hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
会計情報とコーポレートガバナンス－リスク・テイクとR&D投資を中心に

日本会計研究学会では、リスクテイクに影響を与えることが確認されている未積立の年金債務と配当政策について研究発表を行う予定である。またアメリカ会計学会では、同じくリスクテイクと関連がある業績予想についての実証研究を行う。今後は、退職給付に係る負債が現金保有に与える影響、退職給付に係る負債が配当政策に与える影響、退職給付に係る負債がM&Aに与える影響などについて実証研究を行い、学会等での報告後に論文を公表する予定である。財務会計翻訳に対する人件費・謝金が事前に予想していたよりも少額であったため、次年度使用額が生じた。次年度の人件費・謝金として使用する予定である。
ロシアにおける土地改革の経済的社会的効果の分析

(1)ロシア中央黒土地帯、北コーカサス地方、中央非黒土地帯などの地域における独立農民経営の発生とその経営動態に関する調査を行った。特に、独立農民経営に対する政府の財政的支援システムの変化、税制の影響、市場制度・インフラの発展と経営の関連などが分析され、ロシアにおける土地改革が全体として不成功に終わりつつあること、およびその諸要因についての知見が得られた。(2)その法的形態、所有形態を変えた旧国営農場、集団農場における改革の実態を調査研究し、農村の経済・社会に与えているその影響を分析した。また、これに関連し、土地改革に伴う、農村での様々な社会的分野への否定的作用、人口・労働力問題への影響についても一定の知見が得られた。さらに、ロシアの改革と中・東欧諸国の改革を比較分析し、ロシアの改革の持つ固有な性格、特殊性を明らかにした。(3)集団経営の改革については最も先進的な試みとされるニジュニイ・ノブゴロッド方式について詳細に検討を行ない、この方式がロシアの土地改革を推進するための決定的な処方箋にはなり得ないことを明らかにした。(4)住民による個人副業経営の持つ役割について分析を行い、それがロシア農業に占める比重が飛躍的に高まっているにも関わらず、ロシア農業の将来を支える基盤にはなりえないことを明らかにした。ロシア中央黒土地帯タンボフ州、北コーカサス地方のロストフ州、中央非黒土地帯のトゥーラ州など一部地域の実態調査資料、およびロシア全体(88の自治体別)・旧ソ連諸国における土地改革の進行状況に関するマクロの統計資料を電子媒体の形で入手し、資料の整理にとりかかっている。投資の観点からみた土地改革の効率について、実態調査資料からの分析を一部はじめているが、当初予想されていたよりも、改革の効率があがっていないことが明らかになっており、現在、その要因分析へと進んでいる。また、土地改革に伴う、農村での様々な社会的分野への否定的作用、人口・労働力問題への影響についても一定の知見が得られている。平成6年度において獲得された資料は、地域的広がりに関して、なお不十分であり、特にシベリアや極東などの「辺境地域」における資料入手が進んでいない。この点を考慮して、平成7年度には、これらの手つかずの地域を中心に資料の収集につとめなければならない。また、「ニジュヌイ・ノブゴロッドの実験」に代表されるような、当初、あまり重視していなかった動きについても、注目していく必要があり、これに関連した一部地域についての調査を平成7年度に含める必要がある。以下のような調査・研究を行った。(1)前年に続き、ロシア中央黒土地帯、北コーカサス地方、中央非黒土地帯などの地域における独立農民経営の発生とその経営動態に関する調査を行った。特に、独立農民経営に対する政府の財政的支援システムの変化、税制の影響、市場制度・インフラの発展と経営の関連などが分析された。また、これに関連して、特に、「ニジュヌイ・ノブゴロッドの実験」に代表される改革の新しい動きについて、調査を行った。(3)極東における独立農民経営と旧国営農場の動向・変化について、ハバロフスク地方のケースをとりあげ、調査研究した。極東は、「土地改革の後退現象」と呼ばれる状況が最も典型的に現れている地域であることを明らかにし、その諸要因について分析を行った。(4)1995年度は、農業・土地改革関係の法制度において、1991年以来の変化の年であり、これらについて調査研究を行った。以上の調査の結果は、まとめて平成8年度に発表する予定であり、現在、そのための刊行助成費(科学研究費補助金)を申請中である。
トップダウン過程としての催眠：認知心理学的アプローチ

本研究では、採用者の今までの知見とプロトコル作成・実験実施のスキルを活用し、日本版プロトコルの作成と生理計測への展開、理論的モデルの構築、疼痛コントロールへの応用までを射程に入れた研究を行う。複数言語による相互検証を行った後、認知課題を瞳孔反応・脳波計測を行いながら実施することで、催眠のトップダウン過程モデルの精緻化を行う。また、外部の機関との連携によって、本研究で得られた知見に基づく疼痛緩和プロトコルの試作も行う。平成30年度は、日本での研究に必要となる催眠感受性尺度の作成と言語間での一貫性・妥当性調査、およびそれを用いた被験者プールの蓄積を第一の目的としていた。また、来年度以降に本格的に開始する実験のデザインの選定、及び心理実験の知識とノウハウ、装置の使用方法の学習も進めた。具体的には、文献調査により質問項目の洗い出しを行い研究補助員の選定などを進め、来年度以降の研究の加速に備えた。実験の実施もスムーズに行われ,期待される結果を得ているとともに,次年度における研究発表の準備も進んでいる。来年度以降の研究の準備が十分に整ったために、次年度以降に研究を速やかにスタートさせる。
光機能性ポリマー球体の高次連結による光学メタマテリアルの開発

2018年度は、π共役系有機分子および高分子からマイクロ構造体の自己形成、およびそれらの配向制御に関して研究を進めた。また、得られたマイクロマイクロ構造体からのレーザー発振特性を評価した。炭素架橋フェニレンビニレン(COPV)の自己組織化により形成するマイクロ結晶は、発光効率が高く、光を効率的に結晶内部に閉じ込めることから、WGMレーザー発振することを見出した。また、エネルギー供与性および受容性のCOPVを混合することで共結晶化を行い、結晶内部でのエネルギー移動とレーザー発振の関連性について明らかにした。また、金属配位性高分子と希土類悪態の複合による効率的なレーザー発振材料の創成、電子供与性ポリマーと受容性分子のバルクへテロ接合マイクロ球体によるホール輸送特性の向上を見出した。また、基板表面での自己組織化により、半球体の形成とアレイ化に成功した。発光性高分子の合成に関しては、不活性ガス雰囲気を使わなくても効率よく直接的アリール化重合が進行する合成技術を開発した。これにより、発光材料として機能する高分子半導体を大気下での実験操作で簡単に合成できる手法を提供できた。また、芳香族モノマーとジビニルモノマーの脱水素型クロスカップリング反応である直接的アルケニル化反応を効率化することにより、ポリアリーレンビニレン型高分子半導体の合成技術を確立した。発光性錯体に関しては、m-フェニレンリンカーで連結した柔軟な構造をもつ大環状ジピリン四量体および五量体とそのホウ素錯体を合成し、それらのもつ特異な構造を明らかにした。また、合成したホウ素錯体が高い発光性を示すことや、五量体では、二分子のジブチルアンモニウムを段階的に認識することを見いだした。基板表面での自己組織化による球体の形成と、親水疎水パターン表面を利用したマイクロ構造体の大面積アレイ化は、当初予想していた以上の結果を得ることができた。光異性化分子を用いることで、アレイに文字や画像をかき込み/消去が可能となった(現在論文投稿中)。現在、様々な発光性高分子や有機分子を用いた実験を進めている。上記の、親水疎水パターン表面を利用したマイクロ構造体の大面積アレイ化について、現在様々な発光性高分子や有機分子を用いた実験を進めている。それらを用いた書き込み/消去が可能な光メモリーデバイスの構築を進めている。材料合成に関しては、上記の合成技術をさらに効率化して汎用性を高めるとともに、高機能な光機能性高分子の設計・合成を遂行する。また、大環状ジピリン四量体および五量体と他の典型元素との錯形成を利用して、新規な発光特性や分子認識能などの機能をもつ新規な分子群の構築を行い、これを基盤とする発光性材料への展開を試みる。1特徴的な発光特性を有する共役ポリマーおよび蛍光ドーパントの合成ポリマーとして、金属配位部位を有する共役ポリマー、凝集誘起発光特性や遅延蛍光特性、フォトクロミズムを示す共役ポリマーおよび有機分子の開発を行った。蛍光ドーパントとして、リン光特性を示す重元素金属錯体(Ir, Ptなど)や高輝度発光を示す希土類金属錯体(Eu, Er, Tb, Tmなど)を合成し、金属配位部位を有する共役ポリマーへの配位結合の形成を検討した。非共役ポリマーや強誘電ポリマー球体への蛍光ドーパントとして、円偏光発光を示す色素や分子内分極が大きなD-π-A型非線型光学色素、近赤外発光を示す蛍光色素を合成した。合成したポリマーや蛍光色素を用いて、蒸気拡散法もしくは界面析出法により球体を作製し、顕微分光によるWGM発光特性を観測した。2マイクロマニピュレーションによる球体の1次元配列と1Dメタマテリアル特性作製した複数の球体共振器を、マイクロマニピュレーション技術を用いて特定の配列を形成し、WGMを介した効率的な球体間光伝搬および放射エネルギー変換を実現した。例えば、緑・黄・赤色WGM発光を示す球体を連結することによる多段階カスケードエネルギー移動を実現した。同種もしくは異種の球体が連結した場合のモードカップリングや波長変換に関して、実験とシミュレーションの両面から検討を行った。3共役ポリマー球体からの光ポンピングによるレーザー発振の実現本課題の重要目標の一つに、電荷注入発光によるレーザー発振の実現が挙げられる。今回、ミニエマルジョン法を用いて光耐久性の高いポリフルオレン(F8)という共役ポリマーからなるマイクロ球体を作製した。その球体1粒子に対し、フェムト秒パルスレーザーを照射し、発光スペクトルを計測した結果、1.5マイクロJ/cm2の低閾値での青色レーザー発振の観測に成功した。平成28年度は、ほぼ予定通り研究を実施し、関連する論文を計17報発表した。当初の目標であった、球体間光伝搬と波長変換や光ポンピングによるレーザー発振特性など、複数の成果を高インパクトジャーナルに発表することができた(ACS Nano x 2, Angew. Chem. Int. Ed. x 1など)。また、レビュー論文1報とビデオジャーナル1報を発表した。π共役ポリマーからなるマイクロ光共振器の構築と、レーザー発振特性の発現を実現した。球体共振器に関しては、赤外発光を示す共振器の形成、および球体形成メカニズムについて詳細に検討し、それぞれ論文発表した。また、球体からのWGMレーザー発振に関して、論文発表を行った。さらに、π共役デンドリマーの自己組織化に関する研究を進め、ポーラス結晶の形成とガスや蒸気の吸着特性、それに伴う発光特性変化について論文発表を行った。

また、チオフェンやセレノフェンなどのカルコゲノフェンをBODIPYに導入した化合物を各種合成し、光学特性(吸収、発光)の著しい長波長シフトを達成した。十分に高い蛍光発光を示すにもかかわらず、一重項酸素の優れた増感剤ともなるBODIPY誘導体の合成にも成功し、バイオイメージングと光線力学療法を同時に達成しうるリード化合物を開発することができた。さらに、ワンポット合成技術による高分子半導体の合成について検討した。芳香族モノマーのC-H結合を反応点する直接的アリール化重合反応は、従来法に比べて環境調和性が高く、安価で入手容易な原料を利用してπ共役高分子を合成することができるが、この合成法では、依然として純度の高いジハロゲン化芳香族化合物を事前に調製する必要がある。これに対して、芳香族化合物の臭素化と直接的アリール化反応を連続的に進行させるワンポット合成技術を開発した。この手法では、反応物を反応容器に順に投入し、2段階の反応を連続的に行い、これにより有機金属のみならず、有機ハロゲン化物の事前調製も必要とせずに、2種類の芳香族化合物を直接出発原料として利用してπ共役高分子を得ることができた。計画していた通り、研究を進めることが出来た。また、予想外の結果がいくつかでており、それらについても論文発表を行った。2018年度は、π共役系有機分子および高分子からマイクロ構造体の自己形成、およびそれらの配向制御に関して研究を進めた。また、得られたマイクロマイクロ構造体からのレーザー発振特性を評価した。炭素架橋フェニレンビニレン(COPV)の自己組織化により形成するマイクロ結晶は、発光効率が高く、光を効率的に結晶内部に閉じ込めることから、WGMレーザー発振することを見出した。また、エネルギー供与性および受容性のCOPVを混合することで共結晶化を行い、結晶内部でのエネルギー移動とレーザー発振の関連性について明らかにした。また、金属配位性高分子と希土類悪態の複合による効率的なレーザー発振材料の創成、電子供与性ポリマーと受容性分子のバルクへテロ接合マイクロ球体によるホール輸送特性の向上を見出した。また、基板表面での自己組織化により、半球体の形成とアレイ化に成功した。発光性高分子の合成に関しては、不活性ガス雰囲気を使わなくても効率よく直接的アリール化重合が進行する合成技術を開発した。これにより、発光材料として機能する高分子半導体を大気下での実験操作で簡単に合成できる手法を提供できた。また、芳香族モノマーとジビニルモノマーの脱水素型クロスカップリング反応である直接的アルケニル化反応を効率化することにより、ポリアリーレンビニレン型高分子半導体の合成技術を確立した。発光性錯体に関しては、m-フェニレンリンカーで連結した柔軟な構造をもつ大環状ジピリン四量体および五量体とそのホウ素錯体を合成し、それらのもつ特異な構造を明らかにした。また、合成したホウ素錯体が高い発光性を示すことや、五量体では、二分子のジブチルアンモニウムを段階的に認識することを見いだした。基板表面での自己組織化による球体の形成と、親水疎水パターン表面を利用したマイクロ構造体の大面積アレイ化は、当初予想していた以上の結果を得ることができた。
リンパ球活性化調節機構におけるFOXP3遺伝子の機能に関する研究

制御性T細胞の分化決定に重要なマスター遺伝子であるFOXP3の発現とヒトリンパ球機能との関連性を明らかにするために、以下の研究を行った。1)野生型/変異ヒトFOXP3遺伝子をレトロウイルス発現ベクターに組み込み、パッケージング細胞株にトランスフェクションしてウイルス産生細胞を樹立した。その培養上清を用いて、FOXP3欠損患者末梢血由来T細胞株に遺伝子導入した。活性化抗原を含めたT細胞関連抗原の差異を検討したが、野生型または変異遺伝子を導入したT細胞間で明らかな相違を認めなかった。T細胞活性化後に各種サイトカイン産生能を検討したが、野生型または変異遺伝子導入細胞株間で明らかな相違を認めなかった。2)末梢血リンパ球を種々の刺激因子で活性化して、リンパ球活性化に伴うFOXP3発現の変化を解析した。まず、正常人末梢血リンパ球を各種刺激で活性化し、FOXP3発現量の変化をRT-PCR法・Western blot法にて解析した。刺激前にRAN・蛋白レベルで発現していたFOXP3は、各種刺激後でその発現量に明らかな変化は認められなかった。3)ヒトFOXP3塩基配列から予想される合成ペプチドでウサギを免疫しポリクロナール抗体を作製して、細胞質内FOXP3同定法の開発を進めた。細胞膜のpermialization/fixation後に細胞質内FOXP3を染色して、Flow cytometory(FCM)で解析した。FOXP3発現T細胞株では、細胞質内FOXP3をFCM法で確認できた。正常者末梢血リンパ球では発現が非常に少なく定量的な解析が困難であったため、さらに細胞膜処理条件を種々検討してFOXP3をある程度同定可能な条件を決定した。4)FCM法による細胞質内FOXP3簡易同定法を臨床応用して、各種自己免疫疾患患者末梢血リンパ球におけるFOXP3発現細胞の比率を比較検討した。しかし、疾患ごとに若干の差異は認めたものの、有意の結果は得られなかった。制御性T細胞の分化を決定するマスター遺伝子として重要な分子であるFOXP3の発現と特にヒトリンパ球機能との関連を多面的に解析することを目的として、以下の実験を行った。1)野生型および変異ヒトFOXP3遺伝子をレトロウイルス発現ベクター(pLXSN)に組み込み、パッケージング細胞株(PA317)にトランスフェクションして安定なウイルス産生細胞を樹立した。この産生細胞の培養上清中のウイルスを凍結保存(-70°C)し、その後の実験に使用した。このウイルスを、既にHVS(Herpesvirus saimiri)により樹立しているIPEX患者(FOXP3遺伝子変異を同定した患者)末梢血由来T細胞株に感染させ遺伝子導入した。遺伝子導入細胞をG418により選別し、細胞表面抗原の差異を検討した。活性化抗原を含めて調べたT細胞関連抗原のいずれでも野生型または変異遺伝子を導入したT細胞株間で明らかな相違は認められなかった。T細胞をPMA/ionomycinで刺激した後にサイトカイン産生能を検討したが、野生型または変異遺伝子導入細胞株間で明らかな相違は認められなかった。2)FOXP3の塩基配列から予想される合成ペプチドでウサギを免疫してポリクロナール抗体を作製して、細胞質内FOXP3同定の可能性を検討した。細胞表面抗原(CD4,CD8,CD19)を染色した後、細胞膜のpermialization/fixationをし、抗体を反応させて細胞質内FOXP3を染色(間接法)して、Flow cytometryで解析した。

FOXP3の発現を認めるT細胞株では、ある程度のFOXP3発現量が確認されたが、正常者末梢血リンパ球においては解析に十分な輝度を得ることができなかった。制御性T細胞の分化決定に重要なマスター遺伝子であるFOXP3の発現とヒトリンパ球機能との関連を多面的に解析することを目的として、平成16年度に引き続き以下の実験を行った。1)坑ヒトFOXP3抗体を作製して、細胞質内FOXP3同定法の開発を進めた。この抗体を用いてヒトFOXP3のリンパ球内局在を共焦点顕微鏡で調べ、細胞質内の存在を確認した。そこで、細胞表面抗原(CD4,CD8,CD19)の染色後に、細胞膜のpermialization/fixationをし、細胞質内FOXP3を染色(間接法)して、Flow cytometry (FCM)で解析した。FOXP3を発現するT細胞株では、細胞質内FOXP3をFCM法で確認することが可能であった。正常者末梢血リンパ球で同様の方法で細胞質内FOXP3の同定を試みたが、細胞質内の発現が非常に少なく定量的な解析は困難であった。そこで、細胞膜のpermialization/fixationの条件を種々に変化させてFCM法の可能性を検討した結果、試薬や反応時間の変更によってある程度のFOXP3を同定可能となった。2)上記FCM法による細胞質内FOXP3簡易同定法を臨床に応用して、各種自己免疫疾患(若年性特発性関節炎、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、シェーグレン症候群など)の患者末梢血リンパ球におけるFOXP3発現細胞の比率を比較検討した。細胞表面抗原(CD4,CD8,CD19,CD25,CD69)との二重染色でFOXP3陽性細胞の比率を各疾患ごとに比較した。しかし、疾患ごとに若干の差異は認めたが、有意の結果は得られなかった。免疫抑制剤治療中で非活動期の患者が多かった影響も推測され、さらに症例数を増やして病期による変化等も検討する必要があると考えられた。
ゲノム分化した野生イネの地理的分布ならびに生態調査に関する研究

栽培イネの遺伝資源である野生イネ,特に同じゲノムを有するAAゲノム種の多様性評価を行うとともに,現地での生態的特徴を明らかにすることで遺伝資源として栽培イネ改良に資する成果を蓄積した.アジア種である野生イネが最も高い多様性を示すこと,アメリカ種は進化の特殊性から母系においてアジア種と同様な高い多様性を示した.タイの野生イネは1集団でもアジア全域に匹敵する多様性を示し,ベトナムでは隣国と異なる雄性不稔型の栄養繁殖優占の野生イネが生息することがわかった.オーストラリアは極めて特殊であり,新種とみられる種の特徴付けを行った.2013年度はオーストラリアの野生イネの異なる生態型の適応戦略について調査を進めた.クイーンズランド州におけるアジア型多年生野生イネで構成されるClancyラグーン(CL),その上流にありアジア型多年生,オーストラリア型多年生,ならびにオーストラリア型一年生の混合集団の生息するPandanusラグーン(PL)の調査を行った.どのタイプの野生イネも深水耐性を示しながらも,103cm以上の深さには適応していなかった.そのため,アジアの多年生野生イネの特徴である浮きイネ性を示さなかった.これらを節間数ならびに草丈,水面下の桿長計測を行って検証した.雨期・乾期で水深が変動するPLは一定の水深まで水深が深くなるほど草丈が有意に高くなった(p<0.01).しかし,一年を通して安定して水供給のあるCLでは異なる傾向を示した.水深が浅い(1-15cm)場所に生息する個体の草丈は169.5±29.4cmであり,同じ遺伝子型であっても水深が16-43cmとなると草丈は144.2±18.5cmとなった.浅瀬において有意に草丈が高かったのは深水条件よりも適応性が高い条件であったと結論された(p<0.05).遺伝子型により一年生と多年生を識別して桿長を比較したところ,岸辺から水深最大で103cmまでに両生態型が均等に生息していた.異なる生態型間の交雑後代と推定されるヘテロ個体も確認された.このことはJpn1からO. meridionalis,ならびにJpn2への遺伝子流動があったためであろう.2種類の多年生系統の水深反応を比較すると,アジア型のJpn1は節数が増加することで深水に対応している傾向がみられた.これは核型が異なり,独立した進化経路をたどったことによる適応性の違いと推定される.今後は,これらの種特異的な環境適応性や形質を支配する遺伝的特性の違いに関して研究をすすめていくことで,アジアにない有用遺伝子源として利用することが期待されるオーストラリアの野生イネ分布調査では西オーストラリアの分布を確認した.ダーウィンからクヌララまでの幹線道路沿いでは野生イネの分布をみず,クヌララ近郊での調査において枯死した一年生個体ならびに多年生オーストラリエンシスの分布を確認した.しかし,多年生個体の生息がみられなかった.これまで得られた標本は筑波,キューガーデンなどの主要なハーバリウムに寄託する作業をブリスベンハーバリウムのブライアン・サイモンに依頼した.生体での標本はクイーンズランド大学St. Luciaのロバート・ヘンリー教授の温室にて維持している.これらの標本から得られた種子からは,新種候補であるJpn2型の種子サイズは環境変異でなく明らかに種子の大型化が生じていることを確認した.葯が短く,鋸歯密度が高いという一年生,O. meridionalisの特徴を維持しているため,この系統から多年生に分化した仮説のもと検証を進めている.交雑稔性調査を継続しており,この結果も花粉稔性の低下ならびに種子結実不稔性という結果から確認された.クイーンズランドにおける多年生ならびに一年生野生種の調査をすすめ,同所的に生息しているマリーバのパンダナスラグーンの集団を季節毎に採取して遺伝構成の追跡を行った.同ラグーンの個体は葉緑体INDELマーカー,核SSRマーカーの組み合わせ,ならびに形態(葯長,鋸歯密度)の計測を行った.DNA解析からは,交雑種候補が見出された.クイーンズランド州の種間交雑種はこれまでLakelandならびにMareeba,ならびに西側海岸線において観察された.両集団での詳細な調査を行った.鋸歯密度ならびに葯長との調査から,中間方と推定される系統がみだされ,Mareebaの集団では分子マーカーからも一年生ならびに多年生のヘテロ型がみだされた.これらは種間交雑した後代系統と判断された.Lakelandについては,形質調査が終了し,材料を取得したため分子マーカーでの追証を基盤研究終了後に行うこととなった.クーインズランド大学との共同研究は順調に進展し,論文としてその成果を公表とした.さらに,現在も投稿している.共同研究の研究成果は2015年11月にクーインズランド州にて行われたTropAgrシンポジウムにてポスター発表を行うとともに日本育種学会市民公開講座事業においても講演した.タイでの野生イネ開発・保全は順調にすすんでいる.西オーストラリアにおける調査では多年生系統は見出されず,乾期に枯死した一年生のみ確認することができた.雨季に再調査を行うことでサンプル入手が可能となろう.また,PNGとの連絡調整がついたものの,同国に研究者を派遣することができなかった.

この点がおおむね良好とした点である栽培イネの遺伝資源である野生イネ,特に同じゲノムを有するAAゲノム種の多様性評価を行うとともに,現地での生態的特徴を明らかにすることで遺伝資源として栽培イネ改良に資する成果を蓄積した.アジア種である野生イネが最も高い多様性を示すこと,アメリカ種は進化の特殊性から母系においてアジア種と同様な高い多様性を示した.タイの野生イネは1集団でもアジア全域に匹敵する多様性を示し,ベトナムでは隣国と異なる雄性不稔型の栄養繁殖優占の野生イネが生息することがわかった.オーストラリアは極めて特殊であり,新種とみられる種の特徴付けを行った.おおむね良好である.調査地域をまわり,現地の状況を明らかにした価値は高いものがあり,今後の調査地点を絞るために有効であった.さらに,開発の現状から,西オーストラリア州での野生種の保護の必要性も検討すべきであることがわかった.一方,クイーンズランド州では生態調査と平行してゲノムデータの解析が順調に進んでおり各種マーカーが応用可能となっている.27年度が最終年度であるため、記入しない。作物育種学オーストラリアの多年生野生種のうち,アジア型でないO.meridionalisと類似の細胞質ならびに核ゲノムを有する系統が新種であることの分類学的な結論をつけるために標本を分類学者に鑑定してもらう必要がある.これまで標本を各種ハーバリウムに寄託したため,オーストラリアの共同研究者と密に連携して達成する.採取し,生態調査を行った野生イネについては,ゲノム情報を次世代シークエンサーにより取得した.そこから新たに種特異的なDNA情報を抽出して検証を行う事ができた.得られた遺伝情報から,アジア種との比較を行った.アジア型とされた多年生野生イネについては,オーストラリア固有種と同じ葉緑体ならびにミトコンドリアゲノムを有していることが明らかになった.しかし,核情報はアジアと同じであり,交雑後代からも種としての独自性はみられなかった.一方,多年生野生イネにおいて新種とみられる集団を特定し,ゲノム情報の解析を進めることができた.現地機関と共同して調査が進展し,2013年度は現地の共同調査も行うことができた.これまでの情報はRiceに投稿し採択された.よっておおむね順調に進展しているとした.27年度が最終年度であるため、記入しない。石川隆二担当分では792円であり,翌年度との合算により海外調査を充実できるため.一谷,中村らは西オーストラリアでの調査などの状況が確定しておらず,現地情報を得てから再計画して2015年に調査を行うことが計画上妥当であると判断したためである.27年度が最終年度であるため、記入しない。異なる種がオーストラリアの特殊な生態系において適応する戦略について調査し,多年生型野生イネの独自な進化経路について明らかにしたい.昨年調査したCL,PLラグーンについては,そこから採取された個体のDNA情報について遺伝子型解析をすすめて集団構造解析を行う.このことによって,異なる進化を行った種の環境適応戦略についてまとめる.これまで他のラグーンにおいても種間での遺伝子流動が起こったことを推定するサイトがある.そのサイトにおける遺伝子型調査を行うことにより実証する.
日英の低・未利用地の再生による持続可能な地域・都市の再生と創造

英国北西部セント・ヘレンズでは、低・未利用地における環境再生を個別の事例と全体計画、その中間にあたる複数の事例を集めたフォレスト・パーク計画により行われ、個々の事例と全体的な景観戦略の双方に影響を与え、重要な役割を果たしている。高野山東側集落では、主要道路へ向かって縮小する傾向が見られた。人口減少の中、住民のコミュニケーションが取りやすく利便性に配慮した集落形態であることが伺える。1.日本の事例今年度調査を行った高野山東側周辺集落である東又・富貴においては、人口減少・高齢化・過疎化の進行に伴い集落の一部において低・未利用地の進行が見られる。かつて存在した住居や田畑は減少傾向にあり、そうした跡地に槙などが植えられた樹林地や、管理不足となった荒地が増加傾向にあることがわかった。かつては山のふもとから頂上付近までを畑として開拓した東又においては、1963年以降に農作地の縮小が始まり、現在は現存する民家周辺に見られるのみとなった。1970年代以降に人口の転出が始まり、住宅や畑の跡地が樹林地となり、斜面地に点在する民家への見通しが確保できなくなったことから、集落内でのコミュニケーションにも影響を与えたことが考えられる。2.イギリスの事例リバプール・マンチェスター圏における両市の中間に位置し、環境再生の取り組みでの歴史があり、低・未利用地に関する方針を打ち出し、活用を進めているセントヘレンズ町の調査を行った。1970年代から広大な林地を創出し、「荒廃地から林地」事業では約300haにもおよぶ低・未利用地の造成を行い、林地や公園緑地を創出している。近年では低・未利用地における環境創出をはじめ、再生を促進するための全体的な方針にあたる景観計画・戦略「セント・ヘレンズ景観マスタープラン」(2003)を策定している。結果から、セント・ヘレンズでは、低・未利用地の環境創出により良好な環境において再開発を行うことが可能となり、環境向上のみでなく経済的にもメリットがあると捉えて低・未利用地の環境創出やそれらを取り入れた景観計画・戦略を推進している。景観計画・戦略からは、開発事業の半数、事業・工業用地の8割が良好な環境の立地を選定していることが伺え、主要道路付近には農用地や低・未利用地の環境創出が行われた公共緑地が存在することが地区の特徴として挙げられる。フォレスト・パークの事例では、既存の林地の2倍以上に植林を増やし、連続した林地を形成すべく地域の3割近くを林地にする計画・予定が提案され、新たな植林の促進が主な取り組みであることがわかった。1.日本の事例高野山東側周辺集落である樫原・子安は、急な斜面地に立地しており、人口減少・高齢化・過疎化の進行により、樫原は既に住民不在であるため集落跡景観となっており、子安は超限界集落の状態にあり、集落の一部で低・未利用地の進行が見られる。これまでに調査を行った東又・富貴と同じように、かつて存在した住居や田畑は減少傾向にあり、それらの跡地に槙などが植えられた樹林地や、管理不足となった荒地が増加傾向にあることがわかった。2.イギリスの事例チェシャー県ヴェール・ロイヤル区は、岩塩の掘削が行われてきた町で、農村や運河沿いの工業景観や産業遺産をはじめ、多様な景観を有する。当区は、イギリスで、低・未利用地を含む区域全体について、近年勧められている景観特性評価(Landscape Character Assessment)をとりまとめ、都市計画マスタープランの付加的ガイダンスとして位置づけを行うなど、イギリス北西部の中でも、進んだ取り組みが見られる。また、昨年行ったセント・ヘレンズの事例について検討を加えた。特に、フォレスト・パーク計画は、景観戦略と個々の事例との中間に位置し、複数の先進的な事例をまとめて、隣接する事例との関連性を考慮した整備が進められている。全体的な景観戦略との関連により、まとまりのある林地を形成してその特徴を生かすことを目的とし、新たな植林の促進が主な取り組み内容となっている。個々の事例への影響としては、他の公共緑地や周辺の林地とのつながりを増やすため、一旦整備が完了した公共緑地についても見直しが行われ、新たな植林が計画されている。また、マージー・フォレストとのパートナーシップにより、セントヘレンズ区の玄関口において林地景観を創出するなど、行政区域全体に関わる景観戦略の実現にも影響を与えうる大都市圏を視野に入れた取り組みが行われている。従って、こうした中間的な取り組みが低・未利用地における環境再生を推進するにあたり、個々の取り組みと全体的な景観戦略の双方に影響を与え、重要な役割を果たしていることが伺える。高野山東側集落においては、主要道路が走る中心部分へ向かって集落は縮小し、特に規模の小さな島のような離れがある場合は、そこから縮小する傾向が見られた。民家の跡地の管理方法は、高野槙を植えることが最も多く、地域の生業による特徴が表れる結果となった。また、主要道路の周辺に荒れ地、平地が多く存在する傾向があるが、見通しの確保や集落景観への影響も大きいことから植林は行われておらず暫定的な利用となっている。

このことから、跡地管理の方法を考えることは集落の維持管理にもつながるため、重要な課題の一つと考える。行事については、集落の人々の年齢が、高齢に近づいた頃と考えられる約2030年前、急激に衰退していったことがわかった。また、縮小に伴い集落のまわりにある民家の住民が中心にある空き家へと移り住むケースが見られ、人口が減少する中でも、住民同士のコミュニケーションが取りやすく主要道路にも近い利便性に配慮した集落形態を形成していることが考えられる。イギリスでは、大都市圏を越えた地方圏のまとまりで経済面・社会面・環境面の向上に貢献しうる低未利用地を含む緑のインフラづくりが進められている。全体計画を策定し実行する部署がないため、北西部では関連自治体による公的機関と民間企業が共同で定期的に会合を開いて情報交換を行うとともに、北西部を5つの準地域(Sub-region)に分けて検討を進め、ランカシャーが先行的に戦略案をとりまとめたところである。
サルコペニアにおけるオートファジー機能不全の包括的解明

骨格筋は様々な因子により調節を受け、オートファジー機能不全によりサルコペニア(加齢性筋減弱症)が促進される可能性が高い(Sakuma K, et al., p62/SQSTM1but not LC3 is accumulated in sarcopenic muscle of mice. Journal of Cachexia, Sarcopenia, and Muscle. 2016)。機能不全となったミトコンドリアをリサイクルする機構をマイトファジー(オートファジーの1種)という。サルコペニアのメカニズムにこのマイトファジーが関与する可能性がある。本研究では、加齢筋におけるマイトファジー調節物質の変化を調べた。実験動物には若齢(3ヶ月齢)と高齢(24ヶ月齢)のC57Black/6J雄マウスを用い、加齢筋におけるParkinの変化を調べた。筋凍結横断切片(8μm)を用いた蛍光免疫染色から、加齢筋におけるParkin免疫活性の亢進が認められ、オートファジー関連物質であるp62/SQSTM1の発現箇所とかなり類似していた。しかしながらParkinを発現する細胞に、別のオートファジー関連物質(ULK1)の活性は認められなかった。また同様なオートファジー機能不全をもたらす除神経後の筋萎縮モデルにおいても、ほぼ同じ細胞にParkin、p62/SQSTM1の発現亢進が認められた。以上のことから、サルコペニアの筋ではマイトファジーの有意な変化が認められ、除神経による筋萎縮モデルがサルコペニアの短期間モデルとなる可能性がある。リアルタイムPCR解析(mRNAの定量)、細胞分画やミトコンドリア分画のサンプルを用いたタンパク質の生化学的解析についてはまだ実行できていないが、最終年度に必ず解析する予定である。初年度に加齢筋におけるオートファジー調節物質(AMPK2、SIRT1)の変化を、蛍光免疫組織染色で確認した。またミトコンドリアの分解機構(マイトファジー)の関連物質であるParkinについても、オートファジー関連物質(p62/SQSTM1)が活性亢進している筋細胞に発現が認められた。細胞分画やミトコンドリア分画のサンプルを用いたタンパク質の生化学的解析を中心に最終年度は実験を進めて行く予定である。本研究では、加齢筋におけるマクロオートファジー調節物質の変化を蛍光免疫組織染色を用いて調べた。実験動物には若齢(3ヶ月齢)と高齢(24ヶ月齢)のC57Black/6J雄マウスを用い、加齢筋におけるAMPK2およびSIRT1の変化を調べた。筋凍結横断切片(8μm)を用いた蛍光免疫染色から、加齢筋におけるAMPK2免疫活性亢進が認められたが、SIRT1活性には加齢にともなう明らかな変化が認められなかった。AMPK2の活性亢進の場所は複数の筋細胞内に認められたが、オートファジー関連物質(p62/SQSTM1)の発現場所とはあまり一致していなかった。以上のことからサルコペニアによるオートファジー機能不全は、その上流物質であるAMPK2やSIRT1には制御を受けていない可能性がある。分画したタンパク質を用いたWestern blot法により、さらなる検証を行う予定である。またミトコンドリアの分解機構(マイトファジー)の関連物質であるp53についても、徐々に解析を進める予定である。初年度の目標であった加齢筋におけるオートファジー調節物質(AMPK2、SIRT1)の変化を、蛍光免疫組織染色で確認した。リアルタイムPCR解析(mRNAの定量)や細胞分画サンプルを用いたタンパク質の生化学的解析についてはまだ実行できてないが、順次解析していく予定である。

以上のことから、サルコペニアの筋ではマイトファジーの有意な変化が認められ、除神経による筋萎縮モデルがサルコペニアの短期間モデルとなる可能性がある。リアルタイムPCR解析(mRNAの定量)、細胞分画やミトコンドリア分画のサンプルを用いたタンパク質の生化学的解析についてはまだ実行できていないが、最終年度に必ず解析する予定である。初年度の目標であった加齢筋におけるオートファジー調節物質(AMPK2、SIRT1)の変化を、蛍光免疫組織染色で確認した。今年度は、オートファジー調節物質の加齢筋におけるmRNAの発現量やタンパク発現量(細胞分画サンプル)の生化学的解析について調べる予定である。またミトコンドリアの分解機構(マイトファジー)の関連物質であるp53についても、徐々に解析を進める予定である。初年度に加齢筋におけるオートファジー調節物質(AMPK2、SIRT1)の変化を、蛍光免疫組織染色で確認した。またミトコンドリアの分解機構(マイトファジー)の関連物質であるParkinについても、オートファジー関連物質(p62/SQSTM1)が活性亢進している筋細胞に発現が認められた。細胞分画やミトコンドリア分画のサンプルを用いたタンパク質の生化学的解析を中心に最終年度は実験を進めて行く予定である。(理由)初年度に予定していたmRNAの発現量解析と細胞分画を用いたタンパク質解析ができなかったため、当該助成金が生じた。(使用計画)初年度で得られた研究成果を、日本サルコペニアフレイル学会と日本体力医学会で発表予定である。したがって研究費の2割程度は、この旅費にあてる。今年度は、加齢筋におけるオートファジー調節物質のmRNAの発現量解析と細胞分画を用いたタンパク質解析を行なう予定である。研究費の5割程度は、この検証のたの一次抗体、二次抗体、生化学実験、蛍光免疫組織化学実験のための消耗品、実験動物の購入などにあてる予定である。残りの研究費は、本研究を遂行するための学生アルバイト、研究成果公開促進(原著論文、総説、著書)のために別刷り代金(Online掲載料金)に使用する予定である。(理由)予定していたmRNAの発現量解析と細胞分画を用いたタンパク質解析ができなかったため、当該助成金が生じた。(使用計画)得られた研究成果を、日本サルコペニアフレイル学会と日本体力医学会で発表予定である。
コンピュータグラフィックスによる複雑な鉱物

本研究はコンピュータグラフィックスの手法を用いて、複雑な鉱物および無桟物質の結晶構造原理を研究するのがその目的である。構造原理の中でも、特に重要なcell twinning即ち、単位胞レベルの双晶桟構をその主たる研究対象とする所にこの研究の特色がある。研究方法としては、この目的に適合したプログラムの開発と、難解な構造を持つ鉱物として代表的なプラジオナイトの構造桟構の解明が主たる具体的な研究目標である。成果を以下に要約する。1.パソコングラフィックス用のプログラムとしてCRYSTAL18を作成した。このプログラムは平野正弘によりn88BASICで書かれたプログラムCRYSTALを基本としたMS-DUS版で、桟能的に次のように大きな改良を行ったものである。まず、任意の計算過程で入力パラメーターの変更、訂正を可能にした。また、回転用の異なる4つの画像をどうじディスプレイ上に表示出来る。さらに、結晶構造を任意の薄い層に切断して表示することが可能である。以上の主な改良桟能にく加えて、プログラム全体として非常に完成°Cの高いものにされているため、初心者でも容易に使用出来る。2.プラジオナイトグループの結晶化学・プラジオナイト,Pb_5Sb_8S_<17>がPbS型の構造を持つスラブが{313}を接合面とし、2回回転操作で双晶したcelltwinであることを確立し、その結晶軸とサブセルの軸とのrationalな方位関係を導くことに成功した。更にこのグループのフィレッパイト、Pb_3Sb_8S┣D217も全く同様な原理によるcell twinであることが判明した。前者と異る点は原理的にはスラブの幅のみである。これらの結果に基き、プラジオナイトグループの結晶化学的原理を解明することに成功した。この成功は鉱物、無桟物質の構造原理としての単位胞レベルの双晶の重要性に対する認識を一層高めたものといえる。本研究はコンピュータグラフィックの手法を用い,複雑な鉱物および無機物質の結晶構造の原理を研究するのがその目的である.構造原理の中でも特に重要なcell twinning,即ち単位胞レベルの双晶機構をその主たる研究対象とする所に研究の特色がある.研究方法としては此の目的に適したグラフィックスプログラムの改良が必要であるため,本研究ではプログラムの改良とcell twinningの研究の2つの部分より成る.それぞれについての本年度の成果は次のように要約される.1.プログラムCRYSTAL(PC/M-86)をMS-DOS上で動作するよう改良し,同時に入力パラメーターのストア形式を改め,その呼出し,再使用の方法を機能的にするときにパラメーターの設定変更を可能にした.また,イメジプリンターPC-PR8019とCPUとの基本的なシステムを完成し,同プリンターによるハードコピーのテストを繰り返し,良好な成果を得た.2.プラジオナイトPb_5Sb_8S_<17>はa=13.49〓, b=11.87〓, c=19.98〓, β=107.2°,空間群C_2/cの単斜晶系に属する代表的な硫塩鉱物の一つで,ガレナPbS型の原子配列をもったスラブより成る.そのスラブは(001)に平行で,相互に[010]方向の2回回転操作で関係ずけられている.即ちcell twinningで結晶構造が構成されているが,このスラブの境界はPbS型構造のirrationalな面に相当すると報告されていた.

今回,グラフィクスの手法を用いて此の結晶構造を種々の方向より詳細に検討した結果, (1)スラブの構造はPbS型よりむしろSnS型に近いものであり,また(2)境界面はPbS型構造の{323}のrational/s指数の面に相当することが明確にされた.この発見はcell twinningによる結晶構造論展開に対して基本的に重要な貢献とみなすことが出来る.本年度は基本プログラムCRYSTALを改良したグラフィックス用のプログラムを更に完成度の高いものにリファインすること、およびコンピュータグラフィックスを応用して複雑な鉱物の結晶構造解明の例としてのプラジオナイトグループの結晶化学的性格を明らかにすることを研究目標とした。その成果は以下の通りである。1.プログラムについては、リアルタイムの画像廻転という命題に対するパソコンレベルでの解として、ディスプレイ画面上に回転角を異にする4画面を分割して同時表示する方式を可能にした。個々の画像が小さくなる難があるが、回転による効果を全体的に把握するには便利であることが確認された。次に、与えられた一つの構造を薄い層に切断して表示することを可能にした。これは複雑な構造を理解するのに極めて重要な機構である。また、PC-PR801によるA4版のプリントを可能にするプログラムを作成した。以上の機能に加えて、プログラム全体を使用し易い形に改良した最終的プログラムはCRYSTAL18と命名された。2.プラジオナイト、Pb_5Sb_8S_<17>の問題。前年度において、この硫塩がPbS型構造の{313}面を双晶面とするcell twinningであることが判明したが、本年度はグラフィックスによる更に詳細な検討の結果、プラジオナイトの結晶軸と、PbS型サブセルの軸との方位関係が完全に明らかにされ、それらの間の変換マトリックスを導くことに成功した。更に、検討をこのグループのメンバーであるフィレッパイトに押し進め、この鉱物もまた、プラジオナイトと全く同じ機構で結晶構造が作られていることが確認された。以上の結果を総合して、このグループの結晶構造を構成しているcell twinningの機構が完全に明らかにされた。この成功は、われわれの開発したコンピュータグラフィックスの手法が極めて有効であることを立証するものに外ならない。
クロザピンの薬効・副作用に関わる標的分子の探索と機能解析-基礎と臨床の連携研究-

クロザピンによる効果と副作用を評価するための検体作製と解析条件を最適化するための調製方法の検討を実施した。動物個体におけるクロザピンの影響を検討するために、610週齢のマウス(C57BL/6J、Jcl:ICR)に統合失調症様行動障害を惹起するフェンシクリジン(PCP)10 mg/kgまたは生理食塩液(SAL)を14日間皮下投与し、クロザピン(CLZ)10 mg/kgまたは溶媒(Veh)を経口投与した。マウスより脳(前頭前皮質、側坐核、線条体、扁桃体、海馬)および末梢組織・臓器(血液、脂肪、肝臓、膵臓、胆嚢、心臓、膵臓)を採取し、検体とした。前頭前皮質、側坐核、線条体、扁桃体、海馬よりDNA、total RNA、タンパク質を抽出・精製し、前頭前皮質のtotal RNAはDNAマイクロアレイ解析、タンパク質は質量分析により網羅的発現解析を実施した。DNAマイクロアレイ解析において、PCP投与マウスの前頭前皮質では中枢神経機能や遺伝子発現・エピジェネティック制御に関連する遺伝子の発現変化が認められた。質量分析において、PCP/Veh群、SAL/CLZ 10 mg群、およびPCP/CLZ 10mg群では、それぞれ292、312、および335のタンパク質について有意な発現変化が認められ、シナプス小胞サイクル、グルタミン酸作動性シナプス、神経変性疾患、代謝経路)などのパスウェイについて有意な関連が認められた。今後、網羅的発現解析結果のデータマイニングを行い、リアルタイムPCR・ウエスタンブロッティングによる発現変化の再確認を行う予定である。一方、クロザピン結合ビーズの調製を実施し、精製時に遊離するN-ヒドロキシスクシンイミドを高速液体クロマトグラフィーにより定量した。今後、脳ライセートを磁気ビーズと反応させて結合タンパク質を同定する予定である。質量分析の最適化のため、タンパク質抽出、精製、酵素消化、クリーンアップ、分析条件の検討を検体種毎に実施する必要があり、条件検討に時間を要していた。標的臓器である脳組織については二段階消化法、限外濾過膜によるタンパク質精製を行うことにより定性・定量分析が可能となった。確立したサンプル抽出・精製条件を用いて、クロザピン(CLZ)処理した検体作製とその解析を実施していく。CLZ結合ビーズ調製においては高速液体クロマトグラフィーによるビーズ結合状態の確認が可能となり、ライセートを用いたCLZ結合タンパク質の同定を検討している。ビーズの安定性が悪くライセート中のタンパク質を補足できない場合には、CLZ誘導体によるビーズ調製を実施するなどの対応が必要となる。効率的な調製ができない場合には、現在進めているマイクロアレイや質量分析により、クロザピンにより影響を受ける遺伝子・分子群を同定する。1.クロザピン結合ビーズ調製:引き続きクロザピンまたはその誘導体を磁性ビーズに結合させて回収し、その収量を液体クロマトグラフィーにより確認する。細胞株、動物組織のライセートを調整して反応させ、質量分析により結合分子を同定する。2.クロザピンにより効果あるいは副作用を呈する用量において、遺伝子・タンパク質発現変化を網羅的に解析し、検体横断的に共通・特異的な候補分子を同定する。3.クロザピンが影響を及ぼす分子ネットワークをin silico解析により明らかにし、統合失調症の分子病態解明と診断・治療法の開発に繋がりうる知見をまとめる。クロザピンの代表的な副作用である血液毒性に関わる分子を同定するために、ヒト前骨髄性白血病細胞(HL-60細胞)にクロザピンと対照薬を添加して解析検体の調製条件を検討した。HL-60細胞にATRA(1 uM)を添加して120時間培養することで顆粒球様細胞へ分化誘導し、クロザピン(1100 uM)、オランザピン(1100 uM)、ドキソルビシン(0.2 uM)を添加して48、120時間後の細胞生存率に与える影響(副作用である血液毒性)を評価した。動物個体におけるクロザピンの影響を検討するために、610週齢のマウス(C57BL/6J、Jcl:ICR)よりクロザピンの効果発現の標的部位である脳を採取し、DNA、total RNA、タンパク質を抽出して網羅的解析に適用可能なサンプルの調製条件を検討した。クロザピン(50、100 uM)、ドキソルビシン(0.2 uM)は薬物非暴露群と比較して、細胞生存率を有意に低下させたが、オランザピンでは細胞生存率の低下は認められなかった。クロザピンにより細胞毒性やその他の副作用特性を示す濃度を確定して、その条件下において影響を及ぼす分子を同定していく。マウス脳検体よりAllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit(キアゲン社)にてDNA、total RNA、タンパク質を、超音波破砕法にてタンパク質を抽出した。DNAとtotal RNAはシーケンシングやマイクロアレイ解析に適応可能であることを確認した。タンパク質はキットと超音波破砕法との間で質量分析により同定されるタンパク質プロファイルに差はないことを確認した。今後、クロザピン結合ビーズの調製とクロザピン添加・投与による細胞・組織への分子遺伝学的影響について解析を行う。質量分析の最適化のため、タンパク質抽出、精製、酵素消化、クリーンアップ、分析条件の検討を検体種毎に実施する必要があり、条件検討に時間を要している。

標的臓器である脳組織については二段階消化法により定性・定量分析が可能であること、培養細胞については界面活性剤の比較検討によりの質量分析が可能であることを確認し、確立した条件にてクロザピン処理した検体作製とその解析を実施していく。クロザピン結合ビーズ調製においては液体クロマトグラフィーによる結合状態の確認ができず、グラジエントの条件を検討している。クロザピンに直接結合ができない場合に誘導体からの調製を確認する必要がある。効率的な調製ができない場合には、当初の代替計画のようにマイクロアレイや質量分析により、クロザピンにより影響を受ける遺伝子・分子群を同定する。クロザピンによる効果と副作用を評価するための検体作製と解析条件を最適化するための調製方法の検討を実施した。動物個体におけるクロザピンの影響を検討するために、610週齢のマウス(C57BL/6J、Jcl:ICR)に統合失調症様行動障害を惹起するフェンシクリジン(PCP)10 mg/kgまたは生理食塩液(SAL)を14日間皮下投与し、クロザピン(CLZ)10 mg/kgまたは溶媒(Veh)を経口投与した。マウスより脳(前頭前皮質、側坐核、線条体、扁桃体、海馬)および末梢組織・臓器(血液、脂肪、肝臓、膵臓、胆嚢、心臓、膵臓)を採取し、検体とした。前頭前皮質、側坐核、線条体、扁桃体、海馬よりDNA、total RNA、タンパク質を抽出・精製し、前頭前皮質のtotal RNAはDNAマイクロアレイ解析、タンパク質は質量分析により網羅的発現解析を実施した。DNAマイクロアレイ解析において、PCP投与マウスの前頭前皮質では中枢神経機能や遺伝子発現・エピジェネティック制御に関連する遺伝子の発現変化が認められた。質量分析において、PCP/Veh群、SAL/CLZ 10 mg群、およびPCP/CLZ 10mg群では、それぞれ292、312、および335のタンパク質について有意な発現変化が認められ、シナプス小胞サイクル、グルタミン酸作動性シナプス、神経変性疾患、代謝経路)などのパスウェイについて有意な関連が認められた。今後、網羅的発現解析結果のデータマイニングを行い、リアルタイムPCR・ウエスタンブロッティングによる発現変化の再確認を行う予定である。一方、クロザピン結合ビーズの調製を実施し、精製時に遊離するN-ヒドロキシスクシンイミドを高速液体クロマトグラフィーにより定量した。今後、脳ライセートを磁気ビーズと反応させて結合タンパク質を同定する予定である。質量分析の最適化のため、タンパク質抽出、精製、酵素消化、クリーンアップ、分析条件の検討を検体種毎に実施する必要があり、条件検討に時間を要していた。標的臓器である脳組織については二段階消化法、限外濾過膜によるタンパク質精製を行うことにより定性・定量分析が可能となった。確立したサンプル抽出・精製条件を用いて、クロザピン(CLZ)処理した検体作製とその解析を実施していく。CLZ結合ビーズ調製においては高速液体クロマトグラフィーによるビーズ結合状態の確認が可能となり、ライセートを用いたCLZ結合タンパク質の同定を検討している。ビーズの安定性が悪くライセート中のタンパク質を補足できない場合には、CLZ誘導体によるビーズ調製を実施するなどの対応が必要となる。