hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Lambertellaによるマイコパラサイト現象の生物有機科学的解明

リンゴ果実における、Lambertella種のMonilinia fructigenaに対するマイコパラサイト現象を物質レベルで検討した。マイコパラサイトの一つであるLarabertella sp.346は、盛んにlambertellol類を生産する。lambertellol類のうち5種は、本研究課題で申請者らによって見出された新規化合物であるが、Monilinia fructigenaに対して強い抗菌活性を示し、本マイコパラサイト現象への関与が示唆された。ところが、同現象を示すLambertellacorni-mariSの場合、それらlambertellol類を生産するものの、極めて微量であり、共通のメカニズムでマイコパラサイト現象が引き起こされているとするならば、lambertellol類は原因物質でないと考える必要があった。種々条件を検討したところ、Lambertella corni-marisの場合もホストMoniliniafructigenaと共培養した場合著しい量のlambertellol類を生産することが判明した。また、菌糸を除いたホスト培養液の添加でもlambertellol類の生産が増大し、化学物質の存在が示唆された。しかしながら、活性物質の分画には再現性が低く特定の化学物質ではないことが判明した。一方、ホスト培養液は強い酸性であることが判明した。そこで、Lambertella corni-maris培養開始時に、クエン酸を添加し酸性にして培養したところ、lambertel lol類生産性の増大を再現できた。また、本現象は塩酸の添加でも再現でき、lambertellol生産の増大はプロトン濃度によるものであることが明らかになった。1912年堀によって発見されたリンゴ果実夏稔病菌Phaeosclerotinia nipponica Horiは分生子世代と完全世代で様子が大きく異なる糸状菌と注目された。1990年原田は、本病はチャイロミ菌核菌Lambertella sp.が、リンゴ灰星病菌であるMonilinia sp.に対してリンゴ果実上で引き起こしたマイコパラサイト現象の二つの菌を一種と報告したものであることを明らかにした。申請者は本マイコパラサイト現象を支配する物質を、ホスト及びパラサイト代謝物から見出し、物質レベルで解明することを目的とし、研究を展開した。Lambertella sp.1346を^<13>C-ラベル酢酸存在下培養した生合成実験では、極めて効率的にラベル酢酸がlambertellinに取り込まれた。マススペクトルを応用して取り込み率を求める方法の開発を行った。開発した手法は2%の取り込み率の違いを明白に区別できることが判明した。これを応用し、取り込み率の最適化を行い、炭素量比較で0.5%以下の^<13>Cラベル酢酸の添加条件での培養にもかかわらず48%という、これまでに無い高い取り込みに成功した。このような高い取り込み率の場合、マススペクトルはisotopomer存在のため特徴的なイオンパターンを示した。生合成関連物質も類似のマススペクトルシグナルパターンを示すと仮定し、これを指標に生合成関連物質の探索を行い、neolambertellinと命名した新規化合物の単離に成功した。本化合物は微量であり、培養抽出物から構造を確定するに十分なスペクトルデータを得ることはできなかった。そこで天然物のlambertellolから合成し、その構造を確認した。マイコパラサイトの一つであるLambertella sp.1346は、盛んにlambertellol類を生産する。ところが、同現象を示すLambertella corni-marisの場合、それらlambertellol類を生産するものの、極めて微量であり、共通のメカニズムでマイコパラサイト現象が引き起こされているとするならば、lambertellol類は原因物質でないと考える必要があった。

種々条件を検討したところ、Lambertella corni-marisの場合もホストMonilinia fructigenaと共培養した場合著しい量のlambertellol類を生産することが判明した。また、菌糸を除いたホスト培養液の添加でもlambertellol類の生産が増大し、化学物質の存在が示唆された。しかしながら、活性物質の分画には再現性が低く特定の化学物質ではないことが判明した。一方、ホスト培養液は強い酸性であることが判明した。そこで、Lambertella corni-maris培養開始時に、クエン酸を添加し酸性にして培養したところ、lambertellol類生産性の増大を再現できた。また、本現象は塩酸の添加でも再現でき、lambertellol生産の増大はプロトン濃度によるものであることが明らかになった。
容積感受性アニオンチャネルVSORと新規関連タンパク質LRRC8Aの相互作用機構

LRRC8Aがヒト細胞の容積感受性外向整流性アニオンチャネルVSORの重要構成分子であることが報告された。本研究では、1LRRC8Aは、マウス細胞のVSORにおいても本質的な役割を果たすこと、2本分子の関与は、酸感受性外向整流性アニオンチャネル(ASOR)、マキシアニオンチャネル(Maxi-Cl)、Ca2+賦活性アニオンチャネル(CaCC)やcAMP賦活性アニオンチャネル(CFTR)には見られず、VSOR特異的であること、しかし、3シスプラチン耐性がん細胞KCP-4のVSOR活性欠乏の原因には、LRRC8AやLRRC8BEは関与せず、未知の他分子の関与が不可欠であることを明らかにした。細胞容積調節のメカニズムにおいて主役を果たすことにより、細胞分裂・増殖や細胞移動や細胞死誘導にも重要な役割を果たしている容積感受性外向整流性アニオンチャネルVSORの分子実体は長く不明であった。しかし、2014年4月に、LRRC8Aがヒト細胞のVSORの重要構成分子として発見された。そこで私達は、まず第1にマウス細胞においてもLRRC8Aが同様にVSORの重要構成因子であることを本研究において確認した。第2に、LRRC8AがVSOR以外のアニオンチャネル活性に関与する可能性を検討し、マウス細胞のCFTR (cAMP賦活性アニオンチャネル)、CaCC(Ca2+賦活性アニオンチャネル)、Maxi-Cl (マキシアニオンチャネル)、そしてASOR (酸感受性外向整流性アニオンチャネル)には何ら関与していないことを明らかにした。そこで、第3に、VSORとの間でタンパク質・タンパク質相互作用を示すことが知られているABCF2が、LRRC8Aと相互作用・結合するかどうかを免疫共沈降法で検討したとこところ、相互作用・結合はしないことを明らかにした。また、第4に、VSOR電流をごくわずかしか示さないKCP-4細胞が、VSOR電流を豊富に示す親細胞KB細胞に比して、LRRC8A遺伝子の発現が非常に乏しいかどうかをマイクロアレイ法で検討したところ、殆ど両者に差がないことを明らかにした。以上の結果より、1LRRC8Aは、ヒトのみならずマウス細胞においてもVSORの必要構成分子であること、しかし、2VSOR分子実体にはLRRC8A以外の未知の分子も不可欠であること、更には3他のアニオンチャネルではLRRC8Aは関与しないことが明らかになった。すべて計画通りの研究を実施できた。その結果、第1に、マウス細胞のVSORにおいてもLRRC8Aが不可欠の役割をすることを明らかにし、第2にVSOR以外の既知の4種のアニオンチャネル(ASOR、CaCC、Maxi-Cl、CFTR)のすべてにおいて、LRRC8Aは関与しないことを明らかにし、第3に、このLRRC8Aは、VSORとタンパク質ータンパク質相互作用する細胞内ABCタンパク質であるABCF2とは相互作用・結合しないことを明らかにし、第4にKCP-4細胞のVSOR活性の乏しい原因は、LRRC8A遺伝子発現量の少なさにあるのではないことを明らかにした。これらの発見は、すべて世界はじめてのものである。細胞容積調節メカニズムにおいて主役を果たすことにより、細胞分裂・増殖や細胞移動や細胞死誘導にも重要な役割を果たす容積感受性外向整流性アニオンチャネルVSORの分子実体は長く不明であったが、2014年にLRRC8Aがヒト細胞VSORの重要構成分子として発見された。そこで私達は、平成27年度において、マウス細胞においてもLRRC8AがVSOR活性に不可欠であることを初めて確認した。そして、VSOR以外の4種のアニオンチャネル、即ちCFTR(cAMP賦活性アニオンチャネル)、CaCC(Ca2+賦活性アニオンチャネル)、Maxi-Cl(マキシアニオンチャネル)、ASOR(酸感受性外向整流性アニオンチャネル)、にはLRRC8Aは何らの関与もしないことを明らかにした。加えて、VSOR活性の乏しいシスプラチン耐性がん細胞KCP-4におけるLRRC8A遺伝子発現レベルは、その親細胞であり、VSOR活性が豊富なシスプラチン感受性がん細胞KBのそれと差がないことを示した。平成28年度においては、1ASORにはLRRC8の他メンバーLRRC8BEもまた全く関与しないこと、2ヒトがん細胞HeLaにおけるVSOR活性に、LRRC8Aに加えて他LRRC8メンバー(特にLRRC8CとD)が不可欠であること、3LRRC8AはVSOR不活性化スピードを遅くする役割もするが、他LRRC8メンバーは不活性化には関与しないこと、4VSOR活性の乏しいKCP-4細胞にLRRC8A+LRRC8C/Dを強制発現してもVSOR活性を亢進することはなく、VSOR活性にはLRRC8メンバー以外の未知の分子Xが構成分子として不可欠であること、そして5このX分子が不活性化スピードを速くする役割を果たすことが示唆されること、などを示した。

平成28年度という、残された1年間の研究期間においては、次の研究を実施する。第1に、LRRC8Aは他の4つのLRRC8メンバー(LRRC8BE)のいずれかと共に発現することが必要であること、そしてそれらの組合わせの違いにより、VSORの髙陽電圧下での不活性化キネティクスの違いがもたらされることがHCT116細胞で報告されているが、HeLa細胞においても同様であるかどうか、同様であるとすれば、どのメンバーが必要なパートナーであり、どのメンバーが不活性化を速めたり遅めたりするのかを、ダブルノックダウン法やトリプルノックダウン法を用いて検討する。第2に、VSOR分子との相似性が議論されてきたASORへのLRRC8BEの関与の可能性を検討する。第3に、LRRC8AとパートナーメンバーLRRC8X(LRRC8BEのいずれか)の強制共発現によって、VSOR電流の亢進がもたらされるかどうか、もしもたらされない場合には何がミッシング分子(注:我々は、いま2つのミッシング分子Yの候補タンパク質を手にしている。)なのか、などの検討を行い、LRRC8分子のVSORのポア形成への関与の可能性の有無を確定する。第4にミッシング分子Yが特定された場合には、「LRRC8A+LRRC8X+Y」のトリプル強制共発現系を作成し、それら3分子への部位特異性・電荷変動的アミノ酸変異を導入して、これによってアニオン選択性や単一チャネルコンダクタンスやATPオープンチャネルブロッキングなどポア性状に変化がもたらされるかどうかを検討する。以上の結果を総合して、LRRC8AはVSORのポア形成に関与する分子なのか、単なるレギュレータ分子なのかを確定する。生理学一般第1に、実験が順調に進み、試薬類の使用が当初の予想より、下まわったこと、そして第2に、出席予定であった外国での国際シンポジウムの開催が1年延期されたことにより、用意していた外国出張旅費が未使用となったこと。別の資金で雇用していた外国人ポスドクの人件費が、平成27年度で切れたが、平成28年度も引き続き雇用しなければならないので、その資金の一部として使用する。
視細胞で光依存的・ロドプシン非依存的に起こるPKA活性変化の生理的意義とは？

桿体視細胞のProtein kinase A (PKA)が光に応答して活性化される仕組みと、PKAが視細胞の視覚感度に与える影響の解明を目指す。桿体視細胞は夜間視(暗所視)を司る網膜の光受容細胞だが、その感度がPKAの作用で上昇することが近年報告された。しかし、生理学的な条件下で桿体PKAが活性化される仕組みは謎だった。申請者は、多光子蛍光顕微鏡で生きた網膜細胞の中のPKA活性を直接観察する技法を編み出し、それを用いて網膜に光が当たると桿体視細胞でのみ約15分間PKAが活性化されることを発見した。本研究では、この新規現象を司る光受容体の同定と、PKAが視覚感度に及ぼす影響を研究する。
ミトコンドリア機能が関与する分裂酵母の硫黄同化経路の解析とシステイン生産への応用

分裂酵母の硫酸同化反応の一部はミトコンドリアで行われる点で特徴的であるが、ミトコンドリア依存型の硫黄同化系を対象とした研究はこれまでほとんど例がない。一方、申請者はミトコンドリアHtm2タンパク質が分裂酵母の硫酸同化に必須であり、Hmt2がチオ硫酸合成に関与することを見出した。これらの新知見を端緒に開き、本研究では、分裂酵母の硫黄同化経路の全容を明らかにすることを目的とする。また、硫酸からチオ硫酸へ変換する酵素群を大腸菌を用いた物質生産に応用し、システイン生産効率の向上とコストの大幅な削減に挑戦する。
庭園空間の音環境に関する研究-對龍山荘の水音と環境音

庭園空間の音環境に関する研究-對龍山荘の水音と環境音對龍山荘庭園は明治時代後期に植治こと小川治兵衛によって改修・作庭された。本研究においては、環境音レベル等を記録・計測するとともに、造園技術における音の取り扱いを探ろうとするものである。調査実施日及び調査内容1994年8月24日:予備調査11月24日:庭園内環境音レベル分布調査及び環境騒音レベルの終日計測主要水音のFFT分析及び主要環境音のDATによる採音12月1316日:聚遠亭周辺における滝音レベル分布調査主要滝音の庭園内視点場による騒音レベル変化の調査1995年3月78日:周辺環境音と庭園内騒音レベルの相関関係調査調査結果及び考察1)對龍山荘庭園の環境騒音レベル変化は、38dB(A)45dB(A)の約7dB(A)の比較的狭い範囲にある。これは、庭園内の水音が終日止まらないことによると思われる。2)聚遠亭と蹴上交差点の騒音レベル変化の相関関係は0.003、庭園北部四阿と北部隣接道路の騒音レベル変化の相関関係は0.23であった。これは、本庭園が周辺環境騒音レベルの変化を受けにくい音環境を持っていることを示唆する。特に滝音・水音が周辺環境音をマスキングしていると思われる。庭園内環境騒音レベル分布における滝音・水音の優位は明白である。しかし、この水音の聞こえ方と地形には大きな関連性が存在すると思われる。4)小川治兵衛は、對龍台前の滝及び正面の大滝、聚遠亭前小池より南の流れをつけ加えた。この改修部分と水音の騒音レベル分布、及び聞こえ方を照らし合わせた場合、断定は出来ないが、小川治兵衛が作庭時に意識的に水音を操作していた可能性が示唆できる。これについては、文献等により更に検討を加えたい。
電子伝達機能をもつタンパク質/色素超分子複合体の構築

光合成膜の光収穫系(アンテナ色素複合体)から光化学反応中心への効率の良い電子伝達は諸種のタンパク質/クロロフィル色素複合体からなる超分子システムで行われている。先に我々は、光合成細菌のアンテナ色素複合体での光収穫系(LH)タンパク質によるクロロフィル色素誘導体の組織化についてモデル的に検討を行ったところ、界面活性剤中でLHタンパク質とバクテリオクロロフィル(BChla)を用いて光合成膜のアンテナ色素複合体と類似した超分子複合体(LH/BChla complex λmax=870nm)を構築できることがわかった。また、このLHタンパク質とクロロフィル色素のかわりに新たに合成したメソポルフィリン誘導体との複合体もアンテナ色素複合体と類似した性質をもつことがわかった。本年度は、アンテナ色素複合体でのクロロフィル色素誘導体の組織化について合成ポリペプチドを用いてモデル的にさらに検討するために、LHタンパク質に比べ、単純なアミノ酸配列ながらも疎水性コアにHis残基を有する自己会合性ポリペプチド(HAHA)を用い、BChla(λmax =780nm)およびその誘導体との複合体形成挙動についてUV-vis.、CDおよびNIR-FT-Ramanスペクトルで検討した。その結果、自己会合性ペプチドHAHAは疎水性コアのHis残基によってアンテナ色素複合体と類似したBChla(λmax=863nm)およびその誘導体の組織化をできることがわかった。
異なるタイプの動脈瘤（紡錘瘤・嚢状瘤・解離性動脈瘤）発症機序の解明

IL-1Ra欠損マウスの自然発症大腿動脈瘤形成過程を詳細に観察し、炎症性動脈瘤はまず外膜側の炎症から始まり、次いで内膜肥厚を来し、その後血管径拡大・動脈瘤形成を来すことが分かった。この炎症性動脈瘤形成には炎症惹起能力の高いIL-1Ra欠損炎症細胞が大きく関与していることを明らかにし、論文発表することができた。またこの外膜炎症抑制には糖尿病治療薬の1つであるDPP-4阻害薬が有効であることを見出し、論文発表した。さらに、紡錘瘤や嚢状瘤、解離性動脈瘤では病変部の炎症細胞の構成成分が大きく異なり、発症機序解明につながる所見も得られた。更なる検討を継続し、論文化する予定である。動脈瘤形成における要因を検討するため、申請時に示したIL-1Ra欠損マウスを用いて、3つの実験を施行した。1つ目としては外膜側に多数の炎症細胞が見られた後に動脈瘤形成を来すことが分かったので、骨髄由来の炎症細胞における抗炎症性サイトカインのIL-1Raの欠損が大きく関与している可能性を考え、野生型マウスとIL-1Ra欠損マウスの骨髄移植を施行した。早期の炎症性動脈瘤形成モデルとして、大腿動脈周囲にカフを巻き付けるモデルを使用した。野生型マウスの骨髄をIL-1Ra欠損マウスに移植するとIL-1Ra欠損マウスの骨髄を移植した場合より外膜側の炎症細胞数は減少し、血管の炎症や内膜肥厚、血管拡大を抑制することが分かった。逆に野生型マウスにIL-1Ra欠損マウスの骨髄を移植すると、野生型マウスの骨髄を移植した場合と比較して、外膜側の炎症細胞数は増え、血管の炎症やリモデリングが促進することが分かった。このことは、IL-1Raを動脈瘤形成抑制に有用である可能性を示唆している。2つ目は、同様のカフ誘導の外膜炎症モデルにDPP-4阻害薬のアログリプチンを投与することで、炎症性動脈瘤の初期状態を抑制しうるかを検討した。DPP-4阻害薬投与群は生食投与群と比較して、血管の炎症・リモデリングが有意に抑制される結果が得られた。3つ目はIL-1Ra欠損マウスと野生型マウスにアンジオテンシンIIを持続投与し、動脈瘤形成に関して差が生じるかの検討を行った。途中経過として、IL-1Ra欠損マウスでは野生型マウスより、血圧の有意な上昇、腎機能の有意な悪化、大動脈の炎症の有意な増悪を来すことが分かった。これはアンジオテンシンII誘導高血圧抑制にIL-1Raが寄与しているという全く新しい知見が得られたと思われる。これらの結果は、国内外の学会で発表することができた。平成26年度は大腿動脈瘤形成の観察を行い、まず外膜側への炎症細胞浸潤で始まることより、外膜炎症刺激モデルの大腿動脈カフ傷害を使用した研究を行った。外膜側に集積する炎症細胞の効果を明らかにするため、IL-1Ra欠損マウスと野生型マウスの骨髄を野生型マウスに移植したところ、IL-1Ra欠損骨髄由来の炎症細胞は大腿動脈周囲に有意に多く浸潤し、血管の炎症・新生内膜形成の促進を起こした。逆に野生型マウスの骨髄をIL-1Ra欠損マウスに移植すると血管傷害後の炎症と内膜肥厚が有意に抑制されることが分かった。このことはIL-1Ra欠損骨髄由来の炎症細胞が大腿動脈瘤形成に大きく寄与していることを示していると考えられた。この成果を論文にし、J Atheroscler Thromb (21:1208-18,2014)に発表した。更に最近抗炎症作用が証明されているDPP-4阻害薬(アログリプチン)が外膜刺激モデルにおける炎症および内膜肥厚を抑えうるかの検討を行った。大腿動脈の外膜刺激前より経口投与にてアログリプチンを内服させると生食を投与させて群に比較して、炎症および内膜肥厚を有意に抑制することが分かった。従来、動脈瘤進展抑制には降圧薬であるアンジオテンシン受容体拮抗薬やβ遮断薬などの有用性は示されていたが、血糖コントロールとは無関係にDPP-4阻害薬にその可能性があることを本研究は示している。この成果も論文化してアメリカ心臓議会の機関紙であるJ Am heart Assoc (4: e001469,2015)に発表した。上記に平行して、アンジオテンシンII負荷によるIL-1Ra欠損マウスの腹部大動脈瘤形成モデルの確立を開始し、その詳細な検討を平成27年度に行うこととした。平成26年度までに、IL-1Ra欠損マウスの大腿動脈瘤の形成過程を詳細に観察し、炎症性動脈瘤はまず外膜側の炎症から始まり、その後内膜肥厚や動脈瘤形成を来すことが分かった。この炎症性動脈瘤形成には炎症惹起能力が高いIL-1Ra欠損炎症細胞が大きく寄与していることを明きらかにした。この外膜炎症抑制には糖尿病治療薬であるDPP-4阻害薬が有効であることも明らかにした。上記に平行して行っていたアンジオテンシン(AngII)負荷によるIL-1Ra欠損マウスの腹部大動脈瘤形成モデルは再現性の高いことが、平成27年度の研究で明らかになった。そこで野生型マウス(WT)とIL-1Ra欠損マウス(IL-1Ra-/-)に対し、AngIIを28日間投与し比較した。

投与7日目の腹部大動脈におけるIL-6, TNF-α及びMMP-9のmRNAの発現は、WT群に対しIL-1Ra-/-群で有意に高かった。また、AngII投与14日後の収縮期血圧及び腹部大動脈径はIL-1Ra-/-群で有意に高値を示していた。しかし、IL-1Ra-/-では大半が、AngII投与中に大動脈瘤破裂により死亡した。そこで、投与期間を14日間と縮小し、投与開始28日後に解析を行った。興味深いことに両群に血圧に有意な差を認めないものの、腹部大動脈径はIL-1Ra-/-群で有意に拡大していた。腹部大動脈の病理像では、IL-1Ra-/-群において動脈径拡大部位に多数の炎症性細胞浸潤・弾性板の断裂を認めたが、WT群では認めなかった。これらの結果より、IL-1RaがAngIIによって誘導された炎症を増悪させ、動脈瘤形成を促進する作用を持つことが明らかになった。AngII投与中止後に、血圧が正常化したにもかかわらず、この作用は継続することも示された。以上の成果を2015年のヨーロッパ心臓病学会に発表した。IL-1Ra欠損マウスの自然発症大腿動脈瘤形成過程を詳細に観察し、炎症性動脈瘤はまず外膜側の炎症から始まり、次いで内膜肥厚を来し、その後血管径拡大・動脈瘤形成を来すことが分かった。この炎症性動脈瘤形成には炎症惹起能力の高いIL-1Ra欠損炎症細胞が大きく関与していることを明らかにし、論文発表することができた。またこの外膜炎症抑制には糖尿病治療薬の1つであるDPP-4阻害薬が有効であることを見出し、論文発表した。さらに、紡錘瘤や嚢状瘤、解離性動脈瘤では病変部の炎症細胞の構成成分が大きく異なり、発症機序解明につながる所見も得られた。更なる検討を継続し、論文化する予定である。大腿動脈瘤形成機序に関する研究として、まず抗炎症性サイトカインであるIL-1Raがない炎症細胞が瘤形成に大きく関与していることを明らかにすることができ、論文発表まで行えた。更に、DPP-4阻害薬のアログリプチンが血糖コントロールに依存せずに抗炎症作用を発揮し、動脈瘤形成抑制の新しい治療薬となりうる可能性を示した。これも論文発表することができた。現在、アンジオテンシンII負荷によるIL-1Ra欠損マウスにおける腹部大動脈瘤形成モデルを確立中で、概ね順調であると思われる。分子血管学大腿動脈瘤の3つのタイプに関する病理的な検討は進行中で、免疫染色によりそれぞれのタイプの動脈瘤の外膜には異なった炎症細胞が優位に存在することを明らかにできている。この変化に関して、さらにサイトカイン発現やMMP発現に関する免疫染色を進める予定である。さらに、それぞれの動脈瘤の外膜側よりmRNAやタンパクを抽出し、発現パターンの特徴を明らかにしていく。平成26年度の検討で行ったアンジオテンシンII負荷モデルの検討では、野生型マウスと比較してIL-1Ra欠損マウスでは血圧上昇や腎臓の炎症が有意に惹起されることが分かった。この結果は今まで報告されている高血圧発症機序とは異なるため、新しい治療法開発の鍵になるのではないかと考えている。平成27年度はアンジオテンシンII負荷モデルの更なる解析を推進する予定である。動脈瘤形成機序にIL-1Raが大きく寄与していることを明かにすることが出来たことや、DPP-4阻害薬が動脈瘤形成抑制に使える可能性を示すことができた。更に、アンジオテンシンII負荷による高血圧抑制にIL-1Raが大きく関与しているといった全く新しい知見を得ることができ、来年度以降の研究で新しい治療法開発に関する鍵が得られたと思われる。
緊張係留された水中トンネルの動的非線形特性に関する研究

緊張係留された水中トンネルの非線形挙動の解明のために,水中トンネルをテンションレグにより係留(鉛直,斜め)された鉄筋コンクリート製円形断面にモデル化して,以下の項目について解析を行い新たな知見を得た。1.自由振動解析:(1)海底面位置のみを変化させた場合,その増加とともに水平方向,上下方向周期は単調に増加する。また,トンネルの設置水深(海面下の距離)を変化させた場合,その増加とともに水平方向,上下方向周期は単調に減少する。(2)斜レグ角度が増大すると,水平と上下の周期が近づくために一次同調を避けられる周波数領域が狭くなる。また,上下方向周期はレグの軸剛性のため全領域にわたって低い値でほぼ一定値を示す。2.周波数応答解析:(1)鉛直係留の場合,水平方向変化量は海底面位置,設置水深により大きく変化する。しかし,レグに発生する張力は,水平方向変位が増しても安定的に小さい。さらに,水平方向力によるスラックは発生いしない。(2)斜係留の場合,水平方向の変化量は鉛直係留の場合のそれに比べて格段に小さい。しかし,張力の変動振幅が大きく,スラックの発生が見込まれる。ただし,海底面位置や設置水深,斜レグの傾角の変化によって,水平方向変位量および発生張力は大幅に改善される。特に,斜レグの傾角の増加は影響が大きく,スラック防止には効果的である。3.非線形応答解析:(1)解析法として,係留索のスラックとトート状態に応じた運動方程式の解を接続し応答を逐次追跡する手法を提示し,数値的にスナップ荷重を含む非線形挙動を再現できた。(2)スナップ荷重の発生領域はトンネル断面の大小には影響を受けない。
高次元の母数を含む指数型分布族の推測

初年度には経験ベイズ法の研究を推進した。高次元母数モデルの推定において、自然共役事前分布とピタゴラス関係の視点から研究した。自然共役事前分布は、指数分布族と一般化線型モデルの研究で開発されてきた手法で新しい展開を行うことができた。次年度には経験ベイズ法と推定関数を両面からの研究を行った。まず、自然共役事前分布の研究では事後モードの利用を検討した。通常の事後平均に比べて、自然共役事前分布の定義を広くできることが分かった。またこの関連でl-加法的な分布族を導入した。更に一般化線型モデルの連結関数について強不偏性からの特徴づけを試みた。推定関数と経験ベイズ法を平行して研究することにより、一方のみでの研究からは見え難い面に注目できた。その一つとして平均値母数と位置母数の相補的な関係に目をつけた。ベイズ的視点では平均の方が扱い易いと思われるが、推定関数では類似した解析的構造でありながら、位置母数の方が扱い易い場合がある。この点は研究成果に連がると共に、今後の研究の道標と期待できる。この研究では、今日の理論研究において標準的な方向を目指した。理論面での裏付けは分布族の解析的な性質が解明されてきた事実に依拠している。一方応用面では、通信情報機器の進歩に裏打ちされた、良い設計の下での高次元データを対象にした。本研究でも教育試験を一つのターゲットとした。この研究の遂行で協力を得たのは藤井(宮崎大)、藤岡(広島大)、山本(岡山理大)、また平成13年と14年の客員教授である北里大学の竹内、東京大学の大橋がいる。更に途中からは程(北京工業大)が研究所に滞在して研究に携わった。全体として、自然共役事前分布、一般化線型モデルから高次元母数モデルの構造と推測に寄与することができた。研究の方向は多くの母数(あるいは要素)を局外母数として取り扱う、推定方程式、経験ベイズ法がある。その1つの結果は直交性から導かれる推定方程式である。こうした中で平均母数の再母数化と(純粋の)ベイズ統計的方法を通した頻度論的手法の構成である。本年度の研究は推定方程式と経験ベイズ法との関連、事前分布としての分布族、モデル選択を課題とした。研究協力者としては藤井(宮崎大)、藤岡(広島大)、大西(総研大・院生)がいる。更に山本(岡山理大)、藤澤(統数研)、比江島(山梨医大)とも研究交流をもち刺激を受けた。これらの一線・中堅の研究者より若い研究者が関心を持ちつつある。また北里大学の竹内は本年度の客員教授であるので共同研究を行った。研究成果としては事前分布族とその推測の研究を行った。更にCoulombポテンシャルとのつながりが見えた。更に、「推定関数の解が存在しない場合の推定関数の改善」と表現できるような、従来の推定関数の理論では想像しなかった方向への研究の展望が拓けた。また以前に導出した共役事前分布の相対エントロピー表現を発展させ、多くの共役事前の一般化を研究した。全体の計算量では共役事前分布に劣らない場合が多いことを確かめた。本年度の研究を通して見えてきたことは事後尤度の修正である。事後尤度の核となる部分を、変数変換に関して不変な量として、定義することにより、共役分布に関する新しい展開が望める。また平均母数を位置母数と見なすことにより、指数分布族としては見え難い別の視点がある。

しかも物理的解釈が容易になるので来年度の展開を期待している。昨年度には経験ベイズ法の研究を推進した。高次元母数モデルの推定において、自然共役事前分布とピタゴラス関係の視点から研究した。自然共役事前分布は、指数分布族と一般化線型モデルの研究で開発されてきた手法で新しい展開を行うことができた。これを踏まえて、今年度には経験ベイズ法と推定関数を両面からの研究を行った。まず、自然共役事前分布の研究では事後モードの利用を検討した。通常の事後平均に比べて、自然共役事前分布の定義を広くできることが分かった。またこの関連でl-加法的な分布族を導入した。更に一般化線型モデルの連結関数について強不偏性からの特徴づけを試みた。強不偏性は母数の直交性と直接に関係するので、多次元母数モデルの推測にとって将来性のある方法と期待される。この中で一つの適応分野である無作為化項目試験についても研究をした。この為に藤井(宮崎大)、藤岡(広島大)、山本(岡山理大)との共同研究を行った。また平成13年と14年の客員教授である北里大学の竹内、東京大学の大橋も参加した。試験への適用は、仁田(東京医歯大)、前川(東工大)、前田(統数研)が参加した。今年度途中からは程(北京工業大)が滞在して研究に携わった。全体として、自然共役事前分布、一般化線型モデルから高次元母数モデルの構造と推測に寄与することができた。また別の寄与は応用分野での視点である。規範的規準よりも相対的規準による推測が重要である点がより明確になってきた。そうした相対的規準による推測を支える技術が高次元母数モデルでの推測である。
ミトコンドリア由来活性酸素種に依存した新規TGFβシグナルとその生物学的意義

TGFβによる悪性化形質関連遺伝子MMP-9の転写制御機構について、主にマウス乳腺上皮細胞を用い、関与する転写因子をsiRNAによるスクリーニングにより検索した。その結果、cAMP応答配列結合因子(CREB)がMMP9の転写をHDAC3などその他の転写共役因子とともに負に制御する可能性が示唆された。また、TGFβ刺激によりミトコンドリアからの活性酸素産生が上昇し細胞内が酸化状態に傾くが、この変化がシグナルとして重要であった。TGFβシグナルについて、ミトコンドリアに依存して遺伝子発現を制御する経路が存在することを見出した。この経路はTGFβにより誘導される遺伝子のうち、約15%の遺伝子発現に関与していた。その中には細胞の接着、運動、浸潤の制御に関わるものが多く含まれていたが、特にがん細胞の浸潤に重要なmatrix metalloproteinase-9(MMP-9)が含まれていた。一方、この経路はTGFβによる増殖抑制活性には必要とされず、TGFβによる細胞の悪性化形質誘導に特異的な経路であると考えられた。そこで、TGFβ刺激によるミトコンドリアの活性変化について、マウス乳腺上皮細胞を用いて検討したところ、TGFβ処理によりミトコンドリア呼吸鎖複合体1の活性の低下とともにミトコンドリア膜電位が低下し、活性酸素の産生も抑制された。これらの変化がシグナルとなって遺伝子発現の変化につながると考えられた。そこで、TGFβによるMMP-9発現制御メカニズムの詳細を検討したところ、転写因子CREBをコアとする転写抑制複合体が関与していることが示唆された。CREBは核とミトコンドリアに局在する転写因子であり、そのリン酸化状態は、TGFβ刺激によりミトコンドリア内活性酸素濃度の低下と呼応して上昇する。今後、CREBを中心に、ミトコンドリア活性変化を介するTGFβシグナル伝達系の全容を分子レベルで明らかとする予定である。TGFβによるMMP-9の転写制御機構を解析するために、主にマウス乳腺上皮細胞を用い、関与する転写因子についてsiRNAを用いたスクリーニングを行った結果、核とともにミトコンドリアにも局在が示唆されているCREBの関与が示唆された。CREBの発現を低下させるとTGFβによるMMP-9の誘導が特異的、且つ顕著に促進され、逆に過剰発現によってはその発現が抑制された。これらのことからCREBが抑制的にMMP-9の発現制御に関わっていることがわかった。一方、TGFβの主要なシグナル伝達因子であるSmadについて、MMP-9誘導への関与を同様に検討したところ、Smad3、4が促進的に関与していることがわかった。そこで、CREBによる抑制的制御の標的がSmad複合体の転写活性である可能性について、Smad結合配列レポーターを用いて調べたところ、CREBがSmadの転写活性を抑制することがわかった。さらにCREBの変異体を用いた検討から、MMP-9の発現抑制、Smadの転写活性の抑制機能にはCREBのDNA結合能とともにSer-133のリン酸化が必要であることが示唆された。実際、TGFβ処理によりCREBのSer-133のリン酸化が10時間以降促進されることが観察された。CREB以外の関与因子としてHDAC3がTGFβによるMMP-9の転写に抑制的に関与することを見出している。また、TGFβによるMMP-9の発現は抗酸化剤(N-acetylcysteine)の存在により顕著に促進された。したがって、CREBのリン酸化、或いは転写抑制活性を制御する上流のシグナルとしては、ミトコンドリアから産生された活性酸素による細胞質の酸化状態が重要であることが考えられた。今後は細胞質の酸化状態が如何に核内の転写因子の活性制御に至るのか、CREBのリン酸化を主な手掛かりとして、CREBとHDAC3、その他の転写関連因子による具体的なMMP-9転写抑制機構を解析する予定である。その成果として、がんの転移に深く関与するMMP-9の発現抑制手段の提案を目指したい。
コヒーレントX線回折顕微鏡のナノ空間分解能とその場観察実現のための解析手法の開発

コヒーレントX線回折顕微鏡(CXDM)が新しいX線顕微法として注目を集めている。原理的にCXDMは入射X線の波長程度の空間分解能を持った実像を再構成可能であるが、実際には入射X線の強度およぴX線検出器の性能に問題があり、その100分の1程度の空間分解能しか実現できていない。この問題を解決する一つの方法が超解像法などの数値解析的な手法を使って、測定された実験データから測定できない実験データを推定し、結果として再構成像の分解能を向上させることである。本研究では、CXDMのための超解像アルゴリズムを開発し、CXDMによる金属材料のその場観察測定実現を目指している。本年度は、昨年度開発した超解像アルゴリズムを実際の実験データに適用してその有効性を評価することを試みた。昨年度、アルミニウム合金および錫亜鉛共晶合金粒子のコヒーレントX線回折測定を行ったが、それらに超解像アルゴリズムを適用するより、既知の構造を持ったテストパターンに適用する方がより厳密にアルゴリズムの有効性を評価できると考え、大阪大学の設備を用いてテストパターンの作製を行った。Si_3N_4膜上に200nm厚さのC_uを蒸着して、収束イオシビーム加工により1μm程度のサイズのテメトパターンを作製した。それを第三世代放射光施設Spring-8に持ち込み、理化学研究所専用のビームラインBL29XULにて入射X線エネルギー5keVでコヒーレントX線回折パターン測定を行った。テストパターンの構造を反映した良質な回折パターンデータの取得に成功し、現在、像再生および超解像アルゴリズムの有効性の評価を行っている。原理的にCXDMは入射X線の波長程度の空間分解能を持った実像を再構成可能であるが、実際には入射X線の強度およびX線検出器の性能に問題があり、その100分の1程度の空間分解能しか実現できていない。本年度はアルゴリズム開発専用の計算機を導入し、計算機シミュレーションによって様々な方法を試みた。その結果、良好な結果が以下に述べる二つの方法で得られた:(1)位相回復アルゴリズムであるHybrid-Input-Output(HIO)アルゴリズムに再生像の強度が不連続になるような拘束条件を付加する。(2)HIOアルゴリズムで得られた分解能の悪い再構成像を初期値として最大エントロピー法を適用する。どちらの方法でも再構成像の空間分解能が向上した。また、これらの手法を実験データに適用するために、大型放射光施設SPring-8においてコヒーレントX線回折顕微鏡装置を開発し、アルミニウム合金および錫亜鉛共晶合金粒子のコヒーレントX線回折測定を行い、良質なコヒーレントX線回折データを得ることに成功した。
レーザ光を用いた非球状マイクロ物質の非接触3次元姿勢操作・加工の研究

本研究では,複数レーザビームによる光ピンセットと画像処理による特徴抽出技術の統合・融合化により,棒状,非球状,ひも状など様々な形状のマイクロ物質の非接触マイクロ操作のための要素技術開発と,マイクロ作業の自動化の可能性に関する知見を得ることを目的として研究を実施し,以下の結果を得た.1.非球状物質の3次元姿勢操作として,(1)3ビーム光ピンセット法による光軸方向の傾き角制御,(2)走査型マニピュレーション法による3次元の回転と並進運動の制御,(3)走査型の走査方向と長さのリアルタイムでの変更によって生じる「てこの効果」を利用した動的3次元姿勢制御の3つの操作法を提案し,これら3次元操作法の有効性を珪藻やウイスカのマイクロ操作で実証した.2.円ハフ変換や一般化ハフ変換を用いて実時間で顕微鏡カラー画像からマイクロビーズや珪藻などの微小物を検出し,検出したこれら微小物に時分割光ピンセット法を用いて生成した多点光ピンセットビームを照射することで自動的に安定して捕捉し,その後配向姿勢を制御しつつ移動させることなどに成功した.これら結果により,実時間画像処理と光ピンセット法の統合による顕微鏡下のマイクロ作業の自動化の可能性とその有効性を実証することができた.3.ガラスキャピラリによる極微量マイクロ試料の顕微鏡下への定量的な取り出し法,PDMS製のマイクロ流路中を流れるマイクロビーズ,細胞等を異なった位置に配置した回収用ウェルに光圧を利用して能動的に分別できること,ひも状の1分子DNAを塊状に可逆的に形状を変換することで光ピンセットによりサイズごとに分別できることなどを実証した.本研究では,複数レーザビームによる光ピンセットと画像処理による特徴抽出技術の統合・融合化により,棒状,非球状,ひも状など様々な形状のマイクロ物質の非接触マイクロ操作のための要素技術開発と,マイクロ作業の自動化の可能性に関する知見を得ることを目的として研究を実施し,以下の結果を得た.1.非球状物質の3次元姿勢操作として,(1)3ビーム光ピンセット法による光軸方向の傾き角制御,(2)走査型マニピュレーション法による3次元の回転と並進運動の制御,(3)走査型の走査方向と長さのリアルタイムでの変更によって生じる「てこの効果」を利用した動的3次元姿勢制御の3つの操作法を提案し,これら3次元操作法の有効性を珪藻やウイスカのマイクロ操作で実証した.2.円ハフ変換や一般化ハフ変換を用いて実時間で顕微鏡カラー画像からマイクロビーズや珪藻などの微小物を検出し,検出したこれら微小物に時分割光ピンセット法を用いて生成した多点光ピンセットビームを照射することで自動的に安定して捕捉し,その後配向姿勢を制御しつつ移動させることなどに成功した.これら結果により,実時間画像処理と光ピンセット法の統合による顕微鏡下のマイクロ作業の自動化の可能性とその有効性を実証することができた.3.ガラスキャピラリによる極微量マイクロ試料の顕微鏡下への定量的な取り出し法,PDMS製のマイクロ流路中を流れるマイクロビーズ,細胞等を異なった位置に配置した回収用ウェルに光圧を利用して能動的に分別できること,ひも状の1分子DNAを塊状に可逆的に形状を変換することで光ピンセットによりサイズごとに分別できることなどを実証した.本年度は,1.被操作対象となる極微量試料の顕微鏡下への定量的な取り出し方法として,ガラスキャピラリの利用法を検討した.その結果,水溶性の溶液中に混在する微粒子については,ガラスキャピラリのシラン化剤による表面処理,ポンプによるキャピラリへの印可・射出圧力の制御,適切な微粒子濃度の設定などで,取り出し個数の調整が可能であることがわかった.この知見を利用して,水溶性の溶液中に分散させたナノ微粒子をガラスキャピラリに充填し,射出圧力等を制御してガラス基板に射出することで,微粒子を基板上に一列に配列させることに成功した.2.非球状のマイクロ試料として,当研究所で開発された棒状の形態をしたアルミニウムボレートウイスカと,ガラス質の殻を有する珪藻を対象に3次元的な姿勢制御の可能性を検討した.(1)棒状のマイクロ物質を単一の光ピンセット法で捕捉する場合,捕捉姿勢は光軸方向となり,さらに光軸周りに回転することも多い.この問題を克服するために,2本のレーザ光をウイスカの先端近傍に同時に照射し,局所的な2箇所の光ピンセット型のレーザマニピュレーションにより,ウイスカの姿勢変更が可能であることを示した.(2)珪藻に対しては,走査型マニピュレーションによる姿勢制御の可能性を検討した.照射するレーザ光の走査軌跡のXY平面での回転,長さの変更等により,珪藻の安定した捕捉姿勢が変わり,珪藻の立面,側面,正面の3方向からの観察ができた.Z方向のレーザ光の焦点位置の変更なしに,3次元的な姿勢制御ができる可能性があり,来年度に向けより詳細な検討の必要があることがわかった.平成18年度は,昨年度に引き続き,各種レーザマニピュレーション法の非球状やひも状マイクロ物質の3次元姿勢操作への適用可能性を検討し,以下の結果を得た.

1.非球状物質の3次元姿勢操作として,ガラス質の殻を有する大きさが数ミクロンから十数ミクロンの珪藻を対象に,(1)3ビーム光ピンセット法による光軸方向の傾き角制御,(2)走査型マニピュレーション法による3次元の回転と並進運動の制御,(3)走査型の走査方向と長さのリアルタイムでの変更によって生じる「てこの効果」を利用した動的3次元姿勢制御の3つの操作法を提案した.これら操作法をレーザ光焦点位置をガルバノミラーで直接リアルタイム制御する方式により実現した.これら方法により,珪藻の立面,側面,正面の3方向からの観察や3次元的姿勢制御が可能となるなど,提案した3次元操作法の有効性を実証した.2.時分割光ピンセット法の3次元操作への有効性を検証するため,レーザ光の光軸方向の焦点位置をパソコンでリアルタイム制御できる機構と光学系を設計し,ガルバノミラーで直接XY軸制御する光学系と組み合わせることで,3次元空間においてレーザ光焦点位置をリアルタイム制御できる光ピンセット系を構築した.本システムにより,1ビームのレーザ光で複数微粒子の同時捕捉と光軸方向への移動が可能となった.3.ひも状物質の3次元空間での操りの対象として,1分子DNAを検討した.3本のレーザ光でのナノビーズ集積法を用いた捕捉・3次元操作のため,蛍光染色した1分子DNAの蛍光観察系の構築と最適なサンプル濃度,蛍光波長等の検討を行った.今年度構築したシステムでは,光ピンセットビームと同軸照射した蛍光励起用レーザ光の強度が1分子DNAを観察するためには不足しているなどが原因で鮮明な像が得られなかったため,来年度システムを再検討することとした.平成19年度は,各種マイクロ物質の形状に応じた新規操作法を引き続き検討するとともに,これら操作法と被操作対象物の実時間画像処理による特徴抽出法の融合化による操作.配置の自動化手法について検討し,以下の結果を得た.1.非球状の珪藻,棒状のウイスカを一般化ハブ変換を用いて実時間で顕微鏡画像から検出し,検出したこれら微小物に時分割光ピンセット法を用いて生成した多点光ピンセットビームを照射することで自動的に安定して捕捉し,その後,配向姿勢を制御しつつ移動させることに成功した.また,捕捉点数を変えることで,珪藻の安定した3次元的な捕捉姿勢を変更できること等も明らかになった.さらに,ガルバノミラーを利用してレーザ光の照射位置を高速に制御することで,PDMS製のマイクロ流路中を流れるマイクロビーズ等を異なった位置に配置した回収用ウェルに能動的に分別できることを実証した.これら結果により,実時間画像処理と光ピンセット法の統合による顕微鏡下のマイクロ作業の自動化の可能性と有効性を実証することができた.2.ひも状の1分子DNAを塊状に試薬を用いて可逆的に形状を変換することで,光ピンセット法によりサイズごとに分別できる方法を提案し,有効性を実証した.また,昨年度問題点として残された3ビーム光ピンセットシステムでの1分子DNAの観察については,蛍光励起用レーザ光の強度の改善,最適なサンプルおよび染色濃度を精査することで,鮮明な画像として観察できるようになったが,ひも状の1DNAの端点を基板に固定していない状態,すなわち浮遊状態の1分子DNAをナノビーズ集積法を用いて手作業で捕捉するのは非常に困難であり,2点以上の捕捉による引き延ばし・切断の可能性を実証することはできなかった.しかし,観察系,サンプルの最適条件が明らかになったので,来年度以降に画像処理による自動捕捉等により引き続き検討したい.
遊離アスパラギン結合型糖鎖の植物分化制御機能の解明と応用

分化成長中の植物組織には,糖タンパク質から酵素的に遊離した糖鎖(N-グリカン)がマイクロ濃度存在する。その遊離糖鎖の機能を明らかにする研究の一端として,糖タンパク質から糖鎖を切り出す2種類の酵素(ENGase, PNGase)遺伝子について,それぞれの発現を抑制したトランスジェニック植物を作出した。酵素活性の消失に伴い遊離型糖鎖の構造特性に顕著な違いが観察され,変異導入植物は発芽後の成長には生育阻害は見られなかったものの,ある環境条件下においては,果実熟成過程に特徴的な差異が見られた。平成21年度は,分化成長中の植物組織中に存在する遊離アスパラギン結合型糖鎖の生産に関わる2種の酵素(endo-β-NacetylglUsaminidasae, ENGaseとpeptide : N-glycanase, PNGase)について,トマト果実由来の酵素の遺伝子同定と大腸菌による発現系の構築を行った。トマトENGaseについては,我々が既にイネ培養細胞で明らかにしているENGase遺伝子をもとに遺伝子クローニングを行い,組み換え酵素のキャラクタリゼーションを行った。組換えENGaseはネイティブ酵素と同様に,Manα1-2Man残基を有するハイマンノース型糖鎖に対して強い加水分解活性を示した。トマト果実の後期熟成過程におけるENGase遺伝子の発現変動をReal-time PCR法で解析し,ENGase遺伝子が常に一定レベルで発現していることを明らかにした。一方,遊離糖鎖の生成量は果実熟成に従って顕著に増加することを既に明らかにしており,この遊離糖鎖の増加は,酵素の発現量ではなく,基質となるミスフォールドした新生タンパク質の増加を反映していることが推察された。また,ENGase遺伝子をノックアウトした変異株の作製を行ったところ,ENGase遺伝子の発現制御が植物の分化過程に大きく影響を及ぼす可能性が明らかになった。更に,アラビドプシスについても,2種のENGase様遺伝子をダブルノックアウトした変異株を作成し,その2つの遺伝子が共にENGaseをコードしていることを証明した。このダブルノックアウト株は発芽率が野生株に比べて低いものの,発芽後の成長には灘槻られなかった。次に,糖タンパク質からの糖鎖遊離を司るもう一つの酵素であるPNGaseについても,トマト酵素遺伝子の同定を完了した。植物には,細胞質で機能する中性PNGaseと液胞あるいは細胞壁中で機能する酸性PNGaseの2種PNGaseが存在する。21年度には,酸性PNGaseの遺伝子を同定し,酵母による発現系を構築した。本酵素は至適pHが4.5付近,複合型糖鎖を糖ペプチドから遊離させた。系統樹解析から,酸性PNGaseは細胞質PNGaseとは相関がなく,植物成長や分化に関わる別の脱グリコシル化機構に関与することが示唆された。平成22年度には,植物酵素としては最初の例となるトマトα-マンノシダーゼ(Man'ase)の遺伝子同定と酵母による本酵素の大量発現系の構築に成功し,詳細な基質特異性,金属要求性等を明らかにした。本酵素は,ネイティブ酵素と同様に植物パウチマンノース型及びハイマンノース型糖鎖に対して活性を示し,弱酸性(pH6.5)に至適pHを有することから,液胞などの酸性オルガネラではなく,細胞壁等の弱酸性オルガネラに存在し,タンパク質に結合するN-グリカンあるいは遊離N-グリカンの分解に関与することが示唆された。一方,そのアミノ酸配列相同性を基に,既にX線結晶構造解析により立体構造が明らかになっているヒト酸性α-Man'aseをモデルとして立体構造解析を行い,分子モデリング法によりα-Man'aseの基質結合ドメインと触媒ドメインを明らかにするとともに,触媒残基を推定した。更に平成22年度には,果実熟成と糖鎖代謝機構との関連を明らかにすることを目的として,トマト果実の各熟成段階と熟成変異株における糖鎖代謝酵素群(ENGase,PNGase,α-Man'ase,β-Hex'ase)の遺伝子発現解析及び遊離N-グリカンの構造特性解析を行った。その結果,ENGase,PNGase,β-Hex'aseは完熟果実での発現量が多いのに対して.α-Man'aseは緑熱期での発現量が多く,上記α-Man'aseは果実熟成期における糖タンパク質糖鎖代謝で重要な機能を担っていることが推察された。一方。熟成変異株においては,全ての糖鎖代謝酵素遺伝子の発現が著しく抑制されていることから,果実熟成変異と糖鎖代謝酵素群の遺伝子発現には相関があることが明らかになった。平成23年度には,ミスフォールド糖タンパク質からの糖鎖遊離を司るendo-β-N-acetyl glucosaminidase (ENGase)あるいはpeptide : N-glycanase (PNGase)遺伝子をノックアウトさせたアラビドプシスを作成し,それぞれの変異体中に発現される遊離糖鎖の構造解析とENGase及びPNGase活性の検定を行った。その結果,ENGase遺伝子ノックアウト株(2種ENGase遺伝子のダブルノックアウト)では,ENGase活性の完全消失に伴い,内在性PNGaseにより生成した遊離糖鎖のみが発現されていることが確認された。

この結果は,ミスフォールド糖タンパク質からの糖鎖遊離は,ENGase活性が抑制されていても,PNGase活性により補償されていることが明らかとなった,一方,PNGase遺伝子ノックアウト株に発現される遊離糖鎖は,ENGase活性により生成された構造を有していた。この結果は,「PNGaseによるタンパク質からの糖鎖遊離がENGase作用に先んじて起こり,ENGase活性は遊離糖鎖の還元末端構造のプロセシングにのみ関与する」とされている動物細胞での概念とは異なる機構が植物では機能することを示すものであった。ENGase/PNGase遺伝子の発現抑制植物では,発芽後の植物生育には顕著な違いは見られなかったが,今年度までに構築した遺伝子抑制植物では,構造特性の差異はあっても遊離糖鎖そのものは生成されているため,遊離糖鎖の生理機能を明らかにするためには,両酵素遺伝子のダブルノックアウト植物を作成することが必要である。この点については,既にENGase/細胞質PNGaseのダブルノックアウト植物(アラビドプシス),ENGase/細胞質ENGase/酸性PNGaseトリプルノックアウト植物の作成を進めているところである。また,トマトについても,RNAiによるENGase遺伝子発現抑制植物の作成に成功し,トマト果実中に発現される遊離糖鎖の構造解析を行うとともに,ENGase活性の完全消失を確認した。変異トマトでは,ある環境条件下において,果実熟成過程に特徴的な形態変化が見られた