hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
唾液中のGTFase阻害因子の検索

齲蝕原因菌であるSt.mutansやSt.sobrinusが産生する菌体外多糖類の合成に係るグルコシルトランスフェラーゼの阻害因子を唾液中のタンパク質に求めるという目的で実験を行い、St.sobrinus 6715株の培養液から抽出した粗GTFase活性がリゾチーム(卵白由来)存在下・で抑制を受けることを確認した。その結果を第48回歯科基礎医学会にて発表した。しかし、1)500μMリゾチームでGTFase活性がコントロールに比べ50%阻害されたが、リゾチーム濃度が唾液中の濃度(0.6μM)に比べ高濃度であった。2)用いたGTFaseがGTF-I、SIの混合物であり、精製されていなかった。3)Inhibition assayに用いたリゾチームがニワトリ由来のものであり、ヒトリゾチームと約40%アミノ酸組成が異なり立体構造に違いがあった。4)ヒト唾液リゾチームが試薬として市販されていなかった。という点から、リゾチームおよびGTFaseをリコンビナントプロテインとして作成する必要に迫られた。そこで、大腸菌による生成を試みたがインサート生成後のステップで障害が生じ、本年度中にリコンビナントプロテインを得ることが不可能であった。今後、リコンビナントプロテイン作成を効率的に行うために、また、他の唾液タンパク質とGTFaseとの相互作用の解析も視野に入れ、バキュロウィルス発現系を導入を計画している。齲蝕原因菌であるSt. mutansやSt. sobrinusが産生する菌体外多糖類の合成に係るグルコシルトランスフェラーゼの阻害因子を唾液中のタンパク質に求めるという目的で、以下の実験を行った。1)GTFaseの活性中心のアスパラギン酸を含むアミノ酸19残基からなるペプチドを合成し、アフィニティカラムを作成し結合する唾液タンパク質を2次元電気泳動で検索した。2)被験者間に共通するスポットの1次構造の解析を行い、データベースから既知のタンパク質との相同性を比較検討した。その結果、GTFaseの活性中心と相互作用を示すタンパク質がリゾチームと判明したため、以下の実験を行った。1)St. sobrinus6715株を液体培地中で培養し、リゾチームの存在・非存在下で不溶性グルカンの生成量を調べた。2)生成された不溶性グルカンをフェノール硫酸法を用いて測定した。その結果、不溶性グルカンの生成が阻害される場合もあった。以上の結果から、GTFaseによる不溶性グルカンの阻害にはリゾチームが関与する可能性が示唆されたが、さらなる新たなタンパク質の検索を進めている。齲蝕原因菌であるSt.mutansやSt.sobrinusが産生する菌体外多糖類の合成に係るグルコシルトランスフェラーゼの阻害因子を唾液中のタンパク質に求めるという目的で、以下の実験を行った。1)St.sobrinus6715株の培養液から粗GTFaseを硫安分画により抽出し、リゾチーム(卵白由来)存在下・非存在下でのグルカン合成量を比較した。2)酵素濃度を2,5,10倍希釈し、それぞれ2%ショ糖溶液と18時間、37°Cで反応させ、試験管壁に付着したものを壁着性不溶性グルカン、上清中に遊離したものを浮遊件不溶性グルカンとしてその合成量を測定した。また上清中に冷エタノールを等量加え、24時間、4°Cで反応させ得た沈殿を水溶性グルカンとし、合成量を測定した。その結果、リゾチーム濃度500μMで不溶性グルカン合成量はコントロールに比べ50%程度に減少した。また、水溶性グルカンは濃度依存的に合成量が上昇した。今回抽出したGTFaseはGTF-S、GTF-SIが混在しているため、精製した同酵素を用いて同様に実験を行うためにリコンビナントプロテインの作成に着手した。既知の遺伝子配列より合成したプライマーを用いて4850bpのPCRプロダクトを得た。以上の結果からリゾチームによるGTFaseの阻害が示唆された。また、次年度では精製GTFaseを作成し、ヒト唾液リゾチームとの相互作用の解析を行うことを目標とする。
長崎県における結核患者発見の遅れとその背景についての調査

平成24年1月1日平成25年12月31日までに長崎県において新たに肺結核と診断され、協力同意の得られた保健所または結核病床を有する医療機関に登録された患者を対象に、カルテ、患者登録票を用いて情報収集を行った。塗抹陽性者について64歳以下の受診の遅れは21.7%(5例/23例中)、65歳以上では7.9%(5例/63例中)で64歳以下群で若干受診の遅れの割合が多かった。一方、診断の遅れを見てみると、64歳以下群で12.5%(3例/24例中)、65歳以上群で32.9%(27例/82例中)と、65歳以上群で診断が遅れる傾向にあった。発見の遅れについては両群に差は見られなかった。平成23年度には協力頂ける可能性のある保健所所長および保健師と研究を遂行するにあたり実務的会議を行い、各保健所より同意をいただいた。それにより保健所に登録のあった肺結核患者および結核診療病床に入院中の患者で同意の得られたものについてインタビューを行う事となった。研究開始の中で入院中の患者については、保健所よりも各医療機関の主治医に直接協力を仰ぐことがより効率よく研究を進めうることができるとの判断にて、倫理委員会に協力期間として結核病床を有する医療機関を追記し、承認を得た。平成24年8月20日平成24年11月30日まで産休のため一時研究を中断した。さらに育児のため平成25年1月7日から研究再開予定としたが、3月31日まで研究を再開することができなかった。そのため、倫理委員会にて研究課題の延長申請を行い、平成26年月31日まで承認された。4月1日より研究を再開しこれまでのところ患者登録はない。男性108例、女性101例、平均年齢は71.5歳±19.8(中央値78歳)であった。年齢層では65歳以上が73.8%、75歳以上でみると61%と高齢者での罹患が目立つことは多報告と同様であったが、塗抹陽性者は126例であった。居住区は保健所管轄別にみると、長崎市80例、佐世保市60例、県南と県北がそれぞれ16例、県央と五島が13例、西彼が7例と続いた。受診契機となった症状では咳が78例、発熱76例、痰51例、全身倦怠感27例、健康診断時24例、定期受診の際17例、体重減少16例、食欲不振16例、呼吸困難・息切れ16例と続いた。他疾患にて入院時または受診時に発見された例もその他には含まれる。塗抹陽性者について受診の遅れを2ヶ月以上、診断の遅れを1ヶ月以上、およびその発見の遅れを3ヶ月以上として分析を行なった。その結果、64歳以下の受診の遅れは21.7%(5例/23例中)、65歳以上では7.9%(5例/63例中)で有意差は見られなかったものの(p=0.077)、64歳以下群で若干受診の遅れの割合が多かった。一方、診断の遅れを見てみると、64歳以下群で12.5%(3例/24例中)、65歳以上群で32.9%(27例/82例中)と、有意差は見られなかったものの(p=0.051)、65歳以上群で診断が遅れる傾向にあった。発見の遅れについては両群に差は見られなかった結核罹患率の多い長崎においては特に高齢者を診察する場合には他疾患にて受診された場合でも常に結核を念頭に置き、呼吸器症状以外の症状の聴取と積極的な胸部レントゲン撮影は有用と思われる。長崎県自体の新登録患者数については年々減少してはいるものの、2009年の新登録結核患者罹患率は22.1(人口10万対)と全国平均を上回っている。また、罹患数のうち、70歳以上の高齢者が占める割合は60%以上となっており、これも全国平均を大きく上回っており、初回標準治療レジメであるPZAを含む4剤の処方割合は約50%と低くなっているのが現状である。

2009年の結核統計によると、長崎県における発病から初診まで2か月以上経過している割合は17.9%と全国平均とほぼ同数であったが、長崎県は大小約600の島々をもつ全国一の離島県で、人口約145万人のうち、約10%が離島在住であるという特徴がある。これら離島には高齢者が多く在住している上、結核病床を有する指定医療機関や呼吸器・感染症専門医あるいは保健所までのアクセスが非常に悪い状態にあるといえる。これらの事は患者発見の遅れにつながる要因かもしれない。また、未だ結核に対する偏見も一部では存在している。本研究では長崎県における結核患者発見の遅延の状況と社会人口学的情報、結核に対する知識および認識、居住地域での結核に対する差別や恥辱など、その背景を調査し、発見遅延の関連要因を分析すること目的とした。これにより長崎県における、早期結核発見のための政策策定ひいては結核対策のあり方についても検討する。長崎大学大学院医歯薬学総合研究科倫理委員会の承認を得た。それをふまえ、長崎県10ヵ所の保健所へ研究の要旨および協力のお願いを送付し、1月23日には県所長会へ出席し、研究内容の検討を行った。その結果、同意が得られない結核登録患者についても、すでに保健所にて法律に基づいて聴取した情報が取れるよう再度倫理委員会へ承認申請を行うこととした。条件付き承認が得られたため、研究開始および協力要請の準備が整った。当初の研究会計画書と協力期間と実務的な打ち合わせおよび患者情報を収集することについての同意取得に相当な時間を要した。また産休、育児のため研究を一時中断せざるを得なくなり、予定よりも遅れているのが現状である。長崎大学大学院医歯薬学総合研究科倫理委員会の承認を得て長崎県10ヵ所の保健所へ研究の要旨および協力のお願いを送付した。現場関係者との面談にて、現場での活動と研究デザインの間に困難な事項が予測された。そのため、平成24年1月23日には県所長会へ出席し、関係者と研究内容の検討を行った。その結果、本研究の重要性及び必要性を確認した。そのため、当初計画では同意が得られた患者のみを対象に研究を進める予定であったが、同意が得られない結核登録患者についても、すでに保健所にて法律に基づいて聴取した情報が取れるよう、個人情報の保護を担保する方法を検討したうえで、再度倫理委員会へ承認申請を行うこととした。研究再開および研究機関延長の旨、各関係機関へ報告し、引き続き保健所に登録のあった肺結核患者および結核診療病床に入院中の患者で同意の得られたものいついてインタビューを行う。保健所および医療機関へは3か月毎に研究者から連絡を行い、新規患者登録の有無を確認し、より多くの症例を登録いただくよう努力する。上記のような経過で、平成24年3月30日に倫理委員会にて審査が行われ、条件付き承認が得られた。必要条件を満たした後、再度各保健所へ研究への参加および協力を要請し研究を開始する予定である。各種連絡の郵送費、長崎市街の医療機関に出向く際にはレンタカーを使用するため、レンタカー料およびガソリン代に使用予定である。また情報収集および研究成果の発表のため、学会出張に使用する予定である。結核登録患者へのインタビューが始まり、訪問に関して旅費が発生する。また、協力保健師および患者への謝礼が発生する予定である。
唾液を用いた運動時の三大栄養素利用状態評価法の開発

運動時における三大栄養素(糖質,脂質,蛋白質[アミノ酸])の利用状態は,パフォーマンスの向上やコンディショニング,疲労や怪我の予防に深く関与する。非運動時には主に糖質が利用されるが,運動中および運動後には,状況に応じて脂質とアミノ酸の利用が高まる。これまで応募者らは,エネルギー代謝の中心臓器である肝臓と骨格筋で,三大栄養素それぞれが利用される時に生じる特異的代謝物を見出し,血液と唾液を用いた高感度分析法を開発してきた。本研究は,唾液を用いて三大栄養素の利用比率を経時的に把握する方法の開発を目的とし,スポーツ現場で広く利用可能な簡易表示ツールの確立を目指す。
需要の変動および配送平準化を考慮した配送スケジューリング方法に関する研究

本研究は倉庫や支店の配送費の削減だけでなく,小売側の在庫コストの削減も考慮したより現実的なモデルを提案し,その解法を開発したものである.具体的には,まず配送費および在庫コストをそれぞれの片っ方だけを先に最小化し,その前提条件の元で他方を最小にするモデルを作成し,解法を提案した.まず,配送費を優先するモデルでは,配送計画問題を配送ルート決定問題および配送スケジューリング問題に分類し,それぞれの部分の最適化における新しい解法を提案するとともに,配送平準化の元でトータルコストが最小になるように両部分を統合した.配送ルート決定問題ではMinimum Spanning Tree法とSFC(Space Filling Curve)法を組み合わせた配送ルート決定方法を提案し,改良配送スケジューリング問題ではGAH(Generalized Assignment Heuristic)法を用いて配送グループを作成するとともに,各配送グループの配送日はフォワード・バックワード平準化技法を用いて決めることにより配送,在庫,および欠品のトータルコストを最小にすることができた.次に,在庫費用を優先するモデルでは,在庫費用が最小になるような配送頻度および配送間隔を決める方法を提案し,そのもとで各配送点の配送パターンを作成する.この配送パターンを配送費最小のもとで効率よく組み合わせることにより計画期間内の配送計画を一気に作成する方法を提案した.また,配送計画問題はいわゆる(l、m)分枝型在庫モデルを前提条件としており,このような在庫システムにおいては川下の在庫水準や需要情報を川上段階でも把握することによりBullwhip効果の軽減や在庫水準の削減が可能であるとされている.しかし,在庫補充の意思決定方法に用いるエシェロン在庫水準に各小売における在庫偏在情報が含まれていないので,在庫を補充する間隔を一定にしても欠品コストが増えたり,期末の在庫が多くなったりすることがある.このような問題点を解決するために,本研究では予約点方式を考案し,在庫の偏在による平均在庫水準の増加量を理論的に求めるとともに,シミュレーションにより提案法の評価を行った.最後に,配送ルートを決定する際にはさまざまな制約が存在し,それらの制約をすべて考慮すると単純TSPよりはるかに時間がかかってしまう.特にVRP問題のヒューリスティックス解法ではTSP解法を組み込んでいるものが多く,よりスピーディな計算が要求される.そこで,本研究ではSFCに着目し,SFCの問題点を分析し,改善を行った.その結果,スピードをほとんど犠牲せずに解の精度を5%から10%まで上げることができた.今後,タイムウィンドウつきVRPや時間帯により走行時間が変動する用件などを考慮したより現実的な配送計画問題をモデル化し,戦略的なサプライチェーンモデルとして発展させることは大いに意義あるものであると思われる.本研究は倉庫や支店の配送費の削減だけでなく,小売側の在庫コストの削減も考慮したより現実的なモデルを提案し,その解法を開発したものである.具体的には,まず配送費および在庫コストをそれぞれの片っ方だけを先に最小化し,その前提条件の元で他方を最小にするモデルを作成し,解法を提案した.まず,配送費を優先するモデルでは,配送計画問題を配送ルート決定問題および配送スケジューリング問題に分類し,それぞれの部分の最適化における新しい解法を提案するとともに,配送平準化の元でトータルコストが最小になるように両部分を統合した.配送ルート決定問題ではMinimum Spanning Tree法とSFC(Space Filling Curve)法を組み合わせた配送ルート決定方法を提案し,改良配送スケジューリング問題ではGAH(Generalized Assignment Heuristic)法を用いて配送グループを作成するとともに,各配送グループの配送日はフォワード・バックワード平準化技法を用いて決めることにより配送,在庫,および欠品のトータルコストを最小にすることができた.次に,在庫費用を優先するモデルでは,在庫費用が最小になるような配送頻度および配送間隔を決める方法を提案し,そのもとで各配送点の配送パターンを作成する.この配送パターンを配送費最小のもとで効率よく組み合わせることにより計画期間内の配送計画を一気に作成する方法を提案した.また,配送計画問題はいわゆる(l、m)分枝型在庫モデルを前提条件としており,このような在庫システムにおいては川下の在庫水準や需要情報を川上段階でも把握することによりBullwhip効果の軽減や在庫水準の削減が可能であるとされている.しかし,在庫補充の意思決定方法に用いるエシェロン在庫水準に各小売における在庫偏在情報が含まれていないので,在庫を補充する間隔を一定にしても欠品コストが増えたり,期末の在庫が多くなったりすることがある.このような問題点を解決するために,本研究では予約点方式を考案し,在庫の偏在による平均在庫水準の増加量を理論的に求めるとともに,シミュレーションにより提案法の評価を行った.最後に,配送ルートを決定する際にはさまざまな制約が存在し,それらの制約をすべて考慮すると単純TSPよりはるかに時間がかかってしまう.特にVRP問題のヒューリスティックス解法ではTSP解法を組み込んでいるものが多く,よりスピーディな計算が要求される.そこで,本研究ではSFCに着目し,SFCの問題点を分析し,改善を行った.その結果,スピードをほとんど犠牲せずに解の精度を5%から10%まで上げることができた.今後,タイムウィンドウつきVRPや時間帯により走行時間が変動する用件などを考慮したより現実的な配送計画問題をモデル化し,戦略的なサプライチェーンモデルとして発展させることは大いに意義あるものであると思われる.本研究は2年の期間で需要の変動および配送平準化を考慮した多期間配送スケジューリングに関する方法論を提案することを目的とするものである。

本年度の研究計画に基づき、(1)「在庫コストを考慮した多期間配送ル-と決定問題の定式化および新しい解法の提案」、および(2)「配送平準化を考慮した多期間配送スケジューリング手法の提案」については予定通り研究を進め、それに加えて(3)適切な配送計画期間に関する研究も行いました。その内、(1)および(2)は「需要の変動および配送平準化を考慮した多期間配送計画問題」というタイトルの論文(A)にまとめて経営工学会誌に投稿し、Vol.48,No.6,1998年号に掲載されることになりました。また、(3)については"A Research on Proper Length of Planning Horizon in Multiple Period Delivery Scheduling Problem"というタイトルの論文(B)にまとめ、第14回ICPR(International Conference on Production Research)に投稿・発表し、大会論文集に掲載されました。上記(A)では需要がダイナミックに変化することを前提条件に毎日の手持在庫量に在庫コストを課すモデルを構築し、計画期間における累積需要量と配送量の差のノルマを最小にすることを目的とした配送平準化方法を提案した。提案法の有効性を検証するために、現実データを用いて従来法、現状法との比較を行い、テストデータを用いて従来法との比較を行った結果、いずれにおいても提案法は優位であることが分かり、提案法の有効性が検証された。また、(B)においては在庫コストを目的とした配送計画をベースとし、配送コースとを下げるための調整を行った。このとき、トータルコストを下げられる最大シフト期間を求め、在庫コスト係数、配送コスト係数、および計画期間の長さをパラメータに現実のデータを用いた数値実験を行った。その結果、適切な配送計画期間は一週間前後、10日以内が妥当ではないかという結果が得られた。本研究は倉庫や支店の配送費削減だけでなく小売側の在庫コスト削減も考慮したより現実的なモデルを提案し、その解法を開発したものである。具体的には、まず配送計画問題を配送ルーと決定問題および配送スケジューリング問題に分類し、それぞれの問題において新しい解法を提案するとともに、配送平準化のもとでトータルコストが最小になるように両部分を統合した。配送ルート決定問題ではMinimum Spanning Tree法とSFC(Space Filling Curve)法を組み合わせた配送ルート決定方法を提案し、配送スケジューリング問題ではGAH(GeneralizedAssignment Heuristic)法を改良して配送グループを作成するとともに、各配送グループの配送日は提案法の配送平準化技法を用いて決めることにより、配送、在庫、および欠品のトータルコストを最小にすることができた。これらの研究は「需要の変動および配送平準化を考慮した多期間配送計画問題」というタイトルで日本経営工学会誌のVol.48,No.6,1998に掲載された。
ミリ波・サブミリ波帯二次元イメージングアレイによるプラズマ診断

1.準光学素を用いた周波数70GHz帯干渉光学系に4X4素子検出器を適用し、二次元イメージ測定システムを構成した。受信方式は二台の独立した発振器を持つヘテロダイン方式で、発振器の差周波数はPLL回路を用い安定化されている。また、トラッキング方式を併用することにより、従来からの中心周波数455KHzの位相検波回路を使用することが可能となった。2.本干渉計システムをガンマ10プラグ部プラズマに適用し、閉じ込め電位形成時のプラグ部密度分布測定に成功した。干渉計としての空間分解はアンテナ開口と光学系の倍率で決定され、半径方向2.7cm、軸方向2.5cmである。これは誘電体ターゲットを用いた校正実験でも確認された。一方、測定の位相分解は1/200フリンジに達した。3.本システムをヘテロダイン受信機として、電子サイクロトロン放射(ECE)測定にも適用した。光学的に薄い正常波モードおよび異常波モード放射信号の比から、ECH印加時のプラグ部プラズマの高温電子および超高温電子成分の二次元分布導出に成功した。また、二点での信号の相関測定から電子温度揺動の情報も得た。本実験は、ECEイメージングの初めての適用例となった。4.ミリ波-サブミリ波の高周波領域への適用のため、アンテナ・ダイオードが一体となったモノリシック形検出器の設計に着手した。5.本研究で製作した二次元検出器が、文部省核融合科学研究所のヘリカル装置CHSのECEイメージング測定にも適用されることになった。また、研究代表者が中心となり、プラズマ・核融合学会誌に「ミリ波・ザブミリ波計測の基礎と応用」のテーマで平成7年1月号より講座を開始した。プラズマ計測のみならず地球環境観測、宇宙観測まで含めたもので、二次元イメージングの応用などが先端技術として記述される。1.ビームリード形ショットキーバリアダイオードとボウタイアンテナを組み合わせた、4×4素子二次元検出器の設計製作を行った。SN比の改善のため二次元アンテナアレイを検出器前面に取り付け、光学スリットとして動作させた。同検出器の40-70GHz帯における電圧感度特性等を調べ、広帯域特性を有することを確認した。2.位相イメージ法二次元化の第一段階として、参照波発振器を別に持つヘテロダイン受信方式の確立を図った。i)入射波と参照波の二つの発振器の差周波数安定化のため、PLL回路を利用した帰還制御方式を設計製作した。本方式はFVコンバーターを用いたアナログ方式に比べ高周波領域に適用可能で、差周波数2-10MHzの任意の値に対し差周波数のスペクトル幅1kHzで安定化が実現している。ii)ヘテロダイン型干渉計を構成、既設位相イメージ法光学系のr=0cm相当位置でプラズマ測定を行った結果1/130フリンジの密度分解を達成した。〓iii)同上干渉計に既存の一次元検出器アレイを組み合わせ、プラズマに投影した位置でr=±10cm、z=±5cmにわたって測定可能であることを確認した。3.70GHz帯二次元イメージング装置光学系のビーム伝搬および光線追跡計算を進め、既設の一次元位相イメージ法光学系の修正を行った。さらに、新光学系と二次元検出器を組み合わせたシステムのシミュレーション実験を開始した。4.本研究課題と関連し研究代表者が中心となり、平成6年3月10日-12日、筑波大学で「大型装置計測のためのミリ波・サブミリ波技術の開発」に関する日米ワークショップを開催し、情報交換および討論を行った。1.準光学素子を用いた周波数70GHz

帯干渉光学系に4×4素子検出器を適用し、二次元イメージ測定システムを構成した。受信方式は二台の独立した発振器を持つヘテロダイン方式で、発振器の差周波数はPLL回路を用い安定化されている。またトラッキング方式を併用することにより、従来からの周波数455KHzの位相検波回路を使用することが可能となった。2.本システムをガンマ10プラグ部プラズマに適用し、閉じ込め電位形成時のプラグ部密度分布の測定に成功した。干渉計としての空間分解はアンテナ開口と光学系の倍率で決定され、半径方向2.7cm、軸方向2.5cmである。これは誘電体ターゲットを用いた校正実験でも確認された。一方、測定の位相分解は1/(200)フリンジに達した。3.二次元イメージ法システムをヘテロダイン受信機として電子サイクロトロン放射測定にも適用した。光学的に薄い正常波モードおよび異常波モード放射信号の比から、ECH印加時のプラグ部プラズマの高温電子および超高温電子成分の絶対値の二次元分布導出に成功した。また、二点での信号の相関測定から電子温度揺動の情報も得た。本実験はECEイメージングの初めての適用例となった。4.ミリ波-サブミリ波の高周波領域への適用のため、アンテナ、ダイオードが一体となったモノリシック形検出器の設計に着手した。5.本研究で製作した二次元検出器が、文部省核融合科学研究所のヘリカル装置CHSのECEイメージング測定にも適用されることになった。また、研究代表者が中心となり、プラズマ・核融合学会誌に「ミリ波・サブミリ波計測の基礎と応用」のテーマで平成7年1月号より講座を開始した。プラズマ計測のみならず地球環境観測、宇宙観測まで含めたもので、二次元イメージングの応用などが先端技術として記述される。
金属イオンの拡散によって生じる自発的なゲルのパターン形成に関する実験的研究

多糖水溶液を金属イオンによってゲル化させる際に、そのポリマー濃度、金属イオン濃度、サンプル量を変えることによって、多種多様な形態がゲルする際に自発的に形成される。この自発的なゲル形態の形成は、ゲルを形作るポリマーと内部の水の親和性が低下することで生じ、このポリマーのゲル化によって形態が固定化されることが分かった。つまり、水とポリマーの親和性を変えることで様々なユニークな模様をゲル内及び表面に形成できることが確認された。1.擬一次元空間で形成される自発的なゲルのパターン形成1-(a)カラギーナン水溶液へカリウムイオンを拡散させた系毛細管内に封入したκ-カラギーナンの水溶液にカリウムイオンを拡散させてゲルを調製したところ非常に単純なシステムであるが、液晶領域が周期的に局在したゲルが創製された(Narita, T.et al.Langmuir22,349-352(2006))この周期的な空間規則性はLiesegang現象の特徴を表しており、κ-カラギーナンとカリウムイオンの二成分だけを用いてLiesegang現象の特徴を持った液晶周期構造を自発的に形成できることが明らかになった。1-(b)アルギン酸水溶液へカルシウムイオンを拡散させた系同様にアルギン酸においてカラギーナン同様の実験を行ったところ、植物形態の一部に類似したゲルパターンを再現することに成功した。これらのパターンは、容易にチューブ型、セル型、螺旋方、筍形へと形態を制御することができた。パターン発展の傾向からこれらの形態の変化は、束縛空間での粘性摩擦と相分離に起因していることが示唆された。2.擬二次元空間で形成される自発的なゲルのパターン形成二次元空間でこれらのゲルを同様の方法によって調整したところ、リング状、縦縞、横縞等の空間パターンを自発的な方法によって形成させることができた。これらの特徴的な長さはポリマーの濃度によって段階的に変えることができた。これらの形状の違い及び特徴的な長さはゲル化と相分離の競合の違いによって生じることが実験結果から推測された。3.ゲル化と相分離の競合に関する研究上記に挙げたように、ゲル化と相分離の競合が強くパターン形成に関与していることが示唆されたため、基礎的な実験を行った。サンプルは寒天の主成分であるアガロースを用いた。寒天水溶液は温度の低下に伴いゲル化及び白濁することから下限臨界溶液温度持った。また、相分離が進行するとスピノダルリングが観察され、ゲル化によってこの過程がピニングされることが分かった。詳細な実験からスピノダル曲線を決定することができた。1.擬1次元空間で形成される自発的なゲルのパターン形成毛細管中に天然多糖類水溶液を封入してゲル化剤を拡散させる系において様々なパターンを持つロッド状のゲルを得た。このゲルに現れるパターンは大きく分けて、チューブ、セル、セル・チューブ、螺旋、筍の5つに分類できた。チューブパターンを除くパターンではゲル化剤が濃度勾配を作る方向に特有な空間的周期構造が生じた。このパターンは調製時のゲル化剤の濃度と毛細管の直径を変えることで大きく変化した。一方、異なる毛細管サイズでゲルを調製し、ゲル化剤濃度をコントロールすることで、サイズの異なる相似的なパターンを得ることが出来た。2.擬2次元空間で形成される自発的なゲルのパターン形成同様に擬二次元空間に自発的なパターンを形成させることを試みた。天然多糖類水溶液にゲル化剤を拡散させることで天然多糖類水溶液がゲル化し、ゲル化剤の濃度勾配に対してほぼ平行に縦縞のパターンが表れた。天然多糖類水溶液の濃度が低いとき、この縦縞の間隔は広いが、濃度が高くなるにつれて間隔が狭くなることが観察され、濃度を変えることで縦縞の間隔を変えることが出来た。この系は三次元網目構造の形成(ゲル化)と電離度低下に伴う水への不溶化(相分離)が競合する系である。このことから、相分離から生じる濃度ゆらぎがゲル化によって凍結し、縞パターンが形成されたと推察される。このゲルに現れるパターンは大きく分けて、チューブ、セル、セルーチューブ、螺旋、筍の5つに分類できた。今年度は形成されたパターンと温度との相関を明らかにした。ゲルの作成温度を調整することにより、パターンの波長をコントロールできることが分かった。このパターンと温度の相関は、プレゲル溶液の粘性と温度の関係に類似しており、ゲルに現れるパターンの温度依存性は、粘度の温度作用に起因していることが明らかになった。2.擬2次元空間で形成される自発的なゲルのパターン形成同様に擬二次元空間に自発的なパターンを形成させ、天然多糖類水溶液にゲル化剤を拡散させることでゲル化

剤の濃度勾配に対してほぼ平行に縦縞のパターンを形成した。今年度はゲルの厚みと2次元空間に形成されるパターン形状の関係について考察した。ゲルの厚みを変化させることにより、縦縞のパターンだけではなく、横またさらにはチェック状のパターンを形成できることを明らかにした。ゲルの厚みがパターン形状に与える影響の理由として、ゲル内で誘起されるバルクな相分離だけがパターン形成に関わっているのではなく、表面の濡れ現象等がパターンの形成に強く関わっている一ことが示唆された。
電析ナノ結晶材料の疲労特性および破壊機構の解明と粒界工学に基づく疲労特性の向上

マイクロデバイス用構造材料として期待されるナノ結晶金属材料の疲労特性および疲労破壊機構を系統的に明らかにするために、電析法によってナノ結晶化されたニッケル、ニッケル基合金および鉄基合金の異なる3種類の材料について疲労特性と破壊挙動を微細組織変化と関連付けて実験的に調べた。ナノ結晶金属および合金は、通常の結晶粒組織をもつ多結晶材料の約2倍の疲労限を示した。繰返し応力よる結晶粒径、集合組織および粒界微細組織の変化が定量的に評価された。ナノ結晶金属材料の疲労特性・破壊は、繰返し応力による微細組織変化に強く支配されることが明らかにされた。最近、Micro Electro Mechanical Systems (MEMS)のような微小機械の開発が盛んに行われている。このような微小機械用の構造材料として、優れた機械的性質をもつナノ結晶材料の開発が望まれている。特に、MEMSの代表的な製造工程との関連から、電析ナノ結晶金属材料に対する期待が高まっている。本研究は、電析ナノ結晶金属材料の実用化において重要となる疲労破壊特性を材料組織学的に解明すること、その知見に基づき疲労特性を向上することを目的としたものである。面心立方金属材料であるナノ結晶ニッケルとニッケルーリン合金の疲労破壊に伴う微細組織の変化を詳細に調べた。電析ナノ結晶ニッケル合金の高サイクル疲労に伴い生じる結晶粒成長が、疲労破壊過程に強く影響を及ぼし、疲労強度をも制限することを明らかにした。これらの知見から、ナノ結晶金属材料の疲労特性の向上に対しては、繰返し応力の負荷によって生じる結晶粒成長を抑制することが重要であることを導き出した。高サイクル疲労試験前の試験片の結晶方位自動解析結果から、電析ナノ結晶ニッケルの初期組織では、結晶粒界が湾曲した非平衡の状態にあることが示された。湾曲した結晶粒界近傍は、局所的に変形が複雑になり、応力集中を生じることから破壊の起点となるものと予測された。このため、電析ナノ結晶試験片を100°Cから200°Cの範囲で熱処理し、結晶粒界を直線的な形状に変化させた後、機械的性質を評価した。その結果、熱処理を施した電析ナノ結晶ニッケル試験片では、電析させたままの試験片に比べ破断強度および延性ともに向上することを見出した。さらに、体心立方構造をもつナノ結晶鉄ーニッケル合金についても同様に、電析による組織制御プロセスを検討するとともに機械的性質を実験的に調べた。鉄ーニッケル合金についても、ナノ結晶化により疲労特性を向上できる可能性を示した。Micro Electro MechanicalSystems (MEMS)のような微小機械・機械要素の構造材料として、優れた機械的性質をもつナノ結晶材料の開発が望まれている。本研究では、MEMSの代表的な製造工程との関連から、特に要求が高まっている電析ナノ結晶金属材料の疲労破壊特性を材料組織学的に解明すること、その知見に基づき疲労特性を向上することを目的とした。面心立方構造をもつナノ結晶ニッケルとニッケルーリン合金および体心立方構造をもつナノ結晶鉄ーニッケル合金の電析法による組織制御方法を確立し、それらの疲労特性の評価、疲労破壊に伴う微細組織の変化を詳細に調べた。3種類いずれの電析ナノ結晶材料も、通常の結晶粒組織をもつものに比べ、優れた引張強さ、疲労限を示すことが示された。特に、有機添加剤であるサッカリン酸ナトリウムの添加量の最適化により、ナノ結晶ニッケルで約1.5GPa、ナノ結晶ニッケルーリン合金で約2GPa、ナノ結晶鉄ーニッケル合金で約1.2GPaと極めて高い最大引張強さが得られた。さらに、電析ナノ結晶ニッケルに対し、電析したままの試験片を100°Cから200°Cの範囲で焼鈍することにより10%以上の塑性伸びが得られることを明らかにし、ナノ結晶材料における脆性の解決に対して重要な知見を得た。ナノ結晶化により通常の結晶粒組織をもつ材料の1.5から2.0倍まで疲労限を向上できることを明らかにした。しかしながら、ナノ結晶材料では高サイクル疲労に伴い結晶粒成長が生じること、それが疲労破壊過程に強く影響を及ぼし、疲労強度をも制限することを明らかにした。この結晶粒成長過程を集合組織及び粒界微細組織の変化と関連付けて検討した。得られた知見から、ナノ結晶金属材料の疲労特性の向上に対しては、繰返し応力の負荷によって生じる粒界移動と結晶粒成長を抑制することが重要であることを導き出した。ナノ結晶材料は、結晶粒径が100 nm以下の結晶粒によって構成される多結晶材料であり、優れた強度特性を示す。本研究は、ナノ結晶材料のマイクロマシン用構造材料としての応用において重要となる疲労特性・破壊機構を体系的、本質的に解明することを目的とした。そこで、結晶構造の異なるニッケル基および鉄基合金の疲労特性・破壊機構を、従来議論されてきた結晶粒径の影響に加え、集合組織および結晶粒界の影響にも着目して明らかにすることとした。

さらに、得られた知見を基に、粒界制御に基づく疲労破壊制御とそれに伴う疲労特性向上のための新たな材料プロセスを確立することを目的とした。平成23年度は、面心立方構造をもつナノ結晶ニッケルおよびナノ結晶ニッケルーリン合金の疲労特性・破壊機構を調べた。ナノ結晶ニッケルについては、パルスめっき法とその後の熱処理によるナノ結晶組織制御プロセスを確立し、高サイクル疲労特性・破壊機構を明らかにした。ニッケルの疲労強さは、ナノ結晶化により高くなる傾向を示した。さらに、高サイクル疲労後の破断面には、通常の結晶粒径をもつ多結晶金属の疲労破壊の場合と同様に、ストライエーションおよびディンプルが形成されることを示した。ストライエーションおよびディンプルの大きさは、初期のナノ結晶粒に比べて大きくなることがわかった。ナノ結晶ニッケルーリン合金についても、ナノ結晶化により疲労強さが向上することを明らかにした。リンを添加することにより、ナノ結晶ニッケルに比べてさらに疲労強さが高くなることも明らかにした。さらに、高サイクル疲労に伴う結晶粒成長、集合組織および粒界性格分布(異なる性格をもった粒界の多結晶体における存在頻度を統計的に示したもの)の変化を定量的に評価した。その結果、これらの材料微細組織の変化に、ナノ結晶ニッケル基合金の疲労特性・破壊挙動が強く影響を受けることが明らかになった。面心立方構造をもつナノ結晶ニッケルおよびナノ結晶ニッケルーリン合金について、それぞれ電析法によるナノ結晶組織制御プロセスを明らかした。ナノ結晶試験片の繰返し応力負荷による粒界微細組織の局所変化を結晶方位自動解析装置により定量的に評価した。前年度、新たな課題として挙げられた微細組織変化に及ぼす負荷応力の影響についても明らかにすることができた。さらに、交付申請書の「研究の目的」および「研究計画・方法」欄に記載したとおり、ナノ結晶金属材料の疲労特性および破壊過程に及ぼす粒界微細組織変化の影響を明らかにすることができた。得られた知見から、ナノ結晶材料の疲労特性の向上に対しては、安定な初期微細組織を得ることが重要であると考え、ナノ結晶ニッケルの作製プロセスについて、電析浴組成および電析条件の再検討を行うとともに電析後の熱処理の影響を調べ、初期微細組織の最適化を目指している段階である。体心立方構造をもつナノ結晶鉄-ニッケル合金に対しても、電析法によるナノ結晶化プロセスを明らかにすることができた。ナノ結晶鉄-ニッケル試験片の粒界微細組織評価については、得られた試験片の初期結晶粒径が30nm以下と非常に微細であったため、結晶方位自動解析装置による定量評価が困難な状況にあり、現在はX線回折測定により評価を進めている。機械的性質についても評価を始めることができた。今後の対策として、電析条件の見直しおよび電析後の熱処理により、初期結晶粒組織を定量評価可能な大きさにまで制御することを検討している。以上のことから、本研究は、交付申請書の「研究の目的」および「研究計画・方法」欄に記載した内容にしたがって、概ね順調に進んでいるものと考える。
インチューブ固相マイクロ抽出法を用いる薬毒物の全自動オンライン分析システムの開発

有機溶媒を使用せず、キャピラリーカラムを抽出媒体とするインチューブSPME法により試料の抽出、濃縮を自動化して、HPLC、LC/MSやCEシステムへ直接導入する実用的で環境に優しい薬毒物及び環境汚染物質の全自動オンライン分析法を開発した。3年間の研究成果は以下の通りである。(1)フタル酸エステル類などの内分泌撹乱物質は、Supel-Q PLOTキャピラリーカラムを用いるインチューブSPME/HPLC法により18125倍濃縮され、検量線は1500ng/mLで直線性を示し、検出限界は0.14ng/mLであった。本法を食品分析に応用した結果、食品容器や包装中に含まれるDBPやDEHPが食品へ移行していることがわかった。また、医薬品分析に応用した結果、プラスチック製容器中の輸液からDBPが760ng/mL検出され、シロップ剤や点眼剤からも検出され、ラベル紙の接着剤及び容器に印字されているインクが汚染源であることを突き止めた。(2)植物エストロゲンであるダイゼイン及びゲニステインのインチューブSPME/HPLC法を検討し、2431倍の濃縮倍率でng/mLレベルの高感度分析法を確立した。本法を食品分析に応用した結果、ダイゼイン及びゲニステインの添加回収率は97%以上で再現性よく定量でき、大豆やその加工食品中に多く含まれていることがわかった。(3)インチューブSPME/LC/MS/MS法によるステロイドホルモン類の選択的高感度分析法を開発し、環境水試料の分析に応用した。検量線は5200pg/mLの範囲で良好な直線性を示し、検出限界は0.53.7pg/mLであり、直接注入法に比べて30150倍の感度を示した。環境水試料からの添加回収率は87101%であり、再現性よく定量できた。(4)インチューブSPME/LC/MS法により、ダイアジン系及びトリアジン系除草剤やスルホンアミド系抗菌剤を迅速かつ高感度に分析する方法を開発し、環境水試料の分析に適用できることがわかった。(5)天然及び合成エストロゲンに対し高い選択性と濃縮効果を有する分子認識キャピラリーを開発した。(6)インチューブSPME法は、HPLCの他、LC/MS、CE、CE/MSなどとも容易に結合できることがわかった。本研究で開発したインチューブSPME/HPLCやLC/MS法は、試料の前処理からデータ解析までを完全自動化してオンライン分析できることから、分析作業の効率化、省力化、コストの削減などが可能であり、食品、医薬品、環境試料中の薬毒物及び環境汚染物質の実用的分析法として有効な手法になるものと期待される。また、新規キャピラリー開発や様々な分析機器との連結により、インチューブSPME法の適用範囲もさらに広がることが期待される。

また、新規キャピラリー開発や様々な分析機器との連結により、インチューブSPME法の適用範囲もさらに広がることが期待される。14年度は3年計画の初年度であり、薬毒物の中で最近特に環境汚染とその健康影響が問題となっている内分泌撹乱物質に焦点を絞り、インチューブ固相マイクロ抽出/高速液体クロマトグラフィー(インチューブSPME/HPLC)による全自動オンライン分析システムの開発を行い、以下の結果を得た。なお、キャピラリー電気泳動(CE)法との連結に付いては、CEの導入時期が遅かったため、次年度に向けて既存の方法を文献調査中である。1.インチューブSPME/HPLCによるインフラボン類の分析法を開発した。抽出デバイスとしてSupel-Q PLOTキャヒラリーを用いてインチュブSPMEを行う時、最も効率よく抽出できた。ダイゼインおよびゲニステインは、XDB-C_8カラムを用い8分以内に分離分析でき、検出限界は0.410.48ng/mLで、直接注入法に比べて2431倍の感度を示した。また、本法を用いて豆類およびその加工品を分析したところ、乾燥大豆から高濃度のイソフラボン類が検出されたが、小豆やソラ豆などにはほとんど含まれていなかった。2.インチューブSPME/HPLCによるエストロゲンやフェノール類の分析法を開発した。抽出デバイスとしてSupel-QPLOTキャピラリーを用いる時、エストロゲン、ビスフェノールA(BPA)、アルキルフェノールを効率よく抽出できた。これらの化合物は、XDB-C_8またはHypersil-ODSカラムを用い、電気化学検出器(ECD)によりいずれも検量線は0.550ng/mLの範囲で良好な直線性が得られ、直接注入法に比べて1438倍の感度を示した。本法を用いて環境水試料を分析したところ、工場排水および河川水の2試料からBPAが検出された。3.インチューブSPME/HPLC法により、輸液および液体医薬品中のフタル酸エステル類を分析した。プラスチック製容器中の輸液からフタル酸ジ-n-ブチル(DBP)が検出され、バッグやボトル容器の印字インクおよびラベル紙接着剤中のDBPがプラスチック容器を透過して輸液を汚染していることが明らかとなった。また、薬剤を添加した輸液をポリ塩化ビニル製の点滴用チューブに通したところ、フタル酸-2-エチルヘキシル(DEHP)の溶出量が増え、医薬品に用いられている溶剤がポリ塩化ビニルからのDEHP溶出を増強していることがわかった。現在、キャピラリーの選択性を上げるために、エストロゲンを鋳型とした人工受容体キャピラリーや、銅フタロシアニンを固定化したブルーキャピラリーによる多環性芳香族化合物およびVOC濃縮法を開発中である。平成15年度はこれらの分子認識キャピラリーを用いたインチューブSPME法とHPLC、LC/MS、CEなどとのコンビネーションによるオンライン分析システムを構築し、様々な薬毒物のハイスループットな分析法を開発していく予定である。15年度は、法中毒分野で注目されている医薬品や農薬などのインチューブSPME/HPLC及びLC/MS分析システムを開発した。また、選択性を向上させるために新規キャピラリーを開発し、環境中の多環性芳香族化合物の濃縮法についても検討した。さらに、インチューブSPMEとCEシステムの連結に関する基礎的検討を行った。1.インチューブSPME/HPLCによるトリアジン系除草剤の分析法を開発した。
超励起状態の関与する化学反応の理論的研究

本研究では、レーザーやシンクロトロン放射光の発展に伴い関心が高まっている超励起状態からのイオン化過程であるペニングイオン化について理論的に研究した。具体的には、スピン軌道相互作用の効果をAr+He^*(2^3S)の系で調べ、N_2+He^*(2^3S)の系で古典論・量子論で種々の近似計算を行い、比較を行った。紙数の関係で前者についてのみ述べる。計算で求めた共鳴状態のポテンシャルは実験から見積もられたポテンシャルと定性的に一致した。主要な寄与をするΣ_<1/2>状態とΠ_<1/2>状態について調べると、核間距離3Å以上では、同じ比率2:1である。一方、核間距離3Å以下では、Γ(Σ_<1/2>)は核間距離の減少につれて増加するのに対し、Γ(Π_<1/2>)は増加が鈍りついには減少に転ずることがわかった。これは、核間距離の減少に伴ってΣ_<1/2>状態のΣ性がはっきりしてくるためであるとして解釈される。全イオン化断面積の絶対値のオーダーは実験値と一致した。全イオン化断面積がこのエネルギー領域で増加し、また、高エネルギーで増加が頭打ちになる実験結果を再現している。このことより、求められたポテンシャルと幅は概ね妥当なものであると考えられる。低衝突エネルギーでは、σ(^2P_<3/2>)/σ(^2P_<1/2>)は2である。衝突エネルギーが増加すると、その比は2から増加していくことがわかる。この結果は最近行われた実験結果を再現するものである。これは次のように解釈することができる。すなわち、低エネルギーでは、核間距離が大きなところでイオン化が起こるため、Γ(Σ_<1/2>)とΓ(Π_<1/2>)の比が2:1である。したがって、イオン化断面積は2:1となる。一方、衝突エネルギーが増加していくと、ArとHe^*がより接近でき、Γ(Σ_<1/2>)のΓ(Π_<1/2>)に対する比が大きい核間距離でのイオン化の寄与が大きくなる。このために、断面積の比は2より大きくなる。
環状モノテルペノイドの種特異的生合成における精密構造認識機構の解明

ハッカおよびミカンのリモネン合成酵素は,ゲラニル二リン酸(GPP)を種特異的にそれぞれ(S)-リモネンおよび(R)-リモネンに変換する。種特異的な環状モノテルペノイド生合成における基質-酵素との精密構造認識機構の解明を計った。(1)リモネン合成酵素の活性化因子であるMn^<2+>が,GPPの二リン酸基に配位する際のGPP炭素鎖の構造変化を解明した。^1H,^<31>P NMRの緩和時間測定から,GPPの炭素鎖はMn^<2+>の配位によりendo型に折れ曲がっていた。一方,シトロネリル二リン酸およびデヒドロゲラニル二リン酸の二リン酸基にMn^<2+>が配位してもそれぞれの炭素鎖には構造変化がほとんど観測されなかった。従って,Mn^<2+>の配位によるGPPの構造変化は,配位したMn^<2+>と2位および6位の二重結合との相互作用によるものと考えられた。(2)ハッカとミカンのリモネン合成酵素を用いて,(S)-および(R)-[1-^2H]GPPから(S)-および(R)-リモネンを生合成した。それぞれの酵素により生成したリモネンの重水素標識位置から,GPPの二リン酸基は,ハッカにおいてもミカンにおいても(2re,3si)両側に脱離していた。従って,種特異的立体化学を持つリモネンが生合成されるのは,GPPの二リン酸基の脱離によって種特異的なendo型のリナリルカチオン中間体が生成し,これが環化するためと考えられた。さらに,ファルネシル二リン酸(FPP)合成酵素に,[1-^<13>C]GPPとイソペンテニル二リン酸(IPP)を加え,^<13>C NMRを用いて酵素反応を追跡した。反応開始2時間後,δ164.5に新たなシグナルが観測された。このシグナルは,超強酸によるアリルカチオンの^<13>Cケミカルシフトおよび分子軌道計算から,非局在化したリナリルカチオンと同定した。これまでFPP生合成機構は,GPPから生成したカチオンとIPPの付加によりFPPが生合成すると提唱されていた。今回,この機構を初めて実証した。
糖鎖異常に基づく遺伝性筋症の分子病態解明:縁取り空胞型遠位ミオパチーを中心として

縁取り空胞型遠位ミオパチー(Distal Myopathy with Rimmed Vacuoles, DMRV)は日本人に多くの患者が存在し、近年その責任遺伝子がUDP-GlcNAc2-epimerase/ManNAc kinaseをコードするGNE遺伝子であることが明らかとなった。この酵素は、CMP-シアル酸生合成系の重要な酵素であることから、DMRV患者ではシアル酸代謝に異常を来たす可能性があるが、詳しい病態は不明である。そこで、DMRV患者由来の生検筋組織をPNAレクチンで染色すると、筋形質膜の染色性の増強が認められた。次に、PNAレクチンで染色される糖鎖の局在を調べるために、PNAレクチンと筋細胞膜のマーカータンパク質であるジストロフィンに対する抗体との2重染色を行ったところ、DMRV患者由来の筋組織ではPNAレクチンの染色パターンがジストロフィンの染色パターンと一致した。これらの分析結果は、DMRV患者由来の筋組織では、特異的にPNAレクチンで認識されるコア1糖鎖が筋細胞膜上で増加していることを示唆している。一方、対照筋組織のシアル酸をシアリダーゼ処理により除去した後、PNAレクチン染色を行うと、PNAレクチンで強く染色されるのが観察された。これらの分析結果から、対照筋組織の筋細胞膜上の糖鎖は、コア1糖鎖の非還元末端にシアル酸が付加されているのに対して、DMRV患者由来の筋組織の筋細胞膜上の糖鎖では、シアル酸の付加に異常があることが示唆された。対照及びDMRV患者の骨格筋組織の糖タンパク質について、シアル酸の量を緩和酸水解-蛍光HPCL分析法で測定したが、両者の総シアル酸量に大きな差は見られなかった。次に、対照及びDMRV患者の筋組織をN-glycosidase F(PNGase)処理し、N-型糖鎖を遊離させた後に、シアル酸の定量を行ったところ、DMRV筋組織では、対照と比べて30%40%程度の減少がみられた。これらの分析結果から、DMRVでは、本酵素の異常により、特にO-型糖鎖の非還元末端のシアル酸の量が減少すると考えられた。糖鎖が関連する遺伝性筋症の病態を解明し、診断や治療法の開発に結びつけることを目的として研究を行った。疾患対象として、縁取り空胞型遠位ミオパチー(DMRV)とポンペ病を選択した。DMRVにおいては、近年、その責任遺伝子がUDP-GlcNAc 2-epimerase/ManNAc kinaseをコードする遺伝子であることが明らかにされたが、その病態発生機構は不明である。そこで、当該酵素の異常により障害されると予想される筋組織の糖複合体のシアル酸代謝に注目した。DMRV患者由来の生検筋組織を試料として、各種のレクチンを用いて蛍光染色を行った。その結果、患者筋では、PNA(Galβ-3GalNAcに結合)に対して、筋細胞膜で著明な染色性の増加が認められた。一方、対照筋では、PNAに対して染色性が殆どみられなかったが、シアリダーゼ処理により、染色性が著しく増強した。この現象は、レクチンブロット法による解析でも確認された。これらの解析結果から、DMRV筋細胞膜の糖複合体の糖鎖においては、シアル酸量が減少している可能性が示唆された。また、リソソームおよび後期エンドソームのマーカーであるLamp-1やLamp-3の抗体による染色を行うと、DMRVの筋細胞膜や空胞領域が強染した。この事から、DMRVでは、リソソームの機能が亢進していると考えられた。一方、ポンペ病の病因は、リソソーム性α-グルコシダーゼ活性の低下によることが知られている。そこで、オランダのグループとの共同研究により、日本人ポンペ病患者の当該遺伝子の解析を行い、新しい変異を同定した。さらに、日本人患者以外のポンペ病患者の解析結果と合わせて、本症の遺伝型と表現型の関連性を考察した。また、本症の治療用酵素薬の開発を目指して、産業技術総合研究所グループと共同し、特定の酵素合成酵素遺伝子を破壊した酵素株に、ヒトのα-グルコシダーゼ遺伝子を導入し、培地中にヒト型類似糖鎖を持つ当該酵素を発現させた。

これらの分析結果から、対照筋組織の筋細胞膜上の糖鎖は、コア1糖鎖の非還元末端にシアル酸が付加されているのに対して、DMRV患者由来の筋組織の筋細胞膜上の糖鎖では、シアル酸の付加に異常があることが示唆された。対照及びDMRV患者の骨格筋組織の糖タンパク質について、シアル酸の量を緩和酸水解-蛍光HPCL分析法で測定したが、両者の総シアル酸量に大きな差は見られなかった。次に、対照及びDMRV患者の筋組織をN-glycosidase F(PNGase)処理し、N-型糖鎖を遊離させた後に、シアル酸の定量を行ったところ、DMRV筋組織では、対照と比べて30%40%程度の減少がみられた。これらの分析結果から、DMRVでは、本酵素の異常により、特にO-型糖鎖の非還元末端のシアル酸の量が減少すると考えられた。
腫瘍組織で特異的に活性化するタンパク質ラベル化反応の開発

近年、不可逆阻害剤の開発がキナーゼ阻害剤を中心に盛んに行われている。現在、不可逆阻害剤にはCys残基に対する反応基としてマイケルアクセプターが一般的に利用されている。しかしながら、マイケルアクセプターは反応性が高く、標的タンパク質選択的なラベル化は困難であり、副作用の発現が懸念される。本研究では、マイケルアクセプターの正常組織での非特異的なラベル化を抑制するため、腫瘍組織で特異的に活性化されるプロドラッグ型のマイケルアクセプターの開発を目的とした。具体的には、4-アミノクロトンンアミドのアミノ基に電子吸引の保護基を有するEGFRプローブの合成および反応性評価を行った。脱保護体(活性化体)のプローブ1は、生理的条件下においてグルタチオンと迅速に反応した一方で、アミノ基上に電子吸引性の保護基を有するプローブ2は、期待通りグルタチオンとほとんど反応しなかった。次に、EGFRを過剰発現するA431細胞を用いてEGFRのラベル化試験を行った。プローブ1とプローブ2の低酸素条件と通常培養条件におけるEGFRに対するラベル化率を比較したところ、活性化体のプローブ1はいずれの条件においてもEGFRに対するラベル化効率はほとんど変化しなかった一方で、プロドラッグ型のプローブ2は、通常培養条件より低酸素条件においてEGFRラベル化効率が2倍程度向上し、期待通り腫瘍環境に対する選択性を向上することに成功した。以上の結果は、4-アミノクロトンアミドのアミノ基に電子吸引性の保護基を導入することで正常組織と腫瘍組織との間でその反応性をコントロールできるということを示したものである。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。