hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ウコンノメイガの寄主転換を引き起こす要因の解明

ダイズ害虫ウコンノメイガはアカソ等のイラクサ科植物とダイズの間で季節により寄主を変えることが知られているが、なぜ起こるのか不明であった。そこで、その生態的要因と行動的要因を明らかにすることを目的に本研究を行った。幼虫の飼育試験の結果、発育に有利な植物を選ぶわけではないと考えられた。一方、植物間で寄生率が著しく異なったことから、アカソからダイズへの寄主転換には寄生を回避する意義があるものと思われた。また、寄主転換を引き起こす行動的要因を調べたが、成虫の産卵選好性の変化では説明できなかった。そこで、産卵以前の植物への誘引により引き起こされると考えたが、有意な結果は得られなかった。本研究では、ダイズ害虫であるウコンノメイガが、越冬世代と夏世代でアカソ(イラクサ科植物)とダイズの間を寄主転換する要因を明らかにすることを目的としている。平成26年度は、幼虫期の食草によって成虫の産卵植物が影響される、あるいは、季節によって植物の質が変化して成虫の選好する産卵植物が変わる、という2つの仮説を検証するために、アカソあるいはダイズで飼育し、羽化させた成虫に、野外において産卵が行われる時期の植物を用いて産卵選択試験を行った。その結果、飼育植物によっても、試験時期によっても産卵選好性に違いは認められなかった。したがって、直接的な産卵選択によって寄主転換を説明することはできなかった。このため、試験条件を見直すために、雌成虫の産卵数の推移を改めて調べたところ、産卵開始日は平均で羽化後5日ほどであり、その後、数日の間に産卵数がピークに達して減少することが判明した。さらに、産卵開始日には個体差があったので、試験での産卵数を揃えるためには、試験に供する個体の状態を厳密に管理する必要があることが分かった。今後は個体毎の産卵数の推移を確認して試験に供する。ウコンノメイガの個体レベルでの産卵数の推移についてはこれまで報告が見られなかったので、原著論文として公表するため投稿中である。また、以上のことより本種の寄主転換においては、産卵行動そのものの選好性よりも、植物に到達するまでの段階で選択が行われている可能性が考えられたので、今後は誘引行動の選好性に焦点を当てて試験を進めていく予定である。平成26年度は、直接の産卵選択によって、寄主転換が起こるという仮説を検証するため、幼虫期の食草や季節の違いによって産卵植物の選択に影響があるか試験したが、データのばらつきが大きく、結果は不明瞭であった。このため、試験条件を見直し、平成27年度には、供試虫は個体ごとに産卵を確認し、産卵開始後2日目、供試植物は、ダイズ展開葉上から2枚目、およびアカソ上部の展開葉812枚を用いて同様の産卵選択試験を行った。その結果、幼虫をアカソで飼育して得た成虫は、7月のアカソよりダイズに有意に多くの産卵を行った。一方、8月および9月の植物ではいずれの植物で飼育した成虫も産卵数に有意な違いはなかった。7月の結果は、夏季にダイズを寄主とする事実を支持しているが、アカソにもある程度の産卵は行われたので、アカソからダイズへの移動を十分に説明できない。したがって、寄主転換には産卵選択よりも、植物に到達する段階の誘引または忌避が影響する可能性が考えられた。また、研究計画では寄主転換の原因となる行動因子を明らかにすることを目標としていたが、生態的な意義についても調べるため、本年度は飼育試験を行い、寄主転換によって発育に有利な植物が選択されているのか確かめた。その結果、幼虫の発育に大きな違いはなく、発育に有利な植物を選ぶよう寄主転換が起こっているわけでないことが明らかになった。一方、既報でも採集時の結果でも、アカソではダイズより著しく寄生率が高かったことから、寄生を避けるために寄主転換が行われていることが考えられた。本年度の研究では、生態的な意義および、否定的結果ではあるが、寄主転換の要因の一部を検証できたので、論文発表するために準備している。平成26年度の試験について、試験条件を見直し、平成27年度に再びやり直したため計画より進行は遅れている。産卵試験と同時に誘引試験も行う予定としていたが、試験時期を逸したことと、予算の都合から、本試験は翌年に行うこととし、予備試験として植物からの揮発成分の捕集、分析方法を検討するまでに留めた。したがって、当初の計画よりは遅れている。平成27年度までに行った飼育試験において、本種幼虫の発育に大きな違いはなく、発育に有利な植物を選ぶよう寄主転換が起こっているわけでないと考えられた。一方、野外調査によって、アカソにおける寄生率はダイズでの寄生率よりも著しく高かったことから、本種の寄主転換には夏季の寄生を回避する意義があるものと考えられた。次に、このような寄主転換を引き起こす要因を明らかにするため、まず、成虫の産卵選択によって、寄主転換が起こるという仮説を検証した。

一方、8月および9月の植物ではいずれの植物で飼育した成虫も産卵数に有意な違いはなかった。7月の結果は、夏季にダイズを寄主とする事実を支持しているが、アカソにもある程度の産卵は行われたので、アカソからダイズへの移動を十分に説明できない。したがって、寄主転換には産卵選択よりも、植物に到達する段階の誘引または忌避が影響する可能性が考えられた。そこで、平成28年度は植物からの香気成分による誘引効果の強さがアカソとダイズの間で相対的に変化することによって寄主転換が起こるものと予想し、オルファクトメーターを用いた誘引試験を行った。しかし、行動を示した個体は極めて少なく、有意なデータは得られなかった。その中で、反応を示したごく僅かの個体はその季節における寄主側に移動する行動を示したので、試験条件を適切に設定できなかったため、本来の結果が得られなかった可能性もある。したがって、研究期間内に目的を達成できなかったが、今後、実験装置や供試虫、供試植物の条件を検討することで、本研究の目的を達成する計画である。ダイズ害虫ウコンノメイガはアカソ等のイラクサ科植物とダイズの間で季節により寄主を変えることが知られているが、なぜ起こるのか不明であった。そこで、その生態的要因と行動的要因を明らかにすることを目的に本研究を行った。幼虫の飼育試験の結果、発育に有利な植物を選ぶわけではないと考えられた。一方、植物間で寄生率が著しく異なったことから、アカソからダイズへの寄主転換には寄生を回避する意義があるものと思われた。また、寄主転換を引き起こす行動的要因を調べたが、成虫の産卵選好性の変化では説明できなかった。そこで、産卵以前の植物への誘引により引き起こされると考えたが、有意な結果は得られなかった。試験結果は当初期待していたものとは異なっていたため、今後は試験条件を見直すとともに、アプローチを変更して試験を組み立てることになる。このため、平成27年度では再試験を行うとともに、別の試験を準備、遂行することになる。26年度では人工気象室の購入に予算のほとんどが使われたことと、この人工気象室でのアカソの栽培が順調ではなかったことから、冬季には新たな試験を開始することができなかった。よって、当初の計画より進行は遅れている。一方、27年度の計画は当初、26年度の結果を受けて、人工気象室で育成した植物と野外植物との比較を行う予定であったが、これを行わず、新たなアプローチに置き換えられることになるので、順調に進めば28年度の計画には間に合うはずである。当初の研究計画では、2年間で寄主転換を引き起こす行動的な要因を特定し、平成28年度には行動を制御する化学的因子の解明を予定していたが、現在のところ行動的な要因の解明には至っていない。産卵選択では説明できないことが明らかになったため、今後は揮発成分に対する誘引および忌避行動に絞って試験を行うことになるので、行動試験を行いながらGC-MSによる分析を同時に進行する予定である。野外のシーズン(7月)前に、人工気象室内で育成した植物を用いて、オルファクトメーターおよび風洞による誘引試験の方法を確立しておき、79月のアカザあるいはダイズに対する誘引行動を、各植物で飼育した個体で試験する。誘引あるいは忌避行動が見られたら化学分析を行い、候補物質とその変化について調査しておき、植物の得られない冬季にその成分を用いた行動試験を行う。
クロマチンDNAにおける相同的組換え機構に関する研究

真核生物の染色体は、クロマチン構造を形成して造伝子DNAを狭い核内に収容している。この核内で、遺伝子DNAは種々の原因による損傷を受ける。そのため生物には複数のDNA修復機構が存在している。その内の一つに、相同的組換えを介したDNA修復機構がある。クロマチンDNAでの相同的組換えを理解するためには、そこで働くDNA組換え酵素を同定する必要がある。近年、ハムスターのDNA修復欠損細胞を相補するヒトの遺伝子として、XRCC2およびXRCC3遺伝子が単離された。そしてこれらの遺伝子産物が、ヒトの組換え酵素として知られているHsRad51と低い相同性を有することが明らかになった。さらに、HsRad51遺伝子と相同性を有するヒトの遺伝子として、Rad51B、Rad51C、Rad51Dがデータベースより見いだされ、これらRad51ファミリーの相同的組換え修復系への関与が示唆された。そこで、本研究において、これらRad51ファミリーのうち、特にXrcc2、Xrcc3、Rad51C、そしてHsRad51の遺伝子産物を組換え蛋白質として精製して生化学的な解析を行った。その結果、Xrcc3は単独では可溶性画分に見られないが、HsRad51もしくはRad51Cと共発現させると、これらと複合体を形成して可溶性になることが分かった。そして、Xrcc3・Rad51C複合体が単鎖DNAおよび二重鎖DNAと結合し、HsRad51同様にnucleoprotein filament構造を形成すること、HsRad51と同様に相同な単鎖DNAと二重鎖DNAとを対合させる相同的対合反応を行うことが明らかになった。一方、Xrcc2は単独で可溶性画分に精製されるが、それ自身では相同的対合反応は行わなかった。真核生物においてRad51は、体細胞分裂期のDNA組換え修復および減数分裂期の遺伝的組換えで中心的な役割を果たす。このタンパク質は、その原核生物ホモログであるRecAと同様に、単鎖DNAと二重鎖DNAとを対合させる、いわゆる相同的対合反応を行う。その際、RecAとは異なり、Rad51は補因子を要求することが知られており、このRad51と補因子との相互作用が、真核生物特有のクロマチン構造におけるDNA組換えに重要であると考えられている。今回、ヒトRad51とその補因子の一つであるヒトRad52との相互作用を解析した。ヒトRad52は、ヒトRad51と直接相互作用し、Rad51の相同的対合活性を相乗的に上昇することが知られている。しかし、ヒトRad51のRad52結合部位は報告されていない。そこで、すでに報告されている、出芽酵母Rad51のRad52結合領域に相当するヒトRad51領域の欠失変異体(1番から114番アミノ酸の領域)を作製して精製し、そのRad52との結合を解析した。その結果、出芽酵母Rad51とは異なり、ヒトRad51はこの領域ではRad52と相互作用しないことが分かった。加えて、ヒトRad51のこの領域の高次構造をNMR法により決定し、この領域がヒトRad51のDNA結合活性に必須であることを示した。次に、ヒトRad51のRad52結合領域を調べる目的で、PCRランダム変異導入法によって無作為に点変異ヒトRad51を作製した。その結果、ヒトRad51のC末領域のPhe259、Val273、Phe279、Ile287そしてArg299に点変異が導入されると、Rad52との相互作用が著しく、もしくは中程度損なわれることが明らかになった。
機能流体システムの開発とその知的制御に関する研究

以下の各項目について組織的な研究を行った。1.機能流体の製造と物性に関する研究磁場の作用下で高機能を発揮する磁性流体の製法の開発が進められ、従来の磁化の強さに対して34倍の高い磁化を示す窒化鉄微粒子を含む磁性流体やイオン性磁性流体、液晶ベース磁性流体の開発が進み、その磁化特性及び粘度特性が解明された。また、電場によりレオロジー特性が大幅に変化するER流体についても、そのレオロジー特性への電場依存性が詳細に検討された。2.機能流体の力学に関する研究機能性流体の高機能性発現機構の解明を目的に、磁場の作用下での超微粒子の振舞いと凝集形態を解明するための数値シミュレーションが行われた。また、磁場下での粒子の一部凝集、あるいは、濃度変化を考慮して磁性流体の管内流動特性(特に、振動流の特性)を求め得る理論解析を行い、実験結果をよく説明しうることが示された。さらに、管内二相流の流動及び伝熱特性に及ぼす磁場の影響が、流体中の気泡の微視的振舞いをも含めて明らかにされた。そのほか、エマルジョンの脈動流特性、血液を模擬した機能流体の管内脈動流の流動特性、電気流体噴霧の電場制御、プラズマ流の磁場制御等の解明にも見るべき進展がなされた。3.流体の機能化とその応用面の開発に関する研究流体の混相機能化に関する研究が行われた。すなわち、磁性流体に磁場効果のみならず、電場効果を持たせることやER流体のレオロジー特性への磁場付与の効果が検討された。その応用面開発の基礎研究として、軸シール、ダンパ、アクチュエータ及びエネルギー変換システムの性能評価が行われた。以下の4項目について3回の研究連絡会(平成7年7月31日、11月22日及び平成8年3月12日)を持ち、研究が進められた。1.機能流体の開発と物性に関する研究磁場の作用下で高機能を発揮する磁性流体として窒化鉄粒子を含む高磁化特性を示す磁性流体のほか、温度変化により磁化特性が大幅に変化する感温磁性流体、磁場のみならず電場にも応答するように考案されたもの、さらに、イオン性磁性流体の開発が進められ、その諸物性値への電磁場の影響が検討された。2.機能流体の流動特性に関する基礎研究磁場の作用下での超微粒子の振舞いと凝集形態を解明するための数値シミュレーションが行われた。また、粒子の凝集を考慮して磁性流体の管内流動特性(特に、振動流特性)を求めうる理論解析を行い、実験結果をよく説明できることが示された。さらに、管内沸騰二相流の流動特性とその知的制御に関する研究が行われた。流体機器システムとしての特性の研究機能性微粒子(個体、液体、気泡など)を混入することにより流体の混相機能化を促進する研究が進められ、流体システムの開発へ向けての研究が開始された。特に、プラズマジェットの磁場制御特性と2次ガス注入による高機能化の研究成果が報告された。4.応用面開発に関する研究電磁場制御によるアクティブダンパの特性が作動流体として磁性流体やER流体、液晶を用いて検討されている。また、アクチュエータ及びヒートパイプ、エネルギー変換装置の応用機器の開発並びに性能向上に関する基礎研究が進められた。特に、アクチュエータの開発研究にみるべき成果が得られているので、次年度でさらに開発研究を進める予定でいる。前年度に引き続き以下の4項目について、2会の研究連絡会(平成8年11月22日、平成9年1月28日)および2回のセミナー(平成8年4月3日、8月30日)を開催し、研究活動が進められた。1.機能流体の開発と物性に関する研究高機能性を発揮する磁性流体として窒化鉄微粒子を含む

磁性流体および界面活性剤を用いずに、電気二重層の反発力を利用して安定な分散を確保するイオン性磁性流体の微粒子の磁気的性質を含めた流体の磁化特性が明らかにされた。また、従来よりもより均一な粒子分布を示す磁性流体の製法に成功している。さらに、液晶中にマグネタイト粒子を分散させて、磁場のみならず電場の効果も働かせるように工夫した磁性流体のレオロジー特性が示された。2.機能流体の内部ミクロ構造とレオロジー特性磁性流体やER流体を対象として、微粒子の凝集構造の解明がモンテカルロ・シミュレーションやパーコレーション理論の計算手法を用いて進められた。その結果、電磁場の作用下での粒子の凝集により、流体のレオロジー特性が影響を受ける機構の解明が一段と進展した。3.機能流体の力学および流動特性に関する研究磁性流体、ER流体、血液の管内流動特性(主に、振動流、脈動流の特性)および電磁場を用いての流れおよび伝熱特性の知的制御に関する研究に新たな進展がみられた。また、磁性流体液滴の磁場浮揚による位置制御、液体金属の界面形状と流動方向の磁場による非接触制御、二次ガス混入によるプラズマ流の高機能化と磁場制御など、機能流体の流動の知的制御に関する研究が進められた。4.機能流体システムの応用面開発に関する研究電磁場制御によるアクティブダンパやアクチュエータの動特性が作動流体として磁性流体、ER流体、液晶を用いて進められた。また、エネルギー変換装置の応用の基礎研究としての性能向上策が種々提案された。
Targeted delivery of photosensitizers to uterine cervical cancer using iron oxide nanoparticles as a vehicle for effective photodynamic therapy

光感受性物質であるクロリンe6を効率的に癌細胞内へ送達させるために、酸化鉄核、ポリグリセロールコーティング、およびオクタリジン機能性(SPION-PG-Lys8)からなるナノキャリア(SPION-PG-Lys8/Ce6)を設計した。SPION-PG-Lys8/Ce6は暗所では低い細胞毒性を示し、癌細胞内ではミトコンドリア内に集積した。SPION-PG-Lys8/Ce6を取り込ませた癌細胞に光線を照射することで癌細胞を死滅させることに成功した。この成果をJournal of Materials Chemistry B誌に報告した。超常磁性酸化鉄(superparamagnetic iron oxide nanoparticles:SPION)をpolyglycerol(PG)にて被包しoctalysineを介して光感受性物質であるクロリンe6(Ce6)を結合させたナノ粒子SPION-PG-Lys8/Ce6を用いて効率的な癌細胞に対する光線力学療法を実現すべく研究を続けてきた。その結果in vitroの実験で光感受性物質であるce6がナノ粒子に担持されることによりより効率的に癌細胞内特にミトコンドリア内へ担送されることが確認された。さらにナノ粒子にて効率的にクロリンe6を取り込ませた癌細胞に光線照射を行うことによってfree formのクロリンe6と比較してより強い殺癌細胞効果があることもWST-8assayを用いた細胞実験にて明らかになった。このように超常磁性酸化鉄ナノ粒子を利用した光感受性物質の細胞内への運搬によって、効果的な癌細胞に対する光線力学療法の治療効果が確認されたのでその結果をJournal of Materials Chemistry B誌(impact factor 4.872)に共著者として報告した。これらの結果を踏まえた上で現在ヌードマウスに癌細胞株を皮下移植したxenograft modelを用いてこのナノ粒子による光線力学療法の効果をin vivoで研究しているところである。このin vivoの実験で良好な結果が得られた後には論文化する予定である。in vitroの実験では良好な結果が得られたが、ヌードマウスを用いたin vivoの実験においては酸化鉄ナノ粒子に担持される光感受性物質Ce6の量が最低でも500μg/mL程度の濃度必要であると考えられるが、現在のところ200μg/mL程度までのサンプルしか作製することができていない。このように酸化鉄ナノ粒子に担持されるCe6の量が十分でないため酸化鉄ナノ粒子自体の改善が必要になっているためやや計画より遅れている。細胞実験は卵巣癌細胞株、子宮頸癌細胞株を用いておこなた。さらにSPION-PG-Lys8/Ce6を取り込んだ癌細胞は修飾されていないSPIONを取り込んだ細胞に比べてオートファジーが抑制されることを明らかにした。これらの結果からSPION-PG-Lys8は癌に対する光線力学療法におけるクロリンe6の効率的なキャリアになり得ることが明らかとなった。現在これらの細胞実験をもとにxenograft modelマウスを用いたin vivoの実験を継続して行っている。なおin vitroの研究成果はJournal of Materials Chemistry B誌に報告した。さらに癌に対する光線力学療法や化学療法、放射線療法の効果に、癌細胞の活性酸素腫の代謝能力が大きく関わっていることに注目し、そのメカニズム解明のため実験を進めた。先行研究として、癌細胞のミトコンドリアにおける活性酸素代謝に関わる酵素、mitochondrial superixidedesmutase(SOD2)の発現と卵巣癌の予後に関するコホート研究を行った。SOD2の高発現はある特定の卵巣癌においては予後不良因子となることが明らかとなり、その成果を現在論文にまとめcancer biomarker誌に投稿中である。より多くの光感受性物質をナノ粒子に担持させるため様々な手法を検討している。具体的には酸化鉄のサイズを変えた(in vitroの実験で用いた酸化鉄のサイズは8nm程度であったがそのサイズを大きくする手法を確立しており20nm程度までサイズを大きくすることが可能である)酸化鉄ナノ粒子の作製や、酸化鉄自体をナノダイヤモンドやグラフェンなどに置き換えたナノ粒子の作製、さらには担持させる光感受性物質のce6からverteporfinへの変更などを行っている。現時点ではナノダイヤモンドとverteporfinを用いたナノ粒子ND-PG-verteporfinにおいてverteporfin濃度が700μg/mLとin vivoでも十分な量担持させることに成功しておりin vivoの実験を再開しているところである。婦人科腫瘍学
がん悪性化過程における転写調節因子MRTFの関与

本研究では、v-rasやv-srcによる形質転換細胞において転写調節因子であるMRTF (myocardin-related transcription factor)の活性が低下していること、またMRTFが様々なアクチン細胞骨格遺伝子の発現を誘導することでこれら形質転換細胞の転移、浸潤、腫瘍形成能を抑制していることが明らかとなった。また、MRTFと同じファミリータンパク質であるmyocardinが細胞周期抑制因子であるp21の発現を制御しており、平滑筋肉腫においてmyocardinの発現量減少が肉腫細胞の増殖を亢進させていることも見出した。さらに、活性型のMRTFやmyocardinを形質転換細胞や肉腫細胞に導入することで、これらの細胞の転移・浸潤能や細胞増殖能を顕著に抑制することが可能であった。本研究課題は、転写因子MRTFのがん悪性化過程における関与を検討することが目的である。これまで私は、MRTFが様々なアクチン細胞骨格関連遺伝子の発現を誘導することで細胞の形態や運動能を制御していることを報告してきた。さらに、がん細胞の遊走能獲得において重要な事象である上皮間葉転換においてもMRTFが密接に関与していることを明らかにしている。本年度は、まず様々ながん細胞株や形質転換体においてMRTFの発現量や活性変化の有無を検討した。その結果、v-Rasやc-Srcにより形質転換された細胞においてMRTFの核への局在化が著しく抑制されており、そのためMRTFの活性が減少していることが明らかとなった。それに伴い、カルデスモンやトロポミオシンなどのアクチン結合タンパク質の発現が著減していた。一方、これらの細胞に活性化型MRTFを導入するとこれらアクチン結合タンパク質の発現量が回復し、形態も正常細胞に近いものへと変化した。これら遺伝子導入された細胞では、細胞の浸潤能や足場非依存的な増殖能などのがん細胞特有な形質が抑制されていた。このように、MRTFの活性は細胞のがん形質に密接な関わりがあることが明らかとなった。さらに、MRTFファミリータンパク質で特に平滑筋や心筋において発現量の多いmyocardinに関しても、様々な平滑筋肉腫においてその発現が著減していることが明らかとなった。以上のように、MRTFはアクチン細胞骨格関連遺伝子の発現制御を介してがん細胞の悪性化過程に関与しており、MRTFを活性化することでがんの悪性化や転移を抑制できる可能性が示された。これに関して、MRTFにより発現制御されている代表的なタンパク質であるカルデスモンが、ステロイドホルモンの一種であるグルココルチコイドによっても発現誘導され、それにより肺がん細胞株であるA549細胞の遊走能を抑制できることも見出し報告した。本研究課題の目的は、がん悪性化過程における転写調節因子MRTFの関与を検討することである。昨年度までの研究により、v-Rasやc-Srcにより形質転換された細胞においてMRTFの核への局在化が著しく抑制されていること、それに伴いカルデスモンやトロポミオシンなどのアクチン結合タンパク質の発現が著減していること、また活性化型MRTFを導入することによりアクチン結合タンパク質の発現回復、細胞の浸潤能や足場非依存的な増殖能などがん細胞特有の形質が抑制されることなどを見出していた。本年度は、さらにヌードマウスを用いた形質転換細胞移植実験により活性化型MRTFがin vivoにおいても形質転換細胞の腫瘍形成能や転移能を著しく抑制できることを明らかにした。また、MRTFファミリータンパク質の中でも平滑筋および心筋特異的に発現しているmyocardinが、がん抑制因子であるp21の発現を制御していることも明らかにした。ヒトp21遺伝子のプロモーター領域には転写因子であるSRFの結合配列が存在し、myocardinはSRFと協調的にp21の発現を誘導した。さらに、子宮平滑筋肉種では正常子宮平滑筋に比べてmyocardinの発現が著減しており、それによってp21の発現も抑制されていた。また、子宮平滑筋肉種細胞にmyocardinを過剰発現させると、p21の発現誘導を介して細胞増殖が抑制されるとともに平滑筋としての分化形質を一部取り戻すことが明らかとなった。以上のように、MRTFやmyocardinは細胞骨格タンパク質や細胞周期制御タンパク質の発現を調節することでがん悪性化過程において重要な役割を果たしていることが示された。
オキシトシン点鼻による自閉性障害治療法の開発

本研究では、小学1年生から3年生で、IQ3575の自閉症スペクトラム男児に対するオキシトシンの1ヶ月連続点鼻投与の効果を検討した。その結果、11人の投与終了症例の解析では、尿中のオキシトシン濃度はプラシボ期間に比較して増加しており、コンプライアンスや吸収には問題がなかったが、プラセボ期間と比較して、オキシトシン投与によって、養育者評価による、社会性の障害、反復的・常同的な行動、問題行動の有意な改善は認められなかった。一方で、点鼻投与自体の刺激が忍容できない被験者が1名中止したが、重大な有害事象は認めなかった。自閉症スペクトラム障害(ASD)については、パニックや問題行動についての対症的な薬物治療が行われているが、中核症状に対する薬物療法はない。trust hormoneとして知られるオキシトシン(OT)は、ASDの中核症状に対する効果が期待されており、OTの点鼻投与による成人自閉症患者の社会的行動の改善が報告されているが、単回投与による効果、かつ社会性を検討する課題による変化を示したものが主であり、長期投与、また行動の変化による効果判定を行った研究は少ない。さらに、子どもを対象とした研究はまだない。我々は、10歳以上15歳未満の自閉症スペクトラム障害(ASD)男児8名に対して非盲検にてOTの長期投与を行い、コンプライアンスの良さ、安全性を予備的検討にて示した。社会的相互作用における変化が認められた男児もいたが、症例数が少なくRCTではないために有効性を検討することは不能であった。今年度は、有効性の検討を目的として、ASDの子どもに対するOTの効果をRCTにて検証する研究を開始した。具体的には、小学校1年3年生の、35<IQ<75のASD男児に対して、double-blind,cross-overにてOT、またはplaceboを点鼻投与し、2週間おきに、副作用と変化をチェックするというプロトコールである。行動の変化は、社会性や問題行動に特化した質問紙と視線計測を含めた観察によりチェックする。現在6名が研究を終了し、3名が継続、またはエントリー中である。コンプライアンスは極めて良く、明らかな副作用は出現していない。40名で効果判定をする予定である。オキシトシン(OT)は、点鼻投与による成人自閉症患者での社会性の改善や行動の改善が報告されているが、単回投与による効果を示したものが主であり、また子どもを対象としたものはない。本研究では、大阪大学医学部倫理委員会の承認を受けて、自閉症スペクトラム障害(ASD)をもつ小児に対する長期的OT点鼻治療の効果と安全性を検討した。その結果。ADOS-GではOT投与により8名中6名でコミュニケーション及び社会的相互作用の有意な改善を認めた。CBCL、ABC-Jでは下位項目で改善傾向が見られたものはあったものの、統計的に有意な改善は見られなかった。養育者からは8名中5名で何らかの良い効果が報告され、特に言語的なやりとりの質の改善が、短い文で会話可能なASD児達において見られた。服薬コンプライアンスは良好で、明らかな副作用は認めなかった。以上、予備的な検討ではあるが、OTが小児に対しても安全に長期的に投与できることが世界で初めて示され、自閉症の小児に対するOT治療の可能性が示唆された。各被験者の研究期間が終了した時点で、家族にいずれの期間がオキシトシン/プラセボであったかの印象を尋ねているが、一致率は45%であり、ベースラインと考えられた。オキシトシン血中濃度と、主要評価項目であるSRS total score、CBCL total scoreの、プラセボ期間後とオキシトシン期間後の差との相関を解析したが、有意な相関は見られなかった。オキシトシン投与中の尿中オキシトシン濃度は、開始前、プラセボ期間と比較して、有意に上昇していた。開始前とプラセボ期間における尿中オキシトシン濃度は有意差を認めなかった。有害事象については、血圧の有意な変化を含めて、オキシトシンに関連することが明らかなものは認められなかった。今回の研究からは、オキシトシン投与によって、養育者評価による、社会性の障害、反復的・常同的な行動、問題行動の有意な改善は認められなかった。点鼻投与自体の刺激が忍容できない被験者が1名中止したが、重大な有害事象は認めなかった。発達小児科学、神経科学、実験神経病理学、小児睡眠医療交付申請書に記載されている内容、即ち、被験者が合計20名に達するまで、初年度と同じプロトコールでオキシトシン投与を続行し、投与前後の結果を統計学的に比較し、効果の有無と安全性について検証を行うことについては、既に解析を終了し、結果をJ Child Adolesc Psychopharmacol (Impact Factor 2.88)に報告した。これは自閉者患者に対する長期投与としては世界で初めてのものである。

さらに、医学系研究科の倫理委員会の承認を得て、低年齢の知的障害のある男児を対象としたオキシトシンのrandomized-control studyを開始して、問題なく研究を遂行している。交付申請書では、平成24年度の計画は以下の通りである。自閉症または自閉性障害として外来受診中の10歳以上15歳未満の男児を対象として、open-labelで、全員に対して同一プロトコールにて、オキシトシン製剤あるいはプラセボを約6か月間、1日2回、点鼻する。開始前に、遺伝子多型の解析のためにリンパ球からゲノムを抽出し、行動観察と発達の評価を行う。効果の評価は各段階での養育者による評価と、投与前と投与終了前の行動観察検査により行う。投与前および投与期間中は尿および血液検査を行うと同時に、血圧測定等を行い、オキシトシン濃度測定とともに副作用のモニタを行うとしている。知的障害のある自閉症児に限定して、小学校1年ー3年の40名を対象に、Randomized Control Trialにより、オキシトシン点鼻両方の効果判定を行う。シントキシン点鼻薬を輸入購入する納期が遅れため、25年度の研究費に未使用額が生じたが、次年度に納入されるため、今年度行う研究計画と併せて使用する。さらに、目標数の被験者をリクルートするために、ホームページを用いたり、専門病院に依頼して期間内での研究完結をめざす。平成24年度の予備的検討では、オキシトシンの点鼻は、自閉症児のコンプライアンスが良い、安全な治療であるということがわかったが、効果を立証するためには、randomized-control studyを施行する必要がある。さらに、早期治療がより効果的であるという原則からは、より低年齢への投与が望ましい。さらに予備的検討からは、知的障害のある子どもに明らかな効果が認められた。そこで、次年度以降は、知的障害のある自閉症児に限定して、小学校1年ー3年の40名を対象に、Randomized Control Trialにより、オキシトシン点鼻両方の効果判定を行う。医学系研究科の倫理委員会の認証は既に得た。平成25年度からは、予備的検討から明らかな効果が認められた知的障害のある自閉症児に限定して、小学校1年ー3年の40名を対象に、Randomized Control Trialにより、オキシトシン点鼻両方の効果判定を行うことにしたが、認知機能の制限をつけたことと、年少児のために、被験者のリクルートが当初の予想を下回った。そのため、シントキシン点鼻薬の輸入購入額や、解析に要する費用が少なくなり、平成25年度の研究費に未使用額が生じたが、次年度に納入されるため、今年度行う研究計画と併せて使用する。平成26年度は、被験者のリクルートに重点をおき、達成目標の40名に対してオキシトシン点鼻投与(それに対応する輸入購入額が100万程度)を行い、さらに、効果判定や遺伝子解析、さらに国際学会発表のために経費を使用する。オキシトシン製剤であるシントキシン点鼻薬を輸入しているが、納期が遅れため、24年度の研究費に未使用額が生じた。次年度に納入されるため、今年度行う研究計画と併せて実施する。研究費はオキシトシン製剤ならびに測定用RIの購入費、外注検査の費用、ならびに学会発表のための旅費に使用する。
時間分解分子軌道分光による光化学反応における非断熱遷移の研究

理論計算によると,DHの円錐交差での構造は,立体障害のため他の二つと大きく異なる.そのため,基底状態緩和後,励起された分子振動が異なる.相互作用モードの違いによりスペクトルが異なると考えられる.最小の共役系分子であるブタジエンとその誘導体においの励起状態からの緩和過程の置換基効果を、時間分解光電子分光による研究を開始した。ブタジエンは平面分子であるが、励起状態において捻れることにより平面性をくずして超高速緩和するといわれている。質量が重く、大きさが水素原子より大きい置換基を加えると緩和ダイナミクスが変化することが期待される。ダイナミクスを制御することは化学反応制御への最初のステップである。高次高調波を用いた時間分解光電子分光は、構造を反映した電子状態を観測するため、置換基効果を敏感に検出することができる。今年度は、1,2-ブタジエンの超高速緩和ダイナミクスの観測を行った。光励起後、光電子量の振動を観測した。励起状態の寿命は37 ±15 fsで高速に基底状態へ緩和する。励起状態と基底状態の構造の安定点の違いから誘起される振動と考えている。このような現象は、紫外光を用いた光電子分光や時間分解質量分析法では観測できなかった現象である。さらに、ブタジエンの誘導体と見なせる、2,5-dimethyl-2,4-hexadieneと1,3-pentadieneを時間分解光電子分光により調べてた。それぞれ特徴的なダイナミクスを示し、解離現象が起きているのではないかと考えている。それを確認するため、時間分解質量分析による実験の準備を進めている。また、置換基によるダイナミクスの違いを励起状態のポテンシャル形状に依存するかどうかをしらべるために、理論家と議論を進めている。2,5-dimethyl-2,4-hexadieneと1,3-pentadieneの時間分解光電子分光によるデータをえることができた。また、時間分解質量分析による解離生成物の同定の準備を進めている。おおむね順調に進んでいると考えている。昨年度までに、ブタジエン誘導体の緩和ダイナミクスを時間分解光電子分光により観測し、置換基によりダイナミクスが変わることを見出した。しかし、光電子分光の結果のみでは理解することができない現象があった。それをうけ、今年度の研究目的・計画は、1イオン化質量分析法により、励起後の解離生成物の時間依存性を計測する。これらの結果と昨年度の結果を合わせて、置換基が緩和ダイナミクスに与える効果を研究する。また、2連携研究者である量子化学計算の専門家である北海道大学理学研究院の武次徹也教授(連携研究者)に、励起状態のポテンシャル面や緩和経路の理論面からの検討を依頼した。1に関しては、量子科学技術研究開発機構関西光科学研究所の板倉隆二博士、赤木浩博士のに協力を依頼し、フェムト秒レーザーを用いた時間分解質量分析法により解離種の検出を試みた。光励起後、全イオン種の終了が数百フェムト秒のうちに減少することがわかった。昨年度の時間分解光電子分光の結果と比較すると、光励起により誘起された分子振動によりイオン化確率が小さくなると考えられる。置換基により誘起される分子振動に違いが生じ、それが置換基効果に現れると考えられる。2に関しては、ブタジエン誘導体におけるエネルギーポテンシャル面の計算がされた。置換基に応じて基底状態と励起状態間の円錐交差の構造が変わることがわかった。これが光励起による構造変化に対応し、誘起される振動モードの違いへとつながる。その結果、イオン化確率が変化する。他方、昨年度導入したレーザー発振器に、今年度は増幅器を組み合わせることが可能になった。エネルギーが増すことにより、励起波長を変更することが可能となった。共役ジエンである1,3ーブタジエンは、非断熱遷移により高速に基底状態へ緩和すると考えられており、非断熱遷移ダイナミクスを研究するのに適した系である。今年度までに、緩和過程に関して理解することができた。来年度はその知見の評価を世に問う段階であり、おおむね順調に研究は進展している。本研究の主目的は、共役分子系において超高速に起こる非断熱遷移過程を、時間分解光電子分光法により観測することである。最高被占有軌道(HOMO)だけでなく深い分子軌道もイオン化できる高次高調波高調波光源を用いた点が、本研究の他にない特徴である。昨年度までに、1,3-ブタジエン(BD)、1,3-ペンタジエン(PD)、2,5-ジメチル2,4ヘキサジエン(HD)の励起状態緩和ダイナミクスを時間分解光電子分光法により観測した。PDFとHDはBDの末端の水素原子をメチル基に置換した分子であり、置換基効果による緩和ダイナミクスの変化が来される。また、PD,HDについては多光子イオン化による時間分解質量分析法による緩和ダイナミクスの観測を行った。また、量子化学計算による励起状態から基底状態に至るポテンシャル曲面をもとめた。今年度は、以上の結果を総合化し非断熱遷移を含む緩和過程を明らかにすることをめざした。PDはBDと同様の末端水素がtwisted pyramidal構造をとる(S1/S0)CIが主要な失活経路となり、BDと類似の緩和経路をたどることが分かった。一方、DHは、主鎖が中央炭素部分で大きくねじれたtwisted pyramidal構造への経路がエネルギー的に有利であることが分かった。

DHでは、励起状態での分子構造がBD、PDと異なるため、基底状態に戻った際に振動励起される振動モードが異なることが期待される。このことは、励起緩和後のDHの光電子スペクトルが大きく変化したことと矛盾しない。全ての末端水素をメチル置換することにより、末端水素部分の構造変化が抑制され、中央炭素部分の構造変化により基底状態へと緩和する経路が有利となることが示された。これらの知見を論文として公表する準備を進めている。理論計算によると,DHの円錐交差での構造は,立体障害のため他の二つと大きく異なる.そのため,基底状態緩和後,励起された分子振動が異なる.相互作用モードの違いによりスペクトルが異なると考えられる.時間分解質量分析による解離生成物の同定をおこない、光電子分光の結果とあわせ、ブタジエン誘導体における緩和ダイナミクスを明らかにする。そのためには、理論家による励起状態のポテンシャル計算が必要であり、理論家との議論を進めている。実験結果の再現性の確認、および、共同研究者らとの実験結果の解釈に関する合意は得られた。今年度は、国際会議において他の研究者と議論を行い、論文誌での公表をめざす。29年度が最終年度であるため、記入しない。量子エレクトロニクス29年度が最終年度であるため、記入しない。
神経変性を抑制する代謝経路・栄養素の探索

本研究では、摂取栄養素やその代謝産物をコントロールすることで、細胞内タンパク質分解の活性化を介して、神経変性疾患の発症・病態進行を抑制できる機構を探索することを目的とする。神経変性モデルショウジョウバエを利用して、神経変性を抑制する因子や摂取栄養素とその代謝産物を同定し、それらの介在する神経変性発症・進行メカニズムの解明と予防戦略の提示を目指す。本計画の実施にあたり、適切な神経変性疾患モデル生物が必要となる。代表者はこれまでに、神経変性疾患を軽減する遺伝子をスクリーニングにより探索し、ユビキチン・プロテアソーム系を活性化するRpn11を同定した。Rpn11により軽減される神経変性疾患モデルとして、ポリグルタミン病(MJD病)モデルや筋萎縮性側索硬化症(ALS)モデルなどを確認している。ごく最近線虫において、哺乳類にも保存されている転写因子のFoxOがプロテアソーム活性を上昇させ、異常タンパク質凝集体の蓄積や神経変性の亢進を抑制することが示された。そこで今年度は、まず、栄養因子スクリーニングの指標とするポジティブコントロールとして、FoxOやインスリンシグナル経路を人工的に操作し、それにより神経変性表現型を改良する表現型の探索を行った。MJD病およびALS病モデルショウジョウバエにdFoxOの過剰発現系統を掛け合わせ、その表現型を観察したところ、ALSモデル系統はdFoxOにより寿命が延長されることが判明した。この結果より、神経変性疾患系統における寿命を指標に、栄養因子のスクリーニングを行うことを計画している。まず、エサの組成を各種設定し、表現型を観察した。その結果、酵母(主にアミノ酸)を多く含むエサを与えた場合に、ALSモデル系統は致死性を示すことが判明した。来年度も引き続き、神経変性を正に負にコントロールする栄養因子についての探索を行っていく。神経変性発症を遅延・抑制できるような栄養因子のスクリーニングには、その効果を反映する指標および変性モデル系の選択が重要であったが、本年度はその指標として寿命を、および変性モデル系としてALS病の選択を完了した。MJD病はALS病モデルに比べてdFoxOの効果が観られなかったが、運動機能や神経の変性など、寿命以外の指標に関与する可能性もあるため、引き続き検討を行っていく。本年度に得られたエサの組成を各種設定した実験から、また他の栄養素のスクリーニングを、来年度引き続き行っていく。dFoxOによる神経変性抑制効果は、予想していたレベルには到達していなかったため、dFoxOによるプロテアソーム活性の上昇が、ショウジョウバエの系では機能しない可能性が示唆されている。インスリンシグナル経路や他の転写活性化因子など、プロテアソーム活性化を誘導する因子のスクリーニングが急務であり、来年度、行っていく予定である。

今年度は、従来代表者が保持していたショウジョウバエ系統を用いて、その表現型を探索する計画が主だったものであったため、新規の試薬やショウジョウバエ系統の購入が無かった。加えて、エサの組成を改変して栄養因子の探索を行うという新規の実験は行ったが、通常作製しているエサを流用するため、これまでの研究で用いていた試料の流用が可能であった。しかしながら、来年度は、今年度同定されたエサの組成から、栄養素としてアミノ酸を同定する研究計画の実行が必要なため、新規の試薬を購入する必要がある。栄養因子の同定には、トランスクリプトーム解析やプロテオーム解析を行う必要があり、解析費用、人件費、外部委託費が必要となってくる。また、dFoxOのプロテアソーム活性化効果が微小であったため、転写因子系統を新規に購入して、スクリーニングを行う計画であり、人件費を要する。以上の理由から、基金の次年度使用額が生じた。
天然変性タンパク質の分子シールド効果を応用したタンパク質凝集抑制剤

分子クラウディング効果とは,細胞内のような高濃度の高分子溶液中で,分子の性質が変化する現象である.筆者は,天然変性タンパク質(IDP)の高分子クラウダーとしての性質に着目し,ヒトゲノムにコードされているIDPにタンパク質に対する凍結保護活性を見出した.この効果は,従来理論(排除体積効果)では説明できず,新たに分子シールド効果について解析する必要がある.二つのモデルタンパク質(VLドメイン・Aβペプチド)で検証し,IDPには新たにAβペプチドのアミロイド線維形成阻害活性があることを見だした.併せて,既存のタンパク質試料中からIDP領域を判別する簡便なNMR分析手法の開発にも成功した.我々は新規のIDPとその部分ペプチド(2044アミノ酸)にモデル酵素LDHを含む3種のタンパク質に対する凍結保護活性・凍結乾燥保護活性を見出した。更に、「IDPの凍結保護活性は、IDPによる分子クラウディング効果、とくに分子シールド効果に起因するものである」、との仮説を立てた。本研究では、IDPの分子シールド効果を検証するために、評価タンパク質それにIDPを添加する、またはIDPを用いた化学架橋修飾を行い、特定の温度条件で一定時間経過の凝集・沈澱またはタンパク質の失活を定量する系統的な実験を計画した。今年度の予定は、実験に用いる凝集性のモデルタンパク質の試料調製、中温高温域で働くモデル酵素(市販)の選別と酵素活性測定系の導入・確立、および、IDPによる凝集阻害実験の一部試行である。まず、Aβ(1-42)については、試料調製ならびに凝集核混入を低減させるための試料品質管理法の確立に成功し、チオフラビン色素による凝集過程のリアルタイム観察系も確立できた。しかしIDPによる凝集阻害実験の試行には至らなかった。ALアミロイドーシス形成性のIgG-VLドメインについて、大腸菌発現プラスミドを入手し試料調製を試みたが、十分量のタンパク質試料が得られなかった。そこで他のVLドメインとして文献報告がある6aJL2-VLドメインの大腸菌発現系を新規にプラスミドより構築した。高温域でのIDPによる凝集阻害実験においては、IDP添加によるPCR反応の増幅率向上が認められた。しかし耐熱性DNAポリメラーゼの凝集を直接観測するのではなく、PCR反応産物で観測する間接測定系のため、データの再現性は良いとは言えなかった。他方、中温で反応する制限酵素を用いた実験では、長時間インキュベートによる酵素活性低下を低減できたため、凝集抑制が認められたと考えられた。PCR酵素を用いた、高温での耐熱性ポリメラーゼの凝集・失活抑制の実験については、新たな実験系の構築はできた。また、当初の作業仮説通り、IDP添加による酵素活性の失活の抑制効果が確認できた。しかし、必ずしもデータの再現性がよくないため、IDPそれぞれの性能評価には至らなかった。また、今年度中にAβ(1-42)の凝集・繊維形成に関わるIDPの効果、ALアミロイドーシスに関連するVLドメインに対する凝集抑制効果について、計測まで進める予定であったが、試料調製にてまどりそこまで到達できなかった。ただし、試料調製の難度が高いことで知られているAβ(1-42)の高品質試料調製系、ならびにモデル評価系であるALアミロイドーシス由来VLドメイン6aJL2の新規の大量発現系は構築できた。当初計画にはなかったが中温域で動作する制限酵素を用いた新規の評価系の作成に成功した。こちらの系でも、IDP添加による酵素活性失活の予防が確認できた。これらより、IDPの凝集抑制効果が幅広い温度で観察できるという、当初の予測が確認されつつある。以上のことを勘案し「やや遅れている」と自己評価する。応募者はヒトゲノム由来天然変性タンパク質(IDP)と、その部分ペプチドに、他の酵素の凍結融解または凍結乾燥ー再溶解に伴う失活に対する保護効果を見だした。IDPの持つ分子シールド効果に着目して、機構に関する研究を行った。本年度は、ALアミロイドーシスの原因タンパク質である凝集性の高いVLドメインと、2種の市販の抗体医薬品、ならびにAβ(1-42)に対する凝集阻害を観察した。VLドメインについては、凝集の分子機構の研究が進んでいるVL(BRE)、VL(REI)、VL(BRE-N45K)、VL(BRE-D50E)の試料を準備した。抗体については、Panitumumab、Omalizumabを入手した。しかしこれらはいずれも、応募者が行った実験系では、37°C付近で、数日で観測可能な凝集を観察できず、従ってIDPによる凝集阻害実験も成立しなかった。Aβ(1-42)に対しては、試した3種類のIDPのうち、希薄な濃度(25 μM)で、D10(44アミノ酸)に顕著な、FK20(20アミノ酸)に中程度の凝集阻害効果を確認した。E1(40アミノ酸)に凝集阻害効果は見られなかった。上述のようにIDPが有するかもしれない分子シールド効果について、より幅広く研究するために、タンパク質がIDPかどうかを決定するための、簡便で高精度な測定法を開発した。これまで、アミド水素信号のHSQCスペクトル上の化学シフトの分散のみによる方法(誤答率が高い)か、1H-15Nの異種核オーバハウザ効果を測定する手法(測定時間が長時間必要)の二つがあり、それぞれ欠点があった。

我々の方法では、HSQCを異なる温度(最低で2点)で測定し、アミド水素信号の化学シフトの温度依存性を求め、従来法(化学シフトの範囲)に組合わせて、温度依存性それが-3.6ppb/Kよりも小さいものを、IDPとした。分子クラウディング効果とは,細胞内のような高濃度の高分子溶液中で,分子の性質が変化する現象である.筆者は,天然変性タンパク質(IDP)の高分子クラウダーとしての性質に着目し,ヒトゲノムにコードされているIDPにタンパク質に対する凍結保護活性を見出した.この効果は,従来理論(排除体積効果)では説明できず,新たに分子シールド効果について解析する必要がある.二つのモデルタンパク質(VLドメイン・Aβペプチド)で検証し,IDPには新たにAβペプチドのアミロイド線維形成阻害活性があることを見だした.併せて,既存のタンパク質試料中からIDP領域を判別する簡便なNMR分析手法の開発にも成功した.平成29年度は、これまでの研究の遅れを取り戻すべく、以下の研究を粛々と進行させる。1.ALアミロイドーシスに関連するVLドメインの試料大量調製の完了と、それを用いた凝集アッセイ系の構築・実装、さらにはその系を用いたIDPの凝集抑制活性の評価。2.Aβ(1-42)の凝集(アミロイド繊維形成)実験におけるIDPの凝集抑制活性の評価。3.アミラーゼなどの中温域で動作する産業用・食品用酵素のうち、熱安定性がやや低いもののリストアップと購入、酵素活性測定系の導入と確立。その後、それを用いたIDPの凝集抑制活性の評価。4.IDPによる凝集抑制に関して特に産業応用性が高い、モノクローナル抗体に対するIDP凝集抑制活性の評価。これについては評価系の構築から行う必要があるが、特に凝集形成の観察に適した抗体の入手・試料調製に注力する。5.13のIDPの凝集抑制効果の濃度依存性の検証と、対象物質をPEGとしたときの比較。生物物理学