hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
アメロゲニンと生体活性ガラスを併用した骨組織再生療法の開発

アメロゲニン(AME)を再生促進因子として、また、生体活性化ガラス(BAG)を足場として使用することにより、効果的な硬組織再生療法が開発できないかについて検討した。材料および方法として、10週齢のWistar系ラットの頭蓋骨に直径5mmの骨欠損欠損窩洞を作製した。その後、ラットを4群に分け、窩洞に何も入れないコントロール群、BAGだけを埋入したBAG群、AMEだけを埋入したAME群、BAGとAMEを混入したBAG+AME群をそれぞれ作製した。術直後、術後2週、4週、8週でそれぞれの群のラットをマイクロCTで撮影を行い、エックス線学的に検討するとともに、骨欠損窩洞内における水平面での不透過像の割合を定量的に解析を行った。また、4%パラホルムアルデヒドにて灌流固定を行い、通法に従ってパラフィン包埋薄切標本を作製した後、ヘマトキシリン・エオジン染色およびマッソントリクローム染色を行い組織学的に観察を行った。定量解析の結果、コントロール群は実験期間を通して、硬組織形成量は低い値を示した。AME群は経時的に上昇傾向を示した。BAG群、BAG+AME群はコントロール群と比較して4週例と8週例に有意に高い値を示した。また、各群間に有意差は認められなかったが、BAG+AME群は8週例において最も多量の硬組織形成が認められた。一方、組織像ではコントロール群では実験期間を通して、新生骨と推測される硬組織の形成は観察されなかった。AME群では4週目に類円形の硬組織の形成が基底膜に沿って認められ、8週目には活発な硬組織形成像が引き続き観察された。BAG群、BAG+AME群では4週目からBAG粒子の周辺に硬組織の形成が認められ、特にBAG+AME群では8週目に窩洞全域にわたって厚い線維性の硬組織形成像が観察された。アメロゲニンと生体活性ガラス(BAG)の硬組織形成能に及ぼす影響を評価するため、ラット頭蓋骨欠損モデルを用いて、X線学的解析および組織学的に解析を行った。実験に使用するヒトリコンビナントアメロゲニンの入手に時間がかかったため、対照群であるBAG単独群およびコントロール群の試料を作製するとともに、予備実験として、アメロゲニンと同じく硬組織形成促進効果が期待されるホスファチジルセリンで作成したリポソーム(PSL)を使用して実験を行った。ラットを3群に分け、骨欠損部に試作した骨補填材を填入した。すなわち、BAG単独群、BAGとPSL併用群、骨欠損部に何も填入しないコントロール群の3種類の骨窩洞処置群を作製した。処置後、2、4、8週目に標本を採取した。新生骨形成量についてはラット頭部をmicro-CTで撮影および構築を行い、X線学的に検討するとともに、水平面での不透過像の割合を、画像解析ソフトを用いて定量的に解析を行った。その結果、コントロール群では実験期間を通して骨欠損部に硬組織様の不透過像は認められなかった。また、BAG単独群では、処置後2週および4週目では、骨欠損部に硬組織様の不透過像はほとんど認められなかった。処置後8週目では、骨欠損部にBAGを中心にして不透過性の亢進した像が多く認められた。BAGとPSL併用群では処置後4週目から骨欠損部にBAGを中心にして不透過性の亢進した像が認められ、窩洞内における不透過像の面積は、BAG単独群よりも有意に高い値を示した。以上のことより、BAGとPSL併用群はBAG単独群と比較して早期に硬組織形成が促進された可能性が示唆された。実験に使用する完全長のヒトリコンビナントアメロゲニンの入手に時間がかかったため、27年度は骨欠損窩洞実験モデルの作成および実験手技の確立にとどまったため、実験がやや遅れたものとなってしまった。ラット根尖病変モデルを作製し、根尖部歯周組織におけるアメロゲニンの作用について実験を行った。作製したモデルを2群に分け、一方にはアメロゲニンを貼薬した。もう一方にはコントロール群として滅菌済みの生理食塩水を貼薬した。処置後0日、2週、4週でそれぞれ試料を採集し、標本を作製した後、HE染色および免疫染色を行い、組織学的に検討した。その結果、アメロゲニン群においては術後1週目にTGF-β1陽性細胞が骨面に多数観察された。また、術後2週目において根尖部の病変は縮小傾向を認め、病変周辺の骨面ではBMP-2陽性細胞活性を示す骨芽細胞が多数、多層に配列しているのが観察された。一方、骨面近傍では炎症反応の指標であるIL-1β陽性細胞が術後0日目と比較して著しく減少しており、治癒傾向にあることが推測された。一方、コントロール群では実験期間を通してBMP-2およびTGF-β1陽性細胞の発現はほとんど観察されず、術後4週においても根尖部に病巣が観察され、IL-1β陽性細胞が散在性に観察された。また、ラット頭蓋骨欠損モデルを作製し、4群に分けた。そののち欠損部にアメロゲニンを埋入したアメロゲニン群、生体活性ガラス(BAG)とアメロゲニンを埋入したアメロゲニン+BAG群、BAG単独群、窩洞に何も埋入しないコントロール群の4種類の骨窩洞処置群を作製した。処置後、2、4、8週後に試料を採集し、標本を作製した。作製した標本にてHE染色を行い、組織学的に検討した。

その結果、アメロゲニン+BAG群では術後8週目においてBAG粒子のを中心にして新生骨の形成が認められた。しかしながら、根尖病変モデルの実験で認められたBMP-2、TGF-β1、IL-1βの発現について免疫組織学的に検索したが、陽性細胞を同定することができなかった。根尖病変モデルと頭蓋骨欠損モデルを作成し、実験を行っているが、頭蓋骨欠損モデルにて標本を作製し、免疫組織学的に検索を行うも、硬組織形成の指標となるBMP-2、TGF-β1陽性細胞、また、炎症反応の指標となるIL-1β陽性細胞の同定ができなかった。このため、追加実験を行い、n数を増やして原因を検討しているため。ラット頭蓋骨欠損モデルを作製し、4群に分けた。そののち欠損部にアメロゲニンを埋入したアメロゲニン群、生体活性化ガラス(BAG)とアメロゲニンを埋入したアメロゲニン+BAG群、BAG単独群、窩洞に何も入れていないコントロール群の4種類の窩洞処置群を作製した。処置後、2,4,8週後に試料を採取し、標本を作製した。作製した標本にて免疫染色を行い、BMPー2,TGFーβ1、ILー1βの発現について免疫組織学的に検索したが、陽性細胞を同定することができなかった。このため、新たにラットを購入して追加実験を行い、各群のn数を増やした。これらについては現在、標本を作製している。また、実験手技の確認と新生骨形成時におけるアメロゲニンの作用について比較検討するため、同様の手技を用いてラット頭蓋骨欠損モデルを作製し、細胞膜リン脂質であるホスファチジルセリンを含有するPSリポソーム(PSL)とBAGを埋入したPSL+BAG群を作製した。PSL+BAG群も2,4、8週後に試料を採取し、標本を作製してHE染色を行った。その結果、PSリポソーム+BAG群では処置後2週目においてBAG粒子の周囲に単核の紡錘形、類円形、多核形などの多様な形状を示すマクロファージ状の細胞が多数観察されるとともに、BAG粒子に接して多核の巨細胞が観察された。また、BAG粒子の近傍には幼若な骨細胞を含有した新生骨の形成が認められた。8週目においてはBAG+PLリポソーム群およびBAG単独群の両群において一部BAG粒子を含有した、成熟した新生骨形成像が観察された。アメロゲニンと生体活性ガラス(BAG)を併用した骨再生療法の開発を目的として、ラット頭蓋骨欠損モデルを用いて実験を行っている。頭蓋骨の欠損部にBAG単独を埋入した群、BAGとアメロゲニンを埋入した群、BAGとPSリポソームを埋入した群、何も埋入しなかったコントロール群を作り、それぞれ、処置後2週目、4週目、8週目で試料を採取した。採取した試料は骨形成の評価方法の一つとして、マイクロCTにて撮影してエックス線学的に評価するとともに、組織学的に解析するため、組織標本を現在、作製している。当初の予想ではBAG粒子の近傍に新生骨が形成されると考えており、BAGとPSリポソーム併用群では実際に2週目において、BAG粒子近傍で幼若な骨細胞を含有した新生骨が認められた。しかしながら、マイクロCTにおいて撮影した画像で確認したところ、BAGとアメロゲニンを埋入した群でのみ、BAG粒子の消失が観察された。このため、アメロゲニンによりBAG粒子の排出が促進されたのか、または異物巨細胞性吸収によるものか、さらなる検討の必要性が生じたため。アメロゲニン(AME)を再生促進因子として、また、生体活性化ガラス(BAG)を足場として使用することにより、効果的な硬組織再生療法が開発できないかについて検討した。
サイト選択XAFSを用いたクロム・コバルト・銅触媒表面活性サイト構造の研究

平成12年度までに、化学状態の異なるサイトを峻別してX線吸収微細構造(XAFS)スペクトルを測定するための蛍光分光検出装置を考案・製作した。エネルギー分解能1.1 eVで、物理混合試料について価数分離を行ない、90%のサイト選択を得た。本年度助成研究では上記基礎データを基に、COとH_2からメタノールを合成するCu/ZnO触媒について、Cu^0およびCu^Iサイトそれぞれに蛍光分光検出装置をチューンし、サイト選択XAFS測定を行なった。以前エネルギー分解能2.1 eVの条件で、この触媒についてサイト選択XAFS測定を行なっているが、本年度の研究では、実際の触媒試料についてエネルギー分解能向上に伴なうサイト選択向上が見られるか、および触媒作用機構と関連して、炭酸ガスおよび水の共存によるサイト構造変化を調べることにポイントを絞った。スペクトル研究の結果、Cu/ZnO触媒については活性化処理条件が非常にcriticalで、反応ガスCOとH_2の他、炭酸ガスと水共存条件でのみ金属銅サイトのCu^Iサイトベの部分酸化が優勢に見られた。炭酸ガスと水非共存条件あるいは処理温度が453K以下の場合には、金属銅サイトが優勢に観測された。部分酸化されたCu^IサイトはCu_2Oばかりではなく、ZnO表面に原子状に分散したサイトも含むことが、スペクトルのシミュレーションにより示唆された。研究費は蛍光分光検出装置用インターフェース、成果発表(日本化学会、放射光学会)の他、新たな系の探索として行なった鉛、バナジウムの実験の試薬等に用いた。これらの系では低濃度であることにポイントを置き、まだ価数分離には至っていないが、そのための基礎データを一通り得て、低濃度ということで報文(英文校閲)とした。化学状態の異なるサイトを峻別してX線吸収微細構造(XAFS)スペクトルを測定するための検出装置を考案・製作し、触媒表面活性サイトの構造研究に応用した。試料からの蛍光X線を結晶分光しサイトの違いによる蛍光X線の化学シフトを利用して、サイト選択XAFS測定を行なう。シンチレーションカウンターおよびビームサイズを規定するためのスリットを導入し、本検出装置を完成させた。Cu/ZnO触媒および標準モデル試料について、SPring-8 Undulatorビームライン10XUで測定を行なった。Cu Kα発光スペクトル測定におけるエネルギー分解能は、蛍光分光装置(特にRowland円内のスリットサイズ)由来と、ビームラインのモノクロメーター(特にビームサイズ)由来とのconvolutionとなり、1.1 eVとなった。これはCu Kα_1についての内殻寿命自然幅(2.11 eV)より小さい。この高分解能およびCu^0-Cu^I間の化学シフトを利用して、金属銅とヨウ化銅(CuI)とを物理混合した試料および活性化されたCu/ZnO触媒について、蛍光分光装置をCu^0およびCu^Iにチューンした上でXAFS測定した。前者においてはそれぞれの価数サイトを峻別したスペクトルが、後者においては金属銅およびCu_2O+ZnO表面に原子状に分散したCu^Iサイトについてのスペクトルが60-90%の効率で得られた。まとめると、本手法により、触媒中に混在するサイト中から活性サイトのみの構造情報を明らかにできることが示された。またアルコール等の脱水素触媒であるCr/SiO_2触媒について、Cr^<III>とCr^<VI>サイトが触媒表面に共存する中からCr^<III>サイトについてのXAFSスペクトルを得た。以上の成果を国内外3学会で発表し、さらなる高分解能化および新たな応用法について討論したので、発展の手掛りとしたい。
メダカの転移因子の突発的転移頻度上昇の機構

メダカのTol1因子では、転移頻度がある世代で突然上昇するという現象が起こる。この現象の分子レベルでの機構を探るために、転移酵素遺伝子をもつ因子のメダカへの導入と、転移頻度の測定を主体とする実験を、行った。高い転移頻度を示したメダカでは、因子の挿入は、遺伝子の下流で起こっていた。この結果から、上流の遺伝子からのリードスルーが転移酵素mRNAの増加をもたらし、これが転移頻度の上昇につながると、推測した。転移因子の転移頻度が突発的に上昇する現象は、トランスポジションバーストとよばれ、多数の生物種で事例がある。本研究の目的は、メダカでこの現象が観察されたTol1因子に関して、その機構を解明することである。1年目である本年度は、この現象を人為的に再現することを目指した。Tol1因子は、メダカのゲノムに100200コピー存在する。ただし、そのほとんどが、内部が崩壊した非自律的因子である。そのような状態のゲノムに転移酵素を供給すると、非自律的因子の転移が再開することが、予想される。この予想を確認するために、2段階の作業を行った。第1段階は、非自律的因子をまったくもたない系統を準備することである。そのために、因子の各部をプローブとして、ゲノムDNAのサザンブロットを行った。そして、端部のプローブにはシグナルは出るが中央部のプローブでは出ない系統を選んだ。標準的な系統として多用されているHNI系統が、これに該当した。第2段階は、この系統に転移酵素を供給し、転移を検出することである。これを、転移酵素のRNAを受精卵に注入するという方法で、行った。注入から7日後にゲノムDNAを抽出し、Tol1因子をはさむプライマーを5組用いて、PCRを行った。転移が起こればTol1因子が抜けるため、その分短くなったDNA断片が生じるはずである。5組のすべてについて、そのような断片が生じるという結果が得られた。産物の量は、自然で転移が起こる場合の100倍以上であり、転移頻度が高いことが推察された。以上のように、トランスポジションバーストを人為的に再現することができた。この結果の意義は、トランスポジションバーストの機構を解明するための簡便な実験系が準備できたことにある。メダカのTol1因子では、転移頻度の突発的な上昇、すなわちトランスポジションバーストが、起こる。本研究の目的は、その機構を解明することである。昨年度までに、転移酵素のRNAを受精卵に注入することでトランスポジションバーストを誘発できることを、証明した。また、培養細胞を用いて、転移酵素の過剰量での存在が転移頻度低下をもたらさないことも、示した。これらの結果から、自律的因子がもつ転移酵素遺伝子から大量に転写が起こることが、トランスポジションバーストの直接の原因であると、推測した。大量の転写は、因子の外部に強力なプロモーターが存在する状態になったときに起こると、考えられる。これを証明するために、まず、自律的因子をもたないメダカに自律的因子を導入し、自律的因子を1コピーもつ系統を、多数作った。挿入の場所は、系統ごとに異なる。続いて、それぞれの非自律的因子の転移頻度を測定し、転移頻度の高い系統と低い系統を、各2系統選定した。これらの系統から、自律的因子が挿入している場所を特定し、近辺でのホストの遺伝子の配置を調べた。その結果、転移頻度の高い系統では、遺伝子の下流に、転移酵素遺伝子が同じ方向となるように因子が入っていることが、判明した。以上の結果から、Tol1因子が入った場所の近辺にある遺伝子の影響で、転移酵素遺伝子の転写量が増加したときに、トランスポジションバーストが起こると、結論した。メダカ自然集団での自律的因子の地理的分布も調べ、コピー数は個体あたり平均1以下と少ないものの、メダカの分布域に広く存在することが、わかった。このことから、トランスポジションバーストは自然集団で起こり得ると、推測される。
I型ネコ伝染性腹膜炎ウイルスの利用するウイルス受容体の同定

ネコ伝染性腹膜炎(FIP)はイエネコおよびネコ科動物の致死性ウイルス感染症である。FIPの原因ウイルスであるFIPウイルス(FIPV)にはI型とII型の2つの血清型が存在し、野外においてはI型FIPVが優勢である。しかし、I型FIPVの吸着時に利用するウイルス受容体はII型FIPVとは異なることが証明されているが、その分子は未だ同定されていない。そこで申請者はプルダウン法を用いてI型FIPVの受容体を同定することとした。平成30年度は精製したタグ付I型FIPV Sタンパク質をベイトとしてプルダウン法を実施し、相互作用するタンパク質の同定を試みた。しかしながら、プルダウン法では相互作用するタンパク質を同定することが出来なかった。そこで、ベイトであるタグ付I型FIPV Sタンパク質がI型FIPV感受性細胞であるfcwf-4細胞に結合するか否かを確認したところ、I型FIPV Sタンパク質がfcwf-4細胞に結合している事実は確認できなかった。付加したタグがFIPV Sタンパク質とウイルス受容体の相互作用を阻害する可能性を踏まえ、対照として作製したタグ付II型FIPV Sタンパク質のfcwf-4細胞に対する結合性を確認したところ、II型FIPV Sタンパク質はfcwf-4細胞に結合した。さらにこの結合は、II型FIPVのウイルス受容体であるアミノペプチダーゼNに対するモノクローナル抗体により阻害されることを確認した。これらを踏まえると、I型FIPV Sタンパク質のfcwf-4細胞に対する結合性の欠如は、タグによる立体障害というよりもI型FIPV Sタンパク質とそのウイルス受容体に特有の問題である可能性が示唆された。しかし、II型FIPVと比較してI型FIPVは株化細胞における増殖性が悪いため、実験的取り扱いが難しい。このような理由から、I型FIPVは研究に用いられることが少なく、I型FIPVの感染機構には不明な点が多い。特に、I型FIPVの吸着時に利用するウイルス受容体はII型FIPVとは異なることが証明されているが、その分子は未だ同定されていない。I型FIPVの受容体が同定できれば、I型FIPVの感染・増殖メカニズムの解明が急速に進展し、治療薬および予防薬の開発が大きく前進することが期待される。そこで申請者はI型FIPVの受容体を同定することとした。I型FIPVの受容体探索はプルダウン法により行う。平成29年度はプルダウン法のベイトとして用いるタグ付I型FIPV Sタンパク質の発現系を構築した。I型FIPV Sタンパク質のレセプター結合領域を含むS1領域をタグと融合させた組換えタンパク質を哺乳細胞の培養上清中に一過性に発現させた。FIPV感染猫血清を用いたwestern blot解析を行ったところ、精製した組換えタンパク質はFIPV Sタンパク質としての抗原性を有することを確認した。また、組換えタンパク質は天然型のFIPV Sタンパク質と同様にホモ三量体構造を形成している可能性が示唆された。今後、組換えタンパク質のFIPV感受性細胞に対する結合性を確認し、受容体の分離・同定を行っていく予定である。当研究室で保有するFIPV KU-2株のS遺伝子のシグナル配列を用いて発現ベクターを構築したところ、分泌タンパク質として哺乳細胞に発現させることが出来なかった。そこで、異なるタンパク質の分泌シグナル配列を付加した発現ベクターに再構築したところ、分泌タンパク質として発現させることに成功した。以上のことから当初の予定より若干の遅れが生じたものの、平成30年度は引き続き発現させた組換えFIPV Sタンパク質を用いて受容体の分離・同定を行う予定である。

平成30年度はプルダウン法を応用したI型FIPVに対するウイルス受容体の分離・同定を行う。具体的には、精製したタグ付S1領域(ベイト)を精製用セファロースゲルに結合させ、そこにI型FIPV感受性細胞のライセートを反応させて、ベイトと結合するタンパク質を精製する。精製されたタンパク質が得られれば、質量分析による解析を行い、得られた配列と類似する配列から候補となるタンパク質を推定する。さらに、そのウイルス受容体の候補となるタンパク質の遺伝子をクローニングし、株化細胞にトランスフェクションすることでI型FIPVへの感受性が変化するか否かを確かめことでウイルス受容体を証明する。
腫瘍組織における熱ショックタンパク質Hsp105の発現亢進とその癌悪性化誘導

本研究では、肺などの扁平上皮癌組織におけるHsp105の核内高発現を明らかにした。培養細胞レベルの解析により、Hsp105が核内に発現し、癌悪性化に関わるタンパク質の発現や活性化に寄与することが明らかになった。抗癌剤処理によりHsp105の核内発現が増加し、Hsp105の発現抑制により抗癌剤感受性が増加した。今後さらに動物モデルや臨床検体を用いて検証する必要があるが、Hsp105を標的とした治療や診断への応用が期待される。腫瘍組織検体におけるマーカータンパク質の発現解析は、診断や治療法に有益な情報を提供することから、新規腫瘍マーカーの探索は重要な課題である。本研究では、熱ショックタンパク質Hsp105の腫瘍組織における発現亢進、特に核内発現の意義を明らかにし、腫瘍マーカーとしての利用や治療への応用を目指した基盤的研究を行う。平成26年度は以下の検討を行った。(1)腫瘍組織で発現するHsp105の分子種を決定するために、肺がんなど4種の組織についてRT-PCRによりHsp105αおよびHsp105βの発現を評価した。ほとんどすべての組織においてHsp105βでなくHsp105αの発現が認められた。また、正常組織と比較してHsp105αmRNAは大きく変化しておらず、腫瘍組織におけるHsp105の発現亢進は転写レベルで起きていないと考えられた。(2) Hsp105核内発現の意義としてHsp105βによるHsp70誘導に着目し、Hsp105βと相互作用する分子の関与について検討した。その結果、Stat結合タンパク質NmiがStat3の活性化を介してHsp70誘導に関わることを明らかにした。さらに、細胞質に局在するHsp105αがNmiの過剰発現により核に局在化することを見い出した。(3) shRNA発現ベクターによるHsp105ノックダウン株を樹立し、アポトーシス、細胞増殖などに及ぼす影響を評価した。Hsp105の核局在により癌化が起こる可能性について検討するために、核局在型Hsp105を発現する細胞株の作製に着手した。これまでに肺がん組織において、Hsp105αが核内に高発現するという予備的なデータを得ている。本年度は、種々のがん組織におけるHsp105αの核内発現について解析を行った。肺や大腸など12種類の腫瘍組織とそれに隣接した正常組織におけるHsp105の発現を抗Hsp105抗体を用いた免疫染色法により調べた結果、肺、皮膚、食道などの扁平上皮がん組織において、Hsp105の核内発現が観察された。一方、これまでにHsp105の高発現が報告されている大腸がんや肝がんでは、Hsp105が高発現していたものの明確な核内発現は認められず、Hsp105の核内発現が腫瘍組織特異的であることが示唆された。また、昨年度までに樹立したHsp105ノックダウン株について解析し、Hsp105α発現抑制による抗がん剤感受性の増加やDNA傷害性抗がん剤によるHsp105αの核局在化を明らかにした。腫瘍組織におけるHsp105の核内発現の意義の一つとして、Hsp105によるHsp70発現誘導に着目し、検討してきた。核内に発現するHsp105結合タンパク質として同定した急性骨髄性白血病原因遺伝子の転座パートナータンパク質や核内低分子リボ核タンパク質がHsp70発現亢進に寄与することを明らかにし、論文として発表した。本研究の目的は、未だ解明な熱ショックタンパク質Hsp105の腫瘍組織における発現亢進、特に、核内での発現の意義を明らかにすることである。最終年度は、低酸素状態を模倣する塩化コバルト処理やDNA傷害性抗がん剤であるアドリアマイシンによるHsp105αの核局在化に焦点を絞り解析した。前年度までに作製したHsp105ノックダウン細胞株(HeLa/shHsp105)を用いて解析した結果、(1)塩化コバルト処理時において、Hsp105αがHIF-1と相互作用し核に局在すること、Hsp105αが塩化コバルト処理によるHIF-1蓄積および転写活性化に必須であることを明らかにした。(2)アドリアマイシン処理時において、Hsp105αが核に局在すること、この核局在化にはHsp105αに存在するNLSが必要であることを明らかにした。Hsp105αノックダウンにより細胞死が増加した。Hsp105αNLS変異体を用いたレスキュー実験を実施中であるが、Hsp105αの核局在化がアドリアマイシン感受性に寄与することが示唆された。研究期間全体の成果:肺がんなど数種類の腫瘍組織においてHsp105が核内に発現していることを見出した。Hsp105には、細胞質に局在するHsp105αと、核に局在するHsp105βが存在する。腫瘍組織において、Hsp105βではなくHsp105αが核内に発現することが示唆された。培養細胞を用いた実験において、遺伝子導入や薬剤処理によりHsp105αは核内に発現し、がん悪性化に寄与するHsp70、Stat3、HIF-1の発現や活性化を亢進させた。Hsp105の発現抑制により抗がん剤感受性が増加した。

今後さらに、臨床検体や動物モデルを用いて検証していく必要があるが、Hsp105αの核内発現を標的としたがん治療や診断への応用が期待される。本研究では、肺などの扁平上皮癌組織におけるHsp105の核内高発現を明らかにした。培養細胞レベルの解析により、Hsp105が核内に発現し、癌悪性化に関わるタンパク質の発現や活性化に寄与することが明らかになった。抗癌剤処理によりHsp105の核内発現が増加し、Hsp105の発現抑制により抗癌剤感受性が増加した。今後さらに動物モデルや臨床検体を用いて検証する必要があるが、Hsp105を標的とした治療や診断への応用が期待される。腫瘍組織で発現するHsp105の分子種の決定、Hsp105によるStat3活性化機構の解析など、一部変更点があるものの当初の計画どおり進んでいる。腫瘍組織におけるHsp105の核内発現の意義の解析については、核内発現型Hsp105発現細胞を作製して培養細胞および個体レベルで検討する予定でいたが細胞株の樹立に至っていない。今後は、既に樹立しているHsp105ノックダウン株を使用して検討する予定でいる。これまでにHsp105α発現抑制による抗がん剤感受性の増加、サイトカインシグナル伝達系転写因子や低酸素応答因子の機能低下がわかってきたので、これらメカニズムを明らかにする研究を推進していく。分子細胞生物学平成27年度には、当初の計画どおり培養細胞レベルだけではなく個体レベルにおけるHsp105の機能解析を予定している。当面必要な物品を購入できていたため未使用額として4,011円生じたが、次年度の試薬購入費とする。当面必要な物品を購入できていたため未使用額として85,786円が生じたが、次年度の試薬購入費とする。細胞培養関連試薬等の購入に充てる。細胞培養関連試薬や抗体等に加えて実験用動物および飼育経費として使用する。
果実におけるプロアントシアニジン蓄積機構の解明

カキのプロアントシアニジン(PA)蓄積に関連して、カキ果実におけるプロアントシアニジン蓄積に関わる重要なステップであるガレート形成およびポリマー形成について明らかにすることを目的として研究を進めた。これまでの報告では、dehydroquinate dehydratase-shikimate dehydrogenase (DHD/SDH)が没食子酸生成酵素であるとされているが、カキのアイソフォームにはその活性が認めらない。また、チャにおいてserine carboxipeptidase-like protein (SCPL)がflavan 3-olsへの没食子酸転移酵素であるという報告があるが、22遺伝子について配列が挙げられているだけで、機能同定はなされていない。本年度は`倉光'幼果および幼葉から粗酵素を抽出し、3-デヒドロシキミ酸およびシキミ酸を基質とした没食子酸生成および、没食子酸をflavan 3-olsに転移する酵素の活性を確認するための予備試験を行った。ポリマー形成は、LARやANSの関与が示唆される論文が近年発表されたが、flavan 3-olsにシステインを転移する反応については未だ報告がない。これまでにカキ果実より単離した1-cys peroxiredoxin,についてその可能性を確認するためにin vitroおよびカキの形質転換による試験の準備を行った。また、PAの蓄積変異体である完全甘ガキの特性化のために電子顕微鏡による完全甘ガキ羅田甜柿、松本早生富有および完全渋ガキ最勝におけるタンニン細胞の組織観察を行うために樹脂包埋を行った。さらに、経時的に採取した羅田甜柿、天宝蓋、駿河および倉光についてPAの構成flavan 3-olsおよび没食子酸の経時的変化を調査中である。上記のカキの研究以外に、ブドウの成熟および着色に関する研究の論文執筆および試験行った。具体的には`ルビーロマン'の温度処理による着色への影響に関する論文3報、`ルビーロマン'および`安芸クイーン'の着色特性の差異についてである。アントシアニン蓄積およびこれに影響すると考えられるABAとその代謝関連遺伝子の解析について取りまとめている。`ルビーロマン'はこれまでに報告された品種とは異なり、ABAの代謝およびアントシアニンの蓄積が成熟期に高いことが明らかになった。また、高温下においてこれまで発現が低くなると報告されているアントシアニン蓄積に関わる遺伝子発現が高く推移することから、成熟期の高温下での着色抑制に関する問題提起を行えた。さらに、マンゴーの着色に関わるアントシアニン合成に関わる酵素flavonoid 3-O-glucosultransferase(F3GT)の性状解析を行っている。マンゴーには光に反応して発現が上がる2つのF3GTがあるが、これらの遺伝子を大腸菌で発現させ活性のある融合タンパクを得ることに成功した。面白いことに、グルコース転移活性は両遺伝子がコードするタンパク質に認められるが、片方にのみ存在するガラクトース転移活性はグルコースの転移活性よりもずいぶん高いことが確認された。アントシアニンにはガラクトシドを主に蓄積する種とグルコシドを蓄積する種に分かれるが、その進化的機作は大変興味深い。上記の試験をさらに進めるとともに、これまでにカキ果実より単離したシキミ酸生合成経路上の2機能性酵素である3つのDHD/SDHについて、GSTタグをつけたタンパク質を産生し、in vitroアッセイによる酵素の性状解析を進める。1-cys peroxiredoxin, ANR、ANS、LARについてタンパク質産生のための大腸菌での異所発現やカキの形質転換試験を行い、形質転換体が得られれば、その形質転換個体についてRNAseqを行う。これまでにカキ果実より単離したシキミ酸生合成経路上の2機能性酵素である3つのdehydroquinate dehydratase-shikimate dehydrogenase (DHD/SDH)について、カキにおける器官別あるいは果実発達での経時的な発現の変化について再解析を行い、それぞれの機能を推定した。カキ果実の甘渋性において発現量に差異があるDHDSDH01は、渋ガキ幼果実で特異的に発現量が高く、また器官別では幼葉での発現が高く、果皮や種子での発現が低かった。DHDSDH02は種子における発現が特に高い値を示し、DHDSDH03は幼若器官で発現が高いが品種間による差はなかった。従って、それぞれのアイソフォームには異なる役割があると推察された。これまでの報告では、DHDSDHが没食子酸生成酵素であるとされているが、我々の試験からはこれらどのアイソフォームにもその活性が認められていないことから、`倉光'幼果から粗酵素を抽出し、3-デヒドロシキミ酸およびシキミ酸を基質とした没食子酸生成活性の検出を試みたが、検出できなかった。また、タンパク質産生のための大腸菌での異所発現やカキの形質転換のためのベクター作製を行うため、1-cys peroxiredoxin, ANR、ANS、LARについて`倉光'からクローニングを行った。`倉光'幼果から粗酵素を抽出し、3-デヒドロシキミ酸およびシキミ酸を基質とした没食子酸生成活性の検出を試みたが、検出できなかったため、抽出条件の更なる検討が必要である。また、研究分担者として行っているブドウの研究や学務等(教育)に時間を取られたため、十分な研究時間が確保できなかった。

カキのプロアントシアニジン(PA)蓄積に関連して、カキ果実におけるプロアントシアニジン蓄積に関わる重要なステップであるガレート形成およびポリマー形成について明らかにすることを目的として研究を進めた。これまでの報告では、dehydroquinate dehydratase-shikimate dehydrogenase (DHD/SDH)が没食子酸生成酵素であるとされているが、カキのアイソフォームにはその活性が認めらない。また、チャにおいてserine carboxipeptidase-like protein (SCPL)がflavan 3-olsへの没食子酸転移酵素であるという報告があるが、22遺伝子について配列が挙げられているだけで、機能同定はなされていない。本年度は`倉光'幼果および幼葉から粗酵素を抽出し、3-デヒドロシキミ酸およびシキミ酸を基質とした没食子酸生成および、没食子酸をflavan 3-olsに転移する酵素の活性を確認するための予備試験を行った。ポリマー形成は、LARやANSの関与が示唆される論文が近年発表されたが、flavan 3-olsにシステインを転移する反応については未だ報告がない。これまでにカキ果実より単離した1-cys peroxiredoxin,についてその可能性を確認するためにin vitroおよびカキの形質転換による試験の準備を行った。また、PAの蓄積変異体である完全甘ガキの特性化のために電子顕微鏡による完全甘ガキ羅田甜柿、松本早生富有および完全渋ガキ最勝におけるタンニン細胞の組織観察を行うために樹脂包埋を行った。さらに、経時的に採取した羅田甜柿、天宝蓋、駿河および倉光についてPAの構成flavan 3-olsおよび没食子酸の経時的変化を調査中である。上記のカキの研究以外に、ブドウの成熟および着色に関する研究の論文執筆および試験行った。具体的には`ルビーロマン'の温度処理による着色への影響に関する論文3報、`ルビーロマン'および`安芸クイーン'の着色特性の差異についてである。アントシアニン蓄積およびこれに影響すると考えられるABAとその代謝関連遺伝子の解析について取りまとめている。`ルビーロマン'はこれまでに報告された品種とは異なり、ABAの代謝およびアントシアニンの蓄積が成熟期に高いことが明らかになった。また、高温下においてこれまで発現が低くなると報告されているアントシアニン蓄積に関わる遺伝子発現が高く推移することから、成熟期の高温下での着色抑制に関する問題提起を行えた。さらに、マンゴーの着色に関わるアントシアニン合成に関わる酵素flavonoid 3-O-glucosultransferase(F3GT)の性状解析を行っている。マンゴーには光に反応して発現が上がる2つのF3GTがあるが、これらの遺伝子を大腸菌で発現させ活性のある融合タンパクを得ることに成功した。面白いことに、グルコース転移活性は両遺伝子がコードするタンパク質に認められるが、片方にのみ存在するガラクトース転移活性はグルコースの転移活性よりもずいぶん高いことが確認された。
中枢神経系におけるジアシルグリセロールキナーゼの分子多様性の解析

これまでクローニングして得たI型、II型およびIII型DGキナーゼのcDNAを用いて、脳および網膜から抽出したmRNAをもとにして作製したcDNAライブラリーを低いstringencyの条件でスクリーニングした結果、新しいDGキナーゼアイソザイム(IV型)のクローンを得ることができた。このIV型はこれまでのI型からIII型のものとは異なり、その一次構造中にカルシウム結合部位であるEFハンド構造を欠き、またカルボキシル基端側に4つのアンキリン類似配列を含んでいた。このような構造上の特徴は近年クローニングされたショウジョウバエの網膜変性変異体(retinal degeneration A,redgA)の原因遺伝子であるrdgA-DGキナーゼのものと酷似していることが判明した。さらにこのIV型は核移行シグナルをも含んでおり、核内の情報伝達係に関与することが示唆された。そこでこのIV型DGキナーゼのcDNAを培養COS細胞に遺伝子導入し種々の性質を調べた。一次構造中にEFハンド構造を持たないことから予想されたように、DGに対するリン酸化反応がカルシウム非依存性であった。またepitope tag(抗原決定基マーカー)を用いた実験では免疫細胞化学的にIV型DGキナーゼの核内局在が証明された。これらの所見はIV型DGキナーゼの機能のみならず、核内におけるリン脂肪代謝の解明にも有意義なものと思われる。
癌転移初期機構の非侵襲的インビボ解析

癌転移初期機構の解明のために、ポジトロン断層法(PET)を用いて癌転移の初期過程を非侵襲的に解析できる系を開発し、これまでに転移性癌細胞の組織集積性と転移能との相関性などを見いだしてきた。本研究では第1に、癌細胞のシアリダ-ゼ処理やシアリル糖鎖のFACS解析を通して、癌細胞初期接着に対する接着分子セレクチンの役割について一部解明した。またセレクチンリガンドとして働くと考えられるスルファチドにより、癌転移の抑制が見出された。第2に、強固な接着と浸潤に関与する接着分子インテグリンに関して、種々のインテグリントランスフェクタントを用いて検討した。実験にはCHO細胞の各種インテグリンα鎖遺伝子(α2,α3,α4,α6,α9,αV)導入株を用いた。PET解析によりインテグリンαVβ1やα4β1発現細胞の集積性の向上などを見出した。さらにインテグリンαVβ3の肝転移性への関わりについて有益な知見を得た。第3に、癌転移の初期における宿主側の免疫監視機構について知見を得た。癌転移初期において、宿主側の免疫監視機構は転移を抑えるために重要である。我々は実験転移モデルを用いて転移性癌細胞の細胞数の変化、あるいは宿主側の免疫担当細胞の枯渇等により転移形成能がどう変化するかを検討した。実験的癌転移の系ではある程度の細胞数を必要とし、転移の形成がみとめられない少量の細胞数の投与時には、標的臓器での速やかな集積の減少が観察され、転移巣形成能と初期集積との間に相関性が見られた。免疫担当細胞を枯渇させた後に、転移が起こらない細胞数を投与し、転移能と初期動態を解析したところ、マクロファージを予め枯渇させた状態では、少量の細部でも転移巣を形成し、標的組織での細胞集積の低下も抑えられた。このことから宿主側の免疫担当細胞による生体防御系のうち、少なくともマクロファージが転移初期から重要な役割を担っていることが示唆された。本研究は我々が開発した転移性癌細胞の生体内動態を生きたままの動物で非侵襲的に検出する系を用い、癌転移初期過程の機構を明らかにしようと言うものである。本年度は肝転移性細胞と肺転移性細胞を、それぞれ初回通過組織が肺となる尾静脈内投与および初回通過組織が肝となる門脈内投与を行い。いずれの投与経路によっても初期動態が転移組織特異的に働くことを見出した。すなわち初回通過組織への細胞集積が高いものの、肝転移性細胞は肝に肺転移性細胞は肺に、より集積する傾向が見られ組織特異的集積が転移過程初期から起こることを明らかにした(Cancer Res.1997)。次に接着分子セレクチンに関して、セレクチンリガンドであるスルファチドを共存させたときの肝転移性癌細胞の動態について詳細に解析し、スルファチドがセレクチンを介して肝類洞内皮細胞に結合する可能性を示すとともに、スルファチドおよびリポソーム化スルファチドによるがん転移抑制活性をはじめて見出した(投稿準備中)。さらにスルファチドががん細胞の浸潤にも影響することも見出し、現在さらに検討を進めている。また転移性癌細胞に及ぼす免疫系の作用を肝転移性癌細胞を用いて解析し、マクロファージ系の細胞ががん転移抑制に転移初期から作用する可能性が明らかとなった。これについてはさらに詳細な検討を行いつつある。以上、本年度は十分な成果が上げられ、本研究は当初の予定どおり順調に進んでいる。本研究は転移性癌細胞の生体内

動態を生きたままの動物で非侵襲的に検出する系を用い、癌転移初期過程の機構を明らかにすることを目的とする。本年度は昨年に引き続き臓器特異的転移が、癌転移初期過程の転移性癌細胞と標的臓器との特異的な相互作用に依存していることを明らかとした。さらに肝転移性リンパ腫において、その臓器特異的な初期集積を引き起こす因子として、転移性癌細胞上のシアル酸含有糖鎖が関与していることを明らかとし、このシアル酸含有糖鎖はシアリルルイスAである可能性を示した(Jpn.J.Cancer Res.1998)。またこの細胞におけるシアル酸含有糖鎖の関与として、GD1αが見いだされていることに着目し、GD1αのレプリカペプチドによる転移抑制を試み、見事に成功した(Cancer Res.1997)。次に視点を変え、癌転移初期におけるimmune surveillanceの重要性について検討を行った。実験転移モデルとしては、RAW117-H10細胞の門脈内投与による肝転移モデル、肺転移性癌細胞であるB16BL6細胞の尾静脈内投与による肺転移モデルを用いた。まず転移性癌細胞の投与数と転移能との関連および転移初期の細胞動態を検討し、実際の転移形成能に及ぼす生体防御系の関与を解析した。その結果、転移性癌細胞が標的臓器に転移巣を形成するためにはある程度の細胞数が必要であることが明らかとなり、転移形成に至らない細胞数の場合には標的臓器における極端な細胞集積性の消失が観察された。この原因として自然免疫機構、すなわち免疫系が賦活化されていない状態でも宿主の生体防御系が癌細胞に対して働くことが推察された。以上、本年度は十分な成果が上げられ、本研究は当初の予定どおり順調に進んでいる。我々はポジトロン断層法(PET)を用いて癌転移の初期過程を非侵襲的に解析できる系を開発し、これまでに転移性がん細胞の組織集積性と転移能が、ある程度相関することを見いだした。本研究ではがん転移に及ぼすセレクチンやインテグリンの関与を明らかにしてきたが、本年度は癌転移の初期における宿主側の免疫監視機構について検討した。癌転移初期において、宿主側の免疫監視機構は転移を抑えるために重要である。我々は実験転移モデルを用いて転移性がん細胞の細胞数の変化、あるいは宿主側の免疫担当細胞の枯渇等により転移形成能がどう変化するかを検討した。肝転移性リンパ腫と肺転移性黒色腫を、それぞれマウスの門脈及び尾静脈に10^6,10^5,10^4cells投与し、一定期間後に臓器を摘出し転移能を評価した。また同細胞数による転移性癌細胞の初期生態内動態はPET解析により行った。実験的がん転移の系ではある程度の細胞数を必要とし、転移の形成がみとめられない10^4cellsの投与時には、標的臓器での速やかな集積の減少が観察され、転移巣形成能と初期集積との間に相関性が見られた。これは転移性癌細胞が少量の時には免疫系により排除されるため、転移が起こりにくくなると考えると説明がつく。そこで免疫担当細胞を枯渇させた後に、転移が起こらない細胞数を投与し、転移能と初期動態を解析した。マクロファージを予め枯渇させた状態では、10^4cells投与群においても転移巣を形成し、同様な条件によるPET解析では初期集積の減少はコントロールと比較して緩やかであった。以上のことから、宿主側の免疫担当細胞による生体防御系のうち、少なくともマクロファージが転移初期から重要な役割を担っていることが示唆された。
神経因性疼痛に随伴する血流障害の緩和による疼痛治療の可能性

我々は皮膚血管では電位依存性Caに対する依存度が他の血管よりも低いため、温度低下に対する耐性が高く、収縮が維持されることを見出した。一方神経損傷モデルラットでは交感神経の損傷に伴い、細胞内Ca排出が減った結果血管の収縮応答性が亢進し、少ない刺激で大きく収縮することが明らかとなった。これらのことを合わせて考えると、神経損傷モデル動物の皮膚血管では弱い収縮刺激を受けて、すでに血管が収縮している状態にあることが示唆された。そこで、血管を拡張させる薬を投与したところ、血流が回復するとともに、痛みに対する感受性が下がった。以上のことから血管を拡張させることが神経因性疼痛治療になりうることを見出した。神経因性疼痛は治療の困難な慢性疾患で、疼痛の発生機序もまだ不明である。神経因性疼痛は循環障害も併発しており、交感神経に対する皮膚血管の過剰な応答であると解釈されている。しかし疼痛モデル動物の皮膚血管の収縮性を検討した研究がほとんどないだけではなく、そもそも皮膚血管収縮の特異性についての研究が少ない。そこで本課題では、疼痛モデルラットにおける皮膚血管の収縮応答性亢進反応のメカニズムの解明を目標とするために初年度は、皮膚血管と深部血管の収縮応答性、収縮制御の差異について検討した、実験計画に従い、初年度は皮膚血管の特異性を明らかにすべく、摘出ラット尾動脈とその上流にあるラット総腸骨動脈における、α1受容体刺激に対する応答性の差を検討した。37°Cと24°CにおけるPEに対する収縮応答性を比較すると、尾動脈ではフェニレフリン(PE)に対する最大収縮反応が24°Cで増加したのに対して、総腸骨動脈では減弱していた。興味深いことに37°Cにおけるニフェジピン(Nif)による抑制作用は、総腸骨動脈においてより強く現れたことから、PE誘発性収縮において、尾動脈における電位依存性Caチャネル(VDCC)の寄与は総腸骨動脈におけるそれよりも大きいことが明らかとなった。またPE誘発性収縮に対するLOE908単独及びLOE908+Nifの抑制作用を比較したところ、尾動脈では差がなかったのに対して、総腸骨動脈はさらに抑制作用が増強された。このことは、尾動脈ではLOE908感受性チャネルによって脱分極が起きるのに対して、総腸骨動脈ではLOE非感受性チャネルも加わり、より脱分極成分が大きくなっていることが示唆された。VDCCはQ10が大きく、極めて温度感受性の高いチャネルである。このことから、尾動脈では総腸骨動脈に比べてこのチャネルへの依存度が減ることによって、温度低下に対する抵抗性が生じていることが示唆された。神経因性疼痛は難治性疾患で、患者のQOLを著しく低下させている。疼痛の発生機序もさることながら、症状を悪化させる因子の見極めも重要である。神経因性疼痛は循環障害も併発しており、交感神経に対する皮膚血管の過剰な応答であると解釈されているが、科学的なエビデンスはほとんどない。そこで本課題では、疼痛モデルラットにおける皮膚血管の収縮応答性が亢進するメカニズムの解明を目標としている。本年度はまず摘出ラット尾動脈とその上流にある総腸骨動脈において、神経による収縮制御が異なるかどうかを検討したところ、両血管ともチラミン誘発性収縮の大きさは同程度であることが示された。一方平滑筋収縮を引き起こすα1受容体サブタイプの違いを比較したところ、尾動脈の方がα1A受容体に依存した収縮が大きいことが明らかとなった。また昨年度にフェニレフリン(PE)誘発性収縮において、皮膚血管では電位依存性Caチャネル(VDCC)に対する依存度が低いことを明らかにしたことから、本年度は、神経因性疼痛モデルである絞扼性神経損傷(chronic constriction injury: CCI)ラットを作製し、摘出足底動脈において、受容体作動性Caチャネル阻害薬およびVDCC阻害薬存在下でのPEに対する反応性を、術足側と正常足側で比較したが、いずれの場合も術足側血管の方が正常足側血管よりも感受性が亢進したままであった。そこで血管平滑筋のCa排出経路として知られているNa/Ca交換体(NCX)の阻害薬KB-R 7943存在下で比較したところ、濃度反応曲線に差が見られなくなった。これはKB-R 7943によった術足側に比べて正常足側で大きく反応曲線が左にシフトしたためである。このことから、CCIラットでは何らかの機構により、NCXによるCa排出機能が低下することにより、収縮刺激に対する応答性が亢進している事が示された。本研究では神経因性疼痛が循環障害を併発することに着目し、その成因を明らかにすることで、疼痛緩和のターゲット足り得るかどうかを検討した。本年度は、神経因性疼痛モデルである絞扼性神経損傷(chronic constriction injury: CCI)ラットを作製し、摘出足底動脈を用いて比較したところ、患足側の血管は、正常足の血管よりも様々な経路を介した収縮刺激に対して常に反応性が亢進していたが、Na/Ca交換体(NCX)の阻害薬KB-R 7943存在下では亢進が見られなかったことからNCXの関与が疑われた。しかしNCXの逆回転モード選択的阻害薬SEA0400では亢進抑制効果が見られなかったことから、NCXを介した収縮応答性の亢進は、NCXの逆回転によるCa流入ではなく、順方向でのCa排出機能の低下によるものと考えられた。

これは結果的に細胞内Caの動員効率が高まったということであり、同程度に収縮を引き起こすには、患足側の方がCaの流入量が少なくて済むことを示している。つまり裏を返せば同程度の収縮では患足側の血管の方が細胞内シグナル伝達抑制に感受性が高くなる可能性を示している。そこで細胞内cAMP量を増加させるβ受容体作動薬salbutamolの作用を検討したところ、患足では収縮を強く抑制したのに対して、正常足ではそれほどの抑制効果は見られなかった。さらにCCIマウスに低用量のsalbutamolを投与したところ、患足の血流量が増加する傾向がみられた。さらにvon Frey法により痛みに対する閾値を測定したところ、投与により有意に痛みが緩和した。また温度が皮膚血流に影響を与えることから、足の周囲温を10°Cおよび22°C、35°Cと変化させたところ、血流の改善と共に痛みの緩和が有意に認められた。我々は皮膚血管では電位依存性Caに対する依存度が他の血管よりも低いため、温度低下に対する耐性が高く、収縮が維持されることを見出した。一方神経損傷モデルラットでは交感神経の損傷に伴い、細胞内Ca排出が減った結果血管の収縮応答性が亢進し、少ない刺激で大きく収縮することが明らかとなった。これらのことを合わせて考えると、神経損傷モデル動物の皮膚血管では弱い収縮刺激を受けて、すでに血管が収縮している状態にあることが示唆された。そこで、血管を拡張させる薬を投与したところ、血流が回復するとともに、痛みに対する感受性が下がった。以上のことから血管を拡張させることが神経因性疼痛治療になりうることを見出した。平成2526年度の研究で、神経支配とその下流のα1受容体刺激に対する皮膚血管の性状を明らかにしたことで、目標(1)は予定通り達成できた。また、CCIラットを作製し、摘出足底動脈を用いた実験から、神経傷害による血流低下は従来示唆されてきたようなα1受容体の発現量増加ではなく、NCXを介した細胞内Caの排出能が低下したためであることが示された。まだNCXの活性が変化するメカニズムが明らかにはなっていないが、目標(3)を遂行する上でNCXが重視されるべきであることが明らかになったことが最大の収穫である。したがって目標(2)についても予定通りに進んでいると言える。目標(3)については現時点でCCIマウスの作製は成功しており、最低限の到達目標は達成された。循環器薬理学引き続き神経傷害によってNCX活性が変化するメカニズムの解明を行っていく。可能性としては(a) NCXの発現量低下、(b)NCXの形質膜への移行量の変化、(c)NCXと共役するチャネルやトランスポータ活性の変化、が挙げられる。これらの結果から、神経傷害性血流低下反応を引き起こす原因を同定する。またこの知見をもとに、in vivoにおいて、CCIマウスに対して血流低下の原因に対する特定の阻害薬を投与し、血流低下の緩和および疼痛反応の緩和に対する効果を検討する。また、両緩和効果が知られているカルシトニン受容体作動薬の作用が、血流回復によって得られているかどうかも検討し、疼痛緩和に対する血流回復のアプローチの正しさを検証する。初年度の目標は皮膚血管の特異性を解明することであった。
耳下腺細胞のプリン作動性受容体を介するカルシウム情報伝達と分泌反応の解析

トリプシンとコラゲナーゼ処理により得られた耳下腺細胞を実験に用いた。1.細胞内Ca^<2+>濃度([Ca^<2+>]i)及びイノシトールリン脂質代謝に対するATPの効果10μMから1mMまでのATPは、外液Ca^<2+>の存在下で濃度依存的に[Ca^<2+>]iを上昇させた。一方、Ca^<2+>-free液中ではCa^<2+>の上昇は著しく減弱した事から、ATPによるCa^<2+>の上昇が、主に細胞外からのCa^<2+>流入による事が示唆された。ATPの他にADPが弱いCa^<2+>の上昇作用を有していたが、AMPやアデノシンは無効果であった。ATP(1mM)によって起こるイノシトール三リン酸(IP_3)の生成はムスカリン受容体刺激(カルバコール10μM)に比較して極わずかであった事から(約15%)、ATPによるCa^<2+>上昇におけるイノシトールリン脂質代謝の関与は小さいと考えられた。このATPの作用はP_<2Z>受容体を介するものと考えられた。一方、ATP(100μM)はカルバコール(10μM)による細胞内ストアからのCa^<2+>放出及びIP_3生成を強く抑制した。ATPのムスカリン受容体刺激の抑制機構は今の所不明だが、ATPがいろいろな細胞内情報伝達機構の調節に関与している可能性が考えられた。アミラーゼ分泌及びK^+放出に対するATPの効果ATPは細胞内から著しいK^+放出を起こした。この反応は、細胞外Ca^<2+>を除去しても見られたことから、Ca^<2+>依存性の反応では内と考えられた。一方、アミラーゼ分泌は1mMまでのATPでほとんど刺激されなかった。本研究でATPは、細胞内情報伝達系のモジュレーションあるいはイオン・チャンネルに対する直接作用によって水・電解質分泌に関与する可能性が示唆された。