hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
植物の環境応答に伴うカタラーゼの発現とペルオキシゾームへの輸送調節

本研究では、植物カタラーゼのペルオキシゾームへのユニークな輸送機構に着目し、環境に応答してカタラーゼの遺伝子発現がどのように調節され、どのようにペルオキシゾームへと輸送されるのか、そのダイナミックな分子機構について明らかにすることを目的とした。以前の研究で、カボチャのカタラーゼのC末端側から上流-13から-11位のアミノ酸QKLが、内部PTS1様配列として、ペルオキシゾームへの輸送に必要なシグナルである可能性が示された。また、本カタラーゼが弱いながらPTS1レセプターであるPex5Pと結合することが、酵母のtwo-hybrid系を用いた研究により示唆された。これらのことから、カタラーゼのペルオキシゾームへの輸送はPTS1タイプによって輸送されると考えた。しかし、Pex5Pの発現を抑制しPTS1系の輸送が阻害された形質転換タバコ細胞でも、カタラーゼのペルオキシゾームへの輸送は阻害されなかった。また、PTS2レセプターであるPex7Pの発現を抑えた形質転換細胞でも、カタラーゼのペルオキシゾームへの輸送は阻害されなかった。これらの結果から、カタラーゼのペルオキシゾームへの輸送には、Pex5P、Pex7Pは必要でないことが示唆された。さらに、Pex10PやPex12P、また、Pex5Pとペルオキシゾーム膜上で結合するペルオキシンPex14Pに着目し、これらのペルオキシンがカタラーゼのペルオキシゾームへの輸送に関わるかどうか調べた。シロイヌナズナのped2(Pex14P)変異株はペルオキシゾームターゲティングシグナルPTS1およびPTS2による輸送が一部阻害される。そこで、ped2(Pex14P)変異株と、GFP-カタラーゼ融合遺伝子を発現している形質転換株をかけ合わせ、ped2(Pex14P)ホモ変異株を作成し、カタラーゼの細胞内局在を調べた。その結果、カタラーゼのペルオキシゾームへの輸送にPex14Pが必要であることが示唆された。一方、タバコ細胞のプロトプラストに、RNA1、GFP融合遺伝子、RFP融合遺伝子の3つを同時に一過的に導入発現させる系を開発し、RNA1発現株で、カタラーゼとPTS1タンパク質の輸送を同時に解析できる系を確立した。最終的に、植物のカタラーゼは、典型的なPTS1輸送とは異なる特殊な機構によりペルオキシゾームへ輸送されることが示唆された。カタラーゼは、ペルオキシゾームに大量に集積する酵素にもかかわらず、その遺伝子発現の調節機構や、ペルオキシゾームへの輸送機構についてはほとんどわかっていない。これまでに、ペルオキシゾームタンパク質の多くは、C末端に認められるSKLモチーフ(PTS1)、または、N末端の延長ペプチド(PTS2)が輸送シグナルとなって、ペルオキシゾームへ輸送されることがわかっている。しかし、カタラーゼのペルオキシゾームへの輸送シグナルは未だ不明確である。本研究では、植物カタラーゼのペルオキシゾームへのユニークな輸送シグナルを明確にするとともに、環境に応答して、カタラーゼの遺伝子発現がどのように調節され、どのようにペルオキシゾームへと輸送されるのか、そのダイナミックな分子機構について明らかにすることを目的とする。本年度は、ペルオキシゾームのマトリクスタンパク質の輸送に関わるペルオキシンPex5p、Pex7p、Pex10p、Pex12pに着目し、カタラーゼのペルオキシゾームへの輸送にどのように関わっているかを解析した。カボチャのカタラーゼのペルオキシゾームへの輸送シグナルについて調べた結果、C末端側から上流の-13--11位のアミノ酸QKLが、内部PTS1様配列として、ペルオキシゾームへの輸送に必要なシグナルである可能性が示された。また、本カタラーゼが弱いながらPTS1レセプターであるPex5pと結合することが、酵母のtwo-hybrid系を用いた研究により示唆された。これらのことから、カタラーゼのペルオキシゾームへの輸送はPTS1タイプによって輸送されると考えたが、Pex5pの発現を抑制しPTS1の輸送が阻害された形質転換タバコ細胞でも、カタラーゼのペルオキシゾームへの輸送は阻害されなかった。また、Pex7pの発現を有意に抑えた形質転換細胞でも、カタラーゼのペルオキシゾームへの輸送は阻害されなかった。一方、Pex10p、およびPex12pの発現を抑制させた形質転換タバコ細胞では、カタラーゼのペルオキシゾームへの輸送が阻害された。これらの結果から、カタラーゼのペルオキシゾームへの輸送には、Pex10p、Pex12pは必要であるが、Pex5p、Pex7pは必要でないことが示唆された。

しかし、Pex5Pの発現を抑制しPTS1系の輸送が阻害された形質転換タバコ細胞でも、カタラーゼのペルオキシゾームへの輸送は阻害されなかった。また、PTS2レセプターであるPex7Pの発現を抑えた形質転換細胞でも、カタラーゼのペルオキシゾームへの輸送は阻害されなかった。これらの結果から、カタラーゼのペルオキシゾームへの輸送には、Pex5P、Pex7Pは必要でないことが示唆された。さらに、Pex10PやPex12P、また、Pex5Pとペルオキシゾーム膜上で結合するペルオキシンPex14Pに着目し、これらのペルオキシンがカタラーゼのペルオキシゾームへの輸送に関わるかどうか調べた。シロイヌナズナのped2(Pex14P)変異株はペルオキシゾームターゲティングシグナルPTS1およびPTS2による輸送が一部阻害される。そこで、ped2(Pex14P)変異株と、GFP-カタラーゼ融合遺伝子を発現している形質転換株をかけ合わせ、ped2(Pex14P)ホモ変異株を作成し、カタラーゼの細胞内局在を調べた。その結果、カタラーゼのペルオキシゾームへの輸送にPex14Pが必要であることが示唆された。一方、タバコ細胞のプロトプラストに、RNA1、GFP融合遺伝子、RFP融合遺伝子の3つを同時に一過的に導入発現させる系を開発し、RNA1発現株で、カタラーゼとPTS1タンパク質の輸送を同時に解析できる系を確立した。最終的に、植物のカタラーゼは、典型的なPTS1輸送とは異なる特殊な機構によりペルオキシゾームへ輸送されることが示唆された。
P型イオンポンプの無細胞タンパク質合成系を用いた発現法の開発と多量体形成機構

Na/K-ATPaseは、分子量約10万の触媒鎖(α鎖)と糖タンパク質のβ鎖からなる膜タンパク質で、本酵素の機能発現には、αβプロトマーからなるオリゴマー構造((αβ)_<2n>構造)の形成が非常に重要であることが明らかにされている。本研究では、タンパク質の発現をコントロールしやすい無細胞タンパク質合成系を用いることで、Na/K-ATPase合成過程におけるαβプロトマー形成やオリゴマー構造の構築を詳細に追跡することが可能になると考え、小麦胚芽抽出液を用いたタンパク質合成系によるNa/K-ATPaseの機能的発現系の確立を目指して研究を行った。昨年度の研究過程で作成したプラスミッドベクターを用いて、His-tag/Myc-tag/Flag-tagや蛍光タンパク質をN-末端に付加したNa/K-ATPaseα鎖・β鎖タンパク質の合成を行った。合成反応後の試料をSDS-PAGEで解析したところ、CBB染色で合成が容易に検出できる量のα鎖・β鎖タンパク質を合成することができた。このタンパク質のみがN-末端のタグを認識する抗体と反応することから、非常に均一なタンパク質が合成できていることが明らかになった。しかし、α鎖・β鎖面タンパク質を同時に合成すると分子量の大きなα鎖の合成量が大きく減少した。また、膜分画を添加すると、混入するRNaseによるmRNAの分解を完全に阻害することが困難であることから、タンパク質の合成量は著しく減少した。合成されたNa/K-ATPaseを用いて、特異的阻害剤ウワバインで阻害可能なATP加水分解活性やATPase活性の部分反応の検出を試みたが、機能的発現を確認することはできなかった。また、N-末端のタグを認識する抗体を用いた共沈殿実験や蛍光エネルギー移動による、αβ複合体の形成についても検討したが、α鎖・β鎖間相互作用を示唆する結果を得ることはできなかった。Na/K-ATPaseは分子量約10万の触媒鎖(α鎖)と糖タンパク質のβ鎖からなる膜タンパク質で、ATPの加水分解エネルギーを用いてNa^+を細胞外へK^+を細胞内へ対向輸送するイオンポンプである。本酵素が形成する細胞内外のイオン濃度勾配は、細胞の生存に必須であり、ATP加水分解反応中にリン酸化中間体(EP)を形成することからP型ATPaseに分類されている。Na/K-ATPaseの機能発現には、αβプロトマーからなるオリゴマー構造((αβ)_<2n>構造)の形成が非常に重要である。そこで本研究においては、タンパク質合成過程における本酵素のαβプロトマー形成やオリゴマー構造の構築を詳細に追跡するために、タンパク質の発現をコントロールしやすい無細胞タンパク質合成系を利用した、Na/K-ATPaseの機能的発現系の構築を目指し研究を行った。現在までに、His-tag/Myc-tag/Flag-tagをN-末端に付加したNa/K-ATPaseα鎖・β鎖タンパク質を無細胞タンパク質合成系を用いて発現するために必要なプラスミッドベクターを作成することができた。また、サブユニット間・αβプロトマー間の相互作用を蛍光エネルギー移動を用いて解析するために、蛍光タンパク質EGFP/YFP/CFPとの融合タンパク質としてNa/K-ATPaseα鎖・β鎖タンパク質を発現するためのベクターの作成を行った。これらベクターDNAを鋳型として用いmRNAの合成を行った後に、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成システムによるタンパク質の合成を検討した。合成反応後の試料をSDS-PAGEおよび免疫ブロット法で解析したところ、N-末端にこれらのtag配列を含むNa/K-ATPaseα鎖・β鎖タンパク質の発現を確認することができた。これら合成されたα鎖・β鎖タンパク質を用いてATPase活性について検討したが、Na/K-ATPaseの特異的阻害剤ウワバインで阻害可能なATP加水分解活性は検出されなかった。膜分画や可溶化剤・リン脂質の添加によるNa/K-ATPase機能的発現及びにサブユニット間・αβプロトマー間の相互作用ついて現在研究を進めている。

また、N-末端のタグを認識する抗体を用いた共沈殿実験や蛍光エネルギー移動による、αβ複合体の形成についても検討したが、α鎖・β鎖間相互作用を示唆する結果を得ることはできなかった。
肝及び肝癌内銅沈着が磁気共鳴診断における信号強度に与える影響の研究

肝組織内に高度の銅が沈着する先天性代謝異常をもつLong-Evans witha cinnamon coat colorラット(以下LEC rat)と硫酸銅をニトリノ三酢酸を用いてキレートすることによって急性毒性を軽減した銅液を腹腔内に連日投与または隔日投与し肝組織内銅を著明に上昇させたウイスター系ラット(以下Wis rat)の肝実質のCT値を測定した。またCT撮像直後に屠殺し肝標本を作成し、肝組織内銅量、各種組織染色を所見と比較検討した。原子吸光法によって測定された組織内銅濃度とCT値には有意の相関は認められず、肝組織内オルセイン陽性顆粒と肝CT値に強い相関が認められた。またほぼ同定度の肝組織内銅濃度を持つLEC ratと銅負荷Wis ratとの肝CT値の比較では後者のそれが有意に高く、オルセイン染色所見ではLEC rat肝細胞に陽性顆粒はほとんど認められず、Wis rat肝には大量に認められた。以上より組織内金属としての銅は、生理的および病的に生体内に存在し得る濃度では、CT値にはほとんど影響を与えることがないこと、及びオルセイン染色で陽性顆粒として観察されるライソゾーン内に凝集した銅結合蛋白(メタロチオネイン)が局所的電子密度上昇の原因となりCT値を上昇させることが考察された。LEC ratとWis ratとの比較から、細胞質中の可溶性メタロチオネインは大量に存在したとしても肝CT値に影響を与えないことも推定された。以上の結果は、理論式のみで推定されていた肝組織内銅のCT値に与える効果と合致するものであった。本実験は、肝組織内金属銅と銅結合蛋白のCT値に与える影響を動物にて分離して考察した最初の実験と思われ、一部の肝細胞癌診断の上で重要な所見と考えられる周囲肝に比較して高吸収値を示す例の原因あるいはヒトの銅代謝異常疾患として代表的な疾患であるWilson病でみられる病期による様々な肝CT所見の解釈の上で重要な知見が得られたと考えられる。1.LECラットを2群にわけて購入,飼育している。平成4年1月に購入した群(A群;現在13匹)は16ケ月令に達し,肝細胞癌合併期に入っている。平成4年6月に購入した群(B群;現在10匹)は10ケ月令に達し,慢性肝炎期に入っている。2.上記2群のラット数例に対し1.5T超電導MRIを使用してMRI画像を得た。A群のラットでは正常肝と異なる信号強度を呈す腫瘤性病変を肝内に認めた。この腫瘤は病理組織学的に肝細胞癌と確認されている。B群のラットからもMRI画像を得ているが,明瞭な腫瘤性病変は認められていない。A群とB群との肝臓の信号強度に関しては異なるとの印象を受けているが,例数が少なく今後の検討が必要と思われた。3.上記の2群のLECラットに加え,normal controlとしてウィスター系ラット(現在5匹)についてもMRI画像を得ており,A,B群と同様に病理組織学的検討並びに原子吸光法にて銅濃度を測定する予定である。4.研究計画を提出した後に,LECラットの肝臓に銅と同じように正常よりも過度の鉄が沈着を来す事実を知り,この過度の鉄がMRI画像に及ぼす影響を知るために,鉄に対しても染色ならびに原子吸光法にて濃度を検討する事にした。

5.現在各群のラットに対しMRI画像を得た後に,銅及び鉄の沈着につき検討を加えている段階である。肝,肝癌部,筋肉組織等の組織間の信号強度の比を算出し,また原子吸光法にての絶対値を検討し銅が与える信号強度への影響を明らかにしていく方針である。肝組織内に高度の銅が沈着する先天性代謝異常をもつLong-Evans witha cinnamon coat colorラット(以下LEC-rat)と硫酸銅をニトリノ三酢酸を用いてキレートすることによって急性毒性を軽減した銅液を腹腔内に連日投与または隔日投与し肝組織内銅を著明に上昇させたウイスター系ラット(以下Wis rat)の肝実質のCT値を測定した.またCT撮像直後に屠殺し肝標本を作成し,肝組織内銅量,各種組織染色を施行しその所見と比較検討した.原子吸光法によって測定された組織内銅濃度とCT値には有意の相関は認められず,肝組織内オルセイン陽性顆粒と肝CT値に強い相関が認められた.またほぼ同定度の肝組織内銅濃度を持つLEC ratと銅負荷Wis ratとの肝CT値の比較では後者のそれが有意に高く,オルセイン染色所見ではLEC rat肝細胞に陽性顆粒はほとんど認められず,Wis rat肝には大量に認められた.以上より組織内金属としての銅は,生理的および病的に生体内に存在し得る濃度では,CT値にほとんど影響を与えることがないこと,及びオルセイン染色で陽性顆粒として観察されるライソゾーム内に凝集した銅結合蛋白(メタロチオネイン)が局所的電子密度上昇の原因となりCT値を上昇させることが考察された.LEC ratとWis ratとの比較から,細胞質中の可溶性メタロチオネインは大量に存在したとしても肝CT値に影響を与えないことも推定された.以上の結果は,理論式のみで推定されていた肝組織内銅のCT値に与える効果と合致するものであった.本実験は,肝組織内金属銅と銅結合蛋白のCT値に与える影響を動物にて分離して考察した最初の実験と思われ,一部の肝細胞癌診断の上で重要な所見と考えられる周囲肝に比較して高吸収値を示す例の原因あるいはヒトの銅代謝異常疾患として代表的な疾患であるWilson病でみられる病期による様々な肝CT所見の解釈の上で重要な知見が得られたと考えられる.
常磁性内包フラーレン化学の新展開

本研究では、常磁性分子であるLa内包フラーレンとN@C_<60>に着目して研究を行った。これらは、ナノ磁性体の構築素子として多分野から注目を集める一方で、その合成・単離の困難さからその構造や物性はほとんど明らかにされていない。前年度までに、申請者は金属内包フラーレンの発見当初より抽出が困難であったLa@C_<72>、La@C_<74>、La@C_<80>を誘導体として抽出・単離し、構造解析及び物性解明に成功している。また、N@C_<60>については、大量合成法の確立に成功し、単離とLFP測定を行い、特異的な光物性を明らかにした。本年度は、このような未開拓であった常磁性内包フラーレンの更なる構造決定と物性解明を目的とするとともに、機能性材料の開発を目指し、以下の2つについて研究を行った。1.La@C_<82>の第3の異性体の抽出と構造解析金属内包フラーレンにおいて、La@C_<82>は特異的に有機溶媒中へと抽出されることから活発に研究されてきた化学種である。これまでに2つの異性体が報告され、最近では化学修飾や超分子化学を用いたLa@C_<82>の機能化も報告されている。一方で、理論計算によりLa@C_<82>には更に異性体が存在する可能性が示唆されていた。申請者はLa@C_<82>の新たな異性体を誘導体として抽出・単離することに成功し、単結晶X線構造解析によりその構造を明らかにした。2.ナノロッドの創製を目指した単結晶の作成と構造・物性解明フラーレンの自己組織化により生成するナノロッドやナノ結晶は、バルク固体や溶液状態では発現しない構造や物性が期待され、フラーレンを用いた機能性材料創製において重要な役割を果たすと考えられる。しかしながら、それらの結晶構造や物性はほとんど解明されていない。本年度、申請者は内包フラーレンもしくは誘導体と有機化合物との共結晶を作成し、単結晶X線構造解祈によりそれらの結晶構造を解明した。本研究では、スピンを炭素ケージ上に有するLa内包フラーレンと内包原子に有するN@C_<60>に着目して研究を行っている。前年度までに、申請者は金属内包フラーレンの発見当初より抽出が困難であるとされていたLa@C_<74>を誘導体として抽出・単離し、構造解析及び物性解明に成功している。また、窒素内包フラーレンについては、研究を遂行するにあたり解決すべき課題であるN@C_<60>の大量合成法の確立に成功している。本年度は、これら未開拓であった常磁性内包フラーレンの構造決定と物性解明を目的として、以下の2つについて研究を行った。1,La@C_<72>誘導体の単離及び構造解析金属内包フラーレンの発見当初より抽出が困難であるとされていたLa@C_<74>と同様にLa@C_<72>もMissing metallofullereneとして未だに抽出・単離された報告例はない。特にLa@C_<72>は、理論計算により孤立五員環則を満たさない(non-IPR)構造が示唆されていることからその構造は大変興味深い。また、non-IPR構造を有するフラーレンは、IPR構造のものとは物性が異なることが示唆されており、構造だけではなく物性の点からも注目される。本年度、申請者はLa@C_<72>を誘導体として抽出・単離し、その単結晶X線構造解析と物性解明に成功した。2,N@C_<60>の構造解析と物性解明N@C_<60>は量子コンピューターの基本素子としての応用が期待される一方で、その絶対量の少なさからN@C_<60>の物性はほとんど解明されておらず、応用化に向けた大量合成法の確立と物性解明は課題である。本年度、申請者はプラズマ放電法によるN@C_<60>の大量合成と濃縮を行うとともにEPRなどを用いた特性解明を行なった。前年度までに、申請者は金属内包フラーレンの発見当初より抽出が困難であるとされていたLa@C_<72>、La@C_<74>を誘導体として抽出・単離し、構造解析及び物性解明に成功している。また、窒素内包フラーレンについては、研究を遂行するにあたり解決すべき課題であるN@C_<60>の大量合成法の確立に成功し、HPLCによる濃縮とEPR測定を行った。1.La@C_<80>の抽出と構造解析高次フラーレンにおいて、孤立五員環則を満たす構造は複数個考えられる。

孤立五員環則を満たす構造異性体の数は、C_<70>,C_<72>,C_<74>で1つ、C_<76>で2つ、C_<78>で5つ、C_<80>で7つ、C_<82>で9つと増加していく。さらに孤立五員環則を満たさない場合を考慮すれば、各々数十万個の構造異性体が考えられる。本研究では、missing metallofullereneの系統的な研究を行うため、誘導化による抽出で得られたLa@C_<80>の構造決定と物性解明に成功した。得られた構造は、これまでに報告例のないC_<80>ケージ構造を有しており、その物性とともに非常に興味深い結果を得た。2.N@C_<60>の構造解析と物性解明N@C_<60>は量子コンピューターの基本素子としての応用が期待される一方で、その絶対量の少なさからN@C_<60>の物性はほとんど解明されておらず、応用化に向けた大量合成法の確立と物性解明は課題である。本年度、申請者はN@C_<60>の単離を行い、その特異な光物理特性を明らかにした。本研究では、常磁性分子であるLa内包フラーレンとN@C_<60>に着目して研究を行った。これらは、ナノ磁性体の構築素子として多分野から注目を集める一方で、その合成・単離の困難さからその構造や物性はほとんど明らかにされていない。前年度までに、申請者は金属内包フラーレンの発見当初より抽出が困難であったLa@C_<72>、La@C_<74>、La@C_<80>を誘導体として抽出・単離し、構造解析及び物性解明に成功している。また、N@C_<60>については、大量合成法の確立に成功し、単離とLFP測定を行い、特異的な光物性を明らかにした。本年度は、このような未開拓であった常磁性内包フラーレンの更なる構造決定と物性解明を目的とするとともに、機能性材料の開発を目指し、以下の2つについて研究を行った。1.La@C_<82>の第3の異性体の抽出と構造解析金属内包フラーレンにおいて、La@C_<82>は特異的に有機溶媒中へと抽出されることから活発に研究されてきた化学種である。これまでに2つの異性体が報告され、最近では化学修飾や超分子化学を用いたLa@C_<82>の機能化も報告されている。一方で、理論計算によりLa@C_<82>には更に異性体が存在する可能性が示唆されていた。申請者はLa@C_<82>の新たな異性体を誘導体として抽出・単離することに成功し、単結晶X線構造解析によりその構造を明らかにした。2.ナノロッドの創製を目指した単結晶の作成と構造・物性解明フラーレンの自己組織化により生成するナノロッドやナノ結晶は、バルク固体や溶液状態では発現しない構造や物性が期待され、フラーレンを用いた機能性材料創製において重要な役割を果たすと考えられる。しかしながら、それらの結晶構造や物性はほとんど解明されていない。本年度、申請者は内包フラーレンもしくは誘導体と有機化合物との共結晶を作成し、単結晶X線構造解祈によりそれらの結晶構造を解明した。
活性酸素誘導性ネクローシスにおける細胞死誘導シグナルの捕捉と可視化

本研究では活性酸素種(Reactive Oxygen Species, ROS)が関与するプログラム細胞の誘導機構解明を目指した。近年、様々な計画的ネクローシスの誘導機構が明らかとなりつつあり、その多くがROSの発生を介した機構が提唱されている。しかし、ROSには様々な活性種が存在し、どのようなROS活性種がどのような生体分子との反応を介して細胞死誘導機構が制御されているのかは、現在においても解明が困難である。研究代表者はROS誘導性の細胞死を制御する低分子化合物を用いた以下2つのアプローチにより研究を行った。1.細胞死抑制活性とタンパク質ラベル化能を併せ持つプローブの合成2015年度からの新学術領域「ダイイングコード」公募班としての研究課題において、我々は、生体内の一電子移動反応に応答してタンパク質と共有結合を形成(ラベル化)する低分子化合物を見出していた。一電子移動はROS誘導性の細胞死の制御に重要であることから、様々な構造の化合物を合成し、ROS誘導性の細胞死抑制活性とタンパク質ラベル化能を評価した。両活性を併せ持つ化合物を見出した。2.NET阻害剤の標的分子同定による細胞死制御機構の解明好中球が感染時にROSを介して核内のクロマチンを細胞外に放出することが近年注目されている。このクロマチン網はneutrophil extracellular traps (NET)と呼ばれ、新たなタイプの細胞死として注目されている。そこで、本新学術領域内の共同研究者が見出したNET阻害剤の標的タンパク質同定を目指した。我々が独自に開発したタンパク質ラベル化技術を応用し、低分子性のNET阻害剤の標的タンパク質候補を同定した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。活性酸素(ROS)が関連するプログラム細胞死や炎症性疾患に関与する細胞死の誘導機構を同定・可視化するため、以下の2つのアプローチにより研究を行った。1.細胞死抑制活性とタンパク質ラベル化能を併せ持つプローブの合成昨年度の新学術領域公募班としての研究課題において、我々が独自に見出した一部のラジカル的なタンパク質ラベル化剤は細胞内で一電子を放出することで、ROS誘導性の細胞死に関わる酸化的なシグナルをクエンチし、細胞死を抑制することが分かっていた。そこで、それらの誘導体や既存のROS誘導性細胞死抑制剤の誘導体を種々合成し、細胞死抑制活性とタンパク質ラベル化能をモデル実験により評価した。両活性を併せ持つ化合物を合成した。我々はタンパク質の化学修飾技術を応用した低分子化合物の標的タンパク質同定手法を独自に開発している。そこで、まず、標的同定のためのプローブを開発する上で、活性化合物の構造活性相関情報を取得した。見出されたNET阻害剤の誘導化合物について、入手、合成した。NET阻害剤に関する構造活性相関情報を得ることに成功し、標的同定研究に使用できるプローブを開発することに成功した。1.細胞死抑制活性とタンパク質ラベル化能を併せ持つプローブの合成:この研究の目的は、上記のプローブを用いて、細胞死誘導刺激処理の細胞においてラベル化されるタンパク質を同定することである。細胞死抑制活性とタンパク質ラベル化能を併せ持つプローブの合成には成功したものの、過酸化水素を細胞死誘導刺激として加えた細胞内で顕著にラベル化されるタンパク質を同定するには至っていない。また、今回合成した一部の化合物は容易に酸化され易い構造であり、試薬としての安定性に欠ける等の欠点があった。よって、当初の平成29年度の達成目標であった細胞死誘導因子の候補タンパク質の同定までは至っていない。上記に関してはうまくいっていないが、別アプローチとして、[2.NET阻害剤の標的分子同定による細胞死制御機構の解明]を試みた。昨年度までの我々の別の研究課題において、生物活性低分子化合物の標的タンパク質同定に関する新手法を開発している。そこで、本領域内の低分子化合物を研究に用いている研究者との共同研究を新たに、開始した。共同研究が見出したNET阻害剤について誘導化を行い、活性を有する数種の化合物の取得、プローブ化に成功しており、この検討においては順調に研究が進行している。よって、全体を通して、当初の想定通りではないものの、おおむね順調に進展していると評価した。

一電子移動はROS誘導性の細胞死の制御に重要であることから、様々な構造の化合物を合成し、ROS誘導性の細胞死抑制活性とタンパク質ラベル化能を評価した。両活性を併せ持つ化合物を見出した。2.NET阻害剤の標的分子同定による細胞死制御機構の解明好中球が感染時にROSを介して核内のクロマチンを細胞外に放出することが近年注目されている。このクロマチン網はneutrophil extracellular traps (NET)と呼ばれ、新たなタイプの細胞死として注目されている。そこで、本新学術領域内の共同研究者が見出したNET阻害剤の標的タンパク質同定を目指した。我々が独自に開発したタンパク質ラベル化技術を応用し、低分子性のNET阻害剤の標的タンパク質候補を同定した。1.細胞死抑制活性とタンパク質ラベル化能を併せ持つプローブの合成:引き続き、現在までに得られている化合物の誘導体化を行い、細胞死抑制活性とタンパク質ラベル化活性を評価することで、優れたプローブの開発を目指す。また、細胞死誘導因子の候補同定において、これまでは細胞死誘導刺激に過酸化水素を用いていたが、Erastin等のフェロトーシス誘導剤や他の細胞死修道刺激条件でも実験を行う。具体的には、アジド基、もしくはビオチンが連結されたプローブを合成し、細胞死刺激時、非刺激時のラベル化タンパク質のバンドパターンを解析することで、プローブの有効性を評価する。特定のタンパク質が検出される場合には、質量分析によるタンパク質同定を行う。2.NET阻害剤の標的分子同定による細胞死制御機構の解明:現在までに得られているNET阻害剤のプローブや、新たに合成する高活性化合物のプローブを用いて、アフィニティークロマトグラフィーや我々が独自に見出した低分子化合物の標的同定手法により、NET形成に関与するタンパク質性の細胞死実行因子同定を目指す。化合物のデザイン、合成を我々が担当し、合成した化合物の生物活性(NET阻害活性)は共同研究者が分担する。活性を持ったプローブを用いた結合タンパク質の実験については我々が行う。アフィニティークロマトグラフィーでの同定が困難な場合にも、低親和性、低発現量の標的タンパク質の検出が可能な我々独自の手法を適用し、活性化合物の標的同定を目指す。同定される候補タンパク質が細胞死実行因子であることの確認は分子生物学的手法により行う。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
生理活性物質汎用合成を指向した新規鉄塩触媒高効率不斉反応系の開発

筆者は、医農薬品や触媒化学の分野で有用な光学活性1,2-ジアミン類の汎用性高いキラル合成子であるDMImを、安価で低毒性の塩化鉄由来の鉄触媒及び過酸化水素による2-イミダゾロンの酸化反応により簡便且つ効率的に大量合成できる方法を開発した。更に、キラル2-イミダゾロンの鉄触媒酸化反応による高ジアステレオ選択的DMIm構築法やジアステレオマー法を利用した光学分割法によるDMIm両体掌体の大量供給法の開拓にも成功した。キラル鉄触媒を利用したエナンチオ選択的酸化反応系についても検討し、trans-スチルベンではまだ萌芽的範疇ではあるものの従来のtrans型ジアミン系配位子よりも高い選択性を示した。本研究では、安価且つ低毒性の鉄塩を触媒とした効率良い不斉反応系の開発を目的とする。即ち、鉄塩を利用した触媒的新規エポキシ化反応の開発を行うと共に、本反応系に不斉配位子を添加した高エナンチオ選択的不斉反応系の創出を目指す。更に、これら知見を基に、2-イミダゾロンの不斉エポキシ化を経由した光学活性1,2-ジアミン類キラル合成子の高効率大量合成や、生理活性物質類の汎用合成、更には、新規反応系の開拓を目指す。平成24年度は、前年度までに得られた本研究に関する基礎的知見をもとに、研究の発展・展開を主眼に次に示す研究を主に実施するとともに幾つかの興味深い結果を得た。1)2-イミダゾロンの鉄塩ー過酸化水素によるエポキシ化において、これまではin situで調製される鉄錯体を利用していたが、これでは触媒活性種や反応機構などの議論は困難であるため、Fe(III)-dipicolinic acid錯体を新たに別途合成し、過酸化水素水による反応系に適用した所、添加するアミンの種類及び等量に依存するものの、1,2-ジアミン類のキラル合成子である4-アルコキシ-5-ヒドロキシ体を収率良く生成する事を明らかにした。更に、添加するアミンを塩酸塩に変更しても反応が速やかに進行するという興味深い知見が得られた。2)4-アルコキシ-5-ヒドロキシ-2-イミダゾリジノンの4、5位置換変換反応を試みたところ、当研究室により開発した既知法により容易に変換が進行する事が明らかとなった。更に、2つの窒素位の保護を工夫する事で任意のアミン部位を保護した1,2-ジアミンの合成経路の開拓に成功した。3)N-ベンゾイル-2-イミダゾロンの鉄塩ー過酸化水素によるエナンチオ選択的不斉エポキシ化を検討した。昨年度までの知見より得られた各種不斉配位子を用いたが、残念ながら低いエナンチオ選択性しか認められなかった。本研究では、安価且つ低毒性の鉄塩を触媒とした効率良い不斉反応系の開発を目的とした。即ち、鉄塩を利用した触媒的新規エポキシ化反応の開発並びにこれら知見を基にした2-イミダゾロンの不斉エポキシ化を経由した1,2-ジアミン類キラル合成子の高効率大量合成及び応用展開、更には新規反応系の開拓を目指した。その結果、以下の新知見が得られた:1)配座固定屋根付きcis-1,2-ジアミン・鉄塩・ジピコリン酸の3成分触媒系で過酸化水素によるエポキシ化を検討したところ、trans-スチルベンのエポキシ化において文献既知のtrans-1,2-ジアミン骨格以上に高いエナンチオ選択性(40% ee)を与える事を見出した。2)窒素部位に不斉補助剤としてアポカンファンカルボニル基を導入したキラル2-イミダゾロンの鉄塩ー過酸化水素によるエポキシ化を検討したところ、最高94% deの極めて高いジアステレオ選択性で、エポキシ体経由で生成したと考えられる、1,2-ジアミン類のキラル合成子である4-アルコキシ-5-ヒドロキシ体(DMIm)が収率良く得られる事を明らかにした。3)別途合成したFe(III)-ジピコリン酸錯体と過酸化水素・尿素錯体によるN-benzoly-2-イミダゾロンの酸化反応を行なった所、添加するアミンの種類及び等量に依存するもののDMImのラセミ体を収率良く合成した。本ラセミ体は2つの窒素位に光学分割剤MAC基及び2-mesitylenesulfonyl基を導入する事で光学分割が容易となり、キラルDMImの両体掌体の汎用合成に成功した。4)配座固定屋根付きcis-1,2-ジアミン由来含窒素複素環カルベン(NHC)-鉄錯体の有用性検証の準備段階として屋根型NHC-銅錯体の反応性を検討したところ、アリル位アリール化反応に於いて従前とは異なり極めて高いγ位選択性を示す事を明らかにした。

即ち、鉄塩を利用した触媒的新規エポキシ化反応の開発を行うと共に、本反応系に不斉配位子を添加した高エナンチオ選択的不斉反応系の創出を目指す。更に、これら知見を基に、2-イミダゾロンの不斉エポキシ化を経由した光学活性1,2-ジアミン類キラル合成子の高効率大量合成や、生理活性物質類の汎用合成、更には、新規反応系の開拓を目指す。平成23年度はこれら一連の研究に関する基礎的知見の収集に主眼を起き、次に示す研究を主に実施するとともに幾つかの興味深い結果を得た。1)鉄塩とピリジンの2成分触媒系で過酸化水素によるエポキシ化が効率良く進行した知見を基に、不斉配位子の検討を行った。即ち、不斉配位子として申請者が開発した配座固定型屋根付きcis-1,2-ジアミン骨格を機軸とし、trans-スチルベン等を基質として種々探索したところ、40% ee程度の萌芽的値ながら文献既知のtrans-1,2-ジアミン骨格以上の高いエナンチオ選択性を与える事を見出した。また、本研究の過程で、鉄塩への配位にはスルホンアミドやアミドなどの部位は関与していない事も明らかとなり、今後の配位子設計に有益な知見となりうる。2)窒素部位に不斉補助剤としてアポカンファンカルボニル基を導入したキラル2-イミダゾロンの鉄塩ー過酸化水素によるエポキシ化を検討したところ、最高94% deの極めて高いジアステレオ選択性で、エポキシ体経由で生成したと考えられる、1,2-ジアミン類のキラル合成子である4-アルコキシ-5-ヒドロキシ体を収率良く生成する事を明らかにした。今後は、低いエナンチオ選択性に留まっている不斉配位子の設計・開拓に注力するとともに、高純度で生成したキラル合成子を利用した光学活性1,2-ジアミン類の合成を行う。これまでその活性中心錯体構造が全く予見できていなかった本反応系においてFe(III)-dipicolinic acid錯体がその前駆体として間違いなく関与しているというのを明らかにした事は、反応時の錯体構造及び反応機構の予測やそれらを基にした高効率な不斉配位子の設計など、今後の研究の進展に重要な情報を与えるきっかけに充分なり得るものである。また、4-アルコキシ-5-ヒドロキシ-2-イミダゾリジノンから1,2-ジアミンへの合成経路の開拓にも成功した。エナンチオ選択的不斉エポキシ化において未だ低いエナンチオ選択性に留まっている事は残念ではあるが、本年度の研究予定は概ね順調に進展したと考えている。エナンチオ選択的不斉エポキシ化反応系の創出に関して既存の1,2-ジアミン系不斉配位子を上回る反応系を構築できた事、また、ジアステレオ選択的ながら1,2-ジアミン類のキラル合成子を鉄塩と過酸化水素水の組み合わせで簡便且つ高選択的に合成できた事、更に、これら研究の過程で少なからず鉄塩を利用した反応系における種々の基礎的知見が得られたことから、本年度の研究予定は概ね達成できたと考えている。平成25年度では、2-イミダゾロンのエポキシ化においてFe(III)-dipicolinic acid錯体を鉄触媒前駆体とした効率的酸化反応系の確立に注力すると共に、未だ低いエナンチオ選択性に留まっている不斉配位子の設計・開拓を目指す。また、これら知見をtrans-スチルベン等を基質としたエポキシ化反応系に適用し、その汎用性拡大を目指す。更に、鉄触媒下での反応例が殆ど報告されていないとともにその反応制御が困難であるハロゲン原子移動型ラジカル反応(Kharasch反応)やオレフィン類のアリル位酸化反応などについても、これまでに得られた各種知見を生かして、鉄触媒による反応系の効率化並びに選択性の向上について検討する。
脂肪組織由来間葉系(幹)細胞を用いた肝再生療法の開発に関する研究

【目的】脂肪組織中に存在する間葉系幹細胞・ADSCは骨髄間葉系幹細胞類似の細胞として知られ、筋細胞、軟骨細胞、肝細胞へと分化誘導可能なことが近年報告されている。ADSCは簡便な方法で採取可能であり、細胞移植治療の供給源として期待されている。肝再生療法の移植細胞供給源としてのADSCの有効性を検討した。【方法】(1)C57BL6マウスよりADSCを分離した。メディウム中にbFGFを添加してADSCを培養し、4週で遺伝子発現、細胞機能を検討した。(2)GFP陽性ADSCをGFP Tgマウスより採取後、bFGF添加の有無で1週間培養したADSCを準備した[bFGF(+)ADSC、bFGF(-)ADSC]。C57BL6マウスにCC14を0.5ml/kg週2回腹腔内投与し、4週でbFGF(+)ADSCあるいはbFGF(-)ADSCを脾注した[bFGF(+)群、bFGF(-)群]。さらに4週間CC14を投与し、コントロール群との3群間で比較検討した。【成績】(1)in vitroで、bFGF添加群は、肝分化マーカー遺伝子の発現を認め、尿素分泌能、グリコーゲン貯留能、LDL諏り込み能も誘導されていた。(2)in vivoで、ADSC投与群ではいずれも肝臓にGFP陽性細胞が生着しており、bFGF(+)群でより生着細胞数が増加していた。また血清Alb値の改善がADSC投与群で認められたがbFGF(+)群でさらに改善していた。肝線維化はコントロール群に比べbFGF(-)群では増悪していたが、bFGF(+)群では改善を認めた。bFGF(+)群の肝臓では線維化促進遺伝子発現の低下、MMP13の発現増加を認めた。【結論】bFGF刺激によりADSCはin vitro、in vivoの両方で肝細胞様細胞へと分化可能であり、bFGF前処置によるADSC細胞移植は新たな肝再生療法になりうることが示唆された。近年、肝移植に代わる新しい治療法として細胞移植が試みられ、骨髄細胞投与により末期肝疾患患者の肝機能が改善することも報告されている。一方、脂肪組織中には骨髄間葉系幹細胞類似の細胞群-ADSCが存在し、より簡便な細胞移植治療の供給源として期待されている。肝再生療法の移植細胞供給源としてのADSCの有効性を検討するためにin vitroでのADSCの肝細胞様細胞への分化誘導、in vivoで肝障害モデルマウスへのADSC移植を行った。【方法】(1)C57BL6マウスの皮下脂肪よりADSCを分離した。メディウム中にbasic fibroblast growthfactor(bFGF)を添加してADSCを培養し、4週の時点で肝臓分化マーカー遺伝子発現、albumin1(Alb)、cytokeratin18(CK18)の免疫染色、尿素分泌能、グリコーゲン貯蔵能、LDL取り込み能を検討した。(2)GFP陽性ADSCをGFP Tgマウスより採取後、1週間bFGF(20ng/ml)添加の有無で培養したADSCを準備した(bFGF(+)ADSC、bFGF(-)ADSC)。C57BL6マウスにCCl_4を0.5ml/kg週2回腹腔内投与し、4週の時点でbFGF(+)ADSC(bFGF(+)群)あるいはbFGF(-)ADSC(bFGF(-)群)を脾臓から注射した群と注射しない群(コントロール群)の3群で、さらに4週CCl_4を投与した。各群でマウス肝臓内のGFP陽性細胞の有無、血清Alb値を比較検討した。【成績】(1)bFGF添加群では、肝分化マーカー遺伝子の発現を認めた。bFGF群ではAlb、CK18陽性細胞へと分化しており、尿素分泌能、グリコーゲン貯留能、LDL取り込み能も誘導されていた。(2)ADSC投与群ではいずれも肝臓にGFP陽性細胞が生着していたがbFGF(+)群でより生着細胞が増加していた。また血清Alb値の改善がADSC投与群で認められたがこれもbFGF(+)群でより改善していた。コントロール群に比べ肝線維化はbFGF(-)群では増悪していたが、bFGF(+)群では改善していた。【結論】ADSCはin vitroで肝細胞様細胞へと分化誘導可能であり、in vivoでADSCの脾注により、肝臓への生着および血清Alb値の改善を認めた。bFGFによる前処置によりこれらの効果はより顕著となった。ADSCは肝再生療法の移植細胞源となりうることが示唆された。

(2)GFP陽性ADSCをGFP Tgマウスより採取後、bFGF添加の有無で1週間培養したADSCを準備した[bFGF(+)ADSC、bFGF(-)ADSC]。C57BL6マウスにCC14を0.5ml/kg週2回腹腔内投与し、4週でbFGF(+)ADSCあるいはbFGF(-)ADSCを脾注した[bFGF(+)群、bFGF(-)群]。さらに4週間CC14を投与し、コントロール群との3群間で比較検討した。【成績】(1)in vitroで、bFGF添加群は、肝分化マーカー遺伝子の発現を認め、尿素分泌能、グリコーゲン貯留能、LDL諏り込み能も誘導されていた。(2)in vivoで、ADSC投与群ではいずれも肝臓にGFP陽性細胞が生着しており、bFGF(+)群でより生着細胞数が増加していた。また血清Alb値の改善がADSC投与群で認められたがbFGF(+)群でさらに改善していた。肝線維化はコントロール群に比べbFGF(-)群では増悪していたが、bFGF(+)群では改善を認めた。bFGF(+)群の肝臓では線維化促進遺伝子発現の低下、MMP13の発現増加を認めた。【結論】bFGF刺激によりADSCはin vitro、in vivoの両方で肝細胞様細胞へと分化可能であり、bFGF前処置によるADSC細胞移植は新たな肝再生療法になりうることが示唆された。
生体肝移植後における、安全かつ効果的な生ワクチン接種

生体肝臓移植後においては、拒絶反応をおさえるため生涯にわたって免疫抑制剤を服用する。このため、弱毒の微生物が体内で増殖しうる生ワチンを、免疫抑制患者には接種しないことになっている。当院では、肝移植後、免疫機能検査に問題のない患児24名に、麻疹、風疹、水痘、おふくかぜ(ムンプス)の生ワクチンを、同意の上合計88接種行ったところ、概して安全で有効な成績が得られた。【方法】生体肝移植後において、小児外科的基準(主に肝臓の状態)および小児科学的基準(主に免疫の状態)をともに満たした小児に対し、麻疹、風疹、水痘、ムンプスの生ワクチン(抗体陰性の項目のみ)を、4週以上の間隔をあけて通常量接種した。接種にあたっては、希望者に生ワクチンの重要性と危険性を十分理解していただき、書面で同意を得た。抗体が陽性化しない場合、あるいは一度陽性化したものが再び陰性化した場合に、再接種を考慮した。【結果】平成19年3月までに、合計12症例(2-17歳)に対し、のべ47接種(再接種含む)行った。いずれの接種においても、拒絶反応や重篤な副反応は認められなかった。抗体陽転率は、麻疹100%(11症例で、11接種/11接種)、風疹100%(10症例で、10/10)、水痘82%(8症例で、9/11)、ムンプス鳥居株43%(3症例で、3/7)、ムンプス星野株88%(7症例で、7/8)、であった。ワクチン接種後に上記疾患に罹患した者は1症例(水痘)であった。この症例においては、ワクチンによる抗体獲得ができていなかったが、重症化はしなかった。ワクチンにより抗体を獲得した者の中で、その後不顕性感染しブースター効果を得た者(抗体価が有意に上昇した症例)が3症例(ムンプス2症例、水痘1症例)あった。【考察】肝移植後小児12症例に対し、のべ47回の生ワクチン接種が安全に行われた。抗体獲得は、麻疹、風疹において良好であった。水痘においてもおおむね良好であったが、11症例中3症例で再度陰性化したため再接種が必要であった。ムンプスにおいては、星野株での免疫の獲得が比較的良好であった。以上より、健常者への生ワクチン接種とほぼ同等の抗体獲得が、安全に得られるものと考えられたが、一部抗体持続について問題があると考えられた。来年度、更に抗体持続を重視し、より適正で効果的な接種を検討する。【方法】本年度も引き続き、生体肝移植後において、小児外科的および小児科学的基準をともに満たした小児に対し、麻疹、風疹、水痘、ムンプスの生ワクチン(抗体陰性の項目のみ)を、4週以上の間隔をあけて通常量接種した。接種にあたり、希望者に生ワクチンの重要性と危険性を十分理解していただき、書面で同意を得た。症例によっては、家族と相談の上、再接種を実施した。【結果】平成20年3月までに、合計18症例(2-18歳)に対し、のべ69接種(再接種含む)行った。いずれの接種においても、拒絶反応や重篤な副反応と確認できる事項はなかった。抗体陽転率は、麻疹100% (14症例で18接種/18接種)、風疹100% (15症例で15/15)、水痘86% (10症例で12/14)、ムンプス鳥居株43% (3症例で3/7)、ムンプス星野株83% (11症例で10/12)、であった。3症例については接種後間もないので抗体価を測定していない。ワクチン接種後に上記疾患に罹患した者は1症例(ごく軽症の水痘)であり、昨年度すでに報告している(接種後には抗体陽転せず、ごく軽症で罹患後陽転)。ワクチン接種により一度抗体を獲得したのちしばらくして、再度抗体価が有意に上昇した症例が11症例(麻疹1例、風疹1例、水痘4例、ムンプス5例)あった。【考察】肝移植後生ワクチン接種が安全に行われ、ムンプス鳥居株を除き良好な抗体獲得率が得られた。また、ワクチン接種し抗体を獲得したのち、不顕性感染によりブースター効果を得たと考えられる者もおり、ワクチンの有効性を示すこととなった。風疹を除き、抗体持続に関する課題が残された。1.方法:生体肝移植後において、小児外科的および小児科学的基準をともに満たした小児に対し、麻疹、風疹、水痘、ムンプスの生ワクチン(抗体陰性の項目のみ)を、4週以上の間隔をあけて通常量接種した。2.結果:平成21年3月までに、合計24症例(2-18歳)に対し、のべ80接種(再接種含む)を行った。

いずれの接種においても、拒絶反応や重篤な副反応と確認できる事項はなかった。初回接種における抗体陽転率は、麻疹AIK-C株100%(19接種中19接種)、風疹TO-336株100%(17接種中17接種)、水痘Oka株81%(16接種中13接種)、ムンプス星野株85%(13接種中11接種)、ムンプス鳥居株0%(3接種中0接種)であった。ワクチン接種により抗体を獲得した者からの罹患はなかったが、抗体を獲得できなかった者からの水痘発症が1例(ごく軽症の水痘)あった。また、一度低下した抗体価が再度有意に上昇した症例が、19事例(麻疹1事例、風疹2事例、水痘7事例、ムンプス9事例)あった。3.考察:肝移植後の生ワクチン接種が安全に行われた。抗体獲得率については、ムンプス烏居株を除き、一般患者におけるものと比較して遜色がなかった。一度抗体を獲得したのち、不顕性感染によりブースター効果を得たと考えられる19事例も、実際のワクチンの有効性を示していると考えられる。
標準動作モデルを用いた技術指導システムの構築―走幅跳を例にして―

本研究の目的は,小学生の走幅跳の踏切準備および踏切動作を対象に,目標となるモデル動作を構築する(課題1)とともに,体育授業内でモデル動作を利用した新たな指導教材を提案する(課題2)ことであった.課題1では,小学生16名を対象に,走幅跳の踏切準備および踏切動作の特徴を反映した目標となるモデル動作を構築した.課題2では,小学生32名を対象に,体育授業内で標準動作モデルを用いた技術指導を実施した.その結果,跳躍距離が有意に向上したとともに,児童自身が動作改善を実感したことが実証された.平成28年度は,当初の計画通り,走幅跳をより遠くへ跳ぶことのできる小学校の男女児童を対象に,模範と成り得る動作モデルの構築を目標とした.平成28年6月に開催された第32回全国小学生陸上競技大会島根県予選において,走幅跳種目に出場した小学生5,6年生児童計19名における踏切準備および踏切動作を3次元動作分析が実施できるようにデータを収集した.また,同時にレーザー速度測定装置を用いて,小学生児童における助走速度の特徴についても明らかにした.その成果として,小学生児童においても,踏切準備および踏切動作が跳躍記録に及ぼす影響が大きいことが明らかとなり,この局面における動作モデルの構築の必要性が実証できた.また,当初の目標であった踏切準備および踏切局面における標準動作モデルも構築することができた.平成29年度は,今年度の構築したモデル動作を用いて,実際にモデル動作を利用したフィードバックが動作改善に与える影響を検討する計画である.本年度は,その準備段階として,着目すべき技術ポイントなどを明らかにすることができたことも成果の1つとして挙げられる.以上の成果は,山陰体育学研究に原著論文(査読付)として掲載(2017年1月受理)されたことに加え,来年度の国際学会(ISBS)で発表予定である.平成28年度は,当初の計画案通り,おおむね順調に進展していると考えられる.今年度の最大の目標は,熟練者の標準動作モデルを構築することであったが,公認競技会における上位選手達の良い動きを収集し,モデル構築を遂行することができている.最終年度では,前年度に作成した遠くまで跳ぶことのできる小学生児童16名の踏切準備および踏切動作から作成した標準動作モデルを実際の体育授業へ応用し,その効果を検証した.具体的には,小学校5年生の1クラス32名(男子17名,女子15名)を対象に,目標とすべき標準動作モデルと自身の動きを反映した連続写真を配布することで,自身の課題点を視覚的・客観的に気づかせる取り組みを実施した.その後,1手・目線の課題に取り組むコース,2振上げ脚の膝を高く上げる課題に取り組むコース,3踏切脚で強く踏み切る課題に取り組むコースを設定して,授業(全7回)を展開した.その結果,全児童32名の跳躍距離が向上した(第2回Pre:2.53±0.30m,第6回Post:3.00±0.38m).Post試技では,Pre試技よりも大きな水平速度を維持したまま,Pre試技と同程度の鉛直速度を獲得できるような踏切準備および踏切動作に改善されたことが大きな跳躍距離の向上につながったと推察される.また,モデル動作と比較して,「どの時点で,どの部位に課題点があるのか」を明らかにするために,Z-score(偏差値)を用いてバイオメカニクス的に評価した結果,Pre試技では踏切接地時の踏切脚の動作に課題点が目立ったが,Post試技では踏切中の踏切脚の動作がうまく改善されていた(モデル動作に近づいていた).さらに,走幅跳の授業に関するアンケートを実施した結果,「走幅跳では,自分のフォームがうまくなった時楽しい」の項目において,第2回(Pre:4.1±1.1点)よりも第6回(Post:4.6±0.6点)の方が有意に高得点を示し,児童自身が動作改善を実感していたことも読み取ることができた.本研究の目的は,小学生の走幅跳の踏切準備および踏切動作を対象に,目標となるモデル動作を構築する(課題1)とともに,体育授業内でモデル動作を利用した新たな指導教材を提案する(課題2)ことであった.課題1では,小学生16名を対象に,走幅跳の踏切準備および踏切動作の特徴を反映した目標となるモデル動作を構築した.課題2では,小学生32名を対象に,体育授業内で標準動作モデルを用いた技術指導を実施した.その結果,跳躍距離が有意に向上したとともに,児童自身が動作改善を実感したことが実証された.平成29年度は,昨年度と同様の競技会において,引き続き熟練者のデータを収集することに加え,実際のトレーニングや授業などで標準動作モデルを用いて,動作改善を実施し,その効果を実証していく必要がある.また,得られた成果を当該分野の雑誌に投稿するとともに,国内外の学会で発表していく予定である.バイオメカニクス本年度,データ分析の人件費として計上していたものを一人で実施したため,予算を削減することができた.本年度使用予定であった人件費(差額分)は,来年度のデータ分析の人件費および謝金に使用予定である.