hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
X染色体の活性制御と染色体間相互作用

X染色体連鎖Xist遺伝子の転写産物はX染色体不活性化に必須な非コードRNAとして知られ、その発現がX染色体の活性制御に深く関わると考えられる。マウスの胚体組織ではどちらか一方のX染色体がランダムに不活性化する(ランダム型不活性化)のに対し、胎盤などの胚体外組織では母性X染色体(Xm)は決して不活性化せず、必ず父性X染色体(Xp)が不活性化する(インプリント型不活性化)。このインプリント型不活性化については、これまでの研究からXmが卵成長過程に不活性化に対する抵抗性を獲得することが示されているが,Xpが積極的に不活性化するようにインプリントされているかについてはよく分かっていない。この問題に取り組むため、我々はXpがXmの活性に応じてその活性を変化させうるのか、という点に着目し、母性XistをCAGプロモーターにより強制発現させることでXmを不活性化させた場合、Xpがどのような挙動を示すか観察した。このアリルを母由来に受け継いだメス胚は胎生致死であったことから、胚体外組織においてはXpとXmがともに不活性化していると考えられた。しかしながら、X染色体連鎖GFP、およびLacZの発現を指標に個々の細胞におけるXpの活性を調べたところ、本来不活性なはずのXpが一部の細胞で活性を持っていることが示唆された。そこで、改変Xmを持つメス胚の胚胎外組織における父由来Xist発現をRNA蛍光免疫染色とDNA蛍光免疫染色を組み合わせて調べたところ、一部の細胞で父由来Xistの発現消失が観察された。さらにマウス系統間における制限酵素サイト多型を利用しアリルの区別可能としたRT-PCRでXp上の複数の遺伝子の発現を解析したところ、本来不活性なはずのXpからの遺伝子発現が認められた。この研究から、胚体外組織におけるXpの不活性化は、Xmの活性に応じて変化しうるものである可能性が示された。哺乳類の雌は雄の2倍のX染色体連鎖遺伝子を持つため、どちらか一方のX染色体を不活性化することで遺伝子量補償を行っている。マウスの胚体組織では父母由来に関わらずどちらか一方のX染色体がランダムに不活性化する(ランダム型不活性化)のに対し、胎盤などの胚胎外組織では母由来X染色体(Xm)は不活性化することができず、必ず父由来X染色体(Xp)が不活性化する(インプリント型不活性化)。本研究では、インプリント型不活性化においてXpは不活性化するように強固にインプリントされているわけではなく、Xmの活性に応じてその活性を変化させているという仮説をたて、本来不活性化しないはずのXmを不活性化させた場合のXpの挙動を観察することによってこれを検証した。本研究に先立ち、恒常的な活性を有するCAGプロモーターにより制御されるXistアリルを持つマウスが作製された。このアリルを母由来に受け継いだメスの胚は胎生致死となった。これは胚体外組織においてXpに加えXmまでもが不活性化したためと考えられる。しかしながら、GFP、LacZといったトランスジーンを用いて個々の細胞でのXpの活性を調べたところ、本来不活性なはずのXpが一部の細胞で活性を持っていることが分かった。またRT-PCRにおいてもXpの活性が認められた。このことから、インプリント型不活性化においてXpはXmの活性を監視している可能性が示された。Xmを強制的に不活性化させると、本来不活性化されるはずのXpがそれを感知して不活性化を回避するというこの現象は、染色体間の相互作用が遺伝子発現制御に果たす役割という観点からも非常に興味深く、さらに解析を進めることの意義は高いと考えられる。

さらにマウス系統間における制限酵素サイト多型を利用しアリルの区別可能としたRT-PCRでXp上の複数の遺伝子の発現を解析したところ、本来不活性なはずのXpからの遺伝子発現が認められた。この研究から、胚体外組織におけるXpの不活性化は、Xmの活性に応じて変化しうるものである可能性が示された。
超高速極微量全血分析のためのヘルスケアチップ研究

ヘルスケアチップは、近年、マイクロTASやLab-on-a-chipと呼ばれる(バイオ)化学分析用集積化システムの一種であり、マイクロキャピラリー、マイクロオプティクス、バイオセンサーなどの分離・分析素子と電子デバイスを混在集積化させ、極微量の血液・尿など体液の分析からヒトの様々な生理学的浄報を迅速に収集することを可能にする。本研究では血液検査を数cm角のチップ上で行うシステムを実現することを最終目標とし、そのために必要な種々の要素技術の開発とそれらの集積化によるシステム構築のための基盤確立を図った。バイオ分析用マイクロチップは光学的計測あるいは観察装置との組み合わせによりシステム全体が機能する場合が多く、基板材料にLSIやMEMSのようにSiを用いるよりも透明なガラスやプラスチックを採用することが多い。そこで最初はガラス基板を中心とした微細加工、アセンブリ技術等の開発から着手し、これらの技術を応用してマイクロ分析チップの試作・開発を進めていった。本科研費では、(1)石英エッチング技術のマイクロキャピラリー電気泳動チップ作製への応用、(2)高密度フッ素系プラズマによるホウ珪酸ガラスのディープエッチング、(3)ホウ珪酸ガラス製マイクロキャピラリー電気泳動チップの作製と動作特性の研究、(4)陽極接合を用いたマイクロ積層流体デバイスの作製法、(5)微小電極埋込みチップ上でのインピーダンス分光による生体試料検出を再現性良く行うためのチップ内の表面処理等、(6)微小電極埋込みチップ上でのインピーダンス分光による単一細胞の検出、(7)誘電泳動を利用した血球細胞のオンチップ分離・操作技術、(8)キャピラリー電気泳動チップ上の免疫細胞電気泳動、(9)反発性誘電泳動を利用したセルソーターチップの開発、(10)多結晶Siへの不純物導入によるマイクロ流体デバイスへの微細電極集積化技術、(11)自己整合電極形成プロセスによるナノソーティングチップ作製技術についての成果を挙げた。極微量全血から人間の健康状態を高速診断するヘルスケアデバイス実現のため、半導体加工技術を応用したバイオチップ加工技術を開発し、更に、全血試料の前処理から血球分析や免疫分析までをチップ上で行うために必要な要素技術を研究した。バイオチップ加工技術に関しては従来数μmの加工のために開発されてきたプラズマエッチング技術を数10μm級の深さのマイクロ流体素子の作製に適用するために、塩素負イオンプラズマを用いたCrマスクドライエッチング技術とC_4F_8/SF_6系高密度プラズマを用いた高速高選択比ディープ石英エッチング技術を開発した。また、より安価な基板材料であるPYREXガラスについても高密度フッ素系プラズマを用いれば、垂直形状が可能であることを示した。これらの独自技術を駆使して血液細胞のオンチップ分離・分析マイクロチップの試作を行った。マイクロ遠心チップでは0.15μlの微量全血を5000rpmで1分間回転させて遠心力によって血液細胞と血清成分に分離し、低いレイノルズ数を有する微小空間では液体の流れが層流になる特性を利用して容易に血球が分取できることを示した。また、微小埋め込み白金電極アレイを有するマイクロキャピラリーチップを試作し、誘電体に交番電界を印加すると生じる誘電泳動力を利用して血球のサイズフィルタや濃縮などが可能なことを実証した。更に誘電泳動力を利用して特定の細胞を分取することが可能なセルソーターチップを試作するなど、全血試料の種々の前処理をオンチップで実現した。

また、オンチップ細胞免疫電気泳動による細胞の免疫性の高速タイピングを提案し、実際に羊赤血球とその抗体たんぱくであるIgGをマイクロキャピラリー電気泳動チップ上で対向泳動させると羊赤血球表面の電荷の変化により細胞の泳動速度が大きく変化し、この変化を検出することにより免疫反応の高速検出が可能であることを示した。血液検査は現在、人の健康状態を知るための最も有効な手段であり、研究室レベルはもちろん、臨床現場においても血清成分や血液細胞に関して多岐の項目に渡る分析が日々行われている。本研究では、半導体微細加工技術を応用して、血液検査を数cm角のチップ上で迅速に行うシステム実現することを最終目標とし、そのために必要な種々の要素技術とそれらの集積化によるシステム構築のための基盤技術の開発を進めている。本年度の主な成果は以下の通りである。(1)マイクロ検出器の集積微小流体チップ中に微小白金電極対を組み込み、血液細胞や血清中タンパク質等を検出する技術を研究した。キャピラリー内壁と電極上へのタンパク質や細胞の非特異的吸着を抑制するために微小流体チップの内部をポリエチレングリコールにより被覆した。1MHzの交流電圧を電極対に印加し、交流インピーダンスの変化から個々の赤血球細胞の検出が可能であることを示した。(2)オンチップセルソーター個々の細胞の精密観察情報に基づいた分取を実現するため、誘電泳動力を応用したセルソーターチップを開発した。セルソーターチップは細胞導入用流路とシースフロー形成用流路、その下流に位置する一対の電極で挟まれた細胞収集用流路とその両側の廃棄用流路からなる。シースフローを形成することにより細胞を効率よく収集用流路口に送り込み、電極に交番電界を印加して生じる反発性誘電泳動力により、細胞の取り込みを取捨する原理である。良好な動作のためには微小電極と微小流路の形状を高精度に加工する技術が不可欠となるが、数マイクロメートル幅の流路をもつセルソーターについてはコンタクト露光技術による作製技術を確立し、サブミクロン流路幅をもち、細胞小器官等の分取に適用が期待できるナノソーターチップについてはイオン注入を利用した自己整合プロセスと陽極接合技術を用いて作製できることを示した。(1)3次元集積化マイクロ流体チップ形成技術ほう珪酸ガラス基板上にマイクロ流体素子を形成するためのドライ加工技術を開発し、さらに、Si薄膜を介した陽極接合によるチップ貼り合せ技術を確立した。これらの技術により1つのチップ上で複数の試料、試薬を並列に処理するために不可欠な多層積層マイクロ流体チップの製造が可能になった。Si薄膜層にイオン注入等により不純物を導入することにより、任意の位置に電極を組み込むことも可能になった。
遅発性感染症、スクレイピ-における宿主蛋白PrPの機能の解析

伝達性海綿状脳症の感染性はPrPの発現が高い中枢神経系に高く、感染性アミロイドの蓄積も起きる。牛PrP遺伝子を導入したL細胞、L-BPrP3は牛PrPを安定に発現している。このため一般の細胞に比べスクレイピ-病原体の複製増殖が起きるのではないかと期待して、細胞への感染実験をマウス及び羊の病原体を用いて行った。しかし対照として用いたL細胞との間に特に差が認められづ、牛PrP遺伝子の影響はなかった。変異遺伝子については感染実験が完了していない為成績から省いた。羊PrP遺伝子型とスクレイピ-感受性の関連を検討する経過で、発症あるいは感染性アミロイドの形成・蓄積にはPrP以外の遺伝子の関与がある可能性が示唆され、我々の用いた線維芽細胞由来のL-BPrP3はなにか未知の因子が欠けているのではないかと推定するに至り、新たに神経系の細胞に羊PrP遺伝子を高度に発現する細胞を樹立した。PrPの解析を行うには、羊或はうしPrPとだけ反応する免疫抗体、マウスPrPとだけ反応する抗体あるいは両者と反応する抗体が必要となり、これら要求を満たす抗体の作製と、高感度にPrPを検出する方法も開発した。また牛PrPのプロモーターの解析を行い、予想された第一エクソンの上流領域以外に、第一エクソンと第二エクソンの間のイントロン領域にもin vitroでプロモーター活性があることを見いだした。羊PrP遺伝子を扱う上で、用いる羊PrPのアミノ酸配列からの遺伝子型を知る必要があった。一方我々はスクレイピ-の発症と羊DNAのPrP遺伝子を含む制限酵素断片の長さの多様性の関係を調べ、英国などの報告と必ずしも一致しないことに気付き、PrPのアミノ酸配列からの遺伝子型を検討する必要性に迫られ、我が国の羊のPrP遺伝子型を調べ新たな遺伝子型を見いだした。また同時にスクレイピ-発症との関係をも検討した。特異抗体の作成:ヒツジのPrPコアフラグメントのN末端及びC末端領域のマウスのそれとアミノ酸置換のある部分の合成ペプチドに対する抗体を作成したが、予想に反し何れもマウスPrPと高く反応した。このため第3の領域の合成ペプチドおよび精製ヒツジPrP^<SC>を用意し、ウサギ接種と同時にモノクローナル抗体のためマウス接種を行い、免疫が進行中である。ウシPrP遺伝子発現L細胞の培養:正常PrP遺伝子発現細胞は低血清下で培養しても僅かに増殖を続けた。変異PrP遺伝子2種の発現細胞は核周辺のPrPが蛍光抗体法によって粗大顆粒状を呈していた。これらの細胞は凍結保存後何れも回復しなかった。再構築した変異遺伝子を用いて発現細胞の樹立を試みたが、2回のクローニングの時点で消失し、導入した遺伝子が再編成されていた。再度樹立を試みている。病原体感染細胞:ウシPrP遺伝子発現L細胞にマウス病原体を感染させ、継代毎およびクローニングしたもののPrP^<SC>の産生及び感染性を検討している。適当な抗体がまだ用意できないこともあってPrPの種を決定できないでいる。また感染価は継代毎に低下したが、クローニングしたものも感染性を保持してることから、僅かながら複製のあることが判った。他種細胞によるPrP発現細胞の樹立:導入PrP遺伝子発現の安定性はプロモーターが関与していること、細胞種が適当でないこと等の可能性が考えられる。

このため、安定に導入遺伝子を発現し、病原体の複製の良好な細胞を作成するために、プロモーターの検討と共に、マウスL細胞以外の細胞、神経芽細胞腫あるいはクロム親和性細胞腫などに遺伝子を導入したものの作成を行っている。1、牛及び羊に特異なモノクローナル抗体を作製することが出来た。この抗体を用いた予備的な試験として羊PrP^Cをアフィニティークロマトグラフィーで精製したところ単一のバンドとして得られた。しかし分子量の点で若小干さいため検討している。また本抗体で牛PrP発現細胞を蛍光染色したところ陽性の結果が得られた。2、PrPの自然プロモーターの分離・解析を行い、牛PrP遺伝子の5'非コード領域は2つのエクソンから、合計3つエクソンから成りたち、エクソン1と2の間におよそ2.5kbのエクソン2とコード領域を含む3の間に14kbの印と論が存在することが明らかになった。プロモーター活性はエクソン1の上流のみならずエクソン2の上流にも検出された。エクソン1の上流にはTATAbox様配列は無く、GCに富んだ配列が見られた。このことはPrP遺伝子がハウスキーピング遺伝子であることを示唆している。3、牛PrP遺伝子を導入し、発現するL細胞にマウスSAFを感染させたと同様に羊SAFを感染させた成績が得られた。マウスの場合と同様に複製を十分支持しなかった。接種マウス数が6匹と少ない所為もあり統計的に有意ではなかったが、L細胞に比べ牛遺伝子の入った細胞の方が感染価は若干高い傾向が見られた。現在牛変異遺伝子発現細胞にマウス及び羊SAFを感染させ、経時的にマウス接種を行い観祭している。4、PrP^CからPrP^<Sc>に変わる機構を解析する一手段として、先ずPC12細胞の表面を^<125>Iで標識し、特異抗体を用いた免疫沈降でPrP^Cが検出できないか検討したところ、過酸化水素を触媒として用いて標識すると検出されるが細胞が死滅することが判り、より温和な方法を検討している。伝達性海綿状脳症の感染性はPrPの発現が高い中枢神経系に高く、感染性アミロイドの蓄積も起きる。牛PrP遺伝子を導入したL細胞、L-BPrP3は牛PrPを安定に発現している。このため一般の細胞に比べスクレイピ-病原体の複製増殖が起きるのではないかと期待して、細胞への感染実験をマウス及び羊の病原体を用いて行った。しかし対照として用いたL細胞との間に特に差が認められづ、牛PrP遺伝子の影響はなかった。変異遺伝子を用いた成果は未だ感染試験が終わっていないため除いた。羊PrP遺伝子型とスクレイピ-感受性の関連を検討する経過で、発症あるいは感染性アミロイドの形成・蓄積にはPrP以外の遺伝子の関与がある可能性が示唆され、我々の用いた線維芽細胞由来のL-BPrP3はなにか未知の因子が欠けているのではないかと推定するに至り、新たに神経系の細胞に羊PrP遺伝子を高度に発現する細胞を樹立した。PrPの解析を行うに当たって、羊或はうしPrPとだけ反応する免疫抗体、マウスPrPとだけ反応する抗体あるいは両者と反応する抗体が必要となり、これら要求を満たす抗体の作製と、高感度にPrPを検出する方法も開発した。一方、PrPのプロモーターの解析を行い、予想された第一エクソンの上流領域以外に、第一エクソンと第二エクソンの間のイントロン領域にもin vitroでプロモーター活性があることを見いだした。羊PrP遺伝子を扱う上で、用いる羊PrPのアミノ酸配列からの遺伝子型を知る必要があった。
快適環境形成のための生態・景観予測評価システムの整備と最適化モデルの開発

1.生態・景観予測評価システムの構築・運用・公開生態予測評価モデル(樹木活力度を指標とする)と、景観予測評価モデル(視認性を指標とする)とを組み込み、地域・地区レベル数値情報を基に解析・評価を行い、結果を可視化するシステムを構築した。本システムは、ワークステーションとグラフィックス・コンピュータを中核とし、UT-net(東京大学高速ネットワーク)にネットワーク接続され、公開した。コンピュータ・グラフィックスによる、生態・景観予測評価結果の可視化は、複数の研究分野における相互の解析・評価結果の理解に有効であることが明かとなった。これにより、ネットワークを利用した生態・景観共同研究の可能性を明らかにした。2.モデル地区に当該システムの適用し、快適環境形成手法を検討した。多摩ニュータウンをモデル地区にして、当該生態・景観システム運用により、複数の研究者によって、同一対象地における「生態」「景観」予測評価を実施し、両者の評価から新たな評価をおこなう手法を開発した。3.他のケーススタディ地でのシステム実用当該システムを「小笠原諸島」に適用した。生態・景観情報を新規に作成し、予測評価システムを適用した結果、その実用性が検証できた。システムの中核となる「生態・景観情報処理・可視化システム」を中心に、予定した設備をすべて導入し、運用を開始した。研究実績に係わる内容と成果は以下の通りである。1.デ-タの共通フォ-マット化とデ-タベ-ス組み込み:地域、地区で異なる情報形態である地形・生態・景観デ-タを、共通地図メッシュ・フォ-マットに変換し、デ-タベ-スとして入力した。数値地形情報を等副50mメッシュで読み取り、これを基本として、植生情報などのデ-タを50mメッシュに変換した。また、2次平面処理による接谷面探索プログラムを組み込んだ。2.生態、景観モデルのシステムへの組み込み:メッシュ情報の解析処理システムを組み込んだ。各種デ-タのメッシュ重合処理、表示による解析を可能にした。現在生態・景観予測評価システムを開発中である。3.可視化システムの構築:生態、景観相互のデ-タや、それぞれのモデル適用結果を任意の時点・視点・視野角で表現するための可視化システムを構築中である。4.システムテスト:上記生態予測評価システム、景観予測評価システムを開発中である。5.新たな知見:本研究で開発中のシステムは、画像の写実性の向上を目指しフルカラ-を標準としている。これは、従来の画像処理・写真解析で用いられているが、新たに地理情報システム(GIS)をベ-スとした生態・景観情報での各種解析結果の可視化に有効であることが確認された。すなわち、フルカラ-の利用によって航空写真情報、各種地図化情報の重合が可能となり、数値地形情報を用いて3Dパ-スとして表示させることで結果を分かりやすく表示することができ、複数分野での同一地域・地区・地点の検討に有効であることが分かった。1.生態・景観情報処理システムのネットワ-ク化:生態デ-タと生態最適化モデルシステムおよび景観デ-タと景観最適化モデルシステムを核にした「生態・景観情報処理システム」を構築した。さらにイ-サネットを用いた構内高速ネットワ-ク構築を行った。これにより大量の生態・景観デ-タを複数の研究者で共有でき、しかも可視化システムを用いお互いの最適評価状況を即地的に把握することができた。2.システムのサブ・ネットワ-ク化:高速ネットワ-ク化が困難な構外の研究者に対し情報量の多いデ-タを予め配布し、評価モデル情報だけを電話回線によるパソコン通信を用いて転送し、個のパソコン上で評価モデルを再構築する手法開発を行った。3.地点レベルの写実的表示システムの開発した。また地域レベルでのパソコン可視化システムを開発した。4.地域・地区レベルでの生態評価と景観評価を行い、結果をクロス分析して評価予測モデルを作成した。5.地点レベルでの景観に画像処理を用いた生態・景観要素操作を行い予測景観を作成した。これに心理実験による景観評価を行い、その結果から景観予測評価モデルを作成した。6.新たな知見として以下の点を得た。高速ネットワ-クによるデ-タとシステムの共有は生態・景観分野の複数研究者が、環境予測評価の最適モデル開発という同一目的の研究開発を行う上で効果的である。さらにデ-タと予測評価結果の写実的な可視化手法を共有することで複数分野での共通研究が実用的である。

また高速ネットワ-クを介さないパソコン通信であっても、多量のデ-タと予測評価を表現する最小限の情報とに区分して可視化技術を適用することで、複数分野での実用的研究協力が可能となる点が明かとなった。1.システムの公開:本研究で整備した「生態・景観情報処理システム」を、現在東京大学ネットワ-ク「UT-net」に接続し公開した。ネットワ-クによるリモ-トログインでの利用も可能となり、当該システムにIDを持つ共同研究者が利用している。2.モデル地区によるシステム運用:デ-タ整備を行った多摩丘陵にモデル地区を設定し、本システムを用いて生態ポテンシャル評価と景観ポテンシャル評価を行い、両者の評価モデルの妥当性を検討した。生態・景観の両予測評価モデルを用いることで、評価軸の異なる2つの尺度での評価が明になることから、それぞれの地区・地点に即した快適環境形成の計画と、その実現のための具体的手法を効果的に判断することが可能となった。3.新たなケ-ススタディ地域でのシステム適用当該システムを「小笠原諸島」、「逗子市」に適用した。後者は、情報の制約から景観モデルの適用に留まったが、前者では、生態・景観情報を新たに作成して、予測評価システムを適用した結果、当該システムを活用することで十分な成果を得ることができ、その実用性が実証できた。4.研究成果報告書は現在印刷中である。
発熱時の脳内PGE2産生、分泌、排出機構の解明

1、発熱時のPGE2産生機構・LPS刺激による脳内PGE2産生にmPGESが必須であることをmPGES-KOマウスを用いて証明した。・マウスではLPS刺激によって脳血管内皮でCOX-2が誘導されるが、mPGESは誘導されず検出不可能であった。一方、くも膜や脈絡叢にはmPGESが構成的に発現していた。この結果は、血管内皮とその周囲の細胞間でのtrans-cellularなPGE2産生機構を示唆する。・カルシウム非依存性PLA2(iPLA2)がLPsによる発熱に関わっていることを明らかにした。・iPLA2はLPsによるcox-2誘導とサイトカイン産生も抑制した。すなわち、iPLA2はLPsに対する様々な反応に関っていることを明らかにした。・PLA2の産物であるアラキドン酸はPGE2の原料となるだけでなく、脳血管内皮細胞にCOX-2を誘導することを明らかにした。・アラキドン酸によるCOX-2の誘導は、アラキドン酸の直接作用であり、アラキドン酸の代謝産物を介さないことを明らかにした。・カラゲニン炎症による中枢でのCOX-2誘導には血中のインターロイキン6が関与していることを明らかにした。2、PGE2の膜輸送に関る分子の脳内発現・プロスタグランジン輸送体(PGT)がくも膜に構成的に発現していることを明らかにした。・LPS刺激によって、PGTがくも膜と脳血管内皮で誘導されることを明らかにした。・有機陰イオン輸送体のMRP4が脳血管内皮に発現していることを明らかにした。感染時の発熱には、脳内プロスタグランジンE2(PGE2)の産生が必須である。脳内PGE2合成は発熱性刺激で誘導されたシクロオキシゲナーゼ-2(COX-2)とmicrosomalPGE synthase-1(mPGES-1)の酵素作用によることは既に明らかとなっている。しかし、COX-2の上流ではたらくホスホリパーゼA2(PLA2)については、その種類・細胞局在が不明である。本年度は、各種PLA2阻害剤を用いて、発熱にかかわるPLA2について検討した。PLA2活性をもつ酵素群は、cPLA2(細胞質型)、sPLA2(分泌型)、iPLA2(カルシウム非依存性型)に大別できる。これらの酵素それぞれに特異的な阻害剤をラットに投与し、発熱とPGE2産生系におよぼす効果を調べた。Bromoenol actone(BEL)はiPLA2特異的阻害剤である。BELのラット腹腔内への前投与は、LPS静脈内投与による発熱を有意に抑制した。同時にBELはLPSによる脳脊髄液PGE2濃度上昇も獅制した。当初はこのBELの作用がCOX-2上流のPLA2を抑制したためと考えていた。ところがそれに反して、BELの前投与は、脳血管内皮細胞でのCOX-2、mPGES発現も抑制し、さらに血漿中の炎症性サイトカイン(IL-1beta、TNFalpha)の増加も抑制した。肝臓でもこれらのサイトカイン産生を抑制した。多くの炎症関連遺伝子の転写調節因子であるNFkBの核内移行を検討したところ、肝臓ではLPS静注によりNFkBの核内移行が起こり、この移行にBELは明確な作用を示さなかった。以上の結果は、BELがLPS処置ラットにおいて抗炎症作用を発揮すること、そしてその作用点はNFkBの核内移行より後であることを意味する。背景と目的発熱に関わる第1段階の酵素ホスホリパーゼA_2(PLA_2)のタイプは不明である。本研究課題ではこれまでにカルシウム非依存性PLA_2(iPLA_2)が発熱に関わっていることを示す実験結果を得た。

すなわちiPLA_2阻害剤のBELはラットにおいてリポ多糖類(LPS)による発熱と脳内PGE_2上昇を抑えた。しかし予想外にもBELは脳血管内皮でのCOX-2発現も抑制した。本年度は(1)BELが脳血管内皮に作用してCOX-2誘導を抑えるか、(2)PLA_2の産物であるアラキドン酸(AA)がCOX-2を誘導するかについて検討した。結果ラットにLPSあるいは生理食塩水を静脈内投与し、60分後にクモ膜下腔の血管を採取した。この血管をBELあるいはDMSO(BELの溶媒)を含む緩衝液で90分間培養し、COX-2発現量をウェスタンブロットにより検討した。その結果BELはCOX-2発現を有意に抑制した。この結果は脳血管におけるCOX-2発現にiPLA_2に産物であるAAが重要な働きをしていることを示唆する。そこでin vivoにおいてAAが発熱とCOX-2誘導を起こすか検討した。AAをラットの脳室に投与すると即時の体温上昇(第1相)と90分後から始まる体温上昇(第2相)が起こった。COX-2特異的阻害剤は第2相の体温上昇のみを抑制した。またAAの脳室内投与はクモ膜下腔の脳血管内皮にCOX-2を誘導した。以上の結果はAAあるいはその代謝産物がCOX-2誘導と発熱を引き起こすことを意味する。これまでAAは単にPGE_2の原材料であり、COX-2の基質であると考えられてきた。しかし本研究によってAAはシグナル分子としてCOX-2を誘導する、という新しい知見が得られた。背景と目的(1)発熱に関わる第1段階の酵素ボスホリパーゼA_2(PLA_2)の研究過程で、PLA_2の産物であるアラキドン酸(AA)がCOX-2を誘導することを明らかにした。本年度はAAがCOX-2を誘導する機構について検討した。具体的には、AAは3種の酵素で代謝され、生理活性物質となりうる。その酵素はシクロオキシゲナーゼ(COX)、リポキシゲナーゼ(LOX)、エポキシゲナーゼ(EPOX)である。これらの酵素阻害剤を前処置したラットにAAを投与して発熱とCOX-2の誘導を調べた。(2)末梢組織の炎症でPGE2が産生される。これに関るPLA_2種を検討した。結果(1)ラットにおいてCOX阻害剤はAAによる発熱をほぼ完全に抑制し、COX-2の誘導を部分的に抑制した。LOX阻害剤とEPOX阻害剤はAAの発熱とCOX-2誘導作用に全く影響を示さなかった。これらの結果はAAとそのCOX代謝産物がCOX-2を誘導していることを示唆する。(2)PGTmRNAはラット脳において、クモ膜に恒常的に発現していた。LPS腹腔内投与によりPGTmRNAはクモ膜で増加し、血管内皮細胞でも新たに発現した。これと一致したPGTタンパク質の誘導も観察された。PGTが発熱時のPGE2輸送に関っていることが示唆された。(3)マウスの右後肢にカプサイシン、ホルマリンなどの発痛物質を投与すると、対応する1次知覚神経の細胞体でNFkBのリン酸化と核移行が観察された。電気刺激でも同様の反応が観察された。これらの反応は5-15分で生じた。NFkBの下流でどのような遺伝子が誘導されるかは不明であるが、神経の活性化マーカーとして有用である。
Spline要素法を用いた複合構造物の衝撃弾塑性応答解析に関する研究

本研究では、一方向繊維強化型積層板や積層シェルの衝撃応答を明らかにするために、横せん断変形や回転慣性の影響を考慮した積層理論と異方性弾塑性理論を用いて、積層複合板と積層円筒パネルの振動特性、降状領域の進展などの破壊特性を明らかにしている。本研究から得られた主な成果を示すと、以下のようになる。1.複合積層板及び積層円筒パネルの振動特性の解析面外せん断変形と回転慣性の影響を考慮したスプライン要素法を用いて、積層板や積層円筒パネルの振動特性に与える積層数、配向角、弾性係数比、偏平角や境界条件などの影響について明らかにした。積層数、配向角、弾性係数比、積層組を変化させることにより、これらの積層構造の振動特性を自由に変化させられる。したがって、積層構造を適用すれば、設計の自由度が高められる。2.Hillの一般化異方性弾性理論とMisesの降伏条件式を適用した複合積層板と積層円筒パネルの弾塑性応答解析衝撃荷重による一方向繊維強化積層板と積層円筒パネル(グラファイト/エポキシ材)の塑性域の進展や破壊パターンに与える積層数、幅厚比や境界条件による影響について明らかにした。厚さ方向の積層要素の塑性化を考慮して、繊維強化積層板と円筒パネルの塑性領域の進展方向や破壊モードに与える曲げ挙動と面外せん断変形の影響を明らかにした。これより、積層(ラミナ)の塑性化は弱層方向または強化繊維方向と垂直な方向から進展し、また横せん断変形が大きく生じる部分では、厚方向に急激な塑性化が進展する。積層円筒パネルでは、円周方向から塑性化が進展し、円筒軸方向に伝播する。積層複合構造物の破壊モードに与える積層の配向角や積層組も大きな影響を与えることなどを明らかにした。比強度や比剛性の大きな先進複合材を用いた繊維強化積層板の衝撃応答を明らかにするために、面外せん断変形や回転慣性の影響を考慮した積層板理論と異方性弾塑性理論を用いて、複合積層板の振動特性、降伏領域の進展やその破壊モードを明らかにすることを研究目的としている。1.対称及び非対称な複合積層板の振動特性の解析横せん断変形と回転慣性の影響を考慮した一次せん断変形理論に基づくスプライン要素法を用いて、対称クロス・プライ積層板や逆対称アングル・プライ積層板の振動特性に与える積層数、配向角、弾性係数比、幅厚比や境界条件などの影響について明らかにした。また、自由辺を持つ場合に、積層数の増大とともにその剛性が低下する場合を指摘した。2. Hillの一般化異方性弾性理論とMisesの降伏条件式を適用した複合積層板の弾塑性応答解析衝撃荷重による一方向繊維強化積層板(グラファイト/エポキシ材)の塑性域の進展や破壊パターンに与える積層数、幅厚比や境界条件による影響について解析した。厚さ方向の積層要素の塑性化を考慮して、繊維強化積層板の塑性領域の進展方向や破壊モードに与える曲げ挙動と面外せん断変形の影響を明らかにした。これより、積層(ラミナ)の塑性化は弱層方向に板中央部から境界辺に向かって進展し、また横せん断変形が大きく生じる部分では、板厚方向に急激な塑性化が進展することが明らかになった。また、積層の配向角や積層組もその弾塑性応答特性に大きな影響を与えている。今後、繊維強化型曲面板の衝撃弾塑性応答解析を行い、その非線形応答特性についても明らかにする。

先進複合材料より成る繊維強化型積層板や積層シェルの衝撃応答を明らかにするために、面外せん断変形や回転慣性の影響を考慮した積層理論と異方性弾塑性理論を用いて、積層複合板と円筒パネルの振動特性、降伏領域の進展やその破壊モードを明らかにすることを研究目的としている。本研究から得られた主な成果を示すと、以下のようになる。1.対称及び非対称な複合積層円筒パネルの振動特性の解析横せん断変形と回転慣性の影響を考慮したSandersのシェル理論に基づくスプライン要素法を用いて、クロス・プライ積層円筒パネルや逆対称アングル・プライ積層円筒パネルの振動特性に与える積層数、配向角、弾性係数比、偏平角や境界条件などの影響について明らかにした。積層板と比較して、積層数の影響はさほど大きくないが、配向角の影響が顕著に現れることなどを明らかにした。2.Hillの一般化異方性弾性理論とMisesの降伏条件式を適用した複合積層板と積層円筒パネルの弾塑性応答解析衝撃荷重による一方向繊維強化積層板と積層円筒パネル(グラファイト/エポキシ材)の塑性域の進展や破壊パターンに与える積層数、幅厚比や境界条件による影響について解析した。厚さ方向の積層要素の塑性化を考慮して、繊維強化積層板と円筒パネルの塑性領域の進展方向や破壊モードに与える曲げ挙動と面外せん断変形の影響を明らかにした。これより、積層(ラミナ)の塑性化は弱層方向または強化繊維方向と垂直な方向から進展し、また横せん断変形が大きく生じる部分では、厚方向に急激な塑性化が進展する。また、積層円筒パネルでは、円周方向から塑性化が進展し、円筒軸方向に伝播する。積層複合構造物の破壊モードに与える積層の配向角や積層組も大きな影響を与えることなど明らかにしている。
骨格筋組織に含まれる前駆細胞からの心筋形成と機序解析

ラット骨格筋組織由来心筋細胞前駆体(SPOC細胞)について、平成19年度に得られた成果は以下の通り。【骨格筋初代細胞の細胞外マトリックスへの接着と拍動細胞への誘導】ラット骨格筋細胞を自動拍動細胞へ誘導する効果がある細胞外マトリックスを検討した。ポリリジン、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン1、およびラミニン2のうち、ラミニン2はマウス腫瘍細胞由来の可溶化基底膜成分(マトリゲル)と同等の誘導効果をもたらした。【SPOC細胞分画の純化】ラット骨格筋細胞をコラーゲン接着性が低い分画のうちラミニン2接着性が高いものを選別することにより、拍動細胞へ移行する細胞の割合を増やすことができた。一方、細胞密度を用いた遠心選別を行うことで、來雑物が少ない分画をえることができた。これらの方法を組み合わせることで、SPOC細胞分画の純度を高める見通しが得られた。【SPOC細胞の拍動機能とその調節】ラットSPOC細胞では、細胞内カルシウム濃度オシレーションが拍動と同期して観察された。拍動およびカルジウム濃度オシレーションは、カドミウム、ニッケルイオン、DHPR阻害剤等に減少し、カルシウムATPase阻害剤よって、拍動速度に減少が見られた。拍動調節が、カルシウムチャンネルによって行われている可能性が示唆された。骨格筋組織に含まれる幹細胞のうち自動拍動を行うように分化誘導される細胞を骨格筋組織由来心筋細胞前駆体(SPOC細胞)とここでは呼ぶ。平成18年度の以下の研究成果により、ラットにおいてSPOC細胞が存在することが初めて示された。【ラットにおけるSPOC細胞の存在】マウスにおいてはSPOC細胞の存在が報告されているが、本研究ではラット骨格筋組織由来細胞において以下の証拠によってSPOC細胞が存在することが確認できた。(1)自動拍動能を示す細胞が1平方ミリメートルあたり200個以上出現している、(2)それらは心筋細胞転写因子NKX2.5の高発現している、(3)心筋特異的に発現する心筋型トロポミオシンを特異的抗体によって染色される、(4)αアクチニン、ミオシン等の抗体染色によってサルコメア形成が確認された。【ラット由来SPOC細胞の心筋型カルシウム特性】(1)細胞内カノレシウム濃度が拍動周期と同時に規則的に上昇下降変化する。(2)複数の細胞が同期して規則的に拍動する。(3)イソプロテレノールに反応して拍動周期が増大し、NKX2.5の核内への集積も観察され、β受容体の発現が示唆された。(4)コネキシンの拍動細胞表面の存在が抗体染色により示された。【細胞外マトリックスのSPOC細胞分化への効果】SPOC細胞が拍動細胞へ分化するために必要な細胞外マトリックスの種類、培養条件について検討した。【SPOC細胞表面タンパク質を識別する抗体】SPOC細胞表面タンパク質を識別する抗体を作製するためには夾雑物(細胞デブリ)を除く必要があり、SPOC細胞群と夾雑物の分離条件について検討した。
癌化に伴うアルドラーゼアイソザイムの発現転換現象の解析

正常肝で強く抑制されているA型アルドラーゼ遺伝子AHリーダーエクソンが肝癌で強く発現する機構を明らかにするために、AHリーダーエクソンの制御調節領域の解析を行った。そのために上流3キロ塩基をもつ遺伝子にレポーター遺伝子としてCAT遺伝子を接続し上流の解析を行った。宿主としてHepG2細胞を用いたところ、上流から-314塩基対までの欠失変異体には活性の強さに変化が認められなかったが-198塩基対対までの変異体ではCAT活性の強さが約1/5に低下し、さらに-106まで欠失したところ活性はほとんど検出できなかった。以上の結果から-314と-198塩基間、-198と-106塩基間の間に発現を調節するDNAエレメントが存在することが予想された。そこで先ず-314-198塩基間の116塩基対のDNAを標識し種々の核抽出物を用いてゲルリタデーションアッセイを行ったところ2本のバンドが観察された。ついで得られたバンドの各核抽出物による違いを観察したところ、胎仔期の分化段階ではmajorバンドは15、16日目で強く出現したものの20日目、成体ではバンドは観察されなかった。一方HepG2、AH60cなどの肝癌ではmajorバンドは同様に観察されたがその移動度は胎仔期とは若干異なることがわかった。一方B型アルドラーゼ遺伝子も同様に調節領域を明らかにするために各制限酵素の切断部位を利用して欠失変異体を作成した。ラット肝初代培養細胞に感染させた各欠失変異体の解析を行ったところ、転写開始点より上流166塩基内に組織特異性を決定するDNAシスエレメントが存在することがわかった。
管内旋回流を伴う希薄予混合火炎の時系列レーザ画像計測法の開発と火炎伝播特性の解明

円管内希薄予混合火炎の動的挙動と流れ場を同時に計測可能とし,この測定方法を用いて旋回流を伴う希薄予混合火炎の非定常挙動と流れ場の関連性を解析した.ここでは,2種類の予混合旋回羽根を用いて,異なる火炎の伝播挙動を考察した.中央が閉じた旋回羽根を用いた場合には旋回流を伴う火炎の先端部は高い歪みを受けるために火炎の消炎が生じて,中心部が逆流であるにもかかわらず,上流への伝播を抑制されている.一方,中央が空いている旋回羽根を用いた場合には中央からの噴流によって誘引される軸流によって火炎は下流に押し戻される挙動を示すことが分かった.現在,環境適合・窒素酸化物低減の観点から希薄予混合火炎が工業用燃焼器に利用される場合が増加している.これは局所的高温領域の抑制が可能で,NOx低減効果が大きいためであるが,一方では伝播性のために逆火による燃焼器の損傷の危険性が生じ,安定した火炎状態を維持する燃焼法を確立することが重要となる.また,燃焼器管内では火炎安定化と空気・燃料流の混合促進のために旋回流をともなう.このことから,旋回流による渦崩壊や歳差運動が生じ,不安定な伝播挙動が火炎構造をより複雑にする.このため,管内旋回流下での予混合火炎の動的挙動を時系列レーザ応用画像計測から直接測定し,予混合火炎の管内伝播特性を解明することを目的とする.このため本年度は,メタンを燃料とする希薄予混合火炎の非定常挙動を解析するために,高速度カメラとステレオPIVを用いて旋回流を伴う円筒管内を伝播する火炎面の形状,火炎先端付近の未燃焼ガスの流動,火炎面の挙動を同時に計測可能とし,その特性に関する考察を行った.得られた結果は以下の通りである.(1)空気流量が増加するに従って,低い空気比で逆火が生じる傾向がみられた.旋回流中の渦心に沿って火炎が伝播する場合には歳差運動が見られた.(2)火炎先端付近に軸方向流速が低い領域が存在することを明らかにし,火炎の伝ぱする方向とこの火炎先端部に形成される低流速部の関連性を明らかにした.(3)歳差運動する渦心と火炎先端部で鉛直軸方向速度成分が低流速である領域がほぼ一致することを明らかにした.円管内希薄予混合火炎の動的挙動と流れ場を同時に計測可能とし,この測定方法を用いて旋回流を伴う希薄予混合火炎の非定常挙動と流れ場の関連性を解析した.ここでは,2種類の予混合旋回羽根を用いて,異なる火炎の伝播挙動を考察した.中央が閉じた旋回羽根を用いた場合には旋回流を伴う火炎の先端部は高い歪みを受けるために火炎の消炎が生じて,中心部が逆流であるにもかかわらず,上流への伝播を抑制されている.一方,中央が空いている旋回羽根を用いた場合には中央からの噴流によって誘引される軸流によって火炎は下流に押し戻される挙動を示すことが分かった.現在,環境適合・窒素酸化物低減の観点から希薄予混合火炎が工業用燃焼器に利用される場合が増加している.これは局所的高温領域の抑制が可能で,NOx低減効果が大きいためであるが,一方では伝播性のために逆火による燃焼器の損傷の危険性が生じ,安定した火炎状態を維持する燃焼法を確立することが重要となる.また,燃焼器管内では火炎安定化と空気・燃料流の混合促進のために旋回流をともなう.このことから,旋回流による渦崩壊や歳差運動が生じ,不安定な伝播挙動が火炎構造をより複雑にする.このため,管内旋回流下での予混合火炎の動的挙動を時系列レーザ応用画像計測から直接測定し,予混合火炎の管内伝播特性を解明することを本研究の目的とする.そこで,本年度はメタンを燃料とする希薄予混合火炎の非定常挙動を解析するために,2台の高細度高速度ビデオカメラを同時に用いて,ステレオ視による旋回流を伴う円筒管内を伝播する火炎面の形状,火炎先端付近の未燃焼ガスの流動,火炎面の挙動を時系列的に計測可能とし,その特性に関する考察を行った.旋回羽根の角度を変化できる旋回羽根を新たに構築し,流量を一定に保ちながら,スワール数のみを変化させることを可能とした.得られた結果は以下の通りである.(1)空気流量が増加すると,スワール数の変化に対する円管中心部の軸方向速度の変化が大きくなる.そのため空気流量が増加すると,スワール数の変化に対する逆火限界空気比の変化が大きくなる.(2)渦心が歪曲しない場合,周方向最大速度が局所的に変化することで,付近の流体塊の軸方向速度が変化し,渦心逆火に影響を与えている.(3)渦心が歪曲する場合,周方向最大速度が局所的に変化しても,付近の流体塊の軸方向速度が変化しにくい.また大きく歪曲する場合には火炎を後退させることがわかった.現在,環境適合・窒素酸化物低減の観点から希薄予混合火炎が工業用燃焼器に利用される場合が増加している.これは局所的高温領域の抑制が可能で,NOx低減効果が大きいためであるが,一方では伝播性のために逆火による燃焼器の損傷の危険性が生じ,安定した火炎状態を維持する燃焼法を確立することが重要となる.また,燃焼器管内では火炎安定化と空気・燃料流の混合促進のために旋回流をともなう.このことから,旋回流による渦崩壊や歳差運動が生じ,不安定な伝播挙動が火炎構造をより複雑にする.

このため,管内旋回流下での予混合火炎の動的挙動を時系列レーザ応用画像計測から直接測定し,予混合火炎の管内伝播特性を解明することを本研究の目的とする.そこで,本年度はメタンを燃料とする希薄予混合火炎の非定常挙動を解析するために,高細度高速度ビデオカメラを用いて旋回流を伴う円筒管内を伝播する火炎面の形状,火炎先端付近の未燃焼ガスの流動,火炎面の挙動を時系列的に計測可能とし,その特性に関する考察を行った.旋回羽根には中心部を開放して,比較的に低旋回流場を形成した場合と従来の中心部を閉じて高旋回流を形成した場合を比較検討した.得られた結果は以下の通りである.(1)中心開放型スワーラでは中心閉鎖型スワーラに比べ逆火抑制効果が高く,火炎の安定領域も広いことがわかった.中心閉鎖型スワーラを用いた場合に形成される旋回流れ場では,旋回流渦心の逆流領域を伝播する火炎と,火炎伸長による消炎作用,および断続的な正の流速域の形成が相互に作用して,火炎安定化および逆火が生じることを示した.(2)中心開放型スワーラを用いた場合に形成される旋回流れ場では,軸流噴流による逆火抑制効果と,当量比の増加に伴い火炎面がセル状化することで火炎面積が増大し,逆火を誘起することが分かった.メタンを燃料とする希薄予混合火炎の非定常挙動を解析するために,高速度カメラとステレオPIVを用いて旋回流を伴う円筒管内を伝播する火炎面の形状,火炎先端付近の未燃焼ガスの流動,火炎面の挙動を同時に計測可能とし,その特性を明らかにすることができたため.25年度が最終年度であるため、記入しない。メタンを燃料とする希薄予混合火炎の非定常挙動を解析するために,高細度高速度ビデオカメラを用いて旋回流を伴う円筒管内を伝播する火炎面の形状,火炎先端付近の未燃焼ガスの流動の時系列PIV,火炎面の挙動を同時に計測可能とし,その特性を明らかにすることができたため.出射側に光ファイバーによる光学系とコリメータを装着した連続発振レーザを用いて,これと高細精度高速度カメラを用いた管内時系列2次元PIV計測のための光学系を構築する.この光学系を旋回流をともなう希薄予混合火炎の非定常伝播挙動解析に適用する.この測定結果から火炎面の非定常挙動と管内流動との相関性を明らかにする.25年度が最終年度であるため、記入しない。高細度高速度ビデオカメラを2台組み合わせて,管内流動の時系列ステレオPIVを可能とし,さらに旋回羽根角度を可変とした燃焼器の構築を行う.次に,この計測光学系を旋回流をともなう希薄予混合火炎の非定常伝播挙動解析に適用する.この測定結果から火炎面の非定常挙動と管内流動との相関性を明らかにする.
硬骨を持たない原始的脊椎動物ヤツメウナギにおける新規カルシウム代謝機構 の解明

脊椎動物において血中カルシウム濃度は、骨や鱗(硬骨魚類)をカルシウム貯蔵庫にして、血中カルシウム低下ホルモン(カルシトニンとスタニオカルシン)と血中カルシウム上昇ホルモン(副甲状腺ホルモンやカルシトリオール(活性型ビタミンD)により調節されている。我々は、硬骨や鱗のない円口類ヤツメウナギにおける血中カルシウム調節ホルモンの役割を検討した。まずカルシトニンと受容体を同定した。さらに淡水順応したヤツメウナギの希釈海水移行による血漿カルシトニン濃度上昇と、イオン調節に重要な鰓における受容体mRNAの発現上昇を認めた。またスタニオカルシンを新たに同定し、脊椎動物の祖先から存在することを明らかにした。本研究課題は、硬骨をもたない原始的な脊椎動物であるヤツメウナギを用い、ほ乳類において骨代謝ホルモンとして知られるカルシトニンの始原的機能を明らかにすることを目標としている。本年度は、まずカワヤツメウナギ(Lampetra japonica)のカルシトニン及びカルシトニン受容体の全長配列を脳cDNAから決定した。カワヤツメウナギカルシトニン遺伝子は、31アミノ酸残基のカルシトニン様ペプチドをコードしていた。ペプチド配列は、脊椎動物カルシトニンに対して37-53 %の同一性を示した。N末端側は、SーS結合により形成されるカルシトニンに特徴的な環状構造が、C末端側は、カルシトニンに特徴的なアミド化Proが保存されていた。一方、受容体候補は、全長424アミノ酸配列で、脊椎動物カルシトニン受容体とおよそ40-50 %の配列同一性を示した。脊椎動物のカルシトニン受容体とカルシトニン受容体様受容体との分子系統解析の結果、ヤツメウナギのカルシトニン受容体候補が、脊椎動物カルシトニン受容体及びカルシトニン受容体様受容体の共通祖先に由来することを示した。カワヤツメウナギは、淡水と海水を行き来する遡河回遊魚である。回遊により浸透圧の変化に晒されるが、鰓や腎臓の機能により体内の浸透圧を一定に維持することができる。本研究において、カルシトニン抗体を用いたELISA解析の結果、カワヤツメウナギを淡水から海水に移行する実験で、血中のカルシトニン様物質濃度が上昇することを明らかにした。さらに、カルシトニン受容体候補の遺伝子の発現が、鰓において海水移行により有意に上昇することを明らかにした。これらのことから、ヤツメウナギにおいて、カルシトニンが浸透圧調節に関与している可能性が示唆された。現在、上記の結果をまとめ論文を作成している。ヤツメウナギにおいて、カルシトニン及び受容体候補の全長配列を決定し、それらの浸透圧調節との関係を示唆することができたので、順調に研究が進んでいる。本研究課題は、顎や硬骨をもたない原始的な脊椎動物であるヤツメウナギを用い、ほ乳類において骨代謝に関わるホルモンの始原的機能を明らかにすることを目標としている。昨年度は、血中カルシウム低下ホルモンであるカルシトニンに注目してきた。本年度は、カルシトニン以外の血中カルシウム調節ホルモン、血中カルシウム上昇ホルモンとして副甲状腺ホルモン(PTH)、ビタミンDを、血中カルシウム低下ホルモンとしてスタニオカルシン(STC)に着目した。PTHとSTCをコードする遺伝子及びビタミンD合成酵素の遺伝子をヤツメウナギゲノム情報から検索した。さらに、これらが実際に顎口類(顎をもつ脊椎動物)の相同遺伝子であることをアミノ酸配列比較及び系統解析により検討した結果、全ての遺伝子について、顎口類の血中カルシウム調節ホルモンと同じ起源をもつ可能性が高いことを確認した。さらに特に注目しているSTCについて述べる。STCは、硬骨魚類の血中カルシウム濃度を低下させるホルモンである。スタニウス小体と呼ばれる内分泌器官から精製されたホルモンであるが、全身に遺伝子を発現することが知られている。硬骨魚類では、血中カルシウム濃度の上昇に応答し鰓に作用、鰓からのカルシウム排出を刺激する。顎口類には2種類のSTC (STC1, STC2)が存在している。本年度、研究代表者がヤツメウナギと同じ円口類に属するヌタウナギで、STC2を同定した。さらに今年度の解析の結果、ヤツメウナギSTCは、STC1であることが明らかになった。このことは、円口類の祖先には既に2種類のSTCが存在し、ヤツメウナギとヌタウナギが分かれた後、それぞれの系統で、片方のSTCが失われたことを示している。さらにヤツメウナギSTCの発現解析の結果、顎口類と同じく全ての組織で発現が認められた。円口類において、その存在が不明であったSTC及びビタミンD合成酵素遺伝子を同定し、さらにその分子的特徴を明らかにした。本研究課題は、顎や硬骨を持たない原始的な脊椎動物であるヤツメウナギを用い、ほ乳類において骨代謝に関わるホルモンの始原的機能を明らかにすることを目標としている。昨年度は、カルシトニン以外の血中カルシウム調節ホルモンの解析を実施した。今年度は、近年カルシウム調節ホルモンとして注目されているメラトニンについて解析した。ヤツメウナギにはメラトニン産生器官である松果体が存在し、メラトニンを放出することが知られており、メラトニン合成酵素遺伝子も明らかになっている。今回、ヤツメウナギにおいてメラトニン受容体を同定した。ゲノムデータベースよりメラトニン受容体を検索した結果、候補遺伝子を得た。そして分子系統解析により、顎口類メラトニン受容体と同じグループに属することを見出し、この候補遺伝子がメラトニン受容体であることを確認した。さらにメラトニンの投与実験を実施した。

ヤツメウナギを淡水に1日静置し、メラトニンを10mg/BW kgになるように投与、24時間後に採血、血中カルシウム濃度を測定した。なおメラトニンを溶解する1%DMSO入りの蒸留水を投与した個体群を対照群とした。その結果、メラトニン投与による血中カルシウム濃度の変動に統計的有意差は認められなかった。硬骨魚類のキンギョではメラトニン投与により血中カルシウム濃度が低下するが、応答性が高いのは繁殖後期である。今後は、ヤツメウナギの性成熟ステージに注目して投与実験を実施する必要がある。脊椎動物において血中カルシウム濃度は、骨や鱗(硬骨魚類)をカルシウム貯蔵庫にして、血中カルシウム低下ホルモン(カルシトニンとスタニオカルシン)と血中カルシウム上昇ホルモン(副甲状腺ホルモンやカルシトリオール(活性型ビタミンD)により調節されている。我々は、硬骨や鱗のない円口類ヤツメウナギにおける血中カルシウム調節ホルモンの役割を検討した。まずカルシトニンと受容体を同定した。さらに淡水順応したヤツメウナギの希釈海水移行による血漿カルシトニン濃度上昇と、イオン調節に重要な鰓における受容体mRNAの発現上昇を認めた。またスタニオカルシンを新たに同定し、脊椎動物の祖先から存在することを明らかにした。ほ乳類において、カルシトニンは血中カルシウムを低下させるホルモンとしてカルシウム代謝に関わっている。一方、カルシウム代謝関連遺伝子の中には、血中カルシウムを上昇させる働きのあるホルモンも存在する。H27年度に、血中カルシウム上昇ホルモン関連遺伝子がカワヤツメウナギに存在することを確認する為に、カワヤツメウナギゲノムを検索した結果、副甲状腺ホルモン(PTH)、スタニオカルシン、ビタミンD合成酵素(CYP2R1, CYP24A1)と相同な遺伝子が存在することを明らかにしている。またヤツメウナギにおいて、浸透圧変化とカルシトニンの間に関連性を見いだしたため、上記のホルモンは、浸透圧調節に対してカルシトニンと逆の作用を示すと予想される。そこで、今後は、上記のカルシウム上昇ホルモン相同遺伝子をクローニングするとともに、組織発現分布をRT-PCRで検討する。さらにカワヤツメウナギの海水移行実験の系が既に確立されていることから、この実験系における鰓や腎でのカルシウム上昇ホルモン相同遺伝子の発現変動を解析する。興味深い発現動態を示した場合、in situ hybridizationを用いた局在解析を行い、発現細胞の特徴からその機能を考察する予定である。今後は、ヤツメウナギにおけるメラトニンの血中カルシウム調節作用の解析を実施する。顎口類において、メラトニンは松果体から分泌され概日リズムの調節に関わっている。その他にも様々なメラトニンの機能が報告されており、本課題の分担者は、顎口類におけるメラトニンの骨代謝機能を明らかにしている。硬骨魚類において、メラトニンは、血中カルシウム濃度を低下させる作用を示す。この作用は、硬骨魚類の主要なカルシウム貯蔵器官である鱗の破骨細胞の活性をメラトニンが抑制することで引き起こされる。