hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
遺伝子工学を利用した窒素酸化物処理の効率化と地球環境保護

工業の発展に伴い深刻な環境汚染が人々の関心を集めており、近年では窒素酸化物による地球環境の破壊が大きな問題となっている。窒素酸化物の生態系における除去は脱窒菌などの微生物による。これらの菌は廃水処理で再利用されているが、元来生態系に広く分布しておらずまた増殖が良くないものも多いので、必ずしも窒素酸化物の除去が効率的に行われているわけではない。そこで本研究では、遺伝子工学を応用して生物的窒素酸化物処理を飛躍的に効率化することを目的とし、これら脱窒に関する遺伝子をクローン化しその構造を決定した。まず既にクローン化してある亜硝酸還元酵素遺伝子を中心に上流11kb及び下流17kb程度の遺伝子をλファージベクターを用いてクローン化した。現在この遺伝子領域15kb程度の塩基配列を決定中であるが、亜硝酸還元酵素遺伝子の上流領域には脱窒菌Pseudomonas aeruginosaの酸化窒素還元酵素とアミノ酸レベルで60%の相同性を有する部位が発見された。相同性から考えてこの領域は酸化窒素還元酵素遺伝子NorBに相当すると考えられている。この遺伝子は、亜硝酸還元酵素遺伝子NirSの逆向きに存在しており、NirSとNorBの位置関係はP.aeruginosaと酷似していた。一方、NirSの下流側約7kbのDNA塩基配列を決定したところ、やはり電伝達に関与するNirE,C,Fと補酵素ピロールキノリンキノン合成酵素に相同性を有する部位が見出された。このピロールキノリキノン合成酵素と相同な遺伝子の役割りについては不明である。現在、脱窒に関する酵素遺伝子すべてをクローン化することを目的とて亜酸化窒素還元酵素遺伝子を検索中である。工業の発展に伴い深刻な環境汚染が人々の関心を集めており、近年では二酸化炭素や窒素酸化物による地球環境の破壊が大きな問題となっている。窒素酸化物の生態系における除去は、硝化および脱窒菌などの微生物による。これらの菌は廃水処理で利用されているが、元来生態系に広く分布しておらずまた増殖が良くないものも多いので、必ずしも窒素酸化物の除去が効率的に行なわれているわけではなく、研究も進んでいるとはいい難い。そこで本研究では、遺伝子工学を応用してこの生産的窒素酸化物処理を飛躍的に効率化することを第一の目的とする。本年度の研究等より脱窒菌Paracoccusdenitrificansの亜硝酸還元酵素遺伝子をクローン化し、その塩基配列を決定した。これより脱窒に関する遺伝子が、P.denitrificansのゲノム上で集合体(クラスター)を形成していることがわかった。そこでクローン化した亜硝酸還元酵素遺伝子の両側の幅広い領域の遺伝子をクローン化し、塩基配列を決定しつつある。これにより、他の脱窒に関する遺伝子をクローン化することが可能と考えられる。特に現在、脱窒反応で亜硝酸還元酵素の次に位置し、NOをN_2Oに還元するNO還元酵素遺伝子が存在すると思われる亜硝酸還元酵素下流域の約5kbのDNAフラグメントと、遺伝子発現調節領域が存在すると考えられる上流域2kbについて精力的にDNA構造解析を進めている。これらの菌は廃水処理で利用されているが、元来生態系に広く分布しておらずまた増殖が良くないものも多いので、必ずしも窒素酸化物の除去が効率的に行われているわけではない。まず既にクローン化してある亜硝酸還元酵素遺伝子を中心に上流11kb及び下流17kb程度の遺伝子をλ-ファージベクターを用いてクローン化した。

現在この遺伝子領域15kb程度の塩基配列を決定中であるが、亜硝酸還元酵素遺伝子の上流領域には脱窒菌Pseudomonas aeruginosaの酸化窒素還元酵素とアミノ酸レベルで60%の相同性を有する部位が発見された。相同性から考えてこの領域は酸化窒素還元酵素遺伝子NorBに相当すると考えられている。この遺伝子は亜硝酸還元酵素遺伝子NirSと逆向きに存在しており、NirSとNorBの位置関係はP.aeruginosaと酷似していた。一方、NirSの下流側約7kbのDNA塩基配列を決定したところ、やはり電伝達に関与するNirE,C,Fと補酵素ピロールキノリンキノン合成酵素に相同性を有する部位が見出された。このピロールキノリキノン合成酵素と相同な遺伝子の役割りについては不明である。現在、脱窒に関する酵素遺伝子すべてをクローン化することを目的として亜酸化窒素還元酵素遺伝子を検索中である。
ＡＴＰ駆動の回転分子モーターを用いたＡＴＰ加水分解の１分子熱力学

ATP駆動の回転分子モーター・F1-ATPase(F1)は、1分子観察によって、ATP結合部位でのATP加水分解サイクルの素過程(ATPの結合・加水分解・分解物解離)と、回転軸角度との対応関係がほぼ明らかにされている。本研究では、その各素過程でのエネルギーの出入りを決定するために、環境(温度やATP加水分解の自由エネルギーなど)を変化させて1分子観察を行った。環境変化の各素過程速度への影響を調べることで、各素過程の熱力学パラメーターを取得した。1.ATP加水分解サイクルの各素過程の温度依存性:ほぼ無負荷の状態でF1の回転運動を、広範囲にわたる温度領域(4-65°C)で測定し、各素過程速度の温度依存性を得た。ATP結合角度を0°とすると、回転速度の律速過程は、高温(30ー65°C)では、ATP加水分解または分解産物のリリース、低温(5ー15°C)では、ADPリリースであることが示唆された。2.ADPの存在によって影響を受ける未知の素過程: ATPとADPの濃度が等しい条件(ΔGが一定)で、ほぼ無負荷の状態でのF1の回転運動を調べた。各ATP濃度で5割程度の回転速度低下がみられ、この低下が、ATP結合角度の停止時間の増加に由来していることが分かった。ADPの存在によって、本来ATPが結合するはずのサイトにADPが緩く結合することによって、ATPの結合を妨げている可能性が高い。この素過程と低温で見られた素過程には関連がありそうである。3.素過程への分離を容易にするモニター分子:各素過程がさらに別の角度で起きれば、各素過程速度を求めることが容易になる。F1の回転子のN末で7個、C末で29個のアミノ酸を削除した変異体は、野生型と比較して停止角度が多いことを明らかにした。回転速度も遅すぎないため、モニター分子として活用できそうである。24年度が最終年度であるため、記入しない。ATP駆動の回転分子モーター・F1-ATPase(F1)は、1分子観察によって、その回転が明瞭に示され、最近では、ATP結合部位でのATP加水分解サイクルの素過程(結合・加水分解・分解物リリース)と、回転軸角度との対応関係もほぼ明らかにされた。しかし、ATP加水分解の化学エネルギーが、どのようにして回転運動へと変換されているのかという核心の問題は、いまも不明のままである。本研究では、この変換の仕組みへ直接迫るために、1分子観察と熱力学の手法を組み合わせ、ATP加水分解サイクルの各素過程でのエネルギーの出入り(自由エネルギー図)を決定したい。F1と、液胞型V1-ATPase(V1)を用いて、1分子観察でのみ測定可能な各素過程速度を、環境(温度やATP加水分解の自由エネルギーなど)を変化させて測定し、従来は困難を極めた各素過程間の熱力学パラメーターの取得を目指す。F1やV1の回転軸先端に直径40nmの微小金粒子を付け、レーザー暗視野照明を用いた顕微鏡下での高速観察によって、その回転運動をほぼ無負荷の状態で直接捉えることができる。この観察系を用い、溶液中のATP・ADPを等濃度にしてその濃度を変化させて、回転運動を観察した。これは、一定のATP加水分解の自由エネルギー(ΔG)の大きさの下で、回転速度のATP濃度依存性を観たことに等しい。ADPなしの場合と比較して、回転速度が半分ほどに低下した。解析の結果、ATP結合待ちの回転角度の停止時間が増加することに起因していることがわかった。ADP解離の素過程が観えてきた可能性がある。また、回転軸の短い変異体では、律速となる停止角度が、3つ以上見られるものがあり、分解物リリースの素過程が、従来とは別の角度で独立に起きている可能性が出てきた。ATP加水分解の詳しい素過程を見るためのモニター分子として利用したい。

F1の回転子のN末で7個、C末で29個のアミノ酸を削除した変異体は、野生型と比較して停止角度が多いことを明らかにした。回転速度も遅すぎないため、モニター分子として活用できそうである。24年度が最終年度であるため、記入しない。当初の計画での最低限の設定目標である以下の2点が達成されている。(1)溶液中のATP・ADP濃度を変化させて、F1の回転運動を観察した。(2)ATP加水分解の詳しい素過程を見るためのモニター分子として、回転軸の短い変異体から候補を絞り込んだ。当初の計画通り、以下の3項目を実施していく。(1)溶液中のATP・ADP濃度を変化させて、F1の回転運動を観察することに加え、各環境項目[(1)温度、(2)重水、(3)有機溶媒、(4)変性剤]を組み合わせた条件で、同様の実験を行い、基礎熱力学パラメーターの蓄積を行う。(2)これまでに、回転軸の短いF1変異体のうち、速い回転速度(適当な回転速度がないと観測時間が長くなりすぎる)と停止角度の多さ(多いほうが素過程を分離しやすい)を満たすものを2つにまで絞り込んだ。早々に、素過程と停止角度の対応付けを終わらせ、モニター分子として使えるか、結論を出したい。(3)溶媒環境の効果を明白にするには、同一の分子を観察しながら環境を変化させて、その影響を調べた方が良い場合も多い。スムーズな溶媒交換が実現できると、実験の大幅な効率化と実験結果の説得力が期待できる。1分子観察の手法でのみ取り出せる情報をより定量的に扱うために、シンプルで使いやすい還流システムの開発と、より安定した像を得るための光学系の改良を試みる。
極低温における回転状態を識別した・イオン・分子反応の研究

入射イオン型移動管質量分析計は、移動管部に約0.5tvrrのヘリウムガスを充し、そこへ質量を同定したイオンを外部から入射させ移動管内部の電場強度を変えることによりイオンの運動エネルギーをコントロールするものである。移動管部を冷却することにより、測定下限エネルギーを移動管温度まで下げることが出来る。62年度に極低温におけるイオン・分子反応の研究を目的として、移動管を液体ヘリウムで冷却したことろ入射イオンX^+を核とするヘリウムクラスター(XHe_n)^+が検出された。ヘリウムクラスターイオンの生成は、本研究により世界で初めて成功したものであり、急拠目的を変更してヘリウムクラスターイオンの生成とその安定性について研究を行うことにした。移動管内で生成されたクラスターイオンが検出部の残溜気体と衝突してこわれている可能性があるので、62年度補助金によりターボ分子ポンプを購入、63年度補助金により真空配管の改良、バルブの設置を行い差動排気が行えるようにした。入射イオンX^+としてHe^+、Ne^+、Ar^+、Kr^+を用い、各々のイオンを核とするクラスターを生成し、移動管内のイオンの実効温度を変えながらサイズ分布を測定した。サイズnの出現温度からクラスターの結合エネルギーに関する情報が得られた。He^+が核の場合n=1、2、9、13が魔法数であることが判明した。一方Ne^+の場合にはn=1、2、11、13が魔法数であり、Ar^+、Kr^+が核の場合にはn=1、2、12が魔法数であることがわかった。核となるイオン種によって安定なクラスターのサイズは異なっている。その理由は分子イオン(XHe)^+の安定性がイオン種により異るためではないかと考えられる。今後さらに各種イオンを入射させその安定性を調べて原因を究明する予定である。入射イオン型移動管質量分析は,移動管部に約0.5Torrのヘリウムガスを充し,そこへ質量を同定したイオンを外部から入射させ移動管内部の電場強度を変ることによりイオンの運動エネルギーをコントロールするものである.移動管部を冷却することにより,測定下限エネルギーを移動管温度まで下げることが出来る.本年度,極低温におけるイオン・分子反応の研究を目的として,移動管部を液体ヘリウムで冷却したところ,入射イオンを核とするヘリウムクラスター(XHe_n)^+が検出された.ヘリウムクラスターイオンの生成は,本研究が世界で初めて成功したものであり,急拠目的を変更してヘリウムクラスターイオン生成の研究を行うことにした.移動管内で生成されたクラスターイオンがイオン検出部の残溜気体と衝突してこわれている可能性が考えられたので,本補助金によりターボ分子ポンプを購入しイオン検出部を差動排気したところ安定したクラスターの質量スペクトルを得ることが出来るようになった.He+を入射させ, He_n^+(n【less than or equal】5)のn分布を移動管内のガス圧を変えて測定した.その結果,移動管内のn分布は平衡に達していることが判明した.又圧力を一定にし,イオンの実効温度を変えてスペクトルを測定することから,クラスターの結合エネルギーに関する情報を得ることが出来た.その結果He_2^+, He_3^+は結合エネルギーの大きな準分子イオンであり, n【greater than or equal】でクラスターとなること,さらに, nが10と11, 14と15の間で結合エネルギーの不連続が存在しn=10と14が魔法数であることが明らかになった.

これ等の結果から,ヘリウムクラスターの安定構造について重要な知見を得ることが出来た.また,中性クラスターHe_nについて魔法数n=10, 14が報告されていたが,それは電子衝撃によるイオン化のために,安定なクラスターイオンに解離するためであることが明らかになった.62年度に極低温におけるイオン・分子反応の研究を目的として、入射イオン型移動管質量分析計の移動管部を液体ヘリウムで冷却し、イオンX^+を移動管に入射したところX^+を核とするヘリウムクラスター(XHe_n)^+が検出された。ヘリウムクラスターイオンの生成は、本研究により世界で初めて成功したものであり、急拠目的を変更してHe^+を核として生成されるヘリウムクラスターイオンの生成とその安定性について研究を行った。移動管内で生成されたクラスターイオンがイオン検出部の残溜ガスと衝突し壊れている可能性があったので、62年度にターボ、分子ポンプをまた63年度に真空配管、バルブ等を購入し検出部の差動排気を完成させた。その結果残溜ガスとの衝突はほとんど無視出来るようになった。入射イオンX^+としてNe^+、Ar^+、Kr^+を用い各々のイオンを核とするクラスターを生成し、移動管内のイオンの実効温度を変えながらクラスターのサイズ分布を測定しながら、特定のサイズのクラスターの出現温度を決定する方法によって結合エネルギーに関する情報を得た。その結果、Ne^+が核の場合には魔法数はn=1、2、11、13であり、Ar^+、Kr^+が核の場合にはn=1、2、12が魔法数であることがわかった。これ等の魔法数はHe^+が核の場合の値n=1、2、9、13と異っている。このようにヘリウムクラスターイオンは核となるイオン種によって特徴的な安定性を示すことが見い出された。
加齢黄斑変性の戦略的な疾患特異遺伝子探索と治療応用

加齢黄斑変性(AMD)患者の前房水の網羅的解析の過程で,血管新生への関与の報告がない因子Xについて新しく注目し,AMD病態に果たす役割について,血管内皮細胞を用いたin vitro解析,AMDモデルマウスを用いた免疫組織学的解析,AMD患者由来のゲノム情報を元に行ったSNP解析から検討した。因子Xと因子X受容体の遺伝子欠損AMDモデルマウスとsiRNAによる解析から,因子Xと因子X受容体のシグナル阻害で脈絡膜血管新生(CNV)が抑制された。蛍光標識骨髄細胞移植マウスを応用して,免疫組織学的解析により,因子X依存的に骨髄細胞から誘導された単球系細胞によってCNVが制御されていることが示唆された。1.因子Xの発現解析:レーザー誘発脈絡膜新生血管マウスモデルを用いて、因子Xとその競合的抑制因子と推定される因子Y、血管新生関連分子の経時的な発現動態をreal-time PCRで確認した。また、血管内皮細胞に選択的に結合するレクチンまたは抗CD31抗体、免疫細胞特異的抗体との二重染色により、脈絡膜伸展標本と組織切片での因子Xと因子Yの脈絡膜新生血管構造内での発現分布を確認し、正常網膜血管や正常脈絡膜血管と脈絡膜新生血管での発現の比較、網膜、網膜色素上皮、リンパ球での発現を解析した。2.因子Xの作用解析in vivo:レーザー誘発脈絡膜新生血管マウスモデルを用いて、因子Xおよび因子Yの組み替え体を尾静脈投与または硝子体内投与し、脈絡膜新生血管サイズへの影響を評価し、因子Xおよび因子Yの脈絡膜新生血管への作用を確認した。同様に、抗因子X抗体による脈絡膜血管新生の抑制作用を確認した。さらに、因子Xと因子X受容体を介した脈絡膜新生血管への作用が、主に血管内皮細胞を主体としたものか、免疫細胞を主体としたものかを評価するために、抗CD31抗体結合または免疫細胞特異的抗体と結合した因子XのsiRNAを用いて組織選択的に因子Xの作用を抑制し、脈絡膜新生血管への影響を評価した。3.因子Xの作用解析in vitro:マウス骨髄由来血管内皮細胞を用いて、因子Xの刺激によるVEGFを含む主要な血管新生関連因子の発現を解析し、因子Xとの分子メカニズムについて検討した。4.加齢黄斑変性患者と健常者より得られた検体のSNP解析:同意が得られた加齢黄斑変性患者と健常者より提供された血液検体から得られたゲノム情報をもとに、既知の加齢黄斑変性関連遺伝子とともに因子XのSNP解析を進めている。また、同時に採取した前房水の因子Xとその関連分子の発現を解析し、ゲノム情報との関連を確認中である。1.黒色の因子X受容体欠損マウスの作成:海外の共同研究施設から入手した因子Xの受容体欠損マウスが白色で遺伝的背景がBalb/cであったため,再現性のあるレーザー誘発脈絡膜新生血管マウスモデルを確立するため,鳥取大学生命機能研究支援センター動物資源開発分野の支援のもと,C57BL/6を遺伝的背景に持つ黒色の因子Xの受容体欠損マウスを体外受精によって作成することに成功し,戻し交配でN3まで継代し増産した。戻し交配の過程で生産された野生型をコントロールとして,因子X受容体欠損遺伝子型がホモとヘテロのマウスについて,遺伝子型と疾患感受性について解析することが可能になった。2.因子XとY受容体の発現解析:因子XまたはY受容体欠損遺伝子型がホモまたはヘテロのマウスと野生型の3群について因子XとY受容体の発現を確認した。血管内皮細胞に選択的に結合するレクチンまたは抗CD31抗体,免疫細胞特異的抗体との二重染色により,脈絡膜伸展標本と組織切片での因子XとY受容体の脈絡膜新生血管構造内での発現分布を比較し,正常網膜血管や正常脈絡膜血管とレーザー誘発脈絡膜新生血管での発現の比較,網膜,網膜色素上皮,リンパ球での発現を解析した。3.因子Xの作用解析in vivo:因子XまたはY受容体欠損遺伝子型がホモまたはヘテロのマウスと野生型の3群について,レーザー誘発脈絡膜新生血管のサイズを比較し,遺伝子型と疾患感受性について検討した。4.加齢黄斑変性患者と健常者より得られた検体のSNP解析:同意が得られた加齢黄斑変性患者と健常者より提供された血液検体から得られたゲノム情報をもとに,既知の加齢黄斑変性関連遺伝子とともに因子XのSNP解析を進めている。また,同時に採取した前房水の因子Xとその関連分子の発現を解析し,ゲノム情報との関連を引き続き確認中である。1.マウス骨髄細胞を用いた因子Xの機能解析:因子Xの脈絡膜新生血管(CNV)への作用を解析するため,全身放射線照射により骨髄細胞を抑制した野生型および因子X受容体欠損マウスをレシピエントに,野生型GFPマウスをドナーとして骨髄を移植した。移植2週間後にレーザー処置を行うことでCNVを誘発し,AMDモデルマウスを作成した。レーザー処置2週間後に共焦点メージングでCNVサイズを定量解析するが,その際,AMDモデルマウスの骨髄細胞を採取し,フローサイトメトリーで移植骨髄の生着効率を確認した。移植2週間後のGFPマウス骨髄由来細胞が,レーザー処置2週間後に発生したCNVの構造中に集簇しているのを確認できた。また,因子X抗体と因子X受容体抗体,因子Xと結合するが因子X受容体下流のシグナルとは別の役割を果たすと考えられる因子Y受容体抗体を用いて確認したところ,移植した骨髄由来細胞の因子X受容体の発現を確認した。

また,全身放射線照射した野生型マウスをレシピエントに,野生型および因子X受容体欠損マウスをドナーとして,低毒性生細胞蛍光標識した骨髄由来細胞を移植し,AMDモデルマウスを作成し,共焦点イメージングでCNVのサイズを定量解析した。因子X受容体欠損マウスに野生型マウス骨髄を移植したところ,因子X受容体欠損マウス骨髄を移植した場合よりも,CNVサイズは有意に拡大し,野生型マウスに因子X受容体欠損マウス骨髄を移植すると,野生型マウス骨髄を移植した場合よりも,CNVサイズは有意に縮小した。以上から,因子X受容体陽性の骨髄由来細胞がCNV発生に関与する可能性が示唆された。2.加齢黄斑変性患者と健常者より得られた検体のSNP解析:同意が得られた加齢黄斑変性患者と健常者より提供された血液検体から得られたゲノム情報をもとに,既知の加齢黄斑変性関連遺伝子とともに因子XのSNP解析を進めている。1.因子Xの作用解析in vivo:遺伝子欠損マウスの増産が困難なため,実験に必要なマウスの個体数確保のためには体外受精を用いる必要があり,現在,骨髄移植細胞を用いた系の再現性を確認するためのマウスを準備中である。また, CNV感受性に加齢変化が影響するため,実験に使用するマウス週数についても配慮を要する。2.因子Xの作用解析in vitro:概ね順調であるが,成果を開示できるようにするためには,引き続き,因子X受容体のCNV発生に関与する具体的な作用機序の解明を要する。3.加齢黄斑変性患者と健常者より得られた検体のSNP解析:現在,加齢黄斑変性患者と健常者から得られた検体は合計90例を越え,順調であるが,既知の遺伝子のSNP解析の報告との整合性を確認した上で,ゲノムデータを大量に保有する他施設と共同で更に解析を進めるため,ヒトゲノムデータ利用のための臨床研究の手続きを行った上で,因子Xの疾患感受性への関与を確認する予定である。マウス骨髄細胞移植加齢黄斑変性(AMD)モデルマウスを用いた解析: AMDモデルへの応用を新しく着想した低毒性生細胞蛍光標識が移植骨髄由来生細胞と一致することを裏付けるため, GFPマウス骨髄細胞を更に低毒性生細胞蛍光標識し,移植後脈絡膜新生血管(CNV)集簇細胞の二種の蛍光標識が一致するのを確認した。複数の細胞マーカーを用いた免疫組織学的解析で,候補因子X陽性の骨髄由来細胞が分化した後に,CNVに集簇し,CNV感受性に関与することを確認した。マウス初代網膜血管内皮細胞を用いたin vitro解析:野生型マウスの初代網膜血管内皮細胞を用いて,In vitro管腔形成アッセイを行った。VEGF刺激による管腔形成を陽性コントロールとして,候補因子X刺激による有意な管腔形成の促進を確認した。また,候補因子X抗体またはX受容体抗体による阻害で管腔形成が抑制されることを確認した。そのメカニズムを解析するため,濃度の異なる候補因子Xによる刺激後,時系列で上清を回収し,転写とタンパクレベルでMCP-1の有意な増加を確認した。候補因子XのSNP解析:加齢黄斑変性患者と健常者のゲノム情報をもとに,既知の加齢黄斑変性関連遺伝子(CFH,HTRA1,ARMS2の複数のリスクアリル)と候補因子Xのプロモーター領域に存在するアリルについて加齢黄斑変性の感受性との相関を確認した。CFH,HTRA1,ARMS
PPCPsのエストロゲン様作用の一斉スクリーニング分析

水環境汚染が問題視されている医薬品類や化粧品等のパーソナルケア製品(PPCPs)と魚類エストロゲン受容体(ER)サブタイプの分子間相互作用を評価するため、in silicoスクリーニング系を開発した。鎮痛剤/抗炎症剤、脂質調節剤、β遮断薬、抗鬱剤などのPPCPsは、一部の魚類ERαに対して比較的強く相互作用し、相互作用に関与したERsのアミノ酸の種類や数、水素結合の有無やリガンドーERs間の距離は異なり、生物種間差が明らかになった。開発したin silico試験系は、PPCPsーERs分子間相互作用のスクリーニング手法として極めて有用であり、生態リスク評価ツールとしての活用が期待される。水環境中で検出される医薬品類や化粧品等のパーソナルケア製品(PPCPs)による生態影響が問題視されており、特に魚類などの水棲生物は慢性的な影響を受ける可能性がある。魚類における慢性毒性影響のエンドポイントとして、産卵数の減少や受精率の低下が知られており、エストロゲン受容体(ER)の機能と密接な関連がある。しかしながら、ERとPPCPsの相互作用を網羅的に調査した研究はほとんどない。本研究では、in silicoで魚類ERαの立体構造を予測し、PPCPsとの結合状態を解析した。まず分子シミュレーションソフトウェアを用いて、メダカ、ゼブラフィッシュ、ローチ、コイ、ファットヘッドミノーおよびイトヨのERαリガンド結合領域の立体構造モデルを予測し、ドッキングプログラムASEDockを用いて79種類のPPCPsとの結合ポテンシャルエネルギーを算出し結合状態を解析したところ、各魚種のERαに対してエストロゲン類(17β-estradiol、estriol、estrone)は高い結合親和性を示した。また、更年期障害の治療目的にホルモン補充剤の医薬品として使用されるエクイリンなどのエクイン類は、エストロゲン類と同程度の高い結合親和性を示した。さらに一部の魚種のERαに対して、鎮痛剤/抗炎症剤indomethacine、脂質低下薬bezafibrate、βブロッカーmetoprololなどは比較的高い結合親和性を示した。PPCPsの相互作用ポテンシャルエネルギーのERα間比較において違いのみられたメダカ、コイおよびイトヨについて、PPCPsとの相互作用に関与するアミノ酸の推定を試みた。ステロイド骨格を有するエストロゲン類およびエクイン類とその代謝物、あるいは他のPPCPsについて相互作用に関与するアミノ酸を明らかにした。また、それらの種類や距離はERα間で異なることが示唆された。以上のことから、in silicoスクリーニングによりPPCPsのエストロゲン様作用が明らかとなった。魚類エストロゲン受容体(ER)サブタイプに対する医薬品類・化粧品等パーソナルケア製品(PPCPs)の影響を一斉スクリーニングするため、メダカERα、ERβ1およびERβ2のリガンド結合領域(LBD)の立体構造モデルをin silicoで構築し、PPCPsとのドッキングシミュレーション解析を試みた。まず、ドッキングシミュレーション解析で得られた各ERーLBDと17βーestradiol(E2)の結合位置と構造が、X線結晶構造解析で実験的に得られたものをどの程度再現しているかを確認するため、X線結晶構造の報告されているヒトERαーおよびERβーLBDタンパク質と比較した。メダカの各ERサブタイプにおいて算出されたRMSDは1オングストローム以下を示し、本研究で構築したERサブタイプの立体構造モデルは正確に予測できたと考えられた。次に、PPCPsとの相互作用をスクリーニングしたところ、一部の医薬品成分や内因性エストロゲン類であるestrone、17αーE2、17βーE2およびestriolは各ERサブタイプに対して高い結合親和性を示した。そこで、開発したin silico系の有用性を検証するために、in vitroレポーター遺伝子アッセイ系を用いてERα依存的転写活性化能を測定したところ、in silico系で確認されたリガンドーERα分子間相互作用の強弱と同様にERαも活性化され、本スクリーニング手法の有用性が示された。さらに、リガンドとの相互作用に関与する各ERサブタイプのアミノ酸の推定を試みたところ、リガンドによって相互作用に関与するERサブタイプのアミノ酸の種類や数は異なり、水素結合の有無やリガンドーER間の距離も異なっていた。以上のことから、メダカERサブタイプに対するPPCPsのエストロゲン様作用が明らかとなった。本研究で開発したin silico試験系は、PPCPsーER分子間相互作用のスクリーニング手法として極めて有用であり、PPCPsのリスク評価ツールの一つとして活用されることが期待される。生態毒性学・環境分子毒性学In silicoでメダカ、ゼブラフィッシュ、ローチ、コイ、ファットヘッドミノーおよびイトヨのERαリガンド結合領域の立体構造モデルを予測し、PPCPsとの結合状態を解析した。結果として、各魚種のERαに対してエストロゲン類(17β-estradiol、estriol、estrone)は高い結合親和性を示した。

また、更年期障害の治療目的にホルモン補充剤の医薬品として使用され、妊娠中の牝馬の尿中にも含まれているエクイリンなどのエクイン類は、エストロゲン類と同程度の高い結合親和性を示した。さらに一部の魚種のERαに対して、鎮痛剤/抗炎症剤indomethacine、脂質低下薬bezafibrate、βブロッカーmetoprololなどは比較的高い結合親和性を示した。PPCPsの相互作用ポテンシャルエネルギーのERα間比較において違いのみられたメダカ、コイおよびイトヨについて、PPCPsとの相互作用に関与するアミノ酸の推定を試みたところ、ステロイド骨格を有するエストロゲン類およびエクイン類とその代謝物、あるいは他のPPCPsについて相互作用に関与するアミノ酸を明らかにした。また、それらの種類や距離はERα間で異なることが示唆された。以上のことから、in silicoスクリーニングによりPPCPsのエストロゲン様作用が明らかとなった。魚類では、複数のエストロゲン受容体(ER)の存在が確認されている。今後は、ERα以外についても対象として、リガンドの相互作用についてドッキングシミュレーション解析を行う。さらにERsの機能性は、化合物とERsの結合親和性だけでは十分に評価できない。ERsアゴニストは生体内に侵入後、ERsを介して様々な標的遺伝子の転写を促進あるいは抑制することで機能を発揮するからである。そこでERs cDNAクローンを用いたin vitroレポーター遺伝子アッセイ系により、ドッキングシミュレーション解析により得られた候補化合物を対象としてERs転写活性化能を測定する。当初計画していた人件費・謝金の執行において、最適な人材が確保できなかったため。人材派遣会社等を通じて最適な人材を確保する予定である。
職業性過敏性肺炎における起因抗原の予知とその許容限界の設定に関する研究

1)真菌属の過敏性肺炎起因性の検出に関するモデル実験系の検討まず、ハウスナス栽培作業現場から採集したフサリウム属を純粋培養し、これを凍結乾燥後、溶解して精製抗原とした。これを用いて、点鼻法にてマウス(C57Black/6)へ投与する(1回/週、5週間)モデル実験系を設定し、フサリウム属の抗原性を検討した。その結果、本研究により、フサリウム属の過敏性肺炎起因性が初めて実験的に証明されるとともに、本実験系の病態モデルとしての妥当性が検証された。2)農作業に関連する過敏性肺炎起因抗原の検出と反応予測に関する検索システムの設定上記の実験系と抗体検索のプロセスが含まれる、農作業に関連する過敏性肺炎起因抗原の検出と反応予測に関する検索システムのフローチャートを完成した。3)農作業における過敏性肺炎周辺のアレルギー疾患の発生に関する実験的研究(1)ナス植物の抽出成分を用い、作業者の血清のRASTを測定したところ、ナス成分に即時型アレルゲンが存在し、それによる作業者の即時型アレルギーが明らかにされた。(2)アルストロメリアより抗原成分を抽出し、guinea pig maximization test(GMT)を実施したところ、アルストロメリアの遅延型皮膚感作性とそれによる花卉栽培者のアレルギー性接触皮膚炎が明らかにされた。1)最近5年間に熊本県下で臨床アレルギー学的に確認された職業性過敏性肺炎6例についてその病因の特性をケーススタデイの形式で追跡した。その結果、全例農業従事者で、うち5例は非喫煙の女子であった。症例には、従来農夫肺の発症例の大半をしめる畜産・酪農の他に、ハウス栽培(メロン、ナス)の作業者が含まれており、本疾患の拡がりの大きさが確かめられた。2)症例の含まれる畜産作業およびハウスナス作業について、それぞれ作業現場の労働負担と作業環境の実態調査を実施した。これらはいずれも粉じん作業で、そのなかのそれぞれ異なった種類の真菌が抗原として確認されるなど、本疾患の病因学的特性の一部が明らかにされた。とくに、フサリウム属、アスペルギールス属など、従来本疾患の起因抗原として知られた好熱性放線菌属以外の真菌が検出されたことは興味深い。3)過敏性肺炎の起因物質を予知し、量一反応関係を検出するためのモデル実験系を設定するために、予備実験的に病態モデルの作成を検討した。抗原液の経鼻的反復投与法と感作と誘発の2段階にわけた経気管的投与法の二つの方法を検討し、量一反応関係を検出するためには後者の方法がより有用であることを確かめた。1)前年度に引き続き、畜産作業およびハウス栽培(ナス、トマト、イチゴ)作業について、作業現場の粉じんおよび真菌曝露環境の実態調査を実施した。これらの作業にはそれぞれ特異的な真菌の分布が見られ、これらの作業環境中からフサリウム属、アスペルギールス属、クラドスポリウム属、リゾプス属、アルテルナリア属などが同定された。2)1)で同定された真菌のうち、とくに、フサリウム属およびアルテルナリア属について純粋培養を進め、破砕菌体による精製抗原を作成し、前年度研究で検討したモデル実験系のうち、経気管的投与法を用いて、C57Black/6マウス肺組織に対する過敏性肺炎起因性を予備実験的に検索し、フサリウム属およびアルテルナリア属の抗原性を示唆する成績を得た。3)過敏性肺炎が疑われるハウスナス作業者(52歳、女子)1例に対して、上記精製抗原のゲル内沈降反応を施工したところ、陽性反応を示した。4)上記の実験系および抗体検索が含まれる農作業に関連する過敏性肺炎起因抗原の検出と反応予測に関する検索システムのフローチャートを開発した。

その結果、本研究により、フサリウム属の過敏性肺炎起因性が初めて実験的に証明されるとともに、本実験系の病態モデルとしての妥当性が検証された。2)農作業に関連する過敏性肺炎起因抗原の検出と反応予測に関する検索システムの設定上記の実験系と抗体検索のプロセスが含まれる、農作業に関連する過敏性肺炎起因抗原の検出と反応予測に関する検索システムのフローチャートを完成した。3)農作業における過敏性肺炎周辺のアレルギー疾患の発生に関する実験的研究(1)ナス植物の抽出成分を用い、作業者の血清のRASTを測定したところ、ナス成分に即時型アレルゲンが存在し、それによる作業者の即時型アレルギーが明らかにされた。(2)アルストロメリアより抗原成分を抽出し、guinea pig maximization test (GMT)を実施したところ、アルストロメリアの遅延型皮膚感作性とそれによる花卉栽培者のアレルギー性接触皮膚炎が明らかにされた。
単一光子状態における波束の形状測定

この研究は、水銀原子の自然放出を利用して単一光子状態の波束を作り、長光路差マイケルソン干渉計で可視度曲線を測定し、波束の形状を観測することを目的としている。1個の励起原子からは1個の光子が自然放出されるが、多数の原子がある場合でも自然放出確率に比べて励起レートを十分に小さくすることにより個々の波束は単一光子状態になる。このような量子的波束はアンチバンチド状態にあり、通常光を減衰させただけの古典的波束とは異なるので、その波束の形状測定は興味深い課題である。まず、水銀原子-電子線衝突装置を作成し、その蛍光を測定した。陽極電圧700Vの電子線を衝突させると水銀圧力の増加に対して435.8nm線の強度は非線形敵に増加した。これは水銀のイオン化に伴って発生した2次電子が励起に関与するためであると考えられる。また、水銀ランプの546.1nm線を長光路差マイケルソン干渉計により測定した。干渉フィルター(半値前幅10nm)だけを用いると、超微細構造・同位体シフト・ドップラー広がりを反映した構造をもつ可干渉距離L=3cmの可視度曲線が得られた。さらにファブリー・ペロ-干渉計(FSR 27GHz、フィネス25)も用いると、複数の同位体を含む線(波数0)ではL=5cm、質量数199だけの線(波数+0.753)ではL=13cmとなり、超微細構造の分離により可干渉距離が大きく延びることが確認できた。しかし、ドップラー広がりによる可視度の見積もりとのずれがあるので、装置の改善を図る必要がある。これらの結果を踏まえ、水銀原子ビームの電子衝突励起によるドップラー広がりのない光源を使い、単一光子状態の波束の形状測定を行うのが次の目標である。この研究の目的は、単一光子状態における波束の空間自己相関関数を直接測定することによって波束の形状に関する知見を直接得ることである。実験の概要としては、電子衝突励起による水銀原子のカスケード遷移から一対の光子を生成し、カスケード光子の一方を計測トリガーとして用い、他方の光子に伴う波束の自己相関関数をマイケルソン干渉計によって測定する。このうち今年度は以下のことを行った。1.水銀原子のカスケード遷移による光子を得るための準備段階として、電子ビームと水銀原子の衝突用チャンバーを作成し、電子ビームによって励起された水銀原子の蛍光測定を行った。数100eV程度の高エネルギー電子の場合、測定対象となる光子の放出過程は、電子による水銀原子イオン化の際に放出された2次電子の水銀原子励起によるものであることがわかった。このように水銀と電子との相互作用自体、非常に興味のある内容であるが、水銀原子のカスケード遷移による光子を得るためには、今後電子エネルギーの調整、フィルターの使用などを考慮する必要がある。2.単一光子状態に先立つ予備実験として、長光路差マイケルソン干渉計を組立て、デジタルカメラからの干渉パターンのコンピューター取込みによる空間コヒーレンス解析システムを作成中である。このように光源と光学系とに分かれて実験を進めてきたが、来年度はこれらを連結して本実験に入る予定である。
ガンマ線バーストの統一モデルの研究

ガンマ線バーストは100億光年先という宇宙の果てで起こる、全宇宙でもっとも明るい爆発現象である。その起源は発見から30年来明らかでなく、宇宙物理学における最大の謎となっている。観測されるガンマ線は、なんらかの中心天体から噴き出したジェットから生じると考えられるが、中心天体は直接観測できない。本研究の目的はその中心天体が何かという謎に迫るために、観測できるジェットの放射領域の物理状態に制限をつけていくことである。本年度は研究実施計画の延長として、ガンマ線バーストの残光における偏光輸送計算を行なった(雑誌論文2)。これにより残光の多波長にわたる偏光スペクトルを導出した。また近年注目されている低効率電子加速モデルにおける偏光スペクトルも導出し、電波において偏光度が落ちることを示した。この振る舞いは現在計画中の電波望遠鏡ALMAで観測可能である。この研究はガンマ線バーストにおいて偏光によるプラズマ診断の方法を示した初めての論文であり、近い未来にモデルの是非を観測で確かめられることを提案した点が優れている。また、ガンマ線の放射機構に対し新たな理論モデルの提案も行なった(雑誌論文1)。このモデルはいままで解決できなかった高放射効率を実現できるものである。現在このモデルによるガンマ線偏光スペクトルの理論的予測を計画している。さらに昨年度と同様、Swift衛星の観測チーム(宇宙研の佐藤理江氏、東工大の河合誠之氏)と共同して最新のX線観測結果の理論的解釈を行い、現在論文を投稿中である。NASAのガンマ線偏光検出衛星計画POETに参加し、プロポーザルの理論部分の主要部を担当した。研究成果は2つの国際会議で発表し、海外の研究者と活発に議論した。ガンマ線バーストは100億光年先という宇宙の果てで起こる、全字宙で最も明るい爆発現象である。その起源は30年来明らかでなく、字宙物理学における最大の謎となっている。観測されるガンマ線は、なんらかの中心天体から噴き出したジェットから生じると考えられており、中心天体は直接観測できない。本年度はまず研究実施計画に沿って、最近のSwift衛星が明らかにし始めたガンマ線バーストの早期x線残光を説明するために必要な我々の非一様ジェットモデルの条件を導いた(研究発表論文1、2)。この研究によって非一様ジェットモデルではガンマ線の放射効率がいままでの予想より高い必要があることがわかった。この研究と並行して私の研究グループ内で早期X線残光に対する他のジェットモデルを模索し、高いガンマ線放射効率が必要でないモデルの提案も行なった(研究発表論文3)。またSwift衛星の観測チームと共同して観測結果の理論的解釈も行なった(研究発表論文4)。さらにSwift衛星で見つかった低光度ガンマ線バーストなる新種族に対し、通常のジェットモデルが適用できるということを示した(研究発表論文5)。以上のように私はいままでの我々の理論モデルに固執することなく、広い見地に立って観測結果を説明するようなジェットモデルを精力的に提案することができた。どの発表論文もすでに数件引用されている。また国際会議でも発表し、海外の研究者と活発な議論を行なった。広島大学で行なわれた「多波長・多モード連携観測で探る高エネルギー天体現象」という研究会においては招待講師としてガンマ線バーストの理論モデルのレヴュー講演を行なった。そこではいま新たに計画している残光での偏光輸送計算についても紹介し、多々質問を受けた。来年度はその計算を実行し、ジェットモデルにさらに深い物理的制限を加えていきたいと考えている。
アトピー性皮膚炎発症機序の解明

アトピー性皮膚炎(AD)はかゆみを伴う慢性の炎症性皮膚疾患である。先進国では過去数十年間で患者数が激増している。ステロイド等の治療薬が多くの患者で有効であるが、副作用によって治療が困難な症例も多い。ADの発症機序として、皮膚のバリア機能の低下や免疫機能の異常が指摘されている。本研究は、自然発症のADモデルとアレルゲンによる誘発ADモデルを用いて、発症機序を細胞レベルと分子レベルで解明することを目的とした研究であり、未完成ながら、マスト細胞は発症に必要だが,良く似た機能を持つ好塩基球やCD4 T細胞においてPLC-β3が誘発ADモデルに必要ないことを見いだした。本年度のハイライトは、本プロジェクトの基礎となった論文が2報(1. Ando et al., Journal of Investigative Dermatology, 2014;2. Ando et al., Cell Reports, 2014)発表されたことである。第1の論文では、家ダニ抗原を用いた誘発性アトピー性皮膚炎(atopic dermatitis, AD)モデルで、強力な皮膚炎発症には、T細胞だけでなくマスト細胞が必要であり、好酸球は不要であることが示された。皮膚炎症部位では、マスト細胞数が増加していて、炎症の重症度とよく相関し、TSLP(thymic stromal lymphopoietin)受容体とIgE受容体(FcεRI)も重要であることが示された。第2の論文では、Phospholipase C-β3(PLCb3) KOマウスでAD様の皮膚炎が自然に発症し、その皮膚炎においても、マスト細胞が増加していて発症に必要であることが示された。PLCb3 KOマウスのマスト細胞が過剰に増殖しているのは、転写因子Stat5の活性が高く、Stat5を不活化するSHP-1の活性が低いことによることが明らかにされた。マスト細胞のStat5の重要性は、上記誘発性ADモデルでも同様であることは、マスト細胞のみでStat5が欠損したマウスを用いて証明された。反対に、SHP-1がマスト細胞で欠損したマウスでは、誘発性ADモデルで重症度が高かった。PLCb3は、ADの発症に重要なTSLPとPeriostinの発現をそれぞれケラチノサイトと繊維芽細胞で制御していることも明らかになった。また、SNP解析により、マスト細胞でStat5の活性を制御するPLCb3とSHP-1をコードするいずれの遺伝子でも、AD患者に有意の遺伝子多型が見いだされた。さらに、半数以上のAD患者で、活性型Stat5が高いマスト細胞が増えていることが明らかになった。従って、マスト細胞でStat5の活性を制御するPLCb3は他の細胞ではTSLPやPeriostinの発現を制御することで、ADの発症に関わっていることが証明された。DTRマウス)を用いた実験により、好塩基球は必須ではないことを明らかにした(論文執筆中)。2.PLCβ3-/-;FcεR1a-/-二重KOマウスはPLCβ3-/-マウスと同様に皮膚炎を自然発症する。PLCβ3-/-;MyD88-/-二重KOマウスは現在皮膚炎が発症するか否か観察中である。3。PLCβ3遺伝子のfloxedマウスが1系統樹立されており、Stat5 floxedマウスとともに、各種のCre発現マウスと掛け合わせていて、繊維芽細胞におけるPLCβ3, Stat5, Stat6によるPeriostin産生制御機序およびケラチノサイトでのPLCb3によるTSLPの産生制御機序を解析するin vitro実験を開始しつつある。後述のCRISPR-Cas9系で遺伝子を切断した繊維芽細胞やおよびケラチノサイトも用いて、これらの実験を開始できるまでになった。本研究は、自然発症のADモデルとアレルゲンによる誘発ADモデルを用いて、発症機序を細胞レベルと分子レベルで解明することを目的としている。自然発症モデルとして、Phospholipase C (PLC)-β3欠損マウスに他の遺伝子欠損を導入することで、その遺伝子の必要性を検討した。その結果、高親和性IgE受容体(FcεRI)は不要であることが判明した。多くの病原微生物に対する感染の防御に関わるMyD88の必要性は、Plcb3-/-;Myd88-/-の複合KOマウスが生まれにくく、結論を出すに至っていない。誘発モデルでは、各種の遺伝子及び細胞欠損マウスにダニ抗原とstaphylococcal enterotoxin Bを塗布して、AD様の皮膚炎症が発症するか否か検討した。すでに明らかにしているように、T細胞やマスト細胞は発症に必要だが、マスト細胞に似た機能を持つ好塩基球は不要であった。また、いわゆるconditional KOマウスを用いて、CD4 T細胞においてPLC-β3が誘発ADモデルに必要ないことを見いだした。また、我々はStat5の活性PLC-β3によって負の制御を受けることを明らかにしているが、Stat5阻害剤の入手が困難で、誘発ADモデルを予防できるか否か検討できなかった。

ステロイド等の治療薬が多くの患者で有効であるが、副作用によって治療が困難な症例も多い。ADの発症機序として、皮膚のバリア機能の低下や免疫機能の異常が指摘されている。本研究は、自然発症のADモデルとアレルゲンによる誘発ADモデルを用いて、発症機序を細胞レベルと分子レベルで解明することを目的とした研究であり、未完成ながら、マスト細胞は発症に必要だが,良く似た機能を持つ好塩基球やCD4 T細胞においてPLC-β3が誘発ADモデルに必要ないことを見いだした。繊維芽細胞・ケラチノサイト・マスト細胞などで遺伝子を迅速に切断するため、CRISPR-Cas9系を導入した。DNA切断酵素Cas9をsgRNAを用いて、狙い通りのDNA部位を切断するために、sgRNAのデザインをより正確にするための方法を見いだした(論文執筆中)。この方法を用いて、SykやLat遺伝子を破壊すると、FcεRIを介したマスト細胞の活性化が完全に阻害されることを確認した。現在、繊維芽細胞のPLCβ3, Stat5, Stat6等の遺伝子を破壊する実験を施行中であり、この点では予定より遅れているが、CRISPR-Cas9系を早期に導入したことは充分価値のあることと判断している。また、Jak-Stat5阻害剤をダニ抗原誘発性のAD様皮膚炎で検討する件は、相手方(トロント大学)の事情で阻害剤が入手できず、かつ、他の研究グループにより同様の研究がなされた(Jak阻害剤は有効)ことから、断念せざるをえなかった。27年度が最終年度であるため、記入しない。アレルギー、マスト細胞、シグナル伝達上述の通り、CRISPR-Cas9系を導入した。このことは計画の変更にあたるが、CRISPR-Cas9系を早期に使いこなし、狙い通りのDNA部位を切断するために、sgRNAのデザインをより正確にするための方法を見いだしたことは充分価値のあることと判断している。AD様皮膚炎にマスト細胞上のFcεRIが重要であることから、CRISPR-Cas9系を用いた新たなFcεRI signaling moleculesも探索している。以上の変更により、本研究の目的の大半は、最終年度中に達成できるめどが立つとともに、所期以上の成果が生まれることが期待できる。PLCb3-/-;FceR1a-/-マウス等の二重(又は三重)KOマウスは研究計画に従って、作製されつつある。また、PLCb3fl/flマウスの作製は順調である。現在、PLCb3遺伝子をfloxedにしたES細胞から予想されたゲノムをもつマウスが1系統生まれている。しかし、線維芽細胞におけるPeriostin発現調節と最適なJak-Stat5阻害剤を探索する実験は進展していない。(理由)やや遅れている理由は、1)第2の論文完成のために予想以上の労力と期間を要したこと、2)Jak-Stat5阻害剤のMTAが相手方(トロント大学)の事情で遅れていること、3)連携研究者である研究員(安藤智暁)の理研着任が2013年10月と遅れたことによる。しかし、来年度からは、遅れをとり戻すことができると思われる。研究計画の遅れは、研究計画そのものの問題ではなく、外的要因による。
時間相関イメージセンサに基づく新世代パターン計測技術の基礎的研究

本研究の目的は、能動的な画像センシングに適した新しい原理のイメージセンサである時間相関イメージセンサを開発し、それに基づいて従来にない新しいパターン計測技術を展開してゆくことにある。ここで時間相関イメージセンサとは、入射光強度と全画素共通に与える外部電気信号との時間相関を出力するイメージセンサであり、申請者らが独自に研究を進めてき.たものである。研究期間(3年間)の成果概要は以下の通りである。時間相関イメージセンサのデバイス試作と評価東京大学VDECのCMOSプロセスを利用して,下記のデバイスを試作し,動作を確認,検証した。1.64x64画素時間相関イメージセンサ2.時間相関型PSD 3.16x16画素全ディジタル型時間相関イメージセンサ4.32x32画素三相相関方式時間相関イメージセンサ時間相関イメージセンサを用いた応用計測時間相関イメージセンサを用いて,下記の新たなパターン計測技術を提案した。1.構造化照明を用いた振動パターン計測法2.位相変調シート照明を用いた実時間三次元計測法3.画像の局所対称性を検出する固視微動型特徴抽出法4.波長可変単色光源を用いたスペクトルマッチングイメージャ5.時間位相符号化方式実時間レンジファインダ本研究の目的は、能動的な画像センシングに適した新しい原理のイメージセンサである時間相関イメージセンサを開発し、それに基づいて従来にない新しいパターン計測技術を展開してゆくことにある。時間相関イメージセンサとは、入射光強度と全画素共通に与える外部電気信号との時間相関を出力するイメージセンサであり、従来の汎用イメージセンサでは不可能だった、高周波時間軸情報を利用した画像センシングを可能にするものである。本研究で取り組むべき主な課題は、1)時間相関イメージセンサのための能動計測理論の構築、2)汎用CMOSプロセスで容易に集積化可能な設計法の確立、3)256×256画素を目標とした半導体チップの試作と検証、4)画像処理・画像認識・画像計測のための応用システムの構築、である。以上の目的に対する本年度の成果は以下の通りである。1.64×64画素時間相関型イメージセンサの試作東京大学のVDEC(VLSI設計教育センター)の1.2μmCMOSプロセスを利用して64×64画素のイメージセンサを試作し、時間相関の動作を確認した。伝達コンダクタンス乗算器を用いることにより、MOSFETが4個というシンプルな画素セルの構成を実現し、高集積化への見通しを得た。2.時間相関型光位置検出素子(PSD)の提案と試作時間相関型イメージセンサと同じ時間相関による光検出の原理を導入したPSDを提案し、東京大学のVDECの1.2μmCMOSプロセスを利用して試作した。従来のPSDでは困難だった背景光の影響除去や複数輝点の分離抽出を実験により確認した。3.時間相関型イメージセンサを用いた振動パターン計測法の提案時間相関型イメージセンサの応用として、構造化照明を用いた振動パターン計測法を提案し基礎実験を行った。構造化照明により対象表面の機械的振動パターンを明暗分布の振動に変換し時間相関型イメージセンサで撮像することにより、複雑な光学系なしに振動の振幅と位相の分布が得られる点に特色がある。4.時間相関型イメージセンサを用いた三次元計測法の提案時間相関型イメージセンサの応用として、投射角に伴って変調の位相が変化するシート照明を用いた三次元計測法を提案した。時間相関型イメージセンサの1フレーム出力から実時間で奥行きマップが得られる点に特色がある。システムを試作し、実験により1フレーム出力からの立体復元を達成した。時間相関イメージセンサとは、入射光強度と全画素共通に与える外部電気信号との時間相関を出力するイメージセンサであり、従来の汎用イメージセンサでは不可能だった、光パターン入力の高周波時間軸情報を利用した画像センシングを可能にするものである。