hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ロボット群と環境固定センサ群の相互支援による人間・ロボット共生環境の情報構造化

屋内屋外環境にビジョンなどのセンサやRFIDタグなどを分散配置し、環境を情報構造化することは人間と共生しつつ種々の作業を行う次世代ロボット実現の有力アプローチである。この環境情報構造化をロボット自身に行わせる手法を開発した。また環境側に配置したセンサと、移動ロボットに搭載センサを協調して用いることにより、センシング範囲の拡大や隠蔽の回避ができることを明らかにした。本研究は、ロボットと人間が共生する環境において、移動ロボット群と環境固定センサ群の相互支援により、高精度な環境幾何情報の獲得と情報構造化環境の保守とを自動化する手法、ならびに分散センサによる環境状況計測における精度限界を補完するロボット行動の実現手法の開発を目的とする。本年度は以下の成果を得た。1.分散ネットワークカメラを自動キャリブレーションするための群ロボットシステムの開発高精度測量機能を有するロボット群を開発した。これは、移動ロボット(親機1台、子機2台)と自動追尾測量装置で構成し、倉爪らによる既開発の協調ポジショニング法を実装して各ロボットの位置を計測するものである。さらにロボットに視覚識別マーカを付けて、環境固定カメラの視野内で移動させることにより、カメラ視野内に分散した多数点の正確な三次元位置ならびに二次元画像内位置を得る。こうして得られたデータに基づき、カメラの位置姿勢を自動キャリブレーションする手法を開発した。2.群ロボットシステムによる広域環境の三次元幾何モデルの自動生成移動ロボットに搭載したレンジセンサ情報と協調ポジショニングによるロボット計測位置とに基づいて、環境幾何学情報モデルを自動生成する手法を開発した。これにより、従来、高価なレーザレンジファインダを人間が操作して作成していた巨大構造物の三次元幾何モデルを、安価なセンサにより自動的に生成できる見通しをえた。3.分散センサによる移動物体位置の実時間計測法レーザレンジファインダとカメラを組み合わせた分散センサ群による歩行者の位置計測法を開発した。本研究は、ロポットと人間が共生する環境において、移動ロボット群と環境固定センサ群の相互支援により、高精度な環境幾何情報の獲得と情報構造化環境の保守とを自動化する手法、ならびに分散センサによる環境状況計測における精度限界を補完するロボット行動の実現手法の開発を目的とする。1.分散ネットワークカメラを自動キャリブレーションする群ロボットシステムの行動計画手法の開発自動追尾高精度測量装置を搭載した移動ロボット(親機)、カメラによる視覚識別容易なマーカと測量用反射機を搭載した移動ロボット、および測量用反射機のみを搭載した移動ロボットの計3台で構成されるロボット群について、環境内分散カメラをキャリブレーションするための動作計画手法を開発した。2.群ロボットシステムによる広域環境の三次元幾何モデルの自動生成移動ロポットに搭載したレンジセンサ情報と協調ポジショニングにより計測されたロボット位置とに基づいて、環境幾何学情報モデルを自動生成する手法について、広域屋外環境でのモデリング実験を行い、その誤差評価を行った。ICPアルゴリズムが初期位置合わせなしで適用できること、また約94m離れた見通しの効かない地点でも数センチの誤差に収まることを明らかにした。3.分散ビジョンセンサと移動ロボット搭載センサの協調による移動物体位置の実時間計測法の開発環境固定センサにより移動ロボットの位置計測を行い、ロボット搭載センサにより歩行者の認識および位置計測を行う手法を考案し、死角領域の削減効果を明らかにした。本研究は、ロボットと人間が共生する環境において、移動ロボット群と環境固定センサ群の相互支援により、高精度な環境幾何情報の獲得と情報構造化環境の保守とを自動化する手法、ならびに分散センサによる環境状況計測における精度限界を補完するロボット行動の実現手法の開発を目的とする.本年度は以下の成果を得た.1.群ロボットシステムによる広域未知環境の三次元幾何モデル自動生成のための探索動作計画手法の開発これまでに開発した群ロボットシステムを用い、未知環境の三次元環境モデルを自動生成するため、ロボット位置計測の良好な精度を維持するロボット群配置の計画手法、ならびに次に探索すべき未知環境部分の決定手法を開発した。これにより、環境情報がゼロの状態から逐次的に探索範囲を広げ、精度と効率とを維持しつつ環境モデルを自動生成する機能を実現する見通しが得られた.2.情報構造化環境における適応型移動センシング技術の開発環境固定ビジョンセンサにより、その計測範囲内の移動ロボットの位置姿勢計測を行う.この移動ロボット搭載レーザレンジセンサにより歩行者の位置計測を行う.また、この位置姿勢が既知のロボットを他の第三者ロボットが視覚計測することにより、その第三者ロボットの自己位置計測を行う.これら計測機能を実現する手法を開発した.環境固定ビジョンセンサの計測範囲外や他物体により動的に生ずる死角域における歩行者やロボットの位置計測が可能になった.これらの成果と過年度の研究成果により、ロボットのための情報構造化環境の構築と永続的保守とをロボット自身により自動化する技術、ならびに、人間共生に伴う種々の動的環境変化への対応技術を大きく前進させることができた.
CKD合併症におけるCaSRの病態生理学的意義の探索

“CKDでは早期から諸臓器のCaSR発現低下が起こり、SHPT、腎性貧血、さらにはCVD発症に関連する。CalcimimeticsはCaSRシグナルを増強し、種々の合併症を改善させる"という仮説を立て検証する。CaSRという新たな観点でCKD全体の病態を捉え直す事で、別個に捉えられていた種々の合併症をつなぐ疾患概念を構築できる可能性がある。
参院選地方区定数不均一性の選挙競争への影響とその民主的帰結

本研究では参院選挙区の改選数の不均一な選挙制度が政党の選挙資源配分に大きな影響を与え,またこれが有権者の政治参加や利益代表にゆがみを生じさせている可能性について示した。具体的には2000年代後半の自民党と民主党による二大政党制が成立していた時期においては,いずれの政党も選挙期間中の党首選挙区訪問や有権者の動員活動を「無風化」した二人区よりも激戦の一人区へと集中的に配分したこと,また民主党がほぼすべての二人区において複数候補を擁立した2010年参院選では,二人区において投票率が有意に高まったことを明らかにした。2014年度は本研究課題において,(1)地域レベルからのアプローチとして,都道府県および市区町村レベルでの選挙データを用い,候補者数の変化が投票率および政党得票率等に対して与えた影響についての検証を行い,また(2)政党エリートレベルからのアプローチとして,参院選選挙期間中の政党幹部の遊説先とその影響についての検証を行った。前者の研究の成果としては,特に2010年参院選において民主党が二人区で候補者を複数擁立した帰結として,これらの選挙区の競争度が上昇し投票率が平均して2%程度増加したこと,他方この戦略が民主党の比例票の追加的な動員にもたらした影響は不明瞭であることを明らかにした。またこれに加えて,後者の研究の成果として,特に2004-2010年の日本において二大政党制が成立していた時期の参院選においては,自民党・民主党の両党とも選挙期間中の党首の選挙区訪問という希少な資源を一人区に傾斜して配分したこと,また一人区の中でも競争が激しい選挙区に集中させたことを明らかにした。しかし民主党が弱体化,「第三極」が躍進した2013年の参院選においては,自民党が従来通りの党首訪問の配分を行ったのに対し,民主党は二人区での議席確保のために二人区への党首配分を厚くする,という変化が見られた。前者の研究成果については2014年度の日本政治学会において既に報告を行った。後者の研究成果については,2015年度の日本政治学会および米国政治学会においてそれぞれ報告する予定である。本研究課題の目的は2000年代の日本の参院選において改選数が不均一な選挙制度が主要政党間の選挙競争を大きく規定し,これが政党の配分する選挙資源やその結果として有権者の動員が低調に終わる地域を「人工的」に作り出したことを明らかにすることにある。2015年度にはまず2014年度に行った研究に基づき,主要政党の党首の選挙区訪問の戦略的配分とこれに改選数が与えた影響についての論文を学会で報告,研究誌へと投稿した。この論文では自民党と民主党が参院選の選挙期間中に党首の選挙区訪問を“接戦"の選挙区へと配分したこと,ただし選挙戦が“接戦"となるか否かは政党間の当該選挙区における勢力のみにより決定されるのではなく改選数により規定されていることを示した。すなわちこの時期に両政党ともに一人ずつの候補しか擁立せず,選挙結果が事前に決定的であったほとんどの二人区においては,両政党ともに党首の選挙区訪問をほとんど配分しなかったのである。本論文は2015年9月の米国政治学会年次大会および10月の日本政治学会大会で報告し,現在研究誌に投稿中である。さらに2015年度は上記の研究と並行して,政党による有権者の動員活動が上記の党首の選挙区訪問と同様に改選数の影響を強く受けていることを明らかにした。より具体的には参院選後の有権者調査を用いて政党による電話やビラなどを用いた接触・動員活動についての分析を行い,特に2007年と2010年参院選という自民党と民主党が参議院の過半数をめぐって主に一人区で激戦を繰り広げた選挙において,両政党ともに一人区において他の選挙区よりも相対的に高い有権者接触・動員を行っていたことを示した。この研究の成果は先日の2016年度日本選挙学会総会・研究会において報告し,本年度中に研究誌に投稿する予定である。昨年度はおおむね計画した通りのスケジュールで研究をすすめることができた。27年度が最終年度であるため、記入しない。政治学2015年度は事前の計画通り,参議院における政治エリートレベルの戦略の変化が有権者に与えた影響を検証するために選挙有権者調査のデータを用いた研究を行う予定である。また2014年度で行った研究を学会で報告し,討論者から受けたコメントを元に論文を改訂,これを学術誌へと投稿する予定である。
不斉チイルラジカル触媒の創製と反応開発

今年度は前年度に引き続き不斉チイルラジカル触媒の新規な応用を目指して研究を行った。検討を重ねる中で、硫黄と同族元素であるセレンのラジカルはチイルラジカルと比べどのような反応性の違いがあり、合成化学的に有用な活性種になりうるのかについて興味を持った。種々検討した結果、ラジカルとしての挙動はチイルラジカルに酷似していたものの、硫黄よりも酸化されやすく求電子的な活性種(R-Se+)を生じやすいことがわかった。このセレン求電子剤について文献を調査してみたところ、この化学種は炭素ー炭素不飽和結合に対し高い親和性を有するため、当量試薬としてアルケンのセレノ官能基化に汎用されていることがわかった。しかしこれを触媒活性種とするアルケンの触媒的官能基化は報告が少なく、さらに高エナンチオ選択的な触媒反応は未だに達成されていなかった。そこで今回そのような新規な求電子的セレン触媒の開発を行った。その結果、不斉チイルラジカル触媒と同様の不斉骨格を基本にデザインされた求電子的セレン触媒が、不飽和カルボン酸の酸化的環化反応において非常に高いエナンチオ選択性を発現することが明らかになった。このような高いエナンチオ選択性は未だに求電子的セレン触媒の反応では達成されたことがなく、セレンが新しい不斉触媒になりうる可能性を示した有意義な研究結果である。この新規性が認められ、本結果はアメリカ化学会誌(Journal of the American Chemical Society)に受理された。27年度が最終年度であるため、記入しない。今年度私はチイルラジカルによる不斉C-C結合形成反応の開発を目指し、不斉チイルラジカルのデザイン行った。ビニルシクロプロパンとアルケンよりビニルシクロペンタン誘導体を与える[3+2]ラジカル環化反応はチイルラジカルによって促進されることが知られており、この反応が本研究の趣旨には妥当であるとしモデル反応に選択した。まず不斉骨格として有名なビナフチル骨格を有する様々なキラルチイルラジカルを合成し、反応におけるエナンチオ選択性を検討した。その結果、最高44%eeというエナンチオ選択性を観測するに至ったが、この最良の触媒ではすでに相当な立体修飾が施されており、これ以上のエナンチオ選択性の向上は非常に厳しいと考えられた。そこで最良であった触媒の構造から立体選択性に影響を与える部分構造を抽出し、これらの構造的特徴を有しつつさらにチューニングできる触媒骨格をいくつかデザインした。そのデザインに基づいた触媒のプロトタイプを作って検討した結果、インダノンを基にしたキラルな骨格で良好な結果が得られた。置換基のスグリーニングの結果、最高93%eeという満足できるエナンチオ選択性で反応が進行した。この結果は、たとえ立体制御の困難なラジカル反応であっても適切な触媒設計で精密な立体制御が可能になる、ということを明確に示しており、今までのラジカル反応の認識を改める重要な結果であると考えられる。現在これらの結果をまとめ、論文投稿中である。ラジカル反応を酸触媒や遷移金属触媒と共に行うというアプローチは最近特に注目されており、従来にはない反応様式が続々と報告されている。そこで私は、チイルラジカル触媒に酸触媒や遷移金属触媒を組み合わせることで新規な触媒系を構築できないかと考えた。今回は特に、チイルラジカル触媒と遷移金属触媒の共働的触媒作用について二つのアプローチを検討した。一つ目のアプローチは、チイルラジカル触媒反応の基質に金属への配位子となる部分構造を持たせ、既存の反応性との違いを調べるというものである。そのために、チイルラジカルと反応するビニルアジリジン部位に加え、金属に配位できるキノリン部位を有する基質を合成した。ビニルアジリジンはチイルラジカルと反応して非環状ラジカル中間体を与えることが予備実験で分かっているので、結果として生じる金属-ラジカル錯体の特異な性質を調べられると考えた。実際に検討したところ、用いた基質の異性体が高収率で得られる結果となった。後にこの異性化反応はチイルラジカルが関与していないことが明らかとなったが、生成物の有用性からより詳しく検討する価値があると考えている。二つ目のアプローチとして、チイルラジカルによる水素引き抜き反応を利用して炭素-水素結合から炭素ラジカルを生成させ、これを遷移金属を用いたカップリング反応に応用してみようと考えた。様々な条件を検討した結果、炭素-水素結合を炭素-炭素結合に直接変換できる新規カップリング反応を見出した。形成される炭素-炭素結合は二つのsp3混成炭素間の結合であり、カップリング反応の中では難易度が高いため、本反応は有用な炭素-水素結合変換反応としての可能性を有している。詳細な反応機構は未解明であり、今後検討したいと考えている。

しかしこれを触媒活性種とするアルケンの触媒的官能基化は報告が少なく、さらに高エナンチオ選択的な触媒反応は未だに達成されていなかった。そこで今回そのような新規な求電子的セレン触媒の開発を行った。その結果、不斉チイルラジカル触媒と同様の不斉骨格を基本にデザインされた求電子的セレン触媒が、不飽和カルボン酸の酸化的環化反応において非常に高いエナンチオ選択性を発現することが明らかになった。このような高いエナンチオ選択性は未だに求電子的セレン触媒の反応では達成されたことがなく、セレンが新しい不斉触媒になりうる可能性を示した有意義な研究結果である。この新規性が認められ、本結果はアメリカ化学会誌(Journal of the American Chemical Society)に受理された。当初の目標通り、ラジカル反応で高度に立体制御ができる新規なチイルラジカル触媒の創製に成功した。この結果を論文としてまとめNature Chemistry誌に投稿したところ、ほぼ改訂の必要がないほどの高評価をいただき受理された。次なる展開として、開発した新規チイルラジカル触媒を用いた新しい不斉ラジカル反応の検討を現在行っている。また、チイルラジカルを酸触媒、金属触媒とともに用いるといったような新規な共触媒系の構築にも着手している。いくつかの新しい発見もあり、今後検討していきたいと考えている。27年度が最終年度であるため、記入しない。チイルラジカルを酸触媒や金属触媒と組み合わせた共触媒系の構築を目指し、研究を行う。すでに予備実験からいくつか新反応へとつながる結果が得られているので、これらの条件を精査し、反応系を確立させる。より一般的な手法への展開を目指し、用いる触媒や基質を幅広く検討する。当初の計画通り、不斉ラジカル反応を可能にする新規なチイルラジカルの開発に成功したため。今後は今回の研究の成果を国内外で発表するとともに、チイルラジカルのさらなる有機合成への応用範囲拡大を目指す。既知の反応を不斉化するだけでなく、チイルラジカルを用いた新しい有機合成反応を開発し、その展開に努める。
混合金属型キラル配位空間の創製

本研究では、チオール型配位子を用いたキラルな錯体配位子の合成、ならびにこの種の錯体配位子と各種金属イオンとの反応による混合金属型キラル配位空間の創製について検討した。しかし、Pd^<11>との反応では、D-pen配位子がHg^<11>からPd^1へ転移し、3分子のD-penが3つのPd^11を連結した環状三核錯体([Pd_3(D-pen-N,O,S)_3])が形成された。また、この環状三核錯体は、結晶中において、水素結合により層状に配列し、上下に親水性と疎水性の配位空間を形成することも見出した。L-システイン(L-H_2cys)をもつチオラト単核錯体(Δ_1-or ∧_L-[Co(L-Hcys-N,S)(en)_2]^<2+>)にHg^11を反応させることにより、2つの非配位カルボキシル基をもつ硫黄架橋三核錯体([Hg{Co(L-Hcys-N,S(en)_2}_2]^<6+>)の3つのジアステレオ異性体(Δ_LΔ_L、∧_L∧_L、∧_L∧_L)を合成した。このうち、∧_L∧_L体は脱プロトン化により自己集積化し、チューブ状の配位空間をもつ一次元ヘリックス構造を形成することを見出した。本研究では、チオール型配位子を用いたキラルな錯体配位子の合成、ならびにこの種の錯体配位子と各種遷移金属イオンとの反応による混合金属型キラル配位空間の創製にっいて検討した。連結部位がo-xylyl基の場合では、三核ユニットのキラル配置が同じであるラセミ体(Δ4/Λ4)のみが形成されるが、m-xylyl基を用いた場合では、ラセミ体に加えて、三核ユニットのキラル配置が異なるメソ体(Δ2Λ2)も形成された。一方、含硫アミノカルボン酸であるD-ベニシラミン(D-H_2pen)を硫黄単座で配位した金(I)酸錯体([Au(D-pen-S)_2]^<3->)は、配位チオラト基に加えて、フリーのアミノ基およびカルボキシル基を用いて金属イオンに配位する多座の錯体配位子として働くことを見出し、Ni^<II>イオンとの組み合わせにより、性質(色、磁性、キラリティー)が異なり、しかも互いに構造変換可能な、4種の多核錯体が形成されることを明らかにした。さらに、二分子のD-ベニシラミンを硫黄単座でHg^<II>に配位したチオラト単核錯体([Hg(D-Hpen-S)(D-Hpen-S)]^+)に[PdBr_4]^<2->を反応させると、目的のPd^<II>Hg^<II>錯体ではなく、3分子のD-penがN, O, S-三座で2つのPd^<II>に架橋配位した環状三核錯体([Pd_3(D-pen-N, O, S)_3])が形成されることを見出した。同時に、得られた環状錯体に過剰のアンモニア水を反応させると、Hg^<II>イオンが環状構造中に取り込まれたPd^<II>_2Hg^<II>三核錯体([Pd_2HgBr_2(D-pen-N, S)_3(NH_3)]^<2->)が生成することも分かった。
「安全歩行検診システム」の開発－多施設共同研究－

高齢者の看護ケアを行う上で、歩行障害や転倒へのアプローチは特に重要である。本研究では、従来からのハイリスクアプローチもしくはポピュレーションアプローチのどちらかに偏った転倒予防対策から脱却し、それらを融合した新たな転倒予防システム「安全歩行検診システム」の開発を目指した。研究の結果、安全歩行のステージは、高齢者の上・下肢筋力や立位バランス、認知機能を良く反映し、安全歩行検診カードに記載された安全歩行ステージの妥当性が確認された。さらに、介入研究の結果、対象者の歩行ステージは1年経過後も維持されており、昨年度の転倒率(23%)が今年度は18%に減少し、一定の効果が認められた。高齢者の看護ケアを行う上で、歩行障害や転倒に対するアプローチは特に重要である。本研究では、従来からの転倒予防対策の考え方、すなわちハイリスクアプローチもしくはポピュレーションアプローチのどちらかに偏った予防対策から脱却し、それらを融合した新たな転倒予防システム「安全歩行検診システム」の開発を目指す。具体的には、歩行の安全度を17にステージ分類し(安全歩行検診カードを配布)、それぞれのステージに応じた転倒予防対策(パンフレットの配布を含む)を指導する。さらに、安全歩行検診システムの効果判定(歩行能力の改善と転倒予防)をランダム化比較試験による多施設共同研究で検証し、看護場面で臨床応用可能にすることを目的とする。27年度は、滋賀県野洲市在住で生きがいサークルに登録している一般高齢者257名と京都市山科区の健康教室に参加している高齢者48名を対象に、初回検診の実証研究を実施した。初回検診では、転倒歴の調査と歩行能力(バランス歩行と5m最速歩行)を評価した。併せて、30秒間椅子立ち上がりテスト、握力、大腿四頭筋筋力、足趾把持力、上体起こし回数、長座体前屈距離、開眼片脚立位時間、Timed Up and Go testなどの身体機能を詳しく調査した。また、この2つ歩行能力指標から歩行レベルを7段階に分類し、転倒歴の情報を合わせて歩行の安全度を示した「安全歩行検診カード」を参加者に配布した。27年度は、当初の予定(150名)を上回る約300名の高齢者を対象に初回検診と下肢筋力やバランステストなどの体力テストが実施でき、参加したすべての高齢者に「安全歩行検診カード」を配布した。ただし、対象とした高齢者の身体機能は高く、歩行能力が劣っている高齢者のデータ収集が不足していることから、「おおむね順調に進展している」と判定した。本研究では、従来からの転倒予防対策の考え方、すなわちハイリスクアプローチもしくはポピュレーションアプローチのどちらかに偏った予防対策から脱却し、それらを融合した新たな転倒予防システム「安全歩行検診システム」の開発を目指した。今年度は、歩行の安全度を17にステージ分類し、安全歩行検診カードを256名(男性:58名、女性:198名、平均年齢:73.5±5.7歳)の高齢者に配布した。対象者の歩行ステージは7が117名と最も多く、次いで6の79名、5の36名、4の15名、3の9名とステージが下がる程少なかった。なお、男性ではステージ3と4の高齢者はいなかった。よって、本研究で対象とした高齢者の歩行能力の高さがうかがえた。ただし、昨年1年間に転倒を経験した高齢者は23%に上り、日本の地域在住一般高齢者の転倒率が1020%であることを考えると、転倒しやすい高齢者の割合が高いことが推察される。本年度は介入研究として、バランス機能と認知機能を高めることを目的とした「たちばな健康体操」を実施する群、上下肢の筋力アップを目的とした「百歳健康体操」を行う群、マシントレーニングを中心とした筋肉トレーニング群の3群に分類し、週1回の頻度で1年間実施した。その結果、対象者の安全歩行ステージは1年経過後も維持されており、23%であった昨年度の転倒率が今年度は18%に減少し、一定の効果が認められた。平成28年度は、関西・北陸・九州の4つの異なる大学を拠点に、市町村の交流事業に参加している一般高齢者500名ならびに近隣の高齢者施設に通所している虚弱高齢者400名を対象に介入研究を行い、安全歩行検診システムの効果判定(歩行能力の改善と転倒予防)をランダム化比較試験による多施設共同研究で検証する予定である。老年看護学長崎での予備調査用の謝金を計上していたが、謝金が発生しなかったため、5万円を次年度に持ち越すこととなった。長崎での本調査時の協力者へ謝金、成果報告の出張経費に充てる。
PET/MR装置を用いた頚動脈プラークの高解像度ハイブリッドイメージング

頚動脈プラークは脳梗塞や一過性脳虚血疾患の原因であり、その脆弱性の予測を正確に推定できれば最適な治療法の選択に役立つ。PETとMRを同時に収集することのできるPET/MRハイブリッド装置を用いて、PETとMRの高空間分解能画像の取得を試みた。FDG-PET画像では頚動脈壁と内腔の集積の完全な分別は困難であった。MR心電図同期撮像による壁運動の動画像では、高空間分解能画像では信号強度が弱く壁全周でのボクセルトラッキングが不可能であった。またストレイン解析に必要な壁の移動量を検知することができなかった。今後は、デジタルPETによるさらなる高空間分解能撮像とMR動画の高精度化が必要であると思われた。頚動脈プラークは脳梗塞や一過性脳虚血疾患の原因であり、その脆弱性と複合化進行の予測を正確に推定できれば最適な治療法の選択に役立つが、従来のMRでのT1/T2強調像によるプラークの性状評価では不十分であった。プラークの不安定性、脆弱性を増悪させるマクロファージの活性をFDG-PETで評価できれば、プラークのリスクを正確に評価できると期待される。PET/MRハイブリッド装置ではPETとMRを同時に収集し、内部性状と炎症・代謝活性度を重ね合わせ可視化でき、頚動脈プラークの脆弱性、危険度を測定が可能と期待される。平成27年度は、まずPET撮像法およびMRシークエンスの最適化とその解析法の開発に取り組んだ。高分解能PET画像を取得し、最適なPET収集時間、再構成方法と撮像開始のタイミングについて検討を行い、拡散強調像を含めた撮像プロトコルについて検討した。拡散強調像に関して、高磁場化や局所励起法により空間分解能の向上と歪みの低減による位置精度の向上が得られた。また心電図同期撮像による壁運動の撮像にも取り組んだ。拡散強調像によるプラーク成分分析の基準を確認し、PETのFDG集積と拡散強調のADCとの共分散分析の実用性を検討した。またプラークの壁運動から壁の硬さについての解析法を検討中である。申請時に予定していた、PET撮像法とMRシークエンスの最適化はほぼ予定通りに達成した。頚動脈プラークの脆弱性の測定法については拡散強調像とFDG集積の共分散分析法の実用化を達成した。壁運動による壁の硬さの測定に関しては検討中である。頚動脈プラークは脳梗塞や一過性脳虚血疾患の原因であり、その脆弱性と複合化進行の予測を正確に推定できれば最適な治療法の選択に役立つ。従来のMRでのT1/T2強調像によるプラークの性状評価では不十分であった。平成28年度は,前年度に引き続き、PETの高空間分解能撮像およびMRシークエンスと解析法の開発に取り組んだ。高分解能PET画像では2mmボクセルで画像取得し、撮像開始のタイミングによる頚動脈の壁/内腔の集積比について検討した。MRでは拡散強調像を含めた撮像プロトコルについて検討した。さらに拍動に伴う頚動脈壁の動きを可視化するため、black-blood撮像とbright-blood撮像の両者から壁の運動をボクセル毎に抽出しストレイン解析を試みた。PETの高空間分解能画像の取得は可能であったが、頚動脈内腔と壁の集積の完全な分別は困難であった。MR拡散強調像では、局所励起法により歪みの低減による位置精度の向上が得られた。心電図同期撮像による壁運動の動画像では、ストレイン解析に必要な壁の移動量が得られず、さらなる高空間分解能でのシネ撮像が必要となり困難に直面している。最終年度は患者撮像を積み重ねる予定であるが、PETでの頚動脈の壁と内腔の分別描画とMRによるストレイン解析のソフト開発を検討中である。PETでの内腔と壁の分別、壁運動による壁の硬さとストレイン解析に関してはさらに検討が必要。平成29年度は,前年度に引き続き、PET撮像の高空間分解能化およびMRによる頚動脈の高空間分解能と高時間分解能の動画撮像に取り組み、ボクセル単位で壁の動きを解析するためのソフトの改良に取り組んだ。高分解能PET画像では機器の限界である2mmボクセル画像での動態画像の取得と、撮像開始のタイミングによる頚動脈の壁/内腔の集積比について検討した。MRではblack-bloodとbright-bloodの高空間分解能(0.75mmx0.75mmx3mm)のシネ画像を取得し、拍動に伴う壁の動きをボクセル単位で追跡し、ストレイン解析を試みた。

PETの高空間分解能画像の取得は可能であったが、FDG投与1時間後と2時間後の画像ともに血中FDG活性が高く、頚動脈壁と内腔の集積の完全な分別は困難であった。MR心電図同期撮像による壁運動の動画像では、空間分解能を高めると撮像時間が延長し、信号強度も弱く、phase-artifactのかぶりも生じ、壁全周でのボクセルトラッキングが不可能であった。またストレイン解析に必要な壁の移動量を検知することができなかった。今後は、デジタルPETなどのさらなる高空間分解能撮像の可能なPET装置が必要であると思われる。MRによるストレイン解析も動画の高精度化とわずかなボクセル移動量もベクトル化できるようにソフト開発が必要である。頚動脈プラークは脳梗塞や一過性脳虚血疾患の原因であり、その脆弱性の予測を正確に推定できれば最適な治療法の選択に役立つ。PETとMRを同時に収集することのできるPET/MRハイブリッド装置を用いて、PETとMRの高空間分解能画像の取得を試みた。FDG-PET画像では頚動脈壁と内腔の集積の完全な分別は困難であった。MR心電図同期撮像による壁運動の動画像では、高空間分解能画像では信号強度が弱く壁全周でのボクセルトラッキングが不可能であった。今後は、デジタルPETによるさらなる高空間分解能撮像とMR動画の高精度化が必要であると思われた。平成27年度に得られた結果を基にして、平成28年度以降はプラーク患者のデータ収集と解析を行う予定である。平成28年度に得られた結果を基にして、平成29年度以降はプラークの解析法の開発と改良をおこない、患者のデータ収集と解析を行う予定である。放射線医学画像診断予定していたPC関連消耗品の購入を次年度に先送りしたため。PC,PC関連消耗品の購入と海外での研究の情報収集、研究成果発表を行う。
急速凍結軟骨基質における硫酸基の超微局在と石灰化

軟骨プロテオグリカン(PG)は、化学固定により凝集、位置移動といった構造変化を受ける。急速凍結法はよりnativeに近いPGの微細構造の保存を可能にし、電子顕微鏡的にそれらは微細なフィラメント構造を呈することが示されてきた。しかしながら三次元的に広がるコンドロイチン硫酸側鎖、殊に軟骨石灰化に重要な役割が示唆されている硫酸基自身のnativeな分布状態に関する情報は現在ほとんど皆無といってよい。本研究は、急速凍結軟骨基質をエポンもしくはLR WHITEに包埋し超薄切片上で、後高鉄ジアミン染色を施しnativeな硫酸基を検出した。エポンおよびLR WHITE包埋試料では基本的に硫酸基の分布様式は類似したが、染色反応性は明らかに後者が高かった。染色果粒の大きさは一般に前者で小さく、かつ高密度に現れた。細胞外基質の高鉄ジアミン染色果粒は、フィラメント状構造に一致して数珠状配列を呈し、軟骨基質石灰化側においても硫酸基の分布に際だった変化は認められず石灰化基質内に取り込まれていた。また軟骨基質内には染色果粒を伴わない。エアタンパクと推定されるフィラメント構造も存在した。増殖細胞層および肥大細胞層の軟骨細胞ではゴルジ装置の成熟面および分泌果粒に硫酸基の存在を認めた。染色果粒一個が一本の側鎖を示しているのか、側鎖中の複数の硫酸基を示しているのかは不明であるが、少なくとも大型の染色果粒はある程度収縮した側鎖を示すものと思われた。従来軟骨基質石灰化側において伸張していたPGが局所的に凝集することが示唆されてきたが、本研究ではこのことを積極的に支持する所見は得られなかった。
生きている細胞の内部構造とその変化をその場観察するハイブリッド顕微鏡の開発

生きている細胞を蛍光顕微鏡と軟X線顕微鏡で同時に観察可能なハイブリッド顕微鏡を開発した。マウスの精巣ライディッヒ細胞の同時観察を実施することにより、生きている細胞内の単一のミトコンドリアの構造の観察に成功した。さらに、ハイブリッド顕微鏡の生命科学研究への活用の一例として、アポトーシスを起こした細胞核の構造変化を観察した。その結果、これまで明らかにされてこなかったアポトーシスによる細胞核の詳細な構造変化を観察することに成功した。蛍光顕微鏡と軟X線顕微鏡を併用したハイブリッド顕微鏡の実現に必要な新型試料ホルダー及び新しい窒化シリコン窓の設計及び製作を行った。新型試料ホルダーは細胞を試料ホルダーに生きたまま封入した状態で蛍光顕微鏡で40倍の高倍率観察が可能となる構造とし、蛍光顕微鏡と軟X線顕微鏡による細胞の同時観察を可能とした。一方、窒化シリコン窓表面に厚さ5μm、幅5μmのスペーサーと溝構想を構築することにより細胞を取りまく培養液の層の厚さを常に一定に保つとともに培養液の余剰分を外部に排出する構造とした。さらに、窒化シリコン窓とPMMAフォトレジストに密着度をトルクレンチによって正確にコントロールできる。新型試料ホルダーを窒化シリコン窓を用いて生きている細胞の観察を行った。まず、一定の現像条件の下でPMMAの現像を行った結果、細胞周辺の培養液の厚さが安定して5μmに保たれていることを確認した。これは、非常に再現性よく細胞の軟X線顕微鏡観察が可能であることを意味し、軟X線顕微鏡を生命科学研究に活用する際に非常に重要である。ネズミの精巣ライディッヒ細胞を蛍光顕微鏡と軟X線顕微鏡により生きている状態で観察した結果、双方の顕微鏡において細胞核周辺に非常に多くのミトコンドリアが密集して分布していることが観察された。蛍光顕微鏡ではそれらのミトコンドリアを個々に分離して観察することは出来なかったが、軟X線顕微鏡により単一のミトコンドリアの構造の観察に成功した。新型試料ホルダーと細胞周辺の培養液の層の厚さを正確に制御可能な窒化シリコン窓を組み合わせることにより、蛍光顕微鏡と軟X線顕微鏡により生きている細胞を再現性よく観察することが可能となるとともに、軟X線像のコントラストの向上に成功し、生きている細胞の細胞内小器官の構造を詳細に観察することが可能となった。生きている細胞を蛍光顕微鏡と軟X線顕微鏡で同時に観察可能な“ハイブリッド顕微鏡"の本体部の設計を行った。具体的には、(1)軟X線源と試料を格納するための真空容器と真空排気装置、(2)出力20 J、パルス幅600 psの高強度レーザーを金属薄膜ターゲットに集光照射するためのレーザー集光部およびターゲット部から構成され、(3)平成25年度に開発した新型試料ホルダーを取り付けることにより生きている細胞の軟X線顕微鏡像と蛍光顕微鏡増を同時に撮像可能な構造として設計を行った。倒立型蛍光顕微鏡の試料ステージ上に設置できる十分にコンパクトな大きさとなるよう設計を行った。高強度レーザーを金属薄膜ターゲットに集光する集光レンズは、真空容器に直接取り付けることとし、蛍光顕微鏡観察時に真空容器を移動した際にレーザーのターゲットへの集光がずれないような構造とした。試料ホルダーは、真空容器底面に外部から取り付け、容易に細胞試料を交換できる構造とした。軟X線顕微鏡本体部を倒立型蛍光顕微鏡の試料ステージ上に直接取り付けることにより細胞の軟X線顕微鏡像と蛍光顕微鏡像を同時に取得できる構造とした。これらの設計により、細胞機能発現の過程を蛍光顕微鏡によりリアルタイム観察しながら、機能発現の重要な瞬間を見きわめて軟X線顕微鏡により高い解像度で観察することが可能となる。このことにより、様々な生命現象を理解する上で重要となる細胞の機能と構造の相関を直接観察することが可能となった。生きている細胞を蛍光顕微鏡と軟X線顕微鏡で同時に観察可能なハイブリッド顕微鏡の製作を行うとともに、新型試料ホルダーと組み合わせ、ハイブリッド顕微鏡として完成させた。これまでに実績のあるマウスの精巣ライディッヒ細胞を用いてハイブリッド顕微鏡による蛍光顕微鏡と軟X線顕微鏡による同時観察を実施することによりその性能試験を実施した。プログラムされた細胞死であるアポトーシスは生命体の生存にとって非常に重要な生命現象の一つであり、これまでの蛍光顕微鏡を用いた研究で、アポトーシスを起こした細胞核は、DNAが細胞核周辺に集まるリング形状、DNAの断片化に伴うネックレス形状、DNA凝縮、核崩壊という過程をたどることがわかってきているが、その詳細な構造変化は解明されてこなかった。開発したハイブリッド顕微鏡を活用し、蛍光顕微鏡と軟X線顕微鏡による同時観察を行うことによるこれまで明らかにされてこなかったアポトーシスによる細胞核の詳細な構造変化を観察することによりハイブリッド顕微鏡の有用性を実証した。また、開発したハイブリッド顕微鏡により生きている精巣ライディッヒ細胞を観察することにより、細胞核周辺に網の目状に分布するミトコンドリアの観察に成功するとともに、単一のミトコンドリアの構造の観察にも成功した。交付申請書に記載した研究の目的は、生きている細胞を蛍光顕微鏡と軟X線顕微鏡で同時に観察可能なハイブリッド顕微鏡の開発である。

平成26年度の研究実施計画は、軟X線顕微鏡本体部を倒立型蛍光顕微鏡の試料ステージ上に直接取り付けることにより細胞の軟X線顕微鏡像と蛍光顕微鏡像を同時に取得できる“ハイブリッド顕微鏡"本体部の設計と製作を行うというものである。ハイブリッド顕微鏡に使用する高強度レーザーの高繰り返し運転が可能となり、元々考えられていたシングルショットベースの仕様を見直す必要が生じたので設計変更を行った。これにより、より高性能なハイブリッド顕微鏡を実現することが可能になるが、年度内に製作まではいたらなかった。レーザーの高繰り返し運転に対応したより高性能なハイブリッド顕微鏡本体部の設計は完了した。平成26年度の研究実施計画からの若干の遅れがあるが、おおむね順調に進展している。X線光学平成27年度は、平成26年度に完了した、生きている細胞を蛍光顕微鏡と軟X線顕微鏡で同時に観察可能なハイブリッド顕微鏡の製作を行うとともに、平成25年度に製作した新型試料ホルダーと組み合わせ、ハイブリッド顕微鏡として完成させる。これまでに実績のあるマウスの精巣ライディッヒ細胞を用いてハイブリッド顕微鏡による蛍光顕微鏡と軟X線顕微鏡による同時観察を実施することによりその性能試験を実施する。さらに、ハイブリッド顕微鏡の生命科学研究への活用の一例として、アポトーシスを起こした細胞核の構造変化を観察する。プログラムされた細胞死であるアポトーシスは生命体の生存にとって非常に重要な生命現象の一つであり、これまでの蛍光顕微鏡を用いた研究で、アポトーシスを起こした細胞核は、DNAが細胞核周辺に集まるリング形状、DNAの断片化に伴うネックレス形状、DNA凝縮、核崩壊という過程をたどることがわかってきているが、その詳細な構造変化は解明されてこなかった。開発したハイブリッド顕微鏡を活用し、蛍光顕微鏡と軟X線顕微鏡による同時観察を行うことで、これまで明らかにされてこなかったアポトーシスによる細胞核の詳細な構造変化を観察することが可能になり、これを示すことでハイブリッド顕微鏡の有用性を実証する。交付申請書に記載した研究の目的は、生きている細胞を蛍光顕微鏡と軟X線顕微鏡で同時に観察可能なハイブリッド顕微鏡の開発である。平成25年度の研究実施計画は、新型試料ホルダー及び新しい窒化シリコン窓を製作し、細胞の観察を行うことにより細胞の軟X線顕微鏡像と蛍光顕微鏡像の直接比較が可能で細胞周辺の水の層の厚さが常に一定であることを実証するというものであり、本年度に実施した研究実績は平成25年度の研究実施計画に完全に沿ったものであるとともに、当初予定した成果を挙げている。ハイブリッド顕微鏡に使用する高強度レーザーの高繰り返し運転が可能となり、より高性能なハイブリッド顕微鏡を実現するための設計変更を行うことで、平成26年度に計画していたハイブリッド顕微鏡本体部の製作を平成27年度に実施することになったため。
リーディング・リテラシーを育てるためのカリキュラム、学習指導・評価方法の開発

OECD,PISA読解力調査に対応出来るリーディング・リテラシーを育成する指導方法を開発するために以下のことを行った。1.指導法改善に関する理論研究を完成し、わが国に合った指導理論を完成した。2.単元計画・指導案・詳細な授業記録・成果と課題をウェブで公開し成果の普及を図った。3.意識調査を集計し、総合的に分析し、具体的に指導法を改善する方策を明らかにした。報告書に、事前調査と事後調査を比較し、質問項目ごとに学校段階別の変化、教師別の変化などをグラフ化し、どのような成果が現れ、どのような課題があるかを明らかにした。主な研究の成果1.意識調査内容:国際的な読解力についての児童生徒の意識と、授業についての意識を、質問紙で尋ねた。小学校10学級、中学校9学級、高等学校5学級で合計798人に実施し解答結果を入力した。意義:国際的な読解力についての児童生徒の意識と、国際的な読解力を育てる授業がどの程度行われているかを明らかにすることができる。重要性:PISA型の授業はまだ行われ始めたばかりであるから実態を把握することが重要である。2.授業研究内容:小学校4学級、中学校7学級、高等学校3学級でPISA型読解力を育てる授業を行った。授業実施前には指導案の検討を行い、実施後には指導の成果と課題について検討した。意義:大幅に得点が低下した第2回PISA調査と第3回調査は得点が同じで改善が見られない。したがって、読解力の得点が向上する指導法を緊急に開発することは意義がある。重要性:読解力のみが際だって得点が低いため、緊急に指導法を開発することは重要な課題である。3.授業評価内容:PISA型読解力を育てる指導法が行われているかどうか測定出来る授業評上価票を開発し、授業研究を行ったすべての学級で、授業評価を実施した。評価結果は授業の分析に生かした。意義:出来る限り客観的な評価を行うことは、指導法を改善するための有効な資料になる。重要性:客観的に授業を評価する方法はまだ開発されておらず、わが国で初めての試みである。4.グループメールとウェブサイトの活用内容:授業研究実施前にはグループメールで指導案を検討し、授業実施後には指導案と授業記録をウェブサイトで全国に公開した。意義:グループメールで指導案を検討することで指導案の質が高まった。またウェブサイトで指導案と授業記録を公開することで、PISA型の指導法をすばやく普及させることができる。重要性:遠隔地の委員が瞬時にグループメールで意見交換でき、ウェブサイトで指導案と授業記録等を瞬時に公開出来ることは、先例のほとんどないPISA型読解力の指導法を普及するために画期的である。小学校12校、中学校7校、高等学校6校、合計25校で前後2回実施し解答結果を入力した。意義:児童生徒の意識と、授業の実態を明らかにし、今後の指導法の開発に役立てることができる。重要性:PISA型の授業は数年の実績しかないので実態を把握することが重要である。2.授業研究内容:小学校12学級、中学校5学級、高等学校7学級でPISA型読解力を育てる授業を行った。授業実施前に、指導案の検討を行い、実施後には指導の成果と課題について検討した。意義:2009年度第4回PISA調査を目前にして、読解力向上の指導法を開発し公開することは意義がある。重要性:PISAでは、読解力のみがとくに得点が低いため、緊急に指導法を開発することは重要な課題である。3.読書教育により読解力向上を図る「ブッククラブ」の指導法の理論研究、指導法開発、学会発表、普及内容:アメリカで普及し効果をあげているブッククラブの指導法について理論的実践的研究を行い学会発表した。意義:PISAに対応できる読解力を育てるために、ブッククラブの指導法を導入することは最も効果的である。重要性:国際的な読解力を育成するために、ブッククラブの指導法を導入することは画期的である。4.グループメールとウェブサイトの活用内容:授業研究実施前にはグループメールで指導案を検討し、実施後授業記録をウェブサイトで全国に公開した。意義:相互批判によって、指導案の質が高まり、PISA型の指導法をすばやく全国に普及させることができる。重要性:瞬時に意見交換でき、指導案と授業記録等を公開出来ることは指導法を普及するために画期的である。

OECD, PISA読解力調査に対応出来るリーディング・リテラシーを育成する指導方法を開発するために大学教員6名、指導主事11名、小学校教諭12名、中学校教諭7名、高校教諭6名、合計42名の委員と連携して、以下のことを行った。1.指導法改善に関する理論研究を完成し、わが国に合った指導理論を完成した。その成果は「PISA型読解力」の弱点を克服する「ブッククラブ」入門-多読とディスカッションで、楽しくクリティカル・リーディングを育てる-(明治図書)」として刊行した。2.今までの指導法研究の成果に基づいて、授業実施の前に、グループメールで協議して単元計画・指導案を開発した。3.小学校教諭12名、中学校教諭7名、高校教諭6名とともに、授業実践を行い、事後授業研究会を行って成果を評価し改善を図った。4.単元計画・指導案・詳細な授業記録・成果と課題をウェブで公開し成果の普及を図った。5.全国大学国語教育学会において、研究代表者に加え、研究協力委員の中から小・中・高校教諭各1名、合計4名が二年間にわたって成果を発表した。6.意識調査を集計し、総合的に分析し、具体的に指導法を改善する方策を明らかにした。報告書に、事前調査と事後調査を比較し、質問項目ごとに学校段階別の変化、教師別の変化などをグラフ化し、どのような成果が現れ、どのような課題があるかを明らかにした。7.理論研究、授業研究、意識調査の分析結果を総合し、学会発表の要旨や指導資料と合わせて報告書を完成した。
ナイロン加水分解酵素の分子設計と産業応用への基盤研究

ナイロンが生物作用を殆ど受けない要因として、i)ナイロンユニットを認識できる酵素が生物界に殆ど存在しないこと、ii)ポリマー鎖同士が強固な水素結合で結合しているため、一部のアミド結合が切断されても、会合体からのオリゴマーの離脱が進まないことが挙げられる。ナイロン分解の効率化として、i)分解酵素の高機能化、ii)モノマー化が容易なポリマーの探索、iii)ポリマーを溶解する有機溶媒・イオン液体中での反応などのアプローチが考えられる。特に、有機溶媒中での酵素反応は、化学処理と酵素処理の連携を容易にする。本研究では、ナイロンのリサイクル処理で、エチレングリコール(EG)が用いられていることに着目し、種々の濃度のEG/水混合系でのナイロン分解酵素(NylC)の構造、安定性、及び、活性との関連性を検討した。親型NylCは、90%以上のEG濃度においても活性を示すが、G122-Y130-A36-Q263 (GYAQ)変異体ではEG濃度70%以上では、殆ど活性を示さず、EG濃度依存性が変異により影響を受けることが分かった。また、親型NylCでは、90%EG中でも顕著な構造変化は見られなかったが、GYAQ変異体では、EG添加に伴い、CDスペクトルが510nm、長波長域へシフトすることが分かった。CDスペクトルの結果を、Beta Structure Selection(BeStSel)構造予測プログラムに入力し、二次構造を推定した。EG濃度が高くなるにつれて、α-helixの割合が増加するという傾向が見られた。ナイロンは130°C以上でEGに高濃度で溶解することから、EG中において極めて耐熱性の高い酵素の創出が求められる。そこで、超好熱菌由来のセリンプロテアーゼ(水中では90°C以上で安定)を用いて、EG中での構造・機能・熱安定性(30130°C)の関連性についてもを検討を行った。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。ナイロン固相表面の酵素反応の定量化:66ナイロンはヘキサメチレンジアミンとアジピン酸クロリド(C6)との界面重合により合成できるが、ジカルボン酸として、アジピン酸より炭素鎖長が2個分短いコハク酸クロリドを1030%割合で添加して共重合させたナイロンでは、添加率の増加とともにNylCによる分解性が上昇することを見いだした。特に、30%添加したコポリマーは、平板上で白濁した薄膜を形成するが、酵素反応で透明化する。薄膜系では、酵素とナイロン表面との接触面積が、反応中、常に一定であるため、完全分解に至るまで、一定の速度で分解が進む。その結果、ナイロンのモノマー化・生分解性ポリアミド開発に必須の基礎データが得られた。酵素機能と耐熱性改良への応用マイクロプレートに薄膜化したナイロン試料を用いて、迅速に酵素活性を計測可能な実験系を構築できたことから、この系を用いて耐熱性に優れた酵素や、生分解性ポリアミド選別における多検体スクリーング法としての適用が可能となった。例えば、活性面では、異種モノマー(コハク酸ユニット)の添加率や、用いるナイロン膜厚の調整により、段階的に触媒機能を改善することができた。さらに、分解速度が酵素濃度に比例することから、より低濃度の酵素濃度で高活性を示す酵素(高機能化酵素)の取得も選別可能となった。各種ナイロンのモノマー化NylC反応の最終産物は、大半がダイマーであるため、これをモノマー化するためには、別種の酵素が必要である。アジピン酸とヘキサメチレンジアミンから成る66ナイロン基本ユニットを加水分解する酵素は、これまでに報告例がないが、本年度の研究によりNylB変異体の中から、66ナイロンダイマーに作用する変異体を見いだすことができた。ナイロン工業副産物の6アミノカプロン酸オリゴマーを加水分解する酵素(ナイロン加水分解酵素)NylCについて、酵素の高機能化を実現し、産業応用への展開を試みるものである。応用化に当たって、酵素の安定化が重要であり、これまで、耐熱性が親酵素より36°C上昇した変異体を取得しているが、一方、不安定化する現象も確認されている。そこで、本年度は、免疫分析および、MDシミュレーションによるNylCの細胞内での挙動について検討した。まず、NylCの安定性特性について、部位特異的変異導入法により作成した変異体を用いて検討した。AD界面上に位置する122位および137位変異体の安定性機能を調べたところ、Gly122, Val122,Lys122, Arg122の4種の変異体において、親型p2-NylCから熱安定性の向上が確認できた。さらに、ADサブユニット界面に位置するLys159とGlu115のX線結晶構造からの残基間距離において、Tm値が上昇した変異体では、距離が近接していく傾向が見られた。一方で、137位の置換体では、親型からTm値が11°C減少し、さらに122位変異体の中でもPro122, His122, Trp122の変異体では、イオン交換クロマトチャートにてタンパクのピークが出ないなど、不安定化した変異体も同時に取得することが確認できた。さらに、G122Y130A36Q263

変異体は、親型p2-NylCに対して、AD、AB両界面に位置する4箇所にアミノ酸に置換を有し、最も高いTm値を示す。代表的変異体の超遠心分析の結果から、変異により会合状態はテトラマーからモノマーまで変化することが明らかとなった。前年度までの研究から、ナイロン加水分解酵素NylCのサブユニット界面で変異が耐熱性に大きく影響すると予想できている。そこで、この仮説を検証するため、サブユニットAB界面上に位置する着目部位について、部位特異的変異導入を行い、取得した変異体に対して免疫分析および、RT-PCRを行った。また、RT-PCRによる遺伝子発現量算出から、mRNAの合成を確認した。例えば、得られた変異体GYAQ-Q299D, GYAQ-Q299Eでは、大腸菌破砕後の可溶画分のSDS-PAGEにて、NylC由来のタンパクが確認できなかったことから、不安定型の変異体に対してGYAQに対する相対発現量を求めたところ、mRNAの合成は正常に行われていると判断することができた。次に免疫分析による変異体の会合状態を調べたところ、変異体種により、異なることがわかった。変異体を会合状態で分類したところ、1)可溶画分に活性型として存在、2)可溶画分に前駆体型として存在、3)沈殿画分に前駆体型として存在、4)可溶画分にフラグメントのみが存在の4種類の挙動を取ることがわかった。NylC変異体の挙動をMDシミュレーションにて解析を行った。まず、PDBファイルの情報を基に、変異体の分子モデルを作成し、122位変異体のADサブユニット間距離の測定について距離計算を行ったところ、X線結晶構造解析の結果と、MDシミュレーションの結果が良い相関を示すことが判明し、シミュレーションによる推定が妥当であることを示した。この結果から、サブユニット間の不安定化から、タンパク全体の不安定化のつながり、フラグメント化が進行したと推測した。以上のことから、NylCは数アミノ酸の置換でその会合状態や挙動が大きく異なることを明らかにすることができた。バイオコンバージョンを用いた合成ポリマーの再資源化を実現するためには、分解に関与する酵素の高機能化と安定化が重要である。ナイロン再資源化に重要なナイロン分解酵素NylCについて、立体構造解析から、耐熱化に有望な候補箇所を選出し、部位特異的変異導入を行った。モノマーA/D界面の変異(D36A、D122G、H130Y)、およびA/B界面の変異(E263Q)を、野生型NylC (Tm = 52°C)に導入すると、得られた4置換体では熱安定性は36°C上昇する(Tm = 88°C)。しかし、同変異体を親型酵素として、新たにランダム変異を導入すると、殆どの変異体で熱安定性が低下するか、或いは、細胞内発現が見られなくなった。RT-PCRによる遺伝子発現量算出から、mRNAの合成は正常に行われていると判断した。NylCポリクローナル抗体を用いて免疫分析を行ったところ、1可溶画分に活性型として存在、2可溶画分に前駆体型として存在、3沈殿画分に前駆体型として存在、4可溶画分にフラグメントのみが存在の4種類の挙動を取ることが分かった。状態2および3は、何れも自己分断能を失ったためであり、状態3では、さらに、モノマー間の不適切な会合により、不溶性凝集体を形成したためと考えられる。また、状態4では、発現段階で不安定化したため、細胞内プロテアーゼによる分解を受け、フラグメント化したものと推測した。