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硫黄原子を含む分子の光分解と同位体効果

昨年度に引き続き,成層圏の硫酸エアロゾルの循環機構を解明することを主な目的とし,安定同位体を用いた硫黄化学種の動態解明を行った.特に対流圏から成層圏で多く存在する硫化カルボニル(COS)の光解離過程による同位体分別係数の理論的決定を実施した.第一原理計算の結果から,COSの硫黄原子のみ変えた同位体種(CO^<32>S,CO^<33>S,CO^<34>S,CO^<36>S)に関し,紫外線の窓(190240nm)の低エネルギー側において質量依存が殆ど見られず,一定の値になることが判明した.その一方,高エネルギー側では硫黄原子質量に依存し,同位体分離を起こすと予想された.このような現象が予想されたことは世界的に初めてのことであり,今後の実験による確認が重要となると考える.また,炭素や酸素原子の同位体を変えた種に関しては,従来の予想通り,波長により同位体分離が大きく起こることも見出した.次に,大気科学における光解離過程の解明をこれまで主に1997年にScience誌に掲載されたYungとMillerの零点振動準位エネルギーの差で行う方法が長年,脚光を浴び続けて来ていたが,本研究のもう一つの目的である「第一原理に基づく厳密量子動力学の実施こそが,その本質を捉えることができる」という主張を,地球物理関連で最も権威のある雑誌に発表することができた.その際,ノーベル賞受賞者であるR.A.Marcus博士に感謝したい.このような結果がこの2年間の研究成果となるが,平成21年度からこの研究を発展させる事業(平成21年度平成23年度環境省環境研究総合推進費研究課題名「温暖化関連ガス循環解析のアイソトポマーによる高精度化の研究」代表者吉田尚弘(東京工業大学)分担者南部伸孝(上智大学)総額300万円)を環境省のもとで始めることができた.太陽放射と地球放射はほぼバランスしているが、温室効果ガスが増えることにより地表面からの放射を温室効果ガスが吸収してしまい、地球から宇宙空間に出て行く放射(地球放射)が減少してしまうこととなる。つまり、放射のバランスくずれ、大気の温度が上昇することとなる。一般に、温室効果ガスとしてよく知られている分子として、二酸化炭素、メタン、亜酸化窒素(N20)など挙げられる。そして、そのエネルギー吸収特性および大気循環過程などがかなり詳細に解明されて来ている。ところが、吸収特性や循環機構が全く不明な物質としてエアロゾルの解明がここ数年の間に重要視され、様々な研究者が解明に取り組んでいる。本研究課題では、成層圏硫酸エアロゾルの循環機構を解明することを主な目的とした。特に安定同位体を用いた硫黄化学種の動態解明を行う。具体的には成層圏における硫黄化学種の連鎖反応サイクルとして5つの反応が検討されている。本年度は、硫化カルボニル(COS)の光解離過程および硫化カルボニルとOHラジカルの反応における硫黄同位体分別係数の決定を行った。COSの光解離断面積に関しては質量非依存分別の兆候を見出した。またこの原因は、これまでこのような現象の説明によく利用されている分子の「零点振動エネルギー(ZPE)」差では説明できない結果となっている。一方、COSとOHラジカルの反応過程ではZPE差により説明できる質量依存分別過程と結論づけられた。さらに、他の反応系としてSO分子の光解離過程の検討を始めた。特にこの系は、実験による測定が事実上不可能な系である。そこで、光解離過程に関連する電子励起状態のポテンシャルエネルギー曲線を決定した。その結果によるとスピン禁制遷移である三重項状態への非断熱遷移が解明に不可欠な系であると判明した。昨年度に引き続き,成層圏の硫酸エアロゾルの循環機構を解明することを主な目的とし,安定同位体を用いた硫黄化学種の動態解明を行った.特に対流圏から成層圏で多く存在する硫化カルボニル(COS)の光解離過程による同位体分別係数の理論的決定を実施した.第一原理計算の結果から,COSの硫黄原子のみ変えた同位体種(CO^<32>S,CO^<33>S,CO^<34>S,CO^<36>S)に関し,紫外線の窓(190240nm)の低エネルギー側において質量依存が殆ど見られず,一定の値になることが判明した.その一方,高エネルギー側では硫黄原子質量に依存し,同位体分離を起こすと予想された.このような現象が予想されたことは世界的に初めてのことであり,今後の実験による確認が重要となると考える.また,炭素や酸素原子の同位体を変えた種に関しては,従来の予想通り,波長により同位体分離が大きく起こることも見出した.次に,大気科学における光解離過程の解明をこれまで主に1997年にScience誌に掲載されたYungとMillerの零点振動準位エネルギーの差で行う方法が長年,脚光を浴び続けて来ていたが,本研究のもう一つの目的である「第一原理に基づく厳密量子動力学の実施こそが,その本質を捉えることができる」という主張を,地球物理関連で最も権威のある雑誌に発表することができた.その際,ノーベル賞受賞者であるR.A.Marcus博士に感謝したい.このような結果がこの2年間の研究成果となるが,平成21年度からこの研究を発展させる事業(平成21年度平成23年度環境省環境研究総合推進費研究課題名「温暖化関連ガス循環解析のアイソトポマーによる高精度化の研究」代表者吉田尚弘(東京工業大学)
点配置の空間的相関に対するステレオロジーの統計的研究

細胞組織の構造・機能や、金属組織の物性には、粒子同士が互いに空間的にどの様に分布しているかの情報が重要な役割を果たしていると考えられるが、この情報を得るための研究が従来のステレオロジーには欠けていたと思われる。本研究では粒子間の相関に関する情報を得るためのステレオロジーの構築を目指し、以下に示すような研究経過を辿った。(1)種々のパラメータに対する三次元点配置を計算機シミュレーションによって生成し、ランダムに設定した薄断面に交差する粒子の配置データを集積したのち、それに基づいて三次元の動径分布関数と薄断面の動径分布関数との経験的関係を種々のパラメータに対して求めた。(2)パーソナルコンピュータによる画像処理のためのソフトウェアの開発に着手、一部を完成。(3)剛体球系の動径分布関数に対するステレオロジー的理論を打ち立て、シミュレーションの結果によってその正当性を確認する作業を国際共同研究として行い、論文発表の準備を行う。(4)我々がすでに開発した平面上の相互作用ポテンシャル推定法を、薄断面に交差する粒子配置に適用して、三次元における粒子間ポテンシャルと、断面における推定されたポテンシャルとの関係を調べる。(5)空間におけるランダム充填・ランダム分割と空間の次元との関係についてステレオロジー的興味から解明し一定の成果を得た。(6)一次元空間の点配置に対する粒子間相互作用の尤度推定法の開発に着手し、メデルに関する考察と実データの解析を行なう。(7)二次元点配置の尤度法に関する国際共同研究を進展させる。(8)研究結果を各種国際会議にて口頭発表し、論文の出版を行なった。この研究分野はまだその緒についたばかりであり、残された課題は山積している。今後も研究を継続して行きたい。1.従来行われているステレオロジー的手法は,標本中に散布する対象(細胞や金属粒子など,以下では「粒子」と総称する)単体の統計形態的特徴,すなわち大きさや形,向きの分布を取り扱うものであった.しかし,細胞組織の構造・機能や,金属組織の物性には,粒子同士が互いに空間的にどの様に分布しているかの情報が重要な役割を果していると考えられ,この情報を得るためのステレオロジーの研究が従来欠けていたと思われる.本研究では粒子間の相関に関する情報を得るためのステレオロジーの構築を目指した.2.昭和62年度は以下のような研究経過であった. :(1.)種々のパラメータに対する三次元点配置を計算機シミュレーションによって生成した. (2.)シミュレーションで生成した三次元粒子配置に対して,ランダムに設定した薄断面に交差する粒子の配置データを集積し,それに基づいて三次元の動径分布関数と薄断面の動径分布関数との経験的関係を種々のパラメータに対して求めた. (3.)パーソナル・コンピュータによる画像処理のためのソフトウェアの開発に着手した. (4.)剛体球系の動径分布関数に対するステレオロジー的理論を打ち立て,シミュレーションの結果によってその正当性を確認する作業を,国際共同研究としてほぼ完成し,論文発表の準備を行なった. (5.)我々がすでに開発した平面上の相互作用ポテンシャル推定法を,薄断面に交差する粒子配置に適用して,三次元における粒子間ポテンシャルと,断面における推定されたポテンシャルとの関係を調べた. (6.)結果の一部をフランス国で開催された第7回国際ステレオロジー会議にて発表した. (7.)空間におけるランダム充填・ランダム分割と空間の次元との関係についてステレオロジー的興味から解明し,一定の成果を得た.1.ステレオロジーは、ある注目する(三次元空間における)対象の低次元空間における情報から、元の空間における対象に関する情報を引き出そうとする学問分野である。ステレオロジーの研究は、従来、主として対象の個々の形状や密度について行われていた。

然るに、たとえば、ある対象のある機能に注目するとき、それを支配しているのが、対象の構成要素の個々の形状・密度であることよりも、空間中における各要素の相互の位置関係、すなわち空間構造の方が重要であることが少なからず見受けられる。従って、粒子間の位置の相関に関する情報を直接得るためのステレオロジーといったものの研究が必要である。そのためには、粒子集団の構造と空間次元との関連性について、充分な知識の蓄積が不可欠である。2.上の観点から、昭和63年度は空間次元と空間配置のあり方との関連について知見を深めることを一つの研究目標に置き、以下のような研究経過であった。(1)一次元空間の点配置に対する粒子間相互作用の尤度推定法の開発に着手し、結果の一部を1988年6月米国で開催された「空間統計学と画像」国際会議にて発表。また、その後モデルに関する考察を深め、実データの解析を行った。(2)前年に研究発表したランダム充填・ランダム分割と空間次元との関連についての論文を出版。(3)二次元における円のランダム充填密度に関する研究結果を論文にまとめた。(4)二次元点配置の尤度法および、剛体球系の動径分布関数のステレオロジーに関する国際共同研究を進展させた。(5)パーソナルコンピュータによる画像処理のためのソフトウェアを一部完成。(6)三次元空間における粒子間相互作用を、二次元薄断面における粒子配置から推定するための統計的方法に関する研究を進展させた。
フナ類の有性・無性型の共存機構の解明

無性型・有性型からなるフナ類の集団は同所的に共存している。この共存のメカニズムを理解することを目的とした。(1)野外個体群動態から、共存を可能にする3つの仮説(病気、中立、メタ個体群)を棄却した。(2)実験個体群で、有性生殖のオスを作るコストの個体群への影響を初めて実証した。(3)発育段階ごとに、有性・無性型の成長率の違いを明らかにした。結論として、共存メカニズムは出生率の差に関する何らかの要因によることが示唆された。しかし、この共存はパラドックスであり、その個体群動態におけるメカニズムを理解することが研究の全体構想である。これにより生態学における多種共存のメカニズムの理解へ貢献し、さらには、進化生物学の難問である性の進化の問題への洞察を得たいと考えている。本研究では、(1)有性無性比について野外個体群動態の長期観察を行い、負の密度効果に関する検定を行うこと、(2)半野外・室内実験個体群を用いて個体群動態の長期観察を行い、共存が可能か、少数者有利の密度効果があるのかを明らかにすること、(3)室内実験で、環境要因(水温・餌量・溶存酸素)をコントロールし、稚魚・成魚の発育ステージごとに、有性・無性型の死亡・成長率の違いを明らかにすることを目標とする。1.野外調査:共存を説明する二つのモデルについて、野外のデータからその予測を検証した。第一に、Hakoyama&Iwasa 2004の病気モデルで仮定している無性型の高い死亡率が観察できるのかを調べた。諏訪湖のフナ類について年齢査定を行い、有性型・無性型の各年級群の死亡率を比較したが、差はなかった。つぎに、中立仮説(有性・無性で適応度の違いがない場合、個体数が多ければ、絶滅に長い時間を要するため共存が観察される)では、有性無性型の比率に大規模な時間変化は観察されないはずである。1997・1998年の諏訪湖の有性無性比を2006-2008年のそれと比較したところ、10年前に多数派であった有性型が、現在では少数派になっており、モデルの予測は支持されなかった。有性無性比は動的に時間変化していることが明らかとなった。2.実験個体群:継続観察し、体長・体重・倍数性を測定した。再生産が行われている。3.室内実験:(1)実験的に二倍体のオスとペアにした三倍体に子供を産ませて、その子供の中の四倍体比を調べた。結果、三倍体のメス6腹から生まれた子供のうち14%(n=430)が四倍体であった。一方、諏訪湖の野外データからは、6%(n=1753)が四倍体であった。その差は野外の四倍体の死亡率の高さを示唆している。つまり、死亡率の高い四倍体が発生することで、無性型の子の出生率を下げ、有性生殖のコストを緩和していることが分かった。(2)2N,3N,4Nの体長比較を行い、メタ・アナリシスを用いて全体の傾向を検定した。結果、全体として3N>2N>4Nの順で体長が有意に大きい事がわかったが、effect sizeはr-=0.13程度で小さく、結論として大きな成長差はないことが分かった。1.野外調査:青森から四国まで全国13カ所のフナの倍数性比の調査を行った。8割近くが無性型の地域から、9割近くが有性型の地域まで様々な地域が見られ、倍数性比については地域間で大きな違いがあり、統計的にも有意にヘテロであることがわかった。来年度以降も同一地域において倍数性比の変化を調査する。2.実験個体群:半野外および室内の実験個体群について、年に一回魚を取り上げて、個体数の推定・測定を行い、有性無性型の比率、体長・体重を測定した。得られたデータから、有性・無性型の間で増加率の違いを比較し、少数者有利の頻度依存性があるかを検証した。4年間の結果、倍数性比の初期頻度によらず、無性型の比率が増加した。最終的には、どの実験区でも無性型の比率が有性型のそれを大きく上回った。また、新規個体の加入率には無性型有性型の間での少数者有利の傾向は統計的には検出できなかった。これは、有性生殖のオスを作るコストを個体群レベルで初めて観察したものであり、実験系のスケールでは共存が困難であることを示唆している。3.成長実験:飼育環境・発育ステージの異なる3つの実験系で、有性・無性型の体サイズを測定し餌を巡る競争下にある個体の成長の違いを検討した。

半野外の実験区では2歳の個体、室内実験では、60センチ水槽と、2トン水槽で生後5ヶ月の個体の成長を調べた。分散分析と事後検定から二倍体・三倍体・四倍体(生まれた子供に四倍体がいる)の体長比較を行い、メタ・アナリシスを用いて全体の傾向を検定した結果、成長率には大きな違いはなかったが、統計的には三倍体の無性型の成長率がよかった。無性型のフナは全メスの雌性発生であり、有性型のオスなしには増殖できない。一方、オスを作るコストがある有性型の増殖率は潜在的には無性型の半分であるため、共存は困難である。そこで、有性と無性の同所的共存のメカニズムに関する研究を行った。1野外個体群調査:引き続き全国13ヵ所の調査を行い、得られたデータからメタ個体群共存仮説の検証を行った。Kokko et al.(2008)は、地域の絶滅と再コロニー化から共存を説明するメタ個体群共存仮説を提案した。メタ個体群共存仮説は、有性型のみの地域個体群が存在することを予測する。この予測をデータからテストした。結果として、地域個体群の有性・無性型の比率は地域間で大きく異なった。また、有性型(二倍体)のみからなる地域個体群はなかった。したがって、メタ個体群の構造を介した共存の仮説は支持されなかった。魚類の生息地は水系で大きく隔たっているため、頻繁な地域間の移動は起こりにくいことが、メタ個体群共存仮説が支持されなかった理由であろう。2実験個体群:半野外実験個体群:半野外(約17トンの池を8つ)および室内(約2トンの池を7つ)の実験個体群の維持と観察を続けた。初期頻度によらずに無性型の比率が個体群中で増加した。有性無性間で加入率に頻度依存性は検出されなかった。観察された無性型の増殖率は大きく、性のコストの個体群への影響を初めて実証した。数十世代のうちに実験個体群は絶滅すると考えられる。実験系では考慮していない要因が自然での共存を可能にすることを示唆している。(1)野外個体群調査:引き続き全国13カ所の調査を行い、得られたデータからメタ個体群共存仮説の検証データさらに整備・強化した。メタ個体群共存仮説は、有性型のみの地域個体群が存在することを予測するが、データからは支持されなかった.(2)実験個体群:半野外実験個体群:半野外実験個体群の維持と観察を続けた。(3)さらに、共存にも関係する可能性がある遺伝システムについて、四倍体オスと二倍体メスから三倍体メス(新しいクローン)がつぎつぎに誕生していることを確かめた。クローン性についてはAFLP分析によるDNAパターンの一致性と鱗移植による組織不和合性が見られないことで確かめた。無性型・有性型からなるフナ類の集団は同所的に共存している。この共存はパラドックスであり、その個体群動態におけるメカニズムを理解することが研究の目的である。具体的には、(1)有性無性比について野外個体群動態の長期観察を行い、有性型と無性型の間の負の頻度依存淘汰に関する検定を行うこと、(2)半野外・室内実験個体群を用いて個体群動態の長期観察を行い、共存が可能か、少数者有利の頻度依存淘汰があるのかを明らかにすることを行ってきた。
ウイルス抵抗性植物作出のための基礎研究

本研究はDNA組み換え技術を用いてウイルス抵抗性植物作出のための基礎条件を分子レベルで解析することを目的とする。1、In vitroにおけるブロムモザイクウイルスRNA合成系を用い、RNA合成におよぼす種々のRNA断片や蛋白質について検討した。(1)In Vitro RNA合成系にBMVの外被蛋白質を加えるとRNA合成は加えた蛋白質に比例して阻害された。このような現象はBSAやTMVの外被蛋白質を加えたときには認められなかった。またこの阻害効果はRNAと外被蛋白質とを前もって反応させておくとより強く現われるが、合成開始後のRNA鎖の伸長は阻害しなかった。BMV RNAのcDNAから3′末端200塩基のRNAを用いて同じ様な実験を行ったが、この場合もRNAの合成が外被蛋白質によって強く阻害された。また反応産物をしょ糖密度公配遠心によって分析した結果全くウイルス粒子ができていないことから、この阻害作用は外被蛋白質とRNAの再構成されることによって起こるのではなく、外被蛋白質とポリメラーゼのRNA結合部位への競合であることが明らかとなった。(2)BMV RNAのcDNAからゲノムRNAに相補的な3′末端200塩基および5′末端1200塩基のRNAを合成し、in vitro RNA合成系に加えたところ5′末端1200塩基のアンチセンスRNAはRNA合成を強く阻害した。(3)キュウリモザイクウイルス耐性のタバコを作出する目的で外被蛋白質遺伝子のクローニングと塩基配列を決定した。その結果、本研究に用いたキュウリモザイクウイルスのY系統の外被蛋白質遺伝子218残基からなっていることが分かった。外被蛋白質遺伝子のcDNA断片をカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターとターミネーターの間に挿入した。一方、カナマイシン耐性遺伝子をもつベクターも作製し、二つのベクターを混合し、同時にエレクトロポレーション法によってプロトプラストに導入した。
口腔内細菌叢と歯垢に及ぼすサンフェノン^<(R)>の抑制効果について

緑茶抽出物からのカテキン類を含むサンフェノン^<(R)>(太陽科学社製)がglucosyltransferaseによる不溶性グルカンの合成を阻害するという。そこで今回、歯口清掃を中止した成人男子40名(平均年齢26.3歳)を対象に、二重盲検でサンフェノン^<(R)>入り洗口液とサンフェノン^<(R)>を除いた洗口液(以下対照)の2系を実施し、口腔内におけるサンフェノン^<(R)>の歯垢抑制効果と口腔内細菌の変動等について検討した。サンフェノン^<(R)>入り洗口液については対象者を4群に分けてそれぞれの群に0.05%、0.1%、0.2%、0.5%の異なる濃度のサンフェノン^<(R)>洗口液を実施した。各洗口液使用期間は3日間であり、朝、昼、夕食後の1日3回、洗口液15ccを20秒間含嗽した。洗口液使用期間終了後、唾液の摂取および上顎大臼歯頬側面から歯垢を摂取し、それぞれ唾液中の乳酸濃度および歯垢中の総細菌数と総レンサ球菌数を測定した。さらに口腔内をGC社製プロスペックにて染め出し、前歯部の口腔内写真を撮影し、歯垢付着状態の増減を歯面別で判定した。その結果、1.歯垢付着状態は、対照に比べて、サンフェノン^<(R)>洗口液使用後の方が、歯垢付着の減少した部位が増加し、約37%の抑制効果が認められた。2.サンフェノン^<(R)>洗口液による歯垢中の総細菌数および総レンサ球菌数はどの実験群においても減少し、特に0.05%および0.2%群においてはそれぞれ1%および5%の有意差が認められた。3.サンフェノン^<(R)>洗口液による唾液中の乳酸濃度は各サンフェノン濃度においていずれも減少傾向を示した。以上の結果より、サンフェノン^<(R)>の応用によって、歯垢抑制効果と口腔内細菌数の減少を認め、サンフェノン^<(R)>の有用性が示唆された。
精巣間質におけるマクロファージと精巣機能に関する研究

精巣間質に分布するマクロファージの機能を解明するために,幼若期,性成熟期,老齢期の各発育段階のラットの精巣を,免疫組織化学的および電顕的に検索した。免疫組織化学によって同定されたマクロファージの出現頻度は,各発育段階で変化し,加令に伴って増加した。すなわち,精巣間質に存在する全細胞に対するマクロファージの頻度は,幼若期で11.5±3.4%性成熟期では11.8±7.2%,老齢期では26.2±6.0%であった。次にマクロファージとライディッヒ細胞との形態学的な関係を電顕的に検討すると,発育-加齢に伴って著しい変化が認められた。幼若期では,紡錘型のライディッヒ細胞が数個で集塊を作り,この集塊は数層に及ぶ扁平な綿維芽細胞様細胞によって取り囲まれていた。少数のマクロファージはこれらの細胞群の近くに分布していたが,ライディッヒ細胞と直接接することはなく,両者の間には薄い綿維芽細胞様細胞が分布した。しかし時には綿維芽細胞様細胞の間隙に突起を伸ばし,ライディッヒ細胞に接近しているマクロファージも観察された。性成熟期には,多数のライディッヒ細胞が集塊をなして間質内に分布していた。この集塊を綿維芽細胞様細胞が完全に取り囲むことはほとんどなくなり,その結果,ライディッヒ細胞はリンパ腔に露出していた。この発育段階では,マクロフィージはライディッヒ細胞に密接に接触し,時にはライディッヒ細胞の集塊の中に埋れるように存在した。老齢期になると,ライディッヒ細胞は萎縮し,細胞数も減少した。これらの細胞に接して,リポフスチン顆粒を多数含んだマクロファージが観察された。これらの所見は,精巣間質マクロファージが,ライディッヒ細胞を取り囲む微細環境の発育や加齢に伴う変化に,深く関わっていることを示唆するものであり,両細胞は相互に作用しつつ精巣機能の発現-維持に働いていると推測された。精巣間質に分布するマクロファ-ジの機能を解明することを目的として、幼若期、性成熟期、老令期の各発育段階のラットの精巣を電顕的および免疫組織化学的に検索した。実験には15匹のウィスタ-系ラットを用い、これらを生後1ー11日幼若群、16ー20週令の性成熟群、24ー30月令の老令群の3群に分けた。幼若期の精巣間質では少数のLeydig cellが集塊を作っており、その集塊は数層に及ぶfibroblastoidcellによって取り囲まれていた。大部分のマクロファ-ジは、このfibroblastoid cellの取り囲みの外側にあって、Leydig cellと直接接触することはなかったが、fibroblastoid cellの細胞間隙に突起を伸ばしたマクロファ-ジも観察された。性成熟期になると、より多数のLeydig cellが集団をなして間質に分布した。これらLeydig cellの集団を取り囲むfibroblastoid cellは消褪して、Leydig cellはリンパ腔に直接露出していた。この発育段階のマクロファ-ジはLeydig cellと接触したり、Leydig cellの集団の中に存在して、両細胞は密接な位置関係を示した。

老令期では、Leydig cellは減少し、変性に陥ったLeydig cellの近くにリポフスチンを大量にもつマクロファ-ジがしばしば観察された。これらの所見は、精巣間質マクロファ-ジがLeydig cellを取り囲む微細環境の、発育に伴う変化に深く関っていることを示唆するものであり、両細胞は相互に作用しつつ精巣機能の発現、維持に働いていると推測された。哺乳動物の精巣間質には、Leydig cell、線維芽細胞、マクロファ-ジ、肥満細胞などが存在することが知られている。しかしLeydig cell以外の機能については、必ずしも解明しきれていない。本研究は精巣間質に分布するマクロファ-ジの機能を解明することを目的として、幼若期、性成熟期、老令期の各発育段階のラットの精巣を電顕的および免疫組織化学的に検索した。実験には15匹のウィスタ-系ラットを用い、これらを生後1ー11日の幼若群、16ー20週令の性成熟群、24ー30月令の老令群の3群に分けた。幼若期の精巣間質では紡錘型のLeydig cellが数個で集塊を作っており、その集塊は数層におよぶfibroblastoid cellの薄い細胞質によって取り囲まれていた。さらにfi陝roblastoid cellがその突起を、これらLeydig cellの細胞間に挿入している所見がしばしば観察された。大部分のマクロファ-ジは、このfibroblastoid cellの取り囲みの外側にあって、Leydig cellと直接接触することはなかったが、fibroblastoid cellの細胞間隙に突起を伸ばしたマクロファ-ジも観察された。性成熟期になると、より多数のLeydig cellが集団をなして血管の周囲に分布した。幼若期と異なりこれらLeydig cellの集団を取り囲むfibroblastoid cellは消褪して、Leydig cellはリンパ腔に直接露出していた。この発育段階のマクロファ-ジは豊富な細胞内小器官を有し、Leydig cellの集団の中に存在して、両細胞は密接な位置関係を示した。老令期では、Leydig cell,マクロファ-ジ共に減少し、変性に陥ったLeydigcellの近くにリポフスチンを大量にもつマクロファ-ジがしばしば観察された。精巣間質に存在するマクロファージの役割を解明するために、ラット精巣を免疫組織化学と電顕的観察によって形態学的検討を行った。ラットは、精巣機能に差をみとめる幼若期、性成熟期、老齢期の3群に分けた。マクロファージの出現頻度は、精巣間質に分布する全細胞に対する比率で算出すると、加齢と共に増加し、特に老齢ラットでは出現頻度の著しい増加がみられた。すなわち、幼若期の変化は11.5±3.4%、性成熟期では11.8±7.2%、老齢期では26.2±6.0%であった。またマクロファージの大きさも各発育段階で差があり、加齢に従って小さくなる傾向があった。細胞の長経×短径で表わすと、幼若期では15.6×13.4μm、性成熟期では14.7×11.5μm、老齢期では13.8×11.9μmであった。すでに報告したように、幼若期の精巣では、集塊をなすライディッヒ細胞を数層に及ぶ線維芽細胞様細胞が取り囲み、大部分のマクロファージはライディッヒ細胞と直接接することはなかった。性成熟期になると、より多数のライディッヒ細胞が集簇をなして間質に分布した。これらライディッヒ細胞の集団を取り囲む線維芽細胞様細胞は消褪して、ライディッヒ細胞はリンパ腔に露出していた。
cDNAアレイフィルターを用いた食道癌の包括的遺伝子発現プロファイルの解析

進行食道癌は,いまだ消化器癌の中でももっとも予後の悪い疾患の一つであり,また表在癌といえどもリンパ節転移の頻度も高く,食道癌そのものの悪性度の高さが指摘されている.よってその分子レベルでの解明は急務である。細胞の性質は複雑なネットワークを介した多数の遺伝子によって規定されており,これら多数の遺伝子変化により癌の生物学的特性が生み出されていると考えられている。近年,多数の遺伝子変化を同時に捉え,総合的に解析するアプローチとしてcDNAアレイが導入され,遺伝子発現解析が飛躍的に進展しつつある。今回我々は,cDNAフィルターアレイを用いて,食道癌の生物学的特性を解明しようと試み,包括的な遺伝子発現プロファイルにより,食道癌の生物学的特性を分類し臨床に応用したいと考え検討を試みた。患者に承諾を得たうえで,食道癌の切除標本の一部を切離し,超低温で保存を行った。それらのうち病理組織検査の結果、リンパ節転移を認めた群と無かった群についてDNAアレイ解析結果を比較しリンパ節転移に関与する遺伝子群の抽出を試みた。具体的にはニューラルネットワーク解析法にて転移の有無の予測プログラムを作成しようとしている。これまでに集積した40例以上の切除標本よりRNAを抽出しDNAアレイ解析を行った。しかしながら食道癌の外科的切除では他の消化器癌と違って開胸開腹の手術が必要なことから長時間を要するため、一部の標本からは十分に検討に耐えるレベルでのRNAの抽出ができなかった。このため現時点で有意な解析結果が得られていない。RNAの抽出精度を高めるため,内視鏡による生検標本の集積を行った結果、安定した抽出が可能となっている。今後それらの生検標本を用いて予定していたDNAアレイ解析を行い,さらに予後との関係について調査する。食道癌を対象としてcDNAアレイを行ったという報告は現在までのところ少ないが,切除後の化学療法の感受性を予後で判定することで,間接的に化学療法感受性に関与すると考えられる遺伝子群が報告されている。当教室では2000年より患者に承諾を得たうえで,食道癌の切除標本の一部を切離し,超低温で保存を行ってきた。これまでに病理組織検査の結果が判明し,予後調査を行ってきた患者約50例についての腫瘍部と正常粘膜の標本を集積できた。それらのうちリンパ節転移を認めた群と無かった群各20例を用いてDNAアレイ解析を行いリンパ節転移に関与する遺伝子群を抽出し,ニューラルネットワーク解析法にて転移の有無の予測プログラムを作成する。この予測プログラムを用いてテストサンプル10例の予測率を測定したい。さらには症例数を重ね,たとえば表在癌で生検標本を使って転移の有無を予測するような臨床応用に用いたいと考えている。

これまでに病理組織検査の結果が判明し,予後調査を行ってきた患者の腫瘍部と正常粘膜の標本を集積し,それらのうちリンパ節転移を認めた群と無かった群を用いてDNAアレイ解析を行いリンパ節転移に関与する遺伝子群を抽出し,ニューラルネットワーク解析法にて転移の有無の予測プログラムを作成する予定であった。しかし,集積した切除標本よりRNAを抽出しDNAアレイ解析を行ったが,食道癌の外科的切除では他の消化器癌と違って開胸開腹の手術が必要なことから長時間を要し,標本から正確なRNAの情報を得ることが困難であった。そのため現在内視鏡による生検標本の集積を行っている。今後それらの生検標本を用いて予定していたDNAアレイの実験を行い,予後との関係について調査を行う。進行食道癌は,いまだ消化器癌の中でももっとも予後の悪い疾患の一つであり,また表在癌といえどもリンパ節転移の頻度も高く,食道癌そのものの悪性度の高さが指摘されている.よってその分子レベルでの解明は急務である。細胞の性質は複雑なネットワークを介した多数の遺伝子によって規定されており,これら多数の遺伝子変化により癌の生物学的特性が生み出されていると考えられている。近年,多数の遺伝子変化を同時に捉え,総合的に解析するアプローチとしてcDNAアレイが導入され,遺伝子発現解析が飛躍的に進展しつつある。今回我々は,cDNAフィルターアレイを用いて,食道癌の生物学的特性を解明しようと試み,包括的な遺伝子発現プロファイルにより,食道癌の生物学的特性を分類し臨床に応用したいと考え検討を試みた。患者に承諾を得たうえで,食道癌の切除標本の一部を切離し,超低温で保存を行った。それらのうち病理組織検査の結果、リンパ節転移を認めた群と無かった群についてDNAアレイ解析結果を比較しリンパ節転移に関与する遺伝子群の抽出を試みた。具体的にはニューラルネットワーク解析法にて転移の有無の予測プログラムを作成しようとしている。これまでに集積した40例以上の切除標本よりRNAを抽出しDNAアレイ解析を行った。しかしながら食道癌の外科的切除では他の消化器癌と違って開胸開腹の手術が必要なことから長時間を要するため、一部の標本からは十分に検討に耐えるレベルでのRNAの抽出ができなかった。このため現時点で有意な解析結果が得られていない。RNAの抽出精度を高めるため,内視鏡による生検標本の集積を行った結果、安定した抽出が可能となっている。今後それらの生検標本を用いて予定していたDNAアレイ解析を行い,さらに予後との関係について調査する。
蹄葉炎新規治療薬としてのNF-κB阻害剤の効果解析

1ウマ末梢血リンパ球を用いたNF-κB阻害剤(IMD-0354)の有効性解析・サラブレッドの末梢血よりリンパ球を分離し,リポポリサッカライド(LPS)を添加して培養,細胞数および細胞活性を色素排泄法およびMTT法により解析したところ、一定期間生存が維持された。・これに,様々な濃度のIMD-0354を添加して培養したところ,濃度依存的に細胞活性が減弱した。2実験的蹄葉炎モデルに対するIMD-0354の効果・JRAより供与されたサラブレッドにLPSを静脈内投与し蹄葉炎を誘導,蹄温をサーモメータで測定し,血液検査および臨床検査で総合的に病状を評価した。生理的食塩水を投与した場合、ウマの蹄温および体温はほぼ一定に推移した。総白血球数および白血球分画、不快感スコアにも変化はなかった。LPS 30ng/kgを30分間かけて静脈内投与した場合、ウマの蹄温は時間依存的に低下し、90分後には4.3度低下した。また体温は投与60分後から上昇し始め、90分後には0.4度上昇した。白血球数は時間依存的に減少し90分後には投与前の59%に減少した。ウマは投与後、前かき・尾振り等の不快感を示し、振戦や軟便等の全身症状が現れた。以上より、LPSの静脈内投与は、全身性に敗血症様の症状を誘導し、蹄部においては循環障害による蹄温の低下を示し、実験的蹄葉炎モデルとして有用であることが確認された。・蹄葉炎モデルに対し,IMD-0354を指静脈の微細カテーテルから注入し、上述した検査を実施してその効果を判定した。前処置として、ウマの球節部分を駆血し、指静脈へIMD-0354 1mgを注入して20分間静置した。その後駆血を解除し、LPSの静脈内投与を行なった。白血球数の減少や全身症状の出現に差はなかったが、IMD-0354投与馬では蹄温の低下が緩やかとなり、90分後までに1.0度の低下に留まった。以上の結果より、IMD-0354の局所投与は全身症状をあまり改善しなかったが、蹄温の低下を緩和したため、蹄葉炎に対する予防効果が期待された。
鋳造技術からみた朝鮮半島の青銅器文化

昨年度は鋳造にまつわる技術や知識の習得をおこないながら,鋳型に表現された微細な文様が鋳造によってどのように現れてくるのかを観察しようとした。本年度も,異形有文青銅器をモデルとし鋳型の製作技法についてのモデルを作成し,実際に鋳造することで技術と製品にあらわれる現象の因果関係の追求を目指した。異形有文青銅器の文様は凹面によって表現されており,鋳型の文様面は凸面であったことがわかる。鋸歯門が円形にめぐる文様は弧線の描出がシャープである。また,鋸歯文の各単位は所々欠けており,本来あるべきでない箇所に鋸歯文があらわれている。こうした現象の原因は,乾燥した鋳型面に真土を帯状に貼り付け鋸歯状にカットしたためであると推測した。鋳型製作時には鋸歯状の部分がはがれることがあり,因果関係の正しさをうかがわせた。帯状真土の貼り付け時における乾燥状態がことなるサンプルを2点製作し鋳造にのぞんだ。昨年度の失敗をふまえ,鋳造遺構の検討も加え,溶解炉を構築したが今回も銅を溶解することが適わず,設定した条件の効果を確認することができなかった。今年度未使用におわった鋳型は溶解炉の構造を再検討した時間の実験で使用し仮説の検証をおこないたい。今年度の活動は,対象となる青銅器資料の調査,鋳造技術の習得を目的とした。資料の調査については,これまでの研究で作成したデータから技術的側面に関する条項を抽出・整理した,特に青銅器製作技術に関して重要な画期となった土製鋳型の導入に焦点をしぼって,多鈕鏡や異形有文青銅器のデータを再整理した。それらのうちとりわけ製作技術を探るために特徴的な痕跡を残す円形有文青銅器を復元実験のモデルに設定した。今年度は円形有文青銅器の資料調査を果たせず,実見することが適わなかった。また夏期には朝鮮半島青銅器文化との関連が深いロシア沿海州へ資料調査に赴き,銅釦などの複雑な形状をもつ青銅器が石製鋳型で製作されていたことを確認した。摘みの存在等から安易に土製と判断してきた基本認識を改める必要を認めるとともに石製・土製各鋳型による製品が示す特徴を実験を通じて整理する必要性が再認識された。鋳造実験は,円形有文青銅器をモデルとし,造形用ワックスを用いて原型を製作する方法を選択した。原型を3種類の真土でつつみ,3つの鋳型を作成した。自作の溶解炉を構築し鋳造をおこなったが,鋳型のつくりが稚拙であったことと,鋳型素材への理解が不足していたことで,意図した通りの製品を得ることができず,もっとも関心をもっていた微細な文様を鋳出すための凸面が剥離する現象を考察するにはいたらず次回実験の課題となった。
動的脳脊髄液モニタリングによる脳内老廃物排泄機構並びに認知症成因の解明

特発性正常圧水頭症(iNPH)の髄液バイオマーカーの探索は多く試みられてきた。しかし、疾患特異的な髄液バイオマーカーは同定されていない。iNPHが疑われる症例では腰椎穿刺時に大量の髄液(約30ml)を排出させる処置(タップテスト)を行なう。これにより歩行スピードや認知機能の改善が一時的に得られることがある。一般的にはタップテストの最初に採取された髄液を検査検体に用いるが、上述のようにiNPHの病態評価に用いるには限界がある。これまでの研究成果から、iNPHの病態では、通常の腰椎穿刺で得られる髄液は脳室内髄液の濃度を直接的に反映していない可能性があることに着目し、タップテスト時に髄液を2点で採取してマーカー測定する手法を考案した。平成29年度は、iNPHが疑われる症例に対してタップテスト時に得られる髄液の内、最初の髄液1 ml (First Drip : FD)と最後に得られる髄液1 ml (Last Drip : LD)を別々に採取した。また、iNPHに対する治療として脳室ー腹腔シャント術を行なう機会があった場合は、脳室留置シリコンチューブを脳室内に留置する際に交通性の確認のために採取される脳室内髄液を1 ml採取した。それぞれの髄液分画についてタウやアミロイドβなどの髄液バイオマーカー濃度をELISA法にて測定した。結果としては、iNPHにおけるタップテストで得られる髄液では各種バイオマーカー濃度は一定ではないこと、LDが脳室内髄液の濃度をより反映することを示した。29年度が最終年度であるため、記入しない。
動的に活動する大脳皮質神経回路におけるｎＮＯＳ細胞の機能

P物質(substance P, SP)によって、大脳皮質視覚野の神経型一酸化窒素合成酵素(nNOS)発現細胞のうちI型と呼ばれるタイプの細胞でCa2+透過性の非選択的陽イオン電流が誘発されること、そしてそれはホスファチジルコリン特異的ホスホリパーゼC(PC-PLC)の依存性の信号伝達経路に依存すること、また、PC-PLCが阻害された状況ではSPはある種のK+チャネルを抑制することを明らかにした。SPによって活性化されるイオンチャネルを同定するべく、様々なイオンチャネルの阻害薬の効果を検討した結果、SPによって活性化される非選択的陽イオンチャネルについては、transient receptor potential (TRP)チャネルの阻害薬であり、主にTRPV等を阻害するルテニウムレッドによって顕著に抑制されることを見出した。昨年度までに、P物質(substance P, SP)によって、大脳皮質視覚野の神経型一酸化窒素合成酵素(nNOS)発現細胞のうちI型と呼ばれるタイプの細胞でCa2+透過性の非選択的陽イオン電流が誘発されること、そしてそれはホスファチジルコリン特異的ホスホリパーゼC(PC-PLC)の依存性の信号伝達経路に依存すること、また、PC-PLCが阻害された状況ではSPはある種のK+チャネルを抑制することが明らかになっていた。SPの受容体(neurokinin 1, NK1)は大脳皮質においてはI型nNOS細胞に特異的に強い発現が見られることから、SPの作用を詳しく調べることはI型nNOS細胞の機能を解析するうえで必須である。そこで、本年度もI型nNOS細胞に対するSPの作用機序を詳しく解析することにし、SPによって活性化されるイオンチャネルを同定するべく、様々なイオンチャネルの阻害薬の効果を検討した。そして、SPによって活性化される非選択的陽イオンチャネルについては、transient receptor potential (TRP)チャネルの阻害薬であるルテニウムレッドによって顕著に抑制されることを見出した。TRPチャネルには複数のサブファミリーがあるが、ルテニウムレッドはそのうちの主にTRPV等を阻害する。TRPCの阻害薬は有意な効果を示さなかった。一方、SPによって不活性化されるK+チャネルについては現在のところ検討を継続中である。ここまでの研究では、大脳皮質の神経型一酸化窒素合成酵素(nNOS)を発現している細胞にたいするP物質(Substance P, SP)の作用を詳しく調べた。SPはnNOS細胞のSP受容体(NK1受容体)を活性化し、Gタンパク質に依存した信号伝達経路を介して非選択的陽イオン電流を誘発し脱分極させることが分かっていたが、その細胞内信号伝達経路について薬理学的に検討した。通常NK1受容体はGqと共益しているとされている。そこでGqによって活性化されるホスファチジルイノシトール特異的ホスフォリパーゼCの阻害薬U73122の効果を調べたが、予想に反してSPによって誘発される電流は抑制されなかった。そこで、考えられる様々な細胞内信号伝達経路について阻害剤の効果を調べ、ホスファチジルコリン特異的ホスフォリパーゼC(PC-PLC)の阻害薬D609によって電流が抑制されることを見いだした。一方、SPによってnNOS細胞内カルシウム濃度が上昇することが分かっていたが、その機序を検討した。カルシウム濃度の上昇は、細胞内カルシウム貯蔵器官を枯渇させる、またはカルシウム放出を阻害しても抑制されなかったが、細胞外液中のカルシウムを除去すると抑制された。以上をまとめると、SPによってnNOS細胞のNK1受容体が活性化されるとGタンパク質およびPC-PLCに依存した信号伝達経路を介して非選択的陽イオンチャネルが活性化され、そのチャネルを介してカルシウムが細胞内に流入し細胞内カルシウム濃度が上昇すると考えられる。大脳皮質視覚野の神経型一酸化窒素合成酵素(nNOS)発現細胞のうち、I型nNOS細胞はP物質(substance P, SP)受容体(neurokinin 1, NK1)に対する抗体染色で強く且つ特異的に染色されることから、SPの作用を詳しく調べることはI型nNOS細胞の機能を解析するうえで必須である。このような観点から、昨年度までに、SPによってI型nNOS細胞でCa2+透過性の非選択的陽イオン電流が誘発されること、そしてそれはホスファチジルコリン特異的ホスホリパーゼC(PC-PLC)の依存性の信号伝達経路に依存すること、また、PC-PLCが阻害された状況ではSPはある種のK+チャネルを抑制すること、そして、SPによって活性化される非選択的陽イオンチャネルについては、transient receptor potential (TRP)チャネルの一種であることを示唆する結果を得た。本年度は、以上の成果を日本神経科学会で発表し、また論文としてまとめCerebral Cortex誌に発表した。ついで、nNOS細胞の薬理学的性質についてさらに詳しく明らかにすることにし、ムスカリン型アセチルコリン受容体の活性化のnNOS細胞に対する効果について検討した。ムスカリン受容体のアゴニストであるoxotremorine Mを投与したときのnNOS細胞の反応を調べたところ、多くのnNOS細胞で外向き電流が誘発され、過分極を示した。この反応に対してムスカリン受容体のサブタイプ選択的な阻害薬の効果を検討し、現時点では、主にM3タイプが寄与していることを示唆する結果を得ている。P物質(substance P, SP)によって、大脳皮質視覚野の神経型一酸化窒素合成酵素(nNOS)発現細胞のうちI型と呼ばれるタイプの細胞でCa2+透過性の非選択的陽イオン電流が誘発されること、そしてそれはホスファチジルコリン特異的

ホスホリパーゼC(PC-PLC)の依存性の信号伝達経路に依存すること、また、PC-PLCが阻害された状況ではSPはある種のK+チャネルを抑制することを明らかにした。SPによって活性化されるイオンチャネルを同定するべく、様々なイオンチャネルの阻害薬の効果を検討した結果、SPによって活性化される非選択的陽イオンチャネルについては、transient receptor potential (TRP)チャネルの阻害薬であり、主にTRPV等を阻害するルテニウムレッドによって顕著に抑制されることを見出した。研究計画のうち大脳皮質のnNOS発現細胞の性質を詳しく調べる部分は相当程度達成できているが、徐波睡眠様活動中のnNOS細胞の活動についてはまだ実験が進んでいない。よって上のように評価する。予備実験において大脳皮質の急性スライス標本で徐波睡眠様活動を誘発できていたが、確実に安定的に誘発できる条件を確立出来ていないため、まずその条件を検討する必要がある。大脳皮質のnNOS発現細胞の性質を詳しく調べることは本研究計画の重要な部分であるが、その部分を相当程度達成できたと考えている。現在までの達成度研究計画の第一段階でnNOS細胞の性質を詳しく調べる予定であった。大脳皮質のnNOS細胞はNK1受容体に対する抗体によって特異的に強く染色される。このことから、nNOS細胞の機能がNK1受容体とその内因性リガンドであるSPによって特異的に制御される可能性が考えられる。そこでSPによる機能制御はnNOS細胞の特に重要な性質と考え、SPのnNOS細胞に対する作用機序を調べた。そして実績の概要に記したように、今年度の研究でそれを詳しく明らかにすることが出来た。これにより、研究の第一段階について相当程度は達成できたと考える。よって「おおむね順調に進展している」と評価する。平成26年度の前半に、研究成果の一部を論文にまとめて発表することとなったが、その執筆、および査読者から求められた修正に想定していた以上に時間をとられたことにより、予定していた実験が遅れた。その実験のために使用する予定であった費用が未使用となった。次年度は大脳皮質の急性スライス標本で徐波睡眠様活動を誘発し、その時のnNOS細胞の活動を解析する実験を実施したい。基本的に当初の計画に沿って研究を推進する予定である。具体的には、まずnNOS細胞が一酸化窒素(NO)を放出する機構を調べる。放出されたNOを検出するためにはNO感受性の蛍光色素を用いることを考えている。また平行して、徐波睡眠様神経活動を急性スライス標本において誘発し、神経回路が動的に活動している時のnNOS細胞の活動状態を解析する。本研究計画で予定していた実験を継続する予定であり、その実験に使用するマウスの購入費用、遺伝子改変マウスの飼育・管理費用、および実験に使用する試薬の購入費用に充てる予定である。本年度の研究計画はおおむね円滑に進んだため、未使用額を次年度に繰り越すことにした。主に施設備品費および消耗品費として使用する予定である。
脊椎動物の初期発生制御機構における母性効果遺伝子の役割と機能

研究代表者は、脊椎動物初期発生における母性因子の機能と役割を解明するため、ゼブラフィッシュ母性効果変異体を用いた研究を行った。bobtailは、尾芽伸張や中脳-後脳境界オーガナイザー形成に異常をきたす母性効果変異体である。研究代表者は、ポジショナルクローニングにより、この変異体の責任遺伝子がモリブデン補酵素生合成に関与するMOCS1遺伝子であることを明らかにした。また、bobtailではFgfシグナルに対する応答能が著しく低下していること、さらにbobtailの表現型が硫酸イオンを含む溶液中で胚を培養することによって完全に回復することを見いだした。モリブデン補酵素は、亜硫酸イオンを硫酸イオンに変換する亜硫酸オキシダーゼの補酵素として働く。また、Fgfリガンドとレセプターの結合は細胞外マトリックスの構成成分であるヘパラン硫酸プロテオグリカンを必要とし、ヘパラン硫酸はその活性に硫酸基の付与を必要とする。研究代表者は、野生型胚とbtl変異体胚間でヘパラン硫酸の硫酸化の定量分析を行い、btlではヘパラン硫酸の低硫酸化が起きていることを示した。さらに、薬剤誘導可能なFGF受容体システムを用い、btlにおいても活性型FGF受容体によってその下流のERKタンパク質がリン酸化されることを明らかにした。そのことはMOCS1はFGFシグナル経路においてFGF受容体と同レベルまたはより上流で作用することを示唆する。以上のことから研究代表者は、MOCS1が母性因子として、亜硫酸オキシダーゼへのMo補酵素供給による硫酸イオン生成、ヘパラン硫酸への硫酸基付与を通じてFgfシグナル経路を活性化し、脊椎動物発生に必須の働きを果たしていることを明らかにした。研究代表者は、脊椎動物初期発生における母性因子の機能と役割を解明するため、ゼブラフィッシュを用いたフォワード遺伝学的手法に基づく研究を行った。まず第一に、尾芽伸張や中脳-後脳境界オーガナイザー形成に異常をきたす母性効果変異体bobtai1の解析を行った。この変異体の責任遺伝子は、ポジショナルクローニングにより、モリブデン補酵素生合成に関与するMOCS1遺伝子であることが判明していた。研究代表者は、Fgf8タンパク質をしみ込ませたビーズの移植実験等により、bobtailではFgfシグナルに対する応答能が著しく低下していることを明らかにした。このFgfシグナルの異常は、MOCS1がコードする酵素の産物でモリブデン補酵素生合成の中間生成物であるcPMP (cyclic pyranopterin monophosphate)を1細胞期に微量注入することで完全にレスキューできた。このことから、モリブデン補酵素生合成系はFgfシグナルを介して初期発生と関わることが示唆された。さらに研究代表者は、bobtailの表現型が硫酸イオンを含む溶液中で胚を培養することによって完全に回復することを見いだした。以上のことから研究代表者は、脊椎動物初期発生においてモリブデン補酵素生合成が重要な役割を持つことを初めて明らかにし、それは亜硫酸オキシダーゼへの補酵素供給による硫酸イオン生成、ヘパラン硫酸への硫酸基付与を通じてFgfシグナル経路を活性化することによってなされるとのモデルを提唱した。第二に、トランスポゾンを用いた新しい母性効果変異体の単離法の開発を行った。これまでに、卵子の動植物極性形成に異常をきたす変異体を見いだした。現在この変異体について解析を行っている。

母性効果変異体bobtailは、尾芽伸張や中脳-後脳境界オーガナイザー形成に異常をきたす。以前に研究代表者は、ポジショナルクローニングにより、この変異体の責任遺伝子がモリブデン補酵素生合成に関与するMOCS1遺伝子であることを明らかにし、bobtailではFgfシグナルに対する応答能が著しく低下していること、さらにbobtailの表現型が硫酸イオンを含む溶液中で胚を培養することによって完全に回復することを見いだした。モリブデン補酵素は、亜硫酸イオンを硫酸イオンに変換する亜硫酸オキシダーゼの補酵素として働く。また、Fgfリガンドとレセプターの結合は細胞外マトリックスの構成成分であるヘパラン硫酸プロテオグリカンを必要とし、ヘパラン硫酸はその活性に硫酸基の付与を必要とする。研究代表者は、野生型胚とbtl変異体胚間でヘパラン硫酸の硫酸化の定量分析を行い、btlではヘパラン硫酸の低硫酸化が起きていることを示した。さらに、薬剤誘導可能なFGF受容体システムを用い、btlにおいても活性型FGF受容体によってその下流のERKタンパク質がリン酸化されることを明らかにした。そのことはMOCS1はFGFシグナル経路においてFGF受容体と同レベルまたはより上流で作用することを示唆する。以上のことから研究代表者は、モリブデン補酵素生合成が、亜硫酸オキシダーゼへのMo補酵素供給による硫酸イオン生成、ヘパラン硫酸への硫酸基付与を通じてFgfシグナル経路を活性化し、脊椎動物発生に寄与することを明らかにした。