hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
標的タンパク質精製法の開発

生命現象を解明するために、生理活性小分子化合物はさまざまな形で利用されてきた。その中で最も直接的な利用法は、化合物の標的タンパク質を精製・同定することだろう。しかし、標的タンパク質の生化学的精製は困難を極める作業であり、その成功率は低い。本研究の目標は、成功率を向上させる方法を開拓することである。化合物の標的タンパク質精製では、ビオチン化化合物を用いるのが簡便。ビオチン化した化合物をアビジンアガロース担体に結合させ、化合物のアフィニティー担体をつくり、標的タンパク質を細胞抽出液から釣り上げてくる。研究代表者らはこのような精製を繰り返し行う中で、改良を行い、「釣竿法」という方法を開発した。この方法を用いれば、標的タンパク質の細胞抽出液からの回収率が格設に良くなることがおおい。この「釣竿法」をさらに改良し確立させ、特定研究で発見されたり合成される化合物の標的タンパク質決定に活用してきた。例えば、領域内の木越らが精力的に研究してきた海洋天然物オーリライドをとりあげた。この細胞毒化合物は、低濃度(数nM)で細胞にアポトーシスを引き起こすが、そのメカニズムは謎であった。釣竿法を試したところ、標的タンパク質がプロヒビチンであることが判明し、その結果を生化学、分子生物的、細胞生物学的手法で確認した。この他にも、領域内の他の研究者と協力して、生理活性化合物の標的決定を釣竿法で試み、今後の研究へとつながる成果を得た。この釣竿法は製薬会社5社で現在用いられるようになっている。化合物の標的タンパク質精製は「釣り」に似ている。一つの方法は、ビオチン化化合物を用いる精製法である。研究代表者らはこのような精製を繰り返し行う中で、化合物とビオチンをつなぐリンカーの形状や物性が重要ではないかと考えた。そこで、釣りから学び、釣竿状の分子をリンカーとして用いた。釣竿は餌を遠くへ飛ばし、釣り糸が絡むのを防ぐ。釣竿のような物質をリンカーとして用いれば、化合物をアビジン担体から十分に遠ざけて大きなタンパク質やタンパク質複合体の精製が可能になり、リンカー部分が絡んで非特異的相互作用を起こすことが少なくなるだろう。原理の証明のため、われわれが「釣竿」として取り上げたのはポリプロリンである。プロリンが連続すると、左巻きのヘリックスが真直ぐに伸びた釣竿状の物質となる。実際に、各種の既知化合物に9個のプロリンからなる27Åの釣竿をつけると、標的タンパク質の細胞抽出液からの回収率が格段に良くなることを証明した。この結果をまとめた論文は、J.Am.Chem.Soc.誌に発表された。今後、この「釣竿法」をさらに改良し確立させる。そして、特定研究で発見されたり合成される化合物の標的タンパク質決定に活用したい。
『時々入院、ほぼ在宅』を担う病院と地域の看護師が有する能力の探求

本研究の目的は、地域包括ケアシステムの中で「時々入院、ほぼ在宅」を実現するための病院と地域の看護職が多機関間同職種連携をするために必要な能力を明らかにすることである。病院から在宅へと療養場所を移行する際に関わる看護職へのインタビュー調査では、患者・療養者とその家族の思いや希望を中心につながることが明らかとなった。そこで、患者・療養者とその家族の思いや希望を捉えること、また、それを支援方針の中心とするとはどういったことなのか文献レビューを行った。研究計画の修正が必要となったこと、業務との兼ね合いなどにより研究の遂行が遅延している。患者・療養者とその家族の思いや希望を中心につながることが看護職間連携の基盤と考え、患者・療養者とその家族への共感性や看護職間の連携協働の認識、看護職自身の協調性といった概念とともに看護職間連携を検討したい。そのためにIPW自己評価尺度と専門職の基本的能力である共感性や協調性を測る尺度を用いた調査票を作成し、調査を実施する。本研究の目的は、地域包括ケアシステムにおける地域性を踏まえて『時々入院、ほぼ在宅』を担う病院と地域の看護師が多機関間同職種連携をするために必要な能力を明らかにすることである。今年度は、応募者が行った先行研究で明らかになった訪問看護師の専門職連携実践力リストの再検討と、病院と在宅の連携に関する研究について看護師同士だけでなく、医師、リハビリ職、介護支援専門員など多職種の連携・協働の文献を収集し、病院と在宅の連携・協働における問題や課題を地域性や職種の専門性の違いなどの視点から分類し、相違点や共通点の分析を行った。分析結果から、インタビュー調査に用いるインタビューガイドの質問項目を検討した。インタビュー調査のための項目検討に時間を要し、調査の実施が遅れている。今年度は、病院から在宅へと移行する際に必要な在宅療養移行支援について、病棟看護師、退院支援看護師、訪問看護師にインタビュー調査を行った。その結果、患者・療養者と家族の希望を中心につながりあい、役割の異なる看護職が補完しあいながら支援を行っていることが明らかになった。当初想定した研究協力者からの協力が得られず、研究協力依頼に難航した。様々な職場で働く看護職にインタビュー調査を行い、看護職間連携の現状や課題を明らかにしていく。研究協力者を増やし、患者・療養者の状況によって連携の在り方が異なるのかを検討したい。研究計画の実施が遅れているため、助成金の使用も遅れている。研究計画が遅れているため、助成金の使用も遅れている。今年度は更なる調査とともに学会発表等に使用する。また、地域包括ケアシステム構築のためのネットワークづくりや取り組みについて公開されているものに参加し、地域性や課題の特徴なども検討するために経費を使用する。研究計画の遂行が遅れているため、助成金の使用も遅れている。今年度は郵送法による調査及び学会発表等に使用する。最終年度となるため、報告書作成としても助成金を使用する予定である。今年度はインタビュー調査を行うための実施費用に使用する。また、本研究は様々な職場で働く看護職を対象とするため、データ収集や分析の適切性を確認するためにも当該分野の専門職にスーパービジョンを受ける必要があり、その費用としても使用する。
近似計算を用いた半正定値計画問題に対する高速数値解法

半正定値計画問題とは、線形の目的関数を線形制約および半正定値制約の下で最小化する問題で、線型計画問題を含む広いクラスの問題である。制御システムの安定性の判定などの問題が半正定値計画問題に帰着でき、また、組合せ最適化問題や統計の推定の分野への応用などにも適用できるなど適用範囲の広い問題である。この数年、半正定値計画問題を解く枠組みとして内点法が盛んに研究されている。内点法は制約領域内にある最適解に至る中心パスを追跡することによって解に到達する算法である。一回の反復において、線形近似を行い線形システムを解き探索方向を得るのであるが、問題の規模が大きくなるにつれて、全体の計算の中での割合が大きくなり、実際に解くことが困難になる。このような現象を回避するため、線型システムを直接正確に解くことをせずに共役勾配法などの近似計算を行うことが考えられるが、本研究によって近似計算を用いることとアルゴリズムの収束性が矛盾しないような理論的保証を得ることができた。この方法は、高い精度は要求されないが大規模な問題に対して有効で、組合せ問題の緩和問題などに対して効果的であると思われる。また、別の手段として、線形近似ではなく多項近似を行うことによる高速化も考えられる。すべての次数について解くべき線形システムの係数行列が等しくなる為、一度の分解で容易に多項近似ができる性質がある。このことを用いて、p次近似を行うことよってp+1次収束を示すことができた。この方法は中小規模だが高い精度が要求される問題に対して有効であると思われる。
中世仏教僧の詠歌における特質と思想・信仰基盤の研究

中世を代表する僧侶の一人である明恵の和歌の全体像を見極めた。『明恵上人伝記』所収の明恵詠の注釈を行い、申請者が従来行ってきた『明恵上人歌集』所収歌の研究と合わせて、明恵における詠歌と思想・信仰との関わりを総合的に明らかにした。あわせて、和歌に関する明恵の考えを示す発言を含む『明恵上人遺訓』の伝本研究を行い、その成立過程を分析した。中世の寺院文化圏内で編まれた歌集『楢葉和歌集』『続門葉和歌集』『安撰和歌集』に注目し、これらの歌集に収められた釈教歌の内容や典拠を解明した。これによって、中世僧侶の釈教歌は、それぞれが所属する寺院の重んじる聖教をふまえて詠まれたものが多いという特徴が見出され、中世僧侶における詠歌と思想の具体的な関わりを明らかにし得た。1『明恵上人伝記』所収の明恵和歌について、全体の三分の一に注釈を施した。本文批判にのっとった正確な注釈を目指し、注釈作業の前提として『明恵上人伝記』主要伝本九本の本文を参照して校異をとった。そのうえで現代語訳、語釈、考察を加え、参考文献を提示した。その成果は「『明恵上人伝記』所収和歌注釈(一)」(『十文字学園女子大学短期大学部研究紀要37』2006年12月)とした公表した。これによって、難解な部分のあった『明恵上人伝記』所収の明恵和歌と詞書を詳細に理解することができるようになった。残り三分の二の注釈は平成19年度も継続して行う。2明恵の和歌観の一端を知る上で重要な資料である『明恵上人遺訓』について、伝本系統を整理し、その成立過程を明らかにした。『明恵上人遺訓抄出』、『明恵上人伝記』、版本『明恵上人遺訓』に収められた明恵の発言を比較検討し、その関係を分析したことにより、明恵の実際の発言と後世に増補された部分を見極めることができるようになった。その成果は、平成19年度中に「『明恵上人遺訓』の成立」として公表する予定である。3『楢葉和歌集』と『続門葉和歌集』所収の釈教歌のうち、経典に依拠する歌について、その典拠を調査したうえで思想的な基盤を検討した。この作業は平成19年度も継続して行う。平成19年和歌文学会五月例会(於学習院大学)において、その成果の一部を「寺院文化圏の釈教歌-『楢葉集』『続門葉集』を中心に-」として口頭発表する予定である。1『明恵上人伝記』所収の明恵和歌について、全体の三分の二に注釈を施した。前年度から継続して、本文批判にのっとった正確な注釈を目指し、注釈作業の前提として『明恵上人伝記』主要伝本九本の本文を参照して校異をとっている。その成果は「『明恵上人伝記』所収和歌注釈(二)」(『十文字学園女子大学短期大学部研究紀要第38集』平成19年12月)として公表した。これによって、仏教的な知識がなければ理解の難しい『明恵上人伝記』所収の明恵和歌と詞書を詳細に理解することができるようになった。残りの注釈は平成20年度も継続して行い、注釈を完成させる。『明恵上人遺訓抄出』、『明恵上人伝記』、版本『明恵上人遺訓』に収められた明恵の発言を比較検討し、その関係を分析したことにより、明恵の実際の発言と後世に増補された部分を見極められるようになった。その成果は論文「『明恵上人遺訓』の成立」(『古代中世文学論考第20集』平成19年10月、新典社)として公表した。3『楢葉和歌集』『続門葉和歌集』所収の釈教歌のうち、経典に依拠する歌について、その典拠を調査したうえで思想的な基盤を検討した。平成19年和歌文学会五月例会(於学習院大学)において、その成果の一部を「寺院文化圏の釈教歌--『楢葉集』『続門葉集』を中心に--」として口頭発表した。この発表に追加・修正を加えて論文「寺院文化圏の釈教歌-『楢葉集』を中心に」を執筆し、現在査読誌に投稿中である。

1『楢葉和歌集』『続門葉和歌集』所収の釈教歌のうち、経典に依拠する歌について、その典拠を調査したうえで大寺院の僧侶の思想的な基盤を検討した。平成19年和歌文学会五月例会において、その成果の一部を口頭発表し、さらに加筆・修正したうえで論文「寺院文化圏の釈教歌-『楢葉和歌集』を中心に」(『国語国文』2008.8)として公表した。この研究は、まだ途上であるため、今後も研究を継続する予定である。2『明恵上人伝記』所収の和歌に注釈を施した。平成18年度から継続して、本文批判にのっとった正確な注釈を目指し、注釈作業の前提として『明恵上人伝記』主要伝本九本の本文を参照して校異をとり、現代語訳、語釈、考察を加え、参考文献を提示した。その成果を「『明恵上人伝記』所収和歌注釈(三)」(『十文字学園女子大学短期大学部研究紀要』2008.12)として公表し、『明恵上人伝記』所収の全和歌に関する注釈を完成させた。3従来から継続している明恵の和歌に関する研究の総まとめとして、明恵の和歌の全体像と後世への影響を分析してまとめた。その成果を「テクスト布置の解釈学的研究と教育」第四回国際研究集会の第四部会において発表し、「なぜ明恵は和歌を詠んだか-中世僧侶における詠歌-」(阿部泰郎編、「テクスト布置の解釈学的研究と教育」第四回国際研究集会報告書)として公表した。明恵の和歌の特質と後代への影響を探り得たことで、僧侶による和歌の特質の一端が明らかになった。
多数の１細胞から定量性のある網羅的遺伝子発現情報を取り出すための基盤技術の開発

1細胞RNA-seq法は、様々な生理条件で観察される1細胞間に現れるRNA量の不均一性を検出する重要な方法である。1細胞RNA-seq法では、定量性を保ったまま多数の1細胞を解析するスループット性能が重要である。1細胞RNA-seq法は、1細胞からのcDNAの増幅と、その後の増幅cDNAから超並列型シーケンサー用のライブラリDNAへの変換の2つの過程からなる。本申請課題では、両方の過程のスループット性能を上昇させた他、極めて優れた効率を持つシーケンスライブラリDNA作製方法を開発した。発生過程や様々な生理条件では、集団細胞はゲノム情報が同じにも関わらず、1細胞間でRNAの発現量の不均一性が観察される。RNA量の不均一性の網羅的検出は、発生・分化や薬剤応答メカニズムの解明に有効であり、1細胞RNA-seq法の活用に注目が集まっている。本申請課題では、これまでに申請者が開発した1細胞Quartz-Seq法をベースに、定量性を更に向上させつつ、ハイスループット化した1細胞RNA-Seq法を確立することを目的としている。1細胞RNA-seq法は大きく分けて、RNAを増幅可能な形に変換しcDNAを増幅するステップと増幅したcDNAをシーケンスライブラリDNAに変換するステップの2つにわかれる。本申請計画では、定量性及びスループットに関わる以下3点を検討項目としてあげた。1)cDNAの増幅を96穴PCRプレートを1単位として多数の1細胞を処理する方式の開発。2)cDNA増幅法の精緻化3)cDNAからシーケンスライブラリDNAへの変換ステップの精緻化とハイスループット化。昨年度は、2)1細胞レベルの逆転写効率をZip nucleicacidを活用し改善した。増幅産物をaRNAにするためPCR増幅とIVT増幅を組み合わせた増幅法の条件を決定した。3)aRNAから高効率にシーケンスライブラリDNAに変換する条件を決定した。今年度は、3)Tn5トランスポゼースを用いたシーケンスライブラリDNAに変換する条件を検討した。その結果、10-40 pgの増幅cDNAがシーケンスライブラリDNAへの変換に必要であることがわかった。これにより2)PCRによる増幅サイクルを6-8サイクル減少した。1)96穴用のPCRプレートの蓋と遠心機とミキサーを活用することで、シングルPCRチューブでの処理から、おおよそ100個の1細胞を1単位として大量に扱うことができるようになった。本申請課題では、1細胞RNA-Seq法(SP1: Quartz-Seq)をベースに、定量性を更に向上させつつ、ハイスループット化した1細胞RNA-Seq法(SP2:仮称)を確立することを目的としている。完成を目指すSP2では、PCRとIVT: In vitro transcriptionを組み合わせることにより、増幅後の産物がaRNAとなる。これによりSP2ではハイスループット化のボトルネックになる超音波によるcDNAの断片化のステップを回避することで、ハイスループット化が容易になると期待される。これらに加えて、SP2ではSP1で失っていた転写方向の情報の検出が可能になると期待され、non-coding RNAの1細胞での検出に大きく貢献すると期待される。昨年度はSP2の基盤となる各パラメータの設定に成功した。昨年度設定した条件は3つほどあり、1つめは根本的な改善を図るため1細胞レベルのRNAからの逆転写効率の上昇する要因を3つ特定したこと。2つめはDirectional RNA-Seqを可能とするためのPCRとIVTを組み合わせる最適な条件を2つに絞り込むことに成功したこと。3つめはPCR&IVT増幅後得られるaRNAから、ハイスループット化のボトルネックであった超音波による断片化なしにシーケンスライブラリ作製方法できるようになったこと。またシーケンスライブラリ作製の効率化にも成功した。5-10 ngのcDNAから非増幅でシーケンスライブラリを作製することができる方法HALprepを作製した。通常の方法ではスタートマテリアルをシーケンスライブラリDNAに変換する効率が1 %程度だが、HALprepでは10 %程度の効率を持っていた。これらパラメータを組み合わせたSP2のプロトタイプはシーケンスによる検証を待つ段階にある。平成24年度計画では、qPCRなどの方法を駆使して、基盤となるSP2のプロトタイプのために必要な増幅法のパラメータ設定を計画していた。平成24年度は、当初の計画通り増幅法の設定を終えた。またシーケンスライブラリ作製法の効率化にも成功し、SP2プロトタイプが完成した。全体としての達成度は約50%。平成24年度当初の計画としてはほぼ計画通りの達成度である。平成25年度は2つのことを推進しようと考えている。一つは計画通り、PCR増幅とIVT増幅を併用するSP2プロトタイプをシーケンスによる検証をすすめ

完成を目指すこと。もう一つは、平成24年9月に報告されたハイスループットな方法CEL-Seqで使用されている技術がSP2に応用できないか調べること。CEL-SeqはIVT増幅のみを使用する1細胞RNA-Seq法で、一人の人が数百の1細胞を同時に扱える可能性をもった非常にスループット性能の高い方法である。一方で、SP1:Quartz-Seqの定量性能には程遠い。当初の計画にはなかったが、CEL-Seqのスループット性能を上昇させる工夫は非常に重要であるので、本申請課題で作製する方法に組み込めないか検討する。「該当なし」
単一細胞殺傷法を用いた損傷修復並びに極性形成開始機構の研究

昨年度確立したレーザー光による単一細胞殺傷法を使った実験系を用いて、本年度は細胞がどのようにして、損傷修復の特定の様式を選択するのか、またそれぞれの損傷修復の意義を探る実験を行った。損傷修復の様式には2種類あり、極性化した上皮細胞(細胞の周りを隙間なく接着構造が取り巻いている)の場合はアクトミオシンによるリングが傷口の周囲の細胞を貫くように形成され、その協調的な収縮によって傷口の修復と死細胞の排除が行なわれる。極性化の弱い上皮細胞や繊維芽細胞(細胞間の接着構造に大きな隙間が見られる)では、リングは形成されず、ラメリポディアの形成とそれにともなう個々の細胞の移動によって修復が行なわれる。このように細胞間の接着の様式により、修復の機構は異なるようである。それを確かめるため、細胞間の接着が阻害される、低カルシウムの培養条件下で損傷修復を行わせたところ、本来リングを作る、極性化した上皮細胞でもリングは形成されず、ラメリポディアによる修復が行われた。より特異的な実験として、細胞間接着に必須なαカテニン分子を発現しない細胞株とそれにαカテニンを導入して極性化した上皮になった細胞株とにおける損傷修復を比較した。この場合は培養液のカルシウムの有無にかかわらず、接着機能のない細胞にはリングは形成されず、ラメリポディアによって損傷修復が行われた。極性化した上皮細胞の特徴はバリア機能と呼ばれ、すなわちタイトジャンクションを持ち、上皮シートを介した物質の移動が制限されていることである。実際にタイトジャンクションを形成するタンパク質クローディンの挙動を観察すると、リングを使っての修復の場合はリングの修復とともにタイトジャンクションも速やかに延長してバリア機能の破綻を短時間にとどめていることがわかった。本年度は実験系を確立し、基礎データの検討を行なった。単一細胞の殺傷の方法として、レーザー光の熱によるものと、ピエゾ素子の高速振動により細胞膜を傷つけるという二つの方法を比較した。素早さ、簡便さにおいてレーザー光が圧倒的に便利であり、主として使用することにした。傷口の周辺の細胞が修復を行なう時の様態と細胞のタイプとの関係の検討を次に行なった。極性化した上皮細胞(細胞の周りを隙間なく接着構造が取り巻いている)の場合はアクトミオシンによるリングが傷口の周囲の細胞を貫くように形成され、その協調的な収縮によって傷口の修復と死細胞の排除が行なわれる。極性化の弱い上皮細胞や繊維芽細胞(細胞間の接着構造に大きな隙間が見られる)では、リングは形成されず、ラメリポディアの形成とそれにともなう個々の細胞の移動によって修復が行なわれた。極性化した上皮細胞でもミオシンの収縮を薬剤により阻害すると、ラメリポディアにより細胞の基底側では傷口は修復した。しかし、アピカル側では修復は起こらず、死細胞の排除もできなかった。このことから、リングを作る細胞でも基本的にはラメリポディアによる修復機構は持っていること、また、リングの形成、収縮は死細胞を排除するような力強く素早い修復に必要であると考えられた。リングによる修復の過程を詳しく解析するために、GFP融合ミオシン分子を発現する上皮細胞株を樹立し、リングがどのように出現し、収縮しながら傷を塞いでいくかをライブイメージングによって解析をした。リングはアピカル近くの接着装置近傍に形成され、収縮するとともにミオシンの集積も増加する。さらに基底側へと降りながら、死細胞を上へ持ち上げ傷口を塞ぐことがわかった。
セラミック双結晶の粒界構造ユニット形成の体系化

方位関係が異なる結晶が互いに接する結晶粒界には、格子不連続性を緩和する配位多面体が形成される。多結晶体の物性は、この粒界構造と密接に関係する。本課題では、結晶粒界に起因する種々の現象について調べ、その現象と粒界構造との相関について調べた。例えば、電界印加に伴うセラミック圧紛体の急峻な緻密化現象について行った研究では、結晶粒界に優先的に作用する外部電界に起因して、結晶粒界及びその近傍が大気中において強還元状態になること、この効果を利用して大気中において窒化が生じること、粒界還元状態は結晶粒の方位関係に依存することなどをはじめとした成果が得られた。初年度は、全研究期間において最も基本となる実験項目である1セラミック双結晶の作製、2接合面への添加物蒸着と雰囲気制御のもとでの熱拡散接合、3新規双結晶接合炉の設計製作について行った。1については、SrTiO3[001]45°の回転角度を有する対称傾角粒界を作製した。この粒界の構造解析をHAADF-STEM/ABF-STEM法を用いて観察、解析を行った。その結果、粒界は直線状ではなく10-20nm程度の非常に細かいファッセット状であることを見いだした。この特有の構造については現在第一原理を用いた理論計算中である。2については、双結晶表面への添加物蒸着についてはMBE電気炉を設計から準備し、その調整を終了させた。3については、双結晶接合のための接合炉については設計が終了し、各部材を準備中である。本研究の主たる目的である粒界構造ユニット構造と機能特性との相関性の解明について、新たな着眼点を見出した。これは、実用材料で極めて重要な動作中における構造ユニットの構造変化を、その場で計測するというものである。特に電子セラミック材料として用いられることの多いSrTiO3では、外部電場印加が非常に重要となる。この研究について、まず、電場を印加しながら昇温し、その後粒界構造にどのような変化が生じるかについて関連設備を整備し基礎的なデータ取得を行った。その結果、僅か100V/cmの電界で粒界の構造変化が生じることを見出した。今回使用した試料は多結晶体であり、その粒径は約1000nm程度である。これを考慮すると一つの粒界には約0.1V程度しか印加されていないこととなる。それにもかかわらず上記した構造変化が生じたこととなる。今後、この時に変化が生じた構造と変化が生じなかった構造との相違点に着目し、基礎データの蓄積を図り、構造ユニットの体系化へとつなげていく予定である。今年度は、主にSrTiO3における極微量陽イオン比の変化にともなう結晶内部の構造変化、および、粒界部の原子構造変化についての試料作製を行った。また、昨年度において見出した電界印加による紛体焼結過程における結晶粒界の構造変化についても実験を行った。前者については、レーザー用いた薄膜堆積法においてSrTiO3単結晶をターゲットに用い、アブレートさせるときのレーザーエネルギーを調整することで基板上へS/Ti比を制御する手法を採用し、Sr/Ti比を調整させる手法を構築するとともに、その試料の構造解析を行った。その結果、Sr過剰では結晶中に過剰SrO原子層を含む格子欠陥が形成されること、Ti過剰では数10nm程度のSr空孔クラスターが形成されることが分かった。基板状へ多結晶性薄膜を形成させたところ、Sr過剰試料では化学量論比結晶と同様な構造が形成されることを確認した。Ti過剰試料についても順次調査する予定である。一方、後者については、電界印加によって結晶粒界が優先的に強還元状態になることを見出した。この還元特性は結晶粒界の方位に依存することが分かった。この効果は結晶粒界における原子配列の整合によってもたらされるものであり、整合性が低い粒界では外部電界がより効果的に作用することと密接に関係するものと考えられる。さらには、ジルコニアセラミックスにおいて電界印加条件を適切に設定することで結晶粒界が窒化させることも明らかとなった。この結果は、従来の酸窒化物合成方法を凌駕する新規窒化方法として期待される結果である。PLD法を採用して、結晶中の陽イオン比を変化させることが可能となったこと、さらには、電界効果に着目し、その効果が結晶粒界の整合性と密接に関係することを、突き止めることができた。これらの成果は昨年度の研究計画で予定していた内容とほぼ整合するため。本申請課題では、結晶粒界に形成される格子不連続性を緩和する配位多面体(構造ユニット)に関し、粒界での種々の特性を決定づける支配的な構造ユニットの抽出、および、その構造を利用した新たなセラミック焼結への取り組みについて研究を行ってきた。最終年度に得られた研究成果は以下の通りである。結晶粒界の構造解析を行うために結晶どうしを熱拡散接合させるバイクリスタル法を用いていた。この接合において接合自体を適切に行うために、電界を利用することを着想しその適用を試みたところ、一般的な熱処理法と比較して格段に接合状態の良い接合面を得ることに成功した。そこで、この手法を圧紛体の焼結工程に展開したところ、例えば、チタン酸バリウムでは、一般的に用いられる焼結温度である1300°Cを大きく下回る900°C程度で緻密化ができることを見出した。

さらに、本手法をジルコニアセラミックに同様に適用したところ、条件を調整することで焼結体内に窒化物が形成されることを見出した。大気中において電界印加のみで酸化物を窒化できたことになる。この手法は、新たな窒化物合成法の一つとして非常に有意義な手法であると考えられる。この窒化された結晶粒界を調べたところ、粒界整合性が低い粒界から、優先的に窒化されることが分かった。この粒界には配位欠損の多い構造ユニットが含まれているものと考えられる。一方、極微量の陽イオン比を変化させたチタン酸ストロンチウムにおいて、僅か1/1000程度のSr/Ti比の変化がこの焼結特性、ならびに、結晶粒界構造を変化させることが明らかとなった。この陽イオン比の変化は結晶粒界のSingular/Rough構造変化と密接に関係しているものと考えられる。これらの成果をもとに、最終年度において研究期間内の内容の取りまとめを行った。方位関係が異なる結晶が互いに接する結晶粒界には、格子不連続性を緩和する配位多面体が形成される。多結晶体の物性は、この粒界構造と密接に関係する。本課題では、結晶粒界に起因する種々の現象について調べ、その現象と粒界構造との相関について調べた。例えば、電界印加に伴うセラミック圧紛体の急峻な緻密化現象について行った研究では、結晶粒界に優先的に作用する外部電界に起因して、結晶粒界及びその近傍が大気中において強還元状態になること、この効果を利用して大気中において窒化が生じること、粒界還元状態は結晶粒の方位関係に依存することなどをはじめとした成果が得られた。申請時に策定した双結晶作製、そのための接合設備、ならびに、双結晶界面への添加材蒸着のための蒸着設備等、設計から作製までを予定通り終わらせることができた。一方、作製された双結晶の観察実験中に、本研究の構造ユニットの体系化に関する新たな研究指針の着想に至った。それは、設計された双結晶の構造からその機能を類推するのではなく、逆に、機能を有するために使用する外部刺激、例えば、外部電界に対して応答する構造ユニットを抽出するという指針である。これに関しても関連設備を整備し基礎的知見についの取得に成功した。本研究課題においては結晶粒界の原子構造の整合性を整理することをモナ目的の一つとして設定した。この一連の研究を進めていく過程において、紛体の焼結時に外部電界を印加することが極めて有効であることを見出した。この電界印加の有効性が結晶粒界(この場合には、焼結過程で生じる紛体間のネック部に相当)の整合性と密接に関係することが明らかとなっている。今後は、この点に着目して課題を進めていく予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。セラミック材料学上述したように基本的な研究指針に変更はないが、新たに着想した外部刺激に対する構造変化に着目した研究を次年度において取り組んでいく。本年度において、すでに僅か0.1V印加によって構造変化が生じることを見出している。しかしながら、この構造変化が全ての粒界において認められたわけではない。この変化が生じる粒界、変化が生じない粒界、とを系統的に整理し、解析していくことが、本研究の主たる目的である構造ユニットの体系化への最短経路であると判断できる。従来設定した研究については、順に研究を進めていくこととし、さらに、上記した外部刺激に対する粒界構造変化についても取り組んでいく。支配的構造ユニットの系統的な抽出については、次年度も継続して行っていく。
社会関係の発展が精神疾患の予防につながることを検討する縦断研究

本研究は、レジリエンスやソーシャルキャピタルの重要性を定量的に証明するため、(1)大学生における社会関係の発展と精神疾患の予防・軽症化・早期回復との関係を明らかにし、(2)レジリエンスやソーシャルキャピタルの要素となる、大学生がもつ精神疾患へのスティグマの現状とその要因について検討した。本研究は、査読付き英文誌7誌をはじめとした成果を上げた。本研究の研究成果は、下記小冊子に詳細にまとめ、被験者、関係者に配布し、研究成果の普及に努めた。この報告冊子は、研究代表者に請求するか、ホームページ上で手に入れることができる。思春期後期は、社会関係を発展させる一方、精神疾患の有病率も急激に増加する時期で、大学生までに8人に1人が精神疾患を患うか、罹患した経験を持つ。大学生活は、新たに構築する社会関係を利用してライフイベントに対応し、本人の自尊心を高め、自我を確立させる過程として重要な場である。本研究では、大学というコミュニティにおいて社会関係の発展が、精神疾患の予防・軽症化・早期回復につながることを定量的に証明し、社会関係構築の正の側面を見出すことが目的である。本研究によって、レジリエンスやソーシャルキャピタルの重要性を定量的に証明し、大学精神保健・支援機関のモデルケースとなることを目的とする。平成25年度は、都内大学の通学する大学生148名の第一期調査を完了した。91名のデータを用いた予備的解析結果では、32%の被験者が精神的に不健康と感じており(WHO-5精神的健康状態表)、54%の被験者が抑うつ・不安を感じていることがわかった。しかし、1か月後の調査で同様に閾値上の不健康を感じているものは13%であった。過去の検討では、20代の抑うつ症状を呈する割合は10ー20%といわれており、今回の0,1か月で継続して精神的不健康と回答した割合と一致する。大学生はテスト、進学等で精神的不健康であると回答する学生が多いが、1か月後の調査と組み合わせることで、慢性的な精神的不健康かどうか検討することができた。平成26年度は新規被験者数を増やすとともに、1年後の追跡調査を実施し、これらの慢性的な精神的不健康に関与する因子を見出す予定である。本研究によって、レジリエンスやソーシャルキャピタルの重要性を定量的に証明し、大学精神保健・支援機関のモデルケースとなりうることを目的とする。平成26年度までに、都内20の大学より本研究の目的を伝えずにリクルートした259名について、第一期調査を完了した。また、1か月後調査、1年後調査も順調に実施しており、それぞれ100%、83%の回答率を得ている。1年後調査は平成27年8月に終了し、その時点で結果をまとめ、論文化する方針である。また、第一期調査にて並行して実施した統合失調症の名称変更と差別・偏見について、大学生の統合失調症についての差別・偏見は、精神分裂病よりは小さいが、うつ病、糖尿病よりは大きいことを見出し、査読付き英文誌に採択された(Koike et al., Soc Psychiatry Psychiatr Epidemiol. in press)。1年後調査は平成27年8月に終了した。まず、社会関係と抑うつとの関係については、SSQで計測した相談できる人数と満足度において、人数の少なさではなく満足度の低さが1年後の抑うつ症状の悪化を予測した。また、逆に抑うつ症状の悪化によって、相談できる人数ではなく満足度の低下を認めた(Ohta et al., in preparation)。また、レジリエンスやソーシャルキャピタルの形成要因の一つとして精神疾患へのスティグマに着目した研究をまとめた。ランダム化比較試験によるスティグマ軽減戦略の検討を、査読付き英文誌に投稿した(Koike et al., under review)。

本研究は、レジリエンスやソーシャルキャピタルの重要性を定量的に証明するため、(1)大学生における社会関係の発展と精神疾患の予防・軽症化・早期回復との関係を明らかにし、(2)レジリエンスやソーシャルキャピタルの要素となる、大学生がもつ精神疾患へのスティグマの現状とその要因について検討した。本研究は、査読付き英文誌7誌をはじめとした成果を上げた。本研究の研究成果は、下記小冊子に詳細にまとめ、被験者、関係者に配布し、研究成果の普及に努めた。この報告冊子は、研究代表者に請求するか、ホームページ上で手に入れることができる。平成26年度において、健常大学生259名の登録が完了し、登録時調査の結果の一部はすでに査読付き英文誌に採択された。また、1年後調査についてもすでに126名の調査を終え、83%という高い追跡率を得ている。さらに、本研究を発展させた脳画像研究も実施しており(新学術領域・公募班研究「後期思春期のメタ認知成熟過程を検討するマルチモダリティ脳画像計測」)、こちらも順調に推移している。精神医学1年後の追跡調査を完了し、順次解析して論文化していく。また、新学術領域研究とも連携を強化して計測、解析を進めていく。平成25年度の健常対照群の被験者目標100名を超えて調査ができており、想定以上に順調に推移している。患者群は現在追加の調査を行っていないが、東大保健センター精神科で同一の質問票の一部を採用しており、今後さらに計画的な追跡研究を実施する予定である。平成26年度に新学術領域(公募研究)が採択されたので、本研究に使用する費用の一部が節減された。健常対照群は予定の250名の登録を完了し、追跡調査の準備を行っていく。患者群はデータ取得を開始する。追跡調査について、第一陣90名のデータがそろった時点で予備解析を実施していく。指標については、本研究採択後に精神疾患へのスティグマ(偏見、差別)研究を行っている研究者(安藤俊太郎、山口創生)と共同研究することとし、本研究の質問指標の一部にスティグマ関連指標を挿入し、調査終了後にスティグマ解消戦略のための30分程度の介入を追加で実施している。そのため、平成26年度実施予定である1年後の追跡調査でもスティグマ関連指標を実施する予定である。また、平成26年度より、新学術領域研究(公募研究)「後期思春期のメタ認知成熟過程を検討するマルチモダリティ脳画像計測」を実施することが決まったため、本研究の対象者に追加して研究のお願いをし、MRI画像、母への調査を実施予定である。平成27年度も新学術領域(公募研究)は継続するため、引き続き本研究の研究費は節減できることが見込まれる。そのため、平成26年度で得られた研究成果である大学生における精神疾患のスティグマについて、社会関係の発展と絡めた検討を深める。具体的には、精神疾患をメディアがどのように取り上げているかについて調査を行う。平成25年度は国際学会に参加しなかったため、旅費が当初の予定より大幅に少なかった。研究自体は予定より順調に遂行しており、人件費・謝金、その他の経費が当初の予定に比べ超過した。平成26年度は本研究の遂行を引き続き行っていくと同時に、国際学会参加も予定していることから、平成25年度未使用分と合わせて、当初予定より多く請求したい。
GAを援用した農業生産物資の最適輸送経路設計シミュレータの開発

農業生産物資の輸送コストの削減をねらいとする配送・輸送経路の最適化問題に対して遺伝的アルゴリズムを援用し,現在の所実用化のなされていない「燃料コストを最小とする最適輸送経路設計シミュレータの開発」を目的とした基礎研究を行った。都道府県単位の広域地域に分布する複数地点(市町村)を配送・集荷対象とし、同域内に湖沼や山岳といった地理上の通行障害が存在する場合について、実際の道路網における距離や高低差などの地理情報を導入した最適輸送経路の決定の前段となる各都市間を直線で結んで得られる経路の探索を可能とするシミュレータの開発を行った。すなわち、単に2次元平面上に存在する各都市間の総移動距離を最小とするような「巡回セールスマン問題」を発展させ、都市間を結ぶ直線上に湖などの通行障害がある場合は迂回地点を経由する。さらに実際には地球表面の3次元空間座標系に存在する都市間の地理上の高低差や走行車両の農業生産物資の積載重量などを考慮した上で、燃料コストや排出CO_2を最小とする最適輸送経路の設計シミュレータのソースコードを新規に改良開発した。コンピュータのアレイメモリ上に仮想した染色体の世代交代としての交叉には、2点交叉による部分一致交叉を採用すると共に、染色体へのコーディングにはパス表現を採用した最適輸送経路設計用GAを改良開発し、特定の都道府県においてあらかじめ設定した都市を巡るシミュレーションを行った。ANSIに準拠したC言語により開発した最適経路探索シミュレータは、県単位の広域地域あるいは県内の一地域内の複数地点を経由しながら配送・集荷を行い、また輸送経路上に湖沼などの地理上の障害物がある場合には、設定した迂回地点を経由しながら輸送車両の総行程の燃料コストや排出CO_2を最小とする最適経路の探索が可能であることが確認された。本研究は、農業生産物資の輸送コストの削減をねらいとする配送・集荷経路の最適化問題に対して遺伝的アルゴリズムを援用し、現在の所、実用化のなされていない「燃料コストを最小とする最適輸送経路設計シミュレータの開発」を目的としている。最適輸送経路の探索問題に関する研究として、都道府県単位の広域地域に分布する複数地点(市町村)を配送・集荷対象とし、同域内に湖沼や山岳といった地理上の通行障害が存在する場合について、実際の道路網における距離や高低差などの地理情報を導入した最適輸送経路の決定の前段となる各都市間を直線で結んで得られる経路の探索を可能とするシミュレータの開発を進めた。さらに実際には地球表面の3次元空間座標系に存在する都市間の地理上の高低差や走行車両の農業生産物資の積載重量などを考慮した上で、燃料コストを最小とする最適輸送経路の設計シミュレータのソースコードをC言語により新規に改良開発した。コンピュータのアレイメモリ上に仮想した染色体の世代交代としての交叉には、2点交叉による部分一致交叉を採用すると共に、染色体へのコーディングにはパス表現を採用した最適輸送経路設計用GAを改良開発し、特定の都道府県においてあらかじめ設定した都市を巡るいわゆる「巡回セールスマン問題」に対して準備的なシミュレーションを行った。最適輸送経路の探索問題に関する研究として、都道府県単位の広域地域に分布する複数地点(市町村)を配送・集荷対象とし、同域内に湖沼や山岳といった地理上の通行障害が存在する場合について、実際の道路網における距離や高低差などの地理情報を導入した最適輸送経路の決定の前段となる各都市間を直線で結んで得られる経路の探索を可能とするシミュレータの開発を行った。

さらに実際には地球表面の3次元空間座標系に存在する都市間の地理上の高低差や走行車両の農業生産物資の積載重量などを考慮した上で、燃料コストや排出CO_2を最小とする最適輸送経路の設計シミュレータのソースコードを新規に改良開発した。コンピュータのアレイメモリ上に仮想した染色体の世代交代としての交叉には、2点交叉による部分一致交叉を採用すると共に、染色体へのコーディングにはパス表現を採用した最適輸送経路設計用GAを改良開発し、特定の都道府県においてあらかじめ設定した都市を巡るシミュレーションを行った。ANSIに準拠したC言語により開発した最適経路探索シミュレータは、県単位の広域地域あるいは県内の一地域内の複数地点を経由しながら配送・集荷を行い、また輸送経路上に湖沼などの地理上の障害物がある場合には、設定した迂回地点を経由しながら輸送車両の総行程の燃料コストや排出CO_2を最小とする最適経路の探索が可能であることが確認された。
分裂期染色体とその構築因子の力学感受メカニズム

遺伝情報の保持と継承を担う染色体が細胞分裂期に受ける力のシグナルやストレスに適切に応答・対抗するしくみを調べるため、生物物理の力計測ツールを基礎とした顕微解析装置を開発する。これを用いて染色体の力学応答特性を分子、オルガネラ、細胞レベルの各階層で定量的に決定し、親細胞から娘細胞への遺伝情報継承がこのオルガネラの物性によっていかに保証され、またそれがいかに破綻するかを明らかにする。
絶対配置決定に使用できるキラルランタニドNMRシフト試薬に関する研究

1.先に我々が報告したアミノ酸やヒドロキシ酸の絶対配置決定に使用できるキラルシフト試薬光学活性プロピレンジアミン四酢酸イオンのEu(III)錯体Na[Eu^<III>(R or S-pdta)](EPDTA)よりもさらに高いシグナル分離能を持つシフト試薬の創製を目標に実験を行ない以下の結果を得た.錯体の効果的な不斉配位環境を形成をジアミン部の置換基を嵩だかくすることと環状のジアミンを用いることで達成しようとして、EPOTAのMeよりもかさだかい置換基benzyl,Phを持つジアミンとtrans-1,2-シクロヘキサンジアミンの四酢酸誘導体を配位子とする新規Eu(III)錯体(1,2,3;対カチオン=Na^+)を合成した.これらの錯体の水溶性キラルシフト試薬としての機能を代表的なアミノ酸とヒドロキシ酸について^1H NMRで調べたところつぎのような興味ある結果が得られた.a)シグナル分離能が最も高いと期待した3は1よりもかなり低い分離能を示す意外な結果となった.b)ジアミン部の置換基は配位してくる基質と直接に相互作用する位置にないが錯体のシグナル分離能に影響を与えた.しかし予想とは逆により嵩だかい置換基はシグナル分離能を低下させた.これらの予想外の結果の原因はN上の酢酸基がジアミン部の置換基から受ける立体反発にあるとの作業仮説を立て,今回の結果をより効果的な試薬の設計に生かすべく検討を始めている.なお1のシグナル分離能はおよそEPDTAと同程度である.2.EPDTAは有機溶媒に不溶だが,錯体1,2,3の対カチオンをLi^+,Me_4N^+に変えると有機溶媒のMeOHに溶け易くなる.1のLi^+,Me_4N^+塩は重メタノール中プロピレンジアミンのエナンチオマーシグナルを分離し,この種の錯体の有機溶媒への展開に足がかりが得られた.なお,補助金で購入した電子天秤,冷凍庫,クロマトグラフデータ処理装置は本研究のなかで日常用いられている.1.先に我々が報告したアミノ酸やヒドロキシ酸の絶対配置決定に使用できるキラルシフト試薬光学活性プロピレンジアミン四酢酸イオンのEu(III)錯体Na[Eu^<III>(R or S-pdta)](EPDTA)よりもさらに高いシグナル分離能を持つシフト試薬の創製を目標に実験を行ない以下の結果を得た.錯体の効果的な不斉配位環境を形成をジアミン部の置換基を嵩だかくすることと環状のジアミンを用いることで達成しようとして、EPOTAのMeよりもかさだかい置換基benzyl,Phを持つジアミンとtrans-1,2-シクロヘキサンジアミンの四酢酸誘導体を配位子とする新規Eu(III)錯体(1,2,3;対カチオン=Na^+)を合成した.これらの錯体の水溶性キラルシフト試薬としての機能を代表的なアミノ酸とヒドロキシ酸について^1H NMRで調べたところつぎのような興味ある結果が得られた.a)シグナル分離能が最も高いと期待した3は1よりもかなり低い分離能を示す意外な結果となった.b)ジアミン部の置換基は配位してくる基質と直接に相互作用する位置にないが錯体のシグナル分離能に影響を与えた.しかし予想とは逆により嵩だかい置換基はシグナル分離能を低下させた.これらの予想外の結果の原因はN上の酢酸基がジアミン部の置換基から受ける立体反発にあるとの作業仮説を立て,今回の結果をより効果的な試薬の設計に生かすべく検討を始めている.なお1のシグナル分離能はおよそEPDTAと同程度である.2.EPDTAは有機溶媒に不溶だが,錯体1,2,3の対カチオンをLi^+,Me_4N^+に変えると有機溶媒のMeOHに溶け易くなる.1のLi^+,Me_4N^+塩は重メタノール中プロピレンジアミンのエナンチオマーシグナルを分離し,この種の錯体の有機溶媒への展開に足がかりが得られた.なお,補助金で購入した電子天秤,冷凍庫,クロマトグラフデータ処理装置は本研究のなかで日常用いられている.
PEPC特異的リン酸化酵素のC4光合成における生理的意義と活性調節の分子機構

C4光合成の初期炭酸固定をおこなうホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(以下PEPC)は、アロステリックな調節に加えて可逆的リン酸化による活性調節を受ける。このリン酸化には主としてPEPCのみを基質とするプロテインキナーゼ(PEPCk)が関与する。我々は世界で初めてC4光合成に関与するPEPCkのcDNAを、C4モデル植物のFlaveria trinerviaからクローニングすることに成功したので、これを用いて本酵素の調節機構および生理的意義に関する研究をおこない、下記の成果を得た。1)F.trinerviaにおけるPEPCk遺伝子はゲノム上に少なくとも3つ存在し、発現解析からC4光合成に関与するものは一つであることがわかった。2)PEPCkの組換え体酵素(FtPEPCkと略)の調製に成功し、その酵素学的な性質を明らかにした。以前にトウモロコシPEPCkについて報告したように、FtPEPCkもRedox調節を受けることを示し、ジスルフィド結合の生成に関与するシステイン残基について知見を得た。3)PEPC-kによるPEPCの特異的認識機構およびリン酸化によるPEPCの活性化機構について、PEPCへの変異導入実験によって新規の知見を得た。4)トウモロコシのプロトプラストにおける一過的発現系を用いて、PEPCkの速やかな分解を証明し、ユビキチン/26Sプロテアソーム系の関与を示した。5)PEPCkのC4光合成における生理的意義を評価するために、形質転換可能なC4植物であるF.bidentisを用いて、PEPCkの発現をアンチセンス法によって抑制することを試みた。その結果、PEPCのリン酸化程度が非常に低下したは形質転換体を得ることに成功した。遺伝学的にホモとなった後代が得られ次第、光合成能の測定などを行う予定である。1)PEPCの特異的プロテインキナーゼ(PK)によるリン酸化の生理的意義を解明するために、PKの過剰発現および抑御がC4光合成に与える影響を調べることを目的として、本年度は下記の実験をおこなった。a)C4光合成のモデル植物であるFlaveria trinerviaの形質転換系を立ち上げるための基礎実験を行い、杯軸からのカルス形成および個体再生を行うことに成功した。b)形質転換のためのsenseおよびantisenseの方向にPEPC-PKのcDNAをベクターに挿入したコンストラクトを調製した。c)これらのDNAによる形質転換をおこなったものでは地上部の再生はできたが発根ができず原因を調査中である。高CO2(1%)下で育成しているが、PEPC-PKが発生初期において不可欠であるためとも考えられ、誘導発現系も考慮中である。2)Flaveria trinervia由来のPEPC-PKの組み換え体について、活性がレドックス調節を受けるか否かを検討し、さらにその分子機構について手がかりを得るための実験を行った。a)PEPC-PKが酸化型グルタチオンのみならず、種々の酸化処理により活性を失い、還元剤で回復すること確認し、チオレドキシン(Trx)はよい電子伝達体であることを示した。b)システイン残基によるSS結合の形成は分子間でなく分子内でおこることを明らかにした。c)4つの候補となるシステイン残基を一つずつセリンに置き換えたPEPC-PKはなおも酸化条件下で不活化したため、複数のSS結合のいずれかできれば不活化すると考えられ、現在まず4つのシステインの全てセリンに置換した酵素を作成中である。3)トウモロコシのPEPC-PKのcDNAクローニングをおこなった。現在組み換え体を調製中である。

1)PEPCの特異的プロテインキナーゼ(PK)によるリン酸化の生理的意義を解明するために、PKの過剰発現および抑制がC4光合成に与える影響を調べることを目的として、本年度は下記の実験をおこなった。a)C4光合成のモデル植物であるFlaveria trinerviaの形質転換系を立ち上げ、胚軸からのカルス形成および個体再生を行うことに成功した。b)形質転換のためのantisenseの方向にPEPC-PKのcDNAをベクターに挿入したコンストラクトを調製し、遺伝子導入を行い、5個体の形質転換体当代を得、遺伝子の挿入を確認した。c)これらの個体について光合成活性、PEPCリン酸化状態、PK活性、PKmRNAレベルを検討し、内1ラインにおいて、明瞭なPEPCリン酸化状態の低下を見いだした。この個体は、最大光合成活性は正常であるが、著しい生育遅延、種子量の低減の表現型を示した。2)Flaveria trinervia由来のPEPC-PKの組み換え体について、活性がレドックス調節を受けるか否かを検討し、さらにその分子機構について手がかりを得るための実験を行った。a)PEPC-PKが生体内で存在しうる程度の低濃度のチオレドキシン(Trx)に応答すること、そしてNADPHを初発物質とした還元力伝達に応答しうることを示した。b)候補となるシステイン残基をセリンもしくはアラニンに置き換えたPEPC-PKの活性特性を調査し、Cys53とCys250の両方を同時に置換した変異体において酸化・還元に対して感受性を失うことを見いだした。これらの残基が、主として酸化・還元に残基であろうと推定した。3)トウモロコシのPEPC-PKのcDNAクローニングをおこなった。これまでに組み換え体を調製し、酵素活性を確認した。以前我々が報告したように、この酵素もレドックス感受性を示した。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPC)はC4光合成において、初期炭酸固定をおこなう重要な酵素である。この酵素の活性は可逆的なリン酸化による調節を受け、昼間にはリン酸化されて活性化される。リン酸化はPEPCに特異的なプロテインキナーゼ(PEPCk)によっておこなわれる。本年度の主な成果を以下の通りである。1)PEPCkのレドックスによる活性調節:以前にFlaveria trinervia(モデルC4植物)のcDNAから調製した組換え体酵素にっいて、チオレドキシンを介するレドックス活性調節の可能性を示してきた。昨年度までの部位特異的変異の導入実験によって、6つのCys残基のなかでCys53とCys250の間でのS-S結合の形成が示唆されてきたが、さらにその後に得られた結果は複雑であったため、今年度は多くの変異導み酵素を作製してレドックス感受性を調べるとともに、S-S結合に関与するCys残基の同定をLC/MSを用いて試みた。その結果、上記の2つのCysの間のみならず、Cys26またはCys37とCys250の間でもS-S結合の生じうることが明らかとなった。これはプロテインキナーゼの触媒ドメインにおけ大きなコンホメーション変化を初めて示唆したものである。2)PEPC-