hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
マクロファージに由来する脂肪肝惹起物質の同定

ラット肝腫瘍細胞株に、マクロファージ培養細胞株の培養上清を作用させると、脂肪蓄積が惹起されることを見出した。本研究はこのマクロファージに由来し脂肪肝を惹起させる物質の同定を目的とした。その結果、脂肪蓄積には、in vitroおよびin vivoともにPeroxisome Proliferator-Activated Receptor γ(PPARγ)と、その標的遺伝子の発現上昇が伴っていることを見出した。そこで、この脂肪肝惹起物質がPPARγリガンドであるかどうか検討した。また、物理化学的な検討を行い、物質の絞り込みを行い、質量分析による物質同定の前段階まで到達した。In vivoにおいても検討したところ、長期間高脂肪食を負荷した野生型マウスの肝臓において、PPARγとその標的遺伝子の遺伝子の発現が著明に上昇していることが明らかになった。また同時に肝臓マクロファージが著明に増加することを見出した。今まで肝臓におけるPPARγの上昇の意義は殆ど明らかにされていないが、これらin vitroおよびin vivoのデータから、脂肪肝の病態形成にPPARγが重要な役割を担っている可能性が示唆された。そこでこのマクロファージ由来物質(MDSIF)がPPARγリガンド活性をもつかどうかを検討した。マクロファージ培養上清に、PPARγリガンド活性をもつ物質が含まれるかどうかを、培養肝細胞を用いて、レポーターアッセイにより解析した。また、in vivoにおける既知の内因性PPARγリガンドとして、15-Deoxy-12, 14-Prostaglandin J2 (15d-PGJ2)が知られていることから、マクロファージCM中または肝細胞lysate中に15d-PGJ2が増加していないかを、現在検討中である。また、物理生化学的検討による、分子カテゴリー(MDSIFが脂質なのか蛋白なのかアミノ酸・糖などの小分子か等)の絞り込みも現在進行中である。計画年度内にMS解析の実施には至らなかったが、今後従来の計画の如く、MS解析に進む予定である。以上、研究成果として、MDSIFの本体を明らかにするための、Mass spectrometry(MS)解析の前段階程度まで達成することができた。加えてそのin vitroの研究成果を、意義付けるためのin vivoにおける今後の研究の方向性を見出したことも大きな成果と考えられた。In vivoにおいても検討したところ、長期に高脂肪食を与えられた、C57BL/6Jマウスの肝臓において、PPARγとその標的遺伝子の野生型マウスに高脂肪食を負荷すると、長期高脂肪食により、肝臓においてこれらの、遺伝子の発現が著明に上昇していることが明らかになった。脂肪細胞においてPPARγが分化・成熟のマスターレギュレーターの役割を持つことが知られているが、興味深いことに、この高脂肪食摂餌開始後脂肪組織におけるPPARγとその標的遺伝子の発現上昇は、比較的早期にピークアウトして低下に転じていた。一方で、肝臓における脂質合成制御に関わる遺伝子の発現を解析すると、SREBP-1cの持続的な発現上昇を認めなかったが、PPARγとその標的遺伝子の発現は持続的に上昇することを見出した。そこで現在、このマクロファージ由来物質(MDSIF)がPPARγリガンド活性をもつかどうかを検討している。その結果を踏まえた上でMDSIFを同定する実験と、MADSIFを直接同定する実験を並行して進める予定である。平成24年度は、当初の計画に加えて、肝臓マクロファージの肝細胞の病態における意義をまずin vivoにおいて確認することに、もう一つの重点を置いた。その結果、in vivoにおいても、肝臓マクロファージ由来物質が、肝細胞における脂質蓄積を惹起する可能性を確認することができた。またこのメカニズムに肝細胞におけるPPARγが重要な役割を担っている可能性をin vivoにおいて確かめることができた。一方で、事項に述べる、MDSIFの同定にかかわる実験は、現在進行中である。その一つである、肝細胞におけるレポーターアッセイを用いた、PPARγリガンド活性調べる実験は、肝細胞へのベクターのトランスフェクション効率が悪い事、またバックグラウンドが高い(コントロールベクターの導入や細胞の老化などの変化によっても、レポーター活性の変化が大きい)ことなどから、有意なデータの収集に苦労している。MDSIFがPPARγリガンド活性をもつかどうかを引き続き検討する。その結果PPARγリガンド活性が認められれば、まずこれが既知の15d-PGJ2かどうかをWestern blottingやELISAなどで直接検討する。尚、これらの解析で結論が出ない場合も、今後は次のMass spectrometry(MS)に進むことを検討している。並行して、物理生化学的検討により、MDSIFが脂質なのか蛋白なのかアミノ酸・糖などの小分子か等の検討を行う。

マクロファージCM中のMDSIFに対して、水溶性/脂溶性分画の検討、熱や凍結融解に対する安定性、プロテアーゼ処理、分子ふるいを用いた大まかな分子量の推定、等の物理生化学的検討を行い、分子カテゴリーを絞り込む。上記の予備検討を踏まえ、MDSIFの本体をMS解析により明らかにする。具体的には以下の如く計画している。試料として、CMと、肝細胞lysateの2つを用いる。CMは、マクロファージの培養上清と、control細胞の培養上清をMS解析で比較する。肝細胞に直接作用としてMDSIFが働く場合、このCMの比較から同定を目指す。次に上述のそれぞれのCMをふりかけ、マクロファージのCMによって脂肪合成が誘導された肝細胞のlysateと、control細胞のCMで脂肪合成が誘導されていない肝細胞のlysateをMS解析で比較し、以下の3つの視点から検討する。1)肝細胞における代謝物質がMDSIFとして作用する可能性があるため、肝細胞lysateからMDSIFを同定。2)CM中にMDSIFが含まれていたとしても、control細胞のCMとの比較では同定困難であった場合に、MS解析による肝細胞の網羅的な脂質代謝マップからMDSIFを間接的に推定する。3)CM中からMDSIFが同定された場合、脂肪肝惹起のメカニズムを同じく代謝マップから検討する。該当なし
糖尿病性腎症とベイシジン-VEGF/NOシグナルネットワーク

糖尿病性腎症の発症機序におけるBasigin-VEGF/NOシグナルの関与について検討した結果、初期段階からVEGF/NO uncouplingにより、血管新生が引き起こされる。また、Basiginは、VEGFのinducerとしては作用せず、Basigin上の糖鎖がE-selectinの新たなリガンドとして働き、糸球体内へのmicroinflammationを誘導し、糖尿病性腎症の発症・進展に関与する。VEGF-Aはその受容体であるVEGFR-1およびVEGFR-2を介して内皮細胞の恒常性の維持に重要な働きをしており、NOはVEGFR-1を介した情報系の下流で働くと考えられている。今回、我々が研究対象としているCaM-Tgマウスは、早期より高度の高血糖とヒト糖尿病性腎症に特徴的な病変(結節性病変・滲出性病変・メサンギウム融解・輸入・輸出動脈硬化など)が観察される。このモデルでは、VEGF受容体の発現には変化はないが、VEGF-Aの発現亢進とeNOS発現低下がみられ、結果的にVEGF受容体を介する情報伝達系にアンバランスが生じ、その結果内皮細胞障害が進行すると考えられる(VEGF/NO uncoupling現象)。この成果は、J Am Soc Nephrolに投稿し、受理され、現在in pressとなっている。一方、尿細管・間質障害に注目すると、高血糖発症直後から、間質での有意な血流低下が認められ、糖尿病性腎症では、糸球体病変に続発して尿細管・間質障害が発生する前に、糸球体病変とは独立して間質障害が初期から進行する可能性が考えられる。このため、尿細管・間質における血流に影響を与える可能性のある分子としてNOとH2Sに着目し、これらの合成酵素であるeNOS,iNOS,CBS,CSEの発現について検討し、これらの関与の裏付け実験を継続中である。CaM-Tgマウス1,2,3カ月令の尿細管におけるeNOS発現は経時的に野生型に比べて経度減少する。一方、H2Sの合成酵素であるCBSは野生型に比べて増加しており、間質での血流低下に対応して発現亢進し、自己防御的に作用している可能性が考えられ、NOとH2Sのdonorの投与実験を行っている。我々は、糖尿病性腎症の発症におけるMKを介するmicroinflammationの重要性及びVEGF/NOシグナルの重要性を確認した。平成20年度は,VEGF-AのinducerとしてBasiginが糖尿病性腎症発症に関与するかを中心に培養内皮細胞及びCaM-Tgマウス、さらにBasigin欠損型マウスを用い検討した。「研究成果」培養内皮細胞に高血糖刺激を行い、またCaM-Tgマウス腎臓でのBasiginの発現誘導を検討したが、有意なBasiginの発現亢進は確認できなかった。これらの結果から糖尿病性腎症においては、VEGFのinducerとしては作用しないと考えた。次にBasigin欠損マウスを用いて、虚血再灌流モデルを作成し、炎症への関与を検討した。Basigin欠損型マウスは野生型に比べ、虚血による腎障害が軽度に終息する傾向があった。さらに解析を進めると、Basigin欠損型マウスの腎組織には、好中球の浸潤が野生型に比して有意に減少していた。マウス腹腔内チオグリコネート刺激にて得た好中球を用い、マウス血管内皮細胞を不死化したF2細胞との接着をbinding assayにて評価したところ、野生型のほうが内皮細胞への接着が多かった。さらに、Basigin上の糖鎖に注目し、リコンビナントE-,P-selectinとの接着実験を行った結果、Basigin上の糖鎖がE-selectinの新たなリガンドとして働き、炎症を誘導することを確認した。糖尿病性腎症においても、内皮細胞上のBasiginがE-selectinのリガンドとして関与し、糸球体内へのmicroinflammationを誘導し、糖尿病性腎症の発症・進展に関与すると考えた。
ペプチド性神経伝達物質による内向き整流K電流の修飾機構

痛みの神経伝達物質あるいはneuromodulatorとされるsubstance P、またenkephalins,somatostatinの青斑核細胞の膜電流に対する作用及びその細胞内情報伝達機構の解明を目的として研究を行った。1.substance P,somatostatin及びMet-enkephalinは同じ内向き整流K電流を修飾することの証明。substance Pはこの細胞で非選択性カチオン電流の活性化と内向き整流K電流の抑制を引き起こすことが明かになっている。一方somatostatin及びMet-enkephalinは内向き整流K電流を活性化する。これらのペプチドによって活性化あるいは抑制される内向き整流K電流はwhole-cell currentで同様の電流電圧特性を示すが厳密には同一のチャネルの開閉によるという事は証明されていない。これを明らかにする目的で、GTPγSを細胞内にpre-loadし、somatostatinまたはMet-enkephalinによる持続性の内向き整流K電流の活性化による電流を記録し、このsomatostatin等により特異的に活性化された電流をsubstance Pが抑制するかを検討した。その結果、substance Pはsomatostatin,Met-enkephalinによって活性化された内向き整流K電流阻害し、この効果はsomatostatin,Met-enkephalinの再投与によっても回復しないことを観察した。即ちsubstance P,somatostatin及びMet-enkephalinは同じ内向き整流K電流を相反する方向に修飾し、しかもsubstance Pの抑制効果はsomatostatin等の活性化効果に比べ強いという結論を得た。2.substance Pによる内向き整流K電流の抑制は百日咳毒素非感受性GTP結合蛋白によって、somatostatin,Met-enkephalinによる内向き整流K電流の活性化は百日咳毒素感受性のGTP結合蛋白によってそれぞれ伝達されることが知られている。これらの異なるGTP結合蛋白によってどの様に同一のチャネルが互いに機能的に相反する修飾をうけるかは現在検討中である。
インドネシア沿岸都市における持続可能な水資源利用にむけた地下水脆弱性の評価

(1)インドラマユの結果についてClとBr比の結果から,海水の侵入による地下水の塩水化が進行していることが示唆された。海水の地下水への混合率を評価した結果,最大で約62%であった。次に,その混合率を用いて海水の影響を受けている地下水のSO4濃度を計算し実測値と比較することで,人為的なSO4の負荷もしくは硫酸還元反応による減少過程を推定した。その結果,地下水のDOC,FeやMn濃度とは関係がなく,井戸の深度が20m以深で硫酸還元反応が進行することが示唆された。(2)マタラムの結果についてSi濃度は22.052.0mg/Lの範囲で,非晶質SiO2の飽和指数は-0.40-0.03の範囲に入った。Ca濃度は5.060.0mg/Lの範囲で,カルサイトの飽和指数は-2.540.32の範囲に入り,過飽和の試料も認められ一部の地下水ではスケール障害起きる可能性が考えられた。カルサイトの飽和指数は,pHとは関係がなくある一定の深度以上で平衡状態に収束する傾向が認められた。Fe濃度は最大で2.16mg/Lで,定量下限値(0.005mg/L)以下の試料は26試料中11試料あった。また,Fe濃度は酸化的なNO3濃度とは双曲線的な関係がみられ,Mn濃度と同様に2価が主成分であることが示唆された。地下水は相対的に還元な状況下であり,地下水利用にあたってはFe2+が酸化されスケールが生成される可能性がある。(3)人口200万人の沿岸都市セマランでも採水を行った。計30地点である。(4)マタラム(ロンボク島)では、大地震のため大きな被害を受けたが、地下水位のモニター用に設置していた機器及び観測井は無事で、そのまま継続してモニターを行っている。当初の予定どおりカウンターパートのインドネシア科学院との間でMOUを締結し、より円滑な共同研究が可能になった。結果として、日本側の訪問時以外にも現地情報の取集なども可能になった。あわせて、現地スタッフの一人が代表者の研究科に博士課程の留学生として昨年4月から入学し研究しており、分析や解析が一層進展した。ただし、調査地の一つであり、自記水位計を設置していたロンボク島では大地震のため大きな被害を受けるというアクシデントに見舞われた。現地スタッフには被災直後1か月で現地入りしてもらい、機器や観測井の無事を確認してもらったが、予定外の出費となった。想定外の目的を加えつつ、モニタリングは継続している。結果としては、研究はおおむね順調に進行している。(1)1各3都市(インドラマユ、マタラム、スマラン)での現地調査、2情報収集については2年目で終了予定であったが、2年間の調査によって雨季乾季の違いを検証する必要性、および昨年発生したロンボク島で大地震の影響調査の必要性、さらにインドネシア科学院でワークショップを開催し成果の議論を行う必要性などを考慮し、今年も現地調査を実施することにした。3インドラマユ市において雨季のデータを採取する。これは雨季に地下水位が上昇した際の影響を確認するものである。4昨年8月に大地震のあったロンボク島マタラムには地下水位計測用のロガーを設置しており、これを回収に行く際に、その地点のみ地下水の採水を行う。地震の影響についても考慮する。(2)1地下水脆弱性に対する人間活動の影響を評価するため、都市流域GIS準分布型水・土砂・物質輸送モデル(SWAT)に都市経済物質負荷モデルを連結させる。現状SWATモデル解析は完成しており、最終的には窒素収支を中心に評価していく。2地下水汚染の脆弱性に対する自然要因の影響を評価するために、これまで収集した地下水水質情報をもとに地球化学モデル(GWB)による解析を進める。3追加的な解析として、既存のボーリングコアを収集し、その抽出実験を行い、塩水化にともなう物質溶出影響についても評価する。(3)1上記の結果を集約し1地下水脆弱性の定量的な評価を行う。各都市における汚染物質負荷制御および許容揚水量等について推定を行う。また、2地下水脆弱性の指標及びその要因についても主に地質、地形等によって普遍化する。本研究では、沿岸都市の多様な地下水脆弱性、特に、地下水資源の質的リスク(汚染や塩水化)を定量的に評価することを目的とし、地下水の水需要が高い急成長段階にある沿岸都市を多く抱えるインドネシアを対象とし、都市の地理的特性によって異なる多様な脆弱性とその要因を明らかにすることを目的として現地での調査研究を実施した。平成29年度は、主に2回の現地調査を行うとともに現地のカウンタパートに情報収集を依頼した。詳細は下記の通りである。1)7月上旬にカウンタパートのインドネシア科学院の研究者と、ジャカルタ市の本部でワークショップを行い、これまでのそれぞれ成果を確認し今後の共通課題を確認した。2)8月中旬にジャワ島中部沿岸のインドラマユ市(人口20万、現在急速に発展中)における地下水調査および採水調査(計20地点、各種試料採取)を行った。あわせて地下水位のモニター機器および降水の採水装置の設置を行った。3)9月上旬にロンボク島のマタラム市(人口50万、観光都市)における地下水調査および試料採取(計25地点)を行った。4)各種試料は一部日本に持ち帰り分析に供し、一部同位体比用試料は外注分析を依頼した。

5)7月下旬及び1月中旬に日本側のメンバーでそれぞれ研究会を行い、8月下旬にはインドネシア側のメンバーを招聘して岡山大学で国際ワークショップを開催し、情報の共有を行った。また以上の成果を基に、APN(アジア太平洋ネットワーク)に中国とインドネシアを交えた研究プロジェクトを申請した。H29年度は、当初の予定どおりカウンターパートのインドネシア科学院の研究者とのミーティングおよび情報収集を行うとともに、インドラマユおよびロンボクにおける地下水調査および採取試料の分析を実施し、汚染状況に関する解析などを実施した。また、現地機関との共同研究をスムースに行うためのMOUの締結を進めており、さらに現地スタッフの一人が代表者の研究室に留学のため本年1月から滞在しており、一層解析が進展した。そのため、研究はおおむね順調に進行している。(1)インドラマユの結果についてClとBr比の結果から,海水の侵入による地下水の塩水化が進行していることが示唆された。海水の地下水への混合率を評価した結果,最大で約62%であった。次に,その混合率を用いて海水の影響を受けている地下水のSO4濃度を計算し実測値と比較することで,人為的なSO4の負荷もしくは硫酸還元反応による減少過程を推定した。その結果,地下水のDOC,FeやMn濃度とは関係がなく,井戸の深度が20m以深で硫酸還元反応が進行することが示唆された。(2)マタラムの結果についてSi濃度は22.052.0mg/Lの範囲で,非晶質SiO2の飽和指数は-0.40-0.03の範囲に入った。Ca濃度は5.060.0mg/Lの範囲で,カルサイトの飽和指数は-2.540.32の範囲に入り,過飽和の試料も認められ一部の地下水ではスケール障害起きる可能性が考えられた。カルサイトの飽和指数は,pHとは関係がなくある一定の深度以上で平衡状態に収束する傾向が認められた。Fe濃度は最大で2.16mg/Lで,定量下限値(0.005mg/L)以下の試料は26試料中11試料あった。また,Fe濃度は酸化的なNO3濃度とは双曲線的な関係がみられ,Mn濃度と同様に2価が主成分であることが示唆された。地下水は相対的に還元な状況下であり,地下水利用にあたってはFe2+が酸化されスケールが生成される可能性がある。(3)人口200万人の沿岸都市セマランでも採水を行った。計30地点である。(4)マタラム(ロンボク島)では、大地震のため大きな被害を受けたが、地下水位のモニター用に設置していた機器及び観測井は無事で、そのまま継続してモニターを行っている。当初の予定どおりカウンターパートのインドネシア科学院との間でMOUを締結し、より円滑な共同研究が可能になった。結果として、日本側の訪問時以外にも現地情報の取集なども可能になった。あわせて、現地スタッフの一人が代表者の研究科に博士課程の留学生として昨年4月から入学し研究しており、分析や解析が一層進展した。ただし、調査地の一つであり、自記水位計を設置していたロンボク島では大地震のため大きな被害を受けるというアクシデントに見舞われた。現地スタッフには被災直後1か月で現地入りしてもらい、機器や観測井の無事を確認してもらったが、予定外の出費となった。想定外の目的を加えつつ、モニタリングは継続している。結果としては、研究はおおむね順調に進行している。
早産の分子メカニズムとその予防について

今回我々は炎症性サイトカインであるIL-6とTNF-αがLHR発現にどのように関与するかを、ヒト羊膜上皮とラット顆粒膜初代培養を用いて検索した結果を報告する。TNF-αはIL-6の産生を促進し、LH-R発現に関してIL-6は促進的にTNF-αは抑制的に作用した。ヒト羊膜では、TNF-αは、アクチビン産生を増強することが判明した。作用メカニズムに関しては、IL-6はLHR発現をJAK/STAT系を介して増強し、自己のレセプターを誘導することからIL-6の自律的なpositive actionを証明した。TNF-αはNF-κBの核内への移行により作用を示すことが推測された。幼若ラットにPMSG-hCGを投与する排卵誘導実験において、子宮におけるLH-R mRNAの減少を認めたが、このとき同時にメバロネートカイネース(Mvk)を測定するとPMSG投与後に上昇後減少するパターンを示し、子宮においても卵巣同様に本酵素がレセプターmRNAに対して結合蛋白として働き、LH-R mRNA発現を減少させている可能性が考えられた。子宮LH/hCG受容体の機能をみるため、細切した子宮にhCGを添加した後cAMP産生を測定すると量依存的にcAMPの上昇がみられ、本レセプター蛋白が機能を持つことが示された。子宮収縮と局所の炎症の関係が検討され、サイトカインの関与が報告されている。このため、我々は顆粒膜細胞をモデルとしてサイトカインを作用させた時のLH-Rの変化を検討した。TNFαはLH-Rの発現を減少させるが、IL-6はLH-Rの増強の方向に働くことがわかった。それぞれのメカニズムについて検討し、TNFα、IL-6共に転写のレベルで作用していることが推測されたので、今後は子宮内膜に対する作用を検討する予定である。一方、血中AMレベルに関しては、単胎より双胎、三胎と母胎血中で上昇していることが判り、臍帯動脈より静脈中で高い結果がでたため、AMが妊娠中は主に胎盤より分泌していることが判明した。このAMは、レセプターを介して細胞内cAMPを上昇させることから、子宮筋の弛緩に働いている可能性がある。また、妊娠が進行するに従い、分泌量が増加し、正常女性血中レベルをはるかに超える量であることから妊娠中に特異的に作用するメカニズムがあることが考えられた。それぞれのメカニズムについて検討し、TNFα、IL-6共に転写のレベルで作用していることが推測された。本年は、IL-6の作用がLH-Rの発現を促進することが判明したので、そのメカニズムを検討する目的でErk1/2とSTAT3の特異的インヒビターを用いて実験を行った。結果としてErk1/2のインヒビターでは抑制する傾向にあったが、有意な作用ではなかった。一方、STAT3のインヒビターはIL-6の作用を強く抑制することがわかった。このため、IL-6はSTAT3の経路を介してLH-Rの発現を増強する可能性が判明した。一方、アロマターゼ活性を同時に抑制することから、子宮におけるIL-6の作用については、その他の因子に関して網羅的に検索する必要があると思われた。

さらに免疫染色において子宮内膜に特異的に染色されることより、本レセプターは子宮内膜に発現していることが示された。ヒト分泌期の子宮内膜にも染色されるLH-R蛋白が確認されたので、妊娠中の子宮におけるLH-Rの局在を検討する予定である。一方、血中AMレベルに関しては、単胎より双胎、三胎と母胎血中で上昇していることが判り、胎盤の高濃度AM mRNA発現からもAMが妊娠中は主に胎盤より分泌していることが判明した。このAMは、レセプターを介して細胞内cAMPを上昇させることから、子宮筋の弛緩に働いている可能性がある。また、妊娠が進行するに従い、分泌量が増加し、正常女性血中レベルをはるかに超える量であることから妊娠中に特異的に作用するメカニズムがあることが考えられた。このことから、妊娠維持に関与すると予測して、妊娠高血圧症候群の血中レベルのAMを測定したが同時期の正常レベルと有意差はなかった。今後は、炎症などのための切迫早産例での検討を行う予定である。ラットの子宮を用いた実験では、AMとLH-Rの発現は確認できたが、ヒトのサンプルを用いての実験が進んでいない。しかし、ホルマリン固定された子宮のサンプルを用いても免疫組織染色が可能であることが判明したので今後検討を進めることが可能となると予想される。ラット卵巣を用いた実験では、LH-RとAMの発現量が多いため実験が進めやすく、発現量の変化や局在の特定がしやすかったが、子宮でのそれぞれの物質の発現量が少なく、量的変化を追及することに困難が予想される。さらにヒトの子宮をサンプルとすることでの制約がかかり、進行に懸念があるが、免疫組織による発現局在やホルモン分泌の時期の特性を知ることにより、性周期の時期に狙いをつけて実験が可能となる。サイトカインの影響に関しては、LH-Rを発現している子宮内膜腫瘍細胞系を用いて検討することでその作用メカニズムを明らかにしていく予定である。サイトカインの影響に関しても、卵巣の細胞では強いLH-Rの発現に対する影響が観察できたので、子宮内膜初代培養系をもちいて、サイトカインの影響を検討する予定である。子宮内膜のRNA抽出の試薬や染色のために必要な抗体などの試薬に使用することが主になる。また、培養系が確立できた場合は、培養に必要な培養器具、試薬に使用する。
RNA結合蛋白質hnRNPDの配列特異的一本鎖核酸認識機構の解明

1.D1Hの溶液構造を高分解能(r.m.s.d=0.41オングストローム)で決定した。その結果、βαββαβフォールディング構造に加えて以下の構造が形成されていることがわかった。1)αヘリックスのN末端の構造を安定化するNキャッピング構造がα1及びα2に形成されている。2)α1にはαヘリックスのC末端側の構造を安定化するCキャッピング構造が形成されている。3)β2にはβバルジ構造が形成されている。4)二次構造を形成していないループ領域のうちloop1とloop5に含まれるアミノ酸の側鎖間に水素結合が見つかった。これらのloop1及びloop5はRNAと相互作用するloop3の真下に位置することから、RNAが結合する際にloop3を下から支えている可能性がある。2.RNAとの複合体に関して三重共鳴NMR測定を行い主鎖の帰属を行なった。その結果RNAとの相互作用部位がより正確になった。また、RNAが結合した状態でもD1Hの二次構造が保持されていることがわかった。3.複合体形成にともなうD1Hの主鎖の運動性をT1,T2及び15N-NOEを用いて調べた。相互作用に関与するloop3は、RNAが結合していないときは運動性が高いが、結合すると運動性が低くなることからinducedfitしている可能性がある。4.一方、D2の構造も二次構造を決定した。現在立体構造を求めるために解析を続けている。
表面化学修飾固定相ー液相界面における種々の金属錯体の安定度と吸着の選択性

表面化学修飾固定相として,液体クロマトグラフィーの分野で多用されているオクタデシル鎖を化学結合したシリカゲルを取りあげ,種々の溶液と組み合せた二相系での錯体の分配挙動をクロマトグラフィーの手法を用いて研究し,以下のような知見を得た。1.希工類のオクタエチルポルフィリン錯体に対する保持は,移動相溶液中に添加したアミンの種類に依存し,アミンのアルキル鎖長の長さが長いほど影響は大きい。トリアルキルアミンとジまたはモノアルキルアミンの影響は大きく異なっている。2.硅酸亜鉛系の蛍光試剤を含有するオクタデシル化シリカ上でポルフィリンのクロマトグラフィーを行うと,これらポルフィリンはその亜鉛錯体に変化するという重要な事実が見出された。3.化学結合シリカと化学結合していないシリカのポルフィリンやその金属(銅)錯体に対する吸着特性を,ポルフィリンの化学構造,溶媒物性,シリカ表面を化学修飾した原子団の構造の観点から明らかにした。4.種々のβ-ジケトンのクロム(III)およびパラジウム(II)の液液分配係数をドデカン/アセトニトリルー水の系で測定し、分配係数に及ぼす錯体の立体的大きさと,溶媒ー錯体相互作用との影響を考察した。5.種々の有機化合物について,オクタデシルシリカとメタノールー水の系での分配挙動を、オクタデシルシリカの代りにドデカンを用いた液一液系での分配挙動と比較した結果,オクタデシルシリカは極性溶媒(メタノール又は氷)をとり込んで極性の高い状態にあることが明らかになった。6.オクタデシルシリカ表面を移動相に添加したオクタンにより修飾し、疎水性を高めることにより金属テトラフェニルポルフィリンの分離を向上させ得ることを見い出した。
外界の影響を受けるナノ構造体の化学ポテンシャルのトンネル分光による研究

直径が1nm程度の金属クラスターが外部電極と弱く結ばれた系(両者が量子抵抗より充分大きな抵抗を持つトンネルバリアで結合している系)において、その化学ポテンシャルが外部環境でどのような変化をするか、またその結果電極のフェルミレベルとの相対的な位置関係はどのようになるかを知ることを目的として系統的な研究を行っている。前年度まではチオール分子、ジチオール分子からなる自己組織化単分子膜の上に金を蒸着することにより得られる、金クラスター/単分子膜/金(111)基板という構造を作り、走査トンネル顕微鏡を用いてクラスターのトンネル分光を行ってきた。しかしこの方法では金のクラスターしか作れない(下地の金属とクラスターがともに金である)ことや、クラスターや分子が分光中に動き測定に影響を与える等の問題があった。そこで今年度はNiAl(110)基板上に成長するAl_2O_3超薄膜を上の単分子膜/金(111)基板に置き換えることが可能であるか、またその上にクラスターを成長させて化学ポテンシャルの測定を行うことが可能であるかどうかの検証をおこなった。Al_2O_3超薄膜/NiAl(110)基板上に銀、銅の蒸着を行ったところ、1nmクラスのクラスターを主にドメイン境界上に(クラスター間の相互作用が問題にならない程度に分散して)成長させることが可能であることを確認した。また銅クラスターについてトンネル分光を行ったところAl_2O_3超薄膜は、抵抗500MΩ、比誘電率34程度のトンネルバリアとして働くこと(直径1.3nm程度のクラスターの場合)を確認した。クラスターのサイズは蒸着量により制御可能であり、さらにトンネル分光も比較的安定に得ることができた。プレリミナリーな実験において、銅クラスターの化学ポテンシャルの位置がNiAl(110)のフェルミレベルを中心として分布していることが確認された。大きさが1nmクラスの金属クラスターが外部電極と弱く結ばれた系(両者が量子抵抗より充分大きな抵抗を持つトンネルバリアで結合している系)において、その化学ポテンシャルが外部環境でどのような変化をするか、またその結果電極のフェルミレベルとの相対的な位置関係はどのようになるかを知ることを目的としてシステマティックな研究を行なっている。平成15年度はヂチオール分子膜/Au(111)基板上に成長した金クラスターを対象として、その化学ポテンシャルの基板のフェルミレベルに対する相対位置関係を、走査トンネル顕微鏡を用いたトンネル分光により詳細に調べた。用いた試料は、(1)外部電極として働く原子レベルで平坦なAu(111)面、(2)相互作用(トンネル確率等)の大きさをコントロールできる厚さの制御可能なヂチオール分子膜、(3)蒸着量により大きさの制御可能な1nm級金クラスターからなる。トンネル分光ではクラスターを中心電極とした2重トンネル障壁が形成されることから、単一電子トンネル効果によるクーロン階段が見られる。この階段の対称性からクラスターの化学ポテンシャルの基板のフェルミレベルに対する相対位置に関する情報を得ることができる。その相対位置は個々のクラスターにによって異なるため、多くのクラスターについて測定しその分布を調査した。また分布のクラスターサイズ依存性も詳細に調べた。その結果、金のクラスターの一電子帯電エネルギーがサイズ減少とともに単調に増加する事、金のクラスターの化学ポテンシャルは基板のフェルミレベルを中心に分布している事、その分布の幅がクラスターのサイズ減少とともに大きくなる事、分布の幅のサイズ依存性と一電子帯電エネルギーのサイズ依存性の関係からナノクラスターの電気的中性がサイズ増加ともに破れていく様子がみられた。得られた結果は国内学会講演会(4件)、国際会議(4件)、論文(2誌)等で発表を行なった。直径が1nm程度の金属クラスターが外部電極と弱く結ばれた系(両者が量子抵抗より充分大きな抵抗を持つトンネルバリアで結合している系)において、その化学ポテンシャルが外部環境でどのような変化をするか、またその結果電極のフェルミレベルとの相対的な位置関係はどのようになるかを知ることを目的としてシステマティックな研究を行なっている。平成16年度は平成15年度にひきつづきヂチオール分子膜/Au(111)基板上に成長した金クラスターを対象として、その化学ポテンシャルの基板のフェルミレベルに対する相対位置関係を、走査トンネル顕微鏡を用いたトンネル分光により詳細に調べた。15年度は単一電子帯電効果を起源とした化学ポテンシャルのみを議論してきたが、実際には1nmクラスのクラスターの場合、量子的な効果(いわゆる量子ドットとしての振る舞い)も無視できないはずである。これまでの我々の試料の場合、クラスターが密に配置しているため、クラスター間の相互作用が測定に影響を及ぼしている可能性があった。今年度はその影響を排除するための試料の作成を行ないポテンシャルを系統的に調べた。15年度のトンネル分光測定は主に物質材料研究機構のナノマテリアル研究所藤田グループの協力を得て実験を行ったが、今年度は我々の研究室に極現場(高真空、高磁場、超低温)で観測可能な走査型トンネル顕微鏡が導入された。本年度の前半は我々の高精度な測定に必要な条件だしや装置の問題点の解決等に多くの時間を割いた。これにより系統的な研究をする準備はほぼ整った。得られた結果は国際会議(3件)、論文(2誌)等で発表を行なった。

直径が1nm程度の金属クラスターが外部電極と弱く結ばれた系(両者が量子抵抗より充分大きな抵抗を持つトンネルバリアで結合している系)において、その化学ポテンシャルが外部環境でどのような変化をするか、またその結果電極のフェルミレベルとの相対的な位置関係はどのようになるかを知ることを目的として系統的な研究を行っている。前年度まではチオール分子、ジチオール分子からなる自己組織化単分子膜の上に金を蒸着することにより得られる、金クラスター/単分子膜/金(111)基板という構造を作り、走査トンネル顕微鏡を用いてクラスターのトンネル分光を行ってきた。しかしこの方法では金のクラスターしか作れない(下地の金属とクラスターがともに金である)ことや、クラスターや分子が分光中に動き測定に影響を与える等の問題があった。そこで今年度はNiAl(110)基板上に成長するAl_2O_3超薄膜を上の単分子膜/金(111)基板に置き換えることが可能であるか、またその上にクラスターを成長させて化学ポテンシャルの測定を行うことが可能であるかどうかの検証をおこなった。Al_2O_3超薄膜/NiAl(110)基板上に銀、銅の蒸着を行ったところ、1nmクラスのクラスターを主にドメイン境界上に(クラスター間の相互作用が問題にならない程度に分散して)成長させることが可能であることを確認した。また銅クラスターについてトンネル分光を行ったところAl_2O_3超薄膜は、抵抗500MΩ、比誘電率34程度のトンネルバリアとして働くこと(直径1.3nm程度のクラスターの場合)を確認した。クラスターのサイズは蒸着量により制御可能であり、さらにトンネル分光も比較的安定に得ることができた。プレリミナリーな実験において、銅クラスターの化学ポテンシャルの位置がNiAl(110)のフェルミレベルを中心として分布していることが確認された。
血液リポ蛋白非結合型Aβによるアルツハイマー病の発症予測

アルツハイマー病病態惹起分子と考えられるリポ蛋白非結合型Aβの同定と選択的測定法を確立した。60歳以降の健常人ではこの病的分子種の代謝活性機構が存在し、リポ蛋白非結合型Aβの全血漿中に占める割合が減少した。アルツハイマー病ではこの機能障害が存在し、病初期にリポ蛋白非結合型Aβが増加し、その進行とともに減少した。ダウン症候群ではリポ蛋白非結合型Aβが痴呆発症前のアミロイド早期病変形成に至るまで増加し、脳病変の成熟化とともに減少した。脳内アミロイド沈着のtemporal profileによく対応していた。リポ蛋白非結合型Aβがアルツハイマー病病態惹起分子である傍証を得るため、6例のAD脳と4例の健常者脳をsandwich ELISA (BNT77/BA27 for Aβ40,BNT77/BCO5 for Aβ42)とゲル濾過法、イムノブロットにて解析した。AD脳内のリポ蛋白非結合型Aβはダイマー形成能に富むことが明らかとなり、Aβアミロイド沈着に直接関与する分子種(アルツハイマー病病態惹起分子)はリポ蛋白非結合型Aβである傍証が得られた。一方AD脳脊髄液中ではリポ蛋白非結合型Aβが選択的に減少しており、脳からのクリアランス障害がAD脳病変形成に密接に関わっている傍証も得られた.さらに我々は経口メラトニン療法の有用性をAPP過剰発現トランスジェニックマウスにおいて検討し、脳内アミロイド蓄積量の抑制効果、脳内ニトロ化タンパク蓄積抑制(酸化的ストレス防止効果)及びメラトニン投与マウスでの寿命延長を確認した。これらの効果は、メラトニンが脳内からのAβクリアランスを活性化することにより発揮されることも明らかとなり、今後アルツハイマー病脳内Aβクリアランス促進薬の有力な候補として報告ができ、早期臨床応用を検討している。本年度の研究実施計画に従い下記の検討を行った。(1)髄液総Aβ40/42およびリポ蛋白非結合型Aβ40/42の測定リポ蛋白非結合型Aβ40/42の作製は600μlのヒト髄液からsequence density floating超遠心法を用いてリポ蛋白分画を除去し、Aβ40/42の測定はELISAで行った。さらに、ゲルろ過法を用いて、高分子量のリポ蛋白結合型と低分子のリポ蛋白非結合型Aβ40/42を分取後、ELISAにて解析した。(2)AD脳、正常加齢脳におけるリポ蛋白結合型と非結合型Aβ40/42の検討6例のAD脳と4例の健常者脳からトリス緩衝液と70%蟻酸によって可溶性Aβ40/42と不溶性Aβ40/42をそれぞれ抽出した。トリス緩衝液可溶性Aβ40/42からゲルろ過法を用いて、高分子量のリポ蛋白結合型と低分子のリポ蛋白非結合型Aβ40/42を分取後、ELISAとイムノブロットにて解析した。脳内両分子種の存在を確認し、AD脳でAβアミロイド沈着に直接関与する分子種はリポ蛋白非結合型Aβである傍証を得た。(3)家族性AD患者における総Aβ40/42およびリポ蛋白非結合型Aβ40/42の測定本邦のAPP717変異家系(新潟,尼崎,東京家系)とpresenilin-1変異家系(大阪,兵庫,アルゼンチン家系)の家族性ADの血漿でリポ蛋白結合型および非結合型Aβ042を検討し,異なる遺伝子異常(APP, presenilin-1)でも弧発性ADやDown症候群と同様の変化が認められるか検討した。

(4)APP過剰発現トランスジェニックマウスのメラトニン治療APPswmiceで4ヶ月齢から15.5ヶ月齢まで0.5mg/mlのメラトニンを飲水にて投与し、メラトニンの治療効果を検討したメラトニン投与群(0.5mg/ml)において、脳内Aβ蓄積量は可溶性とアミロイドの両画分で有意な低下を認めた。アミロイド蟻酸抽出画分では、すでに8カ月令からAβ42蓄積量の抑制を認めた。一方、脳内amyloid load(15.5カ月令)は、その半数以上で減少傾向を認めたものの有意差を得るには至らなかった。このELISAにおけるAβ量は、免疫組織化学的手法で検出不能なAβを含む脳内アミロイド原性Aβプールを反映していると考えられた。次いで8カ月令と15.5カ月令で脳内メラトニン濃度を検討したところ、メラトニン非治療群では加齢による減少があり、治療群では4-6倍程度増加していた。このメラトニン増加による神経細胞毒性の可能性を検証するため、イムノブトットによる脳内APPの発現量を検討した。メラトニン治療群と非治療群で脳内APPの発現量に差を認めず、今回使用した投与量のメラトニンが毒性をもち、脳内APP発現量を減らし、その結果として脳内Aβ蓄積量が減少している訳ではないことが証明された。次いで、Aβ-mediated oxidative injuryの元凶と考えられているperoxynitrateの関与を脳内nitrotyrosineの定量を指標として、メラトニン治療群、非治療群で経時的(8,9.5,11,15.5カ月令)に検討した。メラトニン治療群において、脳内nitrotyrosineの有意な低下を認め、その低下は若年群において顕著で、加齢とともに減弱傾向にあった。さらに2mg/mlメラトニン投与群(44匹)と非投与群(44匹)4カ月令miceにおいて、15.5カ月令まで生存率を検討すると、メラトニン投与群、非投与群におけるmiceの4から15.5カ月令までの生存率はそれぞれ92.7%,70.4%とメラトニン投与群で有意な寿命の延長が認められた。
雄牛フェロモンの同定と実用化に関する研究

本年度は実施計画に基づいて研究を実施し、以下の成果を得た。1雄牛フェロモン活性に対するバイオアッセイ系の確立鋤鼻神経細胞を用いた生物検定:2年6か月齢の交雑種雌牛の鋤鼻組織から確立した不死化細胞100個以上のクローンからのtotal RNA抽出とcDNA合成を完了した。鋤鼻神経細胞のマーカーであるolfactory marker proteinおよびG protein(Gi)を発現する細胞を検索し、35個のクローンを得た。受容体強制発現系を用いた生物検定:フェロモン受容体の膜発現を実現するため、腎臓由来の細胞株を用いて繊毛発現シグナルの検討を行った。LHパルスを指標とした生物検定:農研機構畜産研究部門において、卵巣除去牛にエストロジェンのインプラントを投与後LHパルスを観察し、フェロモン検定のためのモデルを検討した結果、エストロジェン投与後徐々に負のフィードバック効果が薄れていくことを明らかにした。MUA記録システムを用いた生物検定:農研機構畜産研究部門の牛脳定位固定装置を用いて3頭の雄牛の弓状核に電極を植え込み、東京大学附属牧場にて電気活動を記録することができた。現在LHパルスと同期するMUAボレーは得られていないが、術技と記録法を確立することができた。2雄牛フェロモンのリガンド分子同定現時点では雄牛フェロモンの産生部位が特定できていないため、農研機構畜産研究部門において雄牛頭部のヘッドスペース捕集方法の改良を行うとともに、1歳における雄牛去勢前後のサンプルについて比較を試みたところ、精巣由来アンドロジェン依存性のピークが複数存在することが明らかとなった。1雄牛フェロモン活性に対するバイオアッセイ系の確立・MUA記録システムを用いた生物検定に際し、機器トラブルが生じたために、2頭分の正常データを得ることができなかった。2牛におけるLH分泌に対するエストロジェンの負のフィードバック効果がヤギなどと違い、長続きしないことから長期にわたって用いることができるモデルを作成することが困難であることがわかった。3培養細胞の細胞膜上に何らかの理由でフェロモン受容体がうまく発現せず、in vitroの評価系ができない。引き続きin vivoおよびin vitroのフェロモン検定系を確立することを重点的に推進する。MUA記録システムについては随時機器の状況をモニターすることで早急にバイオアッセイシステムを確立する予定である。LHパルスを指標とした検定については、エストロジェン投与後徐々に負のフィードバック効果が薄れていくことが明らかとなったため、プロジェステロンを用いるなど新たな方法について検討を行う予定である。In vitroでは、鋤鼻神経細胞由来と考えられる35個の不死化細胞株を用いてフェロモン検定系を確立することを目指す。1雄牛フェロモン活性に対するバイオアッセイ系の確立鋤鼻神経細胞を用いた生物検定:2年6か月齢の交雑種雌牛から鋤鼻組織を採取して初代培養したのち不死化し、100個以上の細胞クローンを得ることができた。各細胞クローンからのtotal RNA抽出とcDNA合成を順次進めている。受容体強制発現系を用いた生物検定:マウスとヤギをモデル動物として強制発現手法の検討を行った。マウスV1Rf3については細胞膜での発現が確認され、カルシウムイメージング法においてフェロモン応答が検出されたものの、ヤギV1Rについては、膜移行が認められなかった。LHパルスを指標とした生物検定:東京大学附属牧場において、卵巣除去牛を作成しLHパルスを観察した結果、黄体期や卵胞期に比較してより明瞭なパルスが見られた。このため今後はin vivoの生物検定モデルとして卵巣除去牛を用いることを決定した。MUA記録システムを用いた生物検定:農業生物資源研究所の牛脳定位固定装置を用いて、雄牛の弓状核近傍にBDA(ビオチン化デキストランアミン)を微量投与したところ、正確に投与されていることが明らかとなり、牛における脳定位(電極留置)手術が可能であることが示唆された。2雄牛フェロモンのリガンド分子同定現時点では雄牛フェロモンの産生部位が特定できていないため、畜産草地研究所において雄牛頭部のヘッドスペース捕集及び頭部被毛採取物からのヘッドスペース捕集を行いGC-MS測定を行った。その結果、特徴成分としてHexanal等の脂肪族アルデハイド、HexenalやHexadienal等の脂肪族不飽和アルデハイド及び脂肪族ケトン類が同定された。また、乳酸エステルや脂肪酸類も同定されたことから、現段階としては有意義な知見を得ることができた。本研究において有効なフェロモンの生物検定法を得ることはもっとも重要な課題のひとつである。in vivoでは、LHのパルス状分泌およびMUAを用いた2つのアプローチはいずれも順調に進んでおり、検定法として確立できると考えている。また、in vitroの生物検定法の確立については、鋤鼻器細胞の不死化細胞のクローンを得つつあること、また受容体強制発現細胞ではヤギのV1Rの膜上への発現をめざして実験中であることなど、いずれ順調に推移しており、いずれ有効なin vitroの生物検定法を得られると考えている。また、GC-MSによるリガンド分子の同定法については、予備実験として雄牛頭頂部から得られたサンプルの分析に成功しており、フェロモン産生部位が同定されれば、ただちに分析、同定できる態勢を整えることができた。このように、初年度としては順調に実験を遂行しており、研究班員の互いの連携も整ってきたものと考えられる。

1雄牛フェロモン活性に対するバイオアッセイ系の確立鋤鼻神経細胞を用いた生物検定:2年6か月齢の交雑種雌牛の鋤鼻組織から確立した不死化細胞100個以上のクローンからのtotal RNA抽出とcDNA合成を完了した。鋤鼻神経細胞のマーカーであるolfactory marker proteinおよびG protein(Gi)を発現する細胞を検索し、35個のクローンを得た。受容体強制発現系を用いた生物検定:フェロモン受容体の膜発現を実現するため、腎臓由来の細胞株を用いて繊毛発現シグナルの検討を行った。LHパルスを指標とした生物検定:農研機構畜産研究部門において、卵巣除去牛にエストロジェンのインプラントを投与後LHパルスを観察し、フェロモン検定のためのモデルを検討した結果、エストロジェン投与後徐々に負のフィードバック効果が薄れていくことを明らかにした。MUA記録システムを用いた生物検定:農研機構畜産研究部門の牛脳定位固定装置を用いて3頭の雄牛の弓状核に電極を植え込み、東京大学附属牧場にて電気活動を記録することができた。現在LHパルスと同期するMUAボレーは得られていないが、術技と記録法を確立することができた。2雄牛フェロモンのリガンド分子同定現時点では雄牛フェロモンの産生部位が特定できていないため、農研機構畜産研究部門において雄牛頭部のヘッドスペース捕集方法の改良を行うとともに、1歳における雄牛去勢前後のサンプルについて比較を試みたところ、精巣由来アンドロジェン依存性のピークが複数存在することが明らかとなった。1雄牛フェロモン活性に対するバイオアッセイ系の確立・MUA記録システムを用いた生物検定に際し、機器トラブルが生じたために、2頭分の正常データを得ることができなかった。2牛におけるLH分泌に対するエストロジェンの負のフィードバック効果がヤギなどと違い、長続きしないことから長期にわたって用いることができるモデルを作成することが困難であることがわかった。3培養細胞の細胞膜上に何らかの理由でフェロモン受容体がうまく発現せず、in vitroの評価系ができない。今後もっとも力を入れて進めなければならないのは、MUAを用いたin vivoの検定法を確立すること、また鋤鼻器細胞の不死化細胞、あるいは受容体強制発現細胞のいずれかを用いた生物検定法を確立することである。MUAについては、200kg前後の雌牛に電極を留置することを前提に農研機構畜産研究部のグループと東京大学附属牧場が連携して、現在位置の確認を行っているところであり、28年度中にはLHパルスと同期する発火活動が取れるものと考えられる。27年度の後半からは日本で唯一ウシの脳定位手術が可能な農研機構の研究グループの全面的協力が得られるようになったので、今後の進展を期待している。また、in vitroの生物検定法である2種類の細胞については、東京大学の獣医繁殖育種学研究室と獣医動物行動学研究室を中心として、研究を進めているところである。鋤鼻細胞不死化
木確率モデルを用いた知識発見よりのタンパク質の糖鎖認識部位予測

本研究の目的はレクチンなどのタンパク質の糖鎖構造の認識機構を明らかにするための新しいデータマイニング技術の開発であった。糖鎖結合親和性の高速な測定技術も発展しているため、糖鎖認識パターンを抽出するデータマイニング技術の糖鎖への応用が可能となっている。研究代表者は、これまでProfile PSTMMと呼ぶ木構造中の子の順序を考慮する木確率モデルを開発し、糖鎖構造に応用してきたが、糖鎖の複雑な認識機構の本質を良く理解するために更なる開発が必要であった。そこで、Profile PSTMMの基盤となるState modelの形を確定するために、アミノ酸配列のマルチプルアライメントアルゴリズムCLUSTALWを基に、糖鎖構造のアルゴリズムMCAW(Multiple Carbohydrate Alignment with Weights)を考えた。また、糖鎖構造のマルチプルアライメントを行うため、糖鎖のマルチプルアラインメント形式も決める必要があり、PKCF(Profile KCF)と呼ぶ新しい糖鎖アライメント形式も開発した。そして、この形式を扱うことができるMCAWのプログラムを開発した。Profile PSTMMのモデルの最も重要な問題点は入力された糖鎖構造に適応するState Modelを確定することであった。このモデルはState Modelの形に添ってプロファイルを出力する。そのため、入力された糖鎖構造に対してState Modelの形が不適切であると、不正確なプロファイルを出力する可能性が生じる。この改善のために、初めに入力された糖鎖構造を用いて全対全の最大共通部分を取得し、State Modelの形を確定することが出来る。しかしながら、入力された糖鎖構造の数によって、最大共通部分木が小さくなる傾向が認め照れた。そのため、更に適切なState Modelの確定法の研究を進め、糖鎖の多重配列アラインメントか照のブロックを抽出するアルゴリズムを開発した。糖鎖のブロックは、多重配列アライメントから得たギャップのないモチーフ構造を示す。糖鎖ブロックを決定することによってState Modelの構造を決め照れると考え、まずアミノ酸配列のマルチプルアライメントアルゴリズムCLUSTALWを基に、糖鎖構造のアルゴリズムMCAW(Multiple Carbohydrate Alignment with Weights)を考えた。このアルゴリズムでは糖鎖の類似性から案内木を作成し、有根木に変換する際に重み付けをする。そして、案内木に従って各糖鎖をマルチプルアライメントに追加して行き、重みをスコアの計算で用いることで、糖鎖のブロックを作成することができる。この糖鎖ブロックか照適切なState Modelを構築できると考え照れた。また、糖鎖構造の多重配列アライメントを行うための形式も決める必要があったため、PKCF(Profile KCF)と呼ぶ新しい糖鎖アライメント形式も開発した。