hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
並列計算機上の関数プログラミングシステムの構築に関する研究

本研究は、並列計算機上に関数プログラミングシステムを構築して、あらたな規範に基づく並列プログラミングの支援環境を与えようとするものである。一昨年度より開発を進めてきた並列計算機AP1000上の関数プログラミングシステムParallel Goferを用いてさまざまな並列アルゴリズムを実現したプログラムを用意し、評価しつつコンパイラの最適化を進めてきた。この研究を進めてゆく過程で、関数プログラミングシステムにおけるデータのUnbox化の重要性が明らかになってきた。データを動的に生成するという関数プログラムの実行においては、生成するデータの効率のよい取扱いがきわめて重要になってくる。ここでは、データのUnbox化に関して、動的にヒ-プ上に生成するとされるデータのうちで、実際にはそうする必要のないものを検出する方法を提案して実現し、評価した。本年度には、このようなデータのUnbox化とともに、構成的アルゴリズムに基づくHylomorphismによるプログラムの変換システムを構築し、有効性を確認した。これらは、並列関数プログラムに固有のものではなく、広く関数プログラミングシステムに適用できる手法である。以上の研究成果は、主として、国際学会で発表しているが、これらをもとにして実現した並列関数プログラミングシステムはネットワークでアクセスできる形で公開する予定である。本年度の研究計画は、その基盤となる並列計算機の上の関数型言語の処理系の設計・作成を行うことであった。関数型言語の処理系の原型は、これまでにワークステーション上に作成してあったものを利用し、これに並列化機構を追加して、分散メモリ型並列計算機AP1000と共有メモリ型並列計算機Luna88K上にParallel Goferの処理系を作成した。これらの処理系はほとんどのコードが共通で、機械依存部分だけが異なるという形態であり、さらにあらたな並列計算機にも容易に移植できるものとなっており、当初の設計方針に適合した構成になっている。並列関数型言語の処理系の作成に関する研究成果を公表したが、処理系を用いた評価についてはまだ十分に報告できる状況ではない。本研究は3年間にわたるもので、当初より、処理系の評価は来年度に行うものと計画しているが、本年度にプログラムの実行プロファイルを採取して効率改善を図るための基礎的な実験も行った。来年度は、処理系の評価とともに、これに基づいて改善を行いつつ、これらの処理系をもとにしたプログラムの開発環境・変換系を構築する計画である。本年度の処理系作成によって、並列関数プログラミングの実用化システムに必要な支援環境の基盤が得られたものと考えられる。本年度の研究計画は、昨年度に引き続き並列計算機上の関数型言語の処理系の設計・作成を行って、評価することであった。関数型言語に導入した並列化機構を分散メモリ型並列計算機AP1000上で評価しつつ、処理系を改良した。これらの処理系はほとんどのコードが共通で、機械依存部分だけが異なるという形態であり、さらにあらたな並列計算機にも容易に移植できるものとなっている。並列り列関数型言語の処理系の作成に関する研究成果と処理系を用いた評価をとりまとめたが、同時に並列関数型言語によるプログラミングの方法に関する成果も報告した。来年度は、処理系の評価をさらに進めるとともに、これらの処理系をもとにしたプログラムの開発環境・変換系を構築し、並列関数プログラミングの実用化システムとして公開する予定であった。本研究は、並列計算機上に関数プログラミングシステムを構築して、あらたに規模に基づく並列プログラミングの支援環境を与えようとするものである。

これらは、並列関数プログラムに固有のものではなく、広く関数プログラミングシステムに適用できる手法である。以上の研究成果は、主として、国際学会で発表しているが、これらをもとにして実現した並列関数プログラミングシステムはネットワークでアクセスできる形で公開する予定である。
雌の産子調節における受精時期の重要性に関する研究

本研究では、卵胎生魚類グッピーを用いて、雌は配偶後に卵を受精する時期を操作することで産む子の数を調節しているという仮説を検証した。その結果、好みの雄と配偶した雌は、早く卵を受精させていたことが明らかになった。また、卵を受精させていなかった雌を分析したところ、配偶相手の雄が派手だった場合、多くの熟卵を持っていることが判明した。これらの結果から、本種の雌は配偶相手の雄に応じて卵の受精時期やつくる卵数を操作していることが示唆された。本研究課題は、卵胎生魚類グッピーを対象として、雌が産む子の数や大きさを操作するため、雄と交尾してから卵を受精するまでの期間を調節しているという仮説を検証するものである。これまでの研究結果から、配偶した雄に対する好みの程度に応じて、雌が産む子の数や大きさなどを調節していると予測されるが、それらの産子調節には雌が雄と交尾してから卵を受精するまでの期間が重要であり、大きな子を多く産むには受精までの時間を長くして、その間に多くの熟卵をつくっていると考えられる。雄に対する雌の配偶者選好性を測定した後、雌を雄と交尾させて、適切な期間をおいて開腹し、卵や胚を観察する手法で、雌の配偶者選好性と交尾から受精までにかかる時間、熟卵や受精後の胚の数や大きさの関連を検討した。これまで、雄と配偶後、8日目、15日目、あるいは22日目の雌を開腹し、卵や胚の状態を観察した結果、卵や胚の数は雌の体サイズに強く依存しており、大きな雌は多くの卵・胚を保持していた。一方、配偶した雄に対する雌の選好性は胚の受精時期に影響を与える傾向が見られ、雄に対する選好性が高かった雌ほど早く卵を受精していた。この結果は、雌に2個体の雄を提示した際に、強い選好性を示した雄と配偶した雌は早く産子するという先行研究の結果と一致している。しかし、配偶後22日目の雌においても、半数以下の雌は卵を受精していなかった。この結果は、雄に対する選好性に応じて子の数などを調節する場合、雄との配偶後22日目以降にも雌が受精時期による調節を行っていることを示唆しており、雄との配偶後22日目以降のサンプルが必要であることを示している。配偶経験のないグッピーの雌に対して2個体の雄を提示し、配偶させる方の雄への相対的な選好性を計測してから、雄と配偶させて一定期間後に雌を開腹して、受精の有無や、卵や胚の数、発達の程度などを調査し、受精時期を推定した。平成25年度までは、雌を雄と配偶させた後、8日目と15日目を中心に雌を開腹していたが、当初の見込みと異なり少数の雌しか卵を受精させていなかったため、平成26年度では雄との配偶後22日目の雌のサンプルサイズを増やした。これらのデータから、受精胚を保持していた雌の受精時期を推定して分析を行った。その結果、配偶相手の雄に対する雌の選好性は、大きなオレンジ色の斑点を持つ派手な雄に対して高かった。胚の受精時期に関して有意な影響を与えていた要因は、雌の体サイズと、雄に対する雌の選好性の高さであった。雌の体サイズが大きく、配偶相手の雄に対する雌の選好性が高かった場合、雌は早い時期に卵を受精させていたことが判明した。雌が保持していた受精胚の数に関しては、体サイズが大きい雌が多くの受精胚を保持していたが、配偶相手に対する雌の選好性は受精胚の数に大きな影響を与えていなかった。また、全体の半数以上の雌が開腹時に卵を受精させていなかったことから、これらの雌のデータより受精までに雌が卵数などを調節する際に影響を与えていた要因を分析した。その結果、雌の体サイズが大きく、配偶相手の雄が大きなオレンジ色の斑点を持っており派手であるほど、多くの受精していない成熟卵を雌は保持していた。これらの結果から、本種の雌は配偶相手を好んでいた場合は早く卵を受精させるが、配偶相手の雄が派手な場合は受精時期を遅らせて受精までに多くの卵を作ることが考えられた。今後、これらの結果を基に投稿論文を作成する。本研究課題では、卵胎生魚類グッピーを用いて、雌が子の数や大きさを操作するため、雄と交尾してから卵を受精するまでの期間を調節しているという仮説を検証する。これまでの研究結果から、好みの派手な雄と交尾した雌は、受精するまでの期間が長く、その間に大きな卵を多く作り、好みの雄の子を多く産むことが予測される。

雄と交尾した後、雌が体内で卵を受精するタイミングや卵・胚の数や大きさを調査するにあたって、両親を同じくする姉妹の雌が同一の雄と交尾した場合、交尾してから産子までの子の保持期間や産子数、子のサイズが同等である現象を利用し、同じ雄と交尾した姉妹雌を適切な間隔をおいて開腹し、卵や胚を観察する。平成23年度は、受精時期推定の指標とするため、卵や受精胚を持った雌を開腹して卵・胚の観察を行い、文献を参考にして胚の発生段階の特定を行った。並行して、実験に用いる両親を同じくする姉妹雌の作成を行った。充分に成熟した処女雌を単独の雄と交配させることで、両親が同じであることが確実な姉妹雌を作成した。親となる処女雌の作成、並びに姉妹雌が成熟するまでにいずれも約5ヶ月程度必要なことから、現在は実験に使用する姉妹雌が成熟に至り始めている状況である。成熟した姉妹雌は、雄のデジタルビデオ画像を用いて派手な雄に対する配偶者選好性を計測した。そして、姉妹雌を同一の雄と配偶させた後、1個体ずつ適切な期間をおいて開腹し、卵や胚の大きさや数を計測するとともに、文献や上記の胚の観察から受精時期の推定を行いつつある。まだサンプル数が少ないため、受精時期の特定には至っていないが、今後サンプル数が増えることで、雌の配偶者選好性と受精時期の関連が明確になり、受精時期推定の精度が向上すると期待される。好みの雄と配偶した雌は卵を早く受精させ、発達した胚を保持している傾向が高いという結果が得られたことから、配偶相手に対する選好性に応じて本種の雌が受精時期を調節していることが明らかになりつつある。今後、雄と配偶後22日目以降の雌のサンプルを増やすことによって、卵・胚の数やサイズに対する雌の配偶者選好性の影響、及びそれらと受精時期の関連やトレードオフを検証できると考えられる。当初の予定通り、姉妹雌を作成し、派手な雄に対する配偶者選好性を計測した後、同一の雄と配偶させて、卵・胚の観察を始めている。現在の段階ではサンプル数が少なく、姉妹雌を開腹する間隔が長いため、受精時期の特定には至っていないが、これは研究実施計画においても想定されていることである。これまでの結果から、およそ半数以上の雌が、雄との配偶後22日目以降に卵を受精している可能性が示唆されたため、平成25年度は配偶後22日目以降の雌のサンプルを増やす。これにより、配偶相手に対する雌の選好性が卵の受精時期や卵・胚の数などに与える影響をより明確にすることができ、本種雌の産子調節における受精時期の操作の重要性を明らかにすることができると考えられる。今後も実験に用いる姉妹雌を引き続き作成して実験のサンプル数を増やし、雌の配偶者選好性と受精時期の関連を明らかにすることで、姉妹雌を開腹するタイミングを調整し、受精時期推定の精度を上げる。早期予約による航空運賃の割引が適用できたなどの理由により、出費額を抑制できた。その抑制分が次年度使用額となった。次年度に請求する研究費にこれらの額を加えることによって、雄と配偶後22日目以降の雌のサンプルをできるだけ多く得るように努め、受精時期による雌の産子調節メカニズムの詳細を明らかにするとともに、研究結果の信頼性を高める。実験個体の雌から採集した卵や胚を撮影して数量化するため、デジタルカメラ付き実体顕微鏡を購入する予定であったが、その後、より簡便で安価なデジタルマイクロスコープが市販され、それを購入したため、その差額分が次年度使用額となった。次年度に請求する研究費と合わせて、サンプル数を増やして研究結果の信頼性を高めるため、実験個体数を増やすことに使用する。
特異領域を利用するニューラルネット深層学習法

1.特異領域を利用して実の深層学習法を実現する研究:データが複数の生成源から来たときモデル切り分けが必要となり深層学習は混合回帰に繋がる。2016年度はソフト混合、EMアルゴリズム利用の方針で混合回帰方式を研究し、2017年度は混合線形回帰の解法を考案実装し有効性を確認して国際会議ICAIA2018で発表した。2018年度は非線形に拡張して、強い適合力を持つ多層パーセプトロン(MLP)から成る混合MLP回帰の解法を考案実装し有効性を確認して国際会議ICPRAM2019で発表した。2.特異領域を利用して複素の深層学習法を実現する研究:複素MLPに周期性と非有界性を有する複素シグモイド関数を採用して、複雑な周期関数の近似を目指した。2016年度は優れた解品質と高速学習を実現する複素MLP学習法C-SSF1.3を開発し、カオス時系列予測に適用し良好な結果を得て国際会議IJCNN2016で発表した。さらに、多様なデータを用いた実験の成果を信学論に投稿し採録され、国際会議IJCCI2017で発表した。3.深層モデル選択法の研究:MLPのような特異モデルのモデル選択に近年WAICとWBICが提案された。そのサンプリング評価法として実MLP学習法SSF1.4を用いた実験を続け、良好な結果を得て国際会議ICPRAM2017で発表した(最優秀論文賞を受賞)。4.深層学習の新しい応用を開拓する課題:新応用として長期予測が至難のカオス軌道予測を考えた。予測の精度劣化が急速に拡大するので、高精度予測の他に入力誤差に対するロバスト性が強く要求される。その特性を有するRBFネットに着目しSSF原理を適用してRBF-SSF法を開発し、良好な結果を得たので国際会議ICAISC2018で発表した。さらに、解品質を保持しつつ最大3.6倍の高速化を実現して国際会議ICPRAM2019で発表した。1.特異領域を利用して実の深層学習法を実現する研究:与えられたデータが複数の関数の出力であるとする関数混合モデル(mixture of functions)を研究対象として研究を進めている。現在、関数混合データから複数の関数を分離するためのモデルとアルゴリズムを検討し、試作中である。2.特異領域を利用して複素の深層学習法を実現する研究:複素MLPは活性化関数によって近似性能が大きく異なる。本研究では、周期性と非有界性を有する複素シグモイド関数を採用して、複雑な周期性を持つ関数の近似を実現する。H27年度までの研究で、探索枝刈りの導入と探索数の制限により解品質を保持しつつ高速化を実現する複素MLP学習法C-SSF1.3を開発した。H28年度は、その解法を予測不可能とされるカオス時系列予測に適用して良好な結果を得たので、国際会議IJCNN2016で発表した。さらに、多様なベンチマークを用いて、C-BP法やC-BFGS法と性能比較する計算機実験を行い、C-SSF1.3が解品質と処理時間の面で最も優れていることを実証した。研究成果をCI研究会や情報学ワークショップで発表し、それを増強して信学論を提出し採録された。3.特異モデルと深層特異モデル選択法に関する研究:多層パーセプトロン(MLP)のような特異モデルのモデル選択では、漸近正規性が使えず正則モデル用の情報量基準が使えない。特異モデル理論研究の成果として、近年WAICとWBICが提案された。その評価法としてサンプリング法が有望であると考え、H27年度までの研究で開発した実MLP学習法SSF1.4をサンプリング法として実験を続けたところ、良好な結果を得たので国際会議ICPRAM2017に投稿して採録された。会議では非常に高い評価を得て、最優秀論文賞を受賞した。H28年度では、深層学習法のエンジンとしての特異階段追跡法(SSF法)の優秀性が計算機実験を通して確認できたとともに、特異モデル選択にSSF法をサンプリング法として用いるアプローチに関して良好な研究成果を得た。このようにおおむね当初計画通り研究が進行している。1.特異領域を利用して実の深層学習法を実現する研究:与えられたデータが複数の関数の出力であるとする混合回帰モデル(mixture of regressions)の最初の目標を、混合線形回帰モデル(mixture of linear regressions)として研究を進め、ソフト混合かハード混合かでは滑らかさを重視して前者を選択し、EMアルゴリズムを用いた従来解法を若干拡張した解法を定式化し実装した。EMアルゴリズムは初期値依存性が強いので、多様な配置を可能とする初期化法を考案実装し実験したところ、元の線形回帰群の正確な復元が可能であり、初期値依存性が弱いこともわかったので、国際会議ICAIA2018で発表した。2.特異領域を利用して複素の深層学習法を実現する研究:複素MLPの学習法を大別すると、1次法である複素BP法、2次法である複素BFGS法、複素特異階段を利用した2次法である複素SSF法になる。H27年度までの研究で、複素MLP法C-SSF1.3を開発しており、その性能を他法と多くのデータを用いて比較評価した結果、複素MLPの性能は学習法に大きく依存することがわかったので、信学論に投稿して採録され、国際会議IJCCI2017で発表した。3.深層学習の新しい応用を開拓する課題:新しい応用として、時系列予測を取り上げ、その飛躍的精度向上を目指す。

具体的には、数理モデルに忠実に従うが、長期予測が困難とされるカオスの軌道予測を考える。特に、予測結果を次の予測の入力とするフリーラン予測では、予測結果の精度劣化が急速に拡大するので、高精度の予測が必要となるとともに、入力データの誤差に対するロバスト性も要求される。RBFネットはその特性を有するので、その学習性能を飛躍的に向上させるため、SSF原理を適用したRBF-SSF法を開発して、その初期成果を研究会で発表した。H29年度では、混合線形回帰モデルのEM解法を拡張して実装して実験し、元の関数群の復元が可能で、初期値依存性が弱いことを確認し、複素SSF法の解品質が他法に比して優れていることを確認し、新応用としての時系列予測の精度向上を目指す研究では、入力誤差に耐性があるRBF-SSFの開発が進み、所望の性能が出ていることなどから、おおむね当初計画通りに研究が進展している。1.特異領域を利用して実の深層学習法を実現する研究:データが複数の生成源から来たときモデル切り分けが必要となり深層学習は混合回帰に繋がる。2016年度はソフト混合、EMアルゴリズム利用の方針で混合回帰方式を研究し、2017年度は混合線形回帰の解法を考案実装し有効性を確認して国際会議ICAIA2018で発表した。2018年度は非線形に拡張して、強い適合力を持つ多層パーセプトロン(MLP)から成る混合MLP回帰の解法を考案実装し有効性を確認して国際会議ICPRAM2019で発表した。2.特異領域を利用して複素の深層学習法を実現する研究:複素MLPに周期性と非有界性を有する複素シグモイド関数を採用して、複雑な周期関数の近似を目指した。2016年度は優れた解品質と高速学習を実現する複素MLP学習法C-SSF1.3を開発し、カオス時系列予測に適用し良好な結果を得て国際会議IJCNN2016で発表した。さらに、多様なデータを用いた実験の成果を信学論に投稿し採録され、国際会議IJCCI2017で発表した。3.深層モデル選択法の研究:MLPのような特異モデルのモデル選択に近年WAICとWBICが提案された。そのサンプリング評価法として実MLP学習法SSF1.4を用いた実験を続け、良好な結果を得て国際会議ICPRAM2017で発表した(最優秀論文賞を受賞)。4.深層学習の新しい応用を開拓する課題:新応用として長期予測が至難のカオス軌道予測を考えた。予測の精度劣化が急速に拡大するので、高精度予測の他に入力誤差に対するロバスト性が強く要求される。その特性を有するRBFネットに着目しSSF原理を適用してRBF-SSF法を開発し、良好な結果を得たので国際会議ICAISC2018で発表した。さらに、解品質を保持しつつ最大3.6倍の高速化を実現して国際会議ICPRAM2019で発表した。H29年度は、特異領域を用いた深層学習法の実装を完成させるとともに、特異モデルと深層特異モデル選択法に関する研究を進める予定である。H30年度は、混合回帰モデルでは非線形回帰の混合に拡張するとともに、RBF-SSF法の研究開発を進めて性能向上を目指し、カオス時系列予測に適用する予定である。
往復運動EHL特性に及ぼす表面あらさの影響

機械要素の性能向上に不可欠な弾性流体潤滑(EHL)下における油膜挙動に及ぼす表面あらさの影響を明らかにすることを目的として,表面に微小なあらさを付与した鋼球を用いて点接触往復運動下において二色光干渉法による油膜挙動の直接観察およびトラクション測定を行った.主に用いたあらさは運動方向に直角な方向に母線を持つ単列横方向突起および溝であり,マスクを用いてのクロムスパッタリングや微小切削の手法により鋼球表面上に形成した.得られた知見は以下のようにまとめられる.1.転がり運動の場合には油膜はあらさ近傍だけに影響を及ぼす.つまり突起,溝近傍以外の膜厚・膜形状はあらさを持たない平滑鋼球の場合と同様である.ただし,突起の場合には接触域進入時にスクイズ効果によって突起下流部に厚膜が形成される.2.突起を持つ鋼球が滑り運動する場合では,接触域端近傍に突起が存在し,その突起が接触域内の流量を制限するときには接触域内の油膜厚さの減少をもたらすが,それ以外の場合には突起の存在位置に関わらず油膜厚さおよび形状は突起近傍を除いて平滑面の場合に等しい.3.溝を持つ鋼球が滑り運動を行う場合は,油の流入側の接触域端近傍に溝が存在すると溝部を通しての側方漏れにより行程端からの移動開始時に油膜厚さの低下がみられるが,突起と異なり速度の増加とともに平滑鋼球と同様な油膜形状となる.接触域内に溝が存在する場合は,あらさ近傍を除いてほぼ平滑球と同様な油膜形状を示すが,接触域端の馬蹄形状薄膜部分の膜厚の低下が認められる.機械要素の性能向上に不可欠な弾性流体潤滑(EHL)下における油膜挙動に及ぼす表面あらさの影響を明らかにすることを目的として,表面に微小なあらさを付与した鋼球を用いて点接触往復運動下において二色光干渉法による油膜挙動の直接観察およびトラクション測定を行った.主に用いたあらさは運動方向に直角な方向に母線を持つ単列横方向突起および溝であり,マスクを用いてのクロムスパッタリングや微小切削の手法により鋼球表面上に形成した.得られた知見は以下のようにまとめられる.1.転がり運動の場合には油膜はあらさ近傍だけに影響を及ぼす.つまり突起,溝近傍以外の膜厚・膜形状はあらさを持たない平滑鋼球の場合と同様である.ただし,突起の場合には接触域進入時にスクイズ効果によって突起下流部に厚膜が形成される.2.突起を持つ鋼球が滑り運動する場合では,接触域端近傍に突起が存在し,その突起が接触域内の流量を制限するときには接触域内の油膜厚さの減少をもたらすが,それ以外の場合には突起の存在位置に関わらず油膜厚さおよび形状は突起近傍を除いて平滑面の場合に等しい.3.溝を持つ鋼球が滑り運動を行う場合は,油の流入側の接触域端近傍に溝が存在すると溝部を通しての側方漏れにより行程端からの移動開始時に油膜厚さの低下がみられるが,突起と異なり速度の増加とともに平滑鋼球と同様な油膜形状となる.接触域内に溝が存在する場合は,あらさ近傍を除いてほぼ平滑球と同様な油膜形状を示すが,接触域端の馬蹄形状薄膜部分の膜厚の低下が認められる.
スギ花粉アレルゲンにおける分子構造の変異に関する研究

Cry j 1遺伝子のSSCP分析及びダイレクトシーケンスの結果から、シグナル配列をコードする63塩基においてアミノ酸置換に関与する塩基置換2ヶ所、同義置換1ヶ所が検出された。成熟Cry j 1をコードする1059塩基のうち、アミノ酸置換に関与する塩基置換が11ヶ所、同義置換が22ヶ所検出された。このうち、アミノ酸置換に関与する13ヶ所、同義置換12ヶ所について、ダイレクトシーケンス及びSNP(single nucleotide polymorphysm)分析により精英樹267クローンの遺伝子型を決定した。その結果、アミノ酸置換に関与する塩基置換のうち頻度が高い(>5%)ものは4ヶ所、15%のものは2ヶ所であり、それ以外の7ヶ所は1%以下と頻度が低かった。頻度が1%以上の6ヶ所の塩基置換について、ハプロタイプ推定ソフトPhase2.1.1を使用し、九州、関西、関東、東北育種基本区ごとにハプロタイプの頻度を推定した。その結果、最も頻度の高いハプロタイプはすべての育種基本区で共通しており、関西、関東、東北育種基本区ではこのハプロタイプが50%以上を占めることが明らかになった。また、頻度の低い塩基置換も地域特異的ではなく、全国に散見される傾向にあった。一方、Cry j 2遺伝子は、10のイントロンで分断された11エキソンにより構成されていることが明らかになった。このうち第1、第5、第9、第11エキソンについてSSCPマーカーを設計し、精英樹267クローンを分析した結果、それぞれ4、3、2、6種類の対立遺伝子が検出された。また、第7及び第8エキソンを含む領域について、190クローンを対象にダイレクトシーケンスを行い塩基配列を比較したが、アミノ酸置換に関与する塩基置換は検出されなかった。今年度は、スギ花粉の主要アレルゲンCry j 1とCry j 2のうち、主にCry j 1についてアイソフォームの探索を進めた。東北育種基本区、関東育種基本区、関西育種基本区、九州育種基本区のスギ精英樹269クローンを対象に、塩基配列の変異を高感度で検出可能なSSCP(Single-Strand Conformation Polymorphism)分析により、Cry j 1をコードする領域における塩基配列の変異を調べた。高い精度で変異を検出するためには、SSCP分析に使用するプライマーを保存性の高い領域に設計する必要がある。そのため、これまでの研究の結果から、異なるアイソフォームを生産すると推定されている精英樹7クローンについて、ゲノム中のCry j 1をコードする領域をクローニングし、塩基配列を決定した。決定された塩基配列に基づき、Cry j 1のエキソンの全領域をカバーする5種類のプライマーセットを設計し、そのうち4種類を用いてSSCP分析を行い、SSCP分析で多型の検出が困難であった1種類についてはダイレクトシークエンスにより塩基配列を決定した。その結果、異なるバンドパターンを示したクローンについて、SSCP分析で増幅されたフラグメントの塩基配列をダイレクトシークエンスにより決定し、アミノ酸置換の有無を推定した。その結果からアミノ酸配列の異なるアイソフォームを生産すると考えられたクローンについて、Cry j 1のmRNAを単離して塩基配列を明らかにし、アイソフォームの発現を確認するために、雄花を採取した。さらに、アイソフォームの特性を調査するために、これらのクローンの花粉を採取した。また、ゲノム中のCry j 1遺伝子の塩基配列の決定に用いた7クローンを対象として、Cry j 2をコードする領域についてもクローニングを行い、塩基配列を決定した。
アミン反応性同位体タグによる血清タンパク質ストレス損傷の定量

合成されたばかりのタンパク質には20種類以外のアミノ酸はほとんど含まれない。しかし、生体内では生理的や病理的な化学修飾(リン酸化や活性酸素種との反応など)が常に起こるので、化学的な傷がタンパク質に蓄積していく。このタンパク質の傷は生体内のストレスを反映するので、異常を知らせるバイオマーカーになる。そこで、本研究では、タンパク質を消化してアミノ酸にまで分解し、傷のついたアミノ酸の化学構造を同定し定量することを目指した。その結果、重さだけが異なるタグ(ダブシル基)をアミノ酸につけることで基準試料と未知試料を精確に比較分析・定量する基礎技術が確立できた。アミノ酸混合液の定量精度と信頼性は、ダブシルクロリドによるアミノ基ラベル反応の効率と再現性に大きく依存する。反応のpHが高いほどアミノ基の反応性が高くなるが、ダブシルクロリドの加水分解反応も加速され、大過剰に加えたつもりのラベル剤が急減する。本研究では、非水溶媒を含めたラベル反応の最適な条件を見つけることを研究前半の重要課題として取り組んでいる。この問題は、広く利用されている様々なアミノ基ラベル試薬に共通する課題で、サンプル中に含まれるアミノ酸の濃度に100倍以上の差がある場合には特に重要である。今年度は、サンプルをpH9の重炭酸ナトリウム水溶液に溶解する水系条件について、13C2-グリシンを内部標準とし、同一サンプルを13C0-、13C6-、13C12-ダブシルクロリドでラベルして比較定量することにより問題点の抽出を行った。ダブシルラベルアミノ酸を分離・定量する方法として、今年度は、1ミクロ逆相系カラムによるキャピラリー液体クロマトグラフィーによる分離、2ダブシル基の可視部吸収(430 nm)を利用した検出、32に引き続きエレクトロスプレーイオン化(ESI)によるイオン化とイオントラップ型質量分析装置での3つのサンプル由来アミノ酸の分離と比較定量(LC-Vis-ESI-MS)を開発し、トリプルタグによる定量原理を検証した。血清アミノ酸分析用の市販のアミノ酸標準混合液、糖尿病モデルラットとそのコントロールラットの血清を試験サンプルとして、ラベル反応とLC-Vis-ESI-MSによる比較定量を評価した。質量スペクトルの生データから、指定した質量電荷比(m/Z)を持つイオンのクロマトグラムを自動的に生成するPCプログラムも作成した。また、ヒト血清アルブミンとの複合体の結晶構造がPDBに登録されているダンシルアミノ酸について、結合曲線を測定し学会で報告した(論文作成中)。タンパク質は、生合成された後、いろいろな物質によるさまざまな化学修飾を受ける。これらの修飾の多くはリン酸化など生理的なものであるが、病理的な修飾も起こり活性酸素や高血糖による修飾はその一例である。これらのタンパク質の化学修飾状態は時々刻々変動しているが、それを定量的・網羅的に測定することができれば、未知の化学修飾や有用なバイオマーカーを発見できる可能性が高い。本研究では、質量が6ずつ異なる3種類のダブシルクロリド(トリプルタグ)をアミノ基選択的ラベル剤として利用し、タンパク質化学修飾の定量的プロファイリングを実現することを目指している。タンパク質を化学的に加水分解し、側鎖の修飾を受けたものを含めたすべてのアミノ酸を遊離させ、ダブシルクロリドでラベルして同定・定量する。今年度は、定量精度の根幹となるラベル反応そのものの特徴を解明することに重点を置き、以下の成果を得た。1、ダブシルクロリドを少量のトリフルオロ酢酸を添加したアセトン中に懸濁液として調製することで長期間(1か月以上)保存できる。2、グリシンとプロリンがダブシルクロリドと非常に速く反応してほぼ常に完全にラベルされるため、これらの安定同位体(13C2-グリシンなど)が内部標準として非常に有効であること。3、タンパク質を構成する20種類のアミノ酸のうちロイシンとイソロイシン以外のすべてをキャピラリーHPLC-ESI-MS(キャピラリーカラムで分離し、エレクトロスプレーイオン化して汎用のイオントラップ型質量分析装置で測定)で分離・定量でき(ロイシンとイソロイシンはまとめて定量)、溶媒の使用量も少量で済む。4、サンプルのダブルラベルと標準アミノ酸を加えたトリプルラベルを組み合わせることで、被修飾アミノ酸をダブレットピークとして簡単に検出できる。本研究の目的は、タンパク質が翻訳後に受ける生理的や病理的な化学修飾を定量する方法を確立することにより、薬剤開発や治療・診断に役立つ定量的なバイオマーカーの探索を可能にすること、また、タンパク質の翻訳後修飾の基礎的研究に役立つことである。そのための戦略として、本研究では、タンパク質を嫌気下でまず完全に加水分解し、生じたアミノ酸を同定し定量することにした。その理由は、化学修飾を受けたN-末端アミノ酸以外のすべてのアミノ酸残基(化学修飾を受けた残基も含めて)がアミン選択的ラベル試薬と反応するα-アミノ基またはイミノ基を持つ遊離型アミノ酸として回収できるからである。翻訳直後のタンパク質は20種類のアミノ酸で構成されており、翻訳後修飾を受けるとこの基本20アミノ酸とは異なる多数の種類のアミノ酸ができる。この識別と定量を容易にするために、ダブシルクロリドが2個のベンゼン環を持つことに着目し、[13C0]-、[13C6]-、[13C12]-ダブシルクロリドを合成した。コントロールタンパク質の加水分解サンプル、化学修飾ストレスを受けたタンパク質の加水分解サンプル、基準アミノ酸混合サンプルをこの3つの互いに6だけ異なる安定同位体ラベル剤でそれぞれラベルした後一つにまとめ、キャピラリーHPLCで分離して質量分析計に導入する。

各アミノ酸は、基準アミノ酸と同じものはトリプレットピーク、異なるものはダブレットピークとして検出され、ピーク強度の比から精確に比較定量できる。最終年度において、ようやくこの測定のコンセプトを実証することができ、プラナリアのような小さな生物のもつアミノ酸の個体別定量・比較にも応用できるようになった。合成されたばかりのタンパク質には20種類以外のアミノ酸はほとんど含まれない。しかし、生体内では生理的や病理的な化学修飾(リン酸化や活性酸素種との反応など)が常に起こるので、化学的な傷がタンパク質に蓄積していく。このタンパク質の傷は生体内のストレスを反映するので、異常を知らせるバイオマーカーになる。そこで、本研究では、タンパク質を消化してアミノ酸にまで分解し、傷のついたアミノ酸の化学構造を同定し定量することを目指した。その結果、重さだけが異なるタグ(ダブシル基)をアミノ酸につけることで基準試料と未知試料を精確に比較分析・定量する基礎技術が確立できた。ダブシルクロリドに限らず、アミノ基選択的ラベル試薬は水酸化物イオンによる加水分解を受ける。水酸化物イオンは、pH 9.0では約10μmol/Lもあり、しかも緩衝液中のラベル反応ではこの濃度は一定に保たれる。その結果、試薬が加水分解し続けるため、水酸化物イオンに比べて濃度が低いアミンや反応速度が遅いアミンを完全にラベルすることは難しい。本年度は、測定の精度・正確さを左右するこの根本的な課題について、安定同位体トリプルタグであることを生かして定量的に取り組み、解決の方向を見出すことができた。また、大量に生じる試薬の加水分解産物であるメチルオレンジを選択的に除去する微量スケールの簡単な固相法が確立でき、再現性のあるスムーズなキャピラリーHPLC-ESI-MSが実施できるようになった。また、本研究の分析方法を複数種の軟体動物におけるアミノ酸・アミンレベルの比較定量に応用して、その有効性を実証できた。したがって、総合的に見て、本研究は順調に進展している。生化学今年度は、実証実験を中心に進め、実用化に向けて解決すべき課題の抽出と解決を行う。具体的には、三種類の生体サンプルを取り扱う。1、糖尿病モデルラットの個体別血清について、(1)血清アルブミンを精製し、そのアミノ酸の比較定量、(2)血清中の遊離型アミノ酸の比較定量、(3)血清アルブミン以外の血清タンパク質をひとまとめに加水分解して、そのアミノ酸の比較定量と被修飾アミノ酸の同定、以上を行う。2、軟体動物(アフリカマイマイなど)における遊離型アミノ酸の各種条件による変動解析を行う。3、サンゴ礁沿岸部の海水中の遊離型アミノ酸やアミン類の分析を行う。これらの実験と並行して、研究成果を論文や学会で発表する。本年度は、ダブシルクロリドによるラベル反応条件の検討が水系の範囲に限定されており、当初に計画していた非水溶媒での検討ができなかった。
里親家庭への社会的支援のあり方とその課題：里親の実子に着目して

本研究の目的は、1イギリスの具体的な里親家庭への支援内容をまとめ、2国内の実子と里親に対しての調査で委託児童と実子の関係性や生活上の葛藤や問題を明らかにし、3里親家庭(FH家庭含む)への社会的支援の具体的内容を提示・提案する、ことである。平成26年度の実施状況は研究計画書に基づいて、以下のように行った。1.里親家庭の実子への調査の分析・・・調査の分析は平成25年度引き続き行い、平成26年度はインタビューの内容と分析の整合性や倫理的配慮、妥当性の確保、図の改良などに努めた。特に妥当性の確保として、インタビュー協力者に再度面会し、分析によって明らかになった結果や図を説明し了解を得た。その他研究会でで発表等においてもより詳細に行った。2.日本での実子への具体的支援内容の作成・・・具体的支援の内容の作成の前に、国外での実子支援の現状を確認するため、平成25年度にイギリス、平成26年度にスウェーデンにおいて調査を行った。国外でも実子支援はプログラム化されておらず、より具体的な支援策を生み出すために、近接領域である障害児・病児のきょうだい支援、またグリーフケアに関しても文献調査を行った。3.里親家庭の実子への追加調査・・・里親家庭の実子の追加調査として、調査の分析過程での妥当性確保のための面接の際に追加調査を行うとともに、インタビュー後の協力者のケアにもあたった。インタビューによって言語化することで、課題を明確化してしまったことがあったため、相談を希望する方にはその後数回面接を行っている。また、実子以外で、実子のいる里親や里親支援専門相談員に対して講習会等でお話を伺う機会を得ており、今後実子以外の対象者に対して実子に関する調査を行いたいと考えている。以上のことにより、本研究の目的はおおむね達成された。特に目的12に関してはほぼ達成され、目的3に関して今後も精査して行きたいと考える。26年度が最終年度であるため、記入しない。交付申請書には平成24年度の研究計画として以下の4点を挙げた。それぞれの具体的内容と意義・重要性は以下のとおりである。1、里親制度やファミリーホームに関する文献の整理日本において近年里親・ファミリーホームなどの家庭養護を推進する動きがあり、里親やファミリーホームに関する研究が増えつつある。その上で、制度・政策を含め家庭養護の論文の整理を行い、ファミリーホームの初の実態調査にも関わった。法律の改正や社会的養護の中で育つ子どもの家庭状況など社会的養護に関する対応への変化が大きいため、調査を報告書にまとめ、その他の文献等内容を整理したことには意義があると考える。2、イギリスの実子支援の内容について文献・情報を収集、整理里親家庭の実子への支援に関する研究は国内ではほとんど行われていない。その為、イギリスをはじめアメリカなども含め国外の研究や実践の文献・情報を収集した。国外でも実子に関する文献は里親に関する研究の中でも相対的に少ないことが明らかになった。また、実践も広く公開されているものが非常に少ないので、実際に国外の里親支援機関などで働いている方に話をうかがうことなどを行った。3、日本の里親支援や障害児のきょうだいの支援について、フィールドワークにおける情報収集と整理里親家庭の実子における近隣領域であるきょうだい研究を今年度は文献を中心に行った。里親支援に関しては、里親支援機関事業が始まったばかりではあるので直接支援機関の活動に参加し、職員にお話を伺った。きょうだい研究と実子に関する研究は投稿論文にまとめ現在査読中である。4、里親家庭の実子へのインタビュー調査実子へのインタビュー調査の準備段階として本年度は計画していたが、秋に本大学の倫理審査委員会の承認を受け、1月以降にインタビュー調査を開始し、現在5名のインタビューを行っている。平成25年度の計画として以下の2点を研究計画で挙げた。それぞれの具体的内容と意義・重要性が以下の通りである。1、里親家庭の実子への調査平成24年度に引き続き、里親家庭の実子へのインタビュー調査を行った。平成25年6月までに10名の実子にインタビューを行った。複数径路型・等至点モデル(Trajectory Equifinality Model : TEM)とKJ法を使用し、実子の成長発達段階に沿った分析を行っている。これまで実子の研究において実子の成長に沿った分析を行った研究がなく、今後日本で里親委託が進められるにあたり非常に大きな意義があると考えられる。また、きょうだいの枠組みを実子がどう考えているのかという分析も併せて行っている。2、イギリスにおける、実子支援の調査8月の下旬から9月の上旬にかけて11日間イギリスにて調査・訪問を行った。イギリスにおいて実子の研究をしている研究者を訪問し、日英の研究の状況、情報交換、イギリスの実子支援について話をうかがった。さらに、里親の支援機関の視察を行った。グループ内の各部署を訪問し、里親のリクルートから支援の内容までたくさんの収穫を得られた。特にこの視察で得られたことは、里親の実子の研究が世界的にもほとんどないことや支援が困難であること、イギリスでも具体的な実子への支援はまだ始まったばかりで構築されたものではないということである。イギリスの里親の話を聞くことができ、オックスフォード大学に訪問し、実子の研究についての意見交換も行うことができ、大きな成果があった。3、その他国際会議に出席し、発表を行った。日本と国外の里親委託の課題点などを考え知ることができた。

また、ダウン症のきょうだいの本の翻訳に携わった。これらのことから、国際的な視点で研究を捉える視点を持つ機会が増え、研究内容も発展したと考えられる.本研究の目的は、1イギリスの具体的な里親家庭への支援内容をまとめ、2国内の実子と里親に対しての調査で委託児童と実子の関係性や生活上の葛藤や問題を明らかにし、3里親家庭(FH家庭含む)への社会的支援の具体的内容を提示・提案する、ことである。平成26年度の実施状況は研究計画書に基づいて、以下のように行った。1.里親家庭の実子への調査の分析・・・調査の分析は平成25年度引き続き行い、平成26年度はインタビューの内容と分析の整合性や倫理的配慮、妥当性の確保、図の改良などに努めた。特に妥当性の確保として、インタビュー協力者に再度面会し、分析によって明らかになった結果や図を説明し了解を得た。その他研究会でで発表等においてもより詳細に行った。2.日本での実子への具体的支援内容の作成・・・具体的支援の内容の作成の前に、国外での実子支援の現状を確認するため、平成25年度にイギリス、平成26年度にスウェーデンにおいて調査を行った。国外でも実子支援はプログラム化されておらず、より具体的な支援策を生み出すために、近接領域である障害児・病児のきょうだい支援、またグリーフケアに関しても文献調査を行った。3.里親家庭の実子への追加調査・・・里親家庭の実子の追加調査として、調査の分析過程での妥当性確保のための面接の際に追加調査を行うとともに、インタビュー後の協力者のケアにもあたった。インタビューによって言語化することで、課題を明確化してしまったことがあったため、相談を希望する方にはその後数回面接を行っている。また、実子以外で、実子のいる里親や里親支援専門相談員に対して講習会等でお話を伺う機会を得ており、今後実子以外の対象者に対して実子に関する調査を行いたいと考えている。以上のことにより、本研究の目的はおおむね達成された。特に目的12に関してはほぼ達成され、目的3に関して今後も精査して行きたいと考える。26年度が最終年度であるため、記入しない。上記区分の理由として、インタビュー調査を予定では平成25年度からとしたが平成24年度から開始できた。反対にイギリスの支援内容に関する目的については平成25年度に本格的に実施をする予定の為、現在までは準備期間としているためである。上記の理由として、ほぼ計画通りの調査研究を進めているためである。現在のところおおむね順調に計画が進展しているので、平成25年度も引き続き計画を進展することができるようにしていきたい。平成25年度はインタビューやイギリスでの調査などのフィールドワークが中心となるので、インタビュー協力者などとのスケジュール調整がこれまで以上に増えると考えられる。そのため、時間の活用に注意し効率良く研究を推進していきたいと考える。現在、当初の計画通りにほぼ研究を進められているので、今年度も引き続き研究計画を遂行し、計画以上の進展を行うことができるようにさらに詳細な研究計画を立てて行っていきたいと考えている。
癌の骨転移におけるαvβ3インテグリン結合子の血管形成・細胞接着制御機能の解明

癌の骨転移は悪性黒色腫B16マウスメラノーマ細胞を用いて、骨髄に対する接着並びにこれに伴う骨の破壊についての検討を行った。特に長管骨の骨幹端における骨髄内の癌の転移並びに細胞の接着を骨髄内への直接の癌細胞の埋植によって検討した。実験にはオステオポンチンノックアウトマウス並びにその野生型の対照となるマウスを用い、大腿骨の骨髄に対して、0.6mmのKワイヤーを挿入し骨髄を完全に除去した後、この空間に対する癌細胞の播種を行った。動物は癌細胞の播種の後に経時的にレントゲン撮影を行いその結果、悪性黒色腫細胞による骨の破壊が観察された。オステオポンチンノックアウトマウスと野生型のマウスの比較検討によりノックアウトマウスにおける骨の吸収窩の数の低下が明らかとなった。癌細胞の骨髄内埋植後、4週間の時点において動物を屠殺し、マイクロCTによって骨の破壊レベルを検討した結果、骨髄内における海綿骨の破壊と皮質骨の破壊が野生型では時間と共に亢進したのに対しオステオポンチンノックアウトマウスでは骨髄内の海綿骨並びに皮質骨は悪性黒色腫の播種後にもかかわらず構造が保たれていた。組織学的にはこれらの細胞の周辺における破骨細胞の形成とこれによる骨破壊が野生型では著明に観察されたのに対しノックアウトマウスにおいては破骨細胞の数、ならびにそれによって起こる吸収窩の形成は抑制されていた。以上のことから骨髄に対する直接の悪性黒色腫細胞の播種実験によりオステオポンチンの存在が骨の癌転移巣における破骨細胞の誘導に促進的に関与すること、また破骨細胞自身による骨の破壊にも寄与することが明らかとなった。
メチル化異常に起因する先天異常症候群においてヒドロキシメチル化が果たす役割の解明

5-ヒドロキシメチル化シトシン(5hmC)は5-メチル化シトシン(5mC)から合成され、脱メチル化反応における中間代謝産物として近年注目されている。5mCと5hmCを区別することのできる酸化バイサルファイト法を用いて、代表的なインプリンティング異常疾患であるKagami-Ogata症候群(KOS)における5mCおよび5hmCの分布を解析した。血液中には5hmCは含有量が少なく、KOSにおいて5hmCが果たす役割は不明であったが、一方で脳組織には5hmCが多く含まれていることが確認された。インプリンティング異常疾患の多くは神経症状を伴うことから、神経組織の解析が重要であることが示唆された。近年、ゲノムDNA中に発見された5-ヒドロキシメチルシトシン(5-hydroxymethyl C: 5hmC)は、5-メチルシトシン(5-methyl C: 5mC)の酸化産物であり、DNA脱メチル化機構の一翼を担っている。本研究の目的は、ゲノムインプリンティング異常により発症する代表的なヒト先天異常症候群であるSilver-Russell症候群、Beckwith-Wiedemann症候群、Prader-Willi症候群、Angelman症候群、第14番染色体父性および母性片親性ダイソミー(UPD(14)patおよびUPD(14)mat)症候群において、各疾患責任領域(インプリンティング調節領域)における5hmCの分布を明らかにし、インプリンティング異常症において5hmCの果たす役割を解明することである。平成25年度は、患者末梢血由来DNAを改良型バイサルファイト法(oxBS法)を用いて処理することにより、一塩基レベルの解像度でC、5mC、5hmCの区別が可能であることを確認した。現在、oxBS処理済サンプルを用いてインプリンティング調節領域におけるC、5mC、5hmCの分布を解析中である。また、研究責任者はマウスを用いた予備実験で脳に5hmCが多く含まれ、特徴的な分布を示すことを見出している。患者脳組織を直接解析することは困難であるため、患者皮膚細胞から疾患特異的iPS細胞を樹立し、それを神経細胞に分化誘導するin vitro実験系を構築中である。シトシン塩基(C)のメチル化は最も詳細に解析されているゲノムのエピジェネティック修飾である。また近年、ゲノムDNA中に存在が確認されたヒドロキシメチル化シトシン(5hmC)は、メチル化シトシン(5mC)の酸化産物である。5mC→5hmC→Cという脱メチル化カスケードの存在が証明されたことから、5hmCはDNA脱メチル化機構の中間代謝産物であると考えられ、「第6のDNA塩基」として注目されている。本年度は、酸化バイサルファイト法(oxBS)を用いて、5hmCの分布を一塩基レベルの解像度でゲノムワイドに解析する実験系を確立した。Pilot studyとして、IG-DMRの高メチル化のエピ変異により発症したKagami-Ogata症候群(KOS14)患者の末梢血DNAを用い、oxBS処理サンプルをサブクローニングおよびパイロシークエンスにより解析し、IG-DMRにおける5mCおよび5hmCの分布を正常コントロールと比較検討した。引き続いて、同サンプルをメチル化解析用ビーズチップを用いて5mCおよび5hmCの分布をゲノムワイドに解析した。解析の結果、KOS14患者末梢血DNAに特徴的な5hmCの分布パターンは認められず、エピ変異を生じたIG-DMRやその他のインプリンティングセンターにおいても5hmCはほとんど検出されなかった。一方で、コントロールとして解析した正常人脳サンプルには5hmCが多量に含まれていた。来年度は神経系に注目し、KOS14患者由来のiPS細胞から分化した神経細胞を用いて同様の解析を行う予定である。近年、ゲノムDNA中に存在が確認された5-ヒドロキシメチル化シトシン(5-hydroxymethyl C: 5hmC)は、5-メチル化シトシン(5-methyl C: 5mC)の酸化産物であり、DNA脱メチル化反応における中間代謝産物であることから「第6番目の塩基」として注目されている。本研究は、メチル化異常に起因する小児のインプリンティング異常症において、ヒドロキシメチル化が病態にどのように関与しているかを解明することが目的である。本年度は、代表的なインプリンティング異常疾患である鏡ー緒方症候群(KOS)症例を集積し、ゲノムワイドな5hmCの分布の解明を行った。従来からメチル化解析で頻用されているバイサルファイト法では5mCと5hmCを区別することができないことから、これを改変した酸化バイサルファイト法を用い、これとパイロシークエンス、サブクローニングおよびDNAメチル化ビーズアレイを組み合わせ、5mCおよび5hmCの分布を1塩基レベルで解析し報告した(Matsubara et al. Clin Epigenetics 2015、研究代表者山澤が最終・責任著者)。これは世界で初めてのヒトインプリンティング異常症における5hmCに関する報告である。この報告によってKOS症例における5mCおよび5hmCの分布が明らかとなり、また脳サンプルでの解析が重要であることが示され、さらに本解析法の有用性が証明された。

血液中には5hmCは含有量が少なく、KOSにおいて5hmCが果たす役割は不明であったが、一方で脳組織には5hmCが多く含まれていることが確認された。インプリンティング異常疾患の多くは神経症状を伴うことから、神経組織の解析が重要であることが示唆された。当初予定していた免疫沈降法に代わり、oxBS法を用いた解析を用いることにより、一塩基レベルの解像度で5hmCの同定が可能となった。このoxBS法にビーズチップを組み合わせることで、ゲノムワイドに5hmCを検出することが可能となった。しかしながらoxBS法やビーズチップは高価であること、DNA収量が減少することが問題である。来年度はこれまで集積してきたKOS14以外のインプリンティング異常症例についても同様の解析を行う。総じて、研究計画はおおむね順調に推移している。27年度が最終年度であるため、記入しない。小児科学臨床遺伝学5hmC解析の実験系構築に成功し、KOS14の末梢血DNAでは特徴的な5hmCの分布パターンは確認できないことを見出した。来年度はKOS14以外の多数のインプリンティング異常症例末梢血DNAに対して同様の解析を行う。一方で脳には5hmCが多く含まれることが確認され、またインプリンティング異常疾患では発達遅滞が必発であることから、神経系の解析が重要であると思われる。我々はKOS14患者由来のiPS細胞を既に複数ライン樹立しており、これを神経細胞に分化させて、今回構築した実験系による解析を行う。またoxBS法と次世代シークエンサーによる解析を進め、"hydroxymethylome"を明らかにすることを試みる。当初、5mC/5hmC抗体を用いた免疫沈降法による解析を予定していたが、oxBS法を代替法として用いることにより、さらに詳細で精密な解析が可能となった。一方で、oxBS法は試薬が高価であること、DNAのダメージが大きいことなどが問題であり、結果として処理できるサンプル数が当初より減少した。検体数をしぼり、より高解像度の解析を続けて行く方針である。またiPS細胞を用いたin vitro系の開発も同時に試みており、インプリンティング異常症における5hmCの役割の多角的な解明が期待される。本年度は研究補助員を雇用せず、予定していた人件費に余剰が生じたため。また主に実験系の構築や条件検討に注力し、大量に検体を処理するステップには至らず、物品費が想定よりも少額であったため。今後もさらに症例数と解析部位を増やし、oxBS法を用いたインプリンティング調節領域におけるC、5mC、5hmCの分布の解析を行う。また、特徴的な5hmCの分布が得られた症例に関しては、次世代シーケンサーを用いて"methylome"との比較のうえで"hydroxymethylome"を明らかにする。さらに、疾患特異的iPS細胞を用いて神経細胞を分化誘導する実験系を構築し、5hmCの分布を解析する。