hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞内外で活性を切り替える機能性核酸の創製

我々はr(GGAGGAGGAGG)配列のRNA、R11がカリウムイオン(K+)の無い水溶液中では伸びた立体構造をとること、一方で細胞内環境に相当するK+濃度下においては、K+を中心に配位したコンパクトな四重鎖構造を形成することを見出している。我々はR11のこの特徴に着目し、ハンマーヘッド型リボザイムを2つのサブユニットに分割して、R11の両端にそれぞれを連結させた四重鎖ハンマーヘッド型リボザイム(QHR)を設計した。QHRはK+存在下で活性が高く、K+非存在下で活性が低い。これはK+非存在下ではR11部分が伸びた構造となるためにサブユニット間が離ればなれになって活性を十分に発揮できず、一方K+存在下ではR11の四重鎖構造の形成に伴い、サブユニット同士が接近して活性部位の構造が再形成されることで、活性が復活したのだと考えられる。平成28年度はK+による活性のスイッチング機構を、HIVの転写促進因子Tatタンパク質と高い親和性で結合するTatアプタマー分子に適用させることを試みた。我々は過去にTatアプタマーの立体構造とTatとの相互作用部位を明らかにしており、この情報を基にTatアプタマーを2つのサブユニットに分割し、R11の両端にそれぞれのサブユニットを連結させた、四重鎖Tat捕捉アプタマー(QTAp)を設計した。蛍光標識したTat由来ペプチドを用いた実験により、このQTApは100 mMナトリウムイオン条件下ではTat捕捉活性を発揮せず、100 mM K+条件下でTatを捕捉することを見出した。細胞の内側と外側は大きく異なる環境であり、細胞外におけるカリウムイオン(K+)濃度は約5 mMであるのに対し、細胞内では約100 mMである。我々の創製したQHRおよびQTApはK+を感知して、その機能を細胞の内外で自律的にスイッチすることが期待される。これを検証すべく、生細胞内に導入した核酸のNMRスペクトルを検出する方法論の開発を進めた。その結果、ヒト生細胞内の核酸のNMR信号を捉えることに初めて成功した。28年度が最終年度であるため、記入しない。r(GGAGGAGGAGG)配列をもつRNA (R11)は、細胞内環境に相当するカリウムイオン(K+)濃度下でコンパクトな四重鎖構造を形成する。一方、K+が無い場合は特定の構造を形成しない。この特徴に基づき、我々はハンマーヘッド型リボザイムの配列の一部をR11で置換した四重鎖ハンマーヘッド型リボザイム(QHR)を設計した。このリボザイムの活性部位はR11によって2つのサブユニットに分断されているため、K+非存在下ではサブユニット間が離れているために活性を発揮できず、一方K+存在下ではR11の四重鎖構造の形成に伴い、サブユニット同士が接近して活性部位の構造が再形成されて、活性が復活することを期待した。実際にK+存在下と非存在下における基質の切断量を比較すると、K+存在下は非存在下と比べて4倍程RNAの切断活性が向上した。しかしながらQHRはK+非存在下においても残存活性を示し、その抑制が課題であった。当該年度では、K+非存在下におけるQHRの意図しない活性を抑制する方法論を開発した。QHRに対する相補鎖RNA (CS)および、自身も分子内四重鎖を形成することが可能な相補鎖DNA (QCS)を導入することで、K+非存在下における意図しない酵素活性を抑制させ、酵素活性がオフからオンにスイッチする能力を向上させることに成功した。細胞外におけるK+濃度は約5 mMであるのに対し、細胞内では約100 mMである。K+を感知して自らの活性を制御できる機能性核酸は、細胞の内と外で活性を切り替え可能な分子ツールと成り得、医薬品やドラッグデリバリーシステムなどへの応用が期待できる。

細胞の内側と外側は大きく異なる環境であり、細胞外におけるカリウムイオン(K+)濃度は約5 mMであるのに対し、細胞内では約100 mMである。我々の創製したQHRおよびQTApはK+を感知して、その機能を細胞の内外で自律的にスイッチすることが期待される。これを検証すべく、生細胞内に導入した核酸のNMRスペクトルを検出する方法論の開発を進めた。その結果、ヒト生細胞内の核酸のNMR信号を捉えることに初めて成功した。平成27年度に引き続き、QTApの創製を目指す。蛍光標識したTatあるいはQTApの蛍光の観察によって、アプタマー活性がK+濃度によってスイッチされることを既に見出している。このスイッチングが、我々のデザイン通りの構造変化によって引き起こされているのかどうかを、NMRスペクトルによる構造研究によって明らかにする。また生細胞内でのQHR及びQTApの活性を検証する方法を確立する。平成27年度では、細胞への試料の導入法としてストレプトリジンOの孔形成を利用する方法を検討し、条件の最適化を行ってきた。今年度はこの手法に加えて、膜透過性ペプチドの配列を有するペプチド核酸とQHRまたはQTApを組み合わせる手法を検討する。高効率にQHRあるいはQTApを細胞へ導入する手法を確立した後、in cell NMR法によって細胞内での構造を解析し、意図した構造によって活性を発揮しているのかどうかを調べる。28年度が最終年度であるため、記入しない。
メソポーラス材料を利用した環境センサーの開発

本年度は、環境センサー作製の基本となる、光導波路型センサーのセンシング方式の確立に重点を置いて研究を行った。第一に、溶融塩を用いたガラス基板表面へのイオン交換より、ガラス基板に対し、シングルモード型光導波路の作製を行った。第二に、シングルモード型光導波路層内に、レーザー光等で誘起されるTE・TM波を、TE波とTM波に分離するため、RFマグネトロンスパッタ装置により、イオン交換で作製したシングルモード型光導波路上に、この光導波路よりも屈折率の大きな、TiO_2の薄膜光導波路を構築した。この導波路の構築及び、作製条件の最適化を試み、TE波のみ薄膜光導波路内に誘起し、構築区間のみ、TE波、TM波を分離させた。第三に、このイオン交換導波路上に構築した薄膜導波路の上に、多孔質薄膜であるメソポーラス薄膜を作製し、センシング用素子を作製した。このメソポーラス薄膜が被測定ガスに暴露された場合、被測定ガスにより、メソポーラス薄膜の屈折率がわずかに変化する。この変化により、TiO_2薄膜導波路内を伝搬するTE波の位相が変化する。この変化により、暴露前後で、TE, TM波に位相差が生じ、被測定ガスを検出可能となる。第四に、前述したTE, TM波の位相差を測定するため、レーザー光を利用した測定系の構築を行った。TE, TM波の位相差は、導波路からの出射光の偏光状態に現れるため、偏光状態を確認できる系の構築を行った。第五に、ガス暴露を行うため、本系専用のガス暴露チェンバーの設計及び、ガス暴露ラインの設置を行った。以上が、本年度の研究実績の概要であり、センサー評価実験のための系の作製に注力し、研究を行った。
液体表面上での電解質ナノ薄膜創製手法の確立と電池デバイス応用開拓

本研究では、固体高分子形燃料電池、レドックスフロー電池などで用いられる電解質膜の作製を液体表面上で行うことを提案し、従来よりも2桁低い膜厚の電解質ナノ薄膜の創製を目的とします。高分子電解質を含有した溶液と基材面となる液体の濡れおよび拡がりの挙動、ならびに、液面上での高分子電解質の析出の挙動、に着目した研究を進めます。表面温度分布計測と計算科学的手法を統合して適用することで、熱物質輸送(対流、拡散、蒸発)と固相析出(成膜)について基礎的に明らかにし、デバイス応用開拓に繋げます。
変異型ＷＷＰ１ユビキチンリガーゼによる筋線維変性の分子機構解析

筋ジストロフィーニワトリの筋線維変性はWWP1 E3ユビキチンリガーゼ遺伝子のミスセンス変異により、441番目のアルギニンがグルタミンに変換するためと考えられている。我々はin vivo及びin vitroでの解析から、この1アミノ酸変異がWWP1の分解を誘導しE3ユビキチンリガーゼとしての酵素機能を失活させると同時に、その局在を変化させることを明らかにした。これらの変化は筋変性に先行して生じることから、筋ジストロフィーの原因となる可能性が強く示唆された。平成24年度には、筋ジストロフィーニワトリに認められるWWP1 E3ユビキチンリガーゼ遺伝子のミスセンス変異がアミノ酸置換(R441Q)を生じ、WWP1タンパク質分子の分解を誘導して、small WWP1(sWWP1)を形成することを示した。そこで本年度(平成25年度)は、(1) sWWP1の構造についての解析し、これと並行して(2) WWP1の有力な基質分子と考えられるジストログリカンに焦点を当て分子間の相互作用について検討を行った。(1) WWP1はカルボキシル基端側に位置するHECTドメインに触媒システイン残基を有しており、これによってE2酵素から基質タンパク質へユビキチンを移行させる。WWP1の異なる領域を認識する数種類の抗体を作成して構造を解析したところ、骨格筋における変異型WWP1の分解ではこのシステイン残基を欠失し、WWドメインを残す形でsWWP1を形成することが示された。(2)骨格筋におけるWWP1に対する基質探索は、WWP1が筋形質膜に局在すること、そして筋ジストロフィーニワトリではジストログリカンと呼ばれるラミニン結合性膜タンパク質に異常が認められるという報告があることから、この膜タンパク質に焦点を当て解析を行った。抗WWP1抗体による免疫沈降ではジストログリカンを検出することは出来なかったが、この分子と共にジストロフィン結合タンパク質複合体を形成するα-サルコグリカンを検出することができた。一方でα-サルコグリカンを含む精製複合体の中にはWWP1が検出されなかったため、これはWWP1が完成後のジストロフィン結合タンパク質複合体にではなく、その形成過程或いは分解過程に関与している可能性を示唆していた。今回得られたこれらの知見は、酵素機能を失ったsWWP1が筋細胞膜に局在することで筋線維の健全性維持に影響を及ぼす可能性を示唆していた。筋ジストロフィーニワトリの原因遺伝子に認められるものと同じミスセンス変異(R436Q)をもつWWP1分子を発現させたトランスジェニックマウスでは横紋筋特異的に数百残基のアミノ酸を欠失したWWP1フラグメントを発現するため、このsmall WWP1 (sWWP1)の形成が筋変性に関わるものと推察される。そこで平成24年度はこのsWWP1の形成機構と構造を明らかにする目的で、新規の抗WWP1抗体によるイムノブロットや免疫沈降、また、R436Q WWP1分子のin vitro発現系による解析を行った。まず、sWWP1の形成(R436Q WWP1の分解)が436番目のアミノ酸変異に起因しているのかどうかを明らかにするために、この変異型R436Q WWP1と正常型WWP1を発現ベクターにより培養筋細胞に導入し、それぞれの分子について解析した。その結果、R436Q WWP1のみが筋分化に伴い分解して行くが、これはMG132により抑制されるため、この分解のにはユビキチンープロテアソーム系が関与するものと考えられた。次にWWP1分子の異なる領域にエピトープを持つ抗体を入手してsWWP1の欠失領域の特定を試みたが、抗体の特異性に問題があり明瞭な結果は得られなかった。そこで変異型WWP1のN末及びC末端にcMycエピトープタグを導入し、抗Myc抗体で検出するという方法で解析したところ、分子の両端が共に分解されていることが示唆された。これらの知見は筋ジストロフィーニワトリで発見されたWWP1分子内のミスセンス変異が横紋筋特異的にユビキチン-プロテアソーム系での分解を誘導するシグナルとなり、WWP1の機能に何らかの変化を与え、筋の形成や形態の維持に影響を及ぼす可能性を示唆していた。筋ジストロフィーニワトリの責任タンパク質として報告されたR441Q変異型WWP1を発現させたトランスジェニック(Tg)マウスの解析から、我々はこのミスセンス変異によるアミノ酸置換がWWP1の分解を誘導し、130 kDaのWWP1から約90 kDaの酵素機能を失った小断片(sWWP1)となること、また、このsWWP1が筋形質膜特異的に局在するようになることを明らかにした。

しかしながらこの変異型WWP1の発現が原因とされる筋ジストロフィーニワトリに比べ、Tgマウスの筋症状は軽微であるため、筋再生を誘導しその修復過程に何らかの差異が認められないかを病理学的に解析したが、下肢筋へのカルジオトキシン投与においても、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのモデルマウスであるmdxマウスとの交配においても、変異型WWP1分子の発現群と対照群との間に著しい差異は認められなかった。筋ジストロフィーニワトリの筋肉を使ってWWP1分子の発現を詳細に解析したところ、R441Qのアミノ酸置換が骨格筋特異的なWWP1の分解を誘導しており、Tgマウスがこれを再現していることを確認したが、一方で変異型分子のほとんどは形質膜から消失し、筋小胞体やミトコンドリアへ分布するというTgマウスとは異なる局在であることが示された。さらに、筋ジストロフィーニワトリにおいても筋変性が認められない前広背筋(ALD)について調べたところ、正常のニワトリであってもALDではWWP1が筋形質膜には認められず、発現そのものが著しく低いことが明らかになった。このことは、白筋や赤筋といった筋肉の種類によって筋細胞に果たすWWP1の機能が異なることを示唆していた。また、筋ジストロフィーニワトリの遺伝形式は共優性(codominant)であるが、本解析はホモ接合体を用いて行われた。Tgマウスでは正常と変異型のWWP1が共発現しており、両者の発現バランスが筋ジストロフィーニワトリとは異なり、筋症状に影響を与えている可能性が考えられた。総合領域平成24年度の研究結果を基に立てた平成25年度の研究計画は、WWP1の基質(ターゲット)分子の探索を本格化させると共に、変異型WWP1の消化により形成されるsWWP1の構造解析をより詳細に行うことであった。WWP1の基質探索については基質特異性に関わると考えられるWWドメイン領域とグルタチオン-s-トランスフェラーゼ(GST)やマルトース結合タンパク質(MBP)との融合タンパク質を作製しプルダウンアッセイを行う計画であったが、作製した融合タンパク質の分解が著しいため、抗WWP1特異抗体による免疫沈降法を用いて解析することとした。このような状況下ではあったが、WWP1とジストログリカンは結合しないこと、そしてα-サルコグリカンとは微弱ながらも分子間の相互作用があることを示唆する重要な情報を得ることができた。更にsWWP1の構造解析においては触媒システイン残基の存在を判別することが可能な抗体作製に成功し、sWWP1が基質への結合ドメインを保存しながらE3ユビキチンリガーゼとしての機能を欠失していることを明らかにした。以上のことから、本研究は現在のところ当初の研究計画に沿って「おおむね順調に進展している」と考えている。平成24年度の研究実施計画では、断片化されたsmall WWP1 (sWWP1)の形成機構と構造を調べる目的で、(1)まず、マウスWWP1に生じたR436Qのミスセンス変異がsWWP1形成の引き金となっているのかをin vitro発現系によって解析すると同時に横紋筋特異的な現象かどうかを検討すること、(2)次に、トランスジェニックマウスの骨格筋サンプルなどを用いてsWWP1構造の解析を行うこと、(3)更に、sWWP1に保存されるWWドメインがこれまでに他の組織で報告されている様々な基質と結合できるのかどうかを調べながらターゲット分子を検索することであった。(1)については、計画通り、筋培養細胞を用いたin vitro解析によりR436Qミスセンス変異がsWWP1形成を誘導していることが示唆された。
専門工事業者における労務関連間接費の算出に関する研究

現状、建築工事に投入される労働者を直接的に雇用するのは専門工事業者である。そこでは、労働者に支払われる賃金(日当)の他に、間接的な経費、例えば社会保険費、技能者養成費、寮費、労務対策費等の負担が伴う。しかしながら、従前の重層下請制のもとで、こうした間接経費の取り扱い、負担のルールは明示されてこなかった。一方、欧米では、各国の社会保険制度、税制等の環境の差異はあるものの、通常、賃金の50200%程度の間接経費を積算時に組み込むことが義務づけられている。これにより、コスト圧縮や合理化のもとでも、労働者の労働条件は一定に確保されている。日本でも社会保険費等の一部に法的規制がなされているが、その他の間接経費については、その構成や算出のルールが明確化されていない。現実には、競争性が強まるなか、雇用者が負担すべき社会保険費等さえ確保されない実態が調査によって明らかとなった。本研究で得られた具体的な成果は以下の通り。・国内の躯体系の専門工事業者の現状の原価管理の手法、その問題点等を明らかにした。・国内の専門工事業者における労務関連間接費のボリューム、内容、およびその構成比を明らかにし、実態から労務費のコストモデルを作成し、現行の積算基準と比較した。・ユニオン制度の発達しているアメリカで運用されている労務関連間接費の算出のルールを文献およびアンケート調査、現地ヒアリングによって明らかにした。・フランスで運用されている技能者養成システムを文献およびヒアリングによって調査し、その費用の社会的負担の実態を明らかにした。今年度は,専門工事業者(以下サブコン)による,労務間接費の原価へ組み込み方法について,聞き取り調査等によって明らかにした.サブコンでは,一般管理費や現場経費,作業者の雇用全般にかかる費用を作業者1人工当たりに付随する間接的な費用として表現する.この基準日額の算定方式について典型はない.以下は今年度調査によって得られた基準日額の一般的な算出方法である.(1)年間の総労働人工数の算出年間総実働人工数=作業者数×(平均月間実働日数×12ヶ月-有給休暇)(2)作業者の社会保険等の算出:国は,各事業所で雇用者の数,就業規則等の雇用実態によって,健康保険,厚生年金,雇用保険等への加入を義務づけ,その額は,作業者の日当によって決定される.基準日額を決める階段では,作業者の日当の平均値を用いてこれらを算出する.(3)工事原価に含まれる経費の算出:工事原価内に含めるべき,交通費,通信費,消耗品費,調査研究費,宿舎家賃・賄い等,車両リース・保険費,保守費,退職掛金,組合費等の年間の総額を算出し,これを年間総実働人工数で割り,1人工当たりの工事原価に含まれる経費を算出する.工事原価に含める経費=交通費+通信費+消耗品費・・・+組合費1人工当たりの工事原価に含まれる経費=工事原価に含まれる経費÷年間総実働人工数(4)一般管理費等の算出:工事原価外の年間の一般管理費等を算出し,これを年間総実働人工数で割り,1人工当たりの一般管理費等を算出する.1人工当たりの一般管理費等=一般管理等÷年間総実人工数(5)基準日額の算出基準日額=社会保険費等+1人工当たりの工事原価に含まれる経費+1人工当たりの一般管理等+作業者の日当の平均値作業者1人工投入の際,基準日額をゼネコンに対して請求すれば,サブコンの経営は維持される.他にフランス他で「職人の家」の運営等に関する調査を実施した.次年度整理の予定.今年度は、明確な原価管理方針を持つ専門工事業者8社を対象にヒアリングをおこない、契約関係、原価管理の手法の実態を把握し、労務間接費の算出の根拠を明らかにした。調査対象各社の概要と原価管理手法は以下の通り。・設備系ダクト工事A

社:1954年に設立し、現在大手設備会社の一次下請けを材工一式で担う。直庸の作業員と下請の作業員とをコントロールし、原価管理を行う。・設備系ダクト工事B社:1972年に設立し、現在大手設備会社の一次下請けを材工一式で担う。労務は全て外注し、社員が現場管理を行う。・設備系給排水衛生工事C社:1985年に設立し、受注の大部分を某大手設備会社から材支給で請負う。外注を労務単価契約とした原価管理を行う。・設備系電気工事D社:1958年に設立し、社員が現場を管理し、直庸工を雇用せず労務は全て外注する。分離発注で元請になることもある。・躯体系型枠工事E社:1982年に設立し、現在大手ゼネコンの一次下請けを担う。直庸工を社内外注化とし、社員(番頭)が現場管理を行う。・躯体系鉄筋工事F社:1961年に法人化。去年、鉄筋直庸工と加工工場を分社したが、工務機能は本社が担う。マネージメントに特化し労務は全て外注。・躯体系鳶・土工工事G社:昭和30年代後半に現在の体制となり、大手ゼネコンの一次下請を担うも、今後の意向は公共の土木。直庸工は雇用せず、全て外注。・仕上系左官工事H社:1955年設立し、大阪本社・東京本店がある。大手ゼネコンから受注しているが、単価が厳しく外注でつじつまを合わす原価管理。以上を概括すると、現状の専門工事業者は、元諸に対してコストの主張が十分にできない状況にある。また、直接に作業者を雇用する必要を各社とも認識しているが、工事量の変動、雇用に伴う固定経費を確保できていない。今回調査対象とした、専門工事業者は、徹底的に労務外注化を指向し、本社機能を管理業務にシフトする傾向があり、重層性はさらに高まる。このことは、本来労務提供を機能とする、専門工事業者の将来像に影響を及ぼすと考えられる。現状、建築工事に投入される労働者を直接的に雇用するのは専門工事業者である。そこでは、労働者に支払われる賃金(日当)の他に、間接的な経費、例えば社会保険費、技能者養成費、寮費、労務対策費等の負担が伴う。しかしながら、従前の重層下請制のもとで、こうした間接経費の取り扱い、負担のルールは明示されてこなかった。一方、欧米では、各国の社会保険制度、税制等の環境の差異はあるものの、通常、賃金の50200%程度の間接経費を積算時に組み込むことが義務づけられている。これにより、コスト圧縮や合理化のもとでも、労働者の労働条件は一定に確保されている。日本でも社会保険費等の一部に法的規制がなされているが、その他の間接経費については、その構成や算出のルールが明確化されていない。現実には、競争性が強まるなか、雇用者が負担すべき社会保険費等さえ確保されない実態が調査によって明らかとなった。本研究で得られた具体的な成果は以下の通り。・国内の躯体系の専門工事業者の現状の原価管理の手法、その問題点等を明らかにした。・国内の専門工事業者における労務関連間接費のボリューム、内容、およびその構成比を明らかにし、実態から労務費のコストモデルを作成し、現行の積算基準と比較した。・ユニオン制度の発達しているアメリカで運用されている労務関連間接費の算出のルールを文献およびアンケート調査、現地ヒアリングによって明らかにした。
タイラーウイルスによる持続感染と脱髄の機序の解明

タイラーウイルス感染マウスにおける脱髄病変は免疫学的機序により生じ,実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)とともに多発性硬化症(MS)の動物モデルとして広く使われている。タイラーウイルスは,その生物学的活性により2種類に大別される。一つは,DAをはじめとする弱毒性のTO亜群で,これは、持続感染および脱髄を生じる。もう一つは,強毒性のGDVII亜群で,感染後のマウスは急性脳脊髄炎で1週間以内に死にいたる。これらは,核酸レベル,アミノ酸レベルで共に90%以上の相同性がある。これまで,DAとGDVII間でのキメラを作製し,脱髄と持続感染にいての研究がなされてきたが,未だにそのメカニズムの詳細は不明である。最近,DAではnt1079位のAUGを使って,ポリプロテインとは別の読み枠で合成される18kDの蛋白(L^*)が注目されている。GDVIIではL^*を作らない(nt 1079がACG)こと,DAでのnt 1079位をACGにした変異ウイルスDAL^*-1は持続感染もせず,脱髄も生じなかったことから,この蛋白がウイルスの持続感染と脱髄に極めて重要であることが示唆されている。そこで,我々はL^*を作るような変異を導入した変異GDVII(GDstemL^*AUG)を作成したところ,このウイルスは持続感染するもの,脱髄は生じなかった。このことはL^*の存在は持続感染に必要ではあるが,脱髄を生じるのに十分でないことを示唆した。そこで,我々は脱髄に関与する遺伝子領域の候補としてウイルスの4部分(VP1,VP2,VP3,VP4)のカプシド領域に注目し検討を行なった。それぞれの部分をもつキメラウイルスの作成を試みた。構成領域が短いVP4とのキメラウイルスは、持続感染するものの脱髄は生じなかった。VP1領域のキメラウイルスの作成はうまくいかなった。その他のカプシド領域も現在検討中である。タイラーウイルス感染マウスは、実験的アレルギー性脳脊髄炎とともに多発性硬化症の動物モデルとして広く使われている。タイラーウイルスはその生物学的活性により弱毒性と強毒性の2つの亜群に分けられる。弱毒性のものはDAをはじめとするTO亜群で、脳内接種後に持続感染し、脊髄に炎症性の脱髄病変を生じる。強毒性のものはGDVII亜群で脳内接種後一週間以内にマウスは死に至る。タイラーウイルスによる持続感染と脱髄の機序は不明だが、最近L^*仮説が注目されている。L^*はDAのnt1079位のAUGを用いて合成される18kDaの蛋白だが、GDVIIはこの部位がACGのためにL^*を合成しない。L^*についての研究報告は多いが、その機能は不明である。我々はnt1079位よりも下流でL^*と同じ読み枠で全長のL^*合成を阻害するような終止コドンをもつように変異を導入したところ、このウイルスは持続感染と脱髄を生じなかった。このことはL^*開始のAUGよりL^*そのものが重要であることを示唆した(投稿中)。一方、我々は、GDVIIにL^*を合成するようにnt1079位のACGをAUGに変えた変異ウイルスが持続感染はするが脱髄は生じないことを明らかにした。その理由として、GDVIIのL^*とDAのL^*が同一でないことが考えられた。

そこでDAのL^*をコードする遺伝子領域をGDVIIの相当する遺伝子領域に置き換えたキメラウイルスを作成した。このウイルスは持続感染したが、脱髄は生じなかった。この結果、L^*は脱髄と持続感染には重要であるが、L^*のみでは脱髄は生じ得ないことがわかった。現在我々はウイルスのカプシド蛋白に注目して、検討中である。タイラーウイルス感染マウスは,生じる脱髄病変は免疫学的機序により生じ,実験的アレルギー性脳炎(EAE)とともに多発性硬化症(MS)の動物モデルとして広く使われている。タイラーウイルスは,その生物学的活性により2種類に大別される。一つは,DAをはじめとする弱毒性のTO亜群で,これは持続感染をし,病理学的に脱髄を生じる。もう一つは,強毒性のGDVII亜群で,感染後のマウスは急性脳脊髄炎を生じ,1週間以内に死にいたる。これらは,核酸レベル,アミノ酸レベルで共に90%以上の相同性がある。これまで,DAとGDVII間でのキメラを作製し,脱髄と持続感染についての研究がなされてきたが,未だにそのメカニズムの詳細は不明である。最近,DAではnt1079位のAUGを使って,ポリプロテインとは別の読み枠で合成される18kDの蛋白(L^*)が注目されている。GDVIIではL^*を作らない(nt1079がACG)こと,DAでのnt1079位をACGにした変異ウイルスDAL^*-1は持続感染もせず,脱髄も生じなかったことから,この蛋白がウイルスの持続感染と脱髄に極めて重要であることが示唆されている。そこで,我々はL^*を作るような変異を導入した変異GDVII(GDstemL^*AUG)を作成したところ,このウイルスは持続感染するもの,脱髄は生じなかった。このことはL^*の存在は持続感染に必要ではあるが,脱髄を生じるのに十分でないことを示唆した。そこで,我々は現在カプシド蛋白に注目し、解析を続けている。
岩石高速衝突のダイレクトシミュレーション

本研究では新しい試みとして,岩石やセラミックといった脆性材料の高速破壊に注目し,クラックの発生から破壊に至る過程を,粒子法を応用して直接シミュレーションを試みた.秒速数百メートルから数キロメートルの高速衝突現象は,材料は破壊を伴いつつ慣性に支配される.このとき重要なのは運動方程式と材料の破壊モデルである.衝突を受けた材料は,等方的な材料であれば静水圧の作用下では破壊せず,また残留変形も受けないが,偏差応力が静水圧に加わるとき,破壊形式に著しい影響が現れる.そこでこのような現象を多次元空間でモデル化する為,SPH法と粒子連結法(研究代表者の発案)という2つの粒子法を組あわせて計算を行った.クラックの発生は,偏差応力と静水圧の影響を受けるため,SPH法を用いて静水圧成分を計算し,粒子連結法を用いて偏差応力成分を計算した.そして微小要素間の結合部に作用する全応力(静水圧十偏差応力)を用いて破壊・非破壊を判断した.昨年度は,かこう岩に鉄の弾丸が毎秒数百メートルの速度で衝突するケースについて計算し,実験結果とクレーター形状の良い一致がみられたが,今年度は薄い岩石板への衝突問題を通して,理論クラック線と計算によって得られたクラック線が一致することが示された.本研究の成果は平成9年7月の「破壊力学のシンポジウム」ですでに公表され,併せて日本材料学会誌「材料」平成10年8月号・破壊力学特集の論文として掲載される予定である.粒子法を用いて岩石の破壊の際に生じるクラックを表現した.運動方程式を解いて,各粒子の位置,速度を求めた.応力に関しては,粒子間の歪,歪速度より,偏差応力成分を計算し,比体積より静水圧成分を求め,あわせて全応力を求めた.破壊応力を超えた結合部に関してはクラックが生じたとみなして偏差応力及び負の静水圧を解放した.粒子の分布から静水圧を求めるためにSPH(Smoothed Particle Dynamics)法を応用し,状態方程式には岩石についての実験式であるBirch-Murnaghamの式を用いた.破壊に関しては,引っ張りとせん断破壊に関して単純破壊モデルを用いた.かこう岩に鉄の弾丸が毎秒数百メートルの速度で衝突するケースについて,計算を行った結果,せん断破壊によって衝突部付近に衝突方向に生じる垂直クラック,膨張波を原因し引っ張り破壊によって同心円状に生じる円周クラック,さらに円周方向の引っ張り応力を解放する径方向クラックをシミュレートすることができた.エネルギーの移動経緯をみると,最初の数マイクロ秒で弾丸の持つ運動エネルギーの93%ほどが岩石の破壊エネルギーに費やされ,またその後はほとんどエネルギーの移動が無いことがわかった.宇宙科学研究所によって行われた打ち込み実験と比較すると,クレーター形状のよい一致がみられた.今後は粒子配置密度と計算精度等の検証を行っていく必要があるであろう.本研究では新しい試みとして,岩石やセラミックといった脆性材料の高速破壊に注目し,クラックの発生から破壊に至る過程を,粒子法を応用して直接シミュレーションを試みた.秒速数百メートルから数キロメートルの高速衝突現象は,材料は破壊を伴いつつ慣性に支配される.このとき重要なのは運動方程式と材料の破壊モデルである.衝突を受けた材料は,等方的な材料であれば静水圧の作用下では破壊せず,また残留変形も受けないが,偏差応力が静水圧に加わるとき,破壊形式に著しい影響が現れる.そこでこのような現象を多次元空間でモデル化する為,SPH法と粒子連結法(研究代表者の発案)という2つの粒子法を組あわせて計算を行った.クラックの発生は,偏差応力と静水圧の影響を受けるため,SPH法を用いて静水圧成分を計算し,粒子連結法を用いて偏差応力成分を計算した.そして微小要素間の結合部に作用する全応力(静水圧十偏差応力)を用いて破壊・非破壊を判断した.昨年度は,かこう岩に鉄の弾丸が毎秒数百メートルの速度で衝突するケースについて計算し,実験結果とクレーター形状の良い一致がみられたが,今年度は薄い岩石板への衝突問題を通して,理論クラック線と計算によって得られたクラック線が一致することが示された.本研究の成果は平成9年7月の「破壊力学のシンポジウム」ですでに公表され,併せて日本材料学会誌「材料」平成10年8月号・破壊力学特集の論文として掲載される予定である.
小胞輸送関連分子欠損マウスを用いたマクロファージによる異物貪食機構の検討

マクロファージによる異物貪食は外来微生物からの免疫応答に重要な役割を果たしている.本研究ではマクロファージの異物貪食の分子機構について、小胞輸送に関連する分子であるVAMP7を欠失したマウス(VAMP7 KOマウス)を用いて検討した.その結果、VAMP7依存的な異物貪食は経路特異的であること、ファゴソームとライソソームの融合に関係する可能性があることを明らかにした.また個体におけるマラリア感染に対する免疫応答にはVAMP7は関与していないと推測された.マクロファージによる異物貪食は外来微生物からの免疫応答に重要な役割を果たしている.本研究ではマクロファージの異物貪食の分子機構について、小胞輸送に関連する分子であるVAMP7を欠失したマウス(VAMP7 KOマウス)を用いて検討した.その結果、VAMP7依存的な異物貪食は経路特異的であること、ファゴソームとライソソームの融合に関係する可能性があることを明らかにした.また個体におけるマラリア感染に対する免疫応答にはVAMP7は関与していないと推測された.20年度はこれまでに作成したVAMP7(Vesicular Associated Membrane Protein-7)欠失によるマクロファージ貪食能の影響について、おもにVAMP7欠失マウスより取得した腹腔マクロファージを用いてin vitroでの検討を行った。マクロファージに貪食させる異物として2種類の大腸菌BioParticle、酵母の膜に由来するZymosanを用い、プレートリーダーによる蛍光強度の測定や共焦点レーザー顕微鏡にてそれぞれの貪食効率を評価した。その結果、大腸菌BioParticleやZymosanではマクロファージにおける取り込み効率に、野生型マウス由来の細胞とVAMP7欠失マウス由来の細胞で優位な差を認めなかった。また貪食によって生じたPhagosomeとLysosomeの融合については、Zymosanを取り込んだマクロファージをLysosensorで標識して観察した。その結果野生型マウスとの間で優位な差は認められなかった。これらの結果から、VAMP7は大腸菌BioParticleやZymosanの取り込みおよびその処理には関係しないと推測された。このため今後はヒツジ赤血球を中心にVAMP7欠失マクロファージにおける貪食能について検討していく。一方、マウスマラリアモデルを用いた個体レベルでの解析については、予備実験の段階で個体差が大きく結果が安定しなかった。これは遺伝的バックグラウンドの不均一さから生じたと思われ、C57BLとのバッククロスを継続して行っている。21年度はこれまでに作成したVAMP7(Vesicular Associated Membrane Protein-7)欠失によるマクロファージの貪食後の細胞内小器官の動態について電子顕微鏡を用いて解析した.解析に際してはVAMP7欠失マウスより取得した腹腔マクロファージを用い、マクロファージに貪食させる異物としてはヒツジ赤血球を用いた。まずPhagosome膜上でのLysosomeマーカーの存在を示すシグナルを定量するための条件検討として固定条件およびLysosomeマーカーの選択を行った。LysosomeのマーカーとしてLysosome膜タンパクであるLAMP-1、LAMP-2それぞれ数種類の抗体の中で最も免疫電子顕微鏡の際、安定した染色性を示したものは抗LAMP-1抗体(1D4B)であった.またその際の固定条件としてはグルタールアルデヒドを用いた場合、極端に染色性が低下することから、PLP(periodate-lysine-paraformaldehyde)液を用いた方がよいと判断した.そこでヒツジ赤血球を貪食させたマクロファージを抗LAMP-1抗体で染色し、免疫電顕による解析を行った.その結果、VAMP7欠失マウス由来のマクロファージではPhagosome膜上のLAMP-1シグナル数が減少している傾向が認められた.このことからVAMP7がヒツジ赤血球貪食後のPhagosomeとLysosomeの融合に関係している可能性が考えられた。今後、個体数を増やして統計解析を行う予定である。一方、マウスマラリアモデルを用いた個体レベルでの解析については、遺伝的バックグラウンドを統一するため、C57BLとのバッククロスを継続して行い、本年度中に8代までの交配が完了した。22年度感染実験を行う予定である。本年度はin vitro、in vivo両面からマクロファージ貪食能に対するVAMP7欠失の影響について検討した.In vitroでの検討ではVAMP7欠失マウス(KOマウス)より取得した腹腔マクロファージにヒツジ赤血球を貪食させた際のLysosomeマーカーの局在を電子顕微鏡レベルでの解析を行った.銀増感法を用いて標識したPhagosome膜上のLysosomeマーカーの密度を比較した.電子顕微鏡で観察されたLysosomeマーカーのシグナル個数を単位膜あたりの密度として算出したところ野生型と比べてVAMP7欠失マウス由来のマクロファージで低い傾向がみられた.このことは貪食した異物を処理する過程で重要なPhagosome-LysosomefusionにVIMP7が関係する可能性を示唆している.ただし、細胞間による差が大きいため、骨髄由来マクロファージでの検討がさらに必要と思われた.In vivoにおいてはマウスマラリアであるPlasmodium yoeliiをKOマウスに感染させ、感染率、生存日数について野生型マウスと比較した.この結果、感染後の生存日数、日ごとの感染率ともに野生型マウス群、KOマウス群の間で有意な差は認めなかった.またマラリア感染マウスの肝臓、脾臓を取得し、形態学的な解析を行った.

光学顕微鏡レベルではHE染色像、マクロファージマーカーF4/80を用いた免疫染色像いずれにおいても野生型マウスとKOマウスで大きな変化は見られなかった.また電子顕微鏡での観察にてもどちらの群でも感染赤血球の貪食像が観察され、明らかな差は認めなかった.以上からVAMP7欠失により細胞レベルでの異物貪食および異物処理能力に影響がある可能性が示唆されたが、in vivoにおける意義については今後の研究課題と考えられた.
ヒト爪を用いた癌の早期診断技術の開発

がん診断を目的として、非侵襲的なヒト爪中のポリアミン9種類の一斉分析法、ジアセチルポリアミンの高感度定量法及び2-Hydroxy butyrate (HB)、Asp、Cysの光学異性体一斉分析法を確立した。健常人と肺癌患者の爪中定量値を比較した結果、SPMでは肺癌患者の方が健常人より有意(p < 0.05)に高かった。また、大腸癌患者の爪からはHB、Asp、Cysを初めて検出することができ、HB、Aspにおいて、大腸癌患者は健常者より高い定量値が示され、大腸癌患者に増加傾向が示された。以上の結果より、非侵襲的なヒト爪分析はがんの病状診断の一手段となる可能性が示唆された。病態が潜在的に進行するがんでは、発症前での早期発見が疾病の進行抑制や治療において重要な鍵となる。ヒトの爪は、臨床検査で汎用されている血液や尿に比べ、構造上の特徴から、数ヶ月以上の長期にわたる体内の栄養状態や過去の元素暴露量、薬物使用歴が残されている。そこで、本年度ではヒト爪に微量に存在するポリアミン及びアセチルポリアミン9種類の一斉分離分析と2種類のジアセチルポリアミンの高感度定量方法の開発を試みた。DBD-Fと誘導体化することで9種類のポリアミンは20分以内、2種類のジアセチルポリアミンは3分以内に良好に分離検出することができた。また、健常人39名、肺癌患者17名のヒト爪試料に適用したところ、健常人と肺癌患者の爪からDAP、N1-actPUT、N1-actSPMをはじめとする9種類のポリアミ全てを検出することができた。さらに、健常人と肺癌患者の爪を用い定量値を求め、比較検討を行った結果、健常人の男女間ではPUT、N1-actPUTの2つのポリアミンでは男性の方の含量が高く、有意差(p < 0.01)を示した。また、肺癌患者と健常人の定量値を比較したところ、DAP等の7種類のポリアミンの含量はほぼ同等に検出されたが、SPMでは肺癌患者の方が健常人より含量が高く有意差(p < 0.05)が認められた。さらに、ジアセチルポリアミンの分析においては、健常者と肺癌間者の爪から初めてDiAct-Spd、DiAct-Spmを検出することができた。定量値を比較した結果、若年男性において、DiAct-Spmの含量が女性に比べて多い傾向が見られ、40-80歳代の肺癌患者と健常者の平均値で比較した際、肺癌患者において、DiAct-Spdの増加傾向が示された。以上の結果より、ヒト爪中のポリアミンの測定は肺癌の早期診断への可能性が示唆された。ヒト爪を用い、癌の早期診断技術の開発を目的として、増加の一方を辿っている大腸癌に着目し、光学異性体を含む新規バイオマーカー候補物の同時高感度分析法の開発を試みた。大腸癌は、早期発見による生存率が極めて高く、発症前の早期発見及びその診断法が強く求められている。近年ヒト血中メタボローム解析から大腸癌に早期反応を示す新規バイオマーカー候補物として2-Hydroxy butyrate (HB)、Aspartic acid (Asp)、Kynurenine (Kyn)、Cystamine (Cys)が発見されその有用性が示唆された。しかし、これらの新規バイオマーカー候補物はキラル中心を持つ化合物もあるが、その光学異性体の有用性についてはまだ不明であった。そこで我々は、これらのキラル中心を持つ新規バイオマーカー候補物に着目し、高感度誘導体化試薬として(R), (S)-DBD-Pro-COClを用い、LC-ESI-MS/MSで一斉分析法の開発を行ったところ、3種類の光学異性体を含む7種類の新規バイオマーカー候補物を20分以内に良好な分離を達成することができた。また、健常者、大腸癌患者の爪に適用したところ、HB、Asp、Cysを初めて検出することができた。さらに、健常者と大腸癌患者の爪を用い定量値を比較した結果、HB、Aspにおいて、大腸癌患者は健常者より約4.2-9.5倍高い定量値が示され、大腸癌患者の増加傾向が示唆された。さらに、全体のピーク面積に対するD-体の割合のD/D+L比を比較した結果、大腸癌患者の値の方が健常者よりも高いことが示唆され、ヒト爪中のHB、L-Asp候補物は大腸癌の早期診断への可能性が示唆された。生体機能分子分析学

本年度では、ヒト爪に微量に存在するポリアミン及びアセチルポリアミン9種類の一斉分離分析と2種類のジアセチルポリアミンの高感度定量方法の開発に成功し、さらに健常人と肺癌患者爪中ポリアミンとジアセチルポリアミンの定量値を求め、有意差解析も実施することがでた。以上のことから研究は概ね順調に進展していると判断した。今後、新たな低分子バイオマーカー代謝物の発掘や、他の種類の癌診断における爪の有用性を検討する予定である。複数D, L-光学異性体遊離低分子代謝物を標的とし、高感度検出可能なLC-MS一斉分析法の開発を試み、肺がん、大腸がん患者爪を分析し、新規バイオマーカーとしての有用性を評価し、新規臨床生体試料としてのヒト爪の有用性を検討する。
血管新生因子により網膜色素上皮細胞に発現する遺伝子群の解析

網膜色素上皮細胞のセルラインであるARPE-19の提供をうけ、細胞培養を開始した。ARPE-19は10パーセント牛血清を含むDMEM培養液にて生育した。ARPE-19は初期には繊維芽細胞状のの形態をとるが細胞密度がコンフレントになるとしだいにシート状の形態を示す。まず、血管新生因子であるVEGFの色素上皮細胞に対する形態変化への影響を調べるためにhuman VEGFタンパク投与群と非投与群とに分けて培養をおこなった。結果、光学的顕微鏡下においては形態に相違点はみとめられなかった。次に加えられたVEGFの細胞間接着因子への影響を見るためにE-cadherin, n-cadherinのmRNAの転写変化をRT-PCRを用いて解析したがmRNAに明らかな差は認められなかった。次に我々はラットなどの実験的血管新生モデルや手術にて拔去された新生血管などの血管新生組織の周囲にマクロファージなどの炎症細胞が認められることに注目した。色素上皮に対する炎症細胞の遊走には接着因子であるICAM-1やVCAM-1が関与していることが示唆されている。ICAM-1,VCAM-1のmRNAをRT-PCRを用いて解析したところVEGFによる発現量の影響は明らかではなかった。一方、この実験に際してICAM-1,VCAM-1の発現量は10パーセント牛血清を含むDMEM培養液下では培養初期にはRT-PCRにて検出できないものの、コンフレント後から次第に発現量が増加することが明らかになった。臨床的に特に特発性の新生血管の発生に炎症が関与している事が示唆されておりステロイドの投与などが試されていることを踏まえ、我々はステロイド(コルチコイド)の投与によるICAM-1,VCAM-1のmRNAの発現への影響をRT-PCRを用いて調べた。この結果、ステロイドの投与はICAM-1の発現量には影響を与えないものの、VCAM-1の発現を有為に抑制することが明らかになった。我々は引き続きICAM-1,VCAM-1のタンパクレベルでの解析とVEGF投与下の網膜色素上皮細胞の発現プロファイルの解析をすすめることを予定している。
DNAウイルス初期遺伝子発現調節とその標的細胞遺伝子

この班は本年度で、がん特別研究から数えて3年を経過し、研究を終了する。転写制御とDNA型腫瘍ウイルスの初期遺伝子を中心に据え、初期遺伝子の発現誘導から初期遺伝子機能による細胞増殖誘導に至るシグナル伝達機構の解析という大きい目的に向かって、多数の系で研究を進展させた。初期遺伝子の発現制御については、そこに働く転写因子の詳細な解析を通じて、それらと、他の因子のネットワーク構造を示唆する結果が得られた。例えば、E4TF1がRbを活性化すること、E4TF3がカゼインキナーゼIIにてリン酸化されること、E1AがCBPをコアクチベタ-とすることでMybの系と競合すること、X蛋白質とp53がTAFを介して働くこと等々である。初期遺伝子産物からのシグナル伝達では従来知られていたE2F、p53などの経路に加え、それ以外の経路を見出し、それらの転写因子が、がん形質を発揮するように働く経路につき、極めて示唆に富む結果も得た。例えば、E2Fの経路はPCNA遺伝子の発現を上げ、細胞増殖に直接的な影響を持ち、ets様因子のE1AFを介する経路は3種のマトリックスメタロプロテアーゼを活性化しがんの浸潤性に影響与え、CAAリピート結合因子を介する経路はMHCクラスI抗原の発現を抑制し、がん細胞が免疫系より排除されるのを防ぐ。この方向に添う発見で、意外だったのは、HPVやEBウイルスの遺伝子の持続的発現が、がん形質の維持に必要であったことである。すなわち、DNA腫瘍ウイルスはモデル系以上の意味を持っているわけである。HPVやEBウイルスの研究を強力に進めるのは当然であるが、上記の転写制御に関係した知識が、直接的に臨床癌の理解に役立つ可能性が非常に強まった。今後もこの方向に添った地道な努力が、是非とも必要だろう。DNAウイルスが細胞DNA複製プログラムを誘導する過程を、発がんの初期過程のモデルとして、さらに細胞遺伝子発現調節のモデルとして転写調節に的を絞って解析した。1.ウイルス初期遺伝子の転写調節機構:転写活性化機構のモデル系として、三つの系において、その機構が解析された。アデノウイルスE1AおよびE4遺伝子の転写調節につき、そこに働く転写因子の機能ドメイン、サブユニット構造、および結合蛋白質を転写機能との関連で解析した。HBVのX遺伝子の転写に関しては、X蛋白質遺伝子による自己の遺伝子の活性化機構を明らかにした。2.ウイルス初期遺伝子産物の転写調節機能の細胞側標的遺伝子とその転写調節機構:個々の系において研究の出発点が異なったが、標的遺伝子の同定、同定した遺伝子のプロモーター上のウイルス遺伝子機能の反応配列の同定、および反応配列に結合する調節因子とウイルス蛋白質との相互作用の解析を行った。EBVおよびパピローマウイルスの系では、多段階の過程を経た腫瘍細胞でウイルス遺伝子機能が、悪性形質発現に関与していることを明らかにし、ウイルス遺伝子機能の標的因子を検索している。SV40のT抗原の標的候補である細胞表面抗原遺伝子(MM3)およびアデノウイルスE1Aの標的であるPCNA遺伝子の系ではプロモーター領域をクローニングし、そこに存在する反応配列および結合因子を解析している。E1Aの標的c-junにおいては反応配列を明らかにし、そこにE1A結合蛋白質であるp300が結合することを発見した。またアデノウイルス12型E1Aにより負に調節されるMHCクラスIの転写調節につき、E1Aが転写因子とTBPの間に介在することを示唆した。さらにE1Aの反応配列CRE(cAMP response element)の結合蛋白質(CRE-BP1)とE1Aの相互作用の分子機構を解析した。
不可視光源による影領域を用いた歩容認証システムの開発

本研究では,建物へのアクセス認証や屋内におけるセキュリティシステムにおいて,被認証者の負担の無い個人認証を実現するために,複数台の赤外線ライトにより地面に投影された歩行者の影領域を用いた,個人認証システムの開発を行った.また,着衣や持ち物の変化などの見えの変化に対して頑強な歩容による個人識別システムを提案した.さらに,高い個人認証性能を実現するために,開発システムを拡張して,時系列情報を考慮した個人識別手法を開発した.提案手法を用いて54名の歩行画像データベースを用いて実験を行い,従来手法と比較して高い認証性能を達成したことを確認した.本研究では,建物へのアクセス認証や屋内におけるセキュリティシステムにおいて,被認証者の負担の無い個人認証を実現するために,複数台の不可視光源により地面に投影された歩行者の影領域を用いた,個人認証システムの開発を目的とする.本システムでは,認証を行っていることを被認証者に意識させないために,通常のライトと同様に複数台の赤外線ライトを天井に設置し,また地面に対して垂直に画像を撮影するように,単一カメラを天井に埋め込み設置する.またこのシステムでは,地面に投影された被認証者の“影"は,光源を視点として疑似的に撮影された画像であると考え,単一カメラにより撮影された歩行者の複数の影領域を用いることで,高い識別性能を実現できる.前年度では,対象人物の衣服の変化による,対象人物の見えの変化に対するデータベース,および手法を開発していなかった.これに対し,本年度の実績は次の通りである.(i)見えの変化を6通り(バックパック、ハンドバッグ、ブリーフケース、白衣、ダウンジャケット、ロングコート)を含む,影画像データベースを構築した.また本年度のデータベースは前年度のほぼ2倍に相当する54名からなる.(ii)これまでに開発した見えの変化に頑強な個人識別手法を適用し,衣服の変化の場合にはおよそ70%,かばんの変化の場合には91%の識別率で個人識別が可能であることを確認した.従来手法を用いた場合では,衣服の場合はおよそ30%,かばんの場合はおよそ65%の識別率であることから,従来手法と比較して提案手法は識別率の向上を実現することができた.また,信学技報における本研究の発表「複数の赤外線ライトによる影を用いた歩容による個人識別」は,2011年度PRMU研究奨励賞受賞した.本研究は,建物へのアクセス認証や屋内におけるセキュリティシステムにおいて,被認証者の負担の無い個人認証を実現するために,複数台の不可視光源により地面に投影された歩行者の影領域を用いた,個人認証システムの開発を目的とする.特に本研究では,認証を行っていることを被認証者に意識させないために,通常のライトと同様に複数台の赤外線ライトを天井に設置し,また地面に対して垂直に画像を撮影するように,単一カメラを天井に埋め込み設置した.前年度までに開発したシステムでは,地面に投影された被認証者の“影"は,光源を視点として疑似的に撮影された画像であると考え,単一カメラにより撮影された歩行者の複数の影領域を用いることで,高い識別性能を実現している.また,被認証者の衣服の影響により,観測された対象人物の輪郭線が真の輪郭線と異なる場合でも,観測可能な被認証者の一部の真の輪郭線から,個人認証が可能であるという特徴も有する.前年度までに開発した技術である〝被認証者の衣服の影響による,見えの変化に頑強な個人識別手法"を拡張して,今年度ではさらなる性能改善を行った.具体的には,前年度までは,被認証者の複数枚の歩行画像より得られた一枚の平均画像を用いて,個人識別を行っていたため,時系列情報が失われていた.これに対し,今年度ではそれぞれの歩行画像から抽出された歩行特徴を用いて,時系列情報を考慮した個人識別手法を開発した.これにより大幅な性能改善が実現され,54名の歩行画像データベースを用いた場合,前年度では見えの変化が生じる場合は70%程度の個人識別率であったのに対し,今年度はほぼ100%の個人識別率を実現した.以上より,本研究の目的である,被認証者の負担の無い,かつ識別性能が高い個人識別システムの開発は達成できた.本研究では,建物へのアクセス認証や屋内におけるセキュリティシステムにおいて,被認証者の負担の無い個人認証を実現するために,複数台の赤外線ライトにより地面に投影された歩行者の影領域を用いた,個人認証システムの開発を行った.また,着衣や持ち物の変化などの見えの変化に対して頑強な歩容による個人識別システムを提案した.さらに,高い個人認証性能を実現するために,開発システムを拡張して,時系列情報を考慮した個人識別手法を開発した.提案手法を用いて54名の歩行画像データベースを用いて実験を行い,従来手法と比較して高い認証性能を達成したことを確認した.本研究では,建物へのアクセス認証や屋内におけるセキュリティシステムにおいて,被認証者の負担の無い個人認証を実現するために,複数台の不可視光源により地面に投影された歩行者の影領域を用いた,個人認証システムの開発を目的とする.本システムでは,認証を行っていることを被認証者に意識させないために,通常のライトと同様に複数台の赤外線ライトを天井に設置し,また地面に対して垂直に画像を撮影するように,単一カメラを天井に埋め込み設置する.またこのシステムでは,地面に投影された被認証者の"影"は,光源を視点として疑似的に撮影された画像であると考え,単一カメラにより撮影された歩行者の複数の影領域を用いることで,高い識別性能を実現できる.本年度の実績は,次の通りである.(i)