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16・17世紀における地中海地図とシェイクスピア演劇

地図とは、最も「科学的」な地図といわれたものですら,測量術による客観性を基に作られたというよりも,むしろ社会の伝統や文化的規範によって描き出され,生み出されたものである。いかに精妙な地図といえども,人間が描くものである以上,そこには作者の主観的な世界観が,また時代や社会を支配するイデオロギーが介在することを否定することはできない。初期近代英国において重要な文化表象であった地中海地方の「地図」は、シェイクスピア演劇を考察するうえで興味深い。地図の研究を端緒に、イングランド人が地中海貿易を通して経験した異国人との遭遇によって、いかに自己成型(Self-fashioning)を果たしたか、すなわちムーア人、モロッコ人、トルコ人、スペイン人、ユダヤ人等、他者との遭遇・接触が、イングランド人という国民のアイデンティティ形成にいかに大きな役割を果たしたか、という問題を探求した。科研費助成研究「16・17世紀イングランドにおける地図製作とシェイクスピア演劇」(平成15年18年)における研究を進めていくなかで、イングランド人が地中海貿易を通して経験した異国人との遭遇によって、いかに自己成形(Self-fashioning)を果たしたかの問題が非常に重要であることに気付かされた。ムーア人、モロッコ人、トルコ人、スペイン人、ユダヤ人等、他者との遭遇・接触が、イングランド人という国民のアイデンティティ形成にいかに大きな役割を果たしたかは、是非とも研究し解明すべき問題であると思われる。その際、英国地図同様、人々が見知らぬ土地を思い描くにあたって重要な文化表象であった地中海地方の「地図」が、シェイクスピア演劇を考察するうえで、とても興味深い対象となるものであるということには強い確信を抱いている。今回の科研申請は、平成15年18年度において遂行してきた「地図」の研究を、英国のみならず地中海地域へと拡大するものであり、現在、出版準備を進めている書物『英国地図製作とシェイクスピア演劇』の姉妹編となる書物『地中海地図とシェイクスピア演劇(仮題)』を執筆するための研究基盤となるものである。科研の支援を受けて進めてきた「英国地図の成立とシェイクスピア演劇」は一応まとまり、平成19年5月に最終報告を提出することができた。更にもう1章分を加筆したいと考え、シェイクスピアのRichardIIおよびHenryIVを題材に、10月に開催されたシェイクピア学会第46回大会でセミナー発表「イングランド地図の成立と歴史劇」を行った。これらの研究と並行して、19年度からの課題である「地中海とシェイクスピア演劇」のため地中海地図の収集および英国初期近代における地中海を対象とした研究書の収集を開始した。近年、地中海貿易により異邦人との接触をとおしてイングランド人の自己成型が果たされる過程を研究した文献が次々に登場している。Goran V.Stanivukovic編著のReampping the Mediterranean World in Early Modern English Writingsをはじめ、Gerald MacLean著The Rist of Oriental Travel、Jonathan Burton著Traffic and Turning、更に近代初期英国におけるイスラムの表象としては、Jason P.RosenblattやNabil Matarの書物など重要な文献を収集することができ、資料収集においては、ある程度の成果を得ることができたと思う。現在、これらの書物をもとに論文執筆を進めており、学会での研究発表に応募し、発表が認められれば、平成20年度中にいくつかの学会発表を行うことによって、他の研究者たちと意見交換をしていきたい。またその後、論文の形で学会誌に投稿する予定である。昨年のシェイクスピア学会でのセミナー発表「イングランド地図の成立と歴史劇」を論文の形にまとめ、「イングランド地図の成立と歴史劇-『ウッドストック』,『リチャード二世』,『ヘンリー四世』二部作」と題して、『同志社大学英語英文学研究』第83号に投稿し、掲載された。また資料収集してきた地中海関連の書物をもとに、1590年代におけるモロッコとイングランドの関係を再調査する作業を進め、シェイクスピアの『ヴェニスの商人』の読み直しを試みた。成果を、10月に岩手県立大学で開催された第47回シェイクスピア学会で研究発表し、他の研究者との意見交換を行なった。学会で得られたコメントをもとに部分的に加筆し『同志社大学英語英文学研究』第84号に投稿し、掲載された。イスラム諸国とイングランドの関係は、従来、無視されていただけに、近年、多くの研究者の注目するところである。なかでもDahiru Yahyaの研究は両国の政治・外交関係に光をあてたパイオニア的なものとして注目に値する。また特に『ヴェニスの商人』とモロッコの関連を論じたものとしては、Jonathan Gil Harris、Phyllis Rackin、Gustav Ungererなどの研究が興味深く、多くの刺激を受けた。これらの研究を足がかりに更に資料収集と作品分析を進め、シェイクスピアの他の作品にも地中海世界におけるイングランド人と他者との遭遇を、そして彼らの自己成型の過程を読み取っていきたい。

昨年度に引き続きシェイクスピア演劇と地中海の関係、特にオスマン・トルコを中心とするイスラム世界との関係について研究を進めた。4月から7月にかけては、当時の英国とイスラム世界についての研究書をインター・ライブラリー・サービスによって収集、8月には米国ハーヴァード大学ワイドナー図書館、ホートン貴重本図書館、コロンビア大学図書館、カリフォルニア大学バークレイ校図書館を巡り、日本で入手不可能な資料の集中的収集にあたった。9月以降は集まった資料を整理しながら研究発表の準備を進め、関西シェイクスピア研究会2月例会において「『オセロ』とイスラム世界」と題する研究発表を行なった。研究会に参加していた研究者たちと充実した意見交換ができたので、寄せられた意見を参考に、現在、論文として発表するための加筆を行っている。また平成22年10月に福岡女学院(福岡県・福岡市)で開催される第49回日本シェイクスピア学会において、セミナー「シェイクスピアとイスラム世界」のリーダーを務めることが決まり、このセミナーに参加するメンバーと意見交換しながら、初期近代英国におけるイスラムの影響についての研究を進めている。10月開催の第49回日本シェイクスピア学会において、セミナー「シェイクスピアとイスラム世界」のコーディネーターを務めることが決まっていたため、4月からセミナー・メンバーとインターネットを利用して、文献調査および意見交換を進めた。8月に各メンバーの発表原稿が書きあがったので、それをもとに9月に京都の同志社大学へ全員が集まり、セミナーの予行演習を兼ねて意見交換を行なった。更なる意見交換やそれぞれの発表への質問項目を整理し、10月の学会へ臨んだ。フロアから多くの示唆にとんだ意見や質問などがあり、研究についての客観的な視点を取り入れることができたと思う。セミナーの内容については、学会発行のShakespeare News第50巻2号に掲載されている。またセミナーで発表した拙論「『オセロ』とイスラム世界」は、査読審査の後、『同志社大学英語英文学研究』第86・87合併号に論文として掲載された。セミナー準備と時期を同じくして、David Armitage, Conal Condren, and Andrew Fitzmaurice, eds. Shakespeare and Early Modern Political Thought(Cambridge UP, 2009)の書評を執筆し、Shakespeare Studiesに投稿した。
Field cancerization;口腔癌・食道癌重複症例の探索

日本における口腔癌の罹患者は1975年には2,100人,2005年には6,900人であったが、全癌の約1%を占めると推定されている。高齢化社会の到来とともに癌罹患数は増加している。口腔癌においても同様であり、2015年には7,800人になると予測されている。口腔癌の9割の組織系は扁平上皮癌(Oral Sqamous Cell Carinoma:OSCC)であり、口腔癌の中では舌癌が最も多い。口腔は消化器系の入り口として,喫煙や飲酒、食物などによる化学的刺激に曝露され、また齲歯や不良な歯科補綴物による機械的刺激があり、発癌にかかわる特殊な環境と危険因子が複数存在することが特徴である。口腔癌患者には同時性あるいは異時性に重複癌が発生することがある。口腔癌を含む頭頸部癌患者における重複癌の6070%は上部消化管または肺に認められる。口腔癌を含め、頭頸部癌患者における重複癌の特徴として、最近20年間に発生頻度が急激に増加しており、近隣領域に第2癌が発生することが多くまた頭頸部癌の治療後に第2癌が発生することが多い。上部消化管癌と重複することが多いことの説明として、1953年にSlaughteらが口腔癌の研究から提唱した概念で,咽頭、食道、胃は、同一の発癌環境にあるとされ、共通の癌誘発因子の長期的な暴露によって複数の領域にまたがって広く発癌する現象をさす、field cancerizationの概念が挙げられる。また、口腔癌の重複癌の背景因子には、性、生活習慣、過度の喫煙と飲酒が挙げられる。食道癌も口腔癌同様に9割の組織系は扁平上皮癌(Esophugus Sqamous Cell Carinoma:ESCC)とされていて双方ともに扁平上皮由来の悪性腫瘍であり、同一個体から検出された重複癌同志の遺伝子レベルでの変化など興味深い。口腔・咽頭領域の研究の一貫として「馬蹄形骨切り併用Le Fort I型骨切り術のための上顎骨の解剖学的検討」として学会発表を行い学会賞を受賞した。(第28回日本顎変形症学会2018年6月)当研究における対象患者の抽出・選択行っている段階であり、予定より進捗状況は遅れている。当科において口腔扁平上皮癌(OSCC)と診断された症例で上部消化管の内視鏡スクリーニング検査(GIF)を行い、重複した食道扁平上皮癌(ESCC)を対象とする(または順番が逆のケースや双方の領域での単独症例も含む)。双方で得られた生検・手術検体を次世代シークエンサーなどの手法を用いて遺伝子レベルの異常や発現状態を同一個体から検出された重複癌同志または単独発症のケースと比較する事によって網羅的に評価し異常の関連性や独立性について検討する。それらのデータをもとに解析結果との関連性を評価し、field cancerizationの発生機序の解明や新規治療法の開発にむけた基礎的知見を得ることで新しい診断基準や治療法についての応用を目標とする。口腔・頭頸部領域の癌研究の一貫として[エンドGIA自動吻合器を用いた誤嚥防止術の検討]として学会発表を行った。(第34回江戸川医学会2016年11月19日20日)当研究における対象患者の抽出している段階であり、予定より進捗状況は遅れている。

高齢化社会の到来とともに癌罹患数は増加している。口腔癌においても同様であり、2015年には7,800人になると予測されている。口腔癌の9割の組織系は扁平上皮癌(Oral Sqamous Cell Carinoma:OSCC)であり、口腔癌の中では舌癌が最も多い。口腔は消化器系の入り口として,喫煙や飲酒、食物などによる化学的刺激に曝露され、また齲歯や不良な歯科補綴物による機械的刺激があり、発癌にかかわる特殊な環境と危険因子が複数存在することが特徴である。口腔癌患者には同時性あるいは異時性に重複癌が発生することがある。口腔癌を含む頭頸部癌患者における重複癌の6070%は上部消化管または肺に認められる。口腔癌を含め、頭頸部癌患者における重複癌の特徴として、最近20年間に発生頻度が急激に増加しており、近隣領域に第2癌が発生することが多くまた頭頸部癌の治療後に第2癌が発生することが多い。上部消化管癌と重複することが多いことの説明として、1953年にSlaughteらが口腔癌の研究から提唱した概念で,咽頭、食道、胃は、同一の発癌環境にあるとされ、共通の癌誘発因子の長期的な暴露によって複数の領域にまたがって広く発癌する現象をさす、field cancerizationの概念が挙げられる。また、口腔癌の重複癌の背景因子には、性、生活習慣、過度の喫煙と飲酒が挙げられる。食道癌も口腔癌同様に9割の組織系は扁平上皮癌(Esophugus Sqamous Cell Carinoma:ESCC)とされていて双方ともに扁平上皮由来の悪性腫瘍であり、同一個体から検出された重複癌同志の遺伝子レベルでの変化など興味深い。口腔・頭頸部領域の癌研究の一貫として[馬蹄形骨切り併用LeFortI骨切り術のための上顎骨の解剖学的検討]として論文発表を行った。(日本顎変形症学会雑誌27巻4号2017年)当研究における対象患者の抽出・選択行っている段階であり、予定より進捗状況は遅れている。日本における口腔癌の罹患者は1975年には2,100人,2005年には6,900人であったが、全癌の約1%を占めると推定されている。
小児歯科医院における齲蝕予防管理の費用便益分析について

11歯科医院において25歳で齲蝕を主訴として訪れ齲蝕処置終了後,12歳まで定期健診を継続的に受診した88名と対照群の151名を対象とした。定期健診の状況と乳歯修復物の予後,12歳までの永久歯の齲蝕予防効果について調査した。次に,小児期における定期健診が,生涯における累積医療費の抑制におよぼす影響について経済的に検討した。1)修復物の機能期間は,定期健診群では3.30年,対照群は2.48年であり,定期健診群は約0.8年機能期間が長かった。2)定期健診群の12歳時のDF歯数は,2.39歯,対照群では4.52歯であり,定期健診群の方がDF歯数は約2,1歯少なかった。3)定期健診により抑制された乳臼歯の医療費は,39,45689,664円と推定された。4)定期健診によって抑制された12歳までの永久歯の医療費は,13,802円と推定された。5)定期健診によって抑制された75歳までの医療費は,522,526572,734円と推定された。6)定期健診1回あたりで抑制された累積医療費は,19,35321,212円であった。7)定期健診の費用便益比は,1:5.536.06であった。以上より,小児期からの定期健診を行うことで,歯科医療費を大きく軽減させる可能性があると考えられた。(目的)乳歯齲蝕は,修復処置後も二次齲蝕や新生齲蝕の発生のため,再修復を繰り返す事が多い。この理由として乳歯の齲蝕感受性が高いことがあげられる。そこで乳歯の齲蝕治療は,定期健診等により積極的に齲蝕感受性を低下させることが重要であると考えられる。そこで齲蝕治療後,定期健診を行なうことにより,修復物の使用年数および再治療回数,および12歳時のDMF歯数に与える影響について検討を加えた。(対象および方法)1976年から1988年に出生し,1歳から5歳までに齲蝕を主訴として来院し,以後同一歯科医院に,少なくとも12歳まで継続的に来院したもの239名,乳臼歯治療歯数1750歯を対象とした。まず定期健診群(88名)とコントロール群(151名)に群分けし,乳臼歯部の平均修復回数,初回処置歯の使用年数および12歳のDMF歯数について調査した。(結果)1:対象者の乳臼歯部の平均修復回数は16.4回であり,定期健診群の平均修復回数は13.3回,コントロール群では18.3回と,定期健診群は5.0回修復回数が少なかった(ANOVA P<0.01)。2:初回処置における乳臼歯部の修復物の平均使用年数は2.8年であり,定期健診群では3.3年,"コントロール群では2.5年と,定期健診群の方が0.8年修復物の使用年数が長かった(ANOVA P<0.01)。3:12歳時における平均DMF歯数は3.7歯であり,定期健診群では2.4歯に対して,コントロール群では4.5歯と,定期健診群のDMF歯数は2.1歯少なかった(ANOVA P<0.01)。以上の結果より,齲蝕処置終了後も定期健診を継続することにより,乳歯齲蝕の再発を防止するのみならず,永久歯齲蝕の予防にも寄与することが示唆された。

11歯科医院において12歳まで継続的に来院した小児で処置終了後も定期健診を継続的に受診した小児88名,受診しなかった小児151名に群分けし,定期健診の状況と乳歯修復物の予後,永久歯の齲蝕予防効果について調査した。1)定期健診群における,初回処置後の乳臼歯修復物の機能歯率は,1年後で84.6%,2年後で67.5%,3年後で50.6%であった。対照群では1年後で74.1%,2年後で48.2%であり,定期健診群では50%機能期間は約1年延長した。2)初回修復物の機能期間は,定期健診群では3.30年,対照群は2.48年であり,定期健診群は約0.8年機能期間が長かった。3)定期健診群の12歳時のDF歯数は,2.39歯,対照群では4.52歯であり,定期健診群の方がDF歯数は約2.1歯少なかった。これらの基礎資料より,定期健診による齲蝕予防効果について経済効果について検討した。まず現行の社会保険歯科診療報酬に基づき,本診療室において,標準的な齲蝕処置に関わる費用を試算した。例として,1-2歳初診群において,定期健診群と対照群の再修復回数の差は,約1回/歯であることより,乳臼歯8歯に齲蝕が存在すると仮定すると,1-2歳で齲蝕に罹患し処置終了後も定期健診により,軽減される乳臼歯の医療費は61,440円142,720円と推定された。また12歳までのDF歯数の差は2.4歯であることから,永久歯では,12,528円が定期健診によって軽減された医療費となり,両者を合計すると12歳までに定期健診によって軽減された医療費は,73,968155,248円と推計され,小児期からの定期健診は,歯科医療費を大きく軽減させる可能性があると考えられた。
データベースに基づく欠損歯列拡大のシュミレーションモデルの構築と患者指導への応用

我々はどのような要因が抜歯を引き起こすかを検討すること目的として研究を行った。まず欠損拡大のデータを収集するために、当院にて2004年2005年に義歯を製作した患者の844件の診療録の調査を行った。分析の結果、抜歯される症例に関連する因子は、部分床義歯の支台歯、上顎、臼歯、失活歯、臼歯部の咬合接触がない場合、同顎の残存歯数が少ない場合などであった。本研究の結果、欠損拡大のデータベースの構築を行い、いくつかの抜歯に関連すると考えられる要因を明らかにすることができた。本研究は、欠損補綴治療が終了した症例の残存歯の生存について臨床データを収集・蓄積し、データベースを構築すること、また欠損拡大に関連する因子について検対することを目的としている。本年度の計画は後ろ向き研究として大阪大学菌学部付属病院の過去5年間の症例2000ケースを同標に診療録やレントゲンから出来る隈り多くの臨床データを収集・整理し、データベースを構築すること。得られた調査項目を整理し、必要なデータや効率的なデータ収集の方法の検討を行うこと。データベースソフトを用いて入力しやすいインターフェイスを作成し、今後も臨床データを継続的に蓄積できる環境を整備することなどが主な計画であった。まず本年度前半には必要なPCやソフトのセットアップやデータ保存のためのサーバーの整備等を行い、セキュリティの確保されたデータの保存先を確立した。その後、当院医療情報室と連携して、分析対象となる全診療録の中から条件を満たすケースの抽出を行い、まず100ケースのデータの収集を行った。また、データの収集作業と並行して、データベース構築にむけてデータ入力の際の調査票の改善など、臨床データを継続的に蓄積できる環境の整備をすすめた。得られたケースの分析も開始しており、部分床義歯の支台歯はそうでない歯にくらべ、破折による抜歯の割合が高いことや上顎の支台歯は下顎の支台歯にくらべ、失活歯は生活歯にくらべ抜歯される割合が高いことなどが明らかとなるなど、有意義な結果を符つつある。本研究は、欠損補綴治療が終了した症例の残存歯の生存について臨床データを収集・蓄積し、データベースを構築すること、また欠損拡大に関連する因子について検討することを目的としている。本年度の計画は前年度に行った後ろ向き研究の大阪大学歯学部付属病院の過去5年間の症例の臨床データ収集をもとに製作したデータベースにさらに多くのデータを追加したのち、欠損拡大に関連するデータについて分析、検討し、どのような要因が欠損の拡大を引き起こしやすいかを明らかにすること、ならびに欠損の拡大を予測し得るシュミレーションを開発することであった。データ収集は2004年度ならびに2005年に来院され、義歯を製作した全844件の診療録を調査し、そのうち抜歯が行われたケース322件について終了した。分析の結果、部分床義歯の支台歯はそうでない歯にくらべ、破折による抜歯の割合が高いことや上顎の支台歯は下顎の支台歯にくらべ、臼歯は前歯にくらべ、臼歯部の咬合接触がないものは咬合接触があるものにくらべ、同顎の残存歯数が少ないものは多いものにくらべ、失活歯は生活歯にくらべ抜歯される割合が高いことなどが明らかとなった。つまり本研究の結果より、上記のような条件を満たすような歯は将来的に欠損する確率が高くなる可能性が示された。またさらに、Coxの比例ハザードモデルの構築により、各要因のハザード比も算出されており、例えば鉤歯を選択する際、前歯を鉤歯にする事は臼歯部にくらべて2倍、失活歯は生活歯にくらべ1.6倍のリスクがあることなど、患者指導や治療計画の立案の際にも非常に有用なデータを得る事ができた。
新型シーケンサーを用いた細菌における自然環境でのゲノムアダプテーション解析法

大腸菌O26の解析では、48株の海外分離株と278株の国内分離株について、以下の方法により解析を行った。(1)NexteraXT kitにより作成したライブラリーをIllumina HiSeqでシーケンスし、およそ100x coverageのリードを取得(2)各株のリード配列をPlatanusソフトウエアでアセンブルし、それぞれ200から300本のScaffold配列を取得(3)各株のScaffold配列をreference配列へMUMmerソフトウエアパッケージを用いてアライメントし、SNPsを同定(4)全SNPsリストから、可動性遺伝因子上のSNPsなどを除去(5)各株のSNPs情報(全11,562 SNPsサイト)を基にBEASTソフトウエアを用いて、系統樹予測と分岐年代推定を実施、Figtreeソフトウエアにて系統樹を作製した。系統解析の結果、日本では1930年代あたりに分岐した系統が一気にクローンを増大させていることが明らかとなった。この系統では、人に対する病原性が強くなった可能性と、リザーバーであるウシの体内での生存や定着に有利となった可能性が予想された。今後は、ウシ由来O26を解析に加えることでこの可能性を検証したいと考えている。また、優勢系統とそれ以外の系統に属する株のゲノムを比較することで、優勢菌種に特異的なゲノムの特徴を明らかにし、ゲノムアダプターションへの関与について解析する予定である。結核菌の解析では、ある施設における長期間の集団発生により感染した8名の患者由来株について、O26の解析と同様の方法でSNPsを同定した。本感染事例では、最初の患者から次々とヒトーヒト感染により伝播しているが、SNPs解析により患者間での感染の経路や順序が予測できた。今後は、その変異がヒトへの定着などの病原性や薬剤耐性に関与するかどうかを明らかにする予定である。24年度が最終年度であるため、記入しない。本研究では、疫学・臨床情報が完備された病原性大腸菌O26と結核菌をモデルとして、新型シーケンサーを用いた大規模配列解析による高解像度進化系統解析を行い、病原細菌における自然環境下でのgenome adaptationの解析手法の確立を目指す。今年度は、大腸菌O26の菌株収集とゲノムDNA調整を中心に行った。申請段階では、2004年の国内分離株24株と海外分離株70株を所有していたが、富山県の衛生研究所の協力で1998年から2011年までの国内分離株を73株追加収集した。近日中に、宮崎県、福岡県、大阪府の衛生研究所の協力を受けてさらに200株程度を取集できる予定である。いずれの菌株も分離年と分離場所に関する情報が整備されている。海外分離株については、ベルギーLiege大学獣医学部のJacques Mainil教授に、ヨーロッパを中心として最近分離された20株程度の収集を依頼している。また、当初の計画には無かったが、牛糞便由来の大腸菌O26についても、コントロールとして、複数の株を動物衛生研究所の楠本正博博士の協力を得て収集を進めている。収集した菌株については、随時ゲノムDNAを抽出し、志賀毒素の有無とタイピングを実施している。結核菌については、大阪府立呼吸器・アレルギー医療センターの松本智成博士(感染症センター・センター長(臨床研究部・部長兼任))が保有する200株以上の菌株集を使用する予定なので、さらなる追加収集は行わない。対象株について、半年前から培養をスタートしており、ようやくDNAが抽出できる段階まできている。

当初の予定より解析対象菌株を増やしたため、菌株収集に時間を要している。また、新型シーケンサーのライブラリー調整に使用する予定であった試薬(Nextra DNA sample Prep Kit)を販売していたEpicentre社がillumina社に買収され、illumina社からの本キットの発売が大きく遅れたため、新型シーケンサーのサンプル謂整もそれに伴って遅れている。近日入荷する予定なので、入り次第サンプル調整を行い、シーケンシングを開始する。24年度が最終年度であるため、記入しない。大腸菌026株の解析対象菌株を増やした事以外は、特に大きな変更はない。解析菌株数の増加に対応するために、各解析にかかる費用をできる限り削減するように努める。具体的な1例として、Nexteraによる新型シーケンサーのライブラリー調整を、通常の半量スケールで行い、コストダウンを計る予定である。また、新型シーケンサーのデータ解析については、現在、他のサンプルのデータを使って解析を進めており、解析パイプラインはほぼ完成しており、シーケンシングが終われば、直ちに系統解析を行える準備が整っている。新型シーケンサーの試薬が入荷次第、シーケンシングを行い、全ゲノムに基づいた系統解析、メタ情報との統合解析を遂行する。
免疫学的指標を用いた有害物質曝露の生物学的モニタリングに関する研究

職業性の鉛および有機溶剤曝露の免疫学的影響を評価するため、以下の研究を行ったところ、それぞれにおいて以下に示す知見が得られた。1.毎週3日連続してキレート剤CaEDTAの点滴静注を受けている2人の男子鉛作業者の免疫グロブリン、リンパ球分画および他の鉛関連指標を測定したところ、点滴後に、一人の作業者で、lgG、lgA、lgM、CD8+細胞およびCD57+細胞の有意の増加、もう-人の作業者で、lgDの有意の増加がみられた。また、一人の作業者で、血中鉛濃度とlgGの間に、有意の負相関がみられた。CaEDTAの点滴静注により、抗体産生能等の免疫機能上昇が示唆された。2.ステアリン酸鉛を製造している29人の男子鉛作業者のリンパ球分画を解析したところ、高血中鉛群(血中鉛濃度20μg/dl以上)で、CD16+ナチュラルキラー(NK)細胞数の有意の減少がみられた。また、CD16+細胞数と血中鉛濃度との間に、有意の負相関がみられた。CD16+NK細胞は、リンパ球分画の中で、鉛の影響を受けやすいことが示唆された。3.ステアリン酸鉛を製造している71人の男子鉛作業者のTリンパ球分画を解析したところ、CD3+CD45RO+(メモリーT)細胞数の有意の減少がみられた。また、CD3+CD45+(ナイーヴT)細胞比率と血中鉛濃度との間に、有意の正相関がみられた。CD45RO+メモリーT細胞は、Tリンパ球分画の中で、鉛の影響を安けやすいことが示唆された。4.トルエン曝露を受けている16人の男子グラビア印刷工のリンパ球分画を解析したところ、就業日の終わりに、全てのNK細胞分画細胞数、CD4+CD45RA+細胞数およびCD8+細胞数の減少、B細胞の増加およびそれらと血中トルエン濃度との関連がみられた。これらの細胞数の変化は、トル工ンの影響であることが示唆された。本年度は、鉛作業者のリンパ球サブセットを測定し、鉛曝露のT細胞分画とナチュラルキラー(NK)細胞分画に及ぼす影響を調べた。某化学工場に勤める男子鉛作業者70名(年齢2074歳、血中鉛濃度750μg/dl;喫煙者41名、非喫煙者29名)を対象とした。鉛作業者は鉛曝露の程度により、高血中鉛群40名(血中鉛濃度18μg/dl以上、平均24μg/dl;喫煙者25名、非喫煙者15名)と低血中鉛群30名(血中鉛濃度18μg/dl未満、平均13μg/dl;喫煙者16名、非喫煙者14名)の2群に分けた。被験者の静脈血を採取し、レーザー光線によって励起光を発する蛍光色素florescein isothiocyanate(FITC),phycoerythrin(PE)に各々結合させた抗Leu-18抗体(CD45RA)と抗Leu-3a抗体(CD4)または抗Leu-4抗体(CD3)、抗Leu-7抗体と抗Leu-11抗体とともにインキュベートした後、フローサイトメーターで各分画の細胞百分率を求めた。末梢血中のリンパ球数は自動血球計算機で計算した。

非喫煙者において、高血中鉛群のCD4+CD45RA+およびCD3+CD45RA+リンパ球数が低血中鉛群よりも有意な増加を示し(p<0.05,t検定)、Leu-7(CD57)-,Leu-11(CD16)+細胞数が低血中鉛群よりも有意な減少を示した(p<0.05,t検定)。以上から鉛曝露により、サプレッサー・インデューサーT細胞分画が末梢血中で増加する一方、NK活性が最も強いとされているNK細胞分画が減少することが示唆された。来年度は、喫煙、飲酒をはじめとする生活習慣および職場ストレスが免疫系に及ぼす影響を統計学的に解析するとともに高濃度鉛作業者のキレート剤による治療経過と免疫学的指標の関連を調べる予定である。本年度は、主として鉛作業者、有機溶剤作業者の免疫学的影響を明らかにするために、リンパ球サブセットを測定し、鉛曝露および混合有機溶剤曝露のT細胞分画およびナチュラルキラー(NK)細胞分画に及ぼす影響を調べた。1.毎週キレート剤CaEDTAの点滴静注を受けている2名の男子鉛作業者(61歳および53歳、開始時の血中鉛濃度81および68μg/dl)の点滴前後の血中鉛、免疫学的およびヘム代謝指標等の変動を調べたところ、血中鉛(2名とも)、血漿亜鉛、デルタアミノレブリン酸脱水酵素活性、血色素、ヘマトクリット値、ピリミジン5'-ヌクレオチダーゼ、免疫グロブリン(IgG、IgA、IgM、IgD)、CD8+およびCD16-CD57+リンパ球数(以上1名のみ)に有意差が認められ、点滴静注により抗体産生能等の免疫機能上昇が示唆された。2.化学工場にてステアリン酸鉛の製造に従事している男子鉛作業者71名(平均年齢48歳、平均血中鉛濃度19μg/dl)ではCD3+CD45RA+Tリンパ球数と血中鉛濃度との間に有意な正相関が認められ、鉛曝露によるサプレッサー・インデューサーT細胞分画への影響が示唆された。3.グラビア印刷工場に勤務する男子混合有機溶剤作業者16名(平均年齢37歳)の曝露時は非曝露時に比べ、CD16+CD57-、CD16+CD57+、CD16-CD57+NK細胞数およびCD8+Tリンパ球数の有意な減少とCD19+Bリンパ球数の有意な増加が認められ、NK細胞分画が有機溶剤曝露の短期影響を受けやすいことが示唆された。
ＨＡＣＥＫ群口腔細菌による心臓・血管疾患発症病因機序の解明と予防方策への展開

細菌学的また疫学的研究から口腔細菌は糖尿病をはじめ全身健康、呼吸器や心臓血管疾患との関連が明らかになった。中でもHACEK群細菌は感染性心内膜炎の病因菌として指摘されている。本研究ではA. actinomycetemcomitans(Aa)や口腔内メタン生成Archaeaにおける病原因子候補を調べ、また実際の心内膜炎患者の臨床的、細菌学的な特徴についても調べた。A aの表層エノラーゼやRNAシャペロン蛋白HfqまたArchaeaのgroup IIシャペロニンについて検討した。さらにアミノぺプチダーゼ阻害剤やビタミンK誘導体は新しい治療薬としての可能性を探るためにその抗菌活性について調べた。口腔細菌に起因する歯性感染症の中で重篤な症状となる感染性心内膜炎、心臓弁膜症、冠動脈疾患などの心臓・血管疾患の病態は未だ不明である。本研究では、心臓・血管疾患に密接に関連するHACEK群細菌種の中で申請者らの成果の蓄積があるAggregatibacter actinomycetemcomitans(Aa)を取り上げ、1)Aaの心臓・血管細胞への付着や障害に関わる病原因子の特定、2)Aa感染時における心臓・血管細胞の免疫反応様態の解析、3)Aa感染様態解析のための分子イメージング技術の確立、4)細胞への付着やバイオフィルム形成の新規阻害化合物の探索を目的に研究を行った。そこで23年度は以下のような成果を得て、研究を継続している。1)培養ヒト心臓血管内皮細胞(HMVEC-C)や培養ヒト上皮細胞(HEC)への付着に関わる因子として菌体表層に存在し、レンサ球菌では付着因子として注目されているenolaseをAaについて特定した。2)Helicobacter pyloriで自己免疫反応を介して胃粘膜障害に関わる熱ショック蛋白(HSP)をAaについて特定し、心臓・血管疾患を有する患者血清との反応を調べる準備を整えた。3)大腸菌-Aaのシャトルベクターに緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を導入して蛍光を発するAaを得て、HMVEC-Cへの付着や感染様態を調べている。4)HMVEC-CにAaを作用させ、心臓・血管疾患の発症病態に関わる各種炎症性サイトカイン(IL-1,IL-6,IL-8,TNF-αなど)の発現についてDNAマイクロアレイキットを用いて網羅的に調べている。歯性病巣感染症の中で重篤な症状となる感染性心内膜炎、心臓弁膜症、冠動脈疾患などの心臓・血管疾患の病態は未だ不明である。今年度も24年度、25年度の研究実績を基に1)Aggregatibacter actinomycetemcomitansの表層蛋白のenolaseのリコンビナント蛋白発現系の確立、2)歯周局所のmicro-inflammationの全身健康へ及ぼす影響について研究を進め、研究成果の一部については国内外の学会にて報告した。今年度は心臓・血管疾患の密接に関連するHACEK群細菌種の中で特に珍しいCardiobacterium valvarumを術後弓部大動脈グラフト感染症から見出した。本菌はHACEK groupに属し、2004年に初めて報告された後、これまで世界的に10例の報告があるのみであった。患者は6年前に胸部大動脈瘤に対して弓部大動脈置換術を施行、術直後より中等度の大動脈弁逆流症、歯肉増殖症を認め、3年ほど前には抜歯に伴う歯肉炎に対する治療歴を有する53歳男性。持続する全身倦怠感、食欲不振、体重減少および夜間盗汗を主訴に来院した。受診時、著明な歯肉増殖があり、感染性心内膜炎が疑われ、CT、PET-CTにて弓部大動脈のグラフト周囲に炎症所見を認め、血液培養(増殖が遅く約60時間培養した)からグラム陰性桿菌を認めた。自動同定機器での菌種同定には至らず、最終的に細菌16S rRNA解析によりようやくC. valvarumと同定できた。本菌はおもに感染性心内膜炎を起こすが、症状に乏しく潜行性に進行するため診断時には巨大疣贅を形成していることが多く、弁置換術を要する症例が多い。患者は3年ほど前には抜歯に伴う歯肉炎に対する治療歴を有しており、口腔疾患との関わりが疑われたが、本菌の感染経路や心臓・血管疾患への病原性などの解明には至らず、今後の課題となった。本研究では、心臓・血管疾患に密接に関連するHACEK群細菌種の中で申請者らの成果の蓄積があるAggregatibacter actinomycetemcomitans(Aa)を取り上げ、24年度は以下のような成果を得て、研究を継続している。1)培養ヒト心臓血管内皮細胞(HMVEC-C)や培養ヒト

上皮細胞(HEC)への付着に関わる因子として菌体表層に存在し、レンサ球菌で付着因子として注目されているenolaseをAaについて特定し、リコンビナントタンパク発現系を確立した。心臓・血管疾患を有する患者血清との反応を調べる準備を整えた。またさらにAaにおけるファイブロネクチン結合タンパクを同定して、HMVEC-Cへの付着や感染への関わりについて調べようとしている。2)心臓・血管疾患の発症病態に関わる各種炎症性サイトカイン(IL-1,IL-6,IL-8,TNF-αなど)の発現について、唾液中の8種類のサイトカイン濃度をBio-Plexビーズ・システムを用いて同時に測定した。その結果,歯周病が進行している人ではInteleukin-6濃度が有意に高く,歯肉に炎症がある人では,Inteleukin-1β濃度が高いことが認められ、歯周局所のmicro-inflammationが全身健康にも悪影響を及ぼす可能性を確認できた。3)岡山大学病院を受診した心内膜炎、菌血症の67歳の男性患者の血液培養および口腔内からEnterococcus faecalisを分離して、random amplification of polymorphic DNA法で比較した結果、遺伝子的に同一性を確認できた。これにより口腔感染巣と心内膜炎、菌血症との関連が明らかになった。東日本大震災の影響で、研究費が分割されて支払われたにも関わらず、研究計画書に記載した項目については、研究分担者と協力して概ね進めることができた。GFP蛍光を発するAaについてはアメリカIndiana University School of DentistryのDominique M.Galli博士からの協力も得られた。25年度が最終年度であるため、記入しない。研究計画書に記載した項目については、研究分担者と協力して概ね進めることができた。Aaのゲノム解析データベースからHMVEC-Cへの付着や感染に関わる表層タンパクや病原因子をさらに検索している。Aaに対する抗菌活性が明らかになったnaphthoquinone誘導体やdiol化合物はAaのバイオフィルム形成阻害にも有効であり、現在AaのLPS合成系を阻害することで、Aaの病原性が軽減できるかどうかを検討している。HACEK群細菌種が心臓・血管疾患に関わることは知られているが、実際の心内膜炎や心臓弁膜症の患者からの検査試料における口腔細菌やAaの検出なども合わせて分析できれば意義深いと考えている。倫理上の問題もあるが、そのような患者の歯科診療を担当している当大学病院の医療支援歯科治療部と今後連絡をとって研究を進めてみたい。HACEK群細菌種が心臓・血管疾患に関わることは知られているが、実際の心内膜炎や心臓弁膜症の患者からの検査試料における口腔細菌や特にAaの検出なども合わせて分析できれば意義深いと考えている。そのような患者の歯科診療を担当している当大学病院の医療支援歯科治療部と今後も連絡をとって研究を進めてみたい。
神経特異的Hu蛋白質の機能ドメイン構造の解析

本研究は、神経細胞特異的に発現しており、脳脊髄炎を伴うヒトの自己免疫疾患とも関連するなど興味深い特徴を示し、その細胞内機能が未解明のHu蛋白質の機能ドメイン構造を明らかにすることを目的とし、Hu蛋白質に共通に見られる特徴、すなわちRNA結合ドメインとして3個のRNA recognition motif(RRM)をもつ点に着目し、それぞれのRRMの標的RNA配列を詳細に解析した。マウスHu蛋白質mHuCにさまざまな欠失変異を導入し、変異体蛋白質のRNA結合特異性をUVクロスリンク法などで解析した結果、アミノ末端側の2個のRRM(RRM1およびRRM2)がアデニンとウリジンに富んだ配列(AU-rich配列)に対して特異的に結合することを見出した。この際、RRM2は単独ではRNA結合活性を示さず、RRM1のAU-rich配列への結合を強く促進する機能を担っていることが明らかになった。また、ポリ(A)セファロースを用いた沈降実験から、カルボキシ末端側のRRMはmRNAの3'末端に存在するポリ(A)配列に特異的に結合することを明らかにした。これらのことから、Hu蛋白質はAU-rich配列をもち、かつポリ(A)配列をもつ特異的なmRNAに結合して、それらのmRNAの代謝調節を行っていることが強く示唆された。さらに、酵母two-hybrid systemを用いた解析から、Hu蛋白質間に蛋白質間相互作用があることが示唆された。
キャピラリー電気泳動法における金属・分子錯体の速度論的識別場の解析と高性能化

本研究の目的は,キャピラリー電気泳動による金属錯体やイムノコンプレックスなどの分子錯体に対する新たな分離機能と検出機能の創発にある.3カ年の研究課題を大きく以下の3点に絞り,それぞれにフロンティアを形成しうる成果を上げた.(1)新しいCEイオン分離モード・システムの開発:(1-1)アニオンのCE高度分離を目指し,溶液内のイオン-イオン相互作用をイオン泳動制御パラメータとして駆使するCE分離システムとしてカチオン性高分子電解質を加えることを着想し,その有用性を検証した.(1-2)イオン会合CEシステムにおけるイオン泳動制御パラメータとして,尿素などの疎水的水和破壊剤の添加を着想し,イオン会合現象の溶液化学的基礎となるイオン泳動データと同時に,新たな分離システム構築の萌芽となる結果を得ている.(1-3)ポリマーゲルやセルロースを用いる分子ふるいモードCEによる天然フミン酸・フルボ酸の分離とピークパターン識別化を提案し,水環境の評価技術に寄与する成果を得た.(2) CE精密分離場を最大限に利用しうるイオン識別・キラル識別機能分子の開発:(2-1)フェノール4分子を硫黄原子で環状に架橋したチアカリックスアレーンを基体とし,アルカリ金属から遷移金属に至る多くカチオンに対応する多様なKD-CE適合性試薬を合成できることを見いだした.(2-2)チアカリックスアレーンの架橋硫黄のスルホキシドおよびスルホンへの選択的酸化反応を開発した.前項の成果とも合わせ、カリックスアレーン類の新たな金属イオン選択性創出に成功した.(2-3)キャピラリー内壁の不斉修飾剤として機能する軸不斉1,1-ビナフタレン類として,4-位に長鎖カルボキシル基を有する1,1-ビナフタレン類の高効率的不斉合成に成功した.(3) CE-金属イオン分離に適合する配位子の計算機化学的な分子設計アプローチの方法確立:(3-1)配位子の分子設計および溶媒の効果を有限温度、圧力で扱うことを目的に,密度汎関数法,分子動力学法,モンテカルロ法,バーチャルリアリティなどを活用する統合コンピュータ化学システムを構築した.(3-2)密度汎関数法,分子動力学法,コンピュータグラフィックスを活用し、種々の金属錯体の構造と配位子の種類・置換基効果との関連を検討して,分子認識能設計の指針を原子レベルで解明する手法を提案した.(3-3)錯体の構造ダイナミックスと電子状態を有限温度条件下で高速計算することが可能な粗視化量子分子動力学計算プログラムを開発し,その有用性を検証した.本研究の目的は,キャピラリー電気泳動による金属錯体やイムノコンプレックスなどの分子錯体に対する新たな分離機能と検出機能の創発にある.3カ年の研究課題を大きく以下の3点に絞り,それぞれにフロンティアを形成しうる成果を上げた.(1)新しいCEイオン分離モード・システムの開発:(1-1)アニオンのCE高度分離を目指し,溶液内のイオン-イオン相互作用をイオン泳動制御パラメータとして駆使するCE分離システムとしてカチオン性高分子電解質を加えることを着想し,その有用性を検証した.(1-2)イオン会合CEシステムにおけるイオン泳動制御パラメータとして,尿素などの疎水的水和破壊剤の添加を着想し,イオン会合現象の溶液化学的基礎となるイオン泳動データと同時に,新たな分離システム構築の萌芽となる結果を得ている.(1-3)ポリマーゲルやセルロースを用いる分子ふるいモードCEによる天然フミン酸・フルボ酸の分離とピークパターン識別化を提案し,水環境の評価技術に寄与する成果を得た.(2) CE精密分離場を最大限に利用しうるイオン識別・キラル識別機能分子の開発:(2-1)フェノール4分子を硫黄原子で環状に架橋したチアカリックスアレーンを基体とし,アルカリ金属から遷移金属に至る多くカチオンに対応する多様なKD-CE適合性試薬を合成できることを見いだした.(2-2)チアカリックスアレーンの架橋硫黄のスルホキシドおよびスルホンへの選択的酸化反応を開発した.前項の成果とも合わせ、カリックスアレーン類の新たな金属イオン選択性創出に成功した.(2-3)キャピラリー内壁の不斉修飾剤として機能する軸不斉1,1-ビナフタレン類として,4-位に長鎖カルボキシル基を有する1,1-ビナフタレン類の高効率的不斉合成に成功した.(3) CE-金属イオン分離に適合する配位子の計算機化学的な分子設計アプローチの方法確立:(3-1)配位子の分子設計および溶媒の効果を有限温度、圧力で扱うことを目的に,密度汎関数法,分子動力学法,モンテカルロ法,バーチャルリアリティなどを活用する統合コンピュータ化学システムを構築した.(3-2)密度汎関数法,分子動力学法,コンピュータグラフィックスを活用し、種々の金属錯体の構造と配位子の種類・置換基効果との関連を検討して,分子認識能設計の指針を原子レベルで解明する手法を提案した.(3-3)錯体の構造ダイナミックスと電子状態を有限温度条件下で高速計算することが可能な粗視化量子分子動力学計算プログラムを開発し,その有用性を検証した.本研究の目的は,キャピラリー電気泳動による金属錯体やイムノコンプレックスなどの分子錯体に対する新たな分離機能と検出機能の創発にある.本年度は(1)新しいCE分離モード・システムの開発,(2)CE分離場を意識した不斉識別機能分子の開発,(3)CE-金属イオン分離に適合する配位子の分子設計アプローチの方法確立,の3点を重点的に検討した.

(1)アニオン性金属錯体のCE分離検出に際して,同荷電を有するものに対する分解能を格段に向上させる方法として,キャリア溶液中にカチオン性高分子電解質を加えるころを着想し,ポリアミノカルボン酸(EDTA,Quin2)錯体をモデルとしてその有効性を実証した.本法は溶液内のイオン-イオン相互作用を駆使するCE分離システムであって,イオン会合体と並ぶ精密なイオン泳動制御モードを提供するものとして高く評価される.(2)エステル基を活性基とする芳香族新規求核置換反応を利用し,光学活性ジオキサナフタレンを出発原料とし,4-位の長鎖カルボン酸置換基を有する軸不斉1,1-ビナフタレン類の高効率的不斉合成に成功した.これらのビナフタレン類は高度な分子不斉認識機能を備えた配位子となるばかりではなく,長鎖カルボン酸基を利用して,キャピラリー内壁の不斉修飾剤となることが期待される.(3)密度汎関数法,分子動力学法,モンテカルロ法,バーチャルリアリティなどを活用するKD-HPCE適合する配位子の分子設計のための統合コンピュータ化学システムを構築した.特に,錯体周りの配位子に加え,溶媒の効果を有限温度,圧力で扱うことのできるシステムは今後の発展への期待の大きい成果である.本研究の目的は,キャピラリー電気泳動による金属錯体やイムノコンプレックスなどの分子錯体に対する新たな分離機能と検出機能の創発にある.本年度は昨年度にひきつづき,(1)新しいCE分離モード・システムの開発,(2)CE分離場を意識した不斉識別機能分子の開発,(3)CE-金属イオン分離に適合する配位子の分子設計アプローチの方法確立,の3点を重点的に検討するとともに,環境化学分野への適用の一環として,水中フミン質のキャラクタリゼーション法としてのCEシステムの評価を行った.(1)昨年度は,溶液内のイオン-イオン相互作用を駆使するCE分離システムとしてキャリア溶液中にカチオン性高分子電解質を加える方法を着想し,ポリアミノカルボン酸(EDTA,Quin2)錯体を精密分離することに成功した.本年度はこの手法を拡張して,高感度錯体システム(例えば4-(2-ピリジルアゾ)レソルシノール錯体)と一般的無機イオンの同時分離検出法を開発した.(2)フェノール4分子を硫黄原子で環状に架橋した新しい型の配位子,チアカリックスアレーンの簡便な合成法を確立した.チアカリックスアレーンはO,S,O原子で遷移金属に配位することを見いだし,KD-CE適合試薬として機能することが期待される.また,OH基に,エトキシカルボニルメチル基やカルボキシメチル基を導入し,それぞれアルカリ金属,遷移金属の有力な配位子としての機能させることに成功した.一方,芳香族求核置換反応を開発し,フェノールのO原子をNに置き換えることに成功した.以上のようにチアカリックスアレーンを基体とし,多様なKD-CE適合性試薬を合成できることを見いだした。(3)密度汎関数法,分子動力学法,コンピュータグラフィックスを活用することにより,種々の金属錯体について,配位子の置換位置、配位子の種類がその構造に与える影響を解明するとともに,その分子認識機能をどのように変化させるかを原子レベルで明らかにした.
両生類の受精における精子依存性の電気的反応の解析

無尾両生類(ヒキガエル)と有尾両生類(イモリ)における,正常受精時にみられる卵細胞膜のイオン透過性の変化を,イオン置換法,イオンチャネル阻害剤,および膜電位固定法によって詳しく調べた.カエル卵では以前までに観察されていた受精電位発生の前に,新しいスパイク様の電位が最初に発生することが明らかとなった.このスパイク電位は,受精電位と同様に, ClやIなどのハロゲンイオンの透過性の増加により生じることがわかった.さらに,未成熟卵での多精受精時にも卵への侵入精子数によく対応した同様のスパイク電位がみられることから,この電位は精子に依存した反応であると考えられる.一方,イモリ卵では受精時に大きな電位変化は認められないが,やはり精子の侵入によく対応した過分極電位がみられた.この電位に関与するイオンチャネルはまだ明らかにできていない.しかし,今回の研究から両生類卵の受精時には共通して精子依存性の電気的反応があることが明らかとなった.ヒキガエル卵とイモリ精子との交雑受精時には,スパイク様電位はなく,正常受精時にはみられない過分極電位がみられた.これは主としてNaイオンのような1価の陽イオンの透過性の増加によっていることが明らかとなった.イモリ卵とヒキガエル精子との交雑受精が可能となる条件をみつけることはできなかったが,イモリ卵とカスミサンショウウオ精子との交雑受精が可能であることを発見した.このとき,イモリ卵では侵入精子に対応した小さな脱分極電位がみられた.このように,カエル卵のイモリ卵の両方において,それらに侵入する精子の種類によって,全く異なるイオンチャネルが開放されることが明らかとなった.これらのイオンチャネルが精子細胞膜に依存し,受精時の膜融合により卵細胞膜にもたらされている可能性が大きい.無尾両生類(ヒキガエル)と有尾両生類(イモリ)における,正常受精時にみられる卵細胞膜のイオン透過性の変化を,イオン置換法,イオンチャネル阻害剤,および膜電位固定法によって詳しく調べた.カエル卵では以前までに観察されていた受精電位発生の前に,新しいスパイク様の電位が最初に発生することが明らかとなった.このスパイク電位は,受精電位と同様に, ClやIなどのハロゲンイオンの透過性の増加により生じることがわかった.さらに,未成熟卵での多精受精時にも卵への侵入精子数によく対応した同様のスパイク電位がみられることから,この電位は精子に依存した反応であると考えられる.一方,イモリ卵では受精時に大きな電位変化は認められないが,やはり精子の侵入によく対応した過分極電位がみられた.この電位に関与するイオンチャネルはまだ明らかにできていない.しかし,今回の研究から両生類卵の受精時には共通して精子依存性の電気的反応があることが明らかとなった.ヒキガエル卵とイモリ精子との交雑受精時には,スパイク様電位はなく,正常受精時にはみられない過分極電位がみられた.これは主としてNaイオンのような1価の陽イオンの透過性の増加によっていることが明らかとなった.イモリ卵とヒキガエル精子との交雑受精が可能となる条件をみつけることはできなかったが,イモリ卵とカスミサンショウウオ精子との交雑受精が可能であることを発見した.このとき,イモリ卵では侵入精子に対応した小さな脱分極電位がみられた.このように,カエル卵のイモリ卵の両方において,それらに侵入する精子の種類によって,全く異なるイオンチャネルが開放されることが明らかとなった.これらのイオンチャネルが精子細胞膜に依存し,受精時の膜融合により卵細胞膜にもたらされている可能性が大きい.本年度中は、研究計画にそって、無尾両生類(カエル)と有尾両生類(イモリ)における、正常受精と交雑受精にみられる卵のイオン透過性の変化を主として、イオン置換法とイオンチャンネル阻害剤を用いて検討した。カエル卵では、成熟卵において以前まで観察されていた受精電位の発生の前に、新らしいスパイク様の電位が最初に認められた。このスパイク電位は、受精電位と同様に、【Cl^-】や【1^-】のようなハロゲンイオンの卵細胞膜透過性の増加により生じることが外液のイオン置換により明らかになった。さらに、未成熟卵においてみられる多精受精時には、同様の性質をもつスパイク電位が、卵への進入精子数によく一致してみられた。これは、この電位の発生が精子に依存した反応である可能性が大きい。また、カエル卵とイモリ精子の友雑受精時には、このようなスパイク様の電位は、全く観察されなかった。それとは反対に、ゆっくりとした過分極様の電位が、受精電位の発生の前に認められた。これは、ハロゲンイオンのような負イオンによっているものではなく、【Na^+】のような正のイオンの卵細胞膜透過性の増大によっていることが明らかになった。これも精子依存性の反応であることを強く示唆している。最近になり、これら以外に注目すべき実験結果を得ることができた。その1つは、成熟卵の受精電位の発生が、ハロゲンイオンチャンネル阻害剤であるDIDSやSITSにより完全に阻害されることが明らかになり、精子自身の電位反応と区別して検討することが可能となった。第二には、イモリ精子からカエル卵を付活し、受精電位を誘起する物質の単離し、バイオアッセイする系を確立することができた。これは、精子が卵付活と受精電位を発生する機構を物質レベルで解明するための糸口となると思われ、現在、これらの反応を、イオン電流変化の解析により詳細に知らべるため、膜電位固定法を用いて実験を継続している。
テンダーＸ線分光によるオペランド電子状態分析技術の実用化研究

薄膜デバイスにおいて機能性を担う「埋もれた層」の化学結合状態を動作環境下で非破壊分析するためのオペランド電子状態分析技術を実用化し、デバイスの機能性や劣化等のメカニズムの学理を解明する。これを実現するために、申請者が従前開発した非周期多層膜回折格子による広帯域テンダーX線分光技術の高度化を図る。