hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ペプチド創薬とPRPを併用した歯周組織代謝活性の解明と歯根吸収予防治療への応用

本研究では、アメロゲニンの特異的活性を有する機能性アメロゲニンペプチドと創傷治癒に効果的とされるPRPにおける歯周組織の代謝調節機構に及ぼす影響を解明し、これらを利用した歯根吸収予防法を確立することを究極の目標として研究を行なった。機能性アメロゲニンペプチドとPRPを併用することにより、セメント芽細胞の細胞活性に有効であることが示唆された。歯根吸収は過度なセメント質の吸収により引き起こされる病態であり、セメント芽細胞の細胞活性を向上させる機能性アメロゲニンペプチドを用いた新規の歯根吸収予防法の開発の可能性が示唆された。歯根吸収は矯正歯科治療による副作用のうち、最も高頻度に認められるにも関わらず、発生機序の詳細は不明である。歯根吸収のリスク因子は報告されているものの、現在のところ、消極的な対症療法しか存在しない。エナメル蛋白の主要成分であるアメロゲニンは、近年、エナメル質形成のみならず、歯周組織を構成する様々な細胞に対しても生理活性を有することが多く報告されている。しかしながら、その強い極性から生理的条件下では凝集し、安定的で効率のよい効果を得ることが難しい。そこで、アメロゲニンの安定した効果を引き出すために、その活性部位を探索した。近年血小板を濃縮した多血小板血漿(Platelet Rich Plasma:PRP)を再生療法に応用する試みが盛んに行われている。しかしながら、その効果や詳細なメカニズムは未だ解明されていない。本研究では、主要なエナメル蛋白であるアメロゲニンの活性作用を有する新規の機能性ペプチドを作製し、歯周組織の代謝調節機構に及ぼす影響について明らかにするとともに、歯根吸収抑制効果について検証する。また、PRPが歯周組織代謝に及ぼす影響について解明する。さらに、アメロゲニンペプチドとPRPを活用することにより、矯正歯科治療中の歯根吸収の発症を予防する新規治療法を確立することを最終的な目的とした。平成27年度では、機能性アメロゲニンペプチドおよびPRPの歯根吸収抑制効果の検討とシグナル伝達経路に関する検討を行った。本研究では、歯周組織に対する機能性アメロゲニンペプチドおよびPRPの影響を解明し、歯根吸収を積極的に予防する治療法を確立することを目的とした計画を立案している。これまでの研究により、アメロゲニンのC末端側にアメロゲニンの活性部位が存在することが明らかとなり、その活性部位を含む機能性アメロゲニンペプチドを開発した。平成27年度では、その機能性アメロゲニンペプチドをセメント芽細胞および破歯細胞に添加し、細胞増殖能および基質産生能の評価を行い、また、それぞれのシグナル伝達経路についての検討を行う予定であったが、概ね順調に進展している。本研究では、これまでの研究成果を発展させ、アメロゲニンの特異的活性を有する機能性アメロゲニンペプチドと創傷治癒に効果的とされるPRPにおける歯周組織の代謝調節機構に及ぼす影響を解明し、これらを利用した歯根吸収予防法を確立することを究極の目標とした研究計画を立案した。初年度の研究から、機能性アメロゲニンペプチドの作用により、セメント芽細胞の増殖能および基質産生能の亢進が認められた。その結果は誌上に掲載された。また、PRPの作用により、歯周組織構成細胞の代謝調節に影響を及ぼすことが示唆された。また、機能性アメロゲニンペプチドはMAPK-ERK経路を介して、セメント芽細胞の増殖能を亢進させることが明らかとなった。PRPの作用経路および歯根吸収のメカニズムについては、現在、論文投稿を検討中であるため、データを割愛する。最終年度では、ラット歯根吸収モデルを作成し、機能性アメロゲニンペプチドおよびPRPを歯根表面に投与し、歯根吸収の程度の評価を行った。機能性アメロゲニンペプチドおよびPRP単独投与では有意差が認められなかった。しかしながら、両者を併用することにより、有意差は認められないものの、歯根吸収が抑制される傾向が認められた。今後投与濃度等の検討を行い、検証を続けていく必要があると考えられる。研究期間全体の研究結果から、機能性アメロゲニンペプチドとPRPを併用することにより、セメント芽細胞の細胞活性に有効であることが示唆された。平成27年度では、各細胞に対する機能性アメロゲニンペプチドの効果を明らかとすることができた。また、セメント芽細胞の細胞増殖では、MAPK経路が関与することが明らかとなった。平成28年度では基質産生におけるシグナル伝達経路の解明、および、in vivoでの実験を行う。歯科矯正学
歯周疾患における抗原抗体反応,組織破壊機序と歯周治療による修復の解明

歯周疾患を治療するにあたって,病原に対する病変部の反応性を的確に把握し,歯周組織の破壊あるいは治療による修復の機序を解明することは重要なことである。本研究では,歯周疾患の原因因子について診査し,部位別に存在する病原因子の他に,咬合や局所の組織の応答など,全体的な調和に異常が認められるというという結論を得た。歯周炎は,部位特異的に病変が発症し,進行する。しかし,原因因子としての刺激は,単に細菌によるものだけではなく,物理的,化学的刺激も考えられる。一方,宿主側の応答も,部位特異的なものと,部位特異的ではないが,歯肉局所に限局的に現れる反応に分けて考える必要がある。次に,臨床的に歯肉に炎症反応が認められる場合,あるいは歯周ポケットができて病変が確立しているものの,臨床的には歯肉に炎症が認められない場合,あるいは歯肉の炎症を伴っている場合,また,炎症性刺激が骨に達して骨吸収が生じていると考えられる場合,病変が活性化するには異なった作用機序が考えられる。その結果,歯肉溝滲出液中に検出されるファクタ-によって病変部の変化を検索する場合に,その病態像の違いにより,また治療などによる局所の環境によって検出される物質に変化が認められることが判明した。病変の進行を,健康ー歯肉炎ー病変の深行,歯周ポケットの形成ー骨吸収というようなカテゴリーに分けて考えると,炎症が亢進して,歯周疾患が次のカテゴリ-に進行する時には,そこに病変の活性期が現れると考えられる。その活性期を知る手段として歯肉溝滲出液中成分はある程度有効であると判明した。そこで現在では,歯周疾患における組織破壊の機序,および修復機序を解明するために,犬を用いた動物実験における病変の活性期について検索を進めている。歯周疾患は部位特異性が認められる病態像を示し、病変の進行も活動期静止期を繰り返しながら深部へと波及する特徴を持つ。従って歯周疾患における組織破壊の機序及び修復機序を取明するためにも、病変の活動期または休止期から治癒過程への臨床的なパラメ-タ-の検索と病変の活性度を表す指標をとらえ比較検討することが必要である。まず、若年者16歳から24歳において、原因論的な観点から活動期を臨床的に、あるいは歯肉溝滲出液中の成分の変動をもとにした免疫学的、生化学的検索を行った。また、細菌学的に同じような構成指を示す部位、あるいは異なった構成比を示す部位との間で組織破壊を伴う歯周疾患の進行について比較を行った。次に、32歳から45歳の歯周疾患患者において細菌学的上は類似の構成比を示す部位で、その免疫学的、生化学的性状が異なっていることを解明し、歯周処置を行った後も細菌学的には同様に減少するにもかかわらず再発傾向を示す部位ではILー1,βーグルクロニダ-ゼ等のパラメ-タに違いが認められることを報告した。次に、実験動物(犬)に慢性的歯周炎を惹起させ、その際の組織破壊の機序と修復機構を観察し、どのパラメ-タ-の変化が局所の病態像を反映しているかを検索するため、下顎P3,P4,M1の頬到側近心面に骨欠損を作製し骨欠損内に挿入するように舌型突起を持った鋳造バンドを挿入した。病較の進行とともに歯の表面の形態的特徴と付着物の観察を行いながら、歯周ポケット内の歯肉表面の分析、結合組織中成分の分析、及び滲出液成分の分析を行っている。2頭の犬において慢性的歯周炎が惹起したことを臨床的、組織学的に観察した。現在は:6頭の犬に歯周炎を惹起させている最中であり、上述したそれぞれの項目について検索を行う予定である。なお、抜去した歯及び歯周ポケット

上皮のSEMの観察等も検索中である。歯周疾患は部位特異性が認められる病態像を示し、病変の進行も活動期、静止期を繰り返す特徴を持つ。そのため、臨床的な見知からだけでなく、生化学的、細菌学的、病理組織学的な測定により、活動期を予測できれば非常に有用である。そこで、まず若年者の歯周疾患患者より、歯肉溝浸出液を採取し、歯周病関連菌に対するIgGおよびIgA抗体価、ポケット内細菌の検索の結果と臨床所見および形態学的特徴の比較を行った。しかし、若年者に歯周疾患を惹起すると思われるような特徴的な所見は得られなかった。次に、32才から45才までの高度進行性歯周炎患者のポケット内細菌の検索、歯肉溝浸出液中の成分の生化学的検索を行ったところ、歯周処置後に再発傾向を示す部位ではILー1、βーグルクロニダ-ゼなどの値に上昇傾向が認められることが判明した。成人型歯周炎患者の歯肉溝浸出液中のIgG量を検索した結果、疾患の活動期と平行して、IgG量の増加が認められた。このIgG量の増加が歯周病関連菌に対する特異的なものなのか、ポリクロ-ナルβ細胞活性化によるものなのかは、現在検討中である。実験動物(犬)に慢性歯周疾患を惹起させ、その際の組織破壊の機序と修復機構を観察し、どのようなパラメ-タ-の変化が局所の病態像を反映しているかを検索するため、現在実験を継続中である。歯肉溝浸出液中の成分として、アルカリホスファタ-ゼ、βーグルクロニダ-ゼ,コラゲナ-ゼ,プロスタグランディンE_2の測定を、またそれに加えて、病理組織学的検索を行う予定である。組織修復機構に関する研究としては、歯根膜細胞,歯槽骨由来細胞,歯肉線維芽細胞の培養を行い、それぞれの細胞の性質を調べるとともに、骨、象牙質、セメント質中のタンパク質に対する走化性の検索を行った。その結果、歯根膜細胞が高いアルカリホスファタ-ゼ活性を有し、骨および歯根表面へ高い走化能を持つことが判明した。前年度に引き続き,歯周疾患に罹患した部位特異的に進行する病変を経時的に検索し,また同部位に於ける歯肉溝浸出液(GCF)中の抗体価やサイトカインを検索して,病変の活動期を予知できるファクタ-となりうるかどうかについて検索した。実験的に犬の上下顎の歯に対して歯肉炎,歯周炎を惹起させ,GCF中のβーグルクロニダ-ゼは歯肉の炎症によって高値を示し,アルカリフォスファタ-ゼ,プロスタグランデインE_2などは歯周ポケットの深さに相関しているという結果を得た。コラゲナ-ゼは,その歯肉の炎症の程度に最も鋭敏に反応するファクタ-であると考えられた。一方,宿主側の応答がGCFの中の成分としてどのように評価されるかを知るを目的で,ヒトのプラ-クコントロ-ル期間中に経時的にIgGサブクラスレベルについて検索を行ったが,IgG4が歯周ポケットの存在を含む疾患の程度を示す指標であるのに対して,IgG1は歯肉の炎症,歯周ポケット上皮下の炎症を表すファクタ-として有効であるという結果を得た。また現在は,このようなGCF中成分の変動と歯周ポケット内細菌としてP.Gingivalisとの関係について,犬を用いて研究を継続中である。以上の一連の研究結果から,歯周ポケットが形成されるかにおいてGCF中に検出されるファクタ-を用いれば疾患の進行を予知できる可能性が示された。さらに,歯周炎での好中球の役割,特にその局所への遊走性についても検索を行ったが,P.Gingivalisの産物に好中球遊走因子として認識される成分が含まれていることが解明された。
有機ケイ素反応剤による立体制御と高選択的複素環合成に関する研究

有機ケイ素反応剤はリチウム,マグネシウム,アルミニウムなどの金属を含む他の有機金属反応剤とは異なり,水や空気に対して安定で取り扱いが客易であり,また,その反応性が低いことから,高選択的な精密有機合成を達成する反応剤として極めて有用である。従って種々の官能基を含む有機ケイ素反応剤の合成設計が可能となり,その合成化学的応用は広範囲に及んでいる。すでにアリルシランを中心とする有機ケイ素化合物の有機含成への応用について明らかにしたが、本研究の成果をまとめると、有機ケイ素反応による立体制御と高選択的複素環合成について、多くの成果を得た。1)まず、有機ケイ素化合物を他の方法によって得難い種々の反応中間体の合成等固谷と見倣せる反応剤として設計し、その合成法をめらかにした。そなわち、アゾルチンイリド活性種、交又共役トリエンなどの種々の合成等固体として働く新規有機ケイ素化合物をデザイン合成し、さらにこれら反応剤を用いて、有機ケイ素化合物の反応として興味のある1,Nー脱離反応が関与した有円な新しい反応を明らかにし、合成化学的に重要な複素環化合物の高選択的な合成法を確立した。また、多環縮合系化合物の短段階合成法も明らかにした。2)ケテンジチオアセタ-ルを出発物質とするピリミジン、インドリジン、キノリン、ピラゾ-ル、シクラジン等の各種複素環化合物の効率的な合成法を確立した。3)アリルシランおよび関連化合物を用いる高立体、位置選択的有機合成反応をみつけた。3)複合反応剤としての高配位有機ケイ素化合物の合成とその高選択的有機合成反応を見つけた。1.新規1,3ー脱離反応によるカルボニルイリドおよび関連する種々の1,3ー双極子試薬を用いる不斉[3+2]環化付加反応に関する研究を行った。アルケンやカルボニル化合物に対する選択的な環化付加反応を達成した。(1)光学活性複素環誘導体の効率的な合成法を見つける努力を行った。さらに、種々の構造式(1)で表わされる化合物を用いて光学活性置換基をもつアルケンとの反応を行い、新しい不斉[3+2]環化付加反応について検討を加えた。(2)(1)の窒素(N)を他のヘテロ原子(O、S)に替え、アゾメチンイリドやチオカルボニルイリドを用いた新しい不斉[3+2]環化付加反応を見出した。また、天然型ビオチン合成に本反応を応用を現在検討している。2.新規高配位有機ケイ素反応剤の合成と性質および合成化学への応用研究を行った。トリアルコキシシラン/ジオ-ル/アミン系を用いた高配位有機ケイ素化合物の簡便な合成法を一部、明らかにした。さらに、これらの化学的性質および立体制御や触媒的不斉合成に重点をおいた高選択的有機合成への応用を図り興味有る結果を得た。有機ケイ素化学における新分野の研究の一還として,高反応性有機ケイ素化合物の合成化学への応用や薬化学への応用を目指して,前年度の補助金による研究に引続いて,新しい反応活性種の生成と反応,とくにヘテロ環化学への応用研究を行った。研究成果をまとめると,1)有機ケイ素化合物を他の方法によって得難い種々の反応中間体の合成等価体と見做せる反応剤として設計し,その合成法を明かにした。すなわち,他の方法では得難い1,3ー双種子試薬であるアルキリデンアゾメチンイリド,チオカルボニルイリド活性種や3ーメチレンー1,4ーペンタジエン(クロス共役トリエンの母体化合物である〔3〕デンドラレン)などの合成等価体として働く新規有機化合物をデザイン合成した。

2)このようにして合成した出発物質を用いて,αーアルキリデンピロリジンの立体選択的[3+2]環化付加反応による合成,テトラヒドロチオフェン誘導体の合成,αーアルギリデン1,3ーオキザゾリジン,αーアルキリデンー1,3ーチアゾリジン,オクタリン骨格の短段階合成などを効率的に行う方法を開発した。この方法は新しい複素環化合物の立体選択的および位置選択的な合成反応として注目される。さらに,高配位有機ケイ素反応剤の合成設計と,有機合成反応への応用に関する研究を行った。立体選択的な新規炭素ー炭素結合形成反応が達成でき,反応の立体制御が可能になった。
培養心筋を用いた幼者心筋と成熟心筋に対する吸入麻酔薬の不整脈発生に与える影響

本年度が幼弱心筋と成熟心筋細胞を用い、吸入麻酔薬の成熟心筋細胞に与える影響を、カルシウム感受性色素fura-2を用いて検討した。今年度の研究費の消耗品費にて心筋細胞培養に必要な薬品を購入した。平成4年度の研究費の設備備品費にて購入した倒立顕微鏡と高感度テレビカメラを使用し、心筋細胞の拍動をビデオに記録し、吸入麻酔薬が培養心筋細胞に与える影響を検討した。さらに当大学共同機器センターにある蛍光顕微鏡を使用し、今年度の消耗品費にて購入したカルシウム感受性色素fura-2を用い吸入麻酔薬が心筋細胞内カルシウム濃度に与える影響を検討した。ビデオに記録した画像の解析からはハロセンは幼弱心筋の不整拍動の頻度を増加させる傾向があったが、他の吸入麻酔薬では有為な変化はみられなかった。カルシウム感受性色素INDO-1を使用し、収縮に伴う細胞内カルシウム濃度の変化を検討した。どの吸入麻酔薬も同程度に細胞内カルシウム濃度の上昇を抑制した。静止状態の成熟心筋細胞の細胞内カルシウム濃度は吸入麻酔薬であるハロセン、イソフルレンにより有為な変化を示さなかった。セボフルレンでは細胞内カルシウム濃度が軽度上昇した。虚血状態では細胞内カルシウム濃度は徐々に上昇したが、ハロセンは細胞内カルシウム濃度の上昇を抑制した。一方セボフルレンとイソフルレンは細胞内カルシウム濃度の上昇を促進した。以上から成熟心筋と幼弱心筋では吸入麻酔薬の作用が異なり、虚血状態ではハロセンが細胞内カルシウム濃度の上昇を抑制し心筋保護的に働くことが示唆された。脊髄運動の術中モニタリングを行うには現在主として2つの方法が試みられている。そのひとつは、1.大脳運動領野を電気あるいは磁気刺激して下行する電位を脊髄のレベルで記録するものであり、他は、2.脊髄を電気刺激し末梢筋から筋活動電位を記録する方法である。今回の実験的、臨床的研究により上記1、2の方法の実用化に一段の進歩が得られたと云える。すなわち、1.高位中枢刺激、脊髄記録電位については、サルを用いた動物実験では経頭蓋磁気刺激ならびに電気刺激によって誘発される脊髄記録電位はいずれも大部分は運動路、とりわけ錐体路を下行する電位であるが、その一部には伝導速度の速い錐体外路、あるいは知覚線維を逆行性に伝導した電位が含まれていることが判明した。他方経頭蓋磁気刺激による脊髄誘発電位を臨床例において記録したところ、ほぼ電気刺激と同等の電位が記録可能であった。刺激コイルの安定した保持など今後解決しなければならない問題は残すが、術中のモニタリング法としての有用性を証明することが出来た。さらに術後についても、麻酔覚醒後も引き続き磁気刺激による脊髄電位をクモ膜下腔に留置した電極を利用して記録を行った。麻酔覚醒と共にI-波が多く出現して来るのが観察されたが、D-波を指標としてモニタリングが可能であると判明した。今後も引き続き臨床例を重ねて行く予定にしている。脊髄電気刺激-末梢筋活動電位によるモニタリングについてはネコならびにサルを用いた実験的研究を行った。その結果吸入麻酔下においては連続刺激による刺激が脊髄前角細胞を興奮させて末梢筋活動を惹起することを確認した。この方法の臨床例への応用は脊髄障害が無いかあっても筋力低下を呈していないような軽症の患者群で行い、比較的安定した電位を記録することが可能であった。運動路の術中モニタリングとしての有用性を証明することが出来た。培養心筋細胞を用い、幼若心筋と成熟心筋とにおける吸入麻酔薬の不整脈発生に与える影響を検討した。本年度の補助金により位相差倒立顕微鏡と高感度カメラを購入した。また、消耗品費で培養に使用する各種薬剤を購入した。幼若心筋は妊娠マウスから得たマウス胎児心をトリプシン、コラゲナーゼにより処理し、培養した。

ハロセンを含んだガスで飽和した潅流液で潅流し、幼若心筋の拍動調律に与える影響を検討した。拍動を顕微鏡、高感度カメラで撮影し、ビデオに記録した。記録した画像をvideo motion analyserで計測し、拍動の変化を観察する予定であったが、これが購入できなかったため、実験の進行は遅れている。画像を手動で解析した結果ではハロセンは培養幼弱心筋の不整拍動の頻度を増加させる傾向にあるようである。また、同様の方法で得た幼若心筋を用いて、Caイオン感受性蛍光色素fura-2をもちい、ハロセンで飽和した潅流液で潅流したさいの細胞内Ca濃度の変化を検討した。蛍光測定装置の測定速度が低速であるため、収縮・弛緩の各時点での比較は不可能であった。しかし、ハロセンはresting状態での細胞内ca濃度を低下させる傾向がみられた。ただし、Caイオン感受性蛍光色素fura-2を培養心筋に取り込ませると幼若心筋の自動拍動が停止してしまうため、このCaイオン感受性蛍光色素fura-2の心筋細胞に与える影響の検討も必要であると考えている。成熟ラットからの成熟心筋の培養は技術的に問題点が多く、まだ実験に使用できるまでにはいたらず、現在さらに培養方法の検討を行っている。単離心筋を用いた細胞内Ca濃度に与えるハロセンの影響を検討したが、resting状態の細胞内Ca濃度にハロセンは有意な変化を与えなかった。今年度の予算にて購入した顕微鏡ならびに高感度テレビカメラにて培養幼弱心筋の拍動に与える吸入麻酔薬の影響を検討したが、motion detecterが購入できなかったため拍動数の変化の記録がとれず、正確な結果がだせず、現在代替手段を検討中である。本年度は培養心筋細胞を用い、吸入麻酔薬の幼若心筋細胞と成熟心筋細胞に与える影響を、カルシウム感受性色素fura-2を用いて検討した。今年度の研究費の消耗品費にて心筋細胞培養に必要な薬品を購入した。平成4年度の研究費の設備備品費にて購入した倒立顕微鏡と高感度テレビカメラを使用し、心筋細胞の拍動をビデオに記録し、吸入麻酔薬が培養心筋細胞の拍動に与える影響を検討した。さらに当大学共同機器センターにある蛍光顕微鏡を使用し、今年度の消耗品費にて購入したカルシウム感受性色素fura-2を用い吸入麻酔薬が心筋細胞内カルシウム濃度に与える影響を検討した。ビデオに記録した画像の解析からはハロセンは培養幼若心筋の不整拍動の頻度を増加させる傾向があったが、他の吸入麻酔薬では有為な変化はみられなかった。カルシウム感受性色素fura-2を幼若培養心筋に取り込ませると自動拍動が停止してしまうため、収縮に伴う細胞内カルシウム濃度の変化は検討することができなかった。また機器の制約により他のカルシウム感受性色素を使用することは不可能であった。静止状態の心筋細胞の細胞内カルシウム濃度は吸入麻酔薬であるハロセン、イソフルレンにより有為な変化を示さなかった。セボフルレンでは細胞内カルシウム濃度が上昇する例もみられているが、細胞の形態変化も同時に観察されたためセボフルレンの直接作用かどうかは今後の検討課題である。本年度は幼弱心筋と成熟心筋細胞を用い、吸入麻酔薬の成熟心筋細胞に与える影響を、カルシウム感受性色素fura-2を用いて検討した。
小胞体ストレスで発動するDerlin-3の分子機能と細胞保護効果の解明

小胞体関連分解(ER-associated degradation: ERAD)は、小胞体内腔に生じた構造異常タンパク質を分解除去することで、細胞の恒常性維持に寄与する。本研究では、小胞体ストレスで発動するDerlin-3に注目して、その機能の重要性を探る解析を実施した。低酸素ストレスに晒すと、Derlin-3欠損マウス、およびDerlin-3と複合体を形成するHerp欠損マウスが脆弱性を示すこと、さらに、両マウスに心機能異常があることを発見した。その原因の一端として、Herpが心臓において細胞内シグナル伝達を制御するIP3レセプターの量を調節している事実を突き止めた。生体が遺伝子異常やウイルス感染、虚血等にさらされると、小胞体内に異常タンパク質が蓄積し、小胞体ストレスが誘導される。小胞体ストレスは、循環器疾患や神経変性疾患などさまざまな疾患の発症に関与しており、小胞体ストレスを感知して防御する仕組みの解明は重要である。小胞体関連分解(ER-associated degradation: ERAD)は、小胞体内の異常タンパク質を選択的に分解除去することで、小胞体ストレスを軽減する機構である。本研究では、ERADに関与するDerlin-3に着目して研究を進めている。これまでに我々は、Derlin-3が小胞体ストレスで著しく発現誘導され、同じくERAD因子であるHerpと強く結合することを明らかにしてきた。また、Derlin-3欠損およびHerp欠損のノックアウトマウスもすでに作製済みである。野生型、Derlin-3欠損、およびHerp欠損で相互に表現型を比較しながら解析することで、効率良くそれぞれの分子機能を明らかにしたいと考えている。平成27年度は、Derlin-3およびHerpの生理的重要性を明らかにするため、低酸素条件下でマウスを飼育し、その適応能力について比較した。その結果、野生型が全く死なない条件下で、Derlin-3およびHerp欠損マウスでは一部の個体が死亡した。死因の解析は今後の課題であるが、低酸素条件下では、右心肥大を含む循環器系の適応変化が生存に重要であるため、これらの欠損マウスではその適応不全である可能性を想定している。今後はまず、循環器系のうち特に心臓に焦点を絞って解析を進め、Derlin-3およびHerpの生理的重要性と機能の分子メカニズムを明らかにしていきたい。これまでDerlin-3欠損マウスについては、メンデルの法則に従って一見正常に誕生・成長し、繁殖にも異常がなかったため、生体におけるDerlin-3の重要性を示す結果がほとんど得られていなかった。本研究により、低酸素環境への適応と生存にDerlin-3が重要であることを初めて見出した。また同時に、Derlin-3の結合因子であるHerpについても同様の結果が得られ、これらが協調して低酸素環境への適応に機能していることが示唆された。死因の解析は今後の課題であるが、体重変化の推移や行動変化など、野生型との違いは明確であり、その違いの正体を明らかにすることは、すなわちDerlin-3やHerpの機能に迫ることだと考えられる。以上のように、本研究により、Derlin-3がもつ生理的機能の解明へと繋がる結果が得られており、今後の発展も期待できることから、順調に進展していると考えている。小胞体は分泌タンパク質や膜タンパク質の合成と成熟を担っており、その過程では酸化ストレスや低酸素状態など様々な理由で成熟できない不良品が生じる。小胞体関連分解(ER-associated degradation: ERAD)は小胞体が持つタンパク質の品質管理機構であり、小胞体膜や内腔に生じた構造異常タンパク質(ERAD基質)を分解除去する。本研究では、ERADに関与するDerlin-3に注目して研究を実施している。これまでに我々は、低酸素ストレスに対する適応応答において、Derlin-3欠損およびHerp欠損マウスが野生型と比較して生存率の低下を示すことを明らかにしてきた。また、その一方で、Derlin-3を含むERAD複合体のメカニズムについての解析も進め、マウス肝臓におけるERAD複合体の構成と調節について新たな結果を得てきた。平成28年度は、低酸素ストレス解析において、心臓や肺の組織切片試料を作製してHE染色やマッソントリクローム染色などを実施し、野生型とDerlin-3欠損マウスとの比較解析をおこなった。その結果、肺組織に大きな違いは見られなかったが、心臓組織における血栓や線維化がDerlin-3欠損マウスで顕著であることが分かった。また、ERAD複合体解析においては、肝臓での解析に続き、膵臓の解析を進めた。肝臓では、小胞体ストレス存在下でのみ発現が確認できるが、膵臓においては、定常状態でDerlin-3の発現が確認できる。免疫沈降による複合体解析を実施した結果、膵臓のERAD複合体は、肝臓の小胞体ストレス誘導時と同様の構成であることが分かった。これまで、Derlin-3の生理機能については、Derlin-3のタンパク質発現が非常に限られているため、ほとんど分かっていなかった。しかし、我々はDerlin-3欠損マウスを作製・解析し、Derlin-3のみが示す特徴的な発現様式やDerlinファミリーを含む複数種のERAD複合体を独自に見いだしてきた。昨年度は、低酸素環境への適応と生存にDerlin-3が重要であることを初めて見出した。また、Derlin-3の結合因子であるHerpにおいても同様の結果を得ており、これらのERADにおける協調した働きが低酸素ストレスの克服に重要であることが示唆された。

今年度は、昨年度の解析結果からさらに発展させ、低酸素ストレスにおけるDerlin-3の脆弱性を示す結果として、心臓組織切片における血栓や線維化の増悪といった異常を発見することが出来た。また、分子メカニズムレベルの解析として、ERAD複合体の組織による存在様式の違いを示すデータを得ることができ、我々が見出したERAD複合体調節の重要性をさらに発展させることができた。以上のように、本研究により、Derlin-3の生理的重要性や分子機能解明につながる結果が得られており、今後の発展も期待できることから、順調に進展していると考えている。小胞体は、分泌タンパク質や膜タンパク質の合成と成熟を担っており、その過程では酸化ストレスや遺伝子異常、低酸素状態などさまざまな理由で成熟できない不良品が生じる。小胞体関連分解(ER-associated-degradation: ERAD)は、小胞体が持つタンパク質の品質管理機構であり、小胞体内膜や内腔に生じた構造異常タンパク質(ERAD基質)を分解除去する。本研究では、ERADに関与するDerlin-3に注目して研究を実施してきた。これまでに我々は、低酸素ストレスに対する適応応答において、Derlin-3欠損および、Derlin-3と複合体を形成してERADに関与すHerp欠損マウスが、野生型と比較して生存率の低下を示すことを明らかにしてきた。低酸素ストレスに晒した、心臓や肺の組織切片試料を作製して、HE染色やマッソントリクローム染色などを実施し、その結果、肺組織に大きな違いは見られなかったが、心臓組織における血栓や線維化が、Derlin-3欠損マウスで顕著であることが分かった。また、これらと並行して、Derlin-3を含むERAD複合体のメカニズムについての解析も進め、マウス肝臓におけるERAD複合体の構成と調節について新たな結果を得てきた。平成29年度は、低酸素下で観察された欠損マウスの心脆弱性は、通常条件下でもみられるのか、それとも低酸素ストレスに晒されて出現したものなのかを見極めるために、通常条件下での検討もおこなった。その結果、通常飼育下においてもDerlin-3欠損およびHerp欠損マウスは心機能異常を示すことが分かった。Herp欠損に関しては、チリ大学との共同研究により、心臓においてHerpが、異常タンパク質の除去だけでなく、細胞内シグナル伝達を制御するカルシウムイオンチャネルであるIP3レセプターをタンパク質分解により制御している事実を突き止めた。小胞体関連分解(ER-associated degradation: ERAD)は、小胞体内腔に生じた構造異常タンパク質を分解除去することで、細胞の恒常性維持に寄与する。本研究では、小胞体ストレスで発動するDerlin-3に注目して、その機能の重要性を探る解析を実施した。低酸素ストレスに晒すと、Derlin-3欠損マウス、およびDerlin-3と複合体を形成するHerp欠損マウスが脆弱性を示すこと、さらに、両マウスに心機能異常があることを発見した。その原因の一端として、Herpが心臓において細胞内シグナル伝達を制御するIP
二酸化チタン粒子を用いる水中の可塑剤の連続フロー式光触媒分解-凝集分離装置の開発

塩基性塩化アルミニウムを凝集剤に用いる光触媒分解-凝集分離装置を改良して、電解質添加により促進される二酸化チタン連続遠心分離法を開発した。その装置を連続フロー式光触媒分解装置に接続した連続フロー式光触媒分解-二酸化チタン分離装置を試作した。1.電解質添加による二酸化チタン微粒子の凝集分離脱イオン水に二酸化チタンと電解質(1 mM)を添加し、懸濁液pHを二酸化チタンの等電点(pH=6.5)に調節した。二酸化チタンの凝集分離に及ぼす効果はNa_2SO_4>CaCl_2>NaClの順であった。2.電解質添加により促進される二酸化チタンの遠心分離電解質添加後二酸化チタン懸濁液を連続遠心分離機に通過させ、排出液の流速(滞在時間)と透過率の関係を調べた。[TiO_2]=0.50g/L,[電解質]=1mM, pH=6.5,遠心速度=16,000rpm,ローター容量=2Lの運転条件では、973mL/min(2.06min)まで排出液の透過率が約98%以上(透明)であった。3.河川水中に含まれる電解質により促進される二酸化チタンの遠心分離化学工場の排水中に使用水(河川や井戸水)以上の電解質が含まれている。特に電解質を添加しなくても使用水中の電解質が、二酸化チタンを容易に遠心分離することができた。4.電解質及び回収した二酸化チタンの光触媒分解に及ぼす影響DBP可塑剤を用いた場合、電解質と再利用二酸化チタンは約20%分解を低下させた。5.連続フロー式光触媒分解-二酸化チタン分離装置の開発フロー式光触媒分解装置に二酸化チタン遠心分離機を接続して、連続フロー運転ができた。6.河川水や井戸水に溶解したDBPの排水処理に、本装置を適用することができた。二酸化チタンを用いて水質汚染物質を光触媒分解する際には、懸濁法が固定化膜法より効率が高い。申請者は二酸化チタン微粒子の凝集分離法を提案し、光反応器と凝集分離装置を接続した連続フロー式光触媒分解装置を報告した。平成14年度は、本装置の実用化を目指して研究し、以下の成果を得た。1.光触媒分解-凝集分離装置に関する文献調査を行った結果、本装置は世界で始めての試作であった。2.ジブチルフタル酸エステル(DBP)を分解物に選び、連続フロー式光触媒分解に影響する諸因子解析を行なった。最適の二酸化チタン濃度は0.5g/L、pHは6-7であった。DBPの分解に及ぼす二酸化チタン初濃度及び溶存酸素濃度の影響は、Langmuir-Hinshelwood式に従った。また、分解速度は光強度が強くなると増加が緩やかになり、DBP水溶液に塩を添加しても分解速度の低下は少なかった。3.光触媒分解条件の最適化について調べた。2の結果と経済性を考慮して、DBPの分解最適条件は二酸化チタン初濃度が0.5g/L、pHが6-7、高圧水銀ランプ照射、空気通気、懸濁液温度は常温であった。4.光触媒分解速度式を求めた。pHが6-7、一定の光強度及び常温下で、二酸化チタン初濃度及び通気気体中の酸素濃度を変化させDBPを光触媒分解した。分解速度式と実験値の一致は比較的良かった。5.分解生成物の分析をGC-MSで行った。DBPへのOHの付加、側鎖の水素原子の引抜き、有機酸を経てCO_2とH_2Oに分解することが分かった。

電解質添加により促進される二酸化チタン連続遠心分離法を開発し、その装置を連続フロー式光触媒分解装置に接続した連続フロー式光触媒分解・二酸化チタン分離装置を試作した。1.電解質添加による二酸化チタン微粒子の凝集分離脱イオン水に二酸化チタンと電解質(1mM)を添加し、懸濁液pHを二酸化チタンの等電点(pH=6.5)に調節した。二酸化チタンの凝集分離に及ぼす効果はNa_2SO_4〓CaCl_2>NaClの順であった。2.電解質添加により促進される二酸化チタンの遠心分離電解質添加後二酸化チタン懸濁液を連続遠心分離機に通過させ、排出液の流速(滞在時間)と透過率の関係を調べた。[TiO_2]=0.50g/L,[電解質]=1mM,pH=6.5,遠心速度=16,000rpm,ローター容量=2Lの運転条件では、973mL/min(2.06min)まで排出液の透過率が約98%以上(透明)であった。3.河川水中に含まれる電解質により促進される二酸化チタンの遠心分離化学工場の排水中には使用水(河川や井戸水)以上の電解質が含まれている。特に電解質を添加しなくても使用水中の電解質が、二酸化チタンを容易に遠心分離することができた。4.電解質及び回収した二酸化チタンの光触媒分解に及ぼす影響DBP可塑剤を用いた場合、電解質と再利用二酸化チタンは約20%分解を低下させた。5.連続フロー式光触媒分解・二酸化チタン分離装置の開発フロー式光触媒分解装置に二酸化チタン遠心分離機を接続して、連続フロー運転ができた。6.河川水に溶解したDBPの排水処理へ本装置を適用することができた。
小児体外循環における脳循環生理モニタリング

乳幼児体外循環中の潅流因子としてヘマトクリット値、pH、体温、体外循環時間、酸素分圧、潅流量、潅流圧などが脳循環生理に大きな影響を及ぼすと考えられている。本研究の目的は、無輸血体外循環の安全限界を確立するために、以下に記す3項目を科学的に探求した.1)NIRSを用いて潅流因子が脳酸素化に与える影響2)脳組織レベルでの虚血変化に強く影響を与えている因子の検討虚血変化を予測防止するためのNIRSデータを検討し無輸血体外循環の安全限界の検討動物実験により体外循環中のヘマトクリット値(30,20,10%)が脳組織代謝に及ぼす影響を,NIRSを用いて体外循環中の脳組織内酸素化率の変化と脳病理組織変化から比較検討した.実験動物として体重8-10kgの豚を用いた.麻酔は臨床の心臓手術に準じてフェンタニル、ミダゾラム、パンクロニウムにておこなった。右開胸にて心臓に到達し、大動脈送血、右房脱血にて体外循環を確立した。無輸血体外循環の安全性の確立が主目的であるため、体外循環中の潅流因子として特にヘマトクリット値に着目し10%、20%、30%の3群にわけて実験をおこなった。他の条件は実際の臨床に則してpH strategy、28°Cの中等度低体温、潅流量100ml/kg/min、体外循環時間120分とした。実験終了後、体外循環から離脱しカニューレを抜去し閉創をおこない、その後循環呼吸管理をおこない、人工呼吸器からの離脱をはかった。1週間経過観察をおこない、その間に毎日、実験内容を知らされていない獣医による行動評価をおこなった。行動評価にはNeurological Deficit Score (NDS)およびOverall Performance Categories (OPC)を用いた。また1週間目に動物を犠牲死せしめ脳組織の顕微鏡的観察をおこなった。病理組織的診断は実験内容を知らされていない病理医がおこない、細胞レベルの虚血の有無を点数化し実験のendpointとした。その結果、各群間の検討をおこない、無輸血体外循環の安全限界を検討する。さらにNIRSデータと病理組織的診断との間の関係を検討し、安全のための指標を確立する。
らせん構造を有する光学活性高分子の合成、構造、ならびに不斉識別能に関する研究

1.メタクリル酸1-フェニルジベンゾスベリル(1)、メタクリル酸1-(2-ピリジル)ジベンゾスベリル(2)、メタクリル酸フェニル-ビス(2-ピリジル)メチル(3)、およびメタクリル酸ジフェニル-3-ピリジルメチル(4)から(+)-1-(2-ピロジニルメチル)ピロリジン等の錯体を用いたアニオン重合により、一方向巻のらせん構造を有する光学活性ポリマーが得られた。1、2については、光学活性な溶媒中あるいは連鎖移動剤存在下でのラジカル重合でも、らせんの偏りをもつ光学活性ポリマーが得られた。また2-4の光学活性ポリマーはいくつかのラセミ体に対して不斉識別能を示した。芳香族イソシアナ-トを(+)-1-(2-メトキシメチル)ピロリジンのリチウムアミドなど光学活性開始剤を用いて重合することにより、らせんの偏りをもつ光学活性ポリマーが得られた。3.側鎖に光学活性なカルバメート基を有するフェニルアセチレン誘導体から、Rh触媒を用いた重合によって、らせん状光学活性ポリマーを得た。生成ポリマーを高速液体クロマトグラフィー用のキラル固定相として用いたところ、種々のセラミ体を効率良く光学分割することができた。1.メタクリル酸フェニル[ビス(2-ピリジル)]メチル(1)およびメタクリル酸1-フェニルジベンゾスベリル(2)を新規に合成しこれらの不斉アニオン重合およびラジカル重合について検討した。1および2からはジフェニルエチレンジアミンのリチウムアミドと(-)-スパルテイン(Sp)、(+)-2,3-ジメトキシ-1,4-ビス(ジメチルアミノ)ブタン(DDB)、あるいは(+)-1-(2-ピロリジニルメチル)ピロリジン(PMP)との錯体を用いたトルエン中低温でのアニオン重合により、一方向巻のらせん構造を有する光学活性ポリマーが得られ、これらのポリマーはいくつかのラセミ体に対して不斉識別能を示すことが明らかになった。また、2についてはラジカル重合においても高度な立体規制が可能で、これまでにない高度にイソタクチックなポリマーが合成できることを見いだした。2.すでに不斉重合により光学活性ポリマーを与えることが知られているメタクリル酸トリフェニルメチル(3)の不斉重合の機構について詳しい知見を得た。フルオレニルリチウムとSp,DDB,PMPを用いた不斉オリゴマー化反応の生成物の立体構造をNMRと質量分析装置を用いて詳細に検討した。その結果から、3の不斉重合では重合初期に生成する活性種のうち特定の立体構造を有するものだけが優先的に成長してらせん状ポリマーを与え、それ以外のものはオリゴマーとして重合系に残存することを明らかにした。3.ブチルイソシアナート、4-フェニルブチルイソシアナートから、光学活性なリチウムアミドあるはリチウムアルコキシドを開始剤に用いてアニオン重合することによりらせんの偏りをもつ光学活性ポリマーを得ることに成功した。1.メタクリル酸ジフェニル-3-ピリジルメチル(1)およびメタクリル酸フェニル-ビス(2-ピリジル)メチル(2)を合成し、N,N'-ジフェニルエチレンジアミンモノリチウムアミドと(-)-スパルテイン、(+)-2,3-ジメトキシ-1,4-ビスジメチルアミノブタン、(+)-1-(2-ピロリジニルメチル)ピロリジン(PMP)との錯体を用いてトルエン中-78°Cで重合させた。その結果、1および2ともPMP錯体を用いると、高いイソタクチシチー(mm>98%)と旋光性を有するポリマーが得られた。この旋光性はポリマーが一方向巻きに片寄ったらせん構造をとることによるものである。2.メタクリル酸1-フェニルジベンゾスベリルを(+)-および(-)-メントール中でラジカル重合させると、それぞれメントールとは逆の旋光性を示すイソタクチックなポリマーが生成した。ポリマーの旋光性は一方向巻きに片寄ったらせん構造によることがCD測定より明らかになった。3.メタ-トリルイソシアナートを(+)-1-(2-メトキシメチル)ピロリジンのリチウムアミドを用いて、トルエン中-98°Cで重合させると大きな旋光性を示す光学活性ポリイソシアナートが得られた。

この旋光性は、ポリマーの末端に導入された光学活性基により、ポリマーのらせん構造が一方向に片寄ったことによるものであり、芳香族ポリイソシアナートもらせん構造をとることを示唆するものである。この高分子の熱分析を行い、液晶性と安定性について検討した。4.1の実験で得られた光学活性なポリ(メタクリル酸フェニル-ビス(2-ピリジル)メチルをシリカゲルに吸着させ、高速液体クロマトグラフィー用の充填剤を調製した。この充填剤を用いていくつかのラセミ体の光学分割を行った結果、ヘキサヘリセン、トレガー塩基、1,1-ビナフチル誘導体などが分割されることが明らかになった。1.メタクリル酸1-フェニルジベンゾスベリルのラジカル重合を、光学活性な溶媒(メントール、ネオメントール)中で、あるいは光学活性な連鎖移動剤(メンタンチオール、ネオメンタンチオール)の存在下で行い、アキラルなモノマーのラジカル重合でははじめて高度にイソタクチックならせん状光学活性ポリマーを得た。2.メタクリル酸1-(2-ピリジル)ジベンゾスベリルを合成し、N,N'-ジフェニルエチレンジミンのモノリチウムアミドと(+)-1-(2-ピロリジニルメチル)ピロリジン(PMP)との錯体を用いてトルエン中-78°Cで重合し、高度にイソタクチックな一方向巻のらせん構造をもつポリマーを得た。このポリマーは種々のラセミ体に対して不斉識別能を示した。3.アクリル酸1-フェニルジベンゾスベリル、アクリル酸トリフェニルメチルの不斉アニオン重合により、一方向に片寄ったらせん構造をもつと考えらるポリマーを得た。4.メタトリルおよびメタメトキシフェニルイソシアナ-トのオリゴマー化を(+)-1-(2-メトキシメチル)ピロリジンのリチウムアミドを用いて行い、生成物を高速液体クロマトグラフィーあるいは超臨界流体クロマトグラフィーを用いて重合度別に分別し、各オリゴマーの重合度と比旋光度の関係を調べた。その結果、いずれのオリゴマーについても重合度12-13程度でらせんの反転が起こり始め、それ以上の重合度領域では、重合度の増加とともに旋光性が減少することを明らかにした。側鎖に光学活性なカルバメート基を有するフェニルアセチレン誘導体を合成し、ロジウム触媒により単独重合あるいは種々のモノマーと共重合した結果、らせん構造にもとづくと考えられる強い円偏光二色性スペクトルを示す立体規則性ポリマーを得られた。これらのポリマーを高速液体クロマトグラフィーの固定相として用いたところ、様々のラセミ体を効率よく分割することができた。
呼吸器症状患者・胃腸炎症状患者におけるオルソレオウイルスの検出系構築と疫学研究

ヒトのオルソレオウイルス感染症(呼吸器感染症や感染性胃腸炎)は、哺乳類オルソレオウイルスやプテロパインオルソレオウイルスの感染により起こる。オルソレオウイルス感染患者の報告数は少ないが、海外におけるその抗体保有者は多い。日本国内におけるオルソレオウイルス感染患者やその抗体保有者はこれまで報告されていないが、特異的な検査は行われておらず、感染患者は見落とされている可能性がある。本研究では、オルソレオウイルス遺伝子を検出するreal-time PCR法を確立する。本検出系を用いて、呼吸器症状や胃腸炎症状を示す患者のオルソレオウイルス遺伝子保有率を調査し、日本のオルソレオウイルス感染実態を解明する。哺乳類オルソレオウイルスやプテロパインオルソレオウイルスはヒトでオルソレオウイルス感染症(呼吸器感染症や感染性胃腸炎)を引き起こすことが知られているが、その特徴はほとんど明らかにされていない。オルソレオウイルス感染症患者の報告数は少なく、日本ではほとんど調べられていない。本研究の目的は、real-time PCR法を用いてオルソレオウイルス遺伝子の検出系を確立するとともに、日本における呼吸器症状患者、消化器症状患者のオルソレオウイルス感染の実態を解明することである。平成30年度は、哺乳類オルソレオウイルスおよびプテロパインオルソレオウイルス遺伝子を検出するmultiplex real-time PCR法を確立した。本検出系を用いて、2014年1月ー2018年12月の5年間に採取された呼吸器症状患者、胃腸炎症状患者由来検体873検体を対象にオルソレオウイルス遺伝子を検索した。その結果、2014年、2015年、2017年に1検体ずつ計3検体(0.3%)から哺乳類オルソレオウイルス遺伝子を検出した。一方、プテロパインオルソレオウイルス遺伝子は、検出されなかった。哺乳類オルソレオウイルスは、感染者は少ないが、日本国内に常在している可能性があった。プテロパインオルソレオウイルスは、東南アジアを中心に患者が報告されているが、日本国内には侵淫していないと考えられた。哺乳類オルソレオウイルス遺伝子が検出された3検体についてVero細胞を用いたウイルス分離を試みたところ、全ての検体でVero細胞の細胞変性効果が認められ、哺乳類オルソレオウイルスの増殖が確認された。今後、Vero細胞で増殖した3株の哺乳類オルソレオウイルスについて全塩基配列を解読し、分子疫学解析を行っていく予定である。オルソレオウイルス特異的multiplex real-time PCR法の構築、および呼吸器症状患者、胃腸炎症状患者由来検体を対象としたオルソレオウイルス遺伝子検索が概ね順調に進展した。Vero細胞で増殖した3株の哺乳類オルソレオウイルスについて全塩基配列を解読する。オルソレオウイルスは10分節のゲノムを有する。全ての分節を分子疫学解析することで、日本におけるオルソレオウイルスの流行株を検証する。ウイルス感染と年齢や臨床症状などとの関連性についても解析する。

Vero細胞で増殖した3株の哺乳類オルソレオウイルスについて全塩基配列を解読する。オルソレオウイルスは10分節のゲノムを有する。全ての分節を分子疫学解析することで、日本におけるオルソレオウイルスの流行株を検証する。ウイルス感染と年齢や臨床症状などとの関連性についても解析する。
TTR単量体の変性、凝集体形成の分子機構の解明と遺伝性難病FAPの創薬への応用

家族性アミロイドポリニューロパチー(FAP)の原因タンパク質であるトランスサイレチン(TTR)は四量体から単量体への解離、単量体の変性・凝集体形成を経てアミロイドを形成する。アミロイド形成実験に汎用される酸変性条件ではTTR単量体の変性・凝集体形成過程の解析が困難であるため詳細な機構はこれまで不明であった。本研究では、TTR単量体の変性・凝集体形成を標的とした創薬研究を展開するために「変性により単量体の立体構造がどのように変化し、変性した単量体がどのような会合様式で細胞毒性を示す凝集体を形成するのか」という問いを独自の手法を用いて解明することを目的とした。予備検討により見出していたTTR単量体の3つの構造状態について変異導入実験およびケミカルバイオロジー的手法を用いた解析を行い、TTR単量体の各状態間には動的平衡が存在しており、それぞれの構造状態は熱力学的安定性が異なることがわかった。また、核磁気共鳴分光法による解析からTTR単量体の構造動態の形成に関わるアミノ酸残基の同定に成功した。さらに、予備検討により見出していたTTR単量体の変性に伴い生成するジスルフィド結合を介した二量体(S-S結合二量体)について生化学的解析を行い、アミロイド形成過程においてS-S結合二量体が形成され、その形成効率は変性条件により変動することがわかった。また、S-S結合二量体の立体構造を核磁気共鳴分光法により決定するためにS-S結合二量体の調製法の確立を行った。本年度計画した研究内容を概ね実施することができ、TTR単量体の構造動態に関する有用な知見を得ることができた。また、次年度に行う核磁気共鳴分光法のための試料調製法も本年度中に構築できており、次年度はスムーズに研究を進展させることができる。次年度はTTR単量体の凝集体形成機構に焦点を当て、以下の2点を中心に研究を行う。(1)アミノ酸選択的安定同位体標識したS-S結合二量体を調製して核磁気共鳴分光法によりS-S結合二量体の立体構造を明らかにする。(2)S-S結合二量体が会合した可溶性凝集体の性状を高速原子間力顕微鏡または透過電子顕微鏡を用いて解析し、神経細胞株に対する凝集体の細胞毒性作用を明らかにする。本年度は繰越額が生じたが実験は概ね良好に進んでおり問題はなかった。繰越額は次年度に計画している核磁気共鳴法による構造解析のためのアミノ酸選択的標識に使用する安定同位体試薬に充当する。
新食肉資源としてのニホンジカの集約的飼育管理技術と鹿肉の利用性の開発

東北地域を主体とした養鹿場の実態を把握するとともに、ニホンジカの集約的飼育管理を試みながら、関連技術の確立と鹿肉の利用性開発をはかるための実験を重ね、数多くの知見を得た。産業動物として養鹿している施設10ヵ所を調査の対象にした。養鹿場開設の目的は鹿肉の生産利用加工販売、鹿茸の生産・製品化あるいは生産子鹿の素畜出荷などであるが、ふれあい動物園としての観光を兼ねている施設もある。シカの種類はほとんどがホンシュウジカ(ニホンジカ)で、ほかはエゾシカ、ヤクシカ、アカシカ、梅花鹿、美国梅花鹿および水鹿などである。飼料は購入し、給与している施設が大部分であった。シカの鎮静・保定のために、筋弛緩剤キシラジン1.0mg/kgが有効であった。その拮抗剤としてヨヒンビン1.0mg/kgの投与量によって速やかに前の状態に回復した。シカの出産は概ね6月上旬から7月下旬で、出生時体重は3.33.9kgの範囲に入る。自力で歩行するまでに2762分を要した。人工哺育の効果も調べた。シカの飼料採食量は季節とともに変化がみられたが、嗜好性の高い飼料を増量給与することにより、晩秋から冬期にかけての食欲や体重の減退を軽減することができた。飼料の採食性や消化率はメン羊に近似しており、飼料利用性は他の反芻家畜より低いか、同程度であると結論された。生理的諸元をみると、筋弛緩剤投与後の不動化状態で、体温が成鹿38.4°C、子鹿39.2°C、心拍数は成鹿38.8、子鹿39.8回/分であった。赤血球数は成鹿で915万個/mm^3となり、白血球数は4270個/mm^3であった。鹿乳の成分は、pH6.80、酸度0.33%、水分78%、固形分22%、粗タンパク質8.53%、脂肪7.50%、乳糖4.42%、粗灰分1.15%を示した。鹿肉の枝肉歩留りは60%以上、精肉のpH5.56.2、水分活性値は0.950.98であった。高タンパク質、低脂肪の特徴をもつ。鹿茸は1本300400gで、1頭から2本得られた。1.供試シカは10頭となり、飼育管理や馴化も順調に行われた。青草・ヘイキューブのほかグラスサイレージ、トウモロコシサイレージ等を給与して消化試験を試みた。個体差もみられたが、サイレージの嗜好性・採食性ともに良かった。また同時に消化率の測定も実施した。血液は毎月2回採取し、前年の測定項目以外の一般性状、血液沈降速度、pH、コレステロール、成長ホルモン等の測定を行い、生理的諸元についても継続して調査を行った。