hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
胎児発育不全児の高血圧発症リスク軽減のための栄養管理に関する研究

前年度はこれまでの研究から有用と考えられた栄養管理法がFGRモデル作出方法を変化させた場合も有用であるかを検討するために、母体5/6腎臓摘出によりFGRを引き起こすという新たなFGRモデルを作製し解析に用いた。出生時体重よりFGRを引き起こしていることは確認できたものの、成熟後の血圧上昇が認められず、栄養管理の有用性の検討に至らなかった。血圧上昇が認められない原因としてこのモデルは自然にはcatch-up-growthを達成しないことが考えられた。そこで今年度は5/6腎臓摘出母体より得られた新生子の哺育子数を調整し、catch-up-growthを引き起こした後の腎臓、血圧変化を主として解析を行い、このモデルの特性のさらなる解明を行った。妊娠母体に5/6腎臓摘出手術を施し、得られた新生子の哺育数を3匹にした場合(ope-3群)、1)3週齢で対照群(哺育数:8匹)の体重に追いつき、比較的早期にcatch-up-growthを達成させることができた。2)収縮期血圧は4週齢で対照群、ope群(5/6腎臓摘出手術後、哺育数:8匹)と比較して有意に高くなっており、24週齢まで同様の結果が得られた。3)血液生化学的検査の結果、ope-3群は12週齢、24週齢においてCre, HDLC, T-Cho, TGが他の2群に比べ有意に増加していた。4)組織学的解析の結果、ope-3群は12週齢、24週齢いずれの週齢においても他の2群と比較して腎糸球体硬化が進行している所見が観察された。これらのことより、母体5/6腎臓摘出によるFGRの場合も生後早期にcatch-up-growth引き起こした場合、高血圧発症リスクが増加することを明らかにすることができた。これまでの研究で明らかにした高血圧発症リスク減少に有用と考えられる栄養管理法がこのモデルでも有用であるかを検討することが今後の課題である。本研究はFGRモデルマウスを用いて、これまでの研究で明らかにした幼若期に栄養介入を行った場合に認められる成熟後の血圧上昇抑制がどのような機序でおきているかを解明するとともに、栄養介入が中枢神経系に悪影響を及ぼしていないかを明らかにすることによって、低出生体重児の乳児期、小児期における適切な栄養管理法の開発を目的としている。妊娠中に低蛋白食を給餌することによりFGRを引き起こし、生後catch up growth達成後に栄養介入を行う群(栄養管理群)、行わない群(FGR群)の2種のFGRモデルに対照群を加えた3群のマウスを作製し、研究に使用した。結果:1)生後10週齢での体重、脳重量、大脳半球面積、大脳皮質面積、脳組織のH.E染色像ならびKluver-Barrera(KB)染色像に、3群の間に有意差や目立った差は認められなかった。結果:2)1と同様に生後10週齢で行った、オープンフィールド試験での移動距離、不動時間、中央区画滞在割合、高架式十字迷路試験でのオープンアーム滞在時間、受動回避学習試験でのlatency、freezing、Y字迷路試験での自発交替率、すべてにおいて3群間で有意差は認められなかった。これらのことから本研究での栄養介入は神経学的発達に悪影響を与えないことが示唆された。結果:3)生後30週齢の腎臓を用いてトランスクリプトーム解析を行った結果、2倍以上の発現変動していた遺伝子数は、対照群-FGR群間では1982個、対照群-栄養管理群間では2818個、FGR群-栄養管理群間では1773個であった。FGR群-栄養管理群間で変動の認められた遺伝子のうち栄養管理群で発現が上昇していたものは959個、発現が減少していたものは814個であった。現在、パスウェイ解析、遺伝子セット解析を行っており、本研究での血圧上昇抑制に関与していると思われる遺伝子群を探索中である。当初の予定では初年度に腎臓における遺伝子転写産物の網羅的解析を行った後、重要と考えられる遺伝子群について、解析ポイントを増やして発現変動を明らかにする予定であったが、成熟後の個体数が揃うのが遅れたため、現在重要と考えられる遺伝子群の探索中である。しかしながら次年度以降に行う予定であった、中枢神経系に与える影響の解析を前倒しで行っており、全体の進捗状況としてはおおむね予定通りである。本研究はFGRモデル動物を用いて、胎児発育不全により低体重で出生した児の高血圧発症リスクを軽減させる、乳児期、小児期の栄養管理法の開発を目的としている。昨年度までの研究により、母体低蛋白食給餌によって作製したFGRモデルに対する栄養管理が中枢神経系に悪影響を及ぼすことなく、将来的な高血圧発症を抑制することを明らかとした。そこで本年度は栄養管理がFGRモデル作出方法を変更した場合にも有用であるかを検討するための新たなFGRモデルを作出し、腎臓を主としてその特性を明らかとすることに焦点をあて解析を行った。当初、モデル動物は子宮胎盤循環遮断により作出する予定であったが、産子の成績が安定しなかったため、母体5/6腎臓摘出によりFGRを引き起こすという新たなFGRモデルを作製し解析に用いた。1)妊娠母体に5/6腎臓摘出手術を施したところ、得られた新生子の出生時体重は対照群と比べ、有意に軽くなっており、FGRを引き起こしていることが確認できた。

2)出生時腎臓の組織形態観察を行ったところ、腎臓体積は有意に減少していたものの、低蛋白食給餌によるFGRの場合に認められた、単位体積あたりの腎小体数、腎臓あたりの腎小体数および腎小体体積には有意な差は認められなかった。また24週齢まで観察を行っても同様の結果であった。3)血圧調節因子である、レニン、AGTの発現について検討した。低蛋白食給餌によるFGRで認められた、若齢期でのこれらの因子の発現差は母体5/6腎臓摘出によるFGRモデルでは観察されなかった。4)収縮期血圧を測定したところ、24週齢まで有意な差はなかった。低蛋白食給餌によるFGRでは出生直後の腎臓が未熟な状態であることが今までの研究でわかっているが、母体5/6腎臓摘出によるFGRではその傾向が認められず、そのことが将来的な高血圧発症リスクを高めていない原因と考えられた。当初の予定では、平成29年度は母体低蛋白食給餌によって作製したFGRモデルに栄養介入を行った場合の血圧関連因子を複数ポイントで解析する予定であったが、FGR作出方法を変更した場合とも比較するため、平成30年度に行う予定であった2種類のFGRモデル作出を前倒しで行った。母体5/6腎臓摘出によるFGRモデルだけでなく、摂餌制限によるFGRモデルの作製も現在行っており、全体の進捗状況としてはおおむね予定通りである。前年度はこれまでの研究から有用と考えられた栄養管理法がFGRモデル作出方法を変化させた場合も有用であるかを検討するために、母体5/6腎臓摘出によりFGRを引き起こすという新たなFGRモデルを作製し解析に用いた。出生時体重よりFGRを引き起こしていることは確認できたものの、成熟後の血圧上昇が認められず、栄養管理の有用性の検討に至らなかった。血圧上昇が認められない原因としてこのモデルは自然にはcatch-up-growthを達成しないことが考えられた。そこで今年度は5/6腎臓摘出母体より得られた新生子の哺育子数を調整し、catch-up-growthを引き起こした後の腎臓、血圧変化を主として解析を行い、このモデルの特性のさらなる解明を行った。妊娠母体に5/6腎臓摘出手術を施し、得られた新生子の哺育数を3匹にした場合(ope-3群)、1)3週齢で対照群(哺育数:8匹)の体重に追いつき、比較的早期にcatch-up-growthを達成させることができた。2)収縮期血圧は4週齢で対照群、ope群(5/6腎臓摘出手術後、哺育数:8匹)と比較して有意に高くなっており、24週齢まで同様の結果が得られた。3)血液生化学的検査の結果、ope-3群は12週齢、24週齢においてCre, HDLC, T-Cho, TGが他の2群に比べ有意に増加していた。4)組織学的解析の結果、ope-3群は12週齢、24週齢いずれの週齢においても他の2群と比較して腎糸球体硬化が進行している所見が観察された。これらのことより、母体5/6腎臓摘出によるFGRの場合も生後早期にcatch-up-growth引き起こした場合、高血圧発症リスクが増加することを明らかにすることができた。これまでの研究で明らかにした高血圧発症リスク減少に有用と考えられる栄養管理法がこのモデルでも有用であるかを検討することが今後の課題である。30週齢でのパスウェイ解析、遺伝子セット解析の結果より、本研究で重要と考えられる遺伝子群を抽出した後、解析ポイントを増やして、それらの遺伝子群がどのような発現変動をとるかを明らかとする。また、成熟後のマウスについても行動解析や病理組織学的解析を行うことにより、中枢神経系に与える影響をより詳細に検討する予定である。
ミトコンドリア機能異常による運動失調マウスの開発とその機能イメージング

本研究では、ミトコンドリアの品質管理の破綻による機能異常と疾患との関係を明らかにすることを目的とし、ミトコンドリアの機能異常をバイオイメージングで検知する系、およびミトコンドリアの機能異常に起因するモデルマウスの樹立の樹立を試みた。ミトコンドリアの機能異常を検知する系については、マウスの各臓器、組織におけるミトコンドリアの動態、すなわちミトコンドリアの融合、分裂、移動等を正確、かつ定量的に測定する系の確立できた。モデルマウスの樹立に付いては、研究を続行中である.本研究では、ミトコンドリアの品質管理の破綻による機能異常と疾患との関係を明らかにすることを目的とし、ミトコンドリアの機能異常をバイオイメージングで検知する系、およびミトコンドリアの機能異常に起因するモデルマウスの樹立の樹立を試みた。モデルマウスの樹立に付いては、研究を続行中である.ミトコンドリアは古くから細胞内のエネルギー産生、脂質のβ酸化等、生命維持に必須の化合物生産の場として、そして現在では細胞内Ca2+濃度の調節、アポトーシス等、細胞内シグナル伝達の中継所としても注目されている。それ故、ミトコンドリアの機能失調は生体にとって深刻な影響を与えるため、ミトコンドリアに対する品質管理のシステムを生体は保有している。本研究では、ミトコンドリアの品質管理と疾患との関係を明らかにすることを目的とした。そのため、ミトコンドリアが機能失調に陥った場合に、最も影響を受けると予想される中枢神経系、神経・筋肉系に注目し、その最も顕著でかつ重要な表現型である運動失調に注目し、これらの表現型を呈する既存、並びに新規のモデルマウスを作製する。そのようなモデルを樹立の後、その神経、筋細胞等を用い、ミトコンドリアの挙動をバイオイメージングにより解析することによって、上記目的を達成したい。今年度は、これまでに作製した、4系統のミトコンドリア局在型蛍光蛋白遺伝子導入(Tg)マウスを用いて、細胞内でのミトコンドリアの融合・分裂・輸送などの動態を詳細に観察し、組織ごとにミトコンドリアの形態に著しい差が存在することを見出した(その一部はShitara et al., Exp.Anim., 59 : 99-104, 2010で公表)。さらに、オートファジーとミトコンドリアとの相互作用を形態学的に解析するための準備を行なった。今後これらのマウスを用いて、ミトコンドリアの品質管理の破綻と疾患の表現型との関係を重点的に解析し、その疾患についての組織病理学的所見とミトコンドリアの機能異常との関係を詳細に検討する。ミトコンドリアは古くから細胞内のエネルギー産生、脂質のβ酸化等の生命維持に必須の化合物生産の場として、最近では細胞内カルシウム濃度の調節、アポトーシス等の、細胞内シグナル伝達の中継所としても注目されている。これらの理由から、ミトコンドリアの機能失調は生体にとって深刻な影響を与える。そのため、生体は、機能失調に陥ったミトコンドリアに対する品質管理のシステムを保有している。そこで、本研究では、ミトコンドリアの品質管理と疾患との関係を明らかにすることを目的とした。そのため、ミトコンドリアが機能失調に陥った場合に、最も影響を受けると予想される中枢神経系、神経・筋肉系に注目し、その最も顕著でかつ重要な表現型である運動失調を標的に、これらの表現型を呈する既存、並びに新規のモデルマウスを作製することにした。そのようなモデルが樹立された後、そのモデルの神経、筋細胞等を用い、ミトコンドリアの挙動をバイオイメージングにより解析することによって、上記目的を達成したいと考えている。今年度は、これまで作製したmtGFP-トランスジェニック(Tg)マウスを始めとする4種類以上の蛍光蛋白で標識されたミトコンドリアを有するTgマウスを用い、各種臓器の細胞内におけるミトコンドリアの融合・分裂の詳細を明らかにすると共に、ミトコンドリアの量的・質的挙動に関係するミトコンドリア転写因子A(TFAM)タンパク質、オートファジーに関連する構成タンパク質の条件付き発現系を有する遺伝子改変マウスを用い、上記のミトコンドリアを蛍光標識したTgマウスとのF1マウスを作製し、ミトコンドリアの挙動、特にミトコンドリアの品質管理の破綻と疾患の表現型との関係を重点的に観察した。今後は、これらのマウスを用いて、病態との関係、特に病態の重篤度との関係を明らかにする予定にしている。ミトコンドリアは古くから細胞内のエネルギー産生、脂質のβ酸化等、生命維持に必須の化合物生産の場として、そして現在では細胞内Ca2+濃度の調節、アポトーシス等、細胞内シグナル伝達の中継所としても注目されている。本研究では、ミトコンドリアの品質管理の破綻による機能異常と疾患との関係を明らかにすることを目的とした。そのためには、ミトコンドリアの機能異常に起因するモデルマウスの樹立が必要であった。特に、ミトコンドリアの動態が機能失調に陥った場合に、最も強く影響を受けると予想される中枢神経系、神経・筋肉系の顕著でかつ重要な表現型である運動失調を呈する新規のモデルマウスの樹立が必要であった。

一方、これらモデルの樹立には、各臓器、組織におけるミトコンドリアの動態、すなわちミトコンドリアの融合、分裂、移動等を正確、かつ定量的に測定する系の確立も必要であった。ミトコンドリアの機能異常に起因するモデルマウスの樹立については、現在までのところ成功に至っていない。一方、ミトコンドリアの融合や分裂そして移動等を正確、かつ定量的に測定する系については、mtGFP-Tgマウス、mtDsRed2-Tgマウス等、4種類の蛍光蛋白で標識されたミトコンドリアを発現するマウスが得られた。さらに、Tfam-GFP-Tgマウスなど、ミトコンドリア機能に関わる蛋白を蛍光標識したマウスも得ることができ、様々な組織、器官でのミトコンドリアの動態を定量的に観察することができた。このことから、ミトコンドリアの動態を観察する系は予定通りに確立できた。今後は本研究計画で得られた実績をもとに、本計画の最終目標であるモデルマウスの樹立を目指し、研究を続行中である。
学校の情報化推進のためのコンピテンシーモデルに基づく教師集団の組織・評価方法

学校現場が求める教師像は今や変った.例えば,上司や同僚を調整しチームで問題解決にあたる人材が望まれる.求めている教師の力量は従来の知識や技能といった能力(パフォーマンス)中心では測れない.特性や動因といった資質(コンピテンシー)中心に測るのが有効である.本研究では,学校の情報化推進において適材適所の人材起用をねらいとし,(1)教師個人の資質評価, (2)教師集団の能力評価, (3)両者に基づく学校組織改善の方法論を示す.学校現場が求める教師像は今や変った.例えば,上司や同僚を調整しチームで問題解決にあたる人材が望まれる.求めている教師の力量は従来の知識や技能といった能力(パフォーマンス)中心では測れない.特性や動因といった資質(コンピテンシー)中心に測るのが有効である.本研究では,学校の情報化推進において適材適所の人材起用をねらいとし,(1)教師個人の資質評価, (2)教師集団の能力評価, (3)両者に基づく学校組織改善の方法論を示す.本研究課題においては,学校の情報化推進のための人的資源の活用をねらいとし,教師個人に対するコンピテンシーの評価,および,教師集団に対するパフォーマンスの評価,さらに,両者に基づいた学校組織の改善について方法論を確立し提示することを目的とした。平成18年度は,「1.学校の情報化のためのコンピテンシーモデルの定義」を具体的な目的として研究を進め,個の教師がもつ力量の評価方法にっいて明らかにした。(1)学校の情報化推進に特有のコンピテンシー抽出以下の(1)(3)の手順により,学校の情報化推進のためのコンピテンシーが網羅された"コンピテンシー辞書"を成果として得た。(1)様々な職種の分析により得られたコンピテンシーを網羅する作業(2)(1)の網羅的なコンピテンシーから,教師教育および教員養成において育成すべきコンピテンシーを抽出する作業(3)さらに,(2)の教師教育および教員養成において必要なコンピテンシーから,学校の情報化推進に特化したコンピテンシーを抽出する作業(2)コンピテンシーモデルの構築教育委員会主事,学校情報化コーディネータの経験者から専門的知識の提供を受け、学校の情報化推進に特化したコンピテンシーモデルを構築し、学校の情報化推進のための"役職別の卓越者モデル"を成果として得た。(3)コンピテンシーアセスメントの方法論以下の(1)(2)の手順により、情報化推進のための"コンピテンシー診断ハンドブック"をまとめた。(1)コンピテンシー測定の様々な方法についての整理と解説(2)WWW上へのコンピテンシー診断システムの公開(e-Learningでの出題・回答形式)(4)コンピテンシー育成の方法論コンピテンシー育成の様々な方法について整理し育成プログラムの開発の検討を行った。成果については来年度"コンピテンシー育成ハンドブック"としてまとめる。今年度の前半は「コンピテンシーモデルに基づいたグループダイナミクス(チーム編成方法)」を目的として研究を進め,教師集団の組織方法について明らかにした。後半は「学校の情報化を推進する教師集団についてのパフォーマンス評価」を目的として研究を進め,組織された教師集団の評価方法について明らかにした。教師集団についての組織方法論においては以下の手順で進めた。(1)チーム編成のための目的一覧表をまとめた。(2)目的別チーム(単純作業チーム,問題解決チーム,意思決定チーム,後継者育成チーム)を編成するための方法論を示した。集団の組織方法論のひとつであるグループダイナミクスについて先進的な方法論を見出すために,海外の先進事例についての資料収集を行った。以上(1),(2)により得られた知見を情報化推進のための"チーム編成ハンドブック"としてまとめた。同時に管理職向け組織づくり研修会を実施し,そこで実際に目的別のチーム編成を試行した。教師集団についてのパフォーマンス評価の方法論においては以下のように進めた。(1)集団のパフォーマンスを評価するルーブリックを作成した。なお,ルーブリックは次の3つからの構成とした:(a)目的別評価観点;(b)評価規準;(c)具体的な優れた活動事例。(2)先進的な集団のパフォーマンス評価の方法論に関し海外の先進事例について資料収集を行った。以上(1),(2)により得られた成果を"集団パフォーマンス評価ハンドブック"としてまとめた。今年度は「学校の情報化を推進するための学校経営におけるコンピテンシー情報の活用」を具体的な目的として研究を進め,本研究課題でこれまでに得られた成果の実用化の可能性について実践を通じて検証を行った。具体的には,本研究成果のシステム化,および,学校経営への応用である。まず,本研究成果のシステム化においては,以下の2つの機能をもつチームマネージメントシステム(プロトタイプ)の開発を試みた。・人材データベース機能(個のコンピテンシー情報の蓄積)として,コミュニケーションシートを開発し,それを表計算ソフト上で利用できるようにした。・チーム編成提案機能(集団のパフォーマンスの最適化)として,LMSを利用してアンケート集計を行い,比較的短時間でグループ分けを行う仕組みを作った。次に,本研究成果の学校経営への応用においては,学校の情報化推進場面での異なるコンピテンシー集団の連携を行い,チームマネージメントの応用事例を得た。実際の連携として,教育研究者集団と教育実践者集団との連携を題材とした。教育研究者集団からの人材として,大学教員及び学卒大学院生,教育実践者集団からの人材として学校教諭及び現職大学院生をメンバーとした。

具体的な学校の情報化を目的とした教師集団による取り組みは,以下の2事例である。・集団での学校カリキュラムの開発(全校的な取り組みとして情報モラル授業を開発)・チーム援助による生徒指導(情報社会における問題行動予防のための生徒理解)
地球環境保全に用いる高選択性気体透過膜の開発

本研究は、酸素富化空気を生産し、省エネルギーに役立つばかりではなく、大きな環境問題の一つとなっている二酸化炭素の選択的回収をも可能とする選択的気体分離膜素材ポリマーにを、枝分れ高分子に関する基礎科学としての観点から、統一的に、構造の明確な高分子の機能発現に関する基本的理解を得、新機能材料を分子設計により創製して環境問題の解決に寄与することを目的とした。具体的研究方法としては、重合性を持つオリゴジメチルシロキサンを合成し、その成膜性、気体透過機能を評価し、透過特性を支配する因子を明確にすることを実験方法とした。ビニル重合型のポリマーについては、シロキサン鎖の導入により、ポリマーの物性を有効に制御できることが示された。固体NMRを用いて側鎖の運動性を評価したところ、側鎖の局所的な運動性が物性を大きく支配することが明確になった。オリゴシロキサンの導入がガラス転移温度を下げることも明かになったので、高温でも使用できる材料の設計を目指して、ポリアミドを組み合わせた。重縮合系のポリアミドやポリイミドの主鎖、あるいは側鎖にオリゴシロキサンを導入しても、ビニルポリマーと同様の効果が見られることが明確になった。さらにビニルポリマーの物性の向上を目指して、ポリアミドマクロモノマーを合成し、その効果を検討した。ポリアミドマクロモノマーは、その相溶性に応じ、ビニルポリマーの物性を向上させることが分かった。このことを利用し、単独では成膜性のないポリ{(4-ヘプタメチルトリシロキサン-1-イル)スチレン}に成膜性を与え、優れた選択気体透過能を付与することができた。
植物においてグルタチオン長距離輸送を担う輸送体が硫黄や重金属分配に果たす役割

昨年度までの研究成果をPlant and Cell Physiology誌に投稿し、レビューワーに指摘された追加実験を行った。具体的には、AtOPT6のmRNA量を、鞘、花、茎、葉、根の各器官別にリアルタイムPCRを用いて調査し、花や鞘で発現が高いことを確認した。これは、atopt6変異体において、花や鞘でグルタチオン量が低く、これらのシンク器官においてAtOPT6が主に機能し、グルタチオンの輸送を担っていることと対応していた。また、長日条件で8週間栽培したロゼット葉からの篩管液を採取し、野生型株とatopt6欠損変異体で篩管液中のグルタチオン量を比較したところ違いはなかったので、AtOPT6は篩管へのグルタチオンの積み込みではなく、篩管を通って運ばれてきたグルタチオンをシンク器官へ取り込む際に機能していると考えられた。また種子成熟への影響を調べるために、野生型株とatopt6欠損変異体の未熟種子と完熟種子を実態顕微鏡で観察したが、外見上の違いはなかった。しかし発芽率はatopt6欠損変異体において減少していたことから、種子内部の代謝に変化が生じていると考えられた。グルタチオンは過去の研究で種子成熟に必要であることが知られており、AtOPT6が種子にグルタチオンを送ることにより発芽に貢献していることが示唆された。これら追加実験の内容を含めてPlant and Cell Physiology誌に再投稿したところ、2018年4月9日に受理された。また上記の内容とは別に、篩管中のグルタチオン含量を増加させることでシンク器官へのグルタチオン輸送を活性化できるかどうかを調べるため、スクローストランスポーターのプロモーターにAtOPT6遺伝子をつなげて、シロイヌナズナに形質転換した。また、新たに作成した形質転換シロイヌナズナが完成した。この形質転換体でAtOPT6の発現は、葉においてとても高まっており、スクローストランスポーターと同様に、葉における篩管へのローディングを行う組織で、AtOPT6が強発現していると考えられた。目的通り篩管へのローディングを行う組織で、AtOPT6を強発現させることができた。スクローストランスポーターのプロモーターにAtOPT6遺伝子をつなげた形質転換体を栽培し、篩管液中のグルタチオン量が増加しているか、またシンク器官でのグルタチオン量が増加しているかどうかを調べる。さらにそれに伴う生育の変化や、種子成熟への影響、重金属輸送への影響を調査し、植物体内におけるソースからシンクへのグルタチオン輸送を増加させることによる影響を総合的に解析する。過去にインビトロの系でグルタチオン輸送活性が報告されていたシロイヌナズナAtOPT6について、植物体内での生理機能を知るために、変異株の解析を行った。独立な2系統の変異株両方について、鞘や花といったシンク器官でグルタチオン濃度が低下していることを確認した。過去の研究で、AtOPT6をコードする遺伝子は維管束で発現していることが知られていたため、グルタチオン長距離輸送との関連を知るために、篩管液中のグルタチオンを測定したところ、野生型株とatopt6変異株で同様であった。AtOPT6遺伝子の発現はシンク器官の篩部の周囲で強いことから、AtOPT6は、篩管を通って運ばれてきたグルタチオンをが、篩管からアポプラスト空間に出た後、篩部周囲の細胞に吸収する役割を果たすと考えられた。これにより、シンク器官での成長に必要な、硫黄や窒素源の取り込みに寄与すると示唆された。さらに、変異体では花茎の出現が遅れたことから、栄養成長から生殖成長への変換の制御にも、グルタチオン輸送が関連していることが示唆された。有害元素であるカドミウムは、グルタチオンやその重合体であるファイトケラチンに縫合され、植物体内を輸送されると考えられている。AtOPT6の重金属輸送における機能を明らかにするために、atopt6変異株と野生型株を栽培する際の水耕液にカドミウムを添加した後、ファイトケラチン濃度を器官別に測定した。主要なファイトケラチンであるPC2含量が、atopt6変異株の花で減少していた。また、変異株においてカドミウムが根で蓄積していた。このことから、AtOPT6によるグルタチオンやファイトケラチンの輸送が、植物体内のカドミウム動態に影響を与えていることが明らかとなった。2つの独立な変異株系統を用いて確固な結果を得ることができ、篩管液中のグルタチオン濃度への影響を調べることにより、AtOPT6の生理機能をほぼ推定できた。またカドミウムの輸送についても、変異株と野生型株とでの違いが観察され、カドミウムを抱合するファイトケラチンにも違いがみられたことから、カドミウム動態への影響も示唆することができた。これらの結果について、論文を投稿する段階まで研究が進んだ。

また、長日条件で8週間栽培したロゼット葉からの篩管液を採取し、野生型株とatopt6欠損変異体で篩管液中のグルタチオン量を比較したところ違いはなかったので、AtOPT6は篩管へのグルタチオンの積み込みではなく、篩管を通って運ばれてきたグルタチオンをシンク器官へ取り込む際に機能していると考えられた。また種子成熟への影響を調べるために、野生型株とatopt6欠損変異体の未熟種子と完熟種子を実態顕微鏡で観察したが、外見上の違いはなかった。しかし発芽率はatopt6欠損変異体において減少していたことから、種子内部の代謝に変化が生じていると考えられた。グルタチオンは過去の研究で種子成熟に必要であることが知られており、AtOPT6が種子にグルタチオンを送ることにより発芽に貢献していることが示唆された。これら追加実験の内容を含めてPlant and Cell Physiology誌に再投稿したところ、2018年4月9日に受理された。また上記の内容とは別に、篩管中のグルタチオン含量を増加させることでシンク器官へのグルタチオン輸送を活性化できるかどうかを調べるため、スクローストランスポーターのプロモーターにAtOPT6遺伝子をつなげて、シロイヌナズナに形質転換した。また、新たに作成した形質転換シロイヌナズナが完成した。この形質転換体でAtOPT6の発現は、葉においてとても高まっており、スクローストランスポーターと同様に、葉における篩管へのローディングを行う組織で、AtOPT6が強発現していると考えられた。目的通り篩管へのローディングを行う組織で、AtOPT6を強発現させることができた。AtOPT6は、研究開始前は篩管にグルタチオンを送り込む輸送体だと予想していたが、実際は篩管から出たグルタチオンを、ソース器官で取り込む輸送体であった。この機能は、成長点での窒素・硫黄を取り込む点でとても重要である。しかし、グルタチオンの長距離輸送をより活発化させ、成長点に送り込むためには、篩管に送り込む段階も促進することが有効だと考えられる。このため、篩部伴細胞で発現し篩管に取り込む段階で機能するスクローストランスポーター遺伝子のプロモーターを用い、この下流にAtOPT6遺伝子をつなげシロイヌナズナに導入することにより、篩管と介したグルタチオン輸送を強化した植物を作成する。グルタチオンは細胞分裂、酸化物解毒の機能を持つことから、このようにして成長点へ活発にグルタチオンを送り込むことにより、成長促進等がみられる可能性があり、これを確認する。重金属輸送についても、ヒトにとって必須であり、不足しがちな亜鉛の輸送をグルタチオンが促進することが知られており、この可能性も、作成した形質転換体を解析することによって確認する。スクローストランスポーターのプロモーターにAtOPT6遺伝子をつなげた形質転換体を栽培し、篩管液中のグルタチオン量が増加しているか、またシンク器官でのグルタチオン量が増加しているかどうかを調べる。さらにそれに伴う生育の変化や、種子成熟への影響、重金属輸送への影響を調査し、植物体内におけるソースからシンクへのグルタチオン輸送を増加させることによる影響を総合的に解析する。
磁性単原子制御規則合金膜の偏極中性子散乱による精密磁気構造解析

1.磁性人工格子の中性子による精密構造解析を行うために、日本原子力研究開発機構(JAEA)の研究用原子炉JRR-3に設置されている3軸型偏極中性子分光器TAS-1と中性子反射率計SUIRENの偏極中性子オプションの整備を行い,測定の効率化と高度化を実現した.これにより,本来散乱体積が少ないために難しいと考えられてきた磁性人工格子の磁気構造解析の基盤が整い,その報告を論文発表と学会発表で行った.2.TAS-1と先端的な磁気構造解析装置である3次元偏極解析装置(CRYOPAD)を使ってCr/Sn人工格子の磁気構造の精密解析を行い,特異なスピン密度波の詳細な構造を明らかにした.この他,研究分担者や共同研究者から磁性薄膜,人工格子試料の提供を受け,精密磁気構造解析を行って,その結果を日本物理学会,日本中性子科学会,茨城県中性子利用促進研究会などで発表した.ひとつの例として,巨大磁気モーメントの存在が長年にわたり議論になってきた窒化鉄薄膜の磁気構造解析を行い,巨大磁気モーメントは存在しないこと,ユニットセル内に存在する異なる3サイトに属するFeが異なる大きさの磁気モーメントを持つことを明らかにし,バンド計算と矛盾のないことを示した.3.磁気ヘッド材料などでスペーサー層として重要な役割を果たしているRuの,Kセルによる蒸着に成功した.Ruは高融点金属でありKセルによる蒸着はこれまで試みられた事がなかった.この手法と基板表面の水素終端処理法を使って,歪みのない高品位のエピタキシャル膜を成膜するための基盤を築くことができた.1.磁性人工格子の中性子による精密構造解析を行うために、日本原子力研究開発機構(JAEA)の研究用原子炉JRR-3に設置されている3軸型偏極中性子分光器TAS-1と中性子反射率計SUIRENの偏極中性子オプションの整備を行い,測定の効率化と高度化を実現した.これにより,本来散乱体積が少ないために難しいと考えられてきた磁性人工格子の磁気構造解析の基盤が整い,その報告を論文発表と学会発表で行った.2.TAS-1と先端的な磁気構造解析装置である3次元偏極解析装置(CRYOPAD)を使ってCr/Sn人工格子の磁気構造の精密解析を行い,特異なスピン密度波の詳細な構造を明らかにした.この他,研究分担者や共同研究者から磁性薄膜,人工格子試料の提供を受け,精密磁気構造解析を行って,その結果を日本物理学会,日本中性子科学会,茨城県中性子利用促進研究会などで発表した.ひとつの例として,巨大磁気モーメントの存在が長年にわたり議論になってきた窒化鉄薄膜の磁気構造解析を行い,巨大磁気モーメントは存在しないこと,ユニットセル内に存在する異なる3サイトに属するFeが異なる大きさの磁気モーメントを持つことを明らかにし,バンド計算と矛盾のないことを示した.3.磁気ヘッド材料などでスペーサー層として重要な役割を果たしているRuの,Kセルによる蒸着に成功した.Ruは高融点金属でありKセルによる蒸着はこれまで試みられた事がなかった.この手法と基板表面の水素終端処理法を使って,歪みのない高品位のエピタキシャル膜を成膜するための基盤を築くことができた.本年度は研究初年度であるため、既存のMBE装置を単原子制御人工格子作成用に整備することを最優先課題とした。また、それに平行してすでに存在する試料の偏極・非偏極中性子回折実験を行って精密磁気構造解析手法の確立に取り組んだ。単原子制御磁性人工格子としては、すでに実績のあるCo/Ru人工格子を選んだ。ただし、より完全なエピタキシャル成長を目指し、これまで使われてきたEガンではなくKセルを使うこと、さらに、原子力研究開発機構で開発したSi基板の表面に水素終端を施すとその上に成長させる膜に全くひずみが入らないという技術を適用して、これまでに得られているものよりも良質なエピタキシャル成長膜を得ることを目指した。Ruは必要な飽和蒸気圧を得るのに必要な温度が2,000Cと高く、高温用Kセルでも高温限界付近で使用することになるため、適切なるつぼの選定と精密な温度制御が必要になる。特に温度制御の点に関しては、温度をモニターする熱電対をセルに接触させることができないので、正確な温度を測定するのが容易ではない。実際のセルの温度と熱電対の指示値が300C近く異なるという予想外の事態から、るつぼとMBE成膜チャンバーの汚染事故が発生したため、計画に遅延が生じた。このため、るつぼとチャンバーの修復作業にかかる待機時間を、シャッター制御と膜厚モニターを組み合わせた、単原子制御成膜の自動化を前倒しで行ってほぼ完成した。その一方で、水素終端したSi基板状に成長させたSrOエピタキシャル膜のX線と中性子反射率による構造評価、Cr/Sn人工格子の3次元偏極解析装置(CRYOPAD)を使った磁気構造の精密解析を行った。本年度は前年度に引き続き、高温Kセルと表面に水素終端を施したSi基板を使って、これまでに得られているものよりも良質なエピタキシャル性を有する単原子制御磁性人工格子Co/Ruの作成をめざした。Ruは必要な飽和蒸気圧を得るのに必要な温度が2,000C付近であることが予想され、高温用Kセルでも高温限界付近で使用することになる。2,100C付近までKセルの温度を上げたところ、約0.5nm/sec程度の蒸着レートが得られ、XPSによってRuが基板上に蒸着されていることを確認した。

この条件でさらに実験を進めていたところ、これまでに発表されているRuとWの2元状態図では、この温度に付近に液相線は存在しないにもかかわらず、RuとWるつぼの間で反応が起こり、Kセル内でるつぼが溶解、Kセルが大きく破損して修理を余儀なくされた。Kセル修理後の実験では、1,985Cで0.1nm/secの蒸着レートが長時間にわたって得られており、この温度でエピタキシャル成長の条件を探索している。また、このKセルの修理期間を利用して、高融点金属の蒸着が可能な電子銃の整備も平行して進め、平成19年度から電子銃によるRuの蒸着にも着手できるような実験環境を整備した。その一方で、引き続きCr/Sn人工格子の3次元偏極解析装置(CRYOPAD)を使った磁気構造の精密解析をすすめ、2006年9月に行われた国際会議PNCMI2006(Polarized Neutrons for Condensed Matter Investigations)にその結果を発表した。磁気記録材料・デバイスとして有望な磁気特性,あるいは,新奇な磁気特性を期待することのできる単原子制御人工合金膜を含むエピタキシャル磁性合金膜作成用MBE装置の整備をさらに進め,水素クラッキングセルを導入し,基板表面の水素終端処理が行えるようにした.これにより,界面における原子拡散を抑剃することで,平坦な界面を実現できることから,高品位な単原子制御膜の作成が可能となった.その後,高真空チャンバー内の微小リークの発生やターボ分子ポンプの故障などの障害が続き,実際の成膜を行うことはできていないが,次年度以降の本格的な成膜に向けての準備を整えることができた.これと平行して,中性子,特に偏極中性子を使った精密磁気構造解析を行うために,日本原子力研究開発機構の研究用原子炉JRR-3に設置されている3軸型偏極中性子分光器TAS-1と中性子反射率計SUIRENの偏極オプションの整備を行って,その結果得られた性能向上について,論文発表と学会発表を行った.さらに,これら2台の装置を使って,研究分担者や共同研究者から試料の提供を受け,巨大磁気モーメントと高密度磁気記録テープ材料としての注目を集めている窒化鉄薄膜や,高密度磁気記録ハードディスク用読取ヘッド及びMRAM用に開発が進められている磁気多層膜に対して,幅広い空間スケールでの精密磁気構造解析を行って,その結果を日本物理学会,日本中性子科学会,茨城県中性子利用促進研究会などで発表した.
FRETを中心とした核内受容体の細胞内輸送および局在機構の時間的空間的解析

1.アンドロゲン不応症患者由来の変異型アンドロゲン受容体(AR)の細胞内動態解析完全型および不完全型のアンドロゲン不応症患者由来の2種類の変異型AR(AR-C579F,AR-F582Y)の細胞内動態を、GFP融合タンパク質を用いて解析したところ、野生型ARはリガンド処理後に細胞質から核に速やかに移行して細かいfociを形成するのに対して、変異型ARはまず細胞質に大きなdotを認め、遅れて核に少数で大きいdotを形成した。免疫電顕の結果から、変異型ARの細胞質のdotはミトコンドリアの近傍に位置することが明らかになった。またFRAP解析の結果、変異型ARは野生型に比べて、核内でのmobilityが低下していた。このような変異型ARの核移行障害、核内における局在の障害および核内でのmobilityの低下がAIS発症の原因であることが示唆された。2.新規コリプレッサーTZFおよびTobによるAR転写活性化抑制メカニズムの解析我々は、精巣で特異的に発現するZnフィンガータンパク質であるTZFが、ARの転写活性化能を抑制し、リガンド依存性にARと共局在することを見出した。TZFはARのアミノ末端側と結合した。TZFの欠失ミュータントを作製したところ、TZFの中央部分(アミノ酸512-663)が、ARとの結合および核内共局在に必須であることが明らかになった。TZF複合体はピストン脱アセチル化酵素活性を有しており、HDAC2が複合体中に検出された。GFP融合タンパク質を用いてARとTZFの細胞内動態を調べたところ、TZFの共発現によって、ARのリガンド依存性核内foci形成は抑制された。このTZFによるARのfoci形成の抑制は、コアクチベーターであるTIF2の発現によって回復することから、ARのfoci形成と転写活性化能は相関することが示された。また、骨芽細胞分化を抑制するTobタンパク質もARの転写活性化を抑制することが明らかになった。1.アンドロゲン不応症(AIS)患者由来の変異型アンドロゲン受容体(AR)の細胞内動態の解析AIS患者由来でDNA結合ドメインにアミノ酸置換を有する変異型AR(AR-C579F)の細胞内動態を、GFP融合タンパク質を用いて解析した。野生型ARはリガンド処理後に細胞質から核に速やかに移行して細かいfociを形成するのに対して、AR-C579Fはまず細胞質に大きなdotを認め、遅れて核に少数で大きいdotを形成した。細胞内小器官に特異的に局在する蛍光物質を用いた二重染色やGFP抗体を用いた免疫電顕の結果から、AR-C579Fの細胞質のdotはミトコンドリアの近傍に位置することが明らかになった。また核内fociに対するFRAP解析の結果、AR-C579Fは野生型ARに比べて、核内でのmobilityが低下していた。このようなAR-C579Fの核移行障害、核内における局在の障害および核内でのmobilityの低下がAIS発症の原因であることが示唆された。2.FRETシステムの構築ARとCFP、ARと直接結合することが報告されている転写共役因子SRC-1あるいはTIF2とYFPの融合タンパク質をそれぞれ発現するベクターを作製した。両者をCOS-7細胞で発現させて、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、FRET解析の条件設定を行っている。3.Runx2タンパク質による、ステロイドホルモン受容体を介する転写活性化の抑制

1.新規コリプレッサーTZFタンパク質によるAR転写活性化抑制メカニズムの解析TZFは精巣で特異的に発現するZnフィンガータンパク質である。我々は、TZFがARの転写活性化能を抑制し、リガンド依存性にARと共局在することを見出した。TZFはARのアミノ末端側と結合した。TZFの欠失ミュータントを作製したところ、TZFの中央部分(アミノ酸512-663)が、ARとの結合および核内共局在に必須であることが明らかになった。TZF複合体はヒストン脱アセチル化酵素活性を有しており、HDAC2が複合体中に検出された。GFP融合タンパク質を用いてARとTZFの細胞内動態を調べたところ、TZFの共発現によって、ARのリガンド依存性核内foci形成は抑制された。このTZFによるARのfoci形成の抑制は、コアクチベーターであるTIF2の発現によって回復することから、ARのfoci形成と転写活性化能は相関することが示された。また、TZFのsplicing variantであるTZF-Lは、TZFとは逆にARの転写活性化を促進した。TZFおよびTZF-Lは、ホモダイマーあるいはヘテロダイマーを形成しており、TZF-LはTZFのホモダイマー形成を抑制した。2つのバリアントがARの転写活性化の調節に働いていることが示唆された。2.アンドロゲン不応症(AIS)患者由来の変異型アンドロゲン受容体の細胞内動態の解析AIS患者由来で、DNA結合ドメインに変異を持つARについて解析したところ、野生型のARと異なり、細胞質のミトコンドリア近傍に大きなドットを形成した。変異型ARも核内にドットを形成するが、野生型と比べると数が少なくサイズが大きかった。また変異型ARは核内のmobility低下を認めた。このような変異型ARにおける細胞内動態の異常が、AIS発症の原因であることが示唆された。
ヒト乳癌骨転移における腫瘍細胞の増殖因子.受容体の発現からみた生物学的特性

1.ヌードラットを用いたヒト乳癌骨転移モデルの樹立と転移形成能:MDA-MB-231乳癌細胞を用い,8週齡ラットの左頚動脈から大動脈内に10^6個の細胞を接種.4週目より隔週にX線撮影を行い最長8週目まで骨転移の形成,進展を評価.この結果,100%(20/20)の骨転移を生じ,1例にのみ肺転移をみとめた.他の培養株であるMCF-7細胞T47D細胞,BT474細胞について検討したが転移を生じなかった.そこで,MCF-7細胞に線維芽細胞増殖因子を導入し転移能を増強したMKL-4細胞を用いたところ20%(1/5)の骨転移が得られ,本モデルの骨転移は乳癌細胞が骨髄内に到達して後の特異的な増殖能が転移形成に関与していることが示唆された.骨基質に豊富なTGF-βの増殖抑制に関与するp53の変異に着目し,MDA-MB-231とMKL-4の転移骨組織を用いてTGF-β,p53の発現を免疫組織学的に検討.MDA-MB-231にP53の発現をみとめたがMKL-4にはみとめず,TGF-βはいずれも発現していなかった.また,MDA-MB-231自然肺転移細胞株を樹立しており骨転移能を検討中である.2.ヒト乳癌剖検材料27例の転移骨における増殖因子/受容体発現:c-met(87%),ER(52%),c-erbB-2(43%)の順に発現していたが,IGF-IIR,FGFR,PDGFの発現はみとめなかった.これらは原発腫瘍組織の発現と同等であった.現在,パラフィンブロックからDNAを抽出しており,遺伝子レベルでの検討を予定している.今後の研究展開は,抗体の種類,組織の固定脱灰操作等染色性に影響を及ぼす因子について検討するため剖検材料の新鮮標本を集積している.また,剖検材料は死後変化,治療効果などが腫瘍組織に影響しており動物モデルによる検討が不可欠と考えられ,異なった転移能を有する細胞株の比較検討を行う.活性型,不活性型TGF-βに対する抗体を用いた免疫組織染色及びin situ hybridizationによるTGF-βmRNAの局在とPCR-SSCPによるp53の変異を検出する予定である.(1)ヒト乳癌細胞株MDA-MB231をヌードマウスのmammary padに移植。自然腋窩リンパ節への自然転移をおこす細胞株をFidler等の方法に準じて樹立している。現在第4世代に入り、親細胞より増殖速度が早く、リンパ節転移度の高い細胞株が得られつつある。倒立顕微鏡下の観察では形態学的に親細胞は紡錘形であるのに対し、分離株は上皮様で明らかに異なっており骨転移能を検討中である。(2)MDA-MB231を56日齢の雌ヌードラットの胸部大動脈内に接種することにより実験骨転移を作成した。接種後4週目にレントゲン撮影を行って骨転移を検索すると明らかな骨融解像をみとめ、組織学的にも骨転移が証明された。現在、ホルモン感受性株T47D、原発乳癌より分離された乳癌株BT474についてもこのモデルの適応を検討している。(3)ヒト乳癌骨転移材料を用いた増殖特性の研究は、現在増殖因子、受容体蛋白の発現を免疫組織学的に検討している。ER, EGFR, c-erbB-2, TGFα, c-met (HGFR)についての、現在22例の剖検例について検討した。その結果、ER陽性率は原発腫瘍において52%であり、c-erbB-2, TGFαの発現率は骨転移細胞においてそれぞれ、48%, 68%で原発腫瘍と転移腫瘍で一致していたが特異的とは考えられなかった。一方、c-metの発現は原発腫瘍において78%、骨転移細胞において86%と共に高率であったが、一致率は61%であり、乳癌細胞の骨(骨髄)内での増殖に関与している可能性も考えられ、現在遺伝子レベルでの検討を行っている。EGFRの発現はみとめられなかった。1.ヌードラットを用いたヒト乳癌骨転移モデルの樹立と転移形成能:MDA-MB-231乳癌細胞を用い,8週齡ラットの左頚動脈から大動脈内に10^6個の細胞を接種.4週目より隔週にX線撮影を行い最長8週目まで骨転移の形成,進展を評価.この結果,100%(20/20)の骨転移を生じ,1例にのみ肺転移をみとめた.他の培養株であるMCF-7細胞T47D細胞,BT474細胞について検討したが転移を生じなかった.そこで,MCF-7細胞に線維芽細胞増殖因子を導入し転移能を増強したMKL-4細胞を用いたところ20%(1/5)の骨転移が得られ,本モデルの骨転移は乳癌細胞が骨髄内に到達して後の特異的な増殖能が転移形成に関与していることが示唆された.骨基質に豊富なTGF-βの増殖抑制に関与するp53の変異に着目し,MDA-MB-231とMKL-4の転移骨組織を用いてTGF-β,p53の発現を免疫組織学的に検討.MDA-MB-231にP53の発現をみとめたがMKL-4にはみとめず,TGF-βはいずれも発現していなかった.また,MDA-MB-231自然肺転移細胞株を樹立しており骨転移能を検討中である.2.ヒト

乳癌剖検材料27例の転移骨における増殖因子/受容体発現:c-met(87%),ER(52%),c-erbB-2(43%)の順に発現していたが,IGF-IIR,FGFR,PDGFの発現はみとめなかった.これらは原発腫瘍組織の発現と同等であった.現在,パラフィンブロックからDNAを抽出しており,遺伝子レベルでの検討を予定している.今後の研究展開は,抗体の種類,組織の固定脱灰操作等染色性に影響を及ぼす因子について検討するため剖検材料の新鮮標本を集積している.また,剖検材料は死後変化,治療効果などが腫瘍組織に影響しており動物モデルによる検討が不可欠と考えられ,異なった転移能を有する細胞株の比較検討を行う.活性型,不活性型TGF-βに対する抗体を用いた免疫組織染色及びin situ hybridizationによるTGF-βmRNAの局在とPCR-SSCPによるp53の変異を検出する予定である.臨床的検討は剖検検体27例から原発,転移骨の増殖因子/受容体の発現を免疫組織学的に検討したが,特異的なものは,同定されてない.現在,パラフィンブロックからDNAを抽出しており,遺伝子レベルでの検討を予定している.In vivoにおける研究のためにヌードラットを用いたヒト乳癌骨転移モデルの樹立をおこなった.ヌードラットはマウスに比較して繰り返して採血,採尿,画像評価ができ,実験操作が簡便であり,選択的に骨転移を形成させるモデルの作成に適していた.培養ヒト乳癌細胞の多くは転移能が低く、細胞株の選択が課題でありヌードマウスで実験的に骨転移を起こすことが報告されているMDA-MB-231乳癌細胞を用いた.8週齢ラットの左頚動脈から大動脈内に10^6個の細胞を接種.4週目より隔週にX線撮影を行い最長8週目まで骨転移の形成,進展を評価.この結果,100%(20/20)の骨転移を生じ,1例にのみ肺転移をみとめた.他の培養株であるMCF-7細胞,T47D細胞,BT474細胞について検討したが転移を生じなかった.そこで,MCF-7細胞に線維芽細胞増殖因子を導入し転移能を増強したMKL-4細胞を用いたところ20%(1/5)の骨転移が得られ,本モデルの骨転移は乳癌細胞が骨髄内に到達して後の特異的な増殖能が転移形成に関与していることが示唆された.骨基質に豊富なTGF-βの増殖抑制に関与するp53の変異に着目し,MDA-MB-231とMKL-4の転移骨組織を用いてTGF-β,p53の発現を免疫組織学的に検討.MDA-MB-231にP53の発現をみとめたがMKL-4にはみとめず,TGF-βはいずれも発現していなかった.しかし,抗体の種類,組織の固定脱灰操作等染色性に影響を及ぼす因子について検討中である.今後の研究展開は,脱灰操作を加えない骨組織(樹脂包埋)により活性型,不活性型TGF-βに対する抗体を用いた免疫組織染色及びin situ hybridizationによるTGF-βmRNAの局在とPCR-SSCPによるp53の変異を検出する.
拍動型循環シミュレータを用いた僧帽弁形成手技のin vitro形態解析

これまで早稲田大学先端生命医科学センター(TWIns)では、拍動型循環シュミレータを独自に開発し、僧帽弁機能の評価を行ってきた.今回の研究の主たる目的は、本シュミレータを用いた僧帽弁形態の解析であり、特にシュミレータに改良を加え、従来型では困難であった直視下の弁形態のより詳細な評価を可能とする実験系を確立することである.研究期間の初期においては、従来の拍動型循環シュミレータを用いて、僧帽弁位におけるステント生体弁とステントレス生体弁の弁機能の比較を行った.その結果、一心拍あたりの弁逆流がステントレス生体弁のほうが有意に少ないことが明らかとなり、さらにその差がステント生体弁でしばしばみられる弁閉鎖位における中心部分の漏れの有無による差であることが明らかとなった.この実験により得られた知見は、第13回低侵襲心臓手術学会(ISMICS)において発表し(後述)、現在論文作成中である.また同時に拍動型循環シュミレータの改良の計画をすすめた.従来のシュミレータでは観察が難しかった、正面ならびに側面からの直視下の弁の動きがより詳細に観察可能となるように、僧帽弁装着版と水槽のデザインに変更を加えた.装着版と水槽部分を新たに発注、作成した.駆動部分などは従来のものを使用した.これらを組み合わせた新しいシュミレータは9月に完成した.すでにブタ僧帽弁を用いて、シュミレータを駆動させた予備実験を実施した.一部に改良が必要であることが判明したが、今後は新しいシュミレータを使用して、僧帽弁手術手技に伴う弁形態変化など解析していく予定である.これまで早稲田大学先端生命医科学センター(TWIns)では、拍動型循環シュミレータを独自に開発し、僧帽弁機能の評価を行ってきた.今回の研究の主たる目的は、本シュミレータを用いた僧帽弁形態の解析であり、特にシュミレータに改良を加え、従来型では困難であった直視下の弁形態のより詳細な評価を可能とする実験系を確立することである.研究期間の初期においては、従来の拍動型循環シュミレータを用いて、僧帽弁位におけるステント生体弁とステントレス生体弁の弁機能の比較を行った.その結果、一心拍あたりの弁逆流がステントレス生体弁のほうが有意に少ないことが明らかとなり、さらにその差がステント生体弁でしばしばみられる弁閉鎖位における中心部分の漏れの有無による差であることが明らかとなった.この実験により得られた知見は、第13回低侵襲心臓手術学会(ISMICS)において発表し(後述)、現在論文作成中である.また同時に拍動型循環シュミレータの改良の計画をすすめた.従来のシュミレータでは観察が難しかった、正面ならびに側面からの直視下の弁の動きがより詳細に観察可能となるように、僧帽弁装着版と水槽のデザインに変更を加えた.装着版と水槽部分を新たに発注、作成した.駆動部分などは従来のものを使用した.これらを組み合わせた新しいシュミレータは9月に完成した.すでにブタ僧帽弁を用いて、シュミレータを駆動させた予備実験を実施した.一部に改良が必要であることが判明したが、今後は新しいシュミレータを使用して、僧帽弁手術手技に伴う弁形態変化など解析していく予定である.
血管内皮細胞機能制御の情報伝達機構とその脂質による修飾

動脈硬化の発症進展に関係する変性脂質であるリゾホスファチジルコリン(LPC)は内皮細胞の障害因子として種々の作用を有する。LPCの内皮機能障害の作用を更に明かにするため、LPCが、障害因子である活性酸素(O_2)の内皮細胞での産生に及ぼす影響、並びに内皮細胞の増殖、遊走に及ぼす影響を検討し、以下の結果を得た。1.ウシ大動脈内皮細胞(BAEC)において、NADH、NADPH投与によりBAECの膜分画におけるO_2産生活性が増加した。種々の活性酸素産生酵素の阻害薬を用いた検討により、この内皮細胞ではO_2の産生はNADH/NADPHoxidaseの活性化に依存することが判明した。また、LPC(10μg/ml)によりBAECからのO_2産生は増加し、その増加はNADH/NADPH oxidase阻害薬によって抑制された。2.bFGFにより濃度依存性にBAECでERK1/2が活性化された。一方、bFGFによりBAECの増殖並びに遊走が出現し、これらはMEK阻害薬PD98059ににより抑制された。また、LPCはERK1/2の活性化をPKC非依存性に抑制することにより、bFGFによる内皮細胞の増殖、遊走を抑制することが明らかになった。またLPCは、bFGF受容体の自己リン酸化にも影響を与えなかった。以上より、LPCは細胞障害因子を産生すると共に、障害が受けた内皮細胞の再生機転を阻害することにより、動脈硬化を始めとした血管病変の発症、進展に関与しているものと考えられる。