hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
乳癌における癌幹細胞を標的とした治療戦略の有効性の基礎的検討

固形癌の癌幹細胞に関する知見が蓄積され、腫瘍生着能や抗癌剤耐性能の亢進など、その性質が明らかになるにつれ、癌幹細胞を標的とする治療戦略が注目を浴びている。しかし、現状では概念だけが先行し、この治療戦略が本当に有用であるか否かについての基礎的な知見は未だ得られていない。本研究では、任意に細胞死を誘導する系を構築してこの細胞から癌幹細胞分画を取り出し、野生型細胞由来の非癌幹細胞と混合してマウス異種移植を行うことで、擬似的に癌幹細胞を標的とした治療法を構築し、本治療戦略が実際に有用か否かに関する基礎的知見を得る事を目的とした。本研究課題では、任意に細胞死を誘導する系を構築してこの細胞から癌幹細胞分画を取り出し、野生型細胞由来の非癌幹細胞と混合してマウス異種移植を行うことで、擬似的に癌幹細胞を標的とした治療法を構築し、本治療戦略が実際に有用か否かに関する基礎的知見を得る事を目的としている。研究初年度では、まずGFP陽性乳癌細胞株を作成し、GFP陽性細胞とGFP陰性細胞(野生株)をそれぞれ免疫不全マウス乳腺へ異種移植することで、腫瘍の形成を得ることができる。この際にそれぞれ、(a) GFP陽性細胞由来腫瘍よりCD44(+)CD24(-)細胞分画と、(b) GFP陰性細胞由来腫瘍よりCD44(+)CD24(-)以外の分画を用いるが、(a)と(b)を様々な比率で混合し、再度免疫不全マウス乳腺への異種移植を行った。CD44(+)CD24(-)細胞分画はわずか200-1,000個の細胞が腫瘍を形成することが知られているが、1)腫瘍が形成されるか、2)形成される腫瘍がGFP陽性か否か、3)どのような混合比率でGFP陽性・陰性もしくは混合腫瘍が形成されるかの検証を行った。本研究課題では、任意に細胞死を誘導する系を構築してこの細胞から癌幹細胞分画を取り出し、野生型細胞由来の非癌幹細胞と混合してマウス異種移植を行うことで、擬似的に癌幹細胞を標的とした治療法を構築し、本治療戦略が実際に有用か否かに関する基礎的知見を得る事を目的とする。研究では、2種類のトリプルネガティブ乳癌の細胞株を用いて実験を行った。マウス異種移植モデルを用いて、癌幹細胞分画(CD44(+)/CD24(-))とそれ以外の分画(Bulk tumor)が混在する際、形成される腫瘍は癌幹細胞由来であるか否かの検証を行った。癌幹細胞とBulk tumorを様々な比率で混入させたところ、癌幹細胞群で腫瘍の生着率は上昇した。また、生着した腫瘍を振ろうサイトメトリーで検討したところ、癌幹細胞由来であるGFP陽性細胞の比率が高い傾向が認められた。今後は癌幹細胞分画にアポトーシスを誘導する因子を導入し、任意にこれを発動することで、癌幹細胞を標的とした治療戦略が正しいか否かについて検討を行っていく。免疫不全マウス乳腺へ細胞株を異種移植することで、腫瘍の形成を得ることができたが、これらは一定の大きさに達した後切除され、collagenase等による処理後にFACS(fluorescence activated cell sorting)にて以下の通りソーティングを行う予定であった。しかし、single cellへの分離が困難であり、GFPの発光も弱いため、これら実験に支障をきたした。そのため、現在は腫瘍組織のGFPに対する免疫染色を実行することで、これら問題をクリアし、予定通りの研究計画を進めている。乳腺外科学癌幹細胞理論が正しければ、GFP陰性であるBulk tumor細胞の比率が低い場合は、癌幹細胞由来であるGFP陽性腫瘍が形成される可能性が高いと考えられる。一方で、癌幹細胞とBulk tumor cellとの特別な相互作用等が存在し、癌幹細胞の存在がBulk tumor細胞の生着能を高めるという可能性も予測されるため、実験結果がどちらの仮説を支持するかを今後検体数を増加して検討していく。

また、Bulk tumor細胞の比率を高めることで、GFP陽性・陰性細胞の混合腫瘍が形成されるとすれば、その比率を特定することで、癌幹細胞を標的とした治療を擬似的に再現する研究が可能となるため、これを実現するよう研究を進めていく。
遺伝子多型・血清バイオマーカーによるエストロゲン依存性乳癌罹患リスクモデルの構築

本邦で罹患者数が増加している乳癌、特に女性ホルモンの刺激で増大するエストロゲンレセプター陽性乳癌の発症メカニズムの解明を試みた。我々は、近年さまざまな疾患にかかりやすい要因と報告されている、一塩基多型(SNP)に着目した。TNRC9 rs3803662のSNPがマンモグラフィの乳腺濃度に影響を与えること、CYP17A1 rs743572が血清テストステロンに影響を与えること、それぞれのSNPが乳癌の易罹患性に関与するメカニズムである可能性があることを示した。これら発症メカニズムの解明により、エストロゲンレセプター陽性乳癌の発症を減少させうる可能性がある。当該研究は、日本人女性においてエストロゲンレセプター陽性乳癌罹患高危険群を同定するモデルを構築することにある。対象となるのは、当院にて診断・治療を行った乳癌患者と、当院の乳腺外科外来を受診し異常を認めなかった健常者である。これらを用いた症例対照研究である。まず乳癌患者群となる症例として、当院で手術を施行した約200例の乳癌患者から、問診聴取・血液採取を行った。問診からは疫学因子のデータを解析予定である。また採取した血液からはDNAを抽出し、一塩基多型を解析予定である。一塩基多型を解析するTaq Man PCR Systemは研究室内に設置してあり、試薬を購入すれば速やかに解析できる環境にある。それとともに、血清を解析しエストラジオール、テストステロン、プロラクチンなどの血清バイオマーカーを測定する予定である。これら血清は冷凍保存をしてあり、解析用に提出する準備が整っている。同様に健常者についてもリクルートを行い、問診の聴取、血液の採取を行う予定である。問診については受診時に問診票にて聴取をしているが、血液の収集がともなっていない。今後、外来を受診した健常者において、採血や遺伝子解析、血清解析に同意していただけるボランティアを募って血清サンプルを収集予定である。限られた時間での外来診療で、効率良くサンプルを収集するように努める予定である。システミックなサンプル収集法を工夫し、より早くより多くの健常者サンプルを収集する必要がある。今研究にて我々が予定しているのは、前研究にて構築した遺伝因子を考慮した日本人女性におけるエストロゲンレセプター陽性乳癌罹患リスクモデルのvalidationstudyと、その過程においてエストレゲンレセプター陽性乳癌の発症メカニズムの解明である。我々は、前研究にてTNRC9 rs3803662エストロゲンレセプター陽性乳癌の罹患リスクに有意に関係していることを見出したが、そのメカニズムとしてrs3803662の遺伝子型間にマンモグラフィ濃度の有意差があることを見出し(AA 49.35+-18.43%, AG 48.43+/-20.45%, GG 44.12+-18.41%)、平成26年6月にアメリカ臨床腫瘍学会(シカゴ)のポスターディスカッションにて報告を行った。同様の発表を平成27年7月に日本乳癌学会にて報告した。健常者群の検体採取が当初の予定どおり進捗していない。日本人女性における臓器別がん罹患率で乳癌は第1位であり、その中でも特にエストロゲンの刺激によって増殖するエストロゲンレセプター陽性乳癌が増加している。癌の発症原因はさまざまであり、その予防・治療において発症メカニズムの解明は喫緊の課題である。われわれは既存の疫学因子に加え、遺伝子多型の一種である一塩基多型(SNP)に注目した。このSNPは多種の疾患の易罹患性に関与していると考えられており、乳癌の易罹患性に関与すると考えられるSNPも多数報告されている。我々はこのメカニズムを解明するため、疫学因子、血清バイオマーカー、マンモグラフィ濃度との相関を解析し、そのメカニズムの解明を試みた。われわれはTNRC9 rs3803662のSNPがエストロゲンレセプター陽性乳癌の易罹患性に関与していることを見出し、そのメカニズムとしてマンモグラフィ濃度に影響を与えることを示した。また、閉経前女性におけるエストロゲン合成酵素CYP17A1の一塩基多型rs743572が血清テストステロンに影響を与え、乳がんの易罹患性に関与している可能性を示した。また、マンモグラフィ濃度を予測する重回帰分析モデルを開発し、生殖系の因子や血清バイオマーカーのほか、飲酒も関与することを示した。飲酒が乳癌の発症リスクに関与するメカニズムとしてマンモグラフィ濃度に影響を与えることが原因であることが示唆された。これらの検討により、エストロゲンレセプター陽性乳癌の罹患リスクがよし正確に同定できれば、日本人女性における高リスク群を同定でき、エストロゲンレセプター陽性乳癌の化学予防も視野に入り、本邦での乳癌死の現象がが期待できると考えている。

健常者のサンプル収集が進捗していない。外来でのリクルート方法など、系統的な対応を考慮する必要がある。健常者群のサンプルを集めるための環境整備を至急行う。エストロゲンレセプター陽性乳癌の発症メカニズムの解明引き続き、対象となる患者・健常者の血清サンプル収集に尽力する。当該年度に予定していた出張を取りやめたため、予算が余った。研究計画の進捗が遅れ、必要な実験試薬の購入に至らなかった。余剰金は実験に必要な物品費などにあてることとし、有意義に利用をする。研究計画の進捗に合わせて、実験試薬の購入をすすめる。
視覚入力と社会的認知の相互関係の解明　－他者の目を通した視覚世界の体験－

自閉症スペクトラムにおいて、他者の顔や行動の観察時や、社会的相互交渉場面などにおいて、特殊な視線配分を示すことが知られている。しかし、その特異性が社会認知機能の障害にどのように結びついているのかは不明なところが多い。そこで本研究では、視覚入力と社会認知機能の相互関係を明らかにすることを目的として、研究を進めてきた。昨年度までに、パソコンを用いた認知課題によって、社会交渉場面における視線パターンと他者に対する共感性には相互関係が見られる傾向にあることを示した。本結果は論文にまとめ、国際学術誌に投稿した。今年度は、より自然状態の社会相互交渉場面における視線パターンと社会認知機能の関係性を明らかにすることに焦点を当てて研究に取り組んだ。二者間で自由に会話している際の互いの視線および心拍や瞳孔径などの生理活動を同時計測した。現在までに15組のペアのデータを収集し、アイコンタクトや視線逸らし行動とそれらに起因する生理反応についてデータ解析を行っている。予備的な結果ではあるものの、視線逸らし行動を介して生理活動が覚醒から安静へ向かうような傾向が見られている。今後はより自然活動を阻害しない計測方法の開発を目指すと同時に、二者間インタラクションの際の視覚行動と社会認知機能の相互関係を詳細に明らかにしていく。所属機関の異動のため、予定していた実験の開始時期が遅れてしまった。しかし、一定数のデータを収集できたこと、成果を発表することができた点は良かったと考えている。自閉症スペクトラム(Autism Spectrum Disorder; ASD)において、他者の顔や行動、社会的交渉場面などのあらゆる社会的な視覚刺激に対して、特殊な視線配分、注視パターンを示すことが知られている。しかし、その特異性が実際に彼らの示す社会的困難の直接的な要因になっているのかは定かではない。そこで本研究では、視覚入力と社会認知能力の相互関係を明らかにする事を目的とする。初年度である今年度は、定型発達の成人が社会的交渉場面においてどのような視線配分、注視パターンを示すのかを調べる実験を行った。モニター上に提示された様々な物の中から、他者に指示された物を取る(マウスでクリックする)、というコンピューター課題を実施した。置かれた物の中には他者からは見えない場所に置いてある物があり、他者視点と自己視点で指示の内容がコンフリクトするような場合でも、常に指示者の視点に基づいて指示に答えることが求められた。その際の被験者のモニターへの視線配分をアイトラッカー(Tobii TX-300)にて記録した。現在までに約30名の被験者に実験を実施した。基本的な傾向として、自他の視点がコンフリクトするときには自己視点を優先的に処理する傾向があり、さらに一部の被験者でその傾向が特に強いことがわかった。現在、さらに詳細な注視パターン(物体探索中の視線の動き、視点取得に関わる注視、他者に対する注視等)を、各被験者の自閉症指数と合わせて解析中である。プログラムの作成とアイトラッカーとの同期作業に時間がかかってしまい、実験は実施したものの今年度中に解析を終わらせることが出来なかった。そこで本研究では、視覚入力と社会認知能力の相互関係を明らかにすることを目的として、研究を進めてきた。まず、定型発達の成人が社会的交渉場面においてどのような視線配分、注視パターンを示すのかを調べる実験を行った。モニター上に提示された様々な物の中から、他者に指示された物を取る(モニター上で選択する)、というコンピューター課題を実施した。その際の被験者の視線をアイトラッカー(Tobii TX-300)にて記録した。得られた視線データを時系列的に解析し、エゴセントリシティ(自己視点優先性)についての指標を算出した。それらと自閉症指数との間の相関性を調べたが、有意な関係性は見られなかった。そこで、社会認知機能のひとつである共感性に着目し、社会交渉場面における視線のエゴセントリシティが共感性とどのように関係するのかを調べた。共感性の指標として、他者の表情に対する自発的な模倣反応を計測した。その結果、エゴセントリシティが高い被験者群は、同指標が低い被験者群に比べて、より顕著な表情模倣反応を示す傾向が見られた。この結果から、社会交渉場面における視線配分と他者に対する共感性には相互関係が見られることが示唆された。予定通り実験を実施し、当初の仮説どおりの結果は得られなかったものの、社会交渉場面における視線パターンと他者に対する共感性には相互関係が見られることがわかり、一定の結果を収めることが出来た。

昨年度までに、パソコンを用いた認知課題によって、社会交渉場面における視線パターンと他者に対する共感性には相互関係が見られる傾向にあることを示した。本結果は論文にまとめ、国際学術誌に投稿した。今年度は、より自然状態の社会相互交渉場面における視線パターンと社会認知機能の関係性を明らかにすることに焦点を当てて研究に取り組んだ。二者間で自由に会話している際の互いの視線および心拍や瞳孔径などの生理活動を同時計測した。現在までに15組のペアのデータを収集し、アイコンタクトや視線逸らし行動とそれらに起因する生理反応についてデータ解析を行っている。予備的な結果ではあるものの、視線逸らし行動を介して生理活動が覚醒から安静へ向かうような傾向が見られている。今後はより自然活動を阻害しない計測方法の開発を目指すと同時に、二者間インタラクションの際の視覚行動と社会認知機能の相互関係を詳細に明らかにしていく。所属機関の異動のため、予定していた実験の開始時期が遅れてしまった。しかし、一定数のデータを収集できたこと、成果を発表することができた点は良かったと考えている。今後はデータ解析をなるべく早く進め、社会的交渉場面での視線配分のパターンについてその特徴を抽出するとともに、定型発達者内で自閉症傾向との関連を明らかにする。今後は、よりリアルな社会相互交渉場面を設定し、その際の視線や生体反応を計測する実験を実施する予定である。それにより、視覚を含む様々な感覚入力と社会認知機能の相互関係を明らかにすることを目指す。実験に使用する備品やソフトウェアを購入する予定だったが、既存のもので十分であったために新たな購入を見送った。また、進捗状況が遅延しているため、予定していた物品を買う段階まで至らなかった。(理由)実験に使用する備品やソフトウェアを購入する予定だったが、既存のもので十分であったために新たな物品の購入を見送った。(使用計画)来年度は新たに高性能のデスクトップを購入するほか、その他計測機器の購入も検討しているので、今年度余剰分をそれらにかかる支出に用いる。翌年度分として請求した助成金は、当初の計画通り物品購入や被験者への謝金、国内外の出張費に使用する予定である。計画の軽微な遅延に伴い、消耗品や成果発表のために確保していた金額が未使用のままになった。繰越された予算は、予定通り消耗品や成果発表のために用いる。来年度は研究の展開のために海外の研究者とのやり取りをする予定なので、今年度余剰分は特に海外出張にかかる渡航費や滞在費に使用する。翌年度分として請求した助成金は、当初の計画通り物品購入や被験者への謝金、国内の出張費に使用する予定である。
新しいラット脳性麻痺モデルを使った黄体ホルモンの脳障害回避効果の検証

胎児期に低酸素-虚血負荷を加えて作成した脳障害モデルラットに、出生後プロゲストーゲンを投与しその効果を検討した。プロゲストーゲン投与により、運動能の改善と大脳皮質の神経細胞の増加を認めた。脳性小児麻痺(CP)は、低酸素イベントとこれに続く一連の脳損傷過程を経て病態が形成される。このCPの形成過程は神経細胞の障害からの回復過程でもある。最近、中枢神経には黄体ホルモンとその代謝物を含む多くの神経ステロイドが存在すること、黄体ホルモン投与が外傷や虚血による脳損傷からの回復を早めることが明らかにされている。そこで、黄体ホルモンのCP予防効果について、ラットモデルを用いて検証することを目的として研究を行った。平成24年度の研究により、妊娠母ラット(18.5 d.p.c.)に子宮動脈の駆血(45分、30分)を行い、出生後に連日黄体ホルモン投与(0.1mg/day)を実施し、10日齢で脳の組織学的評価および行動評価を実施するモデルを確立した。子宮動脈駆血新生仔ラットでは、脳室の拡大・透明中隔の肥厚が認められ、大脳の発育過程の遅延が認められた。出生後のプロゲステロン投与により、これらの解剖学的変化を軽減し、体重増加量も増加した。また、哺乳ぶら下がり時間(母ラットを持ち上げた際に、哺乳中の新生仔が自然落下するまでの時間)および腹臥位復帰時間(新生仔を背臥位に保定してから手を離し、腹臥位への復帰までに要する時間)を短縮させた。プロゲステロンの治療効果を示唆する結果が得られたことから、現在、これらのCPモデルラットについて、ラットの成熟を待ってオープンフィールド試験とトレッドミル試験によりプロゲステロン投与の長期的な治療効果の確認を行う準備を進めている。脳性小児麻痺(CP)は、低酸素イベントとこれに続く一連の再灌流・脳損傷、さらには回復過程を経て病態が形成される。損傷過程には炎症が関与しており、神経細胞は脱落後に幹細胞からの増殖・分化を経て再生される。最近では、中枢神経内に存在するneurosteroidsが、これらの過程を制御しており、外傷や虚血による脳損傷からの回復を早めることが明らかになってきた。今回の研究では、黄体ホルモン投与のCP発症予防効果について、ラットモデルを用いて検討した。妊娠母ラット(18.5 d.p.c.)の子宮動脈を45分間駆血して、子宮内虚血再灌流によるCPモデルを作成した。出産後に、黄体ホルモン薬(0.1mg/day)を9日間投与して、経日的に運動能と脳組織像の評価を行った。CPラットでは、大脳皮質と海馬に神経細胞の脱落と膨化、neuN染色性の低下など認められ(10日齢)、ローターロッド試験で運動性の低下が認められた(50日齢)。黄体ホルモン投与は、CPラット脳に認められた破壊性変化を軽減させ神経細胞数を回復させると共に、運動性や自発運動などの機能性指標を有意に回復させた。合成プロゲスチン投与では、回復効果は認められなかった。組織学的検討により、黄体ホルモンが初期の神経細胞死の抑制・脳内炎症反応の抑制・脳神経軸索と髄鞘形成の促進に関与している可能性が示唆された。今回のモデル動物を用いた研究により、黄体ホルモン薬がCPの発症予防に有用である可能性が示唆された。脳性小児麻痺(CP)は、分娩周辺期の低酸素イベントとこれに続く一連の脳損傷過程を経て、その病態が形成される。一方で、黄体ホルモンは切迫流産の治療薬としてすでに臨床応用され妊娠母体に投与され、その安全性が確かめられている薬剤である。そこで、黄体ホルモンのCP予防効果について、ラットモデルなどを用いて検証することを目的として本研究を開始した。ラットCPモデルについて検討したところ、妊娠母ラット(E17-19)にLPSを投与し、出生後(P1)に右頸動脈結紮と低酸素処置を行うモデルが、ヒトCPに類似した運動障害を呈することから、最も適切なモデルであることを確認した。しかしながら、1日齢新生仔に麻酔・手術・低酸素負荷といった一連の侵襲を加えると一定の率で死亡するため、手術手技の習熟と低酸素負荷時間の調節が必要であることが判明した。次に、ヒトにおいて、黄体ホルモンとCP発生との関連を調べる目的で臍帯血中の黄体ホルモンおよびその代謝物の測定系を確立するための検討を行った。アロプロゲステロン、5α,3α-ジヒドロプロゲステロンなど主要な黄体ホルモン代謝産物(神経作動性ステロイド)をGC-MSにより測定する系を確立した。臍帯血およびラット脳サンプルでの検出のために、条件設定を行った。医歯薬学研究計画書では、「低酸素症となった新生児に黄体ホルモンを投与する」ことでその後に起こる脳損傷を予防・軽減できるとの仮説を立て、最近確立された新生仔ラットCPモデルを用いてその治療効果を検証することを目的とした。

今回の成績は、当初予定していた最近報告された新生児ラットCPモデル(LPS虚血モデル)の再現ができなかったものの、従来より報告されていた新生仔ラットCPモデル(虚血モデル)を用いて、所期のプロゲステロン投与の効果を示すことができた。したがって、期待通りの進展と言える。新生仔への侵襲が大きく、歩留まりが低くなることが判明したため手術手技や術後管理方法などに改良が必要となったことによる。当初の計画では、治療効果を成熟後のトレッドミル試験とオープンフィールド試験で行うこととしていた。今回の検討から、新たな評価指標として「哺乳ぶら下がり時間」と「腹臥位復帰時間」を用いることにより、これより短い期間(10日齢)の飼育での評価も可能であることが判明した。そこで、10日齢ラットの大脳標本の病理学的解析をおこなって、プロゲステロンの治療効果の機序を明らかにすることを目指す。低酸素負荷の時間を短縮することなどで、死亡率低下をはかることで改善できる見込みである。また、今回の研究における黄体ホルモン代謝産物測定系を応用することで、ヒト臍帯血でも測定を行いCP発生や臍帯血ガス分析値などとの相関をみることができる。動物実験のバックアップとして、ヒトでのデーターの採集を開始する。10日齢までのラット新生仔脳標本を経日的に作成し、組織学的染色を行なってプロゲステロンの治療効果の機序を推定する。固定標本からの薄切スライドの作成は外注となるため、その費用に充てる。また、免疫染色用抗体の購入費用に充てる。データーの採集・保存は、既存の設備で対応できる。動物実験が順調に進行しない場合には、動物サンプルでの測定費用を臍帯血での測定に転用して対応する。
ゲンチオオリゴ糖による多年生植物の新規休眠制御機構の解明

本課題では、リンドウの冬期における休眠調節機構の解明を目指した。メタボローム解析により、越冬芽の休眠期にゲンチオオリゴ糖の変動が検出されたことから、本オリゴ糖が休眠調節物質である可能性が見出された。そこで、ゲンチオオリゴ糖の調節及び作用機序について調査した。関連酵素の遺伝子発現と活性測定の結果から、休眠期にインベルターゼが顕著に変動しており、本酵素によってゲンチオオリゴ糖が調節される可能性が示された。さらにターゲットメタボローム解析から、オリゴ糖処理によって特定の代謝経路が活性化する結果が得られたことから、越冬芽の休眠調節にゲンチオオリゴ糖が関与していることが示唆された。多年生花卉の周年開花を可能とするには、冬季の休眠調節が必須である。本研究では、人為的な休眠調節技術の確立を目標に、リンドウをモデルとした越冬芽の休眠調節機構の解明を目標としている。平成24年度は、ゲンチオオリゴ糖代謝経路の特定と、越冬芽の休眠制御におけるゲンチオオリゴ糖の作用機構の解明を目指した。本オリゴ糖の分解酵素(β1,6グルコシダーゼ)は、複数のカラムを用いて精製を行い、候補蛋白質を得ることに成功したが、配列決定には至らなかった。そこで、リンドウESTからグルコシダーゼの配列情報を取得し、休眠誘導休眠萌芽までの経時的な発現を調査した。オリゴ糖と挙動が一致するものを選抜し、現在、融合蛋白質を作成している。また、13C標識グルコース並びにシュクロースを用いた実験から、これら糖を出発点にゲンチオビオースとゲンチアノースが合成される経路の存在が明らかとなった。作用機構の詳細を明らかにするため、オリゴ糖を処理した培養越冬芽のメタボローム解析を行った。解析にはLC-Q-TOFMSを使用し、数千のピークを得ることに成功した。顕著な変動が見られた代謝物群をMS/MS解析したところ、ゲンチオオリゴ糖由来と予想される糖類が含まれており、休眠制御との関与が推測された。さらにターゲットメタボローム解析から、オリゴ糖によって萌芽が誘導される際には、エネルギー物質と共に特定の代謝経路が活性化する結果が得られた。本代謝経路に関連する代謝物と酵素遺伝子を詳細に調べたところ、オリゴ糖処理によって明らかな蓄積並びに発現誘導が観察された。圃場栽培されたリンドウ越冬芽でも同様の結果が得られたことから、観察された現象は越冬芽の萌芽メカニズムの一部であり、その調節にゲンチオオリゴ糖が関与していることが強く示された。休眠は、多年生植物が持つ優れた生存戦略の一つである。休眠により環境ストレス耐性が付与されることで、長期間の生存が可能となる。他方、多年生花卉の周年開花を目指す上で最大の障害となっている。その解決には、休眠機構を解明し、人為的に休眠を調節する必要があるが、現在までに成功例はない。そこで本研究では、多年生花卉であるリンドウをモデルに、越冬芽の休眠調節機構の解明を目指した。これまでに、ゲンチオオリゴ糖と呼ばれるゲンチオビオースとゲンチアノースが休眠を調節している可能性が見出されており、新規休眠調節因子と予想されるゲンチオオリゴ糖を調節する代謝経路の探索と機能解明に向け研究を推進している。平成23年度は、ゲンチオオリゴ糖代謝経路の探索を計画し、予想代謝経路を基に、本経路に属する代謝物の定量、酵素遺伝子の単離及び発現解析を実施した。これまでの成果として、越冬芽の休眠期には、これまでに明らかにしたゲンチオビオース以外に、グルコース、グルコース6リン酸、UDPグルコース等が同様に変動することをメタボローム解析により見出した。さらに、関連酵素の遺伝子をリンドウから単離し、発現変化を経時的に調査した結果、休眠誘導期休眠期萌芽期にかけて関連酵素群の発現が大きく変動することが明らかとなった。これらの結果はメタボローム解析から得られた代謝物変動と一致しており、ゲンチオオリゴ糖の調節と共に、リンドウの休眠の鍵となる酵素である可能性が示唆された。今後は、ゲンチオオリゴ糖の作用機序並びに代謝フラックスを明らかにすることで、本オリゴ糖の機能が解明され、植物の休眠調節の更なる理解と共に新たな休眠調節技術の確立が期待できる。全体計画の研究項目は、1)ゲンチオオリゴ糖を合成・分解する酵素の精製、2)休眠過程(誘導、休眠、萌芽)におけるゲンチオオリゴ糖組成を調節するメカニズムの解明、3)ゲンチオオリゴ糖による休眠制御メカニズムの解明である。平成23年度は1)と2)を実施する予定となっている。

1)に関して、ゲンチオビオースを分解する酵素はβ-1,6グルコシダーゼ活性を標的に、Phenyl、MonoQ、MonoSカラム等を使用して部分精製に至っている。ゲンチアノース分解酵素は、ゲンチアノースの構造からインベルターゼが分解すると予想されることから、市販のインベルターゼを使用し、ゲンチアノースがゲンチオビオースに分解されることを確認している。以上のように、最終的な単離には成功していないが、ゲンチオオリゴ糖を分解する酵素は特定できている。合成酵素に関しては、現在、メタボローム解析を用いた解析法を検討している。2)に関しては、予想代謝経路を基に、関連する酵素群の遺伝子を全て単離した。それら遺伝子について、10月から4月の越冬芽を使用して、経時的な発現解析が終了している。また、関連代謝物に関しても同様に経時的な解析が終了している。さらに、それ以外の代謝系への影響を明らかにするため、メタボローム解析を行い、網羅的な代謝変動の結果を得ている。計画目標であった経路の詳細な解明には至っていないが、休眠過程の変遷時に変動する代謝物並びに酵素遺伝子は解明され、調節に関わる代謝経路の特定には至っている。ゲンチオオリゴ糖組成の調節機構についても、中心部は明らかとなっており、研究目的はほぼ計画通りに達成できたと考えている。平成23年度に終了予定であった分解酵素の精製が現在進行しており、精製終了後、ペプチドシークエンス及びMS/MS解析等により、精製蛋白質のアミノ酸配列を決定し、その配列情報に基づいて遺伝子情報を獲得する。得られた情報を基に、リンドウ越冬芽での発現解析を行い、ゲンチオオリゴ糖の調節機構の詳細を明らかにする。また、これまでの研究成果から、ゲンチオオリゴ糖が越冬芽の休眠及び萌芽に関与することが明らかになりつつある。しかしながら、本オリゴ糖自体が直接休眠に影響するのか、本オリゴ糖由来の代謝物が働くことで休眠に影響するのかは不明である。それを明らかにするため、培養に成功している越冬芽を使用し、ゲンチオオリゴ糖を取込ませた後の代謝変化をメタボローム解析により明らかにする。特に休眠にはエネルギー物質の調節が関与すると予想されることから、本オリゴ糖に影響されるエネルギー代謝に注目し、休眠制御の実態解明を目指す。また、本オリゴ糖由来の代謝物が作用する可能性に関しては、安定同位体を用いた手法を計画しており、標識オリゴ糖の作製と培養越冬芽への取り込みを行う予定である。取り込まれたオリゴ糖が、どの様な代謝物へと変換され利用されるかをメタボローム解析で明らかにすることで、本オリゴ糖の作用機序を解明する。平成24年度は、これまでに明らかにした関連代謝物・遺伝子の解析がメインとなる。これらの実験系は既に確立されており、ルーチンで行うことが可能となっているが、試料の処理やサンプル調整には多くの労力と時間を要するため、研究費を用いて研究支援者を雇用し作業を進める。また、市販されている抽出用カラム及びフィルターを購入・使用することで迅速化を図る計画となっている。また、安定同位体を用いた実験を行う予定であり、13C6グルコースと13C6シュクロースを購入する。メタボローム解析に関しては、CE/MS用キャピラリーと、各種有機溶媒に要する資金を研究費から支出する。精製された酵素(グルコシダーゼ等)についてアミノ酸配列分析を外部委託する予定となっている。得られた成果については、国内外学会や学術論文を通して公表する予定であり、学会参加費、外国語論文の校閲料金、投稿料及び印刷料として研究費を使用する予定である。
腫瘍イメージング剤としての放射性金属－八臭素化ポルフィリンの開発研究

本研究では、新規「放射性金属ー八臭素化ポルフィリン錯体」を開発し、腫瘍イメージング剤としての可能性について検討した。その結果、八臭素化ポルフィリン誘導体の一つであるOBTCPPが、診断用核種の111Inで短時間で標識可能であった。111In-OBTCPPは、colon26細胞を移植した担癌マウスにおいて、投与24時間後、腫瘍へ約5%ID/g集積し、腫瘍/筋肉比は、10以上を示した。さらに、投与24時間後にSPECT-CT撮像を行った所、体内分布実験の結果を反映し、腫瘍を画像化可能であった。以上より、111In-OBTCPPは腫瘍イメージング剤としての可能性を有することが示された。本研究は、金属との結合が非常に速い八臭素化ポルフィリン誘導体に着目し、新規「放射性金属ー八臭素化ポルフィリン錯体」を開発し、腫瘍イメージング剤への応用の可能性を明らかにすることを目的として検討を行った。八臭素化ポルフィリン誘導体として、Octabromotetrakis (4-carboxyphenyl)porphine(OBTCPP)を選択し、放射性金属である111Inで標識した111In-OBTCPPの、基礎的性質、及び結腸癌への集積性の検討を行った。111In-OBTCPPの脂溶性を評価するため、オクタノール-リン酸緩衝液分配比(logP値)を調べた所、logP値は0.38となり、脂溶性は高くないことが示された。また、Colon26細胞(マウス結腸癌由来細胞株)をBALB/cマウスに移植することで担癌マウスを作製し、実験に用いた。111In-OBTCPPを尾静脈から投与した後の担癌マウスにおける体内分布を検討した。その結果、111In-OBTCPPは肝臓、腎臓に高い集積を示したが、腫瘍へも集積し、投与24時間後で、腫瘍へ約5% dose/gの集積を示し、腫瘍/筋肉比は、10以上を示した。以上の結果は、111In-OBTCPPが結腸癌に集積する可能性を示しており、腫瘍イメージング剤となり得る可能性を有していることを示唆している。放射性金属での標識に関しては111Inによる標識のみであるが、担癌マウスでの腫瘍集積性の検討まで行っており、おおむね順調に進展している。10%FBS、100 u/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン含有RPMI培地で培地培養したColon26細胞(マウス結腸癌由来細胞株)をBALB/cマウスの肩部に1×10-7個移植し、約2週間飼育することで担癌マウスを作製し、実験に用いた。その結果、111In-OBTCPPは肝臓、脾臓、腎臓に高い集積を示したが、腫瘍へも集積し、投与24時間後で、腫瘍へ約5% dose/gの集積を示し、腫瘍/筋肉比は、10以上を示した。また、予備的実験としてノーマルマウス(癌細胞を移植していないBALB/cマウス)を用い、111In-OBTCPP投与24時間後にSPECT(単一光子放射断層撮影)-CT(コンピューター断層撮影法)の撮像を行った。その結果、肝臓や脾臓、腎臓に高い集積を示し、体内分布実験の結果を反映した画像を得ることができた。以上の結果より、111In-OBTCPPは腫瘍イメージング剤としての可能性を有することが示唆された。ノーマルマウスではあるが、SPECT撮像まで進むことができた。次に、10%FBS、100 u/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン含有RPMI培地で培地培養したColon26細胞(マウス結腸癌由来細胞株)をBALB/cマウスに移植することで担癌マウスを作製し、実験に用いた。

その結果、111In-OBTCPPは肝臓、脾臓、腎臓に高い集積を示したが、腫瘍へも集積し、投与24時間後で、腫瘍へ約5% dose/gの集積を示し、腫瘍/筋肉比は、10以上を示した。さらに、腫瘍イメージング剤としての可能性を検討するため、担癌マウスを用い、111In-OBTCPP投与24時間後にSPECT(単一光子放射断層撮影)-CT(コンピューター断層撮影法)の撮像を行った。その結果、体内分布実験の結果を反映し、肝臓や脾臓、腎臓に高集積を示したものの、腫瘍にも集積し、腫瘍を画像化することが可能であった。以上の結果より、111In-OBTCPPは腫瘍イメージング剤としての可能性を有することが示された。本研究では、新規「放射性金属ー八臭素化ポルフィリン錯体」を開発し、腫瘍イメージング剤としての可能性について検討した。その結果、八臭素化ポルフィリン誘導体の一つであるOBTCPPが、診断用核種の111Inで短時間で標識可能であった。111In-OBTCPPは、colon26細胞を移植した担癌マウスにおいて、投与24時間後、腫瘍へ約5%ID/g集積し、腫瘍/筋肉比は、10以上を示した。さらに、投与24時間後にSPECT-CT撮像を行った所、体内分布実験の結果を反映し、腫瘍を画像化可能であった。以上より、111In-OBTCPPは腫瘍イメージング剤としての可能性を有することが示された。引き続き、111In-OBTCPPに関して、多様な種類の腫瘍を用いて腫瘍集積性を確認するとともに、その集積メカニズムの検討を行う。また、111In以外の放射性金属による標識法の検討、および、より体内動態の優れた化合物の開発を目指す。さらに、SPECT撮像を行い、腫瘍イメージング剤としての可能性を評価する。担癌マウスでのSPECT撮像を行う。さらに、他の種類の腫瘍への集積性、集積機序などを検討する。放射性医薬品H27年度は報告者の所属するアイソトープ総合研究施設の改修工事が行われていたため、支出額が予定よりも少なかったため。検討した腫瘍細胞の種類が当初予定していたよりも少なく、細胞培養の費用が少なかったため。種々の腫瘍細胞の培養および担癌モデルマウスを作製に使用する。
HIVウイルスベクターを用いた遺伝子機能解析法の開発

HIVウイルスベクターの培養細胞への感染と感染細胞のクローン樹立・作成したウイルスベクターを293細胞へ感染させた。細胞の形態、増殖速度などに大きな変化は認められず、クローニングにより発現細胞のクローンを樹立することができた。蛍光顕微鏡にて、ほぼ100%の細胞にGFPの発現を確認できたが、継代を重ねていくと、発現量は減少していった。・PN-1遣伝子(full length)をSINベクタープラスミドにサブクローニングし、各プラスミド(パッケージングプラスミド、Revプラスミド、エンベローププラスミド、SINベクタープラスミド)を293cellにトランスフェクションし、ウイルスベクターとして培養上清を回収した。力価は、サンドイッチELISA法によるウイルス蛋白p24の定量にて行い、GFP発現HIVウイルスベクターと同様、理論上10^3TU(Transfection unit)/mlの力価を得た。・PN-1発現ウイルスベクターを293細胞へ感染させた。GFP発現からは、発現効率は10%以下であった。細胞の形態、増殖速度などに大きな変化は認められなかった。・感染細胞でのPN-1蛋白発現を確認するために、抗PN-1抗体を作成した。PN-1ペプチドを数回免疫したウサギ血清をプロテインGカラムにて精製、濃縮した。ウエスタンブロット法で発現確認を試みたが、明らかなバンドは得られなかった。・効率のよいPN-1の発現のために、ウイルスベクターの濃縮が必要であったが、超遠心によって高力価のベクターは得られなかった。今後は高力価のウイルスベクターを得、感染価をあげる必要があり、検討中である。H14科研研究実績報告書本年度は、GFP発現HIVウイルスベクターの調整と導入効率について実験を行った。1、GFP発現HIVウイルスベクターの調整各プラスミド、1)パッケージングプラスミド、2)Revプラスミド、3)エンベローププラスミド、4)SINベクタープラスミドをコンピテントセル(JM109)に形質転換し、大量培養を行った。プラスミド調整キット(QIAGEN社)を用いて精製度の高いプラスミドDNAをmg単位で調整した。これら4つのプラスミドDNAを293細胞(human embryo kidney由来)に様々な条件下でトランンスフェクションした。トランスフェクション後2日目より蛍光顕微鏡にて、293細胞のGFPの発現を確認し、3日目にその培養上清をHIVウイルスベクターとして得ることができた。2、GFP発現HIVウイルスベクターの力価の測定1)サンドイッチELISA法によるウイルス蛋白の定量2)ウイルスベクターの感染価の測定この培養上清の細胞に対する感染価を調べるため、293細胞に感染を試みたところ、1:10の希釈倍率まで、GFPの発現を確認できた。3、現在、ウイルスベクターの感染価を上げるため、プラスミドDNA導入効率の条件、ウイルスベクターの濃縮法について、検討を行っている。・PN-1遺伝子(full length)をSINベクタープラスミドにサブクローニングし、各プラスミド(パッケージングプラスミド、Revプラスミド、エンベローププラスミド、SINベクタープラスミド)を293cellにトランスフェクションし、ウイルスベクターとして培養上清を回収した。力価は、サンドイッチELISA法によるウイルス蛋白p24の定量にて行い、GFP発現HIVウイルスベクターと同様、理論上10^3TU(transfection unit)/mlの力価を得た。

・感染細胞でのPN-1蛋白発現を確認するために、抗PN-1抗体を作成した。PN-1ペプチドを数回免疫したウサギ血清をプロテインGカラムにて精製、濃縮した。ウエスタンブロット法で発現確認を試みたが、明らかなバンドは得られなかった。・効率のよいPN-1の発現のために、ウイルスベクターの濃縮が必要であったが、超遠心によって高力価のベクターは得られなかった。今後は高力価のウイルスベクターを得、感染価をあげる必要があり、検討中である。
多発性筋炎・皮膚筋炎モデルを用いた筋炎病態解析とプロテアーゼ制御による治療法開発

カルパインは,Ca依存性システインプロテイナーゼの1つだが,皮膚筋炎・多発性筋炎(PM/DM)の病変部位で過剰発現していることが知られ,筋炎病態への関与が示唆される.ミオシン誘発筋炎(MIM)は,マウス・ラットを異種動物ミオシンで免疫して筋炎を誘発する実験動物モデルで,病理学的検討からPM/DMの実験動物モデルと考えられている.昨年度,カルパイン阻害薬E-64-dによるMIMの治療を試み,E-64-d治療MIMマウス群で病理所見と小島分類による点数が対照群に比べ有意に改善したことを報告した.今年度は,MIM誘発マウスにおけるミオシン反応性Tリンパ球の分離・解析を試みた.ウサギミオシン0.2mgをCFAと懸濁乳化し,SJL/Jマウス(5週齢,雌)の尾根部に皮下注射し免疫した.9日後,マウス脾臓および鼠径リンパ節を採取し,MACSビーズ処理にてCD4陽性Tリンパ球のみを選別した.これらを刺激培養するため、ウサギミオシン15μg/mLを添加,別にマウス脾臓より得た放射線照射済みのAPCとともに培養した.培養32日後,それらTリンパ球を解析する目的で,0.0,0.63,1.3,2.5,5.0μg/mLのウサギミオシンとWST-8試薬を添加して,APCとともに培養した.WST-8添加8日後に吸光度を測定したところ,ミオシン濃度依存性にTリンパ球の増殖が促進された.ミオシン誘発筋炎におけるCD4陽性リンパ球の病態への関与が示唆された.カルパイン阻害によるマウス実験的筋炎モデルへの治療効果が示されており,カルパインがCD4陽性リンパ球によるサイトカイン産生などのヘルパー作用を阻害して薬理活性を発揮している可能性が考えられた.カルパインは,Ca依存性システインプロテイナーゼの1つだが,皮膚筋炎・多発性筋炎(PM/DM)の病変部位で過剰発現していることが知られ,筋炎病態への関与が示唆される.ミオシン誘発筋炎(MIM)は,マウス・ラットを異種動物ミオシンで免疫して筋炎を誘発する実験動物モデルで,病理学的検討からPM/DMの実験動物モデルと考えられている.今回,カルパイン阻害薬E-64-dによるMIMの治療を試みた.ウサギミオシン0.5mgをCFAと懸濁乳化し,SJL/Jマウス(5週齢,雌)の背部皮膚に3回(第0,7,14日)皮下注射して筋炎を誘発し,治療目的でE-64-d 15mg/kg/day(HD群),E-64-d 7.5mg/kg/day(LD群),対照溶液(Ctrl群)を連日(第027日)腹腔内投与し,第28日に大腿四頭筋を採取し病理所見を評価した.Ctrl群では,筋線維周囲への炎症細胞浸潤と筋線維の変性・壊死像を認めたが,HD群・LD群では病理所見が改善していた.小島分類(Kojima T, et al., J Neurol Sci, 151(2),141-148,1997)により点数化したところ,Ctrl群2.8±0.3点に対しLD群1.9±0.3点(N.S.),HD群1.9±0.2点(P=0.03)と有意な改善がみられた.カルパイン阻害によるマウス実験的筋炎モデルへの治療効果が示された.本実験動物モデルの筋病変の病態においてカルパインが促進的に作用しており,それがE-64-dにより抑制されて病理学的筋炎所見が改善したと考えられた.カルパインは,Ca依存性システインプロテイナーゼの1つだが,皮膚筋炎・多発性筋炎(PM/DM)の病変部位で過剰発現していることが知られ,筋炎病態への関与が示唆される.ミオシン誘発筋炎(MIM)は,マウス・ラットを異種動物ミオシンで免疫して筋炎を誘発する実験動物モデルで,病理学的検討からPM/DMの実験動物モデルと考えられている.昨年度,カルパイン阻害薬E-64-dによるMIMの治療を試み,E-64-d治療MIMマウス群で病理所見と小島分類による点数が対照群に比べ有意に改善したことを報告した.今年度は,MIM誘発マウスにおけるミオシン反応性Tリンパ球の分離・解析を試みた.ウサギミオシン0.2mgをCFAと懸濁乳化し,SJL/Jマウス(5週齢,雌)の尾根部に皮下注射し免疫した.9日後,マウス脾臓および鼠径リンパ節を採取し,MACSビーズ処理にてCD4陽性Tリンパ球のみを選別した.これらを刺激培養するため、ウサギミオシン15μg/mLを添加,別にマウス脾臓より得た放射線照射済みのAPCとともに培養した.培養32日後,それらTリンパ球を解析する目的で,0.0,0.63,1.3,2.5,5.0μg/mLのウサギミオシンとWST-8試薬を添加して,APCとともに培養した.WST-8添加8日後に吸光度を測定したところ,ミオシン濃度依存性にTリンパ球の増殖が促進された.ミオシン誘発筋炎におけるCD4陽性リンパ球の病態への関与が示唆された.カルパイン阻害によるマウス実験的筋炎モデルへの治療効果が示されており,カルパインがCD4陽性リンパ球によるサイトカイン産生などのヘルパー作用を阻害して薬理活性を発揮している可能性が考えられた.
がん産生ケモカインリガンドを起点とした肺癌の生物学的特性の解明

肺腺癌におけるケモカインの役割の解明を行った。変異型EGFRを導入した不死化気道上皮細胞と変異型KRAS遺伝子を導入した不死化気道上皮細胞に共通して発現の亢進していたIL-24に着目して研究を行った。IL-24は幾つかのヒト肺腺癌細胞株でmRNAの発現消失が見られた。ヒト肺癌切除検体を用いた免疫染色では、IL-24の発現は低分化な癌で消失していた。IL-24発現の低下した症例群では、予後が悪い傾向にあった。IL-24が肺癌において癌抑制的な役割を果たしている可能性が示唆された。これらの研究を通して、ケモカインの相互作用の解明には、組織検体内での発現蛋白の可視化が必要であることを考えて、新たな多重免疫染色の方法を検討した。AECを基質として用いて免疫染色を行い、染色されたスライドをバーチャルスライドでスキャンし、アルコールによって脱色する方法を繰り返し、これらの染色されたスライドに疑似の色をつけてコンピューター上で合成し写真を撮影した。複数のスライドの重ね合わせをマニュアルで行っていたが、細胞単位の合成に苦心し、自動で重ね合わせのできるソフトを使用することで最終的に、細胞の核、細胞質や細胞膜単位で正確な多重染色が可能となった。この方法を用いることで、ケモカインリガンドやケモカインレセプターの発現している細胞ががん細胞なのか炎症細胞なのか正確に把握することができる。また、その他の増殖マーカーやアポトーシスマーカーを免疫染色に組み合わせることで個々の細胞の機能が詳細に記述できるようになった。当該研究室では、これまでに変異型KRAS遺伝子を不死化気道上皮細胞に導入したin vitro実験モデルのマイクロアレイ解析からがん遺伝子によって発現誘導された分子を抽出し、それら分子の肺癌における発生や進展に関わる機序を報告してきた。不死化気道上皮細胞に変異型KRAS遺伝子および変異型EGFR遺伝子を導入することによって、共通に発現亢進のあった分子(CCL3, IL1B, IL-24, MMP1, MMP3)で、サイトカイン分子の中からIL-24に着目し研究をまとめた。不死化気道上皮細胞株に変異型KRAS遺伝子および変異型EGFR遺伝子を導入するとIL-24の発現上昇を認めた。肺腺癌や小細胞癌の肺がん細胞株では発現の低下や消失を認めた。幾つかの肺がん細胞株ではトリコスタチンやアザシチジン処理によりIL-24mRNA発現の上昇を認めた。A549細胞株やPC9細胞株にレトロウィルスを用いて遺伝子導入すると遊走能の有意な抑制を認めた。EGFPタグを用いた過剰発現では、IL-24は気道上皮細胞の細胞質に顆粒状に陽性となることを発見した。肺癌切除検体を用いたIL-24の発現解析では、浸潤パターン優位の肺腺癌で発現の有意な低下を認めた。また、進行期の肺腺癌で発現の有意な低下が見られた。これらの結果よりIL-24が肺腺癌においては、初期ではがん遺伝子により発現が誘導され浸潤を抑制し、後期では進行に伴って消失していく可能性が示唆された。変異型KRAS遺伝子によって誘導される分子の中の解析で、CXCL7高発現の肺腺癌では予後が良い傾向にあった。研究計画のCXCL7については、対象症例の追加、選定に時間がかかっている。CXCL7およびCXCR2の発現について、ヒト肺癌切除検体を用いて免疫染色を行った。CXCL7は低分化な腺癌細胞で陽性を示していた。CXCR2については、炎症細胞での陽性を確認した。CXCL7については、高発現の肺腺癌症例群は低発現群と比較して、Relapse Free Survival(RFS)の評価で有意に予後が良好であることを発見した。これらの結果からCXCL7とCXCR2の発現が肺腺癌の生物学的特性に関与している可能性が示唆された。これまでのサイトカイン解析の中で生じた新たな問題として、サイトカインリガンド、サイトカインレセプターの発現を評価する上で、発現細胞の種類の同定とこれら分子の発現を同時に評価することが必要となった。旧来、多重免疫染色の方法としては、動物種を変えた酵素抗体法による染色や蛍光抗体を用いた染色があるが、いずれも染色種類の制限や自家蛍光の出現といった問題点があった。そこで、我が研究室では、水溶性のAEC発色剤を用いた免疫染色を行い、バーチャルスライドでスキャンし、アルコールによって染色を落とし、オートクレーブによる賦活化で抗体反応を停止させ、これらを繰り返すことで多種類の分子の発現評価をするという多重免疫染色方法を検討した。ヒト扁桃組織を用いた予備実験として、CD20, CD45RO, CKAE1/AE3染色を行った。バーチャルスライドとしては、二種類のメーカーの機器を検討した。AECによる発色は良好で、スキャンについても、自動フォーカスでもピントがあった状態で、10分前後の経過時間でスキャンができるようになった。画像解析は市販のソフトとフリーウェアのソフトの二種類を検討した。いずれのソフトを用いてもスキャンした画像の重ね合わせにより多分子の同時発現の評価が可能となることを確認した。当該年度の予定について、研究計画ではヒト肺癌細胞株を用いたsiRNAノックダウンによる機能解析の予定であったが、ヒト肺癌臨床検体を用いた免疫染色で、CXCL7, CXCR2の発現の局在の複雑さから、新たな解析方法の開発が必要となった。

肺腺癌におけるケモカインの役割の解明を行った。変異型EGFRを導入した不死化気道上皮細胞と変異型KRAS遺伝子を導入した不死化気道上皮細胞に共通して発現の亢進していたIL-24に着目して研究を行った。IL-24は幾つかのヒト肺腺癌細胞株でmRNAの発現消失が見られた。ヒト肺癌切除検体を用いた免疫染色では、IL-24の発現は低分化な癌で消失していた。IL-24発現の低下した症例群では、予後が悪い傾向にあった。IL-24が肺癌において癌抑制的な役割を果たしている可能性が示唆された。これらの研究を通して、ケモカインの相互作用の解明には、組織検体内での発現蛋白の可視化が必要であることを考えて、新たな多重免疫染色の方法を検討した。AECを基質として用いて免疫染色を行い、染色されたスライドをバーチャルスライドでスキャンし、アルコールによって脱色する方法を繰り返し、これらの染色されたスライドに疑似の色をつけてコンピューター上で合成し写真を撮影した。複数のスライドの重ね合わせをマニュアルで行っていたが、細胞単位の合成に苦心し、自動で重ね合わせのできるソフトを使用することで最終的に、細胞の核、細胞質や細胞膜単位で正確な多重染色が可能となった。この方法を用いることで、ケモカインリガンドやケモカインレセプターの発現している細胞ががん細胞なのか炎症細胞なのか正確に把握することができる。また、その他の増殖マーカーやアポトーシスマーカーを免疫染色に組み合わせることで個々の細胞の機能が詳細に記述できるようになった。CXCL7の発現と予後との関係について検討していく。CXCL7およびCXCR2の発現解析について、炎症細胞としてはTリンパ球、Bリンパ球、形質細胞、マクロファージの区別を行い、癌細胞としてはサイトケラチン、また、肺腺癌マーカーのTTF-1、HNF4αの評価を多重免疫染色を行って、同時に評価していく。肺腺癌におけるCXCL7の発現解析をさらに拡大して検討する予定であるが、研究対象症例の選定に時間がかかっていて、免疫染色やFISHを施行する予定だった研究が遂行できず、残額が生じた。免疫染色に用いた抗体や発色剤について既存のものを使用することで、出費を抑えることができた。次年度については、病理画像解析ソフトの購入に充てる予定。IL-24の解析で得られた知見を基に、研究対象例を再検討する。CXCL7とCXCR2のリガンドとレセプターの発現関係を明らかにするために免疫染色で二重染色を施行していく。また、CXCL7の強発現のある症例については、自作のFISHプローブを用いて、遺伝子増幅の有無を評価していく。物品費として、免疫染色の抗体、FISHプローブ作製費を計上する。