hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
がん個別化治療確立を目指した新規がん特異的トランスポーターの橋渡し研究

本研究では、がん型organic anion transporting polypeptide 1B3(がん型OATP1B3)のがん治療・臨床への応用を目指した基礎研究をおこなった。その結果、がん型OATP1B3はヒト肺がんにおいてがん組織特異的に発現することが明らかとなり、ヒト大腸がんでは、さらに頻度・発現量ともに高く発現することが明らかとなった。また、ヒト大腸がん試料を用いた解析から、本遺伝子は高いがん診断力および早期がん検出能を有するバイオマーカーとなる可能性が見出された。我々が同定したがん組織特異的に発現するcancer-type OATP1B3 (Ct-OATP1B3) mRNAについて、本年度はヒト大腸がん組織(n=39)における発現プロファイルの解析をおこなった。その結果、Ct-OATP1B3 mRNA発現は、ヒト大腸組織において87.2% (34/39)と極めて高い頻度で認められたのに対し、隣接正常組織の発現陽性頻度は2.6% (1/39)であった。また、発現陽性検体いずれにおいても、Ct-OATP1B3 mRNAの発現量は正常組織よりもがん組織において高かった。さらに、Ct-OATP1B3 mRNA発現は進行がんばかりでなく早期がん(ステージ0-2)においても高頻度で認められ、またその発現レベルとがん高分化型との間にも関連が認められた。これら発現プロファイルに基づきバイオマーカーの特異性・感度を評価するreceiver operating characteristic curve analysisをおこなったところ、Ct-OATP1B3 mRNAのがん検出力は0.93(最高値は1.0)であった。これは既存の大腸がんマーカーであるcarcinoembryonic antigenと同等の値である。したがってCt-OATP1B3 mRNAは、新たな大腸がん検出・診断バイオマーカーとなる可能性があると考えられた。一方、種々のがん細胞および遺伝子導入細胞系を用いて検討をおこなったが、Ct-OATP1B3のタンパク質発現およびトランスポーター機能はこれまでに認められていない。したがって、今後はCt-OATP1B3 mRNAの大腸がんバイオーマーカーとしての確立を目指すとともに、その機能分子実体の同定にも注力する必要があると考えられる。ヒトorganic anion transporting polypeptide 1B3 (OATP1B3)は、抗がん剤を含む多くの化合物の細胞内取り込みに関与する。最近我々は、がん組織に発現する新規バリアント、cancer-type OATP1B3 (Ct-OATP1B3) mRNAを同定したが、種々のヒトがん組織におけるCt-OATP1B3 mRNAの発現頻度や発現レベル、また、そのタンパク質の機能は明らかとなっていない。そこで本研究では、ヒト肺がん組織を対象としてCt-OATP1B3 mRNAの発現プロファイルを明らかとすること、さらにがん細胞におけるCt-OATP1B3の生物学的機能を明らかとすることを目的とした。ヒト肺がん組織30検体におけるCt-OATP1B3 mRNA発現量を解析したところ、33% (10/30)の検体でその顕著な発現が認められた。がん組織と隣接正常組織との比較解析をおこなったところ、顕著な発現が認められた全ての検体においてCt-OATP1B3 mRNAはがん組織で優位に発現していた(4158倍)。一方、ヒト大腸がん由来HCT116細胞を用いてRNAi法によりCt-OATP1B3 mRNAをノックダウンしたところ、コントロール細胞と比較しノックダウン細胞では細胞増殖能の低下が認められた。以上より、ヒト肺がん組織ではがん化に伴うCt-OATP1B3 mRNAの顕著な発現が、高頻度に認められることが明らかとなった。また、ヒト大腸がん細胞においてCt-OATP1B3は細胞増殖に関与する可能性が考えられた。したがって、今後はより多くのヒト肺がん検体を用いてin vivoにおけるCt-OATP1B3の発現とがんの進行度との関連を確立していくとともに、Ct-OATP1B3による細胞増殖亢進機序を明らかとしていく必要があると考えられた。本研究では、cancer-type organic anion transporting polypeptide 1B3 (Ct-OATP1B3) mRNAのヒトがん組織における発現プロファイルおよびその機能を明らかとすることを目的とした。前年度までにヒト肺がん組織(28検体)およびヒト大腸がん組織(39検体)を用いて遺伝子発現解析をおこない、Ct-OATP1B3 mRNAの発現は極めてがん特異的な発現プロファイルを有することを明らかとした。さらに、ヒト大腸がんにおいては早期ステージにおいても高い頻度でCt-OATP1B3 mRNAの発現が認められることを明らかとした。そこで最終年度では、他のがん種についてCt-OATP1B3 mRNA発現解析をおこない、新たに骨がん細胞においてもCt-OATP1B3 mRNAが発現していることを見出した。一方、前年度までにおこなったCt-OATP1B3発現がん細胞または遺伝子導入細胞を用いた解析では、Ct-OATP1B3のタンパク質発現およびトランスポーター機能は認められていない。

そこで最終年度では、tet-on誘導発現系を構築し、Ct-OATP1B3発現の細胞増殖能への影響を検討した。しかしながら、通常培養においてはCt-OATP1B3発現細胞と非発現細胞間で明確な細胞増殖能の差異は認められなかった。以上、本研究期間では、Ct-OATP1B3 mRNAは様々ながん種において極めて高いがん特異的な発現プロファイルを有していることを明らかとした。したがって、Ct-OATP1B3 mRNAはがん診断における新たなバイオマーカーとなる可能性があると考えられる。一方で、Ct-OATP1B3のがんにおける役割は未だ不明である。今後、がん浸潤や抗がん剤耐性評価など他の手法を用いて、Ct-OATP1B3の機能解明を進める必要があると考えられる。薬物動態本研究の当初の目的は、1)ヒトがん組織における発現プロファイル(頻度・レベル)を明らかとすること、および2)がん特異的OATP1B3のがん細胞における機能を明らかとすること、である。これら目的に対し我々は順次検討を進めており、下記のとおり得られた成果は概ね期待に沿うものであると考えられることから、上記達成度を選択した。1)では、前年度のヒト肺がん検体による解析に加え、ヒト大腸がん組織においてもct-OATP1B3 mRNAが高頻度に認められることを明らかとした。さらに本結果より、ct-OATP1B3 mRNAは新たながんバイオマーカーとなりうる可能性が見出された。また、この成果に対し、海外の研究者からの問い合わせもあり、共同研究遂行に向けた協議をおこなっている。したがって、これらの点について当初予想以上の成果が得られつつあると考えている。2)では、昨年度、大腸がん細胞においてCt-OATP1B3が細胞増殖能に関与する可能性を見出したが、本年度までの検討結果ではCt-OATP1B3タンパク質の発現やトランスポーター機能の同定までに至っていない。しかしながら、これら結果をまとめると、Ct-OATP1B3遺伝子は従来予想されていたものとは異なる機序により細胞増殖能に関与する可能性が考えられる。したがって、これを解明すれば大きなインパクトとともに新たな切り口からのがん治療標的の同定につながると期待される。本研究の当初の目的は、1)ヒトがん組織における発現プロファイル(頻度・レベル)を明らかとすること、および2)がん特異的OATP1B3のがん細胞における機能を明らかとすること、である。1)では、ヒト肺がん組織30検体のうち、約33%の頻度においてct-OATP1B3 mRNAが高頻度に認められることを明らかとした。
廃棄物処分を対象にした止水材料の透水性と膨潤性に関する研究

本研究は放射性廃棄物の地層処分のための止水材料として想定されているベントナイトの透水性と膨潤性について、21年度は前年度に引き続き、ベントナイトの膨潤特性に及ぼす塩分濃度の影響を中心に研究を行った。これは、ベントナイトの膨潤特性に関するこれまでの研究は、その多くが蒸留水を用いたものであったが、放射性廃棄物の地層処分の候補地は海に近い場合が多く、実際の地下水環境には塩分が含まれる可能性があるためである。実験においては、粉末状のKunigel bentoniteを締固めて初期乾燥密度1.301.90g/cm^3の供試体を作製した。また吸水膨潤に使用した塩水のNaCl濃度は0.54.0moles/lであった。圧密試験容器に入れた供試体に一定鉛直圧0.16Mpaの下で供試体下端から塩水を供給し、膨潤量を測定した。蒸留水を用いた実験によると、初期乾燥密度が高いほどモンモリロナイト含有量が多くなるため膨潤率が高くなること、浸透開始から約200時間でほぼ定常状態となることなど、本研究でも既往の研究と整合する結果が得られている。一方、塩分が加わると、塩分濃度が高いほど膨潤量、膨潤速度とも低下し、特に1.0moles/l以上の濃度になると膨潤がほとんど見られなくなった。これは、廃棄物処分の止水材として期待されているベントナイトとしては問題となりうるため、今後更なる検討が必要である。さらに、試料への水の供給は下端面からのみ行われるため、吸水膨潤は高さ方向に不均一である事が考えられる。そこで、供試体を高さ方向へいくつかに分割し、含水比と密度を計測した。その結果、高さ方向での不均一性が確認され、実験結果の解釈において今後更なる考慮が必要である事が示された。本研究は廃棄物処分のための止水材料(3種類のベントナイト及びそれらのベントナイトと砂の混合土)の透水性と膨潤性について、(1)周辺温度が及ぼす影響とその算定式の提案、(2)温度が及ぼす影響をミクロ的な観点から解明すること、(3)10^<-8>cm/s以下の透水係数の信頼性を確認することを目的とし、19年度は(1)を対象にして、特性の異なる3種類のベントナイトを用いて、580°Cの温度、1.31.9g/cm^3の乾燥密度の供試体について、透水試験、膨潤量試験、および膨潤圧試験を行った。その結果、透水係数は間隙比の減少に伴って直線的に著しく減少する。また、温度の上昇に伴って増加するが、温度による水の粘性係数を考慮するとほとんど差がなくなり、透水係数の温度依存性は、主に水の粘性係数の影響であることが明らかになった。無載荷状態における膨潤率および膨潤圧は乾燥密度の増加に伴って増加するが、この傾向は膨潤率よりも膨潤圧の方が著しく、膨潤圧は乾燥密度の影響を受けやすい。また、膨潤量測定過程における供試体の土粒子、水、空気の体積率を算出した結果、膨潤初期において空気の体積率が極めて小さくなり、その後増加し、再び減少に転じて最終的に飽和状態に近づくことが明らかになった。膨潤の初期段階では供試体上部まで水が浸透していないことから、この現象は供試体内に局部的な水の層が形成され、時間の経過とともに水の層が消滅していくことを意味し、膨潤機構を解明するうえで極めて重要な成果である。温度の増加につれて膨潤率と膨潤圧とも増加する。その影響は膨潤圧の方が顕著であり、20°Cから80°Cになると膨潤圧は1.52.0倍にも及ぶことなどが明らかになった。本研究は放射性廃棄物の地層処分のための止水材料として想定されているベントナイトの透水性と膨潤性について、19年度は周辺温度が及ぼす影響とその算定式の提案を目的とし特性の異なる3種類のベントナイトを用いて、580°Cの温度、1.31.9g/cm^3の乾燥密度の供試体について、透水試験、膨潤量試験、および膨潤圧試験を行った。20年度は、ベントナイトの膨潤特性に及ぼす塩分濃度の影響を中心に研究を行った。

これは、廃棄物処分の止水材として期待されているベントナイトとしては問題となりうるため、今後更なる検討が必要である。本研究は放射性廃棄物の地層処分のための止水材料として想定されているベントナイトの透水性と膨潤性について、21年度は前年度に引き続き、ベントナイトの膨潤特性に及ぼす塩分濃度の影響を中心に研究を行った。これは、ベントナイトの膨潤特性に関するこれまでの研究は、その多くが蒸留水を用いたものであったが、放射性廃棄物の地層処分の候補地は海に近い場合が多く、実際の地下水環境には塩分が含まれる可能性があるためである。実験においては、粉末状のKunigel bentoniteを締固めて初期乾燥密度1.301.90g/cm^3の供試体を作製した。また吸水膨潤に使用した塩水のNaCl濃度は0.54.0moles/lであった。圧密試験容器に入れた供試体に一定鉛直圧0.16Mpaの下で供試体下端から塩水を供給し、膨潤量を測定した。蒸留水を用いた実験によると、初期乾燥密度が高いほどモンモリロナイト含有量が多くなるため膨潤率が高くなること、浸透開始から約200時間でほぼ定常状態となることなど、本研究でも既往の研究と整合する結果が得られている。一方、塩分が加わると、塩分濃度が高いほど膨潤量、膨潤速度とも低下し、特に1.0moles/l以上の濃度になると膨潤がほとんど見られなくなった。さらに、試料への水の供給は下端面からのみ行われるため、吸水膨潤は高さ方向に不均一である事が考えられる。そこで、供試体を高さ方向へいくつかに分割し、含水比と密度を計測した。その結果、高さ方向での不均一性が確認され、実験結果の解釈において今後更なる考慮が必要である事が示された。
自動的部分情報抽出方式に基づく知識Webアプリケーションの連携・統合法の研究

従来Web上の一般的なWebサービス関数を連携させて1つの仕事を達成するにはプログラミングが必要であった。プログラミングせずにダイアグラムから作成する手法も存在したが、扱えるWebサービス関数に強い制限があった。本研究はプログラミングなしに、宣言的記述を用いて、WebアプリケーションおよびREST型Webサービスをデスクトップコンピュータやスマートフォン上で連携統合する方法を開発した。Webサービス関数を提供していないWebアプリケーションの情報を利用した統合を可能にするため,部分情報抽出技術を利用してWebサービス関数を作成する手法を開発した.ユーザは少量のページに対して抽出した情報の部分をGUIで指定するだけで,それ以外の類似ページからも同じ情報を自動的に抽出することができ,プログラミングやHTMLの知識を持たない人でもWebサービス関数を作成可能となった.また, Webアプリケーション統合のためのJavaクラスパッケージを開発し,統合の際のプログラミングの労力を軽減することが可能となった.ニュースサイトから収集した記事を利用してWebアプリケーション統合を行うため,我々は,ニュース検索エンジンを利用して本文抽出する手法を開発した.ニュースサイトが提供する検索機能を利用することにより,毎日の定期的なクローリングや収集したページのニュース記事ページか否かの判定の必要がなくなる.また,特定のページ構造に特化しない記事本文抽出手法により,異なるニュースサイトに対しても,突然のページ構造の変更に対しても,引き続き同じ手法を適用可能であるという特徴も持つ.さらに,携帯端末のためのWebサービス統合のためのツールの開発も行った.携帯端末は機種によって使用可能な機能が異なるが,ユーザの端末が持つ機能をチェックし,統合を行うためのツールを開発することにより,機能の限られた端末でもWebサービスの統合が可能となった.平成21年度は,主に2つのテーマについて研究成果を得た.1つ目は,動的コンテンツも含めた部分情報抽出法と連携手法の開発,2つ目はRSSに基づき構造変動に左右されないニュース記事の本文抽出法の開発を行った.従来の部分情報抽出は静的に存在するテキスト,静止画,動画,音声などを対象とし,スクリプトが動的に生成する部分の抽出は対象外であったが,指定した部分以外を非表示にすることにより,これらのスクリプトが動的に生成する部分を抽出する手法を開発した.ユーザは抽出したい部分を指定するだけで,システムは指定部分を検索し,表示する部分と表示しない部分を決定する.また,抽出した部分の間のデータの受け渡しの定義方式の導入により,複数の抽出部分を連携動作させることが可能となった.さらに,従来の静的コンテンツの抽出手法と組み合わせることにより,柔軟な部分情報抽出と抽出した部分の間の連携が可能となった.また,RSSを利用したニュース記事の本文抽出手法を開発した.RSSから取得したタイトルを利用して記事本文の位置を特定し,抽出する.関連手法は機械学習等を利用して事前にレイアウトを分析し,抽出箇所を決定するが,サイトごとに学習・分析が必要であり,また,突然のレイアウト変更に対応できないという問題がある.本手法は対象ページのレイアウトに依存しないため,異なるレイアウトを持つニュースサイトに対しても同じ手法を適用可能であり,さらに突然のレイアウト変更があっても継続して本文抽出が可能という特徴を持つ.Web上のWebサービス関数を連携統合する目的で広く使われる手法に手動プログラミングに基づくWebサービス統合技術がある。またWebサイト上の時間的あるいは空間的に一連と考えられるWebページの必要部分の情報を、手動プログラミング、あるいは手動プログラミングなしに、取得する技術に部分情報抽出がある。本研究では、我々の研究グループが開発した手動プログラミングなしに部分情報抽出を行う方法に基づき、総合的な連携統合技術を開発することに成功した。すなわち、プログラミングなしに、宣言的記述を用いて、Webアプリケーション、REST型Webサービス、スマートフォンのアプリケーションを柔軟に連携統合することが容易に可能となった。例えば、スマートフォンを用いて、洋書のISBN情報のバーコードをカメラで読み取り、対応する書名をネット書店の検索から取り出し、さらに対応する書評を書評サイトから得る連携統合アプリケーションを容易に記述して生成できるようになった。研究成果は、米国、フィンランド、オーストリアの国際会議において、成果発表を行い、多くの参加者から高い評価を得た。デモは代表的なスマートフォンであるAndroidスマートフォンを用いて、Web上の各種WebアプリケーションとWebサービスを連携統合する興味深い実例をいくつか示すことによって行った。
金ナノロッドアレイを用いる高機能SPRセンサの創製

今年度は下記のような研究成果が得られた。(1)金ナノロッド組織体の制御と分光特性評価(山田、連携研究者:熊本大学助教桑原穣)金ナノロッドは大日本塗料(株)より入手した。ロッド表面をアルキルチオール類で交換し、長鎖アミンを含む水-有機二相系に加えて撹拌することにより、相間移動によって数十個程度の集合体を形成させた。異なる形状のナノロッドについて検討し、ナノロッドの形状に依存する配列構造をもつ組織体の形成が確認できた。(2)シリカ系樹脂の活用(山田、大学院生)シリカ系高分子であるコンポセランの有機溶液に金ナノロッドを分散し、一方向からガラス基板にキャストした。キャスト膜にアニール処理を施す前後で偏光吸収スペクトルを測定し、アレイ構造形成の有無を検討した。その結果、アスペクト比が33以上のものについて偏光特性が観測された。しかし、プラズモンバンドがブロードであった。そこで、アスペクト比8.5のものについて検討した。まず、溶媒の誘電率依存性を検討した結果、溶媒の誘電率に依存してプラズモンバンドのシフトが明瞭に観測された。すなわち、センサとして機能することを明らかとなり、透過方式のSPRチップとしての有用性が提唱できた。(3)単粒子膜の検討(山田、大学院生)気-液界面に金ナのロッドを分散した後、表面を圧縮し、ロッドをガラス基板にすくいとった。作製したロッド基板のプラズモンバンドを測定したが、非常に弱く、定性的解析に留まった。今後、より疎水化したロッドの開発が必要であることが分かった。形状の異なる金ナノロッドの調製と分離方法、表面修飾技術ならびに透明基板への固定化技術と特性評価を行った。(1)金ナノロッドの合成(山田)金ナノロッドについては企業と共同でアスペクト比(縦横比)が380程度の範囲のものを合成できるようになった。また、疎水化処理については、有機溶剤に可溶化できる表面修飾法についても検討を進め、水面に浮かぶ状態まで改善できた。(2)表面修飾の検討(山田、連携研究者:上地)金ナノロッドの表面をシランカップリング剤とチオール系色素で覆う方法により、水面に浮かぶ状態になった。このロッドを有機溶剤に分散したものを水面上に展開し、ラングミュア-ブロジェット法で単粒子薄膜を形成することに成功した。しかし、この薄膜をガラス基板に転写することが困難であった。現在も継続して検討を進めている。(3)光学的特性評価と固定化の検討(山田、連携研究者:上地)金ナノロッド薄膜の分光特性を吸収スペクトルで評価解析するために、高出力キセノン光源を購入した。水面単粒子膜についてはガラス基板に転写できなかったので、シリカ系高分子であるコンポセランと疎水処理した金ナノロッドを混合し、ガラス基板にキャストして薄膜を形成した。偏光スペクトルを測定したところ、膜厚が薄く(3-4μm)含有量が多い(25%)場合に明確な偏光特性が認められた。さらに、加熱処理を施すと、180°Cで30分加熱しても安定性が保持できた。一方、疎水化金ナノロッドをガラス基板に直接キャストした場合、プラズモンバンドがブロードになりすぎ、金ナノロッド間の相互作用が強すぎることが分かった。現在、希釈法について検討を進めている。
チタン-口腔上皮界面でのヘミデスモゾーム/基底膜の構成タンパクの発現と産生

上皮細胞の接着と移動に機能するラミニン5(Ln-5)は、付着上皮(JE)の内側基底板(IBL)と外側基底板(EBL)での局在が報告されている。しかしながら、インプラント周囲上皮(PIE)でのLn-5の局在は不明である。光顕的観察により、Ln-5免疫陽性反応物は、インプラントに面するPIEに帯状に認められた。しかし、この界面上部では、Ln-5が局在していなかった。Ln-5は、PIE・インプラント周囲溝上皮・口腔上皮とそれらに面する結合組織との界面にも認められた。電顕レベルでは、PIEとインプラント表面の界面上部では、Ln-5反応物が沈着していたが、低部では、ヘミデスモゾーム(HD)を含む幅100nmのIBLにLn-5反応物が観察された。最内層3層のPIE細胞内にもLn-5が観察された。PIE基底側では、基底細胞内およびEBLにLn-5反応物が認められた。EBLの一部分では、EBLの断裂やHD構造の欠如が観察された。次に、PIE形成時におけるLn-5の分布を抜歯後の口腔粘膜修復過程でのLn-5の分布と比較検討した。抜歯後1日目にJEは消失し、3日後、歯肉溝上皮(OSE)から、Ln-5陽性の上皮細胞が、抜歯窩辺縁から創傷部に水平に伸長した。5日後、伸長した上皮は連続し、抜歯窩創傷部を被覆する新しい上皮が形成された。Ln-5は、この新しい上皮の基底膜に局在していた。12週間後、唯一、口腔上皮によって抜歯窩を覆った状態になる。インプラント埋入後3日目ではJEは消失していた。Ln-5陽性の上皮細胞は、OSEから伸長し、創傷部最前線から根尖側へと伸びた。12週間後、インプラントを取り囲むPIEが形成され、Ln-5は、結合組織界面に局在していた。埋入4週間後では、Ln-5はインプラントとPIE界面にも観察された。以上の知見より、Ln-5が、インプラントとPIEとの接着ならびに、PIEの形成に深く関与することが示唆された。Ln-5の局在様式と密接に関連するIBL、EBLそしてHDの部分的欠如により、PIEは、JEと比べて接着力が弱く、外部から浸透しやすい上皮であると推測できる。さらに、PIEがOE由来であるとも示唆された。歯牙欠損治療の選択肢の一つである歯科インプラントは口腔粘膜を貫通し、口腔内に露出しているため、その貫通部位が感染経路となり結果的にインプラント周囲炎を引き起こし、重篤な結果を招くことがある。インプラント体と骨との結合の重要性と共に、口腔歯肉上皮組織との接着によるインプラント周囲の封鎖がインプラント治療の成功に重要な役割を果たしている。

にもかかわらず、口腔上皮細胞とインプラント体との生物学的関係はいまだ不明の点が多い。そこで、我々はラット口腔上皮細胞と純チタンとの関係を知るため、初代培養を行い、培養口腔上皮細胞のチタン上、培養ディッシュ上、ガラス上での接着、伸展、増殖などの動態を調べた。初期接着細胞数はチタン上において培養ディッシュ上よりも有意に少なく、細胞面積は培養開始24時間後においてのみ、チタンまたはガラス上が培養ディッシュ上よりも小さかった。コロニー形成は培養デイッシュ上やガラス上では48時間後にピークに達したのに対して、チタン上では12時間から120時間にかけて徐々に増加した。細胞増殖率についても、培養ディッシュ上やガラス上では48時間後にピークを迎えたのに対して、チタン上では72時間後であった。以上のことから、口腔上皮細胞は、チタン上では培養ディッシュ上に較べて接着性に乏しく、また増殖時期も遅延することが明らかとなった。さらに、上皮細胞の接着や、移動に重要な役割を果たすことが知られているラミニン5の免疫細胞化学を行った。すると、すべての培養口腔上皮細胞に局在が見られ、興味深いことに、コロニー形成していない単独の細胞では細胞周囲の培養基質にラミニン5の沈着が見られた。現在さらに、チタン上における上皮細胞の接着についての他の種々のタンパクの局在様式の差について、免疫細胞化学的手法を用いて精査しているところである。歯牙欠損治療の選択肢の一つである歯科インプラントは義歯にかわるものとしてよく用いられてきている。しかしながら、口腔粘膜を貫通し、口腔内に露出しているため、その貫通部位が感染経路となり結果的にインプラント周囲炎を引き起こし、重篤な結果を招くことがある。口腔上皮組織とインプラントとの接着は口腔上皮と歯牙との接着よりも弱いことがその原因のひとつであることから、我々は口腔上皮細胞と歯牙そしてインプラント体との界面に着目した。ラット口腔内へのチタンインプラント挿入実験によると、組織学的にはインプラント周囲組織は歯牙周囲の組織と類似した構造を示していた。我々のこれまでの研究によって、このインプラント周囲組織は外来物が進入しやすいことがわかっている。そこで、細胞接着と運動に強く関わっていることが知られているラミニン5の局在について、免疫細胞化学によりチタンインプラント埋入動物のインプラントと歯肉上皮の界面を正常な歯牙との界面と比較した。その結果、付着上皮とエナメル質との界面(内側基底板)に強いラミニン5沈着がみられ、外側基底板から口腔上皮の基底膜にも認められた。一方、インプラント周囲上皮とインプラントとの界面ではやや弱いながらも、ラミニン5の局在が認められた。そのラミニン5の界面での量は歯牙に面したものに比べ少なく、とくに口腔側に近い部分はわずかであった。電顕レベルの観察では、エナメルに面した細胞内外にラミニン5が局在していた。また、インプラント周囲組織では歯根側において、上皮だけでなく結合組織にも強い反応が認められた。また昨年に引き続き、さらに、チタン上における上皮細胞の接着についての種々のタンパクの局在様式の差について、精査しているところである。チタンディスク上、カルチャーディッシュ上でシート状培養をおこなった。カルチャーディッシュ上と比較して、チタンディスク上では、F-アクチンの構成の発達程度が劣っていた。phosphatidyl inositol 3 kinase(PI3-kinase)のインヒビターであるwortomannin(WT)を30分作用させたところ、上皮内のF-アクチンの構成が破綻していた。WTは、リバーシブルな薬剤である。WT処理後、wash outすると、細胞内のPI3-kinaseの活性が徐々に回復することが知られている。
膵β機能再構築インスリン分泌培養細胞を応用したバイオハイブリット型人工膵島の開発

非膵島細胞にヒトインスリン分泌機構を構築し、バイオハイブリッド型人工膵島として用いることができれば、異種膵島移植に比し、ヒトインスリンを分泌しうること、細胞の大量供給が容易になること、など格段に優れた移植方式となる。移植部位として、生理的インスリン注入部位として門脈内投与が望ましいが、安全面、管理面から困難な点がある。そこで、本研究は腹腔内注入を選択し、糖尿病動物を用いて、closed-loopインスリン腹腔内注入アルゴリズムを作成した。その結果、血漿インスリン濃度の最高値(Cmax)は皮下投与時と有意差はなかったが、最高値到達時間(Tmax)は皮下投与時は、皮下投与時45分に比し、25分と速やかに吸収された。血糖値の低下も同様の結果を得た。ヒトインスリン発現非膵島細胞(AtT20HI細胞)にGLUT2とGK両遺伝子を発現せせることによって、ブドウ糖濃度依存性にヒトインスリンを分泌するAtT20HI-GLUT2-GK細胞を構築した結果、膵β細胞機能に極めて類似した細胞特性を有するが、ブドウ糖ステップ状負荷時のインスリン分泌応答は、生理的2相性分泌でなく、インスリン分泌初期第1相を欠如した。そのため、膵β細胞の2相性インスリン分泌調節に関与するとされる細胞内シグナル(ホスホリパーゼ(PLC)・イノシトールホスフェート3リン酸(IP3)系、cADP・リボース)の同定を試みた結果、膵ラ氏島と異なり、AtT20HI-GLUT2-GK細胞にはPLCβ、PLCδの発現は認めないこと、膵ラ氏島におけるPLCの特異的阻害は第1相でなく、第2相インスリンの分泌の消失を来すこと、などが明らかとなった。
mdxマウス横隔膜への治療用遺伝子dystrophinの導入効率と治療効果

dystrophin発現カセットとマーカーであるLacZ発現カセットをもつヘルパーウイルス依存型アデノウイルスベクターを(Maedaら. Virology, 2003)の方法に従い、作製した。そのtiterは約5×10111×1012 particles/ mlであった。作製したウイルス溶液4050μlを7日齢のオスのmdxマウスの腹腔内に注入し、注入1週後に横隔膜を摘出してX-gal染色を行い、横隔膜全体に対するβ-galの発現割合を評価したところ、その発現割合は2050%であった。次に、横隔膜の凍結筋切片を作製してdystrophinの免疫染色を行い、dystrophin陽性の筋線維の割合を定量的に評価したが、その割合は約1020%であった。まず基礎データとするために、6週齢のオスのmdxマウスおよびC57black10マウス(コントロール、以下B10)の横隔膜の等尺性張力(単収縮、強縮)を測定した。単収縮時の張力はmdxでは1.184±0.216(標準偏差)g重、B10では1.507±0.217g重であった。強縮(刺激周波数100Hz)時の張力は、mdxでは5.409±0.887g重、B10では9.0297±0.060g重であり、t検定で明らかな有意差が得られた。そこで次に、mdxとB10それぞれにおいて、刺激周波数を1,10,20,30,50,100,150(Hz)と漸増した際の周波数特性を評価した。その結果、mdxではB10と比較して、周波数増に伴い、等尺性張力の差が明瞭となった。特に、刺激周波数が50,100,150(Hz)では、mdxでのその相対値は、それぞれ0.617, 0.595, 0.579であった。これらは、横隔膜に治療介を行い、張力という機能面の治療効果判定を行う際に、非常に有用な指標となることが確認できた。次に、dystrophinおよびマーカー遺伝子であるLacZ発現カセットをもつヘルパーウイルス依存型アデノウイルスベクター溶液を(Maedaら.Virology,2003)の方法で作製した。そのtiterは約1×10^<12>particles/mlであった。作製したウイルス溶液40μ1を1週齢のオスのmdxマウスの腹腔内に注入し、2週後に横隔膜全体に対するLacZの発現割合を評価したところ、その割合は3050%であった。そこで、横隔膜の凍結筋切片を作製してdystrophinの免疫染色を行い、dystrophin陽性の筋線維の割合を定量的に評価したが、その割合は1020%にとどまった。遺伝子導入がなされやすい幼若なマウスでの短期間の遺伝子発現効率を検討したにもかかわらず、横隔膜でのdystrophinの発現効率は低値であった。次年度は遺伝子導入効率の再検討と合わせて、骨格筋の張力を改善させるのに寄与しうる薬物による補助療法なども含めて検討を行う。遺伝子導入効率の再検討のために、昨年度と同様に再度、dystrophin発現カセットとマーカーであるLacZ発現カセットをもつヘルパーウイルス依存型アデノウイルスベクターを(Maedaら.Virology,2003)の方法に従い、作製した。そのtiterは約5×10^<11>particles/mlであった。作製したウイルス溶液50μ1を7日齢のオスのmdxマウスの腹腔内に注入し、注入1週後に横隔膜を摘出してX-gal染色を行い、横隔膜全体に対するβ-ga1の発現割合を評価したところ、その発現割合は2040%であった。次に、横隔膜の凍結筋切片を作製してdystrophinの免疫染色を行い、dystrophin陽性の筋線維の割合を定量的に評価したが、その割合は約10%にとどまった。今回作製したウイルスベクターのtiterが上述のように低かった影響も考えられるが、遺伝子導入がなされやすい幼若なマウスにおいて短期間での遺伝子発現割合を検討したにもかかわらず、横隔膜でのdystrophinの発現割合は低値であった。我々が過去に行ったdystrophin遺伝子導入実験の結果などから、上記のdystrophin導入効率では病理学的、さらには筋生理学的な治療効果は期待できない。そのため、現在ウイルスベクターのtiterを上げる工夫とともに、mdxマウス骨格筋の張力を改善させる可能性がある薬物について、遺伝子治療との併用療法を念頭に、培養細胞などを用いて研究を進めているところである。
メタゲノム解析と化学生態学からみた“花-酵母-昆虫 三者共生仮説”の検証

我々は、酵母が生産する香気成分が昆虫の誘因に重要な役割を果たしており、花ー酵母ー昆虫の間で三者共生が成立していると仮説した。今回は、化学共生の立場からと、メタゲノム解析の立場からこれを検証を試みた。酵母の、rRNA D1-D2領域、Saccharomyces cervisiaeについては、6つのマイクロサテライト、花に関してはRubisco遺伝子rbcL、昆虫に関しては、ミトコンドリアのチトクロムC酸化酵素サブユニットI (COI)遺伝子をターゲットに、マルチプレックスPCRの方法を確立した。次世代シーケンサを用い同時に384検体の植物の標品から、酵母、植物、昆虫の同時同定を可能にした。花の蜜腺には、高頻度で酵母が検出される。我々の最近の研究から、花の品種ごとに異なる種類の酵母が分離されることが示された。これは花と酵母の間に何らかの相互認識機構があり、未知の共生関係があることを示唆している。酵母は自身の生育に必要がないと思われる様々な揮発性の二次代謝物生産系を有している。今回、我々は、花が蜜を提供し、蜜を利用する酵母が揮発性二次代謝産物を生産し、これに誘引された昆虫が蜜を得るとともに花粉運搬者として働くという三者間の共生系が成立していると仮設を立てた。今研究では、ゲノム微生物学、昆虫化学生態学の立場からこの仮説を検証することを試みた。花のサンプルから、フェノールクロロフォルム法、他。DNeasy Tissue Kit (Quiagen)、NucleoSpin Tissue (Macherey-Nagel)でDNAを抽出した。酵母に関しては、28S rRNAのD1-D2領域、バクテリアに関しては、16S rRNA V3-V4領域、花に関してはmatK rbcL、昆虫に関しては、mitochondrial COI配列をターゲットにDNAの増幅を行った。その結果、酵母、バクテリア、花のプライマーからは、DNAの増幅が可能であった。これらを用いることで、花のサンプリから、花の種類、そこに共生するする酵母、および乳酸菌などのバクテリアの存在を一挙に特定する方法論が確立した。化学生態学的な解析については、GC-EADの導入が完了した。今後、これを用い酵母の遺伝子形と揮発性二次代謝成分の関係、Saccharomyces cervisiaeの変異株を用いた香気成分の生産量の変化と、昆虫の誘因挙動について解析を行う。当初、大学で導入される予定であったゲノムシーケンサが一旦頓挫したため、プライマーの設計に集中してシステム構築を行った。幸い、現在ではゲノムシーケンサの導入が完了したため、今後、大規模解析を開始する予定である。植物は昆虫に蜜を与えることにより昆虫に栄養を与え、その際昆虫は植物の花粉を運搬することにより昆虫に利益を与える。この関係が成立するためには、はじめに昆虫が植物に誘引されることが必須である。そのため、花は独特の形態と色といった視覚情報とともに様々な香気成分を生産している。一方、花の蜜には必ず酵母が生育している。他の多くの環境微生物とは異なり酵母は多糖を分解できない。植物の生産する花の蜜、果樹、樹液は、酵母が自然界で増殖可能な貴重なニッチを提供している。酵母は、単糖、二糖類を代謝し自らが生育するために必要な有機酸、アミノ酸、エネルギーを獲得するとともに、その生育に不必要な香気成分を生産するが、同時に様々な香気成分を生産しているいることが知られている。また、予備的な検討から、花ごとに生育している酵母が、株レベルで異なっていることが示されている。酵母の、rRNA D1-D2領域、Saccharomyces cervisiaeについては、6つのマイクロサテライト、花に関しては、Rubisco遺伝子rbcL、昆虫に関しては、ミトコンドリアのチトクロムC酸化酵素サブユニットI (COI)遺伝子をターゲットに、マルチプレックスPCRの方法を確立した。また、これに加え同時にバクテリアrRNA V3-V4領域ITS領域を用いて、共存するバクテリアについても解析を行えるように準備した。このPCR産物に、12 x 8 x 4通りのTag配列を付加し、同時に384検体の花、果樹のサンプルから、酵母の株レベルの同定、植物の同定、昆虫の同定を可能にした。メタゲノムゲノム解析を行う系の開発が完了したので、今後はこれを用い、花のサンプル、果実のサンプルからDNAを取得し、大規模解析を開始することが、可能になった。酵母と、乳酸菌、酵母と花、乳酸菌と花の間で、種レベルの選択性が存在するかを検証する。

昆虫のDNAバーコードについては、現在のところ検出できていないが、PCRの感度の向上を試みる。また、化学生態学的な解析については、GC-EADの導入が完了した。今後、これを用いた解析を開始する。生物学当初、予定していたゲノム解析が、稼働しなかったため。予定していた金額を消化できなかた。61,102円の余剰金が出来た。次年度のシーケンシングのための予算としたい。
RNA干渉を利用した医療用遺伝子操作家畜の開発に関する基礎研究

1)Tgブタを作出し利用するに当り、受精卵の準備や体外発生に関し様々な課題がある。ブタ受精卵を高率に得るための基礎研究としてブタ卵子の体外成熟過程について分子レベルの機構について調べた。ブタ卵子の活性化はCyclinBの分解により起こること,ブタ願粒膜細胞の核をブタ卵子に移植した実験からcyclinBやMAPキナーぜが染色体周辺に存在することを見出した。ブタ卵子の除核実験から、成熟過程におけるMAPキナーゼの活性化に卵核胞物質が必要でないことを明らかにした。ブタ卵子の成熟過程で、RSKの活性化を明らかにした;MPFの活性は卵子の成熟に必須であること,ブタ卵子の卵殻胞崩壊にcyclinBの合成は必要でない等,ブタ卵子の成熟機構を分子レベルで解明し、ブタ核移植によるクローンブタ作製効率の向上に貢献する重要な知見を提供した。2)α-1,3-ガラクトース転移酵素(α-1,3 Gal)遺伝子のRNA干渉による発現抑制については、研究を進めている段階で当遺伝子に対するsiRNAの設計が非常にむずかしいことが判明した。そこで、そのモデル遺伝子として、当研究室で取り扱いならびに遺伝子操作に比較的熟知しており、またタンパク質化学ならびに生理作用に関し最も解析が進んでいるタンパク質の1つであるSLPI(Secretory leukocyte protease inhibitor)遺伝子を標的に、RNA干渉の有効性について調べた。SLPI(Secretory leukocyte protease inhibitor)遺伝子を標的に乳癌細胞であるMDA-MB-231とMCF-7を用いて、RNA干渉の有効性について調べた。SLPIに関しては、これまで、二本研究では、以上の様なSLPIの機能を基に、これらに対するそのRNA干渉の効果を調べるために実験を実施した。現在のところSLPIの活性を有意に減少させるsiRNAの構築に成功しておらず、今後は、十分なRNA干渉の得られる様なsiRNAを開発する必要がある。本研究課題で最も重要な点は、標的遺伝子に対し最大のRNA干渉効果を得るためには、導入遺伝子の構造とその構築の成否にある。本研究では、マウスおよびブタで、β-カゼイン遺伝子の乳腺での発現抑制ならびにα-1,3-ガラクトース転移酵素(α-1,3Gal)遺伝子の全身性の発現抑制を目標に、2種類のカセット遺伝子の構築を試みた。現在、カセット遺伝子を構築中である。Tgブタを作出し利用するに当り、受精卵の準備や体外発生に関し様々な課題がある。ブタ卵子の活性化はCyclinBの分解により起こること,ブタ顆粒膜細胞の核をブタ卵子に移植した実験からcyclinBやMAPキナーゼが染色体周辺に存在することを見出した。本研究では、標的遺伝子に対し最大のRNA干渉効果を得るためマウスおよびブタで、β-カゼイン遺伝子の乳腺での発現抑制ならびにα-1,3-ガラクトース転移酵素(α-1,3Gal)遺伝子の全身性の発現抑制を目標に、2種類のカセット遺伝子の構築を試みた。

ブタ受精卵を高率に得るための基礎研究としてブタ卵子の体外成熟過程について分子レベルの機構について調べた。ブタ卵子の活性化はCyclinBの分解により起こること、ブタ顆粒膜細胞の核をブタ卵子に移植した実験からcyclinBやMAPキナーゼが染色体周辺に存在することを見出した。ブタ卵子の除核実験から、成熟過程におけるMAPキナーゼの活性化に卵核胞物質が必要でないことを明らかにした。ブタ卵子の成熟過程で、RSKの活性化を明らかにした;MPFの活性は卵子の成熟に必須であること、ブタ卵子の卵殻胞崩壊にcyclinBの合成は必要でないことを明らかにし、ブタ核移植によるクローンブタ作製効率の向上において重要な知見を得た。
特別管理廃棄物の埋立特性とバイオアッセイによる評価手法に関する研究

近年、廃棄物問題は量の増大のみならず、質の多様化に起因するところが大きく、ここ数年、ダイオキシン、PCBおよび環境ホルモン等の環境微量汚染物質による環境汚染が大きな社会問題として取り上げられるようになっている。こうした中で、我国の廃棄物は焼却処理後埋め立てられることが一般的なプロセスである。しかし、見方を変えれば、焼却灰に有害重金属や未規制の新たな物質が濃縮された形で埋め立てられることを意味している。本研究では、1)焼却残渣中の無機塩類の溶出特性、2)有害物質の生成・分解メカニズム、3)有害化学物質等の安定化評価手法の検討を行った。3年間の研究を通じて、得られた知見は以下の通りである。(1)埋立廃棄物中に含有される重金属類は焼却灰の吸着能によって流出し難い。(2)活性化覆土によって、埋立地が有する吸着能と浄化能を高める事ができる。(3)活性化覆土と循環式準好気性埋立構造を組み合わせる事によって、埋立地の吸着・浄化能は拡大する。(4)上記の埋立システムは、ダイオキシンやDBP等の吸着・分解除去にも有効である。(5)浸出水の安定化の評価手法として、エームス法によるバイオアッセイは簡便で、かつ有効な手法の一つである。平成8年度は、特別管理廃棄物の一つである焼却残渣の物性と浸出水中に含有される有害物に関してバイオアッセイ法の一つであるエ-ムス法を用いた試験方法の検討を行なった。焼却残渣には、種々の重金属や無機塩類が多量が含有されている。また、高温燃焼処理によって排出される焼却残渣の性状と成分はセメントの成分に近い物質を含有するため、水との接触によって固化する傾向がある。そこで、焼却飛灰の水混練に伴う金属類の不溶化現象を実験的に明らかにした。一方、多量の水によって、焼却残渣中の無機塩類は可溶化するため、水洗後の残渣の性状及び重金属類の変化を調査した。そして、水洗後の残渣の有効利用の可能性も明らかにした。次に、埋立地浸出水には、有機物の他、種々の成分が含有されるため、変異原試験であるエ-ムス法の従来法では、精度が悪い結果となった。そこで、有機物や高塩類を含有する浸出水にも適用可能な変異原物質の抽出方法の検討を行なった。その結果、変異原物質の抽出にはCSP樹脂吸着法が適しており、高い有機物濃度を示す浸出水には前処理を併用した方が有効である事が解った。また、浸出水中に含有する阻害物質の影響を除去するために、内標準法を用いてエ-ムス試験を行なうと、精度の高い結果が得られる事が明らかとなった。今後は、焼却残渣中の有害物質の埋立地での挙動及び削減方法並びに変異原物質の同定を試みる計画である。今年度は、焼却残渣中の有害物質の埋立地における低減化と浸出水処理施設での除去方法について検討した。前者に関しては、埋立構造及び覆土材の違いについて調査した。その結果、生物毒性物質を表わす変異原物質の低減化は、埋立構造として好気性構造を採用する事によって達成され、更に、覆土材に吸着能を有する木炭類(特に、高温焼成木炭)を併用すると、その効果が高まる事がわかった。また、焼却残渣中の有害化学物質として注目されているダイオキシン類についても、木炭類を覆土材として用いる事によって、浸出水中へのそれらの流出を、現在覆土として用いられている山土の1/2に抑制できる事がわかった。同時に、各種覆土材についてダイオキシンの分解が期待できるカビ類の生育特性を調査した結果、木炭類が山土に比べて生育し易く、特に、カビ類の栄養源となる有機物を含有する廃棄物と混合して埋め立てたり、浸出水を循環する事により、生育は促進される事が明らかになった。

今年度の実験では、カビ類によるダイオキシン類の分解は確認できなかったが、別に行なったフタル酸エステル類の木炭類による吸着・分解実験において、フタル酸エステル類は木炭に吸着された後、木炭に集積されたフタル酸エステル分解菌によって約1ヶ月で分解された事から、木炭類を用いる事によってダイオキシン類の分解も今後徐々に進行するものと考えられる。一方、浸出水処理施設における除去に関しては、対象とする有害化学物質のほとんどが難分解性有機物であるため、現行の生物処理条件での分解は難しく、濾過・吸着等の物理化学処理での効果が大きかった。また、ダイオキシン類の分解方法として注目されている紫外線・オゾン併用処理により、変異原物質の生成が認められる場合があった事から、複合処理方式の組合わせによる評価を行ない、総合的な検討が必要である事が示唆された。本年度は最終年であるため、これまでの実験結果に基づいて特別管理廃棄物の埋立特性と浸出水水質の特性を今後問題となる未規制物質の視点から整理し、それらに対する安全性評価手法と制御するための新しい埋立工法の提案を行なうことを目的として検討を行なった。得られた結果をまとめると以下の通りである。(1)廃木材製木炭を用いた活性化覆土において、ダイオキシン類は29日間で72%吸着された。活性化覆土中に吸着されたダイオキシン類の分解量は、現在分析中である。(2)活性化覆土総におけるフタル酸ジブチルの分解は、それ以外の有機物が存在するとフタル酸ジブチルのみの場合に比べて若干遅れる。つまり、フタル酸ジブチルの分解は優先的に起きない。この傾向は、覆土材に土を用いた場合にも同様に認められた。(3)活性化覆土層及び土層において、フタル酸ジブチル分解菌はNB菌とほぼ同数生息していることから、フタル酸ジブチル分解菌は環境中に広範に生息している細菌群である。(4)フタル酸ジブチルの分解が活発であった活性化覆土層では、溶解性炭酸量が増加したことから、フタル酸ジブチルは最終的に炭酸にまで分解される。(5)焼却残渣の埋立地から流出する変異原物質の主要成分は、多環芳香族炭化水素のニトロ誘導体である。(6)変異原性を示す多環芳香族炭化水素ニトロ誘導体の生成は、廃棄物中に含まれる金属類を触媒とした硝酸性窒素の化学的還元反応によって起きるため、多量の金属類を含有する焼却残渣主体の埋立地において生じ易い。(7)特別管理廃棄物の適正管理手法として、活性化覆土を用いた循環式準好気性埋立構造は、安全性からも支持できる。
小動物モデルとしての HCV 感染性マウスの作製とその応用

C型肝炎ウイルス(HCV)が感染できるマウスを作成するため、知られているヒト受容体のCD81, SRB1, CLDN1, OCLNをマウス肝細胞で発現するトランスジェニックマウス(Tg)を作成した。Tgマウス肝臓切片にHCV E2蛋白質を反応させると、結合する。そこで、患者の血清に含まれるHCVを野生型マウス、Tgマウス各5匹に静脈注射したが、Tgマウスの血液中にはHCVのゲノムRNAは検出されなかった。その原因を検討した結果、ウイルスの侵入過程がうまくいっていないことが判明した。マウス肝細胞に存在する阻害蛋白質の検索と他のヒト感染因子の検討を行った結果、マウスCd81とOcln蛋白質が阻害的に、ヒトNPC1L1蛋白質が促進的に働くことが示唆された。C型肝炎ウイルス(HCV)の侵入に関わる4因子、CD81, SCAVRB1, CLDN1, OCLNを肝細胞特異的に発現させたトランスジェニックマウスを作成した(CCSOマウスと以後呼ぶ)。このマウスから調製した初代肝細胞にHCVppを感染させたが、ウイルスの侵入は起こらなかった。また、4因子をマウスNIH/3T3細胞に発現させた永久株では、HCVppは侵入できることから、4因子の機能に問題ないことがわかる。そこで、マウス肝細胞に阻害蛋白質がある可能性と新たにヒトの因子(第5因子)が必要である可能性を検討するために、Huh7.5.1細胞にマウスCd81蛋白質発現ベクター、マウスOcln蛋白質発現ベクター、ヒトNPC1L1蛋白質をノックダウンさせるベクターを発現する絵永久株を樹立した。これらの永久株細胞にHCVppを感染させると、Cd81発現細胞では30%の、Ocln発現細胞では20%の、NPC1L1ノックダウン細胞では50%のHCVの侵入阻害が観察された。これらの結果は、マウスCd81蛋白質とマウスOcln蛋白質はHCVのヒト肝細胞への侵入を阻害すること、およびヒトNPC1L1蛋白質はHCVのヒト肝細胞への侵入を促進すること、が明らかになった。現在、HCVが侵入できるヒトHuk7.5.1細胞から抽出したmRNAを用いて、レンチウイルスライブラリーを作成した。これをCCSOマウスから分離した初代肝細胞に感染させ、HCVppが侵入する新規遺伝子のクローニングを行っている。患者血清に含まれているHCVをCCSOマウスに静脈注射し、マウス血清中のHCV RNA genomeのコピー数をRT-PCRで定量した。結果は、野生型マウスでもCCSOマウスでも、ウイルスRNAは検出限界以下であり、ウイルス産生は起こっていないことが判明した。そこで、CCSOマウスから初代肝細胞を分離して、この細胞にHCVppを感染させた。control virusは初代肝細胞に侵入できるが、HCVppは侵入できないことが明らかになった。そこで、CCSOマウス肝臓のヒトCD81, SR-BI, Claudin-1, 0ccludin蛋白質量をウエスタンブロットで定量した。HCVppは侵入できるHuh7.5.1細胞の発現に比し、CD81は20%, SR-BIは50%, Claudin-1は5%, Occludiは90%であることが判明した。つまり、CCSOマウス肝細胞でのヒト4因子の発現はHuh7.5.1よりはるかに低く、特にClaudin-1とCD81の発現量が低値であった。また、マウス肝細胞にウイルス侵入阻害蛋白質が存在するかどうかを検定するため、Huh7.5.1細胞と野生型マウス初代肝細胞を融合させた。融合細胞はHuh7.5.1細胞に比べて50分の1のウイルス侵入しか示さないことが明らかになった。この結果は、野生型マウス肝細胞にはウイルス侵入阻害蛋白質が存在することを示唆している。以上を総合して考えると、ヒト4因子、特にCD81とClaudin-1を10倍以上発現するマウスを作成すると共に、ウイルス侵入阻害蛋白質の検索をする必要があると結論付けられる。4つのヒト因子、CD81, SR-BI, Claudin-1, Occludin蛋白質を発現したトランスジェニックマウスを作成することに成功した。そして、このCCSOマウスがHCVの感染するかどうかを判定した。結果は、感染抵抗性を示した。そこで、感染の3過程ー侵入、複製、粒子形成ーのいずれがおこっていないかを検討した結果、侵入過程に問題があることがわかった。また、CCSOマウスのヒト4因子の発現レベルがHuh7.5.1細胞よりもかなり低いことも明らかになった。

このように、いくつかの問題点が明らかになったので、それぞれの問題を解決することで、目的の達成に近づいていけるという展望を抱いている。4つのヒト因子、CD81, SR-BI, Claudin-1, Occludinを発現するCCSOマウスに患者からのHCVを注射してもウイルス産生は起こらなかった。また、CCSOマウスからの初代肝細胞にHCVppは感染できなかった。さらに、2011年に公表されたNatureの論文では、4つのヒト因子を100倍発現しないとウイルス侵入が起こらないことを示している。そこで、4つのヒト因子を大過剰発現させるために、CD81とOccludinあるいはClaudin-1とSR-BIをアルブミン遺伝子座位にノックインマウスを作成する。また、野生型マウスの初代肝細胞がもっている侵入阻害蛋白質はマウスCd81とOccludinではないかという仮説を検証する。主に、実験用動物、試薬類などの物品費として使用する。