hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
無細胞たんぱく質合成系を用いた基板支持生体模倣膜の構築

従って、欠陥孔形成機構を初めて明らかにした本研究は重要である。物理化学、表面科学基板支持脂質膜への膜蛋白質の導入を試みているが、今のところこの試みは成功していない。少なくとも、界面活性剤の使用は避けた方がよさそうである。H25年度以降に予定していた膜タンパク質の実験を前倒しし、モデル膜タンパク質の選択について検討を行った。その結果、本研究目的に適したモデル膜タンパク質を選択することができた。また、フォールディングのためには界面活性剤が必要であり、界面活性剤存在下での基板支持脂質膜および固定化ベシクルの安定性について検討することができた。界面活性剤を用いずに、基板支持脂質膜にOmpA176をフォールディングさせることを試みる。前年度の実験から、基板支持脂質膜と変性したOmpA176とをインキュベートしても、フォールディングは起こらないことが分かっている。従って、支持脂質膜を形成する前に何らかの工夫が必要であることは明らかであり、この点について複数の実験条件を検討する。また、膜蛋白質と基板支持脂質膜との相互作用について考える際、基板支持脂質膜自体の性質をより詳細に理解することが重要である。従って、基板支持脂質膜の性質についても研究を行う。特に、基板表面が膜の性質に与える影響について研究を行う。バルク溶液中での精製OmpA176:Hのフォールディン条件を調べる。これまでの経緯から界面活性剤が必要と思われるので、界面活性剤の種類と濃度を変えて検討を行う。次に、基板固定化脂質膜へのOmpA176:Hのフォールディングについて、その方法の検討を行う。また当該年度の実験において、基板表面に固定化された脂質膜と界面活性剤との相互作用について不明な点が多いために、界面活性剤存在下でのフォールディング条件の検討が難しかった。そこで、脂質-界面活性剤-固体表面間相互作用の基礎的性質について研究を行う。具体的には、界面活性剤を含むベシクルを用いたベシクルフュージョン等について研究を行う予定である。次年度の物品費に充当するため、当該年度の予算を節約し、繰り越しを行った。実験に必要な消耗品を購入し、一部を学会発表のための旅費として使用する。次年度の物品費に充当するため、当該年度の予算を節約し、次年度に繰り越した。次年度は、実験に必要な物品を購入するために物品費が必要であり、また、国内の学会に出席するための旅費が必要である。また、塩基配列解析などに要する予算をその他に計上した。
医師・患者双方に安心と安全を提供する術中骨折予防システムの開発

人工股関節置換術においてセメントレスステムを大腿骨へインプラントする際,適切な固定が得られたか否かの判断は術者の感覚に依存している.ステムの固定が正確になされたことが客観的に判断できるシステムがあるなら,それは臨床医が固定性を判断する一助となりえる.そこで私達は、模擬大腿骨を使用してステムインプラント時の打ち込み音の周波.数と模擬大腿骨内部の応力との関係を調査し、術中骨折を防止するために周波数解析の有用性を評価した.当該年度では人工股関節置換術で生じる術中骨折に対して、骨折予防システムとなりうる科学的根拠に基づいた新しい診断技術を構築した。従来、人工股関節の固定性評価として、ステム挿入時の振動解析が提案されてきた。しかし、その解析を行うためには対象物へ直接器具を設置する必要があり、臨床応用は困難であった。直接器具を設置しない方法としては、周波数解析が提案されているが、固定性評価が主な目的であるため、術中骨折予防を視野に入れた研究は少ない。本研究では打ち込み力とハンマリング音の周波数を計測する際、あわせて有限要素解析を行うことで大腿骨内部の応力との関係性を明らかにした。解析により大腿骨上の応力は、フォルマント周波数が収束してから打ち込みを続けることで骨破壊に至る降伏応力を示すと予想した。基礎医学分野に物理的手法を導入する試みにより、科学的根拠に基づいた客観的かつ多面的評価が可能となった。本診断技術は医師にとって取り扱いやすく、患者にとって負担のない非侵襲の診断技術であり、本研究成果が応用展開された際には、医療現場の利用ニーズに応える「正確かつ低コストに測定可能とするシステム」となりうる。本研究課題の意義は、医師と患者双方にとっての安心と安全を提供することにある。現在、臨床研究段階にあるため実用化に近く、残された技術課題であるシステムの小型化をクリアできれば社会に十分に還元でき、有益性も高い。今後の展開として、現在申請中の特許と類似した技術に新知見を加えた新規特許の出願を予定している。THAにおいて寛骨に設置する臼蓋カップは解剖学的に深部であるため,大腿骨に設置するステムと比較して3倍多く固定不良が生じる(Callaghan et al, 2004).固定不良と判断した場合,臼蓋カップは寛骨へスクリューを打ち固定することが可能であるが,寛骨の内部には傷をつけると命に関わる臓器が存在するため術者としてはスクリューを打つことは極力避けたい.そこで固定不良を回避するため臼蓋とカップが長期に渡り動くことのないよう,力強くハンマリングをする方法がとられている(Albrektsson et al, 1981).しかし臼蓋カップ周囲には大血管や神経が存在し,力強くハンマリングをすることによりカップ周囲の組織に損傷を与える危険性を抱えている.医療現場におけるこの深刻な問題は,臼蓋カップ設置時に十分な固定性が得られたか否かの判断基準がなく,術者の経験や感覚に依存している点にある.れまで申請者は,対象物の固定性により音程が変化する音響解析に着目し,大腿骨に対するステムのハンマリング音を解析することで固定に対する不具合を回避する技術を発明した.本技術は,ハンマリング音を解析することで,最適な打ち込み回数を知らせ,危険性を回避する装置として企業と共同開発を進めてきた.従来のシステムはPC,センサアンプ,ストレージスコープで構成され,手術室で使用するには機材が多く大型である点が欠点であった.医療従事者にとって持ち運びと操作性の簡便さは、システムを利用する際の重要なファクターとなる。そこで当該研究においては小型システムを開発し、i)指向性マイクロフォン、センサアンプ、ストレージスコープなどの集音システムを小型化すること、ii)操作を単純化するためのソフトウェアを開発することの2点を、最重要課題として27年度に取り組んだ。開発した試作デバイスを用い模擬大腿骨を対象にフォルマント周波数を計測した。また新たな対象として、本システムが臼蓋カップのハンマリングにも応用が可能であることを明らかにした。音響を解析することで大腿骨のみならず臼蓋側の非侵襲の診断を可能とし、患者にとって負担のないシステムとなった。今年度の取り組みの中で得られた新知見とそのエビデンスを添付し、改めて新規特許を出願した。人工股関節置換術においてセメントレスステムを大腿骨へインプラントする際,適切な固定が得られたか否かの判断は術者の感覚に依存している.ステムの固定が正確になされたことが客観的に判断できるシステムがあるなら,それは臨床医が固定性を判断する一助となりえる.そこで私達は、模擬大腿骨を使用してステムインプラント時の打ち込み音の周波.数と模擬大腿骨内部の応力との関係を調査し、術中骨折を防止するために周波数解析の有用性を評価した.術中骨折の発生原因として、ステム挿入時に十分な固定性が得られたかどうかの判断基準がなく、術者の経験や感覚に依存している点が問題である。打ち込みが少なすぎると固定不良が生じ、固定力を増すために過度に打ち込みを行うと、術中に骨折が生じることから、術中に科学的根拠に基づいた最適な打ち込みを実施することで術中骨折を回避することが可能となる。当該年度は術者の経験及び感覚に依存しない科学的根拠に基づいた客観的な評価指標の検討を行い、来年度の計画であった評価システムの小型化に着手した。

小型システムの開発に成功したことで医師にとって取り扱いやすい科学的根拠に基づいた骨折予防診断技術を構築できた。本研究成果が応用展開された際には、社会に十分に還元でき、有益性も高い。本研究成果によって実用化の見通しがついたため、今後の活動予定として企業と小型デバイスの開発について共同研究を行い、技術移転の可能性を見出したい。人間医工学次のステップへ進めるための技術的課題は集音システムの小型化と操作を単純化するためのソフトウェア開発である。集音システムは持ち運びに便利なタブレット程度の大きさを目指す。試作した集音システム小型デバイスを用い、2015年6月から基礎データの収集を開始する。その際、これまでと同等の手法を用いることから進捗はスムーズであることが予想できる。学会発表を予定し旅費の計上をしていたが、当該年度に出願した特許申請の新規性を喪失するため控えた。その際の旅費の計上分が余剰となった。学会発表を行うための旅費を計上していたが、当該年度に得られた新知見を基に特許申請を行うため、学会発表を取りやめ、その際の旅費の計上分が余剰となった。消耗品が不足しているため、今年度の旅費の計上分を充当する計画である。
磁界により発振波長の精密な制御が可能なウラン濃縮用赤外レーザーの研究

1.TEA【CO_2】レーザの9R(30)、9.22μm発振線の高出力化をおこない、最高出力11J/pulseを達成するとともに、光励起・赤外域NH3レーザを構成した。3.上記2.の【NH_3】レーザのaP(10.9)発振線励起により、InSb SFR(スピン・フリップラマン)レーザを発振させ、5T(テスラ)以下の磁界における15.9um域InSb SFRレーザの発振に成功した4.また、上記2.の【NH_3】レーザのaP(10.6),aP(9.6),aP(8.6)発振線励起により、InSb SFRレーザを発振させ、その磁界同調特性を調べた。いずれの場合も5-8Tの範囲の磁界で、15.9μm域InSb SFRレーザの発振が得られた。5.InSb SFRレーザの発振出力は、InSb半導体光物性との関連で、磁界の大きさにより大きく変化するが、上記3.の場合、15.9um発振は、高出力の得られる磁界の範囲であった。なお、試料(InSb)表面は損傷をうけなかった。6.【CO_2】分子ガスの赤外域の基礎吸収スペクトルの圧力拡がり効果を調べる方法で、上記の赤外線域【NH_3】レーザ励起InSb SFRレーザの発振線の波長分解能Δυ(FWHM)を求め、現有の装置で、Δυ<0.25【cm^(-1)】が得られた。7.上記1-6.で得られた成果を総合すると、本研究の15.9um域同調可能レーザは、分子法レーザウラン濃縮用赤外レーザとして非常に有望である。今後は、高繰り返し化(1pps→20pps→200pps)、高出力化(0.5mJ/pulse→10mJ/pulse→0.1J/pulse)、ならびに装置化をはかるとともに、本研究で開発した、上記の15.9μm域InSb SFRレーザを使用して、分子法レーザウラン濃縮に関する基礎研究の推進が期待される。1.TEAC【O_2】レーザの9R(30)9.22μm発振線の高出力化をおこない最高出力11J/pulse,1ppsを達成できた。なお、光学系の損傷を少なくするため、通常実験時においては、約5J/pulse,1ppsの出力で使用している。2.上記1のTEAC【O_2】レーザの9R(30)発振線を用いて、赤外域N【H_3】レーザを励起し、aP(8,6)発振線12.97μm光の高出力化に関する研究をすすめた。その結果、TEAC【O_2】レーザの9R(30)発振線(5J/pulse,1pps)励起により、ガスの混合比と圧力、温度を変えて、実験をおこない、N【H_3】レーザのaP(8,6)発振線について、51.7mJ/pulse,1ppsを達成できた。その上、N【H_3】

レーザでaP(8,6)発振線よりもさらに長波長のaP(9,6)発振線13.29μmについても高出力化できる(15.2mJ/pulse,1pps)ことが確かめられた両発振線をより高出力化するため、N【H_3】レーザ共振器の大型化が望まれる。3.ウラン濃縮用15.9μm域InSb SFR(スピン・フリップラマン)レーザを励起するためのレーザとして、上記2の赤外域N【H_3】レーザのaP(8,6)発振線は充分な性能を有する。すなわち、この場合、約7.9T(テスラ)の磁界で、0.5mJ/pulse,1ppsの15.9μm域発振線が得られること、上記2の実験で高出力化できたaP(9,6)発振線で励起すれば、約6.9Tの磁界で、1mJ/pulse,1ppsの15.9μm域の発振線が得られることが分った。4.最高磁界8Tの超電導電磁石装置を用いて、15.9μm域のInSb SFRレーザ発振線の波長の磁界同調特性に関する実験をすすめた、試料のInSb半導体単結晶は、自由電子密度(77Kにおいて)1.7×【10^(16)】【cm^(-3)】,寸法7.5mm×8.0mm×16.0mmおよび10.0mm×5.0mm×15.0mmのものを使用した。5.InSb SFRレーザの15.9μm赤外域における発振線の波長分解能と、超電導電磁石内の磁界の空間均一度、試料の温度等との関係を明らかにするための研究をすすめた。
先天的発声の制御機構の多階層的理解

本研究課題の目的は、ニワトリのCrowingをモデルとして、先天的発声の制御機構を多階層的に理解することである。集団レベルにおいては、祖先種である赤色野鶏を用いて、Crowingが体内時計および社会的順位によって制御されていることを明らかにした。遺伝子発現レベルにおいては、鳴く個体および鳴かない個体の脳内中枢を用いてRNA-seqを実施し、それをインフォマティクスにより解析することで、発声のモチベーションを制御しうる遺伝子の候補を抽出した。ゲノムレベルにおいては、発声のパターンを支配している分子基盤を明らかにするため、正常あるいは特殊な発声を示すニワトリ品種の発声およびDNA血液を収集した。平成27年度の研究実施状況は、以下に示す通りである。1.集団レベル:つつきの順位が最も高い個体は、朝を告げる優先権を持ち、下位個体は最上位個体が鳴くのを辛抱強く待っていることを明らかにした(Shimmura et al. Scientific Reports 2015)。2.遺伝子発現レベル:RNA-seqを用いて、発声のモチベーションを制御する遺伝子を同定した。in situ hybridization法により時空間的な動態を調べたところ、発声の中枢において発現変動していることが明らかとなった。3.ゲノムレベル:ニワトリSNPアレイを用いて、発声のパターンを制御する遺伝子を探索したところ、P値の高いSNPが同じ機能を司る遺伝子であることが明らかとなった。集団レベルの制御機構の研究はScientific Reportsに掲載され、遺伝子発現およびゲノムレベルの制御機構の研究も、制御遺伝子を同定することができたため。平成28年度の実施状況は、以下に示す通りである。2.遺伝子発現レベル:RNA-seqを用いて抽出した、発声の誘導を制御しうる遺伝子の機能解析を実施した。in vivoでの脳室投与法により遺伝子の発現を誘導させたところ、Crowingが誘導されたため、遺伝子機能の1つの立証をすることができた。3.ゲノムレベル:QTL・SNPアレイを用いて抽出した、発声のパターンを制御しうる遺伝子の機能解析を実施した。遺伝子の時空間的な発現動態をin situ hybridizationで解析したところ、発声の中枢において発現が認められることが明らかとなった。集団レベルの研究は、祖先種である赤色野鶏においてもCrowingのタイミングが体内時計によって制御されていることを示すことができ(Ito et al. Animal Science Journal 2017)、遺伝子発現およびゲノムレベルでの制御機構の研究も、制御遺伝子の抽出および機能解析が大きく前進したため。平成29年度の実施状況は、以下に示す通りである。1.集団レベル:ニワトリの祖先種である赤色野鶏のCrowingも体内時計および社会的順位によって制御されていることを示した論文が掲載された(Ito et al. 2017)。2.遺伝子発現レベル:鳴く・鳴かない個体の脳内発声中枢をサンプリングし、そこから抽出したRNAを用いてRNA-seqを実施することで、先天的発声のモチベーションを制御しうる遺伝子を同定した。in situ hybridizationにより時空間的な遺伝子発現解析を実施したところ、同定した遺伝子が脳内中枢において発現変動していることを確認した。最後に、同定した遺伝子を特異的に発現増加させる脳室内投与を行ったところ、先天的発声が増加することが明らかになった。以上により、遺伝子の機能を立証することができたため、論文投稿の準備をしている。3.ゲノムレベル:発声のパターンを制御している分子基盤を明らかにするため、発声のパターンが正常または特殊なニワトリ品種の発声のサンプリングおよび血液を採集した。記録した発声については音声解析ソフトにより発声を定量化し、血液についてはDNAを抽出し、全ゲノム解析の準備を整えた。全ゲノム解析を行う際に用いる集団遺伝学的解析方法については、スーパーコンピューターを用いてコマンドラインにより解析する手法を習得した。同定した遺伝子の機能を、in vitroおよびin vivoで立証する。抽出した候補遺伝子の機能を、in vitroおよびin vivoで立証する。システム行動生物学
乳幼児熱性痙攣後の神経発達障害におけるPGE2合成酵素の役割

癲癇は最も発症頻度が高い神経疾患の一つであり、わが国では約100万人の癲癇患者が存在するにも関わらず、その発症機序は未だ不明な点が多い。幼少期の重度の熱性痙攣が、難治性癲癇に進展するリスクを高めることが知られている。そこで本研究では、痙攣後に生じる脳炎症反応に焦点を当て、熱性痙攣後の神経発達における脳炎症の寄与について、特に炎症性メディエーターのプロスタグランジンに着目して明らかにする。本研究より、熱性痙攣後の脳炎症反応の役割が明らかになれば、熱性痙攣から側頭葉癲癇への進展機序が明らかになるだけでなく、癲癇への進展予防や根本治療に結び付く可能性が期待できる。
神経―骨のネットワークに注目した中枢性骨代謝制御機構の解析

我々はNMUが中枢神経系を介して骨形成を抑制すること、また、NMUがレプチンの骨形成抑制作用の仲介因子であることを見出した。しかしながら、その骨量調節作用の詳細な分子メカニズムは不明である。NMU欠損マウスにおいても分子時計の異常が認められ、また、NMUのhomologueとして同定されたNMSは視床下部において強い発現を示し、かつNMSを脳室内に投与することで体内時計のリズムが偏移することが知られている。これらの知見からNMU/NMSは体内時計の調節を介して骨形成を制御する可能性が示唆される。そこで、我々はNMU、NMS欠損マウスを用いて体内時計と骨代謝調節に関して検討をすすめた。すでに、昨年NMS欠損マウスが骨量の低下を示すことを明らかにしている。そこで、今年度は、骨形態計測法により骨形成、骨吸収の指標を解析したところ、骨形成の低下が認められ、したがって、骨芽細胞の増殖あるいは機能に異常があるものと考えられた。一方で、骨吸収には明らかな異常は認められなかった。引き続いて、NMS欠損マウスの新生児頭蓋骨より骨芽細胞を採取し、その分化、増殖について検討を進めている。また、NMUとNMSの関連を検討すべく、昨年に引き続いてNMU欠損マウスとNMS欠損マウスを交配し、二重欠損マウスを作成中であるが、現在までに両遺伝子二重ヘテロ欠損マウスを得た。予備的検討において、NMS欠損マウスは骨量の異常をきたすことを見出した。そこで、マイクロCTを用いた三次元構築による骨量定量法や骨形態計測法を行ったところ、NMS欠損マウスは骨量の低下を示すことが明らかとなった。現在、NMS欠損の骨代謝の異常が骨形成に起因するか、骨吸収に起因するかあるいは両者の共存によるものかを骨形態計測法にて検討中である。またNMS欠損マウスから骨芽細胞、破骨細胞を採取し、それらの分化増殖に関して、RNAを抽出し骨芽細胞、破骨細胞のマーカー遺伝子の発現を解析中である。さらに、NMUとNMSの関連を検討すべく、現在NMU/NMS二重欠損マウスを作成中である。
ロドコッカス・エクイ病原性プラスミドのPathogenicity Island

研究は、ロドコッカス・エクイ病原性プラスミドがどの様に病原遺伝子群を獲得して、潜在プラスミドが病原性プラスミドに進化し、馬に対する病原性獲得メカニズムを解明することにある。強毒株が保有する病原性プラスミドはそのRFLP型別から世界中に12種類のプラスミド型が存在する。PCRやサザン・ハイブリダイゼーションの結果を基に作成されたプラスミド地図と点変異解析結果の比較検討から、12種類のプラスミド型を5つのグループに分類することができた。グループの内訳は(1)群が85kb I、II、III及びIV型、(2)群が90kb II及びV型、(3)群が87kb I及びIII型、(4)群が90kb II、III及びIV型、(5)群が87kb II型であった。ロドコッカス・エクイ中等度毒力株の21種類の病原性プラスミド用いて全塩基配列が解明されている1型プラスミド(pREA3)と比較検討した。PAI近傍では両端に存在する挿入因子(invA, resA)の塩基配列がpREA3のプラスミド型と一致した群と変異した群に大別された。PAI内の遺伝子及びその右隣のORFには変異が全く認められないのに対し、PAIのより下流(約23,000bp)では遺伝子の挿入や欠損などの多様性が認められた。また中等度毒力株は強毒株に比べVap遺伝子群にも変異が多く認められた。無毒株が保有する潜在性プラスミドについてサザン・ハイブリダイゼーションを行ったところ、韓国済州島で分離株が17箇所で陽性となり、病原性プラスミドのプロトタイプが無毒株の潜在性プラスミドの中に存在することが強く示唆された。本研究から、強毒株と中等度毒力株における病原性プラスミドのvap familyを含む領域は、異なる系統の菌から侵入した遺伝子塊pathogenicity island(PAI)である可能性が示唆され、さらに強毒株と中等度毒力株のPAIは同じ起源を持ち、多型性を形成した後にR.equiの潜在性プラスミドに侵入したことを強く示唆した。本研究は、この作業仮説:ロドコッカス・エクイ病原性プラスミドがどの様に病原遺伝子群を獲得して、潜在プラスミドが病原性プラスミドに進化し、馬に対する病原性獲得メカニズムを解明することにある。これまでの研究から、強毒株と中等度毒力株における病原性プラスミドのvap familyを含む領域は、異なる系統の菌から侵入した遺伝子塊pathogenicity island(PAI)である可能性が示唆され、さらに強毒株と中等度毒力株のPAIは同じ起源を持ち、多型性を形成した後にR.equiの潜在性プラスミドに侵入したのではないかと推察されている。この仮説を基に、以下のことが明らかとなった。このうちブラジル分離株はサザン・ハイブリダイゼーションの成績と制限酵素BamHI消化切断像の病原性プラスミド型87kb type Iとの類似性から87kb type IIIに型別された。

次に12種類のプラスミド型間で、PAI内における2つの領域とPAI外の13の領域の塩基配列についてpREAT701のデータと比較したところ、PAI内の2つの領域では100%の相同性が、PAI外の領域では点変異が、様々な発生頻度でそれぞれのプラスミド型ごとに認められた。PCRやサザン・ハイブリダイゼーションの結果を基に作成されたプラスミド地図と点変異解析結果の比較検討から、12種類のプラスミド型を5つのグループに分類することができた。グループの内訳は(1)群が85kb I、II、III及びIV型、(2)群が90kb II及びV型、(3)群が87kb I及びIII型、(4)群が90kb II、III及びIV型、(5)群が87kb II型であった。さらに今回、PAI以外の領域の病原性プラスミドのプロトタイプを検索する目的で、無毒株が保有する潜在性プラスミドにpREAT701を鋳型として作製した19箇所のプローブでサザン・ハイブリダイゼーションを行ったところ、韓国済州島で分離された無毒株1株について17箇所で陽性となり、病原性プラスミドのプロトタイプが無毒株の潜在性プラスミドの中に存在することが強く示唆されたロドコッカス・エクイ中等度毒力株の病原性プラスミドの多型メカニズムの成立過程を明らかにする為、21種類のプラスミドを用いてPathogenicity island(PAI)近傍6箇所及び、サザンハイブリダイゼーションとPCRにより明らかとなった潜在性プラスミドと相同性のある領域3箇所のシークエンスを行い、全塩基配列が解明されている1型プラスミド(pREA3)と比較検討した。PAI近傍では両端に存在する挿入因子(invA, resA)の塩基配列がpREA3のプラスミド型と一致した群と変異した群に大別された。PAI内の遺伝子及びその右隣のORFには変異が全く認められないのに対し、PAIのより下流(約23,000bp)では遺伝子の挿入や欠損などの多様性が認められた。一方、潜在性プラスミドに相同性のある領域では、pREA3と一致した群と変異したプラスミド型に大別された。驚くべきことに変異の大きなプラスミド型は強毒株の保有する病原性プラスミド90-III型や中国・韓国由来無毒株の潜在性プラスミドと非常に類似した塩基配列を示した。また中等度毒力株は強毒株に比べVap遺伝子群にも変異が多く認められた。これらの遺伝子の変異がアミノ酸配列にどの程度影響しているのかを、Vap遺伝子群、PAI内外ORF各2箇所について調べたところ、Vap遺伝子群では点変異による個々のアミノ酸の置換が少数見られたのに対し、それ以外のORFではフレームシフト変異など大きな置換が認められた。病原性を担うVap遺伝子群では、大きな置換は病原性の消失につながるので自然淘汰されてきたのであろう。今年度の研究では、中等度毒力株と強毒株の病原性プラスミドと潜在性プラスミドとの比較検討から1型(pREA3)に比べ最も似ていなかったプラスミド型の群が、PAIの受け皿となった祖先(プロトタイプ)と考えられる潜在性プラスミドに最も類似していたことが明らかとなった。平成18年度は、強毒株が保有する病原性プラスミドはそのRFLP型別から世界中に12種類のプラスミド型が存在し、5つのグループ((1)85kb type I、II、III及びIV、(2)90kb type II及びV、(3)87kb type I及びIII、(4)90kb type I、III及びIV、(5)87kb type II)に分類されている。本研究では12種類のプラスミドDNAの各制限酵素消化泳動像を用いた系統樹解析と点変異解析を行い、12種類の多様性形成過程を考察した。
環境放射能の低減と検出感度の向上をめざした新世代ラジオイムノアッセイへの展開

短半減期放射性金属核種による高比放射能標識は、これまでの検討で実施してきたラジオイムノアッセイへの展開のみでなく、広く生物科学領域に応用可能と考えられる。そこで、近年非常に発展してきている分子生物学分野での応用性を明らかにするため、オリゴヌクレオチドの放射性金属核種標識とその応用について検討した。オリゴヌクレオチドを金属核種で標識するためには金属結合部位の導入と効率のよい標識法の確率が必要となるため、末端にアミノ基を導入したオリゴヌクレオチドにイソチオシアノ基を有するEDTA誘導体を結合させEDTA部位で金属と結合させることとした。合成反応は比較的容易であったが、単位オリゴヌクレオチドあたりのEDTA結合率は数%にとどまり今後の検討が必要であろうと考えられた。In-111で得られた誘導体を標識しカラム分離により非標識In-111を除去することで、安定に標識された高純度のIn-111-オリゴヌクレオチド誘導体を得ることができた。得られたIn-111-オリゴヌクレオチド誘導体は末端保護されているため4°Cでは1週間以上安定であった。またp-32-オリゴヌクレオチドが血清中で数十分で分解したのに対して、In-111-オリゴヌクレオチド誘導体は比較的安定であり、生体への適用も可能であることが明らかとなった。そこで、癌化遺伝子を導入した細胞を移殖したヌードマウスを用いて、癌化遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドのIn-111標識誘導体の体内分布を検討したところ、In-111標識センスオリゴヌクレオチド誘導体が特異的集積を示さなかったのに対して、In-111-標識アンチセンソオリゴヌクレオチド誘導体では有意に高い腫瘍対筋肉比が得られ、mRNA配列特異的集積の可能性が明らかとなった。抗体のGa-67標識には純度の高いGa-67が必須となる。今回さらに精製法に改良を加えクエン酸を介在させることにより抗体の標識率を減少させることなく少量の抗体を標識できるようになった。この改良によりさらに容易に高比放射能標識が可能となった。この手法を利用した高感度イムノアッセイの一例として成長ホルモンの測定を計画した。本ホルモンは小人症治療薬として重要であるのみならず、低濃度域での老化抑制における寄与が報告されるなど、従来法では難しい低濃度範囲での測定が要求されているものである。抗ヒト成長ホルモンモノクローナル抗体の高比放射能標識において従来の約10倍の比放射能を達成し、これを用いることにより従来不可能であった低濃度域での測定が可能となった。一方、超高比放射能を得るためのひとつの試みとして超短半減期核種の利用が考えられるがこれを得るためには核種製造を病院内で行うことが必要である。ジェネレータシステムは超短半減期放射性核種を容易かつ効率的に入手する有用な手段である。我々は、このようなシステムのひとつであるZn-62/Cu-62ジェネレータについて広範な利用を可能にするための検討を行なった。本年度はインビボ核医学へにおける臨床利用を開始するにあたって必要な基礎検討を実施し、ヒトへの適用に成功した。ラジオイムノアッセイにおいて用いられる標識体にはタンパクのような高分子のみならず薬物などの低分子が用いられることも多い。高感度化への試みにおいてはこのような条件にも適合する標識法の確立が望まれる。そこで本年度は金属放射性核種による低分子薬物標識法の確立とその評価を計画した。

薬物として強心配糖体であるジゴキシンを選択し構造-活性相関を考慮してもっとも影響の少ない末端糖鎖部分に金属結合部位であるデスフェリオキサミンを導入した誘導体を合成した。得られたジゴキシン誘導体はジゴキシン1分子あたりデスフェリオキサミン2分子が結合されたものであり、ガリウム-67に対して強い結合能を有し効率よい標識が可能であった。得られたガリウム-67標識ジゴキシン誘導体は抗ジゴキシン抗体に対して十分な抗原性を保持しており検量線についても良好な直線性を示すラジオイムノアッセイ系であることが明らかとなった。さらに、得られたガリウム-67標識ジゴキシン誘導体はジゴキシン結合タンパクであるNa,K-ATPaseに対して母体化合物であるジゴキシンと同等の結合親和性を有し、心筋Na,K-ATPaseへの結合を指標とする核医学診断薬剤としての基本的性質を有することが示された。本研究で開発された糖鎖への金属結合部位導入法は多くの配糖体薬物あるいは糖タンパクの標識にも適用可能であり今後の広範な研究展開に期待がもたれる。短半減期放射性金属核種による高比放射能標識は、これまでの検討で実施してきたラジオイムノアッセイへの展開のみでなく、広く生物科学領域に応用可能と考えられる。そこで、近年非常に発展してきている分子生物学分野での応用性を明らかにするため、オリゴヌクレオチドの放射性金属核種標識とその応用について検討した。オリゴヌクレオチドを金属核種で標識するためには金属結合部位の導入と効率のよい標識法の確立が必要となるため、末端にアミノ基を導入したオリゴヌクレオチドにイソチオシアノ基を有するEDTA誘導体を結合させEDTA部位で金属と結合させることとした。合成反応は比較的容易であったが、単位オリゴヌクレオチドあたりのEDTA結合率は数%にとどまり今後の検討が必要であろうと考えられた。In-111で得られた誘導体を標識しカラム分離により非標識In-111を除去することで、安定に標識された高純度のIn-111-オリゴヌクレオチド誘導体を得ることができた。得られたIn-111-オリゴヌクレオチド誘導体は末端保護されているため4°Cでは1週間以上安定であった。またP-32-オリゴヌクレオチドが血清中で数十分で分解したのに対してIn-111-オリゴヌクレオチド誘導体は比較的安定であり、生体への適用も可能であることが明らかとなった。そこで、癌化遺伝子を導入した細胞を移植したヌードマウスを用いて、癌化遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドのIn-111標識誘導体の体内分布を検討したところ、In-111標識センスオリゴヌクレオチド誘導体が特異的集積を示さなかったのに対してIn-111-標識アンチセンソオリゴヌクレオチド誘導体では有意に高い腫瘍対筋肉比が得られ、mRNA配列特異的集積の可能性が明らかとなった。
中東・湾岸世界における包摂的未来共生秩序の模索－「壁」を超える勇気と政策の醸成

中東・湾岸地域における「未来共生秩序」(=未来志向の包摂的な共生秩序)の形成に向けた人々や国家を分断する「壁」を乗り越える“勇気"や“政策"の重要性に着目する本研究において、短期的には暴力的過激主義や自国中心主義による対立のエスカレーションが見られるが、より中長期的な取組に、1)マクロの外交戦略とミクロの公共教育戦略の役割を統合した「未来共生」アクティブ・ラーニングの導入、2)未来共生教育の実践的取組として宗教指導者間の対話や若年時からの異文化交流体験プログラムの開発の組み合わせを、マクロのトップダウンの取組とミクロのボトムアップとを融合した取組として有意義であることを確認することができた。歴史的なうねりの中で民族・宗教・宗派をめぐる対立と暴力が後を絶たない中東・湾岸地域において物理的・心理的な「壁(=「共生否定」の象徴的な存在)」を乗り越え、「未来共生秩序(=未来志向の包摂的な共生秩序)」を形成していく“勇気"と“政策"をいかに推し進めていくかを考察する本研究では、国際公共政策、言語文化・人間科学の知見を融合し、学術と政策の両面から現状分析と提言をまとめることを目的とする。その際、マクロの戦略的なレベルとミクロの共生の観点を組み合わせることにより、未来共生秩序に向けた政策要件と教育プログラムの検討をスタートさせた。まずは、中東・湾岸地域の各アイデンティティ・グループ間の相関関係を明らかにし、国際安全保障論及び言語文化研究の観点から物理的・心理的な「壁」がどこにどのように作られているのかを概観した。それとともに、「壁」が作られる源泉として、教育学の観点も盛り込み、各アイデンティティ・グループ間の差異の認識や現状での優劣関係が変更されること(=現状変更)に対する恐怖の存在をあぶり出し、「共生否定」の克服(すなわち、他者への否定的な認識とは別次元の理解と敬意という建設的な認識への転換)に向けた国際協力政策や教育プログラムのあり方を議論する土台を作った。イスラエル及びパレスチナ地域の現地調査も行い、資料収集や現状分析の一助とした。なお、本研究は、「未来共生秩序」形成の一般的な理論と政策を検討することも目的の一つであるため、中東・湾岸地域とは異なる地域(主に東南アジア地域やアフリカ)での動向についても副次的ながら注意を向けて分析した。中東・湾岸地域における「未来共生秩序」(=未来志向の包摂的な共生秩序)の形成に向けた人々や国家を分断する「壁」を乗り越える“勇気"や“政策"の重要性に着目する本研究だが、現実の世界では本研究期間中もシリア情勢の混迷、イスラム教スンニ派過激組織IS(イスラム国)による連続テロ、イスラエルとアラブ世界の対立、及びイラン核問題をめぐる周辺諸国との軋轢など人々を分断する物理的・心理的な「壁」は厳然と横たわり、一部には状況のエスカレーションが見られている。だが、そうであればあるほど本研究の学問的・実務的な意義は再確認されることとなった。互いの「差異」への恐怖を相互理解と敬意へと転換する勇気を醸成する戦略の必要性がますます高まるなか、萌芽的ではあるが国民和解、対話、脱過激化、穏健主義の醸成、テロ対策などのための積極的な動きもあり、いかなる政策がいかなる効果を及ぼすのかを実証的に深めていく素材や課題も明確化されてきた。その分析にあたり、特に、1)マクロの外交戦略とミクロの公共教育戦略の役割に着目し、共生否定を再生産する政治と教育のプログラムからより「未来共生」型にシフトさせるための要件の検討と、2)未来共生の進捗を計測する相関的ベンチマークの開発という両面についての分析の視座をもう少し精緻化する必要性を感じている。マクロのトップダウンの動きとミクロのボトムアップの動きとをどのように結び付けるのか、そのメカニズムの考察の方法についても課題として今後検討していくこととしたい。研究会を通じた研究代表者・分担者の報告や海外調査、招へいした海外からの研究者との議論を通じて研究の論点は明確化が進んだものの、研究分担者の一人の健康問題が重なり、分析が手薄となった部分もあることから、一定の分担の見直しを進めている。その分析にあたり、特に、1)マクロの外交戦略とミクロの公共教育戦略の役割に着目し、共生否定を再生産する政治と教育のプログラムからより「未来共生」型にシフトさせるための要件の検討と、2)未来共生の進捗を計測する相関的ベンチマークの開発という両面についての分析の視座の設定を前進させることができた。今後は、マクロのトップダウンの動きとミクロのボトムアップの動きとをどのように結び付けるのか、そのメカニズムの考察の方法について深掘りをしていくこととしたい。

研究会を通じた研究代表者・分担者の報告や海外調査、招へいした海外からの研究者との議論を通じて研究の論点は明確化が進んだものの、研究代表者が全学の理事・副代表に任命される時期が挟まったことや、研究分担者のうちの二名の健康問題(うち一名は病気退職)が重なり、分析が手薄となった部分もあることから、一定の分担の見直しを行った。中東・湾岸地域における「未来共生秩序」(=未来志向の包摂的な共生秩序)の形成に向けた人々や国家を分断する「壁」を乗り越える“勇気"や“政策"の重要性に着目する本研究だが、現実の世界では本研究期間中もシリアでの化学兵器の使用とそれに対する米英等の軍事作戦、イスラム教スンニ派過激組織IS(イスラム国)による連続テロ、トランプ米政権による在イスラエル米大使館のエルサレム移転及びイラン核合意からの撤退の検討など国家の一方的な行動とそれによる人々の犠牲、また、人々を分断する物理的・心理的な「壁」の存在とエスカレーションなどが進み、本研究の学問的・実務的な意義はますます再確認されることとなった。互いの「差異」への恐怖を相互理解と敬意へと転換する勇気を醸成する戦略の必要性がますます高まるなか、萌芽的ではあるが国民和解、対話、脱過激化、穏健主義の醸成、テロ対策などのための積極的な動きもあり、いかなる政策がいかなる効果を及ぼすのかを実証的に深めていく素材や課題も明確化されてきた。他方、国連安保理の常任理事国間の分裂と対立、主要国の単独行動外交など、予断を許さぬ動きも再び勢いを見せてきた。ここから、最終年度の研究としては、やはり中長期的な取組としても、特に、1)マクロの外交戦略とミクロの公共教育戦略の役割に着目し、「未来共生」をキーワードとするアクティブ・ラーニングの導入、2)未来共生教育の実践的取組として宗教指導者間の対話や若年時からの異文化交流体験プログラムの開発という両面の意義を、マクロのトップダウンの取組とミクロのボトムアップの取組の融合例として確認するなど、そのメカニズムの考察の方法について深掘りを行った。中東・湾岸地域における「未来共生秩序」(=未来志向の包摂的な共生秩序)の形成に向けた人々や国家を分断する「壁」を乗り越える“勇気"や“政策"の重要性に着目する本研究において、短期的には暴力的過激主義や自国中心主義による対立のエスカレーションが見られるが、より中長期的な取組に、1)マクロの外交戦略とミクロの公共教育戦略の役割を統合した「未来共生」アクティブ・ラーニングの導入、2)未来共生教育の実践的取組として宗教指導者間の対話や若年時からの異文化交流体験プログラムの開発の組み合わせを、マクロのトップダウンの取組とミクロのボトムアップとを融合した取組として有意義であることを確認することができた。研究者の健康問題があった。まず、研究分担者の一人が年度後半で大幅に体調を崩し、休職に入ったことは本共同研究にとっては大きな痛手であった。同研究者の休職中も担当分野についての助言は得ているが、本人の早期回復を期待したい。また、研究分担者のもう一人も、海外現地調査に出向こうと計画をしているさなかに足を負傷し、年度内の渡航が困難となり、延期をしたことも遅れを誘発することとなった。
造血因子のレセプターからRasに至る細胞内情報伝達機構

各種造血因子は造血幹細胞の分化増殖に極めて重要な役割を担っており、既に臨床応用も進められているが、その作用機序の解明は極めて遅れている。本研究では造血因子の情報伝達における重要な因子であるRasの活性化に関わる経路を中心に解析を行った。エリスロポエチン(EPO)、GM-CSFの刺激によりチロシンリン酸化されるタンパクをヒト白血病細胞株UT-7において検討したところ、Vavとc-cblのリン酸が明らかとなった。これらはいずれもアダプター分子のGrb2/AshとそのSH3ドメインを介して結合していることも明らかとなった。最近クローニングされたトロンボポエチン(TPO)についてもヒト白血病細胞株Mo7eにおいて同様の実験を行った結果、やはりVavとc-cblのチロシンのリン酸化が確認された。またRasの経路に関与しているShcのリン酸化も確認された。これらはいずれもアダプター分子Grb2/Ashと定常的に結合していることも明らかとなった。このように、いずれの造血因子においてもRasの活性化に関わるVavのリン酸がみられ受容体リン酸化-Grb2/Ash-Vav-Rasの活性化経路が明らかになるとともに,これとは別のc-cblを介する経路の存在も明らかとなった。c-cblのリン酸化についてはまだほとんど報告がないため造血系以外での解析も行った。線維芽細胞をEGFで刺激すると、c-cblのリン酸化の誘導がみられた。またv-srcでトランスフォームした線維芽細胞では定常的にc-cblのリン酸化が確認された。以上より、c-cblは造血系以外にも広く細胞増殖の情報伝達を介している重要な分子であることが示唆された。
新型現場培養装置を用いた極限環境微生物群集の増殖および活性特性の解析

本研究は、申請者自身が開発した採水機ROCSの時系列採水機能を用い、高温熱水噴出孔とその周辺環境に生息する微生物の増殖速度や増殖特性について現場培養から定量評価することを目的に、熱水噴出孔域で使用できる新型微生物培養装置を開発・作成する。具体的には、申請者が中心となり開発した深海用新型採水機(ROCS)と本申請対象である新型培養装置を組み合わせた現場培養実験を通じて、熱水噴出孔生態系内の各種微生物群集の増殖速度やメタン酸化速度など微生物に由来する各種活性の測定と定量評価を試みる。研究最終年度であるH22年度は、まず、チタン製培養槽を用いてH22年3月に無人潜水艇「ハイパードルフィン」を使用し鹿児島湾熱水噴出孔で行った現場培養実験の微生物群集解析を行った。また、有光層下に存在する海洋性古細菌群集の代謝特性を現場培養で測定することを目的に静岡県焼津市沖駿河湾の水深400m環境での基質添加現場培養実験を実施した。鹿児島湾若尊火口海底水中には、全菌数として7.2×10^5 cells/mL存在し、その内訳は真正細菌が4.5×10^5 cells/mL、ユーリアーキオータ(7.0×10^4 cells/mL)、クレンアーキオータ(4.1×10^4 cells/mL)であった。全菌数の値は、一般的は外洋海水の値より1桁高い。現場微生物増殖速度は基質添加系で真正細菌およびクレンアーキオータ群集とも負の値を示した。駿河湾400m水深現場培養実験においても海水置換、基質添加および培養試料の時系列現場固定に成功し、基質添加現場培養から400m水深の真正細菌およびクレンアーキオータ群集の増殖速度を測定した。本研究の結果、潜水艇や調査船・漁船を利用した、任意の水深において基質添加可能な現場微生物培養装置の開発にほぼ成功した。H21年度は、新型培養装置の設計・作成を深海使用各種機器作成で実績のある日油技研工業株式会社と共同で行い、ROCSのフレームに装着可能な容量12Lのチタン製培養槽を作成した。作成した培養槽は、溶存ガス成分分析にも可能なO-リングによる密閉構造、培養槽からの試料採取時の周辺海水混入を防止する機能を組み込んだ。併せて培養槽からの時系列試料採取に必要なROCSクランプユニットの改良他を行った。作成した培養槽を組み合わせたROCS培養機を、H22年3月18日から23日まで海洋研究開発機構所有の研究船「なつしま」および無人潜水艇「バイパードルフィン」を使用した鹿児島湾調査(NT10-05航海)に持ち込み、海底でのテスト培養実験を実施した。3月19日午前の潜行で本培養機を水深200mの熱水噴出孔付近の海底に設置、採水管を通じて熱水の採取および現場培養を実行した。潜水艇による設置時間を見積もった上で、あらかじめ調査船上で培養プログラムを設定の上、2日間の現場培養を実施した。3月21日午前の潜行で培養機を回収し、現場培養が成功したか確認を行ったところ、成功していたことが判明した。現在、回収した試料中微生物群集の増殖速度について測定中である。
仏教史にみる危機意識克服の過程の解明

本研究の目的は、アジア一帯においてさまざまな文化的な価値形成に大きな役割を果たしてきた仏教を、人々が天災や人災を通して危機意識に直面したとき、それにいかに対応し克服する態度醸成に関わったか、という点から明かすことにある。今年度はそのケーススタディとして、仏教起源のインド初期仏教の資料、ことにニカーヤ、律蔵に存在する伝記資料の分析を行った。その結果、自然災害や人的迫害などに出会った者が、ブッダに出会い、苦の自覚から再生へと発展するパターンの底に見られる、苦と自己との関係という基本構造が、およそ明らかとなってきた。ここで重要なのは、災害等に出会った者たちが、その当面に顕在化した苦痛にあらゆる意味を奪われて、けっして苦悩の淵源を洞察する態度にまで至れない点である。苦があくまで外的な偶然の原因によって不当にもたらされた結果として受け取られ、苦に至る以前の状態を恒常のものとして追い求めていこうとする。ブッダの問いはそこに投げかけられ、変わらぬ状態を固定しようとする中に、苦の本源があり、それは自己存在の一様態にほかならないことを自覚させようとしている。その意味で苦は退けられるべきものではなく、取り逃がさないようにかえって深められるべきであり、それを通してより深い自己の露呈と、深化された解放の可能性が示唆される。苦と無常、無我の関係は、こうした実存的な関係として据えられるべきである。また、苦という概念は、恐怖から不安まで、実存が関わる身上を幅広く包括する、その意味で曖昧な概念であり、さらに下位レヴェルでの分析の必要がある。最後に付言すれば、こうした救済例はあくまで宗教的エリートが立ち至った世界であり、広く確認される大衆的な救済例は、別途確認されねばならないだろう。
ボルネオ島北部中核都市コタキナバルのHTLV-1感染状況の疫学調査

積算検体数は平成30年度末(2019年3月31日)時点で1862例となり、昨年度から422例の追加があった。男女比は69:31、平均年齢は36.6歳。ボルネオ島北部地域の42民族から検体を採集を行い、比率の高い順からMalay:21%、Chinese:13%、Kadazan:13%、Bajau:9%、Dasun:9%、Brunei:4%、Rungus:2%、その他29%となっており、この中にはフィリピンから不法入国したコタキナバル市沿岸部の海上生活者も含まれる。Kota Kinabalu、Burunei、Kudatなど各地域のボランティア(献血者、清掃業・農園従事者など)、からいただいた検体が主で、陽性者は1例(末梢血からDNAを回収し、プロウイルスゲノムの解析中)。以上の結果を第59回日本熱帯医学会大会(於長崎大学医学部坂本キャンパス)にて発表。さらには同プロジェクトで回収した血清の解析により、現地における種々の感染症の実態調査(ウイルス脳炎・下痢症、ピロリ菌など)に役立てている。今後はKota Kinabalu市およびその周辺域に加え、ボルネオ島マレーシア領最北部に位置するSandakanに現地共同研究機関Queen Elizabeth II Hospital(QE2)の分院にて、研究スタッフによる血清検体の収集と検出キットによる検査を行う。研究対象のKota Kinabalu市内および近隣地域にて人種比に該当する検体の収集が進んでいる。検体数は最低限の目標である1000例は既に突破し、2000例に届きつつある。血清陽性者の末梢血よりDNAを回収し、プロウイルスの解析を開始した。さらに陽性者のコミュニティー内で検体収集の計画を進めている。現地共同研究者と協議の結果、Kota Kinabalu市内のみならずマレーシア領ボルネオ島北部地域で関連機関と協力し、より広域で検体の収集を行うこととした。最終年度末までに2000例を目標に収集し、得られた陽性例に関しては分子生物学的手技によりHTLV-1ゲノムの解析を行う。実績概要1.積算検体数は平成29年度末(2018年3月31日)時点で1480例。男女比は78:22、平均年齢は33.7歳(最高齢66歳・最年少18歳・中央値32歳)。人種比はMalay:33%、Chinese:21%、Kadazan:15%、Bajau:11%、Dasun:5%、その他15%となっている。現時点ではKota Kinabalu市内のボランティア(献血者、清掃業従事者など)からいただいた検体が主である。陽性者は1例(末梢血からDNAを回収しプロウイルスゲノムの解析中)。実績概要2.ATL患者末梢血より樹立した細胞株、OATL9ゲノム中の2種類のHTLV-1プロウイルスの染色体挿入部位およびウイルスゲノムの全塩基配列を決定した(Genome Announcement, accepted)。細胞表面マーカーおよび遺伝情報解析より、OATL9はB細胞由来であり、エプスタイン・バール・ウイルス(EBV)の感染も認められた。HTLV-1プロウイルスおよびEBV、双方のウイルス遺伝子群の発現様式による感染細胞の不死化に至ったプロセスについて、その分子機序を引き続き検討中。Kota Kinabalu市内の人種比に概ね比例する検体の収集が進んでいる。検体数は最低限の目標である1000例は既に突破した。

最終年度末までに2000例を目標に収集する。さらに現地関連医療施設で造血器悪性腫瘍を発症した症例中にHTLV-1感染例の存在についても検証を進める。またHTLV-1陽性検体から得たDNAのHTLV-1プロウイルスの挿入部位およびプロウイルス全体の塩基配列を決定する。現地共同研究者と協議の結果、Kota Kinabalu市内のみならずマレーシア領ボルネオ島北部地域で関連機関と協力し、より広域で検体の収集を行うこととした。最終年度末までに2000例を目標に収集し、得られた陽性例に関しては分子生物学的手技によりHTLV-1ゲノムの解析を行う。
発現クローニングによる汗抗原の同定

本研究において、発現クローニングを用いて、アトピー性皮膚炎患者の汗過敏性の原因抗原(汗抗原)の同定を試みた。ヒト皮膚cDNAライブラリーを作成し、COS7細胞に遺伝子導入を行い、その培養上清および細胞破砕物についてアトピー性皮膚炎患者好塩基球を用いてヒスタミン遊離試験を行うことで、クローンのスクリーニングを行った。計12万クローンについてスクリーニングを行ったが、有意にヒスタミン遊離活性をもつ分子の同定には至らなかった。本年度はヒト皮膚由来mRNAをいてcDNAライフラリーを作製し、汁抗原のスクリーニングを行った。1.ヒト皮膚由来mDNA(Stratagene社)およびInvitrogen社のcDNAライブラリー作製キット(CloneMiner^<TM >cDNALibrary Construction Kit)を用いて動物細胞用発現ベクターであるpME18SによるcDNAライブラリーを構築した。ライブラリー全体のCFUは7.9×10^6でinsertの平均長は1.6kbであった。2.スクリーニングに際して、陽性コントロールであるダニ抗原Der f1発現ベクターを用い予備実験行った結果、陽性コントロールをemptyvectorで1/1000に希釈した場合でもアトピー性皮膚炎患者好塩基球に有意なヒスタミン遊離(約5%)を起こすことを確認した。3.予備実験の結果をふまえ、1000クローンを1プールとしてプラスミドの精製を行い、COS7細胞に一過性に発現させ、約24時間後に細胞を回収、ヒスタミン遊離には影響しない濃度で蛋白分解酵素阻害剤を加えた後、超音波処理により細胞破砕物を調整した。4.アトピー性皮膚炎患者好塩基球と細胞破砕物を反応させ、遊離したヒスタミンを測定した。104,000個のクローンについて1次スクリーニングを行ったところ、4プールが有意なヒスタミン遊離を示した。5.次に陽性プールからクローン100個あたりをまとめてプラスミド精製し、COS7細胞に発現させ、アトピー性皮膚炎患者好塩基球と反応させて2次スクリーニングを行ったが、これまでの検討では2次スクリーニング以降で陽性クローンプールを得ることが出来ていない。このようなスクリーニング結果から、1/1000希釈ではダニ抗原なら陽性プールとして検出できるが汗抗原の場合は検出できない可能性が考えられた。最終年度となる来年度は、1次スクリーニングの時点での希釈倍率の見直しを行い、1/100で1次スクリーニングを施行して汗抗原の同定を目指す予定である。本年度は、前年度に引き続きヒト皮膚cDNAライブラリーについて、アトピー性皮膚炎患者好塩基球を用いたヒスタミン遊離試験を指標にスクリーニングを行うとともに、これまでの精製課程で分かっている汗抗原の生化学な性質を利用し、検討を行った。1.平成19年度は、cDNAライブラリーののべ1000クローンを1プールとしてプラスミド精製を行なったが、2次スクリーニングで陽性クローンを得ることが出来なかった。そのため、本年度はプラスミドの希釈倍率の見直しを行った。のべ1000クローンを1プールとしてプラスミド精製を行い、COS7細胞にエレクトロポレーション法を用いてトランスフェクションし、培養上清および細胞破砕物に対するアトピー性皮膚炎患者好塩基球のヒスタミン遊離をした。しかしながら、20000クローンについてスクリーニングを行ったが、有意にヒスタミン遊離を惹起するクローンを見いだすことは出来なかった。2.上記スクリーニングを行うとともに、これまでの汗抗原の精製で判明している汗抗原の生化学的な性質(ムチン型糖鎖を持ち、等電点が4.7前後で、おそらく分泌蛋白)からデータベースの検索を行った。候補分子としてMucin like-1(MUCL 1 : small breast epithelial mucin)をヒト皮膚cDNAライブラリーからPCR法でサブクローニングを行い、COS7細胞に強制発現させた。培養上清および細胞lysateのimmunoblotを行い、COS7細胞にても、培養上清中に分泌されることを確認した。しかしその培養上清をヒスタミン遊離試験に供したが、有意なヒスタミン遊離は認められなかった。今後もin silicoで検索した分子について検討していく予定である。