hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
身体負荷の異なる複数タスクの順序効果を考慮した負担評価法の開発

筋疲労モデルと平滑化手法を組み合わせることで、主観に近い作業負担感の反復作業による経時変化を示す方法を検討し、最適な平滑化法とその係数の検討を行った。この結果を踏まえて、これまでの成果を作業順序評価システムとしてとりまとめ、DHMへの実装を試みた。平滑化法としては指数平滑化が妥当であるが、係数は変更の可能性を残した。筋疲労モデルによる推定値は、テキスト出力することで他のシステムから利用可能にし、かつDHM内でもグラフ表示することで、タスク中の負担感の経時変化の観察を随時可能にした。タスク順序入れ替えの総合的な評価値としては、筋疲労モデルにおける疲労度の全体平均値、最終値、ピーク値などを求める。複数タスクの順序効果の検討については、指定された反復作業のタスク条件でタスクの順序を入れ替えた評価結果を出力可能とし、その順位付けを可能にした。妥当性を確認するため、モデル的に設定した複数タスクよりなる作業実験を行った。実際の利用場面を考慮し、短時間の複数のタスクを反復する作業を設定して行った。作業としては上肢のみを使用する動作の小さいタスク、上肢の上下動が大きいタスク、上肢と腰部を同時に使用するタスクの3種類を設定し、そのすべての順序の組み合わせで実験を行った。これを筋疲労モデルで解析したところ、時間的な累積効果がモデルではやや低めになることが判明したのでその補正項を追加し、良好な推定ができることを確認した。なお、複数タスクを繰り返す作業の実験データは、データ量が膨大になってその切り分けが困難になる。そのため、動作データの特徴量に基づく動作分割法の適用可能性の検討も合わせて行った。1)前傾の程度に違いのある複数の保持姿勢作業における負担評価の実験において、その順序を入れ替えた場合の腰部の負担の推移を検討した。評価は筋電図と主観と姿勢により行った。結果的に筋電図と姿勢(体幹前傾角)には明確な順序効果の影響はとらえられなかったため、主観を中心に評価することとした。主観は作業時間とともに経時的に増加する傾向があり、それが姿勢の種類を変えると一時的に軽減する傾向が明らかになった。その際、前傾が深く腰部への負荷が高い作業が持続したあとに前傾が浅く負荷が軽い作業が続くと特に大きな軽減効果が表れることが明らかになった。また、主観に基づく評価指標として、全体の平均負担度、経過中の負担度の最大値、最終の負担度の3つが、評価指標として利用できることが明らかになった。2)上記の負担の順序効果の影響を理論的に検討するため、生体力学モデルによるトルク比を用いた筋疲労モデルの適用可能性を検討した。これは本来2年度目に行う予定だったが、1の結果をより深く理解するため、考察の過程検討を追加することにした。3)作業種類を変えた場合の繰り返し持ち上げ姿勢での負担評価実験として、前屈持ち上げ、中腰持ち上げ、腕持ち上げの3種類の持ち上げ姿勢の影響を調べた。いずれの作業も部位に応じた主観的負担感の増加が明確にとらえられたが、持ち上げ動作による作業の回数やトルクの累積負荷に応じた負担感の増加に加え、単に時間的に増加する負担成分があることも明らかになった。予定通り、順序効果の実験による検討が行えたので、おおむね目的は達成されたとみなしている。評価指標としては、今回は実験リスクも考慮して筋活動としては軽負荷の作業としため、姿勢や筋電図には明確な傾向は現れなかった。特に筋電図は、長時間実験になると、たとえば脊柱起立筋だと背部を湾曲して筋活動が低下しやすい作業姿勢を選択するといった様子が確認され、筋電図評価が困難であった。また、単に実験の経過時間が延びることによる負担感・疲労感の増加の影響が予想よりも大きかった。今後はそれを考慮したモデル化と実験が必要と考えている。1)まず、任意の動作で作業による負荷で生じる筋疲労を定量的に求めることができるモデルを発展させ、反復動作の負担評価の定式化を試みた。ここで利用した筋疲労モデルでは、筋運動単位を活動分、疲労分、非活動分の3要素とみなし、その構成が筋活動と休息により増減するとみなす。反復動作の評価は、筋の疲労成分の増減をそのまま利用する方法と、疲労していない成分に対する筋活動成分を用いる方法がある。文献的に得られる筋疲労モデルのパラメータをによると、筋の疲労成分の回復にかかる時間は極めて長く、そのままでは一時的な休憩による筋疲労の回復を表現できない。逆に、疲労していない成分に対する筋活動成分を使用すると、筋活動の低い休憩時には疲労度がすぐに低下してしまい、通常、休息時に徐々に回復する疲労感のパターンとも一致しない。そこで本研究では、後者に対して時間的に平滑化する方法を利用することにした。平滑化の方法としては、単純な移動平均法と指数平滑化法を比較検討した。2)平滑化を利用した反復疲労の推定モデルに実測データを当てはめ、その適用条件や平滑化パラメータの検討を行った。実測データは、座位、中腰、腕持ち上げの3種類の作業の反復と短時間の休憩の挿入をいくつかの組み合わせで行い、その間の主観的な負担感を上肢・腰部・下肢で記録した。評価に使用する関節については、肩・肘・腰部・股・膝の各関節の使用の可否を検討した。

その結果、関節としては肩関節・腰関節・股関節がそれぞれ評価に適すること、平滑化法については、移動平均よりも指数平滑化法のほうが逐次的に評価値を計算できる利点があり、かつ主観的な負担感と高い一致性を示すことが示された。当初予定していた二値化による順序効果定式化の研究はすすまなかった。しかし、二値化による評価と筋疲労モデルによる評価は相互に補間する方法で、本年度の研究により筋疲労モデルによる評価を任意の繰り返し条件で利用できるよう拡張できたので、二値化による評価法をより広くカバーできる可能性がでた。そのため、その検討を優先した。また、次年度の妥当性検証の研究をスピードアップするため、反復作業実験データ解析のためのデータ分割法の研究も展開できた。そのため、本年度の研究の遅れはほぼないとみなし、かつ次年度は予定通り進めることができると予想している。筋疲労モデルと平滑化手法を組み合わせることで、主観に近い作業負担感の反復作業による経時変化を示す方法を検討し、最適な平滑化法とその係数の検討を行った。この結果を踏まえて、これまでの成果を作業順序評価システムとしてとりまとめ、DHMへの実装を試みた。平滑化法としては指数平滑化が妥当であるが、係数は変更の可能性を残した。筋疲労モデルによる推定値は、テキスト出力することで他のシステムから利用可能にし、かつDHM内でもグラフ表示することで、タスク中の負担感の経時変化の観察を随時可能にした。タスク順序入れ替えの総合的な評価値としては、筋疲労モデルにおける疲労度の全体平均値、最終値、ピーク値などを求める。複数タスクの順序効果の検討については、指定された反復作業のタスク条件でタスクの順序を入れ替えた評価結果を出力可能とし、その順位付けを可能にした。妥当性を確認するため、モデル的に設定した複数タスクよりなる作業実験を行った。実際の利用場面を考慮し、短時間の複数のタスクを反復する作業を設定して行った。作業としては上肢のみを使用する動作の小さいタスク、上肢の上下動が大きいタスク、上肢と腰部を同時に使用するタスクの3種類を設定し、そのすべての順序の組み合わせで実験を行った。これを筋疲労モデルで解析したところ、時間的な累積効果がモデルではやや低めになることが判明したのでその補正項を追加し、良好な推定ができることを確認した。なお、複数タスクを繰り返す作業の実験データは、データ量が膨大になってその切り分けが困難になる。そのため、動作データの特徴量に基づく動作分割法の適用可能性の検討も合わせて行った。予定通り次年度は、タスク順序効果を評価する手続きの定式化を行う.1)負荷量データの筋疲労モデルによる定式化の検討:ある筋活動のタスクによって蓄積した疲労の回復には,そのタスクの筋活動度とその持続時間に応じた回復時間が必要である.つまり,高い負荷が持続的に長い時間継続されるほど負担度は高くなり,いかに高負荷作業と低負荷作業を分散して組み合わせるかが重要である.ただし,極端に負荷の異なる作業を頻繁に切り替えることは現実的ではないし,高反復動作による負担も増大してしまう.これらの現象をモデル化する方法として、筋疲労モデルがある。単純なものは筋の疲労蓄積を指数関数近似するもので、これはデータをローパスフィルタにかけるものに相当する。もう少し複雑なモデルとして疲労と回復の要素を別な係数で増減させる線形微分方程式で表記できるものもある。これらのモデルを参考に、順序効果が検討できる筋疲労モデルと定式化を行う。
海岸段丘の形成に関する営力論的研究

1.離水した緩傾斜の海食台が波食を受けてどのように変形し,どんな地形が形成されるのかを室内実験により調べた.平面造波水槽中に模型岩石で緩斜面を作り,これに実験波を作用させて海食台を形成させた.実験では砕波後の波が初期地形(原地形)に作用し,海食台が作られたが汀線アングルは海面より多少高い所に位置し,海面下に急崖を形成するようなプロセスは全く観察されず,芽根・吉川(1986)が提案しているような段丘形成モデルは実験的に説明することは困難であることがわかった.2.完新世の岩石海岸段丘の形成を記載する数学的モデルを作製した.連続した海面上昇後に生じた間欠的な地盤の隆起によって形成される段丘の幅は次式で示される.3.上述のモデルを使用して,離水年代の不明な段丘の年代を地形(段丘の縦断面形)から推定しようとする一つの試みが行われた.ニュージランドのワイララパ地域プケムリ川地点には7段の段丘が発達しており, I, VVII段は離水年代が既知である.これらのデータをキャリブレーション用に使用して, II, III, IV段の離水年代を推定した結果,それぞれ6000, 5300, 4300YB.P.という値が得られた.1.離水した緩傾斜の海食台が波食を受けてどのように変形し,どんな地形が形成されるのかを室内実験により調べた.平面造波水槽中に模型岩石で緩斜面を作り,これに実験波を作用させて海食台を形成させた.実験では砕波後の波が初期地形(原地形)に作用し,海食台が作られたが汀線アングルは海面より多少高い所に位置し,海面下に急崖を形成するようなプロセスは全く観察されず,芽根・吉川(1986)が提案しているような段丘形成モデルは実験的に説明することは困難であることがわかった.2.完新世の岩石海岸段丘の形成を記載する数学的モデルを作製した.連続した海面上昇後に生じた間欠的な地盤の隆起によって形成される段丘の幅は次式で示される.3.上述のモデルを使用して,離水年代の不明な段丘の年代を地形(段丘の縦断面形)から推定しようとする一つの試みが行われた.ニュージランドのワイララパ地域プケムリ川地点には7段の段丘が発達しており, I, VVII段は離水年代が既知である.これらのデータをキャリブレーション用に使用して, II, III, IV段の離水年代を推定した結果,それぞれ6000, 5300, 4300YB.P.という値が得られた.緩斜面の海底が隆起した場合を想定し、二次元造波水路中に模型岩石で緩斜面を作り、これに実験波を作用させて海蝕台を形成させ、汀線アングルを明らかにすることを第一の目的とした。実験では砕波後の波が初期地形(原地形)に作用し、海蝕台が形成されたが汀線アングルは海面は近、あるいはそれより多少高い所にあり、海面下に急崖を形成するようなプロセスは全く観察されず、茅根・吉川(1986)が提案しているような段丘形成モデルは営力論的立場から説明することは因難であることが判明した。襲来波浪のエネルギーレベルの場所的差異が少ないと考えられる房総半島南端において、幅広い海岸段丘が発達する地点の代表として平磯地区、段丘の発達がほとんどみられない地点の代表として布良地区を選んでそれぞれの地区の構成岩石の力学的諸性質を調査した。岩石試料はいずれも現海面付近から新鮮なものを採取した。圧縮強度(【S_c】)と引張強度(【S_t】)は次のようであった。平磯の【S_c】は111Kgf/【cm^2】,【S_t】は16kgf/【cm^2】で、布良の【S_c】は65kgf/【cm^2】,【S_t】は9kgf/【cm^2】で,【S_c】,【S_t】ともに平磯の方が倍ぐらい強度が大きいことがわかった。このことは、波のエネルギーと岩石強度との相対的な値以外の要因が段丘の形成に大きく寄与していることを示している。この点の解明は62年度の研究に待ちたい。
母乳中におけるスフィンゴリピドアクチベ-タ-蛋白の研究

スフィンゴリピドアクチベ-タ-蛋白(SAP)は、3種類(SAPー1,ー2,ー3)知られており、それぞれの異常によるスフィンゴリピド-シスも明らかとなっている。最近、3種のうちSAPー1,ー2が同じプレカ-サ-から由来することがDNAレベルより明らかにされた。今回我々は、母乳中にプレカ-サ-を含む種々の分子量のSAPが存在することを見いだした。SAPの精製は、搾乳により得られた凍結母乳1.5lを85°C10分間熱処理後、遠心上清を得た。上清より80%硫安分画を得、10mMリン酸緩衝液(pH6.0)に透析後、DAEA Sephaーrose、acid precipitation,chromatofocusingにより精製した。SAP分画は4ーMUーβーglucosidaseの活性化にてモニタ-した。一部TSKーGel、Cosmosil(5C4ー300)カラムにて分析した。母乳中より部分精製したSAPは、4ーMUーβーglucoーsidase,Galceraseを活性化させた。各々の活性化の程度は、至適界面活性剤を用いた測定値のそれぞれ10%,3.5%,4.6%であった。ゲル濾過にて分子量は、25000,等電点はpH4.4にピ-クを持っていた。SDS電気泳動にては分子量14,400に主なる蛋白バンドを認めたが、このバンドはSAPー1,ー2の抗体にては染色されず、αーラクトアルブミンと考えられ、SAPとαーラクトアルブミンがcopurifyされると考えられた。SAPー1の抗体染色では分子量75K,27K,17K以下に、SAPー2では17K以上ではSAPー1と同様のパタ-ンを示し、17K以下ではSAPー1と異なったパタ-ンを示した。逆相カラムでの分析では、acetonitrile54%で蛋白ピ-ク(αーラクトアルブミン)を認め、SAPも溶出された。またαーラクトアルブミン自体にも4MUーβーglucosidaseの活性化作用があることが判明した。我々の研究にて母乳中にこのプレカ-サ-を含むさまざまな分子量のSAPが分泌されていることが判明した。またSAPがαーラクトアルブミンとcopurifyされることも明らかとなった。さらに17K以下ではさまざまなバンドが認められるため、糖鎖の違いによるのかを検討する必要がある。SAPはリソゾ-ムでの局在が判明しているが、一方微量ではあるが母乳中に分泌されていることが明らかとなり、またSAPー1の抗体を用いた直腸の染色においても上皮腺腔内にも染色されることから、この蛋白の細胞内プロセッシング、生理的意義を考える上でも興味深いと思われた。SAPはリソゾ-

ムでの局在が判明しているが、一方微量ではあるが母乳中に分泌されていることが明らかとなり、またSAPー1の抗体を用いた直腸の染色においても上皮腺腔内にも染色されることから、この蛋白の細胞内プロセッシング、生理的意義を考える上でも興味深いと思われた。
微小試験片による高温機械構造用鋼の経年劣化評価

本研究では,蒸気タービンロータとして15.8年使用されたNi-Cr-Mo-V鋼を供試材とした。蒸気タービンロータのメタル温度は部位によって異なる。メタル温度が60°C,268°C,441°C,538°Cの部位より標準サイズ試験片及び1/10サイズ試験片を採取・加工し,計装化シャルピー衝撃試験を行い,延性-脆性遷移曲線を求め,延性-脆性遷移温度(DBTT)及び上部棚温度域吸収エネルギー(USE)により経年劣化度を評価した。ミクロ組織の観察は光学顕微鏡,SEMにより行った。炭化物の解析はEDAX装置付きのSTEMを用いて行った。得られた知見を以下にまとめる。1.1/10サイズ試験片により経年劣化の評価が可能であることがわかった。2.DBTTはメタル温度の増加とともに増加し,441°Cで最大値となり,538°Cでは低下する。一方,USEはメタル温度の増加とともに減少し,441°Cで最小値となり,538°Cでは増加する。これらの結果より,メタル温度441°Cの試料で最大の脆化が生じていることが分かった。3.本供試材には,Fe&CrリッチなM_<23>C_6型,Fe&MoリッチなM_6C型,Mo&VリッチなM_2C型の3種類の炭化物が存在する。4.メタル温度の増加とともに結晶粒界に析出した炭化物は粗大化し,それがDBTTの増加とUSEの減少をもたらす。5.538°Cの試料では,粗大化した結晶粒界炭化物の数が減少し,M_2C型の微細な炭化物の粒内への均一な析出が観察され,それがDBTTの低下とUSEの増加をもたらしたものと推定される。
水晶体上皮細胞の増殖・分化調節

水晶体上皮細胞は、高細胞密度培養系では、外来性の信号なしに生存可能であるが、外来性の信号が無い場合増殖もしなければ水晶体繊維への分化も始めない(Ishizaki et al.J.Cell Biol.121:899-908,1993)。塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を与えると上皮細胞は増殖を開始するがやがて分裂を終了し水晶体繊維への分化を開始する。水晶体上皮細胞が分裂を終了し分化を開始する機構は現在のところ全く不明である。本研究では、水晶体上皮細胞の分裂回数には上限があり、それに到達するともはや増殖刺激が存在しても分裂はせず水晶体繊維への最終分化を開始するのではないか、さらにこの分裂回数の上限の決定にはサイクリン依存性キナーゼ(Cdk)阻害因子が関与しているのではないか、という作業仮説を立てこれを検証することを目的とした。水晶体上皮細胞を高濃度のbFGFで処理すると、増殖が促進されるとともに水晶体繊維への分化を開始すること、この時に核内にCdk阻害因子の一つであるp27/Kip1が蓄積してくることが明らかになった。一方、水晶体上皮細胞を低濃度のbFGF及びインスリン様増殖因子-1(IGF-1)で処理すると初めは盛んに増殖するが一定期間を経ると分裂を終了してしまうこと、また増殖に伴って核内にp27/Kip1が蓄積してくることが明らかになったが、この場合には、増殖を停止しても水晶体繊維への分化開始は全く認められなかった。以上より水晶体上皮細胞の分裂回数には上限があることが示唆されたが、予想に反して分裂を停止した場合直ちに水晶体繊維への分化が開始されるのでは無いことが明らかになった。今後は水晶体上皮細胞から水晶体繊維への分化開始機構の解明を目指す研究を展開していきたい。水晶体上皮細胞は、高密度培養系では、外来性の信号なしに生存可能であるが、外来性の信号が無い場合増殖もしなければ水晶体繊維への分化も始めない(Ishizaki et al.J.Cell Biol.121:899-908,1993)。塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を与えると上皮細胞は増殖を開始するがある一定期間を経ると分裂を終了し水晶体繊維への分化を開始する。本研究では、水晶体上皮細胞の分裂回数には上限があり、それに到達するともはや増殖刺激が存在しても分裂はせず水晶体繊維への最終分化を開始するのではないか、さらにこの分裂回数の上限の決定にはサイクリン依存性キナーゼ(Cdk)阻害因子が関与しているのではないか、という作業仮説を立てこれを検証することを目的としている。水晶体上皮細胞をbFGFで処理すると、初めは盛んに増殖するがやがて増殖を停止し水晶体繊維への分化を開始すること、この時に核内にCdk阻害因子の一つであるp27/Kiplが蓄積してくることが明らかになった。一方、水晶体上皮細胞をインスリン様増殖因子-1(IGF-1)で処理すると初めは盛んに増殖するが一定期間を経ると分裂を終了してしまうこと、また増殖に伴って核内にp27/Kiplが蓄積してくることが明らかになったが、この場合には、増殖を停止しても水晶体繊維への分化開始は全く認められなかった。現在p27/Kiplが蓄積してくる機構及び水晶体繊維への分化開始機構を検討中である。

水晶体上皮細胞は、高細胞密度培養系では、外来性の信号なしに生存可能であるが、外来性の信号が無い場合増殖もしなければ水晶体繊維への分化も始めない(Ishizaki et al.J.Cell Biol.121:899-908,1993)。塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を与えると上皮細胞は増殖を開始するがやがて分裂を終了し水晶体繊維への分化を開始する。水晶体上皮細胞が分裂を終了し分化を開始する機構は現在のところ全く不明である。本研究では、水晶体上皮細胞の分裂回数には上限があり、それに到達するともはや増殖刺激が存在しても分裂はせず水晶体繊維への最終分化を開始するのではないか、さらにこの分裂回数の上限の決定にはサイクリン依存性キナーゼ(Cdk)阻害因子が関与しているのではないか、という作業仮説を立てこれを検証することを目的とした。平成12年度の研究では水晶体上皮細胞をbFGFで処理する際、bFGFの濃度によって細胞の応答性に違いがあることが明らかになった。すなわち比較的低濃度では細胞の増殖が促進されるが水晶体繊維への分化は誘導されないのに対して、より高濃度では増殖のみならず水晶体繊維への分化が促進されることが明らかになった。比較的低濃度のbFGF存在下では細胞が増殖を停止しても水晶体繊維への分化は認められなかった。すなわち低濃度のbFGFに対しては水晶体上皮細胞はIGF-1に対するのと同様の応答を示すことが明らかになった。以上より水晶体繊維への分化は水晶体上皮細胞の増殖停止に伴って自動的に開始されるものでは無く、更なる因子の関与を必要とするものであることが明らかになった。
歯根膜感覚を伝達する三叉神経節ニューロンの、機能と中枢投射の様態との関連の解明(免疫電顕法、電顕的定量解析法と電気生理学的手法を用いて)

歯根膜からの感覚情報は、顎運動の制御に重要な役割を果たしている。本研究では、ネコを用いた動物実験により三叉神経節由来の歯根膜求心性線維を電気生理学的に同定し、その機能と形態との関連を、軸索内染色法、電子顕微鏡による観察、免疫電顕法などを用いて分析した。また、咀嚼運動の制御の観点から、咀嚼に関連する運動ニューロン(三叉顔面、舌下神経運動ニューロン)の樹状突起形態から推定できる電気的特性を求めた。三叉神経節由来の歯根膜求心性線維は、その機能から速順応性と遅順応性に分類された。horseradish peroxidase(HRP)で軸索内染色すると、速順応性の歯根膜求心性線維の軸索終末は、三叉神経吻側核の吻背内側部と背内側部に認められた。電子顕微鏡で観察すると、速順応性の軸索瘤は、明瞭な円形のシナプス小包を含み、樹状突起とシナプス前性にハナプスを形成していた。また、多形性のシナプス小包を含む軸索終末(P-ending)とシナプス後性に接合しているものの数多く認められた。P-endingは、標識された軸索終末がシナプスを作る樹状突起としばしば軸索-樹状突起接合をしていた。遅順応性の軸索瘤も同様の所見を示したが、P-endingとシナプスを作る比率が速順応性と異なっていた。また、咀嚼に関連する運動ニューロンの樹状突起形態から推定できる電気的特性は、その樹状突起の形態が大きく異なるにも関わらず、ほぼ同様の傾向を示した。これらの成果及び関連する成果を、解剖学会、歯科基礎医学会、北米神経科学会などの学会、及び、The Journal of Comparative Neurologyなどの学術雑誌で公表した。ネコを用いた実験により、速順応性と遅順応性を弁別した歯根膜求心性線維をHRPで軸索内染色した。下位三叉神経感覚核(中間核及び尾側核)内で標識された歯根膜求心性線維終末の軸索瘤を確認した後、電子顕微鏡試料を作製した。エポン包埋された切片を光学顕微鏡で観察すると、歯根膜求心性線維終末の軸索瘤は、下位三叉神経感覚核内に比較的密に局在した。遅順応性の歯根膜求心性線維の同定は困難であり、10年度で同定されたものはわずか一例であった。11年度では、遅順応性歯根膜求心性線維の試料の作製、観察、分析に重点を置く予定である。歯根膜求心性線維終末軸索瘤の染色性が良好で、比較的密に存在する標本を選び出し、電子顕微鏡にて観察した。エポン包埋された切片から歯根膜求心性線維終末軸索瘤の密に存在する部分を切り出し、ウルトクミクロトームで約70nmの連続切片を作製し、終末が作るシナプスの連続写真を撮影した。この連続写真をイメージスキャナーにてコンピュータに取り込み、解析ソフト(NIH Image)にて、軸索瘤の体積、active zoneの面積及びその二次元的形態、シナプス小胞の体積、ミトコンドリアの体積などを定量的に解析した。11年度は、免疫電顕法を用いて、歯根膜求心性線維終末が受けているシナプス前終末に、抑制性神系伝達物質と考えられているグリシン、GABAが存在しているか、検出を試みる。また、すでに明らかになっているほかのニューロンのデータと比較し、得られた研究成果を学会及び学術雑誌に発表する。

本研究計画では、動物実験により三叉神経節由来の歯根膜求心性線維を電気生理学的に同定し、その機能と形態との関連を、軸索内染色法、電子顕微鏡による観察、免疫電顕法などを用いて分析した。三叉神経節由来の歯根膜求心性線維は、その機能から速順応性と遅順応性に分類された。horseradish peroxidase(HRP)で軸索内染色すると、三叉神経感覚核群にその軸索瘤が認められた。電子顕微鏡で観察すると、遅順応性の軸索瘤は、明瞭な円形のシナプス小包を含み、樹状突起とシナプス前性にシナプスを形成していた。また、多形性のシナプス小包を含む軸索終末(P-ending)とシナプス後性に接合しているものの数多く認められた。P-endingは、標識された軸索終末がシナプスを作る樹状突起としばしば軸索-樹状突起接合をしていた。速順応性の軸策流も同様の所見を示したが、P-endingとシナプスを作る比率が遅順応性と異なっていた。また、三叉神経主感覚核、吻側核、中間核、尾側核において、シナプスの構成は異なっていた。軸策-軸策シナプスを形成する軸索終末には、グリシン、GABAなどの抑制性神経伝達物質が認められた。これらの成果及び関連する成果を、解剖学会、歯科基礎医学会、北米神経科学会などの学会、及び、The Journal of Comparative Neurologyなどの学術雑誌に公表した。
ゼブラフィッシュ精原幹細胞の増殖因子の単離とその培養系の確立

平成18年度において、肥大化した精巣を用いてA型精原細胞が3ヶ月維持できる培養条件を見出した。そこで、19年度はこの培養条件をもとに、正常な精巣のA型精原細胞の培養を試み、培養初期の植え継ぎ条件を変えることで培養が可能であることを示すことができた。次に、精原細胞を精子まで分化させるセルトリ細胞株ZtA6-12を用いて、このA型精原細胞の分化能を調べた。2ヶ月間培養した後、ZtA6-12株をフィーダーとして培養したところ、精子の頭部と同じ大きさの頭部を持つ精子様細胞が分化した。しかし、この精子様細胞に運動能は認められず、人工授精によっても受精卵を得ることができなかった。現在、減数分裂過程が正常に進行しているか、顕微授精によって受精卵が得られるかを検討しているところである。また、精巣内でのA型精原細胞の細胞周期を知る目的で、BrdUの取込みによる解析や、DNA複製のpre-replicative complex構成要素Sld5抗体を用いた解析を行なった。その結果、これまで均質と考えられていたゼブラフィッシュA型精原細胞に異なる3つのサブグループが存在することがわかった。そこで、ブサルファンにより増殖中の生殖細胞に損傷を与え、その精巣が精子形成を回復する過程で、これらのA型精原細胞の動態を調べた。その結果、それらがdormant stem cell, potential stem cell,分化型精原細胞に対応することが示された。今後、培養系や細胞移植系を用いてこれらの幹細胞としての特性を検証していく予定である。ゼブラフィッシュの新規セルトリ細胞株ZtA6-6はフォルスコリン存在下で魚類の精原幹細胞とされるA型精原細胞を1ヶ月維持する。本課題では、この培養系を足がかりに長期にわたりゼブラフィッシュ精原幹細胞を増殖させる培養系の確立を目的とした。すでにマウスでは精原幹細胞の増殖にglialcell line-derived neurotrophic factor (GDNF)が必須であり、繊維芽細胞増殖因子(bFGF)、上皮増殖因子(EGF)、インスリン様増殖因子(IGF)も有効であることが報告されている。そこでこれらの因子がA型精原細胞の増殖に与える役割を解析するために、ゼブラフィッシュの相同遺伝子を単離して組換えタンパク質を作製した。GDNFが作製できた段階で、vasプロモーターにより緑色蛍光タンパク(GFP)を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュから肥大化した精巣が見つかったため、この精巣の細胞を解離してGDNFおよび市販の哺乳類の増殖因子を添加した培養液で培養を試みた。その結果、セルトリ細胞株を用いなくても、解離した精巣体細胞が培養ディッシュに接着して、それがフィーダーとなりA型精原細胞が安定して増殖することが認められた。精原細胞のマーカーのvasを発現し続けていたこと、ゼブラフィッシュで精原幹細胞から精子までが1ヶ月以内であることを考えると、幹細胞の増殖は起こっていたことが示唆される。しかし、3か月を過ぎた段階で急速に増殖しなくなり、継代できなくなってしまった。培養の間に体細胞の形態的変化が認められ、幹細胞を維持する体細胞の性質が変わってしまったことが増殖しなくなった原因として考えられる。現在、精原幹細胞を維持し続ける体細胞のスクリーニングを進めているところである。
シナプス可塑性時のグルタミン酸受容体動態解析

学習と記憶の細胞レベルの基盤現象であるシナプス可塑性の一型である長期抑圧の発現機構を、私たちが開発した新実験手法で調べた。海馬領域の興奮性シナプスで起こる長期抑圧はシナプス後部のAMPA型グルタミン酸受容体数の減少により起こり、その主因は受容体のエンドサイトーシスによる細胞内への取り込みの増強と考えられていた。私たちは、AMPA受容体を蛍光タンパク質で標識し、培養した海馬神経細胞でその個々のエンドサイトーシスとエキソサイトーシスを高いシグナル・ノイズ比と高時空間分解能で可視化する手法を開発し、長期抑圧発現にはAMPA型受容体のエキソサイトーシスの減少が重要であることを明らかにした。pH依存性蛍光タンパク質SEPと全反射顕微鏡を用いた実験系に、細胞外液を急速に交換できるU管システムを組み合わせることにより、培養海馬神経細胞のシナプス後部内外でAMPA型グルタミン酸受容体の個々のエンドサイトーシスを記録する方法を確立した。そして、定常時のAMPA受容体のエンドサイトーシスがクラスリンおよびダイナミンに依存しないことを見出した。つぎに、記憶・学習の細胞レベルの基盤現象の一つである長期抑圧の発現に際しての、AMPA受容体の変化を調べた。NMDAを投与することにより、長期抑圧を引き起こしたところ、NMDA投与直後にクラスリンおよびダイナミン依存性のAMPA受容体エンドサイトシスの頻度が増大することが明らかになった。しかしながら、AMPA受容体のエンドサイトーシスの頻度増加は一過性であった。一方で、NMDA投与後のシナプス後部内外でのAMPA受容体量の正確な測定も行った。その結果、長期抑圧に際して、AMPA受容体はシナプス内外で5ー10分間かけて減少することが明らかになった。長期抑圧はAMPA受容体のエンドサイトーシス増強だけでは、説明できない可能性が生じたため、AMPA受容体のエキソサイトーシス変化も調べたところ、NMDA投与により、AMPA型受容体のエキソサイトーシス頻度が減少するという結果が得られた。長期抑圧時におけるAMPA型グルタミン酸受容体のエキソサイトーシスおよびエンドサイトーシス変化を記録することができた。また、長期抑圧発現時のシナプス後部内外でのAMPA受容体を定量することもできた。以上のように、研究は順調に進展している。なかでも、長期増強時にAMPA受容体のエキソサイトーシスが抑えられるという知見は、これまでの通説と異なる重要な結果と考えている。シナプス可塑性のうち海馬興奮性シナプスで起こる長期抑圧に注目し、長期抑圧発現時のシナプス内外でのAMPA型グルタミン酸受容体の動態を明らかにすることをめざした。シナプス内外で個々のAMPA受容体エンドサイトーシスを可視化する手法を確立し、長期抑圧発現時のAMPA受容体エンドサイトーシス変化をエキソサイトーシス変化と共に調べた。具体的には、AMPA受容体のGluA1サブユイットにpH感受性蛍光タンパク質SEPを融合した分子の動態を調べ、長期抑圧発現時にはクラスリン・ダイナミン依存性のエンドサイトーシス頻度が、シナプス後部周辺で一過的に増加するが、その後頻度は減少することが分かった。また、エキソサイトーシス頻度は長期抑圧発現時にゆくっりと減少することも判明した。このエキソサイトーシス頻度の減少は、長期抑圧発現時の細胞膜上のAMPA受容体数減少と同期していたことから、長期抑圧は主にAMPA受容体エキソサイトーシスの抑制により発現すると推定した。この結果は、長期抑圧はAMPA受容体のエンドサイトーシス促進によって引き起こされるという通説と異なり、長期抑圧発現の分子機構に関する重要な新知見と考えている。また、長期抑圧発現時のトランスフェリン受容体のエンドサイトーシス・エキソサイトーシス変化は、AMPA受容体に関する変化と異なることも明らかにした。GluA1以外のAMPA受容体サブユニットであるGluA2、GluA3の動態および、GluA1-3のうち複数のサブユニットを共発現させた場合の、各AMPA受容体サブユニット動態についてもデータを収集して解析を行いつつある。海馬神経細胞シナプスでの長期抑圧発現に、AMPA型グルタミン酸受容体のエンドサイトーシス促進ではなく、エキソサイトーシス抑制が大きな寄与をするという意外性の高い仮設を示唆する結果が得られたことは大きな進展と考えている。海馬領域の興奮性シナプスで起こるシナプス可塑性の一つである長期抑圧の発現に際してのAMPA型グルタミン酸受容体の動態の解析を行ってきた。平成28年度までは、AMPA受容体のサブユニットの一つであるGluA1にpH依存性蛍光色素であるSEPを融合した分子(GluA1-SEP)を海馬神経細胞に発現させて、ガラス面直上に形成させたシナプス後膜様構造(PSLM)内外で、AMPA受容体動態を全反射顕微鏡を用いて室温でライブイメージングした。その結果、NMDAという薬剤の投与によって長期抑圧を引き起こすと、GluA1-SEPが持続的に減少すること、NMDA投与開始当初にGluA1-SEPのエキソサイトーシス・エンドサイトーシスは一過的に増加するが、その後は両者ともに減弱することがわかった。これらの成果は、長期抑圧がAMPA受容体のエンドサイトーシスの増強によってではなく、エキソサイトーシスの減弱によることを示している。平成29年度の研究では、室温で観察された現象が生体温に近い34度でも認められることを確認した。また、PSLMで観察された現象が通常のシナプスでも起こっていることを斜光照明法により確認した。

さらに、GluA1とは異なるAMPA受容体サブユニットであるGluA2にSEPを融合した分子(GluA2-SEP)を用いた実験を行い、GluA2-SEPはGluA1-SEPとは異なり、NMDA投与直後のエンドサイトーシス・エキソサイトーシス増加がほとんど認められないこと、細胞表面上のGluA2-SEP量はGluA1-SEPとは異なり、NMDA投与終了後に回復傾向を示すことが明らかになった。これらの結果は、長期抑圧発現に際して、AMPA受容体はサブタイプ特異的に制御されることを示している。こうした成果をまとめて論文投稿した。現在、改定版が査読中の状況である。学習と記憶の細胞レベルの基盤現象であるシナプス可塑性の一型である長期抑圧の発現機構を、私たちが開発した新実験手法で調べた。海馬領域の興奮性シナプスで起こる長期抑圧はシナプス後部のAMPA型グルタミン酸受容体数の減少により起こり、その主因は受容体のエンドサイトーシスによる細胞内への取り込みの増強と考えられていた。私たちは、AMPA受容体を蛍光タンパク質で標識し、培養した海馬神経細胞でその個々のエンドサイトーシスとエキソサイトーシスを高いシグナル・ノイズ比と高時空間分解能で可視化する手法を開発し、長期抑圧発現にはAMPA型受容体のエキソサイトーシスの減少が重要であることを明らかにした。研究は順調に進んでいるので、平成28年度はAMPA受容体の各サブタイプの長期抑圧時の変化を定量的に明らかにして、論文発表することをめざす。意外性の高い興味深い知見が得られているので、必要なコントロール実験等を行い、通説とは異なる新知見を論文公表することをめざす。また、AMPA型グルタミン酸受容体のGluA2、GluA3サブユニットに関する実験も行い、GluA1ホモ4量体、GluA1/GluA2およびGluA2/GluA3ヘテロ4量体の長期抑圧発現時の動態を明らかにする。29年度が最終年度であるため、記入しない。神経科学29年度が最終年度であるため、記入しない。
脳血管内皮細胞による選択的透過機能発現とその調節

「血液・脳関門(BBB)の選択的物質透過性を担う構造体は何か、血管内皮細胞なのか、アストロサイトなのか」についての研究は乏しい。当該研究者らは、これまでアストロサイトの増殖・分化機構の研究を進めるなかで、アストロサイトは隣接する細胞の性質を直接接触あるいは液性因子を介して変化させることを見いだした。BBB構造に於いても、アストロサイトとの接触が生体内にひろく存在する内皮細胞の物質透過性に特異性を付与するものと考えられる。そこで本研究はアストロサイトと内皮細胞を二重層に培養したBBBモデルを調整し、その選択的透過性の機構を明らかにすることを目的に研究を進めた。1、アストロサイト、内皮細胞の調整:アストロサイトはラット大脳よりタイプ1アストロサイトを、申請者(加藤)の開発した方法に従い、初代培養(1週間)から2次培養(5日間)したものを用いた。血管内皮細胞はウシの大動脈および大脳皮質より、コラゲナーゼ処理後、ナイロンメッシュに通して内皮細胞を単離培養した。とりわけウシ大脳皮質の内皮細胞は、収率は良くないが実験に供することができた。2、BBBモデルの設計:交付申請者の方法にしたがって調整した二重層培養系をセットした。電顕的には二重層培養した内皮細胞に特異的にBBB固有のタイトジャンクションが観察された。3、物質透過性実験:二重層培養系での物質透過性を動力学的解析は、複雑になるため二重培養系チャンパーを用いて内皮細胞をアストロサイトを分離した培養系を用いて透過性を検討した。とりあえずL-Glucoseを用いた結果では、大脳皮質由来内皮細胞に特異的透過性が認められた。
同所性部分肝移植の研究

肝移植においてdonor及びrecipientの両者を同時に長期生存させることを目的として、犬を用い同所性部分肝移植の研究を行った。1.donorの肝広範切除・肝動脈同時遮断の病態とCoenzymeQ_<10>(CoQ_<10>)の効果:部分肝移植の肝動脈吻合には肝移植片の動脈として総肝動脈を用いるため、donorの肝移植片採取時に残存肝に流入する肝動脈を遮断して肝移植片に総肝動脈をつけて滴出し検討した。ペニシリン投与下でdonor犬が長期生存可能か否かを主としてfree radicalの立場からみると、70%肝切除・肝動脈同時遮断の4週生存率は43%で肝障害を高度に認めたが、これにCoQ_<10>投与を行うと4週生存率88%と有意に向上し肝障害も軽微であった。電磁血流計で測定した残存肝の血流量は門脈単独支配にもかかわらず相対的に増加し、また残存肝組織や血漿中過酸化脂質量はCoQ_<10>の投与で著しく減少しており、このモデルは部分肝移植ドナーとして用いることが可能であった。2.同所性全肝移植:部分肝移植の対照として送血ポンプによる静脈静脈バイパスを用い検討した結果、手術死はなく10頭中7頭が3日以上生存し術中術後輸液量や肝保存などの手技においても満足すべき成績が得られた。3.同所性部分肝移植:15頭のレシピエント中3日以上生存したものが3頭あり、他の12頭は48時間以内に死亡したが、動脈吻合部の血栓例は少なく、術中術後管理は各種モニターに従って十分管理することが可能であった。3日以上生存例中2頭は拒絶反応にて死亡したが、これら部分肝移植後の肝機能は同所性全肝移植後の肝機能の推移と同様24時間後に回復傾向を示した。以上より、living donorから得られる部分肝移植片は新鮮で、移植後の肝機能の推移は全肝移植後のそれと大差なく、手術手技の改善と強力な免疫抑制剤の使用により、長期生存が可能である。今後は部分肝移植片の移植容量の限界を検討する必要がある。肝移植においてdonor及びrecipientの両者を同時に長期生存させることを目的として、犬を用い同所性部分肝移植を行うが初年度は以下の基礎的検討を行った。1.donorの肝広範切除・肝動脈同時遮断の病態とCoenzyme【Q_(10)】(Co【Q_(10)】)の効果:部分肝移植の肝動脈吻合には肝移植片の動脈として総肝動脈を用いるため、donorの肝移植片採取時に残存肝に流入する肝動脈を同時に遮断して肝移植片に総肝動脈をつけて摘出検討した。ペニシリン投与下でdonor犬が長期生存可能か否かを主としてfree radicalの立場からみると、70%肝切除・肝動脈同時遮断の4週以上生存率は42.9%で肝障害を高度に認めたが、これにCo【Q_(10)】投与すると4週以上生存率が80%以上と有意に向上し、かつ肝障害も軽微で肝の形態並びに機能的再生は良好であった。電磁血流計で測定した残存肝の血流量は門脈単独支配にもかかわらず相対的に増加していた。

残存肝組織や血漿中過酸化脂質量はCo【Q_(10)】で著しく減少し、残存肝機能障害は軽減して長期生存可能となり、このモデルは部分肝移植ドナーとして用いることが可能となった。2.同所性全肝移植:部分肝移植のコントロールとして全肝移植の検討を行った。recipientの肝全摘後、下大静脈や門脈うっ血に対処するべく、これらの血液を頚静脈に返血する静脈静脈バイパスを送血ポンプ(ヘパリン非使用)を用いて施行した結果、全例術後24時間以上の生存が得られ、術死はなく、また肝移植片の灌流保存や術中術後の輸液管理、血行動態の安定化に対しても満足すべき成績が得られた。以上の成績に基づいて、次年度からの部分肝移植における手術手技の確立、術中術後管理法の充実をはかるとともに、移植肝の機能や免疫能についても検討を加えていく所存である。肝臓移植における手術手技や術中後管理はその成否を左右する極めて重要な役割を担っており,初年度(61年)はドナー,レシピエントの両者が共に生存するための移植片採取の工夫を行い, 62年度はその研究を更に継続し,最終年度(63年)に行う部分肝移植のコントロールとして送血ポンプを用いた同所性全肝移植を行い,手術手技や術中術後管理法などを検討した.1.ドナーの肝広範切除・肝動脈同時遮断の病態とCoenzymeQ_<10>(CoQ_<10>)投与の効果:部分肝移植の肝動脈吻合には肝移植片の動脈として総肝動脈を用いるため,肝移植片採取時に残存肝に流入する肝動脈を同時に遮断して肝移植片に総肝動脈をつけて摘出し検討した.ペニシリン投与下でかつCoQ_<10>を投与すると70%肝切除・肝動脈同時遮断の4週以上生存率は80%以上を示し, CoQ_<10>非投与の43%より有意に高く,肝障害は軽度で良好な肝再生を示した.残存肝組織中や血漿中過酸化脂質はCoQ_<10>で抑制され,門脈単独支配である残存肝血流量は相対的に増加していた.CoQ_<10>投与により肝障害は軽減され長期生存が可能で,部分肝移植ドナーのモデルとして利用できると考えられた.2.同所性全肝移植:部分肝移植のコントロールとして,また移植手技やその管理を基本的に習得する目的で検討を行った.レシピエントの肝全摘後,下大静脈や門脈のうっ血を解除すべく,静脈静脈バイパスを作成し送血ポンプを用いてこれらの血液を頚静脈に送血した結果,全例24時間以上の生存が得られ,また肝移植片のprecoolingや保存,血行動態や凝固線溶系機能を中心とした術中術後管理も満足すべきものであった.すなわち,移植後肝血流量は一度増加し数時間後に減少して,これがcritical level以下になると肝不全で死亡しており,血流再開後のnon reflow現象が指摘されるとともに,術中術後の輸液量は肝広範切徐の場合と異なりその58倍の量が適正である等,最終年度に必要な成績が得られた.肝臓移植における手術手技や術中術後管理はその成否を左右する極めて重要な役割を担っており、本研究では特に同所性部分肝移植を行うため移植肝機能の保存のみならず移植後の肝再生が良好に営まれるように全身状態の管理と手術手技の工夫が必要となる。そこで初年度(61年)はドナー、レシピエントの両者が共に生存するための移植片採取の工夫を行い、62年度はその研究を更に継続し、脂質過酸化反応を中心として移植片となる70%領域の肝機能温存について検討し、ペニシリン投与下でかつCoenzyme Q_<10>を投与すると移植片となる70%領域の肝組織中過酸化脂質は動脈遮断下でも抑制され、肝障害は軽度で移植片として有用であることが示された。そこで最終年度(63年)はこの移植片を用いて、レシピエントの肝全摘後に同所性にこれを移植し、術中術後の肝機能や生存率を検討するとともに、部分肝移植のコントロールとして送血ポンプを用いた同所性全肝移植を行い比較検討した。
脊椎症の基盤としての脊柱の力学環境

小動物を用いた脊椎症モデルの開発を行った.傍脊柱筋を剥離,棘突起と棘間靱帯の切離を行ったマウスでは脊椎症変化が早期に生じることは判明しているが,さらに効果的に脊椎症を発症するように一椎間のみ可動性を残し,他の椎間は固定したマウスを作成している.これらの動物モデル群での力学的特性を振動特性測定器を用いて調べた.機械技術研究所で開発したBiomechanical Spectrometerを用いて,56週の雄ICRマウスの頚胸椎部を取り出しC3-T1間の動的粘弾性を測定した.これをコントロールとし,傍脊柱筋を剥離,棘突起と棘間靱帯の切離を行ったマウスの脊柱をモデル1,一椎間(C5/6)のみ可動性を残したマウスの脊柱をモデル2とした.粘弾性測定は静的引っ張り荷重80gを加え,そこに周波数11Hz,35Hzで動的引張荷重25gを加重させ変位応答を測定した.荷重F=F_θ+F_1sinWtに対する変位D=D_θ+F_1sin(Wt-D)による動的こわさ並びに位相差tanδを調べた.本実験では各椎間の動きを測定しているわけではないので,その構造全体としての力学的特性をしらべるということになるが,コントロールでは11Hz,35Hzで,それぞれtanδは0.16,0.18,動的こわさは35.5N,31.6N,モデル1ではtanδは0.15,0.17,動的こわさは34.8N,29.7N,モデル2ではtanδは0.25,0.25,動的こわさは143.9N,164.3Nであった.すなわちモデル1における脊柱不安定は筋系による不安定性であって,モデル2は構造的な力学特性の違いがある.本モデルを用いて椎間板の劣化や反応性と思われる骨増殖における生物学的反応系をあきらかにしたい.現在,軟骨や骨に関与する促進系のサイトカインであるIGF-I,IGF-II,bFGF,TGF-B,BMPや抑制系のIL-1,TNF-A,IL-6の発現を調査中である.小動物を用いた脊椎症モデルの開発を行った.傍脊柱筋を剥離,棘突起と棘間靱帯の切離を行ったマウスでは脊椎症変化が早期に生じることは判明しているが,さらに効果的に脊椎症を発症するように一椎間のみ可動性を残し,他の椎間は固定したマウスを作成している.これらの動物モデル群での力学的特性を振動特性測定器を用いて調べた.機械技術研究所で開発したBiomechanical Spectrometerを用いて,56週の雄ICRマウスの頚胸椎部を取り出しC3-T1間の動的粘弾性を測定した.これをコントロールとし,傍脊柱筋を剥離,棘突起と棘間靱帯の切離を行ったマウスの脊柱をモデル1,一椎間(C5/6)のみ可動性を残したマウスの脊柱をモデル2とした.粘弾性測定は静的引っ張り荷重80gを加え,そこに周波数11Hz,35Hzで動的引張荷重25gを加重させ変位応答を測定した.荷重F=F_θ+F_1sinWtに対する変位D=D_θ+F_1sin(Wt-D)による動的こわさ並びに位相差tanδを調べた.本実験では各椎間の動きを測定しているわけではないので,その構造全体としての力学的特性をしらべるということになるが,コントロールでは11Hz,35Hzで,それぞれtanδは0.16,0.18,動的こわさは35.5N,31.6N,モデル1ではtanδは0.15,0.17,動的こわさは34.8N,29.7N,モデル2ではtanδは0.25,0.25,動的こわさは143.9N,164.3Nであった.すなわちモデル1における脊柱不安定は筋系による不安定性であって,モデル2は構造的な力学特性の違いがある.本モデルを用いて椎間板の劣化や反応性と思われる骨増殖における生物学的反応系をあきらかにしたい.現在,軟骨や骨に関与する促進系のサイトカインであるIGF-I,IGF-II,bFGF,TGF-B,BMPや抑制系のIL-1,TNF-A,IL-6の発現を調査中である.
神経活動依存的コンドロイチン硫酸プロテオグリカン発現変化と神経回路の可塑性

コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)は高度に硫酸化した糖鎖がコアタンパクに結合した複合糖タンパクである。CSPGは、腱や軟骨の構成成分として知られているが、脳では主要な細胞外マトリクスとして働いている。本研究による研究成果として以下の点を上げることができる。2)小脳の生後発生過程におけるphosphacanの局在を調べたところ、生後10-15にごろをピークに分子層に顕著な局在が観察された。電子顕微鏡でさらに詳細を調べると、parallel fiberの細胞膜に局在していた。顆粒細胞培養系で、phosphacanの作用を調べると、軸索伸長や細胞接着を阻害した。一方、phosphacanは、軸索の束化を促進することから、phosphacan小脳の層構造形成に関与することが示唆された(Mol. & Cell. Neuorsci. 2005)。3)CSPGは、脳の成熟とともにある特定の神経細胞群に発現が集中する。CSPGに富んだこの構造はperineuronal netsと呼ばれている。大脳の神経細胞を培養すると、グリア細胞が存在していなくても、CSPGに富んだperineuronal netsが形成されることがわかり、perineuronal netsの由来が神経細胞であることが明らかになった(Neuroscience,2005)。コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)は脳の主要な細胞外マトリクスである。CSPGは、脳の成熟に伴い特定の神経群に発現しPerineuronal netsと呼ばれる構造を形成する。近年まで、このPerineuronal netsの機能に関してはまったく解明が進んでいなかったが、CSPGを分解する酵素であるChondroitinase ABCを注入すると、視覚野の可塑性が回復することより、神経回路の可塑性と関わっている可能性が示唆された。本年度の研究においては、CSPGで形成されたperineuronal netsの、形成要因、機能解析を進めた。1)視床下部下垂体後葉系におけるオキシトシン、バソプレッシン神経にはPhosphacanやNeurocanなどのCSPGが存在し、神経活動に依存してDownregulationされることを見出した。このdownregulationはCSPGのmRNA発現低下によるものではなく、tissue plasminogen activator-plasminやmatrix methalloproteaseなどのマトリクス分解系酵素が神経終末から放出され積極的にこれらのCSPGを分解することが分かった(Brain Res,2004,Neuroscience投稿中)。2)perineuronal netsの形成機構として、グリア細胞を含まない神経単独の培養系でperineuronal netsの形成が生じることを見出した。この成果は、perineuronal netsが、神経細胞由来であることを証明するとともに、in vitro系でのperineuronal nets機能解析に有用であることを示している(Neuroscience投稿中)。一方、phosphacanは、軸索の束化を促進することから、phosphacan小脳の層構造形成に関与することが示唆された(Mol. & Cell. Neuorsci.2005)。大脳の神経細胞を培養すると、グリア細胞が存在していなくても、CSPGに富んだperineuronal netsが形成されることがわかり、perineuronal netsの由来が神経細胞であることが明らかになった(neuroscience,2005)。