hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
運動野に可塑的変化を引き起こす低侵襲性人工皮質間接続の開発

本年度の目標は、(1)一次運動野に活動依存的可塑性を引き起こす人工皮質間接続の開発、(2)人工皮質間接続の適用にともなう運動野の活動変化の解明、であった。人工皮質間接続は、運動野から計測された皮質脳波信号の特徴量に基づいて、任意の皮質脳波電極を介して一次運動野に硬膜外電気刺激をおこなう。この構成要素となる、刺激と記録が可能な多点皮質脳波電極、および記録と刺激が同時にできる実験装置は、年度初頭に使用可能な状態へと整えることができた。しかし、一般的な脳波の振幅や位相の計算アルゴリズム(例:高速フーリエ変換)を用いて神経活動の特徴量を計算すると、大きな時間遅れが生じることがわかり、このままではある脳領域の活動をトリガーにした瞬時脳刺激、という人工皮質間接続の開発要件を満たすことができないことが明らかになった。そこで、音声認識分野で用いられていた計算アルゴリズムを、海外渡航先の研究機関と共同で神経活動推定用に改良し、この時間遅れの問題を解決した。結果、ソフトとハードの両側面で、人工皮質間接続の開発に必要な構成要素を整えることができた。人工皮質間接続の適用にともなう運動野の活動変化の解明は、前述のアルゴリズム開発に時間を要したため、人工皮質間接続を実験動物へと適用するには至らず、達成することができなかった。ただし予備実験として、硬膜外電気刺激を任意の2点に対して常に一定の時間差で与え、その前後での運動野の活動変化を評価した。この2連発刺激は、刺激によって強制的に神経細胞を活動させる点は異なるが、人工皮質間接続と同様に異なる2つの脳領域を同期的に活動させることができる。現在は、この介入前後に計測した脳活動データを解析している。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、(1)低侵襲性の脳神経刺激法(硬膜外電気刺激法)を開発すること、(2)一次運動野に活動依存的可塑性を引き起こす、低侵襲性の人工皮質間接続を開発すること、(3)人工皮質間接続が引き起こす活動依存的可塑性による、運動野の活動変化を解明すること、の3点であった。硬膜外電気刺激法の開発は、概ね目標通り進んだ。海外共同研究機関にて開発された、脳波計測と電気刺激の双方を行うことが可能な皮質脳波電極を用いて、ラットを対象に硬膜外電気刺激を行うことに成功した。また、電気刺激のために電極に通電しても、電極のインピーダンス特性が変化しないことを証明した。この硬膜外電気刺激技術を応用して、運動野の機能地図を短時間で同定する技術を開発し、その技術の妥当性はラット14匹を用いて確認した。これらの内容は、国際学会にて発表した他、その技術に進歩性が認められたことから平成26年11月に国内特許出願した。一方で人工皮質間接続の開発は、当初計画と比べて遅れが生じている。これは、予備的に開発した人工皮質間接続の性能を評価したところ、海外共同研究機関にてそれまでに開発された皮質脳波電極では生体からの脳活動記録を十分に行えないことが判明したため、その再開発に時間を要したことに起因する。人工皮質間接続が引き起こす活動依存的可塑性を明らかにするための、随意運動中の脳活動変化を評価するための脳波データの解析法習得は、概ね修得することができた。随意運動中のマーモセットより脳波データを計測し、それぞれのデータに対して時間周波数解析と、機能的結合解析を行った。なお解析技術習得の過程で、4匹のマーモセットより、1匹あたり100試行程度のエサ取り動作中の皮質脳波を計測することに成功した。硬膜外電気刺激の開発と、随意運動中の脳活動変化を明らかにするための脳波データの解析法習得に関しては、当初の期待以上の研究の進展が得られた。硬膜外電気刺激に関しては、ラット14匹を対象にその開発技術の妥当性を証明し、国際学会発表と国内特許出願を行うことができた。脳波データの解析法も習得することができ、さらに習得過程で計測したデータを以て、来年度以降の論文投稿の目処がたった点は、望外の進展であった。また実験動物が齧歯類から霊長類に変更されたため、来年度の成果次第では、本技術の応用の幅が基礎研究のみならず、臨床応用に向けても大きく広がることが期待される。一方で肝心の人工皮質間接続の開発に関しては遅れが見られるが、これは共同研究機関の開発遅れに由来した、仕方のない事情といえる。それ以外の進捗が極めて順調なため、来年度中の巻き返しは可能であると考えている。

そこで、音声認識分野で用いられていた計算アルゴリズムを、海外渡航先の研究機関と共同で神経活動推定用に改良し、この時間遅れの問題を解決した。結果、ソフトとハードの両側面で、人工皮質間接続の開発に必要な構成要素を整えることができた。人工皮質間接続の適用にともなう運動野の活動変化の解明は、前述のアルゴリズム開発に時間を要したため、人工皮質間接続を実験動物へと適用するには至らず、達成することができなかった。ただし予備実験として、硬膜外電気刺激を任意の2点に対して常に一定の時間差で与え、その前後での運動野の活動変化を評価した。この2連発刺激は、刺激によって強制的に神経細胞を活動させる点は異なるが、人工皮質間接続と同様に異なる2つの脳領域を同期的に活動させることができる。現在は、この介入前後に計測した脳活動データを解析している。平成27年度は、遅れている人工皮質間接続の開発を第一目標に研究に取り組む。その後、開発した人工皮質間接続を、慢性的にマーモセットの運動野に適用する。これは、人工皮質間接続を適用した結果としての「行動レベル」の因果性を証明するには、当初実験動物として供する予定であった齧歯類のラットよりも霊長類のマーモセットの方が、そのバリエーションが豊富であることが期待されたためである。人工皮質間接続によって惹起された活動依存的可塑性は、本年度開発した硬膜外電気刺激を用いての一次運動野の各領域と各筋との対応関係の変化と、記録した随意運動中の皮質脳波の時間周波数解析と機能的結合解析によって明らかにする。27年度が最終年度であるため、記入しない。
ヘパラン硫酸の生合成に関与するEXTL3の脳およびT細胞における新規機能の解明

EXTL3のもつ生物学的機能を明らかにしようとしている。EXTL3はヘパラン硫酸生合成酵素の1つと考えられているが、同じくヘパラン硫酸の糖鎖骨格の形成に関わるEXT1/EXT2とは若干性質が異なる。つまり、細胞内での局在部位やノックアウトマウスの致死となる時期、ヘテロ接合体での表現型、生合成過程での硫酸化修飾に与える影響などが異なっている。そこで、特定の臓器(脳とT細胞)に注目し、これらの臓器での特異的な欠損を利用することにより、EXTL3の果たす生物学的意義を解明しようとしている。今年度は、脳のグルタミン酸作動性神経に特異的にExtl3を欠損させたコンディショナルノックアウトマウスを作成した。このマウスを用いて、外見上の特徴の観察、行動上の特徴の観察を行った。行動観察に関してはオープンフィールドテストを行った。これまでのところ、外見上の特徴は特に目立ったものはなく、オープンフィールドテトでも同腹子の野生型マウスと比較して、目立った異常は検出されていない。また、T細胞に特異的にExtl3を欠損させたコンディショナルノックアウトマウスを作成した。外見上の特徴を観察したが、今のところ、目立った異常は検出されていない。EXTL3変異患者由来の細胞を培養し、各グリコサミノグリカン鎖を精製し、その含有量、二糖組成を調べた。患者の細胞に由来するヘパラン硫酸は、その含有量が、健常人のものと比較して減少していた。引き続き、詳細な解析を行っている。これらの研究成果の一部は、国内および国際学会において、発表した。マウスの繁殖と細胞の培養に時間がかかり、解析の開始が若干遅れため、十分な成果が出ていない。しかし、マウスの繁殖も順調に進んでおり、患者由来の細胞も十分増殖するようになってきた。これらのマウスや細胞を利用して解析を進め、2019年度には遅れを取り戻せるだけの結果が出るものと期待している。脳のグルタミン酸作動性神経に特異的にExtl3を欠損させたコンディショナルノックアウトマウスに関しては、引き続き解析を行っていく。マウスの行動に関しては、Y-迷路試験、新奇物体認識試験等を実施し、短期および物体認知記憶などの脳機能を調べる。また、免疫組織的な解析も行う。発生段階の異なる脳を用いて、脳内でのヘパラン硫酸とEXTL3の分布を、各成分に特異的な抗体を利用して免疫組織染色により調べ、大脳や海馬の発生や機能への影響を探索する。さらに、異なる発生段階で脳を摘出し、脳をさらに細かく分け、各部位でのヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸の構造を解析し、ヘテロあるいは野生型の同腹子と比較する。具体的には、各グリコサミノグリカン鎖の含有量、二糖組成、鎖長を調べる。T細胞で特異的にEXTL3を欠損させたコンディショナルノックアウトマウスに関しては、引き続き、得られたマウスの外見上の特徴、行動上の特徴を観察する。また、血球を採取し、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸の構造を解析し、ヘテロあるいは野生型の同腹子と比較する。T細胞の分化の程度について、FACSで解析することを検討している。EXTL3変異患者由来の細胞に関しては、さらに詳細に各グリコサミノグリカン鎖の構造を調べる。特に鎖長の変化を調べる。

マウスの行動に関しては、Y-迷路試験、新奇物体認識試験等を実施し、短期および物体認知記憶などの脳機能を調べる。また、免疫組織的な解析も行う。発生段階の異なる脳を用いて、脳内でのヘパラン硫酸とEXTL3の分布を、各成分に特異的な抗体を利用して免疫組織染色により調べ、大脳や海馬の発生や機能への影響を探索する。さらに、異なる発生段階で脳を摘出し、脳をさらに細かく分け、各部位でのヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸の構造を解析し、ヘテロあるいは野生型の同腹子と比較する。具体的には、各グリコサミノグリカン鎖の含有量、二糖組成、鎖長を調べる。T細胞で特異的にEXTL3を欠損させたコンディショナルノックアウトマウスに関しては、引き続き、得られたマウスの外見上の特徴、行動上の特徴を観察する。また、血球を採取し、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸の構造を解析し、ヘテロあるいは野生型の同腹子と比較する。T細胞の分化の程度について、FACSで解析することを検討している。EXTL3変異患者由来の細胞に関しては、さらに詳細に各グリコサミノグリカン鎖の構造を調べる。特に鎖長の変化を調べる。
細胞の増殖と死を制御する分子の創製と機能解析

本研究は、細胞の増殖や死の情報伝達にかかわるタンパク質に直接結合し、その機能を特異的に制御する低分子化合物の創製と、それを用いた情報伝達機構の解明を目的としている。1)これまでに、天然物RK-682をもとにしたプロテインホスファターゼ阻害剤の構造展開を行い、細胞周期進行の鍵酵素であるCdc25阻害活性ならびにHL60細胞増殖抑制効果を示す化合物をみいだす事に成功している。さらに本年度は、本化合物がCdc25の活性中心と共有結合を生成することを見いだし、蛍光ラベル体を合成して細胞内局在を調べた。また本化合物を用いたプロテインホスファターゼの網羅的解析手法の開発の検討を行った。2)これまでに我々は、酸化ストレスにより誘導されるネクローシスを選択的に抑制するインドリルマレイミド誘導体の創製に成功している。今年度は、昨年度までにアフィニティーゲルにより同定した結合タンパク質の細胞死への関与を調べるため、培養細胞を用い、RNAiによるノックダウンや過剰発現実験を行った。3)プロテインホスファターゼ阻害剤の候補として期待されるα-フッ素化シアノホスホン酸や、医薬の骨格として重要なα-フッ素化アリール酢酸など光学活性含フッ素化合物の触媒的不斉合成法の開発に成功した。また、他にも生物活性分子合成に有用な反応の開発も行った。4)生物活性物質合成に有用な新しいカーバメート型保護基導入試薬の開発に成功した。5)細胞増殖の制御に重要なガングリオシドの非加水分解性アナログの合成に成功した。本年度は、細胞増殖シグナル伝達の鍵酵素であるプロテインキナーゼC(PKC)の活性化剤について研究を行い、イソベンゾフラノン化合物が優れたPKC活性化剤となりうることを見出した(Bioorg.Med.Chem.Lett.に発表)。ホルボールエステルに匹敵する強い結合能を示す誘導体の開発にも成功し、本化合物が細胞レベルでも優れたPKC活性化能をしめすことを確認した。また、構造修飾により、逆にアンタゴニスト活性を示す誘導体の創製にも成功した。我々がチロシンホスファターゼ阻害剤の開発研究の出発点として位置づけてきたRK-682が、ヘパラナーゼに対する阻害活性と細胞の浸潤阻害を示すことが見出された。そこで構造展開を行った結果、RK-682-O-benzyl誘導体が、VHRなどのホスファターゼに対する阻害を全く示さず、非常に強力な癌細胞の浸潤阻害を示すことがわかった。本成果はMol.Cancer Ther.に発表した。T細胞の活性化の鍵酵素であるPP2Bの阻害剤に関しては、本年度、カンタリジン誘導体のより効率のよい合成法を確立した。これにより、さまざまな置換基を有する誘導体を光学活性体として合成することができるようになった。また、全く別の構造をもつホスファターゼの阻害剤候補として、フルオロホスホン酸を設計し、その効率の良い触媒的不斉合成法を開発にも成功した(Tetrahedron.Lett.に発表)。さらに、当研究室で開発した細胞死抑制剤のさらなる構造展開を行い、より強力で、毒性も低い誘導体の開発に成功した。本化合物は、ネクローシスに選択的なユニークな性質をもつ。1)これまでに細胞増殖シグナル伝達の鍵酵素であるプロテインキナーゼC(PKC)のC1ドメインリガンドとしてイソベンゾフラノン(IB)誘導体を開発している。本年度は、更なる誘導体合成を行ない、リガンドのPKCαへの結合能と活性化能を評価した。その結果、IB誘導体の置換基をかえると、2つのC1ドメインへの結合選択性が変化することがわかった。2)T細胞の活性化の鍵酵素であるPP2Bの阻害剤に関しては、一置換カンタリジン誘導体の構造活性相関研究を行い、光学活性体間で活性に顕著な差があることが分かった(Bioorg.Med.Chem.に発表)。また、カンタリジン誘導体の簡便合成法を確立し、様々な誘導体合成を可能にした。3)我々は、細胞死抑制剤の開発研究も行っている。アポトーシスに関する研究が盛んに行なわれている一方で、ネクローシスを選択的に阻害するバイオプローブはネクローシスの作用機序解明の鍵であると認識されているにも係わらず報告例が少ない。我々は過酸化水素によって誘導されるネクローシスを選択的に阻害する化合物としてインドリルマレイミド(IM)誘導体を開発した。更に、水溶性や安定性にすぐれた誘導体を開発することにも成功した。(Bioorg.Med.Chem.Lett.に発表)。1)これまでに、細胞増殖シグナル伝達の鍵酵素であるプロテインキナーゼC(PKC)のC1ドメインリガンドとしてイソベンゾフラノン(IB)誘導体を開発しているが、本年度は疎水性側鎖の向きの異なる4種の誘導体を合成し、PKCαへの結合能と活性化能を評価した。

その結果、疎水性側鎖の向きのみの違いで、アゴニスト活性をもつものとアンタゴニスト活性をもつものをつくり分ける事ができることを見いだした。2)RK-682をベースとしたプロテインホスファターゼ阻害剤の構造展開を行い、細胞周期進行の鍵酵素であるCdc25に阻害活性を示す化合物をみいだす事に成功した。さらに本化合物は、HL60細胞に対し増殖抑制効果を示した。3)これまでに我々は、酸化ストレスにより誘導されるネクローシスを選択的に抑制するインドリルマレイミド誘導体の創製に成功している。今年度は、その作用機序の解明をめざし、蛍光ラベル誘導体やアフィニティーゲルなどを合成し、それらを用いた細胞内局在や標的タンパク質の同定研究を行った。また、さらなる誘導体展開も行った。4)プロテインホスファターゼ阻害剤の候補として期待されるα-フッ素化ケトホスホン酸など光学活性含フッ素化合物の触媒的不斉合成法の開発に成功した。また、他にも生物活性分子合成に有用な反応の開発も行った。本研究は、細胞の増殖や死の情報伝達にかかわるタンパク質に直接結合し、その機能を特異的に制御する低分子化合物の創製と、それを用いた情報伝達機構の解明を目的としている。1)これまでに、天然物RK-682をもとにしたプロテインホスファターゼ阻害剤の構造展開を行い、細胞周期進行の鍵酵素であるCdc25阻害活性ならびにHL60細胞増殖抑制効果を示す化合物をみいだす事に成功している。さらに本年度は、本化合物がCdc25の活性中心と共有結合を生成することを見いだし、蛍光ラベル体を合成して細胞内局在を調べた。また本化合物を用いたプロテインホスファターゼの網羅的解析手法の開発の検討を行った。2)これまでに我々は、酸化ストレスにより誘導されるネクローシスを選択的に抑制するインドリルマレイミド誘導体の創製に成功している。今年度は、昨年度までにアフィニティーゲルにより同定した結合タンパク質の細胞死への関与を調べるため、培養細胞を用い、RNAiによるノックダウンや過剰発現実験を行った。3)プロテインホスファターゼ阻害剤の候補として期待されるα-フッ素化シアノホスホン酸や、医薬の骨格として重要なα-フッ素化アリール酢酸など光学活性含フッ素化合物の触媒的不斉合成法の開発に成功した。4)生物活性物質合成に有用な新しいカーバメート型保護基導入試薬の開発に成功した。5)細胞増殖の制御に重要なガングリオシドの非加水分解性アナログの合成に成功した。
情報幾何構造の変形と平坦性に関する理論構築とその応用

確率モデルの変形・一般化に関わる理論は,ロバスト統計・機械学習・統計物理などで急速に必要性を増しつつあるが,(情報)幾何学的な視点からの研究はまだ建設途上であり,大いに不足している.これに取り組むため,応募者は自分たちのこれまでの研究成果も勘案し,次の課題の解決を具体的な研究目的とする.(A)非標準的な情報幾何構造の平坦化手法(共形平坦化)の確立とその応用(B)双対的な平坦性を合わせもつ(二重自己平行な)確率モデルの特徴づけとその応用確率モデルの変形・一般化に関わる理論は,ロバスト統計・機械学習・統計物理などで急速に必要性を増しつつあるが,(情報)幾何学的な視点からの研究はまだ建設途上であり,大いに不足している.これに取り組むため,応募者は自分たちのこれまでの研究成果も勘案し,次の課題の解決を具体的な研究目的とする.(A)非標準的な情報幾何構造の平坦化手法(共形平坦化)の確立とその応用(B)双対的な平坦性を合わせもつ(二重自己平行な)確率モデルの特徴づけとその応用
圧力下サブミリ波ESRによる集積型金属錯体の研究

1(1)ピストンにサファイアを用いたピストンシリンダー型の小型圧力セルを開発し,3.5kbarの圧力を発生することに成功した。圧力の限界は外側の肉厚1.5mmのCu-Be合金の降伏のためであった。したがってより肉厚な設計にするか材料を変えることによって3.5kbar以上のより高圧が発生可能であると考えられる。(2)この小型圧力セルを装着可能なサブミリ波ESR測定装置を開発し,スピンパイエルス系CuGeO_3の4.2Kにおける磁気相転移磁場をESRの変化で観測し,圧力下で転移磁場が上昇することを観測した。したがって世界で初めての圧力下でのサブミリ波ESR測定に成功した。さらに検出器感度をあげることによってPd(dmit)_2系の圧力効果の観測が可能になるものと期待される。2サブミリ波ESR測定からM[Pd(dmit)_2]_2のネール温度以下の反強磁性共鳴をM=Me_4As,Et_2Me_2Pについて観測し,磁気異方性や交換相互作用を評価し,理論モデルとの対応を検討した。3(1)様々なS=1一次元ボンド交替ハイゼンベルグ反強磁性鎖のモデル物質についてサブミリ波ESR測定から磁気異方性を決定したり,ハルデン相とダイマー相の境界に位置するギャップレスなモデル物質のサブミリ波ESRの温度依存性測定からそのスピンダイナミクスを議論した。(2)スピンラダー系Cu_2(C_5H_<12>N_2)_2Cl_4の直接遷移を観測に初めて成功し,その磁気相転移との関係を明らかにした。
日本の伝統的民家の架構技法における空間意匠と構造の整合性に関する研究

1.各地域で伝統的に継承されている固有な架構法による代表的民家18棟に対して、架構における水平領域と高さの諸区分により、横架材の配置の多様性とその出現頻度を示した。また、軸組と小屋組の境界に位置する上屋梁と他の構成部材の関係を分析した結果、上屋梁が折置に納まる型では、上屋・下屋の領域区分にとらわれない恣意的な部材配置の様相が認められた。上屋梁が京呂に納まる型では、下屋構造の折置から京呂への移行とともに、上屋・下屋を含み込んだ架橋の整形化がすすんでいく傾向が見られた。2.小屋荷重の伝達経路の複雑さと分散範囲の分析においては、荷重の伝達方向と、到達点までに費される部材数の関連性を考察した。個々の荷重経路において移動方向が生じる部材配置を、上屋・下屋の関係から序列化し、また経由部材数の多寡が生じる構法上の要因を抽出した。一方、荷重経路の集合形式を検討した結果、上屋・下屋間の空間的な展開性と、重層した梁・桁・束に見られるような架構部材の複雑性の双方が、架構形式を特徴づけていることがわかった。3.小屋荷重の分散度と部材断面積の関係については、建物の中通りに大黒柱を据え牛梁で結んだ大黒柱形式と、一対の柱を胴梁で結んだ鳥居形式により異なった結果が得られた。大黒柱形式では、おおむね断面の大きな部材ほど多くの荷重がかかるものの、特別に太い大黒柱や牛梁にはそれほど荷重がかからず、部材断面と荷重分散度の関係はまちまちであった。鳥居形式では、断面の大きな対柱に荷重が集中する合理性が見られる一方で、対柱を結ぶ太い胴梁にはあまり荷重が伝達しないが、全体的には大黒柱形式に比べ部材断面と荷重分散度がバランスよく対応していた。また、上に述べた荷重分散の態様を軸組の立体的な構成として図解した。1.日本の伝統的民家における多様な架構形式を包括的に把握するために、重要文化財修理工事報告書、民家緊急調査報告書、既報文献等を通覧し、構法多様性の実態を把握した。そののち、部材の構成、位置、高さの基本概念を、軸組と小屋組の関係に着目し、記号化した水平領域と高さによる位相として規定し直した。そして、部材相互の位置関係から部材の研究上の名称を再定義した(成果公表済み)。2.分析対象として、地域に固有な名称を冠せられるような安定したシステムとして存続していた架構法を18地域選定した。既往資料から図面等の資料を収集したのち、実際の建物を調査し、部材の寸法、構成、接合部の納まり等を実測し、架構の立体的構成を架構図ならびに写真により詳細に記録した。3.得られた実測資料および文献資料を吟味し、代表的な建物を18地域から各1棟抽出して、CADソフトウェアを用い、平面形式と架構法の基本構造を整理した。また、柱、立ち上がり構面、梁組みの基本配置、部材名称等の特徴を把握した。4.軸組部材に伝わる屋根荷重の経路を把握するために、屋根荷重の起点として扠首尻や束の位置を拾いだし、荷重点の分類、整理を行った。18地域の代表例に対して、荷重点から軸組の各部材に広がっていく荷重経路の概念を用いて、単一の荷重経路を軸組構成材の組み合わせとして表わしチャート化した。このことにより、小屋組を支持している軸組部材の構成原理をヴィジュアルに図解することができた。
脂肪細胞のTCA回路を介したエピゲノム制御

脂肪細胞の分化過程でクエン酸回路のα-ケトグルタル酸を合成する酵素であるIDH3の発現が上昇し、細胞内のα-ケトグルタル酸が増加することが明らかとなった。α-ケトグルタル酸の上昇は、ヒストン脱メチル化酵素であるKDM4Aを活性化し、解糖系遺伝子上のヒストン脱メチル化を促進することを見出した。これにより、解糖系遺伝子の発現が上昇し、糖代謝が亢進し、脂肪が蓄えられることが示唆された。これらの結果は脂肪細胞の分化過程において、代謝がエピゲノムを制御することを示唆する。ヒストン修飾によるクロマチン構造変化は遺伝子発現を後天的に制御し、多因子性疾患発症の鍵となる。本研究では、脂肪細胞において高発現しa-ケトグルタル酸生合成に関わるイソクエン酸デヒドロゲナーゼ(IDH)に焦点をおき、細胞の代謝がどのような作用機序でエピゲノムを制御するかを解明することを目的とする。3T3-L1脂肪細胞分化過程におけるトランスクリプトーム解析により、IDH3a, IDH3b, IDH3g遺伝子発現が誘導されることが明らかになった。IDH酵素活性測定・メタボローム解析から、分化過程においてIDH3活性が増加し、ヒストン脱メチル化酵素の補酵素として使われるa-ケトグルタル酸が3倍上昇することを見出した。IDH3bをノックダウンすると、Ppargならびに脂肪細胞分化マーカー(Fabp4, Adipoq, Cd36)の発現には影響を及ぼさないにも関わらず、a-ケトグルタル酸が上昇せず、解糖系遺伝子(Slc2a4, Hk2)の発現誘導がおこらず、脂肪蓄積を抑制された。一方IDH1またはIDH2のノックダウンでは、解糖系遺伝子発現、脂肪蓄積に変化はなかった。未分化の脂肪細胞において、解糖系遺伝子には転写抑制のヒストン修飾H3K9me2が認められ、分化に伴いH3K9me2は消失し遺伝子発現が誘導された。さらに、IDH3a, IDH3b, IDH3gはそれぞれ相互作用し、複合体を作ることにより安定化され、ミトコンドリアに局在する可能性を見出した。ヒストン翻訳後修飾を介したクロマチン構造変化は遺伝子発現を後天的に制御し、多因子性疾患発症の鍵となる。本研究では、脂肪細胞において高発現し、a-ケトグルタル酸生合成に関わるTCA回路の酵素イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(IDH)に焦点をおき、細胞の代謝がどのようなメカニズムでエピゲノムを制御するかを解明することを目的とした。3T3-L1脂肪細胞分化過程において、IDH3a, IDH3b, IDH3gの遺伝子発現が誘導され、IDH3活性が増加し、a-ケトグルタル酸が3倍上昇する。a-ケトグルタル酸はヒストン脱メチル化酵素の補酵素として機能する。ヒストンメチル化解析と遺伝子発現解析から、未分化の脂肪細胞では転写抑制のヒストン修飾H3K9me2が解糖系遺伝子群の発現を抑え、分化に伴いH3K9me2が脱メチル化されると遺伝子発現が誘導されることを明らかにした。IDH3bの発現抑制をおこなうと、a-ケトグルタル酸が上昇せず、H3K9me2が維持され、解糖系遺伝子群の発現が誘導されないことを明らかにした。またsiRNAによるスクリーニングから、ヒストン脱メチル化酵素KDM4Aが脂肪細胞分化過程において解糖系遺伝子群の発現を制御することを明らかにした。これらの結果から、脂肪細胞においてTCA回路のIDH3がヒストン脱メチル化酵素KDM4Aの活性と解糖系遺伝子群のエピゲノムと遺伝子発現を制御することが示唆された。トランスクリプトーム解析から、解糖系遺伝子をはじめとするIDH3により発現制御される遺伝子群を網羅的に同定することに成功した。また、メタボローム解析とIDH酵素活性測定から、IDH3が脂肪細胞分化に伴うa-ケトグルタル酸上昇に寄与していることを突き止めた。さらに、IDH3により制御されるヒストン修飾の候補として、転写抑制のヒストン修飾であるH3K9me2を見出した。したがって本研究の目的の約半分はすでに達成されており、順調に進展している。エピゲノムIDH3により制御されるヒストン修飾の候補として、転写抑制のヒストン修飾であるH3K9me2を見出していることから、分化過程あるいはIDH3bノックダウンにおけるH3K9me3のゲノムワイド解析をChIP-seqにより行う。またsi-RNAよるスクリーニングにより、IDH3により活性調節されるヒストン脱メチル化酵素を同定し、その脱メチル化酵素の局在をChIP-seqにより解析する。さらに核・ミトコンドリアのIDH3の局在、a-ケトグルタル酸レベルを測定し、a-ケトグルタル酸の細胞内分布制御について基礎知見を得る。当該年度に予定していたChIP-seq解析の一部を、次年度に行うことになった。
非平衡相変化現象の分子動力学法シミュレーション

鉛ビスマス冷却高速炉と鉛ビスマスをターゲットとする加速器駆動核変換炉では、高温の鉛ビスマス流れにより炉心・構造材料やターゲット窓材の材料腐食防止が課題である。また、鉛ビスマスを中間熱輸送媒体とするナトリウム冷却高速炉では2次冷却系鉛ビスマスが1次冷却材であるナトリウム中に漏洩する場合の混合・拡散現象を把握する必要がある。これらの問題では、液体重金属(鉛ビスマス)と固体金属または異種液体金属(ナトリウム)の動的相互作用を分子レベルで解明する手法の開発が重要である。このように高密度エネルギー発生機器やエネルギーシステムで生ずる非平衡相変化現象の機構を理論的に解明するため、分子動力学法シミュレーションにより重金属の固体面からの溶解・拡散、液-液相互拡散現象を解析的に調べた。本年度は、液-液系、固-液系及び蒸気-液系の分子動力学シミュレーションプログラムを開発し、重金属系鉛ビスマス中における純金属の溶解・拡散現象を計算機シミュレーションした。このプログラム開発において、分子動力学シミュレーションに用いる原子間ポテンシャルを分子軌道法により数値計算し、その妥当性を評価した。さらに、金属原子と共存する自由電子の効果を考慮可能な分子動力学シミュレーションプログラムの開発手法を検討した。具体的内容は以下の通りである。1)液体金属の原子間ポテンシャルに関する研究3元系液体金属Na-Pb-Biの拡散計算における原子間ポテンシャルについてGAUSSIANを用いて検討した。2)第一原理分子動力学シミュレーション研究鉄と鉛ビスマスの擬ポテンシャルを作成し、プログラムPHASEを用いて鉄及び鉛ビスマスの電子状態を計算し、これらの相互作用の分子動力学計算を行った。以上の研究成果を国内の学会で公表した。以上により、分子動力学シミュレーションを非平衡相変化・混合拡散現象に適用するための基盤が確立された。本年度は、異種金属の液-液系と固-液系が相互作用する分子動力学シミュレーションプログラムを開発し、1)鉛ビスマスのナトリウム中溶解・拡散現象2)鉄およびステンレス鋼SUS316と重金属系鉛ビスマスとの溶解・拡散・浸透現象に適用した。その結果は定性的な計算結果は得られるものの、定量的には十分良好な精度の計算結果は得られなかった。その原因として、これらのシミュレーションでは、異種金属間の分子間ポテンシャル関数に実験経験式及び理論モデル式を用いており、これが計算結果に大きな影響を及ぼしていることにある。より高い精度で分子動力学シミュレーションを行うためには、この分子間ポテンシャル関数を正確に与えることが必要であることが判明した。そこで分子軌道法に基づくGAUSSIANコードを用いて、Fe,Pb,Bi,およびステンレス鋼SUS316の主要成分であるCr,Niの相互の分子間ポテンシャル関数を求めた。これは最外殻電子のスピンによって異なってくるため、実験結果との対比により妥当なスピンの結果を判定した。
微量元素の細胞性免疫に対する影響の分子栄養学的研究

細胞性免疫に関与するカルシニューリン(CN)の酵素活性に影響を与える微量元素のスクリーニングを行ったところ、3種類のバナジウムイオンがニッケル(Ni^<2+>)刺激したCN活性を二相性に阻害することを見出した。またヒトT細胞様株Jurkat細胞を用いてマンガン(Mn^<2+>)のインターロイキン-2(IL-2)(細胞性免疫の指標)産生の影響を調べたところ、ホルボールエステル存在下において、Mn^<2+>がIL-2産生を相乗的に上昇させることが明らかとなった。1.カルシニューリン(CN)活性に影響を与える微量元素のin vitroにおけるスクリーニングCNは、T細胞においてインターロイキン-2(IL-2)産生を制御し、細胞性免疫に関与する酵素として知られている。CNはin vitroでは、ニッケル(Ni)やマンガン(Mn)で活性化することが示されているが、本研究では、バナジウム(オルトバナジン酸、メタバナジン酸、バナジル)がNi刺激したCN活性を二相性に抑制することを見出した。今後は、バナジウムのこの阻害作用について酵素学的な解析を行うと共に、更にCN活性に影響を与える微量元素のスクリーニングを行う予定である。2.ヒトT細胞様株Jurkat細胞のIL-2発現系を用いた免疫抑制・免疫増強作用を有する微量元素のスクリーニング1のin vitroで見出した、Ni刺激したCN活性を阻害するバナジウムのJurkat細胞に対するIL-2産生への影響を検討したところ、予想に反して微量ではあるが、IL-2産生を認めた。今後はこの作用機序について更に分子栄養学的に解析を行う予定である。3.Mnの細胞性免疫に対する影響の分子栄養学的研究ホルボールエステル存在下において、Mnは、Jurkat細胞のIL-2産生を相乗的に上昇させることを既に示していたが、本分子栄養学的研究により、この理由が転写調節因子NFATではなく、予想に反してAP-1の上昇の結果であることが判明した。今後はMnによるAP-1上昇のメカニズムを検討する予定である。1.カルシニューリン(CN)活性に影響を与える微量元素のin vitroにおける検討CNは、T細胞のインターロイキン-2(IL-2)産生を制御し、細胞性免疫に関与する酵素として知られている。in vitroでは、ニッケル(Ni^<2+>)やマンガン(Mn^<2+>)で活性化することが示されているが、本研究では、3種類のバナジウムイオン(VO_4^<3->、VO_3^-、VO^<2+>)がNi^<2+>刺激したCN活性を二相性に抑制することを見出し、その中でVO_4^<3->とVO_3^-は、基質との競合阻害によりCN活性を限害することを明らかとした。また興味深いことにNi^<2+>刺激したCN活性はMn^<2+>の同時添加により抑制されることを見出した。2.Jurkat細胞のIL-2産生を指標とした、細胞性免疫に影響を与える微量元素のスクリーニング上記1のCN活性を阻害した3種類のバナジウムイオン(VO_4^<3->、VO_3^-、VO^<2+>)について、Jurkat細胞に対するIL-2産生への影響を検討したところ、いずれもIL-2mRNAの発現とIL-2タンパク質の産生を認めた。また、3種類のバナジウムイオンについてIL-2産生を比較してみると、VO_4^<3->とVO_3^-のIL-2産生は同程度であったが、VO^<2+>はそれらより低いIL-2産生を示した。3.Mn^<2+>の細胞性免疫に対する影響の分子栄養学的研究ホルボールエステル存在下において、Mn^<2+>は、Jurkat細胞のIL-2産生を相乗的に上昇させることを既に示し、分子栄養学的研究により、この理由が転写調節因子NFATではなく、AP-1の上昇の結果であることを明らかとしてきたが、更に、ウエスタンブロットにより、c-Jun、c-Fos、P-c-Junが上昇していることが示された。
老人性神経変性疾患原因遺伝子群に対する多面的スクリーニング法の確立

プロテオミクスとショウジョウバエ遺伝学的スクリーニングを組み合わせた新しいスクリーニング法を開発し、この方法を若年性および晩発性パーキンソン病原因遺伝子PINK1およびLRRK2に関して適用した。その結果、PINK1シグナルおよびLRRK2シグナルに関与する新しい分子群を同定することに成功し、パーキンソン病でおこるドーパミン神経変性の病理メカニズムを理解するために貢献した。ヒト培養細胞から生化学的に精製し、質量分析解析により同定したパーキンソン病原因遺伝子産物LRRK2、PINK1結合分子群のスクリーニングを、本年度は遺伝性パーキンソン病モデルショウジョウバエおよび培養細胞を用いて行った。LRRK2に特異的に結合し、そのシグナル伝達に直接関与すると考えられる2つの分子をスクリーニングにより同定した。これらの分子は、エンドソームの小胞輸送を制御するRab7と遺伝的相互作用をもち、LRRK2とともにエンドソームの機能を調節していると考えられた。さらに、ショウジョウバエにおいて別のパーキンソン病原因遺伝子α-synucleinもエンドソームの機能を阻害することから、LRRK2,α-synucleinが共通の病理経路で働いている可能性が考えられた。本研究により、ショウジョウバエの羽を可視化表現型として、一般的なパーキンソン病発症の根幹をなすと考えられるLRRK2、α-Synucleinシグナル伝達に関与する分子のスクリーニングを迅速に行う系を開発した。このスクリーニング系は、関与する遺伝子群のスクリーニングのみならず、次世代パーキンソン病治療薬、予防薬のスクリーニングにも応用できると期待できる。PINK1結合分子群も同様に、モデルショウジョウバエ(PINK1 RNAiあるいはPINK1ノックアウト系統)を用いて、その表現型を修飾する分子をスクリーニングした。その結果、PINK1の機能喪失により認められる筋肉のミトコンドリアの変性を抑制する分子PGAM5を同定することに成功した。PINK1ノックアウトショウジョウバエからPGAM5の遺伝子を喪失させると、PINK1変異より起こるミトコンドリアの変性が抑制される。一方、ショウジョウバエ遺伝学によってPINK1の下流に位置することが示唆されているparkinノックアウトショウジョウバエの表現型は抑制しなかった。以上の遺伝学的解析により、PGAM5は、PINK1とParkinの間を介する分子か、PINK1シグナルの下流でParkinとは独立に働く分子であることが示唆された。若年性パーキンソン病原因遺伝子PINK1とparkinは、それぞれプロテインキナーゼとユビキチンリガーゼをコードする。これら2つの遺伝子に遺伝的相互作用があり、ミトコンドリアの機能に必須であることが明らかにされていたが、その分子メカニズムの詳細は不明であった。本研究では、PINK1をプローブとしてプロテオミクスと遺伝学的スクリーニングを組み合わせた多面的スクリーニングにて、PINK1とParkinの間を介する分子の探索を行った。その結果、ミトコンドリアタンパク質PGAM5をPINK1下流の分子として同定することに成功した。PGAM5はPINK1シグナルの下流で、かつそのシグナルを負に制御することが示唆された。晩発性パーキンソン病原因遺伝子LRRK2は、複数のドメインをもつキナーゼをコードする。LRRK2をプローブとして、PINK1同様プロテオミクスと遺伝学的スクリーニングを組み合わせた多面的スクリーニングにて、LRRK2シグナルに関与する分子を探索した。その結果、2つのタンパク質LBP1とLBP2を同定した。分子レベルの解析により、LBP2はLBP1を介してLRRK2に結合し、複合体を形成することが示唆された。さらにLRRK2,LBP1,LBP2はエンドソームに局在し、Notchシグナルを抑制することを見出した。これは、LRRK2,LBP1,LBP2が、エンドソーム-リソソーム経路においてNotchリガンドの輸送・分解を修飾するためであると考えられた。
けいれんと神糸細胞死に関与する活性型グリア細胞の機能について-GFAP Knockout miceによる検討-

GFAPノックアウトマウスを用いて二つの脳傷害モデル、すなわちstab injuryによる急性の神経傷害および有機スズ化合物(trimethyltin: TMT)の経口投与による進行性の神経傷害に対するアストロサイトおよびマイクログリアの炎症反応について検討した。脳傷害の急性期では血液脳関門(BBB)の破綻が起こり、グリアの活性化が促進される。マイクログリアの活性化とそれに伴うサイトカイン(IL1,TNF-alpha)の産生は速やかに起こり、炎症反応を促進するが、活性型アストロサイトの変化は遅れて起こる。TNF-alphaにはBBBの透過性との関連が注目されている他にinduciblenitric oxide synthase (iNOS)の発現を促すという重要な働きがあるが,脳虚血モデルではiNOSが誘導されることによって進行性の神経傷害が起こり傷害部位が拡大することを示す証拠が集まりつつある。我々はこれまでにラットを用い、(明らかなBBBの破綻が認められない)TMT投与による海馬神経細胞傷害モデルにおいてTNF-alphaとiNOSが持続的に活性型アストロサイトに発現(共存)することを観察した。GFAPノックアウトマウスではBrain Injuryに対して脆弱であるという報告やBBBがは脆弱であるとする報告がなされていることから、GFAP(-/-)、GFAP(+/-)、GFAP(+/+)の各群についてstab injury並びに低用量(2mg/kg)のTMTの投与を行い、NADPH-diaphorase染色やiNOS、vimentin、TNF-alphaの発現を免疫組織学的手法により比較検討した。現在、糸原博士より供与されたGFAPノックアウトマウスを増殖し、このマウスを用いて、海馬神経細胞傷害に伴う活性型アストロサイトとマイクログリアの機能的・形態的変化を検討中である。神経障害の急性期ではマイクログリアが中心となってその病理学的役割を担い、慢性期においてはアストロサイトが機能的な変化(iNOS,vimentin,TNF-alphaの発現)を介して中心的役割を果たすと思われた。preliminaryではあるが、アストロサイトのintermediate filament proteinであるGFAPとVimentinはそれぞれ細胞骨格として働くと同時に、前者はより一般的な活性化の指標であり、後者はcytokineを介する一連の炎症反応の指標であることが示唆された。apoptosis/necrosisにおける神経損傷に続いて神経系の再構築が起こるが、海馬の神経シナプスの発芽や再構築に関係する機能的指標(NGFその他)を中心に、さらに活性型グリアの役割についてcorticosteron、aldosteronとの関係を含め、検討を加える予定である。
日本企業の自社株評価と財務行動に関する実証研究

(1)日本の全上場企業に対するサーベイ調査を行い、企業の投資決定や株式資本コストの推定がどのように行われているのか、財務意思決定の権限委譲がどのように行われているのか、(2)過去の行った複数のサーベイ調査に基づいて回答企業が自社株価評価をどのように行っているのか、(3)、東日本大震災の発生に伴って起きた福島原発事故の推移がエネルギー関連企業の株価にどのような影響を与えたか、について実証研究を行った。主な結果を4編の論文にまとめ、先行研究に基づいた国際比較を含めて日本企業の財務意思決定の特性、危機時の日本の株式市場に反応について、興味深い新しい知見が得られた。2011年7月に行った事業会社の投資決定と財務的意思決定の権限委譲についてのサーベイ調査について、データを分析し、「日本企業が用いる投資評価手法とハードルレート:サーベイ調査に基づく実証分析」と「投資資金配分と財務意思決定の権限委譲ーサーベイ調査による分析ー」という2つの論文にまとめた(いずれも中央大学の花枝英樹氏との共著)。主な結果として、日本企業が米国企業に比べてファイナンス理論が示す投資決定原理(NPVなど)を用いる頻度が少なく、理論的には望ましくない手法(回収期間など)の頻度が多いという、非常に興味深い事実が明らかになってきた。前者は2012年5月の日本ファイナンス学会で報告を行った。後者は2012年10月の日本経営財務研究学会で報告を行った。2011年度から始めた2011年3月の福島第一原発事故が株式市場に与えた影響について、実証分析を行い、"Energy stock returns and the Fukushima Nuclear Accidents"(法政大学の胥鵬氏との共著)という論文にまとめた。この論文は、電力会社だけではなく、電力関連企業や代替エネルギー企業にも注目したユニークな研究で、2012年7月に台北で開かれた国際学会と12月にシドニーで開かれた国際コンファレンスにおいて報告した。日本企業の投資決定についてサーベイ調査論文を作製し、日本経営財務研究学会で報告し、2013年12月のシドニーのコンファレンスでも報告採択されたが、体調を崩して中止した(2014年7月のWorld FinanceConference(ベネチア)で採択され、報告予定)。論文の目的は、日本企業が投資決定手法と資本コスト推定をどのように行っているかを日本の全上場企業にアンケートを行い検証することである。主な結果は、日本企業は、回収期間法を用いる頻度が最も高いのに対して、NPV法やIRR法の利用頻度は低い。これは、欧米やアジアの企業と大きく異なる日本企業に独特な結果である。日本企業の財務意思決定に関する権限移譲論文の作製、完成した。「現代ファイナンス」に掲載が採択され、No.34(2013年9月)に掲載された。論文の目的は、実物投資、M&A、ペイアウト政策などの財務意思決定権限を実質的に誰が担っているのか、また、企業内の投資資金配分はどのような点を考慮して行われているのか、といった点を、日本の全上場企業にアンケートを行って検証することである。主な結果として、1)6つの財務意思決定の中では、M&Aの権限委譲の程度が最も低く、逆に、設備投資とR&D投資の意思決定の権限委譲が最も高かった、2)トップ経営陣の負担度や企業の複雑性が増すにつれ、権限委譲が進むことが確かめられた、3)事業部門間の投資資金配分については、「マーケット・シェアの維持」、「事業部門長の新規投資に対する確信」、「プロジェクトのキャッシュフローのタイミング」、「各事業部門の過去の投資の収益性」が重要であり、「プロジェクトのNPVに基づくランキング」は重視度が低い、4)権限委譲の程度や資金配分で重視する要因の違いが企業パフォーマンスに影響を及ぼしている可能性が示唆された、が得られた。サーベイ調査に基づいた事業会社の自社株評価を用いて、自社株評価に対する自信過剰が財務行動に与える影響について実証分析を行い、"Managerial Attitudes toward to Market Valuations"(法政大学の胥鵬氏との共著)という論文にまとめた。主な結果は、企業の自社株評価には明白な自信過剰が見られ、それは調査直前の株式リターンの影響が大きく、その回答がその後のペイアウト政策に影響を与えることが明らかになった。この結果は、サーベイ調査というこれまでにほとんど行われていない新しい手法で企業の自信過剰とその影響を明らかにした点に大きな意義がある。この論文は、初期の版を2011年5月に日本ファイナンス学会で、また12月にシドニーで開かれた24th Australasian Finance & Banking Conferenceにおいて報告した。事業会社の投資決定と財務的意思決定の権限委譲について、全上場企業にサーベイ調査を行い、実証分析を行った(中央大学の花枝英樹氏との共同研究)。投資決定の考え方について標準的なファイナンス理論と比較して分析を行った。

現在論文にまとめている最中で、主な結果として、日本企業が米国企業に比べてファイナンス理論が示す投資決定原理(NPVなど)を用いる頻度が少なく、理論的には望ましくない手法(回収期間など)の頻度が多いという、非常に興味深い事実が明らかになってきた。2012年度に国内の学会等で報告する予定である。2011年3月の福島第一原発事故が株式市場に与えた影響について、原子力関連企業、代替エネルギー企業を対象に新研究を始め、実証分析を行った。これはきわめて重要かつ特異なイベントで、株式市場についての新しい知見が得られることが期待される。現在論文にまとめている最中で、2012年度に国内の学会等で報告する予定である。1サーベイ調査に基づいた事業会社の自社株評価についての分析は、論文にまとめて、国内外で2度発表するなどし、現在最終的な修正をして投稿する準備中で、予定通りに進んでいる。2事業会社の投資決定と財務的意思決定の権限委譲について、2011年度に行ったサーベイ調査について、データを整理、分析を行い、2つの論文にまとめた。それぞれ国内の学会で報告した。現在、修正をして投稿する準備を進めており、これも順調に進んでいる。32011年3月の東日本大震災の発生を受けて、新たに福島第一原発事故が株式市場に与えた影響について、論文にまとめ、国内外の学会で2度報告した。現在は修正して投稿する準備中で、予定通りである。4日本企業の株価の絶対水準(名目株価)が株価形成に与える影響の分析については、2012年度以降に本格的に取り組む予定であり、この研究ではまだ明確な実証分析結果を得ていない。以上1ー4の研究の進捗状況から区分(2)とした。(1)サーベイ調査に基づいた事業会社の自社株評価についての分析は、論文にまとめて、2度発表するなど、予定通りに進んでいる。(2)また、事業会社の投資決定と財務的意思決定の権限委譲について、2011年度に全上場企業にサーベイ調査を行い、データを整理、分析を行い、論文作成中で、これも順調に進んでいる。(3)2011年3月の東日本大震災の発生を受けて、新たに福島第一原発事故が株式市場に与えた影響について、新たな研究をスタートできたことも、事前の計画外の研究として進めることができた。(4)日本企業の株価の絶対水準(名目株価)が株価形成に与える影響の分析については、2012年度以降に本格的に取り組む予定であり、この研究ではまだ明確な実証分析結果を得ていない。以上(1)ー(4)の研究の進捗状況から区分(2)とした。サーベイ調査に基づいた事業会社の自社株評価については、これまでの報告で指摘を受けたコメントを基に論文を改訂し、雑誌に投稿する。サーベイ調査に基づく事業会社の投資決定については、論文を改訂し(英語論文に改訂する予定)、海外の学会で報告し、雑誌に投稿する。サーベイ調査に基づく事業会社の権限移譲については、報告で指摘を受けたコメントを基に論文を改訂し、雑誌に投稿する。福島第一原発事故が株式市場に与えた影響については、指摘を受けた改善点を基に論文を改訂し、雑誌に投稿する。日本の株式市場における株価の絶対水準についての実証分析を行う。
ヒト脂肪由来幹細胞を用いた血管新生治療の開発

まず、脂肪由来幹細胞を培養する際に血管内皮細胞増殖培地(EGM-2)を用いると、脂肪、軟骨、骨への多分化能を維持したまま、短期間により多くの細胞を培養することが可能であった。また、培養の際に線維芽細胞増殖因子(FGF-2)を添加すると、JNKと呼ばれるシグナル伝達経路を介して、増殖および肝細胞増殖因子(HGF)発現が著明に亢進することが判明した。そして、このFGF-2による脂肪由来幹細胞の増殖促進およびHGF発現亢進は、創傷治癒過程における組織リモデリングや線維化抑制に大きく関与していると考えられた。まず,脂肪由来幹細胞を培養する際の培地についての検討を行った。一般的に用いられている培地であるDMEMと血管内皮細胞増殖培地(EGM-2)との比較を行ったところ,EGM-2を用いた場合,対照群(DMEM)と比較して倍加時間が有意に短縮した。総細胞数の経時的変化からは,EGM-2を用いると,細胞数はより急速に増加し,より早期に定常期に入ることが判明した。Flow cytometryでは,CD31などの内皮細胞マーカーの発現において両群に有意な差は見られなかった。また,EGM-2で培養した細胞群でも,脂肪,軟骨,骨への分化誘導が可能で,定量的評価においてもDMEMとの有意な差は認めなかった。EGM-2は脂肪由来幹細胞の持つ間様系への多分化能を保持したまま,その増殖能を促進することができるため,短時間に多くの細胞を確保する際に有用であると考えられた。次に,種々の細胞増殖因子(VEGF, FGF-2, HGF, PDGF)の影響について検討を行った。DMEMに各細胞増殖因子を添加したところ,FGF-2とPDGFは濃度依存的に脂肪由来幹細胞の増殖を促進した。また,脂肪由来幹細胞が自ら分泌している細胞増殖因子への影響をReal-time PCRを用いて調べたところ,FGF-2を添加することにより,HGFのmRNA発現が著明に亢進することが判明した。培養上清をELISAで調べることにより,FGF-2によるHGF分泌の促進が蛋白レベルでも確認された。また,阻害剤を用いた実験から,このFGF-2によるHGF分泌の亢進には,MAPキナーゼカスケードの中のJNKが大きく関与していることが分かった。最後に,脂肪由来幹細胞に対する低酸素の影響を検討したところ,低酸素状態(1%)で培養した場合にVEGFの発現が亢進していた。これらの研究実績から,脂肪由来幹細胞は細胞増殖因子や低酸素など,周囲の環境因子によって増殖や自らの細胞増殖因子分泌が調整されていることが分かった。また,このような環境因子による調整が,脂肪組織における血管新生に大きく関与している可能性が示唆された。まず、脂肪組織の創傷モデルとして、マウス皮下脂肪の阻血再還流傷害モデルを開発した。鼡径部の皮下脂肪に流入する血管を露出して血管クリップで3時間阻血にした後、血流を再開させることにより、著明な細胞浸潤や組織リモデリングを伴いながら約2週間で治癒するモデルが確立された。このモデルにおいて、FGF-2は創傷1日目の早期から発現が見られるのに対し、HGFはそれより遅れる形で3日目から7日目にかけて発現が上昇してくることが免疫染色やWestern blottingにより確認された。また、そのHGFの発現上昇に一致して、CD34陽性の脂肪由来幹細胞が増殖していることも免疫染色やFlow cytometryにより確認された。このモデルにFGF-2の中和抗体やJNK阻害剤を投与すると、BrdU陽性の増殖細胞が減少し、さらに、HGFの発現が抑制されることが判明した。このような阻害を行うと、2週間後の繊維化(Azan染色)が増加していた。繊維化の増加は、HGFの中和抗体を投与した場合でも同様に認められた。以上の結果から、脂肪由来幹細胞は、創傷治癒の過程でFGF-2の刺激を受け、JNKを介して増殖やHGF分泌を亢進し、創傷治癒過程における線維化抑制に重要な働きをしていることが示唆された。脂肪由来幹細胞を細胞治療に用いる場合、血管新生効果のみならず、線維化抑制の効果も期待できると考えられる。また、その際は、FGF-2を併用することにより、HGFを介した治療効果が高まることが期待される。