hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
免疫測定に係る化学発光反応ダイナミクスと発光効率の革新的最適化

本年度は,化学発光強度が最も強い2,4-ジメトキシカルボニルフェニル10-メチル-10λ-アクリジン-9-カルボキシレイト(以後,DCMACと述べる)と過酸化水素の反応に伴う反応分子ダイナミクス(RMD)を,理論的に解明することを主目的とし,本課題の後半に実施される溶媒運動をも露わに考慮した量子古典混合モデルに基づく非経験的反応分子動力学(ab initio RMD)シミュレーション実施のためのプログラム開発を実施した。中園学(九州大学薬学部)らにより,今年度新規に合成されたアクリジニウムエステル誘導体であるDCMACも含め,フェニル基における置換基の種類の差異および位置により発光強度が大きく変化することが報告されている。しかし,誘導体の種類により燐光の強度が変わり,定量的理解には至っていない。そこで量子化学計算を用い,遷移状態および安定構造の探索などを実施した。また,溶媒効果を暗黙分極連続媒体モデル法により静的に考慮した。これまでの成果と本結果より一つの仮説が見出された。反応経路は,大まかに遷移状態であるジオキセタン構造が現れた後,発光種である三重項状態である励起アクリドンが生成され,この励起種が強い燐光を示す。従って,ジオセキタン構造が現れる前後の反応過程が,燐光の強度を決定している。そして,置換基により明らかに二つの異なる経路に分類されることが判明した。しかし,この結果でも定量的発光強度の再現は出来なかった。次に,溶媒の運動をも露わに考慮した量子古典混合モデルに基づくab initio RMDシミュレーションのプログラム開発と予備的計算を実施した。約1ピコ秒時間発展させた古典軌道の結果には,ジオキセタン構造が現れなかった。しかし,計算は安定し,系のポテンシャルエネルギーが下がっていることが判明した。従って,脱プロトン化が起こり,ジオキセタン構造を取るものと思われる。基本的には予定通り進んでいる。ただし,非経験的反応分子動力学(ab initio RMD)シミュレーションプログラムの開発および予備的計算の実施において変更が必要となってきている。主な理由は,以下の通りである。古典軌道の時間発展において毎時間ステップに実施する量子化学計算により,on-the-flyでポテンシャルエネルギーとその傾きを求め,分子動力学シミュレーションを実施する。しかし,この量子化学計算において並列計算効率が圧倒的に高い,石村和也(分子科学研究所)が開発したSMASHプログラムをこれまで利用して,開発および予備的計算を実施してきた。特に,本研究で扱う分子のジオセキタン構造が現れる前後の反応過程までは,一重項状態の基底状態で計算を進めるため,1ピコ秒の時間発展も約12日間程度で達成できた。因みに時間ステップ(Δt)は0.05フェムト秒であることを考えると約2000ステップで1ピコ秒に達する。この時の計算条件および計算機環境は,基底関数に6-31G(d),メラー・プレセットの2次摂動法(MP2)に従い,CPUはIntel(R) Xeon(R) CPU E5-2680 v4 (Broadwell core) @ 2.40GHzを用い,28スレッド並列計算である。また,我々が提案するab initio RMDシミュレーションプログラムの全計算コストの9割が,量子化学計算の部分であることから,明らかに素晴らしい性能を示していた。しかし,三重項計算が未サポートであることが判明し,急遽Gaussian 16を利用し,テストを行っている。現在,量子化学計算プログラムの再検討を必要としている。現在までの進捗状況にて述べた通り,量子化学計算における並列化効率が,本研究の推進に大きく依存している。今年度は,SMASHやGaussian 16以外のプログラムパッケージで性能を評価し,最適な解を探し出す。そして,溶媒にジメチルスルホキシド(DMSO)を用い,溶媒を露わに考慮した量子古典混合(QM/MM)モデルを用い,計算を進める。特に,粒子メッシュ・エワルド総和(PME)法を既に取り入れて1ピコ秒の反応ダイナミクスが実現できていることから,引き続き溶媒中の非経験的反応分子動力学(ab initio RMD)シミュレーションを実施し,自由エネルギー評価のもとに定量的議論を行う予定である。また,上記とは別にヒトアルカリフォスファターゼ(1EW2)とアダマンチルメトキシホスホリルフェニルジオキセタン(AMPPD)との間で起きる加水分解反応により生成する不安定なフェノキシド置換ジオキセタン誘導体を経て,Chemically Initiated Electron Exchange Luminescence(CIEEL)機構(日本語訳が多分ないので私訳すると,化学誘起電子交換発光機構)により生物発光に匹敵する発光をしめす。本年度は,この反応メカニズム解明に着手する。特に,ヒトアルカリフォスファターゼ(1EW2)のPDBデータより,分子動力学シミュレーションを実施し,タンパク質の構造をコンピュータ上に再現する。また,水系の溶媒中では発光が激減することが実験では観測されていることから,水中でのシミュレーションを実施する。仮にタンパク質がコンピュータ上で安定して運動することが確認されれば,PME-QM/MMモデルのもとab initio RMDシミュレーションの予備的計算を進める。

中園学(九州大学薬学部)らにより,今年度新規に合成されたアクリジニウムエステル誘導体であるDCMACも含め,フェニル基における置換基の種類の差異および位置により発光強度が大きく変化することが報告されている。しかし,誘導体の種類により燐光の強度が変わり,定量的理解には至っていない。そこで量子化学計算を用い,遷移状態および安定構造の探索などを実施した。また,溶媒効果を暗黙分極連続媒体モデル法により静的に考慮した。これまでの成果と本結果より一つの仮説が見出された。反応経路は,大まかに遷移状態であるジオキセタン構造が現れた後,発光種である三重項状態である励起アクリドンが生成され,この励起種が強い燐光を示す。従って,ジオセキタン構造が現れる前後の反応過程が,燐光の強度を決定している。そして,置換基により明らかに二つの異なる経路に分類されることが判明した。しかし,この結果でも定量的発光強度の再現は出来なかった。次に,溶媒の運動をも露わに考慮した量子古典混合モデルに基づくab initio RMDシミュレーションのプログラム開発と予備的計算を実施した。約1ピコ秒時間発展させた古典軌道の結果には,ジオキセタン構造が現れなかった。しかし,計算は安定し,系のポテンシャルエネルギーが下がっていることが判明した。従って,脱プロトン化が起こり,ジオキセタン構造を取るものと思われる。基本的には予定通り進んでいる。ただし,非経験的反応分子動力学(ab initio RMD)シミュレーションプログラムの開発および予備的計算の実施において変更が必要となってきている。主な理由は,以下の通りである。古典軌道の時間発展において毎時間ステップに実施する量子化学計算により,on-the-flyでポテンシャルエネルギーとその傾きを求め,分子動力学シミュレーションを実施する。しかし,この量子化学計算において並列計算効率が圧倒的に高い,石村和也(分子科学研究所)が開発したSMASHプログラムをこれまで利用して,開発および予備的計算を実施してきた。特に,本研究で扱う分子のジオセキタン構造が現れる前後の反応過程までは,一重項状態の基底状態で計算を進めるため,1ピコ秒の時間発展も約12日間程度で達成できた。因みに時間ステップ(Δt)は0.05フェムト秒であることを考えると約2000ステップで1ピコ秒に達する。この時の計算条件および計算機環境は,基底関数に6-31G(d),メラー・プレセットの2次摂動法(MP2)に従い,CPUはIntel(R) Xeon(R) CPU E5-2680 v4 (Broadwell core) @ 2.40GHzを用い,28スレッド並列計算である。また,我々が提案するab initio RMDシミュレーションプログラムの全計算コストの9割が,量子化学計算の部分であることから,明らかに素晴らしい性能を示していた。
NF-E2の標的因子の同定と血小板放出における役割の解明

血小板や赤血球分化の最終段階を制御する転写因子であるNF-E2の標的遺伝子を単離し,それらの機能を明らかにするため,以下の実験を行った。1.NF-E2ノックアウトマウス由来の胚性幹細胞(ES細胞)の樹立。ES細胞はin vitroで分化して,赤血球や血小板を産生することが明らかになっている。NF-E2の標的因子を効率よく単離してその機能をin vitroで解析するために,NF-E2ノックアウトマウス由来のES細胞の樹立を試み,成功した。NF-E2-/-のES細胞はin vitroでTPO依存的に巨核球を産生したが血小板の産生は行わなかった。NF-E2-/-のES細胞由来の巨核球と正常ES細胞由来の巨核球とでサブトラクティブcDNAライブラリーを構築し,血小板マーカー遺伝子を含む数百クローンの塩基配列を決定した。現在その機能を詳細に解析中である。2.NF-E2標的遺伝子の機能解析。正常マウスとNF-E2のノックアウトマウスの造血器(胎仔肝臓)のサブトラクティブcDNAライブラリーのスクリーニングからNF-E2の標的候補遺伝子を数多く単離することに成功した。その中から赤血球や血小板の最終分化に関わる可能性の高い遺伝子として,細胞周期を停止させる働きをもつCREGと,新規チューブリンファミリーのδ-tubulinに着目してその機能解析を行った。CREGとδ-tubulinを特異的に認識する抗体の作製に成功し,組織レベルや細胞レベルでの局在を明らかにした。血小板や赤血球分化の最終段階を制御する転写因子であるNF-E2の標的遺伝子を単離してそれらの役割を明らかにするため,以下の実験を行った。(1)NF-E2標的遺伝子のクローニング正常マウスとNF-E2のノックアウトマウスの造血器(胎仔肝臓)からそれぞれmRNAを精製し,サブトラクションcDNAライブラリーを作製した。300クローンの塩基配列を決定し,その中に細胞内シグナル伝達分子や転写制御因子,膜型受容体などを見出した。ノーザン解析などから,単離した遺伝子はNF-E2のノックアウトマウスの造血器において顕著にその発現が抑制されていることが明らかとなったさらにそれらの遺伝子を大腸菌に発現させ,それを抗原としてウサギに免役し,ポリクローナル抗体を作製した。今後この抗体を用いた詳細な機能解析を行う予定である。(2)胚性幹細胞(ES細胞)を用いたin vitroにおける血小板放出系の構築(1)の実験で単離された遺伝子の機能を生化学的に解析するためには,巨核球が大量に必婁になる。しかし骨髄中の巨核球の量は少なく,またその精製も簡単ではない。そこで,ES細胞にトロンボポエチン(TPO)を添加してin vitroで分化させ,巨核球を大量に産生する培養法を開発した。この方法で得られたES細胞由来の巨核球は,培養液中に血小板様の細胞質断片を生じるため,血小板放出を解析する有用な材料になると期待される。
ストレス応答におけるチオレドキシン還元酵素の発現誘導と機能に関する解析

チオレドキシン還元酵素(TrxR)の3種類のアイソザイムのうち、細胞が種々のストレスに曝されると、TrxR1の発現のみが誘導されることが知られている。本研究では、ストレス応答におけるTrxRの機能を明らかにするために以下の解析を行った。(1)ストレスによるTrxR1の発現誘導機構の解析ウシ頸動脈血管内皮細胞(BAEC)をTNF-α、PMA+A23187、Cdで刺激すると、いずれの刺激においてもTrxR1 mRNA量が増加が増加したが、RNA合成阻害剤actinomycin D存在下刺激を行ったところ、これらの刺激のうちTNF-αで刺激した場合にのみTrxR1 mRNAの分解が抑制されていることがわかった。一方、ヒトTrxR1遺伝子の5'-flanking領域をルシフェラーゼ遺伝子に結合し作製したレポタージーンを、BAECに導入した後、細胞を刺激したところ、PMA+A23187、Cdの刺激ではともに転写活性の上昇が観察されたのに対し、TNF-α刺激では転写活性は変化しなかった。以上の結果から、ストレスによるTxR1遺伝子発現誘導には、mRNAの安定化、転写活性の上昇など、刺激の種類によりいくつかの経路が存在することが示された。(2)TrxR1の過剰発現がストレス応答性転写因子の活性に及ぼす影響TrxR1の発現誘導がAP-1やNF-κBなどのストレス応答性転写因子の活性化に及ぼす影響を検討するために、種々の転写因子の結合配列をもつプロモーターにレポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子をつないだDNAを用い、レポータージーンアッセイによる解析を行なった。その結果、TrxR1を高発現させると、AP-1やNF-κBを介する転写活性が増強されることがわかった。更に、TrxR1のNF-κBを介する転写活性に対する影響について詳細な検討を行なったところ、TrxR1の活性に必須なセレノシステイン残基をシステインに変異した変異型TrxR1の発現ベクターを導入した場合や、TrxRの阻害剤である金製剤で細胞を処理した場合には、転写活性の増強は観察されなかった。また、TrxR1を過剰発現させても、NF-κBの阻害蛋白質IκBの分解やNF-κBの核移行は変化しないことが明らかとなった。以上の結果から、ストレスによりその発現が誘導されるTrxR1は、その還元酵素としての活性を介し、ストレスにより活性化されるAP-1やNF-κBを更に活性化し、種々のストレス応答性遺伝子の発現に深く関与する可能性が示唆された。チオレドキシン還元酵素(TrxR)には3種類のアイソザイム、TrxR1、TrxR2、TrxR3が存在するが、細胞が種々の環境ストレスにさらされると、このうちTrxR1の発現のみが誘導されることが知られている。本研究では、このTrxR1の発現誘導がNF-κBなどのストレス応答性転写因子の活性化に及ぼす影響を検討するために、レポータージーンアッセイによる解析を行なった。

まず、TrxR1の発現ベクターとともに、NF-κB結合配列をもつプロモーターにレポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子をつないだDNAを、COS7細胞に導入し、TNF刺激に応じたNF-κB依存的な転写活性への影響を検討した。その結果、TrxR1を高発現させると、NF-κBを介する転写活性は増強されることがわかった。次に、細胞中のTrxR1活性を上昇させることが知られている亜セレン酸ナトリウムを培地中に添加し同様の実験を行なったところ、TrxR1発現ベクターの導入によるNF-κB依存的な転写活性上昇の亢進が観察された。一方、TrxR1の活性に必須なセレノシステイン残基をシステインに変異した変異型TrxR1の発現ベクターを導入した場合には、NF-κB依存的な転写活性に影響は見られなかった。以上の結果から、環境ストレスによりその発現が誘導されるTrxR1は、その還元酵素としての活性を介し、ストレスにより活性化されるNFκBを更に活性化し、他のストレス応答性遺伝子の発現に深く関与する可能性が示唆された。現在、TrxR1のNF-κB活性化のメカニズムや他の転写因子に対する影響について解析を進めている。チオレドキシン還元酵素(TrxR)の3種類のアイソザイムのうち、細胞が種々のストレスに曝されると、TrxR1の発現のみが誘導されることが知られている。本年度は、ストレス応答におけるTrxRの機能を明らかにするために以下の解析を行った。(1)ストレスによるTrxR1の発現誘導機構の解析ウシ頸動脈血管内皮細胞(BAEC)をTNF-α、PMA+A23187、Cdで刺激すると、いずれの刺激においてもTrxR1mRNA量の増加が観察された。これらの刺激のうち、RNA合成阻害剤アクチノマイシンD存在下刺激を行ったところ、TNF-αで刺激した場合にのみTrxR1mRNAの分解が抑制されていることがわかった。一方、ヒトTrxR1遺伝子の5'-フランキング領域をルシフェラーゼ遺伝子に結合し作製したレポータージーンを、BAECに導入した後、細胞を刺激したところ、PMA+A23187、Cdの刺激ではともに転写活性の上昇が観察されたのに対し、TNF-α刺激では転写活性は変化しなかった。以上の結果から、ストレスによるTxR1遺伝子発現誘導には、mRNAの安定化、転写活性の上昇など、刺激の種類によりいくつかの経路が存在することが示された。(2)TrxR1の過剰発現がストレス応答性転写因子の活性に及ぼす影響昨年度の研究において、TrxR1はその還元活性を介し、ストレスにより活性化されるNF-κBを介した遺伝子発現を更に亢進することを示したが、本年度は、そのNF-κB活性化機構について検討した。その結果、TrxR1を過剰発現させても、NF-κBの阻害蛋白質IκBの分解や、NF-κBの核移行は変化しないことが明らかとなった。TrxR1は核内におけるNF-κBのDNA結合能を上昇させることにより、NF-κBの活性化を亢進するのではないかと予想された。また、TrxR1を過剰発現させた場合、NF-κBを介した遺伝子発現のみならず、AP-1を介した遺伝子発現も亢進することが示された。
外生菌根菌の種多様性はなぜ低緯度で低くなる？～共生樹種の系統的多様性に着目して～

外生菌根菌は、低緯度地域よりも高緯度地域に多様性のピークがあるとされており、このようなパターンが生まれる原因はよく分かっていなかった。私は、外生菌根菌では共生樹種の転換が多様化のきっかけになったのではないかと考え、オニイグチ属菌を用いて、分子系統学的なアプローチからこの仮説の検証を行った。この研究の結果から、オニイグチ類は、共生種種の転換、とりわけ、北半球温帯域に広く分布するブナ科・マツ科樹種に宿主転換することで、急速にその分布域を拡大し、異所的種分化が促進される形で急速に多様化したことが示された。この研究を通して、オニイグチ属菌をはじめとした外生菌根菌の多様化の起源が明らかになってきた。本研究では、「ブナ科・マツ科・フタバガキ科等の樹種と共生する菌類である外生菌根菌において、その種多様性が低緯度地域ほど低くなる」という傾向に着目しており、このような一般的な生物の種多様性の緯度勾配と逆のパターンがなぜ生じるかを明らかにすることを目的としている。本研究では、「外生菌根菌の種多様性は緯度よりもむしろ外生菌根性樹種の系統的な多様性によって決まっている」という仮説を掲げており、この仮説の検証のために緯度の異なる地点において、菌類の多様性と植物の(系統的な)多様性との相関を調べることを計画している。この研究計画の初年度に当たる本年度には、北海道天塩町、滋賀県大津市、および沖縄県八重山郡竹富町という緯度の異なる3地点において、野外調査を行った。野外調査では、それぞれの調査地において12個ずつコドラートを設け、各コドラートから土壌コアを16個ずつ採集した。採集した土壌コアから、菌類の菌糸と植物の細根の融合体である外生菌根を選別し、水道水で洗浄した後、DNAサンプルとした。さらに、土壌コアから選別した土壌は化学分析用のサンプルとした。次年度には、もう一つの調査予定地であるマレーシアサラワク州のランビルヒルズ国立公園でも同様の調査を行い、DNAサンプルと化学サンプルの解析を順次行っていく予定である。この解釈として、1)森林の外生菌根菌の種多様性は緯度よりもむしろ外生菌根菌と共生できる樹種(外生菌根性樹種)の系統的な多様性によって決まっており、2)外生菌根性樹種の系統的な多様性が温帯よりも熱帯でより低いために逆パターンの緯度勾配が生まれると考えている。その上で、本研究においては、国内外の緯度の異なる地域において、コドラートを設け、外生菌根菌の菌糸とその共生植物の根の融合体である菌根を採集し、個々の地域ごとに外生菌根菌の多様性と共生樹種の系統的な多様性との相関を調べることを計画している。前年度には、沖縄県・滋賀県および北海道の森林において、コドラートを設置し、土壌から植物の細根(菌根)のサンプルを採集している。本年度には、前年度に採集した菌根サンプルのDNA抽出の作業を行った。さらに、次世代シーケンサーによるサンプルのDNA塩基配列の解読を行うための前段階として、菌根サンプルのPCRを行い、それぞれのサンプルに由来するDNA配列に対して、次世代シーケンサーが配列を認識するためのアダプター配列、およびサンプルを識別するためのインデックス配列の付与を行った。また、本調査に付随して発見した新種の菌類の報告も行った。さらに、残りの調査地点である、マレーシアボルネオ島サラワク州のランビル国立公園において調査を円滑に行うために、サラワク州のクチン市において開催された国際シンポジウムに参加し、カウンターパートの研究者らとの交流を図った。本研究では、本年度のおいて、熱帯圏における調査地として、マレーシアサラワク州のランビル国立公園における森林を予定していた。しかしながら、近年、東南アジア諸国において遺伝資源の保全に対する意識が急速に高まっていることから、微生物の分子実験を伴う研究の遂行が難しくなってきている。このような状況を打開するために、カウンターパートの研究者との協議を重ねてきたが、本研究を現地で遂行するにはより長期の交渉が必要であることが分かってきた。このような事情から、本年度は予定していた海外調査が行えず、研究の進捗状況はやや遅れているのが現状である。肉眼的に観察可能な子実体(キノコ)を形成する、大型菌類(いわゆるキノコ類)の中で、ブナ科・マツ科・フタバガキ科といった樹種と相利共生する種群は外生菌根菌と呼ばれる。一般的に生物種は低緯度地域ほど種多様性が高い傾向にあるが、外生菌根菌は高緯度地域の種多様性が低緯度地域と同等かそれ以上であることが知られている。本研究では、このような外生菌根菌の種多様性のパターンを生み出したきっかけとして、宿主となる樹種との共生関係に着目した。当初の計画では、菌根サンプルの解析から、外生菌根菌の多様性と共生樹種との関連性について調べる予定であったが、熱帯地域での菌根サンプルの入手が困難となったことから、入手が容易な子実体サンプルを用いて、その関連性について調べた。

まず、世界各地から外生菌根菌の一種であるオニイグチ類の子実体サンプルを収拾した後、80個のシングルコピー遺伝子の塩基配列を解読した後、分子系統推定を行った。さらに、得られた分子系統樹の樹形および樹長と現存種がどういった樹種と共生しているかの情報に基づいて、宿主状態ごとの多様化速度(種分化速度と絶滅速度の差)を推定した。この解析の結果から、オニイグチ類は、アフリカ熱帯域で起源した後、フタバガキ樹種とともに白亜紀末におけるインド亜大陸の移動に伴って東南アジア熱帯域に進出したことが分かってきた。さらに、その後、ユーラシア大陸に広く分布するブナ科・マツ科樹種に宿主転換を果たしたことで、分布域が急速に拡大し、異所的種分化が促進される形で種多様化が一気に進んだことが示された。本研究の結果から、現在見られる外生菌根菌の種多様性のパターンがどのように生まれたかが分かってきた。外生菌根菌は、低緯度地域よりも高緯度地域に多様性のピークがあるとされており、このようなパターンが生まれる原因はよく分かっていなかった。私は、外生菌根菌では共生樹種の転換が多様化のきっかけになったのではないかと考え、オニイグチ属菌を用いて、分子系統学的なアプローチからこの仮説の検証を行った。この研究の結果から、オニイグチ類は、共生種種の転換、とりわけ、北半球温帯域に広く分布するブナ科・マツ科樹種に宿主転換することで、急速にその分布域を拡大し、異所的種分化が促進される形で急速に多様化したことが示された。この研究を通して、オニイグチ属菌をはじめとした外生菌根菌の多様化の起源が明らかになってきた。国内の3地点での野外調査を当初の予定通り、無事、遂行することができた。予定していた海外調査に関しては、カウンターパートの都合で、次年度に見送ることとなった。次年度には、海外調査を行い、DNA実験と化学分析を行っていく予定である。マレーシアサラワク州のランビル国立公園において調査研究を実施するに当たって、当初の予想以上に交渉が長期化している。本年度には、この状況を打開するために、交渉を継続すると同時に、東南アジアにおける代替地域での調査を模索する予定である。現在、代替の調査地の有力な候補地としてカンボジアの森林が挙がっており、年度内の早い時期での調査実施に目処がつきつつある状況である。ランビル国立公園、あるいはカンボジアの森林のいずれかにおいて、調査許可が得られ次第、野外調査を行っていく予定である。菌類系統分類学今後の研究は、まず、もう一つの調査予定地であるマレーシアサラワク州のランビルヒルズ国立公園で同様の野外調査を行う予定である。この調査が完了した後、DNAサンプルと化学サンプルの解析を順次進めていく予定である。DNAサンプルに対しては、DNA抽出を行った後、菌類、または植物に特異的なPCRプライマーを用いて、菌の遺伝子領域(核ITS領域)と宿主樹種の遺伝子領域(葉緑体rbcL領域)をPCRで増幅する。さらに、PCRの増幅産物から、次世代シーケンサー(Illumina, Miseq)を用いて、菌根を形成する菌(外生菌根菌)と宿主樹種の塩基配列を解読する予定である。土壌サンプルに対しては、pHメーターを用いて土壌pHを測定した後、CNコーダーを用いて土壌の炭素/窒素比を測定することを予定している。これらの分析で得られたデータに基づいて、宿主樹種の系統的な多様性が外生菌根菌の多様性にどの程度影響するかについて評価していくつもりである。当初の予定では、マレーシアサラワク州のランビル国立公園において、野外調査を実施する予定であった。
グラフとネットワーク上の効率の良い並列アルゴリズムに関する研究

いくつかのグラフ・ネットワーク上の問題を解く効率の良い逐次・並列アルゴリズムを開発した.以下が主な成果である.1.直並列グラフや部分k-木上の多くの組み合わせ問題は線形時間で解けるが,辺彩色問題は直並列多重グラフ上でも今までに多項式時間のアルゴリズムが知られてない数少ない問題である.本研究では直並列多重グラフ上で辺彩色数を線形時間で求め,さらにO(|V|log|E|)時間で具体的な辺彩色を求める逐次アルゴリズムを与えた.また辺彩色問題をO(log|V|)時間で解く並列アルゴリズムも与えた.ここでVとEはそれぞれ与えられる直並列多重グラフの点集合と辺集合である.この結果はスケジューリング問題を解く上で有用である.2.外長方形とその内部の1つの長方形(内長方形)で囲まれた平面領域をAとする.Aの内部にはγ個の長方形障害物があるとする.外長方形と内長方形の周上にk組の端子対が指定されているとする.本研究ではA上でそれぞれの端子対を結び,長さの総和が最小な非交差直交道を求める効率の良いアルゴリズムを与えた.平面グラフ上の問題に帰着させて問題を解いており,アルゴリズムの計算時間はO(nlogn)である.ここでn=r+kである.このアルゴリズムはVLSIの一層配線問題等に応用できる.3.平面領域にm個の長方形障害物とn個の2層配線領域が与えられているとする.障害物の内部でない4点a,a ́,b,b ́が与えられたときに,a,a ́とb,b ́を結ぶ2本の道で2層配線領域以外では交差しないものの内で長さの和が最小なものを求めるアルゴリズムを与えた.計算時間はO((m+n)log(m+n))である.このアルゴリズムもVLSIの配線問題等に応用を持ち有用である.いくつかのグラフ・ネットワーク上の問題を解く効率の良い逐次・並列アルゴリズムを開発した.以下が主な成果である.1.直並列グラフや部分k-木上の多くの組み合わせ問題は線形時間で解けるが,辺彩色問題は直並列多重グラフ上でも今までに多項式時間のアルゴリズムが知られてない数少ない問題である.本研究では直並列多重グラフ上で辺彩色数を線形時間で求め,さらにO(|V|log|E|)時間で具体的な辺彩色を求める逐次アルゴリズムを与えた.また辺彩色問題をO(log|V|)時間で解く並列アルゴリズムも与えた.ここでVとEはそれぞれ与えられる直並列多重グラフの点集合と辺集合である.この結果はスケジューリング問題を解く上で有用である.2.外長方形とその内部の1つの長方形(内長方形)で囲まれた平面領域をAとする.Aの内部にはγ個の長方形障害物があるとする.外長方形と内長方形の周上にk組の端子対が指定されているとする.本研究ではA上でそれぞれの端子対を結び,長さの総和が最小な非交差直交道を求める効率の良いアルゴリズムを与えた.平面グラフ上の問題に帰着させて問題を解いており,アルゴリズムの計算時間はO(nlogn)である.ここでn=r+kである.このアルゴリズムはVLSIの一層配線問題等に応用できる.3.平面領域にm個の長方形障害物とn個の2層配線領域が与えられているとする.障害物の内部でない4点a,a ́,b,b ́が与えられたときに,a,a ́とb,b ́を結ぶ2本の道で2層配線領域以外では交差しないものの内で長さの和が最小なものを求めるアルゴリズムを与えた.計算時間はO((m+n)log(m+n))である.このアルゴリズムもVLSIの配線問題等に応用を持ち有用である.
OX40とgp34のシグナル伝達機構の解析とその血液疾患の病態形成における役割

(1)OX40シグナルの分子機構とその制御:TRAF3の共発現によって、TRAF2で誘導されるNF-κB活性化は抑制されたが、NIK発現による活性化誘導は影響されなかった。また、いくつかの欠損変異TRAF3を用いた解析において、TRAF3のC末側ドメインだけでなく、N末側ドメインにも抑制活性が認められた。以上の結果からTRAF3がOX40とTRAF2の結合阻害だけでなく、TRAFとNIKの間のシグナル伝達経路への作用によってNF-κBの活性化を抑制している可能性が示唆された(Biochem.Bioph.Res.Co.272:856,2000)。(2)gp34の細胞内シグナル伝達:マウス上皮細胞株MMCEのヒトgp34トランスフェクタント(MMCE-gp34)またはヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を可溶型リコンビナントOX40(sOX40)で刺激する系において、早期反応性遺伝子の発現をNortheor blotで解析した。その結果、sOX40刺激によりMMCE-gp34ではc-fosとc-junの発現が、またHUVECではc-junの発現が誘導されることを明らかにした。すなわち、OX40/gp34系のシグナル伝達は双方向性であることを示した(J.Immunol.163:3007,1999)。(3)血管内皮細胞によるT細胞の活性化におけるOX40/gp34系の役割:純化した正常CD4^+T細胞は固相化抗CD3抗体による刺激に対して殆ど増殖反応を示さないが、放射線照射したHUVECを共存させると強いIL-2依存性の増殖反応が誘導された。そしてこれは、抗gp34抗体の添加によって著明に抑制され、その程度は抗ICAM-1抗体や抗LFA-3抗体よりも顕著であった。これらの結果から、OX40/gp34系を介する補助シグナルが血管内皮T細胞によるT細胞増殖促進作用の主たるメカニズムの一つであることが判明した(J.Leuk.Biol.68:111,2000).(4)ATLの病態形成におけるOX40/gp34系の役割:ATL細胞にはOX40が構成的に発現しているので、OX40と細胞の生存とくにアポトーシス抵抗性との関わりについて検討した。正常活性化T細胞、OX40をトランスフェクトしたT細胞株、またはOX40を発現したATL患者の白血病細胞やOX40をトランスフェクタントしたT細胞株をgp34トランスフェクタント細胞と共培養すると、抗Fas抗体で誘導されるアポトーシスが抑制されること、また、このときXIAPの発現増加を伴っていることを観察した。したがって、ATL細胞が、異常発現したOX40を介して、生存に有利なシグナルを与えられている可能性が示唆された(発表予定)。

したがって、ATL細胞が、異常発現したOX40を介して、生存に有利なシグナルを与えられている可能性が示唆された(発表予定)。TNF受容体ファミリーに属するOX40とそのリガンドであるgp34の細胞内シグナル伝達および生物活性について検討した。これまでにOX40/gp34系は活性化T細胞と血管内皮細胞の接着を媒介することを報告したが(J.Exp.Med.183:2185,1996)、本研究により、血管内皮細胞との共培養によってT細胞の抗CD3抗体存在下の増殖が促進され、これが抗OX40抗体または抗gp34抗体によって強く抑制されることが明らかとなった。このcostimulationに関係しうる他の分子との比較においても、OX40/gp34系がCD2/LFA3系と同等かまたはそれ以上に重要な働きをしていることが示された。また、gp34を発現した血管内皮細胞側にも、OX40との結合によってc-junの発現が誘導されることを観察した。したがって、OX40/gp34系は双方向性システムであり、血管内皮細胞にも何らかの生物学的影響が生じていることが予想された。一方、OX40の細胞内シグナル伝達に関して、gp34との結合後TRAF2、TRAF5を介してNF-κBの活性化に至る経路を明らかにしたが(J.Biol.Chem.273:5808,1998)、そのときTRAF3がOX40の細胞内ドメインに結合してむしろ抑制的に働くことを報告した。現在、TRAF3の種々の欠損変異分子を作成してそのシグナル抑制の分子機構を中心に解析を進めている。(1)OX40シグナルの分子機構とその制御:TRAF3の共発現によって、TRAF2で誘導されるNF-κBの活性化は抑制されたが、NIK発現による活性化誘導は影響されなかった。また、いくつかの欠損変異TRAF3を用いた解析において、TRAF3のC末側ドメインだけでなく、N末側ドメインにも抑制活性が認められた。以上の結果からTRAF3がOX40とTRAF2との結合阻害だけでなく、TRAFとNIKの間のシグナル伝達への直接作用によってNF-κBの活性化を抑制している可能性が示唆された(投稿中)。(2)gp34の細胞内シグナル伝達:マウス上皮細胞株MMCEのヒトgp34トランスフェクタント(MMCE-gp34)またはヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を可溶型リコンビナントOX40(sOX40)で刺激する系を用いて早期反応性遺伝子の発現をNorthern blotで解析した。その結果、sOX4刺激によりMMCE-gp34ではc-fosとc-junの発現が、またHUVECでもc-junの発現が誘導された。すなわち、OX40/gp34系のシグナル伝達は双方向性であることが示された(J.Immunol.163:3007,1999)。(3)血管内皮細胞によるT細胞の活性化におけるOX40/gp34系の役割:純化した正常CD4^+T細胞は抗CD3抗体刺激に対して殆ど増殖反応を示さないが、放射線照射した血管内皮細胞(HUVEC)を共存させると強いIL-2依存性の増殖反応が誘導された。そしてこれは、抗gp34抗体の添加によって著明に抑制されその程度は抗ICAM-1抗体や抗LFA-3抗体よりも顕著であった。これらの結果から、血管内皮細胞がOX40/gp34系を介してT細胞に補助シグナルを賦与することが明らかとなった(J.Leuk.Biol.,in press)。
胆管炎発症機序の分子生物学的検討

腸炎に合併する原発性硬化性胆管炎のモデルであるfMLT投与後の胆管炎の発生機序を分子生物学的に検討した。fMLT投与後胆管周囲にマクロファージ、好中球、リンパ球が浸潤する。培養胆管細胞を用いて、マクロファージが産生するTNF-αの影響を調べたところ、TNF-αは胆管細胞に細胞障害性を示さず、経上皮電気抵抗が可逆的に低下した。これはマーカーの透過性の検討よりtight junctionの透過性が増すことによると結論された。好中球の影響は、fMLTで活性化した好中球の培養上清を胆管細胞の培養液に添加することで検討した。添加後経上皮電気抵抗は非可逆的に低下した。この低下は培養胆管細胞の基質からの剥離を伴っていた。経上皮電気抵抗の低下と胆管細胞の基質からの剥離はα1アンチトリプシンとエラスターゼインヒビターで阻止できた。基質から剥離した胆管細胞は8時間後よりviabilityが低下し、その低下と共に核が分葉化した胆管細胞数が上昇した。12時間後には胆管細胞のDNAは電気泳動でladder formationを示した。以上より、好中球が活性化されるとエラスターゼを分泌し、胆管細胞を基底膜から剥離すると考えられる。その後胆管細胞はアポトーシスに陥る。一方、リンパ球が胆管細胞に対して細胞障害性を有するか今回の検討では結論が出せなかった。マクロファージの阻害物質であるカラゲナンを投与するとリンパ球の浸潤が抑制される。従って、リンパ球浸潤にはマクロファージが必要と考えられる。両者のinteractionを今後検討しなければならない。ヒト原発性硬化性胆管炎の肝組織を見ると浸潤細胞はマクロファージ、好中球、リンパ球であり、基底膜からの胆管細胞の剥離、アポトーシスに陥った胆管細胞を認める。上記の結果はヒト原発性硬化性胆管炎の発生病理に当てはめられると考えられた。
流れ場の毒性物質分解とバイオフィルム形成のシミュレーションとそのメカニズムの解明

本研究は、芳香族化合物分解菌が分解過程でバイオフィルムを形成することに着目し、バイオフィルム内での特異的な発現解析を目指したゲノム解析を行うと共に、流路デバイスを用いたシミュレーションを行い、形成メカニズムの解明を目的とした。その結果、ビフェニルの水酸化代謝物を添加すると、バイオフィルム形成の促進と生細胞率の増加が観察された。また、ビフェニル分解菌TK102株の完全長ゲノム配列(約6.06 Mb)の決定に成功し、PCB分解遺伝子群が可動性遺伝子上にコードされていることを見出した。バイオフィルム形成のモデル化は、フェーズフィールド法の改良を行い、バイオフィルム形成のシミュレーションに成功した。本研究は、芳香族化合物の分解過程でバイオフィルムが形成することに着目し、マイクロアレイによる発現解析を行うと共に、マイクロデバイスを用いて流れ場での形成をシミュレーションし、その形成メカニズムを解明することを目的として行った。1.マイクロデバイスによる形成促進の定量化異なる栄養条件下におけるビフェニル分解菌Comamonas testosteroni TK102株のバイオフィルム形成を、多流路マイクロデバイス用いて観察した。形成したバイオフィルムを共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)で観察し、COMSTATソフトウェアで定量化した。その結果、ビフェニル分解菌TK102株において、栄養濃度の高い条件でバイオフィルム形成の促進が認められた。2.マイクロアレイ解析に有用なマイクロデバイスの改良これまで開発したマイクロデバイスの流路幅を大きくして、得られるバイオマス量を多くする改良を施した。この改良により、RNAの抽出量がマイクロアレイ解析に十分な量になることを目指した。その結果、十分なタンパク量と細菌由来の多糖類が得られることを確認した。3.タイリングアレイによる形成促進機構の解析当初目的としていたビフェニル非分解菌KT2440株のタイリングアレイは使用できないことが判明した。そこで、TK102株のゲノムシーケンスを依頼した。現在シーケンス結果の解析を行っている。4.バイオフィルム形成のモデル化フェーズフィールド法を用いて、デバイス中の流れ場でのバイオフィルム形成のシミュレーションモデルを構築した。23年度の解析式にモノーの式による細菌増殖項を加え計算を行った結果、レイノルズ数が増加するにつれて基質成分の対流速度が大きくなり、基質取り込みに伴う増殖によるバイオフィルム総量とバイオフィルムの厚みがともに大きくなる傾向になることが明らかになった。本研究は、芳香族化合物分解菌がその分解過程でバイオフィルムを形成することに着目し、流れ場での形成をシミュレーションし、その形成メカニズムの解明を目指した。1.流路デバイスによる形成促進の定量化ステンレスを基材としたデバイスでは、ビフェニル分解菌Comamonas testosteroni TK102株のバイオフィルムの付着力が弱いことから、付着面がアクリル製で観察面がガラスの流路デバイスを用いて観察した。その結果、ビフェニルの水酸化代謝物を添加すると、バイオフィルム形成の促進と生細胞率の増加が観察され、形成促進を実証した。2.タイリングアレイによる形成促進機構の解析当初目的としていたタイリングアレイよりも、ゲノム配列に基づくRNAシークエンスの方が転写解析には優れていることから、タイリングアレイの設計を回避し、TK102株の完全長ゲノム配列を決定することに方針を変更した。その結果、本菌株の完全長ゲノム配列(約6.06 Mb)の決定に成功した。また、バイオフィルム形成に深く関与すると予想される性繊毛タンパク質をコードすると予想される遺伝子が、染色体上の複数箇所から見出された。3.バイオフィルム形成のモデル化支配方程式は連続式、運動量保存式、基質の輸送方程式、及びバイオフィルム形成に関するCahn-Hilliard式を用いた。微生物の成長はMonodの式に従うと仮定した。微生物の付着過程は考慮せず、初期条件として種を設置した。バイオフィルム内では摩擦力によりほぼ流れはなく、溶液部ではチャネル形状に依存して上流部で溶液の速度が他の区間より速くなった。その結果、基質の濃度境界層が薄くなり、二相の界面付近で急峻な濃度勾配が形成され、基質がよりバイオフィルムへ供給されることから、上流側からバイオフィルムの成長が促進された。このモデルは、観察で得られた、上流側での成長促進と一致した。1.プレートアッセイによる形成促進の定量化ビフェニル非分解菌Pseudomonas putida KT2440株と、ビフェニル分解菌Comamonas testosteroni TK102株を用いて、ビフェニル中間代謝産物によるバイオフィルム形成促進を、24穴プレートを用いて定量化した。その結果、ビフェニル分解菌TK102株において、二水酸化ビフェニルの添加でバイオフィルム形成の促進が認められた。2.タイリングアレイによる形成促進機構の解析24穴プレートに形成したバイオフィルムからRNAが抽出可能なことを確認した。

しかし、当初目的としていたビフェニル非分解菌KT2440株においては形成促進が認められなかったことから、KT2440株のタイリングアレイは使用できないことが判明した。現在、TK102株のゲノムシーケンスを依頼中であるが、完了していない。3.マイクロアレイ解析に有用なマイクロデバイスの改良これまで開発したマイクロデバイスを用いて、流路に形成するバイオフィルムの定量を行った。その結果、共焦点レーザ顕微鏡で得られたデータをCOMSTATソフトウェアで解析し、バイオマスと生細胞・死細胞並びにマトリックスの定量を行うことに成功した。4.バイオフィルム形成のモデル化フェーズフィールド法を用いて、デバイス中の流れ場でのバイオフィルム形成のシミュレーションモデルを構築した。その結果、レイノルズ数が増加するにつれて基質成分の対流速度が大きくなり、バイオフィルム総量とバイオフィルムの厚みがともに大きくなる傾向になることが明らかになった。バイオフィルム形成促進の定量化は、多流路マイクロデバイスを用いた実験で再現性を持つ結果を得ることができた。タイリングアレイによる形成促進機構の解析は、KT2440株のタイリングアレイが使用できないという結果が出たため、アレイ解析を行うには至っていない。しかし、流路幅を大きくした改良型マイクロデバイスで形成させたバイオフィルムから、RNAの抽出が可能となる結果が得られた。また、ビフェニル分解菌TK102株のゲノムシーケンスが得られたことから、そのデータを解析中であり、マイクロアレイではなく、ターゲットとする遺伝子を特定して、その遺伝子発現の変動を指標とした解析を計画中である。バイオフィルム形成のモデル化は、フェーズフィールド法の改良を行い、バイオフィルム形成のシミュレーションに成功した。以上のように、計画はおおむね順調に進行している。バイオフィルム形成促進の定量は、24穴プレートを用いた実験で再現性を持つ結果を得ることができた。タイリングアレイによる形成促進機構の解析は、KT2440株のタイリングアレイが使用できないという結果が出たため、アレイ解析を行うには至っていないが、24穴プレートに形成したバイオフィルムからRNAの抽出は可能となった。マイクロデバイスの改良については、デバイスに形成するバイオフィルムを定量する解析系を構築できたため、それに合わせた設計を行った。そこで、改良デバイスの作製は24年度に行うことにした。バイオフィルム形成のモデル化は、フェーズフィールド法を用いてバイオフィルム形成のシミュレーションに成功した。
走行車両に作用する風速変動に基づく横転回避情報システムの構築

強風時の走行車両の横転事故に対する安全性向上のため,横転警戒区間を通行する大型車の運転者に事前に安全走行速度情報を伝達するシステム構築を目的とする.1走行車両が受ける風速変動の閾値超過確率は車両に対する相対風向に依存し,向かい風の方が閾値超過確率が増加することが明らかとなった.2横風を急に受ける場合,横力は相対風速,風向に応じて準定常的な変化を示す一方,ヨーイングモーメントは顕著なオーバーシュートが発生した.3ソフトコンピューティングによる短期的強風予測を構築し,数分先の平均風速予測は一定の精度を期待できることが示された.以上より横風による車両横転の警報システムの基本構成がほぼ完成した.強風時の走行車両の横転事故に対する安全性向上のため,横転警戒区間を通行する大型車の運転者に事前に安全走行速度情報を伝達するシステム構築を目的とする.1走行車両が受ける風速変動の閾値超過確率は車両に対する相対風向に依存し,向かい風の方が閾値超過確率が増加することが明らかとなった.2横風を急に受ける場合,横力は相対風速,風向に応じて準定常的な変化を示す一方,ヨーイングモーメントは顕著なオーバーシュートが発生した.3ソフトコンピューティングによる短期的強風予測を構築し,数分先の平均風速予測は一定の精度を期待できることが示された.以上より横風による車両横転の警報システムの基本構成がほぼ完成した.本研究の申請時に計画した5つの検討項目のうち,A)移動測点の風速変動性状の把握(実験),B)移動車両が受ける風速変動性状の把握(実車観測),およびD)橋梁上の風速場の短期的予測手法の構築に取り組み,以下の成果を得た.A)乱流格子により風洞内に一様乱流場を生成し,熱戦風速計プローブを主風向に対し様々な相対角度の方向に一定速度で移動させながら変動風速を測定した.設定した相対角度は主風向に対し90°(真横に移動),45°(追い風),-45°(向い風)とし,測定された風速データをもとに,主風向変動成分(u)とその時間微分(du/dt)の同時確率密度関数を求め,閾値超過確率の相対角度に対する依存性を調べた.その結果,閾値超過確率は相対角度に依存し,向い風のほうが相対的に閾値超過確率が高くなる傾向を見出した.B)本州四国連絡橋において,車両の屋根に超音波風速計を設置した移動観測車により実際に計測された走行中の車両が受ける風速変動の時系列データを対象に,上記A)と同様の同時確率密度関数を求め,閾値超過確率を求めた.上記の手法が実際の風にも十分適用することが確認された.一方,相対風向に対する閾値超過確率の依存性については引き続き検討を継続中である.D)カオス時系列予測,およびニューラルネットワークを用い,上記B)で得られた風速の実測データをもとに,5分から10分程度の短期的風速予測を試みた.その結果,両者の手法ともに数秒の演算時間で精度良い風速予測が可能であることをが確認された.なお,データによっては良好な予測が行えない場合があること,過去の風速を超える値を予測できないこと,などの問題点も明らかとなり,風速の時間微分値(風速変化率)などの条件を追加するなど,予測精度向上のための検討を継続中である.強風時の走行車両の横転事故に対する安全性向上のため,海峡部の橋梁上や地形的特徴から決まる警戒区間を通行する大型車の運転者に事前に安全走行速度情報を伝達するシステム構築を目的とする.具体的には,1走行車両が受ける風速変動の確率分布に基づく風速の閾値通過問題として風速レベル超過確率を求め,2構造部材や近隣地形等による局所的な風速の非一様区間を通過する車体が受ける風圧力(空気力)の非定常性を考慮し,3ソフトコンピューティングによる警戒区間通過時間中の風速変化を含む短期的強風予測を導入した横転回避情報システムの構築を試みた.1では,風洞内の乱流中で熱線流速計を一定速度で移動させ,測定される変動風速の閾値超過確率密度を,風洞に固定した場合と比較した.その結果,閾値超過確率は移動計測の場合,相対風向,相対風速の違いにより影響を受けること,向い風状態で移動する場合に固定計測に比べて閾値超過確率が増加し,追い風状態では逆に小さくなることが明らかとなった.また,移動車両による実際の風速観測記録をもとに,前述の閾値超過確率を導入した規制風速の設定が可能であることを示した.2では,走行車両を模擬した角柱が横風区間に突入する際の横力,ヨーイングモーメントを実験により計測し,その非定常性を調査した結果,横力は風向,風速の変化に対して准定常的であるのに対し,ヨーイングモーメントは一時的にオーバーシュートが確認され,風向,風速急変時の車両の蛇行走行の一因となることが明らかとなった.3では,カオス予測とニューラルネットワークによる風速,風向の短期予測法を提案し,実際の風速観測記録に適用した.5分程度の短期予測では,一定の予測精度が期待できることが明らかとなった.より長時間の予測精度向上については今後の課題となった.以上より,横風による車両横転の警報システムの基本構成がほぼ完成した.風工学,構造工学移動測点の風速変動に基づく風速の閾値超過確率の算出,およびその相対風光に対する依存性を風洞実験により明らかにすることができ,かつ移動車両による実測データについても上記の手法が適用可能であることが確認された.

また,風速の短期的予測手法の構築がほぼ完成し,一定の予測精度も備えていると判断されたこと,および予測精度向上の課題が明らかとなり,今後風向についても同様の手法で予測を試みる見込みが立った.当初の計画検討項目のうち未着手である,C)高重心車両の突風による非定常空気力特性について,横風をシミュレート可能な風洞(既設)を用い,実際に計測する.また,D)風向の短期的予測を実施する.以上を総合し,横風横転を回避するための警戒情報の算出,発信方法棟を検討し,E)横風横転回避システムを構築する.次年度に風洞実験を予定しており,実験用消耗品費等の執行を予定しているため.研究発表のための旅費執行を予定しているため.数値流体解析等の大規模計算を予定しており,計算機使用料を見込んでいるため.物品費447,500円,旅費400,000円,その他費400,000円,間接経費300,000円,計1,547,500円を予定.
B型肝炎ウイルス感染の分子機構

B型肝炎ウイルス感染機構研究のための新規B型肝炎ウイルスベクターの作製およびダックB型肝炎ウイルス(DHBV)の感染に関わる宿主因子の同定とB型肝炎ウイルスのin vitro感染系の確立を試みた。その結果、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子を組込んだB型肝炎ウイルスの効率的な産生に成功した。また、DHBVの感染に関わる宿主因子は同定できていないが、ヒト肝がん由来細胞株HuH7がin vitro感染系樹立に有望であることがわかった。本年度は、分泌性ルシフェラーゼ(CLuc)遺伝子が組み込まれた新規ウイルスベクター(DHBV-CLuc)の構築、ダック肝臓cDNA発現ライブラリー(レトロウイルスベクター)の作製、ヒト肝がん由来培養細胞株の収集とそれらの肝細胞特異的遺伝子の発現について取り組んだ。その結果、感染能があり研究遂行に有用なCLuc発現DHBVベクターの作製に成功した。また、このDHBV-CLucを導入した安定発現株を2種得ることができDHBV感染に関連する宿主因子候補をスクリーニングする準備がととのった。ダック肝臓cDNA発現ライブラリー(レトロウイルスベクター)の作製を進めているがこれまでに10^4以下レベルのライブラリーしか得られずさらにライブラリーの構築を進めている。収集した4種のヒト肝がん由来培養細胞株における肝細胞特異的あるいは特徴的な遺伝子の発現量は調べた限り正常肝細胞と異なり多様であるが、そのうちのひとつの細胞株では特定の条件下で正常肝細胞に似た発現を示すようになることを見いだした。来年度は、ダック肝臓cDNA発現ライブラリー(レトロウイルスベクター)および新たに作製するcDNAライブラリーを導入した発現細胞プールの樹立とDHBVベクター(DHBV-GFPやDHBV-CLuc)を用いた発現スクリーニングによる感染に関連する宿主因子の探索、ヒト正常肝細胞に似た遺伝子発現パターンを示すヒト肝がん由来細胞株についてHBV感染能を検討するとともに、さらに、各種肝がん由来細胞株とHBV感染能についてさまざまな培養条件下で検討を進める。本年度は、分泌性ルシフェラーゼ(GLuc)遺伝子が組み込まれた新規ウイルスベクター(HBV-GLuc)の構築、ダック肝臓cDNA発現ライブラリー(レトロウイルスベクター)の作製、ヒト肝がん由来培養細胞株の培養条件とHBV感染について取り組んだ。その結果、研究遂行に有用なGLuc発現HBVベクターを作製できた。ヒト肝がん由来培養細胞株は至適濃度のDMSOを添加培養することによりわずかな感染がみられること、また、ヒト肝がん由来培養細胞株間の融合細胞では感染がわずかだが高まることを見いだした。これらの発見を新規in vitroHBV感染系の確立を目指す足掛かりとしたい。DHBVについては、DHBV CLuc及びDHBV GFPを用いて、ダック肝臓cDNA発現ライブラリー(レトロウイルスベクター)の作製とその発現スクリーニングからのDHBVレセプター単離の試みを継続して行っている。新たな試みとしてHepatocyte like cells (iHep)の樹立とB型肝炎ウイルス感染について検討している。マウスで実証された4種の遺伝子をヒトあるいはダックfibroblastに導入・発現させdirect conversionによりiHep細胞を得ようと試みた。樹立された細胞はアルブミン等多くの肝細胞特異的な遺伝子の発現が認められたが発現していない遺伝子もあった。マウスのiHep細胞と異なりこれら細胞の形態はfirobrolast様で、HBVあるいはDHBVの感染成立は現在確認できていない。本年度は、分泌性ルシフェラーゼ(GLuc)遺伝子が組み込まれたHBVベクターの高産生系の作製とHBV感染系の確立について主に取り組んだ。DHBVの感染の成立は作成したiHep様細胞で認められなかった。HNF4A、FOXA2、HNF1A、GATA4遺伝子のダックfibroblastsへの導入・発現ではアルブミン等の肝細胞特異的遺伝子の発現が認められてもDHBVは感染しないことから感染に必要な因子がこれらの細胞には欠けているものと考えられる。HBVベクターについてはヘルパーHBV constructとしてHBV core、polymerase、X遺伝子発現とHBV envelope発現と二つに分けることで組換えによる野生型HBVの出現を抑えたより安全な系を構築した。この系では昨年度構築したHBVベクター系より100倍多いウイルス粒子(>107/ml培養液)を産生し、HBV感染機構等の研究に有用なツールを作製できた。研究遂行に有用な組換えウイルスベクターの構築を完了した。新規in vitro感染系・レセプター探索の糸口になるような現象をみつけた。24年度が最終年度であるため、記入しない。本年の発見を足掛かりに新規in vitro感染系の確立をめざすと共に、さらにさまざまな肝細胞・肝がん由来細胞株を入手しそれらのin vitro感染系確立の可能性についても検討していく。また、非感染性肝がん由来細胞株と正常肝細胞との遺伝子発現プロファイルの違いからウイルスレセプター候補を探索し検証していく。DHBVについてはさらにウイルスレセプタースクリーニングを継続する。