hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
予防、治療を目指したヒト疾患特異的iPS細胞を用いた骨系統疾患解析に関する研究

歯科口腔外科領域の代表的な骨系統疾患である鎖骨頭蓋異形成症、線維性異形成症のヒト疾患特異的iPSを用いた病態解析を行う。疾患を制御する薬剤候補物質を探索することで、予防・治療へのアプローチが確立され、罹患患者に提供することを目指す。線維性異形成症の患者から多数のクローンのiPS細胞の株を樹立した。研究に必要な変異のないコントロール用のiPS細胞は多数確保することはできたが、変異のある疾患特異的iPS細胞の樹立ができていない。医の倫理委員会の承認を受け、京大病院ですでに研究がスタートしている「ヒト疾患特異的iPS細胞の作成とそれを用いた疾患解析に関する研究」のプロジェクトの一つとして本研究に取り組んだ。研究参加の同意の得られた線維性異形成症(Fibrous Dysplasia of bone: FD)患者3人の病変部の手術検体より細胞を採取した。CiRA(京都大学iPS細胞研究所)において、レトロウイルスベクターを用いて4遺伝子(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc)を導入することによりiPS細胞の作成を試みた。FD病変部位において、GNAS遺伝子変異のある変異細胞とない健常な細胞とがモザイク状態で分布していると報告されているため、1人目の患者さんにおいて、手術検体の病理組織切片の病変部から抽出したgenomic DNAにおいて201番目のArgの遺伝子変異の有無を確認した。ダイレクトシークエンスにて201番目のArgの遺伝子変異の確認することができた。そこで、12クローンのiPS細胞を作成し、病変採取部位から樹立したiPS細胞よりgenomic DNAを抽出し、ダイレクトシークエンスにて201番目のArgの遺伝子変異の有無を確認した。12クローンすべてが正常型で、変異型のiPS細胞は認めなかった。そこで、2人目の患者さんからは、樹立するiPS細胞クローンの数を増やすこととし、61クローンのiPS細胞を樹立した。同様に変異の有無を確認したが、201番目のArgの遺伝子変異を有するiPS細胞株を得ることはできなかった。3人目の患者さんにおいては、手術検体と手術検体より得られたiPS細胞作製するための培養細胞からそれぞれgenomic DNA抽出し検討を行っているところだ。FD病変部位において、GNAS遺伝子変異のある変異細胞とない健常な細胞とがモザイク状態で分布していると報告されているため1人目の患者さんにおいて、手術検体の病理組織切片の病変部から抽出したgenomicDNAにおいて201番目のArgの遺伝子変異の有無を確認した。そこでCiRA(京都大学iPS細胞研究所)においてレトロウイルスベクターを用いて4遺伝子(Oct 3/4、Sox2、klf4、c-Myc)を導入することによりiPS細胞の作製を試みた。12クローンのiPS細胞を作製し、病変採取部位から樹立したiPS細胞よりgenomic DNAを抽出し、ダイレクトシークエンスにて201番目のArgの遺伝子変異の有無を確認した。そこで、2人目の患者さんからは樹立するiPS細胞クローンの数を増やすこととし、61クローンのiPS細胞を樹立した。3人目の患者さんにおいては、手術検体及び手術検体より得られたiPS細胞作製するための培養細胞から抽出したgenomic DNAにおいて201番目のArgの遺伝子変異の有無を確認したが、確認できなかったためiPS化をしなかった。4、5人目の患者さんにおいて、3人目の患者さんと同様に手術検体及び手術検体より得られたiPS細胞を作製するための培養細胞から抽出したgenomic DNAにおいて201番目のArgの遺伝子変異の有無を確認し、確認できたため、よりiPS化されやすいエピソーマルベクターを用いて6遺伝子(Oct 3/4、Sox2、klf4、L-Myc、LIN28、p53-shRNA)を用いてiPS細胞の作製を試み検討を行っているところだ。医歯薬学現在までのところ、研究参加の同意の得られた線維性異形成症(Fibrous Dysplasia of bone: FD)患者3人から、多数のクローンのiPS細胞の株を樹立したにも関わらず、GNAS遺伝子に変異のある疾患特異的iPS細胞の樹立には至っていない。以後の研究に必要なGNAS遺伝子に変異のないコントロール用のiPS細胞は多数確保することができたが、疾患特異的iPS細胞の樹立できていないため、以降の実験にすすむことができない状況である。早急に疾患特異的iPS細胞の樹立に努める。現在までのところ、病変組織より多数のクローンのiPS細胞の株を樹立したにも関わらず、GNAS遺伝子に変異のある疾患特異的iPS細胞の樹立には至っていない。原因として考えられることとしては、1)病変部では、変異細胞とない健常な細胞とがモザイク状態で分布しているとされるが、変異細胞の割合が健常細胞に比較して著しく少ない。

2)病変部の手術検体より細胞を採取する際に、変異細胞と健常細胞の増殖スピード著しく異なり、結果としてiPS細胞をつくるための細胞の中の変異細胞の割合が著しく少ない。3)変異細胞では、健常細胞と比較し、iPS化の効率が著しく悪い。などの可能性が考えれれる。そこで、病変部、手術検体より得られたiPS細胞作製するための培養細胞における変異細胞の割合を算出するために、それぞれのgenomic PCRのfragmentをplasmid vectorにサブクローンすることによりクローン化する。50ー100クローンをシークエンスし、そこで検出される変異型の割合から、病変部、iPS細胞作製するための培養細胞それぞれの変異細胞の割合を算出する。病変部と培養細胞の変異細胞の割合がほぼ同じであれば、培養細胞の作成方法に問題ないことになるため、もともとの変異細胞の割合の5ー10倍程度のiPS細胞クローン(5%であれば、25ー50クローン程度)を作成数の目安とする。培養細胞で変異細胞の割合が下がるようであれば、培養方法を得るための方法を見直し、変異細胞の得られやすいような培養細胞の作成方法を検討する。現在までのところ、研究参加の同意の得られた線維性異形成症(Fibrous Dysplasia of bone: FD)患者3人から、多数のクローンのiPS細胞の株を樹立したにも関わらず、GNAS遺伝子に変異のある疾患特異的iPS細胞の樹立には至っておらず、研究の進行に遅れがでている。そのため、予定していた研究費を使用する必要がなかったため。現在遅れがでている研究を期間内に完了するために、今年度に研究の進行に合わせて使用する予定である。
マイクロ・メゾ領域を統合した結晶異方性エッチングメカニズムの研究

シリコンと水晶を対象として,単結晶の化学的結晶異方性エッチングメカニズムを,メゾスコピックレベルからミクロンレベルの現象まで,統一的に解明することを目的として研究を実施した.シリコン単結晶に対する主要なエッチング液であるKOHならびにTMAH(Tetra Methyl Ammonium Hydroxide)水溶液のエッチング特性の違いをエッチングメカニズムと関連づけて明らかにした.また,エッチング液中の微量成分がエッチング特性(エッチング速度とその異方性,ならびに表面モフォロジ)を変化させる現象を実験的に研究した.一方,解析的には,シリコン表面の原子ステップ,キンクにおける原子除去確率を,表面吸着原子によるシリコン原子間結合力緩和まで考慮したモンテカルロシミュレーションをおこなって,エッチングメカニズムモデルを検証した.以上の結果,シリコン(111)近傍のエッチング速度を律速するエッチングメカニズムが解明された.(111)近傍では,原子ステップの活性がマクロ的な異方性を直接的に左右することが明らかになり,エッチング液の種類による異方性の逆転現象も説明することが出来た.また,この逆転現象はエッチング液の濃度によっても発生することが判り,エッチング液固有の特殊な問題でないことが明らかになってきた.現在,さらにシリコンの他の表面結晶方位に関して,エッチング速度を律速する過程のモデル化を追求している.これと並行して,シリコン単結晶でこれまでに提案者が実施してきた研究手法を水晶(酸化シリコン単結晶)にも適用して,湿式エッチングにおけるエッチング速度の異方性を全方位に渉って明らかにした.この結果,水晶についても結晶異方性エッチングによるエッチング形状を3次元的に解析予測することが出来るようになった.この技術は水晶を基板材料とするMEMSデバイスの加工プロセス開発に役立てることができる.シリコンと水晶を対象として,単結晶の化学的結晶異方性エッチングメカニズムを,メゾスコピックレベルからミクロンレベルの現象まで,統一的に解明することを目的として研究を実施した.シリコン単結晶に対する主要なエッチング液であるKOHならびにTMAH(Tetra Methyl Ammonium Hydroxide)水溶液のエッチング特性の違いをエッチングメカニズムと関連づけて明らかにした.また,エッチング液中の微量成分がエッチング特性(エッチング速度とその異方性,ならびに表面モフォロジ)を変化させる現象を実験的に研究した.一方,解析的には,シリコン表面の原子ステップ,キンクにおける原子除去確率を,表面吸着原子によるシリコン原子間結合力緩和まで考慮したモンテカルロシミュレーションをおこなって,エッチングメカニズムモデルを検証した.以上の結果,シリコン(111)近傍のエッチング速度を律速するエッチングメカニズムが解明された.(111)近傍では,原子ステップの活性がマクロ的な異方性を直接的に左右することが明らかになり,エッチング液の種類による異方性の逆転現象も説明することが出来た.また,この逆転現象はエッチング液の濃度によっても発生することが判り,エッチング液固有の特殊な問題でないことが明らかになってきた.現在,さらにシリコンの他の表面結晶方位に関して,エッチング速度を律速する過程のモデル化を追求している.これと並行して,シリコン単結晶でこれまでに提案者が実施してきた研究手法を水晶(酸化シリコン単結晶)にも適用して,湿式エッチングにおけるエッチング速度の異方性を全方位に渉って明らかにした.この結果,水晶についても結晶異方性エッチングによるエッチング形状を3次元的に解析予測することが出来るようになった.この技術は水晶を基板材料とするMEMSデバイスの加工プロセス開発に役立てることができる.(1)シリコンの結晶異方性エッチングの研究シリコン単結晶の結晶異方性エッチング特性が,エッチング液,添加剤などに依存して大きく変化する現象を,エッチング面のモフォロジーの変化と関連づけて研究する目的で,エッチング中のシリコン表面に発生する微細な凹凸模様の変化をin-situで光学的に観察する装置を設計製作した.来年度から観察を開始する.TMAH(Tetra Methyl Ammonium Hydroxide)水溶液に微量の界面活性剤を添加するとエッチング速度の異方性が激変する現象に関して,界面活性剤の分子構造とそのエッチング特性への効果,ならびに,界面活性剤の添加量の効果を明らかにするため,構造の異なる界面活性剤を入手して比較実験を開始した.高濃度のKOH水溶液では一般にエッチング速度は低下するが,摂氏100度以上の高温でエッチングすると,エッチング速度はきわめて大きく,かつ(110)において平滑なエッチング面が得られることがわかった.(2)水晶の結晶異方性エッチング特性評価の検討水晶単結晶インゴットから球形試験片を製作し,エッチング前後の表面形状変化からエッチング速度の異方性を全方位に渉って測定した.水晶に関して従来公表されている限られた方位のエッチング速度と上記データとを比較して,球形試験片を使った全方位のエッチング速度測定法の妥当性を検証した.本研究で初めて得られた全方位のエッチング速度のデータを,すでに開発済みのエッチングシミュレータに入力して,矩形のマスクパターンを持つ水晶ウェハのエッチング中の形状変化を解析できることを確認した.ただし,きわめてエッチング速度の小さいm面を含む領域については,エッチング速度の測定をさらに精密に行うことが必要と考えるので,今後さらにエッチング速度測定を追加して実施して,詳細なエッチングデータベースを完成させる予定である.(1)シリコンの結晶異方性エッチングの研究(a)シリコン(100)面をKOH水溶液でエッチングするさいに,円形の浅い巨大なエッチピットが生じることが知られている.この発生原因を追及した.シリコン(100)でエッチングレートが極小値をとること,また,その近傍ではエッチング速度が等方的に増加することから,結晶表面の欠陥を核とするピットがエッチングの進行とともに拡大するというモデルを立てた.

ナノインデンテーション法を使って,シリコン(100)表面に微小な接触力を加えたのちエッチングしたところ,閾値以上の荷重において,高い再現性で円形ピットの発生を観察した.この結果,上記モデルを実証するとともに,工業的な生産プロセスにおけるエッチピット発生抑制の指針を得た.(b)KOH水溶液でシリコン(110)および(100)をエッチングするさいに,エッチング液に含まれるppbレベルの金属不純物が,エッチング速度ならびにエッチング表面粗さに影響することを見出した.水素よりもわずかに還元電位の高い銅では100ppbの濃度以上で表面粗さの著しい増大が観察され,一方,水素よりわずかに還元電位の低い鉛では,100-500ppbの濃度範囲でエッチング速度が極小値を示した.水素と金属イオンとの還元作用の競合による金属の析出,これによるシリコン表面のマスク効果がその原因と考えられる.(c)エッチング液に加えるわずかな非イオン系界面活性剤(ポリオキシエチレン・ノニル・フェニル・エーテル)の効果を研究した.この界面活性剤は,エッチング溶液に対して0.1wt%以上の添加で安定的に効果があり,結晶方位に関して選択的にエッチング速度を低下させると同時に,エッチング面の表面モフォロジに大きく影響する.界面活性剤の分子量を変化させ,その効果を調べたところ,低分子量においてエッチング表面の平滑化効果があることが判った.(2)水晶の結晶異方性エッチング特性評価の検討水晶単結晶インゴットから球形試験片を製作し,エッチング前後の表面形状変化からエッチング速度の異方性を全方位に渉って測定するとともに,特にエッチング速度の小さいm面を含む領域については,別途,平面試験片を作成して精密にエッチング速度を測定した.これにより,水晶に関して,全方位にわたる詳細なエッチング速度データが得られた.このデータは,水晶デバイスの3次元エッチング形状をシミュレーションで解析するさいの重要な手がかりとなる.シリコンと水晶を対象として,単結晶の化学的結晶異方性エッチングメカニズムを,メゾスコピックレベルからミクロンレベルの現象まで,統一的に解明することを目的として研究を実施した.シリコン単結晶に対する主要なエッチング液であるKOHならびにTMAH(Tetra Methyl Ammonium Hydroxide)水溶液のエッチング特性の違いをエッチングメカニズムと関連づけて明らかにした.また,エッチング液中の微量成分がエッチング特性(エッチング速度とその異方性,ならびに表面モフォロジ)を変化させる現象を実験的に研究した.
樹木の日長反応における補光期および暗期温度に関する研究

日長反応は樹木の発育生理の中で重要な反応である。特に、冬にむかって越冬に必要と考えられる成長停止・冬芽形成の時期は、その樹木の生存にかかわる問題である。しかし、温度の低下傾向の晩夏から初秋にかけてのみられる成長停止・冬芽形成をもたらす短日反応における温度の影響を明確にした研究は少ない。そこで、この日長反応での主明期(強光期)、補光期(弱光期)と暗期の温度を区別して、温度の影響を研究した。ポプラの成長停止・冬芽形成における暗期効果に及ぼす影響は、明期温度25°Cでは、暗期効果が最も高いのは25°Cで14時間日長が限界日長であるが、暗期温度10°Cでは12時間日長、暗期温度30°Cでは10時間日長が限界日長となり、暗期効果は低下する。また、明期(6時間補光期・弱光期)は20°C以上ではその効果は低下してくる。そこで、秋の夜温の低下は短日効果の抑制に、その後の朝夕の明期における気温の低下は短日効果の増進をもたらすことになる。また、明期と暗期の温度の組合せによって、同じ日長でも短日にも長日にも、その効果は変化することになる。シラカンバの成長停止・冬芽形成に及ぼす温度の影響をみると、明期温度25°Cでの短日効果が最も高い暗期温度15°Cで、北方に分布する樹木らしくポプラに比べて低いのが目立つ。しかし、それより高い温度でも低い温度でも、暗期の短日効果は低下する。また、北海道と長野産のシラカンバの間で短日効果をもたらす限界日長に明らかな差があることが確認された。カラマツの成長停止・冬芽形成に及ぼす温度の影響をみると、シラカンバと同じ傾向をしめした。また、北海道のカラマツは、まだ、北海道の気候に完全に同調できてはいないようで、気象害にあう可能性があると考えられる。今後、各樹種の種子の産地を増やして、各地の気候の季節変化に、そこで成育している樹木がどのように同調した成育パタ-ンを示しているか解明したい。
環境汚染物質による機能奇形試験

土地造成に際して、大量の殺菌剤が散布される。それらの発生毒性についてはよく知られていない。したがって、胎生期の毒性受容過程を調べる必要がある。この時期は毒物の一次作用を受け易く、神経組織を代表として細胞分化の途中にある。よって本研究では、胎生期にこれらの活性物質に曝された動物の発育過程に現われる神経機能異常を探索した。芝生の病害に対して抗菌域が広くかつ優れた持続効果と予防効果を果たす殺菌剤の一例であるイプロジオン(iprodione,IPRD)製剤を検体として取り上げた。本剤の有効成分であるIPRDのマウスにおける発生毒性を調べるため、これで処置した母マウスから生まれた産仔における発育、各種機能試験および運動神経伝達物質の放出能を調べた。その結果、IPRDによる母マウスの処置が妊娠の後期、すなわち器官形成期以降の場合には発生学的な機能異常を生じる可能性が乏しいが、妊娠の全期間を通じて母マウスがその処置を受け続けた場合には、その産仔に少なくとも運動機能の異常を生じる可能性を示した。IPRD処置母マウスの産仔における行動試験では、反応性の亢進、自発行動量の増加あるいは触刺激に対する応答性の亢進を認めた。試験管内実験では、終板の静止膜電位の減少、運動神経伝達物質の自発性および誘発性放出量の増加を認めた。すなわち、少なくとも、自発的な機能の亢進および外来性の刺激に対する過剰応答の可能性を伝達物質の放出量の増加を通して示し得た。運動神経伝達物質の放出のCa^<2+>依存性を調べた実験では、IPRD処置した母マウスの産仔では、1素量の伝達物質の放出に要するCa^<2+>が3原子であることを示した。以上を要するに、IPRDによる母マウスの処置が妊娠の全期間におよぶ場合、その産仔に、運動神経伝達物質の放出能の変化を含めて、少なくとも運動機能に異常を生じる可能性を示した。これは、神経分化において初めて言及したIPRD感受性のCa^<2+>調節過程である。本剤の有効成分であるIRPDのマウスにおける発生毒性を調べるため、これで処置した母マウスから生まれた産仔における発育、各種機能試験および運動神経伝達物質の放出能を調べた。IPRD処置母マウスの産仔における行動試験では、反応生の亢進、自発行動量の増加あるいは触刺激に対する応答生の亢進を認めた。

すなわち、少なくとも、自発的な機能の亢進および外来性の刺激に対する過剰応答の可能性を伝達物質の放出量の増加を通して示し得た。運動神経伝達物質の放出のCa^<2+>依存性を調べた実験では、IPRD処置した母マウスの産仔では、1素量の伝達物質の放出に要するCa^<2+>が3原子であることを示した。以上を要するに、IPRDによる母マウスの処置が妊娠の全期間におよぶ場合、その産仔に、運動神経伝達物質の放出能の変化を含めて、少なくとも運動機能に異常を生じる可能性を示した。これは、神経分化において初めて言及したIPRD感受性のCa^<2+>調節過程である。
ミクログリア機能への温度センサーTRPM2の寄与

膵臓β細胞は、血中グルコース濃度の上昇に応じてインスリンを分泌することで血中グルコースレベルを適正な範囲に調節する働きをする。このβ細胞からのインスリン分泌には、グルコース代謝により生じたATPによるKATPチャネル機能抑制と、それに伴う脱分極、電位依存性カルシウムチャネルの活性化といった典型的な経路に加え、KATPチャネルに依存しない経路が関わることが明らかとなってきている。本研究では、このKATP非依存性の経路の一端としてのTRPM2チャネルの関わりと、レドックスシグナルおよび温度の関係性について、活性酸素によるTRPM2活性化温度閾値調節という切り口から明らかとした。マウス新生仔大脳皮質から得た培養ミクログリア細胞において、TRPM2の機能的発現が認められ、熱刺激に対する応答が過酸化水素によって増強し、その応答がTRPM2欠損細胞で消失することを確認した。マイクロエクスプラントカルチャーにより得た伸長軸索とミクログリアの混合培養により、変性軸索クリアランスへのTRPM2の関与を検討したが、野生型とTRPM2欠損細胞の間に有意な差を得ることができなかった。この結果は、ミクログリアにおけるTRPM2発現量が細胞ごとに一定でないことが原因と考えられた。したがって、ミクログリアでの検討は難しいと判断し、同じくTRPM2が発現しており、グルコース、インスリンといった生理的シグナルにより活性酸素を産生する膵臓β細胞を用いた検討に移った。膵臓β細胞においてもTRPM2の機能的発現が確認され、熱刺激に対する細胞内カルシウム濃度上昇が過酸化水素処置により増大し、TRPM2欠損細胞で応答が消失することを確認した。また、膵臓β細胞に発現するTRPM2の体温下での活性がレドックスシグナル下で変化することで、β細胞からのインスリン分泌の調節に関わる可能性を検証するため、グルコースにより惹起されるインスリン分泌に対する温度および抗酸化剤(N-アセチルシステイン;NAC)の効果を検討した。その結果、インスリン分泌のNAC感受性の成分が、野生型ランゲルハンス島においては温度依存性に増大したが、TRPM2欠損膵島においては消失していることを明らかとした。本研究では、このKATPチャネル非依存性の経路の一端としてのTRPM2チャネルの関わりとレドックスシグナルおよび温度の関係性を、“活性酸素によるTRPM2活性化温度閾値調節"という切り口から明らかとした。生理学ミクログリアを用いた検討は、残念ながら達成できなかったものの、膵臓β細胞を用いた検討により、生理的レベルのレドックスシグナルにより体温下TRPM2の活性が調節されることで、インスリン分泌を促進的に調節していることを明らかにした。今後、膵臓β細胞における熱応答が過酸化水素刺激による増強する現象を、ホールセルパッチクランプ法によっても確認する。また、in vitroで得られた結果が、in vivoにおいても再現できるかを検討するために、マウス個体を用いたグルコース負荷試験を行い、抗酸化物質の影響を検討する。得られた結果をもとに、論文を投稿する。計画の変更に伴い、当初計上していた細胞培養用の試薬、抗体、妊娠マウス購入費が不要となったため。次年度に行う、in vivoグルコース負荷試験において、マウス購入費、血中グルコース測定キット、インスリンELISAキットに多額の費用が必要と予想されるため、繰り越し分と合わせて請求する。
遺伝子発現の光操作を可能にする機能性分子の開発

光作動性転写因子GAVPOの分子進化により様々なバリアントを作成し、それぞれの実験系に適したGAVPOバリアントを選択できるように組織化した。また、GAVPOの応答配列であるUASについても、コピー数や塩基配列について再検討を行った。また、細胞や組織への遺伝子導入の際においても、GAVPOの発現量、UASのコピー数と、それらの比についても、再度検討をおこない、もっともS/N比良く遺伝子発現を光誘導できるようなシステムの構築を行った。GAVPOのバリアントとしては、薬剤の有無により細胞内での発現量や局在をコントロールし、光応答性の遺伝子発現誘導活性をより厳密にコントロールできるものを作製中である。28年度が最終年度であるため、記入しない。
生物時計における抑制複合体の解明

Tet-Off Flag-Per2 NIH3T3系を用いてPER2に結合する蛋白質を同定した。SDS上展開の後、MS解析を行って得られた物質Mのコンディショナルノックアウトマウスを用いて研究した。全身発現CREを用いると、妊娠中期までに脱落し、胎生致死であった。ニューロン特異的CREを用いた脳特異的コンディショナルノックアウトを作成することに成功し、行動を検定中である。さらに、この物質が核酸代謝に関与することに注目し、核酸と日内リズムに関してメタボローム検索を進め、肝臓の時計は、肝細胞からヌクレオチドを全身臓器にリズミックに供給していることを発見した。ヌクレオチドであるATPは細胞のエネルギー産生に極めて重要であるが、これらはADPの量によって決まる。時計は、ミトコンドリアにあるADPを作る酵素の働きを活動期である夜間にADPの産生量を上げ、時計がないとATPが減少する。次に、我々の体を構成する細胞は恒常的なものでなく、常時、細胞が死に、その代わりとなる細胞が生まれている。この再生時に、核の成分である遺伝情報を担うDNAの構成成分となるdATP、dGTP、dTTP、dCTPの生成は、時計遺伝子によってコントロールされ、時計が無いと減少する。さらに、時計遺伝子Bmallの発現を肝臓で押さえると、肝臓での尿酸量が通常の倍以上に上がる。これは、時計欠損によりプリンの合成が弱まり、分解が亢進することによる。今回明らかとなった核酸酵素の日内変動の研究により、抗がん剤の副作用の日内変動を引き起こす重要な制御因子として、時計遺伝子による制御が示唆された。生物時計における抑制複合体の解のため、Flag-mPer2発現アデノウイルスを作製し、C57B6マウス尾静脈へ投与し、感染した肝臓を摘出後、核・細胞質分画を行った。抗Flag抗体カラムを作成し、分画内のFlag-Per2複合体をカラムへ結合させ、Flag-peptideによるFlag-Per2複合体を回収した。次に、Glycerol Gradientにより複合体の大きさで分画し、SDS-PAGEで各蛋白質を分離し、銀染色後、バンドを切り出し、MS/MS解析を行った。これにより、現在のところ、3つの蛋白質の同定した。これらの同定された蛋白質が真にFlag-mPER2に結合するかを、COS細胞に共発現して検索したところ、その結合を確認した。これら蛋白質が生体リズムの中枢である視交叉上核に発現するかどうかを検索したところ、3種とも発現していた。次に、これら蛋白質のうちの一つ蛋白質MのメッセンジャーRNAが視交叉上核でリズミックに転写制御をうけているかを、定量的in situ hybridizationで調べたところ、朝にピークを持つ、24時間リズムを示した。蛋白質FのメッセンジャーRNAは視交叉上核にてこれも弱いリズムを示した。蛋白質Fはノーザンブロッイングによる解析の結果、肺、心臓、骨格筋、脾臓を初めとする全身の組織に発現していた、また抗体による検索の結果、細胞質、核の両方に存在することが確認された。Tet-Off Flag-Per2 NIH3T3系を用いて、Doxycycline-OFFで血清刺激しリズムを惹起し、PER2蛋白質がピークになる時間帯で細胞を回収し、anti-Flag-M2抗体のカラムに吸着したものをグリセロール濃度勾配で展開し、SDS上展開の後、MAS解析を行って得られた物質Mは、in situ hybridization、RTPCR検索の結果、リズムセンターである視交叉上核だけでなく副腎、肝臓、ファイブロブラストセルラインでリズミックに発現していた。また、まったくリズムの消失したCry-nullマウスでは恒常的に高い値を示した。現在、物質Mのコンディショナルノックアウトマウスを作製し、そのリズムへの効果を検索中である。一方、同様に得られたFについては、PER2への直接結合をタグ標識した各タンパク質を用いて、in vitroで再現した。またノックアウトマウス解析の結果、ホモ接合体は胎生致死であることが判明した。ヘテロ接合体は正常に生まれ、その繁殖も正常であった。ヘテロ接合体を用いて、動物行動解析をしたところ、行動リズムはWTと比べ変動がなかった。従って、現在進行中の準備実験で、我々が独自に開発したPerl-lucレポーターシステムを導入した視交叉上核のスライスカルチャー系に、レンチウイルスを用いてshRNAを導入すると、ルシフェラーゼ発光のリズム周期が変動した。

この再生時に、核の成分である遺伝情報を担うDNAの構成成分となるdATP、dGTP、dTTP、dCTPの生成は、時計遺伝子によってコントロールされ、時計が無いと減少する。さらに、時計遺伝子Bmallの発現を肝臓で押さえると、肝臓での尿酸量が通常の倍以上に上がる。これは、時計欠損によりプリンの合成が弱まり、分解が亢進することによる。今回明らかとなった核酸酵素の日内変動の研究により、抗がん剤の副作用の日内変動を引き起こす重要な制御因子として、時計遺伝子による制御が示唆された。
混合粒径海浜の安定性に関する実証的研究

砂礫混合海浜の安定性を適切に評価あるいは向上させることは、海岸の保全に資するばかりでなく、複数の粒径土砂の相互作用が海浜地形に及ぼす効果を解明する学術的にも重要かつ興味深い課題である。本研究では海岸の礫に非接触で個体識別が可能なRFID(Radio Frequency Identification)タグを埋め込み、個々の粒子レベルで長期間移動経路を追跡することにより、均一粒径海浜とは異なる砂礫海岸特有の海浜変形現象をとらえることに成功した。また、その現象が分級作用によって地形を規定する粒径が波浪条件によって変化することに起因することを明らかにした。砂礫混合海浜の安定性を適切に評価あるいは向上させることは,海岸の保全に資するばかりでなく,複数の粒径土砂の相互作用が海浜地形に及ぼす効果を解明する学術的にも重要かつ興味深い課題である.本年度は,RFIDによる現地海浜での観測を継続するとともに,礫の追跡調査結果をとりまとめ,海岸工学講演会にて成果発表を行うとともに,土木学会論文集に成果を公表した.砂礫混合海浜の安定性を適切に評価あるいは向上させることは,海岸の保全に資するばかりでなく,複数の粒径土砂の相互作用が海浜地形に及ぼす効果を解明する学術的にも重要かつ興味深い課題である.本研究では海岸の礫に非接触で個体識別が可能なRFID (Radio Frequency Identification)タグを埋め込み,個々の粒子レベルで長期間移動経路を追跡することにより,複雑な混合土砂の挙動を正確に把握するとともに,現象の解明をすすめるものである.本年度は,RFIDを現地海浜より採取した礫に埋め込み,アンテナによる探知性能について室内試験によりその探知能力を測るとともに,現地海浜にタグ礫を投入し,1ヶ月間,計7回に渡り,礫の移動を追跡した.その結果,RFIDを用いた追跡では,礫の探知効率が目視探査に比べて約4倍となり,大幅に調査効率が向上した.同時に実施した.高精度GPSによる海浜断面地形測量結果と波浪観測情報を合わせ,堀川ら(1975)によって提案された海浜断面形態に関する無次元パラメーターをもとに観測結果を整理した.その結果,現地砂礫混合海浜では,均一粒径の結果に基づく既往研究の結果と全く異なる土砂移動の傾向があきらかになった.これは,高波浪時と低波浪時で動きうる土砂の粒径分布が変化するために,地形変動を代表する粒径がたとえ同じ海浜であっても,波浪条件によって変化するためであることを示していると考えられる.このように本研究ではRFIDを海浜の土砂移動追跡という新しい分野に導入し,土砂追跡効率を大幅に向上させることに成功するとともに,追跡された移動経路から混合土砂海浜の安定性に関する新しい知見を得た.さらにこれらの成果をOcean Science Meeting 2014等で発表した.砂礫混合海浜の安定性を適切に評価あるいは向上させることは、海岸の保全に資するばかりでなく、複数の粒径土砂の相互作用が海浜地形に及ぼす効果を解明する学術的にも重要かつ興味深い課題である。砂礫混合海浜の安定性を適切に評価あるいは向上させることは,海岸の保全に資するばかりでなく,複数の粒径土砂の相互作用が海浜地形に及ぼす効果を解明する学術的にも重要かつ興味深い課題である.本研究では海岸の礫に非接触で個体識別が可能なRFID (Radio Frequency Identification)タグを埋め込み,個々の粒子レベルで長期間移動経路を追跡することにより,複雑な混合土砂の挙動を正確に把握するとともに,現象の解明をすすめるものである.本年度は,RFIDを現地海浜より採取した礫に埋め込み,アンテナによる探知性能について室内試験によりその探知能力を測るとともに,現地海浜にタグ礫を投入し,1ヶ月間,計7回に渡り,礫の移動を追跡した.その結果,RFIDを用いた追跡では,礫の探知効率が目視探査に比べて約4倍となり,大幅に調査効率が向上した.同時に実施した高精度GPSによる海浜断面地形測量結果と波浪観測情報を合わせ,堀川ら(1975)によって提案された海浜断面形態に関する無次元パラメーターをもとに観測結果を整理した.その結果,現地砂礫混合海浜では,均一粒径の結果に基づく既往研究の結果と全く異なる土砂移動の傾向があきらかになった.これは,高波浪時と低波浪時で動きうる土砂の粒径分布が変化するために,地形変動を代表する粒径がたとえ同じ海浜であっても,波浪条件によって変化するためであることを示していると考えられる.このように本研究ではRFIDを海浜の土砂移動追跡という新しい分野に導入し,土砂追跡効率を大幅に向上させることに成功するとともに,追跡された移動経路から混合土砂海浜の安定性に関する新しい知見を得られた.砂礫混合海浜の安定性を適切に評価あるいは向上させることは,海岸の保全に資するばかりでなく,複数の粒径土砂の相互作用が海浜地形に及ぼす効果を解明する学術的にも重要かつ興味深い課題である.本研究では海岸の礫に非接触で個体識別が可能なRFID (Radio Frequency Identification)タグを埋め込み,個々の粒子レベルで長期間移動経路を追跡することにより,複雑な混合土砂の挙動を正確に把握するとともに,現象の解明をすすめるものである.研究期間においてRFIDを現地海浜より採取した礫に埋め込み,アンテナによる探知性能について室内試験によりその探知能力を測るとともに,現地海浜にタグ礫を投入し,1ヶ月間,計7回に渡り,礫の移動を追跡した.

その結果,RFIDを用いた追跡では,礫の探知効率が目視探査に比べて約4倍となり,大幅に調査効率が向上することを実証した.同時に実施した高精度GPSによる海浜断面地形測量結果と波浪観測情報を合わせ,堀川ら(1975)によって提案された海浜断面形態に関する無次元パラメーターをもとに観測結果を整理したところ,現地砂礫混合海浜では,均一粒径の結果に基づく既往研究の結果と全く異なる土砂移動の傾向があきらかになった.これは,高波浪時と低波浪時で動きうる土砂の粒径分布が変化するために,地形変動を代表する粒径がたとえ同じ海浜であっても,波浪条件によって変化するためであることを示していると考えられる.最終年度は混合粒径効果によって生じる海浜変形の新しい現象について観測結果をとりまとめ、国際堆積学会等で発表を行い、成果の普及に努めた。このように本研究ではRFIDを海浜の土砂移動追跡という新しい分野に導入し,土砂追跡効率を大幅に向上させることに成功するとともに,追跡された移動経路から混合土砂海浜の安定性に関する新しい知見を得られた.海岸工学現地海浜で探知自体はできるものの,当初計画の想定よりも実際に探知できる礫の数が少なく,個別粒子の軌跡を期待していたほどの頻度では追跡できておらず,十分な解析が行えていないため.現地観測で礫の追跡を実施し,RFIDを活用した追跡手法の有効性を確認するとともに砂礫混合海浜における土砂移動と地形変化の関係に関する新しい知見が得られているため,概ね順調に進展していると評価する.本年度は,RFIDシステムについて,現地海浜への適用に有効な周波数やアンテナ,タグ種別に関する検討を室内実験により行い,現地適用可能な探査システムを構築した.さらに,実際の海岸礫にタグと封入し,現地海浜において1ヶ月間にわたり礫の移動追跡を行う実証実験を行い,目視による探知に比べ,礫の発見効率が約4倍と,大幅な調査の効率化が可能であることを確認した.また,得られた成果を均一粒径場に関して既往研究で提案されているの海浜地形変動を代表する無次元パラメーターで現象を整理したところ,現地混合海浜場特有の現象が見つかり,混合海浜の安定性を適切に評価,あるいはモデル化する上で重要な知見が得られた.このように,当初計画されていた室内での実験に加え,現地での実証試験も推進し,研究の本質に迫る重要な知見が得られつつあり,当初計画以上に研究が進展したと評価できる.礫の探査効率が上がらないことが研究の障壁となっているため,機器の小型・軽量化,探査アンテナの増強等の工夫により効率アップを図る.観測で得られた成果に基づき土砂移動および地形変化のモデル化を行う.前年度までに開発したRFIDシステムを活用し,観測情報を蓄積することで,さらに現象を高精度に把握する.これにより,混合海浜の地形変動を規定する新たな無次元パラメーターを提案し,複雑な粒径間の相互作用による海浜地形の応答特性に対する理解を深化させ,適切なモデル化を行う.探査機器の小型データロガー・アンテナの購入および,現地調査旅費,情報収集のための学会参加費等に使用する.現地調査旅費,RFID
肝臓中ｍｉｃｒｏＲＮＡの発現変動が薬物代謝酵素活性に及ぼす影響

ヒト初代培養肝細胞にリファンピシンを処置することにより40種類のmiRNAの発現が2倍以上に変化し、それらが標的遺伝子の発現変化をもたらしている可能性が示された。マウスにmiRNAに対するアンチセンスオリゴを尾静注し、肝臓中の発現をノックダウンすると、薬物代謝酵素活性が変化したことから、miRNAが薬物代謝能の制御に重要な役割を担っていることをin vivoで明らかにした。本研究では肝臓中のmiRNAの発現が何らかの刺激によって変動した際に薬物代謝酵素群が受ける影響を明らかにすることを目的としている。本年度はmiR-122とmiR-27bについてin vivoにおける検討に着手した。miR-122は肝特異的に発現し、かつ、肝臓中で最も豊富に存在するmicroRNAである。miR-122は肝障害時および肝がんにおいて発現が低下することが報告されている。一方、miR-27bはCYP1B1、CYP3A4、薬物代謝酵素の発現を制御するVDRやPPARαなどの転写因子の発現を制御することが明らかになっていることから注目した。miR-122に対するアンチセンスオリゴを肝臓特異的送達脂質ナノ粒子に封入し、マウスに尾静脈より投与した。その結果、肝臓中miR-122発現量が有意に低下し、ノックダウンに成功した。miR-27bについては、pre-miR-27b組換えアデノウィルスを尾静脈から投与した時、肝臓中におけるmiR-27b発現の3倍程度の上昇が認められた。一方、肝臓特異的送達脂質ナノ粒子に封入したpre-miR-27bをマウスに尾静脈より投与した時、肝臓中miR-27b発現が15-20倍に上昇した。以上のように、肝臓特異的送達脂質ナノ粒子の利用により、肝臓中のmiRNAの発現変動を誘発することに成功したため、現在、肝ミクロソームを調製し、各種薬物代謝酵素の発現量および酵素活性を測定しており、今後in vivoにおける薬物動態変化を検討する予定である。本研究ではヒト肝臓中miRNAの発現量が外来からの刺激によって変動した際に薬物代謝酵素群が受ける影響を明らかにすることを目的としている。本年度は、ヒト肝臓中miRNAの発現量が薬物によってどの程度変動するか、リファンピシンを例として検討し、薬物代謝酵素群を含む標的遺伝子産物の発現変動との関係を探った。ヒト肝初代培養細胞を10 μMリファンピシンで処置した時、40種類のmiRNAが2倍以上の発現量の変動を示した。この時、CYP3A4やCYP2C9などを含む165種類の転写産物の発現変動も認められ、miRNAとmRNAの発現変動が逆方向で、miRNAとその標的遺伝子の組み合わせとなるものが16種類存在した。薬物によるmiRNAの発現変動が標的遺伝子の発現をもたらしている可能性が示唆された。また、C/EBPやNFI-Aなどの転写因子によって発現制御されているmiR-223がヒト肝臓中シトクロムb5の発現制御に関わっていることを明らかにした。24検体のヒト肝臓において、miR-233発現量とシトクロムb5のmRNA量または翻訳効率との間に有意な負の相関関係が認められた。シトクロムb5は電子供与やアロステリック効果によりシトクロムP450酵素活性を分子種依存的に上昇させる小胞体膜蛋白質である。miR-223によるシトクロムb5の制御機構は、シトクロムb5依存的分子種であるCYP3A4やCYP2E1の酵素活性を変動させ、一方でシトクロムb5非依存的な分子種であるCYP1A2の酵素活性には影響を与えないことを明らかにした。本研究では肝臓中miRNAの発現量が変動した際に薬物代謝酵素群が受ける影響を明らかにすることを目的としている。肝臓特異的にかつ豊富に発現するmiR-122は肝障害児に発現が低下することが報告されている。その際の薬物代謝能への影響を明らかにするためにmiR-122に対するアンチセンスオリゴを肝臓特異的送達脂質ナノ粒子に封入し、マウスに尾静注したところ、肝臓中miR-122の顕著な低下が認められ、ノックダウンに成功した。その肝ミクロソーム画分では、コントロール群と比べてミダゾラム水酸化酵素活性やトルブタミド水酸化酵素活性の上昇と、モルヒネグルクロン酸抱合活性の低下が認められたことから、シトクロムP450やUDP-グルクロン酸抱合活性がmiR-122発現変動により影響を受けることを明らかにした。以前の研究でretinoid X receptor α(RXRα)がmiR-34aによって調節を受けることを明らかにしている。最近、RXRαが肝線維化に対して保護作用を有することが報告されたことから、miR-34aをノックダウンすることで肝線維化を抑制できる可能性を検討した。四塩化炭素投与による肝線維化モデルマウスを作成したところ、肝臓中miR-34a発現量の有意な上昇が認められ、脂質ナノ粒子に封入したmiR

-34aに対するアンチセンスオリゴを尾静注することでmiR-34a発現量はコントロールレベルまで低下した。さらに肝線維化の発症および進行が抑制されたことを、組織学的検査ならびに線維化マーカー発現レベル等の解析により明らかにした。以上、これまで薬物代謝酵素の発現制御におけるmicroRNAの役割は細胞等を用いたin vitro実験で明らかにしてきたが、本研究によりin vivoにおいてもmicroRNAが薬物代謝能の制御に重要な役割を担っていることを明らかにした。薬物代謝肝臓特異的送達脂質ナノ粒子の利用により、肝臓中のmiRNAの発現変動を誘発することに成功した。学会発表を行い、国際学術雑誌に論文を投稿中である。現在、肝ミクロソームを調製し、各種薬物代謝酵素の発現量および酵素活性を測定しており、今後in vivoにおける薬物動態変化を検討する。ヒト初代培養肝細胞にmiRNAを過剰発現または内因性miRNAをノックダウンし、標的遺伝子の発現変動を検討する予定であるが、通常の培養方法では播種後に薬物代謝酵素群の発現が大きく低下することが問題点となる。そこで、発現低下を抑制できることで近年注目されている三次元培養プレートを利用し、miRNAを過剰発現または内因性miRNAをノックダウンさせる方法を確立した上で検討を行う。該当なし
18-19世紀ロシア小説の文体の計量的・総合的比較研究

1.ラジシチェフ、カラムジン、プ-シキンの作品、及びザソ-リナ編「ロシア語頻度辞典」のデータによる語辞書が完成し、その比較・検討により浦井が「近代ロシア文章語(散文)成立期の語彙的・文体的研究」で、語彙の面から見た18-19世紀のロシア小説の文体の発展におけるカラムジンの散文の意義について基本的視点を提示した。2.ラジシチェフのテキストをロシア語文法解析プログラムで処理したデータベースが完成し、これをもとに浦井がラジシチェフ『ペテルブルクからモスクワへの旅』のlemmatized concordanceを刊行した。ヨーロッパ人文大学(ミンスク)A.レナンスキー教授提供の電子データを整備した『白痴』『悪霊』のテキストデータが完成し、これを利用して安藤が「『白痴』における〈美〉の用法」を分析した。4.Windows95環境でのロシア語データ処理(OCR、スペルチェック、テキスト分析、OCPによるコンコーダンス作成等)や、ロシア語形態生成プログラムを利用したデータベースの作成(NEC機・MS-DOS)、出力結果の印刷(MAC機)のためのシステムを整備し、以下の研究で利用したほか、ロシア語教育へのマルチメディア利用の展望を探り、さらに「ロシア語ミニ辞典」の編纂に利用してその汎用性を実証した。5.現代ロシア文章語の標準型データを集積したUppsala corpusを入手し、研究・教育への利用の可能性を探った。6.第9回国際ドストエフスキー・シンポジウム(30.7-6.8.1995、オーストリア)での安藤、望月の研究発表、1995年度日本ロシア文学会研究発表会(13-14.9.1995、北大文学部)での浦井の発表により、国内外で本研究について認知・評価が進んだ。平成9年3月8日、北大文学部で研究会を催し、島田陽(東京国際大)「『チェヴェング-ル』のコンコーダンスについて」、浦井康男「カラムジンの語彙について」、松田潤「インターネット時代の文学研究」の報告を聞き、研究成果を確認した。(1)データ処理システムの整備ロシア文字の光学的読み取り(OCR)とスペルチェックによるテキストデータベースの作成(DOS-V機上)、ロシア語形態生成プログラムを利用したデータベースの作成(NEC機上)、出力結果の印刷(MAC機上)のためのハードウェア、ソフトウェアを整備し、福井大と北大でほぼ同等の環境で作業が進められるようになった。(2)テキストデータの整備ヨーロッパ人文大学(ミンスク、ベロル-シ)レナンスキー教授提供の電子データを点検・修正して、ドストエフスキー『白痴』『悪霊』のテキストデータベースが完成した。(3)ロシア語辞書データベースの整備浦井の作成したカラムジンのデータによる語辞書に、新たにラジシチェフ、プ-シキンのデータを組み入れるための準備作業がほぼ完了した。(4)ロシア語テキストデータの収集インターネット上でロシア語テキストデータ公開の仕事を精力的に進めているインディアナ大学G.フォーラー氏の協力を得て、ロシア文学作品のテキストデータを相当数収集できた。(5)研究成果の発表第9回国際ドストエフスキー・シンポジウム(30.7-6.8.1995、ガミング、オーストリア、安藤、望月が発表)、1995年度(第45回)日本ロシア文学会研究発表会(13-14.9.1995、北大文学部、浦井が発表)での研究発表により、国内外で本研究について認知・評価が進んだ。(1)ロシア語辞書データベースの整備浦井の作成したカラムジンのデータによる語辞書に、新たにラジシチュフ、プ-シキンのデータを組み入れる作業がほぼ完了した。(2)ロシア語頻度辞典データベースの整備

ザソ-リナ編「ロシア語頻度辞典」(1977)のデータを電子化し、18-19世紀ロシア小説の語彙のデータと現代ロシア語のそれを数量的に比較する準備が進んだ。(3)ラジシチェフ『ペテルブルグからモスクワへの旅』のデータベースの整備ラジシチェフの作品のテキストデータをロシア語文法解析プログラムで処理したデータベースがほぼ完成した。『白痴』テキストデータの点検・整備『白痴』のデータの点検・整備と、ロシア語文法解析プログラムで処理するための準備の作業を進めた。(5)研究会の開催平成9年3月8日、北海道大学文学部において研究会を催し、島田陽(東京国際大)「『チェヴェング-ル』のコンコーダンスについて」、浦井康男「カラムジンの語彙について」、松田潤「インターネット時代の文学研究」の報告を聞き、今後の研究方針について討論を行った。1.ラジシチェフ、カラムジン、プ-シキンの作品、及びザソ-リナ編「ロシア語頻度辞典」のデータによる語辞書が完成し、その比較・検討により浦井が「近代ロシア文章語(散文)成立期の語彙的・文体的研究」で、語彙の面から見た18-19世紀のロシア小説の文体の発展におけるカラムジンの散文の意義について基本的視点を提示した。2.ラジシチェフのデータベースをもとに浦井が『ペテルブルグからモスクワへの旅』のlemmatized concordanceを刊行した。3.『白痴』『悪霊』のテキストデータを利用して安藤が「『白痴』における<美>の用法」を分析した。4.Windows95環境でロシア語処理システムを再編成した結果、OCR、スペルチェック、テキスト分析、OCPによるコンコーダンス作成等の作業が格段に効率化し、ロシア語教育へのマルチメディア利用の展望が開けた。5.上記ロシア語処理システムやザソ-リナ編「ロシア語頻度辞典」(1977)のデータベースを『ロシア語ミニ辞典』の編纂に利用し、その汎用性を実証した。6.現代ロシア文章語の標準的データを集積したUppsala corpusを入手し、研究・教育への利用の可能性を探った。7.平成9年度研究会の成果をまとめて、「スラヴ学論叢」第2号(1997)誌上に公表した。
リンパ管再生を目的とした軟部組織遺伝子治療方法の開発

リンパ浮腫は、がんに対する手術、放射線治療後に高頻度で認められる、無視することのできない医原性後遺症の一つである。再現性、奏効率の高い治療方法は知られておらず、多くの患者が治療を継続、反復しながら生涯にわたる病悩を抱え続ける。将来的な臨床応用の実現性が高く、病態に対して大きな表現型の変化を与えうる介入方法として、本研究ではアデノ随伴ウイルスベクターを用いた遺伝子導入によるリンパ管再生の誘導方法の開発を目指す。失われたリンパ管の再生を促すことができれば、特に現行治療への反応の悪い進行例に対しても治療の機会を提供できる可能性がある。
In silico骨代謝動態観察に基づく骨の力学的適応機構の解明

本研究では、骨代謝・リモデリングの分子機構に関する個別の知見を集約した力学-生化学連成数理モデルを提案し、分子、細胞、組織、器官の振舞いを統合的に理解するためのシミュレーション基盤の構築を目的とする。まず、繰返し流れ刺激に対する骨細胞の力学刺激感知特性を実験とシミュレーションにより把握し、既存のin vivo、in vitro実験を通じて明らかにされた骨代謝関連シグナリングネットワークを組み込んだ骨代謝・リモデリングの数理モデルを構築する。さらに、本数理モデルに基づくin silico実験により、骨の力学的適応現象を再現するとともに、代謝性骨疾患の病態や、投薬による治療過程の予測を試みる。
統合的アプローチによる日本沿岸域サンゴ群集の実態と維持機構の解明

本研究は、群集生態学、海洋物理学、および集団遺伝学的手法を用いて、日本の亜熱帯域から温帯域に生息するサンゴ群集の実態と維持機構を体系的に把握することを目的として、H28年から行っているものである。H28ー29年同様、琉球列島南部および中部、高知、和歌山、静岡にて、人工幼生付着基盤を設置し、新規加入幼生の定量化を行うと共に、ベルトトランセクト法などを用いて、現存群集の被度を定量化した。H28年に大規模白化が琉球列島に多大な被害を与え、H29年には琉球列島南部でミドリイシ科サンゴの被度が激減し、新規加入はほとんど観察されなかった。H30年も同様に低い被度、低い加入量であった。ただし、5センチ前後の幼群体が比較的多く観察された地点があり、今後の回復が予期された。さらに、白化から回復した成熟サイズの群体のうち、産卵をした群体数の割合がH29年の二倍ほどに増えた。しかし、産卵が観察されない群体も未だに見られ、引き続き観察の必要性があることが示唆された。また、H28年の白化の影響を受けたものの、サンゴが死亡するに至らなかった高知から和歌山のうち、後者は、H30年初めに黒潮の大蛇行の影響を受け、群集の主構成者であったミドリイシ科サンゴの多くが低水温により白化し、死亡した。ただし、同域へのミドリイシ科サンゴは非常に数が少ないことから、白化前後でその量にほとんど変化はなかった。また、高知のハナヤサイサンゴ科のうち、主要な加入種であるハナヤサイサンゴについて、新規加入個体と成熟個体の遺伝的集団構造を明らかにした。これまでに、H30年の結果までを国外内の学術学会で発表してきた。現在、論文化を進めている。本研究では、群集生態学、海洋物理学、及び集団遺伝学的手法を用いて、日本の亜熱帯域から温帯域に生息するサンゴ群集の実態と維持機構を体系的に把握することを目的としている。平成28年度は、琉球列島南部及び、中部、高知、和歌山、静岡にて人工幼生付着基盤(以下、基盤)を設置し、新規加入幼生の定量化を行うとともに、ベルトトランセクト法などを用いて、現存群集の被度を定量化した。新規加入幼生は骨格形態から3科(ミドリイシ科、ハナヤサイサンゴ科、ハマサンゴ科)に分けることができるが、さらに、遺伝子配列から種の同定を行った。ミドリイシ科については種レベルでの分類が困難であったが、ハナヤサイサンゴ科については現在使用されているグループ分類が可能であった。このようにして得られた科ごとの幼生加入量と群集被度を比較したところ、琉球列島南部の西表島網取湾では、ミドリイシ科について加入量と被度に正の相関が見られた。一方、高知や和歌山では、どの科についても加入量と被度に関係性は見られなかった。さらに静岡では、周辺群集の産卵が確認されているものの、基盤への新規加入が観察されず、加えて、自然加入したと考えられる稚サンゴも見られていない。これらのことから、温帯域のサンゴ群集は、数年に一度の多量の新規個体の加入、または、現存する群体の成長によって主に維持されている可能性が考えられるため、今後さらなる調査が必要である。上記の調査に加えて、琉球列島南部の西表島網取湾では、海洋モデルを用いて幼生の産卵地や移動距離を推定し、加入の結果と比較を行った。この網取湾での研究結果は現在、論文化を進めている。海流動態については、狭域でしか研究が進んでいない。今後、GPS搭載ブイの放流などを行い、より広域な分散について検討する。また、ミドリイシ科サンゴについて加入幼生の遺伝マーカーを用いた種レベルでの同定が進んでいない。今後は、グループでの分類が可能であったハナヤサイサンゴ科を中心に、群集の遺伝的構造などの解析を行っていく予定である。H28年同様、琉球列島南部および中部、高知、和歌山、静岡にて、人工幼生付着基盤を設置し、新規加入幼生の定量化を行うと共に、ベルトトランセクト法などを用いて、現存群集の被度を定量化した。H29年は、前年に起こった大規模白化の影響がどのように各地のサンゴ群集にあらわれてくるか、も念頭に入れて解析を行った。新規加入幼生は、骨格形態から科ごとに定量し、ハナヤサイサンゴ科については遺伝子配列から種同定を行った。加入量は、琉球列島南部で激減し、ミドリイシ科サンゴの加入がほとんど観察されなかった。琉球列島中部域でも加入量は減ったが、年変動の範囲内に収まる減少率であった。温帯域では、前年と比べ大きな違いは見られなかった。また、ハナヤサイサンゴ科の種同定の結果、琉球列島中部域と温帯域への加入種の構成に違いが見られた。温帯域についてはハナヤサイサンゴ科の加入が多量に見られ、現在も一部サンプルを解析中である。群集被度は、H28年度に起こった大規模白化後にサンゴが回復せず死亡したことで、琉球列島南部でミドリイシ科サンゴが激減した。