hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
脳内神経伝達機能の画像診断を目的とした放射性診断薬の開発に関する基礎研究

本研究課題に関連するこれまでの検討結果より、脳内神経伝達物質の生合成前駆体であるチロシン、ドーパの誘導体^<123>I-AMT、^<123>I-DOPAが、脳におけるそれぞれのアミノ酸膜輸送機能を選択的に測定し得る放射性診断薬として優れた性質を有することを明らかにし、更に、^<123>I-DOPAに関しては部位選択的標識と品質管理の簡便化の観点から、固相化標識法を確立した(06770731,07770764)。本年度は、次の段階として、脳内神経終末に取り込まれたアミノ酸を神経伝達物質に変換する最終反応を掌る芳香族アミノ酸脱炭酸酵素(AADC)の酵素活性測定を目的として、AADCの不可逆的阻害剤であるジフルオロメチルチロシンを標識原料に選択し、その^<123>I標識体の評価を行った。DFMTは、合成により得た。DFMTの放射性ヨウ素標識は簡便に短時間に終了し、高収率かつ高比放射能で得られた。また、精製の際、生理活性を有する標識原料との分離を確認した。^<123>I-DFMTのラット脳スライスへの集積は、同様の機構によりAADCを不可逆的に阻害するDFMD前処理により有意に低下し、^<123>I-DFMTの脳への集積がAADC活性の指標になると考えられた。しかしながら、マウス体内分布において、アミノ酸代謝の盛んな脳や膵臓への特異的集積は認められず、これらの集積にウワバインやチロシン負荷の影響が見い出されなかったことから、^<123>I-DFMTはアミノ酸膜輸送機構に対する親和性を失っていると考えられた。分配係数のpH依存性を検討したところ、^<123>I-DFMTは生理的pHでは、アミノ基が十分に解離しておらず、結果としてアミノ酸膜輸送機構に対する親和性が低下したと考えられた。現在、^<123>I-DFMTの酵素に対する親和性を保持したまま、脳内移行性を向上させることを目的としたプロドラッグ化に関して検討を継続している。
形態形成因子Wntによる細胞内情報伝達経路活性化の分子機構の解析

形態形成にかかわるシグナル分子Wnt/Wingless(Wg)の生物活性については、様々なモデル動物を用いて分子生物学的研究がなされいる。また各種のWntシグナル伝達異常によって引き起こされたβ-cateninの蓄積が細胞のの癌化の原因となっている事も知られている。本研究の目的は、Wnt/Wgに感受性を持つDrosophilaや哺乳動物の培養細胞と、可溶性のWnt/Wg蛋白を用いて、Wnt/Wgシグナル伝達に関わる遺伝子産物の生化学的相互作用の実体を解明する事である。最近Xenopus胚を用いた解析から、Casein kinase I(CKI)が、Wntシグナル伝達の正の制御因子であるとの報告がなされたが、その普遍性は他の動物系を用いて、検証されているわけではなかった。そこで、本研究ではDrosophilaの系を用いて、CKIのWgシグナル伝達経路における役割の解析を行った。Schneider S2R+細胞をDrosophilaのCKIα及びεのdouble stranded RNA(dsRNA)の存在下で培養するin vitroRNAi法を行って、CKIα及びε蛋白の産生を阻止した。するとXenopus胚を用いた結果に反し、著しいArmadillo(Arm)蛋白質の蓄積が生じた。なおRNAiによってArmのmRNAの変化は認められない事からCKIα及びε、はArm蛋白質の安定性を負に制御していることが明らかとなった。さらにDrosophilaの胚に同じdsRNAを注入して、胚におけるCKI蛋白の産生を阻止したところ、Wgシグナルが過剰に流れた事を意味するNaked cuticleの表現型を持つ胚が発生した。これらの結果は、Drosophilaでは、CKIはWgシグナル伝達の負の制御因子として働いている事を示すものであった。
Xenopus laevisの胚を用いた内分泌撹乱化学物質の測定方法に関する研究

本研究では,エストロジェンの存在下で性転換が起こることが知られているXenopus laevisを用いてエストロジェン様物質の測定を試み,この検出感度や試験条件について検討したものである.Xenopus laevisの飼育条件について検討した前年度の結果を基にして、最終年度である今年度は、エストロジェン様物質の代表としてのビスフェノールAと4-n-ノニルフェノールをXenopus laevisに暴露した場合のこれらの濃度とXenopus laevisの雌雑個体数の変化について検討した。あらかじめXenopus laevisの幼生を用いてビスフェノールAおよび4-n-ノニルフェノールに対する急性毒性試験を行って、それぞれの暴露濃度を0.01111.1mg/L、0.00111.1mg/Lと設定した。ビスフェノールAあるいは4-n-ノニルフェノールを各濃度に設定した飼育水中でStage44のXenopus laevisを飼育しはじめ、Stage52まで成長した個体を解剖して顕微鏡で生殖巣を観察することで雌雑個体数を判別した。その結果、これらの物質に暴露したすべてグループから、精巣とも卵巣とも判別しかねる生殖巣を有する個体が見つかった。また、これらの物質を暴露したグループでは、対照系と比較して有意に雄の割合が少なくなった。しかし、ビスフェノールAあるいは4-n-ノニルフェノールの濃度とグループ内の雄の割合との間には、明確な用量反応関係を見出すことができなかった。また、暴露期間として約3ヶ月程度必要になることから、エストロジェン様物質の測定方法として本法を適用するためには、暴露期間の短縮方法を含めた工夫が必要であることがわかった。本研究では,エストロジェンの存在下で性転換が起こることが知られているXenopus laevisを用いてエストロジェン様物質の測定を試み,この検出感度や試験条件について検討するものである.今年度は、エストロジェン様物質の代表としてビスフェノールAを用い,Xenopus laevisの胚を用いた本試験法の検出感度と,Xenopus laevisの飼育条件について検討した。まず、容量的1.5Lの大型シャーレにHoltfreter氏液を用い、週2回の交換頻度で24°Cで飼育を行った。飼育密度を624匹/Lとして飼育を試みたところ、飼育密度が高い場合は成長の個体差が大きくなり、成長が早くてより大きな個体が成長の遅い個体を攻撃し、途中で死亡する個体が多くなることがわかり、雌雄の判別が可能となるStage52まで飼育することができないことがわかった。そこで、14匹/Lで飼育したところ、Stage52まで80%以上の生存率を保つことができた。また各々の個体を解剖し顕微鏡で生殖巣を観察したところ、雌雄の割合はちょうど1:1であった。ただ、文献で示されている成長日数と比較すると、Stage52に到達するまで3倍以上(約3カ月)長期間を要することがわかった。その後、ビスフェノールAを011.1mg/Lの範囲で5段階の濃度に設定してXenopus laevisに曝露したところ、濃度の最も高かったケース(11.1mg/L)では曝露翌日に全個体が死滅したが、これ以外のケースでは死亡個体数も少なく順調に飼育が可能となった。Xenopus laevisは夏期には産卵しないことと、当初予想していた以上に飼育に長期間必要だったことから、ビスフェノールAの曝露による雌雄個体数の変化を年度内に確認できなかったが、飼育中の個体を用いて来年度には確認する予定である。
核磁気共鳴法を用いた準結晶の電子物性の研究

本年度は5回対称を有する全く新しい構造である準結晶の電子物性を核磁気共鳴(NMR)という極めて局所的な性質を反映する研究手段を用いて明らかにすることを目的としたものである。具体的な問題としては(1)格子構造の準周期性に起因する伝導電子の波動関数の特徴を明らかにする。(2)磁性を示す準結晶試料において磁気モーメントを持っている原子の位置する格子位置を固定し格子位置と磁気モーメントの大きさとの関連を明らかにすること等である。まず62年度は当時準結晶としてもっとも代表的であるとされていたAl-Mn系合金をとりあげ種々の合金濃度についてNMRの観測に成功した。それらの共鳴位置や形からAl(80)-Mn(20)の合金が準結晶としては単相であり、この合金が結晶相では非磁性であるにもかかわらず、準結晶になると一部のMnに磁気モーメントが発生し、磁気的になるという結論を導いた。63年度はこの研究を三元合金や四元合金に拡張し、特にAl-Mn-Si-Ru系をとりあげ集中的な研究を行った。実際の試料は単一相であるAl(62)Mn(20)Si(10)Ru(8)で単ロール法で準結晶を作成し、またこれを800^。Cで1時間アニールすることによる結晶相を得た。これらの試料につき帯磁率やNMRの線形、緩和時間の温度依存性が詳細に調べられた。この結果約50K以上の高温ではどちらも磁気的には差がないが、低温では準結晶の方が磁性が結晶相に比べ顕著に大きくなり、より低温で磁気的な秩序相が出現することが判明した。更に、他の準結晶、Al-Li-Si-やMa-Ga-Zn系のように遷移金属を含まない準結晶にも研究を発展させ上記のような特徴、つまり準結晶の方が結晶相より磁性が活性化されるという一般的な性質を明らかにした。しかしなが電子物性を解明するという意味では研究はまだ不十分で、かつ理論的に準結晶の電子状態をどう記述するかについては不明な点が多く、今後の課題である。本年度は準結晶としてもっとも代表的なAl-Mn系合金をとりあげ, Al核やMn核のNMRの実験を行った.種々のAl-Mn濃度についてそれぞれの核のNMR観測に成功し,それらの共鳴位置や形からAl(80)-Mn(20)の合金が準結晶としてはほぼ単相であることが分った.この物質について,特に集中的にNMRによって測定される共鳴線の巾や核磁気緩和時間の温度変化について詳細は実験を行った.その結果,この物質においては,結晶相がまったく非磁気的であるにもかかわらず, Mnに局在モーメントが発生し,磁気的になっていることが判明した.この結果は帯磁率の測定からも指示されるが,すべてのMnが磁気モーメントを持っているのではなく,一部非磁気的なMnも存在することが推察された.そこで第三原素を置換した系での実験をスタートさせ,この準結晶の磁性を明らかにすることを計画した.まずFeを少量Mnとおきかえた試料でメスバウアー効果の実験を行いそのスペクトルの解析よりやはりMnに二種類の磁気状態が存在することが明らかになった.更にSiをドープレ,より準結晶を安定化させた試料でFeやRu, VのMnに対する置換効果を調べたところFeの場合は磁性が強化されるが, Vの場合は極端に磁性が減少することが分った.

このことは準結晶中でのMnの磁気モーメントが周囲の非磁性原子の存在に極めて敏感であることを物語っている.いずれにしても準結晶中で何故Mnに磁性が発生するかは,準結晶の電子物性の解明する上で重要な手がかりとなるもので,今後NMRによる微視的な研究を発展させる予定である.最近我々は新しいタイプの準結晶Al(55)Li(35.8)Cu(9.2)をとりあげている,この物質は平衡相として準結晶が安定であると言われており,我々のLi核のNMRや帯磁率の予備的な実験結果からは磁性の出現は認められていない.今後この物質もLi核のNMRを中心として電子物性の明らかにしていく計画である.本年度は準結晶として最も広い領域において単一相が作製できるAl-Mn-Si-Ru系をとりあげ、その結晶相との比較において、準結晶相における電子物性、特に磁性について研究を行った。実態の試料はAl(62)Mn(20)Si(10)Ru(8)で単ロール法で準結晶を作製し、またそれを800°Cで1時間アニールすることにより結晶相を得た。これらの試料につきまず帯磁率の温度依存性を測定した。その結果約50K以上の高温ではいずれの場合もキュリーワイス則に従い、Mnの磁気モーメントにはあまり差がないことがわかった。又約20K近傍で帯磁率に山がみられスピングラス的な磁気秩序が低温で存在することが推察された。次にAl核のNMRを観測し、そのスペクトルの幅、位置、緩和時間の温度依存性を測定した。高温で準結晶、結晶相とも幅は帯磁率に比例して温度変化し、幅の原因が磁気的相互作用によっていることが分った。しかしながら低温では、結晶相ではみられない急激な幅の増大は準結晶相においてみられた。これは帯磁率の温度変化より大きく幅が増大しており、スピングラス的な磁気的秩序が準結晶相においてより強く発生していることを物語っている。更にこのような異状は核磁気緩和時間の温度依存性にも現れ、準結晶中で低温において緩和率の急激な増大がみられた。このような実験結果は帯磁率ではあまりみられない。磁気的相互作用の差がNMRの研究よりはっきりしたことになり、準結晶になると構造上の変化より磁性がより活性化されると結論できる。このことは従来の我々のNMRによる準結晶の研究とも一致する一般的な性質である。しかしながら、いわゆる準結晶の電子物性の解明という意味からすると研究はまだ不十分で、かつ理論的にもこの電子状態をどう記述するかについては不明な点が多い。これらは今後の課題である。
シダ植物配偶体の形態進化と菌共生関係の変遷

シダ類の地上生の心臓形配偶体はAM菌を共生させ、「心臓形配偶体の中肋(クッション層)の厚さとAM菌感染率との間には関係がある」とする仮説を検証することを目的とした。本研究では第一段階として、シダ類の基部分類群5科(リュウビンタイ科、ゼンマイ科、ウラジロ科、キジノオシダ科、ヘゴ科)6属8種の計274個体の野生配偶体を解析した。野生配偶体はrbcL遺伝子によって種同定で種を確認した後、切片観察からクッション層の厚さと菌感染の有無を確認した。菌感染率は58%-95%と高く、クッション層は207-470ミクロンと厚かった。SSU領域解析から、配偶体に共通するAM菌はGlomeraceaeであった。現生の維管束植物の80%以上が根にアーバスキュラー菌根菌(AM菌)を共生させていることは広く知られており、シダ植物の胞子体の根もAM菌をもつことがすでに報告されていた。これに対してシダ類配偶体(前葉体)は一般に長さ、幅とも1cmに満たない小形の心臓形で、土壌表面に生育することから、AM菌との共生は無いものと考えられてきた。しかし系統の基部に位置するリュウビンタイとゼンマイの野生配偶体についての我々の研究から、これらがともに90%以上という高い確率でAM菌のグロムス菌類Glomeraceaeを多層の中肋部(クッション)に感染させていることが示され、他のシダ類における菌感染性の研究が必要となった。本年度(平成25年度)は、昨年度から続いてシダ類の大半を占める薄嚢シダ類の基部分類群であるウラジロ科と木生シダ類ヘゴ目の野生配偶体について菌感染を明らかにした。手法はrbcL遺伝子を用いた採集配偶体のDNAバーコーディング手法により種同定を行った配偶体について、SSU領域をクローニングしてAM菌の種同定を行った。その結果、ウラジロ科のウラジロ58%(7/12個体),コシダ78%(7/9)、ヘゴ目のキジノオシダ94%(30/32)、オオキジノオ82%(44/54)、クロヘゴ82%(26/32)、ヒカゲヘゴ63%(5/8)の菌感染率を示し、リュウビンタイ、ゼンマイに比較すると低いものの、かなり高い確率でクッションに菌をもっていることがわかった。またAM菌類の種類は、Glomeraceaeが多いが、Claroideoglomeraceae(グロムスBグループ)、Acaulosporaceaeなど別の科も感染しており、個体によっては2科以上が同時に感染しているもが存在することがわかった。現生の維管束植物の80%以上が根にアーバスキュラー菌根菌(AM菌)を共生させていることは広く知られている。これに対して幅、長さとも1cm以下と小形で扁平な心臓形を示すシダ植物配偶体は菌根菌をもたないというのが常識とされてきた。これに対してシダ植物系統樹において基部近くに位置するリュウビンタイとゼンマイの配偶体では、多層の中肋部(クッション)に菌根菌が存在するという報告が古く1990年代初めになされたが、野生配偶体の形態による種同定が困難な状況にあって、配偶体と菌根菌との関係についてそれ以上の研究が進む事はなかった。しかし最近、遺伝子を用いたバーコーディング技術の発達によって野生配偶体の種同定が可能になり、配偶体と菌根菌の関係についての研究は新たな局面を迎えようとしている。本年度は日本各地でリュウビンタイとゼンマイの野生配偶体を採取し、rbcL遺伝子による分子同定から種を確認し、樹脂切片により内生菌の有無、内生菌の同定を行った。その結果、リュウビンタイでは96%(50/52個体)、ゼンマイでは95%(41/43個体)の割合でクッション部にAM菌が存在することが示された。この数値の高さは、両種の配偶体とAM菌との間には栄養の依存関係がある可能性が高いことを示している。また内生するAM菌は、(SSU)rDNA領域を用いた分子同定からグロムス科のグロムスグループAに属するものばかりであり、他のAM菌は存在しなかった。さらに内生するAM菌の多様性は大変高く、同じ集団から採取された配偶体でも、個々の配偶体は1種類のグロムス菌をもち、2種類のグロムス菌をもつことはなかった。以上の内容を論文としてまとめ、Journal of Plant Research (2013年)に出版した。現生の維管束植物の90%以上が根にアーバスキュラー菌根菌(AM菌)を共生させていることは広く知られており、シダ植物の胞子体の根もAM菌をもつことがわかっている。

一方、シダ植物の配偶体(前葉体)はサイズ1cm以下と小型であることからAM菌をもたないと考えられてきた。これに対して著者らは、最近、シダ植物の基部分類群の配偶体がAM菌を感染させており、しかもAM菌は配偶体の多層の中肋部(クッション層)に局在していることを明らかにした。また、種ごとの感染率の比較から、「菌感染率と配偶体のクッション層の厚さとの間に関係がある」という仮説を提出した。本研究では、本仮説を検証することを目的とし、野外で採集した配偶体をrbcL遺伝子を用いて種同定した後、切片観察からAM菌の有無を明らかにした。昨年度までの研究から、シダ植物の派生的分類群である広義ウラボシ類の地上生の心臓形配偶体も中肋部(クッション層)にAM菌をもつものがあること、ただし岩上着生の心臓形配偶体はクッション層が薄く菌感染がみられないことが示されていた。しかしこれらのデータは主に暖温帯や亜熱帯の日本産配偶体で得られたものであった。土壌の菌相が異なると予想される冷温帯でのデータが欠けていた。したがって本年度は、冷温帯に生育する配偶体を採取・解析することを目的とし、長野県松本における調査から4科11種の配偶体を採取し、遺伝子による種同定を行った後、切片観察を行い菌の有無を観察した。今年度は最終年度として、昨年度までの全データと今年度のデータを合わせ、計15科29種323個体のデータを用いて回帰分析(GLM)を行った。その結果、クッション層の厚さと菌感染率には有意な関係があることが示され(p<0.001)、上記仮説が支持される結果となった。植物形態学平成24年度に始めた薄嚢シダ類の基部分類群であるウラジロ科、ヘゴ目配偶体の菌感染性に関する研究を、平成25年度は続けて行いほぼ終了した。25年度も個体数も増やすために補完の採集を行ったが、主には24年度に採集済みの配偶体から抽出・保存していたDNAを用いて配偶体の種同定、組織切片による菌感染の有無、クッションの厚さを解析し、また菌感染があった場合にはDNAによる感染菌類の種同定を進めた。その結果、菌感染率はリュウビンタイ、ゼンマイに比べてやや低いものの58%90%であること、感染している菌はGlomeraceaeだけでなく、Acaulosporaceaeなど他の科も含まれていることが明らかになった。これについては、25年度の日本植物分類学会熊本大会にて発表し、現在論文を執筆中である。また25年度は、薄嚢シダ類の大半を占める大きな分類群である広義ウラボシ類についての研究を開始した。日本各地でオシダ科、メシダ科、イノモトソウ科、ウラボシ科などの心臓形配偶体をかなりの数採集することができた。それらの予備的研究から、地上生配偶体では感染率が50%以上であることが多いが、ウラボシ科のノキシノブ、マメヅタなど岩上着生のものは菌感染率が0%であるというデータが得られており、今後の研究を進める上で有益な情報となった。インドネシアのボゴール植物園のTitien Praptosuwiryo博士との共同研究の準備を始め、チボダス植物園にて予備的な配偶体調査を行い、園内に実験区をもうけ、ヘゴ科Cibotiumの胞子を播種を試みるなど、熱帯における配偶体調査の準備を行う事ができた。本研究課題の「シダ植物配偶体の形態進化と菌共生関係の変遷」の初年度として、本年度はシダ植物系統樹の基部の系統群であるリュウビンタイ(リュウビンタイ科)とゼンマイ(ゼンマイ科)、2種について、95%以上の割合でAM菌が存在し、それらがグロムスグループAに属するものであることを明瞭に示すことができた。
HA高速噴射による除去加工と成膜加工を利用したインプラント周囲炎治療法の提案

パウダージェットデポジション(PJD)法とは,セラミックスパウダーの高速衝突付着現象を利用した金属基板上へのセラミックス成膜方法である.今回提案するPJD法を応用したインプラント周囲炎治療では,チタン表面の除去加工とチタン表面への付着加工をおこし,治癒を促進することを目的とする.酸化チタン-ハイドロキシアパタイト(TiO2-HA)膜の評価を行ったところ、TiO2-HA膜は均一で緊密に生成され、基盤界面との間にギャップは認められなかった。ビッカース硬さはエナメル質と同等であり、、また接着強度は歯質に対するコンポジットレジンの接着強度と同等であり、サーマルサイクル前後でも有意差は認められなかった。ヒト臨床に向けて、前臨床試験を行うために倫理委員会の承認、ならびに本試験の妥当性について検討を進めた。前臨床試験に関しては、倫理委員会にて承認を得て(承認番号「19医施-1」)、試験実施は、東北大学医学系研究科付属動物実験設備にて開始した。なお、試験方法は、平成24年3月に新たに発行されたJIS T 6001:2012「歯科用医療機器の生体適合性の評価」に準拠した内容で行った。なお、本医療機器材料のよる施術部位は、エナメル質と象牙質の両部位が想定されるため、本試験では各部位に対する歯髄刺激性を観察する目的で実施された。象牙質処理に対する歯髄刺激性試験において、HAP成膜層の試料を観察した結果、7、28、70日の各試験期間において、7試料中の1試料で軽度の炎症を認めたが、それ以外においては、炎症スコア0の炎症無しの評価となり、本法において軽度以上の炎症を認めた症例は無く、本法による歯髄為害性はほぼ無いものと判断された。また、陰性対照試料において、28、70日で軽度の炎症が認められ、陽性対照試料においては、試験初期の7日目において、4症例中の3症例で軽度の炎症が確認された。歯髄腔内への細菌の微小漏洩は、全ての試料において観察されず、試験手法に問題の無いことが明らかとなった。エナメル質処理に対する歯髄刺激性試験において、HAP成膜層の試料を観察した結果、7日目の試験期間において、7試料中の1試料で軽度の炎症を認めたが、それ以外においては、炎症スコア0の炎症無しの評価となり、本法において軽度以上の炎症を認めた症例は無く、本法によってエナメル質を処置した場合に歯髄為害性はほぼ無いものと判断された。パウダージェットデポジション(PJD)法とは,東北大学大学院歯学研究科の佐々木啓一,工学研究科の厨川常元らが開発した精密加工分野で広く用いられているアブレイシブジェット加工(除去加工)を発展させたもので,セラミックスパウダーの高速衝突付着現象を利用した金属基板上へのセラミックス成膜方法である.このPJD法を応用し,常温常圧下でHAパウダーをチタン上に高速で吹きつけ,接着材を介することなく直接ハイドロキシアパタイト(HA)膜が形成されることが明らかになった.今回提案するPJD法を応用したインプラント周囲炎治療では,チタン表面の除去加工: HAパウダーを用いたアブレーションによる確実な感染除去を行い,骨再結合のベースを整えること,チタン表面への付着加工:インプラントチタン表面にHA膜を成膜し,バイオインテグレーション(HAと骨が化学的にダイレクトに結合)を誘導,生体内再活性化をおこし,治癒を促進することを目的とする.今年度はHA膜の噴射条件の検討を行った.HAパウダーは,コンプレッサーにより圧縮された空気と混合され,ノズルから噴射される.ガスのオンオフはパソコンで制御された高速電磁弁により行う.PJD装置では,デジタル的にパウダー供給量を制御することにより,パウダーの噴射を定量化できる.ハンドピース型PJD装置を用いて,噴射条件を検討した.その結果,HA膜はチタン基板表面に均一に成膜され,その性状は緊密であった。非接触型三次元測定機においても成膜状態は確認され、約70ミクロンの膜厚を得ることに成功した。パウダージェットデポジション(PJD)法とは,東北大学大学院歯学研究科の佐々木啓一,工学研究科の厨川常元らが開発した精密加工分野で広く用いられているアブレイシブジェット加工(除去加工)を発展させたもので,セラミックスパウダーの高速衝突付着現象を利用した金属基板上へのセラミックス成膜方法である.このPJD法を応用し,常温常圧下でHA(hydroxyapatite)パウダーをチタン上に高速で吹きつけ,接着材を介することなく直接HA膜が形成されることが明らかになった.今回提案するPJD法を応用したインプラント周囲炎治療では,チタン表面の除去加工: HAパウダーを用いたアブレーションによる確実な感染除去を行い,骨再結合のベースを整えること,チタン表面への付着加工:インプラントチタン表面にHA膜を成膜し,バイオインテグレーション(HAと骨が化学的にダイレクトに結合)を誘導,生体内再活性化をおこし,治癒を促進することを目的とする.今年度はチタンインプラントとより親和性を高めるために、酸化チタン配合のハイドロキシアパタイトパウダーを用いて成膜を行い、酸化チタン-ハイドロキシアパタイト(TiO2-HA)膜の評価を行った。TiO2-HA膜は均一で緊密に製膜されており、基盤界面との間にギャップは認められなかった。ビッカース硬さはエナメル質と同等であり、サーマルサイクル前後でも有意差は認められなかった。また、接着強度は歯質に対するコンポジットレジンの接着強度と同等であり、サーマルサイクル前後でも有意差は認められなかった。

パウダージェットデポジション(PJD)法とは,セラミックスパウダーの高速衝突付着現象を利用した金属基板上へのセラミックス成膜方法である.今回提案するPJD法を応用したインプラント周囲炎治療では,チタン表面の除去加工とチタン表面への付着加工をおこし,治癒を促進することを目的とする.酸化チタン-ハイドロキシアパタイト(TiO2-HA)膜の評価を行ったところ、TiO2-HA膜は均一で緊密に生成され、基盤界面との間にギャップは認められなかった。ビッカース硬さはエナメル質と同等であり、、また接着強度は歯質に対するコンポジットレジンの接着強度と同等であり、サーマルサイクル前後でも有意差は認められなかった。PJD法によるチタン表面へのHA膜の成膜が確立されたためである.成膜処置にムラはなく,安定して行うことができる手法を確立できたため,今後はチタン試料表面への歯周病原性細菌付着を行い,汚染物質除去能の評価と生体内最活性化能の評価を行っていく.歯科補綴学PJD法有効性の基礎的検討として,汚染物質除去能の評価と生体内再活性化能の評価を行っていく.具体的には,汚染物質除去能の評価では1チタン試料表面への歯周病原性細菌付着:インプラント周囲炎の原因菌として代表的な歯周病原菌性細菌として,Actinobacillus actinomycetemcomitans (A.a)Y4株を使用し,好標準菌液を作製する.チタン試料を浸漬し,37°C,4時間培養後,付着を強固にするため12時間自然乾燥する.2PJD法による細菌の除染:HAパウダーの粒径,成膜時間を変動パラメータとし,チタン表面にHA成膜する.3除染能の評価:SEMによる表面観察,電子線マイクロアナライザー(EPMA)による元素濃度マッピング分析,クリスタルバイオレット染色法によるA.a菌残留付着量の測定を行う.生体内再活性化能の評価では,1炎症環境下でのチタン試料表面への細胞培養:インプラント表面に上皮組織が侵入を想定したラット由来線維芽細胞株であるRat-1細胞の培養をチタン上で行い、リポポリサッカライド(LPS)を添加し炎症環境を模した状態で、さらに2週間の培養する.2PJD法による生体内再活性化処理:HAパウダーの粒径,成膜時間を変動パラメータとし,チタン表面にHA成膜する.3擬似体液(SBF)への浸漬:ISO規格として承認された組成のSBF(ISO/CD23317)を作製し,7日間浸漬する.4生体内再活性化能の評価:SEMによる表面および断面観察,X線回折装置(XRD)およびフーリエ変換赤外分光光度計(FT-IR)による表面の構造解析を行う.平成25年度では、前臨床試験のプロトコールを作成、倫理委員会の承認を得ることができ、また前臨床試験試験を行った結果、パウダージェットデポジション法の歯髄への安全性を確認することができたためHA成膜条件の選定が順調に進んだため,翌年度の計画に合わせて使用することとした.探索的臨床研究を行う。被験者は、東北大学病院歯科部門咬合回復科にて、調査の趣旨と方法について文書及び口頭で十分に説明した後に、インフォームドコンセントを得られた10名の成人ボランティアを本研究の対象者とする。
VA-Liposome-siRNAHSP47を用いた抗線維化治療

組織線維症は現在全く治療法のない病態である。その責任細胞は星細胞であり、組織が傷害を受けると、それが活性化しコラーゲンを分泌するようになる。この分泌過程にはコラーゲンに特異的なシャペロン蛋白HSP47が補助的に関与する。本研究ではsiRNAHSP47を用いる事により活性化星細胞からのコラーゲン分泌を抑制する事を意図し、ラット肝星細胞での効果を検討したところ、明確に抑制効果が確認された。次いで星細胞がVitamin A(VA)を取り込み貯蔵するという性質を利用して、liposomeにVAを結合させその中に、siRNAHSP47(ラットではsiRNAgp46)を含ませてComplexを作製し、3種類(DMN,CCL4,DBL)の肝硬変ラットモデルでその抗線維活性を調べたところ、いづれのモデルにおいても明確な効果が見られた。また致死的なDMNモデルでは100%の生存率も確保できた。さらに同様な抗線維効果はDBTC膵炎ラットモデルに於いても確認された。本治療効果の機序としてはsiRNAHSP47によりコラーゲン分泌が抑制されると同時に組織中のコラゲナーゼ(一部は活性化星細胞からも分泌される)により既沈着のコラーゲンが分解される事によると考えられる。以上により本研究での開発された臓器線維症の治療法は、今後臨床への展開が多いに期待されるところである。これまで予備的な実験として、ラットにDMNを投与して作成した肝硬変に尾静脈からVA-lipsiRNAHSP47を隔日で5回投与することにより、ほぼ完治させうることを明らかにして来た。平成20年度の実験として、DMN肝硬変モデルに比べてより慢性の肝障害が持続し、ヒト肝硬変により近似したモデルである胆管結紮肝硬変、四塩化炭素肝硬変モデルで同治療法の効果を検討したところ、いずれのモデルにおいても明確な治療効果が確認できた。さらにINFα、TNF、IL12などを測定したところ、いずれも上昇しておらず、本治療がoff target effectとは無関係で、副作用のないものであることが示された。また線維化改善メカニズムについても、まず1)siRNAHSP47によりHSCからのcollagen産生が抑制される結果、肝組織でのコラゲナーゼ活性が相対的に優位となりcollagenを融解する、さらに2)HSCそのもののapoptosisが惹起されることを明らかにした。本研究ではこれまで、臟器線維症の責任細胞である星細胞に、コラーゲン特異的シャペロン蛋白;heat shock protein (HSP47)のsiRNAを、VAとretinol binding proteinのcomplexを認識する受容体を介して取り込ませ(実際にはVAを結合したliposomeにHSP47のsiRNAを含有させた複合体;VA-lipsiRNAHSP47を用いる)、コラーゲン分泌を抑制することにより組織でのコラゲナーゼ活性を相対的に優位とし、collagenを融解するという戦略を用いて、ラットにDMNやCC14を投与するか、あるいは胆管結紮により作成した肝硬変をほぼ完治させうることを明らかにして来た。平成21年度の実験として、上述の方法が、他の臟器(膵、肺、腎)などの線維症にも応用が可能であるか否かを検証した。膵線維症モデルとしてはDB_投与、肺線維症モデルはブレオマイシン投与、腎線維症モデルはSTAMマウスを用いてづれも線維症が確実に構築されたことを確認した後、VA-lipHSP47を静注したところ、明らかな治療効果がみとめられた。さらにこの治療により、障害を受けた臟器が再生することも明らかにした。臓器線維症はしばしば致死的な結果をもたらすにも拘らず、これまで有効な治療法は存在しなかった。我々は本研究で活性化星細胞がコラーゲンを分泌することで臓器線維症を引き起こすことならびに、Vitamin A(VA)を特異的に取り組むという事実に基づき、コラーゲン分泌に必須の役割を演ずるHeat shock protein 47(HSP47)のsiRNAをVA結合リポゾームに含有させた薬剤を開発した。

この薬剤のsiRNAにFAM(蛍光色素)を結合させ、DMNで誘導したラット肝硬変モデルに静注投与したところ肝の活性型星細胞に特異的に分布していることが確認された。そこで同ラットに、本薬剤を全身投与(静注)して治療効果を調べたところ、明確な用量依存性をもって延命効果が認められると同時に組織のコラーゲンが消失していた。このような抗線維作用のメカニズムには単にコラーゲンが消失するという事象のみならず、活性化星細胞がアポトーシスに陥ることも関与していた。一方、正常ラットに薬剤投与して、静止星細胞を調べたところ、アポトーシスは全く見られなかった。本薬剤による線維融解効果はさらにCCL_4投与ラット肝硬変モデルや胆管結紮ラット、肝硬変モデルにおいても確認された。また、DBTCおよびceruleinで誘導した膵線維症のラットモデルにおいても本薬剤は著効を示した。以上から本研究で開発した我々の薬剤は膵器線維症の新規治療薬として極めて有望であることが示された。
リンパ管内皮細胞分化を司る転写調節機構の解明

マウス発生期14.5日目の胎児胚においてソートされた血管内皮細胞およびリンパ管内皮細胞においてEts-2が発現していることが確認され、生体内のリンパ管内皮細胞でもEts-2の発現していることで生物学的により信憑性の高い結果を得ることができた。昨年度までにProx1結合因子として同定したEts-2が実際にリンパ管内皮細胞HDLECにおいてProx1と結合していることが免疫沈降により示されていたが、近年開発されたin situ Proximity Ligation Assayにより両者の結合を分子レベルで検討したところ、両者の結合が検出された。これによりリンパ管内皮細胞内でEts-2がProx1と直接結合していることを示唆する証拠がさらに得られた。内皮細胞において発現することが知られているEts family転写因子について血管内皮およびリンパ管内皮における発現を確認し、また293T細胞においてProx1との結合性を検討したところ、複数のEts family転写因子がProx1と結合することを見出した。HUVECにおいてProx1とEts-2を発現させてクロマチン免疫沈降を行ったところ、両者に対する抗体で、Prox1とEts-2それぞれのDNA結合(予測)配列を含むVEGFR3のプロモーター領域が免疫沈降され、Prox1とEts-2がVEGFR3のプロモーターに直接結合することがわかった。以上のことから、リンパ管内皮細胞でEts family転写因子がProx1の機能調節因子として働いていることが示され、リンパ管新生を制御する転写調節因子を同定することができた。リンパ管新生および分化におけるマスター転写因子Prox1の機能を調節する因子の同定を目的としてyeast two-hybridscreeningを行いProx1の結合因子を探索し、候補因子から11種の核内局在因子に絞り込んだ。さらにHUVEC(ヒト膀帯静脈内皮細胞)およびHDLEC(ヒト皮膚由来リンパ管内皮細胞)でのmRNAの発現をRT-PCR法により確認した。また、哺乳細胞内でProx1との結合を確認した後、それぞれの因子に関する既知の報告から有望と思われる5種の転写因子に絞り込んだ。これらの因子がProx1の下流遺伝子の発現に与える効果を検討するため、アデノウィルスによるProxlのHUVECにおける発現系およびHDLECにおける発現系を用いることにし、それぞれの転写因子をアデノウィルスにより発現できるように遺伝子のクローニングを行った。解析した因子の中で、Ets family転写因子であるEts-1およびEts-2がProx1により誘導されるリンパ管内皮特異的下流遺伝子であるVEGFR3(血管内皮増殖因子ブァミリーの一種であるVEGF-Cの受容体)の発現をさらに充進させた。それを裏付けるようにProxlおよびEts-1を共発現させたHUVECにおいてVEGF-Cへの走化性が充進した。また、Prox1およびEts-1を共発現させたHUVECにおいて増殖効果を検討したところ、Prox1によって誘導される細胞増殖効果を抑制した。これを裏付けるようにProx1によって誘導されたCyclinElの発現もEts-1により抑制されていた。以上の結果から、Ets-1/2がリンパ管内皮細胞におけるProx1の転写共役因子として同定され、リンパ管新生を調節する因子である可能性が示唆された。リンパ管新生および分化におけるマスター転写因子であるProx1の機能を調節する因子としてEts family転写因子であるEts-2を同定した。Prox1によりはHUVEC(ヒト臍帯静脈内皮細胞)においてリンパ管内皮特異的下流遺伝子VEGFR3(血管内皮増殖因子ファミリーの一種であるVEGF-Cの受容体)を誘導するが、Ets-2はVEGFR3の発現をさらに亢進させた。これらを裏付けるようにProx1およびEts-2を共発現させたHUVECにおいてVEGF-Cへの走化性が亢進した。In vivoにおけるリンパ管新生に対するEts-2の機能を解析するため、マウスの無菌性腹膜炎モデルを導入した。チオグリコレートをBalb/cマウスに腹腔内注射して炎症反応を起こさせ、その時に誘導されるリンパ管新生に対するEts-2の効果を検討するため、Ets-2(をコードする)アデノウィルスを腹腔内注射して検討した。Ets-2の比較対照としてDNA結合ドメイン領域のみを含むドミナントネガティブ変異体TM-Ets1を作製して用いた。チオグリコレートを2日おきに、アデノウィルスを4日おきに注射することを繰り返し、16日後にsacrificeした。横隔膜を取り出してリンパ管内皮特異的遺伝子であるLYVE-1に対する抗体で免疫染色し、リンパ管内皮の領域を比較した。LacZアデノウィルスを注射したコントロールに対して、Ets-2アデノウィルスではリンパ管新生が亢進しており、一方でTM-Ets1アデノウィルスではリンパ管新生が著しく抑制されていた。以上から、Ets-2にはリンパ管新生を亢進させる働きがあり、リンパ管新生の機能調節因子であることが示唆された。

昨年度までにProx1結合因子として同定したEts-2が実際にリンパ管内皮細胞HDLECにおいてProx1と結合していることが免疫沈降により示されていたが、近年開発されたin situ Proximity Ligation Assayにより両者の結合を分子レベルで検討したところ、両者の結合が検出された。これによりリンパ管内皮細胞内でEts-2がProx1と直接結合していることを示唆する証拠がさらに得られた。内皮細胞において発現することが知られているEts family転写因子について血管内皮およびリンパ管内皮における発現を確認し、また293T細胞においてProx1との結合性を検討したところ、複数のEts family転写因子がProx1と結合することを見出した。HUVECにおいてProx1とEts-2を発現させてクロマチン免疫沈降を行ったところ、両者に対する抗体で、Prox1とEts-2それぞれのDNA結合(予測)配列を含むVEGFR3のプロモーター領域が免疫沈降され、Prox1とEts-2がVEGFR3のプロモーターに直接結合することがわかった。以上のことから、リンパ管内皮細胞でEts family転写因子がProx1の機能調節因子として働いていることが示され、リンパ管新生を制御する転写調節因子を同定することができた。
免疫応答における遺伝的拘束性を決定する自己抗原糸の役割と意義

免疫応答は,自己内因性抗原によって選択されたT及びBリンパ球が持つレパートリーによって支配される.このレパートリーの形成や維持には,自己主要組織適合性抗原のみならず,その個体が持つ免疫グロブリンイディオタイプが重要な役割を果たしている.本研究では,イディオタイプ特異的T及びB細胞活性の誘導について, B細胞移入法,四親性骨髄キメラマウス法を用いて,宿主や供与細胞がもつ遺伝的背景の役割を解析した.また, TおよびBリンパ球の長期培養クロン化株を作製し,遺伝子レベルでの自己抗原拘束性の本体を明らかにすることを試みた.(I)イディオタイプ特異的細胞障害性T細胞の出現には, T細胞の成熟分化の過程で,相当するイディオタイプがその個体内で発現されていなければならないことを, B細胞移入法,及び四親性骨髄キメラマウスを用いて証明できた.このことは,抗イディオタイプT細胞レパートリーの形成は遺伝的に規定されたものではなくて,後天的な陽性選択の過程によるものであることを意味する.(2)一方B細胞の抗イディオタイプレパートリーの形成は,先天的なものであることが四親性骨髄キメラマウスを用いた実験から証明できた.我々が検出しているB細胞はMHC拘束性を持つ特徴があるが,この拘束性の獲得は後天的な選択,すなわち適応分化によることがわかった.従って,イディオタイプ認識と自己MHC認識は異なった受容体によっている可能性が強く示唆された.(3)イディオタイプ特異的細胞障害性T細胞のクロン化に成功した.(4)イディオタイプ特異的増強性B細胞のクロン化に成功した.現在,イディオタイプ特異的T及びB細胞のクロンから,これらの受容体を規定しているmRNAを取り出し, cDNAクローニングと塩基配列の決定をおこなっている.免疫応答は,自己内因性抗原によって選択されたT及びBリンパ球が持つレパートリーによって支配される.このレパートリーの形成や維持には,自己主要組織適合性抗原のみならず,その個体が持つ免疫グロブリンイディオタイプが重要な役割を果たしている.本研究では,イディオタイプ特異的T及びB細胞活性の誘導について, B細胞移入法,四親性骨髄キメラマウス法を用いて,宿主や供与細胞がもつ遺伝的背景の役割を解析した.また, TおよびBリンパ球の長期培養クロン化株を作製し,遺伝子レベルでの自己抗原拘束性の本体を明らかにすることを試みた.(I)イディオタイプ特異的細胞障害性T細胞の出現には, T細胞の成熟分化の過程で,相当するイディオタイプがその個体内で発現されていなければならないことを, B細胞移入法,及び四親性骨髄キメラマウスを用いて証明できた.このことは,抗イディオタイプT細胞レパートリーの形成は遺伝的に規定されたものではなくて,後天的な陽性選択の過程によるものであることを意味する.(2)一方B細胞の抗イディオタイプレパートリーの形成は,先天的なものであることが四親性骨髄キメラマウスを用いた実験から証明できた.我々が検出しているB細胞はMHC拘束性を持つ特徴があるが,この拘束性の獲得は後天的な選択,すなわち適応分化によることがわかった.従って,イディオタイプ認識と自己MHC認識は異なった受容体によっている可能性が強く示唆された.(3)イディオタイプ特異的細胞障害性T細胞のクロン化に成功した.(4)イディオタイプ特異的増強性B細胞のクロン化に成功した.現在,イディオタイプ特異的T及びB細胞のクロンから,これらの受容体を規定しているmRNAを取り出し, cDNAクローニングと塩基配列の決定をおこなっている.免疫応答の調節機構の中で、イディオタイプを介する調節様式が重要な役割を果たす。我々は、自己イディオタイプ(Id)特異的増強性B細胞とキラーT細胞活性を検出することに成功した。これらはいずれも自己Idと主要組織適合性抗原(MHC)を認識しつつ、自己Id産生に対して前者は促進的に、後者は抑制的に働きかけていることを証明してきた。本年度は、両者の機能発現において、遺伝的拘束性を決定する自己抗原、すなわちIdとMHCについて、四親性キメラマウスを用いた研究を中心に行なった。1)増強性B細胞の機能発現について、自己Id及びMHC認識の適応分化を、四親性骨髄キメラマウスを用いて解析した。MHC認識に関しては、増強性B細胞が適応分化することが証明できた。しかしながら、自己Id認識については、その骨髄細胞が由来する宿主マウスが、相当するId産生能を持たなければ抗Id特異性は出現せず、適応分化しえないことが判明した(J.Immunol.,1987)。最近自己IdとMHCを同時に認識し、かつ増強性活性を有するB細胞クロン長期培養株へ樹立に成功したため、今後、その受容体構造の遺伝子解析を進めたい。自己Id認識が適応分化し得ない事を遺伝子レベルで解析する予定である。2)自己Id特異的キラーT細胞は、B細胞とは全く異なり、四親性骨髄キメラマウスにおいて、Id認識,MHC認識のいずれもが適応分化し得ることを証明した(第16回日本免疫学会総会,J.Immunol.,投稿中)。一方、我々は、自己Id特異的かつMHC拘束性のキラーT細胞クロンの長期培養株の樹立に成功し、これを報告した(Eur.J.Immunol.,in press)。現在、このキラーT細胞抗原受容体遺伝子,Tiα及びTiβのcDNAクローニングを行なっており、その遺伝子構造についても、近い将来報告する予定である。
抗酸菌に対するマクロファージの遊離脂肪酸依存性殺菌メカニズムに関する研究

本研究ではまず,マクロファージ(MФ)ファゴソーム内でのアラキドン酸(AA)の産生に関わるphospholipase A_2(PLA_2)の性状についての検討を中心にを進めた結果,(1)結核菌のMφ内増殖はquinacrine(PLA_2阻害剤)やTFMK(IV型cPLA_2阻害剤)により助長されることから,MФ内での結核菌の殺菌にはcPLA_2が重要な役割を果たすこと,(2)^3H-AAを取り込ませたMФに結核菌を感染させると,ファゴソーム内結核菌への^3H-AAのtranslocationがcPLA_2に依存性が認められること,さらに,(3)IFN-γ活性化MФではcPLA_2発現の増強が認められることなどが明らかになった.次に,結核菌感染MφにおけるcPLA_2の細胞内局在とMAPKによるリン酸化のプロフィールについての一連の検討を進めたところ,(1)抗cPLA_2抗体で染色したMФまたは,pyrene標識cPLA_2基質でcPLA_2のMФ内局在について,螢光顕微鏡や共焦点顕微鏡での観察から,結核菌に感染させたマウス腹腔MФやRAW264.7MФでは,cPLA_2が結核菌を取り込んだファゴソームにtranslocateしており,菌体周囲でのcPLA_2局在が増強すること,(2)Western blot法での検討で,マウス腹腔MФでは,結核菌感染後48時間でMAPK活性依存性にcPLA_2のセリン残基のリン酸化が観察されること,他方,(3)RAW264.7MФではcPLA_2のリン酸化がconstitutiveに起こっていること,(4)ATPの作用によりM.aviumに対するMФの殺菌活性の増強が認められるが,この場合にもcPLA_2が重要な役割を演じていることが明らかになった.以上の成績は,病原性抗酸菌に対するMφの殺菌メカニズムには,cPLA_2の果たす役割が重要であることを示唆している.本研究ではまず,マクロファージ(MФ)ファゴソーム内でのアラキドン酸(AA)の産生に関わるphospholipase A_2(PLA_2)の性状についての検討を中心にを進めた結果,(1)結核菌のMφ内増殖はquinacrine(PLA_2阻害剤)やTFMK(IV型cPLA_2阻害剤)により助長されることから,MФ内での結核菌の殺菌にはcPLA_2が重要な役割を果たすこと,(2)^3H-AAを取り込ませたMФに結核菌を感染させると,ファゴソーム内結核菌への^3H-AAのtranslocationがcPLA_2に依存性が認められること,さらに,(3)IFN-γ活性化MФではcPLA_2発現の増強が認められることなどが明らかになった.次に,結核菌感染MφにおけるcPLA_2の細胞内局在とMAPKによるリン酸化のプロフィールについての一連の検討を進めたところ,(1)抗cPLA_2抗体で染色したMФまたは,pyrene標識cPLA_2基質でcPLA_2のMФ内局在について,螢光顕微鏡や共焦点顕微鏡での観察から,結核菌に感染させたマウス腹腔MФやRAW264.7MФでは,cPLA_2が結核菌を取り込んだファゴソームにtranslocateしており,菌体周囲でのcPLA_2局在が増強すること,(2)Western blot法での検討で,マウス腹腔MФでは,結核菌感染後48時間でMAPK活性依存性にcPLA_2のセリン残基のリン酸化が観察されること,他方,(3)RAW264.7MФではcPLA_2のリン酸化がconstitutiveに起こっていること,(4)ATPの作用によりM.aviumに対するMФの殺菌活性の増強が認められるが,この場合にもcPLA_2が重要な役割を演じていることが明らかになった.以上の成績は,病原性抗酸菌に対するMφの殺菌メカニズムには,cPLA_2の果たす役割が重要であることを示唆している.昨年度までの,特に遊離脂肪酸がファゴソーム内結咳菌にattackする様相に関する検討により,マクロファージ(Mφ)の抗結核菌,抗M.avium complex(MAC)活性には遊離脂肪酸,特にアラキドン酸(AA)と活性窒素酸化物(RNI)との協同作用が重要であることを強く示唆する成績が得られているが,本年度は,Mφファゴソーム内でのAAの産生に関わるPhospholipase A_2(PLA_2)の性状についての検討を中心に研究を進め,概略以下のような成績が得られて来ている。(1)結核菌およびMAC菌のMφ内増殖は,quinacrine(PLA_2阻害剤)やTFMK(IV型cytosolicPLA_2[cPLA_2]阻害剤)によりenhanceされるが,manoalide(II型secretory PLA,[sPLA_2]阻害剤)では影響を受けないことからMφ内殺菌メカニズムにおけるIV型cPLA_2の関与が強く示唆された。(2)^3H-AA標識Mφに結核菌を感染させた後に培養した場合の,^3H放射活性の結核菌菌体べのtranslocationは,colchicinc(貧食阻害剤)やTFMKによって強く抑制されたが,manoalide, NDGA(lipoxygenase阻害剤)あるいはindomethacin(cyclooxygenase阻害剤)では影響を受けないことより,Mφファゴソーム膜のリン脂質より産生されたAAはPGやleukotrieneに変換されることなくファゴソーム内の結核菌にattackすること,さらに,こうした現象にはIV型cPLA_2が重要な役割を演じていることが明らかになった。

(3)IFN-γ活性化マウス腹腔Mφでは,IV型cPLA_2のmRNA発現が強く認められたが,II型sPLA_2のmRNA発現は認められなかった。また,IFN-γで刺激したRAW264.7MφやJ774Mφ細胞株でも,同様な成績が得られているが,この場合V型sPLA_2のmRNA発現も強く認められることが分かった。(4)IV型cPLA_2のmRNA発現が,結核菌H37Rv株(強毒株)やH37Ra(弱毒株)の感染によって増強すると言う現象は認められないことより,IV型cPLA_2によるAA産生の制御は,post transcriptionalなメカニズムによるものと考えられる。現在,MAP kinase系を介するIV型cPLA_2の活性化とMφファゴソーム膜へのtranslocationの様相についての一連の検討を進めつつある。昨年度までの,遊離脂肪酸のマクロファージ(MΦ)ファゴソーム内局在結核菌へのattackのプロフィールに関する一連の検討により,(1)結核菌のMΦ内増殖はquinacrine (phospholipase A_2[PLA_2]阻害剤)やTFMK (IV型cytosolic PLA_2[cPLA_2]阻害剤)により助長されることから,MΦ内での結核菌の殺菌には,cPLA_2が重要な役割を果たすこと,(2)^3H標識アラキドン酸(^3H-AA)を取り込ませたMΦに結核菌を感染させると,^3H-AAのcPLA_2に依存性のファゴソーム内結核菌へのtranslocationが認められること,さらに,(3)IFN-γ活性化MΦではcPLA_2発現の増強が認められることなどが明らかになって来ている.本年度は,結核菌感染MΦにおけるcPLA_2の細胞内局在とMAPKによるリン酸化のプロフィールについての一連の検討を進めたが,概略以下のような成績が得られてきている.(1)抗cPLA_2抗体とpyrene標識リン脂質での二重染色を施したMΦについての螢光顕微鏡下での観察により,結核菌に感染させたマウス腹腔MΦおよびRAW264.7MΦでは,何れにおいても,cPLA_2が結核菌を取り込んだファゴソームにtranslocateしており,菌体周囲でのcPLA_2およびcPLA_2の基質であるリン脂質の局在が増強すること,(2)Western blot法による検討で,マウス腹腔MΦでは,結核菌感染後48時間で,MAPK活性依存性にcPLA_2のセリン残基のリン酸化が起こること,他方,(3)RAW264.7MΦでは結核菌に未感染の細胞でもcPLA_2のリン酸化がconstitutiveに起こっていること,(4)ATPの作用によりM.aviumに対するMΦの殺菌活性の増強が認められるが,この現象にもcPLA_2が重要な役割を演じていることなどが明らかになった.以上の成績は,結核菌やM.aviumなどの病原性抗酸菌に対するMΦの殺菌メカニズムには,cPLA_2の果たす役割が重要であるという考えを支持するものであり,今後はMAPKによるcPLA_2のリン酸化がMΦのToll-like receptorからのシグナルによりどのように制御されているのかについての詳細な検討を進める予定にしている.
ナノ元素置換科学：ナノ結晶相の構造変換と新奇機能開拓

本研究では、電子構造で決定される希少貴金属の優れた物性や触媒能を凌駕する新奇無機ナノ粒子群の合成法と新奇機能を開拓する。具体的には、1低周期dブロック金属元素とpブロック元素との化合物形成ならびにpブロック元素との元素置換により、電子構造を変調した新奇な金属化合物・合金ナノ粒子群を創製する。さらに、2ヘビードープ半導体ナノ粒子の元素置換により、結晶構造・電子構造を部分的に変調し、全近赤外領域を網羅する光エネルギー変換材料を創製する。これら新奇無機ナノ粒子群の新たな物性・固体触媒特性探索を徹底的に行い、「基底電子構造変調」という新しい概念に根ざした物質科学『ナノ元素置換科学』を開拓する。