hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
想起と忘却による共有知識の生成――記憶概念の導入による知識論の展開

2018年10月から12月まで、スイスのザンクト・ガレン(St.Gallen)大学に滞在し、この論点について文献収集や専門家との議論を行った。以上の研究内容の中で一貫しているのは、シュッツ理論の社会学的意義を探るという試みである。本研究は2018年度が最終年度であるが、当初想定していたよりも幅広い方面でシュッツ理論の展開可能性が見いだされた。以上の進捗状況を踏まえ、次年度は以下の方針で研究を進める。・後期シュッツの生活世界論の検討の精緻化を進める。とりわけ、知識と自明性に関するシュッツの見解に注目し、シュッツ現象学の独自の境位を見定めることを目指す。・現実構成のメカニズムにおいて記憶と忘却がどのように関係しているかについて、古典的著作を中心に基礎概念の整理を進める。これにより、体験される時間の流れを核とする理論を構築するための足場を築くことを目指す。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
爆発で生成される渦輪の安定性と物質輸送に関する実験的研究

第1の課題は、水中Exploding Wireと呼ばれる爆発現象で作られ渦輪による物質輸送の実験である。水中を伝播する安定な高レイノルズ数渦輪による効率的な高速物質輸送を確認した。100μFのコンデンサを1.5kVから2.5kVに充電してから、直径0.2mmのW線に印加ことにより、Exploding Wireの爆発を起こし、渦輪を励起した。長さ2m、奥行き0.5m、水深0.45mの水槽中の一端で励起される渦輪に、流体の可視化に用いるダイアイオンを混入し、渦輪によるダイアイオンの輸送を観測した。渦輪発生装置の近傍では渦輪に巻き込まれないダイアイオンが多数存在するため、その領域での測定は除外し、渦輪発生器の0.4mから1.3mまでのあいだで測定を行った。印加電圧が1.5kVから2.5kVまで変化するとき、渦輪の初期速度は4.63m/sから6.40m/sまで増加する。Reynolds数は(1.131.57)×10^5の程度である。このようなReynolds数領域における実験から、渦輪発生器から0.4mの位置で渦輪に取り込まれているダイアイオンの約40%が1.3mまで到達している。渦輪から離脱するダイアイオンの量は指数関数的に減少することから、数m、あるいはそれ以上の距離まで渦輪による効率的な物質輸送が可能であることが予想される。この実験に関する論文は現在執筆中である。第2の課題である、渦輪の安定性については現在実験が進行中である。直線型の渦輪発生装置により、これまで我々が行った10^5のオーダーのReynolds数を越える領域での安定な渦輪の伝搬を目指している。すでに、新型の渦輪発生装置による実験が開始されているが、直線型の渦輪発生装置に適した水槽が短いため、今後水槽を改造して実験する必要に迫られている。
生物間相互作用に基づく種多様性維持メカニズムの解明と生態系機能に関する研究

地形依存的な樹種の空間分布の違いが種多様性を創る事を大面積試験地で明らかにした。さらに病原菌の種特異性が種多様性を創る事を野外実験および室内接種試験から明らかにした。種多様性を説明するトレードオフ仮説の成立を実生の物質分配から明らかにした。スギ人工林における強度間伐が広葉樹の発芽・定着を促すことによって種多様性を高め、同時に水源涵養機能を高める事を明らかにした。I.広葉樹天然林の種多様性維持機構の解明1.大面積試験地(既設6ha)600枠で調査した環境の資源量(光・土壌窒素濃度・水分)の分布パタンやそのクラスター構造がそれぞれ異なることを明らかにした。さらに、いずれの資源量も地形要因(方位角、傾斜角、凹凸)と大きな関連性をもつことを明らかにした。2.ミズキ輪紋葉枯れ病の親木からの距離依存的な感染機構を解明した。親木からの距離別に実生・稚樹の死亡率・成長率を調べ、同時に距離別に病害発生率・菌体トラップ量、病葉のトラップ量を調べた。その結果、ミズキ輪紋葉枯れ病の親木からの距離依存的な感染が明らかになり、Janzen-Connell効果が親木からの感染経路によって個となることを初めて明らかにした。3. Trade-off仮説を物質分配関係から検証した。耐陰性の高いミズナラほど耐陰性の低いクリより、防御・貯蔵への配分率が高いことを明らかにした。これは、暗くて天敵の多い環境でミズナラが病原菌や植食者の被害を回避するための戦略であると考えられ、種多様性を説明するTrade-off仮説を物質分配関係から支持している。II.生態系機能の評価1.間伐強度別スギ人工林(強度・弱度間伐・無間伐:各0. 6ha x3反復:平成15試験地設定済み)において、広葉樹林縁からの距離別に植物の種多様性回復過程を解析した。その結果、前生稚樹では、林縁からの距離依存的に種多様性が高いことが明らかになった。しかし、間伐によって距離依存性は解消された。2.間伐強度別スギ人工林で種多様性の回復過程と物質生産機能(バイオマスの総生産量)の関係を解析した所,両者にはトレードオフ関係があった。温帯林でのJanzen-Connell効果の成立過程を明らかにするため、立ち枯れ病を引き起こす土壌菌の接種試験と3種の広葉樹における交互播種試験を行った。接種試験では、同一の遺伝的組成をもつ菌でも、同種成木下の土壌から採取したものは同種の実生のみを強く攻撃し、他種には強い被害を与えないことが明らかになった。この結果は病原菌の種特異性を強く示している。さらに交互播種試験では3種の母樹下いずれにおいても、同種の実生の死亡率が他種の実生よりも高く、かつ、その死亡要因は土壌菌による立ち枯れと葉の病気の種特異性によるものであることが示唆された。これらの結果は種特異的な病原菌が、母樹下でその種特的に働き、実生の置き換わりを引き起こしていることが示唆された。これは、Janzen-Connell効果の成立過程を病原菌の種特異性の観点から詳細に明らかにした初めての研究である。間伐強度別スギ人工林(強度・弱度間伐・無間伐:各0.6hax3反復:平成15試験地設定済み)において、落葉広葉樹の種多様性回復機構を詳細に明らかにした。間伐は直後のR:FR比および土壌温度の上昇、リターの撹乱が遷移初期種の発芽、定着を容易にし、さらに実生の成長を促し、種多様性を増加させた。特に強度間伐は実生の成長が旺盛であり、林冠木の種多様性を回復させる上では有効な方法であることが明らかになった。また、弱度間伐は林床での広葉樹の多様性回復に止まることが示唆され、むしろスギの成長を主体に施業としては有効であることが示された。山地播種試験でミズナラは林内での生存率は高いがギャップでの相対成長率(RGR)は低くなった。一方、クリはギャップでは勢い良く成長するが林冠下での生存率は低くなり、にトレードオフ関係が見られた。これは、一つの森林内にギャップが混在するような環境ではこの2種は共存できることを示している。広葉樹4種それぞれの親木の下で死亡した同種の実生から立ち枯れ病菌(Colletotrichum anthrisci)を採取し、そのうち2種にそれぞれを接種し宿主特異性を調べた。DNA解析からそれぞれの菌株がすべて同一種であることが確認された。親木由来にかかわらず単離したC.anthrisciの菌株は2種の実生のダメージを引き起こしたが、罹病率は同種由来の菌株の方が他の3種由来のものよりも高かった。これらの事実は、病原菌C.anthrisciは森林内のどこでも普通に見られる菌で多くの樹種の実生を加害するものの、その毒性は同種由来の菌株の方が他種

由来より強く、これは菌株の局所適応による宿主特異性の進化を示している。スギ人工林では強度間伐ほどR:FR比、変温幅が増加し、リター量が減ったので遷移初期種の発芽が促され、遷移初期種の割合が高まった。また、強度間伐ほど遷移系列に関わらず実生の生存率・成長量が高くなった。その結果、強度間伐ほど種多様性が最大になり、針葉樹-広葉樹混交林造成には強度間伐が最適だと考えられた。スギ人工林では強度間伐区ほど表層土の水の浸透能が高くなり、種多様性の回復と共に水源涵養能が回復している事が示された。
明治後期のハワイ移民と移民会社に関する研究

年度当初、二年目の研究課題を二つ設定した。第一課題は、領事報告資料を中心とした資料収集の補充調査を重点的にすることである。第二課題は、収集資料をもとに研究成果報告書を作成することである。第一課題については、収集資料を整理検討した結果、『官報』・『通商彙編』・『通商報告』・『通商彙纂』などに掲載されている移民史料はほとんど収集しているので、外交史料館所蔵の活字化されていない領事報告の収集に重点をおいて実施した。第二課題の研究成果報告書の作成については、研究目的の一つ「領事報告資料を素材に、ハワイにおける日本人移民の動向を明らかにする」に重点をおき、1885年より、1900年までの期間に限定してまとめることにした。したがって報告書の副題は「領事報告からみたハワイ移民」とした。報告書(別冊参照)の概要はつぎのとおりである。内容は四節三項よりなっている。第一節は、官約移民数の十三年間の推移を概観する。第二節第一項は、1886年前後の日本人移民のハワイにおける状況を領事報告を中心に紹介し、ハワイ政府がなぜ日本人移民の移入を熱望したかを明らかにする。同節第二項は、ハワイの砂糖耕地の状況を、営業組織や製糖市価を中心に紹介し、日本人移民の動向の経済的背景を明らかにする。同節第三項は、1894年前後の日本人移民のハワイにおける状況を、領事報告を中心に紹介し、日本人移民社会の変化の姿を具体的に明らかにする。第三節は、官約移民の保健・衛生状況を日布渡航条約によりハワイへ渡航した日本人医師達の報告書を中心に紹介する。第四節は、ハワイにおける日本人移民の増大に対し、ハワイ政府のとった諸政策を具体的に紹介し、ハワイにおいて日本人移民の基盤が形成されていく過程を明らかにする。報告書の作成により、移民研究の視野が拡大し、研究を体系化することに大変有益となった。年度当初,いままでの私の研究蓄積や収集資料を全面的に再検討した結果,つぎの二つの課題に重点を置いて,研究をすすめることにした.第一課題はハワイ駐在日本総領事館より,外務省に報告された多数の領事報告資料を調査・収集・整理して,ハワイにおける日本人移民の実態や動向について,明らかにすることである.第二課題は,ハワイへの日本人移民の増加が,日本国内に与えた影響について,具体的に明らかにすることである.第一課題を達成するために,つぎのことを実行した.(1)昭和62年3月までに,私が外交史料館で調査収集した資料(全部マイクロフィルム)を焼付引伸し,複製を作成する.(2)複製資料を整理検討し,今後収集する必要のある領事報告資料の調査収集計画を立案する.(3)領事報告資料は,国会図書館と外交史料館で,領事報告資料の散逸部分を補充する目的で官報は,九州大学中央図書館で,それぞれ収集することにした.夏休暇・冬休暇・年度末休暇を利用して,精力的に収集調査を行なった.その結果,明治2030年代の領事報告資料の主要なものは,大部分収集することができた.第二課題は,つぎのような方法でとりくんだ.(1)日本政府の移民政策が,移民卓越地域で,どのように具体化され実施されているかを,広島・山口両県の町村役場文書の収集調査を通じて検証した.(2)殖民協会の機関紙『殖民協会報告』が復刻されたので,全14巻を購入し,それを素材に,ハワイ移民の増大が,殖民協会の成立に影響する課程を年表風にまとめる.以上のように,本年度は,資料収集調査に重点を置いたため,具体的な研究成果は乏しいが, 63年度には,収集資料を充分検討吟味して,論文として研究成果を公表する予定である.資料の調査収集を通じて,明治20年代のハワイ日本人移民史の体系化に,明確な見とおしをもつことができたのが,最大の成果であった.年度当初、二年目の研究課題を二つ設定した。

第三節は、官約移民の保健・衛生状況を日布渡航条約によりハワイへ渡航した日本人医師達の報告書を中心に紹介する。第四節は、ハワイにおける日本人移民の増大に対し、ハワイ政府のとった諸政策を具体的に紹介し、ハワイにおいて日本人移民の基盤が形成されていく過程を明らかにする。報告書の作成により、移民研究の視野が拡大し、研究を体系化することに大変有益となった。
慢性痛に対し運動療法が奏効する脳メカニズムの解析：脳報酬系の役割

本研究の目的は、運動による鎮痛(Exercise-induced hypoalgesia:EIH)の脳メカニズムを解明し、運動療法の有効性と科学的根拠を明らかにすることによって、薬物が効かない慢性痛の治療に貢献することを目指している。これまでの研究で、運動は腹側被蓋野(VTA)のDAニューロンを活性化させ、それがEIHにおいて重要な役割を果たしていることがわかった。今年度はVTAのDAニューロンの投射先である側坐核(NAc)に焦点をあて、NAcに投射する扁桃体の基底外側核(BLA)、内側前頭前野(mPFC)がEIHに果たす役割について検討した。BLAのニューロンは均一ではなく、報酬行動に関わるPositive neuronsと、逃避行動に関わるNegative neuronsがある。自発運動(VE)によりNAcへおもに投射する基底核内側部(medBA)のGluニューロンが活性化されることがわかった。一方、扁桃体中心核のGABAニューロンは、坐骨神経部分結紮手術(PSL)によりその活性化が高められたが、PSL+VEはこれらを抑制した。研究の遂行にあたりまず、神経障害性疼痛モデルとして坐骨神経部分結紮手術(PSL)、自発運動として回転盤を設置したケージでのマウスの飼育、運動による鎮痛の評価法の確立、FosB/⊿FosBの発現を指標として、運動により活性化するニューロンの同定、側坐核に投射するニューロンの同定のため側坐核へのRetro-beads Redの微量注入、蛍光免疫多重標識法を確立した。内側前頭前野(mPFC)には、恐怖条件づけの形成に関わるPLと、その消去に関わるILがある。扁桃体基底外側核(BLA)のニューロンには、報酬行動に関わるpositive neuronsと、逃避行動に関わるnegative neuronsがある。慢性痛の患者では、ILニューロンが抑制されており、恐怖条件付けを消去出来ず、痛みに抗して行動を起こせない。しかし、陽性情動によりBLAのpositive neuronsを活性化出来れば、ILやNAcが活性化され、痛みが抑制される。BLAのpositive neuronsはNAcやILに投射することが明らかにされている(Kim et al., 2016)。運動によってもVTAとNAcが活性化され、痛みが抑制される。慢性痛患者も、まずは身体を動かす、楽しいことをする、笑うことが重要であることが脳科学的に証明された。さらに扁桃体基底核(BA)を内側部と外側部に分けて、その投射先を調べた最近の研究により、外側部は扁桃体中心核(CeA)に、内側部はNAcに優位に投射することが明らかにされている。そこで、BAを外側部と内側部に分けて、PSLと自発運動に対する応答を検討すると、内側部のpositive neuronsがNAcに投射してEIHに関与することがわかった。側坐核に投射する扁桃体および内側前頭前野のニューロンのEIHにおける役割について論文をまとめ投稿する。同時に、側坐核に投射する海馬ニューロンについても同様の検討を進める。今後の研究としては、側坐核に投射するニューロン群あるいはその一部の機能を光遺伝学的に、あるいはGi-DREADD法を用いて一時的に抑制した時に、EIHがどうなるかということを確認してこれまでの研究成果の確認を行い、本研究の集大成としたい。これまでの研究により、運動や陽性情動により脳報酬系におけるVTA-DAニューロンの活性化-->NAcの活性化、BLAのpositive neuronsの活性化-->NAcとILの活性化が起こり、これは痛みの抑制に働くとともに、痛みに対する恐怖も消去されて「恐怖ー回避思考」から脱却することが出来ることが示している。さらに日常生活での活動性が高まり、QOLも高まるという好循環が形成されることが期待される。このことは、慢性痛の治療において、日常生活の中で活動性を高めることが重要であることを示しており、痛みに対する不安・恐怖のため不動となって慢性痛を悪化させている現状、すなわち「生活習慣病」としての慢性痛の新しい側面について社会的に注意喚起を促して行く必要がある。出版物や学会での講演などを通じてこれらの成果を周知し、実際の慢性痛の治療に役立てて行きたい。さらに研究代表者は別の基盤研究において、線維筋痛症患者に運動療法のための3週間の入院プログラムを実施し、良好な結果を得ている。今後、症例を増やし報告して行く予定である。研究の遂行にあたり

まず、神経障害性疼痛モデルとして坐骨神経部分結紮手術(PSL)、自発運動として回転盤を設置したケージでのマウスの飼育、運動による鎮痛の評価法の確立、FosB/⊿FosBの発現を指標として、運動により活性化するニューロンの同定、側坐核に投射するニューロンの同定のため側坐核へのRetro-beads Redの微量注入、蛍光免疫多重標識法を確立した。内側前頭前野(mPFC)には、恐怖条件づけの形成に関わるPLと、その消去に関わるILがある。扁桃体基底外側核(BLA)のニューロンには、報酬行動に関わるpositive neuronsと、逃避行動に関わるnegative neuronsがある。慢性痛の患者では、ILニューロンが抑制されており、恐怖条件付けを消去出来ず、痛みに抗して行動を起こせない。しかし、陽性情動によりBLAのpositive neuronsを活性化出来れば、ILやNAcが活性化され、痛みが抑制される。BLAのpositive neuronsはNAcやILに投射することが明らかにされている(Kim et al., 2016)。運動によってもVTAとNAcが活性化され、痛みが抑制される。慢性痛患者も、まずは身体を動かす、楽しいことをする、笑うことが重要であることが脳科学的に証明された。さらに扁桃体基底核(BA)を内側部と外側部に分けて、その投射先を調べた最近の研究により、外側部は扁桃体中心核(CeA)に、内側部はNAcに優位に投射することが明らかにされている。そこで、BAを外側部と内側部に分けて、PSLと自発運動に対する応答を検討すると、内側部のpositive neuronsがNAcに投射してEIHに関与することがわかった。側坐核に投射する扁桃体および内側前頭前野のニューロンのEIHにおける役割について論文をまとめ投稿する。同時に、側坐核に投射する海馬ニューロンについても同様の検討を進める。今後の研究としては、側坐核に投射するニューロン群あるいはその一部の機能を光遺伝学的に、あるいはGi-DREADD法を用いて一時的に抑制した時に、EIHがどうなるかということを確認してこれまでの研究成果の確認を行い、本研究の集大成としたい。これまでの研究により、運動や陽性情動により脳報酬系におけるVTA-DAニューロンの活性化-->NAcの活性化、BLAのpositive neuronsの活性化-->NAcとILの活性化が起こり、これは痛みの抑制に働くとともに、痛みに対する恐怖も消去されて「恐怖ー回避思考」から脱却することが出来ることが示している。さらに日常生活での活動性が高まり、QOLも高まるという好循環が形成されることが期待される。このことは、慢性痛の治療において、日常生活の中で活動性を高めることが重要であることを示しており、痛みに対する不安・恐怖のため不動となって慢性痛を悪化させている現状、すなわち「生活習慣病」としての慢性痛の新しい側面について社会的に注意喚起を促して行く必要がある。出版物や学会での講演などを通じてこれらの成果を周知し、実際の慢性痛の治療に役立てて行きたい。
低放射化材料の変態超塑性変形を応用した成形技術開発研究

研究代表者は、本申請の当初、低放射化フェライト鋼という先進エネルギー材料における製造後の難加工性の解決へ向け、変態超塑性を応用したこれまでにない革新的な超塑性成形(SPF)の実現を目指し研究を開始した。本材料は、これまで変態超塑性の発現が確認されていない材料であったため、この発現を調査する研究から着手した。1年目の調査では、900°C前後で相変態を起こす低放射化フェライト鋼(JLFー1)を研究材料とし、本来の降伏強度を大きく下回る一定荷重下で800/1000°Cの温度変動(温度サイクル)を加えることにより、最大170200%という巨視的な変形結果を得た。比較として、温度変動を与えない試験も行ったが、このような巨視的な挙動は見られなかった。この比較より、巨視的な変形は温度変動が要因となっており、その相変態が駆動力となっていることが明らかになった。2年目の調査では、その変形前後の組織観察を行い、変形前後でその差が少ないことが明らかになった。この要因として、相変態を引き起こす熱変動は、変形のための処理として進みながらも、同時に組織制御の熱処理としても寄与していたためと考えられる。3年目にはこれまでの引張試験のデータをまとめ、論文化作業を進めると同時に、圧縮試験を行うための圧縮機等周辺機器の設計および敷設作業を行った。しかしながら、当初計画していた圧縮試験は、技術上および安全上の観点から、引張試験と比べ非常に困難な課題をはらんでおり、本申請内での完結は困難であると判断した。その一方で、本申請期間で得られた研究結果は、長きにわたる超塑性(変態超塑性)の学術研究の中で、初めて先進エネルギー材料でも発現することを明らかにした。またこれらの知見は、次の申請研究(基盤C)におけるSPFへ向けた圧縮試験研究に大きく貢献できると期待される。本研究では、核融合炉候補材として知られている「低放射化フェライト鋼」の難加工性を克服するため、その成形技術の改善に着目した。その手法として、これまでに試みられなかった変態超塑性を応用した革新的な超塑性成形(SPF)を提案した。一般的に知られている粒界すべりを用いた微細粒超塑性は、引っ張り試験により巨視的な伸びが認められ、そしてこの現象を応用し、複雑形状へと成形するSPFが発展している。一方で変態超塑性による、このようなSPFはまだ事例が少ない。特に高性能に制御された金属組織を持つ低放射化材料において、試みられたことはなく、このような革新的技術を先進材料に適用することにより、核融合工学さらには異なる工学分野への波及も期待できる。そこで、本試験では異なる組織制御が施された「JLF-1」と「9Cr-ODS鋼」と呼ばれる低放射化鋼を比較した。JLF-1は鋳造法により合金化された一般的な低放射化フェライト鋼である。一方で9Cr-ODS鋼は、機械的合金化と呼ばれる手法によりナノレベルオーダーの酸化物を粒内・粒界に分散することにより転位運動を抑制し強化した先進材料であり、どちらの材料も800/1000°C域でγ/α相変態を誘起することが確認されている。これらの2材料に対し、各種変形モードで超塑性発現の有無を確認し、最終的には複合変形モードとなるSPFが可能かを確認する。本申請による実施期間は4か年であり、初年度は引張試験の実施、2年度はその組織解析、3年度は圧縮試験、4年度はその組織解析及びSPF技術への発展を計画していた。現在、初年度が終了し、計画通り、2種類の試験材(JLF-1、9Cr-ODS鋼)におけるサイクル数依存性、荷重依存性を明らかにした。この結果、JLF-1については1.740.87kg/m2の荷重域において70180サイクルの熱処理(800/1000°C)を行うことにより180%近い巨視的な伸びを確認した。またこれに付随し、サイクル数に相当する時間、等温熱処理下による引張を行ったが、巨視的な伸びは確認されなかった。これは、明らかに相変態域を往復したことに起因する現象であることを示唆している。また荷重を4.17kg/m2まで上げると伸びは100%前後まで減少した。これは1サイクルあたりに進む伸び量が多く、連続的な超塑性流動よりも早いため破断に至ったと考えられる。そこで一連の実験を応用し、荷重を初期負荷よりも軽量化する荷重変動試験を行った。その結果、サイクルの初期において、4.17kg/m2を負荷し、数%の伸びを発現させ、その後1.74kg/m2荷重により100%までは伸びを進行させた。その後、破断までは0.87kg/m2を採用し、1サイクルあたりの伸びを制御した。これにより引き延ばし、成形時のへのフィードバックとなる知見を得た。またサイクル数全体として、減少させることが可能であることがわかった。これは実操業時の、効率化にもつながると期待できる。一方では、サイクル数および荷重を上昇させても9Cr-ODS鋼ではこのような現象は見られなかった。これは変態超塑性変形の変形機構が高温クリープ変形の連続であることを改めて示すものであった。本研究では、核融合炉部材として耐熱性、耐照射性を兼ね備えた「低放射化フェライト鋼」の革新的成形技術に着目した。

低放射化フェライト鋼とは、一般的なマルテンサイト系フェライト鋼の添加元素を変更することにより核融合・核分裂エネルギー分野への応用を見込み、開発研究が進められてきた次世代の鋼である。しかしながら、その降伏点の高さなどの特性ゆえに製造後、非常に加工しにくく、この難加工性が、実際の核融合炉を作る上で問題となることが予想されている。そこで本申請では、この難加工性を克服するため、変態超塑性という変形メカニズムを応用した新たな超塑性成形(SPF)技術開発を進めている。一般的に知られているSPFは「微細粒超塑性変形」という粒界すべり変形を主体としている。しかし、本研究では、「変態超塑性変形」と呼ばれる前者とは全く異なる高温クリープを主体としたSPFに着目した。この変形は意図的に急速な温度変化を与えることにより相変態を起こし、高温クリープを短時間で且つ連続的に起こすことにより誘起するという特殊な変形機構を持つ。この変態超塑性変形は、これまで一部の従来型の合金および鉄鋼材料においてのみ発現することが確認されているが、一軸の引張モードでしか確認されてはおらず、成形(圧縮)プロセスにおける応用はこれまでされてこなかった。昨年度までには、先進エネルギー材料として期待されるJLF-1鋼において初めて引っ張りモードにおける変態超塑性現象を確認した。また、荷重およびサイクル数が伸びに及ぼす影響の調査も進められ、より効率的に変形させる荷重変動の技術も試みた。この変形前後の組織観察を観察すると、先進材料が高エネルギー放射線に耐えうるマルテンサイト系組織を維持していることが分かった。これは変形後、再熱処理なく部材へ適用できることを示唆している。初年度は引張試験の実施、2年度はその組織解析、3年度は圧縮試験、4年度はその組織解析及びSPF技術への発展を計画していた。平成27年度では異なる組織制御が施された「JLF-1」と「9Cr-ODS鋼」と呼ばれる低放射化鋼を引っ張り試験により比較した。JLF-1は鋳造法により合金化された一般的な低放射化フェライト鋼である。一方で9Cr-ODS鋼は、機械的合金化と呼ばれる手法によりナノレベルオーダーの酸化物を粒内・粒界に分散することにより転位運動を抑制し強化した先進材料であり、どちらの材料も800/1000°C域でγ/α相変態を誘起することが確認されている。これらの2種類の低放射化材料に関し、基礎的な引っ張り試験を行い、引張試験による変態超塑性の発現の有無を確認した。この実験内では、今後、核融合炉ブランケット・ダイバータなどで用いられることが期待される試験材JLF-1で発現が確認された。平成28年度(前半2か年が終了)では前年度までの内容をもとにし、変形後の組織観察を行った。もともとJLF-1は、鋳造製造後、後熱処理と呼ばれる工程を経て、組織制御が施される。この組織はマルテンサイト/フェライトの複合相であり、このような複合相を残し、変形させることはこれまで極めて困難であった。これは加工・接合後、再熱処理をしなければ元の制御組織には戻らなったためである。しかしながら本試験では、変形後にもほぼ同一の組織を有していた。これは常にサイクル熱処理を加えながら、変形を行い、そして終了するという変態超塑性変形が本来持つ特有の作業が功を奏したと考えられる。この結果は、これまで製造後、精密切出し・溶接を経て、再熱処理まで必要としていた低放射化材料による部材を、将来的に、溶接つなぎ目無しという無縫の部材に製作できる可能性を示唆した。
牛の黄体発育過程におけるLH受容体のスプライシング異型体の発現と機能

牛の黄体における黄体形成ホルモン(LH)受容体mRNAのスプライシング異型体の発現についてRT-PCR法により検討し、さらに準定量的RT-PCR法を用いて黄体発育過程におけるその量的変化について検討した。また牛LH受容体異型体の機能について検討する目的で完全長cDNAのクローニングを行った。RT-PCRによって得られた増幅産物は明瞭な4本のバンドから構成されており、その塩基配列については最長のバンドは全長型(A form)で牛LH受容体cDNAの当該領域の配列と同一であった。残りの3本のバンドは、LH受容体mRNAの異型体であった(F、BおよびG formと命名)。4種のmRNA量は黄体発育過程においてほぼ同様に増加した。また、牛のLH受容体の完全長cDNAのクローニングをRT-PCR法を用いて実施した。RT-PCRは3つの断片に分けて行い、その後3つの断片を制限酵素による切断後、DNAリガーゼによりつなぎ合わせて、4種の完全長cDNA(A,F,BおよびG form)を得た。それらの塩基配列を決定した結果、F formは細胞外のLHと結合する領域の短い部分のみが欠失しており、細胞膜貫通領域および細胞内領域はA formと同一であることがわかった。B formについてはmRNAの一部欠失によるアミノ酸読み枠の移動が起こり、そのため膜貫通領域および細胞内領域を持たない異型体であることが明らかになった。またG formについては、B formの細胞外領域の一部がF formと同様に欠失したものであることがわかった。得られたLH受容体の4種の全長cDNAは哺乳動物発現用のベクターに組み換えて、猿腎臓由来の細胞株に遺伝子導入を行い、その機能について現在解析中である。以上の成績から、牛のLH受容体mRNAのスプライシング異型体は少なくとも3種類存在し(F,BおよびG form)、さらに4種類のmRNA量は黄体発育過程においてほぼ同様に参加することが示唆された。またその3種類の異型体は細胞外領域の一部のみが欠失するもの(F form)、膜貫通領域および細胞内領域が完全に欠損するもの(BおよびG form)であることが明らかになった。本年度は、牛の黄体におけるLHレセプターmRNAのスプライシング異型体の発現について検討し、さらに黄体発育過程におけるその量的変化について検討した。まず、牛黄体のLHレセプターmRNAのスプライシング異型体については、RT-PCRの結果から4本の明瞭なバンドが観察された。各々のバンドの塩基配列については、最長のバンドは519bp(全長型、A from)で牛LHレセプターcDNAの当該領域の配列と同一であった。残りの3本のバンドは、483bp、253bp、および、172bpであり、それぞれ、exonXの全域の欠失、exonXIの5^1側の一部の欠失、およびexonXのNO全域とexonXIの5^1側の一部の欠失が見られた。これら3つのスプライシング異型体は、長いものからそれぞれ、緬羊で報告されたLHレセプターmRNAのF、BおよびG formに相当するものであった。また黄体発育過程におけるA,FおよびG formの量的変化について準定量的RT-PCRを設定して実施した結果、排卵直後から黄体初期にかけて有意に増加し、さらに黄体初期から中期へ有意に増加するが、黄体中期と後期との間には有意差は認められなかった。またB fromは排卵直後から黄体初期にかけては有意に増加するが、その後は有意な変化は認められなかった。またLHレセプター量は排卵直後から黄体初期へは有意な増加は認めらず、黄体初期から中期にかけては有意に増加し、その後黄体中期と後期との間には再び有意差は認められなかった。以上の成績から、牛のLHレセプターmRNAのスプライシング異型体は少なくとも3種類存在し、さらに4種のmRNA量は黄体発育過程において同調して増加することが示唆された。

得られたLH受容体の4種の全長cDNAは哺乳動物発現用のベクターに組み換えて、猿腎臓由来の細胞株に遺伝子導入を行い、その機能について現在解析中である。以上の成績から、牛のLH受容体mRNAのスプライシング異型体は少なくとも3種類存在し(F,BおよびG form)、さらに4種類のmRNA量は黄体発育過程においてほぼ同様に参加することが示唆された。またその3種類の異型体は細胞外領域の一部のみが欠失するもの(F form)、膜貫通領域および細胞内領域が完全に欠損するもの(BおよびG form)であることが明らかになった。
好酸球性上気道炎症における自然免疫リンパ球の発現と微生物コンポーネントへの応答性

近年問題になっている、好酸球性副鼻腔炎においては自然リンパ球が増加していることが知られている。しかし、その役割については、不明な点が多かった。本研究では、副鼻腔炎の手術で得られた鼻茸の細胞を用いて自然リンパ球の発現と役割について解析した。自然リンパ球は多量のサイトカイン産生を行う事が知られている。鼻茸中の自然リンパ球を分離し、黄色ブドウ球菌の毒素で刺激を行ったところ、好酸球性炎症を増悪させるサイトカインの産生が増強される事が明らかになった。また、同時に好酸球性炎症に対して抑制的に働くサイトカインの産生は抑制される事が明らかになった。好酸球性副鼻腔炎の鼻茸では2型自然リンパ球(Innate lymphoid cell)が増加するなど、好酸球性上気道炎症の病態に自然リンパ球が関わる可能性が示されているが、詳細は不明である。我々はこれまでに、好酸球性副鼻腔炎の病態に微生物、特に黄色ブドウ球菌の外毒素(エンテロトキシンやαトキシン)が関与することを明らかにしてきた。一方、これらの微生物コンポートネントに対する桜桃に自然リンパ球がどのように関わるのか、未明な点が多い。そこで本年度は、黄色ブドウ球菌外エンテロトキシンB刺激に対する鼻茸分離細胞のサイトカイン産生におよぼす自然リンパ球(Innate lymphoid cell)関与について検討した。慢性副鼻腔炎兼鼻茸患者の手術時に鼻茸を切除した。鼻茸をコアグラーゼなどの酵素にて処理し、鼻茸分離細胞を精製した。鼻茸分離細胞をLineage(CD2、CD3、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD56、CD123、CD125a)とCD127を用いた磁気ビーズ法にて、Lineage陰性・CD127陽性細胞、すなわち自然リンパ球を単離した。鼻茸分離細胞を黄色ブドウ球菌エンテロトキシンBにて刺激する際に自然リンパ球を添加し、サイトカイン産生の変化を観察した。鼻茸分離細胞は黄色ブドウ球菌エンテロトキシンBの曝露にて、IL-5、IL-13、IFN-γ、IL-10、IL-17AおよびIL-22の産生を示した。自然リンパ球の添加はエンロトキシンB刺激によるIL-5およびIL-13産生を増強した。一方、エンロトキシンB刺激によるIFN-γおよびIL-17AおよびIL-22産生を自然リンパ球の添加は抑制した。以上の結果より、鼻茸を構成する自然リンパ球は黄色ブドウ球菌エンテロトキシンB刺激によって誘導される2型サイトカイン産生を増強し、1型サイトカイン産生を抑制する可能性が示唆された。自然リンパ球を鼻茸細胞から単離し、培養系に添加する手法を確立し、黄色ブドウ球菌エンテロトキシンB刺激に対する鼻茸分離細胞のサイトカイン産生への影響を検討した点には新規性があり、また結果を得たことから、ほぼ当初の計画通りに進展していると言える。好酸球性副鼻腔炎の鼻茸では2型自然リンパ球(Innate Lymphoid cell)が増加するなど、好酸球性上気道炎症の病態に自然リンパ球が関わる可能性が示されているが、詳細は不明であった。一方、これらの微生物コンポーネントに対する応答に自然リンパ球がどのように関わるのか、未明な点が多い。そこで、前年度に引き続き、黄色ブドウ球菌エンテロトキシンB刺激に対する鼻茸分離細胞のサイトカイン産生に、自然リンパ球の及ぼす影響について検討した。鼻茸を伴う慢性副鼻腔炎患者の手術時に鼻茸を切除した。鼻茸をコアグラーゼなどの酵素で処理し、鼻茸分離細胞を精製した。鼻茸分離細胞をLineage (CD2、CD3、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD56、CD123、CD125a)とCD127を用いた磁気ビーズ法にて、Lineage陰性・CD127陽性細胞、すなわち自然リンパ球を単離した。鼻茸分離細胞を黄色ブドウ球菌エンテロトキシンB刺激する際に自然リンパ球を添加し、サイトカイン産生の変化を観察した。鼻茸分離細胞は黄色ブドウ球菌エンテロトキシンB刺激にてIL-5、IL-13、INF-γ、IL-10、IL-17AおよびIL-22産生を示した。自然リンパ球の添加は、黄色ブドウ球菌エンテロトキシンB刺激によるIL-5および、IL-13産生を増強し、一方で、IFN-γ、IL-17AおよびIL-22産生を抑制した。以上より、鼻茸を構成する自然リンパ球は黄色ブドウ球菌エンテロトキシンB刺激によって誘導される2型サイトカイン産生を増強し、1型サイトカイン産生を抑制する可能性が示唆された。

鼻茸中の自然リンパ球を分離し、黄色ブドウ球菌の毒素で刺激を行ったところ、好酸球性炎症を増悪させるサイトカインの産生が増強される事が明らかになった。また、同時に好酸球性炎症に対して抑制的に働くサイトカインの産生は抑制される事が明らかになった。今後は、2型自然リンパ球(type 2 innate lymphoid cells)や3型自然リンパ球の作用を検討すべく、これらの細胞分離を進めたい。また黄色ブドウ球菌エンテロトキシンBだけではなく、エンテロトキシンAやαトキシンなどの外毒素、さらにはプロテインAなどの細胞壁成分の曝露によるサイトカイン産生に自然リンパ球は関与するかなど、より深く研究を進めたい。鼻科学、アレルギー・免疫学研究を効率的、効果的に進めた結果、試薬購入費などの直接経費を節約することができたため。試薬購入を行い、好酸球性副鼻腔炎におけるIL-22の好酸球性炎症の抑制作用についてさらに研究を進める。
造血幹細胞の発生機構の解明

造血幹細胞は、自己複製能と多分化能を兼ね備え、唯一造血系を持続的に維持することができる細胞集団である。本研究課題では、中胚葉系譜から造血細胞が発生してくる過程を詳細に解析し、造血幹細胞の起源を探索した。この解析の中で、リンパ球や骨髄球系譜への分化能に加え、胎仔型赤血球への分化能も有する初期の造血細胞が存在することを見いだした。またこれらの初期の造血細胞と後に発生する造血幹細胞の間の遺伝子発現差異を明らかとし、幹細胞性への関与を示唆した。造血幹細胞は、単一細胞レベルで成体マウスへ移植し長期間にわたり造血系を再構築可能な自己複製能と多分化能を兼ね備えた細胞と定義される。胚胎内において、この定義をみたす造血幹細胞は、未分化中胚葉細胞から新規に造血細胞が形成される時期に遅れて発生する。この時間的空白を埋める細胞集団として、造血幹細胞へ分化する前駆細胞(プレ造血幹細胞)の存在が強く示唆されており、本研究課題では、以前我々の単離した発生最初期の多能性造血前駆細胞とプレ造血幹細胞の同一性について精査するとともに、プレ造血幹細胞から造血幹細胞への移行に細胞内因子を明らかにすることを目的とした。本年度は、プレ造血幹細胞との同一性が強く示唆された発生初期の卵黄嚢に極微量存在する多能性造血細胞と胎仔肝臓の造血幹細胞の遺伝子発現プロファイルを作製した。また胚性幹細胞に由来する多能性造血細胞もプレ造血幹細胞との類似性を多く有することから、卵黄嚢と胚性幹細胞に由来する多能性造血細胞に共通して胎仔肝臓の造血幹細胞との間に発現に差異のある転写制御因子群を明らかにし、これらの転写制御因子が造血系の再構築能の獲得に関与しないか現在、検討を行っっている。造血幹細胞は、限られた細胞寿命を有する成熟血液細胞に対し、自己複製能と多分化能を兼ね備え、唯一、造血系を持続的に維持することができる細胞集団である。造血幹細胞は、実験的には他個体への移植後、長期に渡って造血系を再構築可能な細胞集団と定義される。マウス胚発生期において、造血幹細胞は、胎齢10.5-11日に胚体内外において初めて検出される。しかしながらこれ以前に造血幹細胞がどのような分化経路を経て発生してくるのかについては未解明である。そこで本研究課題では、造血幹細胞がどのような発生経路を辿り出現するのか、また自己複製能が獲得される機構について解明することを目的とした。これまでに研究代表者らは、造血幹細胞が出現する以前の胎齢9.5日に自己複製能を有さないものの造血幹細胞と同等の分化能を有する細胞が存在することを示しており、造血幹細胞の前駆細胞である可能性を示唆していた。本年度は、この細胞が自己複製能を持たないことを利用し、この多能性細胞と自己複製能を有する造血幹細胞間で、異なる遺伝子発現量を示す転写因子に注目して、自己複製能を付与する可能性のある候補遺伝子群の機能解析をすすめた。またパスウェイ解析から、シグナル伝達系、代謝系、また細胞周期に関わる制御系に差異があることを突き止め、自己複製能への関与を示唆した。また、造血幹細胞が出現する以前に多分化能を有する細胞として、上述の胎齢9.5日の細胞よりさらに未熟な造血細胞して、リンパ球や骨髄球系譜への分化能に加え、胎仔期に一過性に産生される胎仔型赤血球への分化能も有する細胞集団を胎齢8-9日胚に同定した。このことは、造血系の発生は、これまで考えられた以上に多段階的に起こる複雑な過程であることを示した。造血幹細胞との関連についても今後検証したい。この時間的空白を埋める細胞集団として、造血幹細胞へ分化する前駆細胞(プレ造血幹細胞)の存在が強く示唆されており、本研究課題では、以前我々の単離した発生最初期の多能性造血前駆細胞とプレ造血幹細胞の同一性について精査するとともに、プレ造血幹細胞から造血幹細胞への移行に必要な細胞外環境また細胞内因子を明らかにすることを目的とする。本年度は、我々の単離した発生最初期の多能性造血前駆細胞の分化能について、さらに精査し、NK細胞を含めたすべてのリンパ球系譜へ効率よく分化することを明らかにし、少なくとも分化能に関しては、造血幹細胞と同義であることを確認した。

またex vivo環境において造血幹細胞を出現させる培養系を確立するため、造血幹細胞が出現する以前の胎齢10日の胎仔肝臓の器官培養を行い、ex vivo培養系でBリンパ球系譜とミエロイド系譜を誘導可能なこととともに、c-Kit陽性Lin(成熟血液細胞系譜マーカー)陰性細胞の増殖を支持できることを確認した。またex vivo器官培養をせずとも、発生最初期の多能性造血前駆細胞を一定培養条件下で培養することで、c-Kit陽性Lin陰性細胞を維持させる培養系も確立できたので、これらの培養系を今後、プレ造血幹細胞の同定、細胞外ニッチの同定へ応用する。発生初期胚のプレ造血幹細胞と胎仔肝臓の造血幹細胞の遺伝子発現プロファイルをマイクロアレイ解析にて比較し、発現差異のある遺伝子群の機能解析を進める予定であったが、発生初期胚のプレ造血幹細胞がごく微量なため、信頼性の高いマイクロアレイ解析を実行できるまでに技術的改良を行わなければならず、この技術改良に時間を要したため、実験計画がやや遅延した。プレ造血幹細胞、ニッチ細胞の同定に必要なex vivo培養系が確立できたため。ひきつづき、プレ造血幹細胞が造血系を再構築可能な造血幹細胞へ移行する現象の分子機構を探索するとともに、そこから得られた知見を、胚性幹細胞などの万能性幹細胞から造血系を再構築可能な造血幹細胞を作製する技術の開発を試みる。今後、ex vivo培養系へ発生最初期の多能性造血前駆細胞を移入し、造血幹細胞へ分化するのかどうか、マウスへの移植を通じて観察するとともに、造血幹細胞の誘導に関わるニッチ細胞を特定する。また造血幹細胞への分化にともなって変化する細胞内因子についても分子遺伝学的解析を行う。上記の計画に必要な消耗品費や技術補佐員の人件費へ充てることとしたい。マウスへの移植系に必要な当施設のX線照射装置のキャリブレーションが適正でなかったため、適正X線照射量の設定に時間を要し、次年度使用額を生じた。次年度は細胞操作、遺伝子操作が多大となるため、物品費、旅費などの他、一部技術補佐員の人件費へ企てる。
大規模組織におけるVLANの相互接続方式に関する研究

本年度は,VLANスイッチで構成される組織ネットワークにおいて,部署外から部署内へのデータリンク層レベルでの一時接続を実現するVLAN相互接続方式として,以下の各課題について研究開発を行った.1 VLAN管理サーバおよび認証サーバの実装前年度の設計を踏まえ,一時接続のためのVLAN-ID管理とVLANスイッチの自動設定を行うVLAN管理サーバと,部署外でユーザ認証を行う認証サーバの実装を行った.前者はPC上で動作するサーバプログラムとして新規作成し,後者は既存の認証サーバプログラムであるFreeRADIUSを拡張して,提案方式で使用する各サーバとの通信機能などを追加した.2システム全体の動作確認と性能評価前述のサーバと前年度までに実装済みのVLAN-ID変換サーバに加え,VLANスイッチとユーザ端末を用いて実験ネットワークを構築し,動作確認実験と性能評価実験を実施した.動作確認実験として,ユーザ端末を部署外のVLANスイッチに接続すると,認証サーバによるユーザ認証後,VLAN管理サーバが一時接続のためのVLAN-IDを割り当ててVLANスイッチを設定すると共に,VLAN-ID変換サーバが部署外と部署内のVLAN-IDを変換することにより,ユーザ端末が所属部署のネットワークにデータリンク層レベルで接続され,これら一連の動作がすべて自動的に行われることを確認した.一方,性能評価実験については,VLAN-ID変換サーバ単体の性能評価は前年度に実施済みであるため,本年度は一時接続に要する時間を計測した.その結果,ユーザ認証の開始からVLANスイッチの設定とVLAN-IDの変換開始が完了するまでの平均時間は3.72秒であり,十分実用的であることを確認した.本年度においては,研究計画調書に記載の通り,VLAN-ID相互変換サーバの詳細設計・実装および評価,および,VLAN管理サーバおよび認証サーバの設計を行った.以下,それぞれの実施内容および成果について詳述する.VLAN-ID相互変換サーバは,VLANが独立して管理される各ネットワークの境界に設置し,VLAN管理サーバからの指示を受けながら,ネットワーク間を通過するフレームのVLAN-IDを相互変換する.このため,VLAN-ID相互変換サーバにはVLAN-IDの変換ルールを格納するデータベースと,VLAN管理サーバとの連携機能が必要であり,それぞれについて詳細設計を行った上で,UNIX上で動作するソフトウェアプログラムとして実装した.このプログラムはUNIXカーネル内ではなくユーザ空間で実現したため,カーネルを迂回したフレーム入出力機能を備えたOSであれば移植は容易であると考えられる.さらに,実装したVLAN-ID相互変換サーバを用いて実験ネットワークを構築し,性能評価実験を実施することにより,(1)フレームサイズの大きなバルク型通信(ファイル転送アプリケーション等)においては,ソフトウェアによる実装で十分な通信速度が得られること,(2)暗号技術を使用するVPN等の仮想ネットワーク技術に対して,安全性を確保しつつより高速な通信が行えること,を明らかにした.2.VLAN管理サーバおよび認証サーバの設計VLAN管理サーバは,VLANが独立して管理される各ネットワークに設置し,一時利用のためのVLAN-IDを管理すると共に,一時利用開始時に空きVLAN-IDを動的に割り当て,これに基づいて各ネットワーク内のVLANスイッチ群の自動設定を行う.このため,VLAN-IDを管理するためのデータベースと,自ネットワーク内のVLANスイッチの接続関係を管理するためのデータベースを設計し,UNIX上で動作するプログラムとして試作した.一方,認証サーバは会議室など組織内の共通スペースと各ネットワークに設置し,共通スペースに接続する一時利用ユーザの認証を行う.パスワード等の認証情報を各ネットワークに設置した認証サーバで分散管理するため,共通スペースの認証サーバは認証のための通信を各ネットワークの認証サーバに中継する必要がある.文献調査により,この中継機能は既存のソフトウェアで実現可能であることが判明したため,これを拡張して,認証成功後にVLAN管理サーバに対して一時利用開始要求メッセージを送信する機能を付加した.さらに,試作したVLAN管理サーバおよび認証サーバと,前項のVLAN-ID相互変換サーバを用いて実験ネットワークを構築し,一時利用ユーザの認証および一時利用のためのVLAN構築が自動的に行われることを確認した.本年度は,VLANスイッチで構成される組織ネットワークにおいて,部署外から部署内へのデータリンク層レベルでの一時接続を実現するVLAN相互接続方式として,以下の各課題について研究開発を行った.1 VLAN管理サーバおよび認証サーバの実装前年度の設計を踏まえ,一時接続のためのVLAN-ID管理とVLANスイッチの自動設定を行うVLAN管理サーバと,部署外でユーザ認証を行う認証サーバの実装を行った.前者はPC上で動作するサーバプログラムとして新規作成し,後者は既存の認証サーバプログラムであるFreeRADIUSを拡張して,提案方式で使用する各サーバとの通信機能などを追加した.2システム全体の動作確認と性能評価前述のサーバと前年度までに実装済みのVLAN-ID変換サーバに加え,VLANスイッチとユーザ端末を用いて実験ネットワークを構築し,動作確認実験と性能評価実験を実施した.動作確認実験として,ユーザ端末を部署外のVLANスイッチに接続すると,認証サーバによるユーザ認証後,VLAN管理サーバが一時接続のためのVLAN-IDを割り当ててVLANスイッチを設定すると共に,VLAN-ID変換サーバが部署外と部署内のVLAN-IDを変換することにより,ユーザ端末が所属部署のネットワークにデータリンク層レベルで接続され,これら一連の動作がすべて自動的に行われることを確認した.一方,性能評価実験については,VLAN-ID変換サーバ単体の性能評価は前年度に実施済みであるため,本年度は一時接続に要する時間を計測した.その結果,ユーザ認証の開始からVLANスイッチの設定とVLAN-IDの変換開始が完了するまでの平均時間は3.72秒であり,十分実用的であることを確認した.
電位依存性L型カルシウムチャネルのtetrad構造と興奮収縮連関

骨格筋、心筋の興奮収縮連関において電位依存性カルシウムチャネル(DHPR)とリアノジン受容体(RyR)は必須の分子である。骨格筋ではDHPRとRyRは分子と分子が直接結合して情報伝達をおこなっていると考えられており、DHPR4分子が1つのRyRと対になっていることが明らかにされている。一方、心筋ではcalcium-induced calcium releaseがその作用機序であると考えられている。我々は骨格筋型(RyR1)と心筋型(RyR2)のリアノジン受容体のキメラ受容体を解析しリアノジン受容体のDHPRとの機能的結合部位を明らかにした。今回これらの6種類のキメラリアノジン受容体をHEK293細胞に発現させリアノジン受容体の構造と機能の関係をさらに明らかにするべく、カルシウムに対するリアノジン結合能と単一チャネル記録を行った。その結果、RyR1のC末4分の1(RyR1:37215037アミノ酸残基)がカルシウムによるRyR1の活性化および不活性化に重要な役割を果たしていることが明かとなった。正常のDHPRと電位依存性が右にシフトした変異DHPR(CSk58)をdysgenic myotubeに共発現させた実験では電位依存性は二相性を示さなかった。これはCSk58のカルシウム放出が正常のDHPRに比して極端に悪いからである可能性が考えられた。そこてmyotubeに打ち込む正常のDHPRのcDNAとCSK58のcDNAの量を変えて、正常のDHPRのcDNA量をCSK58の8倍に増やしたて実験を行ったがそれでも電位依存性は二相性にならなかった。このことから変異DHPRは正常のDHPRに比して1桁以上カルシウムを放出活性が低下している可能性が明らかとなった。今後tetrad形成の実験にはCSk58よりもカルシウム放出活性が高い変異DHPRを用いて検討していく必要がある。一方、心筋ではcalcum-induced calcium releaseがその作用機序であると考えられている。リアノジン受容体は3つのisoformがクローン化されているがこれらのisoformの機能的差異を利用して我々は骨格筋型(RyR1)と心筋型(RyR2)のリアノジン受容体のキメラ受容体を解析しリアノジン受容体のDHPRとの機能的結合部位を明らかにした。その結果、RyR1のC末4分の1(RyR1 : 37215037アミノ酸残基)がカルシウムによるRyR1の活性化および不活性化に重要な役割を果たしていることが明かとなった。Bhatらは先にN末のfoot領域を大部分欠失させたmutanntをもちいてN末にcalclium inactivationの部位があると推定したが、今回の我々の結果は彼等のものとは異なっている。これはキメラと欠失mutanntの違いによるものかもしれない。さらにRyR1のfoot領域をRyR2に置換することによってチャネル活性を維持したまま(リアノジンにより単一チャネルレベルでチャネルブロックが起こる)リアノジン結合能を低下もしくは消失させることができることが明かとなった。

この結果は高感受性リアノジン結合にfoot領域からのlong-rangeの蛋白構造の変化が関与していることを示唆している。骨格筋、心筋の興奮収縮連関において電位依存性カルシウムチャネル(DHPR)とリアノジン受容体(RyR)は必須の分子である。骨格筋ではDHPRとRyRは分子と分子が直接結合して情報伝達をおこなっていると考えられており、DHPR4分子が1つのRyRと対になっていることが明らかにされている。一方、心筋ではcalcium-induced calcium releaseがその作用機序であると考えられている。我々は骨格筋型(RyR1)と心筋型(RyR2)のリアノジン受容体のキメラ受容体を解析しリアノジン受容体のDHPRとの機能的結合部位を明らかにした。今回これらの6種類のキメラリアノジン受容体をHEK293細胞に発現させリアノジン受容体の構造と機能の関係をさらに明らかにするべく、カルシウムに対するリアノジン結合能と単一チャネル記録を行った。その結果、RyR1のC末4分の1(RyR1:37215037アミノ酸残基)がカルシウムによるRyR1の活性化および不活性化に重要な役割を果たしていることが明かとなった。正常のDHPRと電位依存性が右にシフトした変異DHPR(CSk58)をdysgenic myotubeに共発現させた実験では電位依存性は二相性を示さなかった。これはCSk58のカルシウム放出が正常のDHPRに比して極端に悪いからである可能性が考えられた。そこてmyotubeに打ち込む正常のDHPRのcDNAとCSK58のcDNAの量を変えて、正常のDHPRのcDNA量をCSK58の8倍に増やしたて実験を行ったがそれでも電位依存性は二相性にならなかった。このことから変異DHPRは正常のDHPRに比して1桁以上カルシウムを放出活性が低下している可能性が明らかとなった。今後tetrad形成の実験にはCSk58よりもカルシウム放出活性が高い変異DHPRを用いて検討していく必要がある。