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ペスタロッチ・フレーベル・ハウスの保育・教育思想とアメリカへの導入過程

フレーベルの姪娘であるシュラーダー・ブライマンがベルリンにおいて開設したペスタロッチ・フレーベル・ハウスは、1880年代にケート・W・ウィギンやサラ・クーパーらカリフォルニアの無償幼稚園運動家が推し進めたフレーベル主義的教育理論と実践によって、アメリカへの受容の道が開かれていく。1893年、シカゴ市で開催された世界コロンブス博覧会に展示されたハウスの関連資料や監督者A・シェーペルの講演は、『幼稚園雑誌』の編集員であったドイツ人移民ホーファーらを通して全国の無償幼稚園運動家に広められ、その影響力を増していく。H・シュラーダー=ブライマンの代表的な伝記であるマリー・リュシンスカ著『ヘンリエッテ・シュラーダー=ブライマン』(1927年)によれば、シュラーダーは、フレーベルが創設したカイルハウ教育舎を創設後まもなく訪れ、フレーベルから直接指導を受けたとされる。そこで、本年度の研究計画は、カイルハウ教育舎(現在の自由フレーベル学校)の資料室にて、カイルハウ教育舎設立当時の資料、とくに設立当時の関係者の資料を探索し、シュラーダーに関する資料の発見を目的として調査を行った。この学校の研究担当教員のメフェルト博士指導のもとに、資料室所蔵の資料と文献のうち、現在整理中のランゲタール(フレーベルの協力者)関係の書翰類を調査したが、そこには、カイルハウにおけるシュラーダーの営為を確認できる資料は発見出来なかった。ただし同じくフレーベルの協力者だったミッデンドルフ、ならびにバーロップの資料は、まだ十分に調査できなかったため、機会を改めて調査を続行したい。ドイツでの資料調査に加え、アメリカへのシュラーダーの保育・教育思想ならびに、ペスタロッチ・フレーベル・ハウスの受容については、日本教育方法学会第43回大会において発表し、「ペスタロッチ・フレーベル・ハウスの教育実践と母性-家庭・地域社会の教育力再生の視点から-」『鳴門教育大学研究紀要』第23巻にまとめた。ここでは、マリー・リュシンスカ著『幼稚園の原理:その教育的価値と主な適用』(1886年)で紹介されたシュラーダーの保育・教育観、ペスタロッチ・フレーベル・ハウスの実践が、アメリカに受容された経緯に触れながら、アメリカの無償幼稚園設立に及ぼした影響について考察を試みた。シュラーダーの女性観・母生観がアメリカの幼稚園教師の専門性確立に及ぼした影響については、ドイツ人幼稚園運動家エマ・マーウェデルやシルバー・ストリート幼稚園の指導者ウィギンとの比較を通して明らかにしたいと考えている。ペスタロッチ・フレーベル・ハウスにおけるシュラーダー・ブライマンの教育思想と実践の全容を明らかにし、アメリカにおけるシュラーダー・ブライマンの影響力を探ることが本研究の目的である。今年度は昨年の成果である「ペスタロッチ・フレーベル・ハウスの教育実践と母性」に流れるシュラーダー・ブライマンの教育思想と同時期に生きたドイツ人幼稚園指導者エマ・マーウェデルのそれとをアメリカ人幼稚園教員ウィギンの自伝を中心に比較しながら、その類似点を確認する作業を行った。マーウェデルのドイツ、アメリカでの足跡を辿りながら、ウィギンに伝授しようとした幼稚園教員の専門性としての共感を解明し、恩物作業の機械的な指導に陥りがちであったドイツ人幼稚園指導者とは異なる養成の実態が明確となった。特に、(1)幼稚園教員の専門性育成において、子どもの特性や願望、必然性を観察の中で洞察することや、(2)女生徒が「精神的母性」を持った母親や、当時の女性たちに唯一開放されていた職である教員へと準備される練習の場として幼稚園を捉えていた点に、ハウスの実践との類似点が見られた。また、ベルリンのペスタロッチ・フレーベル・ハウスの調査によって、1893年のシカゴ博覧会にハウスが展示した資料ならびに、展示の監督に当たるために渡米したシェーペルとシュラーダー・ブライマンとの交換文書を明らかにすることができた。一方、シカゴ博覧会以前にハウスの保育に関心を示したアメリカ人幼稚園運動家ピーボディやマーウェデルとの交流については明らかにすることができなかった。本研究の目的は、ペスタロッチ・フレーベル・ハウスにおけるシュラーダー・ブライマンの保育・教育思想がアメリカに導入された過程を辿りながら、その影響力を探ることにある。ベルリンのペスタロッチ・フレーベル・ハウスの資料調査から、シュラーダーが1893年にシカゴで開催されたコロンブス博覧会にハウスの関係資料を展示するためにシェーペルを渡米させたのは、1892年10月15日、国際幼稚園連盟の通信幹事、ヘイブンから手紙を受け取り、連盟開催の会議に出席させるためであった。それは、シュラーダーが博覧会を機に、各国の幼稚園教育の理論・実践を報告・論議し合い、情報を共有する中で、幼稚園教育ならびに教員の資的向上を図ろうとして設立された国際幼稚園連盟(会長:サラ・クーパー)の趣旨に共鳴し、その活動に協力するためであった。

さらに、シェーペルがシュラーダー宛てに記した手記から、彼女がシカゴにおいて、『幼稚園雑誌』の編集員であるドイツ人移民ホーファーとの交流や講演を通して、ハウスの保育・教育の目的、信条、月主題による実践などを広めていたことが明らかとなった。ドイツにおける資料整理とともに、今年度はカリフォルニア大学バークレー校のバンクロフト図書館での資料調査を実施した。シュラーダーの保育・教育思想が受け入れられる理論的・実践的基盤となったカリフォルニアの無償幼稚園運動の実態も、ドイツ人幼稚園運動家エマ・マーウェデル、シルバー・ストリート幼稚園の指導者ケート・W・ウィギン、ゴールデンゲート幼稚園協会のサラ・クーパーらの資料から実証することができた。ドイツ・アメリカ双方での資料調査から、ペスタロッチ・フレーベル・ハウスの導入過程が鮮明になるに伴い、カリフォルニアでの無償幼稚園運動がアメリカの幼稚園改革に果たした思想的・実践的意義も浮き彫りにされたと言える。
新規分化誘導剤による固形癌細胞の増殖抑制の分子基盤の解明と臨床応用

本研究は白血病細胞の新規分化誘導剤が固形癌細胞への増殖抑制効果を発揮する可能性があること、およびその分子的基盤を明らかにし、新しい作用機序による固形癌の治療法を確立することを目的とした。その結果、我々が新たに見出した分化誘導剤cotylenin Aはrapamycinと相乗的にヒト乳癌細胞の増殖を顕著に抑制することを見出した。また、この作用機序には、サイクリンG2が関与していることを見出した。我々は、最近、白血病細胞の新規分化誘導剤cotylenin Aは単独処理でもある程度乳癌株細胞MCF-7の増殖を抑制できるが、mTOR阻害剤で、分化誘導活性もあるrapamycinと併用処理すると相乗的にMCF-7細胞の増殖を抑制し、細胞周期のG_1期停止を誘導すること、さらに、MCF-7細胞を移植したヌードマウスに対しても、この併用処理は顕著な治療効果を示すことを見出した。したがって、これら分化誘導剤の併用処理は固形癌に対する新しい治療法となる可能性がある。しかし、これら分化誘導剤の併用処理の作用機序は殆ど解明されていない。我々はこれまでに、cotylenin Aとrapamycinの併用処理によるMCF-7細胞の増殖抑制は細胞周期のG_1期停止の誘導によるものであり、apoptosis誘導によるものではないこと、さらに、RT-PCR法を用いてG_1期停止の誘導に重要と考えられた遺伝子(p53,p21^<cip1>,p27^<KiP1>,cyclinD1 c-mycなど)の発現を検討したが、有意な変動はないことを明らかにしてきた。そこで、今年度はこれら併用処理による増殖抑制効果に関連する遺伝子を見出すために、cDNA microarrayを用いて、cotylenin Aやrapamycinの単独処理および、cotylenin Aとrapamycinの併用処理したMCF-7細胞の遺伝子発現を網羅的に解析した。その結果、cotylenin Aとrapamycin処理によりcyclin G2遺伝子発現が早期から顕著に誘導されることを見出した。また、この増殖抑制に伴いcyclinG2蛋白質も有意に増加していることも確認した。このように今年度の研究では、新規分化誘導剤cotylenin Aとrapamycinの併用処理によるMCF-7細胞の増殖抑制効果には、cyclin G2の誘導が密接に関係していることを明らかにした。我々は、最近、白血病細胞の新規分化誘導剤cotyleninAは単独処理でもある程度乳癌株細胞MCF-7の増殖を抑制できるが、mTOR阻害剤で、分化誘導活性もあるrapamycinと併用処理すると相乗的にMCF-7細胞の増殖を抑制し、細胞周期のG_1期停止を誘導すること、さらに、MCF-7細胞を移植したヌードマウスに対しても、この併用処理は顕著な治療効果を示すことを見出した。我々はこれまでに、cotylenin Aとrapamycin処理によりcyclin G2遺伝子発現が早期から顕著に誘導されることを見出している。そこで本年度は、cotylenin Aとrapamycinの併用処理によるMCF-7細胞の増殖抑制効果とcyclinG2の誘導が密接に関係しているか否かを、cyclinG2に対するsiRNA(small interfering RNA)を作製して、cyclinG2遺伝子発現を特異的に阻害することによって検討した。その結果、cotylenin Aとrapamycinの併用処理によるMCF-7細胞の増殖抑制効果はcyclinG2に対するsiRNA処理によってキャンセルされた。さらに、cyclinG2遺伝子の発現が誘導可能なプラスミドを作製した後、MCF-7細胞に導入し、cyclinG2遺伝子が高発現される時に、細胞増殖は顕著に抑制された。このように、本年度の結果から、cotyleninAとrapamycinの併用処理によるMCF-7細胞の増殖抑制効果とcyclinG2の誘導が密接に関係していることが明らかになった。我々はこれまでに、cotylenln Aとrapamycin処理によるMCF-7細胞の増殖抑制効果とcyclin G2の誘導が密接に関係していることが明らかにしてきた。しかし、これら併用処理におけるcyclin G2の誘導の上流のセルシグナリングについては未だ不明である。そこで本年度ではPI3K/mTOR/Akt

シグナリングに対するcotylenin Aとrapamycinの併用効果を明らかにするために、各シグナル分子に対するリン酸化抗体を用いてWestern blottingを行い検討した。その結果、cotylenin Aがrapamycin処理で誘導されるAktのリン酸化を顕著に抑制することを明らかにした。これらの結果は、rapamycinによるAktの活性化の誘導に対するcotylenin Aによる阻害が、cotylenin Aとrapamycinによる相乗的増殖抑制効果に関与していることを示唆する
構造モデルを用いた入院環境評価に関する検討

本研究は、看護学の立場から「環境」概念を整理し、それらの考え方に基づいた環境看護学の構築に向けて、以下の2つの観点から研究的を行なった。1.文献的な検討による環境看護学のタ-ミノロジーの明確化「環境」概念を整理した後に、人間-環境系(Man-Environmental System)としての「環境」の視点について文献的に考察した。その後、看護学における「環境」概念の位置づけについて看護諸理論をとおして検討し、環境看護学の位置づけについて論じた。2.構造モデルの手法を用いた入院患者の環境認知特性の把握病院に入院している患者が、療養環境に対してどのような認知的評価をしているのかについて、ISM(Interpritive Structural Modeling)法に基づいた手法の提案を行なった。ISM法の手続きによって18の入院環境評価項目を設定し、実際に入院している患者2事例を対象に構造モデル化を試みた。その結果、患者個々人が認知している環境問題のみならず、潜在的な患者の欲求をも顕在化することが出来た。本年度は、これまでの看護理論にみられる環境の捉え方について整理した。その結果、ヘンダーソン、ジョンソン、ロイにみられるような全体性のパラダイムに基づく相互作用論的な環境論、ロジャース、パ-シ-、ニューマン、キングなどの相互浸透論的な環境論など、人間と環境をセットにして捉える環境論の展開がみられた。文献検索CD-ROM(MEDLINE)により、<看護>・<環境>をキーワードに抽出した1980年以降の研究論文を研究内容別に分類し、その数の推移を調べた。1980年以降で検索できた総文献数は1598件で、そのうち多くの看護理論で述べられている全体性のパラダイムに基づいた人間と環境をセットにして環境論を研究の中で展開しているものは101件であった。これらの研究内容は、大きく8つのジャンルに分類出来た。つまり、ストレスや適応などを主題とする、環境認知理論、健康支援の環境などを主題とする環境支援理論、個人の好みや健康観などを主題とする個人的行動理論、社会的交流やグループダイナミクスなどを主題とする社会・文化的行動理論、家庭環境から入院環境への変化などを主題とする生活様式変容理論、積極的看護介入の評価や試みなどを主題とする治療的援助理論、プライバシーやテリトリ-などを主題とする近接理論、さらに看護理論の検証などであった。次年度は、更に文献的な検討を進め、環境看護学の方向性について議論する。また、これらの概念に基づいて現在の病院環境の中でこれらがどのように認知され、どのような点が問題となっているのかについて、患者側、看護婦側の両方に調査するとともに、これらのデータから得られた結果に基づいて、患者の入院環境評価のための評価法の提案を行う。平成7年度の研究は、構造モデル化の手法であるISM法を用いて、入院患者の環境認知特性を、個別的、かつ簡便に把握できる手法を提案し、この方法が看護援助のための観察・判断データとして活用しうるかの可能性について検討を行なった。◇ISM法とは米国のバテル研究所が開発したISM(Interpretive Structural Modeling)法は、複雑な社会システム問題を分析する手法として開発されたもので、複雑な問題を多くのサブ問題に分解し、人間の直観力とコンピュータの支援によって、サブ問題の総合的な順位づけを行なってゆく手法である。■研究の方法ISMの手順に基づき行なった。ISMを遂行するチームの編成は、大学教員3名と、調査協力病院の婦長である看護婦2名、および調査病院に入院している患者6名(女性3、男性3)の合計11名で実施した。問題の設定・評価項目は、KJ法に基づき【(1)快適な生活環境要素】【(2)人間関係要素】【(3)情報に関する要素】【(4)安心や安全要素】の4グループが抽出できた。構造モデル化を具体的かつ有効に行なえるように最終的には18項目に集約・設定した。■研究の結果2事例に対して、提案した構造モデルを適用した。その結果、構造モデルにより入院患者の環境認知特性が図示できる本手法は、刻々と変化していく患者の状態に合わせた環境上の問題点を経時的に把握でき、かつ適切な看護ケアの充実が図れると同時に、看護ケアの評価や、臨床看護研究のためのデータの蓄積にもつながる重要な手法であると考えられる。
間欠的荷重負荷による骨の構造強化作用における低リポ蛋白受容体シグナルの役割解明

1)マウスに高脂肪食を摂取させた群では、標準食摂取群と比較して、血清低比重リポ蛋白(LDL)と酸化LDLが高値であった。高脂肪食群では、脛骨二次海綿骨における骨形成率(BFR/BS)と骨芽細胞面(Ob.S/BS)が低値であった。LDLと酸化LDLはマウス頭蓋冠由来骨芽細胞のアポトーシスを増加させた。2)我々は、高さ1メートルの金網のケージ(最上部に給水瓶を設置)を自発的に駆け登るクライミングモデルマウスを開発した。このマウスでは、四肢に荷重が間欠的に負荷され、骨形成が促進することによって骨量が増加し、骨構造が変化する。大腿骨横断面で皮質骨は外側に拡大し骨強度が増加する。このマウスを用いて、骨髄細胞におけるmRNAの発現をreal-time RT-PCRで解析した。クライミング運動群では運動をしていない対照群と比較して、運動開始後4日目で骨髄細胞中の低比重リポ蛋白受容体関連蛋白5(LRP5)、β-cateninのmRNAの発現が増加していた。運動開始後14日目で骨髄細胞中のwnt-1のmRNAの発現が増加していた。副甲状腺ホルモン(PTH)受容体(PTHR1)のmRNAの発現はクライミング運動後4日で増加していた。次に、骨髄細胞における脂肪細胞分化について調べた。PPARγ2とC/EBP αの発現に変化はないが、脂肪細胞分化の初期段階で発現するC/EBP βとC/EBP δはクライミング運動後4日で低下し、脂肪細胞分化の後期段階で発現するaP2とPEPCKは運動後7日で低下した。クライミング運動は、PTH受容体を介してLRP5、wnt/β-cateninのシグナルを亢進させ、骨芽細胞の分化を促進し、脂肪細胞への分化を抑制することを明らかにした。非荷重状態では、副甲状腺ホルモン(PTH)間欠投与によるc-fos発現亢進が抑制されるため骨形成増加効果が減弱すること、PTH投与により未熟な骨芽細胞の割合が増加するためRANKLの発現が増加し、破骨細胞形成が亢進すること、を明らかにしてきた。今年度は、非荷重後の骨髄細胞において、PTHシグナルが破骨細胞分化を促進しているか否かを検証する目的で研究を行った。6週齢の雄性、ddYマウスを用いた。1週間の予備飼育ののち、右後肢の坐骨神経を切除し、非荷重・不動とした。左後肢の坐骨神経は同定するだけの偽手術とした。この処置をしたマウスを2群に分けて、一方には、甲状腺副甲状腺を摘出(TPTX)し、0.2μgのthyroxineを週3回投与した。他方は、甲状腺副甲状腺を同定するだけの偽手術とした。脛骨二次海綿骨量(BV/TV)は、非荷重・不動により、有意に減少した。破骨細胞面(Oc.S/BS)と破骨細胞数(Oc.N/BS)は、非荷重・不動後3週と4週で一過性に有意に増加した。それに対して、TPTXをすることで、破骨細胞のこの一過性の増加は完全に抑制された。脛骨骨髄細胞において、非荷重・不動後にRANKL mRNAの発現が増加したが、TPTXにより抑制された。骨髄細胞中のMac-1陽性細胞(破骨細胞前駆細胞)の割合は、非荷重・不動により変化しなかった。骨髄細胞培養液中のIL-1α濃度は、非荷重・不動により変化しなかった。

これらの結果から、非荷重・不動後の破骨細胞面と破骨細胞数の増加は、PTHシグナルをブロックすることで抑制された。これは、骨髄細胞におけるRANKL mRNA発現亢進が、PTHシグナルをブロックすることで抑制されたことと関連していた。非荷重・不動後の破骨細胞分化の亢進は、骨髄細胞におけるPTHシグナルの促進によるRANKL発現亢進と関連しているという結論を得た。本年度は、アポリポ蛋白E(Apo E)ノックアウトマウスを用いて、高脂血症による骨形成低下におけるApo E遺伝子の役割を明らかにすることを目的に研究を遂行した。雄性4週齢のApo Eノックアウト(KO)マウス及び野生型マウスを用いて、標準食投与群と高脂肪食投与群の2群ずつ、計4群を作成した。12週間の飼育後、骨検体を摘出しで解析した。Apo E KOマウスでは血清low-density lipoprotein(LDL)値が有意に上昇しており、高脂肪食投与でさらに有意に上昇した。血清LDL値の上昇は、Apo E KOマウスにおいても野生型においても、海綿骨の骨梁表面における骨形成率(bone formation rate)および骨髄細胞におけるオステオカルシンの発現(骨芽細胞の最終分化)を抑制した。Apo E KOマウスにおいて、皮質骨内骨面および海綿骨の骨形成率は血清LDL値と強い負の相関を示した。Apo E KOマウスにおける骨髄接着細胞のp53遺伝子の発現は、血清過酸化脂質と強い正の相関を示した。結論として、血清過酸化脂質は骨髄接着細胞においてアポトーシスを誘導し、骨芽細胞分化と骨形成を抑制する。しかし、Apo E遺伝子はそれらの作用に対して防御的に働いていると考えられた。過酸化脂質である酸化LDLの増加が血管内皮細胞を障害し、動脈硬化を惹起することが知られている。骨粗鬆症、高脂血症、動脈硬化はともにメタボリックシンドロームとして共通した発症メカニズムを有している可能性がある。次年度も引き続き、骨の形成と構造制御と脂質代謝の相互作用について解明を進めていく予定である。我々は、脂質代謝、特に血清低リボ蛋白(low-density lipoprotein :LDL)が骨代謝動態に与える影響、および脂質代謝におけるシグナルと骨形成系細胞のシグナルのクロストークについて調べてきた。今年度は、マウスを用いて高脂肪食が骨代謝動態にどのような作用を及ぼすかについて、標準食を摂取しているマウスと比較し検討した。また、apolipoprotein E(apoE)遺伝子を欠損させることによって高脂肪食の作用がどう修飾されるかを解析した。マウスに高脂肪食を摂取させた群(high fat : HF群)では、標準食摂取群(standard : S群)と比較して、血清LDLと酸化LDLが高値であった。LDLと酸化LDLはマウス頭蓋冠細胞のアポトーシスを増加させた。HF群では、脛骨二次海綿骨における骨形成率(BFR/BS)と骨芽細胞面(Ob.S/BS)が低値であった。骨髄細胞から得たmRNAをreal-time RT-PCRで解析した結果、HF群はS群と比べて、オステオカルシンmRNAの発現に差はなく、I型コラーゲンmRNAの発現が亢進していた。また、HF群では、bax/bcl-2比が増加し、p53の発現が亢進し、骨芽細胞にアポトーシスを生じていた。骨髄細胞の培養結果では、HF群とS群で、アルカリフォスファターゼ陽性CFU-f/Total CFU-fに差がなかった。組織切片上アルカリフォスフアターゼ陽性細胞数は両群で差がなかった。
網膜微小循環における白血球-血管内皮相互反応機構とその病態的意義の解明

高脂血症ラットでは網膜微小循環における白血球集積の亢進がみられる。今回は、NOドナー作用を有する抗緑内障点眼薬nipradilolの白血球集積に対する抑制効果について検討した。ラット網膜微小循環における白血球動態の評価方法としては、acridine orange digital fluorographyの手法を用いた。有色ラット(Brown Norway、体重200g)に高コレステロール食のみを8週間投与したものをA群(コントロール),高コレステロール食を8週間投与し,その期間中に1日2回基剤50μlを点眼したものをB群,高コレステロール食を8週間投与し,その期間中に1日2回1%nipradilol 50μlを点眼したものをC群とした。それぞれのラットに,麻酔下でラット用コンタクトレンズを装着後,尾静脈からacridine orange(AO)を注入した。AOは核DNAと結合して、走査型レーザー検眼鏡(SLO)のアルゴンレーザーにより励起されて蛍光を発するため、白血球を蛍光点として観察できる。AO注入直後と30分後にSLOを用いて網膜微小循環での白血球動態をデジタルビデオに記録した。コンピューターによる画像解析を用いて、網膜血管内白血球ローリング数、網膜内白血球集積数、網膜主幹血管径を測定した。血清コレステロール値は,投与8週後にA,B,C群でそれぞれ148±13.1mg/dl,152±10.7mg/dl,130±9.0mg/dlとなり各群間で有意差は認めなかった。アクリジンオレンジ注入30分後の網膜内白血球集積数は,A,B,C群でそれぞれ29±5.9/mm^2,26±2.6/mm^2,20±4.9/mm^2で,B群ではA群に比べ有意差はなかったが,C群ではA群に比べ有意に減少していた(p=0.0026)。白血球のローリングは3群ともみられず,血管径や血流速度にも各群間に有意差は認めなかった。以上の結果よりnipradilolを点眼投与することにより,高脂血症の網膜微小循環における白血球と網膜血管内皮間の粘着能亢進が抑制される可能性があることが判明した。ラットの網膜微小循環における白血球動態の評価方法として、acridine orange digitalfluorographyの手法を確立した。麻酔下でラットの尾静脈にルートを確保し、角膜に専用のコンタクトレンズをのせ、走査型レーザ検眼鏡(SLO)でラットの眼底を観察する。尾静脈から核染色色素であるacridine orange(AO)を注入すると、染色された白血球がSLOのアルゴンレーザにより励起されて蛍光を発するため、網膜を循環あるいは集積している白血球を白い過蛍光点として観察可能であった。得られた画像から、コンピュータによる画像解析を用いて網膜毛細血管内白血球速度、網膜内に集積した白血球数、網膜主幹血管径を測定した。マウスでもAOを尾静脈にone shotで注入することにより、その撮影方法を確立した。次にラットの病態モデルにおける白血球動態を評価するため、高脂血症モデルと網膜虚血再灌流モデルを作成した。高コレステロール食を4週間投与した高脂血症モデルでは、網膜内の白血球集積数がコントロールと比べ有意に上昇していた。

また、HMG-CoA還元酵素阻害薬を含有した高コレステロール食を投与したラットでは、高脂血症モデルと比べ白血球集積数が有意に抑制されていた。網膜虚血再灌流モデルは、視神経を結紮して網膜の血流を途絶させ、60分後に結紮を解除して再灌流させることにより作成した。網膜虚血再灌流モデルでは、主幹静脈の拡張、白血球のローリングが観察され、網膜内の白血球集積数は著明に増加していた。また、白血球のローリングに関与する接着分子であるセレクチンを阻害するセレクチン阻害剤を、再灌流5分前に投与することにより、ローリングしている白血球数、網膜内白血球集積数は有意に抑制された。組織学的検討でも組織障害が軽減しており、セレクチン阻害剤の虚血再灌流障害における有効性が示唆された。以上の結果より、本法は生体眼の網膜微小循環における白血球動態の評価方法として非常に有用であること、また、薬剤効果の定量的判定も可能であることが判明した。自然発症インスリン非依存型糖尿病モデル動物であるOLETF(Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty)ラットを用いて、網膜における接着分子P-セレクチン、ICAM-1の局在について検討した。生後72週のOLETFラットおよび対照のLETO(Long-Evans Tokushima Otsuka)ラットを屠殺し、眼球を摘出した。摘出した眼球から、網膜を分離し、抗P-セレクチンモノクロナール抗体(ARP2-3)、抗ICAM-1モノクローナル抗体(1A29)を用いてウェスタンブロッティングを行い、P-セレクチンおよびICAM-1を定量した。ウェスタンブロッティングでは、どちらのラットにおいても、P-セレクチン(約140kD)、ICAM-1(約90kD)のバンドを認め、OLETFラットに多く発現していた。次に、それぞれのラット摘出眼球をアルデヒド固定し、厚さ4μmのパラフィン切片にした後、抗P-セレクチンモノクローナル抗体、抗ICAM-1モノクローナル抗体を用いて、sABC(Streproavidin Biotin Complex)法により免疫染色を行い、光学顕微鏡で、網膜血管内皮の染色性を観察し、P-セレクチン、ICAM-1の発現部位を検討し、染色性の程度を比較した。免疫染色では、OLETFラットの網膜血管内皮でP-.セレクチン、ICAM-1とも強く染色されたが、LETOの網膜血管内皮では、ICAM-1はわずかに染色性を認めたが、P-セレクチンの染色性はほとんどみられなかった。今回、P-セレクチン、ICAM-1ともOLETFラット網膜で上昇していたことから、これらの接着分子が、糖尿病での網膜細小血管症の病態において重要な役割を果たしている可能性があると考えられた。高脂血症ラットでは網膜微小循環における白血球集積の亢進がみられる。今回は、NOドナー作用を有する抗緑内障点眼薬nipradilolの白血球集積に対する抑制効果について検討した。ラット網膜微小循環における白血球動態の評価方法としては、acridine orange digital fluorographyの手法を用いた。有色ラット(Brown Norway、体重200g)に高コレステロール食のみを8週間投与したものをA群(コントロール),高コレステロール食を8週間投与し,その期間中に1日2回基剤50μlを点眼したものをB群,高コレステロール食を8週間投与し,その期間中に1日2回1%nipradilol 50μlを点眼したものをC群とした。
新規治療の確立を目的とした全身性強皮症の血管病変モデルの作製

全身性強皮症は皮膚や内臓の線維化をきたす自己免疫性疾患である。加えて、レイノー症状などの血管障害を認めるが、その機序はほとんど明らかになっていない。これは、患者の血管内皮細胞を使った適切な病変解析モデルが存在しないためである。そこで、我々は全身性強皮症患者よりiPS細胞を作製し、そのiPS細胞から患者由来の血管内皮細胞を誘導し、管腔形成を行うことによって、全身性強皮症の血管病変モデルを確立することとした。本研究によって、今まで不明であった全身性強皮症の血管障害の原因解析や血管病変モデルによる新たな治療薬のスクリーニングが期待される。
シロアリ共生原生生物の水素生成機構の解明

セルロース分解能を有するシロアリ共生性のパラバサリア門原生生物は、分子状水素を放出することが特徴である嫌気的エネルギー産生細胞内小器官ヒドロゲノソームをもち、シロアリからの高い水素生成に重要な役割を果たしている。パラバサリア門の3種のみが共生するイエシロアリにおいて原生生物群のcDNAライブラリーを構築してセルロース分解酵素を取得・解析し、EST(expressed sequencetag)解析をすすめ、ヒドロゲノソーム内の嫌気的エネルギー生産関連酵素のホモログ遺伝子など原生生物の主要代謝を推定した。共生原生生物種を顕微鏡下で単離することにより遺伝情報の由来する種を同定できるようになり、分子系統学的にも解析した。ヒドロゲノソームに局在する水素生成酵素(ヒドロゲナーゼ)のホモログ遺伝子群のうち、セルロース分解に重要な原生生物種であるPseudotrichonympha grassii由来の2種の遺伝子を大腸菌に異種発現させて解析した。どちらの組換精製酵素も水素吸収よりも高い水素生球活性を示したが、至適pHやドメイン構造に違いが認められ、異なる機能を果たしていると考えられた。原生生物細胞の微小分画を行って、ヒドロゲノソーム濃縮画分に高い水素生成活性を検出したが、細菌画分には高い水素吸収活性が認められ、種間水素伝達による細胞共生関係が示唆された。シロアリ共生原生生物には細胞内・表層に多様な細菌が共生しており、腸内の微生物群集構造の解明と共進化についても研究を行った。セルロース分解能を有するシロアリ共生原生生物は、分子状水素を放出することが特徴である嫌気的エネルギー産生細胞内小器官ヒドロゲノソームをもち、シロアリからの高い水素生成に重要な役割を果たしていると考えられる。シロアリ腸内の混合微生物群より、腸内を自由生活する細菌を除いて、セルロース分解に主に働く大型原生生物を濃縮して水素生成酵素(ヒドロゲナーゼ)活性を測定するときわめて高い活性が検出された。このセルロース分解にはじまる効率性の高い共生原生生物の水素生成機構の解明を目的とする。培養を介さない方法で、ヒドロゲナーゼ、および、ヒドロゲノソーム関連の酵素遺伝子群を網羅的に探索するために、イエシロアリの共生原生生物群よりmRNAを調製してcDNAライブラリーを構築して、EST(expressed sequence tag)解析をすすめた。数多くのクローンについて決定した部分塩基配列はFASTAプログラム等を用いてデータベース上の塩基配列と相同性検索を行って、機能の推定も行っている。一方、構築したcDNAライブラリーは大腸菌での発現を誘導できるタイプのもので、活性の検出が比較的容易なセルラーゼ(エンドグルカナーゼ)遺伝子をスクリーニングして取得し、組換え酵素の性質を検討した。また、マイクロマニピュレータ装置を利用して種ごとに原生生物細胞を単離して配列特異的なPCRに供すること、また、単一細胞からdegenerate primerを用いたRT-PCR法によって機能遺伝子の発現産物を検出することが達成され、水素生成関連遺伝子が由来する生物種の決定ができるようになり、ヒドロゲノソームの起源など分子系統学的な研究にも興味深い。このセルロース分解にはじまる効率性の高い共生原生生物の水素生成機構の解明を目的とした。水素生成酵素ヒドロゲナーゼ、および、ヒドロゲノソーム関連の酵素遺伝子群を培養を介さない方法で網羅的に探索するために、イエシロアリの共生原生生物群(3種からなる)よりmRNAを調製してcDNAライブラリーを構築し、EST(expressed sequence tag)解析をすすめた。2000を超える数多くのクローンについて決定した部分塩基配列はFASTAプログラム等を用いてデータベース上の塩基配列と相同性検索を行って、機能の推定を行った。セルロース分解酵素群、解糖系酵素群の遺伝子が数多く得られ、高分解能はこれらの遺伝子群が高発現することによってもたらされていると考えられた。ヒドロゲナーゼとヒドロゲノソーム

関連の酵素遺伝子群も複数得られ、ヒドロゲナーゼとピルビン酸-フェレドキシン酸化還元酵素については、由来する原生生物種を同定した。パラバサリア門原生生物Pseudotrichonympha grassiiのヒドロゲナーゼについては、大腸菌に組換えタンパク質を発現させたところ、嫌気条件下での培養により有意な水素生成が検出された。一方で、水素取り込み能は大腸菌自身の有する活性程度しか検出されず、水素生成に特化した酵素と考えられた。精製酵素の解析を行うにあたって、酵素発現条件の最適化とHis-tagを利用した精製条件の検討を行った。セルロース分解能を有するシロアリ共生性のパラバサリア門原生生物は、分子状水素を放出することが特徴である嫌気的エネルギー産生細胞内小器官ヒドロゲノソームをもち、シロアリからの高い水素生成に重要な役割を果たしている。パラバサリア門の3種のみが共生するイエシロアリにおいて原生生物群のEST(expressed sequence tag)解析をすすめ、セルロース分解に関わる数種の糖質加水分解酵素、嫌気的生物に見られるピロリン酸利用性の解糖系酵素、解糖系終段階でリンゴ酸を生じる酵素群、ヒドロゲノソーム内の嫌気的エネルギー生産関連酵素のホモログ遺伝子を見出し。原生生物の主要代謝を推定した。セルロース分解に関わるものを除き、これら主要代謝に関連した酵素遺伝子の多くは同じパラバサリア門のTrichomonas vaginatisのものと高い相同性を示し、本門内で単一起源と考えられたが、なかには水平伝播で獲得したと考えられる明らかに起源の異なるものも認められた。ヒドロゲノソームに局在する水素生成酵素(ヒドロゲナーゼ)のホモログ遺伝子群も見出し、重合度の高いセルロース分解に重要なPseudotrichonympha grassii由来の2種の遺伝子を大腸菌に異種発現させて解析した。どちらの組換精製酵素も水素吸収よりも高い水素生成活性を示したが、至適pHやドメイン構造に違いが認められ、異なる機能を果たしていると考えられた。また、シロアリ共生原生生物には細胞内・表層に多様な細菌が共生しており、これらを分子系統学的に同定した。原生生物細胞の微小分画を行って、ヒドロゲノソーム濃縮画分に高い水素生成活性を検出したが、細菌画分には高い水素吸収活性が認められ、種間水素伝達による細胞共生関係が示唆された。
50年間の林分動態と施業履歴に基づく森林生態系の順応型管理システムの構築

森林管理の基礎となる基盤データ整備を試みた結果、地理情報と施業管理情報を組み込んだ順応型管理のための情報基盤を確立することができた。また、森林生態系のもつさまざまな機能を維持しつつ再生可能な自然資源を利用していくことのできる天然林施業のための知見を数多く得ることができた。さらに、こうした森林と人間との関わりを社会全般に伝える手法についても成果が得られた。長期生態系プロットを中心とした生物多様性の評価に関わる研究として,199293年に前山に設置した面積36.5ha(50×50m区画146個)の大面積プロットのうち,1992年に設置した99区画の毎木調査(胸高直径5cm以上),副本(高さ1.3m以上,胸高直径5cm未満)本数等の調査を完了した。エゾマツの更新を調査するため標高の異なる天然林の地がき地と林内に更新試験地を,育苗法確立のために雪解け等を制御する試験区を設定した。25年前の地がき試験地で数万本/haの更新が認められたが,エゾマツの更新は高標高で顕著で,微細な地形が影響した。低標高エゾマツ人工林を調査し,低標高でエゾマツが成林し,ウダイカンバとの二段林となることを明らかにした。立枯病罹病苗から産生色素がリゾクトニア菌を抑制するケタマカビを検出した。エゾシカの生態を把握するため11月(晩秋期)にライトセンサス,3月(晩冬期)にスノーモービルを使った雪上の生活痕調査を行った。その結果,林分スケールでは晩秋期と晩冬期でシカの分布に顕著な違いは認められなかった。晩秋期には,夜間に畑地に残されたビートに200頭近い大きな群れが形成されるのが確認された。その他,地元猟友会や北海道庁とも情報交換を行った。水文調査のため,7月下旬に北海道演習林人見沢,奥ノ沢の23地点において支流の合流前後の流量・水温・pH・導電率を計測し,さらに広域に20支流における流量・水温・pH・導電率の測定を実施した。GISを利用して,平水時の流量・水質の特異点を見出すとともに,北海道演習林を流出域とする渓流の基底流出の空間比較のためのフィールドデータを収集し終えた。森林の状況を把握するため,空中写真をもとにオルソフォトマップを作成し,過去の林分構造を把握するため,1958年以降の林況調査資料を整理した。優良広葉樹の流通を把握するため,大阪,広島,福岡,沖縄でツキ板に関する聞き取り調査を行った。環境教育についてどのようなプログラムの開発が可能か検討を行い,(1)本科研の成果を市民に普及啓蒙する方法,(2)北海道演習林の天然林管理に関するガイドのためのテキスト作成,(2)環境教育プログラム集作成の3点を目標とすることとした。研究の進め方について検討を行い,データベースの作成や普及についてのシステム開発を中心とすることを決めた。具体的なテーマとして地図情報の充実と森林管理業務への利用促進のためのシステムづくり,利用普及をはかるための方策の検討をあげ,実際にGIS研修会を行って必要な情報の収集を行った。70年以上伐採が入っていない針広混交天然林の動態を調べた結果、直径階別死亡率(%/yr)は、多くの樹種で小径木の死亡率が高い右肩下がりかほぼ一定であったが、新規加入率(%/yr)は樹種によって様々のパターンがみられた。この42年間で択伐林分の蓄積はほぼ安定していたが、針葉樹小径木の減少が認められ、広葉樹の占有割合が増えつつあった。林分施業法が導入された当初は、広葉樹中小径木を積極的に伐採して針葉樹を残す施業がなされたが、最近では針葉樹中大径木の伐採が優先される施業が影響していると考えられた。また、燕麦、大豆、ひまわりの3種の緑肥を施した播種床でエゾマツ播種試験を行った結果、発芽率はひまわりの40%に対して、燕麦、大豆はともに30%未満であった。発芽した個体の生存率でもひまわりが最も高く49%で、燕麦、大豆ともに36%未満であった。燕麦では積雪期を挟む生存率(春の生存数/前年秋の生存数)と夏季を挟む生存率(秋の生存数/同年春の生存数)とはそれぞれ58%と63%と拮抗していた。ひまわりでは68%、84%と夏季の生存率が他に比べ著しく高かった。試験した3種以外の有効な緑肥および病虫害に有効な農薬の探索など、さらに検討するべき課題のあることが示された。天然林施業への影響が懸念されるエゾシカ剥皮害については、剥皮害の発生しやすい条件と、剥皮リスクに対する施業の影響を調査・分析した。

その結果、(1)残雪期のシカ痕跡は「23月の日射量が多く、標高が低く、近傍の補植林分面積が多い場所」で発見されやすいこと、(2)(1)の条件はシカの嗜好性が高いオヒョウの剥皮リスクが高い環境条件と一致すること、(3)他の樹種についても近傍の補植林分面積が多い場所で剥皮リスクが高いが、同じ環塊条件でも樹種間でリスクが異なること、(4)冬期に施業を行うとシカの痕跡が増える傾向がみられたが、立木への剥皮は必ずしも増えず、施業は剥皮の直接的なリスク因子ではないことなどが分かった。70年以上伐採が入っていない針広混交天然林の動態を調べた結果、直径階別死亡率(%/yr)は、多くの樹種で小径木の死亡率が高い右肩下がりかほぼ一定であったが、新規加入率(%/yr)は樹種によって様々のパターンがみられた。この42年間で択伐林分の蓄積はほぼ安定していたが、針葉樹小径木の減少が認められ、広葉樹の占有割合が増えつつあった。林分施業法が導入された当初は、広葉樹中小径木を積極的に伐採して針葉樹を残す施業がなされたが、最近では針葉樹中大径木の伐採が優先される施業が影響していると考えられた。また、燕麦、大豆、ひまわりの3種の緑肥を施した播種床でエゾマツ播種試験を行った結果、発芽率はひまわりの40%に対して、燕麦、大豆はともに30%未満であった。発芽した個体の生存率でもひまわりが最も高く49%で、燕麦、大豆ともに36%未満であった。燕麦では積雪期を挟む生存率(春の生存数/前年秋の生存数)と夏季を挟む生存率(秋の生存数/同年春の生存数)とはそれぞれ58%と63%と拮抗していた。ひまわりでは68%、84%と夏季の生存率が他に比べ著しく高かった。試験した3種以外の有効な緑肥および病虫害に有効な農薬の探索など、さらに検討するべき課題のあることが示された。天然林施業への影響が懸念されるエゾシカ剥皮害については、剥皮害の発生しやすい条件と、剥皮リスクに対する施業の影響を調査・分析した。その結果、(1)残雪期のシカ痕跡は「23月の日射量が多く、標高が低く、近傍の補植林分面積が多い場所」で発見されやすいこと、(2)(1)の条件はシカの嗜好性が高いオヒョウの剥皮リスクが高い環境条件と一致すること、(3)他の樹種についても近傍の補植林分面積が多い場所で剥皮リスクが高いが、同じ環境条件でも樹種間でリスクが異なること、(4)冬期に施業を行うとシカの痕跡が増える傾向がみられたが、立木への剥皮は必ずしも増えず、施業は剥皮の直接的なリスク因子ではないことなどが分かった。本研究のまとめとして得られた成果を含めて北海道演習林の天然林を中心とした森林を環境教育素材として活用するためのテキストを作成した。
前立腺癌細胞分化の揺らぎによる去勢抵抗性獲得機構

本年度は、前立腺癌細胞におけるアンドロゲン感受性の強さと線維芽細胞からのパラクライン刺激への反応性との関連を検討する目的で、アンドロゲン感受性ヒト前立腺癌LNCaP細胞から樹立したアンドロゲン低感受性の亜株E9, F10および不応性の亜株AIDLと、複数の前立腺癌患者の針生検組織から初代培養して得られた線維芽細胞pcPrFsとのin vitro共培養実験を施行した。pcPrFsとのin vitro共培養において、E9およびAIDL細胞の増殖率は有意に上昇した。また、E9細胞では細胞内前立腺特異抗原PSAタンパク質発現量が増加した。一方、F10細胞の増殖率および細胞内PSAタンパク質発現量に変化は認められなかった。精製EGF処理したE9およびAIDL細胞の増殖率は有意に上昇するとともに、リン酸化AktおよびMAPKタンパク質発現量が顕著に増加した。一方、F10細胞の増殖率は精製EGF処理でも変化しなかった。さらに、精製EGF処理したF10細胞ではリン酸化AktおよびMAPKタンパク質発現量に変化は認められなかった。精製EGF処理したE9細胞からのPSA分泌量は有意に増加した。F10細胞ではアンドロゲン受容体ARのスプライスバリアントAR-V7の発現を認めた。以上の結果より、我々はLNCaPを親株とした2つのアンドロゲン低感受性の亜株(E9およびF10細胞)を用いることで、アンドロゲン低感受性という共通の特徴を有する癌細胞であっても線維芽細胞からのパラクライン刺激に反応する癌細胞(E9細胞)と反応しない癌細胞(F10細胞)が共存している可能性を明らかにした。また、アンドロゲン不応性の前立腺癌細胞であっても線維芽細胞からのパラクライン刺激に反応したことは、ホルモン治療が無効な低分化な前立腺癌細胞に対しては癌細胞内シグナル伝達経路が重要な治療標的となることを示唆するものと考えた。本年度は、前立腺間質における線維芽細胞の多様性がアンドロゲン感受性ヒト前立腺癌LNCaP細胞に与える影響を検討する目的で、複数の前立腺癌患者の組織から初代培養して得られた線維芽細胞とLNCaP細胞とのin vitro共培養実験を施行した。実験には市販されている正常ヒト前立腺間質細胞PrSCを比較対象細胞とし、摘出手術材料より初代培養にて単離したヒト前立腺癌患者由来線維芽細胞pcPrFsを用いた。Falconセルカルチャーインサートを用いたin vitro共培養実験では、LNCaP細胞に対してPrSCおよびpcPrFsそれぞれを組み合わせて4日間の共培養を行った後に、LNCaP細胞の細胞増殖率の変化を比較検討した。その結果、PrSCおよびpcPrFs (-M5, -M6, -M7)はLNCaP細胞の増殖率を有意に上昇させた。一方、pcPrFs (-M10, -M11)はLNCaP細胞の増殖率を有意に低下させた。次に、LNCaP細胞に対してPrSCおよびpcPrFsそれぞれを組み合わせて1もしくは2日間の共培養を行った後に癌抑制遺伝子TP53 mRNA発現量を測定したところ、PrSCおよびpcPrFsいずれの線維芽細胞との共培養群でもTP53 mRNA量に明らかな変化は認められなかった。以上の結果より、癌患者由来線維芽細胞が産生・分泌するパラクライン因子には、LNCaP細胞の増殖を促進させる細胞増殖因子やサイトカインとは別に、LNCaP細胞の増殖を抑制させる何らかの因子が含まれている可能性が示唆された。この点を癌細胞の増殖抑制=癌細胞の分化誘導と捉え、癌抑制遺伝子の発現変化を検討したものの、TP53では説明できない結果であった。本年度は癌抑制遺伝子としてTP53の検討しか行うことができず、線維芽細胞との共培養で本当にLNCaP細胞の分化が変化しないのかどうかが確定できなかった。原因であるが、前立腺癌組織から初代培養した複数の線維芽細胞を上手く培養できなかったことが大きく寄与している。この点を改良するために現在、in vitro共培養実験に使用できる線維芽細胞を再度、確認中であり、次年度までに改善したい。本年度は、前立腺間質における線維芽細胞の多様性がアンドロゲン感受性ヒト前立腺癌LNCaP細胞に与える影響を検討する目的で、複数の前立腺癌患者の針生検組織から初代培養して得られた線維芽細胞pcPrFsとLNCaP細胞とのin vitro共培養実験を施行した。実験には市販されている正常ヒト前立腺間質細胞PrSCを比較対象細胞として使用した。Falconセルカルチャーインサートを用いたin vitro共培養実験では、LNCaP細胞に対してPrSCおよびpcPrFsそれぞれを組み合わせて、24時間および48時間の共培養を行った後に、LNCaP細胞における癌抑制遺伝子(TP53, NKX3-1, TP16)および癌遺伝子(NFKB1, SRC, MYC)のmRNA発現量をTaqMan probeを用いたリアルタイムPCRにて比較検討した。その結果、PrSCおよびpcPrFsいずれの線維芽細胞との共培養群でもTP53およびTP16 mRNA量に明らかな変化は認められなかった。一方、NKX3-1 mRNA発現量は複数のpcPrFsとの共培養群で低下することが明らかとなった。また、NFKB1およびSRC mRNA発現量は複数のpcPrFsとの共培養群で増加したものの、MYC mRNA発現量に明らかな変化は認められなかった。以上の結果より、癌患者由来線維芽

細胞pcPrFsが産生・分泌するパラクライン因子は、LNCaP細胞の増殖を促進させる細胞増殖因子やサイトカインだけでなく、LNCaP細胞における癌関連遺伝子発現を変動させる、例えばエクソソームに内包されるmiRNAが重要な役割を担っている可能性が示唆された。本年度は前立腺癌患者由来線維芽細胞の培養で困ることもなく、順調に癌抑制遺伝子5つと癌遺伝子3つのリアルタイムPCRを施行することができた。本年度は、前立腺癌細胞におけるアンドロゲン感受性の強さと線維芽細胞からのパラクライン刺激への反応性との関連を検討する目的で、アンドロゲン感受性ヒト前立腺癌LNCaP細胞から樹立したアンドロゲン低感受性の亜株E9, F10および不応性の亜株AIDLと、複数の前立腺癌患者の針生検組織から初代培養して得られた線維芽細胞pcPrFsとのin vitro共培養実験を施行した。pcPrFsとのin vitro共培養において、E9およびAIDL細胞の増殖率は有意に上昇した。また、E9細胞では細胞内前立腺特異抗原PSAタンパク質発現量が増加した。一方、F10細胞の増殖率および細胞内PSAタンパク質発現量に変化は認められなかった。精製EGF処理したE9およびAIDL細胞の増殖率は有意に上昇するとともに、リン酸化AktおよびMAPKタンパク質発現量が顕著に増加した。一方、F10細胞の増殖率は精製EGF処理でも変化しなかった。さらに、精製EGF処理したF10細胞ではリン酸化AktおよびMAPKタンパク質発現量に変化は認められなかった。精製EGF処理したE9細胞からのPSA分泌量は有意に増加した。F10細胞ではアンドロゲン受容体ARのスプライスバリアントAR-V7の発現を認めた。以上の結果より、我々はLNCaPを親株とした2つのアンドロゲン低感受性の亜株(E9およびF10細胞)を用いることで、アンドロゲン低感受性という共通の特徴を有する癌細胞であっても線維芽細胞からのパラクライン刺激に反応する癌細胞(E9細胞)と反応しない癌細胞(F10細胞)が共存している可能性を明らかにした。また、アンドロゲン不応性の前立腺癌細胞であっても線維芽細胞からのパラクライン刺激に反応したことは、ホルモン治療が無効な低分化な前立腺癌細胞に対しては癌細胞内シグナル伝達経路が重要な治療標的となることを示唆するものと考えた。本年度に苦労した線維芽細胞の培養については、凍結保存した時の線維芽細胞の状態が大きく寄与しており、状態の良い線維芽細胞しか凍結保存しない、という研究室内のルールを策定した。一方、in vitro共培養実験にて既に作製したcDNAを用いて、TP53以外の癌抑制遺伝子の発現量をリアルタイムPCRにて検討予定としており、本年度の遅れを早急に取り戻せるよう計画している。これらの結果を元に、次年度は癌抑制遺伝子のDNAメチル化状態を検討する予定である。次年度は、アンドロゲン感受性LNCaP細胞から樹立したアンドロゲン低感受性やアンドロゲン不応性の亜株についても検討を進めていき、最終目標である癌抑制遺伝子もしくは癌遺伝子のメチル化状態を検討したい。