hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
放電プラズマ焼結法によるTiB_2-B_4C系複合セラミックスの作製と機械的特性評価

TiB_2セラミックスは,機械的特性が高く金属並みの導電性を有する.また,B_4Cセラミックスは,硬度及び表面平滑性が極めて高い.これらの複合焼結体は,機械的特性が高く導電性を有するので,放電加工が可能となる.放電加工可能な金型用セラミックス素材の開発を目的として,高能率な焼結法である放電プラズマ焼結法(SPS法)により,0100mol%B_4C(20mol%ステップ)を含むTiB_2-B_4C系複合セラミックス焼結体を作製し,機械的及び電気的特性,機械的特性を向上する焼結助剤の影響,放電加工性について特性評価を行った.(1)放電プラズマ焼結(SPS)法により焼結したB_4Cを4060mol%含むTiB_2-B_4C複合体は,焼結助剤無添加でも相対密度96%以上に緻密化を図ることができ,その機械的特性は,ビッカース硬度30GPa以上,3点曲げ強度730MPa以上,破壊靭性(K_<IC>)5.4MPa・m^<1/2>以上,平均表面粗さ25nm以下の鏡面,電気伝導度0.251.32MS・m^<-1>以上が得られ,金属なみの導電性を持つ金型用セラミックス素材として有用である.(2)上記SPS複合体は,温度1950°Cでホットプレス(HP)焼結した同じ組成系と比較して,ほぼ同程度の強度や導電性を有する.(3)上記SPS複合体は,安定な放電加工も可能で,鋼の加工条件で任意形状に高速加工が可能であり,加工後も加工前の70%程度の強度を有する.(4)本複合セラミックス機械的特性を向上させる最適な焼結助剤はA1Nであり,ホットプレス焼結の場合,特に破壊靭性(K_<IC>)を約8.0MPa・m^<1/2>程度まで向上可能で,セラミックスの弱点である脆さも改善できる.金型に本セラミックスを採用することで,金型の長寿命化,耐熱性と耐食性の向上,従来不可能であった素材の型成形が可能となると推定される.TiB_2-B_4C系複合セラミックスは、高い導電性、硬度、強度、靭性を示し、特に放電加工可能なセラミックス型素材、工具材料として極めて有望と思われる。近年、放電プラズマ焼結(SPS)法が開発され、ホットプレス(HP)法よりも1/41/5程度の短時間に、かつ、低い温度で高密度の焼結体を得ることが可能となった。本研究では、TiB_2からB_4Cまで20mol%ステップで組成を変化させたTiB_2-B_4C系複合体を温度1750°C(保持時間は17001750°Cで660s)、プレス圧40MPa、真空中の一定条件でSPS焼結し、(1)SPS焼結体の組成による機械的及び電気的特性の変化、(2)SPS法の有効性、(3)HP法による焼結体との特性比較、(4)型素材としての有効性などを検討した。嵩密度はTiB_2の4092からB_4Cの2336kg・m^<-3>まで一様に変化し、全体として軽くて強い素材が得られた。相対密度は、TiB_2、B_4C単体組成でそれぞれ93.4%、93.1%であったのに対し、2080mol%B_4Cを含む複合組成において相対密度97%以上に向上し、緻密な組織を得ることができた。本複合体の機械的特性は、ビッカース硬度:29.030.4GPa、3点曲げ強度:646770MPa、破壊靭性:5.06.0MPa・m^<1/2>、ヤング率:426549GPa、表面粗さ:20.932.8nmRaであった。SPS法により焼結したTiB_2-B_4C複合体は、短時間で焼結している割合に機械的強度は全体的に高く、硬度、曲げ強度、破壊靭性など型材として重要な機械的特性については、TiB_2、B_4C単体組成のおよそ1.21.9倍に向上できた。複合体の電気伝導度は組成により大きく変化したが、B_4Cを2060mol%含むものは0.25MS・m^<-1>以上あり、安定な放電加工が可能と推定された。HP法と比較した場合、気孔が僅か多い傾向があるが、特性上の極端な差は無かった。以上のことから、特にB_4Cを2060mol%含むSPS法により焼結したTiB_2-B_4C複合体は、放電加工可能な型素材としてほぼ実用域の特性が得られたと考えられる。本研究の成果は、日本セラミツクス協会の学術論文誌に投稿予定である。TiB_2セラミックスは,機械的特性が高く金属並みの導電性を有する.また,B_4Cセラミックスは,硬度及び表面平滑性が極めて高い.これらの複合焼結体は,機械的特性が高く導電性を有するので,放電加工が可能となる.放電加工可能な金型用セラミックス素材の開発を目的として,高能率な焼結法である放電プラズマ焼結法(SPS法)により,0100mol%B_4C(20mol%ステップ)を含むTiB_2-B_4C系複合セラミックス焼結体を作製し,機械的及び電気的特性,機械的特性を向上する焼結助剤の影響,放電加工性について特性評価を行った.

(1)放電プラズマ焼結(SPS)法により焼結したB_4Cを4060mol%含むTiB_2-B_4C複合体は,焼結助剤無添加でも相対密度96%以上に緻密化を図ることができ,その機械的特性は,ビッカース硬度30GPa以上,3点曲げ強度730MPa以上,破壊靭性(K_<IC>)5.4MPa・m^<1/2>以上,平均表面粗さ25nm以下の鏡面,電気伝導度0.251.32MS・m^<-1>以上が得られ,金属なみの導電性を持つ金型用セラミックス素材として有用である.(2)上記SPS複合体は,温度1950°Cでホットプレス(HP)焼結した同じ組成系と比較して,ほぼ同程度の強度や導電性を有する.(3)上記SPS複合体は,安定な放電加工も可能で,鋼の加工条件で任意形状に高速加工が可能であり,加工後も加工前の70%程度の強度を有する.(4)本複合セラミックス機械的特性を向上させる最適な焼結助剤はA1Nであり,ホットプレス焼結の場合,特に破壊靭性(K_<IC>)を約8.0MPa・m^<1/2>程度まで向上可能で,セラミックスの弱点である脆さも改善できる.金型に本セラミックスを採用することで,金型の長寿命化,耐熱性と耐食性の向上,従来不可能であった素材の型成形が可能となると推定される.TiB_2-B_4C系複合セラミックスは、高い導電性、硬度、強度、靭性を示し、特に放電加工可能なセラミックス型素材、工具材料として極めて有望である。著者は、これまでホットプレス(HP)法及び放電プラズマ焼結(SPS)法を用いて特性評価を行い、実用レベルに近い値が得られているが、両法とも黒鉛型を用いた高温焼結をしているため、型の制約がない常圧焼結法の開発を試みた。常圧焼結の場合、焼結を促進する適切な焼結助剤を発見することが最重要課題であり、本研究では、この調査を実験的に行った。TiB_2とB_4C原料粉末の組成比を一定(60mol%:40mol%)とし、そこに焼結助剤として金属系粉末(C、Fe、Co、Ni、C+Feの5種類)をそれぞれ2mol%、セラミックス系粉末(Al_2O_3、Y_2O_3、AlN、TiCの4種類)をそれぞれ10mol%添加し、ボールミルにより24h混合した。顆粒化後、室温で金型プレス成形し、さらに200MPaの冷間等方圧を加え、Ar雰囲気中1950°Cで1時間常圧焼結した。得られた焼結体の機械的及び電気的特性を評価し、常圧焼結に有効な助剤を検討した。特性測定を行った結果、AlNを焼結助剤として添加した場合、他の助剤よりもはるかに良好な特性を得ることができた。具体的には、助剤無添加値→AlN添加値で示すと、嵩密度:2116→2648kg・m^<-3>、相対密度:59.7→75.1%、ビッカース硬度:0.287→5.19GPa、3点曲げ強度:38.6→220MPa、破壊靭性:0.749→3.49MPa・m^<1/2>、ヤング率:100→270GPa、電気伝導度1.23kS/m→458kS/mと大幅に向上できた。しかしながら、本セラミックスは難焼結性であるため、HP法やSPS法によるものと比較して1/31/2程度の特性であり、常圧焼結法では高密度品を得ることが容易でないことが分かった。金型用セラミックス素材として開発したTiB_2-B_4C系複合焼結セラミックについて、ワイヤカット型放電加工機による放電加工特性を評価した.B_4Cを0,20,40,60及び80mol%含むTIB_2-B_4C系複合セラミックス(焼結助剤無添加)を,真空中で温度1680-1750°C,時間720s,プレス圧40.0MPaで放電プラズマ焼結(SPS)し,放電加工特性及び加工面の機械的及び電気的特性、走査型電子顕微鏡(SEM)による加工前後の表面組織変化を調査した.その結果,次のことがわかった.(1)B_4Cを080mol%含むTiB_2-B_4C複合体は,すべて放電加工による切断が可能であった.本研究の初期の目的が達成できた.
代理親出産を利用した希少鳥類増殖技術の開発

始原生殖細胞を用いた鳥類遺伝資源の永久的な保存戦略の構築を試みた。天然記念物である岐阜地鶏の始原生殖細胞をドナーとし、不妊化した代理親用のニワトリ(白色レグホン)のレシピエント初期胚へ移植した。こうして生殖キメラを作出し、宿主自身の精子・卵を全く生産せずに異種由来の精子・卵のみを生産する完全な生殖細胞系列キメラ個体を効率的に作出することが可能となった。また生殖系列キメラを介した岐阜地鶏の再生が可能となった。鳥類において精子の凍結保存技術が確立されているのは精液の採取が可能な一部の家禽に限られている。一方で、卵・胚の凍結保存法は全く樹立されておらず、雌由来の遺伝資源の長期保存が不可能である。そのため、鳥類遺伝資源の安全かつ半永久的な保存戦略の構築が切望されている。本研究は宿主へ移植した始原生殖細胞が機能的な精子および卵に分化することに着目し、精子および卵に代わる新たな鳥類遺伝資源として長期保存しようというものである。本研究においてはドナー系として横斑プリマスロック、レシピエント系として白色レグホン、をそれぞれ利用した。放卵直後の横斑プリマスロック受精卵を培養し発生ステージ15前後の胚を得た。胚の循環血を採取した。これらの循環血を密度勾配遠心分離によって分離した。遠心分離によって得た始原生殖細胞を洗浄し、血液や卵黄、卵白を除去した。形態学的な観察、及びCVHを用いた抗体染色によって、始原生殖細胞のみを厳密に分取し得ることが明らかとなった。ブスルファンを用いて白色レグホンの受精卵を処理した。こうした処理胚を孵卵し胚の生殖腺を採取した。採取した生殖線に、CVHを用いて抗体染色した。この結果、ブスルファン処理した胚の生殖腺において、ほとんどの始原生殖細胞が除去または不活化されていることが明らかとなった。今後は、既に調整済の始原生殖細胞をドナーとして利用する。また、代理親出産の宿主として不妊化した初期胚をレシピエントとして利用する。これらのドナー及びレシピエントを用いてキメラを作出する。これにより、宿主自身の精子・卵を全く生産せずに異種由来の精子・卵のみを生産する完全な生殖細胞系列キメラの作出を試みる。地球環悪化に伴い鳥類においても遺伝資源多様化の保全が脅かされている。家禽において精子の凍結保存技術が確立されているのは精液の採取が可能な一部の品種に限られている。また、卵・胚の凍結保存法は全く樹立されておらず、雌由来の遺伝資源の長期保存が不可能である。そこで、移植した始原生殖細胞が機能的な精子および卵に分化することに着目し、精子および卵に代わる新たな鳥類遺伝資源として長期保存を試みた。生殖系列キメラの作出において、ドナー系として横斑プリマスロック、レシピエント系として白色レグホン、をそれぞれ利用した。横斑プリマスロック受精卵を培養し発生ステージ15前後の胚を得て胚の循環血を採取した。密度勾配遠心分離によって循環血中の始原生殖細胞分離した。形態学的な観察、及びCVHを用いた抗体染色によって、始原生殖細胞のみを厳密に分取した。ブスルファンを用いて白色レグホンの受精卵を処理し、胚の生殖腺を採取した。この生殖線に、CVHを用いて抗体染色し、免疫組織化学的解析を行った。これにより始原生殖細胞が除去または不活化されていることが明らかとなった。既に調整済の始原生殖細胞をドナーとして、不妊化した代理親用のレシピエント初期胚へ移植した。これらのドナー及びレシピエントを用いて生殖キメラを作出した。これにより、宿主自身の精子・卵を全く生産せずに異種由来の精子・卵のみを生産する完全な生殖細胞系列キメラ個体を効率的に作出することが可能となった。近年の地球環悪化に伴い生物多様化の保全が脅かされている。移植した始原生殖細胞が機能的な精子および卵に分化することに着目し、精子および卵に代わる新たな鳥類遺伝資源として長期保存を試みる。生殖系列キメラの作出において、ドナー系として岐阜地鶏、レシピエント系として白色レグホン、をそれぞれ利用した。岐阜地鶏受精卵を培養し発生ステージ15前後の胚を得て胚の循環血を採取した。

形態学的な観察、及びCVHを用いた抗体染色によって、始原生殖細胞のみを厳密に分取した。ブスルファンを用いて白色レグホンの受精卵を処理し、胚の生殖腺を採取した。この生殖線に、CVHを用いて抗体染色し、免疫組織化学的解析を行った。これにより始原生殖細胞が除去または不活化されていることが明らかとなった。既に調整済の始原生殖細胞をドナーとして、不妊化した代理親用のレシピエント初期胚へ移植した。これらのドナー及びレシピエントを用いて生殖キメラを作出した。これにより、宿主自身の精子・卵を全く生産せずに異種由来の精子・卵のみを生産する完全な生殖細胞系列キメラ個体を効率的に作出することが可能となった。また生殖系列キメラを介した岐阜地鶏の再生が可能となった。
PKCとの機能協関に着目したDGキナーゼの機能解析とその応用

DGK・の神経系における機能について調べたところ、DGK・はスパインといった神経細胞特有の形態を維持することにより神経ネットワーク形成、しいては記憶や感情などの脳高次機能において重要な働きをしていると考えられた。ついで、DGK・の腎臓における機能をノックアウト(KO)マウスを用いて調べたところ、糖尿性腎症が早期化及び重篤化することが明らかになった。また、チロシンリン酸化と局在調節の関係も調べた結果、c-SrcはDGK・の22番目及び334番目のチロシンをリン酸化することにより細胞質膜移行を誘導し、一方、c-Ablによる218番目のチロシンをリン酸化は核外移行に必須であることが明らかとなった。ジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)は、PKCや様々な酵素を活性化する脂質シグナルであるジアシルグリセロール(DG)をリン酸化しフォスファチジン酸(PA)を産生する脂質キナーゼである。間接的にPKCを抑制しうるが、その生理機能については未だ不明な点が多い。その一方で、最近心臓や免疫系におけるDGKの重要性が報告されているが、現在DGKを作用点とする薬剤はほとんどない。そこで、本研究ではこれまでの研究に基づき、PKCとの機能協関を念頭におきながら神経系及び腎糸球体機能維持におけるDGKの役割を解明するとともに、将来的なDGKを作用点とするサブタイプ特異的薬剤の開発を目指した。とくに本年度は、神経系における役割に重点を置いた。まず、マウス海馬初代培養細胞にアデノウイルスを用いてGFP-DGKβを発現させ、神経突起の数、分枝の数、スパイン数を測定した。その結果、DGKβを発現させると分枝の数が有意に増加し、スパイン様構造も多く認められるようになった。ついで、Sleeping beautyトランスポゾン法を用いて作製したKOマウスから海馬初代培養細胞を調製し、その形態を調べたところ、分枝数及びスパイン数が有意に減少していた。また、この形態異常はDGKβの過剰発現により改善した。さらに、KOマウスの表現形を解析したところ記憶障害が認められた。そこで、海馬CA1領域のLTPとスパイン密度を野生型と比較したところ、KOマウスではスパイン数が減少していた。これらのことから、DGKβはスパインといった神経細胞特有の形態を維持することにより神経ネットワーク形成、しいては記憶などの脳高次機能において重要な働きをしていることが明らかになった(投稿中)。ジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)は、PKCや様々な酵素を活性化するジアシルグリセロール(DG)をリン酸化しフォスファチジン酸(PA)を産生する脂質キナーゼである。その一方で、心臓や免疫系におけるDGKの重要性が最近報告されている。従って、DGKを作用点とする創薬の開発が望まれるが、現在DGKを作用点とする薬剤はほとんどない。そこで、本研究ではこれまでの研究に基づき、PKCとの機能協関を念頭におきながら神経系及び腎糸球体機能維持におけるDGKの役割を解明するとともに、将来的なDGKを作用点とするサブタイプ特異的薬剤の開発を目指している。本年度は、昨年に引き続き、作製したDGKβKOマウスの解析を行い、海馬及び大脳皮質において、神経突起の分枝数及びスパイン数が有意に減少するとともに、記憶障害が認められることを報告した(業績1)。また感情障害も認められ、この感情障害はリチウム処置により改善することが明らかになった(業績2)。これらのことから、DGKβはスパインといった神経細胞特有の形態を維持することにより神経ネットワーク形成、しいては記憶や感情などの脳高次機能において重要な働きをしていると考えられた。また、糖尿病性腎症に関しては、DGKαKOマウスを入手し、ホモ化までを行った。今後、ストレプトゾトシンを用いて糖尿病を誘発させ、その腎症の発症について野生型と比較する予定である。ジアシルグリセロールキナーゼ(DGK)は、PKCや様々な酵素を活性化するジアシルグリセロール(DG)をリン酸化しフォスファチジン酸(PA)を産生する脂質キナーゼであり、PKCを間接的に抑制する。その生理機能については未だ不明な点が多いが、最近、心臓や免疫系におけるDGKの重要性が報告されている。従って、DGKを作用点とする創薬の開発が望まれるが、現在DGKを作用点とする薬剤はない。そこで、本研究ではこれまでの研究に基づき、PKCとの機能協関を念頭におき、神経系及び腎糸球体機能維持におけるDGKの役割を解明するとともに、将来的なDGKを作用点とするサブタイプ特異的薬剤の開発を目指している。

本年度は、昨年ホモ化に成功したDGKαKOマウスにストレプトゾトシンを投与し糖尿病を誘発させ、腎症の指標である尿量、クレアチニンクリアランスなどを野生型と比較した。その結果、DGKαKOマウスは野生型より早く腎症が重篤化することが示唆された。また、腎糸球体において、DGKαはポドサイトに多く発現していることが示された。ポドサイトはスリット膜を形成し腎濾過機能において重要な働きをしていることから、DGKαはポドサイトの機能を調節することによって腎機能において重要な働きをしていることが示唆された。一方、DGKαの機能調節機構解明の一環として、チロシンリン酸化と局在調節の関係を調べた。その結果、c-Srcは22番目及び334番目のチロシンをリン酸化することによりDGKαの細胞質膜移行を誘導するのに対し(業績2)、c-Ablによる218番目のチロシンをリン酸化は核外移行に必須であることが明らかとなった(業績1)。これらの事実は、DGKαは異なるチロシンリン酸化を介して、その構造や結合タンパク質などを変化させることにより、その局在、すなわ「いつ、どこで働くか」を決定していることを示唆していた。
長寿遺伝子Sir2の加齢性心疾患における病態生理学的意義と治療応用

加齢性心疾患である虚血性心疾患、脳卒中、心房細動罹病因子に関し5千名を超す約13年間の臨床研究コホートを用い、加齢による変化を捉えることに注目し危険因子を検討した。臨床研究で遺伝子検査にはハードルがあり今回施行していない。加齢による心電図での時計方向心臓回転、左軸偏位(LAD)、左室高電位(LVH)所見の割合増加、脳梗塞罹病における高齢者でのPR延長の重要性に関して示した。循環器病罹病に関し予後良好因子として心電図での反時計方向心臓回転所見、危険因子としてLAD、LVH、PR延長を示した。また心房細動罹病危険因子として心電図でのLVH、尿酸高値、軽度徐脈、体表面積高値、高身長を示した。加齢性心疾患である虚血性心疾患、心房細動、脳卒中罹病因子に関し、臨床研究として吹田コホートを用い、受診者診察、採血、生理検査、予後調査を行い、危険因子につき検討した。様々な心電図所見から、加齢性循環器疾患罹病にいたる可能性につき、循環器病既往のない30歳以上を対象とした5千名を越す研究参加者で、平均約13年間追跡した結果を検討した。洞調律時、12誘導心電図の移行帯位置には時計方向、反時計方向があるが、これらと循環器病(虚血性心疾患、脳卒中)発症との関連を検討したコホート研究はなく、関連を検討した。ベースライン時、反時計方向群、正常回転群、時計方向回転群となるにつれ高血圧罹患率が有意に増加した。また、時計方向回転割合は30歳台で有意に少なく、加齢により増加した。反時計方向回転をもつ女性は、その後の循環器病罹病が有意に少なく、予後良好因子であることを示した。12誘導心電図の左軸偏位は明瞭な指標であり、高血圧や死亡との関与も指摘されているが、これらと循環器病発症との関連をコホート研究で検討した。加齢により左軸偏位の割合が有意に増加した。女性では心電図の左軸偏位はその後の循環器病罹病リスク上昇と有意に関連しており、簡便かつ有用な予測マーカーであることを示した。心電図上PR間隔が延長していることと循環器病発症との関連をコホート研究で検討した。ベースライン時、PR間隔延長群は正常群と有意な年齢差を認めなかったが、その後の脳卒中罹病に有意に強く関与し、それは高齢者に限定された。つまり、高齢者でPR間隔延長を指摘した場合には、若年者と同様に対応せず、高齢者特有の対応や介入が必要な可能性が示唆された。心電図上、左室高電位(LVH)を持つ割合は加齢で増加した。LVH所見はその後の循環器病罹病リスク上昇に高血圧者で有意に関連していた。また、LVHはその後の心房細動罹病にも有意に関与した。加齢性心疾患である虚血性心疾患、心房細動、脳卒中罹病因子に関し、臨床研究としてコホートを用い、受診者診察、採血、生理検査予後調査を行い、危険因子について検討した。様々な因子につき、加齢性循環器疾患罹病にいたる可能性につき、循環器病既往、心房細動既往のない30歳以上を対象とした5千名を越す研究参加者で、平均約13年間追跡した結果を検討した。ベースライン時、PR間隔延長群は正常群と有意な年齢差を認めなかったが、その後の脳卒中罹病に有意に関与し、それは高齢者に限定された。つまり、高齢者でPR間隔延長を指摘した場合には、若年者と同様に対応せず、高齢者特有の対応や介入が必要である可能性が示唆され、これを2014年のAmerican Heart Association学会で報告した。LVH所見はその後の心房細動罹病リスク上昇に有意に関連していた。また、心電図上ST-T変化をもつ人を除いたLVH者においても、高血圧を合併するとその後の心房細動罹病リスクが有意に上昇していた。このことから加齢において高血圧のみならず、心電図上のLVHの所見に関しても高齢者への介入が心房細動罹病予防に有用となる可能性が示唆された。加齢により心拍数が減少し、ペースメーカー植え込みになる患者が増加することはよく知られているが、今回軽度の脈拍低下があることが、その後の心房細動罹病に有意に関連していることを示した。これから高血圧加療においても過度に脈拍数を減少させることへの危険も示唆された。加齢性心疾患である心房細動、虚血性心疾患、脳卒中罹病因子に関し、臨床研究として吹田コホートを用い、受診者診察、採血、生理検査、予後調査を行い加齢による変化を捉えることに注目し危険因子を検討した。循環器病(虚血性心疾患、脳卒中)既往、心房細動既往のない30歳以上を対象とした5千名を超す研究参加者で、平均約13年間追跡した結果を検討した。ベースライン時の解析はχ2検定で、Hazard Ratio(HR)算出はCox比例ハザードモデルを用い、年齢、性、Body Mass Index、高血圧、脂質異常症、糖尿病、喫煙、アルコール、腎臓病などの交絡因子を加味して解析した。臨床研究で遺伝子検査にはハードルがあり今回施行していないため次に期待したい。

加齢による心電図での時計方向心臓回転、左軸偏位(LAD)、左室高電位(LVH)所見の割合増加、脳梗塞罹病における高齢者でのPR延長の重要性に関して示した。循環器病罹病に関し予後良好因子として心電図での反時計方向心臓回転所見、危険因子としてLAD、LVH、PR延長を示した。また心房細動罹病危険因子として心電図でのLVH、尿酸高値、軽度徐脈、体表面積高値、高身長を示すことができた。本研究成果は心電図、採血、身体検査を用いたこれらの簡便な今後の循環器疾患罹病に対する危険因子スクリーニングにより、病気の早期発見、予防、教育ができるという点に加え、高齢社会での医療経済学的にも重要な点になると考えられる。加齢性心疾患である虚血性心疾患、脳卒中、心房細動罹病因子に関し5千名を超す約13年間の臨床研究コホートを用い、加齢による変化を捉えることに注目し危険因子を検討した。臨床研究で遺伝子検査にはハードルがあり今回施行していない。また心房細動罹病危険因子として心電図でのLVH、尿酸高値、軽度徐脈、体表面積高値、高身長を示した。加齢による変化を捉えることに着目した、加齢性心疾患である虚血性心疾患、心房細動、脳卒中罹病因子同定に関してのコホート研究は十分な成果が出ている。循環器内科学現在まで行ったコホート研究に関してのまとめを順次おこなっていく。遺伝子の関与検索に関しては、他の検査と同様には扱えず高いハードルがあるため現時点では施行できていない。加齢による変化をとらえることに注目した、加齢性心疾患である虚血性心疾患、心房細動、脳卒中罹病因子同定に関してのコホート研究は十分な結果が出ている。今年度は物品費が少なく抑えられたこと、研究成果報告費用が今後予想され、次年度用使用額が生じた。現在のコホート研究に関しては今年度も同様な研究を施行し推進していくことが十分可能である。遺伝子の関与検索に関しては、他の検査と同様には扱えない部分もあり、また費用の問題もあるため、臨床研究か、基礎研究併用かに関しては今後検討である。進行状況に影響される。また、実績がでているため報告と論文化に多くの費用がかかることが予想される。今年度は物品費が少なく抑えられたこと、研究成果良好のため今後の実績報告費用が多大に必要なることが予想され、次年度用使用額が生じた。また、実績が出ているため報告と論文化に関しての費用が多くかかることが予想されている。
しなやかさ・タフさ・機能性を有する機能性メタルベースMEMSのスマート生産技術

最終年度は、前年度までに実施したチタン、チタン合金の微細加工装置・作製技術の開発成果、耐久試験の成果(加工損傷の影響を受けにくい)をもとに、実際に、カンチレバーまたはダイヤフラムの基本構造を有するタフなセンサ・マイクロマシン(MEMS)の試作研究を実施し、センサ・デバイス作製のための作製工程の検証を行った。当該分野では、シリコンMEMSの先行例があるが、チタン、チタン合金は、研究例が少なく、作製工程の一工程ごとに新たな課題が発見されその解決が求められた。特に、陽極接合と絶縁処理の工程の確立は困難であった。まず、接合工程では接合力が弱く剥離する現象が見られた。前例となるシリコンとパイレックスガラス間の陽極接合では、両材料間の熱膨張係数の一致と表面粗さの低減が重要であると知られている。チタン、チタン合金とガラスの場合では、熱膨張係数が一致するソーダーガラスを使用し、チタン、チタン合金の表面粗さを10 nm以下にし陽極接合を実施したが接合不良が発生した。その原因について、接合面の観察から、うねりや平坦度が関与していることを突き止め、平坦度を改善したウェハを使用し接合することに成功した。次の課題の絶縁工程では、酸化膜皮膜にクラックや穴が開く現象が見られた。これは、処理工程で500度近い温度で熱処理するために、熱膨張係数の違いが原因として考えられ、熱膨張係数の近いアルミナを使用することで改善することができた。さらに、処理工程を複数回にすることで、ほぼ完全に絶縁することに成功した。以上に述べたように、研究期間内に課題を解決することができたが、成果発表や研究展開はこれからの段階であり、実績は不十分なままで研究期間を終えた。しかし、本研究支援により、タフなMEMSの基本となる加工・接合・堆積の全工程で作製技術を確保するなど基盤技術の確立に成功し、次の展開への準備を完了することができた。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、タフなセンサ・デバイス(タフMEMS)のための基盤的技術を発展させるために申請者らが有する「熱アシスト型反応性イオンエッチング法」を用いて、まず、初年度は、機能性メタルの加工と形状制御技術を確立し、次年度以降は、加工技術の改善をしつつ、それらの加工片を用いた表面処理(アニール、それによる合金化等の改質による機能強化を含む)および機械、電気的な特性と耐久性を評価し、進捗状況に応じて応用の探索を行うことである。初年度は、具体的な研究成果として、まず、熱アシスト型反応性イオンエッチング装置の試験装置を完成させた。さらに、シミュレーションのアシストによる自己加熱ステージの設計と実際の温度との比較評価を実施しシミュレーションを実機作製の設計支援として利用できることを示した。最後に、新しく設計したステージによる各種機能性メタルの加工特性も明らかにすることができた。以上の成果を、国際会議で2件発表し、論文2報が学術雑誌にアクセプトされた。本研究では、上記の基盤技術の研究推進だけでなく、タフMEMSへ向けたスピンアウトとしての応用研究も加速させた。例えば、確立したシミュレーションによる設計支援により、大面積への対応を想定した3次元の自己加熱型ステージを設計した。実際に、チタン合金の加工への適用を行い、プラスチック成型用金型として対応できる形状制御にも成功した。まだ、完全な形状制御には至っていないが、開発した技術の改良で十分に対応できる見通しである。以上に述べたように、当初計画を大幅に超える成果を得ることができた。現在までに、当初の計画に記したシミュレーションによる設計支援技術や製造装置の試験機の開発に成功した。また、機能性メタルの加工特性を明らかにすることができた。さらに、実用課題として大きな壁である大面積化への対応を解決可能な新しい自己加熱ステージの考案と実機上での性能証明にも成功し、本研究の完了後に実施予定であった応用研究であるプラスチック成型用のタフな金型の開発へと研究を進展させることができた。以上の理由から、当初計画以上に進展していると判断した。本プロジェクトにおける研究項目は、(A)加工装置と条件評価、(B)表面処理(改質による機能強化)、環境ストレス印加、(C)耐久性評価(機械・電気的特性評価)、(D)実試験(実装と現場レベルの耐久性試験)となっています。平成29年度は、研究項目(A)については、ウェハの交換を迅速にできる自己加熱式ステージを熱シミュレーションをもとに設計し、実機上での性能試験まで実施しました。新しく考案したステージにより生産工程全体の高速化に成功しました。本成果は、6月に開催される国際会議で発表する予定です。マイクロファブリケーションに関する本成果は、チタン系材料を用いた実用研究(D)の推進に繋がると期待されます。研究項目(B)については、成膜装置の故障で中断してしまいました。追加の設備導入を本研究費で実施することは、予算を超えるので、代案として微小元素が含有されている合金を直接加工するマイクロファブリケーション技術の向上により、関連する研究項目(C)および(D)に影響がないように進めています。研究項目(C)については、本プロジェクトのマイクロファブリケーション技術で加工した部品であってもバルク材料の材力特性とほぼ同じ特性が得られることを確認できました。開発したマイクロファブリケーション技術では、センサ・デバイス応用上で重要な加工損傷により機械特性の大幅な劣化はないことが確認されました。ただし、前述の設備故障の影響もあり環境試験については遅れています。

研究項目(D)は本年度からの実施項目ですが、チタン合金製のマイクロ金型、マイクロメスの試作を終えて、試験を実施している状況です。本年度は、研究項目(A)の加工装置と条件評価について、ウェハの交換を迅速にできる新しい自己加熱式ステージを熱シミュレーションをもとに設計し生産工程全体の高速化に成功するなど、予想以上の成果を得ました。また、開発したマイクロファブリケーション技術をもとに、研究項目(D)の応用面について、加工面が平滑なチタン合金製マイクロ金型やしなやかで柔軟なマイクロメスの作製が可能になるなどの進展がありました。しかし、研究項目(B)の表面処理(改質による機能強化)、環境ストレス印加については、設備故障によって中断するなどの影響がありました。これは、現状の予算で対策ができないため、あらかじめに機能強化されている材料を加工することで代替しようと試みています。以上、大きく進展した研究成果とほぼ中断に近い状態の研究成果があるため、総合的には、おおむね順調に進展していると判定しました。最終年度は、前年度までに実施したチタン、チタン合金の微細加工装置・作製技術の開発成果、耐久試験の成果(加工損傷の影響を受けにくい)をもとに、実際に、カンチレバーまたはダイヤフラムの基本構造を有するタフなセンサ・マイクロマシン(MEMS)の試作研究を実施し、センサ・デバイス作製のための作製工程の検証を行った。当該分野では、シリコンMEMSの先行例があるが、チタン、チタン合金は、研究例が少なく、作製工程の一工程ごとに新たな課題が発見されその解決が求められた。特に、陽極接合と絶縁処理の工程の確立は困難であった。まず、接合工程では接合力が弱く剥離する現象が見られた。前例となるシリコンとパイレックスガラス間の陽極接合では、両材料間の熱膨張係数の一致と表面粗さの低減が重要であると知られている。チタン、チタン合金とガラスの場合では、熱膨張係数が一致するソーダーガラスを使用し、チタン、チタン合金の表面粗さを10 nm以下にし陽極接合を実施したが接合不良が発生した。その原因について、接合面の観察から、うねりや平坦度が関与していることを突き止め、平坦度を改善したウェハを使用し接合することに成功した。次の課題の絶縁工程では、酸化膜皮膜にクラックや穴が開く現象が見られた。これは、処理工程で500度近い温度で熱処理するために、熱膨張係数の違いが原因として考えられ、熱膨張係数の近いアルミナを使用することで改善することができた。さらに、処理工程を複数回にすることで、ほぼ完全に絶縁することに成功した。以上に述べたように、研究期間内に課題を解決することができたが、成果発表や研究展開はこれからの段階であり、実績は不十分なままで研究期間を終えた。しかし、本研究支援により、タフなMEMSの基本となる加工・接合・堆積の全工程で作製技術を確保するなど基盤技術の確立に成功し、次の展開への準備を完了することができた。現在までに、科学研究費補助金として研究すべき基礎的な研究事項、伝熱工学、材料力学、工業材料学を基にした加工装置の設計を実施し、代表的な機能性メタルについての加工特性も明らかにすることができた。
光・動力・熱力スケーディングエネルギー変換システムの構築をめざす熱レーザーの研究

燃焼により得られる高温高圧エネルギーを直列カスケード的にレーザ光、動力、熱に変換する、3形態のエネルギー変換システムを提案する。本研究では本システム構築のための必要条件の抽出および熱レーザの発振に関する要素研究を実施した。先行研究で明らかにされているCO_2の反転分布により誘導放出される赤外レーザ発振条件のうち、ガスタービン設備等の兼ね合いから燃焼温度および圧力条件が全く異なること、および炭化水素の燃焼反応により連続的なレーザ媒体の発生が可能であるが、レーザ媒体中H_2O分率の増大に伴い励起CO_2は失活する確率が大きくなるため、反転分布状態のCO_2分子数が減少することが最大の課題点と考える。レーザ発振に必要な反転分布状態の確認における実験的検討および理論解析により得られた知見を以下に示す。・レーザ発振部ではレーザ媒体の流速を燃焼条件により決定される所定の超音速状態に設定する事により低準位CO_2分子の振動温度が並進温度に急激に近づき、ボルツマン分布に則らないCO_2分子の反転分布状態の形成が可能であるということが示唆された。・上記CO_2反転分布状態の確認のため10.6μm単一波長のヒーレントプローブ光を用いてゲイン計測を行ったところ燃焼反応における酸化剤中O_2/N_2比と酸化剤の燃料当量比がゲインに大きく影響を与えた。・燃料となるメタンの酸素富化燃焼反応は燃焼ガス組成や燃焼ガス温度が大幅に高いという点で一般の空気燃焼とは異なり、レーザ媒体中のO_2、H_2Oの振動準位(それぞれ1595,1556cm^<-1>)が接近しているためそれらが相互失活することで上準位CO_2分子の維持される確率が増大した結果、正ゲインが得られたと考えられる。燃焼により得られる高温高圧エネルギーから直列でカスケード的に「レーザー発振(光)」,「ガスタービン駆動(動力)」,「スチーム発生(熱)」を行うことにより3形態のエネルギーを得る、新規の複合エネルギー変換システムである「光・動力・熱カスケーディングエネルギー変換システム」を提案する。本研究では本システムを構築するための、システム設計と必要条件の抽出、および要素研究(熱レーザーの発振)を実施する。特に光エネルギーとして最も質的に高い「レーザー光」を、大容量で発生させることに着目し、その高効率化・高出力化が可能となれば、化学プロセス分野において、メソプロセス技術(レーザー誘導反応,レーザー分離,高密度加熱,精密加工)、および新しいエネルギー輸送手段など、広範な応用技術の展開が期待される。高温高圧燃焼ガスを超音速ノズルを通して断熱膨張させた場合、レーザー発振を可能にする反転分布が、燃焼ガス中の二酸化炭素分子で達成されることを確認した。しかし、理論的考察から、本熱エネルギーから光エネルギーへの変換効率が数%程度が現在の条件では限界であることが予測される。本研究では、先行研究にて明らかにされてきたレーザー発振条件のうち、ガスタービン設備等の兼ね合いから圧力条件が全く異なることが最大の課題と考えられるが、本複合エネルギー変換システムに合致する、高容量のレーザー光を発振できるレーザー発振システムの実証を目的として、提案したエネルギー変換システムのシステム設計により得られた作動条件におけるレーザー発振部作動流体の流動状態の解析、及び燃焼ガス中各化学種の挙動が反転分布に及ぼす影響を数値解析により考察し、以下の結果を得た。1)本システムの燃料であるメタンを酸素富化燃焼させることにより、レーザー発振に可能な高圧高温場を容易に得る事が可能であるが、レーザー媒体である燃焼ガスに含まれる水分割合とレーザー発振に必要な反転分布確率がトレードオフであることが判明した。2)レーザー発振部ではレーザー媒体の流速を所定の超音速状態に設定する事により、反転分布状態が可能であるということが示唆された。

燃焼により得られる高温高圧エネルギーを直列カスケード的にレーザ光、動力、熱に変換する、3形態のエネルギー変換システムを提案する。本研究では本システム構築のための必要条件の抽出および熱レーザの発振に関する要素研究を実施した。先行研究で明らかにされているCO_2の反転分布により誘導放出される赤外レーザ発振条件のうち、ガスタービン設備等の兼ね合いから燃焼温度および圧力条件が全く異なること、および炭化水素の燃焼反応により連続的なレーザ媒体の発生が可能であるが、レーザ媒体中H_2O分率の増大に伴い励起CO_2は失活する確率が大きくなるため、反転分布状態のCO_2分子数が減少することが最大の課題点と考える。レーザ発振に必要な反転分布状態の確認における実験的検討および理論解析により得られた知見を以下に示す。・レーザ発振部ではレーザ媒体の流速を燃焼条件により決定される所定の超音速状態に設定する事により低準位CO_2分子の振動温度が並進温度に急激に近づき、ボルツマン分布に則らないCO_2分子の反転分布状態の形成が可能であるということが示唆された。・上記CO_2反転分布状態の確認のため10.6μm単一波長のヒーレントプローブ光を用いてゲイン計測を行ったところ燃焼反応における酸化剤中O_2/N_2比と酸化剤の燃料当量比がゲインに大きく影響を与えた。・燃料となるメタンの酸素富化燃焼反応は燃焼ガス組成や燃焼ガス温度が大幅に高いという点で一般の空気燃焼とは異なり、レーザ媒体中のO_2、H_2Oの振動準位(それぞれ1595,1556cm^<-1>)が接近しているためそれらが相互失活することで上準位CO_2分子の維持される確率が増大した結果、正ゲインが得られたと考えられる。
PET トレーサを応用した標的蛋白発現トリガー/安定化リガンドによる癌治療法の開発

本研究では、PETトレーサにより標的蛋白発現トリガー/安定化リガンドを腫瘍組織まで誘導し、標的癌細胞で選択的遺伝子/蛋白発現や発現させた不安定化蛋白を標的癌細胞内で安定化させることより、腫瘍細胞により特異的な効果をもたらす治療法の礎となる基礎的実験を試みた。扁平上皮癌細胞の遺伝子発現系の変化に加え、外部からの刺激による変化でもSTAT系シグナルの変動が見られ、また薬剤抵抗性にSTAT系シグナルの関与が示唆された。選択的調節発現系の設計には、STAT系シグナルの制御が重要と思われた。平成23年度に得られた結果を踏まえて、in vitroとin vivo実験を展開し、併せて抗腫瘍効果の捕捉実験を培養細胞系において行い、以下の結果を得た。扁平上皮癌細胞に対する標的遺伝子・蛋白の発現による抗腫瘍効果の評価を目的にin vitroとin vivo実験を行なった。in vitroにおいて標的遺伝子・蛋白の発現による細胞死誘導をMTS assayやTUNEL法にて確認した。同様に担癌マウスを用いてこれらによる細胞死誘導を確認した。癌組織周囲あるいは癌細胞自身から発現されるサイトカインやその関連因子によって口腔扁平上皮癌細胞の形質に影響を及ぼし、そのシグナル伝達系にSTAT3の発現やリン酸化が関わることを成果報告した。また、薬剤抵抗性を呈する扁平上皮癌細胞株SQUU-Bにその薬剤を添加して、pro-/anti-apoptosis genesの発現変化を検索すると、anti-apoptosis gene Bcl-2の発現上昇が見られた。他の薬剤を追加してcombination therapyを試行した処、SQUU-Bの薬剤抵抗性は減弱し、そこにはリン酸化STAT3の変化によるBcl-2の発現抑制が関わることが解明した。これらのことより、標的遺伝子・蛋白の調節発現系には癌細胞における恒常的活性化STAT3のみならず、次期研究戦略ではSTAT3の一過性発現の影響も考慮すべきと思われた。これらの結果から焙り出された改善点は、次期戦略構想の礎とする。本研究課題では、癌組織を標的化して癌組織にのみに抗腫瘍性と関連する遺伝子・蛋白の発現調節を行うことを目的とする。トレーサにより標的蛋白発現トリガー/安定化リガンドを腫瘍組織まで誘導させ、標的癌細胞における導入遺伝子の選択的発現や発現した不安定化蛋白の安定化を図る。mRNA発現調節系および不安定蛋白質発現量制御を細胞内および組織内で確認するために、まずはGFPを発現蛋白として検索した。不安定蛋白質発現量制御によるmRNA発現量は導入細胞株間で差が生じ、産生された蛋白の安定化についても株間差が見られた。よって、プロモーターの変更、リガンド添加量やタイミングを含めて検索を進めていく。このシステムに組み入れようと検討している標的蛋白および標的遺伝子siRNAの抗腫瘍効果も検討した。抗腫瘍能が期待される蛋白の一部を欠失させた遺伝子を扁平上皮癌細胞株に導入したところ、細胞生存率が減少してアポトーシス誘導が確認された。また、腫瘍マーカーとして臨床的に用いられるSCCA1/2に対して結合部位の異なるsiRNAを数種類用意して検索を行った。SCCA1/2は、セリンプロテアーゼ阻害因子SERPINB3/4とも呼ばれ、種々の外部刺激によるアポトーシス抑制に関与する。SCCA1/2 (SERPINB3/4)に対するsiRNAを扁平上皮細胞株に導入したところ、どれもがSCCA1/2 (SERPINB3/4)のmRNA量を明らかに減じさせた。しかし、siRNAの結合部位によって細胞形態変化やアポトーシス誘導に差が見られたため、より詳細な検索を進めている。mRNA発現調節系によってmicroRNAの応用も考えられることから、抗腫瘍性を期待するいくつかの標的遺伝子の機能抑制実験および部分欠失蛋白発現実験を行った。これらは予定であったものであり、実験順を一部変更して進めており、おおむね順調に進展している。平成23年度に得られた結果を踏まえて、以下の実験を展開し、併せて標的遺伝子・蛋白の発現調節による抗腫瘍効果の捕捉実験を培養細胞系においても行う。mRNA発現調節系および不安定蛋白質発現量制御システムを備えた扁平上皮癌細胞/不死化角化細胞を移植した動物にて腫瘍組織特異的発現の評価を行う。また、担癌マウスを用いて標的遺伝子・蛋白の発現調節による抗腫瘍効果を評価する。主に組織切片を用いた評価とし、一部分子生物学的検索を行う。取り出す組織は腫瘍部のみではなく、脳、心臓、肝臓、唾液腺、腎臓、腸および脾臓なども組織標本とする。検討項目は、トレーサ注入前後の正常組織および癌組織におけるGFP発光領域の確認、プロモーターや腫瘍組織特異的発現因子のプロモーターに切り替えた場合の組織発現特異性の評価およびトレーサの集積範囲を抗トリガー/リガンド抗体を用いて免疫組織化学染色法にて判定などとする。これらの結果を検討して改善点の焙り出しと、目的蛋白のバックグラウンド発現抑制効果を考察し、今後の戦略の構想の礎とする。

平成24年度の研究に動物実験における標的遺伝子・蛋白発現調節による抗腫瘍効果を一部追加するが、研究費の使用計画は交付申請書に記載した内訳に従って使用する予定である。
Protein 4.1Rによるマスト細胞の脱顆粒制御機構の解明

本研究は、アレルギー症状のエフェクター細胞であるマスト細胞について、アレルギー物質の貯蔵庫である「分泌顆粒」の脱顆粒制御機構の解明を目指すものである。当初、その制御タンパク質としてProtein 4.1Rに注目していたが、詳細な機能解析には至らなかった。しかし研究の過程で、新たな分泌顆粒観察法を開発することができた。この方法は、マスト細胞の細胞質にGFPを発現させることで、分泌顆粒の陰性造影を行うものである。1細胞内のあらゆる分泌顆粒をもれなく観察できる2分泌顆粒の形態を高解像度で観察できる3細胞本体や核も同時に観察できるという利点があるため、この研究分野への大きな貢献が見込まれる。【成果】1ラットマスト細胞RBL-2H3およびヒトマスト細胞HMC-1における分泌顆粒の観察システムを構築した。蛍光相関分光法(FCS)によってprotein 4.1Rおよびそのバリアントである4.1Gの細胞内動態を観察した。成果をH25年日本生化学会大会(2013年9月1113日、パシフィコ横浜)で発表した、さらに4.1R、4.1G、および分泌顆粒マーカータンパク質(CD63、VAMP7、NPY、VMAT2、Rab27)について、波長の異なる3種類の蛍光タンパク質と融合・共発現させ、分泌顆粒上でのそれぞれの共局在性および動態を共焦点顕微鏡によって観察した。2GFPを利用した新規顆粒観察法を構築した(H26年度実施計画として申請)。同法を利用し、マスト細胞内の分泌顆粒について、その個数・体積・形状・結合タンパク質の有無、および脱顆粒の有無に基づいた分類を試みた。成果はH26年日本膜学会大会(2014年5月1213日、早稲田大学)にて発表予定であり、現在論文発表準備中である。【意義と重要性】分泌顆粒の細胞内制御機構については、なお不明な点が多い。このため、研究成果1において、制御タンパク質の候補として4.1Rおよびバリアント(4.1G)の関与を示したことは重要である。さらに、研究成果2において、新規観察法を開発したことで、これまで困難であった分泌顆粒の個別分析が可能となり、個数や体積、表面積など数値的なパラメータに基づく解析ができるようになった。本研究成果により、顆粒制御機構の解明に貢献することができると考えている。本研究は、アレルギー症状のエフェクター細胞であるマスト細胞について、アレルギー物質の貯蔵庫である「分泌顆粒」の制御機構の解明を目指すものである。当初、制御タンパク質としてProtein 4.1Rに注目していた。しかし残念ながらモデル細胞での表現系が微弱であり、詳細な解析には至らなかった。しかし研究の過程で、分泌顆粒の新しい観察方法を発案することができた(論文投稿中)。マスト細胞の分泌顆粒は、直径1μm程度という大きいもので、1000を超える数が細胞内に密集している。さらに様々な成長段階や種類の分泌顆粒が存在する。このため、これまで詳細な観察は、固定細胞を用いた電子顕微鏡によるものに限られていた。本研究で開発したのは、GFPネガティブコントラストイメージングという方法であり、細胞質に発現させたGFPによって分泌顆粒の陰性造影を行う。分泌顆粒の可視化にマーカータンパク質を必要としない為、生細胞の分泌顆粒を、種類や状態を問わずもれなく観察することが可能である。これによって、分泌顆粒の形成過程を連続的に追跡できるようになった。また、高コントラストの細胞像を提供するため、細胞の三次元像構築が容易である。これによって、分泌顆粒一つ一つの構造情報(直径、体積、表面積)や細胞内分布、細胞本体や核の形状や体積情報を得ることができた。このように、1あらゆる分泌顆粒を観察できる2構造情報が得られる3細胞本体や核の構造情報も得られる、という特徴から、本方法は分泌顆粒研究の基盤技術となる可能性を有しており、分泌顆粒制御機構の解明への貢献が期待できる。本方法はこれまでに、日本生化学会本大会(2014年)、日本膜学会本大会(2014・2015年)、アメリカ細胞生物学会(ASCB、2014年)で発表しており、現在論文投稿中である(Scientific Reports)。細胞生物学当初の目的である「分泌顆粒におけるProtein 4.1R結合分子の同定」は、今のところ達成できていない。この原因は、4.1Rの分泌顆粒への局在という形質が細胞の状態(細胞周期?)によってまちまちであり、明瞭に観察できる条件を特定できていないためである。申請者は研究条件の模索の中で、4.1Rのバリアントであるprotein 4.1Gが、より顕著な分泌顆粒局在性を示すことを見出したが、これについても結合分子の同定は途上であり、研究を継続している。

このような膠着した状況であるため、H26年度実施予定であった「GFPを利用した分泌顆粒イメージング法の開発」も並行して着手した。こちらは順調に進行しており、分泌顆粒の個々の計測に基づいて脱顆粒機構を評価することが可能となった。この成果は独立した研究成果として、現在学会発表(H26年度日本膜学会)および学術誌への論文投稿を準備している。引き続き4.1Rについて調査してゆく方針であるが、形質の安定した発現について改善がなされない場合は、なるべく早い段階で研究計画の見直しを検討する。その場合は、現在順調に進行している「顆粒イメージング法の開発(前述)」に比重を移し、同法に立脚して脱顆粒機構の解明を進める。研究計画の修正によりH25年度使用額が不足したため。H26年度使用額と合算し、物品費として使用する。
低分子量G蛋白質による細胞増殖の制御機構

rasがん遺伝子が支配する蛋白質Rasの標的蛋白質であるホスホリパーゼC・が炎症反応の惹起を通じて発がんを促進する普遍的な機能を有することを発見し、その作用機構を解析した。また、GTP結合型Rasの高次構造遷移の分子機構を解明するとともに、それに基づく新しい方法論を用いてRasの機能阻害薬のin silico創薬を進め、担がん動物モデルで既存の抗がん剤と同等もしくはそれ以上の抗腫瘍活性を持つ低分子化合物を開発した。1 Ras/Rap1標的蛋白質ホスホリパーゼCε(PLCε)ノックアウトマウスがras癌遺伝子依存性の皮膚化学発癌に抵抗性を示す分子機構を解析した。活性型raS癌遺伝子を持つ大腸癌や膵臓癌の培養細胞にて、RNA干渉法を用いてPLCεの発現を抑制しても二次元培養の条件では増殖抑制は観察されなかった。PLCεノックアウトマウスで、ホルボールエステルTPA処理により誘導される皮膚基底層細胞の増殖と肥厚が強く抑制される分子機構を解析した。ノックアウトマウス皮膚ではTPA処理によって誘導される顆粒球/好中球の浸潤等の炎症反応やケラチノサイトのEGF受容体のリン酸化の顕著な低下が認められた。上記結果から、発癌プロモーションにおいて、PLCεが炎症反応を介してケラチノサイトの増殖に関与する事が示唆された。2 Rap1/Rap2特異的グアニンヌクレオチド交換因子RA-GEF-1と2の生体内機能解析のため、ノックアウトマウスを作製した。RA-GEF-1ノックアウトマウスは、胎生早期致死性を示したので、組織特異的ノックアウトを行なった。RA-GEF-2ノックアウトマウスは生存可能であり表現型を解析した。3 M-Ras及びそのH-Ras型アミノ酸置換変異体の高次構造解析を通じて、GTP結合型Rasの中に標的蛋白質との結合能力を有する型(state2)と有しない型(state1)が相互変換可能な状態で存在する事を見い出し、state1の高次構造の決定に世界で初めて成功した。State1は、GTPのγ-リン酸基とRasのセリン-35残基側鎖との結合が解離し、低分子有機化合物が挿入可能なポケットが生じていた。このポケットに嵌入しstate1を安定化する低分子化合物をインシリコ・スクリーニングにより同定し、この物質が試験管内でRasとその標的蛋白質Rafとの結合を阻害することを証明した。1、Ras蛋白質の標的蛋白質ボスホリパーゼC_ε(PLC_ε)ノックアウトマウスがras癌遺伝子依存性の皮膚化学発癌に抵抗性を示す分子機構を解析した。PLC_εノックアウトマウスでは、ボルボールエステルTPA処理により誘導される浮腫を伴う皮膚の炎症反応や好中球の浸潤肥厚が強く抑制され、皮膚でのMIP-2を含む複数のサイトカインの発現低下が観察された。また、マウスを用いた他の炎症誘導実験系(大腸炎モデル、および接触皮膚炎モデル)においても、PLC_εノックアウトによる顕著な抑制が認められた。また、PLC_εノックアウトにより、APC遺伝子の変異を持つMin+/-マウスの腸の腺腫発生数の減少とその悪性化の顕著な抑制が認められたことから、PLC_εが炎症応答の調節を通じて発癌に促進的に働くことが示唆された。2、Rap1特異的グアニンヌクレオチド交換因子(GEF)であるRA-GEF-1の生体内機能の解析のためノックアウトマウスを作製したところ、卵黄嚢における脈管形成以上により胎生9.5日で致死性を示した。3、Rap1特異的GEFであるRA-GEF-2が、M-Rasと結合してRap1を活性化し、TNFα刺激依存性のBリンパ球の細胞接着を仲介することを、RA-GEF-2ノックアウトマウスを用いて証明した。4、M-Ras及びそのH-Ras型アミノ酸置換変異体のX線結晶解析により決定したGTP結合型ながら標的蛋白質との結合能力を持たない型(state1)の高次構造情報を基に、その有するポケットに嵌入しstate1を安定化する低分子化合物をインシリコ・スクリーニングにより探索し、試験管内でH-Rasとその標的蛋白質Rafとの結合を阻害する2個の化合物を同定した。また、RasファミリーG蛋白質のGTP結合/解離反応において、state1が重要な役割を有することを初めて証明した。1,Rasの標的蛋白質ボスホリパーゼCε(PLCε)ノックアウトマウスでは、ボルボールエステルTPA処理により誘導される浮腫を伴う皮膚の炎症反応や好中球浸潤が強く抑制され、IL-1α等の炎症性サイトカインの発現低下が観察された。また、マウスを用いた他の炎症誘導実験系(炎症性腸炎モデル及び接触皮膚炎モデル)においても、PLCεノックアウトによる顕著な抑制が認められた。