hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
抗菌ペプチドの抗腫瘍活性分子メカニズムおよび化学療法の効果増強作用の解明

前年度までに、大腸癌細胞であるHCT116は抗菌ペプチドで処理した際にmicroRNA (miRNA)であるmiR-663aが濃度依存的に増加する事を明らかにした。さらに、miR-663aの大腸癌細胞内での役割を明らかにするためにレンチウイルスベクターによるmiR-663a過剰発現株を作成した。本年度はmiR-663aがHCT116細胞に及ぼす影響を明らかにするための実験を行った。miR-663aを過剰に発現したHCT116細胞はベクター未導入の細胞およびコントロールベクターを導入した細胞に比べ、細胞老化の際に見られる細胞質の膨化が引き起こされていた。さらにmiR-663a強制発現によってHCT116の増殖は抑制され、その効果は免疫不全のヌードマウスによる異種移植モデルにおいても観察できた。増殖抑制効果の詳細なメカニズムを明らかにする為に細胞周期を確認したところ、miR-663aの強制発現によってG2/M期における停止している細胞が多く見られた。細胞周期の調節は、非常に多くの因子によって複雑に制御されているが、G2/M期の調節に関与するp21の増加と非活性型のcdc2の割合の増加が観察された。更に、miR-663aの標的として考えられているケモカインレセプターCXCR4の発現を確認したところ、発現量が減少し、下流の活性型Aktの割合も減少していることが分かった。これら一連の挙動の多くはmiR-663aを強制発現していないHCT116を抗菌ペプチドで処理していた際にも共通していたことから、本研究において抗菌ペプチドの大腸癌細胞に対する増殖抑制効果のメカニズムの一端にmiR-663aが関与する事を明らかに出来た。28年度が最終年度であるため、記入しない。miRNAは、2125塩基対程度の機能性non-coding RNAであり、mRNAを制御することで細胞増殖・アポトーシス・発生と分化・代謝などの多岐にわたる調節機能を有している。近年、癌細胞において多くのmiRNAの発現に変化があることが報告されている。我々はこれまでヒト由来のカセリシジンファミリー抗菌ペプチド(AMP)であるLL-37およびそのアミノ酸置換体であるFF/CAP18が大腸癌細胞であるHCT116に対しアポトーシス様の細胞死を引き起こすことを明らかにしている。抗菌ペプチド(AMP)による大腸癌細胞への作用として、miRNAの関与を明らかにするため、LL-37およびFF/CAP18を用いて大腸癌細胞HCT116を処理し、miRNAを含むRNAを回収し、マイクロアレイ解析を行った。マイクロアレイの結果、LL-37による刺激によって40 μg/mLの濃度では17種のmiRNAが2倍以上に発現が上昇し、80 μg/mLの濃度では7種のmiRNAが2倍以上の発現増加が確認された。発現が1/2以下に減少したmiRNAの数は40 μg/mLの濃度では8種、80 μg/mLの濃度では6種であった。アミノ酸置換体であるFF/CAP18によるmiRNAの変動はLL-37 40 μg/mLの濃度において2倍以上の発現が見られたmiRNAは17種、1/2以下に発現が低下したのは30種でありLL-37で確認されたmiRNAとは数も種類も異なることが明らかになった。以上より、AMPによる大腸癌細胞への作用にはヒトが備えたLL-37が特異的に発現を制御しているmiRNAが存在していることが示唆され、その種類に関係なくAMPによって共通したmiRNAも存在していることが明らかになった。次年度以降、発現に変化のあったmiRNAについて、その役割を明らかにしていく予定である。本年度は、昨年度候補として挙がったmiR-663aを大腸癌細胞に導入する事で、その役割を明らかにしようと試みた。miR-663aの導入に関してはエレクトロポレーション法がドランスフェクション試薬よりも効率が良いことが昨年度の段階で分かっていたが、エレクトロポレーションによる細胞へのダメージが予想以上に大きく、その後の実験を行うことが難しいと判断し、レンチウイルスベクターによるmiR-663a過剰発現株を作成する方法に切り替えた。pLV-miRNA Vectorをパッケージングしたレンチウイルスベクターを大腸癌細胞に感染させたところ、多くの細胞で導入が観察された。その後、ピューロマイシンを用いて細胞の薬剤選択を行い、樹立した細胞のmiR-663a発現レベルをqRT-PCRにて確認したところ、導入前の細胞とコントロールベクターを導入した細胞に比べ、有意にmiR-663aの発現が高いことが分かった。miR-663aの細胞に及ぼす影響を確認したところ、この細胞は細胞質が肥大した老化様形態を示し、増殖が抑制されることが分かった。さらに、細胞周期を確認したところ、miR-663aを過剰に発現する大腸癌細胞では、G2/M期で停止している細胞が多く存在していることが明らかになり、細胞周期を調節する因子やアポトーシスに関与する因子の遺伝子の発現レベルも有意に高くなる事が分かった。次年度以降はmiR-663aの更に詳細な効果を検討するため、ターゲットとなるmRNAの解明や、マウスを用いたIn vivoでの役割、既存の抗がん剤との併用を含めたアプローチから検討を行う予定である。miRNA過剰発現細胞株の作成に関しては、トランスフェクション試薬やエレクトロポレーションを行った際にトラブルが生じる事が予想されたため、予めウイルスによる導入までを計画しており、おおむね予想通りの進展であった。

さらにターゲットとしたmicroRNAの導入後、癌細胞の増殖は抑制されたため、このmicroRNAは抗菌ペプチドによって生じる癌細胞の成長抑制作用の一端を担っていると考えられたため。前年度までに、大腸癌細胞であるHCT116は抗菌ペプチドで処理した際にmicroRNA (miRNA)であるmiR-663aが濃度依存的に増加する事を明らかにした。さらに、miR-663aの大腸癌細胞内での役割を明らかにするためにレンチウイルスベクターによるmiR-663a過剰発現株を作成した。本年度はmiR-663aがHCT116細胞に及ぼす影響を明らかにするための実験を行った。miR-663aを過剰に発現したHCT116細胞はベクター未導入の細胞およびコントロールベクターを導入した細胞に比べ、細胞老化の際に見られる細胞質の膨化が引き起こされていた。さらにmiR-663a強制発現によってHCT116の増殖は抑制され、その効果は免疫不全のヌードマウスによる異種移植モデルにおいても観察できた。増殖抑制効果の詳細なメカニズムを明らかにする為に細胞周期を確認したところ、miR-663aの強制発現によってG2/M期における停止している細胞が多く見られた。細胞周期の調節は、非常に多くの因子によって複雑に制御されているが、G2/M期の調節に関与するp21の増加と非活性型のcdc2の割合の増加が観察された。更に、miR-663aの標的として考えられているケモカインレセプターCXCR4の発現を確認したところ、発現量が減少し、下流の活性型Aktの割合も減少していることが分かった。これら一連の挙動の多くはmiR-663aを強制発現していないHCT116を抗菌ペプチドで処理していた際にも共通していたことから、本研究において抗菌ペプチドの大腸癌細胞に対する増殖抑制効果のメカニズムの一端にmiR-663aが関与する事を明らかに出来た。現在までの達成度について、順調に進展している理由として以下の3点を挙げる。1.年次計画における1年目の予定は「大腸癌細胞における抗菌ペプチドによるmiRNAの発現の増減を確認すること」であり、おおむね計画通りにmiRNAの発現に変動を確認できたこと。2.さらにリストアップした発現に変動があるmiRNAには癌との関与が報告されているものも多数存在しており、今後の研究においてもターゲットがある程度しぼれていること。3.マイクロアレイで発現が変動していることが確認できたmiRNAについて、RT-realtime PCRによって再現性を確認できているものが複数あること。当初の予定通りマウスを用いたin vivoにおける抗菌ペプチドの効果を今回のターゲットであるmicroRNA過剰発現細胞も用いて確認する予定である。さらにmicroRNAの標的シグナルを明らかにするため、参加ストレスやアポトーシスの経路に焦点を当て、明らかにしていきたいと思っている。28年度が最終年度であるため、記入しない。発現に変動があったmiRNAのうち、LL-37およびFF/CAP18の両方について発現が確認でき、なおかつRT-realtime PCRでも再現性がとれたものをターゲットとし、HCT116細胞へトランスフェクションを行う。
金属ナノ接合の選択的光形成・光修飾

微小形状の金属への光照射により自由電子の集団振動(プラズモン)が励起され、金属と周りを取り巻く媒体との界面に局所的な電場が生ずることが知られている。この局所電場励起と金属内電子の電気化学ポテンシャル制御を組み合わせて局所的な金属の溶解・析出反応性を制御して金属ナノ構造構築に成功した。溶液内で電気化学電位の制御された金属探針を電極表面に近接させて光照射を行うことにより、位置選択的に金属ナノドット構造が形成されることを示した。この手法は、ドットの高さなどの三次元構造制御が電位と光強度などによって自在に制御可能であることが特徴であることが特徴である。この他、絶縁基板表面上の金属ナノドットについても光照射と外部からの電場印加によって局所的な溶解・再析出反応を制御することに成功し、隣接する金属ナノドットの距離を外部からの摂動制御によりナノメートルのオーダーで自在に制御することに成功した。その結果、光照射下でのドット間隙での局所電場強度制御が可能となり、一般的には制御が困難な表面増強ラマン散乱強度を制御することが可能となり、単分子検出レベルの信号を自在に発現させることに成功した。また、金属ナノ構造制御により、電子伝達単位としての機能の制御、ならびにその金属構造近傍の媒体の場を変調することにより分子やイオン移動を制御することを試みた電解質溶液内の金属のナノ接合形成に種々の金属を用いた単原子レベルの接合を形成することに成功した。その結果、種々の金属の電子的・機械的な特性を利用した電子のエネルギー・スピンの選択透過能を有するナノ接合形成が可能となった。また微小伝導体である単層カーボンナノチューブについて、その直径とカイラリティに依存した電子準位の絶対電位を世界で初めて明確にした。光変調電気化学STMによる光励起局所電場のマッピングを行った。探針と試料の電気化学的な電位を溶液内にてそれぞれ独立に制御可能な電気化学走査型トンネル顕微鏡(STM)とレーザー光照射システムを組み合わせて光変調電気化学STMシステムを構築する。まず光照射のない暗下にて表面形状を決定し、試料表面の高さに関する情報を記憶させる。ついでSTMのトンネル電流のフィードバック回路をオフにし、先の記憶させた表面形状に沿って光照射下にて探針を走査させ、その際のトンネル電流を記録する。実験では、まずこのシステムにより誘起される光電流の探針-試料間の距離とバイアス電位依存性、電気化学的な絶対電位依存性、照射光強度と偏光方位異方性などを検討し、溶液内での光電子放出過程の特徴を明確にする。次いで、この金属探針先端に局在する電場を利用して局所的な電気化学的金属電析反応を誘起することに成功した。本研究では、金属ナノ構造に局所的かつ選択的な光化学的金属電析を誘起させる条件を光変調電気化学走査型トンネル顕微鏡を用いて分光的に検討し、得られた知見に基づき量子的な効果の発現する機能性金属ナノ接合を形成することを目的とした。本年度は、微小金属接合のコンダクタンスの量子化現象について検討を行い、接合形成に光励起過程を利用することを試みた。電極絶対電位制御下での金属ナノ接合形成電気化学的な電位制御下にてトンネル電流状態からナノ接合形成によるバリスティック伝導状態までの広い電流領域を安定に測定可能な金属ナノ接合評価システムを完成させた。市販の金属マイクロワイアを利用して、サブマイクロメートル(sub-mm)サイズのパターン形成を行い、これを電極として先のシステムを用い電析により金属細線を成長させナノ細線を形成した。電気化学的な析出・溶解の繰り返しを利用してナノ細線の幅、高さ、長さ等の形状を制御した。

対向電極間のコンダクタンスを常にin-situにモニターしながらこれをフィードバックシグナルとして使用して細線構造制御を行った。この4電極セルは、光学顕微鏡にてサブミクロンオーダーでの構造評価を行いながらナノ接合形成を行うことが可能である。このようにして作製したナノ細線についても溶液内での共存イオンの吸着の能と構造安定性について、昨年度の走査型トンネル顕微鏡システムでの場合と比較を行った。上記の検討により安定にナノ細線構造が得られるようになった。この様な原子サイズレベルにて構造を規制した条件下において、接合への光照射効果について検討を行い、光による接合部への選択的光電析反応の制御を行った。さらに、表面増強ラマン散乱現象を誘起させ、接合先端部の吸着分子の分光情報を得ることに成功した。
バゾプレシンの細胞内情報伝達の増幅と緩衝系-アクアポリン2遺伝子発現調節-

雄性SDラットにバソプレシン(AVP)V_2アゴニストdDAVP(5ng/h)を浸透圧ミニポンプで投与、食餌を液体食として実験的にSIADHラットを作製した。対照群(dDAVP excessラット)はdDAVP投与と固形食で作った。SIADHラットでは、2日目以降120mEq/l以下の低Na血症を認め、尿浸透圧は800-900mOsm/kgH_2O(対照、3000-3200mOsm/kg H_2O)に低下し、尿濃縮力低下を認めた(AVP escape現象)。腎集合尿細管細胞でのAVPの受容体結合能は、両群のラットとも対照の60%程度に、AVP V_2受容体mRNA発現も25-40%まで著しく低下した。水チャネルアクアポリン-2(AQP-2)mRNA発現はSIADHラットで有意に減弱していた(2日目:183%vs.298%;7日目:154%vs.324%,P<0.05)。AQP-2蛋白発現も同様であった。細胞内情報伝達物質であるcAMPの組織内濃度はSIADHラット、dDAVP excessラットともに増加しておらず、またAVP反応性も著しく低下した。2群のラットではAQP-2蛋白の管腔側細胞膜への細胞内traffickingを認めるが、両群間での有意差はみられず、AVPによるAQP-2のshort-term調節系は影響されない所見と考えられた。SIADHラットでは、体液量増加に伴う細胞容量変化あるいは血漿浸透圧の低下自身が、直接腎の受容体以降のAVPシグナル伝達系を修飾して、AVP escapeにつながる尿濃縮減退をもたらすことが示唆される。この変化がAQP-2自身の転写調節によるものか、今後引き続き検討したいと考えている。
鉱物多結晶体の超塑性

(i)二相共存試料において、第二相分率の増加と共に細粒化し(Tasaka & Hiraga JGR 2013)、それに伴い「超塑性」が発現しやすくなる(Tasaka, Hiraga & Zimmerman JGR 2013)。(ii)「超塑性」変形下、粒界すべりと同相粒子の合体により、第二相粒子が最大圧縮軸に集合化する。本構造が花崗岩起源マイロナイト中に見出された(Hiraga et al. Geology 2013)。(iii)応力・歪速度間が線形関係であるオリビンの「超塑性」下で強い結晶選択配向が生じる(Miyazaki et al. Nature 2013)。岩石でもっとも多く含まれる鉱物の単相系多結晶体のレオロジーから、これまで地球内部のレオロジーが理解されてきた。実際には岩石は多相系であることから、第二相粒子が岩石バルクのレオロジーにどのような影響を与えるのかを、二相目鉱物の量比を系統的に変化させた試料を用いて調べた。上部マントルを代表するカンラン石ー輝石系で実験が行われた。本研究室で合成された鉱物多結晶体を大気圧、1260ー1360度下、歪速度10-5から10-4 /secでクリープさせた。その結果、第二相粒子である輝石の増加と共に、多結晶体のクリープ強度は一桁以上下がることが分かった。この低下は、バルクの平均粒子径が小さくなるのと良い対応を示す。現に、輝石が主相となり、カンラン石の比率が低下すると、クリープ強度は再度増加に転じる。詳細な解析の結果、カンラン石ー輝石系量比を全て網羅するレオロジーは粒径が最も支配的に決定し、副因として、カンラン石、輝石それぞれの粒子の強度が影響を与えていることを突き止めた。前年度、我々はマントル構成物質の「超塑性」を世界で初めて室内実験で示し,地球内部の「超塑性」を実証した.この変形した試料の微細構造を解析し、天然に観察されるウルトラマイロナイトの微細構造と比較した。両試料で、変形に伴う同相粒子の選択的合体、および第一相粒子と第二相粒子の共成長があることを示し、自然界における粒界すべりを実証することに成功した。地球内部の大部分で「超塑性」流動が起きている可能性が示された。この結果は、多相系である地球内部において、「超塑性」の出現条件が広がる。本構造が花崗岩起源マイロナイト中に見出され(Hiraga et al. Geology 2013)、少なくとも地球内部の一部で「超塑性」が発現していることが明らかになった。(iii)「超塑性」変形下での鉱物粒径を決める粒径と第二相分率の関係(ゼナー則)が、10ミクロンから2 mmの粒径を持つ天然ペリドタイト中で成立している(Tasaka, Hiraga & Michibayashi JGR 2014)。これは、「超塑性」が細粒岩石のみならず、平均的な粒径を持つマントル岩でも発現している間接的証拠である。(iv)応力・歪速度間が線形関係であるオリビンの「超塑性」下で、強い結晶選択配向が生じる((Miyazaki et al. Nature 2013)。この選択配向が生じる条件を上部マントルに適用したところ、マントルアセノスフェア内の地震波速度異方性の深度分布と一致した。選択配向は転位(非線形)クリープに固有のもので、地震学的に見出される異方性は、上部マントルで転位クリープが生じている証拠と考えられてきたが、転位クリープでアセノスフェアが流動するに必要な粒径(数cm)もしくは差応力(数十MPa)は、マントル由来の岩石の平均粒径やアセノスフェア内の推定応力0.1 MPaオーダーと大きく異なり、矛盾があった。転位クリープと比べて、より細粒・低応力条件下で発現し、さらに選択配向を作るマントル「超塑性」は、地震波の観測結果と鉱物物理の間の矛盾を解決する。本年度は、新たに導入された試験機を用いて、フォルステライト+ダイオプサイトの二相系の引っ張り+圧縮試験が行われた。

二つの変形様式と試験後の試料中の結晶選択配向性を調べることにより、変形メカニズムの特定が期待された。まず、変形特性として、粒径依存型のクリープであること、引張り歪が300%を超える超塑性型の変形であること、応力指数が1であることが分かった。また、均質だった相の分布が、圧縮方向に凝集していくのが見られ、粒界すべり卓越の拡散クリープであることが分かった。SEMーEBSD法により、フォルステライトの結晶選択配向が調べられ、温度によってその配向性が変化すること、引っ張り方向に強いa軸集中を起こすこと、粒子形が静的な条件で異方成長するほど、選択配向が強くなることが示された。これは、粒界すべりが特定の結晶学面上で生じ、すべりと共に粒子の流動方向へ回転することによって、選択配向が生じることを示す。高温炉内での引っ張り軸調整に手間取り、再度設計し直しなどの手間がかかり、実際の引張実験を開始するまでに時間がかかった。25年度が最終年度であるため、記入しない。種々の電顕法を使用することで、変形メカニズムの詳細を明らかにすることが出来た。拡散クリープにおける選択配向の形成を示すことができ、これは従来のマントル流動の常識を覆す発見をすることが出来た。変形実験時の粒径変化を実測できるようなシステムを導入すべく、設計しなおしている。粒界すべりに伴う選択配向の詳細なメカニズムはまだ分かっていない。特に、粒界の異相界面におけるすべりのし易さが、その形成に関わっていることが予想され、それを明らかにすべく、試料にマーカーをつけることで、すべりの定量化を行うことを計画している。
分子が癌を診断する知的反応システムの創製

本研究課題では、分子がmiRNAの転写パターン情報を処理して癌を診断する知的反応システムの構築に取り組んだ。この反応システムは、核酸増幅法と分子状態機械で構成される。核酸増幅法について、非特異的な増幅反応の抑制、および配列特異性の向上と検出する核酸形態の多様性拡張に成功し、検出の感度を向上させることができた。分子状態機械について、動作効率に影響を与える因子を特定して反応システムの設計を改良した。反応条件の最適化を継続して実施している。本研究課題では、検査サンプルと混合して37°Cの等温条件下に置くだけで、分子がmiRNAの転写パターン情報を処理して癌の種別や進行度、予後予測などを正確に診断できる、情報処理能力を持った知的反応システムを構築する。この反応システムは、申請者がこれまでに開発した核酸増幅法と分子状態機械で構成される。今年度は、miRNAの存在量をシグナルDNAの生成によって評価するための、miRNAを逆転写せずに直接増幅して検出ができる核酸増幅法について、これを応用した反応システムの構築に向けた性能の向上に取り組んだ。その結果、ターゲット非存在下での非特異的な増幅反応の抑制に成功し、検出の感度を向上させることができた。特に、miRNAを検出する際の性能が大きく向上し、癌患者と健常者で転写量に差があり、プロファイリングに有用であることが知られている複数種のmiRNAについて、核酸増幅法によってmiRNAの存在量を定量的に評価できることを実証した。今後は、核酸増幅法で生成されるシグナルDNAの生成順を分子状態機械が判別する反応システムを構築し、癌のプロファイリングに有用なmiRNAを対象とした一連の動作の実現に取り組む。人間は検査の最終結果を読みだすだけで診断が行える、従来手法よりも高感度な検査を簡易な操作で実施できる迅速かつ低コストな検査法を確立することで、これまで不可能だった肺がん、すい臓がん等の早期診断を実現し、生存率を大きく高めることが期待できる。miRNAの存在量をシグナルDNAの生成によって評価するための、miRNAを逆転写せずに直接増幅して検出ができる核酸増幅法については、前年度にターゲット非存在下での非特異的な増幅反応の抑制に成功し、検出の感度を向上させた成果を受けて、今年度はさらに配列特異性の向上と検出が可能な核酸形態の多様性を拡張する研究に取り組んだ。その結果、これまでと同等以上の検出感度を維持したまま1塩基レベルの配列特異性を達成するとともに、miRNA以外の核酸検出の実現可能性を実証した。また、核酸増幅法で生成されるシグナルDNAの生成順を分子状態機械が判別する反応システムを構築するため、分子状態機械の動作効率が向上する設計や反応条件の検討を行った。動作効率に影響を与える因子を特定したが、具体的な設計の改善や反応条件の最適化は、現在継続して実施しているところである。次年度中に分子状態機械の設計および反応条件の最適化を達成し、癌のプロファイリングに有用なmiRNAを対象とした一連の動作を実現して、従来手法よりも高感度な検査を簡易な操作で実施できる迅速かつ低コストな検査法を確立する。臨床現場で求められるmiRNA検出感度を達成するため、核酸増幅法の性能向上に重点的に取り組むなかで、これまでに、他の多くの増幅法でも大きな問題となっているターゲット非存在下での非特異的な増幅反応を抑制することに成功した。その結果、検出感度が大きく向上し、血清中のmiRNA検出において求められる感度を実現する見込みが得られた。また、高精度かつ多様な診断を可能にするためには、検出の配列識別能の向上が求められるが、今年度に配列特異性を高める手法を考案し、1塩基レベルの配列の差を識別して高感度に検出することに成功した。さらに、同手法を適用することで、miRNA以外の形態を持つ核酸を検出できることも実証し、本研究課題で当初計画していたよりも高精度かつ汎用性の高い診断を実現できる可能性を示した。しかし、これまでに確立してきた検出性能を向上させる手法は、修飾された核酸などを用いることで高い効果を発揮するものである。そのため実験に使用するDNA分子の合成に長い期間を要し、設計・合成・実験・検証の研究サイクルにかかる時間が当初の想定より増大した。また、最終的に構築する知的反応システムは核酸増幅法と分子状態機械を統合して動作させるものであるが、分子状態機械の動作について検証したところ期待する効率には達しておらず、設計の改善や反応条件の最適化を次年度も継続して実施する必要がある。最終的には当初計画よりも高性能な、分子が癌を診断する知的反応システムの創製が実現できる見込みであり、研究期間を延長して着実に目標を達成する。この反応システムは、申請者がこれまでに開発した核酸増幅法と、分子内結合を利用した分子状態機械を改変した反応から構成される。

miRNAの存在量をシグナルDNAの生成によって評価するための、miRNAを逆転写せずに直接増幅して検出ができる核酸増幅法については、前年度までに、ターゲット非存在下での非特異増幅の抑制や検出感度の向上、配列特異的検出性能の向上を達成した。また、分子状態機械については、今年度も引き続き動作効率の向上や反応条件の最適化に取り組んだが、その結果として従来の分子内結合を利用した設計では目標性能の達成が困難であることが判明した。そこで、転写パターン情報を処理する能力は保持しつつ、モジュール性の向上や個別の最適化が可能な分子間結合を基本とする反応システムへと設計を変更した。この改変版の分子状態機械については反応条件の最適化を進めている。今年度はさらに、核酸増幅法について癌のプロファイリングに有用なmiRNAを特異的に検出できることを確認したので、今後は一連の動作を統合して、従来手法よりも高感度な検査を簡易な操作で実施できる迅速かつ低コストな検査法の実現に向けて、要求される各種の性能指標を達成することを目指して検討を進める。本研究課題では、分子がmiRNAの転写パターン情報を処理して癌を診断する知的反応システムの構築に取り組んだ。この反応システムは、核酸増幅法と分子状態機械で構成される。核酸増幅法について、非特異的な増幅反応の抑制、および配列特異性の向上と検出する核酸形態の多様性拡張に成功し、検出の感度を向上させることができた。分子状態機械について、動作効率に影響を与える因子を特定して反応システムの設計を改良した。反応条件の最適化を継続して実施している。臨床現場で求められるmiRNA検出感度を達成するため、今年度は核酸増幅法の性能向上に重点的に取り組んだ。その結果、当初計画以上の検出感度を達成することができた。最終的に構築する知的反応システムに向けた、分子状態機械との統合動作の検証については次年度に実施する計画である。本研究課題では、分子状態機械がプロファイリングを行うためのシグナルとなるDNAを、核酸増幅法によりmiRNAに応じて一定量にまで指数増幅することで、miRNAの転写パターン情報を分子反応が処理し、途中で人間が操作することなくプロファイリングが完了する早期診断用の知的反応システムを実現することを目標としている。本年度は核酸増幅法の性能向上と分子状態機械の反応効率の向上に取り組んだ。その結果、検出感度性能を保ったまま1塩基レベルの配列特異性を達成するとともに、miRNA以外の形態を持った核酸についても本法を適用した検出と診断が行える可能性を示すことができた。今後は、分子状態機械の動作効率を向上させるために、設計の改善や反応条件の最適化を実施していくが、複数の考慮すべき因子を調整して改善をはかるには、実験に加えてシミュレーションによる解析を並行して実施することが有効と思われる。要素反応過程に関する実験データを取得して反応モデルを構築し、実験とシミュレーションを併用して最終目標である知的反応システムの創製を実現する。DNAコンピューティング本研究課題では、分子状態機械がプロファイリングを行うためのシグナルとなるDNAを、核酸増幅法によりmiRNAに応じて一定量にまで指数増幅することで、miRNAの転写パターン情報を分子反応が処理し、途中で人間が操作することなくプロファイリングが完了する早期診断用の知的反応システムを実現する。
大都市・都市部以外に居住する幼児の経皮水分蒸散量(TEWL)の基礎的調査

本研究では、大都市と都市部以外の地区に住む幼児の経表皮水分喪失量(TEWL :Transepidermal Water Loss)と個人要因と環境要因を記述し、その特徴や関連を探求した。その結果、都市部以外の地区(福井県)に住む幼児は、大都市(東京都)に住む幼児より、角質に多くの水分を保持し、表皮より多くの水分を蒸散していることが明らかになった。幼児のTEWLは年齢や性別により異なる可能性と、外気温度や表面温度などの環境要因、幼児の行動特性や自己制御行動等の個人要因に影響を受けることが示唆された。本研究の目的は大都市と都市部以外の地区に住む幼児のTEWL(経表皮水分喪失量)とDemographicsを記述し、その特徴や関連要因を探求することである。本研究の初年度にあたる平成22年度は、子どものTEWLに関連する要因について文献や学会の新しい知見から探求して研究枠組みを定め、研究計画書を作成して研究倫理委員会において研究実施への承認を得ることと、研究分担者の決定や必要物品の購入など、研究基盤を構築することが課題である。4月に研究分担者を確定し、8月頃までは文献を検索しながらその特徴や関連要因を探求し、対象者やデータ収集場所などを定めた。文献検討では、TEWLの関連要因は表皮の状態だけでなく、自律神経やアレルギー免疫等を含むことから複雑であることや、生理面だけでなく湿度などの環境面や運動や食事などの生活・活動面によってもTEWLは変化すること等、関連要因と測定時に考慮すべき事柄を明らかした。測定する地域としては、環境面の関連要因から、大都市(人口が1000万人以上の都道府県)であり人口密度が高いが15歳未満の人口割合が全国平均より少ない東京都と、都市部でない(人口が100万未満の県)で人口密度が低く15歳未満の人口割合が高い福井県を選定した。10月以降は小児の皮膚関連の学会を探して参加し、最新の知見や研究動向を探りながら、研究枠組みを組み立て、研究計画書を作成した。小児のADに関する最近の研究では、子どものTEWLを測定する場合、その影響要因の多様性を考慮して同時に角質水分量を測定していることや子どもの特性不安との有意な関係等、最新の研究動向を踏まえながら研究枠組みを定め、質問紙調査の内容を作成した。3月の本学の研究倫理委員会で審査を受け、条件つき承認を得、現在は研究計画書を修正しつつ、フィールドへのアプローチを準備中であり、研究プロセスはやや遅れながらも順調にすすんでいる。本研究の2年目にあたる平成23年度は、大都市部と都市部でない地区においてデータ収集を行う予定であった。4月の本学の研究倫理委員会で承認を得て、データ収集する場所として、都市部でない地区を福井県に定めた。福井県内の私立の保育園に研究依頼を行ったが、研究に協力を申し出る施設が見つからなかった。その理由として、新年度になったばかりであり、保育園での子どもたちの生活が安定しないため研究を受け入れることができないという内容であった。そこで、データ収集の時期を少し遅らせることとし、その間調査の準備を行い、5月中旬頃に福井市福祉課に研究依頼を行い、4つの保育園で研究協力を得ることができた。6月と9月にデータ収集を行い、対象者は1回目の調査が281名、2回目の調査が252名であった。予定していた調査対象はクリアできたが、調査の開始が遅れたことや、調査の場所が遠いこともあり、予定していた以上に調査に時間を要したため、都市部以外の地区でのデータ収集が精一杯であった。そのため大都市部での調査は次年度に持越しとした。今回の調査結果については、後期期間に教育活動が続くため、現在時点で分析ができていない。今後は分析を進めつつ、今回の経験を活かして大都市部でのデータ収集を効率的に行っていく必要がある。平成24年度は、本研究の3年目であり、最終年度となる。本年度は大都市部地区においてデータ収集を行う計画であった。データ収集の場となる保育園への協力依頼が難航したという昨年の反省から、4月から東京都内あるいは神奈川県内の公立保育園を管轄する11地区の育児支援課保育園課に研究依頼を行った。5月中旬にようやく、東京都墨田区の保育課に研究協力への同意が得られ、データ収集の場として5つの保育園を選定してもらった。1回目の調査は6月上旬に行い、対象者は313名であった。2回目の調査は10月中旬に行い、対象者は277名であった。予定していた調査対象はクリアできた。大都市と都市部以外の地区においてのデータ収集は終了した。

2回目のデータ収集後は、教育活動が続き、データ入力が遅れている。現在、分析ソフトSPSS Statisticsを用いて、データ入力の作業中である。早々に入力を済ませて分析し、結果を導いていく。1回目の調査開始が遅れたため、予定していた大都市でのデータ収集ができなかった。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究計画の段階で最終年度は調査の予備期間としていたので、最終年度で大都市での調査を行い、後半でアルバイトを雇用してデータ入力を行って分析をすすめていく。
深部低周波微動の定量的モデル構築によるプレート境界における物理過程の解明

本研究では、深部低周波微動(DLFT)の発生メカニズムを解明することを目的とした。2006年東海地域で名古屋大学と共同で行ったDLFTのアレイ観測の結果を解析し、連続的に発生している微動の短いスケールの時間変化を得ることに成功した。その結果、震源の移動は基本的にプレートの走向に平行な方向で、時速約40kmの移動とほぼ同じ位置での発生とを繰り返す様子が得られた。また、初動が不明瞭で微動の開始終了をはっきりとは定義することは困難なDLFT波動継続時間を見積もる方法を開発した。見積もられた波動継続時間の間の各アレイ観測点でのエンベロープ振幅積分をEAI値と呼び、微動の大きさの指標とした。その結果、検測された微動の多くが波動継続時間45秒前後を持ち、かつその波動継続時間においては他の波動継続時間と比較してEAI値が広い範囲にわたることが示された。この特徴的波動継続時間の存在は、DLFTのメカニズム示すうえで重要な性質である。EAI値から地震モーメントヘの変換を行い、DLFTの単位面積あたりのモーメント解放量を推定した。その結果、1日の活動でおよそ7.5x10^5(N m/m^2)という結果が得られた。DLFTと比較することでその特徴的性質を得るため、2004年紀伊半島南東地震の余震観測の際に設置された海底地震計(OBS)に記録された低周波の微動について解析を行った。決定された震源は、トラフ軸に垂直な方向に分布する。震源分布は超低周波地震の震源にほぼ平行で、相補的な位置に広がる。この結果から、この微動が超低周波地震とは別の現象であることが示された。震源が相補的に分布することは、トラフ近傍の物理過程を考えるうえで非常に重要な結果であり、共に安定、不安定すべりの遷移域である沈み込み帯深部との対応から、この現象が「浅部低周波微動」である可能性が示唆される。成果を博士論文にまとめた。1.独立行政法人防災科学技術研究所において一時的に公開されているHi-net波形記録を恒常的に利用するために、安定的な収録システムの作成を行った。2.KM_20-Langevin方程式論、平均散逸スペクトル法を用いて、2002,2003年に四国西部で発生した深部低周波微動の特徴的周波数構造の推定を行った。その結果、2Hz付近にピークを持ち、0.5Hzという一定周波数おきにピークが存在するという特徴的な周波数構造が得られた。同時に、減衰構造も推定された。この結果は、今後モデル化を行ううえで、大きな拘束条件となると考えられる。今後は、日本(フィリピン海プレート)以外の地域の深部低周波微動に同様の性質が見られるかを解析し、論文にまとめる予定である。3.火山で発生している低周波微動とのアナロジーから、深部低周波微動の発生源として考えうるモデルについて検討を行った。考えうるモデルの一つとしてJulian(1994)による自励振動のモデルを想定し、簡易的なモデルを作成して得られた計算結果と実際の記録から得られた性質のモデルを想定し、簡易的なモデルを作成して得られた計算結果と実際の記録から得られた性質との比較を行った。しかし前述の特徴的な周波数構造を再現するような定量的モデルを構築するには、更なる検討が必要である。4.Stanford大学のDavid Shelly氏,Greg Beroza教授,東京大学の井出哲講師との共同研究に参加し、四国において発生しており、深部低周波微動と関係していると思われる深部低周波地震の震源位置が、プレート境界に沿って面的に存在している可能性を考察した。5.地球惑星科学関連学会2005年合同大会,2005年度日本地震学会秋季大会,2005 AGU Fall Meetingにおいて研究成果を発表し、当該分野における最先端の研究成果を吸収し、同分野の研究者と議論、交流を行った。1.報告者が開発に携わった、波形の特徴的周波数構造を求める手法(平均散逸スペクトル法)を四国西部の最近のデータ、および紀伊半島,東海における深部低周波微動波形データにも適用した結果、前年度に得られた深部低周波微動の特徴的な周波数構造は、場所,時間によらず深部低周波微動の普遍的な性質である可能性が示唆された。また、連続微動波形中に含まれ、孤立的な相として判別できるため震源の位置がより正確に決定できる、孤立的な低周波イベント(気象庁では低周波地震というフラグをつけて震源を決定している)についても同手法により周波数構造を求めた結果、連続微動と同様の周波数構造を持つ可能性が得られた。さらに、手法の新しさから、結果の正しさを証明するために、波形スペクトルのスタッキングという従来から行われている手法により深部低周波微動波形のスペクトル解析を行った結果、複数のスペクトルピークが、平均散逸スペクトル法で得られたものと一致した。2.報告者は、David Shelly博士,井出哲講師らと共に、四国西部の連続微動波形内に存在する孤立的低周波イベントのtomoDD法と相互相関を用いた詳細震源決定に関わった。報告者は、主にデータ準備,議論の面で貢献した。その結果、Shelly et al. 2006によって、四国西部の孤立的低周波イベントの震源はプレート境界面上に帯状に分布しているという結果が得られた。

3.深部低周波微動の微弱な振幅の問題、および震源深さの不確定性を解決するため、名古屋大学の中道,渡辺らと東海(名古屋)地域において、深部低周波微動の到来方向推定,シグナルスタッキングを目的としたアレイ観測を行った。報告者は、観測計画,観測機器設置回収,定期メンテナンスといった観測全般で貢献した。4.San Andreas断層近傍において、深部低周波微動と非常に良く似た特徴を持つ微動現象が発見された。報告者は、この現象と深部低周波微動との関係性を調査する目的で、U.S. Geological Surveyに1ヶ月間滞在し、当該現象の幾つかのイベントに対し、波形解析を行った。エンベロープ相関法を用いた震源決定の結果、震央の位置は、先行研究とほぼ同じCholame付近に決定され、震源の深さは先行研究よりもやや浅い、20km-30kmと推定された本研究では、深部低周波微動(DLFT)の発生メカニズムを解明することを目的とした。2006年東海地域で名古屋大学と共同で行ったDLFTのアレイ観測の結果を解析し、連続的に発生している微動の短いスケールの時間変化を得ることに成功した。その結果、震源の移動は基本的にプレートの走向に平行な方向で、時速約40kmの移動とほぼ同じ位置での発生とを繰り返す様子が得られた。また、初動が不明瞭で微動の開始終了をはっきりとは定義することは困難なDLFT波動継続時間を見積もる方法を開発した。見積もられた波動継続時間の間の各アレイ観測点でのエンベロープ振幅積分をEAI値と呼び、微動の大きさの指標とした。その結果、検測された微動の多くが波動継続時間45秒前後を持ち、かつその波動継続時間においては他の波動継続時間と比較してEAI値が広い範囲にわたることが示された。この特徴的波動継続時間の存在は、DLFTのメカニズム示すうえで重要な性質である。EAI値から地震モーメントヘの変換を行い、DLFTの単位面積あたりのモーメント解放量を推定した。その結果、1日の活動でおよそ7.5x10^5(N m/m^2)という結果が得られた。DLFTと比較することでその特徴的性質を得るため、2004年紀伊半島南東地震の余震観測の際に設置された海底地震計(OBS)に記録された低周波の微動について解析を行った。決定された震源は、トラフ軸に垂直な方向に分布する。震源分布は超低周波地震の震源にほぼ平行で、相補的な位置に広がる。この結果から、この微動が超低周波地震とは別の現象であることが示された。震源が相補的に分布することは、トラフ近傍の物理過程を考えるうえで非常に重要な結果であり、共に安定、不安定すべりの遷移域である沈み込み帯深部との対応から、この現象が「浅部低周波微動」である可能性が示唆される。成果を博士論文にまとめた。
血管内皮細胞透過を介した正常組織内実質細胞への遺伝子送達システムの構築

遺伝子治療は効果的な疾患治療法であるが、現在実用的なものは局所投与によるもののみである。遺伝子ベクターを血中投与により標的部位に送達させ、機能させるためにはいくつかの大きな障壁であり、その中で欠陥壁というのは非常に大きなバリアとなっている。血中投与後、遺伝子ベクターの血管透過のために血管内皮細胞を透過させることが可能になれば、標的組織実質細胞への遺伝子送達が可能となる。そのため血管内皮細胞に取り込まれることが可能な遺伝子ベクターを構築し、さらに血管内皮細胞内に取り込ませた遺伝子ベクターを血管側から実質細胞側ヘトランスサイトーシスさせることが可能な遺伝子ベクターを構築することを目的とする。本年度では、昨年度構築したトランスサイトーシス評価系を用い、昨年度構築したトランスサイトーシス可能な遺伝子ベクターにおける、トランスサイトーシスを誘導しているベクター表面に修飾されたペプチドの詳細な最適配列をスクリーニングを行った。その結果、LXQZZZL(X:カチオン性アミノ酸、Z:親水性アミノ酸)の配列が遺伝子ベクターのトランスサイトーシスを誘起可能であることを見出した。またこの配列を修飾した遺伝子ベクターの細胞内動態を蛍光顕微鏡を用いて観察した結果、本遺伝子ベクターはlipid raftにおけるHSPGを介して細胞内に取り込まれ、小胞輸送された後、エンドソーム・リソソーム系へは移行せずトランスサイトーシスされていることが示唆された。本結果により、人工遺伝子ベクターのトランスサイトーシスにおける細胞内動態が初めて明らかとなり、今後動物実験への応用が期待され、さらには臨床応用が期待される。遺伝子ベクターを血中投与により標的部位に送達させ、機能させるためにはいくつかの大きな障壁があり、その中で血流と血管壁というのは非常に大きなバリアとなっている。血中投与後、血流を克服し、血管通過のために血管内皮細胞を透過させることが可能になれば、標的組織実質細胞への遺伝子送達が可能となる。そのため、血流存在下で効率よく血管内皮細胞内に取り込まれることが可能なベクターを構築し、さらに血管内皮細胞内を血液側から実質細胞側ヘトランスサイトーシスさせることが可能なベクターを構築することを目的とする。本年度は細胞をトランスサイトーシスさせるため、戦略の一つとしてベクターを一度ゴルジ装置へ輸送させ、そこから逆側の細胞膜側へ輸送させるという方法をとる。そのためのゴルジ装置移行性ベクターの構築が必要となる。今回、R8表面修飾リポソームをモデルベクターとし、極性細胞を用い、共焦点レーザースキャン顕微鏡を用いてゴルジ装置とベクターの局在性から調べた。その結果ペプチド非修飾カチオン性リポソームと比較して本ベクターはゴルジ装置との共局在が観察され、ゴルジ装置への移行が示唆された。以上の結果は人工ベクターのトランスサイトーシスの可能性を大きく広げたと同時に、人工ベクターを細胞内のゴルジ装置へ送達させるという未踏の成果であると考えられる。本年度は、まず、ベクターのトランスサイトーシスを評価する系の構築を行った。当初予定していたトランスウェル上で血管内皮細胞の単層細胞培養を行い、apical側からbasal側へのベクターの移行量を計測する方法では、既存のトランスウェルを用いた場合、単層細胞が形成されずトランスウェルの孔も細胞が埋まっている状態となった。そこで単層細胞が形成されるmembraneを用いてトランスウェルを構築し、既存のものではなく信頼性のある評価系とした。そしてこの系を用いて、血管内皮細胞への取り込みがよいとされるシグナルをベクターに修飾し、トランスサイトーシス能のスクリーニングを行い、優位にトランスサイトーシスされるものを見い出した。100nmサイズのトランスサイトーシスはほとんど報告がなく、本結果は遺伝子治療の幅を大きく広げる可能性がある。

またこの配列を修飾した遺伝子ベクターの細胞内動態を蛍光顕微鏡を用いて観察した結果、本遺伝子ベクターはlipid raftにおけるHSPGを介して細胞内に取り込まれ、小胞輸送された後、エンドソーム・リソソーム系へは移行せずトランスサイトーシスされていることが示唆された。本結果により、人工遺伝子ベクターのトランスサイトーシスにおける細胞内動態が初めて明らかとなり、今後動物実験への応用が期待され、さらには臨床応用が期待される。
植物細胞内シグナル伝達物質としてのcGMP/NOの機能解析

植物におけるサイクリックGMP(cGMP)や一酸化窒素(NO)の機能は不明な点が多い。本研究では、cGMP/NOによる植物遺伝子発現調節機構を解析した。シロイヌナズナのcGMP/NO応答性の2種類の遺伝子のプロモーター中にcGMPおよびNO応答性シスエレメントを決定した。その結果、cGMPとNO応答性配列が異なることを明らかにし、cGMPとNOのシグナル伝達が異なることを示した。ダイズのカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター中のUnitI配列がcGMP応答性シスエレメントであることを明らかにした。cGMPおよびNOの植物細胞内シグナル伝達における機能、特に、cGMPの合成酵素および標的タンパク質、および最終的に転写因子の活性化に至る経路など、cGMP/NOが関与するシグナル伝達と遺伝子発現調節の分子機構は未解明である。今年度は以下の研究を実施した。(1)強いNO応答性を確認したシロイヌナズナのニコチアナミン合成酵素(NAS)遺伝子プロモーター中の転写開始点をプライマー伸張法で決定した。NOシグナル伝達のシロイヌナズナ変異株を単離するために、NASプロモーターとホタルルシフェラーゼの融合遺伝子を作成したが、決定した転写開始点が誤っていることが判明したために、現在転写開始点を再度決定中である。(2)T-87細胞のプロトプラストにPEG法でNASとβ-グルクロニダーゼ(GUS)融合遺伝子を導入し、GUSの発現がSNP(NO発生剤)及び8-Br-cGMP添加により誘導されることを認めた。さらに種々の長さに5'末端を欠失したプロモーターの解析によりcGMPおよびNO応答に関わるシスエレメントを絞り込んだ。(3)グアニル酸シクラーゼおよびcGMP依存性プロテインキナーゼの植物ホモログ遺伝子を大腸菌で発現・精製し、酵素の特性を詳細に解析したが、いずれも活性は検出されなかった。(4)ダイズSB-P細胞のプロトプラストに暗所下PEG法で遺伝子を導入する一過的発現系を確立し、NO/cGMP依存的遺伝子発現調節機構の解析を行う準備ができた。これまでにcGMPとNOが多くの植物遺伝子の発現を調節することを明らかにした。しかし、cGMP/NOのシグナル伝達機構と遺伝子発現調節機構は未解明である。今年度は転写調節機構の解析に焦点を絞り、以下の研究を実施した。(1)DNAマイクロアレイ分析により同定した多くのシロイヌナズナのcGMP/NO応答性遺伝子の内、ニコチアナミン合成酵素遺伝子(AtNAS1)とフェリチン遺伝子(AtFER1)の転写開始点をプライマー伸張法で決定し、AtNAS1は3箇所、AtFER1は1箇所の転写開始点を持つことを明らかにした。(2)上記で同定したAtNAS1およびAtFER1プロモーターとβ-グルクロニダーゼ(GUS)融合遺伝子をシロイヌナズナT-87細胞のプロトプラストにPEG法で導入しGUSの一過的発現を解析する系を確立した。両プロモーターがcGMP/NO応答能を持つことを確認した。これにより、cGMP/NO応答性シスエレメントを同定する準備が整った。(3)プロモーター解析を効率的に行うために、ホタルとウミシイタケのルシフェラーゼを用いる一過的遺伝子発現系(デュアルルシフェラーゼシステム)を確立した。(4)ダイズSB-P細胞のプロトプラストに暗所下PEG法でcGMP/NO応答性のカルコン還元酵素遺伝子(CHR)プロモーターとGUS融合遺伝子を導入する一過的発現系を確立し、GUSのcGMP/NOによる発現誘導を認めた。(5)ダイズSB-P細胞をアグロバクテリウム法により形質転換する技術を確立した。cGMPとNOは多くの植物遺伝子の発現を調節するが、cGMP/NOのシグナル伝達機構と遺伝子発現調節機構は不明である。今年度は。転写調節におけるcGMPとNOの相関、NO/cGMPシグナル伝達の標的転写因子の同定等に焦点を絞り、以下の研究を実施した。1)シロイヌナズナのニコチアナミン合成酵素遺伝子(AtNAS1)とフェリチン遺伝子(AtFER1)のプロモーター中にcGMPおよびNO応答性領域を同定した。特にAtNAS1プロモーター中のNO応答性シスエレメントを13塩基に絞り込みこの配列に結合する転写因子を推定した。両遺伝子ともcGMP応答性配列とNO応答性配列が異なっていたことからこれらの遺伝子発現を調節するcGMPとNOのシグナル伝達経路も互いに異なることを推定した。(2)AtFER1プロモーターとホタルルシフェラーゼ遺伝子(LUC)の融合遺伝子を高発現するシロイヌナズナT87細胞形質転換株を確立し、NOとcGMP処理によるLUC活性の上昇を認めた。薬理学的な実験により、NOとcGMPのシグナル伝達経路が異なることを示した。

(3)ダイズのカルコン合成酵素遺伝子(CHS8)の発現がcGMPにより約10倍に増加すること、この反応に新たなタンパク質合成を必要としないことを定量的RT-PCRで示した。(4)ダイズのMYB転写因子GmMYB176によるイソフラボン合成系酵素発現の促進とcGMPシグナル伝達経路の関連を一過的遺伝子発現系で解析したが、両者が関連していることを示す結果は得られなかった。(5)以上の結果明らかになったcGMP/NO応答性シス配列やその配列に結合することが推定される転写因子に関する知見を総合して、植物遺伝子発現調節におけるcGMP/NOの役割を考察した。