hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
高励起状態化学の分子素子や環境問題、ナノおよびバイオテクノロジーへの応用

われわれはパルスラジオリシスとレーザーフラッシュフォトリシスを組み合わせることにより、ダイマーラジカルカチオンの励起緩和過程について検討を行った。ピレンダイマーラジカルカチオンの電荷共鳴帯を選択励起すると、ダイマーラジカルカチオンの減少と、モノマーラジカルカチオンの増加が確認されたことより励起状態での解離過程が確認された。(3)ポルフィリンは種々の超分子構造の重要な構成要素であり多くの研究例があるが、その構造異性体の検討例は少ない。本研究では構造異性体のひとつであるコルフィセンを電子供与体としたドナー・アクセプターダイアッド内の電子移動過程を検討した。電子移動速度の自由エネルギー変化依存性を明らかにし、他の異性体との差異を理論計算より明らかにした。分子素子への展開に関し、ラジカルカチオンに引き続きラジカルアニオンについてもその励起状態からの電子移動の解明を実現した。環境汚染物質分解に関し、二酸化チタン単一結晶に単一分子分光を用いることで触媒活性種の解明に成功した。さらに、DNAを主とした光線力学療法に関連し、DNA損傷の修復過程に重要な過剰電子移動を高速分光で明らかにした。以上の点より、計画通り研究が進行しているといえる。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究最終年度となるため、高励起状態が関与する種々の反応過程を包括的に検討していく予定である。具体的には以下の研究を予定している。分子素子への展開については、ラジカルイオン種の励起による電荷移動およびエネルギー移動過程を明らかにする予定である。また、環境汚染物質の分解については引き続き、単一結晶レベルでの検討により、活性種の解明を行う。さらに、光線力学療法応用に関しては、より効率的な電荷移動過程を実現することを目的として、種々の核酸配列での過剰電子移動速度の導出を行うとともに、超交換相互作用に基づく過剰電子移動過程の解明を目指す予定である。
ナノ粒子胎仔期曝露の脳神経系への影響の解明―脳神経疾患の予防を目指して

これまでに、ディーゼル排ガスやディーゼル排気微粒子、酸化チタンナノ粒子を曝露させるとモノアミンなどの神経伝達物質の変動や学習機能の低下が認められていた。病理学的な所見からも脳血管周囲に障害が多く認められており、血管が障害されることによって脳神経系が障害を受け、行動にまで影響が認められる可能性が示唆されていた。しかし、ナノ粒子が脳内に移行した量やそれと関わる細胞の同定はできておらず、エンドポイントの原因がよく分からなかった。また、ナノ粒子の曝露量の最適化と直接脳内にどれだけ移行するのかを評価した研究はほとんどない。ナノ粒子の健康影響評価を適切に行うためにはエンドポイントを押させるだけでなく、ナノ粒子の体内動態並びにナノ粒子が到達しうる細胞や脳領域の把握が重要である。そこで本年度は表面修飾した金属ナノ粒子を蛍光標識して、マウスの脳内をしらみつぶしに評価した。具体的には、金属ナノ粒子の表面を両親媒性物質で修飾させ、それに蛍光標識を施した(コロナ)。ナノ粒子の細胞認識並びに輸送経路には、ナノ粒子の表面が重要であると仮説をたてて研究を進めた。その結果、ナノ粒子の蓄積は大脳皮質、線条体、小脳に特徴的であった。さらに、脳内に移行したナノ粒子の大半は血管内皮細胞やグリア細胞であった。この結果は、ナノ粒子の物性・性状、及びナノ粒子に含まれる物質で毒性を及ぼすか否かが決定され、表面の情報を明確化させることで、ナノ粒子と関わる細胞の姿が明らかになることが示唆された。これによって、ナノ粒子の健康影響だけでなく、その予防法、さらにはドラッグデリバリーシステム等のナノ粒子健康科学のさらなる発展が望まれる成果を挙げることに成功した。当初は、ナノ粒子の毒性評価、特にエンドポイントを中心に評価していたが、ナノ粒子を蛍光標識させたことで、ナノ粒子と直接関わる細胞をin vivoで明らかにできた。これによって、ナノ粒子の健康科学の一端を明らかにし、予防策の提示に貢献できる一つの形を示すことに成功したと考えている。本研究の課題として、ナノ粒子が生体内に入った後に生体分子と相互作用するのか、明らかにできる方法論が未だ確立できていない。In vitroでは、ナノ粒子の表面に血清成分が吸着されることが示されているものの、今回私が行った研究においては生体内にナノ粒子が入った際にどのような生体分子と相互作用しているのかを明らかにすることはできていない。In vivoでナノ粒子の情報を抽出する方法の開発を試みて、ナノ粒子の複合(コロナ)の理解に努める必要がある。従来、ナノ粒子(粒径:100nm以下)を生体に曝露させる際に、ナノ粒子のみならず、マイクロサイズの微粒子も含まれていたことから、ナノ粒子曝露の健康影響評価としては不十分であった。本年度は、まず曝露条件(ナノ粒子のキャラクタリゼーション)に着目し、ナノ粒子の性質・性状の制御を行った。本研究では、金属ナノ粒子を用いて、リン脂質をナノ粒子の表面に吸着させた。これは、環境中のナノ粒子を吸入した際に肺胞に到達し、肺サーファクタントと相互作用することにより、脳や肝臓などに移行するという仮説のもとに、ナノテクノロジーの技術を用いて行った実験系である。また、従来のナノ粒子を検出する際には、電子顕微鏡(TEM)を用いる必要があった。本研究では、このナノ粒子にカルボシアニン系色素を化学結合させたことにより、蛍光顕微鏡によるラージスケールの解析が可能となったため、電子顕微鏡に比べ、より簡敏に検出が可能となった。この蛍光標識したナノ粒子をマウスに尾静脈投与を行い、各臓器へのナノ粒子の蓄積を評価した。その結果、肝臓に大半が蓄積しており、脳内へは微量が移行していた。しかし、腎臓・脾臓・肺などではナノ粒子が検出されなかった。この結果は、電子顕微鏡によっても解析を行っており、同様の結果(肝臓・脳のみ観察)を得ている。この結果は、ナノ粒子が脳へ移行することを世界で初めて実証した結果となり、非常に意義深い。今後、ナノ粒子と脳神経細胞との相互作用を解析していく予定である。

この結果は、ナノ粒子の物性・性状、及びナノ粒子に含まれる物質で毒性を及ぼすか否かが決定され、表面の情報を明確化させることで、ナノ粒子と関わる細胞の姿が明らかになることが示唆された。これによって、ナノ粒子の健康影響だけでなく、その予防法、さらにはドラッグデリバリーシステム等のナノ粒子健康科学のさらなる発展が望まれる成果を挙げることに成功した。当初は、ナノ粒子の毒性評価、特にエンドポイントを中心に評価していたが、ナノ粒子を蛍光標識させたことで、ナノ粒子と直接関わる細胞をin vivoで明らかにできた。これによって、ナノ粒子の健康科学の一端を明らかにし、予防策の提示に貢献できる一つの形を示すことに成功したと考えている。本研究の課題として、ナノ粒子が生体内に入った後に生体分子と相互作用するのか、明らかにできる方法論が未だ確立できていない。In vitroでは、ナノ粒子の表面に血清成分が吸着されることが示されているものの、今回私が行った研究においては生体内にナノ粒子が入った際にどのような生体分子と相互作用しているのかを明らかにすることはできていない。In vivoでナノ粒子の情報を抽出する方法の開発を試みて、ナノ粒子の複合(コロナ)の理解に努める必要がある。
DNAマイクロアレイを用いた肝動脈化学塞栓療法後の網羅的発現遺伝子解析

本研究は、従来型の肝動脈化学塞栓療法(Lip-TACE)と、薬剤溶出性球状塞栓物質を用いた肝動脈化学塞栓療法(DEB-TACE)を、家兎肝モデルでDNAマイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析を行い、比較検討することで、遺伝子レベルから両者間の差異を明らかにすることを目的とした。TACEの方法、術後日数で遺伝子の発現・変動に変化が見られ、TACEによる非癌部肝実質の機能障害の発現様式や腫瘍に対する局所制御メカニズムと関係している可能性があると考えられた。本年度は、家兎肝VX2腫瘍モデルを用い、油性造影剤リピオドールとアントラサイクリン系抗癌剤エピルビシンの懸濁液と多孔性ゼラチン粒(Gelpart)を使用した従来型Lip-TACEおよびエピルビシン溶出性高吸水性ポリマー(QuadraSphere)を使用したDEB-TACE後の発現遺伝子を、DNAマイクロアレイを用いて網羅的に解析するために、予備検討として塞栓物質と抗癌剤の設定量を探索した。予備検討では、QuadraSphere3mgを超えて家兎肝に塞栓術を行うと、高確率で24時間以上生存しないという結果となった。日常臨床ではQuadraSphere25mgに対してエピルビシン50mgを吸着させるので、この割合を考慮し、エピルビシン6mgを含有させたQuadraSphere3mgを、DEB-TACE群の投与量に設定した。Lip-TACE群では、抗癌剤量を同量とし、エピルビシン6mg、リピオドール0.6mL、Gelpart微量を設定量とした。今後、この設定量で家兎肝VX2モデルにTACEを行い、DNAマイクロアレイを用いて網羅的に解析を進める。本年度は、パリ第7大学に赴き、DNAマイクロアレイを用いて検討すべき遺伝子群の種類について議論を交わし、次年度に行う予定である網羅的解析の遺伝子群の参考とした。本年度は、本実験における最適な家兎肝VX2腫瘍モデルの作成方法を探索した。VX2腫瘍は、培養により増殖させた腫瘍細胞を細胞凍結保存液に浸しー80°Cで凍結保存しておいた腫瘍細胞を解凍し、清潔シャーレ上で0.5mm1mm程度にカットし、移植用に用意する。使用家兎は、(可能な限り3kg以上の)ニュージーランドホワイト腫とし、塩酸メデトミジン、塩酸ケタミン、ブトルファノールで全身麻酔を行い、イソフルランの吸入麻酔により維持する。最初、剣状突起から尾側の上腹部を剃毛後、イソジンスプレーで消毒を施す。メスで腹部正中切開後、肝左葉を把持鉗子で愛護的に把持し取り出し、メスで肝実質に小切開を入れる。VX2腫瘍細胞片を消毒滅菌したストローに仕込み、切開部に挿入し、同様に消毒滅菌した竹串で押し出し、肝臓内に移植する。細胞移植後、肝表面小切開部を4-0バイクリルで縫合する。次に右葉を把持し、右葉にも同様の方法でVX2腫瘍細胞片を移植する。移植1か所につき、VX2腫瘍細胞片を各々3個ずつ移植することとする。VX2腫瘍細胞片移植後、腹膜を4-0バイクリルで縫合し、皮膚はステイプラーで縫合。抗生物質とドミトール拮抗薬を筋注し、覚醒させる。体調管理に注意を払い飼育し、2週間後に移植時と同様の麻酔下で、非イオン性造影剤を静注し、造影ダイナミックCT検査を施行する。1cm2cm程度に発育した肝癌の発現を確認し、TACEを行う予定とする。本実験以外の研究に時間をとられ、また所属施設の異動の準備もあり、動物実験を実行する十分な時間が確保できなかった。本年度は、昨年4月より急遽本施設に異動することとなったが、前所属の大学病院と比較して日常臨床業務が多忙となり、当該科研遂行のための研究時間が全く確保できなかった。本年度に研究再開するための研究体制を整えることに時間を費やし、再度研究計画を練り直した。家兎肝VX2腫瘍モデルを用い、油性造影剤リピオドールとアントラサイクリン系抗癌剤エピルビシンの懸濁液と多孔性ゼラチン粒(Gelpart)を使用した従来型Lip-TACEおよびエピルビシン溶出性高吸水性ポリマー(QuadraSphere)を使用したDEB-TACE後の発現遺伝子を、DNAマイクロアレイを用いて網羅的に解析する予定であった。しかし、エピルビシン溶出性高吸水性ポリマー(QuadraSphere)は、臨床的には使用頻度が少なく、エピルビシン溶出性ビーズ(DCBead)を使用したDEB-TACE後の発現遺伝子を解析する方針とした。Lip-TACE群では、エピルビシン6mg、リピオドール0.6mL、Gelpart微量を設定量としている。日常臨床ではDCBead2mLに対してエピルビシン50mgを吸着させるので、この割合を考慮し、エピルビシン6mgを含有させたDC Bead0.24mLをDEB-TACE群の投与量に設定した。100倍希釈(20.4mL)で投与するようにする。TACE施行時に上記量を注入できない場合は、半量まで減量するようにする。この設定量で家兎肝VX2モデルにTACEを行い、DNAマイクロアレイを用いて網羅的に解析を進める。所属施設の異動により、日常臨床業務が多忙となり、動物実験を実行する十分な研究時間が全く確保できなかった。本年度はウサギ肝モデルを用いて、エピルビシン(EPIR)溶液

(3mg/0.3mL)とリピオドール(0.3mL)の混合液を動注後、多孔性ゼラチン粒(微量)で塞栓(従来型TACE群)(n=3)、EPIR溶出性ビーズ(DC-Bead0.12mL、EPIR含3mg)で塞栓(薬剤溶出性DC-Bead-TACE群)(n=3)、CDDP溶出性球状塞栓物質(HepaSphere1.5mg、CDDP6mg)(n=3)で塞栓(薬剤溶出性HepaSphere-TACE群)(n=3)を施行。3日後に各群n=1、及び7日後に各群n=2、全身麻酔下で安楽死を行い、肝臓を摘出後、塞栓物質の動向を肉眼的に検索。一部サンプルから抽出したmRNAを逆転写酵素でcDNAに変換したものを、基板上のDNA配列にハイブリダイゼーションし、細胞内で発現している遺伝子情報を網羅的に検出した。結果塞栓部は、非塞栓部に対して遺伝子数が、3日後従来型TACE群で、205probeが倍以上の上昇変動、751probeが発現、3日後薬剤溶出性DC-Bead-TACE群で、996 probeが倍以上の上昇変動、1318probeが発現、3日後薬剤溶出性HepaSphere-TACE群で、1168probeが倍以上の上昇変動、1498probeが発現した。7日後従来型TACE群で、2215probeが倍以上の上昇変動、2079probeが発現、7日後薬剤溶出性DC-Bead-TACE群で、404probeが倍以上の上昇変動、1255probeが発現、7日後薬剤溶出性HepaSphere-TACE群で、350probeが倍以上の上昇変動、1011probeが発現した。TACEの方法、術後日数で遺伝子の発現・変動に変化が見られ、TACEによる非癌部肝実質の機能障害低減、腫瘍局所制御の向上への臨床応用のための重要な知見が得られた。本研究は、従来型の肝動脈化学塞栓療法(Lip-TACE)と、薬剤溶出性球状塞栓物質を用いた肝動脈化学塞栓療法(DEB-TACE)を、家兎肝モデルでDNAマイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析を行い、比較検討することで、遺伝子レベルから両者間の差異を明らかにすることを目的とした。TACEの方法、術後日数で遺伝子の発現・変動に変化が見られ、TACEによる非癌部肝実質の機能障害の発現様式や腫瘍に対する局所制御メカニズムと関係している可能性があると考えられた。動物実験を実行する十分な時間が確保できなかった。今年度は、動物実験を実行する時間を確保できる見込みであり、計画の効率化を進め、実験を達成する予定である。DNAマイクロアレイでの検討も時間がかかる可能性があるが、現時点では最終的に実験を達成できると考えている。今年度は、研究再開するための研究体制を整え、動物実験を実行する時間を確保できる見込みであり、計画の効率化を進め、実験を達成する予定である。医歯薬学今年度は、確保できる見込みであり、計画の効率化を進め、実験を達成する予定である。DNAマイクロアレイでの検討も時間がかかる可能性があるが、計画に余裕があるので、現時点では最終的に実験を達成できると考えている。DNAマイクロアレイでの解析前の薬剤設定量に時間を要し、DNAマイクロアレイの解析まで、進むことが出来なった。実験が遅れているため、今年度はDNAマイクロアレイの解析まで進むことが出来ず、その費用が次年度に繰り越されることとなった。
不死化心筋細胞株の作成に関する研究

心臓では、最終分化した成熟心筋細胞はそれ自身増殖能力を持たず、また、幹細胞なるものは存在しない。よって成熟心筋細胞を増殖させる事は不可能であるとされている。しかし、もし仮に成熟心筋細胞を増殖する事が可能ならば、その成果は多大なものになる。また、近年の遺伝組換え技術の発展は目覚ましく、遺伝子発現を自由に制御する事が可能となっている。そこでシミアンウイルス40ラージT抗原遺伝子(SV40Tag)をCre/loxPシステムを用い、ONからOFFの制御を行えるように、培養中の心筋細胞に導入することを考えた。すなわち、癌遺伝子を利用し、心筋細胞を増殖させた後、Cre/loxPシステムを用い癌遺伝子を不活性化し、これを細胞移植に利用することを目標とした。一対のloxP配列間に単純ヘルペスウイルス-チミジンキナーゼ(HSV-TK)融合遺伝子と癌遺伝子であるSV40Tagをコードし、その3'下流にネオマイシン耐性遺伝子(NeoR)をコードしたレトロウイルスベクターを作成した。これをマウス繊維芽細胞株である3T3細胞に感染させた後、ハイグロマイシンを含む培養液中で培養した。2日間培養後、一部の細胞が生存した。この細胞を単離し、増殖させた後RT-PCR法でシミアンウイルス40ラージT抗原の遺伝子発現を調べた結果、確かにこの遺伝子発現を認めた。次にラットの成熟心筋細胞(心室筋、心房筋)を単離後、同様にレトロウイルスベクターに感染させた。しかし、これらの遺伝子は心筋細胞に導入されることはなく、ハイグロマイシン培養液中では生存細胞を認めなかった。そこで、胎児心筋細胞を同様に処置したが、結果は同様で遺伝子導入は困難であった。現在、レトロウイルスベクターの力価を高くしたり、感染処置中の条件を変更したりしてさらに検討中である。
白色脂肪組織形成におけるFGF10の役割の解明

白色脂肪組織は、生体のエネルギー代謝を調節する、きわめて重要な組織である。本研究では生後の白色脂肪組織形成におけるFGF10の役割を明らかにする目的で、FGF10の受容体であるFGF受容体2(FGFR2)を脂肪組織特異的に欠損するマウスを作製し、解析を行った。作製されたマウスは白色脂肪組織特異的に遺伝子欠損が起きていた。またその効率は約50%程度であった。続いて、その表現系について検討した。20週齢まで、FGFR2CKOマウスとコントロールの問に、体重差は見られなかった。しかし、20週齢において、両マウスより脂肪組織を摘出したところ、精巣上体白色脂肪組織、腸間膜白色脂肪組織重量が、FGFR2CKOマウスではコントロールの約5割に低下していた。一方、褐色脂肪組織や心臓、肝臓など、白色脂肪組織以外の他の組織では、重量に差が見られなかった。白色脂肪組織の組織重量の減少の原因を明らかにするため、精巣上体白色脂肪組織を切片化し、その形態を顕微鏡下で観察した。その結果、個々の白色脂肪細胞のサイズが減少していることを見いだした。特に、コントロールに存在する4000平方マイクロメートルを超える大きな白色脂肪細胞は、FGFR2CKOマウスの精巣上体白色脂肪組織には存在していなかった。さらに、算出された白色脂肪細胞の平均面積と組織重量から、脂肪細胞数を概算したところ、FGFR2CKOマウスとコントロールの間に、差は見られなかった。以上の結果より、FGFR2CKOマウスの白色脂肪組織では、個々の細胞のサイズが減少することにより、組織量が減少することが明らかとなった。げっ歯類の白色脂肪組織では、性成熟の後、主に個々の脂肪細胞のサイズが増加することで、脂肪組織量が増加することが報告されている。今回得られた知見から、この脂肪細胞のサイズの増加において、FGFR2が重要な役割を果たしていることが示唆された。研究代表者は、成体の脂肪組織形成過程におけるFGF10の役割を明らかにすることを目的に本研究を行った。脂肪組織特異的にCre酵素を発現するマウス(aP2-Cre/ERT2)とFGF10の特異的な受容体であるFGF receptor2 (FGFR2) floxマウスを交配させた。今回用いたaP2-Cre/ERT2マウスは、タモキシフェン投与により任意の時期において遺伝子組み換えを惹起することができる。まず作製したaP2-Cre/ERT2 x FGF10 flox/floxマウスに対し、胎生14.5日胚より5日間タモキシフェンの連続投与を行い、白色脂肪組織形成の初期過程におけるFGF10/FGFR2シグナリングの役割について検討した。その結果、出生直前のマウスの皮下白色脂肪組織における脂肪滴の蓄積が減少した。この結果から胎生期の白色脂肪組織形成過程において、FGF10/FGFR2シグナリングが脂肪分化を正に調節している可能性が示された。またマウスの発達過程において、離乳前後に脂肪細胞の増殖、脂肪滴の蓄積が活発であることが報告されている。そこで離乳後すぐに組み替えを行ったところ、組み替え体の皮下脂肪組織において、コントロールに比較して、脂肪滴の大きさが増加している個体が見受けられた。この結果より、生後の白色脂肪組織の発達過程においてFGF10/FGFR2シグナリングが脂肪滴の蓄積を負に制御している可能性が示唆された。現在、成体になった後の脂肪蓄積過程、あるいは肥満過程におけるFGF10/FGFR2シグナリングの重要性を明らかにするため、組み換えを8周齢以降に行う、あるいは高脂肪食負荷、遺伝性肥満マウスとの掛け合わせなどを試みている。以上の検討より、生体の脂肪組織形成過程、肥満過程におけるFGF10/FGFR2シグナリングの意義について明らかになると共に、新たな肥満症治療薬の開発等にも有用な知見が得られるものと期待される。

さらに、算出された白色脂肪細胞の平均面積と組織重量から、脂肪細胞数を概算したところ、FGFR2CKOマウスとコントロールの間に、差は見られなかった。以上の結果より、FGFR2CKOマウスの白色脂肪組織では、個々の細胞のサイズが減少することにより、組織量が減少することが明らかとなった。げっ歯類の白色脂肪組織では、性成熟の後、主に個々の脂肪細胞のサイズが増加することで、脂肪組織量が増加することが報告されている。今回得られた知見から、この脂肪細胞のサイズの増加において、FGFR2が重要な役割を果たしていることが示唆された。
ペルオキシダーゼの静的および動的立体構造に基づく基質の活性化機構の解明

ペルオキシダーゼは生体内で生じた過酸化水素を除去するだけでなく、反応過程で生じる活性種を用いて様々な生体物質の代謝に関与している。この酵素は過酸化水素を用いて、ヨウ素イオンなどの無機化合物だけでなくフェノール類などの有機化合物の酸化をも触媒する。この酵素反応は、過酸化水素が分解され酵素自身がcompound Iとよばれる分子種になる過程と、compound Iが還元剤により元の酵素に戻る過程からなる。このうちcompound Iを還元する過程については、基質の結合部位さえもよくわかっていない。本研究では真菌Arthromyces ramosusが分泌するペルオキシダーゼ(ARP)をとりあげ、ヨウ素イオンや芳香族化合物がARPにどのように結合し、活性化されるかを調べた。1.ヨウ素イオンの結合部位ARP結晶を30mMKIを含む緩衝液(pH5.5)にsoakし、ヨウ素イオン結合型を調製した。この結晶の2.06Å分解能の回折強度を測定し、D合成およびバイフット差フーリエ合成から、I^-の結合部位を決定した(I^-の占有率は約30%)。I^-はヘムの遠位側へ通じるチャネルの入口上部に結合していた。I^-はARP表面の小さなくぼみにあり、特定の残基・原子と強い結合はないようである。I^-が接しているIle153の側鎖の内側には活性残基のHis56があり、I^-とヘム鉄との距離は12.8Åである。2.芳香族化合物の結合部位ARP結晶を約21mMのbenzhydroxamic acid(BHA)を含む溶液にsoakし、そのX線回折強度をシンクロトロン放射光を用いて測定した。1.6Å分解能(F_O-F_C)電子密度から、BHAはヘムの遠位側にヘム面とほぼ平行に結合していた。BHAのOH、NHおよびC=Oは、それぞれHis56Nε、Pro154O、およびArg52Nεと水素結合していた。一方p-クレゾールやレゾルシノールはARPと特定の結合様式をとっていないせいか、上記のような方法では同定できなかった。
中小企業におけるオープン・イノベーションのメカニズム解明と概念モデルの提示

事例分析およびそれを受けた統計分析を進めることで、オープン・イノベーションに積極的に取り組んでいる中小企業では、研究開発等の上流部分における連携だけでなく、販売等の下流部分における連携も含めた事業化まで見通したイノベーションの仕組みを構築する取り組みが行われていることを確認できた。その結果、契機(危機感・企業家精神)⇒構想(研究開発着手・外部知識の探索)⇒投資(製品・サービス化)⇒事業化(市場投入・販売促進)⇒組織化(組織的な取り組み体制構築)⇒次の開発ステージへと展開する、大企業とは異なった中小企業特有のオープン・イノベーションのメカニズムを明らかにすることができた。本研究の目的は、戦略論の先行研究を応用し、中小企業のオープン・イノベーションの戦略的なメカニズムを解明することによって、概念モデルを提示することにある。研究初年度の平成26年度には、調査準備とパイロットスタディによる研究フレームワークの有効性検証を行った。1調査準備(平成26年4月8月):過去2回にわたって実施した調査結果の再検証を行うとともに、訪問ヒヤリング調査の対象とする中小企業のサンプリング等、調査準備に取り組んだ。2パイロット調査の実施(平成26年9月平成26年11月):研究フレームワークの有効性を検証するため、事例研究対象のサンプル企業を4社抽出し、パイロット調査を実施した。3論文執筆と投稿(平成26年12月平成27年3月):パイロット調査の分析結果を研究論文として投稿し、査読の結果掲載された。「中小企業におけるオープン・イノベーションの類型」(東洋大学経営力創成研究センター第11号,平成27年3月刊行)。4先行研究サーベイ(平成27年3月):パイロットスタディの結果を受けて、理論的補強を行うため外国文献を中心に先行研究のサーベイを行った。本研究の目的は、研究対象を中小企業のイノベーション戦略の中でもオープン・イノベーションに絞り込み、その戦略的なメカニズムを解明することによって、概念モデルを提示することにある。研究初年度は、パイロット調査、論文執筆と投稿(査読)、先行研究のサーベイを行った。研究2年目の平成27年度は、下記の4項目の研究調査を進めた。1事例研究調査の実施と分析・評価(平成27年4月9月):前年度のパイロット調査の結果をもとに、研究フレームワークの再設定を行い、中小企業のオープン・イノベーションを類型化した。そして、類型別に調査対象企業を抽出し、事例研究を実施した。2学会での研究報告(平成27年10月・12月):事例研究の成果を2つの学会で研究報告を行った(日本中小企業学会全国大会自由論題報告、日本経営学会関東部会シンポジウム)3論文執筆と投稿(平成28年3月):事例研究の成果と学会での研究報告をもとに、研究論文として投稿し、査読の結果掲載された。「中小企業におけるオープン・イノベーションのマネジメント」(『経営力創成研究』第12号、東洋大学経営力創成研究センター、平成28年3月刊行)4アンケート調査の実施(平成28年1月3月):事例研究の結果判明した中小企業におけるオープン・イノベーションのメカニズムの仮説を統計的に検証するため、中小製造業1,200社を対象としたアンケート調査を実施した。ただし、調査結果の分析は平成28年度に行う予定である。当初計画していた事例研究によるメカニズム解明を補強するため、アンケート調査を行うことが出来たため。ただ、想定以上の回収率であったため、統計分析を行うには時間的余裕がなく、次年度に繰り越した。平成28年度は、下記の5項目の研究調査を行った。1アンケート調査結果の分析・評価(平成28年4月6月)平成28年1月3月にかけて実施した、中小製造業1,200社を対象とするアンケート調査の結果分析を行い、研究初年度と2年度にかけて行った事例研究から判明した発見事実の検証をした。2事例研究調査の実施と分析・評価(平成28年7月平成29年2月)アンケート調査の結果分析をもとに、再度事例研究調査を実施し、アンケート調査結果の深堀を行った。3学会での研究報告(平成28年10月)アンケート調査結果と事例研究調査結果をもとに、日本マネジメント学会第74回全国研究大会において、「中小企業の外部機関との連携」について研究報告を行った。4論文執筆と投稿(平成29年7月、平成29年3月)アンケート調査結果と事例研究調査結果および学会報告をもとに2本の論文を投稿し採用された。「中小企業におけるオープン・イノベーションのメカニズム」(日本マネジメント学会『経営教育研究』第19巻第2号)、「中小企業の外部機関との連携」(東洋大学経営力創成研究センター『経営力創成研究』第13号)。5共著の刊行(平成29年3月)東洋大学経営力創成研究センター『スモールビジネスの創造とマネジメント』(学文社)第6章「スモールビジネスのイノベーション」を分担執筆した。アンケート調査結果による検証結果を事例研究により深堀することができた。その結果、契機(危機感・企業家精神)⇒構想(研究開発着手・

外部知識の探索)⇒投資(製品・サービス化)⇒事業化(市場投入・販売促進)⇒組織化(組織的な取り組み体制構築)⇒次の開発ステージへと展開する、大企業とは異なった中小企業特有のオープン・イノベーションのメカニズムを明らかにすることができた。その研究の過程で、以下のような研究課題も抽出された。1中小企業のオープン・イノベーションは、イノベーションの過程の中で、インバウンド型からカップルド型へと進んでいくことは判明していたが、中小企業のオープン・イノベーションメカニズムの事業化から組織化、次の開発ステージへと進む過程の中で、大企業へのアウトバウンド型へと展開することにより事業規模を急拡大させている中小企業が多い。2これまでは積極的でなかった大企業側からの中小企業へのオープン・イノベーションアプローチが、近年急速に増加してきているが、1の現象とリンクしているようである。以上の2点は、当初の研究計画外(想定外)の事象であることから、さらに継続して中小企業のオープン・イノベーションのメカニズムを研究していくことが、学術的かつ実務的にも重要と考えている。事例分析およびそれを受けた統計分析を進めることで、オープン・イノベーションに積極的に取り組んでいる中小企業では、研究開発等の上流部分における連携だけでなく、販売等の下流部分における連携も含めた事業化まで見通したイノベーションの仕組みを構築する取り組みが行われていることを確認できた。その結果、契機(危機感・企業家精神)⇒構想(研究開発着手・外部知識の探索)⇒投資(製品・サービス化)⇒事業化(市場投入・販売促進)⇒組織化(組織的な取り組み体制構築)⇒次の開発ステージへと展開する、大企業とは異なった中小企業特有のオープン・イノベーションのメカニズムを明らかにすることができた。当初計画した、調査準備、パイロット調査の実施、論文・執筆投稿と順調に進んだ。ただ、調査の結果、理論補強の必要性が生じ、急きょ外国文献等を購入し先行研究のサーベイを行うことにした。平成27年度末に実施したアンケート調査の統計分析を行い、事例研究の結果判明した中小企業におけるオープン・イノベーションのメカニズムの仮説を統計的に検証する。その成果を、日本マネジメント学会の全国大会で研究報告を行い、その成果をもとに論文執筆を行い、学会誌等へ投稿する。また、最終年度であることから、研究成果を冊子に取りまとめることにしている。予定していた事例調査対象企業の都合により年度内に調査を終了することができなかったため、「科研費補助事業期間延長申請」を行い、平成29年4月5月に最終調査を終了する予定である。中小企業の経営戦略平成26年度に実施したパイロット調査の結果と、先行研究のサーベイによる理論補強をもとに、研究フレームワークの再設定を行い、オープン・イノベーションの類型化により、パターン別に調査対象企業を抽出し訪問ヒヤリング調査を実施する。
コラーゲンを特異的に認識するインテリジェント生体架橋剤の創製

本研究の目的は、コラーゲンの三重らせん形成に着目した弱い分子間相互作用を駆動力とするコラーゲン選択的インテリジェント生体架橋剤の創製である。多分岐ポリエチレングリコールにコラーゲンペプチドを結合した化合物が超分子ナノ粒子を形成し、線維性コラーゲンのみを選択的に架橋することを見出し、家兎水疱性角膜症モデルを用いた動物実験で角膜再生医療に有効であることを確認した。本生体架橋剤は、コラーゲン特異的な生体架橋剤として医療分野への応用が期待される。本研究は、コラーゲンの三重らせん形成に着目した弱い分子間相互作用を駆動力とするコラーゲン選択的インテリジェント生体架橋剤の開発を目的としている。本年度は、生体架橋剤の合成と最適化、またコラーゲン分子との架橋形成の評価を研究した。縮合反応の条件を検討することで、2,4,8本鎖のPEGにコラーゲンモデルペプチド(POG)_<10>を結合することができた。収率・POGの導入率共に80%以上で良好であった。得られたPEG-(POG)_<10>とコラーゲン分子との架橋形成を評価した。申請前の知見として、I型コラーゲンと4-arm-PEG-(POG)_<10>を混合するとゲル化することをすでに見出していた。そこで、II型、III型、IV型、V型コラーゲンと様々な種類のコラーゲンとの架橋形成を検討した結果、I型、II型、III型と線維性のコラーゲンはゲル化するが、IV型など非線維性のコラーゲンは認識せず、ゲル化しないことを見出した。また、コラーゲン以外の合成高分子、天然由来高分子、タンパク質は認識せず、まったく架橋しないことも明らかとなった。生体のコラーゲンのみを特異的に認識する生体架橋剤はこれまで例が無く、初めてである。また、表面プラズモン共鳴スペクトル装置により、4-arm-PEG-(POG)_<10>と各種コラーゲンの相互作用力を評価した結果、やはり線維性コラーゲンのみ相互作用し、非線維性コラーゲンとは相互作用しないことが確認された。さらに、I型、II型、III型との解離定数(K_D)は10^<-7>Mと非常に強く結合していることが明らかとなった。以上より、本年度は極めて順調に計画を推進することができた。本数の異なる新規生体架橋剤を合成することに成功し、また線維性コラーゲンに対する高い特異性を見出すことができた。本年度は、円錐角膜症への応用に関する基礎知見の収集として、コラーゲンのゲル化における透明性を検討した。また、家兎水痕性角膜症モデルに対する架橋剤点眼の治療効果を検討した。ブタI型コラーゲンを酸性およびアルカリ性水溶液に溶解し、pHを中性に調整した後に架橋剤と混合して透明性を評価した。酸性で溶解させたコラーゲンの場合、中性にした時点で沈殿が生じたため使用することが困難であることが明らかとなった。一方、アルカリ性水溶液で溶解させたコラーゲンの中性溶液は、4度では高濃度においても透明性が高かった。しかし、37度に加温すると白濁したゲル状態へと変化したため、濃度を2wt%以下にすることで37度でも透明性を保つことが確認された。さらに、この状態で架橋剤を混合することで、4度では透明なゲル状態を保てることが明らかとなった。透明性に最適なコラーゲンの溶解方法ならびに濃度が確認された。さらに、家兎水庖性角膜症モデルに本架橋剤を点眼することで、角膜コラーゲンが架橋されることで角膜厚が減少し、水疱性角膜症に対して一定の治療効果を有することが確認された。
高等植物細胞の浸透圧調節機構に関する生化学的研究

高等植物は耐塩性の仕組み(浸透圧調節、根によるイオンの選択的排除、塩腺による塩の排除、水分の損失を防ぐために気孔を閉じる)を持っている。この中で浸透圧調節機構は最も基本をなすものである。浸透圧調節は低分子有機化合物(ベタイン類、アミノ酸、糖)を合成蓄積することによって行われる申請者らはベタイン合成系の調節機構を解析する目的で研究を行い、以下の結果を得た。(1)大麦のベタイン合成酵素(ベタインアルデヒド脱水素酵素)を精製し、分子量が60kDaのサブユニフトからなる二量体であることを明らかにした。(2)大麦のベタインアルデヒド脱水素酵素の組織局在性について研究を行った。本酵素は緑葉ばかりでなく黄化葉にも存在している。根の抽出画分には、ベタインアルデヒドに特異的な酵素は検出できなかった。(3)大麦緑葉のベタインアルデヒド脱水素酵素の蛋白質レベルは塩ストレスにより誘導を受けた。(4)大麦緑葉のベタインアルデヒド脱水素酵素の抗体を用いて、in vitro translationを行い、mRNAレベルも塩ストレスにより誘導されることを明らかにした。(5)本酵素のクロ-ニングを試みている。植物細胞の浸透圧調節機構について、主に浸透圧調節物質ベタインの生合成と蓄積に関する研究を行った。研究成果は以下のとおりである。(1)ホウレンソウ緑葉より、これまで精製のなされていなかったベタイン生合成酵素ベタインアルデヒド脱水素酵素を2000倍に精製し、その酵素学的性質を明からにし、抗体を調製した。(2)イネ科植物におけるベタインの蓄積とベタインアルデヒド脱水素酵素に関する研究大麦、小麦、トウモロコシ、イネ等の主要穀物は、浸透圧調節物質としてベタインを蓄積することが知られるが、ベタイン生合成酵素に関する知見はなかった。我々は、これら4種の作物の緑葉に本酵素系が存在することを明らかにした。さらに大麦は材料にして、塩(水分)ストレスを与えるとき、緑葉の浸透ポテンシャルの低下にともなって、ベタィンの蓄積とベタインアルデヒド脱水素酵素の誘導を明らかにした。またベタインの蓄積は黄化葉と根の組織にも緑葉の約1/4量ベタインの蓄積があった。黄化葉にはベタインアルデヒド脱水素酵素も存在した。現在抗稿論文を作製中である。(3)塩性アカザ科植物におけるベタインの蓄積とベタインアルデヒド脱水素酵素に関する研究塩性アカザ科植物(ホソバノハマアカザ、イソホオキギ、ウラジロアカザ)についても(2)と同様の研究を行った。その結果イネ科よりも、1桁多くのベタインの蓄積とベタインアルデヒド脱水素酵素の存在を認めた。したがってベタイン生合成酵素の生合成の誘導、遺伝子発現の研究材料として適当であると判断した。高等植物はさまざまな耐塩性の仕組み(浸透圧調節、根によるイオンの選択的排除、塩脱による塩の排除、水分の損失を防ぐために気孔を閉じる)を持っている。浸透圧調節は低分子有機化合物(ベタイン類、アシノ酸、糖)を合成蓄積することによって行われる。申請者らはこれまでにベタイン合成素の調節機構に関する研究を行ない以下のような結果を得ていた。(1)大麦のベタイン合成酵素(ベタインアルデヒド脱水素酵素を精製し、分子量が60kDaのサブユニットからなる二量体であることが明らかになった。(2)大麦のベタインアルデヒド脱水素酵素の組織局在性について研究を行い、本酵素は緑葉ばかりでなく黄化葉にも局在していこと。根の画分には、ベタインアルデヒドに特異的な酵素は検出できなかった。(3)大麦緑葉のベタインアルデヒド脱水素酵素の蛋白質レベルは、塩ストレスにより誘導を受けた。さらに、本年度は大麦緑葉のベタインアルデヒド脱水素酵素の抗体を用いて、in vitro translationを行い、mRNAレベルも塩ストレスにより誘導されることを明らかにした。本酵素のクロ-ニングを行っている。
G-CSFで活性化した人好中球機能のMethotrexateによる抑制

1.Mathotrexate(MTX)は、抗炎症効果を持ち、リウマチ性疾患の治療に用いられている。従来、MTXが抗炎症効果を持つ機序として、種々の好中球機能に抑制的に働くことが報告されている。これらの研究は、無刺激の状態(Resting state)にある人末梢好中球を対象としたものであった。しかし、炎症反応の局所にあっては、好中球はなんらかの形で活性化された状態にあると考えられ、したがってMTX等の薬剤の効果を検討する際には、活性化された状態にある好中球を対象とする方が意義がある。本研究でGranulocyte colony-stimulating facotr(G-CSF)で活性化した人末梢好中球を対象として、MTXがその活性酸素産生や遊走能に与える影響を検討した。2.G-CSFにより好中球は活性化され、fMLPで誘導される活性酸素産生や遊走能が著しく亢進する。MTX添加により、それらの機能は抑制されるが、その程度は無刺激の状態の好中球と比較して、G-CSFで活性化された好中球により顕著であった。3.その系に、プリンヌクレオチドプールをサルベ-ジ回路(HGPRT)を通じて補填するヒポキサンチン或いはグアノシンを同時に添加すると、MTXの効果が有意に相殺された。この相殺効果はHGPRTを欠損したLesch-Nyhan症候群の患者の好中球では見られなかった.4.本研究は、活性化された好中球の種々の機能がMTXにより強く抑制されること、及び、その作用機序の一部がプリヌクレオチドの合成抑制にあることを明らかにした。従来、活性化された好中球に対するMTXの効果を検討した研究は例が無く、上述の臨床効果を説明する上で有意義な知見である。
拡張身体表現による遠隔協調作業

本研究では、身振りや手振り自体の身体表現を拡張する基本概念を導入することで、通常の人間以上の表現力を持つ遠隔協調作業の提案と実現を目指す。まず、プロジェクタと深度センサや光学トラッカで構成された身体表現を抽出し拡張する指示者側システムを構築する。そして、この全身の身体表現を抽出し拡大縮小表現・各種VFXによって表現を拡張するシステムと、HMD+HMCで構成された現場の作業者が用いるシステムを接続し、ユーザビリティテストによる効果測定を実施する。次に、身体表現を抽出し拡張する指示者側システムを、センサルームの導入と高解像度HMDを用いて没入型へと発展させる。最初に、各種文献サーベイなどの調査研究を行い、これに基いて身体表現を抽出し拡張する指示者側システムにを構築した。簡易に構築可能で、且つ効果測定が簡単に可能であるシステムを目指すため、ユーザの全身の身振り手振りを深度カメラによって抽出し、この抽出した身振り手振りを、拡大拡張表現または縮小拡張表現可能なシステムを構築した。このシステムによって、仮想身体サイズによる対人距離の視覚的拡張を目指した実験を行った。具体的には、不適切な対人距離によって不快感が発生したとき,不快感が軽減するように距離感を操作し、対象人物からの距離感を見かけ上変更する手法を提案し実装した。この手法の有効性を確認するために、ヘッドマウントディスプレイ(Head Mounted Display: HMD)と深度センサとRGBカメラからなる没入型のビデオシースルシステムを構築した。このシステムは,深度センサで人物領域を検出し,人物のみを拡大縮小してHMDに提示することで,人物サイズを視野上で仮想的に調整できる。実験の結果,システムは見かけ上の対人距離を調節することで,視覚情報をあまり損なわずに不適切な対人距離から発生する不快感を削減できることが分かった。このように、身体の拡大表現もHMD内で実現可能で、将来的には巨大な指示者や小さな指示者を作業者のHMD視界中に出現させられる確信をえた。引き続き平成28年度にかけても改良を行い、部分的な拡張身体表現を取り入れたシステムを構築し、ユーザビリティテストによる効果測定を実施する。高精度なHMDと高精度の深度センサが安価に入手可能になり、またライブラリが充実したために予定通りの研究成果を上げていると考えられる。そして、拡張身体表現によって通常の人間以上の表現力を持った遠隔協調作業での利点と限界を明らかにする。平成28年度の研究実績として、平成27年度で構築した「仮想身体サイズによる対人距離の視覚的拡張」を実現したシステムに対し機能追加による改良を施し、効果測定を行った。具体的には、いままでは単眼映像の提供であったが、ステレオ映像を提供し、両眼立体視を実現したシステムとなった。予定では、拡大縮小表現に加え、VFXによる拡張表現でHMD内の人間の身体表現を強調したり、身体運動低速再現によってHMD内の人間が慎重に行動するような拡張表現の実装を予定していたが、予定外にステレオ視の実装が困難であったため、平成29年度での実装になることとなった。しかしながら両眼立体視の機能の提供により、複雑な形状の物体に対しても立体的な指示者による三次元的な指示の提供の可能性を実現した。平成28年度の研究実績として、平成27年度で構築した「仮想身体サイズによる対人距離の視覚的拡張」を実現したシステムを改良し、効果測定を行った。予定では、拡大縮小表現に加え、VFXによる拡張表現でHMD内の人間の身体表現を強調したり、低速再現によってHMD内の人間が慎重に行動するような拡張表現の実装を予定していたが、予定外にステレオ視の実装が困難であったため、平成29年度での実装になることとなった。具体的にはステレオ立体視を行うための光学系ハードウェア制作の際の、工作精度不足によるものが大きい。平成29年度の研究実績として、前年度までに実装されていた「仮想身体サイズによる対人距離の視覚的拡張」を実現したシステムに対して、両眼立体視が可能な機能を実装し、これを評価した。

これにより、より現実世界に近い形でHMD内に写っている人間の拡大縮小表示が可能となった。さらにシステム全体として、現実世界と仮想世界のスケールの違いを考慮し、違和感を無くすのを目標にするのではなく、より作業をスムースに行えるような効果音または音声の再生方法を目指した。そして、拡張身体表現を有する遠隔協調作業システムの利点と限界を明らかにした。また、これまでの成果を整理し、前年度までと比べ対外的な発表を多く行った。本研究では、身振りや手振り自体の身体表現を拡張する基本概念を導入することで、通常の人間以上の表現力を持つ遠隔協調作業の提案と実現を目指す。まず、プロジェクタと深度センサや光学トラッカで構成された身体表現を抽出し拡張する指示者側システムを構築する。そして、この全身の身体表現を抽出し拡大縮小表現・各種VFXによって表現を拡張するシステムと、HMD+HMCで構成された現場の作業者が用いるシステムを接続し、ユーザビリティテストによる効果測定を実施する。次に、身体表現を抽出し拡張する指示者側システムを、センサルームの導入と高解像度HMDを用いて没入型へと発展させる。平成28年度の研究として、平成27年度で構築した上述の「仮想身体サイズによる対人距離の視覚的拡張」を実現したシステムを改良し、効果測定を行う。前年度までの拡大縮小表現に加え、VFXによる拡張表現でHMD内の人間の身体表現を強調したり、低速再現によってHMD内の人間を慎重に説明できたり、HMD内の人間の動作を高速再現したりする拡張表現を実装する。また、遠隔協調作業での応用に関しては、作業者に装着したHMCは作業者の移動や頭部運動によって映像に変化があるので、この映像上に拡張表現を施した指示者を安定して重畳表示するために、HMC映像安定化システムも開発する予定である。具体的には、HMCの映像からマーカベースのオプティカルトラッキングを行い、ある程度の頭部運動であれば、HMD上に指示者の姿を安定して出現させられると考えている。このような様々な拡張身体表現を追加した場合のシステムの有効性を確かめ改良を行うために、ユーザビリティテストによる効果測定を実施する。前年度までに開発された身体表現を抽出し拡張する指示者側のシステムに、高解像度HMDを導入し、没入型へと発展させる。没入型にすることで、作業空間をある程度自由に動き回りながら指示者はHMDに映しだされた作業現場をマクロ(鳥瞰的)な視点や又はミクロな視点で閲覧し指示を行える。また、CABIN型センサルームの導入により、指示者の高精度な全身のモーションキャプチャが行えるため、複雑な形状の物体に対しても立体的な指示者による三次元的な指示が行えると考えている。平成29年度では、前年度で未実装であった、VFXによる拡張身体表現を実装する予定である。具体的には、平成28年度で実装した三次元空間を自由に移動可能な指示者没入型の拡張身体表現を有する遠隔協調作業システムの評価を行うために、ユーザビリティテストを行う。また、拡張身体表現を導入した遠隔協調作業で、人間の認知にどの程度の影響を与えたかの調査も加えて行う。
初代培養ラット肝細胞を用いた天然由来抗酸化物質の多面的機能性の評価に関する研究

化学発光法を用いた抗酸化活性測定法により各種生薬などのスクリーニングを行った。本化学発光法はキサンチン-キサンチンオキシダーゼ系にて生成するsuperoxide anion(O_2^-)をMPEC(発光試薬)にて捕捉し、その時の発光子を計測し評価する方法であり、従って、計測された光子数が少ないほど被験物質の抗酸化力が強いといえる。従来、catechin類、クロロゲン酸などは強い抗酸化活性を持っているとされ、今回はpositive controlとしてepigallocatechinを指標に比較検討を行った。まず抗酸化作用があるとされる生薬について検討した。その中でも比較的活性の強いものも見受けられたが、簡単な分画を行った場合、脂溶性の高いfractionにO_2^-の発生が認められるようなものも見受けられた。そこでgingerol類について測定を行うと明らかなO_2^-の発生が考えられ、化合物によってはpro-oxidantにもなりうることが示唆された。また、諸培養細胞を用い、活性酸素種を用い炎症を惹起する実験系の検討を行った。一定濃度に調整した天然化合物を培地に添加した状態で24hr培養した。その後、培地を交換するのと同時に0.1%H_2O_2になるように調整した培地を加え40min間、細胞を培養した。その後細胞へ傷害度を測定し保護作用を評価、プレート上に残った細胞はトリプシンを用い剥がし、comet assayを行う。現時点でH_2O_2を用いて酸化傷害を起こさせているが、効果の評価系に酸化還元反応を用いているので残存のH_2O_2の影響や測定する天然化合物自体の影響があり、評価系も再検討すべきと思われた。本研究の初年度であり、化学発光法を用いた抗酸化活性測定法を確立した。本化学発光法はキサンチン-キサンチンオキシダーゼ系にて生成するsuperoxide anion (O_2^-)をMPEC(発光試薬)にて捕捉し、その時の発光子を計測することにより、従って、計測された光子数が少ないほど被験物質の抗酸化力が強いといえる。またその中でも比較的活性の強いものも見受けられたが、生薬エキスと単一化合物では、エキス中に含有される化合物の割合が様々なので一概にはいえない。実際に活性物質を分離精製するまでの指標にしかできず、このことは今後の検討課題である。また、初代培養ラット肝細胞を用い、活性酸素種を用い炎症を惹起する実験系の検討を行った。一定濃度に調整した天然化合物(今回はcatechinを用いた)を培地に添加した状態で24hr培養した。その後、培地を交換するのと同時に0,1%H_2O_2をになるように調整した培地を加え40min間、細胞を培養した。現時点でH_2O_2を用いて酸化傷害を起こさせているが、効能の評価系に酸化還元反応を用いているので残存のH_2O_2の影響が捨て切れず、評価系にも今後検討の余地が残った。また、comet assayを最終的な評価基準にし、その特性を最大限に利用することを考慮し、Hep G2などのヒト由来の細胞の利用も検討していく予定である。
乳歯の再生医療への応用を開拓する発生および細胞工学的研究

乳歯の歯槽骨内移植法に伴うタンパク質の発現変化の同定、タンパク質の発現変化に関連した遺伝子群の同定、乳歯硬組織の骨形成誘導能の同定などを目的とした。そこで乳歯歯髄細胞の培養法の確立とその長期保存の検討の為に、実験動物としてマウスを利用した基礎的研究を行ない、次のような新しい研究成果を得ることができた。1.歯の硬組織などの吸収や形成に深い関わりのある転写因子のひとつであるRunx2/Cbfa1に着目した。Runx2/Cbfa1ノックアウトマウスでは、骨の形成不全と歯の発育の休止が認められる。2.その分子機序の解明のため、人工培養中のマウス歯胚にRunx2/Cbfa1アンチセンスオリゴを投与した実験を行ったところ、胎生11日齢マウス歯胚では蕾状期までは発育できたが、その後の発育は休止した。3.また一方胎生15日齢マウス歯胚の人工培養実験では、類骨様細胞がエナメル芽細胞や象牙芽細胞へ分化することを抑制した。4.RT-PCR法による解析の結果、デンチンマトリックスタンパク1型、デンチンシアロリン酸タンパク、アメロゲニン、アメロブラスチンなどの遺伝子発現が著しく抑制を受けていた。対照群であるRunx2/Cbfa1アンチセンスオリゴセンスオリゴを投与した胎生15日齢マウス歯胚の人工培養実験では、これらの遺伝子発現の抑制は一切認められなかった。これらの結果より、Runx2/Cbfa1は胎児期マウス歯胚の形成と発育に必須であることが確認された。これらの成果に基づき、現在も神経増殖因子のひとつであるNGFに着目し、細胞系と器官培養系を活用して、歯の形成における機能解析を行なっている。その研究成果も発表予定である。研究の目的は、乳歯の歯槽骨内移植法に伴うタンパク質の発現変化の同定、タンパク質の発現変化に関連した遺伝子群の同定、乳歯硬組織の骨形成誘導能の同定などにある。そこで本年度は、乳歯歯髄細胞の培養法の確立とその長期保存の検討の為に、実験動物としてマウスを利用した基礎的研究を先ず行ない、次のような新しい研究成果を得ることができた。先ず、歯の硬組織などの吸収や形成に深い関わりのある転写因子のひとつであるRunx2/Cbfa1に着目した。そこでその分子機序の解明のため、人工培養中のマウス歯胚にRunx2/Cbfa1アンチセンスオリゴを投与した実験を行ったところ、胎生11日齢マウス歯胚では蕾状期までは発育できたら、その後の発育は休止した。また一方胎生15日齢マウス歯胚の人工培養実験では、類骨様細胞がエナメル芽細胞や象牙芽細胞へ分化することを抑制した。RT-PCR法による解析の結果、デンチンマトリックスタンパク1型、デンチンシアロリン酸タンパク、アメロゲニン、アメロブラスチンなどの遺伝子発現が著しく抑制を受けていた。これからは、上記の実験技術を応用しながら、歯胚の無血清器官培養法の確立、増殖因子添加処理した歯胚の歯槽骨内移植法の確立あるいは歯胚の長期保存法の確立などの取り組んでいく予定である。