hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
新卒看護師の職場適応度と離職願望の関係:就職後 1 年間を通して

●新卒看護師が自己評価する看護実践能力得点と彼・彼女らが職場で求められていると感じている看護実践能力得点の差は、彼・彼女らの離職願望得点と正の相関関係を示した(ただし,卒後9・12ヶ月調査のみ).しかし,新卒看護師の看護実践能力,彼・彼女らが職場で求められていると感じている看護実践能力,及び離職意思得点との関係を個別にみると、新卒看護師の看護実践能力だけが,彼・彼女らの離職意思に貢献している事が判明した。目的:本研究の目的は,新卒看護師が自己の能力水準(能力)と職場で要求されていると感じる能力(要求),そして業務に関連する自己の欲求と職場環境から与えられる供給(自己の欲求を実現できる機会)を3ヵ月ごとに調査し,新卒看護師が認知する要求-能力間及び供給-欲求間の適合・不適合の経時的変化を検証することであった。更に,本研究の目的は,上記不適合に対する認識が,新卒看護師の離職意思にどのような影響を与えうるかを調査することであった。方法:研究対象者は,2011年3月に看護師養成学校を卒業し,中国地方の5病院に入職した新卒看護師279名とした。データ収集には自記式質問紙調査方法を用い,入職(2011年4月)3,6,9,12ヵ月目に質問紙を送付した。データ分析には,重回帰分析を用いた。結果:合計で176名の新卒看護師が,1回以上調査に参加し,62名の新卒看護師は4回全ての調査に参加した。分析の結果,新卒看護師は,要求-能力間不適合を認知している事が明らかになった。しかし,新卒看護師の看護実践能力自己評価は,勤務期間が長くなるにつれ改善し,入職1年目の終わりには,不適合度も縮小した。また,新卒看護師は,供給-欲求間の不適合も認知していたが,この不適合は縮小されなかった。更に,新卒看護師の離職意思には,彼・彼女らの看護実践能力自己評価と,職場環境評価が関連していることが確認された。そして入職39ヵ月目は,新卒看護師の職場環境評価が,入職12ヵ月目には看護実践能力自己評価が彼・彼女らの離職意思に大きな影響を与えていたことが明らかになった。考察:新卒看護師の離職意思を軽減するためには,新卒看護師の実践能力を高め,彼・彼女らの看護実践不安を軽減できるようなプログラムの導入が必要である。また,彼・彼女らの学習が促進されるような支持的な職場環境を提供することも,新卒看護師の離職防止には必要である。計画通りに研究が進んでいるため,上記の判断とした.24年度が最終年度であるため、記入しない。今年度は,前年度に得た縦断研究結果を,研究目的に沿ってより詳細に分析する.そして,研究結果を基に,新卒看護師の職場適応及び離職頚眼を図るための方法を考察する.データ収集ほすでに終了しているため,研究計画の変更や,遂行上の問題点が発生する危険はないと考えられる。24年度が最終年度であるため、記入しない。
超高圧電子顕微鏡のオーラルヒストリ―を活用した科学技術史

戦後日本で電子顕微鏡とりわけ超高圧電子顕微鏡の開発が成功したのは、日本における電子顕微鏡学の発展と密接に関連している。また、基礎科学の研究手段としての電子顕微鏡の普及には当時の文部省が大きな支援を行ない、産学官連携の成功例でもある。超高圧電子顕微鏡開発をそれに関わったメーカー、ユーザー、パトロンの関係者に聞き取り調査を行うとともに、超高圧電子顕微鏡の開発と電子顕微鏡学の発展を関連づけて考察して、超高圧電子顕微鏡法の科学技術史を記述したい。
発光性3d金属錯体の開拓

d金属錯体は多くの場合発光性を示さないが、金属錯体が発光材料として注目されている今、貴金属を中心とする4d,5d金属錯体でない3d金属錯体の発光性を開拓していくことは、わが国の元素戦略の観点からも重要な意義がある。3d金属錯体の中で、近年、発光性について活発な研究が展開されている銅(I)錯体、および、クロム(III)錯体について、昨年に引き続き発光性の探求を行った。1.シクロメタレート型クロム(III)錯体の構造と電子状態の解明.配位子場が強く、励起状態でも安定な系の構築を目指し、昨年合成した[Cr(ppy)3](Hppy=2-フェニルピリジン)の類縁体である新規錯体,[Cr(ptpy)3](Hptpy=2-(p-トリル)ピリジン)の合成に成功した。結晶構造を明らかにするとともに分光学的,電気化学的性質を調べた。これらの錯体は常温で発光性を示さず、原因となる無輻射失活を抑制するためには、より剛直な系の構築が必要であることが示唆された。2.d^<10>系錯体における強発光性の導出と制御.昨年、ハロゲン架橋Cu(I)複核錯体から強発光性の4核クラスターが生成することを見出したので、発光特性および構造変換機構について調べた。この4核クラスターは温度により発光色が変わり、77Kでは2つの発光状態から二重発光が起こることが見出された。本研究では、一般には光らない3d金属錯体の発光性を開拓しようという萌芽的研究に挑戦している。金属錯体が発光材料として注目されている今、貴金属を中心とする4d,5d金属錯体でない3d金属錯体の発光性をもっと開拓していくことは、わが国の元素戦略の観点からも重要な意義がある。3d金属錯体の中で、近年、発光性について活発な研究が展開されている銅(I)錯体に加えて、新たな発光性3d金属錯体の構築を目的とする。この目的のため、まず、3d系列の金属イオンのうち、最低励起状態となるdd励起状態が配位子場分裂に関わってこないクロム(III)錯体系の発光性の制御と高発光化について検討した。本年度は、配位子場が強く、励起状態での解離や構造のひずみが起こりにくい構造のクロム(III)錯体の候補として、2-フェニルピリジンを配位子とするシクロメタレート型キレート配位子について検討した。トリスキレート型錯体を合成し、黄色の固体を単離した。現在、異性体の分離や精製が進行中である。また、芳香族ヒドラゾン類を配位子とする新規銅(I)錯体の合成も行った。この錯体は一価の酸化状態を与え、X線構造解析によりひずんだ三方両錐構造をとっていることが見出された。発光性については今度検討を行う。d金属錯体は多くの場合発光性を示さないが、金属錯体が発光材料として注目されている今、貴金属を中心とする4d,5d金属錯体でない3d金属錯体の発光性をもっと開拓していくことは、わが国の元素戦略の観点からも重要な意義がある。3d金属錯体の中で、近年、発光性について活発な研究が展開されている銅(I)錯体に加えて、新たな発光性3d金属錯体の構築を目的として、以下の研究を推進した。1.新規発光性クロム(III)錯体の構築.配位子場が強く、励起状態でも安定なクロム錯体の構築を目指し、2-フェニルピリジンおよびその類縁体を用いて、シクロメタレート型クロム(III)錯体の合成を行った.単結晶X線構造解析によりそれらの構造解明に成功した.また、分光学的な性質を調べたが、いずれも発光性を示さなかった。非対称的な構造に無輻射失活の要因があると考えられ、今後その要因の解明と新規系の構築を行う。2.d^<10>およびd^8電子系金属錯体(ニッケル(II)錯体、コバルト(I)錯体)の発光性探索.昨年度、π共役系置換基をもつヒドラゾン配位子を用いて銅(I)錯体の合成をした。これらの錯体は、発光性は示さなかったが、単結晶X線構造解析により、配位子の炭素-炭素結合形成を伴うクラスター化が起こることが見出された。一方、ハロゲン架橋Cu(I)複核錯体から強発光性の4核クラスターが生成することを見出し、構造や発光特性を明らかにした。

これらの錯体は常温で発光性を示さず、原因となる無輻射失活を抑制するためには、より剛直な系の構築が必要であることが示唆された。2.d^<10>系錯体における強発光性の導出と制御.昨年、ハロゲン架橋Cu(I)複核錯体から強発光性の4核クラスターが生成することを見出したので、発光特性および構造変換機構について調べた。この4核クラスターは温度により発光色が変わり、77Kでは2つの発光状態から二重発光が起こることが見出された。
海馬CA3錐体細胞におけるNMDA受容体の選択的分布のメカニズムの解明

海馬CA3錐体細胞は層別こ異なる興奮性入力を受けており、多くの入力線維シナプス下膜においてAMPA受容体とNMDA受容体が共在しているが、苔状線維(mossy fiber:MF)シナプス下膜ではNMDA受容体の発現を欠く。本研究では、MFシナプス下膜におけるNMDA受容体の排除機構およびNMDA受容体発現がシナプス下膜へのAMPA受容体発現・移行様式に与える影響を明らかにするため、海馬CA3錐体細胞にNMDA受容体、AMPA受容体を強制発現させ、MFシナプス下膜にNMDA受容体を集積させるための条件をAMPA受容体の集積様式と共に検討した。まず、NMDA受容体のシナプス下膜への集積機構を検討するために、NMDAR2B(NR2B)サブユニットおよびgreen fluorescent protein(GFP)を同時に発現させる組換えシンドビスウィルス(SIN)、SIN-EG-NR2Bを作製した。SIN-EG-NR2Bにより導入されたNR2Bサブユニットの受容体形成能を確認するため、ラット小脳にSINをin vivo注入し、NR2群を欠き、NR1のみ豊富に発現する成熟プルキンエ細胞に感染させると、GEP蛍光を発するプルキンエ細胞からNMDA受容体発現を示す電流応答が得られた。また、プルキンエ細胞への主要な興奮性入力である登上線維シナプスおよび平行線維シナプスにおける興奮性シナプス後電流においてもNMDA受容体成分が観察された。このことから、成熟プルキンエ細胞に発現する内在性NR1は、外来性NR2Bと共に機能的NMDA受容体を形成し得る能力を備えていることが示された(Eur.J.Neurosci,2003,17,887)。次に、NMDA受容体発現がシナプス下膜へのAMPA受容体発現・移行様式に与える影響を、NMDA受容体をシナプス下膜に豊富に発現させる連合線維(association fiber;AF)とMF間で比較した。SINにより未編集型GluR2をCA3鋒体細胞に発現させると、未編集型GluR2から成るAMPA受容体はAFおよびMF両シナプス下膜ともに神経活動非依存的に移行することが電気生理学的に示された。また、GluR1をSINによりCA3錐体細胞へ強制発現させると、GluR1から成るAMPA受容体は、AFシナプス下膜へNMDAA受容体およびCaMKII活動に依存して移行されたが、MFシナプス下膜へは神経活動依存的なGluR1受容体の移行は見られなかった。このことから、CA3錐体細胞シナプスヘのAMPA受容体の移行様式には、入力特異性およびサブユニット特異性があり、NMDA受容体のシナプス発現の有無が、特異性を規定している可能性が示唆された。海馬CA3錐体細胞は層別に異なる興奮性入力を受けており、多くの入力線維シナプス下膜においてAMPA受容体とNMDA受容体が共在しているが、苔状線維(mossy fiber, MF)シナプス下膜ではNMDA受容体の発現を欠く。本研究では、MFシナプス下膜におけるNMDA受容体の排除機構を解明するため、海馬CA3錐体細胞にNMDA受容体を強制発現させ、MFシナプス下膜にNMDA受容体を集積させるための条件をAMPA受容体の集積様式と共に検討した。まず、MFシナプス下膜におけるAMPA受容体の集積様式を観察するため、感染細胞において未編集型GluR2(GluR2Q)を発現させる組換えシンドビスウィルス(SIN)を作製した。組換えSINにより導入された外来性GluR2Qから成るCa^<2+>透過性AMPA受容体は、培養海馬スライスにおいてMFシナプス下膜に移行し、シナプス伝達に関与し得ることが免疫組織化学および電気生理学的実験により示された。また、新規Ca^<2+>透過性AMPA受容体を介したMFシナプス後部へのCa^<2+>流入は、MFLTP誘発に影響を与えないことが明らかになった(J.Neurosci.2002,22,4312)。次に、NMDA受容体の集積機構を検討するために、NR2BおよびGFP (green fluorescent protein)を同時に発現させる組換えSIN、SIN-EG-NR2Bを作製した。SIN-EG-NR2Bにより導入されたNR2Bサブユニットの受容体形成能を確認するため、ラット小脳にSINをin vivo注入し、NR2群を欠き、NR1のみ豊富に発現する成熟プルキンエ細胞に感染させると、GFP蛍光を発するプルキンエ細胞からNMDA受容体発現を示す電流応答が得られた。このことから、成熟プルキンエ細胞に発現する内在性NR1は、外来性NR2Bと共に機能的NMDA受容体を形成し得る能力を備えていることが示された(Eur.J.Neurosci.,2003,17,887)。

本研究では、MFシナプス下膜におけるNMDA受容体の排除機構およびNMDA受容体発現がシナプス下膜へのAMPA受容体発現・移行様式に与える影響を明らかにするため、海馬CA3錐体細胞にNMDA受容体、AMPA受容体を強制発現させ、MFシナプス下膜にNMDA受容体を集積させるための条件をAMPA受容体の集積様式と共に検討した。まず、NMDA受容体のシナプス下膜への集積機構を検討するために、NMDAR2B(NR2B)サブユニットおよびgreen fluorescent protein(GFP)を同時に発現させる組換えシンドビスウィルス(SIN)、SIN-EG-NR2Bを作製した。SIN-EG-NR2Bにより導入されたNR2Bサブユニットの受容体形成能を確認するため、ラット小脳にSINをin vivo注入し、NR2群を欠き、NR1のみ豊富に発現する成熟プルキンエ細胞に感染させると、GEP蛍光を発するプルキンエ細胞からNMDA受容体発現を示す電流応答が得られた。また、プルキンエ細胞への主要な興奮性入力である登上線維シナプスおよび平行線維シナプスにおける興奮性シナプス後電流においてもNMDA受容体成分が観察された。このことから、成熟プルキンエ細胞に発現する内在性NR1は、外来性NR2Bと共に機能的NMDA受容体を形成し得る能力を備えていることが示された(Eur.J.Neurosci,2003,17,887)。次に、NMDA受容体発現がシナプス下膜へのAMPA受容体発現・移行様式に与える影響を、NMDA受容体をシナプス下膜に豊富に発現させる連合線維(association fiber;AF)とMF間で比較した。SINにより未編集型GluR2をCA3鋒体細胞に発現させると、未編集型GluR2から成るAMPA受容体はAFおよびMF両シナプス下膜ともに神経活動非依存的に移行することが電気生理学的に示された。また、GluR1をSINによりCA3錐体細胞へ強制発現させると、GluR1から成るAMPA受容体は、AFシナプス下膜へNMDAA受容体およびCaMKII活動に依存して移行されたが、MFシナプス下膜へは神経活動依存的なGluR1受容体の移行は見られなかった。このことから、CA3錐体細胞シナプスヘのAMPA受容体の移行様式には、入力特異性およびサブユニット特異性があり、NMDA受容体のシナプス発現の有無が、特異性を規定している可能性が示唆された。
脂肪組織由来分泌タンパク質による肝マクロファージ機能制御とNASH病態への関与

非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)は単純性脂肪肝と異なり高度な炎症と線維化を特徴とし、肝がん発症の重大なリスクとされている。NASH患者の約90%以上が内臓脂肪型の肥満であり、過剰の内臓脂肪蓄積はNASHの増悪因子の一つとして知られる。肥満脂肪組織由来の何らかの因子がNASH病態に関与すると考えられるが、詳細は明らかでない。本研究では脂肪組織由来の分泌因子MFG-E8(Milk Fat Grobule EGF8)とNASH病態との関連を明らかにすることを目的とする。MFG-E8とNASHとの関連を検討するため、生後48時間後のストレプトゾトシン投与および高脂肪食負荷を組み合わせて作製するNASH-STAMモデルマウスを実験に供した。NASH-STAMマウスでの各組織MFG-E8のmRNA発現を解析したところ、脂肪組織で特に高発現であり血中のMFG-E8濃度が顕著に増加していた。MFG-E8とNASH病態との関連を検討するため、MFG-E8欠損マウスを用いてSTAM-NASHモデルを作製し、肝臓病理評価及び遺伝子発現解析を実施した。肝臓病理評価の一つであるNAS(NAFLD activity score)による評価を行ったところ、MFG-E8欠損マウスでは肝脂肪蓄積の程度に変化ないものの炎症状態及び風船様変性(Balooning)が改善していた。さらに肝組織線維化の程度についてSirius Red染色を実施し染色面積の定量を行ったところ、MFG-E8欠損マウスでは線維化面積の縮小が観察することができた。定量的リアルタイムPCRによる遺伝子発現解析の結果、MFG-E8欠損マウスでは肝臓におけるTNFαやIL6などの炎症性サイトカインやコラーゲンタイプIなどの遺伝子発現が低下していた。おおむね当初の予定通りの実験・解析を実施することができた。STAM-NASHモデルMFG-E8欠損マウスの肝組織遺伝子発現変化、HEおよびSiriusRed染色による組織学的評価、血液生化学的検査などの解析は予定通り完了している。免疫組織染色についてTUNEL染色法による死細胞の検出、マクロファージ抗原F4/80によるマクロファージの肝組織への浸潤・局在の変化等を解析を実施した。血中のMFG-E8タンパク質について、感度・特異性の観点から濃度測定方法の確立に時間を要したが現在では超遠沈とウェスタンブロットによる解析方法を採用し問題なく測定可能である。また現在、当初2019年度実施予定であったNASHによる肝細胞癌発症とMFG-E8との関連について解析検討中である。2019年度においてはMFG-E8によるNASH発症への分子機構について解明を進める。肝細胞やマクロファージ機能に対するMFG-E8タンパク質の影響について培養細胞実験にて検討する。肝細胞癌発症に対するMFG-E8の作用について、現在の解析をさらに進めるとともに中和抗体またはMFG-E8抑制機能を有するドミナントネガティブ変異MFG-E8タンパク質のマウスへの投与実験により、治療標的としての可能性を探る。以上までの研究成果を総合的にまとめ、国内外における成果発表を行う予定である。

2019年度においてはMFG-E8によるNASH発症への分子機構について解明を進める。肝細胞やマクロファージ機能に対するMFG-E8タンパク質の影響について培養細胞実験にて検討する。肝細胞癌発症に対するMFG-E8の作用について、現在の解析をさらに進めるとともに中和抗体またはMFG-E8抑制機能を有するドミナントネガティブ変異MFG-E8タンパク質のマウスへの投与実験により、治療標的としての可能性を探る。以上までの研究成果を総合的にまとめ、国内外における成果発表を行う予定である。2019年度、MFG-E8と肝がん発症および長期予後に対する影響を継続して検討する予定であるが、これまでの途中経過からマウスの個体差によるばらつきが予想より大きく当初の予定より多くの個体を用いて詳細に解析する必要があると考えられたため。次年度使用額のうち100,000円は解析に必要な遺伝子発現解析関連試薬(Sybr green,逆転写キット等:消耗品)を購入予定とし、50,000円はMFG-E8中和抗体(または変異タンパク質:消耗品)、残りをメタボローム解析関連試薬(消耗品)の購入費用とする。
光ミキシングによるミリ波帯信号発生

超高速半導体デバイス(マイクロ波トランジスタ)の,ミリ波帯における光ミキシング特性の解明を目標として研究を進めた.HEMTなどの超高速3端子電子デバイスに光を照射した場合の伝達特性変化,すなわち,マイクロ波/ミリ波信号だけでなく光波信号を同時に入力とする場合の,電子デバイスの応答特性を解明し,これをマイクロ波/ミリ波と光波との相互作用デバイスとして活用するための新しい道を切り開こうとするものである.[1]マイクロ波/ミリ波によって強度および位相変調された光波,[2]異なる2波長(周波数)成分の混合光波,さらには[3]ピコ秒/フェムト秒の超短パルス光波など,様々な光波信号が考えられる.当初計画に沿って実験ならびに理論研究を遂行した.マイクロ波MOSFETおよびHEMTを使用して,まず,半導体増幅回路を構成し,静特性測定およびネットワークアナライザによるマイクロ波/ミリ波特性測定を行った.次に,この回路に[1]強度変調光,および[2]ピコ秒パルス光信号を照射し,応答特性を測定した.これらによって,ピコ秒光パルスに含まれるミリ波帯信号の検出を試みた.また,光波長を可変として,時間応答特性の変化を調べた.以上の実験から,光照射による出力増大,高速応答性などが確かめられ,本研究の方向の妥当性が確かめられた.ただし,残念ながらナノ秒以下の超高速応答を定量的に測定するには至らなかった.当初計画していた,マイクロ波回路設計ツール(CAD)が使用(借用)できず,今回の実験では電気回路設計が十分行えなかった結果,デバイスの電気的特性を十分に活用されていない.しかし,今後研究を進めるに当たって押さえるべきポイントが明らかになり,また,条件によっては光照射によって出力が減少する場合が見つかるなど,腰を据えて今後さらに本研究を発展させる上での貴重な知見が得られた.さらなる研究の継続,展開が強く望まれる.超高速半導体デバイス(マイクロ波トランジスタ)の,ミリ波帯における光ミキシング特性の解明を目標として研究を進めた.HEMTなどの超高速3端子電子デバイスに光を照射した場合の伝達特性変化,すなわち,マイクロ波/ミリ波信号だけでなく光波信号を同時に入力とする場合の,電子デバイスの応答特性を解明し,これをマイクロ波/ミリ波と光波との相互作用デバイスとして活用するための新しい道を切り開こうとするものである.[1]マイクロ波/ミリ波によって強度および位相変調された光波,[2]異なる2波長(周波数)成分の混合光波,さらには[3]ピコ秒/フェムト秒の超短パルス光波など,様々な光波信号が考えられる.当初計画に沿って実験ならびに理論研究を遂行した.マイクロ波MOSFETおよびHEMTを使用して,まず,半導体増幅回路を構成し,静特性測定およびネットワークアナライザによるマイクロ波/ミリ波特性測定を行った.次に,この回路に[1]強度変調光,および[2]ピコ秒パルス光信号を照射し,応答特性を測定した.これらによって,ピコ秒光パルスに含まれるミリ波帯信号の検出を試みた.また,光波長を可変として,時間応答特性の変化を調べた.以上の実験から,光照射による出力増大,高速応答性などが確かめられ,本研究の方向の妥当性が確かめられた.ただし,残念ながらナノ秒以下の超高速応答を定量的に測定するには至らなかった.当初計画していた,マイクロ波回路設計ツール(CAD)が使用(借用)できず,今回の実験では電気回路設計が十分行えなかった結果,デバイスの電気的特性を十分に活用されていない.しかし,今後研究を進めるに当たって押さえるべきポイントが明らかになり,また,条件によっては光照射によって出力が減少する場合が見つかるなど,腰を据えて今後さらに本研究を発展させる上での貴重な知見が得られた.さらなる研究の継続,展開が強く望まれる.
天然基質を用いた蛋白質チロシンキナーゼの活性測定法の開発

従来蛋白質チロシンキナーゼの活性測定には基質としてセリン及びトレオニンを含まないチロシンを含んだぺプチド又はグルタミン酸とチロシンのペプチド重合体が用いられて来たが、チロシンキナーゼの生理的意義及びその活性調節機構の解明には天然基質を用いたこの酵素の活性測定法の開発の必要性を感じチュブリンを用いた活性測定法を開発した。1.基質の調製;ウシ全脳よりチュブリンを抽出し、硫安分画,DEAE-Sephadex,ゲル濾過、【Mg^(2+)】とGTPによる重合,遠沈,透析により可溶化した。混入するセリン、トレオニンプロテインキナーゼは60°C,2分の緩和な熱処理で失活させた。2.チュブリンのチロシン残基のリン酸化の測定;ATP-γ-【^(32)P】と粗酵素標品によりチュブリンのセリン,トレオニン,チロシンのいづれもがリン酸化される場合は反応をSDS,2-メルカプトエタノールを含む緩衝液を加え加熱して止め、反応液をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて、リン酸化されたチュブリンを他の成分から分離した。染色したチュブリンバンドを切り取り、セレンコフ効果によりチュブリンに取り込まれた【^(32)P】を測定し、総リン酸量を算出した。次にこのゲルをアルカリで加熱し、遊離する【^(32)Pi】をリンモリブデン酸とし、イソブタノール-ベンゼン層に抽出し計測した。このアルカリ処理の条件設定はセリンのみがリン酸化されたチュブリンとチロシンだけがリン酸化されたチュブリンを用いて行った。アルカリ処理はセリン、トレオニンに結合したリン酸の方がチロシンに結合したリン酸より不安定である性質を利用したものでチロシンのリン酸の分別定量に用いた。純化された酵素でチロシンのみがリン酸化される場合はトリクロロ酢酸で皮応を止めリン酸化されたチュブリンを濾紙にスポットするか、グラスフィルターでこして【^(32)P】を測定する方法を確立した。
放射光を用いたヒトノイラミニダーゼの細胞内結晶構造解析

本研究は、糖鎖分解酵素ヒトノイラミニダーゼ1(NEU1)の分子構造を決定することによって、その変異が、なぜNEU1のノイラミニダーゼ活性を減少させ、リソソーム病を引き起こすのかを解明することを目的としている。本研究期間では、NEU1細胞内結晶を抽出するための従来の手法を大きく改善させ、NEU1細胞内結晶からX線回折データの収集に成功した。また、抽出した結晶を一度溶解させ、精製することで、良質なタンパク質を調製することにも成功した。以上の成果は、今後のNEU1の再結晶化と構造決定に繋がる進展のみならず、他の細胞内結晶化蛋白質にも応用することが可能なものである。本研究は、糖鎖分解酵素ヒトノイラミニダーゼ1(NEU1)の分子構造を決定することによって、特定疾患難病のリソソーム病であるガラクトシアリドーシス(GSD)およびシアリドーシス(SD)を引き起こす変異がなぜNEU1のノイラミニダーゼ活性を減少させるのか、その原因を解明することを目的としている。その目的の実現のために、本研究では、NEU1蛋白質が細胞内で結晶化するという極めて特徴的な性質を利用し、NEU1細胞内結晶から、放射光を用いてNEU1分子の構造を決定する計画である。もしくは、細胞内結晶を一度抽出し、溶解した後、再度試験管内で結晶化し(再結晶化し)構造決定する計画である。本研究はNEU1の構造解析と難病GSD・SDの治療法の確立という点で医学的、学術的に重要であるのみならず、細胞内結晶から構造を決定できる包括的なシステムの構築を目指しており、構造生命科学・創薬の点において画期的なブレイクスルーとなることが期待される。本年度の実施計画は、NEU1細胞内結晶を大量に抽出するための手法を確立し、細胞内結晶から直接データ収集を行う計画であり、本研究者はその計画通り、その手法を確立し、データ収集に成功した。得られたデータは結晶構造解析が可能であったが、細胞内結晶から直接NEU1の分子構造を解明することは困難であることが明らかとなった。本点は、本計画の当初に予想された懸念される点であったため、予備の研究計画を遂行した。予備の研究計画では、NEU1細胞内結晶を大量に調製し、一度抽出し溶解した後、蛋白質を精製し、試験管内で再度結晶化する計画であり、当初の計画以上に大量の細胞内結晶を調製する手法を確立し、高純度の蛋白質溶液を調製することに成功した。当初の研究計画では、本年度では、NEU1の細胞内結晶の大量抽出の手法を確立し、それを用いて抽出したNEU1の結晶からX線データの収集を行う計画であった。まず、抽出法の確立については、計画通り、10 cm dish 2枚で行っていた予備実験からスケールアップし、計画していた1.5×10の7乗個を上回る2.0×10の7乗個のNEU1細胞内結晶の抽出と調製に成功した。また、培養方法を接着培養から、懸濁培養に変更することで、より大量の細胞内結晶を定期的に得ることができるように手法を改良することに成功した。X線データの収集を行う計画については、計画通り、上述のように調製した、NEU1細胞内結晶を用いて、X線回折実験を行ったところ、NEU1細胞内結晶の結晶構造を解析するに十分なデータを収集することに成功した。そのデータからNEU1の分子構造を決定することは困難であることが明らかとなったが、予備の計画を遂行し、NEU1蛋白質の再結晶化に取り組んだ。上述の改良した手法を用いることによって、一回当りのNEU1蛋白質の収量は、計画していた0.3 mgを上回る0.5 mgを得られるようになり、再結晶化の条件の網羅的な探索を実施した。当初の計画では、平成28年度内に再結晶化結晶を作成し、データ収集を行う計画であったが、再結晶化結晶の作成には至らなかった。本研究は、糖鎖分解酵素ヒトノイラミニダーゼ1(NEU1)の分子構造を決定することによって、特定疾患難病のリソソーム病であるガラクトシアリドーシスおよびシアリドーシスを引き起こす変異が、なぜNEU1のノイラミニダーゼ活性を減少させるのか、その原因を解明することを目的としている。本研究はNEU1の構造解析と難病ガラクトシアリドーシスおよびシアリドーシスの治療法の確立という点で医学的、学術的に重要であるのみならず、細胞内結晶から構造を決定できる包括的なシステムの構築を目指しており、構造生命科学・創薬の点において画期的なブレイクスルーとなることが期待される。本年度の実施計画は、前年度に構築した手法を用いて、NEU1細胞内結晶を大量に抽出し、抽出した結晶を一度溶解させ、ゲル濾過カラムクロマトグラフィによって精製し、試験官内での結晶化を探索する計画であり、その計画に基づいて研究を遂行した。

また、一方で、前年度より引き続いて、NEU1細胞内結晶を調製する手法を改良し、前年度以上に大量かつ、高純度の蛋白質溶液を調製することに成功した。以上の成果は、今後のNEU1の再結晶化と構造決定に繋がる進展のみならず、他の細胞内結晶化蛋白質にも応用することが可能なものである。本研究は、糖鎖分解酵素ヒトノイラミニダーゼ1(NEU1)の分子構造を決定することによって、その変異が、なぜNEU1のノイラミニダーゼ活性を減少させ、リソソーム病を引き起こすのかを解明することを目的としている。本研究期間では、NEU1細胞内結晶を抽出するための従来の手法を大きく改善させ、NEU1細胞内結晶からX線回折データの収集に成功した。また、抽出した結晶を一度溶解させ、精製することで、良質なタンパク質を調製することにも成功した。当初の計画では、平成28年度内にNEU1の分子構造決定可能な細胞内結晶、もしくは、試験管内再結晶化結晶を調製しデータ収集を行う計画であったが、分子構造の決定には至らなかった。本年度内にNEU1の良質な結晶を作成し、分子構造を決定するためには、より多くの蛋白質溶液を調製し、結晶化条件の網羅的な探索の範囲を広げる必要がある。蛋白質の結晶化に重要な点は、結晶化に適した蛋白質発現系を構築することと、良質な蛋白質を調製することである。結晶化に適した蛋白質発現系を構築することは、蛋白質結晶化を試みる上での始めの段階であるが、その発現系が適切であるか否かは、最終的に結晶が析出するまで不明であり、通常多大な労力と時間を必要とする。しかしながら、本研究で用いているNEU1蛋白質は、すでに細胞内で結晶化しているため、用いている蛋白質発現系は結晶化に適したものであることが保証されている。また、良質な蛋白質を調製するにあたり、主にゲルろかカラムクロマトグラフィなどによって、品質を評価することが可能である。本年度、NEU1の細胞内結晶を抽出し、溶解した蛋白質溶液を精製後、ゲルろかカラムクロマトグラフィによって品質を評価したところ、単量体の単分散の性質であった。すなわち、結晶化に適した良質な試料であった。以上を踏まえ今後の推進方策をまとめると、平成28年度内に確立した手法を用いて、大量に細胞内結晶を調製し、蛋白質試料をより広範囲の結晶化条件探索に用いることで本年度内に良質な結晶が得られ、NEU1の分子構造の決定に至るものだと考える。構造生物学物品費について、形質導入試薬と結晶抽出用試薬を計上していたが、手法を改良することによって、削減されたため差額が生じた。国内出張費として、兵庫県佐用郡SPring-8への出張費を計上していたが、申請者の属するPhoton Factoryにて、ビームタイムを確保できたため、それが不要となり差額が生じた。本差額は次年度、推進方策に記載の通り、より多量の結晶の調製が必要となり、当初の計画以上に細胞培養用容器と細胞培養用培地が必要となるためそれらに用いる。
新しい酸化還元補酵素モデル化合物の合成とその機能性に関する研究

本研究は特異な構造を有する新規なNAD^+モデル化合物を構築し、その補酵素機能を追求することを目的として研究を行った。本年度中に得られた成果は以下の通りである。1新規なニコチン酸エステル合成法の開発。NAD^+モデル化合物の前駆体であるニコチン酸エステル誘導体の合成研究として、ビニルイミノホスホラン構造を有するホスホラニリデンアミノエナ-ルとアセチレン誘導体との反応による新規なピリジン環形成反応について検討した。ホスホラニリデンアミノエナ-ル誘導体の合成法としてアジリン誘導体とホスフィンの反応による新たなビニルイミノホスホラン合成法を開発した。これらのホスホラニリデンアミノエナ-ル誘導体と活性アセチレンとの反応により新たなピリジン環形成反応が進行し、種々のニコチン酸エステル誘導体を良好な収率で与えることを見いだした。2パラピリジノファン骨格を有するNAD^+モデル化合物の合成。補酵素の行う不斉還元反応のモデル化を効率的に行う上でパラピリジノファン構造を有する架橋ニコチン酸アミド誘導体が有用なモデル化合物であると考え、その合成法を検討した。合成法として前述のニコチン酸エステル合成法を応用した。ビニルイミノホスホラン構造を有する2-ホスオラニリデンアミノシクロドデセン-1-カルボキシアルデヒドと活性アセチレンとの反応を検討したところ期待したニコチン酸エステル誘導体を与える反応が進行し、新規なパラピリジノファン骨格を有する架橋ニコチン酸エステル誘導体が得られることを見出した。また、架橋ニコチン酸エステル誘導体からアミド化、N-アルキル化を経てパラピリジノファン骨格を有する新規な架橋NAD^+モデル化合物の合成を行った。今後はこれらの化合物を用いた不斉還元反応を行い、補酵素反応の有機化学的モデル化を検討する。
１個の接着蛋白質の特性から生み出される巨大スケールのバクテリア渦状運動

ほぼすべての微生物は運動する機能を持ち、生存のため適した環境に移動する手段として、その機能を巧みに用いている。バクテリアは、真核生物で知られている従来の分子モーターとは異なった多様な運動装置を有しており、生物学のみならず、それらの未知の動作原理は物理の視点からも注目すべき研究対象となっている。本課題では、分子レベルから集団レベルまでのマルチスケールにおいて多面的な研究を展開し、微生物の様々な新しい運動様式を発見し、詳細に解析した。1基板表面に可視光の波長より小さい金属のパターンを蒸着し、そこに全反射照明を行うことで、表面近傍に「異常光学透過(EOT)」という特徴的な電磁波の分布を作ることができる。EOTの分布は、AFMや電子顕微鏡で決定したパターンの構造と、詳細なシミュレーションを組み合わせることにより推定できる。この分布を参照パターン(kernel)とし、一定速度で運動する蛍光バクテリアからのシグナルをkernelで再構成することによって、滑走中のバクテリアMycoplasma mobile(M. mobile)の位置を3次元的に高精度で決定する新しい実験方法を提案した。2桿菌であるFlavobacterium johnsoniae(以下F. johnsoniae)もM. mobile同様、基板の上で滑走運動を行うが、その運動機構はまったく異なる仮説が提唱されている。細胞表面から突き出た接着タンパク質がらせん状に配置したレールの上を動き、この流れが細胞全体の一方向の運動を生み出すと考えている。本課題ではF. johnsoniaeが飢餓状態において、特徴的な渦運動を生み出すことを見出し、基本的なデータの収集を終えた。さらにこの機構を解明するため、渦の形成過程を長時間にわたり安定して記録するシステムの構築に成功した。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、バクテリアの集団の動きに着目する。当研究室では2013年に、寒天上に高濃度でスポットしたバクテリア(フラボバクテリウム・ジョンソニエ、Flavobacterium johnsoniae)が広がる際、バクテリアの集団が左向きの巨大な渦状(うずじょう)に回転しながら特徴的なパターンを形成することを見出した。個々のバクテリアは見かけ不規則な運動を行うにも関わらず、集団においては、ミリスケールの自己組織化を行うのである。そこで本研究課題では、バクテリアを材料とし、申請者のグループが見出した異方性のある回転渦運動の本質について徹底的に探究する。「渦の回転」のみならず、「1個体のバクテリアの運動」、さらには「1個の接着蛋白質の運動」について、最先端の光学顕微鏡技術で画像化・解析することによって、すべてのスケールにおける運動の特性を詳細に定量化し、集団における特徴的な運動が生み出されるメカニズムを明らかにすることを目的としている。これまでの研究実績としては以下の2点である。1ジョンソニエが再現性良く渦形成を行う条件の徹底的な検討。栄養素を含まない寒天培地上において、数百万匹のジョンソニエが不規則に広がる際、特定の条件下において、一見すると方向性を持たないランダムな動きが(接触面をバクテリア側から見て)反時計回りの集団回転運動へと転移する。寒天濃度・湿度・温度といった基本的なパラメータを網羅的に調べることによって、渦形成の再現性にもっとも影響する条件が、バクテリアが広がる際の環境温度、および安定した湿度であることが見いだされた。寒天乾燥時の条件は、渦形成の可否を決定的には決めず、むしろ1個の渦の最終的なサイズに影響する。2別の種のバクテリアであるMycoplasma mobileのゴーストの運動を詳細に解析し、科学史上初めて滑走バクテリアのステップ状運動を発見した。生物試料、特にバクテリアのようなシステムとして複雑な個体、さらには集団を対象とした研究課題においては、実験の再現性が研究そのものの質を決定すると言っても過言ではない。

初年度において、渦が再現する条件を徹底的に検討し、安定して結果が得られる段階まで研究が進んだことは予想外の進展である。当初の計画では、一匹の状態を観察した上で集団の振る舞いの最適条件を絞り込む予定であったが、そのプロセスが安定した温度の実現によりまとめてスキップできたことになる。今後は渦の評価、および個体・接着因子レベルでのメカニズム解明に集中できることになった。まだ未知のパラメータが渦形成の条件として見落とされているという可能性は完全には否定できないものの、バクテリアが広がる際の環境温度(わずか1°Cの温度差で渦が形成されなくなる)が重要であることが見いだされたことは、研究全体の進展を考えた上でたいへん意義深い。27年度が最終年度であるため、記入しない。本課題の核心である、渦状の運動の定量的な評価を試みる。現在までに、再現性良く渦を発生させる条件は見つかっているものの、渦のパターンは幾つかの中間的な状態に分類され、必ずしも一様ではない。基本的には左回転の渦が、右に転移したり、あるいはより大きな渦に吸収されるなど、さまざまな挙動を示す。振る舞いのカテゴリーを明確にしたうえでそれを記述できるパラメータを決定していく。同時に、渦の中に組み込まれている個々のバクテリアの運動も追跡し、集団行動の基本単位も決定していく。渦状のパターンは、バクテリアを寒天培地にスポットしたのち、24ー40時間で形成され始める。この後にも数時間、場合によっては数日の観察が必要なため、これだけの時間で安定して撮影できる顕微鏡システムを構築する必要がある。自動でフォーカスを調整する機能を有した、超安定性光学システムのノウハウは申請者のグループに蓄積されており、これを改良してジョンソニエの観察に特化した観察手法を改めて検討する。加えることのできる摂動としては、基板となる寒天培地の剛性(柔らかいものほど渦の直径が大きくなる)、変異体の菌体、栄養の有無などであるが、これまでの知見から、運動子および一匹一匹の挙動の特性は明らかになっているため、パラメータと摂動条件を対応させることは容易であると期待される。この点こそが、本課題の独自性かつ強みである。(2)シミュレーションによって渦の再現を行う。これまでのモデルでは運動する素子は一方向に動くため、方向そのものが可変であり方向転換が許されるという条件は含まれていなかった。ジョンソニエにおいては、この特性が従来のリニア分子モーターとはまったく異なるものであり、方向性の整流という新しい概念が加わった極めて興味深いモデルが構築できると期待できる。
TiO2の選択的格子振動励起の直接的観測および電子状態への影響の解明

本研究では、アンチストークスハイパーラマン散乱分光法を用いて、二酸化チタンの中赤外パルスレーザーによる選択的格子振動励起の直接観測を行うことを目的とした。まず、アンチストークスハイパーラマン散乱分光を行う上で必須となる光学系の構築を行なった。光学系には、Nd-YVO4レーザーを励起光とした色素レーザーを用いた。本研究期間内に、色素レーザーユニットを購入し光学系に組み込み、励起光を532 nmとして波長変換の確認し、二酸化チタンのハイパーラマン散乱分光の励起光とする796 nmの発振を確認した。次に、これまでの手法で用いていた穴あき放物面ミラーによる中赤外レーザーとプローブ光の同時照射システムを、より高効率かつ容易に励起光およびラマン散乱光を伝送・捕集するために、ITO透明基板を用いた中赤外レーザー・プローブ光の同軸光学系を構築した。また、Nd-YVO4レーザーを用いたラマン散乱による選択的格子振動励起の実証を行う上で問題となっていた中赤外レーザーとプローブ光の照射による和周波を、同時に観測される差周波およびストークスラマン散乱分光によって分離し、目的のアンチストークスラマン散乱のみを抽出して観測する技術を確立した。その技術をSiCを用いたサンプルに適応し原理実証を行なったところ、アンチストークス散乱光のみの抽出に成功した。これら結果より、本研究期間において、ハイパーラマン散乱分光によるアンチストークスラマン散乱を用いた選択的格子振動励起のための基盤システムを構築した。
ゲノム人工合成技術による標的狙撃型殺菌キメラファージの開発

本研究では、ファージの人工合成技術の確立及びCRISPR-Cas13a搭載ファージの合成を実施する。加えて、合成したファージの殺菌活性を検証し、将来のファージセラピーへの応用について、その可能性を検討する。
水素結合と電荷移動相互作用に基づく純有機分子性金属の開発

水素結合と電荷移動の連動に基づいて特異な物性や高次な機能を発現する純有機分子性金属の開発を目指し、テトラチアフルバレン類縁体にイミダゾールや核酸塩基などの水素結合部位を連結した新規電子ドナー分子を設計・合成した。いずれの分子も結晶中で強固な水素結合によって集合することで多様な集積構造を構築していた。また、電子アクセプター分子との電荷移動錯体の合成を行い、高伝導性のものを得ることに成功した。共役π電子系を有する有機化合物は、有機電導体や有機磁性体などの機能性物質の構成成分として重要な物質群である。我々は、水素結合と電荷移動(CT)が連動して相互作用する分子システムに着目し、水素結合型CT錯体を基盤とした純有機物分子性金属や、水素結合とCT相互作用の連動性の化学的制御を基盤にした特異な物性、高次な機能性を有する物質開発を目指した研究を行ってきた。今回は、核酸塩基であるシトシンやグアニンをTTFに結合させたTTF-CおよびTTF-G誘導体を、交叉カップリング法を鍵ステップとして合成した。シトシン置換体の合成は、ニトロフェノール基で保護した1-ブチル-5-ヨードウラシルとTTFのトリアルキルスズ置換体との交叉カップリング反応を行い、その後アンモニアを作用させてアミノ基で置換することにより合成した。また、ウラシル置換体からメシル保護、アミノ基置換を経る1段階の反応手法でも合成に成功した。一方、グアニン置換体は、TTFのトリブチルスズ置換体とリボース基で保護したグアニン誘導体のヨード体とのカップリング反応を行うことで合成した。サイクリックボルタンメトリーの測定を行った結果、TTF-Cの電子ドナー性はTTF自身と比べるとわずかに低下しているものの、CT錯体を作製するのには十分な能力を有していることがわかった。様々な電子アクセプター分子と溶液中で混合することにより得られた錯体の中で、TTF-CとTCNQからなる錯体は、分子間の電子遷移に帰属される吸収を約3000cm^<-1>の低エネルギー領域に示した。加圧形成ペレットを用いた電気伝導度測定では、室温で10^<-2>S cm^<-1>程度の比較的高導電性の半導体であった。本申請研究では、水素結合と電荷移動が連動して相互作用する分子システムの開発を目指して、水素結合型電荷移動錯体を基盤とする特異な物性や高次な機能性を発現する物質開拓を行う。核酸塩基やイミダゾールなどの水素結合部位を持つ骨格と、テトラチアフルバレン(TTF)などの電子ドナー性を持つ骨格を連結した分子を設計・合成し、それらが電荷移動錯体中で発現する構造・物性・機能を探索する。TTFをセレン置換し、より強い分子間相互作用を形成できるテトラセレナフルバレン(TSF)とイミダゾールの連結体TSF-Imについて、単結晶化ならびにX線結晶構造解析に成功した。結晶中ではイミダゾール骨格での水素結合に加えて、TSF骨格でのセレン原子間相互作用によって二次元的なネットワークが構築されていた。電気化学測定によりこの分子の酸化還元能を調べた。その結果、TSF-ImはTSF自身とほぼ同程度の電子ドナー性を有し、かつTTFとの誘導体(TTF-Im)よりもオンサイトクーロン反発が減少していることが明らかになった。TSF-Imと電子アクセプター分子を溶液中で混合することで電荷移動錯体の合成を行った。これらの錯体は圧縮ペレットを用いた電気伝導度測定において、いずれも10^0Scm^<-1>程度の高い導電性を示した。特にp-クロラニルとの錯体は、金属的性質を示したTTF-Im-p-クロラニル錯体と同じ組成と酷似した分光学的特徴を示したことから、この錯体もまた金属的な性質を示すと予想される。現在はX線結晶構造解析や単結晶での電気伝導度測定を実行するべく、この錯体について単結晶化を検討している。本期間では、申請者が開発した電子ドナーである1,6-ジチアピレン(DTPY)にイミダゾールの2-位あるいは4-位で連結した分子(DTPY-Im)を新規に設計・合成した。合成は、DTPYのトリブチルスズ置換体とイミダゾールのヨウ素置換体を用いたクロスカップリング反応を鍵反応とする方法を用い、効果的に目的物を得ることに成功した。X線結晶構造解析の結果、DTPY-Imはイミダゾールの水素結合とDTPY骨格の強い一次元π積層によって二次元的な構造を形成することがわかった。

DTPY-Imと電子アクセプターを溶液中で混合することで電荷移動錯体の合成を行った。これらの錯体のいくつかは、分光スペクトル測定の結果から部分電荷移動状態にあることが示唆された。これらは圧縮ペレットを用いた電気伝導度測定において、室温伝導度が10^<-2>-10^<-1>Scm^<-1>程度の高い導電性を示した。現在はX線結晶構造解析や単結晶での電気伝導度測定によって、錯体中での水素結合の役割の解明や水素結合と電荷移動相互作用が共存することによる特異な物性を探索するために、これら錯体について単結晶化を検討している。
難治性悪性脳腫瘍に対するα波パルス光同調免疫療法の開発に関する研究

我々は、従来の光フィードバック法の技法を改良して眼前に限らない部位から、あるいは両眼を完全に遮光もしくは開眼状態で反復閃光刺激を与えるα波パルス光同調法を考案した。本法は非侵襲的かつ簡便であるため、これまでに健常者数十名を対象として種々の免疫パラメーターへの影響を検討してきた。その結果、本法には選択的なNK活性を介する免疫監視能の上昇作用があることが判明した。我々が独自に考案した、このNK活性を介する免疫監視能を賦活化する光フィードバック法をα波パルス光同調免疫療法として命名した。非侵襲的で簡便な本法は免疫能の低下した難治性脳腫瘍患者にも応用可能であり、その免疫賦活機序の解析とともに治療効果(腫瘍増殖の防止ならびに再発予防作用)も検討した。1.脳腫瘍の術後患者に対し、本治療を開始したのち、定期的(48週毎)に治療効果を評価している。難治性悪性脳腫瘍の場合には、術後標準的治療として放射線療法や化学療法を施行するため、本治療法はこれらの治療中あるいは治療後に実施した。これまで最長1年以上の長期間にわたり本治療法を施行してきた悪性グリオーマ患者1例においては、再発徴候はみられず、また血液免疫パラメーターとして放射線療法や化学療法で通常少なくとも一過性に低下するNK活性は有意な低下を示していない。2.我々は、これまでの研究成果からα波パルス光同調免疫療法の免疫賦活化に関する作用機序として、松果体の内分泌あるいは神経伝達物質の関与を推測している。そこで、稀な腫瘍性疾患であるが松果体部悪性奇形腫の小児患者において、腫瘍全摘後に本治療法を行い、松果体の免疫賦活作用を検討中である。(参考事項)本臨床研究はすべて、被験者(患者)とその家族との十分なインフォームド・コンセントのもとに実施された。我々は、従来の光フィードバック法の技法を改良して眼前に限らない部位から、あるいは両眼を完全に遮光もしくは開眼状態で反復閃光刺激を与えるα波パルス光同調法を考案し、これまでに健常者数十名を対象として種々の免疫パラメーターへの影響を検討してきた。一方、我々のこれまでの基礎研究成果から脳内にはNK細胞を介する免疫監視機構が欠如していることが明らかにされている。本研究では、我々が独自に考案したNK活性を介する免疫監視能を賦活化する光フィードバック法をα波パルス光同調免疫療法として命名し、免疫能の低下した難治性脳腫瘍患者の治療に臨床応用し、その治療効果を検討中である。本治療法の最大の特長は、非侵襲的かつ簡便であることである。装置(研究試作品)は日常生活で使用可能であり、また時と場合と行動を問わず免疫療法として応用できることが特色である。本法は被験者本人のα波をリアルタイムで賦活化させる技法を活用していることから考え合わせると、腫瘍性疾患を有する患者に用いた場合には、非侵襲的、普遍的かつ持続的な免疫監視能の賦活化をはかる治療法として臨床的意義があるものと思われる。また、腫瘍再発の防止にも少なからぬ貢献を果たすことが期待される。これまでの研究成果から本治療法の免疫賦活化に関する作用機構として、松果体の内分泌あるいは神経伝達物質の関与が推察されている。現在まで脳腫瘍患者の2小児例(視床下部に再発した悪性膠腫と松果体部に発生した悪性奇形腫)に対し、手術施行後に本治療法を被験者(患者)とその家族からインフォームド・コンセントを得た上で実施した。第一例では自宅で1年以上継続中であり、長期間NK活性が上昇している。第二例では明らかなNK活性の上昇がみられず、本法の治療効果が松果体の免疫賦活作用を介するものと示唆された。

そこで、稀な腫瘍性疾患であるが松果体部悪性奇形腫の小児患者において、腫瘍全摘後に本治療法を行い、松果体の免疫賦活作用を検討中である。(参考事項)本臨床研究はすべて、被験者(患者)とその家族との十分なインフォームド・コンセントのもとに実施された。
アンチジーン発現ベクターを用いた悪性グリオーマに対する遺伝子療法

従来よりわれわれは、c-erbB遺伝子のプロモーター領域に作用するアンチジーン合成DNAを作成し分子間三重鎖DNAの形成を試み、転写抑制によるc-erbB遺伝子発現抑制効果を検討してきた。c-erbB遺伝子のプロモーター領域のSP-1結合部位とCAP部位を含む26bpの領域を標的とした場合に低濃度の合成DNAで遺伝子の発現抑制が示され、これらの効果を報告してきた。この方法においては代謝、毒性に関して顕著な問題はないとされているが、腫瘍性疾患に対してはどのようにして効率良く発現させるかについてさらに工夫が必要であった。ウイルスベクターにより発現されるアンチジーンRNAの転写阻害効果については従来報告がなく、その効果を検討するため、組み換えレトロウイルスベクターを構築しin vitroでの転写阻害について検討した。CMVプロモーターによりc-erbBアンチジーンを発現するウイルスベクターゲノムpLNCAを構築し、パッケージング細胞psi-CREを用いてアンチジーンレトロウイルスベクターLNCAを得た。一方、EGFRプロモーターにてルシフェラーゼ遺伝子を発現するベクターゲノムpLNELをマウス繊維芽細胞NIH3T3に導入し、この遺伝子組換え体細胞にウイルスベクターLNCAの反復感染を行い経時的にルシフェラーゼ酵素活性の測定を行った。LNCA感染後48時間で量依存性に酵素活性が減少し、MOI=10の条件下にて約50%のルシフェラーゼ発現阻害効果が認められた。レトロウイルスベクターにより発現されるアンチジーンRNAにより、オリゴヌクレオチドと同様に転写阻害効果が得られることが示唆された。転写阻害に必要な力価やウイルスの投与時期などの条件についてさらに検討中である。われわれはこれまでにc-erbB遺伝子のプロモーター領域において各種のアンチジーンを作成して三重鎖DNAの形成を試み、転写抑制による特異的発現抑制効果を検討した結果、低濃度のアンチジーンでc-erbB遺伝子の発現抑制が示され、これらの効果を報告してきた(岡田ら;第52・53回日本脳神経外科学会総会、第52回日本癌学会総会、1994、Growth Factorsほか)。この方法においては代謝、毒性に関して顕著な問題はないとされており、米国ではウイルス性疾患に対して各種のアンチジーンが実用化の域に入ってきている。しかし、腫瘍性疾患に対してはどのようにして効率良く腫瘍細胞に導入し安定に発現させるかについてさらに工夫が必要である。このため、c-erbBアンチジーンを発現するレトロウイルスベクターを構築しin vitroでの転写阻害について検討した。このアンチジーンRNAのgene code blockerとしての効果は従来報告がない。c-erbB genepromoterのSP-1結合部位とCAP siteを含む26bpの領域を標的とし、CMV promoterによりc-erbBアンチジーンを発現するウイルスベクターゲノムpLNCAを構築し、psi-CREを用いてアンチジーンレトロウイルスベクターLNCAを得た。一方、EGFR promoterにてluciferaseを発現するベクターゲノムpLNELをNIH3T3に導入し、このreporter cellにLNCAの反復感染を行い経時的にluciferase assayを行った。転写阻害に必要な力価やウイルスの投与時期などの条件について詳細assayを行った。転写阻害に必要な力価やウイルスの投与時期などの条件について詳細に検討中である。このアンチジーンレトロウイルスベクターのc-erbBプロモーター阻害効果について、第1回日本遺伝子治療学会、第54回日本脳神経外科学会総会、第54回日本癌学会総会などにて発表した。