hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
シグナル伝達から見た牛白血球粘着不全症(BLAD)の生体防御欠損機構の解析

本研究はウシ白血球粘着不全症(BLAD)を中心としたウシ遺伝性白血球機能障害の情報伝達から見た解析と、それを通じて好中球の殺菌能として重要なNADPHオキシダーゼの活性化機構を明らかにすることを目的とした。本研究で明らかに出来た事として、次のようなものである。第一に、正常好中球のNADPHオキシダー活性化と貧食機構に関してp38MAPキナーゼという最近発見された新しいキナーゼの関与を明らかにした。第二に、BLADの好中球はIgGや補体受容体刺激による活性酸素生成能は著しく低下しているが、その情報伝達系にPKCが関係するNADPHオキシダーゼ活性化システムの寄与が大きくなることを明らかにした。第三に、BLADに正常ウシの骨髄の移植を試みたところ、28ケ月に渡りCD18の好中球での発現が観察され、臨床的症状の改善が見られた。第四に、BLADの類似の好中球の活性酸素生成が欠損しているヒト慢性肉芽腫症(CGD)の細胞を用いた研究で、NADPHオキシダーゼコンポーネントであるp47phoxの部位特異的突然変異法を用いた詳細な研究で、p47phoxの11個のセリン残基のうち4つのセリン残基のリン酸化がNADPHオキシダーゼ活性化の引き金になることを明らかにした。第五に、この様な血球細胞からの活性酸素は生体系では、新生児期の様々な疾病、炎症、虚血時の傷害と深く結びついて考えられているが、その防護のために、活性酸素に曝された細胞をその後Troloxやカテキンなどの抗酸化剤で処理することにより、損傷が軽減出来ることを培養細胞とスナネズミの脳虚血モデルで見出した。以上のようなNADPHオキシダーゼ活性化機構をBLADならびにCGDからの細胞を用いることで明らかにすることが出来た。また、骨髄移植、欠損酵素のコンポーネントの発現、酸化傷害からの抗酸化剤による防護法など、将来への治療という点でも意義のある成果が上げられた。本年度は正常牛好中球のNADPHオキシダーゼ活性を評価するために、スーパーオキサイド(O_2-)の測定法を確立する。まず、直接生成したO_2-のラジカルとしての性質を利用して測定する方法として、電子スピン共鳴法(ESR)を適応した。O_2-を安定化しニトロオキサイドラジカルに特異的に変換させるための試薬として5,5-dimethyl-pyrroline N-oxide(DMPO)を用いた.牛好中球は、血清オプソニン化ザイモザン(OZ)あるいはホルボール(PMA)を用いてDMPO存在下で刺激した。刺激後、ESR測定を行ったところ、O_2-の生成を示すシグナルが得られた。しかし、この方法はO_2-の定量的測定には不向きであることが判明した。そこで、ルミノール用いた化学発光量による定量的測定法を用いて、OZあるいはPMAで正常好中球を刺激した時の、O_2-の生成量を評価した。更に情報伝達経路を評価するために各種キナーゼ阻害剤を用いて検討した。Cキナーゼ阻害剤としてGF109203Xを、MAPキナーゼ阻害剤としてPD98059、p38(HOG)の阻害剤としてSB203580、PI3キナーゼ阻害剤としてワ-トマニンを用いて評価した。PMAで刺激した際NADPHオキシダーゼの活性は、GF109203Xでほぼ完全に阻害された。

このことはCキナーゼが活性がPMA刺激の際には重要であることを意味している。またOZ刺激の際にはp38阻害剤、PI3キナーゼ阻害剤、Cキナーゼ阻害剤が効果が見られ、MAPキナーゼ阻害剤にはNADPHオキシダーゼの阻害効果は見いだされなかった。このことはOZ刺激の際にはCキナーゼ以外にもキナーゼの関与があると考えられる。来年度は、粘着不全症牛の好中球について検討し、オキシダーゼのコンポーネントであるp47phoxのリン酸化に着目して検討する予定である。本研究はウシ白血球粘着不全症(BLAD)を中心としたウシ遺伝性白血球機能障害の情報伝達から見た解析と、それを通じて好中球の殺菌能として重要なNADPHオキシダーゼの活性化機構を明らかにすることを目的とした。本研究で明らかに出来た事として、次のようなものである。第一に正常好中球のNADPHオキシダーゼ活性化と貧食機構に関してp38MAPキナーゼという、最近発見された新しいキナーゼの関与を明らかにした。第二にBLADの好中球はlgGや補体受容体刺激による活性酸素生成能は著しく低下しているが、その情報伝達系にRKCが関係するNADPHオキシダーゼ活性化システムの寄与が大きくなることを明らかにした。第三にBLADに正常ウシの骨髄の移植を試みたところ、28カ月にわたりCD18の好中球での発現が観察され、臨床的症状の改善が見られた。第四にBLADの類似の好中球の活性酸素生成が欠損しているヒト慢性肉芽腫症(CGD)の細胞を用いた研究で、NADPHオキシダーゼコンポーネントであるp47phox発現ベクターを発現させることでNADPHオキシダーゼ活性を回復させる事に成功した。またこのp47phoxの部位特異的突然変異法を用いた詳細な研究で、p47phoxの11個のセリン残基のうち4つのセリン残基のリン酸化がNADPHオキシダーゼ活性化の引き金になることを明らかにした。第五にこの様な血球細胞からの活性酸素は生体系では、新生児期のの様々な疾病、炎症、虚血時の傷害と深く結びついて考えられているが、その防護のために、活性酸素に曝された細胞をその後、Troloxやカテキンなどの抗酸化剤で処理することにより損傷が軽減出来ることを培養細胞系とスナネズミの脳虚血モデルで見いだした。以上のようなNADPHオキシダーゼ活性化機構をBLADならびにCGDからの細胞を用いることで明らかにすることができた。また骨髄移植、欠損酵素のコンポーネントの発現、酸化傷害からの抗酸化剤による防護法など、将来への治療という点でも意義のある成果が上げられた。
老人のQOLの規定する心理社会要因の日米比較

本研究は、老人の疾病を予防しQOLを高めるために老人の健康を規定する心理社会要因について、疫学調査で日米比較をしつつ検討することである。日本では研究代表者の鈴木らが、平成5年から群馬県のK村とI市の約1.15万人のコホート集団を設定し「こもいせ」調査として追跡中であり、米国では研究分担者のR.E.ロバート教授、G.A.カプラン教授、W.J.ストローブリッジ博士が1956年からのアラメダ郡調査を受け継いで追跡調査中である。これら2つの追跡調査の途中でそれぞれ中間調査を行う計画を2年にわたり検討した後、実行した。平成11年鈴木ほか4名がバークレイを訪問し、両者のこれまでの研究経過、研究地域/対象集団/方法、成果、問題点等について情報交換し、討論を重ねた。平成12年春にアラメダ郡追跡集団に実施した英語版調査票を検討し、予備調査を行い、22頁75項目の日本語版調査票を作成した。平成12年10月にカプラン教授、M.N.ハーン助教授を招いて研究の情報交換と調査票の検討を行った。この調査票に含まれる内容は、現在の健康状態、罹病歴、日常生活活動、喫煙、飲酒、家庭生活、社会活動などである。平成12年11月にI市7,500人、平成13年1月にK村4,500人を対象にこの調査票を配布回収し、単純集計の結果、多くの項目で差はなかったが、日本の群は米国と比べて比較的に、家族で固まって暮らし、ボランティアも運動もせず、親戚・友人・知人訪問などをせず、多く喫煙し、生き甲斐や健康度の表現がひかえめであることなどがみられた。平行して、閲覧許可を得て平成11年度のK村とI市コホート集団の死亡を採録し、累計で約550の死亡例を得た。がん死亡が4割を占める304の死亡例をコックスの比例ハザード解析した結果、中年者の死亡リスクを有意に高めている要因として、喫煙、やせ、30歳代の肥満、非婚、主観的不健康、運動不足などが確認された。本研究は、老人の疾病を予防しQOLを高めるためにそれらを規定する心理社会要因について、疫学調査で日米比較をしつつ検討することである。日本では研究代表者の鈴木らが、1993年から群馬県のK村とI市の約1.1万人のコーホート集団を設定し「こもいせ」追跡調査中であり、米国では研究分担者のテキサス大学ロバート教授、ミシガン大学カプラン教授、加州政府衛生部ストローブリッジ博士およびクラタ博士が1956年からのアラメダAlameda郡調査を受け継いで追跡調査中である。この2つの追跡調査の途中でそれぞれ中間調査を行い比較研究することを計画し、準備した。これまでの成果をまとめて冊子を作成し、スライド、OHPをつくった。これまでの出版物をまとめるとともに、学会発表をした。平成12年8月22-29日、鈴木ほか4名がバークレイを訪問し、両者のこれまでの研究経過、研究地域/対象集団/方法、成果、問題点等について情報交換し、討論を重ね、多大の成果を得た。2000年春にアラメダ郡追跡集団に実施した英語版調査票を検討し、取捨選択し日本語版調査票を作成した。

この調査票に含まれる内容は、現在の健康状態、罹病歴、日常生活活動、喫煙、飲酒、家庭生活、社会活動などである。数人に予備調査を行い、現地のK村とI市にその実施可能性について打診した。鈴木らによる1993年からの群馬県の11,565人のコホート追跡は1998-3-31〆で死亡304、生存11,151、不明110人であった。死因別には、がん120、心臓病56、脳卒中35、その他93であった。本研究は、老人の疾病を予防しQOLを高めるために老人の健康を規定する心理社会要因について、疫学調査で日米比較をしつつ検討することである。日本では研究代表者の鈴木らが、平成5年から群馬県のK村とI市の約1.15万人のコホート集団を設定し「こもいせ」調査として追跡中であり、米国では研究分担者のREロバート教授、GAカプラン教授、Wストローブリッジ博士が1956年からのアラメダ郡調査を受け継いで追跡調査中である。これら2つの追跡調査の途中でそれぞれ中間調査を行う計画を2年にわたり検討した後、実行した。平成11年鈴木ほか4名がバークレイを訪問し、両者のこれまでの研究経過、研究地域/対象集団/方法、成果、問題点等について情報交換し、討論を重ねた。平成12年春にアラメダ郡追跡集団に実施した英語版調査票を検討し、予備調査を行い、22頁75項目の日本語版調査票を作成した。平成12年10月にカプラン教授、MNハーン助教授を招いて研究の情報交換と調査票の検討を行った。平成12年11月にI市7500人、平成13年1月にK村4500人を対象にこの調査票を配布回収し、点検、修正、入力した。平成13年4月には単純集計の結果を出す予定である。並行して、閲覧許可を得て平成11年度のK村とI市コホート集団の死亡を採録し、累計で約550の死亡例を得た。がん死亡が4割を占める304の死亡例をコックスの比例ハザード解析した結果、中年者の死亡リスクを有意に高めている要因として、喫煙、やせ、30歳代の肥満、非婚、主観的不健康、運動不足などが確認された。
生活習慣病の病態発症における脂肪酸結合タンパク質の役割に関する研究

脂溶性物質は生体内においてエネルギー源や生理活性物質として重要な役割を演じている。本研究では細胞内において脂溶性物質の輸送を担う脂肪酸結合タンパク質(FABP3)に注目し、FABP3の生活習慣病の病態発症との関わりについて検討した。FABP3は脂肪酸取り込み、転写因子の活性調節には大きな影響を与えなかった。一方でFABP3はインスリン抵抗性の改善、およびエネルギー代謝に影響を与えることが示唆された。平成20年度研究実施計画に従い、培養細胞系を用いて脂肪酸結合タンパク質(FABP3)の1.脂肪酸取り込み対する関与、2.代謝系、核内受容体への影響、3.インスリン抵抗性への関与についての検討を行った。1.骨格筋における脂肪酸の取り込みへのFABP3の関与を調べるために、アデノウイルス発現系を用いてマウス筋芽細胞株であるC2C12細胞にFABP3を発現させ、蛍光ラベルした脂肪酸の取り込みについて検討した。その結果、FABP3の有無はC2C12細胞の脂肪酸の取り込みには影響を与えなかった。2. FABP3の脂肪酸合成、脂肪酸酸化などの代謝系への影響について検討するために、C2C12細胞にFABP3を発現させ、リアルタイムPCRを用いて代謝関連遺伝子の発現量を検討した。また、FABP3の核内受容体調節作用を検討するために、培養液に核内受容体PPARα、PPARδ、PPARγ、のリガンドを添加し標的遺伝子の発現誘導に関して検討した。その結果、FABP3の発現は代謝関連遺伝子の発現、核内受容体の標的遺伝子の発現誘導に大きな影響を与えなかった。3. FABP3のインスリン抵抗性への関与を検討した。分化させたC2C12細胞にパルミチン酸を添加しインスリン抵抗性を惹起した後、インスリン刺激を与え、インスリンシグナルに重要な働きをしているAktのリン酸化を検討した。その結果、FABP3の発現によってAktシグナルの回復が見られ、FABP3が骨格筋におけるインスリンシグナリングに関与している可能性が示唆された。以上の研究より、FABP3は脂肪酸の取り込みや核内受容体PPARα、PPARδ、PPARγの作用には大きな影響を与えないが、インスリンシグナルに関与していることが示唆された。平成20年度の実験結果、21年度の研究計画に従い以下の研究を行った。1.20年度の研究より、FABP3が骨格筋におけるインスリンシグナリングに関与していることが示唆された。そこで、FABP3のインスリンシグナルにおける作用メカニズムについて検討した。インスリンシグナルの関連分子に関してウエスタンブロッティングによって詳細に検討したところ、糖の輸送体であるGLUT4の機能発現に重要な役割を果たすAS160の発現量、リン酸化がFABP3の発現によって上昇することが示された。さらに、脂肪酸燃焼のキーファクターであるAMPKのリン酸化も有意に上昇していることが明らかとなった。2.FABP3の機能について検討するために、実施計画に従いFABP3と相互作用する分子の探索を行った。FABP3固定化カラム、およびGST-融合タンパク質によるpull downアッセイにより、FABP3と相互作用するタンパク質を取得し、LC/MS/MSによって同定した。いくつかの分子の同定に成功したが、シグナル等に直接関与する分子を検出することはできなかった。3.生活習慣病の病態発症におけるFABP3の機能を個体レベルで検討するために、FABP3発現アデノウイルスを動脈硬化のモデルマウスであるApoE欠損マウスの尾静脈よりインジェクションした。血中脂肪酸レベル、コレステロールに変化は認められなかったが、FABP3発現マウスは顕著な脂肪肝を示した。この結果よりFABP3は血中脂肪酸の取込みには直接関与していないことが示された。一方で細胞内の脂肪酸プールを上昇させることが示唆された。以上の研究から、FABP3が骨格筋における糖取り込み、脂肪酸燃焼に関与していることが示された。これらはこれまでに報告のない新規の知見であり、FABP3が生活習慣病予防・治療のターゲットとなる可能性が示された。
多糖誘導体モデルの分子鎖構造解析

本研究では、セルロース誘導体モデルとして化学修飾したオリゴ糖を用いて,核磁気共鳴(NMR)法や蛍光分光法などの分光学的手法と,コンピュータによる分子力場・動力学計算などの分子モデリングを組み合わせることにより,溶液中における分子鎖構造を明らかにすることを目的とし,以下の成果を得た。1,希薄溶液におけるセルロース誘導体の分子鎖構造分子鎖にナフチル基を有するセルロース誘導体NPeCの2糖モデルを用いて,分子力場計算を行った。48個の初期コンホメーションを選び出して,エネルギー極小化を行った。計算の結果,分子鎖構造として,通常言われている平面リボン構造の他に,捩れ構造も安定構造として得られた。蛍光測定の結果と併せると,捩れ構造は溶液中にかなりの分率で存在し,近接するナフチル基同士の会合解離が動的に生じていると考えられる。2,セルロース誘導体の液晶構造と分子鎖構造ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)の水溶液系液晶に無機塩を添加したときのコレステリック液晶構造の変化を検討した。コレステリック螺旋に起因する選択反射波長は,CL<Br<No_3<I<SCNの順に大きくなったが,これは水の構造を破壊するカオトロピックイオン効果の序列と傾向が一致した。更に,等方状態で塩添加による分子鎖構造の変化があるか,^<13>C NMR測定を行い検討した。グルコース環の各炭素の化学シフト値には殆ど変化がないことから,塩添加による液晶構造の変化は,分子鎖構造の変化より水の構造変化の寄与が大きいと考えられる。
並列アルゴリズム教育のための環境と教材の開発

本研究は、特に並列処理に有効なアルゴリズムの教育のためのアルゴリズムアニメーションシステムと、その上で稼働する教材の開発を目的として実施した。1.研究着手に当たり、現在までに開発されているアルゴリズムアニメーションシステムを、並列処理に限らず広く調査し、教育に利用するという観点から見直して分類を行った。2.並列アルゴリズムを対象にする場合には、実行系列が同時に複数個存在するために、動作状況が複雑となり、視覚的な情報だけでは状況を把握するのに無理が生じることがある。その対策として、聴覚、即ち音声情報もアニメーションの構成要素の一つと捉え、従来のグラフィカルライブラリに音声処理を加えたライブラリを提案、これを作成した。3.システムを構築するための言語系について考察し、より柔軟で、設計しやすい言語拡張手法を検討し、従来のオブジェクト指向プログラム言語であるC++言語に施した。4.教育への適用という観点からシステムの設計を行い、従来のアルゴリズムアニメーションシステムとは異なる、ユーザ(学生)が自主的に利用することを主眼にしたシステムと、教材を提示するシステム、さらに、教材を作成するシステムを統合した。5.本研究以前に当該研究者により作成されたシステムを併せ利用してアルゴリズムアニメーションを動作させ、実際に幾つかのアルゴリズム開発を行った。本研究は2年度にわたり実施する計画であり、本年度は、並列アルゴリズム・アニメーション・システムの調査及び設計、並列アルゴリズム・アニメーション・システムの作成、ならびに研究環境の整備を行う計画で着手した。並列アルゴリズム実現に際して、適切な可視化ツールを用いることにより、大量のデータを伴うシステムの動的な振る舞いが理解しやすくなる。中でも、効率の良い並列プログラムの作成が特に困難なタスクスケジュール問題では、プロセッサの状態、発生している通信遅延、処理中のタスクとそのタスクに関する依存情報などの理解が容易になるため、可視化ツールの効果が大きいと期待される。この考えに基づいて、タスク依存グラフを用いてスケジューリングを支援するシステムの構成について検討した。具体的なシステムとして、タスク依存グラフをdag(D irected Asyclic G raph)で表現し、それに基づいてタスクスケジューリングに関する諸情報、並びに、スケジュールのボルトネックとなる場所とその発生原因、またその解決方法を考える上で参考となる情報などを解りやすい形で提供し、それらを用いて対話しながらスケジューリングを行えるものを構築した(このシステムをDEPENDと名付けている)。この様な研究を遂行するための環境整備として、ワークステーションを1台新設、稼働させた。ワークステーションとしてはUNIマシンを選び、研究室に既存のネットワークとそれに接続されている他のワークステーションと必要に応じて組み合わせて動作させてより一層研究効果を高めるよう考慮した。
形成的フィードバックの外国語学習動機づけへの作用に関する実証研究

海外の自己調整学習に関する研究および応募者が昨年度に行った質的研究から、英語を苦手とする大学生学習者を動機づけ、自主的な学習に向かわせるためには、教師からの形成的フィードバックが有効に作用するのではないかという仮説を生成した。本年度はそのことを量的に実証するために必要な質問紙の開発を中心に研究を行った。第二言語習得や外国語教育分野において、自己調整学習理論の要素である自己効力感や動機づけ、方略などに関する尺度開発がいくつかなされているが、当理論の提唱者Zimmerman (2000, 2012)の「自己調整学習の3段階とプロセス」の循環性や相互作用性の考えに基づいた尺度は管見の限り見受けられない。上述の各要素に焦点を当てた尺度は、その要素を深く探ることは可能であるが、本研究では外国語学習研究分野において形成的フィードバックの研究が遅れていることを踏まえ、Zimmerman (2000, 2012)に基づき、自己調整学習の諸側面の状態、変化の把握を可能とする尺度を開発することとした。心理学の分野において、Toering, Elferink-Gemser, Jonker, van Heuvelenm and Visscher (2012)が自己調整学習の3段階プロセスを土台として開発した尺度を基に、外国語としての英語学習に対応する質問項目を作成した。探索的および確認的因子分析の結果、「自己効力感」「計画」「努力」「自己モニタリング」「評価・振り返り」という5因子が抽出された。英語力が中級レベルと初級レベルの学生2群間において、予測的妥当性を検討したところ、すべての因子項目において有意な差が確認された。よって、本研究で開発された尺度は信頼性および妥当性が一定程度確保されたものだと結論付けた。初年度に一部計画の変更が必要となったが、その後、概ね計画通りに遂行できているため。最終年度は、形成的フィードバックのある授業とない授業を実験群と統制群として設け、半期間の授業を実施し、本年度に開発した自己調整学習尺度を測定ツールとしてデータを収集する。自己調整学習理論の予見段階、遂行段階、省察段階ごとに分析を行い、どのような差異がどの段階で2群間に生じるかについて考察する。研究の総括として、英語を苦手とする学習者に対する形成的フィードバックの効用に関するモデル図を提示する。応募者の過去の研究より、英語に苦手意識をもつ大学生学習者のディモチベーションを除く、学習に向かわせるためには形成的フィードバックが有効であることが考えられた。形成的フィードバックの当該学習者への効果に関する実証研究はないため、平成29年度はその介入による現象を把握し仮説を見出すために、質的研究法によって分析を実施した。採用したのは新しい質的研究法として注目されているTEM(複線径路・等至性モデル)であった。実際の調査として、一つの英語科目の授業で半期間に渡り、形成的フィードバックを個々の学習者に定期的に提供する教育的介入を実施した。学習者の振り返りシートにおける文言およびインタビューを文字データに変換し、TEM図の作成によって現象の分析を行った。分析にあたっては、形成的フィードバックによって伸長するとされている自己調整学習の要素が表出するかに焦点を当てた。TEM図の作成により、自己調整学習ができるようになるまでの径路は、学期開始時点での英語の授業に対する姿勢(イメージ)と、その発達のスピードの2つの観点から3タイプに区分された。タイプ1.対英語授業姿勢柔軟的・自己調整学習漸次改善型、タイプ2.対英語授業姿勢固定的・自己調整学習漸次改善型、タイプ3.対英語授業姿勢固定的・自己調整学習遅延型である。また、自己調整学習の発達においては、学習者を取り巻く環境の要因も多分に影響していることも確認された。7名中3名の学習者がタイプ3に区分されたが、形成的フィードバックにより最終的には学期開始時には見られなかった調整を行いながら学習に臨むようになり、総合的にみると、英語が苦手な学習者の意欲喚起および学習に向かう姿勢の育成に形成的フィードバックが作用することを示す調査結果を得た。本調査においては、全国英語教育学会紀要第29巻に投稿し、採用された。研究計画と異なる運用となった部分が2点あった。1点目は29年度の担当科目により、予定の英語スピーキングスキルについてではなく、リーディングスキルについての調査となったことである。2点目は勤務校のカリキュラム改訂により、通年間において同じクラスを担当することがなくなったため、半期間でのデータ収集となったことである。しかしながら、本研究では、新しい質的分析法のTEMを採用したため、結果、扱えるデータ量として適当なものとなった。上記の2点を除いては、予定の学会発表および論文投稿(採用)も行ったので、総合的に「おおむね順調に進展ている」と考える。

上述の各要素に焦点を当てた尺度は、その要素を深く探ることは可能であるが、本研究では外国語学習研究分野において形成的フィードバックの研究が遅れていることを踏まえ、Zimmerman (2000, 2012)に基づき、自己調整学習の諸側面の状態、変化の把握を可能とする尺度を開発することとした。心理学の分野において、Toering, Elferink-Gemser, Jonker, van Heuvelenm and Visscher (2012)が自己調整学習の3段階プロセスを土台として開発した尺度を基に、外国語としての英語学習に対応する質問項目を作成した。探索的および確認的因子分析の結果、「自己効力感」「計画」「努力」「自己モニタリング」「評価・振り返り」という5因子が抽出された。英語力が中級レベルと初級レベルの学生2群間において、予測的妥当性を検討したところ、すべての因子項目において有意な差が確認された。よって、本研究で開発された尺度は信頼性および妥当性が一定程度確保されたものだと結論付けた。初年度に一部計画の変更が必要となったが、その後、概ね計画通りに遂行できているため。形成的フィードバックの英語に苦手意識を持つ学習者に対する効果に関する実証研究はないため、当初計画案では平成30年度に質的分析法を用いて、まずは現象の把握をする予定であったが、平成29年度にそれについてはある程度のデータを得たため、30年度は教育現場での実施可能性を探るための研究に発展させる。まず、形成的フィードバックの効果を測定するツールとして、英語学習版の自己調整学習尺度を開発する。近年、同じスキル科目に分類されることがある体育教育において盛んに開発が進んでおり、当該分野での研究成果をもとに開発に従事する。形成的フィードバックは学習者との頻繁な対話が必要とされるものであるが、実際の教育現場においては、個別にそのような時間を確保することは難しい。よって、実行可能性を探るべく、リフレクションシートを活用した教師とのインタラクションによる効果を検証する価値があると考える。振り返りシートなるものは、近年アクティブラーニングの潮流において広く導入されるようになったが、形成的フィードバックの観点から記述項目が指定されているものは少ない。本研究では、形成的フィードバックの観点からのリフレクションシートを導入し、学習者の自己調整学習における変化を捉えることとする。最終年度は、形成的フィードバックのある授業とない授業を実験群と統制群として設け、半期間の授業を実施し、本年度に開発した自己調整学習尺度を測定ツールとしてデータを収集する。自己調整学習理論の予見段階、遂行段階、省察段階ごとに分析を行い、どのような差異がどの段階で2群間に生じるかについて考察する。研究の総括として、英語を苦手とする学習者に対する形成的フィードバックの効用に関するモデル図を提示する。予定した物品購入について勤務先で貸借できるソフトや機器で対応でき、執行する必要がなかったため次年度使用額が生じた。平成30年度においては、当初予定外の統計分析を用いるため、そのソフトの購入や専門書購入に対する支出が必要である。繰り越し分はそれらに充当する予定である。
遺伝性ライソゾーム病における変異遺伝子発現機序の解析

ヒトのβ-ガラクトシダーゼ欠損を示す病気の中で、酵素自体の遺伝子変異の発現としてのGM_1ガングリオシドーンスとモルキオβ病は、それぞれ中枢神経系を含む全身病、遺伝性骨系統疾患としての臨床出得後を示す。我々はこれまでにβ程の異なった変異を同室したが、その細胞内発現の量、質共に多様であった。特に乳児型GM_1ガングリオシドーシスの日本人疾例には、同じ遺伝子型を示す疾例はなかった。しかもすベての変異において、発現産物に酵素活性を認めることができなかった。他の、相対的に、より軽疾である幼児型GM_1ガングリオシドーシス(日本人)、成人型GM_1ガングリオシドーシス(日本人)、モルキオβ病(日本人)のそれぞれに、共通の変異R201C、I51T,W273Lが見出された。これらの遺伝子発現産物の細胞内動態には、著しい違いがみらた。モルキオβ病日人疾例には、これまでのところ、共通の出身地、祖先らしい家系はみつかっていない。しかも最近、イタリアの乳児型GM_1ガングリオシドーシス疾例に、我々がモルキオβ病に見出したW4824変異が多いと報告された。我々はこれまで異なった表現型をとるβ-ガラクトシーダーゼ欠損疾として記載されてきたこれらの病気が、しつの遺伝子の異なった変異の結果生じた現象であること、そして同じ変異が、全く異なった表現型をとる疾例に共通に存在する場合があると結論し、このグループの病気をまとめてβ-ガラクトシドーシスと行うことを提唱した。
フレキシブルな概日ロバスト振動体の分子解剖と個体制御

本研究課題では、時計遺伝子の転写後制御や翻訳・翻訳後制御、さらには根源的な振動子となり得る細胞内レドックス変化など新しい細胞内イベントの日内変動を追究しようと計画した。この目的に沿った研究課題の一つとして、非光情報の伝達経路としてASKキナーゼが体内時計の周期や位相を制御する可能性を調べるため、時計タンパク質PER2とルシフェラーゼとの融合タンパク質を発現するPER2:: Lucノックインマウスを活用し、個々の細胞に内在する時計振動を可視化することを試みた。具体的には、ASKキナーゼの活性を変化させるような刺激がマウス胎児繊維芽細胞時計に与える効果を調べ、この効果が内在性ASKの欠損によって消失するか否かを確認しようと試みた。この目的の遂行には、当研究室が所有している生物発光測定装置をフル稼働しても、非常に数多くの実験条件における発光リズムを効率よく記録するためには実験とデータ解析が追いつかないことが判明した。そこで研究の効率的推進のため、研究計画書に記載した通り、本研究課題の採択直後に高感度生物発光測定装置(中立電機株式会社製)を購入して研究室に設置し、速やかに実験と解析を開始した。その結果、細胞内レドックス状態に応答して細胞リズムが大きく変化することを見出し、細胞内レドックスと概日時計の連関機構への手がかりを得た。29年度が最終年度であるため、記入しない。
肝細胞癌肝移植後のエベロリムス（Ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ）の再発予防効果の研究

肝細胞癌症例24例(ミラノ基準外4例)中1例は術後早期の感染症にて死亡し、23例を対象として研究を行った。23例中3例にエベロリムス(Ev)投与を行った。Ev投与群ではミラノ基準内1例、基準外2例であった。結果として、23例全例肝細胞癌の再発を認めることはなかった。また、血液学的所見では腫瘍マーカーも有意差を認めなかった。移植後の免疫細胞などでも有意差は認めず、免疫抑制効果も強くなると考えられなかった。たミラノ基準外症例が少なく再発には有意差を認めることはできなかった。ミラノ基準外症例にてEv投与を行っており、Ev効果があったことも考えられる。研究を今後も続行し再発の検討を行う予定である。肝細胞癌の肝移植後の再発は非常に大きな問題である。肝移植の場合、通常の肝細胞癌再発とは異なり、免疫抑制剤内服の影響により、腫瘍細胞の増大時間が異常に早く、また肝細胞癌に対する抗癌化学療法は、難治性であり、再発予防がきわめて重要であると考えられる。また、ミラノ基準を越えた肝細胞癌症例では、当施設での成績では術後の再発率が約34%であり、再発の危険性が高くなる。これまでの研究結果を踏まえ、肝細胞癌における再発リスクを抑える基準としてKyoto基準を提唱し、再発リスクの軽減に努めているが、ミラノ基準内でも再発する症例を認め、再発予防が非常に重要と考えられる。そこで、免疫抑制作用もあり、抗腫瘍効果もあるmTOR阻害剤であるエベロリムスによって、腫瘍細胞増殖や血管新生を抑制し、肝細胞癌の再発予防ができると考え、本研究を遂行しているものである。平成24年度には肝細胞癌に対して8例、平成25年度には5例の肝臓移植手術を行った。術後経過が良好な症例は10例認めており、現在外来にて経過順調である。また、すべての症例では進行肝癌症例ではなく、ミラノ基準を満たす症例であり、再発の危険性は非常に低いと考えられる。現在は外来での再発兆候を胸部腹部CTや、腫瘍マーカーで追跡中しており、再発は認めていない。さらに肝移植後、摘出肝病理組織検査において肝細胞癌の分化度、進行度、腫瘍径、個数などを評価し術後の再発因子を解析し、症例の積み重ねを行っているところである。また、これらの症例において、術後の安定期よりmTOR阻害剤の内服を開始しており、今後、外来にての再発の有無などの経過の追跡が必要である。また、基礎的研究として、ラットでの肝癌モデル作成に成功し、肝癌発生の機序、mTOT阻害剤の効果の有無の検討も同時に進行している状態である。平成24年度には肝細胞癌に対して5例の肝臓移植手術を行った。術後経過が良好な症例は3例認めており、現在外来にて経過順調である。さらに移植免疫学的なアプローチとして、移植後のCD4、CD8、CD25陽性T細胞や、制御性T細胞、CD20陽性B細胞、CD56陽性NK細胞などをflow cytometryで測定を行い、免疫学的な変化を観察している。また、これまでの研究成果などを学会などで研究報告も行っている。肝細胞癌の肝移植後における再発時期は、これまでの我々の研究から2年以内に再発を認める症例が大多数を占める。

このため、本研究では、肝移植後の術後早期からのエベロリムスの内服を開始し、エベロリムスの血中濃度をコントロールすることにより、移植後の拒絶反応を抑え、感染症に罹患しない至適濃度で行う。その後外来では3ヶ月ごとの頭部CT、胸腹部CT、骨シンチグラフィー等により再発の検索を行い、術後2年間経過観察することにより、再発の抑制効果を判定するものと考えている。結果として、平成24年度には成人肝移植18例を行い、そのうち肝細胞癌症例6例、ミラノ基準外症例はなく、平成25年度には32症例中肝細胞癌症例7例、ミラノ基準外症例2例、エベロリムス症例3例、平成26年度には22症例中肝細胞癌症例11例、ミラノ基準外症例2例、エベロリムス症例0例であった。肝細胞癌症例24例中23例が生存、外来にて経過観察中であり、現在、いずれの症例においても再発は認めていない。また、血液学的所見では、腫瘍マーカー(AFP,PIVKA-II)や、移植後の免疫細胞(CD4/8,B細胞,NK細胞)などにおいても、エベロリムス投与、非投与群では有意差は認めなかった。また、エベロリムス効果を見るためのVEGFなどのタンパク質発現も投与、非投与群のおいても明らかな有意差を認めなかった。しかし、投与群ではミラノ基準を逸脱しているにも関わらず、再発を認めていないため、癌再発抑制効果を伺わせる所見であった。その他の所見として、拒絶反応の発生頻度や、感染症の罹患率などにも有意差を認めることなく、安全性に関しても特に問題なく使用できると考えられる。また、同時に基礎研究として、エベロリムスの効果を検証するためにラットの肝癌移植モデルを確立し、癌再発抑制効果に関しても現在進行中である。肝臓移植、肝胆膵外科一昨年度は当院の規定により肝臓移植手術プログラムが一時的に中断していた時期があり、手術症例の積み重ねが思うように増加しなかった点が一番遅れているこのともあったが、現在肝移植プログラムも再開し、通常の肝移植手術を行っており、これまで13例の肝癌症例に対して肝移植術を行い、順調に症例を積み重ねている。これまでの症例に関しては症例の検討を行い、再発の危険性、さらに移植免疫学的なアプローチとして、移植後のCD4、CD8、CD25陽性T細胞や、制御性T細胞、CD20陽性B細胞、CD56陽性NK細胞などをflow cytometryで測定を行い、免疫学的な変化の観察などの解析を行ってきており、今後のさらなる症例の積み重ねが必要である。また、基礎的研究では、これまでの報告によると、rat HCCモデルにはNovikoff model(N)とMorris model(M)があり、Nは発癌率が低く肝内・肝外転移しない、またMはrat (Buffalo rat)が日本では入手不可能である。そのため、今回我々の研究では、Novikoff modelの発癌率を上げ、転移するモデルを作る必要があり、70% partial hepatectomyと15 minutes' warm ischemia (IR injury)を加えることで理想的なrat HCC modelを完成することができた。現在、部分肝切除およびIR injuryが実際どの経路を動かしているのかを解析中で、それが解明されれば、mTORiを投与することでその経路の抑制・亢進を調査している最中である。昨年度は当院の規定により肝臓移植手術プログラムが一時的に中断していた時期があり、手術症例の積み重ねが思うように増加しなかった点が一番遅れている原因である。
高齢者糖尿病における高血糖の是正が骨格筋に及ぼす影響に関する多面的検討

本研究は、高血糖がフレイル、サルコペニアの進展に関与しているという仮説のもと、1身体的フレイルを呈する高齢糖尿病患者を対象に、SGLT2阻害薬による高血糖の是正が、筋量、筋力、身体機能、下腿筋エコーによる筋質評価、神経伝達速度評価などに与える影響を検討、2ストレプトゾトシン(STZ)糖尿病モデルラットを用い、SGLT2阻害薬により炎症、筋内脂肪蓄積、AGE蓄積の減少などを介し、筋量減少、筋力低下が軽減するか否かを検討、することを目的としている。1に関して、2018年度に一度承認された臨床研究プロトコール(承認番号17250)で症例エントリーを開始したが、インスリン症例に限定していたこと、SGLT2阻害薬の使用が当初高齢者では慎重投与であったことから、プロトコール変更を余儀なくされたこと、さらに2018年度の臨床研究法改正による乗せ替えが必要となったことから手続きに時間を要した。最終的には少量のSU薬とグリニドとαグルコシダーゼ阻害薬の合剤との比較に変更となり、2018年12月に大阪大学倫理審査委員会の承認を受け(承認番号N18015:高齢糖尿病患者に対する食後高血糖改善がフレイル・サルコペニアの進展に及ぼす影響の多面的検討)、症例登録を開始した。2に関しては、ストレプトゾトシン(STZ)糖尿病ラットを用いた高血糖、SGLT2阻害薬を用いた高血糖是正による下肢筋への影響を検討するため、対照群(C)、対照+SGLT2阻害薬群(C+SG)、高血糖群(STZ)、STZ+SGLT2阻害薬群(STZ+SG)の4群間比較の検討を行った。検体回収までは終了しており、現在予定している実験を遂行中である。臨床研究:前年度に、介入に用いる薬剤をSGLT2阻害薬からαグルコシダーゼ阻害薬の合剤に変更したプロトコールが承認され、症例エントリーの準備が整ったことを報告したが、対象をインスリン症例に限定していたこと、臨床研究法改正による乗せ替えが必要となった。αグルコシダーゼ阻害薬の合剤による食後高血糖改善による骨格筋への効果を、少量のSU薬を対象として比較するプロトコールが最終的に承認された(2018年12月)。当初の予定よりやや遅れているが、現在3症例がエントリーしている。基礎研究:ストレプトゾトシン(STZ)糖尿病ラット(40mg/kg、1回腹腔内投与により作成)とSGLT2阻害薬を用い、高血糖の有無と血糖降下効果の有無による下腿筋への影響を検討した。8週齢の雄性SDラットを対照群(C)、対照+SGLT2阻害薬群(C+SG)、高血糖群(STZ)、STZ+SGLT2阻害薬群(STZ+SG)の4群に分け、STZ投与後高血糖を確認後4週間経過した後にSGLT2阻害薬の4週間経口投与を行い、17週齢時に各種臓器と両側下腿筋(ヒラメ筋、長指伸筋、腓腹筋、前脛骨筋)を採取した。下腿筋重量について、ヒラメ筋重量は4群間で差はなかったが、長指伸筋、前脛骨筋、腓腹筋はSTZ群でC群と比較し有意に重量が減少し、STZ群にみられた速筋群の重量減少はSGLT2阻害薬投与により部分的に改善を示した。以上からSGLT2阻害薬による高血糖是正により骨格筋重量の減少が抑制されたと考えられる。その機序として、既報からAGEの蓄積または脂肪蓄積による筋タンパク分解亢進、ミトコンドリア機能低下を想定し研究を進めている。臨床研究に関しては、平成30年度中に臨床研究法の改正による移行も終了し、現在3症例がエントリーしている。CRCも1名雇用できたことにより、対象症例の抽出と進行が行いやすくなったため、今後登録症例数の増加が期待できる。基礎研究に関しては、平成30年度から実働している大学院生を研究指導経験のあるスタッフが指導する体制が整った。1に関して、課題名「高齢糖尿病患者に対する食後高血糖改善がフレイル・サルコペニアの進展に及ぼす影響の多面的検討」で本学の倫理審査委員会の承認を得(承認番号17250、2018年1月12日承認)、2018年4月より患者エントリーを開始する。尚、当初予定していたSGLT2阻害薬を使用するプロトコールは、倫理審査委員会の審議により食後血糖を下げる治療に変更となっている。2に関しては、2017年度にSTZを用いた糖尿病モデルの構築、筋量減少、筋力低下を呈するかを確認するかを検討した結果、適切なSTZ投与量の決定、モデルとしての妥当性を確認できた。2018年はSGLT2阻害薬の有無による筋量減少、筋力低下への影響を検討する実験を実施する。臨床研究に関しては、初年度の目的として臨床研究のプロトコルについて本学倫理審査委員会から承認を得ることが第一であったが、それについては達成している。ただし、当初の研究計画で使用する予定であったSGLT2阻害薬については、対象としているフレイル症例が日本糖尿病学会が推奨するSGLT

2阻害薬の使用適応でないことから承認されず、食後血糖を効果させるグリニド薬とαグルコシダーゼ阻害薬の使用に変更することにより承認された。薬剤は異なるものの血糖降下による筋量・筋力低下の影響を見る点では同義であるため、承認されたプロトコルで研究を進める。基礎研究に関しては、本実験開始に際し、使用するモデルの妥当性検証(高血糖モデルにおいて対照群に比し有意に下肢筋量、筋サイズが低下)、一連の手技獲得、実験内容の実現性について確認することができており、本実験を開始する準備が整っている。以上から、概ね順調に進展しているとした。本研究は、高血糖がフレイル、サルコペニアの進展に関与しているという仮説のもと、1身体的フレイルを呈する高齢糖尿病患者を対象に、SGLT2阻害薬による高血糖の是正が、筋量、筋力、身体機能、下腿筋エコーによる筋質評価、神経伝達速度評価などに与える影響を検討、2ストレプトゾトシン(STZ)糖尿病モデルラットを用い、SGLT2阻害薬により炎症、筋内脂肪蓄積、AGE蓄積の減少などを介し、筋量減少、筋力低下が軽減するか否かを検討、することを目的としている。1に関して、2018年度に一度承認された臨床研究プロトコール(承認番号17250)で症例エントリーを開始したが、インスリン症例に限定していたこと、SGLT2阻害薬の使用が当初高齢者では慎重投与であったことから、プロトコール変更を余儀なくされたこと、さらに2018年度の臨床研究法改正による乗せ替えが必要となったことから手続きに時間を要した。最終的には少量のSU薬とグリニドとαグルコシダーゼ阻害薬の合剤との比較に変更となり、2018年12月に大阪大学倫理審査委員会の承認を受け(承認番号N18015:高齢糖尿病患者に対する食後高血糖改善がフレイル・サルコペニアの進展に及ぼす影響の多面的検討)、症例登録を開始した。2に関しては、ストレプトゾトシン(STZ)糖尿病ラットを用いた高血糖、SGLT2阻害薬を用いた高血糖是正による下肢筋への影響を検討するため、対照群(C)、対照+SGLT2阻害薬群(C+SG)、高血糖群(STZ)、STZ+SGLT2阻害薬群(STZ+SG)の4群間比較の検討を行った。検体回収までは終了しており、現在予定している実験を遂行中である。臨床研究:前年度に、介入に用いる薬剤をSGLT2阻害薬からαグルコシダーゼ阻害薬の合剤に変更したプロトコールが承認され、症例エントリーの準備が整ったことを報告したが、対象をインスリン症例に限定していたこと、臨床研究法改正による乗せ替えが必要となった。αグルコシダーゼ阻害薬の合剤による食後高血糖改善による骨格筋への効果を、少量のSU薬を対象として比較するプロトコールが最終的に承認された(2018年12月)。当初の予定よりやや遅れているが、現在3症例がエントリーしている。基礎研究:ストレプトゾトシン(STZ)糖尿病ラット(40mg/kg、1回腹腔内投与により作成)とSGLT2阻害薬を用い、高血糖の有無と血糖降下効果の有無による下腿筋への影響を検討した。8週齢の雄性SDラットを対照群(C)、対照+SGLT2阻害薬群(C+SG)、高血糖群(STZ)、STZ+SGLT2阻害薬群(STZ+SG)の4群に分け、STZ投与後高血糖を確認後4週間経過した後にSGLT2阻害薬の4週間経口投与を行い、17週齢時に各種臓器と両側下腿筋(ヒラメ筋、長指伸筋、腓腹筋、前脛骨筋)を採取した。下腿筋重量について、ヒラメ筋
ナメクジ脳における嗅覚記憶形成とアミノ性神経伝達物質による修飾作用の画像解析

.膜電位感受性蛍光色素(Di-4-ANEPPS)によりナメクジ単離脳を染色し、128×128フォトダイオードアレイを用いて光学測定を行った。嗅葉介在神経集団の同期的膜電位振動は、まず、神経突起領域で自発的にゆっくりと脱分極し、それに続いて細胞体層を外側から内側に向かって興奮の波が伝搬する事により生成される事がわかった。この膜電位振動の周波数は嗅覚受容器に対する匂い刺激により増加した。周波数の増加は神経突起領域における膜電位振動の過分極ピーク値と正の相関が認められた。これらの結果は、神経突起領域における過分極の程度が嗅葉全体の振動数を決定し、嗅覚入力による修飾もそこに作用することを示唆している。嗅覚神経束の電気刺激を行い、脳神経節内の嗅覚神経の興奮の伝搬を可視化する事に成功した。セロトニン、ドーパミン、グルタミン酸の及ぼす効果を調べたところ、、嗅葉神経突起領域における脱分極は、セロトニンおよびドーパミンにより増強され、グルタミン酸により抑制されることが解った。単離した嗅覚神経束の一端を電気刺激するとともに他端より誘発電位を記録し、上記伝達物質の効果を調べたところ同様の結果が得られた。これらの結果は、上記伝達物質が嗅覚神経に直接作用することにより嗅葉介在神経への入力を修飾する可能性を示唆している。3.嗅葉介在神経を単離培養し、上記伝達物質が細胞内Ca^<2+>濃度に及ぼす効果をFura-2を用いて調べた。介在神経にはセロトニンとドーパミンの両方に反応して細胞内Ca^<2+>濃度が増加する細胞とドーパミンのみに反応する細胞が存在することが分かった。グルタミン酸による細胞内Ca^<2+>濃度の有意な変化は認められなかった。以上の結果は、セロトニンおよびドーパミンは嗅覚神経(シナプス前神経)に作用するとともに、介在神経(シナプス後神経)にも作用することを示唆している。
Stem Cell Memory T細胞の創出と応用

腫瘍免疫療法ではいかに腫瘍特異的エフェクターT細胞を増やすかが問題である。しかしエフェクターT細胞は増殖しにくく死滅し易い。幹細胞様の性質を示すステムセルメモリーは(Tscm)はナイーブT細胞様の性質を持ち、かつ幹細胞のように長寿命で自己複製しつつエフェクターT細胞を急速に大量に産み出すことから強力な腫瘍免疫を惹起出来ると期待されている。これまでTscmはWnt阻害剤を用いてナイーブT細胞から誘導する方法が報告されていたものの、エフェクターT細胞やメモリーT細胞から誘導する方法は確立されていなかった。我々はストローマ細胞との共培養系においてNotchシグナルを強制的に加えることでエフェクターやメモリーT細胞をTscm様細胞(iTscm)に転換できることを発見した(Nature Commun. 2017; 8:15338)。またヒト末梢血T細胞をiTscm化する方法論も確立した(Cancer Sci. 2018; 109: 2130-2140)。この方法は新たな抗腫瘍免疫療法につながると期待される。このように本研究において従来にない新しい方法でエフェクターT細胞から一段分化が後戻りした形の長寿命の幹細胞様のT細胞を作製できることを見出した。iTscmの性質はNotchシグナルによって付与される。本研究によってiTscmは他のT細胞サブセットに比べて、ミトコンドリアが増加し、酸化的リン酸化能が非常に高いことが認められた。また中性脂肪の蓄積量も増加していた。今後はヒト腫瘍内浸潤細胞でも同様にiTscm化が可能かどうか検討する。免疫記憶は獲得免疫機構の根幹をなす機能である。その中心的役割を担うメモリーT細胞にはエフェクターメモリーT細胞(TEM)、セントラルメモリーT細胞(TCM)、レジデントメモリーT細胞などの集団が存在することがよく知られている。近年ヒトおよび霊長類において、新規メモリーT細胞集団であるステムセルメモリーT細胞(TSCM)が発見された。TSCMはナイーブT細胞マーカーを有するメモリーT細胞集団である。またTSCMは幹細胞性や長期生存能を有し、免疫記憶の根幹を担う重要なメモリーT細胞集団であると考えられている。しかしながらTSCMがどのようなメカニズムで誘導されるかはあまり明らかになっていなかった。我々はまずin vitroによりTSCM様細胞(iTSCM)を誘導する方法を確立した。CD4+およびCD8+活性化T細胞を抗原非存在下でNotchリガンドを発現するフィーダー細胞と共培養を行った。共培養の結果、一部の活性化T細胞はナイーブT細胞マーカーを示す細胞(iTSCM)へと分化した(図2)。私はこのiTSCMが抗原刺激により迅速に大量のエフェクター細胞を生み出すことができ、また生体内において長期生存能や自己複製能を示した。今年度はまずiTSCMの抗腫瘍効果を検討した。CD4+およびCD8+ iTSCMを担癌マウスに移入したところ、ナイーブT細胞やエフェクターT細胞、TCMに比べて有意に腫瘍の増大を抑制した。さらにCD4+およびCD8+ iTSCMを組み合わせて担癌マウスに移入した結果、より強い抗腫瘍効果を得られ、半数のマウスを寛解に導いた。またヒトT細胞からもiTSCMを作製することができた。これまでの成果はNature Communications誌に公表することができた。またヒトT細胞においてもNotchシグナルがiTSCMを誘導するか検討した。ヒト活性化T細胞を、Notchリガンドを発現するフィーダー細胞と共培養を行った結果、マウスと同様にiTSCMが誘導された。さらに健常人から採取した末梢メモリーT細胞はNotchリガンドを発現する細胞と共培養することで抗腫瘍効果を有する抗原特異的iTSCMへ転換することが観察された。これらの結果からNotchシグナルは活性化ヒトT細胞をより高い抗腫瘍活性を有するステムセルメモリーT細胞へリプログラムすることが示された。ステムセルメモリーT細胞(stem cell memory T cell: TSCM)は、ナイーブT細胞マーカーを有するメモリーT細胞で、自己複製能・長期生存能・幹細胞性を有し、抗原刺激によってセントラルメモリーT細胞(TCM)、エフェクターメモリーT細胞(TEM)に分化する能力を持つ。研究代表者らは試験管内で活性化したマウスおよびヒトのT細胞を、Notchシグナル分子を発現しているフィーダー細胞(OP9-DL1)と共培養することでTSCM様細胞(induced TSCM:iTSCM)へと誘導する方法を確立した(Nature Commun. 8: 2017, e15338)。iTSCMのマイクロアレイ解析を行い、既存のデータベースを参照したところ、iTSCMではATR, Aurora Kb, E2F, p73, FOXM1, Plk1シグナルが亢進していた。これらのシグナル経路のうち既報の論文を参照して、最も上流に存在し、かつ発現量の高いFOXM1に着目して研究をすすめる。iTSCM誘導時にFOXM1阻害剤であるThiostrepton処理を行うことでiTSCMの誘導効率を調べる。さらにレンチウイルスベクターによりFOXM1遺伝子を導入し、iTSCM誘導に及ぼす影響を調べる。同時にFOXM1を活性化する薬剤のスクリーニングを行う。またiTSCMは他のT細胞サブセットに比べて、ミトコンドリアに依存した酸化的リン酸化能が非常に高いことが認められた。今後、メタボローム解析によりiTSCMのエネルギー源を明らかにする。ITSCMの誘導方法を確立した。

さらにITSCMにおいてミトコンドリアを中心とした酸化的リン酸化経路が亢進しておりその中心となる候補遺伝子も同定できた。腫瘍免疫療法ではいかに腫瘍特異的エフェクターT細胞を増やすかが問題である。しかしエフェクターT細胞は増殖しにくく死滅し易い。幹細胞様の性質を示すステムセルメモリーは(Tscm)はナイーブT細胞様の性質を持ち、かつ幹細胞のように長寿命で自己複製しつつエフェクターT細胞を急速に大量に産み出すことから強力な腫瘍免疫を惹起出来ると期待されている。これまでTscmはWnt阻害剤を用いてナイーブT細胞から誘導する方法が報告されていたものの、エフェクターT細胞やメモリーT細胞から誘導する方法は確立されていなかった。我々はストローマ細胞との共培養系においてNotchシグナルを強制的に加えることでエフェクターやメモリーT細胞をTscm様細胞(iTscm)に転換できることを発見した(Nature Commun. 2017; 8:15338)。またヒト末梢血T細胞をiTscm化する方法論も確立した(Cancer Sci. 2018; 109: 2130-2140)。この方法は新たな抗腫瘍免疫療法につながると期待される。このように本研究において従来にない新しい方法でエフェクターT細胞から一段分化が後戻りした形の長寿命の幹細胞様のT細胞を作製できることを見出した。iTscmの性質はNotchシグナルによって付与される。本研究によってiTscmは他のT細胞サブセットに比べて、ミトコンドリアが増加し、酸化的リン酸化能が非常に高いことが認められた。また中性脂肪の蓄積量も増加していた。今後はヒト腫瘍内浸潤細胞でも同様にiTscm化が可能かどうか検討する。実際にヒト腫瘍内のT細胞からiTSCM細胞を作製し、対象となるがんを死滅させることができるか、が次の課題となる。すでにヒト化マウスを用いた実験ではヒトiTSCM細胞に強い抗腫瘍効果があることを確認している。また本方法はiPS細胞からT細胞を作製する方法にも適応することが可能である。さらに本研究は老化疲弊した細胞をある程度若返らせることに成功したとも言える。『細胞が若返る』という現象のメカニズムを明らかにできれば、体内で免疫システムを若返えらせることが可能になるかもしれない。さらにT細胞だけではなく神経細胞や生殖細胞など他種類の細胞も若返らせる方法の発見につながる可能性がある。iTSCM誘導の分子機構を明らかにし、iTSCMをフィーダー・フリーで効率よく誘導・作製する方法を確立する。さらにがん細胞に特異的なChimeric Antigen Receptorを発現させたT細胞(CAR-T)をiTSCM化することによって、CAR-iTSCMによるがん治療効果の強化を試みる。リプログラムのメカニズムを明らかにし細胞の脱分化や「若返り」の基本原理を明らかにする。さらに一旦エフェクターに分化したT細胞は再度分化誘導を行っても通常は制御生T細胞(Treg)にはならないことが知られている。