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バイオセルトレーサーシステム(BCT)による迅速バイオアッセイ

本研究はバイオセルトレーサー(BCT)を利用したバイオアッセイ法の有効性を示すと共に適用範囲の拡大を図るために平成79年の3年間で実施された。大別して分野毎の課題1.と標準化の調査2.からなる。1.各種分野毎の課題に関する成果:(1)臨床分野では、一般に成長速度の遅い病原性糸状菌に対処するために測定精度の飛躍的向上を達成(0.01μm/min)。患者の血中濃度に即した測定の重要性に鑑み高精度シミュレーターを開発。次に述べる形状認識プログラムによって赤血球形状変化の高精度測定を達成。(2)生産(医薬・農薬)分野では、酵母型真菌にも適用できる形状認識プログラムを開発。BCT法が抗真菌活性成分の高感度スクリーニング法であることを示し、多くの生薬中に新規活性成分があることを発見、特に知母、射干からは有効成分を単離し分子構造を解析。(3)農業生産及び環境分野では、植物幼根の成長速度計測系を確立し、植物自体の鮮度指標としての利用法を提示。また、環境(河川や土)中の毒物(金属イオン)や成長制御物質(アレロケミカルズ)を検出するバイオ指標としての根の利用法を提示。2.標準化に関する動向調査結果:(1)臨床分野における薬効評価法に対して米国ではNCCLS(National Committee for Clinical Laboratory Standards)が標準法として広く採用されており、日本でもこれに準じていたが、糸状菌については全く規定がなく、標準化は遅れていることが判明。その状況は欧州においても同様であった。(2)食品や薬品の製造、流通プロセスを対象とした化学分析法、及び微生物分析法として米国、欧州で広く支持されているAOAC法にも抗糸状菌活性評価法は無い。(3)準拠すべき公定法や認定法がないため、世界に先駆けた糸状菌測定法としてBCT法の標準化を目指し、そのマニュアルを完成させた。(4)測定法の信頼性を評価するシステムとして、AOAC法に着目、これを推進すべく、AOAC日本支部設立を目指す活動を開始した。以上の成果は、研究組織メンバーの他、研究協力者、研究助言者などの協力によって効率的に得られた。バイオセルトレーサーシステム(BCT)は直線状に成長する細胞や、組織の成長速度をリアルタイムで精確に解析するために開発された。本研究は、このBCTを利用した迅速バイオアッセイの有効性を示すとともに適用範囲の拡大を図るために、情報交換、研究討論、共同実験等を行うべく3年計画で企画された。本年度はその初年度であり、最重要対象として糸状菌を選び、BCTを用いる方法が抗糸状菌活性評価の標準法と成り得るか、という課題を第1に設定し、これについて重点的に調査した。その結果、米国および欧州いすれにおいても標準化の動きは全く遅れていることが判明した。この標準化が最も緊急に要求されている臨床分野で、具体的な問題点を調査した結果、病原性真菌が、極めて広い多様性を示すことが大きな理由の一つであった。そこで、代表的な試験菌の選定とそのケーススタディの集積を系統的に行うことが必要であるとの結論に達した。一方、医薬・農薬生産分野においては糸状菌のみでなく、酵母のアッセイが依然として重要であり、酵母を対象とする専用プログラム開発に着手した。第二の課題は、BCTによる迅速バイオアッセイの実施である。

標準化を念頭においたアッセイ条件を検討し、多くのデータを集積するとともに、異なるアッセイ条件に対応した反応セル条件を検討し、多くのデータを集積するとともに、異なるアッセイ条件に対応した反応セルの設計・製作・機能試験も併せて行った。その結果、特にフロー型で長時間測定が可能な高性能反応セルが開発できたことは大きな成果である。さらに国内における実験のみにとどまらず、コンピューター部分をポ-タブル型に改造し、これをベルギー・英国へ携行し、国外での実験を試みた。この試みは、将来BCTを国外(米国、欧州)に移設して実験を行うための予備試験である。その結果、海外移設の際の問題点とその解決法について、多くの知見が得られた。第三の課題である人的交流及び情報交流については国外の研究分担者の多大な便宜により、適確な人選と予備折衝により効率的かつ有効に実施できた。本研究はバイオセルトレーサー(BCT)を利用したバイオアッセイ法の有効性を示すと共に適用範囲の拡大を図るために3年計画で企画されたもので、本年度はその2年目である。各種分野毎の課題に関しては、研究討論に基づき、BCTの測定精度の向上、需要の多い酵母型真菌にも適用できるような一般的な形状認識用プログラムの新規開発、生体内での薬剤動態を考慮したアッセイに不可欠な高精度薬剤濃度シミュレーターの開発、植物組織のように比較的大きい試料に適用するための測定セルの開発等が進められた。その結果、(1)臨床分野では、速度の遅い病原性糸状菌の測定、分枝発生時の微小速度変化の検知、生体内での薬剤動態のシミュレーションとその条件下でのアッセイ、(2)生産分野(医薬・農薬)では、生薬中からの新規抗真菌活性成分の発見、酵母型真菌に対する抗真菌活性評価、(3)食品生産分野では、生鮮度評価への利用を目指す根の成長速度測定、などが可能になった。標準化に関しては、初年度の調査で、抗糸状菌活性評価標準法の先例が国内外共に無いことが判明したため、BCT法をマニュアル化することによって先鞭をつけようと考え、その構想をまとめるための調査を行った。特に試験菌、培地の選定、管理等について実務担当者からの情報収集を行った。また、当初計画には無かったが、食品、薬品、化粧品等における抗真菌活性評価法の重要性に鑑み、AOAC(科学分析法に基盤をおく標準化を進めるための組織)に関する調査も行った。以上の調査研究、共同実験は延べ3名の海外派遣、延べ5名の招へいを含む研究計画により円滑に遂行され、極めて多くの成果が得られた。本研究はバイオセルトレーサー(BCT)を利用したバイオアッセイ法の有効性を示すと共に適用範囲の拡大を図るために3年計画で企画されたもので、本年度は最終年度である。各種分野毎の課題に関しては、1.臨床分野では、患者に対する薬剤投与設計、患者の血中残留薬剤の影響の評価を目的として、赤血球の浸透圧変化に対する応答特性をBCTにより連続測定するシステムを開発した。2.生産(医薬・農薬)分野では、前年度に引き続き、BCTによる生薬からの抗真菌活性成分スクリーニングを実施し、具体的に射干から病原性真菌に有効な成分の単離に成功した。
環境配慮義務論の新地平－資源管理法のグリーン化を手掛かりとして－

平成30年度は、当初の予定されていた本研究最終年度として、補足調査を行った。その結果として、(1)前年度と同様に、法制度のグリーン化と、自然からの恵み、いわゆる生態系サービスの規範化とが重複するという観点を基本視座に据えて、500本近くの現行法律を対象とした、定量分析を行ったところ、1「環境の恵沢」や「多面的機能」という文言の有無とは関係なく、多くの法律に、生態系サービス(の根源)を直截的に表す文言が書き込まれていたこと、2法の平面では、生態系サービスのとり上げられ方が均一ではないこと、3サービス提供源である生態系のとり上げられ方もが異なることについて検証することができた。すなわち、現行の国内法の平面におけるサービスの規範化が偏っているという状況を具体的に検証することができたものである。これらの知見は基礎的なものであるが、わが国では初めて提供されるものであるため、今後の研究の呼び水になること等が期待できる。また、(2)資源管理法のグリーン化の初期事例であり、かつ展開事例でもある、公有水面埋立法4条1項2号関連の裁判例の分析を行い、かつては「行政権の行使[の]指針」にすぎないとする裁判例も見受けられたところ、埋立地域周辺住民の原告適格問題が論ぜられ、次第に、「十分配慮」の欠如が、私人の個別的利益を具体的に侵害するおそれがあることが認められてきたことを明らかにすることができた。かかる判例法理の発展経緯は、個別法中の環境配慮義務の中身が司法解釈によって変動していくことを示唆するものである。そのため、別な個別法中の環境配慮義務についても、同様のアプローチで研究を行うことで、その動態を捉えられる可能性が浮かび上がってきた。理由前年度までの研究成果をさらに発展させられたからである。(1)「研究実績の概要」で記した(1)について、三井物産環境基金ワークショップ「持続可能性とWell-Being4種の資本概念とその限界」(2019年3月3日(日)午後1時ー5時、早稲田大学9号館5階第1会議室)(主催:早稲田大学比較法研究所)で報告を行い、この成果を広く発信することができた。(2)(1)の成果が、大塚直編著『持続可能性とWell-Beingー4種の資本概念とその限界ー(仮題)」(日本評論社、2019年公刊予定)として公刊されることが決定しており、同成果の波及効果が見込まれる。(3)「研究実績の概要」で記した(2)について、その成果を大塚直・北村喜宣編著『環境法判例百選(第3版)』158ー159頁(有斐閣、2018年)で公刊できた。本研究事業は、補助事業期間の延長が認められたため、平成31年度は、平成30年度に行い得なかった補足調査と成果の取りまとめを行う。具体的には、(1)本研究課題の内容と最も近い内容の研究を実施してきた、辻信一・福岡女子大学教授へ本研究のこれまでの成果を示し、コメントをいただいた上で、最終的な成果報告書の質を向上させることをめざす。そのための研究会を実施する。(2)グリーン化した、ないしは、生態系サービスを規範化した資源管理法の運用実態を調査するために、自治体等へのヒアリング調査を行う。平成28年度は、「グリーン化の内容」を中心とする調査・検討を実施した。具体的には、畠山『自然保護法講義』(2004)や三浦『沿岸域管理法制度論』(2015)等の代表的な資源管理法関係の学術書を参照し、その中で、いかなる法律が森・川・海の管理法としてとり上げられているかをリストアップした。そこでは、研究者の問題関心等によって、とり上げられる法令に若干の違いが出ていていること等がわかった。具体的には、採石法等の産業法をも考察の射程に収めるかどうかの違いである。その上で、それらがどのようにグリーン化(=環境配慮の規範化)しているのかについて、法令データ提供システム等を用いて調査し、省令や規則等も含んだ法構造上の変化を捕捉・整理した。その際には、とくに「生態系サービス」という概念に注目し、それが法制度の平面上でどのように規範化されているのかに係る予備的な調査を行った。その結果、わが国の法令上、生態系サービスという文言がまったく使われていない一方で、その同義語である「自然の恵み」やその他の持続可能性等の概念については、近年のものはもちろん、かなり古い時代の法令にもとり入れられていること等が明らかになった。この調査・検討結果の一部については、いわゆるワード分析を施したうえで、現在のわが国における主要な環境学研究者が結集した、学外の研究会で報告され、その内容が平成29年度中に岩波書店より公刊予定の学術書の一章としてとり入れられることが決定している。1)基本的なことであるが、近年のわが国で公刊された代表的な資源管理法関係の学術書を参照し、その中で、いかなる法律が森・川・海の管理法としてとり上げられているかをリストアップし、そこでとり上げられる法令に違いがあることを検証できたためである。2)これも基本的ながら、これまでにされてこなかった作業であるが、原稿の国内法令に関して、「生態系サービス」という文言がまったく使われていないことを確認できたためである。その一方で、その同義語である「自然の恵み」やその他の持続可能性等の概念については、近年はもちろん、かなり古い時代の法令にもとり入れられていること等が明らかになり、今後のワード分析の基本方針のようなものが得られたためである。

3)1)2)の成果の一部を、平成29年度中に書籍の形で公刊することが決定し、研究成果を広く世の中に発信することが可能となったためである。平成29年度は、法制度の「グリーン化」が、自然からの恵み、いわゆる生態系サービスの規範化と重なることに注目し、かかる規範化が法制度の平面でどのようになされているのか(および、なされてきたのか)を中心とする調査・検討を実施した。具体的には、生態系サービスなる概念の通用度が高まる一方で、わが国の法律が、それに対してどのような言及をしているのかはよくわかっていないことを踏まえ、法令データ提供システムを利用して網羅的な調査を行ったものである。その結果、(1)生態系サービスの趣旨が「環境の恵沢」と「多面的機能」という文言に置き換えられて、この国のルール(規範)となってきた経緯や「持続可能な発展」等の他の基本概念との法令上の関係等が浮かび上がってきた。また、(2)わが国の現行法律中には、生態系サービスに関連すると考えられる膨大な数の言及がある一方で、供給・調整・文化的サービスそれぞれに均一な言及がなされているわけではない実状も確認することができた。生態系サービスは一般に、「説明概念」として通用しているが、それだけではなく、上記の(1)(2)のような特徴を備えた「法規範としての生態系サービス」としても存在していることを認識し、その中身をより豊かにしていくことが、持続可能な社会の実現につながると考えられる。なお、かかる調査・検討結果の一部は、平成30年度中に日本評論社から公刊予定の学術書の一章にとり入れられることが決定しており、現在、同社において初校作成作業が進んでいる。加えて、平成29年度には、「多面的機能」の読み方が問題になった裁判例(札幌地判平成29年5月22日)の評釈を執筆し、その読み方についての簡単な検討を実施することもできた。(1)日本の法律の平面において、生態系サービスの定義は一つの文言の下で単線的な形での発展をみたわけではないことを初めて検証できたためである。少なくともそれは二つの文言の下で発展をみた。「環境の恵沢」の維持は、法律上の基本理念の一つ(環境基本法3条)として位置づけられ、かつ、「持続可能な発展」原則(環境基本法4条)とのリンクを強めながら、現在に至っている(生物多様性基本法前文および2条)。これに対して、産業関連法律群では、「多面的機能」という文言が用いられてきた。留意するべきは、この文言が、供給サービスを重視する(ことによって農林水産業を保護する)ための道具概念として、それらの法律群に書き込まれてきたと考えられる点である。「多面的機能」としての生態系サービスについては、サービス間の関係性が歪に設定されがちであること、ならびに、生物多様性そのものや「持続可能な発展」原則との関係性が(少なくとも法律の規定上は)希薄なことがうかがわれた。(2)「多面的機能」がキーワードとなった、裁判例(札幌地判平成29年5月22日)の評釈を公刊することができたためである。(3)(1)の成果の一部を、平成30年度中に学術書として公刊(日本評論社より出版)し、研究成果を広く社会に発信できることが確実となったためである。当該の学術書の名称は「持続可能性とWell-Being:4つの資本概念とその限界」となる予定である。平成30年度は、当初の予定されていた本研究最終年度として、補足調査を行った。
胎児性癌細胞F9による哺乳類胚初期発生機構の解析

着床前後のマウス初期胚形成を制御している素子を発見することを目的に、モデル系である胎児性癌細胞F9の培養条件を操作して初期胚で出現する3種の内胚葉様細胞の分化要因を解析した。F9幹細胞をレチノイン酸(RA)で処理すると、3、5-、4日目胚の内部細胞塊表面で分化する始原内胚葉と同様の細胞が誘導される。我々はラミニンやプラスミノーゲン・アクティベーター分泌で評価したF9細胞のこの分化が、RA濃度に依存して2相性を持つことを示した。RAは、組織内に濃度勾配を作って形態形成の位置情報として機能することが知られている。従来から始原内胚葉は均一細胞から成ると考えられているが、次段階での位置特異的な分化の分岐を考えると、F9細胞の場合のように、すでに始原内胚葉細胞分化の時点で何らかの位置情報が与えられていても不思議ではない。始原内胚葉周縁部からは壁側内胚葉細胞が分化し、栄養芽細胞層の内壁を遊走して基底膜を介してこれを裏打ちする。我々は基底膜成分の分泌を指標として、始原内胚葉様F9細胞のジブチリルcAMBによる同様の分化が可逆的出あることを主張してきた。最近、壁側内胚葉に特異的な多数のmRNAの発現をを指標に、この可逆性をさらに明確に示した。他方、内部細胞塊が円筒胚に成長すると、表面の始原内胚葉は内臓内胚葉に分化する。RA処理したF9細胞を培養皿への接着を阻止して培養すると、同様に表面に内臓内胚葉細胞が分化した胚様体になる。この分化の要因を解析するために、スピナー培養で様々なサイズの胚様体を成長させ、それらの密度差を利用してサイズ分画した。その結果、0.13mm以上の直径になると表面に上皮様細胞層が形成され、内臓内胚葉のマーカーであるα-フェトプロテインを分泌することが判明した。これは細胞集塊のサイズが分化を決定していることを示す最初の例であり、器官の大きさを加減する機構として興味深い。
上流に近接した遺伝子による筋型CPTI遺伝子の発現調節機構の解明と心筋症治療薬

カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼI(CPTI)はミトコンドリアにおける長鎖脂肪酸のβ酸化に必須の酵素で、組織分布の異なるアイソフォームが存在する.研究代表者はこれまでに、心筋や脂肪細胞で特徴的に発現している筋型CPTIをコードするcDNAや遺伝子を世界に先駆けて単離しその構造解析を行ってきた.その結果、筋型CPTI遺伝子のすぐ上流には、機能的には全く関連しないCK/EKというタンパク質の遺伝子が同じ転写の方向で存在すること、さらにヒトにおいてCK/EKと筋型CPTIの2つの遺伝子領域を含んだポリシストロン様のmRNAが存在することを明らかとした.本研究では、上述したポリシストロン様のmRNAの構造や機能の詳細を明らかとする目的で、まずラットやマウスにおいてもこのようなmRNAが存在するかどうかRT-PCR法によって解析を行った.その結果、ラットやマウスにおいてもヒトと同様にCK/EKと筋型CPTIの領域を含んだmRNAが存在することが明らかとなったものの、その量はヒトの場合と比較してごく僅かであることが示された.さらにノザン・ブロッティングの結果から、このポリシストロン様mRNAの量は、筋型CPTI遺伝子の上流に存在するCK/EK遺伝子のmRNA量とは比例していないことが示された.以上の結果から、このポリシストロン様mRNAはCK/EK遺伝子の転写開始部位から合成されているが、ラットやマウスではCK/EK領域で転写終結が起こりやすいために筋型CPTI遺伝子とのポリシストロン様のmRNAが生じにくい可能性、あるいはこのmRNAはCK/EK遺伝子内に存在する、ヒトで強い活性を有した未知のプロモーターから転写されたmRNAである可能性が考えられた.CK/EKと筋型CPTIの領域を含んだポリシストロン様mRNAの生理的な役割は全く不明であるので、今後、このmRNAがどのような機構で合成されているのか、生体内でどのような役割を担っているのかをさらに解析を行っていく.カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼI(CPTI)はミトコンドリアにおける長鎖脂肪酸のβ酸化に必須の酵素で、組織分布の異なるアイソフォームが存在する.研究代表者はこれまでに、心筋や脂肪細胞で特異的に発現している筋型CPTIをコードするcDNAや遺伝子を世界に先駆けて単離してきた.その結果、ヒト筋型CPTI遺伝子のすぐ上流には、機能的には全く関連しないCK/EKというタンパク質の遺伝子が同じ転写の方向で存在していることを明らかとした.2つの遺伝子の間は非常に狭く(およそ300bp)、CK/EK領域に筋型CPTI遺伝子の転写を調節するエレメントが存在する可能性がある.そこで本研究では、CK/EK領域が筋型CPTI遺伝子の転写に対してどのような影響を与えているのかを明らかとするため以下の解析を行った.ヒト筋型CPTI遺伝子の転写開始部位を含む上流領域をルシフェラーゼレポーターベクターに組み込んで作成したプラスミドを、マウス線維芽細胞株3T3-L1に導入し細胞のルシフェラーゼ活性を測定した.その結果、CK/EK領域を含まないプラスミドを導入した場合ではルシフェラーゼ活性がほとんど検出されなかったのに対して、およそ600bpのCK/EK領域も含んだ筋型CPTI遺伝子上流領域をプラスミドに組み込んだ場合は明らかなルシフェラーゼ活性が観察された.これらのプラスミドをヒト肝がん細胞株HepG2に導入した場合、CK/EK領域の有無によりルシフェラーゼ活性はほとんど変化しなかった.用いた細胞によってCK/EK遺伝子領域が筋型CPTI遺伝子の転写に与える影響が異なっていたことから、解析に用いたCK/EK領域が細胞種に特異的な機構によって筋型CPTI遺伝子の転写を亢進している可能性が強く示唆される.今後はさらに領域を絞り込み、CK/EK遺伝子領域中に存在する筋型CPTI遺伝子のエンハンサーを同定する.カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼI(CPTI)はミトコンドリアにおける長鎖脂肪酸のβ酸化に必須の酵素で、組織分布の異なるアイソフォームが存在する.研究代表者はこれまでに、心筋や脂肪細胞で特徴的に発現している筋型CPTIをコードするcDNAや遺伝子を世界に先駆けて単離しその構造解析を行ってきた.その結果、筋型CPTI遺伝子のすぐ上流には、機能的には全く関連しないCK/EKというタンパク質の遺伝子が同じ転写の方向で存在すること、さらにヒトにおいてCK/EKと筋型CPTIの2つの遺伝子領域を含んだポリシストロン様のmRNAが存在することを明らかとした.本研究では、上述したポリシストロン様のmRNAの構造や機能の詳細を明らかとする目的で、まずラットやマウスにおいてもこのようなmRNAが存在するかどうかRT-PCR法によって解析を行った.その結果、ラットやマウスにおいてもヒトと同様にCK/EKと筋型CPTIの領域を含んだmRNAが存在することが明らかとなったものの、その量はヒトの場合と比較してごく僅かであることが示された.

さらにノザン・ブロッティングの結果から、このポリシストロン様mRNAの量は、筋型CPTI遺伝子の上流に存在するCK/EK遺伝子のmRNA量とは比例していないことが示された.以上の結果から、このポリシストロン様mRNAはCK/EK遺伝子の転写開始部位から合成されているが、ラットやマウスではCK/EK領域で転写終結が起こりやすいために筋型CPTI遺伝子とのポリシストロン様のmRNAが生じにくい可能性、あるいはこのmRNAはCK/EK遺伝子内に存在する、ヒトで強い活性を有した未知のプロモーターから転写されたmRNAである可能性が考えられた.CK/EKと筋型CPTIの領域を含んだポリシストロン様mRNAの生理的な役割は全く不明であるので、今後、このmRNAがどのような機構で合成されているのか、生体内でどのような役割を担っているのかをさらに解析を行っていく.
抗血小板薬クロピドグレル及びチクロピジンの代謝活性化に関与するCYP分子種の研究

クロピドグレル(CLP)は、チクロピジンと共通のチエノピリジン骨格を有する抗血小板剤である。本剤は肝臓で代謝を受けて生成する活性代謝物の-SH基が、血小板上のADP受容体(P2Y12)と不可逆的に結合することでその活性を阻害し持続的に血小板凝集抑制作用を示す。最近、欧米人の肝薬物代謝酵素CYP2C19のintermediate metabolizer(IM), poor metabolizer(PM)で、CLPの活性減弱が報告され、東洋人ではCYP2C19のPMが多いことから注目されている。CLPの肝代謝にはCYP1A2, 2B6, 2C19,3A4が関与するとされるが、活性代謝物の生成に対して各CYP分子種がどの程度寄与するかは不明であったことから、本研究ではその検討を目的とした。CLPから活性代謝物は2段階の代謝を経て生成するが、CYP3A4とCYP2C19では1段目の主たる代謝物が異なっていた。CYP3A4単独では活性代謝物の生成はCYP2C19に比べ少ないが、CYP2C19にCYP3A4を加えると活性代謝物の生成が増加した。CYP2C19のPMではEMに比べて活性代謝物の生成が1/5から半分程度であった。以上より、CLPの活性代謝物はCYP3A4とCYP2C19が共同的に働いて生成するが、CYP2C19がより重要な働きを行っていると考えられた。以上の他にも多くの構造未知の代謝物の生成が認められており、現在、それらの構造の同定を進めている。
制御性Ｔ細胞誘導機構の免疫組織学的解析

DST(ドナー血液輸血療法)は移植に伴う拒絶反応を抑制することが知られていおり、ドナー特異的Treg細胞誘導やドナー抗体産生などの可能性が示唆されている。我々は、輸血血液成分の何が、このDST効果をどのようなメカニズムで誘導するのかを検討した。その結果、輸血血液中のT細胞が最も強いDST効果をもつこと、レシピエント脾臓のT細胞領域に遊走して在住する抗原提示細胞に貪食・抗原提示されることにより、免疫応答を誘導することが確認された。これにより、初めてDST効果の全貌が明らかになり、臨床応用としてドナーT細胞によりTreg細胞応答や抗体産生を誘導するワクチン開発に有用であることが示唆された。最終年度においては、Treg細胞増殖応答を誘導する輸血血液成分のうちドナーT細胞が最も効率的であることを証明した。また、DST効果の一つである抗ドナー抗体産生応答の誘導も同様の結果であった(投稿準備中)。Treg誘導のメカニズムについては、ドナーT細胞を移入したホスト脾臓をドナーI型MHC抗体(MN)もしくはCD4,ホストII型MHC(OX3),FoxP3,IV型collagenによる3重4重染色法を用いて形態学的解析を行い検討した。その結果、移入1日目にはドナーT(MN陽性)細胞が脾臓PALS内に集積、2日目にドナーT細胞の断片がPALS内のホストDC(OX3陽性)に貪食され、3日目にはDCに隣接したホストT細胞(Treg細胞を含む)の増殖応答が確認された。さらにケモカイン阻害剤の百日咳ワクチン処理により、PALS内への遊走を一時的に阻害したドナーT細胞の移入実験では、阻害作用が有効な時間だけ増殖応答が遅れた。よって、DSTによるTreg細胞増殖応答の誘導メカニズムは、ドナーT細胞が血行性に脾臓に遊走し、ケモカインによりPALS内に引き寄せられ、ホストDCに会合したあと貪食されてドナーMHCを提供することが明らかになってきた。今後は、このTreg細胞がどのTreg細胞亜群(nTreg,iTreg他)に属するかを白血球混合培養試験や特異的なタンパク物質の発現を解析して明らかにしたい。本研究は、初めてDST効果の全貌を明らかにし、臨床応用としてドナーT細胞によりTreg細胞応答や抗体産生を誘導するワクチン開発に重要であると考えられる。目的)ドナー特異的輸血(DST)療法によるinducibleregulatory T-cell (iTreg)誘導のメカニズムをin vivo組織切片レベルとin vitroフローサイトメトリーにより、定性的かつ定量的に解明することである。方法)ACI(RT1AaBa)ラットのヘパリン加新鮮血2mlをLewis(RT1AlBl)ラットに静脈投与し、経時的にリンパ臓器を採取して新鮮凍結切片を作製した。脾臓に関しては、一部をコラゲナーゼ処理によってリンパ球を分離し、フローサイトメトリーによる定量解析を行った。また、採取1時間前に同mol数のBrdUとEdUの混合液を静脈投与し、増殖細胞を標識した。結果と考察)脾臓切片を従来の酵素抗体3重染色法で(ドナーMHC抗原、CD抗原もしくはFoxP3 +IV型collagen +BrdU)免疫染色すると、DST処置後数時間で、多数のドナー細胞(RT1Aa+)が白脾髄のT細胞領域(PALS)に遊走し、そこで、3日目をピークにCD4+ T細胞とTregの増殖応答を示した。ドナー血液はDCをほとんど含まないので、宿主DCがPALSで遊走してきたドナー細胞を貪食して、ドナーMHC抗原を宿主T細胞に提示する、いわゆるindirect pathwayによって抗ドナーT細胞応答を誘発したことが示唆される。さらに、同一切片で蛍光抗体3重染色(CD抗原、FoxP3、IV型collagen)にEdU蛍光染色を含めた4重蛍光観察を行ったところ、各細胞の増殖応答は、BrdU解析結果と同様の細胞動態を示し、世界初で、増殖するTreg細胞のフェノタイプ(FoxP3+CD25+またはFoxP3+CD4+)まで確認できた。フローサイトメトリー解析では、同様に世界初で経時的にFoxP3+細胞の増殖応答を定量化することに成功し、切片上の解析結果と相関した細胞動態を確認した。本年度、新たな解析ツールであるEdUを用いた免疫応答の解析法を確立したことは、iTreg誘導メカニズムを解明するための大きな第一歩である。増殖指標であるBrdUの免疫染色には酸や加熱等のDNA開環処理が必要で、それが蛍光多重染色を阻害するため、これまで増殖するiTregのフェノタイプ解析や樹状細胞(DC)とのクラスター形成の解析は極めて困難であった。

今回、cell cycle研究に使われ、開環処理が不要なthymidine analogueのEdU (ethynyl deoxyuridine)検出法を応用して、増殖細胞を検出可能な多重蛍光染色法を新たに開発した。これにより、iTregの増殖応答に関する組織および細胞レベルの並行解析を世界で初めて行ったことになる。具体的には、iTreg細胞の組織内分布、各種免疫細胞との位置関係や臓器あたりの定量化解析が可能となり、iTreg細胞の誘導メカニズムの一部を解明することができた。現在、EdUを取り入れた多重免疫染色法を新たな免疫応答の解析ツールとして提案するために、従来のBrdU解析との相関性を証明する論文を作成中である。DST療法により誘導されたiTreg細胞の抑制機能については、研究者間で定義が分かれており、学会や論文から正確な情報収集を行いながら、予定通り次年度に解析したいと考えている。次年度の研究計画(ドナー血液成分のiTreg誘導)の一部は、すでに本年度にて研究を行っており、かなりの成果が見込まれている。さらにEdUを含めた4重以上の蛍光多重免疫組織染色は、Treg誘導にかかわらず細胞間相互作用(クラスタリング)を形態学的に解析する上で重要な解析ツールとなり、次年度の研究に飛躍的に貢献できるといえる。次年度は、研究実施計画通り進行する予定である。なお前述のとおり、本研究内容を総括するために、新規性にあたる「EdUを用いた免疫応答の解析法」については先行して論文作成を行い、研究成果の先行を押さえるための準備を行っている。本年度の未達成であるiTreg細胞の機能解析については、情報収集を高め、信憑性のある結論を導きたいと考えている。また、今回の研究成果においてEdUを用いた解析方法の確立が、iTreg誘導メカニズムの解明だけでなく、免疫分野における研究推進が図れる研究方法として大きく貢献できると確信し、次年度のみならず再来年度においても何らかの研究費にて継続を計りたいと考えている。次年度の研究費においては、一部研究内容が前後しているが特に問題なく当初の計画通りに使用していくことを前提としている。本年度は研究期間の初年度にあたり計画遂行のための初期投資額が大きかったが、次年度は初期投資や基盤的な研究を遂行するための経費が大きく削減されるので予定通りであれば予算の範囲内で目的に達成できると考えられる。
高等植物の硝酸への応答を担う転写因子群の解析

高等植物における硝酸シグナルに応答した遺伝子発現誘導を担うNLP転写因子ファミリーの分子的性質と植物体における役割の解析を行った。シロイヌナズナの9つのNLPのうち、発現レベルが低いと考えられた一つを除く残り8つのNLPについて解析を行い、これらすべてが硝酸シグナルによる活性化を受けること、中でもNLP6とNLP7が強く活性化されることを示した。また、NLPの多重変異体を作成して解析を行い、地上部のバイオマスに貢献している主要なNLPはNLP6とNLP7であることを示唆した。硝酸応答のためのシス配列(NRE)に結合するシロイヌナズナのNBP(NRE-binding protein)はNIN様タンパク質(NIN-like protein、NLP)であることを明確にしたことから、本実績報告書ではNBPではなくNLPと表記する。シロイヌナズナには9つのNLPが存在し、これまでにNLP6は硝酸シグナルに応答して活性が誘導される転写因子であることを明らかにしていたが、他のNLPの硝酸シグナル応答性は不明であった。そこでまず、他のNLPの硝酸シグナル応答性を解析した。NLP6はDNA結合ドメインを含まないN末端側領域で硝酸シグナルを受信することを明らかにしていたので、NLP1、2、4、5、7、8、9のN末領域とLexAの融合タンパク質を植物細胞内で発現させるためのコンストラクトを構築した。これらを、LexA結合配列を持つプロモーターの下流にGUS遺伝子を接続して構築したレポーター遺伝子を持つシロイヌナズナの根にパーティクルガンを用いて導入し、硝酸イオンの有無でGUS遺伝子の発現が影響されるかどうかを調べることにより評価した。その結果NLP6と同様に、NLP7, NLP9では明確な硝酸シグナル応答性が見られた。しかし、このアッセイ系では明瞭な結果が得にくいものもあったことから、新たにプロトプラストを用いたアッセイ系も構築しアッセイした結果、NLP1、2、4、5、8も硝酸シグナル応答性を示すことが明らかとなった。各NLPの発現を調べるため、各々のNLP遺伝子プロモーターの下流にGUS遺伝子を接続し、これをシロイヌナズナに導入して形質転換植物を作成した。予備的解析結果から、NLP7プロモーターは葉や根の成熟部位において最も強く機能し、NLP7ともっとも相同性が高いNLP6は成熟部位の維管束でのみ発現しているという結果を得た。個々のNLPの機能解析を行うために、バイオリソースセンターから一重T-DNA変異体の種子を取り寄せて、一重変異体のラインを確立すると同時に、多重変異体の作成を開始した。本課題はNLP転写因子群の分子的性質と生理的役割を明らかにすることを目的としている。本年度はNLP遺伝子群の発現解析と、NLP多重変異体の作成と解析を中心に実施し、生理的役割の解明を目指した。発現解析には、NLPのプロモーター領域の下流にGUS遺伝子を融合させたレポーター遺伝子を発現する形質転換体を用い、葉ではNLP2とNLP7が、根においてはNLP1、NLP4、NLP6、NLP7の発現が強いことを明らかにした。また、機能解析のために、NLPのT-DNA変異体の二重変異体を14種類、3重変異体を10種類、4重変異体を4種類、5重変異体を1種類作出した。一重変異体ではnlp7変異体で地上部新鮮重の減少が見られていたが、nlp6とnlp7の二重変異体にすることでさらに顕著になった。他のnlp変異体とnlp7の組み合わせではnlp7一重変異体と差は見られなかった。また、3重変異体、4重変異体や5重変異体では、nlp6とnlp7の両方の変異を含む組み合わせでnlp6 nlp7二重変異体と同様の表現型となった。このことから、NLP7とNLP6が重複した主要な役割を持ち、硝酸シグナルによる地上部の生長制御に関与していることが明らかとなった。根系の生長についてはnlp6やnlp7とは異なる一重変異体で、マイルドな表現型が見られた。このnlp変異体では、窒素飢餓条件で前培養後、硝酸イオン添加条件で培養すると野生型よりも側根の伸長が良かった。しかし、前培養を硝酸イオン添加条件で行うと差は見られなくなった。昨年度の解析において、このNLPが硝酸イオン非添加時においてもある程度の活性を持つことが示されていたことから、このNLPが窒素飢餓状態で機能して根系の発達に負の作用を起こす可能性が示唆された。植物生理学平成25年度は、各NLPタンパク質の分子的性質の解析と、個々のNLPの植物内での生理的役割を明らかにするための準備段階として、発現部位解析、一重変異体の確立、二重変異体の作成に加え、多重変異体作成への着手を予定していた。発現部位解析と二重変異体の作成は若干遅れているが、発現部位解析については予備的な解析は終了しており、概ね計画通りに進んでいる。

本年度の解析から、ほぼすべてのNLPタンパク質が硝酸シグナル応答性を持着ことが明らかとなり、分子的性質としてはこれらの機能は重複していると考えられた。しかし、レポーターを用いた発現部位の解析から、それぞれのNLPの発現器官や組織が異なっていることも明らかとなり、各NLPは発現部位に依存して重複または異なる生理的役割を果たしていると予想される。そこで、各NLPの役割を解析するために、一重変異体からさらに進めて二重変異体、多重変異体を作成する。予備的解析の段階であるが、根で異常が見られている二重変異体があるので、これについては、発現部位の重なっているものとの多重変異体作成、詳細な表現型の解析を行って行く。他の二重、多重変異体についても窒素に関する表現型の解析を進める。器官や組織特異的に異常が観察された変異体については、その部分を用いてマイクロアレイ解析を実施し、その異常の原因となる遺伝子を探索する。また、NLPファミリー全体の機能が抑制されている35S-NLP6-SUPRD形質転換植物の硝酸シグナル応答のDNAマイクロアレイ解析のデータが利用可能となったので、このデータから明らかとなるNLPの標的遺伝子について公共データベースを利用して器官や組織特異性を調べることでも、nlp変異体の部位特異的な異常に関与している標的遺伝子を探索する。H25年8月に遺伝子組み換え植物栽培用の温室が故障したため、二重変異体の作成や発現解析用形質転換体の作成が遅れた。H26年度の主要な実験は、H25年度に引き続きNLP多重変異体の作成、変異体の成長解析、トランスクリプトーム解析による標的の候補遺伝子の探索を予定している。多重変異体の作成と成長解析においては、植物の栽培やPCR法による遺伝子型の判定、当該NLP遺伝子の発現解析を行う。標的遺伝子の探索においては、マイクロアレイ解析を利用する予定である。したがって、植物の培養と分子生物学実験のために消耗品(分子生物学試薬とプラスチック消耗品)と受託費用(シーケンス解析とオリゴヌクレオチド合成)を必要とする。さらに、マイクロアレイによる発現解析には高額の専用の試薬が必要であるので、これらの購入に次年度使用額を充てる予定である
RNAヘリケースAによるコアクチベーター機能活性化の分子機構の解明

本研究により以下の成果が得られ、RNAヘリケースAをはじめとする転写コアクチベーターの機能の分子機構、およびそれらの生物学的・医学的意義の一端を明らかにすることができた。(2)蛋白質糖化の転写因子Fosの活性化経路を報告(FASEB J.1999)。(3)血球系転写因子GATA1の転写活性化機構におけるCBPの重要性(PNAS 1998)。(5)RHAの最小転写活性化領域の同定と同領域とATPase領域のcooperativity (投稿中)。(6)RHAの核内輸送の分子機構(投稿中)(7)新潟大学辻省次教授との共同研究によりポリグルタミン病の神経変性への転写コファクターTAF135の関与を明らかにした(Nature Genetics誌revision中)(8)転写統合装置レベルでの転写因子β-cateninによる細胞癌化モデルの提唱(Nature誌revision中)本研究により以下の成果が得られ、RNAヘリケースAをはじめとする転写コアクチベーターの機能の分子機構、およびそれらの生物学的・医学的意義の一端を明らかにすることができた。(6)RHAの核内輸送の分子機構(投稿中)(7)新潟大学辻省次教授との共同研究によりポリグルタミン病の神経変性への転写コファクターTAF135の関与を明らかにした(Nature Genetics誌revision中)(8)転写統合装置レベルでの転写因子β-cateninによる細胞癌化モデルの提唱(Nature誌revision中)(本年度明らかにした知見)#1.乳癌原因遺伝子産物BRCA1がRNAヘリケースA(RHA)と複合体を形成し,血管平滑筋を始め多くの細胞の細胞増殖のkey moleculeであるp21の発現を介して乳癌発症の成因となる可能性の呈示(本年度明らかにした知見)(未発表・投稿中)1. RHAがそのNTP結合能/NTPase/helicase活性依存的に細胞内局在を種々の刺激に応答して変化させる.2. RHAはその一分子のなかに全く異なった細胞内局在(鏡面像)を示す機能的ドメインを有す.3.それぞれの機能ドメインが,その機能・細胞内局在に応じた因子群と複合体を形成している.4. 1-3よりRHAは2つの機能的ドメインをその細胞内局在において使い分けている.申請者はRHAがCBPのコアクチベーター能を調節する際に,RHAの持つNTP結合能/NTPase/helicase活性に依存的であることを既に報告していた.しかしながら,その詳細な分子機構に関しては不明であった.本研究により,RHAが分子生物モーターとして転写を始めとする遺伝子発現調節に関わっている可能性が示唆された.今後,より詳細な解析を行い,この可能性を検証したい.本研究により以下の成果が得られ、RNAヘリケースAをはじめとする転写コアクチベーター機能の分子機構、およびそれらの生物学的・医学的意義の一端を明らかにすることができた。(2)蛋白質糖化の転写因子Fosの活性化経路を報告(FASEBJ.1999)。(5)RHAの最小転写活性化領域の同定と同領域とATPase領域のcooperativity(投稿中)。(6)RHAの核内輸送の分子機構(投稿中)。(7)新潟大学辻省次教授との共同研究によりポリグルタミン病の神経変性への転写コファクターTAF135の関与を明らかにした(Nature Genetics誌revision中)。(8)転写統合装置レベルでの転写因子β-cateninによる細胞癌化モデルの提唱(Nature誌revision中)。
若年性歯周炎患者好中球の情報伝達機構異常に関する分子生物学的研究

本研究では、若年性歯周炎患者にみられる好中球走化能の低下のメカニズムを細胞内シグナル伝達系を中心に捉えた。好中球の走化能の異常は遺伝的拘束性をもって全身的に現れるもの、歯周病病巣局所の感染細菌との相互作用の結果、局所的に異常が現れるものを想定した。始めに歯周病の進行と末梢血好中球走化能との関りを新しい臨床パラメーターを導入して検討した。その結果、1)末梢血好中球走化能の低下と他の好中球機能異常との組み合わせ、2)走化能は正常で、Actinobacillus actinomycetemcomitans(Aa)の感染があるものに分けられた。1)は、遺伝的拘束性を持ったもの、2)は病巣局所におけるAaと好中球の相互作用の結果が、歯周病の発症、進行に関わっているものと考えられる。そこで、遺伝的拘束性のある末梢血好中球の異常について細胞内刺激伝達系から、およびAaの産生するleukotoxinによる白血球細胞の刺激伝達系への影響を調べた。主な研究課題は次のものである。1.進行性歯周病における好中球走化能の役割。2.若年層歯周病における好中球走化能低下と細胞内シグナル伝達系i)若年性歯周炎患者由来好中球のprotein kinaseC活性についてii)走化性因子刺激による好中球の細胞内カルシウムイオン濃度の変動iii)早期発症性歯周炎とCD18/11分子の発現異常3.Aaの産生するleukotoxinによる白血球障害機序。protein kinaseC活性は走化能の低下した若年性歯周炎患者好中球で低かった。CD18/11分子の発現異常は構造遺伝子の異常としては捉えられなかった。leukotoxinによる白血球障害機序はカルシウムイオン依存性蛋白燐酸化の亢進として説明できる。同じように早期発症型歯周炎を有する家族内の患者でもその病態は異なり、歯周病の病態の多様性が明らかになってきている。この病態の多様性は、宿主の細胞機能、生物学的活性物質、さらにはそれをコードする遺伝子を捉える必要がある。(1)若年性歯周炎患者の診断・選択1.FMLPに対する走化能が健常者のそれと比較して明らかに低下している早期発症型歯周炎患者7名を見い出した。その内、1名は全顎型若年性歯周炎、2名は限局型若年性歯周炎(LJP)、3名は急速進行性歯周炎、他の1名はLJP患者の一人の兄である。2.LJPの中の一人の好中球はFMLP刺激によっても、接着分子LFA-1が充分に発現していなかった。そこで、この患者のB-cellをEB-virusでtransformしcell lineを作った。この、cell line化したB-cellはProtein kinase C(PKC)の刺激剤であるPMAによってもLFA-1を充分に発現しなかった。(2)患者好中球のCキナーゼ系細胞内情報伝達機構の解析1.FMLPに対する走化能が低下している好中球ではPKCの活性が低い傾向があった。

また、FMLPに対する走化能が低下している好中球では、PMA刺激によるPKCの細胞膜への移動が少なかった。2.PKC分子そのものの量を二次抗体に免疫学的手法で測定したが、感度の問題から測定誤差が大きく、方法の改良が必要である。3.RT-PCR法によって好中球から抽出した全mRNAからmRNAを増幅することができた。FMLPに対する走化能とPKCのmRNA発現量との関係については、まだはっきりした傾向を見い出せない。(3)好中球のAキナーゼ系細胞内情報伝達機構の解析1.FMLPに対する走化能が低下している好中球を、cAMP代謝阻害剤であるIBMXで処理することによって、FMLPに対する走化能が回復する傾向をしめした。2.FMLPに対する走化能が正常な好中球を、IBMXおよびFMLPで処理すると、IBMX単独で処理した場合よりも大きなcAMPレベルの上昇が起こることを確認した。平成6年度は新たな、早期発症型歯周炎患者について検討した。好中球走化能の異常が歯周病の発症・進行に深く関っている患者の検出には、新たな臨床パラメーター、Rate of bone loss(RBL)を考案して(4lth JADR.Dec 10,1994発表)、多因子による解析を行って抽出した。その中に、これまでになく、著しい走化能の低下を伴う後若年性歯周炎患者を見出した(1995年度、春季歯周病学会発表予定)。この患者については、好中球膜上のCD18/11分子の発現、EB virus transformed B cell lineを確立した上で、細胞凝集活性を測定した。その凝集様態はこれまでに報告した好中球走化能低下を伴う細胞のものと、質的に異なっていた。さらに、細胞内シグナル伝達系であり、CD18/11分子の細胞内ドメインの燐酸化に関っている、protein kinase C活性を測定したが、健常者由来正常好中球の活性に差は無かった。一方、若年性歯周炎患者の好中球についてサイクリックAMP代謝の異常が報告されていることから、走化性因子刺激後に好中球細胞内のサイクリックAMP濃度と、細胞内カルシウムイオン濃度について検討した。その結果、細胞内カルシウムイオン濃度はサイクリックAMP濃度に影響されない。走化性因子、fMLPは好中球細胞内カルシウムイオン濃度を一過性に上昇させるとともに、その後の細胞内カルシウムイオン濃度の減少にも関っていることが示唆された。また、Actinobacillus actinomycetemcomitans(Aa)の産生するleukotoxinによる白血球障害機序を、HL-60細胞を用いて検討した。leukotoxinによる白血球障害機序は分子量約110kDaの細胞内蛋白質のカルシウムイオン依存性タンパク燐酸化の亢進として説明できた。細胞内シグナル伝達は多くの経路が複雑に関連し、cross talkして、互いに一見矛盾した結果がえられる。全体像を正確に把握するために、今後もそれぞれの系についての研究成果を積み重ねていく必要がある。
機能的スクリーニング法の確立による小胞体ストレス制御因子の網羅的探索・機能解析

【目的】小胞体は、細胞内カルシウム濃度調節・蛋白質の修飾により細胞機能を維持していることが知られていたが、最近、"小胞体ストレス"と呼ばれるストレス応答シグナルの発信器官としての重要性が示されている。また、小胞体ストレスによる細胞死の経路は、疾患(癌、糖尿病、神経変性症)の病態との関係からも注目されている。以上より、細胞レベルでゲノムワイドに小胞体ストレスシグナル経路の制御分子を探索・同定することにより、神経変性疾患、特にアルツハイマー病の治療薬開発の基盤となる知見を得ることが可能となると考えられる。本研究では、特に、小胞体ストレスシグナル分子によるガンマ-セクレターゼ活性の制御機構を解明した。また、スモールプール脳cDNAライブラリから小胞体ストレスシグナルの制御因子、特にガンマ-セクレターゼ活性制御因子の同定法を確立した。【研究実績】1.ガンマ-セクレターゼ活性制御因子の同定:転写因子ATF4によるプレセニリン-1蛋白質の発現増加・成熟化を明らかにした。2.1の機構は、小胞体ストレスシグナルのみならずアミノ酸飢餓(ロイシン・リシン欠乏)によるGCN2キナーゼ活性化によるシグナルにても誘導されることを明らかにした。3.2の機構により、ガンマ-セクレターゼが活性化されることをアミロイド-β産生とNotchシグナルのターゲット遺伝子発現上昇から明らかにした。4.ATF4結合領域の同定:ヒトプレセニリン-1遺伝子発現調節領域におけるATF4結合領域をChip-IT法、ゲルシフト法、ルシフェラーゼ法にて明らかにした。5.4のルシフェラーゼ法に使用したキメラ遺伝子をスクリーニング用プローブとして構築した。【目的】小胞体は、細胞内カルシウム濃度調節・蛋白質の修飾により細胞機能を維持しているが、最近、"小胞体ストレス"と呼ばれるストレス応答シグナルの発信器官として、また、小胞体ストレスによる細胞死の経路は、疾患(癌、糖尿病、神経変性症)の病態との関係から注目されている。すなわち、小胞体ストレス制御因子を同定することにより、治療薬開発の基盤となる知見が得られると考えられる。そこで、細胞レベルでゲノムワイドに小胞体ストレス応答経路の制御分子を探索・同定するため、ガンマ-セクレターゼ活性化プローブの細胞内局在を指標に、機能的スクリーニング法を確立する。ガンマ-セクレターゼ活性と小胞体ストレスとの関連は不明だが、小胞体ストレス応答分子にてその発現が制御されうる知見を得ており、スクリーニングの指標として使う。【研究実績】<ガンマ-セクレターゼ活性化プローブ>1.プローブの構築:ガンマ-セクレターゼの切断の特異性から、膜貫通領域と蛍光蛋白質、さらに核移行シグナルを含むキメラ遺伝子を構築した。さらに、テトラサイクリン誘導ベクターに組み込み、発現誘導を証明した。2.プローブの特異性:(a)プローブの細胞内発現にて蛍光蛋白質が細胞核内へ移行することを明らかにした。(b)ガンマ-セクレターゼ活性阻害剤の投与により、プローブの細胞核内移行の阻害を明らかにした。(c)ガンマ-セクレターゼ活性を示さないプレセニリン-1と-2のダブルノックアウト繊維芽細胞にてプローブの細胞核内移行の阻害を明らかにした。
加齢に伴うH(Hoffmann)反射の考察-筋疲労、筋収縮様式、視覚の影響

前年度の研究成果を踏え、さらにヒラメ筋H反射の変動を調べた。H反射(脊髄反射)の変動を調べることは、ヒトの運動制御の働き(神経筋調整)を解明する手がかりとなる。たとえば姿勢の変化は脊髄反射を変動させる。さらに遠隔筋収縮が反射を変動させ、また同一筋収縮が反射を変動させる。そしてこれらの運動制御は加齢により異なることが明らかにされている。H反射の変動メカニズムはシナプス前抑制の働きと指摘されている。シナプス前抑制とは、筋内の感覚受容器から伝達される感覚神経(Ia線維)が脊髄において単シナプスで同一筋の運動神経を興奮させる際、Ia線維の終端において他シナプスの働きが加わり伝達物質が抑制されることである。本研究の目的は、シナプス前抑制の働きに着目し、上肢筋収縮を用いることで反射を促通させるメカニズムを解明することであった。遠隔筋収縮により下肢脊髄反射が促通することをJendrassik maneuver(JM)と呼ぶ。実験では若年者13名(22.1±1.0歳)を用いて1msec矩形波の電気刺激を膝窩から後脛骨神経に送り、表面筋電図に表れるヒラメ筋反射(H反射)の変動値を測定した。刺激量はM波の閾値1.1倍を用いた。実験は31度の傾斜をつけた滑走背もたれの上に被験者は仰臥位になり、プラットフォームおよびカフレイズ(腓腹筋収縮)台に両足をのせた。足関節は背屈位ゼロ度であった。そして被験者は安静とテニスボールを両手で最大に握ることを無作為に行い、その間H反射を測定した。結果は、すべての被験者は安静に比べJM時において有意に反射量を促通させた。カフレイズ台ではプラットフォーム上よりH波値は少ないが、JMによりその値を多く促通させた。前年度の研究成果から重力、同一筋収縮、または重心動揺においてH波の変動は異なり、そしてJMにより促通値もする。このことはシナプス前抑制がJMにより脱抑制されたのではないかと示唆された。しかしこれらがない伏臥位ではJMによる促通がみられず、つまりシナプス前抑制がほとんどない状態と言え、そのためJMによる脱抑制がなく、促通がなかったのではないかと示唆された。これらの結果は今後加齢に伴う運動制御の変化を調べる手がかりとなった。本研究では、高齢者12名(71.3±5.6)と若年者12名(24.6±2.2)の電気刺激誘発による表面節電図に見られるヒラメ筋脊髄反射(H反射)の変動の特徴について検査した。検査では、伏臥位と直立位の違った姿勢において最大H波および最大M波の振幅幅値に着目した。結果について、若年群は最大H波および最大M波の両振幅幅値が高齢群に比べ有意に高かった。さらに、若年群では直立位の最大H波および最大M波の振幅幅値が伏臥位に比べそれぞれ有意に減少した。一方、高齢群は双方の姿勢においてそれぞれの振幅幅値に有意な変動が見られなかった。このことから、若年群に比べ高齢群の最大M波値の減少は加齢に伴う運動ニューロンの減少と推測できる。また若年群が伏臥位に比べ直立位においてH反射値を減少させたのに対し高齢群がその値を変動させなかった。このことから、高齢群は脊髄反射において高位中枢神経などによる抑制が少なく、つまり重心動揺の影響を受けているのではないかと推測できる。次に、テニスボールを両手でできるだけ強く握った状態の条件を加え両群間において上記と同じ実験を行った。結果について、ボールを握った状態において高齢群と若年群ではH反射値の変動が姿勢により違った。たとえば高齢群では伏臥位においてH反射値がボールを握ると安静時に比べ有意に高くなった。しかし直立位ではその有意差が見られなかった。逆に、若年群では直立位においてボールを握ることによりH反射値に有意な増加が見られたが、伏臥位では見られなかった。本研究の結果から両群間では脊髄反射において運動ニューロンの興奮の変動性が異なることを示唆している。なお、最初の本研究成果は第7回日本運動生理学会(開催東京大学)に於いてすでに発表し、また二つ目の研究成果については第47回アメリカスポーツ医学会(ACSM)(インディアナポリス、USA)に於いて発表予定である。