hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
センサー分子を標的とした革新的肺気腫治療法の開発

肺気腫は、慢性炎症による肺胞構造の破壊を特徴とする難治性の閉塞性換気障害である。その分子病態機序は未だ十分に解明されておらず、有効な治療法(特に薬物療法)はない。本研究では、肺組織への病的刺激(喫煙や機械的刺激)によって炎症が惹起され肺気腫が発症し進展する分子機序の一端を解明する。特に、分子センサーASC/Caspase-1複合体が病的刺激と肺気腫病態とを繋ぐ鍵分子であることを証明し、ASC/Caspase-1を標的とした新たな肺気腫治療法を開発することを目標とする。そのために本年度実施した実験計画は、以下の2点であった。【計画1:ヒト肺気腫組織の解析】平成22年度までに採取されたヒト肺気腫組織標本の解析を実施した。標本は、肺切除術を実施した20症例において、同意を得て手術中に採取されたヒト肺組織であった。術前CTならびに病理組織所見により,肺気腫群(12症例)と非肺気腫群(8症例)に分類された。ASC/Caspase-1の下流で働くと予想される炎症性シグナル分子JNK活性とマトリクス分解酵素MMPをウエスタンブロットならびにザイモグラフィーで定量的に解析した。その結果、肺気腫群では非肺気腫群に比べMMP-9が増加している傾向が見られたが、現在までのところ統計学的な有意差は検出されていない。【計画2:マウス肺気腫モデルにおける予防実験】平成22年度までに確立したマウス肺気腫モデル作成法に基づいて、ASC遺伝子欠損マウス(n=8)ならびに野生型マウス(n=8)の気管内にエラスターゼを投与し、エラスターゼ処理後4週目に、各マウスを犠牲死させマウス肺標本を摘出した。摘出肺組織をHE染色ならびにEVG染色により組織学的に検討したところ、野生型マウスでは肺胞構造の破壊がびまん性に確認され、炎症細胞浸潤を伴っていた。このような肺気腫変化がASC遺伝子欠損マウスで抑制されることが期待されたが、実際には野生型マウスにおける組織破壊像とほぼ同等の変化が観察された。本研究では、病的刺激(喫煙や機械的刺激)によって炎症が惹起され肺気腫が発症し進展する分子機序を解明する。【計画1:ヒト肺気腫組織の解析】肺切除術を実施した20症例において、同意を得て手術中に採取されたヒト肺組織を標本とした。標本は、ASC/Caspase-1の下流で働くと思われる各種炎症蛋白のウエスタンブロット解析用に凍結保存し、一部は組織標本とした。術前CTならびに病理組織所見により肺気腫群(12症例)と非肺気腫群(8症例)に分類し比較すると、肺気腫群の組織中で各種炎症促進分子が増加する傾向がみられた。【計画2:マウス肺気腫モデルにおける予防実験】野生型マウスの気管内にエラスターゼを投与し、肺気腫モデルを作成した。エラスターゼ処理後パルスオキシメーターで肺機能を評価しつつ、2週後、4週後、8週後の経時的にマウスを犠牲死させマウス肺標本を解析した結果、エラスターゼ投与後4週目に肺気腫病変が確立することが分かった。その後、ASC遺伝子欠損マウスと野生型マウスに、各々エラスターゼ処理を行い、4週目に犠牲死させ肺組織を標本として採取した。次年度に、採取標本を病理学的および生化学的に解析予定である。【計画2:マウス肺気腫モデルにおける予防実験】

平成22年度までに確立したマウス肺気腫モデル作成法に基づいて、ASC遺伝子欠損マウス(n=8)ならびに野生型マウス(n=8)の気管内にエラスターゼを投与し、エラスターゼ処理後4週目に、各マウスを犠牲死させマウス肺標本を摘出した。摘出肺組織をHE染色ならびにEVG染色により組織学的に検討したところ、野生型マウスでは肺胞構造の破壊がびまん性に確認され、炎症細胞浸潤を伴っていた。このような肺気腫変化がASC遺伝子欠損マウスで抑制されることが期待されたが、実際には野生型マウスにおける組織破壊像とほぼ同等の変化が観察された。
日本ワインの酒質向上に関する基礎的研究

ワイン品質を保つうえで,微生物汚染は避けるべき必須事項である。マスカット・ベーリーA(MBA)は日本ワインの主力ブドウ品種であるが微生物安定性が低いと経験的に言われている。しかしながら,微生物安定性の低さの原因解明や改善策などは懸案事項のままとなっている。そこで本研究は,まず微生物汚染で生じる酢酸やフェノール系オフフレーバーが品種によって異なるか現状を明らかにする。次に,微生物安定性に寄与するpHおよび抗菌活性成分について品種間差の検証を行う。抗菌活性成分については,ポリフェノールやタンニン類であると予想されるため,これら成分を分取精製してオフフレーバー生成に対する影響を調査する。
イオン記憶無機イオン交換膜の創製

近年、イオン交換膜は様々な新しい応用分野の拡大により、耐熱性や耐腐食性などに優れた、高機能イオン交換膜の開発と応用が要求されるようになってきた。このような、安価で優れた膜として、無機系の材料によるイオン交換膜が考えられる。本研究は、ガス分離膜の製法手法から、金属アルコキシドを用いて無機陰イオン交換体を膜状にすることにより、無機系材料による陰イオン交換膜を製膜し、これを評価することを目的とする。平成7年度において、陰イオン交換の創製を試みた。その結果、金属アルコキシドを用いた手法による完全無機陰イオン交換膜の製膜は困難であるものと思われた。そこで、シランカップリング剤を用いて無機有機複合陰イオン交換膜の創製を試みた。このうち、N-トリメトキシシリルプロピル-N、N、N-トリメチルアンモニウムクロムライドを用いた膜に、陰イオン交換性能を見ることができた。輸率、膜の電気抵抗、及びイオン交換容量をそれぞれ、0.86|・|、75|Ω・cm^2|、6.2×10^<-3>|meq/cm^2|までの性能向上が確認された。平成8年度において、金属アルコキシドを用いてLi^+記憶無機イオン交換膜の創製を試みた。その結果、スピネル型マンガン酸化物をもつ膜について、Li^+に著しい選択透過性を見ることができた。Na^+に対するLi^+選択透過係数、輸率、膜の電気抵抗、及びイオン交換容量がそれぞれ、5.26|・|、0.75|・|、49.8|Ω・cm^2|、2.6×10^<-2>|meq/cm^2|までの性能が確認された。本研究は、ガス分離膜の製法手法から、ゾル-ゲル法を用いることで無機陰イオン交換体を膜状にすることにより、無機系材料による陰イオン交換膜を製膜し、これを評価することを目的とする。平成7年度において、陰イオン交換性能を持つハイドロタルサイトのアルミナ基膜状での製膜をゾル三ゲル法を用いて行った。しかし、輪率が0.5|-|程度であり陰イオン交換膜の製膜はできなかった。そこで、他の数種の5価の金属アルコレートを用いて同様の方法でアルミナ基膜上に製膜を行ったが、やはり陰性イオン交換性能は得ることができなかった。これらの結果より、ゾル-ゲル法の手法による完全無機陰イオン交換膜の製膜は困難であるものと思われる。そこで次に、YRSiX_3で代表されるシランカップリング剤を用いてゾル-ゲル法による無機有機複合陰イオン交換膜の創製を試みた。このうち、N-トリメトキシシリルプロピル-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロムライドを用いた膜に、陰イオン交換性能を見ることができた。様々な製膜条件を変えることにより、輪率、膜の電気抵抗、及びイオン交換容量がそれぞれ、0.86|-|、75|Ω・cm^2|、6.2×10^3|meq/cm^2|までの性能向上が確認された。

本研究は、ガス分離膜の製法手法から、金属アルコキシドを用いて無機陰イオン交換体を膜状にすることにより、無機系材料による陰イオン交換膜を製膜し、これを評価することを目的とする。平成7年度において、陰イオン交換の創製を試みた。その結果、金属アルコキシドを用いた手法による完全無機陰イオン交換膜の製膜は困難であるものと思われた。そこで、シランカップリング剤を用いて無機有機複合陰イオン交換膜の創製を試みた。このうち、Nトリメトキシシリルプロピル・N,N,N・トリメチルアンモニウムクロムライドを用いた膜に、陰イオン交換性能を見ることができた。輪率、膜の電気抵抗、及びイオン交換容量がそれぞれ、0.86||、75|Ω・cm^2|、6.2×10^3|meq/cm^2|までの性能向上が確認された。平成8年度において、金属アルコキシドを用いてLi^+記憶無機イオン交換膜の創製を試みた。その結果、スゼネル型マンガン酸化物を持つ膜について、Li^+に著しい選択透過性を見ることができた。Na^+に対するLi^4選択透過係数、輪率、膜の電気抵抗、及びイオン交換容量がそれぞれ、5.26||、0.75||、49.8|Ω・cm^2|、2.6×10^2|meq/cm^2|までの性能が確認された。
UASB法による硫酸イオン含有脂質性廃水処理の効率化に関する研究

先ず、高級脂肪酸の分解に及ぼす硫酸塩還元菌の存在の影響を検討するため、次に示す2条件の嫌気性細菌群の半連続培養を行った。高級脂肪酸としてパルミチン酸(1000mgCOD/1)を投与し、硫酸塩無添加系、硫酸塩添加系(600mgSO_4/1)の各完全混合型反応槽を水理学的滞留時間20日で培養した。通常、高級脂肪酸の嫌気的分解は高級脂肪酸を利用する水素生産性酢酸生成菌(acetogenic菌)、水素利用メタン生成菌、酢酸利用メタン生成菌の3種の細菌群の共生的作用により遂行される。一方、硫酸塩添加系の場合は硫酸塩還元菌が関与する生態系になるが、その定常状態でのパルミチン酸の分解に関して以下のことが明らかになった。1.水素を利用する菌がメタン生成菌ではなくSRBになる。一方、酢酸はSRBによって殆ど利用されない。2.パルミチン酸自身の分解速度は硫酸塩無添加系でのそれと同程度であり、また同機構で分解される。3.SRBの代謝によって生成した硫化物が酢酸からのメタン生成に対して阻害効果を持つので、処理効率を上昇させるためには阻害対策が必要である。以上の半連続培養で得られた知見をもとに、UASB装置の運転を開始する。基質は全COD3000mg/1(うち脂質50%)、硫酸塩濃度1500mgSO_4/1の合成廃水を用い、また硫化物による阻害を防止するため脱流装置(ストリッピングした硫化水素を酸化鉄に吸着除去)を設ける。予備実験によって脱流装置の適切な操作条件(パ-ジ時間、循環水量など)が明らかになった。
淡水域の生物多様性と生態的機能の基盤となる多様な植生の維持機構の解明に関する研究

ため池の生物多様性や生態系機能の基盤となる水生植物の種多様度を指標として,保全に有効な空間スケールを示し,種多様度を減少させる環境因子との関係を明らかにした.市街化,水質汚濁,面積の拡大などが種数の減少をもたらしていた.釧路湿原シラルトロ湖の沈水植物の分布は、水深、ヒシの現存量、底質の礫と泥の割合に影響され,根を張る沈水植物種がヒシ群落の拡大による負の影響を大きく受けることがわかった.ため池の生物多様性や生態系機能の基盤となる水生植物の種多様度を指標として,保全に有効な空間スケールを示し,種多様度を減少させる環境因子との関係を明らかにした.市街化,水質汚濁,面積の拡大などが種数の減少をもたらしていた.釧路湿原シラルトロ湖の沈水植物の分布は、水深、ヒシの現存量、底質の礫と泥の割合に影響され,根を張る沈水植物種がヒシ群落の拡大による負の影響を大きく受けることがわかった.人間活動が生態系に与える影響を評価するためには,影響を及ぼす環境要因だけでなく,その要因が作用する空間スケールを明らかにする必要がある.本研究ではため池において,水生植物の多様性と関連のある環境特性(ため池の物理構造,周囲の土地利用)とその空間スケールを調べた.水生植物の多様性の指標には生活形(沈水,浮葉,抽水)に注目し,各池の抽水,浮葉植物の出現種数,および沈水植物の有無を用いた.また同様に,ため池の水質と関連する環境特性と空間スケールも調べた.空間スケールはため池の周囲5-5000mに注目した.その結果,沈水植物の有無は,ため池から75mまでの土地利用で説明されたが,浮葉植物の出現種数は500m,抽水植物の出現種数は2500mと水への依存度の低い生活形ほど空間スケールは大きかった.一方,水質は沈水植物と浮葉植物の中間の空間スケール(100-250m)の土地利用で説明された.概ね,市街地面積率の増加に伴い,水生植物の種多様度は減少した.また,周囲の淡水域面積率は正の影響を与えていた.水深が深くなると,水生植物の出現種数は減少した.ため池面積は調査した池うちの中間のサイズ(0.5ha)で,出現種数は最大値を示し,以降わずかに減少した.以上より,池の生物多様性の保全に関係する空間スケールが特定され,市街化,池周辺の淡水域面積の減少,改修工事などによる池の深水化や大型化はため池の水生植物の多様性に対する負の要因となることが明らかになった.本研究では淡水域の生物多様性の保全を、現実的な行政施策に結びつけるための根拠を提示することを目的とし,淡水域の生物多様性と生態的機能の基盤となる多様な植生の維持機構を生態的な観点から明らかにするための研究を実施した.具体的には,ため池の多い兵庫県北播磨・東播磨地域をフィールドとして、まず、ため池に成立している水生植物群落の種数や水生植物種の有無を池の種多様度の指標と考え、種多様度をもっとも説明する周辺の土地利用ならびにその空間スケールを明らかにした。次に、最適な空間スケールの下での土地利用に、池の面積と池の水深を説明変数として加えることで、種多様度と周辺の土地利用、池面積、池の水深の関係を明らかにした。また、この地方に多い重ね池を活用し、池の連続性(connectivity)が浮葉植物と沈水植物の種数やその出現の有無に与える影響を明らかにした。ハビタット間の空間スケールで働く「生育場所間の連続性」とハビタット内の小スケールで働く「生育場所の水質」の相対的重要性について検討を加え、浮葉植物では前者が、沈水植物では後者がより重要であることを示した。そのため、浮葉植物種を保全する場合は水域の連続性について、沈水植物種の場合は水質などの局所スケールの環境保全を重視すべきであるとの知見を得た。最後に、近年、富栄養化などにより急速に沈水植物群落が衰退している釧路湿原シラルトロ湖の調査研究から、沈水植物の現存量を説明する環境要因として、水深、ヒシの現存量、底質の礫と泥の割合が重要であることを示した。さらに、ヒシに対する応答が沈水植物種の根の張り方に大きく依存していることが明らかになった。今後、ヒシ群落が拡大すると、消失するリスクの高い沈水植物種の特徴などについて明確になったことで、優先的に保全すべき種類などが特定された。
侵襲時免疫応答に関する研究

侵襲時全身性炎症反応患者における免疫応答メカニズムに関する研究を行い、以下の結果を得た。(1)単球機能の解明重症外傷、熱傷、感染症患者を対象に、単球のToll-like receptor(TLR)発現とその反応性をフローサイトメトリー法で評価し、細胞内heme oxygenase-1(HO-1)発現との関連性を検討した。その結果、侵襲時単球においてTLR発現と細胞内HO-1発現は共に充進しており、TLRを介した細胞内サイトカイン産生は有意に抑制されること、また患者血清因子が細胞内HO-1発現を誘導することを明らかにした。抗炎症作用を有する細胞内HO-1発現の充進が、侵襲時単球機能不全の一因になりうる。(2)好中球機能の解明侵襲時全身性炎症反応患者における多核白血球の機能制御メカニズムとして、重要な核内転写因子であるNF一κBとglucocorticoid receptorがお互いに発現バランスを保ちながら活性化を制御することを証明した。また、活性化された多核白血球からは接着因子を有するmicroparticleが産生されることを明らかにした。一方で、侵襲時活性化された多核白血球において、組織修復因子であるhepatocyte growthfactorの産生充進を明らかとし、多核白血球の組織修復作用を証明した。(3)血管内皮機能の解明侵襲時進行する血管内皮細胞の活性化の指標として、血管内皮から産生されるmicroparticleが血液中に有意に増加し、活性化された多核白血球との接着も増加することを明らかにした。多核白血球、血小板との細胞連関を介して、血管内皮傷害が進行する可能性を示した。(4)γδT細胞機能の解明初期免疫応答として重要な役割を担うγδT細胞の機能を侵襲時全身性炎症反応患者で評価した。侵襲後、γδT細胞は速やかに活性化され、血中から減少することを明らかにした。重症患者の初期免疫応答として、γδT細胞が侵襲早期から炎症部へ移動する可能性を示した。侵襲時全身性炎症反応における免疫応答を明らかにするため、重症外傷、熱傷、感染症患者を対象に、単球のtoll-like receptor(TLR)発現と反応性をフローサイトメトリー法で評価した。TLR反応性としては、TLR2と4がそれぞれ特異的に認識するペプチドグリカンおよびLPS刺激によって単球内で産生される細胞内サイトカイン(TNF-α,IL-6,IL-10,IL-12)の発現率として評価した。その結果、侵襲時、単球のTLR発現は有意に亢進する一方で、TNF-αなど炎症性サイトカインの細胞内発現は有意に抑制されることが明らかとなった(第63回米国外傷外科学会発表予定)。また、全身性炎症反応疾患の単球機能を評価した結果、HLA-DR低下など単球機能の著しい低下がみられ、細胞骨格の柔軟化やmicroparticleの産生抑制も同時に確認できた(J Trauma 55;1125-1132,2003)。TLRを介して単球機能の低下を引き起こす細胞内物質としてheme oxygenase-1に注目して評価した結果、侵襲時単球内においてheme oxygenase-1の発現が著明に亢進することが明らかになった(第63回米国外傷外科学会発表予定)。

一方、侵襲時進行する血管内皮細胞傷害のメカニズムとして、多核白血球由来のmicroparticleに着目した結果、全身性炎症反応疾患において接着因子を豊富に発現したmicroarticle産生が有意に亢進することが確認でき(Microcirculation annual 19;77-78,2003,J Trauma 54;114-120,2003)、活性化された血管内皮から産生されるmicroarticleも血液中に増加して多核白血球との接着がみられることが明らかになった(J Trauma in press)。現在、侵襲時全身性炎症反応における免疫応答を細胞内サイトカインバランスとしてとらえること、ステロイド、G-CSF使用によるバランスの変化をとらえること、およびtwo-hitmodelにおける免疫応答の制御を中心に進めている。平成15年度の研究結果(J Trauma 55;1125-1132,2003,Microdrcirculation annual 19;77-78,2003,J.Trauma 54;114-120,2003)をもとに、本年度は侵襲時全身性炎症反応における免疫応答メカニズムを明らかにする研究を以下のとおり進めた。(1)まず、重症外傷、熱傷、感染症患者を対象に、単球のtoll-ike receptor(TLR)発現と反応性をフローサイトメトリー法で評価し、細胞内heme oxygenase-1(HO-1)発現との関連性を検討した。その結果、侵襲時単球においてTLR発現と細胞内HO-1発現は共に亢進しており、血清因子がHO-1を誘導することから、単球機能不全の一因をなすと考えられた(第64回米国外傷外科学会発表予定)。(2)次に、初期免疫応答として重要な役割を担うγδT細胞の機能を評価したところ、侵襲時全身性炎症反応では有意に活性化されることが証明され、重症患者の初期免疫が早期から影響を受けることが確認できた(Shock 22;11-15,2004)。(3)さらに、侵襲時全身性炎症反応における多核白血球の機能制御メカニズムとして、重要な核内転写因子であるNF-κBとglucocorticoid receptorがお互いに発現バランスを保ちながら活性化を制御することを証明した(J Trauma in press)。一方で、組織修復因子であるhepatocyte growthfactorの産生亢進も確認できた(J Trauma 56;259-264,2004)。(4)また、侵襲時進行する血管内皮細胞の活性化と傷害のサインとして、活性化された血管内皮から産生されるmicroparticleが血液中に有意に増加して多核白血球との接着も増えることを明らかにした(J Trauma 56;823-831,2004)。現在、侵襲時全身性炎症反応におげる免疫応答を細胞内サイトカインバランス、ステロイド、G-CSF使用による炎症-抗炎症バランスの変化、およびtwo-hitmodelにおける免疫応答の制御を中心に研究を進めている。平成15年度、16年度の研究結果(J Trauma 55;1125-1132,2003,Shock 22;11-15,2004,J Trauma 56;259-264,2004)をもとに、平成17年度は侵襲時全身性炎症反応における免疫応答メカニズムに関する以下の研究を進めた。(1)単球機能の解明
脈管構造におけるEph/エフリンシグナルの機能解析

Eph/エフリンシグナルは動脈-静脈内皮細胞間、内皮-壁細胞間に鏡面的に発現している。その意義を検討するためにアクチンプロモーター(CAG)を用いて全身性にエフリンB2を発現できるトランスジェニック(TG)マウスを作製した。TGマウスは上行大動脈への壁細胞のリクルートメントの異常による大血管形成異常のため生後大血管解離のため死亡した。また、このマウスにおいて血管の走行異常及び毛細血管網の低形成も見出した。次にコンディショナルにエフリンB2を発現できるトランスジェニックマウスを作製し血管内皮特異的なTIE2Creマウスとの交配により血管内皮細胞のみにエフリンB2を発現できるトランスジェニックマウスを作製した。このマウスにおいては、毛細血管網の低形成は認めるものの、大血管構築異常や血管の走行異常は認められなかった。これらの結果より血管系でのEph/エフリンシグナルは内皮-その周囲の間葉系細胞間では大血管構築及び血管の走行に重要な機能を果たしており、一方、動脈-静脈内皮細胞間では毛細血管網の形成に重要な機能を果たしていることが示唆された。最後にエフリンB2の特異的モノクローナル抗体の樹立に成功しFACS細胞分離装置によりエフリンB2陽性及び陰性細胞をを単離できるようになり、血管系におけるEph/エフリンシグナルの正と逆方向性シグナルの機能の相違を現在検討中である。このことは血管発生における特有のEph/エフリンシグナルの機能及び血管発生の機構を明らかにするものと考えている。
電子的に安定化された新規含高周期14族元素ベンゼン類の創製と物性の解明

前年度で発生に成功した1,4-ジリチオ-2,3,5,6-テトラフェニル-1,4-ジゲルマベンゼンの単離を目的とし、トルエンから再結晶させたところジゲルマベンゼンそのものの単離はできなかったが、ジゲルマベンゼン同士が二量化した化合物1,2,5,6-テトラゲルマトリシクロ[2.2.2^<1,6>.2^<2,5>]オクタ-3,7,9,11-テトラエンジアニオン(1)が生成し、その特異な構造をX線結晶構造解析により明らかにした。1は溶媒分離イオン対を形成し、トリシクロ体および溶媒和されたリチウムそれぞれがカラム構造をとり、電気的に空孔を二個有しているため今後の物理的性質(導電性や磁化率等)の解明により、新規機能性材料としての応用が大いに期待できる化合物である。また、ジゲルマベンゼンの単離と溶液中における挙動を明らかにするため、置換基であるフェニル基のパラ位にトリメチルシリル基を導入して同様の反応を検討したところ、溶液中における安定性が格段に向上し、室温10分間は観測に耐えられる試料作成に成功した。1,4-ジゲルマベンゼンの単離は今後の課題であるが、必ず克服できるものと確信する。さらに、1,4-ジゲルマベンゼンを含めた1,4-ジメタラベンゼンの理論計算(B3LYP/6-31+G(d))を行ったところ、炭素の系で良く知られている1,4-ジリチオベンゼンは1,4-位にリチウムが共有結合した化学種が最安定であるのに対し、含ケイ素および含ゲルマニウムの1,4-ジメタラベンゼンは二個のリチウムがベンゼン環の上下に架橋した構造が最安定であるという興味深い結果が得られた。これは高周期14族元素にして初めて発現する性質であり、これまでのベンゼン異性体に新たな構造を提案できる画期的なものである。ベンゼン環骨格の1,4-位に2個のゲルマニウムを導入した不安定とされるジゲルマベンゼンの合成研究を行った。すなわち、2,3,5,6-テトラフェニル-1,4-ジゲルマシクロヘキサ-2,5-ジエン(1)にTHF中、-40°Cでt-ブチルリチウムを作用させたところ、1の白色固体は消失し、赤色溶液となった。そのまま反応溶液を室温まで昇温させ、トリメチルクロロシランを加えて反応混合物を捕捉したところ、瞬時に赤色は消失して無色となり、生成物は2個のゲルマニウム上にエチレンが架橋してそれぞれトリメチルシリル基が導入された1,4-ビス(トリメチルシリル)-2,3,5,6-テトラフェニル-1,4-ジゲルマビシクロ[2.2.2]オクタ-2,5-ジエン(2)が得られた。2は各種NMR、元素分析およびX線結晶構造解析により同定した。この捕捉生成物は反応系中にジゲルマベンゼンが生成していることを強く示唆するものである。また、ジゲルマベンゼンが発生していると考えられる赤色溶液にスチルベンを作用させ、引き続きトリメチルクロロシランで捕捉したところ、スチルベンが1,4-位のゲルマニウム上に付加したビシクロ[2.2.2]オクタ-2,5-ジエン類縁体も単離することができた。この研究成果は化合物が極めて嫌気性のために、当補助金により購入した高真空排気装置の活躍が無ければ成し得なかったと考えられる。
言語知識の獲得とその規定要因の解明

第一に言語構造、養育環境(親の働きかけ、メディア環境、家族環境など)、個体要因(物理的世界の認知能力、社会的認知能力、気質、出産時情報など)の言語発達への影響を明らかにした。第二に親の報告から言語発達を測定するマッカーサー乳幼児言語発達質問紙の妥当性が実験と観察データから高いことを明らかにした。第三に言語構造の違い(複数の形態素の有無)が認知へ寄与するかどうか明らかにした。第四に大人の言語との比較を基調に、子供の言語を(i)非対称性、(ii)「幼児語」の音韻構造、(iii)アクセントの獲得、(iv)促音の出現、以上の4つの観点から明らかにした。1,言語獲得の認知的基盤についての文献展望をおこなった(小椋a,印刷中;小椋b印刷中)。この作業から、社会的認知能力(共同注意、意図読み、視点取得)、物理的世界の認知(問題解決、記憶、カテゴリ化)と両能力がかかわるシンボル機能(ふり、模倣、身振り)と、音声処理能力について来年度から実施する観察・実験項目を明らかにし刺激、課題作成を行った。また、馴化-脱馴化法、選好注視法、選好聴取法による乳児の音声処理能力、カテゴリ化能力測定のための実験設備を整備した。2,言語発達の個人差要因の1つである気質についての質問紙の開発を行った。3,マッカーサー乳幼児言語発達質問紙の「語と文法」版の妥当性の検討のために、20-28ヶ月児29名の玩具、絵本場面のVTR録画を行い、子どもの発話のトランスクリプションの作成を行った。また、表出語彙の妥当性検討のために40語の絵カード刺激作成と24ヶ月児でのデータ収集を開始した。4,複数、単数の区別がある言語(英語)と区別がない言語(日本語)で、複数の認識の発達の日米比較実験を23-27ヶ月児に実施した。5,ふりと道具的行為における模倣学習の重要性と2種類の行為に含まれる異なる意図への子どもの気付きの検証を1927ヶ月児、22名に実施した。ふり条件のほうが子どもは実験者の顔を見る事が多く、実験者の意図を理解、共有しようとしていた。6,大人と子供の音韻現象にそれぞれどのような非対称性(asymmetry)が見られるか考察し、幼児語の韻律構造と成人の音韻現象に共通した非対称性が見られることを指摘した。また、摩擦音と閉鎖音の間の有標性の違いが、音韻獲得や方言の音韻現象にどのように現れるかも考察した。1、言語獲得の認知的基盤についての文献展望を行い、言語獲得の基盤としての社会的認知、物理的世界の認知についてあきらかにした(小椋)。2、音声模倣、動作模倣、ふり行動とコミュニュケーション・言語発達との関係について5ヶ月から24ヶ月まで2ヶ月おきの縦断研究を30名について実施している(小椋・板倉)。3、言語獲得の基盤となる母子の共同注視行動について、生後14ヶ月、21ヶ月のままごと揚面を分析した。14ヶ月から21ヶ月にかけて、子どもの対象への先行注視によって開始される共同注視頻度が増加し、子どもは自発的に関心を示したものへの関心が維持されやすいことを受けて、母親は共同注視を継続させるための注意喚起行動を減少させていくという相互作用の変化を起こすことを明らかにした(小椋)。4、日本語マッカーサー乳幼児言語発達質問紙の親の報告と実際の観察揚面での発話の語彙分類、助詞、助動詞から妥当性を明らかにした。語彙、文法とも観察と親の報告の相関はほぼ0.70であった。現在、語彙理解について、17ヶ月児を対象として親の報告と実験室での選好注視法による研究が進行中である(小椋)。5、日本語マッカーサー乳幼児言語発達質問紙の標準化データから、身振り、語彙、文法の急増の時期がパーセンタイル値ごとに異なる実際のデータに適合する言語発達モデル作成のための統計的作業を進めている(稲葉)。6、複数、単数の区別がある言語(英語)と区別がない言語(日本語)で、複数の認識の発達の日米比較実験を19-27ヶ月児に実施した。日米ともほぼ21ヶ月に1と3、1と4の認識が成立することが明らかになった。7、「幼児語」(あるいは育児語)と呼ばれる語彙の音韻構造を分析した。プロソディー構造(語の長さや、音節構造、アクセント構造)において、幼児語とオノマトペ(擬音語、擬態語)に共通性が高いことを明らかにし、大人の語彙との比較を行った。また、プロソディー構造に関して、日本語の幼児語と英語の幼児語の間に共通性が高いことを明らかにした(窪薗)。

1、1歳半の語彙理解、語彙表出を予測する乳児期の社会的認知、物理的世界の認知、環境要因、人口統計学的要因、出産時情報を説明変数とした重回帰分析の結果、語彙理解には、社会的認知における視線に対する感受性が、語彙表出には事物操作の運動実行系が関与していた(小椋・板倉ら、2008)。2、5ヶ月から18ヶ月の縦断研究で音声模倣、動作模倣、事物を介した摸倣の相互関係は身体摸倣と音声摸倣だけに相関があった。身体摸倣は負の年齢推移を、他の摸倣、言語は年齢に伴い増加した。1歳半の語彙表出には音声摸倣、事物を介した系列摸倣が、事物を介した行為の摸倣は語彙理解、語彙表出の両方と相関が高かった(Ogura,Itakura et al,2008)。3、語彙理解について親の報告と実験室での選好注視法による17・18ヶ月児42名の結果はNonprompt条件よりPrompt条件で注視時間が長く、選好注視法による語彙理解測定は有効であったが、親の報告による語彙理解能力の差は選好注視法による語彙理解には反映されなかった(小椋・末次ら,2008)。4、自己認知、他者認知、自己・他者をあらわす語の発達の年齢推移と各関係を17ヶ月から24ヶ月児65名でみた結果、19ヶ月に自己への認知の急激な発達、自己認知と自己をあらわす語の関係はなく、他者認知の成立に伴い、自己・他者を表す語・自分の名前表出は有意な相関が見られた。5、日本語のアクセントの獲得について「すべての語のアクセントが心的辞書に記載され、子供も語ごとにアクセントを獲得する」という従来の考え方に対し、辞書指定を受けるのは有標なアクセント型のみであり、無標なアクセント型は規則によって獲得されるという仮説を立て、それを統計的な観点から実証した。1、母子の共同注視(JA)、母親の働きかけ内容と語彙発達の関係を明らかにした。14、17、21ヶ月各20組母子のJAの頻度などの量的測度と表出語数の有意な相関は観察時点でも追跡時点(24ヶ月、33ヶ月)でも見いだされなかった。母親の働きかけはJA中、非JA中でも、方略、手段、動作内容、発話内容が観察時点や追跡時点の総表出語数に影響があり、また、月齢により言語と関連する働きかけ内容は異なっていた。2、言語発達の媒介要因であることが予想される気質の質問紙を作成し、乳児版553、幼児版638のデータの因子分析から乳児版では3因子(接近、味覚的過敏、周期の規則性)、幼児版では4因子(接近,周期の規則性,自己制御,敏感性)を抽出した。5-30か月の縦断研究から気質の各次元は個人内で安定していること、気質の性差(接近、周期の規則性で男児が、味覚的過敏は女児が有意に高い)、年齢推移(周期の規則性、自己制御は年齢に伴い増加)、精神発達と関連する気質次元(接近と対成人社会性と負の有意な相関、自己制御と対成人社会性と正の有意な相関)を見出した。言語との関係は27ヶ月の表出語数と4,9ヶ月の周期の規則性、18ヶ月の自己制御と正の相関がみられた。3、単数、複数の区別の形態素を有さない日本語獲得児でも英語獲得児と同様22ヶ月で単数-複数の概念を獲得していることを明らかにした。4、日本語の外来語に頻出する促音の生起条件を考察し、「ブック」「マックス」などの外来語と「ダッコ、ポンポン」などの幼児語(育児語)が共通した韻律構造を示すこと、両者に見られる重音節の生起が共通の原理に支配されていることを明らかにした。
分岐分類によるタナゴ亜科魚類の系統分類学的研究

本研究は、日本産タナゴ類の分岐分類によって提唱された3属について、分析形質セットの特徴から、3属の仮説が中国や朝鮮半島のタナゴ類にも適用されるか否かを検証することを目的とする。結論として、3属の仮説は中国や朝鮮半島のタナゴ類にも適用されることが、形態形質およびミトコンドリアの遺伝子による系統解析によっても反証されなかった。以下に具体的な研究成果を年度ごとに報告する。1.平成7年度は中国の採集標本および海外の博物館から借用した標本を基にして分類学的に混乱している種の整理をした。すなわち、Rhodcus sinensisの地理的変異、体色斑紋を研究、また、中国から初めてTanakia lanccolataを発見した(Arai et al,1995)。2.平成8年度は中国、浙江省で染色体数2n=46の種を発見した(Ueda et al.,1996)。また、アジア大陸および日本のタナゴ亜科魚類の系統解析のため、日本産15種-亜種、中国産9種-亜種、朝鮮半島産1種、ヨーロッパ産1種の頭部感覚管の比較解剖を行った。3.平成9年度はアジア産および日本産のタナゴ類のミトコンドリアの12S rRNA遺伝子の塩基配列を研究し、分子系統樹を構築した。その結果、形態および分子による系統樹に矛盾は見られず、Acheilognathus属の単系統性が確認された。また、中国産タナゴ2種の核型を明らかにする(Ucda et al.,1997)とともに、Rhodeus sinensisの種の整理を終えた(Akai and Arai,1998)。タナゴ亞科魚類の系統分類に用いる基礎的データの収集のために、特に中国からの採集標本と海外の博物館からの標本を中心に、分類学的に大きな混乱がある種の分類学的再検討を行った。今まで十分に行われなかった中国産の種からデータを収集できたことは今年度の大きな成果である。得られた結果を簡単に以下に示す。1.中国産タナゴRhodeus sincnsisの地理的変異・体色斑に関する研究英国自然史博物館に保管されている本種の基準標本と中国からの採集標本及び他の借用標本の比較検討を行った。比較に用いた形質は、外部形態、脊椎骨格系、体色斑等である。その結果、これまで混乱していた本種と近縁種とのsynonymyが整理された。中国科学院水生生物研究所から基準標本を借用し、外部形態、脊椎骨格系を中心とした比較検討を行った。その結果、現在中国では無視されていた本種の学名が有効であるということが判明したばかりではなく、本種と近縁種とのsynonymyが整理された。3.ヤリタナゴTanakia lanceolataの分布に関する研究これまで日本と朝鮮半島のみに分布すると考えられていた本種の分布を中国遼寧省から再発見した。本研究で得られた成果は日本魚類学会誌に投稿・発表した(Arai,Xie.and AKai,1995)。タナゴ亜科魚類の系統分類に用いる基礎的データの収集のために、分類学的に大きな混乱がある種の分類学的再検討を行った。また、日本産、中国産、朝鮮半島産を含むタナゴ亜科の比較解剖を行い、今まで殆ど行われなかった種間の類縁関係を示唆するデータを収集できたことは今年度の大きな成果である。

英国自然史博物館から借用した本種の基準標本、中国産のRhodeus lighti,および朝鮮半島産のR.uyekiiの外部形態、脊椎骨、体色斑等の比較研究により、従来、中国の固有種と考えられていたR.lightiが、また、朝鮮半島の固有種と考えられていたR.uyekiiが、R.sinensisと同一種であり、命名の古さから、R.sinensisが本種の有効名であることが判明した(Akai and Arai,印刷中)。2.中国産タナゴの未記載種について3.タナゴ亜科の比較解剖について日本産15種・亜種、中国産9種・亜種、朝鮮半島産1種、ヨーロッパ産1種の成魚を用いて、頭部感覚管および眼下骨の比較解剖を行い、頭部感覚管で9分析形質、眼下骨で6分析形質を識別することができた。バラタナゴ属では、幼魚の特徴を維持している種がみられることから、幼形成熟と種分化の関係が示唆された。タナゴ亜科魚類の系統分類のために収集した日本産、中国産、韓国産の標本に基づき種のsynonymyを整理した。また、頭部感覚管の比較解剖に加え、個体発生、分子系統学的研究をすすめ、属内および属間の類縁関係の解明をはかった。1.中国江蘇省から新種と思われる標本を発見し、未記載種の発表を投稿中である。2. Tanakia lanceolataの個体発生の予備実験を行い、頭部感覚孔原基の形成は受精後50日前後から始まり、100日前後で感覚管が完成することが推定された。3.頭部感覚管の配列、眼下骨の数、染色体数などを分析形質としてタナゴ亜科の系統樹を再構築した結果、Acheilognathus属の単系統性が確認された。4.ミトコンドリアの12SrDNAの塩基配列に基づいて分子系統樹を構築した。最節約樹、最ゆう法および近隣結合法による系統樹はAcheilognathus属の単系統性を支持した。5.日本と中国の研究者により意見の分かれていたPseudoperilampus属の模式種はAcheilognathus属に属することが種系統樹および分子系統樹で支持された。7.タナゴ亜科の単系統性が種系統樹および分子系統樹で支持された。
身体運動は肥満により肥大化した白色脂肪細胞のベージュ脂肪細胞化を促すか

褐色脂肪細胞は熱産生を介してエネルギーを消費する特徴を有することから,抗肥満療法への応用が期待されて以来,さまざまな視点から褐色脂肪細胞の形成について検討されている.中でもベージュ細胞は,白色脂肪細胞からリバーシブルに形成されることが断定されたことにより,その形成促進作用について多くの知見が報告されている.本研究を行う上で,比較対象としてクラシカル褐色脂肪組織へ及ぼす身体運動の効果も検討する必要があると考え,ラットに一過性の走運動を施し肩甲部に発現するクラシカル褐色脂肪組織について検討したところ,褐色脂肪細胞化シグナルは変化しないことが明らかとなった.そこで,継続的な走運動トレーニングによる肩甲部骨格筋の褐色脂肪細胞化について検討したところ,走運動トレーニングにより肩甲部の褐色脂肪組織量は有意に減少することを観察し,この状況下では,褐色脂肪組織と結合している肩甲部骨格筋のPRDM16/PPARgやPRDM16/EHMT1などの複合体の発現が有意に低下し,前者の結合を阻害するTLE3の発現は有意に増加することなどを観察している.さらに,鼠径部の白色脂肪細胞において,高脂肪食摂取群の白色脂肪細胞では,走運動トレーニングによるベージュ脂肪細胞化率が通常食摂取群と比べて低くなることを観察している一方で,走運動トレーニングの有無で比較すると,やはり高脂肪食摂取群でも走運動トレーニング群ではベージュ脂肪細胞の形成が促されることを見出している.最終年度は,検討してきたクラシカル褐色脂肪組織の変化も一軸として見据えながら,高脂肪食摂取群の白色脂肪細胞のベージュ脂肪細胞化に及ぼす走運動の効果について,DNAアレイ解析とパスウェイ解析のデータから調節分子群とそのシグナル伝達に着眼して検討する予定である.関与する因子群が予想よりも多かったため,ターゲット因子の同定に時間がかかっている.最終年度はパスウェイ解析の結果も加味して,シグナル伝達経路も含めてた検討を計画している.一部の白色脂肪細胞は,PRDM16をはじめとする様々な転写調節因子の作用を介して褐色脂肪細胞様のベージュ脂肪細胞へと分化することがほぼ断定された.ベージュ脂肪細胞は褐色脂肪細胞と同様に熱産生を介したエネルギー消費能を有することから,本機能を介した抗肥満療法の確立に期待が寄せられている.一方,肥満により肥大した白色脂肪細胞がベージュ脂肪細胞へと分化するかについてはよくわかっていない.我々は,持久的な走運動トレーニングが肥満個体ではないラットの鼠径部の白色脂肪細胞をベージュ脂肪細胞化させることを観察している.本年度は,走運動トレーニングが本研究の運動様式として適切かを明確にするために,走運動トレーニングにより変化することが報告されている肩甲部褐色脂肪細胞を指標として検討した.走運動トレーニングにより肩甲部の褐色脂肪組織量は一部の先行研究と同様に有意に減少することを観察し,この状況下において,myf5陽性の肩甲部骨格筋におけるPRDM16/PPARγやPRDM16/EHMT1の複合体の発現を介した褐色脂肪細胞化は有意に低下するが,前者の結合を阻害するTLE3の発現は有意に増加することなどを観察した.一連の結果は,我々の走運動トレーニングプロトコルが脂肪組織の変化を導く有用なツールとなることを再確認するものであり,肥満により肥大した白色脂肪細胞のベージュ脂肪細胞化の検討に応用可能であることを示唆している.概ね計画通りに進んでいるが,異動によって走運動用トレッドミルが無い状況にあるため,高脂肪食摂取の有無を加えた水泳運動トレーニングに切り替えての検討を予定している状況にある.走運動トレーニングを施した動物からではあるが,すでにDNAアレイ解析等から標的分子が決まりつつあることを踏まえて,脂肪細胞株を用いた検討を行っている状況である.褐色脂肪細胞は熱産生を介してエネルギーを消費する特徴を有することから,抗肥満療法への応用が期待されて以来,さまざまな視点から褐色脂肪細胞の形成について検討されている.中でもベージュ細胞は,白色脂肪細胞からリバーシブルに形成されることが断定されたことにより,その形成促進作用について多くの知見が報告されている.本研究を行う上で,比較対象としてクラシカル褐色脂肪組織へ及ぼす身体運動の効果も検討する必要があると考え,ラットに一過性の走運動を施し肩甲部に発現するクラシカル褐色脂肪組織について検討したところ,褐色脂肪細胞化シグナルは変化しないことが明らかとなった.そこで,継続的な走運動トレーニングによる肩甲部骨格筋の褐色脂肪細胞化について検討したところ,走運動トレーニングにより肩甲部の褐色脂肪組織量は有意に減少することを観察し,この状況下では,褐色脂肪組織と結合している肩甲部骨格筋のPRDM16/PPARgやPRDM16/EHMT1などの複合体の発現が有意に低下し,前者の結合を阻害するTLE3の発現は有意に増加することなどを観察している.

さらに,鼠径部の白色脂肪細胞において,高脂肪食摂取群の白色脂肪細胞では,走運動トレーニングによるベージュ脂肪細胞化率が通常食摂取群と比べて低くなることを観察している一方で,走運動トレーニングの有無で比較すると,やはり高脂肪食摂取群でも走運動トレーニング群ではベージュ脂肪細胞の形成が促されることを見出している.最終年度は,検討してきたクラシカル褐色脂肪組織の変化も一軸として見据えながら,高脂肪食摂取群の白色脂肪細胞のベージュ脂肪細胞化に及ぼす走運動の効果について,DNAアレイ解析とパスウェイ解析のデータから調節分子群とそのシグナル伝達に着眼して検討する予定である.関与する因子群が予想よりも多かったため,ターゲット因子の同定に時間がかかっている.次年度は,水泳運動トレーニングがベージュ脂肪細胞化や肩甲部の褐色脂肪組織の変化に及ぼす影響について検討する予定である.すなわち,前年度に得られた走運動トレーニングの結果と比較することによって走運動と水泳運動の性質を明確にし,肥満により肥大した白色脂肪細胞のベージュ脂肪細胞化の検討に応用する適切な運動様式を見出す予定である.上記の検討と並行して,DNAアレイ解析等より得られた情報を元に中心的な役割を果たすターゲット分子を特定するとともに,3T3-L1細胞などを用いた過剰発現細胞株の樹立とパルミチン酸処理を介した肥大化3T3-L1細胞のを用いた検討などを介して,メカニズムの解析を試みる予定である.最終年度はパスウェイ解析の結果も加味して,シグナル伝達経路も含めてた検討を計画している.実験試薬の購入に当たり割引期間に購入したものが多かった為に次年度使用額が発生したが,次年度の実験試薬の購入に充てる計画である.
戦前期中国東北部刊行日本語資料の書誌的研究

この研究では、中国東北部で出版された刊行物のうち、日本支配下満洲時期に出版された雑誌の概要を明らかにしようとした。具体的には、この時期の出版法制や官庁刊行物・総合雑誌の一覧を作成し、解題や目次一覧を作成した。その結果、満洲の出版法制についてはその輪郭を提示できた。また大衆誌で、昭和3年から終戦期まで刊行された『月刊撫順』『月刊満洲』の解題や目次一覧も作成し、それらを研究成果報告書(198p)として公刊した。満洲期の雑誌刊行事情の一端を明らかにし得たと考えている。この研究では、これまで手付かずであった、戦前期の中国東北部「満洲」において出版された刊行物のうち、逐次刊行物について、その概要を明らかにし、総合雑誌や官庁刊行物の目次総覧を作成することを目標としている。18年度においては、まず新聞・雑誌・年鑑など逐次刊行物の刊行実態や書誌的事項を明らかにするための基礎作業として、刊行物の名称・刊行者・出版地・創刊年・刊行頻度・時事的問題掲載の有無などについての一覧表を作成することを試みた。次に、それらのいくつかについて、日本・中国において、所蔵機関に出向きその記事内容を調査して複写を行ない、順次それらの雑誌目次一覧の準備をした。具体的な作業としては、こうした作業を行なうための基礎資料として、『満洲国現勢』『満洲年鑑』を購入し、アルバイトをやとって両資料に掲載されている「満洲」における刊行物について、その書誌事項の入力を行なった。また、日本国内では、滋賀県立大学図書館や国立国会図書館、アジア経済研究所、拓殖大学などに出向いて、資料の調査と複写をおこない、さらにOPACによる所在確認のうえ、複写依頼をおこなって関連資料の入手を進めた。この研究の2年目にあたる19年度では、前年度に入力をおこなった逐次刊行物についてその書誌事項などを点検して、一覧表の充実と正確化をはかった。また、国内に所蔵にある資料については、NACSISなど総合目録を検索してその所蔵機関を調査して、目次一覧を作成する資料については、資料調査や複写の作業をおこなった。また中国所蔵資料にあっては、戦前期日本語資料の有力な所蔵機関である遼寧省図書館で雑誌の閲覧をおこない、必要な資料について複写をおこなった。そして、本学大学院のホームページに、これら国内外での資料調査の状況を掲出し、あわせて閲覧資料の紹介をおこなった(http://www.notredame.ac.jp/ningen/study/study2.htm)。ざらに、最終年となる20年度の報告書に掲載する予定の目次一覧については、順次入力の作業をおこなって、その準備につとめた。中国に所蔵の日本語資料の総合目録である『中国館蔵満鉄資料連合目録』(全30巻)を購入してその所蔵状況や書誌事項を確認するのに役立てた。またこの助成の成果の一部として、満洲国において刊行された資料の目録を集成した『満洲国出版目録』全7巻(金沢文圃閣)の復刻刊行についてその刊行の助言をおこない、満洲国出版物の検閲状況などを中心とした解題を執筆した(20年5月刊行予定)。本研究課題は、中国東北部(以下「満洲」)において出版された刊行物のうち、満洲時期に刊行された雑誌について、その概要を明らかにするというものである。具体的には、満洲・満洲国期において刊行された官庁刊行物や総合雑誌について、その一覧を作成し、解題および目次一覧を作成する、という書誌的な作業を展開するというものであった。本年度は最終年度でもあり、前年度、前々年度の研究をいっそう推進するとともに、研究協力者と連絡をとり研究成果報告書としてまとめる作業を重点的におこなった。具体的には以下のとおりである。1、「満洲」時期に刊行された、逐次刊行物について、その書誌的事項を点検して一覧表の完成をめざした。これについては、一覧表は作成したが、その点検等がまだ十分でなく公刊は見送った。2、逐次刊行物の所蔵機関を来訪し、順次目次を調査して入力材料を蓄積し、また解題の作成をおこない、研究成果報告書に掲載した。3、その過程で、挿絵作家竹中英太郎の満洲渡満時期の論考および『月刊満洲』に寄せた表紙挿絵を新しく発見することができ、その論考および英太郎の論考を再入力して報告書にまとめた。4、今年も遼寧省図書館の訪書を敢行したが、その際の訪書記を執筆し今後の調査者の便をはかるとともに、瀋陽(旧奉天)という都市の印象記をまとめた。5、前年度・前前年度に報告した訪書記もふくめた198ページの『研究成果報告書』の刊行をおこなった。
頭蓋骨早期癒合疾患の次世代遺伝子一括診断システムの確立と治療標的分子の探索

頭蓋骨に変化を来す疾患は多数あり、その診断や予後の判断に苦慮することも多い。そこで、現在までに知られている37疾患(種類)、遺伝子28種類について、ベンチトップ型次世代シーケンサを用いた、プロモーター領域を含む遺伝子解析が行える系を構築した。また、原因不明の疾患について全エクソーム解析を行った。結果、76例中、40例(52.6%)に病的バリアントを確認した。病的バリアントは、FGFR2, FGFR3, ASXL1, TWST1の他、ASXL3遺伝子に認めた。加えて、全エクソーム解析によりASXL2遺伝子、FOXG1遺伝子の病的バリアントを認める例を確認できた。H26年度は次世代ターゲットリシーケンス解析、未同定疾患ホールエクソーム解析について以下を行った。1)頭蓋骨早期癒合症に関する次世代ターゲットリシーケンス解析系の構築と解析オンラインメンデル遺伝カタログ(OMIM)に登録されている、頭蓋骨早期癒合等の症状をきたす37疾患の原因遺伝子28種、および、申請者らが同定したOpitz trigonoceohaly C症候群の原因遺伝子CD96、類縁疾患のBohring-Opitz症候群の原因遺伝子ASXL1に関連すると思われる遺伝子を含む、領域濃縮用のパネルを作製した。作製は、HaloPlex(Agilnet社)を基本とし、トライアルによるターゲットリシーケンスにより濃縮(カバー)の低いと判定された領域、プロモーター側の領域についてPCRベースの追加を行い、最終的な遺伝子パネルとした。本遺伝子パネルを用いて、頭蓋骨早期癒合をきたす患児について、実際に遺伝子解析を施行し、FGFR2, FGFR3の遺伝子変異(それぞれp.S252W, p.P250Rなど)を同定した。遺伝子変異は、Sangerシーケンスにても確認し、検証された。本遺伝子パネルは、他の遺伝子変異の有無も同時に確認できることより、他の遺伝子変異の影響も同時に確認できるため、より正確な診断、および遺伝子変異ー症状関連の解析に有用であると思われた。2)未同定疾患患児のホールエクソーム解析三角頭蓋を呈する患児について、CD96遺伝子、ASXL1遺伝子、FGFR1遺伝子のいずれにも変異を認めない症例が確認された。そこで、本人および両親について、書面による同意の後、SeaCapEZ ver3 (Roche社)によるホールエクソームキャプチャーおよび次世代シーケンス解読(HiSeq2500)を行った。H27年度は、次世代ターゲットリシーケンス解析、未同定疾患、全エクソーム解析に関して以下を行った。1)頭蓋骨早期癒合症に関する次世代ターゲットリシーケンス解析系の構築と解析オンラインメンデル遺伝カタログ(OMIM)登録の、頭蓋骨早期癒合を来す疾患の原因遺伝子および申請者の同定したOpitz三角頭蓋C症候群の遺伝子と類縁疾患Bohring-Opitz症候群の原因遺伝子とシグナル伝達に関連する遺伝子群を搭載したカスタムパネルを構築、遺伝子解析を施行した。69例の解析を行い、38例(55%)に対し変異を確認、検証できた。2)未同定疾患の全エクソーム解析三角頭蓋を呈し、CD96遺伝子、ASXL1遺伝子、FGFR1遺伝子のいずれにも変異を認めない症例について、全エクソーム解析(SeqCap EZ v3等使用によるHiSeq2500解読)を行った。マッピング、フィルタリングにより原因候補と思われる変異を抽出した。H27年度は、頭蓋骨早期癒合症に関連した遺伝子パネルの構築を完了し、69例の検体について解析を行い、診断率が約55%であることが判明した。また、原因不明(遺伝子パネルにて遺伝子変異が同定できなかった)症例での全エクソーム解析により、候補と思われる遺伝子変異を抽出できた。よって、H27年度の予定は概ね達成されたと考えられる。1)頭蓋骨早期癒合症に関する次世代ターゲットリシーケンス解析系の構築と解析頭蓋骨早期癒合等の症状をきたす37疾患の原因遺伝子28種、および、申請者らが同定したOpitz trigonoceohaly C症候群の原因遺伝子CD96、類縁疾患のBohring-Opitz症候群の原因遺伝子ASXL1に関連すると推定される遺伝子を含む、一部プロモーター領域も含むゲノム濃縮用のカスタムパネルを用いて、頭蓋骨早期癒合をきたす患児について、実際に遺伝子解析を施行した。76例の解析を実施し、40例(52.6%)病的バリアントを確認、検証した、病的バリアントは、FGFR2, FGFR3, ASXL1, TWST1の他、ASXL3遺伝子病的バリアントを1例に確認した。全て単独の遺伝子の病的バリアントが原因と推定され、今回、用いた遺伝子パネル上で2つ以上の遺伝子に病的バリアントを認める例はなかった。2)未同定疾患患児のホールエクソーム解析三角頭蓋を呈する患児について、CD96遺伝子、ASXL1遺伝子、FGFR1遺伝子のいずれにも病的バリアントを認めない症例について、トリオにて全エクソーム解析(HiSeq2500)を行った。絞り込み、遺伝学的検討、細胞生物学的検討等の結果、1症例はASXL2遺伝子の病的変異を認めた。また、1症例については、FOXG1遺伝子の病的バリアントとの関連が示唆された。本症例は、非典型例と考えられた。3)頭蓋骨早期癒合の分子基盤病的バリアントを認めた遺伝子のin silico解析から、頭蓋骨早期癒合は、2つの経路(FGFRとASXL)が関与していると考えられた。