hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
遊離核酸を用いた小児悪性腫瘍に対するFluid　Biopsy法の確立

広島大学小児腫瘍グループに過去約20年間に保存され、予後調査が完了している神経芽腫、肝芽腫、腎芽腫、横紋筋肉腫を含む約1000例のうち、治療前の初代培養にて腫瘍細胞のみ選別され、血漿が同時に保存されている200検体、樹立株23株、腹水・胸水80検体を対象として、本年度は無治療例(176例)を検討した。1,腫瘍特異的選別マーカーの検出::既存の細胞株、樹立株の培養液中の遊離核酸およびエクソソームを抽出し、次世代シークエンサー(NGS、ilumina Hiseq2500)を用いて腫瘍特異的な遺伝子変化(変異、欠失、転座)、miRNA発現を検索した。2,エクソソームの同定と抽出:当大学最新のサーマル電解放出型走査型電顕(日本電子)を用いて、エクソソームのがん細胞表面の局在、培養中の動態、患者血漿中の局在を検討する。血漿・体液(胸水・腹水)や培養液のエクソソームのRNA量について測定し、miRNAの発現をNGSにて解析した。3,遊離DNA (cfDNA)抽出:血漿・体液(胸水・腹水)や培養液中のcfDNAを抽出し、2と同様に定量するとともに、デジタルPCR法で断片化を検索し、担癌児での疾患や病期、年齢別のcfDNA抽出量の検討の上、周知の遺伝子異常(MYCN増幅、CTNNB1変異、WT1変異など)を含めた遺伝子変化について、NGSにて測定したが、機器故障のため遅延した。これらから、Cancer fluid biopsyへの評価として、生検あるいは摘出されたがん組織のDNAから検出される遺伝子変化、キメラ遺伝子miRNA発現パターンとの関連を検索したところ、cfDNAでは腫瘍細胞そのものの遺伝子変化はほぼ同定された(98%)。一方、miRNAでは一致率が62%前後であり、血漿中miRNAは腫瘍以外の因子の関与が示唆された。1.腫瘍特異的選別マーカーの検出::既に遺伝子異常が判明している腫瘍の腫瘍由来のDNAと診断時血漿(血清)由来遊離DNA(cfDNA)を用いた次世代シークエンサー(Cancer Panel等)にて遺伝子異常をスクリーニングとデジタルPCRでの検証は順調であったが、次世代シークエンサーの不調のため一部の検討が遅延した。2.エクソソームの同定と抽出:サーマル電解放出型走査型電顕を用いて、エクソソームのがん細胞表面の局在、培養中の動態、患者血漿中の局在は検討し得た。血漿・体液(胸水・腹水)や培養液のエクソソームのRNA量について測定したが、機器の不調でmiRNA発現解析が遅延した。3.遊離DNA (cfDNA)抽出:血漿・体液(胸水・腹水)のcfDNA抽出量の検討の上、周知の遺伝子異常(MYCN増幅、CTNBB1変異、WT1変異など)を含めた遺伝子変化について、NGSの測定が、機器故障のため遅延した。上記から、NGS解析が一部遅延しており、機器の更新も含めて検討が必要と考えらえれた平成30年度以降は、広島大学の小児がん検体と細胞株とともに、治療経過中の血漿検体1000検体と腹水・胸水80検体を遊離核酸の対象とし、また患者の血液検体を診断時と治療中に同意を得て採取し、平成30年までに臨床応用すべく臨床試験へ盛り込んでいく。遅延している次世代シークエンサー解析は機器導入も考えつつ、検討を進める。1.Cancerfluid biopsyのバイオマーカー確定:遺伝子変化との相補性、部位、進行度による陽性率、治療中の経過、再発時のデータなどから、cfDNAにおける各小児悪性腫瘍のバイオマーカーを同定する。2.miRNAによるバイオマーカーの確定:診断時に血漿や体液から抽出したエクソソーム内のmiRNA発現量、治療経過中の発現量を定量し、腫瘍内miRNA量との相関を検索し、各小児悪性腫瘍のなるmiRNAのバイオマーカーを同定する。3.Cancerfluid biopsyの臨床例への応用:新規症例あるいは奏功例、難治例、再発例の検証:実際の小児がん症例の血漿の遊離核酸解析を行い、実際の診断、治療効果の判定、早期再発のモニタリングとしてベッドサイドで検証できるシステムを構築する。また、体液(胸水・腹水)中の遊離核酸、miRNAの継時的解析から、治療効果やフォローアップに有用性を検証する。上記の結果から、Cancer fluid biopsyとして、臨床試験への候補の選別と共に、遊離核酸やmiRNAの解析データから、個々の腫瘍に有効な薬剤の選別システムの確立、これらのマーカーを用いたオーダーメイド医療のガイドラインを作成する。

2,エクソソームの同定と抽出:当大学最新のサーマル電解放出型走査型電顕(日本電子)を用いて、エクソソームのがん細胞表面の局在、培養中の動態、患者血漿中の局在を検討する。血漿・体液(胸水・腹水)や培養液のエクソソームのRNA量について測定し、miRNAの発現をNGSにて解析した。3,遊離DNA (cfDNA)抽出:血漿・体液(胸水・腹水)や培養液中のcfDNAを抽出し、2と同様に定量するとともに、デジタルPCR法で断片化を検索し、担癌児での疾患や病期、年齢別のcfDNA抽出量の検討の上、周知の遺伝子異常(MYCN増幅、CTNNB1変異、WT1変異など)を含めた遺伝子変化について、NGSにて測定したが、機器故障のため遅延した。これらから、Cancer fluid biopsyへの評価として、生検あるいは摘出されたがん組織のDNAから検出される遺伝子変化、キメラ遺伝子miRNA発現パターンとの関連を検索したところ、cfDNAでは腫瘍細胞そのものの遺伝子変化はほぼ同定された(98%)。一方、miRNAでは一致率が62%前後であり、血漿中miRNAは腫瘍以外の因子の関与が示唆された。1.腫瘍特異的選別マーカーの検出::既に遺伝子異常が判明している腫瘍の腫瘍由来のDNAと診断時血漿(血清)由来遊離DNA(cfDNA)を用いた次世代シークエンサー(Cancer Panel等)にて遺伝子異常をスクリーニングとデジタルPCRでの検証は順調であったが、次世代シークエンサーの不調のため一部の検討が遅延した。2.エクソソームの同定と抽出:サーマル電解放出型走査型電顕を用いて、エクソソームのがん細胞表面の局在、培養中の動態、患者血漿中の局在は検討し得た。血漿・体液(胸水・腹水)や培養液のエクソソームのRNA量について測定したが、機器の不調でmiRNA発現解析が遅延した。3.遊離DNA (cfDNA)抽出:血漿・体液(胸水・腹水)のcfDNA抽出量の検討の上、周知の遺伝子異常(MYCN増幅、CTNBB1変異、WT1変異など)を含めた遺伝子変化について、NGSの測定が、機器故障のため遅延した。上記から、NGS解析が一部遅延しており、機器の更新も含めて検討が必要と考えらえれた平成30年度以降は、広島大学の小児がん検体と細胞株とともに、治療経過中の血漿検体1000検体と腹水・胸水80検体を遊離核酸の対象とし、また患者の血液検体を診断時と治療中に同意を得て採取し、平成30年までに臨床応用すべく臨床試験へ盛り込んでいく。遅延している次世代シークエンサー解析は機器導入も考えつつ、検討を進める。1.Cancerfluid biopsyのバイオマーカー確定:遺伝子変化との相補性、部位、進行度による陽性率、治療中の経過、再発時のデータなどから、cfDNAにおける各小児悪性腫瘍のバイオマーカーを同定する。2.miRNAによるバイオマーカーの確定:診断時に血漿や体液から抽出したエクソソーム内のmiRNA発現量、治療経過中の発現量を定量し、腫瘍内miRNA量との相関を検索し、各小児悪性腫瘍のなるmiRNAのバイオマーカーを同定する。3.Cancerfluid biopsyの臨床例への応用:新規症例あるいは奏功例、難治例、再発例の検証:実際の小児がん症例の血漿の遊離核酸解析を行い、実際の診断、治療効果の判定、早期再発のモニタリングとしてベッドサイドで検証できるシステムを構築する。また、体液(胸水・腹水)中の遊離核酸、miRNAの継時的解析から、治療効果やフォローアップに有用性を検証する。
血液細胞の情報伝達機構における新規チロシン脱リン酸化酵素の機能の解析

我々は、増殖因子(IL-3またはGM-CSF)依存性ヒト白血病細胞株F-36Pから新規チロシン脱リン酸化酵素(PTPase)cDNAを単離し、これをHPTPη(Human Protein-Tyrosine Phosphatase η)と命名した。HPTPηは膜貫通型のPTPaseであり、細胞内に1つのPTPaseドメインを持ち、細胞外領域は10個のファイブロネクチン(FN)類似の繰り返し配列を持つ事が判明した。我々はHPTPηがサイトカインによる情報伝達に関与している可能性を検討するために、F-36Pを増殖因子刺激前後で抗HPTPη抗体を用いて免疫沈降し、共沈してくる蛋白質のチロシンリン酸化の変化を検討したが、現在のところ有意な変化は認められていない。この結果はHPTPηがサイトカインによる情報伝達機構に直接には関与しない可能性を示唆しているが、最近ヒト赤白血病細胞株であるHELをDMSO等を用いて赤芽球に分化させる過程でHPTPηが重量な役割を示しているという論文が発表され、今後の検討が必要であると思われる。また、チロシンフォスファターゼは近年癌抑制遺伝子としての役割が期待されている。興味深い事に、HPTPηの遺伝子座位は癌細胞でしばしば欠失が認められるヒト染色体の11番短腕上11p11.2であることが判明した。そこで、各種癌臨床検体および細胞株で、HPTPη遺伝子の再構成をサザンブロットにより検討を行ったが、現在までに再構成の認められた臨床検体および細胞株は認められなかった今後更に症例数を増やして検討を重ねていく予定である。また、モノクローナル抗体を用いて新規白血病およびリンパ球表面抗原の単離同定を行っているスペインのバルセロナ大学の免疫部門のAntoni Gaya博士とアメリカDNAX研究所のStuart Tangye博士との共同研究により、CD(Cluster Differentiation)148と命名された白血球およびTリンパ球膜抗原がHPTPηと同一であることが判明した。この結果は実際にHPTPηがヒト白血球、Tーリンパ球膜上に発現して何らかの働きをしている事を示唆するものであり、現在共同研究によりHPTPηの生物学的機能の解析を行っている。我々は、増殖因子(IL-3またはGM-CSF)依存性ヒト白血病細胞株F-36Pから既知のチロシンフォスファターゼ(PTPase)に保存されている領域をプライマーとしてPCRを行い、3種の新規PTPase cDNAを単離した。このうち白血病細胞株及びマウス臓器中で最も発現が高く認められる1種をプローブとしてひと胎盤cDNAライブラリーのスクリーニングを行い、翻訳領域全域を含むと思われる約5kbのクローンを得、これをHPTPη(Human Protein-Tyrosine Phosphatase η)と命名した。一次構造の解析の結果、HPTPηは膜貫通型のPTPaseであり、細胞内に1つのPTPaseドメインを持ち、細胞外領域は10個のファイブロネクチン(FN)類似の繰り返し配列を持つ、分類上type-IIIと呼ばれるPTPaseに属する事が判明した。血液細胞から単離されたtype-IIIPTPaseはこのHPTPηが初めてであると思われる。我々はHPTPηのチロシンフォスターゼ活性が既知のチロシンキナーゼにどの様な影響を与えるかにつき、src familyのチロシンキナーゼを中心に解析を行なった。

実際の方法としては、各種のsrc familyのチロシンキナーゼを高発現しているマウス3T3 fibroblastにcytomegarovirusのプロモーターのもとでHPTPηを共発現させ、細胞の形態変化を観察すると共に、抗リン酸化をチロシン抗体を用いて細胞内蛋白質のチロシンリン酸化の変化についても検討を行った。しかし、現在までの解析の結果では、細胞の形態および細胞内タンパクのチロシンリン酸化に有意な変化は認められていない。以上の結果はHPTPηの基質がscr familyのチロシンキナーゼ以外のものであることを示唆し、今後更に基質特異性の検討を行っていく予定である。我々は、増殖因子(IL-3またはGM-CSF)依存性ヒト白血病細胞株F-36Pから新規チロシン脱リン酸化酵素(PTPase)cDNAを単離しこれをHPTPη(Human Protein-Tyrosine Phosphataseη)と命名した。HPTPηは膜貫通型のPTPaseであり、細胞内に1つのPTPaseドメインを持ち、細胞外領域は10個のファイブロネクチン(FN)類似の繰り返し配列を持つ事が判明し、いわゆるtypeIIIと呼ばれるPTPaseに属することが判明した。血液細胞から単離されたPTPaseは我々のHPTPηが初めてであると思われる。HPTPηは2種類のヒト増殖因子依存性白血病細胞株(F-36P、F-36E)で高い発現を認めた。この結果は、HPTPηがサイトカインによる情報伝達に関与している可能性を示唆する。この可能性を検討するために、F-36P、F-36Eを増殖因子刺激前後で抗HPTPη抗体を用いて免疫沈降し、共沈してくるタンパクを抗リン酸化チロシン抗体を用いてタンパクのチロシンリン酸化の変化の面からも解析を行ったが、有意な変化は認められなかった。また、チロシンフォスファターゼはチロシンキナーゼによりリン酸化されたチロシン残基を脱リン酸化するところから、近年癌抑制遺伝子としての役割が期待されている。興味深い事に、HPTPηの遺伝子座位はFISH法により、癌細胞でしばしば欠失が認められるヒト染色体の11番短腕上11p11.2であることが判明した。そこで、各種癌臨床検体および細胞株で、HPTPη遺伝子の再構成をサザンブロットにより検討を行ったが、現在までに再構成の認められた臨床検体および細胞株は認められなかった今後更に症例数を増やして検討を重ねていく予定である。
Uー統計量の応用的研究

1.Uー統計量は最良不偏推定量であり、弱い条件の下で漸近正規性が成立する,という理論的最適性を持つ・しかしながら,その計算量の大きさのために次数の大きい場合は実用的とはあまり見なされなかった.また区間推定を行なうには,その分散を推定する必要があるが,実用的な分散推定量は知られていなかった.本研究の目的はUー統計量のこれらの難点を克服することにあった.2.計算量を小さくする問題は,2標本問題において実用的な多くの場合に適用できるようこれまでの研究を整理し,さらに一般な場合への拡張を試みているが,理論的にはまだはっきりしない.3.Uー統計量の分散の推定では,分散をさらに高次の核関数を持つUー統計量で推定する方法(U法),ジャックナイフ法,ブ-ツトラップ法およびそれらを不偏となるように変換した方法を多くのUー統計量について計算機シミュレ-ションで比較し,U法とブ-ツトラップ法が総合的に優れていることを示した.さらに,最も実用的なUー統計量であるマン・ホイットニ-統計量の場合にはU法が最良との結論に達した.これらの結果は現在投稿中または投稿準備中である.その他の2標本Uー統計量の場合についても現在数値計算を行なっている.4.分布関数を推定する場合に,平均2乗誤差の意味では複雑な核型推定量が良いと証明されているが,2乗誤差では単純な経験分布関数との違いは小さく,本質的には差がないことを示した.これらの証明にはUー統計量の特質を用いており,結果は現在投稿中である.5.研究分担者の研究は以下のとおり.(1)稲垣・高木はUー統計量を含む推定関数の漸近理論を研究し,学会で講演予定.(2)松尾は一般化線形模型をUー統計量の立場からまとめている.(3)谷口は時系列への応用を研究し,テクニカル・レポ-トにまとめ,学会で講演予定.論文は投稿準備中である.1.Uー統計量は最良不偏推定量であり、弱い条件の下で漸近正規性が成立する,という理論的最適性を持つ・しかしながら,その計算量の大きさのために次数の大きい場合は実用的とはあまり見なされなかった.また区間推定を行なうには,その分散を推定する必要があるが,実用的な分散推定量は知られていなかった.本研究の目的はUー統計量のこれらの難点を克服することにあった.2.計算量を小さくする問題は,2標本問題において実用的な多くの場合に適用できるようこれまでの研究を整理し,さらに一般な場合への拡張を試みているが,理論的にはまだはっきりしない.3.Uー統計量の分散の推定では,分散をさらに高次の核関数を持つUー統計量で推定する方法(U法),ジャックナイフ法,ブ-ツトラップ法およびそれらを不偏となるように変換した方法を多くのUー統計量について計算機シミュレ-ションで比較し,U法とブ-ツトラップ法が総合的に優れていることを示した.さらに,最も実用的なUー統計量であるマン・ホイットニ-統計量の場合にはU法が最良との結論に達した.これらの結果は現在投稿中または投稿準備中である.その他の2標本Uー統計量の場合についても現在数値計算を行なっている.4.分布関数を推定する場合に,平均2乗誤差の意味では複雑な核型推定量が良いと証明されているが,2乗誤差では単純な経験分布関数との違いは小さく,本質的には差がないことを示した.これらの証明にはUー統計量の特質を用いており,結果は現在投稿中である.5.研究分担者の研究は以下のとおり.(1)稲垣・高木はUー統計量を含む推定関数の漸近理論を研究し,学会で講演予定.(2)松尾は一般化線形模型をUー統計量の立場からまとめている.(3)谷口は時系列への応用を研究し,テクニカル・レポ-トにまとめ,学会で講演予定.論文は投稿準備中である.
視覚運動系の２者間実時間相互作用に関する最適化制御技術の確立

社会性動物にとり重要な他者との動的協調性すなわちコミュニケーションについて,実時間相互作用の動的協調性評価方法および運動先行性を特徴とするプロアクティブ制御を鍵にして,運動速度のリズム成分自己生成機構に着目した協調性メカニズムの描像と運動先行性との関わり,協調性最適化状態の計測とその条件の導出,運動速度のリズム成分自己生成機構への介入および協調性の状態操作手法を通して,2者間実時間動的協調性の実態を明らかにし,コミュニケーションの定量的研究基盤の構築および協調性を操作し最適化するための基礎技術を確立することを目的とする.本年度はコミュニケーションの理論研究基盤構築のため,制御モデルおよびコミュニケーションモデルの精緻化を目指した.本年度の成果は以下の通りである.1.視覚目標追跡運動実験で観測される低周波領域のフィードバック要素優位の振る舞いと高周波領域のフィードフォワード要素優位による先行運動の振る舞いの再現を目指し,制御モデルの拡張を低周波領域モデルと高周波領域モデルとを周波数に応じて接続により実現した.2.修正制御モデルを相互結合し,前年度構築したコミュニケーションモデルを修正した.修正に伴い,仮想相互追跡実験再現のためパラメータ調整し,構築したモデルでの数値実験を実施した.コミュニケーション状態測定値やその最適化条件探索など実験結果との比較検討し,コミュニケーション状態を定量的に操作する条件を明らかにした.社会性動物にとり重要な他者との動的協調性すなわちコミュニケーションについて,実時間相互作用の動的協調性評価方法および運動先行性を特徴とするプロアクティブ制御を鍵にして,2者間実時間動的協調性の実態を明らかにし,コミュニケーションの定量的研究基盤の構築および協調性を操作し最適化するための基礎技術を確立することを目的とする.本年度はプロアクティブ制御観測時の特徴である被験者の運動速度リズム機構を明らかにする.本年度の成果は以下の通りである.1.運動速度リズム生成機構に関わる制御要素を同定するため,視線情報測定装置を導入し,既存設備である手動運動位置計測装置と組み合わせて,視線と手動運動を同時測定可能な視覚目標追跡運動実験装置を構築した.2.構築した実験システムを用いて予備的な追跡運動実験を実施した.運動速度,運動範囲,運動軌道など視覚目標運動に関する部分と視線推定精度の向上のための被験者頭部運動の制限方法,手動軌道の制限方法など実験環境に関連する部分など,次年度以降への被験者実験の際の実験パラメータの決定に資した.2.追跡運動制御モデルにより運動先行性とリズム成分との関連機構および付加非線形項,フィードバック要素とフィードフォワード要素との関係に関連したリズム自己生成機構を明らかにするため,制御モデル中の各情報の時間発展の詳細を追跡し,各制御項の寄与を明らかにするための実験条件の検討を行った.本年度の目的は,運動先行性と運動速度リズムの自己生成機構との関係を明らかにすることで,そのための視覚目標運動追跡実験系の構築および予備実験の実施,制御モデルの内部情報の整理を通じて,各制御項への先行性やリズム生成への寄与を明らかにする実験条件の検討を行った.研究実績の概要の示す通り,ほぼ計画通りに研究を遂行したと判断する.社会性動物にとり重要な他者との動的協調性すなわちコミュニケーションについて,実時間相互作用の動的協調性評価方法および運動先行性を特徴とするプロアクティブ制御を鍵にして,運動速度のリズム成分自己生成機構に着目した協調性メカニズムの描像と運動先行性との関わり,協調性最適化状態の計測とその条件の導出,運動速度のリズム成分自己生成機構への介入および協調性の状態操作手法を通して,2者間実時間動的協調性の実態を明らかにし,コミュニケーションの定量的研究基盤の構築および協調性を操作し最適化するための基礎技術を確立することを目的とする.本年度はコミュニケーション状態の計測,解析および制御モデルの数値実験により,コミュニケーションの理論研究基盤の構築を目指した.本年度の成果は以下の通りである.1.前年度に検討した実験パラメータで視覚目標追跡運動実験を実施し,主に運動速度のリズム成分に関わる事項について実験結果と制御モデルからの予測との比較検討を行い,制御モデルの予測性能を調査した.2.視覚目標追跡運動実験装置を相互結合し,相互追跡実験装置を構築した.コミュニケーション状態測定の予備実験を実施し,コミュニケーション最適状態測定についての実験条件の検討を行った.3.追跡運動制御モデルを相互結合し,コミュニケーションモデルを構築した.構築したモデルでの数値実験を実施し,コミュニケーション状態測定値やその最適化条件探索など実験結果との比較検討準備を行った.本年度の目的は,コミュニケーション状態の計測,解析および制御モデルの数値実験により,コミュニケーションの理論研究基盤の構築を目指し,コミュニケーション状態測定実験装置の構築,および実験条件の検討,また,コミュニケーションモデルの構築,解析への初期検討を行った.研究実績の概要の示す通り,ほぼ計画通りに研究を遂行したと判断する.社会性動物にとり重要な他者との動的協調性すなわちコミュニケーションについて,実時間相互作用の動的協調性評価方法および運動先行性を特徴とするプロアクティブ制御を鍵にして,運動速度のリズム成分自己生成機構に着目した協調性メカニズムの描像と運動先行性との関わり,協調性最適化状態の計測とその条件の導出,運動速度のリズム成分自己生成機構への介入および協調性の状態操作手法を通して,2者間実時間動的協調性の実態を明らかにし,コミュニケーションの定量的研究基盤の構築および協調性を操作し最適化するための基礎技術を確立することを目的とする.本年度はコミュニケーションの理論研究基盤構築のため,制御モデルおよびコミュニケーションモデルの精緻化を目指した.本年度の成果は以下の通りである.1.視覚目標追跡運動実験で観測される低周波領域のフィードバック要素優位の振る舞いと高周波領域のフィードフォワード要素

優位による先行運動の振る舞いの再現を目指し,制御モデルの拡張を低周波領域モデルと高周波領域モデルとを周波数に応じて接続により実現した.2.修正制御モデルを相互結合し,前年度構築したコミュニケーションモデルを修正した.修正に伴い,仮想相互追跡実験再現のためパラメータ調整し,構築したモデルでの数値実験を実施した.コミュニケーション状態測定値やその最適化条件探索など実験結果との比較検討し,コミュニケーション状態を定量的に操作する条件を明らかにした.今後は,コミュニケーション状態の計測,解析および制御モデルの数値実験により,コミュニケーションの理論研究基盤の構築を目指す.そのため,追跡運動実験と制御モデルとの比較により,リズム自己生成機構を明らかにするとともに,リズムへの関与方法の検討を行う.また,実験装置を相互追跡運動実験に拡張し,コミュニケーション最適状態の計測を行う.合わせて,コミュニケーション制御モデルを構築し,理論特性を求め,実験結果との比較を行い,コミュニケーション最適状態の普遍性と限界を導く.今後は,今年度に構築した相互追跡実験装置を用いて,コミュニケーション状態の計測を行い,また,コミュニケーションモデルの解析および数値実験により,コミュニケーション状態操作の可能性を検討する.それらをまとめて,コミュニケーションの実態およびメカニズムを明らかにし,コミュニケーション状態操作技術の基盤に資する.追跡実験系の構築の際に謝金の支払いを計画していたが,研究代表者自らが実験系の構築を行ったので費用がかからなかった.また,研究成果発表用の旅費を計画していたが,発表学会の見直しなどを行い次年度以降に使用するように当初計画を変更した.研究打ち合わせ用の旅費を計画していたが,H30年度のコミュニケーション状態操作に関するデータの収集後に実施するよう当初計画を変更した.相互追跡実験用機器購入費(200,000円程度).また,成果報告や研究打ち合わせ等で旅費(200,000円程度),実験装置構築及び被験者への謝金(30,000円程度),その他,論文投稿のための英文校閲費や学会参加費として使用する計画である.相互追跡実験装置を構築するための電子機器類,その他必要な消耗品,また,コミュニケーション仮想実験のための計算機等を購入する(1,400,000円程度).また,成果報告や研究打ち合わせ等で旅費(200,000円程度),実験装置構築及び被験者への謝金(30,000円程度),その他,論文投稿のための英文校閲費や学会参加費として使用する計画である.
運動同期による二者一体化の神経機構

本研究の目的は、古今東西人間社会に遍在していた他者との運動同期に着目し、二者一体化の神経機構を「運動科学ー社会心理学ー脳科学」の学際手法を用いて解明することである。本年度の研究成果は、学会発表を1件と論文1篇であった。まずは、学会発表した内容から説明する。これまで行ってきた二者間の協調運動(二者が向かいあって立ち、膝をリズミカルに屈伸する運動)に関する研究において、二者のダイナミクスを記述する力学モデルをさらに発展させた。人間のデータやその他の生物学的データは階層構造を持つことが多い。本年度はデータの階層構造を考慮したモデルを提案した。このモデルによって、不確実性を含む人ー人系の結合関数を同定することに成功した。この成果については現在論文執筆中である。次に出版した論文について述べる。先行研究では、二者がリズミカルな運動を一緒に行うと、同位相に引き込まれてしまう引き込み現象が報告されている。この引き込みに個々の心理特性が関与することも報告されている。本研究から、2人で一緒に協調運動を行い90度位相差を作成する課題において、二者の自閉症スペクトラム指数の差が大きいペアは、その差が小さいペアよりもこの課題を早く達成することが明らかになった。このことは、協調運動における2者の相性が社会性の影響をうけることを示唆している。以上2つの研究成果から、協調運動と精神活動の相互作用に関する理解が進んだと言える。近年、社会心理学の研究から他者と運動を同期すると、その相手への心理が変化することが報告されている。運動同期による心理的な変化と相関した運動指標を見つけることが初年度の研究の目的であった。本研究では、リズミカルな運動同期課題を用いるが、リズミカルに振動する運動は人間の運動のみならず、あらゆる自然現象において観察されるため、その振る舞いを記述するための理論的背景が強固である。本研究ではその数理モデルを援用することで、二者の運動同期や引き込みを記述し、二者一体化の指標を探る。被験者に二人一組で向きあって立ってもらい、リズミカルな膝の屈伸運動を行わせた。リズム運動のテンポは、逆位相から同位相へと相転移が生じる周波数の95%の周波数とした。運動の周波数はメトロノームで規定したが途中でメトロノームを止め、被験者にはそのまま同じリズムで運動を継続してもらった。メトロノームを止めた後の膝の関節角度を解析した。その結果、同期し続けるペアや、同期しないペアなど多くの振る舞いが観察された。現在これらの結果を、結合振動子モデルでモデル化を試みている。現在のモデルでは、パラメータ数や推定精度に改善点があるため、より単純化したモデルを作成中である。このモデルで二者の結合強度等を推定し、心理指標や脳活動との相関を調べるのが今後の目標となる。初年度は、心理学指標や脳活動と相関する運動科学的な指標を見つけることが目的であった。その指標として結合振動子モデルの結合強度に着目した。現在のモデルはまだ完成していないが、問題や改善すべき点は明らかになった。本年度は、昨年度から引き続き行っている二者の引き込み現象のモデル化と社会性が二者の引き込みに与える影響を検討する研究を行った。まず二者の引き込みのモデル化について述べる。系の時間発展を記述する力学的なモデルを仮定することにより、時系列データの背後にある系が持つ潜在的な結合強度を推定した。その結果、背中合わせでリズム運動を行う条件では結合強度はほぼ0であり、結合が存在しないことが示唆された。一方向かい合ってリズム運動を行った条件では結合強度が0に比べて有意に大きく、結合が存在することが確認された。現在この結果を論文にまとめている。次に社会性が二者の引き込みに与える影響について述べる。二者の運動の引き込みには社会性が関わっていることを示唆する研究が報告されている。これらの研究では、社会性と関わる精神疾患の患者と健常者とを組み合わせ協調運動を行わせていた。そのため、これらの先行研究の知見が健常者同士の協調運動にも当てはまるのかどうかは検討されていなかった。本年度はこれに関する研究を行い、健常者であっても二者の社会性の差が協調運動に影響を与えることが示唆された。この結果については、論文をまとめ投稿し現在査読中である。

本研究の目的は、古今東西人間社会に遍在していた他者との運動同期に着目し、二者一体化の神経機構を「運動科学ー社会心理学ー脳科学」の学際手法を用いて解明することである。本年度は、二者の視覚的結合をモデル化し、現在論文をまとめている最中である。また社会性と協調に運動に関する研究はすでに論文にまとめ投稿し、現在査読中である。そのため進捗状況はおおむね順調に進展していると言える。本年度の研究成果は、学会発表を1件と論文1篇であった。まずは、学会発表した内容から説明する。これまで行ってきた二者間の協調運動(二者が向かいあって立ち、膝をリズミカルに屈伸する運動)に関する研究において、二者のダイナミクスを記述する力学モデルをさらに発展させた。人間のデータやその他の生物学的データは階層構造を持つことが多い。本年度はデータの階層構造を考慮したモデルを提案した。このモデルによって、不確実性を含む人ー人系の結合関数を同定することに成功した。この成果については現在論文執筆中である。次に出版した論文について述べる。先行研究では、二者がリズミカルな運動を一緒に行うと、同位相に引き込まれてしまう引き込み現象が報告されている。この引き込みに個々の心理特性が関与することも報告されている。本研究から、2人で一緒に協調運動を行い90度位相差を作成する課題において、二者の自閉症スペクトラム指数の差が大きいペアは、その差が小さいペアよりもこの課題を早く達成することが明らかになった。このことは、協調運動における2者の相性が社会性の影響をうけることを示唆している。以上2つの研究成果から、協調運動と精神活動の相互作用に関する理解が進んだと言える。心理学的指標や、脳活動と相関する二者一体化の指標(二者の振動の結合強度)を見つけることが本研究の最も重要な部分である。2年目もその指標の開発を主に行う。またその時間発展(二者の結合が運動同期を重ねるごとに強くなっていくことなど)を検証する。最終年度は、二者の運動同期の時間発展(二者が社会相互作用を重ねるとどのように変化していくか)を検証し、脳活動計測へとつながる行動指標の解明を目指す。現在予備実験として、物理的に接触している二者や、コミュニケーションを続ける二者の姿勢動揺を計測している。この時の姿勢動揺に対して非線形力学系や複雑系の解析を行い、社会相互作用をしている二者の姿勢動揺の背後に潜む協調ダイナミクスを明らかにしていく。
人工知能により冠動脈MRAから冠血流予備量比を計測するMR-FFR法の開発

平成30年度は、13.0T MR装置による冠動脈MRAに対して、新しい高速化技術である圧縮センシングを使用した高空間解像度の冠動脈MRA画像が得られるように撮影方法を最適化すること、2得られた冠動脈MRA画像に対して人工知能(AI)の技術を適用することに冠動脈血流予備量比(FFR)の推定を行うアルゴリズムを研究分担者である立命館大学の中山らとともに共同開発に着手することであった。1の圧縮センシングを使用した高画質冠動脈MRA撮影方法の最適化については予定通り実施できた。この検討では圧縮センシングの手法であるC-SENSE法を用いて撮影された3.0T冠動脈MRA画像を、十分な画質を保ったまま、従来法の2.5倍まで加速することが可能であることが示され、国際学会であるISMRM2018にてポスター発表を行った。また、2のAIによる冠動脈MRAによるFFRの推定については、症例の蓄積は順調にすすんだが、ソフトウェア開発の着手にはいたらなかった。しかし、AI技術の冠動脈MRAへの適用に関する中山らとの共同研究は開始され、畳み込みニューラルネットワーク(CNN)を使ったAI技術を応用することにより、冠動脈MRAの画質を、従来の学習型超解像技術よりもさらに向上させることに成功した。CNNは手動で設定すべきハイパーパラメータが多数あり結果がハイパーパラメータに大きく左右される問題があるが、冠動脈MRA画像の高解像度化のためのCNNのハイパーパラメータをベイズ最適化により自動で決定することにより手動に左右されない冠動脈MRA画像の高解像度化が可能となることが示され、国際学会であるRSNA2018にてポスター展示発表を行った。AI技術の冠動脈MRAへの適用に関する中山らとの共同研究は開始された。AIによる冠動脈MRAによるFFRの推定については、症例の蓄積は順調にすすんだが、当該技術開発の着手にはいたっておらず当初の予定よりやや遅れている。AI技術の冠動脈MRAへの適用に関する中山らとの共同研究は開始され一定の成果が得られている。また、当院において圧縮センシングを用いた高画質冠動脈MRAの撮影およびFFRを実施した症例の蓄積は順調にすすんでいる。今後、これらのデータを用いて、畳み込みニューラルネットワーク(CNN)を用いたAIアルゴリズムを学習させ、冠動脈MRA画像からFFRの推定値を計算できるソフトウェア(MR-FFR)を開発していく予定である。令和元年度に実施することになるAIを用いて冠動脈MRA画像からFFRを推定するソフトウェア開発の際のデータ解析機材に使用する予定である。
生徒の思考・判断・表現力を育てる英語授業における発問ストラテジーの開発

平成30年度の研究目的は、生徒の思考・判断・表現を活性化するために、前年度の研究で考案した異なるタイプの具体的な発問をもとにしながら、授業のあらゆる場面において、どのように事実発問、推論発問、評価発問を連携させることができるか発問の活用方略をさらに具体化することであった。事実発問、推論発問、および評価発問を連携させて授業を行うことで、生徒のより深い思考を促し、指導後に生徒に意見や考えを英語で表現させる活動においても豊かな表現を促すことができることを、「聞くこと」「読むこと」「話すこと(やり取り)」「話すこと(発表)」「書くこと」の5つの領域別に具体的な発問の目的ごとに具体的発問を提案した。「聞くこと」の指導では、大まかな情報や詳細な情報を聞き取らせる、聞き取ったことをもとに推測させる、概要や要点を把握し英語で説明させるなどといった発問を提案した。「読むこと」の指導では、導入で生徒の興味・関心を高める、大まかな情報や詳細な情報を読み取らせる、テキストに書かれていない情報を推測させる、読んだことをもとに生徒の経験や考えを引き出すなどの発問を提案した。「話すこと(やり取り)」の指導では、即興で話をさせる、会話を継続させる、会話の内容を深める発問を提案し、「話すこと(発表)」の指導においては、目的・場面・状況を考えさせる、メモなどを活用して発表させる、まとまりのある内容を発表させる、説得力のあるスピーチをさせる発問を提案した。そして、「書くこと」の指導では、目的・場面・状況を考えさせる、モデル文から役立つ語句を表現に気付かせる、書きたい内容を絞らせる、具体的な事柄について書かせる、事実や考えを整理させる、理由とともに考えを書かせる発問などを提案した。本研究の目的は、教科書本文を扱った英語授業において、教師による異なるタイプの発問をいかに連携させれば生徒の英語による思考・判断・表現力を育成できるか考察し、教師発問の活用方略を提案することにある。平成28年度の研究目的は、生徒の思考・判断・表現を活性化するために、英語授業の導入・展開・まとめの3段階において、どのような事実発問、推論発問、評価発問が実際に可能であるか具体的な発問を明らかにすることにあった。そこで、今年度は以下の2点について研究を行うことにした。(1)英語の4技能指導における教師の発問に関する文献資料の収集および資料の整理を行った。これまでの研究を整理する際の視点は、以下の通りであった。4技能育成のための指導において、教師による発問の効果の有無についてはどこまで明らかにされているのか。教師発問の特徴の違いにより、生徒のテキスト理解や生徒の英語使用への影響の有無に関し、どのようなことが明らかにされてきているのか、外国語教育以外の分野においても同様の事柄がどこまで明らかにされているのか、などに関する文献資料を整理した。(2)具体的な事実発問・推論発問・評価発問に関する枠組みに関し整理を行った。授業展開の3つの段階(導入・展開・まとめ)において、生徒の思考・判断・表現を活性化する仮説的な事実発問・推論発問・評価発問を考案した。発問考案の視点は次の3つであった。1)導入であるプレ活動において、どのような発問が生徒を授業に動機付けるか、2)授業の中核となるイン活動において、指導の中で扱うメッセージ内容を生徒に正確かつ深く理解させる発問とはどのようなものが適切か、3)授業のまとめとなるポスト活動において、どのような発問が生徒の豊かな表現を促すのか。これらの視点のもと、具体的な発問を提示し、その発問作成の原理原則について整理した。平成28年度の研究は以下に示すように、ほぼ研究計画どおり進めることができ、その目的をほぼ達成した。第1の研究予定として、英語の4技能指導における教師の発問に関する文献資料の収集および資料の整理を行う計画であった。そこで、4技能育成のための指導において、これまで、および現在の英語教育において使用されている検定教科書および海外の出版社から出版されている英語学習教科書を収集し、その教科書の中で発問がどのように使われているのかを分析することに着手することができた。教科書内の発問の現状を調べることをもとにしながら、生徒のテキスト理解や生徒の英語使用を促進するための手立てを考察することができた。第2の研究予定として、第1の研究をもとにしながら、生徒の思考・判断・表現を活性化するための基本的な枠組みの整理を行うことであった。授業展開の3つの段階(導入・展開・まとめ)において、生徒の思考・判断・表現を活性化するうえで、事実発問・推論発問・評価発問の3つの枠組みが有効である可能性について以下の観点で考察した。1)テキスト内容を生徒に正確に理解させる発問と、生徒の意見や考えのアイデアを出させる発問には、いずれも事実発問が適切であること、2)テキスト内容を深く理解させる発問と生徒の意見や考えを深める発問には、推論発問が適切である可能性があること、3)テキスト内容をもとに生徒の表現を促す発問と生徒の意見や考えを豊かに表現させる発問には、評価発問が有効である可能性があることを、考察し、それらの発問作成の原理原則について整理することができた。

平成29年度の研究目的は、前年度の研究で整理した異なるタイプの具体的な発問をもとに、授業において、どのように事実発問、推論発問、評価発問を連携させるべきか発問の活用方略を明らかにすることである。本年度の研究では、異なるタイプの発問同士の連携のあり方について考察を行い、その活用方略をまとめる。(1)事実発問、推論発問、および評価発問を連携させて授業を行うことで、生徒のより深い思考を促し、指導後に生徒に意見や考えを表現させる活動でより豊かな表現を促すものと考えられる。例えば、事実発問の有無や発問内容によって、テキスト理解における理解度や思考度に変化が見られる可能性が考えられる、また、推論発問や評価発問の有無や連携の仕方により、生徒がテキスト内容の読みを深めたり、生徒の意見の表現を豊かにしたりすることが予想できる。そこで、英語授業の3つのそれぞれの段階において最適と思われる事実発問、推論発問、および評価発問の連携方法や内容について整理した。(2)事実発問、推論発問、評価発問の連携方法についての考察結果をもとにしながら、英語授業における展開の中での、事実発問、推論発問、評価発問の順序性および発問数、そして発問内容を精選し、発問の連携方法に関する仮説的な活用方略を考案し、効果的な発問の具体例について検討した。具体的には、英語授業のプレ段階やイン段階においての、リスニング指導およびリーディング指導に最適な事実発問・推論発問の活用方略、英語授業のポスト段階における、スピーキングやライティングなどの表現活動までを見据えた推論発問や評価発問の連携方法について具体的に検討した。平成29年度の研究は以下に示すように、ほぼ研究計画どおり進めることができ、その目的をほぼ達成した。第1の研究予定としては、事実発問、推論発問、および評価発問を連携させて授業を行うことで、生徒のより深い思考を促し、指導後に生徒に意見や考えを表現させる活動でより豊かな表現を促すものと考えられる。そこで、英語授業の3つのそれぞれの段階において最適と思われる事実発問、推論発問、および評価発問の連携方法や内容について整理することができた。第2の研究予定として、第1の研究をもとにしながら、事実発問、推論発問、評価発問の連携方法についての考察結果をもとにしながら、英語授業における展開の中での、事実発問、推論発問、評価発問の順序性および発問数、そして発問内容を精選し、発問の連携方法に関する仮説的な活用方略を考案し、効果的な発問の具体例について検討した。具体的には、英語授業のプレ段階やイン段階においての、リスニング指導およびリーディング指導に最適な事実発問・推論発問の活用方略、英語授業のポスト段階における、スピーキングやライティングなどの表現活動までを見据えた推論発問や評価発問の連携方法について具体的に検討することができた。平成30年度の研究目的は、生徒の思考・判断・表現を活性化するために、前年度の研究で考案した異なるタイプの具体的な発問をもとにしながら、授業のあらゆる場面において、どのように事実発問、推論発問、評価発問を連携させることができるか発問の活用方略をさらに具体化することであった。
糖尿病状態における膵島解糖系の変動

本研究ではまず、肝型ホスホフルクトキナ-ゼ(PFKーL)のcーDNAプロ-ブをクロ-ニングした。このプロ-ブおよび筋型ホスホフルクトキナ-ゼ(PFKーM)cーDNAプロ-ブを用いて、培養b細胞ではPFKーMおよびPFKーLのmRNAが発現していることを明らかにした。各組織におけるホスホフルクトキナ-ゼの発現を検討すると、PFKーMの発現は筋、腎で最も多く認められた。PFKーLの発現は腎で最も多く、肝、網状赤血球では少なかった。また、PFKーM遺伝子の転写は組織特異的なスプライシングを受けていることを明らかにした。本研究ではさらにPFKーM遺伝子が30kb、24エキソンにわたる比較的大きな遺伝子であり、少なくとも2つのプロモ-タ-を有することを明らかにした。次にラットを用い、絶食/再摂食に伴う肝グルコキナ-ゼ、PFKーL、ピルビン酸キナ-ゼの発現の変動をmRNAレベルで検討した。肝はb細胞と同様にグルコキナ-ゼ、PFKーLを有している。ノザン分析の結果、肝グルコキナ-ゼmRNAは絶食により低下し、再摂食後急速に数十倍に増加することが明らかになった。ピルビン酸キナ-ゼも同様に絶食に伴い低下したが、再摂食後の増加はグルコキナ-ゼより遅れた。これに対し、PFKーLのmRNA含量の絶食/再摂食に伴う変動は小さかった。また、ストレプトゾトシン処理により糖尿病ラットを作成し、インスリン治療に伴う各律速酵素の発現の変動を同様に検討した。糖尿病の影響、インスリンの効果は絶食/再摂食の効果と類似していた。このように同じ解糖系律速酵素といえども酵素種によりその発現の調節機構は異なることが明瞭に示された。本研究の成果によりcDNAプロ-ブを用いて各種代謝状態における解糖系律速酵素発現の検討が可能となった。平成2年度は研究計画に従い、まず、ラット肝cーDNAライブラリを作成し、肝型ホスホフルクトキナ-ゼのcーDNAプロ-ブをクロ-ニングした。このプロ-ブおよび以前に当施設で単離精製済みの筋型ホスホフルクトキナ-ゼcーDNAプロ-ブを用いて各組織におけるホスホフルクトキナ-ゼの発現をノザン分析およびPCR法を用いて検討した。筋型ホスホフルクトキナ-ゼの発現は筋、腎で最も多く認められた。肝型の発現は腎で最も多く、肝、網状赤血球では少なかった。PCR法を用いると、肝型,筋型ともに検索したすべての組織で認められた。また、筋型ホスホフルクトキナ-ゼ遺伝子の転写は組織特異的なスプライシングを受けていることが明らかになった。次いで、培養膵島b細胞実験系を用いてホスホフルクトキナ-ゼの発現を検討した。培養b細胞ではホスホフルクトキナ-ゼは、筋型、肝型共に発現していた。次にラットを用い、絶食/再摂食に伴うグルコキナ-ゼ、ホスホフルクトキナ-ゼ、ピルビン酸キナ-ゼの発現の変動をmRNAレベルで検討した。再摂食後8時間を過ぎるとmRNA含量は低下した。肝ピルビン酸キナ-ゼmRNAも同様に絶食に伴い低下し、再摂食により増加した。

しかし、再摂食後の増加はグルコキナ-ゼより遅れ、その増加も対照の6ー7倍であった。これに対し、ホスホフルクトキナ-ゼmRNA含量の絶食/再摂食に伴う変動は小さく、再摂食による増加は2倍以内に留まることが明らかになった。以上のように今年度の研究により、解糖系で最も重要な3種の律速酵素の発現を、いろんな病態において検討することが可能になった。平成3年度は、昨年度に引き続き糖尿病状態での解糖系律速酵素の変動を検討した。ラットをストレプトゾトシン処理して糖尿病状態にした後にインスリン治療を行ない、グルコキナ-ゼ、ホスホフルクトキナ-ゼ、ピルビン酸キナ-ゼのmRNAレベルの変動を測定した。グルコキナ-ゼmRNAは糖尿病状態では著しく低下したが、インスリン治療とともに速やかに回復し、6時間後にピ-クに達した後に低下した。これに対し、ピルビン酸キナ-ゼmRNAのインスリンによる回復は遅れ、24時間後も正常ラットの値までは回復しなかった。一方、ホスホフルクトキナ-ゼmRNAは糖尿病状態でも減少しておらず、インスリン投与によっても大きな影響を受けなかった。このことより、同じ解糖系律速酵素といえども酵素によりその調節機構は大きく異なっていることが明暸に示された。さらに本年度は筋型ホスホフルクトキナ-ゼの遺伝子を解析した。ホスホフルクトキナ-ゼは解糖系律速酵素として重要であるにもかかわらず、その分子生物学的検討は比較的遅れている。昨年度の研究で、本酵素の筋型アイソザイムが培養b細胞で発現していること、また組織特異的なスプライシングを受けることを示したが、本年度は筋型ホスホフルクトキナ-ゼ遺伝子の全構造を明らかにした。筋型ホスホフルクトキナ-ゼ遺伝子は30kb、24塩基対にわたる比較的大きな遺伝子であり、5'に独立したnonーcodingエキソンを二つ有していてその各々にプロモ-タ-配列を認めた。レポ-タ-アッセイの結果、この両者にプロモ-タ-活性を認め、二つのプロモ-タ-を有することが明らかになった。以上、今年度の研究により解糖系で最も重要な3種の律速酵素の発現を糖尿病状態およびインスリン治療経過において観察し、さらにb細胞で発現している筋型ホスホフルクトキナ-ゼの全遺伝子構造とその発現調節領域を解明した。
微生物へ遺伝子組換え手法により導入可能な新規エネルギー供給系の開発

微生物による有用物質の生産は広く普及しているが、生産量は菌体内のエネルギーの低下により限定される。そこで、本研究ではアスパラギン酸-β-脱炭酸酵素(AspD)と電位差形成的アスパラギン酸(Asp):アラニン(Ala)交換輸送体(AspT)の二つの因子のみによって構成されるAsp:Ala変換型脱炭酸的リン酸化反応に着目した。醤油乳酸菌Tetragenococcus halophilusより同定されたAspT(Th-AspT)と、産業微生物Pseudomonasdacunhaeより同定されたAspT(Pd-AspT)は、同一の機能を保持しているにも関わらず、両者の輸送速度は全く異なる。そこで、高速型(Pd-AspT)、低速型(Th-AspT)Asp:Ala交換輸送体(AspT)の分子構造を比較解析することで、AspTの基質輸送機構、及び輸送速度制御機構を明らかにすることを目的とした。AAEファミリーに属するトランスポーターで保存されているアミノ酸残基が多数存在するTM3に着目し、Cysteine-scanning法による解析を行った。その結果、OGMによる修飾実験によりIle^<64>からTyr^<75>に位置するアミノ酸残基はOGMによる修飾を受けないcore regionを形成していることを示した。さらに、このcore regionを挟んで両側にaspartate存在下と非存在下でOGMによる修飾効率が変化するアミノ酸残基を見出した。この結果は、AspTが基質であるaspartateとの結合により構造変化を起こし、periplasm側に開口していたものがcytoplasm側に開口した構造に変化したことを示唆しており、AspTが基質との結合により構造変化を伴うalternating access mechanismによって基質を輸送していることが推定された。そこで、本研究ではアスパラギン酸-β-脱炭酸酵素(AspD)と電位差形成的アスパラギン酸(Asp):アラニン(Ala)交換輸送体(AspT)の二つの因子のみによって構成されるAsp : Ala変換型脱炭酸的リン酸化反応に着目した。そこで、高速型(Pd-AspT)、低速型(Th-AspT)Asp : Ala交換輸送体(AspT)の分子構造を比較解析することで、AspTの基質輸送機構、及び輸送速度制御機構を明らかにするため、平成17年度は以下の2点について主に研究を進めた。1)AspTの結晶化AspTの構造と機能の関係を明らかにするには、三次元構造を解明し基質の透過経路(孔)の構造を調べる必要がある。申請者は、平成17年8月29日平成17年11月3日の期間、共同研究者であり、膜輸送体の構造、機能解析の第一人者であるJohns Hopkins大学医学部(米)のPeter C.Maloney博士の元で、二次元結晶の作製法、クライオ電子顕微鏡による解析法について学んだ。現在、AspTの結晶化を試みている。2)生化学的手法によるAspTの構造解析膜輸送体は疎水性が高いため結晶化が難しいとされている。そこで、本研究ではCysteine修飾試薬を用いた解析を行った。その結果、膜貫通α-ヘリックス3(TM3)が基質の透過経路(孔)に面しており、中でもD67-R76がcore領域を形成し、基質の輸送に重要な役割を果たしている可能性が示唆された。申請者は、昨年度に引き続きクライオ電子顕微鏡による構造解析に向け、Johns Hopkins大学医学部(米)のPeter C. Maloney博士の元で学んだ、二次元結晶の作製法による二次元結晶の作製を試みている。また、AspT全体の結晶構造ができなかった場合を想定し、AspTに特異的な構造であるAspT中央の巨大親水性ループ領域の部分発現系・精製系を確立し、現在蒸気拡散法による結晶化を進めている。膜輸送体は疎水性が高いため結晶化が難しいとされている。そこで、Cysteine修飾試薬を用いた解析を行った。その結果、AspTのLooP 4は、reentrant-loopと呼ばれる特徴的な構造を形成していることが明らかとなった。

さらに、loop 4に位置するある残基は、基質であるアスパラギン酸の存在下では修飾試薬による修飾が起こらなかったことから、AspTの基質結合による動的構造変化が推定された。微生物による有用物質の生産は広く普及しているが、生産量は菌体内のエネルギーの低下により限定される。そこで、本研究ではアスパラギン酸-β-脱炭酸酵素(AspD)と電位差形成的アスパラギン酸(Asp):アラニン(Ala)交換輸送体(AspT)の二つの因子のみによって構成されるAsp:Ala変換型脱炭酸的リン酸化反応に着目した。醤油乳酸菌Tetragenococcus halophilusより同定されたAspT(Th-AspT)と、産業微生物Pseudomonasdacunhaeより同定されたAspT(Pd-AspT)は、同一の機能を保持しているにも関わらず、両者の輸送速度は全く異なる。そこで、高速型(Pd-AspT)、低速型(Th-AspT)Asp:Ala交換輸送体(AspT)の分子構造を比較解析することで、AspTの基質輸送機構、及び輸送速度制御機構を明らかにすることを目的とした。AAEファミリーに属するトランスポーターで保存されているアミノ酸残基が多数存在するTM3に着目し、Cysteine-scanning法による解析を行った。その結果、OGMによる修飾実験によりIle^<64>からTyr^<75>に位置するアミノ酸残基はOGMによる修飾を受けないcore regionを形成していることを示した。さらに、このcore regionを挟んで両側にaspartate存在下と非存在下でOGMによる修飾効率が変化するアミノ酸残基を見出した。この結果は、AspTが基質であるaspartateとの結合により構造変化を起こし、periplasm側に開口していたものがcytoplasm側に開口した構造に変化したことを示唆しており、AspTが基質との結合により構造変化を伴うalternating access mechanismによって基質を輸送していることが推定された。