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ムスカリン受容体の腸管運動制御におけるＡＴＰ感受性Ｋチャネルの役割とその分子実態

その結果、M3作動性KATPチャネル抑制機構にはGq蛋白質およびPLCが関与しており、同機構はCa2+に対する依存性が低いことが示唆された。同抑制機構は陽イオンチャネルの開口とともに膜の脱分極に寄与していると考えられる。昨年度明らかにしたSKF96365による小腸平滑筋のKATPチャネルおよび電位依存性Kチャネルの抑制効果については学術論文にて公表した。本研究では、腸管に発現することが知られているATP感受性K+チャネル(KATPチャネル)の特徴および平滑筋収縮制御における役割とそのメカニズムについて検討した。その結果、腸管に発現するKATPチャネルは血管平滑筋に発現するKir6.1/SUR2BタイプのKATPチャネルと特徴が似ており、その活性はM3ムスカリン受容体サブタイプにより抑制性に制御されていることが明らかとなった。同抑制機構は、平滑筋の脱分極に寄与し、筋の収縮制御に関与していると考えられる。予定していた検討項目については、ほぼ達成できた。KATPチャネルのアイソフォーム欠損マウスを用いた実験については、RT-PCRや蛍光免疫染色の条件検討に時間がかかり、実験の遂行に遅れが生じているため、おおむね順調に進展しているとした。獣医薬理学次年度は主に、腸管に発現するATP感受性Kチャネルがムスカリン受容体からどのような制御を受け、その制御機構がどのようなメカニズムにより発現するのかについて検討する予定である。すでに、一部、予備実験に着手しているため、円滑に次年度の計画を遂行することができると考えられる。本年度に遂行できなかったノックアウトマウスの計画については、マウスの導入を含め、積極的に準備を進めている。平滑筋細胞において予定していた検討目的については、ほぼ達成できた。カハール細胞の計画に関しては、同細胞が本当にムスカリン作動性腸管運動調節に関与しているのかを明らかにした上で計画を遂行する必要があると判断し、当該研究を優先したため、やや遅れている。そこで、おおむね順調に進展しているとした。次年度は主に、腸管平滑筋細胞やカハール細胞に発現するKATPチャネルの分子実態および同チャネルが腸管運動制御に関与しているのかを明らかにする予定である。一部、予備実験に着手しているため、円滑に次年度の計画を遂行することができると考えられる。現在、本年度に遂行できなかった計画については、遅れを取り戻すべく積極的に実験を進めている。
農村経済学の構築に向けた環境・文化体験サービスに関する市場形成条件の解明

農村資源を活用した多角化経営活動の発展について評価可能とする、経済学的フレームワークを構築した。具体的には、段階的に農村プロダクト・イノベーションが生じるプロセスを理論的に説明するモデルをミクロ経済学に基づいて構築するとともに、酪農教育ファームや農村ツーリズムの実施農家を対象とした実証分析により、その段階的発展のプロセスの存在を裏付けた。(1)新たな農村サービスとして環境・文化体験サービス財の供給サイドとその社会的効果や効用など需要サイドの相互の要因を明らかにするとともに、地域レベルでのコミュニティビジネス形成への発展プロセスや、内発的農村資源利用のイノベーションの発生メカニズムを解明する。(2)上記の成果を踏まえて、市場形成のプロセスやその条件を明らかにして、環境・文化体験サービスを新たな農村ビジネスとして育成するために必要な支援策の方向性を明らかにする。(3)環境・文化体験サービス財の位置づけを明確にして、農村資源利用と保全を図る農村経済多角化の政策的方向性が明確に位置づける。(4)農業政策と農村政策の整合的役割が明確にされるとともに、両政策の統合的展開に関する制度設計について理論的フレームワークを提示する。(5)農村資源利用と管理の経済学(農村経済学)の基本的骨格を構築し、今後の農村経済学の発展の基盤を確立する。今年度については、以下の概要のとおり分析結果を得た。1)農村資源利用による農村ツーリズムの海外文献をレビューして、現在の研究動向およびその水準と今後の研究課題を把握した。その結果、農村文化的資源への関心の高まりが見られることが把握できた。しかし、本研究課題で目指す経済学的なフレームワークの下での分析は、ほとんど見られないことも判明した。2)需要サイドの分析では、わが国のグリーンツーリズムの需要者ニーズを川越市への来訪者に対するアンケート調査結果からコンジョイント分析により解明し、男女別に体験ニーズに差がみられることや食の加工体験への要望が強いことを明らかにした。3)供給サイドの分析においては、千葉県における定年退職者の農村ツーリズムヘの参入のケーススタディを行い、生産力指向ではない退職者ならではの農業の多面的機能を活用した教育効果の高い体験サービスの提供が可能であることを明らかにした。4)市住民の農業体験ニーズに応える市民農園のあり方と今後の展開方向について、千葉県における動向と制度的な枠組み、および先進事例を基に考察を行い、体験型の市民農園を振興する課題について展望した。5)イタリアにおける農村文化資源の活用を図るアグリツーリズムの需要動向について分析を行い、一般のホテル需要と比較し、各国需要者の特徴を分析した。その結果、アグリツーリズムの需要の伸びが高いことや日本人旅行者の宿泊需要は都市部の一般ホテルに偏っていることを明らかにした。1)最近の農村ツーリズムおよび文化地域資源の活用に関する内外の研究成果について、レビューを行い、その動向について把握した。2)農村ツーリズムを実施している農家および漁家にその満足度と地域資源の活用に関する意識との関連性を統計的に分析した結果、両者に正の相関関係が認められることを計量的に明らかにした。このことは、活動において満足をえることが内発的な地域資源利用の契機となることを示しており、本分析結果から、農村ツーリズム振興に関わる政策支援において、この点を留意することの重要性を指摘した。3)農村ツーリズムの需要サイドの分析として、全国を観光行動のデータから、統計的な分析を実施した結果、農村指向を有している旅行者は、文化的な指向性も有していることを明らかにした。4)イタリア・アグリツーズムの需要動向を分析した結果、国内客と外国人客の二つの大きな市場から成立していることが明らかとなった。このことから、インバウンド(外国人客)を受け入れることが重要であることが指摘できる。5)農村道路整備と農村ツーリズムの関連性について、実証的評価を行った。農村道路整備は、従来の農業生産のみの場合と比べて、農村ツーリズムにとって需要創出の効果を有していることを概念モデルと統計的分析により明らかにした。本年度は、過去2年間の本研究課題の成果を踏まえ、農村文化資源活用に関する海外研究者との共同研究を行った。1)農村資源利用の先進事例として、海外共同研究者のノルウエー生命科学大学教授E.Romstad氏と農村文化資源多様性と農村ツーリズムとの関連性について、事例調査を行い理論的側面と実証的側面の両面から共同研究を実施した。2)イタリアのアグリツーリズムにおける農村文化資源利用とその活動状況との関連性について、海外共同研究者のペルージア大学教授A.Ciani氏と実施しているヘドニック価格関数を援用した実証的な評価モデルの構築と計測に関する共同研究のとりまとめを行った。今後さらに共同研究を進展させることとした。3)国内の酪農教育ファームの取り組み状況について、その取り組み実態を調査するとともに、その調査結果を踏まえて体験サービスを取り入れた酪農経営多角化の経営計画モデルを構築して、その経済性について評価し、自立化したサービスとして成立するための条件とその経営的な課題を明らかにした。4)修学旅行の民泊サービスの提供を行っている調査地域での調査結果を基に、農家および漁家による体験サービスの提供による提供者側の意識の変化と地域資源利用のポテンシャルの変化について実証的に評価する計量モデルを構築計測し、その成果についてとりまとめた。

5)もぎ取り果樹園の経営的展開に、農村道路の整備がどのような影響を及ぼすのかについて、アンケート調査結果から計量的な評価を行い、経営多角化へ作用する要因とその展開への課題を考察した成果を国際学会誌に公表した。6)農村資源管理、とくに文化資源に関する国際共同研究の実施について、フランスペルヒニャン大学と合意した。今年度は、単独で行った研究成果と国内での共同研究、および国際的な共同研究の成果を公表した。概要は以下のとおりである。1)イタリア・アグリツーリズムの展開に関して、ヘドニック価格分析を行い、地域資源活用型よりも施設投資型の展開が一般化している点を明らかにした。これは、地域資源を活用したアグリーリズムのジレンマの一つといえる。両者のバランスある展開が必要であることを提言した。この成果は、海外の学術雑誌に公表した。2)タイ人およびブラジル人研究者との農村ツーリズムに関する共同調査を千葉県および山梨県において実施した。その成果の一部については、現在とりまとめ中で次年度に国際学会において公表する予定である。3)我が国農村ツーリズム研究に関する文献レビューを実施して、現在の研究の到達点を明らかにするとともに、今後の研究課題を展望し、共同執筆者と共に日本農業経営学会編集の刊行図書として公表した。4)我が国酪農教育ファームの経営者意識を計量的に分析して、その成果を国際学会で報告した。新たな農村体験サービスの経済的な自立化に向けたプロセスを明らかにした。この研究成果は、段階的なイノベーションの過程を明らかにしたという点で、海外の学会で高い評価を受け、海外学術誌に受理され、現在印刷中である。5)地域ブランド農産物と農村ツーリズム活動との関連性について、計量経済モデルにより解析した。その結果を国内の学会で公表した。農業生産と農村ツーリズムとの関連性を明らかにすることは相互の発展に取って重要な点であるため、この点に関して成果の最終とりまとめを次年度行う。研究期間の最終年度となる本年度の成果は以下のとおりである。1)酪農教育ファームの提供する体験教育サービスに対する経営者の意識を分析して、その経済的自立化に作用する要因を解析した結果、当初はボランティア、次にコスト回収、そして料金徴収という段階で進むことが判明した。このことから、段階的に経済的自立化を進めることが現実的であることを指摘できる。この点で、交流型の経営へ向けて対応可能な経営者能力の向上が必要である。2)我が国の教育旅行における特徴を考察し、体験型のメニューが増加していること、その中で農業体験は、全体の1割に満たない程度であるが、一定の役割を果たしていることが明らかとなった。
ホスト-ゲスト錯体形成を利用する中性分子センサ-の基礎開発

1.膜界面で中性分子であるカテコ-ル類とホスト-ゲスト錯体を形成しうる脂溶性大環状ポリアミン1a,bを感応素子として、ポリ塩化ビニル支持液模型センサ-を作製し、種々のカテコ-ル関連化合物に対する電位応答を、それらのゲストがバルク水相中でほとんど電荷を持たない中性型をして存在するpH条件下で測定した。2.その結果、(i)電位応答のためにはOH基が必要であり、(ii)2つのOH基が隣り合わせに存在するカテコ-ル構造が強い電位応答のために有利であり、(iii)ゲストの疎水性が高いほど電位応答が強いことが見出された。それにより、電荷を持たない中性分子に対する電位応答のメカニズムとして、電極膜界面でのホスト-ゲスト錯体形成に伴う水相へのプロトン放出の可能性が示された。現在FTIR-ATR法による膜界面の直接観測により、プロトン放出メカニズムの直接的証明を試みている。3.膜界面でゲストを取り込みうる疎水性内孔を持つシクロデキストリンの両親媒性誘導体2__の合成を行なった。液膜型センサ-としては特徴的な電位応答選択性は観測されなかったが、LB膜として下地電極上に累積した場合、アニオン性ゲストとの選択的なホスト-ゲスト錯体形成に伴うマ-カ-イオンの膜透過性変化が、サイクリックボルタンメトリ-により観測された。現在中性ゲストに関して同様な応答性を調べている。4.疎水性内孔を持つ純合性ホストであるシクロファンの両親媒性誘導体3__の合成に着手し、環状合成中間体の構造確認まで行なった。
ナノ構造の制御された高誘電体薄膜のCVDプロセス

平成6年度にはペロブスカイト型高誘電体を作成するためのCVD反応装置の作成を行った。特に本反応系では有機金属錯体の制御性のよい気化、輸送が重要であるとの認識から、供給量をin situに測定可能な新規な原料供給装置を設計・作成し、その性能を検証した。またPb酸化物の蒸気圧が高いことにより、Ti酸化物と化学量論的に反応する部分のみが堆積し、原料供給濃度がPb過剰にあるとき、自発的に量論組成が達成される現象が速度論的な解析から明らかにされた。平成7年度は6年度に開発した原料供給系を用い、ペロブスカイト型の高誘電体薄膜の合成を行い、その特性ならびに反応機構に関する検討を進めることを目標とした。固体原料であるピバロイドメタン系錯体の供給量の安定した制御のために、蒸発器内に残った原料の総重量をマイクロバランスによって計測し、その経時変化を追跡した。変化率が蒸発速度に相当しており、その積分値である総変化量から原料のマスバランスを検討し、供給系の安定性を検討することが出来た。改良型の供給系を複数設置することにより、複合系CVDを可能にし、複数の固体原料を効率的に制御性良く供給することが出来るようになった。このCVD原料供給系を用いた円管型外熱式反応器を用いて製膜実験を行いその反応機構を検討した。例えば、PbTiO_3製膜実験では、TiO_2単元系の反応と同様に気相に拡散律速の製膜機構であることが明らかになった。更に、その製膜種の分子サイズを求めたところ、PbTiO_3とTiO_2とでは異なった値を示すことが分った。これは両反応系における製膜中間体が異なっている事を意味している。即ち、Ti系の原料とPb系の原料が気相で反応を起こすことが分かった。以上の例の反応機構を解明する事に必要な効率の良い実験が可能となった。本年度は、ペロブスカイト型高誘電体を作成するためのCVD反応装置を作成した。特に本反応系ではアルカリ土類金属(Ba、Sr)を含む有機金属錯体の制御性のよい気化・輸送が重要であるとの認識から、供給量をin situに測定可能な新規な原料供給装置を設計・作成し、その性能を検証した。供給量と成膜量を測定し、物質収支を検討しつつ供給系の性能を検証していき、その有効性を確認した。また、この供給装置において、Pb系原料の供給状態を検討する内、反応器の材質として広く用いられている石英ガラスがPb酸化物と反応して鉛ガラスを生じることを、偶然に見いだした。これはPb酸化物の反応性が比較的高く、気固反応が生じることによると推察される。反応器の内壁の表面状態が、この様に変化しやすく、さらには物質収支にまで影響を与えることは、通常見逃されている事実である。石英ガラスは多くの研究者によって反応器素材、窓材、基板材として用いられていることを考えると、鉛ガラスの発生は本装置に限らず、一般的に起こっていると考えられるが、これを明示的に確認した報告はなく、重要な知見を得たと考えている。本研究においては、反応器をアルミナ製のものに替えることによって、この問題を解決し、成膜実験を開始した。特にPb系では、アルミナ製の反応器と石英系の反応器では成膜状況が大きく異なっていた。

Pb酸化物の蒸気圧が高い事により、Ti酸化物と化学量論的に反応する部分のみが堆積し、原料供給濃度がPb過剰にあるとき、自発的に量論組成が達成される現象が、速度論的な解析から明らかに示された。本年度は昨年度開発した原料供給系を用い、ペロブスカイト型の高誘電体薄膜の合成を行い、その特性ならびに反応機構に関する検討を進めることを目標とした。固体原料であるピバロイドメタン系の錯体を蒸発させるて供給することとしたため、供給量の安定した制御のためには、従来の蒸発器型の原料供給系を改良して蒸発量のインライン計測を可能にする必要があった。具体的には蒸発器内に残った原料の総重量をマイクロバランスによって計測し、その経時変化を追跡した。変化率が蒸発速度に相当しており、その積分値である総変化量から原料のマスバランスを検討し、供給系の安定性を検討することが出来る。改良型の供給系を複数設置することにより、複合系CVDを可能にした。また、同時に原料の重量変化測定のために用いていたマイクロバランスを低コストのロードセルに変更した。ロードセル出力の温度依存性の問題であったが、これを解決し、複数の固体原料を効率的に制御性良く供給することが出来るようになった。この改良されたCVD原料供給系を用いて円管型外熱式反応器を用いて製膜実験を行いその反応機構を検討した。例えば、PbTiO_3製膜実験では、TiO_2単元系の反応と同様に気相に拡散律速の製膜機構であることが明らかになった。更に、その製膜種の分子サイズを求めたところ、PbTiO_3とTiO_2とでは異なった値を示すことが分った。これは両反応系における製膜中間体が異なっている事を意味している。即ち、Ti系の原料とPb系の原料が気相で反応を起こすことが分かった。以上の例のように反応機構を解明する事に必要な効率の良い実験が可能となった。
低酸素微小環境によるＨＯＸ遺伝子の発現変化とがん細胞浸潤能の増強

これまで、細胞の位置情報の担い手であるHOX遺伝子の発現異常ががん細胞の転移・浸潤能に影響を及ぼすことを研究してきた。本研究では、がん組織内にしばしば存在する低酸素微小環境ががん細胞のHOX遺伝子の一つであるHOXD3の発現を亢進し、転移・浸潤能を増強させること、ならびにHOXD3発現の高いがん細胞は低酸素環境への適応力に優れている可能性を示した。これまでに細胞の位置情報の担い手であるHOX遺伝子のひとつHOXD3の過剰発現がヒト肺がん細胞A549の転移・浸潤能を増強することを見出してきた。一方、固形がん組織においてしばしば存在する低酸素環境は、がん細胞の転移・浸潤能を増強する場合が知られている。そこで本プロジェクトでは、低酸素環境下でのHOXD3の発現とその転移・浸潤能に及ぼす影響、ならびに低酸素環境下におけるHOXD3過剰発現細胞の動態について検討した。その結果,以下のことが明らかとなった。A549細胞を24時間低酸素(1%)環境下で培養すると、低酸素応答遺伝子として知られるGLUT1やVEGFなどの発現が亢進した。また、ルシフェラーゼを利用したレポーターアッセイによって、低酸素環境下におけるA549細胞は低酸素応答領域(Hypoxia response element: HRE)に対してプロモーター活性を示すことが明らかとなった。さらに、A549細胞は低酸素環境下において、E-カドヘリンの発現を低下させ、かつビメンチン発現を増加させる傾向が認められ、低酸素刺激が部分的な上皮ー間葉移行を引き起こす可能性が示された。一方、HOXD3を過剰発現させたA549細胞と空ベクターを導入した対照細胞を比べてみると、HOXD3過剰発現細胞は低酸素環境下におけるHREに対するプロモーター活性が有意に高いことがわかった。これまでに、HOXD3過剰発現A549細胞は対照細胞に比べて細胞運動能が高いことを報告してきた。これらの細胞を低酸素下で培養し、それらの運動能を測定したところ、HOXD3過剰発現細胞と対照細胞間の運動能の差は常圧(21%酸素)でのアッセイに比べ、より大きくなることがわかった。低酸素環境下でのHOXD3の発現とその転移・浸潤能に及ぼす影響、ならびに低酸素環境下におけるHOXD3過剰発現細胞の動態について検討した。ヒト肺がん細胞A549にHOXD3発現ベクターを導入し、樹立されたHOXD3過剰発現細胞(A549-D3)2系とコントロールの空ベクターを導入したmock細胞(A549-mock)2系ならびにベクター導入前の親細胞(A549-Pa)を、免疫不全マウス(Balb/c nu/nu)の背部皮下あるいは肺内に移植した。移植部位にかかわらず、用いた全マウスにすべての種類の細胞は生着した。皮下移植した場合のA549-D3細胞の増殖は、A549-mockやA549-Pa細胞に比べ遅い傾向がみられた。一方、肺内移植した場合には、すべての種類の細胞はほぼ同じ速度で増殖していることがin vivoイメージングで観察された。形成された腫瘍組織を採材し、現在、血管内皮細胞の分布、低酸素領域の分布(HIF-1alpha、CAIX陽性細胞の分布)、およびHOXD3陽性細胞の分布を免疫組織化学的に解析している。また、in vitroにおけるスフェア形成アッセイを実施したところ、A549-D3細胞は低酸素、常酸素圧環境にかわわらず、コンパクトな単一のスフェアを形成したのに対し、A549-mock細胞は多数の小さなスフェアを形成することがわかった。これらの成果は、HOXD3の発現の有無ががん細胞のin vivoおよびin vitroにおける低酸素応答性に関与していることを示唆している。HOXD3過剰発現細胞の低酸素環境下におけるin vivoおよびin vitroの腫瘍生物学的性状を対照細胞と比較しながら明らかにすることができた。一方、xenograftモデルを用いて得られた腫瘍組織標本の免疫組織化学的解析は、技術的な問題があり、HIF-1alphaおよびHOXD3の検出を首尾よく行うことができなかった。そこで本プロジェクトでは、低酸素環境下でのHOXD3の発現とその増殖能、転移・浸潤能におよぼす影響、ならびに低酸素環境下におけるHOXD3過剰発現A549細胞の動態について検討した。平成28年度は、低酸素微小環境における遺伝子発現プロファイルを、HOXD3過剰発現A549細胞と空ベクターを導入した対照A549細胞との間で比較するために、それぞれの細胞からmRNAを抽出した。これらのmRNAを材料として、cDNAマイクロアレイ解析を行い、得られたデータをもとに遺伝子発現プロファイリングを現在行っている。一方で、10株のヒト肺がん細胞株のHOXD3の発現を、RT-PCR法にて調べた。このうちHOXD3発現の高かった株について、HOXD3遺伝子の発現をsiRNAで抑制する試みを行った。現在、RT-PCR法とウエスタンブロット法でHOXD3の発現レベルと他の38個のHOX遺伝子の発現について確認している。また、低酸素刺激によるHOXD3遺伝子の発現

亢進機構については、HOXD3のプロモーター領域のクローニングがうまくいかず、計画どおりに進めることができなかった。平成28年度から職場が北海道大学から北海道医療大学に異動した関係で、実験機器の不備等があり、予定通りに実験を進めることができなかった。これまでに細胞の位置情報の担い手であるHOX遺伝子の発現異常ががん細胞の転移・浸潤能に関与することを見出してきた。一方、固形がん組織においてしばしば生じる低酸素環境はがん細胞の転移・浸潤に対して促進的に働くことが知られている。我々はこれまでにHOX遺伝子の一つであるHOXD3の発現が低酸素環境下で亢進し、浸潤能が増強することを、ヒト肺がんA549細胞を用いて示してきた。本年度研究では、HOXD3過剰発現A549細胞とコントロールの空ベクターを導入したA549細胞との間で、低酸素環境(1%酸素)あるいは常酸素圧(21%酸素)環境下における遺伝子発現プロファイルを解析した。その結果、常酸素圧環境下におかれた場合、HOXD3過剰発現A549細胞は、TGF-β刺激によって転写活性化する遺伝子の発現亢進が認められた。一方、低酸素環境下におかれた場合、コントロール細胞では、HOXD3とHIF-1αの発現が亢進するとともにHIF-1の下流遺伝子であるGLUT1やVEGFの発現亢進がみられたが、HOXD3過剰発現細胞でみられるインテグリンβ3の発現亢進は認められなかった。HOXD3過剰発現細胞を低酸素環境下においた場合、HIF-1αの発現がコントロール細胞を低酸素下においた場合よりも亢進した。また、HOXD3過剰発現細胞は、コントロール細胞に比べ、運動・浸潤能が高いが、低酸素環境下におくと、両者間の運動・浸潤能の差がより顕著となった。これまで、細胞の位置情報の担い手であるHOX遺伝子の発現異常ががん細胞の転移・浸潤能に影響を及ぼすことを研究してきた。本研究では、がん組織内にしばしば存在する低酸素微小環境ががん細胞のHOX遺伝子の一つであるHOXD3の発現を亢進し、転移・浸潤能を増強させること、ならびにHOXD3発現の高いがん細胞は低酸素環境への適応力に優れている可能性を示した。HOXD3過剰発現細胞の低酸素環境下における腫瘍生物学的性状を対照細胞と比較しながら明らかにすることができた。一方、低酸素刺激によるHOXD3遺伝子の発現亢進機構については、HOXD3のプロモーター領域のクローニングがうまくいかず、計画どおりに進めることができなかった。今回行った免疫組織化学的解析でうまく検出できなかった分子については、専門家の意見を仰ぐとともに、抗体およびその処理条件の検討等をはかっていく予定である。1年間の延長が承認されたので、平成29年度には大学の実験共通スペース等を使用して研究を完遂する。腫瘍生物学HOXD3を過剰発現することによる低酸素環境における細胞増殖、生存、運動などの優位性について、腫瘍細胞生物学的ならびにxenograftモデルを使用した病理組織学的な解析をさらに進めていく。HOXD
ポリオウイルス2C蛋白質機能の阻害剤を用いた解析

ポリオウイルス非構造蛋白質2Cのウイルス増殖における役割を特異的阻害剤であるベンズイミダゾール誘導体F-PABを用いて解析し、以下の結果を得た。2.MBP/2CのATPase活性に対する、ウイルス特異的阻害剤F-PABの阻害効果を検討したところ、高濃度で阻害作用が認められた。特異的阻害作用であるか現在検討している。3.F-PAB耐性変異ウイルスを分離することによりF-PAB耐性にかかわるアミノ酸変異部位を同定した。すべてのF-PAB耐性株のアミノ酸変異部位は2C蛋白質上に認められ、Phe-164→TyrあるいはIle-120→Val変異がF-PAB耐性をもたらした。特にPhe-164は主要なF-PAB耐性決定部位であり、変異ウイルスはグアニジン塩酸に交叉耐性を示した。ポリオウイルス感染性cDNAクローンに上記変異を導入しF-PAB耐性発現を確認した。以上の結果は、ベンズイミダゾール誘導体F-PABがポリオウイルス非構造蛋白質2C機能の特異的阻害剤であることを示している。また、ここで作製したMBP/2Cは、F-PABによる2C阻害のメカニズムをin vitroで解析するために役立つことが期待される。
酸化物超構造形成による非自明なスピン構造の創製と異常磁気伝導

酸化物の示す多様な磁気構造の解明と、人工超構造形成を利用した電子スピンの物性開拓を行った。磁気構造では、螺旋磁性体の実空間での磁気秩序を初めての観察や、外部磁場による磁化と分極の同時制御に成功した。さらに、強磁性体に特徴的な異常ホール効果の包括的な理論を構築した。人工構造では、酸化物半導体最高の移動度と量子ホール効果の観測に初めて成功した。電界効果、光照射等を利用して絶縁体を超伝導・金属状態へ転移させることに成功した。コバルト酸化物、マンガン酸化物などを素材として薄膜人工構造を作成し、その磁気輸送特性をはじめとする物性を測定した。さらに、モデル計算および第一原理計算を用い、ルテニウム酸化物をはじめとする系の電子状態を調べた。具体的には、n型半導体であるNb(ニオブ)を微量ドープしたSrTiO3(チタン酸ストロンチウム)(100)基板上にp型半導体であるLa1-xSrxMnO3薄膜をレーザーアブレーション法により堆積させ、ペロブスカイト型酸化物p-nヘテロ接合La1-xSrxMnO3/Nb : SrTiO3を作製した。この接合において、外部磁場を印加することにより電流-電圧特性が低バイアス側にシフトすることを見出した。さらに、10Kでは、ある固定した順バイアス下において、8Tの磁場を加えると接合における微分電流値は二桁変化するが、その変化は温度上昇とともに減衰することを確認した。このヘテロ接合の電気容量の磁場依存性を測定したところ、界面空乏層の変化に伴う、電気容量の大きな磁場依存性が観察された。SrTiO3へのNbのドープ量を変化させたとき、磁場による電気容量の変化は顕著であった。具体的には、0.5wt%NbをドープしたStTiO3を用いると8Tで120%近い変化が得られた。酸化物ヘテロ接合を利用することにより、電気容量を磁場により大きく変調できることから、この接合をコンデンサーとして回路に組み込むことにより、共振周波数を磁場により変調できる。電波信号を受信する際、アンテナが感知する信号の中から希望する周波数の信号を共振向路を用いて拾い出すのは電波工学の基本であり、鎖場により電気容量を連続的に、しかも大きく変えられる本接合は有用であると思われる。実験においては、ペロブスカイト型酸化物を中心とした物質の界面などにおいて発生する異常な磁気状態の探索とその機構の研究を行った。まず、螺旋磁気構造の形成が古くから知られてFe、Co珪化物における磁気秩序の様子を調べた。本研究の特徴は、これまで粒子線回折などの波数空間での情報のみが得られる手法によって調べられていた螺旋磁気構造を、実空間においてローレンツ電子顕微鏡を用いて観測した点である。その結果、螺旋磁気構造のドメインや、転移の様子など、波数空間での観察では得られない情報が明らかになった。また、基礎物性およびデバイス応用の両方の観点から注目されているマンガン酸化物の界面のごく近傍の特性を調べ、ルテニウムを添加することでバルクの値に匹敵する保持力が界面近傍においても保存することを明らかにした。理論においては、モデル計算および第一原理計算を用いて異常磁気状態の研究を行った。まず、通常の半導体界面の形成過程と同様のバンドベンディングの概念が有効であるとし、モデル計算により通常の金属とドープされたモット絶縁体の界面における電子状態を調べた。その結果、界面のモット絶縁体側にきわめて興味深い状態が実現し、界面からの距離に応じて、キャリアのフィリングが整数量子化された領域が実現した。具体的には、界面側からバンド絶縁体・金属・モット絶縁体という三つの界面相が現われることがわかった。さらに、遍歴磁性体の電子状態について、平均場近似を出発点として乱雑位相近似、GW法などの手法を用いて検討を行った。実験においては、磁気秩序が物質の界面においてその電子物性に与える影響、特異な磁気構造(螺旋構造など)と電気分極との秩序変数の結合についての研究を行った。まず、界面状態については強相関電子系のマンガン酸化物と従来型半導体のチタン酸化物との接合を用いその電流-電圧特性が外部磁場に非常に敏感に依存することを見出し、解析を進めたところ障壁高さが外部磁場によって大きく変化していることを見出した。また、非共線的な磁気秩序が形成されたときに誘起されると予想される電気分極について、実験的に磁気秩序と電気分極の相互制御に初めて成功した。具体的には、冷却過程において電場を印加し電気分極方向を反転させ、螺旋磁気構造のスピンの回転方向、つまり時計回りか反時計回りかを制御した。また、磁化と電気分極が同時に発現するコニカル磁気構造に磁場を印加し、磁化が反転するのに伴って電気分極も同時に反転することを発見した。理論においては、モデル計算及び第一原理計算を用いて異常磁気状態の研究を行った。

前述の非線形的な磁気秩序と電気分極の結合ダイナミクスをスピン軌道相互作用を介して検討し新たな励起モードを見出し、電場によるスピン波励起現象を観察するという新たな実験手法を提唱した。さらに、古くから議論されてきた強磁性体の異常ホール効果について、その大きさが伝導機構によって異なる関数で記述されることを導きだし実験と非常に良く一致することを示した。非自明な磁気秩序を持つ物質においてホール効果、ネルンスト効果といった異常磁気輸送現象に関する研究を行った。特にパイロクロア型モリブデン酸化物では、スピンカイラリティー起源によるネルンスト効果の観測に成功し、スピンカイラリティー誘起の異常ホール伝導度がベリー位相理論の予測する散乱確率の冪乗則を示すことを実験的に確認した。縮退n型半導体SrTiO_3と様々な強相関酸化物ABO_3との整流性接合を作製し、容量測定により拡散電位の化学系統性を明らかにした。AB0_3のBが3価から4価に変わることで化学ポテンシャルが約1ev深くなり、Bの元素種がMnからNiへと電子数が多くなることでも深くなった。この化学的トレンドにより、界面デバイスの設計指針が明らかとなった。マルチフエロイックスの微視的機構および、スピン揺らぎの効果を理論的に探求した。磁性由来の電気分極に関し、d電子配置により異なる微視的機構が働くことを明らかにし、その実験による検証方法を提案した。また、スピン揺らぎの効果で、磁性秩序が存在しないスピンカイラル液体相が存在することを理論的に示した。第一原理電子状態計算を基盤として、特異な構造、特異な電子的性質を示す物質の理論的な解析を行った。具体的には、t_<2g>系遷移金属酸化物における電子相関の見積もり、BNナノチューブの電場に対する応答のカイラリティー依存性、ベンゼン分子と遷移金属元素からなるサンドイッチ型分子の磁気的相互作用の解析を行った。遷移金属酸化物界面の極性不連続性の一般性を検証するため、LaVO_3/SrTiO_3ヘテロ界面の輸送特性を評価し、伝導性が終端面の違いによって発現することを確認した。SrTiO_3に紫外線照射下での光伝導度測定から光キャリアが低温で10^4cm^2/Vsに達する移動度を示し、光励起キャリアを試料表面数十nmに閉じ込めた場合、低温・磁場下での電気伝導度は弱局在に特徴的な振る舞いを示し、伝導が二次元性を示すことを見出した。(1)量子ズピシ系の熱ホール効果の理論的研究を行った。絶縁体量子スピン系の磁場下での熱ホール効果が、その基底状態の性質を反映して、(1)ゼロ熱ホール効果、(2)内因性熱ホール効果、(3)ローレンツカによる寿命の2乗に比例した熱ホール効果、の3種類の振る舞いを示すこと、特に、(3)は非閉じ込め相にあるスピン液体独特の特徴であることを見出した。(2)酸化物界面の電子伝導については、(1)完全に絶縁体であるSrTiO_3に有機電解質を塗り電気二重層コンデンサの原理を使って電界効果によりキャリアを蓄積し金属・超伝導化することに成功した。電界効果により超伝導を誘起した初めての例である。(2)ZnO/MgZnO界面の二次元電子ガスの移動度を20,000cm^2/Vsまで向上した。導電性ポリマーとZnOのショットキー全界面による可視光に応答しない紫外線検出器も作成した。(3) (1)マンガン酸化物においては、強磁性金属相と電荷整列相の安定性が不純物元素に大きく依存することを示した。
In vitro再構成による運動性細胞の極性獲得機構の解明

細胞はアクチン線維の重合力で膜を押し広げることで移動する。アクチン線維が膜を押す力の反作用とミオシンの牽引力で、細胞の前から後に向かってアクチンの流れが維持されるために一方向に動けると考えられている。しかし移動する前の細胞は円盤状で、アクチン流動も細胞膜から中央に向かう点対称性を示すため、細胞には前後がない。そこで本研究では、無極性の細胞が一方向に動き出せる仕組みの解明を目的として、カエル卵抽出液を油中液滴に封入した人工細胞系を構築し、アクチン流動の再現に成功した。さらに液滴の直径が小さくなると、アクチン流動が空間非対称化する現象を発見し、転移点がアクチン重合活性に依存することを明らかにした。ケラトサイト等の運動性細胞はアクチン繊維の重合で膜を押し広げ、平板状突起(lamellipodia)を“前"に出すことで移動する。移動中の細胞は、アクチン繊維が膜を押す力の反作用とミオシンによる細胞“後方"への牽引力で、細胞の前から後に向かってアクチン繊維の流れ(retrograde flow)が維持されるために一方向に動ける。しかし基質に接着した直後の細胞は円盤状の形で、アクチン流動も細胞の端から中心に向かう点対称性を示すため、細胞には前後がない。本研究の目的は、無極性の細胞が如何にして前後を決めて一方向に動き出せるのか、その仕組みを解くことである。初年度は、細胞質(アフリカツメガエルの卵)抽出液を液滴に封入した人工細胞系を構築し、液滴辺縁から液滴中央へのアクチンの定常的な流れを発生させることに成功した。さらに、液滴のサイズを小さくしていくと、アクチンの流れが空間的に非対称になる現象を発見した。各種阻害剤を用いてアクチン重合能を変調させると、対称-非対称転移が生じる液滴の直径が変化したことから、アクチン重合の活性度がアクチン流動の非対称性を制御していることが示唆された。安定した品質の細胞質抽出液を調製する技術を習得し、細胞質抽出液を封入した液滴内で界面から中央部へのアクチン流動を再構成することに成功した。続いて、様々な大きさの液滴に細胞質抽出液を封入してアクチン流動を観察したところ、液滴サイズが小さくなるとアクチン流動が非対称化する現象を発見した。さらに、アクチン重合能を各種阻害剤で変化させ、アクチン重合能とアクチン流動の非対称性の関係を調べることができた。ミオシン活性とアクチン流動の非対称性の関係性までは調査出来なかったが、それ以外は計画通りに実験を進めることができた。ケラトサイト等の運動性細胞はアクチン線維の重合で膜を押し広げ、平板状突起(lamellipodia)を細胞の前方に出すことで一方向に運動する。移動中の細胞は、アクチン線維が膜を押す力の反作用とミオシンによる細胞後方への牽引力で、細胞の前から後に向かってアクチン線維の流れ(retrograde flow)が維持されるために一方向に動ける。本研究の目的は、無極性の細胞がいかにして前後を決めて一方向に動き出せるのか、自発的に細胞骨格の対称性が破れる仕組みを物理で理解することである。平成28年度は、初年度(平成27年度)に構築した、アフリカツメガエルの卵抽出液を油中液滴に封入した人工細胞系を用いて、ミオシンの阻害効果を検証した。ミオシンの各種阻害剤およびミオシンのリン酸化酵素を細胞質に添加してそれらの効果を調べたが、有意な差が見られなかったことから、人工細胞系で自発的に発生したアクチン線維の流れに対するミオシンの寄与を明らかにすることができなかった。一方で、本研究で構築した人工細胞系において、アクチン線維ではなくて微小管の重合を活性化させたところ、微小管とキネシンが細胞質の回転流動を駆動する現象を発見し、微小管細胞骨格の自発的対称性破れと、微小管配向と細胞質の流れの間の正のフィードバックループによって回転流動が促進されるというメカニズムを提唱した(PNAS 2017)。アクチン流動にはミオシンも関与しているはずである。そこで、アクチン重合活性とアクチン流動の非対称性の関係を調べたときと同様に、各種阻害剤を用いてミオシン活性を変調させ、ミオシンの収縮力とアクチン流動の非対称性との関係を明らかにする。続いて、アクチン重合とミオシンの活性度をモデルパラメータとして、現象を再現できる数理モデルを構築し、モデルから予想される現象を実際に実験で確かめることで、アクチン流動が非対称化する仕組みを物理で理解することを目指す。2017/3/8日

経産業新聞「細胞内の流れ再現早大、栄養の輸送解明期待」(8面)生物物理学アクトミオシン活性を生かした状態でカエルの卵抽出液を調製する技術の確立に、予定よりも時間を要したため、ミオシンの阻害実験は翌年度に持ち越しとなったから。ミオシンの各種阻害剤を購入し、阻害剤でミオシン活性を変調させることで、ミオシンの収縮力とアクチン流動の非対称性との関係を明らかにする。
クリティカル・リーディングが英語学習者の深い読みに及ぼす効果

本年度は、学習者の論理的思考を中心とした批判的思考力及び批判的思考態度と説明文の深い内容理解度及び読解ストラテジーの認識の関係を調べた。以下にわかったことをまとめる。重回帰分析の結果、筆記再生得点は、深い内容理解度を予測したが、批判的思考力と批判的思考態度は予測しなかった。また、批判的思考力は英文の深い内容理解度と弱い相関を示したが、批判的思考態度は有意な相関を示さなかった。これらの結果が示すように、本研究では批判的思考力及び批判的思考態度と英文の深い内容理解度には有意な関係は認められなかった。本研究の参加者は、英文の事実情報の理解に精一杯で批判的思考を働かせる余裕はなかった可能性がある。しかし、批判的思考力と深い英文理解の間に弱い相関が認められたので、参加者の英語熟達度に対して易しい英文を用いれば、批判的思考力と深い内容理解の間に有意な関係が認められるかもしれない。次に、参加者を筆記再生課題得点により上位群下位群に分け、読解ストラテジーの認識の質問紙の各項目の評定値を、批判的思考力及び批判的思考態度上位群と下位群間で比較した。その結果、批判的思考力の高低によって有意で意味のある違いが認められた項目はなかった。一方、筆記再生課題上位群のなかで、批判的思考態度上位群の参加者は下位群の参加者よりも、メタ認知的な読解ストラテジーの認識を表す項目の得点が有意に高かった。また、筆記再生課題下位群では、批判的思考態度上位群の参加者は下位群の参加者よりも、内容理解の補助となるストラテジーへの認識を示す項目の得点が有意に高かった。これらの結果から、英文読解ストラテジーの認識は、学習者の批判的思考力とは関係ないが、読解力の高低にかかわらず批判的思考態度とは関係があると言える。本年度、勤務校において管理的な仕事を担当することになり、校務に費やす時間が大幅に増加した。その分研究に割くことができる時間がかなり減少したため。研究時間の確保のために非常勤講師の職を辞することとした。本年度は、当初の計画とは、やや異なる進め方となったが、次年度は計画通りに戻す予定である。統計ソフトの購入を次年度以降に持ち越したことが理由である。次年度は、パソコン、統計ソフト、学会旅費、文献購入、他、当初の計画に沿って効率的に使用したい。
骨延長法を模倣した延長装置を用いない広範囲顎骨再生法の開発

骨髄間葉系幹細胞および歯髄幹細胞培養上清に含まれている成分を検出し,その一部を定量した.培養上清により細胞接着能,細胞遊走能,血管新生能,抗炎症効果,抗アポトーシス効果が高められること,低酸素濃度培養環境下で得られた培養上清により細胞遊走能,血管新生能がさらに高められることをインビトロで示した.また培養上清により実際に血管網構築が進み骨再生が促されること,低酸素培養上清によりこの過程がさらに促進されることをインビボで示した.幹細胞培養上清中には細胞が分泌するさまざまな生理活性物質が含まれる.それらが発揮する多面的な組織再生能にわれわれは着目し研究を進めている.本年度はおもに幹細胞培養上清の機能解析に取り組んだ.幹細胞培養上清は,所定の手続きを経て得たヒト細胞を培養して調製した.細胞種は骨髄間葉系幹細胞とし,その培養に用いた無血清培地を遠心分離することによりその上清を得た.機能解析は既報で示したデータを活かし,それが拡充できるように項目を設定した.まず上清中に含まれるサイトカインの量をELISA法により測定した.つぎにラット骨髄由来間葉系幹細胞培養系に上清を適用し,細胞遊走能,細胞増殖能,創傷治癒能,血管新生能,骨形成および血管新生関連遺伝子発現およびタンパク質発現様相について評価した.さらに上清をラットの骨欠損部に適用し,X線学的,組織学的に評価した.上清はIGF,VEGF,TGF-β,HGFなどのサイトカインを含んでおり,それを定量した.また上清では細胞遊走能,細胞増殖能,創傷治癒能,血管新生能と,細胞増殖,骨形成および血管新生関連遺伝子の発現はいずれも有意に高まった.骨欠損部においては骨組織再生が認められ,そのなかに幹細胞および血管内皮細胞の増加を認めた.骨髄由来間葉系幹細胞培養上清の適用により骨組織の再生が確認され,この効果には血管新生および内在性幹細胞の遊走が関与している可能性が示唆された.これらの結果は今まで取り組んできた一連の研究の内容を補完し,組織再生についての知見を体系化するのに役立てたいと考えている.また適切なバランスのサイトカインを含む培養上清の適量を適時適所に適用することにより,延長装置なしで骨延長部にみられる組織再生過程を再現しようと目論んでいる.さらに将来は創薬につながればどの医療機関でもできる組織再生法への途が開かれると考える.本研究の全体構想は幹細胞培養上清の適用法を工夫することにより,延長装置を用いることなく,骨延長に匹敵する大量の骨再生を可能にし,これにより顎骨区域欠損の再建を目指すものである.これまでに培養上清に含まれている成分は成長因子,サイトカイン,細胞外マトリックスであることが明らかにされている.われわれは骨髄間質細胞および脱落乳歯歯髄幹細胞を細胞種とし,その培養上清成分を詳細に解析してきた.その結果,両者ともそれぞれ微量ながら多種類のものを含んでおり,それらがバランスよく作用して組織を再生させることがわかってきた.本来,組織再生は多段階の過程を経るものであり,適切なサイトカインの組み合わせが適時適所に作用すべきである.また再生の場には何よりも血行を確保すべきである.これまでに培養上清が血管内皮細胞,間葉系幹細胞の遊走を促進し,単独因子よりもその効果が高いことを確認した.本年度までにこの培養上清をビスフォスフォネート製剤由来の顎骨壊死モデル,歯周病による骨欠損モデルに適用し,それぞれの抑制効果,修復効果を確認した.またチタン製インプラント表面に培養上清成分を付着させることにより,その周囲に生じる骨形成を促進することも確認した.これらのことから骨髄間質細胞および脱落乳歯歯髄幹細胞由来の培養上清は,硬組織欠損部に直接的に投与する方法ばかりではなく,人工材料に付着させて間接的に適用する方法も有効であることが明らかにされた.またプラズマ照射により表面加工処理を施すことによりチタン表面への培養上清成分の親和性が高まり,それによりチタンインプラント周囲に著しい骨化促進効果が得られているので,この表面処理法をチタンプレートおよびメッシュに施すことで,また上記のファイバーと組み合わせることで,これらが顎骨区域欠損部でも骨形成を期待し得る再建材料となる可能性についても検討する.本研究の全体構想は幹細胞培養上清の適用法を工夫することにより,延長装置を用いることなく,骨延長に匹敵する大量の骨再生を可能にし,これにより顎骨区域欠損の再建を目指すものであった.本年度の研究は培養条件による培養上清中の成分の変化と適応となる組織欠損の探索,およびその機序の解明を中心に推進した.骨髄間葉系幹細胞,歯髄幹細胞の培養上清を質量分析法で詳細に調べたところ,さまざまな成長因子や細胞外マトリックスが含まれ,これらには血管新生能,細胞接着能,細胞遊走能だけでなく,抗炎症作用,抗アポトーシス作用を有する成分が含まれていること,低酸素濃度の培養条件下では血管新生に関与する因子が増加することが明らかになった.また生体における培養上清の骨形成作用を薬剤関連顎骨壊死モデル,骨区域欠損モデルなどで示すことができ,この作用が低酸素条件培養上清ではさらに促進されることがわかった.チタン製インプラント表面やポリ

乳酸グリコール酸共重合体膜に大気圧プラズマや水酸化ナトリウムで親水化処理を施すことにより培養上清中の成分の付着量が増し,その周囲の骨形成が著しく促進されることを示した.これらの骨形成の過程は,培養上清に含まれる血管形成に関係する因子が組織欠損部で作用し,まず血管網が構築されるところから始まることを示した.本研究の知見は培養上清による組織再生機序の一部を解明するだけでなく,今まで取り組んできた一連の研究による知見を補完し,組織再生の仕組みを体系化するうえで有意義であると考える.骨髄間葉系幹細胞および歯髄幹細胞培養上清に含まれている成分を検出し,その一部を定量した.培養上清により細胞接着能,細胞遊走能,血管新生能,抗炎症効果,抗アポトーシス効果が高められること,低酸素濃度培養環境下で得られた培養上清により細胞遊走能,血管新生能がさらに高められることをインビトロで示した.また培養上清により実際に血管網構築が進み骨再生が促されること,低酸素培養上清によりこの過程がさらに促進されることをインビボで示した.これまでに培養上清に含まれている成分は成長因子,サイトカイン,細胞外マトリックスであることが明らかにされている.われわれは骨髄間質細胞および脱落乳歯歯髄幹細胞を細胞種とし,その培養上清成分を詳細に解析してきた.その結果,両者ともそれぞれ微量ながら多種類のものを含んでおり,それらがバランスよく作用して組織を再生させることがわかってきた.培養中の骨髄間質細胞に他細胞より採取した培養上清を添加することによって細胞増殖能,細胞遊走能,骨形成性細胞への分化能,管腔形成能が向上することを,さらに培養上清により特に骨再生に必要な間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化および血管新生が誘導されることを示した.本年度までにこの培養上清をビスフォスフォネート製剤由来の顎骨壊死モデル,歯周病による骨欠損モデルに適用し,それぞれの抑制効果,修復効果を確認した.またチタン製インプラント表面に培養上清成分を付着させることにより,その周囲に生じる骨形成を促進することも確認した.これらのことから骨髄間質細胞および脱落乳歯歯髄幹細胞由来の培養上清は,硬組織欠損部に直接的に投与する方法ばかりではなく,人工材料に付着させて間接的に適用する方法も有効であることが明らかにされた.これは骨欠損部に骨造成手術をすることなくインプラントが埋入できる可能性があることを意味する.さらに硬組織という領域に限らず末梢神経損傷モデルに応用し,その治療効果もあることが明らかにできている.27年度が最終年度であるため、記入しない。口腔外科学いままでの研究成果を踏まえ,今後の研究は大規模骨欠損モデルに対して応用する方向に推進する.これまでの研究で扱ったのは小規模の骨欠損での骨再生であるが,悪性腫瘍の手術後などに生じるような区域欠損を想定した大型骨欠損が対象になり,マウスやラットなどの小動物だけでなくイヌなどの大動物,また頭蓋骨欠損モデルだけでなく脛骨などの区域欠損モデルでの検討を進める.また培養上清の投与はこれまでの実験では単回投与であったが,連続的に投与する方法をマイクロポンプなどにより検討する.さらに工学部との連携により徐放性担体についても検討し,既存の骨再生に応用されている生体材料に培養上清成分が付着する様相についても調べる.すでに乳酸・グリコール酸共重合体に培養上清成分が付着しそれが骨誘導再生法の効果を高めることを明らかにしたが,これは単に浸漬したのみであり培養上清成分の放出は24時間以内に完了してしまう.
ADHD患者の痛覚伝達における神経学的変調の解明

歯科疾患と疼痛は密接な関係にあるため、疼痛のメカニズムの理解は歯科治療において非常に重要である。現在、国内での学童期の有病率が37%と言われている注意欠陥・多動性障害(ADHD)においては、自閉スペクトラム症の様に感覚過敏が指摘されることはないものの、慢性疼痛の治療中にADHDが指摘されるケースもあり、ADHD患者の痛みの感受性に神経学的変調がある可能性がある。そこで本研究では、三叉神経支配領域における侵害刺激伝達のメカニズムについて、求心性伝達経路と下行性疼痛抑制系に変調がみられるかどうかを検証し、ADHDにおける痛覚変調の存在やそのメカニズムを明らかにする。
腎炎におけるTGF-β・Smad信号系のユビキチン・プロテアソーム分解機構の役割

メサンギウム増殖性糸球体腎炎のモデルである抗胸腺抗体細胞抗体(ATS)腎炎ラットの単離糸球体と進行性の間質線維化をきたす片側尿管結紮(UUO)を施したマウス腎間質において、TGF-βの細胞内信号伝達因子Smadのレベルとそのユビキチン・プロテアソーム分解を検討し以下の知見を得た。1.ATS腎炎糸球体ならびにUUO腎ではSmad2蛋白の著明な減少が認められたが、Smad2 mRNA発現は前者では不変、後者では増加しており、Smad2蛋白特異的な分解調節機構の存在が考えられた。2.ATS腎炎糸球体ならびにUUO腎では内因性Smad2蛋白の分解亢進とSmad2蛋白に対するユビキチン活性の亢進が認められ、それはproteasome inhibitorで抑制された。3.ラットでSmad2ユビキチンリガーゼであるSmurf2 cDNAをクローニングした。4.ATS腎炎糸球体およびUUO腎でSmurf2のmRNA発現と蛋白の増加が確認された。5.UUO腎において、TGF-β・Smad信号伝達抑制性のSmad7のmRNAの増加と蛋白の減少、Smad7蛋白のユビキチン化と分解の亢進が認められ、それはproteasome inhibitorで抑制された。以上より、TGF-βとそのレセプター発現が亢進し、TGF-βの細胞内信号伝達が盛んなATS腎炎糸球体やUUO腎では、Smad2のユビキチン化を介する分解制御の結果、Smad3を介するTGF-β信号伝達がSmad2を介する信号よりも優位となっていること、ならびにUUO腎では、TGF-β・Smad信号伝達抑制性のSmad7がユビキチン・プロテアソーム分解によって減少することでTGF-β・Smad信号伝達の抑制がかかりにくい状況が生じており、それが進行性の尿細管間質線維化に関与するという新たな機序が明らかとなった。メサンギウム増殖性糸球体腎炎のモデルである抗胸腺抗体細胞抗体(ATS)腎炎ラットの単離糸球体と慢性進行性の間質線維化をきたす片側尿管結紮(UUO)を施したマウス腎間質において、TGF-βの細胞内信号伝達因子Smadのレベルとそのユビキチン・プロテアソーム分解を検討し、以下の知見を得た。1.Day7のATS腎炎糸球体ならびにUUO腎ではSmad2蛋白の著明な減少が認められた。一方、real time PCRにて調べたSmad2 mRNA発現は、コントロールに比して前者では不変、後者では増加しており、ATS腎炎糸球体やUUO腎ではSmad2蛋白の特異的分解による調節機構が働いている可能性が考えられた。2.ATS腎炎糸球体およびUUO腎からの蛋白抽出液での内因性Smad2蛋白の分解速度を検討し、ATS腎炎糸球体とUUO腎におけるSmad2の分解亢進を認めた。3.ATS腎炎糸球体およびUUO腎におけるSmad2に対するユビキチン活性を調べるため、ATS腎炎糸球体とUUO腎からの蛋白抽出液にリコンビナントSmad2蛋白を加え、ATP、ユビキチン、プロテアソーム阻害剤の存在下で30分間反応させた後、western blotでポリユビキチン化されたSmad2を調べたところ、ATS腎炎糸球体、UUO腎からの蛋白抽出液でのSmad2蛋白に対するユビキチン活性の亢進が認められた。4.Smad2ユビキチンリガーゼであるSmurf2のラットのcDNAをクローニングした。