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著作権の発展と文学の300年-作品流通の国際化と英語圏各国文学のアイデンティティ

イギリスで最初に著作権法が成立してから300年以上が経ったが、その間に起きた著作権法の発展と文学者の創作に対する意識の変化との関係を明らかにするとともに、次第に増していった国際的な作品の流通とイギリス、アメリカ、カナダを中心とする英語圏の国々の文学的アイデンティティの問題との関連について研究を行った。また、この300年間に確立され、発展してきた著作権というものが果たして文学をはじめとする文化の振興に寄与することになったのかについても考察した。本研究の目的は、世界で最初の著作権法がイギリスで成立してから今日までのおよそ300年の間に起こった著作権法の発展と著作者の創作に対する意識の変化との関係、そして、次第に増していった国際的な作品の流通とイギリス、アメリカ、カナダを中心とする英語圏の国々の文学的アイデンティティの問題との関連を明らかにすることにある。また、この300年間に確立され、発展してきた著作権というものが本当に文学をはじめとする文化の振興に寄与することになったのかについて考察することも目指している。平成22年度には、著作権法の成立・発展の過程と、「著者」の概念、文学者の果たすべき役割に関するアイディアの時代による変遷との関連について研究を行った。1710年の著作権法の成立以降に起こった変化の特質をより明確につかむために、17世紀以降のイギリス、18世紀以降のアメリカ・カナダにおける文学の文化的・社会的役割に関する論考を読み直した。特にアメリカとカナダの文学論における文学的天才の定義の変遷と両国独自の文学の成立において文学者たちが果たすべき役割についての議論を整理し、19世紀における国際著作権条約の成立の前後でフランス、ドイツも含む国々における文学論に変化が見られるか調査した。これらの研究のために必要な文献調査を、大英図書館、スコットランド国立図書館、フランス国立図書館、ドイツ国立図書館等で行った。その成果の一部は、ホイットマン、モンゴメリ、イェイツと著作権との関係に関する論文にまとめ、エディンバラで7月に開催されたMaterial Cultures 2010Conferenceでの口頭発表ではディケンズとアメリカの出版社ハーパーとの関係に英米間の著作権保護法成立に向けての動きが持った影響について論じた。平成23年度には、前年度に行った、著作権法の成立・発展の過程と、イギリスにおける「著者」の概念、文学者の果たすべき役割に関するアイディアの変遷との関連についての研究((1))をさらに進めると同時に、アメリカ、カナダ、アイルランドにおける文学と文学論に関する研究((2))を行った。まず、前者((1))については、永代版権を持つことにこだわった文学者は多いが、彼らがなぜ著作者が持つ永代版権にこだわったのかについて、今日の著作者人格権の要素がイギリスの著作権法においてなかったことが関係しているのではないかとの仮説のもとに研究を行った。フランスにおける著作者人格権の発展過程についても調査し、それがイギリスをはじめとする他国の著作権法や国際条約に与えた影響についても考察した。その成果の一部は、ワーズワースの知的所有権の意識と、著作者人格権的考え方の関連について論文にまとめ、投稿準備中である。後者((2))については、18世紀から20世紀までのアメリカ、カナダの文学論における、文学的天才の定義の変遷と両国独自の文学の成立において文学者たちが果たすべき役割についての議論について調査し、イギリスの対カナダ著作権政策との関係について考察を行った。また、アイルランドにおける状況との比較も行い、それぞれの特徴を把握した。上記の研究に必要な文献を調査するため、イギリスのブリティッシュ・ライブラリー、アイルランドの国立図書館、フランスの国立図書館で文献調査を行うとともに、著作権、文学論をめぐる議論関連の文献を購入した。研究の成果を書籍にまとめている途中のため、今年度の発表論文はないが、次年度中にはその原稿を完成させるとともに、(2)についての論文もまとめる予定である。本年度は、前年度までの研究を踏まえ、20世紀のイギリスとアメリカにおける状況をカナダにおける状況と比較し、3年間の研究をまとめっていった。当年の研究のポイントは以下のとおりである。1)20世紀の英米両国においては、カナダにおいてのように、目立ったイギリス的文学や、アメリカ的文学を求める動きは見られないように思われるが、果たして本当にそうだったのか、また、そうであるとすれば原因は何かを、国際著作権法の発展や、著作権をめぐる言説との関連において考察した。また、イギリスの影響に加え、隣の大国アメリカの影響、さらにはフランスの影響など複雑な政治的・文化的状況にあるカナダにおける文学・文化の問題について検討した。2)アメリカ人作家の保護についての実務の実態を明らかにするために調査を行った。早くはアーヴィング、クーパーに始まり、その後のマーク・トウェインやヘンリー・ジェイムズ、ヘミングウェイらのアメリカの作家たちがアメリカを出て、海外に一定期間暮らし、創作活動を行ったことと、イギリスやフランス、ドイツなどの国が外国人著作者の作品を著作権法により保護していたこととは無関係ではないと考えられる。19世紀の二国間条約、そしてベルヌ条約が非加盟国の国民の作品をどのように保護していたのか、その実務と実態について研究を行った。

また、それらの国でアメリカ的なものがどのように評価され、アメリカ人作家たちの創作観に影響を与えたか分析した。交付申請書に記入した研究計画に従って研究を進めていると同時に、その過程で今後研究を進めるべき新たなテーマもいくつか見つけることができているため。24年度が最終年度であるため、記入しない。平成24年度は、本研究課題の最終年度にあたるため、3年間の研究の総括を行い、書籍として研究の成果をまとめ、公表する予定である。
持続感染期におけるモノネガウイルス・ゲノムRNAの安定化機序の解析

本研究は、持続感染期におけるモノネガウイルス・ゲノムRNAの安定維持機構を宿主因子との相互作用を含めて明らかにし、一本鎖RNAウイルスの複製と持続感染を制御する新たな共通基盤の確立を試みるものである。本研究はボルナ病ウイルス(BDV)を用いて解析が進められている。初年度である本年は、ゲノムRNAの安定維持機構の基礎的な知見を蓄積するために、BDV持続感染細胞における(i)ウイルス蛋白質の細胞内動態とゲノムRNA複製制御の解析、(ii)ウイルス複製複合体vRNPの核内局在とゲノムRNA安定維持との関連性の解明を目標に研究をおこなった。(i)の目標において、持続感染の成立に伴うP蛋白質の細胞内局在の変化にはX蛋白質との相互作用が必要であることを示した。また、(ii)の目標において、BDV持続感染細胞を用いて、各細胞周期におけるBDVのゲノムRNAあるいはvRNP構成蛋白質の核内局在を詳細に観察した。その結果、間期の細胞ではvRNPの集合体と考えられる多数のリング状の構造物(NRS)がクロマチン間領域に観察された。一方、分裂期の細胞ではNRSは消失し、vRNP構成蛋白質がクロマチンと共局在することが明らかとなった。さらに、BDV vRNP構成蛋白質は分裂期の細胞においてクロマチンに接着して娘細胞に分配される可能性が示された。このことは、BDVがゲノムRNAの安定維持に細胞の複製機構を利用していることを示唆している。ゲノムRNAがクロマチンと共局在し娘細胞に分配されるという現象はRNAウイルスでは初めての発見であると同時に、細胞間においても同様の動態を示すRNA分子は見つかっていない。今後、ゲノムRNAの安定維持機序の解明には、細胞側の関連因子の同定を含めたさらなる解析が必要である。
ポリオウイルスの組織特異性を生み出す、組織特異的翻訳機構の解明

小児麻痺(急性灰白髄炎)の原因となるポリオウイルスはmRNAの5'非翻訳領域に存在するInternal Ribosome Entry Site(IRES)と呼ばれる配列を利用して翻訳を開始させ、ウイルス蛋白質を合成する。これまでの研究から、私は、ポリオウイルス野生型IRES中に弱毒化を引き起こす変異が存在すると、神経細胞抽出液におけるIRES依存的翻訳が著しく阻害されることを明らかにしてきた。これは変異型IRES依存的翻訳を神経特異的に阻害する宿主因子(神経特異的因子)の存在を示唆している。そこで、本研究では、変異型IRES依存的翻訳を阻害する神経特異的因子の同定を試みた。これまでの研究から、神経特異的因子は翻訳反応の中心となるリボソームに結合して機能していること、神経特異的因子を非神経細胞のリボソームに結合させても機能的に働くことを明らかにしている。また、質量分析によって神経特異的因子の候補も選出されていたため、本研究ではそれらの候補から変異型IRES依存的翻訳を阻害する因子を探索した。その結果、候補の中から、変異型IRES依存的翻訳を阻害する神経特異的因子(Factor X)を同定した。以上の研究から、ポリオウイルス変異型IRES依存的翻訳はFactor Xによって神経特異的に阻害されていると考えられる。Factor Xは翻訳装置であるリボソームに結合する因子であるため、ポリオウイルスIRES依存的翻訳だけでなく、宿主が行うcap依存的翻訳に対しても神経特異的制御を担う可能性がある。そのため、cap依存的翻訳に対するFactor Xの機能解析を行うことで新たな翻訳制御機構が明らかとなることが期待される。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。小児麻痺(急性灰白髄炎)の原因ウイルスであるポリオウイルスには、野生型と生ワクチンとして利用される変異型が存在する。神経麻痺の症状は神経破壊を伴ったウイルスの増殖によりもたらされるが、変異型の神経における増殖効率は野生型に比べ著しく低いため、変異型は神経毒性を示さない。この神経における両型の増殖効率の変化を決定づける要因はウイルスゲノムのInternal Ribosome Entry Site(IRES)と呼ばれる配列中の変異であると報告されている。IRESはmRNAの5'非翻訳領域に存在する特徴的な構造を有した配列であり、真核生物が一般的に行うcap依存的翻訳機構とは異なるメカニズムによりリボソームを誘導し翻訳を開始させる配列である。このため、『変異型はIRES中の変異が原因で神経特異的にIRES依存的翻訳が阻害され、その結果、増殖効率が低下している』と予想される。しかしながら、神経におけるポリオウイルスIRES依存的翻訳開始の詳細な分子機構は未だ理解が不十分であり、当仮説を実証する報告はなされていない。そこで私は、神経におけるポリオウイルスIRES依存的翻訳を試験管内翻訳系により解析し、ポリオウイルスの神経特異性を生み出す翻訳制御因子(神経特異的因子)を同定することでこの仮説を検証しようと試みてきた。これまでに私は、変異型IRESから開始される翻訳が神経細胞特異的に阻害されること、その原因となる神経特異的因子は翻訳反応の中心となるリボソームに結合して機能していること、神経特異的因子を非神経細胞のリボソームに結合させても機能的に働くことを明らかにした。さらに、質量分析を行うことで神経特異的因子を探索し、これまでに候補をいくつか得た。今後、これら候補を検証し、神経特異的因子を同定する。また、同定後は神経特異的因子のcap依存的翻訳に対する機能を解析する方針である。当研究の目的はポリオウイルス変異型IRES依存的翻訳を神経特異的に阻害する分子機構の解明である。私は、前度中に変異型IRES依存的翻訳を神経特異的に阻害する翻訳制御因子(神経特異的因子)を同定することを計画していた。そこでまず、私は、神経特異的因子をリボソーム複合体から解離さることを試みた。具体的には、超遠心により分離したSK-N-SH細胞由来のリボソーム複合体を高塩濃度処理し、神経特異的因子をリボソーム複合体から解離させた。神経特異的因子の解離は試験管内翻訳系を用いて評価し、変異型IRES依存的翻訳に対する阻害活性が消失していることを確認した。更に、解離させた神経特異的因子を高塩濃度処理後のSK-N-SH細胞リボソーム、またはHeLa細胞リボソームと再度結合させたところ、変異型IRES依存的翻訳に対する阻害活性を回復または獲得した。これにより、神経特異的因子はリボソームに結合することで機能的に働くことを明らかにした。神経特異的因子の探索には、SILAC法を利用した。SK-N-SH細胞とHeLa細胞を、それぞれL-Lysine-13C6とL-Lysine-12C6を含む培養液で培養し、タンパク質に各アミノ酸を導入した。標識後、前述の方法で神経特異的因子を分離し、軽いアミノ酸で標識したHeLa細胞由来リボソームと再度結合させた。この状態のリボソーム複合体を質量分析することで、リボソームと結合し、かつ、機能的に働く神経特異的因子の候補を得た。現在、得られた候補をHeLa細胞に過剰発現させ、変異型IRES依存的翻訳に対する阻害効果を解析している段階である。また、これらの実験手技を応用し、IRES依存的翻訳を行うことで知られるA型肝炎ウイルス(HAV)についても解析した。

HAVのIRES依存的翻訳が肝臓特異的に活性化していることを示し、学術誌に投稿した(現在リバイズ中)。小児麻痺(急性灰白髄炎)の原因となるポリオウイルスはmRNAの5'非翻訳領域に存在するInternal Ribosome Entry Site(IRES)と呼ばれる配列を利用して翻訳を開始させ、ウイルス蛋白質を合成する。これまでの研究から、私は、ポリオウイルス野生型IRES中に弱毒化を引き起こす変異が存在すると、神経細胞抽出液におけるIRES依存的翻訳が著しく阻害されることを明らかにしてきた。これは変異型IRES依存的翻訳を神経特異的に阻害する宿主因子(神経特異的因子)の存在を示唆している。そこで、本研究では、変異型IRES依存的翻訳を阻害する神経特異的因子の同定を試みた。これまでの研究から、神経特異的因子は翻訳反応の中心となるリボソームに結合して機能していること、神経特異的因子を非神経細胞のリボソームに結合させても機能的に働くことを明らかにしている。また、質量分析によって神経特異的因子の候補も選出されていたため、本研究ではそれらの候補から変異型IRES依存的翻訳を阻害する因子を探索した。その結果、候補の中から、変異型IRES依存的翻訳を阻害する神経特異的因子(Factor X)を同定した。以上の研究から、ポリオウイルス変異型IRES依存的翻訳はFactor Xによって神経特異的に阻害されていると考えられる。Factor Xは翻訳装置であるリボソームに結合する因子であるため、ポリオウイルスIRES依存的翻訳だけでなく、宿主が行うcap依存的翻訳に対しても神経特異的制御を担う可能性がある。そのため、cap依存的翻訳に対するFactor Xの機能解析を行うことで新たな翻訳制御機構が明らかとなることが期待される。これまでの研究により、ポリオウイルス変異型IRES依存的翻訳を神経特異的に阻害する因子(神経特異的因子)の候補が得られている。しかしながら、未だ神経特異的因子の同定には至っていないのが現状である。質量分析により得られた候補は複数個あり、現時点で全候補を検証できていないので、今後も得られた候補因子をHeLa細胞に過剰発現させ、そのHeLa細胞抽出液を用いた試験管内翻訳系によって検証を続ける予定である。また、同定後は、SK-N-SH細胞から神経特異的因子をノックアウトまたはノックダウンした状態での変異型IRES依存的翻訳を試験管内翻訳系により解析したいと考えている。神経特異的因子のノックアウトにはCRISPR/Cas9システム、ノックダウンにはsiRNAを利用することを計画している。更に、大腸菌で作成した神経特異的因子の組換えタンパク質をin vitro翻訳系の中に加えた場合の解析も同時に進行させる予定である。これまではポリオウイルスIRES依存的翻訳にのみ着目してきたが、神経特異的因子が宿主の行うcap依存的翻訳に対しても神経特異的な翻訳制御を行っている可能性も考えられる。そこで、神経特異的因子同定後は、神経特異的因子のcap依存的翻訳に対する機能についても解析し、神経特異的な新規翻訳制御機構を探索することを計画している。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
刺激応答性を有する有機無機ハイブリッド分離膜の創成に関する研究

細孔径4nmの多孔質ガラス膜の細孔表面を光、pH,温度の刺激に応答する有機分子を導入することにより、これらの刺激に応答する刺激応答膜の創成を検討した。多孔質ガラスは、SiO_2,B_2O_3,Na_2Oを成分とするホウケイ酸ガラスより得た。この多孔質ガラスを使用して、可逆的付加-開裂連鎖移動(RAFT)型のリビングラジカル重合を行うことで、温度に応答してコンポメーションの大きく変化するポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)(PNIPAM)のグラフトを行った。その結果、ポリマの精密合成の方法として、さまざまな官能基を含むモノマーをリビング的に重合可能な可逆的付加-開裂連鎖移動(RAFT)型ラジカル重合法を用いることで、イオン強度、温度などに応答性を示すポリマーの精密合成が可能であることを確認した。PNIPAMをグラフトした多孔質ガラスは25°Cで細孔のゲートが水和したポリマー鎖により封鎖され、物質の透過を抑制するが、40°Cでポリマー鎖が脱水和を起こして収縮するため、細孔ゲートが開き、物質の透過が可能となることを、ベンジルアルコールを使用した水中での透過実験により確認した。光応答性については、多孔質ガラスの表面に塩化金酸の還元によって金微粒子をコーティングし、金微粒子と極めて反応性の高いチオールを有するアゾベンゼン(HS-(CH2)2-COHN-ph-N=N-ph)を合成し、これを金修飾多孔質ガラス表面へ導入した。6AzIOCOOH改質膜による窒素透過特性では、紫外線の照射非照射によって完全な気体透過のON-OFFが実現できなかったが、本方法で初めて刺激光照射非照射によって気体透過ON-OFFのスイッチングが実現できた。pH応答性については、4-トリエトキシシリルブチロニトリルを多孔質ガラスの細孔内に導入し塩酸酸性の条件下でニトリル基の加水分解を行うことによりカルボン酸基を導入した。当該カルボン酸は、約pH4程度で親疎水性が変化する。即ち、pH4以下では疎水性のために水溶液中では分子鎖が収縮し、pH4以上では、分子鎖が膨潤するので、こうした有機分子で改質した膜はpH応答性を有することが確認された。光応答性分子の導入は、まず多孔質ガラス表面に3-メルカプトプロピルトリメトキシシランを多孔質ガラスの表面水酸基に反応させることによって導入し、導入したチオール基に金コロイドを修飾し、さらにこの金コロイドと11-メルカプトウンデカン酸を反応させることによりカルボキシル基を導入し、カップリング反応によってアゾベンゼンを導入する手法を検討している。アゾベンゼンの光によるシスートランス異性化反応により光応答性を検討する。

当該カルボン酸は、約pH4程度で親疎水性が変化する。即ち、pH4以下では疎水性のために水溶液中では分子鎖が収縮し、pH4以上では、分子鎖が膨潤するので、こうした有機分子で改質した膜はpH応答性を有することが期待される。今回、アセトン水溶液で予備的に得られている結果ではこのような応答性があることを示唆する結果が得られている。温度応答性については、下限臨界溶液温度(LCST)を示すことが知られているN-イソプロピルアクリルアミド(NIPAM)を多孔質ガラス表面にチオール基を導入し、そのチオール基上に金コロイドを担持し、その金コロイド上に末端にチオール基修飾したNIPAMを反応させることによって得られる多孔質ガラス膜について検討している。刺激応答性有機-無機ハイブリッド創成のため、刺激応答性の有機物である刺激応答性ポリマーの精密合成と刺激応答挙動に関する研究を行った。その結果、ポリマの精密合成の方法として、さまざまな官能基を含むモノマーをリビング的に重合可能な可逆的付加-開裂連鎖移動(RAFT)型ラジカル重合法を用いることで、pH、イオン強度、温度などに応答性を示すポリマーの精密合成が可能であることを確認した。以上の知見をもとにして、多孔質ガラス表面上での刺激応答性ポリマーのグラフト重合を行い、刺激応答性有機-無機ハイブリッド膜を作成した。さらに光応答性化合物の光異性化に着目して、多孔質ガラス膜表面および細孔内にアゾベンゼン誘導体を導入し照射光のスイッチングにより気体流量を制御する材料を設計、創製した。多孔質ガラス表面にあるシラノール基(Si-OH)を3-アミノプロピルジメチルクロロシランで改質した後、アゾベンゼン誘導体(11-[4-(4'ヘクシルフェニルアゾ)フェノキシ]ウンデカン酸、6AzCOOH)のカルボン酸をアミノ基との脱水縮合反応によって導入することで光異性化に伴う気体透過性制御を試みた。窒素ならびにヘリウムを当該膜によって透過する際、刺激光の照射あるいは非照射によって透過速度が変化することがわかった。一方で透過性の光照射による変化率は数%程度であり、これは、多孔質ガラス表面におけるアゾベンゼン誘導体のアミノ基との反応率10%という低い改質率が原因と考えられ、数段階を経由する多孔質ガラス表面の改質方法では気体透過を制御するほどのアゾ基を導入することは困難であるという結論が導かれた。そこで金微粒子と極めて反応性の高いチオールを有するアゾベンゼン(HS-(CH2)2-COHN-ph-N=N-ph)を合成し、これを金修飾多孔質ガラス表面へ導入した。結果、改質率は20%まで増加した。この膜を用いて、刺激光の照射あるいは非照射による窒素の透過速度の変化を検討した。透過性の変化率は5-6%程度であり、若干の変化率の上昇が確認できた。このことから、アゾベンゼンの末端基に長鎖のアルキル基を導入できれば、さらに大きな変化率を得られることを示唆するものと考えられる。その結果、ポリマの精密合成の方法として、さまざまな官能基を含むモノマーをリビング的に重合可能な可逆的付加-開裂連鎖移動(RAFT)型ラジカル重合法を用いることで、pH、イオン強度、温度などに応答性を示すポリマーの精密合成が可能であことを確認した。
ピルビン酸脱水素酵素複合体における超分子組織の構築原理とその反応機構

クエン酸回路にアセチル基を導入するピルビン酸脱水素酵素複合体は、多数のタンパク質が組織的に会合した超分子複合体の典型的な例である。本酵素複合体は生物種によって形態が異なり、前核生物では432対称を、真核生物では532対称をもつ。そして、いずれの複合体も3種類の酵素、ピルビン酸脱水素酵素(E1)、アセチル基転移酵素(E2)、リポアミド脱水素酵素(E3)から構成される。このような組み合わせは、2-オキソグルタル酸脱水素酵素複合体や分岐鎖オキソ酸脱水素酵素複合体でも見られる。これらを通じて、E3は全く同一の酵素が利用されているという事実が最近明らかになった。したがって超分子の複合体形成におけるE3の役割に興味がもたれ、本研究ではこのE3のX線解析に重点を置いた。イ-スト菌より単離精製したリポアミド脱水素酵素は結晶化のわずかな条件の違いにより2種類の結晶形が得られたので、これらについてX線解析を行った。つくばの高エネルギー物理学研究所の放射光を用いて測定したデータを用いて、グルタチオン還元酵素を参照分子とする分子置換法で初期位相を求め、剛体分子モデルによる位置と方位の精密化した。二量体のサブユニット間に存在する2回回転対称を利用した電子密度の平均化と溶媒領域の平滑化によって電子密度マップを改善する方法と、コンピューターグラフィックスによる分子モデルの構築とその原子座標を最小二乗法で精密化する方法の2つを交互に繰り返した。この構造をグルタチオン還元酵素と比較すると、4個のドメインそれぞれがシフトしているが、特にC末ドメインが大きくずれていること、しかし、FADの結合部位はほとんど同じで、さらにドメイン間に存在し反応に関与するアミノ酸の立体配置は同じであることが判明した。432対称の複合体を造る前核生物由来の本酵素と比較することにより、立体構造の高い類似性は本酵素が共通の機能という制約によって生物種を問わず保存されて来た可能性、本研究から明らかになった。イースト菌のリポアミド脱水素酵素を結晶化させ,高エネルギー物理学研究所の放射光を利用して巨大ワイセンベルグカメラで測定したX線回折強度データは,分解能が3.0A^^°(2.5A^^°,65%)で,Rmergが5%と質の高いものであった.以前に4軸型回折計で測定したデータ(分解能4.5A^^°)の時は,1次構造の相同性が高いグルタチオン還元酵素の構造を用いて分子置換法で決定した.今回の結晶は空間群が同じであるにもかかわらず,単位格子のb軸の長さにかなりの違いが見られたので,構造決定をやり直した.その結果、分子の傾きは以前と同じであるが,単位格子内の分子の位置が変化していることが明らかになった.確認のために逆空間だけでなく実空間における分子置換法も適用したが,結果は同じであった,この構造をエネルギー極小化さらに分子ダイナミックを含めて精密化した結果,分解能3.5A^^°でR=30.4%を得た.現在,三次元コンピューターグラフィックスで分子モデル表示し,電子密度と重ね合わせてアミノ酸のインサーションとデリーションを確認しながら,ペプチド鎖のコンフォメーションの調節,修正ならびにアミノ酸側鎖の付加を行っている.以上の結果を平成5年8月中国北京で開催される国際結晶学連合会議で発表する予定である.

一方,複合体の構造研究のために,イースト菌をフレンチプレスで2回粉砕し,膜成分からピルビン酸脱水素酵素複合体を溶出した後,等電点沈殿およびPEG沈殿,超遠心密度勾配法で精製を行った.しかしこの方法では収率がそれ程高くなかった.結晶化では多量のサンプルを必要とするので,イオン交換クロマトを使うなど精製方法の改善を検討中である.前年度は高エネルギー物理学研究所の放射光を利用して巨大ワイセンベルグカメラで測定したX線回折強度データを用いて,イースト菌のリポアミド脱水素酵素の結晶構造を分子置換法で解いた.本年度はこの構造から得られた位相を初期値として,位相の改善とモデルの構築,さらに構造の精密化を行った.通常の方法では位相の改善が難航したので,プログラムDENAFを新たに開発し,適用した.このプログラムでは二量体のサブユニット間の2回回転対称を利用してサブユニット間の電子密度を平均化し,さらに溶媒領域の電子密度をその領域全体の平均値で置き換え平滑化することによってノイズを消す.このようにして改良した電子密度をフーリエ変換して新しい位相を得る.改善を加速させるためにFoマップと2Fo-Fcマップを併用する.この計算を繰り返し,位相の変化が収歛すると,さらに分解能を上げて同様の計算を行う.このプロセスを繰り返すことによって電子密度が大幅に改良され,分子モデルの構築と修正が容易になった.分子力学と分子動力学を考慮した最小二乗法によって構造を精密化し,約83%のアミノ酸側鎖を付けた段階で,R値を0.226まで下げることができた.以上の結果は平成5年8月中国北京で開催された国際結晶学連合会議で発表した.現在さらに分子モデルの構築と修正,原子座標の精密化を行っている.一方,複合体の構造研究のために,イースト菌からピルビン酸脱水素酵素複合体の単離を行った.収率が低いので現在精製方法の改善を検討中である.これと並行してヒトのリポアミド脱水素酵素の遺伝子を得ることができたので,これを大腸菌に導入することを進めている.クエン酸回路にアセチル基を導入するピルビン酸脱水素酵素複合体は、多数のタンパク質が組織的に会合した超分子複合体の典型的な例である。本酵素複合体は生物種によって形態が異なり、前核生物では432対称を、真核生物では532対称をもつ。そして、いずれの複合体も3種類の酵素、ピルビン酸脱水素酵素(E1)、アセチル基転移酵素(E2)、リポアミド脱水素酵素(E3)から構成される。このような組み合わせは、2-オキソグルタル酸脱水素酵素複合体や分岐鎖オキソ酸脱水素酵素複合体でも見られる。これらを通じて、E3は全く同一に酵素が利用されているという事実が最近明らかになった。したがって超分子の複合体形成におけるE3の役割に興味がもたれ、本年度はこのE3のX線解析に重点を置いた。イ-スト菌より単離精製したリポアミド脱水素酵素は結晶化のわずかな条件の違いにより結晶形が異なる。今回得られた別の結晶形について、X線解析を行った。つくばの高エネルギー物理学研究所の放射光を用いて測定したデータを用いて、グルタチオン還元酵素を参照分子とする分子置換法で初期位相を求め、剛体分子モデルによる位置と方位の精密化した。
線維芽細胞の内皮細胞への分化による新しい血管新生のメカニズム

血管新生は、従来、既存の血管の内皮細胞によるsproutingと言われる過程によって起こるとされてきた。しかし、筆者らは以前、線維芽細胞由来の内皮細胞が新生血管に存在することを見出した。本研究では、線維芽細胞が内皮細胞へ分化することによる新しい血管新生のメカニズムの存在を明らかにすることを目的として、lacZ遺伝子導入マウスを使用することを計画した。しかし、導入を予定していたlacZ遺伝子導入マウスが使用できなくなり、別の方法を用いて研究を行った。ウサギ耳介皮下の線維芽細胞を培養し、増殖させた後、線維芽細胞の貧食能を活用して墨汁粒子を摂食させた。こうして墨汁により標識した線維芽細胞をこの2日前に取り付けたウサギ耳窓内に自家移植した。その1週間後、新生血管が伸び出して来た頃、固定し、エポンに包埋した。血管先端部分の厚さ1μmの準超薄切片を作製し、トルイジンブルーで染色した。光顕で観察したところ、赤血球を取り囲む血管の内皮に黒色の墨汁粒子を持つ細胞が観察できた。しかし、光顕の解像力では墨汁の存在部分を明確に出来ないので、解像力の大きな走査型電子顕微鏡を用いた。2-3μmの準超薄切片にイオンコーターでイオンエッチングを施し、走査型電子顕微鏡で観察した。走査型電子顕微鏡の二次電子像で血管の内皮細胞の細胞質内に約700Åの小さな粒子が集合体を形成しているのが観察できた。そこで、これが炭素の粒子であるか否かを調べるため、X線による元素分析を行った。その結果、これが炭素原子を豊富に含む炭素粒子であることがはっきりした。以上の結果、線維芽細胞が血管の内皮細胞に分化することが明瞭に示され、sproutingによらない血管新生のメカニズムが存在することが明らかになった。この研究は、清水大三郎、一色伸子、津國秀彰、青柳貞夫など各氏の協力を得たものである。
後眼部血流と緑内障の病態の関連性の解明

本研究では、緑内障モデルネコを作成し、緑内障の進行過程における網膜血流変化を光干渉断層計(OCT)アンギオグラフィー、ドップラーOCT血流計などを用いて経時的に測定することにより、緑内障の発症、進行における網膜血流の影響について検討することを目的とした。当初は緑内障モデルネコの作成に励んでいたが、なかなかうまく進まず、時間のみを浪費してしまった。そのため、緑内障モデルネコの作成を諦めざるを得なかった。アルゴンレーザーを全身麻酔下のネコの網膜静脈に照射して網膜静脈閉塞症モデルネコを作成しドップラーOCT血流計で閉塞部位の上流の網膜血管の血流測定、および側副血管が形成される経過をOCTアンギオグラフィーを用いて観察した。血流測定、血管構造の観察については、レーザーを行う前後とレーザー後1日目、4日目、7日目、14日目で行った。網膜細動脈血流、網膜細静脈血流変化と、側副血管が形成される様子を詳細に観察することができた。現在、論文を執筆、投稿中である。緑内障の発症、進行に対して、視神経乳頭とその周囲の網膜の血流障害は密接に関連していると考えられるが、その因果関係は未解明である。本研究では、従来からの血流計であるレーザースペックルフローグラフィと、次世代の光干渉断層計(OCT)である、OCTアンギオグラフィー、ドップラーOCT血流計を用いて、視神経乳頭とその周囲の網膜の血流動態を詳細に評価し、緑内障の発症、進行に対する視神経乳頭血流、網膜血流の影響について検討することを目的としている。現在までの進捗状況にも記載したが、初年度では、臨床研究および基礎実験系において、大幅な遅延が出てしまっている。過去の文献による情報収集を行い、研究協力者とともに、実験動物を用いた予備実験を行っている段階である。現在、緑内障モデルネコを作成する段階まできている。モデル動物を作成し、経時的に眼血流と網膜・視神経乳頭の構造変化の関係についてデータを収集、慎重に結果を解釈し、成果の発表を行う計画である。本研究開始の平成28年度から、研究代表者の勤務先での別業務が大幅に増えたこと、および、研究協力者の海外留学などが重なり、初年度の研究にかなりの遅延が出ている。本研究では、従来からの血流計であるレーザースペックルフローグラフィと、次世代の光干渉断層計(OCT)である、OCTアンアンギオグラフィー、ドップラーOCT血流計を用いて、視神経乳頭とその周囲の網膜の血流動態を詳細に評価し、緑内障の発症、進行に対する視神経乳頭血流、網膜血流の影響について検討することを目的としている。現在までの進捗状況にも記載したが、研究代表者の研究にあてる時間の低下、研究協力者の留学、退職のために、大幅な遅延が;出てしまっている。現在、緑内障モデルネコ作成のため、研究協力者とともに基礎研究を行っている。本研究開始の平成28年度から、研究代表者の勤務先での別業務が大幅に増えたこと、研究協力者の留学、退職など相次いで重なった。マンパワー低下のために、研究代表者の臨床業務の大幅な増加もあって、研究にかなりの遅延が出ている。現在、研究協力者とともに、緑内障モデルネコを作成する準備をすすめており、間もなく基礎実験を行える状態まで準備がでできている。研究が遅れているが、実験データの解釈については慎重に行う必要がある。現在、まだ緑内障モデルルネコの作成がうまくできていない状態である。研究協力者とともに、モデル動物をなんとか作成し、実験を行っていく。本年度では実験の遅延があったこと、および、予備的な基礎実験では、あらかじめ別の研究費で購入していた実験動物や物品を用いたため。研究が予定通りにすすまず、実験動物や機器の購入に遅れが生じたため、当該助成金が生じた。今後の実験動物、実験にかかる薬品費にあてる予定である。基礎実験での試薬および実験動物の購入費用に経費が必要である。また、研究成果の学会発表および論文執筆に経費が必要である。
ニュートリノ混合とレプトジェネシスでのCPの破れの関係を探る研究

本研究では、シーソー機構で導出されるニュートリノの質量行列の構造を、低エネルギーと高エネルギーでの様々な現象を使って研究した。低エネルギー現象としては、ニュートリノ振動、原子核の二重ベータ崩壊などのレプトン数を破る過程を、また高エネルギー現象としては、レプトジェネシスや超対称性理論で導かれるレプトンの香りを変える有効相互作用を研究した。このようなエネルギースケールの異なる現象を研究するために、くり込み群方程式を解析的解き、その解を用いて議論した。特に、(1)高いエネルギーでニュートリノの特別な混合(Bi-Maximal混合など)を仮定した場合における、上記の現象の解析し、実験を再現する条件を求めた、またCPを破る位相について調べた、(2)CPを破るマヨラナ位相がレプトンの香りを破る過程へ大きな影響を及ぼすことを解析的に示した、(3)原子核の二重ベータ崩壊やμ補角などでの、レプトン数を破る過程の総合的解析し、現実的には原子核の二重ベータ崩壊以外は実験から情報を得ることは困難であることを示した、(4)電子・陽電子衝突で発生したヒッグス粒子の崩壊において、レプトンの香りを破る過程の起こる可能性を解析した、(5)暗黒エネルギーの起源について、宇宙の初期のクォークのスープがハドロン化する際の、孤立したクォークが起源であるとの説を提唱した。次の課題の研究を行った。(1)ニュートリノ系でのCPの破れの研究低エネルギーでニュートリノ振動実験から決めることの出来るディラックCP位相と、高エネルギーでの例えばレプトジェネシスで現れるCPを破る位相(マヨラナ位相)との間の関係を調べた。特に、高エネルギーでのニュートリノ混合がbi-maximal混合である場合について、繰り込み群を用いて、これらの位相の関係を調べ、模型がすべての実験を再現出来ることを示した。また他の実験で得られる量である、二重ベータ崩壊での有効質量、V_<13>の大きさ等を調べた。レプトン数を破る過程である、μ→e+γなどの分岐比を計算した。(2)クオーク系やレプトン系でのCPを破る位相を一元的に記述する模型の可能性を検討している。(3)ニュートリノの質量の起源を統一理論の観点から研究している。CPの破れの起源を探るためには、クォークやレプトンの質量の成り立ちとそれらの構造を調べなくてはならない。このためには、大統一理論からの予言に関する研究と同時に、様々な実験からどのような情報が得られるかを研究することが大切である。このために次の研究を行った。1.ニュートリノ混合行列に関する研究本研究では、T(時間反転)変換に対するニュートリノ振動確率の非対称性を解析的に求め、この観測がディラック位相を決定するために最適であることを示した。本研究では、レプトン数非保存過程に関して、二重ベータ崩壊(A,Z)→(A,Z+2)+e^-+e^-の他の可能性として、原子核によるμ捕獲の現象、μ^-+(A,Z)→(e^+,μ^+)+(A,Z-2)の可能性を調べた。さらに、このほかの様々な過程を考察し、マヨラナ位相を実験的に観測する可能性を調べた。2.大統一理論からのニュートリノの質量行列の研究大統一理論の観点からは、質量行列は柳田達の提案したsee-saw機構からできていると考えられる。ここで現れるディラック質量項とマヨラナ質量項をどのようにして実験的に測定するかが大きな問題である。本研究では、ニュートリノの質量項における繰り込み群の効果を大変よい精度で解析的に求めることに成功した。太陽ニュートリノに現れる混合や質量の2乗の差への影響を求め、特にGUTスケールでbi-maximal混合が実現されている場合を詳しく調べ、この模型の予言を分析した。特に、低エネルギーでの|V_<13>|やディラック位相が繰り込み群から発生すること、二重ベータ崩壊の有効質量が0.02eV程度であること、レプトンの香りを破るプロセスが大きな頻度で起こること、レプトジェネシス機構で発生するバリオンス数を説明できることを示した。

ニュートリノの性質、特にレプトン数非保存過程の研究やCPの破れの研究を通して、ニュートリニュートリノ混合や質量の起源、CPの破れの位相の起源に迫る研究を行った。また、ニュートリノ振動実験、ニュートリノの香りを破る崩壊、レプトジェネシスなどの結果からどのような情報が得られるのかを研究した。特に1.シーソー機構と超対称性を破る項がGUTスケールでユニバーサルであることを仮定し、レプトンの香りを破る過程にCPを破る位相がどのように寄与するか調べ、たいていの場合大きな寄与をすることを示した。特に、μ→e+γ、τ→μ+γの起こる頻度が、位相のない場合に比べ、位相のある場合、大きく変わることを見つけた。(2つの論文として発表した。)2.CPの破れの起源の模型を提案した。具体的には、クォークの質量行列のヒエラルキーな構造を説明するフロガット・ニールセン(FG)機構に現れるスカラー場を2種類に拡張し、クォーク系におけるCP位相の起源がこれらの2つの場の真空期待値の位相の差によると考える模型を提案し検討した。またニュートリノ系についても検討を進めている。(現在論文にまとめている。)質量行列にヒエラルキーな構造をもたせる機構として、Frogatt-Nielsen(FN)によって提案されたものがあるが、CPの破れを起こすことはできなかった。この機構を現実的にするためには、CPの破れを導入しなくてはならない。このため、CPの破れを導入する方法を研究した。その結果、最初の機構とは違い、ヒエラルキーを与えるFN場は2個以上必要であることがわかった。また、FN場とクォークなどの結合する相互作用の強さが世代と無関係とした場合、2つ導入したFN場を区別する量子数が必要である。このような条件を満たす簡単な模型を提案し、小林・益川行列を求めた。混合角は実験結果をほぼ再現したが、予言されたCPの位相は実験地からは少しずれていた。この論文は、現在投稿中である。
マイクロ・メゾ成形中の摩擦界面挙動の定量とモデル化

マイクロ・メゾ成形による金属部品の精度と信頼性に大きな影響を及ぼす工具/材料間の摩擦界面挙動を定量化し,モデル化することを目的とした.摩擦力直接測定では,無潤滑条件で円柱圧縮を行った場合に,成形加工中の垂直・水平力の変化を捉えることができた.摩擦界面の原子スケール計算では,各種皮膜(TiN,VC,CrN)近傍のAl-Al同志のポテンシャルを求めた.これらのポテンシャルを用いて,Al原子の凝着挙動を解析した.各種皮膜上のAlの凝着量の接触電位差測定では,いずれも同じ傾向を示していて違いは現れなかった.原子スケール計算との比較を行うため,現在は,真空中で加工と測定を連続して行う装置を開発している.本研究は,マイクロ・メゾ成形による金属部品の精度と信頼性に大きな影響を及ぼす工具/材料間の摩擦界面挙動を定量化し,不均一で変化していく界面の扱い方を確立することによって,成形の解析のためのモデル化を行うことを目的とする.界面挙動の定量は,工具表面の凝着量についての接触電位差測定を所定量ごとの成形後に行い,モデル化は,この定量結果と工具表面に加わる摩擦力の測定を成形中に行った結果を比較して行う.最終的に,成形前の材料状態の結果として成形中に変化する境界条件を,成形の解析に適用する.摩擦力の直接測定から計算機実験の手法までを含めて系統的に摩擦界面挙動を定量した結果を用いて,変化する界面状態をモデル化する試みは他にはない.界面状態を徹底して定量し,この情報を塑性加工の解析に利用する方法が確立できれば,マイクロ・メゾ成形に限らず,マクロスケールの加工の解析においても必須の手法に発展することが期待できる.これまでに,前加工や焼鈍を行った各種材料を,工具にコーティングした硬質被膜上で押出し据込み加工した場合の加工度ごとの接触電位差測定を行い,様々な場合の凝着挙動を定量化してきた.同時に,同様の材料を用いた押出し据込み加工中の摩擦力直接測定を行い,加工過程における摩擦力の変化についての情報を収集した.前加工や焼鈍を行った各種材料を用いた押出し据込み加工の加工度ごとの接触電位差測定を行い,様々な場合の凝着挙動を定量化してきたが,さらに工具表面に硬質被膜をコーティングした場合にも対応できるように,幅広い接触電位差を高い精度で測定可能な装置に改良した.これを用いると,過去の凝着の計算機実験の結果と比較可能な範囲が拡がり,モデル化のもとになる情報がより多く系統的に得られると予想できる.本研究は,マイクロ・メゾ成形による金属部品の精度と信頼性に大きな影響を及ぼす工具/材料間の摩擦界面挙動を定量化し,不均一かつ変化する界面の扱い方を確立することによって,成形の解析のためのモデル化を行うことを目的とする.界面挙動の定量は,工具表面の凝着量についての接触電位差測定を所定量ごとの成形後に行い,モデル化は,この定量結果と加工中の凝着の原子スケール解析の結果,工具表面に加わる摩擦力の測定を成形中に行った結果を比較して行う.最終的に成形前の材料状態の結果として成形中に変化する境界条件を,成形の解析に適用する.摩擦力の直接測定から原子スケールの計算機実験の手法までを含めて系統的に摩擦界面挙動を定量した結果を用いて,変化する界面状態をモデル化する試みは他にはない.界面状態を徹底して定量し,この情報を塑性加工の解析に利用する方法が確立できれば,マイクロ・メゾ成形に限らず,マクロスケールの加工の解析においても必須の手法に発展することが期待できる.これまでに,(1)摩擦力直接測定装置の工具測定部形状の最適化,(2)工具の各種硬質皮膜上の加工後の凝着の接触電位差測定,(3)工具の各種硬質皮膜上の加工中の凝着の原子スケール解析,を行った.これまでに,(1)摩擦力直接測定装置の工具測定部形状の最適化,(2)工具の各種硬質皮膜上の加工後の凝着の接触電位差測定,(3)工具の各種硬質皮膜上の加工中の凝着の原子スケール解析,を行った.以下具体的に記す.(1)測定部の薄肉部周りの形状を変えたものを試し,薄肉部から工具厚さまでは最小限のテーパ部で接続した垂直の穴を形成したものが,薄膜部のたわみとそれによるレーザーの軌跡の再現性が高いことが明らかとなった.(2)代表的な硬質皮膜であるTiN,VC,CrN上のAlの成形による凝着を接触電位差により定量し,わずかな凝着挙動の違いを調べることが可能であることがわかった.(3)上記3種類の皮膜上のAlの凝着の挙動について原子スケールの計算機実験を行うために,界面付近のAlが感じるポテンシャルの改良を行った.本研究は,マイクロ・メゾ成形による金属部品の精度と信頼性に大きな影響を及ぼす工具/材料間の摩擦界面挙動を定量化し,不均一かつ変化する界面の扱い方を確立することによって,成形の解析のためのモデル化を行うことを目的とする.界面挙動の定量は,工具表面の凝着量についての接触電位差測定を行い,モデル化は,この定量結果と加工中の凝着の原子スケールの解析の結果,工具表面に加わる摩擦力の測定を成形中に行った結果を比較して行う.界面状態を徹底して定量し,この情報を塑性加工の解析に利用する方法が確立できれば,マイクロ・メゾ成形に限らず,マクロスケールの加工の解析においても必須の手法に発展することが期待できる.これまでに,(1)摩擦力直接測定装置による加工中の摩擦力の測定,

(2)工具の各種硬質皮膜上の加工後の凝着の接触電位差測定,(3)工具の各種硬質皮膜上の加工中の原子スケール解析を行った.(1)では,無潤滑状態の摩擦力の変化を測定することに成功し,(3)では,新たに界面付近の被加工材の原子間ポテンシャルを設定し直すことによって,皮膜の種類による凝着挙動を明らかにした.マイクロ・メゾ成形による金属部品の精度と信頼性に大きな影響を及ぼす工具/材料間の摩擦界面挙動を定量化し,モデル化することを目的とした.摩擦力直接測定では,無潤滑条件で円柱圧縮を行った場合に,成形加工中の垂直・水平力の変化を捉えることができた.摩擦界面の原子スケール計算では,各種皮膜(TiN,VC,CrN)近傍のAl-Al同志のポテンシャルを求めた.これらのポテンシャルを用いて,Al原子の凝着挙動を解析した.各種皮膜上のAlの凝着量の接触電位差測定では,いずれも同じ傾向を示していて違いは現れなかった.原子スケール計算との比較を行うため,現在は,真空中で加工と測定を連続して行う装置を開発している.これまでの実験結果に基づいて,加工中の材料の状態と摩擦状態の相関を明らかにする.さらに,これをモデル化して,成形加工の解析に取り入れる方法を確立する.これまでの計算結果と実験にもとづいて,加工中の材料の状態と摩擦状態の相関を明らかにする.最終的にこれらをモデル化して,成形加工の解析に取り入れる方法を確立する.塑性加工納品が年度末に間に合わない物品があったため.本年度,5月中に改めて発注する.
妊娠期低栄養による母体への健康影響の細菌代謝物による改善

本研究では、これまでの研究から糖代謝・脂質代謝異常に対して効果のある緑茶抽出物を用いた。母ラットの妊娠および授乳期における高脂肪食摂取および授乳期における緑茶抽出物の摂取が、雄性仔ラットにおける脂質代謝に及ぼす影響とその機序を明らかにすることを目的とした。母ラットの妊娠・授乳期間中に高脂肪食を与え、離乳後の雄性仔ラットを51週齢まで高脂肪食で飼育した群をFFF群、FFF群と同様な食事に加え授乳期に緑茶抽出物を与えた群をFGF群、すべて通常食を与えた群をCCC群とした。CCC群と比較して、FFF群において精巣上体脂肪量、腎周囲脂肪量、肝臓中TG量及びTGの合成酵素であるDGAT1量が有意に高く、脂肪酸合成の律速酵素FAS量が有意に低下していた。一方、血中TG量は有意に低下していた。肝臓のTGを血中へ運搬を担うMTTP量は低下傾向を示した。次にFFF群と比較して、FGF群においてDGAT1量は有意に低下した。また、肝臓中TG量は低下傾向を示した。さらに、血中TG量と腎周囲脂肪量、肝臓中MTTP量は有意に高かった。次に、Caco-2細胞におけるヒ素誘導毒性に対して、Alpha Lipoic Acid(ALA)の有意な細胞保護効果について検討した。ALAによる細胞の抗酸化防御の強化は、Caco-2細胞における金属誘発性の細胞負荷を取り除くための重要な方法であり得る。しかし、Nrf2-AREシグナル伝達経路を介した還元型GSHの再生は抗酸化防御法に関与している可能性がある。続いて、ALA誘導による細胞死の減少は、ミトコンドリア経路によるアポトーシスの減少に起因し得る。ALAはCaco-2細胞における金属誘発性細胞損傷に対して保護的役割を果たすと結論付けることができる。したがって、ALAは糖尿病、肥満、高血圧などの他のストレスを抑える可能性がある。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。バングラデシュ等の発展途上国では低栄養に依存した妊娠期2型糖尿病などにより母子の健康に重篤な障害がもたらされている。カテキンなどのポリフェノール類はこれらの糖代謝の異常症を改善する有効な手段として考えられているが、その機序については不明な点が多い。本研究では、菌類由来のポリフェノール類似代謝物質に着目し、妊娠期栄養異常が誘発する母子の糖代謝異常の改善にこれらのポリフェノール類似代謝物質が有効である可能性を検討することを目的とする。本年度は第一に、妊娠期低栄養で飼育された子ラットの成熟後の仔ラットの糖および脂質代謝について、糖代謝、脂質代謝に関連するエネルギー代謝のセンサーであるAMPKやSirt1の変動を中心に検討した。その結果、妊娠期低栄養で飼育された仔ラットは、成熟時のAMPKやSIRT1のタンパク発現量の増加傾向が認められた。そこで、妊娠期低栄養で、授乳期母ラットにレスベラトールを投与した群を作製し、同様な実験を行ったところ、対照群と同レベルのAMPKやSIRT1量が認められた。すなわち、妊娠期低栄養で惹起される仔ラットのエネルギー代謝活性の変動を母ラットに対するレスベラトール投与が改善効果を示すことが示唆された。さらに、妊娠期低栄養で飼育された仔ラットは、成熟後において、脂質合成に関連する転写因子が変動しており、脂質合成系の制御がうまく働いていない可能性が示唆され、脂質合成制御系の検討も同時に進めることになった。妊娠期の低栄養が仔ラットの成熟後のエネルギー代謝異常を引き起こしていること、授乳期のポリフェノール投与が仔ラットのエネルギー代謝を正常に戻すことが明らかになった。これらの知見は、妊娠期低栄養の可能性が高い発展途上国の子供の代謝改善に授乳期の母親のポリフェノール摂取が有効に働く可能性を示唆したものであり、大変興味深い。また、糖代謝に関連するAMPK, SIRT1mTORなどの変動を指標とした、糖代謝改善に効果的なポリフェノールおよびポリフェノール類似代謝物質の培養細胞を用いた選別を進めており、当初の予定通り研究は進んでいる。バングラデシュ等の発展途上国では、低栄養に依存した妊娠2型糖尿病などにより母子の健康に重篤な障害がもたらされている。カテキンなどの植物由来ポリフェノール類やポリフェノール類似機能性物質の摂取はこれらの糖代謝や脂質代謝異常症を改善する有効な手段となることを示唆する報告が見られるが、その機序については不明である。本研究では、上記健康障害予防なために、植物および菌類由来のポリフェノール類等に着目し、妊娠期栄養異常による母子の糖や脂質代謝異常について詳細に検討し、その改善にこれらのポルフェノール等の有効性およびその作用機序を明らかにすることを目的とする。本年度は、妊娠期低栄養で飼育された仔ラットの成熟後の脂質代謝について詳細な検討を行った。その結果、成熟後の仔ラットの肝臓中の脂肪酸合成が抑制されていることが明らかになった。その機序として脂肪酸合成酵素群の発現が低下していることが明らかになった。さらに、脂質代謝異常に対するポリフェノール摂取の効果を検討するために、妊娠期低栄養で、授乳期にレスベラトールを投与した母ラットから生まれた仔ラットの脂肪酸合成について検討したところ、肝臓中の脂肪酸合成酵素群の発現が対照群と同程度に回復したことから、授乳中の母親のレスベラトール摂取が仔ラットの脂質代謝改善に効果があることが明らかになった。さらに、ポリフェノールが糖尿病の代謝改善に有効かどうかの検討のために、1型糖尿病のモデルラットを作製し、カテキンが豊富に含まれる緑茶抽出物を摂取させた。

その結果、1型糖尿病を発症したラットは、対照群に比較して酸化ストレスマーカーが有意に上昇するが、緑茶抽出物の摂取がそれを抑制することが明らかになった。授乳期のポリフェノール摂取が妊娠期低栄養による仔の脂質代謝異常を改善できることが示されたこと、さらに、ポリフェノール摂取が糖尿病発症動物の酸化ストレスの増加を抑制することが示されたことは、本研究の目的に沿った結果が得られている。さらに、酸化ストレスに対するポリフェノール等の作用機序を明らかにするために、細胞実験で、金属暴露によって誘導される酸化ストレスによる細胞死に対するポリフェノールの効果について詳細な検討も進んでいる。本研究では、これまでの研究から糖代謝・脂質代謝異常に対して効果のある緑茶抽出物を用いた。母ラットの妊娠および授乳期における高脂肪食摂取および授乳期における緑茶抽出物の摂取が、雄性仔ラットにおける脂質代謝に及ぼす影響とその機序を明らかにすることを目的とした。母ラットの妊娠・授乳期間中に高脂肪食を与え、離乳後の雄性仔ラットを51週齢まで高脂肪食で飼育した群をFFF群、FFF群と同様な食事に加え授乳期に緑茶抽出物を与えた群をFGF群、すべて通常食を与えた群をCCC群とした。CCC群と比較して、FFF群において精巣上体脂肪量、腎周囲脂肪量、肝臓中TG量及びTGの合成酵素であるDGAT1量が有意に高く、脂肪酸合成の律速酵素FAS量が有意に低下していた。一方、血中TG量は有意に低下していた。肝臓のTGを血中へ運搬を担うMTTP量は低下傾向を示した。次にFFF群と比較して、FGF群においてDGAT1量は有意に低下した。また、肝臓中TG量は低下傾向を示した。さらに、血中TG量と腎周囲脂肪量、肝臓中MTTP量は有意に高かった。次に、Caco-2細胞におけるヒ素誘導毒性に対して、Alpha Lipoic Acid(ALA)の有意な細胞保護効果について検討した。ALAによる細胞の抗酸化防御の強化は、Caco-2細胞における金属誘発性の細胞負荷を取り除くための重要な方法であり得る。しかし、Nrf2-AREシグナル伝達経路を介した還元型GSHの再生は抗酸化防御法に関与している可能性がある。続いて、ALA誘導による細胞死の減少は、ミトコンドリア経路によるアポトーシスの減少に起因し得る。ALAはCaco-2細胞における金属誘発性細胞損傷に対して保護的役割を果たすと結論付けることができる。したがって、ALAは糖尿病、肥満、高血圧などの他のストレスを抑える可能性がある。前述のように妊娠期の低栄養が仔ラットの成熟後のエネルギー代謝異常を引き起こしていること、授乳期のポリフェノール投与が仔ラットのエネルギー代謝を正常に戻すことが明らかになった。そこで、妊娠期低栄養がどの様な機構でエネルギー代謝異常を引き起こすのか、また、母ラットへのポリフェノールの投与がどの様な機構で代謝改善するのかを明らかにしていく予定である。また妊娠期の栄養過剰による仔ラットの糖代謝、脂質代謝、エネルギー代謝の変動とポリフェノールの効果についても研究を進めていく。