hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
多機能光干渉断層計による黄斑疾患の包括的３次元多角的画像解析技術の確立

また多機能OCTの安定した臨床運用のために、システムを簡便化することにより、より臨床器機に近い装置の開発製造に成功した(Makita(Miura): Biomed Opt Express 9, 4372,2018)。本研究における重要課題である、脈絡膜メラニンと網膜色素上皮メラニンの自動判別に成功した。多機能OCTから得られた網膜色素上皮メラニン3次元分布が、近赤外自家蛍光画像から得られる網膜色素上皮メラニン2次元分布に類似している事も確認された。これにより、多機能OCTによる自家蛍光画像の3次元解析が可能となる。これは多機能OCTの臨床実用化に向けた大きな進展である。この技術を基にして、既に300眼以上の計測を実施し解析を進めている。この臨床応用の結果のうち、加齢黄斑変性については英文誌に掲載され(Miura:Sci Rep9,3278,2019)、Vokt-小柳-原田病については英文誌(IOVS)に投稿査読中である。多機能OCTによる疾患眼の計測を進め、計測データに関する詳細な解析を進める。これにより下記の課題について検討を進める。1、多機能OCTによる網膜色素上皮メラニン3次元分布と自家蛍光画像を比較する。もし分布が一致しない場合は、その病態を多角的画像解析による比較検討を実施する。これにより一致しない場合の病態について検討する。2、自家蛍光画像の3次元解析技術を用いて、既存の臨床論文を再検討する。これにより、従来の平面情報では得られなかった情報のを探索する。3、脈絡膜メラニン密度の3次元分布解析手法を確立させる。また強度画像の判別技術(segmentation)を組み入れることにより解析の自動化を達成させる。2018年度は国内学会出張費と国際学会出張費は予想より少なく、次年度使用額が生じた。2019年度は、高速コンピューターと大容量高速ハードディスクの購入や、プログラム開発ソフトLabVIEWライセンス使用料等の高額出費が予想されており、次年度使用金額と今年度使用金額を合算した支出が必要となる。
進行大腸癌に対する癌融解性アデノウイルスの検討

アデノウイルスの増殖を規定するE1A遺伝子の発現をCEAプロモーターで制御し、癌細胞内でのみ増殖し細胞融解性を示すようにすることを目的に、アデノウイルスの改良をおこなった。具体的には、アデノウイルスのN末の遺伝子の一部をもつシャトルベクター上で、E1A遺伝子の直前522ntの位置に、CEAのプロモーターを導入した。これをアデノウイルスの骨格DNAと組み換えを行い、Ad.CEA522ウイルスを合成した。また、CEAプロモーターによる制御を確実にするために、460-522ntを除き、CEAプロモーターを導入したAd.CEA460も同時に分離した。まずこの2つのウイルスの細胞障害性をin vitroで検討した。CEAの発現株であるHT29と発現のないHeLa細胞に対し様々なMOI(0.0110)でウイルスを感染させ、24、48、72時間後の細胞活性を検討した。この際、ポジティブコントロールとして複製できるAd.type5を、ネガティブコントロールとして複製のできないAd.E1(-)LacZウイルスを各々用いて検討を行った。どちらの細胞もAd.type5の感染により細胞活性が低下し、高いMOIで感染を受けたものがより細胞障害されていた。低いMOIでも感染後の日数が経るにつれ細胞障害性は強くみられ、ウイルスの複製が示唆される結果であった。Ad.E1(-)LacZのMOI10までの感染ではいずれも細胞障害見られなかった。CEAウイルスに関しては、CEA発現株にはAd.type5と同等の障害性を示した。Ad.CEA522はCEA陰性細胞に対しても高MOIになるにつれ細胞障害性を示すことが分かり、Ad.CEA460の方がCEAの発現の有無による特異度が高いことが示された。これは、E1Aのプロモーターをあらかじめ除くことでCEAプロモーターからの発現制御がより厳密に行われたためだと推測された。このように、CEAプロモーターによりアデノウイルスの細胞障害性を制御することができたが、CEAの発現レベルが異なる細胞を用いた検討による特異度を検討すること、ウイルス自体の複製率を検討することが今後必要であり、in vivoにおける効果もマウスの腫瘍モデルを用いて行う予定である。
遺伝情報の正確性を保つスプライシングチェックポイント機構の解析

スプライシング異常と転写との関係を調べるため、細胞をスプライシング阻害剤であるスプライソスタチンAで処理した後、いくつかの遺伝子の発現レベルを解析した。この際、半減期が長く安定性の高いmRNAの変化も捕らえるために、新規に合成されたmRNAのみを抽出し、解析の対象とすることとした。この解析の結果、多くの遺伝子において、スプライシング阻害時には遺伝子の3'末端の発現量が低下することが明らかとなった。さらに、そのようなパターンを示したいくつかの遺伝子の発現レベルを定量的RT-PCR法を用いて詳細に解析したところ、1.スプライシングを阻害するスプライソスタチンAの処理条件(濃度ならびに処理時間)と、遺伝子の3'末端の発現低下を引き起こすスプライソスタチンAの処理条件は一致する、2.細胞をスプライソスタチンAで処理した後、スプライソスタチンAを培地から除くと、スプライシング活性が回復すると同時に遺伝子の3'末端の発現量も回復する、という2点のことが明らかとなった。以上の結果は、スプライシング異常が遺伝子の3'末端の発現低下を引き起こしていると解釈出来る。現在までに多くの研究者によって、転写がスプライシングをはじめとした転写後修飾の効率に影響を与えることが示されてきたが、この結果は、転写後修飾が転写に影響を与える、いわゆるフィードバック機構もしくはチェックポイント機構の存在を強く示唆するものである。
内因性AGEが引き起こす組織リモデリング病態の発症機序解明と根絶的治療法開発

内因性AGEが引き起こす組織リモデリング病態の発症機序を解明する目的で,内因性AGEをプローブに用いたプロテインアレイ解析を行った。その結果,内因性AGEに対して高親和性を示す複数の生体内微量因子を見出し,これらが炎症病巣局所でクラスターを形成していることが示唆された。また,組換え型の内因性AGEおよび受容体(RAGE)を用いた試験管内結合アッセイの確立ならびにNF-κB活性化や炎症性サイトカイン産生能を指標にした細胞アッセイの確立に成功し,内因性AGE遮断薬開発のための創薬プラットフォームを構築することができた。脳梗塞や糖尿病などの「組織リモデリング」を主徴とする疾病は,我が国での死因の上位を占め,重度後遺症に伴う医療負担も甚大であるにも係わらず有効な治療法は未だ確立していない。我々は,組織リモデリング病巣局所に出現し,過剰な免疫亢進作用によって病態の増悪化を招く因子を見出した。加えて,本因子(内因性AGE)に対する抗体投与が,疾患動物モデル(脳梗塞モデル等)において著効性を示す事も明らかにし,内因性AGEシグナルの遮断が組織リモデリング病態の治療・予防に直結している事を発見した。この様な背景の下,内因性AGEをリガンドに用いたプロテインアレイを行ったところ,内因性AGEと高親和性を持つ数種の生体内微量因子を同定することができ,これらが炎症病巣局所で内因性AGEと共にクラスターとなって細胞外インフラマソームを形成することが示唆された。また,内因性AGE受容体に対する特異抗体も作製し,内因性AGEの病態生理学的意義付けや組織リモデリング病態を制御する上で重要なツールを確立した。「組織リモデリング」を主徴とする疾病(脳梗塞,ぜん息,動脈硬化など)は,極めて重篤な疾患病態であるにも関わらず,未だに治療法が限定的であるため,有効な治療法の開発は医療政策上の最重要課題の一つである。申請者らは,「組織リモデリング病態」の病巣局所に「内因性AGE」が出現し,これによる過剰な炎症・免疫亢進作用によって病態の増悪化が引き起こされることを見出した。また,「内因性AGE」は組織リモデリング病巣において他の複数分子とクラスターを形成し,「細胞外インフラマソーム」の形で存在することも明らかにしてきた。これらの知見に基づいて,本研究では「内因性AGE」および関連タンパク質をリコンビナント体として発現させることに成功した。「内因性AGE」等は末端にタグ負荷した形で発現し,現在,可溶性タンパク質として数mgオーダーで精製品を得ることが可能となっている。今後,これらを用いて免疫担当細胞や動物疾患モデルを用いた評価系にて検討を行い,「内因性AGE」および関連タンパク質の病態生理学的意義について深く追求していく予定である。「組織リモデリング病態」は,病巣局所での病的な組織構造と機能障害を伴う重篤な難治性疾患であり,発症や増悪化の鍵となる重要因子を同定・解明する事は,疾患の未然防止や新たな治療法開発に通じる最重要課題である。私達は,組織リモデリング病巣局所に出現し,過剰な免疫亢進作用によって病態の増悪化を招く因子(内因性AGE)を発見した。本増悪因子(内因性AGE)は,細胞刺激に伴って核から細胞外へと局在移行し,細胞外でサイトカイン様活性を示す特徴的分子であった。内因性AGEに対する中和抗体は,疾患動物モデル(糖尿病や脳梗塞モデル等)において著効性を持つことから,内因性AGEの遮断が組織リモデリング病態の治療や予防に直結することを明らかにしてきた。これらの知見に基づき,本研究では内因性AGEがマクロファージ/単球などの免疫担当細胞に対して,炎症性サイトカイン産生や細胞内NF-κB活性化などの免疫賦活作用を示すことを見出した。この知見を応用して,細胞レベルで内因性AGEを遮断する機能分子を新たに開発する際に,遮断作用を効率的に判定しうることが可能な簡便な細胞評価系を確立することに成功した。この評価系確立によって,内因性AGE遮断物質の開発が促され,組織リモデリング病態モデルを用いた個体評価系への橋渡し研究が,よりいっそう加速されるものと思われた。
小児の前胸部誘導心電図の非特異的ST上昇の発現機序

人、特に小児の中間胸部誘導心電図、V2-V4(V1-V5)、のSTjunction寄りのSTsegmentは生理的に0.1-0.4mV上昇する事が知られているが、その機序は明らかでない。そこでその機序を明らかにする為以下の観察、実験をおこなった。1.人(川崎病、肺動脈弁狭窄,心房中隔欠損,心室中隔欠損Tetralogy of Fallot等170例)でのST最大上昇を示す前胸部誘導部位と心血管造影像,心超音波画像で見る心室中隔の水平面での回転の角度の特徴がほぼ一致する。2.心室節のAction potentialの一般形とSodi-Pallares等による心室中隔より両心室全体への興奮伝播過程から作図したSTsegment時間帯電位勾配の変化の進行から、STsegmentで中隔の前方自由壁付着部位からみた電位勾配はST上昇に一致する。なぜなら前方付着部位からみると中隔はその前後径厚にそって前下方より後上方に向かって順次興奮するからである.一方V3RやV6等は寧ろ直交する誘導なのでベクトル成分として現れない.3.動物実験(成犬、ビーグル,6匹)で開胸後、心表面電位地図をつくると、左冠動脈前下降枝領域に沿ってST上昇が最も強く、心室中隔をその前方付着部位から縦方向に後方を眺めた時の電位勾配に一致する.即ち、2.に述べた仮説が成立する.4.先天性心疾患の手術開胸時に同様の事を16名について観察記録した.人においても犬の場合と同様、心表面前方の電位図を記録作成すると、ST上昇は左前下降枝領域にそって最も強く、その両側に向かって減弱した。以上の事から前胸部誘導心電図の非特異的ST上昇は心室中隔興奮過程をその前方付着部位から真うしろ後方に縦方向に進行するのを記録する為であるとおもわれる。小児の前胸部誘導心電図の、特にST junctionよりST segment前半部が、しばしば非特異的に上昇する現象の機序について、人での直接的観血的観察とその分析を目的とするProjectとして、主に次の2つを計画した。(1)承諾を得た患者につき、心臓カテーテル検査時に、右心系より中隔の前下方より後上方に向けての最低2ヶ所以上の電位分布とその興奮順序の観察(2)先天性心疾患で手術予定患者につき、手術時に心室前面の右室側から中隔の前方付着部位(左冠動脈前下降枝に沿った部分)、更に左室側にわたる局面の電位の直接記録を、行う事から成り立つ。本Projectの採用通知を平成10年10月26日に頂いてから、フクダ電子に(2)のための機器を特注したが、機器一式の納入が平成11年2月23日に、ずれ込んだため、現在、機器の細かな使用時の調整を行っており、4月から実際の測定に入る予定にずれ込んでしまい、(1)も含め、まだデータの解析に入れる程、進行しておりません。平成11年度に入って、充分なデータを得て、解析に入りたいと予定しています。前胸部誘導、特に心の右前方より中間部即ち、V_2V_4(V_1V_5)のSTjunctionよりSTsegmentは生理的に0.10.4mVは上昇する事は永く知られているが、その機序を明らかにするため一連の観察、実験を行った。1.人でST最大上昇を示す前胸部誘導部位と心血管造影像、心超音波画像でみる心室中隔の水平面での回転の相対的な傾きの特徴はほぼ一致する。

3.動物実験(犬)で開胸後、心表面での電位地図を作ると左冠動脈前下降枝領域にそってST上昇か最も強く、心室中隔を縦方向に眺めた時の電位勾配に一致する。4.現在、先天性心疾患の手術治療時の開胸時に同様のことが観察される事を収集中であるが、疾患の重さ、患者の大きさ、同意の必要性等々の制限によりその数はまだ充分ではない。
新奇化合物を用いた植物気孔の発生ロジックの理解と操作

本研究は、名古屋大学トランスフォーマティブ生命分子研究所(ITbM)の理念である「合成化学と生物学の融合による新奇化合物の創出」を目指し、気孔発生に影響を与える合成化合物の探索と同定を通じて、気孔の発生ロジックの理解、操作することを目的とする。I孔辺細胞特異的に強いGFP蛍光を発するライン(野生型背景)を用いて気孔の発生とパターン形成に影響をおよぼす化合物スクリーンを行った。スクリーニングは、誘導体の合成転換を考慮したITbM化合物ライブラリーを用いた。その結果、気孔の数を大きく増やす約100種類の化合物を得た。中でも、最も効果の高い2種類の化合物(E2とKC9)に注目した。興味深いことに、E2は消炎鎮痛薬セレコキシブのアナログである。E2は気孔の数を増やすが、その一方、植物成長阻害作用を示した。C-H活性型触媒反応を駆使して9種類のE2アナログ(構造類縁体)を合成し、その植物に対する生理作用の解析を行った。その結果、植物成長阻害という副作用のない、気孔を増やす効果を持つ化合物の創出に成功した(ZiadiらChem Comm 2017論文発表)。KC9は、気孔の数を増やし植物体の成長を促進する作用を持つ。この化合物に応答した全遺伝子発現変動を解析した。その結果、本化合物は特定の代謝経路の発現を誘導する一方、多くの環境ストレスや病原ストレス応答は抑制されていることが判明し、KC9は植物の【成長と防御のバランスgrowth-defense tradeoff】に関わる経路に作用することが示唆された。このトレードオフは、作物の増収を目指すと、その一方で耐病性やストレス耐性が減ってしまう、という育種の上でのネックとなっている。気孔の形成、代謝経路、そして成長と防御のバランスがどのような関係にあるのか、化合物の標的因子の同定を介した植物の未知の制御機構の解明が今後の課題である。この化合物は、米国に特許出願中である。29年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、研究代表者が所属する名古屋大学トランスフォーマティブ生命分子研究所(ITbM)の理念である「合成化学と生物学の融合による新奇化合物の創出」を目指し、植物の生長とバイオマス生産に非常に重要である、気孔の発生に影響を与える合成化合物の探索と同定を行う。それにより、気孔の発生ロジックの理解し、また、操作することを目指す。本年度は、気孔の数と分布、および気孔系譜幹細胞の維持と分裂に影響をおよぼす化合物のスクリーニングを継続し、100程度の候補化合物を得た。これら化合物の気孔形成に与える効果を定量的に解析し、化合物の効果のランク付けを行った。将来的な作物への応用を考慮し、植物体の成長を促進する(もしくは成長に悪影響与えない)化合物を優先的に解析した。もっとも効果の高い化合物をシロイヌナズナ芽生えに処理し、化合物に応答した全遺伝子の変動を解析した。その結果、本化合物は特定の代謝経路の発現を誘導する一方、多くの環境ストレスや病原ストレス応答は抑制されているとわかった。そのため、本化合物は植物の【成長と防御のバランスgrowth-defense tradeoff】に関わる経路に作用することが示唆された。気孔の形成、代謝経路、そして成長と防御のバランスがどのような関係にあるのか、H29年度には、本化合物の標的同定などを目指すことにより、植物の未知の制御機構の解明を目指す。この化合物は、現在、米国に特許出願中である。さらには、新たに同定された化合物に関しても、その薬理効果の解析を進める。孔辺細胞特異的に強いGFP蛍光を発するライン(野生型背景)を用いて気孔の発生とパターン形成に影響をおよぼす化合物スクリーンを継続した。現在までに約10000種類の化合物をスクリーニングし、そのうち、100種類程度の候補化合物を得た。それら化合物を(i)気孔の数を増やすが、植物発生に異常が生じる(中には気孔の幹細胞であるメリステモイド細胞の分裂や増殖異常が生じるものも含む)(ii)気孔の数を増やし、植物も健全に生育する(あるいは、生育がよくなる)という2グループに分け、気孔系譜のGFPマーカーを用いた定量画像解析を介して、各々の化合物の有用性をランキングした。将来的な作物への応用を見据え、(ii)のグループについて、化合物の構造をベースにさらなるクラス分けを行った。最も有用性の高いKX9に関して、RNA-seq解析を行い、化合物処理による全転写産物の変動を解析した。その結果、KX9添加によって短時間に誘導される遺伝子群には、「気孔の発生分化」に関わるものと、特定の代謝経路に関わるものが含まれていた。一方、KX9添加によりエチレン、ABAなど植物ストレスホルモン応答性、浸透圧ストレス応答性、塩ストレス応答性、病原菌応答性など、幅広い環境ストレスと生物学的ストレス応答性の遺伝子発現が、一律、抑制されていた。この予想外の結果から、KX9は植物の【成長と防御のバランスgrowth-defense tradeoff】に関わる経路に作用することが示唆された。実際に、様々なストレス条件下におけるシロイヌナズナ芽生えにKX9を添加したところ、特定のストレス下で芽生えの成長促進が見られた。

気孔の形成、代謝経路、そして成長と防御のバランスがどのような関係にあるのか解析を続ける予定である。本研究は、名古屋大学トランスフォーマティブ生命分子研究所(ITbM)の理念である「合成化学と生物学の融合による新奇化合物の創出」を目指し、気孔発生に影響を与える合成化合物の探索と同定を通じて、気孔の発生ロジックの理解、操作することを目的とする。I孔辺細胞特異的に強いGFP蛍光を発するライン(野生型背景)を用いて気孔の発生とパターン形成に影響をおよぼす化合物スクリーンを行った。スクリーニングは、誘導体の合成転換を考慮したITbM化合物ライブラリーを用いた。その結果、気孔の数を大きく増やす約100種類の化合物を得た。中でも、最も効果の高い2種類の化合物(E2とKC9)に注目した。興味深いことに、E2は消炎鎮痛薬セレコキシブのアナログである。E2は気孔の数を増やすが、その一方、植物成長阻害作用を示した。C-H活性型触媒反応を駆使して9種類のE2アナログ(構造類縁体)を合成し、その植物に対する生理作用の解析を行った。その結果、植物成長阻害という副作用のない、気孔を増やす効果を持つ化合物の創出に成功した(ZiadiらChem Comm 2017論文発表)。KC9は、気孔の数を増やし植物体の成長を促進する作用を持つ。この化合物に応答した全遺伝子発現変動を解析した。その結果、本化合物は特定の代謝経路の発現を誘導する一方、多くの環境ストレスや病原ストレス応答は抑制されていることが判明し、KC9は植物の【成長と防御のバランスgrowth-defense tradeoff】に関わる経路に作用することが示唆された。このトレードオフは、作物の増収を目指すと、その一方で耐病性やストレス耐性が減ってしまう、という育種の上でのネックとなっている。気孔の形成、代謝経路、そして成長と防御のバランスがどのような関係にあるのか、化合物の標的因子の同定を介した植物の未知の制御機構の解明が今後の課題である。この化合物は、米国に特許出願中である。現在、KX9に関しては、ITbMの化合物合成技術を用いて複数のアナログを作成中である。生理活性を保った状態での側鎖修飾とカラム固相化によるアフィニティークロマトグラフィー法による化合物の標的因子の同定を目指す。また、新たに単離した化合物の中には類似したい構造を持つ物が複数ある。これら一連の化合物の共通性から、気孔の発生を促進する化合物の共通部位が推測される。これらに関しても、植物側の標的因子の同定を目指す。植物体への効果の多面的解析、RNA-seq法を用いた解析を継続し、気孔の数を増やし、かつ、植物成長を促進する一連の化合物の標的経路を明らかにしていく。作物個体の成長や、各種ストレス耐性への投与の効果をフェノームおよびトランスクリプトームレベルで解析し、応用への可能性を開く。29年度が最終年度であるため、記入しない。
歯科矯正治療における力とモーメントの検証：画期的3次元デジタルシステムの開発

矯正歯科治療において用いられる適切な矯正力ならびに治療メカニクスは重要であるが、これまでは実測が困難であった。本研究では、微小6軸センサーを複数用いることで、実寸大の模擬歯列を用いた臨床型矯正力計測システムを開発し、古典的力系の検証および新たに考案した力系の裏づけを行うことを目的とした。1.改良型計測システムの開発申請者らが考案した2歯モデルを拡張し、矯正歯科臨床を想定した片顎の14歯モデルの開発を行う。東京理科大学理工学部機械工学科支援の下、Action stickを介することでセンサーを模擬歯列内面に配置し、模擬歯とセンサー部に生じる測定値の誤差の補正を行うことで正確な力・モーメント値の変換式を導き出すとともに、リアルタイムに観察可能なビジュアルインターフェイスでの出力を目指す。2.模擬歯列が最外周に位置する本装置の利点を活かし、これまでの装置では測定が困難であったループを組み込んだワイヤーや、複数のワイヤーを同時に用いる力系、超弾性と形状記憶の得性を有するNiTiワイヤーを用いた力系の評価を行う。特にNiTiワイヤーは、屈曲時の熱処理によって超弾性特性が変化するため、活性化量と実際に発揮される矯正力の関係が明確でなく、これまでほとんど検討がなされてこなかった。申請者らの臨床においては、レベリングのみならず、犬歯の遠心移動時など幅広い治療ステージで使用しており、様々な治療メカニクスを用いている。活性化量と力・モーメントの関係が定量的に明らかになれば、矯正治療の質向上に大きく寄与するものと期待される。当該年度においては14歯モデルのプロトタイプが完成し、キャリブレーションを行っている。また、より精度の高い新たなセンサーを用いて、少数歯モデルによる限局的なメカニクスの解析を行っている。本年度は14歯モデルのプロトタイプが完成した。キャリブレーションにおいてセンサーの不具合が判明したため、メーカーに依頼し、オーバーホールを行った。また、より精度が高い少数歯モデル構築のため、新たにセンサーを購入し、予備的な実験を行っている。14歯モデルにおいては、プロトタイプを用いて予備的な実験を行いつつ、改良を重ねていく。また、少数歯モデルにおいては、限局的な歯の移動モデルに即した実験を行う。消耗品の購入が予定より遅れているため。
鶏の体脂肪の蓄積制御に関する栄養生理学的研究

近年,産卵鶏およびブロイラーにおいて,体脂肪が過剰に蓄積する傾向が認められ,生産性の低下等により,家禽産業上に多大の損失をもたらしている.また,世界の趨勢として食物に対し栄養を意識した消費者が増加し,低脂肪・低カロリー食品が望まれるようになってきている.この様なことから,鶏の低脂肪化,すなわち体脂肪の蓄積制御が家禽産業並びに食品産業から強く要請されている.本研究は,まず脂肪原始細胞の分裂の活性化時期を確認し,つぎに脂肪細胞中への脂肪蓄積を促進する栄養生理的条件を選定し,最後にこれらに関して得られた結果に基づき,鶏を成熟時まで飼育し体脂肪蓄積の改善に対する有効性を検討することによって,鶏体脂肪の蓄積を制御する具体的方法を提示することを目的として行ったものである.その結果,以下のことが明らかにされた.1.鶏においては,脂肪組織における脂肪原始細胞の分裂活性は,孵化後816日目に急激に上昇する.2.孵化直後から8日齡までの給与飼料として,卵用鶏に関しては70%炭水化物, 12%蛋白質配合調製飼料が,肉用鶏に関しては75%淡水化物, 12%蛋白質配合調製飼料が,細胞数が少なく,しかもその容積(すなわち細胞直径)の大きい脂肪細胞より成る脂肪組織を形成する.3.肉用鶏と卵用鶏のいずれに対しても, 2.で選定された栄養生理的条件下で成熟時まで飼育することによって,脂肪組織脂肪細胞数を減少させることが可能である.近年,産卵鶏およびブロイラーにおいて,体脂肪が過剰に蓄積する傾向が認められ,生産性の低下等により,家禽産業上に多大の損失をもたらしている.また,世界の趨勢として食物に対し栄養を意識した消費者が増加し,低脂肪・低カロリー食品が望まれるようになってきている.この様なことから,鶏の低脂肪化,すなわち体脂肪の蓄積制御が家禽産業並びに食品産業から強く要請されている.本研究は,まず脂肪原始細胞の分裂の活性化時期を確認し,つぎに脂肪細胞中への脂肪蓄積を促進する栄養生理的条件を選定し,最後にこれらに関して得られた結果に基づき,鶏を成熟時まで飼育し体脂肪蓄積の改善に対する有効性を検討することによって,鶏体脂肪の蓄積を制御する具体的方法を提示することを目的として行ったものである.その結果,以下のことが明らかにされた.1.鶏においては,脂肪組織における脂肪原始細胞の分裂活性は,孵化後816日目に急激に上昇する.2.孵化直後から8日齡までの給与飼料として,卵用鶏に関しては70%炭水化物, 12%蛋白質配合調製飼料が,肉用鶏に関しては75%淡水化物, 12%蛋白質配合調製飼料が,細胞数が少なく,しかもその容積(すなわち細胞直径)の大きい脂肪細胞より成る脂肪組織を形成する.3.肉用鶏と卵用鶏のいずれに対しても, 2.で選定された栄養生理的条件下で成熟時まで飼育することによって,脂肪組織脂肪細胞数を減少させることが可能である.鶏において、孵化後早い時期、即ち脂肪原始細胞の分裂が活発化する時期以前に、脂肪原始細胞内への脂肪蓄積が促進される様な栄養・生理的条件下に一時的に置くことにより、成熟時の脂肪細胞数、即ち体脂肪量を制御することを目的として、次の項目について検討を行なった。供試鶏は白色レグホーン種雄とし、脂肪組織として体脂肪率と高い相関を示す腹腔内脂肪組織(以後脂肪組織と略す)を用いた。1.脂肪原始細胞の分裂活性の経時的変化の測定活性測定は、【^3H】-チミジンのin vwoにおける脂肪組織DNAへの取り込み並びに脂肪組織DNA量の定量の両面から行ない、孵化後1,2,4,8,16,32,64及び128日令迄の変化を調べた結果,816日令の間に細胞分裂活性,総DNA量並びに脂肪細胞数が急激に増加し始めることが判明した。2.脂肪細胞中への脂肪蓄積を促進する栄養・生理的条件の検討飼料中の炭水化物量の増加や蛋白質量の減少は、体脂肪蓄積量を増加させることが知られている。そこで、標記の条件を作り出す目的で、飼料中の蛋白質並びに炭水化物含量を各々段階的に変えて組み合わせた実験食(炭水化物:45,55,65及び75%,蛋白質:5,10,15及び20%)を孵化直後から、816日令まで給餌後、脂肪組織から遊離脂肪細胞を調製し、光学顕微鏡下に細胞直径と細胞数を測定した結果、炭水化物含量が75%並びに蛋白質含量が10%の条件下で、細胞直径が最大で、しかも細胞数が少なくなることが判明した。今後、孵化直後から、816日令迄,2.で選定された食餌条件下で飼育し、以後正常食で成熟日令まで飼育して、その間の体脂肪蓄積量の変動を、経時的に調べる予定である。
大脳基底核変性疾患における回路変動と不随意運動出現の因果関係

パーキンソン病は黒質のドパミン作動性ニューロンの変性に起因し、無動、寡動、筋強剛などの重度な随意運動の障害が認められる。治療にはドパミンを補うL-DOPAの投与が有効であるが、長期間のL-DOPA投与によりジスキネジアと呼ばれる不随意運動が生じる。L-DOPA誘導性ジスキネジアにおける大脳基底核神経回路の動態変化を解明するため、薬剤誘導性のパーキンソン病モデルマウスを作製し、このマウスにL-DOPAを慢性投与してジスキネジアを誘導し、ジスキネジアを誘導する前とジスキネジア出現時において大脳基底核を構成する神経核から神経活動を記録した。淡蒼球外節、黒質網様部から神経活動を記録したところ、これらの神経核における自発発火はジスキネジアの有無でほとんど変化していなかった。ところが、大脳皮質から大脳基底核への入力を模倣するように大脳皮質を電気刺激し、黒質網様部で応答を記録したところ、正常なマウスでは「早い興奮ー抑制ー遅い興奮」という一過性の三相性の応答が主に認められるのに対し、ジスキネジアを誘導する前では遅い興奮が強くなり、ジスキネジア出現時においては抑制が強くなり、遅い興奮が弱まっていた。一方で、大脳基底核神経回路の活動を操作してL-DOPA誘導性ジスキネジアと同様の行動を引き起こすことができるのかを検証するため、光遺伝学を用いた実験を行った。線条体投射ニューロンにチャネルロドプシン2を発現するトランスジェニックマウスを用いて、線条体に光ファイバーを刺入し、光刺激により線条体投射ニューロンの興奮を誘導した。このとき、自由行動下での行動を観察したところ、ジスキネジアに類似した不随意運動が観察できた。そこで、線条体に光照射したときの応答を黒質網様部で記録した。大脳皮質への電気刺激と比較したところ、強い抑制と弱い遅い興奮が認められ、ジスキネジア出現時と類似した応答パターンを示した。28年度が最終年度であるため、記入しない。大脳基底核神経回路の代表的な疾患としてパーキンソン病が挙げられる。パーキンソン病は黒質緻密部のドーパミン作動性ニューロンの変性に起因し、パーキンソン病の治療にはL-DOPAの投与が有効である。しかし、長期のL-DOPA服用によりジスキネジアと呼ばれる不随意運動が生じる。これは、長期のL-DOPA服用により大脳基底核の動態が変化した結果、不随意運動の出現という機能シフトが生じた結果であると考えられる。そこで、薬剤誘導性のパーキンソン病モデルマウスを作製し、このマウスにL-DOPAを慢性投与してジスキネジアを誘発した。そして、このマウスの大脳基底核から神経活動を記録し、L-DOPA誘導性ジスキネジアにおける大脳基底核神経回路の動態変化の解明を試みた。大脳基底核の出力核である黒質網様部から神経活動を記録したところ、自発発火は正常なマウスとほとんど同じであった。ところが、大脳皮質運動野を電気刺激して大脳皮質から大脳基底核の入力を模倣したときの応答を記録すると、正常なマウスとは異なる応答パターンが認められた。一方で、ドーパミン作動性ニューロンの入力部位である線条体において、投射ニューロンに光駆動性イオンチャネルであるchannelrhodopsin-2(ChR2)を発現するトランスジェニックマウスを利用して、光遺伝学により、線条体投射ニューロンの神経活動操作を行った。線条体に青色光を照射すると線条体投射ニューロンの興奮が認められた。さらに、自由行動下で線条体に青色光を照射すると、光照射に応じてL-DOPA誘導性ジスキネジアと類似した行動が出現した。そこで、線条体に光照射したときの黒質網様部における神経活動の変化を記録した。その結果、黒質網様部では抑制とその後に弱い興奮が認めら、L-DOPA誘導性ジスキネジアマウスの大脳皮質を電気刺激したときの黒質網様部での応答と類似していた。H27年度は、薬剤を用いたパーキンソン病モデルマウスの作製と、このマウスを利用したL-DOPA誘導性ジスキネジアの誘発、およびこのマウスからの神経活動記録を計画していた。また、一方で、光遺伝学を利用した大脳基底核の神経活動操作も計画していた。6-OHDA(6-hydroxydopamine)を用いたパーキンソン病モデルマウスの作製およびL-DOPA投与によるジスキネジアの誘発は、論文を参考にして標準的な方法を用いることにより順調に進展した。また、ジスキネジア誘導時の神経活動の記録においては、淡蒼球外節、淡蒼球内節、黒質網様部からの記録を行っており、淡蒼球内節および黒質網様部は神経核が小さいため、記録を行う神経細胞の数を増やすために今後も継続して神経活動の記録を行う必要があるが、淡蒼球外節からの神経活動は十分に記録することが出来た。また、光遺伝学を利用した大脳基底核の神経活動操作においては、線条体投射ニューロンにChR2を発現するトランスジェニックマウスを用いて、線条体への光照射で線条体投射ニューロンの興奮を誘導し、このとき、光照射に応じてジスキネジアに似た運動が誘発されることが観察できた。

この行動変化には十分な再現性があったため、行動と神経活動の関係を明らかにするため、このマウスの淡蒼球外節、黒質網様部から神経活動を記録した。記録を行う神経細胞の数を増やす必要はあるが、光照射に応じて、淡蒼球外節では「抑制ー興奮」という一過性の応答パターンが得られた。大脳基底核の出力核である黒質網様部においては「抑制ー弱い興奮」という一過性の応答パターンが認められる傾向が明らかとなった。この進捗状況は、L-DOPA誘導性ジスキネジアの誘発と神経活動記録、光遺伝学を利用した大脳基底核の神経活動操作と行動への影響の観察という当初の計画と照らし合わせて、おおむね順調に進展していると言える。パーキンソン病は黒質のドパミン作動性ニューロンの変性に起因し、無動、寡動、筋強剛などの重度な随意運動の障害が認められる。治療にはドパミンを補うL-DOPAの投与が有効であるが、長期間のL-DOPA投与によりジスキネジアと呼ばれる不随意運動が生じる。L-DOPA誘導性ジスキネジアにおける大脳基底核神経回路の動態変化を解明するため、薬剤誘導性のパーキンソン病モデルマウスを作製し、このマウスにL-DOPAを慢性投与してジスキネジアを誘導し、ジスキネジアを誘導する前とジスキネジア出現時において大脳基底核を構成する神経核から神経活動を記録した。淡蒼球外節、黒質網様部から神経活動を記録したところ、これらの神経核における自発発火はジスキネジアの有無でほとんど変化していなかった。ところが、大脳皮質から大脳基底核への入力を模倣するように大脳皮質を電気刺激し、黒質網様部で応答を記録したところ、正常なマウスでは「早い興奮ー抑制ー遅い興奮」という一過性の三相性の応答が主に認められるのに対し、ジスキネジアを誘導する前では遅い興奮が強くなり、ジスキネジア出現時においては抑制が強くなり、遅い興奮が弱まっていた。一方で、大脳基底核神経回路の活動を操作してL-DOPA誘導性ジスキネジアと同様の行動を引き起こすことができるのかを検証するため、光遺伝学を用いた実験を行った。線条体投射ニューロンにチャネルロドプシン2を発現するトランスジェニックマウスを用いて、線条体に光ファイバーを刺入し、光刺激により線条体投射ニューロンの興奮を誘導した。このとき、自由行動下での行動を観察したところ、ジスキネジアに類似した不随意運動が観察できた。そこで、線条体に光照射したときの応答を黒質網様部で記録した。大脳皮質への電気刺激と比較したところ、強い抑制と弱い遅い興奮が認められ、ジスキネジア出現時と類似した応答パターンを示した。L-DOPA誘導性ジスキネジアマウスからの神経活動、特に大脳基底核の出力核である淡蒼球内節、黒質網様部における神経活動の記録を継続して行う。また、光遺伝学を利用した線条体投射ニューロンの興奮誘導を引き続き行い、淡蒼球内節、黒質網様部における神経活動の記録を行い、L-DOPA誘導性ジスキネジアマウスの神経活動と類似しているのかどうかを検討する。一方で、L-DOPA誘導性ジスキネジアは大脳皮質ー線条体路の神経伝達の変化に起因するのではないかとも考えられていることから、逆行性レンチウイルスベクターを利用して大脳皮質-線条体路にChR2を発現させ、自由行動下で大脳皮質へ光照射を行い、L-DOPA誘導性ジスキネジアと同様の不随意運動が誘発されるのかどうかを観察する。もし、不随意運動が認められたら、大脳皮質ー線条体路を興奮させたときの淡蒼球外節、淡蒼球内節、黒質網様部などから神経活動を記録し、L-DOPA誘導性ジスキネジアを示すマウスの神経活動と似ているのかどうかを検討する。
マルチリガンドなスカベンジャー受容体FEELと細菌感染との関連の解明

血管内皮細胞の同定の指標として蛍光標識したアセチルLDLの取り込み活性が広く用いられている。FEEL-1はその活性を担うマルチリガンドなスカベンジャー受容体である。FEEL-1,-2はグラム陰性、陽性の細菌や動脈硬化の発症や糖尿病の進展に関与すると考えられている酸化LDLやAGE(後期糖化反応生成物)をもリガンドとすることを報告してきた。FEEL-1の細菌の結合に必要なドメインの推定を行うこと、血管内皮細胞の培養上清に検出される可溶性FEEL-1の細菌結合活性の検討を行うこと、マウス肝臓初代培養細胞を用いてFEELの機能を明らかにすることを目的とした。ヒト臍帯静脈血管内皮細胞cDNAライブラリーよりクローン化した可溶型のFEEL-1の機能についてアデノウィルスベクターを用いた可溶型蛋白質の発現によって検討したところグラム陰性、陽性細菌を結合することが明らかになった。最近、FEEL-1が血管内皮細胞のHSP70の受容体であることを明らかにした。これらの結果はFEEL-1が細胞表面で細菌を結合するだけでなく、可溶型の受容体として細菌を捕捉する可能性を示唆している。肝臓類洞血管内皮細胞(liver sinusoidal endothelial cell, LEC)やKupffer細胞(KC)におけるFEELの細菌の結合活性への寄与を検討した。LECとKCにはFEEL-1,-2共に発現が認められた。FEELに対するmiRNAを発現するファイバーミュータントアデノウィルスを用いたFEEL-1,-2蛋白質のノックダウンによりスカベンジャー受容体活性が減少した。これらの結果はin vivoでFEELが細菌の結合、排除に重要な役割を担っている可能性を示唆している。FEEL-1,-2のノックアウトマウスの作出に成功した。血管内皮細胞由来のマルチリガンドなスカベンジャー受容体FEEL-1,FEEL-2の細菌感染への寄与をin vitroで検討した。懸案であったマウスFEEL-1に対するモノクローナル抗体を樹立した。この抗体を用いてマウスでの組織分布を詳細に検討した。またこの抗体を用いて抗原として用いるマウスFEEL-1の精製が可能となり受容体活性のブロッキング活性を持つモノクローナル抗体の樹立のための抗原の精製を行った。ラットに免疫を行いモノクローナル抗体の樹立を行っている。マウスFEEL-1は血管内皮細胞だけでなく末梢白血球、特に単球にも発現しており、広範な組織に発現が見られる。またマウスFEEL-2は多くの毒素産生細菌による感染症の感染伝播経路であるリンパ系組織、脾臓やリンパ節のような免疫担当臓器に発現している。初代培養細胞を用いて、血管内皮細胞、特に肝臓の類洞血管内皮細胞やKupffer細胞でのマウスFEEL-1,FEEL-2の発現を明らかにした。類洞血管内皮細胞やKupffer細胞は細菌感染と密接に関係することが知られている。これらの結果を踏まえて、グラム陰性、陽性細菌の感染と血管内皮細胞に発現しているFEEL-1,FEEL-2との関わりを検討した。ファイバー改変型アデノウイルスベクターを用いたshRNAの発現によるRNAiにより機能解析を行った。その結果、FEEL-1,FEEL-2は類洞血管内皮細胞やKupffer細胞での細菌の結合に寄与することが初めて明らかになった。FEEL-1,FEEL-2のノックアウトマウスの作製と同時にFEEL-1,FEEL-2に対するshRNAの一過性のアデノウイルスベクターによる発現によるFEEL-1,FEEL-2のノックダウンやshRNAを恒常的に発現するトランスジェニックマウスの作製を行うことによりマウス個体でのFEEL-1,FEEL-2と細菌感染との関連を明らかにしたい。
3次元1分子計測法による核膜孔通過の交通ルールの解明

既存の共焦点顕微鏡に新規画像解析法を適用し高精度の多点FCSを実現し、全反射顕微鏡により核付近のような細胞深部での1msの高速1分子計測・超解像イメージングの実現に至った。これら独創的な装置を用いて、ERKシグナル伝達の律速段階である核膜孔通過のキネティクスを解明し、さらにセミインタクト細胞による核膜孔個別の履歴現象の直接観察を目指すことで、核膜孔通過の交通ルール解明のための基盤技術を開発する。
γグルタミルシステイン合成酵素の基質特異性に関する構造生物学的研究

γ-グルタミルシステイン合成酵素(GCS)は、グルタチオン合成反応の律速段階を触媒することから、体内グルタチオンレベルを保つための中心的な役割を果たしており、また抗原虫薬や抗ガン剤のターゲットの一つとなる酵素である。今回、我々は、スルホキシミン構造を基盤とする遷移状態アナログとの複合体、および古典的なGCS特異的阻害剤butionine sulfoximine(BSO)との複合体について大腸菌由来GCSの結晶構造をそれぞれ2.1Åおよび2.3Å分解能で決定した。両複合体中の構造から、これまで分からなかった本酵素のシステイン結合部位は遷移状態で形成され出現することが初めて示された。リガンドが結合していない時には、このシステイン結合部位は大きく開いた空間となっており、フィードバック阻害を引き起こすグルタチオンがこの部位に結合することができることが示唆された。遷移状態アナログが結合すると、241番目と300番目のチロシン残基の側鎖が回転し、阻害剤のシステイン類似部分のカルボキシル基と水素結合のクラスタを形成、同時にシステイン類似部分の側鎖が浅いポケットに結合することで強力な阻害を可能にしていることが明らかとなった。BSOでは末端カルボキシル基がないため、この300番目のチロシン残基側鎖は一定のコンフォメーションをとっていないことが分かった。BSOによる阻害が極めて遅くなるのは、阻害剤結合時のコンフォメーションの違いに起因することが示唆された。今回得られた結晶構造に基づき、配列解析では分からなかったほ乳類や寄生原虫などのGCSシステイン結合部位の配列を予測することに成功した。この発見は、医薬として有効な新規GCS阻害剤を設計する上で重要な知見を提供するものである。γ-グルタミルシステイン合成酵素は、MgATPの存在下グルタチオンの前駆体であるγ-グルタミルシステインを合成する酵素である。本酵素を特異的に阻害するsulfoximine構造を有する遷移状態アナログとの複合体について、2.1Å分解能における結晶構造を決定した。ATP共存下における反応により準不可逆的に遷移状態アナログを結合させた複合体を結晶化に用いた。SPring-8ビームラインBL41XUにおいてX線回折強度測定を行い解析した結果、本結晶の空間群はP2_1、格子定数a=70.5,b=97.4,c=102.2Å,β=109.6°であった。初期位相は分子置換法により得られ、最終的にR_<cryst>=19.9%,R_<free>=22.5%のモデルを得た。得られた構造モデルより、ATPのγ位リン酸基はアナログに完全に転移しておりsulfoximineの絶対配置は予想通りR配置となっていることが示された。Sulfoximine基のNS窒素原子は、Mg^<2+>に配位して、転移したγ位リン酸基、Glu-29、Glu-67とともに平面を構成する。これにより、グルタミン酸のγ位カルボキシル基上に位置するLUMOがシステインによる求核攻撃に有利な配向をとるように厳密に制御されていると考えられた。Tyr-131,Tyr-300のphenol-OH基は、carboxybutyl基のCOOH基と水素結合可能な距離に位置した。遷移状態アナログの結合に伴い240-249残基からなるスイッチループが大きく構造変化しており、これらの構造変化に伴いTyr-131,Tyr-300の側鎖が大きく回転することでCOOH基を認識できるようになることが分かった。以上より、遷移状態アナログの結合に伴うslow-bindingにはこれらの構造変化が関与しており、遷移状態の安定化に関与するこれらの構造変化が初めて示された。

γ-グルタミルシステイン合成酵素の特異的阻害剤として古くから知られるBSOとの複合体について、2.3Å分解能における結晶構造を決定した。ATP共存下における反応によりBSOを結合させた複合体を結晶化に用いた。SPring-8ビームラインBL38B2においてX線回折強度測定を行い解析した結果、本結晶の空間群はP2_1、格子定数a=70.5,b=97.6,c=102.2Å,β=102.7°であった。初期位相は分子置換法により得られ、最終的にR_<cryst>=21%,R_<free>=24%のモデルを得た。BSOでは、システインのα-カルボキシル基に相当する官能基が無いのにもかかわらず、Tyr-241の側鎖はターンしてGln-144と水素結合しうることが分かった。一方、Tyr-300は、側鎖に対応するような電子密度ピークは認められず、一定のコンフォメーションを取っていないものと考えられた。これは、水素結合triad形成による安定化が得られなくなったのと同時に、Tyr-241側鎖のターンにより、π-πスタッキングによる安定化がなくなり、側鎖の自由回転が許容されたためではないかと思われた。このように、BSOでは水素結合triadの形成ができないことが明らかとなり、これがBSOの酵素への親和性が遷移状態アナログに比べて低下している理由と考えられた。従って、中央variable arm及びシステイン結合部位のコンフォメーション変化と水素結合triadの形成を制御することが本酵素の阻害剤設計に重要であると考えられた。
高血圧性臓器障害における炎症機転の重要性

本研究の目的は、慢性高血圧モデルでの臓器障害進展における炎症機転の意義を明らかにすることである。a.自然高血圧発症ラット(SHR)に両側sino-aortic denervation (SAD)により血圧反射除神経したSHR+SADラットを作成した。このラットは、テレメトリー法を用いて24時間連続血圧モニターを行ったところ、慢性安定高血圧モデルであるSHRと比較して、平均血圧は変化しないが平均血圧の標準偏差、共変動が著明に増大していた。これは血圧の変動が増大していることを意味する。すなわち、血圧変動高血圧モデルの開発に成功した。b.SHRにSADまたはsham手術を施行し7週間後に心臓を摘出した。血圧変動高血圧ラット(SHR+SAD群)は、血圧安定高血圧ラット(SHR群)に比して、求心性心肥大が助長されていた。組織学的検討により、血圧変動により心筋横径が増加していた。また、SHR群では線維化は心筋内血管周囲に軽度認められるのみであったが、SHR+SAD群では著明な血管周囲線維化に加え、patchyでmassiveな心筋細胞脱落部位に一致した置換性線維化を広範に認めた。c.SHR群では心筋内血管周囲に軽度認められたマクロファージ浸潤が、SHR+SAD群では血管周囲への浸潤が著増した。リアルタイムRT-PCR法によりマクロファージに対する強力なケモカインであるMCP-1、炎症性サイトカインIL-1β・TNF-α、組織線維化因子TGF-β、アンジオテンシノーゲン遺伝子の発現を検討したところ、SHR+SAD群ではSHR群に比して、著明な発現亢進を認めた。d.非降圧量のアンジオテンシン受容体拮抗薬(ARB)を投与したところ、MCP-1、IL-1β、TNF-α発現増強が減弱しマクロファージ浸潤が抑制された。さらに、心筋肥大や心筋線維化の増悪が抑制された。以上から、心筋組織アンジオテンシン系活性化が血圧変動による心筋リモデリング助長に関与することが示唆された。(2)高脂血症、糖尿病といった危険因子が臓器障害を増悪させるメカニズムについての検討:インターフェロンγ(IFNγ)機能を抑制する可溶型IFNγ受容体遺伝子治療を開発し、IFNγによる炎症抑制が、アポE-KOマウス動脈硬化病変退縮・安定化、血管傷害後再狭窄抑制に有用なことを示した。本研究の目的は、(1)慢性高血圧モデルでの臓器障害進展における炎症機転の意義を明らかにする。(2)血圧変動や高脂血症、糖尿病といった危険因子が臓器障害を増悪させるメカニズムを明らかにすることである。本年度は、以下の点について研究を実施した。(1)血圧変動が高血圧性臓器障害を増悪させるメカニズムについての検討:a.自然高血圧発症ラット(SHR)に両側sino-aortic denervation(SAD)により血圧反射除神経したSHR+SADラットを作成した。このラットは、テレメトリー法を用いて24時間連続血圧モニターを行ったところ、慢性安定高血圧モデルであるSHRと比較して、平均血圧は同等であるが血圧変動が著明に増大していた。

すなわち、血圧変動高血圧モデルの開発に成功した。b.SHRにSADまたはsham手術を施行し7週間後に心臓を摘出した。SHR+SAD群は、SHR群に比して、左室重量・心筋横径が増加しており心肥大が助長されていた。一方、Mallory-Azan染色にて、SHR群では心筋内血管周囲に軽度認められた線維化が、SHR+SAD群では著明な血管周囲炎症のみならず、patchyでmassiveな心筋脱落部位に一致した置換性線維化が広範に認められた。c.免疫組織学的に検討すると、SHR群では心筋内血管周囲に軽度認められたマクロファージ浸潤が、SHR+SAD群では血管周囲への浸潤が著増した。RT-PCR法を用いてマクロファージに対する強力なケモカインであるMCP-1の遺伝子発現を検討したところ、SHR+SAD群ではSHR群に比して、著明な発現亢進を認めた。d.現在、その他の炎症性サイトカイン、接着因子、増殖因子、間質メタロプロテアーゼの発現解析を行っている。(2)血圧変動や高脂血症、糖尿病といった危険因子が臓器障害を増悪させるメカニズムについての検討:マルチプルリスクファクター症侯群のモデル動物であるOLETFラットにSADを施行することで、血圧変動増大マルチプルリスクファクターモデルを作成中である。元来、SHRに比してOLETFラットが脆弱であることから、麻酔死、周術期死亡などの頻度が高いため、安定したモデルの作成に難渋している。手術施行時期、麻酔法、周術期管理の示適化を現在行っており、近々モデル作成に成功する目途が立った。本研究の目的は、(1)慢性高血圧モデルでの臓器障害進展における炎症機転の意義を明らかにする。(2)血圧変動や高脂血症、糖尿病といった危険因子が臓器障害を増悪させるメカニズムを明らかにすることである。本年度は、以下の点について研究を実施した。(1)血圧変動が高血圧性臓器障害を増悪させるメカニズムについての検討:a.自然高血圧発症ラット(SHR)に両側sino-aortic denervation(SAD)により血圧反射除神経したSHR+SADラットを作成した。このラットは、テレメトリー法を用いて24時間連続血圧モニターを行ったところ、慢性安定高血圧モデルであるSHRと比較して、平均血圧は変化しないが平均血圧の標準偏差、共変動が著明に増大していた。これは血圧の変動が増大していることを意味する。血圧変動高血圧ラット(SHR+SAD群)は、血圧安定高血圧ラット(SHR群)に比して、求心性心肥大が助長されていた。組織学的検討により、血圧変動により心筋横径が増加していた。また、SHR群では線維化は心筋内血管周囲に軽度認められるのみであったが、SHR+SAD群では著明な血管周囲線維化に加え、patchyでmassiveな心筋細胞脱落部位に一致した置換性線維化を広範に認めた。c.SHR群では心筋内血管周囲に軽度認められたマクロファージ浸潤が、SHR+SAD群では血管周囲への浸潤が著増した。リアルタイムRT-PCR法によりマクロファージに対する強力なケモカインであるMCP-1、炎症性サイトカインIL-
財産区有林の利用と管理の変遷に関する研究

地域における林野利用と管理の変遷に着目し,本研究では岩手県陸前高田市矢作町の旧財産区有林を事例としてとりあげた。かつて調査した財産区設立から昭和終期頃までの展開の後の変化および現在の状況の整理を通じて,地域における林野(地域森林資源)の今後のあり方,果たすべき役割を考える上で重要な点を明らかにすることを目的とした。調査研究は,文献・資料の整理・分析と地元関係者への聞き取り調査によって行った。成果として次の点が明らかになった。かつて村有林の時代に,薪炭材生産の供給源等の役割を果たし,村民の共同の山として利用され村民の生活を支える基盤となってきた林野が,昭和30(1955)年の町村合併を機に財産区有林となった。それから昭和終期頃までの約30年,内実を変えながらも地域農林家と財産区有林との関わりは維持されていたが,時を経て財産区運営が厳しくなるなかで,平成13(2001)年に財産区有林は市有林に移管された。地域住民との関わりが深かった林野の市有林への移管には紆余曲折があったが,現在,市有林の一部として市の管理のもと,財産区時代と同水準の森林整備が行われており,「地域森林資源の維持・管理」は確保されているといえる。しかし,いまなお精力的な木炭生産等の取組みによる根強い需要がある一方で,旧財産区有林の利用自体は落ち込みをみせている。そのようななかで,当該地域が受け入れた都会の大学生の林業体験が定着をみており,それが旧財産区有林を含めた地域森林資源の有効活用策への手がかりになりえようとしている。外部活力の受け入れを通じて,地元住民が地元地域の林野を,自ら関わる地域資源として捉えなおしていくことの重要性をこの事例から確認できた。近年,地球温暖化問題なども背景に,森林資源の適切な維持管理が重要な課題となっているなかで,各地域が抱える課題解決に向けたさらなる考察が今後の課題である。
ヒトTリンパ球・Tリンパ性腫瘍におけるホメオボックス遺伝子群の発現・機能解析

1.ヒト末梢血T細胞におけるホメオボックス遺伝子発現の検討HOX-B7およびHOX-C4特異的なプライマーを作成し、RT-PCR法により正常人末梢血リンパ球中の発現を検討した。未刺激リンパ球においてRT-PCR法にてHOX-B7およびHOX-C4メッセージを検出した。リンパ球を抗体を用いて、亜分画に分けて、同様の検討を行ったところ、CD4陽性ヘルパーTリンパ球分画およびCD8陽性キラーTリンパ球分画の双方に同メッセージが陽性であり、これらのメッセージの発現はヘルパーまたはキラーT細胞の細胞系列決定には重要でないと考えた。遺伝子発現がTリンパ球の活性化と関連している可能性を検討するため、末梢血Tリンパ球を活性化抗原であるHLA-DR抗原あるいはメモリーT細胞に発現するCD45RO原の有無で分割して検討した結果、活性化Tリンパ球分画およびメモリーT細胞分画により強いメッセージの発現を認めた。これらの結果から、Tリンパ球活性化にともなってホメオボックス遺伝子メッセージの発現が起こることが示唆された。これを確認するために、Tリンパ球を薬物を用いて刺激し、刺激後の各時点にてメッセージの発現を検討したところ、HOX-B7、HOX-C4メッセージとも刺激後早期に一旦低下し、刺激後36時間にかけて再び増強し、刺激後24時間には刺激前の数倍と見積もられる量のメッセージが認められた。アンチセンス法を用いてHOX-B7あるいはHOX-C4遺伝子の発現を抑制した系でのTリンパ球活性化が抑制されるかどうかの検討が必要である。2.HOX-B7産物の機能解析HOX-B7遺伝子の順方向および逆方向に組み込んだベクターを作成し、HOX-B7遺伝子発現陽性および除性のTリンパ球性白血病細胞株に遺伝子導入を試みた。HOX-B7発現陰性細胞株は元来、遺伝子導入困難とされている株であり今までのところ遺伝子導入に残念ながら成功していない。