hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
遺伝子改変マウスを用いたヘム生合成系異常疾患遺伝子治療の基礎的研究

昨年度は、X染色体連鎖鉄芽球性貧血(XLSA)の原因遺伝子であるヘム合成系律速酵素の赤血球型5-アミノレブリン酸合成酵素(ALAS-E)の遺伝子ターゲティング実験を行い、作成されたALAS-E遺伝子破壊(ALAS-E KO)マウスの解析を行い報告した。近年、遺伝性代謝疾患の治療法の一つとして遺伝子治療が試みられている。遺伝子治療法の開発には動物モデルの存在が極めて重要な役割を果すため、本年度はALAS-E KOマウスにXLSA患者より得られたヒトALAS-E変異体遺伝子を導入する部分的レスキューによるXLSA動物モデルの確立を目指した。先ず、既に報告者らの手で解析されていた転写因子GATA-1遺伝子の赤血球組織特異的プロモーター領域に、ヒトALAS-Eの変異体および野生型のcDNAを各々連結されることにより、赤血球組織特異的に発現可能なヒトALAS-EcDNA組換え体を調製し、これを用いてトランスジェニックマウス(hALAS-E Tg)を作成した。これらhALAS-E Tgは卵黄嚢および骨髄細胞でヒトALAS-E mRNAを発現していた。次いで、このhALASE Tgとヘテロマウスとの交配により、ALAS-E KOマウスへヒトALAS-E変異体を導入した。その結果、hALAS-ETg(♂)とALAS-E-/+ヘテロ(♀)のF1個体中で6週齢まで成長したマウスには、ALAS-E欠失体(ALAS-E-/Y: hALAS-E Tg(-))は含まれていなかったが、マウスALAS-E遺伝子を保持していないにも拘らず、胎生致死を免れた(レスキューされた)マウス(ALASE-/Y:hALAS-E Tg(+))が認められた。従って、ALAS-E KOマウスに対してGATA-1プロモーターを用いたALAS-E遺伝子の導入によるレスキューが確認され、この系によるXLSAモデルマウスの確立が可能なことが示された。
非天然型枝分かれアミノ多糖の調製とその機能解析

アミノ多糖であるキトサンに対する位置選択的な化学修飾法を開発した。これにより,キチンおよびキトサンの特定の位置に糖側鎖を導入し,さらに,生成する非天然型枝分かれ多糖の特性を解析する研究を進めた結果,以下の成果を得た。多糖受容体として,N-フタロイル化キトサンから3段階の反応で6位のみに遊離の水酸基をもつ誘導体(1),および,その6-トリメチルシリル体(2)を調製した。2とマンノースのオルトエステル体とのグリコシル化反応はジクロロメタン中で,トリメチルシリトリルフルオロメタンスルホネートを触媒として行い,α-マンノシド側鎖を導入した。置換度は最高で0.6程度であった。生成物の脱保護により,キトサン誘導体に,さらに,遊離アミノ基のアセチル化によりキチン誘導体に変換する方法を確立した。得られた枝分かれキトサンおよびキチンは中性の水に溶解し,コンカナバリンAにより効率的に認識された。また,キチン誘導体のリゾチーム受容性,および,キトサン誘導体の抗菌活性も見いだされた。ガラクトースを用いたグリコシル化反応も同様に進み,β-ガラクトシド側鎖をもつキトサンおよびキチンを調製した。これらの枝分かれ多糖も水溶性,成分解性,吸湿・保湿性などの特徴を示した。N-アセチルグルコサミンのオキサゾリン誘導体を用いた2のグリコリル化反応は,ジクロロエタン中でショウノウスルホン酸を触媒として行った。この反応では,1を用いても同様な結果が得られた。保護基の除去とN-アセチル化を行うことにより,分岐型キトサンおよびキチンを調製した。これらも水溶性で,かつ,高い抗菌活性を示すことが明らかとなり,機能性多糖として大きな可能性をもつことが確認された。キトサンを出発原料とした,位置選択的に単糖を側鎖として導入する手法を開発し,生成する枝分かれ型多糖の特性を解析する研究を進めた。6位のみに遊離の水酸基をもち,溶媒可溶な多糖受容体(1)は,N-フタロイル化キトサンの6位をトリチル化したのち,3位をアセチル化,6位を脱トリチル化して調製した。さらに,1を6-トリメチルシリル体(2)に誘導した。2とマンノースあるいはガラクトースのオルトエステル体とのグリコシル化反応はジクロロメタン中で,トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネートを触媒として行い,マンノシドおよびガラクトシド側鎖を導入した。生成物の保護基を,アルカリ,次いでヒドラジンにより除去することにより,糖側鎖をもつキトサンに,また,遊離アミノ基をアセチル化し,糖側鎖をもつキチンに変換した。しかし,条件によっては保護基の除去が不完全なこともあり,さらに検討が必要である。N-アセチルグルコサミンのオキサゾリン誘導体を用いたグリコシル化反応は,ジクロロエタン中でショウノウスルホン酸を触媒として行った。この反応では,受容体として2以外に1でも進行した。保護基の除去とN-アセチル化を同様に行うことにより分岐型キトサンおよびキチンを調製できることが明らかになった。ここで調製された保護基をもつ枝分かれ型多糖は,一般の有機溶媒に可溶であった。また,脱保護したキトサンおよびキチン誘導体は中性の水煮も溶けるほか,高い吸湿・保湿性を示した。さらに,抗菌活性についての検討にも着手したが,予備的な実験の結果では,糖側鎖をもつキトサン誘導体に顕著な活性が認められた。

アミノ多糖であるキトサンに対する位置選択的な化学修飾法を開発した。これにより,キチンおよびキトサンの特定の位置に糖側鎖を導入し,さらに,生成する非天然型枝分かれ多糖の特性を解析する研究を進めた結果,以下の成果を得た。多糖受容体として,N-フタロイル化キトサンから3段階の反応で6位のみに遊離の水酸基をもつ誘導体(1),および,その6-トリメチルシリル体(2)を調製した。2とマンノースのオルトエステル体とのグリコシル化反応はジクロロメタン中で,トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネートを触媒として行い,α-マンノシド側鎖を導入した。置換度は最高で0.6程度であった。生成物の脱保護により,キトサン誘導体に,さらに,遊離アミノ基のアセチル化によりキチン誘導体に変換する方法を確立した。得られた枝分かれキトサンおよびキチンは中性の水に溶解し,コンカナバリンAにより効率的に認識された。また,キチン誘導体のリゾチーム受容性,および,キトサン誘導体の抗菌活性も見いだされた。ガラクトースを用いたグリコシル化反応も同様に進み,β-ガラクトシド側鎖をもつキトサンおよびキチンを調製した。これらの枝分かれ多糖も水溶性,生分解性,吸湿,保湿性などの特徴を示した。N-アセチルグルコサミンのオキサゾリン誘導体を用いた2のグリコシル化反応は,ジクロロエタン中でショウノウスルホン酸を触媒として行った。この反応では,1を用いても同様な結果が得られた。保護基の除去とN-アセチル化を行うことにより,分岐型キトサンおよびキチンを調製した。これらも水溶性で,かつ,高い抗菌活性を示すことが明らかとなり,機能性多糖として大きな可能性をもつことが確認された。
川崎病の冠動脈瘤形成の機序の解明-血小板カルシウムイオン濃度についての研究-

川崎病は乳幼児の新しい血管炎症候群であり、特に冠動脈に冠動脈炎をきたし、動脈瘤や血栓性閉塞を伴うことがあるために注目されている疾患である。川崎病では急性期血小板増加のみられることが多いが、この血小板は生体内平均寿命も短いため、病態の生じた時点での細胞状態を反映していると考えられた。血小板は血管平滑筋と同様にCaイオン依存性の収縮機構を持つことがわかっているため、川崎病患児の血小板Caイオンを測定することで血管平滑筋のCaイオンを推定し得ると考えた。血管平滑筋のCaイオンが低下していれば、血管収縮作用が減弱することが予測され、それによって冠動脈瘤の形成がされるものと予測されたが、現段階ではまだ十分な結果は得られていない。理由は以下の如くである。1.同一のコントロール検体で血小板回収率を安定させ、ほぼ一定の値を得るのに習熟を要すること。(川崎病患児の検体を一度にまとめて測定するわけにはいかないので、コントロールを安定させた上でその都度コントロールと比較し、補正する必要がある。)2.関連病院に依頼して検体を得るため、採血から血小板分離までの時間による変動の要素を考慮する必要があり、そのために検体が得にくい難点がある。現在同一健康成人の血液を用いてデータの安定を計っており、その上で実際に川崎病患児の検体、同一年令のウイルス感染者の検体を用いて測定を行うこととしている。実際では毎回微妙に条件が違うため、同一健康成人の検体もその都度測定し、補正する必要があると考えている。
海洋の溶存酸素量の変化に対する魚類の生理、生態的な応答

オーストラリアの東海岸、アメリカのテキサスなどで野外調査を行った。様々な硬骨魚類およびサメ類を釣り上げ、記録計を取り付けて放流した。データを超音波にのせて発信するタイプの記録計と、データを内部のメモリーに保存するタイプの記録計の二種類を使用した。前者のデータは、受信器を海岸に設置してしばらく放置し、受信器を回収することによって得ることができた。後者のデータは、記録計をタイマーで魚体から切り離し、電波信号を頼りに回収することで得ることができた。様々な魚種について、横軸に水温をとり、縦軸に加速度をとってプロットすると、上に凸の曲線が表れることがわかった。曲線のピークにあたる水温が、その魚種にとっての最適水温である。最適水温は、分布図から読み取った魚種ごとの最大経験水温と強い相関があった。この結果は、自然状態で調べた魚類の水温反応と、その種の分布範囲とが密接にリンクしていることを示している。さらに、それぞれの魚種の適応可能な水温の範囲は、まわりの水温が高くなるほど狭くなることがわかった。つまり、温かい海にすむ魚ほど、狭い範囲の水温にしか適応できないということがわかった。この結果は、水温の上昇と生物の反応との関係とが線形ではないことを示唆しており、幅広い生物に普遍的に当てはまる可能性がある(Payne et al. 2015)。27年度が最終年度であるため、記入しない。
特発性および膠原病に伴う間質性肺炎の肺内分布と局所でのサイトカインmRNAの発現

特発性間質性肺炎(IIP)と膠原病に伴う間質性肺炎(IP-CVD)の胸部高分解能CT画像の評価と画像解析装置IBASによる解析により、両者の病変分布の特徴や各膠原病間での違いが明らかになるとともに、その広がりの定量的な評価がある程度可能となった。一方、気管支肺胞洗浄液所見の解析、特に回収されたリンパ球と肺胞マクロファージのFACScanによる細胞表面マーカーの検討、さらに、肺胞マクロファージのcompetitive PCR法によるサイトカインmRNA発現の検討により、両疾患での肺局所での病態の違いが明らかにされ、また、膠原病間での違いも明らかにすることができたと思われる。さらに、胸腔鏡下肺生検および経気管支肺生検の生検肺組織材料からの肺線維芽細胞の培養が可能となり、各疾患ならびに同一症例の病変の強弱による生検部位の違いから、線維芽細胞の特徴を検討している。また、間質性肺炎から不可逆性の線維化に至る課程の指標として、I型膠原線維合成の際に生成されるprocollagen typeI carboxyterminal propeptideを、肺線維芽細胞培養上清および患者血清で測定し、各疾患での特徴や予後との関連を検討している。加えて、IIPやIP-CVDをはじめとする間質性肺炎・肺線維症におけるremodeling/repairには、肺内上皮細胞のplasminの関与が重要と考え、その基礎的研究を展開している。特発性間質性肺炎(IIP)と膠原病に伴う間質性肺炎(IP-CVD)症例の胸部高分解能CT画像から、画像解析装置IBASにより、淡い肺野濃度の上昇、濃い肺野濃度の上昇の領域を取り込み、その広がりの定量的解析を行った。同一症例における経時的変化も、画像解析装置によるCT所見の定量的評価が可能となり、胸部X線、呼吸機能、血液ガス分析所見の変化との対比を行った。さらに、各病変の広がりについて、画像解析装置による三次元解析を行う予定である。また、上記疾患での、胸腔鏡下肺生検(TSLB)組織および剖検肺組織の、顕微鏡レベルでの三次元解析も行う予定である。IIPとIP-CVD症例で、気管支肺胞洗浄(BAL)を行い、回収された肺内細胞、特にリンパ球と肺胞マクロファージの細胞表面マーカーについて、FACScanを用いて解析を行った。IIPとIP-CVD、さらにIP-CVDの中でも各膠原病の違いにより、細胞表面マーカーの発現頻度に差がみられ、それぞれの間質性肺炎の発症機序に違いがあることが推察された。同一症例での、病変の強弱に合わせた部位でのBALも試みる予定である。IIPとIP-CVD症例で、TSLBないし経気管支肺生検(TBLB)を行い、病変の高度の部位と病変の軽度の部位からの材料で、線維芽細胞の培養を行った。また、コントロールとして、肺癌患者切除肺の非癌健常部位からの材料でも、線維芽細胞の培養を行った。TSLBによる比較的大きな材料のほか、TBLBによる小さな材料や健常部位からの材料でも、線維芽細胞の培養が可能となった。各材料から得られた線維芽細胞について、その分子生物学的な特徴を検討している。特発性間質性肺炎(IIP)と膠原病に伴う間質性肺炎(IP-CVD)の胸部高分解能CT画像から、画像解析装置IBASにより肺野濃度の上昇領域を取り込み、その広がりの定量的解析を行ったが、必ずしも呼吸機能検査所見、血液ガス分析所見と相関しなかった。慢性型の間質性肺炎では、経時的に濃度上昇領域の拡大とともに、蜂巣肺honeycombingの拡大や気腫性、嚢胞性病変を伴ってきており、肺病変の進行度の評価のために、正常肺野濃度領域の容積を定量的に評価することを試み、これらと呼吸機能、血液ガス分析所見との対比を行った。IIPとIP-CVDの胸部高分解能CT画像および胸腔鏡下肺生検組織の画像解析装置による三次元解析は、画像解析装置への取り込み段階におけるわずかな位置や軸のずれが問題となり、また白黒濃度の認識方法や色調の認識方法にも問題が残っている。

気管支肺胞洗浄(BAL)により回収された肺内細胞、特にリンパ球と肺胞マクロファージの細胞表面マーカーのFACScanによる解析により、IIPとIP-CVD、またIP-CVDの中でも各膠原病の違いにより、細胞表面マーカーの発現頻度に差がみられることが明らかとなり、さらに回収された液性成分でのサイトカインや各種メディエーターの測定を試みている。一方、同一症例での病変の強弱に合わせた部位でのBALの施行は、ベースに存在する間質性肺炎のため低酸素血症をきたしやすく、BALの方法等に検討を要すると思われる。生検肺組織材料からの肺線維芽細胞の培養方法は確立され、培養上清におけるprocollagen typeIc-peptideの測定を行った。さらに、培養肺線維芽細胞の増殖に対するステロイドや免疫抑制薬、さらに各種サイトカインの影響を検討している。IIPとIP-CVDでの比較、同一症例での病変の高度の部位と病変の軽度の部位からの材料での比較検討を行っている。特発性間質性肺炎(IIP)と膠原病に伴う間質性肺炎(IP-CVD)の胸部高分解能CT画像の特徴を検討し、IIPに比べIP-CVDでは、蜂巣肺honeycombingや肺野濃度の上昇の他に、血管・気管支陰影の拡大、小葉間隔壁・胸膜の肥厚像、不規則な線状・板状陰影などが高頻度に認められることを明らかにした。さらに、経時的に撮影された高分解能CTの各スライスを画像解析装置IBASに取り込み、肺野全体および各種病変を除いた正常肺野濃度領域の面積を評価するとともに、全てのスライスを積算することで肺全体および正常肺の容積を定量的に評価した。IP-CVDでは病変の進行により正常肺の容積が減少とともに肺全体の容積が減少する例が多いが、IIPでは正常肺の容積減少と肺容積の減少は必ずしも一致せず、気腫性・嚢飽性病変を伴ってきていることが明らかとなった。また、こうした画像の評価は、必ずしも呼吸機能検査や血液ガス分析所見と相関せず、間質性肺炎・肺線維症の一つの評価項目となると考えられた。IIPおよびIP-CVD患者に気管支肺胞洗浄を行い、回収されたリンパ球と肺胞マクロファージの細胞表面マーカーをFACScanにより解析し、治療に対する反応性や予後にある程度関連することを示した。生検配組織織材料からの肺線維芽細胞の培養上清と同一患者血清中のprocollagen type I carboxyterminal pro-peptideの測定を行い、これらと胸部画像所見や呼吸機能検査・血液ガス分析所見との対比から、肺線維化の一つの指標となる可能性が示唆された。さらに、IIPやIP-CVDをはじめとする間質性肺炎・肺線維症におけるremodel ing/repairには、肺内上皮細胞のplasminの関与が重要と考え、その基礎的研究を展開している。
IL-6アンプに着目した肺高血圧症に対する分子標的療法の開発

低酸素誘発性肺高血圧症(HPH)マウスでIL-6の作用を遮断するIL-6受容体抗体を投与するとHPH病態が抑制された。低酸素負荷でTh17細胞がマウス肺に著明に集積したが、IL-6阻害でその集積は抑制された。Th17細胞が分泌するサイトカインに焦点を当てて解析した所、IL-6の下流でTH17由来のIL-21がHPH病態の誘導に重要な働きをすることをIL-21受容体欠損マウスの解析で解明した。IL-21は肺胞マクロファージをM2マクロファージに極性化して肺動脈平滑筋細胞の増殖を促進することも明らかになった。以上より、IL-6/IL-21シグナルは肺高血圧症の病態形成に重要であることが示唆された。本年度は低酸素負荷肺高血圧症(HPH)モデルマウスで、モノクローナル抗IL-6受容体抗体MR16-1によるIL-6シグナル阻害がHPH発症を抑制する分子機序を検討した。1HPHモデルマウスでのMR16-1の効果について:C57BL6/Jマウスを低酸素負荷曝露すると、肺でIL-6mRNAが負荷後1-2日目をピークに増加して負荷後7日目以降はベースレベルまで下がった。C57BL6/Jマウスを低酸素負荷曝露する直前からMR16-1またはrat IgGを静注した後、4週間にわたり毎週MR16-1またはrat IgGを腹腔内投与すると、rat IgG群に比してMR16-1群では有意に右室収縮期圧の増加が抑制され、右室(RV)/左室(LV+S)重量比も有意に増加が抑制されて、細小動脈の中膜肥厚(medial wall thickness)もrat IgG群に比べて有意にMR16-1群で抑制されていた。2HPHモデルマウスでのMR16-1によるIL-6シグナル阻害のマクロファージに対する影響の検討:免疫組織学的解析により、HPHモデルマウスでのCD68陽性マクロファージの動態を解析した所、低酸素負荷によるCD68陽性マクロファージの肺組織へ集積がrat IgG群に比してMR16-1群では有意に抑制されていた。このマクロファージの内訳を検討すると、Fizz1やMRC1などのM2マクロファージマーカー陽性のマクロファージがrat-IgG群のHPHモデルマウス肺では増加していたが、MR16-1群では有意に抑制されていた。3HPHモデルマウスでのTh17細胞の動態:低酸素負荷後の肺組織へのTh17細胞(CD4/IL-17)二重陽性細胞)の分布に関してFACSにより検討したところ、rat IgG群ではTh17細胞が低酸素負荷後の肺組織で有意に増加したが、MR16-1群では有意に抑制されていた。肺組織のIL-17の発現も低酸素でratIgG群では誘導されて、MR16-1群では有意に抑制されていた。1IL-17に対する中和抗体を用いた低酸素誘発性肺高血圧症(HPH)マウスでの肺高血圧病態形成の検討:IL-17中和抗体ではコントロール抗体投与時とHPH病態形成に有意な差は見られなかった。2IL-21受容体遺伝子ノックアウト(IL-21RKO)マウスを用いた検討:IL-21RKOマウスは野生型マウスに比べて低酸素負荷してHPH病態形成において有意に抵抗性を示した。以上より、IL-21がIL-6シグナルの主要な下流因子としてTh17細胞などから分泌されることでHPH病態形成に機能する可能性が示唆された。3HPH病態形成過程でのM2マクロファージ極性化の分子機構の解析:HPHマウス肺のマクロファージはFizz1やMrc1などをはじめとするM2マクロファージの発現するM2マーカー優位な状態となり、M2マクロファージに極性化することが報告されていたが(Vergadiet al. Circulation123, 1986, 2011)、この機序は不明だった。抗IL-6受容体抗体MR16-1を投与されたマウス肺ではコントロール抗体マウスに比べて有意に肺組織でのM2マクロファージの浸潤は有意に抑制されていた。また、IL-21RKOマウス肺では野生型マウス肺に比してHPH病態におけるM2マクロファージの肺組織浸潤が有意に抑制されていた。また、マウス肺から単離した肺胞マクロファージに対してIL-21を添加して培養するとM2マクロファージマーカーの発現誘導が確認された。以上より、IL-21はHPHマウス肺でのM2マクロファージ極性化の促進に働くことが明らかとなった。

また、IL-21刺激によりM2極性化を誘導したマクロファージとヒト肺動脈平滑筋細胞を共培養すると、IL-21非刺激のマクロファージとの共培養の場合に比して有意にヒト肺動脈平滑筋細胞の増殖応答が見られた。循環器内科学、血管生物学、血管病学IL-6シグナル阻害により低酸素誘発性肺高血圧の発症が有意に抑制されることを確認し、その分子機序にはM2マクロファージの肺組織への動員やTh17細胞の動員が関与することを示唆するデータを得ている。低酸素誘発性肺高血圧の発症過程において、これまでマクロファージのM2極性化形成が強く関わる可能性が他グループからも報告されているが、M2極性化形成の上流シグナルは不明であったが、今回の研究でIL-6シグナルがその制御にかかわる可能性を示唆する結果を得たため、本年度は概ね順調な研究の進展したと考えられる。今後は上記結果を背景として、低酸素誘発性肺高血圧の発症機序を明らかにしたい。特に、IL-6シグナルの下流にあると想定される、Th17細胞とM2マクロファージのクロストークの有無に焦点を当てて、今後詳細な検討をしていきたい。この関係が明らかになれば、肺高血圧症の分子基盤の一端が解明されると期待される。
希少種チビトガリネズミのユーラシアにおける遺伝構造と集団構造

採集の結果は、17年度では、博物館等の保存標本と自らが採集した標本数は、フィンランド15頭、ノルウェイ1、ロシア・カムチャッカ1、同・マガダン州4、同・沿海州5、同・ハバロフスク1、樺太2、国後島1、北海道サロベツ11、同・根室5、同・浜中町2、同・嶮暮帰島5、であった。18年度には、北海道白糠町12頭、同・猿払村1、北部モンゴル1が捕獲できた。道内ではこの他に分布している事が予想された鵡川町、新ひだか町から大樹町の太平洋岸沿岸での捕獲調査を行ったが、捕獲出来なかったことから、これらの地域では、既に絶滅した可能性が示唆された。以上により今までは殆ど不明であったチビトガリネズミの生息場所についての新知見を得ることができた。それはチビトガリは海岸砂丘や岩礫地で捕れることである。これは今までのトガリネズミ類の生息地としては常識外の場所であり、チビトガリは生態的にこれらの不適なハビタットに追いやられている可能性が示唆された。以上のサンプルを用いたミトコンドリアのチトクロムb遺伝子およびより変異が高いコントロール領域の配列による系統解析によると、ユーラシアの東部と西部ではかなり遺伝的に異なっていることがわかった。また。-ラシア東部内でも地理的分化が認められた。また、北海道産のものは遺伝変異がほとんど見られないのに対して、フィンランド産のものは同じような面積から採集したのにもかかわらず、大きな遺伝変異が見られた。北海道の個体群の遺伝変異の少なさは、現在の個体群が最近のボトルネックを経験していることを示しているのかもしれない。一方、大きな遺伝変異のあるフィンランド産の個体群についての一つの仮説として、最終氷期にはヨーロッパでは大陸氷河が発達したために地域個体群が絶滅し、複数の避難地に分散していたものが氷河の後退とともに再融合したために遺伝的変異が高くなった、というシナリオが考えられた。また。チビトガリのDNA分析用のサンプルを博物館等の保存標本と自らが採集した標本から採取した。DNA分析に利用可能な標本数は、東部フィンランド15、ノルウェイ1、ロシア・カムチャッカ1、ロシア・マガダン州4、ロシア・沿海州5、ハバロフスク1、サハリン2、国後島1、北海道サロベツ11、北海道根室5、北海道浜中町2、同・嶮暮帰島5、であった。以上のサンプルを用いて、ミトコンドリアのチトクロムb遺伝子の配列を決定した。系統解析によると、ユーラシアの東部と西部ではかなり遺伝的に異なっていることがわかった。またサハリンの個体は北海道産のものと近いこと、沿海州、マガダンのものはそれぞれ独自のクラスターをつくることがわかった。さらに興味深いことに、北海道産のものは域内で遺伝変異がほとんど見られないのに対して、フィンランド産のものは同じような面積から採集したのにもかかわらず、大きな遺伝変異が見られた。また、ミトコンドリアのコントロール領域は、下流にあるhypervariable領域が地理的変異の分析に使用可能であることがわかった。この領域は配列の最初と最後の部分は変異が少なく、その間に繰り返し領域をはさんでおよそ1,500-2,000bpぐらいの大きさがあった。また頻繁なindelがみられるのでアライメントの取り方に工夫が必要であり、現在やり方を検討中である。

とりあえずギャップを無視して系統樹を作成すると、北海道とフィンランドの個体群は明らかに異なった系統に属しており、チトクロムbと同様に後者における遺伝変異は大きいことがわかった。マイクロサテライト遺伝子については、現在どのプライマーが利用可能であるか調査中である。おそらく今まで発表されたプライマーで分析が可能と思われる。しかし、一地域からのサンプル数が少ないと期待されるので、それを補うためにできるだけ多くの遺伝子座を検索している。17年度におけるチビトガリのDNA分析用のサンプルを博物館等の保存標本と自らが採集した標本から採取した。DNA分析に利用可能な標本数は、東部フィンランド15、ノルウェイ1、ロシア・カムチャッカ1、ロシア・マガダン州4、ロシア・沿海州5、ハバロフスク1、サハリン2、国後島1、北海道サロベツ11、北海道根室5、北海道浜中町2、同・嶮暮帰島5、であった。これに付加して、18年度には、北海道白糠町12頭、北海道猿払村1、モンゴル国北部1を捕獲できた。北海道内ではこの他に、鵡川町、新ひだか町から、大樹町の太平洋岸沿岸も調査を行ったがサンプルを得ることが出来なかったことから、これらの地域では生息していない可能性が考えられた。以上のサンプリングを通じて、いままで殆ど不明であったチビトガリネズミの生息場所についての新知見を得ることができた。いままでは殆どが偶発的に捕獲されていたのだが、チビトガリは海岸砂丘や岩礫地で捕れることがわかった。これは今までのトガリネズミ類の生息地としては常識外の場所であり、チビトガリは生態的にこれらの不適なハビタットに追いやられている可能性が示唆された。以上のサンプルを用いて、ミトコンドリアのチトクロムb遺伝子の配列を決定した。系統解析によると、ユーラシアの東部と西部ではかなり遺伝的に異なっていることがわかった。またサハリンの個体は北海道産のものと近いこと、沿海州、マガダンのものはそれぞれ独自のクラスターをつくることがわかった。さらに興味深いことに、北海道産のものは域内で遺伝変異がほとんど見られないのに対して、フィンランド産のものは同じような面積から採集したのにもかかわらず、大きな遺伝変異が見られた。また、ミトコンドリアのコントロール領域は、下流にあるhypervariable領域が地理的変異の分析に使用可能であることがわかった。この領域は配列の最初と最後の部分は変異が少なく、その間に繰り返し領域をはさんでおよそ1,500-2,000bpぐらいの大きさがあった。ギャップを一部考慮する距離法で系統樹を作成すると、チトクロムbと同様な各地域での地域分化が見られることがわかった。ただし変異の個体変異はチトクロムbよりも大きくて、地域差を調べるには適していることがわかった。またこれもチトクロムbと同様に、北海道産のものは域内で遺伝変異がほとんど見られないのに対して、フィンランド産のものは同じような面積から採集したのにもかかわらず、大きな遺伝変異が見られた。ただ意外なことは、チビトガリの生息地は分断化されていると思われるにもかかわらず、北海道内では地域間の遺伝的変異が殆ど観察されなかったということである。マイクロサテライト遺伝子については、一部が増幅できたのみで結局この遺伝子を用いた研究はサンプル数の関係上、できなかった。
癌特異的転写後調節を利用した癌診断技術の開発

[目的]最近、解糖系律速酵素のひとつであるピルビン酸キナーゼ(pyruvate kinase type-muscle 2 : PKM2)遺伝子の遺伝子発現が癌細胞の増殖に密接に関係していることが報告された(Christofk et al., Nature, 2008)。興味深いことに、PKM2遺伝子は2つのアイソフォームを選択的スプライシングによって産生し、正常組織ではエクソン9を含むPKM1、ほとんど全ての癌組織ではエクソン10を含むPKM2が選択されるようになる。申請者は、PKM2遺伝子の選択的スプライシングを生体内で可視化することにより、どの組織で細胞が癌化しているのかを容易に解析する技術を開発し、その技術の診断への応用を目指して研究を行った。[方法]本研究では、選択的スプライシングを可視化するために、スプライシングレポーターシステムを構築した。このレポーターは、PKM1を選択した場合には緑色蛍光タンパク質GFP、PKM2を選択した場合には赤色蛍光タンパク質RFPを発現する。レポーターは細胞にトランスフェクションし、蛍光顕微鏡による観察と、RT-PCR法によるRNAの解析を行い、内在性PKM遺伝子のスプライシングパターンと比較することでレポーターを最適化した。[研究成果]申請者は、C2C12細胞を用いてPKM2レポーターを評価した。C2C12細胞は分化誘導が可能なマウス筋芽細胞であり、未分化状態ではPKM2、分化状態ではPKM1を選択している。PKM2レポーターをC2C12細胞へ導入したところ、分化依存的にRFPからGFPへの切換えが見られた。このことから、PKM2レポーターは内在性PKM遺伝子のスプライシングを模擬し、細胞内のスプライシング反応を可視化できたと判断した。現在、個体レベルでシグナルを検出しやすくするためにRFP-GFPの代わりに高感度で生体内を透過しやすいCBRluc(クリックビートル由来赤色ルシフェラーゼ遺伝子)を挿入したPKM2レポーターを作製して評価を行っているところである。本研究で構築したシステムは、マウスやアフリカツメガエルといった個体レベルでの細胞の癌化、発生におけるスプライシング変化のライブイメージングに適応可能であり、さらには抗がん剤のスクリーニングやRNAiライブラリーを用いたスプライシング制御因子の探索にも応用できるため、今後の発展が期待される。
Complex Analytic Dynamicsの研究

ジュリア集合に関する研究では, Eλ=λe^zのλについての変化の様子を調べたが,まだ所期の目的を達していない.今後さらに研究を続けて,測度,ハウスドルフ次元などについて結果を得たい.研究分担者による周辺分野の研究では,いくつかの成果を得たので,下にそのうちの数例を記しておく.(1)4次元球面の2つの2次元球面はlinkの状態を引き起す.しかしこのlinkの状態は, 3次元球面内の2つの1次元球面の引き起すlinkとは本質的に異なり, link homotopyの概念のもとではすべて解けることを示した.(2)R.H.Foxが1958年に導入した結び目の合同類に関する定理の証明の誤りを正し,さらにこの概念を一般化して新しい結果を導いた. (3)3次元球面内のグラフに対して,結び目,絡み目の素分解の概念の一般化を試み,その存在と一意性を示した.(4)Function Algebraの摂動,特にFunction Algebraの直和の安定性を調べ無限個のFunction Algebra{Aλ}の直和が安定となるための条件を与えた.(5)Bishopの定理を関数空間に一般化し,関数環におけるいくつかの定理が,ある条件をもつ関数空間においても成り立つことを示した.(6)バナッハ空間におけるC-半群に対して3つの作用素A,〓, Zの間の関係を研究し,〓CA=Zを示した.さらに〓=Aとなるための条件を調べた.この外,中島は,マンデルブロート集合についてコンピュータによる解析を行った.郡はC^nの凸領域における,連続な境界値をもつ解析関数の空間の反対について一定の結果を得た.ジュリア集合に関する研究では, Eλ=λe^zのλについての変化の様子を調べたが,まだ所期の目的を達していない.今後さらに研究を続けて,測度,ハウスドルフ次元などについて結果を得たい.研究分担者による周辺分野の研究では,いくつかの成果を得たので,下にそのうちの数例を記しておく.(1)4次元球面の2つの2次元球面はlinkの状態を引き起す.しかしこのlinkの状態は, 3次元球面内の2つの1次元球面の引き起すlinkとは本質的に異なり, link homotopyの概念のもとではすべて解けることを示した.(2)R.H.Foxが1958年に導入した結び目の合同類に関する定理の証明の誤りを正し,さらにこの概念を一般化して新しい結果を導いた. (3)3次元球面内のグラフに対して,結び目,絡み目の素分解の概念の一般化を試み,その存在と一意性を示した.(4)Function Algebraの摂動,特にFunction Algebraの直和の安定性を調べ無限個のFunction Algebra{Aλ}の直和が安定となるための条件を与えた.(5)Bishopの定理を関数空間に一般化し,関数環におけるいくつかの定理が,ある条件をもつ関数空間においても成り立つことを示した.(6)バナッハ空間におけるC-半群に対して3つの作用素A,〓, Zの間の関係を研究し,〓CA=Zを示した.さらに〓=Aとなるための条件を調べた.この外,中島は,マンデルブロート集合についてコンピュータによる解析を行った.郡はC^nの凸領域における,連続な境界値をもつ解析関数の空間の反対について一定の結果を得た.
中世神道思想における神仏理解の倫理思想史的研究

中世の神道にかんする最近の研究を包括的に回顧してみると、あらためて感じられたことは、個々の事象に関する研究にはさまざまな成果があがっているのに、それらを意義付け、位置付ける全体的な構図、思想史的な構想の研究がきわめて少ないということである。もちろん、それは、非常に困難な知的作業であり、それなくしても個々の歴史的事象の研究も差し当たりは可能であるから、無視されているといってもよいだろう。しかし、個々の事象の研究が蓄積されてくるに従って、このような欠落は、無視しがたいものとして、立ち現れてきている。それを無視することができるのは、おそらくそのような知的態度が習慣として身についてしまったからであろう。このような知的状況は現在の思想史研究の重要な課題の在処を指し示しているといえよう。このような状況を克服するにはどのような知的営為が求められるだろうか。近年の神道研究、一部の仏教研究の特徴は宗派、教派という組織を固定化したものと捉えるのではなく、その相互影響や連続的な特質に注目してきたことにあるだろう。すなわち、従来、対立するものとして捉えられてきた神と仏を、神仏として結び付けて理解することが、この転換を象徴的に示している。しかし、このような態度は構成の教派組織による分断を否定したが、それに代わる新しい分類概念を提供したわけではない。したがって、蓄積された業績を踏まえて、その中から新たな概念、視点を生みだし、思想史を構成するに足る基盤を作り出していくことが求められている。そのためには、宗教、道徳、政治、社会といった領域で問題を捉えるのではなく、それらの根底にある基本的な世界理解として倫理思想を追究することが重要な課題となってくる。研究の現状は、そのような根本的な研究の必要を示唆しているのである。3年に渡る研究の初年度であり、過去の研究成果の確認、最近の研究動向の検討、基本的な文献、研究に必要な機器備品の購入を行い、研究の基礎設定を行った。その結果、次のようなことが認識された。従来の中世の神道を対象とする研究の欠点は、それを積極的に評価するにせよ、消極的に評価するにせよ、神道という存在を実体として想定することにあったといってよい。それを踏まえ、最近は宗教、宗派の枠組みを一旦離れ、信仰の現実そのものを再認識することに比重が置かれている。例えば、昨年の神童宗教学会のシンポジウムでも、このような意見を語る研究者があり、このような認識がある程度共有されていることがわかる。現在、新しい研究においては、従来軽視されていた文献を再評価したり、当時の政治経済的事実や宗教界の人間関係を発掘するといった方法が取られることが多い。しかし、このような研究が新しい中世像を提出しているかといえば、まだそのような成果は生み出されてはいない。その原因は、一つには研究の量的な不足にあるといってよい。しかし、同時に新しい「事実」に頼るという姿勢にも問題があることは否めない。客観的な事実のみに根拠を求めることは、実証主義を標榜する研究の弱点であり、新しい神道研究がこのような弱点みを克服することを一つの目標としているにもかかわらず、それが自覚的に踏まえられていない点に問題があるようである。このような現状に対し、当時の精神世界をどのように構想するかという思想研究の基本に立ち返り、辺緑的な文献・現象を再評価する一方、中心的な文献・現象の再解釈を重視し、思想史の中で日本人の精神世界に新しい視点を見出すよう配慮して、研究を進めたい。今年度は、山岳信仰関連の縁起を中心に研究を行った。日本の神道信仰において、縁起は、単に寺社の成立過程を記録した文献にとどまらない重要な意味をもっている。縁起こそは、日本人の信仰の実態をもっともよく表現したものといわねばならない。

縁起を考える場合、もちろんその内容を十分に分析することが欠かせないが、一方で縁起という表現の形式自体の意味を考察する必要がある。信仰が、特定の時間と場所における神仏の出現と寺社の成立というパターンをとった表現を要求するということは、宗教において一般的なことではなく、日本人の信仰や思考において特徴的な事柄なのである。そこには、信仰を普遍的な超越者のかかわりと考える「大きな」宗教に対し、あくまでも自己が生きている時空との特殊なかかわりの中に超越者を捉えようとする傾向がある。この傾向は、仏教のような「大きな宗教」の受容によって放棄されたのではなく、「元興寺縁起并流記資財帳」などの初期の寺院縁起に見られるように、むしろ仏教との接触によって顕在化し、その後の仏教受容においても、日本化の形式的方法として機能したと思われる。また、このような信仰の機能が、現代の本人の論理規範に与えた影響についても考察した。その形態と評価は時代の社会の構造によって大きな変化を被ったにもかかわらず、基本的な信仰観念は超越的なるものの原像として、人々の心から去ることはなかったように見える。その具体的な事例として、近現代における婚姻儀礼において、近代合理主義的な思考の一般化の中で、神道結婚式の成立という現象をあげることができる。結婚式のように一般的な現代人の生活の一部にも、縁起という形式と共通する発想の信仰が継続していることは、過去の神道思想を考えるにあたっても、留意するべき事実だと思われる。本年度は、三年にわたる研究の最終年度にあたるため、成果のとりまとめを目指して研究を進めた。基本的には、中世神道研究の過去を蓄積を回顧し、現状の問題点を意識化することをまず目指した。また、神仏という概念の実体を確認するために、教義の比較ではなく、具体的な現実の水準での信仰の在り方を理解することが重要である。そこで説経節の「小栗判官」を対象として、中世の具体的な信仰の形を分析した。また、仏教の信仰における神話の一例として親鸞の教説を考察した。現在の神仏の研究が従来の宗派、教派を単位とする研究を克服し、複雑に重なり合った形態を解明することでは一致している。この点は、日本研究全体に見られる基本的な傾向の一つである。しかし、その一方で重要な問題として浮上してくる特徴は次の点である。すなわち、研究が対象とする事象のもつ興味深い特質、形態を個別的に関する理解は展開しているが、それらを俯瞰的に理解するための統一的な視点が確立されていないため、全体を見渡した理解が不明瞭になることである。個々の研究が全体の中でどのような位置にあるのかも把握しにくい。そのため、研究の進展が、かえって混乱を深めているように見えてしまうのである。この点を克服するためには、単に個別的な事象の解明に努力するだけでは不十分であることはいうまでもない。そのために有効な視点の一つとして次のようなものが考えられる。超越的なるものにかかわり、日常的な因果論では説明のつかない説明を行う言説を神話とよぶなら、中世において生まれた神話の特質を明らかにすることが必要である。また、その前提として、文化全体における神話の意味を再検討する必要があろう。
ヒトの上皮系培養細胞を用いた発癌研究

本研究班は本年度も、ヒト多段階における種々の遺伝子変異の役割の解析に応用可能な、培養細胞を用いての実験系の開発を行い、以下の成果及び知見を得た。(1)増井はヒト子宮頸部上皮由来のout-growth培養系を用いることにより、偏平上皮細胞の増殖停止機構に関与する遺伝子eti-1を単離することに成功した。(2)安本はHPV16によるヒトケラチノサイト不死化の系を解析し、細胞同期に関わるp16遺伝子の不死化への関与の可能性を示した。(3)野田は、子宮頸部多段階発癌過程より多数の培養細胞系の解析から、上皮内癌の基底膜への浸潤におけるメタロプロテアーゼの関与を示した。さらにヒト由来培養細胞における遺伝子操作を容易にする、P1ファージの組換え酵素Creの遺伝子を組込んだ。アデノウイルスの作成に成功した。(4)難波と清水は、各々ヒト細胞の試験官内発癌系及び染色体移入によるヒト癌細胞の正常細胞化の系を用いることにより細胞癌化に伴うテロメア短縮化消失現象の重要性を示した。(5)許は、ヒトケラチノサイトの3次元培養系をさらに改良し、創傷治癒過程を試験官内で再現することに成功した。
C型レクチンによる気管支喘息発症抑制機構の解明

気管支喘息の重症度が真菌への感作と相関することが知られているが、Dectin-1、Dectin-2のアレルギー性気道炎症における働きは不明である。我々はDectin-1欠損マウス、Dectin-2欠損マウスを用いてアレルギー性気道炎症におけるDectin-1、Dectin-2の働きを検討した。Dectin-1欠損マウス、Dectin-2欠損マウスでは好酸球性炎症の減弱が認められた。また肺においてDectin-1、Dectin-2はCD11b陽性樹状細胞に発現していた。以上の結果からDectin-1、Dectin-2は樹状細胞を介してアレルギー性気道炎症の増悪に関与していることが示された。気管支喘息は成人の46%が罹患する最も頻度の高いアレルギー性呼吸器疾患である。近年の疫学調査により、喘息有病率は依然増加傾向にあることが示されている。この気管支喘息の増悪因子としては真菌の関与が示唆されている。さらに発症を負に制御する因子としてはBCG、ピロリ菌感染が示されている。興味深いことにこれらの疫学因子はすべて免疫においてはC型レクチンにより認識される。本研究ではC型レクチンに着目し気管支喘息の増悪、および抑制機構を明らかにすることを目的とした。まず、真菌の認識に関与することが知られているC型レクチンであるDectin-1、Dectin-2に着目し解析を行った。野生型マウス、およびDectin-1欠損マウス、Dectin-2欠損マウスにチリダニを経気管投与しアレルギー性気道炎症を惹起し、好酸球炎症、気道過敏性、CD4陽性T細胞分化を比較検討した。興味深いことにDectin-1欠損マウス、Dectin-2欠損マウスにおいては好酸球性炎症、気道過敏性ともに減弱していることが明らかとなった。また、Dectin-1欠損マウス、Dectin-2欠損マウスではTh2細胞分化のみならずTh17細胞分化も減弱していることが明らかとなった。現在は肺におけるDectin-1、Dectin-2の発現細胞を同定し、これらのC型レクチンがTh2細胞分化、Th17細胞分化を促進する分子機構を解析する予定である。気管支喘息は成人の46%が罹患する最も頻度の高いアレルギー性肺疾患である。また、近年の疫学調査でもその罹患率は増加傾向を示していることから、その対策が喫緊の課題とされている。気管支喘息の発症、重症化と正の相関を示す疫学因子として真菌感作が知られており、また気管支喘息の発症と負の相関を示す疫学因子としてBCG接種、ピロリ菌感染が知られている。興味深いことにこれらの因子はすべてC型レクチンにより認識されることが知られているが、C型レクチンのアレルギー性気道炎症発症における働きに関しては不明な点が多い。本研究ではアレルギー性気道炎症における各種C型レクチンの働きを明らかにすることを目的とした。チリダニ(HDM)を経気道投与することにより誘発されるマウスアレルギー性気道炎症モデルを用いて真菌認識機構であるC型レクチンDectin-1、Dectin-2の働きを検討した。Dectin-1欠損マウス、Dectin-2欠損マウスともにDHM誘発性アレルギー性気道炎症モデルにおいて好酸球性炎症が減弱していることが明らかとなった。さらに肺浸潤CD4陽性T細胞のサイトカインプロファイルを検討したところ、Th2サイトカインのみならずTh17サイトカインが減弱していることが明らかとなった。この分子機構を解明するため肺におけるDectin-1、Dectin-2発現細胞を検討した。興味深いことにDectin-1、Dectin-2ともにアレルギー性気道炎症発症に必須であるCD11b陽性樹状細胞に高発現することが明らかとなった。今後は、Dectin-1、Dectin-2のCD11b陽性樹状細胞における働きを詳細に検討するため、それぞれのC型レクチンにより誘導される遺伝子群をRNAシークエンスにより解析する予定である。Dectin-1欠損マウス、Dectin-2欠損マウスの解析によりDectin-1、Dectin-2のアレルギー性気道炎症における働きが解明され、これらの分子に関しては当初の予想を上回る進展を見せていると考える。同様の解析手法は他のC型レクチンの役割の解明にも応用可能であり、今後も順調に進展することが予想される。一方、申請時には他のC型レクチンの解析も並行させることを予定していたが、Dectin-1、Dectin-2の解析を進める過程で、これらの分子が新規治療標的となり得ることが示されたため解析を先行させている。他のC型レクチンに関しても欠損マウスの入手を申請済みであり、コロニーが拡大された時点で早急に解析に着手する予定である。気管支喘息は気道を場とした慢性アレルギー性炎症であり、その病態の中心には抗原特異的Th2細胞、およびTh2サイトカインが存在する。多くの気管支喘息患者は吸入ステロイド薬、および気管支拡張薬によりコントロールが得られるが、喘息患者全体の10%はこれら既存治療に抵抗性であり新たな治療方法の開発が待たれている。一般に気管支喘息の重症度は真菌への感作の有無と相関することが知られている。このことは真菌に対する免疫応答が気管支喘息の重症化へ寄与していることを示唆するが、その詳細な分子機構は不明である。我々は近年、真菌への免疫応答に関わる受容体として同定されたDectin-1、Dectin-2のアレルギー性気道炎症における働きを検討した。Dectin-1、Dectin-

2欠損マウスにHDM誘発性アレルギー性気道炎症を惹起したところ、野生型マウスに比較し有意に気道炎症が減弱していた。さらにTh2細胞分化のみならず、Th17細胞分化も減弱していることが明らかとなった。Dectin-1、Dectin-2が如何にしてアレルギー性気道炎症発症に関わるか、その分子機構を明らかにするため、これらの発現細胞を同定したところDectin-1、Dectin-2ともCD11b陽性樹状細胞に発現することが明らかとなった。さらにDectin-1のCD11b陽性樹状細胞における働きを明らかにするためRNAシークエンス法により解析したところ、Dectin-1は樹状細胞においてケモカイン、ケモカイン受容体の発現を促進することにより樹状細胞の所属リンパ節移行に関与することが明らかとなった。本研究により難治性喘息発症にC型レクチンであるDectin-1、Dectin-2が関与すること、さらにこれらのC型レクチンが難治性喘息治療の新規治療標的となる可能性が示唆された。気管支喘息の重症度が真菌への感作と相関することが知られているが、Dectin-1、Dectin-2のアレルギー性気道炎症における働きは不明である。我々はDectin-1欠損マウス、Dectin-2欠損マウスを用いてアレルギー性気道炎症におけるDectin-1、Dectin-2の働きを検討した。Dectin-1欠損マウス、Dectin-2欠損マウスでは好酸球性炎症の減弱が認められた。また肺においてDectin-1、Dectin-2はCD11b陽性樹状細胞に発現していた。以上の結果からDectin-1、Dectin-2は樹状細胞を介してアレルギー性気道炎症の増悪に関与していることが示された。申請時にはDectin-1、Dectin-2のみならずDC-SIGNなど他のC型レクチンも含めて網羅的に解析し、アレルギー性気道炎症における働きを明らかにすることを目的としていた。しかし、Dectin-1欠損マウス、Dectin-2欠損マウスを用いた解析により興味深い結果が相次いだこと、さらにはこれらのC型レクチンが気管支喘息における新規の治療標的となり得る可能性が示唆されたことから、これらのマウスの解析を先行させている。個々のC型レクチンの発現細胞の同定、細胞内シグナル解析に関してはDectin-1、Dectin-2の解析において用いている手法が他のC型レクチンの解析においても応用できると考えており、当初の研究予定からの変更はあったものの本研究計画は概ね順調に進展していると考える。上記のようにDectin-1、Dectin-2がHDM誘発性アレルギー性気道炎症の発症に寄与していること、さらにDectin-1、Dectin-2が肺CD11b陽性樹状細胞に発現していることが示された。今後はHDMによりDectin-1、Dectin-
魚類の左右非対称性形成機構の解明：なぜ異体類にはオモテとウラができるのか？

本研究では、小型のヒラメ・カレイ類であるササウシノシタにおいて周年採卵技術を確立し、胚のトランスクリプトーム情報を整備し、マイクロインジェクション技術を開発し、ササウシノシタをヒラメ・カレイ類のモデル実験動物として用いていく基盤を整えた。最後に、ササウシノシタにおいてゲノム編集による左右性関連遺伝子の機能解析を試みた。人為的な低水温刺激と短日化により、通常は産卵しない冬に産卵可能かを調べた。500リットルの水槽を用い10月1日から短日化および低温処理(10L14D, 15°C)への移行を開始し、2ヶ月間低温、短日処理を行った後、1月1日から長日化および高温条件(16L4D, 22°C)への移行を開始した。コントロール区は、自然日長、自然水温の条件で飼育を行った。その結果、短日・低温処理を行った試験区においてのみ1月中からの採卵が観察された。このことにより、ササウシノシタで周年受精卵を得ることが事実上可能になったと考えられる。全長約2cmのササウシノシタ稚魚1個体から内臓を取り除き、ゲノムを抽出した。抽出したゲノムを用いてHiseq 2000シーケンサーでシーケンスを行った。その結果、全ゲノムサイズのおおよぼ150×に相当する約75Gbのゲノム情報を得ることができた。CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集技術を確立するためには、ササウシノシタでマイクロインジェクション法を開発しなければならない。今年度は、受精卵の固定方法、インジェクション用針の最適化、受精卵のリンガー液の最適化を行った。その結果、受精卵の固定はピペットマンの200ulのチップの先をカットして吸引して固定する方法が効率よくインジェクションできること、インジェクション用の針はナリシゲ製プラーPC-10のHeaterlevel 80重り250gの設定で作成した針がもっとも卵の生残率がよいことがわかった。またリンガー液について、培養液にアルブミンやポリエチレングルコールなどを濃度を変えて添加し生残率を比較する実験を行ったが生残率の向上は見られなかった。ササウシノシタの成熟の開始に低水温または短日のどちらが必要かあるいは両方が必要かを検討することを目的に実験を行った。コントロール群では周年自然水温自然日長で採卵を行った。試験区1では、夏期に2ヶ月の16°Cの低水温処理のみ、試験区2では夏期に2ヶ月の短日処理のみ、試験区3では2ヶ月の低水温と短日両方の処理を行った。その後12月から徐々に長日、22度の環境条件に移行し、産卵を試みた。その結果、1月から3月までの1日当たりの産卵量について、試験区3の低水温、短日両方の処理を行った区で最も産卵量が多く、続いて、試験区1の低水温処理のみを行った区、続いて試験区2の短日処理のみを行った区、そして無処理区の順となった。このことからササウシノシタでは短日および低温両要因とも成熟を促す要因であること、短日よりも低温がより成熟を促すこと、そして短日と低温は相加的に成熟に影響を及ぼすことが示唆された。ササウシノシタ胚のトランスクリプトーム解析を行い、前年度得られていたゲノム情報と合わせて左右性関連遺伝子の単離を行った。その結果、ヒラメの左右形成に関与することがわかっているnodal, lefty,pitx2の配列を単離した。またその他に同様に左右成形性に関与することが知られているpolycystic kidney disease 2(pkd2)も単離することができた。ササウシノシタをモデル生物として扱うには、周年安定して個体を維持し、周年受精卵を得られるように飼育条件を最適化することが不可欠である。今年度、ササウシノシタにおいて低水温刺激と短日化処理を両方行うことがもっとも産卵量を増加させることを明らかにした。このことによりほぼ周年採卵技術は完成した。また異体類の左右成形性形成に関連するとみられるpitx2, lefty, nodal, pkd2を単離することができた。現在、周年採卵技術開発においてまだ産卵が続いており引き続きデータを取得しているため、ゲノム編集技術開発がスタートできていないが、新たにササウシは飼育条件によっては8ヶ月程度で成熟することがわかっているので十分当初の目標達成可能である。このことにより、当初の計画通り進んでいると考えている。ササウシノシタ親魚に対する栄養強化剤としてビタミンAを添加することでその産卵量が増えるか調べるため、おとひめEP1にビタミンAを強化した餌を給餌した区とビタミンAを強化していない区を設定し、浮上卵数の違いを7月から10月まで4ヶ月間にわたり継続的に70日間調査した。その結果、産卵量はビタミンAを強化した試験区の方で一日平均約4884±966粒(平均±標準誤差)、強化していない試験区で約1563±275粒(平均±標準誤差)であり、統計的に有意にビタミンAを強化した餌料を給餌した試験区で産卵量が多いことを明らかにした(Mann-Whitney's U test, p<0.01)。また、ササウシノシタ胚からクローニングしたsouthpaw, lefty, pitx2遺伝子のホールマウントin situ法での発現解析を行い、他魚種で報告されている部位で同様の発現が確認でき、ササウシノシタにおいてもこれらの遺伝子が左右性形成に関与していることが示唆された。また、