hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
受精から胚盤胞期胚までの胚特異的な損傷修復機構と放射線感受性の研究

本研究は、放射線被ばくが着床前期発生過程に与える影響について明らかにすることを目的に、マウス受精卵を用いて着床前期の放射線高感受性期の特定および放射線に対する胚の細胞応答性について検討した。まず、着床前期の放射線高感受性期を特定するために、媒精後0.5 Gyのガンマ線を照射し、胚盤胞期胚への発生率を観察した。その結果、ある一定の照射区で有意に発生率の低下を示した。さらに、同照射区で異なる線量の放射線を急性照射し、胚発生を観察したところ、照射線量によって2つの発生停止時期が存在することが明らかとなった。これらの結果から、照射線量によって胚の細胞応答性が異なることが示唆された。哺乳動物において、受精直後から胚盤胞期までの着床前期は放射線に対して高感受性期であると考えられている。しかしながら、着床前期の放射線に対する損傷修復の詳細な分子機構についてはほとんど明らかにされていない。本研究では、着床前期発生過程における放射線高感受性期の特定および高感受性期における損傷修復の分子機構について明らかし、最終的に、哺乳動物の着床前期における放射線被曝に対する胚特異的な損傷修復の分子機構の解明ならびに妊娠期におけるリスク評価につながる知見を獲得する。研究計画として、1)着床前期発生過程における急性放射線照射による放射線高感受性期の特定、2)着床前期発生過程の急性照射による損傷修復の分子機構の解明、3)着床前期発生過程の慢性放射線照射による損傷修復の分子機構の解明を挙げた。平成27年度では、1)の着床前期発生過程における急性放射線照射による放射線高感受性期を特定した。次に、研究の方向性から、平成28年度の研究実施計画に挙げているEdU(5-エチニル-2'-デオキシウリジン)の取込みを利用した感受性期での放射線照射がDNA複製期に与える影響について検討した。また、放射線照射胚の着床後の影響について検討するため、放射線高感受性期に放射線照射した胚を用いて胚移植を行った。並行して、研究計画2)の着床前期発生過程の急性照射による損傷修復の分子機構を解明するため、初期胚のタイムラプスイメージングの系を確立した。研究計画2)で使用するATM及びp53の遺伝子欠損マウスが必要匹数準備できたため、年度を繰り上げて実験を行った。研究計画1)では、マウス受精卵における放射線に対する高感受性期を特定し、その時期の放射線照射がDNA複製期に与える影響についても明らかにした。しかしながら、胚移植を用いた放射線が着床後に与える影響については、技術面で不十分な点もあり、現在まで明確な成果を得られていない。また、初期胚のタイムラプスイメージングの確立は、予定していたよりも多くの時間を費やしたが、明視野でのタイムラプスイメージングによる形態学的観察を可能とした。ATM及びp53の遺伝子欠損マウスを用いた検討においても、順調に進行している。哺乳動物において、着床前期は放射線に対して高感受性期であるといわれている。しかしながら、その時期の放射線に対する詳細な損傷修復機構についてはほとんど明らかにされていない。本研究では、着床前期発生過程における放射線高感受性期の特定および高感受性期における損傷修復の分子機構について明らかにする。平成27年度では、実験11「急性放射線照射による胚盤胞期胚への発生率の検証」に関して、受精直後での急性放射線照射による高感受性期を明らかにした。また、その時期の放射線照射がDNA複製期に与える影響について明らかにしている。実験21「タイムラプスを用いたイメージングによる放射線照射胚の分裂動態の観察」では、受精卵でのタイムラプスイメージングを確立し、放射線照射後の受精卵の胚盤胞期までの経時的な観察を可能にした。平成28年度は、まず、実験12「急性放射線照射による着床後の発生率の検証」では、胚盤胞期胚の子宮への移植を試みた。そして、実験21に関連して、平成27年度に行ったタイムラプスイメージングの結果から、受精卵から8細胞期胚までの各細胞の分裂時間を算出した。また、平成27年度では、分裂動態を観察するために電気穿孔法を用いてHistone H2Bを可視化するHistone H2B-mCherry mRNAの導入を試みたが、電気穿孔法では導入効率が低かった。そのため、代替策として平成28年度はマイクロインジェクションによるmRNAの導入を試みた。実験12では、産仔率の影響を見るために子宮への胚移植の技術向上を目指したが、予想以上に難航した。実験21に記載の「タイムラプスイメージングにより放射線照射胚の分裂動態の観察」において、平成27年度ではマウス受精卵への電気穿孔法による蛍光タンパク質を融合させたHiston H2B mCherry mRNAの導入を行なったが、導入効率が低かったため、平成28年度はマイクロインジェクションによる導入を試みた。しかしながら、マイクロインジェクションの技術の習得に時間がかかってしまい、現在のところ結果が得られていない。妊娠期における放射線被曝影響は、発生過程によって異なり、中でも着床前期発生過程は放射線に対して感受性が高い。本研究では、放射線被曝が着床前期発生過程に与える影響について明らかにすることを目的に、マウス受精卵を用いて着床前期の放射線高感受性期の特定および放射線に対する胚の細胞応答性について検討した。まず、着床前期の放射線高感受性期を特定するために、媒精後0.5 Gyのガンマ線を急性照射し、胚盤胞期胚への発生率を観察した。また、この結果は、持続(慢性)照射においても同時期に放射線に対して高感受性を示した。

さらに、同照射区で異なる線量の放射線を急性照射し、胚発生を観察したところ、照射線量によって2つの発生停止時期が存在することが明らかとなった。2つの発生停止時期は、タイムラプスイメージングのデータからも支持された。これらの結果から、照射線量によって胚の細胞応答性が異なることが示唆された。一方、DNA損傷修復関連遺伝子の1つであるATM変異マウスを用いた同様の実験では、現在のところ、野生型と比較して大きな変化は認められなかった。今後は、2つの発生停止時期に着目し、これらの時期に停止した胚での遺伝子発現の違いを検証する。本研究は、放射線被ばくが着床前期発生過程に与える影響について明らかにすることを目的に、マウス受精卵を用いて着床前期の放射線高感受性期の特定および放射線に対する胚の細胞応答性について検討した。まず、着床前期の放射線高感受性期を特定するために、媒精後0.5 Gyのガンマ線を照射し、胚盤胞期胚への発生率を観察した。その結果、ある一定の照射区で有意に発生率の低下を示した。次年度は、27年度の研究計画の一部と28年度の研究計画を実施するため、胚移植等の技術面での向上を目指す。また、研究実施計画に記載したmRNAの胚への導入法が電気穿孔法では導入効率が悪いため、マイクロインジェクションによる導入を試みる。並行して、導入するmRNAのプラスミド構築及び合成を行い、本研究を遂行する。実験12に関しては、子宮移植は着床できる胚が少なくなるため、産仔率を検討する実験には適さないと判断し、2細胞期胚で卵管に移植することに変更する。実験21に関しては、着実に技術は向上しているので継続して行う。また、導入するmRNAの精製度が導入後の胚発生に影響を与えることがわかったのでその点に注意し、実験を遂行する。発生工学
海馬・網膜神経細胞におけるDNA損傷フォーカスの可視化と放射線・ストレス影響評価

放射線や生体に生じる内外のストレスの結果として、細胞内の活性酸素種(ROS)産生が高まり、核内のDNA損傷が引き起こされる。脳虚血や緑内障に伴う低酸素血症でも、放射線と同様にDNA2本鎖損傷フォーカスを形成することが報告されている。この損傷部位に集積する53BP1タンパク質にGFPを融合させたセンサータンパク質をマウスに発現させ、生きた神経組織でのDNA損傷応答を観察することを試みた。増殖する培養細胞とは異なり、分化した神経細胞の組織内ではDNA損傷応答が抑制されていることが明らかとなり、分化した組織の特殊性が明らかとなった。生体内で生きたまま細胞内に引き起こされるDNA損傷を検出するために、53BP1-GFPを発現するマウスの解析を行ってきた。これまでの解析では大脳・海馬の神経細胞と網膜の視神経細胞での53BP1-GFPの高発現を認め、それらの組織における蛍光観察法の確立を試みた。本年度においては、特に生きた組織片として、海馬を振動刃ビブラトームを用いて薄切切片の切り出しを行い、海馬とその周辺組織におけるDNA損傷誘導薬剤ならびに放射線による応答の変化を検討した。まず、グラスボトムディッシュの中で短期間の培養を行った海馬切片において、放射線類似薬剤を投与しながらタイムラプス顕微鏡撮影に成功した。その結果、海馬とその周辺組織である海馬采の細胞において、海馬ではDNA損傷修復応答として通常の細胞で観察される53BP1のフォーカス形成が起きないことが観察された。一方海馬采の細胞では、通常と同様のフォーカス形成がなされていた。また、マウスに放射線照射を行い、その後に脳組織を切り出してDNA損傷応答の違いを検討した。この結果でも53BP1-GFPのみならず、gammma-H2AXに関しても同様なフォーカス形成の差異が認められている。このことは、海馬とそれ以外の細胞で、明らかにDNA損傷修復応答が異なることを示しており、小児脳腫瘍患者に対する放射線治療などで観察される副作用の記憶障害等に関与している可能性が示唆された。本年度は、EGFP-53BP1マウスのトランスジェニックマウスの純系統の作成を試みてきたが、次第に繁殖力が低下し、十分なマウスが得られなくなった。導入した遺伝子のホモ化による影響と考えられる。この系統での純化の影響を回避するため、c57BL/6とバッククロスを行い、c57BL6系統のマウス作成を継続している。また、網膜神経節細胞(RGC細胞)の単離と分散培養法を確立するために、パニング法を用いたRGC細胞培養法の条件検討を行った。これまでのラット神経節細胞培養法をマウスへ応用したが、ラットで用いる抗体がマウスでは十分に機能せずに、ラットほど純粋なRGC細胞の単離ができなかった。最終的には、Thyー1抗体による分離を諦め、多少非RGC細胞を含む条件下でのRGC細胞の培養には成功することができた。このマウスRGC細胞に対して、放射線類似のDNA損傷を誘導するネオカルシノスタチンを用いたところ、EGFP-53BP1のフォーカス形成は、通常の培養細胞に認められるものより、かなり遅れてフォーカス形成がなされていることが予想された。このことは、RGC細胞のように高度に分化した細胞では、DNA損傷に伴うフォーカス形成が培養細胞などの増殖細胞とは異なることが考えられた。今後さらに実験を繰り返し、増殖する細胞と分化した細胞との違いを明らかにし、組織におけるDNA損傷応答のメカニズムの違いを明らかにしていく予定である。網膜神経節細胞の培養法が、これまでにラットで確立されていた方法がマウスではうまく作動しないことが明らかになった。そのために、かなりの試行錯誤の時間を取られ、目標とした網膜神経節細胞の培養が確立できなかった。Thy-1抗体を使わない方法で、代替となる方法を試みて、未だ不純物となる細胞は含まれるが、RGC細胞の観察は可能となった。今後、同じ条件で実験を続けるとともに、別の抗体を用いることでさらに改善できるかの検討が必要と考えられる。また、マウスの繁殖が非常に遅くなった問題に関しては、現在バッククロスにより改善傾向が認められるが、未だ十分なマウスの数が得られていない。これも今後改良を試みていく。研究代表者の所属機関が、新設の大学に変更になった。そのため、実験動物の繁殖・維持に時間を費やすことになった。マウスに関しては、C57BL/6とのバッククロスを継続して行った。また、新設学部の研究棟ならびに共通実験機器等が揃わないために、神経初代培養、神経組織培養実験の準備が整わなかった。また、レーザー照射による損傷形成やタイムラプス実験によるフォーカス形成観察の至適な実験条件の設定ができなかった。これらに関しては、来年度以降に計画を変更して実施する環境を整えていく。研究代表者の所属機関が、新設の大学医学部に変更となり、大学の研究室、共通実験室、共同利用機器の整備が遅れ、研究の環境が整わなかった。そのため、次年度以降に計画を延長して行うこととした。EGFP-53BP1マウスのトランスジェニックマウスの純系統の作成に関して、c57BL/6とのバッククロスを継続して行い、同系統のF10を得ることができて純化が完了した。このマウスを掛け合わせて、導入したトランスジーンをホモに有するマウスの作成を継続している。

これまでに、EGFP-53BP1マウスから採取した海馬において、特にCA1領域で導入したEGFPの高い傾向を発する海馬神経細胞において、DNA損傷誘導によりEGFP-53BP1の蛍光集積がどのように生じるかの検討を行った。DNA損傷は、共晶点レーザー顕微鏡の405nmのレーザー光を照射することにより行った。その結果、海馬のスライス培養下では培養細胞で見られるようなDNA損傷に53BP1蛍光の集積は認められなかった。しかしながら、海馬神経細胞を組織から分離し分散培養を行ったところ、一部の細胞で培養2ー3日目からレーザー照射によって生じたDNA損傷に損傷フォーカスの形成を認めた。この結果は、組織の中での高度に分化した神経細胞では、DNA損傷後の最初の段階であるDNA損傷応答が抑制されている可能性があるが、それを分散培養下で細胞培養環境を変えることで分化段階が変化し、一部の細胞で培養細胞で認められるようなDNA損傷フォーカス形成が起こることが確認された。増殖する細胞と分化した細胞におけるDNA損傷応答の違いがあることが観察された。放射線や生体に生じる内外のストレスの結果として、細胞内の活性酸素種(ROS)産生が高まり、核内のDNA損傷が引き起こされる。脳虚血や緑内障に伴う低酸素血症でも、放射線と同様にDNA2本鎖損傷フォーカスを形成することが報告されている。この損傷部位に集積する53BP1タンパク質にGFPを融合させたセンサータンパク質をマウスに発現させ、生きた神経組織でのDNA損傷応答を観察することを試みた。増殖する培養細胞とは異なり、分化した神経細胞の組織内ではDNA損傷応答が抑制されていることが明らかとなり、分化した組織の特殊性が明らかとなった。マウスの生きた組織内の細胞において、DNA損傷応答を可視化することを試み、海馬と海馬采の異なる細胞において、DNA損傷誘発の放射線類似薬剤および放射線照射によるDNA損傷応答のフォーカス形成に差異があることを見いだしている。今後の課題として、DNA損傷フォーカスをより詳細に明確に可視化する必要があり、培養条件、撮影条件のより細かい検討が必要となっている。また、観察している神経細胞の種別の判定が未だ成功していない点で、今後実験をを進めていく。また、損傷フォーカスのの定量解析がまだ十分でなく、今後の課題である。マウスの系統の問題を回避するためのバッククロスを継続するとともに、マウス網膜神経節細胞の分離の効率化を目指していく。十分なマウスRGC細胞が得られるようになったのちに、マウス緑内障発症モデルでの実験に移行していく予定である。それまでに、さらに培養系でのRGC細胞での放射線影響やストレス影響の評価も継続して行っていく。研究代表者の所属が、新しい大学に移ったため、現在実験環境が未だ整備されておらず、研究が遅れる可能性が高い。次年度に持ち越す可能性も検討中である。現在、新設の研究教育棟の建設と共同実験施設、実験機器の整備を進めているが、完成予定が2018年2月であり、なかなか実験が進められていない状況である。特に、今回の実験が組み換え実験動物を用いた組み換えDNA実験が申請・認可できる施設に限られるため、マウスの移動も困難であり実験が進まない可能性もある。実験の可能な環境を整備しながら研究を進めていく。
生産性と光学特性に秀でたチューナブル波長選択フィルタの開発と赤外波長域への展開

(1)温度制御型チューナブル波長選択フィルタ(TO-BPF)の性能向上とモジュール化■TO-BPFチップを光ファイバフェルールにコンパクトな実装化および低消費電力化に取り組んだ.昨年度の反省を踏まえ,今年度はフェルール端に断熱溝を設けたファイバ実装TO-BPFを提案し,そのための作製プロセスを検討した.フェルールとBPFチップとの接触面積比30%の場合,消費電力効率35mW/nmの測定結果を得,断熱溝の有効性を実証した.次年度には更なる断熱効率の改善および応答評価を試みる予定である.(2)赤外波長域(0.814μm)にわたる光学定数の高精度評価■波長1.11.65μmの光学定数を測定評価するのに(前年度に適用を試みた)分光光度計の代わりに,広帯域光源と光スペアナ(+光ファイバ,アクロマティックレンズ,波長板,回転検光子)を用い,角度拡がりの小さなコリメータビームによるエリプソメトリーの開発を進めている.■エリプソとは別に,近赤外分光光度計の反射率と透過率の測定結果を用い,逐次分析法により基板材料や薄膜材料の光学定数(n,k)の解析の改善も進めている.(1)温度制御型チューナブル波長選択フィルタ(TO-BPF)の性能向上とモジュール化■マルチキャビティ型TO-BPFの作製を実施したかったが,そこまで行えていない.■TO-BPFチップの消費電力低減のため,断熱構造の導入してその効果を確認できたが,応答速度の評価まで行えなかった.(2)赤外波長域(0.814μm)にわたる光学定数の高精度評価■分光光度計をエリプソ測定に適用するのは困難なため,新たな方法を考案して開発を開始したばかりである.次年度に推し進めたい.■いくつかの試料について(n,k)データベースを公開したかったが実施できず,次年度に持ち越す.(1)温度制御型チューナブル波長選択フィルタ(TO-BPF)の性能向上とモジュール化■波長1.6μmのレーザ光源を入手してTO-BPFの作製と評価■厚い基板を採用してマルチキャビティ型BPFの開発■チップを実装化する際の断熱構造の改良■応答速度の評価■水素リッチa-Si:H成膜(2)赤外波長域(0.814μm)にわたる光学定数の高精度評価■広帯域光源と光スペアナを用いて角度拡がりの小さなコリメータビームによるエリプソメトリーの開発■近赤外分光光度計の反射率と透過率から逐次分析法による解析向上■(n,k)データベースを公開(1)温度制御型チューナブル波長選択フィルタ(TO-BPF)の性能向上とモジュール化■BPF多層膜成膜時の光学モニタ法について,次の改良を行った:1ビーム径の小さなモニタ光の照射,2厚い基板の採用.この改善によりモニタ反射率の挙動を理論値に近づけることができ,半値全幅0.6nmのTO-BPF(シングルキャビティ型)を作製できた.この改良により,今後マルチキャビティ型BPFの開発につながる.■TO-BPFチップを光ファイバフェルールに実装した際の消費電力を低減すべく,次の改良を行ったが,消費電力は低減しなかった:1チップの更なる薄型化(0.2→0.1mmt), 2チップへの断熱溝加工.低減しなかった原因を隻眼線サーモカメラで観察し,チップからフェルールへの熱伝導抑制が十分でないことがわかった.次年度に断熱構造の導入を試みる予定である.(2)赤外波長域(0.814μm)にわたる光学定数の高精度評価■波長0.82.0μmの光学定数を測定評価するため,分光光度計に波長板と回転検光子を組み込んでエリプソトリーの開発を試みた.分光光度計の入射ビームは角度拡がりをもつため,偏光状態の誤差(つまりエリプソパラメータの誤差)が大きいことが分かった.次年度に解決を試みる予定である.■エリプソとは別に,近赤外分光光度計の反射率と透過率の測定結果を用い,逐次分析法により基板試料や薄膜試料の光学定数(n,k)を解析した.吸収が小さな波長領域であれば(n,k)を算出できるが,吸収が大きい場合には計算値が発散してしまう状況である.次年度には,前述のエリプソ開発と並行して,解析の改善を進める.(1)温度制御型チューナブル波長選択フィルタ(TO-BPF)の性能向上とモジュール化■マルチキャビティ型TO-BPFの作製を実施したかったが,そこまで行えていない.■TO-BPFチップの消費電力低減するため,小型化を追求すれば改善がみられると考えていたが予想通りにいかなかった.新たに断熱構造を導入する予定である.(2)赤外波長域(0.814μm)にわたる光学定数の高精度評価■分光光度計をエリプソメトリー測定に適用ための問題点が明らかになった点はよかった.この結果を踏まえて次年度に対策を講じたい.■いくつかの試料について(n,k)データベースを公開したかったが実施できず,次年度に持ち越す.(1)温度制御型チューナブル波長選択フィルタ(TO-BPF)の性能向上とモジュール化

■TO-BPFチップを光ファイバフェルールにコンパクトな実装化および低消費電力化に取り組んだ.昨年度の反省を踏まえ,今年度はフェルール端に断熱溝を設けたファイバ実装TO-BPFを提案し,そのための作製プロセスを検討した.フェルールとBPFチップとの接触面積比30%の場合,消費電力効率35mW/nmの測定結果を得,断熱溝の有効性を実証した.次年度には更なる断熱効率の改善および応答評価を試みる予定である.(2)赤外波長域(0.814μm)にわたる光学定数の高精度評価■波長1.11.65μmの光学定数を測定評価するのに(前年度に適用を試みた)分光光度計の代わりに,広帯域光源と光スペアナ(+光ファイバ,アクロマティックレンズ,波長板,回転検光子)を用い,角度拡がりの小さなコリメータビームによるエリプソメトリーの開発を進めている.■エリプソとは別に,近赤外分光光度計の反射率と透過率の測定結果を用い,逐次分析法により基板材料や薄膜材料の光学定数(n,k)の解析の改善も進めている.(1)温度制御型チューナブル波長選択フィルタ(TO-BPF)の性能向上とモジュール化■マルチキャビティ型TO-BPFの作製を実施したかったが,そこまで行えていない.■TO-BPFチップの消費電力低減のため,断熱構造の導入してその効果を確認できたが,応答速度の評価まで行えなかった.(2)赤外波長域(0.814μm)にわたる光学定数の高精度評価■分光光度計をエリプソ測定に適用するのは困難なため,新たな方法を考案して開発を開始したばかりである.次年度に推し進めたい.■いくつかの試料について(n,k)データベースを公開したかったが実施できず,次年度に持ち越す.(1)温度制御型チューナブル波長選択フィルタ(TO-BPF)の性能向上とモジュール化■厚い基板を採用して,マルチキャビティ型BPFの開発■チップを実装化する際の断熱構造の検討(フェルールに断熱溝加工)■応答速度の評価■水素リッチa-Si:H成膜(2)赤外波長域(0.814μm)にわたる光学定数の高精度評価■分光光度計の入射ビームを(アクロマティックレンズの導入で)平行ビームにすることでエリプソ測定結果の改善を試みる■分光光度計の反射率と透過率から逐次法による解析■いくつかの試料について(n,k)データベースを公開(1)温度制御型チューナブル波長選択フィルタ(TO-BPF)の性能向上とモジュール化■波長1.6μmのレーザ光源を入手してTO-BPFの作製と評価■厚い基板を採用してマルチキャビティ型BPFの開発■チップを実装化する際の断熱構造の改良■応答速度の評価■水素リッチa-Si:H成膜(2)赤外波長域(0.814μm)にわたる光学定数の高精度評価■広帯域光源と光スペアナを用いて角度拡がりの小さなコリメータビームによるエリプソメトリーの開発■近赤外分光光度計の反射率と透過率から逐次分析法による解析向上■(n,k)データベースを公開(理由)消耗品(石英基板や高純度標準ガス)の残量があったので,購入を次年度に変更したため(使用計画)残量に応じて,基板とガスを適切な時期に購入するTO-BPFの設計波長を(これまでの1.55μmでなく)NG-PON2の規格である1.6μm付近に合わせる必要が生じた.しかしレーザ光源を所有していないため,作製できない状況であった.そこで,次年度に波長1590-1600nmをカバーする波長可変光源(中古,100万程度)を購入する予定である.
ウェブを利用した継続可能な能動的学修教材の開発

大学進学率の上昇に伴い、学生の多様化が進み、学習時間の減少も指摘されてきている。いかに学習時間を確保するかは、単位の実質化の議論においても重要な要素となる。本研究では、マーケティングで活用されているゲーミフィケーションの手法を取り入れ、時間や場所にとらわれないウェブを利用した学習教材の開発を行い、これを利用することで学習時間の増加と学習効果の向上を目指している。この結果、アクティブ率は下がることなく推移し、大手SNSに比較しても十分に能動的なアクセスを促す機能を果たしていることがわかった。本研究では、大学・短期大学の進学率が50%を超えた現状において、十分に動機づけがなされていない学生に対して、いかに学修時間を確保させるかについて検討し、ウェブを利用したゲーム性をもった学習教材を開発することで、学修時間の増加を促そうとするものである。このゲーム性をもたせて繰り返し行動を起こさせることは、マーケティングで顧客との関係性強化に利用されているゲーミフィケーションという概念を指している。本年度の計画では、ゲーム性の設計に先立ち、システム定義と開発環境の整備などを行うこととなっていた。開発環境の候補としては、まずサーバー環境として、OSにウインドウズを用いるか、無償のリナックスをベースに行うかの検討を行った。いくつかの検討課題をふまえて、最終的にウインドウズサーバーを土台とし、その上にアプリを開発することとした。そのうえで、実際に運用するハードとしてのサーバーの機種選定を行い、サーバー運用の実績を評価したうえでデル製のサーバー2台を購入した。これらの環境は一度決めると、変更が困難となるため十分な検討時間を確保した。このほか、ゲーム性の設計として、まず題材となるテーマをアンケート調査し、先端の科学技術の中で、いまの学生がどのようなものに興味をもっているのか検討した。多くの学生が、もっとも身近なスマートフォンやタブレットといった情報端末に興味をもっていることがわかった。これはタッチパネルの仕組みを通して電気の学習項目に入れるなど、その他の技術項目についても検討を行った。さらに、現在の学修時間のアンケート調査も行い、これまでなされている調査結果とほぼ似たような結果を得ることができた。近年、学生の学修時間の減少が指摘されており、大学・短期大学への進学率が50%を超えた状態での学生への学修の動機づけは、重要な課題となっている。そこで本研究では、マーケティングにおいて顧客との関連性強化の手段として扱われている「ゲーミフィケーション」という概念を用いた、ウェブによる学修教材の開発を行い、学修時間の増加とそれによる学習効果の向上を目指している。昨年度にハードなどの選定を行い、システム運用の条件を整えた。本年度はこれに続き、ゲーム性の設計などを進めてきた。そこで学生がウェブ等e-learningについて、どのような意識をもっているか、またネットの滞在時間など、資料となるべき各種アンケート調査を実施した。クイズなどを利用したゲーム性の教材が学修への興味を惹起するか確認したところ、75%が役立つと回答し、おおむね想定された数値となった。また、学修の継続への動機づけとしては、コンテンツのわかりやすさより、ログインするごとの加点など、目先の報酬に左右される結果を得たり、他人との進捗状況を確認し、競争的な情報が効果を上げることもわかった。ネットの利用形態では、86%の学生がスマートフォンと回答しており、教材作りではパソコンを念頭においた画面作りではうまく機能しないことが予想される。この点については、次年度への課題となった。各種調査で指摘されている学生の学修時間の減少に歯止めをかけるため、本研究ではマーケティングにおいて顧客との関連性強化の手段に利用されている「ゲーミフィケーション」の手法を援用し、WEBによる学修教材の開発を行い、学修時間の増加とそれによる学習効果の向上を目指している。これまで行ってきたアンケートや、ハード・ソフト両面の調査を踏まえて、当該年度ではWEBプログラムの試作を行い、実際に学生に利用してもらうことで問題点の洗い出しなどを行った。ゲーミフィケーションの応用として、WEB課題に取り組むためにも、まずはログインを促すため、ポイント制度やそれに伴う視覚的な効果を盛り込んだ画面デザインを採用した。また、ゲーム性として、毎日ログインすることで抽選を行い、「アイテム」を与えてポイントの増加やレベルアップを図れる仕組みを盛り込んだ。このほか、学生同士のコミュニケーションの場としての掲示板や、リアルタイムで変化するスコアボードなど、ゲーミフィケーションの概念を応用したものを多く組み入れた。学生に対する試用期間として半期分を当て、その間のログイン状況の調査や課題への取り組みについて調べ、自由記述によるアンケート調査なども行った。それによると、確かにゲーム性の付与による効果が認められ、毎日課題に取り組む姿勢が強まったことがわかった。また、学習課題の解説に関していくつか要望などが出ていることから、それらの改善や画面構成などが、次年度への課題となった。パイロットプログラムが完成し、半期の間とはいえ、実際に300名ほどの学生にWEBプログラムを利用してもらい、その利用状況や課題についてのアンケート調査などを行い、課題のあぶり出しなどが実施できたため。本研究では、WEB上に用意した学修コンテンツに学生自身が能動的にアクセスし、継続的に学修成果を上げられるようにするシステムの構築を目指している。背景にあるのは、近年の大学・短期大学への進学率の増加によって引き起こされているマス化現象に伴い、じゅうぶんな動機づけがなされていない学生が増えており、学生全体の学修時間の確保が喫緊の課題となっているためである。

そこで本システムにおいては、マーケティング分野で顧客との関係性強化に用いられている「ゲーミフィケーション」という概念を援用し、学修コンテンツ内にゲーム性を付与することで、日々のアクセスを促し、ひいては継続的な学修によって成績の向上を図り、さらなる動機づけによる正のスパイラルへ導こうとするものである。ゲーム性の設計や実際の学修コンテンツの作成および実際のプログラム開発などを経て、昨年度にWEBサーバーの試験運用を開始した。アクセスログの解析や利用した学生アンケートを踏まえて、今年度は年間を通して安定的に運用することができた。登録者数290名に対して、1日当たりの平均アクセス数は前期(4月から8月)には291で、後期(9月から12月)は176であった。前期に数が多いのは、成績公開に伴い1000を超えるアクセスがあったためである。また、サイトの公開日から後期試験日まで253日中、各学生の平均ログイン日数は145日であり、57%のアクセス率であった。内訳としては、200日を超えてログインしていた学生数は83名いる一方、10日未満の学生は7名であった。2016年においてメジャーなSNSと比較すると、本システムのアクティブ率(1か月で1回以上利用)は97.6%であり、LINEの96.6%、twitterの70.2%などと比較しても、能動的なアクセスを促すシステムとしては十分に機能している結果が得られた。大学進学率の上昇に伴い、学生の多様化が進み、学習時間の減少も指摘されてきている。いかに学習時間を確保するかは、単位の実質化の議論においても重要な要素となる。本研究では、マーケティングで活用されているゲーミフィケーションの手法を取り入れ、時間や場所にとらわれないウェブを利用した学習教材の開発を行い、これを利用することで学習時間の増加と学習効果の向上を目指している。この結果、アクティブ率は下がることなく推移し、大手SNSに比較しても十分に能動的なアクセスを促す機能を果たしていることがわかった。教材のゲーム性に対する学生の意識調査や、ウェブで学修するというe-learningの継続性に対する動機づけ、ネットを利用するデバイスや利用時間等、各種システム設計に必要なアンケート調査を行った結果、進めてきた教材開発に変更を加える必要性が出てきた。このため、全体の見直しなどを行い、変更のための時間を要するため、進捗状況に遅れがみられている。アンケート調査により、学生の希望する内容がいくつか具体的に判明した。これらを踏まえ、画面構成やビジュアルの改善などを行い、プログラムの全体的な見直しを図りながら、年間を通した利用を行い、その結果をまとめていく。学生の利用状況から、ほとんどの学生がスマートフォンからの利用となっており、できる限り、PC以外からの端末に対応させたものに変更を行っていく。物理教育対象としている学生すべてにパソコンが配布されているため、当初はパソコン利用を前提としていたが、アンケート調査の結果、9割近い学生は慣れ親しんだスマートフォンを利用する結果となった。
適応指導教室における体験的活動が不登校児童生徒の回復過程に果たす役割に関する研究

全国849の適応指導教室に対し,適応指導教室に通う児童生徒の1学期から半年後の3学期末にかけての状況変化を問う調査を実施した。第1次調査(1学期)は,347の教室から2214人分,第2次調査(3学期)は,300の教室から1899人分のデータを得た。(1)半年間の教室活動の結果,指導職員調査では「みんなと相談しながら学習ができる」,「多くの通室児童生徒と会話できる」,「学習について指導員に質問したり相談できる」,「自由時間に友だちと遊ぶことができる」,「自分の考えをみんなに伝えることができる」,「一人で読書や学習などの活動ができる」などの活動状況の諸側面に関してかなりの向上が見られた。(2)適応指導教室に通いながら登校行動もし始めた段階を学校復帰途上の段階と呼ぶ。学校復帰途上の段階の児童生徒が,適応指導教室の支援を離れて,学校のみに通うようになることを「完全」学校復帰と呼ぶと,1学期末に学校復帰途上段階だった,633人中92人(15%)が適応指導教室を巣立って授業に復帰,保健室登校も含めると合計156人(25%)が適応指導教室を巣立っており,半年間の「完全」学校復帰率は25%である。しかし,逆に,19%は適応指導教室にしか通わない状況に逆戻りしている。(3)学校との接触がなく適応指導教室にしか通っていなかった児童生徒1266人では,学校との接触が始まったことを「学校復帰開始」とすると,3学期末までの半年間で,授業への復帰が127人(10%),保健室登校も含めた学校復帰を開始したのは367人(29%)で,半年間の学校復帰開始率は29%である。不登校児童生徒を対象とした自然体験事業(キャンプ)参加前後の行動等の変容について参加者の保護者に対する調査を行った。対象とした体験事業は117事業であるが,教育委員会,適応指導教室,青少年教育施設が連携しあって実施しているものが多かった。事業にはじめて参加するまでの経過期間をみると,保護者が子どもの不登校の兆候を感じてから,平均2年1か月,保護者がはっきり不登校であるとの認識をもってから,平均1年4か月が経過している。兆候を感じてから半年以内の初期の参加者も27人(12.2%)いるが,概ね,不登校の兆候があってから2年程度経過した回復期に体験事業に参加する機会を得ている。効果測定には4件法の尺度12項目を用いて,事前調査から事後1か月調査の間の子どもの変容を検討した。最も向上の見られた項目は,項目「ひとの目を気にしすぎている」で,有効回答者334人中,視線からの解放が33.7%の参加者に見られた。自分が意識する程,他人は自分のことを見たり考えたりしていないのだが,自己に対する客観視は不登校児の多くにとってはむつかしい課題である。野外における集団活動という,直接自分と向き合う必要のない自然な時間の流れの中に身を置き,多くの児童生徒は自己を相対視することが可能になったと考えられる。次いで,多くの参加者に見られた向上は,多い順に「感情の抑制」からの解放が25.6%,「友だちへの電話」の増加が18.9%,「友だちとの外出」の増加が16.6%,「外出行動」の増加が14.6%であった。この調査研究で得た知見を踏まえて,適応指導教室における体験的活動の効果を明らかにするための調査票を作成し,2000年度に調査をする予定である。全国849の適応指導教室のすべてに対して,第1次調査を2000年6月8月に実施したところ,347の教室から回答があった。その347

教室に対して,第2次調査を2001年2月3月にかけて実施,現在回収途中である。調査票は3種類からなり,教室担当者が回答する運営方針等調査票(調査票A),指導職員が在籍児童生徒の状況を一人一人答える通室生現状チェック表(調査票B),児童生徒自身が自分の状況等に答えるアンケート(調査票C)からなる。調査票Aに関して一部分析した結果,例えば,職員が必要性を感じているのに不十分な設備は,多い順に,軽スポーツ室,調理室,面接室,グラウンド,プレイルーム,パソコン室などとなっている。教室の在籍者には中学生が多いが,実際の運営は小中合同が多い。運営方針としては,第1に自主性・自立性の育成,第2に自信の回復,第3に対人関係能力の育成であり,学校復帰の準備や学習面の指導は比較的下位である。しかし,実際の活動内容は日常の活動としては,個人での学習活動と指導職員との会話・相談が多い。集団でのスポーツ活動,野外活動,調理体験などは教室によって頻度の差が大きい。入室の経路については,学校からの紹介が56%で最も多く,家族からの直接の申し出が29%,相談機関からの紹介が15%となっている。以上について沢崎達夫と連名で,目白大学人間社会学部紀要に発表予定である。現在,回収中の調査票B,調査票Cについての第2次調査と,すでに1学期後半に実施済みの第1次調査のデータを比較することにより,児童生徒の半年間の変化が明らかになる予定である。全国847の適応指導教室に対し,適応指導教室に通う児童生徒の1学期から半年後の3学期末にかけての状況変化を問う調査を実施した。第1次調査(1学期)は,347の教室から2214人分,第2次調査(3学期)は,300の教室から1899人分のデータを得た。(1)半年間の教室活動の結果,指導職員調査では「みんなと相談しながら学習ができる」,「多くの通室児童生徒と会話できる」,「学習について指導員に質問したり相談できる」,「自由時間に友だちと遊ぶことができる」,「自分の考えをみんなに伝えることができる」,「一人で読書や学習などの活動ができる」などの活動状況の諸側面に関してかなりの向上が見られた。(2)適応指導教室に通いながら登校行動もし始めた段階を学校復帰途上の段階と呼ぶ。学校復帰途上の段階の児童生徒が,適応指導教室の支援を離れて,学校のみに通うようになることを「完全」学校復帰と呼ぶと,1学期末に学校復帰途上段階だった,633人中92人(15%)が適応指導教室を巣立って授業に復帰,保健室等登校も含めると合計156人(25%)が適応指導教室を巣立っており,半年間の「完全」学校復帰率は25%である。しかし,逆に,19%は適応指導教室にしか通わない状況に逆戻りしている。(3)学校との接触がなく適応指導教室にしか通っていなかった児童生徒1266人では,学校との接触が始まったことを「学校復帰開始」とすると,3学期末までの半年間で,授業への復帰が127人(10%),保健室等登校も含めた学校復帰を開始したのは367人(29%)で,半年間の学校復帰開始率は29%である。
超高性能圧電微小超音波レンジファインダの創製とロボット用センサシステムへの応用

本研究の目的は,圧電薄膜を用いながら,低電圧(例えば3.3V以下)で数mの測距が可能な小型の超音波距離センサーを創り出し,ロボットシステムへの応用可能性を示すことである。次のような要素技術開発および実証実験を行った。(1)クラックフリーの超高性能PZT系単結晶薄膜のSi基板上への形成,(2)PZT用金属エピタキシャルバッファ層の開発,(3)圧電微小超音波トランスデューサ(pMUT)の信号雑音(SN)比を最大化するための理論の構築,(4)pMUTレンジファインダの試作と高性能測距能の実証。この結果,小型で安価なロボット用近接覚センサモデュールやソナーシステムを実現できる可能性が示唆された。1クラックフリーの超高性能理想配向PZT系単結晶薄膜のSi基板上への形成スパッタ急冷法によって形成した正方晶組成c軸配向PZT系単結晶薄膜の性能の高さは,申請者のこれまでの研究によって実証済であった。しかし,c軸配向を強制的に促進させるがゆえに,残留応力によってクラックがしばしば生じるといった問題が生じていた。そこで,成膜温度やスパッタ急冷回数について最適化を行った。その結果,クラックの生じない単結晶薄膜を形成できる条件を見出した。その特性は,e31,f=14.5 C/m^2,比誘電率=250300であり,pMUTレンジファンダーに適した特性を持つことが実証された。2pMUTの信号雑音(SN)比を最大化するための理論の構築pMUTのSN比を最大化するためには,大きな圧電特性と小さな誘電率を両立する圧電薄膜を用いることが望ましいということは定性的に理解されてきた。しかし実際のデバイスでは,機械的熱雑音や電子回路由来の雑音が存在する。これによって,圧電材料の特性が実際にどのように,そしてどれくらいpMUTのSN比に影響を与えるかについては不明瞭であった。そこで,電流や電圧,電荷検出方式のセンサー回路における圧電材料の特性とSN比の関係について理論式を導出した。その結果,いずれの回路においても,申請者の開発した上記PZT系単結晶薄膜は,pMUT用として最適な材料の一つであることが導き出された。3ユニモルフ駆動超音波距離センサーの試作得られた高性能圧電単結晶薄膜を用いた超音波距離センサーの微細加工プロセスの開発を行った。その結果,ユニモルフ駆動型デバイスの試作に成功した。並行して,このデバイスの性能を評価するための電荷検出型回路の試作を行った。PZT系単結晶薄膜の成膜時にクラックがしばしば発生するという問題は,当初予期していなかった問題であったが,成膜条件を見直すことで早期に解決できた。これにより,2016年度内にデバイスの加工プロセスを確立し,一次試作を完了することができた。また,申請者の開発した圧電単結晶薄膜は,pMUT用として最適な材料の一つであることを理論的に導出できたことは,今後の実験的実証のための重要な知見である。さらに,検出回路に関する知見やノウハウの蓄積は,今後センサーシステムを構築する上で必須であるが,これも2016年度内に達成できた。以上より,本研究課題は順調に進展しているといえる。1.PZT用金属エピタキシャルバッファ層の探索これまではSi基板上に酸化物バッファ層を用いていたが,理想的には電極抵抗をより低下させることが望まれていた。そこで,(100)SrRuO3/(100)Pt/(100)Ir/(100)YSZという,金属層も含むバッファ層構造の開発を行った。Ptの(111)方位への自律配向性が強く,酸化物バッファ層よりもプロセスウィンドウが狭かったが,成膜温度や圧力を最適化することでこれを達成した。次に,その上にPZT膜をエピタキシャル成長させ,その性能を評価した。その結果,酸化物バッファ層上と遜色のない高性能指数のPZT系単結晶薄膜の形成に成功した。2.pMUTレンジファインダの試作理想配向PZT系単結晶薄膜を用いた超小型ユニモルフ型pMUTレンジファインダを試作し,測距実験を行った。その結果,閾値を12dBとしたとき,1Vp-pという小さな駆動電圧でも,最大測距距離2m以上を達成した。このような低電圧駆動での長距離測距は,一般的な圧電膜,例えば多結晶PZT薄膜やAlN系薄膜では達成は難しい。低電圧駆動が可能であるということは,デバイスを駆動するための昇圧回路や高耐圧回路を必要とせず,一般的な集積回路の出力電圧で直接駆動できることを意味する。また,AlN系薄膜よりも20倍程度誘電率が大きいので寄生容量に対するロバスト性も高く,実装形態の自由度が高いことも示された。これらの結果から,汎用ICとデバイスからなる安価なロボット用近接覚センサモデュールを実現できる可能性が示唆された。(1)クラックフリーの超高性能PZT系単結晶薄膜のSi基板上への形成,(2)PZT用金属エピタキシャルバッファ層の開発,

(3)圧電微小超音波トランスデューサ(pMUT)の信号雑音(SN)比を最大化するための理論の構築,(4)pMUTレンジファインダの試作と高性能測距能の実証。この結果,小型で安価なロボット用近接覚センサモデュールやソナーシステムを実現できる可能性が示唆された。まず,試作したデバイス単体についての性能評価を行い,申請者のPZT系単結晶薄膜を搭載したpMUTは,従来のものと比較して圧倒的に高性能であることを実証する。次に,用途に合わせて構造や駆動周波数などを最適化したデバイスを作製し,ロボット用分散型センサシステムや画像化システムなどを研究開発する。微細加工学,MEMS,ナノ・マイクロ工学他の汎用的な研究資金によって,消耗品などの物品費や,共通機器使用料などを支払うことができたので,次年度使用額が生じた。翌年度は,初年度の成果を基にデバイスの試作回数を増加し,さらにシステム開発も行う。そのために,スパッタターゲットや消耗品,電子回路などの物品費や,共通機器使用料,実装基盤作製依頼,国際会議での成果発表のための旅費,論文投稿費など,初年度以上に費用が必要と予想される。ゆえに,助成金はこれらに使う予定である。
ヒトヨタケ培養液を用いたフェノール系内分泌攪乱物質除去システムの開発

はじめに回転円板型培養器を用いてヒトヨタケ(Coprinus cinereus)によるペルオキシダーゼ生産を行った。円板枚数と培養液の体積を変化させて、微生物膜の比表面積(微生物膜の面積/培養液の体積)とペルオキシダーゼ生産性の関係について検討したところ、最大ペルオキシダーゼ活性は、比表面積24.5の範囲でほぼ一定となった。また、生産速度は34.5で最も高い値となった。これらの結果から、比表面積を3.5付近に設定した場合に最も高い生産性が得られることが明らかとなった。次に、培養液の入れ替えによる反復回分培養を行ったところ、少なくとも培養液の入れ替え6回目まで高い生産性を維持できることが分かった。なお、反復回分培養での生産性は、既報の文献値と比較して最高レベルであった。次に、ヒトヨタケにより生産したペルオキシダーゼ(培養液)を用いてノニルフェノールの除去について検討した。ノニルフェノールに対する過酸化水素の添加量について検討したところ、モル比で7付近が最適であることが明らかとなった。この値は、フェノール(最適モル比1付近)やビスフェノールA(最適モル比2付近)に比べて著しく大きく、反応機構が異なることが予想された。最適反応温度は、2540°Cであったが、060°Cの範囲では安定した除去率が得られた。pHについては、7付近が最適であり、酸性領域やアルカリ性領域では著しく除去率が低下した。反応後の溶液の急性毒性、エストロゲン様活性について測定したところ、反応前に比べて高い毒性やエストロゲン様活性は検出されなかった。この結果から、ペルオキシダーゼによる反応では有害な物質は生成していないと考えられる。また、反応中間体や生成物についてLC/MSとGC/MSを用いて測定したが、反応生成物の濃度が非常に低いため特定することはできなかった。得られた粗酵素液を用いてフェノール系内分泌撹乱物質の重合沈殿除去を検討した。ビスフェノールAの除去条件を検討したところ、除去率の温度依存性、pH依存性はフェノールと同様であり、過酸化水素の添加量については、フェノールの場合の約2倍が必要であった。また、ビスフェノールA除去後の溶液の毒性を発光細菌を用いて測定したところ、除去率が上がるに連れて毒性は低下し、除去率100%では殆ど毒性は検出されなかった。この結果から、ペルオキシダーゼによる重合沈殿反応では可溶性の有害な副生成物は発生していないことが分かった。上記のビスフェノールAに関する除去条件の検討結果については、化学工学会福井大会で発表した。現在、反応後のエストロゲン活性について測定中である。次に、ヒトヨタケにより生産したペルオキシダーゼの精製度とフェノールとの反応性について検討した。培養液は限外ろ過膜、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いて精製した。生成途中のペルオキシダーゼを用いてフェノールとの反応を行ったところ、精製度が高くなるに連れて除去率は低下した。精製によって除去された不純物の影響を検討したところ、培養液に窒素源(アミノ酸など)として添加したポリペプトンと酵母エキスなどの高分子量物質が影響していることが分かった。これらの不純物は反応生成物(沈殿)によるペルオキシダーゼの失活を抑制する効果があることが分かった。なお、精製したペルオキシダーゼを用いた場合の酵素必要量は、未精製のペルオキシダーゼ(培養液)を用いた場合に比べて4倍程度であった。
増分関係式による土の応力ー歪関係

歪増分は平均主応力増分による部分と偏差応力増分による部分とに分けて与えられるものとして、増分形の応力ー歪関係式を誘導した。試験方法の改良した点は、供試体作成方法では落下法により密詰めにしたものを毛管飽和させ、これを凍結させて三軸セル中にセットし、供試体内の間隙水を炭酸ガスで置換してから再度脱気水を通水させた後に側圧と二重管ビュ-レットの背圧を4段階に分けて1.20kgf/cm^2まで載荷することによって、高飽和度な供試体を得ることができた。また、マイコン制御による三軸試験装置自動制御システムの改良は、既存の応力制御バルブ軸にステッピング・モ-タとドライバを設置し、予め入力させた応力径路値に追随するようにマイコン制御したことである。パラメ-タを決定する時は、等方圧による歪部分である等方圧縮試験から、偏差応力による変形係数のパラメ-タをそれぞれ独立に決定している。ところが、主応力比一定径路や側圧一定径路の場合は、等方圧も偏差応力も同時に変化するにもかかわらず、等方圧縮試験と平均主応力一定試験だけから決定したパラメ-タを用いて応力ー歪関係を表現でき、提案式の妥当性を検証することができた。また、応力出発点が同じで最終応力到達点が同じであるが、途中の応力径路が異なる場合の最終歪の違いを、側圧一定応力径路や主応力比一定応力径路及び平均主応力一定応力径路などの試験結果から、表現できることが検証できた。今後は、等方圧の履歴や偏差応力の履歴の影響や、非排水状態でのダイレイタンシ-現象の解析を行う。
３次元ゲル培養法を応用した角膜神経誘導法の開発

角膜移植やレーシック術後などに生じる神経麻痺性角膜症に対して,正常な神経線維再生を得るために必要な因子とその制御方法開発を目的とした研究である。神経細胞を生体(角膜実質)に見立てた3次元ゲル内培養を試み,ゲル内での神経細胞(PC12)の培養は可能であるが,神経成長因子(NGF)の濃度勾配による神経線維の誘導結果が安定せず検討を続けている。一方で,コラーゲンビトリゲルによる共培養システムを利用して,角膜上皮重層化に三叉神経が必須であることを明らかにした。さらに,Substance PあるいはCGRPがその機能を果たしていることを明らかにした。本研究の究極の目的は,角膜移植や角膜屈折矯正手術であるレーシック術後などに生じる角膜神経再生異常に伴う神経麻痺性角膜症に対する新しい角膜神経再生治療法の開発である。そのために,今回は3次元ゲル培養法を用いた神経線維誘導を評価できる培養システムの確立とコラーゲンビトリゲルを併用した共培養系を用いて神経細胞と角膜細胞(上皮細胞,実質細胞)との相互作用および調節機構を探索することを目的とする。本年度は,1)3次元ゲル内培養法の確立と神経線維誘導因子の検討と2)神経細胞と角膜細胞の共培養システムの確立を予定していたが,コラーゲンゲル内で神経細胞(ラットの三叉神経細胞あるいはPC12)が安定して培養できる条件の決定において,ゲル内での培養条件が不安定で培養法の確立に至っていない。しかしながら,培養条件および方法に変更を加えてPC12に対して神経成長因子であるNerve Growth Factor (NGF)の神経線維伸長の影響を観察したところ神経線維の伸長にNGFの濃度勾配による神経線維の誘導が観察された。今後,条件確立後に種々の誘導因子を用いて,神経線維伸長を顕微鏡下で観察・定量化し評価する予定である。一方,神経細胞と角膜上皮細胞の共培養では,株化神経細胞(PC12)に加えて三叉神経節細胞においてもin vitro系で角膜細胞と共培養を試み,その両者の共培養に成功した。また,これらの神経細胞の存在下では,サブスタンスPやCGRPと同様に,角膜上皮細胞の重層化の促進が観察された。以上より,この研究で見出した共培養系を応用し,3次元ゲル培養に展開することで,生体内の環境に近づけることが可能になり,神経麻痺性角膜症や様々な角膜疾患に対する新しい治療法の開発に結び付く可能性を期待できる。本年度は,1)3次元ゲル内培養法の確立と神経線維誘導因子の検討と2)神経細胞と角膜細胞の共培養システムの確立を予定していたが,コラーゲンゲル内で神経細胞(ラットの三叉神経細胞あるいはPC12)が安定して培養できる条件の決定において,ゲル内での培養条件が不安定で,現時点では培養法の確立に至っていない。条件確立後に種々の誘導因子を含んだディスクをゲルへ置き,神経細胞の線維伸長を顕微鏡下で観察・定量化し評価する予定である。一方,神経細胞と角膜上皮細胞の共培養では,株化神経細胞(PC12)を用いてin vitro系で角膜細胞と共培養を試み,その両者の共培養に成功した。その共培養の方法としては,コラーゲンタイプIビトリゲル膜を用い,その両面に神経細胞と角膜細胞を同時に一定期間培養を行い,その後,角膜細胞内の変化の解析を行った結果,角膜実質細胞では,神経細胞の存在下で実質細胞からのMMP-1の発現が顕著に増加し,さらに炎症性サイトカインIL-6の分泌も増加することを明らかにした。また,神経細胞の存在下で、角膜上皮細胞の重要な機能であるバリアー機能をつかさどる上皮細胞の重層化の促進が見られた。本研究の究極の目的は,角膜移植や角膜屈折矯正手術であるレーシック術後などに生じる角膜神経再生異常に伴う神経麻痺性角膜症に対して,特殊コンタクトレンズによるドラッグデリバリーシステムを利用した角膜神経再生治療法の開発である。