hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
定性解析と定量解析を統合した動的システムの自動解析システムに関する研究

(1)3次元の相空間上の区分線形常微分方程式の挙動解析アルゴリズムの開発3階の区分線形微分方程式を対象にした挙動自動解析システムの開発を行なった。主な成果は次の通りである。(1a)空間、特に領域の形状と位相的関係を表現するための情報構造とその管理方式を設計した。(1b)解曲線群の幾何学的特徴を表現するための情報構造とその管理方式を設計した。(1c)定性解析と定量解析を統合して、解曲線群の局所的な幾何学的特徴を抽出するアルゴリズムを開発した。(1d)解曲線群の局所的な幾何学的特徴を統合して、大域的な挙動の特性を解析し、定量解析のプランを生成する大域解析アルゴリズムを開発した。(1e)以上の成果を挙動自動解析システムとして統合した。(2)挙動解析システムの大規模化のためのプラットフォームの開発前項で開発した挙動解析システムの構造を分析し、さらに大規模化するためのプラットフォームの設計開発を行なった。(2a)大規模システムをエージェントと呼ばれる自律的なソフトウェアモジュールが相互作用する系と捉え、エージェントプログラミングのためのプラットフォームを開発した。(2b)共通オントロジー(概念体系)を用いてエージェントを連携させる方式を開発した。(2c)既存の人間向きの知識源(自然言語文書や専門家)から知識をボトムアップに獲得するための知識表現方式を開発した。動的システム、とりわけ非線形微分方程式で記述されるシステムは一般的方法で取り扱うことができない上、挙動自体がしばしば非常に複雑になるため、挙動解析はほとんど人手で行われ、自動化は極めて困難であった。本研究では、挙動解析を知的に制御するために定性推論の考え方と技術が有効であることに着目し、問題に適した解析方法の選択と結合、数値計算や数式処理の立案、結果の解釈とそれに基づくプランの修正、挙動の要約など、従来人間の専門家にしかできなかった知的作業の自動化を行い、動的システムの挙動の自動解析システムの設計と試作を行う。平成4年度は、3次元以上の相空間上の微分方程式の挙動の自動解析に関して研究を行ない、次の成果を得た。1.3次元の相空間上の区分線形常微分方程式の挙動解析アルゴリズムの理論的検討と実現。3階の区分線形微分方程式を対象に、(a)空間、特に領域の形状と位相的関係を表現するための情報構造とその管理方式の設計、(b)解曲線群の幾何学的特徴を表現するための情報構造とその管理方式の設計、(c)定性解析で得られる情報とその挙動解析における利用法に関する理論的考察、を行ない、挙動解析アルゴリズムの設計と一部試作を行なった。2.挙動の自動解析のためのサブシステム間の相互作用の分析と情報交換手順の標準化。数値計算、数式処理、知識処理の連携に必要な相互作用のタイプの同定と理論的分析を行い、分散人工知能の観点から有効な連携を可能にする情報交換方式の設計を行った。3.挙動解析における視覚情報の役割に関する理論的・実験的考察。視覚から得られる大域的情報の特性を分析し、挙動解析システムにおける利用方について考察した。本研究では、常微分方程式の挙動解析を知的に制御するために定性推論が有効であることに着目し、問題に適した解析手法の選択と結合、数値計算や数式処理の立案、結果の解釈とそれに基づくプランの修正、挙動の要約など、従来人間の専門家にしかできなかった知的作業の自動化に関する研究を行なう。平成5年度は次の成果を得た。1.3次元の相空間上の区分線形微分方程式の挙動の大域解析アルゴリズムの設計と試作。前年度までに作成された3次元の相空間上の区分線形微分方程式の挙動の局所解析アルゴリズムを用いて得られた局所解析結果を統合して、大域的な挙動の特性を解析し、定量解析のプランを生成する大域解析アルゴリズムの設計と試作を行なった。2.区分線形微分方程式の挙動の手法の非線形微分方程式への拡張に関する考察。3階区分線形微分方程式の挙動解析アルゴリズムを一般の非線形微分方程式に拡張するときに生じる問題の分析と考察を行ない、3次元非線形微分方程式の挙動解析システムの基本設計を行なった。

3.挙動解析システムのサブシステム間での情報交換手順の詳細設計とそれに基づく挙動解析システムのカーネルの開発。予備検討で試作した2次元相空間上の非線形微分方程式の自動解析システムと前年度開発した局所的な挙動の解析システムを分析し、サブシステム間の相互作用の分類と分析を行った。それに基づいて情報交換手順の詳細設計を行ない、大規模な挙動解析システムのプラットフォームとなり得るカーネルの設計・試作を行った。(1)3次元の相空間上の区分形常微分方程式の挙動解析アルゴリズムの開発3階の区分線形微分方程式を対象にした挙動自動解析システムの開発を行った。主な成果は次の通りである。(1a)空間、特に領域の形状と位相的関係を表現するための情報構造とその管理方式を設計した。(1b)解曲線群の幾何学的特徴を表現するための情報構造とその管理方式を設計した。(1c)定性解析と定量解析を統合して、解曲線群の局所的な幾何学的特徴を抽出するアルゴリズムを開発した。(1d)解曲線群の局所的な幾何学的特徴を統合して、大域的な挙動の特性を解析し、定量解析のプランを生成する大域解析アルゴリズムを開発した。(1e)以上の成果を挙動自動解析システムとして統合した。(2)挙動解析システムの大規模化のためのプラットフォームの開発前項で開発した挙動解析システムの構造を分析し、さらに大規模化するためのプラットフォームの設計開発を行なった。(2a)大規模システムをエージェントと呼ばれる自律的なソフトウェアモジュールが相互作用する系と捉え、エージェントプログラミングのためのプラットフォームを開発した。(2b)共通オントロジー(概念体系)を用いてエージェントを連携させる方式を開発した。(2c)既存の人間向きの知識源(自然言語文書や専門家)から知識をボトムアップに獲得するための知識表現方式を開発した。
腫瘍壊死因子スーパーファミリーＬＩＧＨＴによる上皮間葉転換の機序の解明

重症喘息などの気道炎症において発現が亢進しその病態に関与していると考えられているLIGHT/TNFSF14分子は、気道上皮細胞において上皮間葉転換を誘導し気道リモデリングに関与し、さらに気道上皮細胞からの炎症性サイトカインやケモカインの産生を誘導し気道炎症に関与している可能性が示唆された。LIGHT/TNFSF14分子は、重症喘息などの炎症性気道疾患における分子標的治療のターゲットとして、その候補になり得る可能性が示唆された。気管支喘息における気道リモデリングは気流制限の難治性病態の形成につながるため、その機序の解明に向けて世界的に研究がすすめられている。我々はリモデリング形成において上皮細胞の上皮間葉転換(EMT)による間葉細胞が重要な役割をはたすと考えて、研究をすすめている。近年、炎症性病態に重要な役割を果たすLIGHT(TNFSF14)が重症喘息の気道炎症に深く関与し気道リモデリングに影響することが報告されたので、LIGHTがEMTに与える影響についてや、LIGHTによる気道炎症への影響について、検討をすすめている。前年度には、気道系上皮細胞株であるA549細胞を用いて、LIGHT刺激により、上皮細胞マーカーであるE-cadherinが抑制され、間葉系マーカーであるvimentinなどが誘導されることを確認し、又、LIGHTはTGF-bによるを増強することが判明した。しかしながら、BEAS-2B細胞およびNHBE細胞において、LIGHT刺激によるCXCl-8/IL-8をはじめとするケモカイン産生が誘導されることが判明した。現在、LIGHTによるケモカイン産生による気道炎症への影響に関して、検討中である。気管支喘息における気道リモデリングは気流制限の難治性病態の形成につながるため、その機序の解明に向けて世界的に研究がすすめられており、リモデリング形成において上皮細胞の上皮間葉転換(EMT)による間葉細胞は重要な役割をはたすと考えられている。近年、炎症性病態に重要な役割を果たすLIGHT(TNFSF14)が重症喘息の気道炎症に深く関与し気道リモデリングに影響することが報告されているが、LIGHT自体がEMTに与える影響については、未だ研究されていないため、我々は、LIGHTがEMTに及ぼす影響を検討した。今年度は、まず、LIGHTが気道上皮細胞に対して、EMTを誘導し形態学的変化を生じるかについて検討した。気道系上皮細胞株として、A549細胞を用いて、LIGHT刺激を0.1, 1, 10, 50ng/mlで刺激を48時間行い、Western blotting法にて評価したところ、上皮系マーカーであるE-cadherinは濃度依存性に抑制され、間葉系マーカーであるvimentinやα-smooth muscle actinやN-cadherinは濃度依存性に増強され、LIGHTが形態学的にEMTを誘導しうることが判明した。また、細胞内のmRNAレベルにおいても、LIGHT刺激(1, 10, 50ng/ml)にて、E-cadherin mRNAの発現が濃度依存性に抑制され、Vimentinの発現が濃度依存性に増強されていた。また、LIGHTによるEMT誘導の機序において、TGF-βによるEMTで誘導される転写因子であるsnailの発現を検討したが、LIGHTでは、snailの発現が誘導されなかった。加えて、TGF-βとLIGHTによる併用作用についても検討したところ、LIGHTはTGF-βとの併用にてよりEMTを誘導しうることが判明した。重症喘息の気道炎症性病態に関与するLIGHT/TNFSF14分子が、気道上皮細胞において上皮間葉転換(EMT)に及ぼす影響や炎症性ケモカインの産生およびその機序に関して、検討を行ってきた。まず気道上皮細胞におけるLIGHTのEMTへの影響について検討した。気道上皮細胞におけるTGF-β誘導性のEMTにおいて、LIGHTによりTGF-β誘導性のE-cadherinの抑制とVimentinの増加が促進され、形態学的にもEMTがLIGHTにより促進されることが判明した。さらに、LIGHT単独にてE-cadherinの発現が抑制され、Vimentinの発現が亢進し、EMTを誘導しうることが判明した。さらにLIGHTによるEMTではTGF-β-smad系の細胞内シグナル伝達経路を介さない、LIGHT-ERK系を介してEMTが誘導されることを明らかにした。加えてLIGHTによるEMTにおいても、間葉系細胞としての機能的な収縮能を獲得していることを確認した。またLIGHTによる気道上皮細胞におけるサイトカイン・ケモカインへの影響について検討した。サイトカインアレイによりLIGHTは気道上皮細胞においてIL-6, oncostatin M, MCP-1, GROやIL-8の産生を誘導することが判明した。加えて気道上皮細胞(BEAS-2B)におけるLIGHTの受容体であるHVEMとLTβRの発現に関して評価したところ、LTβRの発現が有意であることが判明したので、LTβR-siRNAを用いてLIGHTの受容体をknock-downしたところ、IL-6やIL-8の産生が抑制された。

さらに、LIGHTによるLTβRの下流のシグナル伝達経路を評価すると、ErkおよびNFkBを介した炎症性サイトカイン・ケモカインの産生であることが判明した。以上の結果より、LIGHT/TNFSF14は気道上皮細胞において、EMTを介してリモデリングに関与している可能性と共に、炎症性サイトカインの産生を介して、重症喘息に関与している可能性が示唆され、分子標的な治療targetの候補として期待できると考えられる。8204呼吸器内科学気道上皮細胞株であるA549細胞では、LIGHTによりEMTが誘導され、上皮系細胞が間葉系細胞となり、機能獲得やその細胞内シグナルなどの機序について、確認できた。ところが、異なる気道上皮細胞株であるBEAS-2B細胞やNHBE細胞では、LIGHTによるEMTは誘導されない(されにくい)ということが判明した。しかし、BEAS-2B細胞やNHBE細胞では、LIGHTによるケモカイン産生が誘導されることが判明し、LIGHTによるケモカイン産生は、気道炎症において重要な役割を果たすと示唆されることにつながる。また、LIGHTに対する受容体であるHVEMおよびLTbRの発現について、BEAS-2B細胞では、HVEMの発現は乏しく、LTbRの発現が優位であることも判明した。したがって、LIGHT刺激によるLTbRからの刺激は、EMTに影響しにくい可能性があり、気道炎症に関連している可能性が高いとも思われる。以上より、現時点では、順調な経過で、検討が進められていると考えている。LIGHT(TNFSF14)が上皮間葉転換に与える影響に関して、重要なポイントである形態学的な変化をwestern blottingにて確認でき、mRNAレベルにおいてもLIGHTがEMTを誘導しうるが、TGF-βのEMTとは異なり、snailを介さない系であることが確認できた。また、TGF-βとLIGHTとの併用にて、よりEMTを強く誘導しうることが確認できた。間葉系細胞としての機能解析としての収縮能の評価でも、LIGHT刺激でも収縮能が誘導できることが確認できた。加えて、細胞内伝達シグナル経路に関しても、MAP阻害剤による解析を行うことができ、ERKを介してEMTを誘導していることを確認した。以上より、現時点では、順調な経過で、検討が進められていると判断する。LIGHTによる気道上皮細胞への影響について、引き続き、検討していく。LIGHTによる気道上皮細胞のEMTについての影響については、上述のごとく、BEAS-2B細胞やNHBEでのEMTは誘導されにくいことが判明したため、これ以上のEMT誘導に関わる研究は遂行しがたいと考える。しかしながら、気道炎症によるリモデリングという観点から、今後も、LIGHTが気道炎症を惹起することに関する検討をすすめたいと考える。今後は、特に、気道上皮細胞へのケモカインの産生に重点をおいて、LTbRからのシグナル伝達機序やケモカインの産生機序について、さらに検討をすすめることとする。
植物メリステムにおける細胞分裂・分化制御機構のイメージング解析

多細胞生物である高等植物の形態は、個々の細胞を取り巻く堅い細胞壁の存在により、これに規定された各細胞の分裂と生長の方向に基づいて決定されている。植物メリステムにおける細胞分裂は細胞形態にとって始原的意義をもつが、植物細胞では動物細胞とは異なる独自の分裂様式が知られている。また、細胞分化についても植物特有の細胞内構造に基づく分化様式が示されている。そこで、本研究ではメリステムにおける植物細胞形態の制御機構を解明すべく、細胞分裂と分化という基本的現象における細胞内構造とその動態についての、顕微鏡画像に基づいた定量的かつ網羅的なイメージング解析を行った。特に、細胞の形態形成に関係の深い細胞核・染色体、細胞板、液胞の動態および細胞骨格系の構造的関係を重点的に解析し、メリステムでの細胞分裂から茎根の分化形態形成に至る植物細胞に特有の細胞分裂・分化様式を多角的に明らかにすることを目指した。本年度は昨年度に確立した撮像システムにより、下記1)3)について、画像解析およびシミュレーション解析に取り組んだ。1)細胞分裂期における細胞膜および液胞膜近傍のアクチン繊維量の増減を定量的に示した。また、分裂中期後期の表層アクチン繊維の動きを定量解析した。2)表層微小管の挙動を擬似乱数によって模擬するシミュレーションソフトウェアを作成し、表層微小管の配向が細胞形状や微小管形成中心の影響を受ける可能性について検討した。3)細胞外への輸送経路が葉の表皮細胞の湾曲部形成に関与する可能性を検討すべく、ゴルジ体シス層マーカーであるERD2-GFPを用いてゴルジ体の動態を定量評価した。我々はこれまで、可視化細胞と画像解析により、細胞分裂、分化形態形成について解析を行ってきた。本年度は、1)表層微小管の再構築過程について、顕微鏡画像から定量的に解析するとともにシミュレーションによる検討を行った。その結果、M/G1の表層微小管の再構築過程について、微小管プラス端の動画像解析による伸長角度の定量評価とシミュレーションにより、表層微小管の配向変化のうちPhase IIIbまでは表層微小管の「初期配置」によって規定されていることが示唆された。また、Phase IIIbIIIcの配向変化は、「細胞端部でのカタストロフ」および「分枝によらない微小管新生」によって説明できることが明らかになった。2)多くの双子葉植物の葉表皮細胞はジグゾーパズルのピースのように複雑な形状をとるが、その形態形成過程における微小管の動態と役割について、微小管を線分抽出して配向評価するとともに阻害剤を用いて検討し、葉の表皮細胞の形態形成と微小管の重合・脱重合との関連を見出した。3)分裂中期の植物細胞において表層アクチン繊維は細胞中央部の両側に一対の密な帯状パターン(actin microfilament twin peaks:MFTP)を形成するなど特徴的な配向が知られているが、アクチン繊維(およびアクチン繊維と微小管)、を可視化したタバコBY-2の形質転換細胞にアクチン束化誘導剤であるTIBAおよびJasplakinolide(Jasp)を処理すると、これらの表層および紡錘体周囲のアクチン繊維パターンが変化し、紡錘体および細胞板が著しく傾斜することなどから、細胞分裂期のアクチン繊維パターンが紡錘体の向きを制御することが示された。植物細胞形態の制御機構について上記1)3)の結論が得られた。これは研究の成果であるばかりでなく,次年度の解析にも繋がる結果である。上記1)3)について論文に纏めるべく執筆や補充実験を行っている。また、研究用に開発した画像解析ツールは今後も研究室HPで逐次公開して行く予定である。
遺伝子治療による血管狭窄病変制御法の開発-Antisense Delivery Systemの確立と心臓血管外科への応用-

申請者らはantisense delivery systemのdeviceとして有力な候補であるステントの、留置血管への影響を検討するため、家兎大動脈ステント留置モデルを確立、免疫病理組織学的及び分子生物学的に検討し、ステント留置後の平滑筋細胞の脱分化と増殖が生じ、留置後2ケ月までに増殖が停止、再分化が完了することを示した(Bai H,1994,Arterioscler Thromb 1994)。また実際には血管狭窄病変のベースに認められる動脈硬化病変に対するステント留置後の動態についても検討を行い、新生内膜に蓄積するマトリックスの産生の過程において、マクロファージ及びプロテオグリカンの関与が示唆されることを報告した(T Yamakawa,Japan Cric J,Suppl 1996)。また、実際に心臓外科領域において代用血管として最も用いられている自家静脈グラフトの移植後に生じるvein graft diseaseのモデルを作成、確立し、静脈グラフトの動脈化の過程において、平滑筋細胞は増殖し、形質を胎児型に変換し血管壁が肥厚するが、2カ月以降平滑筋が徐々に脱分化することを免疫組織学的に確認した(W Zhang,日外会誌,suppl 1995)。更にターゲット臓器に直接アプローチできる、という外科治療の特性を生かし、摘出した血管にHVJリポゾーム法を用いて遺伝子を導入し、この血管を自家移植したところ、術後2週間導入した遺伝子が発現していることを確認し(Bai H,日外会誌,suppl 1996)、また細胞周期の制御因子であるsdilを静脈グラフトに導入し、新生内膜の形成が抑制されることを報告した(Bai H,Circulatin,supple 1996)。この静脈グラフトの摘出時に遺伝子導入を行う「ex vivo遺伝子導入法」は、ベクターに対する安全性の確保、目的臓器への導入効率の両面から極めて有効な手段と考えられた。本研究の検討に用いる内膜増殖性病変の実験モデルとして、vein graft diseaseモデル及びステント留置モデルを作成し確立した。即ち前者では、家兎を用い頸部静脈を動脈に移植し、静脈グラフトの動脈化の過程において、急性期に一時血管壁はひ薄化し平滑筋細胞が減少するが、その後平滑筋細胞は増殖を開始し、形質を胎児型に変換し、血管壁が肥厚することを免疫病理組織学的に確認し、学会報告を行った(アジア心臓血管外科学会、日本外科学会総会)。また後者では、ステント留置後の平滑筋細胞の増殖及び形質変換が一過性で局在性を持った反応であることを明らかにし、論文報告した。さらに高脂血症下fatty streak lesion及びfibromuscular lesionにおける反応を検討し、学会報告した(日本循環器病学会総会、日本外科学会総会)。現在投与するantisenseを決定し、in vitroにおいてそのantisenseが平滑筋細胞の増殖を抑制することを確認中である。申請者らはantisense delivery systemのdeviceとして有力な候補であるステントの、留置血管への影響を検討するため、家兎大動脈ステント留置モデルを確立、免疫病理組織学的及び分子生物学的に検討し、ステント留置後の平滑筋細胞の増殖と分化の機序につき報告した(Bai H,1994,Arterioscler Thromb 1994)が、更にステント留置後の、新生内膜におけるマトリックスの分布と平滑筋細胞の分化の経時的変化の関連性について報告した(T Yamakawa,Japan Circ J,Suppl 1995)。また実際に血管狭窄病変のベースに認められる動脈硬化病変に対するステント留置後の動態についても検討を行い、新生内膜に蓄積するマトリックスの産生の過程において、マクロファージ及びプロテオグリカンの関与が示唆されることを報告した(TYamakawa,Japan Circ J,Suppl 1996)。

また、実際に心臓外科領域において代用血管として最も用いられている自家静脈グラフトの移植後に生じるvein graft diseaseのモデルを作成、確立し、静脈グラフトの動脈化の過程において、平滑筋細胞は増殖し、形質を胎児型に変換し血管壁が肥厚するが、2ケ月以降平滑筋が徐々に脱分化することを免疫組織学的に確認した(W Zhang,日外会誌,suppl 1995)。また、ターゲット臓器に直接アプローチできる、という外科治療の特性を生かし、摘出した血管にHVJリボゾーム法を用いて遺伝子を導入し、この血管を自家移植したところ、術後2週間導入した遺伝子が発現していることを確認した(Bai H,日外会誌,suppl 1996)。この静脈グラフトの摘出時に遺伝子導入を行う「exvivo遺伝子導入法」は、ベクターに対する安全性の確保、目的臓器への導入効率の両面から極めて有効な手段と考えられる。
感情制御過程に関する基礎的研究とその臨床的応用

不登校、いじめ、学級崩壊など学校場面における児童・生徒の心の問題は増加の一途をたどっている。このような心理的問題は、複雑な要因が絡み合っており、多層構造をもっていると考えられる。特に心理的悩みに大きく関わるとされている、不合理な感情をどのように調整していったらよいのかという点は重要な問題といえるだろう。本研究は、このような心理的悩みの根幹にあると考えられる不合理な感情をどのように調整していったらよいのかという、感情制御の基礎的研究を行った。悲しい気分の時に悲しい音楽、楽しい音楽を聴かせ、特性不安の違いによりどのように気分が変化するか検討した。その結果、悲しい音楽、楽しい音楽ともに悲しい気分は低下するという結果が得られた。しかし、特性不安の高い群は悲しい音楽を聴いたときに、フラストレーションが低下しないという結果が得られた。特性不安が高いと、イライラを単純に低下させることはできず、感情制御が困難なのではないかと考えられる。さらに臨床的応用の研究として、児童・生徒は学校場面においてどのような場所で感情を表出しているか、また感情を表出するためにはどのような条件が必要なのか、心の居場所という観点から研究を行った。小学校においては、教室、体育館、図書室などが心の居場所となりやすく、中学校においては、友だちと居るとき、教室、部活、保健室等が心の居場所となりやすいという結果がみられた。また小学校においては、自分が認められることが心の居場所条件として必要であり、中学校においては、気楽に過ごせることが重要であるという結果が得られた。「キレル」などふつうの子どもが内面に抱えている不満やストレスを爆発させる「いきなり型」の非行が生じているといわれている(文部科学省,2002)。「キレル」のように、過多に感情を表出したり、逆に抑えすぎたりせず、状況に応じて怒りの感情を適度に表出できることが、対人関係の円滑さにつながると考えられる。怒り感情の表出に関する研究は、今まで表出をよくおこなうのか、抑制するのかという頻度の側面から行われてきた。このような頻度の側面からだけではなく、キレルのように過多に感情を表出したり、過剰に抑制したりというように、制御の量についても検討することが必要だと考えられる。そこで、制御の量、つまり怒りを感じる程度と怒りを表出する程度のズレに焦点をあて、精神的健康、対人不安との関係を検討した。また、友人場面、公的場面という場面の違いも検討した。結果として、友人場面において、男性は表出を抑える人が精神的に健康であり、公的場面においては、ズレが小さい男性が精神的に健康であるという違いがみられた。場面、制御差によって、精神的健康、対人不安との関連が異なることが示された。感情表出を多くする方が健康というわけではなく、場面に応じて異なる表出を行うことが重要だと考えられる。
和解の倫理学としての滝沢克己の後期思想の総合的研究

われわれはすでに滝沢克己の中期思想-最も大切な思想であり、研究されていなかったそれ-を解明した。それを受けて、「和解の倫理学としての滝沢克己の後期思想の総合的研究」という課題によって、われわれは滝沢克己の後期思想の全体像の解明に取り組んだ。現代の対立する宗教・学問・芸道との対話を通して「現代の精神的状況」を分析し、それらの間の和解をもたらそうと滝沢克己によってなされた研究の検証である。1.課題「仏教(久松禅学)とキリスト教」(富吉建周)に関して,論文「ルネ、デカルトと滝沢克己」(中その七,下その一,その二)に時間をとられ,まとめることができなかった。2.同「ピィエティストおよびバルトと滝沢克己」(中島秀憲)に関して,「ヘーゲルのイエス観」を媒辞としてバルト、滝沢克己、ピエティスト相互の連関を探っている。第一段階の研究は「ヘーゲルはプロテスタントなのか?」としてまとめられた。第二段階の研究は論文「滝沢克己のバルト論」としてまとめられつつある。3.同「バルトと滝沢克己」(寺園喜基)に関して,独文「キリスト論の根本問題」の翻訳を先立てて論ずる予定であったが,現在その翻訳の途中である。4.同「日本人の精神構造とユダヤ人の精神構造」(辻厚治)に蘭して,論文「ベンダサン批判の矢は,はたして的を射抜いたか?」としてまとめられた。5.同「実存哲学(キェルケゴール)と滝沢克己」(水田信)に関して,論文「滝沢克己と実存思想」としてまとめられた。6.同「西田幾多郎と滝沢克己」(前田保)に関して,論文「西田幾多郎と滝沢克己-『哲学の根本問題』と『西田哲学の根本問題』-」として纏められた。7.同「仏教(親鸞)と滝沢克己」(村上一朗)に関して,論文「親鸞と滝沢克己」としてまとめられた。8.同「大学紛争をめぐる滝沢克己の著作の研究-その原点論をめぐって-」(坂口博)に関して,論文「滝沢克己「原点」論をめぐる諸問題」としてまとめられた。9.ドイツにおける滝沢克己についての学術調査(寺園喜基)については,2008年1月1122日,ボンおよびバーゼルにて実施された。10.滝沢克己の父(佐市)の故郷長野県木曽郡楢川村の学術調査(富吉建周と坂口博)については,2008年3月35日にかけて行われた。同3月8日の滝沢克己協会のセミナーにおいてその成果を公表した。11.滝沢克己の九大時代に関する学術調査(前田保)については2007年9月2830日にかけて福岡市にて実施された。多岐にわたる滝沢克己の後期思想-「和解の倫理学」として性格づけられる、また厳密な学問的方法論による「現代の精神的状況」の実証的分析と総括できるそれ-の全貌の解明こそ、われわれの研究の目的である。1.「仏教とキリスト教との対話」については、「滝沢克己における仏教とキリスト教」として、滝沢克己の後期思想の概略については、「和解の倫理学としての滝沢克己の後期思想について」として、そして「『聖書を読む-マタイ福音書講解』の研究」については、「滝沢克己『聖書を読む-マタイ福音書講解』の研究(その一)」として結実した。2.「ピエティスト及びバルトと滝沢克己との対話」については、「『ピエティスト』ヘーゲル及び滝沢克己とバルトとの対話」として結実した。3.「バルトと滝沢克己」については、「ボン時代のカール・バルトと滝沢克己」として、「キリスト論の根本問題(独文)」の翻訳については、「滝沢克己『キリスト論の根本問題』(寺園喜基訳)として、そして、「ブルトマンと滝沢克己との対話」については、「滝沢克己とブルトマン」として結実した。4.「新興宗教(晴明教)と滝沢克己との対話」については、「滝沢克己『現代の医療と宗教』において死はどのように扱われているか?」としてまとめられた。5.「芥川龍之介の文学と哲学との対話」については、「芥川龍之介と滝沢克己」として結実した。6.「親鸞と滝沢克己との対話」については、「親鸞と滝沢克己」として、また「大学紛争をめぐる滝沢克己の著作の研究」については、「滝沢克己『原点』論の帰趨」として結実した。しかし、「夏目漱石の文学と滝沢克己との対話」及び「宇野弘蔵の経済学と滝沢克己との対話」については、今後の課題とせざるをえなかった。
3次元蛍光共鳴エネルギー移動法による細胞内タンパク質間相互作用の解析

神経系組織で高度な発現が認められる新規タンパク質であるNP25について,3D-FRETシステムを用いて蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の解析を行った。本タンパク質は,筋肉系組織に特異的に存在するCalponinやSM22等のタンパク質に対して著しく高いアミノ酸配列の相同性を示すことから,これらのタンパク質と類似の機能が予想された。CalponinやSM22については既に多くの報告がなされており,アクチンとの相互作用が明らかにされている。そこで,NP25とアクチンの結合について検討した。FRET測定にはNP25の蛍光免疫染色によるImmuno-FRET法を新たに導入し,donorとしてAlexa488,acceptorとしてRhodamineを使用した。またFRET効率の推定には,acceptor photobleaching法を用いた。Neuroblastomacell lineであるSK-N-SH細胞をNP25抗体+Alexa 488二次抗体で染色後,アクチンは,rhodamine-phalloidinで染色した。この細胞について,acceptor photobleachingによるImmuno-FRET法を適用すると,アクチンとNP25の結合を示す高いFRET効率が細胞内のストレスファイバー上で検出された。このことは,NP25が細胞内で実際にアクチン繊維と結合していることを示している。また,PC-12細胞を用いた観察から,NGFによって誘導される神経突起の形成に伴いNP25の発現量が増加することが明らかとなった。これらの結果は,神経突起の伸長に必須名アクチン繊維の構築にNP25が関与していることを示唆する。3次元空間での蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の測定を可能とするために,蛍光顕微鏡にフォーカス駆動装置とフィルター切替装置を新たに装着した。そして,それらを制御するためのコンピュータプログラムを作成し,DonorとAcceptor画像を交互に取得しながら,細胞のZ軸方向の各断面での蛍光画像を解析するシステムを構築した。このシステムを用いることにより,細胞内の立体空間でのFRETを検出することが可能となった(3D-FRETシステム)。次に,本システムを用いて,実際のタンパク質間相互作用の測定を行った。対象としたタンパク質は,ステロイド受容体スーパーファミリーの1つであるRXRと,我々が新たに見いだしたユビキチン付加酵素と相互作用するRNF8である。これらRXRとRNF8の結合については,既に酵母のツーハイブリッド法によって予測がなされていたが,生きた細胞内での相互作用については全く不明であった。そこで,これらのタンパク質と蛍光タンパク質であるBFP及びGFPの融合遺伝子(BFP-RNF8,GFP-RXR)を作成し,培養細胞にリポフェクション法によって遺伝子導入した。発現した融合遺伝子は,いずれも核内に局在した。両タンパク質が同程度の発現量の細胞を選び,我々が構築したシステムを用いてBFPからGFPへのFRETを測定したところ,核内で強いFRET効率を示すことが明らかとなった。こうした結果は,今回の研究で構築した3P-FRETシステムの有効性を示している。現在,細胞のZ軸方向の各断面について得られたFRET画像の3次元構築についての作業を進めている。
IP-SANの実行時動作最適化とセキュリティレベル制御を行うミドルウェアの構築

本研究においては、iSCSIイニシエータよりリモートストレージアクセスを行う際の輻輳ウィンドウ制御手法の検討を行った。前年度までの成果により、iSCSIイニシエータとターゲット間のデータ転送が行われる際に、カーネル内のTCP層よりパラメータを抽出し、iSCSIアクセス時め通信制御を行う手法が確立された。さらにイニシエータ複数台になった場合においても、コネクションごとの輻輳ウィンドウを区別する手段を講じたことにより、ストレージアクセス制御が実現できた。またセキュリティ対策として、アクセス時暗号化方式の検討を行い、アプリケーション層とトランスポート層の間の上位層において暗号化し、これを最適化する手法を確立してきた。本年度はこれらの成果をミドルウェアとして実現し、実装ソフトウェアをシステムに組込んで総合的な評価を行った。実験環境を工夫し、高遅延環境やノード数が多いネットワーク接続環境など、様々な状況において実験を行い、提案方式とその実装ミドルウェアの有効性を確認した。実験結果は良好なものであり。これらの結果をまとめて国際会議や国内ワークショップ、論文誌などで発表を行った。その結果、IEEE国際会議TCT2007や日本データベースLettersなどに直読付の論文が採択され発表された。本研究において、今年度はIP-SANの基本構成であるiSCSIイニシエータとターゲット間の接続環境を構築して実験を行った。ノード間をギガビットイーサネットで接続し、間に広域ネットワーク環境を模擬するための遅延ノード(Dummynet)を配置した。イニシエータ及びターゲットのミドルウエアは、カーネル内のTCP層におけるパフメータ等を抽出し、iSCSIアクセス時の通信制御を行うものとした。これらの情報をイニシエータとターゲットのミドルウェア間で交換し、パフォーマンスとセキュリティの面で最適に制御されたネットワークストレージアクセスの実現を目指した。本研究では、シーケンシャルリードアクセスの際にターゲットで輻輳ウィンドウの値を観察し、この結果をイニシエータに伝えてブロックサイズを変化させることにより、iSCSIの実行時動作の制御を行った。その結果、制御を行わない時には輻輳ウィンドウの振舞が安定せず増加と減少を繰り返し、それによりシステム性能であるスループットも不安定な状態となっていたが、提案手法を適用することにより、輻輳ウィンドウの値が一定となり、スループットも安定させることができた。この機能をiSCSI用のミドルウェアとして実装した。一方セキュリティ面に関しては、暗号化方式もiSCSIによるストレージアクセス実行時には、プロトコルの下位層ではなくミドルウェアのレベルで暗号化を行う方が適していることがわかった。そこで暗号化処理とその最滴化を行うミドルウェアの実現を検討した。提案手法を部分的に実装して評価を行った結果、ミドルウェアレベルで暗号化処理を行う方式の優位性が示された。来年度以降の課題として、実行時動作最適化に関しては複数ノードのシステムにおける制御手法を確立すること、またセキュリティ面では暗号化処理とその最適化を行うミドルウェアの構築と評価を行うことなどが挙げられる。今年度、本研究では複数台のiSCSIイニシエータよりリモートストレージアクセスを行う際の幅輳ウインドウ制御手法の検討を行った。前年度の成果により、iSCSIイニシエータとターゲット間のデータ転送が行われる際に、カーネル内のTCP層よりパラメータを抽出し、iSCSIアクセス時の通信制御を行う手法が確立された。しかしイニシエータの台数が複数になった場合、ノードごとに幅輳ウインドウなどTCPパラメータの振舞が異なり、ネットワークの帯域幅がノード間で無秩序に奪い合われる状態が生じてします。そこで本研究では、各ノードのコネクションごとに幅輳ウィンドウを区別する手段を講じ、iSCSIリモートストレージアクセス時にその値をノードごとにフィードバックしてアクセスブロックサイズを制限することによって、複数台iSCSIイニシエータからのストレージアクセス制御に成功した。これにより、各ノードからのアクセスが均等化され帯域幅の公平な分配が実現されるだけでなく、トータルのスループットを最大値に保つことに成功した。これらの研究成果をまとめて投稿した結果、日本データベース学会Letters、そして電子情報通信学会論文誌などに採択されて論文が公開された。またiSCSIストレージアクセスのセキュリティ対策として、アクセス時暗号化方式の検討を進めた。その結果、IPsecなどのようにプロトコル下位層で暗号化を行うのではなく、アプリケーション層とトランスポート層の間の上位層において暗号化を行い、これを最適化する手法が優れていることがわかった。そこでそのような動作を行う上位層向けのミドルウェアの構築を行い、最適化して評価を行った。その結果、提案手法の優位性が示された。こちらの結果をIEEE国際会議AINA2006ならびに電子情報学会論文誌などに投稿した結果、採択されて論文が公開された。

実験環境を工夫し、高遅延環境やノード数が多いネットワーク接続環境など、様々な状況において実験を行い、提案方式とその実装ミドルウェアの有効性を確認した。実験結果は良好なものであり。これらの結果をまとめて国際会議や国内ワークショップ、論文誌などで発表を行った。その結果、IEEE国際会議TCT2007や日本データベースLettersなどに直読付の論文が採択され発表された。
古代ローマ都市オスティア・アンティカの総合的研究

古代ローマ都市の中でも最も重要なものの一つであるオスティア・アンティカの遺跡を、建築、経済、社会、宗教、美術、住環境といった様々な観点から調査し、都市の構造と、人々の活動を明らかにした。また、中世における古代遺跡の転用による都市形成過程の一端を、ボルゴ・ディ・オスティアにおいて確認した。さらに、遺跡の3Dレーザ測量をほぼ都市全域において実施し、ローマ都市研究の基礎的データを提供した。昨年の6月29日に全体集会を開催し、メンバーそれぞれの調査目的・方法を確認し、夏の調査に向けた準備をおこなった。現地(イタリア、ローマ近郊のオスティア・アンティカ遺跡)での調査は、7月後半9月はじめに、各自のスケジュールに合わせて参加するという形で実施した(詳しい日程は、報告書を参照)。組合のschola(集会施設)、公共建築物および住居の排水施設とトイレ、下水、共和政時代の遺構、宗教(いわゆる異教)関係の建築、インスラ(集合住宅)、キリスト教関係の建築(オスティア内外のバシリカ)、中世に城壁や建物の壁に転用された水道の跡などを、調査してデータを集めた。また、碑文についてもデータを集積した。堀は、メイン・ストリートであるデクマヌス通りと、都市の中心部であるフォルム(市民広場)およびその周辺の建築物の、レーザー・スキャナーを使用した測定をおこなった。秋からは、調査で得られたデータを分析する作業にはいった。各メンバーは、それぞれの専門とする分野で、従来の説に修正を迫る重要な知見を得ているが、さらにそれを確かなものとするために、次年度の調査によってさらにデータを集める必要がある。今年度で得られた成果の一部は報告書に記載されているが、その中ではとくに、従来の測量によってつくられ、学術書や論文で用いられている市街図に誤差があることを明らかにした堀の報告は重要である。平成20年度に引き続き9月にオスティア・アンティカ遺跡における実地調査をおこなった。対象は、街路、組合の施設、商工業施設(パン製造所、マーケット、店舗など)、宗教関係出土物(奉納品など)、排水施設、集合住居の遺構、中世において建築の一部として転用されたローマ時代の遺構などである。とくに、遺跡西半分の街路、「トラヤヌスのスコラ」をはじめとする組合の施設や一部の住居、オスティアの司教館の壁に転用されたローマの水道の跡については、3Dレーザスキャナによる測量を実施した。これは、平成19年度のものとあわせて、オスティア遺跡の最初の大規模なレーザ測量である。そのデータはディスクによって公開しており、各方面の研究者に貴重な基礎的データを提供している。これとあわせて、オスティア出土の碑文を調査し、その画像データを収集した。これらの作業を通じて、従来の通説の見直しを迫る新しい知見を得ることができた(たとえばトラヤヌスのスコラについて、中間報告書を参照)。また、司教館の壁に残された水道跡には、初めて本格的な調査のメスが入れられた。収集されたデータはかなり膨大なものになり、引き続き解析を進めている。なお、21年度の現地調査に参加できなかった研究分担者の加藤と池口は、繰越金によって22年度に現地調査をおこない、加藤はミトラエウムを重点的に調査して、初期キリスト教美術につながる宗教美術の発展をとらえ、池口はおもに倉庫を調査して、ローマの食糧供給事情を解明するためのデータを収集した。さらに、21年度には十分おこなえなかった現地研究者との学術交流を、22年度に開催した一連のシンポジウム、講演会を通じておこなうことができた。9月にオスティア遺跡における現地調査を実施し、街路や建物の3Dレーザ測量をおこなうとともに、商業施設(マーケットや個別店舗)、倉庫、ミトラエウム(ミトラス神の礼拝所)、集合住宅の遺構を調査した。過去2年間の結果とあわせて、3Dレーザ測量はオスティアのかなりの範囲をカヴァーできたことになり、そのデータはディスクによって公開され、各方面の研究者に基礎的データを提供するものとなる。また、ローマの商業、食糧供給システム、宗教と美術、居住環境についても、多くのデータを収集することができた。現地調査と並んで、11月には東京・京都・神戸・福岡において、現地イタリアとイギリスから5名の研究者を招いての連続シンポジウムと講演会を開催し、これまでの研究成果の一部を発表するとともに、海外の研究者の知見を得、学術交流を深めることができた。さらにこれと同時に、東京・京都・福岡において、オスティアに関する展示会を開催し、日本ではあまり知られていないオスティアの姿とその重要性を紹介するとともに、遺跡調査の最新の方法とその可能性を広く伝えることができた。この3年間に集めたデータ、資料はかなり膨大なものになり、現在その解析を進めている。現段階での成果は、報告書としてまとめるが、さらに引き続き個別的な論文等として発表していく予定である。
転写因子MafB遺伝子改変マウス作成による喫煙肺気腫の病態研究

ドミナントネガティブを用いてマクロファージ特異的に転写因子MafBの活性を抑制する遺伝子改変マウスを作製した(MSR-DN MafB TGマウス)。このTGマウスにおいて、肺胞マクロファージ数が減少しておりアポトーシスの亢進によるものと考えられた。さらに、本TGマウスでは細胞の形態や、貪食能などにも変化が観察された。よって、転写因子MafBの生体における様々な機能(アポトーシスの抑制、細胞形態の制御、貪食能などの機能制御)が明らかとなった。マクロファージ特異的DN-MafBマウスの作製マクロファージ特異的な遺伝子発現を可能にするSR-PとDN-MafBの両プラスミドは完成し、さらにこの2つを融合させたプラスミドベクターも完了した(pcSR-P DN-MafB)。そしてpcSR-P DN-MafBをマウス胚細胞にマイクロインジェクションし、FOマウスを作製した。マウスの尾より遺伝子解析を行い、目的としていたマクロファージ特異的にDN-MafBを発現するマウスが作製されたことを確認した。免疫染色によるDN-MafB発現の確認およびDN-MafBの生体内での効果の確認DN-MafBがマクロファージ特異的に発現しているかを免疫染色で検討した。pcSR-PDN-MafBには蛋白質C末端にFLAGエピトープがタグとして付加されるように設計されている。よってDN-MafBの発現に関しては市販の抗FLAG抗体を用いることによって免疫染色で発現の検討が可能である。そしてDN-MafBが、肺胞マクロファージ、肝Kupffer細胞などに発現していることを確認した。さらに、この遺伝子改変マウスとコントロールマウスに気管支肺胞洗浄を施行して、肺胞マクロファージ数を計測したところ、遺伝子改変マウスで統計的に有意な細胞数の減少を観察した。一方、末梢血中の単球数には差を認めなかった。この結果より、MafBがマクロファージのsurvivalに重要な機能を演じていることが示唆された。マクロファージ特異的ドミナトネガティブMafB発現マウスを昨年度に完成することができた。最終的には喫煙負荷がこのマウスの肺に及ぼす影響を検討する必要があるが、その前段階として、現在このマウスの非刺激下での表現型解析が進行中である。20週齢未満のこの遺伝子改変マウスでは、マウスに負荷をかけない状態では、明らかな肺組織の変化は認められないようである。しかし、コントロールマウスに比して気管支肺胞洗浄中の肺胞マクロファージ数が有意に減少を観察していた。一方、末梢血中の単球数はコントロールと差を認めなかった。マウスの各組織中のマクロファージの細胞表面マーカーを検討したところ、マクロファージの終末分化マーカーであるCD11b,F4/80の発現が有意に減少していることをFACSにて確認した。すなわち、転写因子MafBはマクロファージの分化において、重要な役割を演じていることが強く示唆された。また遺伝子改変マウスとコントロールマウスに対して気管支肺胞洗浄を施行し、回収された肺胞マクロファージの形態を電子顕微鏡にて比較した。その結果、遺伝子改変マウスでは、細胞からの偽足の形成に変化が生じてきている可能性が高く、現在検討マウス数を増やしての確認作業を展開している。すなわち、現在までの解析では、MafB遺伝子改変マウスでは、マクロファージのsurvivalならびに終末分化が変化をきたしている可能性が高い。今後は、非刺激下での当該マウスの表現型解析が終了次第、喫煙負荷時の肺組織の差を検討してゆく予定である。肺胞マクロファージ(AM)は、慢性閉塞性肺疾患(COPD)の病態に重要な役割を果たしている。我々は以前、喫煙暴露マウスのAMで転写因子MafBが発現亢進し、アポトーシスを抑制していることを報告した。しかしMafB欠損マウスは致死的であり、これまで遺伝子改変マウスを用いてAMにおけるMafBの役割を検討した報告はなかった。そこで本研究はMafBの機能をマウス生体内で検討することを目的として開始された。昨年度までに、マクロファージ特異的にDN MafBを発現するマウス(MSR-DN MafB TGマウス)を作製し、DN MafBの発現は、RT-PCR、免疫染色で確認した。レポーターアッセイにより、マクロファージでのDN MafBがMafB活性を高度に抑制していることを確認した。気管支肺胞洗浄液細胞およびマクロファージ数はDN MafB-TGマウスで有意に減少していた。TUNEL染色ではTGマウスAMでアポトーシスの亢進が観察された。透過電子顕微鏡では核内のヘテロクロマチン量がTGマウスで有意に増加していた。走査電子顕微鏡では偽足形態に膜状変化が観察された。

また、DM MafB-TGマウスのチオグリコレート誘発腹腔マクロファージでは、F4/80、CD11bの発現がともに減弱していたが、無刺激状態のAMではこれらの発現に変化を認めなかった。AMの貪食能はDN MafB-TGマウスで有意に低下していた。以上より、MafBが肺胞マクロファージの数、細胞形態、機能に影響を及ぼしていることが理解された。
特異的DNA切断分子の開発のための修飾オリゴヌクレオチドの大量合成とその高度利用

本研究は、アンチセンス、アンチジーン法など特定遺伝子の発現制御や、ヒト遺伝子全塩基配列決定の実現のために必要な塩基配列特異的な切断分子の合成を目指し、修飾オリゴマーの合成と、その利用を目的としている。今年度の研究によって、以下に示す知見及び成果が得られた。1)修飾オリゴヌクレオチドの合成抗生物質によるDNA切断の機構及び分子認識を解析する目的として、また切断分子のDNA塩基配列認識部位として、2-アミノアデニン、8-メチルグアニン、4'-メチルチミジン、4'-チオチミジン、ステロイド、5'-ヨードシチジン、2'-ヨードウリジン、5'-ブロモシチジンを含む修飾デオキシヌクレオチドの合成法を確立し、その反応性、物性を検討した。2) DNA切断機構の解明ラジカルの寿命を測定する化学プローブであるラジカルクロックを、ブレオマイシン金属錯体の反応サイトに導入し、それぞれの錯体により生成するラジカルの寿命について検討を行なった。その結果、コバルトによる反応においても鉄錯体と同様、4'位水素引きぬきにより4'位のラジカルが生成していることを世界に先がけて確認した。3)相互作用モデルの構築デュオカルマイシンがディスタマイシンにより、新たにグアニンとも反応することから、協奏的認識という概念をはじめて提案した。この結果に基づき、デュオカルマイシンとディスタマイシンがマイナーグルーブ上に2枚入るモデルをつくり、分子力場計算により最適化を行ない、コンピューターグラフィックスにより視覚化した。
肺指向性・長期作用持続型ナノDDS製剤を基盤とした革新的肺線維症治療薬の創出

平成30年度は肺指向性・長期作用持続型ナノDDS製剤をsmallinterferingRNA (siRNA)への応用を検討した。siRNAと様々なカチオン性高分子、アニオン性高分子を自己組織化させ、多種類の製剤を調製することができた。調製した製剤は粒子径約100nmのアニオン性微粒子であった。ルシフェラーゼをサイレンシングするsiRNAを用いて製剤を調製し、ルシフェラーゼを恒常発現した細胞株への取り込みおよび遺伝子発現抑制効果を評価し、製剤のスクリーニングを行った。その結果、高効率に取り込まれ、高いルシフェラーゼ抑制効果を示す製剤を見出すことに成功した。また、細胞毒性も示さなかった。ナノDDS製剤をマウスに尾静脈内投与した結果、肺に高効率に分布することが分かった。以上のように、我々は平成30年度の研究によって、肺指向性・長期作用持続型ナノDDS製剤をsiRNAに応用することに成功した。令和元年度は、ルシフェラーゼを恒常発現させた肺繊維芽細胞株を作成して、取り込みおよび遺伝子抑制効果を評価するとともに、疾患モデルマウスを作成し、薬理効果についても検討を行う予定である。当初予定していたとおり、肺指向性・長期作用持続型ナノDDS製剤をsiRNAへ応用することができ、研究計画をほぼ達成できているため、おおむね順調に進展していると評価した。令和元年度も予定通りに研究を推進する。具体的にはsiRNAを内包したナノDDS製剤を調製し、肺線維芽細胞での評価を行う。さらに、疾患モデルも作成し、薬理効果について評価する。肺指向性・長期作用持続型ナノDDS製剤のプロトタイプの改良と基礎的評価を行った。様々なカチオン性高分子、アニオン性高分子のスクリーニングを行い、プラスミドDNA(pDNA)と自己組織化させることで、肺指向性を有し、長期作用が可能なナノDDS製剤を開発することに成功した。調製したDDS製剤の粒子径と表面電荷をゼータサイザーで測定した結果、粒子径約100 nmのアニオン性微粒子を形成していることが明らかになった。さらに透過型電子顕微鏡により球状であることが確認できた。ルシフェラーゼをコードしたpDNA(pCMV-Luc)を用いてDDS製剤を作製し、in vitroにおける肺繊維芽細胞への取り込みおよび遺伝子発現効率を評価した。その結果、DDS製剤は肺繊維芽細胞に高効率に取り込まれ、高い遺伝子発現を示した。また、取り込まれた製剤は細胞内で分解されたため、生体分解型であることが示された。細胞毒性を評価した結果、調製したDDS製剤は一般的なカチオン性ベクターで認められる細胞毒性は示さなかった。さらに、pCMV-Luc、蛍光標識したカチオン性高分子、アニオン性高分子を用いてナノDDS製剤を作製し、マウスへ尾静脈内投与した結果、DDS製剤は肺へ選択的に分布することが明らかとなった。また、肝臓、腎臓、脾臓、心臓、肺における遺伝子発現を測定した結果、肺において選択的に遺伝子発現を示した。また、血液毒性を評価した結果、血球凝集は起こさなかった。以上のように、我々は本年度の研究によって、肺指向性・長期作用持続型ナノDDS製剤のプロトタイプの改良に成功した。来年度は、small interfering RNA (siRNA)への応用を試みる予定である。当初予定していた研究計画をほぼ達成できているため、おおむね順調に進展していると評価した。平成30年度は肺指向性・長期作用持続型ナノDDS製剤をsmall interfering RNA (siRNA)への応用を検討した。平成30年度も当初予定していた研究計画に従い、研究を推進する。具体的には、今年度の研究で改良に成功したナノDDS製剤をsiRNAへ応用させる。siRNAを内包したナノDDS製剤を調製し、製剤学的検討を行い、最適な製剤を見い出す。その製剤を用いて、細胞レベルおよび動物レベルでの遺伝子抑制効果について評価する。キャンペーン期間中に試薬の購入を行うなどして研究費を功利的に使用したため。平成30年度に配分される研究費については、消耗品および旅費として使用する予定である。また、平成29年度の繰越は消耗品費に補填する。

キャンペーン期間中に試薬の購入を行うなどして、研究費を効率的に使用したため。平成30年度の繰り越しは消耗品費に補てんする。