hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
モデル生物を用いたバルプロ酸新規標的遺伝子の同定

VPAの多彩な作用の標的分子の正体は不明である。我々は、分裂酵母モデル生物を用いて、分子遺伝学的研究を進め、以下の結果を得た。VPA超感受性株の原因遺伝子としてVrg4遺伝子を同定できた。その人ホモログは蝸牛様骨盤異形成症である。我々はVrg4がゴルジに局在していた。また、vrg4変異体細胞を用いて多コピー抑圧遺伝子数種類を同定できた。また、VPAで処理した野生細胞では多くの遺伝子の発現は上昇していることをCAGE法にて明らかにした。本研究は分裂酵母をモデル生物として用いて、バルプロ酸の生体内での標的分子をゲノム薬理学的に同定しようと考えている。具体的には下記の方法で研究を展開する予定であった。1バルプロ酸超感受性変異体の原因遺伝子の同定と解析;2多コピー抑圧遺伝子の取得とプルダウンにより、薬物感受性遺伝子と機能的関連をもつ遺伝子の同定と機能解析;3野生細胞にバルプロ酸耐性を付与する遺伝子の同定と解析4バルプロ酸による転写制御メカニズムの解明。研究実績の概要に記したように1と2の実験が完成できた。3と4については精力的に行っているところである。平成28年度に主に哺乳動物培養細胞系での実験を進める。具体的には(1)同定できたバルプロ酸による発現が制御される遺伝子についてその他のHDACインヒビターによる効果を検討する。(2)バルプロ酸に特異的に制御される遺伝子についてshRNAによリノックダウンし、細胞の生育や転写に与える影響を調べる。(3)実際に候補遺伝子産物がバルプロ酸の分子標的であることを確認する。平成28年度8月以降には主に実験の結果を解析しデータをまとめて論文を投稿する予定である。分子薬理平成27-28年度に分裂酵母での機能解析と平行して哺乳動物培養細胞系での機能解析を試みる。具体的には(1)同定できた生育に必須かつ哺乳動物細胞において高度に保存された遺伝子については、shRNAによリノックダウンし、細胞の生育、メンブレン・トラフィック機構や転写に与える影響を調べる。(2)上記細胞系におけるバルプロ酸の効果を検討し、実際に候補遺伝子産物がバルプロ酸の分子標的であることを確認する。次年度に使用額33,074円が生じた理由としては、1名の大学院生が2015年3月18日20日に名古屋で行われた第88回日本薬理学会年会を参加する予定でしたが、研究成果が学会発表の水準にまでは達しなかった部分があり、学会などへの出張をキャンセルしたため、旅費が発生しなかった。未使用額は備品費と旅費で使う予定である。
新規同定した小胞体ストレス応答で誘導されるncRNAによる腎癌発症機構の解明

最終年度のncRNAによる腫瘍促進効果の分子機構をncRNAとUVクロスリンクして単離したRNAを次世代シーケンサーによる網羅的解析する計画を変更し、樹立することができた新規ncRNAのノックアウトマウスの解析を優先して行った。解析結果からノックアウトマウスはホモでは軟骨形成不全から胸郭が小さいために出生後に肺が十分に拡張せずに死亡することがわかり、ヘテロマウスは野生型と外見上全く違いを認めなかったが、小胞体ストレス誘導剤によって極めて脆弱で死亡率が高いことがわかった。このことから、新規のncRNAの生理的な意義や小胞体ストレス応答での意義について個体レベルで明らかにすることが出来た。小胞体ストレスが癌微小環境で惹起されることから、小胞体ストレス応答の網羅的な遺伝子発現解析を行い、新規のncRNAを同定した。その予備的解析から同定したncRNAはストレス下での細胞増殖に必須で、しかもその発現はヒト腎癌患者の予後と高い相関を示すことをすでに見出している。本研究では、予備的解析から同定したncRNAと腫瘍形成の因果関係を明らかにし、その分子機構を解明して新たな腎癌治療法の基盤を確立することを研究目的としている。平成28年度は、新規同定のncRNAが腫瘍促進因子として機能するかを、ヒト患者由来サンプル、腎癌モデルマウス、ゲノム編集した細胞を用いた解析などで検証を行った。具体的には、以下の3つの解析を行い、同定したncRNAによる腎癌促進効果の検討を実施した。1.臨床コホートサンプルで同定したncRNA発現と腎癌との相関解析2.マウスへの腎癌移植で同定したncRNAによる発癌効果解析3. AAVウィルスによる同定したncRNA発現抑制による発癌抑制効果解析新規同定のncRNAが腫瘍促進因子として機能するかを、ヒト患者由来サンプル、腎癌モデルマウス、ゲノム編集した細胞を用いた解析などで検証を行ったが、ncRNAによる腎癌促進効果の検討のやや時間を要している。予備的解析から同定したncRNAはストレス下での細胞増殖に必須で、しかもその発現はヒト腎癌患者の予後と高い相関を示すことを見出している。本研究では、同定したncRNAと腫瘍形成の因果関係を明らかにし、その分子機構を解明して新たな腎癌治療法の基盤を確立することを本研究の目的としている。平成29年度は、ncRNAによる腫瘍促進効果の分子機構をncRNAとUVクロスリンクして単離したRNAを次世代シーケンサーによる網羅的解析を計画していたが、次世代シーケンサー解析の前の予備実験が上手くいかず、修飾方法を含めて条件等が必要であることがわかり、年度内での実施を断念した。その代わりに、新規ncRNAのノックアウトマウスを樹立することができたので、その解析を優先して行った。ノックアウトマウスはホモでは軟骨形成不全から胸郭が小さいために出生後に肺が十分に拡張せずに死亡することがわかった。一方、ヘテロマウスは野生型と外見上全く違いを認めなかったが、小胞体ストレス誘導剤によって極めて脆弱で死亡率が高いことがわかった。今度の研究として、ncRNAによる腫瘍促進効果の分子機構を、ncRNAとUVクロスリンクして単離したRNAを次世代シーケンサーによる網羅的解析で糸口に明らかにする。古生物TiaSによるRNA修飾とクリック反応を組み合わせたsite-specificにビオチンラベルしたncRNAをbaitとして、ncRNAとUV架橋して単離できた標的mRNAをストレプトアビジンビーズで単離し次世代シーケンサーで同定する。ゲノム編集による同定したncRNAの標的mRNAの機能解析同定したmRNAがncRNAの標的分子として機能するかを、ゲノム編集でncRNA欠損を欠損したヒト腎癌細胞株を作製して小胞体ストレスでの増殖効果への影響で検証する。細胞生物学本研究では、同定したncRNAと腫瘍形成の因果関係を明らかにし、その分子機構を解明して新たな腎癌治療法の基盤を確立することを目的をしている。本年度においては、新規同定のncRNAが腫瘍促進因子として機能するかヒト患者由来サンプル、腎癌モデルマウス、ゲノム編集した細胞を用いた解析などで検証を行ったが、AAVウィルスによる同定したncRNA発現抑制による発癌抑制効果解析の条件検討に多少時間が要しているため。本年度に得られた結果をもとにncRNAによる腫瘍促進効果の分子機構を、ncRNAとUVクロスリンクして単離したRNAを次世代シーケンサーによる網羅的解析を糸口に明らかにすることを目的としているため、次世代シークエンサー受託解析や組織標本作製の経費、また研究成果発表費として学会への旅費、雑誌投稿料の経費にあてる。
緑色光合成細菌におけるアンテナ色素系の構築原理-蛋白質を用いない分子設計

緑色光合成細菌の主要なアンテナ系はクロロソームと呼ばれる扁平な形をした構造体で、細胞質膜に接して存在する。この中では、色素が生理機能を発現するために色素の自己会合体を形成しており、タンパク質が機能発現に関与しないという、他のアンテナ系に比較して、際だった特徴を示す。しかし、この会合体形成の機構は多くの研究にもかかわらず、未だに明確にはなっていない。この点を明らかにする目的で以下のような研究を行った。1.磁気円偏光二色性(MCD)による会合次数の解析我々はMCD強度が色素の会合状態を反映することを見いだし(Kobayashi et al.,1996)、これを用いて会合次数を求めた。その結果、クロロソーム中では8量体よりも大きいことを確認した。2.クロロソーム中での新しい成分の発見クロロソームをヘキサノールで処理すると、可逆的にその光学特性が変化することが知られている。我々はこの過程を詳細に検討した結果、従来はまったく知られていなかった成分を発見した。これは非常に低い濃度のヘキサノールに感受性があり、その吸収特性から、クロロソームと細胞質膜内に存在するアンテナを結ぶ成分であることが確認された。この成分を考慮した色素系の新しいモデルを作成した(Mimuro et al.,1996)。3.色素の自己会合体のモデル従来から議論が多い自己会合体のモデルを新たに提出した(Mimuro et al.,1995)。根拠となる色素間の相互作用はラマン散乱のデータから求めた。このモデルは、従来のモデルを総て説明可能なもので、今後の指針となると考えられる。
大企業の健康診断と在職死亡者に関する多施設継続調査

常勤産業医が健康診断と事後措置を徹底している事業所で20122014年の在職死亡者の死因と健康診断結果を調査した。また、調査結果を先行研究(19992011年)の結果と統合して解析した。死因は、男性が、がん47.3%、循環器疾患22.9%、自殺10.9%、女性が、がん65.6%、循環器疾患12.5%、自殺10.9%だった。人口動態統計の一般人口と比べた2059歳の標準化死亡比は、男性が、全死因0.42、がん0.66、循環器疾患0.70、自殺0.31、事故0.45、女性が、全死因0.39だった。健康診断結果では、循環器疾患のリスクはBMI25から、腹囲は90cm以上で増加傾向を認めた。本研究は、これまで継続してきた研究を通じて信頼関係を構築してきた多業種の大規模事業場(約30社)とその専属産業医を対象に、労働者の在職死亡例について、個人情報を連結不可能匿名化することでその保護を徹底したうえで、性、年齢、死因及び直近の健康診断結果を取得し、人口動態統計による就労者の死亡率と統計的に比較することによって、1)法定の健康診断による循環器疾患の死亡の抑制、2)事業場が独自に追加した検査による目的疾患の死亡の抑制、3)問診や事後措置の実施による死亡の抑制について明らかにすることを目的として実施してきた。平成25年度は、上記の産業医を対象に担当する事業所の健康管理対象者数、死亡者数、死因等を調査した。平成26年3月末時点で23事業場から回答を得た。対象労働者数は148,910人、死亡者数は118人であった。人口動態統計と比較した標準化死亡比(SMR)は、男性0.351、女性0.461、昭和60年モデル人口による年齢調整死亡率(10万人対)は、男性76.6、女性20.3であった。男性の死因は、がん49.2%、循環器疾患19.4%、自殺8.9%で、がんは肺がんが7.3%と最多で、次いで結腸癌6.5%だった。女性の死因は15人中11人ががんであり、乳がんが4人と最多であった。死亡者の定期健康診断結果の解析では、循環器疾患での死亡者には、喫煙者、高血圧、メタボリックシンドローム及びその予備軍の該当者が多い傾向を認め、在職者の死因とこれらの要因との間に関連が示唆された。本研究は、これまで継続してきた研究で信頼関係を構築してきた多業種の大規模事業場とその専属産業医を対象に、労働者の在職死亡例について、個人情報保護を徹底したうえで、性、年齢、死因及び直近の健康診断結果を取得し、人口動態統計による就労者の死亡率と比較することにより、1)法定の健康診断による循環器疾患の死亡の抑制、2)事業場が独自に追加した検査による目的疾患の死亡の抑制、3)問診や事後措置の実施による死亡の抑制について明らかにすることを目的として実施してきた。平成26年度は、上記の産業医を対象に事業所の健康管理対象者数、死亡者数、死因に加え、事後措置の実施状況、独自に追加している検査を調査した。平成27年3月末時点で22事業場から回答を得た。対象労働者数は153,927人、死亡者数は102人で,人口動態統計と比較した標準化死亡比(SMR)は、男性0.201、女性0.192、昭和60年モデル人口による年齢調整死亡率(10万人対)は、男性61.6、女性24.3であった。男性の死因は、がん36.6%、循環器疾患26.9%、自殺16.1%で、がんは膵がんが7.5%と最多で、次いで肺がん5.4%だった。女性の死因はがん55.6%と最多で、乳がんが2人と最多だった。死亡者の健康診断結果の解析では、循環器疾患での死亡者には、喫煙者、高血圧が多い傾向を認め、在職者の死因との関連が示唆された。事後措置について、すべての事業所で要精密検査対象者の一部またはすべてに産業医や看護職が受診勧奨と結果確認を行っていた。また就業上の措置を講じる際に参考にする項目は、血圧が100%と最多で、次いで血糖値87.0%、心電図73.9%、メンタルヘルスに関する症状56.5%だった。追加検査では、尿酸値の測定が最も多く行われ、がん検診では大腸がん検診(便潜血)が100%、胃がん検診87.0%など高い実施率であった。本研究は、これまで継続してきた研究で信頼関係を構築してきた多業種の大規模事業場とその専属産業医を対象に、労働者の在職死亡例について、個人情報保護を徹底したうえで、性、年齢、死因及び直近の健康診断結果を取得し、人口動態統計による就労者の死亡率と比較することにより、1.法定の健康診断による循環器疾患の死亡の抑制、2.事業場が独自に追加した検査による目的疾患の死亡の抑制、3.問診や事後措置の実施による死亡の抑制について明らかにすることを目的として実施してきた。平成28年3月末時点で18事業場から回答を得た。

対象労働者数は78,603人、死亡者数は75人で、人口動態統計と比較した標準化死亡比(SMR)は、男性0.333、女性0.397、昭和60年モデル人口による年齢調整死亡率(10万人対)は、男性94.9、女性58.8であった。男性の死因は、がん50.0%、循環器疾患21.2%、自殺18.2%で、がんは肺がんが15.2%と最多で、次いで胃がん7.6%だった。女性の死因はがん55.6%と最多で、乳がんが2人と最多だった。死亡者の健康診断結果の解析では、循環器での死亡者にBMI≧25、血圧≧140/90mmHg、総コレステロール値≧220mg/dl、糖尿病域、メタボリックシンドローム該当者、喫煙者が多い傾向が認められ、在職者の死因と関連性がある可能性が示唆された。平成20年度から実施してきた調査結果を統合したところ、専属産業医が健康管理を担当する事業場における在職死亡率は、全体的に減少傾向を認めた一方で、自殺の割合が増加し、特に30歳代で顕著であった。常勤産業医が健康診断と事後措置を徹底している事業所で20122014年の在職死亡者の死因と健康診断結果を調査した。また、調査結果を先行研究(19992011年)の結果と統合して解析した。死因は、男性が、がん47.3%、循環器疾患22.9%、自殺10.9%、女性が、がん65.6%、循環器疾患12.5%、自殺10.9%だった。人口動態統計の一般人口と比べた2059歳の標準化死亡比は、男性が、全死因0.42、がん0.66、循環器疾患0.70、自殺0.31、事故0.45、女性が、全死因0.39だった。健康診断結果では、循環器疾患のリスクはBMI25から、腹囲は90cm以上で増加傾向を認めた。初年度に引き続き2年目の調査を行い、予定通り対象事業場の産業医から事業場の健康管理対象者、在職者死亡の死因、健康診断結果を報告させ、死因の集計、循環器疾患等による死亡とBMI、高血圧、耐糖能、脂質値、メタボリックシンドロームとの関連を解析することができた。対象事業場の産業医に対しては調査結果をまとめたニュースレターを作成しており、平成27年度調査時に送付予定である。また、今回は事業場が独自に追加している検査やがん検診、事後措置についての調査も実施できた。ただし、専属産業医のいる大企業であるため、事後措置やがん検診の実施率が非常に高く、その違いによる在職死亡の差を統計学的に証明するまでの結果は得られなかった。今後より詳細に結果を分析し、死亡抑制に影響している因子がないか検討する。産業医学平成25、26年度の調査から、専属産業医のいる大規模事業場では一般国民や一般就業者と比較して死亡率が低く、特に循環器疾患及び自殺で予防効果が大きいことが明らかとなった。また、全がんによる死亡率も低い傾向があり、大規模事業場の産業医を中心とする健康管理が在職死亡を抑制している可能性が示唆された。平成27年度は、引き続き同様の調査を継続してデータを蓄積するとともに、最終年度である今年度は、これまで平成20年から蓄積してきたデータを統合して、年代別死因の経年推移等を解析し、継続的な健康管理による死亡抑制の効果や、今後取り組んでいくべき疾病の傾向についても明らかにしていく。本研究では平成25年度に研究体制の整備を行い、産業医科大学倫理委員会での承認を経て計画どおり、対象事業場の産業医から事業場の健康管理対象者、在職者死亡の死因、健康診断結果を報告させ、死因の集計、循環器疾患等による死亡とBMI、高血圧、耐糖能、脂質値、メタボリックシンドロームとの関連を解析することができた。対象事業場の産業医に対しては調査結果をまとめたニュースレターを作成しており、本年度調査時に送付予定である。平成27年3月に開催予定であった会議について、研究者の日程が合わず平成27年度4月19日に開催したため、当該年度の旅費が使用されなかった。平成25年度の調査から、調査対象事業場では一般国民や一般就業者と比較して死亡率が低く、大規模事業場の産業医を中心とする健康管理が在職死亡を抑制している可能性が示唆された。
腎疾患に対する遺伝子治療法の確立

近年開発された遺伝子導入法HVJ-リポソーム法を用いて我々は腎臓特に糸球体への効率の良い遺伝子導入の成果を報告してきた(Tomita N et al.BBRC 1992)。本法は導入しようとする遺伝子を脂質(リポソーム)の膜内に封入後、不活化したHVJ(Sendai Virus)をリポソームと融合させて、HVJのもつ膜融合能を利用し、高効率に遺伝子導入をさせるものである。また、導入方法としては経血管的にアプローチする必要があった。それにより導入効率を上昇させることができることも我々は報告している。また、我々は遺伝子導入だけでなく、本法のオリゴ導入法としての有効性についても早くより検討し、腎臓においては市販されているリポソームを用いた場合にはほとんどが尿細管に取り込まれるが、本法を用いた場合には糸球体へのオリゴの導入にはかなり有効であることが判明した。既に我々はThy1腎炎に対してはデコイと呼ばれるオリゴを基本にした新しい方法で、細胞周期の進展阻害をE2Fデコイにより行い、遺伝子治療効果も報告した(Tomita N et al.JASN 1995)。また炎症性のサイトカインによるとされている腎炎モデルに対してもNFκBデコイを用いた遺伝子治療の成果を報告した(Tomita N et al.JASN 2000)。また、その他のモデルに対しても同様にデコイによる遺伝子治療効果を確認し、既に報告している(Tomita N et al.Exp Nephrol 1997,Tomita N et al.Gene Ther 2000)。以上の様に本研究では腎疾患に対する遺伝子治療に取り組み、その導入方法としては熟練した技術を有している。また、デコイ法と遺伝子導入を組み合わせた遺伝子治療では心筋梗塞やPTCA後再狭窄にも応用し、その成功例も報告している(Morishita R et al.Nat Med 1997,Morishita R et al.PNAS 1995)。本研究では国内で発見された肝細胞増殖因子(HGF)が尿細管保護作用があることも我々は見い出した(Yo Y et al.Kidney Int 1998)。さらに、腎臓特に腎糸球体細胞を特異的にtargetingできる遺伝子導入法の確立にも成功した(ASN 2000)。具体的には腎臓にのみ発現する蛋白を認識できる抗体や受容体をリポソームに組み込み、その後、HVJを反応させ、新しいタイプのimmunoliposomeを作成した。本リポソームを応用し、抹消からのNFκBデコイを投与し、腎炎モデルでの病態進展を抑制した(ASN 2000)。以上本研究においては動物実験のレベルではあるが、腎臓への遺伝子導入方法を確立し、それを応用したデコイ法とよばれる新しい遺伝子治療のストラテジーの開発に成功した。これらの結果をもとに今後大動物での実験がおこなわれ、そのステップの後臨床応用されることを期待する。本年度は、遺伝子治療用ストラテジーの開発を主に行った。我々はそのターゲットとして肝細胞増殖因子(HGF)に注目した。まず最初に腎臓におけるHGFの役割について詳細に検討し、以下の知見を得た。1)メサンギウム細胞には増殖作用を示さないが、尿細管上皮細胞には増殖作用を示す(Kidney Int 1998,Kidney Int 1998)。2)高血圧性の腎障害に対してアジジオテンシン変換酵素投与により腎障害が改善されたが、そのメカニズムとしてはHGFが関与している(日本腎臓学会発表)。3)虚血により尿細管上皮細胞に誘導されたアポトーシスをHGFが抑制する。そのメカニズムについては現在検索中である。HGFの作用に関してはその他、血管平滑筋細胞や血管内皮細胞を用いても検討し、今後の遺伝子治療ストラテジー開発へのステップと考えている。また、遺伝子導入用ベクターの開発はまずこれまでに確立したHVJ-リポソーム法の改良に重点をおいた。具体的にはリポソーム組成を変更し、その導入効率について検討する。また導入する方法自体にも改良を加え、静脈及び尿管を一時的にクランプして導入効率がどうのように変化するかについて検討した。その結果としては以下のように要約できる。1)リポソームの組成を変えてリポソーム自体を陰性に荷電するとin vivoにおける腎糸球体への導入効率は有意に上昇した。しかし、培養細胞に対しては逆に導入効率は低下した。2)技術的にはできるだけHVJ-リポソーム液を腎臓に溜め込むほうが導入効率が上昇する。つまり静脈及び尿管をクランプした方が導入効率が良かった。さらにリポソームに修飾を加え、腎臓のターゲッティングも試みており、改良された導入方法を用いて検討した結果、その毒性についてはまず問題がないという結果を得ている。今後はさらにその方法を用いて治療ストラテジーの開発を目指す。

また、我々は遺伝子導入だけでなく、本法のオリゴ導入法としての有効性についても早くより検討し、腎臓においては市販されているリポソームを用いた場合にはほとんどが尿細管に取り込まれるが、本法を用いた場合には糸球体へのオリゴの導入にはかなり有効であることが判明した。既に我々はThy1腎炎に対してはデコイと呼ばれるオリゴを基本にした新しい方法で、細胞周期の進展阻害をE2Fデコイにより行い、遺伝子治療効果も報告した(Tomita N et al.JASN 1995)。また炎症性のサイトカインによるとされている腎炎モデルに対してもNFκBデコイを用いた遺伝子治療の成果を報告した(Tomita N et al.JASN 2000)。また、その他のモデルに対しても同様にデコイによる遺伝子治療効果を確認し、既に報告している(Tomita N et al.Exp Nephrol 1997,Tomita N et al.Gene Ther 2000)。以上の様に本研究では腎疾患に対する遺伝子治療に取り組み、その導入方法としては熟練した技術を有している。また、デコイ法と遺伝子導入を組み合わせた遺伝子治療では心筋梗塞やPTCA後再狭窄にも応用し、その成功例も報告している(Morishita R et al.Nat Med 1997,Morishita R et al.PNAS 1995)。本研究では国内で発見された肝細胞増殖因子(HGF)が尿細管保護作用があることも我々は見い出した(Yo Y et al.Kidney Int 1998)。さらに、腎臓特に腎糸球体細胞を特異的にtargetingできる遺伝子導入法の確立にも成功した(ASN 2000)。具体的には腎臓にのみ発現する蛋白を認識できる抗体や受容体をリポソームに組み込み、その後、HVJを反応させ、新しいタイプのimmunoliposomeを作成した。本リポソームを応用し、抹消からのNFκBデコイを投与し、腎炎モデルでの病態進展を抑制した(ASN 2000)。以上本研究においては動物実験のレベルではあるが、腎臓への遺伝子導入方法を確立し、それを応用したデコイ法とよばれる新しい遺伝子治療のストラテジーの開発に成功した。これらの結果をもとに今後大動物での実験がおこなわれ、そのステップの後臨床応用されることを期待する。本年度は、遺伝子導入方法の改良・開発を主に行った。我々はそのターゲットとして腎糸球体細胞を選び、腎糸球体細胞特異的導入法の確立をめざした。我々はこれまでに腎糸球体細胞へのin vivo遺伝子導入法として世界で初めてHVJ-リポソーム法を報告してきたが(BBRC 1992)、本法にはまだまだ改良すべき点が多く残されていることも指摘してきた。腎糸球体細胞への効果的な遺伝子導入方法としてimmunoliposomeの開発を行い、実際に腎糸球体細胞への遺伝子導入効率の上昇は既に確認済みであり、本研究において今後治療効果および安全性についても検討した(未発表)。具体的には腎糸球体細胞を特異的に認識する抗体Thy-1.1とよばれる抗体をリポソーム内にくみ込み、さらに、HVJを付加するimmunoliposomeを作製した。その効果を馬杉腎炎モデルに対してNF_κBデコイを投与し、検討した結果、本immunoliposome法の有用性が示された。
経済自由化後の南インド社会の構造変動に関する総合的研究

期間中、分担者、協力者の現地調査は、のべ20回以上、調査地も、メインとなる南インド、タミルナードゥ州内だけでなく、マハーラーシュトラ州、ケーララ州、デリーなどのインド国内、および、グローバル・ネットワークにつき、フランス、韓国、タイ、シンガポール、ドゥバイなどで実施した。また、6本の雑誌論文、21回の学会発表、12件の図書などを公表した。その結果、南インド社会の構造変動について、村落、地方都市、大都市、海外までも結ぶネットワークの中で進行していることが実証的に明らかになった。とくに当初の社会経済的変化、カースト社会構造の変化、に加えて宗教空間をめぐる変化が大きかったことが明らかになった。インド社会の構造変動に関して以下のような研究を実施した。1.南インド、タミルナードゥ州タンジャーウール県クンバコーナム市および近郊農村において共同の村落調査を実施した。また、2011、12年に同地域で実施した調査資料の整理作業を行い、1990、91年の調査資料と比較分析を行った。その結果、とくに女性の教育水準の変化が著しいこと、耐久消費財の急速な普及に政治的要因が強く働いていることなどが、実証的に明らかになった。2.チェンナイ市のMadras Institute of Development Studiesにおいて南インドにおける工業発展に関する資料を収集し、また1980年代末に実施したティルチラーパッリ県の村落社会調査資料を分析し、クンバコーナム地域と同様、教育水準の大幅な向上が見られることが実証的に明らかになった。3.タミルナードゥ州各地におけるキリスト教におけるカースト問題について調査を実施し、とくに改宗法の施行以後、キリスト教内部でのカースト問題が一層先鋭化している実態が明らかになった。4.ケーララ州起源の神霊信仰が、デリー、バンガロールなどの大都市、そして海外にまで広がり、それがまたケーララ社会に影響を及ぼし、さらに世界を巡るような環流現象が顕著であることが明らかになった。また、ナグプールのマハール・カースト仏教徒の集住地区における調査により、改宗をめぐって元不可触民ヒンドゥー教徒との緊張関係が生じていること、グジャラートにおいてヒンドゥー教とカーストとの連関調査によりグローバル化の影響が大きいこと、などが明らかになった。インド社会の構造変動に関して以下のような調査・研究を実施した。1.南インド、タミルナードゥ州タンジャーウール県クンバコーナム市および近郊農村において共同調査を実施した。また、2011年度より実施してきた調査資料の整理作業を引き続き実施し、さらに1990、91年の調査資料との比較分析を行なった。その結果、昨年度までの教育、生活水準の変化に加えて、21世紀に入って宗教施設の再建が相次いで行なわれ、それも外部性を負った人びとのアイデンティティ戦略として実施されていることが、実証的に明らかになった。本件については2014年8月の国際地理学会で共同報告を行なった。2.上記宗教施設への消費の問題に関連して、ヒンドゥー教の聖地の変容を通した社会変動を比較検討するため、北インドUP州のベナレス(ワーラーナシー)と、西インド・マハーラーシュトラ州のトランバケーシュワルにおいて調査研究を実施した。3.タミルナードゥ州のキリスト教徒社会におけるカースト問題についての調査研究を継続するとともに、東インド、オディシャ州における改宗法の問題についての比較研究も実施した。4.社会変動に関する比較研究のために、パリ、プラハ、チェンマイ、ならびにシンガポール、マレーシアなどのインド人社会における調査研究を実施し、インド人の海外ネットワークが、大都市だけでなく、村落部にまでその影響を及ぼしいることが実証的に明らかになった。1.南インド、タミルナードゥ州タンジャーウール県クンバコーナム市および近郊のティルップランビヤム村において補充的な共同調査を実施した。その結果、昨年度までの教育、生活水準の変化、宗教施設の再建、に加えて、カースト間関係がいっそう複雑化していることが、実証的に明らかになった。これらの成果の一部については、日本南アジア学会第28回全国大会(9.27,東京大学)において杉本星子らと共同報告を行なった。2.上記宗教施設への消費の問題に関連して、ヒンドゥー教の聖地における変容を通した社会変動を比較検討するため、西インド・マハーラーシュトラ州トランバケーシュワル、北インドUP州ベナレス(ワーラーナシー)において調査研究を引き続き実施した。3.調査対象の一農村を巻き込んだグローバル・ネットワークに関して、楽師カーストの、シンガポール、マレーシアなどのヒンドゥー寺院への出稼ぎや、現地における人的ネットワークの形成などについて調査研究を実施し、その実態を実証的に明らかにした。4.タミルナードゥ州のキリスト教徒社会におけるカースト問題についての調査研究を継続的に実施するとともに、全体的なカースト社会の構造変動についての考察を行った。

とくに当初の社会経済的変化、カースト社会構造の変化、に加えて宗教空間をめぐる変化が大きかったことが明らかになった。調査対象村落における調査資料の分析は、補充調査資料を含めて順調に進行しており、成果のとりまとめの段階に入っている。また、各研究員のそれぞれの調査地に加えて、インド人の海外ネットワークの影響についての調査研究が予想以上に進んでおり、村落から世界を見据えたダイナミックな社会変動の実相が実証的に明らかになってきている。27年度が最終年度であるため、記入しない。文化人類学1.現地調査は2014年度で一旦終了し、15年度はごく限られた補充的な情報を収集する。2.対象地域以外のインド国内外における変化の諸相について、情報収集などを継続する。3.研究成果の一部を英文で公表するよう準備を進める。調査対象村落における世帯聴取調査資料をエクセル・データ化し、分析を進めるとともに、補充調査を実施して資料の充実を図っており、実証的研究としての質が飛躍的に高まっている。また、クンバコーナム地域、ティルチラーパッリ地域において経済自由化前に実施した調査資料との比較検討が進み、さまざまな面での構造変化の実相が明らかになってきている。さらに、イギリス、東南アジア、中東各地域の在外インド人の活動などによって、グローバル化の影響が国内の大都市から地方都市を経由して農村にまで及んでいることも視野に入ってきた。その意味で、「比較」研究の実が上がり、構造的社会変化について説得的に実証する見通しができている。航空運賃およびアルバイト謝金を予想以上に節約できた。1.村落調査資料の分析をさらに進め、社会変化の実相を総合的かつ説得的に実証する必要がある。2.グローバル化の影響について、在外インド人社会なども対象に、比較検討する必要がある。3.相変わらずインド社会を基礎づけているカースト制の現代的様相について、さらに質的な調査研究を進める必要がある。4.研究成果の公表について、検討する。平成27年度に使用する予定。全体に現地調査が予定より順調に進み、日程が若干短縮できたのと、航空運賃も節約できたため。現地調査費用と資料整理謝金にあてる。
脈絡膜血管新生病における自然免疫細胞群の関与とその治療への応用

1.マウスを用いた網膜下瘢痕化モデルの作成<方法>顕微鏡で直視しながらマウス網膜下に、同系チオグリコレート誘導腹腔滲出細胞(大部分は活性化型マクロファージ)を注入した。7日後に、AMD患者で見られる瘢痕像と類似した網膜下病変を再現することに成功した。<評価法>経時的に脈絡膜フラットマウントを作成し、瘢痕部表面をグリア細胞のメーカーであるGlial Fibriary Acidic Protein(GFAP)で染色した。瘢痕部位の表面は網膜のグリア細胞が表面に迷入するため、面積の定量化ができた。2.局所浸潤自然免疫細胞群の同定と炎症性因子のスクリーニング(1)作成した疾患モデルにおいて、自然免疫細胞群(マクロファージ・好中球・primitiveT細胞)カイネテクスをフローサイトメトリーで解析し、病態形成への関与を個別に検討した。浸潤細胞はマクロファージに加えてサイトケラチン陽性の網膜色素上皮細胞であった(2)同時に磁気ビーズで眼内浸潤細胞分画を単離し、RT-PCRおよびRNAse protection assayで産生ケモカイン・サイトカインを解析した。マクロファージ・網膜色素上皮細胞いずれもIL-6とMCP-1の発現亢進が見られた。3.治療応用を踏まえた実験結果スクリーニングアッセイをもとに、IL-6が本モデルで主要な役割を担うと考えた。抗IL-6抗体全身投与で綱膜瘢痕は抑制され、IL-6を基軸とした眼炎症の瘢痕病態への関わりが明らかになった。また網膜色素上皮細胞に代表的炎症反応抑制性サイトカインであるIL-10遺伝子をSIVベクターを用いて導入し、硝子体手術で局所注入した。この結果網膜瘢痕が有意に抑制された。この方法は遺伝子導入を完全に体外で行い、移入細胞以外の生体組織に全く遺伝子は導入されない。遺伝子治療に伴う倫理的問題等も軽減されるすぐれた戦略と考えた。1.マウスを用いた網膜下瘢痕化モデルの作成とその解析<方法>顕微鏡で直視しながらマウス網膜下に、毛様体扁平部経由で33G針を刺入し、網膜下に同系チオグリコレート誘導腹腔滲出細胞(大部分は活性化型マクロファージ)を注入した。HE染色では網膜下に紡錘形細胞の多数集蔟をみとめ、これらは平滑筋アクチン陽性であった。<評価法>経時的に以下の方法で網膜下瘢痕組織を評価した(1)眼底写真による瘢痕部面積測定(2)連続切片による最大直径の算定(+病理組織学的評価)(3)脈絡膜フラットマウントを作成し、瘢痕部表面をグリア細胞のメーカーであるGlial Fibriary Acidic Protein(GFAP)で染色した。瘢痕部位の表面は網膜のグリア細胞が表面に迷入するため、より面積の定量化が容易となった。2.局所浸潤自然免疫細胞群の同定と炎症性因子のスクリーニング(1)作成した疾患モデルにおいて、自然免疫細胞群(マクロファージ・好中球・primitive T細胞)カイネテクスをフローサイトメトリーで解析し、病態形成への関与を個別に検討した。

浸潤細胞はマクロファージに加えてサイトケラチン陽性の網膜色素上皮細胞であった。(2)同時に磁気ビーズで眼内浸潤細胞分画を単離し、RT-PCRおよびRNAse protection assayで産生ケモカイン・サイトカインを解析した。マクロファージ・網膜色素上皮細胞いずれもIL-6とMCP-1の発現亢進が見られた。1.マウスを用いた網膜下瘢痕化モデルの解析<方法>顕微鏡で直視しながらマウス網膜下に、毛様体扁平部経由で33G針を刺入し、網膜下に同系チオグリコレート誘導腹腔滲出細胞(大部分は活性化型マクロファージ)を注入した。7日後に、AMD患者で見られる瘢痕像と類似した網膜下病変を再現することに成功した。<評価法>経時的に脈絡膜フラットマウントを作成し、瘢痕部表面をグリア細胞のメーカーであるGlial Fibriary Acidic Protein(GFAP)で染色した。瘢痕部位の表面は網膜のグリア細胞が表面に迷入するため、面積の定量化ができた。抗IL-6抗体全身投与で網膜瘢痕は抑制され、IL-6を基軸とした眼炎症の瘢痕病態への関わりが明らかになった2.サプレッサー細胞誘導による網膜瘢痕抑制生体リンパ球には病的エフェクターT細胞と共に、必ずそれを抑えるサプレッサーT細胞が存在する。CNV関連疾患の局所にあり、かつ抗原提示細胞としての機能を有するRPEに代表的炎症反応抑制性サイトカインであるIL-10遺伝子をSIVベクターを用いて導入し、硝子体手術で局所注入した。この結果網膜瘢痕が有意に抑制された。この方法は遺伝子導入を完全に体外で行い、移入細胞以外の生体組織に全く遺伝子は導入されない。遺伝子治療に伴う倫理的問題等も軽減されるすぐれた戦略と考えた。
遺伝子導入細胞系を用いた薬物の代謝、毒性研究

合成薬物や活性天然物の代謝活性化や解毒の過程は、多種類の酵素が関与し、その多くは他段階反応で進行する。この領域の研究において、今日まで多種の酵素を一つの細胞に導入した例や、それを用いた機能発現の報告は極めて少ない。これらの現状を踏まえて、本研究では複数の異なる種類の薬物代謝酵素の遺伝子を哺乳動物細胞に導入・発現させることにより、各種酵素の異物代謝における機能的役割の解明を試みた。最初に、薬物代謝酵素遺伝子を細胞に導入・発現させるために、エステラーゼ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、およびP450のcDNAクローニングを行った。ラット、マウス、サルおよびヒト肝よりRNAを抽出しmRNAを精製した後にcDNAを合成し、λgt 1l、λgt 10またはλZapの発現ベクターを用いてライブラリーを作成した。cDNAライブラリーのスクリーニングはそれぞれの酵素の特異抗体をプローブに用いて行ない、陽性クローンについての塩基配列をジデオキシ法を用いて決定し、比較検討した。マウス、ラット肝よりエステラーゼ、サル肝よりP450、ヒト肝よりエステラーゼおよびグルタチオンS-トランスフェラーゼと薬物代謝酵素として6種の新規cDNAのクローニングに成功した。得られたcDNAの発現の実験を試みたところ、エステラーゼの哺乳動物細胞での発現に成功した。すなわち、ラット肝エステラーゼRL1およびRH1,マウス肝MH1のcDNAを哺乳動物の発現ベクターであるpCR3に組み込み、哺乳動物培養細胞であるCOS7細胞に遺伝子を導入したところ、それぞれのアイソザイムに特異的な活性を維持したまま発現することに成功した。このように、薬物代謝酵素の機能を維持したままin vitro系で再現することにより、複雑な生体内での機能を限りなくin vivoに近いモデル系で解明することが可能になり、新薬の開発における薬効の判定や、毒性発現機構の解明に際しての新たな試験系として資するところが多い合成薬物や活性天然物の代謝活性化や解毒の過程は、多種類の酵素が関与し、その多くは他段階反応で進行する。このように、薬物代謝酵素の機能を維持したままin vitro系で再現することにより、複雑な生体内での機能を限りなくin vivoに近いモデル系で解明することが可能になり、新薬の開発における薬効の判定や、毒性発現機構の解明に際しての新たな試験系として資するところが多い薬物代謝酵素のcDNAクローニング平成5年度は、薬物代謝酵素遺伝子を細胞に導入・発現させるために、エステラーゼ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、およびP450のcDNAクローニングを行った。ラット、マウス、サルおよびヒト肝よりRNAを抽出しmRNAを精製した後にcDNAを合成し、λgt11またはλZapの発現ベクターを用いてライブラリーを作成した。マウス、ラット肝よりエステラーゼ、サル肝よりP450、ヒト肝よりグルタチオンS-トランスフェラーゼと薬物代謝酵素として4種の新規cDNAのクローニングに成功した。薬物代謝酵素の細菌、酵母、哺乳動物細胞での発現得られたcDNAの発現の実験のなかで、平成5年度はエステラーゼの大腸菌での発現に成功した。ラット肝エステラーゼRL1のcDNAを大腸菌の発現ベクターであるpTrc99Aに組み込み、大腸菌に遺伝子を導入したところタンパクレベルでの発現が確認された。以上、平成5年度は薬物代謝酵素のcDNAクローニングに成功し、さらに一部ではあるが大腸菌での発現にも成功したので、平成6年度は複数の薬物代謝酵素の細菌、酵母、哺乳動物細胞での発現を試みる予定である。薬物代謝酵素のcDNAクローニング平成6年度は、薬物代謝酵素遺伝子を細胞に導入・発現させるために、エステラーゼ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、およびP450のcDNAクローニングを行った。

マウス、ラット肝よりエステラーゼ、サル肝よりP450、ヒト肝よりグルタチオンS-トランスフェラーゼと薬物代謝酵素として6種の新規cDNAのクローニングに成功した。薬物代謝酵素の哺乳動物細胞での発現得られたcDNAの発現の実験のなかで、エステラーゼの哺乳動物細胞での発現に成功した。すなわち、ラット肝エステラーゼRL1およびRH1,マウス肝MH1のcDNAを哺乳動物の発現ベクターであるpCR3に組み込み、哺乳動物培養細胞であるCOS7細胞に遺伝子を導入したところ、それぞれのアイソザイムに特異的な活性を維持したまま発現することに成功した。このように、薬物代謝酵素の機能を維持したまま哺乳動物細胞での発現に成功したことから、今後、細胞工学を基盤とした生命科学の研究に寄与するだけでなく、新薬の開発における薬理効果の判定や、毒性発現機構の解明に際し新たな試験系として資するところが多い。
抗酸化食品の積極的摂取と治療後の放射線皮膚炎回復の関連

本研究の目的は、放射線治療を受けた乳がん患者の皮膚状態と血清酸化/抗酸化ストレス状態へ積極的にトマトジュース摂取が効果をもたらすかを明らかにすることである。放射線治療後1ヶ月間毎日トマトジュース(160ml)を摂取させた。皮膚状態の指標は皮膚表面温(SST)と皮膚水分量(SMI)とした。血清酸化/抗酸化ストレス状態を決める指標はd-ROMsとBAPであった。測定ポイントは、放射線治療開始時、終了時、治療1ヶ月後、治療3ヶ月後とした。トマトジュースを1ヶ月間摂取した後の治療3ヶ月後では皮膚表面温は上昇しているが、水分量も上昇していた。d-ROMsとBAPは測定期間を通して変化はなかった。本研究は、がん放射線治療を受けた患者の治療後の放射線皮膚炎と酸化ストレス度d-ROMs(Reactive Oxygen Metabolites-derived compounds)と抗酸化力を示すBAP(biological antioxidant potential)と抗酸化食品摂取の関連を解析し、放射線皮膚炎の慢性的な回復過程を解明すること、抗酸化食品の摂取が放射線皮膚炎の回復過程に効果があるのかを明らかにし、がん放射線治療を受けた患者の慢性経過を追跡することを目的としている。26年度は、以下の計画のもと実施した。1.倫理委員会への申請:1)研究開始にあたり、研究課題について倫理委員会に申請し審査を受けた。研究代表者所属の倫理委員会で承認された。2)共同研究契約の締結。3)臨床研究実施施設の倫理委員会へ申請し承認された。2.乳がん患者の放射線皮膚炎の慢性経過の実態の把握:1)乳がん患者の放射線治療中、治療後の放射線皮膚炎の評価1CTCAE判定。2照射野の皮膚表面温度、皮膚水分量、皮膚紅斑、メラニンの測定。サーモグラフィ撮影。2)細胞レベルのダメージの評価1回復の指標としてd-ROMs、BAPを測定。2超音波エコーで照射野/健側の皮膚厚比を計測。3.末梢血単核球に対する抗酸化食品摂取の放射線防護効果の解析:健常ボランティアの採血をトマトジュース(リコピン約20mg含有)摂取前、3週間連日のトマトジュース摂取後、その後引き続いての3週間連日トマトジュース非摂取後の計3回行う。血清中酸化ストレス関連マーカー(d-ROMs、BAPなど)および血中カロテノイド濃度と微小核形成試験(MNT)を行う。MNTでは、0Gy(コントロール)、100mGy、0.5Gy、2Gy照射した全血を用いる。放射線照射による酸化ストレスと細胞核損傷について検討した。本研究は、がん放射線治療を受けた患者の治療後の放射線皮膚炎と酸化ストレス度d-ROMs(Reactive Oxygen Metabolities-derived compounds)と抗酸化力を示すBAP(Biological Antioxidant Potential)と抗酸化食品摂取の関連を解析し、放射線皮膚炎の慢性的な回復過程を解明すること、抗酸化食品を摂取することが放射線皮膚炎の回復過程へ効果もたらすのかを明らかにし、がん放射線治療を受けた患者の慢性経過を追跡することを目的としている。26年度は所属施設の倫理委員会の申請と食事調査票の作成準備と対象施設の選定を行った。また、データ収集対象施設への倫理委員会申請準備を行った。27年度はデータ収集施設の倫理委員会の承認を受け、データ収集を開始したが、対象となる乳がん患者が少なく、データ収集が難航した。また、データ対象施設の医師の都合により、施設を変更することになったため、新たな施設への倫理委員会へ申請し、データ収集を開始することになった。対象施設の変更に伴い、研究方法の見直し、測定項目の見直しを行った。初年度は、当初から倫理委員会の申請と食事調査票の作成を予定していた。倫理委員会申請については計画通り達成できた。また、抗酸化食品の摂取効果を検討するために、末梢血単核球に対する抗酸化食品摂取の放射線防護効果の解析を研究内容に追加した。2年目は所属施設の倫理委員会の承認を受け、また、データ収集施設の倫理委員会の承認も受け、データ収集を開始したが、担当医の都合で対象施設でのデータ収集が不可能になり、データ収集施設を変更した。変更に際し、新たな対象施設での倫理委員会に申請し、承認を得た。今後はこの施設でデータ収集を行っていく。また、対象施設が変更になったため、これまで放射線皮膚炎の客観的指標として使用していたデバイスを使用することができなくなったため、新たなデバイスで測定、測定項目の見直しを行うことになった。当初の対象施設では対象者が少ないこと、継続したデータが収集できなかったことから、論文化に至らなかった。しかし、新たな対象施設では順調にデータ収集ができている。また、末梢血単核球に対する抗酸化食品摂取の放射線防護効果については解析が済み、論文作成中である。本研究は、がん放射線治療を受けた患者の治療後の放射線皮膚炎と酸化ストレス度d-ROMs(Reactive Cxygen Metabolities-derived compounds)と抗酸化力を示すBAP(Biological Antioxidant Potential)と抗酸化食品摂取の関連を解析し、放射線皮膚炎の慢性的な回復過程を解明すること、抗酸化食品を摂取することが放射線皮膚炎の回復過程へ効果をもたらすのかを明らかにし、がん放射線治療を受けた患者の酸化ストレス度と抗酸化力を追跡することを目的としている。平成28年度は、データ収集を本格的に実施し、対象となる乳がん患者の協力を得ながら、データ収集を行った。データのそろっている4人についての結果を報告する。対象は乳房温存術後に放射線治療を受けた患者4人である。

放射線治療終了後から1か月間、トマトジュース(160ml、リコピン16mg含有)を飲んでもらった。測定ポイントは、放射線治療開始時、治療1週間後、治療後1か月後、治療後3か月後である。測定項目は、皮膚状態と血清酸化ストレス状態である。皮膚状態は、皮膚表面温度と水分量とし、放射線治療側から対照側を引いた値を用いた。酸化ストレス状態は、血清中のd-ROMsとBAPを指標とした。皮膚表面温、水分量は放射線治療後1ヶ月で最も低かった。トマトジュースを1ヶ月間摂取した後の治療後3か月後では皮膚表面温は上昇しているが、水分量も上昇していた。d-ROMsとBAPは測定期間を通して変化はなかった。放射線治療終了後も酸化ストレス状態が継続していた。3か月後に皮膚表面温が再び上昇していることは放射線皮膚炎の悪化が懸念される。しかしながら、水分量が治療後3か月で上昇していたことは、皮膚状態は良好な傾向にあることが示唆された。本研究の目的は、放射線治療を受けた乳がん患者の皮膚状態と血清酸化/抗酸化ストレス状態へ積極的にトマトジュース摂取が効果をもたらすかを明らかにすることである。放射線治療後1ヶ月間毎日トマトジュース(160ml)を摂取させた。皮膚状態の指標は皮膚表面温(SST)と皮膚水分量(SMI)とした。血清酸化/抗酸化ストレス状態を決める指標はd-ROMsとBAPであった。測定ポイントは、放射線治療開始時、終了時、治療1ヶ月後、治療3ヶ月後とした。トマトジュースを1ヶ月間摂取した後の治療3ヶ月後では皮膚表面温は上昇しているが、水分量も上昇していた。初年度は、当初から倫理委員会の申請と食事調査票の作成を予定していた。倫理委員会申請については計画通りに達成できている。しかし、食事調査票については正確さを追求すると対象者に負担がかかり、介入が完遂されない。簡易で負担のない調査票を作成したが、調査票の有効性を含めて27年度の抗酸化食品を積極的に摂取した結果のデータを収集しながら、修正を行う必要がある。一方で、抗酸化食品の摂取効果を検討するために、末梢血単核球に対する抗酸化食品摂取の放射線防護効果の解析を研究内容に追加した。解析途中であるが、研究課題を探求するためには重要な研究となる。最終年度は、新たな対象施設でデータ収集を重ね、分析し、論文化していく。研究方法・測定項目が一部変更したため、1施設でのデータで解析を行っていく。看護学倫理委員会から承認を受けた施設のデータ収集を開始する。1.乳がん術後放射線療法を受けた患者に研究協力を依頼し、データを収集していく。機器を使用したデータ収集については、施設が限定されるため、機器を使用しないデータ、例えばCTCAE判定やd-ROMs、BAPのみの実施も視野に入れ、研究を進めていく。
各種藍草からの安定的かつ効率的なインジゴ生成法の確立と残滓色素の有効利用

インジゴ生成において、加水分解酵素の活性を促す方法および藍葉の段階での酸化カップリング反応を促進する方法の有効性を、処理藍葉に含まれるインジゴ量から検討した。ドライヤー乾燥、手揉みや叩くなどの処理をすることで藍草に含まれるインジゴ量が増加した。次に乾燥藍葉を沈殿藍やすくもに加工せず、粉砕して直接染色に用いることが可能かどうかを検討した。その結果、この方法が非常に有効で、藍による染色工程を簡略化できることが明らかになった。また、天然藍から沈殿藍を製造後の残滓色素の有効利用について検討し、すくも作製と堆肥としての利用の可能性を見出した。藍草に含まれるインジカンをインジゴに変える酵素インジカナーゼの活性を促す方法を検討し、最も簡単確実なインジゴ生成法を確立するために、藍草5種類(琉球藍・タデアイ・ナンバンコマツナギ・ウォード・ミャンマーのナンバンコマツナギ)を用い、インジカンとインジカナーゼの接触(叩く・揉む)、光(天日乾燥・日陰乾燥)、熱(ドライヤー乾燥・アイロン乾燥)の影響を処理後の藍草内のインジゴ量測定により検討した。インジゴ量測定は処理藍草を乳鉢で粉砕後目開き125μmの篩に通して粒子を微細化して得た粉末0.01gにN,N-ジメチルホルムアミド(DMFと略称)2mlを加え、攪拌しながら抽出液が透明になるまで繰り返し全量を50mlとし、インジゴが示す最大吸収波長611nmの吸光度を測定した。各種藍草の抽出時間のよる吸光度変化を補正し、合成インジゴと市販粉末インド藍のインジゴ量を100とした時のそれらに対する各種藍草のインジゴ含有率(%)を算出した。その結果、琉球藍やタデアイでは611nmにインジゴの吸収ピークを見ることができるが、ナンバンコマツナギではその吸光度は小さく、葉自体のインジゴ量が少ないと判明した。また、ミャンマーのコマツナギやウォードでは611nmよりも660nmの値が高かったため、インジゴよりもクロロフィル(葉緑素)が多いと考えられた。各種藍葉のインジゴ含有量には差があり、さらに同じ藍草でも処理方法の違いによって得られるインジゴ量が変化した。ドライヤー乾燥、手揉みやたたくなどの処理をすることで藍葉に含まれるインジゴ量は増加した。一方で、アイロンや熱湯処理、45°C乾燥などは酵素を失活させる原因となりインジゴ量は減少した。沈殿藍製法を琉球藍葉およびナンバンコマツナギ品種藍葉において沖縄本島と石垣島で調査した。琉球藍葉の発酵安定のための漬け込み時間はナンバンコマツナギ藍葉に比し長く、気温18l9°Cでは72時間、気温2324°Cでは48時間、気温25°Cでは36時間、ナンバンコマツナギ藍葉では気温2830°Cでは1920時間であった。使用するアルカリ剤は消石灰で、藍草の3.55%、藍草の品種、栽培地の気温により攪拌方法、静置時間にも大きな差があった。沈殿藍作製後の残滓藍葉の活用の可能性を探るために、ナンバンコマツナギ残滓からスクモ、琉球藍残滓から堆肥を作成し、インジゴが示す611nm付近の吸収の有無を調べた結果、インジゴが示す611nm付近の吸収が存在した。沈殿藍作製後のナンバンコマツナギ残滓からのスクモ作成は有効であるが、琉球藍残滓からの堆肥中にはクロロフィルの存在が多かった。琉球藍残滓は堆肥として活用できるが、本土に比べて温度の高い沖縄ではすぐに腐敗し虫の発生もあり琉球藍残滓からのスクモ作製は解決すべき点が多い。藍草に含まれるインジゴは泥藍やすくも藍に加工して染色に用いられるが、多くの手間と精巧な技術が必要なため一般には普及し難い。乾燥藍葉を前述の加工をせず染色に用いる方法を検討し、藍製造行程を簡略化するとともにと新たな染色方法を検討した。得られた結果は、以下のとおりである。1)乾燥藍葉の粉砕粒子の大きさは染着量K/S値および染色物の色相に大きな影響を与えないが、微粉末にすることにより扱いやすくなる。2)アルカリ・還元浴作製はNaOH:0.6g/L、ハイドロ:1.5g/Lが適切である。3)染色時間は10分間で染着量はほぼ一定になる。4)染浴温度は2460°Cでは染着量K/S値に大きな影響を及ぼさず、染浴温度の上昇と共に僅かに減少する。5)別浴で染色すると、染色回数の増加に従い染着量は直線的に増加した。