hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
抗線維化薬の新規スクリーニング法の開発およびその応用

特発性肺線維症(idiopathic pulmonary fibrosis:IPF)に代表される間質性肺炎は現在のところ有効な治療法が確立していない難治性の肺に線維化をきたす疾患群であり、5年生存率3050%と予後不良で、依然として治療に使用できる薬剤が限られている。線維化の病態は、コラーゲンなどの細胞外基質の沈着による組織構築の破壊により特徴づけられる。従来の抗線維化薬の探索はDNAマイクロアレイ法等で治療標的のスクリーニングを行ない、さらに同定された分子に作用する薬剤の抗線維化作用を検討する方法で行われてきたが、この方法では効率が低いことが問題であった。今回の研究では、既知の薬剤・化合物・天然分子の中から肺線維症に対して有効な薬剤を見いだすため、コラーゲン産生を指標としたハイスループット・スクリーニング法を開発し、抗線維化薬を同定することを目的とした。Collagen(COL1A2)-Luciferaseトランスジェニックマウスの摘出肺から分離した線維芽細胞を用いて、コラーゲン1A2遺伝子の発現抑制をアウトカムとして既知薬剤ライブラリーのスクリーニングを行ったところ、1241薬剤のうち392薬剤でTGF-β単独処置と比較してコラーゲン遺伝子の発現抑制を認め、うち45薬剤で25%以上のコラーゲン遺伝子の発現抑制効果、かつ細胞のバイアビリティーに影響がないことを確認した。再現性を確認した一部の薬剤については、in vitroの系において、ヒト由来肺線維芽細胞を用いてコラーゲン遺伝子の発現抑制効果の検証を進め、その結果、安全性が高く、かつ経口投与が可能な薬剤で抗線維化作用を示す候補薬剤が見出されており、今後、スクリーニングで同定された薬剤の抗線維化作用を、さらに検証することで臨床応用につなげることを目的としたい。特発性肺線維症(idiopathic pulmonary fibrosis:IPF)に代表される間質性肺炎は現在のところ有効な治療法が確立していない難治性の肺に線維化をきたす疾患群である。2014年5月にIPFに対するピルフェニドン、ニンテダニブの有効性がN Engl J Med誌に報告されたものの、5年生存率3050%と悪性疾患に匹敵する予後不良の疾患で、依然として治療に使用できる薬剤が限られている。申請者らは以前にエンドスタチンのC末端に由来する合成ペプチド(E4ペプチド)がin vitroにおいて抗線維化作用を有することを見いだし、さらにこのペプチドがin vivoでも肺の線維化抑制に有効であることを報告した(Sci Transl Med 4(136):136ra71, 2012)。エンドスタチンは、もともと内因性の血管新生抑制因子として発見され、海外では悪性腫瘍に対する薬剤として臨床の場でも肺癌の治療に用いられている。このように既知の薬剤で抗線維化作用を有する物質が同定できれば、より速やかな臨床応用が可能となる。今回の研究では、既知の薬剤・化合物・天然分子の中から肺線維症に対して有効な薬剤を見いだすため、線維化の病態に重要な役割を果たすコラーゲン産生を指標としたハイスループット・スクリーニング法を開発することを目的としたが、本年度においては、in vitroでのTGF-beta添加線維芽細胞でのコラーゲン産生をアウトカムとして抗線維化薬をスクリーニングするシステムの確立を行った。さらに、Collagen(COL1A2)-Luciferaseトランスジェニックマウスを用いることにより、スクリーニングの高速化を目指した。線維化において中心的な役割を果たす細胞である線維芽細胞に着目して実験を行った。本年度は下記のように当初の目標としていたスクリーニングシステムの確立を行った。1.トランスジェニックマウスの繁殖継代:雄性ヘテロのCollagen(COL1A2)-Luciferaseトランスジェニックマウスと野生型の雌マウスとの交配によりマウスの繁殖を行った。尾をサンプルとしたルシフェラーゼ活性測定による遺伝子タイピングの手技により実験に用いる雄のヘテロマウスを安定供給する環境を整えた。2.マウス肺線維芽細胞のプライマリーカルチャーの作成:マウス摘出肺を用いて線維芽細胞のプライマリーカルチャーを作成した。作成方法については研究者がすでに経験のある手法を用い(Am J Pathol 169(5):1633, 2006)、細切した肺組織をディッシュ上で培養し、線維芽細胞を単離した。線維芽細胞は継代を繰り返しながら凍結保存を行ない、以後の実験に継続的に使用できるようストックの作成を行っている。3.既知薬剤ライブラリーを用いた抗線維化薬のスクリーニング:単離したマウス肺線維芽細胞を96ウェルマイクロプレート上で培養した。ベースラインのLuciferase発現を定量し、さらに、線維化のフェノタイプを誘導する因子としてTGF-beta(1, 5, 10 ng/mL)を添加した後のLuciferase発現も評価した。現在、線維芽細胞単離後のTGF-beta刺激下で既知の薬剤ライブラリーを用いて1200種以上の薬剤を添加し、Collagen(COL1A2)-Luciferase発現抑制効果により抗線維化作用を有する薬剤の同定を行っている。

申請者らは以前にエンドスタチンのC末端に由来する合成ペプチド(E4ペプチド)がin vitroにおいて抗線維化作用を有することを見いだし、さらにこのペプチドがin vivoでも肺の線維化抑制に有効であることを報告した(Sci Transl Med 4(136):136ra71, 2012)。エンドスタチンは、もともと内因性の血管新生抑制因子として発見され、海外では悪性腫瘍に対する薬剤として臨床の場でも肺癌の治療に用いられている。このように既知の薬剤で抗線維化作用を有する物質が同定できれば、より速やかな臨床応用が可能となる。今回の研究では、既知の薬剤・化合物・天然分子の中から肺線維症に対して有効な薬剤を見いだすため、線維化の病態に重要な役割を果たすコラーゲン産生を指標としたハイスループット・スクリーニング法を開発することを目的としたが、本年度においては、in vitroでのTGF-β添加線維芽細胞でのコラーゲン産生をアウトカムとして抗線維化薬をスクリーニングするシステムを確立した上で、実際に既存薬ライブラリーの中から抗線維化作用を有する薬剤のスクリーニングを行った。なお、Collagen(COL1A2)-Luciferaseトランスジェニックマウスを用いることにより、スクリーニングの高速化を目指した。実際には、コラーゲン1A2-Luciferaseトランスジェニックマウスの摘出肺から線維芽細胞を分離、96ウェルマイクロプレート上で培養し、線維化のフェノタイプを誘導する因子としてTGF-β(10 ng/mL)を添加した後、コラーゲン1A2遺伝子の発現をLuciferase発光シグナルで定量した。このコラーゲン1A2遺伝子の発現抑制をアウトカムとして1,241種類の既存薬からなる薬剤ライブラリーのスクリーニングを行ったところ、392薬剤でTGF-β単独処置と比較してコラーゲン1A2遺伝子の発現抑制を認めた。うち、149薬剤で25%以上のコラーゲン1A2遺伝子の発現抑制効果を確認することができた。また、スクリーニングの効率を上げるために、細胞上清を用いて、最近、新規の肺線維化マーカーとして注目されているペリオスチンのELISA測定も開始した。ペリオスチンは、細胞外マトリックスタンパク質であり、I型コラーゲン、フィブロネクチン、テネイシンCなどの各種細胞外マトリックスと架橋し、結合組織の構成成分として線維化の形成に寄与するとともに細胞表面のインテグリンと結合し、細胞機能の調節を担うマトリセルラータンパク質としての機能も有する(Am J Respir Crit Care Med. 193(9):949, 2016)。肺の線維化においては、血清ペリオスチン濃度が高いと肺機能予後のみならず生命予後も悪く、ペリオスチンはそれらを予測するバイオマーカーとして既存の血清マーカーより優位性を示すことが報告されている(Respir Investig. 53(2):73, 2015)。試験的に48薬剤でのペリオスチンELISAを行ったところ、うち15薬剤でコラーゲン、ペリオスチン双方の発現抑制効果が確認された。
B型肝炎の抗ウイルス療法における血中RNA遺伝子量測定の意義

HBV RNA/DNA量測定系を開発し、その臨床的意義をHBV DNA量、HBcrAgと比較検討した。B型慢性肝炎のラミブジン治療例を対象とし、治療開始6ヶ月目の測定値でその後の耐性株出現を予測した。HBV DNA量は耐性株が出現しやすい症例の予測に、HBcrAgは耐性株が出現しにくい症例の予測に有用であった。HBV RNA/DNA量はHBV DNAに近い性格を示したが、感度に優れ、精度は3者の中で最も高かった。HBV RNA/DNA量測定系は新しいマーカーとしての可能性が示唆された。本年度はB型肝炎ウイルス(HBV)のRNA遺伝子量測定系の基礎検討を行った。血清検体200μ1からキットを用いてウイルス核酸を抽出した。RNA分解酵素を含まないDNA分解酵素で処理後、HBVのS遺伝子領域に設定したプライマーで逆転写およびリアルタイムPCR法による定量的測定を行った。これにより、2.6logコピー/mlの感度でHBV RNAを定量的に測定することが可能になった。特異性に関しては、DNA分解酵素で処理後、逆転写を行わずにアルタイムPCRを行った。この結果、核酸の増幅はなく、今回の条件でHBV RNA量を特異的に測定していることが示された。今回、HBV DNA量とRNA量を同時に測定する方法も検討した。すなわち、上記RNA量特異的測定法において、DNA分解酵素での処理を省いたものである。このHBV D-RNA量は、核酸アナログ薬非投与下ではDNA量と相関し、投与下ではRNA量と相関した。本法はDNA分解酵素での処理過程がない分、簡便で安定性が良好であった。今回はHBV RNA量とHBV D-RNA量の両方の有用性が示された。HBVコア関連抗原量はHBV遺伝子のPre-C・C遺伝子から転写・翻訳されるペプチドを全て測定する系である。HBVコア関連抗原は、核酸アナログ薬非投与下ではDNA量と相関し、投与下ではRNA量と相関した。この点でHBV D-ANA量と類似しており、今後はHBV核酸量と同時に測定し比較検討を行う予定である。今後の検討で使用する臨床検体については、倫理委員会の承認を受け、患者から同意を取得し、B型慢性肝炎の治療例についてシリーズ血清を採取、保存した。昨年度はB型肝炎ウイルス(HBV)RNA量の測定系の基礎検討を行い2.6 log copy/mlの感度で定量的に測定することが可能になった。本年度は、これに加え、HBV DNA量とRNA量を同時に測定する方法(HBVD-RNA量)を検討し、これを2.6 log copy/mlの感度で定量的に測定することが可能になった。このD-RNA量測定法は、HBV RNA量測定法において、DNA分解酵素での処理段階を省いた方法である。核酸アナログ薬非投与下ではHBV RNA量はDNA量に比較して極めて少ないので、HBV D-RNA量はDNA量と有意に相関する。一方、核酸アログ薬投与下ではHBV RNA量とDNA量は逆転するため、D-RNA量はRNA量を主に反映する。HBV D-RNA量測定法はDNA分解酵素での処理過程がないので、RNA量測定法に比較しより簡便で安定した測定結果が得られた。このため、臨床的に使用するにはD-RNA量測定系の方がRNA量測定系より適していると考えられた。HBVコア関連抗原量はHBV遺伝子のPre-C・C遺伝子から転写・翻訳される抗原をまとめて測定する系である。HBVコア関連抗原量は、核酸アナログ薬非投与下ではDNA量と有意に相関した。これに対し、核酸アナログ薬投与下ではRNA量やD-RNA量と有意に相関した。本年度の研究で、HBV関連核酸や抗原の測定系として、DNA量、RNA量、D-RNA量、コア関連抗原量の4つが揃った。この4測定法の臨床的意義を核酸アナログ薬治療例のシリーズ血清を用いて検討した。この結果、核酸アナログ薬投与開始後、HBV DNA量は速やかに低下したが、HBV RNA量、HBV D-RNA量、HBVコア関連抗原量の低下は有意に緩徐であった。
蠕虫感染防御に関与するIgE産生量規定遺伝子の解析

本研究は、各種の蠕虫感染におけるIgE依存性の感染防御能とIgE産生量規定遺伝子に支配されるIgE産生能との関係を検討し、さらにその遺伝子座を決定することで、蠕虫感染防御に関わる遺伝子としてのIgE産生量規定遺伝子の性質を明らかにすることを目的とした。第一の実験系は我々がさきに明らかにしたIgE産生量規定遺伝子の支配下にIgE高応答性(BALB/c)と低応答性(SJL)とされるマウスの交配によってもどし交配世代(N2)マウスを得て、旋毛虫を感染させるものである。感染後のN2マウスの各個体はIgE高応答性または低応答性に分離し、その個体数の比は1:1で、IgE産生量の単一遺伝子支配が確認された。また、IgE高応答性N2マウスでは旋毛虫に対する感染防御能が低応答性のそれに比し有意に強いことが判明した。すなわちIgE産生量規定遺伝子が蠕虫感染防御遺伝子であることが示唆された。この遺伝子座については、N2世代マウスについてマイクロサテライトマーカーを用いてIgE産生量との連鎖解析を進めているが同定に至っていない。第二の実験系は、NC/Ngaマウスの高IgE血症の解析である。このマウスの高IgE血症がIgEクラスに限定され抗原非特異的であることから新しいIgE産生量規定遺伝子を想定し、交配実験を行った。NC/NgaとBALB/cの交配によるF1,F2およびN2世代の各個体のIgE産生能から、IgE高応答性の形質は常染色体上の2つの遺伝子によって支配され、劣性に遺伝することが示された。この遺伝子はそれぞれieh1とieh2と命名した。現在ieh1とieh2遺伝子によるIgE高応答性と旋毛虫感染防御能の関係について解析中である。本研究は、蠕虫感染におけるIgE依存性の感染防御能とIgE産生量規定遺伝子に支配されるIgE産生能との関係を検討し、さらにその遺伝子座を決定することで、蠕虫感染防御能に関わる遺伝子としてのIgE産生量規定遺伝子の性質を明らかにすることを目的として行われた。感染後の総IgE値および特異IgE抗体価についてN2マウスの各個体は高応答性または低応答性となり、その個体数の比は1:1に分離し、単一遺伝子支配が確認された。また、IgE高応答性N2マウスでは旋毛虫に対する感染防御能が低応答性に比し有意に強いことが判明し、IgE産生量が蠕虫感染防御に影響することが示唆された。第二の実験系では、NC/Ngaマウスがアトピー性皮膚炎様の症状を自然発症することを見いだした。NC/Ngaマウスは加令とともに皮膚症状の発現と著しい高IgEを示し、そのIgE値は正常マウスの500倍にも達する。この高IgEの原因は皮膚の肥満細胞からのIL4に依存することが示唆された。NC/NgaマウスのIgE産生亢進は、SPF条件下ではみられず、環境因子によって誘導されるが、その抗原を特定することはできなかった。このIgE産生制御はIgEクラスに限定され抗原非特異的であることから新しいIgE産生量規定遺伝子の存在が考えられる。

現在このIgE産生系について交配実験により遺伝子を解析中である。本研究は、蠕虫感染におけるIgE依存性の感染防御能とIgE産生量規定遺伝子に支配されるIgE産生能との関係を検討し、さらにその遺伝子座を決定することで、蠕虫感染防御能に関わる遺伝子としてのIgE産生量規定遺伝子の性質を明らかにすることを目的として行われた。昨年度の研究でNC/Ngaマウスがアトピー性皮膚炎様の症状と著しい高IgE血症とを自然発症することを見いだした。このマウスのIgE産生亢進はIgEクラスに限定され抗原非特異的であることから新しいIgE産生量規定遺伝子の存在が想定されることから、交配実験を行った。NC/NgaとBALB/cの交配によるF1は雌雄ともにIgE低応答性であった。IgE高応答性と低応答性の個体数の比はF2世代のマウスで15:1でみられ、F1とNC/Ngaのもどし交配によるN2世代マウスでは3:1となった。すなわちNC/NgaにみられるIgE高応答性の形質は常染色体上の2つの遺伝子によって支配され、劣性に遺伝することになる。この遺伝子はそれぞれieh1とieh2と呼ぶことにした。現在ieh1とieh2遺伝子によるIgE高応答性と旋毛虫感染防御能の関係について解析中である。一方アトピー性皮膚炎の発症はIgE応答性とは異なる遺伝子の支配を受けることが交配実験から示された。ちなみに皮膚炎発症の形質は常染色体上の単一遺伝子によって劣性に遺伝するこたがしめされ、遺伝子をdermと命名した。もう一つのIgE産生量規定遺伝子として知られるSJL/JマウスのIgE低応答性を支配する遺伝子座については、交配実験によるN2世代マウスについてマイクロサテライトマーカーを用いて連鎖解析を進めているが同定に至っていない。
ヘリウムを用いた精密低温高圧装置の試作

最近注目されている高温超伝導体、ヘビーフェルミオン系物質、有機物質などで見い出された異常な現象は固体内の電子、原子、イオン間の種々の相互作用が拮抗した中で発現しているのが特徴である。これらの異常現象を解明するには要素間の相互作用を温度、磁場、高圧の外部パラメータによって人為的に制御し、その現象の機構を調査、研究することが重要である。このような背景のもとに本研究課題は外部パラメータとして温度と高圧を選び、精密な低温・高圧発生装置の試作をめざした。低温での圧力発生は極めて困難である。測定する試料に圧力を印可するには圧力媒体を用いるが低温高圧下ではヘリウムといへども固体となり、静水圧性が失われるのみならず、試料を破壊させてしまう。このような事情を理解した上で高圧装置を試作しなければならない。我々はまず、ヘリウムが液体で存在できる低温で029気圧の圧力範囲で動作する圧力発生技術を確立し、液体ヘリウム3の超流動状態の測定に成功した。次いで、超低温で一軸応力を発生できる装置を開発するためにヘリウムを用いたべローズによる駆動装置を作成し、有機物超伝導体α-(BEDT-TTF)_2KHg(SCN)_4の電気抵抗を34mKまで測定することに成功した。さらに高い圧力を発生させる方法としてヘリウムガスをピストン・シリンダー装置を用いて直接加圧する計画を立てたが、圧力発生装置が大がかりとなり、設置するには「高圧ガス取り締まり法」に抵触する事が分かり、この方法は断念せざるを得なかった。高圧を発生させる他の方法としてダイアモンド・アンビルを用いることを検討し、低温で圧力発生の駆動装置として多段ベローズ方式とメンブレム方式を採用した。これらはいずれも30GPaの圧力を超低温・強磁場下で発生させる、いわゆる多重極限環境発生装置で今後の物性研究の主力技術として期待されている。多重極限環境発生装置としてブリッジマン・アンビルを用いた装置、キュービツク・アンビルとX線発生装置と組み合わせたもの、低温・高圧・磁場下での磁気測定の装置なども開発した。今年度は、ヘリウムを用いた精密低温高圧装置を試作するため、ヘリウムガスの直接加圧方式とヘリウム液体を加圧する方式について調査・検討することから始めた。ヘリウムガスの直接加圧方法は日本を除く世界の各研究所、大学で実施されているが、日本では高圧ガス取締法の規制があるため、研究用の小型装置は製作されていない。このため外国の装置についt検討したが、やはり取締規制に抵触する部分があることが判明した。また、ガス圧縮法では万が一の爆発時の安全性を検討したが、その対策には費用がかかるのみならず、実験空間も広くとる必要があり、当研究所のような共同利用研究所に設置することは極めて困難であるとの検討結果が得られた。したがって、ヘリウム液体を加圧する独自の手法による安全な圧力発生装置の開発をすすめた。ヘリウム液体を加圧する方法としてピストンシリンダーとダイヤモンドアンビル装置を設計した。ピストンシリンダーは低圧発生用で20GPaまで、ダイヤモンドアンビルは10GPa以上の圧力発生を目指した。そのため、ピストンシリンダー装置で圧力を発生させるための精密圧力制御装置と圧力を一定に保ったまま温度制御できるヘリウム加圧インサート装置を設計製作した。精密圧力制御装置はオイルポンプのオイルの流量を微量ポンプと連結させて行った。この微量ポンプは圧力センサーの信号でコントロールされる。精密に制御された圧力は強化エポキシガラスを用いた圧力伝達コラムからなるインサートでピストンへ圧力を伝達するとともに断熱を行い、精密温度制御ができるように設計された。また、低温でダイヤモンドアンビル内に圧力を発生させる手法として、ベローズを多段に用い、20気圧の低圧ヘリウムで駆動できるダイヤモンドアンビル装置の開発を行った。

これらはいずれも30GPaの圧力を超低温・強磁場下で発生させる、いわゆる多重極限環境発生装置で今後の物性研究の主力技術として期待されている。多重極限環境発生装置としてブリッジマン・アンビルを用いた装置、キュービツク・アンビルとX線発生装置と組み合わせたもの、低温・高圧・磁場下での磁気測定の装置なども開発した。今年度はヘリウム3クライオスタット及び希釈冷凍機温度領域で駆動可能なダイヤモンドアンビルを用いた高圧装置の設計試作を行っている。希釈冷凍機のクライオッスタットの有効内径は40mmであるので、ダイヤモンドアンビルを駆動する方式として多段式ベロ-を用いることとした。その理由はクライオスタットの内径の制約からベロ-の最大外形は32mmとなり、ヘリウムガスで加圧するため、ヘリウムガスが固化しない様な圧力すなわち20気圧以下で使用しなければならないためである。従って1個のベロ-で最大約140kg重の加重が発生できることになる。一方、ダイヤモンドアンビルを駆動するに必要な加重は用いるダイヤモンドの大きさと、発生圧力で決まるが、我々は1/2-1/4カラットのダイヤモンドを用いて最大30GPaを目標にしているので、総加重は約700Kg重必要となる。このため、5個異常のベロ-を直列に連結し、駆動できる加圧装置を設計試作した。昨年度の報告書で述べたが、ダイヤモンドアンビルを用いた精密な輸送現象の測定を行うにはリ-ド線の出し方の工夫が必要である。ガスケットに金属板を用いるので、各リ-ド線間の絶縁をどのように行うかが問題となっている。この技術はまだ確立されたものはなく従来はガスケットにアルミナの粉末を置いて絶縁している。しかし、この方法では圧力媒体として精密測定に必要な液体を用いることができない。新しい方法として、我々はガスケットにアルミナのスパッタ膜を付着させ、さらに電極として金のスパッタ膜を付着させて、圧力媒体の密閉を可能にする方式を開発するため、スパッタ装置の導入し、電極の試作を行っている。来年度はこの装置を用いた輸送現象の精密測定を行い所期の目的を達成する。前年度に引き続き、ヘリウムガス圧で駆動可能なダイヤモンドアンビルセル及び加圧装置の設計試作、サンプリングの技術開発、及び実際の運転を行った。冷凍機、超伝導マグネットなどの中での使用を考えた場合、加圧装置の直径は40mm以下でなければならず、この有効面積内で、かつヘリウムガスの低温下での固化圧力(およそ25気圧)までで、ダイヤモンドアンビルセルでの圧力発生に必要な荷重を発生させるために、加圧装置は直径32mmのステンレス製ベロ-を10個直線上に配置して使用した。一方ダイヤモンドアンビルセルについても、上記の加圧装置に組み合わせて使用するものを製作した。また、加圧装置に関してであるが、室温域から稀釈冷凍機温度まで一定荷重を発生させることで広い温度域での高精度な測定を目指しているので、供給ガス圧力を装置の温度変化にかかわらず一定に保つようなヘリウムガス供給・排出装置が必要になる。これに関しても、ボンベからの供給用のヘリウムガス用高精度高圧レギュレータ、及び排出用の高精度Back Pressureレギュレータを組み合わせ、加圧装置用のヘリウムガスハンドリングシステムを完成させた。
ミトコンドリア由来活性酸素による障害発現におけるメタロチオネインの役割

近年メタボリックシンドロームが増大している。これらは遺伝的素因に環境からのストレスが加わった多因子病であり、その関与要因を明らかにし防止の方策を探る事が必要である.生活習慣病の発症、進展には細胞内産生活性酸素の関与が示唆される。細胞内ミトコンドリアにおける呼吸により活性酸素が産生され、加齢や寿命などの生命の基本、更に退行性疾患に関連するがその詳細は明らかではない。本研究でストレスによっておこる障害を防止するために、精神的ストレスによる影響、ミトコンドリアストレスに対する生体の応答反応とその防御的性質を解析し、ストレスに対する障害発現抑制物質を探る事を目的とした。1.ミトコンドリア呼吸阻害剤により活性酸素が産生され、低分子量・システイン多量含有たんぱく質メタロチオネイン(MT)を誘導し、MTは活性酸素障害を防御する可能性をを明らかにした.2.ミトコンドリア呼吸は細胞エネルギーを産生するとともに細胞死アポトーシスを制御する。ミトコンドリア呼吸阻害剤antimycin Aにより活性酸素が産生され、二相的に細胞死をおこす事、さらに、活性酸素による細胞死が他の物質による細胞死と同一であるかどうか、ここでは重金属を用いて検討した。3.肥満はメタボリヅクシンドロームの基礎となり糖尿病、虚血性疾患などを誘発する。肥満防止が加齢性疾患防止に重要である。高脂肪食摂取したメタロチオネイン欠損マウスが肥満を呈し、メタロチオネインが肥満抑制作用を示す事、その要因としてレプチンである可能性を示した。4.拘束などの精神的ストレス負荷が糖尿病発症因子に与える影響を検討した。肥満時に脂肪細胞から分泌され、インスリン耐性、糖尿病へと誘導するアジポサイトカインが、精神的ストレス単独負荷により分泌される事を明らかにした。高齢化社会の進展と共に増大する生活習慣病は遺伝的要素因に環境因子が加わった多因子病であり、現代の課題は双方の要因を明らかにする事である.生活習慣病の発症、進展には活性酸素の関与が示唆される。細胞内ミトコンドリアでは、呼吸での消費酸素の数%が活性酸素となり加齢や寿命などの生命の基本、更に退行性疾患に関連するが詳細は明らかではない。本年度は以下の点を明らかにした。(1)ミトコンドリア電子伝達阻害剤投与によるミトコンドリアでの活性酸素産生の解析脱共役剤2,4-ジニトロフェノール(DNP)、アンチマイシンAをマウスに皮下投与すると、肝組織および分離トコンドリア画分の過酸化月旨質濃度増大が見られた。グルタチオン合成阻害剤ブチオニンーS・R-スルフォキシミンを予め投与後にDNPを投与すると、肝ホモジネート及びミトコンドリアにおける過酸化脂質、同時にメタロチオネイン(MT)合成がDNP単独投与群に比較し増大し活性酸素産生による膜脂質変性及び活性酸素への応答反応が示された。メタチオネインは種々のストレスで誘導される事が知られるが、これまで不明であったミトコンドリア産生活性酸素とMTの関係が明らかとなった。他の抗酸化防御系の変動は見られなかった。(2)ミトコンドリアにおける活性酸素産生が生成したメタロチオネインの役割の検討MT遺伝子発現欠損及び野生型マウスにDNPを投与すると肝障害度はMT遺伝子発現欠損マウスが大きく、MTが活性酸素産生を調節している可能性がある。この事をMT遺伝子発現欠損及び及び野生マウス繊維芽細胞でDNP、アンチマイシンAを添加し活性酸素産生を比較すると、前者で大きくMTが細胞内でミトコンドリア由来活性酸素の産生と障害を調節している可能性が明らかとなった。

更に、この事は、ビタミンEを前投与後にDNPを投与するとこれらの活性酸素産生と障害は抑制される事から確認された。高齢化社会の進展と共に生活習慣病は増大している。これらは遺伝的素因に環境因子が加わった多因子病であり、生体側と環境側の双方の関与要因を明らかにする事が必要である.生活習慣病の発症、進展には活性酸素の関与が示唆される。呼吸での消費酸素の数%が活性酸素となるとされ、細胞内ミトコンドリアにおける活性酸素産生が、加齢や寿命などの生命の基本、更に退行性疾患に関連するがその詳細は明らかではない。本年度は、種々のミトコンドリア呼吸阻害剤投与によるメタロチオネイン産生がミトコンドリアの活性酸素産生を介する事の解析をおこなった。前年度では脱共役剤2,4-ジニトロフェノール(DNP)、アンチマイシンAのマウスへの投与によりメタロチオネイン(MT)合成が観察された。しかし、活性酸素産生がミトコンドリアでおこる事とMTの関係が充分に明らかでなかった。そこで、(1)異なる作用機序をもつミトコンドリア呼吸阻害剤を投与するといずれもMT合成と過酸化脂質増大がみられ、ミトコンドリアで共通しておこる反応を示唆した。さらに、(2)ミトコンドリアに局在するトリカルボン酸回路の一つである酵素の基質であるコハク酸は、競合阻害剤の一つであるマロン酸投与によるMT合成を完全に抑制した。この事はマロン酸投与によりミトコンドリアにおける電子伝達が阻害され、活性酸素産生がおこり、MT誘導へ導いた事を示している。(3)呼吸阻害剤投与によるメタロチオネイン産生が他の要因による可能性がある。例として炎症反応があるが、線維芽細胞にDNPを添加すると、MTmRNAの発現がみられた事から、ミトコンドリアで産生された活性酸素がMT誘導に導いたものと考えられる。また、ミトコンドリアで活性酸素産生を経て誘導されたメタロチオネインは、野性型線維芽細胞とMT欠損型線維芽細胞にDNPを加えて比較するとNF-kBの活性化発現を調節している事が示された。高齢化社会の進展と共に肥満を基礎にした生活習慣病が増大している。これらはエネルギー代謝に関連し、遺伝的素因に環境因子が加わった多因子病で、生体側と環境側の双方の関与要因解明が必要である.生活習慣病の発症・進展に活性酸素関与が示唆されている。常時産生される呼吸時の消費酸素の数%に相当する活性酸素は、細胞内ミトコンドリアにおいて行われ、加齢や寿命などの生命の基本、更に退行性疾患に関連するがその詳細は明らかではない。昨年度は、動物へのミトコンドリア呼吸阻害剤投与によるメタロチオネイン生成がミトコンドリアを介する解析を行った。本年度は活性酸素産生が真にミトコンドリア呼吸阻害による事を、リン脂質過酸化脂質-グルタチオンパーオキシダーゼ過剰発現(PLHP-GSHPx)細胞と正常細胞を用いて証明した。脱共役剤2,4-ジニトロフェノール(DNP)の培地への添加では細胞生存率は、(PLHP-GSHPx)細胞の方が正常細胞に比較して顕著に大きい事が経時的、用量依存的に認められた。
漿膜乳斑組織の構造と機能に関する研究

大網内に非常に多く含まれる漿膜乳斑組織の悪性腫瘍に対する免疫反応に関する研究を行った。BALB/cマウスにBAMC-1腫瘍細胞を移植しOK432、PC-C203U(OK432と同様に溶連菌より生成された免疫賦活剤で、抗腫瘍効果は劣る)および生食(コントルール)を用いた3群間での治療効果を検討した。検討項目は、1)生存率、2)腹腔内への好中球遊走能、3)腹腔内におけるIL-1β、IL-6、MIPlα産生(ELISA)、4)臓器(大網、脾臓および肝臓)におけるIL-1β、TNF-α、IFN-γ、MCP-1産生(mRNA)、5)漿膜乳斑組織の電顕的形態学的変化、とした。生存率における治療効果は有意にOK432が優れ、以下PC2-C203U、コントロールの順であった(p<0.05)。2)-4)の検討項目はすべて治療効果とよく相関していた。すなわち、好中球遊走能や腹腔内に産出されたサイトカイン、大網におけるサイトカイン産生はOK432>PC-C203>コントロールであった。OK432治療早期では漿膜乳斑組織の形態学構造が破壊されるほど、好中球で占められていた。われわれは、好中球がOK432治療効果発現のためのfirst runnerであり、以後マクロファージ、リンパ球と遊走・誘導され腫瘍特異免疫が確立されることを報告してきた。今回の検討より、漿膜乳斑組織におけるサイトカインネットワークが、悪性腫瘍に対する免疫反応に重要な役割を果たしていることが示唆された。漿膜乳斑組織の免疫担当臓器としてのさらなる機序解明のため、1)大網非切除群と切除群でのOK432の治療効果、2)OK432刺激下での大網の組織培養における免疫担当細胞の解析、3)腸内細菌がおよぼすOK432の治療効果および漿膜乳斑組織機能、の3つの研究が現在、進行中である。(目的)OK-432の抗腫瘍効果のメカニズムを分子生物学的に明らかにする為に、同剤の誘導するサイトカインの発現量が全身と局所(乳斑,MS:OK-432注入後早期に好中球がmigrateする場所)で異なるかを検討した。対照として、非活性型OK-432類似溶連菌、PC-C203U,を用いた。(結果)OK-432及びPC-C203U,投与で夫々67%、33%の生存が得られた。両治療法とも同等に腹腔内浸出細胞のアポト-ジスを誘導した。また、両者ともIL-8,TNF-α,IFN-γの発現を誘発し、それらの発現量は肝、脾、MS間には差がなかった。しかしOK-432投与では、IL-1βの発現量が肝及び脾に比しMSにおいて高い傾向が認められた。菌投与4時間後の腹腔内好中球の腫瘍細胞付着能には両群間で差がなかった。(考察)OK-432及びPC-C203Uとも非特異的に炎症性サイトカインを誘導した。また両治療による腹腔内細胞のアポト-ジスは差がなかった。これらの点から、OK-432とPC-C203Uの抗腫瘍効果の差は、早期に誘導されるサイトカイン及び好中球の抗腫瘍作用に依存するよりは、その後に生じる細胞性免疫の変化の差によることが確認された。

漿膜乳斑組織の免疫担当臓器としてのさらなる機序解明のため、1)大網非切除群と切除群でのOK432の治療効果、2)OK432刺激下での大網の組織培養における免疫担当細胞の解析、3)腸内細菌がおよぼすOK432の治療効果および漿膜乳斑組織機能、の3つの研究が現在、進行中である。漿膜乳斑部(大網)におけるサイトカイン動態の解析とメカニズム解析を行った。Balb/cマウスにBAMC-1腫瘍を腹腔内に接種し、抗腫瘍性溶連菌OK-432、その対照溶連菌PCC203U及び生食投与の3群について抗腫瘍作用とその機序の解明を行った。治療成績はOK-432>PCC203U>生食の順に有意の差をもって生存日数の延長及び、救命率の向上が得られた。OK-432、PCC-203U共に胆癌マウスへの腹空内投与後早期(4時間以内)に好中球の腹腔内への遊走を惹起し、それら好中球は腫瘍細胞とrosette形成をすることが走査電顕にて証明出来た。OK-432では、かかる好中球附着部で腫瘍細胞の細胞膜の消失が認められ、腫瘍細胞にApoptosisが誘導出来た。PCC-203Uでは判然した作用の確認は今のところ得られていない。目下検索を続行中である。腫瘍細胞一ヶあたりの好中球誘導能はOK-432が他のものよりも有意に亢進していた。乳斑組織に富む大網膜と腹膜内の免役担当組織の代表として、肝臓、脾臓をとりあげ、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF、TNF-α、INF-γ、MCAForMCP-1等のサイトカイン誘導能をRT-PCR法にて検索した。大網におけるIL-1βmRNAはOK-432で他の2群よりも有意に高かったがその他のサイトカインのmRNA発現量には3群間に差は認められなかった。Moloney murine sarcomavirusによる漿膜での発現実験は、所有virus様の力価が下った為かまだ十分の発癌率が得られていない。マウスの系統を変えて実験を続け、漿膜における発癌機序を証明するべく努力中である。また腸内細菌叢の有無が乳斑部における免役反応を如何にして修飾するかを無菌動物、gnotobiota、通常飼育群を用いて解明するべく無菌動物系をset-upした。大網内に非常に多く含まれる漿膜乳斑織織の悪性腫瘍に対する免疫反応に関する研究を行った。BALB/cマウスにBAMC-1腫瘍細胞を移植しOK432、PC-C203U(OK432と同様に溶連菌より生成された免疫賦活剤で、抗腫瘍効果は劣る)および生食(コントルール)を用いた3群間での治療効果を検討した。検討項目は、1)生存率、2)腹腔内への好中球遊走能、3)腹腔内におけるIL-1β、IL-6、MIP1α産生(ELISA)、4)臓器(大網、脾臓および肝臓)におけるIL-1β、TNF-α、IFN-γ、MCP-1産生(mRNA)、5)漿膜乳斑組織の電顕的形態学的変化、とした。生存率における治療効果は有意にOK432が優れ、以下PC2-C203U、コントロールの順であった(p<0.05) 2)-4)の検討項目はすべて治療効果とよく相関していた。すなわち、好中球遊走能や腹腔内に産出されたサイトカイン、大網におけるサイトカイン産生はOK432>PC-C203>コントロールであった。OK432治療早期では漿膜乳斑組織の形態学構造が破壊されるほど、好中球で占められていた。われわれは、好中球がOK432治療効果発現のためのfirst runnerであり、以後マクロファ一ジ、リンパ球と遊走・誘導され腫瘍特異免疫が確立されることを報告してきた。今回の検討より、漿膜乳斑組織におけるサイトカインネットワークが、悪性腫瘍に対する免疫反応に重要な役割を果たしていることが示唆された。
ウェーブレット解析の応用における数学的基礎付けと関連する諸問題

ウェーブレット解析、特にその中心にあるウェーブレット変換に関して、応用場面で現れる数学的問題のいくつかについて考察を加え、応用の基盤となる性質について、ある程度明確にすることができた。特に、ウェーブレット関数の(分数べき)ヒルベルト変換に対応するスケーリング関数の変換について、明らかにすることができた。数学的にもメイエウェーブレットの特性の1つが明らかになった。この結果はブラインド信号源分離(複数の原信号が混じった信号のみが観測できる際に、それら観測信号から原信号の情報を得るという問題)の新たな手法にも結び付いた。一般の直交スケーリング関数と直交ウェーブレット関数のペアにおいて,平行移動の一種の変形であるユニタリ作用素を定義し,これとヒルベルト変換の拡張であるユニタリ作用素(fractional Hilbert transform)のそれぞれをスケーリング関数とウェーブレット関数に作用させたものが,MRA理論に基づく自然な対応をなすことをすでに証明していたが,これらの作用素を作用させたものの局在性が重要な問題点となっていた.例を調べて笑ることを理論的に証明する必要があったが,これらの局在性はウェーブレット関数のゼロモーメント条件と深くかかわることが明らかとなり,ゼロモーメント条件のもとで局在性が保たれることが証明できた.この結果は日本数学会の欧文論文誌に投稿し,掲載が決定した.この結果については,双直交の場合についてもある程度拡張できることが分かってきている.ウェーブレット変換に関する不確定性原理について,すでに発表されている他研究者による結果の証明の大きな穴についてはいまだ解明できていない.信号源分離については,信号源(現在は画像を考えている)の単純な線形和ではなく,平行移動したものの線形和で平行移動の大きさも未知の場合(spatio-temporal mixing model)について,連続マルチウェーブレット変換の相互相関を用いた手法を考案した.具体的な画像でシミュレーションを行い,有効性を確認した.メイエウェーブレットの場合に,スケーリング関数の1/2平行移動から作ったウェーブレット関数が,元のウェーブレット関数のヒルベルト変換になることの不思議さを解明するため,一般のスケーリング関数とウェーブレット関数のペアにおいて,平行移動の一種の変形であるユニタリ作用素とヒルベルト変換の拡張であるユニタリ作用素を定義し,それぞれをスケーリング関数とウェーブレット関数に作用させたものが対応することを証明することができた.ウェーブレット変換に関する不確定性原理については,片側幅を考えた場合のフーリエ変換の不確定性原理との関係は分かったが,フーリエ変換の不確定性原理の正しい下限については,いまだ不明な点がある.今後の大きな課題である.信号源分離については,時間スケール情報行列を用い,ガウスの消去法の原理を使って信号源を一つずつ減らしていく手法を考案した.シミュレーションにより,従来の方法より多くの信号源に対して有効であることが分かった.前年度までの研究で,一般の直交スケーリング関数と直交ウェーブレット関数のペアにおいて,平行移動の一種の変形であるユニタリ作用素の族を定義し,これをスケーリング関数に作用させたものと,ヒルベルト変換の拡張である分数べきヒルベルト変換(fractional Hilbert transform)をウェーブレット関数に作用させたものとが,再びMRA理論に基づくスケーリング関数とウェーブレット関数の自然な対応をなすこと,およびこれらの作用素を作用させたものの局在性について,証明を完成させていたが,これらの結果を双直交ウェーブレットの場合に拡張し,やはりウェーブレット関数の分数べきヒルベルト変換に対応するスケーリング関数が上記ユニタリ作用素で得られることを明確にした.また,上の結果を具体的な双直交ウェーブレットに対して適用し,N分木離散ウェーブレット変換に応用した.実際の応用ではフィルタ係数が重要であるが,上記で得られたスケーリング関数やウェーブレット関数に対応したフィルタ係数を理論的に計算した.連携研究者の守本晃氏の協力により,シミュレーションも行った.ウェーブレット変換に関する不確定性原理については,関数(信号)のフーリエ変換において,正負の周波数を統合した片側幅に関する不確定性原理が重要なキーとなるはずであるが,残念ながら停滞している.信号源分離については,上記N分木離散ウェーブレット変換を使って,平行移動を含んだ混合画像の場合に,具体的な画像でシミュレーションを行った.前年度までの研究で,MRA理論に基づく一般の直交スケーリング関数と直交ウェーブレット関数のペア及び双直交スケーリング関数と双直交ウェーブレット関数のペアにおいて,平行移動の一種の変形であるユニタリ作用素の族を定義し,これをスケーリング関数に作用させたものと,ヒルベルト変換の拡張である分数べきヒルベルト変換(fractional Hilbert transform)をウェーブレット関数に作用させたものとが,再びスケーリング関数とウェーブレット関数の自然な対応をなすこと,およびこれらの作用素を作用させたものの局在性について,証明を完成させていたが,これらをもとにしたN分木離散ウェーブレット変換への応用を進めた.これには,連携研究者である守本晃氏の研究室の大学院生の応援も一部得た.研究成果は,守本晃氏がラスベガスで開かれた国際会議で口頭発表し,プロシーディングスに5名共著で論文を発表した.信号源分離についても,双直交の場合のスケーリング関数とウェーブレット関数のヒルベルトペアを元にしたN分木離散ウェーブレット変換を使って,平行移動を含んだ混合画像の場合について,昨年度の研究を進めた.研究成果は,連携研究者の守本晃氏が中国の広州で開かれた国際会議で口頭発表し,プロシーディングスに3名共著で論文を発表した.また,これに関連して,一般の信号の瞬間振幅についての新たな不等式が得られ,周波数帯が狭い場合に瞬間振幅(解析信号の絶対値)が元の信号の粗い変動を表すことの数学的基礎づけの1つが得られた.

これについては台湾で行われた国際会議で萬代が発表し,それに基づいた論文が掲載される予定(掲載決定)である.ウェーブレット解析、特にその中心にあるウェーブレット変換に関して、応用場面で現れる数学的問題のいくつかについて考察を加え、応用の基盤となる性質について、ある程度明確にすることができた。特に、ウェーブレット関数の(分数べき)ヒルベルト変換に対応するスケーリング関数の変換について、明らかにすることができた。数学的にもメイエウェーブレットの特性の1つが明らかになった。この結果はブラインド信号源分離(複数の原信号が混じった信号のみが観測できる際に、それら観測信号から原信号の情報を得るという問題)の新たな手法にも結び付いた。ウェーブレット変換の分数べきヒルベルト変換については,双直交ウェーブレットの場合に拡張することができ,ある程度応用もできた.不確定性原理については停滞しているが,問題の難しさが明らかになってきつつある.信号源分離については,ウェーブレットの分数べきヒルベルト変換とそれに対応するスケーリング関数を応用する試みがある程度うまくいっている.ウェーブレット解析ウェーブレット関数のヒルベルト変換に関しては,定義したユニタリ作用素のより深い性質などについて考察する.特に同様の性質も持つ作用素の中で我々の定義したものの持つ長所より明確にしたい.ウェーブレットに関する不確定性原理については片側中心と片側幅を考えた場合のフーリエ変換の不確定性原理について更なる考察を行い,ウェーブレット変換の場合に応用する.その他,以下の課題について昨年度に引き続き考察を進める.1.解析信号を使ったエンベロープ・瞬間周波数の妥当性の検討2.帯域制限信号の空間と数列空間の同型性(サンプリング定理)3.離散ウェーブレット変換の平行移動不変性について4.信号源分離の原理についてまた,各種応用に現れる数学的問題(数学的にきちんと定式化・証明がされていない問題)について情報収集に努める.ウェーブレット関数のヒルベルト変換を引き起こすスケーリング関数のユニタリ変換については,その性質が明らかになり,当初の思惑以上に良い性質をもつことが明らかになった.一方,不確定性原理に関わる他研究者の結果の証明の穴は,当初思っていたより難しい問題であることがはっきりしつつあり,当初の思惑通りの解決は難しいと思われる.信号源分離については着実に進展している.年度当初に想定していた結果は出たと思われる.ただ,今後については,当初の予定より困難が大きいと思われることが分かってきた.海外出張に行く予定を取りやめ,大学での研究と国内での出張を重視したため,およびパソコン購入の時期を遅らせて次年度としたため,余裕が生じた.
微小重力環境などのストレスが生体システムに与える影響の理論的解析

微小重力環境においては、どの生物もその後生過程にストレスを被ることが知られています。可変パラメータとして重力の効果を明示的に評価できる環境に多世代おかれた結果としてその体制に現れる(必要条件/十分条件としての)形質について数理モデルを用いて調べました。遺伝的アルゴリズムに代表される確率的最適化技法によってシステムを構成しようというアプローチは、発生現象のように、システムの構成要素がある程度明らかになり、しかも入出力の制約を満たす解がパレト解(ある保存量が一定値をとる面)上に分布しているような対象の進化を調べる際に有用である。実働時の因果関係や、相互作用を再現することによって、対象の持つ性質・特性の明快な理解が可能になる.この技法をその体制に「重力に対応する内骨格および造血系と自己非自己認識を行う獲得免疫系」を持つ「脊椎動物」に適用した。水棲から陸棲へと移行した体制構築、細胞間情報伝達、蛋白間相互作用のaffinityなどの柔軟な制御の総合を、可変な結合を持つネットワークで表し、移行に伴う胚のパレト解の変化を、体制構築の場における異時性と胸線教育の場における多様性という二つの保存量を定義することにより、実装する。胚の運命決定点は空間において位置情報の連続性を保ちつつ、時をずらすことによって十分な機能的複雑さを実現するように分布する。胚の獲得免疫系は抗原の圧倒的な多様性に逆接続を行い、自己非自己を適切に見極めるように構築される。この時かかわる二体間相互作用には「場」と「行為者」という非対称性が伴い、細胞集団として一定値をとる保存量が「どちらに片寄って現れるかは分からない」という意味で観測における不確定性が期待され、遺伝子ネットワークの問題を、各個体内で定義した相互作用の枠組みの上で、葉曲の存続をその生活史に則った階層的淘汰過程によってモデリングし、追跡を行ったとき観測される傾向(predisposition)として定式化することによりこれに事後確率としての予測を与えることができます。微小重力環境から通常重力環境への多世代再生に基づく脊椎動物の体制構築を中胚葉->神経堤->骨髄造血->獲得免疫系各細胞集団の付加を介した解析接続として捉えることにより、系全体に対する一意的な眺望を「健康を正しく保持する」という設計の実現として理解することができる。確率的に破綻を伴う(シュレーディンガーの猫的)状況に多世代おかれた結果としてその体制に現れる(ことが期待される)形質について数理モデルを用いて調べました。遺伝的アルゴリズムに代表される確率的最適化技法によってシステムを構成しようというアプローチは、発生現象のように、システムの構成要素がある程度明らかになり、しかも入出力の制約を満たす解がパレト解(ある保存量が一定値をとる面)上に分布しているような対象をモデル化する際に有用である。実働時の因果関係や、相互作用を再現することによって、対象の持つ性質・特性の明快な理解が可能になる。この技法をその後生過程に「かなりたくさんのvulnerableな箇所」を持つ「脊椎動物」に適用した。その体制構築、細胞間情報伝達、蛋白間相互作用のaffinityなどの柔軟な制御の総合を,可変な結合を持つネットワークで表し、胚の球面極座標表示を、中心力の場における角運動量とエネルギーに対応する二つの保存量を定義することにより、実装する。この時かかわる二体間相互作用には「場」と「行為者」という非対称性が伴い、細胞集団として「一定値をとる保存量がどちらに片寄って現れるかは分からない」という意味で観測における不確定性が期待され、遺伝子ネットワークの問題を、各個体内で定義した相互作用の枠組みの上で、集団の存続をその生活史に則った階層的淘汰過程によってモデリングし、追跡を行ったとき、観測される傾向(predisposition)として定式化することによりこれに事後確率としての予測を与えることができます。胚の運命決定点は空間において位置情報の連続性を保ちつつ十分な機能的複雑さを実現するように分布する。球面極座標表示:余緯度:誘導と細胞自律性(神経堤細胞と神経軸-頭部と体幹)方位角:細胞間交信におけるリガンドと受容体(サイトカインと増殖因子)動径方向:免疫の細胞間相互作用(獲得性免疫の構造、再構築)遺伝子治療における免疫療法の設計などを目的に哺乳類免疫系の局所的な細胞分化経路、細胞表面抗原集合を操作する際に、必要とされる膨大な知識を対話的な3次元世界構築によって裏打つための統合環境を実現する指針を得られた球面極座標表示は与えます。

水棲から陸棲へと移行した体制構築、細胞間情報伝達、蛋白間相互作用のaffinityなどの柔軟な制御の総合を、可変な結合を持つネットワークで表し、移行に伴う胚のパレト解の変化を、体制構築の場における異時性と胸線教育の場における多様性という二つの保存量を定義することにより、実装する。胚の運命決定点は空間において位置情報の連続性を保ちつつ、時をずらすことによって十分な機能的複雑さを実現するように分布する。胚の獲得免疫系は抗原の圧倒的な多様性に逆接続を行い、自己非自己を適切に見極めるように構築される。この時かかわる二体間相互作用には「場」と「行為者」という非対称性が伴い、細胞集団として一定値をとる保存量が「どちらに片寄って現れるかは分からない」という意味で観測における不確定性が期待され、遺伝子ネットワークの問題を、各個体内で定義した相互作用の枠組みの上で、葉曲の存続をその生活史に則った階層的淘汰過程によってモデリングし、追跡を行ったとき観測される傾向(predisposition)として定式化することによりこれに事後確率としての予測を与えることができます。微小重力環境から通常重力環境への多世代再生に基づく脊椎動物の体制構築を中胚葉->神経堤->骨髄造血->獲得免疫系各細胞集団の付加を介した解析接続として捉えることにより、系全体に対する一意的な眺望を「健康を正しく保持する」という設計の実現として理解することができる。