hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
サッカーゴールキーパーのダイビング動作分析からみるパフォーマンス向上の要素の解明

2018年度は当初の予定には無かったが,トップレベルのゴールキーパー(GK)がゲームにおいてどのようにダイビングを行っているのかを検討した.標本は,2018FIFAワールドカップ全64試合における,全シュート1617本からペナルティキックならびに直接フリーキックによって放たれたシュート,GK以外の選手がブロックしたシュート,ゴール枠外に放たれたシュートを除いた416本のシュートとした.また,シュートの放たれた位置をゴールまでの距離と角度から,6つのエリアに分類し,シュートに対する防御行動(最終的にボールに触れる際の動き),防御行動前のステップの種類をエリアごとに抽出した.まず,得点になったシーンにおけるGKの防御行動をみると,ダイビング時における失点が多く見られた.これはゴールシーンにおいてはGKの届かない位置にシュートが飛んできていることが多いため,必然といえる.そこでシュートの放たれた位置によって,どのようなステップからダイビングを行うケースが多かったのかを416シーンの内,ダイビング動作が確認された150シーンを検証したところ,(i)近い距離かつ正面のエリアから放たれたシュートに対してはステップをせずに踏み切ってダイビングを行うケースが有意に多かった.(ii)近い距離で角度がある場合はボール側の脚を構えた位置の内側に着いてダイビングを行っていた.(iii)距離があって角度がある場合は,ステップの後に踏み切ってダイビングを行うケースが有意に多かった.これらの結果は,シュートの放たれる位置によって,GKが守るべき範囲,またシュート到達までの時間が限定されることが要因であると考えられる.これらトッププレーヤのプレーの傾向を鑑みて,これまで行ってきたダイビング動作分析の結果が,どのような場面で起こりうる動作なのかを対応させて実践面へ反映させることが効果的であると考える.本研究では、サッカーのゴールキーパー(GK)のダイビング動作を対象に,(1)ボールの高さ,距離の違いに伴う,地面反力と下肢の関節トルク,関節角速度,重心移動を比較検討し,ダイビング技術の力発揮メカニズムを分析する.(2)また多くの実験設定で用いられる静止球へのダイビングと実際に飛来してくるボールへのダイビング動作における違いを明らかにすることで,競技場面及びGK初心者の導入段階におけるコーチングへの示唆を得ること.(3)さらに「より早く」,「より遠く」へダイビングを行うために必要とされる要素を抽出し,青少年代GKの競技レベルの向上ならびに指導メソッドの発展に貢献することが研究の目的である.サブテーマ(1)に関しては,1それぞれの脚が発揮した地面反力の合成ベクトルを分析したところ,ダイビング方向側の脚において,ベクトルの大きさだけでなく,角度も調節していること2踏切局面のうち,ダイビング方向側の脚では離地にかけて,ボールへの距離によって大きく貢献する部位が異なり,GKから近い距離へのダイビングでは股関節,遠い距離へのダイビングでは足関節による貢献が大きく,各部位による貢献の仕方が異なるということが明らかになった.これらの結果は28年10月に国際論文として『Journal of sports sciences』へ投稿したが,29年2月に掲載不可の審査となったため,引き続き加筆修正を行い,再投稿の準備を進めている段階である.サブテーマ(2),(3)については,29年2月に実際に飛来してくるボールへの動作を分析とするため,キックマシーンを用いてボールを発射させ,そのボールに対してGKがダイビングする様子を三次元動作分析装置とフォースプラットフォームを用いて測定した.当初の予定から変更した点として,キックマシーンとGKとの距離を20mから8mに短縮した.これはGKが実際の試合で素早いダイビングを求められるシチュエーションが,ペナルティエリア内からの相手シュートを防御する際に多くみられるためである.したがってこの変更によって,実際にGKが対面するであろう場面を再現した形で実験を行うことが出来たと考える.なお,本実験の結果の一部は5月31日からのWORLD CONFERENCE ON SCIENCE & SOCCER(フランス・レンヌで開催)において口頭発表の予定である.本研究では,サッカーにおけるゴールキーパー(GK)のダイビング動作を対象に,ボールの高さ・距離の違いに伴う,ダイビング技術の力発揮メカニズムを分析する事を目的の一つとしている.近年のサッカーでは得点になったシュートの55%が,ゴールラインから10ヤード以内の中央エリアから放たれており,失点数を減らしていくためには,GKの至近距離からのシュートに対応する能力が求められるといえる.そこで29年度は下記の3つの設定の下,ゴール中央の9.15m離れた位置から「Eurogoal1500」というキックマシーンを使用し,放出されたボールへGKが向かう際のダイビング動作を三次元動作分析装置VICON 20台を使用し撮影した.さらにGKの踏切位置には地面反力計2台を設置し,両脚によって発揮された地面反力を測定した.そしてGKからボールまでの距離を近・中・遠距離の3パタン(平均1.74m, 2.10m, 2.51m)に設定した際の比較検討を行った.それらデータより至近距離(9.15m)からのシュートに対して,GKは「ボール側の脚を構えていた位置よりも内側に踏み出す」ことで,体をボール方向へ傾けるまでの時間を短縮し,離地するという動作(Quick diving)の特徴が確認された.Quickdivingでは,申請者らがこれまでの動作分析において対象としていた動作と比較して,ボール方向への重心移動は少ないものの,踏切に要する時間が短縮されていたことが確認された.

その際の地面反力の発揮方向を見ると,ボール側の脚においては,ほぼ同一方向に力が発揮されており,このことが踏切に要する時間が短縮に貢献していたと考えられる.本結果は,GKのダイビング動作の研究としては数少ない実際に飛来してくるボールへの動作を分析したものとして,現代サッカーのGKトレーニングに対しての有意義な示唆を行う結果であると考える.投稿した論文が、採択されなかったため、再度校正を行い再投稿の準備を進めたため、当初の予定よりも遅れてしまっている。今後発表予定の論文も、投稿した論文の結果を基に論を進める予定であったため、投稿が送れてしまっている状況である。2018年度は当初の予定には無かったが,トップレベルのゴールキーパー(GK)がゲームにおいてどのようにダイビングを行っているのかを検討した.標本は,2018FIFAワールドカップ全64試合における,全シュート1617本からペナルティキックならびに直接フリーキックによって放たれたシュート,GK以外の選手がブロックしたシュート,ゴール枠外に放たれたシュートを除いた416本のシュートとした.また,シュートの放たれた位置をゴールまでの距離と角度から,6つのエリアに分類し,シュートに対する防御行動(最終的にボールに触れる際の動き),防御行動前のステップの種類をエリアごとに抽出した.まず,得点になったシーンにおけるGKの防御行動をみると,ダイビング時における失点が多く見られた.これはゴールシーンにおいてはGKの届かない位置にシュートが飛んできていることが多いため,必然といえる.そこでシュートの放たれた位置によって,どのようなステップからダイビングを行うケースが多かったのかを416シーンの内,ダイビング動作が確認された150シーンを検証したところ,(i)近い距離かつ正面のエリアから放たれたシュートに対してはステップをせずに踏み切ってダイビングを行うケースが有意に多かった.(ii)近い距離で角度がある場合はボール側の脚を構えた位置の内側に着いてダイビングを行っていた.(iii)距離があって角度がある場合は,ステップの後に踏み切ってダイビングを行うケースが有意に多かった.これらの結果は,シュートの放たれる位置によって,GKが守るべき範囲,またシュート到達までの時間が限定されることが要因であると考えられる.これらトッププレーヤのプレーの傾向を鑑みて,これまで行ってきたダイビング動作分析の結果が,どのような場面で起こりうる動作なのかを対応させて実践面へ反映させることが効果的であると考える.サブテーマ(2)については静止球と飛来球に対するダイビング動作を比較検討し,これまでの実験設定に対しての検証とGK初心者へのトレーニング手段としての静止球へのダイビングの効果を検証する.サブテーマ(3)については1同じ位置に異なるスピード2異なる位置に同じスピードで発射されたボールへのダイビング動作を比較検討する.運動方程式によって鉛直方向、水平方向の重心加速にはどちらの脚のどのトルクがどれだけ貢献しているかを分析する.なお、これら結果は年内に学会発表ならびに論文として投稿を予定している.一年間の期間延長を行ったため、今後は昨年度学会発表した内容に加え、既にデータを収集しているものの分析を進め、年度内の投稿のための執筆作業を進めていく予定である。
看護教育のための知的CAIの開発

1)平成2年度になり、ソニ-社ワ-クステ-ションNEWSのOSのヴァ-ジョンが3・4となり、ウィンドシステムもXー11レリ-ス3となり、計算機の動作環境が一応の整備をみたので、QRSシステムを1ウインド、4ーの独立したエ-リヤとする基本正計を完了し、プログラムの改修を行い、合計24のプログラムにまとめ、実際に稼働するようにしたが、未だバグが多少残っている可能性がある。学生の実際の使用を待ってバグの絶滅に近付けたい。2)一つのウインドを独立した4つのエ-リャに区分したのは、試験問題エ-リャ、解答欄エ-リャおよび2つの参考エ-リャとするためである。それぞれのエ-リャの選択及び諸事項の指定はマウスで簡単に指定可能であり、使い易いCAIシステムを意図している。3)平成3年度にはOSのヴァ-ジョンが3・4から4・0となり、Xーwindowがレリ-ス4となるので、来年度以降もプログラムの改修を予定しなければならない。4)入力された国家試験問題は、教科目別が約1Mb,66ー74回の看護婦試験問題、68ー72回の保健婦試験問題及び65ー69回の助産婦試験問題合計約3Mbである。次年度以降も試験問題の入力を計りたい。5)その他、入力された専門用語(医学および看護学知識)ファイルは約4000語を含み、参照能力を増加しているが、次年度以降も専門用語ファイルの充実を計りたい。1)本年度当初に計画した研究目的の第一段試、すなわち32ビットEWSへのQRSプログラムの移植は、ほゞ不完全ながら達成した。不完全という意味は我々の入手したNEWSー1850はいわゆる新製品であり、しかも最初のロットの製造(#10066)であるということもあってか、正常に作動しなかったり、あるいは原因不明のシステムダウンを引き起こすこともあったり、必ずしもプログラムの移植が完了したとはいいがたいことがあったからである。これは一つには、OSがBSD4.2からBSD4.3にバージョンアップされたこと、およびXーWINDOWがX10からX11にしかもXー11のバージョがレリース1から2に変更されたことゝ無縁であるとはいえない。つまりNEWSを入手した昭和63年10月から平成元年2月末までの僅か5ケ月の間にNEWS-OSが3.0から3.2に3回も代ったことでも、プログラムの動作環境がいか整備されていなかったかが容易に分る。平成元年2月末現在では、NEWSにRS232Cで接続されたPCー9801をNEWSの端末とするいわゆるエミュレーション・ソフトは完成し、NEWS上のQRSのプログラムをNEC PCー9801のうえで作動させることも可能な状態となっている。もちろん、NEWSのコンソールで同時にQRSプログラムを実行できるのはいうまでもない。2)従来NEC PCー9801のうえで作動していた看護婦国家試験問題とその解答ファイル(科回別に作成)約1Mの集録は完了している。3) QRSプログラムの機能拡充(例えば学習履歴のFD等への記録)は未だ実現をみていない。その理由は1)において述べられたことと同様である。4)新規データの集録は、本年度の謝金計上が不可能であったので、余り進行していない。病理学に関するキーワード約200とその解説、第66回69回の看護婦国家試験問題とその解答および昭和63年度の看護婦、保健婦、助産婦国家試験問題とそのキーワード等約500Kであった。1)ソニ社NEWSのOSのバ-ジョンが3.2となり、ウインドウシステムもX11レリ-ズ2となり、計算機の動作環境が一応の整備をみたため、QRSシステムを一ウインドウ、独立した4つのエ-リアとする基本設計を完了し、プログラムの改修を行い、実際に稼動するようになった。独立した4つのエ-リアとした理由は試験問題エ-リア、解答エ-リヤそして参考のためのエ-リヤが2つという考え方に従った。

というのは、CAIでも従来の学習スタイルと基本的に同様な方法で実行できる即ち、試験問題集(同エ-リヤ)を開き、分らない事柄を参考書(参考エ-リヤ)を2冊(エ-リヤ)まで開き、最終的には解答欄(エ-リヤ)を開いて、自分の解答と照合するという作業が容易に(マウスを用いて)可能なシステムとした。勿論他にウインドウを聞いて、他の仕事をすることも可能なのは云うまでもないこと柄である。ただし、自分で解答を記入するという作業は現在企画中であり来年度には完成する予定である。なお、OSのバ-ジョンが3.2から3.3に、Xウインドウのレリ-ズが2から3へ変更されることになった。その為のプログラムの改修も予定しなければならない。2)知識デ-タより人工知能技術により、規則化とフレ-ム化作業は進行していない。というのはル-ル作りとフレ-ム作りだけが人工知能技術ではなく、最近新しいコネクション概念が提唱されだしたので、これらのいずれが我々のCAIシステムに適わしいか検討中であるからである。3)知識デ-タの収用は当初考えた予定どうりに進行しているが、これらの構造化は、医学的知識デ-タと同様に非常に難かしい問題を包含している。一般的に医学的知識の論理性は極めて低い為である。4)UNIXが非常に大きなシステムであり、標準のハ-ドティスクでは容量に不足をきたし、拡張用のハ-ドディスを購入せざるをえなかった。1)平成2年度になり、ソニ-社ワ-クステ-ションNEWSのOSのヴァ-ジョンが3・4となり、ウィンドシステムもXー11レリ-ス3となり、計算機の動作環境が一応の整備をみたので、QRSシステムを1ウインド、4つの独立したエ-リヤとする基本設計を完了し、プログラムの改修を行い、合計15のプログラムにまとめ、実際に稼働するようにしたが、未だバグが多少残っている可能性がある。学生の実際の使用を待ってバグの絶滅に近付けたい。2)一つのウインドを独立した4つのエ-リャに区分したのは、試験問題エ-リャ、解答欄エ-リャおよび2つの参考エ-リャとするためである。それぞれのエ-リャの選択及び諸事項の指定はマウスで簡単に指定可能であり、使い易いCAIシステムを意図している。3)平成3年度にはOSのヴァ-ジョンが3・4から4・0となり、Xーwindowがレリ-ス4となるので、来年度以降もプログラムの改修を予定しなければならない。4)入力された国家試験問題は、教科目別が約1Mb,66ー74回の看護婦試験問題、68ー72回の保健婦試験問題及び65ー69回の助産婦試験問題合計約3Mbである。次年度以降も試験問題の入力を計りたい。5)その他、入力された専門用語(医学および看護学知識)ファイルは約4000語を含み、参照能力を増加しているが、次年度以降も専門用語ファイルの充実を計りたい。
文化財美術品搬送における振動および温湿度環境の調査

2012年3月2014年2月わたるTBSが主催し、全国展開した『インカ帝国展』の各会場への展示品移送時に展示品とともにデータロガを設置し、展示品梱包箱(クレート)内の移動時の振動や温湿度を計測した。振動は人的移動、車両、昇降機材による移動、航空機への積み下ろし、航空機の発着環境、道路路面環境等のさまざまな局面において振動が生じるが、特に人的な要因が振動に大きく影響を与えることが判明した。また、梱包容器内の温湿度については、季節、搬送車輛・航空機内環境が大きな影響を及ぼすと考えられた。今年度の研究は、展示品移動時に生じる振動や梱包箱内の温湿度を計測し、展示品搬送に関わる振動・温湿度の数的データを求め、文化財・美術品搬送時に実際生じる種々の局面での振動・温湿度についてのデータを収集することに務めた。この振動に就いては人的移動、車両、昇降機材による移動、航空機への積み下ろし、航空機の発着環境、道路路面環境等のさまざまな局面において異なった振動が予想され、その影響も異なることが考えられる。また、梱包容器内の温湿度については、季節、搬送車輛環境、航空機内環境が大きな影響を及ぼすと考えられる。2014年度3月国立科学博物館を皮切りに2ヶ年にわたって全国9箇所で開催されたTBS主催「インカ帝国展」の展示品の各展示館への移送に際して展示品梱包箱の5箱に振動計兼温室度計を設置し、移送時の振動記録と梱包箱の内部の温室度の記録を取った。今年度は、4月7日の富山県民会館美術館での「インカ帝国展」閉幕後のデータロガの設置以後、京都文化博物館での回収・設置、福岡市博物館での回収・設置、鹿児島県歴史料センター黎明館での回収・設置、沖縄県立博物館・美術館での回収・設置とペルー国への返却時での回収をおこなった。展示品の上記展覧会会場への移送については鹿児島ー沖縄間に船舶による海上輸送、ペルー返却のために沖縄ー東京への移送には航空機が使用された。そして東京ーリマ間はアムステルダム経由の航空機による移送であった。他の搬送手段は記述した以外は、すべて車両による陸送であった。この展覧会での展示品移送の全記録をとることができた。本研究は、文化財・美術品の搬送時の梱包箱内を含めたあらゆる局面で生じる微振動や温湿度を記録することにより、微振動・温湿度の文化財への影響を考え、その影響の程度を探る。この研究は、文化財・美術品の搬送時の搬送手段や梱包の微振動・温湿度の問題点を抽出するのが目的であり、今後の文化財・美術品の搬送に大いなる貢献できる。そしてこの研究は、文化財・美術品の国内搬送だけを考えるのではなく、時に応じ航空機を使用した海外からや海外への文化財・美術搬送も試みる。2014年度、TBSが主催し、2ヶ年にわたって開催される「インカ展」の展示品移送に際して展示品梱包箱に振動計および温室度計を設置し、どのような振動が移送時に生じるかを記録することから開始した。さらにその際梱包箱の内部の温室度の記録もおこなっている。今年度は、国立科学博物館における「インカ展」の閉幕後に振動計・温室度計を設置し、仙台市博物館にて回収・設置、山梨県考古博物館にて回収・設置、静岡県立美術館にて設置・回収、富山県民会館美術館にて回収までおこなった。上記展覧会会場への移送はすべて車両による陸送であった。今回の計測した記録の詳細な分析は、まだ十分にはおこなっていないが、陸送時における道路路面環境は如実に振動に反映することが判明した。特に東北ー東京間の移送に対しては、東日本大震災による道路路面環境の悪化と見られる振動に反応が計測された。本研究は、博物館内の展示品にかかわる振動対策ではなく、文化財移送時に生じる振動の影響に注目した研究であり、2012年3月2014年2月の2カ年にわたってTBS主催が全国巡回を展開した『インカ帝国展』の各会場への展示品移送時に展示品と共にデータロガを設置し、移動時の振動に関わる加速度や梱包箱内の温湿度を計測し、文化財・美術品搬送時に実際生じる種々の局面での振動・温湿度について考えた。この振動に就いては人的移動、車両、昇降機材による移動、航空機への積み下ろし、航空機の発着環境、道路路面環境等のさまざまな局面において異なった振動が予想され、その影響も異なることが考えられた。また、梱包容器内の温湿度については、季節、搬送車輛環境、航空機内環境が大きな影響を及ぼすと考えられた。文化財の移送時には外気温度は、大きく影響を与えるということである。そのため展示品の移送手段によってクレート内の温度も異なる。トラック等の車輛は外気の温度に敏感に影響を受けるため、走行時の速度や時間帯への留意が必要であり、航空機は車輛以上に外気の影響が強い。しかし船舶(フェリー)での展示品移送は外気が船体とトラックの二重の防護が働くためクレート内温度の変化は少ない。

展示品の中で金製品などの金属製品を納めたクレートは、際立って温度に敏感と言えるが、しかし、布製品等を納めたクレートの温度の変化はあまりなかった。湿度もまた移送時に外気に影響された。しかし、それは通年での緩やかな変化である。また展示品移送に際して、梱包された展示品の素材によって湿度変化があるのではと考えていたが、今回の調査ではコンポされている展示品ではなく、梱包材の影響による湿度変化と考えられる。考古学本研究は博物館内の展示品にかかわる振動対策ではなく、文化財移送時に生じる振動の影響に注目し、新たな研究を展開しようとするものである。全国各地の博物館では展覧会のために頻繁に文化財・美術品の貸し借りがおこなわれているが、その文化財・美術品の搬送時に生じる振動・温湿度については科学的な数値は少なく、経験的な要素から、搬送時の文化財・美術品に注意が払われている。その中で指定文化財に対しては、免振付きケースで搬送が図られる場合があるが、数的根拠は乏しい。それは温湿度に対しても同様である。そのような中、この研究は2014年度3月国立科学博物館を皮切りに2ヶ年にわたって全国9箇所で開催されたTBS主催「インカ帝国展」の展示品の各展示館への移送に際して展示品梱包箱の5箱に振動計兼温室度計のデータロガを設置し、最終的にはペルー国への返却時での回収をおこなった。上記展覧会会場への移送については陸送が主であったが、船舶による海上輸送、航空機による空輸と各種移送手段の振動記録と梱包箱の内部の温室度の記録を取ることができた。その意味で研究は順調に進捗していると言える。現在、「インカ展」の全国巡回展に合わせて、展示品の移送時に振動計を設置している。巡回期間が2ヶ年にわたるが、今年3月で1年が経過し、残すところあと1年となった。これまで東日本を中心に展覧会は5箇所で開催され、その展示品の移送に振動計を設置し、陸上移送時の振動を計測している。それゆえデータは、着実に蓄積している。これらのデータの解析でも文化財移送時における振動についての問題点は十分に指摘することはできるが、これまでこの種のデータ計測はほとんどなく、そのためより多くのデータ収集が必要である。そのため、この1年にわたって実施してきた計測をさらに継続し、データ収集に務める。それゆえに、現段階でのこの研究の達成度は、道半ばと言った感がある。この研究は、3ヶ年を計画しており、今後2ヶ年をもってより充実した研究へと高めていきたいと考えている。今回の計測した記録の詳細な分析は、まだ十分にはおこなっていない。しかし、2年間にわたる陸送、海上輸送、空輸の異なった移送手段の記録の分析にどのような相違が認められるのか、さらに異なった移送手段への積み降ろし時にどのような振動が発生しているのかを26年度に分析し、最終的な報告をおこなう。この研究に際して全面的な協力をしてくれたペルー文化省からもこの研究の報告が期待されている。今年度の最終的な分析を踏まえ、今後さらに詳細なデータ収集や異なった分析法が必要な場合、さらに研究を継続して実施していきたいと考えている。今年度は、「インカ展」の2年目に当たり、京都、福岡、鹿児島、沖縄において展覧会が開催される予定である。その後、東京に搬送され、2014年2月中旬にペルーに返却される予定である。
マイクロ曲面デバイスで切り拓く細胞の立体形状認識機構のメカノバイオロジー

本研究は、直径数百μmの制御されたマイクロ曲面上で細胞・組織を培養する新しいプラットフォームを開発し、曲率-細胞張力-接着力からなる細胞接着界面の力学バランスが三次元組織の形態・機能に与える影響を世界で初めて定量解析することを目的とし、これを実現するために細胞培養面の曲率を操作できる新しい細胞培養系の構築に取り組んだ。具体的に、シリコンゴム製の薄膜を加工し、その上で細胞を培養することができる培養チャンバーを製作した。また、光硬化性樹脂とフォトリソグラフ法を用い、長方形(幅500μm,長さ8mm)や円形の貫通孔(直径500μm)を複数持つマイクロスリットを製作した。さらに、アクリル板を切削し、ガラス板と圧力コントローラー・ダンピングチャンバー・真空ポンプを接続することで減圧装置を製作した。これらの部品を組み合わせ、空気圧により細胞培養面の曲率を操作し、その様子を顕微鏡下で観察可能な新しい培養デバイスのプロトタイプを製作した。このデバイスは細胞培養面の曲率を0-3/mmの範囲で制御可能であり、培養環境下で細胞培養面の曲率を操作し、その応答を観察することに成功した。これまで多くの先行研究が、平面上で細胞の接着領域を制限することで二次元形状に対する応答を観察してきたのに対し、本研究は細胞接着面の曲率という立体的なパラメーターに着目する点で新しい。立体面で細胞を培養し、培養環境下で曲率の大きさや向きを操作可能な本デバイスは、今後曲率操作の範囲や時間応答性、培養操作のスループットを向上することでこれまでにない新しい力学アッセイを実現し、細胞の力学応答や形状認識メカニズムの解明に貢献するものと期待される。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
抗原トリミングアミノペプチダーゼの作用発現メカニズムと制御

強直性脊椎炎(AS)感受性ERAP1依存的なHLA-B27提示リガンドの同定に向けた培養細胞株を作製した。テトラサイクリン誘導体(Dox)により遺伝子発現をコントロールすることが可能な細胞株Tet-off HEK293細胞を用い、まずその内在性ERAP1の発現量をshRNAによって低下させた細胞株HEK293/koERAP1細胞を作製した。次いでHEK293/koERAP1細胞にx6 Hisタグを付加したHLA-B*27:05遺伝子を安定に発現するHEK293/koERAP1+B27細胞を樹立した。最後に別途作成したshRNA耐性となるように同義置換を導入したAS感受性ならびに耐性ERAP1遺伝子をDox感受性プロモーターの下流に挿入したプラスミドをHEK293/koERAP1+B27細胞に導入することで、HEK293/koERAP1+B27+rsiERAP1(WT/K528R/Q730E)細胞株を樹立した。本細胞株を用いて各SNP型ERAP1の発現誘導に伴う細胞表面HLA-B27の変化を解析した結果、いずれの場合も細胞表面HLA-B27発現量が低下していたが、AS耐性型である野生型ERAP1の場合がHLA-B27量の低下が最も大きく、AS感受性であるK528RならびにQ730E ERAP1では小さな変化しか認められなかった。これらの結果から、樹立した細胞株がAS感受性ERAP1依存的なHLA-B27リガンドの同定に適していることならびに各SNP型酵素が作り出すHLA-B27リガンドのレパトアが大きく異なっていることが示唆された。24年度が最終年度であるため、記入しない。小胞体アミノペプチダーゼ(ERAP)-1遺伝子上の一塩基多型(SNP)のうち、528ArgおよびGlu730をコードする非同義置換型の多型は、ヒト白血球抗原(HLA)依存型(HLA-B27と高い相関をもつ)自己免疫疾患病である強直性脊椎炎の原因遺伝子として同定されている。そこでSNP型のリコンビナント酵素を作製し、その抗原ペプチド生成能を検討した。その結果、いずれの酵素もHLA-B27提示抗原前駆体ペプチド(LSRHHAFSFR)から成熟エピトープ(SRHHAFSFR)への変換能が野生型と比較して低下していた。その原因の一つとして、各SNP型酵素が本前駆体抗原ペプチドによる基質阻害を受けることによるものと考えられた。このことと良く相関して、HeLa細胞を用いた細胞表面HLA-B27量もLys528ArgおよびGln730Glu型ERAP-1導入遺伝子によって低下していた。また、ERAP-1の活性を上昇させるペプチドの存在も明らかとなってきた。そこで活性化ペプチドの一つであるペプチド(SIINFEKL)による活性化の程度を比較検討したところ、SNP型酵素間で活性化ペプチドに対する感受性が大きく異なることも明らかとなった。すなわち、SNP型ERAP-1酵素間では酵素学的性状に差異が認められ、それが強直性脊椎炎の発症に寄与している可能性が強く示唆された。ERAP-1とERAP-2の酵素学的性状を82種類の人工蛍光基質からなる基質パネルによって比較検討した結果、基質プロファイルに著しい差異が認められた。この際は、各酵素のS1ポケットの構成アミノ酸に起因していると考え、両酵素が小胞体内腔において別々の抗原ペプチドの生成に関与していることを示唆している。さらにマクロファージのERAP-1が特定の刺激(LPSとIFN-γ)によって、小胞体内腔から細胞外へと分泌されることを見出した。本分泌機構の詳細を解明することで、ERAP-1の小胞体貯留機構の解明に重要な示唆を与えることが期待される。点変異導入実験により、Laeverinの基質特異性発現にはS1ポケット内のGln238の役割が重要であることも明らかにした。

本細胞株を用いて各SNP型ERAP1の発現誘導に伴う細胞表面HLA-B27の変化を解析した結果、いずれの場合も細胞表面HLA-B27発現量が低下していたが、AS耐性型である野生型ERAP1の場合がHLA-B27量の低下が最も大きく、AS感受性であるK528RならびにQ730E ERAP1では小さな変化しか認められなかった。これらの結果から、樹立した細胞株がAS感受性ERAP1依存的なHLA-B27リガンドの同定に適していることならびに各SNP型酵素が作り出すHLA-B27リガンドのレパトアが大きく異なっていることが示唆された。24年度が最終年度であるため、記入しない。リコンビナント酵素を用いた抗原ペフチド消化能の解析は十分な成果が得られていると考えられる。また、次年度の解析に向けた細胞株の作製なども着実に進んでいる。研究計画通りに進める。
未分化胚細胞と器官原基の培養法を用いた哺乳類形態形成に関する動物実験代替法の開発

1.胎児器官法とmicromass培養法の確立胎齢12.5日及び13.5日のマウス胎児口蓋ならびに11.5及び12.5日のマウス胎児四肢原基を完全合成培地で4872時間回転培養しin vivoに準ずる発育と組織分化を得る器官培養系を確立した。また、ラット胎児中脳および四肢原基の細胞を高密度で培養して三次元に近い状態で分化を観察し得るmicromass培養法も確立した。2.培養胎児器官に対する化学物質の影響胎齢12.5日及び13.5日のマウス胎児口蓋を培養し、催奇形性化学物質に対する感受性を調べたところ、12.5日胎児口蓋の方が化学物質の毒性に対する感受性が高いことが明らかになった。12.5日のマウス胎児器官培養系に、in vivoで発生毒性を示す約20種の化学物質を種々の濃度で添加したところ、培養器官に対する毒性の強さはin vivoの発生毒性の強さと相関していた。また、それぞれの毒性発現濃度をヒトの臨床投与条件下における血中濃度と比較することにより、ヒトでの催奇形性のリスク予知に応用し得ると考えられた。以上の結果から、マウス胎児器官の培養系は発生毒性スクリーニングのための代替試験法として有用であることが明らかになった。3.正常及び異常形態形成メカニズムの解析マウス胎児口蓋を培養し、培地に上皮成長因子(EGF)2080ng/mlを加えたところ、濃度依存的に口蓋閉鎖が抑制された。また、培地にレチノイン酸を添加したところ、口蓋上皮の分化転換が阻害され、口蓋裂が誘発された。これらの結果から、本胎児器官培養法が、形態形成機序ならびに奇形発生機序の解析にも有用であることが示された。1.胎児器官培養法の確立申請者らが開発したマウス胎児の口蓋と四肢原基の器官培養法について、至適培養条件(培養液、気相、回転数など)を検討し、それを確立した。また、5-fluorouracilとhydroxyureaをモデル物質として用い、胎齢12日と13日のマウス胎児口蓋に対する毒性を調べたところ、13日に比べて12日胎児の口蓋の方が有意に感受性が高く、発生毒性スクリーニングには胎齢12日のマウス胎児を用いるのが適当であると考えられた。更に、in vivo試験で繁用されるラットについても胎児器官の培養法を検討し、胎齢1314日のラット胎児器官をマウスに準じて培養する方法をほぼ確立した。マウス胎児口蓋培養系の発生毒性スクリーニング系としての有用性を検討するため、約15種類の化学物質を選び、in vitroでの種々の濃度における毒性を調べた。その結果、器官培養系における毒性の強さは、in vivoでの発生毒性の有無やその強さとよく相関しており、また全胚培養法での毒性に近い毒性が示された。この結果から、マウス胎児器官培養系の発生毒性スクリーニング系としての有用性が確認された。3.四肢奇形発生メカニズムの解析マウス胎児胚芽を培養し、in vivoで多指を誘発するbromodeoxyuridine(BrdU)を培地に添加したところ、指間部の細胞死が有意に減少した。このことからBrdUは指間のプログラム細胞死を抑制することによって指奇形を起こすことがわかった。胎児器官培養法は各種奇形の形成メカニズムの解明に有用と考えられる。培養胎児器官に対する化学物質の影響(1)胎齢による感受性の差胎齢12.5日及び13.5日のマウス胎児口蓋を4872時間回転培養し,5-fluorouracilとcycloheximideに対する感受性を調べたところ,12.5日胎児口蓋の方が化学物質の毒性に対する感受性が高いことが明らかになり,in vitroの発生毒性スクリーニングには,12.5日胎児の口蓋がより適していると判断された。

(2)発生毒性スクリーニング系としての胎児器官培養系の有用性12.5日のマウス胎児器官培養系に,4種の抗けいれん薬ジフェニルヒダントイン(DPH),フェノバルビタール(PB),バルプロ酸(VPA),ジアゼパム(DAZ)を種々の濃度で添加したところ,毒性効果はDPHが最も強く,次いでVPA,DAZの順であった。また、それぞれの毒性発現濃度をヒトの臨床投与条件下における血中濃度と比較することにより、ヒトでの催奇形性のリスク予知に応用し得ると考えられた。in vivoで発生毒性を示す約20種の化学物質について同様の検討を行ったところ,培養器官に対する毒性の強さはin vivoの発生毒性の強さと相関していた。これらの結果から,マウス胎児口蓋の器官培養系は発生毒性スクリーニングのための代替試験法として有用であることが明らかになった。2.口蓋閉鎖メカニズムの解析マウス胎児口蓋を培養し,培地に上皮成長因子(EGF)2080ng/mlを加えたところ,濃度依存的に口蓋閉鎖が抑制された。また,培地にレチノイン酸(RA)を添加したところ,口蓋上皮の分化転換が阻害され,口蓋裂が誘発された。これらの結果から,本胎児器官培養法が,形態形成メカニズムの解析にも有用であることが示された。
マルチフェロイック鉄酸化物電子強誘電体の応用へ向けた新規相探索

代表者らが発見した電子強誘電体RFe2O4(R:希土類)につき、室温でのマルチフェロイック性の発現を目指して研究を行った。元素置換等では、本系の磁気転移温度は250Kから大きくは変動しなかった。しかし、関連物質R2Fe3O7を合成したところ、転移温度が20K高い270Kであることが判明し、更なる転移温度上昇へのヒントが得られた。また、磁化の安定化である交換バイアスや、電流印加による磁気異方性の増大など、応用可能性を示唆する結果も得られた。電子強誘電体RFe_2O_4(R=Y,Ho-Lu)につき、希土類(R)サイトをイオン半径の大きい希土類イオン(R^<3+>=Gd^<3+>,Tb^<3+>,Dy^<3+>)で置換し、新規相を合成することを試みた。常圧で1200°C近辺において多結晶試料合成を行ったところ、上記希土類が10%ほど置換したという結果を放射光吸収分光測定(広域X線吸収微細構造)により得た。これら試料を実験室系X線回折で観測したところ、微量の不純物が含まれていることが分かったため、純良な試料を合成するため合成実験を継続中である。また、研究目的の一つである、物理的・化学的圧力によりRFe_2O_4の物性を制御する試みについて、R=Y,Er-Lu,Inに対し、交換バイアスの結果をJ.Phys.Soc.Jpn.誌に発表した。交換バイアス効果は、磁化の方向を安定化させることができることから、応用面から重要な物性である。本系においては、全てのRイオンに対して交換バイアス効果が約100K以下で観測されたが、R^<3+>イオンを小さくする(=希土類を重くする)ほど、交換バイアス効果は増強されることを報告した。この結果は、RFe_2O_4系においてRを置換し、化学的圧力を変化させることによって系統的かつ応用的に重要な物性変化を観測した最初の報告例と考えられる。なお、ここから派生した研究として、ペロブスカイトLa_<1-x>Pr_xCrO_3において、200K以下で特異な交換バイアス効果を見出しAppl.Phys.Lett.誌に報告した。この系は10年ほど前に、研究代表者が異常な負の磁化を報告したものであり、基礎的にも応用的にも興味深い系である。代表者らが発見したマルチフェロイック電子強誘電体RFe4O4(R:希土類)について、応用可能性を探るための研究を行った。本系の強誘電相転移温度は室温直上の330Kであるが、磁気転移温度は室温直下250Kであることから、マルチフェロイック性は250K以下で発現する。このため、室温動作するマルチフェロイックメモリ素子などの開発可能性を探る目的で、磁気転移温度の上昇を試みた。現在のところ、RFe2O4の元素置換等の手法からは、磁気転移温度の上昇は見られていない。しかし、Feの三角格子が単位格子に2枚余分に挿入された関連系R2Fe3O7(R:Yb.Lu)を合成したところ、磁気転移温度がRFe2O4に比べ20K程度上昇し、270Kとなった。これに伴い、磁気冷凍に用いられる磁気熱量効果のピーク温度も20K程度上昇し270K近傍となった。過去の研究からは、R2Fe3O7も室温で電子強誘電性を示すので、この系は270K以下でマルチフェロイックな物質である。RFe2O4とR2Fe3O7は、一般式RnFe2n+1O3n+1(n:整数)で表される。即ち、この結果は、nを大きくすると磁気転移温度が上昇する可能性を示唆する。このため、今後、nを大きくした物質を合成し、室温でのマルチフェロイック物質の発見を狙う。なお、これらRFe2O4の一連の研究から、公益財団法人・関記念財団より、第一回関博雄記念賞を受賞した。さらに、鉄を含む新規質探索研究の一環から、2011年に発見された新規強磁性体BaFeO3の磁気熱量効果を報告した。鉄イオンは通常見られないFe4+という大きい価数を持っているが、このスピンが110Kで整列し、約6 J kg-1 K-1という大きな磁気熱量効果をを示す。また放射光測定から、Fe4+が磁気異方性の無いFe3+状態のため、ヒステリシス損の無い効率の良い冷凍物質であることを報告した。前年度に引き続き、電子強誘電体マルチフェロイックRFe2O4(R=Y, Ho-Lu)の磁気転移温度を上昇する目的で、希土類(R)サイトを大きい希土類イオン(R3+=Eu3+, Gd3+,Tb3+,Dy3+)で置換した。

前年度の研究よりも大きい希土類Eu3+を置換したところ、最大50%ほど置換したことを放射光吸収分光などで確認した。ただし、磁気転移温度は母体物質より低い210-220Kであるため、高圧合成法などにより研究を継続している。また、関連系R2Fe3O7を合成し(R=Yb,Lu)、磁気転移温度270K近傍であることを観測した。これは磁気転移温度を上げるヒントになりうる結果である。さらに、物理的・化学的圧力でRFe2O4の物性を制御する試みと関連し、YbFe2O4単結晶の磁化を測定し国際会議で報告した。RがLu(LuFe2O4)の磁化データは報告例が多いが、Ybの場合は報告が少ない。実験の結果、磁気冷凍効果におけるエントロピー変化が広い温度範囲(100K程度の範囲)で起こることを観測した。これは応用に有利な性質である。また、既報のLuFe2O4と異なり、エントロピーの符号が低温170K近傍で反転する。これは、希土類を変えることにより冷凍効果を制御できる可能性を示唆する。これに加え、低温において負の磁性という珍しい現象を報告し、新規メモリ素子開発の可能性を示した(J. Phys.印刷中)。以上に加え、近年、誘電性と磁性が共存すると提言されているクロム系TmCrO3においても負の磁性を見出し論文で報告した。この系は磁化の符号反転が2つの温度で起こる稀な系であり、それによる新しいメモリ素子の原理を示唆した。これら研究と関連して誘電体一般の研究も行い、BaTiO3やKTaO3の放射光分光の結果を報告した。RFe_2O_4の希土類(R)サイトにイオン半径の大きい希土類イオンを置換するという最大の研究目的は、一部置換ではあるが成功しつつある。また、他の研究目的である、物理的あるいは化学的圧力により物性をコントロールするという試みは、交換バイアスの希土類依存性で観測した。25年度が最終年度であるため、記入しない。RFe2O4の希土類(R)サイトにイオン半径の大きい(原子番号の小さい)希土類を入れるという研究目的は達成しつつある。また、関連系R2Fe3O7で高い磁気転移温度を観測し、今後の研究展開のヒントを得た。さらに、目的の一つである、物理的あるいは化学的圧力によりRFe2O4の物性をコントロールするという試みは、YbFe2O4単結晶の磁気熱量効果などの測定によって示唆された。上述通り、RFe_2O_4のRサイトの10%程度の一部置換は達成されているが、今後、さらに置換量を増やす合成実験を常圧下で行う。さらに、単相にならない試料に圧力を印加し、単相になるか否か観測する。これらと並行し、非平衡手段である薄膜作成法(パルスレーザー体積法)によって大きな希土類イオンを含むRFe_2O_4が単相で合成できるかどうか探る。良質な試料ができれば物性測定を行い、本研究の目的である、室温での磁気転移が起こるかを観測する。さらに、物性を物理的にコントロールできる可能性を探るため、本年度購入した高圧セルで試料に圧力を印加し、磁性や誘電性などの物性を測定する。上述通り、RFe2O4のRサイトの置換は達成されつつあるが、今後、R2Fe3O7などの関連系も含め、さらに磁気転移温度が高い系を探索する。並行し、高圧法や非平衡手段である薄膜作成法(パルスレーザー体積法)によって軽希土類を含むRFe2O4が単相で合成できるか探る。また、物性を物理的にコントロールするため、現有の高圧セルで試料に圧力を印加し、磁性や誘電性など物性を測定する。
蛍光性窒化物系バルクセラミックスの極低散乱透明化

本研究では、窒化物系無機化合物の特異な発光特性と、窒化物系セラミックスの高機能化に関する知見と粉体合成・セラミックス製造技術を融合しながら、光の散乱限となるため従来の透明体作製で疎まれてきた材料中の不均質構造を制御するだけでなく、積極的に利用するという斬新な発想に基づき、光の散乱限となる気孔や第二相、可視光の波長程度の粒径の粒子を限界まで除去した窒化物系セラミックスを作製し、単結晶レベルの透明化を実現することを目的とする。これを達成するために、原料粉体複合構造制御、成形体高密度・高均質化、焼結体高純度・高密度化の各項目を高度化する。
一活性・二抑制因子反応拡散モデルにおける特異摂動解の存在と安定性について

三成分の反応拡散方程式系に進行座標を導入し,定常問題を考えた。その定常問題に対して特異摂動法を適用した。重要な問題はそこから導出される外部近似問題(連立で不連続な非線形項を持つ楕円型の境界値問題)の解(解は一回連続微分可能)の存在及びパラメータ依存性を調べることである.力学系的に見直すとこの問題は,四次元相空間において二次元安定多様体と二次元不安定多様体をもつ二つの双曲型平衡点があり,この二つの平衡点から出る(あるいは入る)軌道の内で,ある二次元平面に射影したときに連続になっているものを見つけることに対応している。まずは数値計算を行い,パラメータを動かしながら各多様体の特徴的な挙動を調べ,二つの平衡点をC^1-級で接続する軌道が存在していること確認した。次に,この情報をもとに厳密に多様体のパラメータ依存性を調べ,力学系理論を利用し,二つの平衡点をC^1-級で接続する軌道を考察したが,残念ながら,完全な解決は出来なかった。人工的な仮定を設けることによって,この軌道の存在を示した。さらにこの結果を用いて,元の問題の解の存在とその安定性も考察した。また,空間二次元の問題に対して,球面対称な座標系を導入し,空間一次元の場合に考察した外部近似問題の性質を利用して球面対称な特異摂動解(局在定常解)の存在を示した。但し,一部において人工的な仮定を設けている。さらに,この解のまわりでの線形化固有値問題を考察した。数値計算によって,非線形項に現れる2つのパラメータを変化させた時,第0モードと第1モードの不安定化が起こることを確認した。第0モードの不安定化は定常解からの進行波解の分岐を意味しており,第1モードの不安定化は球面対称な定常解が不安定になり,非対称な定常解の分岐を意味している。2つのパラメータをどう動かすかによって,上記の不安定化が個々に現れたり,同時に現れたりする(複合解の存在)ことを確認した。残念ながらHopf分岐を起とすようなパラメータを見つけることは出来なかった。特に,第0モードの不安定化を起こすパラメータに注目すると,この課題の目的である進行スポット解が安定に分岐していることも確認できる。しかし,論理的にそれらを示すことはかなりの困難を伴うので,現在は数値的検証法のテクニックを利用して,安定な進行スポット解の存在証明を行っている。三成分の反応拡散方程式系に進行座標を導入し,定常問題を考えた.その定常問題に対して特異摂動法を適用した.大きな問題はそこから導出される外部近似問題(連立で不連続な非線形項を持つ楕円型の境界値問題)の解(解は一回連続微分可能)の存在及びパラメータ依存性を調べることである.力学系的に見直すとこの問題は,四次元相空間において二次元安定多様体と二次元不安定多様体をもつ二つの双曲型平衡点があり,この二つの平衡点から出る(あるいは入る)軌道の内で,ある二次元平面に射影したときに連続になっているものを見つけることに対応している.現有あるいは購入したパソコンを利用して各多様体を動きとパラメータの依存性を入念に調べた.その結果,数値的にはそのような軌道は存在していることが判った.現在,この計算機による結果を数学的証明に反映させようと努力中である.外部近似問題が解決されれば,従来の解析的な特異摂動法を適用することで三成分の反応拡散系に対して二つの安定な平衡点を結ぶフロント型の進行波解を求めることが出来,かつフロント型の進行波解を二つ結び付けること(ホモリニック分岐理論)により、局在定常解(スタンディングパルス)を構成することが可能であることを確認した.局在定常解の安定性に関しても解析を進めているが,これには前述の外部近似問題から派生してくる新たな問題があり,新たな解決策を考察中である.三成分の反応拡散方程式系に進行座標を導入し,定常問題を考えた。

第0モードの不安定化は定常解からの進行波解の分岐を意味しており,第1モードの不安定化は球面対称な定常解が不安定になり,非対称な定常解の分岐を意味している。2つのパラメータをどう動かすかによって,上記の不安定化が個々に現れたり,同時に現れたりする(複合解の存在)ことを確認した。残念ながらHopf分岐を起とすようなパラメータを見つけることは出来なかった。特に,第0モードの不安定化を起こすパラメータに注目すると,この課題の目的である進行スポット解が安定に分岐していることも確認できる。しかし,論理的にそれらを示すことはかなりの困難を伴うので,現在は数値的検証法のテクニックを利用して,安定な進行スポット解の存在証明を行っている。空間一次元の外部近似問題を考察した。四次元相空間において,二次元安定多様体と二次元不安定多様体をもつ二つの双曲型平衡点がある。昨年度は数値計算を行い,パラメータを動かしながら各多様体の特徴的な挙動を調べ,二つの平衡点をC^1-級で接続する軌道が存在していること確認した。今年はこの情報をもとに厳密に多様体のパラメータ依存性を調べ,力学系理論を利用し,二つの平衡点をC^1-級で接続する軌道を考察したが,残念ながら,完全な解決は出来なかった。人工的な仮定を設けることによって,この軌道の存在を示した。さらにこの結果を用いて,元の問題の解の存在とその安定性も考察した。パラメータの数が多すぎて,それらの安定性に対する依存性を調べることは来年度の課題である。次に空間二次元の外部近似問題を考察した。球対称な座標系を導入し,半直線上での外部近似問題を考えた。空間一次元の問題と同じく人工的な仮定を設けて,C^1-級の軌道の存在を示した。その軌道に対するパラメータ依存性を調べることは来年度の課題である。さらにその結果を利用して,元の問題の球対称解の存在,安定性の考察も来年度の課題である。空間二次元の問題に対して,球面対称な座標系を導入し,昨年度考察した外部近似問題の性質を利用して球面対称な特異摂動解(局在定常解)の存在を示した。但し,一部において人工的な仮定を設けている。さらに,この解のまわりでの線形化固有値問題を考察した。数値計算によって、非線形項に現れる2つのパラメータを変化させた時,第0モードと第1モードの不安定化が起こることを確認した。残念ながら,Hopf分岐を起こすようなパラメータを見つけることは出来なかった。
動物細胞のホスファチジルセリンの生合成と機能に関する分子遺伝学的研究

1.初年度ホスファチジルセリン(PS)合成酵素に対する抗体を作製した。本抗体を用いることによりPS合成酵素の細胞内存在部位を検討した結果,小胞体膜に存在することを示唆する結果が得られた。今後他の方法によりさらに確認する予定である。2.初年度作製した抗体はPS合成酵素のC未付近のオリゴペプチドを抗原として作製したものである。さらに抗体価の高いものを得るため,異なるオリゴペプチド3種を合成し,これらを用いて抗体を作製した。現在,抗体の精製等を実施中である。3.PS合成酵素を抗体カラムを用いて精製するため本酵素の可溶化を試みた。約20種の界面活性剤を用いて検討したが,酵素活性を保持して可溶化できるものはまだ見出されていない。今後は異なる界面活性剤を混合する等して可溶化条件をさらに検討する。4.初年度遺伝子ターゲティング法によりPS脱炭酸酵素欠損CHO変異株の樹立を試みた。本酵素をコードするゲノムDNAの塩基配列を決定し,これにneo遺伝子を挿入することにより遺伝子破壊を行い,この破壊遺伝子をCHO-K1細胞に導入し,PCR法により目的の変異株をスクリーニングした。段階希釈法により3つの候補株を得た。これらのうち1株を精製し,PS脱炭酸酵素活性を測定した結果,野性株と差が見られなかった。このことは,破壊された遺伝子はもともと不活化されていた可能性を示唆している。今後,もう一方の遺伝子を破壊する方向で研究を発展させる予定である。1.ホスファチジルセリン(PS)合成酸素及びPS脱炭酸酵素に対する抗体の作製を試みた。前者はcDNAの塩基配列から推定されたアミノ酸配列を基にCー末付近のオリゴペプチドを化学合成し,これをウサギ血清アルブミンに結合したものをウサギに免疫して作製した。本抗体を抗原としたオリゴペプチドを用いたアフィニティ-カラムで精製した。精製した抗体を用い,PS合成酵素を過剰発現したCDTー1細胞の膜画分をウェスタンブロット解析をした結果,抗体は分子量約37KDaのタンパク質に結合することが明らかとなった。また,本抗体を用いCDTー1細胞膜を綿疫沈降したところ,PS合成酵素活性の一部が沈澱画分に回収され,同時にこの沈澱画分に先の37KDaタンパク質も回収された。一方,非免疫ウサギの血清できPS合成酵素は免疫沈降されなかった。以上の結果から,得られた抗体がPS合成酵素に対するものであることが示唆された。PS脱炭酸酵素に対する抗体は,CHOーK1細胞から得た本酵素のcDNAを用い,酵素タンパク質を大腸菌に発現させたものを抗原としてウサギに免疫して作製した。現在,抗体の性状を解析中である。2.遺伝子タ-ゲティング法によりPS脱炭酸酵素欠損CHO変異株の樹立を試みた。本酵素をコ-ドするゲノムDNAの塩基配列を決定し,これにneo遺伝子を挿入することにより遺伝子破壊を行い,この破壊遺伝子をCHOーK1細胞に導入し,PCR法により目的の変異株をスクリ-ニングした。段階希釈法により3つの有力候補を得ることに成功した。現在,最終的な精製を行っており,今後,得られたクロ-ンの生化学的解析を開う予定である。1.前年度ホスファチジルセリン(PS)合成酵素に対する抗体を作製した。2.前年度作製した抗体はPS合成酵素のC未付近のオリゴペプチドを抗原として作製したものである。

約20種の界面活性剤を用いて検討したが,酵素活性を保持して可溶化できるものはまだ見出されていない。今後は異なる界面活性剤を混合する等して可溶化条件をさらに検討する。4.前年度遺伝子ターゲティング法によりPS脱炭酸酵素欠損CHO変異株の樹立を試みた。本酵素をコードするゲノムDNAの塩基配列を決定し,これにneo遺伝子を挿入することにより遺伝子破壊を行い,この破壊遺伝子をCHO-Kl細胞に導入し,PCR法により目的の変異株をスクリーニングした。段階希釈法により3つの候補株を得た。これらのうち1株を精製し,PS脱炭酸酵素活性を測定した結果,野性株と差が見られなかった。このことは,破壊された遺伝子はもともと不活化されていた可能性を示唆している。今後,もう一方の遺伝子を破壊する方向で研究を発展させる予定である。