hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
働く女性のストレスマネージメントに関する実証的介入研究

G得点の値から高ストレス群(G得点12点以上)と低ストレス群(G得点11点以下)に分類し、職場や家庭内のソーシャルサポートの有無と職業性ストレッサーおよび職業以外のストレスとの関係を検討した。その結果、高ストレス群では低ストレス群に比べて職場内と家庭内支援の不足や仕事のコントロール不良や技術の低活用が見られた。職業以外のストレッサーの割合も多く多重役割によるストレスの影響が明らかになった。更にその関係を客観的に評価するために内科系と救命部署の看護師64名に対し血中カテコールアミン、血中コルチゾル、NK細胞活性などのストレスホルモンを測定し、G得点との相関を見たが有意差は認められなかった。2)平成9年と14年の調査をいずれも受けた例のみを抽出し、運動習慣の有無がストレス軽減にどのように影響しているかを検討した。その結果、運動習慣が無し→無し群(n:318)のG得点は8.1から8.8点へと有意(P<0.05)に増加していた。一方、運動習慣有り→有り群(n:36)のG得点は6.9から6.8点へと減少していたが有意差は見られなかった。以上より習慣的な運動の実践はメンタルヘルスの維持に有用であることが示唆された。3)管理監督者に対するストレス研修の場を設け、組織が対応するストレスマネージメントの強化をはかったがその評価については今後の検討を継続したい。4)働く女性を対象に運動負荷試験から求めた最大酸素摂取量やBaeckeのQuestionnaireの日本語版から求めた活動状況を基に運動・認知行動療法を実践した。その結果、3名については活動量が増加し職業性ストレッサーやストレス反応の程度が軽減する傾向が見られ、今後更に症例数を増やして検討していきたい。
超臨界流体場での化学反応を利用する新しい有機材料解析システムの開発

超臨界流体場での材料の化学反応分解の基礎検討として、種々のポリマー材料の各種反応試薬共存下での反応熱分解ガスクロマトグラフィーによるキャラクタリゼーションを行った。まず、水酸化テトラメチルアンモニウム(TMAH)共存下400°Cで、各種共重合型ポリカーボネート(PC)を反応分解したところ、各構成モノマーおよび末端基のメチル誘導体が定量的に生成し、パイログラム上に観測されるそれらの相対ピーク強度を基に、共重合組成および末端基濃度を正確かつ高精度に定量することができた。つぎに、近年生物機能材料としての可能性が注目されているキチン質の基本特性であるアセチル化度を、シュウ酸共存下での反応分解を利用して正確に求めることを検討した。キチン質をシュウ酸共存下で熱分解したところ、N-アセチル基部分が酸加水分解的に選択分解され、パイログラム上に観測される特性生成物の相対ピーク強度を基に、もとのアセチル化度をほぼ正確に定量することが可能になった。つづいて、本法により熱帯地方のカイガラムシの一種から採取される天然樹脂シェラックの化学組成分析を試みた。このセラック樹脂は、ジャラール酸を始めとするセスキテルペン類とアレウリチン酸などのオキソ酸とのエステル化体を主成分とする多成分の混合物であり、この試料をTMAH共存下において反応熱分解した場合、試料中のエステル結合が選択的に加水分解されると同時に、オンラインでのメチル化が達成されるため、得られたパイログラム上には、セラックの構成成分がメチル誘導体として高感度に観測された。これらの成分ピークの強度を基にして、セラック試料の構成成分の定量を行うことができた。さらに、実用的なポリオレフィン樹脂にしばしば添加されている、高分子量ヒンダードアミン型光安定剤(HALS)を、樹脂からの抽出操作等を行うことなく、迅速簡便かつ高感度に定量する、画期的な手法を開発した。本年度は、超臨界流体場での材料の化学反応分解の基礎検討として、種々のポリマー材料の各種反応試薬共存下での反応熱分解ガスクロマトグラフィーによるキャラクタリゼーションを行った。まず、水酸化テトラメチルアンモニウム(TMAH)共存下での反応分解を利用して、各種共重合型ポリカーボネート(PC)の化学組成と末端基量との同時定量を試みた。多置換型シクロヘキシル基を有する共重合成分を持つ耐熱性PCと、共重合成分にベンゾトリアゾール基を有する耐光性PCを、それぞれTMAH共存下400°Cで分解すると、各構成モノマーおよび末端基のメチル誘導体が定量的に生成し、パイログラム上に観測されるそれらの相対ピーク強度を基に、共重合組成および末端基濃度を正確かつ高精度に定量することができた。キチン質をシュウ酸共存下で熱分解したところ、アセチル化度の程度にかかわらずN-アセチル基部分が酸加水分解的に選択分解され、酢酸やアセトアミドなどがほぼ定量的に生成した。そこで、パイログラム上に観測されるそれらの相対ピーク強度を基に、もとのアセチル化度をほぼ正確に定量することが可能になった。このほか、ポリマー中の塩素原子をあらかじめ水素還元する手法を併用して、熱分解ガスクロマトグラフィーにより、イオン交換樹脂の主原料であるクロロメチル化されたスチレン-ジビニルベンゼン共重合体の架橋度を推定することにも成功した。

本年度は、超臨界流体場での材料の化学反応分解の基礎検討として、種々のポリマー材料の各種反応試薬共存下での反応熱分解ガスクロマトグラフィーによるキャラクタリゼーションを行った。まず、水酸化テトラメチルアンモニウム(TMAH)共存下での反応分解を利用して、熱帯地方のカイガラムシの一種から採取される天然樹脂ラックの化学組成分析を試みた。このセラック樹脂は、ジャラール酸を始めとするセスキテルペン類とアレウリチン酸などのオキソ酸とのエステル化体を主成分とする多成分の混合物であり、この試料をTMAH共存下において400°Cで反応熱分解した場合、試料中のエステル結合が選択的に加水分解されると同時に、オンラインでのメチル化が達成されるため、得られたパイログラム上には、セラックの構成成分がメチル誘導体として高感度に観測された。これらの成分ピークの強度を基にして、セラック試料の構成成分の定量を行うことができた。さらに、このようにして得られたセラック試料の組成分布のデータから、異なる産地で採取されたセラック試料の識別分析も可能になった。次に、超臨界流体場を用いる解析システム構築の基礎検討として、超臨界流体クロマトグラフィー(SFC)により実用化されている各種アクリルオリゴマーの成分分析を行った。SFCにおける、カラム温度、移動相圧力、およびモディファイアーの添加量などの様々なパラメータを最適化することにより、微量の不純物を含めた試料中のほぼ全ての成分を分離定量することが可能となった。本年度はまず、引き続き超臨界流体場での材料の化学反応分解の基礎検討として、種々のポリマー材料の各種反応試薬共存下での反応熱分解ガスクロマトグラフィーによるキャラクタリゼーションを行った。ここでは、水酸化テトラメチルアンモニウム(TMAH)共存下での反応分解を利用して、実用的なポリオレフィン樹脂にしばしば添加されている、高分子量ヒンダードアミン型光安定剤(HALS)を、樹脂からの抽出操作等を行うことなく、迅速簡便かつ高速度に定量する、画期的な手法を開発した。続いて、TMAHの使用では困難であった、脂質中の多不飽和脂肪酸成分を、反応熱分解の手法により正確に分析することを、反応試薬として水酸化トリメチルスルホニウムを使用することにより達成することに成功した。これらの基礎検討の結果をうけて、反応温度や反応時間などの分解条件を制御でき、超臨界流体状態をも達成できる、マイクロカプセルを利用した新しい反応熱分解法の開発も試みた。その結果、紙中の微量添加剤分析に際して、カプセル内で反応熱分解を行うことにより、紙マトリックス中のセルロースの分解が著しく促進されることを利用して、微量の添加剤成分をより高速度に検出する手法を開発することが出来た。さらに、これまでは解析が困難視されていた、ポリカーボネート中の不溶性微小異物(いわゆるフィッシュ・アイ)を分析することが初めて可能になり、その架橋化学構造に関する直接的な知見を得ることができた。
プラズマ成長ハイブリットナノカーボンによる新概念分子モータ-の創製

本研究では,基板入射イオンエネルギーを精密に制御することで,単層カーボンナノチューブ(SWNTs)からの選択的垂直配向グラフェン合成に成功した.また,詳細な物性評価により,垂直配向グラフェンがSWNTsの伝導に対する室温安定な量子ドットとして振る舞うことを明らかとした.さらに,分子モーター機能発現に向けた機能化に関して,垂直配向グラフェン表面へのナノ粒子担持に成功し,ナノ粒子由来のプラズモン共鳴応答を観測した.このナノ粒子担持垂直配向グラフェン/SWNTsは,外部光との応答可能かつ室温安定な量子構造を有していることから,分子モーターを含む様々なデバイス応用が期待できる.三年計画の初年度である今年度は,カーボンナノチューブへの垂直配向グラフェン合成に特化して研究を行った.カーボンナノチューブ及びグラフェンに構造欠陥が生成されないように,基板入射イオンエネルギーが極限まで低下できる低電子温度拡散プラズマCVD装置を製作した.さらに本装置において,垂直配向グラフェン合成条件の最適化を行い,触媒を用いない基板上に数層の厚みを有するグラフェンを基板垂直方向に配向成長することに成功した.さらに,カーボンナノチューブ塗布基板に対して同様の合成実験を行った.合成時間依存性を測定した結果,十分時間が経過した合成においては,カーボンナノチューブの有無にかかわらず基板一面に垂直配向グラフェンが合成されたのに対し,合成時間が極めて短い場合においては,カーボンナノチューブの表面のみに選択的に垂直配向グラフェンが合成することを見出した.これは,カーボンナノチューブが核成長点となり垂直配向グラフェンの成長が促進された結果と考えている.さらに,異なる直径(1nm, 20nm)を有するカーボンナノチューブを用いて垂直配向グラフェン合成を行った結果,配向度がカーボンナノチューブの直径に強い相関を示すことが判明した.これは,直径の差に伴い電界集中効果が変わるため,配向の駆動力となる電界強度が変化した結果と考えている.このように,条件を最適化することにより,カーボンナノチューブ表面に選択的に垂直配向グラフェンが合成されたカーボンナノチューブ/グラフェンハイブリット物質の合成に成功した.さらに,次年度計画の一部であった,ハイブリットナノカーボン物質へのナノ粒子担持実験も行った.その結果,垂直配向グラフェン表面に金ナノ粒子を高密度で担持することに成功した.三年計画の二年度にあたる今年度は,前年度までに合成に成功したカーボンナノチューブとグラフェンからなる新奇ハイブリットナノカーボン物質に関して,その電気伝導特性評価とナノ粒子担持法の開発に特化して研究を行い以下の成果を得た.(1)カーボンナノチューブ/グラフェンハイブリットナノカーボン物質の電気伝導特性評価本研究の最終目的である,ハイブリットナノカーボン物質を用いた分子モーターの創製に向け,ハイブリットナノカーボン物質の基礎物性を明らかにすることは重要である.そこで,前年度までに合成に成功したカーボンナノチューブ/グラフェンハイブリットナノカーボン物質に対して,詳細な電気伝導特性評価を行った.その結果,電気伝導測定から,量子伝導特性の一種であるクーロンダイヤモンド特性が観測された.さらに,その特性から見積もられた量子ドットのサイズとカーボンナノチューブ上のグラフェンのサイズがほぼ一致することが判明した.このことは,カーボンナノチューブ上のグラフェンが,良好な量子ドットとして機能することを示している.(2)ハイブリットナノカーボン上へのナノ粒子担持法の開発分子モーターとしての駆動力を得るために,レーザー光に応答可能なナノ粒子をハイブリットナノカーボン物質の表面に付加させることは,非常に重要な課題である.前年度までの結果により,ナノ粒子担持に関する原理実証に成功している.そこで,今年度はナノ粒子の粒径制御を試みた.応答可能なレーザー照射光の波長とナノ粒子の粒径は密接に関連しているため,ナノ粒子粒径制御は,重要である.真空蒸発法により,金属薄膜を蒸着し,その後真空アニールにより微粒子化を行うことで,ナノ粒子の担持を行った.初期の蒸着膜厚を精密に制御した結果,担持するナノ粒子のサイズが大きく変化することを明らかとした.三ヶ年計画の最終年度にあたる今年度は,前年度までに合成に成功しているナノ粒子を担持したハイブリットナノカーボン物質の光学特性解明に重点的に取り組み,以下の成果を得た.前年度までにカーボンナノチューブ表面に垂直配向グラフェンを合成し,さらにグラフェン表面に白金粒子を担持することに成功している.最終的に分子モーターとしての動作を実現するためには,外部光信号により本ハイブッリットナノカーボン物質の並進運動制御を実現する必要があり,そのためには本研究で合成した物質の光学特性を明らかにすることが極めて重要である.そこで,グラフェン/カーボンナノチューブハイブリット物質のラマンスペクトルの詳細な測定を行った.その結果,白金担持前のグラフェン/カーボンナノチューブではグラファイト構造由来のGバンドと欠陥由来のDバンドの比が1対1程度であったのに対し,白金を担持することでDバンドの強度が明確に増大する現象が観測された.この結果は白金ナノ粒子表面に生成された表面プラズモンにより,照射レーザー光の電界強度が局所的に増大するプラズモン共鳴によって得られた結果と考えている.Dバンドのみが特異的に強く表れた理由に関しては,白金担持プロセスにおいて白金ナノ粒子とグラフェンとの間で化学反応が進行し,グラフェン構造中に欠陥が導入され,結果として白金ナノ粒子が担持されている周辺領域がアモルファス化したためと考えている.

本研究で得られた白金ナノ粒子担持グラフェン/カーボンナノチューブの特異なDバンド増強効果は,本ハイブリットナノカーボン物質が外部光に対して特異な応答を示すことを実証し,さらにプラズモン共鳴を伴った局所応答の可能性をも示した重要な成果である.従って,本成果は分子モーターはもちろん,それ以外のバイオ応用全般においても,今後重要な貢献が期待できるものと考えている.本研究では,基板入射イオンエネルギーを精密に制御することで,単層カーボンナノチューブ(SWNTs)からの選択的垂直配向グラフェン合成に成功した.また,詳細な物性評価により,垂直配向グラフェンがSWNTsの伝導に対する室温安定な量子ドットとして振る舞うことを明らかとした.さらに,分子モーター機能発現に向けた機能化に関して,垂直配向グラフェン表面へのナノ粒子担持に成功し,ナノ粒子由来のプラズモン共鳴応答を観測した.このナノ粒子担持垂直配向グラフェン/SWNTsは,外部光との応答可能かつ室温安定な量子構造を有していることから,分子モーターを含む様々なデバイス応用が期待できる.今年度は,前年度までに合成した新規ハイブリットナノカーボン物質の表面に金属ナノ粒子を担持しその物性を評価することを目指し研究を行った.その結果,ハイブリットナノカーボン上への金属ナノ粒子の担持手法の開発に成功し,さらに担持するナノ粒子のサイズ制御も実現した.このことは,最終年度に予定している,分子モーターとしての動作実証実験に向けて重要な成果である.また,金属ナノ粒子担持前のハイブリットナノカーボンの物性に関する詳細な測定を行い,カーボンナノチューブ上のグラフェンが量子ドットとして機能することを見出した.ナノ粒子担持後のハイブリットナノカーボンの物性評価までは進んでいないが,ハイブリットナノカーボン自体の新規基礎物性を明らかにした点で,本成果は重要であると言える.上記の結果から,今年度の研究は"おおむね順調に進展している"と判断した次第である.プラズマエレクトロニクスこれまでに合成した,金属ナノ粒子担持カーボンナノチューブ/グラフェンハイブリットナノカーボン物質に関して,今後は分子モーターとしての動作実証を主目的に研究を行う予定である.具体的には,担持した触媒金属ナノ粒子のプラズモン共鳴波長に対応するレーザー光を,溶媒中に分散したナノ粒子担持ハイブリットナノカーボン物質に対して照射し,外部環境との化学反応を通じてハイブリットナノカーボン物質の軸方向への駆動力を発現させることを目指し研究を行う.初年度はカーボンナノチューブ表面へのグラフェン合成(カーボンナノチューブ/グラフェンハイブリット物質)を目的として研究を行い,プラズマCVD条件の最適化によりカーボンナノチューブ表面に選択的に垂直配向グラフェンを合成することに成功した.さらに次年度計画の一部であった,カーボンナノチューブ/グラフェンハイブリット物質表面へのナノ粒子担持も実現した.
高等植物における細胞周期のM期時更的な遺伝子発現制御機構

ニチニチソウから得られたB-typeサイクリン遺伝子(CYM)が細胞周期中のM期に特異的に発現する。この遺伝子のプロモーターがタバコ培養細胞中でM期に特異的に活性化しレポーター遺伝子の発現を誘導することを既に明らかにしている。CYM遺伝子のプロモーターに様々な変異を導入した改変型プロモーターを作成し解析した結果、この遺伝子のプロモーター中に4回繰り返し存在している9bpからなる塩基配列がM期特異的なプロモーターの活性化に必要かつ充分であることを明らかにした。そこで、このシスエレメントをMSA(M phase-specific activator)elementと名付けた。アラビドプシス、タバコ、ダイズなど様々なの植物種からB-typeサイクリンのプロモーターを単離し塩基配列を決定したところ、調べた4種類すべてのプロモーターに3個から5藺のMSA様配列が認められた。このMSA配列に結合するトランス因子の同定を試みた。酵母を用いたone hybrid法によりタバコcDNAライブラリーをスクリーニングした結果、2種類のmyb相同遺伝子(OH53,OH88)が単離された。これら2種のmyb様遺伝子は、いくつかの点において、これまでに高等植物で知られているmyb様遺伝子とは異なる特異な遺伝子であることが分かった。特にmyb domainと呼ばれる繰り返し単位を、動物のmybと同じく3個有しているなど、植物のmyb様遺伝子よりも、より動物のmyb遺伝子に類似していた。この二つの遺伝子のうちの一つは細胞周期中のM期に転写産物の量が増大することが示された。これらの結果より、おそらくタバコmyb相同遺伝子OH53の産物が、MSA配列に結合し、M期特異的な転写を制御していると考えられた。ニチニチソウから得られたB-typeサイクリン遺伝子(CYM)は細胞周期中のM期に特異的に発現することを既に明らかにしている。この遺伝子のプロモーターに様々な変異を導入した改変型プロモーターとレポーター遺伝子(ルシフェラーゼ遺伝子)との融合遺伝子を作成した。この融合遺伝子をタバコ培養細胞BY2に導入し、同調培養することによって細胞周期中のルシフェラーゼ活性の変動を解析した。この結果、CYM遺伝子のプロモーター中に4回繰り返し存在している9bpからなる塩基配列がM期特異的なプロモーターの活性化に必要かつ充分であることを明らかにした。そこで、このシスエレメントをMSA(M Phase-specific activator)elementと名付けた。アラビドプシス、タバコ、ダイズなど様々な植物種からB-typeサイクリンのプロモーターを単離し塩基配列を決定したところ、調べた4種類すべてのプロモーターに3個から5個のMSA様配列が認められた。また、サイクリン遺伝子以外にもM期に特異的に発現するタバコのキネシン様タンパク質をコードするNACK1,NACK2遺伝子のプロモーター領域に、それぞれ2個のMSA様配列が存在していた。ダイズのB-typeサイクリン遺伝子(cyc4Gm)とタバコNACK1遺伝子のプロモーター中に存在するMSA様配列にpoint mutationを導入するとM期特異的なプロモーターの活性化が認められなくなった。これらの結果は、MSAが高等植物を通じて保存された遺伝子発現制御機構に関わっており、B-typeサイクリン遺伝子を含む一群のM期特異的な遺伝子の発現制御に共通に働いていることを示している。今後、このMSAに結合し、M期特異的転写を活性化するタンパク質因子のcDNAクローニングを行い、MSAを介した遺伝子発現制御機構を更に詳細に解析する予定である。
副作用のない画期的な「自己不活型新規シャペロン」の開発

変異酵素蛋白質結合し、構造異常を補正する化合物(シャペロン化合物)を用い、変異酵素活性を上昇させるシャペロン療法の開発を行っている。本研究では、ライソゾーム酸性環境下で構造変化し、不活性型に変換することで標的酵素蛋白質から解離する「自己不活型新規シャペロン」の開発を行った。デオキシノジリマイシン(DGJ)化合物を元に、pHにより構造変化を起こすオルトエステル基を付加した候補化合物を合成した。これらの化合物を用い、ファブリー病とゴーシェ病を対象に試験管内および培養細胞を用いた検討を行った。その結果、当初のコンセプト通り、高濃度使用時にも酵素阻害活性を示さない、それぞれ疾患への化合物を同定できた。先天代謝異常症の一つであるライソゾーム病に対し、我々は変異酵素蛋白質に特異的に結合し、構造異常を補正することのできる化合物(シャペロン化合物)を用い、変異酵素活性を上昇させるシャペロン療法の開発に取り組んできた。一方で、従来のシャペロン化合物は、基本的に酵素活性中心に結合する、基質競合阻害剤であり、高濃度で使用すると酵素阻害活性が問題となってきた。本年度、我々は、ライソゾーム酸性環境下で構造変化を起こし、不活性型に変換後、酵素蛋白質から解離する「自己不活型新規シャペロン」の開発を行った。ファブリー病とゴーシェ病で欠損しているライソゾーム酵素、α-ガラクトシダーゼとβ-グルコシダーゼを標的に、分子デザインした新規化合物を合成後、試験管内阻害活性試験により、有効な化合物をそれぞれ同定した。また、患者皮膚線維芽細胞に対するシャペロン試験により、ファブリー病とゴーシェ病細胞内で酵素活性を上昇させる効果を示す化合物を得ることができた。これらの化合物は、高濃度で細胞に投与しても、阻害活性は認めなかった。今後は、他の変異型を持つ皮膚線維芽細胞や、変異酵素cDNA発現細胞系を用い、候補化合物の有効性を示す変異型を同定する。本来のコンセプトに従い、2つのライソゾーム病に対する、有効な自己不活型シャペロン化合物の同定に成功した。また、予備的な解析では、高濃度での阻害活性が見られないことから、細胞内で自己不活型に変換しているものと思われた。今後は、これらの候補化合物の培養細胞への効果をより詳細に解析することで、新規シャペロン化合物としての有用性を示す知見が得られるものと考える。先天代謝異常症の一つであるライソゾーム病に対し、我々は変異酵素蛋白質に特異的に結合し、構造異常を補正することのできる化合物(シャペロン化合物)を用い、変異酵素活性を上昇させるシャペロン療法の開発を行っている。本研究課題では、ライソゾーム酸性環境下で構造変化し、不活性型に変換することで標的酵素蛋白質から解離する「自己不活型新規シャペロン」の開発を行った。本年度は、昨年度同定した候補化合物について、ファブリー病とゴーシェ病で欠損しているライソゾーム酵素の変異cDNA発現細胞系を用い、化合物が有効性を示す変異型の同定を行った。また、ファブリー病とゴーシェ病の患者由来培養線維芽細胞を用い、細胞病態に対する化合物の効果に関する検討を行い、有効性を明らかにした変異酵素蛋白質結合し、構造異常を補正する化合物(シャペロン化合物)を用い、変異酵素活性を上昇させるシャペロン療法の開発を行っている。本年度同定した、ファブリー病とゴーシェ病に対する自己不活型シャペロン候補化合物について、変異酵素cDNA発現細胞系を用い、シャペロン効果を示す変異型のプロファイルを明らかにする。また、ライソゾーム内の蓄積基質や、オートファジー・ミトコンドリア異常などに対する化合物の効果について検討を行い、シャペロン化合物としての有効性を培養細胞実験で証明する。人類遺伝学小児神経学本年度は新規化合物の入手など、共同研究先から可能となり、想定よりも使用額を節約することができた。新たな候補化合物の入手や測定方法の検討に費用を使用する。
乳がん新規治療標的としてのカルシウムシグナル

乳腺におけるカルシウムシグナルに焦点をあて、乳腺上皮細胞におけるストア作動性カルシウム流入の役割を解析した。まず、乳腺上皮細胞においてストア作動性カルシウム流入が活性化していることを明らかにした。次に、Stim1とStim2の両遺伝子を欠損するマウスの解析の結果、ストア作動性カルシウム流入が欠損した場合、未経産メスマウスの乳腺上皮細胞の発生や形成に影響はない一方、経産メスマウスではミルク分泌などが減少するため、産仔が発育不良となった。以上から、ストア作動性カルシウム流入は、乳腺上皮細胞の機能を正に制御することを明らかにした。本研究の目的は、乳癌に対する新規癌治療戦略の標的として、ストア作動性カルシウム流入ーカルシウムシグナルの可能性を実証し、最終的には、ストア作動性カルシウム流入を制御する新規化合物の探索を行うことである。本年度は以下の解析を行った。1. NFATレポーター乳癌細胞株の樹立を試み、現時点で、良好な細胞株は得られていない。2.乳腺上皮細胞特異的なStim1とStim2の遺伝子欠損マウスの作製を開始した。これまで両遺伝子のヘテロマウスの解析では、異常は認められなかった。3.乳がん細胞の転移を制御すると考えられているヒストン脱メチル化酵素Kdm5bの遺伝子発現制御を解析した。その結果、ストア作動性カルシウム流入によってある程度の発現が制御されていた。したがって、乳がん細胞では別のカルシウム流入経路が存在していると考えられる。また、Kdm5bの組織特異的ノックアウトマスの作製を開始し、現在までにキメラマウスからのジャームライン・トランスミッションを確認した。本研究の目的は、乳癌に対する新規癌治療戦略の標的として、ストア作動性カルシウム流入ーカルシウムシグナルの可能性を実証し、最終的には、ストア作動性カルシウム流入を制御する新規治療法の開発つながる基盤の確立を目指すことである。1.乳腺上皮細胞特異的なStim1とStim2の遺伝子欠損マウスを得ることが遅れたため、外胚葉由来の組織でCreを発現するK14ーCreトランスジェニックマウスを用いてStim1とStim2の遺伝子欠損マウスを共同研究者とともに作製した。その結果、ノックアウトマウスは雌雄共に正常に生まれてきたが、雌のノックアウトマウスから生まれた仔の成長が著しく不良であった。また、仔マウスの腹に確認できるミルクの量が野生型マウスで保育した場合よりも少なかった。これは乳腺の発達に影響があり、乳の分泌量が減少していることを強く示唆している。さらに、その他の外胚葉由来の組織において、分化が不良であった。2. Kdm5bの組織特異的ノックアウトマスの作製を試みているが、ヘテロマウスが得られる一方でホモマウスが得られていない。以上の解析から、Stim1とStim2で制御されるストア作動性カルシウム流入ーカルシウムシグナルは、乳腺の機能に重要である可能性が示唆された。1)NFATレポーター乳癌細胞株の樹立が遅れていること、2)譲渡していただいた乳腺上皮細胞特異的にCreを発現するトランスジェニックマウスが他の遺伝子変異を持っていたため、その除去に3世代の交配を要したこと、3)Kdm5b組織特異的ノックアウトマスのジャームライン・トランスミッションの効率が予想を下回り、時間がかかったため。免疫学他の薬剤選択、導入方法の改良(レンチウイルス等)しNFATレポーター乳癌細胞株早期に樹立する。乳腺や乳がんにおけるストア作動性カルシウム流入の役割に関しては、Stim1とStim2の2重欠損マウスの解析が望ましいが、個体作製に時間を要するので、Stim1欠損マウスを優先して解析を行う。予定していたマウスの交配が遅れ、マウスの個体数が少ないこと、そのため解析用に試薬の購入を控えたため。マウスが得られつつあるので、控えていた試薬等の物品費として使用する。
粉砕及び反応操作の乾式化によるゼオライトナノ粒子の新規高収率合成プロセス開発

通常のゼオライトナノ粒子合成法では、合成後大量の上澄み溶液が残ってしまうため、バッチあたりの収率が低下してしまう。一方本研究では、ボールミル粉砕により微細化させた後、(湿式粉砕法と異なり、乾燥工程を省くことができる)、その粉末をドライゲル転換法を応用し、ごくわずかなアルミノシリケート溶液共存下で粉砕により生じた非晶質をゼオライトへと再結晶化できることを明らかにした。アルカリ溶液はごくわずかな酸で中和できる。実質的に見た目は粉末状のままでミクロンサイズのゼオライトをナノサイズ化できることが本研究の特色である。近年、ゼオライトナノ粒子合成に関する研究が盛んに行われている。本申請では、収率が低いゼオライトナノ粒子合成法である一般的なバッチ式水熱合成法ではなく、乾式粉砕及び反応操作を組み合わせる手法を提案する。具体的には、乾式ジェットミル粉砕によりゼオライトを粉砕・微細化し、粉砕により生成した非晶質をドライゲル転換法を用いて再結晶化させることにより、微細化と高結晶性化を同時両立させる新規合成プロセスの確立を目指す。本プロセスの特徴は合成した(もしくは購入した)ミクロンサイズのゼオライトを、プロセスを通じてほぼ乾燥状態のままナノサイズ化・高結晶性化できることにあり、希薄アルミノシリケート中で合成する既往のゼオライトナノ粒子調製法よりも、バッチあたりの収量が10-30倍高いことである。これまでに、LTA型、FAU型、CHA型ゼオライトを研究対象として、粉砕させたゼオライトをドライゲル転換法により再結晶化させたところ、結晶性が回復することが確認された。200nm程度の粒子を安定的にえることに成功した。ドライゲル転換法による再結晶化条件を最適化させた。バッチあたりの収率向上のため、添加するアルミノシリケート溶液を極力減らす必要があったため、低温・短時間で処理する条件をみいだした。合成条件における主要操作パラメーターと生成物の状態(結晶化度、平均粒径、粒径のばらつき等)の相関をある程度明らかにした。さらに、得られたゼオライトナノ粒子に対し、核磁気共鳴法、放射光を用いた高エネルギーX線回折による動径分布解析を行い、非晶質構造から結晶へと変化する過程を明らかにした。最終的に、高結晶性かつ微細なゼオライトを合成するためのプロセスパラメータを明らかにすることに成功し、平均粒径50200nmで自在にチューニングできる技術を確立した。200nm程度の粒子を安定的に得ることに成功した。当初目標ではMOR型、MFI型ゼオライトも対象とする予定であったが、それは今後行う予定である。ゼオライト研究計画通り、遂行する。特に、乾式粉砕及びドライゲル転換法の各パラメーターの生成物に与える影響を理解し、平均粒径30200nmで自在にチューニングできる技術を確立することを目的としており、より研究をスピードアップさせる。研究対象とするMFI型、MOR型ゼオライトを今年度に集中的に行うことになった。そのための実験経費を昨年度使用しなかったため。昨年度に引き続きMFI型、MOR型ゼオライトの微細化実験を行い、さらに本年度当初予定していた研究を行う。
ストレスと歯周病の関連性についての実験的研究

近年、歯周炎における1つのリスクファクターとして推測されているストレスに関するいくつかの報告がなされている。しかし、ストレスと歯周病との明確な因果関係が得られておらず、また、実験方法が確立されていないのが現状である。そこで本研究では、ウィスターラットを用い、金網を用いた拘束ストレスを夜間12時間負荷し、さらにラットの臼歯部にナイロン糸を結紮する方法で実験的歯周炎を惹起させることにより、ストレス・歯周病動物モデルを用いた実験を行うことを検討した。その結果、ラットにストレスを負荷することにより、胸腺の萎縮、血漿アドレナリン濃度の上昇が認められ、拘束ストレスがラットにおけるストレスモデルとしての1実験系になることが確認された。また、同ラットに実験的歯周炎を惹起することで、ストレス群では非ストレス群に比較して歯周病が進行することがが病理組織学的に確認された。本研究の結果より、ストレスと歯周病の進行が相関していることが推測され、全身的因子であるストレスが歯周病の進行に影響を与える可能性が示唆された。また、ストレス状態では末梢の神経シナプスガ興奮し、各種の神経ペプチドが放出されて起こす、神経原性炎症(neurogenic inflammation)の概念が提唱されており、その状態についても病理組織学的に確認し、歯周病に与えている影響について調べることにした。現在のところ、ウィスターラットに10日間ストレスを与えることで、病理組織学的に神経末端部が房状に呈した像が一部確認されているが、まだ、実験匹数が少ない為、今後ラットの数を増やしてさらに検討する予定である。
婦人科癌におけるCD44の発現

CD44は接着因子のひとつであるが、最近、癌の転移に関わりがあるとされ注目をあびている。今回特に子宮頚癌のリンパ節転移との関係について検討した。転移と特に関係が深いとされるCD44v6のモノクローナル抗体を用いて、免疫染色を施行した。CD44v6は清浄子宮頚部でも傍基底膜に発現しれおり、異形成となると上層まで、発現するようになった。上皮内癌では全層に発現がみられたが、その強度は一様ではなく、ばらつきが見られた。子宮頚癌では扁平上皮癌、特に角化型に高率で発現していたが、腺癌は一例も発現していなかった。扁平上皮癌においては進行期が進むにつれて、発現率が上昇し、癌の進展と関わりがあることが示唆された。また、I期、II期の手術例で検討すると、リンパ節転移例と非転移例CD44v6の比較では、転移例で発現率が高かった。以上のことから、子宮頚癌の進行とリンパ節転移に、CD44v6が関与していることが示唆された。まず手術においてられた子宮頚癌、卵巣癌の組織よりRNAを抽出した。その材料を用いてRT-PCRを施工し、CD44v3からv6のmRNAについて検討した。PCRに使用するprimerはすべてアイソフォームに共通するCD44のsequenceの513から540、90から922の2種類を用いる。得られたPCR産物に対して、各variantに特異的なsequenceの部分を用いてsouthern blot hybridizationを施行し、どのvariantが発現しているか確認した。子宮頚癌においてはリンパ節転移例でCD44variant6 (v6)のmRNAが増幅している例が多く、やはり転移との関連が疑われた。しかし卵巣癌においては明らかな傾向は認められなかった。子宮頚癌においては、mRNAの評価は原発巣だけではなく転移巣に対しても行ったが、転移リンパ節でもやはりCD44v6のmRNAが増幅していた。手術において得られた子宮頚癌、卵巣癌の組織よりmRNAを抽出した。その材料を用いてRT-PCRを施行し、CD44v3からv8のmRNAについて検討した。すべてのアイソフォームに共通するprimerにより、PCRを施行し、その後、各variantに特異的なプローブを用いてhybridizationを行った。その結果は、子宮頚癌においてリンパ節転移例でCD44v6のmRNAが増幅している例が多かった。CD44v3、v5、v6、v8に対するモノクローナル抗体を使用して、免疫染色を行った結果も、やはり転移例でCD44v6の発現が高度であった。また、浸潤が深い部分でCD44v6の発現が強くみられた。リンパ節転移例で、転移部分のリンパ節においても、CD44v6の発現が認められた。腫瘍細胞に正常上皮においては傍基底層の部分でCD44v6の発現が認められ、これはEpidemal growth factor receptor〈EGF-R〉の発現部分と一致し、CD44v6が接着分子の役割だけではなく、上皮の増殖と何らかの関係があることが示唆された。卵巣癌において、転移と、CD44v6のmRNAレベル増幅との明らかな関係は認められなかった。また免疫染色においても、転移とCD44v6の発現との関係は明らかではなかった。卵巣癌の免疫染色において、EGF-RとCD44v6の発現の明らかな相関は認められなかった。CD44の発現と、子宮頚癌のリンパ節転移との関係を、免疫組織学的に検討した。CD44v3、v6と、すべてのCD44の共通部分なCD44 heamapoietic (H)のモノクローナル抗体を使用してABC法で検討した。まず、正常組織ではCD44v3、v6、Hとも傍基底層の細胞膜に発現していた。しかし、正常頚管腺には発現が認められなかった。異形成においては、CD44v3、v6、Hとも、より上層まで発現していた。異形成の程度が高くなるほど、染色される範囲も程度も高度となる傾向があった。しかし、上皮内癌、微小浸潤癌になると、症例により、染色の程度が様々で、染色の部位にもむらがあった。浸潤癌となると陽性例と陰性例とに別れ、明らかな相違が認められた。また、CD44v3、v6の染色部位が異なることもしばしば認められ、異なるアイソフォームが存在していることが考えられた。

リンパ節転移例においては、CD44v6はリンパ節転移例で陽性率が高かった。また、転移リンパ節においても、転移した腫瘍細胞が強く発現していた例が多かった。一方CD44v3は発現率とリンパ節転移との関係は明らかではなかった。転移リンポ節での発現も腫瘍細胞での発現は明らかではなく、リンパ球に発現していることもあった。CD44Hは発現率は最も高かったが、やはり、リンパ節転移との関係は明らかではなかった。以上より、CD44v6とリンパ節転移との関係が示唆された。その他、v4/5、v8/9の発現についても検討したが、リンパ節転移との関係は明らかではなかった。mRNAのレベルでも同様な結果を現在確認中である。また今後、転移部位と原発巣でのCD44の発現の比較を行う予定である。
末梢小型肺癌に対する新しい内視鏡治療法の開発

超高齢化社会における肺癌治療戦略上で、様々な併存症を有することが予測されるため、低侵襲でQOLを損ねることのない治療法の確立が望まれる。また、医療費増加を抑制するような低コストな肺癌治療法の確立は、社会のニーズである。光線力学的治療(Photodynamic therapy: PDT)は、光感受性物質と低出力レーザー照射による低侵襲治療法で中心型早期肺癌に対する標準治療の1つとして確立されている。PDTは、低侵襲、低コスト、QOLを損ねることにない早期肺癌に対する根治的治療である。しかし、肺野末梢に存在する小型肺癌に対しては、病巣へ誘導可能なファイバーがなく、適切にレーザー照射しPDTを施行することが不可能であった。末梢小型肺病変(腫瘍径30mm以下)に対する気管支鏡による診断率は、バーチャル気管支鏡、電磁場を利用した気管支ナビゲーションにより大きく進歩した。末梢病変への経気管支的なアクセスが向上したが、治療する方法がなかった。そのため、本研究では、末梢肺癌に対する経気管支鏡的にPDTを施行するために、どの部位にもアクセス可能で、正確に治療のために低出力レーザー光を照射可能なプラスチックファイバープローブを新規医療機器としてMeiji Seikaファルマ社と共同開発を行った。プローブの特性として熱発生がなく、先端を砲弾状にすることで、操作性、末梢肺へのアクセス性について検討した。また、医師主導治験にむけた対面助言後相談を数回実施し、治験プロトコール作成をおこなった。今後、この研究を発展させ、従来は、気管支鏡治療の対象とならなかった小型末梢肺癌に対して、「切らずに治す」、高者に適した低侵襲治療の開発を行う。今回、開発したプラスチックファイバーは、長軸方向および周方向の両方において均一な拡散光照射が可能である。拡散長は加工により10から90 mmの間で任意に選択可能である。この細径拡散光照射プラスチック光ファイバーを、FEP透明チューブ内に設置し封止したプローブが当該プラスチックファイバープローブであり、プローブの外形は0.9 mm以下と非常に細径で柔軟性に優れるため、経気管支鏡(鉗子孔)的なプローブ挿入操作が容易である。当該プラスチックファイバープローブおよび既承認のPDT用プローブについて、プローブからのレーザー光照射分布を計測した。当該プローブは長軸方向および周方向ともに均一な照射が可能であり特に長軸方向について、既承認プローブより優れた均一性を有する。光照射によるプローブ温度上昇を計測し、プローブの安全性を評価する実験を行った。当該プラスチックファイバープローブおよび市販のMedlight社製のプローブ(CE Mark取得済み)を用いて比較実験を行った。いずれも拡散長50 mmのものを用いた。プローブへの入力パワーを500 mWとし、500 s間の光照射中のプローブ表面温度をサーモグラフィーカメラを用いて経時的に計測した。当該プローブは既存のプラスチック製プローブと比較して温度上昇が優位に小さく、安全性が高いことが示された。当該プラスチックファイバープローブおよび既承認のPDT用プローブについて、プローブからのレーザー光透過率を計測した。既承認プローブの伝送率は64%、であったのに対し、当該プローブでは伝送率は70%と同等以上の伝送効率を有している。このように、光照射分布、耐熱性、光透過率など従来よりもすぐれていることが明らかになった。プラスチックファイバーに関してPMDAに戦略相談などは行ったが、動物実験の開始が遅延している。平成29年度は、この遅延を回復させる予定である。本研究は、今後到来する超高齢化社会をみすえ、急増する小型末梢肺癌に対する低侵襲、低コストである新しい内視鏡治療法の確立を目的としている。そのために、新しく開発した柔軟性を有し末梢肺野へのアクセス性のよいプラスチックファイバーを肺末梢病変に誘導し、全周性にレーザー照射を行い光線力学的治療(Photodynamic therapy: PDT)を施行すること、3D画像構築による気管支鏡ナビゲーションにより超音波プローブで末梢肺野病変を確認し、柔らかく極細ファイバーを誘導して行うことなどを当初計画した。平成29年度は、ファイバーに関する熱発生の有無、レーザー光の拡散などについて検討した。組織内で低出力レーザー照射を施行しても熱発生がおさえられることなどを確認した。また、末梢肺への誘導が行いやすくするために、ファイバー先端の形状を円形にすることで操作性の向上を確認することができた。また、「末梢小型肺癌に対する光線力学治療」に関する医師主導治験を行い、ファイバーの薬機法承認、タラポルフィンナトリウムやPDレーザー(半導体レーザー)の適応拡大にむけた取り組みを行ってきた。本年度では、治験にむけた対面助言、対面助言後相談をうけ、治験プロトコール等について検討した。本研究は、多数の併存疾患を有する高齢者肺癌に対して、QOLを損なうことがなく、安全性の高い経気管支鏡的な根治術の確立を目指すもので、低コストであるPDTの適応拡大は、医療費の抑制効果も期待できるものである。「末梢小型肺癌に対する光線力学的治療」を本研究で開発しているファイバーを用いて臨床研究、治験を予定している。そのため、PMDAへ対面助言(P4322)及び対面助言後相談を行い、治験での対象症例、試験デザイン等、プロトコールについて助言をいただいた。これと並行でファイバーに関する非臨床データの充足性について検討中である。

また、医療費増加を抑制するような低コストな肺癌治療法の確立は、社会のニーズである。光線力学的治療(Photodynamic therapy: PDT)は、光感受性物質と低出力レーザー照射による低侵襲治療法で中心型早期肺癌に対する標準治療の1つとして確立されている。PDTは、低侵襲、低コスト、QOLを損ねることにない早期肺癌に対する根治的治療である。しかし、肺野末梢に存在する小型肺癌に対しては、病巣へ誘導可能なファイバーがなく、適切にレーザー照射しPDTを施行することが不可能であった。末梢小型肺病変(腫瘍径30mm以下)に対する気管支鏡による診断率は、バーチャル気管支鏡、電磁場を利用した気管支ナビゲーションにより大きく進歩した。末梢病変への経気管支的なアクセスが向上したが、治療する方法がなかった。そのため、本研究では、末梢肺癌に対する経気管支鏡的にPDTを施行するために、どの部位にもアクセス可能で、正確に治療のために低出力レーザー光を照射可能なプラスチックファイバープローブを新規医療機器としてMeiji Seikaファルマ社と共同開発を行った。プローブの特性として熱発生がなく、先端を砲弾状にすることで、操作性、末梢肺へのアクセス性について検討した。また、医師主導治験にむけた対面助言後相談を数回実施し、治験プロトコール作成をおこなった。今後、この研究を発展させ、従来は、気管支鏡治療の対象とならなかった小型末梢肺癌に対して、「切らずに治す」、高者に適した低侵襲治療の開発を行う。本ファイバーを臨床応用するために、非臨床データを充足させるため、ファイバーに関する安全性、耐久性、屈曲性、操作性についてブタ肺を用いて行っていく予定である。また、PMDAへの相談は、適宜行い、薬機法承認に向けて進めていく予定である。平成30年度は、ファイバーなどについての非臨床データの充足性についてPMDAへ機器に関する戦略相談をうけ、PMDAのアドバイスに従って実験を行う予定である。対面助言後相談を複数回行い、治験のためのプロトコール完成、プローブなどの薬機法承認を見据えた取り組みを行う。主に動物実験(クラウンミニブタ購入、麻酔薬、運送料など)に関する実験の遅れのため、当該年度に使用できませんでした。次年度に動物実験、主にクラウンミニブタを使用してプラスチックファイバーの操作性、安全性、耐熱性について検討する予定です。前年度の実験の遅れは、動物実験の開始により当初の計画どおりに遂行し、予算を執行できると考えております。
絶縁性金属酸化物表面における触媒反応素過程の原子スケール直接観察

金属酸化物は、触媒や光学・磁性材料、半導体デバイスなど多くの分野に応用可能な機能性物質の一つである。その表面上で温度や圧力といった環境に依存しておこる複雑な現象を、原子・分子レベルで理解することは次世代技術開発に不可欠である。そこで、温度制御かつ圧力制御が可能な非接触型原子間力顕微鏡を作製し、絶縁性金属酸化物の構造・電子状態、さらにはその表面局所領域での反応素過程を、原子オーダーで明らかにすること狙った。その表面上で進行する物理的・化学的現象の本質を原子・分子レベルで理解することは、現在社会的要請が高まっている次世代技術の開発に不可欠である。特に、イオン性の化合物である金属酸化物では、個々のイオンの局所的な配位環境が表面での物理的・化学的現象に大きく影響することが知られており、局所領域での現象を区別して観察する必要がある。また、これらの物理的・化学的反応は温度や圧力といった条件にも依存するため、その本質に迫るためには反応環境の制御も欠くことができない。本研究では、温度制御かつ圧力制御が可能な非接触型原子間力顕微鏡(NC-AFM)を作製することで、特に走査トンネル顕微鏡(STM)では観察困難な絶縁性金属酸化物の構造・電子状態、さらにはその表面局所領域での反応素過程を、原子オーダーで明らかにすることを目的としている。本年度は、温度制御かつ圧力制御しつつ高分解能観察が可能な非接触型原子間力顕微鏡(NC-AFM)システムの設計を行った。本装置で最も特徴的かつ独創的なのが、NC-AFMのカンチレバーに水晶振動子を用いる点である。水晶製カンチレバーはバネ定数が数千数十万N/mと非常に剛性が高いため周囲の気体の粘性に影響されにくく、大気中でも安定した動作が可能である。ただし、剛性が高いことは微小な力を検出する際にはマイナス要因として働くため、信号検出には従来以上に注意を払う必要があり、カンチレバー近傍に電流/電圧変換アンプを配置するといった工夫により広感度かつ低ノイズの検出系を作製する必要がある。そこで、現有のAFMに水晶振動子センサーを導入し、検出計の試作および性能評価を行った。その結果、サブ・ナノメートルの分解能を有し、AFMリソグラフィーにも応用可能であることが確認できた。本研究では、温度制御かっ圧力制御が可能な非接触型原子間力顕微鏡(NC-AFM)を作製することで、特に走査トンネル顕微鏡(STM)では観察困難な絶縁性金属酸化物の構造・電子状態、さらにはその表面局所領域での反応素過程を、原子オーダーで明らかにすることを目的としている。本年度は、昨年度に設計した温度・圧力可変非接触型原子間力顕微鏡(NC-AFM)システムを作製し、性能評価を行った。本装置では水晶製カンチレバーを力センサーに用いており、ハロゲンランプを用いた赤外線加熱により、AFM観察位置において試料温度を室温から600°C程度の範囲で制御可能である。また、AFMユニットおよびAFM真空槽は、全て金メッキ処理を施しており、部材表面におけるガス反応を極力低減させるよう、工夫を凝らしている。試料・探針を含むAFMユニット部はバネ吊りにし、さらに装置全体を空気バネにより除振台上に設置することで、外部振動の影響を低減させている。本装置を用いることにより、超高真空から大気圧まで圧力を変えつつ、さらに、試料温度を制御した状態で、絶縁体表面の原子構造をNC-AFMを用いて高分解能観察することが可能となった。
妊娠における免疫抑制型Fc受容体の調節機構の解析:自己免疫疾患合併症の病態解明

今回の萌芽研究により、女性ホルモンによってどのように免疫システム、特に抑制型Fc受容体(IIb)が制御を受けているのか、妊娠母体特有の性ホルモン環境を利用し、女性ホルモンによる免疫抑制型Fc受容体の調節の仕組みを明らかにするために研究を行った。初期、後期の正常妊婦さんより採取した血液より、単球、リンパ球、好中球を単離し、RNAを抽出。また、満期産の胎盤からもRNAを抽出した。女性ホルモン受容体(エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体)とFc受容体(FcRI,IIa,IIb1,IIb2,III,胎児型)mRNAのPCR定量解析を行った。胎盤のFcRIIbは、妊娠初期では僅かな発現のみで、満期胎盤では10倍以上の強い発現の増強を示した。一方、妊婦血液中の好中球のFcRIIbは、妊娠初期では非妊娠時と比較し、減少する傾向にあった。しかし、妊娠週数が進むに連れ発現は増強し、非妊娠時と同じ程度の発現(満期胎盤のFcRIIbと同じ程度の強い発現)を示した。妊婦血液中の単球のFcRIIbの発現量は、好中球の1/4以下であったが、妊娠週数が進むに連れ、好中球とは逆に減少する傾向を示した。今回の基盤研究により、妊娠中の白血球細胞におけるFc受容体の発現様式を明らかにした。また、胎盤絨毛内の胎児由来マクロファージ(Hofbauer細胞)はFcRIIaのみを発現しており、一方、脱落膜に存在する母体由来マクロファージ、および母体血中の単球はFcRIIaとIIbの両方の受容体を発現していることが明らかとなり、生殖免疫系におけるFcRII受容体に関する新知見を得た。In vitro系を用いたFcRII発現の調節に関する詳細な解析が課題として残された。成果は投稿準備中である。今回の萌芽研究により、女性ホルモンによってどのように免疫システム、特に抑制型Fc受容体(IIb)が制御を受けているのか、妊娠母体特有の性ホルモン環境を利用し、女性ホルモンによる免疫抑制型Fc受容体の新規調節機構を明らかにするために研究を開始した。初期、中期、後期の正常妊婦さんより血液の収集を継続して行っている。採取した血液より、単球、リンパ球、好中球を単離、RNA抽出。女性ホルモン受容体(エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体)とFc受容体(FcR I, IIa, IIb1,IIb2,III,胎児型)mRNAのreal-time PCR定量解析をすすめている。また、蛋白レベルのFc受容体の解析を進めるため、Fc受容体(FcR IIa, IIb,胎児型)に対する抗体を作製した。作製した抗体の特異性を検定するため、Fc受容体(FcR I, IIa, IIb1,IIb2,胎児型)を白血球細胞よりクローニングし、GFP融合Fc受容体ベクターを作製、COS7細胞にトランスフェクションし、Fc受容体を発現させた。Western blotにて、作製された3つのFc受容体抗体は特異的に各々のFc受容体を認識していることを確認した。Fc受容体(FcR IIa, IIb)抗体を用いて正期産胎盤を免疫染色したところ、胎盤絨毛内のマクロファージ(Hofbauer細胞)はFcRIIaのみを発現し、脱落膜に存在するマクロファージはFcRIIaとIIbの両方の受容体を発現しており、胎盤の生殖免疫系における新知見を得た。今後、この知見に関してもさらに検討を進める予定である。
動脈硬化に伴う慢性膀胱虚血による低活動膀胱動物モデルの開発と病態の解明

本研究は、膀胱虚血の重症化や長期化に伴って膀胱機能障害は膀胱過活動から膀胱低活動へ進行するか検討した。膀胱過活動(排尿間隔の短縮と残尿を伴わない膀胱容量の減少)は、膀胱虚血の比較的軽症および早期に認められた。一方、虚血の重症化と長期化に伴い、膀胱機能障害は、膀胱低活動(排尿間隔の延長と有意な残尿を伴う膀胱容量の増大)へ進行した。慢性膀胱虚血は、進行性膀胱機能障害の原因となることが示唆された。[仮説]膀胱虚血による膀胱機能障害は、膀胱虚血の重症度や膀胱虚血の期間に依存し、例えば長期間の高度の膀胱虚血は、平滑筋ダメージ、神経障害、膀胱線維化を導き、膀胱低活動を引き起こすのではないか。[対象と方法]S-Dラットを4群分けた。1Control群は、水道水と普通食で飼育、2NO合成阻害剤(L-NAME)群は、L-NAME(3mg/ml)を溶解した飲水と高コレステロール食で飼育、3Arterial Injury (AI)群は、両側腸骨動脈内皮傷害後高コレステロール食で飼育、4AI/L-NAME群は、両側腸骨動脈内皮傷害後、L-NAME(3mg/ml)を溶解した飲水と高コレステロール食で飼育した。L-NAMEは、血管内皮障害を惹起するために用いた。8週間後、これら4群に対し覚醒下に膀胱内圧測定を行い、排尿動態を検討した。[結果]Control群に比較し、L-NAME群およびAI群の排尿間隔は短縮し、膀胱容量は減少した。一方、AI/L-NAME群の排尿間隔は著明に延長し、膀胱容量はControl群よりも有意に増加した。さらに、AI/L-NAME群において有意な残尿を認めた。[結論]AI/L-NAME群に認められた、排尿間隔の延長と残尿発生は、膀胱低活動の始まりを反映する所見と考える。よって、血管のダメージが重症化することにより、膀胱機能障害は、膀胱過活動から膀胱低活動に進行する可能性が示唆された。[目的]最近、膀胱虚血が膀胱機能障害の病因として注目されている。本研究は、膀胱虚血の重症化と長期化に伴って膀胱機能障害は膀胱過活動から膀胱低活動へ進行するか検討した。[対象と方法]1;重症化の検討:雄性ラットを対照群、L-NAME(NOS阻害剤:薬剤性の内皮障害)投与群、両側腸骨動脈バルーンカテーテル内皮傷害(AI)群とAI+L-NAME投与群の血管ダメージの異なる4群に分け、8週間飼育後に膀胱内圧測定を行った。2;長期化の検討:雄性ラットを対照群とAI群に分け、4、8、12および33週以上経過した時点で膀胱内圧測定を行った。測定後、両側総腸骨動脈を摘出し組織学的検討を行った。[結果]1;対照群と比し、L-NAME群とAI群の排尿間隔は短縮し膀胱容量の減少を認めた。一方、AI+L-NAME群の排尿間隔は著明に延長し、膀胱容量の増大と有意な残尿の発生を認めた。AI+L-NAME群の総腸骨動脈は、動脈閉塞性変化を示し、4群間で最も壁肥厚が顕著であった。2;AI後4、8週目では、対照群に比べ、排尿間隔は有意に短縮し膀胱容量も減少していた。残尿量は差を認めなかった。AI後12週目では、個体間のばらつきが大きく有意な差に至らなかった。AI後33週以上では、逆に排尿間隔が著明に延長し膀胱容量の増大と有意な残尿発生を認めた。AI群の総腸骨動脈は、すでに4週目で明らかな内膜増殖を伴う血管壁肥厚を呈し、33週以上維持され、経時的に厚くなっていた。[考案]膀胱過活動(排尿間隔の短縮と残尿を伴わない膀胱容量の減少)は、膀胱虚血の比較的軽症および早期に認められた。本研究の結果から、慢性膀胱虚血は、進行性膀胱機能障害の原因となることが示唆された。生体を用いた機能的評価に関しては、概ね順調に経過している。今後、凍結保存した組織サンプルを用いて、分子生物学的な検討を予定してしている。また、パラフィン固定標本における組織学的検討も併せて行う予定である。