遊走させるためにこれまで骨髄幹細胞について遊走能を有すると報告されている血清を用いた。また、血管内皮細胞を移動する骨髄幹細胞を観察するために血管内皮細胞はEGFPを発現し緑色蛍光を呈するグリーンラットから採取したものを用い、骨髄幹細胞は赤色蛍光試薬により標識した。その結果、骨髄幹細胞が血管内皮細胞層と多孔質膜の間に遊走し、更に多孔質膜の下面に移動しているのを確認した。

インビトロ血液脳関門を透過する骨髄幹細胞の動画取得を行った。骨髄幹細胞は血管内皮細胞層と多孔質膜の間に遊走し、更に多孔質膜の下面へ移動することを静止画のみでなく、リアルタイムイメージングが可能な共焦点顕微鏡を用いて動画で確認できた。培養脳スライスを用いた脳傷害部位集積機構の解析系構築は当初計画通りには進まなかった。MSC-BMECリアルタイムイメージング系を活用し、種々の蛍光標識タンパク質および蛍光イメージングプローブタンパク質を用いることにより、MSCのBBB通過機構に関して先端的かつ独創的な研究成果が得られることが期待されたため、平成24年度の研究では本イメージング系を用いたBBB通過機構の解析に焦点を絞り研究を進めた。着実に研究は進展しているが、実験に時間を要するために1年研究期間を延長することにした。ほぼ計画通り進み、その結果を査読のある英文誌に投稿し、受理されて印刷された。蛍光タンパク質で標識したクロージン-5とカルシウムイメージング用蛍光プローブ分子を用いて、MSC通過中のBMECでのタイトジャンクション分子動態と細胞内カルシウム動態をリアルタイム観察するための実験系構築に取り組み、それらタンパク質をBMECに共発現させリアルタイムイメージングを行う実験系の構築に成功した。今後はこの実験系を用いてさらに血液脳関門の機能解析および脳虚血時の動態について解析を進める予定である。次年度は、骨髄幹細胞の神経保護作用の検討、神経・アストロサイト培養系と骨髄幹細胞を共培養させた際の骨髄幹細胞の変化を検証する。インビトロ血液脳関門システムを構築し、その系を用いて虚血性脳細胞傷害の病態について解析中であるが、予想以上に実験に時間を要している。そのために、未使用額が発生し、補助事業期間を延長することにした。未使用額は、次年度の研究の試薬費、ガラス器具費、培養液費など実験に要する消耗品費として使用する。本年度の計画が予想以上に順調に進み、予定していた物品費が予想以上に少なくて目標を達成することができた。次年度(平成24年度)に使用する予定の研究費と平成24年度に請求する研究費を合わせて、主に物品費として使用する。培養細胞系のための培養液、実験動物代、試薬費、ガラス器具などの購入のために研究費を使用する計画である。
カミキリは樹木が発する振動を触診して産卵するのか:振動感覚の神経行動学的研究

本課題は、昆虫の鋭敏な振動感覚系に着目し、マツの害虫であるマツノマダラカミキリをモデルとする。本種は振動に対してフリーズ反応等を示し、その感度は低周波域で高いことを明らかにした。さらに、低周波域の振動を受容できる感覚器が脚にあることも特定した。カミキリの産卵に適する衰弱したマツは、低周波域を含む自発振動を発する。本種はこの自発振動を感知し、産卵する樹木を選択している可能性が示唆された。昆虫は一般に振動に対して敏感であることが知られているが、振動に対する行動反応性及び振動検知のための感覚受容器の知見はコウチュウ目において極めて少ない。マツノマダラカミキリ成虫を用いて、この問題に取り組んだ。まず、振動刺激の周波数と振幅を変えて与えたところ、本種が静止している時には低周波成分(1kHz以下)に対して自発運動の停止(フリージング)や発音などの行動反応を敏感に示した。並行して、脚部の組織学的観察をしたところ、感覚細胞群が細長い弦を介して脛節基部に付着する腿節内弦音器官をコウチュウ目で初めて同定した。さらに、腿節内弦音器官を全ての脚について除去した個体は、低周波の振動刺激に対するフリージングを歩行中に示さなかった。以上の結果から、腿節内弦音器官が低周波の振動を受容することが明らかになった。昆虫は一般に振動に対して敏感であるが、振動に対する反応性及び感覚受容器の知見はコウチュウ目において極めて少ない。今年度はマツノマダラカミキリ成虫(以下、本種)を用いて振動反応性の解明と寄主木であるクロマツ(以下、マツ)の振動解析を進めた。樹木を伝わる振動によって、本種は捕食者回避や配偶者認識を行う。また、産卵に好適な衰弱したマツは振動を自発的に発することから、この自発的振動に基づいて本種は寄主木を認識する可能性がある。振動による産卵選択性を調べるために、加振機を用いて切断したマツ幹に一定周波数の振動を与えたところ、振動の振幅に依存して産卵は抑制された。次に、記録したマツの自発的振動をマツ切断幹に与えて、本種の産卵行動を連続的に観察した(プレイバック試験)。振動を与えない条件と比較した結果、産卵孔形成や産卵管挿入等の行動について頻度や時間に増減が見られた。マツ材線虫病により衰弱したマツにおいて、仮道管の気泡形成に起因する微小な高周波(20kHz以上)の振動発生は知られているが、本種が感受性を示す低周波の振動に関する報告は無い。今年度、マツで振動測定を行ったところ、低周波(50-200Hz)の自発的振動が衰弱期後半に発生することを確認できた。本種はマツの自発的振動の周波数帯域と振幅を含む振動刺激に反応を呈したことから、衰弱したマツの自発的振動を感知して産卵選択を行う可能性が示された。マツノマダラカミキリは肢に振動受容器を持ち,振動刺激によって驚愕反応等の回避行動を示すことが今までの研究で明らかになっている。今年度は振動がマツノマダラカミキリの産卵行動と摂食行動に与える影響を明らかにした。振動によってマツノマダラカミキリの産卵行動と摂食行動が抑制されることを明らかにした。実験室内において、クロマツ小丸太の1本に100Hzのサイン波を与え、他の1本は振動を与えずに、6頭のメス(3反復)を容器に放して産卵選択試験を一晩おこなった。その結果、振動を与えられたマツにおける産卵数はゼロで,振動のないマツにおいては平均で15.0となった。次に、同様の実験条件下で摂食選択試験をおこなった。振動を与えられたマツでは摂食行動に変化がみられ、振動のないマツと比べて摂食面積が増加した。以上の結果から、振動を樹木等に発生させてマツノマダラカミキリの行動を制御し、産卵の阻害によって行動制御をおこなうことが可能であることが示された。例えば,景勝地・公園等のマツ名木毎に高出力の振動発生装置を取り付けてマツを守ることができ,生態系への影響を最小限にした被害防止が可能となるだろう。振動を用いた行動制御技術は,カミキリムシだけでなく,振動に感受性のあるコウチュウや他の害虫種にも広く適用可能となる。
書き換えシステムに基づく発展的プログラミングの研究

プログラムの漸増的な発展過程で保存される性質を明らかにするため,書き換えシステムの変形・組合せで保存される性質の解析を中心に研究を進め,以下の成果を得た。1。書き換えシステムの分解・合成書き換えシステムの発展過程における不変な性質を明らかにするため,型情報の変更が書き換えシステムの停止性や合流性に及ぼす影響を理論的に解析した。さらに、自然なソ-ト付けによるシステムの分解可能性という概念を導入することで,直和システムのモジュラ性と同様な性質が成り立つことを明らかにした。2。木持ち上げ順序による停止性2つの項書き換えシステムの合併の停止性を導く手法として木持ち上げ順序を提案した。これは,従来知られていたダミ-削除による停止性判定手法を発展させたものであり,階層構造をもつシステムの解析にも有効な手法である。3。優先順位付き書き換えシステムの意味論関数型言語の計算モデルである優先順位付き書き換えシステムの操作的意味論を与えた。さらに,優先順位付き書き換えシステムの効率的な計算方法について解析を行い,強逐次性のクラスが決定可能であること,及び,そのクラスにおいては,インデックス書き換えが正規化戦略であることを示した。1。2。3。
国際貿易、観光、環境に関する経済理論モデルの構築とその分析

本年度の研究計画は、交付申請書に記載の通り、(1)モデルを用いた現実的政策課題の検討、(2)同モデルの精緻化である。(1)については、観光税と他の政策手段の比較検討が主目的であった。(1)については、当初は観光税と労働所得税など他の租税政策との比較を想定したが、国際学会での成果報告の際、当該モデルの他の現実的政策課題(統合型リゾート(IR)施設の規制)への適用に関する重要な示唆を得られたため、本モデルを用いて、IR施設の入場料規制とライセンス規制を比較検討することとした。具体的には、当該国におけるIRサービス市場における需要側が、当該国の居住者と外国人観光客で構成され、供給側は、それらサービスを供給する少数の私企業から成る寡占市場モデルを構築し、政府が当該国の経済厚生を最大化にすべく入場料の水準を決めるケースとライセンス数を選択するケースを比較し、どちらがより優れた政策手段となるかを検討した。(2)については、前年度に構築した理論モデルが、完全な公企業と私企業が競争する最も単純な設定であるため、より現実的な設定である「部分的に民営化された企業」が存在するモデルへと拡張・分析を試みた。また、申請書にも記載したように、数値解析ソフトウェアを用いたシミュレーション分析を行った。今度は、より明確な結果を導出することを目指す。本年度の研究成果としては、前年度の成果をまとめた論文を、西海岸経済学会(Western Economic Association International)第93回年次大会(2018年6月)において報告した。また、得られたコメントを基に論文の修正を施し、立正大学『経済学季報』誌に公刊した。国際貿易と観光に関わる理論研究を3つの側面から発展させることを目的とする本研究課題における本年度の研究実施計画の主目的の一つは、第2の側面である「構築されたモデルを応用し、現実的政策課題を検討する」ことであった。当初の計画では、交付申請書の研究実施計画欄(2-1)(2-2)にも記載の通り、観光税と労働所得税を一般均衡モデルの枠組みで比較検討することを想定していたが、上記「研究実績の概要」欄でも述べた事情により、入場料(観光税)とライセンスによる規制を比較検討することとなった。従って、現時点では、労働所得税と観光税の比較検討には至っておらず、そのような評価とした。また、研究実施計画欄(2-3)における数値解析ソフトウェアを使用したシミュレーション分析については、「部分的に民営化された」公企業と私企業が競争するモデルを用いた分析を実施している。先述のとおり、本年度においては、(1)前年度に構築したモデルを用いた現実的政策課題の検討、(2)同モデルのさらなる精緻化を実施した。しかしながら、当初の計画である、観光税と労働所得税の比較検討は実施できなかった。従って、まずは、完全競争市場の枠組みで労働供給を内生化した一般均衡モデルを構築し、観光税と労働所得税の比較分析を進めたい。さらには、本研究課題における第3の側面である「環境への影響」については、可能な限り早い段階で、観光需要の増大や政策手段の変化が、一国の環境水準と経済厚生に与える影響について分析を進めたい。本年度は、研究期間を通じて用いる分析の基盤となる理論モデル構築の準備段階として、「研究実施計画」に挙げた文献資料を用いて、国際貿易論・観光経済学の各分野において、貿易と観光の関係性に関わる既存の理論研究を包括的に検討した。その際、当該分野においては、完全競争の枠組みに加えて、不完全競争の枠組みで分析された研究が多いことから、今年度は、不完全競争市場において、観光需要が当該国の経済厚生に与える影響について分析を進めた。具体的には、当該国における観光サービス市場における需要側が、当該国の居住者と国境を越える外国人観光客で構成され、他方、供給側は、それらサービスを供給する少数の企業から成る寡占市場を想定した。その上で、観光ブームが当該国の経済厚生に与える影響について検討した。特に、観光サービス市場が、通常の寡占市場のケースと公企業と私企業が競争する混合寡占市場のケースについて、観光ブームの厚生効果と最適な観光税率を特徴付けた。得られた結論は以下の通りである。当該国にとっての最適な観光税率は、通常の私企業による寡占市場の場合は、特定の水準で与えられる一方で、混合寡占市場の場合は、私企業の利潤最大化条件を満たす任意の水準によって与えられる。外国人観光客数の増加が当該国の経済厚生に与える影響については、通常の私企業による寡占市場では、観光税が非負の水準に与えられている限りプラスになるが、混合寡占市場のケースでは、観光税率が低い水準に設定され、かつ、私企業の供給規模が市場全体に比べて十分に小さい場合、マイナスになり得る。上記研究成果を"Tourism Tax, Tourism Boom and Privatization in a Mixed Oligopoly"として論文にまとめ、Western Economic Associations Internationalで報告を行う予定である。本研究課題の目的は、国際貿易と観光に関わる理論研究を3つの側面から発展させることにある。本年度の研究実施計画の主目的の一つは、第1の側面である「分析の基盤となる理論モデルを精緻化し、観光需要の増大と一国の経済厚生の改善を両立させるような経済的諸要因の変化とそれが可能となる経済環境を特徴付ける」ことであり、そのような目的はある程度達成されたものと考えられる。

(1)については、観光税と他の政策手段の比較検討が主目的であった。(1)については、当初は観光税と労働所得税など他の租税政策との比較を想定したが、国際学会での成果報告の際、当該モデルの他の現実的政策課題(統合型リゾート(IR)施設の規制)への適用に関する重要な示唆を得られたため、本モデルを用いて、IR施設の入場料規制とライセンス規制を比較検討することとした。具体的には、当該国におけるIRサービス市場における需要側が、当該国の居住者と外国人観光客で構成され、供給側は、それらサービスを供給する少数の私企業から成る寡占市場モデルを構築し、政府が当該国の経済厚生を最大化にすべく入場料の水準を決めるケースとライセンス数を選択するケースを比較し、どちらがより優れた政策手段となるかを検討した。(2)については、前年度に構築した理論モデルが、完全な公企業と私企業が競争する最も単純な設定であるため、より現実的な設定である「部分的に民営化された企業」が存在するモデルへと拡張・分析を試みた。また、申請書にも記載したように、数値解析ソフトウェアを用いたシミュレーション分析を行った。今度は、より明確な結果を導出することを目指す。本年度の研究成果としては、前年度の成果をまとめた論文を、西海岸経済学会(Western Economic Association International)第93回年次大会(2018年6月)において報告した。また、得られたコメントを基に論文の修正を施し、立正大学『経済学季報』誌に公刊した。国際貿易と観光に関わる理論研究を3つの側面から発展させることを目的とする本研究課題における本年度の研究実施計画の主目的の一つは、第2の側面である「構築されたモデルを応用し、現実的政策課題を検討する」ことであった。当初の計画では、交付申請書の研究実施計画欄(2-1)(2-2)にも記載の通り、観光税と労働所得税を一般均衡モデルの枠組みで比較検討することを想定していたが、上記「研究実績の概要」欄でも述べた事情により、入場料(観光税)とライセンスによる規制を比較検討することとなった。従って、現時点では、労働所得税と観光税の比較検討には至っておらず、そのような評価とした。また、研究実施計画欄(2-3)における数値解析ソフトウェアを使用したシミュレーション分析については、「部分的に民営化された」公企業と私企業が競争するモデルを用いた分析を実施している。先述のとおり、本年度においては国際貿易と観光の関係性に関わる既存の理論研究の包括的なレビューを通じて幅広い視点から検討を行った。今後は、研究計画にも記述したように、不完全競争モデルに加えて、完全競争市場の枠組みを用いてモデル分析を行うことで、市場の競争形態による観光ブーム(観光需要の増大)の厚生効果の比較・検討を行う。加えて、観光税・補助金を始めとする国際貿易・観光に関わる政策手段を明示的に導入した上で、観光ブームとの政策効果の相違点などについても検討する。先述のとおり、本年度においては、(1)前年度に構築したモデルを用いた現実的政策課題の検討、(2)同モデルのさらなる精緻化を実施した。しかしながら、当初の計画である、観光税と労働所得税の比較検討は実施できなかった。
強磁場中性子星モデルを用いた巨大フレア現象の解明

軟ガンマ線リピーターにおける巨大フレア現象で観測された準周期的振動と系統的に調べた中性子星クラスト領域のズレ振動数を比較することで、原子核飽和パラメータに制限を与えることに成功した。地上における原子核実験とは、全く質の異なる天体観測からの制限であり、宇宙物理学のみならず原子核物理学にも資する成果である。さらに、低質量中性子星の質量公式の導出にも成功した。中性子星を上手く記述する原子核飽和パラメータの組み合わせの発見により、中性子星の観測から原子核物理学を直接議論できることが可能となった。中性子星内部は地球上では実現が困難な程、超高密度状態となる為、極限状態における物理を調べる上で中性子星は絶好の「実験室」であると言える。特に、軟ガンマ線リピーターで観測された巨大フレア現象に伴う準周期的振動は、中心天体として考えられる中性子星の振動に強く関連している。これは、中性子星の振動を直接捉えた初の事例かもしれない。そこで、現実的な状態方程式を用いてクラスト領域でのズレ振動を相対論的枠組みで計算し、原子核物質飽和パラメータに対する依存性を調べた。そして、観測された準周期的振動数と比較することで、この飽和パラメータに制限を与えることに成功した。天体観測を用いた原子核パラメータへの制限であり、地上における原子核実験で与えられる制限とは全く質の異なる制限である。そういう意味で、本研究は宇宙物理学のみならず原子核物理にも資するものである。また、これまで多くの研究で用いられていた、ズレ振動数を特徴づける物理量であるズレ弾性率は、電子の分布を一様と仮定したものであるが、実際は原子核の存在(陽子の局在)により電子も非一様な分布となると考えられる。そこで、この効果を取り入れたズレ弾性率を用いて、ズレ振動の解析も行った。この結果、用いた状態方程式によらず振動数は6%小さくなり、上述の原子核飽和パラメータに関する制限は15%程度シフトすると期待される。さらに、中性子星から放出される重力波に励起される電磁波の解析や低質量中性子星に関する質量公式の導出にも成功している。今後、低質量中性子星が観測されれば、我々の見つけた質量公式を通して原子核パラメータへの制限も可能かもしれない。軟γ線リピーターで発見された準周期的振動は、中心天体である中性子星の振動と密接に結びつくと考えられる。一方、中性子星の内部構造に関する統一的な見解は未だ得られていない。その主な原因は、星内部が超高密度となりそのような状況下での物性を地上において実験的に決める事が困難であることによる。そこで、我々は、観測された中性子星の準周期的振動を用いて、中性子星物質の状態方程式への制限の可能性に迫った。この際、標準核密度より高密度となるコア領域の状態方程式の不確定性を取り除くため、中性子星のクラスト領域を星表面から積分する事で構築した。クラストを構築するにあたり、現象論的な状態方程式を用いた。ここで、地上実験からは制限の難しい、非圧縮率(K0)と核物質の対称エネルギーに関するパラメータ(L)の2つをパラメータとし、星の半径や質量を系統的に変えながら、クラストにおけるズレ振動数を解析した。その結果、ズレ振動の基本振動数は、K0依存性が小さい事が分かった。さらに、観測された最低振動数と、理論的に予想される最低振動数を比較する事で、L>50MeVと言うLに関する天文観測からの制限を与えた。これは、地上実験とは全く別次元の観測的制限であり、非常にインパクトのある結論である。一方で,クラストのより内側では、中性子の漏れ出しと呼ばれる現象が起こると考えられている。この場合、原子核から漏れ出した中性子は超流動として振る舞うと思われる。そこで、中性子超流動のズレ振動に対する影響を調べた。その結果、超流動の効果で振動数は大きくなる事が分かった。また、理論的に予想される幾つかの振動数を用いて、軟γ線リピーターで観測された準周期的振動数との対応を調べることで、Lに対するより厳しい制限を得ることにも成功した。軟γ線リピーターで観測された準周期的振動という天文観測を用いて、地上実験では決定の困難な原子核状態方程式に対する制限を与えるという快挙は、宇宙物理学のみならず原子核の分野にも非常にインパクトのある成果である。同じような動機のもと、軟γ線リピーターでの観測事実を用いた核物質状態方程式への制限をアメリカのグループも行っているが、星の振動解析に於いては、我々の手法の方が一歩先を進んでいると言える。一方で、磁気的な振動に関する解析に於いては、2次元波動方程式を解く為の数値コードを作成した。まだ、テスト段階ではあるが時間発展を調べたところ、本研究対象である磁気的な非軸対称振動は軸対称振動の場合と異なり、離散スペクトルの傾向が見られる。今後より慎重な解析を行っていきたい。強磁場中性子星に於ける磁気的振動に関しては、ほとんどの解析が軸性軸対称振動を対称としたものである。

しかし、軟γ線リピーターにおいて発見された準周期的振動を説明する事には、未だ成功していないことを考えると、これまでの解析を超えた新たな挑戦が必要である。そこで、我々は軸性非軸対称振動と極性軸対称振動に着目する。これまでのテスト計算の結果、軸性非軸対称振動は離散スペクトルである可能性がある。今後、詳細な解析を行い、スペクトル特性を見極めるとともに、新たな振動モードである軸性非軸対称振動の振動数から観測事実の理論的な解明に迫る。更に、現在日本を含め世界中の協力のもと建設/稼働中の重力波望遠鏡に於ける一つの波源候補として強磁場中性子星が適当かどうかを調べるつもりである。そのために、密度変化を伴う極性振動の解析を行い、放出重力波のエネルギーを見積もる予定である。平成24年度に所属機関を異動したため、計画していた国際会議に出席することができず、未使用金が発生してしまった。この平成24年度の未使用金を用いて、平成25年度に開催予定の国際会議に参加する予定である。また、平成25年度分の研究費に関しては、当初の計画通り、上述以外の国際会議にも積極的に参加し成果を広く宣伝するとともに情報交換も行う予定である。また、データ解析の為に幾つかのソフトウエアを購入すること、より理解を深める為に宇宙物理学関連の図書の購入も予定している。さらに、これまで共同研究を続けてきたココタス教授(ドイツ/テュービンゲン大学)との研究打合せのためドイツ訪問も考えている。この他、日本国内に於いては、秋と春に日本天文学会、日本物理学会への出席を予定している。
アミノ酸トランスポーターを標的とする血管障害に対する新規治療戦略

アミノ酸トランスポーターLAT1はラットの血管平滑筋細胞および頚動脈に発現しており、平滑筋細胞の増殖と生存に必要であること、頚動脈の血管障害後内膜肥厚に深くかかわっていることがラットやマウスを用いた動物実験で明らかにすることができた。さらに慢性血管障害である動脈硬化や大脳虚血病変の形成にかかわっていることを現在モデル動物を使って検証中である。これらの研究により各種血管障害におけるLAT1の重要性が明らかになりつつある。粥状動脈硬化病変の形成に対するアミノ酸トランスポーターLAT1の役割を検討する目的で以下の実験を行った。1.培養血管平滑筋細胞(VSMC)におけるLAT1の発現の検討:通常の条件(DMEM+10%FBS)で培養したラット大動脈VSMC(RASMC)におけるLAT1の発現を抗LAT1特異抗体を用いてWestern blotによって検討したところ、非還元下で125kDの位置に、還元下で32kDの位置に(4F2hcとのヘテロダイマーが外れるため)、LAT1の特異バンドが認められ、本細胞においてLAT1が発現していることを確認した。2.培養血管平滑筋細胞(VSMC)の増殖に対するLATの関与に関する検討:5%の血清刺激によっておこるRASMCの増殖に対して、LAT阻害薬であるBCHを添加したところ、濃度依存的に(5,10,25mmol/L)、添加2,4日後の細胞数の増加が抑制された。また、細胞生存性をMTT assayで評価したところ、同じBCHの濃度で(5,10,20mmol/L)細胞生存は低下した。このことから、LAT1はRASMCの増殖と生存性に必要なトランスポーターと考えられる。3.バルーン傷害後内肥厚におけるLATの発現に関する検討:雄性Wistarラットの頸動脈を採取し、上記実験1と同様にLAT1の発現をWestern blotで調べた結果、190kDの位置(非還元下)と75kDの位置(還元下)にLAT1のバンドが認められた。また、総頸動脈にバルーン傷害を施し、形成される新生内膜におけるLAT1 mRNAの発現をreal time PCRによって調べた結果、障害3,7,14日後にLAT1 mRNAの発現が増加することを確認した。粥状動脈硬化病変の形成に対するLAT1の役割を検討する目的で、以下の実験を行った。1.ラット培養血管平滑筋細胞RAVSMC)の増殖に対するLATの関与に関する検討:昨年報告したLAT阻害薬BCHによるRASMC生存性の低下と関連して、定量的ELISAによってアポトーシスの関与を検討した。その結果、BCH5,10,20mmol/Lを添加してもRASMCのアポトーシスに有意な増加は見られなかった。一方、BCHによる細胞周期に対する影響をFACS解析で検討したところ、5%の血清刺激に対して、BCH20mmol/Lを同時に添加した細胞では、GO-Gl期の細胞の割合が40%→55%に増加し、S-G2-M期の細胞の割合は60%→45%に低下した。すなわち、BCHの投与によって細胞周期は遅延するが、アポトーシスに対しては明らかな影響はない、との結果であった。2.培養血管内皮細胞の増殖に対するLATの関与に関する検討:5%の血清刺激によるウシ頚動脈内皮細胞(BAEC)の増殖に対して、BCH10,20mmol/Lを同時添加し、3日後の細胞数を調べたところ、平滑筋細胞と同様、いずれの濃度でもBAECの細胞増加は抑制された。3.バルーン傷害後内膜肥厚に対するLAT1阻害薬の効果についての検討:ラットの総頸動脈にバルーン傷害を施し、同時にLAT阻害薬BCHをpluronic gelを用いて傷害部位局所に投与した結果、傷害14日後の血管の新生内膜部分の面積は、BCH 100mg/kgの投与によって対照群(vehicle投与群)の約40%に低下した。さらに、新生内膜部分での細胞増殖をBrdU取り込み実験で確認した結果、同様にBrdUの取り込みは対照群の約40%に低下した。すなわち、LATを阻害することによって、バルーン傷害による内膜増殖は抑制されることが判明した.1. LAT1欠損マウスを用いた血管障害後内膜肥厚に対するLAT1の効果の検討1114週齢のLAT1ヘテロ欠損マウスの大腿動脈にワイヤー障害を施すことで内膜肥厚を誘発し、処置28日後の血管内膜肥厚の状態を対照マウス(C57BL/6)と比較した。その結果、内膜/中膜比は対照群2.05に対し欠損群1.65で、有意差は認められなかった。今後さらに数を増やし検討する予定である。2. ApoE欠損マウスの動脈硬化病変の形成におけるLATの役割に関する検討LAT1欠損マウスホモ接合体は胎生致死となるため、ApoE欠損マウスとの掛け合わせによって、生後の血管障害病変をみることは不可能である。そこで、ヘテロ接合体とのバッククロスを進めている。今年度中には実験を行うほどマウスを増やすには至らなかった。

今後、掛け合わせを進め、必要な数が揃ったら、2048週齢の時点で大動脈展開標本と胸部上行大動脈起始部の粥腫面積と病変の質的評価を行う予定である。3.虚血による大脳白質障害モデル(ラット)の構築当初ラット頚動脈を両側結紮することで大脳虚血病変の作成を試みたが、実際には白質病変をうまく作成するには至らなかった。そこで手法を変えて、C57BL/6マウスの両側頚動脈を極小コイルで狭め、血流を低下させるよう試みた。その結果、Kluver-Barrera染色でcorpus callosumその他の関心領域に脱髄所見を認め、虚血白質病変ができたと考えられた。今後、本モデルを用いてLAT1の発現、分布等を解析する予定である。
次世代シーケンサーを用いたクロマツにおけるマツノザイセンチュウ感受性遺伝子の探索

本研究は、マツノザイセンチュウ(Bursaphelenchus xylophilus)感染時にクロマツ(Pinus thunbergii)が自ら病徴の悪化を導くネガティブな生体防御反応とその反応を誘導する遺伝子に着目し、次世代シーケンサーを用いた遺伝子型決定法(Genotyping-by-sequencing)を利用した遺伝解析から、マツノザイセンチュウ抵抗性遺伝子の特定を行う。平成29年度は、平成28年度に作成した抵抗性家系136個体のGBSライブラリーをもとに取得した次世代シーケンサーのデータを利用して、クオリティーコントロール解析から各個体の塩基配列情報についてクオリティーチェックを行い、GBS解析ソフトを利用して一塩基多型(SNP)の検出を行った。クオリティーコントロール解析において、クオリティーが低い1個体及び遺伝子型情報に欠測値が多い7個体、さらに抵抗性家系の親個体1個体を除いた計127個体を遺伝解析の対象個体とした。さらに127個体の多型情報をもとに、メンデル遺伝の理論値に合致する合計6,881個のSNP情報を取得した。さらに得られた多型情報を用いて、高密度連鎖地図の構築と接種試験によって得られた形質情報を用いた連鎖解析を試みた。高密度連鎖地図の構築では、LODスコアが18以上かつ200以上のマーカーで構成される連鎖グループは12となり、クロマツの基本染色体数に収束し、連鎖群あたりの平均マーカー数は457個となった。構築した高密度連鎖地図情報と接種試験の形質情報をもとに連鎖解析を行った結果、第10連鎖群において感受性形質に寄与するLODスコア6以上の領域を検出した。平成28年度に構築する予定であった高密度連鎖地図は、次世代シーケンサーで分析するためのGBSライブラリーの構築に多大な時間を要したため、シーケンス情報の取得のみとなり、高密度連鎖地図の構築に着手することができなかった。平成29年度では、高密度連鎖地図の構築と形質情報を利用した遺伝統計解析を進めることができ、本研究課題における当初の計画をおおむね順調に進めることができた。平成29年度に構築した高密度連鎖地図については、連鎖地図の作成に用いる各個体の遺伝子型情報に多くのエラーが含まれているため、それらのエラーを修正した上でより精度の高い連鎖地図を構築する。また、既存のクロマツ連鎖地図情報との比較及び統合を行うためにアンカーマーカーとしてマイクロサテライトマーカーを用いたジェノタイピングを行い、連鎖地図情報への適用を行う。連鎖解析より感受性形質との関連が検出された領域については、マーカーの塩基配列情報を利用して、既存のクロマツEST(遺伝子の部分配列)情報やテーダマツ(Pinus taeda)のゲノム情報に対して相同性検索を行うことで、対象となるゲノム領域の特定とそこに含まれる候補遺伝子の探索を行う。本研究は、マツノザイセンチュウ(Bursaphelenchus xylophilus)感染時にクロマツ(Pinus thunbergii)が自ら病徴の悪化を導くネガティブな生体防御反応とその反応を誘導する遺伝子に着目し、次世代シーケンサーを用いた遺伝子型決定法(Genotyping-by-sequencing;GBS)を利用した遺伝解析から、マツノザイセンチュウ感受性遺伝子の特定を行う。平成28年度は、抵抗性家系をもとにGBSライブラリーを作成し、次世代シーケンサーによる塩基配列情報の収集を行った。具体的には、抵抗性親を含む抵抗性家系136個体についてDNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)を用いてDNAを抽出し、既報のプロトコルに基づいて、各個体のDNAを制限酵素処理を行った後、次世代シーケンサーで分析するためのジェノタイピングライブラリーを作成した。このとき、各個体の塩基配列が識別できるよう136種類のバーコード配列によるタグ付けを行った。作成したライブラリーをもとに、次世代シーケンサー(Illumina社Hiseq4000)を用いてペアエンドシーケンスによって塩基配列情報の収集を行った。その結果、生データとして取得した総リード数は約14.3億リードとなり、取得総塩基数は1,585億塩基となった。また、所得した塩基配列情報のうち、各個体(バーコード毎)の平均取得リード数は約1千万リードであり、平均取得塩基数は約10億塩基となった。今年度取得した塩基配列情報をもとに来年度は、塩基配列のクオリティーチェック及びDNA多型(SNP)を検出した上で、高密度連鎖地図の構築を目指す。平成28年度は、次世代シーケンサーによる塩基配列情報の収集を行い、収集した塩基配列情報をもとにDNA多型の検出と高密度連鎖地図の作成を行う予定であった。しかし、次世代シーケンサーで分析するためのジェノタイピングライブラリーの構築に多大な時間を要したため、次世代シーケンサーによる塩基配列情報の収集までに留まった。

さらに127個体の多型情報をもとに、メンデル遺伝の理論値に合致する合計6,881個のSNP情報を取得した。さらに得られた多型情報を用いて、高密度連鎖地図の構築と接種試験によって得られた形質情報を用いた連鎖解析を試みた。高密度連鎖地図の構築では、LODスコアが18以上かつ200以上のマーカーで構成される連鎖グループは12となり、クロマツの基本染色体数に収束し、連鎖群あたりの平均マーカー数は457個となった。構築した高密度連鎖地図情報と接種試験の形質情報をもとに連鎖解析を行った結果、第10連鎖群において感受性形質に寄与するLODスコア6以上の領域を検出した。平成28年度に構築する予定であった高密度連鎖地図は、次世代シーケンサーで分析するためのGBSライブラリーの構築に多大な時間を要したため、シーケンス情報の取得のみとなり、高密度連鎖地図の構築に着手することができなかった。平成29年度では、高密度連鎖地図の構築と形質情報を利用した遺伝統計解析を進めることができ、本研究課題における当初の計画をおおむね順調に進めることができた。平成28年度に取得した塩基配列情報をもとに平成29年度は、各個体で得られた塩基配列のクオリティーチェック及びDNA多型(SNP)を検出した上で、高密度連鎖地図の構築を目指す。また、高密度連鎖地図の情報と抵抗性家系の形質情報を利用した遺伝統計解析を行うことで、感受性形成津に寄与する遺伝子座を特定する。平成29年度に構築した高密度連鎖地図については、連鎖地図の作成に用いる各個体の遺伝子型情報に多くのエラーが含まれているため、それらのエラーを修正した上でより精度の高い連鎖地図を構築する。また、既存のクロマツ連鎖地図情報との比較及び統合を行うためにアンカーマーカーとしてマイクロサテライトマーカーを用いたジェノタイピングを行い、連鎖地図情報への適用を行う。連鎖解析より感受性形質との関連が検出された領域については、マーカーの塩基配列情報を利用して、既存のクロマツEST(遺伝子の部分配列)情報やテーダマツ(Pinus taeda)のゲノム情報に対して相同性検索を行うことで、対象となるゲノム領域の特定とそこに含まれる候補遺伝子の探索を行う。平成28年度は、得られた塩基配列情報に対して、次世代シーケンサーのデータ解析に必要な遺伝統計解析のパイプラインを構築する予定であった。しかし、次世代シーケンサーで分析するためのジェノタイピングライブラリーの構築に時間を要したため、次世代シーケンサーによる塩基配列情報の収集までに留まり、遺伝統計解析のパイプラインの構築までに至らなかった。平成29年度は、比較的順調に解析を進めることができ、予定していた予算額に対し安価に研究を推進することができた。平成30年度は、候補となる遺伝子の構造解析等を行う予定であり、それらの解析に必要となる試薬消耗品に使用する予定である。