hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
酵素合成法を用いた Treg 分化誘導能を有するポリフェノール配糖体の創製

アレルギー疾患は、国民の約3割が罹患する国民病であり、現在も増加の一途を辿っている。本研究では、アレルギー疾患の根治的治療につながる免疫寛容誘導剤の開発を目的とし、Treg分化誘導能を有するポリフェノール配糖体の創製を酵素合成法により試みた。その結果、新規に合成したポリフェノール配糖体は樹状細胞の抗原提示能を抑制する働きが認められた。Treg分化誘導能については顕著な効果が得られなかったが、ポリフェノール配糖体の抗アレルギー作用に関する重要な知見が得られた。本研究では,抗原特異的に免疫寛容を誘導する新規免疫調節剤の開発を目的として,酵素合成法によるTreg分化誘導能を有するポリフェノール配糖体の合成を試みた。得られた成果は以下のとおりである:1.酵素合成法により5種類のポリフェノール配糖体(カテキン,バニリン酸,シナピン酸,フェルラ酸,カフェ酸)を合成した。上記ポリフェノール配糖体の分子量はFAB-MSにより決定し,さらにNMR分析により構造解析(糖の結合位置を含む)を行った。なお,ポリフェノール配糖体合成における糖転移反応の至適条件は,50°C,pH 5.0,250ukatであり,加水分解反応の至適条件とは異なることが明らかになった。2.樹状細胞様THP-1を用いたin vitroアッセイ系により,上記ポリフェノール配糖体の免疫寛容誘導作用および免疫調節機能について検討した。Treg分化誘導に関するIL-10産生量とレチノイン酸合成酵素RALDH2のmRNAレベルを測定したが,顕著な変化は認められなかった。一方,卵白主要アレルゲンOVA刺激下において,樹状細胞様THP-1のMHCクラスII分子のHLA-DRと補助刺激分子CD86の発現量は,ポリフェノール配糖体の添加により有意に低下した。以上の結果は,酵素合成法により合成したポリフェノール配糖体が樹状細胞における免疫調節機能を有し,アレルギー疾患予防への利用が期待できる新たな化合物であることを示唆するものである。本研究では,アレルギー疾患の根治的治療につながる免疫寛容誘導剤の開発を目的として,Treg分化誘導能を有するポリフェノール配糖体の創製を試みた。得られた成果は次の通りである:1.酵素合成法により新規ポリフェノール配糖体を合成し,HPLCにより分離精製した。加水分解反応の逆反応を利用して,フェノール性化合物に糖鎖を付加させた。その結果,シナピン酸,カフェ酸,バニリン酸,フェルラ酸,カテキンを骨格とした新規配糖体を得ることができた。これらの構造はNMRおよび質量分析により確認した。これらの配糖体については,脾臓細胞のインターフェロンγ産生能が糖鎖導入により上昇することが示された。2.樹状細胞様THP-1を用いたin vitroアッセイ系を用いて,免疫寛容誘導能を有する免疫制御因子のスクリーニングをおこなった。樹状細胞様THP-1上のHLA-DR(MHCクラスII抗原)の発現量はOVA刺激により著しく上昇した。このときの抗原提示能を指標として,抗原提示抑制作用を有する免疫制御因子のスクリーニングを行なった。その結果,カテキン,カテキン重合体(プロシアニジン),さらにはグルコマンナンやカラギーナンなど数種の糖類において,OVAに対して顕著な抗原提示抑制作用が示された。現在,Treg分化誘導に及ぼす影響を明らかにするため,IL-10産生能とレチノイン酸合成酵素RALDH2の発現レベルについて検討している。樹状細胞様THP-1を用いたin vitroアッセイ系によるスクリーニングは,順調に進行している。また,酵素反応の逆反応を利用したポリフェノール配糖体についても,すでに5種類の合成を終えている。今後は,同スクリーニングにより効果の高いものを選出し,アレルギーモデルマウスによる動物実験を実施することで,その効果を実証していく。以上の進捗状況から,本研究はおおむね順調に進展していると評価した。樹状細胞様THP-1を用いたin vitroアッセイ系により,様々な抗原による抗原結合型ポリフェノール配糖体の免疫寛容誘導能を評価する。効果が高かったものについては,卵白OVAを経口摂取することによって食品アレルギー様の免疫応答を誘発するモデルマウスを用いて,経口摂取への影響を検討する。血清中のIgE量,ヒスタミン量をELISA法で測定し評価するとともに,CD4+Foxp3+細胞(=Treg)分化誘導作用を検討する。次年度の研究費の使用計画は以下の通りである。1.マウスを用いた動物実験を実施するため,実験動物とその飼育に必要な消耗品を購入する。2.細胞実験を実施するため,細胞培養に必要な消耗品を購入する。3.遺伝子発現の定量解析のため,分子生物学試薬や消耗品を購入する。4.サイトカイン,抗体,およびヒスタミンなどをELISA法で定量するため,各種抗体や試薬類を購入する。5.抗原結合型ポリフェノール配糖体の作製および分離精製に必要な試薬類を購入する。
レベル依存型のブロック構造を持つマルコフ連鎖の数値計算法

「レベル依存型のブロック構造を持つマルコフ連鎖」は、近年、待ち行列分野の応用で多く利用価値が見出されている。このマルコフ連鎖を用いて性能評価を行う際には、システムの状態確率(定常分布)を得る必要がある。しかしながら、マルコフ連鎖のブロックがレベル依存してしまうことにより、全体の構造が複雑になり、定常分布を解析的に陽な表現で得ることは困難である。ゆえに、多くの応用では計算アルゴリズムを用いて数値的に定常分布を求め、それを用いて性能評価が行われる。しかしながら、近年提案されたものも含めた数値計算アルゴリズムにおいて、レベル数が有限でない場合に有限に打ち切ることが必要となるが、その基準が明確でなく精度保証の理論的裏付けが存在しない。ゆえに、本研究では上記の問題を考慮した定常分布の計算アルゴリズムの提案を行う。2018年度は、「レベル依存型のブロック構造を持つマルコフ連鎖」の応用例として、マルチメディア通信ネットワークのモデル化に着手し、既存のアルゴリズムで数値計算を実施した場合の計算速度およびその精度の検証を行った。わかったこととして、既存のアルゴリズムでは計算時間・精度の保証が難しいことが再確認できたため、アルゴリズムの改善を考える必要性が生じた。本研究は、レベル依存型のブロック構造を持つマルコフ連鎖に対して1つの見解が得られた意味で有効であったと考えている。本結果については、すでに信号処理関係の査読付き国際会議にて発表済みである。2018年度中に数値計算アルゴリズムにおける制度保証について十分な検討が行えなかったため、早急に取り掛かる必要がある。一方で、「レベル依存型のブロック構造を持つマルコフ連鎖」の応用例とその特性については十分な見解が得られたことは評価できる。2018年度に十分実施できなかった、数値計算アルゴリズムにおける制度保証について研究を進めていく。必要に応じて、数値的・解析的評価を行い、結果をまとめることを考えている。あわせて、「レベル依存型のブロック構造を持つマルコフ連鎖」の実問題への利用拡張を検討する。生産システムや情報通信システムでの応用例を考え、そのモデル化・数値計算を実施し、モデルの特性を観測する。2018年度に予定していた本課題に関する一部の実験を見送ったため、それに関する諸経費が余ってしまったことが原因である。上記の実験は、2019年度に実施することを考えており、そこで使用額を調整することとする。
フォトレドックス触媒作用による反応性含フッ素化学種の創製とその高度活用

有機フッ素化合物は、医農薬や有機機能性材料の分野で有用である。本申請者は、フォトレドックス触媒作用として認知されるようになってきた金属錯体や有機色素の可視光誘起電子移動反応を基盤に、適切なフルオロメチル化剤を設計・開発することで、汎用性の高いラジカル的フルオロメチル化反応を報告してきた。本研究では、フォトレドックス触媒作用を基軸に、前例のないフルオロメチル基導入法を開発し、高機能性有機フッ素化合物の創製に挑戦している。本年度は、1アルケン類のケトージフルオロメチル化反応を開発した。また、2高い還元力を有する新しい有機分子光触媒の開発にも成功し、アルケン類のモノフルオロメチル化反応を実現した。1では、フロー光反応装置を用いることでαージフルオロメチルケトン類を高い効率で合成する手法を確立した。得られたケトン類を生物活性が期待される光学活性アルコールや、αーハロケトン類、シアノヒドリン誘導体などに変換することにも成功した。新しい含ジフルオロメチル化合物への誘導法を開発した。2では、これまで報告例のなかったアルケン類から一段階でγーフルオロアルコールを得る方法を開発した。本手法は、高い還元力を発現する光触媒が必須であった。ジアミノナフタレン骨格を有する新しい触媒設計指針を得ることができ、今後、さらに高い還元作用を有する触媒の創製も可能になった。これらの成果は学会発表し、投稿論文としてまとめた。目的としていた新しい光触媒的モノフルオロメチル化反応を開発することができた。適切に設計されたモノフルオロメチル化試薬と有機分子光触媒が本反応を実現するためには必要であった。現在までに得られた成果は、今後、より高い反応性のフルオロメチル化剤や高性能な光触媒を創製するうえで重要な知見である。また、光フロー反応系により含フッ素化合物のグラムスケール合成が可能になった。得られる含フッ素生成物の機能調査を効率的に行うことが期待される。本研究は、当初の計画以上に進展している。本年度、確立した光触媒的フローシステムを用いれば、触媒反応によって含フッ素生成物をより効率よく得ることが期待される。これによって、含フッ素生成物の機能評価を行うことが容易になる。最終年度は、新規含フッ素化合物の合成だけでなく、新機能の開拓にも取り組む。有機フッ素化合物は医農薬や機能性材料を設計する際に重要な化合物である。本申請者はこれまでにフォトレドックス触媒作用として一般に認知されるようになってきた可視光を駆動力とする一電子移動反応が、トリフルオロメチル化反応の強力な合成ツールとなることを明らかにしてきた。本研究ではフォトレドックス触媒作用を基盤とした前例のないジフルオロメチル化反応及び、立体選択的なフルオロメチル化反応を開発し、高機能性有機フッ素化合物の創製に挑戦する。平成28年度は、1新型ジフルオロメチル化試薬の開発及びその反応性調査と2アレンの立体選択的トリフルオロメチル化反応の開発におもに取り組んだ。1スルホニウム塩型のジフルオロメチル化剤は、一般に不安定で求電子的なジフルオロメチル化剤やジフルオロメチルラジカル源として十分に研究されてこなかった。本申請者は、分子設計を適切に行うことで安定性と反応性をバランスよく有するジフルオロメチルスルホニウム塩を合成することに成功した。開発したジフルオロメチル化試薬とペリレンを光触媒として用いると効率よくアルケン類のアミノージフルオロメチル化反応が進行することを見出した。2アレンに対して、本申請者らが開発した光触媒的オキシートリフルオロメチル化反応を適用したところ、酸素源として酢酸を用いると立体選択的二官能基化反応が進行し、四置換アルケン骨格を有するCF3基含有アリルアセテートが得られることを見出した。本生成物は、多様な含フッ素有機化合物へと誘導できる原料となることもわかった。以上の知見は、今後の光触媒の設計や反応設計に指針を与える重要なものであった。新しいジフルオロメチル化剤の開発に成功し、さらにこれまでは貴金属光触媒を用いていた反応が多環芳香族分子であるペリレンを光触媒とすることで進行することが分かった。今後、触媒開発を進めるうえで新しい触媒設計の指針が得られた。またアレンの立体選択的オキシートリフルオロメチル化反応も開発することができ、おおむね研究は順調に進んでいる。一方で、生成物である有機フッ素化合物の機能開拓は現在のところ進んでおらず、今後の課題となっている。有機フッ素化合物は、医農薬や有機機能性材料の分野で有用な化合物である。本申請者は、フォトレドックス触媒作用として認知されるようになってきた金属錯体や有機色素の可視光誘起電子移動反応を基盤に、ラジカル的トリフルオロメチル化反応やジフルオロメチル化反応を開発し報告してきた。本研究では、フォトレドックス触媒作用を基軸に前例のないフルオロメチル基導入法を開発し、高機能性有機フッ素化合物の創製に挑戦する。本年度は、1不斉フルオロメチル化反応に資する有機光触媒及び光触媒システムの開発に取り組んだ。また、2フルオロカルボン酸類をフルオロアルキルラジカル源とする光触媒システムの開発にも取り組んだ。1では、芳香環に電子ドナー部位を組み込んだ新しい有機光触媒を開発し、これまで貴金属光触媒で実施していた反応の置き換えが可能であることを明らかにした。この成果は、元素戦略に立脚したグリーンケミストリーの観点から意義深いと考える。

また、キラルなフルオロメチル化剤の光学分割に成功し、不斉フルオロメチル化に資する重要な知見を得た。今後、光学分割した試薬を用いた光触媒的不斉フルオロメチル化反応を検討する。2では超原子価ヨウ素試薬を用いることで2,2-ジフルオロ-2-フェニル酢酸から光触媒的にフェニルジフルオロメチルラジカル種を発生できることを見出した。今後、他のフルオロアルキルカルボン酸類を用いた反応に展開するうえで重要な結果であった。新しい有機光触媒を開発し、不斉反応への足がかりも見つけることができた。安価で入手容易なフルオロカルボン酸類を用いた反応への展開も期待できる光触媒システムも見出した。これらは、本研究が立案した計画通り進んだ結果得られた成果である。これらに加えて、これまで合成した有機フッ素化合物の農薬試験を行い、新しい分子及び反応設計の指針を得た。機能性有機フッ素化合物創製につながると期待でき、本研究が計画以上に進展していると考えている。有機フッ素化合物は、医農薬や有機機能性材料の分野で有用である。本申請者は、フォトレドックス触媒作用として認知されるようになってきた金属錯体や有機色素の可視光誘起電子移動反応を基盤に、適切なフルオロメチル化剤を設計・開発することで、汎用性の高いラジカル的フルオロメチル化反応を報告してきた。本研究では、フォトレドックス触媒作用を基軸に、前例のないフルオロメチル基導入法を開発し、高機能性有機フッ素化合物の創製に挑戦している。本年度は、1アルケン類のケトージフルオロメチル化反応を開発した。また、2高い還元力を有する新しい有機分子光触媒の開発にも成功し、アルケン類のモノフルオロメチル化反応を実現した。1では、フロー光反応装置を用いることでαージフルオロメチルケトン類を高い効率で合成する手法を確立した。得られたケトン類を生物活性が期待される光学活性アルコールや、αーハロケトン類、シアノヒドリン誘導体などに変換することにも成功した。新しい含ジフルオロメチル化合物への誘導法を開発した。2では、これまで報告例のなかったアルケン類から一段階でγーフルオロアルコールを得る方法を開発した。本手法は、高い還元力を発現する光触媒が必須であった。ジアミノナフタレン骨格を有する新しい触媒設計指針を得ることができ、今後、さらに高い還元作用を有する触媒の創製も可能になった。これらの成果は学会発表し、投稿論文としてまとめた。目的としていた新しい光触媒的モノフルオロメチル化反応を開発することができた。適切に設計されたモノフルオロメチル化試薬と有機分子光触媒が本反応を実現するためには必要であった。現在までに得られた成果は、今後、より高い反応性のフルオロメチル化剤や高性能な光触媒を創製するうえで重要な知見である。また、光フロー反応系により含フッ素化合物のグラムスケール合成が可能になった。得られる含フッ素生成物の機能調査を効率的に行うことが期待される。研究はおおむね順調に進んでいる。とくに当初予想していなかった多環芳香族分子のフォトレドックス触媒作用が反応に有効であることを見出した。今後は得られた知見をさらに発展させ、新型有機光触媒の開発にも取り組んでいく。
国際刑事実体法の体系的整理―管轄権・手続法的視点から

本研究は、近年の国際刑事法を取り巻く現状を反映した、国際刑事管轄権・手続法的関心に基づく国際刑事実体法の体系的整理を目的としてきた。前年度の研究成果から、適用される手続法の特定における混乱を取り除くには、中核犯罪とその他の国際犯罪の分類と手続法が対応していないことを明らかにするだけでなく、中核犯罪とその他の国際犯罪の分類の真の意義を明らかにすることが必要であることが明らかとなった。平成30年度開始時点での仮説は、中核犯罪概念の意義は管轄権や手続法的な法的帰結ではなく、中核犯罪が国際共同体にとって特別な犯罪であるという理念上のものであるというものである。平成30年度のアプローチは、この仮説について検証するものとし、世界的なプロジェクトとしての中核犯罪訴追(国際刑事司法)と、それを実現するための国際刑事手続法という概念について検証してきた。そのアプローチとして、中核犯罪訴追が世界的なプロジェクトとして発展してきた規範的背景からは、国際刑事手続法の体系性と、国際法から区別される独自性について考察する必要性が生じた。本年度の研究実績として、上記の課題に関連する諸論点に関し、英語報告3回、日本語論文2本(うち1本査読付き)によって研究成果を発表した上、書籍として3年半の研究の集大成をまとめ、原稿を完成させた。上記の研究結果を公表するにあたり、書籍の出版は研究期間満了後1年以上経過してからとなる。今後の研究の展望として、第一に、上記の研究結果の公表を、日本語の書籍として予定通り行うとともに、主要な理論的諸発見について英語のトップジャーナルに論文の形で掲載することを目指す。また、国際法の近年の様々な分野における発展の在り方を説明する一般理論の形成につなげていきたい。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究は、国際刑事法の対象犯罪の訴追に関する管轄権や手続法における混乱の問題の解決という視点から、近年の国際刑事法を取り巻く現状を反映した、国際刑事管轄権・手続法的関心に基づく国際刑事実体法の体系的整理を目的とするものである。1年目である本年度においては、研究課題の法的背景と検討の法枠組みの要素を明らかにするため、具体的場面で国際刑事法における実体的法益が、管轄権と手続の両面においていかに影響するかという前提的考察を行うことを予定した。具体的には、本研究が前提とする、刑事実体法における国際法及び国内法の双方向からの統合現象が招来した国際刑事法が対象とする犯罪の訴追に関する管轄権や手続法における法的混乱の状況について、より具体的にいかなる混乱状態があり、いかなる法的論点があげられるかについての検討である。そのため、1年目には、具体的な研究課題を、管轄権(I.A.)と手続(I.B.)の場面という2つに分け、さらに各課題につき、小課題を各3つあげた。今年度の実施計画として、必要な研究資料の収集、国内外の学会における発表及び、研究者間の交流を深め、将来へつながる人脈を作るとともに、彼等との意見交換を通じて研究の主題に対する理解を深めることをあげた。上記の実施計画に従い、すべての小課題について個別に研究を行い、すべてについて研究発表を行うことができた。また、2年目の研究計画である研究課題II(国際刑事法における法益論と国際法における法益論の関係)についても個別論点について検討した。本年度中に、1年目の研究課題として挙げた上記6つの小課題のすべてにつき、以下の通り研究業績の発表を行った。1そもそも管轄権が行使できるかという管轄権の有無(小課題I.A.1)については、『ICD Brief』に英語で論文を提出し、査読の上掲載された。2どの司法権の管轄権行使が優先されるかという優先関係(小課題I.A.2)については、香港中文大学での国際セミナーにおいて口頭発表(英語)を行った。3国内裁判所での裁判を想定した刑事手続きの場面(小課題I.B.1)に関連して、北京大学で行われた国際セミナーにおいて、口頭発表(英語)を行った。4いずれかの司法権で裁判が実施された場合、別の司法権での後訴が許容されるかの一事不再理(小課題I.A.3)、他国への引渡しが要請されている場面(小課題I.B.2)、及び国際的な刑事裁判所への協力が要請されている場面(小課題I.B.3)に関連する論点については、京都大学で行われた国際セミナーにおいて口頭発表(英語)を行った。また、2年目の研究課題IIについては、研究結果について国際人権法学会での口頭発表及び『国際公共政策研究』への原稿寄稿を行った。以上の理由から、1年目の研究計画はおおむね順調に進展していると言える。本研究は、近年の国際刑事法を取り巻く現状を反映した、国際刑事管轄権・手続法的関心に基づく国際刑事実体法の体系的整理を目的とする。2年目である本年は、1年目に行った、いかなる場面で「国際(中核)犯罪」という既存の犯罪類型の曖昧性が問題となっているかに関する研究を土台として、それらが各場面において、どのように、なぜ問題となっているのかについての研究を進化させることを目標とした。そのため、「国際(中核)犯罪」という犯罪類型が有する意味を実践的意味と実体的意味に分類するアプローチを提示した。そして、2年目の研究課題としていた研究課題II(国際刑事法における法益論と国際法における法益論の関係)は上記の研究目標の中に取り込むかたちに研究計画の修正を行った。

実践的意味については、国際裁判所の管轄犯罪、普遍的管轄権の対象、訴追義務及び引渡義務、恩赦の例外、一事不再理の例外、刑事裁判権免除の例外、国内での犯罪化の無関係という諸場面に分類し、問題を整理した。また、3年目の研究計画としていた研究課題III(国際刑事実体法における保護法益)については、「国際(中核)犯罪」という犯罪類型が有する実体的意味として位置づけ、引き続き情報収集を行った。特に、これまで収集した情報を基に、「国際(中核)犯罪」という犯罪類型が有する実体的意味に関する諸仮説を提示し、3年目の研究枠組みを示した。また、「国際(中核)犯罪」という分類を提案し定着させた国際法委員会(ILC)の活動を歴史的に再検討することを通じて、いかなる議論を通じて「国際(中核)犯罪」という類型が確立されたのかについて明らかにした。本年の研究課題である「国際(中核)犯罪」という犯罪類型が有する意味を実践的意味と実質的意味に整理するものとして、京都大学で行われた国際セミナーで口頭報告を行った。実践的意味に関する諸論点については、以下の研究成果をあげている。国際裁判所の管轄犯罪に関連して、『Criteria for Prioritizing and Selecting Core International Crimes Cases』と題する書籍に英語論文の掲載が決定した。恩赦の例外の問題との関連では、ロンドン・ウェストミンスター大学で開催された国際会議において口頭報告を行った。一事不再理の例外については、日本刑法学会関西部会夏期例会において口頭報告を行った。また、学術雑誌『ノモス』に査読の上論文が掲載された。実体的意味に関する諸論点については以下のような進捗が挙げられる。3年目の研究課題III(国際刑事実体法における保護法益)について、「国際(中核)犯罪」という犯罪類型が有する実体的意味として位置づけ、ブカレストでの国際刑法協会研究大会やニューヨークでのアメリカ国際法学会、ハーグでの国際弁護士協会研究大会等に参加して情報収集を行った。また特に、京都大学で行われた国際セミナーでは、これまで収集した情報を基に、3年目の研究枠組みを示した。さらに、「国際(中核)犯罪」という分類の歴史的背景に関連し、『Historical Origins of International Criminal Law: Volume 5』という書籍において英語論文が掲載予定である。2年目の課題としていた諸論点に加え、3年目の研究計画に資する情報の収集、及び関連業績の発表状況から、2年目の研究計画はおおむね順調に進展していると言える。本研究は、近年の国際刑事法を取り巻く現状を反映した、国際刑事管轄権・手続法的関心に基づく国際刑事実体法の体系的整理を目的とする。3年目である本年は、1年目・2年目で行った、いかなる場面で中核犯罪という既存の犯罪類型の曖昧性が問題となっているか、そしてそれらが各場面において、どのように、なぜ問題となっているのかについての研究を土台に、これまで収集した情報の整理と分析を行って、体系的整理のためのアプローチを検討した。まず、2年目の課題のうち未解決であった引渡における中核犯罪の類型の曖昧さが問題になる場面の特定に関して分析を行い、論文「国際犯罪に関する引渡義務の抵触と優先ー中核犯罪の重大性の考慮について」を執筆し、雑誌に投稿した。
ラット虹彩筋のムスカリン受容体遺伝子解析と散瞳筋弛緩機構

平成9年度では、まずラット虹彩部位からRT-PCR法を用いてムスカリンm4受容体をクローニングしたが、脳由来のm4と完全に相同であった。さらにm1,m2,m3およびm4のmRNAの発現についてRT-PCR法を用いて定量することを平成8年度に引き続き試みた。しかし特にm2とm4については、プライマーの選択によりPCR増幅効率がかなり変ったので、サブタイプ間の比較については定量的に記述することが困難と思われる。しかし他の平滑筋組織に比べ、虹彩においてm4が多く発現していること、m1とm5サブタイプのmRNA発現は他の平滑筋同様に虹彩においても少ないことは確かであった。さらに虹彩平滑筋に対する副交感神経除去効果の機序を検討するため、毛様体神経節を除去したラット虹彩からRNAを得て、これまでと同様にRT反応によりcDNAを作製し、PCRにより各種ムスカリン受容体サブタイプのmRNA発現量の変化を検討した。その結果、これらのmRNA量には顕著な変化の無いことが示唆された。カルモジュリン、ミオシンやミオシン軽鎖キナーゼなどの収縮蛋白mRNA発現量の変化についてはまだ検討中である。また、画像解析により虹彩散瞳筋の細胞内Ca^<2+>濃度は、静止時緊張を持たない縮瞳筋や他の平滑筋に比べ高いことが明らかとなった。ムスカリン受容体刺激により細胞内Ca^<2+>濃度の低下が生じたので、弛緩はこの機序によるものと推測される。副交感神経除去した虹彩散瞳筋ではムスカリン受容体刺激により細胞内Ca^<2+>濃度減少も弛緩も生じないことも明らかとなった。平成8年度ではラット虹彩筋に存在するムスカリン受容体サブタイプのmRNA発現量をRT-PCR法を用いて検討した。摘出ラット虹彩部分から総RNAを抽出した後、逆転写反応によりDNAを得て、これを基にPCRを行った。ラット脳のムスカリン受容体遺伝子m1からm5までのプライマーを作成し、グリセルアルデヒド3燐酸デヒドロゲナーゼm-RNAを内部標準としてm-RNA発現量を比較定量した。その結果、虹彩ではm2, m3, m4がほぼ同程度に発現しており、m1とm5は少なかった。心臓や膀胱と胃ではm2とm3が主で、m4と殆ど発現しておらず、脳にはm1、m4やm5も存在する。m4の発現が多いことは虹彩においてかなり特徴的と考えられるが、どのような役割を果たしているか現在検討中である。また虹彩m4のクローニグも試みている。虹彩散瞳筋は自発性の筋緊張を持ち、ムスカリン受容体刺激により弛緩する。そこで静止状態での細胞内Ca濃度が通常の細胞より高いかを蛍光色素fura-PE3と画像解析装置Argus50を用いて検討した。その結果、細胞内Ca濃度は散瞳筋において自発性緊張を持たない虹彩縮瞳筋に比べ高いこと、ムスカリン受容体刺激により散瞳・縮瞳筋において細胞内Ca濃度はそれぞれ減少・増大し、それは弛緩・収縮に対応することが明らかとなった。散瞳筋のスキンド標本では、pCa6.0で正常標本の自発張力に対応する張力を持ったが、この時、ムスカリン受容体刺激により弛緩は生じなかった。またスキンド標本において収縮のpCa依存性は散瞳筋・縮瞳筋において殆ど差が無いことが明らかとなった。虹彩散瞳筋のムスカリン性弛緩は収縮蛋白系のCa感受性の低下よりもむしろ主に細胞内Ca濃度の低下により生じると推測される。ラット虹彩に存在するムスカリン受容体サブタイプのmRNA発現量を、脳等からクローニングされたそれぞれの遺伝子の塩基配列を基に適当なプライマーを作成し、RT-PCR法を用いて検討した。

m1,m2,m3,m4及びm5のmRNA量を半定量的に検討した結果、虹彩にはm2,m3,m4が多く、m1,m5は少ないことが明らかとなった。特にm4のmRNA量は他の平滑筋と比較して虹彩に多いことが推定された。さらに虹彩でのm2,m3,m4のクローニングをRT-PCR法により行った。その結果、アミノ酸配列でm2は心臓のものと9個(ただしゲノム由来のもとは100%相同)、m3は脳のものと3個異なっていた。またm4は脳のものと100%相同であった。さらに虹彩平滑筋に対する副交感神経除去効果の機序を検討するため、RT-PCR法を用いて毛様体神経筋を除去したラット虹彩での各種ムスカリン受容体サブタイプのmRNA発現量の変化を検討した。その結果、これらのmRNA量には顕著な変化の無いことが示唆された。また、画像解析により虹彩散瞳筋の平静時の細胞内Ca^<2+>濃度は、静止時緊張を持たない縮瞳筋や他の平滑筋に比べ高いことが明らかとなった。ムスカリン受容体刺激により細胞内Ca^<2+>濃度の低下が生じることが明らかとなったので、弛緩はこの機序によるものと推測される。副交感神経除去した虹彩散瞳筋ではムスカリン受容体刺激により細胞内Ca^<2+>濃度減少も弛緩も生じないことも明らかとなった。
腫瘍放射線感受性予測のための腫瘍内低酸素細胞分画測定法の開発

1.^<62>Cu-ビスチオセミカルバゾン銅錯体が腫瘍細胞において低酸素状態のマーカーとして使用可能であるかを検討した。腫瘍細胞と正常細胞では還元のメカニズムが異なることが分かった。腫瘍細胞はミトコンドリアは機能が正常であるにもかかわらず活性を示さず、細胞質に正常細胞にはない還元能を有していること、つまり、酸素存在下においても嫌気的な代謝をおこなっていることが分かった。腫瘍細胞においてもこの薬剤は滞留性するが、これは組織の低酸素状態を意味するものではなく、腫瘍細胞がもつ代謝上の特異性が原因であった。すなわちこの薬剤は低酸素細胞分画を測るには適していないが、腫瘍の細胞学的悪性度を知るマーカーになり得ると考えられた。2.独自のコメットアッセイ法を開発した。in vitroで常酸素状態および低酸素状態で同線量を照射した細胞を適当な比率で混じコメットアッセイを行ったところ混合比率にしたがってtail momentの大きい(すなわち常酸素状態で照射)細胞と小さい細胞(低酸素状態で照射)が認められた。特に、アルカリ法が低酸素細胞分画を求めるために有効と考えられた。次にin vivoで、コメットアッセイ法を用いて求めた腫瘍内低酸素細胞分画を従来の放射線生物学的方法で求めた低酸素細胞分画値と比較、検討した。2種類の異なる低酸素状態をとる腫瘍に置いてコメットアッセイ法によって検出された低酸素細胞分画は、放射線生物学的方法で求めた値と有意に相関関係を示した。異なる低酸素状態をとる2腫瘍において、個々のDNA障害の差を検出するコメットアッセイ法と、細胞の生死をエンドポイントとする放射線生物学的方法との間で相関関係が得られることは、放射線照射時の低酸素細胞分画値の測定を目的とした臨床応用の可能性を大いに示唆するものである。1.^<62>Cu-ビスチオセミカルバゾン銅錯体は正常組織内で低酸素細胞内に滞留する性質を持ち、脳および心において虚血状態の検出にポジトロン化合物として使用されている。その滞留機構はミトコンドリア電子伝達系のNADH依存的な還元反応によることが明らかにされた。そこで、これらの薬剤が腫瘍細胞において低酸素状態のマーカーとして使用可能であるかを検討した。結果:腫瘍細胞と正常細胞では還元のメカニズムが異なることが分かった。ヒトの腫瘍細胞に共通する性質として、そのミトコンドリアは機能が正常であるにもかかわらず活性を示さないこと、細胞質に正常細胞にはない還元能を有していること、つまり、酸素存在下においても嫌気的な代謝をおこなっていると分かった。結論:腫瘍細胞においてもこの薬剤は滞留性するが、これは組織の低酸素状態を意味するものではなく、腫瘍細胞がもつ代謝上の特異性が原因であった。すなわちこの薬剤は低酸素細胞分画を測るには適していないが、腫瘍の細胞学的悪性度を知るマーカーになり得ることにより、一つひとつの細胞におけるDNA主鎖切断の程度を定量的に解析する方法である。画像解析システムとして、画像取り込みにはオリンパス蛍光顕微鏡BX60-34-FLB-1、セキテクノトロン冷却CCDカメラSwnSys0400、画像解析ソフトIPLab-PCVCAMを用い、計算にはIDL(Research System.Inc)画像解析ソフトを導入した。現在、この方法を用い種々の細胞の放射線感受性を調べ、従来のcolony assay法との比較・検討を行っている。次年度からは、マウス腫瘍および臨床症例では術中照射症例を用い低酸素細胞分画の測定を行う。in vitorで培養細胞を常酸素状態で照射した細胞についてアルカリ法および中性法で細胞融解しDNAの電気泳動を行って個々の細胞に対応したコメットを作成した。コメットの尾部の種々のパラメータと照射線量について検討したところ、tailmomentおよびtail lengthと線量の間に強い相関を認めた。

次に常酸素状態および低酸素状態で同線量を照射した細胞を適当な比率で混じコメットアッセイを行ったところ混合比率にしたがってtailmomentの大きい(すなわち常酸素状態で照射)細胞と小さい細胞(低酸素状態で照射)が認められた。特に、アルカリ法が低酸素細胞分画を求めるために有効と考えられた。次に、マウスに移植したEMT6およびSCCVIIを用いて、従来の放射線生物学的手法で求めた個々の腫瘍の低酸素細胞分画とコメット法で求めた低酸素細胞分画の関係を求めた。まだ、実験手技上のばらつきはあるものの両者の間に相関が認められ、本法で腫瘍内の低酸素細胞分画が測定可能と考えられた。京都大学医の倫理委員会に術中照射症例および子宮頸癌の腔内照射症例を対象に放射線照射直後の細胞を採集し本法を用いて低酸素細胞分画を測定することを申請中であり、来年度は、臨床症例を中心に低酸素細胞分画を測定し、本方法による腫瘍内低酸素細胞分画の測定精度および臨床成績と比較する。用いた細胞はマウスに移植したSCCVIIおよびEMT-6腫瘍細胞である。我々が行った以前の研究によると、SCCVII腫瘍は急性の低酸素細胞を多く含む一方、EMT-6腫瘍は慢性の低酸素状態となる傾向がある。慢性低酸素細胞においては細胞の酸素濃度が幅広く分布することが予測され、この場合放射線照射によるDNAの障害の程度が段階的なばらつきを示しと考えられた。したがって個々のDNA障害の差を利用したComet Assay法では、酸素に富んだ細胞(障害の強い細胞)と低酸素細胞の分離・同定が困難であると予測された。しかし、結果は、Comet Assay法によって検出されたDNA障害の分布は、両腫瘍とも、大きく2群に分離し、障害の小さな群の割合として求めた低酸素細胞分画は、clonogenic assay法で求めた値と有意に相関関係を示した(相関係数はSCCVIIで0.85、EMT-6で0.75)。異なる低酸素状態をとる2腫瘍において、個々のDNA障害の差を検出するCometAssay法と、細胞の生死をエンドポイントとするclonogenic assay法との間で、このような相関関係が得られたことは大変興味深いことであるとともに、今後、放射線照射時の低酸素細胞分画値の測定を目的とした、臨床応用の可能性を大いに示唆するものであると考える。現在、我々は術中照射症例および子宮頚癌の腔内照射症例を対象に、Comet Assay法を用いた、低酸素細胞分画の測定を計画しており、その細胞採集方法等について検討中である。
植物保護を指向した生物活性天然物の合成研究

有機合成化学・天然物化学の視点から、「植物保護」をキーワードとし植物保護に関連する生物活性天然物の合成化学的研究を行った。具体的には、根寄生雑草の種子発芽刺激物質であるストリゴラクトン類と昆虫成長制御活性物質であるデカチュリン類の合成などを行った。Strigolactone類の合成研究1、Sorgomolの合成:標的分子合成の重要中間体である3環性ラクトンをナザロフ環化を基盤とした戦略に基づき合成した。その合成において、ヨードアセトニトリルを求電子剤として用いるアルキル化の優位性を見出し、ラセミ体合成ではあるが、sorgomolの世界初の合成を達成した。また、現在、光学活性体合成法の確立を目指し、酵素分割法を検討している。2、Solanacolの合成:我々がその誤りを証明したsolanacol提唱構造の合成法に基き、改訂構造の合成を達成した。ただし、本合成法は効率の点で致命的な欠点があるため、現在その改良合成法を検討中である。3、酵素分割を用いた4-HO-GR24(新規合成ストリゴラクトンアナログ)光学活性体の合成法を確立した。この成果はsolanacolの光学活性体合成に直結すると期待される。Decaturin類の合成研究1、Decaturin C合成の鍵中間体となるビニルエポキシドの調製法確立を目指し、ロビンソン成環反応の条件検討に集中的に取り組んだ。従来の知見では、この反応の収率が30%を超えず、これが全合成を阻む最大要因となっていた。現在、有機塩基を用いた方法を詳細に調査中である。本研究では有機合成化学・天然物化学の視点から「植物保護」をキーワードとし、植物(作物)保護に関連する生物活性天然物の合成化学的研究を行っている。研究の最優先課題は標的分子である生物活性天然物の全合成であるが、実用・応用の可能性も見据え、新規生物制御物質の開発およびその有効利用への展開を目指す。Strigolactone類の合成研究:1)Sorgomol光学活性体合成おける鍵反応である合成中間体に対する酵素を用いた速度的分割に関して、酵素のスクリーニングをほぼ完了し、現在、反応条件の最適化を行っている。2)Solanacolの合成に関しては、酵素を用いた速度論的分割を鍵反応として用い、その光学活性体合成を達成した。3)既に報告した4-HO-GR24の光学活性体合成サンプルに関する生物活性試験結果を足掛かりに、報告されていたalectrolおよびorobancholの絶対立体配置が間違っていることを明らかにした。Decaturin類の合成研究:1).Decaturin Cの光学活性体合成研究において、合成の鍵中間体となる.ビニルエポキシドの調製法を確立した後、独自に開発したスピロ環形成反応を駆使してdecaturin Cの光学活性体合成を達成した。現在、その効率化を検討中である。本研究では有機合成化学・天然物化学の視点から「植物保護」をキーワードとし、植物(作物)保護に関連する生物活性天然物の合成化学的研究を行った。平成24年度の主な研究成果を記す。根寄生雑草の種子発芽刺激物質であるストリゴラクトン類の合成研究:1)Sorgomol光学活性体合成における鍵反応である合成中間体に対する酵素を用いた速度論的分割に関して、酵素のスクリーニング・反応条件の最適化を行った。現在、光学活性体合成を継続中である。現在、細部の条件最適化を行っている。昆虫成長制御物質であるデカチュリン類の合成研究:Decaturin Cの光学活性体合成を達成した。その他:大豆フィトアレキシンglyceollin Iの形式合成を達成した。当初の最重要課題であった天然物合成に関して、細部の検討は残されているものの、いくつかの標的分子の合成を達成できた。また、合成を達成したことによるアウトプット(天然物の構造訂正および生物活性に関する新たな知見獲得)も得られている。まだ合成を達成していない標的分子も残されているが、全体としてはおおむね順調である。24年度が最終年度であるため、記入しない。おおむね順調に推移しているので、とくに計画を変更をすることなく本研究を遂行する。合成が達成できていない標的分子(sorgomol等)に関しては、その完成を急ぐ。また、合成した天然物のみならず、それらのアナログ類も含めて、活性・機能の評価を継続する。
環境的公正を考慮したリスク管理方策のあり方に関する基礎的研究

本研究では、人間活動がもたらす便益や費用、リスクのそれぞれを負担する主体が乖離する傾向にあることに鑑み、今後のリスク対策を効率性とともに社会的な公正という視点から捉え直し、新たなリスク管理のための基礎的な知見を得ることを目的とした。本研究で明らかになった点は、次の3点である。第一に、米国では環境影響と住民の社会的属性との関係を公開されている行政データに基づいて研究が進められているが、わが国では同様の研究に必要なデータへのアクセスが極めて困難であるため、同様の研究は容易に遂行できない。また、わが国で検討が必要と思われる複数の都市圏や地域を包括する広域環境に対する研究は比較的少ない。第二に、東日本地域を対象とした産業廃棄物の広域処理に関する調査の結果、行政が把握している行政区域外からの廃棄物搬入量は全体として減少傾向にある。ほぼ全ての各自治体がこのような状況を望ましい方向と考えており、平成8年度から開始される廃棄物処理計画の策定段階でも積極的な姿勢は示されていない。しかし、国は処理・処分の実効性を高めるため都市圏の枠を超えた広域的な処理を進める方針を打ち出しており、都県レベルと国の方針との間に整合性を見出しにくい。行政当局におけるこのような対応は環境的な公正を担保する上で好ましいものとはいえない。このため、廃棄物処理に伴い発生するベネフィット、コスト、リスクの負担主体を考慮した広域的な視点から各都県の方針を調整する機関や組織の必要性が極めて大きいことが示唆される。第三に、産業廃棄物に限らず一般廃棄物や電気・水道等のライフライン供給、また観光資源の開発にも必要になると考えられる。各々の問題について他の問題との共通性と特殊性を検討し、設定されるべき地域間の調整機関や組織のあり方を今後検討する必要がある。
自発的な酸素環境の変化に伴うiPS細胞の分化スイッチング現象の解析

本研究は、独自に開発したマイクロウェルチップ培養を利用して、iPS胚様体(球状細胞組織体)を取り巻く微小培養環境と細胞分化特性の関係を明らかにすることを目的としている。本年度は、酸素環境を変化させた際にみられるマウスiPS胚様体の分化特性と細胞内シグナルの変動を明らかにすることに取り組んだ。さらに、酸素供給環境に応答する細胞特性の変動がヒトiPS胚様体においてもみられる現象であるかを評価した。培養系内の酸素環境は、培養液内への酸素供給能と細胞の酸素消費によって決定される。そこで、培養系内へ高い酸素供給を達成できるポリジメリルシロキサン製チップにおいて、チップ上のウェル数(=胚様体数)を100個、300個、500個と変化させることで胚様体近傍の酸素環境が異なる条件を作製した。マウスiPS胚様体は、ウェル数の増加に伴って分化速度が低下し、ウェル数の少ないチップでは血管系分化、ウェル数の多いチップでは肝分化が促進された。これらの結果から、低酸素環境は細胞の分化がゆっくりと進行し、かつ肝分化が促進されやすい環境であることが示された。また、この現象に連動する細胞内シグナルの変化を評価した結果、細胞が自己分泌するWnt5aの発現が変動し、高酸素環境ではその下流シグナルであるAkt1の高発現に伴う血管系分化の促進、低酸素環境ではFoxa2の高発現に伴う肝分化の促進が起こっていることが示された。ヒトiPS胚様体では上記のような酸素環境に応答する分化スイッチング現象はみられなかったが、酸素供給能が高いチップ条件では神経分化が飛躍的に促進されたことから、酸素環境は細胞分化を制御する重要な因子であることが示された。本研究の取り組みによって、胚様体を取り巻く微小酸素環境と細胞分化特性の関係の一端が明らかとなった。独自に開発したマイクロウェルチップ培養を利用して、iPS胚様体(EB)を取り巻く微小培養環境と細胞分化特性の関係性を評価した。まず、チップ培養と従来技術であるハンギングドロップ(HD)培養において、胚様体初期サイズ(播種細胞密度)の違いがiPS細胞特性に与える効果を評価した。チップ培養における胚様体の増殖性はHD培養に比べて著しく抑制され、胚様体初期サイズに関係なく一定のサイズに到達することがわかった。また、チップ培養とHD培養の細胞分化特性は大きく異なる挙動を示した。HD培養では初期細胞密度が500cells/EB以下では血管系分化、1000cells/EB以上では心筋分化が促進されるのに対し、チップ培養では100cells/EB以下では血管系分化、500cells/EB以上では肝分化が促進されることを見出した。また、培養系内への酸素供給能の違いがiPS細胞の特性に与える効果として、ガス透過性が低いポリメチルメタクリレート(PMMA)製チップとガス透過性が高いポリジメリルシロキサン(PDMS)製チップを作製し、iPS胚様体の数と初期サイズを一定する条件において細胞の増殖性と分化特性を比較した。その結果、PDMSチップの胚様体増殖性はPMMAチップよりも著しく高く、酸素供給環境の違いで細胞増殖性が異なることがわかった。また、PMMAチップでは肝および心筋分化が促進されるのに対し、PDMSチップでは血管系分化が促進され、HD培養に類似した分化特性へと変化することを見出した。以上の結果から、iPS胚様体の分化スイッチングが起こる胚様体サイズ条件およびチップ材質条件を見出した。また、これらの現象から、胚様体を取り巻く酸素環境は幹細胞の初期分化に大きく作用する重要な因子の一つであることが示された。本年度の目標は、iPS胚様体のチップ培養において分化スイッチングが起こるチップおよび培養条件を見出すことであった。本年度の取り組みにおいて、胚様体初期サイズ(播種細胞数)と細胞分化の関係およびチップ材質と細胞分化の関係を明らかにすることができた。具体的には、初期サイズの小さな胚様体およびガス透過性の高いチップ条件では血管系分化、その逆に大きな胚様体およびガス透過性が低いチップでは肝分化が増強された。すなわち、これらの結果から、酸素供給が活発に行われる環境では血管系分化、低酸素環境では肝分化が促進されることを実証した。特に、チップのガス透過性を変えることでHD培養と類似あるいは全く異なる初期分化状態を作り出せることを見出した点は大きな収穫であり、これらの結果は微小培養環境制御の重要性とチップ培養の有効性を示すものである。これらの実施内容は当初の計画通りに進行しており、本研究目標の第1段階をクリアした。本研究では、独自に開発したマイクロウェルチップ培養を利用して、iPS胚様体(球状細胞組織体)を取り巻く微小培養環境と細胞分化特性の関係性を明らかにすることを目的としている。昨年度の研究において、酸素供給環境の違いによってiPS胚様体の分化スイッチング現象が起こることを明らかにしたことから、本年度は胚様体内部の酸素化状態と分化特性の解析および分化スイッチングに関与するシグナル系の探索を行った。まず、独自に設計・作製したポリメチルメタクリレート(PMMA)製チップとポリジメリルシロキサン(PDMS)製チップにおいて、微小酸素電極を利用して培養系内の酸素濃度変化を実測した。その結果、PDMSチップはPMMAチップに比べ、培養系内への酸素供給能が約15倍高いことがわかった。

次に、低酸素蛍光プローブを用いて酸素供給能の異なる両チップにおけるiPS胚様体内部の酸素化状態を評価した結果、PMMAチップでは胚様体中心部(体積比にして約25%の領域)において低酸素環境が発生したのに対し、PDMSチップでは培養7日目でも低酸素環境の発生はほとんど見なれなかった。さらに、蛍光プローブを用いて未分化状態を評価した結果、胚様体内部に未分化細胞集団が多く存在することが示された。これらの結果から、iPS細胞の分化は胚様体周辺部から進行し、低酸素環境が発生する胚様体内部では未分化状態が維持されやすい傾向にあることが示唆された。酸素供給能の異なる両チップにおいて、iPS細胞が分化スイッチングを起こす細胞内シグナル経路を探索した。様々なシグナル因子のなかで、細胞が自己分泌するタンパク質であるWnt5aの発現に変動がみられ、そのシグナル伝達の下流に位置する細胞内酵素であるAKT1の作用が血管系細胞と肝細胞への分化を調節している可能性を見出した。本年度の目標は、(1)ガス透過性チップを用いたiPS胚様体の分化特性の評価、(2)胚様体内部の分化状態と酸素環境の関係性、(3)ヒトiPS細胞を利用した分化スイッチング現象の評価であった。(1)については、当初、酸素供給能を変化させたPDMSチップを作製し、胚様体の分化特性の変化を評価することを計画していたが、次年度に計画していた「酸素応答による分化スイッチングのメカニズム解析」の取り組みが科学的インパクト性が高く、早急に取り組むべきと考え、実験計画を前後させた。「メカニズム解析」を優先し、その一端が明らかになったことは大きな成果である。また、当初計画していた(1)は来年度に引き続き実施する。(2)については計画通りに実施でき、胚様体中心部に低酸素環境が発生するとともに、その領域は未分化能が維持される傾向にあることを見出した。さらに、胚様体周辺部から細胞の分化が進行することを明らかにした。(3)については予備検討を実施した。マイクロウェルチップ培養によるヒトiPS細胞の胚様体形成は確認できた。しかしながら、ヒトiPS細胞はマウスiPS細胞に比べて胚様体形態の安定的な維持が難しいことから、現在、培養培地や添加マトリクス条件の最適化を実施している。本年度の実施計画には多少の変更があったが、全体計画からみれば予定通りに進行しており、本研究目標の第2段階をクリアした。本研究は、独自に開発したマイクロウェルチップ培養を利用して、iPS胚様体(球状細胞組織体)を取り巻く微小培養環境と細胞分化特性の関係を明らかにすることを目的としている。本年度は、酸素環境を変化させた際にみられるマウスiPS胚様体の分化特性と細胞内シグナルの変動を明らかにすることに取り組んだ。さらに、酸素供給環境に応答する細胞特性の変動がヒトiPS胚様体においてもみられる現象であるかを評価した。培養系内の酸素環境は、培養液内への酸素供給能と細胞の酸素消費によって決定される。そこで、培養系内へ高い酸素供給を達成できるポリジメリルシロキサン製チップにおいて、チップ上のウェル数(=胚様体数)を100個、300個、500個と変化させることで胚様体近傍の酸素環境が異なる条件を作製した。マウスiPS胚様体は、ウェル数の増加に伴って分化速度が低下し、ウェル数の少ないチップでは血管系分化、ウェル数の多いチップでは肝分化が促進された。
ミジンコにおける単為生殖雌から両性生殖雌への転換機構の解析

甲殻類の中でもミジンコ(枝角類)は,水温,餌,日長,飼育密度,などの生息条件に応じて単為生殖性の雌が雄を産生したり,休眠卵(耐久卵)を産生する両性生殖性の雌に変換する.これらの外的要因が,体内でどのようなシグナルに変換され,そのシグナルがどのようなメカニズムで性決定や生殖様式の変換に関与しているかは,ほとんど解明されていない,我々は最近,ファルネセン酸メチル(MF)をオオミジンコに与えると雄産生が誘導されることを見いだした.そこで,MFが実際にオオミジンコ体内で合成されているかどうか知るために,MF生合成の最終段階であるメチル化反応の有無を,famesoic acidのメチル化を[methyl-^3H]methionineのメチル基の転移反応と,上記反応を触媒する酵素famesoicacid O-methyltransferaseのmRNAの有無をRT-PCR法によって検討した.その結果,オオミジンコの体内でMFが合成されているという証拠は得られなかった.さらに,自然界では雄産生と同時に休眠卵が誘導されるが,MF処理によっては休眠卵は誘導されないことも明らかとなった,これらの結果は,MFは単為生殖から両性生殖への転換へは関与していいことを示しており,MFによる雄産生は生体内の生理作用とは別の経路(例えば,アーティファクト)によって誘導されものと解釈された.さらに,種々のMfhの誘導体を化学合成し,雄産生誘導効果と化学構造との相関性を検討した.これらの成果は,日本動物学会第75回大会のシンポジウム「動物の性決定及び性分化機構-性決定の進化を探る-」にて「オオミジンコの性決定と生殖様式の変換」と題して発表された.甲殻類の中でもミジンコ(枝角類)は,水温,餌,日長,飼育密度,などの生息条件に応じて単為生殖性の雌が雄を産生したり,休眠卵(耐久卵)を産生する両性生殖性の雌に変換する.これらの外的要因が,体内でどのようなシグナルに変換され,そのシグナルがどのようなメカニズムで性決定や生殖様式の変換に関与しているかは,ほとんど解明されていない.我々は,最近,昆虫の幼若ホルモンの一種であるファルネセン酸メチル(MF)が雄産生に関与していることを見出した.そこで,本研究では,1.MFの有効処理期間の決定,2.MFの生合成系の解析,3.卵成熟に対するエクジステロイドの影響,などについて解析をすすめた.1.MF処理は卵巣成熟の中頃から後半(形態学的には卵黄の蓄積が始まり卵母細胞が充分発達する時期)に最も有効であることが明らかになった.2.MFが実際にミジンコ体内で合成されているかどうかを調べるために,MFへのmethyl基供与体である[^3H-methyl]methionineをミジンコに注入して[^3H]MFの形成をHPLCにて解析した.今のところ,[^3H]MFは検出されていない.また,MF生合成の律速酵素と考えられているfarnesoic acid O-methyltransferase (FAMeT)の抗体(エビの一種Metapenaeus ensisで作製)を用いたウエスタンプロット法でもMFが合成されているという証拠は得られなかった.現在,FAMeTのmRNAが検出されるかどうかを調べるために,RT-PCRによってミジンコFAMeTのcDNAクローニングを試みている.3.MFと並んで甲殻類のホルモンであるエクジステロイドは,ミジンコの卵巣成熟や雄産生,耐久卵産生に影響を与えないことが明らかになった.甲殻類の中でもミジンコ(枝角類)は,水温,餌,日長,飼育密度,などの生息条件に応じて単為生殖性の雌が雄を産生したり,休眠卵(耐久卵)を産生する両性生殖性の雌に変換する.これらの外的要因が,体内でどのようなシグナルに変換され,そのシグナルがどのようなメカニズムで性決定や生殖様式の変換に関与しているかは,ほとんど解明されていない,我々は最近,ファルネセン酸メチル(MF)をオオミジンコに与えると雄産生が誘導されることを見いだした.そこで,MFが実際にオオミジンコ体内で合成されているかどうか知るために,MF生合成の最終段階であるメチル化反応の有無を,famesoic acidのメチル化を[methyl-^3H]methionineのメチル基の転移反応と,上記反応を触媒する酵素famesoicacid O-methyltransferaseのmRNAの有無をRT-PCR法によって検討した.その結果,オオミジンコの体内でMFが合成されているという証拠は得られなかった.さらに,自然界では雄産生と同時に休眠卵が誘導されるが,MF処理によっては休眠卵は誘導されないことも明らかとなった,これらの結果は,MFは単為生殖から両性生殖への転換へは関与していいことを示しており,MFによる雄産生は生体内の生理作用とは別の経路(例えば,アーティファクト)によって誘導されものと解釈された.さらに,種々のMfhの誘導体を化学合成し,雄産生誘導効果と化学構造との相関性を検討した.これらの成果は,日本動物学会第75回大会のシンポジウム「動物の性決定及び性分化機構-性決定の進化を探る-」にて「オオミジンコの性決定と生殖様式の変換」と題して発表された.