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ポスト・ローマ期西ヨーロッパにおける行政・管理文書の総合的研究

貴族の文字文化の審美的探究が、実は最も日常的で、凡庸な記録形態である行政実務文書が日々生産される現実を下支えしていたとするその所説は、ランゴバルド王国だけでなく文字文化一般の理解にとっても、非常に示唆的である。西ゴート国家は、行政文書を一点も残していない。この事実は長く西ゴート国家が行政文書を作成する伝統を持たなかったのがその理由と考えられたが、1967年にマドリッド国立文書館で偶然西ゴート国王文書の断片と思しき数点の羊皮紙が発見された。僅かの断片的記録しか伝来していない理由として、人為的かつ体系的破壊が想定されている。西ゴート国家に独自な文書形態として、地中から出土する粘板岩に刻まれたいわゆるスレート文書がある。これは西ゴート国家における公文書の存在形態と、密接な関係が考えられる。重要なのは西ゴート国家においても統治実践面で、文字記録が用いられていたことが確実と思われる。アングロ・サクソン七王国の一つであるマーシア国家で作成された「トライバル・ハイデジ(TH)」は、国家的賦課をになう地域とその負担量を一覧にした記録である。現存の三写本は全て後代の写しであり、原本は存在していない。またこの種の記録は孤立したものではあり得ないが、周辺的文書は一切現存していない。THがその最終帰結であるところの、個別税査定に始まる一連の文書作成プロセスをが解明するのが今後の課題である。現時点ではこの文書に内在する情報の性格に依りながら、論理的想定として、この時代のイングランドに紛れもなく実務的文字記録作成の慣行が実在した事実を確認することで満足しなければならない。平成13年度は約半年にわたって招聘教授としてフランスに招かれ、エクサン・プロヴァンス大学、パリ社会科学高等研究院、ソルボンヌ高等研究院、コレージュ・ド・フランスなどの高等研究機関において、ポスト・ローマ期の制度や行政機構、行政文書について一連の講義や講演を行い、また史料調査・研究ばかりでなくフランス、ドイツ、イタリア、イギリスの専門家たちと研究課題についての意見交換をする絶好の機会に恵まれた。具体的には、現在11世紀前半の写本の形で伝来している「部族別賦課簿(the Tribal Hidage)」と称される行政文書について、アングロ・サクソン期古書体学の第一人者サイモン・ケインズ教授(ケンブリッジ)と数日間にわたって意見交換をすることができた。私が知る限り、この史料を用いての研究は歴史地理学的なそれ以外には見当たらず、このテクストがいかなる制度的、社会的背景のもとに作製され、何を目的としたのかなどの根本的な問題は、全く手付かずに残されており、大いに研究の余地があることが確認された。今年度の後半は、イサベル・ヴェラスケス・ソリアーノによって一昨年写真版と読解が刊行された、6、7世紀スペイン・西ゴート王国のスレート板(石版)文書の基礎的調査を行った。これはスペイン中部のサラマンカやアヴィラ地方で出土し、現在総数で153点知られている。内容は判決文、売買文書、土地交換文書、租税徴収文書などである。石版という独特な支持素材を用いており、この点で支配・統治のための文字記録の使用の新しい認識をもたらす可能性を秘めた史料であることは明らかで、それだけに今後の研究の進展は国際レベルで学界に新知見をもたらすと思われる。平成14年度は、2000年にそのテクストが刊行された西ゴート王国の「スレート(石板)文書」を検討する作業を軸に研究を遂行した。現在までスペイン・西ゴート王国の版図内では全部で153点の同種の文書が発見され、数次にわたるテクスト公刊が行なわれたが、叢書
節足動物の卵巣形態および卵形成様式の多様性と進化に関する研究

節足動物の卵巣構造と卵形成様式の多様性を把握するために、特にこれまでこれらの形質についての情報が欠落している群を中心に、比較形態学的観察を行った。鋏角類では、ヤイトムシ目で初めて詳細な組織学的観察を行うと共に(Miyazaki et al.,'01)、メクラツチカニムシの卵形成段階の観察から、生活史に関する新たな知見を得た(加藤・塘,印刷中)。ウミグモ類では、生殖器官系と循環器官系の位置関係が、他の節足動物には見られないユニークなものである事を確認すると共に(Miyazaki & Pass, in press)、スイクチウミグモの生殖孔に関する記載の誤りを明らかにした(Miyazaki, in press)。昆虫類では、カカトアルキ目の卵膜の微細構造を観察し、昆虫類全体でもユニークな形質を記載した(Tsutsumi et al., in press)。また卵生と卵胎生のコカゲロウ類を比較し、両者に共通した後胚発生様式と、生殖様式の違いを反映したと考えられるいくつかの卵形成様式の相違点を明らかにした(高橋・塘,'01;Takahashi & Tsutsumi,'02;影山・塘,印刷中)。多足類では、ヤスデ類で網羅的な観察を行い、各上位分類群毎の卵巣の基本形態を把握し、その進化傾向を推定した。甲殻類では、大顎類なのに鋏角類と類似した卵巣を持つ介形類の主要群について観察を行い、鋏角類型の卵巣が収斂的に進化してきた事を明らかにし、新たに鋏角類型と大顎類型の中間タイプの卵巣を記載した(Ikuta & Makioka,'04)。またザリガニ類の卵巣の概形と形成細胞層を観察し、卵巣構造の進化様式を推定した。更にカブトエビ類の生殖巣の後胚発生と(Mitsumoto & Makioka,'02,'03)、ヤドリムシ類の生殖巣の構造を記載した(松澤・八畑,'03)。鋏角類に関しては、これまで卵巣構造や卵形成様式について十分な知見が得られていなかった蛛形綱ヤイトムシ目について、サウダムシSchizomus sawadaiを用いた組織学的観察を行い、従来不明確であった卵巣と卵母細胞の位置関係を明らかにし、排卵及び産卵の経路を特定した(Miyazaki et al.2001)。昆虫類に関しては、原始的な有翅昆虫であるカゲロウ目のフタバカゲロウCloeon dipterumについて、H字形をした特異な卵巣の後胚発生を調べ、この卵巣形状が後胚発生のごく初期から存在することを見出した。また共輸卵管と不対の産卵口という、この目では従来確認されていなかった構造を初めて発見した(Takahashi & Tsutsumi, in press)。多足類に関しては、倍脚綱について主要分類群を網羅する2亜綱9目18種についての組織学的観察がまとまり、卵巣形態が2亜綱に対応する2つのタイプに分かれ、そのうちの唇顎亜綱では更に3つのサブタイプがあることを確認した(Yahata & Makioka,2001)。

甲殻類に関しては、雄性先熟型性転換を行う寄生性等脚目であるウミホタルガクレOnisocryptus ovalisについて、生殖巣の形態と後胚発生を組織学及び微細構造学的に観察し、卵巣がH字形をする、卵形成が卵巣内で同調的に進む、更には体表全体のクチクラが剥離して出来た空間に産卵するといった、等脚目では他に例がない、おそらくは寄生生活による様々な特殊化を確認した(Matsuzawa et al.2001)。鋏角類については、ウミグモ類の生殖巣の血体腔中での位置が、他の節足動物と基本的に異なることを示した(Miyazaki & Pass,2002,in press)。また蛛形類メクラツチカニムシの卵巣構造の発達を組織学的に観察し、年一世代の生活史と対応した形態変化を示すことを明らかにした。昆虫類については、カゲロウ目のコカゲロウ類9種を用い、卵巣構造と卵形成様式を組織学的及び微細構造学的に調べ、H型の卵巣構造がコカゲロウ類に広く共通している事、卵胎生種と卵生種とでは卵形成過程に違いがある事を明らかにした。またカマキリ目オオカマキリとコカマキリの若齢幼虫の卵巣を組織学的に観察し、カマキリ目の卵巣型が無栄養室型である事や卵母細胞及び卵巣小管の分化の時期を明らかにしたが、これはこの目と近縁と考えられる2002年に新発見されたマントファスマ目との比較という意味で重要な知見である。甲殻類については、成体の卵巣構造が鋏角類に類似する、介形類ウミホタルの卵巣の後胚発生について組織学的に観察し、亜成体でみられた卵原細胞が成体では消失することを突き止めた。また十脚類のザリガニ類について、卵巣の概形と卵形成の概要を現生の代表的な科で比較し、卵巣の形状には♂の外部生殖器による区分と対応した違いがみられるが、卵巣の組織学的特徴と卵形成様式は、基本的に共通であることを明らかにした。多足類については、ヤスデ類のうち、卵巣構造に鋏角類に似た特徴があるとの報告があるヒメヤスデ目、昆虫類に似るとの報告があるヒキツリヤスデ目、これら2目と同じヒメヤスデ上目に属するが過去の報告が全くないフトヤスデ目の3群について、それぞれの代表種の卵巣を組織学的に観察し、その卵巣構造と卵形成様式はいずれも非常によく類似し、その特徴は鋏角類とも昆虫類とも異なり、他のヤスデ類のものと基本的に同じであることを明らかにした。鋏角類については、これまでの知見を総合し総説的な紹介を行った(Miyazaki & makioka,2003)。生殖孔の位置が、他のウミグモと異なる位置に記載されていたスイクチウミグモ類の一種について、記載の誤りを明らかにした(Miyazaki, in press)。フタツメイソウミグモの生殖器官系と循環器官系の位置関係が、他の節足動物には見られないユニークなものである事を指摘した(宮崎・Pass,印刷中)。また蛛形類メクラツチカニムシの生活史と卵形成段階との対比を行い、繁殖期を特定し、越冬時の卵形成の停止を確認した(加藤・塘,印刷中)。昆虫類については、2002年に新発見されたマントファスマ目のビドーカカトアルキの卵膜の微細構造を観察し、産卵地の環境に応じた適応的な形質を見出すと共に、それが昆虫類全体でもユニークな形質である事を指摘した(Tsutsumi et al.,2003,in press)。また卵生コカゲロウ類であるシラハラコカゲロウの卵巣の後胚発生と卵形成過程を、卵胎生コカゲロウ類と比較し、両者に共通した後胚発生様式と、生殖様式の違いを反映したと考えられる、卵形成過程に関するいくつかの相違点を明らかにした(影山・塘,印刷中)。甲殻類については、介形類Halocyprida目の一種の卵巣構造と卵形成様式を観察し、近縁と考えられる他の二目の中間的な特徴を持つ事を明らかにした(Ikuta & Makioka,2004)。また十脚類のザリガニ類について、卵巣の概形と形成細胞層の比較から、最近の分子系統学的解析の結果と一致する、卵巣構造の進化様式が推定された。
真菌感染症とGVHDのクロストーク

真菌感染症がGVHDに及ぼす影響についてマウスモデルを用いて検討した。Candida菌体壁成分a-MannanあるいはCandida死菌の投与によってGVHD、特に肺病変の重症化がみられた。a-Mannan投与はGVHDに伴う肺マクロファージのTh17分化を促進するIL-6, IL-23, CCL20などの発現を増強し、ドナーTh17細胞の肺浸潤を促進した。一方、Dectin-2欠損レシピエント、あるいはIL-17A欠損ドナーでは肺GVHDの増悪はみられなかった。以上から、Candida感染はレシピエントのdectin-2を介し、ドナーTh17細胞の肺集積を促進する新たな機序が判明した。移植モデルとしてはMHC完全不適合のBALB/c→B6、MHC半合致であるB6→BDF1、MHC適合のC3H.Sw→B6の3種類を用いた。真菌感染モデルとしては、菌体壁成分であるalpha-Mannanを投与する標準的なモデルを用いた。alpha-Mannanを移植日に腹腔内に単回投与したところ、GVHDスコアの悪化と死亡率の増加がすべてのモデルで普遍的に観察された。その効果はalpha-Mannanの用量依存性であった。臓器別にGVHDを病理学的に検討したところ、腸、肝で有意なGVHDの増悪が認められたが、とくに肺GVHDの増悪が顕著であった。移植後の各臓器の解析において、とくに肺に顕著なドナーT細胞の浸潤がみられたため、これを分離、解析したところTh17細胞の性格を有していた。肺マクロファージにおいてはTh17分化に関連するIL-6, IL-23, CCL20などの発現亢進がみられ、これが肺に病変が集中する原因と考えられた。このような変化は同系移植ではみられず、アロ免疫応答が必須であると考えられた。またCandida albicans感染死菌投与実験を行い、肺GVHDの増悪を再確認した。一方、肺GVHDの増悪はレシピエントにDectin-2ノックアウトマウスを用いた場合、あるいはドナーにIL-17Aノックアウトマウスを用いた場合にはキャンセルされた。以上の結果から、Candida感染は壁成分であるalpha-Mannanがレシピエントのdectin-2を介し、ドナーT細胞のTh17細胞分化を促進し、肺におけるTh17環境がドナーTh17細胞の集積を促進し、肺GVHDの発症、増悪に関与する可能性が示唆された。現在までに得られた知見がBlood誌に論文として受理されたため。また申請者は米国造血細胞移植学会において申請者がシンポジウム招待講演を行った。これまでの研究成果から、T helper (Th)-17免疫応答が真菌感染による肺graft-versus-host disease (GVHD)増悪のメカニズムであることが判明した。そこで、肺GVHD治療法の開発を目指し、Th17免疫応答に関連するIL-6の阻害により真菌感染による肺GVHDの発症を防止できないか検討した。MHC半合致であるB6→BDF1モデルを用い、alpha-Mannanを投与後に抗マウスIL-6抗体、MR16-1を投与し、そのT細胞免疫応答、肺GVHDに対する影響を検討した。しかし、T細胞応答、肺GVHDともに抑制されず、IL-6以外のサイトカインなどの病態形成への関与が示唆された。そこで次に線維化の進展に関与するheat shock protein 47 (HSP47)を標的とした肺GVHD治療法開発の研究を開始した。現在までに、HSP47を阻害するsiRNAの投与により、皮膚GVHDにおける線維化の予防および治療が可能であるという結果が得られている。現在、GVHDに伴う閉塞性細気管支炎のモデルである、B6→B10.BRモデルを用い、肺におけるHSP47の発現を検討中である。さらにHSP47阻害により閉塞性細気管支炎の予防あるいは治療が可能か検討する。また、腸内細菌叢とGVHDには相関がみられるが、腸内真菌叢とGVHDの関連を検討するため、移植後の糞便サンプルを継時的に収集し、次世代シークエンサーを用いて糞便中のファンジオーム解析を行った。真菌の検出頻度は同系移植に較べ、同種移植で明らかに高かった。今後、その菌量および菌種について検討を行う予定である。これらの一連の研究によって、真菌感染とGVHDの関連について包括的な理解を深めて行く予定である。今までに得られた結果から、Th17免疫応答が真菌感染によるGVHD増悪のメカニズムであることが判明したため、治療介入を目指し、Th17免疫応答に深く関連する抗IL-6抗体の投与によりGVHD増悪が阻止できないかどうか検討する。MHC半合致であるB6

→BDF1モデルを用い、alpha-Mannan投与後に抗マウスIL-6抗体、MR16-1を投与し、そのT細胞免疫応答、肺GVHDに対する影響を検討する。また、今までに得られた知見は、真菌の全身感染のモデルであったので、今年度は、腸内における真菌コロナイゼーションとGVHDの関連性を検討する。臨床的には、腸内Candidaコロナイゼーションが急性GVHDのリスクであるという報告があり(van der Velden: Clin Immunol. 2010)、その機序の解明が求められる。MHC半合致であるB6→BDF1モデルにおいて、同系移植、同種移植後の糞便サンプルを継時的に収集し、次世代シークエンサーを用いて糞便中のファンジオーム解析を行う。現時点までの解析ではGVHD発症マウスにおいては腸内細菌叢に顕著な菌交代現象がみられることを見出し、昨年の米国血液学会で口演発表した(Hayase, ASH 2015)。このサンプルを用い、ファンジオーム解析を行い、GVHDとの関連を検討する。血液内科学
関節軟骨におけるストレス応答分子の検索と炎症・基質破壊経路との関連性に関する検討

高齢化社会の到来に伴い、変形性膝関節症などの関節疾患の有病率が増加している。関節疾患では様々な要因により自己再生能力に乏しい関節軟骨の損傷や滑膜組織の炎症により、歩行時や加重時に疼痛を伴い、高齢者は特にその傾向が顕著で生活におけるQOLを著しく低下させる要因となっている。そこで物理的ストレスによってもたらされる活性酸素に着目し、軟骨組織の恒常性維持に関わる滑膜組織で活性酸素の発生に伴い活性化されるTAK1を見出した。TAK1を抑制することで痛みの原因を効率良く抑制することが可能であった。また、軟骨細胞の恒常性維持に抗酸化マスター因子のNrf2が重要な役割を果たしていることも見出した。高齢化社会の到来に伴い、変形性膝関節症(OA)などの関節疾患の有病率が増加している。OAを始めとした関節疾患では様々な要因により関節軟骨の損傷や滑膜組織の炎症により、歩行時や加重時に疼痛を伴うことから、高齢者の生活におけるQOLを著しく低下させる要因となっている。軟骨組織は自己再生能力に乏しいため一度損傷すると自発的な再生・回復を望みにくく、高齢者においては特にその傾向が顕著である。これまでに、軟骨組織に対する物理的ストレスの負荷が軟骨細胞における活性酸素種(ROS)の発生を誘引し、組織の変性を加速度的に進行させることが報告されている。ROSは様々な組織における重要な組織障害因子であるにも関わらず、軟骨におけるROSの発生からROSがもたらす症状のメカニズムの理解は十分とは言えない。ROSによる軟骨の障害を緩和することは非常に重要な手がかりとなると考えられる。しかし、ROSの発生をもたらした細胞内分子メカニズムは依然不明であり、ROSが軟骨細胞におよぼす影響についても未知の点が多い。本研究では強い物理的(圧迫)ストレスに対し一次的に応答するシグナル分子の探索を行い、この機構に介入する方法の開発を目指す。具体的な研究として、1)軟骨組織に対する荷重の負荷とストレス応答物質の探索、2)炎症・基質破壊カスケードとの関連性に関する研究を計画した。初年度(平成24年度)にはウシ関節軟骨組織をモデルとして、周期的圧迫負荷を行いストレスセンシング機構の探索を実施した。2年目の昨年度(平成25年度)は、軟骨細胞破壊の制御を目的とし初年度に探索したプライマリーセンサーをターゲットとした研究を実施した。また、すでに日常診療で症状緩和薬として使用されているヒアルロン酸による軟骨細胞のストレス除去メカニズムがこの過程の中で見出され、現在海外誌に投稿しているところである。超高齢社会の到来に伴い、変形性関節症(OA)などの関節疾患の有病率が増加している。OAでは様々な要因により関節軟骨が損傷し、歩行時や加重時に疼痛を伴う事から、高齢者の生活におけるQOL(生活の質)を著しく低下させる要因となっている。軟骨組織は自己再生能力に乏しいため一度損傷すると自発的な再生、回復を望みにくく、高齢者においては特にその傾向が顕著である。ROSは様々な組織における重要な組織障害因子であり、軟骨におけるROSの制御方法の解明は軟骨の障害を緩和する上で非常に重要な手がかりとなると考えられる。その結果、ストレス応答MAPKであるp38のリン酸化に先立って低分子量GTPaseRhoの活性化が生じ、軟骨基質破壊分子MMP13の発現を上昇させることを見出した。また、OAに対する症状緩和薬として日常診療で使用されているヒアルロン酸はRhoの活性に介入しうる可能性を見出した。関節疾患では様々な要因により関節軟骨の損傷や滑膜組織の炎症により、歩行時や加重時に疼痛を伴うことから、高齢者の生活におけるQOLを著しく低下させる要因となっている。本年度は、過去二年に渡り探索し明らかとなった軟骨変性の抑制因子となりうるNF-E2-related factor 2(Nrf2)、ストレス応答に関するプライマリーセンサーであるTAK1をそれぞれターゲットに軟骨細胞や滑膜細胞への有効性を検討した。

1DNAやタンパク質を直接酸化するストレス因子を分解・解毒するHO-1やNQO-1、GSTなどといった酵素は酸化ストレス応答因子であるNrf2によって制御されている。OAにおいて、酸化ストレスは有意に上昇している。そこで、正常ウシ軟骨細胞のNrf2をsiRNAを用いてノックダウンしたところ軟骨細胞特異的なSox9およびCol2aが有意に低下していること、ROSの上昇と共に、マトリックス分解酵素の一つであるADAMTS-5が有意に上昇していることが明らかとなった。さらに、OAの治療薬の一つであるヒアルロン酸を用いたところ、CD44/RHAMM-Aktを介してNrf2を活性化し軟骨細胞の恒常性に寄与していることが示唆された。2軟骨組織を取り巻く滑膜組織は、OAによる炎症により肥大化することで慢性的な痛みを作り出す原因の一つと考えられている。本研究で過酸化水素による刺激によってTAK1が活性化することが明らかになった。また、ヒアルロン酸の添加によってROSが除去されTAK1および疼痛マーカーであるCOX-2/PGE2の抑制が可能であった。現在、1および2はそれぞれ海外誌に投稿中であり、1においては査読結果がMinor revisionとして返却されており再投稿の準備を進めているところである。再生医療2年目に当たる昨年度は、当初の予定通り初年度で得られたプライマリー分子と軟骨組織の炎症・破壊に関わる既知の物質との関連性について検討した。また、変形性膝関節症を始めとした膝関節組織における疾患に対し、既存薬としてヒアルロン酸製剤による治療があるが、症状緩和の詳細なメカニズムは知られていない。そこで我々が初年度で得たカスケードに対し、ヒアルロン酸が軟骨破壊のメカニズムをどのように制御しているのか検討した。その結果、ヒアルロン酸の持つ抗酸化効果のメカニズムをin vitroで示すことに成功し、ROSによって発現が抑制されていたCOl2a等の軟骨特異的なマーカーの亢進や、発現が上昇していた軟骨破壊マーカーであるADAMTSの抑制が認められた。これより、膝関節組織の治療におけるヒアルロン酸投与の有用性を示すメカニズムが示唆された。今後、軟骨細胞のみならず既に滑膜細胞においても炎症とストレスに関する研究もスタートさせており、3年目の課題である。初年度には、当初の予定どおりストレス応答のプライマリ分子を抽出した。また、既存薬の介入性についても検討することができた。しかしながら、in vitro実験による具体的なストレス伝達機構の解明が完了しておらず、詳細な解析が必要である。加えて、選択的阻害剤を用いた介入実験も十分ではないため、2年目以降の課題である。今後は、膝関節疾患において症状の増悪に極めて重要な役割を担う滑膜細胞についても、ROS由来の炎症メカニズムを解明するとともに、主にin vitro実験系においてカスケードの中間分子の検索を進めていきたい。また、既存薬として用いられているヒアルロン酸と中間分子の関係性も検討し、滑膜細胞に対する抗炎症効果・抗疼痛効果のメカニズムを明らかにしていきたい。
非母語子音クラスタへの母音添加の機序は言語により異なるか

電磁式調音運動測定装置WAVEsystem(NDI Corp.カナダ)により子音クラスタ調音時の舌先の運動(子音クラスタの第1子音から第2子音までの変位)を日本語話者3名、英語話者3名において計測し、データを収集した。これらのデータを解析し、総合的評価を行なった。日本語および英語話者のデータを解析したところ、子音クラスタへの母音添加の機序に関して、言語による違いはないと考えられた。少なくとも日本語と英語においては母音添加の機序は異なっていないであろう、と考えられた。申請書記載の実験のため被験者として英語母語話者3名、日本語母語話者6名を選定した。各被験者において、電磁式調音運動計測装置により調音運動計測を行ない、子音クラスタ調音時の調音器官(舌、唇、顎)の運動データを収集した。子音クラスタを構成する第1子音の調音点から第2子音の調音点への舌等の移動時間および変位を計測した。得られたデータは解析中である(一部解析済み)。調音運動計測と並行して子音クラスタ発話時の声帯振動計測(電気式喉頭計)を行ないデータを収集した。データは現在解析中であるが、英語母語話者1名についてはデータ信頼性確認のため再計測の必要があるかもしれない。検討中である。本年度は、EMA(Electro-magnetic Articulograph、ドイツCarsten社製)を使用して計測されたデータの規格化を試みた。各被験者の調音器官(舌、口腔等)の大きさは被験者により異なっており、特に性差、体格差の異なる被験者から計測されたデータをそのまま比較することは、適当ではないからである。規格化はX軸(体の前後方向、anterior-posterior)とY軸(体の上下方向、inferior-superior)に分けて行なった。X軸方向の規格化は各発話中の舌先の最高点から最低点を減じたもので計測値を除した。Y軸方向の規格化は各発話中の舌先の最前点から最後点を減じたもので計測値を除した。舌先の移動時間については、各音素の調音完了点間の時間を単語長で除したものを規格化値とした。これらの規格化により各被験者の比較が正確に行なえるようになった。さらに、新しく開発された電磁式調音運動測定装置WAVE(カナダ、AURORA社製)により子音クラスタ発話時の調音運動を日本語話者3名、英語話者3名において予備的に計測した。このWAVEはEMAに比べて測定前の装置の較正が容易(EMAが較正に半日から一日要するのに比べ、WAVEは30分程度で完了する)であることが特徴である。得られた測定結果はEMAと比較して遜色ないものであると考えられ、次年度以降WAVEによる計測を行なう予定である。電気式喉頭計による声帯振動の計測も行なったが解析は次年度に行なう予定である。24年度は、EMA(Electro-magnetic Articulograph、ドイツCarsten社製)を使用して計測されたデータの規格化を試みた。得られた測定結果はEMAと比較して遜色ないものであると考えられた。25年度は被験者として英語母語話者3名、日本語母語話者6名を選定した。。26年度は、前年度までに得られたデータの解析およびそれらの総合的評価を行なった。英語母語話者および日本語母語話者のデータを解析したところ、子音クラスタへの母音添加の機序に関して、違いはないと考えられた。少なくとも日本語と英語においては母音添加の機序は異なっていないであろう、と結論付けることができた。音声科学実験はおおむね順調である。

日本語母語話者6名、英語母語話者3名のデータを収集し終えた。得られたデータの一部は解析を終わり、現在残りのデータを解析中である。EMAによる調音運動計測データから、子音クラスタ調音時の調音器官(舌、唇、顎)の運動データを収集した。子音クラスタを構成する第1子音の調音点から第2子音の調音点への舌等の移動時間および変位を中心に計測を行ない、得られたデータを解析し、データの規格化を行なった。EMAよりも測定前の準備が簡便なWAVEを試用し予備的計測も行なった。WAVE計測と同時に子音クラスタ発話時の声帯振動計測(EGG)を行ないデータを収集した。WAVEにより得られたデータは現時点までの解析では、EMAにより得られたデータと質的に遜色ないと思われる。EGGデータの解析は次年度に持ち越すことになったが、それ以外の点についてはおおむね計画通りに推移している。引き続き残りのデータの解析を行ない、日本語母語話者の子音クラスタへの母音添加の機序を明らかにする。英語母語話者1名については、声帯振動計測(電気式喉頭計)のデータを詳細に検討し、必要があれば再計測を行う予定である。予備的実験の結果を踏まえ、EMAに代わりより測定が簡便なWAVEによる計測を行ないデータ数を増やす予定である。さらにWAVE計測と同時に電気式喉頭計による声帯振動の計測を行なう。WAVEデータと喉頭計によるデータの同期を行ない、声帯振動と舌の運動との関係(タイミング制御)を明らかにする。舌の調音運動と声帯振動から子音クラスタへの母音添加の機序を明らかにする。得られた結果を国際会議等で発表する予定である。新しく開発されたWAVE測定装置を使用したことにより、装置使用料、消耗品等の額に差が生じたために次年度繰越額が発生した。この繰越額を使用し被験者数を増やす予定である。WAVEによる調音運動の計測を行なう予定である。WAVE使用料及び消耗品費約30万円。
ＩＮＧ遺伝子発現を用いた口腔扁平上皮癌患者の予後予測方程式の作成

口腔扁平上皮癌の予後予測分子マーカーの探索のために、ING1bの癌細胞での結合タンパクであるSIRT1発現を免疫組織化学を用いて頭頸部扁平上皮癌症例で検討した。その結果、SIRT1発現は、年齢が高いほど高率で、口腔症例で高率で、リンパ節転移、病理学的病期とは負の相関を示した。即ち、癌の進展に比例して低率となった。また、SIRT1発現は、頭頸部扁平上皮癌症例にとって有意な予後良好因子であった。口腔癌症例では特に有意であった。多変量解析でもSIRT1発現は独立した予後良好因子であった。口腔扁平上皮癌の予後予測分子マーカーの探索のために、ING1bの癌細胞での結合タンパクであるSIRT1発現を頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)症例で検討した。症例は、神奈川県立がんセンター病院・頭頚科で手術あるいは化学療法・放射線療法(CRT)が施行されたHNSCC 437症例の内訳は、男女比356 :81平均年齢63.7 ±11.0才、咽頭101例、喉頭143例,口腔193例であった。組織型は、高分化型184例、中分化型162例、低分化型90例であった。病理学的病期は、stage Iが68例、stage IIが114例、stage IIIが55例、stage IVが200例であった。治療は、手術単独が91例、手術とCRT109例、CRT単独が230例であった。SIRT1は、class IIIの脱アセチル化酵素であるが、その発現は、免疫組織化学(IHC)で行い、その他にp53, H3K9アセチル化(Ac)、H4K16アセチル化(Ac)に対する抗体を使用し、SIRT1発現との相関を検討した。また、HNSCC症例の臨床病理学的事項との検討も加えた。p53発現とは相関が見出せず、H3K9Ac, H4K16Acとは正の相関を示した。即ち、SIRT1発現は、p53変異とは関係なく、H3K9とH4K16のアセチル化を脱アセチル化していないと考えられた。また、SIRT1発現は、HNSCC症例にとって有意な予後良好因子であった。特に、口腔癌症例では特に有意であった。口腔扁平上皮癌の予後予測

分子マーカーの探索のために、ING1bの癌細胞での結合タンパクであるSIRT1発現を頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)症例で検討した。症例は、神奈川県立がんセンター病院・頭頚科で手術あるいは化学療法・放射線療法(CRT)が施行されたHNSCC 437症例の内訳は、男女比356 :81平均年齢63.7 ±11.0才、咽頭101例、喉頭143例,口腔193例であった。組織型は、高分化型184例、中分化型162例、低分化型90例であった。病理学的病期は、stage Iが68例、stage IIが114例、stage IIIが55例、stage IVが200例であった。治療は、手術単独が91例、手術とCRT109例、CRT単独が230例であった。SIRT1は、class IIIの脱アセチル化酵素であるが、その発現は、免疫組織化学(IHC)で行い、その他にp53, H3K9アセチル化(Ac)、H4K16アセチル化(Ac)に対する抗体を使用し、SIRT1発現との相関を検討した。また、HNSCC症例の臨床病理学的事項との検討も加えた。その結果、SIRT1発現は、年齢が高いほど高率で、口腔症例で高率で、リンパ節転移、病理学的病期とは負の相関を示した。即ち、癌の進展に比例して低率となった。p53発現とは相関が見出せず、H3K9Ac, H4K16Acとは正の相関を示した。即ち、SIRT1発現は、p53変異とは関係なく、H3K9とH4K16のアセチル化を脱アセチル化していないと考えられた。また、SIRT1発現は、HNSCC症例にとって有意な予後良好因子であった。特に、口腔癌症例では特に有意であった。多変量解析でもSIRT1発現は独立した予後良好因子であった。研究課題を、1)充分な症例数を解析できた、2)解析方法が容易であった、などの理由により、研究は順調に進展している。研究陣容の努力により、予定のように研究は進捗している。今後は、SIRT1発現が頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)の予後良好因子であることを分子生物学的方法を用いて証明する。しかしながら、研究代表者が大病を患ったことから、研究の遂行に支障が発生した。それに対しては、分子生物学的手法に長けた人材を雇用し、対応することとした。今までは、免疫組織化学が中心の研究であったが、今年度以降は培養細胞と新鮮癌組織等を用いて分子生物学的手法により研究を推進していく。研究遂行に当たって、分子生物学的手法に長けた人材を雇用するためには科学研究費を使用し、研究試薬等は当該研究所の研究費を使用する。現在の施設でおおむね分子生物学的研究は可能であるので、研究費の殆どは分子生物用試薬と研究発表のための英文校正費と旅費になると考えられる。
肝血行遮断の呼吸機能への影響

肝血行遮断時における全身(呼吸機能)に対する影響の研究[目的]我々はSD系雄性ラットを使用して総虚血時間と総再潅流時間を一定にした反復肝血行遮断群と連続肝血行遮断群が全身に及ぼす影響を比較検討した。[方法]SD系雄性ラットを使用し、外頚静脈にカニュレーションを行った。ヘパリン200U/kgを投与した後、生理食塩水3ml/kg/hrを持続静注した。また、動脈血採取のため大腿動脈にカニュレーションした。逆U字切開にて開腹後、肝正中葉・左葉に入る肝動脈,門脈及び胆管をクランプし70%部分肝血行遮断を施行した。実験群を以下の4群に分けた。S60群:60分肝血行遮断後60分間再潅流したもの。R60群:15分肝血行遮断後15分間再潅流を行う事を4回繰り返したもの。S90群:90分肝血行遮断後90分間再潅流したもの。R90群:15分肝血行遮断後15分間再潅流を行う事を6回繰り返したもの。再潅流終了時点での血中AST、ALT、LDH、TNF-α、IL-6、虚血前及び再潅流終了時点での血液ガス分析を行った。また再潅流終了時点で肝、肺、腎組織を採取した。[結果]S60群ではTNF-α13.86pg/ml,IL-6 36.62pg/ml(平均値、n=5)、S90群では、TNF-α15.20pg/ml、IL-6 44.98pg/mlと上昇していたが、R60群ではTNF-α、IL-6は測定限界未満、R90群ではTNF-αは測定限界未満、IL-6は34.24pg/mlであった。血液ガス分析では再潅流終了時と虚血前のBE値の差を計算したところS90群で-3.48、R90群で-0.53でこの2群間に有意差を認めた(p<0.05)。尚、R群とS群において再潅流早期において肝、肺、腎の病理組織学的変化に差を認めなかった。現在再潅流24時間後の肝、肺、腎の病理組織学的変化を検討中である。更に塩化ガドリニウム(Kupffer cell阻害剤)や抗白血球抗体等を使用して検討を重ねる予定である。
流雪溝の設計方法

(1)流雪構および融雪溝の布設路線数・延長距離は年々増加傾向にある。青森県では年平均8箇所、約5kmの布設距離となっている。(2)近年、融雪溝の設置が増大している。(3)幅、底勾配の急変箇所、急曲部箇所数が年々増加傾向にある。特に、急曲部の箇所の増加が著しい。(4)流雪溝や融雪溝の送雪能力よりもその能力に応じた運用方法の確立が重要となる。(5)曲がりや勾配変化等は町域の形、流雪溝の配置形状、地形等によって定まり、どうしても避け難い状況にある。こうした弱点箇所が、全体の作業能率を落とさない為に、どの様に設計されなくてはならないかは極めて重要な問題となっている。(6)現地調査により、構造的原因に関して流雪溝の閉塞状況を3箇所について把握し、勾配により閉塞箇所が異なることが示された。(7)室内実験により、流雪溝屈曲部の閉塞の有無を雪塊の接近速度・硬さ・大きさの3項目により分類した。雪塊が屈曲部を通過するときに破壊される体積に着目し、雪塊の持つ運動エネルギとの関係から流雪溝屈曲部での閉塞条件を用いて、条件を1つにまとめることができた。連続して流れる雪塊を考え、その送雪能力を導きQ_W/Q_S≒45であることを示した。(8)流雪溝内の雪混じり流れをダイレタント性の流れとしてモデル化し、平均流速式を導いた。(9)雪水二相流の流動現象についての観測をポリスチレン粒子を用いて行った結果、断面内の速度分布は水平方向にはほぼ一様となっているが、鉛直方向には大きく変化する分布となっていることが明らかとなった。
超音波と微少気泡エネルギーを用いた新しい抗癌戦略:抗腫瘍効果の分子基盤解析

(1)集束超音波によるアポトーシス発現経路の解明KDH-8肝癌を有するラット皮下腫瘍を用いて集束超音波によるアポトーシス関与の検討をおこなった。[結果]1.病理学的検討TUNEL染色において10W×0.5秒および10W×1.0秒でアポトーシス細胞の発現が非照射群より増加しており,20W×1.0秒,30W×1.0秒では有意に低下していた(P<0.05)。2.局所効果・生存率照射群と非照射群の生存率は有意に照射群の生存率が良好だった(P<0.05)。3.アポトーシスの発現Hoechst 33258染色において20W×1.0秒以下の照射エネルギー条件では有意にアポトーシス発現が高かった。4.カスペースの活性caspase-3の活性が最も高く,-8の方が-9/6より活性が高かった。[結語]集束超音波の抗腫瘍効果において熱変性凝固壊死の他にアポトーシスが殺細胞の機序となりうることが明らかとなった。集束超音波においてはcaspase-8を実行過程とする細胞膜誘導によりアポトーシスが活性化されたことが示唆された。(2)微少気泡存在下における集束超音波作用発現増強の検証家兎の皮下に移植したVX_2腫瘍に(1)微少気泡を加えないコントロール、(2)Optison(4.8μm/ml)添加、(3)Definity(5μ/ml)添加、(4)Levovist(300mg/ml)添加にてそれぞれ集束超音波を照射した。[結果]Levovist, Optison群においてはコントロール群と比較して腫癌の壊死範囲は広範であった。特にOptison群では腫瘍はほとんど完全壊死となっていた。[結語]微少気泡添加により、集束超音波単独に比較してより効率的な抗腫瘍効果が現れることが明らかとなった。すなわち、集束超音波による腫瘍ablationは微少気泡を添加することでより効率的かつ安全な治療法となることを明らかとした。平成16年度の研究内容として、KDH-8肝癌を有するラットの集束超音波照射群と非照射群の生存率の対比と細胞死形態の評価としてアポトーシス関与の検討をおこなった。その結果、以下の点が明らかとなった。1.病理学的検討30W×1.0秒以上のエネルギーでは病理組織学的に腫瘍の壊死、変性と腫瘍血管の断裂・閉塞が観察された。TUNEL染色においては10W×0.5秒および10W×1.0秒でアポトーシス細胞の発現が非照射群より増加しており,20W×1.0秒,30W×1.0秒では有意に低下していた(P<0.05)。2.局所効果・生存率30W×1.0秒以上の照射エネルギー条件では全て腫瘍は消失した。照射群と非照射群の生存率は有意に照射群の生存率が良好だった(P<0.05)。3.アポトーシスの発現Hoechst33258染色において30W×1.0秒以上の照射エネルギー条件では70W×1.0秒の条件を除いては非照射群と有意な差は見られなかった。しかし20W×1.0秒以下の照射エネルギー条件では有意にアポトーシス発現が高かった。

4.カスペースの活性caspase活性は-3,-8,-9/6ともに10W×0.4秒で最も高く見られた。このエネルギー条件ではcaspase-3の活性が最も高く,-8の方が-9/6より活性が高かった。30W×1.0秒の照射エネルギーを境に,腫瘍壊死が起こる最低エネルギーや最短照射時間の設定ができた。以上より、集束超音波治療には熱凝固以外の機序で抗腫瘍効果を示す可能性があることが示唆された。さらに集束超音波の抗腫瘍効果の作用機序に関して,変性凝固の他に低いエネルギー条件ではアポトーシスが殺細胞の機序となりうることが明らかとなった。またcaspaseの活性の比較から,集束超音波においてはcaspase-8を実行過程とする細胞膜誘導により活性化されたことが示唆された。平成17年度は前年度における研究、すなわちKDH-8肝癌を有するラットの集束超音波照射群と非照射群の生存率の対比と細胞死形態の評価としてアポトーシス関与の検討を受けて、微少気泡存在下における集束超音波(HIFU)による抗腫瘍効果をin vitro, in vivoにて検討した。結果(1)in vitro : Levovist、Definityのいずれにおいてもコントロールと比較して温度上昇が得られ、温度上昇は微少気泡の濃度が上昇するほど増加した。結果(2)in vivo : OptisonおよびLevovist併用下HIFUにおいてはHIFU単独よりもそれぞれ、1.3倍、1.1倍の壊死範囲の拡大が見られた.Optison併用下では腫瘤の完全壊死が見られたが、Levovist併用下ならびにHIFU単独では一部に残存が見られた.Definity併用下では腫瘤増大による変性が見られたが治療による壊死は確認できなかった.HIFU単独治療と比較して0.7倍と壊死範囲が縮小した.HE染色にてHIFU単独と微少気泡-HIFUの間には病理学的な相違はなかった.以上よりHIFUは微少気泡の存在下において非存在下と比較して照射エネルギーの増大と腫瘍壊死が拡大することが明らかとなった。すなわち、これら一連の実験において、微少気泡添加でのHIFU照射は抗腫瘍効果を増強することを示した。これらの実験は将来的にHIFUを人体において行う際により効率的かつ完全な抗腫瘍効果を得るための重要な基礎的データとなることが示唆された。
ワークフローと差分情報収集を用いたウェブ上の分散情報の動的収集システムの研究開発

Web上に分散する知識情報を有効活用できるようにするため,情報収集ワークフローに基づき利用者をナビゲートし,重複した情報を含む複数のページからオリジナルな追加情報を抽出するシステムの研究開発を行った.具体的には,国際会議への参加を支援するシステム,個人の行事や行動の段取り力を高めるワークフローシステム,検索履歴を利用して情報検索を支援するシステム,市民グループの活動の位置情報を自動収集するシステムなどを開発し,有効性を確かめた.Web上に分散する知識情報を有効活用できるようにするため,情報収集ワークフローに基づき利用者をナビゲートし,重複した情報を含む複数のページからオリジナルな追加情報を抽出するシステムの研究開発を行った.具体的には,国際会議への参加を支援するシステム,個人の行事や行動の段取り力を高めるワークフローシステム,検索履歴を利用して情報検索を支援するシステム,市民グループの活動の位置情報を自動収集するシステムなどを開発し,有効性を確かめた.国際会議に参加することが不慣れな研究者や大学院生を対象として,そのための一連の作業(行為)を支援するためのWebデータベースシステムを設計し試作した.このシステムの特徴はワークフロー管理とナレッジ共有機能を融合している点にある.あわせて,Webからマルチメディアコンテンツに関するキーワードや最新情報を取得する仕組みも検討した.具体的には以下のことを行った.まず,国際会議に参加するための一連の作業を分析し,参加のためのワークフローを作成した.また,そのワークフローのアクティビティごとにどのような情報が必要になるのか,どのような手段でそれらの情報を収集し管理しているのかを検討した.その結果,国際会議に参加するためのワークフローは大きく,研究成果を発表するための作業と,国際会議へのエントリーなど聴講のための作業に分類され,さらに所属機関などの違いにより,事務手続きなどの作業に違いがあることがわかった.そこで本研究課題では,参加のためのワークフローを,利用者に共通の作業からなる「共通フロー」と,利用者の属性により異なる「追加フロー」にわけ,利用者情報に基づき適宜ワークフローを生成する方式を考案し実装した.試作システムでは,ワークフローの進行状況を常に監視し利用者に視覚的に提示することで,作業の実施や情報収集を促すことができる,また,作業単位で参加のためのノウハウを利用者同士で共有することもできる.さらに,利用者がWebの検索エンジンに入力したキーワードを共有可能にする機能も備えている.国際会議に参加することは研究者にとって非常に重要な活動であるため,その作業をサポートすることは意義深いと考えている.国際会議に参加することが不慣れな研究者や大学院生を支援するため,平成20年度に開発した,ワークフロー管理とナレッジ共有機能を融合させたシステムを大幅に発展させ,スケジュール管理機能も一体化したシステムの設計と試作を行った.国際会議への参加では,参加予定の会議のスケジュールに合わせて論文執筆や旅行の手配などを適切なタイミングで実施する必要がある.そのためスケジュール管理が極めて重要である.そして現在では,スケジュールを管理するためにWeb上のサービスの利用が増えつつある.そこで本研究課題では,参加予定の国際会議のスケジュールにあわせて,利用者が通常利用しているスケジュール管理サービスに,通知機能を設定したイベントを追加することで,適切なタイミングで作業(行為)の実施を促すことができる支援機能を実現した.一方,電子メールは研究活動においても不可欠なツールであり,ほとんどの研究者が日常的に利用している.そしてホテルの手配など国際会議への参加のためにも多用される.そのため本研究課題では電子メールとの連携を実現し,本システムにも電子メールを送信することにより,そのメールメッセージをナレッジとして共有可能にする機能を実装した.本研究課題の代表者や分担者らが参加した国際会議において本システムを試用し,(平成20年度に実装した機能により蓄積される)Web検索で利用された検索語や送信された電子メールと,国際会議の参加のために実施した作業の記録とを照合すると,それらの内容からどの作業を実施しようとしていたのかがある程度理解できることがわかり,Web上のサービスや電子メールなど日常的に利用されているツールをシステムに取り入れる価値は十分にあると認識した.さらに,情報系学部の卒業研究支援への応用や情報の関連性を重視したスケジュール管理の検討も行った.平成22年度は国際会議への参加支援の他にも多様な目的に応用可能なシステムを開発した.日常生活で物事を実行するとき,その物事に対して段取りを組むことが多く,段取りの良し悪しが結果を左右する.本研究では,この段取りをワークフローと見なして構造化し,共有するためのシステムを開発した.段取りは時系列順に実行される,または平行して実行可能なワークアイテムから構成され,各アイテムには作業内容,キーワード,コメントなどを付与することができる.そのためユーザは,ワークアイテムごとに何をやるべきかが明確となり,それにより必要な情報の収集も行いやすくなる.本システムは,ユーザがスケジューラに予定している物事を入力すると,それに適した段取りを推薦することもできる.また本研究では,「同じ目的で検索した先人は必ず存在する」という観点から,あるユーザのWeb検索履歴を,検索語句,閲覧ページ,検索語句の遷移により定式化し,同一目的の別めユーザの検索を支援するシステムを,Webブラウザの拡張機能として開発した.本システムはユーザが検索ボックスに入力した検索語句などを定式化に従がって随時蓄積し,蓄積されたWeb検索履歴と別のユーザが入力した検索語句や閲覧ページを比較して,その別のユーザの検索目的を推測し,その目的を満たすWebページを推薦する.

さらに,市民団体の活動情報を対象として,数多くのWebサイトに分散した情報を自動収集するシステムを開発した.本システムは,市民団体のWebサイトの構造的特徴や所在地情報との差分などを利用して活動の位置情報を抽出し地図上にマッピングする.またさらに,本研究ではネットショッピングを支援するため,各サイトに分散したユーザレビューを一元的に管理するシステムを開発した.これらのシステムにより,情報の収集の道筋をナビゲートし,複数のページから有益な情報を収集する技術を実現した.
多剤耐性菌の制圧に向けた乳酸菌由来抗菌ペプチド・バクテリオシンの強化

乳酸菌が生産する抗菌ペプチドであるバクテリオシンは、一般のタンパク質と同様にリボソーム上で合成される抗菌ペプチドで、安全な抗菌物質として食品保存をはじめとする様々な分野での利用が期待されている。近年では、バクテリオシンをはじめとする抗菌ペプチドが、種々の病原細菌や多剤耐性菌に対抗しうる、従来型の抗生物質に変わる次世代型の抗菌物質としての期待も集めている。これまでに多様な乳酸菌バクテリオシンが見出され、我々もN末端とC末端がペプチド結合した環状バクテリオシンやリーダーペプチドを伴わずに生合成されるリーダーレスバクテリオシンのように特徴的な構造を有するものを多数見出してきた。なかでも、新奇環状バクテリオシンであるenterocin NKR-5-3B、および新奇リーダーレスバクテリオシンであるlacticin Qについて、それらの生合成機構を利用してバクテリオシンに改変を加えることで、抗菌活性の向上や抗菌スペクトルの改変を図り、多剤耐性菌等の標的細菌への抗菌作用の強化を試みた。両バクテリオシンをコードする遺伝子の変異による改変体の創出に適した異種発現系を構築し、これを用いて抗菌活性との相関が強いと予想された領域に変異を導入し、両バクテリオシンの改変体ライブラリーを構築した。得られた多数の改変体について、その構造の確認を行うとともに、種々の細菌に対する抗菌活性を評価したところ、両バクテリオシンとも、その構造中のαへリックスの末端および近傍に位置するアミノ酸残基が抗菌活性に大きな影響を及ぼすことが明らかとなった。本研究室では、他にも環状バクテリオシンをはじめとする多くの新奇バクテリオシンを見出しており、今後、これらの成果をさらに展開・活用することで、多剤耐性菌への活性を強化した新たなバクテリオシン改変体の構築が期待できる。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。乳酸菌が生産する抗菌ペプチドであるバクテリオシンは、一般のタンパク質と同様にリボーム上で合成される抗菌ペプチドで、安全な抗菌物質として食品保存料への利用が期待されている。さらには、抗生物質の安全な代替品としての利用、とくに抗生物質耐性菌への利用も検討されている。我々はこれまでに多種多様な乳酸菌バクテリオシンを見出してきた。乳酸菌バクテリオシンは、その構造遺伝子を改変するのみで比較的容易に多様な改変体を得ることができ、抗菌活性の強化・改変を図ることが可能と考えられる。そこで本研究では、我々が発見した乳酸菌バクテリオシンのうち、とくに、強力な抗菌活性を示す、環状バクテリオシンenterocin NKR-5-3B(Ent53B)とリーダーレスバクテリオシンlacticin Q(LnqQ)を対象とした。すでに構築されているEnt53BおよびLnqQの異種分泌発現系を基に、種々の改変体を構築し、その評価と抗菌活性の強化を試みている。Ent53BおよびLnqQはグラム陽性細菌への広い抗菌スペクトルと強力な抗菌活性がすでに認められているが、種々の薬剤耐性腸球菌に対しても強い抗菌活性を示した。また、異種発現系を用い、ランダム変異および部位特異的変異によって構築したEnt53BおよびLnqQの改変体を評価したところ、一部の変異体で抗菌活性が低下した一方で、抗菌活性が大きく向上する変異も認められた。これらの結果より、Ent53BおよびLnqQの特定の位置あるいは特定のアミノ酸残基が抗菌活性に大きく影響することが見出された。Ent53BおよびLnqQの抗菌活性の評価はおおむね順調に進行した。また、多数のEnt53BおよびLnqQ改変体を構築することに成功し、その評価を進めることができた。抗菌活性の向上したEnt53BおよびLnqQの改変体を取得できたことに加え、Ent53BおよびLnqQの抗菌活性に必須な部位や重要なアミノ酸残基を見出すことができた。これらの結果は、Ent53BおよびLnqQについて今後さらに多剤耐性菌への抗菌活性・選択性の強化を図る上で重要な情報となる。

得られた多数の改変体について、その構造の確認を行うとともに、種々の細菌に対する抗菌活性を評価したところ、両バクテリオシンとも、その構造中のαへリックスの末端および近傍に位置するアミノ酸残基が抗菌活性に大きな影響を及ぼすことが明らかとなった。本研究室では、他にも環状バクテリオシンをはじめとする多くの新奇バクテリオシンを見出しており、今後、これらの成果をさらに展開・活用することで、多剤耐性菌への活性を強化した新たなバクテリオシン改変体の構築が期待できる。これまでの研究はおおむね順調に進展しているため、引き続き、Ent53BおよびLnqQの改変体の構築と評価を行い、多剤耐性菌への抗菌活性・選択性の強化を図る。構築と評価のサイクルをさらに進めることで、抗菌活性・選択性の一層の強化が図られる。また、抗多剤耐性菌活性を有する新奇バクテリオシンについて、本研究室が有する新奇乳酸菌バクテリオシンリソースからの探索、および新たな生産乳酸菌の探索を行う。将来的に、Ent53BやLnqQ、および種々の新奇バクテリオシンより得られる成果を総合することで、さらに効果的な抗多剤耐性菌活性をもつ抗菌ペプチドの設計・創出を図る。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。