hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
自己フィブリン糊製剤の外科手術への応用使用

自己血輸血、自己フィブリン糊使用を、整形外科、胸部外科以外に形成外科、口腔外科、皮膚科、消化器外科等の臨床各科の手術に際して症例数を重ねてきている。現在までの研究により、術中および手術後の持続的な出血が問題となる血管手術あるいは骨切り術を含む手術において、自己フィブリン糊の使用が、止血に対して特に有用であることが判明している。また、同製剤は、止血効果のみならず、組織修復を促進する効果も認められた。皮膚科あるいは口腔外科、形成外科の植皮手術時に、植皮部位に同製剤を使用した場合に、市販精製製品に比べて、著しく組織修復が速やかであった。皮膚移植等へ広く応用するべく臨床各科と連携し協力を得て症例数の積み重ねを行なっている。以上の如く、臨床応用は進んできたが、自己フィブリン糊を汎用するためには、出血を有意に減少させる得ることを示す客観的な成績が必要である。しかしながら、手術対象疾患、対象患者、術式、術者の相違により、手術時の出血量は、大きく変動する。臨床各科と共同で、これらの要素を加味した症例の検討の最終的な統計処理に入っている。現在の自己フィブリン糊製剤は、冷凍保存した患者血漿を解凍して得られるクリオプレシピテート粗分画を遠心分離、濃縮して用いている。市販精製品よりも組織修復に優れている理由は、フィブリノーゲン、血液凝固第XIII因子など以外に血管内皮細胞への白血球の遊走、接着を促進する因子等が濃縮されていると想定される。血漿中からクリオプレシピテート分画中で、各因子が、実際にどの程度、濃縮されているか解析中である。整形外科,胸部外科の他、形成外科、口腔外科領域の手術に於いて、自己血輸血、自己フィブリン糊の症例を重ねている。各病例毎に、自己血採血による貧血の程度、また貧血からの回復の予測も十分可能である。それに基づいて、自己血採血の計画をたて、同種血輸血回避を計っている。また、血状保存法の最大の問題とされていた、有効保存期間が3週間に限られ、十分な採血量が確保し難いという点も、エリスロポエチンによる造血促進、長期保存液の開発等新たな局面を迎えている。今までの研究により、持続的な出血が問題になり易い、血管外科あるいは骨切りを含む手術において、自己フィブリン糊が特に有用であることが判明している。また。同製剤は、止血効果のみならず、組織修復を促進する効果も認められた。顔面の悪性黒色腫の手術時に、植皮部位に同製剤を使用した所、従来の製品に比ベ、著しく組織修復が速やかであり、ヒキツレ等の問題も全くなかった。皮膚移植等へ広く応用することが期待される。以上のように、臨床応用は進んでいるが、自己フィブリン糊を汎用するためには、出血を有意に減少し得ることを示す客観的な成積等が重要と思われる。しかるに、手術対象疾患、術式、術者等の相違によって、手術時の出血量は大きく変動する。臨床各料と共同で、これらの要素を固定した症例で、比較検討していきたいと考えている。現在のフィブリン糊製剤は、冷凍保存した患者血漿を手術前日夕方に冷蔵庫に移し、緩徐に解凍し、浮遊してくるクリオプレシピテートを遠心分離・濃縮している。但し、最後に濃縮成分を単離する際、血漿を別バッグに移す操作を行なっている為、濃縮が不十分になる傾向がある。遠心底部よりのクリオプレシピテートを採取する等の方法を検討中である。
法歯学・法医学を支援する画像ベース個人識別技術の開拓

本研究課題では,離散フーリエ変換により得られる画像の位相情報に着目する超高精度画像マッチング技術(位相限定相関法)を基本として,口内法歯科X線画像などの2次元X線画像データの自動照合技術,CTやMRIなどの3次元画像データの自動照合技術.2次元-3次元異種画像データの自動照合技術を開発した.これらの技術は,法歯学・法医学を支援する基盤であり,大規模な性能評価実験を通して有効性を実証した.本年度は,下記の3項目に関する研究開発を実施した.(i)前年度に開発した照合アルゴリズムの高速化および大規模データベースを用いた性能評価実験を行った.高速化では,MATLABスクリプトのC言語化・GPGPU (General-Purpose computing on Graphics Processing Units)対応により,MATLAB実装で1ペアあたり約4秒程度の処理時間を,0.1秒以下に高速化した.性能評価実験では,歯科医院で実際に診療に用いた数年分の口内法X線画像(1万枚以上)を使って,大規模災害を想定した実験を行い,照合アルゴリズムの身元確認における性能を総合的に評価した.(ii)前年度に開発したボリュームデータの照合アルゴリズムを拡張し,ボリュームデータの非剛体変形に対応した.サブボクセル精度で得られた対応点に対して,非剛体変形モデルを導入することにより,モダリティの異なるデータ(たとえば、CTデータとMRIデータなど)でも高精度に位置合わせおよび照合することが可能となった.さらに、身元確認以外の応用として,各医院から提供される医用データの信頼性の検証に照合アルゴリズムが利用できることを検証した.また、(i)と同様にGPGPUを用いて照合アルゴリズムを高速化した.(iii)前年度に検討した3次元画像データからの整合面探索アルゴリズムと,(i)で開発した2次元X線画像データ照合アルゴリズムを組み合わせることで,2次元-3次元異種画像データを自動的に照合するアルゴリズムを検討した.また、同一人物から撮影した頭頸部CTデータおよび口内法X線画像を用いて性能評価実験を行い,提案アルゴリズムの有効性を実証した.本研究課題では,離散フーリエ変換により得られる画像の位相情報に着目する超高精度画像マッチング技術(位相限定相関法)を基本として,口内法歯科X線画像などの2次元X線画像データの自動照合技術,CTやMRIなどの3次元画像データの自動照合技術.2次元-3次元異種画像データの自動照合技術を開発した.これらの技術は,法歯学・法医学を支援する基盤であり,大規模な性能評価実験を通して有効性を実証した.平成24年度は,下記の3項目に関する研究開発を行った.1. 2次元X線画像データの自動照合技術の確立:これまでに開発している歯科X線画像照合アルゴリズムの高精度化を検討した.正確に歯科X線画像(口内法X線画像およびパノラマX線画像)を照合するためには,高度な歪み補正技術が必要となる.X線の照射角の違い,フィルムの設置位置の違い,頭部位置の違いなどにより,同一人物の同一部位を撮影した画像間であっても非線形な歪みが生じることを確認した.そこで,位相限定相関法に基づくサブピクセル対応点探索アルゴリズムを用いて,画像間を高精度に対応付け,非線形な変形モデルに当てはめることで,画像間の歪みを正確に補正するアルゴリズムを検討した.さらに,変形モデルとして従来よりも高度な非線形歪みモデルを用い,実験的検討を通して照合アルゴリズムを最適化を検討した.2. 3次元画像データの自動照合技術の確立:位相限定相関法の3次元空間拡張を行うことで,ボクセルで表現された臓器などのボリュームデータを照合することを検討した.3次元位相限定相関法は,ボリュームデータの直接的に対応付けるとともに,ロバストで,かつ,サブボクセル精度のボリューム対応付けが可能であることを実験を通して確認した.また,3次元位相限定相関関数のピーク値よりボリュームデータ間の類似度を算出することが可能であることを利用し,ボリュームデータの照合アルゴリズムを検討した.3. 2次元-3次元異種画像データの自動照合技術の確立:2次元X線画像データと3次元画像データを照合するために,頭頚部CTデータから口内法X線画像に整合する断面を検索するアルゴリズムを検討した.当初計画していたとおりに, 2次元X線画像データの自動照合技術,3次元画像データの自動照合技術,2次元-3次元異種画像データの自動照合技術を検討するとともに,性能評価実験を通して,それらの技術の有効性を実証することができた.以上より,おおむね順調に研究が進展していると判断する.今後は,以下に示すように研究を進める予定である.1. 2次元X線画像データの自動照合技術の確立:前年度に開発した照合アルゴリズムの高速化および大規模データベースを用いた性能評価実験を行う.2. 3次元画像データの自動照合技術の確立:前年度に開発したボリュームデータの照合アルゴリズムを拡張し,ボリュームデータの非剛体変形に対応するとともに,高速化を検討する.3. 2次元-3次元異種画像データの自動照合技術の確立:前年度に検討した3次元画像データからの整合面探索アルゴリズムと,1.で開発する2次元X線画像データ照合アルゴリズムを組み合わせることで,2次元-3次元異種画像データを自動的に照合するアルゴリズムを検討する.各種アルゴリズムのGPU実装のために必要となるGPU,高性能PCを購入する予定である.その他に,計算機消耗品の購入,成果発表および資料収集のための旅費に思量する予定である.
外環境浸透圧刺激から微小管脱重合応答に至る植物新規リン酸化シグナル経路の解明

微小管構造の変化は、細胞周期だけでなく外環境の刺激にも影響を受ける。PHS1は植物細胞が高浸透圧ストレスを受けると、αチューブリンをリン酸化し、微小管脱重合を促し、微小管の形成・維持に関与している。本研究では、αチューブリンのThr349がPHS1の標的であることを明らかにした。また、高浸透圧処理で応答する15か所のPHS1のリン酸化部位を同定した。分裂期に高浸透圧ストレスを受けるとき、PHS1を介した微小管脱重合がM期チェックポイント発動に関わり、安全な染色体分配に重要な事が強く示唆された。まずαチューブリンのリン酸化部位を決定するために、PHS1キナーゼ部位-GFPを発現誘導する植物を作出し、免疫沈降後ブタ脳チューブリンのリン酸化を確認し、質量分析(理研・中神博士と共同研究)によりThr349がリン酸化されることを明らかにした。さらに、リン酸化ミミック変異を導入したGFP-αチューブリン(T349D)がほとんど微小管に取り込まれないことを、mCherry-αチューブリンとの蛍光共局在解析により明らかにした。この結果はPHS1の活性の分子メカニズムを解く上で重要である。また、PHS1が引き起こす微小管脱重合の実体が、重合されにくいチューブリンであり、報告のある浸透圧刺激により微小管結合性が低下するMAP65-1のように微小管構造を不安定にする仕組みとまったく異なっており、この結果もPHS1の生理的な役割を追求する上で重要である。また、高浸透圧処理はABAシグナル伝達を活性化するが、ABA添加によりαチューブリンがリン酸化されないことも示した。以上まとめ、current biologyに受理され10月号に掲載された。高浸透圧処理で起こる微小管脱重合の役割に迫るための予備実験を行った。浸透圧処理のひとつ0.8Mマンニトールは、最終的に植物個体に致死性を与えるため、生育可能な濃度を検討した。0.4Mで処理すると、野生型の微小管は壊れた後、時間経過とともにやや束化した微小管配向が回復し、PHS1欠損変異体の微小管は壊れないものの、野生型同様やや束化した微小管配向に変化した。高浸透圧により、PHS1を介さす微小管配向に影響を与えるシグナルの存在が新たに予想された。さらに、浸透圧処理によりPHS1の自己リン酸化部位を確定するため、estradiolによるPHS1-GFP発現誘導植物を作出し、実験の条件検討に入った。前年度までにPHS1がαチューブリンのリン酸化を行うこと、そしてその部位がThr349である事を明らかにした。このリン酸化部位は、微小管重合の際のαβチューブリンダイマー間のコンタクトサイトに当たり、重合を阻害する効果を持つ。また、PHS1を介したチューブリンリン酸化は高浸透圧により誘導する。今年度はPHS1が高浸透圧によって活性化される仕組みに特に注目した。これまでの結果によりキナーゼドメイン以外の部位がPHS1の活性を抑制すること、高浸透圧処理でPHS1自身もリン酸化することから、リン酸化によるPHS1の活性調節が予想された。PHS1にGFPを融合したPHS1-GFPを導入した植物に、高浸透圧処理後GFPで抽出してきたPHS1-GFPの質量分析を行い、リン酸化される残基を複数同定した(理研・中神博士との共同研究)。これら19箇所の候補セリン残基をアスパラギン酸に置換し、一過的発現系を用いて、植物細胞に導入し微小管脱重合アッセイを行ったが、活性化には影響はなかった。高浸透圧でPHS1が活性化され、αチューブリンをリン酸化し、微小管重合が阻害される。このとき、PHS1自身もリン酸化されるので、PHS1の活性がリン酸化で調節されている事が予想された。PHS1-GFPを導入した植物に、高浸透圧ストレスを与えて、GFPアフィニティー精製を行い、PHS1のリン酸化される部位を19か所同定し、PHS1の活性への影響を調べた。前年度、これら部位のアミノ酸をAspに置換し、一過的発現系を用いて微小管の重合活性を測定したが、どれも活性に影響がなかった。今年度、Asp置換を複数同時に持たせた物、また、Alaに置換し、同様のアッセイを行ったが、野生型と違いがなかった。高浸透圧ストレスを受けると、植物細胞内のCa2+の速やかな上昇が検出され、高浸透圧依存的カルシウム透過チャネルOSCA1がこの分子実体である事が示されている。この変異体では、浸透圧ストレスに対してCa2+の上昇が抑えられる。予備的に、この変異体において、高浸透圧処理後αチューブリンのリン酸化をウエスタンブロッティングで経時的に調べると、変異体では野生型に比べわずかに早くαチューブリンのリン酸化反応が検出された、更なる検討が必要である。今回、分裂期微小管に対する浸透圧ストレスへの影響と、PHS1の関与を調べた。細胞周期G2/M期にタンパク質蓄積がピークに至るCyclinB1の性質を利用し、D-boxを含むCyclinB1;1のN末端をGFP-α-tubulinと融合し、CyclinB1;1のプロモータで発現させる植物体を作出した。0.3Mソルビトール処理すると、恐らくM期チェックポイントの発動により野生型の染色体分離は著しい遅延を示すが、phs1変異体では耐性が見られた。以上の結果から、PHS1を介した高浸透圧

ストレスの微小管の重合・脱重合調節が、分裂期微小管にも関与している事を強く示唆された。微小管構造の変化は、細胞周期だけでなく外環境の刺激にも影響を受ける。PHS1は植物細胞が高浸透圧ストレスを受けると、αチューブリンをリン酸化し、微小管脱重合を促し、微小管の形成・維持に関与している。本研究では、αチューブリンのThr349がPHS1の標的であることを明らかにした。また、高浸透圧処理で応答する15か所のPHS1のリン酸化部位を同定した。分裂期に高浸透圧ストレスを受けるとき、PHS1を介した微小管脱重合がM期チェックポイント発動に関わり、安全な染色体分配に重要な事が強く示唆された。申請の計画どおりに、高浸透圧によってPHS1のリン酸化される部位は同定できた。変異を導入し微小管脱重合アッセイをおこなったものの、それらがPHS1の活性調節にどのような意味を持つのかまでは現在あきらかにできてはいない。また、本年度は長期の出張もかさなり、phs1変異体の詳細な表現型解析についてはほとんど進行できなかった。しかし、解析に必要な植物の作出については進行させる事はできた。植物分子細胞生物学高浸透圧刺激によって迅速に細胞内カルシウムが上昇し、この上昇に関わるカルシウムチャネルが報告された。PHS1を介したチューブリン酸化も高浸透圧処理により比較的早くに起こる。この変異体とPHS1との遺伝学的関係や、チューブリンリン酸化に関与しているかを調べる。また、細胞内カルシウムの濃度をモニターできる蛍光タンパク質を用いて、高浸透圧、カルシウム、微小管の脱重合の相関性について調べる。今年度に明らかにされたリン酸化部位に対して、今度はPHS1の不活性化に関与していないかを調べる。当初申請した計画の順番とは異なり、二つの研究がほぼ並行に進んでいる。当然、一つ一つで考えると遅れ気味だが、総じて最終的な目標に向かい順調に進行している。また、PHS1を中心とした分子機構について大きな枠組みを今年度論文にまとめ、受理されたことは、最大の進展である。前年度、奈良先端科学技術大学院大学の研究大学強化促進事業により実施する若手研究者海外武者修行制を利用し、アメリカのカリフルニア大学デービス校にほぼ一年間ビジター研究者として出張した。BoLiu教授の研究室に所属し、植物微小管に関与する新規因子の解析、および、今後、私の研究において必須になると考えられるゲノム編集技術についての研究をおこなった。この出張は一昨年の後半に決定したものであり申請時にはわかってなかった。私が出張の間は、本研究に関わる大学院生によって本申請に関係する研究が進められたが、人員配分的に十分に遂行する事はできなかったために、多くの予算を次年度に繰り越す事になった。PHS1タンパク質の活性化機構を考える上で、多くのリン酸化タンパク質と同様、自己リン酸化の仕組みを明らかにすることは非常に重要であると考えられる。現在、PHS1のリン酸化部位を決定するための実験が整いつつある。出来る限り、条件検討を早急に行い、PHS1のリン酸化部位の決定、さらに、高浸透圧刺激との関係を明らかにすることを推進していく。前年度に充分に遂行できなかったPHS1の表現型の特長づけを本年度に行う。
チベット高原における高山植物の環境適応に関わる集団間の遺伝的分化の解明

野生生物の集団の遺伝構造や過去の来歴とともに、集団間の遺伝的分化における選択圧の寄与を明らかにすることを目的とし,適応的遺伝子に関わるゲノム領域と,関わらない中立なゲノム領域の変異の遺伝変異を解析した。チベット高原において標高という環境勾配に着目し,幅広い標高に分布するPotentilla fruticosa L.(バラ科キジムシロ属)を対象とした。野生生物の集団間の遺伝的分化における選択圧の寄与を明らかにすることを目的とし,適応的遺伝子に関わるゲノム領域と,関わらない中立なゲノム領域の変異を比較する。今年度は,中立な領域を調べ、集団の遺伝構造や過去の来歴について明らかにした。チベット高原において標高という環境勾配に着目し,幅広い標高に分布するPotentilla saundersiana RoyleとP. fruticosa L. (バラ科キジムシロ属)を対象とした。標高の高い高原中央部から標高の低くなる北東部にわたる23集団よりサンプリングした。葉緑体DNAのmatK領域の塩基配列を決定し,33個のハプロタイプを見出した。分岐年代の古いハプロタイプは高原中央部の集団のみに見られ,北東部集団には分岐年代の新しい共通したハプロタイプが優先していた。また北東部より中央部の遺伝的多様性が高かった。このことは高標高域の集団の起源が古く、遺伝的変異が蓄積していることを示唆している。適応的遺伝子に関わるゲノム領域を調べるマーカーの開発には,Potentillaに近縁なイチゴの発現遺伝子の塩基配列(EST)情報を利用した。データベースより情報を取得し,シロイヌナズナの塩基配列とアライメントし,相同性の高い領域にプライマーを作成した。作成したプライマーでP. saundersianaでは約30%,P. fruticosaでは約60%の遺伝子の増幅が可能であった。増幅率の違いは系統関係の近さを反映していると考えられる。今後は増幅可能なプライマーを用いて集団内および集団間の変異を探索する。モデル生物の塩基配列情報を利用することで,本来ESTを得るのに必要な作業(mRNAを抽出しcDNAライブラリーの構築を行う)にかかる時間とコストを節約できると考えられる。作成した192対のプライマーのうち約80%(154)で増幅が可能であった。そのうち57領域の塩基配列を決定し、各集団の遺伝変異を中立部位であるとされている葉緑体の遺伝変異と比較した。その結果、Gossypium hirsutum gaiacol peroxidase (pod 1)領域のものは中立部位で見られたパターンと異なることが明らかとなった。本領域は17のSNPが存在したが、中立部位で最も高い遺伝的多様性を示した高標高域の集団では1つの遺伝子型に固定していた。このことから、高標高域の集団では、この領域あるいは近傍の領域になんらかの淘汰圧が働いた可能性が考えられた。
アンジオテンシンII受容体阻害による抗腫瘍効果の検討

我々のおこなってきた研究では、アンジオテンシンII受容体抑制による抗腫瘍効果はマクロファージを介する炎症機序が抑制されるために引き起こされることが示唆された。詳しいメカニズムを解明するために、マクロファージの遊走に重要な役割を果たしているMCP-1 (monocyte echemoattractant prorein-1)の強力な阻害遺伝子である7ND遺伝子を導入したモデルを用いて抗腫瘍効果を検討した。melanoma細胞を用いて検討した。(A)Wild typeマウス(WT)群、(B)WT+7ND導入マウス(7ND)群にわけ、それぞれ腫瘍細胞を皮下投与し、腫瘍増殖を検討した。結果は、7ND群で有意に腫瘍増殖が抑制され、F4/80抗体を用いた免疫染色にて7ND群で有意に組織中のマクロファージが減少しており、ELISAでも7ND群でMCP-1が減少しており、腫瘍増殖においてマクロファージが重要な役割を果たすことが分かった。また、腫瘍増殖後の抗腫瘍効果を見るために同様にマウスmelanoma細胞が増殖したマウスを2群に分け(A)Wild typeマウス(WTα)群、(B)WT+7ND導入(7NDα)群、とし腫瘍増殖を検討した。結果は腫瘍増殖後の7ND投与でも有意に7NDα群で腫瘍増殖を抑制できた。他の腫瘍細胞でも検討を行ったが同様に7ND投与にて腫瘍増殖が抑制され抗腫瘍効果が確認された。このことから、マクロファージを介した抗腫瘍効果は非常に有効なものであり、今後7NDタンパクを作成することで遺伝子治療が可能と考えられ今後検討を進めていく予定である。アンジオテンシンII受容体ノックアウトマウスにおいて内皮型一酸化窒素合成酵素(eNOS)の発現がmRNAレベルで著明に抑制されていることから、次に腫瘍増殖におけるeNOSの関係を検討した。(A)Wild typeマウス(WT)群、(B)eNOS欠損マウス(eNOS)群、(C)WT+L-NAME投与群にわけ、それぞれマウスmelanoma細胞を皮下に接種し腫瘍増殖を比較した。WT群とeNOS群の比較においてeNOS群で有意に腫瘍増殖が抑制されたが、eNOS阻害薬であるL-NAME投与群ではWT群と有意差は認めなかった。このためL-NAMEの投与量を増量し再検討したところL-NAME投与群とWT群との有意さを認めた。今後の臨床応用が可能であるか検討を進めていく予定である。詳しいメカニズムを解朋するために、マクロファージの遊走に重要な役割を果たしているMCP-1(monocyte echemoattractant prorein-1)の強力な阻害遺伝子である7ND遺伝子を導入したモデルを用いて抗腫瘍効果を検討した。マウスmelanoma細胞を培養し継代させ増やした後,(A)Wild typeマウス(WT)群、(B)WT+7ND導入マウス(7ND)群にわけ、それぞれ腫瘍細胞を皮下投与し、腫瘍増殖を検討した。結果は、7ND群で有意に腫瘍増殖が抑制され、E4/80抗体を用いた免疫染色にて7ND群で有意に組織中のマクロファージが減少しており、ELISAでも7ND群でMCP-1が減少しており、腫瘍増殖においてマクロファージが重要な役割を果たすことが分かった。この機序は現在のところ不明であり、今後検討していく予定である。

他の腫瘍細胞でも検討を行ったが同様に7ND投与にて腫瘍増殖が抑制され抗腫瘍効果が確認された。このことから、マクロファージを介した抗腫瘍効果は非常に有効なものであり、今後7NDタンパクを作成することで遺伝子治療が可能と考えられ今後検討を進めていく予定である。アンジオテンシンII受容体ノックアウトマウスにおいて内皮型一酸化窒素合成酵素(eNOS)の発現がmRNAレベルで著明に抑制されていることから、次に腫瘍増殖におけるeNOSの関係を検討した。(A)Wild typeマウス(WT)群、(B)eNOS欠損マウス(eNOS)群、(C)WT+L-NAME投与群にわけ、それぞれマウスmelanoma細胞を皮下に接種し腫瘍増殖を比較した。WT群とeNOS群の比較においてeNOS群で有意に腫瘍増殖が抑制されたが、eNOS阻害薬であるL-NAME投与群ではWT群と有意差は認めなかった。このためL-NAMEの投与量を増量し再検討したところL-NAME投与群とWT群との有意さを認めた。今後の臨床応用が可能であるか検討を進めていく予定である。
視・聴覚受容の【左右差】を基盤とした疾患概念の確立を目指して

脳機能の局在は、系統発生と個体発生の両面から獲得された仕組みと考えられるが、謎が多い。脳は形態的には左右対称であるのに、「優位・劣位半球」という機能的極性が存在する。この極性を獲得する機序として、脳への情報のインプット、即ち、感覚受容器には元来【左右差】が備わっており、結果として脳機能極性を創り出す可能性がある。又、感覚受容の【左右差】が、疾患の発症の「基盤」となっている可能性がある。本研究では、視・聴覚の【左右差】及びそれを生み出す原因として活性酸素種に注目し、【左右差】の存在と疾患における役割を実証し、種々の疾患の発症・進行機序を解明する上での新たな基盤・概念の確立を目指す。
世界最高の電子移動度を示す電子不足型有機半導体高分子の開発

正孔を輸送するp型半導体高分子は数多く存在するが、電子輸送性のn型半導体高分子の報告例は限られている。本研究では、ベンゾビスチアジアゾールという強力電子アクセプター骨格を用いて、有機トランジスタにおいて世界最高の電子移動度を示す高分子を開発する。(1)重合条件の最適化、(2)高分子主鎖の平面性向上、(3)高分子の配向制御、(4)トランジスタの構造最適化により優れた電子輸送を実現する。
ゴルジ体に局在する５回膜貫通蛋白質群YIPFの機能解明

Yip1p, Yif1pは,小胞体ーゴルジ体間の小胞輸送に必須の複数回膜貫通タンパク質である。哺乳類では9種のホモログが存在するが,これらの機能はほとんど理解されていない。本研究では,局在や機能が未解析であるYIPF1, YIPF2及びYIPF6についてその局在と機能を解析した。免疫蛍光染色によってYIPF1, YIPF2及びYIPF6が主としてトランスゴルジ局在することが明らかとなった。また,薬剤や遺伝子発現抑制による実験から,YIPF1とYIPF2がゴルジ体の集合促進に働き,ムチン産生細胞での正常な糖鎖合成に重要な働きを持つことが示唆された。まず,YIPF1, YIPF2, YIPF6を特異的に認識する抗体を作成し免疫蛍光染色でその局在を解析した。いずれの抗体によっても典型的なゴルジ体染色像を得た。ゴルジ体のシスからトランスにかけてのマーカータンパク質と共染色して,それぞれの分布を詳細に解析したところ,YIPF1, YIPF2, YIPF6はシスゴルジには少なく,メディアルゴルジ以降に多く分布していることが明らかとなった。また,YIPF6はゴルジ体のメディアル部位からTGNにかけて広く分布していたが,YIPF1とYIPF2はトランスゴルジからTGNにかけてより多く分布していた。YIPF1及びYIPF2はさらにエンドソーム用の細胞質顆粒状構造にも局在していた。以上のことから,YIPF1, YIPF2, YIPF6は主としてトランスゴルジ局在することが明らかとなった。つぎに,YIPFタンパク質群の間で最も保存性の高いアミノ酸残基(N末端細質領域のR/K,第1膜貫通部位の細胞質側境界のD,第3膜貫通部位のGY)に注目して,これらの残基をAに変異させて細胞に導入し,その効果を解析した。低レベル発現細胞で変異体の局在を観察したところ,野生型との大きな違いは観察されなかった。特にR/K->Aの変異体はほとんど野生型と同じ局在を示した。また,野生型のYIPF1, YIPF2, YIPF6と同様に変異体の過剰発現によってゴルジ体の分散が観察された。一方,D->A, GY->AAの変異体は小胞体に蓄積する傾向を示した。また,YIPF2の野生型は中程度の発現レベルでエンドソーム用の構造に蓄積したが,YIPF2のD->A及びGY->AAの変異体はエンドソーム用の構造への蓄積を示さなかった。したがって,第1膜貫通部位の細胞質側境界のD,第3膜貫通部位のGYがYIPFの局在に重要な役割を担っていることが示唆された。HeLa細胞にYIPF1, YIPF2とYIP6を外来性に発現させたところ,YIP1とYIP2は50%以上の細胞で高効率に発現したが,YIP6は10%以下の細胞で低効率でしか発現しなかった。そこで,YIPF6がERADあるいはリソソームで分解されているかどうかを,阻害剤を用いた実験で確認した。YIPF6をトランスフェクションした細胞をエポキソマイシン処理,あるいはバフィロマイシンA1処理したところ,いずれの処理でもYIPF6の量が増加した。したがって,過剰発現したYIPF6はERADで分解されるとともに,一部はリソソームに輸送されて分解されることが明らかとなった。YIPF1についても同様に,両試薬それぞれでYIPF1の増加が観察され,過剰発現したYIPF1はERADで分解されるとともに,一部はリソソームに輸送されて分解されることが明らかとなった。しかしながら,YIPF2については,いずれの試薬でもタンパク質量の増加が見られなかったため,YIPF1,YIPF6と異なり安定であることが示唆された。一方,内在性のYIPF1, YIPF2, YIPF6の量は,どちらの試薬によっても変化しなかった。したがって,内在性のYIPF1, YIPF2, YIPF6は安定であり,ERADやリソソームでの分解を受けていないことが明らかとなった。以上の結果から,YIPF6の発現量が低い理由として,ERADやリソソームでの分解が寄与していることが示唆されたものの,YIPF1も同様の調節を受けているにもかかわらず,YIPF1の発現量が高いことから,YIPF6は主として合成レベルでの調節を受けていることが示唆された。YIPF6もYIPF1も同じベクターにより同じプロモーター下で発現させているため,タンパク質翻訳レベルでの差がある可能性が考えられた。HeLa細胞にsiRNAを導入してYIPF1, YIPF2及びYIPF6のノックダウンを行った。ウェスタン・ブロッティングによって各タンパク質量を解析したところ,siRNA処理後72時間で,約10%と最大のタンパク質量の低下が観察された。同時点で免疫蛍光染色によってゴルジ体の形態を観察したところ,コントロールsiRNAと比較して有意な形態変化は観察されなかった。ノックダウン細胞をBrefeldinAで1時間処理しゴルジ体の分散を誘導したところ,いずれのYIPFのノックダウンによってもコントロールとの差は観察されなかった。したがって, BrefeldinAで処理によるゴルジ体の分散にはYIPF1, YIPF2, YIPF6は関与していないことが示唆された。

面白いことに,BrefeldinAで処理後,薬剤を洗浄除去し1時間培養したところ,コントロールの細胞ではゴルジ体がリボン状に再構築されたが,YIPF1及びYIPF2ノックダウン細胞では,リボン状への再構築が優位に阻害された。YIPF6のノックダウンではこのような効果は観察されなかった。したがって,BrefeldinA処理後のゴルジ体の再構築においては,YIPF1及びYIPF2は促進的に働くことが示唆された。ムチンを産生するHT-29細胞を用いて,YIPF1, YIPF2及びYIPF6のノックダウンを行い,PAS染色にて糖鎖合成量を解析したところ,YIPF1あるいはYIPF2の発現抑制によって糖タンパク質の合成が低下していることが明らかとなった。一方,YIPF6のノックダウンではこのような効果は見られなかった。以上のことから,YIPF1及びYIPF2は小胞体からゴルジ体への輸送とゴルジ体での糖鎖合成に促進的に働くことが示唆された。Yip1p, Yif1pは,小胞体ーゴルジ体間の小胞輸送に必須の複数回膜貫通タンパク質である。哺乳類では9種のホモログが存在するが,これらの機能はほとんど理解されていない。本研究では,局在や機能が未解析であるYIPF1, YIPF2及びYIPF6についてその局在と機能を解析した。免疫蛍光染色によってYIPF1, YIPF2及びYIPF6が主としてトランスゴルジ局在することが明らかとなった。また,薬剤や遺伝子発現抑制による実験から,YIPF1とYIPF2がゴルジ体の集合促進に働き,ムチン産生細胞での正常な糖鎖合成に重要な働きを持つことが示唆された。YIPF1, YIPF2, YIPF6の生化学的解析が進展して,論文に取りまとめ中である。機能解析の側面では,はっきりした表現系が得られず多少苦戦しているが,今年度中に研究目的が達成できる見通しである。細胞生物学分極細胞,ムチン産生細胞を用いて,YIPFの機能解析を重点的に行う。細胞レベルでの詳細な局在の解析と変異体の解析によって今後の研究の発展の基礎となる結果が得られている。ゼブラフィッシュを用いた個体レベルでの実験系の構築や酵母ツーハイブリッドシステムの実験系の構築も終了した。研究計画変更にともない,サーマルサイクラー(TC)の購入を今年度に延期していたが,今年度も必要度が高くならなかったため購入を見送った。さらなる変異体の作成とその解析,また個体レベルでの解析を進展させる。また,YIPF結合タンパク質のスクリーニングを開始する予定である。研究の進捗状況によっては,来年度にTCを購入することもありうるが,現在の計画では,電子顕微鏡解析の委託等の実験が多く予想されるため,計画を変更して上記金額を来年度に繰り越し,上記の計画にて使用したい。当初計画では,実験の効率アップのためサーマルサイクラーを購入する予定であったが,実験計画の変更のため当初の予定ほどサーマルサイクラーの仕様頻度があがっていないため,導入を次年度以降に見送ることにした。使用頻度の増加によっては,サーマルサイクラーを購入する予定であるが,必要ない場合は実験補助アルバイト雇用による人件費あるいは,必要に応じて消耗品費や業務の外部委託などにあてる予定である。
葉緑体で見出された新しい翻訳様式の分子機構の解析

葉緑体のNADH脱水素酵素の2種のサブユニットをコードするタバコ葉緑体のndhCとndhKのシストロンは、一部重複しており共転写される。ndhC/ndhK mRNAの翻訳をin vitro系で解析したところ、ndhCの翻訳を止めても、ndhKがかなり翻訳されることから、ndhKシストロンの翻訳にはndhCの5'UTRからの翻訳に加えて、新たな翻訳開始の機構があると考えられる。本研究では、上流のndhCシストロンの中央部に存在するAUGコドンから始まるndhKシストロンの翻訳機構を明らかにした。葉緑体のNADH脱水素酵素の2種のサブユニットをコードするタバコ葉緑体のndhCとndhKのシストロンは、一部重複している。一般的には下流のシストロンの翻訳は上流シストロンに比べ極めて低いので、ndhKの翻訳が低いと想定される。ndhC/ndhK mRNAを、われわれが開発したin vitro系で翻訳したところ、意外にもNdhCサブユニットとNdhKサブユニットが等量合成された。上流のndhCの終止コドンを除くと下流のndhKの翻訳は起きないこと、更に、上流の5'UTRとそれに続くAUG開始コドンを除いてndhCの翻訳を止めても、ndhKがかなり翻訳されることを最近発見した。この知見から、ndhKシストロンは二つの機構で翻訳されるとする『1シストロン2翻訳機構』仮説を立てた。本研究では、この仮説に基づく新しい第2の機構の分子機構を、我々の葉緑体in vitro翻訳系を用いて明らかにする。本年度は、タバコ葉緑体のndhKの翻訳は、ndhKフレームに緑色蛍光タンパク質コード領域(GFP)を付けて蛍光で測定し、以下の3点の解析を進めた。1) ndhCシストロン(360nt)を体系的に欠失実験して、第2の機構の必須領域としてndhCシストロンの中央部とndhKシストロン直前部の各々40ヌクレオチドを同定した。2) ndhCのUAG終止コドンを除くと、このndhK翻訳は起きないので、リボソームはndhCフレームを認識して入ると考えられる。ndhCシストロン内に同じフレームのAUGが3個あるので、各AUGの変異実験でndhK翻訳を調べたところ、第2番目のAUGを変化させるとndhK翻訳が止まることを見出した。3)第2番目のAUGから57コドンあり、このORFが翻訳されるかどうかを蛍光リジルtRNAを使って調べた。もし翻訳産物があるとしても極めて少ないと考えられる。mdhC/ndhK mRNAを、われわれが開発したin vitro系で翻訳したところ、意外にもNdhCサブユニットとNdhKサブユニットが等量合成された。本研究では、この仮説の基づく新しい第2の機構の分子機構を、我々の葉緑体in vitro翻訳系を用いて明らかにする。本年度は、緑色蛍光タンパク質コード領域(GFP)を翻訳活性の指標とした解析を行い、以下の進捗があった。1)ndhCシストロン(360nt)の中心部の更なる欠失実験から、リボソームの入口の配列をおよそ20ヌクレオチドに絞り込んだ。2)上の必須領域のすぐ下流にndhCシストロンと同じフレームのAUGが1個あり、このAUGからリボソームが翻訳しながら進んでいくと考えられる。3)ndhK開始コドン直前の必須領域に存在するShine-Dalgarno(SD)様配列に変異を導入するとndhKの翻訳が影響を受けることから、この配列がシス配列であると考えられる。

この知見から、ndhKシストロンは二つの機構で翻訳されるとする『1シストロン2翻訳機構』仮説を立てた。本研究では、この仮説に基づく新しい第2の機構の分子機構を、我々の葉緑体in vitro翻訳系を用いて明らかにすることを目的とした。緑色蛍光タンパク質コード領域(GFP)を翻訳活性の指標とした解析と蛍光標識tRNAを用いた解析から、以下の結果を得て論文発表を行った。1)ndhCシストロン(360nt)中央部のndhCシストロンと同じフレームのAUGがリボソームの第2の入口である。2)このAUGからリボソームが翻訳しながら進んでいくが、翻訳産物は蓄積せず、すみやかに分解されると考えられる。3)ndhK開始コドン直前の必須領域に存在するShine-Dalgarno(SD)様配列が翻訳終結に依存した翻訳再開始のシス配列である可能性がある。ndhKシストロンは二つの機構で翻訳されるとする『1シストロン2翻訳機構』仮説のうち、他には例を見ない新しい第2の機構の分子機構を、我々の葉緑体in vitro翻訳系を用いて明らかにすることが本研究の目的であるが、これまでに、2つの必須領域を同定しており、両者はリボソームの入り口と翻訳再開始のシス配列を含んでいると考えられる。これまでの期間にこのような成果を得たことで目標は十分に達成できており、本研究はおおむね順調に進展しているといえる。24年度が最終年度であるため、記入しない。本年は、主に、蛍光標識リジンtRNAを用いて、必須領域内にあるndhCシストロンと同フレームのAUGからの翻訳産物の検出を行い、リボソームが翻訳しながら進むかあるいはスキャンしているだけなのかを明らかにする。同時にこのAUGからの翻訳とndhKの翻訳の比率を確認する。また、本年は最終年度であるのでこれまでの解析結果をまとめ論文として成果を発表する。
蛋白質結晶の高圧状態凍結トラップ法の開発

蛋白質結晶の高圧結晶構造解析は室温実験が必須であるため,放射光の高輝度X線照射による放射線損傷が問題であった.本研究では,高圧を印加した状態のままで蛋白質結晶を凍結し,それを用いてX線回折実験を行う手法開発を試みた.加圧状態で結晶凍結可能な装置開発には成功した.加圧によって蛋白質結晶から結晶水が滲み出し,凍結時の結晶性低下をもたらすことが判明したが,それを回避する方策は創出出来なかった.前年度に一番の問題点であった液体窒素冷却時にガスケットを保持するクライオピンのXYZステージ部の凍結については,当初ステージにヒーターを設置して保温する方針で改良を試みたが,最終的にはステージを使用しないクライオピンのマウント法を開発して対応することが出来た.同時にこの改良によって装置全体をそのまま蛍光測圧器に搭載出来るようになり,凍結直前のアンビルセル内の圧力をモニターすることも容易になった.また,凍結後液体窒素中から取り出してX線を照射する際,X線装置の低温窒素ガスの吹付による低温維持のため,クライオピンのガスケット保持部もマコール製のピンに改良を行った.高圧凍結のテストは,我々がこれまで室温での高圧構造解析で蓄積しているShewanella属の3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(IPMDH)および大腸菌のジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)で実施した.結晶母液をそのまま圧力媒体として高圧凍結のテストを実施したが,成功率が低かったため,一端結晶周辺の母液を完全に除去して別の液体を圧力媒体とすることを試みた.数種類のフロリナートやフォンブリンオイル等をテストした所,高粘度のパラトンが最適であることが分かった.これらの条件で,同じバッチの結晶を常圧で凍結したものと,本手法で高圧凍結したものと比較すると,格子定数は23%縮んでおり,高圧による圧縮の効果は保ったままで凍結出来ていると考えられる.但し,多くの場合,高圧凍結結晶のモザイク角が約2倍に悪化しており,凍結方法にはさらなる改善が必要である.蛋白質結晶の高圧結晶構造解析は室温実験が必須であるため,放射光の高輝度X線照射による放射線損傷が問題であった.本研究では,高圧を印加した状態のままで蛋白質結晶を凍結し,それを用いてX線回折実験を行う手法開発を試みた.加圧状態で結晶凍結可能な装置開発には成功した.加圧によって蛋白質結晶から結晶水が滲み出し,凍結時の結晶性低下をもたらすことが判明したが,それを回避する方策は創出出来なかった.これまで申請者が実施して来ているダイヤモンドアンビルセル(DAC)を用いた蛋白質の数百MPaの高圧下でのX線結晶構造解析は室温での測定であるため,放射光の高輝度X線の照射によって結晶が放射線損傷を受ける.これを避けて高圧状態の構造解析を実施することを目指して,高圧下で凍結して高圧構造をトラップし,そのまま低温で測定を可能にする方法を開発している.高圧状態の蛋白質構造をそのままトラップすることを可能とするためには圧力を印加した状態のままで結晶を凍結する方法が必要である.交付決定された予算を検討した結果,申請書で提案した2つの方法のうちマイクロチューブを利用する凍結方法の開発は無理と分かったので,DAC型の装置の開発研究に絞ることとした.初年度である平成24年度は結晶を保持するクライオピンとガスケットを共通化し,クライオピンの位置を調整するためのXYZステージを液体窒素外に置く構造を設計した.しかし,液体窒素下で時間を要するとステージが凍り付いて動かなくなってしまったため,断熱材を挿入する構造に改造した.そのためにステージが大型化したため,蛍光測圧器との整合性に問題が生じている.凍結した結晶はクライオピンとガスケットを共通化出来たため,DACを開放すると,結晶周辺の圧媒体を置換しておかなくても,結晶化母液(水溶液)でも,そのまま結晶を容易に取り出せることが出来ることは確認できた.そのまま凍結状態でX線を照射することが出来る.ステージの製作と凍結対策が遅れ,実際の高圧凍結実験による評価が進んでいないため.ステージの断熱に加えてヒーターによる保温を検討し,長期間液体窒素中に保持してもDAC部の開放が容易に行えるようにするとともに,蛍光測圧器との整合性により工夫をし,実際の蛋白質結晶の高圧凍結実験を進める.平成24年度に試作したDAC型凍結トラップ装置のガスケットを保持するクライオピンのXYZステージ部の改良を進め,それを用いて,実際の蛋白質結晶を高圧下凍結トラップし構造解析して評価する.その際,高圧下の構造が凍結後も保持されているかどうかは,我々がこれまで室温での高圧構造解析で蓄積しているShewanella属の3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(IPMDH)等を用いる.また,塩や有機系など出来るだけ多様な結晶化条件で結晶化するいくつかの標準的な蛋白質を用いて,本方法が一般的に可能かどうかも広くテストを行う.
C型肝炎ウイルスの遺伝子発現機構

我々は組換えアデノウイルスの作製法に改良を加え、その作製効率を数十倍にすることに成功し、1年間で世界全体の作製数の約3倍に当たる30以上の組換えアデノウイルスを作製した。この技術を用いて、C型肝炎ウイルス(HCV)の3種の構造蛋白(C、E1、E2)のそれぞれ、あるいはこの3種を同時に発現する非増殖型組換えアデノウイルスを作製した。発現のためのプロモ-タ-としては、強力なSRaプロモ-タ-を用いた。これらの組換えアデノウイルスは、ヒト肝癌由来のHepG2細胞株で目的のHCV蛋白を産生し、少なくとも10日は発現が持続することが、特異的モノクロ-ナル抗体を用いたウエスタン法で確認された。さらに、この3種の構造蛋白を同時に発現する組換えウイルスを10^9PFU、マウスに腹腔内接種を行った結果、2回目までの投与で10匹のマウス全例において3種全ての構造蛋白に対する液性抗体の産生を確認した。10^<10>PFU投与したマウスでは、抗体価の上昇は10^9PFU投与群と同等以下であり、また腹膜炎などの症状が現れるなど、副反応である炎症反応が現れた。この結果は、現在ヒトの遺伝子治療に使われ始めている非増殖型アデノウイルスベクタ-にHCVの遺伝子を組み込むことにより、C型肝炎の生ワクチンを開発する可能性を開いたと考えられる。中和抗体が惹起されるか否かについては、チンパンジ-を用いたチャレンジ試験を行う必要があるが、本研究の結果はこのチャレンジ試験への前段階をクリアしたものと考えられる。
リチウム選択吸着性樹脂の開発と地熱発電熱排水からのリチウムの採取

グリシジルメタクリラート(GMA)-ジビニルベンゼン(DVB)球状共重合体(RG)を希釈剤として酢酸イソブチル(IBA)を用い懸濁重合法により合成した。RGをリン酸と加熱してリン酸型キレート樹脂(RGP)を得た。DVB量を変化させて橋かけ度の異なるRGP7種を合成した。DVB量10mol%、希釈剤量140vol%を用いて合成したRGP(10)-140を用いて3種のアルカリ金属水酸化物(LiOH、NaOH、KOH)についてバッチ法によりアルカリ金属イオン相互間の選択性を評価した。また、比較のためにホスフィン酸型樹脂、ホスホン酸型樹脂についても同様に行った。いずれの樹脂もアルカリ性領域でリチウムに対して選択吸着性を示したが、RGPが最も高選択性を示した。選択性はリチウム>>ナトリウム>カリウムの順であった。次に、DVB量がアルカリ金属イオン間の選択吸着性に及ぼす影響をDVB量2.525mol%と変化させて合成したRGPについて検討した。DVB量が増大するにつれてリチウム吸着量は僅かずつ減少したが、リチウム吸着量とナトリウムおよびカリウム吸着量との差は大きくなった。以上の結果より、RGPは3種のアルカリ金属イオン間で、リチウムに対して最も高い選択性を有し、DVB量が増大するにつれてその選択性が高くなることが明らかとなった。さらに、地熱発電熱排水の模擬溶液(Li^+:0.7mM、Na^+:45.7mM、K^+:3.38mM、Ca^<2+>:0.7mM、pH7.8)からのリチウムの吸着分離についてカラム法により検討した結果、リチウム濃度に対してナトリウムが65倍、カリウムが4.8倍存在する溶液中からでもリチウムが選択的に吸着されることが認められた。以上、本研究において従来の陽イオン交換樹脂とは異なるナトリウムおよびカリウムイオンよりはリチウムイオンに対して高選択吸着性を有する樹脂、RGPを開発することができた。
宿主細胞カスパーゼ活性の制御を介した結核菌のマクロファージ内生存の分子機構

結核菌をはじめとする細胞内寄生性細菌に対する、宿主マクロファージのカスパーゼ活性制御を介した感染防御機構および細胞内生存機構について解析を行い、以下の点を明らかにした。結核菌の感染により、宿主マクロファージのカスパーゼ1活性化が誘導され、炎症性サイトカインIL-1βやIL-18が産生されることがわかった。さらにこの現象には、結核菌の病原性候補遺伝子領域RD1が関与することが明らかとなった。結核菌と同じ抗酸菌であるBCGと、代表的な細胞内寄生菌であるリステリアの感染により、FasL/Fasシグナル系を介してカスパーゼが活性化され、これが炎症性サイトカイン産生に関与していることが明らかとなった。結核菌と同じ抗酸菌であるBCGと、代表的な細胞内寄生菌であるリステリア菌を用いて、宿主防御免疫誘導に重要なIL-18産生におけるFas/FasLシグナル系の関与を検討した。マウス腹腔マクロファージを回収し、in vitroでリステリア菌及びBCGを感染させたところ、Fas遺伝子の発現が誘導された。Fas/FasLシグナル系が宿主の防御免疫誘導に関与するか調べるため、野生型及びFasL機能欠損マウスにリステリア菌を感染させたところ、野生型に比べFasL機能欠損マウスで血清中IL-18の低下とともにリステリア菌排除の低下が認められた。さらに、これらのマウスより腹腔細胞を回収し、in vitroでリステリア菌及びBCGを感染させたところ、FasL機能欠損マウスの腹腔細胞でIL-18の産生が低下した。以上のことから、Fas/FasLシグナル系により産生されるIL-18が宿主防御誘導に関与する可能性が示唆された。現在、機能的IL-18産生には、感染細胞の細胞質内で形成されるinflammasomeと、前駆体IL-18の切断に必要なcaspase-1活性化が重要であることが知られているが、Fas/FasLシグナル系によるIL-18産生には、inflammasome形成に重要なASCが必須であるものの、機能的IL-18産生にはcaspase-1以外のcaspaseが関与する可能性が示された。このように、感染宿主におけるFas/FasLシグナル系を介したIL-18産生には、これまでに知られているものとは全く異なる経路が関与することを明らかとした。前年度に引き続き、結核菌のマウス感染モデルであるBCGと、結核菌と同様に代表的な細胞内寄生性細菌であるリステリアを用いて感染宿主のカスパーゼ応答について解析を行った。これまでの研究により、感染マクロファージではアポトーシス誘導に重要なFas遺伝子発現が誘導され、それを介して炎症性サイトカインIL-18が産生されることを示した。そこで、さらにその機序を詳細に解析する目的で、マウス腹腔細胞を調整し、リステリアを感染させた後、リンパ球応答を調べた所、FasL発現誘導が認められた。そこでリンパ球の役割を明らかにするため、リンパ球を除去してリステリアを感染させたところ、IL-18産生が有意に低下した。このことから、感染によりリンパ球のFasL発現が誘導され、マクロファージのFasシグナル系を活性化することでIL-18産生に至ることが明らかとなった。一方、LPSや加熱死菌体でマクロファージを刺激すると、Fas遺伝子発現が誘導され、さらにFasL発現T細胞株で刺激するとIL-18産生が誘導されることを明らかとしている。そこで、Fasシグナルで活性化された時のマクロファージの細胞死について検討を行った。Fasシグナル系で刺激した後、細胞の形態を電子顕微鏡を用いて観察したところ、アポトーシスに特徴的な核の凝縮や細胞構造変化は認められなかった。以上の結果から、LPSや死菌体で活性化されたマクロファージはFasシグナルによる細胞死に抵抗性であり、カスパーゼ活性化を介して、IL-18産生に至り、宿主防御に作用しているものと考えられた。