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プルーストのテクストにおける引用

プルーストの小説『失われた時を求めて』における引用及び小説の生成過程について文献調査を続けた。小説のモチーフと引用の関係を明らかにすることを目的として、研究を進めた。研究期間中に、研究課題に関する論文「『失われた時を求めて』における舞台芸術:小劇場の演者」(査読付)が掲載された。具体的には、小説『失われた時を求めて』における舞台芸術のなかでも、特に重要な役割を果たしている演劇を分析対象とした。主要な登場人物のひとりで、ラシーヌの悲劇『フェードル』を演じる大女優ラ・ベルマの演技だけでなく、無名の役者たちによって演じられる小劇場の芝居、そして芝居がはねたあとで練習するダンサーの姿を描いた場面も取り上げた。それぞれの場面の成立過程を辿り、物語の設定や登場人物をめぐる色彩の変更の理由について考察した。その結果、『失われた時を求めて』において、舞台芸術がいかなるものか、草稿で描かれていた色彩が小説のモチーフとどのように結び付けられているのかを分析することができた。舞台芸術をめぐる描写や設定に着目し、草稿から最終稿に至るまでに加えられた変更点を詳細に辿った結果、小劇場における観劇の描写に、舞台芸術に関する問いと答えが暗示されていることが明らかになった。登場人物の描写において、色彩が最終稿で変更されていることを指摘し、小説『失われた時を求めて』における色彩とモチーフとの関連を明らかにすることができた。大学図書館を利用し、文献調査を進めることができた。網羅的な文献調査に基づき、研究期間中に論文(査読付)を刊行することができた。プルーストの小説『失われた時を求めて』の生成過程についてさらに詳しく研究を進め、小説のモチーフと引用との関連を考察する予定である。研究課題に関する文献調査等のための出張を予定している。プルーストのテクストにおける「フランスの17世紀文学」のうちでも特に重要な劇作家であるラシーヌについて、査読付きの学術論文「ラ・ベルマの『フェードル』ー別離の苦悩とラシーヌの詩句」を刊行した。その際、2016年に刊行された草稿カイエ67の転写版を用い、生成過程を辿ることで、プルーストの作品においてラシーヌの引用がいかなる役割を果たしているのかという問題を考察することができたと思われる。本論では『失われた時を求めて』において、主人公「私」が初めて『フェードル』を観に行く場面を取り上げ、生成過程を辿ることで、最終稿に至るまでの作家の模索について考察した。たとえば、観劇の前に「私」は『フェードル』の告白の場面における台詞を唱えるが、プルーストの草稿カイエ67の該当箇所で引用されていたのは別の場面のフェードルの台詞であり、その台詞もまた最終稿では他の箇所に移されていた。こうした一連の変更がなされた理由を探ったところ、ラシーヌ悲劇の引用と小説の主要なテーマとの関連が明らかになった。『失われた時を求めて』の中でも、特に『花咲く乙女たちのかげに』と『ゲルマントの方』におけるラシーヌの引用を分析の対象とした。女優ラ・ベルマの演技をめぐる複数の登場人物の談義についても生成過程を辿り、対照的な登場人物像を浮かび上がらせた。学術論文を発表しただけでなく、本年度は草稿や文芸批評を含めた資料の解読により、プルーストや同時代の小説家、批評家が明示的に引用の対象とした17世紀フランス文学のテクストを網羅的に特定し、分析することに重点を置いた。プルーストと同時代の作家がどのようにラシーヌを引用したか辿っていくことで、19世紀から20世紀にかけての小説の変遷を追うことも目的とした。校務や予期していなかった業務があったため、予定通り研究を進めることが困難だった。プルーストの小説の生成過程に関する調査をさらに深めていく予定である。また、プルーストと同時代の批評を調査し、プルーストの小説の手法との関連を探る。

同時にプルーストの手法と同時代の小説家のそれを比較し、プルーストの作品の独自性の一端を明らかにする。プルーストの小説『失われた時を求めて』の生成過程についてさらに詳しく研究を進め、小説のモチーフと引用との関連を考察する予定である。研究課題に関する文献調査等のための出張を予定している。(理由)校務や予期していなかった業務があったため。資料収集等研究のための出張ができなかったため。(使用計画)プルーストの小説の生成過程研究やプルーストと同時代の批評等の文献調査を進めるため、資料収集を目的とした出張をする予定である。(理由)日程が合わず、予定していた文献調査のための出張を入れることができなかったため。(使用計画)研究課題に関する文献調査等を進めるため、出張をする予定である。
子宮体癌幹細胞を標的にした新規治療法の開発

我々は子宮体癌SP細胞はがん幹細胞の特性を持つことを報告した。SP細胞は既存の抗がん剤に対して抵抗性を持ち、新規薬剤の開発が必要である。マイクロアレイ解析にて、SP細胞ではEMTに関与するシグナル伝達経路を構成する遺伝子群の発現が亢進していた。そこで、EMT阻害剤として報告されているsalinomycinのSP細胞に対する効果を解析した。salinomycinはSP細胞においてアポトーシスを誘導し、Wntシグナルを抑制することにより、細胞増殖を抑制した。また、運動能、浸潤能やマウス皮下への腫瘍形成も抑制し、子宮体癌幹細胞を標的とした治療薬の候補となることが示された。1.まず、子宮体癌細胞株Hecl細胞、Ishikawa細胞、SNGM細胞、ラット子宮内膜細胞RENT4に活性化型K-Rasを形質導入し造腫瘍能を獲得したRK12V細胞のside-population(SP)細胞の出現率を解析したところ、Hec1細胞,RK12V細胞にSP細胞が安定的にみとめられた。2.このRK12V-SP細胞は、以前我々が報告したHecl-SP細胞と同様にnonSP細胞に比べ分化マーカーの発現の低下・自己複製能・長期増殖能の性質を示した。また、SP細胞はnonSP細胞に比べ造腫瘍能が著明に亢進しており、間質に富む腫瘍を形成した。3.RK12V-SP細胞とRK12V-NSP細胞の間でマイクロアレイ解析を行ったところ、RK12V-SP細胞においてepithelial-mesenchymal trasition(EMT)に関与する遺伝子群をはじめ、複数の増殖因子、サイトカインの遺伝子の発現増加がみとめられ、幹細胞の増殖制御にはEMTをはじめ、複数のシグナルの関与が示唆された。4.そこで、複数の作用機序を持つヒストン脱アセチル化酵素阻害剤(以下HDAC阻害剤)sodium butyrate(以下NaB)の効果を解析した。5.NaB添加により、RK12V-SP細胞の増殖や軟寒天培地上のコロニー形成能を有意に抑制された。また非添加時に比べγH2AX,リン酸化p38MAPK,p21,p27の発現が亢進した。この変化はnonSP細胞よりSP細胞で有意であった。以上より、HDAC阻害剤は癌幹細胞の標的治療薬の候補として有用であることが示された。我々は様々な組織で幹細胞として機能していると報告されているSide population細胞(SP細胞)を用いて子宮体癌幹細胞の研究を行っている。子宮体癌SP細胞は、未分化、自己複製能、少なくとも腫瘍細胞と間質細胞への2方向性分化能、造腫瘍能亢進を示し、癌幹細胞の特性を持つことを明らにした。更に、この子宮体癌SP細胞の形態を観察すると足突起を持ち、著明な運動能を持つこと示した。標的分子を探索するため、マイクロアレイで解析したところ、SP細胞においてNSP細胞に比べて増殖因子やサイトカインを含む多くの遺伝子の発現が亢進しており、子宮体癌幹細胞の増殖や維持には複数の因子やシグナルが関与していることが示唆された。よって、がん幹細胞を標的にした治療のためには、複数のシグナルを阻害する必要があると考えられる。パスウエイ解析にて、SP細胞ではEMTに関与するシグナル伝達経路を構成する遺伝子群の発現が亢進していた。本研究ではEMT阻害剤として報告されているsalinomycinのSP細胞に対する効果を解析した。正常組織幹細胞と発癌機構の関連は不明である。我々はHoechst33342の取り込みの低い分画の細胞(side population cells, SP細胞)を用いてヒト正常子宮内膜や子宮体癌細胞株のSP細胞が幹細胞の特性をもつことを報告してきた。本年度ではラット不死化子宮内膜細胞株(RENT4細胞)を用い、内膜SP細胞の癌化機構への関与を検討した。まず、RENT4細胞よりSP、nonSP細胞を分離し(RSP、RNSP)、活性化型[12Val]K-Rasを形質導入し、それぞれの細胞由来の癌細胞のモデルとした(RSP-K12V、RNSP-K12V)。それぞれの細胞から形成された腫瘍より初代培養細胞を分離した。これらの細胞の増殖能、造腫瘍能、SP出現率、各種蛋白発現(ER,Oct4,Myc)およびER転写能を解析した。結果は、1)RSP-K12V細胞はRNSP-K12V細胞に比較し増殖能、造腫瘍能の亢進、SP出現率の増加をみとめた。

2)RSP-K12V由来腫瘍細胞は長期増殖能、造腫瘍能を獲得したが、RNSP-K12V由来腫瘍細胞は腫瘍を形成しなかった。3)RSP-K12V細胞およびそれ由来腫瘍細胞はRNSP-K12V細胞およびそれ由来腫瘍細胞に比べ、ER、Oct4、Mycの発現、SP出現率およびER転写能の亢進をみとめた。4)RSP-K12V細胞はE2依存性増殖を示したが、RSP-K12V細胞由来腫瘍細胞はE2非依存性の増殖を示した。以上よりSP細胞由来の癌細胞とNSP細胞由来の癌細胞は生物学的特性に違いがあり、前者は悪性度が高く、子宮内膜SP細胞は、子宮体癌の発生に関与すると考えられた。子宮体癌幹細胞を標的とした新規治療法を開発するために、標的とするシグナル分子やその経路の候補がリストアップできた。また、複数のシグナル経路を抑制するHDAC阻害剤は癌幹細胞の標的治療薬の候補として有用であることが明らかとなった。25年度が最終年度であるため、記入しない。子宮内膜の癌化への関与を明らかにするという研究目的に対してSP細胞由来の癌細胞とNSP細胞由来の癌細胞は生物学的特性に違いがあり、前者は悪性度が高く、子宮内膜SP細胞は、子宮体癌の発生に関与することを明らかにした。1.癌幹細胞の性質と深く関与するEMTを抑制する薬剤の効果を検討する。2.SP細胞出現の低かった子宮体癌細胞株のSP細胞出現率を上げる遺伝子や刺激を同定し、幹細胞形質獲得に重要なシグナルを同定する。1.癌幹細胞の性質に深く関与するEMTを抑制する薬剤の効果を検討する。2.幹細胞の維持・増殖に必要なシグナルを同定する。
断層の活動性評価のための高速摩擦試験と鉱物・化学分析の高精度化に関する研究

本研究は,断層内物質の模擬試料と天然に存在する断層岩,及び断層運動を模擬した高速摩擦試験によって人工的に破壊させた岩石の物理的・化学的性質を,鉱物・化学分析,顕微鏡観察等により解明することで,断層の活動性評価の鍵となるような特徴(鉱物・化学組成の変化や変形組織等)を的確に捉えることを目的とする。平成30年度は,断層ガウジを模擬するように鉱物組成を調整した人工試料に対し,山口大学の回転式高速剪断摩擦試験機を用いた高速摩擦試験を行い,試験後の試料に対して組織観察や電子プローブマイクロアナライザ(EPMA)による面分析を実施した。本研究では,実験系を極力単純にする目的で石英と黒雲母の2種類の鉱物の標準試料を混合することにより断層ガウジの模擬試料を調製した。また,高速摩擦試験ではガウジに蒸留水やMnなどの標準液を添加することで含水条件の試験も行った。ガウジを挟む岩石(母岩)は花崗岩または砂岩とし,回転速度は地震性すべりを想定し1 m/s,軸圧は地表付近の断層を想定し1 MPaまたは3 MPaとした。以上のような条件をそれぞれ変化させて,複数のパターンの高速摩擦試験を行った。試験後に母岩ごと試料を回収し薄片に加工した上で,偏光顕微鏡や走査型電子顕微鏡による観察と,EPMAによる面分析を実施した。その結果,一部の試料のガウジ中に,clay-clast aggregate(CCA)とみられる組織が生じていることが明らかになった。CCAは,岩片や鉱物片の周りを細粒の粘土質物質が同心円状に取り囲んだ組織であり,地震性すべり速度における摩擦実験で形成されたとの報告があるほか,天然の活断層でも確認されている。したがって,CCAの産状や化学組成に着目することにより,地震性の断層すべりを特徴づけるような物理的・化学的変化を見出すことができる可能性がある。人工試料を断層内物質として用いた岩石の高速摩擦試験を行うことができた。さらに試験後の試料について断層内物質の組織観察や化学分析を実施し,地震性の断層すべりを特徴づけるような物理的・化学的変化を見出す糸口となり得る特徴(CCA)を見出すことができた。以上より,本研究はおおむね順調に進展しているといえる。今後は,CCAの産状や化学組成に着目して高速摩擦試験及び試験後の試料に対する分析を継続する。また,実際の活断層と非活断層それぞれの断層岩に対して観察や元素マッピング・鉱物組成分析等を行い,高速摩擦試験の結果と比較することにより,活断層を特徴づける元素の挙動や岩石組織の変化を抽出する。当初の見通しよりも少ない実験数で研究の糸口となる現象,すなわちCCAの形成を捉えることができたため,物品費や旅費の使用を抑えることができた。「次年度使用額」は,CCAの形成される条件の考察に必要な実験のための物品費・旅費に充てる。
ヒト疾患を招く性染色体ゲノム脆弱性決定因子の解明

研究項目1.ゲノム再構成の新規成立機序の解明:2500例の先天異常症候群患者の全ゲノムコピー数解析を行い、先天奇形を有する男児1例において5つの染色体上のde novoゲノム再構成を同定した。患者と両親のwhole genome sequencing, haplotype phasing, microsatellite解析などにより、このゲノム再構成の発症機序について検討した。その結果、本症例では、精子形成の減数分裂に限局して一過性多焦点性ゲノムcrisisが生じたことが明らかとなった。このゲノム変化の一部には、クロモスリプシスが関与していた。出生後のゲノム脆弱性は否定された。本研究によって、ヒト生殖細胞系列における複雑染色体構造異常を招く新たなメカニズムが明らかとなった。研究項目2. X染色体不活化解析:受精直後の異数性レスキューに起因する片親性ダイソミー患者のX不活化解析を行った。その結果、これらの患者では一般女性に比較して不活化の偏りが顕著であることが見いだされた。統計学的モデル解析によって、異数性レスキューは不活化X染色体決定期の胎児幹細胞数の減少を介して、X不活化の偏りを招くことが明らかとなった。とくに、出生を可能とするモノソミーレスキューが3-4細胞期に限局して生じることが示唆された。研究項目3. Y染色体構造解析:体細胞性Y染色体モザイク欠失が、胎児期から老年期までの男性の生涯における各段階において生じ、性分化疾患や生殖機能障害を含むさまざまな疾患に関与することを明らかとした。また、この発症にY染色体特異的パリンドローム構造が関係することを見出した。生殖細胞系列のゲノム再構成の新たな発症メカニズムを解明した。また、異数性レスキューがX不活化に与える効果を明らかとし、ヒト初期胚における染色体動態に関する新たな知見を得た。研究計画に沿って研究を推進する。新たな染色体構造異常発症機序の解明を目指す。また、昨年度得られた知見を論文として公表する。研究項目1ゲノム再構成の成立機序の解明:2000例以上の先天異常患者を対象に、アレイcomparative genomic hybridizationによるゲノムコピー数異常の検討を行った。特記すべき成果として、成長障害、多発奇形、新生児一過性糖尿病を認める男児において、5つの染色体の複雑構造異常を同定した。マイクロサテライト解析の結果、これらのゲノム再構成はいずれも父由来染色体上に存在するde novo異常であることが判明した。PLAGL1プロモーターのDNAメチル化は正常下限から軽度低値であり、成長障害、新生児一過性糖尿病は父由来PLAGL1アリルのコピー数増加に起因するものと考えられた。患児のゲノム再構成は、胚細胞において複数の染色体に独立して同時に生じたものと推測された。これは従来想定されている非対立遺伝子間相同組換え、非相同末端再結合、microhomology-mediated break-induced replication、微小核を介したchromoanagenesisでは説明困難である。現在、全ゲノム解析やマイクロサテライト解析を行い、この多焦点性ゲノム再構成の発症メカニズムについて検討を行っている。研究項目2 X染色体不活化解析:X染色体構造異常症患者10例を集積し、DNAメチル化パターンの検討を開始した。本年度は、偽常染色体領域内のX不活化を免れる遺伝子のメチル化について検討し、XIST重複を伴う大規模な構造変化症例で異常メチル化を同定した。研究項目3 Y染色体不活化解析:MLPAを用いてY染色体構造多型の検証を行い、gr/gr欠失領域内にY特異的身長関連遺伝子がないことを確認した。当初の計画通りにX不活化解析とY染色体解析が進行した。また、既知のメカニズムでは説明困難なゲノム再構成を有する症例を同定した。

生殖細胞系列のゲノム再構成の新たな発症メカニズムを解明した。また、異数性レスキューがX不活化に与える効果を明らかとし、ヒト初期胚における染色体動態に関する新たな知見を得た。性染色体については、計画に沿って研究を進める。また、新規ゲノム再構成発症機序の解明を目指して、全ゲノム解析などを推進する。研究計画に沿って研究を推進する。新たな染色体構造異常発症機序の解明を目指す。また、昨年度得られた知見を論文として公表する。
HSP105/110群に属する新しい遺伝子apg-1とapg-2の機能解析

特異な熱応答性を示す新規のHSP群のストレス防御機構への関連、シャペロン機能の有無、標的基質を、分子から個体までのレベルで解析を開始した。(1)HSP110と共に一つのファミリーを形成する新たなHSP遺伝子apg-1及びapg-2を単離した。さらにそれぞれに特異的なポリクローナル抗体を作成した。(2)apg-1は、通常よりも低温からの熱ショックにより体細胞で誘導されたが、精子形成細胞では恒常的に発現がみられ熱誘導はされなかった。即ち、apg-1は前者ではストレス環境下で、後者では生殖に関連した機能を果たしていると考えられた。実際、精子にapg-1蛋白の発現を認めた。またラットの一過性脳虚血モデルにて、apg-1発現の亢進を認めた。現在ノックアウトマウスを作製し,ヘテロのマウス同士をかけあわせて、ホモに欠損しているマウスを得ようとしている。(3)NIH/3T3細胞にapg-1蛋白を高発現させ、導入したルシフェラーゼ活性の熱安定性を検討したが、対照群と差が認められなかった。In vitroのシャペロン活性の測定系を検討中である。(4)apg-2は体細胞、生殖細胞で恒常的に発現がみられ、熱誘導はされなかった。受精における機能を解析中である。また、動物で初めての低温ショック蛋白を見出し、cirpと命名した。RNAシャペロンとして、RNAの構造、発現その他に影響を与えると考えられ、体細胞の細胞周期G1からSへの移行を阻害する活性を有していた。現在その標的RNA分子の同定を試みている。
初代培養と糖尿病マウスにおける膵癌細胞の増殖進展に対するAdipoRonの効果

抗糖尿病低分子化合物であるAdipoRonが膵癌細胞株の細胞死を惹起し、動物実験でも抗腫瘍効果を示すことを報告した。糖尿病と膵癌発生には密接な関連があることが示唆されていることから、糖尿病モデルマウスにおけるAdipoRonの抗腫瘍効果を検討した。昨年度、4週令のC57BL/6マウスに60 Kcal%の高脂肪食を給餌させることで作出した前2型糖尿病マウスモデルB6J-DIOにマウス膵臓癌細胞Panc02を同所移植したモデルにおいて、通常食給餌群に比べて有意に腫瘍増殖速度が速いこと、Panc02細胞の細胞増殖に影響を与えない低濃度のAdipoRon(3 mg/kg)の投与により糖尿病の症状の緩和が認められたが腫瘍増殖にはほとんど影響しないことを見出した。これらのことから、肥満の軽減が膵癌の腫瘍増殖抑制に重要であり、そのような状況下では高濃度AdipoRonによる抗腫瘍効果がより発揮されるのではないかと推察された。そこで、DIOマウスにPanc02細胞を同所移植した後に高脂肪食給餌群と低脂肪食給餌群に分け、それぞれの群をさらに対照群と高濃度AdipoRon(30 mg/kg)投与群に分け腫瘍増殖を観察した。その結果、3週間の実験期間中に、高脂肪食給餌群では肥満が維持されたが、低脂肪食給餌群では約16%の体重減少が観察され、有意ではないが腫瘍増殖の遅延が認められた。興味深いことに、AdipoRon投与によって、高脂肪食給餌群においては腫瘍増殖に有意な抑制は認められなかったが、低脂肪食給餌群においては腫瘍増殖抑制傾向が認められた。これらの結果から、Panc02細胞移植DIOモデルマウスでは、肥満の軽減が膵癌の腫瘍増殖抑制さらにはAdipoRonの抗腫瘍効果にとって重要な要因になることが示唆された。抗糖尿病低分子化合物として発見されたアディポネクチン受容体アゴニストAdipoRonがヒト膵癌細胞株の細胞死を惹起し、動物実験でも抗腫瘍効果を示すことを見出した。この知見をさらに発展させるために、手術で摘出された膵臓癌から膵臓癌初代培養細胞を細胞塊(スフェロイド)として得て、AdipoRonの効果を検討した。その結果、組織の線維化が顕著な症例が多く成功例が少ないが、手術検体8例のうち4例で初代培養細胞を得ることができた。まず、これらの初代培養細胞におけるアディポネクチン受容体(AdipoR1とAdipoR2)の発現をqRT-PCRで調べたところ、いずれも発現されていることが判った。そこで、AdipoRonを作用させ、細胞死誘導をFITC-EpiCAM陽性細胞中のPI陽性細胞の割合で算出した。その結果、全例において細胞死の誘導が観察された。この細胞死にミトコンドリア由来活性酸素が関与するかどうかを検討するために、AdipoRonとミトコンドリア活性酸素のスカベンジャーであるMitoTEMPOを同時に作用させたところ細胞死が減弱した。このことから、ミトコンドリア由来ROSの細胞死への関与が示唆された。この時の細胞死の様式は、細胞形態学的にはネクローシスであることが推察された。一方、次年度の研究計画で使用予定であるルシフェラーゼ発現マウス膵臓癌細胞Panc02-Lucを、Panc02細胞にpHIV-Luc-ZsGreenをレンチウイルで感染させることで樹立した。この細胞をC57BL/6マウスの皮下に移植し、腫瘍形成後にIVIS in vivo imagingを行い、腫瘍増殖経過を観察できることを確認した。さらに、次年度に行う予定である前2型糖尿病マウスモデルB6J-DIOの作出のために、60 Kcal%の高脂肪食とコントロールとしての通常食の給餌を開始した。膵臓癌初代培養細胞にAdipoRonを作用させた際に、cytochrome c, AIFの細胞質への遊離あるいは核移行、AMPK, mTOR, Akt, MAKPs,NF-kappaBなどのリン酸化を調べる予定であったが、手術材料から調製できる膵臓癌細胞の数が極めて少なかったことから実施できなかったが、研究計画はおおむね順調である。抗糖尿病低分子化合物として発見されたアディポネクチン受容体アゴニストAdipoRonが膵癌細胞株の細胞死を惹起し、動物実験でも抗腫瘍効果を示すことを見出している。糖尿病と膵癌発生には密接な関連があることが示唆されていることから、AdipoRonが糖尿病の症状を軽減し、かつ膵癌の腫瘍増殖を抑制するかどうかの可能性を検討している。まず、前2型糖尿病マウスモデルB6J-DIOの作出のために、4週令のC57BL/6マウスに60 Kcal%の高脂肪食とコントロールとしての通常食の給餌を行ない、約3ヶ月後(16週令)にグルコース負荷試験と血中インスリン濃度の測定を行い、高脂肪食群において糖尿病の症状が出ていることを確認した。次に、前年度に作成したルシフェラーゼ発現マウス膵臓癌細胞Panc02-Lucを高脂肪食群とコントロール群の膵臓に同所移植し、腫瘍増殖をIVIS in vivo imagingを行うことで観察したところ、高脂肪群において有意に腫瘍増殖速度が速く、体重と腫瘍重量との間に明瞭な相関関係があることが判った。次に、Panc02細胞の細胞死を誘導しない低濃度のAdipoRonを、Panc02細胞を同所移植した高脂肪食群のマウスに腹腔内投与し、糖尿病の症状と腫瘍増殖を評価した。

その結果、AdipoRon投与により若干の体重減少、グルコース負荷試験と血中インスリン濃度の測定糖尿病の症状の緩和が認められた。しかし、腫瘍の増殖にはほとんど変化がないことが判った。従って、糖尿病と腫瘍増殖には明確な相関がないことが推察された。DIOマウスの作成に長期間を要するために、計画通の進捗がやや遅れている状況である。抗糖尿病低分子化合物であるAdipoRonが膵癌細胞株の細胞死を惹起し、動物実験でも抗腫瘍効果を示すことを報告した。糖尿病と膵癌発生には密接な関連があることが示唆されていることから、糖尿病モデルマウスにおけるAdipoRonの抗腫瘍効果を検討した。昨年度、4週令のC57BL/6マウスに60 Kcal%の高脂肪食を給餌させることで作出した前2型糖尿病マウスモデルB6J-DIOにマウス膵臓癌細胞Panc02を同所移植したモデルにおいて、通常食給餌群に比べて有意に腫瘍増殖速度が速いこと、Panc02細胞の細胞増殖に影響を与えない低濃度のAdipoRon(3 mg/kg)の投与により糖尿病の症状の緩和が認められたが腫瘍増殖にはほとんど影響しないことを見出した。これらのことから、肥満の軽減が膵癌の腫瘍増殖抑制に重要であり、そのような状況下では高濃度AdipoRonによる抗腫瘍効果がより発揮されるのではないかと推察された。そこで、DIOマウスにPanc02細胞を同所移植した後に高脂肪食給餌群と低脂肪食給餌群に分け、それぞれの群をさらに対照群と高濃度AdipoRon(30 mg/kg)投与群に分け腫瘍増殖を観察した。その結果、3週間の実験期間中に、高脂肪食給餌群では肥満が維持されたが、低脂肪食給餌群では約16%の体重減少が観察され、有意ではないが腫瘍増殖の遅延が認められた。興味深いことに、AdipoRon投与によって、高脂肪食給餌群においては腫瘍増殖に有意な抑制は認められなかったが、低脂肪食給餌群においては腫瘍増殖抑制傾向が認められた。これらの結果から、Panc02細胞移植DIOモデルマウスでは、肥満の軽減が膵癌の腫瘍増殖抑制さらにはAdipoRonの抗腫瘍効果にとって重要な要因になることが示唆された。当初の研究計画通りに、1)膵癌細胞株におけるEMT, CSCに対するAdipoRonの効果をEMT関連遺伝子やCSCマーカー遺伝子の発現を調べることで検討する。2)膵癌初代培養系におけるAdipoRonの増殖抑制と細胞死誘導効果の機序の検討を行う。3)前2型糖尿病が膵癌細胞の増殖、EMTおよびstemnessに及ぼす影響を検討するために、B6J-DIOマウスの膵臓にPanc02-Luc細胞を同所移植し、in vivo imagingを行い、増殖経過をコントロールマウスと比較する。また、実験のエンドポイントとして、腫瘍組織を切り出し、組織切片におけるEMT, CSC関連マーカーの発現を検討する。4)Panc02-Luc細胞を同所移植したB6J-DIOマウスにAdipoRonを経口投与し、前糖尿病症状や腫瘍増殖に対する影響を検討する。Panc02細胞の細胞死をin vitroで誘導する濃度に相当するAdipoRonをDIOマウスに投与し、糖尿病の症状と同所移植したPanc02細胞の増殖が抑制されるかどうかを検討する。同時に、実験のエンドポイントにおいて腫瘍組織を取り出し、EMT, CSCに対するAdipoRonの効果をEMT関連遺伝子やCSCマーカー遺伝子の発現を調べることで、細胞死以外の腫瘍増殖抑制の機序を探る。
抗菌薬による選択圧評価を通した抗菌薬適正使用の指標を明らかにする研究

本研究は1国立国際医療研究センター病院における該当抗菌薬使用患者における前向きマイクロビオーム解析(個体レベルでの評価)、2J-SIPHE加入施設における該当抗菌薬使用量と耐性菌検出率・CDI発生率の関連解析(施設レベルでの評価)の2つのレベルでのカルバペネム代替薬の選択圧評価を行い、新たな抗菌薬適正使用の指標を明らかにすることを目的としている。
分散システムの不正情報流防止方式の研究

分散システムでは、イベント駆動型のトピックベースなPS (Publish/Subscribe)モデルが分散システムの新しいモデルとして着目されている。subscriberプロセスは、興味があるトピックを示す(subscribe)。一方、publisherプロセスはsubscriberによって示されたトピックに関する応用レベルのイベントメッセージを発行(publish)する。イベントメッセージは、そのイベントに興味のあるsubscriberのみに届けられる。本年度は、各プロセスがpublishとsubscribeの両方を行えるピア(プロセス)から構成されるpeer-to-peer(P2P)型の分散型PSモデルを考え、オブジェクトに着目したP2PPSO (Peer-to-Peer Publish/Subscribe with Object concept)モデルを新たに考案した。P2PPSOモデルでは、あるピアがsubscribe可能でないトピックに関するオブジェクトが、ピアに流れてしまう不正情報流が生じてしまう問題がある。研究代表者は、先行研究で考案したトピックベースアクセスコントロール(TBAC)モデルに基づいて不正情報流を論理的に定義し、不正情報流を起こすオブジェクトの配送を禁止することで不正情報流を防止するTOBS (Topics-of-Objects-Based Synchronization)方式を新たに考案した。さらに、各ピアにおいて受信されたイベントメッセージを因果順序順に配送しながら不正情報流を防止するTOBSCO (TOBS with Causally Ordering delivery)方式、TOBSCO方式に比べてシステム全体で交換されるイベントメッセージ数を低減できるETOBSCO (Efficient TOBSCO)方式を新たに考案した。本年度は、P2P型の分散型PSモデルを考え、オブジェクトに着目したP2PPSOモデルを新たに考案した。不正情報流を起こすオブジェクトの配送を禁止することで不正情報流を防止するTOBS方式を新たに考案した。TOBS方式を評価するために、前年度に開発したシミュレータを改良した。本シミュレータを用いることで、より実際の環境に近いシステムを想定したTOBS方式の性能評価を行うことができた。次に、受信イベントメッセージを因果順序順に配送するTOBSCO方式を新たに考案した。因果順序順に配送されないイベントメッセージ数と配送時間(イベントメッセージが受信されてから配送されるまでにかかる時間)の観点でTOBSCO方式を評価した。TOBSCO方式では、TOBS方式に比べて、因果順序順に配送されないイベントメッセージの発生を防止できる一方で、配送時間が大きくなることを示した。最後に、TOBSCO方式に比べてシステム全体で交換されるイベントメッセージ数を低減できるETOBSCO方式を新たに考案した。配送されるイベントメッセージ数と一部のオブジェクトの更新遅延時間(オブジェクトが更新されてから他のピアが保持している同一オブジェクトが同期されるまでにかかる時間)の観点でETOBSCO方式を評価した。ETOBSCO方式では、TOBSCO方式に比べて、システム内で配送されるイベントメッセージ数を低減できる一方で、一部のオブジェクトの更新遅延時間が増加することを示した。本年度では、以上のように、前年度のシミュレータを改良し、より実用的な方式の考案と有用性を明らかにする性能評価を行うことができた。これらの研究成果を、国際学術論文誌やAINA等の国際会議で論文として発表した。よって、本研究の進捗状況は「おおむね順調に進展している」である。本年度は、P2P型の分散型PSモデルを考え、オブジェクトに着目したP2PPSOモデルを新たに考えた。どのピアがどのトピックに対してどのような操作を行えるかを示すTBACモデルに基づいて不正情報流を論理的に定義し、不正情報流を起こすオブジェクトの配送を禁止することで不正情報流を防止するTOBS方式、各ピアにおいて受信されたイベントメッセージを因果順序順に配送しながら不正情報流を防止するTOBSCO方式、TOBSCO方式に比べてシステム全体で交換されるイベントメッセージ数を低減できるETOBSCO方式を新たに考案した。これらの研究成果を踏まえ、「アクセス制御に基づいて不正情報流を定義し、これを防止する方式を考案する」という考え方を他の分散システムのモデルに応用し、対象となったモデルにおける不正情報流防止方式を新たに考案する。考案する方式について、不正情報流の生じる数を中心とした様々な観点から評価し、有用性を明らかにする。研究成果を論文としてまとめ、国際学術論文誌、国際会議で積極的に発表していく。分散システムでは、ノード間の協調動作により各ノードの保持する情報が交換され、機密情報を含む様々な情報がノード間で流れる。このとき、オブジェクトに対する権限のないユーザが他のオブジェクトを経由して情報にアクセスできてしまう不正情報流が生じる。本研究では、分散システム全体での情報流制御を考えている点に特長がある。本年度は、分散システムの新しいモデルとして着目されてきているpeer-to-peer (P2P)型のトピックベースなpublish/subscribe(P2PPS)モデルにおける情報流制御の研究を行った。P2PPSシステムは対等で自律的なピア(プロセス)で構成される。各ピア(subscriber)は、興味のあるトピックを示す(subscribe)。一方、他のピア(publisher)はそのトピックに関するメッセージを発行し、興味のあるsubscriberにのみ通知される。各ピアはpublishとsubscribeの両方を行える。最初に、システム上の各ピアが各トピックに対してどのような操作を行えるかを示すトピックベースアクセス制御(TBAC)モデルに基づいて、不正情報流の生じる可能性のあるピア間の情報流関係を論理的に明確にした。このような関係に基づき、不正情報流を起こす可能性のあるメッセージを検知し、この受信を禁止することで不正情報流を防止する方式を考案した。本年度に提案した方式では、トピック間の関連性を新たに考慮した。各ピアは、subscribeしているトピックに関連するトピックを新たにsubscribe可能にしていくことで、自身の興味の及ぶ範囲を拡大していく方式を提案した。

このようにすることで、受信を禁止されるメッセージ数を減少させることができ、これまで研究を行ってきた情報流制御方式に比べ、システム全体での負荷を減少できることを示した。本年度は、P2PPSシステムにおいて、ピア間で生じる不正情報流を防止する方式の研究を行った。システムにおけるトピック間の関連性を新たに考慮し、これに基づいて、各ピアがsubscribeしているトピックに関連するトピックを新たにsubscribe可能にしていく情報流制御方式を提案した。本提案方式を用いることで、不正情報流を起こす可能性のあるメッセージの受信を禁止することによってシステム全体で生じる不正情報流を防止でき、さらにこれまでに研究してきた他の方式よりもシステム全体における負荷を減少できることを示した。これらの研究成果を、国際学術論文誌やIEEE AINA等の国際会議で論文として発表し、Best paper賞(NBiS-2017, Toronto, Canada)を受賞する等、国際的にも高い評価を得ることができた。本情報流制御方式を、システム全体において受信を禁止されるメッセージ数の観点で評価するために、シミュレータの研究開発を新たに行った。開発したシミュレータでは、システムにおけるトピック間の関連性を新たに考慮するようになり、より現実世界に近いシステム環境を想定したシミュレーションを行うことが可能となった。これまでに提案してきた他の情報流制御方式に対しても適用でき、より現実的な環境でのシミュレーションを行うことが可能となった。実際にシミュレーションを行った結果、トピック間の関連性を考慮しないシステム環境下に比べ、受信を禁止されるメッセージ数を減少できることを示すことができた。これらの研究成果を生かして、来年度の研究を推進する予定である。以上のことを踏まえ、本研究の進捗状況は「おおむね順調に進展している」である。分散システムでは、イベント駆動型のトピックベースなPS (Publish/Subscribe)モデルが分散システムの新しいモデルとして着目されている。subscriberプロセスは、興味があるトピックを示す(subscribe)。一方、publisherプロセスはsubscriberによって示されたトピックに関する応用レベルのイベントメッセージを発行(publish)する。
間葉系幹細胞による脳梗塞に対する細胞治療

脳梗塞等の疾患は高齢者に多く、高齢や生活習慣因子の低下に伴い細胞の機能が低下している可能性がある。自家体制幹細胞の老化に伴う細胞の遊走能や生着能、及びサイトカインなどの栄養因子の分泌能の低下の課題を克服するために、我々はMicrovesicleを再生医療に利用することを発案し、研究を進めた。Microvesicleは粒形100-1,000nmの細胞外小胞の一つである。内部にはmRNA, miRNA,蛋白などを内包しており、細胞間連絡に関与していると言われている。本研究では、乳幼児のAlde-low endotherial progenitor cellから採取したmicrovesivle (EMV)を用いて、EMVが成人のAT-MSCの機能を向上させる効果を検証した。研究のために、以下の細胞を準備、作製した。これらの4つの細胞、及びコントロールPBSをマウス一過性脳虚血モデルに投与した。投与方法は、マウス中大脳動脈を塞栓糸にて1時間閉塞後に、頚動脈から動脈投与した。投与細胞数は5x105個である。投与24時間後に神経症状を評価し、組織学的検討を行った。結果:EMV Adult AT-MSCはAdult AT-MSCに比べて、脳梗塞を抑制し、神経症状を改善させた。EMV-adult AT-MSCはBaby AT-MSCと同等の脳梗塞抑制効果、神経症状改善効果を示し、EMVは細胞の機能を乳幼児のレベルに改善させる可能性を示した。その効果は、細胞が分泌するサイトカインによるものと考えられ、解析を進めている現在のところ経過どおりであるが、論文作成までの期間に課題が残っている。EMV Adult AT-MSCはAdult AT-MSCに比べて、脳梗塞を抑制し、神経症状を改善させた。その効果は、細胞が分泌するサイトカインによるものと考えられ、解析を進めている。脳梗塞領域周辺部では、Microgliaの動員を認め、細胞障害型Microglia(M1)と細胞保護型Microglia (M2)との評価では、EMV-Adult AT-MSCではM2 microgliaを遊走させて、脳梗塞病変部周囲に動員し、脳梗塞を抑制し、神経症状を改善さることが示唆されその確認を計画している。以下に29年度の実験で結果を確認できた項目を挙げる。1)マウス一過性能虚血モデルの作製マウス一過性脳虚血モデルの作成はイソフルレンの吸入下に行う。右鼡径部に切開をおき、大腿動脈、静脈にそれぞれPE10カテーテルを挿入し、術中の動脈血モニタリングライン、および薬剤投与ルートとした。マウス頭蓋骨に骨窓を作成し、レーザードップラー血流計で脳血流を測定した。次に、前頚部正中切開をおき、右総頚動脈と外頚動脈を結紮し、先端をシリコンコーティングしたナイロン糸を総頚動脈から頭蓋内内頚動脈へと誘導し、中大脳動脈を閉塞させた。1時間の虚血の後、ナイロン糸を頚部まで引き抜くことで再還流させた。最終的に20匹の実験で、脳梗塞発現率は15匹75%と想定内であった。2)ヒト脂肪由来間葉系幹細胞(AT-MSC)の単離培養術前に患者の同意を得て手術時に摘出された正常脂肪組織からAT-MSCを単離培養した(筑波大学附属病院倫理審査委員会承認済み)。脂肪組織をコラゲナーゼ溶液内で可能な限り細かく裁断する。Fliterを通して遠心し、液面の脂肪と上澄を除去し、ペレットを懸濁後、再度遠心し、上清を除去した。その後培養液(IMDM, FBS, bFGFmL-Gln)へペレットを播種して培養した。単離された細胞を脂肪、骨、軟骨へ分化させ、多能性を確認した。アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の違いにより、分化能が異なることが証明された。マウス一過性脳虚血モデルの作成に時間を要した。しかしながら研究スタッフの慣れと技術の向上により、最終的には想定内の成績を確認できた。ヒト脂肪由来間葉系幹細胞(AT-MSC)の単離培養は問題なく行われたが、申請にはないアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性のによる分化能の違いを確認する項目を追加したために、想定よりも時間を要した。しかしながら新たな知見を得られたため、有意義な遅延と認識している。

投与方法は、マウス中大脳動脈を塞栓糸にて1時間閉塞後に、頚動脈から動脈投与した。投与細胞数は5x105個である。投与24時間後に神経症状を評価し、組織学的検討を行った。結果:EMV Adult AT-MSCはAdult AT-MSCに比べて、脳梗塞を抑制し、神経症状を改善させた。EMV-adult AT-MSCはBaby AT-MSCと同等の脳梗塞抑制効果、神経症状改善効果を示し、EMVは細胞の機能を乳幼児のレベルに改善させる可能性を示した。その効果は、細胞が分泌するサイトカインによるものと考えられ、解析を進めている現在のところ経過どおりであるが、論文作成までの期間に課題が残っている。今年度は作成した動物モデルにヒト脂肪由来間葉系幹細胞(AT-MSC)を投与する作業に入る。経動脈及び経静脈的に細胞を投与し、移植1、7、14日後における脳虚血巣における細胞数を評価し、最適な投与細胞数と投与方法を決定する。AT-MSCの生着、脳保護、血管新生と神経再生に関与するサイトカイン発現を評価し、脳梗塞体積の推移を確認する。具体的にはi)細胞投与後の血流評価および神経症状、ii)Cresylviolet染色による脳梗塞領域の判定、iii)移植細胞の分化とNeurovascular networkの再構築を検証する。可能であれば幹細胞のアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性による分化能の違いを検証したい。EMV Adult AT-MSCはAdult AT-MSCに比べて、脳梗塞を抑制し、神経症状を改善させた。その効果は、細胞が分泌するサイトカインによるものと考えられ、解析を進めている。脳梗塞領域周辺部では、Microgliaの動員を認め、細胞障害型Microglia(M1)と細胞保護型Microglia (M2)との評価では、EMV-Adult AT-MSCではM2 microgliaを遊走させて、脳梗塞病変部周囲に動員し、脳梗塞を抑制し、神経症状を改善さることが示唆されその確認を計画している。マウス一過性能虚血モデルの作製に手間取り、実際にヒト脂肪由来間葉系幹細胞(AT-MSC)を投与する実験が実施できなかったため、動物実験自体を次年度に施行する計画とした。AT-MSC自体は問題なく抽出できている。2018年度は論文作成費、学会発表を使用しなかったため、次年度は積極的に行う予定です。
高齢院外心肺停止傷病者における心肺蘇生および予後に関する研究

総務省消防庁の院外心停止全国前向き全例登録から2005年-2014年の10年間のデータを解析した。75歳以上の高齢者の院外心停止病院搬送数は経年的に著しい増加を認めた。神経学的転帰良好を伴った生存率は年齢の上昇に伴い低下した。神経学的転帰良好を伴った生存率は65-74歳および75-89歳では経年的に改善傾向にあったが、90歳以上では改善を認めなかった。神経学的転帰良好に関連する因子として、初期波形が除細動適応であること、目撃があること、より年齢が若いこと等が同定された。院外心停止蘇生後の神経学的転帰良好の予測率を救急現場において簡易に参照できる『院外心停止後神経学的転帰良好予測率層別化モデル』を作成した。2011年-2013年を開発群、2014年を検証群とした。開発群を初期波形除細動適応の有無、目撃の有無、年齢(18-64、65-74、75-84、85歳以上)の3個の病院前因子を用いて16群(2×2×4=16)に分け、1ヶ月後の神経学的転帰良好予測率(<1%、1-3%、3-10%、10-20%、>20%)の16分割表を作成した。検証群においても1ヶ月後の神経学的転帰良好の割合を同様に弁別可能であった。しかしながら2015年-2016年の院外心停止を用いて検証したところ神経学的転帰良好の割合が低く予測された。1ヶ月後の神経学的転帰良好の割合は年々改善傾向にあるため、適宜、アップデートが必要と考えられた。一方で、全年齢区分において初期波形が非除細動適応で目撃のない場合には、1ヶ月後の神経学的転帰良好は1%未満と予測され、特に高齢者においては蘇生処置の差し控えを検討する根拠となると考えられた。本研究の成果は、高齢者の望まない救急搬送や無益な救急搬送の減少、救急搬送受け入れ病院の負担軽減、限られた医療資源の効率的な活用に繋がり、社会的、経済的、倫理的に非常に意義があると考える。超高齢化社会であるわが国において高齢院外心停止傷病者の蘇生後生存率の改善は喫緊の課題である。また高齢院外心停止傷病者の病院搬送数は今後さらなる増加が予想され、限られた医療資源を考慮すると救急医療の破綻が危惧される。総務省消防庁の院外心停止傷病者全国前向き全例登録から2005年2014年の10年間のデータを解析したところ、院外心停止傷病者の病院搬送数は75歳以上の高齢者において経年的に著しい増加を認めた。神経学的転帰良好を伴った生存率は65-74歳で2.6%、75-89歳で1.0%、90歳以上で0.4%であり年齢の上昇に伴い低下した。また神経学的転帰良好を伴った生存率は65-74歳および75-89歳では経年的に改善傾向にあったが、90歳以上では改善を認めなかった。神経学的転帰良好に関連する因子としては、より年齢が低いこと、初期波形が除細動適応リズムであること、目撃があること等が同定された。今後はより詳細な項目について検討することにより、1予後改善につながる因子を同定すること、2高齢院外心停止傷病者において、心肺蘇生を積極的に行うべきかどうかを判断する基準を設定することを目標とする。また本年度は、95歳以上の超高齢院外心停止傷病者における予後予測因子の同定、心肺蘇生中に非除細動適応リズムから除細動適応リズムに移行した際の予後と年齢の関係、心肺蘇生における適切な心肺蘇生時間と年齢の関係、年齢で層別化した院外心停止傷病者予後予測モデルについて、それぞれ学会発表、一部論文発表を行った。当初の研究計画にそって研究を進めることができ、またその成果を国内外の学会で発表し、一部論文とすることもできたため、概ね順調に進展していると判断した。超高齢化社会であるわが国において、高齢院外心停止傷病者の蘇生後神経学的転帰良好を伴った生存率の改善は喫緊の課題である。

今後はより詳細な項目について検討すること、また2015年以降のデータも合わせて解析することにより、1予後改善につながる因子を同定すること、2高齢院外心停止傷病者において、心肺蘇生を積極的に行うべきかどうかを判断する基準を設定することを目標とする。また本年度は、院外心停止傷病者において神経学的転帰良好を達成するために必要な心肺蘇生時間と年齢の関係、救急隊による病院前アドレナリン投与が神経学的転帰良好に及ぼす影響と年齢の関係、年齢で層別化した院外心停止傷病者における神経学的転帰予測チャートについて、それぞれ学会発表、一部論文発表を行った。当初の研究計画にそって研究を進めることができ、またその成果を国内外の学会で発表し、論文とすることもできたため、概ね順調に進展していると判断した。総務省消防庁の院外心停止全国前向き全例登録から2005年-2014年の10年間のデータを解析した。75歳以上の高齢者の院外心停止病院搬送数は経年的に著しい増加を認めた。神経学的転帰良好を伴った生存率は年齢の上昇に伴い低下した。神経学的転帰良好を伴った生存率は65-74歳および75-89歳では経年的に改善傾向にあったが、90歳以上では改善を認めなかった。神経学的転帰良好に関連する因子として、初期波形が除細動適応であること、目撃があること、より年齢が若いこと等が同定された。院外心停止蘇生後の神経学的転帰良好の予測率を救急現場において簡易に参照できる『院外心停止後神経学的転帰良好予測率層別化モデル』を作成した。2011年-2013年を開発群、2014年を検証群とした。開発群を初期波形除細動適応の有無、目撃の有無、年齢(18-64、65-74、75-84、85歳以上)の3個の病院前因子を用いて16群(2×2×4=16)に分け、1ヶ月後の神経学的転帰良好予測率(<1%、1-3%、3-10%、10-20%、>20%)の16分割表を作成した。検証群においても1ヶ月後の神経学的転帰良好の割合を同様に弁別可能であった。しかしながら2015年-2016年の院外心停止を用いて検証したところ神経学的転帰良好の割合が低く予測された。1ヶ月後の神経学的転帰良好の割合は年々改善傾向にあるため、適宜、アップデートが必要と考えられた。一方で、全年齢区分において初期波形が非除細動適応で目撃のない場合には、1ヶ月後の神経学的転帰良好は1%未満と予測され、特に高齢者においては蘇生処置の差し控えを検討する根拠となると考えられた。本研究の成果は、高齢者の望まない救急搬送や無益な救急搬送の減少、救急搬送受け入れ病院の負担軽減、限られた医療資源の効率的な活用に繋がり、社会的、経済的、倫理的に非常に意義があると考える。今後はより詳細な項目について検討することにより、1予後改善につながる因子を同定すること、2高齢院外心停止傷病者において、心肺蘇生を積極的に行うべきかどうかを判断する基準を設定することを目標とする。効率的な予算の施行により、次年度使用額が生じた。消耗品とその他(論文投稿代金等)の代金の一部に補充する予定である。
間葉系幹細胞を用いた人工骨膜のin vitro構築と臨床応用への展開

インプラント治療の適応の拡大のため,再生医療が強く望まれている.そこで本研究では多血小板血漿(PRP)ならびに骨髄から採取した自己幹細胞を骨芽細胞に分化させた細胞塊などによりインプラント埋入周囲の骨欠損に対する骨再生法の可能性について,ビーグル犬を用いて組織学的ならびに組織形態計測学的に検討し,骨窩における骨再生実験においてPRPを併用することで骨再生を促進できる可能性があることが示唆された.インプラント治療の適応の拡大のため,再生医療が強く望まれている.そこで本研究では多血小板血漿(PRP)ならびに骨髄から採取した自己幹細胞を骨芽細胞に分化させた細胞塊などによりインプラント埋入周囲の骨欠損に対する骨再生法の可能性について,ビーグル犬を用いて組織学的ならびに組織形態計測学的に検討し,骨窩における骨再生実験においてPRPを併用することで骨再生を促進できる可能性があることが示唆された.インプラント治療の滴応の拡大、治療期間の大幅な短縮、さらにより審美的なインプラント補綴を可能にするため、再生医療が強く望まれている.しかしながら、ES細胞やウイルスベクターを用いた遺伝子導入を用いた方法は倫理的な問題があるため、臨床応用までの道程は遠いと言わざるを得ない.そこで本研究では自己幹細胞を用いて骨芽細胞に分化させ、さらに人工骨膜を作ることが可能となれば骨再生の速度と量を制御できるのではないかと着想した.本年度はまず骨髄から採取した間葉系幹細胞を分離・培養し、FGF-2を用いて大量に増殖させるだけでなく、骨分化誘導メディウムを用いて分化誘導も行うプロトコールの確立を目的とした.まず骨髄液の採取部位として、腸骨と顎骨を検討した.腸骨から採取した方が顎骨から採取したよりもより多くの骨髄幹細胞が確認できた.今後再生医療を行っていく上で、採取部位の疼痛など問題点があるものの、多くの骨髄幹細胞を採取するためには腸骨を用いるのが有用である可能性が示唆された.また、FGF-2を用いることにより増殖能が低い骨髄幹細胞であっても大量に増殖することができる可能性も示唆された.骨分化誘導メディウムを用いることにより、骨芽細胞へも分化することを確認するため、ALP活性を検討した.さらに、人工骨膜を作製するためPLGA膜上へ骨芽細胞を播種し、一定期間培養を行ったが、膜上での細胞増殖は難しいため、播種する前にかなりの量になるまで細胞を増殖させておく必要があると考えられた.インプラント治療の適応の拡大、治療期間の大幅な短縮、さらにより審美的なインプラント補綴を可能にするため、再生医療が強く望まれている.しかしながら、ES細胞やウイルスベクターを用いた遺伝子導入を用いた方法は倫理的な問題があるため、臨床応用までの道程は遠いと言わざるを得ない.そこで本研究では自己幹細胞を用いて骨芽細胞に分化させ、さらに人工骨膜を作ることが可能となれば骨再生の速度と量を制御できるのではないかと着想した.本研究では,最近大きな注目を集めている骨髄幹細胞を用い,望む骨芽細胞に分化させ,それを血液から分離精製した多血小板血漿(Platelet Rich Plasma; PRP)と共に用いて人工骨膜を作る新しい再生医療を考えた。そこで,我々はビーグル犬を用いて,この『間葉系幹細胞を用いた人工骨膜のinvitro構築と臨床応用への展開』について細胞学的,組織学的ならびに組織形態計測学的に検討した。1.FGF-2を用いた、自己間葉系幹細胞の培養法を確立し,PLGA膜上で短期間培養することにより人工骨膜を構築できる可能性が示唆された。2,PRPの併用により,実験的に形成された骨欠損に対する骨再生は促進された。3.実験的に形成された骨欠損において,自己間葉系幹細胞の注入は骨再生促進には明確な効果が認められなかった。以上の結果から、顎骨に形成した骨窩における骨再生実験においてPRPを用いることで,骨再生を促進できる可能性があることが明らかとなった。しかし,PLGA膜と自己幹細胞、PRPを用いたインプラント周囲の新しい骨再生法を開発するためには,間葉系細胞の分化の制御,スキャフォールド,手術手法など,さらに検討が必要であることも示唆された。