hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ドキソルビシンによる心筋細胞障害の機序の解明とその予防

[目的]抗腫瘍薬であるドキソルビシンの副作用である心筋細胞毒性の機序とその予防について明らかにするために、ドキソルビシンの心筋細胞内カルシウム動態に及ぼす影響とこれに対するACE阻害薬の効果について実験を行なった。[方法]WKYラット新生児より酵素法を用いて単離した培養心筋細胞にドキソルビシン0.1μM,1μM,10μMを投与し、24時間後fura-2/AMを用い細胞内カルシウム濃度を測定した。β受容体刺激薬であるイソプロテレノールにより刺激し、その反応性についても測定した。また培養心筋細胞にACE阻害薬であるM-1を前投与しておき、ドキソルビシン10μMを投与した時の細胞内カルシウム濃度を測定した。β受容体刺激薬であるイソプロテレノールにより刺激し、その反応牲についても測定した。[結果]ドキソルビシンは濃度依存性に心筋細胞内カルシウムトランジエントのpeak ratio,amplitudeを低下させ、またタイムコースを延長させた。イソプロテレノールに対する反応性もドキソルビシンの濃度依存性に低下した。M-1の前投与により心筋細胞内カルシウムトランジエントのpeak ratio,amplitudeの低下とタイムコースの延長は改善された。イソプロテレノールに対する反応性の低下も改善した。[結論]ドキソルビシンは細胞内カルシウム濃度を低下させるだけでなくβ受容体刺激薬に対する反応性も低下させた。ACE阻害薬は、ドキソルビシンの心筋細胞毒性を予防する可能牲が示唆された。
インデックス生成関数の分解に関する研究

インデックス生成関数は連想メモリ(Content Addressable Memory:CAM)の機能を数学的に表現したものであり、インターネットのルータ、パターンマッチング回路などの設計で有用である。インデックス生成関数を用いると高速にパターンマッチングを実行可能である。申請者は、インデックス生成関数を複数のメモリやモジュール(IGU)に分解(分割)して実現する方法について研究を行った。関数分解では、列複雑度が重要である。重みkのインデックス生成関数を分解した際列複雑度を組み合わせ数学、および、モンテカルロ法を用いて予測する方法を求めた。1.インデックス生成関数の分解に関して国際会議(ISMVL-2018, SASIMI-2018)で発表した。2.インデックス生成関数の変数最小化に関して国際会議(ISMVL-2018,DATE-2019 Workshop)で発表した。3.インデックス生成回路の変数最小化システムを国際会議のブースで展示した(DATE-2019)。4.論理関数のアフィン同値性を高速に検出するアルゴリズムを開発した(SASIMI-2018)。5.海外から共同研究者を招聘し、インデックス生成関数の分解に関して理論的な研究を行った。6.線形関数を能率よく実現する方法を開発し国際会議で発表した(IWLS-2018).7. TCAMの故障を検出する方法を開発し、国際会議、学会論文誌(IWLS-2018、IEEE Trans. CAD 2018)に採択された。8.インデックス生成関数を表現するための変数の個数の平均値を導く公式を求めた(ISMVL-2018)。9.ニューラルネットワークをFPGAで効率よく実現する方法を開発し国際会議で報告した(ISCAS-2018)。10.日本のコンピュータの開発の歴史を国際会議で発表した(EUROCAST2019)。インデックス生成関数の分解に関しては、国際会議で採択された(ISMVL-2018, SAIMI-2019).また、インデックス生成関数を回路実現する際に必要である変数最小化の方法を大幅に改良した。インデックス生成関数の分解に関しては、今後も共同研究を続ける予定である。また、インデックス生成関数の変数最小化に関しても、改良を続ける。最終年度は、国際会議(ISMVL-2019:カナダ)と国際会議(IWLS-2019:スイス)で論文発表の予定であり、そのため旅費がかかり、研究費を殆ど使い切る予定である。さらに最終年度であるので研究の取りまとを行う予定である。重みkのインデックス生成関数を分解した際の列複雑度を組み合わせ数学、および、モンテカルロ法を用いて予測する方法を求めた。また、実用的回路でも実験を行った。1)インデックス生成関数を複数のIGUで実現する方法を開発し、学会論文誌(IEICE-2017)に掲載された。2)インデックス生成関数の変数最小化に関して、国際会議(ISMVL-2017, Novi Sad, Serbia)で招待講演を行った。3)インデックス生成関数の分解に関して幾つかの国際会議(IWLS-2017, SASIMI-2017)で発表した。この方法は、イデックス生成関数をメモリのみで実現する際に有用である。4)インデックス生成関数の分解に関する論文が、二冊の単行本に採録された。5)海外から共同研究者を招聘し、インデックス生成関数の分解に関して理論的な研究を行った。6)インデックス生成回路の高速書き換えに関する国際特許(JST補助:米国)が採択された。インデックス生成関数の分解に関しては、国際会議で発表した。また、以前、国際会議で発表した成果を発展させた論文は単行本に採録された。

8.インデックス生成関数を表現するための変数の個数の平均値を導く公式を求めた(ISMVL-2018)。9.ニューラルネットワークをFPGAで効率よく実現する方法を開発し国際会議で報告した(ISCAS-2018)。10.日本のコンピュータの開発の歴史を国際会議で発表した(EUROCAST2019)。インデックス生成関数の分解に関しては、国際会議で採択された(ISMVL-2018, SAIMI-2019).また、インデックス生成関数を回路実現する際に必要である変数最小化の方法を大幅に改良した。インデックス生成関数の分解に関しては、海外から研究者を招聘して今後も共同研究を続ける予定である。また、インデックス生成関数の変数最小化に関しても、改良を続ける予定である。インデックス生成関数の分解に関しては、今後も共同研究を続ける予定である。また、インデックス生成関数の変数最小化に関しても、改良を続ける。最終年度は、国際会議(ISMVL-2019:カナダ)と国際会議(IWLS-2019:スイス)で論文発表の予定であり、そのため旅費がかかり、研究費を殆ど使い切る予定である。さらに最終年度であるので研究の取りまとを行う予定である。国際会議の出費や滞在費の計算で誤差が出た。
コウモリによる能動的捕食行動の数理モデリング

コウモリは超音波を放射し、そのエコー(反響音)にもとづいて獲物や障害物を感知する。例えば、日本国内に多く生息するアブラコウモリは、一晩に数百匹もの昆虫を捕食することが知られている。このように大量の餌を効率よく捕食するには、短時間でいかにロスなく接近し捕食していくかが重要と考えられる。本課題では、コウモリの飛行経路選択に関わる非線形ダイナミクスの研究を行う。今年度は、これまでに考案した2次元飛行モデルを3次元空間に拡張し、1匹のコウモリが2匹の餌を追いかける状況を数値シミュレーションにより調べた。その結果、近接個体に加えて遠方の個体の空間情報を使ったほうが、両者の捕食確率が高くなることがわかった。また、野外での計測データから数理モデルの未知パラメータを推定し、実際のコウモリが捕食確率を高める行動をとっていることを示した。上記の研究成果は、査読付き学術論文として投稿しアクセプトされた次に、コウモリの超音波放射に注目した研究を行った。具体的には、コウモリが自身の飛行方向に加えて、超音波の放射方向も動的に制御すると仮定し、両者のダイナミクスを記述する数理モデルを提案した。この数理モデルを用いた数値シミュレーションにより、餌を見失わずに捕食していく条件を調べた。さらに、野外での計測データから数理モデルの未知パラメータを推定し、数値シミュレーションの結果と比較した。上記の研究成果は、査読付きの国際会議論文として公開した。翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。コウモリの捕食行動時の飛行方向とパルス放射方向のダイナミクスを数理的に研究した。これまでに取り組んできた飛行方向に関する研究成果(I. Aihara et al., PLOSONE, 2013)を拡張し、飛行方向とパルス放射方向の変化を記述する数理モデルを提案した。具体的には、コウモリが四方を壁に囲まれた空間で飛行する状況を考え、壁からの距離と角度に応じて飛行方向とパルス放射方向を変化させると仮定した。この数理モデルを解析し、実験的に観測された八の字型飛行経路とパルスの放射特性を再現した。この研究成果は、査読付学術論文としてIEICE Nonlinear Theory and Its Applicationから出版された。また、野外でのコウモリの捕食行動をマイクロフォンアレイにより計測し、その際の探索範囲を記述する数理モデルを研究した成果が、査読付学術論文としてJournal of the Acoustical Society of Americaから出版された。一方で、コウモリを初めとする夜行性動物の野外での音響計測には技術的な課題が多い。そこで、様々な動物の音響計測への応用が期待される、マイクロフォンアレイシステム、音声可視化システム、時系列データ解析法に関する研究を進めた。これらの計測技術の応用可能性を広く検討するために、種々の学会・研究会に参加し、研究発表および情報収集を行った。コウモリの行動はこれまで室内実験や野外観測により活発に研究されてきたが、その洗練された行動原理の数理研究はほとんど行われていない。平成26年度は、コウモリのエコーロケーション行動の重要なファクターである、飛行方向とパルス放射方向のモデル化に取り組み、実験的に観測された行動特性の説明に成功した。また、野外での探索行動についても新たな数理モデルを考案し、野外での探索行動が効率的であることを示した。以上の研究成果は、査読付き学術論文2編などとして平成26年度に公開した。以上から、当初の計画以上に進展していると評価できる。平成26年度の成果を拡張し、実際の野外でのコウモリの行動特性の数理解析を進めていく。具体的には、餌が複数存在する場合に捕食に効率的な運動特性、複数のコウモリが連動して餌を捕食する際の集団行動特性をターゲットに、数理的・実験的研究を進めて行く。
遺伝子変換マウスを用いた個体薬理・生理学研究

本研究では主に遺伝子ノックアウトマウスの解析を通して、プロテインチロシンホスファターゼζ(PTPζ)とNa_xイオンチャンネルの関わる生命現象とその分子・細胞機構を明らかにすることを目指す。本年度の研究成果は以下の通りである。1.基質分子中の基質サイトの同定PTPζの基質分子中の基質サイトの同定については、昨年度p190 RhoGAP中のY1105が明らかになったが、本年度はGit1(ArfGAP)とMagi1について、そのサイトを決定した。2.PTPζ遺伝子ノックアウトマウスのメタンアンフェタミンに対する不感受性の分子機序について、ドーパミン・トランスポーターの細胞内への取り込み能について細胞生物学的解析を行なった。3.眼におけるPTPζのisoformの多様性について解析を行なった結果、受容体型PTPζがsheddingを受けている可能性が明らかになった。1.昨年度Na_xとNa^+,K^+-ATPaseのα1サブユニットが結合していることを見出したが、その後この結合が細胞内Naレベルの上昇に応答してNa^+,K^+-ATPaseが活性化するために必要であることが明らかになった。また、Na_x陽性細胞ではNa^+,K^+-ATPase活性化の結果、糖代謝の増加、並びに乳酸の産生と分泌が上昇することが確認された。2.マウスの尿中におけるバソプレッシン量を測定する系を確立した。本研究では主に遺伝子ノックアウトマウスの解析を通して、プロテインチロシンポスファターゼζ(PTPζ)とNa_x、イオンチャンネルの関わる生命現象とその分子・細胞機構を明らかにすることを目指す。1.基質分子の同定2.ドーパミン(DA)神経系ノックアウトマウスのDA神経系に異常があることを、新奇環境下の行動異常、メタンアンフェタミンに対する応答性の異常、マイクロダイアリシス解析等から同定した。3.記憶・学習13週齢以上のノックアウトマウスにおいて、海馬CA1領域のLTPに亢進が見られること、Morris water mazeによる空間学習に障害が見られることを見出した。脳室周囲器官においてNa_xを発現する細胞がastrocyteとependymalcellであることを明らかにした。2.ノックアウトマウスの塩分摂取行動異常の回復アデノウイルスベクターを用いて、ノックアウトマウスの脳にNa_x遺伝子を導入・発現させる実験によって、脳弓下器官に導入した時にのみ、塩分の摂取行動が正常に復することを見出した。1.基質分子中の基質サイトの同定2.PTPζのリガンド分子による調節機構PTPζは2量体化によって不活性化されることが、基質分子のリン酸化レベルを指標にすることによって初めて明らかになった。3.記憶・学習PTPζ遺伝子ノックアウトマウスは恐怖条件付学習において、cued hear conditoningは正常であるが、contexual fear conditioningが障害されていること、ノックアウトマウスでは海馬CA3領域において学習時におけるp190 RhoGAPのチロシンリン酸化の低下が認められないことを見出した。1.機能的発現系の開発C6グリア細胞を用いて、Na_xチャンネルの機能的発現に成功した。相互作用分子としてNa^+, K^+-ATPaseのαサブユニットを同定し、Na_xと本分子の関係を解析しつつある。Na_x活性化によるNa^+イオンの流入は本分子を活性化することが予想され、Na_xの発現するグリア細胞のエネルギー要求性を亢進させていると考えられる。
高速計算を用いた力学的ストレスのリアルタイム評価に基づく下肢障害の予防と訓練

本研究では下記の課題を達成し、走行動作中に下肢に作用する力学的ストレスに関する情報を利用したトレーニングを可能にした。(1)歩行・走行等の下肢動作を行っている際に筋骨格系に作用する力学的ストレスを、コンピュータシミュレーションの技術を用いてリアルタイムに評価することを可能にした。(2)得られた結果に基づいてリアルタイムなバイオフィードバックを行い、使用者の身体に作用するストレスを呈示することを可能にした。(3)その認識に基づいて、バイオフィードバックを実施しながら走行動作のトレーニングを行い、よりストレスの小さい動作様式を身につけること可能にした。今年度は主として下記二つのトピックについて研究を推進し成果を挙げた。(1)使用者の意図を推定するインテリジェント・トレッドミルを開発し、その有効性を検証した。研究のプラットフォームとしてはカセンサを内蔵したスプリットベルト・トレッドミルを用いた。様々な一定速度で歩行・走行動作を行った際の床反力を計測し、そのデータと歩行・走行速度との関係性を調べた。特に床反力推進成分の力積、遊脚時間、立脚時間に着目し、これらのデータに基づいて使用者の意図する歩行・走行速度を推定する重回帰式を作成した。この重回帰アルゴリズムをトレッドミルに実装した検証実験では全ての被験者が自在に歩行・走行速度を調節できた。これによって従来のボタンやタッチパネルを用いたインターフェースによらず、より自然な歩行・走行に近い動作をトレッドミル上で実現できるようになった。(2)走行動作における障害(ランニング障害)を予防するために、走行運動時の床反力の初期ピーク値と脚部のスティフネスに着目し、バイオフィードバックを用いてこれらの値を調節する可能性について実験研究を行った。(1)と同様のカセンサ内蔵のトレッドミル上を走る際の床反力を計測し、得られたデータから床反力の初期ピーク値を計算した。また、質量ばねモデルに基づいて脚部のスティフネスをリアルタイムに推定した。これらの結果を視覚情報として即時に被験者に与えるバイオフィードバックを行った.その結果視覚フィードバックにより走行動作様式が明確に変化する事が明らかになった。この成果は本研究が目指すランニング障害の予防に大きな貢献を出来る可能性がある。今年度は主として下記3つのトピックについて研究を推進し成果を挙げた。(1)初年度に開発したバイオフィードバックの技術を用いて、踵接地時の衝撃力を低下させる走行動作を被験者にトレーニングして頂いた。その後にこの動作のバイオメカニクス的特性を明らかにした。手法としてはモーションキャプチャーを用いた。得られた床反力データと身体のキネマティクスデータから逆動力学解析を実施して、関節で発揮されるトルクおよび筋張力を計算した。これにより、踵接地時に衝撃力を低下させる場合には足関節底屈筋群がより顕著な活動をし、足関節においては底屈モーメントが発揮され、爪先に近い位置で接地が行われる事が明らかとなった。(2)歩行動作を実施している際の身体分節の加速度を、小型・軽量・ウェアラブルな無線センサを用いてリアルタイム計測した。このデータを解析することで、歩行動作時に身体に作用する力学的ストレスを詳細に評価することが可能となった。また床反力に由来する衝撃力とこれらのデータを統合して処理することで、関節構造を経過する毎に衝撃が緩和されていく様相が明らかとなった。(3)ランニング動作をしている際の心拍数をリアルタイム計測し、これに基づいてトレッドミルの速度を制御するシステムを構築した。安静時においても運動時においても心拍数にはゆらぎがあることが知られているが、本研究ではこれらのゆらぎの影響を受けずにロバストに運動強度を調整できるアルゴリズムを開発した。これによってダイナミックに運動強度(走行速度)を調整し、目的とする運動プログラムを実施できる様になった。本年度は以下の3つのトピックにおいて成果を挙げた。1.走行時に脚部に作用する力学的ストレスを詳細に評価した。比較的遅い速度から比較的速い速度まで段階的に走行速度を変化させ、その際に足部と床との間に作用する力(床反力)、並びに足部・下腿部・大腿部・骨盤部・頭部に作用する加速度を計測した。床反力の計測には力センサ内蔵のトレッドミルを用い、加速度の計測には小型・軽量・ウェアラブルな加速度センサを用いた。その結果、(1)加速度は足部から頭部にかけて小さくなっていく、(2)加速度の変動性も同様に足部から頭部にかけて小さくなっていく、(3)加速度の値・変動性ともに速度の増加に伴い大きくなる、という事が明らかとなった。2.リアルタイムな心拍計測の値に基づいてベルト速度を調節するインテリジェントなトレッドミルを作成した。このシステムを用いる事で、任意の運動強度での走行・歩行動作を実現する事ができる。走行・歩行の運動の際に、最大心拍数のX%という形で運動強度を設定する手法が良く用いられる。しかし実際には走行・歩行動作中に心拍数が変動するためこれを厳密に実現するのは容易ではない。

本研究ではリアルタイムな心拍計測値に基づいて、心拍数がターゲットとする範囲より小さい際にはトレッドミルの速度を増加させ、逆に心拍数がターゲットとする範囲より大きい際にはトレッドミルの速度を低下させるアルゴリズムを構築した。これを用いる事で任意の運動強度での走行・歩行動作を容易に実現できる様になった。3.走行・歩行動作中に全身の筋が発揮する力を推定する事を可能にした。推定には動作解析の手法を用いる。全身の動作をモーションキャプチャーし、逆運動学計算・逆動力学計算を実施する。これにより全身の関節が発揮するトルク、並びに全身の筋が発揮する力を計算する事が可能となった。26年度が最終年度であるため、記入しない。バイオメカニクス26年度が最終年度であるため、記入しない。走行機能を評価するためのプラットフォームとして活用できるインテリジェント・トレッドミルを開発した。またこのトレッドミル上での走行動作中に下肢に作用する力学的ストレスをリアルタイム評価してバイオフィードバックするシステムを構築した。更にその有効性を実験的に検証した。成果は既に複数の論文や国際・国内学会発表としてまとめており、これは当初の計画以上に進展していると判断できる。これまでに開発したバイオフィードバックの技術を活用し、フィードバックトレーニングを行うことでどのように動作特性が変化するかを明らかにした。また、より拘束の少ない環境でのデータ取得を可能にするため、ウェアラブルなセンサを用いた研究にも取り組み、成果を挙げた。さらに心拍数を考慮することで生理学的なストレスについても考察を行える様にした。今後は以下のトピックに取り組む。(1)バーチャル・リアリティの技術を活用し、より直観的で定量的にも正確なバイオフィードバックの手法を開発し活用する。(2)様々な被験者の歩行・走行動作を筋骨格系モデルを用いて詳細に解析し、その動力学的特性を明らかにする。(3)本研究で開発したシステムの効果を検証する。今後は走行動作において、身体各部位に作用する力学的ストレスの様態と走行速度との関係を明らかにする。身体各部位に作用するモーメントや衝撃力の値の大きさだけでなく、値の変動性にも着目し、より負荷の少ない走行トレーニングを可能にするシステムを構築する。床反力計を内蔵するトレッドミルと、小型・軽量・ウェアラブルな慣性センサを用いてリアルタイムな計測と評価を実現する。また、平成26年度は本研究の最終年度であるため、多数の被験者を用いた検証実験も実施する。これまでに開発したシステムや計測・評価アルゴリズムの有効性を検証する。
各種皮膚疾患におけるエラスチンm-RNAのスプライシングの違いに関する研究

本年度は、(1)エラスチン代謝異状で疑われている皮膚疾患(弾力線維性仮性黄色腫.早老症など)及び(2)皮膚線維性腫瘍について、(1)病的な異状の有無(2)'良性悪性の鑑別点となるパターンが存在するか否かについて明らかにすることを目的とした。まず生検材料、手術材料よりm-RNAを抽出し(腫瘍部or病変部、周辺正常部)C-DNAを合成後、エラスチン遺伝子の中のエクソン22,23,24,26A,32,33のスプライシングを検索するために設定したプライマーを用いて、PCR法を行った。電気泳動により、合成産物の塩基長の違い、パターン、特定バンドの消失の有無を調べた。本年度は、上記(1)に相当する患者がいなかったため、(2)については皮膚線維腫、持久性隆起性皮膚線維肉腫について検討した。その結果、両者側に今のところ明らかに有意と思われる違いを見い出すことはできないでいる。この点についてはさらに他のエクソンについての検討や、また点突然変異などの微小な変化の存在している可能性もあり、症例を増やすと共に上記の点について検討を進めている。
腫瘍領域に高発現する亜鉛トランスポーターの役割解明と治療標的としての可能性の探求

本研究は、腫瘍病態において病理的役割を果たしている亜鉛トランスポーターの探索とその作用機構の解明を目的としている。生体にとって亜鉛は必須微量元素であり、鉄に次いで二番目に多く含まれている。亜鉛の欠乏や体内分布のバランスの破綻は、種々の疾患を結びついている。亜鉛トランスポーターは亜鉛の生体内恒常性の維持を担うと共に亜鉛の輸送を介して種々の細胞機能の制御に関わる。細胞内小器官から細胞質へ亜鉛を輸送する亜鉛トランスポーターZIP7が腸上皮恒常性の維持に必須であり、そのメカニズムの一つとして小胞体ストレスの解消を介しての腸上皮幹細胞の維持と前駆細胞の増殖を担っていることを見出していた。本年度は、ZIP7を過剰する大腸がん発現株の樹立を行なった。ヒトZIP7遺伝子を組み込んだレンチウイルスを作製し、HCT116株、HT29株、SW480株の大腸がん細胞株へこれらのウイルスを感染させた後、ブラスチサイジンによる薬剤処理により薬剤耐性株を得た。ウエスタンブロットによる解析からこれらの薬剤耐性株はZIP7の発現が亢進していることを確認した。これらのZIP7発現亢進細胞を用いて、がん細胞性へのZIP7発現亢進の影響について検討を行い、ZIP7の発現の変動により影響を受けるがん細胞性質の特徴化を進めている。加えて、亜鉛トランスポーターの発現変動によるがん細胞機能変化の分子機構を明らかとするため、現在、RNA-seqを用いた遺伝子発現解析を行なっており、次年度へ継続して解析を実施する予定である。亜鉛トランスポーター過剰発現株の樹立が完了した。これを用いたがん細胞機能解析を実施し、亜鉛トランスポーターの発現の変動が影響を及ぼすがん細胞機能の特徴化を行なっており、更に、この作用機構の解明に向けての解析に着手しており、研究は概ね順調に進展している。次年度は、ZIP7のがん細胞機能への寄与における詳細な作用機構を分子レベルでの解析を進め、ヒト臨床例と用いての解析を計画している。生体にとって亜鉛は必須微量元素であり、亜鉛トランスポーターは亜鉛の生体内恒常性の維持を担う。亜鉛トランスポーターは亜鉛の輸送を介して種々の細胞機能の制御に関わること、この亜鉛トランスポーターの機能破綻は様々な病態形成と繋がりうることが示唆されている。本研究は、腫瘍病態において病理的役割を果たしている亜鉛トランスポーターの探索とその作用機構の解明を目的として行なっている。これまで、亜鉛トランスポーターZIP7が腸上皮恒常性の維持に必須であり、そのメカニズムの一つとして小胞体ストレスの解消を介しての腸上皮幹細胞の維持と前駆細胞の増殖を担っていることを見出している。大腸がんにおける亜鉛トランスポーターZIP7の役割について検討を行った。大腸がん細胞株であるHCT116, HT29, SW480株を用いた検討から、これらの細胞株はどれもZIP7を高発現していることが分かった。大腸腫瘍形成におけるZIP7の寄与を調べるため、これらの細胞株においてZIP7をノックダウンし、免疫不全マウスへの移植実験を行った結果、ZIP7ノックダウン細胞から形成された腫瘍は対照と比較して著しくサイズ、重量共に小さく、ZIP7は腫瘍形成に促進的に寄与することが示唆された。加えて、ZIP7のノックダウンは細胞増殖を著しく抑制し、ZIP7のノックダウンによりアポトーシスが惹起されることから、ZIP7の発現低下によりアポトーシス性の細胞死の誘導による細胞増殖抑制が起こり、この機構が腫瘍形成の抑制に寄与していることが示唆された。概ね計画に沿って進行している。本年度、亜鉛トランスポーターZIP7の大腸がん細胞増殖と腫瘍形成における役割を見出した。今後は、この機能の分子メカニズムを解析すると共に、ヒト臨床例と用いての解析を計画している。

次年度は、ZIP7のがん細胞機能への寄与における詳細な作用機構を分子レベルでの解析を進め、ヒト臨床例と用いての解析を計画している。RNA-seq解析費用とRNA-seq解析結果を受けての検証費を予定していたが、予定より解析費用が低かったことと、複数の細胞種についての解析と検証の順番に少しの変更を行なったことにより、検証にかかる実験費用の支出が次年度になったため次年度使用額が生じた。
日本近世煎茶書の研究　―漢籍受容と文人趣味の展開

本研究は、日本近世の煎茶書を主な研究対象として、以下3つの疑問を明らかにすることを目指す。(1)日本の煎茶書が中国の茶書からどのような内容、どの時代の作品を中心に受容したのか。本研究は煎茶書の成立過程を解明する。(2)江戸中後期の煎茶家が、抹茶家を批判するために様々な改革意見を提出した。そのような意見に対して、本研究は当時の社会の文化・教育・芸術など多方面の視点から考察を行い、煎茶家の主張と立場を検討する。(3)明治以降、煎茶嗜好が文人趣味・骨董趣味として、一時的に全国に普及した。本研究は煎茶の趣味が全国に展開するまで、どのような発展を経たのか、その変容過程を明らかにする。
非晶質を介する新奇充放電機構を有するナトリウム二次電池用金属硫化物材料の創製

全固体ナトリウム二次電池は、高安全・低コストな次世代の大型二次電池として期待されている。実用化の課題の一つとして、高エネルギー密度の電極材料の開発が挙げられる。研究代表者はこれまでに、リチウム二次電池用の金属多硫化物系電極材料を開発してきた。開発した金属多硫化物系電極材料においては、硫黄の酸化還元、遷移金属の配位数変化、非晶質/結晶間の可逆構造相転移などを含む新奇な充放電機構を有することを明らかにしてきた。本研究においては、これらの知見のナトリウム二次電池への展開を目指し、新物質の開拓から検討を始めた。初年度はNa2TiS3の組成に着目し、新物質を探索した。Na2SとTiS2を1 : 1のモル比で混合した後、500°Cでの固相反応、溶融急冷、遊星型ボールミル装置を用いたメカノケミカル合成の3種類の手法を用いてNa2TiS3組成の化合物を合成した。固相法で合成した場合、ナトリウムが八面体サイトを占有するNa2TiS3が得られることが分かった。溶融急冷法によって合成した場合、ナトリウムが三角柱サイトを占有する新結晶相のNa2TiS3が得られることが分かった。この新結晶相はNa2TiS3の高温相であると考えられる。さらに、メカノケミカル法を用いた場合は非晶質Na2TiS3が得られた。得られた3種のNa2TiS3を用いてナトリウム全固体セルを作製し、電極特性の評価を行った結果、すべての材料において、室温で可逆的に作動することが分かった。急冷法で作製したNa2TiS3では、理論容量の280 mAh g-1での可逆充放電が確認された。急冷法で作製したNaA2TiS3が最も高い導電率を示すことが、高い電極性能の要因であると考えられる。Na2TiS3の新規結晶相の開発し、全固体電池用高容量電極活物質としての高いポテンシャルを見出したため。Na2TiS3の高温相、低温相、非晶質相のキャラクタリゼーションを進める。それぞれの物質の結晶構造解析を始めとする構造解析、電解液を用いたセル及び全固体セルでの電極特性の評価、充放電時の構造変化の評価を進める。大容量発現のメカニズムの解明を目指す。さらに、非晶質相のポストアニール、Na-TiーS系の組成探索や中心金属の変更を行うことで新物質の探索も続ける。予算執行率は86%であり、おおよそ当初の予定通りの予算執行を行った。人件費・謝金に10万円計上していたが、使用する必要が生じなかった。
慢性掻痒時の活性化アストロサイトによる痒み増強の神経回路メカニズムの解明

慢性的痒みは睡眠障害、過度の肉体疲労、精神的ストレスをもたらしQOLを著しく低下させることから、その制御はきわめて重要な課題である。当研究室では、脊髄後角に存在するアストロサイトの活性化及び産生されるLipocalin-2 (LCN2)が、慢性的な痒みのメカニズムにおいて重要な役割を担うことを明らかにしている。この活性化アストロサイトによる痒みの増強メカニズムを明らとする目的で、昨年度は脊髄後角でかゆみ伝達に重要な神経細胞であるgastrin-releasing peptide receptor(GRPR)陽性神経に着目し、接触性皮膚炎モデルマウスにおいてGRPR陽性神経の痒み伝達物質(GRP)に対する応答性が著明に増強していることを明らかとした。今年度は慢性掻痒時に増強される痒み伝達のメカニズムを明らかとするため、アストロサイトの活性化に重要な転写因子であるSTAT3に着目した。脊髄後角のSTAT3機能を抑制する目的で、ドミナントネガティブSTAT3(dnSTAT3)をアストロサイト特異的に発現させるウイルスベクターを用いて検討を行った。dnSTAT3マウスでは慢性掻痒モデルマウスで認められるアストロサイトの活性化が著明に抑制されており、さらに接触性皮膚炎による痒み行動や皮膚炎が慢性期において優位に抑制された。さらに接触性皮膚炎で増強されるGRPR陽性神経の痒み伝達物質(GRP)に対する応答性がコントロールレベルまで減少した。このマウスでは、過去に特定したアストロサイト産生因子であるLCN2のmRNAが著明に減少していることから、GRPR陽性神経の神経伝達増強にLCN2が関与することが示唆された。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。本研究の目的は、脊髄後角に存在するアストロサイトの活性化及び産生されるLipocalin-2 (LCN2)が、慢性的な痒みのメカニズムにおいて脊髄後角のかゆみに関わる神経回路をどのように変調させるのかを明らかとすることである。今年度は脊髄後角でかゆみ伝達に重要な神経細胞であるgastrin-releasing peptide receptor(GRPR)陽性神経に着目して、慢性掻痒時の活性化アストロサイトによるかゆみ感覚の増強メカニズムに関して研究を行った。GRPR陽性神経を蛍光標識するGRPR-eGFPマウスを用いて免疫組織染色を実施したところ、GRPR陽性神経は脊髄後角表層(I-II層)に局在し、その多くが興奮性介在神経であった。次に、同マウスを用いてパッチクランプ記録を行い、GRPR陽性神経の膜電位応答特性や形態学的な特徴づけを行った。GRPR陽性神経の8割近くが興奮性神経に特異的な発火特性であるdelayed firingもしくはtransient firngを示し、免疫組織化学的手法による結果と一致した。また形態学的な解析からGRPR陽性神経の6割近くが、樹状突起を背側から腹側へ伸ばし、軸索を背側に伸ばして脊髄後角の投射神経に興奮性のシグナルを伝達するvertical cellに分類された。さらに、同マウスを用い接触性皮膚炎モデルを作製し、GRPR陽性神経のGRPに対する応答性を調べたところ、モデルマウスではコントロールマウスと比較してGRPに対する応答性が著明に増強していた。また、慢性掻痒時に脊髄アストロサイトから産生されるLCN2を脊髄スライスに還流処置すると、GRPR陽性神経に誘起されるグルタミン酸性の興奮性シナプス伝達が増強された。以上の結果から、GRPR陽性神経の生理学的な特徴及び、病態時におけるGRPに対する応答性の変化を明らかとした。かゆみ特異的な神経細胞であるGRPR陽性神経を蛍光標識するマウスを用いて、電気生理学的な解析を実施した。GRPR陽性神経の電気生理学的な特性や、形態学的な特徴づけを行った。さらに、このマウスを用いて接触性皮膚炎モデルを作成するとGRPに対する応答性が同神経において増強されることを明らかとした為。

今年度は、GRPR陽性神経の生理学的な特徴づけと病態における変化を明らかとした。今後は、病態で見られた変化に関して、アストロサイト及び産生されるLCN2に着目して検討を行う。具体的には、アデノ随伴ウイルスベクターを用いてアストロサイトの活性化やLCN2の発現を抑制した際のシナプス応答やGRPR陽性神経のGRPに対する応答性について詳細に検討を行う。さらに、LCN2によるかゆみの増強メカニズムについて、GRPR陽性神経はヘテロな集団であることから、それぞれの細胞に関して、reconbinant LCN2に対する応答性を、パッチクランプ法でさらに詳細な解析を続ける。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
餌料生物「ワムシ」の耐久卵休眠・孵化機構の解明と大量保存技術への展開

平成8年度耐久卵の休眠・孵化機構シオミズツボワムシ(以下ワムシ)の耐久卵休眠期の内部形態を組織学的に調べると共に、光の強さと波長が耐久卵の孵化に与える影響について検討した。両性生殖発現頻度が高いNHIL株(L型ワムシ)が形成した耐久卵を材料とした。両性生殖雌虫によって産出された直後(0日目)のものから内因性休眠が終了する8日目までの耐久卵を2日毎に採取し、Karnovsky液と1%オスミウム酸で二重固定した。その後樹脂で包埋し、1μm厚の切片を作成した。切片はトルイジンブルーで染色した後、光学顕微鏡下で観察した。次に形成後暗黒下で15日以上保存し、外因性休眠期にある耐久卵を孵化に適した水温25°C、塩分16ppt下におき、ハロゲンランプまたは紫外線ランプと色ガラスフィルターの組み合わせにより、光の強さ(3.5-99μE/S・m2の間に6段階)と波長(250-700nmの間に9段階)調節のもとに照射して孵化率を求めた。休眠期間を通じて耐久卵の細胞質は多核体であると推察された。産出後2,4,6日目の受精卵の核数は、それぞれ22,20(各々n=1)で、休眠中に増加する傾向がみられた。また二次卵膜も休眠中に徐々に厚くなることが分かり、厚さ(μm)は1.2(0日目)、2.0(2日目)、3.2(4日目)、3.7(6日目)、4.0(8日目)(各々n=10)だった。耐久卵は孵化の準備が整っても暗黒下では孵化せず、77μE/S・m2(20分)以上の光照射で孵化した。また波長350nm以上では孵化率は1-25%で、照射波長が長くなると共に低下したのに対し、波長250-310nmでは孵化率は50-60%に達した。過酸化水素の添加(1700μmol/l)により暗黒下でも孵化が起こったことから、光照射にともなう活性酸素の生成が休眠卵孵化の一因となっていると推察された。平成9年度ワムシ耐久卵の缶詰保存耐久卵の卵膜に細菌が感染すると孵化率が低下することが明らかになった。これは休眠を終了した卵がガス交換鋼管をおこなうために役立つ、二次卵膜表面の0.1μm径の多数の孔が、細菌により覆われて機能しなくなるためである。そこで、ステージが異なり、細菌の感染を受けた耐久卵を材料として、薬剤処理(抗生物質、抗菌剤等)や乾燥・凍結処理が卵の孵化能力にどのような影響を与えるか調べた。その結果、休眠期間が1ヶ月以内の卵では、0.5ppmホルマリン、5ppbテトラサイクリン、5ppbオキシテトラサイクリンでも孵化能力を回復させることができたが、5年以上休眠させた卵では効果がみられなかった。一方、1ppm次亜塩素酸ソーダと5ppbニフルスチレン酸ナトリウムでは卵の休眠期間によらず不可能力を回復させる効果がみられた。次に、真空凍結乾燥処理を施した卵を低真空度下で缶詰化することを最終的な目的とし、そのために必要な知見として、長期保蔵実験を行い、最適な乾燥条件、凍結条件、保蔵時での圧力を求めた。その結果、耐久卵は水洗後、恒温器(20°C)内で24時間予備的に乾燥したのち、凍結することが必要で、凍結温度は-20、-35、-80°Cいずれでも解凍後の孵化率に影響を与えなかった。その後、真空度を変えて(21-101KPaに7段階)缶詰を作成し、この状態で6ヶ月保存した後、孵化率を調べたところ、88および101kPaで孵化率の低下があったものの、他では処理前の孵化率を維持できた。また12ヶ月保存では61kPaのとき最高孵化率35%を得た。処理前の耐久卵の水分含量は77.8%だったが、凍結乾燥後には7.8%となった。

産出後2,4,6日目の受精卵の核数は、それぞれ22,20(各々n=1)で、休眠中に増加する傾向がみられた。また二次卵膜も休眠中に徐々に厚くなることが分かり、厚さ(μm)は1.2(0日目)、2.0(2日目)、3.2(4日目)、3.7(6日目)、4.0(8日目)(各々n=10)だった。耐久卵は孵化の準備が整っても暗黒下では孵化せず、77μE/S・m2(20分)以上の光照射で孵化した。また波長350nm以上では孵化率は1-25%で、照射波長が長くなると共に低下したのに対し、波長250-310nmでは孵化率は50-60%に達した。過酸化水素の添加(1700μmol/l)により暗黒下でも孵化が起こったことから、光照射にともなう活性酸素の生成が休眠卵孵化の一因となっていると推察された。平成9年度ワムシ耐久卵の缶詰保存耐久卵の卵膜に細菌が感染すると孵化率が低下することが明らかになった。これは休眠を終了した卵がガス交換鋼管をおこなうために役立つ、二次卵膜表面の0.1μm径の多数の孔が、細菌により覆われて機能しなくなるためである。そこで、ステージが異なり、細菌の感染を受けた耐久卵を材料として、薬剤処理(抗生物質、抗菌剤等)や乾燥・凍結処理が卵の孵化能力にどのような影響を与えるか調べた。その結果、休眠期間が1ヶ月以内の卵では、0.5ppmホルマリン、5ppbテトラサイクリン、5ppbオキシテトラサイクリンでも孵化能力を回復させることができたが、5年以上休眠させた卵では効果がみられなかった。一方、1ppm次亜塩素酸ソーダと5ppbニフルスチレン酸ナトリウムでは卵の休眠期間によらず不可能力を回復させる効果がみられた。次に、真空凍結乾燥処理を施した卵を低真空度下で缶詰化することを最終的な目的とし、そのために必要な知見として、長期保蔵実験を行い、最適な乾燥条件、凍結条件、保蔵時での圧力を求めた。その結果、耐久卵は水洗後、恒温器(20°C)内で24時間予備的に乾燥したのち、凍結することが必要で、凍結温度は-20、-35、-80°Cいずれでも解凍後の孵化率に影響を与えなかった。その後、真空度を変えて(21-101KPaに7段階)缶詰を作成し、この状態で6ヶ月保存した後、孵化率を調べたところ、88および101kPaで孵化率の低下があったものの、他では処理前の孵化率を維持できた。また12ヶ月保存では61kPaのとき最高孵化率35%を得た。処理前の耐久卵の水分含量は77.8%だったが、凍結乾燥後には7.8%となった。1.耐久卵の休眠機構【目的】シオミズツボワムシ(以下ワムシ)の耐久卵休眠期の内部形態を組織学的に調べると共とに、光の強さと波長が耐久卵の孵化に与える影響について検討した。【方法】両性生殖発現頻度が高いNH1L株(L型ワムシ)が形成した耐久卵を材料とした。両性生殖雌虫によって産出された直後(0日目)のものから内因性休眠が終了する8日目までの耐久卵を2日毎に採取し、Karnovsky液と1%オスミウム酸で二重固定した。その後樹脂で包埋し、1μm厚の切片を作成した。切片はトルイジンブルーで染色した後、光学顕微鏡下で観察した。次に形成後暗黒下で15日以上保存し、外因性休眠期にある耐久卵を孵化に適した水温25°C、塩分16ppt下におき、ハロゲンランプまたは紫外線ランプと色ガラスフィルターの組み合わせにより、光の強さ(3.5-99μE/S・m2の間に6段階)と波長(250-700nmの間に9段階)調節のもとに照射して孵化率を求めた。【結果】休眠期間を通じて耐久卵の細胞質は多核体であると推察された。産出後2,4,6日目の受精卵の核数は、それぞれ22,20,(各々n=1)で、休眠中に増加する傾向がみられた。
蛋白質立体構造を用いたゲノム塩基配列変化の機能解析のための情報科学的基盤の構築

本研究では大規模ゲノム解析の結果得られる大量のゲノム塩基配列変化(バリアント)の機能解析のために、非同義変異の効果をProtein Data Bank (PDB)の蛋白質立体構造を用いて推定する手法を開発している。今年度はまずゲノムバリアントの座標情報から対応するPDBエントリの残基を検索する手法を開発した。加えてPDBの立体構造について機能解析に必要な二次構造や埋もれ度、タンパク質間相互作用、低分子との相互作用などの重要な構造的特徴を各残基について計算し、バリアントの機能注釈として利用可能なデータベースを作成した。これらの注釈をゲノム解析において一般的に用いられるVCFフォーマット等で記述されたゲノムワイドのバリアントデータについて高速で付与する手法を開発した。この手法を用いて東北メディカル・メガバンク機構で解析された日本人のバリアントや、世界の様々な集団のゲノム解析の集合体であるgnomADのバリアントなどについて立体構造を用いた評価を行った。その結果、健康な個人のゲノムに存在するタンパク質の構造や機能に影響しうる多数の非同義バリアントを同定することができた。また、PDBは毎週新規のタンパク質立体構造が登録されることがあり、常に最新の更新情報を利用できるようにすることで、既存のバリアント情報から新しい発見が生まれる可能性がある。この点について開発手法について毎週アップデート可能な機能を構築して、構造生物学情報を用いたゲノムバリアント解析の高度化を目指した。ゲノム非同義バリアントのタンパク質立体構造を用いた機能アノテーション手法の開発について以下のような進捗を得た。(1)立体構造検索:ヒト参照ゲノム配列の塩基配列変化を蛋白質コード領域情報を用いてヒト蛋白質配列変化への変換を行う機構を作成した。ヒトの蛋白質配列とPDB立体構造のアミノ酸配列の網羅的対応付けをBLASTを用いて行った。これらの情報からゲノム座標とPDB立体構造の残基の対応のデータベース構築を行った。(2)構造情報からの特徴抽出と統合化:二次構造、埋もれ度、溶媒接触表面積、水素結合、天然変性領域などの計算をすべてのPDB構造に対して行った。また、リガンドや他の蛋白質サブユニットとの相互作用の定量化した。これらの構造特徴量をデータベースに追加して拡張し、複数の構造特徴量情報の統合解析を可能とした。(3)ゲノムワイド解析:ゲノム解析結果(VCFファイル等)への高速なアノテーション方法および残基の構造特徴によるゲノムワイド変異の絞り込みアルゴリズムを構築した。(4)アップデート機能作成:ゲノム配列とPDB立体構造残基、構造特徴量のデータベースの更新機能を作成し、PDBエントリごとに登録日情報による管理とタイムスタンプ化を行い、最終更新分からの差分の取得とバリアントの評価を行える機能の追加を行った。今後の研究方針として、ゲノムバリアントのタンパク質構造を用いたアノテーション手法の高度化を行う。構造特徴としてアミノ酸変化の折りたたみ自由エネルギーの変化などの予測値を検討する。変異のある遺伝子について近年の大規模ゲノム解析によって分かってきた機能欠失への不寛容さの指標を用いて、バリアントの選択に使えるようにする。また、この手法を公開し、様々なゲノム解析を行った研究者がゲノムバリアントの一覧からタンパク質の構造と機能に影響しうるものを抽出し、機能変化について考察できるようにする。集団に見つかった機能に影響するゲノム変化については実験的検証を検討する。(3)ゲノムワイド解析:

ゲノム解析結果(VCFファイル等)への高速なアノテーション方法および残基の構造特徴によるゲノムワイド変異の絞り込みアルゴリズムを構築した。(4)アップデート機能作成:ゲノム配列とPDB立体構造残基、構造特徴量のデータベースの更新機能を作成し、PDBエントリごとに登録日情報による管理とタイムスタンプ化を行い、最終更新分からの差分の取得とバリアントの評価を行える機能の追加を行った。今後の研究方針として、ゲノムバリアントのタンパク質構造を用いたアノテーション手法の高度化を行う。構造特徴としてアミノ酸変化の折りたたみ自由エネルギーの変化などの予測値を検討する。変異のある遺伝子について近年の大規模ゲノム解析によって分かってきた機能欠失への不寛容さの指標を用いて、バリアントの選択に使えるようにする。また、この手法を公開し、様々なゲノム解析を行った研究者がゲノムバリアントの一覧からタンパク質の構造と機能に影響しうるものを抽出し、機能変化について考察できるようにする。集団に見つかった機能に影響するゲノム変化については実験的検証を検討する。当該研究のための計算機資源の一部を既存の設備及び共用計算機資源としてのスーパーコンピュータなどでまかなったために物品費の次年度利用額が生じた。これらは次年度以降に人件費・謝金・学会参加費・論文投稿料などに利用する予定である。
口腔扁平上皮癌の浸潤・転移に関わる新規因子の同定

我々は、口腔扁平上皮癌(OSCC)の浸潤・転移に関わる新規因子を発見することを目的に、OSCC患者の頚部転移巣より樹立した細胞株とその細胞株よりin vitro invasion assay法を応用して分離した高浸潤能細胞株をcDNA microarray法を用いて、OSCCの浸潤・転移に関わる新規因子として、Periostinを同定した。Periostinの発現は、癌組織において強く、浸潤態度とよく相関していた。Periostin遺伝子をPeriostinの発現のみられない細胞株に遺伝子導入したところ、in vitroで浸潤能と軟寒天培地上でのコロニー形成能を増強させるとともに、ヌードマウスの同所移植モデルではコントロール細胞では、転移がみられなかったにもかかわらず、Periostin導入細胞では、高頻度に頸部リンパ節および肺に転移を来したことから、PeriostinがOSCCの浸潤・転移に深く関わることが証明された。さらに、血管内皮細胞にPeriostinタンパクを投与したところ、血管の増生を促進し、OSCC症例におけるPeriostinの過剰発現と血管数の増加に有為な相関を認めた。また、Periostinが分泌タンパクであることから、マウス腫瘍移植モデルで、血清でのPeriostinの発現をELIZA法を用いて、検討した結果、腫瘍を移植したマウス血清中で、高い発現を示したことから、今後、OSCC患者の血清を用いた検討を行いたい。Periostin遺伝子導入細胞とコントロール細胞をマイクロアレイ法により比較検討したところ、MMP群やSERPIN群の遺伝子のup-regulationが認められた。今後の課題としては、OSCCにおけるPeriostinの過剰発現のメカニズムとPeriostinの浸潤に関わるメカニズムの詳細を明らかにすることが必要と考えられる。我々は、口腔扁平上皮癌(OSCC)の浸潤・転移に関わる新規因子を発見することを目的に、OSCC患者の頚部転移巣より樹立した細胞株とその細胞株よりin vitro invasion assay法を応用して分離した高浸潤能細胞株をcDNA microarray法を用いて比較した。なかでも、Periostin/OSF-2は、親株に比べて、高浸潤能細胞株で強い発現を示す遺伝子のなかで、最も差があるものとして同定された。我々は、Periostinに着目し、口腔癌の浸潤・転移への関与について検討した。まず、OSCC細胞株および組織におけるPeriostin mRNAの発現をRT-PCR法により検討したところ、癌組織で強い発現を示すことが明らかになった。さらに、Periostin特異的抗体を作製し、Periostinの発現をOSCCのパラフィン切片標本で検討したところ、mRNAと同様に癌組織において強い発現を示し、浸潤態度とよく相関することがわかった。そこで、Periostin遺伝子をPeriostinの発現のみられない細胞株に遺伝子導入したところ、in vitroで浸潤能を高めるとともに、軟寒天培地上でのコロニー形成能も高めることが明らかとなった。さらに、Periostin遺伝子導入OSCC細胞をヌードマウスの舌に同所移植したところ、コントロール細胞では、転移がみられなかったにもかかわらず、Periostin導入細胞では、高頻度に頸部リンパ節および肺に転移した。以上より、我々は、OSCCの浸潤・転移に関わる新規因子として、Periostinを同定した。次年度は、Periostinの浸潤に関わるメカニズムを明らかにするとともに、悪性度診断に応用できるかを検討したい。
リポテイコ酸の構造多様性と乳酸菌の特異的LTAの免疫誘導能の解明

本研究では、ヒト腸内乳酸菌のLactobacillus gasseriのリポテイコ酸(LTA)の構造多様性と特異性を調べ、本菌種に特異的な構造と免疫誘導能の関わりを明らかにすることを目的とした。以上により、HT-29細胞におけるIL-8産生において、LTAの単独刺激ではS. aureusとは異なり、L. gasseriとL. lactisはIL-8の産生に影響を与えなかった。LPSによるIL-8の産生誘導に対しては、L. gasseriでのみ抑制活性が弱いという特徴が認められた。これは、L. gasseriのLTAの特異的な構造と特徴的な生物活性との相関が示唆される。なお、死菌体による評価では、単独刺激もLPS刺激によるIL-8産生誘導に対しても有意なIL-8産生量の変化は認められなかった。一方で、LTAの純度の向上や、比較対照をより広げることなどによって、L. gasseriのLTAの特徴をより明確なものにしていく必要がある。今年度は、上記の他に細菌の生育段階におけるLTAの表層局在の変化に関する知見も得ることができた。本研究では、ヒト腸内乳酸菌のLactobacillus gasseriをモデルとして、種および株レベルでの細胞表層多糖の一つであるリポテイコ酸(LTA)の構造多様性を調べるとともに、これらの特異的な構造と免疫誘導能の関わりを明らかにすることを目的とした。今年度は以下の成果が得られた。本研究の過程で、種特異的なLTAの構造が存在することが明らかになった。今後はこれらの構造がもつ免疫誘導能を評価する。本研究では、L. gasseri種が共通して特異的なLTAの化学構造をもっているのかを明らかにして、この構造の免疫誘導能に与える影響を観察することが目的である。そのため、本年は7菌株のL. gasseriと比較対象となる3菌株(L. lactis、S. aureus、E. faecium)のLTAの構造情報を明らかにすることができた。L. gasseriは、共通して特異的なLTA構造(四糖と三残基のアシル基)を持っており、比較対象となる3菌株は全て異なる化学構造(糖およびアシル基の数が異なる)をもっていた。これらの構造情報は、次年度に実施する予定である免疫誘導能の評価において、構造活性相関を明らかにする重要なデータである。したがって、次年度ではヒト腸管上皮細胞株であるHT-29細胞を使用して、LTAを免疫刺激因子として産生されるサイトカイン(IL-8)量を測定することで免疫誘導能を評価する予定である。以上のことから、おおむね当初の計画通り進行していると考えられる。次年度は、ヒト腸管上皮細胞株HT-29細胞とL. gasseri 7菌株、比較対象3菌株(L. lactis、S. aureus、E. faecium)から得られたLTA画分を使用して、LTAが免疫刺激となってHT-29細胞から産生されるIL-8をELISA法によって定量することで免疫誘導能の評価を行う予定である。さらに、実験ではLTAの単独刺激やリポ多糖による免疫刺激後のLTAの影響などを評価する計画である。これらの結果と今年度に得られた構造情報から、LTAの構造活性相関を明らかにする。また、LTAがヒトの免疫細胞と相互作用することを考えると、菌体細胞上でのLTAの局在を理解することも重要であると考えられる。そのため、追加試験として細胞上のLTAの局在評価を行う。当初の計画よりも効率的に菌体が回収できたことで、それに伴う培養関連用品の費用やLTAの抽出・精製にかかわる消耗品の費用が削減できた。また、その他消耗品(シャーレやピペット等のプラスチック製品や培地など)に関しても、節約等により使用額を抑えることができた。次年度は、ヒト腸管上皮細胞の培養関連消耗品やELISAキットが必要であり、これら消耗品の購入や学会等での発表のための旅費として繰り越した金額の使用を計画している。