hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
低分子量G蛋白質Rhoの活性化機構と作用機構

本研究では、Rho低分子量G蛋白質の活性化機構、機能および作用機構について検討した。私共を含めたいくつかのグループによって、Rhoが、アクチン細胞骨格の制御を介して、種々の細胞機能を制御していることを見い出している。本年度の研究において、まず、RhoをADPリボシル化して不活性化するC3を用いて、Rhoの新しい細胞機能についてさらに検討した。その結果、MDCK細胞において、細胞外Ca^<2+>濃度の上昇によって細胞間接着(adherens junctionおよびtight junctionの形成)が誘起されるが、RhoはそのマーカーであるE-カドヘリンのadherensjunctionへの局在、および、ZO-1のtight junctionへの局在に関与していることが明らかとなった。一方、細胞膜上でアクチン細胞骨格の再構成を制御する蛋白質系としてERMファミリー(Ezrin,Radixin,Moesin)-CD44系が知られているが、私共は、すでに、Rhoが細胞内でERMと共に局在していることを明らかにしている。しかし、RhoがERMの機能を制御しているか否かについては不明であった。そこで、本年度の研究において、C3をマイクロインジェクションしたMDCK細胞において、ERMの局在を検討したところ、RhoはERMの細胞辺縁領域への局在を制御していることが明らかとなり、RhoがERMを介してアクチン細胞骨格を制御していることが強く示唆された。今後は、Rhoのこの機能に関与する標的蛋白質を単離し、それがどのような機構でERM-CD44系を介してアクチン細胞骨格の再編成を制御しているのかを明らかにする予定である。以上の結果を得たことにより、本年度の本研究の研究計画はほぼ達成できたと考えている。
凍結・融解による土の不可逆変化メカニズム解明へ、ミクロ～メソ可視化からの突破口

地盤材料が凍結・融解を繰り返す際に、排水条件下では体積の変化、非排水条件下では有効応力の変化など、不可逆な状態変化が起こる。この現象のメカニズム解明を経て、地盤変形解析や防災技術の発展に有用な土質モデルを構築することを目的として室内土質試験・マイクロフォーカスX線CTスキャン・要素モデル化などを含む多面的な研究を開始した。初年度にあたる平成30年度には、X線CTスキャンにより凍結・融解過程を可視化するという、本研究の中心に位置づけたテーマに取り組むため、装置の試作を開始し、実際にX線室内での適用を試行した。高解像度のX線CT画像を取得するためには多層にわたるスタッキングが必要なため、今回用いた最新のCT装置でも1つの状態の撮影に約1時間を要し、この時間中、安定して凍結状態をX線室外から遠隔で制御するためのシステムはほぼ構築が完了した。その結果、試行的に実施したこれまでの凍結・融解実験から、初期は均一であった粘土試料が凍結により不均質化(メソスケールでの多数のクラックの生成)すること、またこのクラックはキャビテーションではなく氷晶が占めていることなどが観察された。これにより、土の凍結・融解に伴う不可逆変化の原因として研究提案時に挙げた3つのメカニズムのうち、少なくとも1つは実際に発現していることが確認された。X線CTを用いた上記試験と平行し、より簡易な装置で粘土の凍結・融解時の体積変化挙動をマクロスケールでより多条件下で観察した。その結果、一般的な有効応力・温度変化履歴に対して比較的正確に不可逆体積変化を予測するモデルの骨子を考案した。本研究は、作業員が立ち入ることができないX線CT室内で応力制御下の凍結・融解繰返し試験を行うというこれまでにない試みを含むものであり、装置の設計等、ゼロから開始した。しかし、装置設計・試作担当の研究代表者とX線施設を所有する研究分担者が密に情報交換を行うことで、2回目の試作にて、目標としていた凍結・融解過程の可視化に成功した。当該助成金の交付が7月末であったことをふまえると、初年度の大きな課題と想定していた上記開発は比較的短期間で順調に達成できたといえる。また、可視化された凍結・融解の定量化についてもツール(画像解析に必要なライブラリとその実装)の整備が進んでおり、不均質化領域の抽出など、まだ課題は残されているものの、取り組んでいく目途がたった。以上は、研究提案時のスケジュールに沿ったものであり、進捗状況は良好であるといえる。凍結・融解過程の内部可視化とは独立したタスクとして計画していた、より簡易な(カメラ撮影による外部からの不均質化の可視化のみ)室内試験についても、提案時のスケジュールに沿って進んでおり、著者らが標準的に用いてきた粘土に対しては異なる応力状態・温度履歴に対して一通りの結果が得られ、先述のモデル化作業に大きく寄与した。この結果は年次講演会レベルでの公表が済んでいる。第三のタスクとして提案していた、多様な土質の凍結特性(NMRによる不凍水分量曲線の同定と不飽和特性との関連付け)については、研究分担者の異動予定により実施が計画より遅くなったものの、現在は取り組みが開始しており、研究期間全体としては完了の見込みがたっている。以上より、初年度の進捗は研究全体として概ね良好であると評価している。今後は、研究提案時に挙げ、上記の通り取り組みを開始している3つのタスクをこれまでの軌道に沿って実施していき、最終年度に当たる本年度(H31年度)の末にかけてとりまとめを行っていく。X線CTによる凍結・融解過程の可視化については、実験実施・撮影の技術は完成に近づいているため、画像解析手法の確立にエフォート配分を移していく。フィルタリングやモルフォロジー変換など、既存の処理手法だけではX線CT特有のアーチファクト補正に対応が困難な場合もあり、新たなアルゴリズムの考案も計画している。凍結・融解実験については、X線室内用・室外用ともに装置自体は安価であるため、設計が完成した時点で複数の装置を製作してデータ蓄積を加速させることも視野に入れている。本研究の主眼は凍結・融解による不均質化の可視化とそれによる土の不可逆状態変化メカニズムの解明にあるが、研究進捗が良好であることや、これまでの国内外での研究討議を受けて、有限要素法など既存の連続体解析手法での変形解析に適用が可能なマクロスケール(土要素としてのスケール)のモデル構築にもエフォートを配分していく予定である。これにより、メカニズム解明型・萌芽的性格である本研究からの結果が、より工学的に有用な形で示されることが期待できる。本研究からの成果は、年次講演会レベルでの公表はもとより、本年度より国際ジャーナルなどより権威ある媒体で公表することを目指していく。

高解像度のX線CT画像を取得するためには多層にわたるスタッキングが必要なため、今回用いた最新のCT装置でも1つの状態の撮影に約1時間を要し、この時間中、安定して凍結状態をX線室外から遠隔で制御するためのシステムはほぼ構築が完了した。その結果、試行的に実施したこれまでの凍結・融解実験から、初期は均一であった粘土試料が凍結により不均質化(メソスケールでの多数のクラックの生成)すること、またこのクラックはキャビテーションではなく氷晶が占めていることなどが観察された。これにより、土の凍結・融解に伴う不可逆変化の原因として研究提案時に挙げた3つのメカニズムのうち、少なくとも1つは実際に発現していることが確認された。X線CTを用いた上記試験と平行し、より簡易な装置で粘土の凍結・融解時の体積変化挙動をマクロスケールでより多条件下で観察した。その結果、一般的な有効応力・温度変化履歴に対して比較的正確に不可逆体積変化を予測するモデルの骨子を考案した。本研究は、作業員が立ち入ることができないX線CT室内で応力制御下の凍結・融解繰返し試験を行うというこれまでにない試みを含むものであり、装置の設計等、ゼロから開始した。しかし、装置設計・試作担当の研究代表者とX線施設を所有する研究分担者が密に情報交換を行うことで、2回目の試作にて、目標としていた凍結・融解過程の可視化に成功した。当該助成金の交付が7月末であったことをふまえると、初年度の大きな課題と想定していた上記開発は比較的短期間で順調に達成できたといえる。また、可視化された凍結・融解の定量化についてもツール(画像解析に必要なライブラリとその実装)の整備が進んでおり、不均質化領域の抽出など、まだ課題は残されているものの、取り組んでいく目途がたった。以上は、研究提案時のスケジュールに沿ったものであり、進捗状況は良好であるといえる。凍結・融解過程の内部可視化とは独立したタスクとして計画していた、より簡易な(カメラ撮影による外部からの不均質化の可視化のみ)室内試験についても、提案時のスケジュールに沿って進んでおり、著者らが標準的に用いてきた粘土に対しては異なる応力状態・温度履歴に対して一通りの結果が得られ、先述のモデル化作業に大きく寄与した。この結果は年次講演会レベルでの公表が済んでいる。第三のタスクとして提案していた、多様な土質の凍結特性(NMRによる不凍水分量曲線の同定と不飽和特性との関連付け)については、研究分担者の異動予定により実施が計画より遅くなったものの、現在は取り組みが開始しており、研究期間全体としては完了の見込みがたっている。以上より、初年度の進捗は研究全体として概ね良好であると評価している。今後は、研究提案時に挙げ、上記の通り取り組みを開始している3つのタスクをこれまでの軌道に沿って実施していき、最終年度に当たる本年度(H31年度)の末にかけてとりまとめを行っていく。X線CTによる凍結・融解過程の可視化については、実験実施・撮影の技術は完成に近づいているため、画像解析手法の確立にエフォート配分を移していく。フィルタリングやモルフォロジー変換など、既存の処理手法だけではX線CT特有のアーチファクト補正に対応が困難な場合もあり、新たなアルゴリズムの考案も計画している。凍結・融解実験については、X線室内用・室外用ともに装置自体は安価であるため、設計が完成した時点で複数の装置を製作してデータ蓄積を加速させることも視野に入れている。
電子顕微鏡による遺伝子の構造と機能の解析

1)チトクロ-ムC展開法によって二本鎖DNA、二本鎖RNAおよび環状一本鎖RNAの観察法を確立した。展開した核酸は白金-パラジウムで回転蒸着して観察した。またBAC展開法による核酸の電顕観察法も確立できた。本法ではウラニル酢酸で染色し、チトクロ-ムC展開法より簡便に核酸が観察出来た。(上田・佐野)2)イネ萎縮ウイルス、イネ黒条萎縮ウイルス、イネラギッドスタントウイルスの全ての分節ゲノム二本鎖RNAを電顕観察してその大きさを決定した。測定値は塩基配列より得られる値とよく一致した。(上田)3)植物病原菌Rhizoctonia属の核外遺伝子と思われる二本鎖RNAを電顕観察したところ線状の遺伝子が観察された。(生越)4)ホップわい化ウイロイド、スモモのウイロイドは、やく50nmの棒状粒子として観察されるが、90%ホルムアミド、60Cの変性条件下で展開すると90100nmの一本鎖状分子として観察された。(佐野)5)テンサイのミトコンドリヤDNAを電顕観察すると0.2851μmの環状分子が観察された。正常と雄性不稔株の間では、0.28-0.6μmの分子間で大きさに差が認められた。葉緑体DNAを電顕観察すると約45umの環状分子として観察され、分子量は約101×10^6と測定された。(木下)6)昆虫病原細菌の結晶性毒素生産遺伝子をコ-ドするプラスミドを、Bacillus thuringensisより抽出し、電顕観察したところ70kbの環状DNAが認められた。(飯塚)7)イネ萎縮ウイルス感染細胞よりバイロプラズムを抽出した。植物磨砕液を分画遠心して超薄切片法で電顕観察すると5,000g分画にバイロプラズム様構造物が同定された。(上田)1)チトクロ-ムC展開法によって二本鎖DNA、二本鎖RNAおよび環状一本鎖RNAの観察法を確立した。(上田)1.チトクロームC展開法によって二本鎮DNA,二本鎮RNAおよび環状一本鎮RNAの観察法を確立した。即ち精製した核酸をチトクロームCと混合して複合体を形成し、水層に展開してメッシュに吸着させた。その後白金-パラジウムで回転蒸着して電顕観察した。2.タバコモザイクウイルスの複製中間体dsRNAを電顕観察した。長さは平均1909nmの線状で、全長が6395塩基対とすると、一塩基対当り0.299nmであった。3.イネ萎縮ウイルス(RDV)とイネラギッドスタントウイルスの分節ゲノムである各々12本、10本のdsRNAを電顕観察した。RDVの11番目と12番目の遺伝子を除いて、その分子量は、電気泳動法で決定したそれとよく一致した。RDVの11,12番目の遺伝子は、やや大きい分子として観察された。本法が遺伝子の大きさを決定する有効な方法であることがわかった。4.ホップ矮化ウイロイドは、本法で約50nmの棒状粒子として観察された。しかし変性剤として90%ホルムアミドを用いて60°Cで展開すると、90100nmの一本鎮環状分子が確認できた。5.テンサイのミトコンドリヤと葉緑体DNAを電顕観察して、その分子形態を明らかにした。

ミトコンドリヤのDNAは、0.2851μmの環状分子であり、正常と雄性不稔株の間では、0.280.6μmの分子間で大きさに差が認められた。葉緑体DNAは、約45μmの環状分子として観察され、これより分子量が約101×【10^6】であることが判明した。1.イネ黒条萎縮ウイルスのゲノムを抽出して, 10本に分節した遺伝子各々について大きさを決定した.ポリアクリルアミドゲル電気泳動で決定された遺伝子の大きさと比較したところ電顕観察の方が9番目と10番目のゲノムで10%以上大きく測定された.2.イネ萎縮ウイルスについて,ゲノムのcDNAを合成し, 10番目の遺伝子の全塩基配列を決定した.電顕観察で測定した同遺伝子の大きさと比較したところよく一致した.3.イネラギッドスタントウイルスのゲノムのcDNAを合成し, 9番目の遺伝子の全塩基配列を決定した.電顕観察で測定した同遺伝子の大きさと比較したところよく一致した.4.植物病原菌Rhizoctonia属の核外遺伝子と思われる2本鎖RNAを電顕観察したところ線状の遺伝子が観察された.5.スモモより分離されたウイロイド様低分子RNAを純化して電顕観察したところウイロイドに特有の環状分子が観察された.6.核酸の電顕用試料作成法として, BAC展開法を開発した.本法は,チトクロームC展開法を較べて,簡便,迅速であり,暗視野観察法と組合せて明暸な電顕像を得た.7.昆虫病原細菌の結晶性毒素産生遺伝子をコードするプラスミドを, Bacillus thuringensisより抽出し,電顕観察したところ70Kb.p.の環状DNAが認められた.1.イネ黒条萎縮ウイルスの分節ゲノム10番の全塩基配列を決定し、昨年度電顕で測定した分子長と比較した。分節ゲノム10番は1805塩基で電顕で測定した値とよく一致した。2.イネ萎縮ウイルスの分節ゲノム9番の全塩基配列を決定し、電顕測定した分子長と比較した。分節ゲノム9番は、1305塩基で電顕の測定値とよく一致した。3.イネ萎縮ウイルス感染イネより、ウイルス複製の場と思われるバイロプラズムを部分純化した。イネ磨砕液を分画遠心した試料の蛋白をSDS-PAGEで検定したところ50gと900g分画には無いが、5,000gと10,000g分画で感染細胞特異蛋白質を検出した。これら分画を電顕観察したところ10,000g分画でのみウイルス粒子が検出された。そこで感染細胞特異蛋白を含み、粒子を含まない5,000g分画を垉理して、超薄切片法で電顕観察したところ、感染細胞のバイロプラズム超薄切片像と同様の構造物が確認できた。以上の結果から5,000g分画がバイロプラズム分画であることが判明した。更に分画よりウイルスゲノム核酸を抽出したところ全ての分画でゲノム核酸が検出されたので、これら核酸とウイルス粒子やバイロプラズム等の関係を現在検討している。1)イネ萎縮ウィルスの分節ゲノム3番と4番の全塩基配列を決定し、電顕で測定した分子長と比較した。3番は3195塩基対で電顕で決定した3258塩基対とよく一致した。また4番は2468塩基対で電顕で決定した2526塩基対とよく一致した。(上田)2)すでに電顕観察したBacillus thuringensis subsp.sottoの他にsubspp.kurstaki HDー1とaigawaiの結晶性毒素産生遺伝子プラスミドも観察した。いずれの分子も環状であり、約70K塩基対と測定された。この値は電気泳動による測定値とよく一致した。(飯塚)3)イネ萎縮ウィルス感染細胞磨砕液の5,000g分画は、電顕の超薄切片観察からバイロプラズム分画と同定された。
気相水和クラスターを用いた核酸塩基水和構造のモデリング：ヌクレオチドへの展開

核酸塩基の水和構造と機能発現との関連をモデリングすることを目的としてこれら核酸塩基の気相水和クラスターの構造解析を行った。その結果、塩基に糖-リン酸基バックボーンが結合したヌクレオチドの水和構造を検討する手法を確立した。本研究費により整備した中赤外レーザー分光装置を用いて、尿酸分子のCO伸縮振動領域のスペクトルを測定した。その結果、尿酸の一水和物について、2つの構造異性体のローカルモード結合様式に大きな違いがあることを見出した。更にこのモード結合様式の水素結合サイト依存性を利用することで、近赤外領域の測定では困難であった、尿酸-メラミンの水素結合錯体の構造決定を明確に決定した。DNAやRNAの結晶構造解析の結果、これらの内部には特定の構造を持った水和殻が存在することが明らかになりつつある。しかしこの第一水和圏を構成する水分子が、分子認識機能にどのような役割を果たしているかを結晶構造から知ることは難しい。そこで本研究では、核酸塩基の水和構造と機能発現との関連をモデリングすることを目的として、これら核酸塩基の気相水和クラスターの構造解析を行った。具体的には、実際のDNAやRNAの構成単位である糖-リン酸基バックボーンが結合したヌクレオチドの微細水和構造を検討した。特に、ヌクレオチドとそのデオキシ体の水和構造の違い、2つの塩基が糖-リン酸基により結合したジヌクレオチドにおける塩基対構造(水素結合型構造とスタッキング型構造)と水和の関連性を検討した。またこれまでの赤外レーザーの掃引可能な波数領域は2000 cm-1以上に限られていたため、塩基や糖のOH/NH/CH伸縮と水のOH伸縮など高波数側の振動スペクトルにより構造決定を行ってきた。しかし、糖-リン酸基バックボーンを含むヌクレオチドの高次構造を決定するためには、それらの骨格振動を含む指紋領域(1000-2000 cm-1)への展開が重要となる。そこで本研究では、中赤外領域でレーザー発振が可能な非線形結晶を導入した。その結果、尿酸分子の中赤外領域の赤外スペクトルを測定することに成功した。同様にして、現在尿酸水和物、ヌクレオチド、ジヌクレオチドの赤外スペクトルの測定を行っている段階である。重要な生体分子の一つである尿酸についてその微細水和構造をモデル化することを目的として、尿酸の水和クラスターをレーザー脱離法を用いて気相孤立化し、中赤外レーザー分光により構造決定を行った。中赤外レーザー光設備は昨年度の本研究により既に整備していたが、種々の技術的な改良を加えることにより得られるスペクトルの質が飛躍的に向上し、質量選別した水和クラスターの中赤外スペクトルを測定することに成功した。レーザー脱離法と中赤外レーザー分光法を組み合わせて、生体分子の構造決定を行った初めての例と思われる。尿酸には3つのCO伸縮振動があるが、その振動数の違いが水和による振動数の低下と同程度であるために、2つ以上伸縮振動が混じり合うという興味ある現象を見出した。一方、近赤外領域におけるNH伸縮振動の場合は、水和による振動数低下が大きいためこのような効果は観測されない。このような水和構造による分子振動数の違いを利用して、中赤外レーザー光により構造異性体を分離することが可能であることを明らかにした。また同様に尿酸とメラミンの錯体についても、中赤外分光を用いて構造決定を行った。メラミンという分子は生体には存在しないが、これが混入した粉ミルクを摂取した乳幼児の尿道や膀胱に結石が形成するのは、メラミンが尿酸と錯体を形成することが原因とされている。結石の化学分析の結果、結石の核となるのは尿酸とメラミンの1:1錯体であると推測されてきたが、本研究により、1:1錯体の構造は従来提案されたものと大きく異なる特異的な構造であることを示した。25-26年度の研究費により整備した中赤外レーザー分光装置を用いて、代表的な生体分子の一つである尿酸のカルボニル基(C=O)伸縮振動領域の赤外スペクトルを測定した。その結果、尿酸の一水和物の2つの構造異性体について、水和サイトによりローカルモード結合様式に大きな違いがあることを見出した。更にこのモード結合様式の水素結合サイト依存性を利用することで、以前に報告した近赤外領域のスペクトルからでは帰属が困難だった、尿酸-メラミンの水素結合錯体の構造決定を明確に行うことができた。この成果は、英国化学会誌のPhysical Chemistry Chemical Physicsに公表した。また我々の研究グループは、フランスで生体分子の赤外レーザー分光を行っているMichel Mons博士のグループ(CEA)と共同研究を行ってきた。本研究グループで博士号を取得した浅見祐也が、Mons博士の研究室で博士研究員として一年滞在し、DNA塩基グアニンに関する共同研究を行った。DNA中に存在するグアニンのケト互変異性体は、電子励起状態の寿命が短いため、ナノ秒UVレーザー光によるイオン化では観測できないとされてきた。そこで、グアニンの一部をナフチル基で化学修飾し電子励起状態の寿命を長くすることを試みた結果、世界で初めてグアニンのケト体を観測することに成功した。更にこの修飾グアニンのC=O伸縮振動スペクトルを測定し、ケト互変異性体であることを明確に示した。この成果は、米国化学会誌Journal of Physical Chemistry Aに公表した。

核酸塩基の水和構造と機能発現との関連をモデリングすることを目的としてこれら核酸塩基の気相水和クラスターの構造解析を行った。その結果、塩基に糖-リン酸基バックボーンが結合したヌクレオチドの水和構造を検討する手法を確立した。本研究費により整備した中赤外レーザー分光装置を用いて、尿酸分子のCO伸縮振動領域のスペクトルを測定した。その結果、尿酸の一水和物について、2つの構造異性体のローカルモード結合様式に大きな違いがあることを見出した。更にこのモード結合様式の水素結合サイト依存性を利用することで、近赤外領域の測定では困難であった、尿酸-メラミンの水素結合錯体の構造決定を明確に決定した。波長可変の中赤外レーザー光を発振させる技術の向上を試みたことで、従来の2倍以上の出力が定常的に得られるようになった。これを用いて赤外スペクトルを測定した結果、スペクトルの分解能が飛躍的に改善された。レーザー分光学および光化学これまでは核酸塩基分子の一つである尿酸の水和構造、メラミンとの錯体の構造の決定を行ったが、今後は核酸塩基に糖やリン酸基が置換したヌクレオシドやヌクレオチドへと拡張し、これらの水和構造を検討する予定である。これらのヌクレオシドやヌクレオチドはレーザー脱離法を用いて気化しても殆ど分解してしまうことが知られている。我々は既に共同研究者(名古屋大学塚本眞樹博士)との研究により、これ等の核酸塩基構造の一部を化学修飾することで非破壊的に気化できることをで明らかにした。本研究でも、これを共同研究者が担当する予定である。共同研究者(塚本眞幸)が合成した種々のヌクレオチド、ジヌクレオチドの質量スペクトルを測定し、現在赤外スペクトル測定を行っている段階である。レーザー脱離法を用いてグアニンジヌクレオド(c-GMP)を非破壊的に気化することに初めて成功した。赤外レーザー分光法を中赤外領域へと拡張し、すでに核酸塩基分子の赤外スペクトルを測定している。13円のため次年度に繰り越す。共同研究者の合成した多くのジヌクレオチドには、レーザー脱離法を用いて気化しようと分解してしまうものが多い。そこでこれらの分子が分解しないような置換基の導入を検討している。共同研究者が中心となってこれらの化学修飾を行う予定である。赤外レーザー分光法を中赤外領域へと拡張する際の問題は、この領域には空気中の水分による強い吸収が存在するため、赤外レーザー光は殆ど吸収される。これを克服するために窒素ガスを用いたパージシステムの作成を行う必要がある。次年度の助成金の一部として使用する予定である。
生体微透析システムによる黄体分泌調節機構の解明(羊を実験モデルとして)

平成6年度は、羊をモデルとして、生体微透析システム(MDS)を1個の自然に形成された黄体(一頭あたり)に直接埋め込み、黄体のホルモン(progesterone:Pおよびoxytocin:OT)分泌に与えるPGF_<2α>およびサイトカインの直接的影響を検索した。さらに、黄体退行現象に関わる活性酸素の役割を、MDSを通してフリーラジカルスカベンジャーを退行中の黄体内へ投与してそのホルモン分泌に及ぼす影響を調べた。1.PGF_<2α>が黄体中のP・OT分泌に及ぼす影響MDSにPGF_<2α>を潅流したところ、高濃度ではP分泌を一時的に刺激した。PGF_<2α>潅流後数時間後にP分泌は3050%減少した。OT分泌は部分的に弱く刺激されたものの、一定の作用としては認識できなかった。この結果は、PGF_<2α>の黄体退行作用は、黄体細胞に直接的だけではなく血流を通して黄体に作用することが必要不可欠な作用経路であることを示している。2.サイトカインの作用MDSで、マクロファージの産物であるIL-1αとTNF-αを投与した。前期黄体ではその作用は認められなかった。一方、中期黄体では、TNF-αの24h潅流によりP分泌が弱く刺激され、黄体のPGF_<2α>分泌も刺激された。これにより、TNF-αは正常な中期黄体細胞にこれまで細胞培養系で示されたような抑制的でなく、刺激的に作用できることが示された。3.フリーラジカルスカベンジャーの作用黄体内にMDSを埋め込んだ後、羊にPGF_<2α>を注射し黄体退行を誘起した。そこにSODやカタラーゼなどのフリーラジカルスカベンジャーを潅流し続けたところ、退行に伴うP分泌の急激な現象が有意に弱められ、本現象に活性酸素が大きく関与していることが示された。以上の一連の結果から、黄体退行に関わるPGF_<2α>、サイトカイン、活性酸素の作用機序の理解が進展した。
シリカネットワークエンジニアリングの提案と高度分離膜の創製

本研究では,シリカアモルファスネットワークの細孔径制御技術として,側鎖および主鎖に各種の官能基を有する構造化アルコキシドの利用を提案した。細孔径1nm以下の評価法であるNormalizedKnudsen-based Permeance法(NKP)を提案した。2個のSiの間に各種官能基を有する橋かけ型アルコキシドであるbis(triethoxysilyl) ethane(BTESE)膜を気体分離(H2/有機ガス),有機水溶液脱水,逆浸透法へ応用し,極めて高い透過率と選択性を示すことを明らかとした本研究では,シリカアモルファスネットワークの細孔径制御技術として,側鎖および主鎖に各種の官能基を有する構造化アルコキシドの利用を提案した。2個のSiの間に各種官能基を有する橋かけ型アルコキシドであるbis(triethoxysilyl) ethane(BTESE)膜を気体分離(H2/有機ガス),有機水溶液脱水,逆浸透法へ応用し,極めて高い透過率と選択性を示すことを明らかとした本研究では,シリカアモルファスネットワークの細孔径制御技術として,構造化アルコキシドの利用を提案している。構造化アルコキシドは有機官能基がSi原子に直接結合したSi-C結合を有し,加水分解後も残存しゲル化する。本研究では,アルコキシドのSi原子数1個および2個以上の構造化アルコキシドを用いて,テンプレート法およびスペーサー法によりシリカネットワーク制御技術の確立を目的とする。以下を本研究の研究実績とする。(1)ゾルの調製:市販されている構造化アルコキシドとして,Si=1ではTEOSの1個のエトキシドをアルキル基で置換した各種のアルキルシランR-Si≡(OEt)_3(R=(CH2)_n:アルキル基としてn=1, 2のMetyl(triethxysilane)およびフェニル基置換のPhenyltriethoxysilaneを用いた。さらに,Si=2としては(EtO)_3≡Si-R-Si≡(OEt)_3(アルキレンR=(CH_2)_nとしてn=1, 2,のBis(triethoxysilyl)methane, Bis(triethoxysilyl) ethaneを用いた。(2)ゾルおよびシリカ粉末の評価:窒素雰囲気および空気雰囲気で熱重量測定を行い,熱分解温度および酸化条件での安定性の検討を行なった。さらに,窒素吸着により各種シリカ粉末の特性評価を行なった。(3)製膜:αアルミナ基材(3および10φ)への製膜を行なった。焼成雰囲気は空気および窒素雰囲気とした。各種の単成分気体透過実験を行なった結果,Siが1個の珪酸エチルTEOSでは約3Aの平均細孔径を有するのに対して,各種構造化アルコキシドを用いることで細孔径を4-7A程度に制御可能なことを明らかとした。(4)透過モデル式の提案:構造化アルコキシドを用いたシリカ膜は,従来法のシリカ膜と比べて細孔径を大きく制御(4-6A)することが可能なことを明らかとした。各種の膜材料を評価するためには,細孔径の評価を行なう必要があるが,4-6Aレベルの細孔径を評価うする手法はこれまで提案されていなかった。200°Cでの気体透過率に基づき,Knudsen透過機構を考慮した細孔径分布評価モデル式を提案した。本研究では,シリカアモルファスネットワークの細孔径制御技術として,構造化アルコキシドの利用を提案している。(1)ゾルの調製:市販されている構造化アルコキシドとして,Si=1ではTEOSの1個のエトキシドをアルキル基で置換した各種のアルキルシランR-Si≡(OEt)_3(R=(CH_2)_n:アルキル基としてn=1,2のMetyl (triethxysilane)およびフェニル基置換のPhenyltriethoxysilaneを用いた。さらに,Si=2としては(EtO)_3≡Si-R-Si≡(OEt)_3(アルキレンR=(CH_2)_nとしてn=1,2,のBis (triethoxysilyl) methane, Bis (triethoxysilyl) ethane,さらにジシロキサン化合物として,1,1,3,3-tetraethoxy-1,3-diethoxy disiloxane (TEDMDS)を用いた。(2)製膜:αアルミナ基材(3および10φ)への製膜を行なった。TEDMSはtemplate法およびspacer法で,細孔径が制御できることを明らかとした。(3)Normalized Knudsen-based Permeanceの提案:1nm以下の細孔透過モデル式として,透過ガス分子径を考慮した修正Gas-Translation modelを提案した。

さらに修正Gas-Translation modelを元に,1nm以下の細孔の決定法としてNormalized Knudsen-based Permeance法(NKP)を提案するとともに,ゼオライト膜を用いて理論の健全性明らかとした。本研究では,シリカアモルファスネットワークの細孔径制御技術として,側鎖および主鎖に各種の官能基を有する構造化アルコキシドの利用を提案している。以下を本研究の研究実績とする。(1)ゾル調製と製膜:市販されている構造化アルコキシドとして,Si=1では珪酸エチルTEOSの1個のエトキシドをアルキル基およびフェニル基で置換した側鎖型アルキルシランを用いた。さらに,2個のSiの間に各種官能基を有する橋かけ型アルコキシドとして,bis(triethoxysilyl)methane(BTESM), bis(triethoxysilyl)ethane(BTESE),さらにジシロキサン化合物として,tetraethoxy-diethoxy disiloxane(TEDMDS), hexaethoxy disiloxane(HEDS)を用いた。αアルミナ基材(3および10φ)へコーティングし,空気および窒素雰囲気で焼成することで製膜を行った。(2)Normalized Knudsen-based Permeanceの提案と細孔径評価:細孔径1nm以下の評価法であるNormalized Knudsen-based Permeance法(NKP)(昨年度提案)を用いて,各種構造化アルコキシドを用いたシリカ膜の細孔径の評価を行った。その結果,側鎖に官能基を有しない場合,Siが1個の珪酸エチルTEOSでは約3Åの平均細孔径を有するのに対して,Si=2のアルコキシドを用いることで細孔径を4-7Å程度に制御可能なことを明らかとした。さらに,側鎖の有機官能基は,シリカ膜の透過性を低くすることを明らかとした。(3)各種の応用分野への応用:気体分離(H_2/有機ガス),有機水溶液脱水,逆浸透法への応用を行った。水素透過率が1x10^<-6>mol/(m^2s Pa)程度,H_2/C_3H_8透過係数比が1,000以上を示すことを明らかとした。さらに有機水溶液の浸透気法に応用した場合,極めた高い水透過透過率3x10^<-6>mol/(m^2sPa),および高い分離係数(水/酢酸>300,水/イソプロピルアルコール>1,000)を示すことを明らかとした。
ＩＣＰ発光分光分析法のための環境にやさしい高感度化技術の開発と応用

ICP発光分光分析法の高感度化を目的として,静電シールド法を適用した。シールドの接地とプラズマ操作条件の最適化によって,いくつかの元素のバックグラウンド等価濃度(BEC)を約410倍向上させることができた。発光スペクトルやプラズマの半径方向における発光強度分布を精査し,BECの向上がバックグラウンドの著しい低下によるものであることを突き止めた。異なる素材のシールドをICP質量分析法に適用し,シールド素材の影響を系統的に調べた。その結果,SUS304が感度,耐久性,コストの点で優れていることを見出した。【シールドの形状に関する検討】ICP発光分光分析法(ICP-AES)において,スリットの入ったシールドを接地できるようにリード線の取り付けやスイッチの挿入などの改良を施し,感度等への影響を検討した。シールドを接地することによって,目的元素およびバックグラウンド(BG)のいずれも発光強度が低下したが,Li,Mo,Tl,Sb,Seについては特にBGの強度が大きく減少した。このため,バックグラウンド等価濃度(BEC)で分析特性を評価したところ,通常のトーチの場合に比べてBECを4から10倍程度向上させることができた。これらの元素においてBG強度が著しく減少する理由を調べるため,プラズマの半径方向における発光強度のプロファイルを測定した。その結果,シールドの接地の有無によらずプロファイルの形状はほぼ同じであった。このことから,BG強度の減少はプラズマの形状の変化によってもたらされたものではないことが分かった。【シールド素材の影響に関する検討】ICP質量分析法(ICP-MS)においてスリットの入っていないシールドを使用し,目的元素やアルゴン分子イオンなどに及ぼすシールド素材の電気伝導率や組成の影響を調べた。目的元素とBGの信号強度の比(SB比)の向上には電気伝導率が低いほうが望ましいが,ただ低ければ良いわけではなく,シールド素材に適した値があることが分かった。また,シールド素材の組成については,Cの含有率が低い鋼種(SUS304およびSUS316L)を用いると,高周波電力の低下に伴ってBGイオンの強度が減少した。特に,SUS304は純正に比べて目的元素(Fe)のSB比が約5倍向上した。純正の代わりにSUS304製シールドを用いると既存の装置を高感度化できるだけでなく,純正の200分の1程度のコストで作製できるため,費用削減の面においても有用であることを見出した。【シールド素材の影響に関する検討】昨年度,ICP質量分析法(ICP-MS)における目的元素やアルゴン分子イオンなどの強度に及ぼすシールド素材の組成の影響を調べた。その結果,目的元素とバックグラウンド(BG)の信号強度の比(SB比)の向上にはステンレス鋼(SUS)が適していることを見い出したが,鋼種によって影響に差があることも分かった。そのため,本年度はSUSの主成分の一つであるNiの含有率に着目して検討を行った。Niの含有率の範囲が1070%の種々の合金を用いてシールドを作製し,目的元素(FeおよびCr)とそれぞれのBG分子イオンの強度を測定した。目的元素の信号強度はNiの含有率が40%のコンスタンタンを用いたときに最大になったものの,BGも増大したため,SB比はNiの含有率が10%のSUS304を用いたときに最も高くなった。この結果からも,ICP-MSのシールド素材としてSUS304が適していることが確かめられた。【プラズマの温度測定】昨年度,ICP発光分光分析法(ICP-AES)において,プラズマの半径方向における発光強度のプロファイルを測定した結果,静電シールドの有無に関わらず,プラズマの形状の変化はほとんど認められなかった。そこで,本年度は3種類のSUS(301,302,304)を用いてシールドを作製し,ボルツマンプロット法を用いてプラズマの励起温度,ガス温度および電子密度の測定を試みた。その結果,励起温度,ガス温度,電子密度のいずれにおいてもシールドの有無による差が認められた。励起温度はシールドを挿入すると低くなる傾向を示すのに対して,ガス温度および電子密度は逆の傾向を示した。また,励起温度,ガス温度,電子密度のいずれも,程度の差はあるものの,素材間で変化が見られた。これらのことから,静電シールドの挿入によってプラズマの励起温度およびガス温度が変化し,このことが干渉抑制効果をもたらした結果,ICP-AESの感度向上につながったのではないかと考えられる。材料分析化学環境分析化学平成25年度の目標の一つとして,シールドの形状の最適化を試みることを挙げたが,この点についてはシールドを接地できるように改良を加えた。その結果,バックグラウンド(BG)強度が大きく低下し,Li,Mo,Tl,Sb,Seのバックグラウンド等価濃度を通常のトーチの場合に比べて約4から10倍向上させることができた。さらに,分光学的な手法によってプラズマの半径方向における発光強度のプロファイルを測定し,シールド接地時のBG強度の著しい減少がプラズマの形状の変化によってもたらされたものではないことを明らかにした。

また,シールドの素材による影響については,ICP-MSを用いて検討を行った。電気伝導率や組成の異なるシールド素材を用いて影響を調べた結果,シールド素材として適した電気伝導率があることやCの含有率が低い鋼種(SUS304およびSUS316L等)がシールド素材として適していることを見出した。以上のように,当初目標としていたシールドの形状による感度向上およびシールド素材の影響について,一定以上の成果を得ることができた。しかしながら,スリットシールドの適用によるICP-AESの感度向上のメカニズムに関しては,感度向上がプラズマの形状の変化によるものではないというメカニズム解明の一助を得たものの,必ずしも十分とは言えないことから,現時点における研究目的の達成度として上記の区分とした。【スリットシールドの適用による感度向上のメカニズムの解明】スリットシールドの適用によるICP-AESの感度向上のメカニズムについて,必ずしも十分に解明することができなかったことから,平成25年度に引き続いて検討を行う。その手法としては,分光学的なプラズマ診断法等を利用してプラズマの温度測定を行い,シールドとICPの状態との因果関係を明らかにしていく。また,ICP-MSにもスリットの入ったシールドを適用し,感度および2次放電に及ぼす影響を調べる。この結果とICP-AESの結果とを相補的に比較することにより,シールドの適用によるICP-AESの感度向上のメカニズムを解明する。【既存の装置への適用と有効性・汎用性の実証】平成25年度の成果と今後得られる知見に基づいて,10倍以上の感度向上が達成できるスリットシールドを設計・試作する。試作したシールドをいくつかの異なるメーカーの装置にも適用し,有効性・汎用性を実証する。【実試料分析への応用】スリットシールドを装着したトーチを用いて,金属材料や環境試料を実際に分析し,共存元素の影響や耐久性などを調べ,スリットシールドの実用性を確認する。【研究成果発表ならびに総括】研究成果を国内の関連学協会ならびに国際会議で発表するとともに,学術雑誌に投稿する。加えて,申請年度内に得られた研究成果の総括を行う。
ポリオウイルスの組織特異的増殖を制御するＩＲＥＳ依存的な翻訳機構の解明

ポリオウイルス(PV)感染は中枢神経系特異的に病変を認めるというトロピズム(指向性)を有する。本研究は、PVのIRES(internal ribosome entry sites)依存的翻訳開始機構を制御する宿主因子を同定し、機能解析を行うことで、PVの中枢神経特異性に寄与するIRES依存的翻訳開始機構の素過程を解明することが目的である。本研究では、生化学的・分析化学的なスクリーニング系を駆使し、神経細胞特異的に発現・機能している宿主因子の候補をいくつか同定した。これらの候補宿主因子の機能解析を通じて、PVのIRES依存的翻訳を介した、中枢神経特異性獲得の分子基盤を明らかにできると考えられる。本研究は、ポリオウイルスのIRES依存的翻訳開始機構を制御する宿主因子を同定し、機能解析を行うことで、ポリオウイルスの組織特異性に寄与するIRES依存的翻訳開始機構の素過程を解明することを最終目的とする。神経特異的に存在すると考えられるポリオウイルスIRESの宿主因子を、効率的かつ網羅的に同定するためには、複数の手段でアプローチすることが最も有効な手段であると考えられる。そこで本年度は、神経細胞特異的に発現・機能している宿主因子を同定するために、以下のような生化学的・分析化学的な実験系の確立に集中した。1.in vitro翻訳系による解析:ポリオウイルスの強毒株および弱毒株由来のIRES依存的翻訳活性を測定する系を立ち上げた。また、神経細胞(SK-N-SH)を用いてin vitro翻訳活性を測定する系を確立した。2,RNA pull-down法による網羅的な解析:λファージのNタンパク質由来ペプチドとGSTとの融合蛋白質、およびN蛋白質によって認識されるヘアピン型RNAであるboxB配列を用いたmRNA pull-down系を導入した。上記1で用いたレポーターRNAにboxB配列を挿入したmRNAを作製することで、IRES RNAのpull-down法を確立した。3.siRNAライブラリを用いたハイスループットスクリーニング:真核生物の翻訳開始は多くのシグナル伝達分子によって複雑に制御されていることから、IRES依存的な翻訳開始機構についてもKinaseやPhosphataseといったシグナル伝達分子が重要な役割を果たしている可能性がある。そこで、IRESに間接的に作用するシグナル伝達分子を同定するために、ヒトのKinaseを標的としたsiRNAライブラリを利用したハイスループットスクリーニング系を立ち上げた。本年度は、昨年度に確立した生化学的・分析化学的なスクリーニング系を駆使し、神経細胞特異的に発現・機能している宿主因子の候補をいくつか同定した。1.ポリオウイルスの強毒株と弱毒株の差異を利用し、強毒株由来のIRES依存的翻訳に必要な宿主因子について、in vitro翻訳系を用いた同定を試みた。2.非神経細胞(HeLa)と神経細胞(SK-N-SH)の細胞抽出液を用いたin vitro翻訳系を駆使し、神経特異的宿主因子の同定を試みた。4.シグナル伝達分子のsiRNAライブラリを用いたハイスループットスクリーニングにより、IRES依存的な翻訳開始に関わるKinaseやPhosphataseの同定を試みた。最終的に、上記スクリーニングにより同定した宿主因子群が、真の神経特異的宿主因子であるのかについて、ポリオウイルス感染神経細胞(SK-N-SH)の細胞抽出液を用いたin vitro翻訳系により再評価した。絞り込んだ宿主因子がIRESのどの領域に結合するのかについて、生化学的アプローチにより評価した。ポリオウイルスの組織特異性に寄与するIRES依存的な翻訳開始機構の素過程を解明するためには、神経細胞特異的に発現・機能している宿主因子を網羅的に同定する系を新規に立ち上げる必要がある。本年度は、計画していた3つの系を全て確立することができた。25年度が最終年度であるため、記入しない。神経特異的に存在すると考えられるポリオウイルスIRESの宿主因子を網羅的に同定するために、本年度は生化学的および分析化学的な解析系の立ち上げを行った。今後は、これらの解析系により単離したタンパク質群を、MS解析(LC-MS/MS)により同定する。また、同定した宿主因子が、ポリオウイルスのIRES依存的翻訳に寄与する真の宿主因子であるかどうかについての再評価を行う。一方で、当初はFirefly luciferase(Fluc)およびRenilla luciferase(Rluc)を用いたレポーター解析の導入を予定していた。

しかしながら、Fluc(61 kDa)やRluc(36 kDa)は分子量が大きく、翻訳活性に与える影響やRNA pull-downにおけるbackgroundの増幅が予想される。現在は、FlucやRlucよりも強い発光強度を有し、低分子量(19 kDa)であるOplophorus gracilirostris由来のLuciferase(NanoLuc)を用いた系に移行中である。25年度が最終年度であるため、記入しない。
寄生原虫トリパノソーマの解糖系酵素はなぜペルオキシソームに局在するのか

寄生原虫トリパノソーマを含むキネトプラスチダ類は、解糖系10酵素のうちの初段7酵素を含む特殊化ペルオキシソーム、グリコソームを持ち、これは病原性の発現に必須である。本研究によって、グリコソームが捕食性の自由生活生物ディプロネマ類とキネトプラスチダ類の共通祖先で成立し、その後キネトプラスチダ類では宿主体内に豊富なグルコースを好適炭素源とする代謝基盤を、ディプロネマ類では被補食生物の主要炭素源であるアミノ酸を中心とするユニークな糖代謝基盤を確立したことが明らかとなった。すなわち、解糖系のペルオキシソーム移行は寄生適応のみならず、補食という生活様式においても有利に働いたことを示している。本研究は、寄生原虫トリパノソーマ類に存在するペルオキシソーム関連オルガネラ、グリコソームの起原とその進化プロセスを解明することを目的とする。グリコソームは、解糖系10酵素のうちの初段7酵素や他の代謝経路酵素群を含む。代謝経路のオルガネラ移行はミトコンドリアや色素体などの細胞内共生体に由来する代謝経路以外には見つかっておらず、その進化原理の解明はトリパノソーマの進化のみならず代謝経路の適応進化を理解する上でも重要である。本年度は、トリパノソーマ類と共通祖先を持つディプロネマDiplonema papillatumについて、ゲノム解読および解糖系酵素の分子系統解析(平成25年度)、およびペルオキシソーム局在タンパクの網羅的解析を実施した。予備実験で得られていたゲノム情報に加えて、さらにリードを増やしてゲノム情報を取得し、解糖系を含む糖代謝関連酵素遺伝子を同定した。ペルオキシソーム局在性タンパクは移行シグナル(PTS)を持つことが知られているが、D. papillatumは初段7酵素でトリパノソーマ類と同じタイプのPTSを持っていた(第6酵素グリセルアルデヒドリン酸脱水素酵素GAPDHを除く)。分子系統解析の結果、第3ホスホフルクトキナーゼPFK、GAPDH、およびホスホグリセリン酸キナーゼについて、D. papillatumとトリパノソーマ類の間で起原が異なることが明らかとなった。次に解糖系各酵素の組換え体に対する特異抗体を作製し、ウエスタン法で酵素の発現を調べたところ、初段ヘキソキナーゼおよびPFKが発現していないことが明らかとなった。予備実験から、D. papillatumが培地中のグルコースを消費しないことが明らかとなっているが、これはPFK活性が失われているためであると推定された。これまでの研究から、トリパノソーマ類と共通祖先を持つディプロネマDiplonema papillatumは培地中のグルコースを消費せずアミノ酸を優先的に取り込むこと、解糖系第3酵素ホスホフルクトキナーゼ(PFK)の活性を持たないこと、PFKを除く解糖系初段6酵素がペルオキシソームに局在することを明らかにしている。本年度は、D. papillatumにおける代謝基盤の解析を実施した。13Cグルタミンを用いたトレーサー実験の結果、グルタミンは直ちにTCA回路に取り込まれ、糖新生経路(解糖の逆行)を辿りペントースリン酸経路の基質となることが明らかとなった。一方、13Cグルコースはほとんど取り込まれず、わずかに取り込まれたグルコースはペントースリン酸経路で代謝されていた。D. papillatumが補食性の原生生物であることを考えると、餌となるバクテリアや原生生物にはフリーのグルコースはほとんど含まれず、アミノ酸が主たる炭素源であり、栄養成分への適応として解糖系に依存しない代謝基盤が成立したと考えられた。これまでの研究から、トリパノソーマ類を含むキネトプラスチダ類と共通祖先を持つディプロネマDiplonema papillatumは培地中のグルコースを消費せずアミノ酸を好適な炭素源としていること、解糖系第3酵素ホスホフルクトキナーゼ(PFK)の活性を持たないこと、PFKと解糖系第6酵素グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)を除く解糖系初段5酵素がペルオキシソームに局在することを明らかにしてきた。本年度はD. papillatumゲノムの再解析と分子系統解析によって、D. papillatumが2つのPFK遺伝子を持ち、どちらもトリパノソーマPFKとは起源が異なることを明らかにした。

すなわち、解糖系のペルオキシソーム移行はキネトプラスチダ類とディプロネマ類の共通祖先で起きたが、その後の進化の方向性は両系統で異なり、ディプロネマ類ではアミノ酸代謝を主体とする糖新生に依存したユニークな代謝基盤を確立し、キネトプラスチダ類ではグルコースを好適基質とする代謝基盤を確立したと考えられる。ディプロネマ類は最も豊富な海洋プランクトンの一群であり、またキネトプラスチダ類は多様な真核生物を宿主とする寄生生物であることを考慮すると、解糖系のペルオキシソーム移行は生物進化の可能性を大きく拡大した進化イベントであったと結論づけられる。寄生原虫トリパノソーマを含むキネトプラスチダ類は、解糖系10酵素のうちの初段7酵素を含む特殊化ペルオキシソーム、グリコソームを持ち、これは病原性の発現に必須である。本研究によって、グリコソームが捕食性の自由生活生物ディプロネマ類とキネトプラスチダ類の共通祖先で成立し、その後キネトプラスチダ類では宿主体内に豊富なグルコースを好適炭素源とする代謝基盤を、ディプロネマ類では被補食生物の主要炭素源であるアミノ酸を中心とするユニークな糖代謝基盤を確立したことが明らかとなった。すなわち、解糖系のペルオキシソーム移行は寄生適応のみならず、補食という生活様式においても有利に働いたことを示している。本研究は極めて順調に進み、当初予定していた研究についてはほぼ全て実施することができた。また、研究が進んだことにより解糖系酵素のペルオキシソーム移行の合理的解釈に向けて更なる解析の必要が生じた。寄生虫学D. papillatumにおける代謝基盤をさらに詳細に解析し、13Cグルコースだけでなく、同位体ラベルしたアミノ酸を用いたトレーサー実験によって糖代謝の全体像を把握することによってD. papillatumの代謝基盤の全貌を明らかにするとともに、トリパノソーマ類のグリコソームがどのような進化プロセスで成立したのかを解明する。平成25年度に予定していたD. papillatumのゲノム解読および解糖系酵素の分子系統解析はすでに達成し、さらに解糖系酵素群のペルオキシソーム局在についても明らかになるなど、研究は格段に進んでいる。研究助成金については研究計画全体を見通した上で経費を配分することが可能となったため、年度単位の経費使用を遵守しつつも無駄を極力排除した結果、当該助成金が生じた。次年度以降については当該助成金を計上し、研究費の無駄な支出を排除しつつ柔軟に運用する予定である。これまでに得られた成果を踏まえ、D. papillatumのメタボローム解析や放射性同位体でラベルした基質を用いたトレーサー実験を行ない、解糖系のペルオキシソーム移行の生理的意義を解明する。D. papillatumにおける代謝基盤をさらに詳細に解析し、13Cグルコースだけでなく、同位体ラベルしたアミノ酸を用いたトレーサー実験によって糖代謝の全体像を把握することによってD. papillatumの代謝基盤の全貌を明らかにするとともに、トリパノソーマ類のグリコソームがどのような進化プロセスで成立したのかを解明する。研究費の節約に最大限努めた結果、支出を押さえることができた。研究は極めて順調に進んでおり、次年度に予定しているメタボローム解析は外部受託の予定である。各種培養条件を変えてD. papillatumのメタボロームを複数回にわたって解析する必要があり、特に高額になると予想されるのでこれに充当する。