hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒートポンプ用無着霜流動層蒸発器の試作に関する研究

極浅層流動層を応用したヒートポンプ用流動層蒸発器を試作し、実用の11kWヒートポンプシステムに取入れ、冬北の屋外実験を行うことによって、空気の温・湿度や気象条件による伝熱性能と除霜特性に及ぼす影響について実験的に明らかにした。得られた結果を要約すると以下のようになる。(1)今冬は外気温度、相対湿度が異常に高く、実験条件としては劣悪な状態であったため、完全な除霜結果を得ることが出来なかった。しかし、単相に比較すると霜の成長は遅く、また熱通過率は2倍以上向上することが確認された。(2)相対湿度が80%以下の条件では、無着霜域が広がり伝熱管上部は全く着霜しないことが確認された。また無着霜運転の実現には、入口空気条件や蒸発温度の変動を極力小さくすることが今後の課題であることが明らかとなった。研究実績の詳細は「科学研究費補助金成果報告書」に記載してある。以上要するに、本研究の目的は、今期が異常な暖冬であったことを考慮すると、ほぼ達成されたと考えられる。
遺伝子導入による乳腺及び消化器官を標的としたトランスジェニック動物の作出

1.導入遺伝子の構築に関する研究:マウス受精卵への遺伝子導入に用いる遺伝子の基本構造は、発現調節領域と発現遺伝子本体からなる。発現調節領域には、遺伝子を遺伝子導入動物の乳汁中へ特異的に発現されるために、ウサギのβ-カゼイン遺伝子の第一イントロンの一部と転写開始部位から上流2.2kbを用いた。この領域にはTATAとCAATからなる典型的なプロモーターと転写因子の結合領域に似通った核蛋白質結合領域(NP binding site)に加えて、イントロン内にグルココルチコイドレセプター結合領域(GRBE)が存在している。発現遺伝子としてはヒト黄体ホルモン(LII)のβサブユニットのゲノム遺伝子を用いた(2.3kb)。転写産物を安定化させるpoly (A) siteはLII遺伝子のそれを利用している。黄体ホルモンの生物活性はβサブユニットの糖鎖構造に依存していることから、乳汁中に産出された遺伝子産物の糖鎖構造および機能を解析するうえで有用な蛋白質である。受精卵への遺伝子導入に際しては、これらのβ-カゼイン遺伝子発現調節領域およびヒトβ-LIIサブユニットゲノム遺伝子配列を接続した4.5kbの遺伝子を用いた。2.体外受精によるマウス受精卵の作出と受精卵の体外培養に関す研究:遺伝子導入用の均一な前核期受精卵を得るための体外受精法の確立と受精卵の体外培養条件について検討した。ICR系雌マウスから過剰排卵処理によって排卵卵子を回収し、精巣上体精子によって体外受精を行った。その結果、すべての卵子に精子の侵入が認められた。これらの卵子をM16培養液中で120時間体外培養を行ったところ、M16液中では胚発生は全く認められなかったが、培養液にEDTAを添加することにより95%(122/128)が胚盤胞期に発生した。3.マイクロインジェクション法による受精卵への遺伝子導入とトランスジェニックマウスの作出に関する研究:上記1で構築した導入遺伝子を、マイクロインジェクション法を用いてマウス受精卵前核に5μg/mlの濃度で3-6pl注入し、120時間体外培養を行った。998個の遺伝子導入卵子の内474個(47.5%)が胚盤胞期に発生した。これらを偽妊娠雌マウスの子宮内に移植したところ、65頭の産子を得た。PCR法およびサザン法による解析から、これらの産子の内の5頭が遺伝子導入マウスであることと判明した。遺伝子の染色体への導入形態は、head to tailであり、導入コピー数は1-40コピーであった。正常マウスとの交配により、これら全ての遺伝子導入マウスは導入遺伝子を次世代に伝達した。導入遺伝子領の乳腺内での発現をサンドイッチELA法により解析したところ、3頭の遺伝子導入マウスに0.8-1.6mIU/mlのLIIβ遺伝子産物の発現を確認した。4.マウス初期胚および生色細胞由来の未分化細胞株作出条件の検討:未分化細胞を用いた効率的な遺伝子導入法を確立するために、マウス胚盤胞期胚および原始生殖細胞(PGCs)からの未分化細胞株の樹立と樹立にともなう増殖因子の影響について検討した。マウス胎子線維芽細胞(MEF)あるいはマウス骨髄由来細胞(ST2)を支持細胞とする培養系において、胚細胞および生殖細胞はそれぞれ異なった増殖形態をとった。胚盤胞期胚はMEF支持細胞上で培養することにより、未分化細胞の株化が可能であったが、ST2支持細胞上ではその増殖は支持されなかった。また、未分化細胞の樹立に培養系への増殖因子の添加を必要としなかった。一方、PGCsの培養では、MEFは胚細胞と異なりPGCsの増殖に対する効果は認められなかったが、ST2細胞を支持細胞とし、増殖因子(LIFおよびbFGF)を培養液中に添加することによってのみPGCsの増殖が認められた。しかし、いずれの条件下でも体外でのPGCsの増殖は5日間に限られ、胚細胞のような未分化細胞の株化には至らなかった。

その結果、すべての卵子に精子の侵入が認められた。これらの卵子をM16培養液中で120時間体外培養を行ったところ、M16液中では胚発生は全く認められなかったが、培養液にEDTAを添加することにより95%(122/128)が胚盤胞期に発生した。3.マイクロインジェクション法による受精卵への遺伝子導入とトランスジェニックマウスの作出に関する研究:上記1で構築した導入遺伝子を、マイクロインジェクション法を用いてマウス受精卵前核に5μg/mlの濃度で3-6pl注入し、120時間体外培養を行った。998個の遺伝子導入卵子の内474個(47.5%)が胚盤胞期に発生した。これらを偽妊娠雌マウスの子宮内に移植したところ、65頭の産子を得た。PCR法およびサザン法による解析から、これらの産子の内の5頭が遺伝子導入マウスであることと判明した。遺伝子の染色体への導入形態は、head to tailであり、導入コピー数は1-40コピーであった。正常マウスとの交配により、これら全ての遺伝子導入マウスは導入遺伝子を次世代に伝達した。導入遺伝子領の乳腺内での発現をサンドイッチELA法により解析したところ、3頭の遺伝子導入マウスに0.8-1.6mIU/mlのLIIβ遺伝子産物の発現を確認した。4.マウス初期胚および生色細胞由来の未分化細胞株作出条件の検討:未分化細胞を用いた効率的な遺伝子導入法を確立するために、マウス胚盤胞期胚および原始生殖細胞(PGCs)からの未分化細胞株の樹立と樹立にともなう増殖因子の影響について検討した。マウス胎子線維芽細胞(MEF)あるいはマウス骨髄由来細胞(ST2)を支持細胞とする培養系において、胚細胞および生殖細胞はそれぞれ異なった増殖形態をとった。胚盤胞期胚はMEF支持細胞上で培養することにより、未分化細胞の株化が可能であったが、ST2支持細胞上ではその増殖は支持されなかった。また、未分化細胞の樹立に培養系への増殖因子の添加を必要としなかった。一方、PGCsの培養では、MEFは胚細胞と異なりPGCsの増殖に対する効果は認められなかったが、ST2細胞を支持細胞とし、増殖因子(LIFおよびbFGF)を培養液中に添加することによってのみPGCsの増殖が認められた。しかし、いずれの条件下でも体外でのPGCsの増殖は5日間に限られ、胚細胞のような未分化細胞の株化には至らなかった。
熱帯果樹の果実着色機構と高温下でのアントシアニン合成

近年、日本でマンゴーのハウス栽培が拡大しつつあり、高級果物としての需要が高まっている。日本では主に`Irwin'が栽培されており、成熟期に鮮やかな赤色を呈するのが特徴である。温帯果樹のリンゴやブドウでは、高温によりアントシアニン合成が阻害されることが示されており、30°Cを超える条件で栽培すると、果実着色は不良となる。一方、マンゴー`Irwin'は40°Cを超える高温下で栽培されているにも関わらず、着色への影響はあまり見られない。本研究では、マンゴーの着色と気温との関係を明らかにするために、低温処理がマンゴーの着色に及ぼす影響について調査した。低温処理(果実周辺温度を2025°Cに保つ)した果実では、アントシアニン含量は対照区(果実周辺気温2545°C)と差がなかったが、クロロフィル含量の減少が抑制され、果皮はくすんだような赤色になった。一方、アントシアニン合成系(PAL, CHS, ANS)の遺伝子発現は、低温処理によって増加していた。夜間のみ低温処理を行った果実でも、アントシアニン含量は対照区と同程度であり、低温によるアントシアニン合成の促進は見られなかった。それに対し、遮光処理を行うと、アントシアニン含量は著しく抑制され、また、夜間低温処理と遮光を組み合わせると、アントシアニン蓄積とクロロフィル分解が共に抑制されることが示された。マンゴー果皮におけるアントシアニン合成系遺伝子群の発現量はアントシアニン含量と相関が低く、低温や遮光が遺伝子発現に及ぼす影響は明確でない。以上の結果から、マンゴー`Irwin'の果皮におけるアントシアニン蓄積は、30°C以上の高温でもほとんど阻害されることなく、気温の影響は光の影響と比較して小さいことが明らかとなった。2025°C程度の低温は、成熟を遅延させ、クロロフィルの分解を妨げることから、赤色を鮮やかに発色させるためには適さないと考えられた。近畿大学附属湯浅農場でハウス栽培されている'Irwin'マンゴーを用いて、温度処理がマンゴーの果実着色に及ぼす影響を調査した。温度処理は透明なアクリル製の筒の内壁にビニールチューブをめぐらせた装置をマンゴー果実に取り付け、チューブ内に冷却水を流すことにより行った。処理区には低温区(20°C25°C)と高温区(25°C40°C)をもうけ、無処理の果実を対照区とした。着色開始前の7月1日から収穫期まで行い、果皮のアントシアニンおよびクロロフィル含量、果肉の糖含量を測定した。さらに、アントシアニン合成に関する遺伝子の発現の解析も行った。果実着色に関しては対照区の果実に比べ、低温処理区、高温処理区ともに果実着色は不良となった。両処理区ともにアントシアニン含量は対照区より低くなり、クロロフィル含量の減少が緩やかであった。糖含量も温度処理区では対照区より低い値を示し、温度処理により成熟過程が遅れていることが示唆された。果実周辺部の温度は高温区と対照区でほとんど変わらなかったことから、高温区における果実着色の阻害および成熟の遅延は温度の影響というよりむしろ、温度調節を行う装置による遮光効果によるものと考えられる。一方、低温区における果実周辺部の温度は、温帯果樹類においてアントシアニン合成の適温とされる20°C25°Cに保たれていたが、果実着色は高温区と同程度であった。このことから、マンゴーにおいて気温が果実着色に及ぼす影響は少なく、光による影響の方が強く表れることが示唆された。アントシアニン合成系遺伝子の発現は、低温処理でPALやCHSの発現量が増加していることが確認されたが、アントシアニン含量との関係は明確になっておらず、今後詳細に検討する必要があると思われた。近年、リンゴやブドウの果実着色機構について研究が進み、アントシアニン合成系についても、分子レベルでの解析が進んでいる。これらの果樹では、高温によりアントシアニン合成が阻害されることが明らかとなっており、30°Cを超える条件で栽培すると、果実着色は不良となる。一方、最近日本で栽培が拡大しているマンゴー`Irwin'はハウス内の高温下で栽培されているが、'特にアントシアニン合成が阻害されることもない。これまでに、光がマンゴー果実のアントシアニン合成に影響を及ぼしていることが明らかとなっているが、温度との関係は明確になっていない。本研究では、低温処理がマンゴーの着色に及ぼす影響について調査した。本学湯浅農場で栽培されているマンゴー`Irwin'を実験に供試した。低温処理区では、果実周囲に冷水を流すチューブを設置し、果実周囲の気温を20°C15°Cに保った。対照区は、冷水を流さずチューブだけを設置したものとした(果実周辺気温40°C20°C)。果実着色開始前の7月下旬から処理を開始し、各処理区における果皮の色調、アントシアニン、クロロフィル、カロチノイド含量を経時的に測定した。低温区の果実ではa値が低くなり、赤色発現がやや劣るように見えたが、アントシアニン含量にはほとんど差がなかった。一方、クロロフィル含量は、対照区では成熟期にかけて著しく減少したのに対し、低温区ではほとんど減少していなかった。これらのことから、低温区で赤色の発現が劣るように見えたのは、クロロフィルによりアントシアニンがマスクされたことが原因であると考えられた。また、低温処理区では果実の成熟が遅れる傾向が見られた。

リンゴやブドウなどでアントシアニン合成を促進するとされる20°C前後の気温は、マンゴーにおいて特に促進効果はなく、逆にクロロフィル含量の減少を抑制することで、赤色発現の低下をもたらすことが分かった。今後、アントシアニン合成系遺伝子やクロロフィル分解酵素の発現解析も行い、これらの点について分子レベルでの解析を進める予定である。近年、日本でマンゴーのハウス栽培が拡大しつつあり、高級果物としての需要が高まっている。日本では主に`Irwin'が栽培されており、成熟期に鮮やかな赤色を呈するのが特徴である。温帯果樹のリンゴやブドウでは、高温によりアントシアニン合成が阻害されることが示されており、30°Cを超える条件で栽培すると、果実着色は不良となる。一方、マンゴー`Irwin'は40°Cを超える高温下で栽培されているにも関わらず、着色への影響はあまり見られない。本研究では、マンゴーの着色と気温との関係を明らかにするために、低温処理がマンゴーの着色に及ぼす影響について調査した。低温処理(果実周辺温度を2025°Cに保つ)した果実では、アントシアニン含量は対照区(果実周辺気温2545°C)と差がなかったが、クロロフィル含量の減少が抑制され、果皮はくすんだような赤色になった。一方、アントシアニン合成系(PAL, CHS, ANS)の遺伝子発現は、低温処理によって増加していた。夜間のみ低温処理を行った果実でも、アントシアニン含量は対照区と同程度であり、低温によるアントシアニン合成の促進は見られなかった。それに対し、遮光処理を行うと、アントシアニン含量は著しく抑制され、また、夜間低温処理と遮光を組み合わせると、アントシアニン蓄積とクロロフィル分解が共に抑制されることが示された。マンゴー果皮におけるアントシアニン合成系遺伝子群の発現量はアントシアニン含量と相関が低く、低温や遮光が遺伝子発現に及ぼす影響は明確でない。以上の結果から、マンゴー`Irwin'の果皮におけるアントシアニン蓄積は、30°C以上の高温でもほとんど阻害されることなく、気温の影響は光の影響と比較して小さいことが明らかとなった。2025°C程度の低温は、成熟を遅延させ、クロロフィルの分解を妨げることから、赤色を鮮やかに発色させるためには適さないと考えられた。
近未来の希少メタル対策:ゴムの加硫の亜鉛フリー化

近未来に亜鉛不足によるゴム工業の停滞やゴム製品不足による社会の混乱が懸念される中、硫黄による三次元網目形成反応で酸化亜鉛を用いない金属酸化物系の加硫反応を探究した。その結果、酸化亜鉛と同等の機能をもつ安全かつ豊富な金属酸化物は無いことが判った。今後、金属酸化物を用いないゴムの硫黄架橋技術を確立する必要がある。一般に、加硫反応には酸化亜鉛(ZnO)が使用され、高性能ゴム製造に至っている。しかし、亜鉛鉱石の可採年数が22年程度と言われていることから、現在の水準でゴム製造に亜鉛が消費されるとその不足事態は免れず、ゴム製品の不足は社会に大きな混乱を招くと懸念される。また、タイヤの磨耗による亜鉛微粒子の環境汚染がEUを中心に問題化されつつある。そこで本研究では、ゴム材料の硫黄を用いた三次元化網目形成反応で、「亜鉛フリー」の新しい加硫反応構築に挑戦することを最終目的として研究を行った。最終年度では、主に時分割フーリエ変換赤外吸収(IR)スペクトル分析を行って、キュラストメータ測定結果との相関を検討した。その結果、酸化マグネシウム(MgO)とステアリン酸は反応してステアリン酸マグネシウムにほぼ定量的に変化するが、ZnOとステアリン酸の場合と異なり、加硫の進行に伴ってスペクトルは変化しなかった。酸化銅(CuO)とステアリン酸はほとんど反応せず、加硫によりスペクトル変化を示さなかった。ステアリン酸マグネシウムを用いた系でもスペクトル変化はなかった。ステアリン酸銅は加熱すると分解しステアリン酸と銅化合物に変化した。ステアリン酸を混合しないMgO+加硫促進剤+硫黄系、あるいは、CuO+加硫促進剤+硫黄系は、それらの金属酸化物を混合しない系と比較して、IRスペクトルには大きな違いはなかった。これらの結果から総括として、MgOとCuOは加硫促進剤+硫黄系の反応開始を促進する触媒作用はあるが、ZnOのように架橋反応の反応率を大きくする作用はないことが判明し、ZnOに代替可能な安全で豊富な金属酸化物は、現在の所ないことが判った。今後、亜鉛資源の有効利用を図るためには、加硫反応で金属酸化物を使用しない新たな架橋法の確立が必要であり、ステアリン酸亜鉛を最小限使用する系の構築が有望であろう。先ず1年目では、ZnO以外の他の金属酸化物の加硫反応への有用性を明らかにするために、ZnOが加硫反応においてどのように寄与しているかを探究し、そして、酸化マグネシウム(MgO)、酸化銅(CuO)を用いて比較実験を行った。実験法は、イソプレンゴムをもちいて、汎用の二本ロールで金属酸化物、ステアリン酸、ベンゾチアゾール系促進剤、硫黄を混練して配合物を作製し、そして、得られた配合物をキュラストメータ測定と時分割フーリエ変換赤外吸収スペクトル測定に供し、加硫反応挙動を追跡した。同時に、配合物を熱プレスしてゴムシートを作製し、その力学物性も比較検討した。その結果、(1)MgOとCuOのいずれの金属酸化物も加硫反応の開始を早める働きがあること、(2)これらの金属酸化物は加硫速度に大きな変化はもたらさないこと、(3)MgOやCuOは、加硫の反応率上昇にはほとんど寄与しないことが判った。これらの結果は、ゴムの加硫反応におけるZnOの代替が他の環境に優しい金属酸化物では非常に困難なことを示めした。酸化亜鉛の加硫反応における有用性を明らかにし、我々が提案している加硫メカニズムに合致することを見出した。酸化亜鉛の性能に匹敵する環境適合性のある金属酸化物はほとんどないことが明らかになった。従って、計画通り、本申請研究の第二段階目に進むことになるから。先ず、ステアリン酸カルシウムやステアリン酸マグネシウムの加硫試薬としての性能を評価する。そして、我々が論文発表した加硫における二相網目不均一構造形成がZnO無しにどう形成できるかに関して探究を進める。つまり、「網目ドメインを形成させる硫黄架橋反応」で、ZnOを用いずに数十ナノメーターサイズの網目鎖密度の高いドメイン相を創生できるかどうかを検討する。ひとつの方法は、シリカ粒子の表面化学修飾を行って、硫黄および硫黄系化合物とのアフィニティが高いナノシリカ粒子を作製することである。そして、二本ロールを用いて硫黄や加硫促進剤等を混練し、キュラストメータによる加硫度測定や時分割赤外吸収スペクトル測定、示差走査熱量分析で加硫反応性を研究する。

今年度の研究計画であった「有用と見出した金属酸化物の金属元素に関するX線吸収微細構造測定をシンクロトロン放射光を用いて行い、加硫反応の進行をin situに分析する」という項目が実験結果に基づき不要となったために、442,820円を次年度に持ち越した。その結果、当初から使用予定の研究費(物品費、旅費、人件費、謝金、その他)1,100,000円に加えてこの研究費を平成24年度研究計画遂行のために使用する。特に、タイ国シンクロトロン放射光施設での硫黄元素に関するK殻X線吸収微細構造測定を行うための旅費、国内資料収集旅費、および、実験補助の謝金とする予定である。そのため、合計1,542,820円を次年度の当該研究の研究費として使用する予定である。
両面葉の気孔の緑色光応答に見られる背腹性:緑色光受容体は何か

気孔応答の背腹性を調べる上で、気孔の環境応答が、気孔孔辺細胞のみの機能によるのか、葉肉の機能も気孔に影響を及ぼすのかは、解いておかなければならない問題である。ツユクサの葉片、剥離表皮、剥離表皮を葉肉に再び載せたもの、をゲル上で長時間観察することができるシステムを構築し、赤色光下の気孔開孔、および高CO2下の閉口には葉肉組織からのシグナルが関与していることが分かった。赤色光下の開孔への葉肉シグナルには光合成機能が必須、高CO2下の閉口には光合成が関与しないことも明らかになった。これらの結果は、単色光ごとに葉肉因子の解析が必要であることを示している。気孔の環境応答における、葉肉組織の役割を検討した。ツユクサの剥離表皮を適当なバッファーを含むゲランガム上におくと、長時間にわたる観察が可能である。剥離表皮では、白色光低CO2濃度では気孔は開くが、白色光高CO2における閉鎖は観察されない。また、葉片で見られる赤色光低CO2濃度における開孔は見られなくなる。剥離表皮を葉肉上にもどすと葉片と同様な反応が見られる。したがって、気孔の高CO2における閉口や赤色光による開口には葉肉からのシグナルが効くといえる。また高CO2による閉口は光合成阻害剤の有無にかかわらず起こるが、赤色光に開口は光合成阻害剤によって阻害される。この葉肉シグナルの実態を探るべく、メタボローム解析を行ったが、環境条件によって大きな変化をみせる有機酸やアミノ酸はなかった。今後糖類、植物ホルモン類などを精査する予定である。CAM植物のコダカラベンケイソウでも同様な実験を行った。日中に墓ら剥離した表皮の気孔は光に応答しないが、夜間に剥離した表皮の気孔は光に応答して大きく開口した。また、同一時間帯に解析した場合でも、葉からの剥離した表皮と葉片とでは光に対する応答性が異なった。これらの結果から、CAM植物の気孔開閉制御にはリズムや葉肉組織からのシグナルが関与することが示唆された。いずれの系でも、単色光の効果を精査をする段階までには至らなかったが、2013年度以降も、経常経費などを利用して研究を継続する予定である。最近、気孔の開閉への葉肉の関与が話題になっている。また、気孔開度におよぼす光環境の光受容体が孔辺細胞にのみ存在するとは限らず、葉肉にも存在する可能性がある。気孔開閉への緑色光の影響を、表皮と葉肉に分けて解析するために、Mottら(2008)を参考に、気孔観察システムを構築し、ツユクサの葉を用いて、気孔開閉応答における葉肉の役割を研究した。剥離表皮をゲルに載せて適度な水分を保つと数時間におよぶ観察が可能になった。ゲルに載せた剥離表皮に赤色光で照射しても気孔はほとんど開かないが、これを葉肉に載せると赤色光に応答して開くようになる。剥離表皮を青色光を含む白色光で照射すると気孔は開くが、その状態でCO2濃度を高めてもほとんど閉鎖は見られない。剥離表皮を葉肉に載せると、高CO2による閉鎖が見られるようになる。剥離表皮と葉肉の間にポリエチレンのスペーサーを挟むと、気孔は、剥離表皮の気孔と同様の挙動を示すが、緩衝液に浸したセロファンを挟むと、剥離表皮を直接葉肉に載せた時と同様な応答が見られるようになる。これらの結果は、葉肉がアポプラストの液相連絡を介して気孔の開閉に作用することを示している。今後はこのシグナルの特定が課題となる。また、これまでに検討したのは、青色光と赤色光のみなので、本来の課題である、緑色光を用いた実験も行う。また、上記とは異なる実験系で、葉柄から蒸散流を介して与える人工木部液のABA濃度やpHが気孔開度におよぼす影響を精査した。単色光の効果は今後検討の予定である。葉肉組織の関与の重要性が認識されたため、葉肉と剥離表皮の光環境応答性を別個に解析するシステムの構築を急いだ。緑色光の効果を確認する研究にはまだ手がついていない。また、シャガを使った研究には取り組んでいない。しかし、葉肉の関与がある以上、葉肉系と表皮系の分離は必須であり、この意味で順調に進展していると判断した。・ツユクサを用いて、緑色光応答を解析する。・シロイヌナズナの剥離表皮を用いて生理学的な実験を行うことは困難だが、ツユクサの結果に基づいて、シロイヌナズナの野生型、フォトトロピンやクリプトクロムの変異体の葉片の光応答を解析する。

・シャガを用いた、気孔分化の研究に着手し、少なくとも予備的な結果を得る。植物の栽培用消耗品(約20万円)、LEDなどの光源(約20万円)、光学顕微鏡用レンズやファイバーによる照射系(約20万円)、その他の消耗品(約20万円)、の購入に用いる。20万円程度を研究発表用の旅費や英文校閲に用いる。
空間テータ曲線の局所変形とVassiliev不変量の研究

結び目・絡み目の局所変形にC_k-moveと呼ばれるものがある.これは葉広氏により定義されたもので,同氏は数年前に次の驚くべき結果「2つの結び目の位数k-1のVassiliev不変量が等しい為の必要十分条件は,それらがC_k-moveで移り合うことである.」を示した.結び目の集合をC_k-moveで割った同値類(これをC_k同値類と呼ぶ)は,結び目の連結和という操作の下で可換群になる.これは葉広氏の結果の証明のキーポイントである.結び目理論で良く扱われる空間グラフの1つに,空間θ曲線と呼ばれるものがある.空間θ曲線に対してもC_k-moveが定義できるのであるが,最近の私の研究により,空間θ曲線のC_k同値類が頂点連結和と呼ばれる操作の下で群構造をもつ事がわかり,位数kの低いところでは,葉広氏の定理と同様な結果が得られることがわかった.結び目のC_k同値類のなす群と空間θ曲線のC_k同値類のなす群の大きな違いは,結び目の方は可換群になるのが明らかなのに対し,空間θ曲線の方は位数kが大きくなると可換か否かの判定が困難になる事が挙げられる.平成13年度の研究成果として次が得られた.[定理]空間θ曲線のC_k同値類のなす群が可換であれば,2つの空間θ曲線の位数k-1のVassiliev不変量が等しい為の必要十分条件は,それらがC_k-moveで移り合うことである.従って,空間θ曲線のC_k同値類のなす群が可換か否かを調べることが重要な課題であった.これに対し,平成14年度の成果として次が得られた.結び目・絡み目の局所変形にC_κ-moveと呼ばれるものがある.これは葉広氏により定義されたもので,同氏は数年前に次の驚くべき結果「2つの結び目の位数κ-1のVassiliev不変量が等しい為の必要十分条件は,それらがC_κ-moveで移り合うことである.」を示した.結び目の集合をC_κ-moveで割った同値類(これをC_κ同値類と呼ぶ)は,結び目の連結和という操作の下で可換群になる.これは葉広氏の結果の証明のキーポイントである.結び目理論で良く扱われる空間グラフの1つに,空間θ曲線と呼ばれるものがある.空間θ曲線に対してもC_κ-moveが定義できるのであるが,最近の私の研究により,空間θ曲線のC_κ同値類が頂点連結和と呼ばれる操作の下で群構造をもつ事がわかり,位数κの低いところでは,葉広氏の定理と同様な結果が得られることがわかった.結び目のC_k同値類のなす群と空間θ曲線のC_κ同値類のなす群の大きな違いは,結び目の方は可換群になるのが明らかなのに対し,空間θ曲線の方は位数κが大きくなると可換か否かの判定が困難になる事が挙げられる.本年度の研究成果として次が得られた.[定理]空間θ曲線のC_κ同値類のなす群が可換であれば,2つの空間θ曲線の位数κ-1のVassiliev不変量が等しい為の必要十分条件は,それらがC_κ-moveで移り合うことである.今後の研究の課題は,可換か否かを明らかにすることである.結び目・絡み目の局所変形にC_k-moveと呼ばれるものがある.これは葉広氏により定義されたもので,同氏は数年前に次の驚くべき結果「2つの結び目の位数k-1のVassiliev不変量が等しい為の必要十分条件は,それらがC_k-moveで移り合うことである.」を示した.結び目の集合をC_k-moveで割った同値類(これをC_k同値類と呼ぶ)は,結び目の連結和という操作の下で可換群になる.これは葉広氏の結果の証明のキーポイントである.結び目理論で良く扱われる空間グラフの1つに,空間θ曲線と呼ばれるものがある.空間θ曲線に対してもC_k-moveが定義できるのであるが,最近の私の研究により,空間θ曲線のC_k同値類が頂点連結和と呼ばれる操作の下で群構造をもつ事がわかり,位数kの低いところでは,葉広氏の定理と同様な結果が得られることがわかった.結び目のC_k同値類のなす群と空間θ曲線のC_k同値類のなす群の大きな違いは,結び目の方は可換群になるのが明らかなのに対し,空間θ曲線の方は位数kが大きくなると可換か否かの判定が困難になる事が挙げられる.平成13年度の研究成果として次が得られた.[定理]空間θ曲線のC_k同値類のなす群が可換であれば,2つの空間θ曲線の位数k-1のVassiliev不変量が等しい為の必要十分条件は,それらがC_k-moveで移り合うことである.従って,空間θ曲線のC_k同値類のなす群が可換か否かを調べることが重要な課題であった.これに対し,平成14年度の成果として次が得られた.
次世代シーケンサーによる遺伝子解析の難聴診断・治療への応用

東大病院耳鼻科難聴外来を受診した難聴患者が19名、およびその家族42名を対象に解析。ターゲットシークエンスは、難聴遺伝学的検査でも取り上げられている19遺伝子とUsher症候群とWaardenburg症候群の原因遺伝子をカバーするように計32遺伝子アミノ酸コード配列全体を対象にし、AgilentのSureSelectを用い、illumina Miseqを用いて解析を行った。結果、19難聴遺伝学的検査でも調べられている、いわゆるhot spotについて3人の患者サンプルに病因とみられる変異が見つかったターゲットシークエンスと全エクソン遺伝解析結果を用い、新たな難聴遺伝子について検索を行った。全エクソンシークエンスをおこなったある1症例について、臨床的にwaardenburg症候群の疑いが生じてきたため、症候群の原因遺伝子について点変異を確認した。遺伝子変異の解析は、Burrows-Wheeler Aligner(BWA)によるリファレンス(hg19)のマッピング、Genome Analysis Toolkit (GATK)での変異検出、annovarによる遺伝子のアノテーションにより行った。得られた変異は、dbSNPと1000 Genomes、Human Genetic Variation Browserの1208人のエクソームデータ、当科の正常症例862サンプルと4種類のデータベースを使用し、登録されているアレル頻度6%以上の変異は一塩基多型(SNP)として除外した。Waardenburg症候群の遺伝子(PAX3,MITF,EDRNB,EDN,SOX10)について点変異を確認したところ、PAX3:p.R261Xにstopgainの変異を認めた。両親の血液サンプルと本人についてSangerシークエンスを行ったところ、白髪と目の症状を持つ父親にヘテロ変異を認め、症状からPAX3変異がcausalだと推測された。兄弟で難聴が存在した症例について、健聴の両親と家族については全エクソン解析結果を用い遺伝形式ごとに解析を行った。ホモ接合遺伝形式で4遺伝子に、複合ヘテロ遺伝子で9遺伝子に候補変異が見つかった。コピー数解析も行ったが明らかなコピー数変異は見つからなかった。新規の患者のターゲットシークエンス解析がやや遅れている。原因としては試薬の高騰により以前使用した試薬ではなく他社の試薬を購入したため、以前のデータが使えず試薬の購入も予定より時期が遅れたためである。現在新規の患者については両親の検体とともにDNA抽出を行い、ターゲットシークエンスのライブラリーを調整中である。H28年度にライブラリー調整を行っていた難聴の症例とその両親についてターゲット検査を行った。解析は、東大病院耳鼻科難聴外来受診した難聴患者が19名、およびその家族42名を対象にした。東京大学医学部倫理委員会の審査・認証を経て、同意を得られた患者を対象にしている。ターゲットシークエンスは、難聴遺伝学的検査でも取り上げられている19遺伝子とUsher症候群とWaardenburg症候群の原因遺伝子をカバーするように計32遺伝子アミノ酸コード配列全体を対象にし、AgilentのSureSelectの試薬を用い、illumina Miseqを用いて解析を行った。得られた変異のうちの除外については、dbSNPと1000Genomes,ToMMO,当科でのデータベースに登録されているminor allele frequency 3%以上の変異は一塩基多型(SNP)として除外した。結果、19難聴遺伝学的検査でも調べられている、いわゆるhot spotについて3人の患者サンプルに病因とみられる変異が見つかった(3/19=15.8%)。3人についてCDH23、USH2A,TMPRSSの常染色体劣性遺伝子に複合ヘテロでの候補のpositionに新規の変異を認めた。従来の遺伝子検査では解析しえなかった難聴遺伝子の新規の変異部位の探索が可能であった。遺伝子の種類により難聴の程度や進行の有無を高精度に予測することが可能になったため、解析結果によって人工内耳の選択等臨床的に有用な情報を得ることができて速やかな対応が可能となった。元々の試薬から変更し、ミトコンドリアと常染色体を同じ実験系でターゲット解析を行えるようになり当初より進展した難聴遺伝子解析が可能となった。結果、19難聴遺伝学的検査でも調べられている、いわゆるhot spotについて3人の患者サンプルに病因とみられる変異が見つかった東京大学耳鼻咽喉科に来院する難聴の患者より採血もしくは口腔内の粘液採取にて検体を採取し遺伝子解析を実施する、これまで解析を行ってきた難聴患者38名に関して既知の既知の難聴遺伝子の全エクソン領域については解析終了し、既知難聴遺伝子以外の遺伝子のエクソン領域について解析を28年度からさらに評価を進める。変異情報を絞り込むためにもアレル頻度情報によるフィルタリングを1000genome database、DBExome、TOMMOなどの公共のデータベース、東京大学先端学研究所ゲノムサイエンス講座でのin Houseのデータベースを用いて行う。現在難聴遺伝子が明らかになっていない21症例の両親についてターゲットシークエンス検査を行う。それで変異が明らかにならなかった場合全エクソンシーケンスを行い、遺伝形式を確認しながらTrio解析を行う。コピー数変化について、全エクソンシーケンスデータを使用し、難聴患者だけではなく患者の両親も解析し、難聴と関連あるコピー数変化について探索予定である。

さらに、全エクソンシーケンスデータを使用しコピー数変化について検討を行う。コピー数変化と塩基置換の複合ヘテロ変異でも病因になりうるのか検討も追加する。一方難聴症例を先天性でなく後天性にも広げ、難聴の蓄積がある家系を中心に遺伝子解析をすすめていく予定である。また兄弟でも難聴の程度が違うものについても新規遺伝子を探索する。29年度が最終年度であるため、記入しない。医学29年度が最終年度であるため、記入しない。
神経細胞内の分子移動障害による痴呆発症機構の解明

高齢化社会で重要課題であるアルツハイマー病研究での研究には、2つの方向性がある。1つは、アミロイド蛋白を中心としたものであり、老人斑の神経病変を出発点にしている。残る1つは、神経原線維変化であり、タウ蛋白を中心に展開している。神経原線維変化はアルツハイマー病だけでなく、多くの痴呆症に散見されることから、むしろ痴呆症共通カスケードとして出現する非特異的な病変である可能性が考えられてきたが、FTDP-17(rontotem poral dementia with parkisonism linked to chromosome17)の原因遺伝子がタウ蛋白であることから多くの注目を集めるに至っている。今回、アルツハイマー病をはじめとする痴呆症におけるタウ蛋白の生理学的および病理学的意義を探索する目的で、6種類のタウ蛋白分子種を識別するモノクローナル抗体とポリクローナル抗体を作成した。まず、その特異性を確認した後、実際のアルツハイマー病脳組織を用いて分析したところタウアイソフォームの不均一性が観察された。すなわち、タウ352とタウ381の2つの分子種の脳内蓄積が他のアイソフォーム(タウ383、410、412、441)より顕著であることを見出すことができた。この結果は、従来タウ蛋白の異常リン酸化の高進だけに焦点が集められてきた神経原線維変化研究に対し、アイソフォームの変化という痴呆研究に新たな視点を与えるものであり、FTDP-17とも共有する異常反応である可能性が示唆された。今回の結果は、痴呆症の病因機構の解明だけでなく診断という臨床応用面でも有用である可能性があり、今後の研究展開の重要性が考えられる。
東南アジア大陸部における民族間関係と「地域」の生成

本年度は、具体的な事例の照合を行う比較研究と、研究課題に関する知見を深める目的で、他地域での隣地調査に従事した研究者、さらに他の研究分野で現地体験を持つ専門家を招いて計5回の研究会を開催した。その作業を通じて確認されたのは次の論点である。第一に、民族間関係の考察における観念論的研究と実態研究の接合の方法論的検討の必要性、第二に、フィールドで交錯するさまざまな立場からの視点に研究者が対峙しているという現実についての共通認識、第三に、それぞれのフィールドで目下展開する「自文化の構築」についての問題意識などである。今後はさらに「地域」の生成との関連から民族間関係についての議論を重ねる予定である。
特殊関数の大域的研究

1.積分表示式を利用する事により、二変数Bessel関数に関し、巾級数開,モノドロミ-行列,不確定特異点における漸近展開,ストークス係数等の大域的性質を明らかにした。(下村)2.立法体内でのビリヤードの軌跡に関するRauzyの予想が解決された。(塩川)3.ポアソン多様体上において,微分可能関数環にパラメーターを添加した形式巾級数環を考え,その中に非可換積を構成した。そらに無限次元ILH Lie環のユニーバーサルエンベロップ代数に対応するものを構成した。(前田)4.2-スリット実験の数値解析を実行し,粒子の軌跡の図を描いた。得られた図は量子力学におけるものであるにもかかわらず,古典力学の軌跡の概念に近いものであることが興味深い。(石川)5トーラス上の正値フーリエ級数をもつ局所L^2関数はL^2関数になるが,実数直数上の正値フーリエ変換をもつ局所L^2関数に対してはこのような事はいえない。そのような例を構成し,L^2関数になるための十分条件を求めた。(河添)今後上記の成果の様々な応用,発展が期待される。
グリア機能の操作と計測による脳内異種細胞間ネットワーク機構の解明

種々の標本を用いて、細胞質局在型のpHセンサーの性能評価を行った。脳スライス標本において、電気刺激により誘発した神経活動に伴い、周辺のグリア細胞がアルカリ化すること、またグリア初代培養細胞において、D-アスパラギン酸投与によりグリア細胞内が酸性化することが確認された。上記2点は従来の報告にある現象と一致しており、作製したpHセンサーが期待通りに動作しており、脳内のグリア細胞内pHの計測が可能であることが確認された。一方で、細胞質局在型のセンサーでは、特に観察対象としたい神経細胞近傍を取り巻くグリア微細突起構造上のpH変化をとらえるには、発現パターンが適していないことも明らかになった。このため、当該年度においては新たに、細胞膜上に限局して発現するタイプのpHセンサーの設計、開発、および遺伝子改変マウスへの実装を行った。細胞膜局在シグナルとしては、過去にカルシウムセンサーG-CaMPとに付加して用いられた実績のある配列を応用し、これをpHセンサーのN末端側に付加した発現ベクターを作製した。この発現ベクターをHEK293T細胞にトランスフェクションした際、pHセンサーが発する蛍光が細胞膜上に局在することを確認した。また発現局在確認の後、pH計測機能の確認実験を行い、pH7.4付近で線形に蛍光強度比が変化することが確認された。このセンサーを用いて脳内環境の生理的変化に伴うグリア細胞内pHの変化を計測可能であると考えられたため、このpHセンサーを発現する遺伝子改変マウスの作出に着手する予定である。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
複合汚染環境における薬剤耐性遺伝子の消長とヒト病原菌への伝播リスク

抗菌剤とほかの化学物質の共存下での薬剤耐性菌の応答を明らかにした.1)特定の金属存在下で薬剤耐性遺伝子の水平伝播が促進されることが明らかになった.2)その促進の有無は遺伝子の供与菌種と受容菌種の組み合わせなどで異なったことから,環境由来日和見感染菌の耐性獲得リスクはケースバイケースであることが示唆された.3)海水中のyet-to-becultured細菌群集が耐性遺伝子のリザーバになっていることを初めて明らかにした.4)薬剤汚染がほとんどない環境でも耐性遺伝子は残存する実態が明らかになった.今後は環境の耐性遺伝子の人間環境への侵入ルート,そのリスクを明らかにする必要がある.抗菌剤とほかの化学物質の共存下での薬剤耐性菌の応答を明らかにした.1)特定の金属存在下で薬剤耐性遺伝子の水平伝播が促進されることが明らかになった.2)その促進の有無は遺伝子の供与菌種と受容菌種の組み合わせなどで異なったことから,環境由来日和見感染菌の耐性獲得リスクはケースバイケースであることが示唆された.3)海水中のyet-to-becultured細菌群集が耐性遺伝子のリザーバになっていることを初めて明らかにした.4)薬剤汚染がほとんどない環境でも耐性遺伝子は残存する実態が明らかになった.今後は環境の耐性遺伝子の人間環境への侵入ルート,そのリスクを明らかにする必要がある.薬剤耐性菌の水圏環境中での発生原因,潜伏場所,移動・拡散などの知見はいまだにないので,本研究では,環境細菌において,薬剤耐性が様々な化学物質によっても誘導され,その形質がヒトの病原細菌にまで侵入・伝播する機構と実態を解明することを目的としている.初年度では,台湾の台南地域が水銀に汚染され,大きな養鶏場,養殖場が近接することを申請者は予備調査でみいだしているので,この地域を調査フィールドとし,研究過程で,さらに適切な場所がみいだされた場合は加えて検討することとした.現場の汚染状況調査では,抗生物質定性・定量はHPLCおよびLC-Ms/Msを用い,金属分析はICP-Msを用いた.水銀は原子吸光法も併用した.また,備品としてリアルタイムPCRを購入し,現場の薬剤耐性遺伝子の定量を行なった.さらに,現場試料では培養法で耐性率算出を行ない,細菌を分離した.台湾試料では,オキシテトラサイクリン(OTC)耐性遺伝子tetAと水銀の耐性遺伝子merA両方を持つ菌が見いだされた.ヒトの腸内細菌が多く,これら耐性菌はヒトや家畜に由来する種が環境へ放出されたものであることが示唆された。tetAとmerAは遺伝子タイプの違うものが同じ菌に担われている場合があり,独立的に伝播していると考えられた.また,韓国の南岸,ガーナのラグーンなどが複合汚染の可能性があるため,予備調査を行った.現在遺伝子の定量中である.当初予定していたマイクロコズムでの群集構造への汚染影響は実施できなかったので,23年度に行なう計画である.ヨーロッパの状況視察と今後の共同研究の打ち合わせをヘルシンキ大と行い,23年度からシングルセルレベルでの遺伝子伝達実験の予備研究を行なう計画を立てた.24年度から本格的に開始する予定である.薬剤耐性菌の水圏環境中での発生原因,潜伏場所,移動・拡散などの知見はいまだにないので,本研究では,環境細菌において,薬剤耐性が様々な化学物質によっても誘導され,その形質がヒトの病原細菌にまで侵入・伝播する機構と実態を解明することを目的としている.2年目(H23年度)は昨年度実施に至らなかったマイクロコズムでのオキシテトラサイクリン(OTC)の水中から堆積物への移行と堆積物中の微生物群集への影響を調べた.その結果,30日間で海水へ添加したOTCの60%が堆積物へ移行した.このとき,60μg/gのOTCでは群集構造に有為な変化はなかった,通常OTCでは800μg/mlが有効濃度(ED)である,ED以下の濃度では耐性菌の選択が起こると言われており,今回の結果では耐性率変化は得られていないが,菌叢変化は起こらない事が示唆された.この結果は現在論文を作成中である.また,近年,船舶排気・排水からのバナジウム(V)汚染が懸念されているが,Vの海洋微生物生態系への影響はまったく不明である.本年度,VがOTC耐性遺伝子tet(M)の海洋性細菌から大腸菌への伝達率を上昇させることを明らかにした.さらに,太平洋の底泥試料中のV濃度とOTC耐性率に正の相関があり,実験的に明らかにした耐性遺伝子の水平伝播促進が自然界でも起こっていることが考えられた.Vの遺伝子水平伝播への影響は初めて明らかにされたもので,現在論文を投稿中である.さらに,複合汚染として重油と亜鉛の微生物生態系影響にも着目している.本研究に関連して,多くの海外の研究者達と抗生物質,金属などによる環境中での薬剤耐性菌出現に関するワークショップを持ち,現在総説論文を複数作成中であり,本研究テーマが国際的にも重要視されていることが確かめられた.次年度は本研究をさらに国際共同研究へ展開する予定である.抗生物質汚染のない自然環境でも薬剤耐性菌,耐性遺伝子が広く分布することが知られてきた.特定の薬剤種に対応する耐性遺伝子は,1対1の対応で出現するだけではなく,対応する薬剤以外の汚染や抗生物質以外の化学物質汚染によっても引き起こされる例が知られつつある.

本研究の目的は,環境細菌が抗生物質を含む複数の化学汚染物質で誘導され,発生した耐性菌(遺伝子)が人へのリスクになるか否かを明らかにすることである.作業仮説としては,耐性遺伝子の水平伝播が複合的汚染によって促進されるか?,またその伝播が環境細菌からヒトの病原菌や腸内細菌へ伝播するのではないか?,という2つを立て,これらの検証を試みる.平成24年度にはバナジウムが海洋細菌Vibrioから大腸菌へのテトラサイクリン耐性遺伝子tet(M)の水平伝達を促進する効果があることを報告した.薬剤耐性遺伝子の伝達に及ぼす金属の影響が一般的に起こるものかどうかを知る事は,複合汚染のリスク要因か否かを決める上で重要である.平成25年度は水圏環境からの日和見感染菌として各国で問題視されているアシネトバクターから環境細菌への耐性遺伝子伝達に焦点をあてた.実験では養豚場排水から分離されたサルファ剤耐性遺伝子sulが水圏環境中で汽水・海水環境でビブリオ属細菌へ伝達されるか否かをしらべた.その結果,種々の実験条件下でもアシネトバクターの場合はバナジウムの遺伝子伝達促進効果は認められなかった.菌種,金属種,伝達因子などによって異なることが示唆された.薬剤耐性菌の水圏環境での発生原因,潜伏場所,移動・拡散などの知見を得るために,本研究では,環境条件下で,薬剤耐性菌および耐性遺伝子が,抗生物質とともに,他の化学物質による複合影響で誘導される機構および耐性遺伝子がヒトの病原菌へ伝達または耐性環境細菌がヒト環境へ侵入する実態を明らかにすることを目的としている.3年目(平成24年度)は,昨年度実験的に解明したオキシテトラサイクリン(OTC)の動態およびバナジウムによるOTC耐性遺伝子tet(M)の水平伝播促進についての論文を公表した.また,新しい研究アイデアとして,(1)水圏環境の「非培養菌」の耐性遺伝子のリザーバとしての働きを明らかにするため,フィリピンで以前に採取してあった試料を再分析し,サルファ剤耐性遺伝子sul1, 2, 3のうち,sul1, 2は培養可能菌が主に有する一方でsul3は稀であるが,海洋では非培養菌がsul3を保有することが明らかになった.これはまったく新しい実態の解明である.さらに,(2)四国沿岸養殖場で分離したOTC耐性海洋細菌から,tet(M)をプラスミド中に保有し,それが大腸菌のゲノム上へ伝達するこれまでにない水平伝達機能を発見した.現在全ゲノム解析によって,大腸菌ゲノム上の挿入位置の特性を解析中である.本研究では,複数の抗生物質の濃度測定と薬剤耐性遺伝子の定量,および培養可能菌・非培養菌での比較解析という新しいアプローチで実験的証明をし,さらに現場観測との比較による実態へのフィードバックの両面で進めており,順調に期待した成果が出ている.また,遺伝子定量の研究では予定外の新規な結果も得られつつあり,次年度に継続する.薬剤耐性菌の水圏環境中での発生原因,潜伏場所,移動・拡散などの知見はいまだになく,本研究では,環境細菌の薬剤耐性能が種々の薬剤や化学物質によって誘導され,その形質がヒトの病原細菌にまで侵入・伝播する機構と実態を解明することを目的としている.これまで,1)水銀とテトラサイクリン(TC)耐性遺伝子の共存が見られた.2)バナジウムでTC耐性遺伝子の水平伝播が促進されることが初めて分かり,これはビブリオから大腸菌への伝播ではみられたが,アシネトバクターではみられなかった.3)TCは遮光下の水環境中では60%が30日間で堆積物へ移行し,水中には5-6%が残存した.
微細藻類のスターチ生合成を制御する分子機構の解明

TORの活性をその特異的な阻害剤ラパマイシンにて阻害したところ、通常培養条件であるにも拘らず、細胞内にスターチの蓄積が観察された。スターチ合成に関わる遺伝子群のmRNA量は、TOR活性阻害によって変化しなかったことから、転写後調節によってスターチ量が調節されている可能性が考えられた。そこで、翻訳後調節の主制御であるリン酸化に注目し、LC-MS/MSを用いてリン酸化タンパク質とその量的な変動を観察した。その結果、53個のタンパク質のリン酸化状態がTORの活性依存的に変化することが明らかになった。また、53個のリン酸化部位周辺のアミノ酸配列を解析した結果、RXXSP (Xは任意のアミノ酸)モチーフが見出された。同定された53個のタンパク質の内、Glycogeninタンパク質に着目した。酵母におけるGlycogeninの相同タンパク質は、スターチ生合成の初期段階において重要な役割を担っていることが明らかになっているからである。Glycogeninタンパク質のリン酸化が確認された613番目のセリン残基について、リン酸化状態を常に模倣するためにグルタミン酸残基に置換したGlycogenin(リン酸化模倣)が発現するシゾン株、リン酸化が引き起こされない状態を常に模倣するためにアラニン残基に置換したGlycogenin(脱リン酸化模倣)が発現するシゾン株をそれぞれ構築した。その後、各株におけるスターチ蓄積量をコントロール株と共に比較した。その結果、リン酸化を模倣したGlycogenin発現株に対して、脱リン酸化を模倣したGlycogenin発現株では、スターチ量が2倍に上昇していた。このことは、Glycogeninの特異的な残基のリン酸化状態によって、スターチ量が調節されていることを示している。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。TORの活性を阻害すると、微細藻類において中性脂質であるトリアシルグリセロール(TAG)が蓄積することが我々の先行研究によって明らかになっている。スターチ生合成系を不活性化すると、TAGの蓄積量が増加することから、光合成で同化された余剰な炭素は、まずスターチとして貯蔵され、その後にTAGとして蓄積すると考えられている。よって、今年度はまず、TOR (target of rapamycin)の活性とスターチ蓄積との関係を解析した。実験には、TORの特異的な阻害剤である、ラパマイシンに対して感受性性を示す紅藻シゾンSF12株を用いた。SF12株にラパマイシンを添加した後のスターチ量を測定した。その結果、ラパマイシンを添加した後にスターチ蓄積が観察された。このことから、TOR阻害によって、スターチ蓄積が誘導されることが示された。ラパマイシンを添加してTORを阻害した際、どのようにしてスターチ蓄積が引き起されるのかについて、その機構の一旦を明らかにすることを試みた。その分子機構を解明する手がかりとして、リン酸化プロテオーム解析を行い、TORの基質タンパク質の情報を得ることを試みた。その結果、TORに阻害によって、リン酸化の程度が変化したタンパク質を同定することができ、TORの基質候補をピックアップした。その中で、スターチなどの糖質合成に関わるであろう因子を探索し、次年度の機能解析の基盤情報を得た。本年度の計画は、TOR阻害時におけるスターチ蓄積量の変動を解析すること、更に、TORの基質タンパク質の情報から、スターチ生合成に関わるであろう因子をピックアップすることである。スターチ蓄積量に関しては、ラパマイシン感受性シゾンを用いてTORを不活性化した条件でのスターチ量を測定した結果、スターチが時間経過と共に蓄積することを明らかにしている。また、リン酸化タンパク質の網羅的な解析によって、スターチなどの糖質合成に関わるであろう候補因子を幾つかピックアップすることに成功している。よって、おおむね計画通りに順調に研究が進んでいると考えられる。微細藻類を用いたエネルギー生産系は、次世代の再生可能エネルギー生産として注目を集めている。しかし、微細藻類を用いた大規模かつ商業的なエネルギー生産系は確立されていない。その大きな障壁は、生産にかかる高いコストでる。この課題を解決するためには、微細藻類が生産するバイオマスの生合成メカニズムを理解することが肝要であると考えられる。微細藻類が生産するバイオマスは多岐に渡るが、液体燃料の原料となるトリアシルグリセロールなどの中性脂質については、多くの研究者が生産性向上を目指している。しかし、油脂を抽出した後の藻類残渣の有効利活用法は見出されていない。当研究グループの先行研究により、藻類から油脂を抽出した後に多く含まれるスターチなどの糖質を化学触媒を用いて、レブリン酸メチルや乳酸メチルへ変換することに成功している。レブリン酸メチルや乳酸メチルは、医薬品や生分解性プラスチックの原料であり、藻類バイオマスを高付加価値化できる。本研究では、それら有用化合物の原料となるスターチの細胞内生合成の制御機構を明らかにすることを目的にしている。本年度は、リン酸化プロテオームで得たスターチ生合成に関わるタンパク質の機能解析を行った。各候補タンパク質を過剰に発現する株を取得し、スターチ蓄積に対する影響を観察した。その結果、GAP1と命名したタンパク質を過剰に発現した際に、スターチ量がコントロール株に比べて約5倍に上昇していることを見出した。TORの下流で機能するスターチに関連するタンパク質を同定していることから、概ね順調に研究が進展していると判断できる。