hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒトES/iPS細胞由来血管細胞分化誘導技術開発および血管病態機構解明への応用

心筋梗塞、脳梗塞などの動脈硬化病変を基盤とした虚血性疾患に対する血管再生療法、さらには新たな治療法開発を目的とし、ヒトES/iPS細胞からの血管内皮細胞および血管平滑筋細胞分化誘導技術の開発、改良に取り組んだ。さらに構築した血管細胞分化誘導法を血管関連疾患特異的iPS細胞に応用することで多発性嚢胞腎における動脈瘤形成機序、高安病の遺伝的要素、もやもや病の病態解明といった共同研究を推進できた。当研究課題において、H26年度には、研究実施計画に沿って、まずはヒトES/iPS細胞からの血管構成細胞分化誘導技術の改良に取り組んだ。これまで血管細胞分化誘導の第一段階は、ヒトES/iPS細胞の未分化コロニーを適当なサイズに分割し、培養dishに接着させることであった。ヒトES/iPS細胞は未分化状態ではsingle cellにすると生存率が大きく下がるためであるが、このstep、手技の再現性が乏しく、各セルライン、実験による血管誘導効率の差異に繋がると考えられた。このため、Rho/ROCK inhibitorを誘導初期に併用することで、未分化ES/iPS細胞をsingle cellにまで分離してから血管細胞誘導を開始できないかを検討した。結果、Rho/ROCK inhibitorを最初の24時間のみ添加することで、single cell状態でも未分化ES/iPS細胞がdishに接着し、血管細胞誘導が可能であった。これにより血管細胞誘導に最適な初期細胞densityを検討することも可能となり、高い細胞密度では未分化細胞の残存率が上昇することが判明した。さらに、single cellから誘導をはじめる分散培養法を導入することで、セルラインや各実験runによる血管内皮細胞誘導効率の差異が減少し、より安定した誘導系を確立できたと考える。次に、sortしたFlk1陽性細胞からのpericyteおよび血管平滑筋細胞分化誘導に関しての検討を行った。具体的には、pericyte markerと血管平滑筋細胞マーカーを区別し、その発現を経時的に検討するとともに、VEGFやTGFβ1といった各種液性因子がどのような影響を与えるかを検討した。検討の結果、誘導中期にのみTGFβ1を添加することで、血管平滑筋細胞への分化誘導が促進されることを見出した。当研究課題において、H27年度には、研究実施計画に沿って、H26年度に引き続きヒトES/iPS細胞からの血管細胞分化誘導技術の改良に取り組んだ。具体的には、フローサイトメトリーを用いてsortingしたFlk(+)VE-cadherin(ー)細胞分画からの血管平滑筋細胞分化誘導に関し、各種液性因子の作用および至適血清濃度を検討した。結果、TGFβ1を使用し、低血清で誘導することで、SM2やSM22といった血管平滑筋マーカーを発現する細胞を誘導することに成功した。さらに血管細胞誘導の各ステップをrefineし、現在では血管内皮細胞(EC)誘導に関しても安定して20%以上の分化誘導効率で誘導することが可能となった。これらの分化誘導法において、誘導各ステップでの心血管ホルモンおよびその受容体の発現を詳細に検討した。結果、我々が誘導した血管内皮細胞はエンドセリンを強発現しており、内分泌学的見地からも成熟した血管内皮細胞であることが証明された。また誘導過程で得られるFlk(+)VE-cadherin(ー)細胞がBNPを発現、産生していることを見出し、その意義につき現在も検討中である。また、血管関連疾患特異的iPS細胞を用いた研究では、多発性嚢胞腎(ADPKD)患者から樹立したiPS細胞を用いて、ADPKDにおいてなぜ動脈瘤が発生しやすいのかにつき、研究を続けた。PKD患者のうち、臨床的に脳動脈瘤を呈する患者、呈さない患者双方から複数のiPS細胞を樹立し、誘導された血管内皮細胞をDNAマイクロアレイで遺伝子網羅的に解析することで、脳動脈瘤を呈する患者から樹立されたiPS細胞由来ECで高い発現を示す分子Aを見出した。また遺伝歴のある高安病患者から樹立したiPS細胞を用いて血管細胞誘導を行い、研究を推進し、高安病患者iPS細胞由来ECにて高発現するいくつかの遺伝子を同定した。研究実施計画に沿い、初年度にあたる当該年度では、研究の基礎となる血管細胞誘導技術自体の改良に主に取り組んだ。結果、これまでヒトES/iPS細胞からの血管構成細胞分化誘導において問題となっていた、セルラインによる誘導効率の差を減少することに成功出来たとともに、fik1陽性VE-cadherin陰性細胞からの血管平滑筋細胞分化誘導技術に関してもある程度の進展が得られた。先天的な遺伝子異常によって血管に異常をきたす疾患患者から樹立した疾患特異的iPS細胞を用いた研究に関しても、継続して進展できている。再生医学pericyteと血管平滑筋細胞を分離して誘導するには更なる検討が必要である。今後は、改良できたヒトES/iPS細胞からの血管分化誘導技術を用いて1)血管関連疾患特異的iPS細胞を用いた研究2)我々の血管細胞分化誘導法において各種心血管ホルモンが血管細胞分化に影響しているかを検討するを中心に研究を進める予定である。

1)では、具体的には現在進行中である、高安病の母娘からそれぞれ樹立したiPS細胞を用いた高安病研究、さらに遺伝的素因が関係していると考えられる若年発症重症冠攣縮性狭心症患者から樹立したiPS細胞を用いた血管spasm研究をさらに推進する。研究計画に基づき研究を実施したが、算定した細胞培養規模よりも若干小規模での細胞培養でも血管細胞分化誘導技術開発は十分に施行することが出来た。このため、若干ではあるが、当初の消耗品として見積もった額より小額で研究を遂行できた。結果として生じた小額の次年度使用額として持ち越された分は、今後、疾患特異的iPS細胞を用いた血管細胞分化誘導研究を続けるための消耗品購入に当てる予定である。
遷移金属電極表面からのスピン分極電流の第一原理計算

本研究の目的は,遷移金属界面のトンネル接合を流れるスピン分極電流,電極表面からの電界放出電流を,密度汎関数法の範囲で第一原理から計算する方法を開発し,興味ある系に応用することである。平成13年度15年度までの研究により,この目的を達成した。我々の手法では,線形化補強平面波基底(LAPW)とエムベッディング法を用いて界面領域の一電子Green関数を自己無撞着に計算する。具体的な計算過程は以下である。1.フルポテンシャルLAPW法により,電極内部の3次元結晶の電子構造を決定する。2.波動関数の転送行列から,電極の面方位に対応する電子の複素エネルギーバンド構造を計算する。3.2で得られたBloch波,エバネッセント波から半無限電極と透過なエムベッディングポテンシャルを計算する。4.半無限の2電極に挟まれた界面領域のGreen関数を,密度汎関数法の範囲で自己無撞着に決定する。5.Landauer公式から,電極間を流れるバリスティック電流を計算する。ここで我々は同公式をGreen関数とエムベッディングポテンシャルの虚部から直接計算する公式を導いた。またLandauer公式では扱えない表面局在状態からの電流を計算できるように公式を改良した。この方法を用いて,我々は次の系を解析した。1.貴金属表面からの電界放出電流の面依存性を調べ,表面バンドからのトンネル電流が重要であることを明らかにした。2.Cu/Co/Cuトンネル接合や,磁気ランダムアクセスメモリー(MRAM)として重要なFe/MgO/Fe接合におけるスピン分極トンネル電流を計算した。本研究の目的は,密度汎関数法の範囲の第一原理計算によって,遷移金属電極界面を流れるトンネル電流,および金属電極からの電界放出電流を解析することである。平成13年度は共同研究者のBlugel教授のグループとの共同研究により,この目的を達成するための基礎理論の構築し,計算プログラムの開発を行った。1.グリーン関数法による波動関数の転送行列の計算スラブ上の領域を考え,その両側の境界面をS_1,S_2とする。S_1上での電子の波動関数とその法線微分(Ψ,∂Ψ)を,S_2上の(Ψ,∂Ψ)に結びつける行列を転送行列という。2電極界面の両側を結ぶ転送行列から,界面を通過する電子波動関数の透過係数が計算でき,Landauer公式を用いてトンネル伝導度が計算できる。我々は,境界面上の法線微分を0とするNeumann型境界条件を満たすグリーン関数を用いて,転送行列が簡単に表せることを示した。2.FLAPW法による計算プログラムの開発上記の理論を実証するため,線形化補強平面波(LAPW)基底関数を用いたグリーン関数の計算プログラムを開発した。この際,グリーン関数のNeumann型境界条件は,Inglesfieldのエムベッディング法を用いて取込んだ。3.複素エネルギーバンド構造の計算界面をトンネルする電子波動関数は,2電極結晶の内部では,ブロッホ波とエバネッセント波の重ね合せで記述される。両者を合せた一般化ブロッホ状態は,結晶の1原子層に対応する転送行列の固有ベクトルとして計算される。また対応する固有値を複素エネルギーバンド構造という。我々は上記の計算プログラムの最初の応用として,Si,Fe,Cu,Ag等の複素エネルギーバンド構造を計算した。本研究の目的は,密度汎関数法の範囲の第一原理計算によって,遷移金属電極の界面構造を流れるトンネル電流,電極からの電界放出電流を解析することである。平成14年度は,ドイツ・ユーリッヒ研究センターのBlugel教授のグループ,および同研究センターのLiebsch博士のグループとの共同研究を平行して行い,基礎理論の構築,計算プログラムの開発,興味ある実際の系の解析を行った。1.グリーン関数法によるLandauer公式の再定式化(Blugel教授のグループとの共同研究)通常,遷移金属界面やサンドイッチ構造を流れるバリスティック電流・トンネル電流の第一原理計算には,Landauer公式が用いられる。

この際,界面に入射する各一電子状態に対して,散乱問題を解き,波動関数の反射・透過係数を計算する必要があった。我々は,界面領域のグリーン関数と,バルク結晶の効果を表す境界面上のエムベッディングポテンシャルを用いると,Landauer公式が極めて簡単に表現できることを示した。これを用いてCu/Co/Cu磁性サンドイッチ構造における電子の界面での反射率を計算して,KKR法による計算結果に一致することを示した。2.金属電極表面からの電界放出電流の計算(Liebsch博士のグループとの共同研究)上の1で得られた公式を利用して,貴金属清浄表面(Au, Cu)からの電界放出電流を電場の関数として計算した。これは半無限結晶表面に対する,初めての自己無撞着な電界放出の計算である。バルク状態からの電流に関しては,(001)面のほうが(111)面より大きい。しかし,フェルミエネルギー付近の浅い占有表面準位からの表面電流のため,全電流は(111)面のほうが大きくなる。この表面電流にもかかわらず,全電界電流は,自由電子模型で予言されたのと同じFowler-Nordheim直線で,良く表される。本研究の目的は,遷移金属電極の界面構造を流れるトンネル電流,電極からの電界放出電流を,密度汎関数法の範囲で第一原理から計算する方法を開発し,興味ある系に応用することである。平成15年度は,年度中にドイツ・ユーリッヒ研究センターからつくば産業技術総合研究所に異動したポストドクター研究員Wortmann氏および大脇氏と,電極からの電子の電界放出およびトンネル電流の基礎理論に関する共同研究を行い,ミラノ・ビコッカ大学のTrioni博士のグループと半無限固体表面の電子構造計算プログラムの改良を行い,また同プログラムを用いて英国ウェールズ大学のInglesfield教授のグループとCu表面上の酸素吸着層の電子構造を調べた。主な成果は以下である。共同研究者のWortmann氏によって,磁気ランダムアクセスメモリー(MRAM)として最近注目されているFe/MgO/Fe磁性トンネル接合のトンネル伝導度が,エムベッディング法とFLAPW法を組み合せた第一原理Green関数計算プログラムおよびLandauer公式を用いて計算された。2.一般化勾配近似(GGA)交換相関ポテンシャル,鏡像ポテンシャルの計算(Trioni博士のグループとの共同研究)エムベッディング法とFLAPW法を組み合せた第一原理のGreen関数計算プログラムにおいて電子の交換相関ポテンシャルを局所密度近似(LDA)から一般化勾配近似(GGA)に改めた。これによって電界放出を計算する際,極めて重要になる遷移金属の仕事関数の計算値の実験値との一致が良くなった。またモデル的な鏡像ポテンシャルを導入して,鏡像準位も計算できるようになった。3.バルク状態,表面状態からのトンネル電流を同時に計算する新公式の導出(Wortmann氏,大脇氏との共同研究)
原子直視コインシデンス電子顕微鏡の試作

本研究は、電子顕微鏡、JEM-120CXを改造し、これに大口径X線検出器を取り付け、更に蛍光板の代わりに二次元位置敏感検出器(PSD)を用いて、X線とX線励起透過電子とのコインシデンスをとることによって、透過型電子顕微鏡を用いて試料中の二次元マッピングを行おうとするものである。現時点で得られている成果を次に記す。(1)大口径X線検出器として1インチ径のシンチレータを特注してJEM-120CXに取り付け、パルス波高分布より特性X線を検出するシステムを製作した。(2)高速に信号処理出来る二次元検出器としてPSDを購入し、位置敏感型光電子増倍管(PSPM)を製作し、これに自作した高速信号処理回路システムを接続した。本システムの性能は、立ち上がり時間5.5ns、伝達時間17ns、伝達広がり時間1.0nsできわめて良好なPSPMとして動作する事を確認した。(3)コインシデンス測定を行った。予備実験として、蛍光板に高速電子を照射して、蛍光の方はPSPMで検出し、蛍光板より出るX線の方は、シンチレータ(NaI)で検出して、両者のコインシデンスをPとる事にした。その結果、遅延時間約26nsの所で明瞭なコインシデンスピークを確認する事が出来た。今後の課題は、実際に膜厚のわかった試料を入れて、試料からの特性X線を検出して、目的とする二次元マッピングを観測する事である。このためには、若干X線の遮蔽等の装置の改造が必要となるものと思われるが、実現に向けての十分な成果を得ている。試料中の重金属等の原素の分布状態を原子レベルで観察する原子直視コインシデンス電子顕微鏡の試作を行っている。本年度はコインシデンスを行うための基本要素について試作を行った。まず,X線検出器として従来用いられているSi半導体検出器にかえNaIシンチレ-タと光電子増倍管を組合わせたものを試作した。エネルギ-分解能は43.7%と悪いが,軽元素と重元素の識別には十分である。又時間応答に関しては、立上り時間0.5μsという高速性能が得られた。次に、電子検出器として位置有感検出器を用いる事にした。2枚のマルチ・チャネル・プレ-ト(MCP)で入射した電子を増副し,両面分布型半導体検出器(PSD)へ入射させる。この検出器により1mm当り16本の分解能を得,検出信号としては立上り0.5nsの高速応答性能が得られた。この2次元検出信号の処理に市販されている演算回路を用いると,毎秒1000カウント程度にしかならず使用できない事が判明した。このため演算回路を自作する事にし,動作試験には位置有感検出器としてマルチアノ-ド光電管を用いる事にした。現在回路の主要部である割算器の高速化を行っており50MHz動作を目ざしている。一方コインシデンス電子顕微鏡用に、放出電子のエネルギ-分散が少ない電子銃の試作も行った。まず既在の電子顕微鏡にLaB6電子源を取りつけ,これを熱電界放射型として用い輝度の測定等を行った。以上のように、本年度はコインシデンス顕微鏡の実現へむけての基本構成技術の開発を行った。本研究は,電子顕微鏡,JEM-120CXを改造し,これに大口径X線検知器をとりつけ、更に蛍光板の代りに二次元位置敏感検出器(PSD)を用いて、X線とX線励起透過電子とのコインシデンスをとることによって,透過型電子顕微鏡を用いて試料中の元素分布の二次マッピングを行おうとするものである。(1)大口径X線検知器として1インチ径のシンチレ-タを特注してJEM-120CXにとりつけ,パルス汲高分布より特性X線を検出するシステムを製作した。(2)高速に信号処理出来る

2次元検出器としてPSDを購入し,位置敏感型光電子増倍管(PSPM)を製作し,これに自作した高速信号処理回統システムを接続した。本システムの性能は、立ち上がり時間5.5(ns)伝達時間17(ns)伝達広がり1.0(ns)できわめて良好なPSPMとして動作することを確認した。(3)コインシデンス測定予備実験として,蛍光板に透過電子を照射して,蛍光の方はPSPMで検出し,蛍光板より出るX線の方は,レンテレ-タ(NaI)で検出して,両者のコインシデンスをとることにした。その結果、遅延時間約260Sのところで、明瞭なコインシデンスピ-クを確認することが出来た。今後の課題は,実際に膜原のわかった試料を入れて,試料からの特性X線を検出して、目的とする二次元マッピングを観測することである。このためには、若干X線の遮ヘイなどの装置の改造が必要となるものと思われるが、実現に向けての十分な成果を得ている。
細胞核内部アーキテクチャーの分子構築とクロマチン機能制御メカニズム

真核生物ゲノムの機能制御には、クロマチンと細胞核が中心的な役割を果たしている。本研究では、細胞核に局在するアクチンファミリーであるアクチン関連タンパク質(actin-related protein ; Arp)に主に焦点を当て、細胞核の内部構造の分子構築がどのようにクロマチンやゲノムの機能に関与しているかを明らかにすることを目的として研究を進めた。その結果、クロマチンや細胞核の構築において、Arpが様々な分子機構で関与することを明らかにすることができた。1、細胞核に局在するアクチン関連タンパク質(Arp)の解析ヒトの細胞核に局在するアクチン関連タンパク質のそれぞれについて、細胞核内での詳細な局在やダイナミクスを観察し、核内アーキテクチャー構築への関与を解析した。核内Arpについては、その細胞内局在を詳細に解析すると共に、クロマチン免疫沈降法でタンパク質間相互作用を検出した。その結果、Arp6.Arp8とNuMA (Nuclear Mitotic apparatus)との相互作用が検出され、核内Arpが遺伝子転写制御のみならず、細胞核の構築や染色体分配にも関与することが示唆された。また、Arp6がHP1(heterochromatin protein1)との相互作用を介して、転写抑制や染色体分配に関与することを示した。2、トポイソメラーゼIIの解析ラット小脳顆粒神経細胞の初代培養系を用いて,分化過程の細胞で起こる遺伝子発現変化に対するDNAトポイソメラーゼIIβ(トポIIβ)の影響を調べた.トポII阻害剤の非存在/存在下での5日間の培養期間中におけるmRNA発現量をマイクロアレイで網羅的に解析し,減少(<0.5),不変(0.5<,<2),増加(2<)を指標として10種類の遺伝子グループに分類した.このうち,発現が誘導され,トポII阻害剤で誘導が阻害される(即ちトポIIβに依存して発現誘導を受ける)遺伝子群(A1)は,誘導される遺伝子の約25%(全体の3%)を占めていた.A1遺伝子群にはイオンチャンネルや伝達物質のレセプターなど,神経活動に必須な遺伝子が有意に多く含まれていた(Gene Ontologyによる解析).一方,ラットゲノム上に同定したトポIIβの作用点288個は,AT含量が高く長い遺伝子間領域に有意に多く,トポIIβにより制御されるA1遺伝子群とは遠く離れた位置にマップされた。真核生物のゲノムDNAはクロマチンとして細胞核内に収納されて、細胞核とクロマチンの相互作用によってゲノム機能が制御されることが知られている。しかし、核構造を形成するアーキテクチャーの分子基盤はほとんど明らかにされていない。本研究では、アクチン関連タンパク質(actin-related protein ; Arp)とトポイソメラーゼに注目して、核構造の分子基盤を明らかにすることを目指している。本年度はヒト培養細胞のhArp5にFlagタグを付加して細胞内で発現させ、タグを利用したアフィニティー精製により、hArp5複合体を精製した。現在、その構成因子の同定を進めている。また、hArp5のRNA干渉法のノックダウンにより核構造の異常が現れることを明らかにした。さらに、出芽酵母のArp6について、クロマチン上への結合をChIP-Chip解析により検出した。トポイソメラーゼIIβが特定のゲノム領域に働き、一群の神経関連遺伝子の転写誘導を引き起こすことを前年度までに明らかにしてきた。一方、トポIIβを含む分子複合体が存在し、トポIIβのターゲティング機能を担うと思われるMAR結合タンパク質、SP120/SAF-A/hnRNP Uがその一員であることを見いだした。マイクロコッカル・ヌクレアーゼ処理で核から遊離するクロマチンをトポIIβ、あるいはSP120の抗体で免疫沈降すると、再現性よく特定のタンパク質とRNAを含む複合体が分離され、両者の複合体に共通するタンパク質が多く認められた。現在、これらのタンパク質をイムノブロッティングと質量分析で同定している。細胞核に局在するアクチン関連タンパク質の一つであるhArp5をRNA干渉法によってノックダウンしたところ、細胞核の形態に異常が観察されたことから、hArp5が細胞核構造の構築に関与することを示した。また、hArp6が、heterochromatin protein 1(HP1)と相互作用し、ヘテロクロマチンの形成に関与することを明らかにした。DNAトポイソメラーゼIIβ(トポIIβ)がMAR結合タンパク質SP120(SAF-A/hnRNP U)を含む巨大な分子複合体中に存在することを見いだした。核の可溶性画分をトポIIβ、あるいはSP120の抗体で免疫沈降(IP)すると、再現性よく多数のタンパク質とRNAを含む複合体が分離された。両複合体タンパク質をイムノブロットと質量分析で解析し、同定された70種余りのタンパク質のうち、約6割が共通していること、それぞれの複合体にトポIIβとSP120が共に含まれることを確認した。さらに、複合体に含まれるRNAは複合体の構造維持に必須であることを示した。トポIIに特異的な阻害剤

etoposideでDNAとトポIIβを架橋させてから、トポIIβ抗体でIPすることにより、この酵素が実際にin vivoで作用したDNA部位を同定する方法(eTIP)を確立した。eTIPによれば、トポIIβが切断・再結合するDNA鎖(G-segment)のみならず、断端の間を通過するだけのDNA鎖(T-segment)を捕捉し、両者を区別できる。eTIPで回収されるDNAをショットガンクローニングとタイリングアレイを用いて解析した結果、トポIIβの作用点はゲノムの局所的GC含量と強い相関をもつことが明らかになった。現在までの成果から、トポイソメラーゼIIβが特定のゲノム領域に働き、一群の神経関連遺伝子の転写誘導を引き起こすというメカニズムが明らかになりつつある。細胞核内の機能ドメイン構築の分子基盤解明を目的として、ヒトおよひ出芽酵母の細胞核に局在するアクチン関連タンパク質に対してポリクローナル抗体を作成した。これまでに、ヒトではhArp5, hArp6, hArp8、出芽酵母ではArp4, Arp5, Arp6, Arp8に対するポリクローナル抗体を得た。また、ニワトリDT40細胞を用いて、Arp6遺伝子を破壊したgArp6 KO細胞を作成した。この細胞を用いて、間期核内における染色体配置を観察したところ、正常細胞においてはmacrochromosomeが核の周辺部に、microchromosomeが核中心部に存在するのに対し、KO細胞ではこの配置がランダムになることが示された。DNAトポイソメラーゼ2β(トポ2β)が実際にin vivoで作用しているDNA部位を同定する方法(eTIP)により、局所的にGC含量が異なる2種類の作用点(トポサイトc1とc2)が存在することを明らかにした。トポ2βが転写を誘導する遺伝子群(A1遺伝子)の一部は、ATに富む長い遺伝子間領域(LAIR)に隣接しているが、このようなA1遺伝子の内部と、隣接するLAIRの内部にはトポサイトc2が多く、LAIRが隣接する遺伝子に対して及ぼしている抑制的な位置効果を、トポ2βが解除することにより、転写が誘導されるという機構が考えられた。さらに、このような遺伝子(LA遺伝子)は共通した機能をもつ遺伝子群であり、対立遺伝子の片方しか発現しないようなものが多いことから、トポ2βは何らかのepigeneticな発現調節にも関わっていることが示された。真核細胞の核内では、ゲノムはヒストンタンパク質などと共にクロマチンを形成して収納されている。このクロマチンは細胞核内のアーキテクチャーと相互作用することにより、階層的な高次構造を形成しており、この高次構造がゲノム機能の制御に重要な役割を果たしている。さらに、多様なクロマチン機能ドメインが細胞核内の特定の領域に配置されており、このような細胞核内でのクロマチンの空間配置がゲノム機能の制御に重要であることが示唆されている。しかし、この核内アーキテクチャーの分子基盤はほとんど明らかにされていない。
胃癌腹膜播種に対するシスプラチン担持ヒアルロン酸ゲルによる腹腔内化学療法の開発

シスプラチンをヒアルロン酸ハイドロゲルに内包することで腹腔内停留性を増加させ、腹腔内投与に適した新たな生体材料を作成することを目標とした。二種のヒアルロン酸ポリマーを混合させることによりシスプラチンは分解するゲルより5日間以上かけて放出されることが示された。ヒト胃癌細胞を用いたマウス腹膜播種モデルにて、シスプラチン1mg/kgを担持させたヒアルロン酸ハイドロゲル投与群において、腹膜播種結節の合計重量の減少が認められたが、同濃度のシスプラチン単体投与では有意な抗腫瘍効果は認められなかった。ヒアルロン酸ハイドロゲルは水溶性抗癌剤の腹腔内投与に適した新たなドラッグデリバリーシステムとして有用である。我々がヒト胃癌細胞株から樹立した腹膜播種を高頻度に起こす細胞株MKN45Pを用いて、in vitroの基礎的研究を行った。ヒアルロン酸ゲルポリマー単体では、1mg/mlの濃度にて培養液に添加させても細胞毒性は認められなかった。この濃度のポリマーにシスプラチンを担持させ、培養液に添加させたところシスプラチン濃度0.001mg/mlにて細胞増殖抑制効果がみられた。続いてヒアルロン酸ゲルポリマーのswelling kineticsの解析を行った。ヒアルロン酸分解酵素の存在しない状況では、4日間以上、分解されなかったが、ヒアルロン酸分解酵素の存在下では速やかに分解された。ポリマー濃度10mg/mlのほうが20mg/mlに比較し速やかに分解された。MKN45を腹腔内注射することにより腹膜播種モデルを作成し、次年度の抗腫瘍効果を確認する実験に用いることとした。シスプラチンの腫瘍結節内部の浸透性を確認する実験は、シスプラチンに蛍光標識を付加することが困難であったため今年度は行わなかった。腹膜播種病変に対する抗癌剤の腹腔内投与は、静脈投与に比べて効果を有するが示されてきた。しかしながら水溶性低分子抗癌剤であるシスプラチンは、腹腔内に投与しても腹腔内滞留時間が短いため、腹腔内投与薬剤としては適さないことが知られてきた。本研究では、シスプラチンをin situ架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルに内包することにより腹腔内投与に適した新たな生体材料を作成することを目標とした。二種のヒアルロン酸ポリマーを混合し、架橋ゲル化に要する時間は、ポリマー濃度により異なることが示されたが、担持させるシスプラチン濃度には関係しなかった。放出動態実験ではシスプラチンは分解するゲルより5日間以上かけ放出されることが示された。細胞増殖実験では、架橋ヒアルロン酸ハイドロゲルは、ヒト胃癌細胞株であるMKN45Pに対し、1 mg/mlという高濃度において細胞毒性を示した。続いてシスプラチン(0.01または0.1 mg/ml)を1 mg/mlの濃度のポリマーに加えたところ、シスプラチン単体を加えたときとほぼ同様の細胞毒性を示した。ヒト胃癌細胞を用いたマウス腹膜播種モデルにおいて、In situシスプラチン担持ヒアルロン酸ハイドロゲルの抗腫瘍効果を検討した。腹腔内では、架橋によるヒアルロン酸のゲル化が認められた。シスプラチン1 mg/kgを担持させたヒアルロン酸ハイドロゲル投与群において腹膜播種結節の合計重量の減少が認められたが、同濃度のシスプラチン単体投与では有意な抗腫瘍効果は認められなかった。In situシスプラチン担持ヒアルロン酸ハイドロゲルは、腹膜播種に対する腹腔内投与において、長期間の腹腔内停留性と持続的なシスプラチン放出能力を有し、抗癌剤のドラッグデリバリーにおいて極めて有用な新たな生体材料として期待される。平成23年度の研究計画に沿い、まずヒドラジドヒアルロン酸(A液)とアルデヒド化ヒアルロン酸(B液)のポリマー濃度を変化させ、腹腔内投与に最適なそれぞれの濃度を決定した。具体的にはゲル化時間を決定する因子を定量的に調べ、ゲル化時間の最適化をおこなった。300 rpmで回転している9 mm攪拌子の中心部に200 μLのHA-CHOをマイクロピペッターを用いて加え、その後同じポリマー濃度、シスプラチン(CDDP)濃度のHA-ADHを200 μL滴下し、ゲル化がおきるまでの時間を観測した。ポリマー濃度0.5%、1.0%、1.5%、2.0%のゲル化時間はそれぞれ100秒、40秒、24秒、18秒であった。これは高濃度の場合の方が架橋点の数が多く、加えてポリマー濃度が高いために相対的な架橋密度が低くくても、ゲル化しやすいためである。2.01.0 %では濃度を薄くしてもゲル化時間は急激に変化はしなかった。

これはHA-ADHとHA-CHOの混合が律速になっており、ゲル架橋反応は瞬時に起こっているからだと考えられた。ゲルの粘度は濃度を下げると徐々に低下して行き、0.5%では形を保たないほど粘度が低かった。以上の結果からゲル化時間が最も速いポリマー濃度2%と決定した。続いてCDDP担持ヒアルロン酸ハイドロゲルをマウスの腹腔内に投与し、28日後に残留ゲルを摘出、ヒアルロン酸分解酵素を加えゲルを完全に分解し、原子吸光法によりシスプラチン濃度を測定した。CDDP 0.1 mg/mL投与群では3.9 μg、CDDP 0.02 mg/mL投与群では0.7 μgであった。1回の注入で100 μgのCDDPが担持されているので3.86 %が残っている結果となった。これは以前に行ったin vitroの結果とほぼ一致しCDDPがHA-ADHと配位子形成をしたことと矛盾しない。In vitroの実験において、細胞増殖抑制効果が確認されたこと、またハイドロゲルの動的解析がなされたことで、次年度のin vivoのシスプラチン担持ヒアルロン酸ゲルポリマーの抗腫瘍効果を実際の生体において評価する研究につなげることができた。シスプラチンの腫瘍結節内部の浸透性を確認する実験については、シスプラチンを蛍光標識することが困難であったため試行できなかったが、腫瘍結節内部のシスプラチン濃度を測定するなど、他の方法で検討することを予定している。ほぼ実験計画目標はおおむね達成されているといえる。ヒドラジドヒアルロン酸とアルデヒド化ヒアルロン酸のポリマー濃度は2%が最も速やかにゲル化すること、またこれにシスプラチンを加え腹腔内に残留したゲル中のシスプラチンを測定したところ、3.86%が担持されていることが判明した。これら結果は、我々が当初予想していたとおり、ハイドロゲル中にシスプラチンを担持させ、腹腔内に投与することにより、単独では短時間で腹膜中皮から吸収されてしまう水溶性抗癌剤であるシスプラチンが長時間腹腔内に停留していることが証明された。シスプラチン担持腹腔内投与後の腹腔内ゲル・液体中のシスプラチン濃度は測定したが、ラットを使用しての腹腔内投与後の血清中濃度測定については現在実験を進めているところである。これ以外の実験計画目標はほぼ達成された。ヒアルロン酸ゲルよりシスプラチンを腹腔内に長期間徐放させることによる腹膜播種治療効果を検討する。MKN45とヌードマウスを用いた腹膜播種モデルにおいて,胃癌細胞を腹腔内に接種後,7日目,14日目,21日目にシスプラチンを担持させたヒアルロン酸in situ架橋ハイドロゲルを腹腔内に投与し,28日目に犠牲死させ,生じた腹膜播種結節の数と重量を測定し,腹膜播種に対する抑制効果を検討する.また,28日目に犠牲死させずに癌死するまで観察する各群を設け,シスプラチン担持ヒアルロン酸ゲルの生存期間に与える影響について検討する.昨年度からの研究を継続する形で、ラットを使用してのシスプラチン担持腹腔内投与後の血清中シスプラチン濃度測定を行う。これに引き続き、シスプラチン担持ヒアルロン酸ゲル腹腔内投与後のシスプラチンの播種病巣内部への経時的浸透性を検討する。具体的には、ヌードマウスを用い,我々がヒト胃癌細胞株から樹立した腹膜播種を高頻度に起こす細胞株MKN45Pを腹腔内注射することにより腹膜播種モデルを作成する.28日目に犠牲死させ,腸間膜に生じた腹膜播種結節を確認するが,その3時間前,12時間前,24時間前に蛍光標識したシスプラチンを担持させたヒアルロン酸ハイドロゲルを投与しておく.
酵素-基質複合体誘導によるSer/Thrホスファターゼ基質同定法の開発

タンパク質のリン酸化は、キナーゼとホスファターゼにより厳密に制御されており、これらの制御破綻はがんを含む様々な疾患を引き起こすことが知られている。タンパク質のリン酸化制御に重要なSer/Thrホスファターゼの基質を同定することは、細胞内シグナル伝達を解明するうえで極めて重要であるが、これまで有用な手法は確立されていない。本研究では、Ser/Thrホスファターゼの触媒機構、ならびにリン酸化ミミック分子に着目し、Ser/Thrホスファターゼに対する2つの新規基質同定法の開発を行った。これらの手法は、他のSer/thrホスファターゼにも展開可能であり、幅広い応用が期待される。平成27年度はリン酸化ミミックAlF4-を用いたSer/Thrホスファターゼの基質トラップ法の有用性確認を実施した。まず、Ser/ThrホスファターゼとしてPPMタイプのPPM1D430、ならびにSCP/FCPタイプのヒト由来SCP1およびFCP1について、大腸菌発現システムを用いて発現・精製を行った。pNPPならびにリン酸化ペプチドを用いた速度論的解析を実施し、発現したすべての組み換えタンパク質がホスファターゼ活性を有することを確認した。次に、AlF4-イオンによるホスファターゼ阻害活性を確認したところ、SCP1, FCP1はAlF4-添加により顕著に活性が阻害され、PPM1D430においても弱い阻害活性が認められた。これらのことから、AlF4-がリン酸化ミミック分子として組み換えタンパク質にトラップされることが示唆された。立体制約型ファージライブラリーの構築は、フィブロネクチン由来構造を導入したファージミドベクターを構築し、現在クローニング中である。そこで、最初に基質同定のためのスクリーニングの系を確立するため、7残基提示の立体制約型ファージライブラリーを用いてFCP1ホスファターゼに対する基質モチーフ探索実験を実施した。AlF4-存在下、FCP1結合ファージをスクリーニングし218個の塩基配列を解析したところ、9種類の集積した配列を同定した。、これらの配列の中には機知のFCP1基質配列であるPolII CTDドメイン類似配列を含んでおり、本手法がSer/Thrホスファターゼ基質同定法として有用であることが強く示唆された。また、Ser/Thrホスファターゼの基質トラップ型変異体についてはPPM1D430を用いて作製し、これまでに高純度で発現精製することを確認した。当初計画であるin vitroホスファターゼ基質トラップスクリーニング法の有用性を確認できた。また、立体制約性ライブライブラリーの構築、ならびに基質トラップ型変異体の作成も当初計画に従った展開をしている。また、学会での成果発表等も実施している。平成28年度はリン酸化ミミックAlF4-を用いたSer/Thrホスファターゼの基質トラップ法の最適化と結合モチーフの同定を行った。昨年度までにAlF4-イオンによる明確な酵素活性阻害が確認されていたSCP1を用いて7残基提示の立体制約型ファージライブラリーから基質モチーフの探索を実施したところ、配列の集積が見られた2種類の結合モチーフを同定した。得られた結合モチーフはSCP1の既知基質と高い相同性を有していたことから、Ser/Thrホスファターゼ基質同定法として有用であることが強く示唆された。本研究成果については現在論文投稿中である。立体制約型ファージライブラリー確立するため、既知のSer/Thrホスファターゼ結合ペプチドを提示した抗体類似低分子組み換えタンパク質を発現・精製し、実際に標的タンパク質と結合することを確認し、本構造が立体制約型ライブラリーの母体構造として有用であることを確認した。次に本母体構造を有するファージミドライブラリーを作製し、M13ヘルパーファージと大腸菌に共感染することによりファージライブラリーを構築した。現在作製したファージライブラリーを用いて、Ser/Thrホスファターゼ基質モチーフの探索を実施している。Ser/Thrホスファターゼの基質トラップ型変異体については、合成リン酸化ペプチドを用いた酵素活性測定により、リン酸化基質に対する脱リン酸化活性が失われていることを確認した。ビオチン化したリン酸化ペプチドに対する結合試験により、野生型に比べて基質トラップ変異体に高い結合能が観察されたことから、本変異体が基質トラップ変異体として機能することが示唆された。立体制約性ライブライブラリーの有用性、ならびにファージライブラリーの構築することに成功している。また、リン酸化ミミック分子を用いたSer/Thrホスファターゼ基質同定法については、SCP1に対する複数の結合モチーフ同定している。基質トラップ型変異体については、合成ペプチドを用いた結合試験まで終了しており、現在動物細胞を用いた未知の標的タンパク質の探索を実施している。平成29年度はリン酸化ミミックAlF4-を用いたSer/Thrホスファターゼの基質トラップ法により得られたペプチドに対して,リン酸化ペプチドを合成し,脱リン酸化活性を評価することにより本手法の有用性を確認した.

SCP1ホスファターゼに対して,AlF4-存在下で最も高頻度で検出されるとともに,AlF4-依存的に結合することが確認できているM12-1ペプチドを用いた解析により,本ペプチドがSCP1により有意に脱リン酸化されること,またその脱リン酸化能は脱リン酸化部位周辺のアミノ酸配列により影響を受けることが明らかとなった.このことから,AlF4-を用いた本手法は,新規Ser/Thrホスファターゼの基質トラップ法として有用であることが示された.また,配列データベースを用いてM12-1ペプチドのホモロジー検索を実施したところ,M12-1は筋骨格系の疾患であるリッチャー-シンゼル症候群に関与するWASH complex subunit 5 (別名ストルペリン)と高い相同性を示すことから,SCP1が筋骨格疾患の制御に関与することが示唆された。また,PPM1D430を用いたSer/Thrホスファターゼの基質トラップ型変異体については,昨年度までにビオチン化した既知基質由来のリン酸化ペプチドに対する結合試験により,野生型に比べて基質トラップ変異体に高い結合能を持つことを確認していた.そこで,本年度は,既知基質由来タンパク質を細胞内で発現させ,基質トラップ変異体を用いて細胞内における結合能の解析を実施した.その結果,既知基質タンパク質は基質トラップ変異体に特異的な結合が検出されたことから,本変異体が,Ser/Thrホスファターゼに対する基質トラップ変異体として機能することが明らかとなった.これらの研究成果より,基質,ならびに酵素側の両方向からのアプローチによるSer/Thrホスファターゼ新規基質同定法の有用性が確認された.作製した独自の立体制約型ファージライブラリーを用いて、より結合力の強いSer/Thrホスファターゼ基質候補ペプチドを同定する。同定したペプチド配列含有タンパク質をタンパク質データベースより探索し、実際に生体内標的分子として機能するかどうか検証する。また、得られた結合配列をもとに、Ser/Thrホスファターゼ阻害剤への展開を行う。また、基質トラップ型変異体を用いた、細胞内基質の同定を行う。基質トラップ型変異体を用いて、細胞内基質の同定を行う。また、作製した独自の立体制約型ファージライブラリーを用いて、Ser/Thrホスファターゼ基質候補ペプチドを同定する。これらによりSer/Thrホスファターゼを介した発がんメカニズムの解明を行う。生体関連化学、酵素化学研究で使用するマイクロプレートリーダーが当初計画予算より低価格で購入できたため、また、研究の進行が概ね順調であったため、経費節減により次年度使用額が生じた。
新紫外波長可変レーザー結晶を用いた高エネルギー出力の抽出への試み

本年度は下記のように研究を行った。1.昨年度、Ce^<3+>イオンをドープしたLiCAF等の各種レーザー結晶の各種特性(蛍光寿命、誘導放出散乱断面積)を評価した。結晶は、東北大学金属材料研究所の福田教授とロシア共和国カザン大学のダビンスキイ博士が育成にあたり、新しく作製された大型結晶を簡便なレーザー共振器を構成し、高エネルギー抽出の実験を行った。2.本年度は、その情報をもとにパルス幅100ピコ秒程度の再生増幅YAGレーザーシステムの第4高波長を励起源としたCe^<3+>ドープ結晶を用いてQ値の低い短発振器(パルス注入発振器)を設計した。励起密度を最適化することによりできるだけパルス幅の短い単一パルスを発生させた。(1ピコ秒、10μJ)。この様にして開発された発振器をチャープパルス発振/増幅器システムに組み込んだ。3.チタンサファイアで申請者らが開発した共焦点多重光路増幅の工学系設計を工夫して新紫外レーザーに適用して、チャープパルス増幅取り出しエネルギーの増加を計り、超短パルス増幅と高エネルギー抽出を同時に実現した。本研究では、新紫外レーザー媒質を用いた全固体波長可変レーザーシステムからの超短パルスの直接発生と大出力化を目的とする。特に、共同研究者である東北大学福田教授とロシア共和国ダビンスキイ教授が最近育成した世界最大級の紫外固体レーザー媒質を用いて、レーザーシステムの再デザインを行ない、パルスエネルギーの大出力化を試みる具体的には、先に自己注入同期による疑似モード同期法で実証したQ値の低い短発振器(パルス注入発振器)を、大型Ce:LiCAF結晶等に適応し、さらに短パルス励起を組み合わせることにより1ピコ秒台の短パルスを発生し、加えて共焦点多重光路増幅光学系の構築によりサブTWレベルの増幅を実現する。紫外領域の波長可変固体レーザーの広い利得帯域は、赤外領域のチタンサファイアレーザーと同様に、超短光パルスの増幅・発生への応用が期待される。しかし、新紫外レーザー媒質においては、結晶成長技術が工学的に未成熟なため高品位な結晶の安定供給は難しく、偶然にできた良質な結晶を頼りに実験を行われてきた。そのため、基礎レーザー特性の評価以外はあまり進歩がなかった。事実、新紫外波長可変レーザー結晶による超短パルス光源の研究は、申請者ら(レーザーデバイス研究担当)とダビンスキ教授ら(結晶育成担当)の共同研究グループからのみ研究発表が行われているが現状である。しかるに本研究に対する期待は世界的に大きく、新レーザー媒質の超短パルスレーザー応用を左右する研究と位置づけられる。さらに、この様な基礎研究レベルでの新紫外レーザー結晶の応用上の有用性が確認されれば、結晶育成の問題解決の研究の大きな動機づけを行える。
多次元拡散過程及び関連分野の研究

1.研究目的:一次元拡散過程は、W.Feller,E.B.Dynkin,H.P.McKeanJR.,伊藤清等によって解析的にも確率論的にも完全に解明されている。しかしながら、多次元拡散過程は、解析学における偏微分方程式論、関数解析学、複素解析学、確率論と密接に関連する重要な研究課題であるにも拘わらず、一次元の場合と比べると完全な解明からは未だ遠い状態にある。本研究の目的は、多次元拡散過程を解析学の立場から総合的に研究することである。2.研究実績:研究代表者及び分担者は、多次元拡散過程の境界問題を、最新の偏微分方程式的手法及び関数解析的手法を用いて研究するアプロ-チを発展させることにより、楕円型とは限らない一般の境界条件の場合を詳しく考察することができた。さらに、この研究を通じて、偏微分方程式論における各種の十分条件を、「拡散粒子の運動」という具体的なイメ-ジを通じて、直観的に解釈することを試みた。解析学の偏微分方程式論、関数解析学、確率論の三分野の接点に光を当てる、この研究結果は、「Boundary Value Problems and Markov Processes」(境界値問題とマルコフ過程)、「On the Existence of Feller Semigroups with Boundary Conditions」(境界条件付きのフェラ-半群について)と題してそれぞれ講義録及び特集論文として、シュブリンガ-社(ドイツ)、アメリカ数学会から出版された。これは、この方面で現在最も進んだ研究結果として、欧米を中心に高く評価されたことの証左であり、本研究の目的は十分に達成することができたといえる。一次元拡散過程の研究の例を見るまでもなく、多次元拡散過程及び関連する諸問題を多分野から総合的に研究して行くことは、今後の解析学の発展にとって益々重要になるものと思われる。
自閉症スペクトラム障害の≪機能的連関≫障害仮説に関する発達脳科学的研究

本研究では、脳波データによる機能的連関評価を応用したASD超早期診断技術開発の基盤となる知見を確立するため、主として1乳児の機能的連関評価に適した脳波計測パラダイムの確立に関する予備的検討、2ASD超早期スクリーニングの精度向上に併用可能な生物学的因子の探索的検討に取り組んだ。研究の結果、乳児の視覚的注意を引きやすい幾何学図形アニメーション観察中の背景脳波データ計測により、機能的連関評価に十分な長さの脳波データを安定して計測可能なことが示された。また、神経伝達に関連する遺伝子多型が、発達早期の社会的コミュニケーション能力と関連している可能性を見出した。近年の研究により、高次脳機能の発現においては、単一の脳機能部位の働きではなく、脳機能部位間の機能的な結びつきの強さ=≪機能的連関≫が重要であることが明らかにされつつある( Stramaglia et al, 2011)。自閉症スペクトラム障害(ASD)患者において異常が認められる機能の多くは、脳機能部位間の≪機能的連関≫により実現されることが明らかになっている。したがって、≪機能的連関≫障害がASDの本質的病因である可能性がある(≪機能的連関≫障害仮説)本研究は、ASD患者およびASDハイリスク乳児を対象に脳波計測を行い、脳波データを基に評価した≪機能的連関≫の強さとASD症状の関連解明を主たる目的としている。本研究課題期間中に、機能的連関評価系を立ち上げたほか、乳児の脳波データの縦断的収集を開始した。具体的には、情動的にneutralと考えられるアニメーション観察時の背景脳波(EEG)を計測し、脳波センサー間で記録されたEEGの各周波数における機能的連関の分析系を確立した。さらに、乳児期にみられるASD症状に関連する神経基盤を検証するため、神経伝達物質関連遺伝子多型とASD様行動傾向の関連性に関する予備的検証を行った。具体的には、性腺ホルモンの生体内生物活性発現に関与する児の遺伝子多型と視覚的な社会的コミュニケーション刺激に対する注視反応との関連性を分析した。しかし、解析した一塩基多型と注視反応との間に関連性は見出されなかった。以上、本研究では、ASDの客観的早期診断指標を確立するため、縦断的研究による機能的連関評価系確立に取り組んだ。最終年度に開始した縦断的追跡は、現在データを集積中である。今後は、このデータセットをもとに、EEG解析によるASD早期スクリーニング技術開発の可否を検討する。近年の研究により、高次脳機能の発現においては、単一の脳機能部位の働きではなく、脳機能部位間の機能的な結びつきの強さ=≪機能的連関≫が重要であることが明らかにされつつある。平成24年度は、健常者を対象に長崎大学医学部に設置された高密度脳波計を用いて、Go/NoGo課題(Beste et al, 2011)および視聴覚情報統合課題を遂行中の脳機能活動を計測した。さらに、脳波解析ソフトウェアであるFieldTrip, sLORETA, EEGLabを連動させた機能的連関評価系を立ち上げたほか、乳児の脳波データ収集用の実験設備をセットアップした。乳児研究に関しては、新たに、生物学的運動と呼ばれる特殊な運動刺激認知が、乳児期の自閉症罹患リスクの行動学的マーカーとなる可能性を見出した。そこで、乳児を対象とした脳機能計測では、当初計画に加え、生物学的運動認知時の脳機能的連関評価を実施することとし、生物学的運動認知時の脳機能活動計測用刺激を作成した。平成24年度は、脳波データ計測・解析系の立ち上げと、健常被験者を対象としたデータ収集を完了した。現在は、成人ASD患者のリクルートと、乳児被験者の脳波データ収集を行っている。研究対象者確保はスムーズに進んでいることから、研究は概ね順調に進展しており、研究期間内での目的達成は十分可能であると見込まれる。平成25年度以降は、成人ASD患者のデータ収集、及び、健常群・疾患群の機能的連関の群間比較を行い、機能的連関障害仮説を検証する。また、健常乳児のデータ収集と並行し、ASDハイリスク乳児のリクルート・データ収集を実施する予定である。平成24年度までに、本研究計画の実施に必要な研究設備・ソフトウェアは導入済みである。
次世代水電解型水素製造プロセス実現のための耐熱耐圧耐食性電気化学マイクロセル開発

本研究では、高温高圧場でのアルカリ水電解による次世代型水素製造プロセス開発のための基盤研究を実施する。水電解は高温、高圧、高アルカリ濃度ほど性能が向上するため、有効な水素製造法の一つと考えられている。一方、装置、電極、セパレーターの腐食や耐久性の問題から、安全面やコスト面を含めて装置作製上の課題が多く、実用化には至っていない。なお、商用での最高温度は90°C程度である。本研究では、次世代型水素製造プロセス実現のために耐熱、耐圧、耐食性に優れたマイクロ電極を含む新規な構造の電気化学マイクロセルを提案、開発するとともに、常温から400°C、常圧から50MPaにおけるアルカリ水電解を実施し、プロセス化に不可欠な電流電圧曲線や水素生成速度といった基盤データを蓄積し、提案するプロセスの有用性を例証することを目的としている。今年度は、白金線を用いたマイクロ電極を備え、耐熱、耐圧、耐食性に優れた接液部をチタンとする電気化学マイクロセルを作製して、流通式電解装置を組み上げるとともに、高圧下でポンプを用いて1系統で供給した水溶液をセル内で2系統に均等分配するための流量制御システムを構築した。実際にNaOH水溶液を流通させ、圧力24MPa、温度23°Cから400°C、電圧15Vの条件で電解実験を実施し、電流密度の温度や電圧依存性等のデータを蓄積するとともに、装置改良のための課題を抽出した。また、水素や酸素濃度をインラインで分析するためのシステム開発もほぼ完成した。電極の作製方法、高圧下での流量制御方法をほぼ確立し、実際に、マイクロ電極を備えた電解装置を作製し、高温高圧下での電解実験を実施することができた。圧力、電圧、NaOH濃度、流量を大幅に変化させた際の、電流密度や水素・酸素生成量のデータを蓄積しつつ、高温高圧場での電解特性を見極る。一方で、より、過酷条件での検討が増えるため、適宜、装置(特にマイクロ電極や電気化学マイクロセル)や流量制御方法の改良を実施する。今年度は、ナノ粒子充填構造を利用したマイクロ電極の作製方法について、粒径や種類の異なるナノ粒子を用いて最適な電極への粒子塗布・固定化方法について検討した。また、併せて、耐圧性、耐熱性、耐食性、絶縁性をより確実に維持できる電極作成方法についても検討した。その結果、耐食絶縁材であるアルミナやチタニア等のセラミックスを金属の機械加工と同程度の寸法公差(±0.03mm)で微細加工できることが分かった。実際に耐食絶縁部を作製し、シール性、絶縁性等の性能を確認した。また、電流-電圧データを計測する電気化学測定装置を導入し、基本となる計測システムを構築した。さらに、発生水素をオンラインで分析するためのガスクロマトグラフィーシステムの開発を開始した。耐圧性、耐熱性、耐食性、絶縁性を確実に維持できる電極作成のための耐食絶縁部の作製方法に関する指針を整理できた。また、高温高圧アルカリ水電解場で、電気化学測定装置を用いて電流-電圧データを計測する基本システムを予定通り構築できた。

電極の作製方法、高圧下での流量制御方法をほぼ確立し、実際に、マイクロ電極を備えた電解装置を作製し、高温高圧下での電解実験を実施することができた。研究分担者を1名加えて、以下の研究を推進する。【マイクロ電極の作製方法の確立】セラミックスの微細加工により作製した耐食絶縁部を用いて、耐熱性、耐圧性、耐食性、絶縁性を確保したマイクロ電極の作製方法を確立する。特に、耐食絶縁部ー電極細線間、耐食絶縁部-耐圧耐熱配管間のシールや設置・固定方法を重点的に検討する。また、必要に応じて、耐食絶縁部の構造を最適化する。【高温高圧溶液供給および圧力制御システムの開発】水電解特性の圧力依存性を正確に把握するために、100MPa程度までの高圧条件での電解を想定し、高圧ポンプを購入するとともに圧力制御システムを構築する。また、本研究では、1系統で供給した溶液をセル内で均等分配する必要があるため、その流量制御システムも構築する。【装置作製と水電解実験】開発する溶液供給部および圧力制御部に加え、溶液加熱部、溶液冷却部、温度・圧力の測定・制御部、電気化学測定部を含む電解装置を作製する。実際に電気化学セルを試作して組込み、高温高圧下でアルカリ水溶液の流通・電解試験を実施する。温度や電圧を操作因子として電流を測定するともに生成水素と酸素を分離し、定量するための一連のシステムを完成させる。また、電解現象の把握に重要となる電極間距離を精密に制御する方法についても検討する。圧力、電圧、NaOH濃度、流量を大幅に変化させた際の、電流密度や水素・酸素生成量のデータを蓄積しつつ、高温高圧場での電解特性を見極る。一方で、より、過酷条件での検討が増えるため、適宜、装置(特にマイクロ電極や電気化学マイクロセル)や流量制御方法の改良を実施する。