hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
カテーテルで挿入する僧帽弁位人工弁の開発

このため、ブタを用いた人工弁の評価方法を見直し、また、動物を使用することなく人工弁の評価を行う目的に、拍動流を再現することが出来る模擬回路(当科で所有している)にシリコン製の半透明な成人心臓モデルを組み込み、この心臓に人工弁を装着して評価を行うことに実験方法を変更しました。本法では、実験計画が遅れた要因であるステント骨格の見直しや、拍動流下のシリコン製の成人心臓模型における装着実験を容易に繰り返し行うことができ、今後の実験の遂行が効率的に行えるようになりました。ステント骨格の決定のための試作ならびに修正に時間を要したことが一つの理由です。ブタを使用した実験を行う場合においては、ステント骨格の修正や見直しの回数が多くなると考えられました。この場合、急性期実験で安楽死させるブタの頭数が、当初の予定を大幅に上回ると考えられ、動物愛護の観点や実験費用の面でも問題があると考え動物実験の見直しが必要になりました。再検討の結果、弘前大学・大学院医学研究科で所有する水を拍動流で灌流させることが出来る模擬回路に、正常成人心臓の画像データから作成されたシリコン製の心臓模型を組み込み、この半透明の心臓内に人工弁を組み込んだモデルは、動物実験の代用になり得ること、拍動流の流体内での人工弁の装着性を可視化できという利点があります。超音波検査による弁周囲逆流の評価などの弁輪へのフィッティングの評価も可視化できるという点で有用でありました。カテーテルを使用した大動脈弁置換術は定型的な手術として確立され、人工心肺を使用することなく、小さな皮膚切開で大動脈弁置換術が可能となった。一方、僧帽弁位への植え込みに関しては、需要が多いにもかかわらず、カテーテル植込み式の人工弁は無い。これは、僧帽弁周囲の構造的な違いによるものであり、人工弁の支持性や固定性が得られないためである。動物実験レベルでは、弁下組織に引っかかるようなフック構造を有する人工弁が報告されているが、構造的な問題があるために臨床では普及していない。本研究では、ステント構造を工夫することでカテーテル植込みや縫合が不要な僧帽弁位人工弁の開発を行うことを目的とした。僧帽弁位に固定できる、密着性および自己拡張性を有するステント構造の開発が本研究の重要課題であり、形状記憶合金であるナイチノール鋼線とZ-stentを使ってステント骨格の試作を繰り返した。当初は、僧帽弁や腱索に引っかかるようなフック構造を試作したが、組織を損傷しやすい構造であるために、フックの形状を根本的に変更した。最終的に、らせん状のリング構造をステントに組み入れ、これを僧帽弁の交連部から回転するように弁輪を1周するように挿入して、弁尖を左心房側と左心室側から挟み込むように留置する構造とした。さらに、ステントの自己拡張力によって強い線維組織である弁輪に密着させることが出来た。ブタ摘出心を用いて植込み実験を行い、弁輪への密着性および固定性は満足できる結果であった。今後の改良点として、軽微な弁周囲逆流を防ぐために左心房側への傘状の構造物を付加することが必要と考えられたが、本研究で試作したステント構造は若干の構造的工夫を加えることでカテーテル内への装填も可能と考えられた。あるいは、縫合の不要な短時間の心停止時間で植込みが可能なsutureless valveとしても発展が可能と考えられた。近年、心臓弁膜症に対する人工心肺装置を使用しない低侵襲手術として、カテーテル植込み式の人工弁の発展が著しい。しかしながら、僧帽弁用に使用可能なカテーテル植込み式の人工弁の開発は途中段階である。これまでに報告されている僧帽弁用の人工弁は、ステント骨格に付いたフックによって僧帽弁や弁下組織に引っ掛かって拡張することで、弁輪への固定性を保持するような構造となっている。
分化初期における植物生殖細胞の単離法の確立

植物の生殖器官を構成する生殖細胞と体細胞は、互いに異なる遺伝子発現パターンを示すが、その原因究明には特定細胞の抽出が必要となる。そこでイネ生殖細胞遺伝子のプロモーター(MEL1p)を用い、DNA・RNAを濃縮する技術の開発を目指した。MEL1pおよび核膜局在蛋白質遺伝子、蛍光蛋白質遺伝子(GFP)を利用して、葯の細胞のうち生殖細胞の核のみがGFP蛍光を発する植物体の作出に成功した。その後の核の濃縮には課題を残した。一方、GFPと翻訳装置の融合蛋白質の発現は、イネの育成阻害から実験を中止した。今回の知見は、更なる条件検討により植物生殖細胞から核を単離できる可能性を示している。植物の生殖細胞発生の包括的な理解には、生殖細胞のみを正確に単離し、DNAやRNA、蛋白質の抽出に供試する技術が必要となる。そこで本課題では、イネの減数分裂期の生殖細胞を単離し、各種のゲノムワイドな解析に資する技術開発を目的とした。当初は、減数分裂前の生殖細胞特異的に発現するイネMEL1遺伝子を利用して、マイクロマニピュレーター(MM)あるいはセルソーター(CS)による細胞単離を計画した。しかし申請予算の減額のためMMが購入できなかった。また、CSの前処理として細胞壁の分解により組織から細胞を遊離する行程が必要であるが、カルスを用いた予備実験で、遊離細胞はしばしば細胞塊を形成し、CSに不向きであると予想された。今年度は、核膜結合蛋白質RanGAPおよびリボソームサブユニットRPL18をコードするイネ遺伝子に着目し、MEL1 prを用いてTRAPやINTACTに利用可能な形質転換イネを得ることができた。RPL18とRanGAPのN末端はそれぞれ、FLAGペプチドと蛍光蛋白質GFPで標識されている。35S prを用いたイネで、RPL18は予想通りの細胞内局在性を示した。MEL1 prを用いたイネについては、平成28年度の前半までにRPL18およびRanGAPの生殖細胞内局在を確認できる予定である。「研究成果の概要」で述べた理由から、当初計画していたマイクロマニピュレーターあるいはセルソーター(CS)を用いた生殖細胞の単離法の確立は、本課題期間中での実施が極めて困難な状況となった。また、CSの本課題への適用を検討する予備実験にも時間を取られ、年度の半ばになってから方針転換を決断せざるを得なかった。最終的に選択したINTACTおよびTRAP法は、申請時に予定した手法とは全く異なるため、進捗を当初計画に照らし合わせて記述するのは難しいが、来年度早々には生殖細胞核や生殖細胞特異的mRNAの単離を検証する目処が立ったものの、残念ながら当初計画からはやや遅れていると判断した。今年度は、イネRanGAP蛋白質の核膜結合ドメイン、FLAGペプチド、そして蛍光蛋白質GFPの3者の融合遺伝子(WGF)を生殖特異的MEL1プロモーターに繋いだ融合蛋白質発現コンストラクト(gMEL1:WGF)を正常型のイネに導入した。gMEL1:WGF植物の減数分裂期の葯を用いて、WGFの細胞内局在を蛍光顕微鏡で調べたところ、期待通り減数分裂細胞でのみ核膜周縁にGFPシグナルが検出された。この植物体およびFLAG抗体を用いて生殖細胞の核単離を試みる予定であった。しかし形質転換当代(T0)の植物体のため生育が思わしくなく、また種子稔性も非常に低かったため方針を転換し、T1植物で十分な種子を得ることにした。現在T2植物を育成中であり、それら植物から減数分裂期の花が得られ次第、INTACTによる核単離に供試する予定である。初年度の初めに生殖細胞の単離法の見直しを行ったこと、また今年度、形質転換植物の生育が思わしくなく、種子増殖したのちに核単離用に供試することに計画を変更したため。植物の生殖細胞が減数分裂に至る過程の遺伝的制御ネットワークの解析は、減数分裂組換えの仕組みや生殖的隔離機構など、遺伝・育種の根幹をなす現象を理解する上で重要である。生殖細胞発生の包括的な理解には、生殖細胞のみを単離し、DNAやRNA、蛋白質の抽出に供試する技術が必要となる。本研究では、減数分裂期前のイネ生殖細胞で特異的に発現するMEL1遺伝子のプロモーター(pMEL1)を利用した生殖細胞核の単離法、いわゆるIsolation of Nuclei Tagged in specific Cell Types (INTACT)法、の開発を試みた。pMEL1にイネRanGAP蛋白質の核膜結合ドメイン(WPP)・蛍光蛋白質GFP・3xFLAGをコードする融合遺伝子(WGF)を繋いで(pMEL1:WGF)、イネのカルスに導入した。その結果、26個体の独立した形質転換イネが得られ、うち13個体で減数分裂前の雄性生殖細胞の核周縁にGFP蛍光シグナルが検出された。しかし期待に反して、穎花の基部を構成する体細胞にも非常に強いシグナルが検出された。形質転換第一世代種子から増殖した第二世代のイネから減数分裂前の幼穂を採取し、常法により核を単離して蛍光顕微鏡下で観察したところ、GFP陽性の核が一定数確認できた。

そこでGFP市販抗体を用いて核抽出液を免疫沈降し、沈降画分を観察したが、核の回収率が悪く、GFP陽性の核も非常に少なかった。種々の条件を検討したが改善されず、残念ながら当初目的の達成、すなわち生殖細胞特異的なDNAあるいはRNA濃縮の確認には至らなかった。本研究により、pMEL1の生殖細胞核単離への利用の有効性が確認されたが、同時に、穎花基部の体細胞でも発現するなど、サンプリングの際に注意を要することがわかった。生殖細胞核の核単離条件の検討は今後の課題である。植物の生殖器官を構成する生殖細胞と体細胞は、互いに異なる遺伝子発現パターンを示すが、その原因究明には特定細胞の抽出が必要となる。そこでイネ生殖細胞遺伝子のプロモーター(MEL1p)を用い、DNA・RNAを濃縮する技術の開発を目指した。MEL1pおよび核膜局在蛋白質遺伝子、蛍光蛋白質遺伝子(GFP)を利用して、葯の細胞のうち生殖細胞の核のみがGFP蛍光を発する植物体の作出に成功した。その後の核の濃縮には課題を残した。一方、GFPと翻訳装置の融合蛋白質の発現は、イネの育成阻害から実験を中止した。今回の知見は、更なる条件検討により植物生殖細胞から核を単離できる可能性を示している。マイクロマニピュレーターおよびセルソーター(CS)を用いた方法は、セルラーゼやペクトリアーゼなどの酵素を用いて、生殖組織から細胞を遊離させる必要がある。またCSではGFPなど蛍光蛋白質による特定細胞の標識化が前提となるが、GFPが固定処理により蛍光能を失うため、CS解析は生細胞を用いる必要がある。酵素処理や細胞収集作業の過程では、mRNA分解など細胞へのダメージが無視できない。特に生細胞を用いる場合は、細胞周辺環境の変化により、単離行程に時間がかかればかかるほど遺伝子発現パターンが影響を受け、生体内における発現パターンとは懸け離れた結果が得られる危険性が極めて高い。その点、INTACTおよびTRAP法では、組織を固定した後で特定の細胞の核、あるいはリボソーム複合体を単離することができる。まず組織の固定処理を行うことにより、サンプリング直後の遺伝子・蛋白質発現パターンの固定化が可能となり、生体内の状態をより忠実に再現できる可能性が高い。本課題の年度途中における方針転換は別の理由によるものだが、結果として本課題の目的により適した手法を選択することができた。従って、今後もINTACTおよびTRAP法のイネ生殖細胞への適用を目指して研究を進めていく予定である。最終年度である平成28年度の早い段階で、標識したRan-GAPおよびRPL18蛋白質が期待通りの生殖細胞内局在性を示すかどうかを、27年度作成の形質転換イネを用いて確認する。そして28年度末までに、両法がイネ生殖細胞に特化した遺伝子発現やクロマチン修飾などの網羅的な解析に適用可能であるかどうかを検証したい。現在育成中の形質転換イネについて8月中には減数分裂期の葯を採取できる見込みである。その後、迅速に核単離を行い、蛍光顕微鏡下で生殖細胞核の濃縮の有無を確認する。同手法のイネ生殖細胞への単離は過去に報告がないため、成果は速やかに論文として公表する。植物生殖遺伝学申請時に計画していた研究手法を、諸々の事情から全く異なる手法へと変更する必要が生じた。最初の計画では、平成27年度の使用予定額の大半を、マイクロマニピュレーター購入のための初期投資に当てていた。
分子異常に基づいた肺腺がんの分類と浸潤・転移機構の解明

気道上皮細胞に変異型KRAS遺伝子、EGFR遺伝子を導入すると、共通してサイトカイン、ケモカイン遺伝子の高発現が誘導される。IL-1βについて検討すると、肺がん細胞株と肺がん組織において高発現が認められ、遺伝子導入によって細胞増殖速度の上昇が起きた。肺腺がん組織では、高悪性度病変において高い発現が認められ、肺がんのプログレッション、がん細胞の悪性化に関与するものと考えられた。特発性間質性肺炎に合併する肺がんは高齢者、男性、重喫煙者に好発していた。合併腺がんでは高円柱状細胞亜型が多く、EGFR変異の頻度は低かった。また全生存期間、無再発生存期間についてI期の腺がんでは予後不良であった。1.肺がんにおけるサイトカイン、ケモカイン遺伝子の発現我々の研究室ではこれまでに不死化気道上皮細胞に変異型KRAS遺伝子、変異型EGFR遺伝子を導入し、マイクロアレイ解析によって網羅的に下流分子を検討してきた。両者で共通していくつかのサイトカイン、ケモカイン遺伝子の高発現が誘導されることを見出したが、サイトカイン遺伝子の肺癌での発現、役割については未だ不明な点が多い。肺腺癌におけるサイトカイン遺伝子(CCL3, IL24, IL1B)の発現を測定し、組織亜型や病期との関連を検討した。IL24のmRNA発現は非腫瘍部と比較して腫瘍部で優位に発現が低下していた。IL24のmRNA発現は低分化な充実性増殖型優位腺癌では低い傾向にあったが、病期では有意差は見られなかった。IL24はアポトーシスや浸潤、血管新生に関連する多彩な役割が報告されてきており、細分化した評価が重要と思われる。2.特発性間質性肺炎合併肺がんの臨床病理学的特性特発性間質性肺炎( IIPs)に合併する肺癌とIIPsの特性についての報告は少数であり、未だ十分な理解が及んでいない。今回、IIP群(207例)とIIPsを合併していない肺癌症例( non-IP群: 1079例)を、対象に、それらの臨床・病理学的な差異について比較検討を行った。特発性間質性肺炎(IIPs)合併肺癌は、高齢者・男性・重喫煙者・下葉に好発していた。組織型では、扁平上皮癌の割合が高かった。細胞亜型として高円柱状細胞の形態を示すものが殆どであった。またEGFR変異の頻度が低かった。全生存期間では、I期症例で予後不良であった。無再発生存期間では、I期腺癌で予後不良であった。今回の結果は、過去の報告に比べ、より長期観察・多数症例を対象としており、より信頼性の高い結果が得られた。肺腺がんの発生、進展におけるにおいて分子基盤を明らかにするため、本年度は変異型EGFR遺伝子によって誘導される分子変化の探索を行った。レトロウィルスを用いて不死化気道上皮細胞株にEGFRのexon 19の欠失遺伝子とexon 21 L858R点突然変異遺伝子とを導入し、細胞の変化、遺伝子変化を解析した。変異型EGFR遺伝子によって誘導される分子変化を明らかにするため、不死化気道上皮細胞株にEGFRのexon 19の欠失遺伝子とexon 21 L858R点突然変異遺伝子とを導入し、細胞の変化を解析した。変異型遺伝子の細胞では顕著な増殖の抑制と、核の腫大や多核化等の細胞異型を認めた。マイクロアレイ解析により網羅的に候補遺伝子を検索した。変異型導入細胞株では、CCL3, IL24, IL1Bなどのcytokineの活動に関わる遺伝子の高発現が見られた。IL24のmRNA発現は非腫瘍部と比較して腫瘍部に有意に発現が低下していた。IL24のmRNA発現は低分化な充実性増殖型優位腺がんでは低い傾向があったが、病期では有意差は見られなかった。IL-1Bについては肺癌細胞株と原発性肺癌病変において、顕著な上昇を示すものが存在した。IL-1βの発現導入によって、非がん細胞株に細胞増殖速度の上昇、足場非依存的な増殖能といったがん形質の獲得が起きた。原発性肺癌病変においては腺房型腺癌や充実型腺癌といった高悪性度の病変においての高い発現が認められた。特発性間質性肺炎(IIPs)に合併した肺がん例、EGFR遺伝子変異を有した多発脳転移例、EGFR遺伝子変異を有したリンパ節転移例の臨床病理学的検討を行った。IIPs合併肺がん例ではKRAS, EGFR変異頻度が低く、腺癌では高円柱状の細胞亜型を示した。I期で全生存期間、無再発生存期間について予後不良であった。

多発微小脳転移例はEGFR変異例に多く、リンパ節転移例では微小乳頭型の割合が多く認められた。EGFR遺伝子変異を有した肺腺がん例の中に多発性微小脳転移を示す一群、初期段階からリンパ節転移を有する一群があり、微小乳頭状構造がその悪性度と関連があることが明らかになった。病理学サイトカイン、ケモカインのモノクロナル抗体の作成、検証に予想外に時間がかかった。間質性肺炎症例については症例数が非常に多く、臨床病理学的検討、遺伝子解析に予想外の時間が要している。変異型EGFRベクターの調整、不死化気管支上皮細胞への遺伝子導入実験が当初難航し、予定より研究の進行は遅れた。しかし、導入実験が成功した後は遅れを挽回している。最終的にはDNAマイクロアレイを用いて、変異遺伝子を導入した細胞における遺伝子異常の網羅的探索を行うことができ、一部の遺伝子についてはヒト肺がん細胞株における発現の検索もできた。IL24はアポトーシスや浸潤、血管新生に関連する多彩な役割が報告されてきており、細分化した評価が重要と思われる。各種サイトカイン、ケモカインの免疫染色については、吸収試験を行って特異性を最終確認した後に、肺腺癌症例での解析を蓄積し、総合的な検討を行う予定である。間質性肺炎合併肺がん症例についてはRAS,EGFRなどの遺伝子解析をさらに進める予定であり、いずれの変化も認めない症例については染色体異常、メチル化異常、マイクロサテライト修復の異常についても検討を進める予定である。DNAマイクロアレイによる検索の結果、変異型EGFR遺伝子の導入によって変化が起こる遺伝子の候補が明らかになったが、その中にヒト肺がん細胞株、ヒト肺がん臨床検体において実際発現が亢進しているものがあるのか検討する。以前の研究で変異型K-RASを同一の細胞に導入した実験も行っているが、RAS遺伝子の導入と共通して起こる遺伝子、EGFR導入に特異的に起きる遺伝子があるのか否か明らかにしたい。また、それぞれの遺伝子発現の意義をヒト材料を用いて検討したい。モノクローナル抗体の作成、検証に予想外に時間がかかったことが影響した。特発性間質性肺炎合併肺がんの検討では検討する対象の症例数が多く、臨床病理学的解析に時間がかかり、遺伝子解析に時間がかかったことが影響した。現在モノクロナル抗体の作成、検証は進み、今後抗体を利用した解析はスムーズに進むことが予想される。特発性間質性肺炎合併肺がんの検討についても、臨床病理学的解析が一段落し、今後は遺伝子研究が順調に進むことが予想される。EGFR遺伝子の異常、予後不良例に影響を与える分子異常の解析が進むことが期待される。変異型EGFR遺伝子導入細胞で高発現されている遺伝子群について、ヒト肺がん細胞株を用いて順次高発現されているのか検証していく。今年度は研究の遅れから、ヒト肺がん細胞株における発現の検討が十分できず、繰越金が生じてしまったが、次年度ではchemokine関連の遺伝子群から検討を始め、研究の遅れを取り戻す予定である。ヒト肺がんデータベースの整備を行う。肺がん手術検体から採取されたパラフィン封埋材料、凍結検体を用いてEGFR, RAS, ALKなどの遺伝子変異を検索し、組織学的分類、臨床病理学的事項以外にも遺伝子異常について明らかにしてデータベースを整備していく。ヒト肺がん細胞株で高発現されている遺伝子群については、整備されたデータベースの検体を用いてヒト肺がん組織における発現を検索し、組織像、臨床病理学的事項との関連を解析する。
わが国のGCTE(地球変化と陸域生態系)研究の推進と国際対応

IGBPのコアプロジェクトのひとつであるGCTE(地球変化と陸域生態系)を推進すること,および,わが国のイニシアティブにより提案され採択されたGCTEコアリサーチTEMA(モンスーンアジア陸域生態系に及ぼす地球変化のインパクト)の実施計画を策定しこれを推進することを目的に以下の調査研究を行った.(1)文部省・農林水産省・環境庁・科学技術庁等の研究機関で実施されえちる地球変化と陸域生態系に係わる研究の現状を調査した.(2)地球変化が陸域生態系に与える影響および陸域生態系の変化が地球環境にフィードバックする機構を明らかにするための新しい研究方法・研究課題を検討した.(3)TEMA研究推進A」,「国際学術研究」を企画した.(4)平成8年度発足の環境庁地球環境研究総合推進費による研究「湿潤熱帯山岳における森林植生帯閾値と地球温暖化のインパクト評価」「大面積長期観測林を用いた温暖化が森林の自律機能に及ぼす影響」を計画組織した.(5)平成7年8月日本生態学会大会シンポジウム「森林生態系のモデリング-ギャップダイナミックスからグローバルチェンジへ」「葉群・樹冠・林冠-構造の自律形成過程」を開催した.平成8年3月日本生態学会大会シンポジウム「地球変化と生態系の生理学」を企画した.(6)平成8年5月北京で開催予定の国際シンポジウム「地球変化と生物多様性に関するトランセクト研究」参加準備行った.(7)平成7年1月森林総合研究所で「熱帯山岳林生態系-キナバル山」を開催した.(8)平成8年2月の日本学術会議IGBPシンポジウムに参加し,GCTE小委員会を開催した.(9)TEMAの一環として屋久島・キナバルで進行している研究の推進・調整を図った.(10)オランダのKluwerから「Global Change and Terrestial Ecosystems in Monsoon Asia」を出版した.(11)GCTE-SSCとの連絡を密にし,国際対応を図った.IGBPのコアプロジェクトのひとつであるGCTE(地球変化と陸域生態系)を推進すること,および,わが国のイニシアティブにより提案され採択されたGCTEコアリサーチTEMA(モンスーンアジア陸域生態系に及ぼす地球変化のインパクト)の実施計画を策定しこれを推進することを目的に以下の調査研究を行った.(1)文部省・農林水産省・環境庁・科学技術庁等の研究機関で実施されえちる地球変化と陸域生態系に係わる研究の現状を調査した.(2)地球変化が陸域生態系に与える影響および陸域生態系の変化が地球環境にフィードバックする機構を明らかにするための新しい研究方法・研究課題を検討した.(3)TEMA研究推進A」,「国際学術研究」を企画した.(4)平成8年度発足の環境庁地球環境研究総合推進費による研究「湿潤熱帯山岳における森林植生帯閾値と地球温暖化のインパクト評価」「大面積長期観測林を用いた温暖化が森林の自律機能に及ぼす影響」を計画組織した.(5)平成7年8月日本生態学会大会シンポジウム「森林生態系のモデリング-ギャップダイナミックスからグローバルチェンジへ」「葉群・樹冠・林冠-構造の自律形成過程」を開催した.平成8年3月日本生態学会大会シンポジウム「地球変化と生態系の生理学」を企画した.(6)平成8年5月北京で開催予定の国際シンポジウム「地球変化と生物多様性に関するトランセクト研究」参加準備行った.(7)平成7年1月森林総合研究所で「熱帯山岳林生態系-キナバル山」を開催した.(8)平成8年2月の日本学術会議IGBPシンポジウムに参加し,GCTE小委員会を開催した.(9)TEMAの一環として屋久島・キナバルで進行している研究の推進・調整を図った.(10)オランダのKluwerから「Global Change and Terrestial Ecosystems in Monsoon Asia」を出版した.(11)GCTE-SSCとの連絡を密にし,国際対応を図った.
インシュリン様成長因子-1のマウス登上線維シナプスの生後発達に及ぼす影響

外因性のインシュリン様成長因子-1(IGF-I)を生後8日目にマウス小脳皮質に局所的慢性投与を行うと、成熟個体における小脳登上線維-プルキンエ細胞シナプスの残存率が上昇するという平成13年度の結果を受け、さらに以下のような実験を行った。まず、内因性IGF-Iの登上線維シナプス発達への影響を調べるため、ethylene-vinyl acetate copolymer (Elvax)を用い、IGF-Iの機能を阻害する中和抗体(Anti-IGF)の局所的慢性投与を行った。外因性IGF-I投与で効果が見られた生後8日目より、ElvaxによりAnti-IGFを小脳皮質に慢性的に投与されたマウスは、正常個体では登上線維シナプスの発達形成が完了している生後24日以降まで生存可能であった。そこで、小脳スライス標本を作製し、ホールセルパッチクランプ法でプルキンエ細胞から電気記録を行った。そして、登上線維シナプスの興奮性シナプス後電流(EPSC)のステップ数の測定により個々のプルキンエ細胞に入力する登上線維の本数を求め、IGF-Iの登上線維シナプス発達/除去への影響を解析した。生後8日目より小脳皮質にElvaxによりAnti-IGFを投与した群のElvax近傍の小脳8葉では、生後24-36日目において、2本以上の登上線維より多重支配を受けているプルキンエ細胞の比率は6%で、vehicleを投与した対照群の15%より有意に低かった。引き続き、生後8日目よりIGF-IあるいはAnti-IGFを投与したマウスの登上線維シナプスEPSCの振幅を解析したところ、対照群と比較してIGF-I投与群ではEPSC振幅の増大し、Anti-IGF投与群では減少した。以上の結果より、IGF-Iは、生後発達期のマウス小脳において、限られた時期に登上線維シナプスの伝達効率を増大させ、その結果、成熟個体におけるシナプスの残存率が上昇する作用を及ぼすことが明らかになった。インシュリン様成長因子-1(IGF-I)のマウス生後発達期における、小脳登上線維-プルキンエ細胞シナプスの発達への影響と時期特異性を調べるため、先ず、ethylene-vinyl acetate copolymer(Elvax)を用いた局所的慢性投与法を確立した。生後8日目よりElvaxによりIGF-Iを小脳皮質に慢性的に投与されたマウスは、正常個体では登上線維シナプスの発達形成が完了している生後24日以降まで、生存可能であった。そこで、小脳のスライス標本を作製し、ホールセルパッチクランプ法でプルキンエ細胞から電気記録を行った。そして、登上線維シナプスの興奮性シナプス後電流(EPSC)のステップ数を測定することにより、個々のプルキンエ細胞に入力する登上線維の本数を定量し、IGF-Iの登上線維シナプス発達/除去への影響を解析した。その結果、生後8日目より小脳皮質にElvaxによりIGF-Iを投与した群のElvax近傍の小脳8葉では、生後24-36日目でも50%のプルキンエ細胞が2本以上の登上線維より多重支配を受けており、この多重支配の比率は、対照群としてvehicleを投与した群の15%より有意に高かった。一方、同じ個体の小脳でも、Elvaxから遠い小脳1/2葉および10葉では、IGF-I投与群、対照群とも、多重支配を受けるプルキンエ細胞の割合は20%程度で、両群間に有意な差は見られなかった。したがって、Elvaxにより投与されたIGF-Iの効果は小脳6-8葉付近に限局されており、小脳皮質内の受容体を介して、登上線維シナプスの発達・残存に影響していると考えられる。また、生後12日目よりIGF-Iを投与した群では、多重支配の比率に有意な上昇は認められず、IGF-Iの登上線維シナプスの発達・残存効果には、時期特異性があることが示された。

引き続き、生後8日目よりIGF-IあるいはAnti-IGFを投与したマウスの登上線維シナプスEPSCの振幅を解析したところ、対照群と比較してIGF-I投与群ではEPSC振幅の増大し、Anti-IGF投与群では減少した。以上の結果より、IGF-Iは、生後発達期のマウス小脳において、限られた時期に登上線維シナプスの伝達効率を増大させ、その結果、成熟個体におけるシナプスの残存率が上昇する作用を及ぼすことが明らかになった。
時間医学を考慮した小児歯科治療-夜間の処置は歯髄炎を誘発するか

多くの生理機能にみられる概日リズムは、自律振動する全身の細胞リズムが統合され形成される。個々の細胞リズムは時計遺伝子群の周期的な転写、翻訳、翻訳後修飾から構成される負のフィードバックにより生じる。中でも転写因子CLOCK-BMAL1二量体は標的分子の転写量を約24時間周期で制御し、リズム発振に中心的な役割を果たす。本研究ではCLOCKおよびBMAL1の蛍光タンパク質融合タンパク質を作製し、生きた細胞内における局在を可視化した。CLOCKの多くは核に局在したが、一部の分画は細胞質に局在した。細胞内小器官マーカーを用いた検証の結果、細胞質に局在するCLOCKは小胞体に集積することが明らかになった。ホルモンや唾液分泌、免疫など多くの生理機能には約24時間周期の概日リズムが存在する。近年の研究により炎症反応にも概日リズムがみられることが示され、歯髄炎など口腔領域の炎症にもリズムがあることが予想される。本研究の目的は歯髄組織における炎症応答分子MAPKのリズムを分子間の相互作用を検出できる蛍光イメージングであるFRETシステムを用いて明らかにすることである。これまでに時計遺伝子Rev-erbα発現を蛍光タンパク質でモニターするバイオセンサーを用いてNIH-3T3細胞のサーカディアンリズムを計測することに成功した。Rev-erbαは生体内で昼に発現する遺伝子であるため、このセンサーは細胞内の時刻情報を得る「時計の針」として利用することができる。次に、二量体を形成することによりRev-erbαを周期的に転写促進するBMAL1およびCLOCKにそれぞれ蛍光タンパク質を結合し、両者が近接したときにFRETが起こるように設計したバイオセンサーを新規作成した。またMAPKファミリー分子であるERK1, JNK1の活性化ドメイン配列を改良型FRETシステムに組み替えたバイオセンサーを作製した。このセンサーによりMAPK活性を高感度で検出できる。細胞内のMAPKリズム測定に必要な蛍光バイオセンサーが完成したため、今後MAPK活性化リズムを解析する予定である。これまでの研究成果を平成27年日本生理学会大会において発表した。近年の研究により炎症反応は概日リズムを示すことが知られており、歯髄炎など口腔領域の炎症にもリズムがあることが予想される。本研究では歯髄など細胞内のリズムを調べることを目的に、炎症応答分子Mitogen-activated Protein Kinase(MAPK)や時計遺伝子の変化をリアルタイムでモニターできる蛍光バイオセンサーを新規作製した。二量体を形成し、様々な遺伝子を周期的に転写促進する時計遺伝子BMAL1およびCLOCKにそれぞれ蛍光タンパク質を結合し、両者の近接をフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)にて判定した。FRETは2種の蛍光タンパク質を利用して、目的分子の構造変化を色(波長)の変化により見ることができる方法である。この結果、BMAL1-CLOCK二量体形成に概日リズムがみられることが明らかになった。またこれまで核以外の局在が知られていなかったCLOCKの小胞体への集積が観察された。MAPKファミリー分子であるERK1, JNK1の活性化ドメイン配列を改良型FRETシステムに組み替えたバイオセンサーを作製し、これらを安定発現する線維芽細胞株を樹立した。このMAPK安定発現細胞に対し様々な時刻に炎症を模倣した刺激を行うと、FRETで示されるMAPKの応答には時刻依存性が見られた。このことから炎症応答には、その細胞自体の内因性概日リズムに起因する日内変動が存在することが示唆される。以上の結果の一部を日本生理学会や歯科基礎医学会にて発表した。また次回の歯科基礎医学会にて講演を行う予定である。現在、培養マウス歯髄細胞に作成したバイオセンサーを導入し、より生体に近い環境での炎症応答リズムの解析に挑戦中である。蛍光バイオセンサーによる細胞の概日リズム測定システム、およびFRETシステムを既に構築し、MAPK活性を検出するバイオセンサーもすでに作成した。今後MAPK活性リズムの測定を行う予定であり、おおむね順調に進展している。小児歯科学、生理学まずNIH3T3等の哺乳類線維芽細胞由来の細胞株を用いてMAPK活性リズムを解析する。24時間周期の活性変化を連続測定するための条件の最適化を行う。次にマウス・ラット歯髄細胞の初代培養にバイオセンサーを導入しリズムの測定を行う。またこれらの細胞に対し、歯髄処置に使用される薬剤などを作用させリズムの変化を観察する。同時に北海道大学病院・自主臨床研究審査委員会に臨床研究の申請を行い、患者さんの抜去乳歯由来の歯髄細胞の培養およびリズム解析を開始する。培養細胞、動物を用いた実験は秋ごろまで、抜去乳歯の実験を年内に終了させ論文を執筆する。また国内外の学会にて研究成果を随時発表する。研究は概ね予定通りに進展しており、次年度も当初の計画通り実施する予定である。

本年度に引き続き細胞培養、遺伝子組み換え、イメージングに必要な試薬、抗体や消耗品類が必要である。動物実験を計画しているため、動物実験施設の使用料や動物の維持費を計画している。また、日本小児歯科学会(5月、広島)、日本歯科基礎医学会(9月、新潟)、日本時間生物学会(11月、東京)にて発表を予定しているため出張旅費が必要である。
抗癌剤耐性克服と抗腫瘍効果増強を目的としたドラック・デリバリーシステムの開発

深部癌、特に肝臓癌に対する効果的な化学療法を企図して、ハイドロキシ・アパタイト(以下HAP)に抗癌剤の一種である塩酸ドキソルビシン(以下DOX)と、free radicalのscavengerであるglutationeの生成を阻止するbuthionine sulfoximine(以下BS0)を凍結乾燥法を用いて吸着させ、新たな制癌効果を持った薬物輸送複合体(DOX&BSO-HAP)を作製し、in vitroにおける徐放性、ならびに移植腫瘍を用いたin vivoの系においてその有効性について報告を行ってきた。今回、さらに薬剤耐性克服と抗腫瘍効果の増強を目的として、温熱療法の併用を行うことにより、治療効果比の上昇を目的として基礎実験を行った。(2)担癌動物モデルを用いた基礎実験:ddYマウスにSarcoma180を移植し、一定の腫瘍径になった後、経皮的にDOX&BSO-HAP complexを投与し、さらに一定条件の温熱療法を併用した。温熱療法を施行したことにより、施行しなかった場合と比較していかほどの抗腫瘍効果が得られたかということを、腫瘍体積の増加率と組織学的に得られた腫瘍壊死面積の検討により評価を行った。(Imamura et.al.投稿中)これらの結果より、DOX&BSO-HAP complexに温熱療法を併用した場合、簡便かつ効果的に、しかも副作用が少なく、肝癌患者の治療改善に寄与出来る可能性が示唆された。
抗菌薬のPK/PD解析を基盤とした特殊病態化における感染症治療の新たな展開

Pharmacokinetics/pharmacodynamics(PK/PD)に基づいた抗菌薬の患者個別最適化投与法の構築は喫緊の課題である。本研究では、特殊病態下(血液濾過透析(HDS)、化膿性髄膜炎、全身性炎症反応症候群(SIRS))における抗菌薬のPKデータを取得・解析した。HDF時におけるメロペネム、セファゾリン、化膿性髄膜炎時のセフタジジム、セフェピム、バンコマイシン、リネゾリドSIRS時のダプトマイシンの薬物動態を明らかにした。さらに、個々の患者背景に応じた効果的かつ安全な抗菌薬投与法を確立した。本研究結果はすぐに臨床応用可能であり、抗菌薬の適正使用に大変役立つと考えられる。近年、感染症治療に対し経験的な投与法ではなく、抗菌薬の薬物動態と感染症部位における効果に焦点をあて、PK/PDアプローチから最大限の効果、副作用防止かつ耐性菌の発現阻止を考慮し、患者個別に最適化した抗菌薬投与を行うことが重要とされてきている。一方、高齢社会を迎え、感染症領域においても特殊病態下にある感染症患者が増加の一途を辿ってきている。重篤化しやすい特殊病態下の患者においては、一層の個別化最適投与が望まれているが、病態下における抗菌薬薬物動態についてはほとんど検討されていないのが現状である。特に全身性炎症反応症候群(SIRS)、透析、化膿性髄膜炎、熱傷では分布容積、腎クリアランス、薬物の移行性など、正常時と比べて異なり、薬物動態は非常に複雑になっている。平成27年度は、各抗菌薬の血中濃度測定法を高速液体クロマトグラフを用いて確立し、SIRS患者、透析患者の血中濃度を集積した。ダプトマイシンはアセトニトリルで除蛋白後、Unison UK-C8カラム、移動相は0.1Mリン酸緩衝液(pH2.1):アセトニトリル:メタノール=110:30:60、検出波長は214nm、流速は1.5mL/min、注入量は20μLで、27分に単一のピークとして検出された。メロペネムは限外濾過法で除蛋白後、Kinetex EVO C8カラム、移動相は0.1Mリン酸緩衝液(pH7.8):メタノール=85:15、検出波長は300nm、流速は1.0mL/min、注入量は20μLで、5分に単一のピークとして検出された。セファゾリンはメタノールで除蛋白後、Luna 5u C18カラム、移動相は0.03Mリン酸緩衝液(pH5.0):メタノール=82:18、検出波長は274nm、流速は1.2mL/min、注入量は20μLで、16分に単一のピークとして検出された。3剤とも再現性よく、0.1μg/mLまで測定できた。世界中で抗菌薬への耐性化が進み、現在、抗菌薬の適正使用が推進されつつある。共同研究を行っている慶應義塾大学病院でも感染制御センターが中心となり、抗菌薬の適正使用が図られ、ダプトマイシン、メロペネムの使用患者は減少し、SIRS患者において、平成27年度に予定していた検体数(5060例)を得ることができなかった。研究計画にも記載していたが、予定の症例数が集まるまで待ち、解析及び検証を行う。したがって、平成28年度においても症例数を集積し、予定の症例数が集まり次第、PK/PD解析を実施する。透析患者の血中濃度を得るための共同研究施設として、神奈川県立汐見台病院を挙げていたが、経営母体が変わり、共同研究が出来なくなった。そこで新たに共同研究施設として、聖マリアンナ医科大学病院を加え、今後、SIRS患者および透析患者の抗菌薬血中濃度を測定していく。平成28年2月に研究倫理委員会の承認を得た。近年、PK/PDアプローチから最大限の効果、副作用の防止、耐性菌の発現阻止を目指し、患者個別に最適化した抗菌薬投与を行うことが重要視されている。一方、高齢社会を迎え、感染症領域においても特殊病態下の患者が増加している。重篤化しやすい特殊病態下の患者においては、一層の個別化最適投与が望まれるが、抗菌薬の薬物動態についてはほとんど検討されていないのが現状である。特に全身性炎症反応症候群(SIRS)、透析濾過(HDF)、化膿性髄膜炎、熱傷では分布容積、腎クリアランス、薬物の移行性など、正常時と比べて異なり、薬物動態は非常に複雑になっている。平成28年度は患者から得られた各抗菌薬の血中濃度を高速液体クロマトグラフィーで測定し、SIRS患者、HDF患者、髄膜炎患者の血中濃度を集積した。症例が集まったHDF患者においては、薬物動態解析を行い、最適投与法の検討を行った。メロペネム投与患者におけるHDF条件は、血流量200 mL/min、透析液流量500 mL/min、補液流量5.83 mL/min、HDF施行時間4時間であった。メロペネムのHDF時のクリアランスは5.78 ±1.03L/h、非HDF時のクリアランスは1.05 ±0.27L/h、分布容積は15.80 ±3.59 Lであった。Time above MICが40%以上になる最適投与法として、1日1回0.250.5 g投与(HDF施行日はHDF後に投与)が推奨された。

セファゾリンも同様の検討を行い、HDF条件として、血流量120 mL/min、透析液流量300 mL/min、補液流量0.8 mL/min、HDF施行時間4時間の場合、Time above MICが60%以上になる最適投与法として、1日1回0.51.0 g投与(HDF施行日はHDF後に投与)が推奨された。世界中で抗菌薬への耐性化が進み、現在、抗菌薬の適正使用が推進されている。共同研究を行っている慶應義塾大学病院、聖マリアンナ医科大学病院、公立昭和病院でも感染制御チームが中心となり、抗菌薬の適正使用が図られ、ダプトマイシン、メロペネムの使用患者は減少し、SIRS患者(5060例)、化膿性髄膜炎患者(1020例)において、予定している検体数を得ることができなかった。一方、HDF患者については予定通りの検体数が得られた。近年PK/PDアプローチから最大限の効果、副作用の防止、耐性菌の発現阻止を目指し、患者個別に最適化した抗菌薬投与を行うことが重要視されている。しかし、特殊病態時(化膿性髄膜炎、全身性炎症反応症候群(SIRS)、血液濾過透析(HDF)など)の薬物動態は明らかになっておらず、これらの患者に対して最適な投与量設計ができていないのが現状である。平成30年度は化膿性髄膜炎患者に投与された抗菌薬の血中濃度ならびに髄液中濃度を測定した。髄液中濃度は治療経過が良好な場合、治療経過と共に移行性が低下することが示され、治療期間中は改善が認められたとしても投与量を減量することなく投与すべきことが明らかとなった。さらに、脳室ドレーン留置下ではドレーンからの排出があり、髄液中濃度が低くなるが、ドレーン抜去により上昇することが示された。抗菌薬の中でもリネゾリドは髄液への移行性が高く、ドレーン抜去や治療経過による影響をほとんど受けなかった。また、SIRSの患者において、ダプトマイシンの血中濃度を測定した。ダプトマイシンはクレアチニンクリアランスが30 mL/min未満の場合、2日に1回投与となっているが、休薬日にはダプトマイシンの有効性の指標であるAUC 666 mg*h/Lを超えず、十分な効果が得られないことが示された。腎機能障害患者では可能な範囲で1回量を減量し、毎日投与することが推奨された。研究期間全体を通じて、HDF患者において、メロペネムの最適投与法は1日1回0.51.0 g投与(HDF施行日はHDF後に投与)であることも明らかにしている。本研究より、特殊病態下(HDF、SIRS、化膿性髄膜炎)における最適な投与法を明らかにすることができた。今後、これら患者の予後改善が期待される。Pharmacokinetics/pharmacodynamics(PK/PD)に基づいた抗菌薬の患者個別最適化投与法の構築は喫緊の課題である。本研究では、特殊病態下(血液濾過透析(HDS)、化膿性髄膜炎、全身性炎症反応症候群(SIRS))における抗菌薬のPKデータを取得・解析した。HDF時におけるメロペネム、セファゾリン、化膿性髄膜炎時のセフタジジム、セフェピム、バンコマイシン、リネゾリドSIRS時のダプトマイシンの薬物動態を明らかにした。さらに、個々の患者背景に応じた効果的かつ安全な抗菌薬投与法を確立した。本研究結果はすぐに臨床応用可能であり、抗菌薬の適正使用に大変役立つと考えられる。特殊病態下(SIRS、透析、化膿性髄膜炎、熱傷)において、各種抗菌薬が使用され、研究内容を説明し、同意が得られた患者を対象に本研究は行う(連携施設及び申請者所属施設の倫理委員会の承認を得た上で実施する)。平成28年度はSIRS患者はダプトマイシン、メロペネムの症例数が集まり次第、PK/PD解析を行う。
フコキサンチンによる血糖改善効果と骨格筋繊維分化に関する研究

本年度はFxOHをマウス骨格筋モデルC2C12筋管細胞に添加し、骨格筋の主要な糖トランスポーターであるGLUT4の発現誘導機序について検討を行った。まずGLUT4の発現誘導の関係するいくつかの経路を阻害しFxOHがGLUT4の発現に与える影響を検討した。その結果、AMPK阻害薬であるコンパウンドCはFxOHによるGLUT4のmRNA発現の増加を打ち消した。AMPKの活性化はKK-Ayマウスの骨格筋においても見られたことから、FxによるGLUT4発現の増加にはAMPK経路が関係することが推察された。次に、C2C12細胞を用いてAMPKの活性化に重要なAMPKの核内移行について検討した結果、AMPKの核移行はFxOHの添加2h後から有意に増加したことからFxOHは速やかにAMPKを活性化し核内移行を促進すると考えられた。一方、GLUT4の発現誘導において重要なPGC-1αはFxによりマウスの骨格筋においてその発現が誘導されるが、C2C12細胞にFxOHを添加しても発現量に変化は見られなかった。そこで、PGC-1αの発現に関係すると考えられるサイトカイン存在下でFxOHによるPGC-1αの発現に及ぼす影響を検討した。しかし、アディポネクチンなどのサイトカインは単独若しくはFxOH併用下においてもPGC-1αのmRNA発現は誘導しなかった。この結果から、少なくともin vitroにおけるFxOHによるGLUT4の誘導にはPGC-1αの発現増加は関係していないことが推察された。次に、PGC-1αとGLUT4の発現に関与するMEF2Aの発現をそれぞれ又は両方同時にsiRNAによりノックダウンしたがsiRNAによりmRNA発現量はそれぞれ40%まで低下したにも関わらずFxoH存在下であってもGLUT4のmRNA発現増加には影響が見られなかった。以上からFxはAMPKの活性化やPGC-1αの発現を誘導し、これらの因子は異なる機序で糖代謝や脂肪酸代謝を制御することで、インスリン抵抗性の改善や高血糖を改善すると推察された。(抄録なし)本研究では1つ目としてFxが糖尿病・肥満モデルKK-Ayマウスの骨格筋におけるエネルギー代謝や筋繊維分化に与える影響を検討した。その結果、Fx投与により筋繊維マーカーであるトロポニンのmRNA発現量に変化が見られなかったが、脂肪酸代謝に関係するCpt1bやACADMや筋持久力に関係するMyoglobinなどのmRNA発現が有意に増加した。さらに、運動により骨格筋からの分泌が増加し、他の組織でのエネルギー代謝に関係するマイオカインのmRNA発現が有意に増加した。これらの結果から、FxはKK-Ayマウスの骨格筋において筋繊維分化へは影響しないものの、β酸化の亢進や筋持久力の向上に加え、身体全体でのエネルギー代謝を高めることで効率的に糖尿病や肥満を改善することが期待された。Fxやその生体内代謝物であるフコキサンチノール(FxOH)はKK-Ayマウスの骨格筋やマウス骨格筋モデル細胞において骨格筋の主要な糖トランスポーターであるGLUT4のmRNAやタンパク質発現を増加させる。そこで、2つ目として、Fxの生体内代謝物フコキサンチノール(FxOH)をマウス骨格筋モデル細胞に添加し、GLUT4の発現誘導機序について検討を行った。その結果、AMPK経路の阻害剤は、FxOHによるGLUT4のmRNA発現の増加を打ち消した。さらに、KK-Ayマウスの骨格筋やモデル細胞においてAMPKの活性化が見られたことから、FxによるGLUT4発現の増加にはAMPK経路が関係することが推察された。骨格筋においてAMPKは下流因子であるPGC-1αやMEF2Aによる転写を活性化することで、筋繊維の分化やGLUT4発現の誘導に加え、β酸化などエネルギー代謝に関連する因子の発現を誘導することが知られている。このことから、AMPKはFxの作用機序の重要な因子の1つとして考えられる。

次に、PGC-1αとGLUT4の発現に関与するMEF2Aの発現をそれぞれ又は両方同時にsiRNAによりノックダウンしたがsiRNAによりmRNA発現量はそれぞれ40%まで低下したにも関わらずFxoH存在下であってもGLUT4のmRNA発現増加には影響が見られなかった。以上からFxはAMPKの活性化やPGC-1αの発現を誘導し、これらの因子は異なる機序で糖代謝や脂肪酸代謝を制御することで、インスリン抵抗性の改善や高血糖を改善すると推察された。フコキサンチンはKK-Ayマウスの骨格筋において筋繊維の分化に影響しないことが推察されたことから、当初の研究計画を変更する必要があった。しかし、フコキサンチンによる骨格筋での脂肪酸代謝の活性化に加え、近年注目されているマイオカインの誘導など興味深い知見が得られた。更に、GLUT4の発現誘導機序としてAMPK経路が関与することを新たに見い出した。AMPKはGLUT4の発現誘導に加え骨格筋のエネルギー代謝などに重要な役割を担う。よって本研究から、フコキサンチンによる抗肥満・抗糖尿病効果の作用機構を考察する上で重要な知見が得られたと考えられる。フコキサンチン及びフコキサンチノールによる骨格筋でのGLUT4の発現誘導機序としてAMPK経路が考えられたことから、その下流であるMEF2やPGC-1αの活性化など、さらに詳細な検討を行う。また、フコキサンチンによりマイオカインの発現が誘導されることから、この点についても誘導機序など更なる検討を行う。(抄録なし)
進行大腸癌におけるレゴラフェニブ治療に対する階層的分子マーカーの探索

切除不能進行再発大腸癌の薬物療法における効果予測バイオマーカーの探索では、まず分子生物学的に分類し、そのサブグループ内でのマーカー探索、すなわち階層的バイオマーカー探索を試みた。125例の進行再発大腸癌に対して、CIMP解析および5つのEGFR関連遺伝子の変異解析を行った。CIMP陽性例では有意にFOLFOX-FOLFIRI順次療法がFOLFIRI-FOLFOX順次療法よりもPFSが短かった。また、2次治療以降の抗EGFR抗体薬に関してはCIMP陽性例のほうがCIMP陰性例よりもPFSが短い傾向があった。3次治療以降でのレゴラフェニブは症例数が十分得られなかった。125例の進行再発大腸癌において、CACNA1G, IGF2, NEUROG, RUNX3, SOCS1の5つの部位のメチル化特異的PCR法によりCpGアイランドメチル化表現型(CIMP)の有無を評価し、EGFR関連遺伝子(KRAS, BRAF, PIK3CA, NRASおよびAKT1)に関してホットスポットの変異解析を行った。これらのエピジェネティック、ジェネティックな腫瘍の特徴と標準的がん薬物療法の治療成績との相関を後方視的に解析した。CIMP陽性の大腸癌は21.6%であり、CIMP陽性例では右半結腸原発が51.9%とCIMP陰性の28.9%に比し高率であるという特徴はこれまでの報告と一致していた。また、CIMP陽性例ではBRAF変異が18.5%とCIMP陰性例の0%に比して明らかに高率であり、EGFR関連5遺伝子全体の変異率はCIMP陽性例で74%、CIMP陰性例で48%とCIMP陽性例にはEGFR関連に遺伝子変異が高い傾向を認めた。CIMP陽性例、陰性例では1次治療においてオキサリプラチンを含む化学療法を行った症例がそれぞれ10例、60例、イリノテカンを含む化学療法を行った症例がそれぞれ14例、24例であった。CIMP陽性例のオキサリプラチンを含む治療の無増悪生存期間中央値は4.5ヶ月、イリノテカンを含む治療の9.4ヶ月に比べて有意に低かったが、CIMP陰性例ではその傾向を認めなかった。これまでに125例の進行再発大腸癌において、Weisenbergerらの報告した5つの部位(CACNA1G, IGF2, NEUROG, RUNX3, SOCS1)を指標としたメチル化特異的PCR法によるCpGアイランドメチル化表現型(CIMP)解析、5つのEGFR関連遺伝子(KRAS, BRAF, PIK3CA, NRAS及びAKT1)に関してシークエンスによる変異解析を行った。この125例に対しては、標準的な化学療法がおこなわれており、オキサリプラチン及びイリノテカンを含む1次治療および2次治療を行った患者がそれぞれ109例、78例であり、2次治療以降に抗EGFR抗体薬を使用した患者が57例であった。CIMP陰性群においては1次治療としてオキサリプラチンを含む治療を行い2次治療でイリノテカンを含む治療に移行した場合とその逆の順序で治療した場合において、1次ー2次治療を合わせた無増悪生存期間は有意差がなかったが、CIMP陽性群においては有意に1次治療で1次治療としてオキサリプラチンを含む治療を行い2次治療でイリノテカンを含む治療に移行した場合のほうが、その逆の順序で治療した場合よりも無増悪生存期間が短くなることが示された。したがって、何らかの機序でCIMPは異なる薬剤に関して投与の順序に依存した感受性に相関すること、すなわちCIMP陽性のがんは薬物感受性に関して可塑性を持つという可能性が示唆された。また、2次治療以降の抗EGFR抗体薬に有意差はつかないもののCIMP陽性群のほうがCIMP陰性群よりも無増悪生存期間が短く、CIMPは抗EGFR抗体薬の感受性にも関連する可能性が示された。現在、3次治療以降のレゴラフェニブの感受性に関する検討を行っている。現在のところ、進行大腸癌におけるレゴラフェニブは3次、4次治療以降での標準的治療であり、そこまで治療継続ができず脱落する症例が多く、レゴラフェニブの感受性に関するデータ収集が十分にできていない。切除不能進行再発大腸癌の薬物療法における効果予測バイオマーカーの探索では、まず癌を分子生物学的背景に基づいて分類を行い、そのサブグループ内でのマーカー探索を行うこと、すなわち階層的バイオマーカー探索が有用であるいう仮説の下に、マルチキナーゼ阻害薬レゴラフェニブのバイオマーカー探索を目的とした。サブグループとして、CIMPの状態を採用し、それぞれのグループにおけるがん薬物療法の有効性を解析した。125例の進行再発大腸癌に対して、5つの部位を指標としたメチル化特異的PCR法によるCIMP解析を行った。さらに分子標的薬である抗EGFR抗体薬の感受性に関与する5つのEGFR関連遺伝子(KRAS, BRAF, PIK3CA, NRAS及びAKT1)の変異解析を行った。この125例に対しては、1次-2次治療においてオキサリプラチン、イリノテカンを含む療法を行い、2次治療以降で抗EGFR抗体薬を使用した。CIMP陰性例においては、1次治療にオキサリプラチンを含むFOLFOX療法、2次治療にイリノテカンを含む治療(主としてFOLFIRI)に移行した場合すなわちFOLFOX-FOLFIRI順次療法とその逆の順序のFOLFIRI-FOLFOX順次療法では無増悪生存期間(PFS)に有意な差を認めなかった。しかし、CIMP陽性例においては有意にFOLFOX-FOLFIRI順次療法がFOLFIRI-FOLFOX