hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
経皮ペプチド免疫療法によるヒトの悪性黒色腫治療

我々は、進行期悪性黒色腫患者に対して、皮膚に腫瘍抗原ペプチドを貼付することでランゲルハンス細胞を介して腫瘍特異的細胞障害性T細胞(CTL)を誘導し、抗腫瘍効果発揮することを狙った治療、即ち経皮ペプチド免疫療法を行い、生命予後の改善効果がみられた。経皮ペプチド免疫療法(PPI)は、角質層を剥離した皮膚にペプチドを貼付することによって強力な細胞障害性リンパ球(CTL)反応を誘導する簡便で非侵襲的な免疫アプローチである。我々は、角層バリア破壊後のヒトの皮膚では、表皮のランゲルハンス細胞はHLAと活性化分子の発現を増強して機能的に成熟し樹状突起の数を減らして遊走することを示した。さらにHLAクラスI拘束性の抗原ペプチドをもちいたPPIによりMHC-ペプチドテトラマー/ペンタマー陽性でIFN-γ産生性のCD8+細胞が末梢血中に出現した。これらの結果をもとにPPIをヒト悪性黒色腫の治療に応用し、より効果的な手技手法の開発と治療条件の検討を行うことを目的とする.我々は、進行期悪性黒色腫患者に対して、皮膚に腫瘍抗原ペプチドを貼付することでランゲルハンス細胞を介して腫瘍特異的細胞障害性T細胞(CTL)を誘導し、抗腫瘍効果発揮することを狙った治療、即ち経皮ペプチド免疫療法を行い、生命予後の改善効果がみられた。我々は、角層バリア破壊の後のヒトの皮膚では、表皮のランゲルハンス細胞はHLAと活性化分子の発現を増強して機能的に成熟し樹状突起の数を減らして遊走することを示した。さらにHLAクラス1拘束性の抗原ペプチドをもちいたPPIによりMHC-ペプチドテトラマー/ペンタマー陽性でIFN-γ産生性のCD8+細胞が末梢血中に出現した。メラノーマ関連のペプチドを用いたPPIによる実際の臨床試験では、7人のメラノーマ患者のうちの4人で病変のサイズを減らしたり腫瘍の更なる出現を抑制した。これらの臨床的効果は、縮小しつつある病変にテトラマー/ペンタマー陽性でin vitroにおける細胞障害性活性を有するCD8陽性T細胞が浸潤することによりもたらされることがわかった。PPIの副作用としてはメラノーマ患者での、白斑の出現を除いて、局所的にも全身にも毒性または自己免疫性を誘導しなかった。これらの結果からPPIは癌治療の臨床における新しい治療戦略となり得ることが示された。今後は、さらに多くの症例にたいして治療を行い、個々の症例においてPPIが効果を発揮しやすい条件や、効果が得られなかった症例においてどのような阻害因子が関与しているのかを検討し、最も効果的な手技、方法を確立していく方針である。経皮ペプチド免疫療法(PPI)は,角質層を剥離した皮膚にペプチドを貼付することによって強力な細胞障害性リンパ球(CTL)反応を誘導する簡便で非侵襲的な免疫アプローチである。我々は,角層バリア破壊の後のヒトの皮膚では,表皮のランゲルハンス細胞はHLAと活性化分子の発現を増強して機能的に成熟し樹状突起の数を減らして遊走することを示した。メラノーマ関連のペプチドを用いたPPIによる実際の臨床試験では,7人のメラノーマ患者のうちの4人で病変のサイズを減らしたり腫瘍の更なる出現を抑制した。これらの臨床的効果は,縮小しつつある病変にテトラマー/ペンタマー陽性でin vitroにおける細胞障害性活性を有するCD8陽性T細胞が浸潤することによりもたらされることがわかった。PPIの副作用としてはメラノーマ患者での,白斑の出現を除いて,局所的にも全身にも毒性または自己免疫性を誘導しなかった。今後は,さらに多くの症例にたいして治療を行い,個々の症例においてPPIが効果を発揮しやすい条件や,効果が得られなかった症例においてどのような阻害因子が関与しているのかを検討し,最も効果的な手技,方法を確立していく方針である。我々の開発した腫瘍ペプチドを用いた経皮免疫療法(PPI)は、簡便で非侵襲的に抗腫瘍細胞傷害性T細胞(CTL)を誘導する画期的な免疫治療である。これを用いてこれまで第III/IV病期の悪性黒色腫患者25名に対し、臨床試験を行った。被験者は、我々の保有する腫瘍ペプチドと特異的に結合するHLAハプロタイプ,すなわちHLA A0201またはA2402をもつ20歳以上の悪性黒色腫患者で、Europe cooperative oncology groupによるperformance statusが1以下、中枢神経または肝臓への転移を認めないものとした。PPI治療により多くのCTLが誘導された例は、腫瘍の縮小効果が顕著であった。第III病期であった78歳の女性例では、右下腿に多数の皮下結節を呈し、これがすべて悪性黒色腫の皮膚転移であったが、PPI療法施行後2回目より、これらの皮下結節はすべて消失していった。本患者の末梢血中のペプチド特異的CTLをテトラマーを用いてフロサイトメーター解析すると、200300個/10000CD8陽性細胞と多数認めた。また、PPI施行中に皮下結節を採取し、その浸潤T細胞を調べると、浸潤細胞の5%以上がペプチド特異的CTLであった。

患者プロファイルの偏りはあるが、従来の本施設における第IV病期8名とその予後を単純に比較すると、PPI治療群の方に延命効果がみられた。また、PPI治療の回数が7回以上である場合と7回未満とで比較すると、有意に7回以上免疫した群に延命効果がみられた(Kaplan-Meier法,p<0.0001)。内臓/骨転移群は、リシパ節にのみ転移がとどまる患者よりも予後が悪かった(Kaplan-Meier法,p=0.0373)。これらの結果より、PPI治療は、第III/IV期の悪性黒色腫の近未来的治療のオプションと成りうる可能性を示唆させる。我々の開発した腫瘍ペプチドを用いた経皮免疫療法(PPI)は、簡便で非侵襲的に抗腫瘍細胞傷害性T細胞(CTL)を誘導する画期的な免疫治療である。これを用いてこれまで第III/IV病期の悪性黒色腫患者30名に対し、臨床試験を行った。被験者は、我々の保有する腫瘍ペプチドと特異的に結合するHLAハプロタイプ,すなわちHLA A0201またはA2402をもつ20歳以上の悪性黒色腫患者で、Europe cooperative oncology groupによるperformance statusが1以下、中枢神経または肝臓への転移を認めないものとした。途中脱落や死亡などで効果判定できなかったケースを除き、2010年2月時点で5回以上の治療を受け効果判定可能であった26例においては25例で貼付ペプチドのいずれかのCTLが誘導されていた。また、PPI施行中に皮膚転移を生じた1例で、その転移巣を切除し、浸潤細胞を調べると、CD45陽性細胞の24.3%がCD8陽性であり、さらにその23.8%がペプチド特異的CTLであった。内臓/骨転移群は、リンパ節にのみ転移がとどまる患者よりも予後が悪かった(Kaplan-Meier法,p=0.0373)。
パテントプールの法技術を応用した環境技術の国際移転モデルの構築

途上国の環境悪化及び周辺諸国への影響は我が国にとっても深刻な問題である。世界の多くの地域では、環境技術の導入や普及が進んでおらず、自力での環境改善が難しい状態にある。このような現状を踏まえ、国際機関、民間企業及び非営利組織は様々な法技術を利用して環境技術移転のプラットフォームを形成してきたが、本研究はその歴史的な発展及び既存のプラットフォームの成否、他の技術分野での取組から学ぶべき点を抽出した。その上で、今後の国際環境技術移転プラットフォームの形成と技術移転の促進に関する提言を、技術移転当事者の利用できる法技術及びライセンス契約の促進のための法規制のあり方という観点から行った。本研究は、地球環境問題の解決のため、環境技術を有する先進国から新興国・途上国への円滑な技術移転を支える国際技術移転のための新たなパテントプール・プラットフォームを形成し、それを機能させるための国際的枠組みに関する提言を行うことを目的としている。パテントプールの法技術の応用は従前より試みられてきたが、未だ萌芽的な段階にあり、実績は乏しい。本研究は、従前の取り組みの問題点を洗い出し、それを改善し、またその実現を阻害する新興国・途上国の国内法的な阻害要因を除去して、新たな技術移転プラットフォームを機能させるための国際的な枠組みに関する提言を行うものである。今年度は、主に判例・法令・政策文書・公開されているデータ等の一次文献及び他の研究者によって書かれた二次的文献の講読と、国際学会参加による情報収集、政策担当者や実務家へのインタビューを通じて研究を行った。文献の多くは勤務先である東大から利用可能なデータベースおよびミュンヘンのマックス・プランク研究所図書館を通じて収集した。研究対象として扱った中国・米国・ドイツに関してはフィールドワークを行い、裁判官、研究者、実務家等からの情報収集を行った。また、実際に環境保護に資する原子力技術の国際的なライセンシング・プラットフォームの形成を検討している国際原子力機関と連携し、そのプラットフォーム形成の準備過程に参画することで、実務上の課題に触れ、その解決策を模索した。本年度行った研究の一部は、研究代表者の博士論文の一部として発表したほか、2016年11月に開催された国際原子力機関主催の国際学会においても口頭発表を行った。本年度は(i)これまでの枠組が不十分な成果しかもたらしてこなかった原因の分析、(ii)環境技術の国際移転を支えるライセンシング・プラットフォームの構想、(iii)国際的なライセンス規制の制定の経緯、現状に対する評価、(iv)日本、中国・欧州・ガーナのライセンス関連の国内法の制定の経緯、現状に対する評価、(v)国内法における問題点の洗い出し、を行った。このうち、(iii)及び(iv)は、(v)の前提条件として研究が必要であるとの考えから、計画よりも研究内容を広げたものである。(i)これまでの環境技術の国際移転の枠組:90年代以降に誕生したライセンシング・プラットフォームを10例検討し、その歴史的背景、応用可能性及び今後の実務の発展の展望について検討した。その結果、プール・ライセンシングの手法が分野を超えて普及しており、非営利目的での利用も進んでいること、また技術移転に止まらず、南北間での共同技術開発のための知財プラットフォームも作られていることが明らかになった。(ii)環境技術の国際移転を支えるライセンシング・プラットフォームの構想:形成途上の環境技術の国際共同研究プラットフォームに関わる技術者及び国際機関の担当者を対象にヒアリングを行い、研究の結果生まれた技術の国際ライセンシングによる移転・普及までをカバーするプラットフォームを、パテントプールの形成・管理手法を取り入れることで実現するというモデルを構築した。(iii)国内法における問題点の洗い出し:中国及びガーナにおける国内法の調査を行った結果、我が国や欧米で一般的なライセンス契約内容であっても、途上国の国内法によって違法とされる可能性があることが明らかにされた。途上国への技術移転はもとよりリスクが高く、さらに独自の規制への対応を求められると、非営利目的のプロジェクトであれば特に、技術移転の実現は難しくなる。(iv)国際的な実現の枠組:TRIPS協定の下では、技術ライセンシングの規制は各国の裁量に委ねられている。しかし、過度な規制や国際的な規制の不調和は技術を保有する企業が途上国への技術移転をためらう理由となる。そのため、技術移転の促進のためには、途上国のライセンシング規制改革は大変重要な意味を持つ。国際機関や外国特許庁による法整備支援は、先進国企業にとっても技術移転を含む投資を行う環境を整えるものであり、途上国にとっても、新しい技術を取り入れて発展できる契機となるであろう。今後は、上記の研究成果を踏まえて、(vi)国際法・国内法の現行法上の規制を遵守しつつ実効的なプラットフォームを実現をするための国際的な実行の枠組のあり方、並びに(vii)実務上の慣行と法律(特に途上国国内法)との不調和を最小限に抑えるような法制度の提言を行う。

昨年度に引き続き各国の知的財産法専門家と協力して実務の最新の動向を把握し、研究の成果を論文にまとめて査読付き英文誌に投稿する予定である。29年度が最終年度であるため、記入しない。知的財産法29年度が最終年度であるため、記入しない。
胚盤胞補完法を利用したマウス多能性幹細胞を用いた肺再生

ゲノム編集技術であるCRISPRA/CAS9により肺形成に関与する遺伝子であるFgf10遺伝子に変異を導入した。これによりホモ変異である肺欠損モデルマウス胚を作成し一部は実際に肺が欠損することを組織切片と造影マイクローCTで確認した。残りの胚には胚盤胞補完法を利用しEGFP陽性ES細胞を注入し、キメラマウスを作成した。このキメラマウスについて肺の組織学的検討を行い、また元々の胚におけるFgf10の遺伝子型について確認を行った。キメラマウスの組織学的探索において肝細胞がES細胞由来であることを示すEGFPの蛍光が少ないことが判明した。そこで肝細胞を単離し、セルソーターでEGFP陰性細胞をソーティングし、そこからDNAを抽出して胚盤胞自体の遺伝子型がホモ変異しているものがあることを確認した。肝細胞の単離には各種文献報告を参考としたが、同じキメラマウスから心肺も摘出するため、還流液の注入方法などの手技を確立するのに時間を要した。実験を簡便化させるため、肺欠損モデルマウスの遺伝子型を複合ヘテロとして同様に実験を行った。複合ヘテロ胚の作製および肺欠損することの確認はホモ変異モデルと同様に組織学的および造影マイクロCTで確認した。胚盤胞補完法を利用したキメラ作成には挑んでいるが、従前の実験内容とは異なり、原因は不明だがキメラマウスの生存率が不十分であり、解析に時間がかかっている。今後もキメラマウス作成を繰り返し行い、生存したキメラマウスを用いて遺伝子型の解析を行い、複合ヘテロモデルにおいてもES細胞由来の肺が作成できることを示す予定である。複合ヘテロモデルを用いた実験系統において、キメラマウスの生存個体が少なく十分な数を得られないことが遅延の原因となっている。胚盤胞補完法を利用し、複合ヘテロマウス胚へのES細胞の注入を繰り返し行い、できるだけ多くのキメラマウスを確保する。実験に使用する物品費として使用した。学会発表に要するような旅費や論文投稿に伴う構成費などは今後かかるものと予想される。
遺伝子改変動物を用いたオステオアクチビンの肝発癌・線維化に及ぼす影響の解析

オステオアクチビン(OA)が肝線維化ならびに肝発癌におよぼす影響を検討するために以下のような検討をおこなった。1.肝臓特異的にOAを強発現するトランスジェニックラットの作成に成功した。2.上記トランスジェニックラットにコリン欠乏食を投与することで肝線維化発癌モデルを作製し、肝線維化におよぼす影響を画像的評価ならびにハイドロキシプロリン含有量を指標として検討した結果、OA強発現が線維化を抑制する可能性が示唆された。3.活性化星細胞に関する検討では、OA強発現はその活性化星細胞の数を減少させる結果をえた。4.上記トランスジェニックラットから得られた肝組織を用いてマイクロアレイ解析を行った。その結果OAの強発現で発現量が亢進・抑制される遺伝子プロファイルを得ることができた。5.4.で得られた結果よりOA強発現ではTIMP-1、-2やPDGFR-α、-βなどといった線維化のkeyとなる分子の遺伝子発現が抑制されていることを確認し、うちTIMP-1とPDGFR-αのタンパク発現も抑えられていることを確認した。上記よりOA強発現は肝線維化を抑制し、その作用は肝線維化に寄与する遺伝子の発現抑制と関連することを見出すことができた。コリン欠乏アミノ酸置換(CDAA)食をTGラットに12週間投与すると,OA強発現により肝線維化の抑制が認められた.肝組織の線維化面積,肝組織ハイドロキシプロリン含有量ともにTGラットで低い値が得られた.また,生化学的検査では血中ALT値(TG>wild),LDH値(TG>wild),中性脂肪値(TG>wild),総コレステロール値(TG>Wild)に有意差を認めた.また前癌病変であるGST-P陽性結節の比較を行った.陽性結節はコントロール群で多い傾向にあったが,明らかな有意差は無かった.結節の面積はコントロール群と比較してTG群で有意に小さかった.CDAA食投与12週目の肝組織のマイクロアレイ解析により,コントロールラットに比較してOA-TGラットで発現が有意に抑制されていた遺伝子として,PDGFR, MMP関連遺伝子が抽出された.これらの遺伝子は肝線維化に関与することが報告されており,まずこれらの遺伝子発現についてRT-PCRやノーザンブロット法を用いて再確認中である.CDAA食投与1週目の肝組織のマイクロアレイ解析では現在のところ有意な所見を見出せていないが,生化学的検査では血中グルコース値(TG<Wild),中性脂肪値(TG>Wild)に有意差を認めた.また,同検体にて肝組織の中性脂肪含有量には有意差を認めなかった.CDAA食投与6ヵ月目の肝組織標本でも線維化面積はTGラットで小さかった.オステオアクチビン(OA)が肝線維化ならびに肝発癌におよぼす影響を検討するために以下のような検討をおこなった。
糖尿病と糖尿病性腎症の進展を抑制するプロテインSを増加させるPIポリアミドの開発

肝臓や内皮細胞で産生されるプロテインSは、抗血液凝固因子以外に、炎症やアポトーシスを抑制し、糖尿病と糖尿病性腎症の改善に重要な役割を持つが、糖尿病患者の血中では低下している。本研究ではプロテインSの転写活性を選択的に増加させて蛋白発現を増やすピロール・イミダゾール(PI)ポリアミドを分子設計および合成し、培養肝細胞等においてmRNAおよび蛋白の発現に対する効果を確認した後、共培養にて培養膵β細胞や腎メサンギウム細胞に対する保護効果を検討する。次いで糖尿病マウスにPIポリアミドを投与し、マウスの血糖値の改善や膵β細胞のアポトーシスの抑制、腎糸球体に対する保護作用について検討する。
抗原特異的免疫寛容の人為的導入法に関する解析

(1)抗マウスCD48(CD2リガンド)、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD29(β1)、CD49a(α1)、CD49b(α2)、CD49e(α5)、CD49f(α6)、CD40、CD40リガンド、Fasリガンド抗体、抗ラットCD86抗体、及び抗ヒトCD86、Fasリガンド抗体の作製に成功した。(2)抗LFA-1/ICAM-1、VLA-4/VCAM-1、CD2/CD48、あるいはCD80/CD86抗体の投与により、同種移植心、小腸、膵ラ島に対する寛容の導入が可能であった。(3)同種移植心に対する寛容は、抗LFA-1/ICAM-1投与では主にアロクラスI反応性CD8陽性T細胞の不活化によるのに対し、抗CD2/CD48の場合にはアロクラスII反応性T細胞のTh2型への偏りによりアロクラスI反応性CTLの誘導が阻害されており、また、抗CD80/CD86の場合にはクラスII反応性CD4陽性T細胞の不活化及びTh2偏向によるといったように、誘導法により異なる機序の関与が示唆された。(4)抗CD80/CD86抗体の投与により、骨髄移植後の急性GVHDの発症が阻止された。(5)抗LFA-1/ICAM-1抗体の投与により、マウス及びラットコラーゲン関節炎の系でコラーゲン特異的な寛容の成立による発症阻止が可能であった。(6)抗LFA-1/ICAM-1抗体の若年期における短期投与により、NODマウスにおける自己免疫性糖尿病発症の永続的阻止が可能であった。(7)抗CD80/CD86抗体の投与により、(NZB x NZW)F1マウスにおける自己抗体の産生及び腎病変が阻止された。(8)抗IL-12抗体の投与により、実験的自己免疫性ブドウ膜炎の発症が阻止され、その後のchal lengeにも抵抗性の寛容が成立した。(9)IL-12 antagonistであるIL-12p40遺伝子の導入により同種移植筋芽細胞の拒絶が抑制された。(10)IL-12p40遺伝子の導入により、同時に導入した遺伝子産物(β-gal)に特異的なCTLの誘導が抑制された。1.マウスCD2に対するリガンドがCD48であることを見い出し、抗マウスCD48抗体が抗マウスCD2抗体と同様な免疫抑制作用を有することを示した。2.抗マウスCD2抗体によるアロCTLの抑制は、標的細胞障害の抑制だけではなく、選択的にT_H2型の抑制性T細胞を誘導することに起因することを示した。3.抗CD2抗体と抗CD48抗体の組み合わせにより、マウス同種移植心に対する寛容の導入が可能であることを示した。4.抗CD3抗体に抗CD2抗体を組み合わせることにより、抗CD3抗体の副作用を軽減しつつ、マウス同種移植心に対する寛容の導入が可能であることを示した。5.抗LFA-1/ICAM-

1抗体の投与により、マウス同種移植膵島に対する寛容の導入が可能であることを示した。6.抗VLA-4/VCAM-1抗体の投与により、マウス同種移植心に対する寛容の導入が可能であることを示した。7.抗LFA-1/I抗体の投与により、マウスコラーゲン関節炎の発症が阻止されるだけではなく、II型コラーゲンに対する寛容が成立することを示した。8.NODマウスに抗LFA-1/ICAM-1抗体を幼仔期に投与すると、自己抗原に対する寛容が成立し、発症が阻止されることを見い出した。9.CD28に対するB7以外の第2のリガンドとしてB70を見い出し、そのcDNAを単離し、抗体を作製した。また、免疫反応の初期においては、B7よりもB70の方が重要であることを示した。10.マウスB7,B70,CD40,CD40リガンドに対する単クローン抗体を作製した。(1)抗LFA-1/ICAM-1抗体の投与により、同種移植小腸に対する寛容の導入が可能なことが明らかになった。(2)抗LFA-1/ICAM-1抗体の投与により導入された同種移植心に対する寛容においては、アロクラスIIに対する反応性は保持されているが、アロクラスI反応性T細胞が不活化されているため、クラスIのみを発現している同種移植心の拒絶が起こらないことが明らかとなった。(3)抗CD2/CD48抗体の投与により導入された同種移植心に対する寛容においては、アロクラスII反応性T細胞が産生するリンホカインにTh2型への偏りが認められ、これらの抑制性サイトカインによりアロクラスI反応性CTLの誘導が阻害されていることが明らかとなった。(4)マウスB7(B7-1)及びB70(B7-2)に対する単クローン抗体の作製に成功し、同種移植心に対する寛容の導入にはこの両者の抗体が必要なことを明らかにした。(5)若年期に短期間の抗LFA-1/ICAM-1抗体の投与により、NODマウスにおける自己免疫性糖尿病の発症が永続的に阻止されることを見い出した。(6)ラットのコラーゲン関接炎の系で、抗LFA-1/ICAM-1抗体の投与によりコラーゲンに対する寛容が成立し、永続的に発症が阻止されることが示された。(1)抗LFA-1/ICAM-1及び抗B7-1/B7-2抗体の投与により、同種移植小腸に対する寛容の導入が可能なことが明らかになった。(2)抗B7-1/B7-2抗体の投与により導入された同種移植心に対する寛容においては、アロクラスIIに対する反応性が低下するとともに、Th2型への偏り、及びCTL前駆細胞の減少が認められ、抗LFA-1/ICAM-1抗体の投与により導入された寛容の場合と大きく異なることが示された。(3)抗LFA-1/ICAM-1及び抗B7-1/B7-2抗体の投与により導入された同種移植心に対する寛容はIL-2の投与、抗IL-4/IL-10抗体の投与、宿主と同系の未処置マウス由来リンパ球の移入、あるいは心筋炎誘発性のCoxsakie B3ウイルス感染により破錠せず安定であった。(4)抗B7-1/B7-2抗体により導入された寛容はCD4陽性T細胞によって移入されたが、抗LFA-1/ICAM-1抗体の場合にはCD8陽性T細胞あるいはナイロン付着性のAPCによって移入されることが示された。(6)ヒト血管内皮細胞上には恒常的にCD86(B7-2)が発現しており、IFN-γ処理により発現するMHCクラスIIとともにアロCD4陽性T細胞を活性化すること、及び抗CD86抗体の添加によりアロクラスII反応性がanergyに陥ることが示された。(7)SLE様病変を生じる(NZB x NZW)
細胞膜透過性阻害剤を利用した局所的RNA脱メチル化反応の解析

細胞の発生や機能発現のためには適切な遺伝子発現制御が不可欠であり、エピジェネティクスに加えてRNAの転写後修飾(エピトランスクリプトミクス)が重要な要素として注目されている。神経細胞は複雑なネットワークを形成して様々な入力に応答するうえで遺伝子発現を時空間的に制御しなくてはならず、RNA修飾による局所的翻訳の調節機構の研究が進められている。mRNAに最も豊富に存在するN6-メチルアデノシン(m6A)は可逆的な修飾で、これまでにm6Aによる翻訳調節についての報告があるが、神経突起にはメチル化酵素・脱メチル化酵素の両方ともが存在している。そこで脱メチル化反応が局所的翻訳へ寄与しているのかどうかを、阻害剤を利用して解析することを計画した。mRNAに対するm6A脱メチル化酵素は2種類存在するため、基質特異性が明確で、かつ細胞透過性のある阻害剤の取得が本研究には必須である。今年度は候補化合物の一次スクリーニングおよび活性評価のアッセイ系構築を進めた。脱メチル化酵素活性のin vitro評価系を立ち上げ、薬理・生理活性物質ライブラリーおよびエピジェネティクス関連化合物ライブラリーのスクリーニングを実施し複数の候補化合物を見出した。同時にin silicoスクリーニングによって示唆された化合物についても阻害活性を検討した。さらにin vivo評価系として、培養細胞のゲノム編集により、それぞれの脱メチル化酵素のノックアウト細胞を構築した。目的の阻害剤取得のための一次スクリーニングにて、改良を加えるための候補化合物をいくつか見出すことができた。一般にin vitro評価系を利用して、類似の活性部位を有するタンパク質への非特異的作用の少ない化合物を選定することは可能であるが、その後の細胞内でのm6A脱メチル化酵素それぞれに対する特異的阻害効果を具体的に評価した報告はこれまでなかった。今回ノックアウト細胞を作成し新たなツールを得たことは成果であり、今後の研究推進に大いに役立つと期待される。その一方で、一部のin vitro評価系の構築と神経細胞を使った観察系の構築は完了しなかったので、やや遅れている、とした。化合物のタンパク質特異性を評価するためのin vitro評価系について、FTO、ALKBH5以外の評価系の構築を完了させる。同時並行で前年度に構築したKO細胞を使ってin vivo評価を行い、神経細胞に投与可能な化合物選択の精度を上げる。目的の阻害剤を取得するために一次スクリーニングで得た候補化合物と脱メチル化酵素の結合様式をシミュレーションし、酵素特異性を上げるための改良を試みるとともに、細胞膜透過性を高めるためのデザインを行い、二次スクリーニングを進める。また神経細胞の形態観察の系を構築する。スクリーニングのための化合物の購入に物品費の大半をあてる予定にしていたが、連携研究者の協力によってその費用が大幅に削減された。その結果、共通機器利用料の支出もなかったため。未使用額は今年度の化合物(単品、ライブラリー)購入や、化合物合成のための試薬および共通機器利用料にあてる。
医療用X線撮像装置システムの総合評価関数ソフトウエアの開発

本研究の目的はX線画像の画質と被曝線量を撮影条件で制御するために、画質の物理的要因の定量値と被曝線量を撮影条件の関数として作成し、それらを組み込んだX線撮像システムの総合評価関数とそのソフトウエアを開発することである。1.X線撮像システムの総合評価関数の開発(1)人体を模擬したアクリルファントムに画像信号として低コントラストの被写体を埋め込み、それを撮影し、被写体コントラストと被写体の鮮鋭度を示すoverall MTF(modulation transfer function)の管電圧依存性を測定した。その結果、二つの定量値は大きく管電圧に依存することがわかった。(3)(2)の結果をさらに調べるために、散乱X線のMTFを求める方法とoverall MTFを直接線成分と散乱X線成分に分離する方法を開発した。その結果、低周波数領域で散乱線が大きく影響を与えていることがわかった。散乱X線量は患者の体厚と撮影距離に依存することから、これらは鮮鋭度に大きく影響を与えると言える。(4)散乱X線によるボケを考慮したX線撮像システムの総合評価関数を開発した。総合評価関数には画質の物理的要因の定量値、被写体コントラスト、overall MTF、そして、皮膚呼吸線量の撮影条件依存性の関数を含む。2.X線撮像システムの総合評価関数ソフトウエアの開発総合評価関数ソフトウエアをパーソナルコンピュータ上で開発した。3.今後の展開本研究の結果から患者の体厚と撮影距離は鮮鋭度に大きく影響を与えることが示唆された。したがって、実際の医療に適用するためには、患者の体厚と撮影距離を考慮した総合評価関数を開発する必要がある。本研究の目的はX線画像の画質と被曝線量を撮影条件で制御するために、画質の物理的要因の定量値と被曝線量を撮影条件の関数として作成し、それらを組み込んだ撮像システムの総合評価関数とそのソフトウェアを開発することである。その目的のために本年度は画質の物理的要因の定量値測定、被写体の減弱曲線測定、被曝線量測定を行った。1.画質の物理的要因の定量値測定(2) X線画像の粒状の一つである量子モトルのウィナースペクトルとMTFとの関係はスクリーンの厚さに依存することを実験と理論で示した。(3)コントラストの定量値である特性曲線は管電圧50-100kVの間ではほとんど形に変化がないことを実験と理論で示し、管電圧40kV以下では形が変化しうることを理論的に示した。(4)濃度依存性において両面乳剤と片面乳剤のウィナースペクトルの関係を究明した。2.被写体の減弱曲線測定アクリル板を被写体とし、半導体検出器を用いてX線スペクトルを測定し、減弱曲線をいろいろな管電圧で測定した。3.被曝線量測定アクリル板に入射するX線スペクトルとアクナル板の表面での後方散乱係数を測定し、表面での吸収線量をいろいろな管電圧で求めた。次年度は被写体内の吸収線量分布も求め、実質的な被曝線量を求める予定である。(2)散乱X線の被写体鮮鋭度に及ぼす影響を調べるために、X線管焦点のMTFを測定し、(焦点のMTF)×(画像検出器のMTF)とoverall MTFを比較した。その結果、散乱X線が各空間周波数で異なる影響を与えることがわかった。
農村地域における農業用水の多面的機能の評価に関する研究

地域用水に関する研究は,多面的機能の実態把握を中心として農業用水単独を対象にしており,農業用水とそれ以外の利用可能水との関係性が論じられることは少なかった.しかし地域用水整備にあたっては,地域の水源全体を考慮することが必要と考えられる.本年度は,琵琶湖沿岸に位置する滋賀県湖北町を事例に,地域の水源に占める地域用水の位置づけを示すことを目的として,暮らしの水に関するアンケート調査を各世帯1票の悉皆で行った(2,275世帯配布,有効回答率81.6%).その結果,湖北町全体でみると,水道普及後は川・水路の水利用の多様性が失われ,「庭への散水」や「防火用水」などの雑用目的に限られていることがわかった.集落別にみると,川・水路の水は雑用水としてほとんどの集落で利用されているが,琵琶湖側の集落ではその利用率が低く,地下水の利用率が高いことが示された.現在,当該地域において実施されている地域用水整備を含む農業水利事業では,用水系統の末端に位置する用水不足の集落も,すべからく集落内水路に水を流すことが目標とされている.しかし,在来の水利用を重視すれば,例えば末端に位置する琵琶湖側集落において,集落内水路に必ずしも水を流す必要はないと考えられる.通水するとしても,排水路へ落とされた灌漑用水を反復利用する以外に,地下水などを積極的に利用することが期待される.一方,雑用水として川・水路の水を使う理由は,「水道代を節約できるから」が「昔から使っているから」よりも卓越していた.すなわち,慣習的に使っているというよりむしろ実利性を見いだして使い続けてきたことが窺えた.さらに,自由回答からは「水はタダ」という価値観が依然として残っていることが示唆された.地域用水の受益に対する費用負担を非農家も含めた地域住民全体に求めるならば,少なくとも水道料金よりも低い料金設定をする必要があると思われる.地域用水に関する研究は,多面的機能の実態把握を中心として農業用水単独を対象にしており,農業用水とそれ以外の利用可能水との関係性が論じられることは少なかった.しかし地域用水整備にあたっては,地域の水源全体を考慮することが必要と考えられる.本年度は,琵琶湖沿岸に位置する滋賀県湖北町を事例に,地域の水源に占める地域用水の位置づけを示すことを目的として,暮らしの水に関するアンケート調査を各世帯1票の悉皆で行った(2,275世帯配布,有効回答率81.6%).その結果,湖北町全体でみると,水道普及後は川・水路の水利用の多様性が失われ,「庭への散水」や「防火用水」などの雑用目的に限られていることがわかった.集落別にみると,川・水路の水は雑用水としてほとんどの集落で利用されているが,琵琶湖側の集落ではその利用率が低く,地下水の利用率が高いことが示された.現在,当該地域において実施されている地域用水整備を含む農業水利事業では,用水系統の末端に位置する用水不足の集落も,すべからく集落内水路に水を流すことが目標とされている.しかし,在来の水利用を重視すれば,例えば末端に位置する琵琶湖側集落において,集落内水路に必ずしも水を流す必要はないと考えられる.通水するとしても,排水路へ落とされた灌漑用水を反復利用する以外に,地下水などを積極的に利用することが期待される.一方,雑用水として川・水路の水を使う理由は,「水道代を節約できるから」が「昔から使っているから」よりも卓越していた.すなわち,慣習的に使っているというよりむしろ実利性を見いだして使い続けてきたことが窺えた.さらに,自由回答からは「水はタダ」という価値観が依然として残っていることが示唆された.地域用水の受益に対する費用負担を非農家も含めた地域住民全体に求めるならば,少なくとも水道料金よりも低い料金設定をする必要があると思われる.
ＧＴ－Ｍａｐ等時空間解析システムを利用した木簡等出土文字資料分析の基礎的研究

本研究は、木簡等出土文字資料が内包している、時空間情報をデータ化して分析する手法を確立するための基礎的研究である。この目的のため、平城宮・京出土木簡の持つ時空間情報の整理・数値化を進めた。木簡の持つ時空間情報は大きく、木簡に記載された情報と、出土遺構に付随する情報がある。本研究では、1木簡に記載された地名情報の数値化、2木簡に記載された時間情報の整理、3木簡出土遺構の時間情報の数値化、4木簡出土遺構の空間情報の数値化、の4つの作業を進め、123の作業をほぼ完了した。また、これらの数値情報に基づく、時空間分析作業に着手した。平成24年度に実施した作業は大きく3つである。1木簡地名の抽出と、数値化作業:古代の行政地名(国・郡・鄕)のうち、国名についてはその国府所在想定地または国府関連遺跡などのリスト化を終了し、郡名については郡家遺跡がほぼ判明している遺跡についてはそのリスト化をおおむね終了した。また、リスト化した所在地の座標データを収集した。以上の作業により、木簡に記載された地名について、現在の段階で知られる地名のリスト化・数値化はほぼ終了したと考えている。なお、こうして作成した地名および地名数値化データの一部は、科学研究費補助金基盤S「木簡など出土文字資料釈読支援システムの高次化と綜合的研究拠点データベースの構築」で開発している木簡画像データベース・木簡字典に反映させ、公開した。2木簡出土遺構の数値データとしてのリスト化:近年の調査についてはほぼ見通しが立ちつつあるものの、古い時期の発掘調査データについては、測量基準のあり方が現在とは大きく異なる。こうした発掘調査については、現在数値化の方向性を模索中である。3木簡内容分析の基礎作業の一貫としての食品名整理作業:食品は表記方法が多様な上、現在とは呼称が異なるなどの問題が存在する。また、加工状況等によって、地理的に整理できる産地情報と、どの程度直接的に関連づけられるかというような点が変化するので、極力加工状況に関する情報も入手することが臨まれる。こうした点を解決するための基礎的な整理作業を、料理研究の立場から集積された情報を援用しつつ行った。古代の国・郡地名の数値データ化を行い、ほぼ終了した。郷以下の詳細地名は、一部について実験的に数値化を行った。また、平城宮・京内の木簡出土遺構の位置情報の整理を行い、数値化作業を行った。これらの情報は、奈良文化財研究所が公開している木簡画像データベース『木簡字典』を通じて公開し、地名情報から地図へのリンクにが可能になっている。本年度はさらに、これらの数値化データの時空間分析に着手した。平城宮内裏北外郭出土木簡群(国指定重要文化財)は、天平18年頃に一括して「廃棄」された木簡とされる。一方、木簡に記された「年紀」=木簡「作成」の年にはばらつきがあることが知られており、これらを木簡に記された「地名」と関連づけて分析する作業を行った。年代のばらつきは、地名と有意な関連性がある様相が確認されつつあり、既往の研究成果と整合性の高い見通しを得ている。以上から、この手法で、データ化を終えた木簡を分析すれば、これまで見落としていた新たな地名と年代の関連が見いだせることが、ほぼ確認できた。分析は、高田祐一氏が特許を有する分析支援システムによる。なお、当初予定していたGT-MAP等ではなく、本システムを採用した理由は、高田祐一氏が現在、研究代表者と同じ奈良文化財研究所に勤務しており、技術的支援を受けやすいためである。今年度は、主として1木簡記載地名を現地名に置き換える作業、2その地名に具体的な数値を付与する作業、の二つを行った。この作業は、当初計画の研究目的A各タグやデータに不足している情報の検討・補充と、B各木簡のデータに不足している項目の検討・補充に相当する。なお、当初計画ではSK820土坑出土木簡(特に塩荷札)についてのみこの作業を重点的に行うこととしたが、研究の効率や上記諸点の必要性が早期に確認されたことに鑑み、現時点でタグが付与されたデータに対しSK820出土木簡を優先しつつも、極力網羅的に作業を進めている。現時点では地名の置き換え作業が6割程度、数値化は数例をサンプル的におこなっている。また、既存のシステムに改良を加え、「木簡の構文・文字表記パターンの解析・抽出研究(若手研究(B)。研究代表者・馬場基)」で作成し、「木簡など出土文字資料釈読支援システムの高次化と綜合的研究拠点データベースの構築(基盤研究(S)。研究代表者・渡辺晃宏)」に反映させ、さらに情報を追加したデータを直接的に本研究に利用出来るようにした。

これは、当初計画の研究目的C関連データとの連携に必要なテーブルなどの検討・対策に相当し、一定の成果を得られたと言える。さらに、当初計画通り、「ボーンデジタル画像管理システムの確立に基づく歴史史料情報の高度化と構造転換の研究(基盤研究(A)。研究代表者・山家浩樹)」と成果を共有することで、データ蓄積の効率化も検討した。ただし。この点についてはまだ有効な方向性の確立には至っていない。なお、東日本大震災の影響により、当初研究費の執行を控えるようにとの通達を受け、作業着手が遅れてしまった。その結果、見通しより作業の進捗が遅れ、時空間分析ソフトGTーMapとGSーMapでの実験が行えていない。初年度に抱えた遅れを、完全には取り戻せていないと考える。情報の数値化やその整理作業はほぼ当初計画に追いつくことができた。また、データベースへの反映など、当初計画以上の成果も上がりつつある。木簡情報の整理作業は、計画通りもしくは当初計画を越えた進捗を見せつつあると考えている。一方、GT-MAP等を用いての実際的な分析実験が、当初計画通りには進んでいない。初年度の遅れを取り戻す作業を、基礎作業である情報整理・数値化を中心に進めたことが最大の理由と考えている。基礎的データの作成や、研究進展の為のシステム改良、また他の研究グループとの意見交換や成果共有のための検討は比較的順調に進めることができた。ただし、GTーMap・GSーMapなど時空間分析システムでの実験が遅れている。これは、年度当初、補助金執行を7割程度以内に留めるようにとの通達があったことにより、アルバイト雇用などを控えたため、作業の進捗が遅れ、年度後半での挽回を期したものの、アルバイト確保などに困難があったことが主たる原因である。次年度で最終年度のため、研究を以下の3方向に収斂させて、成果を挙げることを目指す。1時空間分析システムを用いての分析作業:当初計画していたGT-MAP等での分析はもちろん、そのほかのツールを用いての分析も行い、出土文字資料の時空間分析方法確立に向けた検討を行う。2木簡内容分析用の情報整理作業:食品情報を中心に作業を進めているが、これを一定の完成水準に到達させる。なお、この成果については時空間分析に用いる以外に、単独でその成果を公表する方法も模索している。3木簡関連地理情報の補充とGIS等との連携方法の検討:ほぼ終了している木簡関連地理情報リスト化の補充を行う。また、考古学研究などで蓄積されているGIS研究とコネクトさせつつ発展させるための方向性を検討し、必要な情報を追加する。基本的に、当初計画通りの推進を目指す。GTーMap・GSーMapを用いての実験が遅れているが、それ以外は総じて順調に作業が進んでいる為である。なお、GTーMap・GSーMapを用いての実験の遅れについては、平成24年度中に挽回したい。また、この実験の遅れを取り戻すため、墨書土器に関する作業等、当初平成24年度中に計画していた内容の若干を平成25年度に繰り越す。イメージとしては、平成23年度の遅れの内70%は平成24年度中に解消し、30%は平成25年度に解消したい。上記の研究状況・目的から、大きく以下の4つを想定している。1分析研究等のための打ち合わせ・助言を求める旅費:発掘調査成果と文献資料の統合的分析事例を有する東京大学史料編纂所等他機関や、研究者に分析の方向性や成果公表の方法について助言や意見を求める。
生活科及び総合的な学習における教師の「観」の転回を促す省察的実践モデルの開発

本研究では,生活科及び総合的な学習における真正の主体的学習の具現化に向けて,長野県師範学校附属小学校の「研究学級」(1917-1937)の系譜にある実践の思想性及び臨床分析に基づき,教師の「観」の転回を促す省察的実践モデルの開発を目指す。具体的には,1「研究学級」の系譜にある実践について省察的実践の視点から思想的枠組を分析検討し,それを基盤に2実践記録の省察レベルの深化過程の分析から教師の「観」の転回を促す省察方法を導出し,3実践への具体的支援を通して,教師の省察的思考の醸成条件とその過程,及び省察の質的変容が及ぼす学習効果を明らかにする。この研究により,教育現場において形骸化が危惧される「省察」が,本来の機能を発揮し,子どもと共に教師が成長する省察的実践モデルを提案できるものと考えている。1については,我が国の総合学習の系譜と長野県の総合学習の相対化を図ることを目指し、a.県内外の大正新教育に関わる史料の収集、b.県内外の戦後新教育に関わる史料の収集と分析の2点を行った。a.では、長野師範学校男子部附属小学校の「研究学級」の担当教師と指導者の著作・論文等の収集と整理を引き続き行った。同時に、「研究学級」に影響を与えたアメリカの新教育の特定と史料調査を行った。b.では、戦後初期の長野県における低学年社会科の実態について、総合授業化やコア・カリキュラム論の受容に着目して関係史料の収集を行い、分析を行った。2については,分析対象となっている2つの事例を分析する中で,実践者の「観」の転回が図られる契機は,予想外の学習展開で,省察的思考が起動することに因るのではないかという仮説を立てた。3については,複数校の実践者とのかかわりの中で,2との関連で,授業後の省察については,教師のリヴォイシングに着目して,新たに二人称的アプローチの視点から,教師の支援の分析をすすめてきている。30(2018)年度の研究計画及びその実際は以下の通りであった。1文献資料調査:「研究学級」の資料文献から思想的枠組の調査分析について,デューイの著作を参考に思想的背景を分析すると共に,我が国の総合学習の系譜と長野県の総合学習の相対化を図ることを目指し、1県内外の大正新教育に関わる史料の収集、2県内外の戦後新教育に関わる史料の収集と分析の2点を行った。2実践記録の調査:教師の観の転回場面の抽出分析を通した省察方法を検討考察した。(調査記録)「海の命」(国語6年:総合の学習への転移の観点から)3臨床研究:教師理解を基盤に技術的省察から批判的省察への省察的思考の醸成と分析(対象の実践)・N小学校Y教諭(ヤギ飼育・28年度から3年間)・I小学校T教諭(染め物作り・30年度から3年間の予定)・K小学校K教諭(散歩・3年間)この中で,実践における予想外の事態で,子どもの行為や言動をどう受け止め,どう応えたか,殊に教師のリヴォイシングに着目して助言支援してきた。しかし省察と学習基盤形成との関連を調査するために,定期的に児童及び教師の意識調査の実施を計画していたが,実施は1校のみとなった。4成果の発表:3に基づく研究をまとめ,日本生活科・総合学習学会で,『生活科・総合的な学習における省察的実践に関する研究ー授業展開と教師のリヴォイシングに着目してー』を発表し意見交換をした。以上,現在までの研究の進捗状況の中で,臨床研究においては新たな視点(教師のリヴォイシング)から分析を含めて,おおむね順調に進展していると判断した。現段階まで,概ね研究計画通りに進行している。2019年度の計画は以下の通りである。1文献資料調査:(2019年度)研究学級以降の実践資料文献から実践における指導観を抽出分析し,30年度の調査をもとに省察的実践の視点から実践の思想的枠組を考察する。2実践記録の調査:(2019年度)長期間の飼育活動を通した教師の省察的思考の変容を調査分析,(2020年度)これまですすめてきた個々の事例分析をもとに,事例相互の比較検討から考察する。3臨床研究:30年度に引き続き実践への協働的支援を通した調査をすすめる。この中で,新たな視点として,教師の観が授業の展開に及ぼす影響について,ツリー型とリゾーム型に判別する中で,子どもの意欲や関心が喚起され発展する生活科や総合的な学習は,リゾーム型に展開するのではないか,という仮説に基づき,教師のアプローチに着目して支援をしていく。4成果の発表:3について,省察的思考と学習基盤形成の関連をまとめ学会で発表し意見交換する。2019年度は日本教師教育学会において,『生活科及び総合的な学習における省察的実践に関する研究ー教師のアプローチに着目してー』を予定している。

具体的には,1「研究学級」の系譜にある実践について省察的実践の視点から思想的枠組を分析検討し,それを基盤に2実践記録の省察レベルの深化過程の分析から教師の「観」の転回を促す省察方法を導出し,3実践への具体的支援を通して,教師の省察的思考の醸成条件とその過程,及び省察の質的変容が及ぼす学習効果を明らかにする。この研究により,教育現場において形骸化が危惧される「省察」が,本来の機能を発揮し,子どもと共に教師が成長する省察的実践モデルを提案できるものと考えている。1については,「研究学級」の実践基盤となっているジョン・デューイの思想が戦後長野県下ですすめられてきた総合学習の実践との関連について,その代表的な牛山榮世の実践を取り上げ,思想的つながりについて検討を進めている。2については,分析対象となっている2つの事例を分析する中で,実践者の「観」の転回が図られる契機は,予想外の学習展開で,省察的思考が起動することに因るのではないかという仮説を立てた。3については,複数校の実践者とのかかわりの中で,2との関連で,授業後の省察については,予想外の事態で,子どもの行為や言動をどう受け止め,どう応えたか,殊に教師のリヴォイシングに着目して,振り返るよう支援をすすめてきている。29年度の研究計画及びその実際は以下の通りであった。1文献資料調査:「研究学級」の資料文献から思想的枠組の調査分析について,デューイの著作を参考に思想的背景を分析すると共に,戦後の代表的な実践者牛山榮世の実践について資料をもとに検討をすすめた。2実践記録の調査:教師の観の転回場面の抽出分析を通した省察方法を検討考察した。(調査記録)「森と遊ぼう」(生活科2年),「焼き物づくり」(総合6年),3臨床研究:教師理解を基盤に技術的省察から批判的省察への省察的思考の醸成と分析(対象の実践)・N小学校M教諭(ヤギ飼育・28年度から2年間)・I小学校H教諭(ものづくり・27年度から3年間)・K小学校S教諭(ヤギ飼育・2年間)・K小学校K教諭(散歩・3年間)※計画した実践以外にも,H小学校S教諭(ウサギ飼育・28年度から2年間)についても実践支援を通した研究対象とした。この中で,実践における予想外の事態で,子どもの行為や言動をどう受け止め,どう応えたか,殊に教師のリヴォイシングに着目して助言支援してきた。しかし省察と学習基盤形成との関連を調査するために,定期的に児童及び教師の意識調査の実施を計画していたが,実施は1校のみとなった。4成果の発表:23に基づく研究をまとめ,日本生活科・総合的学習教育学会で,『生活科・総合的な学習における省察的実践に関する研究ー教師の成長の視点から観の転回に着目してー』,また日本教師教育学会において,本研究と関連して『教師の「観」の転回を促す省察的実践に関する研究ー文学作品の読みを通してー』を発表し意見交換をした。本研究では,生活科及び総合的な学習における真正の主体的学習の具現化に向けて,長野県師範学校附属小学校の「研究学級」(1917-1937)の系譜にある実践の思想性及び臨床分析に基づき,教師の「観」の転回を促す省察的実践モデルの開発を目指す。
ウシ肝臓ジヒドロジオール脱水素酵素の構造と触媒機能の関連

申請者は、多環式芳香族炭化水素の解毒代謝に関わるアルドケト還元酵素について、種々の動物の組織で検討してきた。その過程において、3つのジヒドロジオール脱水素酵素[EC1.1.1.20]をウシ肝臓可溶性分画に見いだし、それぞれを精製した。基質特異性や阻害剤感受性及び免疫化学的な検討の結果、DD1及びDD2はそれぞれ3α-hydroxsteroid dehydrogenaseとaldehyde reductaseと同定された。しかし、3番目の酵素(DD3)は、基質特異性や阻害剤感受性及び免疫化学的の検討の結果、今まで報告のない新規な酵素であることが明らかになった。本酵素の部分アミノ酸配列から、酸化還元による酵素活性の制御に重要なシステイン残基が見いだされた。このアミノ酸配列を元にDNAプローブをPCR法で作成した。単離したDD3cDNAは、1339塩基対(323アミノ酸)からなっていた。このcDNAを発現ベクターpET28aに組み込みpET28a-dd3を構築した。この発現プラスミドを大腸菌BL21(DE3)に導入してIPTGによりrecombinantタンパク質を誘導した。大量発現したタンパク質をNi++アフィニティーカラムで高純度かつ効率よく精製した。この方法に準じてmegaprimer PCR法で点変異を導入した変異体を精製した。9つの変異体(D50N,Y55F,Y55H,K84N,H117Q,H117Y,Y55F+H117Q,C145S and C193S)の基質特異性や阻害剤感受性の結果から、これら変異を導入したアミノ酸は、活性発現に重要な役割を有することが示唆された。また、コンピューターによる立体構造の推定から典型的なα8,β8-barrel structureを持っており、Asp-50,Tyr-55,Lys-84,His-117及びCys-193は、barrelの中にそしてCys-145は表在性であることが分かった。申請者は、環境中に存在する多環式芳香族炭化水素の代謝中間体に作用し、発癌性物質の生成を阻害し得るジヒドロジオール脱水素酵素を、ウシ肝臓に3種類の酵素分子多形を見い出し、基質特異性あるいは阻害剤感受性などの違いから特異な酵素を見い出し、Cys^<193>の役割、酵素反応機構、酸化還元の触媒機能などをすでに明かにした。部分アミノ酸配列解析の結果をもとにオリゴヌクレオチドを合成し、PCR法によってDNAプローブを合成したところ、目的の酵素の予想塩基配列と類似した塩基配列を見し出した。このDNAプローブを用いてウシ肝臓cDNAライブラリー30万クローンのスクリーニングを行い、13個の陽性クローンを得た。塩基配列の結果、2個のcDNAクローンの推定アミノ酸配列が先の酵素の部分配列と完全に一致し、目的の酵素のcDNAクローンであることが明らかになった。得られたcDNAクローンを用いてタンパク質の発現を大腸菌で成功した。発現タンパク質をアフィニティーカラムを用いて、粗抽出液より簡便かつ高収率な精製法を確立した。この精製発現酵素が、基質特異性や阻害剤感受性などの観点から肝臓中の酵素と全く同一の諸性質を示すことを見い出した。

このcDNAクローンを用いて、合成オリゴヌクレオチドをプライマーとするメガプライマーPCR法により、アスパラギン酸、チロシン、リジンやヒスチジンをアスパラギンやメチオンニンに置換した各種変異体を作製するとともに、先の簡便な精製法にて均一な発現酵素標品を得た。各変異体の酵素活性、阻害剤感受性、基質との親和性、補酵素との結合定数あるいは至適pHなどを測定することにより、これらのアミノ酸残基が活性に必須であることを見い出すとともに、アスパラギン酸、リジンからチロシンへのプロトンの動き、いわゆるプロトンリレイの存在を明らかにした。ウシ肝臓に、環境中の多環式芳香族炭化水素の発癌性代謝中間体の代謝酵素であるジヒドロジオール脱水素酵素を見いだした。その部分のアミノ酸配列をもとにDNAプローブを作製してウシ肝臓cDNAライブラリーをスクリーニングし、ウシ肝臓ジヒドロジオール脱水素酵素でcDNAクローンを単離した。このcDNAクローンをpET-28a発現ベクターに組み込み、腸菌でのタンパク質の大量発現及び簡便かつ高収率な精製法を確立した。この精製発現酵素は、基質特異性や阻害剤感受性などの観点から肝臓中の酵素と同一であった。メガプライマーPCR法により、Asp-50、Tyr-55、Lys-84やHis-117に変異を導入した変異体酵素酵素を作製して諸性質を詳細に検討した。これらに加えて、Cys-145やCys-193にも変異を導入して、酵素活性、阻害剤感受性、基質との親和性、補酵素との結合定数あるいは至適pHなどを測定することによりこれらのアミノ酸残基が活性に必須であることを明らかにした。さらに、既に結晶構造が解析されているヒトやラットaldose reductaseなどのデータをもとに、各種コンピューターソフトを用いて野生型及び変異酵素の立体構造の推定を行った。活性変動や推定立体構造の解析の結果より、Asp-50,Tyr-55,Lys-84並びにHis-117は、特異な立体構造であるα8,β8-barrel構造の内側の基質あるいは補酵素の結合が予想される部位に局在し、補酵素から基質への水素の転移に重要なproton relayに極めて重要なアミノ酸残基であった。さらに、Cys-145及びCys-193は、SH-修飾試薬に対して極めて感受性が高いが酵素活性発現には直接関与していなかった。前者は、酵素のC-末端に近い部位に表在性で存在し、SH-修飾試薬による修飾は酵素活性に影響しない、また、後者は、補酵素結合部位と予想されるクレフトに局在しており、この残基の修飾は、補酵素の結合を阻害することにより活性低下を惹起していることが推定できた。