hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マウス胎盤形成に関わる核マトリックス関連蛋白Ｓａｔｂの解析

具体的には分化に伴う表現型であるendoreduplicationを抑制し、また分化刺激に対して起こる幹細胞マーカーの発現低下を抑制し、分化マーカーの発現上昇を抑制した。Satbはその中でも栄養膜幹細胞の未分化維持に必須な分子であるEomesの発現をmRNAレベルとタンパク質レベルの両方で著名に上げることを見出した。SatbがEomesを直接の標的として転写調節している可能性を考え、Eomesの転写調節領域を調べるといくつかのSatb結合配列の候補を見つけた。クロマチン免疫沈降法とゲルシフト解析にて転写開始点の125塩基上流にSatbが実際に結合することを見出した。さらにルシフェラーゼを用いたレポーター解析を行ったところSatb1とSatb2はいずれもEomesのプロモーター活性を上げ、両者の共発現によりさらに活性が上がった。また予想通り、SatbのノックダウンによりEomesのプロモーター活性は抑制された。Satbによるこの効果はレポーターのSatb結合配列に変異を入れることにより消失した。当課題の開始前に得られていたデータと今回得た結果を合わせて論文投稿し、掲載された(Asanoma et al., Journal of Biological Chemistry, 2012)。平成23年度にSatb1/2がEomesを標的とすることを見出し、論文発表に至った。その後の方針としてSatb1/2が標的とする遺伝子群を全ゲノム的に調べることを目標と掲げた。しかしアッセイのシステムがうまく機能せず、この方向性が頓挫している。しかしその間、我々はSatb1/2の結合領域をId1、Id2、Gata3に見出し、実際にこれらの遺伝子がSatb1/2により制御されていることを確認することができた。我々は達成度を上記のように評価した。他方で我々はダイオキシン受容体を中心とするプロジェクトにおいて国際雑誌に論文掲載に至り大きな成果を上げることができた。当課題の目的はSatbの栄養膜細胞における機能を明らかにし、その作用機序を解明することであった。我々はSatb遺伝子を導入した細胞株を解析することにより、Satbが栄養膜細胞の分化に重要な機能を有することを明らかにした。また、Satbの標的遺伝子を探索し、栄養膜細胞の分化を制御するマスター分子であるEomesを見出した。これらの結果をまとめ、世界的に権威のある学術雑誌に最初の1報を掲載することができた。我々は当初予定した目的を順調に達成していると考える。我々はSatb1/2が標的とする遺伝子群を全ゲノム的に調べることを目標と掲げた。しかしアッセイのシステムがうまく機能せず、この方向性が一旦頓挫している。この原因を探って当初の予定を遂行するとともに米国共同研究者との協力を強化し課題の完成を目指す。具体的にはHA標識したSatb1/2をマウスの胎盤幹細胞に遺伝子導入し、抗HA抗体を用いたクロマチン免疫沈降法と次世代シークエンサーを組み合わせたChIP-Sequence法により全ゲノム規模でSatb1/2の標的領域を探索する。得られたSatb1/2標的領域が制御すると予想される遺伝子を同定する。
韓国憲法学の成立過程における国権と人権の関係-日本との比較の視点から-

今年度は、6月に韓国の韓日関係史学会において、「韓国の西洋法思想受容と兪吉濬」というテーマで、兪吉濬の著書のなかでも、特に福沢諭吉の『西洋事情』と同一の内容を多く含む『西遊見聞』および東京大学で教鞭をとったKarl Rathgenの講義録の翻訳であるといわれる『政治学』を素材に兪吉濬の西洋法、特に憲法思想受容の特徴を考察した。その結果、かれの叙述には社会的ないし歴史的要素が権利,法、国家の形成要素として非常に重視されているという特徴があることがわかった。この特徴は、かれの儒教的思想基盤が西洋法思想受容過程において、特にドイツ歴史学派の法思想とうまく融合されるための機能を果たしたのではないかと思われる。また一月には、韓国の法史学学会において「兪致衡と穂積八束」というタイトルで報告を行なったが、これは日本で発表したものを改編したものである。なお、今年度は昨年度からの継続で、韓国第一共和国憲法の制定過程および同憲法の原案を作成したといわれる兪鎭午の憲法思想を考察することを主たる作業とした.特に、韓国に滞在する機会が数回あったため、当地の研究者たちにインタビューをしつつ、研究を進めた。インタビューに応じてくれたのは、ソウル大学崔鐘庫教授(法思想史)、延世大学柳永益教授(韓国史)、ソウル大学金哲洙名誉教授(憲法)、延世大学兪浣教授(都市工学、兪鎭午博士子息)、仁荷大学李京柱教授(憲法)、明知大学金学俊教授(政治史)、東亜大学金孝全教授(憲法、法思想史)、ソウル大学李映録博士(法思想史)の各氏である。これらのインタビューを踏まえた資料分析のなかで第一共和国憲法の制定過程ではドイツ(特にワイマール憲法)やアメリカの憲法思想の影響のほか上海臨時政府時代の憲法を通じて、中華民国憲法の影響も見られること、またそこに現れた民主主義思想には民族主義との結びつきが見られることがわかった。今年度は、まず開化派の人権思想について考察することから始めた。なかでも親日開化派とされ、日本を通じて人権思想を学んだ朴泳孝、兪吉濬および合衆国に渡って直接アメリカの人権思想を学んだ徐載弼の三人を取り上げ、かれらの人権思想を分析した。かれらの思想はそれぞれ天賦人権的な考え方を示している。しかし他方で、かれらの主張には、こうした人権思想が列強に対する独立の維持や国力の増強といった当時の国家目的と密接な関連をもって唱えられているというところに共通した特徴を見出すことができる。このように国権と人権を対立せずに互いに助け合うものとして捉える思考は、明治期の日本における自由民権運動の性格にも類似し、ある意味で日本も含めたアジア諸国に共通の人権観でもあるように思われる。またこうした思考は、朝鮮のその後の発展のなかで自然権的な人権論よりも国法に基づく法的権利論を発展させる契機にもなったと考えられる。事実、1900年代に入って、朝鮮では愛国啓蒙団体による憲法についての議論や法律専門学校のための憲法の教科書などが現れるようになるが、それらのなかでは法実証主義的なドイツ国法学に基づく説明が圧倒的に多くなっている。今年度後半は、こうした憲法の教科書のひとつとして兪致衡の書いた『憲法』をかれが手本にしたといわれる穂積八束の教科書と比較検討した。両者の異同を検討すると、兪致衡の議論は全体を通じて穂積の叙述をほぼそのまま受容しているにもかかわらず、穂積の特徴である国体論や公法と私法の区別についての議論が欠けているという特徴があることがわかった。ここには、旧態依然たる当時の朝鮮の国家制度のなかで、特殊日本的な国体論を受容しないことで法実証主義的な性格を堅持しようとする反面、公法、私法の区別をしないために、近代的国家観念を提示しきれないまま、強い国家権力を法的に位置づけようと腐心する朝鮮人研究者の姿が見出せる。今年度は、当初の予定では、昨年の研究の続きとして愛国啓蒙団体による憲法についての議論や人権観を掘り下げて吟味するとともに、植民地時代の独立運動のなかに現れる憲法論を考察してゆくことを考えていた。しかし、膨大な資料を集めるにつれ、現研究段階では当時の複雑な状況における議論の正確な理解を得ることが極めて困難であることを痛感し、研究順序を変更し、戦後の韓国における憲法論を先に概観することとした。戦後の韓国では植民地支配を脱したあとの国家の再建過程で「民主化」が常に重要な課題として提示されてきた。この民主化はしかしながら必ずしも個人の権利に基点をおいて主張されたものとは言い難く、あるいは植民地支配に対する「自主独立」と同じ意味で、あるいは北朝鮮との比較における韓国の正統性のアピールとして、あるいは朴大統領の維新体制時代に見られるような開発体制的な民主主義の形で、外に対する国家の強化の一材料として使われてきたという側面が強い。一般的な意味での民主化は現在の第六共和国憲法の下で本格的に始まったといってよいであろう。この憲法の下では。憲法裁判所がおかれ人権への配慮が格段に強化されている点が注目される。もっとも他方で、「民主」を自らの目的のひとつとして揚げるこの憲法裁判所が、本来民主主義とは整合しないともいわれる裁判所の機能と民主主義とをどのように調和的に解釈してゆくかには未知の部分も多く、憲法裁判所の活動は、韓国憲法の発展の重要な試金石になっていると考えられる。

なお、こうした分析に続いて現在、戦後の第一共和国憲法草案起草者である兪鎭午の民主主義観および人権観を考察中である。戦後の憲法論構築過程に植民地時代の思想がどのように反映したか(あるいは反映しなかったか)を考えることで上記の植民地時代の憲法論理解のための視座も得たいと思っている。今年度は、6月に韓国の韓日関係史学会において、「韓国の西洋法思想受容と兪吉濬」というテーマで、兪吉濬の著書のなかでも、特に福沢諭吉の『西洋事情』と同一の内容を多く含む『西遊見聞』および東京大学で教鞭をとったKarl Rathgenの講義録の翻訳であるといわれる『政治学』を素材に兪吉濬の西洋法、特に憲法思想受容の特徴を考察した。その結果、かれの叙述には社会的ないし歴史的要素が権利,法、国家の形成要素として非常に重視されているという特徴があることがわかった。この特徴は、かれの儒教的思想基盤が西洋法思想受容過程において、特にドイツ歴史学派の法思想とうまく融合されるための機能を果たしたのではないかと思われる。また一月には、韓国の法史学学会において「兪致衡と穂積八束」というタイトルで報告を行なったが、これは日本で発表したものを改編したものである。なお、今年度は昨年度からの継続で、韓国第一共和国憲法の制定過程および同憲法の原案を作成したといわれる兪鎭午の憲法思想を考察することを主たる作業とした.特に、韓国に滞在する機会が数回あったため、当地の研究者たちにインタビューをしつつ、研究を進めた。インタビューに応じてくれたのは、ソウル大学崔鐘庫教授(法思想史)、延世大学柳永益教授(韓国史)、ソウル大学金哲洙名誉教授(憲法)、延世大学兪浣教授(都市工学、兪鎭午博士子息)、仁荷大学李京柱教授(憲法)、明知大学金学俊教授(政治史)、東亜大学金孝全教授(憲法、法思想史)、ソウル大学李映録博士(法思想史)の各氏である。これらのインタビューを踏まえた資料分析のなかで第一共和国憲法の制定過程ではドイツ(特にワイマール憲法)やアメリカの憲法思想の影響のほか上海臨時政府時代の憲法を通じて、中華民国憲法の影響も見られること、またそこに現れた民主主義思想には民族主義との結びつきが見られることがわかった。
遺伝子導入マウスを用いた生物時計リミットサイクルの解析

視交叉上核におけるPer1遺伝子の誘導の限局性と時差ボケの機序の解明夜間の光照射によってラットPer1は視交叉上核の腹外側部に発現し背内側部には誘導されなかった。Per1の誘導は位相変位のinitial stepと考えられており、このようにPer1遺伝子が限局した部位にのみ発現することは光反応性の時計と光には直接反応しない時計の2種類の体内時計が視交叉上核の中で乖離して存在することを示唆する。更に明瞭に2つの時計の存在を明らかにするため、急激な明暗サイクルのシフト後、視交叉上核の時計の位相をPer1の発現を指標として観察した。この際に背内側部の位相は明暗サイクルのシフト後にもとの位相からシフト後の位相に変位するのに約一週間を要しこれが時差ボケ現象の原因であると考えられた。遺伝子導入ショウジョウバエを用いた哺乳類PER1タンパクの機能解析ショウジョウバエの時計遺伝子ピリオド(Per)のマウス相同遺伝子mPer1,mPer2をショウジョウバエのper、timelessプロモーターの制御下においてショウジョウバエに導入し、行動の変化について検討した。mPer1,mPer2を導入したピリオド遺伝子欠失体(Per0)のうち、いくつかの系統にて、概日リズムの回復を認めた。マウス時計遺伝子導入トランスジェニックマウスの解析Per1,Per2,Per3cDNAおよび、おのおのの遺伝子の上流の調節領域を採取し、そのプロモーター活性を測定した。これらのcDNAを発現ベクターに組み込み、エピトープタッグとしてFLAGを下流に結合し、株化細胞であるCOS7に発現させたところ、Western blottingにてタンパクの発現を検出できた。また、GFPにPer1,Per2,Per3を結合させて、その発現を観察した。これを用いてトランスジェニックマウスの作成段階に入っている。最近になり他施設よりPer1を過剰発現するトランスジェニックラットが作成された。今後、このようなラットに関しても時計遺伝子の発現の解析を行う予定である。また、TetracyclinによってPer1の発現が誘導される遺伝子導入動物の作成にも着手している。トランスジェニックマウスを作る前段階として、Per1,Per2,Per3 cDNAの採取、おのおのの遺伝子の上流の調節領域を採取し、そのプロモーター活性を測定した。まず、マウスのPer1,Per2,Per3 cDNAのcodingregionを報告された配列に従って、PCRを用いてその全長を採取した。これらのcDNAを発現ベクターに組み込んでエピトープタッグとしてFLAGを下流に結合し、株化細胞であるCOS7に発現させたところ、Western blottingにてタンパクの発現を検出できた。また、Green fluorescent proteinにPer1,Per2,Per3を結合させて、その発現を観察した。主に細胞質での発現を認めたが、一部の細胞においては、核内での発現があった。また、Per1,Per2,Per3のプロモーター部位を採取するために、Per1,Per2,Per3の部分配列をプローブとして、ジェノミックライブラリ一をスクリ一ニングしおのおのの遺伝子の調節領域を得た。おのおのの調節領域を、ルシフェラーゼ遺伝子の上流につなぎ、株化細胞に導入してルシフェラーゼアッセイを行ったところルシフェラーゼ遺伝子の活性化を認めた。すなわち、プロモーター活性を示した。現在これらの材料を用いて、トランスジェニックマウスの作成を行っている。

具体的には、これらの遺伝子の発現量が増大した際にサーカディアンリズムの周期に変動が生じるかどうか、また、本来著明な日周変動を示すPer1,Per2の振動をなくするために、神経細胞で特異的に発現するneuron specific enolaseのプロモーターをPer1,Per2cDNAにつないでマウスに導入し、その変化を観察する予定である。視交叉上核におけるPer1遺伝子の誘導の限局性と時差ボケの機序の解明夜間の光照射によってラットPer1は視交叉上核の腹外側部に発現し背内側部には誘導されなかった。Per1の誘導は位相変位のinitial stepと考えられており、このようにPer1遺伝子が限局した部位にのみ発現することは光反応性の時計と光には直接反応しない時計の2種類の体内時計が視交叉上核の中で乖離して存在することを示唆する。更に明瞭に2つの時計の存在を明らかにするため、急激な明暗サイクルのシフト後、視交叉上核の時計の位相をPer1の発現を指標として観察した。この際に背内側部の位相は明暗サイクルのシフト後にもとの位相からシフト後の位相に変位するのに約一週間を要しこれが時差ボケ現象の原因であると考えられた。遺伝子導入ショウジョウバエを用いた哺乳類PER1タンパクの機能解析ショウジョウバエの時計遺伝子ピリオド(Per)のマウス相同遺伝子mPer1,mPer2をショウジョウバエのper、timelessプロモーターの制御下においてショウジョウバエに導入し、行動の変化について検討した。mPer1,mPer2を導入したピリオド遺伝子欠失体(Per0)のうち、いくつかの系統にて、概日リズムの回復を認めた。マウス時計遺伝子導入トランスジェニックマウスの解析Per1,Per2,Per3 cDNAおよび、おのおのの遺伝子の上流の調節領域を採取し、そのプロモーター活性を測定した。これらのcDNAを発現ベクターに組み込み、エピ卜-プタッグとしてFLAGを下流に結合し、株化細胞であるCOS7に発現させたところ,Western blottingにてタンパクの発現を検出できた。また、GFPにPer1,Per2,Per3を結合させて、その発現を観察した。これを用いてトランスジェニックマウスの作成段階に入っている。最近になり他施設よりPer1を過剰発現するトランスジェニックラットが作成された。今後、このようなラットに関しても時計遺伝子の発現の解析を行う予定である。また、TetracyclinによってPer1の発現が誘導される遺伝子導入動物の作成にも着手している。
新素材繊維の高弾性伸び特性を利用したRC部材の耐衝撃性向上に関する研究

異形鉄筋を補強筋とするRC部材は、構造部材として多く用いられているが、衝撃的な外力を受けることにより、載荷点部にひび割れが集中し、塑性ヒンジが発生する。このため靱性に乏しいことが明らかになっており、衝撃的な外力に対する安全性確保に問題があることが指摘されている。本研究は、衝撃力に対するこのようなRC部材の欠点を克服出来るような構造部材を開発することを目的として、新素材繊維を補強筋とするRC構造を考え、その耐衝撃性状についての実験的及び数値解析的検討を行なったものである。ここで検討するRC梁は、弾性歪範囲が広いアラミドあるいはビニロン繊維を用いたFRPロッドを補強筋とするものである。これらの弾性歪範囲は鉄筋の約810倍程度で、多少のひび割れに対しても十分弾性状態を保持できるため、鉄筋のような応力集中も発生せず、曲げひぼ割れが分散して発生し梁全体で挙動出来るものと考えられる。本年度の研究では、実験研究として基本寸法が桁高24cm、幅16cm、全スパン長を250cm(支点間距離200cm)とする各種複鉄筋RC梁を製作して、重量200kgfの重錘を用いた衝撃荷重載荷実験を行なった。実験結果の検討は、重錘加速度、支点反力、ひび割れ状況、補強筋の軸歪および梁の変位の応答波形を用いて総合的に行なった。また、実験の妥当性を検証するために、衝撃問題解析用汎用コードDYNA3Dを用いて、実験と同一条件の基における数値解析を試みた。その結果、以下のことが明かとなった。1)衝撃力による破壊形式は、異形鉄筋を補強筋とするRC梁では鉄筋の降伏、アラミド繊維を用いたFRPロッド(AFRPロッド)を補強筋とするRC梁では圧縮側コンクリートの圧壊である。2)異形鉄筋RC梁の衝撃耐力はほぼ静的耐力と同程度であり、AFRPロッドRC梁では静的耐力の約2倍程度である。3)AFRPロッドRC梁は、異形鉄筋RC梁より最大変位は大きいものの、残留変位は格段に小さく、耐衝撃性に優れている。
医療機関における管理会計機能に関する理論的・実証的研究

自治体立病院の経営改革の事例研究を通じて,自治体立病院における政策的な医療サービスを維持しながら,財務的な効率性を追求するといった,相反する諸目標の同時的な実現を促すための管理会計手法を中心としたマネジメント・コントロールとはいかなるものかについて, Simons(1995)の分析枠組み(Levers of Control)に依拠し,特に,マネジメント・コントロールの導入のプロセスとその効果に着目しながら明らかにした.自治体立病院の経営改革の事例研究を通じて,自治体立病院における政策的な医療サービスを維持しながら,財務的な効率性を追求するといった,相反する諸目標の同時的な実現を促すための管理会計手法を中心としたマネジメント・コントロールとはいかなるものかについて, Simons(1995)の分析枠組み(Levers of Control)に依拠し,特に,マネジメント・コントロールの導入のプロセスとその効果に着目しながら明らかにした.本年度は,病院経営・会計に関する先行研究の収集と文献サーベイを行いつつ,継続的に公立病院の主たる関係者へのヒアリングを中心とした調査を実施してきた。一連の先行研究と質的調査については中間報告というかたちで,日本管理会計学会九州部会(2009.10.31,別府大学)において報告した。そこでは,(1)医療機関を対象とした管理会計研究のレビューおよび先行研究からの知見・限界の提示,(2)調査を行ってきた公立病院での制度変革のケースの提示,(3)制度変革(医療制度や公立病院のガバナンスの変化など)の中でも特に管理会計システム(予算制度,公営企業法予算の適用,業績評価制度など)の導入・変更についての記述,(4)以上の調査内容について,医療機関における制度変革におけるマネジメント・コントロールの考察を試みた。また,本報告の特徴は,関係者のヒアリングデータの綿密なトランスクリプ化を行い,アーカイブも含め,それら分析を通じて,組織成果(財務的・非財務的業績および制度変革の導入の促進・阻害)には,実証ベース(定量的調査可能)のアプリオリな管理会計システム(マネジメント・コントロール)の側面だけではなく,管理会計システムを含めた制度変革とその対象となる医療機関との間に相互作用的な側面が影響しているという可能性を確認することができたことである。特に国内の研究では,管理会計システムの導入に関する先行研究では,管理会計システムがアプリオリなものとして想定されていた。しかしながら,本年度の研究を通して,そのような側面の重要性を十分に認識しながらも,既存研究で見過ごされてきた側面を確認することができ,次年度以降の調査研究の可能性を大きく拡大することができた。本年度は,前年度に引き続き,先行研究の収集と文献サーベイを行いつつ,前年度に行った公立病院での調査内容を解析し,理論的考察を試みた。一連の成果については,国際学会「Academy of Management Annual Meeting (2010.8.8,モントリオール)」において,「Passion and Compassion and Social Power: Rethinking Japanese-Style Management」という統一テーマのもと発表を果たした。そこでは,(1)医療機関を対象とした管理会計研究のレビューおよび先行研究からの知見・限界の提示,(2)病院改革のケースにおける問題化アプローチ(Problematization Approach)および脱問題化アプローチ(De-Problematization Approach)の発見,そして,(3)脱問題化アプローチの組織改革における有効性,を中心に成果報告をした。これまでの「組織改革」では,まず組織成員を問題化することから始まり,顕在化された問題を解決すべく,外部から導入された管理会計などの管理手法の型に彼らをはめ込もうとするのが主流であった。しかし,このようなアプローチでは,特に病院組織では,経営者側とコンフリクトを起こしてしまう。本報告では,問題化アプローチではなく,トップ(院長)の明確な戦略コンセプト(組織の強みを引き出し,かつ収益性につながるビジネスモデル)のもと,現場に十分にエンパワメントし医師を動機付け,管理手法も医師,看護師,その他スタッフと一体となって組織独自での開発を促すといった脱問題化アプローチが,病院組織の改革成功のひとつの方向性と考えている。このような成果を,本研究では,次年度以降の予定している定量研究の分析枠組みを構築する上で重要な視点としている。本年度は,これまで実施してきた,自治体立病院の経営改革の事例研究の追加的な調査と,事例研究の理論的な位置づけを明確にするための,網羅的な文献サーベイ,そして,文献研究と事例研究の結果を踏まえた上での,マネジメント・コントロール研究の理論的分析枠組みの開発である.具体的には以下のとおりである.まず,本研究では,自治対立病院の大規模な経営改革の事例に着目しながら,病院組織のガバナンスの変化(県知事から企業長による統括,企業団の設立),構造的変革(施設の民間委譲,職員数の削減,給与改革),マネジメント文化の形成,病院機能特化,様々な管理ツールの導入(公営企業予算,報酬連動型業績評価,など)など,マネジメント・コントロールの観点から観察してきた.病院におけるマネジメント・コントロールの形成が,既存のマネジメント・コントロール研究にどのような意義があるのか位置づける必要性があるため,プロフェッショナル組織,とくに,病院を対象としたマネジメント・コントロール研究の現状と課題を網羅的な文献レビューから抽出することにした.さらに,病院では,管理者と医療スタッフとの間で生じるコンフリクトが古くから問題視されてきた.従来のマネジメント・コントロール研究では,そのようなテンションを解消・回避することが重要視されてきた.しかしながら近年の研究では,組織の中で生じるそのようなテンションを安易に解消・回避するのではなく,両者の意思決定・行動をいかにマネジメントして組織成果に結びつけるかに関心が寄せられている.本研究では,文献サーベイと自治体立病院や民間企業の事例も考慮しながら,特定の組織に限定することのない,テンション・マネジメントのための理論的な分析枠組みの開発を行った.
抗菌ペプチドと炎症収束メディエーターレゾルビンを用いた敗血症性ショックの制御

レゾルビンは、魚油に多く含まれるω-3系脂肪酸由来の炎症収束性脂質ファミリーであり、強力な抗炎症性作用を示すことから炎症性疾患の治療薬として期待されている。一方、敗血症性ショックはグラム陰性菌エンドトキシン(リポ多糖:LPS)などによって引き起こされる重篤な全身性の炎症疾患である。本実験では、ドコサヘキサエン酸由来のresolvin D1(RvD1)をエンドトキシンショックモデルに投与し、その病態に与える影響を検討した。炎症組織中に炎症性細胞が集積すると、ω-3系多価不飽和脂肪由来の生理活性脂質レゾルビンが産生され、起炎性物質や炎症性細胞のクリアランスを制御して炎症を収束させることが最近報告されたが、全身性炎症反応である敗血症性ショックの病態でも実際に働いているのかどうかは不明である。従って、敗血症性ショックの場で主として働く細胞を用い、平成20年度は、(1)レゾルビンによる炎症反応の抑制について、また(2)LPS刺激したマクロファージ系、あるいは血管内皮系培養細胞が産生するレゾルビンの検出方法確立について検討を行う予定であったが、権利問題で当初用いる予定であったレゾルビンE1(RvE1)標準品が販売停止となったため、次いで10月に販売開始となった類似作用を持つレゾルビンファミリー分子、レゾルビンD1(RvD1)を用いて(1)について実験を行った。PMA処理によりマクロファージ様に分化させたU937細胞やマウスマクロファージ様RAW264.7細胞をRvD1存在下あるいは非存在下にLPS刺激し、上清中のTNF-α産生への影響を観察したところ、RvD1は弱いながらも濃度依存的にTNFの産生を抑制した。抑制作用の機序を調べるために、RAW264.7細胞へのLPS結合にRvD1が影響するかをFCMで調べたところ、RvD1は細胞へのLPS結合には影響を及ぼさなかった。また、次年度行う予定であったIn vivoの実験の予備実験としてD-ガラクトサミン負荷エンドトキシンショックモデルマウスに対するRvD1の影響を観察した。D-ガラクトサミン並びにLPS100 ngを投与したマウスにおいて、RvD1(1μg)は致死率に影響しなかった。これに関しては、投与量を含めて検討の余地があり、引き続き進めてゆく予定である。敗血症性ショックの病態では、炎症性サイトカインやhigh mobility group box-1(HMGB1)といった起炎性メディエーターの血中濃度が上昇し、生体がsystemic inflammatory response syndrome: SIRSの状態となる。一方、生体にはω-3系多価不飽和脂肪酸を前駆物質として、炎症収束性メディエーターレゾルビン(resolvin)が産生され、炎症性細胞のクリアランスや起炎性サイトカインの産生制御を通じて炎症を収束させるメカニズムが有ることが最近分かってきた。本実験では、D-galactosamine誘発エンドトキシンショックモデルマウスを敗血症動物モデルとして用い、DHA由来レゾルビンであるresolvin D1(RvD1)のエンドトキシンショックへの作用について検討し、以下の知見を得た。(1)RvD1は1-100ng/mlの濃度ではLPS刺激したマウスマクロファージ様細胞RAW264.7からのサイトカイン産生、HMGB1放出に影響を及ぼさなかった。(2)エンドトキシンショックモデルマウスにRvD1を腹腔内投与すると、血中MCP-1濃度の上昇が、1μg/mouseの投与量において有意に抑制された。さらに、HMGB1濃度の上昇もRvD1t投与により有意に抑制された。(3)モデルマウスの腹腔内細胞数の増加、腹腔内への好中球の遊走、肝細胞アポトーシスの増加に対してRvD1は抑制傾向を示したが、いずれも作用は弱いものであった。以上の結果により、RvD1は敗血症性ショックの病態においてMCP-1の産生、HMGB1の血中放出を抑制し、敗血症性ショックに対して抑制・保護的に働くことが示唆された。
増殖因子徐放作用を有する機能性コラーゲン材料の開発および組織再生への応用

分子生物学および発生生物学の発達により、多くの新たな遺伝子やタンパク質の発見およびその機能解明、ならびに、新たな細胞分化誘導方法の開発が近年飛躍的な進歩を遂げており、このような知見をもとに再生医療実現の期待が高まっている。特に、骨や歯などの硬組織再生に関しては、硬組織細胞の増殖、分化を制御する基本的因子の解明が進んでいるため、実用化が最も期待されている分野の1つである。しかし、これら分野から得られる知見を取り入れた具体的な組織再生構築技術の確立は遅れており、いまだ効率の良い硬組織再生技術は確立されていないのが現状である。そこで、本研究では、増殖因子放出制御の可能な新しい機能性材料の創製を目的に、生体由来成分であるコラーゲンおよびアパタイトの修飾および複合化を試みた。アパタイトからのタンパク質放出制御検討において、異なる結晶性を有する粉末状アパタイトは異なる生体吸収性を持つこと、その比表面積に依存して吸着タンパク質量が異なること、また、タンパク質吸着量を変えて作成したタンパク質吸着アパタイトからアパタイト吸収に依存するタンパク質放出制御を確認できた。次に行ったコラーゲンとアパタイトとの複合化において、コラーゲン溶液のゲル化過程にアパタイト粉末を存在させることで、コラーゲン繊維と親和性の高い状態でコラーゲンアパタイト複合体を作成することができた。この複合材料の生体吸収性について検討したところ、含有アパタイト量に依存して生体吸収性が変化すること、また、コラーゲンの代謝にともなうアパタイトの放出が確認できた。これらの結果から機能性タンパク質の放出制御が可能な複合材料を作成できることが示唆された。(1)粉末アパタイト含有コラーゲン膜を作製し、その生体内代謝性およびアパタイトの放出挙動について検討したところ、コラーゲンの代謝にともないアパタイトが放出されること、また、アパタイト含有量によりコラーゲンの代謝性を調節できることが明らかとなり、新しい薬剤放出型のコラーゲン膜としての有用性が確認された。(2)我々の講座で最近、新しい血管成長を促進させるペプチドを確認した。そこで、このペプチドとゼラチンとの結合を試みた。この際、ペプチド自体に可動性を付与するため、ゼラチンとペプチドとの間にグリシンを1つ介在させた。また、ゼラチンとペプチドとの結合はグルタールアルデヒドを用いた。液体クロマトグラフィーを用いてゼラチンとペプチドが結合していることを確認した。このゼラチン-ペプチド結合体を用いて3次元培養系にて血管内皮細胞の培養を行ったところ、ゼラチン単体の場合と比較して有意に多くの血管内皮細胞の増殖が確認され、また、血管特有の管腔構造の形成も確認された。透過型電子顕微鏡では、管腔構造の内側にマイクロビライが確認され、また、細胞同士がタイトジャンクションで結合していることから、血管内皮細胞が分化し、管腔の内外を認識していることが明らかになった。次に、ゼラチン-ペプチド結合体をマウス背部皮下に埋入し、血管新生能について検討したところ、スパイラル状の新生幼若血管がゼラチン単体の時と比較して有意に増加していることが明らかとなった。以上のことから、ペプチド単体を溶液状で使用した場合と同様の機能がゼラチンと結合した場合でも起こることが確認できた。ペプチドの担体として用いたゼラチンは架橋させることにより任意の形状にできることが知られていることから、現在、ゼラチン-ペプチド結合体およびゼラチンのみの複合体を作製し、部位特異的な血管新生を試みている。また、ゼラチンの代謝にともなうペプチドの放出についてもin vitro的に検討を行っている。コラーゲンはその精製方法が確立されており、また製法により種々の形状を付与できる汎用性の高い材料である。我々は、薬剤徐放可能なコラーゲン生体材料の創製を目的に研究を遂行している。I型コラーゲン(ブタ、皮膚由来)凍結乾燥粉末をpH3.0の塩酸溶液に浸漬することでコラーゲン溶液を得た。

これに炭酸アパタイト粉末を含有しpH7に調整することでゲル化した後、室温にて乾燥しアパタイト・コラーゲン複合体膜を作成した。この膜の生体吸収性をin vitro、in vivoにて検討したところ膜作成時のコラーゲン濃度および含有アパタイト量の変化により生体吸収性を調節できることが明らかとなった。また、コラーゲン代謝にともなうアパタイトの放出も同時に確認された。次にアパタイトへのタンパク質吸着によりタンパク質吸着アパタイトを作成し、このアパタイトからのタンパク質放出について検討したところ、異なるpH環境および異なるアパタイトの結晶性により、タンパク質放出を任意に調節できることが明らかとなった。以上の結果からアパタイト・コラーゲン複合膜を用いたタンパク質放出制御の可能性が示唆された。また、コラーゲンの変性物質であるゼラチンを用いた糖質の放出制御を試みた。この研究はその機能が徐々に解明されつつある糖質の薬剤としての応用方法を具体化するものである。使用した糖質はヒアルロン酸で関節疾患や炎症において取り上げられる高分子多糖である。ヒアルロン酸を含有したゼラチンをグルタールアルデヒドを用いて架橋しゲルを作成した。このゲルは乾燥させることで膜やスポンジなどに成形でき、また、そのままでもインジェクタブルに使用できる。このゲルをPBSおよびゼラチナーゼ含有水溶液に浸漬したところ、ゼラチナーゼによるゼラチンの分解によりのみヒアルロン酸を放出すること、また、この放出は架橋剤濃度に依存していることが確認された。このように原料の複合化条件やその周囲環境条件により複合体の分解を人為的に制御でき、また、生体活性物質の放出も調節できることが確認された。本研究では、前年度までにアパタイト含有コラーゲン複合膜を利用し、アパタイトに機能性たんぱく質を吸着させることでコラーゲンアパタイト複合膜からの蛋白質放出制御を検討してきた。本年度は、さらに高度なタンパク質放出制御を達成するためアパタイトの生体吸収性制御を試みた。アパタイトの結晶性を変えることでアパタイトの溶解性は大きく異なる。また、生成アパタイトの結晶サイズによって食細胞の貧食による生体吸収性促進も期待できる。そこで、合成温度の制御およびアミノ酸存在によるアパタイト結晶成長阻害をすることで複数の異なる結晶性および結晶サイズを有するアパタイトを合成した。このアパタイトの生体吸収性に関してラット頸骨に形成した骨欠損モデルを用いて検討したところ、結晶性の低いアパタイトおよび結晶サイズの小さいアパタイトほど生体吸収性に優れ、生体内での残存期間が短くなることが確認された。また、ここで合成した結晶性、結晶サイズの異なるアパタイトにタンパク質を吸着し、タンパク質吸着アパタイトからのタンパク質放出挙動を検討したところ、結晶性ならびに結晶サイズの違いを変えてやることで任意のタンパク質放出を量的、時間的に制御できる可能性が示唆された。このアパタイトを用いたコラーゲンアパタイト複合膜を生成することで、より細密なタンパク質放出制御が期待できる。さらに初年度に報告した血管新生ペプチドを含有したコラーゲンゲルを作成し、このゲルの血管新生能について検討を行った。
亜熱帯地域における大気エアロゾルの光化学特性について

これまでの研究において、エアロゾルの水溶性画分中で光化学的に生成するFe(II)の供給源について調べた結果、エアロゾル中のFe(II)の供給源は鉄-シュウ酸錯体のような波長依存性を示す化合物であることが示唆された。エアロゾル中で光化学的に生成するFe(II)の供給源を更に詳細に検討し、エアロゾル中のFe(II)供給源に関する反応メカニズムを調べるには、もっと多くのFe(II)の供給源化合物について調べる必要があるが、個々のFe(II)の供給源について、波長依存性に関する報告はあまりない。そこで、Fe(II)供給源として、鉄-ジカルボン酸錯体に注目し、波長依存性を調べた。エアロゾル中には、ジカルボン酸が多く含まれていることが報告されているため、多くの鉄-ジカルボン酸錯体が存在していることが考えられる。そこで、人工的に調製したFe(III)-ジカルボン酸水溶液に光を照射して生成するFe(II)を測定し、様々なFe(III)-ジカルボン酸錯体の光化学特性を調べた。本研究では、ジカルボン酸の中でも、環境中で高濃度に存在すると考えられるシュウ酸、マロン酸、コハク酸を選定した。理論計算と定量的な実験を結びつけることで、各Fe(III)-ジカルボン酸錯体のモル吸光係数とFe(II)光生成の量子収率を実験から決定した。大気エアロゾルの水溶性画分であるWSF溶液中のFe(II)光生成速度とFe(OH)^<2+>とFe(oxalate)_2^-に加えて今回決定したFe(III)-マロン酸錯体とFe(III)-コハク酸錯体をFe(II)供給源として計算したFe(II)光生成速度を比較すると、エアロゾル中のFe(II)供給源としては、やはりFe(oxalate)_2^-が最も有力であることが示唆された。琉球大学(2005年6月)、沖縄本島北部の辺戸岬(2005年8月)の2ヶ所にハイボリウムエアサンプラーを設置し、フィルター上にエアロゾル粒子を採取した。採取期間は1週間であり、採取したフィルターは冷蔵保存した。採取したフィルターを超純水中に浸して撹拌し、エアロゾル中の水溶性成分を抽出した(エアロゾル抽出液)。このエアロゾル抽出液にモノクロメーター(単色光)を用いて光を照射し、エアロゾル抽出液中で光化学的に生成するFe(II)を研究した。エアロゾル抽出液に光を照射するとFe(II)の生成が確認でき、光生成したFe(II)濃度はエアロゾル抽出液中存在する全溶存鉄濃度の80-100%に短時間で達した。この結果から、エアロゾルが大気中を浮遊している間にFe(II)が短時間に生成し、エアロゾル中の液相に存在する鉄のほとんどはFe(II)になっているということが示唆された。エアロゾル抽出液中のFe(II)光生成の量子収率は、時期や場所により変動することがわかった。これは、それぞれのエアロゾル中の鉄のスペシエーションが異なることを示唆している。また、Fe(II)光生成の量子収率には照射波長340nm付近で最も高いという波長依存性があることがわかった。このことから、Fe(II)光生成には340nm付近の光を吸収する物質が大きく影響を与えていることが考えられる。本研究と過去に報告されているデータを比較すると、エアロゾル中で光化学的に生成するFe(II)の供給源は、鉄-水酸化物錯体ではなく、鉄-有機物錯体である可能性が高いことがわかった。琉球大学と辺戸岬の2ヶ所にハイボリウムエアサンプラーを設置し、フィルター上にエアロゾル粒子を採取した。採取したフィルターを超純水に浸して撹拌し、エアロゾル中の水溶性成分を抽出した(エアロゾル抽出液)。このエアロゾル抽出液中に含まれる溶存成分(主要な陽・陰イオン、溶存有機炭素、全溶存鉄)を測定した。硫酸イオン、全溶存鉄、溶存有機炭素濃度は、2005年11月に他の期間よりも高かった。後方流跡線解析を用いて気団の流跡を調べると、濃度が高い期間の気団は中国大陸方面から到来しており、その前後の期間は太平洋や日本列島方面から到来していることが確認できた。これらの成分は化石燃料の燃焼で排出される排気ガスに含まれているので、中国大陸に存在する工業地帯から排出される物質が輸送されてきたと考えられる。また、エアロゾル抽出液中のどの溶存成分も6月から10月にかけて最も低濃度を示していた。沖縄本島では、夏季には東からの風が卓越するので太平洋の清浄な気団の影響、冬季に西からの風が卓越するので大陸の汚染物質を含む気団の影響がある。この6月から10月の期間は、太平洋の清浄な気団の影響を受けたエアロゾルが飛来しているため、様々な溶存成分が低濃度を示したと考えられる。全溶存鉄、硫酸イオンと硝酸イオンは、琉球大学が辺戸岬よりも高濃度であることがわかった。鉄、硫酸塩や硝酸塩は人為起源物質だと考えられるため、琉球大学で採取されるエアロゾルは辺戸岬よりも人為的影響を受けていることが示唆された。また、全溶存鉄は、非海塩性硫酸イオンや水溶性有機化合物と比較的強い正の相関を示した。非海塩性硫酸イオンは工場などを起源とし、有機化合物は鉄の溶解度を増加させることが知られている。

これらのことから、エアロゾル中の鉄は工場などを主要な起源とし、長距離楡送される過程で溶存態が増加していくのではないかということが考えられる。これまでの研究において、エアロゾルの水溶性画分中で光化学的に生成するFe(II)の供給源について調べた結果、エアロゾル中のFe(II)の供給源は鉄-シュウ酸錯体のような波長依存性を示す化合物であることが示唆された。エアロゾル中で光化学的に生成するFe(II)の供給源を更に詳細に検討し、エアロゾル中のFe(II)供給源に関する反応メカニズムを調べるには、もっと多くのFe(II)の供給源化合物について調べる必要があるが、個々のFe(II)の供給源について、波長依存性に関する報告はあまりない。そこで、Fe(II)供給源として、鉄-ジカルボン酸錯体に注目し、波長依存性を調べた。エアロゾル中には、ジカルボン酸が多く含まれていることが報告されているため、多くの鉄-ジカルボン酸錯体が存在していることが考えられる。そこで、人工的に調製したFe(III)-ジカルボン酸水溶液に光を照射して生成するFe(II)を測定し、様々なFe(III)-ジカルボン酸錯体の光化学特性を調べた。本研究では、ジカルボン酸の中でも、環境中で高濃度に存在すると考えられるシュウ酸、マロン酸、コハク酸を選定した。理論計算と定量的な実験を結びつけることで、各Fe(III)-ジカルボン酸錯体のモル吸光係数とFe(II)光生成の量子収率を実験から決定した。大気エアロゾルの水溶性画分であるWSF溶液中のFe(II)光生成速度とFe(OH)^<2+>とFe(oxalate)_2^-に加えて今回決定したFe(III)-マロン酸錯体とFe(III)-コハク酸錯体をFe(II)供給源として計算したFe(II)光生成速度を比較すると、エアロゾル中のFe(II)供給源としては、やはりFe(oxalate)_2^-が最も有力であることが示唆された。
中枢神経疾患による手指感覚障害回復訓練・検査システムの開発とその臨床応用

本研究では,中枢神経疾患のある患者を対象として,手指の感覚障害の定量的な評価と訓練を行うことができる訓練・検査システムの開発を行った.刺激とプラセボをランダムに繰り返し与え,正答率によって刺激の強さを自動的に変えていく方法に特徴がある.強い刺激から始め徐々に刺激を弱めていき識別できた最小値を閾値とすることにより,感覚障害の客観的ならびに定量的評価が可能な検査機能を実現した.また,検査方法と同様の方法で刺激の強さを変え,閾値前後の刺激を頻回に与えることにより効果的な訓練機能も実現した.手指感覚障害の訓練・検査システムを鹿児島大学病院附属霧島リハビリテーションセンターに設置し,臨床試験を実施した.その結果,以下の知見が得られた.1.本研究で開発した訓練・検査システムは自動的に閾値を測定できる機能を持ち,感覚障害の客観的,定量的評価を可能にした.2.本訓練・検査システムでは,閾値前後の刺激を頻回に与える訓練が可能である.3.本訓練・検査システムの閾値測定機能の評価を行った結果,閾値には再現性があり,十分な信頼性を持っていることが判明した.4.本訓練・検査システムによる感覚障害回復訓練を行った結果,閾値に改善傾向が見られた.今後の課題として,本訓練・検査システムによる一層の訓練効果を確認するために,長期の訓練を行い,症例数も拡大していく必要がある.また,本研究では,症例数ならびに検査対象者が少なかったことから,触覚障害の回復と振動覚障害の回復との関連性の有無について十分に確かめるだけの結果を得ることができなかった.しかし,これらに関しても触覚と振動覚の両方に麻痺がある患者に対して臨床試験を継続して行えば,関連性の有無も明らかにすることができると期待される.本研究では,中枢神経疾患のある患者を対象として,手指の感覚障害の定量的な評価と訓練を行うことができる訓練・検査システムの開発を行った.刺激とプラセボをランダムに繰り返し与え,正答率によって刺激の強さを自動的に変えていく方法に特徴がある.強い刺激から始め徐々に刺激を弱めていき識別できた最小値を閾値とすることにより,感覚障害の客観的ならびに定量的評価が可能な検査機能を実現した.また,検査方法と同様の方法で刺激の強さを変え,閾値前後の刺激を頻回に与えることにより効果的な訓練機能も実現した.手指感覚障害の訓練・検査システムを鹿児島大学病院附属霧島リハビリテーションセンターに設置し,臨床試験を実施した.その結果,以下の知見が得られた.1.本研究で開発した訓練・検査システムは自動的に閾値を測定できる機能を持ち,感覚障害の客観的,定量的評価を可能にした.2.本訓練・検査システムでは,閾値前後の刺激を頻回に与える訓練が可能である.3.本訓練・検査システムの閾値測定機能の評価を行った結果,閾値には再現性があり,十分な信頼性を持っていることが判明した.4.本訓練・検査システムによる感覚障害回復訓練を行った結果,閾値に改善傾向が見られた.今後の課題として,本訓練・検査システムによる一層の訓練効果を確認するために,長期の訓練を行い,症例数も拡大していく必要がある.また,本研究では,症例数ならびに検査対象者が少なかったことから,触覚障害の回復と振動覚障害の回復との関連性の有無について十分に確かめるだけの結果を得ることができなかった.しかし,これらに関しても触覚と振動覚の両方に麻痺がある患者に対して臨床試験を継続して行えば,関連性の有無も明らかにすることができると期待される.脳卒中患者などの中枢神経疾患による手指感覚障害はそれ自体ADL、QOLにとって重要であるばかりでなく、上肢の運動機能および能力の回復に大きく影響する。しかし、手指感覚障害を回復させるための系統立った治療手段の検討は非常に少ない。本研究では、主として手指の触覚と振動覚とを取り上げ、刺激レベルの識別訓練・検査システムの開発を行なう。本システムの特徴は、手指の感覚障害回復訓練の過程を記録して、これを定量的に評価する機能を実現することである。本年度は、システムのハードウエアーの製作と検査・訓練のためのソフトウエアーの構築に重点をおいた。(1)手指触覚刺激装置の製作触覚刺激用のSW知覚テスターA835-1から8種類のレベルの触針を選び、往復運動で刺激を与える装置を開発した。触針の交換はパソコンを使って自動的に行っている。(2)手指振動刺激装置の製作128Hzの周波数で、振幅を変化させて振動刺激を発生させる装置を、小型のバイブレーターを購入して作成した。(3)ソフトウエアーの構築刺激閾値(知覚できる最小レベルの刺激の強さ)を自動的に測定する方法を考案し、それをシステムに組み込んだ。検査および訓練のためのシーケンスを完成させた。(4)性能評価2回のテストにおける刺激閾値の測定値の相関係数が高く、閾値測定値の再現性、信頼性が十分高いことが判明した。次年度は本システムの臨床応用での治療成績の検討を行い、自然回復ではない積極的なリハビリテーション訓練による感覚障害改善の促進効果を確認して、新しい手指感覚障害の回復訓練療法の発展につなげたい。脳卒中患者などの中枢神経疾患による手指感覚障害は、それ自体ADL、QOLにとって重要であるばかりでなく、上肢の運動機能および運動能力の回復に大きく影響する。

本研究では、手指の触覚(表在感覚)と振動覚(深部感覚)を取り上げ、刺激識別訓練を頻回に繰り返すことができる訓練・検査システムの開発を行なった。本システムは、手指の感覚障害回復訓練の過程を記録して、これを定量的に評価する機能を持つところに特徴がある。訓練・検査システムは鹿児島大学病院霧島リハビリテーションセンターに設置して、訓練・検査内容の説明を行い、同意を得た健常者および患者に対して刺激識別訓練・検査を行い、以下の知見を得た。1.健常者および患者の手指感覚刺激識別測定と識別閾値の再現性確認本システムで自動的に得られる刺激識別閾値の再現性を評価するために、練習効果の除外を目的として24時間以上の期間を置いて、2回の検査を行った。2回の検査間の刺激識別閾値の相関は、接触覚では0.905、振動覚では0.784と高く、十分な再現性のあることが判明した。2.2週間の訓練の前後で検査を行った結果、訓練による刺激識別閾値の改善傾向が見られ、本訓練システムの有用性が確認された。3.本装置は、刺激識別閾値前後の感覚刺激を頻回に与えることができるので、効果的な訓練が期待できる。4.触覚訓練による振動覚刺激識別閾値の改善、逆に振動覚訓練による触覚刺激識別閾値の改善については興味ある課題であるが、判定できるだけの充分なデータが得られなかった。
人為的な細胞死誘導を通じたビャクダン培養細胞における心材成分の合成方法の確立

ビャクダン懸濁培養細胞に対して様々な細胞死誘導因子処理を行い、細胞及び培地の有機溶媒抽出成分の質的・量的変化を調べた。細胞死の進行に伴い、ビャクダン心材に特異的な芳香成分や関連化合物が生成されることを期待した。安定して細胞死を誘導し得る処理条件はいくつか見出されたものの、そのような処理条件のいずれにおいても、目的成分の生成は認められなかった。一部の処理条件では特異的に増加する物質が検出されたが、目的成分との関連はないと考えられた。前年度に引き続き、ビャクダン懸濁培養細胞に対して細胞死誘導因子処理を行うとともに、細胞及び培地の有機溶媒抽出成分の変化を調べた。これまでの実験により見出された細胞死誘導条件(シトシンアラビノシド、メナジオン及び塩化ナトリウムの添加、並びに高温処理)に加え、アフィディコリン(DNA合成阻害剤)、シクロヘキシミド(タンパク質合成阻害剤)、硫酸銅(酸化ストレス)、クロロホルム(酸化ストレス)処理を今年度新たに実施し、これらの処理によっても1週間程度で細胞死が誘導できることを明らかにした。また、細胞死は効率的に誘導できなかったものの、マンニトール(高浸透圧・乾燥ストレス)、ペクチナーゼ(細胞壁分解酵素:エリシター作用)処理による抽出成分の変化についても検討した。細胞を培地に懸濁させた状態で一定量回収して有機溶媒を加え、ホモジナイズ・遠心分離した後の上清を抽出物とした。前年度は作業環境と溶媒の毒性とを考慮して抽出溶媒としてペンタンを用いたが、抽出効率が悪かった。そこで今年度は、作業環境を改善するとともに抽出溶媒を酢酸エチルに変更した。抽出物はガスクロマトグラフィー(GC)により分析した。その結果、メナジオン及びシクロヘキシミド処理時の抽出物において、無処理時には見られない特徴的なピークがGCクロマトグラム上に認められた。これらのピークを与える物質について、ビャクダン心材油のGC分析結果と比較検討したが、ビャクダン心材油中の主要な成分とは一致しないことが分かった。添加した化合物の関連化合物(分解・代謝産物)であると推察されるが、物質の同定等の詳細な検討は行っていない。他の処理によっては、特異的な成分の増加は認められなかった。細胞死誘導処理に伴って発現する遺伝子の解析を実施する予定であったが、心材成分(芳香成分)の生成誘導条件を見出せなかったことから、実施していない。はじめに、ビャクダン胚由来の懸濁培養細胞に対して、動植物細胞において既知の各種細胞死誘導因子及びストレス因子を処理し、細胞死の誘導効果を検討した。これまでに、シトシンアラビノシド、メナジオン及び塩化ナトリウムの添加、並びに高温処理(45°C55°C)について、処理後1週間で大部分の細胞が死細胞と判定される条件を見出した。一方で、塩化ナトリウム添加以外の高浸透圧処理や低温処理によって細胞死を誘導する条件を見出すことはできなかった。研究実施計画に挙げた他のストレス因子についてはまだ検討していない。なお、細胞死の判定に際しては、3-(4,5-ジメチル-2-チアゾリル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)の還元活性を指標とした。細胞抽出成分については、細胞死の判定時(ストレス処理1週間後)に細胞と培地を合せて回収し、ペンタンを加えて全体をホモジナイズした後に遠心分離を行い、ペンタン相を回収・濃縮し、ガスクロマトグラフィー(GC)を用いて分析した。この方法による限りでは、細胞死に伴うビャクダン心材特異的成分の生成や、その他揮発性成分の質的・量的変動は認められなかった。揮発性の成分が配糖化されペンタン相に抽出されない可能性を考慮し、上記ペンタン抽出後の水相をグルコシダーゼ処理した後に改めてペンタン抽出してペンタン相をGC分析に供したが、細胞死に関連した変動は認められなかった。細胞死処理に伴う遺伝子発現の解析については、平成23年度は心材特異成分を含めた抽出成分の変動を誘導するストレス因子処理条件を見出すに至らなかったことから、実施していない。ビャクダンの培養細胞系を安定に維持するとともに、その細胞に対して人為的に細胞死を誘導し得るストレス処理条件をこれまでに複数見出すことができた。本研究を遂行するにあたり、もっとも基礎的な過程を確立することができ、初年度として最低限の目標は達成できたものと考えている。しかしながら、これまでに行った各種のストレス処理によっては、目的の心材特異的成分を含めた有機溶剤抽出成分の質的・量的な変動は全く認められなかった。心材特異的成分に限らず、ストレス処理に伴って量的に大きな変動を示す物質が抽出成分中に見出された場合には、その物質がいかなるものであるのかを確認する計画であったが、現状ではそのような段階に至っていない。