hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
グルコース濃度に応答した異種細菌間相互作用の解明～日和見感染症制御を目指して～

平成30年度は以下の研究成果を得た。(1)我々がこれまでにヒト表皮から単離していた、異種細菌に対して細胞外マトリクス産生を誘導する細菌の培養物から、細胞外マトリクス産生誘導活性を指標に活性物質の精製を進め、活性物質は低分子の親水性物質であり、共培養時にのみ分泌されるものではなく、単一培養時においても、ある培養条件の際に分泌されることが示唆された。(2)異種細菌の共培養により生産が誘導された細胞外マトリクスの精製、および、GC/MSによる構成成分分析や、600MHz核磁気共鳴装置などによる構造解析を進め、これまでに報告のない新規の多糖構造であることが示唆された。(3)これまでに単離してきたヒト表皮由来微生物に加えて、ヒトに対して日和見感染症を引き起こすことが知られている病原性微生物も用いて、異種微生物間相互作用を示す新たな菌種の組み合わせを探索した結果、異種微生物に対して固体表面への接着能を低下させる相互作用などを示す、新たな微生物種の組み合わせを複数組見出だした。これら相互作用に関与する活性物質についても精製を進めた。(4)異種細菌間相互作用を示すヒト表皮分離細菌について、ゲノムDNAを抽出、精製し、次世代シークエンサーによるドラフトゲノム解析を行った。また、高分解能LC/MS/MSシステムを用いたプロテオーム解析により、異種細菌間相互作用を示す細菌のタンパク質発現について、最適な共培養条件、および、分析、解析条件について検討し、共培養時と単独培養時との比較を試みた。平成28年度は以下の研究成果を得た。(1)これまでに我々がヒト表皮から単離していた、異種細菌に対する細胞外マトリクス産生誘導や、抗菌物質生産などの異種細菌間相互作用を示す細菌2種について、16SrDNA塩基配列を決定し、種の同定を行った。(2)異種細菌に対して細胞外マトリクス産生を誘導する細菌の培養物から、活性物質の精製を試みた結果、活性画分を分画することができたため、さらに細胞外マトリクス産生誘導活性を指標に精製を進めている。(3)異種細菌の共培養により生産が誘導された細胞外マトリクスの成分や構造に関して検討を進めており、共培養条件や、抽出、精製手法を最適化して、構造解析に供することができる量と精製度の細胞外マトリクスを取得できた。得られた精製細胞外マトリクスについて、GC/MSによる構成成分分析や500MHz核磁気共鳴装置などによる構造解析を進めた結果、これまでに報告のない多糖構造である可能性が示唆された。(4)これまでに単離してきたヒト表皮由来微生物と、ヒトに対して日和見感染症を引き起こすことが知られている代表的な病原性細菌、および、真菌との異種微生物間相互作用についても検討を進めており、新たな相互作用の組み合わせを見出した。(5)異種細菌間相互作用を示す細菌同士の共培養時におけるタンパク質発現を単独培養時と比較するため、最適な共培養条件を検討し、高分解能LC/MS/MSシステムによるプロテオーム解析を進めている。研究者の異動が予定されたため、当初に計画していた研究タイムスケジュールに若干の変更が生じたが、各小課題に着手する時期が若干前後しただけで、全体としてはおおむね順調に進展している。平成29年度は以下の研究成果を得た。(1)我々がこれまでにヒト表皮から単離していた、異種細菌に対して細胞外マトリクス産生を誘導する細菌の培養物から、細胞外マトリクス産生誘導活性を指標に活性物質の精製を進めており、低分子の親水性物質であることが示唆された。現在さらなる精製と構造解析を進めている。(2)異種細菌の共培養により生産が誘導された細胞外マトリクスの成分や構造に関して検討を進めた。細胞外マトリクス産生誘導に適した共培養条件、および、細胞外マトリクスの抽出、精製条件を確立できたため、得られた精製細胞外マトリクスについて、GC/MSによる構成成分分析や、600MHz核磁気共鳴装置などによる構造解析を進め、これまでに報告のない新規の多糖構造であることが示唆された。現在詳細な構造解析、および、その生物活性の解析を進めている。(3)これまでに単離してきたヒト表皮由来微生物と、ヒトに対して日和見感染症を引き起こすことが知られている代表的な病原性微生物との異種微生物間相互作用について、新たな相互作用の組み合わせを見出しており、その相互作用に関与する活性物質についても精製を進めている。(4)高分解能LC/MS/MSシステムを用いたプロテオーム解析により、異種細菌間相互作用を示す細菌のタンパク質発現について、共培養時と単独培養時との比較を試みている。最適な共培養条件、および、分析、解析条件について引き続き検討している。研究者の新設研究室への異動があり、研究室設営に時間を要したが、全体としてはおおむね順調に進展している。(2)異種細菌の共

培養により生産が誘導された細胞外マトリクスの精製、および、GC/MSによる構成成分分析や、600MHz核磁気共鳴装置などによる構造解析を進め、これまでに報告のない新規の多糖構造であることが示唆された。(3)これまでに単離してきたヒト表皮由来微生物に加えて、ヒトに対して日和見感染症を引き起こすことが知られている病原性微生物も用いて、異種微生物間相互作用を示す新たな菌種の組み合わせを探索した結果、異種微生物に対して固体表面への接着能を低下させる相互作用などを示す、新たな微生物種の組み合わせを複数組見出だした。これら相互作用に関与する活性物質についても精製を進めた。(4)異種細菌間相互作用を示すヒト表皮分離細菌について、ゲノムDNAを抽出、精製し、次世代シークエンサーによるドラフトゲノム解析を行った。また、高分解能LC/MS/MSシステムを用いたプロテオーム解析により、異種細菌間相互作用を示す細菌のタンパク質発現について、最適な共培養条件、および、分析、解析条件について検討し、共培養時と単独培養時との比較を試みた。次年度は以下の内容を計画している。(1)異種細菌に対して細胞外マトリクス産生を誘導する細菌の活性物質を精製し、構造解析を試みる。(2)異種細菌の共培養により生産が誘導された細胞外マトリクスの構造解析を進め、その生理活性についても検討する。(3)これまでに単離してきたヒト表皮由来微生物と、ヒトに対して日和見感染症を引き起こす代表的な病原性菌との共培養で認められた新たな相互作用に関与する分子を明らかにする。(4)異種細菌間相互作用を示す細菌同士の共培養物に対するプロテオーム解析を進める。(1)異種細菌に対して細胞外マトリクス産生を誘導する細菌が分泌する活性物質について、精製度をさらに向上させ、構造解析を試みる。(2)異種細菌の共培養により生産が誘導された細胞外マトリクスについて、詳細な構造解析をさらに進め、その生物活性を明らかにする。(3)これまでに単離してきたヒト表皮由来微生物と、ヒトに対して日和見感染症を引き起こす代表的な病原性菌との共培養で認められた新たな相互作用に関与する活性物質を明らかにする。研究者の異動が予定されたため、少額の物品費で実施できる小研究課題を優先的に実施したことから、次年度使用額が生じた。研究者の新設研究室への異動があり、研究室設営のため予算執行を慎重に行ったため。当初計画していた研究課題を実施するために必要な物品の購入に重点的に使用する。研究者が新設研究室へ異動したため、当初計画していた研究課題を実施するために必要な物品の購入に重点的に使用する。
胆管内乳頭状腫瘍の提唱とその発生・進展に関する分子病理学的研究

今同の研究により、以下の研究成果を上げることが出来た。(1)IPNBの画像、形態、組織像を検討し、IPNBは膵のIPMNの主膵管型に相当することを明らかにした。(2)IPNBの表現型として、膵胆管型、好酸型、腸型、胃型があり、各々で特徴的な分子の発現パターンおよび臨床病理画像を明らかにした。(3)IPNB発生・進展に関する分子、遺伝子異常を解析し、P53やp16(INK4a)がその発生に、MMP7の発現がその進展、予後に関連することを明らかにした。これらの研究成果を米国肝臓学会誌Hepatologyなどの欧米の一流紙に掲載した。(4)IPNBに関する主題は胆道学会、消化器病学会などの学会で複数同取り上げられ、さらに"肝胆膵"や"胆道"などの専門誌でも特集あるいは特別企画として取り上げられ、IPNBは胆道学では1つのトピックスとなり、大きく研究が展開した。(5)現在、WHOのblue book series(界で最も権威のある腫瘍病理の単行本)の改訂が行われており、胆管系腫瘍(研究代表者中沼が責任編集者)でも、我々が提唱したIPNBと肝胆の粘液産生嚢胞性腫瘍の概念が認められつつある。(6)IPNBに関する研究は国内外で大きな展開を見せており、この基盤研究Bの本来の目的は達成された。ヒト胆道と膵の組織成分の類似性を検討する。まず、胆道周囲腺が不完全な膵腺組織である可能性を、組織標本を用い、形態、蛋白・遺伝子レベルで検討する。次に、培養胆道上皮と膵管上皮の遺伝子発現を網羅的に解析し、類似性を検討する。培養胆道上皮に膵多分化遺伝子Pdx1の遺伝子導入を行い、Pdx1強発現による胆道上皮での遺伝子発現の変動や形態変化を明らかにする。胆道癌の初期病変BilIN、膵癌の初期病変PanINを用い、免疫染色、ISH法、microdissection法、RT-PCR法を用い、BilINとPanINの比較を行う。胆道腫瘍の発生・進展に、胎生期の胆道・膵で発現する遺伝子、特にPdx1の再発現とその意義、さらにPdx1再発現に関連して発現する癌関連の遺伝子異常を検索する。胆道癌の初期病変であるBilINの分類に関する国際コンセンサスを形成する。胆道と膵の双方に発生する炎症性疾患および形成異常を比較し、共通する病態の関与を蛋白、遺伝子発現の観点から検討する。本年度は、胆管内乳頭状腫瘍intraductal papillary neoplasm of bile duct(IPN-B)の疾患概念を臨床病理学的に確立し、その発生・進展過程を膵pancreatic intraductal papillary mucinous neoplasm(IPMN-P)および通常型胆管癌と比較した。(1)外科的切除材料を用いた検討で、IPN-Bには、嚢状の拡張を示すもの、大量の粘液産生を示すもの、乳頭状増殖の目立つものがあることが明らかとなり、臨床病理学的に複数な病態を呈することが明らかとなった。(2)IPN-Bは、通常型胆管癌に較べ、外科的術後の予後が良好であり、またMUC2の発現が目立った。一方、通常型胆管癌ではMUCIの発現が目立ち、両者に粘液形質の発現の違いが見られ、発癌経路の違いが示唆された。(3)IPN-BとIPMT-Pに共通する臨床病理像、粘液形質/産生、細胞形質を検討した結果、IPN-BはIPMN-P、特に主膵管型のカウンターパートとしての特徴を示した。IPMN-Pの分枝型に相当する症例はIPN-Bでは殆どみられなかった。(4)IPN-Bの進展や浸潤能の獲得にはmatrixmetalloproteinase MMP-7の発現が重要であった。また、進展と伴に細胞接着因子であるβ-カテニンやE-カドヘリンの発現が低下し、これにより癌細胞の進展が促進されることが示唆された。

本年度は、胆管内乳頭状腫瘍intraductal papillary neoplasm of bile duct(IPN-B)の疾患概念を臨床病理学的に確立し、その発生・進展過程を膵pancreatic intraductal papillary mucinous neoplasm (IPM)および通常型胆管癌と比較した。(1)外科的切除材料を用いた検討で、IPN-Bには、嚢状の拡張を示すもの、大量の粘液産生を示すもの、乳頭状増殖の目立つものがあることが明かとなり、臨床病理学的に複数な病態を呈することが明らかとなった。(2) IPN-Bは、通常型胆管型に較べ、外科的術後の予後が良好であり、またMUC2の発現が目立った。一方、通常型胆管癌ではMUC1の発現が目立ち、両者に粘液形質の発現の違いが見られ、発癌経路の違いが示唆された。(3) IPN-BとIPMT-Pに共通する臨床病理像、粘液形成/産生、細胞形質を検討した結果、IPN-BはIPMN-P、特に主膵管型のカウンターパートとしての特徴を示した。IPMN-Pの分枝型に相当する症例はIPN-Bでは殆どみられなかった。(4) IPN-Bの進展や浸潤能の獲得にはmatrix metallproteinase MMP-7の発現が重要であった。また、進展と伴に細胞接着因子であるβ-カテニンやE-カドヘリンの発現が低下し、これにより癌細胞の進展が促進されることが示唆された。21年度は、以下の研究成果を上げることが出来た。(1)IPNBの画像、形態、組織像を検討し、IPNBは膵のIPMNの主膵管型に相当することを明らかにした。(2)IPNBの表現型として、膵胆管型、好酸型、腸型、胃型があり、各々での特徴的な分子の発現パターンおよび臨床病理学像を明らかにした。(3)IPNB発生・進展に関連する分子、遺伝子異常を解析し、P53やp16(INK4a)がその発生に、MMP7の発現がその進展、予後に関連することを明らかにした。これらの研究成果を米国肝臓学会誌Hepatologyなどの欧米の一流紙に掲載した。(4)IPNBに関する主題は胆道学会、消化器病学会などの学会で複数回取り上げられ、さらに"肝胆膵"や"胆道"などの専門誌でも特集あるいは特別企画として取り上げられ、IPNBは胆道学では1つのトピックスとなり、大きく研究が展開した。(5)現在、WHOのblue book series(世界で最も権威のある腫瘍病理の単行本)の改訂が行われており、胆管系腫瘍(研究代表者中沼が責任編集者)でも、我々が提唱したIPNBと肝胆の粘液産生嚢胞性腫瘍の概念が認められつつある。(6)IPNBに関する研究は国内外で大きな展開を見せており、この基盤研究Bの本来の目的は達成された。
拡張現実感を用いた物体の見えの制御に関する研究

本研究では,プロジェクタ・カメラ同軸光学系を試作し,立体物に対する見えの制御方法を確立した.2009年にはバウハウス大学(ドイツ)に赴き,プロジェクタ・カメラシステムを用いた拡張現実感技術において世界的に有名なProf. Oliver Bimberにアドバイスを頂き,彩度やコントラストの強調のみならず任意の見かけの制御を行う方法論を確立した.さらに,提案手法の応用として,二色性色覚のためのカラーマネジメント技術と弱視のための見かけの強調技術を確立した.また,見かけの制御技術の光学顕微鏡への応用も試みた.本研究では,プロジェクタ・カメラ同軸光学系を試作し,立体物に対する見えの制御方法を確立した.2009年にはバウハウス大学(ドイツ)に赴き,プロジェクタ・カメラシステムを用いた拡張現実感技術において世界的に有名なProf. Oliver Bimberにアドバイスを頂き,彩度やコントラストの強調のみならず任意の見かけの制御を行う方法論を確立した.さらに,提案手法の応用として,二色性色覚のためのカラーマネジメント技術と弱視のための見かけの強調技術を確立した.また,見かけの制御技術の光学顕微鏡への応用も試みた.平成21年度は,まず立体物に対する見えの制御を実現するにあたり,プロジェクタカメラ同軸光学系を試作した.試作した同軸光学系は透過率70%反射率30%のハーフミラーを用い,ハーフミラーを透過してシーンへ補正光を投影する.これと同時にシーンからの反射光をハーフミラーで反射した同軸上に設置されたカメラで撮影するものである.試作前に懸念していた投影光のハーフミラー上での写り込みについては,余剰光をハーフミラーから距離を離した光吸収シートにより処理することで実用上問題の無いレベルまで低減することができることが確認された.また,平成21年度はバウハウス大学(ドイツ)に赴き,プロジェクタカメラシステムを用いた拡張現実感技術において世界的に有名なJohn Kepler University, Linz (元Bauhaus University Weimar)のProf.Oliver Bimberにアドバイスを頂き,彩度やコントラストの強調のみならず任意の見かけの制御を行う方法論を確立した.具体的には,プロジエクタカメラ系の光学的な関係をモデル化して,モデル予測制御を用いることで,彩度,コントラストおよび色相の制御,色彩の除去,エッジ強調,ぼかし,明度の均一化などを自由に行う方法論を確立した.これらの成果により,複数のプロジエクタカメラシステムを協調させた立体物の全周囲に対する見えの制御を行うための環境が整った.また,見えの制御技術の確立と同軸光学系の検討の過程において,Prof.Oliver Bimberらと共同で本研究のベースとなっているプロジェクタカメラによる見かけの強調技術の光学顕微鏡への応用を行い,同軸光学系における見かけの制御に関する知見を得た.本研究は「プロジェクタ・カメラ系による動的な物体の見えの強調技術」を発展させ,実応用に向けて立体物に対する動的な見えの制御技術を確立することを目的とする.この目的のもと本研究課題では,(1)プロカム同軸光学系の設計および試作,(2)立体物に対する見えの制御手法の確立.,(3)全周囲に対する見えの制御手法の確立.,(4)様々な分野への応用の実現可能性の評価の実施を計画し,平成22年度はこのうち(3),(4)を実施した.(3)全周囲に対する見えの制御手法の確立プロジェクタ・カメラ同軸光学系を用い,立体物に対する見かけの制御手法を確立した.また,複数のプロジェクタ・カメラ系の協調方法について研究した.この過程で見かけの制御は人間が見るための補助としてだけではなく,コンピュータビジョン応用として,物体認識における陰影問題が解決できる,HDR画像をが取得でき,類似物体の識別が可能になることが確認された.(4)様々な分野への応用の実現可能性の評価二色性色覚のためのカラーマネジメント技術と弱視のための見かけの強調技術および光学顕微鏡への応用について評価した.二色性色覚のためのカラーマネジメシト技術では,Jeffersonらの方法を適用した.石原式色覚異常検査表を用いた検証より,提案手法を用いることで混同色の色彩を置き換えることが可能であり,二色性色覚で判読できないパターンも判読可能になることが二色性色覚の評価モデルより確認された.光学顕微鏡への応用はJohannes Kepler UniversityのProf.Oliver Bimberとの共同研究で行い,低コントラスト物体のコントラスト強調,湿組織上の光沢除去,均一照明による画像処理品質向上,石英の色偏差強調などを実現した.以上,見かけの制御の実用化に向けて大きな成果が得られた.
非アロステリック型ピルビン酸キナーゼM1の活性制御機構と糖代謝の調節

ピルビン酸キナーゼ(PK)M遺伝子から発現するM2アイソザイムは典型的なアロステリック型PKである一方、M1は非アロステリック型であることが知られている。ところが、反応に必要なMgイオンに対する応答性に着目すると、M2のMgイオンに対する応答は単純飽和型であり協同性を示さないのに対して、非アロステリック型アイソザイムであるM1では協同性を示すことを見出した。本研究では、主としてこのアイソザイムの2価イオン要求性について検討した。バキュロウイルス・昆虫細胞発現系を用いて調製した精製酵素を用いて以下のような解析を行った。M2ではMgイオンに対して、これまで知られているようにほぼ単純飽和型の速度論的性質を示したが、M1では見かけの活性化定数K=0.51.0mMをもった、弱いジグモイド状の応答を示した。このことから、M1にはアロステリック型M2では見られない、Mg依存的はサブユニットの協同的な構造変化があると考えられた。すなわち、M1は常に活性型コンフォメーションであるために、基質であるホスホエノールピルビン酸やフルクトース1,6二リン酸(FBP)による活性化という現象は観察されないが、Mg濃度の低下により不活性型コンフォメーションに変化し、この2価イオン濃度の上昇とともに協同的に活性型へと変化することが示唆された。十分な濃度(5mM以上)のFBPを共存させておくと、先述したようなジグモイド状の応答、すなわち協同性が認められないことからも、これまで恒常的に活性型コンフォメーションであると考えられていたM1はMgイオンによって速度論的な性質が変化し、活性が調節されるものと考えられた。さらに、M2のTyr-389をM1のPheに置換することによってMgイオンの応答性がジグモイド状のM1型に変化することから、389位のアミノ酸残基が重要と考えられた。このようにMgイオンの関わる調節には様々な様式があることがわかったが、糖代謝の生理的な調節における意義をさらに検討していきたいと考えている。ラットピルビン酸キナーゼの非アロステリック型アイソザイムであるM1の2価イオン要求性について検討した。酵素はバキュロウイルス・昆虫細胞発現系を用いて産生し、硫酸アンモニウム分画、陽イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過により均一に精製したものを用いた。アミノ酸レベルで一次構造上約90%の相同性をもつアロステリック型アイソザイムであるM2では、2価イオンであるマグネシウムイオンに対して、これまで知られているようにほぼ単純飽和型の速度論的性質を示したが、M1では、見かけの活性化定数K=0.51.0mMをもった、弱いジグモイド状の応答を示した。このことから、M1にはアロステリック型M2では見られない、アグネシウム依存的はサブユニットの協同的な構造変化があると考えられた。すなわち、アロステリック型アイソザイムでは、基質であるホスホエノールピルビン酸(PEP)や活性化エフェクターであるフルクトース1,6二リン酸(FBP)によって不活性型から活性型へと協同的なコンフォメーション変化が起きるが、マグネシウム濃度の変化ではそのような変化は起きないことがわかった。これと対照的に、M1は常に活性型コンフォメーションであるために、PEPやFBPによる活性化という現象は観察されないが、マグネシウム濃度の低下により不活性型コンフォメーションに変化し、この2価イオン濃度の上昇とともに協同的に活性型へと変化することが示唆された。

十分な濃度(5mM以上)のFBPを共存させておくと、先述したようなジグモイド状の応答、すなわち協向性が認められないことからも、これまでnativeに活性型と考えられていたM1アイソザイムはマグネシウムイオンによって速度論的な性質が変化し、活性が調節されるものと考えられた。ピルビン酸キナーゼ(PK)M1アイソザイムと共通の遺伝子から発現し、相互排他的オルタナティブスプライシングによって生成するM2アイソザイムは典型的なアロステリック型PKであり、哺乳類ではプロトタイプの酵素と考えられている。このアロステリック型のM2のMgイオンに対する応答は、単純飽和型(hyperbolic)であり協同性を示さない。PK-M2のTyr-389をM1のPheに置換することによってMgイオンの応答性がジグモイド状のM1型に変化することから、Mgイオンに関するM1の特殊な性質を決定づける残基として389位のアミノ酸(PK-M1の場合はPhe)が最有力候補と考えられた。さらに、MgイオンによるPKの活性制御を別の観点からも検討するため、エフェクター以外のリガンドであるMgイオンの濃度変化による酵素の失活という点からPK-M2を用いて詳細に検討した。FBP非存在下において反応系に添加するマグネシウムイオン濃度を0.1mMまで低下させると、急激な酵素活性の消失が観察された。その失活過程は見かけ上一次反応に従っていた。反応途中でFBPを添加すると、ヘテロットロピックなアロステリック効果による活性化が観察されたが、その時点での残存活性に依存したものであり、不活性化された酵素はFBPの添加によっても再活性化されないこと、そして酵素の失活途中であってもFBP添加によって酵素が安定化されそれ以上活性が低下しないことが速度論的な解析からわかった。このような性質は常に安定なPK-M1には観察されず、アロステリック型と非アロステリック型のPKにおけるMgイオンによる制御には様々な様式があることがわかった。どのような構造基盤によってこういった制御の違いが生じ、糖代謝の生理的な調節において実際にどういった意義があるのかをさらに検討していきたいと考えている。
シーマージンの確率論的推定法の研究

本研究では、シーマージンに寄与する要因の一つである"季節(風、波)影響"についてシーマージンを船速低下の形で表現した場合の推定法を確率論の立場から合理的な解釈に基づいて提案することを目的としている。特に、意識的減速に焦点をあて、意識的減速の主因であるプロペラレーシングと甲板冠水の推定法について短期不規則波浪海面ならびに長期予測法のアルゴリズムを純確率論的に改良し、その成果にもとづいて、基本設計段階での船の性能保証に際して有力な判定ツールを提供する。初年度、2年度および3年度の成果に基づいて、統計変動量のあるレベルを超える持続時間推定式を適用し、甲板冠水予測法、プロペラレーシング予測法などのアルゴリズムの汎用化を図り、シーマージンの確率論的推定法の構築に向けての有用なツールを得た。まず、統計学基礎理論に基づき、統計変動量のあるレベルを超える持続時間の推定式として理論的に誘導された式を甲板冠水の現象ならびにプロペラレーシングの現象へ適用して、その結果を船速低下推定法のアルゴリズムに組み込んだ。初年度ならびに2年度に引き続き、対象船型として、150mの多軸コンテナ船等を採用しシリーズ計算を実施した。また、人工衛星長期波浪データベースを利用して、長期予測計算を実施した。さらに、推定式の精度を検証確認するために、小型高速艇による実船試験を追加実施した。最終年度における研究の重点は、初年度ならびに2年度における研究成果の検証確認を行なうことにあり、ほぼ初期の目標を達成できたが、甲板冠水予測法とプロペラレーシング予測法のアルゴリズムを融合するプロセスが複雑となりすぎて、シーマージン推定の従来法による結果と比較し大幅な改善を達成できたとは言えない。アルゴリズムの合理的な融合法を検討することが今後の課題であると思われる。研究最終年度として、3年間における研究成果をまとめ、研究を完了した。特に、意識的減速に焦点をあて、その推定法について短期不規則波浪海面ならびに長期予測法のアルゴリズムを純確立論的に改良し、その成果にもとづいて、基本設計段階での航海速力推定制度を向上させ、船の性能保証に際して有力な判定ツールを提供する。研究初年度である今回は、シーマージンの確率論的推定法開発のための調査研究を実施した。まず、統計学基礎理論に基づき、統計変動量のあるレベルを超える持続時間の推定式を理論的に誘導し、その式を甲板冠水の現象ならびにプロペラレーシングの現象へ適用して、その結果をシーマージン推定法のアルゴリズムに組み込んだ。また、海域として、北太平洋を重点的に、汎地球波浪統計資料から、船舶満載喫水線帯域図の見直しを行うために、長期波浪発現確率を再構成して、シーマージンの観点から帯域の区画線の根拠を調査した。さらに、推定式の精度確認のために、小型高速艇による実船試験を実施した。平成11年度における研究の重点は、[0]統計変動量のあるレベルを超える持続時間推定式の誘導、[I]甲板冠水予測法とプロペラレーシング予測法のマッチング、[II]シーマージン推定法の構築とシリーズ数値計算、[III]就航コンテナ船計測データの解析と推定法の評価、[IV]小型高速艇による実船試験であった。[0]、[I],[II]については、ほぼ初期の目標を達成できたが、[III]および[IV]については、解決すべき新たな課題ができたため、次年度以降に、引き続き研究の重点として継続し、その他については当初の研究計画どうりに研究を実施する予定である。本研究では、シーマージンに寄与する要因の一つである"

季節(風、波)影響"についてシーマージンを船速低下の形で表現した場合の推定法を確率論の立場から合理的な解釈に基づいて提案することを目的としている。特に、意識的減速に焦点をあて、その推定法について短期不規則波浪海面ならびに長期予測法のアルゴリズムを純確率論的に改良し、その成果にもとづいて、基本設計段階での航海速力推定精度を向上させ、船の性能保証に際して有力な判定ツールを提供する。研究2年目である今回は、初年度の成果に基づいて、統計変動量のあるレベルを超える持続時間推定式、甲板冠水予測法とプロペラレーシング予測法のマッチング、シーマージン推定法をシステマティックに組み合わせて、シーマージンの確率論的推定法開発のための調査研究を続行した。まず、統計学基礎理論に基づき、統計変動量のあるレベルを超える持続時間の推定式として理論的に誘導された式を甲板冠水の現象ならびにプロペラレーシングの現象へ適用して、その結果をシーマージン推定法のアルゴリズムに組み込んだ。次ぎに、シリーズ計算の対象船型として、175m一軸コンテナ船、150mの一軸コンテナ船、二軸コンテナ船、三軸コンテナ船等を採用した。人工衛星リモートセンシングデータから求められた長期波浪データのデータベースを利用して、長期予測計算を実施した。さらに、推定式の精度確認のために、小型高速艇による実船試験を実施した。平成12年度における研究の重点は、就航コンテナ船計測データの解析と推定法の評価、ならびに、小型高速艇による実船試験であった。ほぼ初期の目標を達成できたが、コンテナ船が一般に航行する海域をカバーする長期波浪データベースが未完成のため、就航コンテナ船実績との比較が十分にできなかった。研究最終年度である次年度に、引き続き研究の重点として継続し、当初の研究計画どうりに研究を実施し完了する予定である。本研究では、シーマージンに寄与する要因の一つである"季節(風、波)影響"についてシーマージンを船速低下の形で表現した場合の推定法を確率論の立場から合理的な解釈に基づいて提案することを目的としている。研究3年目で最終年度である今回は、初年度ならびに2年度の成果に基づいて、統計変動量のあるレベルを超える持続時間推定式を適用し、甲板冠水予測法、プロペラレーシング予測法などのアルゴリズムの汎用化を図り、シーマージンの確率論的推定法の構築に向けての有用な知見を得た。初年度ならびに2年度に引き続き、対象船型として、150mの多軸コンテナ船等を採用しシリーズ計算を実施した。また、人工衛星長期波浪データベースを利用して、長期予測計算を実施した。
脳関門排出輸送に基づく痙攣誘発性グアニジノ化合物の中枢解毒機構

腎不全患者に認められる神経異常症状は、脳内及び脳脊髄液内のグアニジノ化合物クレアチニンの蓄積が原因の一つとされている。しかし、クレアチニンの脳内動態を決定付ける分子機構には未だ不明が多く残されている。本年度は、脳内クレアチニン生成の分子細胞機構を明らかにするとともに、申請者の仮説「脳関門は、グアニジノ化合物を脳内から積極的に排出輸送する中枢解毒機構として機能している」ことを実証することを目的とした。クレアチニンは、クレアチン及びクレアチンリン酸から一定速度で非酵素的に変換されるが、申請者はクレアチンを合成する酵素(GAMT)が、オリゴデンドロサイト、嗅神経被覆グリア及びアストロサイトで豊富に発現することを明らかにした。さらにクレアチンリン酸を生成する酵素であるクレアチンキナーゼ(CK)は、ubiquitous mitochondrial CK(uCK-Mi)がニューロン構成要素のミトコンドリアに局在し、CK-Bがアストロサイトと抑制性ニューロンに高発現することを明らかにした。以上の結果から、クレアチニンは脳内ニューロン及びグリア細胞で生成されることが示唆された。脳室内に投与した[^3H]クレアチニンは半減期6.1分で脳脊髄液中から消失し、見かけの消失クリアランスは脳脊髄液のbulk flowを表す[^<14>C]イヌリンと比較して59倍速かった。一方、血液脳関門を介した[^3H]クレアチニンの脳内からの時間依存的な排出は少なくとも90分まで示されなかった。本研究から、グアニジノ化合物クレアチニンは脳内ではニューロン及びグリア細胞で生成され、血液脳脊髄液関門を介して脳内から排出輸送されるという脳関門の生理機能が明らかになった。
新規大環状化合物による包接を鍵とした金属内包フラーレンの可溶化と単離法の開発

広範囲の応用・実用化の期待されている金属内包フラーレンについて、新規大環状化合物による包接を鍵としたの可溶化と単離報の開発を目指した。剛直なパイ共役骨格を持つ新たな環状化合物を合成し、その化合物を用いた包接の評価を行った。この化合物は簡便に合成でき、多量に供給することが可能である。各種評価法からから、一定のサイズを持つフラーレンを選択的に包接することができる性質をもつことを見出した。また、理論研究者との共同研究によって、従来にない新たなフラーレンを包接する環状化合物の設計を行い、その包接時の安定化エネルギーなどを評価した。金属内包フラーレンは炭素ケージ内に金属を内包した分子である。金属原子からフラーレン殻への電子移動に由来して特異な電子物性や光物性を示すことから、広範囲の応用・実用化の期待されている。しかし、その研究は未だ発展途上である。その原因として分離・精製の困難さや、溶解性の低さといった問題が挙げられるその原因としては分離・精製の障害が挙げられる。金属内包フラーレンの科学を発展させるためには、より優れた分離法の開発が不可欠である。そこで、精密に設計したπ共役骨格を有する環状化合物を合成し、その内部へ金属内包フラーレンを選択的に包接化させることで、前述の問題を解決できると発想した。本年度では、それまでに見出しつつあったベンゼン環11個からなる大環状化合物である[11]シクロパラフェニレン(CPP)による金属内包フラーレンの抽出について更なる検討を行った。様々な種類の金属内包フラーレンとの結合定数を明らかにするとともに、アーク放電によって合成したフラーレン混合物の中からガドリニウム(Gd)原子を内包した金属内包フラーレンであるGd@C82の高純度化に成功した。また、これらの結果をもとにして、剛直なパイ共役骨格とともにスペーサー部分を挿入した新たな環状化合物を設計し合成を行った。この化合物はCPPと比較して、より簡便に合成できるだけでなく、比較的多量に供給することが可能である。核磁気共鳴スペクトル、光吸収スペクトル、質量分析などの測定の結果から、ある一定のサイズを持つフラーレンを選択的に包接することができる性質をもつことを見出した。その原因として分離・精製の困難さや、溶解性の低さといった問題が挙げられる。本年度では、剛直なパイ共役骨格とともにスペーサー部分に硫黄原子を挿入した新たな環状化合物を合成し、その化合物を用いた包接の評価を行った。また、理論研究者との共同研究によって、従来にない新たなフラーレンを包接する環状化合物の設計を行い、その包接時の安定化エネルギーなどの評価を検討した。26年度が最終年度であるため、記入しない。ナノカーボン化学26年度が最終年度であるため、記入しない。CPPによる金属内包フラーレンの高純度を達成するだけでなく、新たにフラーレンを選択的に包接することができる環状化合物類を見出しつつあり、本年度としてはおおむね順調に達成したといえる。今後の研究推進に関しては、新たに見出した環状骨格をもとにして、側鎖の導入など更なる官能基の検討を行い、金属内包フラーレンの可溶化を試みるととともに実際にサイズ選択的な抽出を目指す。特に抽出に関してはCPPの場合には不可能であった、金属内包フラーレンからの取り外しについて検討を行う予定である。実際に金属内包フラーレンを様々な応用をする上で、包接後の取り外しは極めて重要であるだけでなく、繰り返し再利用による抽出も可能となると考えられる。
繊維補強コンクリートによる放射性核種の格納効果に関する基礎的研究

本研究は、放射性廃棄物のあるいは核反応生成物(核種)に対する遮蔽隔離材として繊維補強コンクリートを使用すると考えた場合の検討項目について考察を行ったものである。その研究成果をまとめれば、以下のようである。1.放射性廃棄物の格納法と工学的バリアシステムについて調査し、廃棄物の地下貯蔵法に関する従来の研究を概観した。そして、監視手法としてのアコースティック・エミッション(AE)法の適用性も検討した。2.コンクリート壁にひびわれが発生する場合の監視法としてのAE法の適用性について検討し、遮蔽用コンクリートでのひびわれ機構解明の可能性を明らかにした。3.有限要素法(FEM)と境界要素法(BEM)による解析コードの整備と開発を行った。そして、核種輸送のシミュレーション解析により次の点が明らかになった。(1)バリア材の拡散係数、吸着係数、吸収係数は遮蔽壁の表面付近での汚染領域の広がりより、そこでの蓄積に主に関係する。(2)汚染領域の広がりに大きく関係するのは、気体の移動速度であり透気性能である。これは透水性とも関連することより密実なコンクリートの開発が期待される。4.物性値として重要な透水係数を非定常散実験により求める方法を開発した。ここで透水係数の決定に際して、初年度は一次元理論解に基づいた方法を考案したが、最終年度では実際の供試体のFEM解析結果より補正する方法を開発した。これによって繊維補強コンクリートの透水係数を実際に評価したが、モルタル、普通コンクリートとオーダ的に差異はなく、繊維の混入は透水性能に影響のないことが確認された。本研究は,放射性の核反応生成物(核種)の遮蔽隔離材として,繊維補強コンクリートを使用するうえでの有用性について基礎的な検討を行うことを目的としたものである.初年度は,まず,種々の繊維補強コンクリートの格納能力を検討するために,透水試験を実施した.しかしながら,従来のアウトプット法による方法では,実験に長期間を要し,かつ,実験データにもバラツキが存在したため新たな測定法を検討した.それは, 24時間の透水実験後に供試体を割裂破壊し,そこで観測される浸透深さから,非定常拡散方程式の理論解を用いて決定する方法である.このとき,浸透深さの測定を厳密に行うため,浸透液としてNacl水溶液を用い,フルオレセインナトリウムと硝酸銀を試薬として用いることにより塩分濃度の高い領域を着色する方法を用いた.その結果,コンクリート,モルタルともに鋼繊維を1%3%混入することによって,約2倍程度透水係数が大きくなることが認められた.しかし,最大でも, 1×10^<-10>cm/secと非常に小さな値であり,遮蔽材としては十分に有効であることが認められた.核種移動を解析するプログラムとしては,非定常輸送方程式を解く必要があるため有限要素法(FEM)およびFEMと境界要素法(BEM)の結合法による数値解析プログラムの開発を行った.この解析例によれば,岩盤に対し1/10程度の透水係数を有するコンクリートをライニング材として使用するだけで,かなりな格納効果を期待できることが明らかになった.本研究は、放射性廃棄物あるいは核反応生成物(核種)に対する遮蔽隔離材として線維補強コンクリートを使用するうえでの検討項目に関して基礎的な考察を行ったものである。実験としては透水実験を行ったが、従来のアウトプット法では長時間を要し、かつ、データに大きなバラツキを生じたため24時間程度での非定常状態で透水係数を求める方法を昨年度に開発した。しかし、非定常拡散方程式の解を求める際に一次元理論解を用いていたため、実際の供試体に対応する二次元非定常拡散方程式の解についてFEM(有限要素法)により検討した。その結果、透水係数を求める際に修正の必要なことが明らかとなり、この点についての改良を行った。核種の漏洩に関する拡散方程式および輸送方程式の解析コードの整備および開発を行った。

そして、開発したソフトウェアを用いて核種輸送のモデルケースについて幾つかのシミュレーション解析を試みた。その結果、以下のような点が明らかとなった。(1)格納材料およびバリア材の拡散係数、吸着係数、吸収係数は、遮蔽壁表面付近での汚染の蓄積に主に関係する。(2)放射性核種の減衰特性は、格納性の評価に考慮する必要があるほどの影響はない。(3)汚染領域の広がりに大きく関係するのは、気体の移動速度である。したがって透気性の低い材料の開発が望まれるが、これは透水性の抑制とも同意義と考えられる。この他に、放射性物質の地下貯蔵に関する従来の研究をも調査し、監視技法としてのアコースティック・エミッション法についても検討を行った。また、境界要素法によるひびわれ進展解析についても考察した。
哺乳類配偶子における免疫関連分子の発現と卵透明帯の機能に関する生物学的意義の解明

これまでにマウスの精子や卵子上にそれぞれMHCクラスII抗原、CD4/p56^<lck>複合体を見出してきた。更に、バキュロウイルス-昆虫細胞(Sf9)の系にマウスの卵子由来のCD4 cDNAを組み込み発現させ、種々の精子を媒精して、その結合実験によって受精の場におけるCD4とMHCクラスII抗原との種特異的結合を明らかにしてきた。一方、マウスの卵巣における閉鎖卵胞形成の分子機構の解明を進め、この機構がアポトーシスによる細胞死の機序によって主に推進されていることを見出してきた。とりわけFas/Fas Ligand(FasL)システムの発現とその役割に焦点を絞り,in situ hybridizationやRT/PCRでtranscriptionalレベルでの発現を、またFas/FasL抗体を使用し蛍光抗体、酵素抗体法、免疫沈降法でtranslationalレベルでの発現を検討した。その結果Fasは卵母細胞、過排卵や、ある段階での顆粒膜細胞に発現し、FasLは顆粒膜細胞に局限していることを確認した。またこれらの発現はゴナドトロピン(FSH)によって制御されていることも見出している。更に、バキュロウイルス-Sf9系でFasLをSf9細胞上に高度に発現させ、卵透明帯を除去した卵子に反応させると、卵子のアポトーシスを誘導できることを発見した。FasLを発現している顆粒膜細胞と卵子との試験管内反応でも同様の結果を得た。逆に、卵透明帯が付着している卵子には顆粒膜細胞やSf9-FasL細胞によりアポトーシスを誘導することは出来なかった。ヒトの卵巣においても顆粒膜細胞や、卵母細胞にFasが発現しているとの他家の報告ともあいまって、これらの実験結果を総合すると、哺乳類の卵巣におけるFas/FasLシステムはこれまで長い間謎とされてきた閉鎖卵胞形成機序の最初の誘発分子として働いていることを解明できたと考える。そして、排卵卵子とはおそらく卵透明帯の完成によってこのFas/FasL分子間相互作用が遮断されアポトーシスから免れたものであることが示唆された。これまでにマウスの精子や卵子上にそれぞれMHCクラスII分子、CD4/P56^<lck>複合体分子を見い出してきた。そこでこれらの免疫関連分子による受精における接着・結合や情報伝達経路を明らかにすること、また卵透明帯には精子レセプターとしての機能の他に、割球の保護作用、卵巣における閉鎖卵胞形成機序としてのアポトーシスからの卵子のエスケープメカニズムや生殖系路感染に対するDefense Barrierとしての役割などの新しい機能としての役割の解明を目的としている今年度はバキスロウィルス-Sf9の系でマウスの卵子由来のCD4-cDNAを組み込み発現させ、種々の精子を媒精として、その結合実験によって受精の場におけるCD4とMHCクラスII分子との種特異性を明らかにしてゆく系を構築してきた。卵透明帯の新しい機能に関する研究では、マウス卵巣におけるアポトーシス誘導分子として卵細胞や顆粒膜細胞におけるFarの発現と顆粒膜細胞でのFasLigardの発現をRT/PCR-Southern法やEnsitu hybridization法によってmRNA levelsで確認してきた。それぞれ学会発表、論文発表を行ってきた。さらにTranslationallevelsでの発現つまり蛋白levelsでの発現を検討し、実際in vitroの実験系で顆粒膜細胞によって透明帯除去した卵がアポトーシスを引きおこすことを見い出しつつある。

この実験系に卵透明帯のいずれの分子構造がこのアポトーシスを制御するのか証明することによって目的を達することが出来る。ブタの卵透明帯の構造解析の結果硫酸化された糖鎖構造がみつかり、これが感染防御の中心的分子ではないかと推測している。マウス卵巣における閉鎖卵胞形成の分子機構の解明を進め、この機構がアポトーシスによる細胞死の機序によって主に推進されていることを見いだしてきた。とりわけFas/Fas Ligand(Fas L)システムの発現とその役割に焦点を絞り検討した。その結果Fasは卵母細胞、過排卵卵細胞や、ある段階での顆粒膜細胞に発現し、Fas Lは顆粒膜細胞に局限して発現していることを確認した。さらにこれらFas/Fas Lの発現はゴナドトロピン(FSH)によって制御されていることも見いだしている。分子レヴェルでの発現を検討するめたにFas/Fas L RNAプローブを作成し、insitu hybridization、RT/PCRでtranscriptionalレヴェルでの発現を調べた。同時に抗Fas/Fas Lモノクロナール抗体やアフィニティー純化抗体を使用してtranslatioanlのレヴェルでの発現を蛍光抗体、酵素抗体法で検討した。さらに、バキュロウイルス-昆虫細胞(Sf9細胞)の系でFas LをSf9細胞上に高度に発現させ、卵透明帯を除去した卵子に反応させると、卵子のアポトーシスを誘導できることを発見した。Fas Lを発現している顆粒膜細胞と卵子との試験管内反応でも同様の結果を得た。逆に、卵透明帯が付着している卵子には顆粒膜細胞やSf9-Fas L細胞によりアポトーシスを誘導することはできなかった。ヒトの卵巣において卵母細胞にFasが発現しているとの他家の報告ともあいまって、これらの実験結果を総合すると、哺乳類の卵巣におけるFas/Fas Lシステムはこれまで長い間謎とされてきた閉鎖卵胞形成機序の最初の誘発分子として働いていることを解明できたと考える。そして、排卵卵子とはおそらく卵透明帯の完成によってこのFas/Fas L分子間相互間が遮断、停止されたものであることが示唆された。
神経炎症反応によって制御される脳内アミロイド代謝システムの分子機構

高齢化社会を迎え、アルツハイマー病(AD)は大きな社会問題となっている。本研究計画において、申請者はAD発症に関わるAβの産生及び分解機構を制御する脳内炎症システムに関する分子基盤の解明を目指し、研究を遂行した。特に平成25年度においてはAβを分解するシステムについて、アストロサイトとの関連に注目して解析を進めた。その結果、ヒトアストロサイトーマCCF-STTG1の培養上清にAβ分解活性が存在することを見出した。この活性はセリンプロテアーゼ阻害剤DIFPによって阻害され、さらに各種阻害剤の検索から、組織型カリクレインファミリー分子の一つKLK7がその活性を担っていることが示唆された。実際にsiRNAによるノックダウン実験や抗KLK7阻害抗体などを用いて、CCF-STTG1培養上清中のAβ分解活性にKLK7が必要であることを明らかにした。またリコンビナントタンパクを用いて、KLK7タンパクにAβ分解能が存在することも見出した。引き続き免疫染色により、KLK7が脳内においては神経細胞やアストロサイトに発現していること、特にアストロサイトに強い発現が確認された。これらの結果から、脳内におけるAβ代謝システムの一端を担う分子メカニズムとして、アストロサイトから分泌されているKLK7が想定された。今後KLK7ノックアウトマウスを用いてその重要性についてさらに検討を行う他、アストロサイトのKLK7発現を上昇させる化合物をスクリーニングし、新規AD創薬につなげていくことを考えている。25年度が最終年度であるため、記入しない。これまでに申請者は、AD発症に関わるAβの産生機構、特にセクレターゼについて研究を進めてきた。その過程で、Aβが神経活動依存性に産生されること、さらに炎症性メディエーターであるS1P、TNFβなどのシグナル刺激によりAβ産生が変化することを見出していた。しかしその分子機構の多くについては明らかではない。そこで初代培養神経細胞およびグリア細胞を用い、S1P関連脂質、S1P受容体アゴニスト・アンタゴニストなどがAβ産生に及ぼす影響について検討を行い、FTY720やKRP203などのS1P受容体アゴニストがAβ産生を抑制することが明らかとなった。その作用点としては、γセクレターゼ活性に対することが示唆されたが、in vitroアッセイでは影響が見られなかったことから、何らかの受容体を介したシグナル伝達によってγセクレターゼ活性が影響を受けていることが明らかとなった。しかし、S1Pとは大きく異る構造を持つ1型S1P受容体アゴニストSEW2871や、1型S1P受容体アンタゴニストW123ではAβ産生に対する影響は観察されなかった。さらに通常S1P受容体はGiを介してシグナル伝達を行うが、Gi阻害剤であるSuraminも神経細胞からのAβ産生に影響を与えなかった。以上から、FTY720およびKRP203がAβ産生を抑制する薬効については、その受容体、下流のシグナル伝達機構、ともに新規のものであることが推測された。当初の計画のうち、FTY720およびKRP203によるAβ産生抑制作用について、既知のS1P受容体とGiシグナル経路を介さない、新規受容体が関与していることを解明し、現在4つの受容体がその候補として残されている。また下流についてもアレスチン経路の可能性があることが初期的検討から明らかとなっていることから、γセクレターゼの輸送について検討を行なっている。一方、グリア細胞由来Aβ分解酵素についてもキモトリプシン型セリンプロテアーゼであることが明らかとなり、siRNAによる候補分子の解析とケミカルバイオロジーによる分子実態の同定を進めている。FTY720およびKRP203のシグナル経路については、受容体が明らかとなった段階で次に内因性リガンドの同定を目指す。現在得られている候補GPCRはいずれもオーファン受容体であることから、リピドミクスを含めたオミクス的アプローチを行うことを考え、既に初期検討に着手している。

またAβ分解酵素についてもその分子実態として絞り込みが進みつつあることから、ノックダウンが可能となるようにウイルスベクターの作成を開始し、最終的にはin vivoでの検証を目指す予定である。25年度が最終年度であるため、記入しない。
心臓死肝移植モデルにおけるトロンボモジュリンの阻血再潅流障害抑制効果

トロンボモジュリン(Thrombomodulin:TM)/プロテインC系は、ヘパリン/アンチトロンビンIII系と並ぶ生体内の主要な抗凝固システムである。脳死肝移植のドナー不足は深刻で、心臓死肝移植への適応拡大は重要な課題である。しかし、心臓死肝臓移植において温阻血障害は不可避であり、primary non functionの危険性が高い。これは、再灌流障害により移植片の類洞内皮細胞から抗凝固因子であるTMが喪失するために微小血栓が形成され、局所循環が障害されるためである。組換えアデノウィルスを用いた遺伝子導入は、in vivo、静脈投与で肝臓特異的に高効率な遺伝子導入が可能である。そこで我々は、組換えアデノウィルスの静脈投与にて、ヒトTM遺伝子(hTM)をラット肝臓へ導入し、肝温阻血再灌流障害モデル(30分間の全肝阻血を行い、その後阻血を解除する)を用いて、TMの肝障害抑制効果について検討した。TM遺伝子導入群に対し、LacZ遺伝子導入群と非遺伝子導入群をコントロール群とした。再灌流6時間後、12時間後、24時間後、7日後に犠牲死させ、検体を採取した。まず、hTM遺伝子の導入を、RT-PCRと免疫染色で確認した。再灌流12時間後において、対象群と比較しTM遺伝子導入群で、AST、ALT、ヒアルロン酸の低下と組織血流量の増加を認めた。血清TM濃度に差はみられなかった。病理像では、HE染色でコントロール群と比較し、TM群で肝障害が抑制され、好中球数の浸潤は、TM群で抑制された。以上より、TM遺伝子を導入することで、再灌流12時間後において肝温阻血再灌流障害の抑制効果が認められた。トロンボモジュリン(Thrombomodulin : TM)は血管内皮上に発現し、ヘパリンと並ぶ生体内の強力な抗凝固蛋白である。心臓死肝移植モデルにおいては、肝移植片の温阻血障害により再灌流後に肝内の類洞内皮細胞より多量のTMが喪失し、これが肝移植片内の過凝固状態さらには肝機能不全の原因となるとされている。アデノウイルスベクターは静注後に肝臓に集積され、肝臓への高いレベルの遺伝子導入を達成しうるが、我々はヒトTMの機能ドメインの全長をコードするアデノウイルスベクター(AxCAhTM)を作成し、ラット肝臓へのhTM遺伝子導入に供している。導入された肝臓のhTMレベルに関してもRT-PCR、免疫染色ですでに確認し、高いレベルでhTM蛋白の発現が得られることを確認している。特に、免疫染色にては導入したhTM蛋白が、肝細胞のみでなく肝静脈域を中心とする類洞領域(類洞内皮細胞)にも発現していることを確認した。現在は、フット脳死肝移植モデルとして遺伝子導入肝に全肝阻血(30分間)を加え、血清肝細胞逸脱酵素、TMレベル、肝組織像、フィブリン沈着などについて分析中である。また、hTM導入肝の阻血再灌流障害軽減効果を評価するために、マーカー遺伝子であるLacZ(AcCAlacZ)を使用して、同様の阻血再灌流障害モデルにて実験を行い、hTM遺伝子導入効果を評価するためのコントロール群として検討中である。血管内皮細胞に発現するトロンボモジュリン(Thrombomodulin : TM)は、ヘパリンと並ぶ生体内の強力な抗凝固蛋白である。心臓死肝臓移植においては、肝臓移植片の温阻血障害により、再灌流後に類洞内皮細胞膜上のTMが多量に喪失するため、肝臓移植片内の過凝固状態が惹起され、これが肝臓移植片の機能不全の原因となるとされている。アデノウィルスを用いた遺伝子導入は、静脈注入されたアデノウィルスベクターが肝臓特異的に集積することから、肝臓への高効率の遺伝子導入が可能である。

我々は、アデノウィルスベクターを用い、ヒトTM遺伝子の機能ドメイン(hTM)をラット肝臓へ導入している。hTM遺伝子を導入した肝臓でのhTM mRNA発現に関してはRT-PCRで、hTM蛋白発現に関してはモノクローナル抗体を用いた免疫染色で確認し、いずれも高効率の発現が得られることを確認した。特に免疫染色では、hTM蛋白が肝細胞のみではなく中心静脈周囲の類洞内皮細胞にも発現していることを確認した。現在は、ラット肝温阻血再灌流障害モデル(30分間の全肝阻血を行い、その後阻血を解除する)において、hTM遺伝子導入による阻血再灌流の障害軽減効果を検討中である。具体的には、コントロール群としてLacZ遺伝子を用い、肝障害の指標として、血清肝逸脱酵素、肝組織像、フィブリン沈着などを分析中である。トロンボモジュリン(Thrombomodulin : TM)/プロテインC系は、ヘパリン/アンチトロンビンIII系と並ぶ生体内の主要な抗凝固システムである。脳死肝移植のドナー不足は深刻で、心臓死肝移植への適応拡大は重要な課題である。しかし、心臓死肝臓移植において温阻血障害は不可避であり、primary non functionの危険性が高い。これは、再灌流後の障害により移植片の類洞内皮細胞からTMが喪失するために微小血栓が形成され、局所循環が障害されるためである。組換えアデノウィルスを用いた遺伝子導入は、肝臓特異的に高効率な遺伝子導入が可能である。そこで我々は、組換えアデノウィルスの静脈投与にて、ヒトTM遺伝子(hTM)をラット肝臓へ導入し、肝温阻血再灌流障害モデル(30分間の全肝阻血を行い、その後阻血を解除する)を用いて、TMの障害抑制効果について検討した。TM遺伝子導入群に対し、LacZ遺伝子導入群と非遺伝子導入群を対象とし存。再灌流6時間後、12時間後、24時間後、7日後に犠牲死させ、検体を採取した。まず、hTM遺伝子の導入を、RT-PCRと免疫染色て確認した。再灌流12時間後において、対象群に比しTM遺伝子導入群で、ALTの低下と組織血流量の増加を認めた。AST、ヒアルロン酸、血清TMでは差はみられなかった。病理像では、HEで対照群に対し、TM群で肝障害の抑制を認めた。フィブリン血栓については有為な差はみられなかった。以上より、TM遺伝子を導入することで、再灌流後の微小循環障害を抑制し、肝障害を抑制しえた。