hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
発水材によるコンクリート構造物の耐久性向上に関する研究

具体的には、小型供試体を用いて、重量変化率および切断面等からシランによる発水効果の長期安定性を検討した。また、大型供試体によって、相対湿度・温度測定装置により、種々のレベルのかぶり深さでのコンクリート中の水分分布を測定し、実現の構造物における発水効果範囲の検討を行った。さらに、実験結果から、水分逸散のモデル化を試み、有効性の定量化を試みた。得られた結果を以下に示す。(1)アルカリ骨材反応による膨張に関しては、無処理と比較して、長期的にある程度制御することは可能である。しかし、反応性骨材を用い塩化物を多量に含むコンクリートに対しては、シランで処理したものでも過度の膨張を完全に制御することは困難であると考えられる。(2)鉄筋腐食に関しては、塩化物を多量に含むものについては、無処理物と比較してシラン処理したものがむしろ腐食が進行している傾向が見られた。シラン処理により長期的に鉄筋腐食を制御することは困難であると考えられる。(3)大型供試体による試験の結果、有限要素法による解析により、コンクリート中におけるシランの効果範囲をある程度推定することは可能であると考えられる。解析結果および大型供試体の実験結果を検討した結果、シラン処理した後、60日頃ではシラン処理による発水効果はコンクリート表面から約5cm付近まで、180日頃では約20cm付近までとみられた。180日頃から360日頃までは、乾燥と湿潤を繰り返しており、発水効果範囲は20cm程度にとどまっていた。深さ30cm以上では、無処理とシラン処理の差は見られないものと思われる。
軟Ｘ線マイクロＣＴ法による植物プランクトンの細胞外代謝物が含有する有機物の定量

天然水中に存在し,汚濁物質として問題となっている有機物には,植物プランクトン由来で,他の方法では把握が困難で,主に多糖類から成る細胞外代謝物(EPS)がある。EPSに含まれる有機物量を正確に計測するため,細胞とEPSに含まれる元素を軟X線顕微法で詳細に調べた。X線吸収微細構造(XAFS)による細胞内の構造体の同定とX線マイクロCT法によるEPSの基本構成物質であるアガロースのX線顕微鏡像の取得に成功し,EPSに含まれる有機物量をより正確に計測する方法を開発することができた。天然水中に存在する有機物の中で,植物プランクトン由来で,他の分析法や顕微法では把握が困難である主に多糖類から成る細胞外代謝産物(EPS)に含まれる有機物量を,軟X線マイクロCT法で計測する方法の確立を目指している。今年度は、EPS観察のためのX線顕微鏡(XM)試料セル関連技術の最適化を行った。これは,申請者が開発してきた,XM像とEPSの組成比からEPSに含まれる有機物量を炭素換算で求める方法を,大型のシアノバクテリアに適応するために必要な技術である。ガラス管をプーラで局所加熱して引き伸ばし,良好なX線透過率と適度な剛性および形状を持ったガラスキャピラリィ(直径10 μm以下,ガラス壁厚100 nm以下)を作製し,試料セルとした。ガラスキャピラリィへのEPSの充填は吸引法で行うこととした。吸引法で必要量のEPSをガラスキャピラリィに充填できたかの確認は,モデル試料(直径500 nmの着色ポリスチレンラテックス微粒子を含むアガロースゲル)を用い行った。モデル試料は吸引後,-160°Cで凍結しXMで観察した。観察には,酸素のk吸収端より低いエネルギーのX線を用いた。このエネルギーのX線は,水の構成要素である酸素に対する透過率が極めて高いので,水中のラテックス微粒子でも,高いコントラストのX線吸収像を得ることができる。CT法で,ガラスキャピラリィ内で適度に分散したラテックス球を観察することができた。一般に,ラテックス球は溶液内で沈殿凝集することから,アガロースゲルがガラスキャピラリィに充填されていることが示された。また,高分解能CT法で必要な,-160°C冷却時に起こる試料ドリフト軽減に向け,試料ステージとセルの固定治具の見直しを行い,原因を突き止めた。初年度は,主に,EPSの軟X線マイクロCT法を実現するための専用CTセルの最適化と, EPSだけを専用CT用セルに封入する方法の確立を目標として実験を進めた。まず,セルの仕様を決定し,次に,このセルに寒天質状のEPSを,いかなる化学処理を施すことなく,含水状態のまま注入する方法として吸引法を用いることに決定できた。この方法の性能の検証も,着色ラテックスを分散したアガロースゲルをモデル試料として用い,目視によるキャピラリー内への試料の導入および,X線マイクロCT法によるアガロースゲルの充填を確認することができた。これは,申請者が,細胞径が数百nm以下のシアノバクテリアを用い開発してきた,XM像とEPSの組成比からEPSに含まれる有機物量を炭素換算で求める方法を,大型のシアノバクテリアに適応するために必要な技術である。実際のシアノバクテリアへの適用は次年度に行う予定である。また,分解能を下げる原因の一つであるクライオ観察中の試料のドリフトの原因は突き止めたが,改善にむけた試料ステージの改良は現在行っている最中であり,次年度の上半期中には完了予定である。今年度は,微細シアバクテリアを軟X線顕微鏡で明瞭に観察するためのエネルギー最適化に向けた実験を行った。2週間培養したP. foetidaの細胞内で,通常細胞で多くみられたポリリン酸顆粒様体は確認できなかったが,532 eV (2.33 nm)付近で高いX線吸収を示す構造体を確認した。532 eV付近にカルボニル基(C=O*)O 1s→π*遷移があることから,カルボニル基に由来する構造であると考えた。細胞内に存在するタンパク質や糖類はDNAに比べ,532 eV付近で高いX線吸収を示すことから,この構造体はタンパク質や糖類が多く含むと考えられる。12週間培養したP. foetidaの細胞は,外形がはっきりせず,原核細胞オルガネラも確認できなかったことから,活動していない死細胞であると考えられる。ここまでの成果をまとめ,第13回X線顕微鏡国際会議(XRM2016)で報告した。平成27年度に最適化したCTセルおよびクライオ試料ステージを用い,含水EPSのX線マイクロCT法に最適な観察条件の設定を行う予定であったが,4月に予定していたX線顕微鏡の制御PC仕様変更による画像処理系のバージョンアップが,物品の納品が大幅に遅れ,顕微鏡の立ち上げも遅れ,予定していた実験が全てできなかった。糖類とタンパク質を分離して観察するための最適なエネルギーを見極めるため,UVSORで走査型X線顕微鏡による実験を計画し,実施したが,装置の不具合でビームタイム中に必要なデータを全て取得することができなかった。

天然水中に存在する有機物の中で,植物プランクトン由来で,他の分析法や顕微法では把握が困難であり,主に多糖類からなるとされている細胞外代謝産物(EPS)に含まれる有機物量を,軟X線マイクロCTなどのイメージング法を用い見積もる方法の開発を行った。今年度は,EPSと細胞の識別(同定)とそれらのX線吸収係数の実効値の決定を行い,EPSに含まれる有機物量の見積を行った。試料は,琵琶湖から単離し滋賀県琵琶湖環境科学研究センターで培養したSynechococcus sp.とPseudanabaena foetida nom. nud. (Phormidium tenue緑株,以下PTGと略す)を用いた。培養した株を立命館大学SRセンター結像型軟X線顕微鏡ビームライン(BL12)と分子科学研究所極端紫外光研究施設(UVSOR)走査型X線顕微鏡ビームライン(STXM BL4U)で観察した。対数増殖期以降のSynechococcus sp.で,EPSと考えられるX線画像を取得し,X線吸収微細構造(XAFS)でカルボキシル基の存在を確認した。この方法をPTGに適応したところEPSは確認できなかった。この結果は電子顕微鏡観察の結果とも一致している。XAFSで,PTGの細胞内でポリリン酸顆粒様体の存在を確認した。ポリリン酸顆粒様体以外に複数の構造体が存在することも確認した。Synechococcus sp.のX線イメージからEPSと細胞の実効X線吸収係数を求め,それぞれの含有有機物量を求めたところ,全EPSには細胞と同程度の有機物が存在する可能性があること分かった。この有機物はSynechococcus sp.の細胞内でも局在していた。この結果は,EPSがSynechococcus sp.の細胞内で産生していることを示唆し,EPSが細胞内で産生されている様子が初めて可視化されたと考えている。天然水中に存在し,汚濁物質として問題となっている有機物には,植物プランクトン由来で,他の方法では把握が困難で,主に多糖類から成る細胞外代謝物(EPS)がある。EPSに含まれる有機物量を正確に計測するため,細胞とEPSに含まれる元素を軟X線顕微法で詳細に調べた。X線吸収微細構造(XAFS)による細胞内の構造体の同定とX線マイクロCT法によるEPSの基本構成物質であるアガロースのX線顕微鏡像の取得に成功し,EPSに含まれる有機物量をより正確に計測する方法を開発することができた。平成27年度に最適化したCTセルおよびクライオ試料ステージを用い,含水EPSのX線マイクロCT法に最適な観察条件の設定を行う。最適化したEPS充填法を実際のシアノバクテリアに適応する。これらの成果を第13回X線顕微鏡国際会議(XRM2016)で報告する。(1)X線マイクロCT法の観察条件の設定:最適化したCTセルに含水EPSを封入し,クライオX線CT観察を行い,観察に最も適したエネルギー(波長),温度,時間などのパラメータを決定する。テスト試料は,アガロースゲルと細胞径が2μm以下のピコシアノバクテリアSynechococcus sp.とする。合わせて,前年度から進めているCT像の高分解能化に向けたクライオ試料のドリフト軽減のための試料ステージの改良と,撮像の高速度化に向けたX線CCDカメラの画像取得装置の改良を完了させる。(2)EPS充填法の大型の植物プランクトンへの適応:アガロースゲルを用い検討したEPS充填法を,実際の試料に適応する。
カービング氷河末端における氷融解量の直接測定

カービング氷河(海や湖に流入する氷河)の水中融解は観測が困難で、その定量化とプロセスの理解が急務となっている。そこで本研究では、サイドスキャンソナーを使って氷河末端の水中形状を測定し、融解速度の測定を試みた。パタゴニア、グリーンランド、南極で観測を行った結果、パタゴニアの湖に流入するグレイ氷河にて、水中で前方に突出した氷河形状が明らかになった。水温の測定結果と合わせて、湖面付近でより著しい氷融解が示された。当初計画した手法では融解の定量化には至らなかったものの、水温、濁度、水同位体の測定から融解速度の推定に成功した。以上の成果は、淡水カービング氷河の消耗機構に新しい知見を与えるものである。2014年度は、カービング氷河末端での観測に使用するサイドスキャンソナーの選定と調達、パタゴニアとグリーンランドのカービング氷河で試験的な運用を実施した。1.サイドスキャンソナーの導入:カービング氷河末端形状を測定するために、扇状の音波を使って水中地形をセンシングするサイドスキャンソナーを導入した。観測機器会社との情報交換を通じて機器を選定し、調達にあたっては国内代理店の研究所を訪問して海洋での試験測定を実施した。2.カービング氷河での観測:2014年8月にグリーンランド北西部にて、サイドスキャンソナーによる観測を実施した。まず海洋に流入するボードイン氷河では、氷河から崩れた氷山の影響で十分にカービング端に近づくことができず、また200mを超える深い海底からの反射が十分でないため、当初予定した測定が難しいことが判明した。そこで、過去に氷河が流入していたと考えられる比較的浅い海洋で測定を行ったところ、海底に形成された氷河地形の二次元情報を取得することができた。さらに2014年10月に南パタゴニア氷原ペリート・モレノ氷河にて、氷河前の湖で同様の観測を実施した。その結果、海底の地形構造の一部を測定することに成功した。上記の試験的な観測を通じて、導入したサイドスキャンソナーの測定能力、カービング氷河前での測器の取り回し、データの取得等に関するノウハウを習得した。その結果、精密な測定を行うためには、対象物との距離を十分短くすることが重要であり、当初予定したよりも氷河に近づいて観測を行う必要性が示された。従って、当初予定のペリート・モレノ氷河に加えて、より規模の小さなカービング氷河での観測も視野に入れて研究を進める必要がある。プロジェクト二年目にあたる2015年度は、グリーンランド、パタゴニア、南極半島にてサイドスキャンソナーを運用し、カービング氷河末端部の水中観測を行った。また、氷河前の海洋、湖において、水温、塩分、濁度などを測定し、人工衛星データを使った解析では氷河末端変動と流動速度を測定した。2015年7月にはグリーンランド北西部サン氷河において、カービング端から数10メートルにまで近寄ってサイドスキャンソナー観測をおこなった。至近距離からの観測によって水中の氷壁から反射が得られた。しかしながら船の揺動が激しく、氷壁形状の詳細ははっきりしない結果となった。次に、2016年1-2月には南パタゴニア氷原グレイ氷河前の湖にてサイドスキャンソナー観測を行った。ここでは氷壁から20-30メートルまで接近して、水中の氷壁を明瞭に観察することに成功した。ソナーの反射データは水中で氷が大きく前にせり出していることを示すものであり、そのような測定結果はこれまでに報告されていないものである。氷壁前でロープに固定したCTDを水中に降下させて水深を測定したところ、水中深さ約50mの地点で、氷河から前方に突出した氷の存在を確認した。水中に氷が張り出すことで水との接触面積が増え、氷の融解速度に影響を与えている可能性がある。2016年2月には南極半島リビングストン島ジョンソン氷河前の海洋で、サイドスキャンソナーの観測を試みた。しかしながら海洋が非常に浅く(10-20m以下)、有意義な観測データは得られなかった。上記の3地域では、氷河前の海洋と湖にて水温、塩分、濁度、溶存酸素を測定するとともに、サンプリングによる酸素水素同位体分析を実施した。これらのデータを使って、氷河融解水の存在割合の計算を進めており、現在その精度向上を検討中である。また人工衛星データから氷河の末端位置変動と流動速度を測定し、その差分から末端消耗量(カービング+水中融解)の推定を行った。研究目的を達成するための最も有力な手段として、サイドスキャンソナーによる水中での氷壁観測を検討してきた。過去二年間において、パタゴニア、グリーンランド、南極のカービング氷河においてサイドスキャンソナーを用いた観測を実施し、これまでほとんど前例のない水中での氷壁直接観測データが得られつつある。当初の見込みと比較して、使用するソナーの測定範囲が狭く、氷壁の詳細な形状測定は容易ではない。また、氷山の状態やカービングの危険から氷河前縁に十分近寄ることが難しい場合が多く、同じ氷壁を複数回測定してその形状差分から融解量を測定する試みは成功していない。しかしながら、パタゴニアのグレイ氷河では非常に明瞭な反射像を得ることに成功し、またその結果から、水中で氷壁が前方にせり出している、という新しい知見が得られた。

サイドスキャンソナーに加えて、カービング氷河前縁の海洋および湖でCTDを運用し、水温、塩分濃度、濁度、溶存酸素などの測定データが得られている。これらの海水・湖水特性に基づいて、水中融解量の定量化を進めているところである。CTDによるデータ収集は当初の計画よりも順調に進んでおり、今後計算手法を工夫して精度を上げることにより、水中融解量測定の有力手法となると考えている。以上の観測と解析の成果は、すでに国内外の学会でその一部を発表済みである。またスイス、スペイン、チリ、アルゼンチンの研究者との連携、共同研究も順調に進んでいる。以上の研究進捗状況から鑑みて、本研究はおおむね順調に進展しているといえる。プロジェクト最終年度にあたるH28年度は、(1)パタゴニアにおける野外観測、および(2)人工衛星データと野外観測データを用いた解析を実施した。(1) H30年3月512日に、チリ・グレイ氷河とその前縁湖において野外観測を実施した。小型船をチャーターして、サイドスキャンソナーによる氷河末端部の水中構造の測定、CTDによる水温・濁度測定、分析用の採水を実施を行った。サイドスキャンソナーによる測定では、前年に明らかになった氷河末端の氷が水中に突き出た構造が再度確認された。また、現地で活動するガイドから、H28年10月に起きたカービングイベントに関する情報を収集した。カービング時に撮影された氷河末端の写真は、サイドスキャンソナーのデータと一致するものであり、水中に突き出た氷に作用する浮力が大規模なカービングを誘起したことを示唆する。この観測は海外共同研究者(チリ・Austral大学、Marius Schaefer)との共同で実施した。(2)これまでにアルゼンチン・ペリートモレノ氷河で測定した湖水特性データと人工衛星データを合わせて解析し、氷河末端の水中融解を推定することに成功した。この解析結果は、水中融解速度が湖水温度の影響を受けて季節的に変動することを示している。また人工衛星データによって明らかになった氷河末端位置の季節変動が、水中融解を含む末端消耗によって駆動されることが明らかになった。以上の結果をまとめて、国内外の学会で発表するとともに、国際誌に英文論文を公表した。またチリ国内の氷河研究機関(Centro de Estudios CientificosおよびGeoestudios Ltda)を訪れて、研究成果に関する講演を行った。カービング氷河(海や湖に流入する氷河)の水中融解は観測が困難で、その定量化とプロセスの理解が急務となっている。そこで本研究では、サイドスキャンソナーを使って氷河末端の水中形状を測定し、融解速度の測定を試みた。パタゴニア、グリーンランド、南極で観測を行った結果、パタゴニアの湖に流入するグレイ氷河にて、水中で前方に突出した氷河形状が明らかになった。水温の測定結果と合わせて、湖面付近でより著しい氷融解が示された。当初計画した手法では融解の定量化には至らなかったものの、水温、濁度、水同位体の測定から融解速度の推定に成功した。以上の成果は、淡水カービング氷河の消耗機構に新しい知見を与えるものである。2014年度は当初の計画に沿って、サイドスキャンソナーの導入を行い、カービング氷河の前縁で試験的な観測をおこなった。予定していたパタゴニア、ペリートモレノ氷河での観測に加えて、グリーンランドでもソナーを使った観測を行い、装置の特性や運用方法に関して重要な知見を得ることができた。
標識薬剤を用いた心疾患進行過程における心臓エネルギー獲得機能の変化に関する研究

2種の心臓集積性標識薬剤(標識脂肪酸、標識糖)を用い、様々な状況下(3種の状況:心不全疾患、心不全+心機能改善薬、糖尿病疾患)にある心臓のエネルギー獲得機能の変化を、動物実験(心機能評価法):心臓集積性実験,心筋代謝物実験,心筋局所集積性画像化実験等により検討した。その結果、心不全疾患においては,疾患の進行に伴ない心筋エネルギー獲得機能が脂肪酸代謝から糖代謝への移行が確認され、心機能改善薬投与の実験では,改善薬の脂肪酸代謝機能改善効果が示され、また糖尿病疾患においては,糖尿病による心臓エネルギー獲得機能(脂肪酸代謝機能、糖代謝機能)への影響(障害)が示された。1.【標識薬剤および実験動物】(標識薬剤)脂肪酸代謝を評価する薬剤として[I-131]9MPAを、糖代謝を評価する薬剤として[C-14]2DGを用いた。(実験動物)正常動物群(rat;正常)および心疾患作製動物群(rat;心不全(慢性期;CHF))を用いた。2.【研究内容】正常心臓およびCHF心臓における集積性経時変化実験、局所集積性画像化実験(ARG:オートラジオグラフィ)、脂肪酸代謝物実験等を行い、心不全疾患の進行過程(正常→心不全慢性期(心筋線維化))における心臓エネルギー獲得機能(脂肪酸代謝機能および糖代謝機能)の変化および心不全疾患進行過程おける心筋脂肪酸代謝機能(代謝物分布)の変化について検討した。【結果・考察】集積性経時変化実験よりー標識脂肪酸の場合、検討したいずれの時間においても(正常心筋集積性)>>(CHF心筋集積性)であり、これら2本の(時間ー集積性)曲線はいずれも投与直後において最大の集積性を示し、その後時間経過と共に減少していくことがわかった。一方標識糖の場合、検討したいずれの時間においても(CHF心筋集積性)>(正常心筋集積性)であり、心筋集積性は時間経過と共に非常に穏やかに増加していくことが確認できた。これらの結果より、心不全の病期進行過程において、心臓のエネルギー獲得機能が(脂肪酸利用)→(糖利用)にシフトしていることが確認できた。この知見はARG画像より得られた結果からも支持された。脂肪酸代謝物実験(心筋における脂肪酸代謝物の分布をTLCの手法を用いて分離・定量解析)よりー上記心不全疾患進行過程における心筋脂肪酸集積性の急激な減少は、心筋における脂肪酸貯蔵機能の減少に起因していることがわかった。1.【標識薬剤、実験動物】(標識薬剤)薬剤として標識脂肪酸[I-131]9MPAを用いた。(心機能改善薬)PV(脂肪酸代謝機能改善予想薬)およびカルベジロール(心臓交感神経機能改善薬;Car)を用いた。(実験動物)正常動物群(正常群)、心不全(慢性期(CHF))モデル作成動物群(CHF群)及び(CHF+心機能改善薬)動物群(改善薬投与群(PV投与群、Car投与群))を用いた。(操作、改善度解析方法)〈操作〉正常群、CHF群および改善薬投与群に薬剤を投与し、心臓集積性を放射能計測により算出,同時に心重量を計測する。次に各動物群においてX軸に心重量値, Y軸に心臓集積性値をプロットしたグラフを作成する。〈解析方法〉実験動物3群の心臓において、X軸の変化より,心機能改善度=(CHF群から改善薬投与群へのX座標移動値)÷(CHF群から正常群へのX座標移動値)のように、またY軸の変化より,脂肪酸代謝機能改善度=(CHF群から改善薬投与群へのY座標移動値)÷(CHF群から正常群へのY座標移動値)のように各々の改善度を数値化した。2.【研究内容】本研究では実験動物3群の心臓における心重量増減の検討、心臓集積性実験等を行い、改善薬の薬効を心機能の改善度及び脂肪酸代謝機能の改善度として数値化することにより、2種の改善薬間の脂肪酸代謝機能(エネルギー獲得機能)の改善度の違いを示した。【結果、考察】PV投与群では、心機能改善度=0.57、脂肪酸代謝機能改善度=0.89の結果となり、PVの薬効は中程度の心機能改善作用を有し,且つ主な作用点は脂肪酸代謝機能改善であることがわかった。一方Car投与群では、心機能改善度=0.59、脂肪酸代謝機能改善度=0.15であり、Carの薬効は中程度の心機能改善効果を有するが、脂肪酸代謝機能改善への寄与はわずかであることがわかった。平成25年度は心臓集積性標識薬剤を用いて「心不全疾患の進行過程に伴う心臓エネルギー獲得機能の変化」に関する研究を行い"心機能評価法"を確立した。平成26年度は上記"評価法"を用いて「心不全+心機能改善薬における心臓機能評価」を行い,改善薬の薬効を評価した。平成27年度では"評価法"を「糖尿病における心臓機能評価」に応用し,糖尿病により障害を受けた心臓機能を腎臓機能と対比させながら評価を行った。研究内容は以下のようである。1.【標識薬剤、実験動物】(標識薬剤)標識脂肪酸:[I-131]9MPAおよび標識糖:[C-14]2DGを用いた。(実験動物)正常動物群:14-3-3トランスジェニックマウス(14-3-3系正常),糖尿病動物群:正常群にストレプトゾトシン投与により作成(14-3-3 DM)。【操作】

正常群,糖尿病群に2種の標識薬剤を同時投与し,目的時間経過後心臓,腎臓を摘出,更に臓器含有の2核種([I-131]と[C-14])を半減期の差を利用した放射能分離計測を行い,標識脂肪酸集積性および標識糖集積性を別々に算出した。更に糖尿病群における心臓(脂肪酸/糖)集積性をX軸に,腎臓(脂肪酸/糖)集積性をY軸にプロットしたグラフを作成した。2.【研究内容】本研究では糖尿病による腎臓および心臓への障害の影響を、両臓器の標識脂肪酸および標識糖の集積性を対比させることにより検討した。【結果、考察】(結果)標識脂肪酸の場合,腎臓脂肪酸集積性(↓)に伴う心臓脂肪酸集積性(↓)より,比較的良好な正の相関が見られ、一方標識糖の場合,腎臓糖集積性(↓)に伴う心臓糖集積(↑)より,比較的良好な負の相関が見られた。(考察)糖尿病発症に伴い、脂肪酸集積性/糖集積性において腎臓機能および心臓機能に変化が見られ、両機能の変化の間に一定の関連性があることが示唆された。2種の心臓集積性標識薬剤(標識脂肪酸、標識糖)を用い、様々な状況下(3種の状況:心不全疾患、心不全+心機能改善薬、糖尿病疾患)にある心臓のエネルギー獲得機能の変化を、動物実験(心機能評価法):心臓集積性実験,心筋代謝物実験,心筋局所集積性画像化実験等により検討した。その結果、心不全疾患においては,疾患の進行に伴ない心筋エネルギー獲得機能が脂肪酸代謝から糖代謝への移行が確認され、心機能改善薬投与の実験では,改善薬の脂肪酸代謝機能改善効果が示され、また糖尿病疾患においては,糖尿病による心臓エネルギー獲得機能(脂肪酸代謝機能、糖代謝機能)への影響(障害)が示された。平成26年度は標識脂肪酸および正常動物、慢性心不全(CHF)動物、CHF+心機能改善薬動物を用いた動物実験(心重量の変化、心臓集積性の経時変化実験)を行い、心機能改善薬の薬効を心機能改善度および脂肪酸代謝機能改善度の点で数値化することにより、用いた2種の改善薬(PVおよびCar)の心機能改善の作用点および改善の程度を検討することにより、改善薬の違いによる慢性心不全からの脂肪酸代謝機能(エネルギー獲得機能)の改善度の違いを数値により示した。上記のように、平成26年度はほぼ申請通り(内容:心機能改善薬の薬効を、脂肪酸代謝機能(エネルギー獲得機能)の変化より評価)実験が進行し、自己点検による「研究の目的」の達成度は約85%(おおむね順調)と評価した。医療系薬学、化学系薬学、放射性医薬品1.平成27年度は心不全疾患の進行過程(3段階:正常→心不全(急性期)→心不全(慢性期))における心臓エネルギー獲得機能の変化について検討する。2.【実験材料】(標識薬剤)脂肪酸代謝を評価する薬剤として標識脂肪酸[I-131]9MPAを、糖代謝を評価する薬剤として標識糖[C-14]2DGを用いる。(実験動物)正常動物群(rat;正常)、心疾患作成動物群(rat;心不全(急性期、慢性期);ヒト巨細胞性心筋炎様自己免疫性心筋炎モデル作成動物)を用いる。(標識薬剤投与法)2種の標識薬剤の同時投与【研究内容・方法】正常心臓および心不全(急性期、慢性期)
国語科教師の専門知の発展を促す授業批評会のあり方に関する研究

本研究の成果は、(1)国語科教師が、研究授業の一環として行われる授業批評会を介して、授業づくりのための教職専門知を構築する、教師としての学習過程を解明できたことと、(2)現職教員研修としての授業批評会の今後の可能性を考察できたこと、である。本研究の意義は、先行研究のような脱文脈化・抽象化された結果理論ではなく、授業改善のための教職専門知を構築するに至る教師の学習モデルを提示できた点に見出される。なお、具体事例に関わる調査分析結果は、査読あり学会誌を含め複数の学術論文として発表するとともに、全国規模の学会での口頭発表も行った。本研究の目的は、国語科授業研究の一環として行われる授業批評会に焦点を絞り、そこでの授業者教師の学びの姿(授業づくりに関わる専門知を獲得し発展させていく過程)をライフストーリー・インタビューに基づく語りの記述・解釈によって解明し、教員研修としての授業研究のあり方について考察することにある。なお、研究の対象となる授業は「読むこと」の領域とした。また、授業批評会における同僚教師の批評を授業者教師がどのように取り込みつつ語りを構築したのかについて、具体的な文脈も含めて明らかにするべく、事例研究により研究を遂行した。本年度は、全国各地で活躍する若手教師からベテラン教師に至る、幅広い年代の国語科教師の協力の下、それぞれの教師が授業批評会をどのように意味付けたのかに関わるインタビューを実施し、データの収集と記述・解釈に努めた。なお、インタビューだけでなく、研究代表者が協力者教師の授業及び批評会を観察するという参与観察も実施し、インタビューの場において、語り手教師との間で語りの内容についてイメージの共有を図れるよう配慮した。研究の結果として、現職国語科教師にとって、授業づくりに関わる専門知は、国語科教育研究における理論が背景とした領域だけで構築されるものではないことが判明した。「読むこと」の授業づくりに関する先行研究理論は、抽象的・一般的な学習者の思考モデルや教材文が持つ言語構造を背景に開発されてきた。ところが、現職国語科教師が日々の授業づくりにおいて背景とするのは、そうした領域にとどまらない。学校ごとに異なる個別具体的な学習者はもちろん、勤務校の学校文化や目標、それに基づいて策定された年間指導計画、同僚教師の思想といった社会状況の文脈に基づいて専門知は構築され、そこにこそ、現職国語科教師の授業づくりのリアリティが見出される。本年度の研究成果は、国語科教師が、領域「読むこと」の授業改善を、研究授業の一部である授業批評会での同僚教師の批評を手がかりに、どのような省察過程を通して図ろうとしているのか、複数の事例研究として解明できた点にある。具体的には、日本教育実践学会『教育実践学研究』12-2(2011年)、『和歌山大学教育学部教育実践総合センター紀要』20(2010年)、『和歌山大学教育学部紀要-人文科学-』61(2011年)にて論文発表し、全国大学国語教育学会第118回東京大会(2010年)で口頭発表を行った。研究方法として、インタビューによる教師の語りを分析考察した。教師の語りには、実践の具体的文脈が伴い、その教師ならではのリアリティ・真実性が反映されるからである。授業改善には、唯一絶対の脱文脈化された正解理論がないため、「反省的実践家」としての教師が、自身の授業を文脈的総合的に省察しつつ語るという方策が適している。複数の教師たちの語りから解明された成果は、以下の通りである。同僚教師の批評を手がかりに、授業者教師は、1:1時間の授業を単元全体に位置づける、現実践を実践歴に位置づけるなど、より幅広い文脈の中で省察できる、2:国語科教材文解釈の方法を学習者に習熟させる学習指導過程で、どの段階でどんな知識を与えるべきかという必然性を導き出すことができる、3:国語科指導過程論について、定式化・抽象化された先行理論を機械的に適用するのではなく、課題の発見と解決策の模索という省察の過程を通して、必然性のある指導過程論が構築できる、のである。本研究では、授業改善に関する、国語科教師の学習過程を解明した。先行研究では、授業改善のための過程ではなく、結果としての抽象化・脱文脈化・定式化された理論が提示されてきた。そのような中で、本研究は、課題解決方法ではなく、課題解決過程モデルを提示できた点に意義が見出される。
シグナル動態操作によるB細胞分化遺伝子群の発現制御

BCRシグナルではNFκBの活性化に必要である要素が不確定であった。申請者は、TAK1がB細胞の活性化、細胞分化に必須の分子であることを生理学的に明らかにし、TAK1会合分子TAB2/3がNFκBの活性化に必須であることを分子生物学的に示した。数理モデル解析と細胞の入出力を定量的に計測し、IKKのSteepな活性動態は正のFeedback機構により制御されていることを明らかにした。また、ERKやIKKの活性動態を制御するユビキチン化酵素IAPを、遺伝子発現解析と反応速度数理モデルを駆使し同定した。更にBCR刺激によるエピジェネティックな制御もNFκBによって媒介されることを明らかにしている。シグナル伝達の中心的役割を担う分子を標的とした現行の薬剤はシグナルそのものを抑制するため深刻な副作用が懸念される。シグナルの活性動態を操作することによる特異的な遺伝子群の発現制御が可能であれば脱分化(癌)、過分化(自己免疫疾患)治療への新規戦略になりうる。数理モデル解析ではシグナル動態操作による特異的な遺伝子群の発現制御が理論上可能であることが示されている。本課題ではシグナル動態操作による特異的な遺伝子群の発現制御は本当に可能かどうかを明らかにすることを目的としている。申請者はB細胞を用いた系で、分化誘導可能な刺激によるシグナルの活性動態に関与している分子を既に6遺伝子同定している。このシグナル動態を制御する候補分子の形成するシグナルネットワークと分化誘導に関わる機能解析を行い、特異的な分化関連遺伝子群の発現とB細胞分化の制御を試みる。これまでの解析から得ているNF-κB活性動態を制御する候補分子Xは、同定している6分子の中で唯一正にシグナル動態を制御していることから、シグナルの活性化動態と誘導される遺伝子の発現動態を定量的・経時的に計測し、数理モデル解析を行い、B細胞受容体シグナルの活性動態を正に制御し、その維持に必要であることを見出している。現時点でここまでを論文にまとめ近く出版される予定である。この解析の知見を基に、NF-κB活性動態の操作に必要な候補分子Xの機能部位の推定を行い遺伝子発現への影響を会席する予定である。候補分子Xは遺伝子発現を介して正の動態制御に関わり、かつ早期のシグナル伝達にも関わるため、その遺伝子欠損はシグナル活性そのものを大きく減衰させる。そのため候補遺伝子の改変は文献情報とモデルによるシミュレーションにより後期のシグナルネットワークに関与するアミノ酸部位の変異が望ましい。候補遺伝子の機能部位が不明であるため、定量質量分析から機能部位の同定と関わるネットワークの推定を行っている。申請者はB細胞を用いた系で、分化誘導可能な刺激によるシグナルの活性動態に関与している分子を遺伝子発現解析により6遺伝子同定した。これまでの解析から得ているNF-κB活性動態を制御する候補分子は、同定している6分子の中で唯一正にシグナル動態を制御していることからInhibitor of Apoptosis Protein(IAP)であることを明らかにした。このIAP欠損細胞と阻害剤を用いて、シグナルの活性化動態と誘導される遺伝子の発現動態を定量的・経時的に計測し、数理モデル解析を行い、B細胞受容体シグナルの活性動態を正に制御し、その維持に必要であることを見出している(Sci Rep. 2016;6:27706)。これらの解析の知見を基に、NF-κB活性動態の操作に必要なIAP分子の機能部位と蛋白修飾の標的となっている分子の推定を行い遺伝子発現への影響を解析する予定である。シグナル動態を制御しているIAPは遺伝子発現を介して正の動態制御に関わり、かつ早期のシグナル伝達にも関わるため、その遺伝子欠損はシグナル活性そのものを大きく減衰させる。そのため遺伝子の改変は文献情報とモデルによるシミュレーションにより後期のシグナルネットワークに関与するアミノ酸部位の変異が望ましい。IAPの機能部位が不明であるため、定量質量分析から機能部位の同定と関わるネットワークの推定を行っている。申請者はB細胞を用いた系で、分化誘導可能な刺激によるシグナルの活性動態に関与している分子を遺伝子発現解析によりNF-κB活性動態を制御する候補分子としてInhibitor of Apoptosis Protein(IAP)がその一つであることを明らかにした。

このIAP欠損細胞と阻害剤を用いて、シグナルの活性化動態と誘導される遺伝子の発現動態を定量的・経時的に計測し、数理モデル解析を行い、B細胞受容体シグナルの活性動態を正に制御し、その維持に必要であることを見出している(Sci Rep. 2016;6:27706)。このシグナル動態を制御する候補分子の形成するシグナルネットワークと分化誘導に関わる特異的な分化関連遺伝子群の発現を検証するため、マウスのプライマリーのB細胞を用いて刺激依存的な時系列、濃度依存的遺伝子発現のゲノムワイド解析も行った(投稿中)。分化シグナルの活性動態操作により分化に関連した遺伝子群が特異的に制御されているかどうかを評価する。BCRシグナルではNFκBの活性化に必要である要素が不確定であった。申請者は、TAK1がB細胞の活性化、細胞分化に必須の分子であることを生理学的に明らかにし、TAK1会合分子TAB2/3がNFκBの活性化に必須であることを分子生物学的に示した。数理モデル解析と細胞の入出力を定量的に計測し、IKKのSteepな活性動態は正のFeedback機構により制御されていることを明らかにした。また、ERKやIKKの活性動態を制御するユビキチン化酵素IAPを、遺伝子発現解析と反応速度数理モデルを駆使し同定した。更にBCR刺激によるエピジェネティックな制御もNFκBによって媒介されることを明らかにしている。候補分子Xの遺伝子欠損はシグナル活性そのものを大きく減衰させるため、対応策として刺激後阻害剤を添加し、活性動態を操作した細胞の時系列、濃度依存的遺伝子発現を次世代シークエンサにて大規模定量データを取得している。この大規模定量データの統計学的解析を行い、シグナルの動態と相関する遺伝子群が動態操作により分化に関連して特異的に制御されているかどうかを評価する。IAPの遺伝子欠損はシグナル活性そのものを大きく減衰させるため、対応策として刺激後阻害剤を添加し、活性動態を操作した細胞の時系列、濃度依存的遺伝子発現を次世代シークエンサにて大規模定量データを取得している。システム免疫学
GPIアンカーの構造から解明するペルオキシソーム病の病態と発症メカニズム

細胞膜上に発現するグリコシルホスファチジルイノシトールアンカー(GPIアンカー)型タンパク質は大部分がアルキルアシル型であり、GPIアンカーの生合成過程でその脂質部分がジアシル型からアルキルアシル型に変換される。本研究では、その脂質変換に用いられるアルキル供与体を明らかにすると共に、GPIアンカー型タンパク質がアルキルアシル型である生理的意義を解明することを目的とした。これまでの研究では、ヒト慢性白血病由来細胞株であるK562細胞を用いて小胞体のアルキル脂質生合成系を破壊、GPIアンカー型タンパク質の脂質構造に対する影響を検討してきた。しかしながら、細胞が小さく精密質量分析を行うだけの十分量のタンパク質を得ることができなかった。そこで各種データから細胞サイズを比較検討し、細胞の表面積が大きく、かつ本実験系に用いることのできる細胞として、ヒト子宮頸がん由来細胞株であるHeLa細胞を選択した。その後、本細胞表面にタグ付のGPIアンカー型タンパク質を恒常的に発現する細胞株を構築、この細胞株からさらにアルキル脂質生合成系を破壊した細胞株の構築に取り掛かった。本研究において、細胞膜の表面積が大きくかつGPIアンカー型タンパク質の発現効率が良い細胞株はHeLa細胞であることが分かった。さらに本細胞株では、ノックアウト細胞の作成効率も良いことが分かった。我々は、これまでにGPIアンカーの生合成の過程でジアシル型のGPIアンカーがアルキルアシル型に変換されることを明らかにしていた。しかしアルキルアシル型に変換される際のアルキル供与体については不明なままであり、そのアルキル供与体の同定を試みた。先に生合成における中間体の脂肪鎖構造を分析すると、その構造は細胞内の特定のリン脂質の脂肪鎖構造と類似することが分かり、生体内でのリン脂質生合成を行う酵素であるSELI, CHPT1, CEPT1をそれぞれ欠損させ、GPIアンカーへの影響を検討することにした。事前の研究において、その上記のリン脂質の生合成に関わる酵素遺伝子をCRISPR/Cas9のシステムを用いてノックアウト細胞を作出すると、細胞にストレスが掛かり死滅あるいは増殖が極端に遅くなることが分かっていた。そこで本研究課題では、Tet-offシステムでターゲット遺伝子の発現を制御しつつ、CRISPR/Cas9のシステムでノックアウトする方法をとった。細胞はヒト血球細胞のK562を用いて、GPIアンカー型タンパク質であるCD59にタグを付けて恒常的に発現させ、Tet-offシステムを導入後にCRISPR/Cas9のシステムでノックアウトした。この手法により、ゲノム上のターゲット遺伝子が破壊されても目的の細胞が得られた。その後Tet-offシステムでターゲットとなる遺伝子の発現を抑制、GPIアンカーに対する影響を検討した。アフィニティークロマトグラフィーでCD59を精製、PVDF膜に転写後、亜硝酸ナトリウムで処理することでPI部分を遊離、得られたPIの脂質部分を質量分析法で分析した。また総脂質の分析を行った。以前の実験で、目的遺伝子を直接ノックアウトした時は細胞への影響が大きくノックアウト細胞を作出できなかった。そのためTet-offシステムを併用し目的遺伝子の発現を制御しながら遺伝子を破壊、細胞への影響を少なくすることでノックアウト細胞を得ることが出来た。本研究におけるノックアウトの確認方法としては、ゲノムDNAおよびcDNAをDNAシーケンサで分析することで確定した。さらにノックアウト細胞の、GPIアンカーの構造を検討した。作出したノックアウト細胞にトリチウムラベルされたマンノースを取り込ませ、GPIを標識、アシル鎖がアルカリ感受性を持つという性質を用い、リゾ体を薄層クロマトグラフィーで分離、アルキル鎖の有無を確認した。その結果、コントロールと比較して、アルキルドナーの候補として考えていた脂質を生合成する遺伝子のノックアウト細胞では、アルキルアシル型GPIアンカーがわずかに減少していた。しかし考えていたよりも少ない変化量であった。さらに細胞から上記の遺伝子のノックアウト細胞から、リン脂質を抽出し精密質量分析を行った。この結果、先のいずれの遺伝子を潰した細胞でも、コントロールと比較して細胞内の総リン脂質に占める各リン脂質の割合が変化していることが明らかになった。このことは細胞が代替の経路を活性化することで、脂質のプロファイルが変化した可能性が有る。

当初の想定よりGPIアンカーへの影響が出なかった、あるいは脂質プロファイルが予想と異なったことの原因としては、以下のことが考えられる。Tet-offシステムを働かせ、既に発現しているタンパク質と細胞内に蓄積する脂質が消失して影響が出るまでに少なくとも10日ほど時間が掛かる。さらにGPIアンカーの脂肪鎖分析に必要なタンパク質量は1 nmolで、大量の細胞を得る必要が有り、それまで培養を続ける必要が有る。培養時間が掛かりすぎると、細胞に掛かるストレスを回避するパスウェイが活性化されたと考えられる。この影響を回避するため、一時的な遺伝子抑制が可能なsiRNAによって目的の遺伝子をノックダウン、GPIアンカー型タンパク質を精製、そこから亜硝酸ナトリウム処理によって脂肪鎖部分を得て精密質量分析を行うことを考えている。この方法はノックアウト細胞を作出する前に行っていた方法であり、前述のアルカリ感受性の方法を用いてアルキルアシル型が減少して、ジアシル型になったことを確認していたシステムであり、確実に結果が得られるものと考えている。
熱ショック応答を用いた変形性関節症治療のための基礎的研究

温熱刺激は関節軟骨基質生合成を促進することや、軟骨細胞に熱ショック応答によるストレス耐性を与えるなどの報告がなされており、変形性関節症進行予防効果が期待されている。しかしながら、関節を構成する細胞における温熱刺激に対する反応の詳細は未だ不明な点が多い。本年度は、培養温度条件の違いが関節軟骨細胞の代謝と生存率に与える影響を検討した。培養温度条件が与える影響を解明するために、膝関節内温度付近の32°C、深部体温の37°C、および細胞生存可能閾値付近の温度である41°Cの3条件において、最大21日間ペレット培養した。軟骨細胞の分化状態と細胞外基質形成の評価を、湿重量測定、遺伝子発現解析、組織学的観察、超微細構造観察、および生化学的解析によって多角的に検討した結果、37°C条件において軟骨分化マーカーであるII型コラーゲンのmRNA発現が最も高くなり、細胞外基質も最も形成されることが示唆された。DNA量は41°Cで有意に少なく、温度が高い程DNA量が少なかった。本研究により、培養温度は脱分化した軟骨細胞の再分化およびECM形成に影響を与えることが明らかとなった。41°Cという高温環境では、細胞数の減少およびECM関連遺伝子の発現抑制が生じ、その結果、著しくECM形成が阻害されたと考えられた。32°Cと37°Cを比較すると、37°Cの方がII型コラーゲンおよびプロテオグリカンの産生がより認められたことから、再分化が促進され、硝子軟骨様のECM形成に働いたと考えられた。以上の研究は、培養温度環境が軟骨細胞の再分化および細胞外基質形成に及ぼす影響の解明に貢献し、関節軟骨再生治療研究に寄与するところが多いと考えられる。26年度が最終年度であるため、記入しない。しかしながら、関節を構成する細胞(軟骨・半月板・骨・滑膜)における温熱刺激に対する反応の詳細は未だ不明な点が多い。本年度は、刺激温度・時間条件の違いが関節構成細胞(軟骨・半月板・骨・滑膜細胞)の代謝と生存性に与える影響を明らかにすることを目的として解析を行った。ブタ関節軟骨から軟骨細胞を単離し、32°C、37°C、41°C環境下で単層培養後、解析した。細胞増殖能は37°Cで最も促進されたが、細胞生存率は32°Cから41°Cにおいては影響が認められなかった。mRNA発現は、細胞外基質関連遺伝子は温度が高い程促進された。さらに軟骨細胞代謝を詳細に検討するために、三次元培養(ペレット培養)下における温度環境の影響を解析した。その結果、コラーゲンの産生は32°Cで最も生成され、グリコサミノグリカンは37°Cで最も生成される結果が得られた。このことから、温度環境が軟骨細胞代謝において重要な因子であること、また単層培養下と三次元培養下では温度に対する反応が異なることが明らかとなった。最後に、関節構成細胞を32°Cから49°Cで10分間もしくは20分間温熱刺激を暴露し、24時間後に生存細胞数を解析したところ、10分間の暴露でな細胞数の減少は認められなかったが、20分間の暴露では47°Cで軟骨細胞と滑膜細胞の減少が認められ、49°Cでは全ての細胞において著しく減少が認められた。このことから、細胞種によって温度耐容能が異なることが示唆され、また比較的高温でも10分程度であれば細胞死に至らないことが確認された。

26年度が最終年度であるため、記入しない。初年度の研究計画として、刺激温度・時間条件の違いが関節構成細胞(軟骨、半月板、滑膜など)の代謝と生存率に与える影響の解析を挙げていたが、軟骨細胞において成果が予想以上に得られたため、研究を若干集中させた。温熱刺激が軟骨細胞代謝に与える影響に関する実験は、刺激頻度・時間条件をさらに検討することで、臨床上有益な知見が得られる可能性が高いため、さらに推進させる。また、滑膜細胞や半月板細胞など他の関節構成細胞に関する実験は、リスクとなる温度条件の検討に焦点を絞り解析を進める。その上で、最終年度の計画として挙げている、関節構成細胞における熱ショック応答によるストレス耐性獲得のための至適温度条件を検討する。
エイズウイルス複製制御個体で誘導される細胞性免疫反応の解析

HIV複製の制御維持機序を知ることを目的とし、サルエイズモデルでのワクチン接種・サル免疫不全ウイルス(SIV)チャレンジ実験で2年間以上SIV複製が制御された個体群の解析を行った。これらは、ウイルスゲノムgag・nef領域に変異蓄積が認められる群と認められない群とに大別されるという興味深い新知見が得られた。前者では感染後1年目にGag・Nef以外の抗原を標的とする広範な細胞傷害性Tリンパ球(CTL)反応が認められ、後者はこれまでに報告のない極めて安定したSIV複製制御維持群と考えられた。本研究結果は、HIV感染に対するCTLによる機能的治癒の可能性およびその機序を示すものとして重要である。エイズウイルス複製の制御維持機序を知ることを目的とし、サルエイズモデルを用い、ワクチン接種・サル免疫不全ウイルス(SIV)チャレンジ実験でSIV複製が制御された個体群のウイルス学的および免疫学的解析を行った。解析には、これまでの実験で長期SIV複製制御に至ったMHC-Iハプロタイプ90-120-Ia共有群10頭の凍結サンプルを用いた。これらは血漿中ウイルスゲノムが検出限界以下の個体であり、血漿サンプルよりのウイルスゲノムcDNA増幅が困難であるため、凍結リンパ球サンプルよりのプロウイルス増幅を試みた。リンパ球より抽出したゲノムDNAよりのプロウイルスDNA増幅は困難であったが、IL7-IL15存在下における培養後のリンパ球のゲノムDNAよりnested PCRにてプロウイルスDNAの増幅が可能となり、長期SIV複製制御群のウイルスゲノム塩基配列解析に初めて成功した。SIVゲノムの各蛋白をコードする領域の塩基配列解析により、新しい知見として、これらのSIV複製制御群は、変異蓄積が認められる群(第I群:5頭)と変異がほとんど認められない群(第II群:5頭)とに大別されることが明らかとなった。90-120-Ia共有群はSIV感染初期には、主にGag-Nef抗原特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)反応の優位な誘導を示した。特に、強いGag206-216エピトープおよびGag241-249エピトープ特異的CTL,反応を示し、変異蓄積を認める第1群ではこれらのCTLからの逃避変異が選択されていた。一方、第II群ではこれらのCTL,逃避変異は認められなかった。これら両群の抗原特異的CTL反応の比較により、HIV/SIV複製の制御維持機序の解明に結びつくことが期待される。HIV複製の制御維持機序を知ることを目的とし、サルエイズモデルを用い、ワクチン接種・サル免疫不全ウイルス(SIV)チャレンジ実験でSIV複製が2年間以上の長期にわたり制御された個体群の感染免疫学的解析を推進した。H24年度までの解析で、長期SIV複製制御群は、ウイルスゲノムgag領域に変異蓄積が認められる群(第I群)と変異が認められない群(第II群)とに大別されるという極めて興味深い新知見が得られ、前者では、感染後1年目にGag・Nefだけでなくそれ以外の抗原も標的とする広範なCTL反応が認められることが判明した。H25年度には、ウイルスゲノムのgag領域以外の塩基配列ならびに各抗原特異的CTL反応の経時的解析を行った。その結果、第I群では、感染後2年目には、gagだけでなくnef領域にもCTL逃避変異が蓄積され、CTL標的の広範化がさらに進むことが判明した。一方、第II群では、2年目でもウイルスゲノム全領域にわたってCTL逃避変異は選択されておらず、CTL標的はGag・Nefにほぼ限局され、経時的にCTL頻度の減少を示す個体が見出された。第I群は不安定なSIV複製制御を示しており、検出限界以下レベルのウイルス複製により誘導されるCTLに対する逃避変異の選択、さらにその逃避変異選択に対する新たな抗原特異的CTLの誘導といったウイルスと宿主の相互作用が繰り返され、CTL標的の広範化とウイルスゲノム逃避変異の蓄積が生じていると考えられた。本結果は、CTL標的の広範化がHIV・SIV複製制御破綻徴候を示す指標であること示している点でも重要である。一方、第II群では、ウイルス複製がほぼ制御され、CTL反応も減衰傾向を示すと考えられた。このような安定したSIV複製制御群は、これまでに報告されておらず、HIV感染の機能的治癒機序解明に結びつくモデルとして極めて重要である。エイズウイルス複製の制御維持機序を知ることを目的とし、サルエイズモデルを用い、ワクチン接種・サル免疫不全ウイルス(SIV)チャレンジ実験でSIV複製が2年間以上の長期にわたり制御された個体群のウイルス学的および免疫学的解析を推進した。H24年度はGag206-216あるいはGag241-249エピトープ特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)反応を選択的に誘導するワクチンを接種した7頭の凍結サンプルを用い詳細な解析を進めた。H23年度に樹立した手法を用い、凍結リンパ球サンプル由来のプロウイルスのgag塩基

配列解析を行ったところ、感染後2年目にCTL逃避変異蓄積が認められる第I群と変異が認められない第II群に分かれることが確認された。さらに感染後1年目のプロウイルスgagの塩基配列解析を行ったところ、両群とも変異が認められないことが判明した。つまり、SIV慢性持続感染では感染後1年で多数の変異蓄積が認められるのに対し、長期SIV複製制御群では、感染後1年で変異選択が認められず、CTL逃避変異選択が抑えられていることが明らかとなった。しかし第I群では、感染後1年から2年の間に変異蓄積が認められたことから、この群でのSIV複製制御が一部破綻してきていると考えられた。感染後2年のGagエピトープ特異的CTL反応の解析結果は、第I群でこれらのCTL反応が認められなくなる傾向を示し、CTL逃避変異蓄積を反映していると考えられた。90-120-Ia共有群は、SIV感染初期にはGag・Nef抗原特異的CTL反応の優位な誘導を示すが、第I群では感染1年目にGag・Nef抗原だけでなくGag・Nef以外の抗原も標的とする広汎なCTL反応を示した。このCTL標的の広範化は、HIV・SIV複製制御破綻徴候を示す指標として重要であると考えられる。長期SIV複製制御群からのウイルスゲノムcDNAの増幅およびその塩基配列解析は技術的に容易ではないと予想されたが、IL7-IL5存在下における培養後のリンパ球のゲノムDNAよりnested PCRにてプロウイルスDNAの増幅が可能となり、長期SIV複製制御群のウイルスゲノム塩基配列解析に初めて成功した。25年度が最終年度であるため、記入しない。H23年度に樹立した手法を用い、長期SIV複製制御群のプロウイルスゲノム塩基配列解析が進展した。さらに、CTL標的の広範化がHIV・SIV複製制御破綻徴候を示す指標となるという新規性の高い知見を得た。この知見獲得は、学術的に重要な成果である。長期SIV複製制御群は、変異蓄積が認められる群(第I群)と変異がほとんど認められない群(第II群)とに大別されるという極めて興味深い新知見が得られたことから、これら両群の抗原特異的CTL反応の比較検討を中心に研究を推進する計画である。また、近年、プロウイルスの宿主染色体組込み部位の網羅的解析法が開発されたことから、この手法を用いてSIV複製制御へのプロウイルス組込み部位の関与についての解析を進めることを検討中である。本研究にて、長期SIV複製制御群は、変異蓄積が認められる群(第I群)と変異がほとんど認められない群(第II群)とに大別されるという極めて興味深い新知見が得られ、両群におけるCTL反応の差異を示す結果も得たことから、これら両群の抗原特異的CTL反応のさらに詳細な比較検討を中心に研究を推進する計画である。
無意識誌自然-現象学的構造解明の試み-

近代以降の哲学の中心に据えられた「意識」は、最広義での「無意識的なもの」が可能している。私の研究の目的は、現象学の方法をもちいて、この無意識的なものを発掘し、その構造を明らかにすることである。研究は、まずドイツ観念論、特にシェリングの自然哲学を、クリングスなどの研究を手引きとして再考察しなおすことから始められた。シェリングの自然哲学は、意識哲学としての超越論的観念論と同格のものではなく、むしろ自然哲学は、意識を可能にする無意識として「自然」を扱っていると解することができる。その「自然」は機械論的な自然ではなく、自己創造性をもつ「主体としての自然」である。この自然=無意識が意識を可能にする。しかし、現象学は意識を出発点とする。とすると、意識の発生基盤としての自然を「意識」が問うことになる。これは、比喩的に言えば、目が、目の発生以前を見ようとする試みに近い。同様の困難を、精神分析も抱えている。無意識の考察自体が、無意識になるものの捏造だという謗りを免れにくい。こうした問題点に対して、ミシェル・アンリの「内在」という概念はひとつの解答を与えてくれた。意識と無意識は、内在=生の距離化によって同時的に成立する。この距離化が、意識と意識の分解=ズレを産み出す。これによって、シェリングの自然哲学を、ズレを介在させた意識発生論として、意識の側から現象学的に読み取る観点が確立された。さらに、こうした点はデリダなどの哲学にも深く関わる。その点についても研究がなされた。これからの研究の効果は、本紙裏面の論文でも一部発表された。以上が今年度の研究の成果である。