hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
昆虫無細胞タンパク質合成系における利用基盤の構築

本研究では、昆虫無細胞タンパク質合成系の利用基盤を構築することを目的として、カイコ無細胞タンパク質合成系の翻訳促進配列であるSpodoptera frugiperda核多角体病ウイルス由来ポリヘドリン遺伝子の5'非翻訳領域の解析を行った。その結果、3'末端から18塩基の翻訳促進に重要な配列を見出し、もとの配列と比べて1.3倍の合成量向上に成功した。先の科研費研究を発展させ、有機溶媒耐性チロシナーゼをモデルタンパク質として用い共発現解析システムを構築した。さらに、耐熱性ラッカーゼをモデルタンパク質として用い、ウエスタンブロット解析も含めた膜結合性タンパク質の発現解析システムを構築した。本研究は、新しい昆虫産業を創出し発展させるための基盤技術を確立することを最終目的とし、これまで我々が開発してきた昆虫無細胞タンパク質合成系を有力なタンパク質生産・解析手段の一つとするべく、その利用基盤を構築することを目的としている。平成24年度は、研究を進める体制を構築し、カイコ無細胞タンパク質合成系において翻訳を促進する機能を有する40塩基からなるSpodoptera frugiperda核多角体病ウイルス(SfNPV)由来ポリへドリン遺伝子の5'非翻訳領域(5'UTR)をスクリーニングによって見出した。今年度は、(1)まず、SfNPVポリへドリン遺伝子5'UTRの5'末端、3'末端から2塩基ずつ削除していった変異体、コザック配列の影響を無くすために3'末端の4塩基を残し5塩基上流から2塩基ずつ削除していった変異体、合計56種類の変異発現プラスミドを作製し、翻訳促進配列削除の影響を調べた。その結果、3'末端から18bp(5'-ACATTGTGAAAAAATAAA-3')の配列を用いた場合に、元の配列よりも約1.4倍のタンパク質合成量を示した。これにより、当初の目標である合成量の向上に成功した。この成果は、2014年度日本農芸化学会大会にて発表した。(2)次に、活性化にシャペロンを必要とするチロシナーゼをモデルタンパク質として用い、昆虫無細胞系における最適な共発現条件を決定した。その結果、シャペロンとチロシナーゼは1:1の関係で相互作用し、銅イオンの受け渡しを経てチロシナーゼが活性化することが示唆された。この一連の実験において、Strep-tagII配列を用いて迅速に相互作用の様子をウエスタンブロット解析することができるようになり、昆虫無細胞タンパク質合成系における共発現解析システムの構築に成功した。平成24年度は、(1)まず、本研究を確実に遂行するための研究体制を確立した。具体的には、評価に用いるβ-ガラクトシダーゼ遺伝子発現プラスミドの構築を行った。また、カイコの安定的な飼育体制を確立し、それを用いてカイコ幼虫後部絹糸腺抽出液の大量調製を行った。(2)次の段階として、カイコ幼虫後部絹糸線無細胞タンパク質合成系において効果が期待される翻訳促進配列をバキュロウイルス構成タンパク質遺伝子の5'非翻訳領域などの配列から検索し、6種類の異なる翻訳促進配列を有するβ-ガラクトシダーゼ遺伝子発現プラスミドを作製した。それを用いて合成量における翻訳促進配列の影響を調べることで翻訳促進配列のスクリーニングを行った。その結果、40塩基からなるSpodoptera frugiperda核多角体病ウイルス(SfNPV)由来ポリヘドリン遺伝子の5'非翻訳領域が最も翻訳促進能が高いことが明らかとなった。(3)現在、SfNPV由来の40塩基からなる翻訳促進配列の5'末端、3'末端から2塩基ずつ削除していった変異体、コザック配列の影響を無くすために3'末端の4塩基を残し、5塩基上流から2塩基ずつ削除していった変異体、合計56種の変異発現プラスミドを作製し、それを用いて合成量における翻訳促進配列削除の影響を調べている。本研究は、昆虫無細胞タンパク質合成系を有力なタンパク質生産・解析手段の一つにするべく、その利用基盤を構築することを目的とした。本研究では、以下の新たな知見を得ることができた。1.カイコ無細胞タンパク質合成系において翻訳を促進する機能を有する40塩基からなるSpodoptera frugiperda核多角体病ウイルス(SfNPV)由来ポリへドリン遺伝子の5'非翻訳領域(5'UTR)をスクリーニングによって見出した。次に、SfNPVポリへドリン遺伝子5'UTRの5'末端、3'末端から2塩基ずつ削除していった変異体など、合計56種類の変異体を作製し、翻訳促進配列削除の影響を調べた。

その結果、3'末端から18bp(5'-ACATTGTGAAAAAATAAA-3')の配列を翻訳し促進配列を用いた場合に、もとの配列の場合よりも約1.3倍のタンパク質合成量を示した。これにより、翻訳促進配列中の翻訳促進に重要なコアとなる配列を見出すことができた。2.活性化にシャペロンを必要とする放線菌Streptomyces sp. REN-21由来有機溶媒耐性チロシナーゼをモデルタンパク質として用い、昆虫無細胞合成系における最適な共発現条件を決定した。その結果、シャペロンとチロシナーゼは、1:1の関係で相互作用し、銅イオンの受け渡しを経てチロシナーゼが活性化することが示唆された。この一連の実験において、Strep-tagII配列を用いて迅速に相互作用の様子をウエスタンブロット解析することができるようになり、昆虫無細胞タンパク質合成系における共発現解析システムの構築に成功した。3.水溶液中で不溶化する膜結合性タンパク質である放線菌Streptomyce lavendulae REN-7由来耐熱性ラッカーゼをモデルタンパク質として用い、昆虫無細胞合成系における最適な発現条件の検討を行った。その結果、効率的に活性を有するラッカーゼを発現することに成功し、ウエスタンブロット解析も含めた膜結合性タンパク質の発現解析システムを構築した。タンパク質工学平成24年度では、(1)本研究を確実に遂行するための研究体制を構築した。(2)また、次の段階として、カイコ幼虫後部絹糸腺無細胞タンパク質合成系においてSfNPVのポリへドリン遺伝子5'UTRの配列が高い翻訳促進能を有することを見出した。平成25年度では、(1)SfNPVポリへドリン遺伝子5'UTRをもとに合計56種類の変異発現プラスミドを作製し、翻訳促進配列削除の影響を調べた。その結果、3'末端から18bp(5'-ACATTGTGAAAAAATAAA-3')の配列を用いた場合に、元の配列よりも約1.4倍のタンパク質合成量を示した。これにより、当初の目標である合成量の向上に成功した。(2)次に、活性化にシャペロンを必要とするチロシナーゼをモデルタンパク質として用い、昆虫無細胞系における最適な共発現条件を決定した。なお、当初予定していた分子間相互作用解析装置を用いた相互作用の解析は、今後、ぜひ取り組み、その方法もふくめてシステム化していきたい。以上のことから、おおむね順調に進展していると考えている。平成24年度は、(1)本研究を確実に遂行するための研究体制を確立した。(2)また、次の段階として、カイコ幼虫後部絹糸線無細胞タンパク質合成系において効果がある翻訳促進配列をバキュロウイルス構成タンパク質遺伝子の5'非翻訳領域の配列から検索した。(3)さらに、得られた翻訳促進配列の変異解析によりその機能を考察している。
スピングラス系の臨界現象と動的相転移

我々は2次元ランダム横磁場イジングモデルの絶対零度における量子相転移についてモンテカルロ法を用いて研究した.このモデルは異常に遅い緩和を示す可能性のあるモデルとして,一般のスピングラス系やエイジングなどの現象とも深く関連している.まず,有限温度でさまざまな横磁場の値においてモンテカルロシミュレーションを行い,磁化の4次のモーメントと2次のモーメントの比であるビンダーパラメータを求めた.この結果各温度での臨界磁場の強さが決定され,有限温度相図を確定した.その外挿により絶対零度での臨界磁場の値が求められた.また,高磁場の非秩序相内では局所的緩和時間を求め,その分布関数の長時間領域で冪的なながい裾をもつことが分かった.これは1次元の場合と同様に,無秩序相のなかですら,動的な振舞に異常がある,すなわちグリフィス・マッコイ異常性があることを意味している.またこの振舞から,動的臨界指数を求めた.その結果,動的臨界指数は磁場の強さとともに変化し,絶対零度での臨界磁場に近付くにつれて発散することがわかった.さらに発散を特徴づける冪指数が1次元の場合と同じになることが示唆された.また,臨界点直上での2点相関関数の計算から,平均的相関が冪的に減衰するのに対して,特徴的相関はこれより速く,指数関数の肩に冪関数がのったいわゆるstretched exponentialの形で減衰することが分かった.通常の相転移においては,平均的相関と特徴的相関は等しくなるのにたいし,このように両者が定性的に大きく異なる振舞をするのはランダム系の特徴であると考えられる.以上の結果から,2次元ランダム横磁場イジングモデルの量子臨界現象は1次元のそれと似通っており,フィッシャーが実空間繰り込みの考え方に基づいて1次元系に対して展開した描像が実はかなり広範囲の現象を記述している可能性を示唆するものである.HeikoRieger(HLRZ,Julich)と共同で,2次元の±Jイジングモデルに関して、基底状態における相転移を調べた.ボンド分布が非対称な場合,その非対称性の強さの関数として,スピンstiffnessと磁化とを計算し,有限サイズスケーリングによって,臨界指数を評価したところ,相関長の発散を特徴づける臨界指数νが2次元のパーコレーション転移のものと有効数字2桁で,統計誤差の範囲内で一致する事が見いだされた.これは,この相転移がなんらかのクラスターのパーコレーション転移として理解できることを示唆している.この事実とドッロップレット描像とを組み合わせることによって,相転移近傍における動的性質が理解されると期待できるが,それについては,研究継続中である.これと平行して,2次元のランダムな横磁場イジングモデルについて,動的異常性である量子グリフィス異常性について調べた.これは,横磁場の強さが,自発磁化を破壊する臨界値をこえても,帯磁率などに異常が現る現象としてとらえられる.1次元系については,すでに詳細な研究がなされており,動的臨界指数が横磁場の強さの関数として,臨界値に近づくにつれて発散することなどが報告されている.今回始めて2次元系を調べた結果,有限温度での相図が確定し,さらに,動的臨界指数が1次元系と同様に発散していることが確かめられた.また,以上の研究の為には,低温で有効な数値計算法が必要であるが,原田(京大工),Matthias Troyer(東大物性研)と共同で,量子系のための,新しいクラスタアルゴリズムを開発し,その特性を調べた.この方法はランダム系に限らずその他の量子系にも広く適用することができ,一般的な価値がある.我々は2次元ランダム横磁場イジングモデルの絶対零度における量子相転移についてモンテカルロ法を用いて研究した.このモデルは異常に遅い緩和を示す可能性のあるモデルとして,一般のスピングラス系やエイジングなどの現象とも深く関連している.まず,有限温度でさまざまな横磁場の値においてモンテカルロシミュレーションを行い,磁化の4次のモーメントと2次のモーメントの比であるビンダーパラメータを求めた.この結果各温度での臨界磁場の強さが決定され,有限温度相図を確定した.その外挿により絶対零度での臨界磁場の値が求められた.また,高磁場の非秩序相内では局所的緩和時間を求め,その分布関数の長時間領域で冪的なながい裾をもつことが分かった.これは1次元の場合と同様に,無秩序相のなかですら,動的な振舞に異常がある,すなわちグリフィス・マッコイ異常性があることを意味している.またこの振舞から,動的臨界指数を求めた.その結果,動的臨界指数は磁場の強さとともに変化し,絶対零度での臨界磁場に近付くにつれて発散することがわかった.さらに発散を特徴づける冪指数が1次元の場合と同じになることが示唆された.また,臨界点直上での2点相関関数の計算から,平均的相関が冪的に減衰するのに対して,特徴的相関はこれより速く,指数関数の肩に冪関数がのったいわゆるstretched exponentialの形で減衰することが分かった.通常の相転移においては,平均的相関と特徴的相関は等しくなるのにたいし,このように両者が定性的に大きく異なる振舞をするのはランダム系の特徴であると考えられる.以上の結果から,2次元ランダム横磁場イジングモデルの量子臨界現象は1次元のそれと似通っており,フィッシャーが実空間繰り込みの考え方に基づいて1次元系に対して展開した描像が実はかなり広範囲の現象を記述している可能性を示唆するものである.
レーザーホログラフィを用いた地殼潮汐ひずみの精密観測

1.地殼の微小ひずみ変化を精度良く測定するための新しい観測方法として、ホログラフィ干渉計測法の原理に基づく観測システムが1984年に京大防災研究所において開発された。このシステムを用いた地殼変動連続観測が、天ケ瀬地殼変動観測室(京都府宇治市)において、長期間続けられているが、本研究では、月及び太陽の引力によってひきおこされる地殼の潮汐ひずみ変化のみに焦点を絞り、天ケ瀬観測室のレーザーホログラフィ観測システムで得られた観測データーを、同観測室に既設のレーザー伸縮計の記録と合わせて解析し、潮汐力による観測坑道の微小変形の空間的な特徴を明らかにした。2.これとは別に、移動型のレーザーホログラフィ装置を用いた臨時観測を岩倉地殼変動観測室(京都市左京区)において実施し、潮汐ひずみ変化の精密観測を行った。得られた観測データーを、同観測室に既設のスーパーインヴァール棒伸縮計の記録とともに解析し、岩倉観測室の潮汐ひずみ変化の局所的な特徴を明らかにすることができた。3.さらに、奨来、近畿地方の他の場所においてもホログラフィ装置を用いた移動観測を行うための予備調査を、逢坂山地殼変動観測所(大津市)及び六甲地殼変動観測室(神戸市)において実施した。4.天ケ瀬地殼変動観測室では、レーザーホログラフィ記録装置を写真乾板を使用せずに干渉計測を行い得るようにするための装置の改良を進めている。将来、半円形のドーム状の天井を持つ地下観測室を新たに掘削し、そこにホログラフィ記録装置を設置し、天井に向けてレーザー光を照射することにより、ドームの変形を干渉じま計測の方法で常時監視すれば、地殼応力の時間的変化を観測することができ、地震予知に貢献できると考えられる。
小分子アジュバントによる自然免疫活性化を介した抗腫瘍免疫増強効果の解析

有効な抗腫瘍免疫を成立させるには、自然免疫を活性化させることが重要である。自然免疫の担当細胞である樹状細胞は、Toll様受容体(TLR)を介した刺激により、活性化され、IL-12などのサイトカインを分泌するとともに、CD40などの補助機能分子の発現を増強する。これまでに同定されているTLRのリガンドは、主に病原微生物由来の構成成分であるが、合成小分子の方が、生成過程が簡便で、かつ、副作用が少ないので、抗腫瘍免疫への応用の際には、有用性が高いと考えられる。本研究では、合成小分子の中から、抗腫瘍免疫に有効と考えられる、アジュバント活性の強い分子をToll様受容体、Toll様受容体のアダプター分子MyD88の遺伝子欠損マウスを用いて探索した。その結果、抗ウイルス薬イミダゾキノリン誘導体のアジュバント活性がMyD88欠損マウス、TLR7欠損マウス、およびそれらのマウス由来のマクロファージ、樹状細胞において欠如していることを見出した。また、イミダゾキノリン誘導体でヒト樹状細胞亜集団、骨髄樹状細胞(MDC),形質細胞様樹状細胞(PDC)を刺激した。どちらの樹状細胞も刺激により、生存率を上昇させ、補助機能分子の発現を増強した。しかし、MDCにおいては、IL-12産生が誘導されたが、PDCにおいては、インターフェロンα産生が誘導された。すなわち、TLR7リガンドによって誘導されるサイトカイン産生パターンが樹状細胞サブセットによって異なることを明らかにした。
モバイル手話通信のためのマルチチャネル低ビットレート手話動画像伝送に関する研究

聴覚障害者が携帯電話あるいはノートパソコンなどのモバイル機器を利用して、テレビ電話形式による手話コミュニケーションを想定した超低ビットレート手話動画像伝送に関する基礎的研究を行った。本研究では、次の(1)-(6)のような成果が得られた。(1)超低ビットレート手話動画像伝送方法の検討:超低ビットレートかつ手話認識可能な圧縮は通常の手法では不可能なため、動画像フレームから認識に必要なものだけを選択的に抽出し、これを圧縮して送る方法として選定した。(2)手話認識要素の解析:重要なフレームを選定する基礎として、14手話単語の認識に重要な要素を解析し、立っている指とその方向、および、手の位置と動きが重要であることを示した。(3)意味的特徴点フレーム抽出アルゴリズムの考察:手話動画から認識に必要な意味的特徴点フレームを抽出するアルゴリズムを前述の成果も取り入れて考察し、フレーム間の輝度差分値を基にして、手首の移動軌跡を考慮したアルゴリズムを考案した。(4)分散システムのソフトウェア構成の考察:手話画像伝送システムは分散システムとなるため、プログラミング言語・ソフトウェア構成について検討した。その結果、Java言語が適当であり、分散システムを効率よく構成するためにエージェントシステムに関して考察した。(5)手話動画圧縮アルゴリズムの定量的評価:提案した圧縮プログラムの性能を定量的に評価した。その結果、MPEG2に比較してデータ量を50%以下に抑えられることが示され、さらに15%以上の改善が可能なことを示した。これにより、本研究で提案するシステムの有効性が示された。(6)得られた成果を研究会など学術論文として発表した。聴覚障害者がモバイル環境下において、テレビ電話により手話を用いてコミュニケーションを行うことを想定して、超低ビットレート手話動画像伝送に関する研究を行った。本年度は、その基礎的な研究として、以下の(1)-(3)を実施した。(1)手話調動の解析:各手話単語の手話調動を細かな調動要素に分解して解析し、各手話単語認識に必要な調動要素を調査した。また、単語認識に必要となる調動要素の一般的傾向についても考察を行った。その結果、これまでの基礎実験により、動作が一瞬停止した点の他に動作方向が急変した点も重要であることが分かった。(2)手話単語認識要素の解析:(1)より求められた調動要素において、その手指のどの部分が手話認識に必要な要素であるかを、手話画像からの単語認識により考察した。14単語について、認識に必要な要素を明らかにし、立っている指とその方向、および、手の位置と動きが重要であることが分かった。この結果を手話単語認識方法として発表した。(3)手話動画像圧縮アルゴリズムの考察:これまでの研究により、手話単語認識において各単語認識に必要なフレームは数個であることが分かっており、これを意味的特徴点と呼んでいる。意味的特徴点を標準的な圧縮方法であるMPEG1およびMPEG2に組み込むための方法を考察した。まず、フレームレートの低い画像をそのまま入力した場合について調査し、意味的特徴点だけを入力すれば1/2程度に圧縮可能であることが分かった。現在、再生に標準的な方法を用いたままで、さらに庄縮するための方法について考察を行っている。本年度は、その基礎的研究を実用的な研究とするために、以下の(1)-(3)を実施した。(1)コンピュータ間での手話動画像の伝送:今年度新規に購入したノートコンピュータ2台にPCカメラを装備して画像の伝送実験を行った。データ圧縮などを行わないストリームとして伝送するソフトウェアを開発した。さらに本研究で開発している手話動画像圧縮アルゴリズムを組み込んだソフトウェアの開発に着手したが、WindowsのOSにおけるAPIとの接続に問題を残した。(2)手話動画像に適した圧縮方法の検討:提案している手話動画像の圧縮においては、手指、手首の動きを追跡することが必要になっている。

この処理は通常の動画像圧縮方式における動き補償と同様な処理になるため、これを同時に行う圧縮方法を考案した。さらに、手話動画像の圧縮と通常の動画像圧縮が分離して独立に処理される場合を想定して、冗長な処理を行わないために、動き情報を受け渡すための仕様についても検討を行った。(3)モバイル分散環境を想定したエージェントによる伝送:モバイル環境では通信が不安定になったり、通信不能になる場合が想定される。このような場合においても通信を継続させる、あるいは、復旧させるために、自律分散処理が可能となるモバイルエージェントを導入することが必要となる。このため、エージェントとそのマイグレーションに関する研究を行った。聴覚障害者がモバイル環境下において、テレビ電話により手話を用いてコミュニケーションを行うことを想定して、超低ビットレート手話動画像伝送に関する研究を行った。本年度は、その基礎的研究を実用的な研究とするために、以下の(1)-(5)を実施した。(1)手話動画像圧縮アルゴリズムの改良:昨年度までに考案した超低ビットレート手話伝送のための圧縮アルゴリズムは、処理過程で8枚の連続画像フレームを必要としていたため、処理遅延が大きかった。本年度は、手の動きベクトルを求めて、これを併用することにより、処理遅延を小さくする改良を行った。(2)エンコーダプログラムの考察:上記の圧縮アルゴリズムをMPEGなどの汎用エンコーダに組み込むことにより、冗長な処理を排除することに関して考察した。具体的な実装に関しては、画像データの画素数や画像表現の相違があり、冗長性を除外した実装は行えなかった。(3)1対Nテレビ会議ソフトウェアの検:今年度新規に購入したノートコンピュータ1台にPCカメラを装備して、昨年度までに購入したノートコンピュータなど複数のコンピュータ間の画像伝送を試みた。現在のところ、Windows APIを利用したソフトウェアで試作しているが、安定性に問題を残している。(4)Java環境における実装の検討:手話動画像の伝送を行うためには、インターネットなどによる配信が必要だと考えられるため、ネットワーク環境に適したJava言語によるプログラム実行とその処理時間短縮の考察を行った。プログラムのリファクタリングにより数%の処理時間短縮を実現した。(5)手話画像圧縮アルゴリズムによる定量的評価:開発した圧縮プログラムの性能を定量的に評価した。これにより、データ量を50%以下に抑えられることが分かった。現在、これをさらに改善する方法について考察中である。
脊髄－腕傍核－扁桃体路による痛み情動生成機構の解明

痛みが苦痛情動を引き起こす脳機構として、脊髄ー腕傍核ー扁桃体路に着目し、下記を明らかにした。(1)光遺伝学を用いた腕傍核ー扁桃体路の選択的活性化は、侵害受容なしに恐怖・脅威学習を成立させる。(2)同経路の活性化は、扁桃体中心核ネットワークの単シナプス性、および、多シナプス性のネットワーク活動を惹起し、その影響は、炎症性疼痛モデルで増大する。(3)化学遺伝学的手法による扁桃体中心核ニューロンの活動抑制は炎症性疼痛モデルにおける痛覚過敏応答を抑制し、同活性化は健常動物に痛覚過敏を引き起こす。以上より、同経路が脳に有害性を伝達する経路であり、その活性化は疼痛応答行動の変容をもたらす事実をつきとめた。平成25年度は下記の新事実を明らかにした。(1)ラット口唇部へのホルマリン炎症性疼痛誘発6および24時間後、腕傍核ー扁桃体シナプス伝達が増強する。この増強は右扁桃体選択的に生じ、シナプス前からの放出確率の増大を伴う。この増強様式は、下肢足底へのホルマリン皮下注射による腕傍核ー扁桃体シナプス伝達の増強と同様である。三叉神経支配領域における炎症疼痛が腕傍核ー扁桃体シナプス伝達を増強することを初めて示した。(2)2つの異なる温度を示す領域を自発的に選択させる温度嗜好性テストにおいて、口唇部へのホルマリン炎症性疼痛誘発624時間後に、有害閾値温度近傍の低ー高温域滞在時間が有意に変化する。脊髄神経支配領域の温度知覚に基づく自発的選択が、三叉神経支配領域の慢性痛の成立とともに変容する可能性を示す。(3)CGRP欠損動物は、下肢足底ホルマリン皮下注射6時間後の腕傍核ー扁桃体シナプス伝達増強を示さない。腕傍核ー扁桃体シナプスでのCGRP放出がシナプス増強に必須である可能性が示された。(4)脊髄後角のノルエピネフリン・トランスポーター発現が、重篤な痛覚過敏を示すストレプトゾトシン腹腔内投与1型糖尿病モデルにおいて亢進し、選択的ノルアドレナリン神経毒DSP-4前処置によってほぼ消失する。(5)有痛性糖尿病性神経障害の痛覚過敏に対するセロトニン・ノルアドレナリン再取り込み阻害薬の鎮痛効果がDSP-4前処置によって消失する。(6)マウス腕傍核への両側性ムシモール微量注入によって恐怖学習効率が低下する。(7)腕傍核へのChR2発現ベクター導入によって、脳スライス扁桃体中心核から光誘発単シナプス性応答が記録される。以上の新知見は、さまざまな体部位からの侵害受容情報が腕傍核を介して扁桃体に収斂し、有害性と連関した情動行動を変容させるとともに、下行性制御系によってさらに侵害受容を亢進させる可能性を示す。「痛みはなぜ苦痛なのか」という問題に答えることを目指し、脊髄(三叉神経)ー腕傍核ー扁桃体路を介して伝えられる侵害受容情報が恐怖学習および慢性痛の成立において担う役割を解明すべく以下の研究を進め成果を上げた。(1)【マウス腕傍核ー扁桃体路の薬理学的抑制は恐怖学習を抑制する】聴覚刺激を条件刺激、四肢への電気ショックを無条件刺激とした恐怖学習において、学習時に薬理学的に神経活動を抑制したところ、24時間後の想起実験におけるすくみ時間が有意に短縮した。(2)【マウス腕傍核ー扁桃体路の光遺伝学的活性化は恐怖学習を成立させる】腕傍核にchannelrhodospin (ChR2)発現アデノ随伴ウィルスベクターを感染させ、両側扁桃体中心核にLEDを光源とする小型光ファイバーを装着し、無条件刺激の代わりに光刺激を行って恐怖学習課題を行ったところ、想起時のすくみ時間が有意に延長した。(3)【腕傍核ChR2発現ラットの扁桃体スライスにおける光刺激誘発シナプス後電流は、単シナプス性興奮性応答に加え、多シナプス性フォードフォワード抑制を扁桃体中心核ニューロンに生じさせる】光刺激によって、TTX感受性単シナプス性興奮性応答が誘発された。その振幅は下肢足底ホルマリン皮下注射の24時間後有意に増加した。(4)【ラット炎症性疼痛は扁桃体中心核シナプス伝達増強と全身性痛覚過敏を生じる】ラット口唇部皮下へのホルマリン注入によって三叉神経炎症性疼痛モデルを作成した。炎症の左右にかかわらず、6、および、24時間後に右側腕傍核ー扁桃体中心核シナプス伝達増強が、また、3ー48時間後に機械性アロディニアが両下肢に生じ、自発的温度指向性テストにおける低温忌避傾向が認められた。以上より、腕傍核ー扁桃体路が痛みの全身化を伴う慢性痛の成立と恐怖学習および情動性行動に必要かつ十分に関与する事実を明らかとした。「痛みはなぜ苦痛なのか」という問題に答えることを目指し、脊髄(三叉神経)ー腕傍核(LPB)ー扁桃体路を介して伝えられる侵害受容情報が恐怖学習と慢性痛の成立において担う役割を解明すべく以下の研究を進め成果を上げた。(1)【マウスLPBー扁桃体路の光遺伝学的活性化は恐怖学習を成立させる】腕傍核にchannelrhodospin (ChR2)発現アデノ随伴

ウィルスベクターを感染させ、両側扁桃体中心核(CeA)にLEDを光源とする小型光ファイバーを装着し、無条件刺激の代わりに光刺激を行って恐怖学習課題を行ったところ、想起時のすくみ時間が有意に延長した。(2)【LPB内ChR2発現ラットの扁桃体スライスにおける光刺激は、CeAニューロンにシナプス性およびネットワーク性の活動を生じさせる】光刺激によってCeAニューロンに単シナプス性興奮性応答が誘発され、その振幅は下肢足底ホルマリン皮下注射24時間後に有意に増加した。また、CeA外包亜核よりも内側亜核で有意に高頻度高振幅の多シナプス性抑制性入力が観察された。CeAからの出力はCeA内抑制回路による高度の統合を受けている事実が明らかになった。(4)【ラット炎症性疼痛は扁桃体中心核シナプス伝達増強と全身性痛覚過敏を生じる】ラット口唇部皮下へのホルマリン注入によって三叉神経炎症性疼痛モデルを作成した。炎症の左右にかかわらず、3時間後に両側LPB、および、右CeAのFOS発現細胞数が有意に増加し、また、6、および、24時間後にLPBーCeAシナプス伝達増強が右のみ増強した。加えて、3ー72時間後に機械性アロディニアが両下肢に生じ、これは、右CeAへのCGRP受容体遮断薬微量注入によって有意に抑制された。以上より、腕傍核ー扁桃体路が痛みの全身化を伴う慢性痛の成立と恐怖学習および情動性行動における主要かつ直接的な役割を担う事実を明らかにした。腕傍核ー扁桃体路系の意義に関して、計画以上に研究が進捗し、すでに3報論文公表した。さらにもう2報準備中である。十分な成果が上がったと評価する。「痛み情動の成立における腕傍核ー扁桃体論の意義の解明」という研究目的は達成され、世界的にも注目される成果となり、これからの痛み情動研究の流れを変え得る重大な成果である。現在、英文総説を準備中である。今年度は昨年度末に投稿し、査読者とのやり取りを経て受理されるに至った論文をopen access化した。研究成果は平成27年度末までに得られており、平成27年度の研究実績の概要に示した。要約すると(1)マウス腕傍核ー扁桃体路の光遺伝学的活性化は恐怖学習を成立させる、(2)腕傍核内チャネルロドプシン2発現ラットの扁桃体スライスにおける腕傍核ー扁桃体投射ニューロン終末の光刺激は、扁桃体中心核ニューロンに単シナプス性、および、他シナプス性のネットワーク活動を介した活動を生じさせる、ならびに、(3)ラット炎症性疼痛は扁桃体中心核シナプス伝達増強と全身性痛覚過敏を生じる、が明らかにされた。その後に進めた化学遺伝学法ならびに新規に作製したVGAT-Creラットを用いた研究によって、右扁桃体中心核のニューロン興奮性が全身性の疼痛閾値の制御に関与している事実を示した。これは、本研究課題によって証明された、痛みが恐怖情動の責任核である扁桃体を活性化させるのみならず、その結果として、おそらくは下行性疼痛制御系の活動を変容させることによって、侵害受容に対する感受性を末梢脊髄レベルで変化させる可能性が示された。この研究成果は、外部からの侵害刺激に対する感受性や閾値を、炎症や傷害などの身体の状態に呼応して扁桃体が制御している可能性を意味しており、「情動」の生物学意義・起源を考える上で極めて興味深く、「痛み」を超えた広汎的生存戦略としての重要性を示唆している。今後のさらなる研究の推進が必要である。痛みが苦痛情動を引き起こす脳機構として、脊髄ー腕傍核ー扁桃体路に着目し、下記を明らかにした。(1)光遺伝学を用いた腕傍核ー扁桃体路の選択的活性化は、侵害受容なしに恐怖・脅威学習を成立させる。
歯嚢由来細胞のトランスクリプトーム解析

歯科治療過程で破棄される歯嚢には幹細胞が存在し,歯嚢由来細胞(歯嚢細胞)は骨芽細胞誘導培地にて培養すると石灰化することが報告され,骨再生医療の細胞源として注目されている.一方, microRNAはmRNAの3'末端非翻訳領域に結合して発現を調節し,発生や分化,病態形成に関与すると示唆されている.本申請では,歯嚢細胞の骨芽細胞分化・石灰化を制御するmicroRNAを検索するとともに,そのmicroRNAの標的遺伝子を検索する.Non-codingおよびcoding RNAの両面からのトランスクリプトーム解析は,骨再生医療に適する細胞のスクリーニングや石灰化機序の解明に役立つと考える.歯科治療過程で破棄される歯嚢には幹細胞が存在し,歯嚢由来細胞(歯嚢細胞)は骨芽細胞誘導培地にて培養すると石灰化することが報告され,骨再生医療の細胞源として注目されている.一方, microRNAはmRNAの3'末端非翻訳領域に結合して発現を調節し,発生や分化,病態形成に関与すると示唆されている.本申請では,歯嚢細胞の骨芽細胞分化・石灰化を制御するmicroRNAを検索するとともに,そのmicroRNAの標的遺伝子を検索する.Non-codingおよびcoding RNAの両面からのトランスクリプトーム解析は,骨再生医療に適する細胞のスクリーニングや石灰化機序の解明に役立つと考える.歯嚢には,骨芽細胞や神経芽細胞へと分化する未分化な細胞が存在することが報告されたことから,再生医療の細胞源として期待されている.本申請は,歯嚢由来細胞(DFC)の臨床応用を視野に入れ,分子生物学的性質を検討することを目的としている.本年度では,DFCのランスクリプトーム解析を行った.【方法】本学倫理委員会の指針に従い,埋伏抜歯の際採取した歯嚢を酵素処理し,DFCを分離した.骨髄由来未分化間葉系幹細胞(MSC)はLONZA社から購入した.DFCおよびMSCをgrowth mediumまたはosteogenic induction medium (OIM)で培養し,total RNAを抽出した.遺伝子発現はAffymetrix Gene Chip HG U113 plus 2.0を,miRNA発現はAgilent miRNAmicroarray 8x15Kを用いて測定した.【結果および考察】骨芽細胞へ分化誘導を行っていないDFCおよびMSCについて, coding RNAおよびnon-coding RNAの発現を比較検討した.stem cell markerはDFCとMSCで発現が類似していた.一方,DFCではLHX8, FOXO1遺伝子発現が,MSCではHOXA遺伝子群の発現が高かった.また,miRNAでは,DFCでmiR-20A*, miR-129-3p, miR-1271が,MSCではmiR-196a,b, miR-10a,bの発現が高かった.HOX遺伝子やmiRNAは細胞特異的に発現していると示唆された.次に,DFCの石灰化過程で発現変動する遺伝子群を調べたところ,培養3日目ではBMP-2, BMP-6, TGF-βの遺伝子発現が高かった.骨芽細胞誘導初期では,BMPおよびTGF-βsignalig pathwayが亢進していることが示唆された.十数名の患者から歯嚢を採取し,歯嚢由来細胞の分離・培養後,細胞保存しており,実験に使用可能な歯嚢由来細胞の例数は増えている.歯嚢由来細胞および骨髄由来未分化間葉系幹細胞について,coding RNAおよびnon-coding RNAのマイクロアレイを用いた網羅的遺伝子発現解析は順調に進んでいる.さらに,歯嚢由来細胞の石灰化に関与するmicroRNAの検討も進んでいる.十数名の患者から歯嚢を採取し,歯嚢由来細胞の分離・培養後しており,試験に使用可能な歯嚢由来細胞の例数は増えている.歯嚢由来細胞および骨髄由来未分化間葉系幹細胞について,coding RNAおよびnon-coding RNAのマイクロアレイを用いた網羅的遺伝子発現解析は順調に進んでいる.歯嚢由来細胞の石灰化過程で発現減少したmiR-29abcの標的遺伝子を検索する.また,miR-29abc以外にも石灰化過程で発現変動するmiRNAを検索するとともに,発現変動したmiRNAをDFCに遺伝し導入し,石灰化への影響を調べる.歯嚢由来細胞および骨髄由来未分化間葉系幹細胞について,石灰化過程で発現変動するcoding RNAとnon-coding RNA間での比較発現解析を行う.石灰化または骨芽細胞分化に関与すると示唆される遺伝子を検索する.また,候補に上がった遺伝子の経時的変化をreal time-PCR法で調べる.マイクロアレイ解析を行う歯嚢由来細胞および骨髄由来未分化間葉系幹細胞の例数を増やす.歯嚢由来細胞および骨髄由来未分化間葉系幹細胞のcoding RNAおよびnon-codign RNAのマイクロアレイ解析結果ををもとにして,石灰化過程で発現変動する遺伝子の経時的変化をreal time-PCR法で詳細に調べる.石灰化過程で発現変動するcoding RNAとnon-coding RNA間での比較発現解析を行う.石灰化過程で発現変動するmiRNAの標的遺伝子を検索するとともに,発現変動したmiRNAをDFCに遺伝し導入し,標的遺伝子の発現変動および石灰化への影響を調べる.DFCとMSC間でトランスクリプトームの比較解析を行い.DFCまたはMSCの分子生物学的性質の比較検討を行う.1.細胞培養用培地および器具:歯嚢由来細胞および骨髄由来未分化間葉系幹細胞の培養3. miRNAmimicおよび遺伝導入用試薬:石灰化過程で発現変動したmiRNAをDFC遺伝子導入し,石灰化への影響を調べる.また,導入したmiRNAの標的候補遺伝子を検索し,タンパク質産生のへの影響を調べる.

4.マイクロアレイおよびマイクロアレイ測定用試薬:患者から採取した細胞を実験に使用する場合,個体差が問題となる.そこで,数名の患者から分離した歯嚢由来細胞について,coding RNAおよびnon-coding RNAのマイクロアレイ解析を行う.1.細胞培養用培地および器具:歯嚢由来細胞および骨髄由来未分化間葉系幹細胞の培養2.マイクロアレイおよびマイクロアレイ測定用試薬:患者から採取した細胞を実験に使用する場合,個体差が問題となる.そこで,数名の患者から分離した歯嚢由来細胞について,coding RNAおよびnon-coding RNAのマイクロアレイ解析を行う.3. real time-PCR用試薬およびprimer作製:coding RNAおよびnon-coding RNAのマイクロアレイ解析結果をreal time-PCR法を用いて検証する.4. miRNAmimicおよび遺伝導入用試薬:石灰化過程で発現変動したmiRNAをDFC遺伝子導入し,石灰化への影響を調べる.また,導入したmiRNAの標的候補遺伝子を検索し,タンパク質産生のへの影響を調べる.
重度上肢麻痺にたいする反復末梢磁気刺激（rPMS）療法の開発

反復性末梢磁気刺激(rPMS)治療は磁気を用いて選択的に筋肉を刺激する手法である。同様の治療である神経筋電気刺激(EMS)と比較し、より広く深く筋肉を刺激することが可能であるとともに、痛みが少なく安全な治療であることが知られている。このrPMS治療は脳卒中などによる麻痺の改善にたいし有効な治療法である可能性がある。本研究では脳卒中を契機として重度の上肢麻痺を有する患者に対するrPMS治療を確立することを目的とする。rPMS治療の最も効果的な刺激方法を確立した上で、その刺激方法を用いたrPMS治療とリハビリテーションの併用療法の有効性を明らかにすることを目的とする。
新規ATL発がん遺伝子Fra-2の発現と機能解析

CCR4はTh2細胞、制御性T細胞、皮膚指向性T細胞などに選択的に発現するケモカイン受容体である。我々は成人T細胞白血病(ATL)でのCCR4の高頻度発現を初めて報告した(Yoshie et al., Blood 2002)。そしてATLでのCCR4発現の転写制御機構を調べることにより、ATLではAP-1ファミリーのFra-2が構成的に異常発現しており、Fra-2はJunDとヘテロダイマーを形成することにより、ATLでのCCR4の発現を誘導し、さらにc-Myb、MDM2、Bcl-6などの原がん遺伝子の発現も誘導していることを明らかにした(Nakayama et al., Oncogene 2008)。ATLでFra-2やこれらの原がん遺伝子の構成的発現が示されたのは初めてである。そこで本年度は、Fra-2/JunDによるc-Mybの発現誘導を転写レベルで証明した。また皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)は菌状息肉腫やCD30陽性未分化大細胞型リンパ腫などの多様な成熟型T細胞リンパ腫よりなるが、ATLと同様にCCR4を高頻度で発現する。そこでCTCLでのFra-2の発現と役割を検討した。そ.の結果、CTCLでもCCR4の発現とともにFra-2とJunDの構成的な発現が確認され、ATLと同様にFra-2とJunDはCTCLの増殖に関与すること、さらにFra-2とJunDはCCR4の発現だけでなく、c-Myb、MDM2、Bcl-6の発現も誘導していることを明らかにした。これらの結果は、Fra-2の構成的発現と発がんにおける役割はATLに限られるものではなく、CTCLも含めてCCR4を発現する成熟型T細胞由来の白血病/リンパ腫に普遍的に当てはまるものであることを示す。そしてFra-2で発現が誘導されるCCR4はこれらの悪性腫瘍の有用な腫瘍マーカーであるとともに有望な治療標的でもあると言える。成人T細胞白血病(ATL)は高頻度でケモカイン受容体CCR4を発現している。ATLにおけるCCR4発現に関わる転写因子の解析から、ATLではAP-1ファミリーのFra-2が異常発現しており、そしてFra-2はJunDとともにヘテロダイマーを形成してATL細胞の増殖を促進し、またその下流遺伝子としてc-Myb, MDM2, Bc1-6などの原癌遺伝子の発現を誘導すること明らかにした。皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)は菌状息肉腫/セザリー症候群やCD30陽性未分化大細胞型リンパ腫などからなる腫瘍群で、ATLと同様にしばしばCCR4を発現し、さらにc-Mybの強発現が知られている。そこでCTCLにおけるFra-2の発現と役割について検討した。その結果、ATLと同様にCTCLでもFra-2、JunD、JunBの強い発現が認められ、さらにFra-2とJunDはCTCLでも細胞増殖を促進するとともに、c-Myb、MDM2、Bc1-6の発現を誘導することを明らかにした。このようにATLとCTCLという異なる腫瘍群でFra-2が関与する共通の発癌機構の存在が明らかになった。そこでさらにc-MybのATLとCTCLでの発現誘導機構をプロモーターレベルで解析した。その結果、-149塩基に存在するAP-1サイトがATLやCTCLでのc-Mybの発現に重要であり、Fra-2とJunDはこのAP-1サイトを介してc-Mybの転写発現を直接的に誘導すること、またATLやCTCLの細胞ではこのAP-1サイトにFra-2とJunDがインビボでも結合していることを明らかにした。
ナトリウム原子による相関光子対の発生

ラムダ型3準位系を持つシステムであるナトリウム蒸気に、電磁誘導透過条件を満たすような強いカプリング光と弱い信号光(プローブ光)を入射することで、第3のアイドラー光(ストークス光)を発生させ、信号とアイドラーの相互結合に起因する、パラメトリックな増幅過程、強度相関、パルス伝搬の挙動等を理論的実験的に解析した。ナトリウム原子蒸気を含むガラスセルに、対向する方向から強い共鳴励起レーザー光を入射した場合に生じるパラメトリック蛍光、及びパラメトリック発振に関して、理論的実験的に解析した。このような蛍光は、off-axis方向に出射され、Stokes-shiftあるいは、anti-Stokes-shiftしており、対角線方向に出る4つの出射光は、電磁誘導回折により、強く結合している。そのため、エネルギー保存則、運動量保存則を満たす。すなわち、4つの出射光は、従来のパラメトリック理論、実験における信号光とアイドラー光の役目を果たし、一つの自然放出光から、同時に立ち上がっていることが推定され、我々はこれを4光波パラメトリック増幅(発振)と名づけた。ただし、系の軸対称性のため、パラメトリックゲインは軸対称に分配されるため、このままでは、発振に至らない。発振のためには、外部からシード光を入れるか、あるいは、励起光のビームプロファイルを楕円形にして軸対称性を崩すか、であるが、いずれの場合も発振が観測され、4光波は同じ閾値を持ち、しかも30%程度の高い効率で励起光から信号光に変換される。また、パラメトリック蛍光の段階においても、4光波のカオティックな時間波形は、強い相関を持っており、相関関数は、幅0.8マイクロ秒程度の相関時間で鋭いピークを持つ。この4光波が果たして量子力学的な相関を持っているのか、あるいは、例えば「4つ子の光子対」とも呼ぶ、光子レベルでの相関があるのか、そして、それが実現できたとして、それを用いた4光子Bell状態の実現は可能であるのか、等が今後の課題である。前年度に引き続き、ナトリウム原子蒸気を用いたパラメトリック発振と増幅の問題を解析した。前年度は対向ポンピングによる4光波のパラメトリック発振を、シード光を入れた場合と、楕円ビームを用いた場合の2種類の方法により実現させたが、今年度は、一方向入射によるパラメトリック増幅の問題を取り上げた。この配置は、従来の電磁誘導透過の系であり、プローブ光は透明化はするものの、増幅には至らないという結論になっていた。しかし我々は実験のパラメーターを操作することにより、特に、原子密度を高くし、高いカプリング光強度を用いることで、プローブ光は大きく増幅され、また、それにつれてストークス光も同様のパワーで発生することが確かめられた。最大で30倍近いゲインが得られ、しかも線形吸収の極めて大きい周波数領域でも大きなゲインは観測される。これらの結果は、従来の電磁誘導透過が2モードしか考えていなかったのに対し、ストークス光も含めた3モードのリウビル方程式を解き、カプリング光は十分強く、定数であると仮定して、プローブ光とストークス光による結合伝搬方程式を解析することで理解することができた。また、カプリング光の周波数に関しては、吸収曲線の中心では、2つの非線形素過程が干渉を起こし、ゼロになってしまうため、カプリング光は中心より、サブレベル周波数分だけブルーあるいはレッドシフトした場合にパラメトリック増幅率が最大になることが判明し、実験的にも確かめられた。これらの結果をまとめて、Phys.Rev.Aに投稿中である。今後は、ストークス光に外部共振器をつけることで、パラメトリック発振を実現させる予定である。ラムダ型3準位系を持つ原子においては、2光子共鳴条件を満たす2つの入射電磁波(強いカプリング光と弱いプローブ光)が存在すると、プローブ光の透明化が引き起こされ、それを電磁誘導透過(Elect romagnetically Induced Transparency: EIT)と呼ぶ。我々は、媒質は透明になるのみならず、入射プローブ光を増幅するパラメトリック増幅(Parametric Amplification: PA)作用があることを理論的実験的に示してきた。このようなPAの状況においては、信号光(プローブ光)とアイドラー光(ストークス光)は、強度相関を持った相関光子対としてともに成長していく。今年度は、このようなPAの系に外部共振器をセットすることにより、予想通りパラメトリック発振が引き起こされることを実験的に観測し、Optics Lettersに発表した。(Opt.Lett.34,698(2009))トータルの変換効率は39%と極めて大きく、外部共振器長をピエゾ素子で制御することにより、安定した発振を達成することができた。さらに、信号光とアイドラー光がパルスとしていかに伝搬するかを調べるため、信号光をガウシアンパルスとして系に入射し、信号パルスとアイドラーパルスのパルス伝搬の様子を調べた。電磁誘導透過に見られる鋭い透明窓のため、両パルスは光速度の1/500程度の超低速パルス伝搬をすることが観測され、両パルスは、お互い離れることができないmatched pulsesとして伝搬していくことが観測された。
ニホンウズラにおける遺伝連鎖地図と比較染色体地図の作製

本研究は最小の家禽であるニホンウズラ(Coturnix japonica)の遺伝連鎖地図の構築およびその連鎖地図とニワトリ遺伝子地図間での比較染色体地図の構築を目的とした。近年、家畜・家禽においても遺伝子地図の構築が急速に進められているが、鳥類の実験動物および経済動物として多くの利点を有する日本ウズラについては遺伝子連鎖地図の構築が行われてこなかった。この観点から申請者は1)AFLP (amplified fragment length polymorphism)法を用いたニホンウズラの連鎖地図構築、2)機能遺伝子の連鎖地図上への位置付け、3)ニワトリとの比較染色体分析を行い、相同染色体領域を同定する、の3点を目的とした。最終的に、1933のAFLPマーカーを得ることで高密度な連鎖グループの構築に成功した。この、実際の遺伝子座数としては646であった。この地図は66の連鎖グループからなり、その全長は3200cMであった。マイクロサテライトを含む機能遺伝子に対するマーカー開発、cDNA-AFLPを用いたマーカー開発、ニワトリゲノム情報を生かした機能遺伝子に対するマーカー開発により、合計30の機能遺伝子が構築した連鎖地図上に位置付けられた。この機能遺伝子マッピングの結果から、構築したニホンウズラ第1、2、3、4、6連鎖群がそれぞれニワトリ第1、2、3、4、5染色体と相同であることが示された。特に第2連鎖群に関しては物理マッピングによって、ニホンウズラの第2染色体に位置付けられた機能遺伝子VIPRが位置付けられたので第2染色体であると断定した。この日本ウズラ-ニワトリ間の相同遺伝子領域はよく保存されており、その比較染色体地図分析から機能遺伝子の順序までよく保存されていることが示された。本家系は筋ジストロフィーとニューロフィラメント欠損の表現型を持ち、これらと連鎖グループ間での連鎖解析を行ったところ、ニューロフィラメント欠損は第6連鎖群に位置付けられ、また筋ジストロフィー表現型とは連鎖が認められなかった。本研究の結果、日本ウズラにおける遺伝子地図の構築に成功した。そのニワトリとの比較染色体地図から、日本ウズラとニワトリは染色体情報においてもよく保存され、近縁種であることを裏付けている。課題としては、マイクロ染色体における保存性、マクロ染色体における染色変化の箇所を同定するために、より多くの機能遺伝子をこの地図上に位置付けることが期待される。本研究は最小の家禽であるニホンウズラ(Coturnix japonica)の遺伝連鎖地図の構築を目的としている。この観点から申請者は1)AFLP(amplified fragment length polymorphisim)法を用いたニホンウズラの連鎖地図構築に取り組む、2)数多くの機能遺伝子をこの連鎖地図上に位置付ける、3)ヒトやニワトリとの比較染色体分析を行い、相同染色体領域を同定する、の3点を目的としている。本年度では、AFLP法よるマーカー数を増加し、これまでの600マーカーから1883マーカーに増やすことに成功し、かなり高密度な連鎖グループの構築に成功した。しかしマーカーの同一遺伝子座での重複が数多く認められたために、実際のマーカー数としては661となった。この地図は58の連鎖グループからなり、その全長は3418cMであった。次にニワトリで既知のマイクロサテライトマーカーが日本ウズラの連鎖地図作製に有効かを検討した。200のマイクロサテライトマーカーの増幅を日本ウズラで試みたが、増幅不可能なものや多数バンドが検出されるため、多くのマーカーではその利用が不可能であった。20のマーカーにおいて良好な増幅と使用家系において多型が認められたために、これらを連鎖グループにマッピングした。さらに新たに開発した機能遺伝子マーカー9つのマッピングに成功した。そのうち、ニワトリ第1染色体にマップされている遺伝子では本連鎖グループ第一に、またニワトリ第2染色体上の遺伝子は連鎖グループ第2に位置付けられ、ニワトリと日本ウズラ間で染色体のシンテニーが認められた。マーカー数は連鎖グループにおける遺伝子座の重複から十分であると考えられるため、次年度は機能遺伝子のマッピングに力を注ぎ、ニワトリやヒトの染色体間での相同性を検出すると共に、その染色体進化について考察する予定である。

マイクロサテライトを含む機能遺伝子に対するマーカー開発、cDNA-AFLPを用いたマーカー開発、ニワトリゲノム情報を生かした機能遺伝子に対するマーカー開発により、合計30の機能遺伝子が構築した連鎖地図上に位置付けられた。この機能遺伝子マッピングの結果から、構築したニホンウズラ第1、2、3、4、6連鎖群がそれぞれニワトリ第1、2、3、4、5染色体と相同であることが示された。特に第2連鎖群に関しては物理マッピングによって、ニホンウズラの第2染色体に位置付けられた機能遺伝子VIPRが位置付けられたので第2染色体であると断定した。この日本ウズラ-ニワトリ間の相同遺伝子領域はよく保存されており、その比較染色体地図分析から機能遺伝子の順序までよく保存されていることが示された。本家系は筋ジストロフィーとニューロフィラメント欠損の表現型を持ち、これらと連鎖グループ間での連鎖解析を行ったところ、ニューロフィラメント欠損は第6連鎖群に位置付けられ、また筋ジストロフィー表現型とは連鎖が認められなかった。本研究の結果、日本ウズラにおける遺伝子地図の構築に成功した。そのニワトリとの比較染色体地図から、日本ウズラとニワトリは染色体情報においてもよく保存され、近縁種であることを裏付けている。課題としては、マイクロ染色体における保存性、マクロ染色体における染色変化の箇所を同定するために、より多くの機能遺伝子をこの地図上に位置付けることが期待される。