hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
大学教員資質開発(FD)活動の教育方法学的分析

本研究は、次の3つの基本的課題を検討することをその目的とした。1.教育方法学・教育心理学・情報科学等の関連分野の視点から、FD活動の理論的体系化を目指すこと。2.質問紙と面接による調査により、日本の諸大学におけるFD活動を一層促進させるための具体的な目標と、実践的な技法、ならびにそれらに対する阻害要因を明らかにすること。3.大学における教育活動全般の活性化ならびに教員個人の授業改善に役立たせるためのFDプログラム診断用チェックリストを作成すること。そこで、FDのワークショップおよび研修会に参加した積極的推進者および実践中の現場教員、約150名を対象に、質問紙法による事前・事後調査を実施した。調査質問紙の内容は、(1)被調査者が最も深く関心を抱いているFD研修の課題とそれらの問題点、(2)彼らの個人的努力を阻害する主な要因、(3)FD実践上の成功と失敗の具体例、(4)それらのFD活動の成果を評価するための基準と方法である。最初の2項目については評定表を使用し、後の3項については記述式で回答を求め、統計的処理と内容分析とを試みた。その結果、質問紙によるFD研修の事前・事後調査からは、評定値の変動を基にした統計的分析から研修の効果を判定することは非常に困難なことが判明し、自由記述式ないしは非構造的面接法による追跡調査の重要性が改めて指摘された。最後に、前掲の各領域それぞれについて一組みの質問項目を用意し、教員個人が各自の授業を、また、大学が教育活動全般について自己点検をするための診断用チェックリストを作成した。これらの項目を状況に応じて適切に組合せることにより、そこに描かれるプロフィールの分析を基にして、利用者は教授方法の改善を始めとし、広く大学全体の活性化に資することが期待される。本研究は、大学における教育活動の活性化と実践研究の水準の向上を図るため、組織的且つ体系的な教員養成の研修を体験したことのない大方の大学教員を対象とした場合のFDプログラムの教育学的理論とその効果についての実証的研究を目的とする。1)FD活動の理論的体系化を目指して、先ずカリキュラムの改善と教授技法の向上に関わる諸要因を抽出し、教育方法学・教育心理学・情報科学等関連分野の基礎的文献から学際的にFDの方法論的枠組みを構築することを試みた。この課題は本年度中にほぼ完了させることができた。2)次に前項の体系を基礎にFD活動の積極的推進者、実践中の現場教員ならびに高等教育に関する有識者たち約300名を対象に質問紙法による調査を実施中である。調査の内容は、(a)FD研修の課題とその到達目標、(b)各自が抱える具体的な問題点、(c)彼らを取り巻く教育環境上の阻害要因、(d)改善に向けての試策の事例、(e)その効果を判定するための基準と評価の方法の5領域である。それぞれについて10数項目の質問を用意し、回答を多角的に分析するためのプログラムを作成した。すなわち、期待する教育目標や指摘された問題別に、その阻害要因と見做される教員自身の教授技法や性格特性、学生たちの素質・学習意欲・勉学習慣、ならびに環境的条件である人物・物的・財政的支援体制や学園の雰囲気等を分析し、各種のFDプログラムのもつ有効性を「適性処遇交互作用」の視点から検証することを試みている。3)上記の成果を踏まえて、来年度は大学の恒常的自己点検評価活動の一環として役立たすため全学的FDプログラムのモデルの策定と、個別授業(講義・演習・実技等)に向けた診断用チェックリストの作成を計画中である。

本研究では、大学における教育活動の活性化を図る教員の資質開発(ファカルティー・デベロップメント:FD)の実践と、その教育的効果を測定評価するための研究方法論、ならびに大学内外の組織的支援体制を創り出すことの可能性につき、文献資料と調査結果を基にして検討を行った。これらの課題は全て、過去に体系的な教員養成の研修過程を体験したことの少ない大方の大学教員を対象としたものであり、実践的FDプログラムの教育学的理論の構築と、その効果に関する実証的調査研究の事例を示すことを目的とし、下記の方法を用いた。1)FD活動の理論的体系化を目指し、先ずカリキュラムの改善と教授技法の向上に関わる諸要因を抽出し、教育方法学・教育心理学・情報科学等関連分野の基礎的文献から学際的にFDの方法論的枠組みを構築することを試みた。2)次に、前項の体系を基礎にして、FD活動の積極的推進者および実践中の現場教員、約200名を対象に、質問紙法による調査を2度実施した。調査の内容は、(a)FD研修の課題とその到達目標、(b)各自が抱える具体的な問題点、(c)彼らを取り巻く教育環境上の阻害要因、(d)改善に向けての試策の事例、(e)その効果を判定するための基準と評価の方法の5領域である。最初の2項については評定表を使用し、後の3項については記述式で回答を求め、統計的処理と内容分析を試みた。質問紙によるFD研修の事前・事後調査から、評定値の統計的処理によって研修効果を判定することは非常に困難なことが判明し、面接または記述式回答による追跡調査の重要性が改めて指摘されることになった。3)最後に、前掲の5領域それぞれについて10数個の質問項目を用意し、回答を多角的に分析できる診断用チェックリストを作成した。そのプロフィールから、期待する教育目標や課題別に、阻害要因と見做される教員自身の教授技法や性格特性、学生たちの素質・学習意欲・勉学習慣、ならびに教育環境条件としての人的・物的・財政的支援体制や学園の雰囲気等を、「適正処遇交互作用」の視点から自己点検することが可能となった。以上の成果から、本研究は、FD活動の単なる授業(講義・演習・実技等)の改善のみならず、大学の恒常的自己点検評価活動の中核として捉え、更に教員個人の生涯学習に役立たせる全学的に組織化された活動としての発展に資することを願うものである。
インドネシアにおける身体技法の伝播と変容

本研究においては、4年間の期間中にインドネシア国内の各島を訪れ、そのうちバリ島(バリ州)、ロンボク島(ヌサ・トゥンガラ州)、スマトラ島(西スマトラ州)、スラウェシ島(南スラウェシ州)、ジャワ島(ジャカルタ)の5島に関し、舞踊(民族芸能)ならびに格闘技に関する文献資料・インタビュー資料ならびに映像を入手することが出来た。他の島や、上記5島5州以外に関しては、予定されていたイベントが急遽延期・中止滞在期間中に実施されず、資料を入手できなかった。今回資料を得られた範囲では、複数の舞踊問、また格闘技問で、それぞれ類似性が認められた。また既に先行研究において、インドネシアの舞踊には格闘技の技法を導入したと思われる振付が認められることが明らかにされているが、それが伝播し、当該格闘技の無い地区にその身体技法を伴った格闘技のあることが認められた。またインドネシア国内、特にジャワ島とスマトラ島で普及している格闘技シラットに関しては、そのまま舞踊作品として上演したり、あるいは舞踊の初心者用のトレーニングに用いられるなどの事例もあった。なお舞踊に関しては、まったくの土着のものについて資料収集するのは困難であり、従って各地区で、あるいは民間で私的にカンパニーを組織し、内外の観光客を対象に公演活動を行っている団体のものを観賞した。またこのような舞踊(民族芸能)の一つのあり方として、モダンダンスという洋舞にそのエッセンスを導入し、新たな魅力を有する現代的な作品を創造しようとするロンボク島の若手舞踊家の事例も得ることが出来た。本研究の成果は、論文のみならず、台湾における学会大会での講演、さらには教科書として編まれた『教養としてのスポーツ人類学』(寒川・編、大修館書店)の執筆部分に反映されている。平成13年度は、国立民族学博物館等の国内の研究機関での資料収集、8月(ロンボク島及びバリ島)と3月(ジャワ島他)の計2回、いずれも研究者の都合により短期間の海外調査にとどまった。以下に海外調査で得た知見を述べる。(1)8月の調査:ロンボク島には、バリ島同様プロフェッショナルなダンスグループが多数あるが、バリ島とは異なり、ほとんどが州や市のイベントへの出演という島民対象の活動をしている。今回観賞した中に舞踊「プレシアン」があるが、これは格闘技プレシアンを舞踊化したものである。格闘技の方には、一戦交えた後に、有利な方が対戦相手をからかう為におどけて踊る場面がある。舞踊の方は、もちろんそのような場面も含んでいるが、対戦は実戦に近かった。この場合の舞踊化とは、実践される場の性質や、あるいはプレシアンそのものの本来持っている宗教的な意味あいを取り去ったことであり、観光化とも言える。バリ島では、観光用の舞踊と非観光用の舞踊の双方を調査した。これらに関し、伝承においては「秘儀」がキーポイントとなり、また「オリジナリティ」の捉え方によって、異なった系譜のできる可能性があると言える。そしてこれらは伝播についてもあてはまる。バリ島にはプレシアンに類似した格闘技がムカレカレ等2つあるが、これらを舞踊化したものは知られていない。この点に関しては、今後調査を進め、新たに見い出すか、或いは他の島々での事例を集め、これにバリ島の舞踊のもつ意義や特性を合わせることで明らかになるであろう。(2)3月の調査:本報告書の提出後に行う。教育省や大学等でインドネシア全島に関する資料を収集する他、ジャワ島の舞踊と格闘技を見る予定である。平成14年度も引き続き、国内の研究機関での資料収集の他、6月と3月の計2回、海外調査を実施したが、いずれも研究者の都合により短期間にとどまった。(1)6月の調査:バリ・アートフェスティバルを視察した。ここで発表されたバリ島の舞踊、舞踊劇、遊戯をビデオ収録、関連する資料を収集した。

発表されたものは、全て「見せる」ことを前提に観光化を図ったものである。バリ人以外、つまり対外的(バリ人を除くインドネシア人を含む)には、テーマや意図はそのままに、作品や空間の構成をアレンジし、バリ文化の独自性というものを印象付けようとしている。後者に対しては、特化された人物を登場させ、その語りによって笑いを誘う。舞踊の合間に、踊り手同士の掛け合いが入る、舞踊劇に女装した男性が登場してかん高い声で早口にまくしたてて妙なアクションを見せる、出演者同士がド突き合うなど、である。これらは「おもしろい」「笑える」ことを根拠とする、「観ていて楽しい」という印象を植え付けている。このように対象によって異なった見せ方ができるのが、バリ島の舞踊や舞踊劇なのである。(2)3月の調査:本報告書の提出後に行う。ジャカルタの教育文化省でインドネシア全島の舞踊・格闘技・遊戯に関する資料を収集する他、西スマトラ州ソロ郡タペ村に入り、ミナンカバウ文化圏の舞踊と格闘技を調査する予定である。平成15年度においては、8月と3月の2回、主にスラウェシ島にある南スラウェシ州の州都・ウジュンパンダンにおいて海外調査を実施した。しかし研究者の都合により、8月は2名で2週間、3月は研究協力者1名を加えた4名ながら1週間10日間という短期間にとどまった。(1)8月の調査ウジュンパンダンで舞踊公演と前日のリハーサル風景を取材した。市立及び州立図書館で文献資料を、観光案内所と州立アートセンターでDVDの視聴覚資料を入手した。南スラウェシ州の舞踊は、タナ・トラジャのものも含め、下肢は足踏みか歩行に限られる、という動性に乏しいものであった。それは、用いられる音楽が、打楽器中心であり、かつリズムを刻むのではなく、反響を利用していることにもよるものである。また格闘技では、足技を中心とするシセンバがあるが、実際に見ることは出来なかった。(2)3月の調査本報告書の提出後に行う。南スラウェシ州のアートセンターで資料を収集し、舞踊団の施設と練習を視察する。またこの他、ジャカルタのシラット協会で、インドネシア全土に普及しているシラットについて資料を収集する。なおシラットに関しては、寒川が日本体育学会第54回大会(於・熊本大学)にて、「プンチャック・シラットの精神文化」との演題でポスター発表を行っている。今年度は配分額の関係から、インドネシアでのフィールドワークは各人1回行い、調査地もジャワ島とスラウェシ島とに分かれた。ジャワ島では、ジャカルタのシラット協会及びシラット道場で、シラットに関するさらなる貴重な資料や映像を入手した。また通訳者の出身地であるバンドゥンへ行き、ダンス教室を視察した他、シラットの名人の紹介を受けて、取材を実施した。スラウェシ島では、南スラウェシ州ウジュンパンダンにある大学等にて図書館で資料収集し、教員からは情報を入手した。また身体技法を広く捉えるために「ものつくり」に着眼し、「ものつくり」の現場における身体技法とそれを生み支えている背景を調査することにした。
生涯学習における必要課題のカリキュラム化に関する総合的研究

1.大学教育における必要課題のカリキュラム化に関する実態調査大学卒業生の生涯学習の実態を通して、必要課題と要求課題に関する意識や内容、生涯学習の基礎的態度・能力の形成に対する大学教育への要望、生涯学習の「落ちこぼれ」の特長、女性の生涯学習の特長、世代別生涯学習観の変遷などが明らかになった。さらに、大学のカリキュラム調査より、生涯学習体系への移行に根ざした、必要課題のカリキュラム化の実態調査が明らかになった。2.県別生涯教育の特性調査生涯学習の県別パタ-ンの社会的背景を各種デ-タを用いながら分析し、新たに生涯学習の県別パタ-ンを析出し、それをもとに、将来への必要課題への対応をバランス診断した。3.地域住民意識調査生涯学習に積極的な取り組みをみせている特定市町村をピックアップし、そこの地域特性などを明らかにした。4.学校教員調査大学卒業者で教員になっている人たちに限定した生涯学習の実態調査を通して、教員の生涯学習の特長、教員の必要課題に関する意識、研修での位置づけ、教育実践における生涯学習の評価などを明らかにした。また、退職教員を対象にして、教師教育の生涯化、退職後の準備教育、退職後の生涯学習の実態を明らかにした。5.生涯教育・社会教育担当者調査生涯教育・社会教育担当者のキャリア形成の上で、大学教育が職業的社会化に果している役割、研修要求、学習課題などを明らかにした。6.報告書作成各研究成果について、大学の紀要などで、発表、報告をした。1.大学卒業生に対する生涯教育の課題調査生涯教育における要求課題と、それに対応する必要課題を明らかにするために、2種類のアンケート調査を実施した。(昭和63年12月平成元年1月)まず、大学(短大を含む)卒業生で現職の小・中学校教員を対象に「教員の生涯学習」についてのアンケート調査を行なった。対象は3大学1186名であった。もう一方は、女子大学(短大を含む)卒業生に対して「生涯学習」についてのアンケート調査を2大学、545名について行なった。これらの結果については現在集計を行なっており、高学歴者の生涯学習における要求課題と必要課題のからみを明らかにする方向に進める。次年度には、調査結果の分析を基礎にして、今後の大学教育でのカリキュラムの在り方を提示する。2.各都道府県・市町村に対する生涯教育の必要課題からみた実態調査都道府県および市町村で現在展開されている生涯教育事業を把握するために、文部省や大量の各種データ類から情報収集を行なった。この情報をもとに、各都道府県・市町村の生涯教育事業への「取り組み方」のタイポロジーが明らかになった。そして10タイプ以上に分類される、多岐にわたる実践の現状が把握された。現在は、今までに得た同一基準からみた大量のデータ指標のより詳しい比較検討を行なっている。次年度にはこれをもとに、生涯教育の必要課題の社会的条件マップを作成していく。1.大学教育における必要課題のカリキュラム化(1)大学卒業生に対する生涯教育の課題調査の結果を分析することにより、今後の大学教育でのカリキュラムの在り方を検討した。その結果学習意欲があるが実践しない、学習を始めたが長続きしないという、いわゆる生涯学習から落ちこぼれている人は、自己教育力不足が指摘された。さらに、こうしたいわゆる落ちこぼれは、学習内容によるものではなく、学習時間不足によって、助長されていることがわかった。(2)退職教員に対する調査では、教職についてから715年目の間に一人前の教師になった者が、5割近く占めていることなどがわかった。2.生涯教育の必要課題の社会的条件マップの作成生涯学習県別パタ-ンの社会背景を各種を各種デ-タを用いながら分析し、新たに生涯学習のり県別パタ-ンを析出した。このような社会的必要課題の診断を通して、現時点での各県における生涯学習における必要課題の実施状況から、そのバランス診断を行ないつつある。そして、将来の必要課題への対応を、産業構造の変動、高齢化への対応、情報化など観点から明らかにしつつある。

3.特定市町村での住民意識調査生涯教育に積極的取り組みをみせている川島町と満濃町を選びだし、住民意識調査を行ない、現在分析中である。4.国際比較文化論的研究生涯教育を社会的・歴史的・文化的背景から関連分析を行ないつつある。5.社会教育主事に対する調査生涯教育担当者の力量向上において、研修体系や学習要求、学習課題を把握するための調査を行ない、現在調査結果を集計中である。1.大学教育における必要課題のカリキュラム化(1)大学卒業生に対するの生涯教育の課題調査の続行今年度は、調査対象を、情報教育と福祉教育関係に絞り、生涯教育の課題調査を引き続き行った。その結果を分析するとことにより、今後の大学教育でのカリキュラムの在り方を検討した。情報教育関係の分析結果としては、とくに文系の情報教育としては、ワ-プロ関係の授業の評価は高かった。今後、大学教育に求められるものとしては、コンピュ-タをツ-ルとして用いるためのリテラシ-教育の充実があげられていた。(2)女子大学における情報処理教育カリキュラム本調査では、とくに情報を専門とする学部学科をほとんどもたない、女子大学における情報教育のカリキュラムの実態を明らかにし、生涯教育とのマッチングを検討した。その結果、情報化社会への対応を積極的に推進しつつあることが示された。とくに授業科目としては、専門教育科目でカリキュラム化が図られており、それも家政学部や複合学部での充実ぶりが明らかになった。2.報告書の作成過去の研究成果を踏まえ、生涯学習における必要課題とは何か、それをいかにして必要課題たらしめるか、要求課題からいかにして必要課題を発展せしめるかなど、必要課題の内容ならびに学習プロセスといったカリキュラム化の問題に焦点をあて、大学の紀要などでまとめてきている。今後の展望としては、メンバ-がそれぞれに作成した報告論文を、生涯学習内容論、生涯学習過程論、生涯学習社会論といった各観点から全体の最終報告書が作れるよう、構想している。
膜脂質過酸化のアセチルコリン電流傷害機序

副交感神経系による心機能の調節が、活性酸素存在下でどのように影響されるかを検討するため、副交感神経系の最終的作用部位の一つであると考えられる、アセチルコリン感受性カリウムチャネルに対する活性酸素生成系の効果を検討した.ウサギ又はモルモットの心房筋を酵素処理により分離し、単一心房筋細胞を作成、生理的条件下に、全膜細胞電位固定法により膜電流を記録した.電極内液にGTP結合蛋白質の非可逆的活性化物質であるGuanosine5'-O-(3-thiotiphospate(GTP-γS)10μMを添加、40mVに膜電位を保持し膜電流の時間経過を計測すると、記録開始時には外向き電流はほとんど計測されなかったが、時間と共に増加し、3ないし5分後に最大となり、その後やや減少した後ほぼ定常状態に達した(n=6).記録開始時と外向き電流増加後の定常状態で、膜に種々の電位への可分極又は脱分極パルスを加え電流電圧曲線を作成、保持電位以下の直線部分で比較すると、Slcpeconductanceは175±12%増加していた.この後、活性酸素生成系である、t-Butylhydroperoxyde(TBH)をO_2存在下で灌流液に添加したところ、膜電流は用量依存性に減少し、100μMの薬剤作用下ではSlopeconductanceは作用前に対して、35±7%減少した.ウサギ又はモルモットの心房筋には、内向き整流性カリウムチャネルは少なく、GTP-γSにより活性化された電流はほぼ純粋にアセチルコリン感受性カリウムチャネルを通る電流と考えられる.GTP-γS存在下では、GTP結合蛋白質までの副交感神経活動に関与する因子がいかなる状態であっても、チャネルに対する活性化刺激は影響を受けないと考えられるので、TBHにより生成された活性酸素はチャネル自体、又はチャネルとGTP結合蛋白との相互作用に影響を及ぼし、副交感神経による心筋活動の調節を減弱させるものと考えられた.副交感神経系による心機能の調節が、活性酸素存在下でどのように影響されるかを検討するため、副交感神経系の最終的作用部位の一つであると考えられる、アセチルコリン感受性カリウムチャネルに対する活性酸素生成系の効果を検討した.ウサギ又はモルモットの心房筋を酵素処理により分離し、単一心房筋細胞を作成、生理的条件下に、全膜細胞電位固定法により膜電流を記録した.電極内液にGTP結合蛋白質の非可逆的活性化物質であるGuanosine5'-O-(3-thiotiphospate(GTP-γS)10μMを添加、40mVに膜電位を保持し膜電流の時間経過を計測すると、記録開始時には外向き電流はほとんど計測されなかったが、時間と共に増加し、3ないし5分後に最大となり、その後やや減少した後ほぼ定常状態に達した(n=6).記録開始時と外向き電流増加後の定常状態で、膜に種々の電位への可分極又は脱分極パルスを加え電流電圧曲線を作成、保持電位以下の直線部分で比較すると、Slcpeconductanceは175±12%増加していた.この後、活性酸素生成系である、t-Butylhydroperoxyde(TBH)をO_2存在下で灌流液に添加したところ、膜電流は用量依存性に減少し、100μMの薬剤作用下ではSlopeconductanceは作用前に対して、35±7%減少した.ウサギ又はモルモットの心房筋には、内向き整流性カリウムチャネルは少なく、GTP-γSにより活性化された電流はほぼ純粋にアセチルコリン感受性カリウムチャネルを通る電流と考えられる.GTP-γS存在下では、GTP結合蛋白質までの副交感神経活動に関与する因子がいかなる状態であっても、チャネルに対する活性化刺激は影響を受けないと考えられるので、TBHにより生成された活性酸素はチャネル自体、又はチャネルとGTP結合蛋白との相互作用に影響を及ぼし、副交感神経による心筋活動の調節を減弱させるものと考えられた.
早産低出生体重児における脂肪細胞の数と大きさの変化が将来の疾病リスクに与える影響

低出生体重児は将来インスリン抵抗性を獲得しやすく、それと関連してか、生活習慣病の発症リスクが高いことが知られている。本研究は「低出生体重児では、脂肪組織の数や大きさなどの点で、正期産AGA児と比較して異なる脂肪組織の発達が認められるのではないか」との仮説に基づいて立案された。その方法は、乳幼児期(6か月5歳)に脂肪組織を採取し、合わせて血液検査を行い関連する指標を調べることで、周産期因子や生後の成長が脂肪組織の発達に与える影響を調査するものである。現在まで約90名の対象から脂肪組織を採取し検討を加えているが、現在のところ男児のリクルートが多く、仮説を評価するための十分な数に達していない。そのためまずは、男児に限定して、低出生体重児群(9名)と39週40週出生の正期産・AGA児(35名)での検討を行った。全体(44名)の検討で、脂肪細胞の直径の平均は、BMIおよび肩甲下皮脂厚とそれぞれ有意な正の相関を示し、出生体重、在胎期間、評価時の身長SDスコアと有意な負の相関を示した(それぞれ、p < 0.05)。また、低出生体重児群では、正期産AGA児群と比較して、有意に脂肪細胞の直径が大きく、これは評価時の年齢やBMIで調整した場合により顕著となった(p < 0.001)。一方で脂肪細胞の直径は、インスリンやHOMA-IR、アディポネクチンおよびレプチンなどの指標とは関係しなかった。以上の結果から、少なくとも男児においては、低出生体重児群で体格のわりに脂肪細胞のサイズが大きい傾向があることが示唆された。乳幼児期には、脂肪細胞の大きさとインスリン抵抗性、アディポネクチンやレプチンなどの関連指標との間に有意な相関は認められなかったが、この時期の脂肪細胞の大きさに両群間で違いが認められたことは重要な所見であり、それが将来の生活習慣病リスクにつながっていく可能性はあると考えられた。現時点では、女児および低出生体重児のリクルート数が目標に到達していない。対象候補者の条件を、乳幼児期に外鼠径ヘルニア、臍ヘルニア、停留精巣の手術を受けるものと設定しているため、原疾患の罹患率に性差があることと関連して、男児に偏ってしまっている。それ自体は予測していたことであり致し方ない部分もあるが、現在のところ予想以上に偏りがあり、リクルート期間の延長が必要な状況である。本研究は1年間研究期間を延長し、女児および低出生体重児に限定してリクルートを継続する方針とした。現在までに男児に限定した検討では仮説の検証がある程度できているが、これを女児および低出資体重児を増やして再検討することで、その結果を確かなものとしたい。乳幼児期までの脂肪組織の発達(脂肪細胞の数や大きさの変化)は、将来の肥満リスクと関係していることが知られている。早産低出生体重児は将来生活習慣病を発症するリスクが高いことが多くの疫学的データから明らかとなっており、本研究では早産低出生体重児における将来の肥満や代謝合併症リスクを早期に把握し介入するため、乳幼児期における脂肪組織の発達を早産低出生体重児と正期産正常体重児の間で比較し、関連する指標との関係性を検討するものである。本研究は3年間での実施を予定している。初年度(平成28年度)は研究実施のための準備として、まずは当該機関の倫理委員会で研究計画について審議を受け、研究計画の実施について許可された。また、対象のエントリー方法や脂肪および血液検体採取の手順を、研究協力者の間で確認・周知し、関連部署(小児外科、麻酔科)スタッフとの調整を行った。また、検体処理に必要な器具や機器を入手し、使用方法について確認した。本研究の実際のエントリーは平成28年12月から開始した。平成29年3月までの4か月間のエントリー数は22名であるが、早産低出生体重児はそのうち4名しかおらず、現在のところ両群間を統計学的に解析・比較できるほどのエントリー数は得られていない。現在までにエントリーしたものの中に、血液検査所見(空腹時血糖、インスリン、HOMA-IR、血清脂質、アディポネクチン、レプチン)が正常範囲を逸脱していると考えられたものはなかった。また、身体計測値(体重SDスコア、身長SDスコア、BMI、皮脂厚など)と、HOMA-IRや血清脂質との有意な関連は今のところ認められていない。脂肪細胞の評価については、評価前の前処置に一定の時間を要し現在は単離・固定中であるため、今後本格的に評価を開始する予定である。本研究ではもともと、二重エネルギーX線吸収法(DEXA)を用いて、対象となる児の体脂肪量を評価する予定だった。しかし、実際に本研究実施にあたって、被ばくのリスクなどについての対象候補者からの心配の声が強く、エントリーを見合わせる声が多かった。このままでは検討に必要な十分なエントリー数を確保することが困難であると推測されたたため、最終的には研究計画を修正し、DEXAによる体脂肪量測定は行わないこ戸に決定し、その他のパラメータ(BMIや肥満度、皮脂厚など)から体脂肪量を推測することで研究の質を保持することとした。以上の経過から、本研究のエントリーは実質的には平成28年12月から開始した。平成28年12月から平成29年3月までの4か月間のエントリー数は22名(うち早産低出生体重児は4名)であり、1か月あたりのエントリー数は5.5名だった。

今後の残りエントリー期間を1年半と推定した場合(残りの研究実施期間は2年間を予定)、さらに100名前後のエントリーが得られる計算となることから、研究の実施予定期間に今回の検討を行うための十分な人数をエントリーすることは可能であると考えられる。しかしその場合でも、早産低出生体重児は120名中2530名と十分なエントリー数とならない可能性があり、今後は早産低出生体重児のエントリー率を上げるための方策を考えるべきであると思われる。また、それでも目標の人数に到達しない場合にはエントリー期間の延長を考慮する。乳幼児期までの脂肪組織の発達(脂肪細胞の数や大きさの変化)は、将来の肥満のリスクと関係していることが知られている。早産低出生体重児は将来生活習慣病を発症するリスクが高いことが多くの疫学的データから明らかとなっており、本研究では早産低出生体重児における将来の肥満や代謝合併症リスクを早期に把握し介入するため、乳幼児期における脂肪組織の発達を早産低出生体重児と正期産正常体重児の間で比較し、関連する指標との関係を検討するものである。本研究は3年間での実施を予定している。初年度(平成28年度)は研究実施のための準備として、まずは当該機関の倫理委員会で研究計画について審議を受け、研究計画に実施の許可を得た。必要物品の入手、関係部署の調整などを行ったうえで、平成28年の12月から実際に研究協力者のエントリーを開始した。次年度終了時点(平成30年3月)までの16か月間で、合計67名のエントリーが得られたが、早産低出生体重児はそのうち13名しかおらず、十分な統計学的検出力をもって二群間で比較することはできない状況である。現在までにエントリーしたものの中に、血液検査所見(空腹時血糖、インスリン、HOMA-IR、血清脂質、アディポネクチン、レプチン)が正常範囲を大きく逸脱していると考えられたものはなかった。中間解析では早産低出生体重児では乳幼児期に小柄・痩せ型である(体脂肪蓄積が少ない)傾向があった。脂肪細胞の評価は前処置に時間を要するためさらに少数での評価しかできていないが、早産低出生体重児では正期産正常体重児と比較して、脂肪細胞の大きさは変わらないかむしろ大きい傾向があった。以上を踏まえると、早産低出生体重児では、乳幼児期の脂肪細胞数が少なく、この時期に認められる脂肪蓄積は脂肪細胞の肥大と主に関係していると解釈されうるが、これらは症例数の蓄積をもって再検討する必要がある。本研究ではもともと、二重エネルギーX線吸収法(DEXA)を用いて、対象となる児の体脂肪量を評価する予定だった。しかし、実際に本研究実施にあたって、被爆のリスクなどについての対象候補者からの心配の声が強く、エントリーを見合わせる声が多かった。そのため、DEXAによる体脂肪量評価ではなく、身体計測値(BMIや肥満度、皮脂厚など)から体脂肪量から推測することで研究の質を保持しつつ、エントリー数を増やす方策を取った。その結果、平成29年12月平成30年3月までの16か月間で、合計67名のエントリーが得られ、1か月あたり4.2名のペースである。これは前年度より若干低下しているが、それでも研究期間終了までに目標のエントリー数が得られるものと推測できる。しかし現在までエントリーしたものの中に早産低出生体重児が少ないため、今後も十分な人数に到達しない場合には、エントリー期間の延長も考慮する必要があるかもしれない。その他の問題点として、これまでエントリーしたものが男児に偏っている点がある(女児は67名中7名しかいない)。
CCR9を介する関節リウマチ病態形成の分子機構の解明とその阻害による新規治療開発

関節リウマチにおける、CCL25/CCR9相互作用の病態への関与について検討した。関節リウマチ患者由来の滑膜線維芽細胞様滑膜細胞や健常人末梢血単球をCCL25で刺激したところ、サイトカイン等の炎症性メディエーター産生亢進がみられた。また、CCL25による破骨細胞分化促進作用も認めた。コラーゲン誘導関節炎マウスにCCR9阻害剤を投与したところ、関節炎が抑制され、CD11b陽性脾細胞の滑膜組織への遊走も阻害した。CCL25は、CCR9を介してリンパ球や単球/マクロファージに対する走化因子として作用し、炎症性腸疾患への関与が知られており、現在クローン病に対してCCR9阻害薬による臨床試験が行われている。そこでCCL25/CCR9相互作用には関節リウマチ(RA)の病態形成にも関与している可能性があると考え、CCL25、CCR9のRA滑膜での発現、その作用を解析した。RA滑膜組織では、CCL25、CCR9の発現は変形性関節症より亢進しており、二重染色にてCCL25はマクロファージ、CCR9はマクロファージ、樹状細胞、線維芽細胞様滑膜細胞、一部のCD4、CD8 T細胞にそれぞれ発現していた。RA滑膜組織由来の線維芽細胞様滑膜細胞、および末梢血単球にCCR9が発現していることを確認した。In vitroで、CCL25刺激はRA線維芽細胞様滑膜細胞からのIL-6、MMP-3産生を亢進した。さらに、CCL25刺激により単球からのIL-6、TNF-α産生が亢進し、またM-CSF+RANKL併存下での単球からの破骨細胞形成も促進された。コラーゲン関節炎(CIA)マウスにCCR9阻害薬を投与したところ、関節炎スコア、組織学的炎症細胞浸潤、骨破壊が有意に抑制された。CCR9阻害薬の関節炎抑制効果は、関節炎発症後からの投与でも認められた。また、脾臓マクロファージの滑膜組織への浸潤もCCR9阻害薬が抑制した。以上の結果より、CCL25/CCR9はRA滑膜において炎症細胞遊走のみならず、線維芽細胞様滑膜細胞や単球、マクロファージからの炎症性メディエーター産生、破骨細胞誘導などにも関与し、新たな関節炎治療の標的となることが示唆された。そこでCCL25/CCR9相互作用には関節リウマチ(RA)の病態形成にも関与している可能性があると考え、RA滑膜におけるCCL25、CCR9の発現、CCR9阻害によるモデルマウスの関節炎抑制効果を解析した。RA滑膜組織におけるCCL25、CCR9の発現を免疫染色にて解析したところ、CCL25、CCR9の発現は変形性関節症より亢進しており、二重染色にてCCL25はマクロファージ、CCR9はマクロファージ、樹状細胞、線維芽細胞様滑膜細胞、一部のCD4、CD8 T細胞にそれぞれ発現していた。In vitroで、CCL25刺激はRA由来の線維芽細胞様滑膜細胞からのIL-6、MMP-3産生亢進を誘導した。さらに、CCL25刺激により末梢血単核球からのIL-6産生が亢進し、M-CSF+RANKL併存下での単球からの破骨細胞形成も促進された。また、コラーゲン関節炎(CIA)マウスにCCR9阻害薬を投与したところ、関節炎スコアが有意に抑制された。CCL25/CCR9はRA滑膜において炎症細胞遊走のみならず、線維芽細胞様滑膜細胞や単球、マクロファージからの炎症性メディエーター産生、破骨細胞誘導などにも関与し、新たな関節炎治療の標的となることが示唆された。当初の研究計画通りに、RA滑膜組織におけるCCL25、CCR9の発現を解析でき、またin vitroでのCCL25刺激能も検討できた。また関節炎モデル動物におけるCCR9阻害による関節炎抑制効果も見出せた。今後は、マウスコラーゲン関節炎に対するCCR9阻害の影響の詳細な解析、炎症細胞浸潤、骨破壊、Th分化、抗コラーゲン抗体産生に対する影響を解析する。また、CCR9欠損マウスを用いて、関節炎発症への影響を検討する。研究試薬(細胞培養試薬、抗体、ガラス器具)、およびマウス購入などの動物実験費に用いる。
符号理論への応用を視野に入れた超幾何微分方程式の研究

本プロジェクトで得られた成果は主に以下の3点である。(1)Gaussの超幾何微分方程式に対してそのSchwarz写像の特異値の代数性は一般には得られない。では、どのような状況で代数的になるのか?Frankfurt大学のWolfart氏との共同研究によって、この困難な問題が、超幾何曲線の虚数乗法性および、その虚数乗法体の微分の空間への作用と関連していることを解明した。その結果は(1)および(2)にまとめられた。(2)6変数のパラメータを持つ、ピカール格子の構造で特徴付けられるK3曲面の族において、その周期は多変数の超幾何微分方程式を満たし、そのSchwarz写像の逆写像は有力な多変数保型関数を導いていることが期待される。このような展望のもとに、KriegによるII型有界対称領域での理論との関連を追及したのが2001年Int.Nat.J.Math.に掲載された論文である。この研究を発展させて数論的応用を見いだす研究計画が立てられた。現在論文を準備中である。(3)Batyrevが導入したreflexive polytopeから対称性を持つCalabi-Yau多様体の族を構成する方法をK3曲面で綿密に展開してテータ関数によってミラー写像を展開し、Mackyらの得ていたmoonshine現象との関係を2001年のCentre Res.Mat.において明らかにした。この議論をさらに一般的な状況で展開する試みが研究日程化された。次の3つの観点から研究を進めた。1)見かけの特異点を持つフックス型微分方程式のシュワルツ写像の研究。2)定められた格子構造を持つK3曲面の族から導かれる周期写像の研究。3)符号理論における重み多項式とテータ関数を通じて現れる保型形式との関係。1)に関しては、常微分方程式でモノドロミー群が三角群でありながら、複数個の見かけの特異点をもつ場合の研究を行った。結果はすでに得られフランクフルト大学Wolfart教授との共著の論文原稿をすでに送付中である。ここでは、ガウス超幾何微分方程式との関係が明らかにされ、代数的数の変数に対して、写像された点の代数性に関しての考察を展開した。2)ここからは、IV型領域上の各種の保型関数が導かれるが、その保型関数を具体的に表示することが要求される。Borcherdsらによって幾つかの限定された場合にBorcherds積を用いた表示が得られているが、我々は古典的なテータ零値を用いる方法を追求している。手始めの結果が[1],[2]によって得られた。3)標数pの素体上の長さnの符号Cにおいて、自己双対性を仮定すると、符号の特性を記述するLee式重み多項式には著しい特徴が現れる。一方、p次円分体の整数環は階数p-1のZ加群となり、符号Cは自然にn(p-1)次元の格子を定める。この格子は多変数のヒルベルトモジュラー形式としてのテータ零値をもたらすことがわかる。研究代表者は修士大学院生牧野貴臣の論文指導を通じて、上記のLee式重み多項式とテータ零値を通じて現れる最低重みの(p-1)/2個のテータ零値との間の対応をp=7の場合に、具体的に記述することができた。(1)三角群をモノドロミー群とするフックス型微分方程式の研究。ガウスの超幾何微分方程式のモノドロミー群はある条件のもとでポアンカレ計量をもつ上半平面に作用する三角群である。また、ガウス超幾何関数の代数点での値がいつ代数的になるかは80年代から数論家の懸案になっている問題である。本プロジェクトでは、一般に三角群をモノドロミー群とするフックス型微分方程式(これは当然上記のガウス超幾何を含むが)をパラメータ付きのシステムとして決定し、このとき生じる"みかけの特異点"とパラメータとの対応を解析した。また、このシステムに対してシュワルツ写像による像が一般の予想に反して稀にしか代数値をとらないことを明らかにした。

これは、フランクフルト大学J.Wolfart教授および共同研究者筒井亨氏と研究代表者による共同研究の成果である。(2)虚数乗法をもつピカール曲線の研究。位数3の解析的自己同型を有する種数3の代数曲線をピカール曲線という。この曲線たちは2つのパラメータで決定され、その積分周期はアッペル型超幾何微分方程式を満たす。一方、整数環上定義されたピカール曲線を有限体に還元してその上の有理点が符号理論に利用され、極めて信頼度の高い符号システムを構築するものとして注目されている。その際虚数乗法をもつ曲線が必要であるが、現在ドイツEssen大学Annegrete Weng女史(同氏は昨春千葉大学を訪問して、代表者と討議を行った)による実験的結果以外にそれを見出す一般的な手段が知られていない。代表者の80年代の研究がこの方面での大きな手がかりになると予想され、現在研究が進展中である。本プロジェクトで得られた成果は以下の2点である。(1)Gaussの超幾何微分方程式に対してそのSchwarz写像の特異値の代数性は一般には得られない。では、どのような状況で代数的になるのか?Frankfurt大学のWolfart氏との共同研究によって、この困難な問題が以下のような文脈の元で解明された。Schwarz写像は超幾何曲線の第1種および、第2種微分の異なる積分サイクル上での周期の比である。その代数的性質は、超幾何曲線のヤコビ多様体の部分多様体であるプリム多様体の単純成分への分解および、各単純成分の虚数乗法性と関連して記述される。すなわち、虚数乗法体が現れる場合、その虚数乗法体の微分の空間への作用を考え、当初の微分が1次元の固有空間に属している場合に代数性が導かれることがこの研究における中心的成果である。なお、このような一般定理に呼応する実例の呈示は、より詳細な研究へのステップとして不可欠であるが、上の現象を説明する虚数乗法的分解を示すSchawarz写像の実例も構成した。(2)フックス型常微分方程式のSchwarz写像は、その微分方程式が見かけの特異点を有する場合は詳しい研究が皆無である。Farnkfurt大学wolfart教授との共同研究で、真の確定特異点が3点で他に見かけの特異点を持つ場合のSchwarz写像に関して、その代数点での値の代数性を研究した。この問題は、超幾何曲線上での第2種積分の周期の比を考察することから解明されることが分かった。以上の研究は、現在まだ未解決のAndre-Oort予想の解明につながることが期待されるもので、まだ、幾多の未解決な問題を残しており、今後も解明に努力する予定である。
プロテアーゼを標的とするリムーバブル阻害剤の創製

本研究ではプロテアーゼ阻害剤を直接的にビオチン化した誘導体を合成し、ストレプトアビジンの添加により酵素活性のOFFからONへの制御が可能な「リムーバブル阻害剤」を創製することを目的とした。本年度は、HIVプロテアーゼのX線共結晶構造の情報を基に、結合に関与しない部位へ直接的にまたは連結構造を介してビオチン化したリムーバブル阻害剤を設計した。中でも、bPI-11とHIV-1プロテアーゼの共結晶構造の解析に成功し、ビオチン部位が結合ポケットから溶媒の水へと向かって伸びており、結合に影響することなくビオチンを導入できたことが明らかとなった。また、リムーバブル阻害剤bPI-11のHIV-1プロテアーゼに対する酵素活性のON/OFF/ON/OFFの繰り返し制御が可能であることが分かった。この結果を基に、bPI-11を利用して血清中からアフィニティー精製したHIV-1プロテアーゼの酵素活性を検出し、再び薬剤を加えることにより、回復した酵素活性の阻害が確認できた。本結果は薬剤耐性検査が問題となる治療前の阻害薬の感受性試験への応用が期待される。更に、トリプシン阻害剤の直接的ビオチン化を行い、新規リムーバブル阻害剤を設計して合成したところ、ヒトトリプシン酵素活性をOFFからONへと制御できることが分かった。本研究のリムーバブル阻害剤の設計手法は、その原理どおりに、アスパラギン酸プロテアーゼだけでなくセリンプロテアーゼを標的とする阻害剤にも応用できることが分かった。アミノ基をビオチン化したHIVプロテアーゼ阻害剤のbPI-11を合成し、bPI-11とHIV-1プロテアーゼの共結晶構造の解析に成功した。ビオチン部位が結合ポケットから溶媒の水に向かって伸びており、結合に影響することなくビオチンを導入できたことが明らかとなったことから、X線結晶構造に基づく分子設計が有用であることが示された。既存のペプスタチンAとカテプシンDとの複合体のX線結晶構造データから、ペプスタチンAのC末端とビオチンのカルボン酸同士をヒドラジドで連結させた誘導体を合成したところ、pMレベルの強力なカテプシンD阻害活性を維持する化合物を得た。セリンプロテアーゼであるトリプシンを標的としてリムーバブル阻害剤の設計を試みた。X線結晶構造情報からビオチン化部位を決定し、カルボキシ基をヒドラジド化してビオチンを結合させたところ、bPI-14はヒトトリプシン-2に対してサブμMのIC50値を示した。また、bPI-14により阻害したトリプシン-2は、ストレプトアビジンの量依存的に酵素活性が上昇し、過剰量の添加により十分に回復した。本結果から、bPI-14はトリプシン-2のリムーバブル阻害剤であることが分かった。bPI-11によりHIV-1プロテアーゼの酵素活性を阻害した後でストレプトアビジンを添加して酵素活性が回復し、そこへ再び阻害剤を追加して酵素反応が抑制されたことから、酵素活性の繰り返し制御ができることを確認した。この結果を基に、血清中より結合させた野生型HIVプロテアーゼをbPI-11で溶出し、ストレプトアビジンを添加すると酵素活性が検出し、ダルナビル、ロピナビル、アタザナビルを加えて酵素活性を再び抑制した。次年度からは、各種プロテアーゼを標的としたビオチン化阻害剤の合成、プロテアーゼ阻害活性およびストレプトアビジンによる阻害活性消失の評価、アフィニティー結合プロテアーゼの酵素活性を検出、疾患原因タンパク質の分解を実施する。各種プロテアーゼを標的としたビオチン化阻害剤の合成では、カテプシンDやβセクレターゼなどのアスパラギン酸プロテアーゼの阻害剤、また、トリプシンなどのセリンプロテアーゼの阻害剤について、X線結晶構造情報を基にビオチン化部位を決定し、アミノ基やカルボキシ基を介してビオチン化を行う。プロテアーゼ阻害活性およびストレプトアビジンによる阻害活性消失の評価においては、ビオチン化阻害剤の各種プロテアーゼ阻害活性を測定して、ストレプトアビジン添加後の阻害活性の添加量依存的な変化を調べる。リムーバブル阻害剤の部分構造を変換し、阻害活性と水溶性を改善する。強い阻害活性を示し、ストレプトアビジンにより阻害活性がほぼ消失する、優れたリムーバブル阻害剤を同定する。アフィニティー結合プロテアーゼの酵素活性を検出においては、シュードタイプのHIV様ウイルス粒子や、癌細胞の破砕液から標的プロテアーゼをアフィニティー結合し、リムーバブル阻害剤で溶出し、酵素活性を測定する。疾患原因タンパク質の分解においては、アミロイドタンパク質をリムーバブル阻害剤を結合させたプロテアーゼを添加し、ストレプトアビジン処理で切断を観察し、プロテアーゼ医薬品としての可能性を評価する。以上のように本研究を実施し、優れたリムーバブル阻害剤を獲得し、様々なプロテアーゼに対するリムーバブル阻害剤を用いて、血液や細胞成分からプロテアーゼの酵素活性を簡便に検出し、HIVや癌の画期的な診断薬の開発につなげる。そして、疾患原因タンパク質を分解するプロテアーゼ医薬品の開発をめざす。

中でも、bPI-11とHIV-1プロテアーゼの共結晶構造の解析に成功し、ビオチン部位が結合ポケットから溶媒の水へと向かって伸びており、結合に影響することなくビオチンを導入できたことが明らかとなった。また、リムーバブル阻害剤bPI-11のHIV-1プロテアーゼに対する酵素活性のON/OFF/ON/OFFの繰り返し制御が可能であることが分かった。この結果を基に、bPI-11を利用して血清中からアフィニティー精製したHIV-1プロテアーゼの酵素活性を検出し、再び薬剤を加えることにより、回復した酵素活性の阻害が確認できた。本結果は薬剤耐性検査が問題となる治療前の阻害薬の感受性試験への応用が期待される。更に、トリプシン阻害剤の直接的ビオチン化を行い、新規リムーバブル阻害剤を設計して合成したところ、ヒトトリプシン酵素活性をOFFからONへと制御できることが分かった。本研究のリムーバブル阻害剤の設計手法は、その原理どおりに、アスパラギン酸プロテアーゼだけでなくセリンプロテアーゼを標的とする阻害剤にも応用できることが分かった。アミノ基をビオチン化したHIVプロテアーゼ阻害剤のbPI-11を合成し、bPI-11とHIV-1プロテアーゼの共結晶構造の解析に成功した。ビオチン部位が結合ポケットから溶媒の水に向かって伸びており、結合に影響することなくビオチンを導入できたことが明らかとなったことから、X線結晶構造に基づく分子設計が有用であることが示された。既存のペプスタチンAとカテプシンDとの複合体のX線結晶構造データから、ペプスタチンAのC末端とビオチンのカルボン酸同士をヒドラジドで連結させた誘導体を合成したところ、pMレベルの強力なカテプシンD阻害活性を維持する化合物を得た。セリンプロテアーゼであるトリプシンを標的としてリムーバブル阻害剤の設計を試みた。X線結晶構造情報からビオチン化部位を決定し、カルボキシ基をヒドラジド化してビオチンを結合させたところ、bPI-14はヒトトリプシン-2に対してサブμMのIC50値を示した。また、bPI-14により阻害したトリプシン-2は、ストレプトアビジンの量依存的に酵素活性が上昇し、過剰量の添加により十分に回復した。本結果から、bPI-14はトリプシン-2のリムーバブル阻害剤であることが分かった。bPI-11によりHIV-1プロテアーゼの酵素活性を阻害した後でストレプトアビジンを添加して酵素活性が回復し、そこへ再び阻害剤を追加して酵素反応が抑制されたことから、酵素活性の繰り返し制御ができることを確認した。この結果を基に、血清中より結合させた野生型HIVプロテアーゼをbPI-11で溶出し、ストレプトアビジンを添加すると酵素活性が検出し、ダルナビル、ロピナビル、アタザナビルを加えて酵素活性を再び抑制した。次年度からは、各種プロテアーゼを標的としたビオチン化阻害剤の合成、プロテアーゼ阻害活性およびストレプトアビジンによる阻害活性消失の評価、アフィニティー結合プロテアーゼの酵素活性を検出、疾患原因タンパク質の分解を実施する。
リポキシゲナーゼにおける非ヘム鉄リガンドの反応修飾機能の解析

本研究では、リポキシゲナーゼ(LOX)の非ヘム鉄リガンドの反応修飾機能を詳細に解析するために、野生型酵素及びその第5鉄リガンド変異体を調製し、反応特性を比較検討することにより、第5鉄リガンドがLOXの反応特性に及ぼす影響を解明することを目的した。モデル酵素として、第5鉄リガンドの位置にSerを有する8LOXを用い、このSerをAsn、His及びAlaで置換した酵素を調製した。先ず、HeLa細胞での小スケールの発現と解析を試みたところ、相対活性は、Ser体>Asn体>>His体、Ala体となった。Ala体が十分な酵素活性を保持していることが判明し、LOX活性の発現に、第5非ヘム鉄リガンドは質的に必要ないことが示唆された(Jisaka et al.,ABB)。各変異酵素の反応特性をより詳細に検討するために、各酵素の大腸菌発現・精製系を確立した。各精製酵素の鉄含量を測定した結果、いずれも相当量の鉄を保持しており、第5鉄リガンドは鉄含量に影響しないことが確認された。Asn体のVmax値は、Ser体と同等であったが、Km値は10%以下に低下していた。一方、His体では、Km値に大差はなかったが、Vmax値はSer体の2倍に増大していた。以上の結果より、第5鉄リガンドにより、酵素反応のKm値及びVmax値が各々独立して影響を受ける可能性が示唆された。また、小スケール実験では低い相対活性であったHis体が、Ser体より大きいVmax値を有したことより、His体は、反応時間及び基質濃度等の反応条件の影響を受けやすいことが示唆された。Hisを持つLOXは、動物LOXの主要なファミリーを成すことから、Hisによる反応修飾機能のより詳細な解析が望まれる。リポキシゲナーゼ(LOX)の非ヘム鉄リガンドの反応修飾機能を詳細に解析するために、本年度の研究計画は主に基盤情報の確立に関わるものであった。1.8S-LOX及びその第5鉄リガンド変異体の大量調製系の確立:野生型のS(Ser)体、及び変異体の、N(Asn)体、H(His)体及びA(Ala)体の大腸菌での発現に成功した。さらに、Ni-アフィニティークロマトグラフィーを組合わせ、各酵素の迅速な調製系を確立した。2.各酵素標品の反応特性の解析:大腸菌での発現系の確立には予想外に時間を要したため、先ず、HeLa細胞での小スケールの発現と解析を試みた。T7RNAポリメラーゼ遺伝子を組込んだワクシニアウイスルとの共トランスフェクションにより、酵素活性を検出できる程度に発現させることができた。その結果、N体及びH体はS体と同等の活性を示した一方、A体もまた十分な酵素活性を保持していることが判明した。これはLOX活性の発現に、第5非ヘム鉄リガンドは本質的に必要ないことを示唆している(ABB,in press)。大腸菌で得られた各酵素標品の反応特性を検討したところ、各々のKmは同程度であるが、反応速度が大きく異なることが明かとなった。これに対する第5鉄リガンドの効果の詳細は引き続き検討中である。3.各酵素標品の鉄含量の測定:各酵素標品が相当量得られることとなり、より簡便な発色法による鉄含量の測定が可能となった。A体を含め、変異体はすべて野生型と同等量の鉄を含有しており、8S-LOXの第5鉄リガンドが鉄の保持性に影響しないことが判明した。4.8S-LOXの新規反応性の検討と反応生成物の同定:8S-LOXでは、反応の一次産物である8S-HPETEが生成した後、わずかながらより極性の高いトリエン化合物の生成が確認された。本生成物の同定、及び各変異体での生成は現在検討中である。

また、小スケール実験では低い相対活性であったHis体が、Ser体より大きいVmax値を有したことより、His体は、反応時間及び基質濃度等の反応条件の影響を受けやすいことが示唆された。Hisを持つLOXは、動物LOXの主要なファミリーを成すことから、Hisによる反応修飾機能のより詳細な解析が望まれる。