hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
呼吸鎖電子伝達酵素の分子構築

近赤外用ラマン分光計を製作し、チトクロム酸化酵素のCu_A部位の分子構造の共鳴ラマンスペクトル測定に世界で初めて成功した。酸化酵素とcとの複合体形成やa_3-Cu_B部位の酸化還元状態の変化、リガンドの結合でCu_Aの配位構造は変化しないこと、Cu_A部位がほかの酸化還元部位から独立していることを示した。(小倉)回虫の発生段階で好気的代謝を行なう幼虫の複合体IIを酵素化学的に調べた。FRD活性はなく、SDHのみの哺乳類型に似ていた。クロマト溶出位置も成虫とは異なっていた(ミトコンドリア複合体IIアイソザイムの存在の初例)。大腸菌複合体IIの部位特異的変異解析からヘムbの配位に関与する2つのヒスチジンを同定した。(北)グラフィックスを中心とした蛋白質結晶のX線による構造解析系を構築し、ヒドロゲナーゼや硫酸還元菌のエネルギー代謝系に関与する蛋白質のX線回折測定、構造解析を行なった。ヒドロゲナーゼ結晶の解析で6A分解能の電子密度を得、鉄硫黄クラスターとニッケル原子の位置を同定できた。(安岡)ウシ心筋チトクロム酸化酵素の結晶化の再現性を妨害する要因は用いたコール酸中の微量不純物によることが明らかとなり、不純物除去法を検討している。分解能向上のため、界面活性剤の種類を検討し、3.5A分解能のX線回折を示す結晶を得たが結晶化の再現性が低いのでその向上に努力している。(吉川)NAD(P)Hのレーザー励起ラジカルによるチトクロムc還元機構を明らかにし、還元型cから酸化酵素へ供給された電子が、ヘムaと銅に迅速に分配される過程を実測し、電子伝達過程を定量的に解析した。この励起がプロトンをもパルス的に生成するのでプロトン輸送過程の解析への応用を図っている。人工リポソームに再編成したbcl複合体を用い、膜電位により駆動されるプロトンの流れが複合体内で電子逆流をもたらすことを証明した。(折井)ウシ心筋チトクロムbc_1複合体の精製標品を再結晶することにより、結晶が析出する条件範囲がこれまでより広くなり、より高分解能の回折点を与える結晶がえられた。(松原)チトクロムbc_1複合体の六方晶について、2種類の誘導体を調製し、同型置換法で10Å分解能電子密度を計算した。(福山)酸化型チトクロム酸化酵素とH_2O_2を反応させると607nmに吸収極大を与える反応中間体が生成する。これがFe=O型ヘムを持つことを共鳴ラマン分光法で証明した。(小倉)回虫複合体IIの、補欠分子族としてFADを含むFpサブユニットについてstage-specificに発現される2種のcDNAクローンを見つけた。また大腸菌複合体IIの機能的アッセンブリーにcytochrome b_<556>サブユニットのN末端45残基が必須であった。(北)ヒドロゲナーゼのX線解析から、活性部位のクラスターはFe _4S_4,Fe_3S_4,Fe_4S_4,Niの順に、分子の表面近くに直線状の約13Å間隔で配列していた。(安岡)臨界ミセル濃度は等しいが親水性部分の大きさの異なる種々の界面活性剤の、チトクロム酸化酵素の結晶化に及ぼす効果を検討した結果、界面活性剤の最適の大きさがあった。さらに分解能3.5Å近いX線回折を示す結晶を得た。(吉川)ヘム生合成系の幾つかの新しい遺伝子を見つけ、大腸菌のhemAやhemHを相捕する植物のcDNAクローン、hemGを相捕できるヒトのcDNAクローンを分離できた。
MRIを用いた頚動脈分岐部における血管壁剪断応力の解析

本研究は、ヒト頸動脈分岐部の血管壁勇断応力(WSS)と動脈硬化性病変との関連を明確にすることを目的として行った。このため、正常ボランティア及び動脈硬化性病変を有する患者の三次元血管情報から作成した拡大三次元実体血管模型(シリコン塊の中に実際の血管の内腔形状をそのまま再現したもの)を作成し、近年開発されたTime-Resolved Three-Dimensional Phase-Contrast MRIを用いて解析し、WSSを求め、さらに超音波検査で血管壁の内中膜複合体厚(IMT)を計測し、得られたWSSとIMTを比較し、関連を探ることを最終目標とした。本年度は昨年度に作成した拡大三次元実体血管模型に血液擬似流体を流して解析を行った。ただし、対象物が実際の人体に比べて大きいため撮像時のMR装置の負荷が高く、撮像精度を下げざるを得ず、十分な信号雑音比のデータが得られなかった。MR装置及び撮像方法について改良を要すると考えられた。また、Time-Resolved Three-Dimensional Phase-Contrast MRIとコンピュータシミュレーションとの比較を行った。内頸動脈起始部外側部では流れの剥離やWSSの相対的低値が観察された。血管狭窄部においては、WSSは相対的高値を示し、狭窄後の部位においては、流れの剥離が観察されるとともにWSSは低値を示した。双方とも同様の傾向であった。Time-Resolved Three-DimenSional Phase-Contrast MRIの信頼性をある程度証明できたものと考えられる。IMTとWSSとの関連については、十分な相関を得ることはできなかった。低WSSがIMTを増大させると仮定したが、実際にはIMTの増大に伴う血管内腔の狭窄に伴って血流速度が増大し、結果としてWSSが高値を示すに至ったためと考えられる。本研究は、ヒト頸動脈分岐部の血管壁剪断応力と動脈硬化牲病変との関連を明確にすることを目的としている。このため、正常ボランティア及び動脈硬化性病変を有する患者の三次元血管情報から作成した三次元実体血管模型(シリコン塊の中に実際の血管の内腔形状をそのまま再現したもの)を作成し、近年開発されたTime-Resolved Three-Dimensional Phase-Contrast MRIを用いて解析し、血管壁剪断応力を求め、さらに超音波検査で血管壁の内中膜複合体厚(IMT)を計測し、得られた血管壁剪断応力とIMTを比較し、関連を探ることを最終目標としている。今後、二倍拡大した三次元実体血管模型を用いたin vitro実験や、コンピュータシミュレーションとの比較などを行う予定である。
大規模医療情報データベースの利活用による乳がん患者の精神疾患に関する研究

本研究は全国規模の医療情報データベースを用いて,乳がん患者の実診療下での精神疾患の罹患状況の解明と,それらが再発や死亡に及ぼす影響,さらに患者の診療に係る医療経済について評価することである。これまでに,乳がん患者の精神疾患を他の主要ながん(胃,大腸,子宮,前立腺,肺,肝臓,膵臓)と比較することで,他がんとの違いを明確にした。本研究では,2009年から2014年に新たに8大がん(乳房,胃,大腸,子宮,前立腺,肺,肝臓,膵臓)のいずれかの診断を受けた患者,かつ過去6か月以内に精神疾患の診断がなかった患者14661人を対象に,診断後13ヶ月間の新規の精神科系薬剤の処方実態を保険者のレセプトデータから成るJMDCclaimsdatabaseを解析して調査した。全対象患者の約半数の45%が精神科系薬剤を処方されており,最も多かった薬剤はベンゾジアゼピン系の薬剤であった。精神科系薬剤はがん診断後の一か月以内の処方割合が高く,処方割合が最も大きかったがん種は肺がんで,最少は前立腺がんであった。乳がんの処方割合は全体の平均の割合と同様であった。また処方に大きな影響を及ぼす因子は化学療法,外科療法などで,女性や併存疾患のある患者も処方される傾向にあった。またがん診療拠点病院のがん患者は一般病院のがん患者と比較して精神科系薬剤が処方されない傾向にあった。本研究の結果は,2016年の国際薬剤疫学会で発表しており,その後,さらなる追加解析や結果の解釈など議論を重ねて論文化し,Psycho-oncology誌に採択された。また,精神科臨床Legotaでも紹介された。本研究は,全国レベルの医療情報データベースを用いて,乳がん患者の実診療下での精神疾患の罹患状況の解明と,医療経済評価,及びその際の統計解析方法を検討することである。本年度は,まず研究計画書を作成し倫理審査を申請した。本計画書の中では,乳がんだけでなく,他の7つのがんも対象に含め包括的ながん診療の実態解明を目指した。データに関連して,データ定義書,データ倫理チェック表などを作成し,データの質向上にも努めた。当該のデータセットは入手済みであり,基礎解析も完了させた。基礎解析では約14,600人が対象患者として特定された。そのうち最も多かった患者が乳がんで約5,000人であり,大腸がん3,200人と胃がん2,300人がそれに続いた。精神科系薬剤の処方は全体で約45%であった。さらに,薬剤分類で最も処方が多かったのはベンゾジアゼピン系(BZD)薬剤で43%の処方割合だった。最も処方されていたがん種は,肺がん58%で,すい臓がん53%,肝がん47%と続いた。乳がんの処方割合は43%であり,平均的な処方割合であった。さらに,個別の薬剤に注目すると,最も多く処方されていた薬剤はBZDのゾルピデム12%であり,続いてブロチゾラム11%,エチゾラム4%で,上位のほとんどがBZDであった。精神科系薬剤の処方に影響していた因子は,併存疾患の有無,がん種,治療(化学療法,手術,放射線療法),医療機関,家族の有無であった。併存疾患では,糖尿病,虚血性心疾患,高血圧症,脳血管障害による影響が見られた。がん種類では大腸がんに比べて,肺がんは約2.5倍,すい臓がんは約2倍,肝がんは約1.5倍,乳がんは約1.1倍,処方される傾向であった。医療機関は病院やがん診療拠点病院ではクリニックに比して処方されない傾向にあった。家族の影響はわずかであるが,家族がいる方が若干処方される傾向にあった。初年度であり研究計画書作成とデータ入手に時間が要した。そのため,精神疾患罹患状況の検討が遅れてしまい経済評価まで研究が進まなかった。本研究は全国レベルの医療情報データベースを用いて,乳がん患者の実診療下での精神疾患の罹患状況の解明と医療経済評価,及びその際の統計的手法を検討することである。本研究は,乳がんだけでなく他の7つのがん(胃がん,大腸がん,子宮がん,前立腺がん,肺がん,肝がん,膵臓がん)を含める事で乳がん患者の精神疾患の罹患状況の比較可能性を高めた。昨年度には,研究実施の承認を京大の医の倫理員会から受けており,当該の研究計画書を元に対象患者を含むデータを入手し,解析を終了させた。解析の結果により,約半数のがん患者が精神科系薬剤の処方を受けており,さらに,そのほとんどがベンゾジアゼピン系の薬剤であった事がわかった。また,その処方はがんの診断を受けた後の早い段階で処方されていた。また,がん診療拠点病院では若干その精神科系薬剤の処方割合が少ない傾向にあった。がん診療拠点病院と一般病院とでは,がん患者のメンタル疾患に対する薬物療法の提供状況が同様ではない可能性が示唆された。さらに,本研究は論文作成・投稿済みであり,Psycho-oncology誌でメジャーリビジョンのため,再投稿を実施予定である。乳がん患者の精神疾患の罹患状況の解明のため,他のがん患者を含めた研究に拡張させたため,データハンドリングや解釈等で時間を要してしまった。また,本研究結果の成果として学会発表は実施できたが,論文作成にも時間を要してしまい,採択までの時間が掛かっている。

学会発表,論文投稿を優先させていたため,乳がん患者の経済評価に関しての評価が遅れている。雑誌社の返答を待つ間に,経済評価のための資料検索を実施中である。本研究は全国規模の医療情報データベースを用いて,乳がん患者の実診療下での精神疾患の罹患状況の解明と,それらが再発や死亡に及ぼす影響,さらに患者の診療に係る医療経済について評価することである。これまでに,乳がん患者の精神疾患を他の主要ながん(胃,大腸,子宮,前立腺,肺,肝臓,膵臓)と比較することで,他がんとの違いを明確にした。本研究では,2009年から2014年に新たに8大がん(乳房,胃,大腸,子宮,前立腺,肺,肝臓,膵臓)のいずれかの診断を受けた患者,かつ過去6か月以内に精神疾患の診断がなかった患者14661人を対象に,診断後13ヶ月間の新規の精神科系薬剤の処方実態を保険者のレセプトデータから成るJMDC claims databaseを解析して調査した。全対象患者の約半数の45%が精神科系薬剤を処方されており,最も多かった薬剤はベンゾジアゼピン系の薬剤であった。精神科系薬剤はがん診断後の一か月以内の処方割合が高く,処方割合が最も大きかったがん種は肺がんで,最少は前立腺がんであった。乳がんの処方割合は全体の平均の割合と同様であった。また処方に大きな影響を及ぼす因子は化学療法,外科療法などで,女性や併存疾患のある患者も処方される傾向にあった。またがん診療拠点病院のがん患者は一般病院のがん患者と比較して精神科系薬剤が処方されない傾向にあった。乳がん患者の精神疾患の実態解明のため,他の主要ながん(胃,大腸,子宮,前立腺,肺,肝臓,膵臓)と比較することで,これらのがん種の中での乳がんの位置づけを明確にさせた。その拡張のため,データハンドリングや解釈に時間を要した。さらに,成果として学会発表後の論文採択まで時間を要した。本解析の結果により,基礎的な疫学情報が把握できたが,これらの結果を次の段階の再発や死亡,さらに経済的影響の評価に反映して応用する研究を実施するための準備が整わなかった。本研究では,2009年から2014年に新たに8大がん(乳房,胃,大腸,子宮,前立腺,肺,肝臓,膵臓)のいずれかの診断を受けた患者,かつ過去6か月以内に精神疾患の診断がなかった患者14661人を対象に,診断後13ヶ月間の新規の精神科系薬剤の処方実態を保険者のレセプトデータから成るJMDCclaimsdatabaseを解析して調査した。本研究の結果は,2016年の国際薬剤疫学会で発表しており,その後,さらなる追加解析や結果の解釈など議論を重ねて論文化し,Psycho-oncology誌に採択された。
ヒト小児神経芽腫の病態に類似する新たな神経芽腫マウスモデルの解析

神経芽腫において、がん遺伝子MYCNは増幅し、過剰発現することで悪性化に寄与する。これまでの研究において我々はMYCNと共に増幅する遺伝子であるNCYM遺伝子がヒトとチンパンジーなど限られた種にのみ存在することを見出していた。発がんモデルであるMYCNトランスジェニックマウスは神経芽腫の治療法の評価に用いられてきたが、発生する神経芽腫は、転移能が低く、治療感受性であり、ヒトの病態を反映しない。そこで、本研究ではNCYMとMYCNを交感神経系に過剰発現する新規の発がんマウスモデルを作製した。このマウスモデルは高頻度に転移し、治療抵抗性を示すなど、よりヒトの病態を反映することが示された。我々はこれまでにがん遺伝子MYCNのアンチセンス遺伝子であるN-CYMがタンパク質をコードし、神経芽腫悪性化に関わることを示してきた。昨年度はMYCN/N-CYM double Tgマウスを作成し、従来のマウスモデルであるMYCN tgマウスに比べ有意に遠隔転移率が上昇することを示した。本年度は、N-CYMによる転移促進の分子メカニズムを調べることを目的とした。これまでの研究から、ヒト神経芽腫細胞株において、N-CYMがMYCNタンパク質を安定化すること、MYCNの安定性を制御するGSK3betaがN-CYMと結合することが示されていた。そこで、MYCN/N-CYM tgマウスの神経芽腫組織を用い、N-CYMとGSK3betaの結合を免疫沈降法で検討したところ、N-CYMと内在性GSK3betaは結合した。また、MYCNタンパク質の安定化にともなって、GSK3beta S9のリン酸化が上昇し、不活性化されていることが示された。さらに、GSK3 betaの上流制御因子であるS6Kのリン酸化がGSK3beta S9のリン酸化と相関し、mTOR-S6K経路の活性化がGSK3betaの不活性化を介して、MYCNを安定化することが示唆された。また、MYCN tgマウスに比べMYCN/N-CYM tgマウス由来の腫瘍はCleaved Caspase-9陽性細胞が少く、アポトーシスが阻害されていた。これらの結果から、N-CYMはGSK3betaを阻害することでMYCNを安定化するとともに、mTOR-S6K経路を活性化することによりアポトーシスを阻害し、転移促進に寄与する可能性が示された。本研究の成果はPLOSGENETICS誌に受理され、掲載された。がん遺伝子MYCNは神経芽腫で増幅し、過剰に発現することで発がんおよびがん進展に寄与する。神経芽腫の発がんモデルとしてMYCNトランスジェニックマウス(以下MYCN tgマウス)が用いられてきたが、このモデルは明確な遠隔転移が見られないなど、ヒト神経芽腫のMYCN増幅例と明らかに異なる病態を示す。我々はこれまでにヒト神経芽腫において、N-CYMがMYCNと100%共に増幅し、過剰に発現することを示した。また、N-CYMはMYCNタンパク質を安定化し、神経芽腫細胞の増殖に寄与することを発見した。そこで、本研究の目的はMYCN/N-CYM double tgマウスを作出し、このマウスがヒト神経芽腫の病態に類似した新たな神経芽腫のマウスモデルとなり得るかを検証することである。本年度は、まずMYCN tgマウスとN-CYM tgマウスを交配させることで、MYCN/N-CYM double tgマウスを作出した。生存解析としては、MYCN tg/-, N-CYM tg/- doubleマウスとN-CYM tg/-マウスを交配させ、その子80個体について遺伝子型を決定し、200日間の観察を行った。N-CYM遺伝子量により神経芽腫の発症率、発症時期には有意な差は見られなかったが、MYCN tgマウスに比べMYCN/N-CYM tgマウスでは遠隔転移の発生率が6倍に上昇した。また、それぞれの遺伝子型の腫瘍におけるMYCN発現量をWestern blotting法により定量したところ、MYCN/N-CYM tg由来の腫瘍ではMYCN tg由来腫瘍に比べMYCN発現量が上昇していた。これらの結果は、生体内において、N-CYMがMYCNの安定化を介して神経芽腫悪性化に寄与することを示唆する。MYCN/NCYM Tgマウスの腫瘍を解析したところ、MYCN Tgマウスの腫瘍に比較して、アポトーシスが抑制されていることが明らかになり、アポトーシス抑制因子であるMyc-nick産生が上昇していた。さらに、In vitro cleavage assayによりNCYMが直接的にCalpainによるMYCNの切断を促進することで、Myc-nick産生が上昇することが示された。細胞周期の解析から、NCYMはMyc-nick

産生をG2/M期に促進することで、微小管を安定化し、細胞死を抑制する可能性が示唆された(Shoji, Suenaga et al., Biochem.Biophys. Res. Commun. in press)。分子生物学、腫瘍学N-CYMによる転移促進の分子メカニズムの一端を明らかにし、論文掲載に至ったため。N-CYMによるMYCNタンパク質安定化機構を検討する実験において、予期せず、NCYMがMYC-nickの産生を促進することを見いだした。MYC-nickはMYCNおよびc-MYCがcalpainにより切断されることで産生され、大腸がんにおいてがんの悪性化に寄与することが示されている。そこで、次年度はMYC-nick産生におけるN-CYMの役割について調べる目的で、分子生物学的な研究を行う。I. N-CYMがMYC-nick産生を直接的に促進するかを検証するため、精製タンパク質を用いたin vitro cleavage assayを行う。II. N-CYMによるMYC-nick産生の意義を検討するため、神経芽腫細胞株を同調させ、細胞周期ごとにN-CYMおよびMYC-nickの発現量を調べる。MYCNタンパク質はユビキチン-プロテアソーム系により分解される。CDK1/Cyclin B複合体によりS62がリン酸化されたMYCNはGSK3betaにより、T58がさらにリン酸化される。T58がリン酸化されたMYCNはE3リガーゼによってポリユビキチン化され、プロテアソームによる分解を受ける。これまでの研究から我々はN-CYMがMYCNと結合し、ユビキチン-プロテアソーム系によるMYCNの分解を阻害することを示している。また、予備的な実験からN-CYMは神経芽腫の細胞内でMYCNのタンパク質安定性を制御するリン酸化酵素GSK3beta、に結合するとの結果を得ている。そこで、N-CYMがCDK1/Cyclin BおよびGSK3betaによるMYCNのリン酸化を抑制する可能性を考え、以下の実験を行う。I. N-CYMがMYCNのリン酸化を阻害するかを調べるために、まず精製タンパク質を用いたin vitro kinase assayを行う。その後、精製N-CYM濃度やATP濃度を変化させることで、リン酸化酵素のATPポケットに結合し、ATP結合を競合的に阻害するかを調べるなど、さらに詳細にリン酸化酵素の活性を阻害する様式を決定する。N-CYMの機能がリン酸化の阻害ではないことが明らかになった場合は、E3ユビキチンリガーゼによるポリユビキチン化の阻害効果、プロテアソームによる分解の阻害効果を調べる。年度末に試薬(抗体)を購入する必要性が生じたが、残額では足りなかったため、次年度に使用することにした。次年度使用額は当該抗体購入の費用とする予定である。次年度使用額として1円が生じた。これは振り込み手数料等、翌年度以降に請求する研究費とともに使用する予定である。
医薬品およびその置換体に対する分子インプリントポリマーの調製と応用

分子インプリント法は、鋳型分子に対する特異的認識部位あるいは群特異的認識部位を得る方法であり、対象物質の特異的あるいは群特異的認識に利用されている。分子インプリントポリマー(MIP)は人工抗体とも呼ばれ、鋳型分子(抗体では抗原)に対して最も高い分子認識能を与えるというのが定説であった。「置換体鋳型分子を用いて調製したMIPが、鋳型分子を用いて調製したMIPより、鋳型分子に対して高い分子認識能を与えるという」発見は、MIPにおける定説を覆すものであり、その分子認識機構の解明が待たれるとともに、MIPの分析化学的応用およびMIP調製における新たな展開が期待される。
膜タンパク質立体構造予測システム(MAKU)の開発とWWWへの公開

大腸菌では約4000の遺伝子でできており、ヒトの場合は数万ないし10万の遺伝子でできている。それぞれの遺伝子はタンパク質をコードしており、それぞれのタンパク質は機能を持った分子機械となっている。そして、各タンパク質は固有の構造を持っており、それによって多様な機能を発揮している。そこで研究では全体の約1/4に相当する膜タンパク質を対象として膜タンパク質の判別と構造を予測する方法を開発した。膜タンパク質の判別の問題では、3つのパラメータ(ヘリックス領域の平均疎水性値、平均両親媒性値、タンパク質全体の大きさ)を用いると、高精度の判別が可能だということが示された。約500個の構造の分かったタンパク質を用いて判別制度を調べた結果、膜タンパク質の判別では99%、膜貫通ヘリックスの判別では96%の精度が得られた。7本の膜貫通ヘリックスを持つ膜タンパク質における膜貫通ヘリックス配置問題においては、極性の側面ができるだけ向き合うように配置することによってユニークな配置をするという極性ジグソーパズルの考え方を基本とした。任意の構造を生成できるようにするために、三角格子モデルをテンプレートとした。これによって、膜貫通ヘリックスの配置、方向、傾きなどがエネルギー最小構造として決定できる。実験的に構造が分かっているバクテリオロドプシンに対してこの方法を適用したところ、非常に良く似た構造が予測された。本研究では、膜タンパク質における様々な構造の特徴にはそれぞれを特徴づける相互作用があって、それを適切に取り込めば構造予測が可能であるということを示している。本研究は二つの部分にできる。膜タンパク質のための物理化学的予測アルゴリズムを確立することと、それをwww上で公開し、全ての生物科学者に利用可能にすることである。1.物理化学的相互作用計算を基とした膜タンパク質の立体構造予測法の確立アミノ酸配列から膜貫通ヘリックスの配置・配向予測を行うために、本研究では三つの過程と一つのデータベース(MAKU Base)を考える:(1)アミノ酸配列から膜貫通ヘリックスを持つタンパク質の予測との高精度予測(MAKU Secondary)、(2)膜貫通ヘリックスの配置・配向・傾き予測(MAKU Tertiary)、(3)膜タンパク質に対する基質のドッキング構造の予測(MAKU Docking)。2.HTMLによるインターネット(WWW)対応の統合化システムMAKUの開発膜タンパク質形態、二次構造予測のそれぞれをc言語を使ってプログラム開発を行う。個別に作成されたプログラムはインターネット(WWW)対応のHTML(Hyper Text Makeup Language)で作成されたホームページによってリンクされる。これによりシステムが世界的に解放される環境が設定される。ユーザーは問い合わせのアミノ酸配列入力するだけで膜貫通ヘリックスの情報(膜貫通領域、極性相互作用情報、膜貫通ヘリックス間の相互作用による配置・配向・傾き情報、ドッキング情報)が得られる。本研究では、当初の申請内容に従って膜タンパク形態、二次構造予測についての研究を完成することができた。これまで私達は、非常に機能の高い膜タンパク質について立体構造形成のメカニズムを理解し、その構造予測を可能にしようと研究を進めてきた。そして、いくつかの膜タンパク質についての変性実験や、計算機によるアミノ酸配列の物理的情報処理を行うことによって、膜タンパク質の立体構造予測法の流れがようやく現実的なものとなってきた。そこで本研究では、これまでの研究成果をまとめて、1.アミノ酸配列から膜貫通ヘリックスを予測し、さらにヘリックスの配置・配向・傾きまでを理論的に決定するためのソフトウェアシステムを開発し、2.誰でも利用できる形として、インターネット(WWW:World Wide Web)上での公開を目的としている。本研究では、膜内へのアミノ酸残基の侵入には疎水性相互作用が、次に膜内でのヘリックス構造形成には極性相互作用がかなり決定的な役割を果たすこと、および構造的には比較的単純でほぼ同じ大きさのヘリックスが平行な束になっていることを利用して、二次構造の予測、三次構造の予測がかなりの精度でできるようにした。そして、まず第1段階の膜タンパク質への分岐と膜貫通ヘリックス領域予測のモジュールをWWWホームページ上に公開した。最近は月間3,000件ほどの利用があり、その半数は海外からのものである。

これまで私達は、非常に機能の高い膜タンパク質について立体構造形成のメカニズムを理解し、その構造予測を可能にしようと研究を進めてきた。そして、いくつかの膜タンパク質についての変性実験や、計算機によるアミノ酸配列の物理的処理を行うことによって、膜タンパク質の立体構造予測法の流れがようやく現実的なものとなってきた。そこで本研究では、これまでの研究成果をまとめて、(1)アミノ酸配列から膜貫通ヘリックスを予測し、さらにヘリックスの配置・配向・傾きまでを理論的に決定するためのソフトウェアシステム「MAKU」を開発し、(2)誰でも利用できる形として、インターネット(WWW:World Wide Web)上での公開を目的としている。これまで、システムは完成し、比較的極性の高い膜貫通ヘリックスの多い膜タンパク質については、構造予測が可能となっている。実際、7本膜貫通型の膜タンパク質であるバクテリオロドプシンについて、モデルタンパク質として構造予測を行ったところ、実験的な構造と非常によく似た構造を再現している。計算時間かなり長いという欠点がまだあり、インターネットでの公開には至っていないが、アルゴリズムを単純化することによって、WWWホームページで公開する可能性もほぼ目途がついている。
江戸期文芸を通じた食文化研究―「食」の現実と文芸化をめぐって―

本研究は、江戸期の庶民文芸、草双紙と浮世絵版画のうち、「食」を描くものを当時の調理、本草学上の効能といった観点から総合的に研究するものである。なぜこれらの文芸が生まれたかを、その前後に連なる食生活・習慣や文芸との関わりから検討し、江戸の文芸が生成される文化的背景と過程について明らかにするのが目的である。本年度は、(1)黄表紙の中に擬人化される食物の分類・分析と、(2)錦絵に描かれた飲食について、研究を行った。(1)では、前年度に調査・翻刻を行った黄表紙27点について、擬人化された食物が現れる場面とその役割を中心に検討を行った。特に、頻出する食物がどのように調理されるものであったかを、同時代の料理書から分析することができた。この成果については、「黄表紙の中の擬人化される食べ物」として学会報告を行った。また、前年度から継続して研究を行っている、酒を擬人化した黄表紙については、「黄表紙に擬人化される酒」として論文化したほか(現在印刷中)、「酒と菓子の優劣争い「酒餅論」と江戸の酒ー擬人化される酒をめぐってー」として学会報告を行った。(2)では、食物そのものではなく、広く飲食がいかに描かれたかを知るため、飲食を主題とする錦絵「飲食養生鑑」を取り上げ、飲食をめぐる臓器の機能がどのように文芸に表現されたかを、医学書や養生書を用いて検討した。その成果は、2019年4月に行われた研究会で報告している。本年度は赤本・黒本に描かれた食物を分析する予定であったが、黄表紙の分析に時間を要してしまい、計画より遅れてしまっている。しかしながら、料理書による食物の調理法の分析を詳細に行うことができた。とりわけ、食物が描かれた組み合わせと、調理法について丹念に分析することができた。本年度までに予定していた赤本・黒本の調査・分析を急ぐ。調査の必要な資料の一覧は既に作成しているため、各作品に描かれた食物を抽出し、その調理法に関する分析を行う。これにより、料理と文芸の関わりを明らかにしたい。本年度は、(1)黄表紙の中に擬人化される食物と、(2)『精進魚類物語』に描かれる食物を中心に研究を行った。(1)では、東京都立中央図書館加賀文庫や東北大学附属図書館狩野文庫などに所蔵される黄表紙のうち、食物を擬人化するもの27点を対象とした。未翻刻の作品については翻刻を行った上で、作中に登場する食物名(食材名・料理名)や、それらの食物が描かれる組み合わせについて分類し、次年度以降に予定している、料理書や本草書による分析のための資料作成を行った。この結果、頻出する食物の傾向を把握できたことに加え、次年度以降の分析では、料理や本草学だけでなく、ことわざや流行歌など、言葉遊びの面からの分析の必要性を確認するに至った。なお、現在、酒を擬人化する黄表紙に関して得られた成果を論文化している最中である。(2)では、上記した黄表紙など、本研究が対象とする文芸に先行する作品として、『精進魚類物語』の分析を行った。この『精進魚類物語』に描かれた食物が、その後の作品に影響を及ぼしているのかを把握するためである。特に、それぞれの食物に付された擬人名に着目し注釈作業を行い、その成果の一部を「ワークショップ『精進魚類物語』を読む」総合討議にてパネリストとして報告した。当初の計画では、本年度は赤本・黒本と一部の黄表紙の翻刻・分類による資料作成を予定していたが、本年度後半に他プロジェクトによる長期海外出張があったため、黄表紙のみに留まってしまった。

(2)では、食物そのものではなく、広く飲食がいかに描かれたかを知るため、飲食を主題とする錦絵「飲食養生鑑」を取り上げ、飲食をめぐる臓器の機能がどのように文芸に表現されたかを、医学書や養生書を用いて検討した。その成果は、2019年4月に行われた研究会で報告している。本年度は赤本・黒本に描かれた食物を分析する予定であったが、黄表紙の分析に時間を要してしまい、計画より遅れてしまっている。しかしながら、料理書による食物の調理法の分析を詳細に行うことができた。とりわけ、食物が描かれた組み合わせと、調理法について丹念に分析することができた。本年度に翻刻・分類することのできなかった赤本・黒本について、速やかに調査を行い、分析のための資料作成を行う。また、本年度に注釈を加えた『精進魚類物語』を始めとして、御伽草子作品にも目を向けることで、江戸期の文芸生成と「食」との連関をより明確にすることができると考える。本年度までに予定していた赤本・黒本の調査・分析を急ぐ。調査の必要な資料の一覧は既に作成しているため、各作品に描かれた食物を抽出し、その調理法に関する分析を行う。これにより、料理と文芸の関わりを明らかにしたい。本年度後半に、他プロジェクト(頭脳循環を加速する戦略的国際研究ネットワーク推進プログラム)の採択を受け、長期海外出張に赴く必要が生じたため、研究に遅れが生じた。次年度は、本研究課題における資料収集をより一層強化し、資料作成や分析に注力するため、国内調査や複写、古典籍の購入等を含めた研究課題推進に努める。上記したように、黄表紙の分析に対して予想以上の時間を要してしまったこと、また昨年同様、長期海外出張に赴いたことから遅れが生じた。次年度は、草双紙や料理書の調査・翻刻など、資料作成を急ぎ、研究推進に努める。
高対称ナノ構造による高忠実な非古典的光子発生

申請者らが開発した液滴エピタキシー法による格子整合系量子ドットの自己成長は,基板と量子ドットの格子定数が等しいので,内部応力によるピエゾ電場が生じないという極めてすぐれた特徴をもつ。また,構造歪みを伴わないことから,高い空間対称性をもつ量子ドットの作製が可能である。窒素ペア等電子トラップに捕捉された励起子では,試料構造の均一性を反映して50μeV以下の極めて小さな不均一幅が実現できる。本研究では,液滴エピタキシー法による高対称GaAs量子ドットとδドープで作製する窒素ペア等電子トラップについて,高効率・高忠実な単一光子発生と量子もつれ合い光子対発生の実現を第1の目的とする。また,新しい材料系の開発による非古典光発生の波長領域の拡大を第2の目的とする。平成29年度は,1配置間相互作用の方法による閉じ込め励起子の電子状態の理論解析,2高対称基板面を利用した高対称量子ドットの作製,3電流励起単一光子・もつれ合い光子対発生などを目標として研究を進め,以下の成果を得た。1昨年度に見出した量子ドット-量子リング結合系について,配置間相互作用の方法による理論解析で,励起子アハラノフ・ボーム効果に特有な磁場印加による発光波長と発光強度の変化を正確に算出するとともに,試料作製にも成功,2昨年度に作製に成功したInAlAs/InP(111)A基板上のInAs量子ドットについて,InAs下地層を利用する等,作製条件を最適化,3量子もつれ合い光子対発生について,高対称GaAs量子ドットを含むPN接合から成る電流励起型試料を作製。これらに加えて,4化学合成で作製したCdSxSe1-xナノプレートについてk・p摂動法による励起子遷移エネルギーの解析を行って,実測値と良い一致を得るなど,当初計画に無かった成果も得られた。平成29年度までの研究成果によって,本研究の最終目標達成の目途がほぼ得られたことに加え,典型的な量子現象の一つでありながら,従来,実現が難しかった励起子アハラノフ・ボーム効果について,その困難の原因がクーロン相互作用による電子・ホール対の混成であることを理論解析で解明したこと,また,配置間相互作用の方法を用いた精密な数値解析によって,この困難が回避できる試料構造を発見したこと,さらに,CdSxSe1-xナノプレートの電子状態の解明が進んだこと等,当初計画に無かった研究成果も得られたことによる。平成30年度は,平成29年度に開始した,1もつれ合い忠実度の定量的な理論解析,2窒素等電子トラップに捕捉された励起子の安定化,および,3電流励起単一光子・もつれ合い光子対発生の検討をさらに進める。平成28年度は,1配置間相互作用の方法による閉じ込め励起子の電子状態の理論解析,2フォトニック結晶共振器の作製とパーセル効果による発光促進,3高対称基板面を利用した高対称量子ドットの作製,4新規材料の開発による波長拡大,および,5精緻な光子相関測定による単一光子発生ともつれ合い光子対発生の特性解析を目標として研究を進め,以下の成果を得た。1これまで実現が難しかった励起子アハラノフ・ボーム効果について,配置間相互作用の方法による精密な理論解析によって,これを実現する試料構造を発見,2フォトニック結晶共振器を作製して,窒素ペア等電子トラップの励起子の発光促進を実現,3(111)面上の高対称GaAs量子ドットについて,磁気光学測定により超微細相互作用の大きさを決定,4InP(111)A基板上にInAs量子ドットの作製に成功し,高対称量子ドットの発光波長を1.55μm帯(通信波長帯)へ拡張,5従来の光励起型に加えて,電流注入型素子の評価を目指して専用の光子相関測定装置を製作。平成28年度の研究目標がすべて達成できたことに加えて,典型的な量子現象の一つでありながら,従来,実現が難しかった励起子アハラノフ・ボーム効果について,その困難の原因がクーロン相互作用による電子・ホール対の混成であることを理論解析で解明した。さらに,配置間相互作用の方法を用いた精密な数値解析によって,この困難が回避できる試料構造を発見したことから,将来の実証実験の見通しが得られた。

本研究では,液滴エピタキシー法による高対称GaAs量子ドットとδドープで作製する窒素ペア等電子トラップについて,高効率・高忠実な単一光子発生と量子もつれ合い光子対発生の実現を第1の目的とする。また,新しい材料系の開発による非古典光発生の波長領域の拡大を第2の目的とする。平成29年度は,1配置間相互作用の方法による閉じ込め励起子の電子状態の理論解析,2高対称基板面を利用した高対称量子ドットの作製,3電流励起単一光子・もつれ合い光子対発生などを目標として研究を進め,以下の成果を得た。1昨年度に見出した量子ドット-量子リング結合系について,配置間相互作用の方法による理論解析で,励起子アハラノフ・ボーム効果に特有な磁場印加による発光波長と発光強度の変化を正確に算出するとともに,試料作製にも成功,2昨年度に作製に成功したInAlAs/InP(111)A基板上のInAs量子ドットについて,InAs下地層を利用する等,作製条件を最適化,3量子もつれ合い光子対発生について,高対称GaAs量子ドットを含むPN接合から成る電流励起型試料を作製。これらに加えて,4化学合成で作製したCdSxSe1-xナノプレートについてk・p摂動法による励起子遷移エネルギーの解析を行って,実測値と良い一致を得るなど,当初計画に無かった成果も得られた。平成29年度までの研究成果によって,本研究の最終目標達成の目途がほぼ得られたことに加え,典型的な量子現象の一つでありながら,従来,実現が難しかった励起子アハラノフ・ボーム効果について,その困難の原因がクーロン相互作用による電子・ホール対の混成であることを理論解析で解明したこと,また,配置間相互作用の方法を用いた精密な数値解析によって,この困難が回避できる試料構造を発見したこと,さらに,CdSxSe1-xナノプレートの電子状態の解明が進んだこと等,当初計画に無かった研究成果も得られたことによる。平成29年度は,平成28年度に開始した,1配置間相互作用の方法による閉じ込め励起子の電子状態の理論解析,2パーセル効果を利用した発光促進による,電子系の位相緩和と無輻射遷移の相対的な低減,3高対称基板面を利用した高対称量子ドットの作製,4精密な光子相関測定による特性解析を進めるとともに,5もつれ合い忠実度の定量的な理論解析,6窒素ペア等電子トラップに捕捉された励起子の安定化,7電流励起単一光子・もつれ合い光子対発生の検討を開始する。平成30年度は,平成29年度に開始した,1もつれ合い忠実度の定量的な理論解析,2窒素等電子トラップに捕捉された励起子の安定化,および,3電流励起単一光子・もつれ合い光子対発生の検討をさらに進める。
トランスポゾン抑制因子piRNAの生合成機構の解明

20-30塩基長の小分子RNAによる遺伝子発現抑制機構をRNAサイレンシングと呼ぶ。正しい遺伝情報を次世代へと受継ぐ使命を担う生殖細胞では、PIWI-interacting RNA(piRNA)がDNA損傷を引き起こす転移性因子トランスポゾンからRNAサイレンシング機構を介して生殖細胞のゲノムをまもると同時に、生殖組織の分化を正常に導く。しかし、その動作原理は未だ不明である。piRNAによるトランスポゾンのサイレンシング機構はpiRNA生合成機構とpiRNAによるトランスポゾン発現抑制機構の二つに分けられるが、本研究では、特にpiRNA生合成機構に焦点を絞り、その仕組みを包括的に理解することを目指す。これまでのpiRNA研究を通して培った研究基盤や成果を活かしつつ本研究を進展させる。本年度は、特に人工的piRNA系を確立することを目的として研究をすすめた。我々はこれまでにtraffic jam mRNA 3'UTRを由来とするジェニックpiRNAの発現に必須なシス配列(100塩基長)を決定したが、この配列に相同性が高い配列を、ジェニックpiRNAを発現する他のmRNAに見出す事はできなかった。つまり、ジェニックpiRNAの生合成機構は、核酸の一次配列ではなく、他の要因をもとに、前駆体を選別している可能性が見出された。そこで、その様な要因を探りあてるため、ジェニックpiRNAを発現する他のmRNAにおいてシス配列として機能する断片を決定することにした。現在、コンストラクトを作成中である。コンストラクトの作成後は、OSCにそれらを発現させることによって、またnorthern解析をすすめることによって、ジェニックpiRNA産生に必要な部分配列を同定する。traffic jam mRNA 3'UTRを由来とするジェニックpiRNAの発現に必須なシス配列との相同性を探る。25年度が最終年度であるため、記入しない。
ポリマーメカノケミストリーにおける結合切断点ナノ可視化技術の構築

本研究では、近年研究が活発化しているポリマーメカノケミストリーにおいて、高分子膜への引張応力の印加により発生する高分子鎖結合切断点の空間分布を分子レベルで可視化する新技術を確立することを目的としている。結合切断点プローブの構築へ向けて、異性化反応により可逆的に蛍光特性を変化させるフォトクロミック分子骨格の合成について検討した。具体的には、多段階の反応を経由することで、重合反応性官能基を導入可能なヒドロキシ基を有するジアリールエテン系フォトクロミック分子を合成した。また、この分子についてスペクトル測定を行うことで蛍光特性を評価した。この分子は有機溶媒中で蛍光を示し、蛍光量子収率は0.4程度の比較的高い値であった。また、この分子は光照射により異性化反応を示し、蛍光強度を変化させるスイッチング挙動を示した。この分子のスイッチング挙動を機械的刺激により誘起することができれば、高分子膜の応力分布を可視化することが可能になると期待される。しかし、現状ではフォトクロミック分子の合成収量が少なく、フォトクロミック分子への重合反応性官能基の導入および高分子の合成には至っていない。各段階の反応収率の向上を試みながら、追加合成を行っている。また、フォトクロミック分子の合成と並行して、フォトクロミック分子ではない単純な基質を用いて重合反応の予備検討を行った。ヒドロキシ基を有する低分子量有機化合物を出発物質として重合反応性官能基を導入し、それを開始剤とした重合反応により高分子が得られることを確認した。十分な量のフォトクロミック分子を合成できた場合には、この重合方法により、フォトクロミック分子へ高分子鎖を導入する予定である。当初の想定では、本年度中にフォトクロミック分子骨格を有する結合切断点プローブを含む高分子を合成し、光および機械的刺激に対する高分子の応答性の観測に着手したいと考えていた。フォトクロミック分子を合成することはできたものの、その途中段階であるアリール環のハロゲン化などの反応収率が低いためにフォトクロミック分子の収量が少なく、高分子の合成と応答性の観測に取り組めていない。よって、現在までの進捗状況としては「やや遅れている」と評価した。各段階の反応収率の向上を試みながら、重合反応やその後の各種測定に必要な量のフォトクロミック分子を合成することを目指す。具体的には、アリール環のハロゲン化などの反応で用いる試薬や溶媒などの条件を検討する。十分な量のフォトクロミック分子を合成したあと、その分子を用いた重合反応により高分子を合成し、光および機械的刺激に対する高分子の応答性の評価を行う。
部分因子環に対する組合せの構造

V. JonesはII_1-factor Masubfactor Nに対してJones index[MiN]を導入した。その後subfactorの研究は大変発展したが、ほとんど1コのsubfacter NのMへの含まれ方のみを考察されてきた。今回研究では必ずしも包含関係のない2個以上のsubfactor遠N_1, N_2, ..., N_nを同時に考察し、それらの相互の相対的な位置関係を解明することを目標とした。特に2個のsubfactorの間の直交関係と相対エントロピーの関連について具体的な成果をJ. Functional Anclysisに発表した論文について示したのでそれを中心にのべる。そのThenem 6においてはVon Weuman algeherの4つの組MCL UU KCNがという関係式が成立することを示した。これは可換な確率論の世界で独立性の下での相対エントロピーの式の量子化に当たるものがある。次にThenem nにおいてはII_1-factorの4つ組MCL UU KCNがco-comtingsqnaneをなしKCMがextremmalならばその相対エントロピーについて次が成立することを示した:これはThenem 6の双対であるが、非可換化して始めて発見されたもので意義がある。これ以外に既対なsubfactorの中間因子環のなす束についても結果がえられたが、これから深めたい。
濃厚金属塩水溶液からのセラミックス微粒子の調製

本研究では、研究代表者の所属機関で開発された、濃厚な水酸化第二鉄ゲルから精密に形態制御したヘマタイト微粒子を高収率で合成する方法(ゲル-ゾル法)を他の金属酸化物の系に適用し、濃厚塩水溶液系から形態を制御した各種セラミックス微粒子を合成することを試みた。本研究における具体的な研究実績は以下に述べる通りである。オキシ水酸化アルミニウム(ベ-マイト)、オキシ水酸化ガリウム、オキシ水酸化バナジウム、各種フェライト(スピネル型およびマグネトプランバイト型)等、種々の(含水)酸化物について、濃厚金属塩水溶液からの形態制御した微粒子の調製に関する検討を行い、特にベ-マイトおよびコバルトフェライト、バリウムフェライトについては重点的に研究を遂行した。これら各々の系に対してゲル-ゾル法を適用する場合、ヘマタイトの場合とは全く異なった条件を設定する必要があることが明らかになり、微粒子析出反応における、出発塩、温度、濃度、添加物、pH等の反応条件が析出する微粒子の形態、粒径分布、化学組成、構造に与える効果について、セラミックス微粒子生成過程の道筋に沿って詳細な検討を行った。さらに、種粒子を利用した単分散性の向上や粒径制御、微粒子析出反応の際に金属イオンのリザーバーとして作用する前駆物質の重要性についても検討・考察した。
リアルタイムMRIによる健常軟骨及び変性軟骨の物理的特性の解明

1.圧縮変形下における生体軟試料MRI測定系の開発4.9テスラMRI装置の測定ボア内で生体軟試料に圧縮変形を負荷するため,アクリル部材を用いて治具を作製した.圧子をネジ式で押し込む様式とし,ネジ回転角を調整することで変位制御を可能とした.対象試料は生体軟組織を模擬したハイドロゲルとした.開発した装置を用いて試料に10%の圧縮ひずみを負荷し,応力緩和過程の挙動を2次元イメージングによる形状測定で観察した.作製した圧縮装置を用いることで,ゲルの応力緩和過程でMRI装置内部で試料に定常的に圧縮変形を与えられることがわかった.2.圧縮変形下での試料内部の水分布リアルタイムMRIシークエンスの開発開発したMRI用圧縮装置を用いて,応力緩和過程での試料内の水成分の流動をリアルタイムに観察するために,1-dimentional proton density imaging sequenceを開発した.本シークエンスは試料のproton励起の際に励起面を圧縮変形に平行な面と垂直な面の二つで行うことで,面が交差する線部分の水分子の信号強度分布を計測した.これにより試料内の任意の直線上の水の濃度分布をリアルタイムに測定することが可能となる.本シークエンスと1において開発したMRI用圧縮装置を用いて応力緩和過程でのハイドロゲル内の水分子の信号強度を測定した.その結果,応力緩和過程において水分子の信号強度の低下が見られ,応力緩和においてゲル内部では外部への水の流出が生じていることが明らかになった.これにより高含水性の生体組織では粘弾性挙動に内部の水分子の流動が関わっていることが実験的に初めて示唆された.3.再生軟骨内部の陰性固定電化密度の観察陰イオン性造影剤を用いた陰性電化密度分布MRイメージングを再生軟骨に対して行い,固定電化密度の変化を観察した.軟骨組織の再生に伴い電化密度の上昇が確認された.1.変性軟骨モデルの確立仔ウシ肩関節より関節軟骨を採取し,0.1U/mlコンドロイチナーゼ処理と30U/mlコラゲナーゼ処理をそれぞれ行った.処理前後に試料の厚さを計測し,同時に静的圧縮試験を行い応力緩和挙動を観察した.その結果,試料厚さはコラゲナーゼ処理群において上昇したのに対し,コンドロイチナーゼ処理群では有意な変化は見られなかった.応力緩和ではコラゲナーゼ処理群において最大応力で68.6%,平衡弾性率で65.6%に低下したのに対し,コンドロイチナーゼ処理群では最大応力で25.7%,平衡弾性率で11.2%に低下した.さらに動的圧縮試験及び動的せん断試験を両試料に行ったところ,コンドロイチナーゼ処理群では圧縮特性で損失正接が上昇したのに対し,コラゲナーゼ処理群ではせん断特性で損失正接が上昇する傾向にあった.これらの酵素処理が異なることによる差異は,軟骨においてコラーゲン,プロテオグリカンが果たす役割が異なることによるものと考えられる.仔ウシ肩関節より軟骨組織片を採取後,軟骨細胞を酵素的に抽出した.細胞の懸濁液と低融点アガロース溶液を混合することで軟骨細胞・アガロース複合体を作製し,37°C,5%CO2環境下で培養した.培養0,7,14,21,28日ごとにMRIにより自己拡散係数(Diffusion coefficient)を測定した.同時に圧縮特性,硫酸化グリコサミノグリカンの定量を行いMRIによる測定結果との相関を検討した.その結果,自己拡散係数と平衡弾性率,硫酸化グリコサミノグリカンの含有量との間には強い相関が見られた.これよりMRI測定シークエンスを改善し測定に要する時間を短縮する必要はあるが,Diffusion-MRIを用いることで関節軟骨の物理的特性を評価できる可能性が示された.1.圧縮変形下における生体軟試料MRI測定系の開発4.9テスラMRI装置の測定ボア内で生体軟試料に圧縮変形を負荷するため,アクリル部材を用いて治具を作製した.圧子をネジ式で押し込む様式とし,ネジ回転角を調整することで変位制御を可能とした.対象試料は生体軟組織を模擬したハイドロゲルとした.開発した装置を用いて試料に10%の圧縮ひずみを負荷し,応力緩和過程の挙動を2次元イメージングによる形状測定で観察した.作製した圧縮装置を用いることで,ゲルの応力緩和過程でMRI装置内部で試料に定常的に圧縮変形を与えられることがわかった.2.圧縮変形下での試料内部の水分布リアルタイムMRIシークエンスの開発開発したMRI用圧縮装置を用いて,応力緩和過程での試料内の水成分の流動をリアルタイムに観察するために,1-dimentional proton density imaging sequenceを開発した.本シークエンスは試料のproton励起の際に励起面を圧縮変形に平行な面と垂直な面の二つで行うことで,面が交差する線部分の水分子の信号強度分布を計測した.これにより試料内の任意の直線上の水の濃度分布をリアルタイムに測定することが可能となる.本シークエンスと1において開発したMRI用圧縮装置を用いて応力緩和過程でのハイドロゲル内の水分子の信号強度を測定した.その結果,応力緩和過程において水分子の信号強度の低下が見られ,応力緩和においてゲル内部では外部への水の流出が生じていることが明らかになった.これにより高含水性の生体組織では粘弾性挙動に内部の水分子の流動が関わっていることが実験的に初めて示唆された.3.再生軟骨内部の陰性固定電化密度の観察陰イオン性造影剤を用いた陰性電化密度分布MRイメージングを再生軟骨に対して行い,固定電化密度の変化を観察した.軟骨組織の再生に伴い電化密度の上昇が確認された.
接合伝達プラスミドを応用する大規模なDNA移動に関する研究

ゲノム全塩基配列が利用できる枯草菌ゲノム工学では、多数の遺伝子群によって支配される有用形質を、異なる遺伝的背景の株に効率よく移動させる技術が必要である。接合伝達(conjugational transfer)を用いて、巨大なDNAを枯草菌ゲノムベクター間で簡便に導入する手法の開発に取り組んだ。枯草菌は自然形質転換系が利用できるが、この方法で送り込めるDNAのサイズには技術的な限界があり、これをブレイクするためにも接合伝達系の構築が必要であった。本研究課題の成果で、初期の目的は達成された。また世界で枯草菌の接合伝達に本格的に取り組んでいるグループは見当たらないことが、2報の成果論文への反応によって確認した。具体的な成果を以下に記す。16年度の成果:「納豆菌由来の接合伝達プラスミドpLS20の調製と塩基配列決定」(1)pLS20を大量に調製し塩基配列を決定。接合伝達に必要なtypeIV secretion遺伝子群の存在を確認。(2)pLS20の一部を枯草菌ゲノムベクター中に組み込んだ。(3)接合伝達に利用可能な小型の安定なdelivery plasmidとして納豆菌からpLS30(6.6kb)を分離。mob遺伝子とoriTを確認。17年度の成果:「pLS20による接合伝達システムの構築」(1)pLS20に薬剤マーカーを付加したpLS20catを構築し、非常に安定な保持率を示した。(2)pLS20cat自身の枯草菌間での接合伝達性を固形培地上で確認。さらに接合伝達の条件検討を行う過程で従来は報告されていない液体培養中でのkineticsを調べた結果、供与菌,受容菌ともに最適の接合伝達のタイミングがあることを発見。再現性のある接合伝達システムの標準実験プロトコールを確立した。(3)pLS30に薬剤耐性マーカーを導入したpLS3001をpLS20catの接合伝達システム経由で、枯草菌間で接合伝達能を確認。小型の安定なdelivery plasmidとしての有効性が実証された。枯草菌ゲノムに接合伝達プラスミドを再構築する事を目標として、まず納豆菌由来の接合伝達プラスミドpLS20をpLS20保持株(BEST323)から超遠心法により大量調製した。大まかな制限酵素マップを作成し、EcoRI断片を大腸菌でサブクローニングし、約8割をカバーするライブラリーを得た。これをもとに、解読困難なリピート配列(数kb)を除く約65kbの塩基配列を決定した。接合伝達に関わる遺伝子は幾つか確認できたがクラスターを構成していない点と、hypothetical proteinも多数存在する点から、pLS20全体を枯草菌168ゲノムに導入する方針を固めた。pLS20を組み込むために、pBR322配列に大腸菌で作製した2つの足場配列を並べたプラスミドをまず構築した。これを枯草菌ゲノム中に既に組み込んであるpBR322配列に相同組み換えを利用して組み込んだ。足場配列を持つ枯草菌にpLS20のDNAを与えて取り込ませ、足場配列同士の組み換えで、足場に挟まれたpLS20DNAのクローニングが完成する。65kbを約15kb(oriを含む)約53kb(oriを含まない)に2分割して、これらを別々に組み込んだ株が薬剤選択で得られた。