hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
部位特異的制限酵素I-PpoIを応用したPCRによる染色体転座検出法の開発

放射線照射後の突然変異の中でも染色体転座は最も重篤な変異であるが、その検出は染色体実験に関する熟練した技術が必要であり、その技術を臨床現場に広く普及させることは極めて困難である。本研究では部位特異的制限酵素I-PpoIを用いて、迅速かつ簡便な転座検出法の開発を目指した。タモキシフェン誘導体4-OHTによりI-PPoIを誘導するHT1080細胞を用いて、rDNA部位およびDAB1遺伝子間での染色体転座をPCRにより検出することを試みたが、明らかな増幅は認められなかった。その他の実験結果を合わせた総合的解釈として、転座検出のためにはより高い効率でI-PpoI部位を切断する必要があると考えられた。二次発がんを導く重篤な突然変異として染色体転座がある。転座はDNA二本鎖切断後に導かれるが、転座発生までのステップは複雑であり様々なDNA修復因子が関わるため、患者の遺伝的背景からその予測をすることは極めて困難である。一方、現在主流の放射線誘発染色体転座を検出する方法は熟練した技術が必要であり測定完了まで数日を要する。本研究ではPCRを用いた新染色体転座検出系を開発することで、細胞内における放射線誘発染色体転座頻度を簡便かつ短時間に予測する方法の確立を目指す。本研究では、転座発生原因となる放射線照射誘発DNA二本鎖切断(DSB)を模倣且つ制御するために、15bpと長い認識配列を有するゲノム内在性制限酵素I-PpoIを用いる。本年度は全細胞集団においてI-PpoIを同時期に誘導するため、細胞はタモキシフェン誘導体4-O(4-hydroxytamoxifen)で誘導可能なI-PpoI-HT1080細胞を樹立した。4-OHT誘導DSB量を調整するため、4-OHTの濃度及び処理時間の条件検討を行った。4-OHTの濃度は、転座が発生するまでの期間である72時間以内に細胞死が起こらないことを基準として設定を行った。条件検討を行う際に、DSB量の評価は蛍光免疫染色によるgH2AX fociを用いて行った。その結果、300 nM 4-OHTの4時間添加が細胞に適度のDSBを誘導が誘導出来ることが確認出来た。一方、現在主流の放射線誘発染色体転座を検出する方法は、熟練した技術が必要であり測定完了まで数日を要する。本研究では転座発生原因となる放射線照射誘発DNA二本鎖切断(DSB)を模倣且つ制御するために、15bpと長い認識配列を有するゲノム内在性制限酵素I-PpoIを用いる。本年度は全細胞集団においてI-PpoIを同時期に誘導するため、細胞はタモキシフェン誘導体4-0HT(4-hydroxytamoxifen)で誘導可能なI-PpoI-HT1080細胞を樹立した。その結果、300nM 4-OHTの4時間転嫁が細胞に適度のDSBを誘導できることが確認出来た。本研究の基盤となるI-PpoI-HT1080細胞が樹立することができ、DSB誘導条件が決定したことから、研究計画に沿って順調に進展していると考えている。またDSB切断は、DSBマーカーであるgH2AX、DNA切断部位におけるPCRにより確認することが出来た。しかし転座を検出するためのプライマーセットではPCRによる増幅が認められなかった。すなわち、本研究で標的にしていた染色体間での転座の検出は現在のプライマーセットでは検出できないことが明らかになった。本年度は全細胞集団においてI-PpoIを同時期に誘発するため、細胞はタモキシフェン誘導体4-OHT(4-hydroxytamoxifen)で誘導可能なI-PpoI-U2OS細胞の作成および樹立を試みた。しかしながらER-I-Ppo1を発現するU2OS細胞でのDSBの切断が認められなかった。

そのため、昨年度まで使用したI-PpoI-HT1080細胞を使い、1000 nM 4-OHT処理後のrDNA部位での転座頻度をPCRにより測定したが、4種類の転座の組み合わせの全てで転座の発生はほとんど確認出来なかった。他染色体実験による放射線照射後の転座頻度を上昇させるATM阻害剤およびDNA-PK阻害剤の処理も試みたが、I-Ppo1によって誘発されるrDNA部位での転座はほとんど観察されなかった。qPCRにより切断効率を確認した結果、約30-50%のみが切断されていたため、今後の課題として切断効率を上げる方法の確立が必要であると考えられた。放射線照射後の突然変異の中でも染色体転座は最も重篤な変異であるが、その検出は染色体実験に関する熟練した技術が必要であり、その技術を臨床現場に広く普及させることは極めて困難である。本研究では部位特異的制限酵素I-PpoIを用いて、迅速かつ簡便な転座検出法の開発を目指した。タモキシフェン誘導体4-OHTによりI-PPoIを誘導するHT1080細胞を用いて、rDNA部位およびDAB1遺伝子間での染色体転座をPCRにより検出することを試みたが、明らかな増幅は認められなかった。その他の実験結果を合わせた総合的解釈として、転座検出のためにはより高い効率でI-PpoI部位を切断する必要があると考えられた。本研究の基盤となるI-PpoI-HT1080細胞が樹立することができ、DSB誘導条件が決定したことから、研究計画に沿って順調に進展していると考えている。適正な4-OHT濃度及び処理時間を用いて、今後は異なるプライマーセットを用いて転座部位でのPCRを試みる。また数時間のみの一過性I-PpoI発現を可能にするため、精製I-PpoI酵素を細胞内に導入するPCR転座検出法の確立も併せて進めていく。適正な4-OHT濃度及び処理時間を用いて、今後は転座部位でのPCRを試みる。前年度の後半に計画していたリアルタイムPCR解析へ向けた条件検討が遅れたため、解析に必要な試薬を購入しなかった。リアルタイムPCR解析に必要な試薬を購入する。
ＤＮＡ損傷時のユビキチン修飾による高次クロマチン構造の動的制御

分裂酵母のヘテロクロマチン関連タンパク質であるRik1は、Cul4ユビキチンリガーゼと複合体を形成し、UV損傷修復に関わるDDB1と構造的によく似たタンパク質であることから、ヘテロクロマチン構造の形成ばかりでなく、その領域の損傷修復にも重要な役割を果たしていることが推測される。そのため、本研究では、Cul4ユビキチンリガーゼ複合体によってユビキチン化修飾されるタンパク質を同定するため、まず自身が以前に構築したGST-Ub法を応用し、ユビキチン化修飾を受けるヘテロクロマチン因子のスクリーニングを行った。その結果、ヘテロクロマチン関連因子59種類のうち、25種類のタンパク質のユビキチン化を見出した。さらに、本年度はこれらのユビキチン化タンパク質の中からCul4ユビキチンリガーゼの構成因子をコードするrik1やclr4を破壊した約200株を作製し、Cul4ユビキチンリガーゼによってユビキチン化されるタンパク質の同定を行った結果、2種類のタンパク質を基質の候補として見出した。そのうちの一つがヘテロクロマチンタンパク質HP1/Swi6である。HP1はDNA損傷に応じてリン酸化されることやDNA損傷部位にリクルートされることが報告されているが、その機構に関しては現在に至るまで不明なままである。解析の結果、Swi6はユビキチン化修飾ではなく、SUMO化修飾されている可能性が示唆され、このSwi6のSUMO化がCul4ユビキチンリガーゼ複合体によって直接的もしくは間接的に制御されている可能性を見出した。24年度が最終年度であるため、記入しない。生命は常にDNA損傷の脅威に曝されており、損傷はゲノムのどの領域でも起きると推測されている。ヘテロクロマチンは高度に凝縮した構造であり、この領域の内部に損傷が起こると、その修復に関わる修復因子や細胞周期チェックポイント因子が容易にアクセスできず、非常に効率が悪いことが予想される。しかしながら、生物がいかにこの問題を解決しているかは未だに明らかになっていない。本研究では、Cul4ユビキチンリガーゼ複合体によってユビキチン化修飾されるタンパク質を同定することによって、高次クロマチン領域におけるDNA損傷修復の分子機構を明らかにすることを目的としている。本年度は、自身が以前に構築したGST-Ub法を応用し、ユビキチン化修飾を受けるヘテロクロマチン因子のスクリーニングを行った。その結果、ヘテロクロマチンタンパク質HP1/Swi6がユビキチン様の修飾を受けることを見出した。さらに、Swi6のユビキチン様修飾は、Rik1やClr4をコードする遺伝子の破壊株において消失した。これらの結果から、Cul4ユビキチンリガーゼ複合体がSwi6のユビキチン様修飾を直接的もしくは間接的に行っていることが示唆される。Swi6の翻訳後修飾がCul4ユビキチンリガーゼ複合体によって制御される機構を明らかにすることで、ヘテロクロマチン上のDNA損傷修復機構を明らかにできると考えられる。Cul4ユビキチンリガーゼ複合体によって修飾されるユビキチン化タンパク質を同定するための株の構築に時間がかかったため。Clr4やRik1によって制御されるSwi6のユビキチン様修飾の修飾部位をMS/MSによって同定する。修飾部位を同定した後、変異株を構築し、変異株を用いたクロマチン免疫沈降法(ChIP)を行い、Cul4複合体が修復因子やチェックポイント

因子をDNA損傷部位にリクルートしてくるか検討する。その後、rik1変異株やswi6の変異株で、DNA損傷修復の初期シグナルのH2AX(分裂酵母H2A)、ATM(分裂酵母Tel1)そしてATR(分裂酵母Rad3)のリン酸化が変動するか検討することで、Cul4複合体がDNA損傷修復の初期シグナルに関与しているか明らかにする。最後に各変異株を用いて、DNA損傷時にヘテロクロマチン上のヒストンが変動しているか検討する。
古細菌における分子シャペロンシステムの機能

超好熱性古細菌Thermococcus strain KS-1由来シャペロニンのα,βサブユニットは非常に高い相同性を有しているが,C末端のみ相同性が低い.このC末領域のペプチドを抗原として,各サブユニットに特異的な抗体を作成し,Western Blotting及びELISAにより,菌体内における各サブユニットの量を定量した.その結果,Thermococcus菌体内のシャペロニンでは,生育温度によりオリゴマーのサブユニット組成が異なり,αとβサブユニットのそれぞれが個別に発現制御されていることを明らかにした.αの発現は構成的であり,高温でも発現量は変化しない.一方,βは至適生育温度前後ではαよりも少ないが,温度が上がるに従って発現量が多くなった.また,αホモオリゴマーとβホモオリゴマーの結晶化を試み,αホモオリゴマーの結晶が得られた.T.KS-1のsHspを大腸菌で生産し,その特性を調べた.組換えT.sHspは精製が不十分な状態ではタンパク質の変性中間体に結合する活性はほとんどなかったが,精製度を上げると活性が確認され,Thermoplasma由来Citrate synthaseの熱変性による凝集を防いだ.T.sHspはホモオリゴマーを形成し,その分子量を光散乱法により測定したところ478.6kDaであった.塩基配列から予想されたモノマーの分子量は20kDaであることから24量体であることが予想された.Methanococcus jannashiiのsHspは、結晶構造解析の結果,24量体のサッカーボール型であることが分かっているが,T.sHspも同様な構造を形成していることが示唆される.電子顕微鏡による解析結果もサッカーボール型であることが支持している.また,Pyrococcus horikoshii OT3の2つのPrefoldin遺伝子を大腸菌に組み込む,発現系を構築した.超好熱性古細菌Thermococcus strain KS-1由来シャペロニンのα,βサブユニットは非常に高い相同性を有しているが,C末端のみ相同性が低い.このC末領域のペプチドを抗原として,各サブユニットに特異的な抗体を作成し,Western Blotting及びELISAにより,菌体内における各サブユニットの量を定量した.その結果,Thermococcus菌体内のシャペロニンでは,生育温度によりオリゴマーのサブユニット組成が異なり,αとβサブユニットのそれぞれが個別に発現制御されていることを明らかにした.αの発現は構成的であり,高温でも発現量は変化しない.一方,βは至適生育温度前後ではαよりも少ないが,温度が上がるに従って発現量が多くなった.また,αホモオリゴマーとβホモオリゴマーの結晶化を試み,αホモオリゴマーの結晶が得られた.T.KS-1のsHspを大腸菌で生産し,その特性を調べた.組換えT.sHspは精製が不十分な状態ではタンパク質の変性中間体に結合する活性はほとんどなかったが,精製度を上げると活性が確認され,Thermoplasma由来Citrate synthaseの熱変性による凝集を防いだ.T.sHspはホモオリゴマーを形成し,その分子量を光散乱法により測定したところ478.6kDaであった.塩基配列から予想されたモノマーの分子量は20kDaであることから24量体であることが予想された.Methanococcus jannashiiのsHspは、結晶構造解析の結果,24量体のサッカーボール型であることが分かっているが,T.sHspも同様な構造を形成していることが示唆される.電子顕微鏡による解析結果もサッカーボール型であることが支持している.また,Pyrococcus horikoshii OT3の2つのPrefoldin遺伝子を大腸菌に組み込む,発現系を構築した.
観光に焦点をあてた歓待についての地理学的研究

本研究では,観光に焦点をあて,歓待について地理学的に考察を行った。歓待についての研究はこれまで,「1神への信仰と歓待の関係」,「2無制限の歓待とその制限の関係」,「3現代社会におけるサービスと歓待の関係」,という三つの観点に注目して主として検討が行われてきたが,文化社会的関心に基づく1・2と,経営的関心に基づく3の関係性についての考察がほとんどなされてこなかった。そのため本研究では,現代資本主義社会おける象徴的な歓待現象である観光に注目し,与論島と沖縄本島を事例としてこれらの関係性について検討した。本研究は、観光に焦点をあて、歓待について地理学的に考察を行うものである。歓待についての研究はこれまで、(1)神への信仰と歓待の関係、(2)無制限の歓待とその制限の関係、(3)現代社会におけるサービスと歓待の関係、という3つの観点に注目して主として検討が行われてきたが、文化社会的関心に基づく(1)・(2)と、経営的関心に基づく(3)の関係性についての考察がほとんどなされてこなかった。そのため本研究では、現代資本主義社会おける象徴的な歓待現象である観光に注目し、これらの関係性を考察することを目的とする。特に、特定の場所を取り上げて研究することで、歓待の複数の特徴が織りなす複雑な関係性について詳細な検討を行うこととする。こうすることで本研究は、歓待研究を深化させると同時に、文化・政治・経済に注目する人文地理学における議論に貢献することを目指している。本年度は、歓待・観光関係を中心とする関連文献のレビューを実施すると共に、奄美・沖縄の事例に関する資料・現地調査として、特に与論島の研究を集中的に行った。その成果は、観光学術学会第3回大会(2014年7月6日、於:京都文教大学)と7th East Asian Regional Conference in Alternative Geography(2014年7月25日、於:Osaka City University Medical School)で口頭発表を行い、また論文「観光地と歓待ー与論島を事例とした考察」(観光学評論,3(1), 2015, 3-16頁)と、書籍の分担執筆「観光地と場所イメージーメディアがつくる他所への憧れー」(遠藤英樹・寺岡伸悟・堀野正人編著『観光メディア論』ナカニシヤ出版, 2014, 43-62頁)でも発表した。そのため本研究では、現代資本主義社会おける象徴的な歓待現象である観光に注目し、これらの関係性を考察することを目的とした。本年度は、前年度に引き続き、歓待・観光関係を中心とする関連文献のレビューを実施すると共に、奄美・沖縄の事例に関するさらなる資料・現地調査を実施し、与論島に加え、沖縄本島における状況を調査した。与論島に関しては、同島の歓待に密接に関係する「たそがれる」という概念に注目し、「与論島への観光と「たそがれる」」(地理60-6,12-19頁, 2015)と題する論文を発表した。沖縄に関しては、与論観光のブーム期にも注目され、沖縄観光の重要な観光資源であった死にまつわる場所に注目し、かかる資源を対象とする観光およびその歓待のあり方について検討して、その成果を11月に開催された人文地理学会大会(於:大阪大学)において、「沖縄本島における死にまつわる場所を対象とした観光の社会的生産とその変容」と題して研究発表を行った。また、本研究に関連する理論部分の一部を、書籍の分担執筆「観光空間を文化論的に理解する」(竹中克行編著『人文地理学への招待』ミネルヴァ書房, 143-159頁,2015)において発表した。本研究では、歓待現象としての観光について奄美・沖縄を事例として検討するにあたり、特に与論島に注目して検討してきた。その結果、昨年度は、1本の査読論文(「観光地と歓待ー与論島を事例とした考察」観光学評論3-1, 3-16頁, 2015)、1本の分担執筆(「観光地と場所イメージーメディアがつくる他所への憧れー」(遠藤英樹・寺岡伸悟・堀野正人編著『観光メディア論』ナカニシヤ出版,43-62頁,2014))、そして2件の学会発表( “Recreating traditional culture forhospitality:a case study of “YORON KENPO" on Yoron Island in Japan"(The 7th EARCAG)、「観光地とホスピタリティー与論島を事例とした考察」(観光学術学会))という多くの成果を発表した。さらに、本年度には論文「与論島への観光と「たそがれる」」(地理60-6,12-19頁, 2015)を発表しており、当初の計画を上回るペースで成果を挙げていると考える。また本年度からは、沖縄観光における歓待の問題について、特に死にまつわる場所を対象とした観光に注目して検討した。死にまつわる場所を対象とした観光については、沖縄観光において重要な点であるにも関わらず研究が進んでいなかった。

加えて、かかる観光のあり方は、与論観光ブーム期においても注目され社会的な議論を巻き起こしたものであり、両地域を歓待の問題に注目しながら比較検討を行うにあたっても、重要な点となっている。そのため、こうした研究を今年度から新たに開始し、その成果を、「沖縄本島における死にまつわる場所を対象とした観光の社会的生産とその変容」(人文地理学会)と題して報告した。このように、本研究では、特に与論島に関して当初計画していた以上に成果を発表すると共に、沖縄においては死に注目した新しい観点の研究を行っている。そのため本研究は、当初の計画以上に進展していると判断した。本研究は、観光に焦点をあて、歓待について地理学的に考察を行うものである。歓待についての研究はこれまで、(1)神への信仰と歓待の関係、(2)無制限の歓待とその制限の関係、(3)現代社会におけるサービスと歓待の関係、という3つの観点に注目して主として検討が行われてきたが、文化社会的関心に基づく(1)・(2)と、経営的関心に基づく(3)の関係性についての考察がほとんどなされてこなかった。そのため本研究では、現代資本主義社会おける象徴的な歓待現象である観光に注目し、これらの関係性を考察することを目的とした。本年度も前年度までに引き続き、歓待・観光関係を中心とする関連文献のレビューと、奄美・沖縄の事例に関する資料・現地調査を実施した。また、歓待現象を生じさせるモビリティの問題に注目し、かかる観点からの考察も実施した。そうした成果は、2016年7月の観光学術学会第5回大会(於:立命館大学)において、「沖縄本島における墓地を対象とした観光の生産とその変容ーモビリティに注目したダークツーリズムの一考察」として口頭発表し、さらに論文としても「沖縄本島における墓地を対象とした観光の生産とその変容ー移動に注目したダークツーリズムの考察」(観光学評論5(1), 2017, pp.93-110,査読有)として発表した。また、モビリティに関する理論部分の成果発表として、アンソニー・エリオット&ジョン・アーリのモビリティに関する著書の邦訳に参画した(『モバイル・ライブズ』(遠藤英樹監訳)ミネルヴァ書房, 266頁, 2016,翻訳担当部分:第4章「グローバルズとモビリティーズ」pp.89-112)。本研究では,観光に焦点をあて,歓待について地理学的に考察を行った。歓待についての研究はこれまで,「1神への信仰と歓待の関係」,「2無制限の歓待とその制限の関係」,「3現代社会におけるサービスと歓待の関係」,という三つの観点に注目して主として検討が行われてきたが,文化社会的関心に基づく1・2と,経営的関心に基づく3の関係性についての考察がほとんどなされてこなかった。そのため本研究では,現代資本主義社会おける象徴的な歓待現象である観光に注目し,与論島と沖縄本島を事例としてこれらの関係性について検討した。そして、夏期の年8月23日から年9月16日まで、与論島及び関連地域での資料及び聞き取り調査を行い、観光地化の過程と歓待との関係性に関する歴史、与論献奉と呼ばれる歓待儀礼の創造、フィルムツーリズムにともなう新しい観光客の歓待のあり方、そして来訪者の歓待への参与についての考察を行った。
オクルーザルガイダンスと咀嚼能力との関連

本研究は,健常有歯顎者における側方ガイダンスと客観的咀嚼能力の関連を明らかにすることを目的として行われた.本研究結果から,側方ガイダンスは,健常有歯顎者の客観的咀嚼能力に関与する因子としてこれまでに明らかになっている咀嚼運動パラメータや最大咬合力と比較して,関与する程度が低いことが示唆された.本研究は,健常有歯顎者における側方ガイダンスと客観的咀嚼能力の関連を明らかにすることを目的として行われた.本研究結果から,側方ガイダンスは,健常有歯顎者の客観的咀嚼能力に関与する因子としてこれまでに明らかになっている咀嚼運動パラメータや最大咬合力と比較して,関与する程度が低いことが示唆された.平成20年度においては,健常有歯顎者8名(男性7名,女性1名)を被験者としてサンプリングした.研究実施計画[研究1]に従い,データ採得を開始した.咀嚼能力の評価は,試験試料としてピーナツを用いる粉砕能力試験と,ワックスキューブを用いる混合能力試験によって行った.健常有歯顎者において,咀嚼粉砕能力あるいは咀嚼混合能力と咀嚼運動様式には関連があることが報告されている.また,研究代表者らが行ったこれまでの研究から,咀嚼混合能力は,咀嚼運動様式に加えて,最大咬合力と関連があることが明らかになっている.一方,咀嚼運動様式は,側方ガイダンスの影響を受けることが示されている.すなわち,咀嚼運動様式は,咀嚼能力と側方ガイダンスのどちらとも関連があることから,咀嚼運動様式を介して咀嚼能力と側方ガイダンスとの間に見かけ上の関連が生じる可能性がある.これらをふまえて,咀嚼能力と側方ガイダンスとの関連をより詳細に検討するために,実施計画を更新し,ナソヘキサグラフ((株)小野測器)を用いて,側方ガイダンスと,試験試料を咀嚼している時の下顎運動を計測した.下顎運動の分析パラメータは,咀嚼サイクルごとの垂直/側方/前後範囲[mm],開口/閉口経路角度[°],開口相/閉口相/咬合相時間[S],咀嚼周期[S],開口時/閉口時最大速度[mm/S]とした,また,最大咬合力をデンタルプレスケール((株)ジーシー)で計測した.加えて,咬合接触面積とその分布を,バイトチェッカー((株)ジーシー)で計測した.平成21年度においては,被験者を追加し,得られたデータから,咀嚼能力と側方ガイダンスとの関連について検討する予定である.平成21年度においては,被験者の追加サンプリングを行った.研究実施計画[研究1]に従い,データ採得を行った.咀嚼能力の評価は,試験試料としてピーナツを用いる粉砕能力試験,ワックスキューブを用いる混合能力試験によって行った.健常有歯顎者において,咀嚼粉砕能力あるいは咀嚼混合能力と咀嚼運動様式には関連があることが報告されている.また,研究代表者らが行ったこれまでの研究から,咀嚼混合能力は,咀嚼運動様式に加えて,最大咬合力,咬合接触面積と関連があることが明らかになっている.一方,咀嚼運動様式は,側方ガイダンスの影響を受けることが示されている.すなわち,咀嚼運動様式は,咀嚼能力と側方ガイダンスのどちらとも関連があることから,咀嚼運動様式を介して咀嚼能力と側方ガイダンスとの間に見かけ上の関連が生じる可能性がある.これらをふまえて,咀嚼能力と側方ガイダンスとの関連についてより詳細に検討するために,実施計画を更新し,ナソヘキサグラフ((株)小野測器)を用いて,側方ガイダンスと,試験試料を咀嚼している時の下顎運動を計測した.下顎運動の分析パラメータは,咀嚼サイクルごとの垂直/側方/前後範囲[mm],開口/閉口経路角度[°],開口相/閉口相/咬合相時間[s],咀嚼周期[sl,開口時/閉口時最大速度[mm/s]とした.また,最大咬合力をデンタルプレスケール((株)ジーシー)で計測した.加えて,咬合接触面積とその分布を,バイトチェッカー((株)ジーシー)で計測した.平成22年度においては,被験者を若干名追加し,咀嚼能力と側方ガイダンスとの関連について多変量解析の結果から検討する予定である.平成22年度においては,研究実施計画に従い咀嚼能力と側方ガイダンスとの関連について検討した.[研究の背景・目的]上下歯列の咬合面形態およびその接触関係によって誘導される側方滑走運動は,臨床において歯科医によって調整または変更される場合があり,また咀嚼運動と密接に関連することから,客観的咀嚼能力との関連について興味がもたれてきたが,これまでに報告されていない.

そこで本研究では,健常有歯顎者における側方ガイダンスと客観的咀嚼能力の関連を明らかにすることを目的とした.[方法]被験者は,研究への同意が得られた健常有歯顎者55名とした.側方ガイダンスは,ナソヘキサグラフ(小野測器)を用いて算出した.客観的咀嚼能力は,混合能力試験および粉砕能力試験によって評価した.最大咬合力は,オクルーザルフォースメーター(長野計器)を用いて計測した.統計解析には,混合能力試験または粉砕能力試験で得られた値を従属変数,性別,側方ガイダンス,最大咬合力を独立変数とした重回帰分析をそれぞれ行った.有意水準は0.05とした.[結果・総括]本研究の結果から,健常有歯顎者において,咀嚼混合能力および咀嚼粉砕能力と側方ガイダンスの間の関連について,弱い関連が示唆されたが,統計学的有意レベルには達しなかった(P>0.05).一方,咀嚼混合能力および咀嚼粉砕能力と最大咬合力の間にはそれぞれ関連があることが示され,これまでの研究結果と一致することが確認された.以上から,側方ガイダンスは,健常有歯顎者の客観的咀嚼能力に関与する因子としてこれまでに明らかになっている咀嚼運動パラメータや最大咬合力と比較して,関与する程度が低いことが示唆された.
樹状細胞主導の消化管粘膜バリアー維持機構

腸管局所の免疫系は、腸内細菌叢という細胞外環境と宿主細胞との相互作用によって制御されている。腸内細菌の情報は、粘膜局所に存在する樹状細胞に一時集約され、そこから制御された形でT細胞やB細胞の活性化につながる。消化管にはinterleukin (IL)-17産生性のT細胞(Th17細胞)と制御性T細胞(regulatory T細胞、Treg)が多数存在していることから、活性型樹状細胞と抑制型樹状細胞が存在し、それぞれ特異的にTh17細胞・Treg細胞の分化を促進していると考えられている。またそれぞれの樹状細胞を特異的に活性化する腸内細菌も存在していると考えられている。このモデルを検証すべく、本研究においては、ある特定の細菌のみを定着させたノトバイオートマウスを多種類作成し、免疫系に強く影響を与える腸内細菌をスクリーニングした。それにより、小腸においてTh17細胞数を劇的に増加させる細菌としてセグメント細菌(segmented filamentous bacteria)を同定した。さらにセグメント細菌を定着させたマウスは、病原性細菌感染に対して抵抗性を持つことも見いだした。すなわち、セグメント細菌に誘導されたTh17細胞は、粘膜のバリア機能を保つ役割を持つと考えられた。これらを論文として報告した(Cell 139,485-98,2009)。一方Treg細胞分化にも焦点を当て研究を進めた。特にIL10遺伝子領域にVenus蛍光タンパクをノックインしたレポーターマウスを作成し、更に無菌化した。それにより、Treg細胞の中でもIL10を産生する細胞は、消化管粘膜においてのみ存在しており、特に大腸においては、その誘導が消化管常在菌によって促進されていることを見いだした。さらにノトバイオート作成により、強力にTreg細胞分化誘導能を持つ細菌の同定に成功した(論文投稿中)。腸管局所において厳密に調整されている複雑なネットワークの制御メカニズムの根幹は、腸内細菌叢や周囲細胞という細胞外環境と樹状細胞との相互作用にある。そこでは個々の特徴ある腸内細菌によって刺激された樹状細胞が、活性型あるいは抑制型樹状細胞となり、互いに協調し合って、T細胞の活性化或いは抑制(即ち、Th17細胞、制御性T細胞(Treg)分化)を行っていると言うモデルが考えられる。本年度、腸内細菌による腸管樹状細胞刺激メカニズム追求し、まずTh17細胞数が消化管粘膜固有層に特異的に且つ恒常的に存在すること、そしてそれは、生後腸内細菌叢の形成に伴い増加することを見出した。更に無菌マウスあるいは抗生物質を投与したマウスにおいては、Th17細胞数がSPFマウスと比べて著減していることを見出した。即ち、腸内細菌の存在が、消化管粘膜におけるTh17細胞分化に必須の役割をすると言うことを確認した。更に腸内細菌由来のどういった分子がTh17細胞分化に関わるのかを鋭意検討し、その一つがATPであることを突き止めた。即ち、腸内細菌の中にはATPを多く分泌するものがあり、そのATPを認識した樹状細胞はIL6,IL23,活性型TGFbを分泌し、Th17細胞分化を誘導するような活性型樹状細胞となるというデータを得た。これらを論文として報告した(Nature 455,808-812,2008)。一方、消化管粘膜におけるTreg細胞分化にも焦点を当て、研究を進め、本年度、特にIL10を産生するTregは、消化管粘膜で特異的にその分化が誘導されること、更にそれが、腸内細菌の存在に依存していることを突き止めた。
生物学的、および力学的条件による全部床義歯の人工排列位置と咬合せ様式に関する研究

本研究は,2種類の臼歯部人工歯排列を有する上下顎全部床義歯を用い,片側第一大臼歯部に厚さの異なる疑似食品を介在して荷重を負荷し機能時の義歯の動態をシミュレーションし、その時の義歯の変位を3次元的に測定し比較検討した.2種類の排列とは、歯槽頂間線法則に従った力学的な排列(A排列義歯)と天然歯列の再現を目的とした生物学的排列(N排列義歯)である.その結果,次のことが示された.1.上顎全部床義歯について、1)両排列法による全部床義歯とも、荷重を片側に加えた作業側で下方、前方、外側に変位、移動した。2)義歯の変位は,人工歯の排列位置,介在食片の厚み,機能時の下顎位、および平衡側接触の有無によって影響を受けた。3)介在食片の厚みが厚く、非介在側である平衡側に接触が無い場合には、A排列義歯がN排列義歯より変位が大きくなった.4)介在食片の厚さが薄く平衡側接触を生じた時には、両義歯とも変位が抑制されたが、N排列義歯がA排列義歯より変位は少なくなった.2.下顎全部床義歯義歯について、1)両排列方による全部床義歯とも、前作業側方向へ水平的に移動し,作業側では沈下,非作業側では浮上が生した。しかし,その変位量は大きなものではなかった。2)下顎全部床義歯の変位は,人工歯の排列位置,介在食片の厚み,機能時の下顎位によって影響を受けたが,N排列義歯よりA配列の方が変位は小さく、安定していた。また、介在食片の厚みが薄い時には,側方偏心位より中心唆合時の方が義歯の変位が大きくなった.本研究は,2種類の臼歯部人工歯排列を有する上下顎全部床義歯を用い,片側第一大臼歯部に厚さの異なる疑似食品を介在して荷重を負荷し機能時の義歯の動態をシミュレーションし、その時の義歯の変位を3次元的に測定し比較検討した.2種類の排列とは、歯槽頂間線法則に従った力学的な排列(A排列義歯)と天然歯列の再現を目的とした生物学的排列(N排列義歯)である.その結果,次のことが示された.1.上顎全部床義歯について、1)両排列法による全部床義歯とも、荷重を片側に加えた作業側で下方、前方、外側に変位、移動した。また、介在食片の厚みが薄い時には,側方偏心位より中心唆合時の方が義歯の変位が大きくなった.平成8年度は、上顎全部床義歯の臼歯部排列位置による機能時の動揺れ関して、以下の研究を行った。歯槽頂間線法則に従った力学的配慮に基づく人工歯排列法(以下歯槽頂排列と表記する)と、筋圧平衡や審美性,装着感を優先して天然歯列の再現を目的とし、生物学的配慮から排列した人工歯排列法(生物学的排列法と表記)の2種の人工歯排列を同一義歯床内に交換できる全部床義歯を製作し、シミレーションモデル上に装置した。厚さ1mmと4mmの疑似食品(シリコーンラバー)を介在させ、中心咬合位と側方偏心位の2種の咬合位で荷重し、義歯床の3次元変位を測定した。その結果、1.両排列した義歯のいづれも義歯床の前歯部と作業側では作業側前方に沈下し、平衡側では同方向に浮上した。2.咬合位の相違では、中心咬合位よりも側方偏心位において変位量が大きくなった。3.排列法の比較では、4mm疑似食品で両咬合位とも生物学的排列法の方が変位が大きかった。これは疑似食品が4mmの場合、いずれの排列法でも平衡側では人工歯接触が発生しないため、全体的な義歯床の変位が大きくなるが、力学的排列法では片側性平衡咬合が達成しやすく義歯床の変位が少なくなる、と考えられた。疑似食品が1mmでは、中心咬合位で両排列法ともに義歯の変位量は少なく、両排列法で有意な差異は認められなかったが、側法偏心位では生物学的排列法による義歯で有意に変位量が少なくなった。

これは疑似食品が1mmの場合、平衡側での人工歯接触が生じており全体的な義歯の変位が抑制されるが、生物学的排列法では力学的排列法より人工歯列が頬側に排列され人工歯列の副径が大きく、テコアームの拡大となり、平衡側接触がより早期に生じやすく義歯床の変位を抑制しやすいため、と考えられた。下顎全部床義歯の機能時の動揺に関し、歯槽頂間線法則に従った力学的配慮に基づく人工歯排列法(以下、A排列と表記する)と、筋圧平衡や審美性、装着感を優先した天然歯列の再現を目的とした人工歯排列法(以下、N排列と表記する)の2種の人工歯排列を全部床義歯を製作し(同一義歯床内で交換できる)、シミレーションモデル上に配置した。厚さ1mmと4mmの疑似食品(シリコーンラバー)を介在させて、中心咬合位と側方偏心位の2種の咬合位で荷重し、義歯床の3次元変位を測定した。その結果、1.両排列義歯とも同様な変位傾向であり、前方かつ、作業側方向へ水平的に移動し,平衡側では浮上が生じた.2.排列位置の違いに関しては,同一条件間でA排列がN排列より小さかったが,その相違は前報における上顎義歯ほど著明ではなかった.また一部の例外を除き下顎義歯の各方向への変位量は両排列義歯とも上顎義歯より少なかった.これは上顎義歯の変位は,口蓋を支点としたテコ様変位であったため作業側の沈下により大きな平衡側の浮上が生じた.それに対し,下顎義歯では,明確な支点がないためテコ様変位をせず前作業側方向への水平移動が主となり作業側の沈下に比較し平衡側の浮上は小さいものだった.これは両者の変位量の違いとなったものと考えられる.3.疑似食片の厚みによる影響では,両排列とも中心咬合において1mm疑義食片の方が4mm疑似食片よりB点の浮上量が大きく,偏心咬合では1mm疑似食片の方が逆に小さくなった.これが中心咬合において1mm疑似食片が、4mm疑似食片より薄く弾性体であるため,閉口時,臼歯後方咬合小面の影響を受けやすく,義歯が前方椎進し作業側での義歯床の沈下が生じた結果,義歯変位が大きくなったと考えられる.一方,偏心咬合では作業側臼歯が咬頭対咬頭の関係にあり,咬合小面の影響を受けづらく,しかも同位では,荷重方向が中心咬合より舌側に作用したため変位が小さくなったと考えられた.以上の結果から下顎義歯の機能時の動揺は顎位および疑似食片の厚みに影響されるが,臼歯の排列位置に関しては上顎義歯より影響を受けづらいことが示唆された前年度まで、上下顎の平均的な顎堤形態で歯槽頂間線角度80゚の顎堤モデルによる全部床義歯の機能的動揺を検索してきたが、今回は、総義歯臨床上最も困難で頻度も少なくないと思われる上顎の顎堤の吸収が強く前歯部にフラピーガムを有する症例を想定し、上顎顎全部床義歯の機能時の動揺について検討した。シミレーションモデルは上顎顎堤の吸収が強く、歯槽頂間線角度を80゚とし、このモデルから歯槽頂間線法則に従った力学的配慮に基づく人工歯排列法(以下、A排列と表記する)と、天然歯列の再現を目的とした人工歯排列法(以下、N排列と表記する)の2種の人工歯排列を行った全部床義歯を製作し(同一義歯床内で交換できる)、これら2種の義歯をシミレーションモデル上に設置し、厚さlmmと4mmの疑似食品(シリコーンラバー)を作業側として介在して、中心咬合位と側方偏心位で5kg荷重し、三茨元座標測定機によって実験義歯に設けた3つの標点(前歯部相当部辺縁=I点,作業側辺縁=W点,平衡側辺縁=B点)の変位を義歯床の漱元変位として測定した。その結果、1.両排列義歯とも下顎義歯の位置,擬似食片の厚みにかかわらず,一部を除き1点は鯖方かつ平衡側方向,W点では作業側前方方向,B点は作業側前方に大きく浮上するという同様な変位傾向を示した.2.顎位の相違については中心咬合よりも偏心咬合において,変位量が大きくなる傾向がみられた。3.排列位置の相違では,顎位や食片の厚みにかかわらず,N排列義歯の方がA排列義歯よりも大きな変位を示す傾向が強く,平衡側の浮上量において顕著であった。4.擬似食片の厚みによる影響では,両排列義歯とも中心咬合において,4mm擬似食片の方が1mm擬似食片より大きな変位を示す傾向がみられたが,偏心咬合では一定の傾向はみられなかった。
元素合成起源の解明に向けた核ガンマ線イメージング分光法の気球観測による実証

Heより重い元素の起源の解明は、宇宙物理における最重要課題の一つであるが、決定的証拠を欠いた状態が続いている。元素合成された放射性同位体からのガンマ線を直接観測することで、この問題の解決が期待されているが、定量的で誤差の少ない観測手法が確立されていない。そこで、ガンマ線の到来方向を一意に決定できる望遠鏡、電子飛程検出型コンプトンカメラを新規開発し、天体を用いた原理実証として、気球実験を行い、銀河中心領域からの電子・陽電子対消滅線を観測した。このデータ解析によるガンマ線観測手法の確立を目指している。
プラトンによる魂の原的把握についての問答法的・国際的研究

台北、北京での学会で、プラトン『国家』第7巻における、教育と関連した強制について発表した。強制が、初めは本人の意に反してという意味だったのが、やがて「魂の目」の下降傾向に反してという意味になると論じた。強制されるのは各人ではないという点も指摘した。第11回国際プラトン学会大会での発表論文が選抜論文集に採択され公刊された。『パイドン』における魂不滅最終論証の大詰めで、対話相手ケべスの応答が、魂の不死性と永遠性の関係についての謎めいた理解を含意していることを指摘し、背景にある考えを推測した。魂は自らによって生命をもたらされているがゆえにその生命供給は絶えることがない、という考えである。ケべスのこの考えと、『パイドロス』におけるソクラテスの魂不死論証とがともにアルクマイオンの考えと繋がっている可能性を示唆した。単著『マクダウェルの倫理学ー『徳と理性』を読む』を勁草書房から刊行した。マクダウェルの難解な倫理学的議論(アリストテレスら古代ギリシャの洞察の復権をもくろむ)をわかりやすく解説しようと試みた。解説とはいっても筆者自身の、ときに立ち入った諸見解を示しており、マクダウェルの論敵であるブラックバーンと筆者との応酬をも収めている。徳を<そのつどの状況からいかなる行為を要求されているかを見て取る能力>と捉えるマクダウェルの立場が有望であることを示そうとした。その立場は、合理性をめぐる近現代的偏見(人間の実践の合理性は当の実践に外在的な視点から正当化できなければならないとする)の鋭い批判と軌を一にしている。論文「浮気されれば気付かなくてもその分不幸になるかーという問いをきめこまかくするー」を『思索』に発表した。幸福は経験に他ならないとする立場に批判的な方向を取りながらも、ある人の幸福いかんをその人自身の幸福観(経験主義や反経験主義)にある程度まで相対化しうることを提唱した。第12回国際プラトン学会大会(テーマは『パルメニデス』)で発表すべく、要旨を提出して応募したが、採択されなかったのは残念である。言い訳をすれば、主として、(次に述べる)単著の刊行準備のために、十分な時間が取れなかった。要旨に記したアイディアを練り直して、別の場所で発表したい。だが、台北での国際プラトン学会アジア大会、北京での世界哲学会にて、プラトン『国家』第7巻の、教育と関連した強制について発表し(英語)、その魂論的特質に注意が向けられた。また、単著『マクダウェルの倫理学』(邦語)が勁草書房より刊行され、倫理的な事柄(あるいはより広く「価値」)についての古代的な「心の哲学」が、近現代的な見方との対比で明確に論理化された。また、プラトン『パイドン』についての発表の改訂版(英語)が第11回国際プラトン学会選抜論文集に採択され、プラトンの著作における魂の本性をめぐる一つの把握(生命の供給に関わる)に光が投げかけられた。また、幸福についての経験主義についての論文(邦語)が『思索』誌に発表され、幸福感、幸福観、幸福のあいだの微妙な関係(幸福が幸福観との関連でフレキシブルでありうること)に注意が向けられた。また、プラトン『ピレボス』についてのGarner氏の著書の書評(英語)がClassical Review誌に刊行され、『ピレボス』における善と存在との関係の独自の理解の検討を通じて、後期プラトンの思考を見る一つの視座が確認された。以上のことは、本研究課題の研究がおおむね順調に進展していることを示すだろう。プラトン『ピレボス』の魂論をさらに掘り下げたい。そのさい、同篇後半部最初の箇所における<魂と身体の対比>というトピックの扱いに注目したい。『ピレボス』の問題意識を背景として、同じくプラトン後期の『ソフィステス』・『政治家』の諸問題へと道をつけたい。著書『マクダウェルの倫理学』を諸賢に検討してもらい、私がマクダウェルに賛同して示した古代的な「心の哲学」の有効性を改めて吟味したい。エピクロスの魂論の本格的な研究に着手したい。以上の諸目的のために、海外の研究者を含む一流の研究者と意見交換を活発に行ないたい。

マクダウェルの難解な倫理学的議論(アリストテレスら古代ギリシャの洞察の復権をもくろむ)をわかりやすく解説しようと試みた。解説とはいっても筆者自身の、ときに立ち入った諸見解を示しており、マクダウェルの論敵であるブラックバーンと筆者との応酬をも収めている。徳を<そのつどの状況からいかなる行為を要求されているかを見て取る能力>と捉えるマクダウェルの立場が有望であることを示そうとした。その立場は、合理性をめぐる近現代的偏見(人間の実践の合理性は当の実践に外在的な視点から正当化できなければならないとする)の鋭い批判と軌を一にしている。論文「浮気されれば気付かなくてもその分不幸になるかーという問いをきめこまかくするー」を『思索』に発表した。幸福は経験に他ならないとする立場に批判的な方向を取りながらも、ある人の幸福いかんをその人自身の幸福観(経験主義や反経験主義)にある程度まで相対化しうることを提唱した。第12回国際プラトン学会大会(テーマは『パルメニデス』)で発表すべく、要旨を提出して応募したが、採択されなかったのは残念である。言い訳をすれば、主として、(次に述べる)単著の刊行準備のために、十分な時間が取れなかった。要旨に記したアイディアを練り直して、別の場所で発表したい。だが、台北での国際プラトン学会アジア大会、北京での世界哲学会にて、プラトン『国家』第7巻の、教育と関連した強制について発表し(英語)、その魂論的特質に注意が向けられた。また、単著『マクダウェルの倫理学』(邦語)が勁草書房より刊行され、倫理的な事柄(あるいはより広く「価値」)についての古代的な「心の哲学」が、近現代的な見方との対比で明確に論理化された。また、プラトン『パイドン』についての発表の改訂版(英語)が第11回国際プラトン学会選抜論文集に採択され、プラトンの著作における魂の本性をめぐる一つの把握(生命の供給に関わる)に光が投げかけられた。また、幸福についての経験主義についての論文(邦語)が『思索』誌に発表され、幸福感、幸福観、幸福のあいだの微妙な関係(幸福が幸福観との関連でフレキシブルでありうること)に注意が向けられた。また、プラトン『ピレボス』についてのGarner氏の著書の書評(英語)がClassical Review誌に刊行され、『ピレボス』における善と存在との関係の独自の理解の検討を通じて、後期プラトンの思考を見る一つの視座が確認された。以上のことは、本研究課題の研究がおおむね順調に進展していることを示すだろう。プラトン『ピレボス』の魂論をさらに掘り下げたい。そのさい、同篇後半部最初の箇所における<魂と身体の対比>というトピックの扱いに注目したい。『ピレボス』の問題意識を背景として、同じくプラトン後期の『ソフィステス』・『政治家』の諸問題へと道をつけたい。著書『マクダウェルの倫理学』を諸賢に検討してもらい、私がマクダウェルに賛同して示した古代的な「心の哲学」の有効性を改めて吟味したい。エピクロスの魂論の本格的な研究に着手したい。以上の諸目的のために、海外の研究者を含む一流の研究者と意見交換を活発に行ないたい。次年度に重要な研究文献が刊行されるとの情報を得、本年度には研究文献の購入を若干控え、次年度の購入を控えることにした。また、次年度7月のパリ出張には相当の費用がかかるものと予想され、若干を本年度の予算から回すのがよいと考えた。
人文科学系学部におけるアカウンタビリティ遂行に関する日英比較研究

本研究では、高等教育、特にいわゆる文系学部におけるアカウンタビリティに関する理論研究と主にイギリスにおける高等教育機関のアカウンタビリティ遂行に関する比較研究を試みている。理論研究については、アカウンタビリティ概念の広範な定義を踏まえて、特に教育政策評価に関してアカウンタビリティ遂行の理論的課題を検討した。特にいわゆるarts and science系の文学部(人文学部・教養学部)の場合、各学問領城ごとに研究形態の違い、研究成果として現れる成果の違いが顕著に存在し、学部としての単一の基準を設定することの困難さが指摘されている。また、教育機能に関する説明責任についても、依然として何を習得させることがliberal artsにとって必要なのかに関する議論が錯綜している。とりわけコア・カリキュラムの作成については、案はいくつかすでに提案されているが、実際に機能しているのは少数の事例に限られ、学問領域特有の問題が依然として克服されていない。なおシラバスの作成とウェブサイト上での公表については、増加する傾向が明らかであり、これについては拙HPにてリンク集を作成・公表している。比較研究については、主にイギリスの大学評価に関する情報を収集し、分析を試みた。2001年12月に2001年度研究評価の結果が公表され、人文社会系及び教育学系のいくつかの学問領域でも結果が公表されている、本研究評価が実際の研究に関する公的資金の分配の指標とされることになり、例えば教育学では83大学(うち2大学はオープン・ユニバーシティ)のうち、最高の評価5*を受けたのは、カーディフ大学とブリストル大学の2大学、評価5はケンブリッジ、オクスフォードなどの12大学で、これらの大学は相当の研究資金を受けることができる一方、8大学は評価2、1大学は評価1とされ、研究のための公的資金を受けることができない。2年計画の調査研究の1年目として次の活動を進め、2年目につなげる成果をあげた。(1)文献収集を進め、文学部・教育学部の理論研究を進めた。その結果、文学部の学科構成は多様であるが、人文学部については諸外国の同様な学部と比較して自然化学系の学科がほとんど含まれていないこと、またアカウンタビリティという概念そのものは、人文科学系学部の改革においても使用され始めていること、しかしその概念整理は未だ不十分であることが明らかとなった。(2)特に自己点検・評価報告書の収集・閲覧を進め、文学部・教育学部の教育改革実践事例の抽出を進めた。なお特に各大学のウェブサイト上で公開されている改革事例については、拙ウェブサイト上でリンク集として整理・公開している。(3)学部・教育課程改革を進めている学部の担当者に対する聴取調査を進め、資料収集を行った。その結果、改革プランは構想・立案されている事例がみられるが、他学部と比較した場合プランを全学的に実施することが容易ではないことが明らかとなった。(4)文学部・人文学部の教員を対象として、人文科学系の学部教員として教育責任、研究責任をどのように捉えているかについての全国意識調査の準備を行い、年度末にかけて調査を実施した。本調査の分析は次年度に実施し、学会での報告を進める予定である。(5)イギリスの改革事例についての資料を収集し、分析を行った。特に大学評価過程の詳細な分析、ならびにその中でのアカウンタビリティ概念の整理形態について検討を進めている。
ヒトES細胞からの分化誘導システムを用いた小児固形腫瘍発生モデルの開発

未分化ヒトES細胞を無血清培養条件下でNodal/activinインヒビターを投与すると、分化6日目よりCD271強陽性の神経堤細胞が出現した。この神経堤細胞分化誘導過程で認められる種々の細胞表面抗原の発現レベルをフローサイトメトリーで解析すると、様々な小児固形腫瘍細胞株でCD146が発現していた。悪性ラブドイド腫瘍・神経芽腫細胞株を移植した免疫不全マウスへ抗ヒトCD146ウサギポリクローナル抗体を投与すると、著明なin vivo抗腫瘍効果を示した。ヒト多能性幹細胞であるES細胞から多くの小児固形腫瘍の起源である神経堤細胞(NC細胞)およびその分化細胞を選択的に増殖する培養システムを用いて、(1)小児固形腫瘍の発生モデルの開発(2)本発生モデルを用いたがん幹細胞の出現様式に基づくがん発生メカニズムの解明と新規治療開発を行った。未分化ヒトES細胞を無血清培養条件下でNodal/activinインヒビター(SB431542)を投与すると、分化6日目にCD271強陽性のNC細胞が全培養細胞の5080%で検出された。リアルタイムPCRでは、得られたNC細胞はNC細胞の発生・生存(FOXD3)、ニューロンやメラニン産生細胞への分化(SOX10)、軟骨や骨への分化(SOX9)に関連した遺伝子が高発現していた。続いてNC細胞をSB431542+ bFGF存在下で培養すると、CD271陽性CD73陽性でSOX9のみ発現が維持された骨・軟骨前駆細胞が選択的に増殖された。さらに、SB431542で分化誘導したES細胞に分化3日目からGSK-3インヒビター(CHIR99021)を投与すると、分化6日目に神経系ガングリオシドGD2を高発現している交感神経系様前駆細胞が高頻度に認められた。ヒトES細胞からNC細胞またはその分化細胞の分化誘導過程においてNC細胞の発生・分化に関連した細胞表面抗原の発現を継時的に解析したところ、CD271・CD73・CD146・GD2を高発現した細胞が認められた。本研究の主目標の一つはヒトES細胞からの小児固形腫瘍発生モデルに用いる神経堤細胞由来の分化誘導方法の確立と得られた分化細胞の表現型の検討である。昨年度の検討では、未分化ヒトES細胞を無血清培養条件下でNodal/activinインヒビター(SB431542)、GSK-3インヒビター(CHIR99021)、bFGFなどを添加して培養することにより、NC細胞やその分化細胞(骨・軟骨前駆細胞および交感神経系様前駆細胞)を選択的に分化誘導することが可能となった。また、増殖した細胞についてはリアルタイムPCRによりNC細胞の発生・生存・分化に関連した遺伝子発現が確認できた。また、本研究における最大の目標は小児固形腫瘍の発生モデルを用いた小児固形腫瘍共通の細胞表面抗原をターゲットとした抗体治療などの新規治療の開発である。昨年度の検討では、ヒトES細胞からNC細胞またはその分化細胞の分化誘導過程においてNC細胞の発生・分化に関連した細胞表面抗原の発現を継時的に解析したところ、CD271・CD73・CD146・GD2を高発現した細胞が認められた。今年度以降はこれらの候補の中から小児固形腫瘍がん幹細胞特異的な細胞表面抗原を抽出し、小児固形腫瘍に共通して使用出来るマウスモノクローナル中和抗体の作成を目指していく予定である。リアルタイムPCRでは、得られたNC細胞はNC細胞の発生・生存(FOXD3)、NC由来の分化細胞(SOX10、SOX9)に関連した遺伝子が高発現していた。続いてNC細胞をフィブロネクチンでコートした培養皿上でSB431542+ bFGF存在下で培養すると、CD271陽性CD73陽性の骨・軟骨前駆細胞、分化3日目からGSK-3インヒビター(CHIR99021)を投与するとGD2を高発現している交感神経系様前駆細胞が高頻度に認められた。ヒトES細胞からNC細胞およびその分化細胞の分化誘導過程において発現する様々な細胞表面抗原の網羅的スクリーニングを行った結果、悪性ラブドイド腫瘍、神経芽腫、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、骨肉腫などの小児固形腫瘍に共通してCD146が発現していた。続いて悪性ラブドイド腫瘍細胞株をCD146陽性・陰性細胞に分離すると、CD146陽性細胞は高いin vitro増殖能およびin vivo腫瘍形成能を示した。さらに、悪性ラブドイド腫瘍細胞株を免疫不全マウスへの皮下移植した後に抗ヒトCD146ウサギポリクローナル抗体を投与すると、著明なin vivo抗腫瘍効果を示し、本疾患における新規治療法として有用である可能性が高いことを明らかにした。本研究における最大の目標は小児固形腫瘍の発生モデルを用いた小児固形腫瘍共通の細胞表面抗原をターゲットとした抗体治療などの新規治療の開発である。