hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
星間塵の組成・大きさから見る星間物質循環

本研究では、星間塵をサブミクロン粒子からなる凝集体とモデル化することによって、科学研究費の交付期間内に、星間塵の組成を明らかにしその場測定および全ての周波数領域での観測結果と矛盾のない光散乱特性を明らかにすることを目的としている。平成19年度の研究では、まず、平成18年度の研究から得られた星間塵の組成から塵の構成物質の同定を行った。ここで、星間塵の組成が彗星塵や惑星間塵の組成と類似していることから、彗星起源だと考えられている地球外起源固体微粒子の構成物質の情報を用いて星間塵凝集体モデルを構築した。この星間塵凝集体モデルを彗星塵のモデルとして用いると、可視から遠赤外線まで全ての周波数領域での彗星塵観測結果を再現することができた。これによって、星間塵凝集体モデルは、彗星塵の形成・進化を理解する上で重要な役割を果たすことが示された。特に、NASAディープインパクト・ミッションの観測結果におけるこれまでの解釈では、彗星核さらに太陽系形成期の環境について完全に間違った認識を与えていたことがわかった。次に、星間塵凝集体モデルで星間減光スペクトルの数値計算を行った。可視光から近赤外線までの波長領域では、計算結果と観測データを比較することで、星間塵の主要物質である有機物などの炭素質物質に関して制約を付ける可能性を示唆した。平成18年度の研究では、宇宙元素存在度およびガス相元素存在度より星間塵の組成を決定することを目標とした。近年、星間雲中のガス相元素存在度が多岐に渡り高精度で測定されてきた。これらの観測結果をコンパイルおよび統計処理し、最近改訂された太陽光球の元素存在度を宇宙元素存在度として固相元素存在度、つまり、星間塵の組成を快定することを試みた。これまでの応募者の研究において、Local Interstellar Cloud(LIC)と呼ばれる局所星間雲について星間塵組成を決定し、局所星間雲の形成・進化を議論している。しかし、これまでの研究では、まだデータの質・量ともに乏しかったので、まずLICでの塵の組成を更新することからはじめた。その結果、以前に得られたLICでの塵の組成は、十分に正しいものであるという確証が得られた。次に、G-Cloudと呼ばれるLICに近接する星間雲での塵組成を決定しようと試みが、G-Cloudのデータ数は乏しく信頼できる塵組成を決定するには至らなかった。しかし、Blue-Cloud(BC)と呼ばれるLICに近接する星間雲の塵組成を決定することに成功した。得られた結果の比較によって、星間雲ごとの塵組成の違いは見られなかった。これによって、局所星間雲での塵組成が、星間雲の典型的な塵組成を反映していると結論づけられる。また、LICとBCでのガスの電離度に宅差異は無いと考えられる。平成19年度に星間塵の光散乱特性を調べる準備として、星間塵凝集体モデルを彗星塵のモデルとしてその有効性をテストした。星間塵凝集体モデルは、可視から中間赤外線まで彗星塵観測結果を全て再現し、このモデルの有効性が示された。
ものの聴覚的な理解に関する研究-オノマトペを利用して

ヒトとチンパンジーでものの音や言語音の理解を、オノマトペを利用して、多角的に検討した。研究は4つの側面よりなる。1)ものの実際音、それを声で模したオノマトペ、ものの名称は脳でどのように受け取られるのか。2)チンパンジーは環境音を理解するが、言語音に関しては理解が悪い。オノマトペを導入することで、言語音の理解につなげることはできないか。3)日本語を母語とする乳幼児はものの名称を獲得する前に、そのオノマトペを獲得する傾向が強いが、選好注;視法でその理解の過程を捉えることはできないか。4)脳の損傷による言語理解の障害はしばしばものの理解の障害(聴覚失認)を伴う。しかし両者は乖離しており、言葉の理解は回復しないが、環境音の理解は戻ることがある。そのような症例で、オノマトペを導入することにより、言葉の理解の回復が促進されないだろうか。そのようなためのテスト、訓練法をコンピュータ上で実現することを目指した。1については、ものの実際音、名称はそれぞれ共通する脳領域、独自の脳領域を活性化させること、オノマトペはそれらをまたがるように広範な脳領域を活性化させることがPET.fMRIにより確認された。オノマトペは実際音と名称理解の橋渡しをすると考えた。2については、1頭のチンパンジーがものの音を理解するが、その名称を理解しないことが確認された。オノマトペを導入したが、それは理解できた。3については目下データの蓄積中であるが、環境音のみ理解する乳幼児、それに加えてオノマトペを理解する乳幼児などの存在が確認できた。4についてはVisual Basicにより、ものの実際音、オノマトペ、名称の理解、訓練のための課題制御、データ収集のソフトウェアを完成させた。オノマトペを利用して、ものの聴覚的な理解を以下の4点を検討している。1)機能的なMRIによる実際音、オノマトペ、名詞の聴覚皮質における受容について、2)主に失語症患者で、これらの音響刺激の理解はどのようになっているか、そして実際音と名詞の中間に位置するオノマトペは、言語障害の改善に利用可能か、3)日本人の幼児は一般に名詞の前に実際音、オノマトペを学習する傾向があるが、それをpreferential looking法で捉えられるか、4)1頭のチンパンジーは実際音を理解するが、名詞は理解しない。では、オノマトペの形で、チンパンジーにヒトの言葉を理解させることは可能か。1の脳画像研究に関しては、刺激の選定を終え、現在日本大学医学部で予備テストを実施中である。〓月半ばに本テストに入る予定となっている。この実験を実施する前に近赤外分光法(NIRS)によるテストを実施した。名詞をコントロール、オノマトペをテスト刺激として、聴覚野の酸素化、脱酸素化ヘモグロビンの変化を測定した結果、オノマトペで聴覚野の活動の上昇が見られ、より多くの処理が行われることが分かった。2.については、Visual Basicによる課題が完成し、健常者に対してテストを行った。使用した音響刺激に音韻的、意味的に類似したもの、動物を含む映像を選択刺激として提示した(4選択肢)が、健常者は100%の正答率だった。済世会中央病院で、主に失語症患者でテストすることになっている。3.については来年度に実施する予定である。現在、乳幼児の認知機能を検討する基盤整備に努めている。4.については、オノマトペの理解が75%弱だったため、刺激を動物とその泣き声、オノマトペ(擬声語)を利用し、さらに刺激セットを減少させて検討した。

しかし成績の改善はなかった。チンパンジーの名前という最も彼らに身近で、日常生活で理解されていると思われる刺激でも、成績はチャンスレベルだった。この研究はオノマトペを利用して、音声言語を含むものの聴覚的な理解を以下の4点から検討した。1)健常者の脳機能画像により脳内基盤を明らかにする、2)チンパンジーでその系統発達を明らかにする、3)ヒトの個体発達を明らかにする、4)脳障害の機能回復の課題を作成し、その効果を検討する。脳機能画像に関してはものの実際音、そのオノマトペ、そのものの名詞を聞かせ、カテゴリ判断をさせて、そのときの脳の活動をfMRIで記録した。その結果、実際音、名詞がそれぞれ特異的な脳活動を示すこと、オノマトペはその両者の特徴を併せ持つことを明らかにした。近赤外分光法でも類似した結果を得ている。チンパンジーでは、かれらの環境音認知の能力を明らかにするとともに、名詞の理解が困難であることを明らかにした。そして、オノマトペの理解を通して、言語音知覚の能力を検討した。その結果、環境音は理解するが、そのものの名詞は理解できないチンパンジーがオノマトペを理解することを示した。ヒトの幼児による個体発達の研究では、物の実際音とオノマトペ、名詞を提示し、それに対応する映像を長く見るかを検討した。その結果、理解している音(実際音、オノマトペ、名詞)に対応した映像を長く見た。脳障害による研究では、コンピュータを用いた聴覚、視覚マッチング(理解)テストを開発した。実際音、オノマトペ、名詞を提示し、それにマッチする映像を4つの選択肢の中から選ぶ課題である。選択肢は音にマッチしたターゲット映像に加えて、音として類似するもの、意味的に類似するもの、無関係のものが含まれた。現在、その有効性をテストしている。
植物の形態進化に関わる分子機構の解明

花の器官形成を決定する分子機構は、双子葉植物であるシロイヌナズナやキンギョソウを用いて盛んに研究されており、その結果、過去10年の間に飛躍的に理解が進んだ。われわれは、イネ科植物が独自の花形態を進化させた分子機構の解明をめざしている。本研究においてはシロイヌナズナで明らかになったABCモデルがどの程度までイネ科植物に適応できるかを調べる。これにより、イネ科植物に独特の花器官と双子葉植物の花器官との対応関係が明らかになるものと期待される。今年度は、イネのクラスC遺伝子であるRAGを構成的に発現させ、その結果起こる花器官のホメオティック変異を解析した。シロイヌナズナでは、クラスC遺伝子を構成的に発現させると、花弁、がく片がそれぞれ雄ずい、雌ずに変化する。解析の結果、イネではRAGの発現により、鱗皮が雌ずいに変化した。この結果から、「イネ科植物の鱗皮は双子葉植物の花弁の相同器官である」という、従来の形態学的解析により示されていた説を分子レベルで裏付けることができた。しかしながら、内穎、外穎では形態の変化が観察されず、これら器官のアイデンティティーの解釈に関しては今後、さらに詳細な解析が必要であると考えられる。イネ相同遺伝子の解析・シロイヌナズナLFYおよびキンギョソウFLOのイネ相同遺伝子の発現ハターンをin situ hybridization法により詳細に解析した。その結果、RFLは生殖成長相に転換後、茎頂部で発現が誘導されること、枝梗が分化する領域でその発現が抑制されること、さらに、穎花分化期には発現が検出されないことが明らかになった。このことから、RFLが、イネ穂の分岐に関与していることが示唆された。また、RFLをCaMV35Sプロモータにより構成的に発現させることにより、イネが早咲きになったが、アラビドプシスではこの効果は見られなかった。イネではLFY/FLO相同遺伝子が、発現ハターン、アミノ酸配列のいずれにおいても、他の植物とは異なることがわかった。・シロイヌナズナTFL1、キンギョソウCEN遺伝子の相同遺伝子RCN1、RCN2タンパクとしての機能が保存されているにも関わらず、発現ハターンがTFL1、CENとは大きく異なることがわかった。・これらの結果から、遺伝子機能の多様化のハターンは遺伝子ごとに異なるのではないかと考えられた。生物のかたちの多様性を進化させた分子メカニズムの理解は、生物を理解する上で非常に重要な課題である.そこで本研究では、イネの花の形態形成を決定する分子機構を解析し、植物における形態の多様性の分子レベルでの理解を深めることを目指す。これまでに、シロイヌナズナの花器官決定遺伝子のホモログである、RAP1A、RAGをイネから単離している。今年度はこれら遺伝子にくわえ、他グループにより単離されたOsMADS2遺伝子の発現パターンをin situハイブリダイゼーション法により決定した。その結果、RAP1A遺伝子は、花芽形成のごく初期に花芽全体で発現し、その後は、鱗皮、内穎、外穎で局所的に発現することが明らかとなった。また、OsMADS2は花芽形成初期には発現が見られず、鱗皮が形成されるステージに鱗皮と雄蕊の原基で特異的に発現が認められた。一方、RAGは雄蕊と雌蕊で発現する。RAP1A、OsMADS2、RAG遺伝子がシロイヌナズナのABCモデルの主要遺伝子であるクラスA、B、C遺伝子のホモログとして単離されたものであり、今回明らかになった発現パターンはそれぞれの相同遺伝子のシ口イヌナズナにおける発現とほぼ同じであると考えられる。したがって、イネとシロイヌナズナの間でも花芽形成の基本メカニズムがある程度保存されていることが示された。また、この結果は、鱗皮と花弁が相同な器官であるという、これまでは形態学的な観察から提唱されていた説を分子生物学的な側面から証明した。

花の器官形成を決定する分子機構は、双子葉植物であるシロイヌナズナやキンギョソウを用いて盛んに研究されており、その結果、過去10年の間に飛躍的に理解が進んだ。われわれは、イネ科植物が独自の花形態を進化させた分子機構の解明をめざしている。本研究においてはシロイヌナズナで明らかになったABCモデルがどの程度までイネ科植物に適応できるかを調べる。これにより、イネ科植物に独特の花器官と双子葉植物の花器官との対応関係が明らかになるものと期待される。今年度は、in situハイブリダイゼーション法によりクラスA,B,C遺伝子のイネホモログであるRAPIA、OsMADS4、RAGの発現パターンを解析した。シロイヌナズナでは、クラスA、B、C遺伝子は、それぞれがくと花弁、花弁と雄ずい、雄ずいと雌ずいで発現する。解析の結果、RAPIAは内穎、外穎、鱗皮で、OsMADS4は鱗皮と雄ずい、RAGは雄ずいと雌ずいで発現するということが明らかになった。この結果から「イネ科植物の鱗皮は双子葉植物の花弁の相同器官である」という、従来の形態学的解析により示されていた説を分子レベルで裏付けることができた。ただし、内穎、外穎の解釈に関してはさらに形質転換植物を用いた解析が必要であると考えられる。今年度は、イネのクラスC遺伝子であるRAGを構成的に発現させ、その結果起こる花器官のホメオティック変異を解析した。シロイヌナズナでは、クラスC遺伝子を構成的に発現させると、花弁、がく片がそれぞれ雄ずい、雌ずに変化する。解析の結果、イネではRAGの発現により、鱗皮が雌ずいに変化した。この結果から、「イネ科植物の鱗皮は双子葉植物の花弁の相同器官である」という、従来の形態学的解析により示されていた説を分子レベルで裏付けることができた。しかしながら、内穎、外穎では形態の変化が観察されず、これら器官のアイデンティティーの解釈に関しては今後、さらに詳細な解析が必要であると考えられる。
創薬開発に向けたウイルススーパーファミリー１ヘリカーゼの構造と機能に関する研究

スーパーファミリ1(SF1)ヘリカーゼは、多くの農学上および獣医学上重要なウイルスにコードされている。しかし、その立体構造や原子レベルでの機能は不明な点が多い。近年、我々はトマトモザイクウイルス(ToMV)がコードするSF1ヘリカーゼの安定領域(ToMV-Hel)を決定し、その立体構造の決定に成功した。同様に、他のウイルスがコードするSF1ヘリカーゼの構造と機能が解明できれば、その共通性や相違点から、ウイルスSF1ヘリカーゼの機能を明らかするとともに、将来的に創薬開発に対しての基盤情報となることが期待できる。本申請課題では、ToMVと同様にSF1ヘリカーゼをコードする4種類ウイルスについて、i)発現系の構築、ii)精製方法の確立、iii) NTPase活性の評価、iv)結晶化の検討、v)X線溶液散乱(SAXS)実験を行った。E型肝炎および風疹ウイルスのヘリカーゼドメインについては、発現量が少なく精製タンパク質を得ることはできなかった。ベネズエラウマ脳炎ウイルスのヘリカーゼドメインを含むタンパク質(VEEV-nsP2)については、精製タンパク質が効率よく得られた。SAXSによる解析の結果、精製VEEV-nsP2は単分散で良好な溶液状態にあることが分かり、低分解能構造が得た。しかし、本課題終了時点で結晶化条件の検討を継続中である。豚流行性下痢ウイルスのヘリカーゼドメインを含むタンパク質(PEDV-nsp10)についての研究は、大きく進展した。純度の高いタンパク質の精製方法を確立し、VEEV-nsP2と同様にSAXS解析を行った結果、単分散で良好な溶液状態にあることが分かり、低分解能構造が得た。さらに結晶化条件の検討を行い、タンパク質由来の反射を確認した。本課題終了時点では、より分解能の高い結晶を得るため結晶化条件の再検討中である。同様に、他のウイルスがコードするSF1ヘリカーゼの構造と機能が解明できれば、その共通性や相違点から、ウイルスSF1ヘリカーゼの機能を明らかにすることが可能となる。そして、この成果は将来的に創薬開発に対しての基盤上となることが期待できる。H26年度は、ToMVと同様にSF1ヘリカーゼをコードする4種類ウイルス(ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)、E型肝炎ウイルス(HEV)、風疹ウイルス、各種ウイルス)について、ToMV-Helとの比較やアミノ酸シーケンスから予測される二次構造を解析し発現領域を特定した。それぞれの発現領域に対して、可溶性の向上および精製の効率化のため各種タグを付与した発現ベクターを構築した。ヘリカーゼ領域を含むVEEV nsP2タンパク質は、ヒスチジンタグを付加して発現し、精製方法を確立した。また、得られたVEEV nsP2タンパク質は、等温滴定型カロリメトリーを用いた実験の結果、高いNTPase活性を有することが明らかになった。この結果は精製されたVEEV nsP2タンパク質が活性構造を形成していることを示している。さらに動的光散乱実験の結果、VEEV nsP2タンパク質はATPアナログ存在下で安定化することが分かった。現在、安定化条件における結晶化を検討中である。HEVに関しては発現を確認し、可溶化条件を検討中である。風疹ウイルスおよび各種コロナウイルスについては発現系の構築を進めている。本申請課題では、ToMVと同様にSF1ヘリカーゼをコードする4種類ウイルス(ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)、E型肝炎ウイルス(HEV)、風疹ウイルス、豚流行性下痢ウイルス(PEDV))について、i)発現系の構築、ii)精製方法の確立、精製タンパク質が得られたタンパク質については、iii)NTPase活性の評価、iv)結晶化の検討、v)X線溶液散乱(SAXS)実験を行った。HEVおよび風疹ウイルスのヘリカーゼドメインについては、発現系の構築はできたが、発現量が少なく精製タンパク質を得ることはできなかった。VEEVのヘリカーゼドメインを含むタンパク質(VEEV-nsP2:ヘリカーゼドメイン+プロテアーゼ)については、精製タンパク質が効率よく得られ、SAXSによる解析により低分解能構造が得られた。現在、条件の違いによる構造変化の有無について実験を進めている。SAXSの結果では、精製VEEV-nsP2は単分散で良好な溶液状態にあることが分かったが、現時点で結晶化には成功していない。次年度以降も結晶化条件の検討を行う予定である。PEDVのヘリカーゼドメインを含むタンパク質(PEDV-nsp10:金属結合ドメイン+ヘリカーゼドメイン)についての研究は大きく進展した。

純度の高いタンパク質の精製方法を確立し、結晶化条件の検討を行い、タンパク質と思われる結晶を得たスーパーファミリ1(SF1)ヘリカーゼは、多くの農学上および獣医学上重要なウイルスにコードされている。しかし、その立体構造や原子レベルでの機能は不明な点が多い。近年、我々はトマトモザイクウイルス(ToMV)がコードするSF1ヘリカーゼの安定領域(ToMV-Hel)を決定し、その立体構造の決定に成功した。同様に、他のウイルスがコードするSF1ヘリカーゼの構造と機能が解明できれば、その共通性や相違点から、ウイルスSF1ヘリカーゼの機能を明らかするとともに、将来的に創薬開発に対しての基盤情報となることが期待できる。本申請課題では、ToMVと同様にSF1ヘリカーゼをコードする4種類ウイルスについて、i)発現系の構築、ii)精製方法の確立、iii) NTPase活性の評価、iv)結晶化の検討、v)X線溶液散乱(SAXS)実験を行った。E型肝炎および風疹ウイルスのヘリカーゼドメインについては、発現量が少なく精製タンパク質を得ることはできなかった。ベネズエラウマ脳炎ウイルスのヘリカーゼドメインを含むタンパク質(VEEV-nsP2)については、精製タンパク質が効率よく得られた。SAXSによる解析の結果、精製VEEV-nsP2は単分散で良好な溶液状態にあることが分かり、低分解能構造が得た。しかし、本課題終了時点で結晶化条件の検討を継続中である。豚流行性下痢ウイルスのヘリカーゼドメインを含むタンパク質(PEDV-nsp10)についての研究は、大きく進展した。純度の高いタンパク質の精製方法を確立し、VEEV-nsP2と同様にSAXS解析を行った結果、単分散で良好な溶液状態にあることが分かり、低分解能構造が得た。さらに結晶化条件の検討を行い、タンパク質由来の反射を確認した。本課題終了時点では、より分解能の高い結晶を得るため結晶化条件の再検討中である。研究計画当初は、VEEV-nsP2の結晶化条件の検討、HEV、風疹ウイルスのヘリカーゼドメインおよびPEDV-nsp10の発現条件および精製条件の検討を進める予定であった。研究を進めた結果、HEVおよび風疹ウイルスのヘリカーゼドメインについては、発現系の構築は予定通り進めることができたが、目的タンパク質の発現量が少なく精製に成功することができなかった。一方、現在感染が問題になっているPEDVについては、PEDV-nsp10の精製に成功することができた。この精製タンパク質は等温滴定型カロリメトリーを用いた実験の結果、NTPase活性を有することが明らかになったことから、活性型の構造を形成していると考えられた。また、NTPase活性の基質選択性の傾向はToMV-HelやVEEV-nsP2とは大きく異なっていることが明らかとなった。
脱ユビキチン化酵素 A20 のマウス個体における役割の研究

本研究では、炎症反応を負に制御する脱ユビキチン化酵素A20の組織特異的ノックアウトマウスを作成した。腸上皮特異的ノックアウトマウスは目立った表現型を示さなかった。皮膚特異的ノックアウトマウスは生育遅延を起こした。解析の結果、皮膚には異常は認められなかったが、胃の食道側の上皮に炎症および肥厚化を認めた。このことから、A20皮膚特異的ノックアウトマウスにおいては、胃において異所的にCreが発現してA20が欠損することによって炎症を起こし、その結果生育が遅延すると考えられる。平成22年度は当初の実験計画に従い、炎症反応を負に制御する因子である脱ユビキチン化酵素A20の組織特異的ノックアウトマウスの作製を行った。まず、A20遺伝子の二番目のエクソンがloxPで挟まれているマウスES細胞由来のキメラマウスを野生型マウスに交配することにより、A20 floxedマウスを作製した。得られたA20 floxedマウスを、皮膚特異的にCreを発現するマウスであるKeratin-5 Cre (K5-Cre)マウス、および腸上皮特異的にCreを発現するマウスであるVillin-Creマウスと交配し、さらにその交配で生まれた子孫を兄弟交配することにより、予定通りA20遺伝子の皮膚特異的ノックアウトマウスおよび腸上皮特異的ノックアウトマウスを得ることができた。A20の腸上皮特異的ノックアウトマウスは目立った表現型を示さなかった。皮膚特異的ノックアウトマウスは正常に生まれてくるが、離乳後の生育が野生型と比べて悪かった。また、生後数週間で手足指に炎症を起こすことが明らかとなった。今後はマウスの経過観察をしつつ、A20を欠損させた組織をマウスから単離して組織切片を作製し、表現型を形態学的に解析する。また、免疫蛍光染色法などを用いて、組織への免疫細胞の浸潤の程度や細胞増殖などの解析を行う。それに加えて、マイクロアレイやリアルタイムPCRなどの手法を用い、野生型マウス組織との間の遺伝子発現の違いについても検討する。これらの実験結果より、炎症反応、および慢性炎症のがん化におけるA20の役割についての知見を得たいと考えている。平成23年度は当初の実験計画に従い、炎症反応を負に制御する因子である脱ユビキチン化酵素A20の組織特異的ノックアウトマウスの解析を行った。まず、A20の腸上皮特異的ノックアウトマウスは目立った表現型を示さなかった。A20皮膚特異的ノックアウトマウスは正常に生まれてくるが、離乳後の生育が野生型と比べて著しく悪かった。A20を欠損させた組織をマウスから単離して組織切片を作製し、表現型を形態学的に解析したところ、皮膚組織には顕著な異常はみられなかったが、手足指に激しい炎症が認められた。さらに詳しく解析を行ったところ、胃の食道側の部位に激しい炎症および肥厚化が認められた。マウスにおいては、胃の食道側は角化扁平上皮で覆われていることが知られている。このことから、おそらくA20皮膚特異的ノックアウトマウスにおいては、胃において異所的にCre遺伝子が発現するためA20が欠損していると考えられる。また、その結果として胃に炎症が起き、食物の消化吸収が阻害されることが原因で生育不全が起こっているものと考えられる。皮膚に炎症が起きず、手足指と胃に炎症が限局する原因については不明であるが、.離乳前は生育に差がないことから、物理的刺激の多寡が原因のひとつとして考えられる。この点については今後検討していく予定である。
細胞内蓄積生産物の連続的透過処理を伴う植物細胞培養法に関する研究

本研究においては,植物培養細胞を用いた有用物質生産系に関して,細胞内に目的生産物を蓄積してしまう例として,イチゴ(Fragaria ananassa cv.Shikinari)培養細胞を用いた植物色素アントシアニンの生産を取り上げ,細胞内蓄積生産物の超音波による透過処理プロセスを開発するために,工学的な観点から実験的な検討を行った。(1)イチゴ培養細胞によるアントシアニン生産に影響を与える因子まず,イチゴ培養細胞のアントシアニンの経時的な生産挙動に影響を与える因子,特に,溶存酸素濃度,窒素源の寄与について明らかにした。(2)超音波透過処理の条件続いて,上記の色素生産細胞系を用いて,超音波(約1MHz)を用いた透過処理プロセスの有用性に検討を行なった。超音波照射の作用を物理的な側面と化学的な側面に分けて実験的に評価し,細胞内色素の放出は,主として,超音波によって生じるキャビテーションによる化学的な作用(ラジカル生成)によること,細胞の失活は物理的作用により生じることを指摘し,処理槽の改良を行なうことにより,細胞の死滅を抑制した状態で色素の透過率(生存放出率)を比較的高く維持することが可能であることを示した。(3)超音波による透過処理の機構蛍光プローブを用いた偏光解消法による実験から,細胞膜の流動性が,超音波の細胞に対する作用に関与することが示唆された。また,個々の細胞内に蓄積された色素の定量的評価法を,画像処理装置を用いて確立した。以上の結果は,本系のみならず,広く植物細胞を用いた有用物質の連続的生産に対して有用な知見を与えることになる。今年度は、赤色色素アントシアニンを蓄積したイチゴ(Fragaria glandiflora)培養細胞に超音波を照射し、色素の放出挙動についての定量的な知見を得るとともに、細胞レベルで画像処理技術を応用することにより、各細胞ごとの色素の放出挙動について、統計的な解析を行うための手法を確立した。さらに、超音波による連続的透過処理に必要な条件を明らかにした。一方、この超音波による放出効果を規定する物理的あるいは化学的因子が何であるのかを定量的に評価し、超音波の作用メカニズムの一端を明らかにした。以下に主な結果を列記する。(1)振盪フラスコによりイチゴ細胞を培養し、アントシアニンが細胞内に蓄積したところで、発振回路と圧電セラミックス(ピエゾ素子)により発生させた超音波を細胞に当て、色素を排出させた。その際の条件として、1MHz程度の高周波数の有効性および処理時間は1分程度で飽和すること、色素の安定性から氷温に近い温度がよいこと等を見い出した。(2)超音波による透過処理効果がその物理的な作用(キャビテーション)に起因するのかあるいは化学的な作用(副生する酸素ラジカル)に起因するのかを確かめるために、それぞれの効果をβナフトール粒子の溶解速度と過酸化水素の発生量によって評価した。その結果、化学的な効果が透過処理には有効であることが明らかにとなったため、物理的な効果による細胞破壊を抑え、化学的な作用は維持されるように装置の改良を行ない、透過効果を向上させた。(3)培養細胞の色素蓄積量および放出量のバラツキを定量的に評価するために、細胞集団の顕微鏡像を画像処理することにより、統計的に解析する方法を確立した。すなわち、写真撮影可能な生物顕微鏡、ビデオカメラ・データプロセッサなどからなるカラー画像処理システムを用い、各細胞内の色調の平均値の細胞毎の分布を数値化し、標準物質と比較して濃度として定量化するソフトを構築した。前年度と同様,赤色色素アントシアニンを蓄積したイチゴ(Fragaria ananassa cv.Shikinari)培養細胞に超音波を照射し,細胞レベルで画像処理技術を応用することにより,各細胞ごとの色素の放出挙動について、統計的な解析を行い、超音波による連続的透過処理に必要な条件(超音波の強度、処理液の組成、温度、pH等)を明確にするための検討を引き続き行なった。

特に,前年度の研究成果から,この超音波による放出効果を規定する因子が,化学的なものである可能性が高くなったので,超音波照射に伴う過酸化水素生成量を滴定することにより,ラジカル生成量を定量的に評価した。その結果,振動子と細胞懸濁相の間に膜を介することにより,ラジカル生成速度を維持したまま,キャビテーションの生成を抑えることが可能であることが示された。また,このような条件下では,色素の透過率(生存放出率)が比較的高く維持されることが示された。さらに,比較的低温条件の方が細胞の生存率の維持が容易であることもわかった。しかし,色素の生存放出率は,放出率の増大とともに低下しており,超音波以外の方法によるラジカルの発生も検討したが顕著な効果はなかった。次に,超音波による透過処理がどのような細胞に対して有効なのかを明らかにするために,培養の各段階における色素蓄積量の異なるイチゴ細胞を用いて,同様の検討を行なったが,放出率に大きな差は見られなかった。一方,植物細胞に対する超音波の作用と蓄積物質の透過性を関係付ける指標として、細胞膜または,細胞壁の流動性に着目し、細胞膜に取り込ませた棒状の蛍光分子を偏光で励起し、照射される蛍光の旋光度を測定することにより、これを評価した。培養のフェーズによって膜流動性が異なることが示されたが,このことが色素の放出とは直接に関連はしていなかった。
カテゴリー分析による中学校家庭科教育食物領域の評価方法の開発

研究の初年度は、調理学習時の学習者の行動をビデオ録画し、調理における学習者の具体的行動を分析し、行動分析のためのカテゴリーシステムの妥当性を検討し開発した。開発した40項目の調理カテゴリーにより分析の結果、各行動の種類、時間共に個人差が大きいこと、直接行動、間接行動の何れかに片寄る生徒が多いこと、間接行動の多い生徒の中に消極的行動をとる生徒がいることが明らかとなった。第2年次は学習中の学習者の音声情報を、最大20人分、最長60分間録音することができるシステムを開発した。40MBZ9波、200MHZ帯11波の計20波のワイアレス集録が可能で、マルチトラックレコーダ5台によりMCー120のコンパクトカセットテープに4人ずつ録音が可能である。このシステムにより「献立・栄養」授業の記録及び分析を実施した。その音声情報よりプロトコールを作成し、発話行動分析の新しいカテゴリーを作成した。発話種別7項目、発話内容6項目を組合わせた39カテゴリーにより分析を行った。第3年次は、調理学習行動分析の結果、調理行動の実態を明らかにし、調理製作行動が多く行われる時間帯は、個人及び調理の種類によって異り、調理技術の習得に関連することが分かった。献立作成学習におけるグループ発語行動のカテゴリー分析の結果、献立作成に直接関係する発言が多いが、グループによる相異が認れられた。自発的発言が多いのに比べ応答が少ないことからグループ内に相互作用は必ずしも活発であるとはいえない。発話内容別カテゴリーにより時系列で分析・検討した結果、グループによる特色がみられた。調理実習および献立作成学習における行動分析の結果から学習過程を検討した。調理および献立学習の評価とフィードバックをする場合の視点を検討し、評価方式の基本的な考え方を提案した。3年次計画の初年度としての研究実績は次の通りである。食物領域に焦点をしぼり、実際の授業における個々の学習者の行動を分析し、そこにおける学習者の具体的行動の実態から、学習者の実践的学習能力の視点に立つ教育目標の構成を解明するために、(1)行動分析のためのカテゴリーシステムの開発(第一次試案)と、それによる調理実習授業の分析ならびにカテゴリーシステムの妥当性の検討、(2)(1)の分析結果に基づく、学習者の実践的能力の視点からの教育目標の検討に焦点をあてた。調理に関する行動25項目、調理の情報に関する行動15項目、安全清潔に関する行動3項目、その他1項目、計44項目からなる行動分析カテゴリーを作成し、それを用いて、食物領域の内容のうち、「調理」について合計6番組1番組、10本、計60本の学習行動ビデオ記録及び各授業中の学習者の発声行動の音声録画とその分析を行った結果、(1)各行動の種類及び行動時間ともに個人差が、かなり大きい。(2)さらに直接経験行動(調理に関する行動25項目)とに分けて分析した結果(1)直接経験行動だけの多い生徒(2)間接経験行動の多い生徒(3)直接、間接ともに多い生徒、(3)行動観察により各行動を積極的行動(+)消極的行動(-)、どちらとも言えない(0)の3つの観点で分析した結果、調理実習時間の半分以上も積極的に行動している生徒もいる半面、間接行動の多い生徒の中に消極的行動をとる生徒が存在することが判明した。調理における目標分類をKJ法で行った結果、行動分析により技能の習得過程を明らかにしてから、目標構成を修正することになった。3年次計画の第2年次としての研究実績は以下のとおりである.

1.マルチチャンネルワイアレス録音システムの開発と試行学習中の学習者の音声情報を,リアルタイムで同時に,ワイアレスで最大20人分,最長60分間の録音をすることができるシステムを開発し,家庭科の調理実習において,授業者1,学習者19の音声情報録音の試行を実施した.本システムにおいては,40M・Hz帯90波,200MHz帯11波の計20波のワイアレス録音が可能であり,マルチトラックレコーダ5台により,Cー120(片面60分)のコンパクトカセットテープに4人ずつ録音することが可能である.これら5台のレコーダはリモートコントローラにより操行が連動できる.また録音された20チャンネルの音声情報から任意のチャンネルをとり出し,編集することが可能である.試行の結果,マイク及び送信機を装着したことによる学習者への心理的影響はほとんどないことが,調査の結果から判明した.2.中学校家庭科の「栄養・献立」授業における学習者の学習過程の分析家庭科食物領域の栄養・献立に関する学習活動における学習過程を明らかには,適切な評価方法を開発するために,授業の記録をとり,分析を行った.授業の記録には1のシステムを用い,その音声情報よりプロトコールを作成した.言語分析のカテゴリーは,従来の研究では授業者と学習者間の相互作用を分析するきためのものが多いが,学習者間の相互作用のカテゴリー分類に関する先行研究は少ない.本研究はその点に着目し,評価に結びつくように配慮した.作成したカテゴリーを用いて学習行動の分析を行った結果,さらに改善する必要のあることが判明した.3年次計画の第3年次としての研究実績は次のとおりである。1.中学校家庭科食物領域・調理学習の行動分析抽出生について調理実習中の行動をカテゴリー分析とコンピュータ集計をした結果、調理操作やこれに付随する行動が約1/2の時間を占めたが、情報受授の行動やその他の行動も多かった。グループの調理においては後者の調理の間接的行動が学習の重要な部分である。調理操作行動が多く行われる時間帯は個人及び調理の種類によって異り、調理技術の習得に関連すると思われる。2.献立学習におけるグループコミュニケーションの実態分析栄養・献立に関する学習はグループ学習による例が多い。本研究では献立作成学習におけるグループの発話行動をカテゴリー分析し、コミュニケーションの実態を検討した。その結果、全体に沈黙時間が多かった。発言は献立作成に直接関係するものが最も多い。次にグループによって学習に間接的に関連した発言や無関係な発言が多い。また、自発的発言が多く応答が少ないことから、グループ学習において相互作用は必ずしも活発でなかったといえる。献立作成のプロセスを発話内容別カテゴリー分析して時系列で検討した結果、グループにより特色がみられた。3.調理および献立学習における行動評価の視点の検討調理実習および献立作成学習における行動分析の結果から、学習過程に関して新しい知見を得た。このことをもとに、調理および献立学習における評価の基本的な考え方を提案した。
HA重複組み換えインフルエンザウイルスの構築と多価(半)生ワクチンへの応用

本研究では、リバース・ジェネティクス法により人為的に多段階の弱毒化を施し、さらに1つの粒子中に現在人で流行中の三種類のHA遺伝子(A/H1,A/H3, B)を同時に組み込んだHA重複組み換えウイルスワクチンの開発を最終目的とする。このワクチンは現在用いられている三種類のウイルスHAを混合した不活化ワクチンに比べ、接種量の制限が排除され、体内の抗原量を増すのみならず、粘膜免疫、細胞性免疫をも誘導できるため優れた免疫効果が期待される。さらに、間違いなく安全性、経済性にも優れる。この組み換えワクチンを作製する前提として、二種類以上のHA遺伝子があるいはキメラHA遺伝子がウイルス中に組み込まれる必要がある。そこでまずA型HIウイルスとB型ウイルスのキメラ遺伝子を構築し、その感染性ウイルス粒子への取込みを検討した。その結果、A型ウイルスHAのN末側シグナル領域より上流(3'非コード領域を含む)とC末側トランスメンブレン領域より下流(5'非コード領域を含む)をB型ウイルスHAに入れ換えたA/BキメラHA遺伝子が効率良く感染性ウイルス粒子中に取り込まれることを発見した。さらに、この組み換えウイルスは、B型野生株の攻撃に対して高い防御効果が認められた。これらの成績から、HA遺伝子のパッケージングおよびHA蛋白質の相互機能性についての情報が獲得でき、今後のHA組み換えウイルスの構築に大きく貢献する。現在、各種HA組み換え体の構築を進めている。
電荷密度波と磁気秩序の相関による異常物性の解明

金属間化合物RNiC2(Rは希土類元素)について、電気抵抗率・磁化測定・X線回折・X線散漫散乱実験をおこない、電荷密度波転移とその前駆現象、および不整合-整合相転移の存在を見出した。電荷密度波は、強磁性秩序のみならず反強磁性秩序の発生の場合においても大きく変化することが明らかとなった。また、変調構造、状態密度、磁場誘起相転移についても調べた。最近、SmNiC_2において、電気抵抗の温度依存性に折れ曲がりが現れる温度(148K)で格子変調が発生すること、その格子変調が17.7Kの強磁性転移と同時に消失するとともに電気抵抗が急激に減少することが見出された。また、148K以上で、フォノンのソフト化に起因すると考えられるX線散漫散乱の存在が明らかとなった。以上の結果は、発生した電荷密度波が強磁性秩序と同時に消失するとして理解できる。本研究では、強磁性秩序を示すSmNiC_2に加えて反強磁性的秩序を示すRNiC_2(Rは希土類元素)を研究対象とし、電荷密度波と磁気秩序が関連した新奇現象について詳細な性質を探るべく研究をおこなった。シンクロトロン放射光を用いた低温x線回折実験により、SmNiC_2の強磁性相でも結晶構造は斜方晶が保持されていることが明らかにされた。変調波数ベクトル(0.5,0.516,0)を持つ不整合な変調構造に対してX線結晶構造解析がおこなわれ、電荷密度波状態における各原子の変位パターンが明らかとなった。また、SmNiC_2の高分解能光電子分光実験により、電荷密度波の形成によると考えられるギャップが部分的に開くことを意味する結果が示された。さらに、反強磁性転移を示すRNiC_2について、放射光を用いたX線回折・電気伝導・磁化測定を低温下や磁場中でおこない、希土類元素の違いによる格子変調の類似点と相違点、および、磁気秩序の違いが格子変調にどのような異なる影響を与えるのかを調べている。本研究では、RNiC_2(Rはま希土類元素)において現れる電荷密度波(以下、CDWと略す)と磁気秩序の相関関係に基づく新奇現象を系統的に調べ、その起源を明らかにすることを目的としている。以前、我々はSmNiC_2において、148KでCDWに起因すると考えられる格子変調が発生し、その格子変調が強磁性転移温度(17.7K)で消滅すると同時に電気抵抗率が約一桁減少するという特異な現象を見出した。RNiC_2におけるCDWと磁性の相関関係を系統的に調べるため、強磁性秩序を示すSmNiC_2に加えて反強磁性的な秩序を示すTbNiC_2とGdNiC_2を研究対象物質とし、各物質のCDWの振る舞いと物質間の系統性、磁気秩序の違いがCDWと磁性の相関に与える影響、磁場誘起による相転移と磁気抵抗効果、について調べた。TbNiC_2およびGdNiC_2について電気伝導と格子変調の温度依存性を測定した。両物質についてCDWの存在を示す格子変調の存在を確認し、新たなCDW秩序の存在も明らかとなった。また、CDW転移温度以上でフォノンのソフト化を示唆するX線散漫散乱を観測した。以上より、肋違いによるCDW転移の系統性を明らかにするとともに、反強磁性秩序とCDWの相関関係を明らかにしたSmNiC_2について磁場下での磁化・電気抵抗率・x線回折測定をおこなった。CDW相と強磁性金属相の相転移を磁場により誘起することが可能であることを示し、同時に負の巨大磁気抵抗効果を確認した。以前、我々はSmNiC2において、電気抵抗率の温度依存性に異常が現れる148Kで格子変調が発生し、その格子変調が強磁性転移温度(17.7K)以下で消滅し電気抵抗率が約一桁減少することを見出した。この実験結果は、発生した電荷密度波が強磁性転移と同時に消失するとして理解できる。このような現象はこれまでになく、電荷密度波と磁性の相関による新たな現象といえる。本研究では、反強磁性転移を示すGdNiC2およびTbNiC2に注目し、電荷密度波状態の存在の有無、および、様々な磁気秩序が電荷密度波にどのような異なる影響を与えるのかを明らかにすることを目的とし、低温下や磁場下において電気抵抗率・磁化測定およびX線回折・X線散漫散乱実験をおこなった。その結果、電荷密度波の存在とその前駆現象、不整合-整合相転移の存在、磁場による磁気転移の誘起に伴う電荷密度波の変化が明らかとなった。以上の実験結果を整理したところ、RNiC2(R = Sm, Gd, Tb)における電荷密度波状態は物質間で系統的な性質を示すことがわかった。一方、磁気秩序と電荷密度波の相関は多様であるが、磁気秩序は電荷密度波状態を抑圧する傾向があることがわかった。さらに、放射光を用いたX線磁気散乱実験をおこない、磁気秩序について調べた。

入射X線のエネルギーを変化させて測定をおこなった結果、共鳴条件で明瞭な強度の増大が観測された。さらに、散乱X線の偏光を解析することにより磁気散乱であることが確認できた。予定していた実験の多くを実施でき、新しい知見が得られていることから、研究はおおむね順調に進んでいると考えている。24年度が最終年度であるため、記入しない。当初の研究計画に沿って研究を継続する。研究を遂行する上で克服できないと考えられる問題は現段階では無い。
セグメント重水素化中性子散乱法による天然変性タンパク質の動的構造解析

本研究ではセグメント重水素化と逆転コントラスト同調法を用いた中性子小角散乱法により天然変性領域をもつマルチドメインタンパク質の動的構造を解析し天然変性タンパク質の高度な分子認識・機能発現機構の解明を目指す。当該年度は、(1)セグメント重水素化のためのプロテインライゲーション条件の検討、(2)X線溶液散乱法による中性子溶液散乱実験に向けた予備的解析、(3)マルチドメインタンパク質の動的構造を再現する構造アンサンブルの作成を行った。目的とするマルチドメインタンパク質はN末端とC末端にそれぞれ折れ畳まれた機能ドメインを持ち、その間に大な天然変性領域が存在する。(1)ではまず天然変性領域とC末端ドメインのプロテインライゲーションによる連結が可能であることを確認した。同様の反応でN末端ドメインを連結すれば全長タンパク質を調製できるため、セグメント重水素化タンパク質調製の道筋を示すことができた。(2)ではセグメント重水素化した全長タンパク質を用いた中性子散乱実験に先立って、X線溶液散乱法で重水素化していない全長タンパク質を用いて溶液中での動態を確認した。その結果、全長タンパク質は低濃度であれば中性子溶液散乱実験に使用可能な均一な溶液状態(単分散状態)であることがわかった。また、(2)では実測のX線溶液散乱データが得られているため、中性子溶液散乱実験に先立ち、(3)で得られた構造アンサンブルから理論的なX線溶液散乱パターンを計算し、実測のX線溶液散乱パターンと比較した。その結果、溶液中で天然変性領域がとりうる多様な構造を再現するためには構造アンサンブルの数が不十分であることが示され、次年度への課題として構造アンサンブルの作成法の検討も予定している。Hefの天然変性領域とヌクレアーゼドメインとがインテインを用いて連結可能であること、Hef全長タンパク質は低濃度であれば中性子溶液散乱実験に使用可能な均一な溶液状態(単分散状態)であること、などが確認できたので、初年度の研究成果としては概ね順調に進展していると判断した。今後は、セグメント重水素化Hefタンパク質の粗視化MD-中性子/X線溶液散乱解析の準備として、全長Hefタンパク質の調製と粗視化MD-X線溶液散乱データの収集・解析を推進する。具体的には;・Hefの天然変性領域とヌクレアーゼドメインとがインテインを用いて連結可能であることを確認できたので、次はHefの天然変性領域とヘリカーゼドメインの連結を試みる。現状、インテインによる連結には連結箇所のアミノ酸はシステインである必要があるが、Hefタンパク質では連結部分のアミノ酸がトレオニンとセリンであるので、システインの代わりにトレオニンやセリンでも連結可能かどうかを検討する。トレオニンやセリンでの連結が困難な場合には、トレオニンやセリンをシステインに置換する。この場合、システイン置換により全長Hefの構造に変化がないかどうかをX線溶液散乱法等で確認する。・75%重水素化したヌクレアーゼドメインおよびヘリカーゼドメインと重水素化していない天然変性領域を連結してセグメント重水素化Hef(全長)を調製するためには、質量分析等で重水素化率を正確に評価する必要がある。そこで、そのために必要な大腸菌培養プロトコールを確立する。・現状、セグメント重水素化していないHef(全長)の粗視化MDでは構造のサンプリング数が不足しているので、計算ステップを増やして中性子/X線溶液散乱データを十分説明できるようにする。

具体的には;・Hefの天然変性領域とヌクレアーゼドメインとがインテインを用いて連結可能であることを確認できたので、次はHefの天然変性領域とヘリカーゼドメインの連結を試みる。現状、インテインによる連結には連結箇所のアミノ酸はシステインである必要があるが、Hefタンパク質では連結部分のアミノ酸がトレオニンとセリンであるので、システインの代わりにトレオニンやセリンでも連結可能かどうかを検討する。トレオニンやセリンでの連結が困難な場合には、トレオニンやセリンをシステインに置換する。この場合、システイン置換により全長Hefの構造に変化がないかどうかをX線溶液散乱法等で確認する。・75%重水素化したヌクレアーゼドメインおよびヘリカーゼドメインと重水素化していない天然変性領域を連結してセグメント重水素化Hef(全長)を調製するためには、質量分析等で重水素化率を正確に評価する必要がある。そこで、そのために必要な大腸菌培養プロトコールを確立する。・現状、セグメント重水素化していないHef(全長)の粗視化MDでは構造のサンプリング数が不足しているので、計算ステップを増やして中性子/X線溶液散乱データを十分説明できるようにする。
C型肝炎マウスモデルを用いた細胞性免疫応答の解析とワクチン開発

C型肝炎における肝細胞障害の機序を検討するためにHCVの構造蛋白をdefective adenovirusに組み込み(HCV-AdV)マウスに静脈内投与し、C型肝炎モデルを作製した。正常マウスにおいてはHCV-AdVによる肝炎は抗CD8抗体によって抑制されるCTL依存性の肝細胞障害であったが、免疫不全マウスにおいては著明な肝細胞内の脂肪蓄積とミトコンドリア障害を伴うHCV蛋白自体によると考えられる肝細胞障害を認めた(投稿準備中)。HCVに対するCTL誘導型ワクチンを開発するためにBCGにNS5領域のCTLエピトープを発現するベクターを組み込んだ組み替えBCGワクチンを作製した。このワクチンを接種後、NS5を組み込んだvaccinia virusを投与したところその感染をほぼ完全に抑制した(Vaccine,2003)。そこで細胞性免疫を誘導するBCGのα抗原とNS5のCTLエピトープを組み込んだベクターによるDNAワクチンを作製しBCGワクチンと同様の検討をおこなったところ、NS5組み込みvacciniavirusの感染をほぼ完全に抑制した(投稿準備中)。細胞性免疫をより効率的に誘導するためにTh2 cytokineであるIL-4のアミノ酸2カ所に変異させたIL-4/IL-13receptor antagonistを作製した。このantagonistの有用性を検討するためにTh2 cytokine依存性の疾患である気管支喘息モデルを作製し、antagonistの発現ベクターを投与したところ気管支喘息をほぼ完全に抑制し有用性が確認できた(Gene Ther.,2003)。1:C型肝炎ウイルス(HCV)の構造蛋白(core, E1, E2)を組み込んだrecombinantアデノウイルスベクターをマウスに静脈内投与し、すべての構造蛋白に対する細胞障害性T細胞(CTL)の誘導を確認した。3種類の構造蛋白を別々にマウス肝に発現させた場合、肝炎の程度は差がなかったが、SCIDマウスに投与した場合には、core蛋白において肝細胞の脂肪変性を伴う著明な肝細胞障害が認められた。2:すべての構造蛋白を発現させた肝炎組織において不飽和脂肪酸の増加と、脂肪酸排泄に関与するトランスポーターの発現低下が認められ、HCV感染時における酸化ストレスの一因と考えられた。3:HCVのNS5領域のCTLエピトープを組み込んだrecombinant BCGワクチンを作製し、腹腔内投与し、特異的CTLを誘導した後NS5領域を組み込んだrecombinantワクシニアウイルスを感染させたところ、ほぼ完全に感染を阻害できた。recombinant BCGワクチンを経口投与しても同様の結果が得られた。4:抗酸菌のα抗原は、結核菌などに対して強力に細胞性免疫を誘導することが知られている。そこでこのα抗原とNS5領域のCTLエピトープを組み込んだプラスミドベクターを作製しelectroporation法で皮下にワクチン接種したところ特異的CTLが誘導され、recombinantワクシニアウイルスの感染をほぼ完全に阻害できた。細胞性免疫をより効率的に誘導するためにTh2 cytokineであるIL-4のアミノ酸2カ所に変異させたIL-4?IL-13receptor antagonistを作製した。

このantagonistの有用性を検討するためにTh2 cytokine依存性の疾患である気管支喘息モデルを作製し、antagonistの発現ベクターを投与したところ気管支喘息をほぼ完全に抑制し有用性が確認できた(Gene Ther.,2003)。