hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
グルココルチコイド作用増強物質によるリンパ性白血病の新治療法の開発

我々はグルココルチコイド(GC)作用増強物質として、GCに対する細胞の感受性を増強するGlucocorticoid Sensitivity Amplifier(GSA)とGCの示す最大効果を標的細胞でさらに増幅させるGlucocortikoid Potency Amplifier(GSA)の二種の物質群を見出してきた。GSAはPesudouridiny-N-oleoyl-phosphamateと構造決定されている。本物質の化学合成を研究目的として推進し、今までにPsendouridine5'-phosphateの酵素学的大量合成法を確立し、現在Oleamideと縮合法の検討を行っている。現在さらに酵素学的縮合法を検当している。一方GPA物質(EGF、フォルホールエステル、ジアシールグリセリド)はいずれもプロテインキナーゼCの活性化物質群で、逆にプロテインキナーゼCの阻害剤のH-7は、GC作用を強く阻止することを明らかにした。さらにH-7の作用機序に関する研究結果より。H-7は、細胞質画分におけるGCレセプターと熱ショック蛋白(HSP-90)の解離を抑制し、GCセレプター活性化を抑制した。その結果GCセレプターのの細胞質画分からの核への移行が抑制され、GC作用の発現が阻止された。以上のことから、プロテインキナーゼCがGCレセプターの活性化と核への移行に不可欠であることが推定される。以上の結果より、GC体制白血病細胞や種々のGC不応症の中に、プロテインキナーゼCによるGCレセプターの活性化の阻害が考えられ、GC体制リンパ性白血病細胞株をプロテインキナーゼCを指標にスクリーニングしている。さらに、ジアシールグリセリドの長さを変える予備実験より、これらがGPA作用を示す臓器に特異性が認められた。このことから、GSA、ジアシールグリセリドの脂肪酸の長さを変えることにより、臓器特異的にGC作用の増幅が可能か否か検討している。また従来用いられてきた抗白血病治療薬と、GSA、GPAの併用によるリンパ性白血病の治療法をL5170Y、L1210リンパ性白血病細胞を用いて検討している。
体育授業における思考・判断を促すＩＣＴを利用した指導方法に関する実践的研究

本研究の目的は、小学校体育授業における思考・判断を効果的に獲得させるICTの効果的な利用方法を実践的に明らかにすることであった。今後の我が国の教育で求められる日本型資質・能力の枠組みは、21世紀型能力と言われる(国立教育政策研究所、2013)が、その中核にあたるのが、思考力である。本研究は、その思考力を、体育授業で求めていくための発達段階に応じた具体的な体育実践の在り方を検討しようとするものである。その際,思考・判断の育成に関するツールとしてタブレットPCに着目した。当該のツールは携帯可能なため、授業中に実施した運動や動きの映像を容易に撮影・視聴でき、さらに、思考・判断を自己評価したりすることが可能である。対象は、高学年に当たる第5学年の3クラスのハードル走の単元であった。タブレットPCの使用に関する条件は、15-6名のグループに2台用いた、2ハードル走の試技の映像を撮影した、3振り返りの際にその映像を使用した。以下の3つの活用方法を適用し、学習成果及び学習過程を比較検討した。(1)個人の必要性に応じて使用、(2)一人一人の1回の試技毎に使用、(3)2-3回の試技毎に1回使用、であった。収集したデータは、(1)抽出グループの会話、(2)学習者行動、(3)思考力・判断力に関わる調査、(4)形成的授業評価、(5)体育授業に対する愛好的態度調査、であった。その結果、第一に、いずれの活用方法にも関わらず、形成的評価、愛好的態度に大きな違いは見られなかった。高学年において,使用回数を設定してタブレットPCを使用しても、愛好的態度等に大きな影響をしないことがわかった。第二に、タブレットPCのいずれの活用方法において,ハードル走の技能の思考・判断に関する発話がみられた。
ペルフルオロフェニル基の特性を利用した不斉有機酸触媒の開発とアリル化反応への応用

本研究は、キラルブレンステッド酸触媒による新規ホモアリルアミン合成法の開発を主題に、以下の計画に準じ研究を遂行した。(1)光活性キラルブレンステッド酸触媒の設計・開発(2)アリルトリメチルシランとイミン類との櫻井-細見アリル化反応への応用(3)触媒反応系についての評価(4)クロチル化反応への展開MOM-(R)-BINOLおよびMeO-(R)-H8BINOLから3,3'位にペンタフルオロフェニル基を有する新規キラルリン酸の合成に成功した。合成した新規リン酸触媒を用いて、イミン類への櫻井-細見アリル化反応を試みた。反応は円滑に進行し、3,5位にtert-ブチル基を有するベンゾイルイミンを用いた場合に最高98%eeで目的生成物が得られた。本研究は、金属・キラルブレンステッド酸触媒による新規ホモアリルアミン合成法の開発を主題に、以下の研究計画に準じ21年度の研究を遂行した。(1)光活性キラルブレンステッド酸触媒の設計・開発(2)アリルトリメチルシランとイミン類との櫻井-細見アリル化反応への応用(3)触媒反応系についての評価(4)クロチル化反応への展開(1)高活性キラルブレンステッド酸触媒の設計・開発:ペルフルオロフェニル基の強力な電子求引性と特異的なスタッキング相互作用に着目し、ペンタフルオロフェニル基を有する、新規キラルリン酸触媒の合成を試みた。種々検討し、MOM-(R)-BINOLおよびMeO-(R)-H8BINOLから誘導した光学活性ペルフルオロリン酸の合成法を確立することができた。(2)(3)(4)アリルトリメチルシランとイミン類との櫻井-細見アリル化反応への応用と評価:得られた新規リン酸触媒を用いて、イミン類への櫻井-細見アリル化反応を試みた。反応は、ベンゾイル基を有するアシルイミンとアリルトリメチルシランを用い、種々の反応溶媒中、1当量のキラルリン酸触媒存在下で行った。いずれの溶媒を用いた場合でも反応は円滑に進行し、ベンゾイル基を種々検討したところ、3,5位にtert-ブチル基を有するベンゾイルイミンを用いた場合に、エナンチオ選択性が飛躍的に向上し、最高99%eeで目的生成物が得られた。また、本触媒系はクロチル化反応にも有効であり、良好なジアステレオかつエナンチオ選択性で、1,2位置換型ホモアリルアミンを与えた。本研究は、キラルブレンステッド酸触媒による新規ホモアリルアミン合成法の開発を主題に、21年度に引き続き、イミン類の細見-櫻井アリル化反応について研究を遂行した。21年度の研究において、ビナフチル基の3,3'位を強力な電子求引性を有するペンタフルオロフェニル基で置換したキラルリン酸の合成に成功し、本触媒20mol%存在下、3,5-tert-Bu_2C_6H_3基を有するベンゾイルイミンを用いることで、ほぼ完全なエナンチオ選択性(99%ee)の獲得に成功している。しかしながら、種々検討を行ったものの、収率の改善には至らなかった(20%収率)。そこで、22年度は、収率の改善を目指し、以下の研究計画に準じて研究を遂行した。(1)20mol%のキラルリン酸触媒による細見-櫻井アリル化反応の反応機構の考察(2)触媒量のキラルリン酸・量論量のブレンステッド酸協同触媒系の開発(3)協同触媒反応系の検証低収率の原因がキラルリン酸の再生プロセスにあると考え、量論量のブレンステッド酸を添加剤として加えキラルリン酸の再生を試みた。大変興味深いことに、向山アルドール反応等で有用性が報告されていたフェノールやカルボン酸では収率は向上せず、ビフェノールから誘導したリン酸を用いた場合にのみ収率に改善がみられた。特に、ビフェニルの3,3'位を2,6-Me_2C_6H_3基で置換することで、収率エナンチオ選択性ともに良好な結果が得られた(83%収率、92%ee)。検証実験により、量論量のビフェノールから誘導したリン酸は、シリル化されたキラルリン酸エステルからキラルリン酸への再生に関与しており、従来の方法論とは異なるブレンステッド酸再生プロセスを経て反応が進行していることを明らかにした。
大企業・中小企業間における下請・系列関係の評価に関する理論的・実証的研究

平成6年度の研究は,前年度に引き続き大企業・中小企業間における下請・系列関係の評価に関して,自動車工業、家庭電機工業の実証分析をもとに,理論的研究を進めた。とくに,日本における大企業・中小企業間の企業間分業関係の特質について究明した。1.日本型企業間分業関係の利点として,(1)製品の安定的供給,需要の確保,(2)生産技術,研究開発等に関する情報の交換,共有,(3)専用的な特定資産(specific assets)投資による効率性と協調的関係,(4)取引企業間の情報の非対称性の回避,軽減,(5)利益,リスクの長期的共有・シェア,(6)設計変更,納期変更,需要変動等への弾力的な対応,(7)垂直統合による組織肥大化の弊害(X-非効率)の克服,(8)技術や生産ノウハウの移転と専門化,(9)長期,継続的取引による高い習熟効果(learning effect)による技術力向上,コスト・ダウンや関係に特有の技能(relation-specific skill)の発展,(10)適切な競争原理発揚による企業間競争の市場成果等があげられる。2.しかし他方,日本型企業間分業関係の問題点として,(1)企業間の経営資源格差による,優位企業の優越的地位の濫用,劣位企業間の過度競争の可能性,(3)多大なコミュニケーション・コスト,(3)埋没費用(sunk cost)が参入障壁となること,(4)不完全契約下での多面的競争が国際的視点からは透明性に欠くこと,(5)個人株主の経営に対するチェック(モニタリング)機能が働きにくいこと等があげられる。今後の研究課題として,こうした企業取引分業関係に関する経済・経営理論フレームを構築し,大企業・中小企業間の下請・系列関係の発展方向を措定することとしたい。平成4年度の研究は、まず大企業・中小企業間における下請・系列関係の評価に関する、これまでの主な先学の理論的研究を再検討し、現在における研究課題を再整理した。かつて、下請・系列関係は支配従属関係として把握されがちであり、事実、浮動的関係、従属的関係の側面が実態面でも強く現われていた。しかし、高度経済成長期以降、親企業の成長とともに、下請・系列企業、とくに1次下請・系列企業の一部を中心に成長、発展がみられ、親企業との企業間関係は双方にとっての組織レントをもたらすものとなってきた。いわば、協調的関係が親企業と一部の下請・系列企業間に明確化した。これはとくに自動車工業など戦後日本の高度経済成長の代表的産業としての組立加工型機械工業に顕著であった。さらに、こうした傾向が一層顕著となった1980年代以降は、特定の大企業(親企業)から自立化する下請・系列企業も目立ち始め、下請系列関係の自立的関係への発展方向が注目され始めた。しかし、下請・系列関係は頂点の親企業から1次、2次、3次等の下請・系列企業までを含めた、全構造として成り立っているものである以上、一部企業の動勢のみで下請・系列関係を評価するのは誤りと考えられる。以上、本年度の研究を踏まえ、次年度以降の研究課題として、(1)下請系列関係の効率的側面と問題的側面は表裏一体のものであり、全構造的に把握せねばならないこと、(2)こうした下請・系列関係は日本企業内部の「日本的経営」と深く結びつき、企業内・企業間関係がともに日本的関係として進展していること等が、理論的・実証的に究明されねばならない点と考えられる。平成5年度の研究は,大企業・中小企業間における下請・系列関係の評価に関して,自動車工業,家庭電機工業の実証分析をもとに,研究を進めた。とくに,日本における大企業・中小企業間の取引分業関係が欧米諸国やアジア諸国と如何なる差異を持つか,またそうした差異が何故生じているのか等を究明した。1.国際的にみて,諸外国において,日本のような豊富な大企業・中小企業間の下請・系列関係は発展していない。日本における業種別,規模別に縦横の下請・系列関係が構築されている状況は極めて特徴的である。2.日本における下請・系列関係を取引関係面からみると,長期的・継続的関係が支配的であり,非契約,暗黙の合意による信頼関係など,高コンテクスト社会に規定されるものといえる。日本では継続的企業間分業関係をする理由として,長期的信頼関係が上位にあげられており,米国,欧州等との差異を示している。したがって,その取引関係は限定された少数の相手と利益・リスクを共有・回避するものとなっている。3.日本における取引分業構造は1次,2次,3次等多段階の重層的階層構造となっており,そうしたいわば集団的に相互の資源依存による環境適合を図るものである。技術面でも「技術の集有」や新製品開発・研究開発等における深い協調関係=デザイン・インが進められている。4.こうした特徴は企業経営において株主構造,雇用慣行,企業間取引分業関係の3側面に共通してみられる日本的特徴であり,その背景には社会,文化的構造要因がある。以上,本年度の研究成果を踏まえ,次年度においては,【.encircled1.】企業間取引分業関係に関する,さまざまな理論的アプローチを検討し,【.encircled2.】日本的下請・系列関係の効率・公正の経済的意義を理論的に分析・考察する予定である。

とくに,日本における大企業・中小企業間の企業間分業関係の特質について究明した。1.日本型企業間分業関係の利点として,(1)製品の安定的供給,需要の確保,(2)生産技術,研究開発等に関する情報の交換,共有,(3)専用的な特定資産(specific assets)投資による効率性と協調的関係,(4)取引企業間の情報の非対称性の回避,軽減,(5)利益,リスクの長期的共有・シェア,(6)設計変更,納期変更,需要変動等への弾力的な対応,(7)垂直統合による組織肥大化の弊害(X-非効率)の克服,(8)技術や生産ノウハウの移転と専門化,(9)長期,継続的取引による高い習熟効果(learning effect)による技術力向上,コスト・ダウンや関係に特有の技能(relation-specific skill)の発展,(10)適切な競争原理発揚による企業間競争の市場成果等があげられる。2.しかし他方,日本型企業間分業関係の問題点として,(1)企業間の経営資源格差による,優位企業の優越的地位の濫用,劣位企業間の過度競争の可能性,(3)多大なコミュニケーション・コスト,(3)埋没費用(sunk cost)が参入障壁となること,(4)不完全契約下での多面的競争が国際的視点からは透明性に欠くこと,(5)個人株主の経営に対するチェック(モニタリング)機能が働きにくいこと等があげられる。今後の研究課題として,こうした企業取引分業関係に関する経済・経営理論フレームを構築し,大企業・中小企業間の下請・系列関係の発展方向を措定することとしたい。
Smadシグナルにより血管壁細胞に発現誘導される新規動脈硬化抑制因子の解明

多機能サイトカインTGF-βの細胞内シグナル伝達分子に着目し、動脈硬化に対する新しい治療法の開発に結びつけることを目的として研究を実施した。TGF-βの主要シグナル分子であるSmad3とアポEのダブルノックアウトマウス(以下KO)を作成し、高脂血症に基づく粥状動脈硬化病変へのSmad3の役割をin vivoならびにin vitroの検討により検討した。ApoE/Smad3ダブルKOは、通常餌による飼育下において、対照であるApoE KOに比べ大動脈に著しい粥腫を形成した。ダブルKOマウスの粥腫は泡沫化マクロファージに富み、コラーゲン沈着が減少していた。マクロファージの集積が増加した背景として、ダブルKOマウスでは組織における単球遊走因子MCP-1が恒常的に高発現していた。In vitroの検討において、Smad3欠損マクロファージでは、TGFβによるMCP-1の発現抑制作用が失われ、その機序としてはSmad3分子がMCP-1プロモーターへ結合し、遺伝子発現を修飾することが示唆された。また、Smad3欠損マクロファージでは野生型マクロファージに比べTGFβによる細胞増殖抑制効果がほぼ消失し、TGFβによる細胞周期抑制蛋白の発現上昇が失われていることが明らかとなった。以上のことから、粥状動脈硬化巣においてマクロファージに発現するSmad3は、炎症性遺伝子発現の抑制と細胞増殖抑制性遺伝子の発現を通じ、病変抑制的に働くことが示唆された。多機能サイトカインTGF-βは、粥状動脈硬化病変には抑制的、再狭窄病変に対しては促進的に働くことが示唆されている。しかし、TGF-β下流の各シグナル分子が動脈硬化形成に及ぼす影響は不明のため、我々はTGF-βの主要シグナル分子Smad3のノックアウトマウス(KO)を代表的な粥状動脈硬化モデルマウスであるApoEKOと交配し、TGF-β・Smad3シグナルの動脈硬化における役割と治療応用への可能性について検討している。本年度、ApoE/Smad3ダプルKOについて、10週から25週にかけて経時的に大動脈の病理組織学的解析を行なったところ、ダブルKOではApoEKOに比べ、約8倍と著しい粥腫の増大を認め、その主体はマクロファージの集積であった。Smad3欠損による血管病変増強に寄与する因子としては、骨髄由来マクロファージやリンパ球の機能亢進と血管壁に内在する内皮細胞機能障害が考えられる。このためダブルKOとアポE単独KOマウスとの間で相互に骨髄移植を行ない、Smad3欠損による粥状硬化促進の原因がいずれの細胞の由来するか検討したところ、病変の形成は骨髄由来マクロファージの性質に依存することが示唆された。また、病変部のマクロファージが単球遊走因子MCP-1を高発現していたことから、マウス腹腔内マクロファージを採取して機能解析を実施したところ、Smad3欠損によりTGF-βによるMCP-1抑制作用が失われていることが明らかとなった。また、Smad3欠損マクロファージは、TGF-βによる増殖抑制作用も失われており、TGF-βによるp15の発現増加の消失がその分子基盤の一つであると推察された。このように、内因性Smad3はマウスにおいて高脂血症による粥状動脈硬化病変の形成に抑制的に働くことが示唆され、Smad3あるいはその下流因子としてのp15の増強は新しい動脈硬化抑制手段として期待される。多機能サイトカインTGF-βの細胞内シグナル伝達分子に着目し,動脈硬化に対する新しい治療法の開発に結びつけることを目的として研究を実施した。TGF-βの主要シグナル分子であるSmad3とアポEのダブルノックアウトマウス(以下KO)を作成し,高脂血症に基づく粥状動脈硬化病変へのSmad3の役割をin vivoならびにin vitroの検討により検討した。ApoE/Smad3ダブルKOは,通常餌による飼育下において,対照であるApoE KOに比べ大動脈に著しい粥腫を形成した。ダブルKOマウスの粥腫は泡沫化マクロファージに富み,コラーゲン沈着が減少していた。

マクロファージの集積が増加した背景として,ダブルKOマウスでは組織における単球遊走因子MCP-1が恒常的に高発現していた。In vitroの検討において,Smad3欠損マクロファージでは,TGFβによるMCP-1の発現抑制作用が失われ,その機序としてはSmad3分子がMCP-1プロモーターへ結合し,遺伝子発現を修飾することが示唆された。また,Smad3欠損マクロファージでは野生型マクロファージに比べTGFβによる細胞増殖抑制効果がほぼ消失し,TGFβによる細胞周期抑制蛋白の発現上昇が失われていることが明らかとなった。以上のことから,粥状動脈硬化巣においてマクロファージに発現するSmad3は,炎症性遺伝子発現の抑制と細胞増殖抑制性遺伝子の発現を通じ,病変抑制的に働くことが示唆された。
高電界によるDNAの分子ビーム化の検討

DNA1分子を真空中に取り出し伸ばした状態で針状に固定し、高電圧を印加することにより電界の集中するDNA分子の先端から化学結合を順次切断され、分子ビームが発生することが期待される。その分子ビームを直接、質量分析装置等で解析することが可能になれば、従来の生化学的手法を用いることなく簡便でかつ直接的な塩基配列決定が実現できると思われる。この手法を実現するためにはDNA1分子を伸長固定する技術の開発が求められている。そこで、微細加工した金属針の先端にポリエチレングリコールと低分子カチオンでグロビュール構造を誘導したDNA分子を誘電泳動力により吸着させた後に脱グロビュール化させるためのバッファー交換を行ない、スライドガラス上にDNAを末端から順に伸長固定する方法を開発した。この技術を用いることで、ガラスキャピラリー先端にDNA1分子を伸長し、それを凍結昇華することで分子ビームを作るための基質を製作することができると考えられる。しかし、現状ではヌクレオチド1分子レベルでの検出は極めて困難である。そこで、分子ビームの検出の予備実験として繊維状のDNAを高電圧側の電極に固定し、TBEバッファで満たしたマイクロチューブ内部に接地電極を置き、DNAに立ち上がり時間の速い高電圧パルスを印加することによりチューブ内に切断されたDNA分子を回収することを試みた。しかし、これらの実験を空気中で行った結果、DNA分子が酸化してしまったため、酸化を防ぐためにアルゴンに置換して実験を行った。アルゴン雰囲気中で高電圧を印加して得られた試料の吸光度を測定した結果、260nmの吸光度としては0.18程度が得られた。その際の280nmの吸光度との比を調べた結果、試料中に切断されたDNAが回収されていると考えられる。これらの結果からDNA1分子を基質とした分子ビームの作製が可能であると期待される。
高エネルギー陽子ビームを用いた次世代型粒子線治療のための基盤研究

新しい放射線治療の領域としての陽子線治療と同時に中性子捕捉療法により,圧倒的な治癒率の向上がはかれる可能性がある.本研究では,2つの粒子線治療の基礎研究とともに,陽子線治療に化学療法を併用した効果を,食道癌,進行肺癌,胆管細胞癌を対象に検討を行った.その結果,化学療法と併用した陽子線治療は,治療効果が良好であるだけでなく,心や肺毒性が低減可能であり,新しい治療法として確立できる可能性が示唆された.小児腫瘍に対する陽子線治療の安全性の確率のため,150例の治療を行い長期的な経過観察を開始している.中性子捕捉療の臨床試験では,4例の治療を終了した.新しい放射線治療の領域としての陽子線治療と同時に中性子捕捉療法により,圧倒的な治癒率の向上がはかれる可能性がある.本研究では,2つの粒子線治療の基礎研究とともに,陽子線治療に化学療法を併用した効果を,食道癌,進行肺癌,胆管細胞癌を対象に検討を行った.その結果,化学療法と併用した陽子線治療は,治療効果が良好であるだけでなく,心や肺毒性が低減可能であり,新しい治療法として確立できる可能性が示唆された.小児腫瘍に対する陽子線治療の安全性の確率のため,150例の治療を行い長期的な経過観察を開始している.中性子捕捉療の臨床試験では,4例の治療を終了した.陽子線治療と同時に中性子捕捉療法(BNσr)を行うことのできる次世代型治療装置を開発中であり,本治療により線量分布の良い陽子線により腫瘍の物理学的ターゲッティングが可能となり,がん細胞致死効果の高いBNCTにより放射線抵抗性,浸潤性,多発性の克服といった腫瘍の生物学的ターゲッティングが可能となる.本研究では,高エネルギー陽子ビームを用いた次世代型粒子線治療のための基盤研究として,以下の4つのテーマを実行し,基礎と臨床をつなぐトランスレーショナルリサーチを行った.1.陽子線およびBNCTによる高次の抗腫癌効果発現メカニズムの解明については,陽子線のブラッグピーク周辺部での酸素効果を評価し,ピーク終末部で生物学的効果がやや高くなる傾向を見いだした.陽子線誘発アポトーシスについては.マウスの小腸腺窩細胞と精巣細胞を指標に治療線量および低線量の全身被曝の影響を検討した.低線量であっても有意にアポトーシスが誘導されるのを観察した.II.ホウ素化合物の腫瘍内輸送法の開発と細胞内分布の解明については,平成24年度は,準備不十分で研究が遅れ25年度に実施をする予定とした.III.陽子線とBNCTの最適な併用法の探索に関する検討については,おもに陽子線治療に化学療法を併用した効果を,食道癌,進行肺癌,胆管細胞癌を対照に検討を行った,進行食道癌に対する化学療法と併用した陽子線治療は,治療効果が良好であるだけでなく,心や肺毒性が低減可能であり,新しい治療法として確立できる可能性が示唆された.IV.新しい臨床試験の立案と実行についえは,小児腫瘍に対する陽子線治療の安全性,有効性評価を約30例に行い長期的な経過観察を開始している.進行非小細胞肺癌に対する化学療法併用陽子線療法のプロトコールについては試験を終了し,X線治療との線量評価の比較を行うとともに,試験結果を国際誌に投稿中である.陽子線治療と中性子捕捉療法(BNCT)を行うことのできる次世代型治療装置を開発中であり,本治療により線量分布の良い陽子線により腫瘍の物理学的ターゲッテイングが可能となり,がん細胞致死効果の高いBNCTにより放射線抵抗性,浸潤性,多発性の克服といった腫瘍の生物学的ターゲッテイングが可能となる.本研究では,高エネルギー陽子ビームを用いた次世代型粒子線治療のための基盤研究として,以下の4つのテーマを実行し,基礎と臨床をつなぐトランスレーショナルリサーチを行った.I.陽子線およびBNCTによる高次の抗腫瘍効果発現メカニズムの解明については,今後の低線量照射による正常組織障害の評価方法として,ヌードマウス移植腫瘍系を用いた正常組織反応のアッセイ系の一つとして、大腿骨の骨髄細胞への影響を定性・定量する為にこのアッセイ系の確立を行った.II.ホウ素化合物の腫瘍内輸送法の開発と細胞内分布の解明については,平成25年度は,準備不十分で研究が遅れ26年度に実施をする予定とした.III.陽子線とBNCTの最適な併用法の探索に関する検討については,放射線治療と免疫療法の併用の可能性を探るべく,照射後のサイトカインの件等を行った.マウス悪性黒色腫の局所照射後にサイトカインが誘発され、とくにIFN-γの上昇は局所効果と関連がある可能性が示唆され,新しい治療法として確立できる可能性が示唆された.IV.新しい臨床試験の立案と実行についえは,小児腫瘍に対する陽子線治療の安全性,有効性評価を約80例に行い長期的な経過観察を開始している.進行非小細胞肺癌に対する化学療法併用陽子線療法のプロトコールについては試験を終了し,国際誌に掲載した.また新たに,BNCTの臨床試験を学内の倫理委員会に申請し,26年4月から臨床試験を開始する予定である.高精度の陽子線治療と病院併設型加速器中性子捕捉療法(BNCT)を行うことのできる次世代型治療装置を開発中であり,本治療により線量分布の良い陽子線により腫瘍の物理学的ターゲッテイングが可能となり,がん細胞致死効果の高いBNCTにより放射線抵抗性,浸潤性,多発性の克服といった腫瘍の生物学的ターゲッテイングが可能となる.

本研究では,高エネルギー陽子ビームを用いた次世代型粒子線治療のための基盤研究として,以下の4つのテーマを実行し,基礎と臨床をつなぐトランスレーショナルリサーチを行った.I.陽子線およびBNCTによる高次の抗腫瘍効果発現メカニズムの解明については,低線量粒子線照射によるマウス小腸および精巣のアポトーシスを検討し,0.05Gy以下の低線量でも線量依存性があることが確認された.II.ホウ素化合物の腫瘍内輸送法の開発と細胞内分布の解明については,PETによる解析を行うための基盤整備を行った.III.陽子線とBNCTの最適な併用法の探索に関する検討については,マウス悪性黒色腫の局所照射後にサイトカインが誘発され、とくにIFN-γの上昇は局所効果と関連がある可能性が示唆された.また,化学療法と粒子線治療の併用効果について,基礎的な研究を開始した.IV.新しい臨床試験の立案と実行についえは,小児腫瘍に対する陽子線治療の安全性,有効性評価を約130例に行い長期的な経過観察を開始している.進行非小細胞肺癌に対する化学療法併用陽子線療法については試験を終了し,国際誌に掲載された.また新たに,BNCTの臨床試験を学内の倫理委員会に申請し,原子炉を利用した臨床研究であるが,4例の治療を終了し経過観察を開始している.26年度が最終年度であるため、記入しない。放射年腫瘍学26年度が最終年度であるため、記入しない。陽子線治療に関する基盤研究(物理研究,生物研究)は,順調に進んでおり多くの結果を得ることができた.また臨床試験または先進医療により得られた肝細胞癌,肺癌,頭頸部腫瘍,脳腫瘍,小児腫瘍などについての結果についても,英文論文として掲載することができた.問題点としては,BNCT関連の機器整備が遅れ,研究が十分に行えていない現状がある.陽子線治療に関する基盤研究(物理研究,生物研究)は,順調に進んでおり多くの結果を得ることができた.また臨床試験または先進医療により得られた食道癌,肝細胞癌,肺癌,頭頸部腫瘍,脳腫瘍,小児腫瘍などについての結果についても,英文論文として掲載することができた.BNCT関連の機器整備が遅れていたが,25年度から担当教員を1名増員し,26年度に臨床試験を行う体制が整っている.26年度が最終年度であるため、記入しない。BNCT研究の推進については,25年度から専門の研究者を雇用して,基礎研究を充実させるとともに,地域のがん専門医の啓蒙活動を行いおもだった臓器の腫瘍別専門部会を設立し,臨床研究実行を確実なものとする.BNCT研究の推進については,26年度から基礎系の専門の研究者を雇用して,研究を充実させる.すでに人事選考が終了しており26年5月より加速器を用いたBNCTの基礎研究を開始する予定である.基礎研究と同時に,地域のがん専門医の啓蒙活動を行い.おもだった臓器の腫瘍別専門部会を設立し,臨床研究実行を確実なものとする.すでに近隣の頭頸部腫瘍の専門医と連携をはかり,臨床試験の推進を計っている.26年度が最終年度であるため、記入しない。24年度は,物品費として計上した金額を下回る使用であったが,この理由はBNCTに関わる装置整備の遅れにより,消耗品の支出が抑えられたためであり,25年度はこの領域の研究を加速することにより,25年度経費と合わせて有効な利用を図る.25年度は,物品費として計上した金額を下回る使用であったが,この理由はBNCTに関わる装置整備の遅れにより,消耗品の支出が抑えられたためである26年度は専任の研究者の配置を行うことが決まっており,BNCT領域の基礎的な研究を加速することにより,26年度経費と合わせて有効な利用を図る.
HLAクラスIIおよびクラスIII領域遺伝子の分子進化学的研究

HLAクラスII遺伝子群は共通の祖先遺伝子から分岐、進化した多重遺伝子族と考えられるが、このうちDR遺伝子は免疫応答性に、DQ遺伝子は免疫抑制性に関与すると推定される。これらの遺伝子群は互いに相同性が高いが、構造領域とともにその発現に関与するプロモーター領域にも変異が存在している。多重遺伝子群の機能分化をもたらした機構を解明するために、DR、DQそれぞれの、β遺伝子の発現レベルの相違を解析した。末梢血リンパ球ならびにヒト由来の種々の細胞株を用いて、HLAクラスII遺伝子群の恒常的発現、インターフェロンγによる誘導性発現レベルを解析したところ、DQαはDRαの510%、DQβはDRβの2030%の発現量を有した。またT98G細胞におけるインターフェロン誘導性発現に対してのTNFγ、ILb、IFNγ、β等のサイトカインの影響は遺伝子毎に異なっており、クラスII遺伝子群に共通の発現制御機構と遺伝子特異的発現制御機構の存在が確認された。各遺伝子のプロモーター領域の塩基配列の比較の結果、上流-350-100領域のみに高い相同性が認められた。このうちDQα遺伝子では、CTF類似の核蛋白(Y60×結合核蛋白)の結合領域内に特異的1塩基置換が存在し、この核蛋白への結合親和性の低下が認められた。CAT融合遺伝子を用いた解析では、DRα、DQα、DQβそれぞれ-250、-400、-450bp領域が、リンパ球特異的発現、抗原提示細胞におけるインターフェロンγ誘導性発現に充分であることが示された。またこれらの領域がDRαとDQα、βの発現レベルの差、TNFγへの反応性への差を同時に規定することがわかった。またDQαプロモーター特異的にクラスI遺伝子のTNF誘導性を規定する領域との相同性が認められ、この領域のTNF反応性への関与が示唆されるとともに、HLAクラスI、クラスII遺伝子群に共通の発現調節が行われうることが示された。
糖鎖高分子のデノボデザインによる抗体様の高分子医薬の開発

タンパク質と結合する糖鎖高分子をリビングラジカル重合によって精密に制御して合成した。高分子の分子の長さ、分子認識素子である糖鎖の配置、糖鎖の種類を設計することで、糖認識タンパク質(レクチン、コンカナバリンA)、インフルエンザウイルスに対して強く、特異的に結合する分子の開発を行った。また、糖鎖高分子は、ポストクリックケミストリーによって合成し、モノマーは反応性ビニル基の電子密度、共役性より新たに設計した。高分子の精密重合はRAFT剤を用いた精密合成によって行い、ポリアクリルアミドについては連続的なマルチブロック重合手法も開発した。高分子の側鎖に糖鎖を結合させた、生体機能性高分子である、糖鎖高分子について、リビングラジカル重合によって分子の空間構造を制御、設計して、合目的的に分子認識能を設計している。特に高分子をペプチドのデノボデザインのように狙って機能を獲得できるように設計できる指針の獲得を検討している。1)リビングラジカル重合による分子鎖長とブロックポリマーの設計:糖鎖を認識するタンパク質(レクチン)では、糖鎖と結合するサイトが一定間隔で離れて複数存在する。これまでの糖鎖高分子の設計では基本的に糖鎖を多数提示する以外のことはできていなかった。糖鎖高分子の分子鎖の長さを精密重合法で制御して、タンパク質との結合解析を行うことで、半経験的に糖鎖高分子の分子鎖長を明らかにした。その上で、他の高分子と組み合わせてブロックポリマーを合成することで、多価効果と他の高分子の機能を併せ持つ新しい分子の設計を可能にした。2)リビングラジカル重合を利用したナノメディシンの設計:モノマーのラジカル反応性を明らかにした上で、クリックケミストリーによってオリゴ糖鎖を導入できるアクリルアミドを開発した。シアル酸オリゴ糖を導入した高分子ではインフルエンザウイルスに対する阻害活性を示し、高分子の分子鎖長、糖鎖密度によって、インフルエンザウイルスの阻害活性を調節することができた。ヒトとトリのインフルエンザウイルスに対する分子認識性は糖鎖密度に強く依存し、特定の糖鎖密度で認識の特性が良く発現した。これまでに(1)長さを種々に変えた糖鎖高分子の合成とタンパク質の分子認識の解析、(2)多価効果を同様に発揮できるホモポリマーとブロックポリマーの合成に成功している。これまでの研究で、高分子の分子デザインによって、多価効果を基本とする分子認識の制御に成功している。25,50,100merの分子の長さ、分子認識能との相関をレクチンを用いた蛍光解析から明らかにしている。これらの定鎖長ポリマーを分子認識のビルディングブロックとして組み入れることで、ブロックポリマーにおいてもホモポリマーと同様に機能を発揮できることを明らかにした。これは、ペプチド合成やDNAナノテクノロジーで行われているような合目的的な分子デザインを一部実現したものである。本研究はおおむね時間スケールの上で、予定通りに進行している。学会発表、論文発表ともに順調に行っている。リビングラジカル重合を利用して、明確なシーケンスを持った高分子を設計、合成し、望む分子認識能を持つ生体機能性高分子の開発を行った。1)ブロック共重合体による糖鎖の配置の制御と分子認識能の発現:ターゲットとするタンパク質はコンカナバリンAで糖鎖と結合するタンパク質のサイトが6.5nmずつ離れている。長さ、ブロックを制御した糖鎖高分子をいくつ重合させた上で、蛍光消光実験によってタンパク質との結合定数を評価した。2箇所のタンパク質結合サイトに糖鎖が配置するように設計された、マルチブロック共重合体について、結合定数が顕著に増大することがわかった。2)マルチブロック重合体の合成法の開発:1ではマクロマーを作製して、逐次重合したが、合成に時間を要し、収率も低かった。系中でモノマーを逐次加えて連続的に重合する手法について設計した。特に、完全に水溶性の可逆的付加開裂連鎖移動剤(RAFT)を新たに設計することで、糖鎖高分子および、マルチブロックな糖鎖高分子をワンステップで重合することができた。コンカナバリンAに対する結合は1)と同様の手法で評価して、設計通りの分子認識能を得ることができた。3)糖鎖高分子を用いたウイルス阻害剤の開発:病原体である、インフルエンザウイルスに対する毒性阻害能について検討を行った。インフルエンザウイルスではシアリルオリゴ糖を認識している。リビングラジカル重合を用いることで、シアリルオリゴ糖の配置を制御し、インフルエンザウイルスヘマグルチニンへの結合能の制御と解析を行った。糖鎖高分子の分子鎖長を変えたところ、ヘマグルチニンの複数の糖鎖結合サイトに結合するように高分子を設計したときに強いウイルス中和能を発揮した。同時に、ウイルスへの糖鎖の結合能は糖鎖密度に依存しており、高分子主鎖に対して、70%の糖鎖を組み込んだときに、最も適切な中和能を発揮することがわかった。本研究では、精密重合を駆使することで、糖鎖高分子の合目的的な機能設計法の獲得を目指している。最終的には合目的的な設計によって、抗体を超えるような分子認識能を発揮するナノメディシンの開発を目指す。1)糖鎖高分子の精密合成法の検討

リビングラジカル重合を自由自在に駆使できるようにすることが重要である。主にRAFT剤を用いたリビングラジカル重合を検討している。RAFT剤については、既存のものを使ってきたが、RAFT剤の構造をモノマー(メタクリル酸骨格、アクリルアミド骨格)に適したものになるように設計する。また、メタクリル酸骨格のポリマーについては、原子移動ラジカル重合法についても検討を行う。ブロックポリマーの合成においては、逐次重合ができるように合成法を検討する。2)生体機能の解析方法の検討糖鎖高分子の分子認識を構造と分子認識能が機知のタンパク質(レクチン)を用いて詳細に解析を行う。蛍光ラベル化したレクチンを用いた解析を主とするが、最終的には結合がより詳細に明らかになるような、等温カロリメトリーの使用も検討する。高分子化学
内因性リガンドに対する樹状細胞応答機構の解明

自然免疫のセンサーは病原体ばかりでなく、宿主由来の核酸などの成分にも応答し、炎症反応を引き起こす。この非感染性炎症(自然炎症)においては、樹状細胞、マクロファージが主要な役割を果たしている。本研究では、主に樹状細胞において、核酸センサー刺激によってI型インターフェロンや炎症性サイトカインの産生が誘導される機構、および、その産生誘導が過度にならないようにブレーキをかける機構に関与する機能分子を明らかにした。また、自然炎症に関与すると考えられる樹状細胞サブセットの機能的意義の解明に有用な遺伝子改変マウスを樹立した。病原体センサーは、病原体成分ばかりでなく、内因性物質を認識し、種々の炎症反応を惹起させる。この炎症を本領域では、「自然炎症」と呼んでいる。Toll様受容体(TLR)の中のTLR3, TLR7, TLR9は、病原体ばかりでなく、宿主由来の核酸も認識し、I型インターフェロン(IFN),炎症性サイトカイン産生を誘導することにより、自然炎症を引き起こす。このTLR3/7/9は、樹状細胞サブセットによって異なる発現様式、応答様式を示す。TLR7/9シグナルは、形質細胞様樹状細胞(pDC)において、大量のI型IFN産生を誘導する。我々は、すでにこの産生誘導にセリンスレオニンキナーゼIKK_αが関与していることを明らかにしていた。PDC以外の樹状細胞、通常樹状細胞(cDC)は、TLR7/9刺激に対して、IFN-αは産生せず、IFN-βだけを産生するが、このcDCにおけるIFN-β産生誘導はpDCとは異なる分子機構で制御されている。今回、このTL、R7/9刺激cDCにおけるIFN-β産生誘導にも、IKK_αが必須であることを見出した。興味あることに、これまでpDCにおけるI型IFN産生に必須であるとされている機能分子IRAK-1, TRAF3, Osteopontinは、cDCにおけるI型IFN産生には必須ではなかった。このことから、IKK_αは、pDC, cDC両サブセットにおいてTLR7/9シグナルによるI型IFN産生を制御するユニークな分子であることが明らかとなった。しかし、IKK_αpDCと異なり、IRF-7の活性化ではなく、IRF-1,NF-κ_Bの活性化に関与していた。また、IKK_αは、IRF-1と結合し、IRF-1をリン酸化することも確認された。このように、IKK_αは、樹状細胞サブセット特異的な機構を介して、TLR7/9刺激によるI型IFN産生を制御していることが明らかになった。本研究では、このTLR3, TLR7, TLR9シグナルの分子機構を明らかにすることを計画している。TLR3/7/9は、樹状細胞サブセットによって異なる発現様式、応答様式を示す。この産生誘導には、pDCにおいて恒常的に高く発現されている転写因子IRFT-7が必須である。しかし、IRF-7は、PDC以外の樹状細胞、通常樹状細胞(cDC)においても、刺激後早期に高い発現が誘導されるが、cDCからは大量のI型IFN産生は認められない。このことから、pDC特異的に発現する未知の機能分子の関与が考えられる。遺伝子発現プロフィールを比較することにより、我々は、pDC優位に発現する転写因子Xを見出した。この転写因子は、IRFファミリーの中では、IRF-7と相乗的に作用し、IFN-α、IFN-βプロモーターを活性化した。また、この転写因子Xの遺伝子欠損マウスを作成、解析し、特にpDCの機能に障害が認められることを見出した。さらに解析を進め、XによるI型IFNプロモーター活性化機構、pDCにおけるTLR7/9シグナルの分子機構を解明することを計画している。病原体センサーが自己由来内因性リガンドに応答する平衡状態、およびその破綻によって生じる種々の非感染性慢性炎症を本研究領域では、「自然炎症」と捉えている。核酸を認識する病原体センサーは、宿主由来の核酸を認識し、自己免疫疾患などの非感染性慢性炎症に関与する。核酸センサーは、樹状細胞を中心とした抗原提示細胞で機能するが、その機能や分子機構は細胞種によって大きく異なる。炎症に関与する細胞種として、形質細胞様樹状細胞(pDC)とCD8α陽性樹状細胞(CD8αDC)に焦点を絞っている。

pDCは、核酸センサーに応答して1型インターフェロンを産生するという特性を持ち、その特性は,SLEなどの自己免疫疾患の病態に関与する。この特性にpDC優位に発現する転写因子Spi-Bが関与することを見出した。一方、CD8αDCは、死細胞の貪食能、炎症性サイトカインの産生能、および、細胞障害性T細胞の分化誘導能(クロスプライミング能)が高いと言う特性を持つが、その特性がどのように炎症病理に関与しているかは明らかではない。CD8αDCの機能的意義を明らかにするためには、CD8αDCを選択的に欠失できるマウスが有用である。ジフテリアトキシン受容体(DTR)遺伝子を、CD8αDC特異的に発現する遺伝子領域にノックインすることにより、Xcr1-DTRマウスを樹立した。このマウスでは、DTの投与により、1-2日後、CD8αDCが選択的に欠失した。また、CD8αDCが関与すると考えられているクロスプライミング応答は顕著に障害されていた。このマウスは、CD8αDCの機能的意義を明らかにするために有用と考えられる。非感染性慢性炎症を制御する機構の解明を、分子レベル、細胞レベル、個体レベルで進めている。分子レベルでは、炎症に関与する転写因子NF-κBを制御する分子機構の解析を行った。これまでにユビキチンリガーゼPDLIM2が核内でNF-κBのp65サブユニットをユビキチン化して分解すること、すなわちPDLIM2による炎症制御機構を見出していたが、さらに、その作用にシャペロンタンパクHSP70が関与することを明らかにした。HSP70は、転写因子NF-κBの活性化後に発現が増強し、核内へ移行した。そして、PDLIM2とプロテアーゼ関連分子BAG1に結合することにより、NF-κBのp65サブユニットの分解を促進した。また、HSP70あるいはBAG1の欠損マウス由来の樹状細胞において、PDLIM2欠損マウス由来の樹状細胞と同様に、炎症性サイトカインの産生亢進が認められた。これらの結果から、HSP70による転写因子分解を介した炎症制御という新規の分子機構が明らかになった。また、細胞レベルでは、死細胞を取り込む活性、および細胞傷害性T細胞分化誘導活性の強い樹状細胞サブセット、CD8α陽性樹状細胞(CD8α+DC)に着目した。これまでに、CD8α+DCを一時的に欠失させることのできるマウス(XCR1-DTRvenusマウス)を作成していたが、さらにCD8α+DCを恒常的に欠失させるマウス(XCR1-DTAマウス)を作成し、その樹状細胞サブセットの個体レベルでの機能的意義の解明を試みた。そして、このマウスにおいて、腸管のT細胞が著明に減少し、化学物質誘導型の腸炎症状が増悪していることを見出した。この結果から、免疫恒常性を制御する、CD8α+DCの新規の機能的意義が示唆された。病原体センサーが自己由来内因性リガンドに応答する平衡状態、およびその破綻によって生じる種々の非感染性慢性炎症を本研究領域では、「自然炎症」と捉えている。本研究では、自己由来内因性リガンドとして、核酸に焦点を当てている。形質細胞様樹状細胞(pDC)は、核酸センサー(TLR7,TLR9)に応答してI型インターフェロンを産生するという特性を持ち、この特性は, SLEなどの自己免疫疾患の病態に関与する。
細胞増殖および細胞分化におけるミトコンドリアによる細胞外環境センシング機構の解析

本研究のミトコンドリアによる環境センシングの分子機構の解明において、直接のATP量の変化やカルシウムイオンの変化を検出することはできなかったが、グルコース飢餓状態においてミトコンドリアの形態が大きく変化することを見出した。この分子機構について解析を行い、阻害剤やsiRNAによる発現抑制実験によりAMPKが関与している結果を得た。AMPKは細胞外の栄養状態などにより活性化するキナーゼであり、環境センサーとして機能している可能性が示唆されたことから、現在AMPKからミトコンドリアにつなぐ機構を解析するため、ミトコンドリアに局在する新規AMPK基質の同定を試みている。本研究において、まずミトコンドリアにおけるカルシウム濃度変化およびATP濃度変化を検出するため、これまでに埼玉大学医学部中井淳一博士、京都大学医学研究科今村博臣博士よりそれぞれのプローブセンサー(カルシウムセンサープローブVLMTS-GCaMPHSおよびATPセンサープローブmitoATeam)をご提供いただき、ミトコンドリア移行シグナルを付加させた発現ベクターを作成した。それら作成したミトコンドリアカルシウムセンサープローブ、ATPセンサープローブを安定的に発現するヒト正常網膜上皮細胞であるRPE、イヌ腎由来正常上皮細胞であるMDCK細胞を樹立した。それらの安定発現細胞を用いて様々な刺激におけるミトコンドリアのカルシウムおよびATP変化の検出を試みたが、増殖因子や細胞密度、細胞運動などによって顕著な変化は確認できなかった。一方、2-デオキシグルコース(2-DC)で細胞にグルコース飢餓刺激を与えると、長く伸びたミトコンドリアが分裂し、小さなミトコンドリアがふえ、それらが積極的に細胞辺縁部に輸送される様子が観察さられた。また、AMPK阻害剤処理により、比較的長く枝分かれしたようなミトコンドリアが多数見られた。このような形態はAMPKalphaをsiRNAにより抑制した場合にも見られた。このことはAMPKが細胞の栄養状態に応じてミトコンドリアの形態制御に関与していることを示唆している。さらに、AMPKの基質がミトコンドリアに存在するかを検討したところ、粗ミトコンドリア画分に複数のAMPK依存的なリン酸化タンパク質を確認した。また、この抗体が免疫沈降に用いることができることも確認した。これらの結果は細胞外の栄養状態をAMPキナーゼがミトコンドリアに何らかのシグナルを伝え、制御していることを示唆する結果であり、ミトコンドリアによる細胞外環境のセンシングの一旦であると考えられる。細胞が様々な諸過程を行うにはエネルギー源としてATPが必須であり、細胞内オルガネラであるミトコンドリアがそのほとんどを合成、供給している。そのため、ミトコンドリアの機能異常は癌や神経疾患、糖尿病など様々な病態に関わるとされている。近年、ミトコンドリアは細胞の置かれた状況に応じて非常にダイナミックに形態や局在を変化させることが分かってきたが、その制御機構や役割に関しては不明な点が多い。本研究では、ミトコンドリアの細胞内局在とその活性に着目し、ミトコンドリアが様々な細胞外環境(細胞接着、増殖因子、栄養状態、酸素状態など)をセンシングし、それによりATP合成系を制御する仕組みを明らかにすることを目的とする。本年度はこれらの研究を進めるに当たり、まずカルシウム、ATPをセンシングするプローブおよびミトコンドリアの形態を可視化するためのプローブとしてVLMTS-GFPを安定発現する培養細胞株の作成を行った。用いた細胞はヒト網膜上皮細胞(RPE)およびイヌ腎由来正常上皮細胞(MDCK)を用いた。各細胞において、安定発現する細胞を数クローンずつ獲得した。これらの細胞を用いてタイムラプス観察によりミトコンドリア内におけるカルシウムイオン濃度、ATP濃度やミトコンドリアの形態を、様々な刺激を加えて観察した。カルシウム濃度はA23187やATPを加えた際には顕著な変化が観察されたが、増殖因子刺激や酸化ストレス刺激、栄養飢餓、また細胞密度の変化によっては観察できなかった。それらの刺激による変化は今回用いたプローブの検出限界以下であった可能性が考えられた。しかしながら、これらの観察からグルコース飢餓状態にすることでミトコンドリアの形態が顕著に変化することを見出した。ミトコンドリアによるATP産生能力とその形態には相関性が指摘されており、形態変化したミトコンドリアの活性を調べる必要が考えられた。本研究のミトコンドリアによる環境センシングの分子機構の解明において、直接のATP量の変化やカルシウムイオンの変化を検出することはできていないが、栄養飢餓(グルコース飢餓)状態においてミトコンドリアの形態が大きく変化することを見出した。この分子機構について解析を行った。細胞内ATP濃度の減少によって活性化するAMPKというキナーゼが知られているため、その阻害剤を用いてミトコンドリアの形態に与える影響を検討した。その結果、グルコース飢餓によって引き起こるミトコンドリアの断片化とその細胞周囲への移動はAMPKの阻害剤であるcompoundCの処理により抑制された。また、AMPKのキナーゼサブユニットをsiRNAにより発現抑制し、内在性のAMPKの活性を阻害した場合においてもそれらのミトコンドリアの形態変化は見られなかった。

このことから、栄養飢餓状態によるミトコンドリアの形態制御にはAMPKが関与していることが示された。また、ショ糖密度勾配遠心法を用いて細胞内オルガネラの分画を行いAMPKの基質分子がミトコンドリアに局在するかを検討したところ、AMPKの基質のリン酸化特異的抗体によって複数のタンパク質がAMPKによってリン酸化されていることを示唆する結果を得た。そこでスケールを大きくして、飢餓状態とcompoundCによってAMPKを阻害した細胞からミトコンドリアを精製し、可溶化後、AMPKの基質のリン酸化特異的抗体によって免疫沈降し銀染色によって沈降タンパク質を調べたところ、飢餓状態において複数のタンパク質の沈降を確認した。ミトコンドリアの形態とミトコンドリアのATP産生能力には相関性が指摘されており、また、ミトコンドリアの形態変化はアポトーシス時にも必要であると考えられている。今回栄養飢餓状態(グルコース欠乏)とした時において細胞の栄養センサータンパク質の一つであるAMPKを介したミトコンドリアの形態変化制御機構が存在することを明らかとした。この分子メカニズムを明らかにするため、ミトコンドリア、及び細胞質に存在するAMPK基質分子の網羅的なスクリーニングをするため、AMPKの活性化状態と、その活性を阻害した状態の細胞からショ糖密度勾配遠心により細胞質、ミトコンドリアを分画し、AMPKの基質のリン酸化特異的抗体によって免疫沈降し、SDS-PAGEによって泳動分離して銀染色を行う。特異的なバンドを質量分析装置(LC-MS/MS)により同定を行い、ミトコンドリアの形態制御に関わる分子を決定する。これらの解析から、ミトコンドリアが細胞外の栄養状態をセンシングしその形態、活性を制御する仕組みを明らかとすることを目的とする。質量分析装置により同定される複数のタンパク質がAMPKによるミトコンドリアの形態制御機構に関与するかを検証するため、各遺伝子のクローニング、リン酸化部位の同定とその変異体の作成を行い培養細胞に導入し、ミトコンドリア形態制御に関わる因子を探索する。また、内在性タンパク質の機能を調べるため、siRNAを複数作成し、遺伝子抑制した際のAMPKによるミトコンドリア形態制御にどのような変化が見られるかを調べる。この時発現量のチェックや内在タンパク質の解析のため、各タンパク質の抗体を購入し調べる。さらには、昨年度作成したATPセンシングプローブやカルシウムセンシングプローブの安定発現細胞を用いて、AMPKによるミトコンドリア形態制御因子に関与が示されたタンパク質をsiRNAにより発現抑制し、ATP産生能力やカルシウム調節能力の変化を観察する予定である。さらに、リン酸化が重要であることが示されれば、その特異的交代を作成する。