hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高ヘテロ植物集団を活用した高速育種の実証研究

幅広い祖先品種に由来する自家不和合性系統をランダム交配した合成集団(WOLF : Widely-diversified Outbred Line Family)を複数回無作為交配と循環選抜することで得た「高ヘテロ植物集団」を用いて、重要遺伝子近傍に着眼し、どの程度連鎖不平衡が打破され、新規の組換え遺伝子型が小断片化されているかを明らかにした。また、これらの無選抜集団と糖分循環選抜集団を比較して、選抜に伴ってアリル頻度に偏りが生じているマーカーを明らかにした。さらに、ゲノミックセレクションのシミュレーションにより、高糖分遺伝子型選抜における高速育種のポテンシャルを示した。平成25年は、北海道農業研究センター精密育種試験圃場において、作出した多系統合成集団をペーパーポット移植栽培法により評価し、サンプリングを行った。ゲノムシャッフルした2つの実験集団(糖分循環選抜集団ならびに無選抜集団)の個体識別したDNAと形質データの取得(田口担当)については、北海道農業研究センター精密育種試験圃場において、ペーパーポット移植栽培法の生育条件で実施した。表現型の調査形質については、根重、根中糖分、糖量および品質成分(Na、K、アミノ対窒素含量)は、Sachs-Le Docte法の変法(テンサイの糖分分析の公定法)にしたがって詳細に調査した。αーアミノ態窒素は、比色計を使用して化学発色させた溶液の吸光度を測定することにより、ナトリウムおよびカリウムは炎光光度計を使用して測定した。得られた実験サンプルは個体別に緑葉を取得し、DNA抽出を行い、すでに他の育種集団で開発済みのDNAマーカーを用いて遺伝子型データの取得を開始した。多系統合成集団の解析プログラムおよび育種シミュレーションプログラムの構築(岩田担当)については、高ヘテロ集団について、個々の遺伝子領域におけるマーカー多型やゲノムワイドマーカー多型をもとに、ゲノミックセレクションを行うための解析プログラムGS wizaredの適用を予備的に試みた。まだ遺伝子型データ数が不十分であるが、根中糖分などに有意なゲノミックセレクションの効果を確認した。平成26年度は、4つの高ヘテロ集団(糖分循環選抜1群、糖分循環選抜2群、無選抜増殖1群、無選抜増殖2群)からなる合計300個体の遺伝子型調査を進めた。なお、糖分循環選抜1群、糖分循環選抜2群は、平成25年度に個体別にSachs le docte法に基づいて個体別に糖分分析を行ったものである。これら4集団の遺伝子型データは、Taqman法によるSNPマーカー53種類、およびテンサイのエリート育種集団において視認性と識別性が優れたCAPSマーカー35種類の合計88種類を用いて取得した。ゲノミックセレクションの解析ソフトについては、岩田らが開発を進めてきたgsWizardのプロトタイプ版をコンピューター上でデモデータを用いて各線形回帰モデルに基いた計算を行い、正常に動作したことを確認した。平成27年度は、高ヘテロ植物集団2集団を根部搾汁液のBrix値で循環選抜した群と無選抜増殖群に分け、合計4集団(糖分循環選抜1群、糖分循環選抜2群、無選抜増殖1群、無選抜増殖2群)からなる300個体の遺伝子型情報をTaqman SNPおよびCAPSなどのDNAマーカー計91種類を用いて、各集団の遺伝構造の比較を行った。その結果、初期集団の組成や選抜の有無に関係なく、調査した4群全てにおいて、集団内で分離したマーカー座の9割はHWE(ハーディーワインベルグ平衡)に適合した。遺伝子型の分離パターンは、集団や選抜の有無によって様々であったが、一部に選抜集団で共通して増加するSNPのパターンもあった。4集団の多型情報を使ったAMOVAによると、変異の10%が集団間、90%が集団内の変異として説明可能で、循環選抜後も集団内の多様性が高度に保持されていた。さらに、個体間の遺伝距離マトリックスのデータからPCo分析を行うと、無選抜集団よりも循環選抜集団における個体間の多様性が増加し、この傾向は2集団ともに共通していた。さらに、gsWizardを用いて、2013年に測定した根中糖分の実測値と遺伝子型情報から得られるゲノミックセレクションの予測モデルを検討してみた。その結果、想定される個々の遺伝子座のLDレベルに対して利用したマーカー数が不十分ではあったものの、r=0.4前後の有意な相関関係を確認できた。このような高度にシャッフリングされた高ヘテロ植物集団でも、ゲノミックセレクションを応用した予測選抜改良の可能性が示唆された。解析に必要な表現型データと遺伝子型データを計画通りに取得できた。遺伝解析ソフトウェアも予定通りに作成され、正常な動作を確認した。遺伝育種科学平成27年度は、当初計画通りに2種類の高ヘテロ集団について糖分選抜および無選抜の集団間の遺伝子型を比較し、糖分選抜の有無とマーカー遺伝子型のアソシエーションについて調査する。加えて、平成25年に個体別に糖分分析して評価したデータに基いて、ゲノミックセレクションによる高速育種の可能性を検討する。

得られた知見、解析結果については、学会発表ならびに論文公表を積極的に進める予定である。提案書の計画どおりに、多系統合成集団を高度にゲノムシャッフルした集団を使って、循環選抜集団と無選抜集団について表現型データならびにDNAサンプルを無事に取得した。現在、いくつかの多型解析技術を利用して遺伝子型データの調査を進めている。解析方法については、田口・岩田の間で打合せおよび緊密に連携をとって、データの処理方法についても準備が整った。平成26年10月から長期在外研究のため米国(ウィスコンシン大学)の客員研究員として海外へ滞在することになったため。平成26年以降は、既往の研究などから提案者が得ているテンサイのゲノム情報や近年公表されたドイツのドラフトゲノムシーケンスの情報等も活用し、高ヘテロ集団における連鎖不平衡の程度やシャッフリングによって生じた組換え遺伝子型のパターンについて調査を進める。また、複数の座におけるSNPやSSR多型についてもゲノムワイドに調査し、集団内のゲノム動態を解明する。選抜実験により、得られた形質データとDNA多型データを活用して両者の関連性を解析し、とくに根中糖分の高蓄積に着眼して、高ヘテロ集団を使った高速育種法の理論構築を目指す。帰国後には、すみやかに成果の取りまとめを行い、共同研究者とともに発表ならびに論文執筆を進める。DNAサンプル取得ならびに表現型データ取得が当初予定より遅れ、11月以降となり、遺伝子型調査点数が予定より少なくなったため。テンサイ集団で多型性の高いSNP、SSR、CAPSなど、複数の多型調査技術を使って、遺伝子型調査点数を増やす。
脳内代謝物質拡散化学シフト画像法の開発と実用化

磁気共鳴法を用いて、代謝物質の脳組織内での拡散の状態を画像化する方法を開発し、代謝学的に重要な基質の動態解明への応用を目的とした。まず、ハードウエアの開発の検討を行った。最も重要な条件は強い静磁場と傾斜磁場を渦電流なく高速でスイッチングすることであった。静磁場は現有の4.7T動物用装置(CSI-II)で検討したが信号強度は弱く、米国University of California,San Franciscoの最強の7.0T装置でようやく可能と思われた。傾斜磁場では新規導入した強力な電源装置(8606 TECROW)で十分な出力が得られたが、コイル自体は配分予算削除のために自作せざるを得ず、渦電流の発生に大きな問題点が残り、その解決のためにはShield Gradient Coilが不可欠であると痛感した。この状況下で、測定パルス系列の開発とその基礎的検討を行った。対象核種を^1Hに限定し、拡散強調画像に必要なmotinprobing gradient(MPG)をdoulble spinecho法による局在MRSのパルス系列に組み込んだ。まず、標準試料(乳酸、N-acetyl asparatate)での測定を行った。4.7T装置では200-500mMという高濃度での測定は可能であった。しかし、ラット脳での実験では、実用的な信号検出は行えなかった。そのため、測定パルス系列の最適化や改良が更に必要な現状である。今回の研究結果からは、本法では代謝物質の組織内移動という独走的な情報が非侵襲的に測定できるという点で、非常に重要な方法であり、更に開発を続ける価置の高い研究であることが判明した。また、装置としては7.0Tクラスの超硬磁場があれば良いが、4.7Tクラスでも測定方法の最適化にては不可能ではない。また渦電流のないShielded gradientcoilが必須条件であることも判明した。今後、磁気共鳴法による脳機能代謝解析の新しい方法となるといえる。磁気共鳴法では、物質の拡散速度や方向の情報が得られ、水分子に関してはその画像化も可能になってきた。本研究は、この技術を他の物質に活かし、微視的なレベルで不断の動きをしている各種の代謝物質の脳組織内での拡散の情報を得て画像化することを目的として、基礎的検討を行った。まず、(1)代謝物質の拡散のデータを得るためのハードウエアの検討を行った。最も重要なことは、強い静磁場で強い傾斜磁場を高速でスイッチングする必要があることである。強い静磁場は47Tesla動物実験用NMR装置(CSI-II(GE))にて得られ、これに強力な傾斜磁場を印加できる電源装置(8606by TECROW)を接続できたが、渦電流の発生に対しては大きな問題点が残り、その解決にはShield Gradient Coilの必要性を痛感した。次いで、(2)測定パルス系列の開発を行った。従来の水分子の拡散強調画像に必要なmotinprobing gradient(MPG)を磁気共鳴スペクト(MRS)のパルス系列に組み込んだ。測定系を単純化するため、対象核種を^1Hとし、non-locaized MRS法に組み込んだが、水抑制や脂肪の信号の影響で良好な結果が得られず、localized MRSへの組み込みが不可欠であると結論でき現在検討中である。本年度は、主体となる備品の設置と調整に時間がかかり、ハードウエアの検討を行う充分な時間がなく次年度以降への研究課題として残った。

また、本研究を遂行する上で、もっと強い磁場での測定を検討する必要性が生じたため、それを行える米国Univeristy of California,SanFranciscoへ赴き、基礎的研究を行うこととなった。その結果は次年度以降への研究に活かす予定である。各種代謝物質の脳組織内での拡散状態を画像化することを目的として、昨年来の課題の基礎的検討を行った。まず、ハードウエアの条件として強い静磁場と傾斜磁場を渦電流なく高速でスイッチングする必要がある。前者では4.7T実験用NMR装置(現有)では十分な信号強度が得られず、米国Univeristy of California,San Francisco(UCSF)の7.0T装置でようやく可能と思われる程度であった。後者は、配分予算の削除のため自作せざるを得なかったが、渦電流対策が十分ではなく高速スイッチングに関し良好な結果が得られなかった。本研究では当初申請通りshielded gradientcoil(既存製品)の導入が不可欠であった。この状況下で、測定パルス系列の開発とその基礎的検討を行った。対象核種を^1Hに限定し、拡散強調画像に必要なmotinprobing gradient(MPC)をdoulble spinecho法による局在MRSのパルス系列に組み込んだ。まず、標準試料(乳酸、N-acetyl asparatate)での測定を行った。上記の如く4.7T装置では200-500mMという高濃度での測定は可能であった。しかし、動物実験をラット脳で行ったが、実用的な信号検出は行えなかった。そのため、測定パルス系列の最適化や改良を行っている現状である。さらに、どの位の磁場強度が必要であるかの検討のため米国UCSFへ赴き7.0Tでの実験を行い、本研究の最終確認を行う予定である。本年度の研究結果からは、7.0Tクラスの装置とshielded gradientcoilが必要であることが判明したが、装置および測定方法の最適化、目的とする代謝物質の限定化により低い磁場装置でも測定のる可能性があることが見い出せた。本法は代謝物質の組織内移動という非常に重要な情報が非侵襲的に測定できるいう点で、更に開発を続ける価値の高い研究である。
海水中塩分測定用標準のトレーサビリティに関する研究

本研究の目的は、塩分測定用に広く使われているIAPSO標準海水(SSW)のトレーサビリティを塩分0.001のレベルで保つこと及び塩化カリウム定義溶液を用いてSSWのオフセットの成分を突き止めることである。海洋深層での塩分を塩分0.001のレベルで高精度に測定することは塩分そのものおよび淡水フラックスの観点から海洋学および気候変動の研究に貢献する。このために、最新のSSWのバッチまでについて、オフセットテーブルを提示した。このテーブルは日本とアメリカの2つの研究所(日本の海洋開発研究機構および米国ウッズホール海洋研究所)で同時期に同じ手順で同期させて行った複数回のSSW比較実験の結果をもとに、作成された。P103かP144までのSSWのオフセットは塩分-0.002から0.0001の範囲にあった。現実の海洋データにおいて、WOCEで得られたP1およびP17航海での塩分データと1999-2001年に行った再観測の塩分データの間に見られた不自然な塩分変動あるいは日本海での塩分変動は提示したオフセットを用いて補正することにより、そのかなりの部分がSSWのオフセットに由来するものであることがわかった。従って、塩分データをSSWオフセットで補正することは、海洋学および気候変動の研究に有効である。SSWのオフセットの成因を突き止めるために行った塩化カリウム定義溶液を用いた実験の結果、同一濃度であっても塩化カリウムのロットにより電気伝導度に差があること、また、製造メーカーによっても電気伝導度に差があることが明らかになり、これがSSWオフセットの成因である可能性が示された。最近のIAPSO塩分標準海水の相互比較実験を行い、過去に公表されているIAPSO塩分標準海水のOFFSETTableに接続し、そのTableをバッチP142まで延長した。また、日本側で行った比較実験とまったく同じ並びで7つのバッチ計55本についてウッズホール海洋研究所でも比較実験を行い、日本側で行った実験結果と比較した。独立にそれぞれの手法により行った比較実験によりえられたIAPSO塩分標準海水のOFFSETの値が、塩分0.0000-0.0005の差に収まり比較的良く一致していることが確認されたので、得られているOFFSET値が妥当であること検証された。これは、2ヶ所以上で相互比較実験を継続して行うことにより、塩分標準のトレーサビリティを塩分0.001の水準で確保することができることを示唆している。将来にわたって、塩分の標準海水のトレーサビリティを確保するため、高純度塩化カリウムによる定義溶液の作成とメーカーや試薬のバッチ間の差を調べる実験を、最近のIAPSO塩分標準海水の相互比較実験と並行して行った。これにより統計的に処理できる数の塩化カリウム標準液を作成できるようになった。現実の海洋データへIAPSO塩分標準海水のOFFSETを適用することの適否を調べるために、日本周辺の高精度の塩分データを収集し、解析を開始した。その結果、西部北太平洋亜熱帯域の深層での、10年で塩分0.005程度の塩分変動を研究するには、IAPSO塩分標準海水のOFFSETを適用する必要があることを見出した。最近のIAPSO塩分標準海水について、条件を完全に同一に設定し時期も同期した塩分標準海水相互比較実験を日本側および米国ウッズホール海洋研究所で行った。平成14年度に行った実験と今回の4組の実験結果(2機関各2回)を、過去に公表されているIAPSO塩分標準海水のOFFSETTable(Aoyama et al.,2003)に接続し、そのTableをバッチP143まで延長した。

また過去のIAPSO塩分標準海水のOFFSET Tableにおいて、試料が入手できず直接の比較実験が行えなかったためOFFSETが求められていなかった複数のバッチについて、直接の標準海水比較実験ではないが、間接的に比較実験をしたとみなせる文献を利用してOFFSETを推定した。これにより、ほとんどすべてのバッチについてOFFSETを確定することができ、1990年以降の世界的なプロジェクトで行われてきた海洋における塩分測定によりえられた値の補正を可能にした。現実の海洋データへIAPSO塩分標準海水のOFFSET適用について、塩分測定時の詳細なデータが得やすい日本周辺の高精度の塩分データを収集し、塩分の長期変動について解析した。その結果、西部北太平洋亜熱帯域中層や日本海深層で見出された10年で塩分0.005程度の塩分上昇の約半分程度はIAPSO塩分標準海水のOFFSETに起因するものであり、実際の塩分上昇量は報告されている値の約半分であることを見出した。このことは、塩分0.005程度の塩分変動を研究するには、現実の海洋塩分データに対してIAPSO塩分標準海水のOFFSETを適用する必要があることを示している。昨年度に引き続き、最新のIAPSO標準海水(SSW)のバッチP145までについて日本とアメリカで同時期に同じ手順で同期させてSSW比較実験を行った。この結果、独立に2箇所で行った比較実験で得られたIAPSO塩分標準海水のオフセット値が塩分0.00020.0005の差に収まり比較的良く一致していることが確認され、得られているオフセット値が妥当であることが検証された。さらに日本側では単独でもSSW比較実験を行った。これら複数回のSSW比較実験の結果をもとに作成されたP103からP145までのSSWのオフセット値は塩分-0.0020.001の範囲にあった。また、現実の海洋データにおいて、WOCEで得られたP1およびP17航海での塩分データと1999-2001年に行った再観測の塩分データの間に見られた不自然な塩分変動あるいは日本海での塩分変動は、提示したオフセット値を用いて補正することにより、そのかなりの部分がSSWのオフセットに由来するものであることが分かった。これらのことから、塩分データをSSWオフセット値で補正することは、海洋学および気候変動の研究にとって非常に有効であると思われる。さらに、SSWのオフセットの成因を突き止めるために行った塩化カリウム定義溶液を用いた実験の結果をまとめた結果、塩化カリウムのロットあるいは製造メーカーによる電気伝導度の差が明らかになり、これがSSWオフセットの成因である可能性が示されるとの論文を発表した。
未利用の小規模・分散的な表層型メタンハイドレートの特性とガス生産原理に関する研究

日本海に分布する表層型メタンハイドレートは、海底表層の粘性土の中に塊状に存在する。本研究は、研究事例が少ない粘性土中に分布する塊状表層型メタンハイドレートの形成機構とその貯留層特性の解明を目的とする。また、貯留層特性を考慮したガス生産方法の基礎・基盤的研究を実施する。メタンハイドレートが粘性土中で塊状に成長するためには、メタンハイドレートの成長界面にメタンを含む間隙水が連続的に供給され、土粒子を排除しながらメタンハイドレートが析出する必要がある。本研究においては、まず、日本海の表層型メタンハイドレートが分布する海域の堆積物試料を対象として、間隙水の浸透特性に係る堆積物の粒径等の物性を測定するとともに、メタンハイドレートの生成平衡条件を実測した。堆積物の粒径分布は、レーザ回折式粒子径分布測定装置を用いた測定により、粒径75μ以下の細粒分98%、そのうち粒径5μm以上のシルト分が73%であり、シルトが卓越した。塊状メタンハイドレートの形成と同様に、寒冷地の土壌凍結においてレンズ状氷塊を伴って生じる凍上現象は、土粒子径が0.1mm以下の細粒を含む土により発生するが、2μm以下の粒径では透水性の低下により不活発となる。表層型メタンハイドレート分布海域の堆積物の粒径は、凍上現象を生じ易い土粒子径に相当することが分かった。メタンハイドレートの生成平衡条件に対する堆積物の影響を調べるために、ステンレス製小型圧力容器を恒温槽内に設置して、堆積物中にメタンハイドレートを生成させた後、一定の温度変化率(0.1K/h)で昇温させる方法でメタンハイドレートが分解する温度と圧力を実測した。その結果、メタンハイドレートの生成平衡条件は、海水のみの場合と比較して、低温・高圧側へ遷移することが確認された。この堆積物効果は、塊状メタンハイドレートの成長界面に対するメタン供給に関係している可能性がある。当初計画において、平成30年度は、塊状の表層型メタンハイドレートが存在する細粒の粘性土試料を対象として、間隙水の浸透特性に係る粒径等の物性評価手法と、メタンハイドレートの生成平衡条件の測定手法を確立することとしていた。これに対して、表層型メタンハイドレート分布海域の細粒の粘性土試料を用いて、レーザ回折方式の粒子径分布測定装置による測定が可能になるとともに、堆積物中におけるメタンハイドレートの生成平衡条件の実測が可能となった。これらの実験により、寒冷地の土壌凍結における凍上現象と同様に、メタンを含む間隙水が連続して供給されることにより堆積物粒子を排除しながら塊状メタンハイドレートが成長する可能性が示唆された。また、表層型メタンハイドレートの貯留層特性を考慮したガス生産方法に関する研究については、平成30年度は、メタンハイドレートの分解過程を解析可能な実験装置を整備することとしていた。これに対して、原位置の堆積層の温度・圧力条件を再現可能なコア試験装置を立上げ、メタンハイドレートの分解実験とともに、浸透率の測定も可能なことを確認した。これらのことから、本研究は、おおむね順調に進展している。表層型メタンハイドレートの形成機構と貯留層特性の解明については、昨年度の研究に引き続いて測定例を増やし、異なる海域、深度等の結果を比較検討する必要がある。また、メタンハイドレートが分布しない地点の堆積物との差異を検討する必要もある。ここで、十分な天然試料の入手が困難な場合には、市販されている細粒の粘土及び砂試料、ガラスビーズ等を利用して、粒径分布等の物性が塊状メタンハイドレートの形成過程に及ぼす影響を検討する。また、塊状メタンハイドレートの成長界面へメタンが供給される過程を検討するために、コア試験装置を用いた間隙水の浸透率測定等を行う。表層型メタンハイドレートの特性を考慮したガス生産方法に関する研究については、昨年度に立ち上げたコア試験装置を用いて、塊状の表層型メタンハイドレートを模擬したコア試料を作製して、ハイドレートの分解過程とその速度を評価する実験方法を開発する必要がある。ここで、可燃性のメタンを使用することなく、代替のガスハイドレートによる実験手法、塊状ガスハイドレートの模擬方法等の検討が必要となる。代替ガスハイドレートについては、メタンより低温・高圧の条件でガスハイドレートを生成可能な不活性ガス等の利用を検討する。塊状の産状を模擬する実験手法としては、粗粒堆積物の間隙にガスハイドレートを生成させ、細粒分から成る層と積層させる手法等を検討する。これらのコア試験方法を確立した後に、低温な日本海固有水の存在、他の海域と比較して地温勾配が極めて大きいなどの日本海の表層型メタンハイドレート分布海域の特徴を踏まえたガス採収方法の検討を行う。

堆積物の粒径分布は、レーザ回折式粒子径分布測定装置を用いた測定により、粒径75μ以下の細粒分98%、そのうち粒径5μm以上のシルト分が73%であり、シルトが卓越した。塊状メタンハイドレートの形成と同様に、寒冷地の土壌凍結においてレンズ状氷塊を伴って生じる凍上現象は、土粒子径が0.1mm以下の細粒を含む土により発生するが、2μm以下の粒径では透水性の低下により不活発となる。表層型メタンハイドレート分布海域の堆積物の粒径は、凍上現象を生じ易い土粒子径に相当することが分かった。メタンハイドレートの生成平衡条件に対する堆積物の影響を調べるために、ステンレス製小型圧力容器を恒温槽内に設置して、堆積物中にメタンハイドレートを生成させた後、一定の温度変化率(0.1K/h)で昇温させる方法でメタンハイドレートが分解する温度と圧力を実測した。その結果、メタンハイドレートの生成平衡条件は、海水のみの場合と比較して、低温・高圧側へ遷移することが確認された。この堆積物効果は、塊状メタンハイドレートの成長界面に対するメタン供給に関係している可能性がある。当初計画において、平成30年度は、塊状の表層型メタンハイドレートが存在する細粒の粘性土試料を対象として、間隙水の浸透特性に係る粒径等の物性評価手法と、メタンハイドレートの生成平衡条件の測定手法を確立することとしていた。これに対して、表層型メタンハイドレート分布海域の細粒の粘性土試料を用いて、レーザ回折方式の粒子径分布測定装置による測定が可能になるとともに、堆積物中におけるメタンハイドレートの生成平衡条件の実測が可能となった。これらの実験により、寒冷地の土壌凍結における凍上現象と同様に、メタンを含む間隙水が連続して供給されることにより堆積物粒子を排除しながら塊状メタンハイドレートが成長する可能性が示唆された。また、表層型メタンハイドレートの貯留層特性を考慮したガス生産方法に関する研究については、平成30年度は、メタンハイドレートの分解過程を解析可能な実験装置を整備することとしていた。これに対して、原位置の堆積層の温度・圧力条件を再現可能なコア試験装置を立上げ、メタンハイドレートの分解実験とともに、浸透率の測定も可能なことを確認した。これらのことから、本研究は、おおむね順調に進展している。表層型メタンハイドレートの形成機構と貯留層特性の解明については、昨年度の研究に引き続いて測定例を増やし、異なる海域、深度等の結果を比較検討する必要がある。また、メタンハイドレートが分布しない地点の堆積物との差異を検討する必要もある。ここで、十分な天然試料の入手が困難な場合には、市販されている細粒の粘土及び砂試料、ガラスビーズ等を利用して、粒径分布等の物性が塊状メタンハイドレートの形成過程に及ぼす影響を検討する。また、塊状メタンハイドレートの成長界面へメタンが供給される過程を検討するために、コア試験装置を用いた間隙水の浸透率測定等を行う。表層型メタンハイドレートの特性を考慮したガス生産方法に関する研究については、昨年度に立ち上げたコア試験装置を用いて、塊状の表層型メタンハイドレートを模擬したコア試料を作製して、ハイドレートの分解過程とその速度を評価する実験方法を開発する必要がある。ここで、可燃性のメタンを使用することなく、代替のガスハイドレートによる実験手法、塊状ガスハイドレートの模擬方法等の検討が必要となる。
イネ根に共生する細菌の群集構造変動機構の解明

水田から放出される温室効果ガスメタンの量は、イネ品種により異なる。品種間差の原因を探るために、代表的なイネ品種であるコシヒカリとメタン放出量の少ないタカナリを用いて、根圏土壌や根に生息する微生物の群集構造やメタン酸化、生成に関わる遺伝子のコピー数の違いを調べた。・微生物群集構造:コシヒカリとタカナリの根に生息する細菌と真核微生物の群集構造を16S, 18S rRNA遺伝子のシーケンス解析により調べた。両品種とも、イネ生育ステージが進むと微生物群集が変化した。イネの生育ステージが進むことによる微生物群集の変化は、コシヒカリの方が顕著であった。コシヒカリの方が大きな変動を示した微生物種には、メタン生成菌を含む多様な分類群が含まれていた。本研究の結果は、メタン放出が少ないタカナリでは、イネのグロースステージが進んでも、メタン生成菌や共生微生物の菌数増加が、コシヒカリよりも低く抑えられていることを示唆しており、根圏微生物群集のステージ変化が水田からのメタン放出量と深く関わることが示された。・メタン酸化、生成に関わる遺伝子のコピー数:昨年度は、根圏土壌や根から抽出したDNAに含まれるメタン酸化、生成に関わる遺伝子のコピー数を調べた。本年度は、根圏土壌から安定的に高品質のRNAを得る方法を確立し、その方法を用いて採取した根圏土壌サンプルの分析を行った。根圏土壌のメタン酸化、生成遺伝子のコピー数は、DNA, RNAともに顕著な品種間差は観察されなかった。この結果は、根や根に非常に近傍な土壌でのメタン生成、酸化がメタン放出量に大きく影響することを示唆している。そこで、根サンプルのRNA解析法の検討を行い、安定的に高品質のRNAを抽出し、メタン酸化、生成に関わる遺伝子のコピー数を分析する方法を確立した。28年度が最終年度であるため、記入しない。1、大気中の二酸化炭素濃度上昇が水稲根共生細菌へ与える影響大気中の二酸化炭素濃度上昇が水稲根共生細菌の群集構造やメタン酸化、生成菌の共生菌数に与える影響、水稲品種間での影響の違いをFACE(開放系大気CO2増加)実験施設水田で栽培した水稲を用いて調べた。16S rRNA遺伝子配列解析により、水稲根共生細菌の群集構造は、大気中の二酸化炭素濃度上昇により統計的に有意に変化することが明らかとなった。メタン酸化細菌であるMethylosinus属の存在比率は、二酸化炭素濃度上昇により低下した。大気中の二酸化炭素濃度上昇と品種の交互作用は、統計的に有意な効果は認められなかった。FACE実験施設を用いた過去の研究により、大気中の二酸化炭素濃度上昇により、水田からのメタン放出量が増加することが報告されている。増加の原因は、水稲のバイオマスの増大等により根圏の有機物が増加し、メタン生成量が増加するためであると考えられてきたが、本研究によりメタン放出量増加の一因は、メタン酸化量の減少にあることが示唆された。2、水稲根に共生する細菌群集構造の時系列変動幼穂形成期と登熟期の水稲根に共生する細菌の群集構造解析を行った。幼穂形成期の水稲根ではBurkholderia属、登熟期ではメタン酸化細菌(Methylosinus属)やC1化合物代謝能を持つ細菌(Bradyrhizobium属等)が高頻度で検出され、1か月半程度の短期間で群集構造が大きく変化することが明らかになった。幼穂形成期と登熟期の間には、水田土壌で生成されたメタンが水稲根を通り大気中に大量に放出されている。水稲根におけるメタン濃度の増加がメタン酸化細菌やC1化合物代謝細菌の存在比率を高めたと推測された。水稲根に共生する細菌群集構造の変動要因として、メタンが重要な役割を果たしている可能性が強く示唆された。FACE(開放系大気CO2増加)実験施設水田の慣行施肥期、無窒素施肥区で栽培した水稲を幼穂形成期、穂ばらみ期、出穂期、登熟期にサンプリングし、根に棲息するバクテリア、古細菌の群集構造を、16S rRNA遺伝子配列解析により調べた。UniFracにより定義したサンプル間の距離行列を主座標解析したところ、イネの生育ステージ順に第一軸に並び、根に棲息する細菌は稲の生育ステージにより変化することが示された。二酸化炭素濃度上昇、窒素施肥でも群集は有意に変化した。全サンプルの群集構造の分散のうち、およそ50%が生育ステージ変化によるものであった。窒素施肥、二酸化炭素濃度上昇の寄与分は5%以下であり、窒素施肥、二酸化炭素濃度上昇が細菌群集構造に与える影響は生育ステージに比べて小さいことが明らかになった。窒素施肥や二酸化炭素濃度上昇による生育ステージ変動のパターン変化は、観察されなかった(P>0.05)。窒素施肥、二酸化炭素濃度等の生育環境変化が水稲根に共生する細菌群集構造に与える影響は、生育ステージ変動に比べ遥かに小さいことが示された。属レベルで最も高い相対存在比率を示したのは、水田土壌における鉄還元細菌として報告のあるAnaeromyxobacter (全サンプル平均14%)、次いでGeobacter(同9%)であった。これらの菌群は、生育ステージが進むにつれて、増加する傾向を示した。水稲根表面には、鉄化合物が沈着しており、細菌群集の形成や変動に大きな影響を持つことが示唆された。水稲根に棲息する細菌群集の時系列変動の原因として、鉄化合物が重要な役割を果たすことが示唆された。

群集変動の機構解明は、本研究の主要目的のひとつであり、研究は順調に進展している。水田から放出される温室効果ガスメタンの量は、イネ品種により異なる。品種間差の原因を探るために、代表的なイネ品種であるコシヒカリとメタン放出量の少ないタカナリを用いて、根圏土壌や根に生息する微生物の群集構造やメタン酸化、生成に関わる遺伝子のコピー数の違いを調べた。・微生物群集構造:コシヒカリとタカナリの根に生息する細菌と真核微生物の群集構造を16S, 18S rRNA遺伝子のシーケンス解析により調べた。両品種とも、イネ生育ステージが進むと微生物群集が変化した。イネの生育ステージが進むことによる微生物群集の変化は、コシヒカリの方が顕著であった。コシヒカリの方が大きな変動を示した微生物種には、メタン生成菌を含む多様な分類群が含まれていた。本研究の結果は、メタン放出が少ないタカナリでは、イネのグロースステージが進んでも、メタン生成菌や共生微生物の菌数増加が、コシヒカリよりも低く抑えられていることを示唆しており、根圏微生物群集のステージ変化が水田からのメタン放出量と深く関わることが示された。・メタン酸化、生成に関わる遺伝子のコピー数:昨年度は、根圏土壌や根から抽出したDNAに含まれるメタン酸化、生成に関わる遺伝子のコピー数を調べた。本年度は、根圏土壌から安定的に高品質のRNAを得る方法を確立し、その方法を用いて採取した根圏土壌サンプルの分析を行った。根圏土壌のメタン酸化、生成遺伝子のコピー数は、DNA, RNAともに顕著な品種間差は観察されなかった。この結果は、根や根に非常に近傍な土壌でのメタン生成、酸化がメタン放出量に大きく影響することを示唆している。そこで、根サンプルのRNA解析法の検討を行い、安定的に高品質のRNAを抽出し、メタン酸化、生成に関わる遺伝子のコピー数を分析する方法を確立した。イネ根に共生する細菌の群集構造を規定する要因として、メタン等のC1化合物が重要であるという仮説が得られた。大気二酸化炭素濃度上昇により、根に共生するメタン酸化細菌、C1化合物代謝細菌の存在比が減少することも発見し、メタン以外の要因もメタン酸化細菌、C1化合物代謝細菌数に影響を与えることを見出した。細菌相解析の結果、窒素固定をすることが知られる細菌が検出された。今後は水田環境における窒素固定にも着目して研究を進める。FACE(開放系大気CO2増加)実験施設水田で複数品種のイネを栽培し、2週間程度おきにイネと根圏土壌をサンプリングし、以下の分析を行う。アセチレン還元法等による窒素固定活性の測定、nifH遺伝子の定量PCR解析による窒素固定細菌の菌数の推定、nifH遺伝子、16S rRNA遺伝子を標的にした菌総解析も行う。イネの生育、窒素含量、イネ根の形態等のデータも取得し、窒素固定がイネの生育に与える影響を検討する。28年度が最終年度であるため、記入しない。施肥や大気二酸化炭素濃度等の条件を変えて栽培したイネに根に共生するメタン酸化菌の菌数や活性を調べ、根に共生するメタン酸化細菌、C1化合物代謝細菌に影響を与える要因を特定する。
平行噴流噴霧バーナー上に形成される希釈火炎のNOx排出量スケーリング則の導出

本年度は,デカンを燃料とした燃焼実験を行い,熱電対による炉内温度分布測定を行った.この結果から火炎体積を求め,ノズル間隔および予熱温度との関係を明らかにした.さらに,燃焼炉から排出される窒素酸化物(NOx)の濃度測定を行い,その結果と火炎体積からNOx生成速度を求め,火炎の最高温度との関係を調べた.この結果,両者の間には明確な相関が見られ,火炎体積と最高温度が高温空気噴霧燃焼から排出されるNOxの支配要因であることが明らかとなった.燃焼実験と並行して,ノズルから噴射される燃料液滴の粒径分布測定を行った.液滴分布の測定には,常温非燃焼場である噴霧室と,シャドーブラフ法を用いた.しかし,想定した以上の微細な液滴が多く噴射されたため,実験装置の空間分解能の制限から,正確な液滴粒径を算出できなかった.この点に関しては,光学系の改良を行い,空間分解能を向上させたのち,再度実験を行う予定である.また,燃焼炉内のNOx生成メカニズムの詳細を明らかにするために,汎用流体解析ソフトウェアであるFluentを用いて,燃焼炉内の定常RANSシミュレーションを行った.燃焼モデルにはEDCモデルを用い,反応機構として四段総括反応機構を用いた.輻射の影響は考慮されている.この結果,シミュレーションから得られた温度分布と実験結果は良い一致を示す.ただし,用いた四段総括反応機構は既燃ガスにより希釈された混合気の燃焼反応を再現できなかったため,反応機構のパラメータを調整した.今後,この調整の妥当性を検証する必要がある.この数値シミュレーションに関する結果は,第56回燃焼シンポジウムにて発表済みである.申請時の計画では,本年度は,小型燃焼炉内に形成される希釈火炎の火炎体積の測定と,燃料ノズルから噴射される燃料液滴の粒径分布測定,および数値シミュレーションに用いる小型燃焼炉の計算メッシュの作成を行う予定であった.火炎体積に関する研究に関しては,デカンを燃料とした小型燃焼炉の実験から,火炎体積の算出,ノズル間隔および予熱温度の影響の解明,およびNOx排出量を決定する要因の解明が行われた.このことから,火炎体積に関する研究は,予定通りに完了したと考えている.燃料液滴の粒径分布測定については,計画より遅れている.当初想定していた液滴径より微細な液滴が多く噴霧されているため,現状のシャドーグラフ法による撮影からは,十分な空間分解能を有する結果が得られていない.今後,光学系の改善などを行う予定である.また,数値シミュレーションに関する研究は計画より前倒しで進めることができた.当初の計画は,シミュレーションに必要な計算メッシュの作成であったが,それを用いた数値シミュレーションを実際に行った.この結果,実験結果を数値シミュレーションで再現するには,用いる多段総括反応機構の再調整が必要であることがわかった.現状,総括反応機構のパラメータを簡易的に調整することで,数値シミュレーション結果を実験結果とほぼ一致させることができる.このように,数値シミュレーションに関しては,第二年度の予定である合わせこみの段階に既に入っている.上記三点に関する研究の進捗から,本研究は全体としておおむね順調に進んでいると判断している.本研究の計画では,本年度は燃焼炉内の液滴到達距離を測定する予定である.現在,液滴を可視化するための観察窓付き燃焼炉と光学系を構築中である.これらの実験装置を用いて液滴の到達距離を測定し,それに対する予熱温度およびノズル間隔の影響を明らかにする.同時に,NOx濃度を再測定し,液滴到達距離とNOx濃度の関係を明らかにする.また,昨年度の残課題であるノズルから噴射される燃料液滴径の測定を常温非燃焼場にて再度行う.空間分解能を改善するために,レンズを含めた光学系の再調整を行う.測定方法には,引き続きシャドーグラフ法を用いる.昨年度の研究結果から,シミュレーション結果を実験結果と合わせるには,反応機構の再調整が必要となることがわかった.本年度では,現在使用している四段総括反応機構と詳細化学反応機構を用いて,さらに単純な場での反応計算を行い,総括反応機構の精度を検証する.この結果を踏まえて,総括反応機構のパラメータの調整と総括反応の取捨選択を行う.この調整された反応機構を用いてシミュレーションを行い,実験結果と比較をすることで,希釈燃焼に最適な反応機構を提案する.この際,同時にシミュレーションでの液滴の到達距離と実験から得られた到達距離を比較し,実験結果に合わせこむ.このために,蒸発モデルにおけるパラメータの調整とモデルの選択を行う予定である.これらの手法を用いて,シミュレーション結果の高精度化を図る.本年度は,デカンを燃料とした燃焼実験を行い,熱電対による炉内温度分布測定を行った.この結果から火炎体積を求め,ノズル間隔および予熱温度との関係を明らかにした.さらに,燃焼炉から排出される窒素酸化物(NOx)の濃度測定を行い,その結果と火炎体積からNOx生成速度を求め,火炎の最高温度との関係を調べた.この結果,両者の間には明確な相関が見られ,火炎体積と最高温度が高温空気噴霧燃焼から排出されるNOxの支配要因であることが明らかとなった.燃焼実験と並行して,ノズルから噴射される燃料液滴の粒径分布測定を行った.液滴分布の測定には,常温非燃焼場である噴霧室と,シャドーブラフ法を用いた.しかし,想定した以上の微細な液滴が多く噴射されたため,実験装置の空間分解能の制限から,正確な液滴粒径を算出できなかった.この点に関しては,光学系の改良を行い,空間分解能を向上させたのち,再度実験を行う予定である.

また,燃焼炉内のNOx生成メカニズムの詳細を明らかにするために,汎用流体解析ソフトウェアであるFluentを用いて,燃焼炉内の定常RANSシミュレーションを行った.燃焼モデルにはEDCモデルを用い,反応機構として四段総括反応機構を用いた.輻射の影響は考慮されている.この結果,シミュレーションから得られた温度分布と実験結果は良い一致を示す.ただし,用いた四段総括反応機構は既燃ガスにより希釈された混合気の燃焼反応を再現できなかったため,反応機構のパラメータを調整した.今後,この調整の妥当性を検証する必要がある.この数値シミュレーションに関する結果は,第56回燃焼シンポジウムにて発表済みである.申請時の計画では,本年度は,小型燃焼炉内に形成される希釈火炎の火炎体積の測定と,燃料ノズルから噴射される燃料液滴の粒径分布測定,および数値シミュレーションに用いる小型燃焼炉の計算メッシュの作成を行う予定であった.火炎体積に関する研究に関しては,デカンを燃料とした小型燃焼炉の実験から,火炎体積の算出,ノズル間隔および予熱温度の影響の解明,およびNOx排出量を決定する要因の解明が行われた.このことから,火炎体積に関する研究は,予定通りに完了したと考えている.燃料液滴の粒径分布測定については,計画より遅れている.当初想定していた液滴径より微細な液滴が多く噴霧されているため,現状のシャドーグラフ法による撮影からは,十分な空間分解能を有する結果が得られていない.今後,光学系の改善などを行う予定である.また,数値シミュレーションに関する研究は計画より前倒しで進めることができた.当初の計画は,シミュレーションに必要な計算メッシュの作成であったが,それを用いた数値シミュレーションを実際に行った.この結果,実験結果を数値シミュレーションで再現するには,用いる多段総括反応機構の再調整が必要であることがわかった.現状,総括反応機構のパラメータを簡易的に調整することで,数値シミュレーション結果を実験結果とほぼ一致させることができる.このように,数値シミュレーションに関しては,第二年度の予定である合わせこみの段階に既に入っている.上記三点に関する研究の進捗から,本研究は全体としておおむね順調に進んでいると判断している.本研究の計画では,本年度は燃焼炉内の液滴到達距離を測定する予定である.現在,液滴を可視化するための観察窓付き燃焼炉と光学系を構築中である.これらの実験装置を用いて液滴の到達距離を測定し,それに対する予熱温度およびノズル間隔の影響を明らかにする.同時に,NOx濃度を再測定し,液滴到達距離とNOx濃度の関係を明らかにする.また,昨年度の残課題であるノズルから噴射される燃料液滴径の測定を常温非燃焼場にて再度行う.空間分解能を改善するために,レンズを含めた光学系の再調整を行う.測定方法には,引き続きシャドーグラフ法を用いる.昨年度の研究結果から,シミュレーション結果を実験結果と合わせるには,反応機構の再調整が必要となることがわかった.本年度では,現在使用している四段総括反応機構と詳細化学反応機構を用いて,さらに単純な場での反応計算を行い,総括反応機構の精度を検証する.この結果を踏まえて,総括反応機構のパラメータの調整と総括反応の取捨選択を行う.この調整された反応機構を用いてシミュレーションを行い,実験結果と比較をすることで,希釈燃焼に最適な反応機構を提案する.
逆行遺伝学手法を用いたウィルソン病遺伝子の単離

1.Microdissection/microcloning改良法の確立:この方法によって作成されたDNAライブラリ-は,ヒト核DNAとホモロジ-を示さない多数のクロ-ンを含んでいることが判明した。種々の解析の結果,問題は以下の点にあることを理解した。(1)外来性DNAの試料への混入。(2)PCRによるコンタミDNA以外のartifactual DANの生成。(3)染色体標本DNAの増幅不良。(1)(コンタミDNA)に関しては,反応液容量を減少すること及びpsoralenを用いることによって解決した。(2)に関しては,artifactual DNAは両端に期待される塩基配列を持っていないというシ-クエンシングの結果に基き,新しいプライマ-を作成して2段階のPCRを行うselective PCR amplification法によって克服した。(3)に関しては,増幅不良が染色体DNA固有のものか,標本作成に付随したものか等について今後の解析をまたなければならない。2.スクリ-ニングの効率化(exonーenrichment法の開発):in uitrotranscriptを用いて,10^5bpオ-ダ-のゲノムから10^2オ-ダ-のRNAに対応するDNAを選別・増幅することができた。明瞭な選別・増幅を得る為に10^8molecules/dotのRNAが必要であったが,RNA blotはDNA blotに比し約百分の一にハイブリ効率が劣ることが判明。そしてこれはRNA blot→bakingの過程でRNAがこわれていくことによるらしいことがわかった。別のblot法を用いるか新しく改良することによって,10^7 molecules/dotのRNAでも選別・増幅することが可能と思われる。
関節スティフネス調整から評価する自己運動映像を伴う観察運動学習

本研究は観察運動学習のメカニズムの解明を目指し,身体運動の制御で最も重要と考えられる関節スティフネスが運動を観察するだけで変化させることができるかを検討した.用いた運動は飛び降りて出来るだけ高く飛び上がるドロップジャンプである.実験の結果,自己の映像とお手本の映像の両者を見る事によって,関節スティフネスを増大させ,動きをモデルの動きに近づけることができることが明らかになった.本研究は観察運動学習のメカニズムの解明を目指し,身体運動の制御で最も重要と考えられる関節スティフネスが運動を観察するだけで変化させることができるかを検討した.用いた運動は飛び降りて出来るだけ高く飛び上がるドロップジャンプである.実験の結果,自己の映像とお手本の映像の両者を見る事によって,関節スティフネスを増大させ,動きをモデルの動きに近づけることができることが明らかになった.これまでこの運動学習の研究は,いかにしたら運動学習が効率的に進むかに焦点が当てられ,主に練習方法と学習過程における運動結果の与え方が着目されてきた.つまり,実際に身体を動かしその誤差を修正するといった,トライアンドエラーを基本としている.これに対して,実際に運動しなくても運動を観察したりイメージしたりするだけで運動学習の効果が現れることが明らかにされ,観察運動学習と呼ばれている.しかしながら観察運動学習の研究においては運動時間やタイミングなどが着目されているに過ぎず,力調整や関節スティフネスの調整などの実際の運動学習の主体が環境へ働きかける側面からの研究はない.そこで本研究は,観察運動学習のメカニズムの解明を目指し,この観察学習によって身体運動の制御で最も重要と考えられる関節スティフネスが変化し身体運動を変化させることができるか否かを検討した.その一年目として,ドロップジャンプを関節スティフネス調整の運動対象に選び,10名の健康な被験者に異なる着地方法(つま先着地と踵着地)でドロップジャンプを行ってもらい,その映像とフォースプレートから得られる力データから下肢各関節および下肢全体の関節スティフネスを定量化した.その結果,着地方法の変化により関節スティフネスが変化することが明らかになった.この基礎データを用いて次年度は,関節スティフネス値が観察学習とともにどのように変化するかを明らかにする.さらに,その観察運動学習の際に被験者に見せるお手本の映像も変化させることにより,どのような映像が観察運動学習にとって有効かを検討する予定である.これまでこの連動学習の研究は,いかにしたら運動学習が効率的に進むかに焦点が当てられ,主に練習方法と学習過程における運動結果の与え方が着目されてきた.つまり,実際に身体を動かしその誤差を修正するといった,トライアンドエラーを基本としている.これに対して,実際に運動しなくても運動を観察したりイメージしたりするだけで運動学習の効果が現れることが明らかにされ,その運動学習は観察運動学習と呼ばれている.しかしながら観察運動学習の研究においては運動時間やタイミングなどが着目されているに過ぎず,力調整や関節スティフネスの調整などの実際の運動学習の主体が環境へ働きかける即面からの研究はない.本研究は,この観察運動学習のメカニズムの解明を目指し,身体運動の制御で最も重要と考えられる関節スティフネスが運動を観察するだけで変化させることができるかを検討した.実験は, 10名の健康な被験者に異なる着地方法(つま先着地と踵着地)でドロップジャンプを行ってもらい,その映像とフォースプレートから得られる力データから下肢各関節および下肢全体の関節スティフネスを定量化した.その結果,着地方法の変化により関節スティフネスが変化することが明らかになった.さらに,観察運動学習の際にお手本の映像と自己の映像を観察することによって,着地方法を変化させて自己の関節スティフネスをお手本のスティフネスに近づけることが可能なことが明らかにされた.これらの結果は,動きの観察からその動きを生成させている力の学習が可能な事を示唆すると言える.
水の代替物質トレハロースの作用機構から探る生体系における水の役割2

1.水中におけるトレハロースとベンゼンの相互作用を分子動力学シミュレーション(MD)により、調べた。具体的には、トレハロースとベンゼンの質量中心間距離を反応座標にとり自由エネルギー変化を算出した。その結果、質量中心間距離R=5.2Å付近に極小値が見出された。ついで、極小点におけるトレハロースに対するベンゼンの相対的配向を解析したところ、ベンゼンはトレハロースの上部(exocyclic methylene基の存在する側)と相互作用することが判明した。一方、トレハロース1分子水溶液に対するMDの解析から、トレハロースは、下部ではよく水和されているのに対し、上部では水和されにくい部分があることがわかった。このことから、ベンゼンは脱水和のペナルティを最小にする経路でトレハロースに接近し結合すると結論した。このような水和ポケットは、α,α-1,1-グリコシド結合の剛直性から生ずることから、ベンゼンとの錯体形成は他の糖では起こらないことも説明できた。2.LEA蛋白質の構造と機能の関係を調べるため、ネムリユスリカ由来のPvLEA2とモデルペプチドを用いた実験を行った。その結果、乾燥状態ではPvLEA2はαヘリックス構造をとること、また、ナトリヴムイオンの共存はこのαヘリックスの形成を妨げないがモカルシウムイオンの場合は著しく阻害することが判明した。モデルペプチドを用いた実験では、カゼイン水溶液の乾燥→再水和過程で起こる凝集に対し、モデルペプチドの添加がどのような影響を与えるかを調べた。その結果、低濃度では凝集を促進するが、高濃度では天然のLEAと同等な抑制作用を示すことが判明した。水溶液中では無構造であるが乾燥すると構造化するという、LEA蛋白質の特異な性質を解明するため、レプリカ交換分子動力学計算を行った。その結果、LEA蛋白質の11mer繰り返しモチーフ2個から成るペプチドは、真空中(乾燥状態に相当)においてαヘリックスが最安定構造であることが確かめられた。トレハロースは、水の代替物質して細胞内に産成される適合溶質であり、細胞膜や蛋白質を乾燥や凍結破壊から防ぐ役割をする。本研究では、実験及び理論計算を通して、この糖の作用機構に関し以下の成果を得た。1.レハロースを蓄積することにより乾燥耐性を獲得した代表的生物としてネムリユスリカをとりあげ、水置換仮説とガラス化仮説のどちらのメカニズムが優位に働いているかを検証した。具体的には、乾燥した幼虫試料を直接FTIR法あるいはDSC法により測定した結果、ネムリユスリカの生命維持にはガラス化メカニズムが優位に働いていると結論した。2.トレハロースが乾燥DNAの構造安定化にどのような効果をもつかを、FTIR実験とDSC測定から調べた。その結果、1ヌクレオチド対当り2分子のトレハロースを混合し乾燥させるとB型二重螺旋構造が保持されること、トレハロースはDNAのリン酸基に直接結合しているらしいこと、さらに乾燥したDNAとの混合物中でトレハロースはガラス化していることが判明した。以上より、DNAの熱安定性はトレハロースのガラス化と密接に関係していると結論した。3.水置換仮説やガラス化仮説を原子レベルで検証するため、分子動力学シミュレーションを実行した。まず、リン脂質二重膜とトレハロースから成る系に対しシミュレーションを実行した結果、トレハロースはリン脂質極性基に直接水素結合すること、及び脂肪鎖の秩序パラメータはトレハロース濃度依存的に増大することが判明した。これにより、水置換仮説が実証できた。次に、ガラス状態のシミュレーションにより、ガラス化しやすく劣化し難いというトレハロース特有の性質が何に起因するのかを調べた。分子間水素結合数、平均二乗変位、自由体積及び糖のコンホメーション揺らぎなどの解析結果から、トレハロースは単一のコンホメーションをもつため、分子のパッキング密度が高くなりガラス転移点の上昇がもたらされると結論した。

水溶液中では無構造であるが乾燥すると構造化するという、LEA蛋白質の特異な性質を解明するため、レプリカ交換分子動力学計算を行った。その結果、LEA蛋白質の11mer繰り返しモチーフ2個から成るペプチドは、真空中(乾燥状態に相当)においてαヘリックスが最安定構造であることが確かめられた。