hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
上皮間葉系移行を標的とした脈絡膜悪性腫瘍の浸潤・転移抑制治療の開発

腫瘍細胞の組織内への浸潤や遠隔転移には、腫瘍細胞の上皮ー間葉系移行(EMT)が関与する。EMTにはしてトランスフォーミング成長因子ベータ(TGFβ)が関与する。培養実験では細胞をTGFβ1(1 ng/ml)で処理すると、各種シグナル伝達の中でもSmad2/3とp38のリン酸化の亢進が著明であった。細胞質と一部核に検出された。EMTマーカー検索ではビメンチンとI型コラーゲンの発現増強が検出された。TGFβで細胞が死滅する事は無かった。B16細胞は、TGFβ1で部分的なEMTを起こすと言える。TGFβに関連するシグナル伝達の制御による浸潤,転移抑制をターゲットとした患者予後改善効果が期待できる。脈絡膜悪性黒色腫症例の摘出眼球は6症例となり、増加した分の症例でパラフィン切片で免疫蛍光染色を行った。使用した一次抗体は、Eカドヘリン、ビメンチン(共にSanta Cruz社)、ファイブロネクチン、IV型コラーゲン、PCNA(共にSouthern Biotechnology社)、ラミニン(Sigma社)、リン酸化Smad2(Cell Signaling社)であった。脈絡膜悪性黒色腫標本で、腫瘍内で比較的分化度の高い領域と紡錘型に伸張した細胞が増殖している比較的未分化な細胞の領域が判別できる標本が4症例であった。1例の脈絡膜悪性黒色腫では、分化型の細胞の集族からなる組織像、1例では、約80%が無色素性の細胞の集族を呈した。分化度の低い部分(細胞が伸張している領域)では、高い領域と比較して、細胞内のビメンチン、細胞間のファイブロネクチンの染色が強い傾向であった。IV型コラーゲンは正常組織の血管や基底膜領域の染色が観察されたが、腫瘍内では、細血管と思われる部分に染色が観察された。分化度の低い胞が繊維芽細胞様の領域に血管様構造が多いようであった。同様にpSmad2とPCNAも共に分化度の低い細胞が繊維芽細胞様の領域で腫瘍細胞の核に一部、染色性を認めた。インテグリンあるいは各種細胞外マトリックス添加群、非添加群の遠沈培養液から増殖に関与する種々のサイトカインのタンパク量をELISAで測定する。両遠沈培養液を一定期間の培養後,細胞の血管新生、リンパ管形成に関与するサイトカインのmRNAを細胞から、タンパクを上清で検討し。さらに上清を添加した血管内皮細胞培養で形成された管腔をCD31の染色により評価した結果、血管新生の亢進がみられ,インテグリンや細胞外マトリックスによるリンパ管形成の影響を免疫染色で陽生所見が得られた。脈絡膜悪性黒色腫症例の摘出眼は6症例である。パラフィン切片で免疫蛍光染色を行っている。今回追加した症例も含めてβ-cateninの一次抗体を使用した。腫瘍の発生過程にはTGF-β/Smad系が関与しているが、それとクロストークすると考えられるWnt/β-catenin系の発現を検索した。Wnt/β-カテニン経路は、脊椎動物と無脊椎動物の発生における細胞の運命の決定を調節する。Wnt/β-カテニン経路は、多くの異なる型の細胞や組織において、レチノイン酸、FGF、TGF-β、及びBMPなどの他の多くの経路からのシグナルを集約しているもので、その検討が腫瘍発生に関係する。すべての症例においてβ-cateninの発現が認められた。このことによりβ-cateninが腫瘍発生に関与することが示唆され、今後の腫瘍の発生や治療方針を予測する有用な分子マーカーになると考えられた。β-cateninの器官形成に関する影響を検討する目的にて、βcatenin遺伝子exon領域floxマウスを利用して検討を行った。方法として、それぞれのマウスを交配させることにより胎児での検討を13.5日15.5日17.5日の眼および眼瞼の組織切片を組織学的および免疫組織学的に検討した。胎生15.5に以降でβ-catenin免疫染色陽性の腫瘍様結節形成や細胞の分裂亢進を認めた。このことにより細胞の異型性もしくは癌化にβ-cateninが関与することが示唆された。今回、ヌードマウスに発生した眼腫瘍モデルの組織学的検討も行い、細胞外マトリックス(オステオポンチン、テネイシンC,X、フィブロネクチン、インテグリンなど)、増殖系シグナルのマーカー(Erk-1及びBrdU)陽性所見が認められた。また、腫瘍の切片上でRT-PCR反応を行い,標的分子を増幅した後,ジゴキシゲニンを標識した相補的プローブの取り込み量を免疫染色で発色して、腫瘍組織内に発現した。脈絡膜悪性黒色腫4症例の摘出眼球のパラフィン切片で免疫蛍光染色を行った。脈絡膜悪性黒色腫標本で、腫瘍内で比較的分化度の高い領域と紡錘型に伸張した細胞が増殖している比較的未分化な細胞の領域が判別できる標本が2症例であった。

分化度の低い部分(細胞が伸張している領域)では、高い領域と比較して、細胞内のビメンチン、細胞間のファイブロネクチンの染色が強い傾向であった。IV型コラーゲンは正常組織の血管や基底膜領域の染色が観察されたが、腫瘍内では、細血管と思われる部分に染色が観察された。分化度の低い細胞が繊維芽細胞様の領域に血管様構造が多いようであった。同様にpSmad2とPCNAも共に分化度の低い細胞が繊維芽細胞様の領域で腫瘍細胞の核に一部、染色性を認めた。網膜剥離下に散布されている円形の黒色細胞(腫瘍細胞と思われる)はビメンチンに染色されなかったルミカン、オステオポンチン、テネイシンノックアウトおよびワイルドタイプマウスの皮膚下に悪性黒色腫の培養細胞を移植する。皮膚下に作製した腫瘍径を計測し経時的変化を観察する。腫瘍と周辺の組織を摘出し、パラフィン切片を作成し、免疫組織組織学的検討を行う。抗体は、細胞外マトリックス(オステオポンチン、テネイシンC,X、、フィブロネクチン、インテグリンなど)、増殖系シグナルのマーカー(Erk-1及びBrdU)および各種サイトカイン(TGFーβ、Smad2,3,4,7、pSmad3C, 3L, 2Cなど)を用いる。血管形成に対する影響は、抗CD31抗体で評価した。その結果、皮膚に現れた腫瘍は平均5mmと増大傾向をしめしていた。また、すべての症例において上皮間葉系移行がおこっていたので、腫瘍の組織に陽性所見を示していた。それと、腫瘍の免疫染色にて上皮細胞と考えられる部位にS100陽性所見を認め、細胞質内にHMB45陽性所見をみとめており、また抗Melan抗体も陽性所見みとめたために、これらの腫瘍は悪性黒色腫であると同定できた。抗CD31抗体を用いて血管内皮細胞を検出したところ腫瘍組織中の新生血管の著明な減少が見られた。腫瘍からtotal RNAを抽出し、real-time RT-PCRで各種遺伝子発現について成長因子関連を中心に検討する。発現パターンに変化が検出されたRNAについては、ジゴキシゲニンを使用したin situハイブリダイゼイションで組織内の発現パターンを評価する。その結果、Eカドヘリンの発現が抑制していると考えられ、上皮間葉転換を惹起するSnailの発現は抑制、間葉系のマーカーであるslpja-smooth-muscle actinの発現は低下していた。今回の追加の悪性黒色腫のB16悪性黒色腫細胞株をコンフルエントに培養し、以下の細胞の検討を行った。B16悪性黒色腫細胞株は網目状に増殖した。トランスフォーミング成長因子ベータ(1 ng/ml)添加の無い状態では有意なリン酸化Smad2とリン酸化p38は検出されなかった。トランスフォーミング成長因子ベータ(1 ng/ml)添加後、30分,60分、120分でのシグナル伝達の活性化を検討した。Smad2とp38のリン酸化が促進されたが、JNKとErkのリン酸化の亢進は観察されなかった。DAB発色免疫組織化学的にリン酸化Smad2とリン酸化p38は,主に細胞質に,一部細胞核に検出された。トランスフォーミング成長因子ベータ(1 ng/ml)に48時間暴露したB16悪性黒色腫細胞株ではビメンチンとI型コラーゲンの発現が増強したが、アルファ平滑筋アクチンの発現誘導は観察されなかった。ファイブロネクチンの発現亢進は観察されなかった。
バングラデシュの沖積平野におけるヒ素汚染地下水形成機構の解明

ガンジス・ブラマプトラ・メグナデルタにおけるヒ素含有地下水の形成機構について,多くの調査から種々の溶出機構が示され,現在もなお議論が行われている.本研究では,この形成メカニズム解明のため,地下水の地球化学的特性把握と帯水層構造調査を行った.ダッカ20km東方地域で,沖積低地・台地縁辺部230箇所井戸での雨季末期・乾季末期の地下水採水調査,試錐による地層試料採取・帯水層分布確認・透水性把握・地下水位観測,三次元帯水層モデルによる地下水流動シミュレーションを実施した.その結果,完新統砂層からなる埋没された谷・放棄流路構造を伴う帯水層中に島状にヒ素を含む地下水と含まない地下水の出現する地域が近接して現れ,塩化物イオン濃度が低い地下水ほどアンモニウムイオン・全鉄イオン・総ヒ素濃度が高く,井戸のケーシングパイプに沿って,あるいは井戸周辺で表層水が垂直方向に浸透する流れが局所的にあることが明らかとなった.地下水シミュレーションの結果,雨季-乾季の水位変動上部帯水層のうち埋没谷を充填する部分は,雨季乾季の季節変動にほとんど影響を受けず停滞状況にあることが確認された.連続コアの分析から,ヒ素の濃度と雲母の出現頻度に良い相関が見られた.形態別分析により,堆積物中のヒ素の形態は大部分が有機態と難溶態であるが,堆積物はほとんどイオウを含まないため,難溶態ヒ素は大部分がケイ酸塩であると推定された.全岩化学分析値から,ヒ素濃度と鉄・アルミニウム濃度には良い正の相関が見られ,ヒ素を含む一次物質は黒雲母であると強く示唆される.以上を総合すると,ヒ素含有地下水の形成は,浸透する地下水による黒雲母の分解(化学的風化作用)により生じ,その分布は帯水層構造によって生じる停滞と井戸周辺の水利用に伴う流動が大きな要因となっていると説明できる.このようなヒ素汚染地下水形成機構に関する説明は,全く新しいものである.ガンジス・ブラマプトラ・メグナデルタにおけるヒ素含有地下水の形成機構について,多くの調査から種々の溶出機構が示され,現在もなお議論が行われている.本研究では,この形成メカニズム解明のため,地下水の地球化学的特性把握と帯水層構造調査を行った.ダッカ20km東方地域で,沖積低地・台地縁辺部230箇所井戸での雨季末期・乾季末期の地下水採水調査,試錐による地層試料採取・帯水層分布確認・透水性把握・地下水位観測,三次元帯水層モデルによる地下水流動シミュレーションを実施した.その結果,完新統砂層からなる埋没された谷・放棄流路構造を伴う帯水層中に島状にヒ素を含む地下水と含まない地下水の出現する地域が近接して現れ,塩化物イオン濃度が低い地下水ほどアンモニウムイオン・全鉄イオン・総ヒ素濃度が高く,井戸のケーシングパイプに沿って,あるいは井戸周辺で表層水が垂直方向に浸透する流れが局所的にあることが明らかとなった.地下水シミュレーションの結果,雨季-乾季の水位変動上部帯水層のうち埋没谷を充填する部分は,雨季乾季の季節変動にほとんど影響を受けず停滞状況にあることが確認された.連続コアの分析から,ヒ素の濃度と雲母の出現頻度に良い相関が見られた.形態別分析により,堆積物中のヒ素の形態は大部分が有機態と難溶態であるが,堆積物はほとんどイオウを含まないため,難溶態ヒ素は大部分がケイ酸塩であると推定された.全岩化学分析値から,ヒ素濃度と鉄・アルミニウム濃度には良い正の相関が見られ,ヒ素を含む一次物質は黒雲母であると強く示唆される.以上を総合すると,ヒ素含有地下水の形成は,浸透する地下水による黒雲母の分解(化学的風化作用)により生じ,その分布は帯水層構造によって生じる停滞と井戸周辺の水利用に伴う流動が大きな要因となっていると説明できる.このようなヒ素汚染地下水形成機構に関する説明は,全く新しいものである.本研究は,世界最大のヒ素汚染地下水出現地であるベンガルデルタのヒ素溶出過程を明らかにするために,沖積層と洪積層の2つの深度で帯水層が見られる地域での掘削を中心に計画した。本年度はこの掘削地点を選定するための予備調査に当てられた。現地共同枡究者であるダッカ大学のDr.Kazi Matin Ahmedの助言を受けて,ダッカの南東約30kmにあるジョナルガオを調査対象地域とした。2km×2km地域で230あまりの民家の井戸から雨季(910月)と乾季(23月)の2度,地下水を採取した。雨季には,酸化還元電位(-30+20mVが多い)が低い地下水から数百2000ppmの亜ヒ酸が検出された。また,亜ヒ酸濃度の高い試料はアンモニウム濃度が高かった。酸素の同位体比は-2-8‰(SMOW)であったが,亜ヒ酸濃度が高い地下水の酸素同位体比は-3-4‰に集中していだた。乾季の試料は現在分析中で詳しいことはわからないが,亜ヒ酸は還元的な地下水ほど高濃度であることが期待されるので,乾季は雨季よりも亜ヒ酸濃度の変動が大きいと予想される。これらのことから,堆積物から地下水中へのヒ素の溶出は雨季から乾季への移行期に活発になると考えられる。また,雨季の調査では板たたき法による地震波探査,乾季には電気探査を行い,沖積層と洪積層の境界の深度を推定した。

調査地域西側から東側に向かって境界は深くなり,亜ヒ酸濃度が高い地域が集中する旧ブラマプトラ川の東側氾濫原にあたる地域では6070mと推定された。2度の調査の結果と,掘削装置の搬入経路などを考慮し,最も高濃度のヒ素汚染が見られる2つの集落で2004年1112月にかけて掘削を行うこととし,地元住民と掘削業者との折衝を行った。バングラデシュにおける沖積平野では,ヒ素含有地下水が広く分布している.今年度は,この形成メカニズム解明のため,ショナルガオ北部のファテプール・ダリカンディでのコアボーリングとその周辺地域での7本のパーカッション式掘削調査によって,この地域の帯水層構造の把握とその特性について検討した.掘削調査の結果,以下のような帯水層構造が明らかとなった.沖積平野の表層部には青灰色の細-中粒砂が2050mの厚さで広く分布し,完新統に対比され,河川環境で形成された堆積物とみられる.また,この砂層には黒雲母を多く含んでいる.その下位には,灰色の粘土-シルト層が420mの厚さで地表下2445m深の間に広く分布している.この粘土層中には藍鉄鉱や植物片が含まれていて,淡水域の還元的な湖あるいは沼に堆積した地層であるとみられる.これらの完新統の下位には茶褐色の砂と灰色の粘土-シルトの互層が広く存在する.調査地域の西部に位置する台地部にはこの互層が直接露出している.砂層の赤色度は最上部で最も強く,下位へ向けて徐々に弱くなる.従って,この赤色化は,最終氷期に浸食された旧地表面からの表層風化によるものとみられる.帯水層構造としては,最上部帯水層として完新統の細-中粒砂層が位置づけられ,還元環境下にある.下部帯水層とこの最上部帯水層は厚さ約10mの淡水成粘土層によって明確に区分される.下部帯水層は更新統の粗-中粒砂層から構成され,酸化環境下にある.この砂層が調査地域西部の台地に直接露出することから,下部帯水層の地下水は天水の涵養を台地側から直接受ける状況にある.この帯水層構造はヒ素含有地下水の形成に地質的背景として寄与しているものとみられる.2003-2004年度バングラデシュ・ショナルガオ地域で地下水採取調査およびボーリングによる地層試料採取を行い,本年度は続けて水質分析,地層中のヒ素濃度分析を進めた.その結果,調査地域の帯水層構造としては,約30m深までは完新統の細粒中粒砂層を主とする不圧地下水帯水層,その下位3040m深は粘土層,40m深以下は中粒粗粒砂層から構成され40m以深が被圧帯水層である.完新統の不圧帯水層は,還元的であり,20m深前後の井戸の地下水中のヒ素濃度は数10数100ppbと高い.中部の粘土層は,藍鉄鉱を含むことから,還元環境下で堆積した淡水成層である.粘土層からの3試料の^<14>C年代はいずれも50kaを上回り,後期更新世以前の堆積物となる.40m深以下の砂層最上部は褐色を呈し,強い酸化を受けている.それは下位に向けて弱くなること,砂礫層上面は浸食した谷地形呈することから,強いラテライト化作用を被った地層であると判った.この被圧帯水層の地下水は酸化的で,ヒ素を含まない.上部の不圧帯水層にはNH_4イオンがヒ素濃度と正の相関を持つ.その窒素同位体比は周辺地域で使用されている窒素肥料のそれと同様の値を示していることから,施肥過多の傾向も還元環境を助長する要因とみられる.調査地域の地下帯水層構造を明らかにするため,簡易ボーリング掘削を3地点で行った.この現地調査によって,調査地域の地層分布が明確になってきている.さらに,昨年度掘削し,帯水層毎に設置した観測井戸を用いて,揚水試験を実施した.その結果,上部帯水層は7.4×10^<-3>2.6×10^<-2>(cm/sec),下部帯水層は1.6×10^
リスク計量化における多変量極値理論と従属性の研究

金融におけるリスクを定量的に捉えるリスク計測手法の開発は重要な課題である。従来から用いられているバリュー・アット・リスクの欠点を解決する,新しい歪みリスク尺度から成る1パラメータ族を提案し,それが望ましい性質をもつことを示した。そして,データからその値を推定する統計的・数値的手法や,そのリスク尺度を用いたポートフォリオの最適化や資本配分を検討した。さらに,接合分布関数を用いたリスク相互依存性のモデルとの関連についても考察した。本年度の研究では,金融面での定量的な分析の1つとして,現代リスク管理での重要課題であるリスクの計量化の理論的な側面に取り組んだ.リスクの計量化の本質は,過去のデータ及び特定化された確率モデルに基づき,損益を表す確率変数の分布,あるいはその特性値を定めることにある.このために,金融機関が保有する様々なポジションを総計して,そのリスクを1つの数字で表すリスク尺度の概念が必要となる.本研究では,そうしたリスク尺度としてよく用いられているバリュー・アット・リスク及び期待ショートフォールに代わって,それらの欠点を補うリスク尺度を提案し,その推定方法を論じた.より具体的には,Artzner etal.(1999)によるリスク尺度の整合性,さらには楠岡による法則不変性や共単調加法性などを条件として課し,さらに期待ショートフォールとの比較可能性の条件を加えて,歪みリスク尺度の1パラメータ族を導いた.そして,確率順序に関連してその性質を調べ,さらに独立同一分布データが得られたときの推定力法についてその推定量を定め,MATLABを用いて実際に計算を行った.理論的な結果としては,推定量の漸近的な振る舞いも検討した.さらに,正規分布とt分布の場合について,バリュー・アット・リスク,期待ショートフォールとの数値的な比較を行った.さらに,推定問題については,金融データについて独立同一分布の仮定が疑わしい場合も多いことから,時系列データに基づく推定量の理論的な性質を考察し,その結果の一部は3月のシンポジウムで報告した.理論面では,リスク尺度の多期間版について,これまで提案されている様々な拡張について検討し,それらの実用化に向けて研究を進めている.これは,経済学での不確実性の下での動学的選択理論とも関連しているため,現在その分野の知識獲得へ向けて努力中である.関連した仕事としては,現在A.J.Mcneil, R.Frey & P.Embrechts著の書物"QuantitativeRisk Management : Concepts, Techniques AndTools"の邦訳に訳者代表として取り組んでおり,2007年中には共立出版から訳書が出版される予定である.この本を通読することにより,現代の定量的リスク管理手法について深く理解することができた.まず,リスク尺度として標準的となっているバリュー・アット・リスク(VaR),そして期待ショートフォールを特殊例として含む,歪みリスク尺度と呼ばれるクラスの1パラメータ族に関する計量経済学の見地から分析するために,まず正規分布とt分布に加えて,一般化パレート分布に対してリスク尺度の数値の比較を行い,裾の重い分布に対しては比例オッズ・リスク尺度がVaRと期待ショートフォールの問の値をとることが確認された.また,従属性のある時系列データに基づく推定量の漸近理論的な性質を考察し,MATLABを用いてシミュレーションを行い,ここでも比例オッズ・リスク尺度が統計的扱いやすさを有していることがわかった.これらの結果については,2007年8月2日に開催されたJAFEE(日本金融・証券計量・工学学会)の夏季大会,および11月14日に東京大学大学院数理科学研究科で開かれた統計数学セミナーで中間報告的な発表を行った.さらに,2008年3月21日にキャンパスプラザ東京で開催された第8回立命館国際シンポジウム"確率過程論と数理ファイナンスへの応用"においてもその後得られた結果を追加して研究発表を行った.様々なリスクの従属性を分析するための鍵である接合関数(コピュラ)については,2005年に応用統計学会の雑誌に掲載された論文に大幅に加筆・修正を施した概説論文を執筆し,2008年3月1日に成城大学で開かれた日本統計学会春季集会で発表を行った.さらに,米国ポートランドのLewis&Clark Collegeに赴き,接合関数の専門家であるRoger Nelsen教授と意見を交換した.歪みリスク尺度に対して,従属性のある時系列データに基づく推定量(L統計量)の漸近的な統計的性質を厳密・詳細に分析した結果,定常かつ強ミキシング性の下で大数の法則や中心極限定理が成り立つための条件を明確に述べることに成功した.それらはこれまでの研究で得られているものを若干改善した結果となっている.さらに,ファイナンスデータに良く適合するとされるGARCHモデルを用いてシミュレーションを行い,この場合には理論的に得られた漸近正規性がある程度の標本数で実現されていることやここでも比例オッズ・リスク尺度が統計的扱いやすさを有していることが示された.

これらの結果については,本年度に国内外のいくつかの研究集会において発表した.様々なリスクの従属性を分析するための鍵である接合関数(コピュラ)については,以前の論文に大幅に加筆・修正を施した概説論文を執筆し(文献の項参照),2008年3月に成城大学で開かれた日本統計学会春季集会で発表を行い,2008年8月に論文集「21世紀の統計科学III:数理・計算の統計科学」(北川源四郎・竹村彰通編,東京大学出版会)に所収された.これに関連して,当研究課題とは少し話題がずれるが,生存解析の分野での接合関数の応用および漸近理論について,以前からの研究をまとめた論文が完成しつつある.
モンテカルロ線量計算法を用いた強度変調放射線治療QAシステムの開発

Monte Carlo(MC)線量計算が可能な28-CPUを搭載したLinux Clusterシステムである、MCRTV(Monte Carlo for Radiotherapy Treatment Plan Verification)を開発した。モンテカルロ計算モデルは、直線加速器(Varian 2300/CD)の加速器ヘッド、マルチリーフコリメータ(Varian社Mark II 80-leaf system)および患者/ファントムのそれぞれについてEGS4/PRESTA MCコードを用いて独自に構築した。さらに、dynamic multileaf collomater(DMLC)IMRTによるマルチリーフコリメータ連続運動下での線量計算にも対応させた。これにより、IMRTのQAにおける臨床使用が可能な仕様とした。線量計算は、並列処理に独自の工夫を加えることによりQA目的の日常臨床使用に耐えうる計算速度を達成できた。電離箱による線量測定との比較による線量計算精度の検証では、MCRTVによる計算結果は、均質・不均質の2つの条件下でそれぞれ1%、2%以内と精度良く一致していた。また、最終目的であるDMLC法による強度変調放射線治療(IMRT)照射線量をMCRTVで計算した結果、すべての検討条件下において1%未満の誤差で電離箱を用いた実測値と一致した。また、5門のDMLC-IMRTによる前立腺IMRT臨床プランの検討では、実測値との差は概ね2%以内と良好であった。また、将来の4次元線量計算システムへの拡張に備えた付随研究として、前立腺IMRTプランにおけるシステマティックエラーの影響を含めて線量評価方法の考案と、IMRTにおける各種治療関連エラーの線量分布に与える影響を実測にて検証可能な四次元動体ファントムシステムの開発と精度検証を行った。本研究では、IMRT治療計画において大きな問題でありかつ実際の臨床現場において多大な労力が費やされている線量分布の品質保証(Quality assurance : QA)問題を解決しIMRTのさらなる臨床応用を促進するために、高速かつ高精度でIMRT線量分布計算が可能なシステムを開発することを目的としている。具体的には、独自にモンテカルロ計算プログラムの開発とその精度検証、PCクラスターシステムへのインストールを行い、日常臨床への使用可能なシステムの開発を目指している。平成17年度は、(1)直線加速器ヘッド部分のモンテカルロ線量計算モデルの開発(2)マルチリーフコリメータ部分のモンテカルロ線量計算モデルの開発(3)代表的照射野における直線加速器からの照射線量の測定及び(4)PCクラスタシステムのソフトウェア環境の構築を行った。(1)ヘッド部分のモデル開発を完了し、モデルの最適化・精度検証を行うため(3)の線量測定結果をフィードバックしつつパラメータの調整中である。(2)マルチリーフコリメータのモデル開発を完了した。(3)(1)の精度検証に必要な全データの線量測定を完了した。(2)のデータ測定については,一部未実施である。(4)今回,線量計算用に導入したPCクラスタシステム(Appro Hyper Blade System, BESTSYSTEMS社製)の立ち上げ,及びモンテカルロ計算システムのインストールを完了した。1.直線加器ヘッド部分のモンテカルロ線量計モデルの最適化・精度検証前年度に開発した15MV X線ビーム(京都大学でIMRTに主に使用)モデルについて,測定データをフィードバックしつつ最適化及び精度検証を行った.その結果,測定データと1%以内の誤差と十分な精度で一致するモデルを得ることができた.2.マルチリーフコリメータ(MLC)部分のモンテカルロ線量計算モデルの最適化・精度検証前年度までに開発した80-leaf MLCモデルについて,1.で最適化したビームモデルを用いて調整・精度検証を行うことにより,十分な精度を得た.京都大学で臨床適用しているIMRTの照射法であるDMLC法のための計算モデルは,80-leaf MICに関して2.で構築したモデルをベースに完成させた.

4.PCクラスタシステムを用いた並列処理による計算高速化前年度に環境整備を行ったPCクラスタシステムでの並列処理は,各種計算コードの実装を完了した.さらに,クラスタに実装した計算アルゴリズムの精度検証を行い,日常臨床の精度検証(QA)に応用する上で精度が十分であること確認した.また,臨床使用に際して問題となる計算時間については,クラスタを応用することで,臨床的に十分な速度を達成できた.加えて、将来モンテカルロ線量計算をIMRTの最適化に応用すべく、最適化アルゴリズムの違いがIMRT治療計画に及ぼす影響について検討を行なった。MCRTVでは、直線加速器(Varian 2300/CD)の加速器ヘッド、マルチリーフコリメータ(MLC:Mark II 80-leaf system)、および患者/ファントムの計算モデルをEGS4/PRESTA MCコードを用いて独自に構築した。MCRTVの本体は28-CPUを搭載したLinux Clusterシステムからなり、線量計算を高速で行うことが可能である。また、MCRTVは、DICOMフォーマットへ市販の治療計画装置(Varian: Eclipse)からMC計算に必要なデータをインポート可能な設計としている。電離箱による線量測定との比較による線量計算精度の検証では、MCRTVによる計算結果は、均質・不均質の2つの条件下でそれぞれ1%、2%以内と精度良く一致していた。また、最終目的であるDMLC法による強度変調放射線治療(IMRT)照射線量をMCRTVで計算した結果、すべての検討条件下において1%未満の誤差で電離箱を用いた実測値と一致した。また、5門のDMLC-IMRTによる前立腺IMRT臨床プランの検討では、実測値との差は概ね2%以内と良好であった。また、将来の4次元線量計算システムへの拡張に備えた発展研究として、前立腺IMRTプランにおけるシステマティックエラーの影響を検証する方法を考案するとともに、4次元動体ファントムシステムを開発しその精度検証を行った。
ヒートシンク型ダイヤモンドバイトによる乾式・超精密切削の基礎研究

バイトのシャンク表面に作成したNi-Pメッキに含まれる微粒ダイヤモンドは約4wt% (6.6Vol%)と少ないので、メッキ層の熱伝導率はヒートシンク層として十分でないことが分かった。湿式切削での切削抵抗は安定した値を示すが,乾式切削における切削抵抗は安定しない。これは切削熱による膨張にもとづき、真の切込み量が変動することによるものと考えられる。乾式の場合のバイトの温度上昇は、湿式の場合の約3倍であった。バイトの磨耗による刃先後退量は極めて小さいが、バイトを切り込み方向にのみ切り込んで得た刃先の転写輪郭を表面粗さ計で測定し、その形状変化から求め得ることが分かった。湿式切削における加工面粗さは理論粗さにほぼ等しいが、乾式における粗さは理論値の数倍であった。採取した切りくずを観察したところ、切りくずの自由面側にはせん断変形によると考えられる層状組織が全面にわたって認められる。バイトすくい面と接した側の表面には切りくずの長手方向に、すくい面との擦過によると思われる明瞭な筋が多数認められる。またこの筋に沿って小さな穴が分布したり、切りくずが分離して幅の小さい切りくずが数多く見られることが分かった。乾式切削においては、超精密加工面にとって是非とも必要である鏡面が得られなかった。平成7年度は、バイトにメッキするヒートシンク層の熱的物性値の解析と切削時の各種測定方法について具体的に検討した。1)ヒートシンク層(単体)を作成し、光交流法により比熱・熱伝導率を計算した。また、多成分から成る混合体として、各成分の熱伝導率から平均熱伝導率を計算した。2)実験における粗さ測定とバイト研磨の容易さを考慮して、取付角度1°の直線刃バイトとした。3)切削抵抗・バイトシャンクの温度・刃先後退量・切削面粗さの測定法の詳細を確立した。また、切りくずの採取法と切りくずの観察法も確定した。4)湿式での切削抵抗は安定した値が得られる。乾式においては、切削サイクルによりまた時間的にも安定しない。これは真の切込み量が変動することによるものと考えられる。切削抵抗が安定している場合には、バイトの温度も切削時間とともにスムースに増加する。5)刃先後退量はバイトを切込み方向にのみ移動して得られる工作物へのバイト刃先の転写輪郭を表面粗さ計で測定し、その形状の変化から求められることが分かった。6)湿式では理論粗さにほぼ等しい加工面が得られるが、乾式では数倍の粗い面となった。7)切りくずの自由面側にはせん断による層状組織が存在する。すくい面と接する側には層状組織は認められず、切りくずの長手方向の擦過による筋が存在する。ダイヤモンドバイトのシャンク表面に薄い層のヒートシンク層を配置した有限要素モデルを作成し、この部分の物性値が種々異なる場合について温度解析を行った。シャンク内部はS45C鋼製である。ヒートシンク層に含まれる微粒ダイヤモンドは組成分析の結果約4wt%(6.6Vol%)と少ないので、数値計算で求めた熱伝導率はさほど大きくない。ヒートシンク層と同一成分の薄い試料について熱的物性値を測定したところ、やはり熱伝導が良くないことが分かった。切削抵抗は湿式の場合にはほぼ一定でその値が小さいのに比べ、乾式においてはその値が大きく且つかなり大きく変化することがある。これは切削熱にもとずく熱膨張により切り込み量が大きくなることによるものと考えられる。切りくずのすくい面側には、切削時にすくい面との擦過により生じたと考えられる引き目(切りくず長手方向の筋)が見られ、自由面側には微小厚さの層状のせん断変形が見られる。

湿式の場合に比べ、乾式切削の切りくずは連続せず、また切りくずの幅方向の中央部に不規則に穴が生じたり、この穴が連続して切りくずが縦方向に裂け、切りくず幅が小さいものが観察されることが多い。
量子ドットを用いた好中球自己抗体による血管内皮細胞傷害機構のイメージング解析

本研究は、MPO-ANCA関連急速進行性糸球体腎炎の発症における糸球体血管内皮細胞の役割について明らかにすることを目的とした。本研究の成果としては、1) MPO-ANCAによる糸球体血管内皮細胞の活性化に関わるターゲット分子を特定することに成功し、加えて活性化に伴う炎症性分子の発現を詳細に明らかにした。さらに、2)量子ドットをMPO-ANCAに結合させることに成功し、その生体内分布を明らかにするための基礎検討を行った。本年度は,マウス糸球体由来の初代血管内皮細胞培養細胞を用いてMyeroperoxidase(MPO)抗体標的分子の特定を中心に行い,さらに次年度のマウスモデルを用いたin vivo実験に利用できる条件を検討した。1.糸球体血管内皮細胞に発現するanti-MPO抗体のターゲット分子の特定Western Blottingを用いて糸球体血管内皮細胞に発現するanti-MPO抗体のターゲット分子を検出したところ,anti-MPO抗体特異的なバンドが3種類ほど確認できた。しかし,非特異的なバンドも多数見られるため,マススペクトロスコピーで解析するには至っていない。非特異的バンドを出来るだけ少なくするために,現在細胞膜フラクションを精製して免疫沈降を行っている。また,新たな知見として,anti-MPO抗体に反応しない培養内皮細胞を発見することが出来たため,これをネガティブコントロールとしたターゲット分子のスクリーニングを行う予定である。2.In vivoにおけるanti-MPO抗体による接着分子発現量上昇の確認Anti-MPO抗体を投与したC57BL/6マウスから腎臓,腎糸球体,肝臓,肺,胸部大動脈を摘出、調製し,それらの接着分子発現量を検討するため,cDNAを合成した。現在これらをRT-PCRを用いて解析中である。3.量子ドットのanti-MPO抗体へのタギングとこれを利用したイメージングの条件検討国立国際医療センター研究所との共同研究により,Anti-MPO抗体を量子ドットでタギングすることに成功し,これを用いて炎症性サイトカインで刺激した好中球のMPOの細胞膜への表出を検出することができた。さらに,この量子ドットラベルanti-MPO抗体をC57BL/6マウスに投与したところ,肺,脾臓,肝臓によく集積するものの,腎糸球体への集積も確認することができた。1.mGECにおけるanti-MPO抗体のターゲット分子に関する検討mGECのタンパク抽出液を二次元電気泳動で展開し、ウェスタンブロットによってanti-MPO抗体と反応する分子をCBB染色で検出し、単独のスポットを得た。PMF解析により、そのスポットタンパクをタンパクM(特許申請のためタンパク名は伏せる)と特定した。また、anti-MPO抗体と同様に、anti-M抗体でmGECを刺激した結果、有意なICAM-1発現の上昇が見られた。以上から、anti-MPO抗体がmGECのタンパクMに作用して細胞を活性化し、炎症を誘導する可能性が示唆された。このタンパクMに関する報告は世界的にも全くなく、新規マーカータンパクとして今後診断に応用可能であると考えられる。当該部分に関する論文投稿の準備を進めているが、タンパクMに関する特許申請の関係上、学会発表を含め、外部への発表は現段階では行っていない。2.QDを用いたanti-MPO抗体の生体内動態の解析Anti-MPO抗体をQDでタギングすることに成功し、これを用いて炎症性サイトカインで刺激した好中球のMPOの細胞膜への表出を検出することができた。さらに、この量子ドットラベルanti-MPO抗体をC57BL/6マウスに投与したところ、肺、脾臓、肝臓によく集積するものの、腎糸球体への集積も確認することができた。
国境・領土紛争の比較研究-ロシアとウクライナ、中国、日本-

現代世界においては、約160の国境・領土紛争がある(英ダーハム大学国際国境研究所)。各紛争は種々様々の原因によって発生し、状況も解決法(未解決の理由)も異なる。そのような相違点の故に安易な類推は禁物である。だが、その限界を弁えればある程度の比較は可能であるし、教訓も得られることがわかった。ロシアウクライナエリツィン前大統領は、1997年ウクライナにクリミア半島を割譲する決定を行い、ロシア議会も同決定を承認した。ロシアとクリミア半島との結びつきは、歴史、人口、軍事、心理のすべての側面で、ロシアと北方四島との結びつきとは比較しえないくらい密接である。では、なぜエリツィン政権はそのような大英断をなしたのか?ロシアの安全保障の観点から、その決断を下さねばならぬ「政策の緊迫性」(policy imperative)が存在する。つまり、そのような譲歩をしなければ、将来ウクライナがNATOに加盟し、ロシアが地政学的なバッファー・ゾーン(緩衝地帯)を喪うおそれがあると判断したからであった。ロシアと中国ゴルバチョフ、エリツィン両政権は、中国とのあいだでロシアの東部と西部で国境画定協定を結び、中国に多くの島嶋や領土を返還した。なぜか?ロシアは、今後の中国の台頭を懸念し、とくに中ロ国境地域における両国間の人口の伸びの差がロシアに不利に働くことを危惧したからである。ここでも「政策の緊迫性」が存在した。カリーニングラード問題と北方領土問題2004年までにポーランドやリトアニアのEU加盟が実現すれば、カリーニングラード地方はロシア本土から切り離された陸の孤島となる。そうなる前に、プーチン大統領は同地方に対するモスクワの政策形成に迫られよう。他方、日本との間の北方倭出紛争には、「政策の緊迫性」がない。もし「政策の緊迫性」が発生するときには、同紛争が急転直下解決へ働きだすとも予想される。1.研究の経過:本学年度は、主としてロシアと中国との間の国境画定交渉の研究に専念した。まず、1988年7月、99年9月における計2回にわたる中ロ国境地帯への調査旅行の折の日記、インタビュー、蒐集資料を丹念に読み返した。次に、それと先行研究者や類似のテーマを研究している人々の調査・分析と比較する作業をおこなった。2001年1月における北大スラブ研究センターでの岩下明裕助教授との討論も有益だった。同助教授は、私が現場調査旅行をおこないえなかった12の中ロ国境地点へも足を踏み入れている世界でも稀な研究者である。2.研究上の検討点:専門家のなかで見解の相違があり、私も未だ確信をもちえないのは、次の2点である。(1)中ロ国境交渉は、果たして何%くらい解決され、逆にまだ何%未解決なのか?ボリショイ・ウスリースキー島、タラバオフ島、アルグン川のボリショイ島-これら3つが棚上げとなっていることは、周知の事実である。その結果、中ロ国境紛争の97%(中国の石〓)、9899%(ロシアのA・プシコフ氏)、100%(ロシアのステグニー氏)が解決されたとみる見方の他に、同紛争の重要部分は棚上げされたままという見方がある(米のローズマン氏)。(2)ロシア連邦の沿海地方やハバロフスク地方の知事たちが、当初中国に多くの島嶼を割譲することに猛烈に反対したにもかかわらず、結局モスクワと北京の中央政府の決定に従うこととなった理由。3.日ロ間の北方領土紛争への教訓:中ロ間での国境線画定を日ロ間のそれに自動的に適用させる試みは、間違いを犯す。だが、次の三点は、参考に供しよう。(1)国境紛争は、国際法の原則に仕上がって解決されるべきこと。(2)国境画定交渉の成功が、当該国家関係全般の改善と関連していること。(3)経済的要素が政治・外交交渉に与える影響の正確な測定の必要。(4)地元の反対の過小評価ならびに過大評価の戒め。4.次年度の計画:次年度はロシア-ウクライナ間及びロシア-ドイツ間のカリーニングラード問題を検討する予定。なぜか?

ロシアは、今後の中国の台頭を懸念し、とくに中ロ国境地域における両国間の人口の伸びの差がロシアに不利に働くことを危惧したからである。ここでも「政策の緊迫性」が存在した。カリーニングラード問題と北方領土問題2004年までにポーランドやリトアニアのEU加盟が実現すれば、カリーニングラード地方はロシア本土から切り離された陸の孤島となる。そうなる前に、プーチン大統領は同地方に対するモスクワの政策形成に迫られよう。他方、日本との間の北方倭出紛争には、「政策の緊迫性」がない。もし「政策の緊迫性」が発生するときには、同紛争が急転直下解決へ働きだすとも予想される。当学年度は主として、ロシアによるウクライナへのクリミア半島の正式割譲についての研究を行った。1997年5月1日、エリツィン・ロシア大統領は、クチマ・ウクライナにクリミア共和国の割譲に同意した。このような大英断を、同大統領はなぜ行ったのか?ロシアの安全保障の観点から、そのような決定を下さねばならぬ、次のような「政策上の緊迫性」があったからである。端的にいえば、ウクライナの・NATO加盟を牽制する必要性である。地政学上の要衝の地であるウクライナが将来万一NATOに加盟することとなれば、ロシアはウクライナという緩衝地帯(buffer zone)を喪い、NATO加盟諸国と直接地続きで接しなければならない羽目となる。ロシアとしてはそのような可能性を防止せねばならない。そのようなロシアの弱味を見越して、ウクライナはNATO加盟問題にたいする己の立場を暖味なものとする。ロシアは、そのようなキエフの戦術を承知しつつも、ウクライナにアメの提供を余儀なくされた。今年度は次いで、カリーニングラードについての研究も行った。カリーニングラード地方は、かってのドイツ領(ケーニスベルグ)。第二次大戦後のドイツは、ロシアに返還要求を断念している。カリーニングラードは、20024年に隣国のリトアニアやポーランドがEUやNATOに加盟すると完全な陸の孤島と化する。そのために、ロシア政権は同地域を「自由経済特区」に指定している。これは、ロシア政府が北方四島について提案している「経済共同開発」と類似の構想である。しかし、そのための法整備などが不備のために、隣接諸国との経済格差は埋まらず、頭痛の種となっている。ウクライナ、カリーニングラードの問題と、日ロ間の北方領土問題との類似点と相違点がかなりの程度明らかとなった。これが、今年度の成果である。
イネの易変性ヴィレッセント変異に係る新規DNAトランスポゾンの解析

本研究は、易変性ヴィレッセント変異体pyl-vから同定されたイネの新規DNAトランスポゾンnDartによる遺伝子タギング系の確立を目的としており、トランスポゾンディスプレイ(TD)等の手法を用いて新規挿入変異や自律性因子の解析を行っている。昨年度までに信頼性の高いTD実験系の確立に成功したことから、今年度は同実験系を用いてnDart関連因子の転移能および挿入部位の特徴を調査した。1.nDart関連因子の転移能調査pyl-v自殖後代集団のTD解析により、イネゲノム内に存在する7種のnDart関連因子の転移能を調査した。その結果、pyl-vの原因遺伝子に挿入したnDart因子(nDart1-0)のホモログであるnDart1-3サブグループ因子のみが高頻度に転移しており、後代にも伝達していることが明らかになった。また、nDart1-0のみを特異的に可視化するTD系を確立して解析を行った結果、新規の挿入の半分以上はnDart1-0の転移によることが明らかになった。2.nDart1-3サブグループ因子の新規挿入部位解析上記1のTD解析で検出されたnDart1-3サブグループ因子の新規挿入バンドのシーケンス解析を行い、BLAST検索に基づいて約150の挿入部位を決定した。その結果、挿入箇所は大きな偏りなく染色体全域に分布し、挿入部位には特定の認識配列も存在していなかった。また、新規挿入因子の半分以上が予測遺伝子領域(非翻訳領城も含む)に挿入しており、特に5'-非翻訳領域へ挿入しやすい傾向が明らかになった。以上の結果より、nDart1-3サブグループ因子は、特定の領域および配列への挿入制限を受けず、高頻度に遺伝子領城に挿入する傾向を持つことが明らかになった。同因子を用いた遺伝子タギングは、今後のイネの遺伝子機能解析において非常に有用な手法となると確信している。本研究は、イネの交雑後代に分離した易変性ヴィレッセント変異体から同定された、非自律性の新規DNAトランスポゾン(nDartと命名)およびその関連因子において、トランスポゾンディスプレイ(TD)等での解析を用いて新規挿入変異や自律性因子の同定を行い、新たなタギング系を確立することを目的としている。今年度の主な目標はトランスポゾンディスプレイの確立であったが、全ゲノム配列が公開された日本晴および挿入領域が特定された易変性ヴィレッセント変異関連系統のゲノムを用いて、大部分のDart関連因子の増幅が可能な実験系を確立した。1、日本晴を用いたTD解析BLAST検索に基づく解析により、日本晴には約15のnDartと、末端配列が相同で内部に転移酵素をコードする可能性のある自律性因子様の因子が約50同定されたので、これらの因子のそれぞれの近傍配列データから目標とするバンドパターンを計算し、実際のTD泳動像と比較した。Dart関連因子はGC含量が極めて高く、PCR増幅は困難であったが、プライマーやDNA polymeraseを多数検討した結果、約8割のDart関連因子の増幅が可能となった。2、易変性ヴィレッセント変異関連系統を用いたTD解析上記の実験系を用い、易変性あるいは安定なヴィレッセント系統と、nDartが脱離した復帰系統をディスプレイで比較したところ、予想されるサイズにバンドの有無の差が検出され、さらに新規の挿入部位も同定できた。また、これらのバンドに関してはゲルから切り出してシーケンス解析を行い、挿入された染色体領域を確認した。現在はさらに検出頻度の高いディスプレイ系を目指すとともに、他の挿入変異系統や自律性因子分離集団においてもTD解析を進めているところである。今後はそれと平行してイネにおけるDart関連因子の分布に関しても調査を行う予定である。本研究は、nDartと名付けたイネの新規DNAトランスポゾンおよびその関連因子において、トランスポゾンディスプレイ(TD)等の手法を用いて新規挿入変異や自律性因子の解析を行ない、新たなタギング系を確立することを目的としている。今年度は昨年度確立したTD実験系をさらに改良すると共に、同実験系を用いての新規易変性変異体の原因遺伝子の同定に成功した。1、nDart関連因子の種類別TD解析ゲノム配列が公開されている日本晴には現在81個のnDart関連因子が同定されており、それらは因子のサイズや配列相同性に基づき7種類のサブグループに分類されている。昨年度はこのうち4つのサブグループに関して、1種類のプライマーを用いて同時にTD増幅を行なったが、今年度はnDart関連因子の分布や転移能の詳細な調査を目的として、各サブグループの特徴的な配列部位にプライマーを設計したところ、7種のnDart関連因子を80%以上の効率で増幅できる種類別のTD増幅が可能となった。2、新規易変性変異体の原因遺伝子の同定最初にnDartが同定された易変性ヴィレッセント変異体の後代には、新規易変性変異体が複数分離している。今年度はそれらの中から、復帰変異体ホモ個体が得られた2つの易変性変異体(ジベレリン非感受性矮性変異体、アルビノ変異体)に関して、TD解析による原因遺伝子の同定を試みた。その結果、どちらの遺伝子も変異体特異的なバンドが得られたので、バンドの塩基配列の解析からnDart挿入領域を特定し、原因遺伝子を同定した。今後は、今年度確立した種類別のTD実験系を用いて多数のイネ系統や自律性因子を保持する系統の後代集団を解析し、各因子のイネゲノム内の分布や転移頻度を調査する。また、さらなる新規易変性変異のTD解析を行なうと同時に、今年度同定された遺伝子の機能解析も行なう予定である。

本研究は、易変性ヴィレッセント変異体pyl-vから同定されたイネの新規DNAトランスポゾンnDartによる遺伝子タギング系の確立を目的としており、トランスポゾンディスプレイ(TD)等の手法を用いて新規挿入変異や自律性因子の解析を行っている。昨年度までに信頼性の高いTD実験系の確立に成功したことから、今年度は同実験系を用いてnDart関連因子の転移能および挿入部位の特徴を調査した。1.nDart関連因子の転移能調査pyl-v自殖後代集団のTD解析により、イネゲノム内に存在する7種のnDart関連因子の転移能を調査した。その結果、pyl-vの原因遺伝子に挿入したnDart因子(nDart1-0)のホモログであるnDart1-3サブグループ因子のみが高頻度に転移しており、後代にも伝達していることが明らかになった。また、nDart1-0のみを特異的に可視化するTD系を確立して解析を行った結果、新規の挿入の半分以上はnDart1-0の転移によることが明らかになった。2.nDart1-3サブグループ因子の新規挿入部位解析上記1のTD解析で検出されたnDart1-3サブグループ因子の新規挿入バンドのシーケンス解析を行い、BLAST検索に基づいて約150の挿入部位を決定した。その結果、挿入箇所は大きな偏りなく染色体全域に分布し、挿入部位には特定の認識配列も存在していなかった。また、新規挿入因子の半分以上が予測遺伝子領域(非翻訳領城も含む)に挿入しており、特に5'-非翻訳領域へ挿入しやすい傾向が明らかになった。以上の結果より、nDart1-3サブグループ因子は、特定の領域および配列への挿入制限を受けず、高頻度に遺伝子領城に挿入する傾向を持つことが明らかになった。同因子を用いた遺伝子タギングは、今後のイネの遺伝子機能解析において非常に有用な手法となると確信している。
自然免疫系の活性化とOX40/OX40L系を利用した造血器腫瘍の免疫療法

本研究では、自然免疫系の活性化とOX40/OX40L系を利用して造血器腫瘍に対して有効な免疫療法の開発を目指し以下の実験を行った。LPS誘導体であるONO-4007を、腫瘍巣に集積しやすいPEG-リポソームに封入した。これを、マウスリンパ腫細胞株EL4を皮内接種し腫瘍径が約1cmになった担癌マウスに静注すると、24時間後には腫瘍巣に好中球の浸潤がみられ、3日後には壊死を起こした。ただし、PEG-リポソームに封入せずにONO-4007を静注した場合も同様の炎症反応が認められ、PEG-リポソームへの封入による腫瘍選択性は認めなかった。5例の急性骨髄性白血病(AML)患者より分離した新鮮白血病細胞をSCF、FLT-3L、GM-CSFとTNF-α存在下に7日間培養して樹状細胞(DC)様細胞に分化させながら、レトロウイルスベクターを用いてOX40Lを形質導入した。これらの細胞の抗原提示細胞としての活性をアロCD4^+T細胞増殖とIFN-γ産生刺激によって比較検討したところ、全例でOX40L導入白血病細胞由来DCが、新鮮白血病細胞、サイトカイン添加のみの白血病由来DC、およびmockベクター導入DCに比べて強い活性を示した。また、AMLの1例で行ったHLA一致ドナーのT細胞を用いた増殖刺激実験でも同様の結果が得られた。EL4にマウスOX40Lをトランスフェクトして安定発現株EL4-OX40Lおよびそのmockコントロール株EL4-mockを作成した。親株とこれらのトランスフェクタント株をC57/B6マウスの皮下に1x10^5接種し、造腫瘍性を比較したところ、親株およびEL4-mockではすべてのマウスで早期に腫瘍の生着が認められたのに対して、EL4-OX40Lでは、腫瘍の増殖が遅延し、一部のマウスでは全く生着しなかった。また、EL4-OX40Lを接種したマウスの脾細胞中にEL4-OX40Lだけでなく、親株に対する特異的な細胞傷害活性が認められた。以上の結果から、ONO-4007は抗腫瘍免疫のエフェクター作用を増幅する活性を有すること、そして、OX40Lワクチンによって造血器腫瘍に対する特異的免疫応答を誘導しうることが明らかになった。本研究では、自然免疫系の活性化とOX40/OX40L系を利用して、造血器腫瘍に対して有効な免疫療法を開発することを目的とする。本年度は、そのための基礎実験として(1)LPSの主要成分であるlipid Aの誘導体ONO-4007による炎症反応と抗腫瘍作用、および、(2)OX40 ligand (OX40L)を遺伝子導入した腫瘍ワクチンによる抗腫瘍免疫の誘導について検討した。(1)ONO-4007を、腫瘍巣に集積しやすいPEG-リポソームに封入した。

一方、PEG-リポソームに封入せずにONO-4007を静注した場合も同様の炎症反応が認められ、PEG-リポソームへの封入による腫瘍選択性を見いだすことが現時点ではできていない。(2)EL4にマウスOX40Lをトランスフェクトして安定発現株EL4-OX40Lおよびそのmockコントロール株EL4-mockを作成した。親株とこれらのトランスフェクタント株をC57/B6マウスの皮下に1×10^5接種し、造腫瘍性を比較したところ、親株およびEL4-mockではすべてのマウスで早期に腫瘍の生着が認められたのに対して、EL4-OX40Lでは、腫瘍の増殖が遅延し、一部のマウスでは全く生着しなかった。また、EL4-OX40Lを接種したマウスの脾細胞中にEL4-OX40Lだけでなく、親株に対する特異的な細胞傷害活性が認められた。以上の結果から、ONO-4007は抗腫瘍免疫のエフェクター作用を増幅する活性を有すること、また、OX40L腫瘍ワクチンによって造血器腫瘍に対する特異的免疫応答を誘導しうることが示された。本研究では、自然免疫系の活性化とOX40/OX40L系を利用して、造血器腫瘍に対して有効な免疫療法を開発することを目的とし、本年度は、この方法の有効性を示す以下のような研究成果が得られた。(1)大腸癌細胞株CT26の担癌マウスにアジュバントであるlipid A誘導体ONO-4007を封入したPEG-リポソームを静注すると、3日後には腫瘍巣に多数の好中球が集積し腫瘍の縮小がみられた。この腫瘍縮小における好中球の役割を検討するために、抗Gr-1抗体投与で好中球を除去すると、むしろ腫瘍のさらなる縮小がみられた。このことから、Gr-1+サプレッサー細胞の減弱化が、自然免疫系の活性化を利用した抗腫瘍免疫の誘導とって重要であると考えられた。(2)リンパ腫細胞株EL4にマウスOX40Lをトランスフェクトして安定発現株EL4-OX40Lおよびそのmockコントロール株EL4-mockを作成した。以上の結果から、ONO-4007は抗腫瘍免疫のエフェクター作用を増幅する活性を有すること、また、OX40Lワクチンによって造血器腫瘍に対する特異的免疫応答を誘導しうることが示された。これらを組み合わせることによって有効な腫瘍ワクチンを作成できるのではないかと期待される。