hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新規アポトーシス誘導分子の病原体による発現増強機構の解析

肝臓は免疫反応が収束する際、リンパ球の活性化後細胞死が起こる場所であり、それは免疫系の恒常性の維持や自己免疫からの回避に重要である。肝臓における活性化後細胞死の機序を検討するなかで、マウス肝細胞を一次培養した培養上清による、抗原刺激されたT細胞クローンならびにTリンパ腫細胞に対する増殖抑制作用を見い出した。生化学的検討では、この増殖抑制作用はカスパーゼ依存性のアポトーシス誘導によることが示された。このアポトーシス誘導作用は、トリプシン、70度の熱処理、pH5以下の酸性状態で失活したが、TNF-α、FasL、TGF-βなどに対する抗体で中和できなかった。培養上清から単離し純化したアポトーシス誘導分画は分子量68kDaの蛋白分子であった。これは、マウスT細胞、B細胞に、また弱いながらヒトのリンパ球にアポトーシスを誘導したが、マクロファージには誘導しなかった。以上より、マウス肝細胞から同定されたアポトーシス誘導蛋白は、リンパ球に選択的にアポトーシスを誘導し、肝臓における免疫抑制の機構の存在の可能性が示唆された。病原体感染とこの蛋白分子の産生の関連を調べるために、肝細胞をLPS、ペプチドグリカン、フラゲリンおよびCpGDNAなどで刺激し蛋白発現を検討した。しかし、いずれにおいてもアポトーシス誘導蛋白の発現変化を認めなかった。一方、日本住血吸虫卵特異的T細胞クローンにて、リンパ球の活性化とアポトーシス誘導活性の関連を調べた結果、活性化T細胞において感受性が亢進していた。以上より、感染症におけるアポトーシス誘導活性は、肝細胞におけるアポトーシス誘導蛋白の産生亢進より、むしろ抗原特異的に活性化されたリンパ球のアポトーシス誘導蛋白への感受性亢進が重要であると結論付けられた。マウス肝臓細胞由来のアポトーシス誘導因子の構造決定のため、マウス肝臓細胞の大量培養を行ない、いろいろなカラムクロマトグラフィーを組み合わせて精製し、銀染色により単一バンドとなる分子量68kDaの蛋白を得た。この蛋白は、活生化T細胞およびTリンパ腫細胞、Bリンパ腫細胞などリンパ系細胞に選択的にアポトーシスを誘導することが明らかとなった。マウス由来の蛋白であるが、程度は弱いながらヒトのリンパ系細胞にもアポトーシスを誘導することが明らかとなった。しかし、単球/マクロファージ系細胞にはアポトーシスを誘導できず、細胞選択性をもって作用することが示唆された。これらは次の雑誌にて報告した(Immunology, vol.108:116-122,2003)。今年度予定していたDNAレベルにおけるクローニングのため、精製蛋白の一次構造の一部を決定しようと試みたが、ポジティブな結果を得ることができなかった。理由として、糖鎖付加などの修飾を多分に受けている可能性が示唆され、再度精製を行なっておりアポトーシス誘導活性のあるいくつかの蛋白分子を分離精製することができているが、構造決定ならびにシークエンスの決定には種々の困難が予想される展開となってきている。なお、病原微生物の感染とこれに伴うアポトーシス誘導分子の発現増強については、種々の病原体菌体成分を用いることによってその効果を検討している。最後に、アポトーシス誘導のメカニズムについて、他の因子であるFasL、TRAILなどとの比較検討を行なっているが、カスパーゼ依存性であることにおいては共通であることが示された。以上をふまえ、来年度は先に示された分子量68kDaの蛋白を中心に、cDNAのクローニング・アミノ酸配列の決定、抗体の作製など残された問題について明らかにしていく予定である。

マウス肝臓細胞に由来するアポトーシス誘導分子を同定するため、マウス肝臓細胞の大量培養を行ない、種々のカラムクロマトグラフィーにてこのタンパク分子を精製し、SDS-PAGEおよび銀染色により単一バンドとなる分子量68kDaのタンパク分子を精製した。この蛋白は、マウスT細胞クローンおよびEL-4胸腺腫細胞、Bリンパ腫細胞などリンパ系細胞に選択的にアポトーシスを誘導した。またマウス由来のタンパク分子であるが、程度は弱いながらヒトのリンパ系細胞にもアポトーシスを誘導することが明らかとなった。しかし、単球/マクロファージ系細胞にはアポトーシスを誘導せず、リンパ球特異的に作用することが示された。この分子によるアポトーシス誘導のメカニズムについては、FasL、TRAILなどによるアポトーシス誘導機序と比較検討を行なったが、細胞表面のレセプターを介する可能性が高く、ミトコンドリア膜電位の低下を伴っている点、カスパーゼ依存性である点においてこれらと共通であることが示された。現在、アミノ酸分析に必要な純度と量のタンパクを精製し、その一次構造の一部を決定しよう試みている。タンパク分子精製の過程において、糖鎖付加などの修飾を多分に受けている可能性が示唆され、精製を繰り返すなかでアポトーシス誘導活性のあるいくつかの蛋白分子を分離精製することができており、アポトーシス誘導活性をもつ蛋白分子がヘテロな二量体などを形成している可能性が示唆された。今後さらに発展させ、DNAシークエンスの決定やアミノ酸配列の決定、抗体の作製など残された問題について明らかにしていく予定である。
APP代謝における糖鎖機能の解析

糖鎖はタンパク質の物理的性質や分子間の認識に影響する。老化などによる糖鎖変化はアミロイド前駆体タンパク質(APP)のプロセシングに影響する可能性がある。そこで、APP代謝における糖鎖変化の影響を検討した。アルツハイマー病(AD)脳におけるO型糖鎖の合成酵素であるGALNTファミリー遺伝子の発現解析から、GALNT6などいくつかのアイソザイムがADで増加することが明らかとなった。また、GALNT6によるAPPの特定の部位のO型糖鎖修飾がAβの産生を抑制することが明らかとなった。本研究により、糖鎖修飾がアルツハイマー病の病態に関わることが明らかとなった。我々はこれまでに、家族性アルツハイマー病に見られる変異型APPにおけるバイセクティングGlcNAc型糖鎖の増加とアルツハイマー病脳におけるバイセクティングGlcNAc合成酵素GnT-III遺伝子の発現増加を報告してきた。今年度、アルツハイマー病脳におけるバイセクティング型糖鎖について解析した結果、APPを切断しアミロイドβ(Aβ)を産生する酵素であるBACE1がバイセクティングGlcNAc型糖鎖修飾を受けること、アルツハイマー病脳でバイセクティングGlcNAc型糖鎖を持つBACE1が増加すること、が明らかとなった。さらに、GnT-IIIノックアウトマウス(GnT-IIIの欠損によりバイセクティングGlcNAcを合成できないマウス)では、Aβ蓄積の減少が認められた。これらの結果から、BACE1上のバイセクティングGlcNAc型糖鎖の増加がAβ蓄積の原因となることが明らかとなった。生体のタンパク質の多くは糖鎖を有しており、糖鎖はタンパク質の物理的性質や分子間の認識に大きく影響する。老化などによる細胞内代謝の変化は糖鎖修飾に影響してアミロイド前駆体タンパク質(APP)のプロセシングを変化させることが考えられる。我々はこれまでに、アルツハイマー病において糖鎖修飾がAPPの代謝に関わることを明らかにしてきた。糖タンパク質糖鎖にはアスパラギン(Asn)に結合するN型とセリンもしくはスレオニン(Ser/Thr)に結合するO型がある。タンパク質中のN型糖鎖の修飾位置はアミノ酸配列により決定されるが、O型糖鎖の修飾位置を決める仕組みはあまりわかっていない。また、O型糖鎖の構造解析はN型に比較して困難であり機能の解析もあまり進んでいない。主要なO型糖鎖であるムチン型糖鎖の合成開始酵素であるN-アセチルガラクトサミン転移酵素(ppGalNAcT, polypeptide GalNAc transferase)は約20種のアイソフォームが報告されているが、それらの機能や基質特異性の違いはあまりわかっていない。今年度、我々はアルツハイマー病患者と健常者の脳検体を用いてppGalNAcTファミリー遺伝子の発現解析を行い、アルツハイマー病の進行にともなっていくつかのppGalNAcTアイソフオームの発現が変化することを明らかにした。我々は東京都健康長寿医療センター高齢者ブレインバンク保管の検体を用いることで、実際のアルツハイマー病患者脳における糖鎖関連遺伝子の発現解析を行っている。今回ppGalNAcTに注目し、遺伝子の発現変化をより正確に解析するため、対照群(C)、早期アルツハイマー群(eAD)、アルツハイマー群(AD)の脳灰白質検体各10例を用意し、20種のppGalNAcT全てについて、定量的リアルタイムPCRにより解析し多群検定を行った。その結果、eADからADへの病態の進行に伴って有為に発現が増加するアイソフォーム、発現に全く変化の見られないアイソフォーム、eADでのみ増加するアイソフォームがあることがわかった。今回多数の検体を解析し、各アイソフィームと病態の関連性をより明らかに示すことができたことは、今後の生化学的アプローチの有益な情報となる。我々はこれまでに、糖鎖修飾がAPPの代謝に関わることを明らかにしてきた。主要なO型糖鎖であるO-GalNAc型(ムチン型)糖鎖の合成開始酵素であるN-アセチルガラクトサミン転移酵素(GALNT)は約20種のアイソフォームが報告されているが、それらの機能や基質特異性の違いはあまりわかっていない。作年度、我々はアルツハイマー病患者と健常者の脳検体を用いてGALNTファミリー遺伝子の発現解析を行い、アルツハイマー病の進行にともなっていくつかのアイソフオームの発現が変化することを明らかにした。今年度は、アルツハイマー病患者で有意に増加するGALNT6とAPP代謝との関係について検討した。培養細胞にGALNT6とAPPを共に強制発現させたところ、アミロイドβ(Aβ)の産生量が減少した。このとき、sAPPβの産生量は減少し、sAPPαの産生量は増加していたことから、Aβ産生量の減少は、APPのβ切断の抑制とα切断の促進によることが明らかとなった。一方、APP代謝に関わる各セクレターゼの発現量や活性には有意な差は認められなかった。APPのアミノ酸配列由来ペプチドを基質に用いたGALNT6活性測定実験から、APP切断部位近傍の特定のThrに対する過剰なO型糖鎖修飾がAPPの代謝に影響することが示唆された。

本研究により、GALNT6によるO型糖鎖修飾はAβ産生を抑制し、アルツハイマー病に対して防御的な役割を果たしている可能性が考えられた。糖鎖はタンパク質の物理的性質や分子間の認識に影響する。老化などによる糖鎖変化はアミロイド前駆体タンパク質(APP)のプロセシングに影響する可能性がある。そこで、APP代謝における糖鎖変化の影響を検討した。アルツハイマー病(AD)脳におけるO型糖鎖の合成酵素であるGALNTファミリー遺伝子の発現解析から、GALNT6などいくつかのアイソザイムがADで増加することが明らかとなった。また、GALNT6によるAPPの特定の部位のO型糖鎖修飾がAβの産生を抑制することが明らかとなった。本研究により、糖鎖修飾がアルツハイマー病の病態に関わることが明らかとなった。アルツハイマー病脳の解析から、GnT-III遺伝子の増加によりBACE1の糖鎖がバイセクティングGlcNAc型に変化することが明らかになった点。さらに、GnT-III欠損マウスにおいてAβの蓄積が減少することが示された点。これらの結果から、我々が以前に報告した、アルツハイマー病脳におけるGnT-III遺伝子の増加の意義について明らかにすることができた。さらに、BACE1におけるバイセクティングGlcNAc型糖鎖の増加がアルツハイマー病の発症や進行に密接に関わることを示すことができ、病態の一側面の解明に貢献できた。本研究成果は、GnT-IIIの活性阻害などにより、バイセクティングGlcNAc型糖鎖修飾の量を制御することで、アルツハイマー病の予防や治療に応用できる可能性を示すものである。アルツハイマー病患者の脳におけるppGalNAcTファミリー遺伝子変化が明らかになったことから、培養細胞を用いて各アイソフォームを強制発現しAβ産生への影響を調べる。APPあるいはセクレターゼを共発現し、各アイソフォームによるAPPやセクレターゼのO型糖鎖修飾を比較解析する。ppGalNAcTファミリーにはアイソフォーム特異的な標的タンパク質の存在が想定されるので、これらの実験によりAPPを標的とするアイソフォーム、セクレターゼを標的とするアイソフォームが明らかにできる。さらに、アイソフォーム間の協働作用などが報告されている。そこで、各アイソフォームの単独発現に加えて、複数のアイソフォームを組み合わせて発現させることでさらなる情報が得られる生化学GnT-IIIに関する我々のこれまでの知見では、神経系培養細胞におけるGnT-IIIの過剰発現ではAβの産生量は減少することを報告しており、今回報告したGnT-III欠損マウスの結果と矛盾する。その要因として、培養細胞での強制発現系ではGnT-III活性が非常に高く、広範なタンパク質が高度にバイセクティングGlcNAc化されているため、他のタンパク質の糖鎖変化の影響が関与するためと考えられる。したがって、実際のアルツハイマー病脳では、BACE1などのGnT-IIIに親和性の高いタンパク質からバイセクティングGlcNAc化されることが病態に関わる可能性が考えられる。
鳥類卵管のグレリン産生制御による胚子発育促進戦略

私達はニワトリの卵に母性グレリンが移行して胚の発達の調節に関与する可能性を追究している。これまでに,(1)グレリンは卵管と卵胞【顆粒層でも産生されて卵内に入り,その濃度は卵白より卵黄で高いこと,(2)卵黄と卵白のグレリン濃度は艀卵5日まで変化しないこと,(3)初期胚にグレリン受容体遺伝子が発現することを示した。(3)グレリンが胚の発達に関与する可能性を検討するために,グレリン受容体(GHS-Rla)のアンタゴニストであるD-Lys^3-GHSR6または抗グレリン受容体抗体を孵卵前の受精卵の卵黄または卵白中に投与して,胚発達を形態学的に評価したが,有意な影響は認められなかった。本年度は,受精卵や胚細胞にグレリンを作用させて,胚発達やが胚細胞の増殖に及ぼす影響を解析した。孵卵前の受精卵にグレリンを投与し,孵化後のヒナの形態,神経や内臓の組織,行動(神経機能に及ぼす影響)を解析したが,有意な影響は認められなかった。これらのヒナのグレリン産生機能と感受性への影響を解析するために,腺胃においてグレリンおよびその受容体の免疫染色を行ったが,陽性細胞の出現に影響は無かった。一方,胚細胞を採取して培養し,卵内のグレリンが存在しない条件で,グレリンが細胞増殖に及ぼす影響を解析した。その結果,グレリンは胚細胞の増殖を有意に促進することが明らかとなった。このことから,鳥類では母性グレリンが卵へ移行し,胚細胞の増殖を調節することにより,胚の発達にに関与する可能性が示唆された。グレリンは成長ホルモンの分泌を促進する内因性リガンドとして発見された。主な分泌器官は消化管であるが,私達は,ウズラの卵管膨大部でグレリンが産生されることを見出した。このことは,卵管内で卵が形成される間に,卵白中にグレリンが分泌される可能性を示しており,卵白にグレリンが含まれるならば,受精卵において,これが胚子の発達に関与する可能性がある。これを検討するために,卵白におけるグレリンの存在を示し,胚におけるグレリン受容体(GHSR)の発現を解析した。受精卵を孵卵し,孵卵0,2,4,6,8および10日目に卵白を採取して,時間分解蛍光免疫測定法でグレリン濃度を測定した。孵卵4,6,8および10日目胚を採取し,各胚のGHSRの発現を免疫組織化学およびRT-PCT法で解析した。孵卵前および孵卵10日目までの受精卵の卵白中にグレリンが検出された。このグレリン濃度は,孵卵2日目までは0.1ng/ml程度で,4日目には半減する傾向を示した。4日から10日目の胚においてGHSRの分布を免疫組織化学的に検索したところ,すべての胚で,表皮にGHSR陽性反応が認められ,この染色性は6日目に比較的強く,10日目では弱まる傾向があった。脳の上皮にもGHSR陽性反応が検出され,脊髄の一部でも陽性反応が認められた。RT-PCR法でGHSRのmRNA発現を検証したところ,4日目から10日目までのすべての胚で発現が認められた。以上の結果から,ニワトリ受精卵の卵白中にグレリンが存在し,胚は4日目にはGHSRを発現することが明らかとなった。このため,卵白のグレリンは,胚子を刺激してその発達の調節に関わる可能性が推定されるので,それを実証する必要がある。私達はニワトリの卵管でグレリンが産生されることを見出して,昨年度までに,卵白にグレリンが検出されることを明らかにした。本年度は本研究は,孵卵4日目までの受精卵に重点をおいて,胚の発育におけるグレリンの役割を検討した。このために,(1)孵卵前から4日目までの胚におけるグレリンおよびその受容体遺伝子と蛋白質の発現,(2)受精卵へのグレリン阻害剤の投与が胚子発達に及ぼす影響を解析した。その結果次のことが明らかとなった。(1)受精卵の卵白だけでなく卵黄にもグレリンが存在するかと解析したところ,グレリンは卵黄にも存在し,その濃度は卵白より濃いことが明らかとなった。卵巣で産生されるものと考えられたので,卵胞壁のグレリンを免疫組織学的に検索したところ,顆粒層に存在することが明らかとなった。卵黄と卵白のグレリン濃度は孵卵5日まで変化しないことが示された。(2)初期胚に受容体が発現するかをRT-PCR法で解析したところ,孵卵前と1日後に強い発現が認められ,その後に減少した。免疫組織学的にはこの受容体は検出されなかったが,遺伝子発現を示したので,受容体は発現するものと推定された。(3)グレリンが胚の発達に関与する可能性を検討するために,グレリン受容体(GHS-Rla)のアンタゴニストであるD-Lys^3-GHSR6または抗グレリン受容体抗体を孵卵前の受精卵の卵黄または卵白中に投与して,胚発達を形態学的に評価した。処理卵の胚を5日目または15日目に剖検ならびに組織学的に解析したが,胚の異常な発達は認められなかった。胚細胞による阻害剤の取り込みまたは抗体による受容体の中和がなされたかを含めた今後の検討が必要である。

私達はニワトリの卵に母性グレリンが移行して胚の発達の調節に関与する可能性を追究している。これまでに,(1)グレリンは卵管と卵胞【顆粒層でも産生されて卵内に入り,その濃度は卵白より卵黄で高いこと,(2)卵黄と卵白のグレリン濃度は艀卵5日まで変化しないこと,(3)初期胚にグレリン受容体遺伝子が発現することを示した。(3)グレリンが胚の発達に関与する可能性を検討するために,グレリン受容体(GHS-Rla)のアンタゴニストであるD-Lys^3-GHSR6または抗グレリン受容体抗体を孵卵前の受精卵の卵黄または卵白中に投与して,胚発達を形態学的に評価したが,有意な影響は認められなかった。本年度は,受精卵や胚細胞にグレリンを作用させて,胚発達やが胚細胞の増殖に及ぼす影響を解析した。孵卵前の受精卵にグレリンを投与し,孵化後のヒナの形態,神経や内臓の組織,行動(神経機能に及ぼす影響)を解析したが,有意な影響は認められなかった。これらのヒナのグレリン産生機能と感受性への影響を解析するために,腺胃においてグレリンおよびその受容体の免疫染色を行ったが,陽性細胞の出現に影響は無かった。一方,胚細胞を採取して培養し,卵内のグレリンが存在しない条件で,グレリンが細胞増殖に及ぼす影響を解析した。その結果,グレリンは胚細胞の増殖を有意に促進することが明らかとなった。このことから,鳥類では母性グレリンが卵へ移行し,胚細胞の増殖を調節することにより,胚の発達にに関与する可能性が示唆された。
ウサギにおける生殖工学基盤技術の確立

平成30年度は、体外受精のための条件検討を行った。若齢(12ー14週齢)および成熟(20ー23週齢)ウサギから採取した卵子に成熟雄から精子を採取し、BOメディウムもしくはHTFメディウムを基礎とした修正メディウムで前培養した精子を媒精し、翌日に分割した卵子を受精卵として受精率を算出した。これまでの成績では、媒精24時間後の卵子の分割率は成熟ウサギ由来卵子で63.8%、若齢ウサギ由来卵子で42.2%であった(1実験群で188259個の卵子を使用)。さらに144時間培養後の胚盤胞への発生率は、成熟ウサギ由来卵子で17.6%、若齢ウサギ由来卵子で4.2%であった。体外受精の検討においては、前培養時間の検討やこれまで他の動物種において報告のある様々な薬剤の精子前培養用メディウムへの添加を試みたが、有意な改善効果は確認できず、現時点の体外受精の条件では実用的な成績とは言えない。今後もさらなる条件確立のための検討が必要であると考えられた。また、体外受精の成績も成熟ウサギに比較して若齢ウサギにおいて低い傾向が観察されたことから、過排卵処置に用いるホルモンの比較(妊馬血清性ゴナドトロピンと卵胞刺激ホルモン、今回の検討では前者を使用)や、顕微授精による受精率・胚発生率、さらには人工授精後の回収卵子数・受精卵子数による評価を追加するなど、若齢ウサギ由来の卵子の質の評価については、複数の実験系による、より正確な評価を行う必要があると考えられた。体外受精の条件検討の確立が計画通り進んでいない。条件検討については、試行錯誤での検討となることから計画通りに進まないことが想定されるが、好条件を見出すことが当初の想定よりも困難であり、さらに時間を要すると考えられる。また、体外受精による卵子の質の評価で、未成熟ウサギ由来卵子が成熟ウサギ由来卵子よりも成績が低い傾向が見られたことから、さらに追加実験を行い複数の評価法を用いて、より正確に評価する必要性が生じたため。体外受精による成績が低いことから、さらなる条件検討を継続し、成績向上を目指す。また、平成30年度に行った体外受精の実験で、若齢ウサギにおいて、体外受精後の受精率および発生率が成熟ウサギに比較して低い傾向が観察されていることから、過排卵に用いるホルモンの比較や、顕微授精ならびに人工授精後の受精率あるいは受精胚の回収の実験も追加し、若齢ウサギ由来の卵子の質について複数の実験系による評価を行う。さらに、内視鏡を用いた胚移植技術の確立に関する検討も進める。ヒト関節用内視鏡システムを使用し、麻酔下で腹腔内に内視鏡を挿入、経チューブ的に胚を卵管采から移植する手順を確立し、従来法(開腹手術)と内視鏡を用いた胚移植法間で、胚移植後の妊娠率、産子数を比較検討する。若齢ウサギにおける過排卵誘起の条件検討を行った。まず、妊馬血清性性腺刺激ホルモン(PMSG)投与による週齢の影響を確認した。8-20週齢のJWウサギにPMSGを投与して過排卵を誘起し、PMSG投与日を1日目として4日目もしくは5日目にヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)を投与して排卵を誘起した。翌日、卵管灌流により未受精卵を回収し、回収卵子数を計測した。その結果、12ー14週齢時が最も回収卵子数が多く、一匹当たりの平均卵子数は約100個(最大236個)であった。これは、通常過排卵処置を行う20週齢以降(平均約30個)に比べ約3倍の回収数であった。また、hCGの投与の時期による影響ついて、13-14週齢時でPMSG投与後4日目と5日目を比較したところ、PMSG投与5日目の回収卵子数がやや多い傾向が観察されたが、統計学的に有意な差は認められなかった。卵子の形態観察では、10-14週齢(未性成熟)と20週齢(性成熟後)から回収した卵子で特に形態的な差は認められず、いずれも1個の極体も観察されることから成熟卵子の状態であると思われた。次に、未成熟ウサギから回収した卵子の受精能を確認するため、体外受精を行った。成熟雄から精子を採取し、BOメディウムで約13時間の前培養後に12ー14週齢および20ー23週齢のウサギから採取した卵子と媒精し、翌日に分割した卵子を受精卵として受精率を算出した。その結果、現在のところ、約5ー7割の受精率が得られている。今後、さらに体外受精の条件を検討し、例数を増やして検討を進める予定である。当初の計画通りに進行しており、成果も得られている。今のところ問題となることは生じていない。これまでの成績では、媒精24時間後の卵子の分割率は成熟ウサギ由来卵子で63.8%、若齢ウサギ

由来卵子で42.2%であった(1実験群で188259個の卵子を使用)。さらに144時間培養後の胚盤胞への発生率は、成熟ウサギ由来卵子で17.6%、若齢ウサギ由来卵子で4.2%であった。体外受精の検討においては、前培養時間の検討やこれまで他の動物種において報告のある様々な薬剤の精子前培養用メディウムへの添加を試みたが、有意な改善効果は確認できず、現時点の体外受精の条件では実用的な成績とは言えない。今後もさらなる条件確立のための検討が必要であると考えられた。また、体外受精の成績も成熟ウサギに比較して若齢ウサギにおいて低い傾向が観察されたことから、過排卵処置に用いるホルモンの比較(妊馬血清性ゴナドトロピンと卵胞刺激ホルモン、今回の検討では前者を使用)や、顕微授精による受精率・胚発生率、さらには人工授精後の回収卵子数・受精卵子数による評価を追加するなど、若齢ウサギ由来の卵子の質の評価については、複数の実験系による、より正確な評価を行う必要があると考えられた。体外受精の条件検討の確立が計画通り進んでいない。条件検討については、試行錯誤での検討となることから計画通りに進まないことが想定されるが、好条件を見出すことが当初の想定よりも困難であり、さらに時間を要すると考えられる。また、体外受精による卵子の質の評価で、未成熟ウサギ由来卵子が成熟ウサギ由来卵子よりも成績が低い傾向が見られたことから、さらに追加実験を行い複数の評価法を用いて、より正確に評価する必要性が生じたため。H29年度に引き続き、若齢ウサギにおける過排卵誘起の条件検討、若齢ウサギから得られた未受精卵の体外受精の条件検討を実施し、H30年度中にこれらの検討を完了させる。完了次第、内視鏡を用いた胚移植技術の確立に関する検討を開始する。ヒト関節用内視鏡システムを使用し、麻酔下で腹腔内に内視鏡を挿入、経チューブ的に胚を卵管采から移植する手順を確立し、従来法(開腹手術)と内視鏡を用いた胚移植法間で、胚移植後の妊娠率、産子数を比較検討する。予定以上に検討が進んだ場合、すでに系統維持・保存のため保管されている凍結精子の効率的な利用を考えて、凍結精子を用いた体外受精の条件についても検討を実施したい。また、体外受精後の初期胚での凍結成績の向上についても検討を行いたい。これには、我々がウサギで確立した超急速凍結法(論文投稿準備中)の応用を試みる予定である。体外受精による成績が低いことから、さらなる条件検討を継続し、成績向上を目指す。また、平成30年度に行った体外受精の実験で、若齢ウサギにおいて、体外受精後の受精率および発生率が成熟ウサギに比較して低い傾向が観察されていることから、過排卵に用いるホルモンの比較や、顕微授精ならびに人工授精後の受精率あるいは受精胚の回収の実験も追加し、若齢ウサギ由来の卵子の質について複数の実験系による評価を行う。さらに、内視鏡を用いた胚移植技術の確立に関する検討も進める。定価からの差額等による少額の端数が生じた。少額であることから、無理に調整せず、次年度助成金と合わせ計画通り執行を行う予定である。
カンジダの細胞壁合成酵素阻害薬に対する薬剤耐性機構の解析

近年、日和見真菌症患者から抗真菌薬耐性株が頻繁に分離されているが、新規の抗真菌薬である細胞壁β-グルカン合成酵素阻害薬(ミカファンギン;MCFG)に対する耐性機構については十分に検討されていない。そこでMCFG耐性機構を明らかにするために、日和見真菌症の原因菌として一般的なCandida albicansを用いて、MCFG感受性株を親株とするMCFG特異的耐性株を分離し、MCFGの標的酵素であるβ-グルカン合成酵素をコードする遺伝子(GSC1)の変異がMCFG耐性に関与にしているかどうか検討した。1.MCFG耐性株を複数分離し、それらのGSC1の塩基配列を解析した。その結果、片方のアレルにおいてF641C、S645FまたはR1361Sのいずれか1箇所のアミノ酸変異が認められた。2.耐性株において変異アレル(耐性アレル)または変異のないアレル(感受性アレル)をそれぞれ破壊し、作製した各破壊株のMCFG感受性を検討した。その結果、耐性アレルのみ有する株は親株である耐性株よりもさらに高度耐性を示し、一方感受性アレルのみ有する株は感受性を示した。3.プラスミドベクターを用いて耐性アレルを感受性株に、または感受性アレルを耐性株に導入して発現させ、MCFG感受性を検討した。その結果、ベクラターのみを導入した対照株と比較して、耐性アレルを導入した親株では感受性に明らかな差がみられなかったが、感受性アレルを導入した耐性株では顕著な感受性化が認められた。以上のことから、GSC1の変異はMCFG耐性に関与しており、これによりC.albicansはMCFGに耐性化することが分かった。また、耐性に関与するアミノ酸変異が起こる箇所は数箇所あり、それらのいずれが1箇所のアミノ酸変異により耐性が生じると考えられた。
作物に対する高濃度二酸化炭素とオゾンの単独および複合影響に関する研究

O_3区で育成したダイズの個体葉面積は、いずれのサンプリング時においても、対照区に比べて有意に小さかった。また、O_3区の個体乾重量は、22日目においては、対照区に比べて有意な差はなかったが、48日目および61日目では有意に低かった。O_3暴露によってダイズの純光合成速度や下位葉のクロロフィル濃度が低下したが、種子の品質には大きな影響は認められなかった。高CO_2区で育成したダイズの個体葉面積は、22日目においては対照区に比べて有意な差はなかったが、48日目および61日目では有意に大きかった。また、いずれのサンプリング時においても、高CO_2区で育成したダイズの個体乾重量は、対照区に比べて有意に高かった。高濃度CO_2条件下では、ダイズの純光合成速度が増加した。高CO_2+O_3区で育成したダイズの個体葉面積は、22日目においては対照区に比べて有意な差はなく、48日目および61日目では有意に大きかった。また、高CO_2+O_3区の個体乾重量は、22日目においては対照区に比べて有意な差は無く、高CO_2区に比べて有意に小さかった。しかしながら、48日目および61日目においては対照区に比べて有意に大きく、高CO_2区とは有意な差は認められなかった。また、55日目にガス交換速度を葉位別に測定した結果、高CO_2+O_3区の第10葉と第11葉の純光合成速度は高CO_2区のそれらに比べて増加した。この時、高CO_2+O_3区の第10葉以上の葉では、高CO_2区に比べて、気孔コンダクタンス、葉面積およびN含量が増加した。これらの結果より、高CO_2+O_3区のダイズでは、育成中期以降に出現した葉の面積を拡大し、光合成を活発に行うことにより、個体当たりのO_3による乾物生産効率や乾物生長の低下を補償したことが考えられる。O_3で育成したダイズの個体葉面積は、いずれのサンプリング時においても、対照区に比べて有意に小さかった。また、O_3区の個体乾重量は、播種後22日目においては対照区に比べて有意な差はなかったが、48日目および61日目では有意に低かった。高CO_2+O_3区で育成したダイズの個体葉面積は、20日目においては対照区に比べて有意な差はなく、48日目および61日目では有意に大きかった。また、高CO_2+O_3区の個体乾重量は、22日目においては対照区に比べて有意な差は無く、高CO_2に比べて有意に小さかった。しかしながら、48日目および61日目においては対照区に比べて有意に大きく、高CO_2区とは有意な差が認められなかった。これらの結果より、高濃度CO_2条件下で育成したダイズの葉面積および乾物成長におけるO_3感受性は、生育時期によって異なり、比較的初期の段階では高いが、それ以降は低下することが明らかになった。
大脳新皮質のペプチド含有非錐体細胞の生理的・形態的特徴の解明

今までに、大脳皮質のGABA作働性非錐体細胞は、生理的に次の4種類に分けられることを見つけた。(1)Fast-spiking(FS)cell,(2)Late-spiking(LS)cell,(3)Regular-spiking nonpyramidalcell(RSNP)cell,(4)Burst-spiking nonpyramidalcell(BSNP)cell。また、大脳皮質の非錐体細胞は、化学的には、主に次の3種類に分けられることも見つけた。(1)カルシウム結合蛋白質parvalbuminを発現している細胞、(2)ペプチドのsomatostatinを持つ細胞、(3)ペプチドのvasoactive intestinal polypeptide(VIP)を持つ細胞。本研究では、これらの非錐体細胞の生理的サブタイプと化学的サブタイプの関係を調べた。その結果、生理的サブタイプと化学的サブタイプの間には、ある程度の相関があることと、化学的サブタイプにはそれぞれ形態的特徴があることがわかった。FS cellはparvalbuminを発現し、形態的にはextended plexus cellかchandeliercellであった。ペプチドのsomatostatinやVIPは、RSNP cellまたはBSNPcellに発現していた。somatostatinを持つのは、主に、1層にまで上がって行く軸策を持つMartinotti cellであった。一方、VIPを持つのは、double bouquet cellであり、一部はカルシウム結合蛋白質calretininも発現していた。LS cellは、parvalbumin、somatostatin、VIPのいずれも発現せず、形態的にはneurogliaform cellであった。
新動作モードに対応した赤外線アレイ検出器の開発

JASMIN計画は高精度位置天文測定のための赤外位置天文衛星(Japanese Astrometry Satellite Mission for INfrared Exploration)である。本研究の目的はJASMINEに必要な赤外線アレイ検出器を1開発し、実用化のための道筋を明らかにすることである。JASMINEでは広大な視野を埋め尽くす赤外1線に感度を持つ2次元のアレイ検出器が必要である。またサーベイを効率良く行うためには、TDI(Time Delay Integration)モードという電荷を転送しながら、同時に蓄積する手法が極めて有効であることが確認されている。JASMINEのために、必要な検出きは28000ピクセル×28000ピクセルの広大な領域を埋め尽くすことができ、赤外線に感度を持ち、さらにTDIモードでの動作が可能な2次元検出器である。さらに、天文観測のため検出効率が高く、雑音レベルの低い高性能な検出器である必要がある。2つの方向で新しい動作モードに対応する赤外線に感度をもつ検出器の検討を進めた。第一の方法は、HgCdTe(水銀カドミウムテルルの三元合金)を用いた、赤外線アレイ検出器をTDIモードに対応させる方法。第二の方法はCCDの赤外線感度の向上を試みることである。第一の方法ではおよそ2ミクロン波長帯のK-bandが観測波長帯となり、第二の方法ではおよそ0.9ミクロンのz-bandが観測波長帯となる。検討の結果、JASMINEには第二の方法を採用することとした。シミュレーションにより0.9ミクロンという短い波長域での観測でも、銀河構造解明のために必要な星数が確保できる見通しがたったこと、検出器製造コストがHgCdTeよりはるかに安価に抑えることができること、より安定した性能が得られることなどによる。そこですばるグループに合同して完全空乏型CCDの開発を進めるとともに、衛星搭載を念頭に置いたオンポードデータ処理システムを開発し、これを小型衛星に搭載し実宇宙空間で性能の実証を行うための基礎システムを構築した。JASMINE計画は近赤外線におけるアストロメトリ観測を衛星を用いて行う計画で、銀河系内、特に銀河面、バルジなどのサーベイを行い、数億個の星の位置、距離、固有運動を今までにない高精度で測定することを目的とる。星の位置、年周視差、1年あたりの固有運動などを15等級の星に対して10万分の1秒角を実現することが最終目標である。可視波長域でのサーベイ観測では望遠鏡を一定の速度で掃天しながらCCD蓄積された電荷を同じ速度で転送し、同時に積分も行うTDIモードの観測が極めて有効である事が知られている。視野を変更し、積分を始めるなどの不要な作業を必要しないため観測の効率が非常に良いこと、一つの天体の画像はCCD一列の画素を喪散ることにより感度が平均化され較正の精度が極めて高くなることなどTDIモードによるサーベイ観測には利点多い。そこで本研究では、JASMINE計画のための新方式赤外アレイ検出器の開発を目指して作業進めた。今年度は第一年度として、試作アレイ装置の評価システムの構築、すなわち、汎用CCD読み出し装置、アレイ素子冷却装置などを整備し、今後試作される素子評価のための機器整備を行った。これらの作業と平行して、TDI動作が可能な赤外アレイ素子の構造についての検討・調査を行った。赤外素子としては感度波長域量子効率などから、やはり水銀カドミウムテルライドが最適であることを確認した。

またこれをTDIモードで動作させる方法として、CCDタイプの読み出し装置とインジウムバンプとして結合することで新アレイ素子を構成する方法と、従来の直接読み出し方式を用いながら、蓄積用の積分セルを設けることで、TDIモードでの動作をさせることが可能であることがあきらかとなった。この方式の利点は比べて製造コストが安くできることがある。今後これら2つの方式の実現の可能性の検討と試作素子製作の実現を目指していく予定である。JASMINE計画は近赤外線におけるアストロメトリ観測を衛星を用いて行う計画で、銀河系内、特に銀河面、バルジなどのサーベイを行い、極めて多数の星(数億個)の星の位置、距離、固有運動を今までにない高精度で測定することを目的とする。星の位置、年周視差、1年あたりの固有運動などを15等級の星に対して10万分の1秒角を実現することが最終目標である。可視波長域でのサーベイ観測では望遠鏡を一定の速度で掃天しながらCCDに蓄積された電荷を同じ速度で転送し、同時に積分も行うTDIモードの観測が極めて有効である事が知られている。視野を変更し、積分を始めるなどの不要な作業を必要しないため観測の効率が非常に良いこと、一つの天体の画像はCCD一列の画素を喪散ることにより感度が平均化され較正の精度が極めて高くなることなどTDIモードによるサーベイ観測には利点多い。そこで本研究では、JASMINE計画のための新方式赤外アレイ検出器の開発を目指して作業を進めた。今年度はHgCdTeを用いた赤外線アレイ検出器のCCD化の検討を行い、これとは異なった可能性であるSiを用いたCCDの赤外域の高感度素子の開発、そして、衛星搭載を視野に入れたデータ取得制御システムの開発を行った。HgCdTeを用いた赤外線アレイ検出器のCCD化については数少ない赤外アレイメーカーのひとつである、Raytheon社のKen Ando氏を招いて、これの実現の可能性を検討した。いくつかの問題はあるものの実現の可能性は充分あるが、最大の問題は価格であることが鮮明となった。赤外線アレイの価格は材料としてのHgCdが高価であることによるためで、今後技術的な対策で価格が下がることはあまり期待できないことが明らかとなった。一方、可視CCDの改良版であるfull depletion CCDの開発を進め、小規模サンプルながら期待される感度が得られることが確認されている。まだ実用化するには暗電流が多いなどの問題点があるが、さらに裏面照射型の試作などを経て大型化に進める予定である。データ取得のためのオンボード基板の試作を行った。汎用CCDを用いて動作試験を行い、アレイ素子の評価を行うとともに、試験結果を踏まえて今後実機システムの開発を進める。JASMINE計画のための新方式赤外アレイ検出器の開発をおこない、これを実用化するための試験開発を行うことが本研究の主たる目的である。昨年度はJASMINE計画で必要とする量産を前提とした試作品を設計製作し、衛星搭載を前提とした評価を行い、新方式赤外アレイ検出器の実用化を目指した。一昨年度に開発を行った衛星搭載用試作CCD制御ボードを用いて、CCDの動作試験システムの評価等を行った。
マルチモーダルイメージングによる小動物生体機能定量評価システムの開発

本研究ではマルチモーダルマウス無麻酔測定用固定装置を開発し,蛍光イメージングと陽電子放出断層撮影(PET)を行って麻酔によるトレーサーの動態変化を評価した.固定装置は,マウス頭蓋骨に固定する固定用プレートおよび固定用フォルダで構成した.開発した固定装置を用い,PETと蛍光イメージングでグルコースアナログの動態変化をマウスで評価した.その結果,無麻酔時に比して麻酔時は脳における取り込みが減少し,その変化は蛍光イメージングの方が大きかった.これは,脳血流の変化やトレーサーの違い等が原因と考えられた.イメージングデバイスにより麻酔の影響の現れ方が異なるため,評価の際に十分留意すべきである.昨年度に開発した無麻酔測定用固定デバイスを用いたイメージング実験を行い,固定用デバイス自体のいくつかの問題点を発見した.これらの問題点は手術手技の困難さおよびマウスの生活環境の悪化をもたらしていたため,早急な対処が必要となった.そのために,本年度はこのデバイスの改良に注力した.結果として,マウス頭蓋骨頭頂部に固定するアタッチメントは従来通り板状であるが,形状をマウスの頭部に沿うように変更すると共にどの方向からでもピンセット等で確実に確保できるようなホールを配置したものとなった.これにあわせて,アタッチメントを固定するデバイス側の形状変更を行うと共に,マウスの空間を最大限確保した.これらにより,手術手技が比較的容易になったとともに,マウス固定時の操作が楽になった.またアタッチメントによりマウスの視界が遮られることがなくなったために生活環境は向上したと考えられた.この形状を変更したデバイスを用いて18F-FDGの脳内分布の評価を行ったが,従来のデバイスと比較してSUV値において有意差がないことがわかった.また,吸収補正および散乱補正については,従来と同様に吸収補正は必要であるが散乱補正は必要ないことが示唆された.これにより,本改良によるPET/CTイメージングへの影響がないことが示された.また,本デバイスを用いて麻酔を行った状態で,MR画像の取得を試みた.マウス頭部用表面コイルを用いると,頭頂部の信号が減衰してしまい腹背方向の感度ムラが非常に大きいことがわかった.これは,アタッチメントの存在で特の頭頂部がコイルと離れてしまい,このために感度ムラが生じたことが示唆された.そのために,本デバイスを用いる場合は表面コイルの形状が平面であるデュアルチューンコイルを用いるべきであると考えられた.本年度は,作成したマルチモーダル対応マウス無麻酔固定装置を用いて,マウスの脳を対象として蛍光イメージング(BLI)および陽電子放出断層撮影(PET)を吸入麻酔下および無麻酔下で行い,脳におけるグルコース類似物質の取り込みの違いを測定した.マウスは雄のICR 5匹を用い,5週齢時に無麻酔固定装置の取り付け手術を施行した.6週齢以降でBLIおよびPET測定を麻酔および無麻酔で行い,BLI同士およびPET同士の測定間隔は3日および2日以上設けた.最低6時間の絶食後,BLIではXenoLight Rediject 2-DG-750 probeを60-80μL,PETでは18F-FDGを約10MBq尾静脈より静脈投与し,BLIは30, 60および90分後,PETでは50分後から10分間測定した.吸入麻酔にはイソフルランを使用した.使用装置は,BLIにはCaliper社製IVIS imaging system, PETにはSiemens社製Inveon PET/SPECT/CTを用いた.画像処理および解析処理はLiving ImageおよびIAW viewerを用いて行い,大脳および小脳における2DGおよびFDGの蓄積量を投与量との比として求めた.PETでは麻酔時に比して非麻酔時は大脳で約78%,小脳で85%の集積となった.BLIにおいては大脳で約35%,小脳で約40%にまで集積が低下した.これらの結果は,麻酔薬が脳における糖代謝に非常に大きな影響を与え,イメージングデバイスによってその評価に大きな差があることが示された.本研究により,動物実験においては麻酔薬の影響が無視できないほど大きい事が示唆された.これは,動態や薬効評価を行う際に麻酔薬の影響を考慮する必要があることを示すと共に,ヒト投与に近い状態を創り出すためには無麻酔測定システムが必須であることを示唆するものであった.本研究ではマルチモーダルマウス無麻酔測定用固定装置を開発し,蛍光イメージングと陽電子放出断層撮影(PET)を行って麻酔によるトレーサーの動態変化を評価した.固定装置は,マウス頭蓋骨に固定する固定用プレートおよび固定用フォルダで構成した.開発した固定装置を用い,PETと蛍光イメージングでグルコースアナログの動態変化をマウスで評価した.その結果,無麻酔時に比して麻酔時は脳における取り込みが減少し,その変化は蛍光イメージングの方が大きかった.これは,脳血流の変化やトレーサーの違い等が原因と考えられた.イメージングデバイスにより麻酔の影響の現れ方が異なるため,評価の際に十分留意すべきである.本年度は,マウスの脳を無麻酔測定可能なアタッチメントとそれを固定するデバイスの開発を行うと共に,小動物用PET/CT装置を用いて麻酔時と無麻酔時の18F-FDGの体内動態を評価した.マウス頭部に装着する固定用アタッチメントは,光イメージング測定・MRI測定およびPET/CT測定のいずれにも対応できるようにするため,当初は頭頂部が開口している形状で開発を行ったが,この形状では使用する接着剤の強度が不足することがわかったために,板状のものに形状を変更した.これにより頭蓋骨と幅広く接触することができ,接着強度が向上して安定的に固定されることが確認された.

また,接着後の長期飼育においてもアタッチメントの変性等は生じず,他のモダリティでも十分に使用できると考えられた.アタッチメントを装着したマウスを固定するデバイスは,50mLコニカルチューブを形成することにより作成した.X線吸収の少ないプラスチック製のねじで固定することで,長時間の測定に耐えうるシステムの構築に成功したが,マウスの体重が35g程度を越えると内部空間が狭隘になってしまうことが判明し,特に体軸方向の長さが足りないことがわかった.長期に飼育して経時的な変化を評価しなければならない場合は,より長いデバイスを用意しなければならないことが判明した.開発したデバイスを用いて麻酔下および無麻酔下の18F-FDGの体内動態を,小動物用PET/CT装置を用いて評価した.無麻酔状態における脳のSUVmeanは,麻酔下の約70%であった.また,吸収補正を行ったものに比して補正を行わない場合は80%程度の値となったため,デバイスの影響と考えられる吸収の補正は必須と考えられた.しかし,散乱補正を加えても有意なSUV値上昇は見られず,散乱補正は必要ないことが示唆された.これらの成果は,他のモダリティに応用できるものであった.本年度は昨年度に開発したデバイスを用いて,複数のイメージング装置を用いた測定を行う予定であった.しかし,デバイスの不具合が生じたことでその対応に時間がかかってしまい,本来行うべきイメージング測定を十分に行う事ができなかった.本年度の最大の目標である無麻酔測定用アタッチメントおよびその固定用デバイスの開発は成功し,第一段階であるPET/CT測定を行いその定量結果を出すことはできた.しかし,当初の予定であるMRI測定や光イメージング測定を行うことはできなかった.これは,アタッチメント開発に想定以上の時間がかかったことと,学内において同一研究者がマルチモダリティの装置を使用することの想定がなかったために,その基準および環境作りを行うことにも時間がかかったためである.しかし,これらの問題点は現時点で概ね解消されており,次年度は当初の予定に従った研究活動ができるものと考えている.マウスの無麻酔測定用デバイスが完成したので,本年度はマルチモーダルイメージングによる生体機能の定量評価に供与できるかについて評価を行う.所属施設が変わったが,従来施設と同等以上のイメージング装置(PET/SPECT/CT, MRI, CT, IVIS, US)が設置されているため,これらを用いた特に麻酔薬が脳機能に与える影響について評価を行う.PETではFDGの動態,SPECTおよびMRでは脳血流,IVISでは糖の動態を測定し,これらを相互比較して無麻酔測定の有用性を検証する予定である.本年度の開発したアタッチメントおよび固定用デバイスを用い,光イメージング測定・MRI測定およびPET/CT測定を行うことにより,開発したアタッチメント等のマルチモダリティ対応が可能かどうかを検証することを第一の目標とする.その上で,マルチモダリティ測定における開発したアタッチメントやデバイスの問題点を洗い出し,無麻酔マルチモダリティ測定に最適なアタッチメント開発を継続する.
ケモカイン受容体を標的とした新たな加齢黄斑変性の治療戦略

本研究では加齢黄斑変性に対する炎症性のサイトカインであるIP-10の役割を調査した。その結果、IP-10は脈絡膜新生血管モデルでは炎症性のマクロファージや網膜色素上皮細胞から産生されその受容体であるCXCR3を介して脈絡膜新生血管を抑制する事が示された。本研究で治療に難渋する加齢黄斑変性の新たな治療標的を同定し、新規の治療の可能性の道が開かれた。本研究では加齢黄斑変性の動物モデルを用いて発現の上昇の見られるサイトカインのうち、IP-10に着目して研究を行ってきている。in vivoの検討により1. CXCR3リガンドのうち加齢黄斑変性モデルで発現上昇が見られるのはIP-10のみである。2. CXCR3 KOマウスでは加齢黄斑変性の病巣が拡大する、という事を明らかにしてきた。現在までのところ、in vitroの実験系を用いて1. IP-10はM1マクロファージより放出される2. in vitroのtube formation assay, aortic ring assayにて血管新生抑制作用を有するという事を明らかにしている。虚血性新生血管を評価する酸素誘発性網膜症モデル(OIR model)を使用した検討では、IP-10の受容体のCXCR3を欠損させたマウスは野生型に比較して新生血管領域が大きかった。すなわち、CXCR3シグナルは血管新生に抑制的に作用する事が示唆された。このため、このモデルを用いてCXCR3のリガンドを検討するとI-TAC,MIG-1,IP-10のうち、IP-10のみCXCR3KOマウスでの発現が低下していた。さらに、レーザー誘発性脈絡膜新生血管モデルではM1およびM2マクロファージが病巣に集積するが、レーザー照射後3日目の網膜・脈絡膜サンプルを用いてM1およびM2マクロファージを採取し、RT-PCRで検討した結果、IP-10はM1マクロファージでのみ発現が認められた。in vitroではマクロファージの細胞株であるTHPー1細胞株をそれぞれM1、M2マクロファージに分化させ、IP-10の発現をみたところmRNAおよびタンパクレベルでM1マクロファージがIP-10を産生しているのを確認した。さらに、Tube formation assay(HUVECを使用)にてM1マクロファージのならし培地(Conditioned Medium)下で血管形成が低下し、抗IP-10抗体を添加すると血管形成が増加することを確認した。さらに、in vitroでは分化誘導後のマクロファージをLPS(10ug/ml)、血清、血清+A2E(10-8M)で刺激し、qPCRにて発現量の変化をみたところ、網膜色素上皮細胞株ARPE-19との共培養下においては、M1マクロファージ存在下でLPS、A2E刺激によりM1マクロファージおよびARPE-19からのIP-10増加が見られたこれらよりM1マクロファージや網膜色素上皮細胞によって産生されるIP-10やが血管内皮細胞に作用し、血管形成を抑制すると考えられた。CXCR3は主にTリンパ球に表出されるケモカイン受容体として知られているが、腫瘍などの新生血管内皮にも発現し、血管新生抑制に関与するとされている。今回我々は、レーザー誘発性モデルを用いCXCR3とそのリガンドの一つであるIP-10の脈絡膜新生血管(CNV)への関与について検討を行った。まず、C57BL/6マウスにレーザー誘発性CNVモデルを作成し、CXCR3の免疫染色を行い,更にCXCR3とその主要リガンド(MIG, IP-10, ITAC)の発現をRT-PCRで検討した。次に、CXCR3ノックアウト(CXCR3KO)マウスと野生型(WT)マウスにCNVモデルを作成し、蛍光眼底造影(FA)と脈絡膜伸展標本によるCNV面積の比較を行った。WTマウスのCNVモデルに対しCXCR3中和抗体やIP-10中和抗体の硝子体投与も行い、CNVへの影響を検討した。更に、各種炎症性サイトカインの発現をRT-PCRにて検討した。その結果、蛍光免疫染色にてCNVの血管内皮にCXCR3の発現を認めた。RT-PCRではCNVを誘発した眼球でCXCR3とIP-10の発現上昇が認められた。また、CXCR3KOマウスでは、WTマウスに比較して、CNVの蛍光漏出、CNV面積ともに有意に拡大した(p<0.01, nested-ANOVA)。WTマウス硝子体への抗CXCR3中和抗体/抗IP-10中和抗体投与も、CNVを有意に拡大した(p<0.05, nested-ANOVA)。更に、CXCR3KOマウスではWTマウスと比較してCNVを誘発した眼球の色素上皮/脈絡膜でCCL2の発現上昇を認めた(p<0.05)。これらの結果からCXCR3、IP-10はCNVモデルで発現が上昇し、CXCR3はCNVの進展抑制に関与すると考えられる。おおむね予定通りの進捗状況である。予定していた検討は順調に進展している。

さらにin vivoの加齢黄斑変性モデルを用いてIP-10を産生する細胞を明らかにすると同時に加齢黄斑変性における経時的な発現変化を検討する。別の新生血管モデルを用い、今回明らかとなったケモカインについて検討を行うと同時に、臨床サンプルを用いた新たな治療標的の可能性についても検討する。研究費は、すべて実験に用いる。主に、実験動物および消耗品(解析のための試薬)に使用する。血管新生モデル作出、解析。臨床サンプルの解析。