hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
外国人子女にも応用可能な読字指導法開発のための基礎的研究

親密度(頻度)と一貫性に配慮した漢字音読課題を作成し、日本人成人、日本人小児、成人非母語話者、外国人子女、日本人ディスレクシア児について、漢字読み能力の特徴と関連する認知能力を検討した。親密度(頻度)と一貫性の漢字音読に与える影響は各群で異なること、漢字の読み能力には語彙力や規則性の学習能力が関与することを確認した。機能的MRI研究により、一貫性と親密度は異なる経路によって処理されることが示された。この結果から、ディスレクシア児・外国人子女のいずれに対しても、語彙力と文字と読みの対応規則の学習能力という視点から強みと弱みを評価することで、特性に配慮した個別の漢字指導法が検討できると考えられた。平成23年度の研究成果により,漢字の読みには語彙に依存する経路と音韻化に依存する経路が存在することが示唆された。この二経路の神経基盤を確認するため,一貫性と親密度を統制した漢字単語の読み課題を作成し,大学生22人(男性10人,女性12人)を対象として機能的MRI実験を行った。この結果,一貫性が低い語でより強く活動する部位として左下頭頂小葉が認められたことから,この部位が音韻化の曖昧さの解決に特異的に関与する脳部位であると考えられた。一方,一貫性・親密度とも低い語で強く活動する部位として,左中下前頭葉,左上頭頂小葉,左下側頭葉が認められた。これらの部位は,複数候補の中からの選択や視覚的注意の維持など,難易度の高い課題に関わる非特異的な脳活動であると考えられた。この研究成果については国際学会にて発表した。さらに,昨年度の研究で漢字の読み能力との関連を認めた語彙力や潜在学習能力と脳活動のとの関連について検討中である。また,子どもを対象として,漢字読み能力と語彙力や認知能力との関連を検討するため,子ども用の漢字音読課題を作成した。子ども(小中学生)における単語親密度や一貫性は既存のデータベースから算出することができないため,親密度の代わりとして小学生用国語教科書での出現頻度を用い,一貫性も同じ教科書に出現する単語を用いて算出した。学年配当,音読み・訓読みの割合は統制した。健常の小学6年生36人(男児21人,女児15人)を対象としてこの課題の妥当性の検討を行い,正答数に有意な頻度効果,一貫性効果を認めることを確認した。この結果から,この課題は大学生用に作成した課題と質的に等しい課題となっていると思われた。平成23年度に行った成人の漢字の読みモデルの検討(研究1)についてもさらに検討をすすめ,潜在学習能力との関係,非母語話者(留学生)での検討について,それぞれ国際学会に発表した。本研究では、日本語における読みの仮説モデルが言語背景や基礎的能力の異なる学習者にも適応可能であるかを検証し、外国人子女にも応用可能な読字指導法を開発することを目的とした。主に漢字について検討した。読みの二重経路モデルでは語彙経路と非語彙経路が想定されている。漢字単語の読みにおいて、語彙経路の読みに関連する要因として単語の親密度や出現頻度、非語彙経路の読みに関連する要因として読みの一貫性を用い、それぞれを統制した漢字音読課題を作成した。これを用いて、1日本人大学生、2成人の日本語学習者(留学生)、3読み障害のない日本人小児、4発達性ディスレクシア児、5小児の日本語学習者(外国人子女)を対象として漢字の読み能力と、単語属性、語彙力・その他の認知能力との関連を検討した。この結果、読み障害のない日本人(1および3)では、低親密/低頻度語において一貫性の程度が読みの正答率に影響したが、発達性ディスレクシア児では低頻度語における一貫性の影響がみられなかった。全ての群で語彙力は漢字の読み能力の最大の説明因子であったが、発達性ディスレククシア児では他群に比べ語彙力に対する相対的な漢字読み能力が低かった。また漢字の読み能力に対する視覚認知・視覚記銘力の影響は認めなかった。あわせて、日本人大学生を対象として漢字の読み課題による機能的MRIを行い、漢字の読みにおける脳活動に親密度と一貫性が異なる影響を与えることを確認した。このことは、漢字の読みにおける語彙経路と非語彙経路での並列処理の傍証になると考える。以上より、漢字の読みに二重経路モデルを適応することは妥当であり、言語背景の異なる学習者(留学生や外国人子女など)や基礎的能力の異なる学習者(発達性ディスレクシア児など)への指導においては、それぞれの特性を考慮し、親密度/頻度と一貫性を意識した指導方略が必要であることが確認された。本年度は漢字の音読課題を作成し、大学生を対象として漢字の音読能力とそれに関連する認知能力の検討を行った。漢字音読課題として、高親密度単語、低親密度単語、非語について、それぞれ高・中・低一貫性語を作成した。

非語課題では漢字の読みの統計的特性に対する鋭敏さをみるため、最も頻度の高い読みを正答として一貫性を求めた。関連する認知能力としては、視覚認知能力(TVPSーIIIより弁別、図地判別、閉合)、視覚記銘力(TVPSーIIIより視覚記銘)、語彙能力(WISC-IIIより単語、類似)、潜在学習能力(確率的系列学習課題)を調べた。二重経路モデルを基礎として漢字の読みを説明する仮説モデルを作成し上記の各課題の成績を当てはめ、共分散構造モデリングを用いてその妥当性を検証した。その結果、低頻度語の読みには語彙能力が強く影響すること、潜在学習能力は非語の読みに影響しており、非語の読み能力を介して低頻度語の読みに影響を与えていることが明らかとなった。一方、視覚認知・視覚記銘力の漢字の読み能力への影響は明らかでなかった。個人差が小さかったためである可能性もあり、対象を広げて検討をする予定である。また、言語背景・認知能力の異なる学習者でのモデルの妥当性を検討するため、非母語話者(漢字語圏・非漢字語圏)を対象に同様の実験を行った。対象者を中級以上の日本語学習者としたため十分な数の被験者を得ることができず、モデルの検証にはいたらなかったが、学習年数や語彙力に加えて母語の違いが漢字の読み能力に影響することが示唆された。本研究により、漢字の読みには語彙に依存する経路と音韻化に依存する経路が存在すること、どちらが主体となるかは個人の背景能力によっても異なることが確認できると思われる。これにより、読字困難児や非母語話者への読み指導において各個人の弱い経路と強い経路を意識した漢字の読み指導が可能になると考えられる。平成23年度に実施した成人での漢字の読みモデルの検討(研究1)についてはさらに検討・解析をすすめ,研究代表者(関),研究分担者(田中)がそれぞれ国際学会での発表を行った。以上によりすべての研究について,おおむね計画どおり進展しているといえる。本年度は漢字の読字能力の課題の作成と、関連する認知課題の選定を行い、成人を対象として仮説モデルの検証を行うことを目的としていた。被験者として母語話者については十分な数の被験者を得て研究を遂行でき、モデルの検証を行うことができた。非母語話者については、課題の難易度にあった適切な被験者を得ることができず、十分な数の被験者は得られなかったためモデルの検証にはいたらなかったが、母語の違いの影響について有用な知見を得ることができ、成果はあったと考えている。平成25年度は,読字障害児と非母語話者(外国人学童・生徒)を対象として,漢字の読み能力とそれに関わる認知能力,語彙力の調査を行う(研究3)。読字障害児については,小学6年生中学生を対象とする。非母語話者については,生活背景が比較的近い日本の学校に通う外国人児童・生徒を主な対象とする。滞在歴,日本語での教育歴,両親の日本語能力などが異なると考えられるが,日本語における音声言語での語彙力を1つのパラメータとすることで調整を図る。十分な数の被験者を得るため,外国人児童・生徒の多い他県(岐阜県など)にも依頼しデータを得る。母語の違いと漢字の読み能力との関連を確認するため,漢字圏(中国籍)と非漢字圏(ポルトガル語など)の被験者各2030名について検査を行う予定である。これまでの研究成果を踏まえて,外国人子女にも応用可能な指導方法の提案を行う。
チャシの源流に関する研究

我々は平成11年度から14年度の科学研究費補助金を得て、北海道枝幸町ウアバトマナイチャシ、岩手県岩手郡西根町暮坪遺跡、暮坪II遺跡、子飼沢山遺跡、スバット遺跡の発掘謂査と、多くの北海道のチャシと東北北部・北海道南部の平安時代防御性集落の踏査を行ない、また関係文献を収集した。暮坪遺跡などは北日本平安時代高地性集落の代表的なものである。その結果、北日本の防御性集落出現の時代的背景やチャシとの関係についてほぼ次のような結論に達した。高地性集落を含めて北日本の防御性の高い集落はほぼ一〇世紀後半を中心とした年代に集中するらしい。そしてこの時期には低地に立地する集落は、皆無ではないにせよきわめて少なくなるようである。この時期に東北北部から道南地方にかけての広範な地域に時を同じくして防御性の高い集落が出現したのである。この時期は、前九年・後三年の合戦の前夜にあたっており、蝦夷の世界にも経済的な面を含めて政府側の影響が強く及び、蝦夷社会の分裂・抗争が激しくなっている。防御性の高い集落の出現は、このような状況をふまえたものなのであろう。しかし平泉藤原氏の時代から鎌倉時代になると、東北地方の北部までは朝廷や幕府の支配が及ぶようになり、対立・抗争は上からおさえつけられることになったため、防御性集落は姿を消すことになる。しかし北海道には朝廷や幕府の直接の支配は及ばず、そのために北海道では対立・抗争のエネルギーがそがれることはなかったのである。このような状況の中で北海道ではアイヌ民族成立にむけての歴史が進行し、アイヌの砦といわれるチャシが盛んに作られるようになると考えている。本年度の研究は次のような事項を中心に実施した。1北海道のチャシの実態を把握すること。2東北北部の平安時代高地性集落の実態を把握すること。上記1、2についての研究成果の概要は次のとおりである。チャシについては、北海道枝幸郡枝幸町ウバトマナイチャシの発掘調査に参加し、丘先式チャシの規模・構造などについて詳細なデータを得ることができた。ウバトマナイチャシはオホーツク海にむかって突き出た小半島の突端に位置し、基部には濠があり、その中央部は陸橋状に掘り残してある。また濠の内側には柵列が存在する。さらに北海道各地のチャシを踏査し、さまざまな形態のチャシの実態を把握することにもつとめた。東北北部の平安時代高地性集落については、岩手県岩手郡西根町子飼沢山遺跡の発掘調査を実施し、その年代・集落の規模と構造の把握につとめた。その結果、子飼沢山遺跡は標高500メートルの子飼沢山の頂上付近に存在する平安時代後期、10世紀ころの集落で、約30軒前後の竪穴住居跡が遺存すること、集落の主要部には濠がめぐることなどを確認した。また主として西根町内の高地性集落の分布調査を行ない、我々が先に調査を行なって平安時代の高地性集落であることを確認している暮坪遺跡の沢をはさんだ対岸にも古代のものと思われる高地性集落が存在することを確認し、次年度以降にその年代や規模・構造などを把握するための発掘調査を実施する予定で準備をすすめることにした。本年度は東北北部の平安時代高地性集落の実態を把握することを中心に研究を行なった。本研究は東北北部の平安時代高地性集落と北海道のチャシとの間に関連があるかどうかをさぐることを目的としている。そのためにこれまでにすでに一定の資料を得ている高地性集落である岩手県岩手郡西根町暮坪遺跡と子飼沢山遺跡の調査データがどの程度に普遍性を有するかを確定する必要があり、今年は暮坪遺跡に近い暮坪II遺跡を発掘調査の対象とすることにした。

暮坪II遺跡は暮坪遺跡からは深い沢をはさんだ対岸の山上に存在し、前記の深い沢にそそぐ谷にへだてられた南と北の2地区に竪穴住居跡と思われるくぼみが確認できる。そのうち本年度は北地区で2軒、南地区で3軒の住居跡をえらび発掘調査を実施した。その結果、北地区の住居跡はいづれも方形を呈し、壁ぎわにカマドを有する構造で、出土した土器の様式から10世紀末前後の年代のものであることを知り得た。南地区の住居跡も方形を呈するものであったがカマドはなく、遺物も出土しなかった。これらの点からすると南地区の住居跡は長期にわたる居住は行なわれなかった可能性が高い。ただし住居跡は10世紀初頭に降下した火山灰を切って構築されており、年代の点では北地区の住居跡と大きな差はないものと考えられる。本年度に行なった暮坪II遺跡の調査によって、東北北部の高地性集落の多くは10世紀末を前後する時期に営まれたこと、長期にわたる生活を行なわなかったものも存在することが判明した。なお本年度は西根町内の遺跡の分布調査も行ない標高500メートルの山上に位置する子飼沢山遺跡への登口近くに平安時代に営まれた可能性が高い集落跡を発見した。次年度にはこの遺跡の調査をも行なう予定で計画を進めている。本年度の研究は次のような事項を中心に実施した。1東北北部の高地性集落のうち、比較的低いところに立地する遺跡の発掘調査を行なって、その実態を把握すること。2これまでに発掘調査を行なった遺跡のうちの子飼沢山遺跡について、遺跡全体の地形測量を実施すること。上記1、2についての研究成果の概要は次のとおりである。1については、春季に岩手県岩手郡西根町のスバット遺跡の発掘調査を実施した。スバット遺跡は、子飼沢山遺跡が所在する山地の麓の丘陵上に存在する。調査前の状況は、子飼沢山遺跡などの竪穴住居跡と同様のくぼみが散在していることから、くぼみの発掘調査を実施し、出土土器の様式などから子飼沢山遺跡のような高地の遺跡との年代差などを把握する予定であった。しかし発掘調査の結果ではスバット遺跡のくぼみは、子飼沢山遺跡などの竪穴住居跡とはちがい、きわめて深いものであり、カマドのような構造物も存在せず、土器などの遺物も残っていない特殊な遺構であり、くぼみの性格も年代も子飼沢山遺跡などとは大きく異なることが判明した。そしてこの成果によって、表面観察のみによってくぼみを平安時代の竪穴住居跡ときめてしまうことはできないという新たな事実が浮かび上がることになり、今後の大きい研究テーマが浮上してきたのである。2については子飼沢山遺跡の全体にわたる測量調査を実施し、遺跡の規模と構造を具体的に把握することができ、次年度に予定している平安時代高地性集落の総合的な考察の重要な資料を得ることができた。平成14年度は本研究の最終年度にあたっている。そのために今年度は過去三年間の研究成果を総括するべく、東北北部の平安時代防御性集落とチャシとの関係を明らかにするため、平安時代防御性集落とチャシのそれぞれについて、その年代・構造・分布などについてこれまでに集積してきた資料の分析を行なった。また、岩手県岩手郡西根町寺田所在の暮坪遺跡と同町荒木田所在の子飼沢山遺跡については、東北北部の防御性集落の実態を明らかにするための重要な遺跡であることから、9年間にわたって発掘調査を実施して、集落の年代や構造などについての研究を進めてきたところであるが、その精密な測量図の作成が課題として残されていたので、4月から5月にかけてその作業を実施した。
新規内在性カンナビノイドレセプターリガンド・2-アラキドノイルグリセロールの研究

我々は、内在性カンナビノイドレセプターリガンドである2-アラキドノイルグリセロールが、培養神経系細胞であるNG108-15細胞において、カンナビノイドCB1レセプター依存性機能により、速い一過性の細胞内遊離Ca^<2+>濃度上昇をもたらすことを見いだした。次いで我々は、本化合物の構造類緑体を24個合成し、それらの上記活性を測定したところ、2-アラキドノイルグリセロールは0.3nMという低い濃度から活性が認められ、最大活性も他の全ての類緑化合物よりも強いことが明らかになった。合成カンナビノイド受容体アゴニストであるHU-210やCP55940でも同様に0.3nMから活性が見いだされたが、その最大活性は2-アラキドノイルグリセロールよりも低いものであった。以上の結果から、カンナビノイドCB1受容体の本来のリガンドが2-アラキドノイルグリセロールであることを強く示唆するものである。次に本物質の生合成機構を研究した。ラット脳ホモジネートにおいて、2-アラキドノイルグリセロール及びアラキドン酸含有ジアシルグリセロールが速やかに生成した。また、外からアラキドン酸含有ジアシルグリセロールを添加した時には、2-アラキドノイルグリセロールの生成が認められた。次に、放射標識した種々のリン脂質を基質として加えると、2-アラキドノイルグリセロールやアラキドン酸含有ジアシルグリセロールは、ホスファチジルコリンやホスファチジルエタノールアミンなどではなく、ホスファチジルイノシトールから生成することを明らかにした。これらの結果から、2-アラキドノイルグリセロールは、脳ホモジネート中では、主としてホスファチジルイノシトールなどのイノシトールリン脂質から生じたジアシルグリセロールが、更にジアシルグリセロールリパーゼによって分解されて産生されるものと考えられる。我々は、内在性カンナビノイドレセプターリガンドである2-アラキドノイルグリセロールがカンナビノイドCB1レセプター依存性機構により培養神経系細胞であるNG108-15細胞において、速い一過性の細胞内遊離Ca^<2+>濃度上昇をもたらすことを見いだした。次いで我々は本化合物の構造類縁体を24ヶ合成し、それらの上記活性を同様に測定したところ、2-アラキドノイルグリセロールが最も生理活性が強いことが分かった。即ち、その活性は0.3nMで認められ、最大活性は他のすべての類縁化合物よりも強かった。カンナビノイド受容体アゴニストであるHU-210やCP55940でも0.3nMの低い濃度で同様の活性が見いだされたが、最大活性は2-アラキドノイルグリセロールのものよりも低いものであった。もう一つの内在性カンナビノイドレセプターリガンドとして知られる化合物であるアナンダミドもこの活性測定システムでは部分アゴニストとしてしか働かなかった。また、遊離アラキドン酸にはこれらの活性は認められなかった。更に、代謝的に不活性な2-アラキドノイルグリセロールのエーテル型化合物は活性それ自体は低いものの、アゴニストとしての活性が認められ、また、様々なカンナビノイド受容体アゴニストで細胞を前処理すると2-アラキドノイルグリセロールの反応が消失した。一方、様々な神経伝達物質(例えばエンケファリンなど)では、このような効果は認められなかった。以上のような結果は、本来のカンナビノイドCB1受容体リガンドは2-アラキドノイルグリセロールであり、このカンナビノイドCB1受容体リガンドが生体内でのもともと存在する内在性リガンドであることを強く示唆するものである。

我々は、内在性カンナビノイドレセプターリガンドである2-アラキドノイルグリセロールがカンナビノイドCB1レセプター依存性機構により培養神経系細胞であるNG108-15細胞において、速い一過性の細胞内遊離Ca^<2+>濃度上昇をもたらすことを見いだした。次いで我々は2-アラキドノイルグリセロールの生合成機構について研究を行った。ラット脳ホモジネートをカルシウムイオン存在下インキュベートすると、2-アラキドノイルグリセロール及びアラキドン酸含有ジアシルグリセロールが速やかに生成した。また、外からアラキドン酸含有ジアシルグリセロールを添加した時には、カルシウムイオンの非存在下でも、2-アラキドノイルグリセロールの生成が認められた。次に、放射標識した種々のリン脂質を基質として加えた実験から、2-アラキドノイルグリセロールやアラキドン酸含有ジアシルグリセロールは、ホスファチジルコリンやホスファチジルエタノールアミンなどではなく、ホスファチジルイノシトールから生成することを明らかにした。上記の実験を総合すると、ラット脳ホモジネートにおいて、2-アラキドノイルグリセロールは、主としてホスファチジルイノシトールなどのイノシトールリン脂質がまず、脳ホモジネート中に存在するホスホリパーゼ-C活性によりジアシルグリセロールを生じ、それが更に、ジアシルグリセロールリパーゼによって分解されて産生されるものと考えられる。
進化計算によるグラフ構造表現を用いたプログラムの自動生成に関する研究

本年度は,当初の研究計画通り,我々が先に提案した進化計算によるフロクラムの自動生成手法の拡張と実問題への応用を行った.まず,先に我々が提案したグラフ構造をプログラムの表現形式とする自動プログラミング手法であるGraph Structured Program Evolution(GRAPE)の拡張を行った.GRAPEを用いて探索空間を探索するエージェントの行動プログラムを自動生成することで,探索アルゴリズムの獲得を行う方法を提案した.提案手法を用いて関数最適化問題のベンチマーク関数とテンプレートマッチング,探索空間が動的に変化する問題に対して探索アルゴリズムの獲得実験を行った.提案手法によって構築された探索アルゴリズムは,従来提案されている探索アルゴリズムと比較して良好な結果を示すものであった.この成果によって,従来は問題に合わせて人が試行錯誤的に開発していた探索アルゴリズムを自動的に生成することができるようになると考えられる.次に,画像変換部を含む画像分類アルゴリズムの自動構築手法であるGenetic Image Network for Image Classification (GIN-IC)の拡張を行った.通常,画像分類は「画像の前処理」,「特徴量抽出」,「分類」の3つのフェーズから構成される.それぞれのフェーズについて様々な研究が行われているが.GIN-ICでは「画像変換部」,「特徴量抽出部」,「演算部」から構成される一連の画像分類アルゴリズムを全自動で構築する点に特徴がある.GIN-ICでは画像変換部をもつことによって,画像を分類し易いかたちに変換することが可能となる.本年度はこのGIN-ICを1つの弱識別器として扱い,アンサンブル学習法を利用してGIN-ICを複数組み合わせることで分類精度の向上を図った.本年度は主に、我々が先に提案した進化計算による自動プログラミングの手法の改良、拡張を行った。当初の研究計画通り、効率的なプログラムの自動生成に関する研究と実問題への両方の面から順調な研究が実施できているといえる。次に具体的な研究成果を述べる。まず、先に我々が提案したグラフ構造をプログラムの表現形式とする自動プログラミング手法であるGraph Structured Program Evolution(GRAPE)の拡張を行った。ここでは、プログラムの進化過程において個体集団内の多様なプログラムサイズを保持することが必要であると考え、プログラムの評価時にプログラムサイズを考慮することで、個体集団内のプログラムサイズの多様性を保持する手法の提案を行った。また、GRAPEに自動関数定義の概念を導入し探索効率の向上と再帰プログラムの自動生成を行った。自動関数定義とはプログラムの進化過程で関数を自動的に定義し利用する概念である。自動関数定義を導入したGRAPEを用いてループ構造を必要とするプログラムの自動生成実験を行い、従来のGRAPEと比較して性能が向上することを確認した。次に、実問題として画像処理分野を考え、「画像変換部」、「特徴量抽出部」、「演算部」から構成される画像分類アルゴリズムの自動構築法であるGenetic Image Network for Image Classification(GIN-IC)の提案を行った。GIN-ICでは画像変換部をもつことによって、画像を分類し易いかたちに変換することが可能となる。GIN-ICは一連の画像分類アルゴリズムを全自動で構築する点に特徴がある。多クラスのテクスチヤ画像の分類問題を例としてGIN-ICの性能評価を行い、実験の結果から高い分類性能が得られることを示した。本年度は,当初の研究計画通り,我々が先に提案した進化計算によるフロクラムの自動生成手法の拡張と実問題への応用を行った.まず,先に我々が提案したグラフ構造をプログラムの表現形式とする自動プログラミング手法であるGraph Structured Program Evolution(GRAPE)の拡張を行った.GRAPEを用いて探索空間を探索するエージェントの行動プログラムを自動生成することで,探索アルゴリズムの獲得を行う方法を提案した.提案手法を用いて関数最適化問題のベンチマーク関数とテンプレートマッチング,探索空間が動的に変化する問題に対して探索アルゴリズムの獲得実験を行った.提案手法によって構築された探索アルゴリズムは,従来提案されている探索アルゴリズムと比較して良好な結果を示すものであった.この成果によって,従来は問題に合わせて人が試行錯誤的に開発していた探索アルゴリズムを自動的に生成することができるようになると考えられる.次に,画像変換部を含む画像分類アルゴリズムの自動構築手法であるGenetic Image Network for Image Classification (GIN-IC)の拡張を行った.通常,画像分類は「画像の前処理」,「特徴量抽出」,「分類」の3つのフェーズから構成される.それぞれのフェーズについて様々な研究が行われているが.GIN-ICでは「画像変換部」,「特徴量抽出部」,「演算部」から構成される一連の画像分類アルゴリズムを全自動で構築する点に特徴がある.GIN-ICでは画像変換部をもつことによって,画像を分類し易いかたちに変換することが可能となる.本年度はこのGIN-ICを1つの弱識別器として扱い,アンサンブル学習法を利用してGIN-ICを複数組み合わせることで分類精度の向上を図った.
EGFR結合蛋白LRIG1に着目した、EGFR変異陽性肺癌に対する新規治療戦略

平成30年度は、HCC827 (EGFR exon 19欠失)以外のEGFR遺伝子変異を有する肺癌細胞株を用いて、LRIG1安定発現細胞株を樹立した。具体的には、HCC4011 (EGFR L858R)と、H1975 (EGFR L858RおよびT790M)の細胞株を用いて、LRIG1安定発現細胞株を作成した。また、EGFR遺伝子変異を有しない肺癌細胞株(A549)も用いて、LRIG1安定発現細胞株を既に作成しており、これらの細胞株を用いてEGFRの発現や細胞増殖について検討を行った。EGFR遺伝子変異を有する肺癌細胞株においては、LRIG1により変異EGFRタンパクおよびリン酸化の発現が抑制し、細胞増殖も抑制されたが、EGFR遺伝子変異を有しない肺癌細胞株においてはEGFR蛋白発現の変化に乏しく、細胞増殖も抑制されなかった。HCC827については、浸潤能・遊走能におけるLRIG1の影響も評価したところ、LRIG1安定発現株では浸潤能・遊走能が抑制されていた。マウスモデルでin vivoでのLRIG1の効果を検討したところ、EGFR遺伝子変異を有するHCC827では腫瘍増殖が抑制されたが、EGFR野生型のA549ではLRIG1による腫瘍増殖抑制効果は認められなかった。また、HCC827を用いて、LRIG1のEGFR以外のレセプターチロシンキナーゼに対する影響を検討したところ、LRIG1安定発現細胞株では、LRIG1によりHER2, HER3, MET, IGF-1Rのリン酸化も抑制されていた。以上の結果を踏まえ、Carcinogenesis誌に研究成果を投稿し、掲載された。複数の肺癌細胞株(EGFR変異陽性または野生型)を用いてLRIG1安定発現細胞株を作成することに成功し、LRIG1がEGFR変異陽性肺癌細胞株においてEGFR発現を抑制し、細胞増殖を抑制することを、in vitro, in vivoで示すことが出来た。また、得られた研究成果を学術雑誌に投稿し掲載されたので、研究は順調に進展していると考えられる。申請者らが樹立しているEGFRチロシンキナーゼ阻害剤耐性肺癌細胞株を用いて同様にLRIG1安定発現細胞株を作成する予定である。また、バイオインフォマティクス解析を用いたLRIG1の標的シグナル伝達経路・耐性因子の同定も検討している。物品購入において、一部当初の見込みよりも少額で購入出来たものがあったため、19849円の余剰が生じたが、新たに物品を購入出来る金額ではなかったために年度内の使用は不可能であった。次年度に繰り越して物品購入に充当する。
微生物酵素による新しい物質変換系の開発

本研究では,微生物酵素を用いる物質の合成,変換法を画期的に発展させるべく,各種酵素が人為的制御条件下で発現する合成活性,非天然合成化合物に対して示す変換活性,あるいはアミノ酸・ヌクレオチド,ビタミンなどの代謝に関与する多機能的作用などを解析するとともに,それらの酵素の力価増大を図ることによって種々の有用物質の工業的生産方式の基礎を確立する.さらにキラルな有機化合物を創り出す微妙な酵素機能を精密合成法と組合わせた独創的生産分野を開拓することを目的とする.本年度の研究実績は以下の通りである.(1)微生物酵素シスタチオニンj-リアーゼとシスタチオニンj-シスターゼを用いるL-シスタチオニンの酵素的合成のための反応条件を確した.(2)好熱菌の耐熱性アラニン脱水素酵素遺伝子を大腸菌にクローニングし,本酵素を大腸菌より単一に精製した.また本酵素タンパクの一次構造を決定した.(3)酵母由来カルボキシペプダーゼYおよびかび由来カルボキシペプダーゼPを用いる縮合反応の最適反応条件を確立した.(4)微生物リパーゼによる油脂のグリセロリシス反応の最適化および連続反応条件ならびに微生物ホスホリバーゼDによるホスファチジルエタノールアミンの生産条件を確立した.(5)食用系状菌の変異株の新濃縮法を見いだすとともに各種食用系状菌のj-グルタミルトランスペプチダーゼの性質を究明した.(6)メタン生成細菌の菌体を固定床バイオリアクターに保持してメタノールを炭素源としたビタミンB-12の生産条件を確立した.(7)カルバペネム抗生物質およびプロスタサイクリンなどの不斉炭素を有するシントンを,エステラーゼを用いて創り出した.(8)酵母の還元力およびリバーゼを利用して光学活性生物活性物質を調製した.(9)キレート形成に基づくタンパク質の修飾法を開発し,サリチルアルデヒドを導入した牛血清アルブミンとリシンをリガンドとする固定化担体との相互作用を究明した.本研究では,微生物酵素を用いる物質の合成,変換法を画期的に発展させるべく,各種酵素が人為的制御条件下で発現する合成活性,非天然合成化合物に対して示す変換活性,あるいはアミノ酸・ヌクレオチド,ビタミンなどの代謝に関与する多機能的作用などを解析するとともに,それらの酵素の力価増大を図ることによって種々の有用物質の工業的生産方式の基礎を確立する.さらにキラルな有機化合物を創り出す微妙な酵素機能を精密合成法と組合わせた独創的生産分野を開拓することを目的とする.本年度の研究実績は以下の通りである.(1)微生物酵素シスタチオニンj-リアーゼとシスタチオニンj-シスターゼを用いるL-シスタチオニンの酵素的合成のための反応条件を確した.(2)好熱菌の耐熱性アラニン脱水素酵素遺伝子を大腸菌にクローニングし,本酵素を大腸菌より単一に精製した.また本酵素タンパクの一次構造を決定した.(3)酵母由来カルボキシペプダーゼYおよびかび由来カルボキシペプダーゼPを用いる縮合反応の最適反応条件を確立した.(4)微生物リパーゼによる油脂のグリセロリシス反応の最適化および連続反応条件ならびに微生物ホスホリバーゼDによるホスファチジルエタノールアミンの生産条件を確立した.(5)食用系状菌の変異株の新濃縮法を見いだすとともに各種食用系状菌のj-グルタミルトランスペプチダーゼの性質を究明した.(6)メタン生成細菌の菌体を固定床バイオリアクターに保持してメタノールを炭素源としたビタミンB-12の生産条件を確立した.(7)カルバペネム抗生物質およびプロスタサイクリンなどの不斉炭素を有するシントンを,エステラーゼを用いて創り出した.(8)酵母の還元力およびリバーゼを利用して光学活性生物活性物質を調製した.(9)キレート形成に基づくタンパク質の修飾法を開発し,サリチルアルデヒドを導入した牛血清アルブミンとリシンをリガンドとする固定化担体との相互作用を究明した.
アフリカトリパノソーマの抗原変異の契機について

Trypanosomab.gambienseの変異表面抗原(VSG)が変異する契機を探るため,変異の頻度を的確に評価する方法をRT-PCRにもとめた。最も発現されやすいVSG KuTat1.1,1.2,1.3のどれかのクローン内に,他のVSGの発現が始まったことを検知するために各VSG遺伝子をクローニングし,その塩基配列を決めようとした。KuTat1.1については,1.5kbのうち5'側347個の塩基配列を決めることができた。KuTat1.2についてもクローニングしているが,トリパノソーマのコドンの使用が独自的で変わっているためか,読み枠をずらしてどの読み枠にしても終止コドンが現れ,塩基配列が決められないでいる。KuTat1.2やKuTat1.3遺伝子のクローニングについてはミニエクソン部のプライマーとVSGに共通な3'側の配列をプライマーとして,RT-PCRによるクローニングも試みている。トリパノソーマのmRNAに特徴的な5'側の配列であるミニエクソン部の配列18塩基を5'側プライマーとし,決定されたKuTat1.1の配列18塩基から3'側のプライマーをつくり,RT-PCRを試みてみた。これらのプライマーはKuTat1.1に特異的であるはずだが,量的に少ないながらもKuTat1.2クローンにおいてもPCR産物が生じた。PCRの条件を変えて試みたが,その産物を与える原虫の最小限界数の比は1:1000であった。10^<-4>以下という極めて少数含まれるヘテロなVSGを発現しているトリパノソーマ原虫を増幅して検出することが所期の目的である。血清学的には交差反応はないが,データベースによる検索では,塩基配列上,各VSG間のホモロジーが予想以上に高いので,RT-PCRにより変異を検出する方法を再考中であり,トリパノソーマ原虫における,蛋白質の燐酸化のパターンを解析するなど,直接シグナル伝達の機構について検討することも進めている。bruceiトリパノソーマの虫体表面の変異性糖蛋白質(VSG)が変異する機構についてはかなり詳細に説明できるようになったけれども,何が契機となって一連のプロセスが動き変異が生ずるのか全く解明されていない。変異の頻度は10^<-7>10^<-4>の範囲といわれている。この頻度を確定することを目的とし,極めて少数の集団を増幅して検出するため,発現中のVSGのmRNAをPCR法により増幅検出する方法を開発することが主眼である。Trypanosomab.gambiense Wellcome株についてすでに30種類ばかりのVSGクローンを保存しているので,それらのVSGに対するモノスペシフィックなマウス抗血清を作成した。VSG KuTatl.1,KuTatl.2,KuTatl.3の原虫からオリゴdTマグネットを用いてmRNAを分離しcDNAをクローニングするにあたって,VSGの分子量からcDNAの長さを1.7kbと想定して電気泳動されたバンドを切り出し,プラスミドベクターに挿入しようとしたが成功しなかった。そこでSchistosomajaponicumのグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)遺伝子をもつプラスミドベクターにその遺伝子とインフレームで連結するようにcDNAを挿入し,GST-VSG融合蛋白質が合成されるような発現ベクターを作成した。このベクターを大腸菌5αにいれてトランスフォームライブラリーをつくり,インダクションをかけ,抗KuTatl.1モノスペシフィックマウス抗血清により目的のコロニーを選択した。

同様にしてKuTatl.2のVSG遺伝子もクローニングできた。KuTatl.3については進行中である。この2種類のVSG遺伝子をクローニングする過程で新しくVSGの特性を見いだした。VSGにはN末に可変部があり,C末には抗原性について保存されたCRD(cross reactive determinant)とよばれる部位がある。ウェスタンブロットの結果から融合蛋白質として発現されるVSGはCRD部位がプロテアーゼにより切断され易くなることが推測された。Trypanosomab.gambienseのオリジナルな安定した変異表面抗原(VSG)KuTat1.1のmRNAをオリゴdTマグネットにより集め,それをもとに,cDNAライブラリーをつくった。日本住血吸虫のグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)遺伝子をもつプラスミドベクターにcDNAを入れ,大腸菌内でGST-VSGの融合蛋白質を発現するような発現ベクターを作成した。抗KuTat1.1モノスペシフィックな抗体で大腸菌コロニーを選択した。KuTat1.1遺伝子を複数得たが,塩基配列決定を試みると,読み枠をずらしていずれの読み枠にしても,終止コドンと認識される並びが含まれており,正しい塩基配列を決定するのが困難であった。一つだけ5′側から全体の約1/5に当たる347番目まで塩基配列を決定することができた。その配列からKuTat1.1に特異的であると思われる18塩基を3′側のプライマーとした。一方,5′側のプライマーとしては,トリパノソーマのmRNAの5′側に存在するミニエクソン部の塩基配列中の18塩基をプライマーとした。それらを用いてRT-PCR(Reverse transcriptase-polymerase chain reaction.)を試みたところ,KuTat1.1に特異的であるはずだが,KuTat1.1クローンだけでなく,KuTat1.2クローンでもPCR産物が生じ,その産物を与える原虫最小限界数の比が,たかだか,1:1000であった。目的の検出感度である10^<-4>以下のオーダーにはおよばない。KuTat1.2のVSG遺伝子も同じ理由で塩基配列が決められないでいる。これとKuTat1.3についての塩基配列が得られれば,より特異的なプライマーが得られるはずである。現在ミニエクソン部のプライマーと,VSG遺伝子3′側に共通な部分のプライマーを用いてRT-PCRによる遺伝子のクローニングも試みている。
レプチンにより誘導される新規遺伝子の肥満・レプチン抵抗性に対する役割の検討

LIT2遺伝子欠損マウスは、普通食給餌下において野生型と比較して痩せを認めたが、摂食量には差が認められなかった。また、高脂肪食給餌下においても、野生型マウスで認められる肥満がLIT2遺伝子欠損マウスでは軽減していたにもかかわらず、摂食量に野生型との間で有為差は認められなかった。また、LIT2遺伝子欠損マウスでは耐糖能とインスリン感受性が上昇していた。これらのことより、LIT2は視床下部においてレプチンの摂食抑制機能以外の機能(エネルギー代謝調節や糖代謝調節など)に関与している可能性が示唆された。1.前年度の結果より、LIT2遺伝子欠損マウスは普通食給餌下において、「痩せ」やインスリン感受性の増加を認めたが、体重あたりの摂食量は野生型と比較して差が認められなかった。2.前年度の結果を受け、今年度は普通食給餌下のLIT2遺伝子欠損マウスのさらなる解析を行うとともに、高脂肪食給餌下においてもLIT2遺伝子欠損マウスの解析を行った。まず、高脂肪給餌下のLIT2遺伝子欠損マウスにおける体重、組織重量、摂食量を検討した。高脂肪食給餌下において野生型マウスでおこる肥満は、LIT2遺伝子欠損マウスでは軽度であった。また、LIT2遺伝子欠損マウスでは、皮下脂肪組織や肝臓の重量が野生型と比較して減少していたが、傍精巣上体脂肪の重量は増加していた。高脂肪食給餌下におけるLIT2遺伝子欠損マウスの摂食量は、野生型マウスと比較して統計学的な有為差は認められなかったが増加する傾向を示した。3.高脂肪食給餌下におけるLIT2遺伝子欠損マウスの糖代謝異常や脂質代謝異常について検討した。腹腔内糖負荷試験とインスリン負荷試験によりLIT2遺伝子欠損マウスの耐糖能とインスリン感受性を検討した。野生型マウスでは、高脂肪食給餌により耐糖能異常やインスリン抵抗性が惹起されるが、LIT2遺伝子欠損マウスにおける耐糖能異常やインスリン抵抗性は野生型と比較して軽度であった。また、普通食、高脂肪食給餌下ともにLIT2遺伝子欠損マウスの肝臓における中性脂肪の含有量が野生型と比較して低下傾向にあった。4.高脂肪食給餌下において、摂食量に有為な差が認められないにもかかわらず、インスリン抵抗性や脂肪肝が野生型と比較して軽度であるというLIT2遺伝子欠損マウスの表現型は、LIT2が糖代謝制御や脂質代謝制御など摂食調節以外の作用に関連している可能性を示唆している。1.野生型マウスの組織(視床下部、肝臓、膵臓)におけるLIT2の発現を、リアルタイムPCR法を用いて検討した。LIT2は、肝臓において非常に強く発現しており、視床下部においては弱いながらもその発現を認めたが、膵臓ではほとんど発現が認められなかった。次に、LIT2に対する抗体を作製し、ウエスタンブロット法を用いてLIT2の発現を検討したところ、肝臓と視床下部において29kDaの位置にLIT2のバンドを認め、それらのバンドはLIT2遺伝子欠損マウスでは認められなかった。また、免疫染色法により肝臓と視床下部におけるLIT2の発現を検討したところ、肝臓では肝細胞に、視床下部では弓状核の神経細胞に、LIT2の発現を認め、それらの染色像はLIT2遺伝子欠損マウスでは認められなかった。また、LIT2遺伝子欠損マウスの脳における発生学的異常を肉眼的およびヘマトキシリン・エオジン染色により組織学的に検討したところ、異常は認められなかった。2.普通食給餌の野生型マウスとLIT2遺伝子欠損マウスにおいて、体重と摂食量を比較した。20週齢におけるLIT2遺伝子欠損マウスは、野生型マウスと比較し、体重が有意に減少していた。また、LIT2遺伝子欠損マウスは、皮下脂肪や内蔵脂肪(精巣上体脂肪)の重量が減少していたことより、LIT2遺伝子欠損マウスの体重減少は「痩せ」によるものであることが明らかとなった。さらに、1日あたりの摂食量がLIT2遺伝子欠損マウスでは、野生型マウスと比較し減少していたことより、LIT2遺伝子欠損マウスの「痩せ」の原因は、摂食量の低下による可能性が示唆された。3. LIT2遺伝子欠損マウスにおける糖代謝異常の有無を検討するため、腹腔内糖負荷試験とインスリン負荷試験を行ったところ、LIT2遺伝子欠損マウスは野生型マウスと比較し、耐糖能やインスリン感受性が増加していた。LIT2遺伝子欠損マウスは野生型マウスと比較して「痩せ」を呈し、その原因の1つは摂食量の低下によるものであるという結果を得た。また、LIT2遺伝子欠損マウスは野生型マウスと比較し、耐糖能やインスリン感受性が増加していた。本年度の研究実施計画中では脂質代謝異常の検討が残っており、来年度に遂行する予定である。

一方、次年度の実施計画である「レプチンの作用に対するLIT2の役割の検討」について、LIT2が視床下部の中でも弓状核の神経細胞に発現しているという結果や、ob/obマウスにレプチンを投与すると視床下部においてLIT2の発現誘導が認められるという結果を既に得ている。以上のことより、本年度の研究は、おおむね順調に進展していると考えられる。LIT2は、視床下部においてレプチンにより誘導される遺伝子として単離されたが、本年度の結果より、視床下部以外にも肝臓において強く発現していることが明らかとなった。また、LIT2遺伝子欠損マウスは「痩せ」と「インスリン感受性増加」という表現系を示した。LIT2遺伝子欠損マウスにおける摂食量の低下がそれらの表現系の原因である可能性が考えられるが、肝臓は糖代謝、脂質代謝において生体内で重要な作用を担っており、LIT2遺伝子欠損マウスの表現系の原因を解析する上で重要である。今後は、次年度の実施計画である「レプチンの作用に対するLIT2の役割の検討」を遂行するとともに、肝臓や、糖代謝・脂質代謝に関わるその他の臓器(骨格筋、脂肪組織、腎臓)におけるLIT2の作用にも焦点を当て、LIT2の発現やその役割について検討する。1. LIT2遺伝子欠損マウスの「痩せ」、「インスリン感受性増加」の原因の検討摂食促進ニューロペプチド(NPY、AgRPなど)や、摂食抑制ニューロペプチド(POMC、CARTなど)の発現量を、LIT2遺伝子欠損マウスの視床下部において検討する。また、血中や肝臓における中性脂肪や遊離脂肪酸の値を測定するとともに、脂質代謝に関連する遺伝子(脂質合成酵素など)や肝臓における脂質代謝に関わる転写因子(PGC-1αやPPARαなど)の発現量をLIT2遺伝子欠損マウスにおいて検討する。さらに、組織特異的なインスリン抵抗性の有無を明らかにするために、骨格筋、脂肪、肝臓におけるインスリン投与時の細胞内シグナルの活性化(インスリン受容体やAktのリン酸化など)を検討する。2.レプチンの作用に対するLIT2の役割の検討レプチンの摂食抑制に対するLIT2の役割を検討するために、普通食給餌の野生型マウスとLIT2遺伝子欠損マウスにレプチンを投与し、摂食量を測定する。また、視床下部におけるレプチンの細胞内シグナル伝達分子(STAT3、MAPK、PI3K、AMPKなど)の活性化を、野生型マウスとLIT2遺伝子欠損マウスで比較する。次に、摂食調節に関わるニューロペプチドの発現量を測定する。さらには、レプチン投与による血糖値や血清インスリン濃度、血中脂質の変動を野生型マウスとLIT2遺伝子欠損マウスで比較する。普通食給餌と高脂肪食給餌の野生型マウスの視床下部におけるLIT2の発現量を比較する。また、高脂肪食給餌の野生型マウスとLIT2遺伝子欠損マウスにレプチンを投与し、野生型マウスで起こるレプチン抵抗性がLIT2遺伝子欠損マウスでも起こるのかを検討する。
希土類ヒドリドクラスターを基盤とする多金属触媒

新規触媒の開発は様々な分野にインパクトを与える極めて重要な研究課題である。本研究では、希土類を基盤とする多金属触媒により、一酸化炭素からの選択的エチレン生成反応や、末端アルキンとイソシアニドの選択的クロスカップリング反応、イソプレンの位置・立体選択的重合反応などを開発した。また希土類とd-ブロック遷移金属を組み合わせた異種多金属錯体が水素の付加/脱離においてユニークな性質を示すことを見出した。本研究では、新しい構造を有する多核希土類ポリヒドリド錯体の合成とそれを用いる新反応の開拓を中心に、これまでにない新しい反応場の構築とそれを用いた新規触媒反応の開発を目指す。とくに従来の触媒では実現困難な新しい物質変換反応の開発を念頭に入れ、これまでほとんど研究されていなかった希土類多核ポリヒドリド錯体やそのカチオン・アニオン錯体、また特異な協奏機能が期待できる希土類とd.ブロック遷移金属を合わせもつ混合型多核ポリヒドリド錯体の合成などについて重点的に検討を行う。平成18年度はおもに希土類ポリヒドリド錯体と一酸化炭素との反応、およびポリヒドリドカチオン錯体の重合反応について検討した。希土類ポリヒドリドクラスターと一酸化炭素との反応ポリヒドリド錯体[(C_5Me_4SiMe_3)Y(μ-H)_2]_4(THF)は一酸化炭素と温和な条件化で反応して、短時間で混合物をほとんど生じずにエチレンを生成することを明らかにした。エチレンは、ポリエチレンやポリ塩化ビニルのような化学製品の前駆物質として広い用途をもつため、このプロセスの波及効果は大きいものと思われる。また反応機構に関する知見を得るため、低温下で一酸化炭素との反応を追跡したところ、いくつかの鍵となる中間体を検出した。以上の結果は、一酸化炭素(CO)と水素(H_2)を反応させて、液化炭化水素(人造石油)や酸素を含むその誘導体から成る混合物を生成する反応(フィッシャー・トロプシュ反応)の機構解明にも寄与するものと考えられる。ポリヒドリドカチオン錯体の重合反応ポリヒドリド錯体[(C_5Me_4SiMe_3)Y(μ-H)_2]_4(THF)と[Ph_3C][B(C_6F_5)_4]との反応によりカチオン性ヒドリド錯体[(C_5Me_4SiMe_3)_4Y_4(μ-H)_7(THF)][B(C_6F_5)_4]の合成および構造解析に成功した。これまで構造が明らかにされたカチオン性希土類ヒドリド錯体の例はなく今回が初めてである。このカチオン錯体は1,3-シクロヘキサジエンの位置選択的重合反応の触媒として作用し、選択的にシス1,4-ポリシクロヘキセンを与えることを明らかにした。これとは対照的に中性のポリヒドリド錯体と1,3-シクロヘキサジエンとの反応では重合活性は見られず、一分子のみ基質が錯体中に取り込まれるにとどまった。今回、このカチオン錯体を用いることによって1,3-シクロヘキサジエンのみならずスチレンに対しても立体選択的な重合反応が進行することが明らかとなった。単核ヒドリド錯体は実験および理論計算の両面から詳細に研究されているが、ヒドリドクラスターは全く合成例がない。Ln_3H_9やLn_4H_<12>などのヒドリドクラスターについて理論計算を行った結果、Ln_3H_9は環状の5配位構造がもっとも安定であり、希土類元素の5d軌道とヒドリドの1s軌道の寄与により芳香族性を有することが示唆された。また、Ln_4H_<12>は四面体構造がもっとも安定であった。Ln_3H_9やLn_4H_<12>は単核のLnH_3と比べ103-204Kcal/mol安定であり、これらの複核ヒドリドクラスターが存在しうることを予測される。また、金属ヒドリド結合へのアルケン挿入反応は,水素化反応や重合反応において重要な鍵反応であり、この反応機構に関する単核錯体の計算化学的研究は数多く行われているが,複数の金属に架橋したヒドリドを有する多核錯体に関してはほとんど行われていなかった。イットリウム錯体[(Me_3SiC_5Me_4)_4Y_4H_8]におけるY-H結合へのエチレン挿入反応に対する理論研究を行ったところ、架橋様式が異なる1つのμ4-H、1つのμ3-H、6つのμ2-Hの内、μ4-Hは4核構造の中心に位置しているためエチレン挿入反応には関与しない。ONIOM(B3LYP:HF)計算の結果、Y-(μ3-H)よりもY-(μ2-H)へのアルケン挿入の方が速度論的に有利であり、μ2-架橋エチル基が生成することが明らかになった。一方、希土類金属ポリヒドリド錯体とモリブデンヒドリド錯体を反応させることにより,d-f混合金属ヒドリド錯体の合成に成功した。

この錯体は、水素と可逆的に反応することが判明し、現在、実験および計算の両面からその詳細な反応機構について検討している。4核構造を有する希土類ポリヒドリドクラスターの中心に4つの金属と架橋した<μ4>_-Hが存在ずることをX線構造解析により明らかにしているが、X線では精度の点で問題があり、金属とヒドリドの結合長について議論することは困難だった。本年度は南カリフォルニア大学のロバートバウ教授との共同研究により、イットリウムポリヒドリド錯体の中性子回折を行い、ヒドリド配位子の精密な構造解析に成功した。これは<μ4>_-Hの配位様式を中性子回折によって明らかにした初めての例である。通常、二重、三重架橋と架橋数が増えるにつれて金属ヒドリド結合長は長くなる傾向があるが、このイットリウム錯体では四重架橋の結合長は三重架橋のものより短くなっており, 4核クラスターコア内の空間が比較的狭くなっていることを示している。また、希土類金属とd-ブロック遷移金属を有する異種金属ヒドリド錯体は,金属間の協同効果が期待される興味深い錯体であるが、これまでほとんど報告例がない。本年度は、ハーフサンドイッチ型ルテチウムジアルキル錯体Cp*Lu(CH_2SiMe_3)_2(THF)(Cp*=C_5Me_5)を出発原料として用い、ルテニウムトリヒドリドホスフィン錯体Cp*RuH_3(Pme_3)と反応させることにより、トリメチルホスフィン上の一つのメチル基でC-H結合活性化反応を伴って、対応するLu/Ru異種金属ジヒドリド錯体が得られることがわかった。このフォスフィノメチレンで架橋された2核錯体にフェニルシランを反応させると、このメチレン上で脱水素シリル化反応が起こることが明らかとなった。我々はC_5Me_4SiMe_3をもつハーフサンドイッチ型希土類ビスアルキル錯体[Cp'Ln(CH_2SiMe_3)_2(THF)](1 : Ln=Sc,Y, Lu, Cp'=C_5Me_4SiMe_3)を水素などのヒドリド源と反応させることにより、四核構造を持つポリヒドリドクラスター[Cp'Ln(μ-H)_2]_4(THF)(Ln=Y(2-Y), Lu(2-Lu))が合成可能であることを報告した。今年度は、「希土類ヒドリドクラスター2とカルボニル錯体との反応」、「希土類とd-ブロック金属を含む混合型多金属錯体の合成」、などについて詳細に検討した。2-Yと6、7族のカルボニル錯体との反応ではオキシカルベン錯体、オキシメチル錯体が得られた。一方、9族のカルボニル錯体との反応ではCO結合が切断されたメチルーオキソ錯体が得られた。これらの結果は、COの選択的な還元による炭化水素類の生成をもたらす新たな均一系触媒開発の手がかりを与えるものである。希土類金属とd-ブロック金属を組み合わせた混合型多金属錯体は、異なる金属が協奏的に作用することで同種の多金属錯体には見られない特異な反応性が期待される。ここでは錯体1をビルディングブロックとして用い、d-ブロック遷移金属ヒドリド錯体([Cp^*RuH_2]_2など)との反応により新たに混合型多金属ヒドリド錯体が合成できることを見出した。これらの結果は、錯体1は混合型多金属錯体の構築に有用な前駆体(ビルディングブロック)であることを示している。また、希土類側の活性化サイトであるアルキル基を残したままd-ブロック金属と希土類金属を結合させることにも成功した。
口腔癌におけるリンパ管新生抑制とリンパ節転移抑制のための基礎的研究

(1)頚部郭清術の手術材料から、リンパ節を分離しその細胞にVEGF-C及びVEGF-Dを加え、増殖してくる細胞の継代を繰り返し、これに各種培養口腔扁平上皮癌細胞株の培養上清を加えた。さらに、増殖してくる細胞の継代を繰り返し、VEGFR3とデスモプラキンをマーカーにして、培養リンパ管内皮細胞を樹立した。(2)培養リンパ管内皮細胞のVEGFR3の発現を免疫染色法、ウエスタンブロット法、PCR法で検出し、既存の血管内皮細胞とその発現量を比較した。さらに、この培養リンパ管内皮細胞に各種口腔扁平上皮癌細胞株(10種類)の無血清培養上清を加え、リンパ管内皮細胞のVEGFR3発現亢進をもたらす癌細胞株を検索した。(3)用いられた癌細胞株のVEGF-CとVEGF-DおよびVEGF、HGF、FGFの発現量をELISA法、PCR法およびノーザンプロット法にて比較し、リンパ管新生因子がVEGF-CやVEGF-Dであるか否かを検討した。(4)口腔扁平上皮癌細胞とリンパ管内皮細胞との親和性を両細胞の接着分子の発現から解析した。リンパ管内皮細胞上に癌細胞を播種し、種々の抗接着分子抗体を用いて、接着阻害を調べ、どの接着分子が重要であるかを解析した。(5)リンパ管内皮細胞の培養上清を遊走因子と仮定して、migration assayを行い、リンパ管に対する親和性を扁平上皮癌で検討した。リンパ管内皮細胞の培養系を確立し、口腔扁平上皮癌のリンパ管新生因子につて検討した。(1)頚部郭清術の手術材料から、患者の承諾書を得た上で、リンパ節を分離しその細胞を分散し培養した。培養細胞にVEGF-C及びVEGF-Dを加え、増殖してくる細胞の継代を繰り返した。また、このようなリンパ節細胞に各種培養口腔扁平上皮癌細胞株の培養上清を加え、増殖してくる細胞の継代を繰り返した。このようにしてリンパ節から、VEGFR3とデスモプラキンをマーカーにして、培養リンパ管内皮細胞の樹立した。また一方、既存の培養リンパ管内皮細胞様細胞を入手し培養した。この培養リンパ管内皮細胞に各種口腔扁平上皮癌細胞株(10種類)の無血清培養上清を加え、リンパ管内皮細胞のVEGFR3発現亢進をもたらす癌細胞株を検索した。その結果、この癌細胞株はリンパ管新生因子を産生していると考えられた。