hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
血漿PAFアセチルヒドロラーゼの活性調節機構の解明を目的とした遺伝生化学的研究

モルモットクローンについてはFull-length cDNAは得られなかったため、5'-RACE法により失われている5'上流部分のcDNAを調整し、両断片に共通の制限酵素サイトを利用してFull-length cDNAを再構築した。一方、ヒトクローンに関しては1クローンがFull-length cDNAであることが明らかとなった。DNA塩基配列分析の結果推定される両酵素の一次構築を比較すると、アミノ酸レベルでは67%のホモロジーを有するものの、ヒト酵素の推定分子量(45kDa)は、酵素精製の結果(44kDa)とよく一致するのに対し、モルモット酵素の推定分子量(49kDa)は、酵素精製の結果(63kDa)よりかなり小さく、モルモット酵素はヒト酵素と異なり蛋白分子に糖鎖結合などの修飾が行われていることが示唆された。1.モルモット血漿PAFアセチルヒドロラーゼのcDNAクローニング(初年度)精製モルモット血漿PAFアセチルヒドロラーゼ(分子量63kDa)をリジルエンドペプチダーゼ処理し、得られた9個のペプチド断片のアミノ酸配列を気相法シークエンサーにより決定した。この配列をもとに、モルモット肝臓mRNAから調製した1st strand cDNAをテンプレートとしてPCRを行い、約600bpの特異的フラグメントを得た。これをプローブとし、モルモット肝臓cDNAライブラリー30万pfuををスクリーニングした結果、4個のポジティブクローンを得た。ところがN末端部分が含まれていないことが判明したため、5'RACE法により欠損部分を得た。塩基配列より予想されるタンパクは436アミノ酸(推定分子量49kDa)から成り、セリンエステラーゼに典型的なモチーフとアスパラギン結合型糖鎖により修飾可能な配列3個所を有していた。2.組換モルモット血漿PAFアセチルヒドロラーゼの発現と特異的抗体の作製(最終年度)His tagを有する発現ベクターを用いて大腸菌に発現させ、本遺伝子産物が活性を持つことを確認した。リコンビナント酵素をNi^+カラムおよびSDS-PAGEによって精製した。リコンビナントタンパクをウサギに免疫して特異的抗体を得た。この抗体は血漿中の63kDaの蛋自質と反応することから、本酵素は糖鎖付加などの翻訳後修飾を受けている可能性が考えられる。この修飾の生理的意義については今後明らかにしていかなければならない。このほかヒト酵素のcDNAクローニングと、アデノウイルスベクターを用いた哺乳動物細胞での発現実験を行った。現在、ゲノムDNAのクローニングを実施中である。これまでに肝臓およびマクロファージでエストラジオールによって、またマスト細胞ではインターロイキンにより本酵素の発現調節が行われていることが示唆されている。
多色輻射流体力学的模型による早期型質量放出星の脈動

動径脈動のモデル研究は線形脈動の解析にしても非線形シミュレーションにしてもかなりの研究がされている。これらのモデル研究では恒星の外層での輻射がエネルギーを内部から外部に運ぶ主たる機構である。したがって星の外層でのエネルギー収支、これが脈動の励起に関連する、を精度よく見積もることが必要になる。研究期間で明らかにしたこと(2)結果は線形解析では脈動周期と、脈動成長率に着目にてみるとこの近似による効果はほとんど無視できる大きさであることがわかった。非線形シミュレーションでは観測量(モデルの光球での物理量の変化)の時系列に着目して比較した。結果は規則的な非線形脈動ではこの近似による効果は無視てきる大きさであることがわかった。(3)興味ある結果が不規則脈動の場合に得られた。小質量超巨星の脈動では非線形脈動は不規則になることが知られている。このような不規則脈動では、時系列の振る舞いに異なる結果が得られた。規則的な非線形脈動では基本方程式系のわずかな違いは増幅されることはないとおもわれるが、不規則脈動では基本方程式系のわずかな違いは時系列の振る舞いに大きな効果として現れるからだと思われる。脈動変光星の理論低な研究では線形解析と非線形シミュレーションが相補的に行われている。線形解析では恒星の諸元に対してその恒星で可能な脈動モードの周期や脈動成長率などが得られるが、観測の比較や有限振幅に達したときの脈動の振る舞いなどは非線形シミュレーションに頼らなければならない。しかし、非線形シミュレーションが調べている脈動と線形解析でえられた脈動モードの対応がはっきりしないと非線形シミュレーションが何をシミュレーションしているのかわからなくなる。このためには、線形解析の解析プログラムと非線形シミュレーションの解析プログラムを統一的に構築する必要がある。拡散近似では、T.Aikawa(Ap. J.,374,700,1990)などでこの用法がとられ、小質量超巨星で出現するストレンジモードによる有限振幅の脈動の様子などがしらべられている。早期型の脈動では拡散近似では不十分で、輻射場をさらに高い近似で取り扱う必要がある。本研究では、輻射場を拡散近似より高いものを使い脈動の線形解析と非線形シミュレーションが統一的に扱えるコンピュータプログラムの作成を目指している。準備的な試みであるが、非平衡拡散近似で統一的に線形解析と非線形シミュレーションが行えるプログラムを制作中であり、結果は6月のIAU Colloq. 193に出したいと考えている。最終的には多色輻射場として輻射場を取り扱うプログラムとして、しかも、並列処理システムに載せることを考えている。この方向での模索は、相川利樹・佐藤昭治"小規模並列処理システムによる計算: PVM, MPIを使ってみて"(人間情報学、2002)で公にした。本研究は小質量の超巨星として現れる脈動星の脈動の性質を調べるために必要なモデルの研究である。これらの脈動星は星の進化から見るとAGB段階で著しい質量放出を経験した後の段階にあると思われる。この著しい質量放出の機構は不明な点が多い。したがってその後の恒星進化も不確かな点がある。そのような段階にある脈動変光星が本研究の対象とするものでる。これらの脈動の性格が解明できるとこの脈動の性質からこれらの恒星についての情報が取り出せる。そのためには、これらの脈動星の外層のモデルを精度よく構築し、その外層の脈動を調べる必要がある。小質量の超巨星の外層は光度が大きく熱力学的に見ると非断熱性の高い輻射流体になっている。そのような流体での脈動では輻射輸送を精度よく取り扱う必要がある。本研究では多色輻射輸送のモデルを展望しつつこの点に焦点を当てて研究を進めた。さらに本研究では、脈動の線形解析と非線形シミュレーションの対応関係がつくように両モデルを整合性あるように扱うことにも留意している。線形解析からはどのようなモードが脈動不安定かがわかる。非線形シミュレーションではその不安定モードにより励起された脈動の有限振幅になったときの脈動の振る舞いが出てくる。この非線形脈動の振る舞いが観測と比較されるものである。以下本研究でこれまでに得られた成果を列記する。

(1)輻射流体の取り扱いの精度を上げる方法として、輻射輸送方程式のモーメントを流体力学の基本式に導入する方法で精度をあげることにして、出てきた動径脈動の流体方程式が線形解析、非線形モデルで取り扱えることを確認した。(2)この輻射輸送方程式もいくつかの近似がとりうる。もっとも単純な近似をとるとこれが拡散近似であり、従来から用いられているものである。現在はこれより高い近似を採用した場合のモデルを調べている。この近似による線形解析の結果は一部公表している。ここでは対象としてpost-AGB星に現れる脈動を調べた。(3)本研究では、最終的に多色輻射輸送を取り込んだ輻射流体による脈動を調べたい。そのためにコンピュータ資源として並列システムの利用が不可欠である。そのための予備的の研究として、小規模並列システムの計算効率を調べた。小規模並列システムが本研究を進める上で有効であることを確認している。
脳血管障害のオーダーメイド予防システムの開発

研究参加施設の協力により、患者対照集団4,500例(脳梗塞1,000例、脳出血500例、対照3,000例)のDNAサンプルおよび臨床データを収集した。これらのサンプルについて202遺伝子多型の関連解析により、interleukin-6遺伝子多型がアテローム血栓性脳梗塞および脳出血の発症に強く関連することを報告した。さらにアテローム血栓性脳梗塞では7個の多型が、脳出血では8個の多型が発症と有意に関連した。またアテローム血栓性脳梗塞発症に関連する遺伝子多型は、男性と女性、あるいは高血圧・糖尿病・高脂血症などの危険因子の有無によって異なることを明らかにした。また、ミトコンドリアのハプログループAが女性のアテローム血栓性脳梗塞の危険因子であることを報告した。さらに、98遺伝子多型について関連解析を行い、ABCA1遺伝子多型、IRAK1遺伝子多型、ROS1遺伝子多型がアテローム血栓性脳梗塞の発症に、LIMK1遺伝子多型が脳出血の発症にそれぞれ強く関連することを見出した。これらの多型に加え、アテローム血栓性脳梗塞では4個の多型が、脳出血でも7個の多型がそれぞれ発症と有意に関連した。また、アテローム血栓性脳梗塞131例、対照135例について、SNPチップ(GeneChip Mapping 500K Set, Affymetrix)を用いたゲノム全領域関連解析を行い、アテローム血栓性脳梗塞発症と強く関連する(P<10^<-20>)SNPsを100個抽出した。これらのSNPsについて別の集団で関連解析を行い、発症に関連するSNPsを8個同定した。これらのSNPsの中でも、とりわけ関連の強い上位3個のSNPsについて連鎖不平衡ブロックのシークエンスを行っており、アテローム血栓性脳梗塞発症に強く関連するSNPsを確定することにより、より精度の高いオーダーメイド予防システムを開発する予定である。研究参加施設(岐阜県総合医療センター、岐阜県立多治見病院、弘前脳卒中センター)の協力により、600例の脳血管障害(脳梗塞、脳出血、くも膜下出血)のDNAサンプルおよび臨床データを新たに収集した。また、152候補遺伝子202多型の関連解析により、interleukin-6遺伝子多型がアテローム血栓性脳梗塞および脳出血の発症に強く関連し、polycystic kidney disease 1-like遺伝子多型とtumor necrosis factor遺伝子多型がくも膜下出血の発症に強く関連することを報告した(Yamada et al.Arterioscler Thromb Vasc Biol 2006)。さらにアテローム血栓性脳梗塞では7個、脳出血では8個、くも膜下出血では9個の多型が発症と有意に関連することを見出した。また、候補遺伝子アプローチとして、新たに50遺伝子98多型の解析を行っており、既に半分の49多型については解析を終了している。さらに、包括的なアプローチとして、アテローム血栓性脳梗塞131例、対照135例について、SNPチップ(GeneChip Mapping 500K Set, Affymetrix)を用いたゲノム全領域関連解析を行った。即ち、ヒトゲノム全領域に配置された約50万個のSNPsのスクリーニング関連解析を行い、アテローム血栓性脳梗塞発症と強く関連する(P<10^<-20>)SNPsを抽出した。現在、これらのSNPsについてさらに別の集団で関連解析を行っており、疾患発症に強く関連するSNPsを確定することにより、より精度の高いオーダーメイド予防システムの開発を目指している。本研究は、三重大学医学部および各研究参加施設の倫理委員会の承認を得ており、ヒトゲノム・遺伝子解析研究に関する倫理指針(平成16年12月28日全部改正、平成17年6月29日一部改正)を遵守して行っている。

これらのSNPsの中でも、とりわけ関連の強い上位3個のSNPsについて連鎖不平衡ブロックのシークエンスを行っており、アテローム血栓性脳梗塞発症に強く関連するSNPsを確定することにより、より精度の高いオーダーメイド予防システムを開発する予定である。
シンクロナイズドスイミング競技の技術向上をめざしたトレーニング方法の開発

シンクロナイズドスイミング競技において,バレーレッグ姿勢(上向き水平姿勢から,右股関節を90度に屈曲させる動作)は競技力を構成する重要な基本動作である.しかしながら,バレーレッグ姿勢を実施するために必要な体力的要因は明らかにされていない.従って,本研究では,シンクロナイズドスイミング競技におけるバレーレッグ姿勢の股関節屈曲角度の正確性と体力テスト項目との関係を検証し,技術を遂行するために必要な体力要素(技術関連体力)を明らかにすることを目的とした.27年度は,高い競技レベルを有する小学生,中学生,高校生,および大学生をジュニア群とシニア群に分類し,バレーレッグ姿勢の評価と体力測定項目の関係を検討した.その結果,水中におけるバレーレッグ姿勢の再現誤差角度は,ジュニア群と比較してシニア群が低値を示した.また,体力測定項目はジュニア群と比較してシニア群が全ての項目において高値を示した.水中で行うバレーレッグ姿勢を正確に遂行するためには,スカーリング動作,股関節の可動域,体幹保持能力などの体力要素が貢献している可能性が示唆された.28年度は,高い競技レベルを有する小学生,中学生,高校生,および大学生をジュニア群とシニア群に分類し,バレーレッグ姿勢における視覚遮断が動作に与える影響をを検討した.その結果,シニア群,ジュニア群ともに,課題動作における視角遮断条件と通常条件との間には,再現誤差の差異は認められなかった.シンクロ競技選手にとって,バレーレッグ姿勢は反復練習によって動作が確立されているものと推察された.29年度および30年度は,高校生選手を対象とし、試合期におけるデュエットフリールーティン種目の演技中の技術的要素の推移を観察した.シンクロナイズドスイミング競技において,バレーレッグ姿勢(上向き水平姿勢から、右股関節を90度に屈曲させる動作)は競技力を構成する重要な基本動作である.しかしながら,バレーレッグ姿勢を実施するために必要な体力的要因は明らかにされていない.従って,本研究では,シンクロナイズドスイミング競技におけるバレーレッグ姿勢の股関節屈曲角度の正確性と体力テスト項目との関係を検証し,技術を遂行するために必要な体力要素(技術関連体力)を明らかにすることを目的とした.本年度は,高い競技レベルを有する小学生,中学生,高校生,および大学生選手24名を対象に,バレーレッグ姿勢の評価と体力測定を実施した.対象者を競技規則に従い,シニア群(年齢17.7±2.6歳)とジュニア群(年齢年齢11.5±1.5歳)に分類し,検討を加えた.バレーレッグ姿勢の評価は,動作をハイスピードカメラ(CASIO, EX-F1)を用いて撮影し,得られた映像から股関節屈曲角度を分析した(Dipp Motionpro,Ditect).課題角度(90度)と実施動作によって再現された角度との差の絶対値を再現誤差として算出し,用いた.体力測定項目は,ダブルバレーレッグ姿勢の保持時間,水中での股関節可動域,陸上での体幹保持時間および上体起こしとした.その結果,水中におけるバレーレッグ姿勢の再現誤差角度は,ジュニア群と比較してシニア群が低値を示したが,陸上で行ったバレーレッグ姿勢では,ジュニア群とシニア群の間に差異は認められなかった.体力測定項目は,ジュニア群と比較してシニア群が全ての項目において高値を示した.以上のことより,水中で行うバレーレッグ姿勢を正確に遂行するためには,スカーリング動作,股関節の可動域,体幹保持能力などの体力要素が貢献している可能性が示唆された.現在までの研究状況は,おおむね順調に進展していると考えられる.その理由は,予定していた研究協力者に,主な測定項目を実施することができ,研究計画において,希望していたデータを収集することができたからである。シンクロナイズドスイミング競技において,バレーレッグ姿勢(上向き水平姿勢から,右股関節を90度に屈曲させる動作)は競技力を構成する重要な基本動作である.しかしながら,バレーレッグ姿勢を実施するために必要な体力的要因は明らかにされていない.従って,本研究では,シンクロナイズドスイミング競技におけるバレーレッグ姿勢の股関節屈曲角度の正確性と体力テスト項目との関係を検証し,技術を遂行するために必要な体力要素(技術関連体力)を明らかにすることを目的とした.27年度は,高い競技レベルを有する小学生,中学生,高校生,および大学生をジュニア群とシニア群に分類し,バレーレッグ姿勢の評価と体力測定項目の関係を検討した.その結果,水中におけるバレーレッグ姿勢の再現誤差角度は,ジュニア群と比較してシニア群が低値を示したが,陸上で行ったバレーレッグ姿勢では,ジュニア群とシニア群の間に差異は認められなかった.また,体力測定項目はジュニア群と比較してシニア群が全ての項目において高値を示した.水中で行うバレーレッグ姿勢を正確に遂行するためには,スカリーング動作,股関節の可動域,体幹保持能力などの体力要素が貢献している可能性が示唆された.28年度は,高い競技レベルを有する小学生,中学生,高校生,および大学生をジュニア群とシニア群に分類し,バレーレッグ姿勢における視覚遮断が動作に与える影響をを検討した.その結果,シニア群,ジュニア群ともに,課題動作における視角遮断条件と通常条件との間には,再現誤差の差異は認められなかった.シンクロ競技選手にとって,バレーレッグ姿勢は重要視されている基本姿勢であるため,反復練習によって動作が確立されているものと推察された.また,バレーレッグ姿勢時の筋活動についての検討は29年度も継続して実施する.現在までの研究状況は,おおむね順調に進行していると考えられる.その理由は,予定していた研究協力者に、主な測定項目を実施することができ、研究計画において,希望していたデータを収集することができているからである.

シンクロナイズドスイミング競技において,バレーレッグ姿勢(上向き水平姿勢から,右股関節を90度に屈曲させる動作)は競技力を構成する重要な基本動作である.しかしながら,バレーレッグ姿勢を実施するために必要な体力的要因は明らかにされていない.従って,本研究では,シンクロナイズドスイミング競技におけるバレーレッグ姿勢の股関節屈曲角度の正確性と体力テスト項目との関係を検証し,技術を遂行するために必要な体力要素(技術関連体力)を明らかにすることを目的とした.27年度は,高い競技レベルを有する小学生,中学生,高校生,および大学生をジュニア群とシニア群に分類し,バレーレッグ姿勢の評価と体力測定項目の関係を検討した.その結果,水中におけるバレーレッグ姿勢の再現誤差角度は,ジュニア群と比較してシニア群が低値を示した.また,体力測定項目はジュニア群と比較してシニア群が全ての項目において高値を示した.水中で行うバレーレッグ姿勢を正確に遂行するためには,スカリーング動作,股関節の可動域,体幹保持能力などの体力要素が貢献している可能性が示唆された.28年度は,高い競技レベルを有する小学生,中学生,高校生,および大学生をジュニア群とシニア群に分類し,バレーレッグ姿勢における視覚遮断が動作に与える影響をを検討した.その結果,シニア群,ジュニア群ともに,課題動作における視角遮断条件と通常条件との間には,再現誤差の差異は認められなかった.シンクロ競技選手にとって,バレーレッグ姿勢は反復練習によって動作が確立されているものと推察された.本年度は,中学,高校生選手を対象とし,陸上と水中におけるバレーレッグ姿勢時の筋活動についての分析を実施し,陸上実施時と水中実施時の比較,最大筋力発揮時との比較を検討している.本課題は30年度も継続して実施することとする.現在までの研究状況は,やや遅れていると考えられる.その理由は,実験のプロトコールについて試行錯誤し,予備実験に時間を要したことである.次年度に持ち越さざるを得なかった実験を早急に実施して,データを収集し,分析を行っていく予定である.シンクロナイズドスイミング競技において,バレーレッグ姿勢(上向き水平姿勢から,右股関節を90度に屈曲させる動作)は競技力を構成する重要な基本動作である.しかしながら,バレーレッグ姿勢を実施するために必要な体力的要因は明らかにされていない.従って,本研究では,シンクロナイズドスイミング競技におけるバレーレッグ姿勢の股関節屈曲角度の正確性と体力テスト項目との関係を検証し,技術を遂行するために必要な体力要素(技術関連体力)を明らかにすることを目的とした.27年度は,高い競技レベルを有する小学生,中学生,高校生,および大学生をジュニア群とシニア群に分類し,バレーレッグ姿勢の評価と体力測定項目の関係を検討した.その結果,水中におけるバレーレッグ姿勢の再現誤差角度は,ジュニア群と比較してシニア群が低値を示した.また,体力測定項目はジュニア群と比較してシニア群が全ての項目において高値を示した.
枯草菌を中心とした細菌ゲノムにおける転写制御領域とネットワークの情報学的解明

一般に共発現されている遺伝子のプロモーター領域は、共通の転写因子で制御されている可能性が高く、その解析はグローバルな細胞制御ネットワークの理解にとって、非常に重要である。そこで、注釈情報がついた66のグラム陽性菌門(firmicutes)のゲノムを比較して、まず相同遺伝子クラスターを構築した。それらの上流配列を調べるのに二つのアプローチをとった。第一に、枯草菌の転写情報を集めたデータベースDBTBSに収められた枯草菌の既知転写因子結合配列を表す重み行列を、各ゲノムの対応遺伝子上流配列に適用し、枯草菌における結合部位の系統的な保存情報を調べた。第二に、先に求めた相同遺伝子クラスターの上流配列の進化的保存状態を系統的に調べた。既知モチーフの保存パターンを観察するために、独自のグラフィック表示法を開発した。そこでは、各遺伝子クラスターについて、どのストレインに相同遺伝子が存在し、またその上流にその転写因子結合部位候補が存在するかの一覧を表示している。この方法によって、CtsRとHrcAという熱ショック反応レギュロンの制御システムのグラム陽性菌門における保存状態と相違点がわかりやすく表示された。一方、各遺伝子クラスターの上流遺伝子間領域の保存状態を調べるために、保存された部分領域ごとに重み行列を作成し、既知のモチーフとの重なりを調べたところ、多数の新規エレメント候補を抽出できた。このように多数のゲノムを比較解析することによって、単に一つのストレインではなく、属全体にわたる制御ネットワークの違いを明らかにすることができる。従って、今後このアプローチにより、現在の細菌類の制御ネットワークへの理解を高めていけるだけでなく、新たな実験研究を生み出す力になることが期待される。枯草菌をはじめとする低G+C含量グラム陽性菌のプロモーター領域を組織的な比較ゲノム解析によって研究している。まず、NCBIから66種類の低G+C含量グラム陽性菌門(phylum)の全ゲノム配列をダウンロードし、それらに含まれるアミノ酸配列の類似性を調べて、ホモログクラスター(オーソログ、パラログを含む)を作成した。次に我々のグループで構築・管理している枯草菌転写データベースDBTBSから、既知の転写因子の認識配列を表す31個の重み行列をそれらのホモログクラスター上流に適用して、共通の綱(class)やsubclassに共通して出現するかどうかを検討した。その結果、たとえばストレス応答遺伝子HrcA遺伝子は一般に自分自身によって制御されているが、スタフィロコッカスの仲間ではこれに加えて別のストレス応答因子CtsRによっても成業されていることがわかった。その生物学的意味は今のところ不明であるが、より詳細に(あるいはより自動化して)結果を検討することにより、生物学的に興味深い発見をできるのではないかと期待している。また、ホモログクラスターの遺伝子上流配列を、そのclass毎に保存度の位置依存性を描画して、制御上重要な部位がどのように進化的に保存されているか(あるいは保存されていないか)を網羅的に調べている。こちらもデータベースとしての公開とこの結果を用いたより詳細な解析を予定している。また、カタユウレイボヤゲノムにおける転写制御配列の解析にも取り組んでおり、その第一段階として、既知のシスエレメントや遺伝子の組織特異的発現情報、近縁種間のプロモーター配列比較などの情報を文献から渉猟して構築したデータベースDBTGRを構築し、一般公開している。
精子のエピゲノム修飾と経世代変化

本研究は、ほ乳類における精子ゲノムのシトシン修飾の変化が次世代の個体に伝わる可能性を検証することを目的としている。特にメチルシトシンのみならずヒドロキシメチルシトシンも含めて網羅的に解析することで、個体レベルでの経世代的なエピゲノム修飾についての新しい知見を得ることを目指す。このため、マウスを用いて父親の生理的な条件による精子のエピゲノム修飾の変化や、精子形成過程でのシトシン修飾の変化を我々が新たに開発したメチルシトシン、ヒドロキシメチルシトシンを同時に1分子ずつで解析する画期的な手法であるEnIGMA法をゲノムワイド解析が行えるよう改良を加え、これを用いて網羅的に解析することを目的としている。これまで、EnIGMA法について改良を重ね、ゲノムワイド解析への適応が可能となるEnIGMA-seq法として技術的な目処を立てることに成功した。また、次世代シーケンサーによる解析から得られるデータを用いて全てのCpGについてメチルシトシンとヒドロキシメチルシトシン、非修飾シトシンの同定を行うパイプラインを構築した。そこで、現在実際にマウスの精子において標準的なメチルシトシン、ヒドロキシメチルシトシンの全ゲノムプロファイル取得を試みている。今後、受精後の初期胚においてヒドロキシメチル化を中心としたゲノムの非対称な修飾とそのダイナミックな変化に伴う遺伝子発現調節を解析することで精子ゲノムのシトシン修飾の変化が次世代に伝達する可能性についての可能性を明らかにできると考えている。これまで、研究代表者が開発したメチルシトシンとヒドロキシメチルシトシンを同時に同定解析する手法であるEnIGMA法について改良を重ね、ゲノムワイド解析への適応が可能となるEnIGMA-seq法として技術的な目処を立てることに成功した。また、次世代シーケンサーによる解析から得られるデータを用いて全てのCpGについてメチルシトシンとヒドロキシメチルシトシン、非修飾シトシンのいずれであるかをEnIGMA法において同定する解析用のスクリプトを完成させた。現在EnIGMA-seqを用いてマウスの精子ゲノムの標準的なメチルシトシン、ヒドロキシメチルシトシンの全ゲノムプロファイル取得を試みている。ゲノムワイドの解析においてEnIGMA-seqが十分な検出精度を持っているかの検証を行うとともに、必要に応じて解析精度の向上を行う。今後ゲノムワイドの解析の結果、成熟精子においてhmCが集積していると考えられる部分について、雄マウスの栄養条件や週齢など様々な生理的条件を変化させた場合にこれらの部位のシトシン修飾が影響を受けるかを解析を行うことで、精子ゲノムのシトシン修飾の変化が次世代に伝達する可能性について明らかにする。

そこで、現在実際にマウスの精子において標準的なメチルシトシン、ヒドロキシメチルシトシンの全ゲノムプロファイル取得を試みている。今後、受精後の初期胚においてヒドロキシメチル化を中心としたゲノムの非対称な修飾とそのダイナミックな変化に伴う遺伝子発現調節を解析することで精子ゲノムのシトシン修飾の変化が次世代に伝達する可能性についての可能性を明らかにできると考えている。これまで、研究代表者が開発したメチルシトシンとヒドロキシメチルシトシンを同時に同定解析する手法であるEnIGMA法について改良を重ね、ゲノムワイド解析への適応が可能となるEnIGMA-seq法として確立するために検討を行ってきた。その過程で現有のdropletPCR装置をバージョンアップして増幅のモニターを蛍光物質のEverGreenを用いて可能にする計画であったが、装置のバージョンアップのサービスが終了したことが判明し、この手法による増幅のモニターを行うことができなくなった。そのためTaqManprobeを用いてbisulfite反応の産物のPCRを現有のdropletPCR装置で確認できるよう、用いる配列を新たに設定し直すなどの検討を行って条件検討を可能とすることができた。したがって、初年度の研究の遅れを取り戻すことができた。さらにこの改良の結果を基盤として用いることで、EnIGMA法の改良を進め、ゲノムワイド解析への適応を行うEnIGMA-seq法として実験系の改良を行った。現在EnIGMA-seqを用いてマウスの精子ゲノムの標準的なメチルシトシン、ヒドロキシメチルシトシンの全ゲノムプロファイル取得を試みている。ゲノムワイドの解析においてEnIGMA-seqが十分な検出精度を持っているかの検証を行うとともに、必要に応じて解析精度の向上を行う。今後ゲノムワイドの解析の結果、成熟精子においてhmCが集積していると考えられる部分について、雄マウスの栄養条件や週齢など様々な生理的条件を変化させた場合にこれらの部位のシトシン修飾が影響を受けるかを解析を行うことで、精子ゲノムのシトシン修飾の変化が次世代に伝達する可能性について明らかにする。
圧力誘起フラーレン超伝導体の超伝導発現機構の解明

圧力誘起超伝導体Cs_3C_<60>の超伝導発現機構の解明のために,Cs_3C_<60>の構造と物性を常圧から6GPaまでの圧力下で詳細に調べた.常圧では,Cs_3C_<60>には体心斜方相(Immm)と,マイナー相として単純立方相(A15:Pm3^^-n)の二相が存在することを確認した.さらに,体心斜方相においては,Csのサイト占有が完全でないために,Cs_4C_<60>との間に固溶体的な中間相が存在できることが予想されたために,中間相を作製して構造と物性を調べた.Cs_<3.00(6)>C_<60>および中間相であるCs_<3.5(1)>C_<60>においては,常圧では,上述の二相が存在し,30kbar以上ではA15相が消滅することがわかった.また,A15相が50%程度存在する試料の作成に成功した.ESRから,Cs_<3.00(6)>C_<60>およびCs_<3.3(1)>C_<60>は2-300KでPauli常磁性的であったが,ΔH_<pp>/(Δg)^2はElliot-Yafet関係を示さず,金属的と断定できなかった.一方,中間相の電気抵抗率ρは金属的な温度特性を示さず,ホッピング伝導もしくはfluctuation誘起トンネル伝導を示唆する温度特性を示した.中間相の交流帯磁率は,10kbarまでは1.5K以上で超伝導転移を示さず,中間相が超伝導相ではないことを示している.Cs_XC_<60>以外にも,二次元ポリマーであるNa_4C_<60>およびDy@C_<82>の構造および電子輸送の温度・圧力依存性を調べた.Na_4C_<60>ではESRから金属的特性が示唆されたが,ρの温度依存性はギャップエネルギーE_g=0.5-0.8eVの半導体であることを示した.Na_4C_<60>は,高圧では三次元ポリマー化の傾向を示した.Dy@C_<82>異性体I固体では,310Kで構造相転移が確認され,低温相の空間群がPa3^^-と決定できた.常圧では,Dy@C_<82>は0.2eVの小さなギャップを有する半導体であった.これは,高圧で金属化などの興味深い特性が見いだされることを示唆する.圧力誘起超伝導体Cs_3C_<60>の超伝導発現機構の解明のために,Cs_3C_<60>の構造と物性を常圧から6GPaまでの圧力下で詳細に調べた.常圧では,Cs_3C_<60>には体心斜方相(Immm)と,マイナー相として単純立方相(A15:Pm3^^-n)の二相が存在することを確認した.さらに,体心斜方相においては,Csのサイト占有が完全でないために,Cs_4C_<60>との間に固溶体的な中間相が存在できることが予想されたために,中間相を作製して構造と物性を調べた.Cs_<3.00(6)>C_<60>および中間相であるCs_<3.5(1)>C_<60>においては,常圧では,上述の二相が存在し,30kbar以上ではA15相が消滅することがわかった.また,A15相が50%程度存在する試料の作成に成功した.ESRから,Cs_<3.00(6)>C_<60>およびCs_<3.3(1)>C_<60>は2-300KでPauli常磁性的であったが,ΔH_<pp>/(Δg)^2はElliot-Yafet関係を示さず,金属的と断定できなかった.一方,中間相の電気抵抗率ρは金属的な温度特性を示さず,ホッピング伝導もしくはfluctuation誘起トンネル伝導を示唆する温度特性を示した.中間相の交流帯磁率は,10kbarまでは1.5K以上で超伝導転移を示さず,中間相が超伝導相ではないことを示している.Cs_XC_<60>以外にも,二次元ポリマーであるNa_4C_<60>およびDy@C_<82>の構造および電子輸送の温度・圧力依存性を調べた.Na_4C_<60>ではESRから金属的特性が示唆されたが,ρの温度依存性はギャップエネルギーE_g=0.5-0.8eVの半導体であることを示した.Na_4C_<60>は,高圧では三次元ポリマー化の傾向を示した.Dy@C_<82>異性体I固体では,310Kで構造相転移が確認され,低温相の空間群がPa3^^-と決定できた.常圧では,Dy@C_<82>は0.2eVの小さなギャップを有する半導体であった.

これは,高圧で金属化などの興味深い特性が見いだされることを示唆する.圧力誘起超伝導体Cs_3C_<60>の超伝導相の特定と、圧力誘起超伝導機構の解明のために、常温・高圧のX線回折、低温・高圧のX線回折、高圧ラマン、常圧でのESR、常圧の電気伝導および高圧での交流帯磁率測定を行った。高圧でのX線回折パターンは、30kbar以上でのA15相の消滅を示した。また、低温・高圧でのX線回折から、超伝導領域に当たる温度・圧力領域でもA15相は存在せず、体心斜方晶(bco)のみが存在することがわかった。これらの結果は、超伝導相がbco相であることを示唆している。また、Cs_3C_<60>はCs_4C_<60>と同形構造でありその違いはCsの占有数が0.75から1.00に変わるだけである。これは、Cs_3C_<60>とCs_4C_<60>の中間相が存在することを意味している。また、ラマンから求めたCs_<3.2>C_<60>の電子-格子結合定数λは常圧で0.23であり、通常のフラーレン超伝導体と比べて小さい。また、その値は高圧領域でも超伝導を発現できるほど大きくなかった。これは、この相が超伝導相でない可能性を示唆している。これを調べるために、Cs_<3.0>C_<60>および中間相の常圧での輸送特性をESRと電気伝導から調べた。得られた結果から、Cs_<3.0>C_<60>以外の中間相、すなわちbco相のCs_<3.2>C_<60>やCs_<3.4>C_<60>は通常の金属ではないことが見いだされた。一方、Cs_<3.0>C_<60>は金属的であった。一般に、フラーレン超伝導体では、金属的挙動を示す相のみが超伝導転移を起こす。したがって、中間相は超伝導相ではないことが予想されるが、高圧での交流帯磁率からも中間相は超伝導ではないことが見いだされた。以上の結果から、bco相のCs_<3.0>C_<60>が圧力誘起超伝導相であると結論された。現在、bco相のCs_<3.0>C_<60>の圧力誘起超伝導転移を直接確認するためにCs_<3.0>C_<60>の高圧交流帯磁率測定を行っている。圧力誘起超伝導体Cs_3C_<60>の超伝導発現メカニズムを明らかにするために,Cs_3C_<60>の常圧と高圧領域での構造と物性の研究を行った.さらに,Cs_3C_<60>の体心斜方相においては、Csのサイト占有が完全でないために、Cs_4C_<60>との間に固溶体的な中間相が存在できることが予想されたために,中間相を作製して構造と物生を調べた.Cs_<3.00(6)>C_<60>および中間相であるCs_<3.5(1)>C_<60>においては常圧で体心斜方相(Immm)とA15(Pm3^^-n)相が存在するのに対して,30kbar以上ではA15相は消滅することがわかった.ESRから,Cs_<3.00(6)>C_<60>およびCs_<3.3(1)>C_<60>は2-300KでPauli常磁性的であったが,ΔH_<PP>/(Δg)^2はElliott-Yafet関係を示さず,金属的と断定できなかった.一方,中間相の電気抵抗率ρは金属的な温度特性を示さず,ホッピング伝導もしくはfluctuation誘起トンネル伝導に基づく温度特性を示した.中間相の交流帯磁率は、10kbaまでは1.5K以上で超伝導転移を示さず,中間相が圧力誘起超伝導相であることを否定した.本研究では,Cs_XC_<60>以外にも,二次元ポリマー構造をとるNa_4C_<60>および金属内包フラーレンの構造および電子輸送の温度・圧力依存性を調べた.Na_4C_<60>はESRから金属的特性が示唆されたが,ρの温度依存性はギャップエネルギーE_g=0.5-0.8eVの半導体であることを示した.高圧では,三次元ポリマー化する傾向が見られた.Dy@C_<82>異性体1固体では,310Kで構造相転移が確認され,低温相の空間群がPa3^^-と決定できた.常圧では,Dy@C_<82>は0.2eVの小さなギャップを有する半導体であった.これは,高圧で金属化などの興味深い特性が見いだされることを示唆する.
礼学形成史資料としての両戴記の基礎的研究

『儀礼』の記述を「経」(各礼の冒頭部から始まって一貫した礼の儀節を記す部分)と「記」(「経」以外の部分)に区分することによって、各「経」の成立について、その相対的な先後を定めるとともに、各「経」「記」の成立が先秦に遡るものであることを示した。また、そのことを利用して、『礼記』の冠義篇以下六篇で『儀礼』の義を解説した部分や、礼運、礼器、郊特牲の三篇、祭法等の礼の義を説く各篇の成立が先秦に遡ることを示すことによって、これらを先秦礼学史の資料として利用する道筋を付けた。本年度は『礼記』中の礼の義を解説した諸篇のうち、『儀礼』の礼の義を解説したとされる諸篇と、喪礼の義を解説した諸篇を中心とした読解を行い、その内、冠篇と昏義篇前半については、注疏を含む訳注を『東洋古典学研究』第38、39集に掲載した。『儀礼』の礼の義を解説したとされる諸篇を分析する過程で、『儀礼』に付けられた「記」について分析を行う必要が生じ、田中利明「儀礼の「記」の問題」(『日本中国学会報』第19集)の「経」「記」の区分を基盤として、『儀礼』の文献的性格についての基礎的な分析を行い、士冠礼「経」ー特牲饋食礼「経」ー少牢饋食礼「経」および郷飲酒義礼「経」ー燕礼「経」ー大射儀「経」の順に「経」が成立したこと、燕礼「経」は聘礼「経」、公食大夫礼「経」、特牲饋食礼「経」に先立って成立したこと等を明らかにした。これは、本研究の目的よりすると付随的な成果に過ぎないが、『儀礼』各篇の成立の相対的な前後の推定を可能にしたものとして、大きな意義を持つものである。また、『儀礼』の分析から、礼の完備化を中心として、初期礼学の展開の姿を明らかにし、『礼記』の内、特に礼との関係の深い諸篇もまたこの初期礼学の展開の上に乗ることを明らかにした。具体的には、『礼記』の投壷篇や『大戴礼記』の公冠篇等が「経」の種類を増やしていく方向での礼の完備化を、『礼記』の喪大記篇や喪服小記篇等が「直接的な記」による礼の完備化を、『礼記』の曾子問篇等が「間接的な記」による礼の完備化を受け継ぐものとしてとらえ得ることを明らかにするとともに、『礼記』の冠義篇や昏義篇等が礼の完備化の過程において問われることになる各儀節の意義への探求を受け継ぐものであることを明らかにした。これは、今後の本研究の基本的な方向を定めるものである。なお、上記の成果については、『東洋古典学研究』第39集に掲載した。本年度は両戴記中の礼の義を解説した諸篇のうち、『儀礼』の礼の義を解説したとされる諸篇と、『礼記』礼器、郊特牲、『大戴礼記』朝事、本命の諸篇を中心に読解および分析を進めた。その内、昏義篇後半および郷飲酒義前半については、注疏を含む訳注を『東洋古典学研究』第40集、41集に掲載した。本年度中に論文として発表した研究実績は、『礼記』の冠義以下六篇の、従来、今文礼の義を説いたと目されていた諸篇についてである。『礼記』郊特牲篇には、『儀礼』士冠礼の「記冠義」重複文と並べられ、「記昏義」とでも称すべき昏礼の義を記した部分であり、その一部が郭店楚簡『六徳』と重複している。この「記昏義」が昏義篇を利用するものであることを論証し、かつ「記昏義」の一部が『韓詩外伝』に引用されていることから、昏義篇の成立の下限を前漢初期に確定することができた。さらに、冠義篇以下六篇の構成を分析し、各篇ともに由来を殊にするいくつかの資料から構成されているものの、その核となる部分においては、その論述形式、解経意識を共有しており、それらがほぼ同じ時代に同じ思想傾向を持つグループによって作成されたものであること示し(射義篇を除く)、また、この部分の成立の上限が『儀礼』士冠礼等の「経」「記」の成立に置かれ、下限が『礼記』哀公問篇および『荀子』楽論篇の成立に置かれることを示した。このことは、冠義篇以下六篇(射義篇を除く)の中核部分が、先秦時期に成立した可能性が高いことを示しており、これらの篇を漢代に成立した今文礼の義を説くものとする、これまでの見解が成立し得ないことを示している。なお、上記の成果については、『東洋古典学研究』第41集に掲載した。本研究の基礎的作業となる両戴記各篇の読解については、ほぼ予定のペースで進められており、その訳注成果を日本、学術誌に掲載することができている。よって、現時点において、本研究は「おおむね順調に進展している」と判断した。

両戴記と『儀礼』に見える「玄酒」に関する記述を分析し、『儀礼』の各礼で用途を持たずに虚設される単なる真水が「玄酒」と呼ばれ最上の酒として位置付けられていく過程を明らかにすることによって、『礼記』の坊記、礼運、礼器、郊特牲、楽記および『大戴礼記』の礼三本の各篇の相対的先後関係がほぼこの順であることを明らかにするとともに、これらの篇の成立が先秦に遡るものであることを明らかにして、これを先秦礼学史の資料として用いる道筋をつけた。さらに、『礼記』祭法篇が内包する廟制の姿を明らかにして、これが前漢廟制論議の骨格を与えていることを示すとともに、楚簡の卜筮祷祀記録に見える五祀や人鬼の祭祀対象の状況や秦簡の日書に見える五祀の記録を利用して祭法篇の成立が先秦に遡るものであることを明らかにして、これを先秦礼学史の資料として用いる道筋を開いた。前年度に議論した『礼記』の冠義以下の六篇を加えると、研究実施計画で分析することを予定していた両戴記の礼の義を説く各篇の主たる三領域(『儀礼』の義を説明した各篇、礼運以下の三篇、祭法以下の祭祀の義を説明した三篇)について一通りの解析を行い、その少なからぬ篇についてそれが先秦の成立であることを導いて、両戴記を用いて先秦礼学史の議論を行うことの基礎を築いたこことになる。また、『礼記正義』の郷飲酒義篇の後半部、射義篇の前半部の訳注を『東洋古典学』誌上に発表し、研究期間全体を通じると、『礼記正義』の巻六十一全体と、巻六十二の約三分の一の訳注を公開できたことになる。『儀礼』の記述を「経」(各礼の冒頭部から始まって一貫した礼の儀節を記す部分)と「記」(「経」以外の部分)に区分することによって、各「経」の成立について、その相対的な先後を定めるとともに、各「経」「記」の成立が先秦に遡るものであることを示した。また、そのことを利用して、『礼記』の冠義篇以下六篇で『儀礼』の義を解説した部分や、礼運、礼器、郊特牲の三篇、祭法等の礼の義を説く各篇の成立が先秦に遡ることを示すことによって、これらを先秦礼学史の資料として利用する道筋を付けた。本研究の基礎的作業となる両戴各篇の読解については、ほぼ予定のペースで進められており、その訳注成果を二本、学術誌に掲載することができている。当初の見込みでは、まず『礼記』中の礼の義を解説した諸篇のうち、『儀礼』の義を解説したとされる諸篇を分析し、その分析を基礎として他篇の分析を行っていく予定であったが、前者を分析する過程で、『儀礼』の「記」との関係を分析していく必要が生じ、本年度の研究は多く『儀礼』の分析に費やされることになった。これは、当初の予定からすると、大きな回り道ではあったが、その過程で『儀礼』各「経」の相対的な成立順序の推定に成功するなど、大きな副次的成果を得ており、また、『儀礼』の分析を通じて、初期礼学の展開の大筋が明らかとなり、両戴記中の礼と関係の深い諸篇の多くが、この展開の上に乗るであろうとの見通しを得ることができた。これは、本研究の今後の展開の道筋をつけるものであり、次年度以後の研究を大きく加速するものであるといえる。以上のことから、現時点において本研究はおおむね順調に進展していると判断した。次年度以後も、両戴記中の礼の義を解説した諸篇の読解を継続し、その成果の一部を訳注の形で公表していく。次年度は、本研究の最終年度に当たるが、訳注作業をのぞく研究の重点は次の二点に置かれることになろう。一つは、今年度解析した『礼記』冠義以下六篇と、他の礼の義を解説した諸篇との関係である。従来の研究において、前者は今文礼の義を説いたもの、後者(の一部)は古文礼の義を説いたものとされていたが、本年度の研究によって前者が今文礼の義を説いたものでないことが明らかになり、両者の関係が改めて問われなければならない状況になっている。前者と後者は無関係であるのか、どちらかがどちらかの展開であるのかを見極めながら、初期礼学の流れの解明に資する研究を行っていく。もう一つは、喪・祭に関する義を説いた諸篇についての分析である。本年度までの研究においてはいまだ分析を進めていない『礼記』祭法、祭義、祭統等の篇の分析を進めながら、これまでに研究を進めてきた喪礼に関する義を説いた諸篇についての分析結果を結合して、喪礼および祭礼に関する初期礼学の諸相を明らかにしていく。その際にも、本年度の研究による、冠義以下六篇の分析における手法・成果が活用されることになろう。
AML1標的遺伝子群の白血病における機能解析

AML1はヒトの白血病において最も高頻度に遺伝子異常の標的となる標的の一つである.われわれが未分化造血細胞において明らかにした新規AML1標的シグナルである,NF-kBシグナルの造血器悪性腫瘍での機能を解析した.AML1はNF-kBシグナルを抑制するが,造血器悪性腫瘍で認められるAML1の変異体はその抑制能を欠いており,AML1関連造血器腫瘍においてNF-kBシグナルが亢進しており,新たな分子標的治療候補となることが明らかとなった.AML1はヒトの白血病において最も高頻度に遺伝子異常の標的となる標的の一つである.われわれが未分化造血細胞において明らかにした新規AML1標的シグナルである,NF-kBシグナルの造血器悪性腫瘍での機能を解析した.AML1はNF-kBシグナルを抑制するが,造血器悪性腫瘍で認められるAML1の変異体はその抑制能を欠いており,AML1関連造血器腫瘍においてNF-kBシグナルが亢進しており,新たな分子標的治療候補となることが明らかとなった.本研究では,急性白血病での最も多い遺伝子異常の一つである, AML1関連白血病での分子標的療法の確立を試みている.これまでAML1に関しては様々な解析が行われてきたにも関わらず,依然分子標的療法が確立できていない.そこで,本研究では, AML1自体ではなく, AML1の標的遺伝子をターゲットとすることにより,分子標的療法の確立を試みた.われわれはこれまでAML1について行ってきた解析の中で,マウスの正常造血幹細胞におけるAML1の標的遺伝子群を同定している.一方,白血病においても,幹細胞が重要であると考えられるようになっており,これらの遺伝子群が, AML1関連白血病における,鍵分子ではないかと考え,白血病細胞における機能解析を行い治療標的となりうるかを検証した.まず,正常造血幹細胞でAML1の正常造血幹細胞でのターゲットとして我々が同定したNF-kBシグナルについて検証を行った.我々が以前作成したAML1のコンディショナルノックアウトマウス(cKO)に白血病遺伝子MLL/ENLをレトロウィルスで導入し不死化させる系で検証を行った. AML1を欠失したMLL/ENL不死化細胞では, AML1が保たれたMLL/ENL不死化細胞に比べ,増殖が亢進するが,このAML1欠失MLL/ENL不死化細胞では, NF-kBシグナルの標的遺伝子の発現の亢進がみられ,さらにNF-kBの核内移行の亢進がみられた.次に,ヒト白血病細胞の細胞株では, NF-kBシグナルの亢進がみられた.また,マウスの骨髄細胞にAML1/ETO融合蛋白を導入し,不死化させた細胞でも, NF-kBシグナルの亢進がみられた.以上から, AML1関連白血病においても, AML1の新規標的シグナル1であるNF-kBシグナルが重要な役割を果たしており, AML1関連白血病の有力な治療標的となることが示唆された.われわれはこれまでに,AML1の欠失により,炎症やがん化に関わるNF-κBシグナルが活性化されることを見いだしている.本年度の研究により,AML1はNF-κBシグナルカスケードに位置するIκBキナーゼを抑制することにより,そのシグナル伝達を阻害することが明らかとなったが,非常に興味深いことに,白血病や骨髄異形成症候群(MDS)で形成されるAML1の変異体や融合遺伝子は,NF-κB抑制能を失っていた.MDSで同定されたAML1のC末欠失変異体(S291fsX300)を用いたマウスの白血病モデル,および白血病で高頻度に認められるAML1融合蛋白である,AML1-ETOを発現しているヒトの白血病細胞を用いた白血病モデルを用いてさらに解析を進めた.これらのAML1関連白血病マウスモデルにNF-κBシグナル阻害剤bortezomibを投与したところ,いずれも白血病細胞の増生が個体において抑制された.さらに,in silico解析により,ヒトAML1関連白血病でもNF-κBシグナルが亢進することを見いだした,これらの研究により,AML1関連白血病の有望な治療標的としてNF-κBシグナル分子がもたらされ,今後の発展が期待される.さらにわれわれは,in silico解析の結果,AML1関連白血病以外にも,NF-κBシグナルが亢進している症例の集団を同定した.これらの症例は予後不良であり,NF-κB阻害剤の適応となる症例の層別化に道を開くものであり,今後さらに解析を進める予定である.
膵臓がんの発生・進展とDNA修復機構異常との関与

これまでに我々は、染色体欠失にはDNA修復機構の経路が関与しており、がんの発生・進展にはその分子機構の異常が関与するという結果を得た。今回、我々は膵臓癌の発生・進展をDNA修復異常の観点から追及した。膵臓癌細胞におけるDNA修復遺伝子(H2AX、MSH2、ATM)の発現量と局在を明らかにし、さらにそれぞれの症例の予後、stage、化学療法への反応性などにどのように関与しているかを追及中である。以前、我々は、染色体欠失にはDNA修復機構の経路が関与しており、その分子機構の異常を明らかにすることで膵臓癌の発生、進展のメカニズムを推定することが可能であることを示している結果を得た。今回、我々は膵臓癌の発生と進展をDNA修復異常の観点から追及する。膵臓癌細胞におけるDNA修復遺伝子の発現と局在を明らかにし、実際の症例の予後、stage、化学療法への反応性にどのように関与しているか追及する。具体的にはH2AX、MSH2、ATMの各遺伝子についてみていくことにする。(1)膵臓がん臨床症例の腫瘍部の切片標本を作製し、DNA修復遺伝子およびそれに関連した遺伝子の抗体を使用して免疫組織染色を施行して、膵臓がん組織・細胞内のそれらの遺伝子の局在を明らかにするため免疫染色にて検討した。H2X、γH2AX、hMSH2、p53、ATM抗体を使用し、抗体の濃度、賦活化など条件を細かく設定中。多重染色する予定だったがうまくいかないため、連続切片での検討とし、解析中。(2)同様の標本を利用して腫瘍のmRNAおよび核抽出液または細胞質抽出液を採取し、RT-PCR法またはウェスタンブロット法にてそれぞれの遺伝子産生物の発現量を明らかにするため、SampleをデータシートにまとめmRNAを抽出、また核、細胞質抽出液も回収中。回収終了次第、PT-PCRを行い遺伝子産物の発現量を確認する予定。(3)同様にして腫瘍のDNAを抽出し、これらの遺伝子の変異・欠失などを検索するとともに、DNAの構造自体がそれらの変異・欠失に影響をおよぼしているかどうかを明らかにするため、(2)と同様DNA抽出中。それぞれの症例の予後・組織型・放射線化学療法への反応性などの情報を収集し、相関を検討する予定である。多重染色の技術は安定したが手術検体の症例数が30例ほどと少なく、解析に不足していたため、群馬県立がんセンターから症例を30例ほど頂くこととなった。倫理委員会を通し、患者名を完全に暗号化することで承諾を得た。追加症例に関しては染色を開始している。終了しだい解析に移る(2)同様の標本を利用して腫瘍のmRNAおよび核抽出液または細胞質抽出液を採取し、RT-PCR法またはウェスタンブロット法にてそれぞれの遺伝子産生物の発現量を明らかにするため、SampleをデータシートにまとめmRNAを抽出、また核、細胞質抽出液も回収中。

(1)膵臓がん臨床症例の腫瘍部の切片標本を作製し、DNA修復遺伝子およびそれに関連した遺伝子の抗体を使用して免疫組織染色を施行して、膵臓がん組織・細胞内のそれらの遺伝子の局在を明らかにするため免疫染色にて検討した。H2X、γH2AX、hMSH2、p53、ATM抗体を使用した。多重染色する予定だったがうまくいかないため、連続切片で検討した。現在染色終了し、各因子の相関を統計解析中(2)同様の標本を利用して腫瘍のmRNAおよび核抽出液または細胞質抽出液を採取し、RT-PCR法またはウェスタンブロット法にてそれぞれの遺伝子産生物の発現量を明らかにするため、SampleをデータシートにまとめmRNAを抽出し、また核、細胞質抽出液も回収する。現在mRNAおよび、核、細胞質抽出液回収終了。PT-PCRを行い遺伝子産物の発現量を確認中。(3)同様にして腫瘍のDNAを抽出し、これらの遺伝子の変異・欠失などを検索するとともに、DNAの構造自体がそれらの変異・欠失に影響をおよぼしているかどうかを明らかにするため、(2)と同様DNA抽出する。現在DNA抽出作業終了。それぞれの症例の予後・組織型・放射線化学療法への反応性などの情報を収集し、相関を検討する予定である。