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十世紀敦煌-言語生活史の研究

およそ中国には古い時代の言語生活を具体的に再現し得るような一次資料が乏しい。そのような状況下にあって例外とすべきは敦煌写本であって、そこには極めて豊富な材料がほとんど手つかずのままに残されている。わけても十世紀の写本は種類の上でも多様であり、民間の生活を反映する材料に事欠かない。そのための基礎作業として「敦煌言語生活史資料集成」を目指したが、不完全ながらほぼ使用に堪えるデータベースが完成しつつある。十世紀敦煌における漢・チベット二言語併用の問題は、きわめて重要な側面であり、資料もかなりの數にのぼっている。敦煌資料中のこれら資料を網羅的に分析することによって、背景のチベット化された漢人社会の様相、とりわけ佛教社會におけるそれが明らかになった。チベット文字書寫「長卷」の研究がその解明においておおきな部分を占めている。十世紀敦煌における言語に対する規範意識の問題では,いわゆる河西方言がこの地域の共通語的性格を一層強め,吐蕃支配期および帰義軍期の初期にはなお大きな影響力をもった長安の国家標準語が衰退していくという構図を藏漢資料を中心とする敦煌寫本ははっきりと示している。トルファンと敦煌との比較は興味ある事柄であるが、トルファンでは強く漢化されたウイグル人が獨自の字音を形成し、發展させた。これは敦煌におけるチベット人が結局字音の成立までに至らなかったことと對比して興味深い事實である。恐らくこれは敦煌が古來漢人が優勢な社會であり、またチベットの敦煌占據が時間的に短く、文化的にも有效な浸透を成し得なかったことに理由を求められるであろう。今年度の作業は主として10世紀敦煌におけるチベット・漢の二言語併用の問題の解明にむけて、資料の収集と分析とに充てられた。敦煌発見の写本中にはチベット文字で書かれた漢字写本があわせて20種近くあって、本研究代表者はかねてより、その収集と研究に従事してきたが、とりわけ近年においてはロンドンのIndia Office Library所蔵「長巻」(The Long Scroll)を研究の主たる対象としている。「長巻」とは、漢語による禅の教理問答や各種の讃文をチベット文字のみで連写した長巻子であるが、これらのテキストの種類および音写形式のありかた等から判断して、明確に10世紀の産物であると認定できる。したがって、「長巻」は他の10世紀に書かれたであろうと考えられるチベット文字書写漢文文献とならんで、10世紀敦煌におけるチベット・漢語の二言語併用社会の貴重な資料となる。この写本に連写されたテキストは、すぺて僧侶の日常生活に不可決のものであって、実際に日々の僧院生活で用いられたものである。ということは、この写本巻子の使用者が口頭では漢語を用いてそれを理解しながらも、文字使用の上ではチベット文字のほうを選択したことになる。チベット文字で書かれた漢文写本は、かつて考えられていたように、漢語に未熟なチボット人が造ったものでは決してなく、むしろその背景にチベット語チベット文字を採用した漢人社会の存在を想定するのがより妥当であると考えられる。このような10世紀における藏漢双語社会の存在は、チベット文字書写漢文文献のみならず、チベット文字で音注を施した漢文文献や、漢人社会に特有の社会組織である「社」に関するチベット語文書、そしてチベット語による、これも漢人に特有の五姓説に関するチベット語文献など、さまざまな資料によっても想見できる。今年度の作業は昨年に引続き10世紀敦煌におけるチベット・漢の二言語併用の問題の解明にむけて、資料の収集と分析とに充てられた。その中でもロンドンの大英図書館印度省および東洋収集部所蔵の「長巻」(The Long Scroll)の研究を集中的に行った。

「長巻」は、漢語による禅の教理問答や各種の讃文をチベット文字のみで連写した巻子であるが、これらのテキストの種類および音写形式のありかた等から判断して、明確に10世紀の産物であると認定できる。したがって、「長巻」は他の10世紀に書かれたであろうと考えられるチベット文字書写漢文文献とならんで、10世紀敦煌におけるチベット・漢語の二言語併用社会の貴重な資料となる。この写本に連写されたテキストは、すベて僧侶の日常生活に不可決のものであって、実際に日々の僧院生活で用いられたものである。ということは、この写本巻子の使用者が口頭では漢語を用いてそれを理解しながらも、文字使用の上ではチベット文字のほうを選択したことになる。チベット文字で書かれた漢文写本は、かつて考えられていたように、漢語に末熟なチベット人が造ったものでは決してなく、むしろその背景にチベット語チベット文字を採用した漢人社会の存在を想定するのがより妥当であると考えられる。このような10世紀における藏漢双語社会の存在は、チベット文字書写漢文文献のみならず、チベット文字で音注を施した漢文文献や、漢人社会に特有の社会組織である「社」に関するチベット語文書、そしてチベット語による、これも漢人に特有の五姓説に関するチベット語文献など、さまざまな資料によって想見できる。今年度の作業も重點を10世紀敦煌におけるチベット・漢の二言語併用の問題の解明にむけて、資料の分析を行った。數ある資料の中でもロンドンの大英図書館印度省および東洋収集部所蔵の「長巻」(The Long Scroll)のテキストの原文同定とその漢字還元の結果とを公刊できたことは、今年度の大きな成果の一つであった(『東方學報・京都』65)。このテキスト中にはかなり忠實に口語を寫した部分が存在して、漢字で書かれた他の同一テキストの敦煌寫本と比較することによって、當時の敦煌の口語の實情を知る貴重な素材となる。このテキストの公刊に對して外國の研究者から大きな反響があったことはむしろ幸いであった。平成6年3月にPhiladelphiaで行われる中國中世口語に關する國際會議で、この口語部分の分析を發表する豫定である。また一般に10世紀敦煌の藏漢二重言語社會を背景とした「長巻」の位置付けに關しては、すでにパリで行われた日佛コロックにおいて發表を行い、その論文が近く出版される手筈になっている。吐魯番はウイグル人が漢化された文化を育んだところで、敦煌とは異なった意味で興味ある寫本群を殘している土地である。高田は以前からこの地にウイグル獨自の字音體系が存在したことを強く主張し、近年これが定説となりつつある。今回新たにベルリンにある吐魯番寫本中から、ウイグル文字で音注を附した漢文寫本を發見されたが、それは正にウイグル字音に依據した音注であり、貴重な資料である。これに解説を附して公刊できたことも關連する成果の一つである(Altorientalische Forschungen,20-2)。
神経活性ペプチドの生成,分解に関与するプロテアーゼ系の解析

神経活性ペプチドの生成、分解に関与するプロテアーゼ系の解析の一環として、ウシ脊髄の可溶性分画および細胞骨格分画に存在する二種のカルシウム依存中性プロテアーゼを精製し、その諸性状を比較検索するとともに、各種の神経ペプチドおよび関連ペプチド等に対する作用特異性を比較検索した。細胞骨格結合性プロテアーゼは、細胞骨格分画より0.6MKCLで抽出後、有機水銀セファロース4B、カゼインセファロース4BおよびセファロースCL-6Bカラムによるクロマトグラフィーにより均一標品として精製した(精製度3300倍)。可溶性酵素は可溶性分画をDEAE-セルロースカラムクロマトグラフィーにより分画後、同様なクロマトグラフィーにより精製した。両酵素とも、分子量約10万で7.9万と2万のサブユニットから構成される。両者とも0.5mM【Ca^(2+)】濃度で顕著な活性を示し、種々のチオールプロテアーゼ阻害剤により強く阻害された。0.1-0.2mM【Ca^(2+)】濃度下で、可溶性酵素はニューロフィラメント蛋白質の分子量6万8千と16万の成分を主に分解したが、結合型酵素では同様な分解に2倍の濃度の【Ca^(2+)】を必要とした。両酵素を種々の神経ペプチド等に作用させ、生成物を逆相カラムを用いる高速液体クロマトグラフィーで分離し、アミノ酸組成分析により同定し、切断点を比較した。この結果、用いたペプチドの中では、ダイノルフィン(1-13)、α-およびβ-ネオエンドルフィン中のArg-ArgまたはArg-Lys結合が特異的に分解されること、また、ニューロテンシン中のTyr-GLu、アンジオテンシン中のTyr-Ile、酸化インスリンB鎖中のTyr-Leuの各結合が特異的に分解されることが判明した。一方、Leu-エンケファリン、Met-エンケファリン、BAM-12Pは分解されなかった。また、これらの結果は二つの酵素で大差なかった。
タンパク質を含む生体膜モデル反応場での脂質分子配向および反応活性の制御と検出

細胞膜反応において反応因子として働く脂質分子の活性構造を明らかにするための新しい生体膜モデル反応場の作製と実証を目指した。イノシトールリン脂質(PI)含有支持脂質二重膜(SLB)中に形成されるサブミクロンdepressionドメインとその周辺領域がそれぞれ、PI-SLB上での膜変形モジュールタンパク質の自己組織化反応において反応の起点として、その反応起点へのタンパク質の供給を行う領域として働く、ことを直接観察し、脂質膜内微小ドメインのおける役割分担を明らかにした。また、膜内分子状態の計測手法開発のために、グラフェン酸化物およびpolyvinyl chloride膜上へのSLB形成法を確立した。細胞膜上での脂質およびタンパク質の分子配向と組織化は細胞内外での物質・情報・エネルギーの輸送に関わる重要な要因である。本研究課題では、支持平面脂質二重膜(SLB)にペプヂドやタンパク質を導入するてとで真に生体膜モデル反応場として機能する人工脂質膜系を構築し、膜内の脂質およびタンパク質の分子配向と反応活性を検出・制御することを目的とする。そのために必要な3つの要素技術の開発に取り組んだ:(1)SLBへの機能を保った状態でタンパク質を導入する、(2)脂質膜内の分子配向を1分子レベルで直接観察する蛍光デフォーカスイメージング(FDI)法に必要な光学系の構築、(3)分子配向制御のための電極埋め込み基板の作製。平成23年度は、(1)に向けて膜変形モジュールタンパク質であるF-BARをSLBに導入し、その活性評価および自己組織化過程をリアルタイム観察することを試みた。F-BARが活性を示すフォスファチジルイノシトール(PI)を含むSLBを、緩衝液中にCa^<2+>を加えることでSiO_2/Siおよびマイカ基板上に再現性良く作製する方法を確立した。緩衝液中からCa^<2+>を除いた後にF-BARを加えると、SLBから管状構造が伸長することが蛍光顕微鏡で観察されたことから、F-BARがSLB上でも活性を保つことが確認できた。F-BAR添加後のPI含有SLBを緩衝液中で原子間力顕微鏡顕微鏡観察し、F-BARに由来する吸着物の2次元ドメインが成長する様子をin situで観察することに成功した。(2)のFDI法に向けての光学系の改良にも現在取り組んでいる。また、高電子移動度材料として知られるグラフェン上へのSLB形成についても取り組み、グラフェン酸化物(GO)および還元GO上にSLBを作製することができることを示した。グラフェンを電極材料として用いることで、(3)の電極埋め込み基板を代替できる可能性もあると考えている。本研究課題では、支持平面脂質二重膜(SLB)にタンパク質を導入することで真に生体膜モデル反応場として機能する人工脂質膜系を構築し、膜内の脂質およびタンパク質の分子配向と反応活性を検出・制御することを目的としている。平成24年度までにphosphatidylcholine (PC)+phosphatidylinositol (PI)-SLB上に幅20-300 nmのdepletionドメインが形成され、これが膜変形モジュールタンパク質F-BARの自己組織化反応における核生成サイトとして働くことを見出した。平成25年度は蛍光一分子追跡法(SMT)を用いてPC+PI-SLBの流動性とその時空間依存性の評価を行った。射入射照明法によってマイカ基板上で、ビデオレート(33 fps)高速観察(500 fps)で2種類の蛍光標識脂質(BODIPY-H-PC、DiI)を用いてSMT計測を行い、10-40 ms, 60-100 msにおいて段階的に拡散係数が減少する異常拡散現象がPC+PI-SLB中で起きていることを明らかにした。この際の空間依存性はAFM観察におけるdepletionドメインの大きさと密度から得られる値と良く一致しており、depletionドメインが拡散障壁として働いているといえる。核形成サイトとして働く低流動性領域(depletion)と、初期過程においてこのサイトにF-BAR分子を供給する周囲の高流動性領域、という2種類のドメインの物性と役割の関連を直接示すことができた。また、SLBへの電場印加と電気特性計測を行うためにCCDイオンイメージセンサ上へのPC-SLB形成を行い、その流動性をfluorescence recoveryafter photobleachingによって計測した。その結果、本センサに用いるイオン感応膜上のSLBは非流動成分が30%存在するにもかかわらず流動成分が高い流動性を保持していることを明らかにした。そのために必要な3つの要素技術の開発に平成24年度も引き続き取り組んだ:

1SLB上でのタンパク質反応のその場観察、2脂質膜内の一分子蛍光観察と分子配向計測のための蛍光デフォーカスイメージング(FDI)に必要な光学系の改良、3分子配向制御のための電場印加用基板上へのSLB形成。1膜変形モジュールタンパク質のF-BARをphosphatidylcholine (PC)+phosphatidylinositol (PI)-SLB上に添加し、SLB上でのF-BAR自己組織化過程のその場観察を行った。マイカ上に形成したPI+PC-SLB上には深さ約0.9 nmのdepletionドメインが形成された。F-BARはこのドメイン上へと優先的に吸着し、ドメイン内への吸着が飽和した後にドメイン外のSLB上にF-BARの2次元ドメインが成長した。F-BARの優先吸着がおきたことと、2種類の蛍光標識脂質(BODIPY-H-PC、DiI)を用いての蛍光褪色後回復(FRAP)の結果から、depletionドメインがPIリッチな低流動相であることが考えられる。2FDI観察においては通常の蛍光観察よりも高輝度の照明が必要であり、また、FDI像の解析には視野内で均一分布の励起光が必要である。新規に購入した高輝度レーザー光源を用いて光学系の改良を行っている。3電極材料としてグラフェン酸化物(GO)および還元GO上へのSLB形成および還元度合の影響について詳細に検討した。また、電場印加の可能な基板としてCMOS pHセンサーを用いることとし、センサー表面上へのPC-SLB形成方法を確立した。SLBへのタンパク質の添加は平成24年度目以降を計画していたが、前倒しで始めることができた。当初の計画では初年度の目標であったFDI計測についても、基本的な光学系のセットアップを済ませることができた。25年度が最終年度であるため、記入しない。1SLB上でのF-BAR自己組織化反応の直接観察については、マイカ上のSLB中に存在する膜内微小ドメインがF-BAR自己組織化の起点として働くという新規現象を見出した。21分子蛍光観察とFDIについては平成24年度に購入した励起光源を用いて、観察に必要な高輝度照明のための光学系を構築中である。3のために本学で独自に開発されたCMOS pHセンサー上へSLB形成を行う条件を確立した。SLB上でのF-BAR自己組織化過程のその場観察についてはタンパク質濃度や、異なるタンパク質由来のF-BARを用いるなどしてより詳細な観察を行い、メカニズムの解明を目指す。FDI計測については光学系を完成させ、回折像の取得と分子配向観察に着手する。観察系を構築するためには、蛍光色素だけではなくまずより輝度の高い量子ドットを用いる方が適している可能性もあるので、適宜判断する。PI含有SLBおよびF-BARについてFDI計測を行い、F-BARの反応活性を司るPI親水頭部の分子配向の可視化とメカニズムの解明を目指す。平成25年度も上記13の小課題を発展させ、それぞれで得られた知見と要素技術を統合することを目指す。
高齢者の高次脳機能と酸化ストレスに対する効果的な摂食嚥下機能療法の探索

最終年度である本年度は、当初予定していた施設での実施ができなかった機能的磁気共鳴画像(functional magnetic resonance imaging: fMRI)による脳機能の計測を新たな施設で行った。まず、課題発生プログラム(paradigm generator)を動作させるために必要なヘッドフォンを設置することで、被験者が安全かつ安心して課題を遂行できる環境を整備した。被検者に課題を適切に行わせるために課題を図示して、十分に説明し、スキャン中の体動、とくに頭部の動きを最小限に抑えることにも考慮した。「手をにぎったり(ぐー)、開いたり(パー)する掌握運動」でfMRIでの課題の再現性を確認した。被験者は、神経疾患や精神疾患の既往のない、右利きの健常ボランティア(有歯顎者)男性3名、女性2名とした(平均年齢:34.8 ±11.0歳)。実験デザインにはブロックデザインを採用し、課題として「クレンチング」と「舌の口蓋への押し付け」「ガムチューイング」の3つについて検討した。ブロックデザインでは課題と休憩を繰り返し行い、課題と休憩のMRI画像を比較し、差分から脳活動の賦活部位を捉えた。本研究では、課題30秒および休憩30秒の計60秒を1ブロックとして、4回繰り返す計4ブロックを行った。異なる課題間では休憩を60秒に設定した。その結果、個人差はあるものの、健常または要介護高齢者の対照群としての健常者のデータの再現性を確認した。これらの結果から、本研究の検討課題の摂食嚥下機能に関わる口腔機能の舌運動機能訓練が認知機能に及ぼす影響についてfMRIによる高次機能解析の基盤が整った。今後は、これらのデータのさらなる蓄積が必要であり、これらのデータに加え、ESR法により測定した唾液中の抗化能の結果を統合し、舌運動機能訓練の神経科学的意義および酸化ストレス制御との関連性の詳細をさらに解明することが必要であると考えている。本研究は、脳血管障害患者や軽度認知障害、認知症患者において、嚥下体操を実施した前後に2種類の認知機能検査(Mini-Mental-State Examination; MMSE、かな拾いテスト)および磁気共鳴機能画像法と光トポグラフィを用い計測し、評価することで、前頭前野の賦活と再生および認知機能への影響を解明することを1つの課題としている。同時に、被験者の唾液中の活性酸素消去能を電子スピン共鳴(ESR)法にて測定し、嚥下体操による変化を捉えることで、酸化ストレスを介した神経認知機能の状態を評価することも目的である。これらの目的を達成するために、今年度は、まず脳血管障害後遺症患者、認知症患者に対して、十分なインフォームドコンセントを行い、書面による同意が得られたものを対象として、本研究を遂行した。対象者に対して嚥下体操を図示し、分かりやすく説明することで、習得させた。そのうえで、初回の嚥下体操の前後にMMSEとかな拾いテストを実施した。さらに初回の嚥下体操の前後に安静時唾液を採取した。得られた唾液を処理し、主要な活性酸素であるスーパーオキシド(O2・ー)とヒドロキシラジカル(HO・)に対する消去能をESR法にて測定した。O2・ーまたはHO・の産生系に被験者の唾液を加えた後、それら活性酸素をESR法で捕捉するためのスピントラップ剤を用いin vitroX-band ESR法で検出を行い、唾液の活性酸素消去能を解析した。その結果、要介護度の高い脳血管障害後遺症患者、認知症患者では嚥下体操前後のO2・ー、HO・の消去能に変化を認めなかった。嚥下体操が過度な体操となり、ROSが増加し、生じたROSに対して、十分な抗酸化酵素や抗酸化物質の働きが認められず、抗酸化機構のバランスが崩れた可能性が考えられた。当初の計画で、初年度の研究対象者を反復唾液嚥下テスト(RSST)が30秒間に3回以上であり、これまで嚥下体操を日常的に行っていない高齢者ボランティア(6075歳)としていたが、十分な人数の確保ができなかった。そこで次年度に予定していた脳血管障害患者、認知症患者を対象者に加え、研究を進めた。本人のみではなく、介護者の立会いのもとで書面によるインフォームドコンセントを得るため、説明に時間を要し、研究の開始が遅れた。現在、嚥下体操を開始し、初回の嚥下体操前後のデータの採取が完了し、対象者は継続的に嚥下体操を行っている。1ケ月、3ケ月、6ケ月のデータの採取はできていない。そのため、データの蓄積が不十分である。本研究は、脳血管障害患者や軽度認知障害、認知症患者において、嚥下体操を実施した前後に2種類の認知機能検査(Mini-Mental-State Examination; MMSE、かな拾いテスト)および磁気共鳴機能画像法と光トポトラフィを用い計測し、評価することで、前頭前野の賦活と再生および認知機能への影響を解明することを1つの課題としている。これらの目的を達成するために、昨年度に引き続き今年度も、十分なインフォームドコンセントを行い、書面による同意が得られた健常高齢者、脳血管障害後遺症患者、認知症患者を対象としてデータを収集した。本年度は昨年度の結果を受けて、一連の嚥下体操のなかで、どの運動が抗酸化能を高めるかの検証を開始した。

まず、健常者で舌、頬、口唇の各体操および発声の前後に安静時唾液を採取した。得られた唾液を処理し、主要な活性酸素であるスーパーオキシド(O2・-)とヒドロキシラジカル(HO・)に対する消去能をESR法にて測定した。O2・-またはHO・の産生系に被験者の唾液を加えた後、それら活性酸素をESR法で捕捉するためのスピントラップ剤を用いin vitroX-band ESR法で検出を行い、唾液の活性酸素消去能を解析した。健常者ではO2・-またはHO・の抗酸化活性は嚥下体操により上昇するが、脳血管障害後遺症患者、認知症患者ではそのような結果がみられなかった。現在、被験者数を増やし、データを蓄積している。さらに運動の効果をMMSEとかな拾いテストにより検討する予定であったが、他の認知機能や高次脳機能評価を取り入れ、fMRIの検討を含めた脳機能の評価のブラッシュアップを同時に進めている。健常者では唾液中のO2・-またはHO・の抗酸化活性が嚥下体操により上昇し、脳血管障害後遺症患者、認知症患者ではみられない結果を得た。そのため、加齢、脳血管障害、認知症などは唾液中の抗酸化機能の変化に影響を与えることから、本研究結果の詳細な検証が必要である。この結果をうけ、認知機能テスト、高次脳機能評価の検証を進めるために、研究分担者関連病院との共同研究を進めていくはずであったが、研究分担者の研究環境の変化により、当該病院での共同研究が難しくなった。そのため、新たな高次脳機能評価を専門とする連携研究者とfMRI、光トポグラフィ等の高次脳機能評価法の議論を重ねた。その結果、結果の判定がしにくいfMRI、光トポグラフィ等の高次脳機能評価法の前に、既に連携研究者が推奨している高次脳機能評価法で評価した後に必要であれば、fMRI、光トポグラフィによる評価を行うことにした。そのため、当初の研究計画が変更になり、計画に遅れを生じている。有効なデータでの解析を行うためには、被験者数を増やす必要がある。また、脳血管障害患者、認知症患者を対象者にした検討も必要であり、早急に被験者数を増やし、検討を行う予定である。当初の計画における評価も継続的に行っているが、十分な人数の確保ができない状況である。最終年度である本年度は、当初予定していた施設での実施ができなかった機能的磁気共鳴画像(functional magnetic resonance imaging: fMRI)による脳機能の計測を新たな施設で行った。まず、課題発生プログラム(paradigm generator)を動作させるために必要なヘッドフォンを設置することで、被験者が安全かつ安心して課題を遂行できる環境を整備した。被検者に課題を適切に行わせるために課題を図示して、十分に説明し、スキャン中の体動、とくに頭部の動きを最小限に抑えることにも考慮した。「手をにぎったり(ぐー)、開いたり(パー)する掌握運動」でfMRIでの課題の再現性を確認した。被験者は、神経疾患や精神疾患の既往のない、右利きの健常ボランティア(有歯顎者)男性3名、女性2名とした(平均年齢:34.8 ±11.0歳)。実験デザインにはブロックデザインを採用し、課題として「クレンチング」と「舌の口蓋への押し付け」「ガムチューイング」の3つについて検討した。
有害異常血管閉塞用コラーゲンコイルの開発

◆有害異常血管塞栓術におけるNew device:アテロコラーゲンコイル開発を計画したが、現在コイル作製が不可能のため、新たにコラーゲン溶液製の液体状血管閉鎖栓の開発を立案した。◆(株)高研の「アテロコラーゲンインプラント:ACI」は、37°C以上で液体状から弾性ゲル状に変化し、涙腺閉鎖栓や皮膚陥没充填剤として実用化されている。◆ACIを異常血管へ留置するデリバリーシステムは、直径5Fr.以上の先孔式カテーテル内に直接ACIを注入する方式に修正した。◆In vitro実験、計画修正・立案のため、ウサギによる動物実験開始が大幅に遅れた。今後、当初の計画通りに動物実験を進める予定である。【アテロコラーゲンを素材とする生体吸収性液状血管閉鎖栓の開発】◆乳幼児・小児の有害異常血管へのコイル塞栓術において、金属コイル血管内留置の影響・予後を懸念しアテロコラーゲンコイル開発を計画したが、H23年度計画実施に際し、作成予定の30%濃度コラーゲン溶液が製造中止、溶液を紡糸する高圧紡糸機器が稼動中止である事からコラーゲンコイルは作成不可能との結論に至った。◆この解決策としてH24年度は既存のアテロコラーゲン製品(MIGHTY)を加工して使用する計画に修正、さらにアテロコラーゲン製ステントの開発を追加立案した。しかし円柱状コラーゲンスポンジのMIGHTYに加工を施すと極端に強度が落ち、MIGHTY自体が圧縮には強いが牽引には弱く、カテーテル内や血管内での操作性・安全性に問題があり適さないとの結論に至った。◆そこで新案としてアテロコラーゲン溶液を素材とする生体吸収性液状血管閉鎖栓の開発を立案した。コラーゲン溶液は冷所では液状だが、37°C(≒体温)でゲル化する性質を有し、既に眼科領域ではドライアイに対する涙点閉鎖栓として実用化されている。◆現在、実験モデルとしてウォーターバス内に血管に見立てた栄養チューブを置き、37.5°C加温下でコラーゲン溶液の注入実験を行っている。コラーゲン溶液は(株)高研のアテロコラーゲンインプラントで1%、2%、3%がある。3%溶液は粘稠度が高く注入中にマイクロカテーテル内でゲル化したが、2%以下の溶液ではチューブ内に充填できた。造影剤と混合し12%濃度に調整すれば異常血管内への充填が可能だと考えられる。デリバリーシステムとして先孔式バルーンカテーテルとマイクロカテーテルを使用する。前者は液状のコラーゲン溶液が標的以外に拡散しないよう後方からの血流遮断の目的で、後者はコラーゲン溶液を注入する目的でのみ使用する。◆実験動物は引き続きウサギを使用する。◆乳幼児・小児の有害異常血管へのコイル塞栓術において、金属コイル血管内留置の生体へ及ぼす影響・予後を懸念しアテロコラーゲンコイル開発を計画したが、H23年度計画実施に際しコイル作成が不可能となったため、新たにコラーゲン溶液を用いた液体状血管閉塞栓の開発を立案した。◆その資材は(株)高研から発売されている「アテロコラーゲンインプラント:以下ACI」である。冷所では液体状に、37°C以上で弾性に富むゲル状に変化する性質を持つ。眼科領域では涙腺閉鎖栓として、皮膚科領域では皮膚陥没充填剤として実用化されており、安全性は実証されている。◆H23、24年度は、このACIを経カテーテル的に異常血管へ留置するデリバリーシステムの開発と、適正濃度選択をin vitroに繰り返し実験した。◆デリバリーシステムは後方血流遮断目的である先孔式バルーンカテーテル内のマイクロカテーテルにACIを注入する方式を考案。またX線透視下での視認性と操作性を課題とした。◆ACIゲル化の観察では、極細径のカテーテル内を押し出すには高粘調性で抵抗が強く押し出し注入は困難であった。濃度調整を試みたが解決に至らず、直径の異なるカテーテルを各々試した結果、径5Fr以上ではゲル化が始まっても押し出し可能であることが確認された。そこで先孔式カテーテル内に直接ACIを注入する方式にデリバリーシステムを修正した。◆ACIはX線透視下で視認されず血管内注入に際しては何らかのマーカーが必要となるため、選択的造影の際に注入する造影剤をマーカーとした。◆以上の経過を経てH25年度にウサギを用いた動物実験に着手した。しかしウサギに対するカテーテル留置は技術的に困難であり、開始後しばらくの間はACI注入ができなかった。このため遅れていた研究実験が更に遅れる結果となった。今後、当初の計画通りに動物実験を進めていく予定である。

◆乳幼児・小児の有害異常血管へのコイル塞栓術において、金属コイル血管内留置の生体へ及ぼす影響・予後を懸念しアテロコラーゲンコイル開発の研究を計画したが、H23年度計画実施に際し二つの問題に直面した。◆(株)高研に依頼したコラーゲンコイルは(1)30%濃度コラーゲン溶液をノズルより空気中に押し出し紡糸、(2)得られたコラーゲン糸を金属芯に巻き付けコイル形状固定し作製予定だったが、現在30%濃度溶液は製造を中止、更に高圧紡糸機器が使用不能でありコラーゲンコイルは作製不可能との結論に至った。◆この解決策として、既存の円柱状アテロコラーゲン製品(MIGHTY)を加工して使用する計画に修正した。MIGHTYは直径3mm,縦5mmの円柱状の密なアテロコラーゲンスポンジで、50%の圧縮が可能、圧縮解除により復元する能力を持つ。またこの円柱形態を利用してもう一つの計画を追加立案した。血管閉鎖栓と反義である血管拡張用デバイス、即ちアテロコラーゲン製ステントの開発である。狭窄血管拡張用ステントは現在薬剤溶出性金属ステントが主流であるが、再狭窄が最大の問題点である。MIGHTYの中心部をくり抜く加工により円筒状コラーゲンが作製でき、これをバルーンカテーテルに装着し、狭窄部でバルーン拡張し留置する計画である。天然素材によるステントがより金属異物反応を低減できる可能性を秘めており、再狭窄予防効果が期待される。現在この2種類のデバイスを作製中である。◆実験動物は仔豚30頭を計画したが、単価・飼育料が高額のため実験頭数を大幅に減らす必要性に迫られた。◆この解決策として、より安価で実験頭数を確保できるウサギへ変更することに修正した。ウサギは生涯体重35kg位であり人間の新生児乳児相当であることから本研究には合目的的である。H24度よりコラーゲン閉鎖栓およびステントを用いた動物実験に着手する予定である。コラーゲンコイル作成が不可能となり、H24年度に修正立案したアテロコラーゲンスポンジ製品の加工による閉鎖栓開発および追加立案したコラーゲンステント開発計画は、素材の特性から実験遂行が難航、適さないと判断し、コラーゲン製液状血管閉鎖栓開発という新たな実験案に修正し研究実験を開始したため。(理由)H23年度中にコラーゲンコイルを作製・改良し、動物実験も開始する予定であったが、研究実績の概要に前述したとうり以下の二つの問題に直面した。1.計画していたコラーゲンコイルは工場において作製不可能との結論に至った。2.実験動物は仔豚30頭を計画したが、単価・飼育料が高額のため実験頭数を大幅に減らす必要性に迫られた。以上の理由から、研究の達成度は当初の予定よりやや遅れる結果となった。これに対して前述した解決策によりそれぞれ計画を修正し、現在アテロコラーゲン血管閉鎖栓およびアテロコラーゲンステントの2種類のデバイスを作製・改良中である。新たに立案したアテロコラーゲンを素材とする生体吸収性液状血管閉鎖栓の作成・開発を進めていく。現在行っているin vitroでの実験により、デバイスおよびデリバリーシステムが完成次第、ウサギを用いたin vivoでの動物実験を開始する。動物実験開始後は、予定期間経過後に血液検査および血管造影検査を施行後解剖し、摘出したデバイス留置血管の組織学的検討を行う。新たに計画修正した円柱状アテロコラーゲンスポンジ(MIGHTY)を加工して作製する血管閉鎖
真核植物における生物時計の普遍性と進化の解明

ほぼ全ての生物の生命活動は、24時間周期のリズム(概日リズム)を示し、リズム発振の分子機構を生物時計と呼ぶ。概日リズムの性質は普遍的であるが、植物細胞においては、シアノバクテリア、真核緑藻クラミドモナス、高等植物シロイヌナズナで時計遺伝子に普遍性が見出されていない。本研究では、植物時計の進化と普遍性を解明することを目的として、よりシンプルな真核植物における時計遺伝子の探索、様々な植物系細胞における生物時計支配下の生理現象の解析、シアノバクテリアの時計装置の解析を試みた。C. merolae(シゾン)において、生物発光リアルタイム測定法でリズム変異体を効率良くスクリーニングするために、綺麗で再現性の良い発光リズムを示す発光株の確立を進めた。まずシゾンの核ゲノムのコドン使用頻度に最適化した高発光型ルシフェラーゼ遺伝子を人工合成し、DNAアレイのデータから高発現で概日リズムを示ことが予想される9つの遺伝子を選抜した。次に、これら9種類の遺伝子の発現をそれぞれ生物発光としてモニタするための発光レポーター遺伝子と、それをシゾンの核ゲノムに組み込むためのベクターを開発した。そして、9種類の発光レポーター遺伝子それぞれを、シゾンの核ゲノムに相同組換えによって遺伝子移入した。9種類の発光レポーター遺伝子それぞれについて、シゾンの核ゲノムに設計通りに組み込まれた発光株の選抜を行い、9種類の発光レポーター遺伝子それぞれに対して、設計通りに組み込まれている形質転換株体を得た。これらの発光株の生物発光の検出と発光パターンを調査した結果、概ねDNAアレイの発現プロファイルと一致する発現レベルとパターンを示した。また、生物発光リズムの調査を行ったところ、概日リズムが検出できたレポーター遺伝子とできなかった遺伝子があった。しかし、概日リズムを示す発光株においても、ハイスループットスクリーニングを精度良く行うためには、リズムの綺麗さが十分ではなかった。このため、測定条件や培養条件等の詳細な条件検討を進めた。その他の研究として以下の4つを実施し、論文を発表した。(1)藍色細菌における生物時計による水チャンネルの発現制御に関する研究、(2)藍色細菌の時計タンパク質KaiBの構造変化と時計機能との相関の解明、(3)藍色細菌の時計タンパク質SasAの時間情報出力の役割の解明、(4)イネにおける糖代謝遺伝子の発現制御の解析。昨年度に引き続き、C. merolae(シゾン)において、生物発光リアルタイム測定法でリズム変異体を効率良くスクリーニングするために、綺麗で再現性の良い発光リズムを示す発光株の確立を進めた。まず、昨年度作成した9種類のレポーター株を用いて、生物発光リズムが再現良く測定できる条件を検討したが、十分な条件を見出せなかった。いずれのレポーター株も発光レベルが十分であったが、リズムの振幅が低く、高発光のまま光り続けてしまう傾向があった。細胞内における発光タンパク質の分解速度が遅く過剰蓄積している可能性が高かったため、発光タンパク質に分解シグナルを付加して、安定性を低下させることにした。タンパク質分解シグナル配列を付加した発光タンパク質をコードする人工的な遺伝子(EL2)を設計してシゾンのコドンに最適化して人工合成した。EL2をシゾンの4種類のプロモーターそれぞれと接続してレポーター遺伝子を作製し、それぞれをシゾンのゲノムに遺伝子移入した。新たに作成した発光レポーター株は、以前のレポーター株と同等の生物発光レベルを示し、発光レベルの変化も鋭敏になったが、依然として、ハイスループットなスクリーニングに十分ではなかった。プロモーターの選択や測定条件の再検討を進めている。また、これらの過程で、シゾンの遺伝子操作(形質転換体作成)における新たな選択マーカー遺伝子を開発した(論文作成中)。その他の研究として以下の3つの研究を実施して、論文を発表した。(1)代表者が高等植物で発見した時計遺伝子PCL1の単細胞性真核緑藻クラミドモナスにおける類似遺伝子ROC15が、生物時計の光リセッティングに重要であることを明らかにした。(2)藍色細菌におけるイオンチャンネルの機能と生物時計で制御される発現タイミングの相関を明らかにした。(3)藍色細菌の時計タンパク質KaiBとKaiCの相互作用を明らかにした。・C. merolae(以降「シゾン」と略す)の発光レポーター株の作製:生物発光リアルタイム測定法でリズム変異体を効率良くスクリーニングするためには、綺麗で再現性の良い発光リズムを示す標準型株が不可欠である。発光レポーター株を作製するにあたり、市販の高発光型ルシフェラーゼ遺伝子のシゾン細胞内における発現を調査したところ、十分な効率が得られなかったので、同じタンパク質をコードし、シゾンの核ゲノムのコドン使用頻度に最適化した遺伝子を人工合成した。次に、シゾンのDNAアレイ実験のデータから発現が日周変動していると思われる遺伝子を数十個ピックアップし、さらにその中から、発現レベルが高いと予想される遺伝子を9個選抜した。そして、これらの遺伝子のプロモーター配列をクローニングし、それぞれを人工合成した発光遺伝子と接続して、発光レポーター遺伝子カセットを作製した。

また、同時並行して、シゾンの核ゲノムの特定の部位に外部から遺伝子移入を行うためのターゲッティングサイトとターゲッティングベクターを開発した。このターゲッティングベクターに、それぞれの発光レポーター遺伝子カセットを組み込んだベクターを作製した。そして、野生型シゾンに対して、発光レポーター遺伝子の移入を行った。現在、発光レポーター遺伝子が設計通りに組み込まれた発光株の選抜を進めている。その他の研究として、以下の2つを実施した。(1)藍色細菌における生物時計による水チャンネル遺伝子発現の制御に関する研究、(2)藍色細菌の時計関連タンパク質SasAを介した生物時計タンパク質からの時間情報の伝達機構の解明。これらの研究成果は学術論文として発表した。当初の予想に反して、発光レポーター遺伝子をシゾンのゲノムへ遺伝子移入する作業効率が劇的に悪かったため、発光株を確立するために、多大な時間を費やしてしまった。しかし、様々な最適化を行うことで、問題は解決できた。市販の生物発光レポーター遺伝子は、原始紅藻シゾンの細胞内で十分な発現を示さなかったので、発現効率を改善するために、コドン使用頻度を最適化した発光レポーター遺伝子の人工合成を行った。また、発光レポーター遺伝子のシゾンのゲノムへの遺伝子移入効率が予想以上に低かったため、発光レポーター株の作製に予想以上の時間を要してしまった。(1)リズム変異体の大規模スクリーニングと分離した変異体の分類:まず、開発した発光レポーター株でスクリーンイングの条件を検討し、野生型発光株をEMS(ethyl methane sulfonate)で処理して突然変異を誘発する。そして、「ハイスループット生物発光リアルタイム測定システム」を用いて、遺伝子発現を生物発光として連続的に自動測定する。リズムの周期や位相(タイミング)および振幅に野生型と顕著な差異が観察される変異体を多数分離し、表現型に基づいて分類する。(2)変異体の全ゲノム配列解析による原因遺伝子候補の同定:変異体が十分な個数(例えば100個)分離収集できた時点で、変異表現型が類似した各変異体からDNAを調製し、それぞれに異なるタグDNAを付加して(DNAにバーコードラベルを付加して)プールし、次世代シーケンサーを使って全ゲノム配列を解析する。標準株と異なる塩基(主に置換)を全て抽出し、各遺伝子座上に変異をマップする。リズム変異に関係する重要な遺伝子であれば、同一遺伝子座上に何度も塩基変化が出現すると予想できるので、そのような塩基変化が何度も見つかる遺伝子が時計に関係する遺伝子(時計遺伝子を含む)の候補である。(3)特定した遺伝子が時計遺伝子であることの確認:各変異体に野生型の原因候補遺伝子を移入し、変異表現型が野生型に戻ることを確認し、候補遺伝子が変異体の原因遺伝子であることを確認する。
フライトデータに基づく姿勢制御システムの評価と高精度ポインティング技術の開発

恒星センサの屋内評価環境であるスターシミュレータの整備を行い,恒星センサの3軸の回転を補正するために回転テーブルを追加し,並進方向と合わせて6自由度でセンサの取付位置および角度を調整可能とした.その後,恒星センサの処理速度の向上のためにNearest Neighbor Star Search Approach(最隣接恒星探索法)を用いたトラッキングアルゴリズムを開発し,星の参照速度を超小型衛星RISING-2に搭載した恒星センサに比べて25倍高速にした.また,高精度恒星センサの開発のためにCMOSセンサを使って姿勢検出実験を行った.スターシミュレータで任意の方向の星を表示し,正常に姿勢を検出できることを確認し,屋外においても姿勢の検出が可能であることを確認した.これにより,本研究によって,恒星センサの姿勢検出周期や姿勢決定精度を向上させる技術を確立することができた.一方,RISING-2のフライトデータ解析では,姿勢制御系のセンサデータのノイズ解析やバイアス補正等を行い,磁気センサや太陽センサのセンサモデルを構築した.そして,それらのデータに対して拡張カルマンフィルタ(EKF)を適用し,姿勢推定解析を行った.その結果,EKFによって安定した姿勢情報を得ることができることが確認された.特に,磁気センサとジャイロセンサの計測データにEKFを適用することで常時安定した姿勢推定値が得られることがわかった.また,EKFによる推定法を応用することで磁気センサのみで衛星の姿勢と角速度を推定することができ,高精度姿勢制御システムを補う手法を開発することができた.これらの成果から,高精度ポインティングに必要な恒星センサの技術を確立し,それを支援する姿勢推定技術を構築できたと考えられる.27年度が最終年度であるため、記入しない。27年度が最終年度であるため、記入しない。2014年5月24日に超小型衛星RISING-2の軌道投入に成功した.運動解析の結果から,軌道投入後磁気コイルによる角速度減衰制御により角速度を低下させることができた.衛星の電力系や通信系の正常動作を確認後,搭載姿勢センサの動作を確認し,得られたフライトデータから磁気センサやジャイロセンサの取付誤差やオフセットを推定した.また,アクチュエータであるリアクションホイールの動作テストにより,地上での評価結果と同程度の性能を発揮することが確認された.その後,リアクションホイールを使った地心指向制御や地表面定点指向を実施し,搭載した望遠鏡による地表面の撮影および画像の取得に成功した.磁気センサ,太陽センサおよびジャイロセンサによる指向制御時の運動解析から指向精度は10度以下,姿勢安定度は0.2deg/s以下であった.赤外線を用いた観測機器であるボロメータアレイによる観測のために深宇宙指向と地心指向を連続的に行う2地点指向制御を実施し,観測機器の特性上必要な太陽光を回避を行いながら大角マヌーバに成功した.さらに恒星センサを用いて軌道上で姿勢検出および星画像の取得に成功し,独自に開発した恒星センサの宇宙実証を実現した.これらの成果から,後継機にも搭載される同種の各センサのキャリブレーション技術の蓄積,3軸姿勢制御技術の確立ができたと考えられる.衛星の運用および解析に並行して,恒星センサ用試験環境の構築を行った.モニタ上に星を写すソフトウェアの開発および移動ステージ等を用いた位置調整機能の構築を行い,簡易的な表示システムで,RISING-2ベースの恒星センサを用いて姿勢を検出できることを確認した.また姿勢制御シミュレータと連携させ,恒星センサを用いたハードウェアループシミュレーション環境の構築を行った.今後,この開発環境の整備を進めることで,汎用的な衛星開発環境の性能向上につながると考えられる.恒星センサの屋内評価環境であるスターシミュレータの整備を行い,恒星センサの3軸の回転を補正するために回転テーブルを追加し,並進方向と合わせて6自由度でセンサの取付位置および角度を調整可能とした.その後,恒星センサの処理速度の向上のためにNearest Neighbor Star Search Approach(最隣接恒星探索法)を用いたトラッキングアルゴリズムを開発し,星の参照速度を超小型衛星RISING-2に搭載した恒星センサに比べて25倍高速にした.また,高精度恒星センサの開発のためにCMOSセンサを使って姿勢検出実験を行った.スターシミュレータで任意の方向の星を表示し,正常に姿勢を検出できることを確認し,屋外においても姿勢の検出が可能であることを確認した.これにより,本研究によって,恒星センサの姿勢検出周期や姿勢決定精度を向上させる技術を確立することができた.一方,RISING-2のフライトデータ解析では,姿勢制御系のセンサデータのノイズ解析やバイアス補正等を行い,磁気センサや太陽センサのセンサモデルを構築した.そして,それらのデータに対して拡張カルマンフィルタ(EKF)を適用し,姿勢推定解析を行った.その結果,EKFによって安定した姿勢情報を得ることができることが確認された.特に,磁気センサとジャイロセンサの計測データにEKFを適用することで常時安定した姿勢推定値が得られることがわかった.また,EKFによる推定法を応用することで磁気センサのみで衛星の姿勢と角速度を推定することができ,高精度姿勢制御システムを補う手法を開発することができた.これらの成果から,高精度ポインティングに必要な恒星センサの技術を確立し,それを支援する姿勢推定技術を構築できたと考えられる.高精度恒星センサの光学設計にいまだ着手できていないため.また,ソフトウェアに関して新たなセンサ素子に対応できるアルゴリズムの実装やRISING-2ベースの恒星センサで用いた星検出アルゴリズムの改良に取り組めていないためである.27年度が最終年度であるため、記入しない。

高精度恒星センサの光学設計およびソフトウェア開発を実施し,恒星センサ用試験環境での性能評価を行う.遮光バッフルについては,これまでの開発実績から予算的に困難であることがわかったため,開発は行わず,恒星センサの姿勢決定精度の向上に特化して研究に取り組むこととする.また,姿勢決定に関するカルマンフィルタの研究開発に取り組み,RISING-2で得られた知見をもとに次期衛星の姿勢制御系全体の品質向上に取り組む.磁気コイルとリアクションホイールの複合制御系の開発は,RISING-2のフライトデータから擾乱が少ないことが分かったため,リアクションホイールによる姿勢制御精度の向上に研究対象を絞って研究開発に取り組む.そして,これらの技術開発を統合し,ハードウェアループシミュレーションにより,ポインティング精度の評価を行う予定である.27年度が最終年度であるため、記入しない。
アセチル化ケルセチンの生理活性増強の原因の解明

最も合成しやすい4AcQの合成経路を基本とし、反応条件を検討することで5AcQ, 3AcQ-Aが高収率で得られた。また、位置違いのアセチル基を持つ4AcQ-B, 3AcQ-Bはケルセチンのヒドロキシ基をアセチル修飾するのではなく、既にアセチル化された5AcQまたは4AcQ-Aからそれぞれ7位アセチル基を選択的に脱離させることによって合成を試みた。細胞実験では、Quercetinと合成した5種類のアセチル化体を用いてヒト結腸癌細胞HCT116 p53+/+, HCT116 p53ー/ーにおける細胞増殖抑制能とプログラム細胞死の一種であるアポトーシス誘導能を評価した。その結果、アセチル化体はケルセチンよりも強い細胞増殖の抑制とアポトーシスの誘導を引き起こし、その強さは4AcQ, 3AcQ, 5AcQの順であった。またウエスタンブロッティングにより細胞周期関連タンパク質の発現を検出した結果、Quercetinや他のアセチル化体と比べ、4AcQが早い段階で細胞周期停止を引き起こしていることが示唆された。膜透過性評価においては、Quercetinは受動拡散による膜透過が低いのに対し、アセチル化体は5AcQ, 4AcQ, 3AcQの順に高い透過性を示した。実測値であるPAMPAによる透過性試験と予測ソフトウェアを用いた同実験での透過性シミュレーションは同じ傾向を示した。これらの結果より、ケルセチンよりも生理活性が高くなるアセチル化体は、膜透過率を増加させていることが明らかになった。しかし、アセチル化体の中では、生理活性は4AcQ-Aが高く、透過性は5AcQが最も高い値を示したことより、透過性以外にも生理活性作用に影響を与える要因があることが示唆された。15箇所のヒドロキシ基を段階別にアセチル修飾した5つの異なるアセチル化ケルセチンの合成を試み、核磁気共鳴(NMR)や赤外吸収(IR)などを用いた構造の特定を行った。その結果、1箇所のヒドロキシ基をアセチル化したケルセチン以外、全ての種類のアセチル化体の合成に成功したが、2および3箇所のヒドロキシ基をアセチル化したケルセチンについては、多種類が同時合成されており、単一化合物として細胞実験に使用するためには精製が必要であることが分かった。さらに各アセチル化ケルセチン(2Ac-Q4Ac-Q)について液液法を用いた単結晶化を試みた結果、4Ac-Q、2Ac-Qにおいて結晶を得ることが出来たが、単結晶ではなかったためにX線結晶構造解析には至らなかった。また、高い純度で必要十分量得られた4Ac-Q、5Ac-Qおよびケルセチンをヒト乳がん細胞に添加し、アポトーシス誘導能の変化ならびにROS産生量の変化を測定した結果、4Ac-Qのアポトーシス誘導能およびROS産生量が一番高く、5Ac-Qのアポトーシス誘導能およびROS産生量はケルセチンより僅かに高いか、同等程度であることが示唆された。また、4Ac-QならびにケルセチンではROS産生時間が異なる可能性があることが示唆された。今年度遂行予定であった1-1ケルセチンの段階別アセチル化ならびに構造決定1-2X線結晶構造解析2アセチル化ケルセチンの生物活性作用機序の解明の全ての実験を実施し、1-1では1箇所のヒドロキシ基をアセチル化したケルセチン以外は少なくとも合成可能であることを確認したと同時に、2の生物活性作用機序の解明として細胞実験を施行しうる純度と量を4Ac-Q、5Ac-Qで得ることができた。1-2においても4Ac-Q、2Ac-Qが結晶化しうることが確認されたことより、条件を検討することで単結晶を作成しX線結晶構造解析を行える可能性を見出した。さらに2における生物活性作用機序の解明ではヒト乳がん細胞において得られた結果より、アセチル化ケルセチンの生理活性増強の起因が、アセチル基の数ではなく、置換部位にある可能性を見出すまでに進展した。本年度は、昨年度からの課題であったケルセチンの5箇所のヒドロキシル基のうち、3箇所をアセチル置換した3Ac-Qの混合体の分離精製ならびに、ヒト大腸がん細胞HCT-116を用いた、ケルセチンアセチル化体の評価を中心に行った。その結果、3Ac-Qの分離に適したHPLCカラムとして、ナカライテスク株式会社のπ-NAPカラム最適であり、合計2種類の3Ac-Qが合成されていることが判明した。また、昨年度に引き続き、単結晶化を試みた4Ac-Qにおいて、液液法による単結晶化に成功しX線結晶構造解析を行うことができた。さらに、HCT-116細胞を用いた生理活性評価において、4Ac-Q >5Ac-Q ≧3Ac-Q(混合体)の順でアポトーシス誘導能が高いことが示されたことより、アセチル化による生理活性増加の起因は、アセチル化の数に限定されるものではなく、アセチル化される場所による可能性も示唆された。また、ケルセチンならびに4Ac-Qのアポトーシス誘導のシグナル経路に差異が無いかを調べるため、単一試料中に存在する35種類のアポトーシス関連因子を、同時に検出できる抗体アレイキットを用い測定したところ、4Ac-Qはケルセチンに比べ、活性化カスパーゼに結合し、不活性化することでアポトーシス誘導を抑制するタンパク質であるIAP(Inhibitor of Apoptosis Protein)ファミリーを強く抑制することが示された。

一方、ケルセチンはDeath receptor 4 (DR4)として知られている、TRAIL-R1を活性化することが示され、これらの相違が、ケルセチンならびにアセチル化ケルセチンの生理活性の差異の一つの起因になる可能性が示唆された。今年度遂行予定であった3Ac-Q混合体の分離精製が可能であることが確認できた。また、既に得られていた5Ac-Qの単結晶に加え、本年度は4Ac-Qの単結晶化に成功し、X線結晶構造解析を行うことができた。また、前年度に行われたヒト乳がん細胞の実験で示され結果と同様に、ヒト大腸がん細胞による生理活性の変化の検討についても、アポトーシス誘導能が4Ac-Q > 5Ac-Qの順に強くなる結果が得られた上に、混合体ではあるが3Ac-Qを用いたアポトーシス誘導能試験では、5Ac-Qに僅かに低いが相応に順ずる誘導能を有することが示されたことで、アセチル化ケルセチンの生理活性増強の起因が、アセチル基の数ではなく、置換部位にあることが確定しうる段階までに進展した。最も合成しやすい4AcQの合成経路を基本とし、反応条件を検討することで5AcQ, 3AcQ-Aが高収率で得られた。また、位置違いのアセチル基を持つ4AcQ-B, 3AcQ-Bはケルセチンのヒドロキシ基をアセチル修飾するのではなく、既にアセチル化された5AcQまたは4AcQ-Aからそれぞれ7位アセチル基を選択的に脱離させることによって合成を試みた。細胞実験では、Quercetinと合成した5種類のアセチル化体を用いてヒト結腸癌細胞HCT116 p53+/+, HCT116 p53ー/ーにおける細胞増殖抑制能とプログラム細胞死の一種であるアポトーシス誘導能を評価した。その結果、アセチル化体はケルセチンよりも強い細胞増殖の抑制とアポトーシスの誘導を引き起こし、その強さは4AcQ, 3AcQ, 5AcQの順であった。またウエスタンブロッティングにより細胞周期関連タンパク質の発現を検出した結果、Quercetinや他のアセチル化体と比べ、4AcQが早い段階で細胞周期停止を引き起こしていることが示唆された。膜透過性評価においては、Quercetinは受動拡散による膜透過が低いのに対し、アセチル化体は5AcQ, 4AcQ, 3AcQの順に高い透過性を示した。実測値であるPAMPAによる透過性試験と予測ソフトウェアを用いた同実験での透過性シミュレーションは同じ傾向を示した。これらの結果より、ケルセチンよりも生理活性が高くなるアセチル化体は、膜透過率を増加させていることが明らかになった。しかし、アセチル化体の中では、生理活性は4AcQ-Aが高く、透過性は5AcQが最も高い値を示したことより、透過性以外にも生理活性作用に影響を与える要因があることが示唆された。ヒト大腸がん細胞による生理活性の変化の検討については、まだ細胞増殖抑制能を決定した段階であるため、今後、ヒト乳がん細胞の実験同様にアポトーシス誘導能およびROS産生量の変化を検証すると共に、両細胞種ともに詳細な分子メカニズムをタンパク質レベルで解明する。また、4Ac-QならびにケルセチンではROS産生時間が異なる可能性があることが示唆されたことより、産生時間の差異についても詳細なタイムコースを行い検証する。さらにX線結晶構造解析のために、前年度に引き続き4つのアセチル化ケルセチン(Ac-Q4Ac-Q)について液液法など各種の方法を用いた単結晶化を続行する。