hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
台湾における恙虫病の調査ーわが国における本病多発と関連してー

第2次大戦後は日本の多発な契機に1985年ごろから台湾省伝染病研究所を中心に調査が行われるようになった。同所の報告患者数(確定数)を集計すると、19851990年の6年間に約660(340、死亡2)名の発生をみた。患者の発生は主に511月にまたがり、6、7月の夏期に集中し、10月に小さな山がみられる。台湾本島と大陸との間にある澎気島に多発し、次で本島東部諸県に多く、主として農民や各地に駐屯する軍人にみられる。予後は良好で、日本の新型恙虫病にかなり類似している。2.患者血清の検討台湾大学医学院、高雄医学院の協力を得て、全島から集められた住民の血清426検体について間接蛍光抗体法(免疫ペルオキシダ-ゼ法)で検査したところ、平均54.9%が抗体陽性で、特に台東県の離島蘭嶼(96.0%)および澎湖県七美(66.7%)が高値を示した。別に行われた台中市とその近郊90検体では41.1%が得られた。それで日本および東南アジア方面と同様に、いわゆる不顕性感染者がかなり存在すると考えられた。患者血清は概して3標準株との反応特異性に乏しく、また日本各地で分離された弱毒リケッチア株との反応性も弱かった。これらのことは、日本および南方系恙虫病との関連を考える上で注目される。なお澎湖島の現地医師に依頼して集めた恙虫病患者11名の血液からはリケッチアの分離にまだ成功していない。3.野ネズミ寄生ツツガムシの調査および病原リケッチアの分離台湾各地の平地(19861990年、78月)、台東、屏東,高雄、台北、花蓮の5県で捕獲した野ネズミ5種58匹から約8500個体のツツガムシ幼虫が得られ、その90%以上がデリ-ツツガムシであった。しかし一部の地域の野ネズミからは、本種が得られないか、少なかった。中部の嘉義県阿里山(標高2,200m、1988年8月)ではタツアカネズミ、ニイタカネズミの2種19匹からはデリ-ツツガムシ以外の7種102個体のツツガムシ幼虫が得られた。澎湖島(1986年78月)ではハツカネズミ、ジヤコウネズミ2種18匹から457個体のツツガムシ幼虫(約99%はデリ-ツツガムシ)、蘭嶼(1990年8月)ではクマネズミ53匹から33,000個体の幼虫(約95%はデリ-ツツガムシ)が得られた。以上のうち台東、屏東、澎湖島の野ネズミ6匹それぞれから得られた病原リケッチアについては目下その抗原構造および型別の検討が行われている。また蘭嶼のデリ-ツツガムシ2個体からのリケッチアについても目下検討中である。台湾の高地(阿里山、日本時代に恙虫病発生の記録あり)では南方系および台湾の主媒介者であるデリ-ツツガムシが認められず、代って日本の新型恙虫病の主媒介者の一つであるタテツツガムシ類似種、またカワムラツツガムシ等が得られたことは注目される。近年、恙虫病リケッチアは媒介者であるツツガムシそのものの共生体で、しかも経卵伝達されることが次第に明かになってきた。このことに関連してツツガムシ種と病原リケッチア株との間に強い結びつきがあり、しかも病原リケッチア保有ツツガムシ幼虫は地上に時に直経数ヤ-ドの地点(hot spot)に集積生息していると推定されている。本調査で得られた上記の各種資料についても、特にこれらの観点から日本および東南アジアを通じて本病伝播のメカニズムに関して更に解析を進めてゆくつもりである。
生体内に移入した生体物質標識マーカーとしての蛍光ナノ粒子の応用

石灰化した骨組織を破壊・吸収することで骨代謝に関与する破骨細胞の起源はマクロファージ系の細胞である。したがって破骨細胞の成熟過程においても免疫細胞と同様にケモカインによる制御機構があることが予想された。骨髄細胞から組織に重固有のマクロファージへと分化する過程において、ケモカインが要な役割を担い、同時に組織の恒常性の維持に寄与しているという仮説を基に、骨リモデリングに関与する破骨細胞ならびに骨芽細胞の分化成熟におけるケモカインの機能に関する研究を行った。本研究では、破骨細胞の成熟と細胞融合におけるケモカインならびにケモカイン受容体の役割についてわれわれが開発した蛍光ナノプローブで破骨細胞を標識しその高輝度蛍光を利用して、破骨細胞の形成過程に対するケモカインならびにケモカイン受容体の影響を解析した。破骨細胞においては分化の過程において特定のケモカイン受容体CCR1ならびにCCR5が選択的に発現していた。また骨組織に存在する間葉系細胞から分化する骨芽細胞からは、上記受容体に対応するリガンドが選択的に分泌されており、このケモカインとケモカイン受容体との持続的相互作用が破骨細胞の分化成熟に必須の因子であることを示した。東京大学大学院医学系研究科の松島鋼治教授との共同研究により提供を受けた、これら受容体の遺伝子欠損マウス(CCR1KO、CCR5KOならびにCX3CR1KOの各遺伝子破壊マウス)では、骨代謝回転に異常を来しており、骨密度・骨長ならびに骨構造が大きく変化していた。それに付随して下顎骨の成長不全に起因する不正咬合が観察された。当該研究は現在論文投稿準備中である。本試験は、一桁ナノメートルサイズの蛍光半導体ナノ粒子(カンタムドット:QD)を生物・医療分野へ応用可能な形態に表面を加工・修飾することで、薬物伝達システムの開発を可能することを目的とする。現在のところ、遺伝子治療あるいはドラッグデリバリーシステム(DDS)において遺伝子・薬物の体内への導入担体として検討されているのは、大きくウィルスまたはリポソームに大別される。なかでもウィルス担体に関してはいち早く臨床研究まで到達したものの、その後病原性など担体の安全性の問題からその後の研究は停滞を余儀なくされている。この研究では、蛍光半導体ナノ粒子を、特定の細胞に薬物や遺伝子を選択的に導入するために用いる非ウィルス・非リポソーム系の新規遺伝子/薬物導入担体実験としての使用法を確立することを最終目的とする。本年度は、蛍光半導体ナノ粒子に薬物・生理活性物質を結合させた機能的複合体を作成し、in vitroにおける薬効について解析した。蛍光半導体ナノ粒子に遺伝子を結合させた遺伝子導入担体を作成した。これを、すでに蛍光粒子QDがエンドサイトーシスによって取り込まれることが判明している上皮系培養細胞であるヒトHEK293細胞の培養系に添加し、標的遺伝子の発現の有無を検討した。結果、ナノ粒子QDに遺伝子のみを結合させた担体においては、細胞に遺伝子の発現が確認できなかった。一方、同時にナノ粒子表面に核内移行性をもつシグナルペプチドを付加することで、細胞に遺伝子を導入・発現させることが可能となった。これらのことから、少なくともin vitroにおいては遺伝子を細胞内に導入し、かつ継続的に発現させることが可能であった。上記のほかに、蛍光ナノ粒子QDを細胞の蛍光標識体として用いてマクロファージに導入し炎症時におけるマクロファージの体内動態を、またタンパク質の標識体として自己免疫性の血管炎・糸球体腎炎を発症する動物モデルにおける自己抗体の体内動態を、それぞれ解析し、病態への関与を観察した。これら技術は、蛍光ナノ粒子QDを単なる蛍光標識体としてのみならず、10ナノメートル以下という微小粒子の特徴を最大限に活用し遺伝子等を運搬する担体としても活用可能であることを示し、材料工学的・分子生物学実験的に、また医療技術的にも重要であると考えている。
脳腫瘍擬似血管を標的とした新規ＤＤＳ治療薬の開発と治療への応用

本研究では、脳腫瘍グリオーマに対する新規DDS治療法の開発を目指した研究を行ってきた。中でも近年脳腫瘍組織中に存在し、腫瘍増殖や転移に関与することが明らかとなってきた擬似血管構造に着目し、標的とした特異抗体の創製を試みた。まず、in vitroにおいて脳腫瘍細胞が管腔形成することによって構築された擬似血管モデル細胞を再現することに成功した。次に、この細胞たんぱく質をマウスに免疫することによって、脳腫瘍擬似血管免疫抗体ライブラリを創出した。さらにこの抗体と抗原たんぱく質の結合親和性を利用したパンニングと呼ばれる手法を用いることで、擬似血管に対する高親和性抗体を増幅させることに成功した。本申請課題では、難治性がんである脳腫瘍、中でもグリオーマの治療に焦点を絞り新規治療法の開発を目指した研究を行った。我々は、近年腫瘍組織内でがん増殖および転移に関与することが報告されてきた擬似血管(Tumor Vasculogenic Mimicry; TVM)に着目し、TVMを標的とした抗体医薬の開発およびがんワクチン療法の開発を進めてきた。その点本年度は、まず昨年度に確立した方法にて作成したTVMモデル抗原を免疫したマウスより脾臓を摘出し、脳腫瘍TVM免疫抗体ライブラリの作製を行った。具体的には、脾細胞よりTotal RNAを回収し、抗体の抗原認識部位である可変領域の重鎖(VH)と軽鎖(VL)を連結した一本鎖抗体ライブラリを作製した。さらにファージ表面提示法を駆使し作製した抗体ライブラリから、TVMに特異的な抗体を単離・創出するために、TVMモデル細胞と抗体との親和性を利用したパンニングという手法を用いてTVM高親和性抗体の選別を行った。その結果、パンニング操作を繰り返し行うことによりTVMに対して強く結合する抗体ファージの増幅を確認することができた。今後は、TVMに対する結合特異性を指標にスクリーニングを行っていく。また、TVM細胞を抗原として用いたがん免疫療法に関しては、TVMを抗原として導入した樹状細胞をマウスに免疫することにより、樹状細胞を単独で免疫したマウスと比較をして腫瘍の増殖に対する抑制作用を発揮する可能性が示唆された。このように本研究課題により、脳腫瘍におけるTVMはがん治療における標的となりうることが示され、TVMを標的とした抗体の作製ならびにワクチン療法の開発がグリオーマに対する新規DDS型治療法の開発に繋がるものと期待される。本申請課題では、難治性のがんとして知られている脳腫瘍の中でも極めて予後不良であることが報告されているグリオーマに対する新規治療法の開発を目的としている。特に近年、腫瘍増殖や転移に関与することが明らかとなってきたがん細胞由来の擬似血管構造(Vasculogenic Mimicry; VM)に着目し、VMを標的とした免疫療法の開発を目指している。その点、本年度は脳腫瘍グリオーマ細胞である203G細胞をマトリゲル上で3次元培養を行うことで、血管様のVM管腔構造を形成することを明らかとした。またファージディスプレイ法を駆使した脳腫瘍における抗VM抗体の単離を目指した検討として、このVM様構造を抗原たんぱく質として抽出して用いる免疫抗体ライブラリの創出を検討した。VMを隔週で2回免疫したマウスより回収した血清を用いてIgGの抗体価測定を行ったところ、免疫抗原特異的な抗体価の上昇が確認できた。次年度は、免疫マウスの脾臓より抗体遺伝子ライブラリを構築し、特異的抗体の単離を目指した検討を行っていく予定である。また免疫療法の効果を検討するためのマウスグリオーマ細胞同所移植モデルを作成するにあたり、その効果を簡便に評価するための手法として、ルシフェラーゼ遺伝子発現グリオーマ細胞の樹立を試みた。ルシフェラーゼ搭載プラスミドを203G細胞に対してリポフェクチンを用いて導入し、抗生物質によるセレクションを行った。その後、限界希釈法によりモノクローン細胞を樹立した。この細胞のルシフェラーゼアッセイの結果から203G細胞への遺伝子導入できたことが明らかとなり、安定発現株の作成に成功した。本年度は、この細胞を用いてマウス同所移植モデルを作成し、治療効果を明らかとするための評価系として用いていく予定である。当初予定していた計画の順序とは異なっているものの、全体の実験計画としては順調に進んでいると考えている。まず抗原としては、in vitroにおいてマトリゲル上で脳腫瘍細胞を培養することによって形成した管腔構造をVMとして用いることができることを本年度中に明らかとした。また、このVMをモデル抗原として用いた抗体の作成にも着手することができた点は特筆すべき事項である。具体的には、VM抗原をマウスに免疫することによって、VMに対する血清中の抗体価が上昇することを確認した。次年度はこれらマウス脾臓より回収した遺伝子をもとに、抗体遺伝子ライブラリを作成してファージディスプレイ法を駆使した抗体の単離・同定に向けた検討を行っていける状態にある。

また治療効果を検討するにあたっては、動物モデルによる脳腫瘍の効果を定量的に評価する必要がある。その点申請者は、その際の有用なツールになると考えられるルシフェラーゼ遺伝子導入細胞の作成に成功するなど、治療法を開発するための評価系も確立しつつあり、次年度への足がかりになると考えている。以上のように、VMを標的とした抗体の創出・免疫療法を確立するための検討および評価系の構築に向けた検討が並行して進められていることから、研究計画全体として予定通りに進捗していると考える。次年度は、当該年度にVMに対する抗体価の上昇が確認されたマウスより脾臓を摘出して、その中からTotal RNAの回収およびmRNAの精製を行う。さらに、抗体の可変領域であるVL, VH遺伝子のクローニングを行い、リンカーにより連結した一本鎖抗体ライブラリを創出する。一億種類以上もの種類からなる抗体ライブラリの中から、ファージ表面提示法を駆使してVMに対する特異的結合抗体の単離を目指す。本検討にあたっては、作成したファージ抗体ライブラリと標的細胞の結合性を利用したパンニングという方法を利用して高親和性抗体クローンの濃縮を行う。ただし本方法では、VM構造ではなく、203G細胞そのものへの結合性を示す抗体が得られてしまう可能性も想定される。したがって、予め203G細胞とファージ抗体を結合させて、203G細胞由来のたんぱく質を認識してしまうファージ抗体を取り除いた後に、VM構造を形成した203G細胞と結合させることで、VMを特異的に認識する抗体を濃縮するサブトラクションパンニングを行う。得られた抗体は、VMに対する特異的抗体であると予想されるため、抗原を同定することによって、VMの標的とした治療の創薬ターゲットとなる分子の探索にも繋がると期待できる。また一方で並行して、免疫に用いたVM抗原を用いてワクチン療法を試みることで、VMの治療標的としての有用性を明らかとする予定である。具体的には、ワクチン投与による細胞性免疫の誘導能を血清抗体価や血清中サイトカイン、リンパ組織中のリンパ球ポピュレーションを解析するなどの検討を行う。本年度は、キャンパスの移転に伴う準備や作業が生じたこと、また当初の動物実験計画を次年度の計画と入れ替えて遂行したため、実験動物購入費が抑えられ、支出に関して予定していた予算の一部を繰り越すこととなった。次年度には、VMを標的としたワクチン療法の開発および確立した治療法の有用性を評価するために動物モデルを用いた検討が必要となり動物の購入費として予算を計上する。また抗体ライブラリの作成およびスクリーニングのために必要な遺伝子関連試薬の購入、および単離した抗体をたんぱく質精製するための試薬購入が必要となるために予算を計上する。またこれら成果を学会等に参加して報告するための予算としても使用予定である。
老化に伴うヒト皮膚線維芽細胞の遊走能低下の機構に関する研究

インビボ、インビトロ細胞老化に伴い、剥離された空所へのヒト皮膚線維芽細胞の遊走能は低下する。この遊走能低下の機構を解明するため遊走調節因子を検討した結果、成人皮膚線維芽細胞の遊走はパラクリン因子のPDGFとコラーゲンが(成人型)、胎児皮膚線維芽細胞の遊走はオートクリン因子のbFGFとコラーゲンが調節していることが分かった(胎児型)。この遊走刺激の変化がいつ起きるかを調べたところ、胎児皮膚線維芽細胞だけがbFGF刺激で遊走し、新生児、幼児、成人、老人皮膚線維芽細胞はPDGFの刺激で遊走した。すなわち、胎児型-成人型転換は誕生前に起きる。この違いを説明するために、bFGFのレセプターであるFGFレセプター1、2、3、4のmRNAの発現を検討した。結果は、胎児、成人、老人皮膚線維芽細胞にはFGFレセプター1のみが発現しており、発現量はこの順に減少した。シグナリングの胎児-成人型転換は既知のFGFレセプターでは説明されない。次に、ヒト皮膚線維芽細胞の遊走の抑制とコラーゲン合成の関係を検討した。インターフェロン-βは、ヒト胎児皮膚線維芽細胞の剥離された空所への遊走を濃度依存的に抑制することが見られた。この抑制効果は、インターフェロン-βの中和抗体で無効になることから特異的である。細胞遊走が抑制されるインターフェロン-βの濃度で、コラーゲン合成は抑制された。他方、成人血清はヒト胎児皮膚線維芽細胞の遊走を非常に強く(45%)抑制した。このとき、コラーゲン合成も抑制された。これらの結果は、コラーゲン(合成)と細胞遊走が強く相関していることを明らかにした。コラーゲン合成がインビトロ細胞老化で低下するとの報告と併せて考えると、遊走能の細胞老化における低下の主要な原因をコラーゲン(合成)によることを示唆する。成人由来皮膚線維芽細胞の遊走は培地中の血清に依存することから、成人皮膚線維芽細胞はPDGFとコラーゲンの刺激により遊走し、他方、胎児由来皮膚線維芽細胞は血清に依存せずbFGFとコラーゲンを自ら産生しその刺激により遊走することを見つけた。本年度は、皮膚線維芽細胞の遊走が老化で低下する機構の解析のため、主に、細胞増殖因子に注目し検討した。第一は、細胞遊走が血清に依存しない胎児型(オートクリン型)から血清に依存する成人型(パラクリン型)に変わる時期を検討したところ、胎児と乳児の間にあることが分かった。幼児由来皮膚線維芽細胞では成人のものと同じで、また老人由来皮膚線維芽細胞も同じ性質であった。乳児由来皮膚線維芽細胞は胎児型と成人型の中間であった。第二は、この胎児型、成人型の性質がインビトロ細胞老化で変化するかを調べたところ、変化せず安定であることが分かった。第三は、bFGFは胎児線維芽細胞の遊走には効果を持つが、成人、老人線維芽細胞の遊走にも効果をもつかどうかを検討した。増殖因子の非特異的阻害剤スラミンによる遊走阻害を回復する能力を血清添加培地を用いて測定したところ、胎児線維芽細胞のみにbFGFによる回復効果が観察された。PDGFが胎児、成人、老人皮膚線維芽細胞の遊走刺激になっているかを阻害剤を用いて検討したところ、PDGFは全ての皮膚線維

芽細胞の遊走促進刺激になることが分かったが、胎児と老人由来皮膚線維芽細胞ではPDGFへの感受性が低下していた。第四は、bFGFは胎児皮膚線維芽細胞だけでなく、成人、老人皮膚線維芽細胞でも産生されているかを、細胞蛋白をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離しbFGFの抗体を用いてウェスタンブロット法で調べた。bFGFは、胎児皮膚線維芽細胞だけでなく成人皮膚線維芽細胞でも産生されていることが分かった。インビボ、インビトロ細胞老化に伴い、剥離された空所へのヒト皮膚線維芽細胞の遊走能は低下する。この遊走能低下の機構を解明するため遊走調節因子を検討した。前年度までの結果で、胎児皮膚線維芽細胞はbFGFとコラーゲンを自ら産生利用し遊走しており、成人や老人皮膚線維芽細胞は血清中のPDGFとコラーゲンを利用して遊走していることを見いだした。なぜ、成人や老人皮膚線維芽細胞はbFGF刺激で遊走していないかを調べるため、FGFレセプターmRNAの発現をノーザンブロット法で検討した。その結果は、bFGFが結合することが知られている4種のFGFレセプターのうち、FGFレセプター1のみが検出された。その発現量は胎児、成人、老人線維芽細胞の順番に低くなるが、この量的差異で、成人および老人線維芽細胞がbFGFで遊走が促進されないのかを説明されない。インビトロ細胞老化で、胎児線維芽細胞のFGFレセプター1mRNAの発現も、減少する。次に、ヒト皮膚線維芽細胞の遊走の抑制とコラーゲン合成の関係を検討した。インターフェロン-α、β、γのうち、インターフェロン-βがヒト胎児線維芽細胞の遊走を抑制した。この抑制は濃度依存的で、また、インターフェロン-βの中和抗体で抑制されることから特異的である。2重鎖RNA処理により細胞遊走が抑制された、これはインターフェロン-β産生が誘導される条件なのでうまく説明される。細胞遊走が抑制されるインターフェロン-βの濃度で、コラーゲン合成は抑制された。他方、成人血清はヒト皮膚線維芽細胞の遊走を45%抑制した。このとき、コラーゲン合成も抑制されていることが見られた。これらの結果は、コラーゲン(合成)と細胞遊走が強く相関していること、おそらく、細胞遊走能の細胞老化での低下の主要な原因はコラーゲンであることを示唆する。
腫瘍幹細胞を標的とした難治性小児固形腫瘍に対する治療法の開発

小児腫瘍細胞株である、肝芽腫株、横紋筋肉腫株、神経芽腫株、ラブドイド腫瘍株における腫瘍幹細胞マーカーの発現検索では、CD44は全ての腫瘍株で発現が確認され、CD133の発現は横紋筋肉腫株や神経芽腫株では一部の株では確認されたが、CD44vは多くの小児がんで低発現であった。肝芽腫株HuH6株ではFACSにてCD13の表出が約10%に認められたため、CD13陽性細胞をソーティングし、免疫不全マウスにenrichして移植した。細胞数1/10,1/100, 1/1000のいずれのenrichに対しても16週にて腫瘍は形成されなかった。平成25年度はFACSにて小児固形腫瘍株を用いて、候補腫瘍幹細胞マーカーの表出の確認を行った。具体的には肝芽腫細胞株(HepG2, HuH6)、横紋筋肉腫細胞株(Rh30, KYM-1, RMS-YM, RD)、神経芽腫細胞株(LAN5)、ラブドイド腫瘍株(W4)についてFACSにより候補腫瘍幹細胞マーカー(CD13, CD44, CD44v, CD133)を同定した。腫瘍幹細胞マーカーの表出がみられる株においてはソート分離し免疫不全マウス(SCID-NOD)に移植して造腫瘍能を確認した。1.現在までの研究実績:CD44では全ての腫瘍株で表出が確認された。しかし、一部の成人癌では腫瘍幹細胞と密接な関係があるとされているCD44vはいずれも小児固形腫瘍細胞株での発現はみられなかった(少なくともFACSにて確認できる限度以下であった)。これに対して、肝芽腫細胞株(HepG2, HuH6)ではCD13の表出がそれぞれ約50%,10%に認められ、現在HuH6でCD13陽性細胞をSCID-NODマウスに移植してその造腫瘍能をCD13陰性細胞との比較を行っている。また横紋筋肉腫RD株はCD133陽性細胞の比率が高いため、分離・移植の実験を引き続き行ってゆく予定である。2.考察:今研究では、2種類の肝芽腫細胞株において候補癌幹細胞表面マーカーであるCD13陽性細胞を認め、その高い造腫瘍能や抗癌剤抵抗性が示されればCD13陽性細胞が腫瘍幹細胞の性質をもつことが示される。現在、CD13陽性細胞阻害剤として医薬品のウベニクス(ベスタチン)、が臨床使用可能であるので、肝芽腫においてはCD13を標的とした腫瘍幹細胞に対する治療が可能となるかもしれない。組織幹細胞の一つであるLgr5も注目されるマーカーであるので全ての細胞株での表出を確認していきたい。肝芽腫細胞株(HepG2, HuH6)、横紋筋肉腫細胞株(Rh30, KYM-1, RMS-YM, RD)、神経芽腫細胞株(LAN5)、ラブドイド腫瘍株(W4)についてFACSにより候補腫瘍幹細胞マーカー(CD13, CD44, CD44v, CD133)の表出をFACSにて評価した。CD44では全ての腫瘍株で表出が確認された。しかし、一部の成人癌では腫瘍幹細胞と密接な関係があるとされているCD44vはいずれも小児固形腫瘍細胞株での発現はみられなかった。肝芽腫細胞株(HepG2, HuH6)ではFACSにてCD13の表出がそれぞれ約50%,10%に認められた。そのためHuH6株でCD13陽性細胞をソーティングし、SCID-NODマウスにenrichして移植した。bulk細胞では腫瘍を形成したのに対して1/10(1.0x104),1/100(1.0x103), 1/1000(1.0x102)のいずれのenrichに対しても16週経過しても腫瘍は形成されなかった。肝芽腫においてCD13陽性細胞が高い造腫瘍能をもてばCD13阻害剤であるウベニクス(ベスタチン)による阻害効果をみる予定であったが、その評価ができなかった。研究目的:集学的治療によっても進行小児固形腫瘍の治療成績は生存率が低く治療抵抗性である。これら治療抵抗性小児固形腫瘍に対する化学療法、放射線療法の強化は極限に達しており、革新的な治療法の開発が喫緊の課題である。近年、腫瘍幹細胞の機能として活性化酸素(Reactive oxygen species:ROS)の蓄積抑制機能が注目されており、小児固形腫瘍においても腫瘍幹細胞マーカーを標的としてROS抑制阻害により腫瘍幹細胞に対しての新規治療の開発が可能である仮説をたてて以下の3点を目的として研究を遂行した。1.小児がん細胞株(肝芽腫細胞株(HepG2, HuH6)、横紋筋肉腫細胞株(Rh30, KYM-1, RMS-YM, RD)、神経芽腫細胞株(LAN5)、ラブドイド腫瘍株(W4)ならびに臨床検体組織における腫瘍幹細胞マーカー候補(CD13, CD44, CD44v, CD133)をFACSにて解析すると、CD44は全ての腫瘍株で発現が確認され、横紋筋肉腫株や神経芽腫株の一部ではCD133の発現も確認されたが、成人癌で腫瘍幹細胞との密接な関係を指摘されるCD44vは小児がんでは多くのがん腫で発現が低いことが明らかにされた。2.肝芽腫細胞株(HepG2, HuH6)ではFACSにてCD13の表出がそれぞれ約50%,10%に認められた。

そのためHuH6株でCD13陽性細胞をソーティングし、SCID-NODマウスにenrichして移植した。bulk細胞では腫瘍を形成したのに対して1/10(1.0x104),1/100(1.0x103), 1/1000(1.0x102)のいずれのenrichに対しても16週経過しても腫瘍の形成はみられなかった。そのため肝芽腫の治療薬として期待されたCD13阻害薬(ウベニメクス)の効果の研究を進めることができなかった。小児腫瘍細胞株である、肝芽腫株、横紋筋肉腫株、神経芽腫株、ラブドイド腫瘍株における腫瘍幹細胞マーカーの発現検索では、CD44は全ての腫瘍株で発現が確認され、CD133の発現は横紋筋肉腫株や神経芽腫株では一部の株では確認されたが、CD44vは多くの小児がんで低発現であった。肝芽腫株HuH6株ではFACSにてCD13の表出が約10%に認められたため、CD13陽性細胞をソーティングし、免疫不全マウスにenrichして移植した。細胞数1/10,1/100, 1/1000のいずれのenrichに対しても16週にて腫瘍は形成されなかった。肝芽腫細胞株(HepG2, HuH6)ではFACSにてCD13の表出が認められた。bulk細胞では腫瘍を形成したのに対して1/10(1.0x104),1/100(1.0x103), 1/1000(1.0x102)のいずれのenrichに対しても16週経過しても腫瘍は形成されなかった。この予想外の結果のために肝芽腫細胞株での腫瘍幹細胞のマーカーとしてCD13が有用である評価が得られず、CD13阻害剤での造腫瘍能の抑制を評価することができなかったため研究がやや遅れ気味である。小児腫瘍、小児再生医療、免疫細胞株ではなく、肝芽腫臨床検体にてCD13の表出を免疫染色にて確認する。またLgr5は近年、消化管の幹細胞のみではなく、種々の組織の幹細胞マーカーとして認識されている。小児固形腫瘍株ならびに臨床検体でのLgr5の評価を本年度は行っていく予定である。抗体(CD13)のFICH, PEなどによりCD13陽性細胞の%にばらつきがでたため、CD13陽性細胞をソーティングして集めるのに時間がかかってしまったため。また当初、考えていたCD44v8-10での陽性細胞をFACSでは確認することができなかったために遅れてしまいました。予想と異なり肝細胞癌では有力な腫瘍幹細胞候補マーカーとされているCD13が肝芽腫細胞株では表出はみられるものの、腫瘍造成能の高さが証明できなかったために次のステップであるCD13阻害剤の評価ができなかったために、そのれに必要とする薬剤等が不要となったため。現在のところ肝芽腫にCD13陽性細胞が確認できたので、これからはCD13陽性細胞の肝芽腫治療薬である、CPA,VCR,THP-ADR,CDDPなどの抗癌剤への感受性、ならびに免疫不全マウスへの移植により腫瘍造成能を評価する。更には、CD13阻害剤(Ubenimex)の腫瘍造成能の抑制を評価する。組織幹細胞の一つであるLgr5も注目されるマーカーであるので全ての細胞株での表出を確認していく。新規腫瘍幹細胞マーカーと考えられるLgr5を使用して小児固形腫瘍臨床検体の免疫染色を行うとともに、細胞株を使用してFACSにてLgr5の表出評価を行う予定である。研究がやや遅れ気味であったために抗体、免疫不全マウスの発注が計画より遅れました。平成26年度に研究を進め、使用予定でございます。
超・亜臨界流体の研究に従事する学生を対象にした安全教育プログラム開発とその実践

●研究目的:「超・亜臨界流体」は臨界点以上もしくはその近傍の温度・圧力の状態にある流体と定義されている。気体・液体とは異なる物性値や特徴を持ち、温度や圧力を制御することにより、水の場合は高分解力やイオン性の特徴を持ち、二酸化炭素の場合は有機溶媒の代替物として活用できるため、環境汚染や資源枯渇の問題に大きく貢献できる新規溶媒として期待されている。有害物質の無害化や有価成分の抽出・回収といった実用化の他、最近は超・亜臨界流体場を用いた材料開発や、他の技術と融合させた研究が進められている。超・亜臨界流体に関する研究が国内外で広く進められているが、高温・高圧場での実験が欠かせない本研究を進める前に、学生等への安全教育が欠かせない。そこで、超・亜臨界流体を用いた研究を行う学生を対象にした、安全教育プログラムを開発し、それを実践することを目的とした。●研究方法:これまでの研究経験や学内外の教員・学生からの意識調査等をベースに安全教育プログラムの検討を行った。検討の結果、体系的に習得できるよう、講義・実験の両方を盛り込んだ。超・亜臨界流体の特徴・研究例・注意点等を講義し、現行の研究テーマにおける実験を、補助者指導の下で行わせた。●研究成果:計2回の安全教育を行った。1回目は、学内の教員・学生に対して行った。研究経験により難易度に差が見られ、特に未経験な受講者にとって難易度は高めだったが、体系的に学んだことでより深く学ぶことができたと感想が寄せられた。2回目は、沖縄県工業技術センターの研究者に対して行った。日程の都合上講義のみだったが、既存研究や施工方法に関する活発な質疑応答を行うほど関心が高く、研究を行う足がかりとしていただけた。これらの成果を「平成21年度実験・実習技術研究会」にて報告した。最後に、今回作成した資料をWebに掲載し、研究機関等で活用していただく。
ラジカル開環重合を利用した新規機能材料の合成とその物性評価

本研究は汎用ビニルモノマーと種々のラジカル開環能を有するモノマーとの共重合を検討し、エステル結合、エーテル結合、ケトン基等の官能基を主鎖に導入した今までにない新しい物性を有する汎用ポリマーの開発を行なった。1.新規ラジカル開環性モノマーの開発:(1)2,2-ジフェニル-4-メチレン-1,3-ジオキソラン(DPMD)のラジカル重合では、定量的なベンゾフェノンの脱離を伴いながらポリケトンが得られることを見出した。(2)高歪エネルギーを有するシクロブタン誘導体のラジカル重合挙動では、メチレンシクロブタンはビニル重合が、ビニルシクロブタンは開環重合が進行することを明らかにした。(3)ビニルチイランもラジカル開環重合することを見出し、その開環の方向性がビニルオキシランとは異なり、炭素-ヘテロ原子(硫黄原子)間が開裂することを明らかにした。(4)フェニル基、エステル基、シアノ基等を有するビニルシクロプロパンを合成し、重合挙動を検討した結果、いずれのモノマーもラジカル開環重合することを見出した。2.共重合体の生成(1)ビニルオキシランとエチレンのラジカル共重合では、主鎖にビニルエーテル結合を有するポリエチレンが得られた。(2)DPMDとエチレンのラジカル共重合では、主鎖にケトン基およびエーテル基を有するポリエチレンが得られた。(3)DPMDとスチレンのラジカル共重合では、主鎖にケトン基を有するポリスチレンが得られた。また仕込み組成を変えることによってケトン基の含有量を任意に制御できることを明らかにした。(4)DPMDとビニルピロリドン、酢酸ビニル、及びメチルメタクリラートとの共重合では、それぞれポリマー主鎖にケトン基を有する共重合体が得られた。これら共重合体の物性評価(Tg、分子量効果、電気物性、機械的特性)、生分解性評価、及び光分解特性評価等は、現在検討中である。本研究は、汎用ビニルモノマーと種々のラジカル開環能を有するモノマーとの共重合を検討し、エステル結合、エーテル結合、ケトン基などの官能基を主鎖に導入した今までにない新しい物性を有する汎用ポリマーの開発を行なうことである。今年度は新たな種々の官能基を汎用ポリマーに導入することを目的として、新しいラジカル開環性モノマーの開発と、これらのモノマーを用いる汎用ビニルモノマーとの共重合を検討した。以下に研究成果を述べる。1.新規ラジカル開環性モノマーの開発:ビニルチイラン、ビニルシクロブタンのラジカル重合を検討した結果、それぞれ開環重合してポリマー主鎖にアソルスルフィド構造、炭素ー炭素二重結合が導入できることを明らかにした。またフェニル基、シアノ基、エステル基等を有するビニルシクロプロパンを合成し、重合挙動を検討した結果、いずれのモノマーもラジカル開環重合し、側鎖にこれらの官能基、主鎖に炭素ー炭素二重結合を有するポリマーが得られることを見出した。さらに2、2ージフェニルー4ーメチレンー1、3ージオキソラン(DPMD)のベンゼン環上に種々の官能基を導入し、DPMDのラジカル開環重合に及ぼす置換基効果を検討した結果、生成するポリマーは置換基によらずポリケトンであるが、重合速度は、種々の置換基によって自由に制御できることを見出した。これは汎用ビニルモノマーと共重合する上で重要な知見である。

2.DPMDと汎用ビニルモノマーとの共重合:DPMDとスチレン、メチルメタクリラート、酢酸ビニル等とのラジカル共重合を検討した結果、いずれもポリマー主鎖にケトン基を有する共重合体が得られた。これら共重合体の物性評価や光分解特性評価は、現在検討中である。
フロリゲン制御における２つの鍵転写因子の機能解析

花成は、葉において産生されたフロリゲン(FTタンパク質)が茎頂部へと輸送されることによって調節されている。本研究課題では、フロリゲン機能を理解する上で最重要な「葉」と「茎頂」において、シロイヌナズナで鍵となる2つの転写因子に焦点を当てる。「葉」におけるフロリゲン産生過程ではFE(Abe et al., 2015)に、「茎頂」におけるフロリゲン受容過程ではFD(Abe et al., 2005)に注目する。「葉」において機能するMyb型転写因子FEの機能解析を通じて、フロリゲン遺伝子(FT遺伝子)の転写活性化における新たな制御機構、新たな制御階層を見出す。また、茎頂ではたらくbZIP型転写因子FDの機能解析では、先端的な可視化技術を採用し、茎頂部におけるフロリゲン機能領域の同定を目指していく。フロリゲン機能制御における鍵因子である両転写因子の解析によって、植物固有の発生現象である花成の分子的理解をより深化させ、新たな発生ロジックを提唱することを目指していく。これまでに、FEとヒストン修飾制御因子との遺伝学的、生化学的相互作用の検討を行い、エピジェネティックな側面からFEによるFT転写活性化の仕組みを検討してきた。最終年度は「野生型とfe変異体におけるFT遺伝子座ヒストン修飾の比較解析」を中心に行った結果、FT遺伝子の転写制御において、ヒストン修飾を介した新たな制御階層が存在することが明らかになった。また、改変BiFC法によって茎頂部におけるFD-FT相互作用領域を探索し、AP1発現領域との同時観察によって、FDがFTとタンパク質複合体を形成する細胞においてAP1の発現が誘導されることを確認した。さらに、FD-FT複合体の形成が一過的なものであることも新たに見出した。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。植物の栄養成長から生殖成長への相転換(花成)は、葉において産生されたフロリゲン(FTタンパク質)が茎頂部へと輸送されることによって調節されている。平成29年度までに、FEとヒストン修飾制御因子との遺伝学的、生化学的相互作用の検討を行い、エピジェネティックな側面からFEによるFT転写活性化の仕組みを検討した。その結果、FT遺伝子の転写制御において、ヒストン修飾を介した新たな制御階層が存在することが明らかになった。また、改変BiFC法によって茎頂部におけるFD-FT相互作用領域を探索し、FDがFTとタンパク質複合体を形成する細胞においてAP1の発現が誘導されることを確認した。フロリゲン機能を理解する上で最重要な「葉」と「茎頂」において、シロイヌナズナで鍵となる2つの転写因子FEとFDに焦点を当てて研究を進めてきた。「葉」でのFE機能に関しては、平成29年度までに野生型とfe変異体におけるFT遺伝子座ヒストン修飾の比較解析、ならびにFEとヒストン修飾制御因子との遺伝学的、生化学的相互作用の検討を行い、エピジェネティックな側面からFEによるFT転写活性化の仕組みの理解に取り組んだ。その結果、FT転写活性化に際し、ヒストン修飾を介した新たな制御階層が存在することを示唆する結果を得ることができた。FDによる茎頂部でのフロリゲン機能制御についても重要な知見を得ることができた。改変BiFC法を採用し、形質転換シロイヌナズナを用いてFD-FT複合体形成領域の可視化に取り組んできたが、今年度は、茎頂部におけるFD-FT相互作用領域の探索の結果、FDがFTとタンパク質複合体を形成する細胞においてAP1の発現が誘導されることを確認することに成功した。これまで、FD-FT複合体の各構成要素の発現でしか確認できなかった茎頂でのフロリゲン機能の理解に大きな進展をもたらす結果である。

また、茎頂ではたらくbZIP型転写因子FDの機能解析では、先端的な可視化技術を採用し、茎頂部におけるフロリゲン機能領域の同定を目指していく。フロリゲン機能制御における鍵因子である両転写因子の解析によって、植物固有の発生現象である花成の分子的理解をより深化させ、新たな発生ロジックを提唱することを目指していく。これまでに、FEとヒストン修飾制御因子との遺伝学的、生化学的相互作用の検討を行い、エピジェネティックな側面からFEによるFT転写活性化の仕組みを検討してきた。最終年度は「野生型とfe変異体におけるFT遺伝子座ヒストン修飾の比較解析」を中心に行った結果、FT遺伝子の転写制御において、ヒストン修飾を介した新たな制御階層が存在することが明らかになった。また、改変BiFC法によって茎頂部におけるFD-FT相互作用領域を探索し、AP1発現領域との同時観察によって、FDがFTとタンパク質複合体を形成する細胞においてAP1の発現が誘導されることを確認した。さらに、FD-FT複合体の形成が一過的なものであることも新たに見出した。上記2研究項目について研究を推進し、研究成果をとりまとめ次第、成果として公表する。FEを介したFT転写活性化機構の詳細を解明することにより、ヒストン修飾を介した新たな制御階層の理解に繋げる計画である。現在、クロマチン免疫沈降法によって、FT遺伝子座におけるヒストン修飾動態の詳細な解析を進めている。今後、野生型とfe変異体のヒストン修飾の違いを詳細に解析することで、研究を推進する計画である。また、茎頂でのフロリゲン機能に関しては、FD-FT複合体を可視化し、その動態の時空間的観察が可能となった現在、成長相転換の分子的実体を本質的に理解するための新たな取り組みを開始する予定である。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。
大学教育のためのプロジェクト型環境教育プログラムの開発

I、環境データリゾースの開発:若菜(2004)は、我が国における生態系保護運動の起源が、百年にもおよぶ現代魚付林思想にあることを明らかにした。田中ら(2002)は、文献研究およびタイ、ベトナムでの水・大気汚染の現地調査から、発展途上国における都市環境問題の実態を明らかにした。これらの成果は先進国高等教育に求められる環境教育の事例モデルと教材を提供した。II、簡便なシュミレーションプログラムの開発:高橋・佐々木(2004)は、気象情報サイトからダウンロードした衛星画像の色彩を市販の表計算ソフトによってコンピュータ数値処理を行い、黄砂の飛散量の分布を分析し、中国大陸の砂漠化と本邦への黄砂の飛来のモニターするプログラムの開発に成功した。III、環境情報画像データベースの構築:発展途上国の環境問題についての環境教育での衛星画像の活用を試みたが、解像度の高い画像データは高価であること、雲による遮蔽の影響で利用できる画像が少ないこと、衛星生データからの画像処理技術の複雑さから、教育的に利用可能なデータベースを構築するほどの画像を収集することができなかった。IV、環境学習リゾースの公表:高橋・今野(2005)は、本研究において得られた環境教育に資すると思われる環境学習リゾースを学内Webサイトに掲載し、大学生の環境学習とその自己評価に活用できるようなデータベースシステムを構築して教育実践を試みた。V、プロジェクト型環境学習の試行:田中ら(2002)は、発展途上国の環境問題を事例としたグローバルな環境問題にかかわる学習モデルを提案したが、教育実践の試行数が少ないことから、全体を網羅したプロジェクト型環境学習指導マニュアルは完成には至っていない。平成14年度において,本研究グループでは,大学における環境教育の普及と改善をはかるためのプロジェクト型環境教育プログラム関発に必要な情報の収集と試行的プログラムの開発を行ってきた。とりわけ,日進月歩で進展しつつある環境科学の研究成果を検索できるサイト,一般に公開されている航空写真や人工衛星画像などのリモートセンシングに関する検索サイトの発見につとめ,あわせて環境教育ゲームの開発に必要な基礎データの収集とシュミレーションプログラムの試行的開発を行った。研究代表者の田中邦明は,音環境の問題を解決するための実践的な学習プログラムの開発に取り組んだほか,シュミレーションゲーム開発の基礎となるデータを収集するために,ミクロ生態系における植物群落と植物プランクトンの競合と安定性に関する実験的研究を行った。また,大学の「総合演習」の指導をとおして,無料で閲覧可能な世界規模での人工衛星画像検索サイトのサンプル画像を利用することで,アフリカのエリトリアーエチオピア国境付近の森林破壊と砂漠化の進行状況を捉えることに成功したほか,Eメールによる通信によって海外6カ国の非政府組織と連絡を取り合いながら,身近な環境問題の調査活動を行った。さらにタイおよびベトナムでの現地調査によって深刻な大気汚染および水質汚濁の発生の現状を明らかにした。研究分担者の高橋伸幸は,環境学習のためのコンピューターシュミレーションゲームの基礎的な開発を試み,単純な生態系モデルのプログラミングによって,安定型,変動型,絶滅型の3型モデルの創作に成功した。さらに研究分担者の若菜博は,北海道漁民による自然保護と復元の活動の歴史を詳細に検討し,北海道えりも地区の漁民による100年間にも及ぶ植林の実践が環境科学における人類の「自己認識」に大きく貢献したことを明らかにした。(担当:W:若葉,O:尾崎,T:高橋)1.環境データ・リソースの開発の継続(1)体験型学習の環境リソースとして「地域」の有効性を検討した。「地域における学習の場」として北海道大学附属苫小牧演習林,旭山動物園,岩見沢農業高校の活動事例を分析した。(W)(2)環境学習リソース「歴史」として、魚附林思想が海由来養分(魚肥)を内陸部へ移動させ、溯河性魚が内陸森林に栄養を与えて成長促進した,「森-海の関係」の双方向性を指摘した。(W)(3)実験・製作プログラム

教材作成のため、廃羊毛繊維のリサイクルとして、羊毛から抽出したケラチンタンパクから得たフィルムの物性を調べた。(O)(4)プラスチック廃棄物の呼称や容器包装リサイクル法への認識について大学生にアンケートを実施し、教育プラン開発の基礎データとする作業を継続した。(O)2.簡便なシミュレーションプログラムの開発の継続(1)大気成分変動シミュレーションの理解・操作を容易にするアニメーション化のため、ミクロな過程の分子運動として鎖状分子クラスターのシミュレーションを行い、融解・気化などのグラフィクス(一部アニメーション化済)を作成して、実験・シミュレーション専門家による評価を受けた。(T)(2)学生自ら分子シミュレーションを行って、体験的に理解を促進できるプログラム開発のため、既存公開ソフトウエアの使用の手引きを作成(一部完成)し、初学者のタンパク質シミュレーションに使用した。(T)3.環境情報画像データベースの構築の継続画像データベースの仕様を検討するため、公開Webサイト画像データの環境教育への活用事例のモデルを作成・評価した。衛星黄砂画像を、ポピュラーな表計算ソフトで画像処理する学習プログラムを作成・試行した。浮遊している黄砂の全体量を求める過程を開発者・初学者の二つの立場から学習者に体験・評価させた。(T)1、環境データリソースの開発:我が国における生態系保護運動の起源が、百年にもおよぶ現代魚付林思想にあることを明らかにした。発展途上国の環境問題についての文献研究およびタイ、ベトナムでの水質および大気の現地調査によって、発展途上国の都市環境問題の実態を明らかにし、発展途上国の環境問題を視野に入れた先進国高等教育に求められる環境教育のあり方と課題について論じた。2、簡便なシュミレーションプログラムの開発:高知大学気象情報ページからダウンロードした衛星画像の色彩を市販の表計算ソフトによってコンピュータ数値処理を行い、黄砂の飛散量の分布を分析し、中国大陸の砂漠化と本邦への黄砂の飛来のモニターに成功した。3、環境情報画像データベースの構築:発展途上国の環境問題についての環境教育での衛星画像の活用を試みたが、解像度の高い画像データは高価であること、雲による遮蔽の影響で利用できる画像が少ないこと、衛星生データからの画像処理技術の複雑さから、教育的に利用可能なデータベースを構築するほどの画像を収集することができなかった。4、環境学習リソースの公表:本研究において得られた環境教育に資すると思われる環境学習リソースを学内Webサイトに掲載し、大学生の環境学習とその自己評価に活用できるようなデータベースシステムを構築して教育実践を試みた。5、プロジェクト型環境学習の試行:エジプトの環境問題の教材化の試み(2)で、発展途上国の環境問題を事例としたグローバルな環境問題にかかわる学習モデルを提案したが、教育実践の試行数が少ないことから、全体を網羅したプロジェクト型環境学習指導マニュアルは完成には至っていない。
ナメクジ長期記憶に必要な遺伝子の探索と遺伝子機能阻害法の確立

本研究では、ナメクジ神経系における遺伝子強制発現系、および遺伝子発現抑制系の確立を目的としている。これに関連して、本年度では主として「ナメクジ一酸化窒素合成酵素遺伝子(NOS)構造の解析」を行った。代表者は、ナメクジ一酸化窒素合成酵素には2つの遺伝子(NOSp、NOSf)が存在することを見出した。このうちのひとつ(NOSp)は、前脳葉特異的なmRNAの発現を示し、この遺伝子のプロモーターを解析することで、前脳葉特異的発現ベクターを構築することができると考えた。そこで、転写開始点上流の数100bpの塩基配列を解析したところ、C/EBPやCREなど誘導性の転写因子結合配列を複数確認できた。しかし、これまでのところ、この遺伝子の転写を上昇させることができるような条件は見出せていない。嗅覚情報処理に重要な役割を果たすとされる前脳葉で、特異的な発現を起こさせるようなシスエレメントが明らかになれば、これを含む発現ベクターを用いることで、ナメクジ脳を用いたin vitro、in vivoでの実験において強力なツールとなることが期待される。また、同時にナメクジNOSfの全ゲノム構造を解析したところ、ヒトnNOS遺伝子に極めて類似したエキソン-イントロン構造を持つことが明らかになった。このことから、NOS遺伝子(すくなくともNOSf遺伝子)に対して強い進化的な保存的圧力が働いていること、およびNOS自体が持つ機能の重要性も示唆された。これに関連して、本年度では下記の2点を行ったので報告する。(A)神経損傷によって発現誘導される遺伝子の探索脳の単離後3時間で発現誘導される遺伝子群を網羅的に探索した。differential display法によって見出され、クローニングまで成功した10バンドのうち、cDNAlibraryscreeningの結果、4つの遺伝子については次の通りであることが分かった。(1)アルコールデヒドロゲナーゼ様遺伝子(2)limKLF(Fukunaga et al. 2006)(3)分子内repeatを多数含む新規transcript(4)全長6.9kb以上ある未知遺伝子。これまでの我々、および他のグループの研究により、ナメクジには分子内にtandemなrepeatを含む遺伝子が多数見出されており、上記(3)が神経活動によって誘導される、という事実は非常に興味深い。(B)発現ベクターを用いた遺伝子強制発現ナメクジに近縁であるアメフラシの神経細胞において遺伝子強制発現が可能であることが知られているpNEX3ベクターの供与を韓国ソウル大学のKaang博士より受け、これを組み替えてβ-ガラクトシダーゼを発現するベクターを作成した。このコンストラクトが少なくともアメフラシの神経ではβ-ガラクトシダーゼを発現することを示したが、これをナメクジの神経細胞に導入する方法を現在試行錯誤中である。また、内在性のプロモーターを用いた遺伝子強制発現系の確立を目指すため、ナメクジの神経系で発現することが知られているnitric oxide synthase遺伝子のゲノムを、ライブラリースクリーニングによって取得した。
カンキツ果実の裂果における果皮表面の気孔数の影響

本研究ではカンキツの裂果発生要因について調査するため,裂果感受性品種と非感受性品種の形態的,生理的特性や遺伝子発現を比較した.気孔数にはやや違いが見られたが,果皮表面からの吸水に関しては裂果発生時期において違いが見られず,裂果が果皮から多くの水を吸水することによって起こるのではないことが示唆された.一方で,裂果感受性品種では裂果の多い秋の雨の時期に砂じょうが急速に肥大しており,このことと果皮が薄いことが裂果発生と関係していると考えられた.RNA-seq解析の結果,細胞肥大に関係している遺伝子の発現パターンが品種間で異なっており,このことが裂果の発生の品種間差異に関係している可能性が示唆された.愛媛県では,近年県で育成した`愛媛果試第28号(紅まどんな)'や`甘平'といった良食味新品種の栽培が増加し,県内農業の振興に大きく寄与している.しかし,これら優良品種は高価格で取引される反面,その栽培は容易ではなく,特に雨による裂果が問題となっており,裂果の発生機構解明は非常に重要である.そこで,裂果を生じやすい`愛媛果試第28号'と生じにくい`せとか'を用いて予備試験を行った結果,`愛媛果試第28号'は果皮表面からの吸水量や果皮表面の気孔数が有意に多いことから`愛媛果試第28号'の裂果感受性は果皮表面の気孔数が多く,降雨後果皮表面からより多くの水を吸収するためであると考えられた.そこで本研究では,さらに品種数を増やし,果皮表面の気孔数や果皮からの吸水量について調査した.しかし,気孔数については,`愛媛果試第28号'が`せとか'に比べ有意に高かったものの他の裂果しにくい品種とは同程度の値であり,果皮表面からの吸水も裂果多発時期に品種間差や大きな変化はみられなかった.これらのことから,`愛媛果試第28号'の裂果は果皮の気孔数や果皮からの吸水が特に多いために起きるのではないことが示唆された.一方で,果実肥大の経時的変化を調査すると,`愛媛果試第28号'は裂果多発時期に最も顕著な果実肥大を示し,この時期の急激な果実肥大が裂果の要因であると考えられた.しかし,同時期に果実肥大パターンを示す`清見'では裂果が見られなかったことから,裂果は果実肥大の時期や肥大量に加え,果皮の物理的強度が関係していると考えられた.裂果の要因が気孔数ではないことが示されたが,果実肥大の時期や果皮の厚さが裂果に関係していることが示され,遺伝的要因が関係していると考えられるこれらの形質について今後遺伝的な解析を行うことで,裂果非感受性品種の育成の基礎となる知見が得られると考えられる.予備試験で得られていた気孔数や果皮表面からの吸水量の品種間差が裂果非感受性品種を増やして調査を行うと,裂果感受性品種と非感受性品種で見られなかったため,当初予定していた気孔数を中心とした調査では裂果の品種間差を明らかにできない可能性が高くなった.反面,果実肥大や果皮の形態的特性との関係が見られたため,気孔に関する詳細な調査を中止し,果実肥大や果皮の調査に切り替え,砂じょうや果皮の観察を追加したが,裂果の機構解明という点では若干遅れ気味になっている.本研究はカンキツの裂果発生機構を明らかにすることを目的とし,昨年度は裂果感受性品種と非感受性品種の形態的差異と裂果との関係を本年度は形態的差異と遺伝子発現との関係について調査を行った.昨年度行った実験の結果,裂果の発生は果皮表面の気孔数の差異や果実表面からの吸水が原因ではなく,急速な果実肥大と降雨の時期が重なることに加えて果皮が薄いことが原因であることが示唆された.そこで本年度は裂果感受性と非感受性品種種の砂じょうの成長パターンの違いや果皮の厚さの差異についての遺伝的差異を明らかにすることを目的とし,果肉と果皮の網羅的遺伝子発現解析を行った.裂果感受性品種の`愛媛果試第28号'および非感受性品種の`清見'と`せとか'の果皮と果肉を7月20日および9月6日,10月26日にサンプリングし,RNA-seq解析を行い,品種間や時期によって発現が異なる遺伝子を抽出した.果皮の発現解析では,細胞分裂に関係しているCDC6やCycD6で果皮の薄い`愛媛果試第28号',`せとか'と厚い`清見'で発現に差異が見られたが,発現量が低く,これらが果皮の厚さと関係しているかどうかはさらに調査が必要であると思われた.果肉の発現解析では,細胞肥大で重要な細胞壁のゆるみに関係しているエクスパンシンやキシログルカンエンドトランスグリコシラーゼ/ヒドロキシラーゼ,ペクチンメチルエステラーゼなど品種間で発現パターンが異なっているものがあり,これらの違いが砂じょうの伸長や肥大のパターンと関係している可能性が示唆された.さらに,bZIPなどの転写因子やジベレリンやエチレンの生合成やシグナル伝達にかかわる遺伝子についても品種間で発現パターンの違いが見られ,これら転写因子や植物ホルモンが上述の下流遺伝子を制御している可能性が示唆された.