hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
歯の移動に伴う歯根吸収重篤化に関わる好塩基球性免疫機構の解明と修復活性化の検討

発育中の歯根尖は根完成歯とは異なる特徴があることから、根未完成歯の矯正歯科治療を行う際には配慮が必要と考えられている。しかしながら、その科学的根拠は十分明らかになっているとは言えない。そこで本年度は、動物実験モデルを用いて発育中の歯根に対する機械的矯正力の影響を明らかにすることを目標として研究を行った。生後21日齢雄性SDラットの第一臼歯(M1)に1,3,5,7日間3-5gfの矯正力を付与した。さらに、3日後と7日後に矯正力を解放し、35日齢で歯根尖組織の形態や細胞増殖能、各種タンパクの局在やmRNAの発現を評価した。矯正力付与後1日と3日では、M1近心根根尖部でラミニンの局在の増加を伴う歯根尖形態の変化が認められた。矯正力付与後7日では、歯根尖部が屈曲して発育し、マイクロフォーカスX線CTでの解析より、対照群に比べ歯根長が有意に減少した。また、免疫組織化学的手法により根尖部組織の細胞増殖能の低下、およびin situハイブリダイゼーション法により、I型コラーゲンα1mRNAおよびオステオカルシンmRNAの発現の変化が認められた。3日後に矯正力を解放した群では35日齢で歯根尖形態に明らかな異常は認められなかった。また、7日後に矯正力を解放した群では、歯根尖部屈曲の改善が認められなかった。本研究では、比較的短期間の矯正力付与では明確な悪影響は認められなかった。他方、比較的長期間矯正力を付与するとヘルトヴィッヒ上皮鞘の形態および歯根尖部の細胞動態への影響により歯根尖形態が変化することが明らかとなった。まず、生理的な乳歯歯根吸収ならびに永久歯萌出機構を明らかにすることを目的とし、生後24か月齢から29か月齢のウシ(和牛)の下顎前歯部並びに歯周組織、下顎骨を入手し、乳歯並びに永久歯歯冠幅径・厚径、乳歯並びに永久歯の歯根長、歯槽骨幅径、左右別アーチレングスディスクレパンシー、動揺度(ミラーの分類、ペリオテストによる計測)、歯小嚢表層の色等の計測・記録・解析、写真撮影、単純X線写真撮影、歯科用コーンビームCT撮影を行った。その結果、変化が大きかった第3前歯切歯では、永久歯の歯根長が長くなるにつれ、乳歯の歯根長が吸収され、有意に短くなっていた。また、負のアーチレングスディスクレパンシーの絶対値が大きいと、乳歯の歯根吸収・動揺・脱落、後継永久歯の歯根形成・萌出が遅延する傾向にあった。また、歯の移動の歯根形成に対する影響を明らかにすることを目的に、生後3-5週齢のラットの生理的歯根形成状態を組織学的並びにマイクロフォーカスX線CTにて撮影し、生後3週齢での歯根形成が活発であることが明らかとなった。以上の結果から、歯根吸収を評価できる歯根形成期並びに完成期ラット並びにマウスの歯の移動モデル構築を開始している。今後、in vivoでの歯の移動による歯根吸収モデルをアレルゲン特異的なIgEを構成的に発現する遺伝子改変マウス等にも適用し、抗マウス好塩基球モノクローナル抗体等を用い、好塩基球除去を行った後にアレルゲンで暴露する実験群と好塩基球除去を行なわずにアレルゲン暴露する対照群における、歯根吸収量の差異の有無をマイクロCTにて経時的に定量評価すること、また、各種標的分子の発現等の3次元分布を光イメージング装置にて経時的に定量評価することにより、歯根吸収の重篤化に関わる、好塩基球はじめとした各種アレルギー関連因子の関与について明らかにしていくことを検討している。研究協力者が体調不良のため、半年間休学するという、研究開始当初では想定できなかった状況による研究活動遅延が生じた。ラット下顎切歯に平行に設置した絶対的固定源の切縁側から50gfのコイルスプリングにて下顎第一臼歯を近心咬合面方向に牽引して、歯科矯正学的な歯の移動に伴う根尖部周囲の歯根吸収モデルを作製した。対照群と比較して、8日・15日間移動群では、下顎第一臼歯遠心根遠心面の根尖部付近には有意に大きな吸収窩が形成された。実験群の同部位歯根膜には、シクロオキシゲナーゼ-1陽性細胞の増加は認められなかったが、TRAP陽性破骨細胞ならびにインターロイキン-1、インターロイキン-6、腫瘍壊死因子(TNF)、シクロオキシゲナーゼ-2、プロスタグランジンE2の各陽性細胞が、対照群に比べ有意に多く認められ、下顎の歯の移動に伴う根尖部周囲の歯根吸収にも、これらの炎症性サイトカイン等が関与していることが明らかとなった。また、乳歯歯根吸収ならびに永久歯萌出が認められる生後24か月齢から29か月齢のウシの下顎前歯部の形態学的計測、X線写真・コーンビームCT観察における詳細な解析を行った。その結果、第4切歯歯小嚢による吸収の前に、歯槽骨との近接に伴う第4乳切歯歯根遠心側の吸収が生じることがあった(27/110)。また、第3切歯歯小嚢により第4乳切歯歯根近心側の吸収が生じることがあり(2/110)、異所萌出永久歯による隣在永久歯の歯根吸収との類似性が示唆された。

さらに、短期間の歯の移動の歯根形成に対する影響を明らかにすることを目的に、生後21日齢と28日齢のラットの上顎第一臼歯と第二臼歯を相反的に3日間移動し、35日齢時の歯根形成状態をマイクロCTにて撮影し、第一臼歯近心根歯根長を計測した。その結果、歯根形成が旺盛な生後21日齢では対照群と比較して歯根長に有意差は認められなかったが、歯根形成がやや鈍る28日齢での歯の移動では歯根長が有意に減少した。今後さらに詳細な検討を行う。アレルギーと歯根吸収に関する検討では有意差のない実験結果に伴う計画の修正が必要になったが、歯根吸収の実験系における炎症性サイトカインの局在に関する論文の掲載が決まり、乳歯の歯根吸収モデルにおける検討についても論文の投稿を終えた。さらに歯の移動の歯根形成に対する影響に関する検討についても、学会発表を行う予定となり、新たな計画に従い研究活動は順調に進展している。ラット下顎切歯に平行に設置した絶対的固定源の切縁側から50gfのコイルスプリングにて下顎第一臼歯を近心咬合面方向に牽引して、歯科矯正学的な歯の移動に伴う根尖部周囲の歯根吸収モデルを作製し、歯の移動群では、遠心根遠心面の根尖部付近には有意に大きな吸収窩が形成された。実験群の同部位歯根膜には、TRAP陽性破骨細胞ならびにインターロイキン-1、インターロイキン-6、腫瘍壊死因子(TNF)、シクロオキシゲナーゼ-2、プロスタグランジンE2の各陽性細胞が、対照群に比べ有意に多く認められ、下顎の歯の移動に伴う根尖部周囲の歯根吸収にも、これらの炎症性サイトカイン等が関与していることが明らかとなった。また、乳歯歯根吸収ならびに永久歯萌出が認められる生後24か月齢から29か月齢のウシの下顎前歯部の形態学的計測、X線写真・コーンビームCT観察における詳細な解析を行った。その結果、第4切歯歯小嚢による吸収の前に、歯槽骨との近接に伴う第4乳切歯歯根遠心側の吸収が生じることがあった(27/110)。また、第3切歯歯小嚢により第4乳切歯歯根近心側の吸収が生じることがあり(2/110)、異所萌出永久歯による隣在永久歯の歯根吸収との類似性が示唆された。さらに、歯の移動の歯根形成に対する影響を明らかにすることを目的に、生後21日齢のラットの上顎第一臼歯と第二臼歯を相反的に1, 3, 5, 7日間移動し、歯根形成状態をマイクロCTにて撮影し、第一臼歯近心根歯根長を計測した。その結果、歯の移動群では、対照群と比較して歯根長が有意に減少し、組織学的にも未石灰化部分の屈曲が明らかとなった。また、細胞増殖マーカーであるEdUの減少、歯根形成タンパクのや遺伝子の減少も示唆されている。アレルギーと歯根吸収に関する検討では有意差のない実験結果に伴う計画の修正が必要になったが、歯根吸収の実験系における炎症性サイトカインの局在に関する論文が掲載され、乳歯の歯根吸収モデルにおける検討についても論文が掲載された。さらに歯の移動の歯根形成に対する影響に関する検討についても、学会発表を行い、その後も新たな計画に従い研究活動は順調に進展している。発育中の歯根尖は根完成歯とは異なる特徴があることから、根未完成歯の矯正歯科治療を行う際には配慮が必要と考えられている。しかしながら、その科学的根拠は十分明らかになっているとは言えない。そこで本年度は、動物実験モデルを用いて発育中の歯根に対する機械的矯正力の影響を明らかにすることを目標として研究を行った。生後21日齢雄性SDラットの第一臼歯(M1)に1,3,5,7日間3-5gfの矯正力を付与した。さらに、3日後と7日後に矯正力を解放し、35日齢で歯根尖組織の形態や細胞増殖能、各種タンパクの局在やmRNAの発現を評価した。矯正力付与後1日と3日では、M1近心根根尖部でラミニンの局在の増加を伴う歯根尖形態の変化が認められた。
食料と栄養の地球規模長期展望のための動的シミュレーション

208の国・地域別に、水産物を除く348品目別の農畜産物・食料品の19612011年のデータを用い、年別・国別に56種類の供給可能な栄養量を推計した。また、個別の食料供給量の、外れ値に頑強な線形トレンドを計測し、20122025年の栄養供給量の中期的なトレンドを予測した。過去のトレンドからは、例えば、アジア地域におけるサツマイモ供給量の減少が、ビタミンA(レチノール活性等量)供給量の減少に大きく寄与している可能性が示唆された。推計された栄養の妥当性を検証するため、19952005年の国別のビタミンAと就学前児童の夜盲症罹患率を比較したところ、アフリカ諸国について低いビタミンA供給量と高い夜盲症罹患率が観察され、推計値の妥当性が一定程度確認された。栄養供給量の推計と予測、検証の結果は、第25回世界食料見通し会合において報告された。また、国際連合食糧農業機関(FAO)が公表している水産物データベースに含まれる水産物データの整理と、これらを栄養価換算するための対応表の作成を行った。入手可能な水産物のデータが栄養成分データと対応していないため、FAOの水産物データ約1,1002,200種類を、HSコードや、綱・目・科等に基づき分類し、栄養成分データとの対応関係を明らかにする作業を行った。この作業により、HSコードに基づく水産物の生産・貿易量データを栄養換算することが可能になった。気候変動の影響評価研究でしばしば用いられる共通社会経済シナリオ(SSP)や、定性的な手法によるシナリオ作成、長期食料需給予測に関する論文や報告書を収集した。また、米国の国際食糧政策研究所(IFPRI)やミズーリ大学、アーカンソー大学等を訪問し、食料需給予測の担当者等と打ち合わせを行うと共に、国内においても、農林水産政策研究所や国立環境研究所の専門家に聞き取りを行い、デルファイ法による予測シナリオ構築の妥当性、SSPの作成や食料需給予測への活用法、食料需給予測を栄養需給予測に拡張する際の問題点などについての情報を収集した。これと並行して、食料・栄養需給予測を行う準備として、世界の国別・品目別の時系列の食料生産・消費・貿易や、年齢階層別人口、GDPなどの経済データなどをエクセルに入力した。また、予測された食料需給を栄養換算するため、品目ごとの栄養成分データを入力した。これらのデータは、主に国際連合食糧農業機関(FAO)のFAOSTATやFISHSTAT、国際通貨基金(IMF)、国際連合、米国農務省のウェブサイトなどから収集した。エクセルに入力したデータを用いて、国別・品目別モデルのパラメータを推定するためのプログラムを作成した。入力したデータにはノイズが含まれるため、この影響を除くことができるロバスト推定によりパラメータを求めることとした。予備的な分析として、アフリカにおける国別のコメ生産の弾力性を推定し、コメ生産量の中期予測を行った。計画時には、デルファイ法によってシナリオを構築する予定だったが、専門家への聞き取りを通して、シナリオ作成手法の新規性等の問題が指摘されたため、まずSSPなどを参考にした、定量的な手法に基づくシナリオ作成を優先することとした。このため、年齢階層別人口や出生・死亡・移動人口のデータを収集した。社会階層についての情報を加味するため、ジニ係数等のデータも収集した。データをエクセルに入力したが、ファイルのサイズが大きく、操作が困難になった。このため、Rからデータにアクセスして、これを加工するためのプログラムを作成することで対応した。アフリカのコメを対象とした予備的な分析の結果、食料需給予測で一般的に用いられる両対数型モデルでは、データの外れ値の影響を受けにくいロバスト回帰を用いても、予測値の指数的爆発が容易に生じ、長期予測が不可能になることが明らかになった。指数的爆発回避のため、一般的に食料需給モデルで用いられる関数形や予測手法を変更することで対応する予定である。

平成27年度に明らかになったデルファイ法によるシナリオ作成の問題に対して、まず、ワークショップ等に基づくシナリオ作成の経験を持つ研究者等と打合せを行う。聞き取りに基づき、パイロット版のシナリオを作成する。また、定性的な手続きに基づき作成されたシナリオの、科学的な価値を高める手法について情報を収集する。年齢階層の食料需給への影響を予測するため、年齢階層別人口予測モデルを開発する。また、予測モデルのパラメータとして利用するため、計量分析によって社会経済的要因の食料需給への影響を計測する。平成27年度に明らかになった予測値の指数的爆発の問題に対処するため、各要因の影響評価には、計量経済分析で一般的な両対数型以外のものも用いる。食料需給データを栄養価に換算する。また、国別データを食料需給モデルに入力できる形に集約し、集約データのパラメータを推定するためのプログラムを作成する。集約データとパラメータ、及びパイロット版のシナリオを基に、栄養需給の予測を行う。平成27年度に予定していた海外出張に、一部行くことができなかったため、次年度使用額が生じた。平成28年度に、海外出張を行い調査を行うことで使用する。
古代日本における外交機構の研究

1.外交史料集成の作成。古代の外交史料をカード化し、そのカードを通交事例ごとにルーズリ-フノートにまとめる作業を行った。活字化されていない史料については、その写本等を実見するために東京方面に出張を行い、史料の集成に努めた。こうして出来上がったノートをもとに、事例ごとに通交の経緯、使者として派遣された者の氏名・官位・経歴、通交の目的及び相手国の対応、賓礼の様子などを整理し、データベース化する前作業に着手したが、このワークシートは今年度は9世紀末までの分しか完成できなかった。今後、10世紀以降についても作業を続け、外交史料集成の完成を期したいと考えている。2.古代日本におれる外交機構の研究。1で作成したあるいは作成中の史料をもとに、律令条文や延喜式などの法制史料と合わせて、まず古代日本における賓礼の手順や各々の儀礼の場のあり方を整理し、外交機構の大系を考えるノートを作成した。これをもとに、今年度は難波の地における外交儀礼とその変遷を考究することを通じて、古代日本の外交のあり方とその変遷の背景を考察した。この成果は「古代難波における外交儀礼とその変遷」と題して『東アジアと前近代の日本』(仮題)(吉川弘文館、1994年12月刊行予定)に掲載の予定である。今後は、太宰府や諸国での外交や10世紀以降の外交のあり方、外交政策の決定過程などについても研究を深めたいと思う。3.外交に関わる遺跡の巡見。北陸道の松原客館、能登客館に関わる遺地を見学することができ、今後越前国や加賀国といった到着地での外交や都とのやり取りのあり方を考える参考材料を得ることができた。
触媒的不斉光延反応の開発に関する研究

本研究はこれまで全く例の無い不斉S_N2反応を開発し,ラセミの2°-アルコールに対しその反応を適用することで立体特異的に一方のエナンチオマーのみを立体反転を伴ってアシル化し,ついで,アルカリ条件で後処理することで,合成化学的に非常に利用価値の高い光学活性2°-アルコールを得ることを目的としている.鍵となるS_N2反応には光延反応を選択し,それに使用される試薬の一つであるホスフィンに不斉情報を導入しその目的を達成する計画である.さらに,本反応により生じるホスフィンオキシドが触媒的に働き得れば,その利用価値はより高いものとなることが期待される.そこで,本研究遂行のための鍵となるホスフィンオキシドの効率的還元法の探索を行った.その結果,トリフェニルホスフィンオキシドをチタンテトラクロリド存在下,トリクロロシランとトルエン中加熱することで,トリフェニルホスフィンへと容易に変換できることが判明した.よって,光延反応によって生じるホスフィンオキシドを同一反応系内において原料であるホスフィンに戻すことが出来る可能性が強く示唆される.本研究はこれまで全く例の無い不斉S_N2反応を開発し,ラセミの2-アルコールに対しその反応を適用することで立体特異的に一方のエナンチオマーのみを立体反転を伴ってアシル化し,ついで,アルカリ条件で後処理することで,合成化学的に非常に利用価値の高い光学活性2-アルコールを得ることを目的としている.鍵となるS_N2反応には光延反応を選択し,それに使用される試薬の一つであるホスフィンに不斉情報を導入しその目的を達成する計画である.さらに,本反応により生じるホスフィンオキシドが触媒的に働き得れば,その利用価値はより高いものとなることが期待される.そこで,本年度においては,本研究遂行のための鍵となるホスフィンオキシドの効率的還元法の探索を行った.その結果,トリフェニルホスフィンオキシドをチタンテトラクロリド存在下,トリクロロシランとトルエン中加熱することで,トリフェニルホスフィンへと容易に変換できることが判明した.よって,光延反応によって生じるホスフィンオキシドを同一反応系内において原料であるホスフィンに戻すことが出来る可能性が強く示唆される.今後,この系が光延反応条件下で触媒的に働き得るか,さらには,種々のキラルなホスフインを用いた場合のそのエナンチオ特異性について詳しく検証していく計画である.本研究はこれまで全く例の無い不斉S_N2反応を開発し,ラセミの2°-アルコールに対しその反応を適用することで立体特異的に一方のエナンチオマーのみを立体反転を伴ってアシル化し,ついで,アルカリ条件で後処理することで,合成化学的に非常に利用価値の高い光学活性2°-アルコールを得ることを目的としている.鍵となるS_N2反応には光延反応を選択し,それに使用される試薬の一つであるホスフィンに不斉情報を導入しその目的を達成する計画である.さらに,本反応により生じるホスフィンオキシドが触媒的に働き得れば,その利用価値はより高いものとなることが期待される.そこで,本研究遂行のための鍵となるホスフィンオキシドの効率的還元法の探索を行った.その結果,トリフェニルホスフィンオキシドをチタンテトラクロリド存在下,トリクロロシランとトルエン中加熱することで,トリフェニルホスフィンへと容易に変換できることが判明した.よって,光延反応によって生じるホスフィンオキシドを同一反応系内において原料であるホスフィンに戻すことが出来る可能性が強く示唆される.
ナノ・レーザ計測と粗視化モデルの相互補完解析法による界面フルイディクスの深化

界面熱流動に関する理論の再構築を目的として,エバネッセント波ラマン散乱イメージング法と,複数の分子の集合体を一つの粒子として扱う粗視化モデルによる相互補完解析法の開発を行う.今年度の研究成果を下記に述べる.1.エバネッセント波照射によって深さ方向百ナノ以下の領域からの計測結果は,バルクとは異なっていることが明らかとなり,エバネッセント波を用いることにより界面極近傍に存在する分子やイオンの挙動を的確に把握することが可能であることが判った.換言すると,エバネッセント波を用いた計測結果は,界面からの影響を充分把握可能であると云える.全反射ラマン散乱イメージング法を用いて,親水性および疎水性表面における水分子および重水分子の濃度空間分布の計測を行い,更に全反射ラマン分光法を用いて,水分子の振動モードが表面性状および重水分子によってバルクよりも顕著に変化することが明らかとなった.2.石英ガラスおよび塩化カリウム溶液を選定し,石英ガラスの壁面ゼータ電位を変化させ,電解質溶液における水分子の振動モードの変化を明らかにした.壁面ゼータ電位は,特に変角振動および対称伸縮振動に影響を及ぼすことが明らかとなり,水分子の振動モードのみの計測によって,今後は壁面ゼータ電位の非侵襲計測が可能であることが判った.上述の実験結果より,熱流動を伴う界面極近傍では,固体表面性状からの影響とともに,金属イオン等による水分子の構造破壊等の影響を受けているが,それらの影響は複雑ではなく,水分子のみに着目すると,振動モードおよび水素・非水素結合を的確に把握することができれば,界面極近傍の熱流動現象の定量的把握は可能であることが判った.3.全原子および粗視化モデルによるミュレーションを用いて,温度勾配および水分子動態の関係を明らかにし,更に,固体界面極近傍における水分子の正四面体構造の形成メカニズムを明らかにした.平成29年度が最終年度であるため、記入しない。平成29年度が最終年度であるため、記入しない。界面熱流動に関する理論の再構築を目的として,エバネッセント波自発ラマン散乱イメージング法と,複数の分子の集合体を一つの粒子として扱う粗視化モデルによる相互補完解析法の開発を4ヶ年に渡り行う.今年度の研究成果を下記に述べる.1二波長エバネッセント波自発ラマン散乱イメージング法の開発による固体・液体界面極近傍における分子濃度分布計測:マイクロチャネル内に水・重水から成る混合場を形成し,励起光としてエバネッセント波を用いることにより,固体・液体界面極近傍の水・重水濃度分布計測を行った.水と重水では,ピーク波長を有するラマンシフトが著しく異なるため,EM-CCDカメラにそれぞれのラマンシフトに合致したフィルタを装着することにより,ラマン散乱光強度と,水と重水の混合比との相関関係である校正曲線の取得を行い,水と重水の濃度分布の非侵襲イメージングに成功した.3水分子および重水分子に関する分子動力学シミュレーション:実験結果を理論的に解析するため,分子内振動を考慮した第一原理分子動力学シミュレーションを用いて,水分子および重水分子から成る混合溶液の計算を行った.水と重水の比率を1:0, 0.75:0.25, 0.5:0.5, 0.25:0.75, 0:1.0としてシミュレーションを行い,振動スペクトル,動径分布関数,平均自乗変位(水分子の拡散を解析)を算出した.系の分子数は64分子とし周期境界をかけ,温度は能勢フーバー法を用い300 Kに制御した.各系について15 psの計算を行い,振動スペクトルは各原子の速度の相関関数をフーリエ変換する方法と,系のダイポールモーメントをフーリエ変換する方法とにより計算した.その結果水と重水それぞれの混合系において,各原子や系が持つ振動数を比較することができた.界面熱流動に関する理論の再構築を目的として,エバネッセント波自発ラマン散乱イメージング法と,複数の分子の集合体を一つの粒子として扱う粗視化モデルによる相互補完解析法の開発を4ヶ年に渡り行う.今年度の研究成果を下記に述べる.1前年度に開発した二波長エバネッセント波自発ラマン散乱イメージング法を用いて,マイクロチャネル内の水・重水から成る混合場,ならびに電解質溶液・重水から成る混合場に適用し,濃度分布の非侵襲イメージングを行った.電解質溶液を混入した際,親水性の石英ガラスに陽イオンが吸着することにより,電気二重層が形成されるため,レイノルズ数の違いによる濃度分布の変化が見られなかったことから,固体・液体界面極近傍における水分子挙動とイオン挙動には,明確な差異があることが実験的に明らかとなった.2振動スペクトルを粗視化モデルへ反映するのを考慮して,温度変化による分子挙動への影響をラマンスペクトルを用いて定量的に把握するため,電解質溶液を用いて,温度および濃度変化に伴うラマン散乱光強度変化を捉え,温度・ラマン散乱光強度および濃度・ラマン散乱光強度に関する相関関係を実験的に明らかにし,両者とも線形関係を有していることが判った.3振動スペクトルを考慮した粗視化モデルを構築するために,分子内振動を含む分子動力学計算を行った.糖分子を例として取り上げ,いくつかの糖分子についてその周りの水分子の振動スペクトルを第一原理分子動力学シミュレーションを用いて解析した.さらに,アンモニア/水の系についても同様の計算を行い,振動エネルギーについての解析を第一原理分子動力学シミュレーションにより解析した.また,古典分子動力学シミュレーションを用いて,振動を考慮したモデルにより,振動エネルギーが回転運動,並進運動の運動エネルギーに移動することが解析できる方法を検討した.

エバネッセント波照射によるナノスケール熱流動計測および粗視化モデルによる分子動力学シミュレーションによる熱流動相互補完解析法の確立を目標として,二波長エバネッセント波自発ラマン散乱イメージング法による界面極近傍の分子およびイオンの濃度分布計測,ならびに粗視化モデル構築に向けた分子動力学シミュレーションを行い,今年度の進捗状況は概ね良好である.1二波長エバネッセント波自発ラマン散乱イメージング法を用いて,固体・液体界面極近傍に存在する分子およびイオンの挙動を,濃度分布を介して把握することが可能となった.特に,電気二重層がイオン挙動に及ぼす影響が,非侵襲イメージングにより,初めて定量的に把握することが可能となった.2電解質溶液を選定して,温度・ラマン散乱光強度および濃度・ラマン散乱光強度に関する相関関係を定量的に把握することが可能となり,分子やイオンの振動スペクトルを粗視化モデルに反映する試みが可能となった.3Evanescent Wave fora Chip(EvaChip)をエバネッセント波自発ラマンイメージング法に展開する際の,様々な問題点を抽出し,散乱光低減が可能となった.更に高出力のレーザ光システムを用いることにより,エバネッセント波自発ラマンイメージングによる非侵襲濃度分布計測が可能となる.4粗視化モデル構築に向けて,水分子,重水分子,そして石英ガラスからなる場の分子動力学シミュレーションを行い,固体表面の分子拡散係数への影響を物理的に把握するとが可能となった.界面熱流動に関する理論の再構築を目的として,エバネッセント波自発ラマン散乱イメージング法と,複数の分子の集合体を一つの粒子として扱う粗視化モデルによる相互補完解析法の開発を4ヶ年に渡り行う.今年度の研究成果を下記に述べる.1.前年度の結果より,石英ガラス表面に化学修飾を施し疎水性に変化させると,炭素のラマンスペクトルがラマンシフト全域に渡って影響を及ぼすことが明らかとなり,疎水性表面極近傍に存在する水分子および重水分子の拡散係数を実験的に評価することが困難であった.本年度は,石英ガラス表面にフッ素コーティングにより疎水性を実現させ,水分子および重水分子の混合溶液からのラマンスペクトルの取得を試みた.親水性表面の実験結果とは異なり,低ラマンシフト領域のラマン散乱光が大きくなったが,理論的に解釈することが困難であった.2.そこで,固体表面に拘束されていないチャネル中央付近の水分子およびイオンから自発ラマン散乱光を,購入したイメージスプリッティング光学系,および様々なラマンシフトに対応したバンドパスフィルタを用いて,計測を行った.ラマンシフト毎,即ち,波長毎に,自発ラマン散乱形態が異なっていることが判った.
キラルヘリカルテンプレートを用いた単一方向性らせん集積構造の構築

不斉ならせん構造の形成のメカニズムは、らせん構造を有する生体高分子の構造-機能相関を理解する上で、また、化学進化における不斉の発生を考える上で興味深い。本研究課題では、柔軟ならせん分子の不斉を光学活性らせんテンプレートで制御し、らせん部位間に働く相互作用を介したヘリシティ-ヘリシティー認識による単一方向性らせん集積構造の構築について検討した。らせん分子として非環状テトラピロールの亜鉛錯体である亜鉛ビリノンの二量体を、キラルヘリカルテンプレートとしてヘリセンおよびビナフチル誘導体をそれぞれ用い、円偏光二色性(CD)およびプロトン核磁気共鳴(^1H NMR)スペクトルを用いてそれらの配座平衡の解析を行った。ヘリセンをテンプレートとする亜鉛ビリノン二量体は、ヘリセン部位の不斉に起因する光学異性体間の分割が困難であり、単一方向性らせん集積体を得るには至らなかった。一方、ビナフチル骨格をテンプレートとする亜鉛ビリノン二量体として、(S)-ビナフチル基の6,6'-位からフェニルメチル基を介して亜鉛ビリノンが結合した一連の量体を合成し、単一方向性らせん集積構造の形成について評価した。CDスペクトル測定から、右巻き-右巻きのホモヘリシティー構造が安定であることがわかったが、ビナフチル基と、フェニルメチル基を介して結合する亜鉛ビリノンとの相対的な幾何が異なることによって、ホモヘリシティー構造の安定性が異なることが示唆された。^1H NMRスペクトルおよび分子モデリングの結果から、亜鉛ビリノン同士が近傍に位置する二量体では、ヘリシティー-ヘリシティー認識が有効に働き、ホモヘリカルコンフォマーが安定化したと考えられる。さらに、光学活性アミン類との錯形成によってホモヘリシティー構造の安定性は助長され、外部不斉因子によっても単一方向性らせん集積構造の形成の制御が可能であることがわかった。不斉ならせん構造の形成に関するメカニズムの解明は、DNA2重らせん構造やペプチドα-ヘリックスなどの生体高分子の構造-機能相関を理解する上で、また、化学進化における不斉の発生を考える上で重要である。本研究課題では、柔軟な構造を有するらせん分子の不斉を光学活性ならせんテンプレートを用いて制御し、らせん部位間に働く非共有結合的な分子内相互作用を利用した単一方向性らせん集積構造の構築について検討を行っている。平成13年度は、らせん分子として非環状テトラピロールの亜鉛錯体である亜鉛ビリノンの二量体を、キラルヘリカルテンプレートとしてヘリセンおよびビナフチル誘導体を用いて合成し、円偏光二色性(CD)およびプロトン核磁気共鳴(^1H NMR)スペクトルを用いてそれらの配座平衡の解析を行った。ヘリセンをテンプレートする亜鉛ビリノン二量体の合成は、光学活性ヘリセン誘導体の合成が困難であることから、現在なお検討中であるが、ビナフチル骨格をテンプレートとする亜鉛ビリノン二量体は合成することに成功した。CDスペクトル測定から、(S)-ビナフチル基の6,6'-位からフェニルメチル基を介して亜鉛ビリノンが結合した一連の二量体では、右巻き-右巻きのホモヘリカル構造が安定であることがわかったが、亜鉛ビリノンが結合する位置によってその安定性が異なることが示唆された。^1H NMRスペクトルでは、亜鉛ビリノン骨格とビナフチル部分が近傍に位置する二量体では、それぞれのコンフォマーが独立して観測されたのに対し、亜鉛ビリノン骨格とビナフチル部分が離れている二量体では1化学種のみ観測され、それらのコンフォマーが同様なスペクトルを与えた。以上の結果から、亜鉛ビリノン部位とキラルテンプレート間の距離や配向が光学活性なホモヘリカル構造の安定化に重要であることが示唆された。
流動性あるリン脂質自己組織化膜を用いた超高感度検出技術開発の基礎研究

本研究は、リン脂質自己組織化膜の流動性を利用した膜表面での分子間相互作用、特に糸状部位と環状部位との相互作用によるロタキサン構造の形成による新規な超高感度検出技術開発を目的とするものである。その結果、本リン脂質自己組織化膜上に蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を起こす組み合わせとしてよく知られているCy3とCy5で標識した2種類のシクロデキストリン誘導体を固定化することで、ポリエチレングリコール添加によりロタキサン構造が形成される結果、蛍光強度変化を利用した新しい検出技術の開発が期待できることが明らかとなった。本研究は、既存の生体分子固定化技術とは異なり、流動性あるリン脂質自己組織化表面に環状分子を固定化することによりその位置の移動が可能なため、糸状分子とのロタキサン構造形成が可能となり、ロタキサン構造の形成による微量成分の高感度検出を目指す研究である。本年度は、リン脂質膜の流動性の制御と、膜表面に固定化が可能なシクロデキストリン誘導体合成について検討を行った。リン脂質自己組織化膜の流動性をその熱安定性(リン脂質膜を加熱した時の脱離挙動)より評価したところ、高分子基材表面に導入した短鎖アルキルグラフト鎖の導入率により流動性の制御が可能であることを明らかにした。また、導入するアルキルグラフト鎖の鎖長も流動性に影響を与えるが、炭素数が6以上のアルキル鎖では顕著な流動性への影響は認められなかった。自己組織化膜の厚さは、原子間力顕微鏡および光学干渉膜厚測定の結果より810nmであり、単分子膜ではなく3層のリン脂質層が形成されていることが示唆された。環状分子としてシクロデキストリンを選び、シクロデキストリンへの2つのカルボキシル基あるいはアミノ基の導入について検討を行った。種々の条件にて検討を行ったところ、複数のカルボキシル基あるいはアミノ基の導入が可能であることを機器スペクトル測定により確認しているが単離には至っておらず、今後精製・分離条件の検討を行っていく。また、他の環状分子として環状フェナントロリン誘導体についても検討を進めている。本年度は、リン脂質膜の流動性の評価、膜表面に固定化が可能なシクロデキストリン誘導体合成とその蛍光標識、およびフェナントロリン化合物の合成について検討を行った。リン脂質自己組織化膜の流動性評価として、脂肪酸を導入したリン脂質自己組織化膜を構築した後アルブミンを固定化し、そのアルブミンをフルオロセインでラベル化して、蛍光顕微鏡により移動速度の評価を実施した。蛍光強度の強さを指標として経時的な強度変化より移動速度を評価したところ、導入する脂肪酸量の増加に伴い移動速度が速くなる傾向が示され、細胞膜の流動性と類似した特徴を有することが示唆された。また、シクロデキストリンに複数のアミノ基を導入した化合物の合成に成功しており、そのうちの1つのアミノ基に蛍光物質であるCy3あるいはCy5を固定化した化合物の合成を実施し、目的物が得られることを確認し、化合物の大量合成を行っている。さらに、溶液中での2種類の蛍光標識したシクロデキストリン誘導体を用いたロタキサン構造形成によるFRET現象の確認を進めている。フェナントロリン化合物についても、アミノ基を導入した化合物の合成を進めている。本研究は、既存の生体分子固定化技術とは異なり、流動性あるリン脂質自己組織化表面に環状分子を固定化することにより、膜の流動性を活かし膜表面上での超分子の形成による超高感度検出技術の確立を目指すものである。具体的には、シクロデキストリンなどの環状分子を膜表面に固定化し、ポリエチレングリコール(PEG)などの糸状分子とのロタキサン構造を形成させ、環状分子に導入した蛍光分子間での蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)による微量成分の高感度検出を目指す。本年度は、蛍光色素であるCy3あるいはCy5とシクロデキストリン誘導体であるper-4-amino-β-cyclodextrinを結合させた蛍光標識シクロデキソトリン誘導体(Per-6-ABCD-Cy3およびPer-6-ABCD-Cy5)を合成した。Per-6-ABCD-Cy3およびPer-6-ABCD-Cy5を等モル流動性あるリン脂質自己組織化膜上に固定化したところ、Cy3の励起波長を当てた後Cy5の蛍光が認められたことより、予想に反してこの時点でFRETが起きていることが示唆され、シクロデキストリンとCy3あるいはCy5間での包接錯体の形成が考えられた。そこで、この系にPEGを添加すれば包接錯体が崩壊し、蛍光強度に変化が生じると考え、PEG添加による蛍光強度の経時変化について検討した。その結果、PEG添加により濃度依存的に蛍光強度が低下することが明らかとなった。

さらに、低濃度域においては、蛍光強度が極小値に達した後、増加し定常化する傾向が示され、包接錯体が崩壊した後、ロタキサン構造形成あるいは包接錯体の再形成によるFRET現象が示唆された。以上、本研究により流動性あるリン脂質自己組織化膜を利用した、新規検出法を確立することができた。本研究は、既存の生体分子固定化技術とは異なり、流動性あるリン脂質自己組織化膜表面に環状分子を固定化することにより、膜の流動性を活かし膜表面上での超分子の形成による超高感度検出技術の確立を目指すものである。具体的には、シクロデキストリンなどの環状分子を膜表面に固定化し、ポリエチレングリコールなどの糸状分子とのロタキサン構造を形成させ、環状分子に導入した蛍光分子間での蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)による微量成分の高感度検出を目指す。本年度は、リン脂質自己組織化膜の調製条件による膜厚の変化および加熱処理による膜厚の変化について検討を行った。その結果、熱的に最も安定であったのは約10nmの厚さであり、リン脂質膜が3層重なった構造であることが明らかとなった。さらに、これよりも多層の場合は、加熱により2層ずつ脱離することも明らかとなった。また、シクロデキストリン誘導体としては、per-6-amino-β-cyclodextrinを合成した。本化合物は、各種溶媒に不溶であったため、3塩酸塩として、水溶性とした後、リン脂質自己組織化膜への固定化を行い、リン脂質に導入したステアリン酸との縮合反応が効率的に進行することを確認した。さらに、本化合物への低分子蛍光分子の導入として、dansyl chlorideとの反応を行い、目的物の生成を確認した。また、sodium 6-hydroxy-2-naphthalenesulfonateをper-6-amino-β-cyclodextrinに導入するため、sodium 6-(carboxy)methoxy-2-naphthalenesulfonateの合成も行い、シクロデキストリン誘導体との反応を進めている。一方、フェナントロリン化合物については、水への溶解性が低いため、水溶性の官能基導入の検討を行っている。1)リン脂質自己組織化膜の流動性の評価により、流動性制御の因子として脂肪酸の導入量があることを見出しており、脂肪酸の種類による制御の可能性も期待される。2)蛍光標識したシクロデキストリン誘導体の合成を終えており、溶液中でのロタキサン構造形成によるFRETの確認もめどが立っている。25年度が最終年度であるため、記入しない。1)リン脂質自己組織化膜の流動性や熱的に安定な層数など物性部分については、十分な知見が得られている。2)低分子蛍光物質で標識したシクロデキストリン誘導体の合成も大方終えており、自己組織化膜表面へのシクロデキストリン誘導体固定化も可能であることを明らかにしている。1)流動速度と脂肪酸量あるいは脂肪酸の種類との定量的な相関関係の確立を目指す。2)蛍光標識したシクロデキストリン誘導体のリン脂質自己組織化膜上への固定化と、固定化によるリン脂質自己組織化膜の安定性への影響について明らかにする。3)フェナントロリン誘導体に関しても蛍光標識体合成法の確立とFRET現象の確認を目指す。
生物発光共鳴エネルギー移動機構を利用した低分子化合物の光イメージング法の開発

本研究では、生物発光共鳴エネルギー移動機構とファージディスプレイ技術を利用した低分子代謝産物の光プローブの創製ならびにその測定法の開発を行った。まず、低分子化合物S-アデノシル-L-ホモシステインに結合する二つのペプチドの探索を行った。次に、2つのペプチドをつなぐリンカー配列が選定され、ルシフェラーゼと蛍光タンパク質の間に挿入したDNAコンストラクトを調製した。さらに、融合タンパク質の生物発光共鳴エネルギー移動を利用したSAHの観察を試みた。本研究は、低分子化合物を可視化する新規の発光プローブの創製ならびに光イメージング法の確立を目指すものである。具体的には、低分子化合物を挟む二種類のペプチドやアプタマーをスクリーニングし、ルシフェラーゼや蛍光タンパク質に融合させることによって、低分子化合物の生物発光エネルギー移動機構に基づく生物発光プローブの創製を計画した。本年度では、分子量384ダルトンであるS-アデノシル-L-ホモシステイン(SAH)を標的とする発光イメージングプローブの開発を行った。まず,化合物SAHのホモシステイン部分の一級アミノ基を介してマグネットビーズに固相化し、ファージディスプレイ技術を用いてアデノシン骨格に結合するペプチドのスクリーニングを行った。得られたファージクローンのDNA配列の情報を特定することができた。次に、ホモシステイン化合物のチオール基を介して同様に固相化し、ホモシステインに結合するペプチドのスクリーニングを行った。しかし、ファージクローンから特異的に結合する配列を特定することができなかった。そこで、アデノシンの実験で得られたペプチド配列をもとに、合成したペプチドとSAHとの複合体を調製し、その複合体に対してファージスクリーニングを行った。その結果ファージクローンの配列においてある程度の傾向が見られた。現在、得られたペプチド候補の親和性の確認を進めている。一方、化合物SAHは不安定なため、SAHのモノクローナル抗体を利用して、SAHをミミックするペプチドの探索を行った。その結果、得られたペプチドの配列はELISAアッセイにおいてSAHを代替することができた。本研究は、生物発光エネルギー移動機構に基づく低分子化合物の発光プローブの創製を目指す。昨年度では、低分子化合物であるS-アデノシル-L-ホモシステイン(SAH)の2級アミノ基を介して固相化し、ファージディスプレイ技術を用いてSAHに結合する複数のファージクローンを得た。本年度は、得られた複数のクローンからアデノシン骨格に結合するペプチドを決定するために、同じアデノシン骨格を有するアデノシン三リン酸(ATP)のリン酸基を介してマグネットビーズに固相化し、同様にファージディスプレイの手法でファージクローンのスクリーニングを行った。その結果、アミノ酸配列CRGATPMSCを持つペプチドが得られた。このペプチドは昨年度のSAHに対するスクリーニングの際にも得られていたので、このペプチドはアデノシン骨格に結合することが強く示唆された。一方、ATPのリン酸部分に結合するペプチドを得るため化合物8-Azidoadenosine-5'triphosphate(ATP誘導体)をクリック反応でアデノシンの部分を介してビオチン官能基を導入し、ストレプットアビジンカラムにて固相化した。それから、ファージディスプレイの手法で結合するファージクローンのスクリーニングを行った。その結果、塩基性ペプチドSDVHRNAIKSTMが得られた。単離された上記2種類ファージクローンは抗M13抗体HRPによって固相したATPに対して陽性であることを確認した。現在、この2種類ペプチドをルシフェラーゼや蛍光タンパク質との融合タンパク質を用いて、ATPに対する親和性の確認作業を行っている。本研究は低分子化合物であるS-アデノシル-L-ホモシステイン(SAH)を可視化する新規光プローブの創製ならびに低分子化合物の発光イメージング法の確立を目指すものである。これまで、SAHのホモシステイン部位の2級アミン基を介して固相化し、アデノシン環に結合するファージクローンを同定し、そのファージのDNA配列の情報を基に調製したビオチン化したペプチドとSAHとの複合体に対してファージスクーニングを行い、複合体に結合するファージクローンを得ることに成功していた。今年度は、SAHに結合する一分子発光プローブを完成させるため、まず得られた2つのペプチドのDNA配列の間にさらに21merのランダムオリゴヌクレオチドを挿入し、T7ファージDNAベクターに組み込んで大腸菌に感染させることによって得られたファージライブラリーを新たに作製した。次に、作製したライブラリーを用いて再度S-アデノシル-L-ホモシステインに対するバイオパンニング実験を行い、得られた複数のファージクローンのDNA配列を解析した。それから、得られたファージクローンのDNA配列情報を基に、ルシフェラーゼと蛍光タンパク質のDNA配列の間に同定したファージクローンのDNA配列を挿入したプラスミドを調製し、市販の無細胞翻訳系キットを用いて融合タンパク質を調製した。さらに、その融合タンパク質溶液中に化合物SAHを加えて一分子生物発光共鳴エネルギー移動現象の観測を行った。本研究は、低分子化合物を可視化する新規の生物発光プローブの創製を目指すものである。

具体的には、低分子化合物を挟むニ種類のペプチドをスクリーニングし、得られたペプチドをルシフェラーゼや蛍光タンパク質に融合させることによって、生物発光エネルギー移動機構に基づく低分子化合物を検出する発光プローブの創製を計画していた。本年度では、低分子化合物であるアデノシン三リン酸(ATP)の両側のリン酸基やアデノシル基を介してそれぞれ固相化し、ファージディスプレイ技術を用いてATPに結合する2つのペプチド配列を得ることに成功した。次に、これらのペプチド配列をオーバーラップエクステンションPCR法でルシフェラーゼや蛍光タンパク質の上流に融合させて、無細胞翻訳発現系を用いた融合タンパク質の転写と翻訳を行った。現在、得られた融合タンパク質はATPのビーズに対する親和性の確認の実験を行っている。一方、ペプチドをルシフェラーゼや蛍光タンパク質への融合する場所が作成される融合タンパク質としてのルシフェラーゼや蛍光タンパク質の発光・蛍光活性に対して影響を及ぼすので、2種類の融合タンパク質の配列の挿入位置についてさらなる検討が必要です。その作業は予想以上に時間が掛かった。そのため、当初の計画にあった生物発光エネルギー移動機構に基づく低分子化合物であるATPの検出までにはまだ至っていない。次年度以降に検討を行う予定ことになった。ケミカルバイオロジー今年度はファージディスプレイ技術を用いてATPに結合する2つのペプチド配列が得られたので、次年度以降の予定としては、まずルシフェラーゼや蛍光タンパク質との融合タンパク質の作製の最適化と融合タンパク質のATPに対する親和性の確認作業を加速させる。次に、2つの融合タンパク質がATPの存在下で分子間の生物発光共鳴エネルギーの移動の有無を測定する。それから、融合発光タンパク質や蛍光タンパク質のそれぞれの濃度を変化させて、ATPの濃度に依存する生物発光共鳴エネルギー移動のシグナルの変化について発光ルミノメーターを用いて調べる。さらに、生物発光共鳴エネルギー移動を観測する発光測定装置のバンドパスやロングパスフィルターの選定についても検討する。一方、より優れる一分子内の生物発光共鳴エネルギーに基づく発光プローブの創製についても検討する。具体的には、すでに得られた2つのペプチドのDNA配列断片の間に50mer以下のランダム合成オリゴヌクレオチドを繋ぎ、T7ファージDNAベクターに組み込んで大腸菌に感染させることによって得られるファージライブラリーを用いて、すでに固相化したATPに対して再度スクリーニングを行い、より親和性の高い一分子タイプのペプチド配列の探索を行う。それから、同定されたペプチドの配列の両端にルシフェラーゼや蛍光タンパク質を繋ぐことによって、分子内の発光ローブの生物発光エネルギー移動機構の構築を試みると同時にその挙動を観測する。
胃酸分泌細胞の未知なる塩酸防御バリアの分子生理基盤解明

胃酸分泌細胞の頂端膜は、過酷なpH条件下(pH 0.8)にさらされているにも関わらず、通常は傷害を受けないが、そのメカニズムについては不明である。これまでに我々は、胃酸分泌細胞基底側膜に存在する分子実体未知のCl-チャネルが細胞防御機構に関与することを見出している。本研究で、1)胃酸分泌細胞の細管小胞に多様性があり、発現するイオン輸送タンパク質のパターンが異なること、2)基底側膜に発現するSLC26A7のCl-チャネル機能が、細胞防御機構に必須であること、3)胃プロトンポンプβサブユニットの糖鎖末端のシアル酸がポンプの活性調節および細胞防御機構に重要であることを明らかにした。胃酸分泌細胞固有の自己防御機構の解明を目的とした研究を行い、主として以下の成果を得た。1.ブタ胃細管小胞の多様性とその機能について解析するため、まずクラスリンに着目した小胞の分別化を行った。抗クラスリン抗体とDynabeads M-280を用いた胃細管小胞の沈降実験を行い、ビーズ結合(沈降)およびビーズ非結合サンプルの胃プロトンポンプ量を比較した。胃プロトンポンプは、ビーズ非結合サンプルに主として検出されたことから、胃酸分泌に関わる小胞と塩酸防御に関わる小胞が独立して存在する可能性が示唆された。また、Cl-輸送タンパク質のClC-5とSLC26A9は異なる膜分画に検出されたことから、それぞれの発現する小胞は異なることが示唆された。ClC-5は胃プロトンポンプと機能共役してCl-輸送を行っていることを見出した。2.ヒトSLC26A7をサブクローニングし、HEK293T細胞に発現させたところ、免疫細胞染色により、原形質膜における発現が確認された。ホールセルパッチクランプ法において、SLC26A7の発現に起因するNPPB感受性のCl-電流が観察された。重炭酸イオン存在下でBCECFを用いた細胞内pH測定を行ったところ、SLC26A7発現細胞において細胞外Cl-濃度減少に伴う有意な細胞内アルカリ化が観察された。以上のことは、SLC26A7による細胞防御機能評価系の確立を意味する。3. SLC26A7ノックアウト(SLC26A7-KO)とワイルドタイプ(WT)マウスの胃にジブチリルcGMP(cGMPはプロスタグランジンE2刺激による細胞防御Cl-チャネル活性化のためのメッセンジャー)を前投与した後、エタノールを経口投与し、胃粘膜を摘出し組織標本を作製した。ジブチリルcGMPは、WTのエタノール傷害を有意に軽減したが、SLC26A7-KOのエタノール傷害を回復しなかった。他方、生理食塩水投与による粘膜傷害は観察されなかった。胃酸分泌細胞のイオン輸送タンパク質、糖鎖に着目し、胃粘膜および胃酸分泌細胞の細胞防御機構の解明を目的とした研究を行い、本年度は主として以下の成果を得た。1. SLC26A7発現細胞のCl-チャネル電流は、diphenylamine-2-carboxylate (DPC)により有意に抑制された一方で、mock細胞の電流はDPCにより影響を受けなかった。次に、これらの細胞にBCECFをロードし、細胞外Cl-濃度変化による細胞内pH変化を、重炭酸バッファ中で測定したところ、両者のpH変化に有意な差は観察されなかった。pH変化はDIDSに感受性であり、内因的なCl-/HCO3-交換輸送体が関与していることが示唆された。これらの結果からSLC26A7はCl-チャネルとして機能し、Cl-/HCO3-交換輸送体としての機能は有していないものと考えられた。2. SLC26A7ノックアウト(SLC26A7-KO)とワイルドタイプ(WT)マウスの胃にDPCを前投与した後、エタノールを経口投与した。WTのエタノールによる胃粘膜傷害の程度は、DPC前投与により有意に増悪した。免疫染色した組織標本の顕微観察により、DPC前投与で傷害を受ける胃酸分泌細胞数が有意に増大していることがわかった。一方、SLC26A7-KOのエタノールによる胃粘膜傷害および傷害を受ける胃酸分泌細胞数は、DPC前投与によって変化がなかった。したがって胃酸分泌細胞のSLC26A7チャネルがDPCにより抑制されると、エタノールによる傷害が増大することが示唆された。3.胃プロトンポンプβ鎖(HKβ)の糖鎖末端のシアル酸を切断すると、胃酸分泌機能が有意に低下することを発現細胞系において見出した。またラット胃において酸分泌刺激時にはHKβのシアル酸が切断され、休止時にはHKβにシアル酸が付加していることを見出した。胃酸分泌細胞のイオン輸送タンパク質の局在と機能に着目し、細胞防御バリアの分子生理機構の解明等を目的とした研究を行い、以下の成果を得た。1. SLC26A7チャネル発現細胞において、胃酸分泌細胞防御機構のメッセンジャーであるcGMPが、SLC26A7電流を増大させることを見出した。2.ラット胃より効率的に高純度で初代培養胃酸分泌細胞を作製する方法を構築した。細胞は1週間以上培養可能であり、H,K-ATPaseと機能共役するCl-/H+交換輸送体のClC-5を強制発現させることができた。3.ポリリジンコートしたガラス上にブタ胃細管小胞(TV)を固定し、免疫染色を行った。H,K-ATPaseのシグナルは、ほぼ全てのTVで観察された。

Caveolin-1とclathrinのシグナルの一致率は3%と非常に低く、H,K-ATPaseのシグナルとの一致率は、clathrinで50%、caveolin-1で25%であった。H,K-ATPaseと各種イオン輸送タンパク質とのシグナルの一致率は、ClC-5で85%、Cl-チャネルのCFTRで50%と高い一方、K+チャネルのKCNQ1では25%と低かった。また、胃酸分泌細胞の電子顕微鏡解析において、caveolin-1で被覆されている小胞構造は少なかった。したがって、胃細管小胞には、clathrinもしくはcaveolin-1でコートされた小胞およびどちらにもコートされていない小胞が存在し、Cl-輸送とK+輸送を担う小胞が異なっていることが示唆された。4.ラットおよびブタ胃粘膜において、H,K-ATPaseβサブユニットの糖鎖には、胃酸分泌休止状態では末端にシアル酸が付加されている一方、酸分泌刺激状態では切断されていることを見出した。シアル酸付加が、胃酸分泌機構および細胞防御機構と関連している可能性が考えられた。胃酸分泌細胞の頂端膜は、過酷なpH条件下(pH 0.8)にさらされているにも関わらず、通常は傷害を受けないが、そのメカニズムについては不明である。これまでに我々は、胃酸分泌細胞基底側膜に存在する分子実体未知のCl-チャネルが細胞防御機構に関与することを見出している。本研究で、1)胃酸分泌細胞の細管小胞に多様性があり、発現するイオン輸送タンパク質のパターンが異なること、2)基底側膜に発現するSLC26A7のCl-チャネル機能が、細胞防御機構に必須であること、3)胃プロトンポンプβサブユニットの糖鎖末端のシアル酸がポンプの活性調節および細胞防御機構に重要であることを明らかにした。平成26年度に行った研究から、胃酸分泌細胞を起点とする胃粘膜傷害機構について、以下のような新規メカニズムが明らかになったことから、本研究はおおむね順調に進行していると考える。1. SLC26A7は、トランスポーターとして細胞内pH調節に関与するのではなく、Cl-チャネルとして機能していることがわかった。2. SLC26A7ノックアウトマウスを使用した実験により、胃粘膜のエタノール傷害は、胃酸分泌細胞のSLC26A7のチャネル活性の抑制に伴い増悪することがわかった。これは胃酸分泌細胞の傷害が起点となり、胃粘膜傷害が引き起こされることを示唆する。SLC26A7は胃酸分泌細胞において細胞防御機構の指令塔として働いている可能性が考えられる。3.胃プロトンポンプβ鎖の糖鎖におけるシアル酸付加の有無により、胃酸分泌機能が調節されるという興味深い知見を得た。シアル酸付加の有無が胃酸分泌機能調節を介して細胞防御機構に関与している可能性が示唆される。27年度が最終年度であるため、記入しない。細胞生理学、分子生理学平成27年度は以下のポイントに重点的に取り組み、本研究を推進する。1.胃酸分泌細胞の細胞防御機構に関与する細胞内小胞を発現タンパク質の差異を利用して、分別単離し、細胞内小胞の種類と機能の全容について明らかにする。また、胃粘膜および細胞に高圧凍結技法を適用し、標本を作製し、各種細胞内小胞の形態やタンパク質分布パターン等を電子顕微鏡で解析する。