hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脳アストロサイトと腸管筋線維芽細胞の免疫学的類似性-

アストロサイト、小腸絨毛上皮下でネットワークを形成している筋線維芽細胞、小腸筋層間神経叢に付随する介在細胞(interstitial cell)、肝臓の伊東細胞などは実質細胞と血管のあいだをつなぐ何らかのシグナル伝達や、血管の血流の調節機能を持つと考えられている。これらの細胞に共通して存在し機能している物質を見いだす為に、我々は培養小腸筋線維芽細胞を抗原としてアストロサイトや腸管筋層のinterstitial cellを染めるモノクローナル抗体8E1を作製し、その性質を解析した。8E1の認識する物質は等電点6.8、分子量約50KDで、大脳や培養アストロサイト、培養筋線維芽細胞に豊富に存在し、肝臓、腎臓にはほとんど存在しない。ラット大脳では生後直後には存在せず、1週令ころから発現し、成長に従って増加する。発生を追って、大脳の凍結切片を抗GFAP抗体と8E1とで二重ラベルすると、GFAPを発現しているアストロサイトだけが8E1で染まることが明きらかになった。しかし、抗GFAP抗体では細胞突起の先端まで線維状に染まるのに対し、8E1ではドット状に突起の途中までしか染まらず、免疫電顕では中間径フィラメントにドット状に染色される。大脳ホモジェネートの二次元電気泳動では8E1によるスポットはGFAPのスポットと重なる。しかし8E1は精製したGFAPやビメンチンを認識せず、また、これらの抗原を大量に添加しても8E1は失活しなかった。以上の実験結果から、8E1の認識する物質はGFAPやピメンチンに非常に類似しているが、これらとは異なったエピトープを認識している可能性がある。アストロサイトや筋線維芽細胞、interstitial cellは形態および推測される機能が類似しているだけでなく、これらに共通した物質が発現していることが明きらかになった。アストロサイト、小腸絨毛上皮細胞下でネットワークを形成している筋線維芽細胞、小腸筋層間神経叢に付随する介在細胞(interstitial cell)、肝臓の伊東細胞などはアクチンに富んだ不規則な突起を持ち、細胞相互がギャップ結合で連結して網状構造を呈す。これらの細胞は、実質細胞と血管の間をつなぐ何らかのシグナル伝達や、血管の血流の調節機能を持つと考えられている。そこで、これらの細胞に共通して存在し機能している物質を見いだす為に、培養小腸筋線維芽細胞を抗原として脳のアストロサイトおよび腸管筋層内のinterstitial cellを染めるモノクローナル抗体をin vito immunization法にて作製した。得られた抗体のほとんどは、SDS可溶化の過程で抗原性が失われ、ウエスタンブロッティング法にてバンドが出なかった。8E1抗体はウエスタンブロッティングが可能な数少ない抗体のひとつで、培養筋線維芽細胞やC6グリオーマ細胞、大脳に存在する約50Kの抗原を認識した。免疫組織化学では、大脳および小脳のアストロサイト、培養小腸筋線維芽細胞、グリオーマ細胞、腸管筋層のinterstitial cellなどが強く染まった。大脳の凍結切片を抗GFAP抗体と8E1抗体を用いて二重ラベルすると、皮質や髄質で同一のアストロサイトが染まる。しかし、抗GFAP抗体では細胞突起の先端まで線維状に染まるのに対し、8E1抗体ではドット状に突起の途中までしか染まらなかった。また、培養小腸筋線維芽細胞は抗ビメンチン抗体では線維状に染まるが、8E1抗体では不連続に染まる。8E1抗体はGFAPともビメンチンとも異なるタンパク質を認識していると考えられる。アストロサイト、小腸絨毛

上皮下でネットワークを形成している筋線維芽細胞、小腸筋層間神経叢に付随する介在細胞(interstitial cell),肝臓の伊東細胞などは実質細胞と血管のあいだをつなぐ何らかのシグナル伝達や、血管の血流の調節機能を持つと考えられている。これらの細胞に共通して存在し機能している物質を見いだす為に、我々は培養小腸筋線維芽細胞を抗原としてアストロサイトや腸管筋層のinterstitial cellを染めるモノクローナル抗体8E1を作製し、その性質を解析した。生後1日から8週令のラット大脳の凍結切片を抗GFAP抗体と8E1とで二重ラベルすると、生後1日の大脳皮質では8E1、抗GFAP抗体、ともに腸性の細胞は見当たらなかった。生後6日では、8E1及び抗GFAP抗体腸性の細胞が増加し始め、GFAPを発現しているアストロサイトだけが8E1で染まることが明きらかになった。コンフォーカル顕微鏡で観察すると抗GFAP抗体では細胞突起の先端まで線維状に染まるのに対し、8E1ではドット状に突起の途中までしか染まっていなかった。また、培養アストロサイトを免疫電顕にて観察すると、8E1の抗原は主に中間径フィラメントにドット状に存在した。8E1抗原を解析するために、組織をSDS電気泳動しウエスタンブロッティングを行うと、大脳や培養アストロサイトに約50Kの抗原が存在し、肝臓や腎臓には存在しなかった。この結果、大脳のホモジェネイトを二次元電気泳動後ウエスタンブロッティングしてみると、GFAPの小スポットと同じ位置に8E1による大きいスポットが検出された。又、小腸筋線維芽細胞では8E1による4つの小スポットはビメンチンの4つの大スポットと位置が一致した。しかし、8E1は精製したヒト脳由来のGFAPや牛レンズ由来のビメンチンを認識せず、また、これらの抗原を大量に添加しても8E1は失活しなかった。以上の実験結果から、8E1はアストロサイトや筋線維芽細胞、interstitial cellに存在し、GFAPやビメンチンに非常に類似しているが、これらとは異なったエピトープを認識している可能性が示唆された。
ポンペイ及びエルコラーノ遺跡壁画保存修復新技法開発と遺跡保存管理体制の確立

前年度では、ポンペイ遺跡のアポロの家(メルクーリ通りフロッカーニ通り間)に描かれた壁画を対象に各種非破壊調査を実施した。その結果、過去の修復時に塗布されたと考えられる蜜蝋や合成樹脂の存在が確認でき、こうした修復材料が現在のポンペイおよびエルコラーノ遺跡に残る壁画の主な損傷原因になっていることが明らかとなった。これを受けて本年度は、壁画表面に残留する彩色層補強材の安全な除去方法を検証すべく各種実験研究を実施した。その結果、適切な溶剤と媒体の組み合わせや施工時間を特定するに至った。実験の課程では、ある種の溶剤の効果によって補強材とは異なる物質への反応を確認することができ、これまで単なる彩色層の補強材や湿度対策処置法と考えられていたものが、壁画の見栄えを良くするためのニス材としての利用があったのではないかという可能性が浮上した。本研究の最終的な目的のひとつでもある壁画の新保存修復技法開発においては大きな進展がみられた年度となった。しかしながら、2017年から2018年にかけて実施された現地考古学監督局における大幅な人事異動の煽りを受けて発生した研究の遅れはいまだ取り戻せておらず、今後はより計画的な現場実地研究過程を考えていく必要がある。一方で遺跡保存管理体制の確立に向けて研究は順調に成果が得られているといえる。国内外を対象にした事例調査を通じて、検討すべき優先順位が明らかになりつつある。今後もポンペイ及びエルコラーノ遺跡に適した維持管理方法の指針を示せるよう調査を継続していく予定である。本年度に引き続き、実際の壁画作品を用いながら新保存修復技法開発に向けた研究を継続する。その過程で、同地域において活動する保存修復士および研究者との連携を強め、情報の共有を積極的に行うなど、研究業績上の交流の機会を確保していきたい。また、こちらも継続して、考古遺跡における文化遺産の損傷抑制に適した覆屋構想についても国内外での調査を進め、効率的な保存管理体制の確立に向けた研究を進めていきたい。本年度は、ポンペイ遺跡およびエルコラーノ遺跡において、壁画が残存するエリアを中心に保存状態に着目した現状調査を実施した。その結果、古代ローマ様式の壁画の特徴のひとつである多層塗り工法が適用されていることから、各層間での剥離が深刻な問題となっていることが明らかとなった。特に雨曝しの環境下に置かれた壁画は、漆喰層が厚みをもつがゆえに水分を長時間内部に蓄える傾向にあり、このことが原因で炭酸カルシウムの溶解を促し、剥離発生に繋がっていると考えられる。また、ポンペイの壁画は表面に光沢を帯びたものが数多くみられるが、その原因のひとつとして、制作時の鏝による最表層の押さえ作業が挙げられる。こうして表面に圧力をかけることで漆喰内部に含まれる水分を表面に浮かび上がらせることで、フレスコ画の制作時間を長く確保することができる。しかし、こうして密度高く仕上げられた漆喰は、内部の水分の揮発経路を塞ぐことにも繋がり、上記した剥離の原因に繋がっていることは否定できない。また、彩色層においては、過去の修復方法が問題となり傷みに繋がっていることが明らかとなった。この地域では、彩色層の補強を目的に蜜蝋や合成樹脂を塗布する処置方法が頻繁にとられていた。その目的には、1.ポンペイやエルコラーノの街が海岸線に近いことから湿気の影響を受け易いことから防水効果を得るため。2.彩色層を補強すると同時に発色を際立たせるため。などが挙げられる。こうした塗布材は表面に皮膜を形成し、ニスがけしたような強い光沢を放つ。こうした処置も、壁画本来のオリジナル性を損ねるだけでなく吸放湿性能を著しく低下させ、彩色層の劣化を促す要因になっていると考えられる。本年度の調査結果より特定した壁画を対象により詳細な研究調査を実施する予定であったが、認可元である現地考古学監督局の対応が遅れ、予定が大幅に狂ったため。前年度に実施した、ポンペイ遺跡およびエルコラーノ遺跡における現状調査の結果、エリア内に残存する壁画に共通してみられる損傷傾向を掴むことができた。これを受けて、より詳細な研究へと移行するに相応しい壁画作品を特定し、非破壊での調査を実施した。今年度の調査研究対象として選定した壁画は、ポンペイ遺跡内の北側外壁に隣接するアポロの家の内壁に描かれており、メルクーリ通りとフッローニカ通りの間に位置する。この壁画は、1830年に発掘されて以降、複数回に渡り修復が行われている。この過去の修復について詳細を明らかにするため文献調査を実施した結果、この地域の考古遺跡内で発掘された壁画は、補強と湿度対策を目的に蜜蝋を塗布する方法が広く取り入れられており、しばしばエンカウスト技法の導入があったと誤って判断される要因になっていることが明らかとなった。また、アポロの家に描かれた壁画を対象に、デジタルカメラを用いた超高解像度撮影を実施し、壁画の保存状況を順光および斜光で記録した。その結果、この壁画の表面にも過去の修復時に塗布されたと考えられる蜜蝋の存在が確認でき、その損傷状況から漆喰層の通気孔が塞がれたことが原因となり、彩色層の剥離および&#21085;落が発生していることが明らかとなった。また、近年漆喰の多層塗りを特徴のひとつとしてもつポンペイ遺跡およびエルコラーノ遺跡の壁画において、深刻な問題として注目される複数層間での剥離も同様に、通気性が損なわれたことで発生する残留湿気が原因のひとつになっていることが予測された。

本研究の目的である壁画の損傷原因の究明については、現地研究協力者と円滑な連携がとれていることもあり、当初の予定よりもおおむね順調に成果が得られているといえよう。遺跡内における壁画を対象とする調査研究には現地考古学監督局の許可が必要となるが、2017年から2018年にかけて大幅な人事異動が実施されると、本研究の担当者も変更を余儀なくされた。その結果、同局の対応に遅れが生じるなど、現場実地研究課程において制約を受けざるを得なかった結果、予定していた保存修復作業の実施を通じた研究および新保存修復技法開発フェーズには至らなかった。前年度では、ポンペイ遺跡のアポロの家(メルクーリ通りフロッカーニ通り間)に描かれた壁画を対象に各種非破壊調査を実施した。その結果、過去の修復時に塗布されたと考えられる蜜蝋や合成樹脂の存在が確認でき、こうした修復材料が現在のポンペイおよびエルコラーノ遺跡に残る壁画の主な損傷原因になっていることが明らかとなった。これを受けて本年度は、壁画表面に残留する彩色層補強材の安全な除去方法を検証すべく各種実験研究を実施した。その結果、適切な溶剤と媒体の組み合わせや施工時間を特定するに至った。実験の課程では、ある種の溶剤の効果によって補強材とは異なる物質への反応を確認することができ、これまで単なる彩色層の補強材や湿度対策処置法と考えられていたものが、壁画の見栄えを良くするためのニス材としての利用があったのではないかという可能性が浮上した。本研究の最終的な目的のひとつでもある壁画の新保存修復技法開発においては大きな進展がみられた年度となった。しかしながら、2017年から2018年にかけて実施された現地考古学監督局における大幅な人事異動の煽りを受けて発生した研究の遅れはいまだ取り戻せておらず、今後はより計画的な現場実地研究過程を考えていく必要がある。一方で遺跡保存管理体制の確立に向けて研究は順調に成果が得られているといえる。国内外を対象にした事例調査を通じて、検討すべき優先順位が明らかになりつつある。今後もポンペイ及びエルコラーノ遺跡に適した維持管理方法の指針を示せるよう調査を継続していく予定である。現地考古学監督局からの許可がおり次第、研究対象となる壁画作品の詳細な研究を実施する。また、考古遺跡における文化遺産の損傷抑制に適した覆屋構想について国内外での調査を行い、効率的な保存管理体制の確立に向けた研究を進めていく。これまでに得られた研究成果をもとに、実際の壁画作品を使いながら、新保存修復技法開発に向けた研究を行う。その課程で、同地域において活動する保存修復士および研究者との連携を強め、情報の共有を積極的に行うなど、研究業績上の交流の機会を確保していきたい。また、考古遺跡における文化遺産の損傷抑制に適した覆屋構想についても国内外での調査を進め、効率的な保存管理体制の確立に向けた研究を進めていきたい。本年度に引き続き、実際の壁画作品を用いながら新保存修復技法開発に向けた研究を継続する。その過程で、同地域において活動する保存修復士および研究者との連携を強め、情報の共有を積極的に行うなど、研究業績上の交流の機会を確保していきたい。また、こちらも継続して、考古遺跡における文化遺産の損傷抑制に適した覆屋構想についても国内外での調査を進め、効率的な保存管理体制の確立に向けた研究を進めていきたい。
破骨前駆細胞の形成を調節する新規因子の同定

破骨細胞の分化過程を制御する因子の同定とその機能を解析することは、骨疾患の制御方法の解明に役立つ。我々は、破骨細胞の分化過程における遺伝子発現の変化を解析した結果、Signal transducers and activators of transcription (STAT) 5が破骨細胞分化に重要な役割を担っていることを見出した。同様に、AP-1ファミリーに属するBatfにも着目し解析したところ、マクロファージにBatfを過剰発現させると破骨細胞分化が抑制される傾向が認められた。以上の結果から、Stat5やBatfはIRF8と同様に、破骨細胞分化を抑制する可能性が示唆された。破骨細胞と樹状細胞は共通の前駆細胞から分化するが、これらの細胞の分化振り分け機構はいまだ不明な点が多い。申請者は、『分化振り分けを制御する因子が破骨細胞性骨破壊を阻止する可能性がある』という仮説を立て、その候補因子として樹状細胞の分化を制御する因子に着目し、新たな破骨細胞分化制御因子の発見とその機能解析を目指し、それを応用した骨代謝疾患の治療方法の開発を目的とする。平成25年度は前年度に引き続き、破骨細胞の分化における樹状細胞分化に重要な因子の役割を明らかにするため、破骨細胞の分化課程における遺伝子発現変化を網羅的に解析した。樹状細胞の分化に関わる因子に着目して解析を行った結果、転写因子Signal transducerand activator of transcription 5(Stat5)の発現が経時的に減少することがわかった。しかし、2014年1月、東大のグループから破骨細胞の骨吸収機能にStat5が重要な役割を担っていると報告がなされた(Hirose J et al. J Exp Med. 211:153-163, 2014)。Stat5は、破骨細胞分化を負に制御している転写因子IRF8の発現を制御しているとの報告があるので(Esashi E et al. Immunity. 28:509-520, 2008)、現在、我々はIRF8とStat5の相互関係に焦点を当て、解析を進めている。また、Stat5以外に、IRF8の発現制御に関与している転写因子の挙動について再検討を行った。その結果、樹状細胞分化に重要な転写因子ODF2(申請者が仮に命名)がIRF8の発現を制御していることが示唆され、現在、マクロファージにODF2を強制発現させる、あるいはODF2 siRNAで発現抑制させたとき、あるいは強制発現させたとき破骨細胞分化がどのように変化するか検討している。平成24年度は、破骨細胞の分化における樹状細胞分化に重要な因子の役割を明らかにするため、破骨細胞の分化課程における遺伝子発現変化を網羅的に解析した。まず、マクロファージを破骨細胞分化誘導因子であるRANKLで刺激し、0、24、72時間後の細胞からRNAを調整しマイクロアレイを行った。そこで、Stat5の発現を抑制するためにsiRNAでマクロファージに対してStat5遺伝子をノックダウンさせたが、破骨細胞形成が顕著に抑制されることはなかった。そこで、以前Zhao B.らによって報告された結果(Nat Med 15:1066-1071, 2009)をもとに、破骨細胞分化を負に制御している転写因子IRF8の発現を制御している因子群の挙動について、再検討を行った。その結果、転写因子ODF2(申請者が仮に命名)がIRF8の発現を制御していることが示唆され、現在、マクロファージにODF2を強制発現させる、あるいはODF2 siRNAで発現抑制させたとき、破骨細胞分化がどのように変化するか検討している。申請者は、「樹状細胞分化の振り分けを制御する因子が破骨細胞性骨破壊を阻止する可能性がある」という仮説を立て、その候補因子として、樹状細胞の分化を制御する因子に着目し、新たな破骨細胞分化制御因子の発見とその機能解析を目指した。平成26年度は前年度に引き続き、破骨細胞の分化における樹状細胞分化に重要な因子の役割を明らかにするため、破骨細胞の分化過程における遺伝子発現変化を網羅的に解析した。樹状細胞の分化に伴って発現が上昇する因子に着目して解析を行った結果、転写因子Signal transducerand activator of transcription 5 (Stat5)の発現が破骨細胞の分化に伴って経時的に減少することがわかった。しかし、同時期に、骨代謝(特に破骨細胞の機能)に関わるStat5の機能解析が報告され(Hirose J et al. J Exp Med. 211:153-163, 2014)、着目すべき因子を再検討することとなった。Stat5の解析と同時に、樹状細胞分化に重要な因子群の網羅的解析を進めたところ、新たに重要な因子ODF3(仮名)が候補に挙がった。

ODF3は破骨細胞分化の負の制御因子として知られているInterferon regulatory factor 8(IRF8)と相互作用することによって樹状細胞分化を調節しているので、現在、破骨細胞前駆細胞であるマクロファージにODF3を強制発現させる、あるいは、siRNAで発現抑制させたとき、破骨細胞分化にどのような作用を及ぼすのか検討している。また、ODF3の遺伝子改変マウスを用いて解析することでin vivoで検討する準備を進めている。破骨細胞と樹状細胞は共通の前駆細胞から分化するが、これらの細胞の分化振り分け機構はいまだ完全に解明されていない。申請者は、「樹状細胞の分化を決定している因子が破骨細胞の分化ならびに破骨細胞性骨破壊を阻止する可能性がある」という仮説を立て、その候補因子としてSignal transducerandactivator of transcription 5 (Stat5)に着目し、破骨細胞分化に伴う発現調節機構を検討した。しかしながら、Hiroseらによって、Stat5が破骨細胞の機能(骨吸収能)に重要な役割を担っていると報告され、平成27年度は、候補因子の再検討を行った。その結果、Basic leucinezipper transcription factor(Batf)に着目した。BatfはBatf、Batf2、Batf3からなり、Activator protein 1 (AP-1) familyに属する。今回、これらのBatfのうち、Batf3に焦点を当てて解析した。その結果、Batf3は破骨細胞分化が進むにつれて発現が低下する傾向を示したことから、破骨細胞の分化段階に何らかの役割を担っていることが想像される。最終的にBatf遺伝子改変マウスの解析を行う。破骨細胞の分化過程を制御する因子の同定とその機能を解析することは、骨疾患の制御方法の解明に役立つ。我々は、破骨細胞の分化過程における遺伝子発現の変化を解析した結果、Signal transducers and activators of transcription (STAT) 5が破骨細胞分化に重要な役割を担っていることを見出した。同様に、AP-1ファミリーに属するBatfにも着目し解析したところ、マクロファージにBatfを過剰発現させると破骨細胞分化が抑制される傾向が認められた。以上の結果から、Stat5やBatfはIRF8と同様に、破骨細胞分化を抑制する可能性が示唆された。申請者は、平成25年度に、樹状細胞と破骨細胞の分化振り分けに重要な因子としてStat5を見いだし、平成26年度はその機能解析を行っていた。しかしながら、Stat5と骨代謝(特に破骨細胞の機能)に関する論文が報告されたことから、平成26年度はStat5に限らず、樹状細胞分化に重要でかつ破骨細胞分化で発現の変化が生じる遺伝子として、新たにODF3(仮名)を得た。現在、in vitroでの機能解析にin vitroでの機能解析ならびにODF3の遺伝子改変マウスの購入、in vivoでの機能解析の準備を進めている。
多次元化学反応系における基礎理論に関する共同研究

本国際共同研究では化学反応系の多次元性に重点を置きながら、化学反応が、(a)時間に依存した量子動力学過程である事と、(b)非線形・非平衡・非定常過程である事、の2点に焦点を当てて以下の2つの基礎的な研究題目を進めた。(1)大自由度多次元系である化学反応系の粗視化モデルの理論構築、(2)古典非可積分力学系の微視的散逸過程の発現メカニズムの解明、最終年度である本年度は、研究計画書並びに交付申請書記載の研究計画に沿って、以下の共同研究を進めた。1、長岡は,今年度は海外出張の日程が調整できなかったため電子メール等による通信手段を用いて、Gaspard博士と量子拡散過程に関する波動関数アプローチ(量子状態拡散モデル)に関する共同研究を進め、非マルコフ的確率シュレディンガー方程式を導入し、スピン-ボソンモデルに適用した。2、田崎は、平成11年6月30日から7月26日までブリュッセル自由大学(ベルギー)にてGaspard博士とエネルギー座標を含む多重パイこね変換における微視的散逸機構や間欠性を示す写像の発展演算子のスペクトル分解などに関する共同研究を発展させた。3、また、長岡と田崎はGaspard博士との上記の共同研究を通して得られた成果を、部分的に学会発表し、かつ論文として公表した。(1)大自由度多次元系である化学反応系の粗視化モデルの理論構築、(2)古典非可積分力学系の微視的散逸過程の発現メカニズムの解明、初年度は、研究計画書並びに交付申請書記載の研究計画に沿って、以下の共同研究を進めた。1、長岡は,平成10年8月6日から22日までブリュッセル自由大学(ベルギー)にてGaspard博士と量子拡散過程に関する波動関数アプローチ(量子状態拡散モデル)を用いて、多自由度の凝縮系化学反応系を想定した共同研究を行い、スピン-ボソンモデルに適用して、従来の対症療法的結果が著しく改善されることを確認した。2、田崎は、平成10年7月13日から8月9日までブリュッセル自由大学(ベルギー)にてGaspard博士とエネルギー座標を含む多重パイこね変換における微視的散逸機構や間欠性を示す写像の発展演算子のスペクトル分解などに関する共同研究を行なった。3、また、長岡と田崎はGaspard博士が平成10年10月31日から11月11日まで来日した際に、上記共同研究に関する討論を行なった。現在、こうして得られた成果は、学会発表や論文として公表済み、あるいは投稿準備中である。1、長岡は,今年度は海外出張の日程が調整できなかったため電子メール等による通信手段を用いて、Gaspard博士と量子拡散過程に関する波動関数アプローチ(量子状態拡散モデル)に関する共同研究を進め、非マルコフ的確率シュレディンガー方程式を導出し、スピン-ボソンモデルに適用した。
日本各地でのシカによる植生への影響度を決定する要因の解明

北海道、千葉県、山梨県、愛知県、京都府で5kmメッシュ単位のシカ密度を、階層モデルによって推定した。シカ密度が高いほど森林を構成する木の皮が剥がれる(剥皮)確率が高く、また下層植生は衰退していた。しかし、剥皮確率は木が細く雪が多い場所でも高く、また樹種によって大きく異なっていた。下層植生の被度は最大積雪深が浅く、傾斜が急であるほど低くなっていた。これらのことから、木の剥皮や下層植生の被度はシカによる影響度として適切な指標である一方、これらの影響度をシカ管理の目標とするためには、積雪深や傾斜など他の要因も考慮する必要があることが明らかになった。北海道、千葉県、山梨県、京都府のニホンジカ密度指標及び捕獲数のデータを収集し、状態空間モデルによる5kmメッシュスケールでのニホンジカ密度の字空間変異の推定を試みた。北海道以外は、あいまいな事前分布しか用いなくても妥当なニホンジカ密度を推定することができた。北海道については、パラメータを収束させることはできたが、推定値が過大な傾向を示した。推定値が過大になってしまった要因として、北海道のシカ密度指標は出猟カレンダーによる目撃効率(SPUE)しか利用可能でなかったことが考えられる。そのため、北海道の多くの地点で実施されているライトセンサスについて、データを電子化する作業を進めた。東京において2回の打ち合わせを行い、研究の進行状況、課題、今後の方向性について確認した。山梨県について、推定したニホンジカ密度といくつかの植生指標との関係を解析し、学術論文として発表した。また、日本哺乳類学会大会、IUFRO2014、日本生態学会大会、日本森林学会において、研究成果を発表した。各都道府県(北海道、千葉県、山梨県、京都府)において、既存の植生データを調べたところ、都道府県間で重複して測定されている項目が複数あることが明らかになった。そのため、本年度は各都道府県で収集されている既存の植生データを整理し、収集した。下層植生の被度は全都道府県で、立木の剥皮率は千葉県以外の都道府県で、ササの被度は千葉県以外の都道府県で、スギ・ヒノキの剥皮率は京都府と山梨県で、アオキの食痕は千葉県と京都府で、リョウブの剥皮は京都府と山梨県で、ササの高さは北海道と山梨県で、ササの食痕は北海道と山梨県で収集されていた。また、岐阜県と愛知県について、シカの個体数推定が可能であり植生データを保有していることが明らかになったことから、新たに本研究に加えることとなった。岐阜県は下層植生の被度、剥皮、アオキ食痕、リョウブの剥皮、ササ被度が、愛知県は剥皮が利用可能であった。北海道については、シカの個体数推定に使えるデータが研究当初は出猟カレンダーしか無く、推定することができなかった。そこで本年度は、ライトセンサスデータをGIS化し、推定データとして追加した。しかし、一部のパラメータが非現実的な値となり、推定することができなかった。そのため、来年度は一部の地域で距離標本法によって推定されているシカ個体数をデータとして加えることで、全道の個体数推定を目指すこととした。また、全道で推定が難しい場合、東西、あるいは振興局単位で推定することも検討することとした。都道府県間で比較可能な植生データを整理することができた。さらに、研究当初は含まれていなかった2県を新たに加えることができた。その一方で、北海道については個体数推定ができていない。予定より進捗している部分と遅れている部分があるため、全体としてはおおむね順調に推移していると判断した。推定したシカ密度と対象道府県全てで利用可能な植生指標との関係を、気象条件(最大積雪深)及び環境条件(周囲の人工草地の割合、傾斜)も考慮して解析した。その結果、剥皮強度は調査全年のシカ密度が高い、最大積雪深が非常に少ないあるいは多い、周囲の人工草地の割合が高い、傾斜が急な場所ほど強いことが明らかになった。低木層の植皮率は、シカ密度が低い、最大積雪深が非常に少ないあるいは多い、周囲の人工草地の割合が高い、傾斜が急な場所ほど高いことが明らかになった。さらに、北海道と山梨県のみで利用可能であったデータからは、調査全年のシカ密度が高く、調査地の最大積雪深が深く、細い樹木ほど剥皮されやすいこと、特に剥皮されやすい樹種はリョウブ、ナツツバキ、アオダモ、ツリバナ、モミ、ミズキ、コミネカエデ、ヤマウルシ、ノリウツギ、オヒョウ、バッコヤナギ、ハルニレ、ウラジロモミ、ダンコウバイ、コハウチワカエデ、キハダ、ウリハダカエデ、特に剥皮されにくい樹種はミズナラ、サワシバ、ケヤキ、エゾヤマザクラ、ウダイカンバ、クマシデ、イヌブナ、クリ、アサダ、ミヤマザクラ、シラカンバ、ダケカンバであることが明らかになった。京都府のみで利用可能であったデータからは、低木の摂食、クロモジの摂食痕の有無、ヒサカキの摂食痕の有無、ツツジの摂食痕の有無、下層植生衰退度は比較的シカ密度が低い段階から反応することが明らかになった。ただし、本研究の結果は様々なシカ密度の地点と植生指標の関係を検討したものであるため、シカ密度を低下させた場合の植生指標の反応は検討できていないため、今後さらなる研究が必要である。

シカ密度が高いほど森林を構成する木の皮が剥がれる(剥皮)確率が高く、また下層植生は衰退していた。しかし、剥皮確率は木が細く雪が多い場所でも高く、また樹種によって大きく異なっていた。下層植生の被度は最大積雪深が浅く、傾斜が急であるほど低くなっていた。これらのことから、木の剥皮や下層植生の被度はシカによる影響度として適切な指標である一方、これらの影響度をシカ管理の目標とするためには、積雪深や傾斜など他の要因も考慮する必要があることが明らかになった。北海道については妥当な推定値を得ることができなかったが、他の府県についてはニホンジカ密度を推定することができた。北海道についても、ライトセンサスデータの電子化が順調に進んでおり、今後推定が可能になると考えられる。また、研究成果を学術論文や学会で発表することができた。そのため、おおむね予定通りに研究は進捗していると考えられる。北海道については、距離標本法によるデータが入手でき次第、推定を試みる。他の都府県については個体数データと植生データがそろっているため、共通の解析に用いることができるようにデータを整理し、個体数と植生の関係を気象要因なども考慮して解析する。野生動物管理学,個体群生態学,森林生態学北海道については、ライトセンサスの電子化が終了し次第、状態空間モデルによる個体数推定を試みる。各道府県においてシカによる影響を受けると考えられる植生データを収集する。さらに、いくつかの県を本研究に追加し、データ量を増加させる。当初予定していた野外調査を資料収集に変更したため、若干予算に差額が生じた。物品費が予定よりも安く抑えられたため。次年度については計画通りシカ密度と植生の関係を解析するため、予定通り執行する。消耗品の購入に使用する。
カルシニューリンが関与する神経細胞内カルシウム情報伝達機構の分子遺伝学的解析

C.elegansにおいてカルシウム/カルモジュリン依存性のタンパク質脱リン酸化酵素であるカルシニューリンTAX-6は、感覚ニューロンの感度を負に調節している。本研究では神経系におけるカルシニューリン情報伝達機系を明らかにするために、分子遺伝学的手法をもちいた解析を行った。平成15年度の研究では、哺乳類の脳でカルシニューリン情報伝達系に関与するタンパク質リン酸化酵素CaMキナーゼIIに着目し、そのC.elegans感覚ニューロンにおける機能を検証した。哺乳類の記憶・学習成立機構において、カルシニューリンとCaMキナーゼIIは括抗的に機能していると考えられている。そこで、C.elegansにおいてCaMキナーゼII UNC-43が、カルシニューリンTAX-6と括抗した機能を担っているかを検証した。CaMキナ-ゼIIの機能欠失変異体unc-43は、好冷性の温度走性異常を示した。この異常は、tax-6変異体が示す好熱性異常とは逆の表現型であった。また、unc-43変異体が示す好冷性異常は温度受容ニューロンAFD特異的にunc-43cDNAを発現させることでレスキューされたことから、UNC-43はTAX-6と同様に温度受容ニューロンAFDで機能していることが明らかになった。さらに、unc-43cDNAを温度受容ニューロンAFD特異的に過剰発現させた個体は、AFDの感度が上昇しているtax-6機能欠失変異体と同様に好熱性異常を示した。これらの結果から、CaMキナーゼII UNC-43はカルシニューリンTAX-6とは逆に温度受容ニューロンAFDの活性を正に制御する因子であることが明らかになった。C.elegansにおいてカルシウム/カルモジュリン依存性の脱リン酸化酵素であるカルシニューリンは、感覚ニューロンの感度を調節している。本研究では、C.elegansカルシニユーリン機能低下変異体tax-6(p675)の異常表現型を抑圧する変異を遺伝学的に単離し、その原因遺伝子を同定・解析することにより神経系におけるカルシニューリンが関与する情報伝達機構を明らかにする。平成14年度の研究ではtax-6(p675)変異体を突然変異原であるエチルメタンスルホン酸(EMS)で処理し、その子孫(F2)からtax-6(p675)変異の表現型が部分的に回復した抑圧変異体候補を単離した。1次スクリーニングとして、約5000ゲノムのtax-6(p675)変異体をEMSで処理し、F2世代でtax-6(p675)変異体が示す体の大きさの異常を部分的に抑圧する変異体候補A602-10-1を単離した。この変異体候補A602-10-1に関して、2次スクリーニングとして、tax-6(p675)変異体が示す行動異常が正常に回復するか解析を行った。温度走性行動、NaClに対する化学走性行動解析を行った結果、変異体候補A602-10-1はtax-6(p675)変異体と同様の行動異常を示した。これらのことから、変異体候補A602-10-1の原因遺伝子はC.elegansにおいて体の大きさの制御にのみ関与する遺伝子であることが示唆される。tax-6(p675)変異体が示す体の大きさの異常は、感覚ニューロンでtax-6cDNAを発現させることでレスキューされることから、変異体候補A602-10-1の原因遺伝子も同様に感覚ニューロンで機能している可能性が考えられる。
房質回帰性頻脈誘発性の心房細・粗動の研究-光学的多チャネル計測による解析-

1.活動電位の光学的測定:ラットの右心房と近傍の心室の一部を、シリコンラバー上で洞房結節を中心にシート状に展開した標本を、膜電位感受性色素NK2761で染色後、マトリックス型フォトダイオードアレイを用いた光学的膜電位多部位同時測定システムにより、標本上の1020ヶ所の領域から活動電位を光学(吸光)シグナルとして同時記録した。データはコンピュータに転送し、興奮波伝播の等時線を作成した。心拍動によるアーチファクトは、筋収縮抑制剤であるBDM(2,3-butainedione monooxime)で抑制した。2.人工副伝導路の開発:任意の部位の心房の興奮が開始するtimingを取り出し、一定のdelayを加えたtimingで、房室結節の近傍の心室筋を吸引電極を用いて電気刺激する装置を自作し、副伝導路のモデルとした。これを用いて、副伝導路の位置や特性と興奮波伝播パターンの関係を調べた。その結果次のことが明らかになった。(1)房室伝導路を逆行した頻脈の興奮波と洞房結節に自発性に起こり伝播してくる興奮波が心房上でぶつかると、不均一な脱分極が惹起されるが、これが細・粗動に移行するのは一定の条件下に限られる。(2)房室結節に作用する薬物が無効であることや興奮頻度が房室結節の不応期から想定されるものより速いことなどから、心房細・粗動の発現後は房室性の旋回路は関与してないと考えられた。(3)薬物(アコニチン、ウアバイン等)を作用させた場合や酸素欠乏などの条件下で心房細・粗動を誘発させた時、興奮波伝播パターンに変化が見られた。これらのことから、このモデルは、ヒトの先天性疾患であるWPW症候群の病態によく合致し、頻脈発作の予防や治療薬の開発に極めて有用であることが強く示唆された。
新規Ｄｒｅａｍｌｅｓｓ遺伝子に基づくレム睡眠制御機構の解明

<平成27年度研究実施状況>目的と方法)本研究の開始より以前、すでにDreamless変異マウスにおける候補遺伝子および塩基配列変異部位が染色体連鎖解析と次世代シークエンシングにより同定されていた。通常、フォワードジェネティクス研究で候補遺伝子が見出され、その表現型が優性遺伝だった場合、同様の遺伝子変異を導入したマウスを作製し、同じ表現型を示すかどうかを確認することで、原因遺伝子かどうかを確定することができる。また今回は、化学変異原ENUで遺伝子変異がランダムかつ複数導入されているため、同一染色体内の他の遺伝子にも変異が残存している可能性が残されていた。そこで、CRISPR/Casシステムを用いて候補遺伝子のみに特異的に変異導入することでDreamless変異マウスを再現し、Dreamless遺伝子変異と表現型の因果関係を確定する実験を計画した。すなわち、本研究におけるDreamless家系と同様のレム睡眠異常が認められるかどうかを、個体レベルで最新のゲノム編集技術により迅速に検討することを試みた。結果)Dreamless変異マウスにおける原因遺伝子の証明Cas9タンパクとガイドRNAをコードするプラスミドベクターおよび変異導入の鋳型となる一本鎖DNAをマウス胚に同時微小注入することで、Dreamless特異的遺伝子改変アリルを持つマウス個体の作成に成功し、この変異アリルが遺伝性を有することも確認した。このヘテロ変異個体を用いて、脳波筋電図測定(EEG/EMG recording)により睡眠覚醒行動様式について解析した結果、ENU由来のDreamless変異マウスと同じレム睡眠時間減少の表現型を示すことがわかった。すなわち、Dreamless遺伝子がレム睡眠異常の原因遺伝子であることを直接証明し、本研究におけるレム睡眠異常と原因遺伝子変異部位との因果関係を確定することができた。平成27年度における本研究課題の進捗状況は、おおむね期待通り順調に進展しているといえる。1年目の当初の予定どおり、Dreamless変異マウスにおける原因遺伝子について、CRISPR/Casシステムを用いた変異アリルの再現により確定することができた。また、脳波筋電図測定により得られた各種データの詳細な解析から、レム睡眠様式における異常だけでなく、覚醒やノンレム睡眠の様式においても、野生型のそれと比較して顕著に変化している部分を見出すことができた。特に、得られた脳波筋電図データに対してFFT(Fast Fourier Transform)により周波数領域のデータに変換を行い、その周波数領域データの主成分分析を行った結果、ノンレム睡眠時やレム睡眠時に生じる徐波について変化している様子を観察できたのは意外であった。さらに、ViewRNA ISH法と呼ばれる感度の高い特殊なin situハイブリダイゼーション法の導入を試み、成体期野生型マウスにおけるDreamless遺伝子を発現する細胞の神経領域内の分布についても同定することができた。以上より、レム睡眠が減少する表現型の原因遺伝子の確定、その遺伝子の発現パターンについての知見が得られたことにより、本年度の研究実施計画における当初の目的は達成できた。本年度、本研究課題で主な研究対象として用いたレム睡眠異常の表現型を呈するDreamless変異マウスにおいて、レム睡眠の異常を誘導する遺伝子変異を同定し、その遺伝子変異を野生型マウスに対してCRISPR/Casシステムにより人工的に導入することで、同様の表現型を再現することにより原因遺伝子の確定ができた。すなわち、睡眠研究分野における新規睡眠関連遺伝子を同定することに成功した。今後は、どのようにしてDreamlessマウスに特徴的な睡眠覚醒様式の変化が現れるのか、新たなDreamless遺伝子改変マウスを用いた脳へのウイルスベクター注入実験によって、その原因を明らかにしていきたい。本年度の研究過程において、共同研究として筑波大学の生命科学動物資源センターとのDreamless-floxノックインマウス作成実験も平行して進んでいることから、平成28年度の秋頃にはCreリコンビナーゼタンパクを強制的に発現させるウイルスベクターを用いた、脳内局所微量投与によるloss-of-function実験も開始できることが期待される。これにより、神経領域特異的にDreamless遺伝子を欠失させることが可能となり、Dreamless遺伝子がレム睡眠を制御する神経回路において、いったいどの部分で機能しているのかを明らかにできる可能性がある。ウイルスベクター注入部位の選定については、Dreamless遺伝子の脳内発現パターンを調べたin situハイブリダイゼーション実験から得られた情報より、特に顕著に発現が強い領域を優先的に候補に挙げ、その中でもこれまでレム睡眠制御と関連があると報告されている脳部位をターゲットにする予定である。結果)Dreamless変異マウスにおける原因遺伝子の証明Cas9タンパクとガイドRNAをコードする

プラスミドベクターおよび変異導入の鋳型となる一本鎖DNAをマウス胚に同時微小注入することで、Dreamless特異的遺伝子改変アリルを持つマウス個体の作成に成功し、この変異アリルが遺伝性を有することも確認した。このヘテロ変異個体を用いて、脳波筋電図測定(EEG/EMG recording)により睡眠覚醒行動様式について解析した結果、ENU由来のDreamless変異マウスと同じレム睡眠時間減少の表現型を示すことがわかった。すなわち、Dreamless遺伝子がレム睡眠異常の原因遺伝子であることを直接証明し、本研究におけるレム睡眠異常と原因遺伝子変異部位との因果関係を確定することができた。平成27年度における本研究課題の進捗状況は、おおむね期待通り順調に進展しているといえる。1年目の当初の予定どおり、Dreamless変異マウスにおける原因遺伝子について、CRISPR/Casシステムを用いた変異アリルの再現により確定することができた。また、脳波筋電図測定により得られた各種データの詳細な解析から、レム睡眠様式における異常だけでなく、覚醒やノンレム睡眠の様式においても、野生型のそれと比較して顕著に変化している部分を見出すことができた。特に、得られた脳波筋電図データに対してFFT(Fast Fourier Transform)により周波数領域のデータに変換を行い、その周波数領域データの主成分分析を行った結果、ノンレム睡眠時やレム睡眠時に生じる徐波について変化している様子を観察できたのは意外であった。さらに、ViewRNA ISH法と呼ばれる感度の高い特殊なin situハイブリダイゼーション法の導入を試み、成体期野生型マウスにおけるDreamless遺伝子を発現する細胞の神経領域内の分布についても同定することができた。以上より、レム睡眠が減少する表現型の原因遺伝子の確定、その遺伝子の発現パターンについての知見が得られたことにより、本年度の研究実施計画における当初の目的は達成できた。本年度、本研究課題で主な研究対象として用いたレム睡眠異常の表現型を呈するDreamless変異マウスにおいて、レム睡眠の異常を誘導する遺伝子変異を同定し、その遺伝子変異を野生型マウスに対してCRISPR/Casシステムにより人工的に導入することで、同様の表現型を再現することにより原因遺伝子の確定ができた。すなわち、睡眠研究分野における新規睡眠関連遺伝子を同定することに成功した。今後は、どのようにしてDreamlessマウスに特徴的な睡眠覚醒様式の変化が現れるのか、新たなDreamless遺伝子改変マウスを用いた脳へのウイルスベクター注入実験によって、その原因を明らかにしていきたい。
細菌における環境ストレス応答と細胞内情報伝達ネットワーク

本研究計画では、細菌の環境への応答機構を包括的に理解するために、分子遺伝学的、分子生物学的解析基盤が確立されている大腸菌を対象として、浸透圧や高塩ストレスに応答した細胞内情報伝達機構と遺伝子発現制御機構の解析に焦点を絞り、その分子機構を明らかにすることを目的として立案した研究課題を遂行した。特に本年度は、大腸菌の二つの浸透圧センサー、EnvZ及びKdpDによる浸透圧シグナルの受容と伝達の分子メカニズムを中心に解析し、以下の点を明らかにした。(1)、EnvZは膜局在性の浸透圧センサーと考えられるが、膜領域の機能的重要性を明らかにするために、この領域にアミノ酸変化を生じた変異EnvZの手得を試みた。その結果各種の変異EnvZを手得することができ、膜貫通領域がEnvZによる情報伝達にとって重要であることが明らかとなった。(2)、上記、変異EnvZの一種を用いて、その復帰変異株を手得を試みたところ、同じく膜貫通領域にもう一つのアミノ酸変異が導入されることにより野生型の性質を示すことが明らかとなった。また、この複帰変異は分子間の相補によっても可能であることも示した。したがってEnvZ浸透圧センサーは二量体で機能していることが明らかとなった。(3),KdpDもEnvZと同様に膜局在性の浸透圧センサーと考えられるが、KdpDに関しては、膜から可溶化する方法を用いて精製し、生化学的解析を行なった。精製したKdpDは活性を示さなかったが、リピドを用いてリポソームを形成したところ活性のあるKdpDを再構成することができた。これを用いて浸透圧センサーKdpDの生化学的諸性質を明らかにすることができた。本研究計画では、細菌の環境への応答機構を包括的に理解するために、分子遺伝学的・分子生物学的解析基盤が確立されている大腸菌を対象として、浸透圧や高塩ストレスに応答した細胞内情報伝達機構と遺伝子発現機構の解析に焦点を絞り、その分子機構を明らかにすることを目的として研究計画立案及びその遂行を目指した。特に本年度は、浸透圧に応答したK^+-イオン透過系に関与するK^+-ATPaseの発現制御に焦点を絞り解析し、以下の点を明らかにした。(1)、K^+-ATPaseをコードするKdpABC遺伝子群のプロモーター構造を明らかにし、このプロモーターの発現が浸透圧ストレスに応答して転写レベルで制御されていることを示した。(2)、Kdpプロモーター発現の調節因子であるKdpD及びKdpEタンパク質を同定・精製し、その生化学的性質を解析した。(3)、KdpDは膜局在性の侵透圧センサーと想定され、自己リン酸化能及びKdpEに対するリン酸化能を有することを証明した。(4)、KdpEはDNA結合性の転写活性化タンパク質であり、Kdpプロモーター上流に結合することを証明した。(5)、KdpEはKdpDによりリン酸化され、その結果、Kdpプロモーター領域への結合能、及び転写活性化能が著しく上昇することが明らかとなった。(6)、Kdpプロモーター上流領域のKdpE結合部位には特徴的な湾曲構造が存在することが明らかとなった。以上の結果より、大腸菌における浸透圧ショックに応答したKdpABC遺伝子群の発現制御の全貌を分子レベルでほぼ明らかにすることができた。今後は、KdpEによる浸透圧検知、情報変換の分子機構に焦点を当てて解析を進め、本一般研究(B)の当初の目的の達成を目指す予定である。本研究計画では、最近の環境への応答機構を包括的に理解するために、分子遺伝学的、分子生物学的解析基盤が確立されている大腸菌を対象として、浸透圧や高塩ストレスに応答した細胞内情報伝達機構と遺伝子発現制御機構の解析に焦点を絞り、その分子機構を明らかにすることを目的とした。

特に本年度は、大腸菌の二つの浸透圧センサー、EnvZ及びKdpDによる浸透圧シグナルの受容と伝達の分子メカニズムを中心に解析し、以下の点を明らかにした。(1)、EnvZは膜局在性の浸透圧センサーと考えられるが、膜貫通領域の機能的重要性を明らかにするために、この領域にアミノ酸置換が生じた変異EnvZの取得を試みた。その結果、各種の変異EnvZを取得することができ、膜貫通領域がEnvZによる情報伝達にとって重要であることが明らかになった。(2)、上記変異EnvZの一種を用いて、その復帰変異株の取得を試みたところ、同じく膜貫通領域にもう一つのアミノ酸変異が導入されることにより野性型の性質を示すことが明かとなった。また、この復帰変異は分子間の相補によっても可能であることが示され、EnvZ浸透圧センサーは二量体で機能していることが示唆された。(3)、KdpDもEnvZと同様に膜局在性の浸透圧センサーと考えられるが、KdpDに関しては、膜から可溶化する方法を用いて精製し、生化学的解析を行なった。精製したKdpDは活性を示さなかったが、リピドを用いてリポソームを形成したところ活性のあるKdpDを再構成することができた。これを用いて浸透圧センサーKdpDの生化学的諸性質を明らかにすることができた。
分子シミュレーションを用いたセミクラスレートハイドレートの熱力学的安定性の解明

セミクラスレートハイドレートは水分子が作るかご状構造の中にイオン性の分子やメタン等のゲスト分子かごに内包されることで生成する結晶であり,二酸化炭素や水素の貯蔵,蓄熱,冷凍サイクルなど様々な熱工学分野における応用が期待されている.クラスレートハイドレートの応用においてはゲストとなる分子の占有率や生成における温度圧力条件を測定・見積もることが必要となるが,実験的な測定には時間・コスト的な負担が必要となる.本研究では第一原理分子シミュレーションを用いてゲスト分子の占有率や相平衡に及ぼす影響を見積もることを目的として研究を進めている.本年度は昨年度に引き続きTBABを含むセミクラスレートハイドレートについて第一原理熱力学法を用いて第一原理計算からケージ専有率の計算を行い,占有率やゲスト分子がケージや構造の安定異性に寄与する要因の解明を実施した.第一原理計算においてはゲスト分子とホスト分子の間のファンデルワールス相互作用を正しく見積もる必要がある.そのため相互作用の計算手法を変更しながら検証し,どのような違いが生じるか,どの手法が最も適しているかを検証した.また実験結果と比較し計算結果を検証するため,第一原理分子動力学法を用いて振動スペクトルの計算も行った.前述の手法でスペクトルを計算した後,実験によって実際にハイドレートを作成し生成したハイドレートの占有率や構造をラマン分光法を用いて測定し,計算結果の検証を実施した.計算結果のスペクトルと実験的なスペクトルにはある程度の一致が見られ,検証中の計算手法が占有率の推定に利用できることが確認できた.得られた成果は日本エネルギー学会や分子シミュレーション討論会,日本熱物性学会などへ報告した.本年度は1.直方晶,立方晶,正方晶など,昨年度検証した手法を用いてセミクラスレートの結晶構造やイオン分子の種類を変更しながらセミクラスレートの占有度合いを求めること,2.得られた結果を実験的に生成したもののガス専有率やそのラマン振動スペクトルと比較し結果を検証すること,3.二酸化炭素やメタン・水素等のガス包蔵性を計算し,ガス分離や畜冷熱の観点から応用に適したセミクラスレートの探索を行うこと,4.ハイドレートの成長性や結晶核の生成条件,過冷却温度など,ハイドレートの生産において重要となる生産性の向上に向けた研究を進めることを予定とし研究を実施した.1,2については,イオン分子やゲスト分子を昨年度検証したものを元にして変更し,また立法小以外の結晶構造について専有率や温度圧力に対する安定性を計算した.その際に昨年度に引き続き民都度汎関数法におけるファンデルワールス相互作用が結果に及ぼす効果について検証を行い,本研究に適した手法を決定した.またその一部について実験的に生成し,ラマン分光スペクトルを用いて専有率や構造の推定を行い結果を比較した.結晶構造や含有率についてはラマン分光スペクトルのみでは推定の精度がX線回折等を用いたものと比較して劣りはするが,現在のところ計算結果と実験結果は概ね一致する結果を得ている.また3, 4のハイドレートの利用を目的としたガス包蔵性や成長性については,二酸化炭素やメタンを包蔵するものについて,分子シミュレーションや実験を用いながら成長速度の制御を行うための添加剤が作用するメカニズムや,外場によってハイドレートの生成・成長速度や条件がどのように変化するかを検証しながら探索を実施している.全体として概ね順調に推移していると考えている.引き続き二酸化炭素やメタン,水素を包摂するセミクラスレートハイドレートを対象としながら,占有性やケージの安定性,温度圧力に対する依存性を計算を用いて計算し,ガス貯蔵や分離,蓄冷熱媒体としての利用に適したものを探索していく.また実験的に生成しやすいものについては,スペクトル測定や相平衡条件の測定を通して結果の検証を実施していく.加えて,セミクラスレートの専有率やケージ安定性が変化する要因について,自由エネルギーや分子間相互作用の観点からメカニズムの解明を進める.またセミクラスレートハイドレートの生成においてはモンテカルロ法による古典的な推定も有効である可能性があるため,古典的な手法による相平衡条件・ガス包蔵性の推定も実施し,第一原理計算によって得られた結果と比較しその有効性を検証する.古典的な推定が有用である場合には,第一原理計算によるものに加え,モンテカルロ法による推定も実施する予定である.そのほか,ハイドレートの利用しやすさの観点から,核生成速度や結晶成長速度が添加剤や外場によってどのような影響を受けるかについて,分子シミュレーションを用いて検証していく.結晶成長のシミュレーションには古典的な分子動力学法を用いる予定である.同時に実験的にハイドレートの生成時間や成長速度が添加剤や外場にどのように依存するか,また計算結果とどの程度一致するかを検証する.セミクラスレートハイドレートは水分子が作るかご状構造の中にイオン性の分子やメタン等のゲスト分子かごに内包されることで生成する結晶であり,二酸化炭素や水素の貯蔵,蓄熱,冷凍サイクルなど様々な熱工学分野における応用が期待されている.クラスレートハイドレートは内包されるゲスト分子の種類によって相平衡条件やゲスト分子の包蔵性が大きく異なるため,より利用に適したゲスト分子の組み合わせを見つけることが重要である.そこで本研究では分子シミュレーションを用いてセミクラスレートの相平衡条件やガス包蔵性を計算し,様々なゲスト分子と熱力学的安定性の関係を解明することを目的として研究を進めている.本年度ははじめにセミクラスレートハイドレートのX線解析から明らかになっている酸素原子の配置からセミクラスレートの単位格子構造における水素分子の安定的な配置を分子シミュレーションからダイポールモーメント,ポテンシャルエネルギーが小さくなるように決定した.つづいて先行研究の比較と手法の確認のために構造Iのメタンを含むハイドレートとTBABを含むセミクラスレートハイドレートについて第一原理熱力学法を用いて第一原理計算からケージ専有率の計算を行った.