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卵巣癌において異常活性化したリン酸化酵素の同定とその特異的阻害剤の開発

1卵巣癌におけるリン酸化酵素PTK6:卵巣癌において高発現しているリン酸化酵素を同定することを目的とし、その結果PTK6を同定した。卵巣癌進行期III-IV期(進行例)においてPTK6発現陽性群において全生存期間に関して予後不良の傾向が見られた。2初代三次元培養法と薬剤感受性評価系の確立:株式会社トランスパレント社と共同で新規初代三次元培養プレートを開発したEpCAM陽性細胞がspheroidを形成し、EdUの取り込み試験から約1週間の培養が可能であることが明らかとなった。また薬剤感受性の評価としてEdUの取り込みならびにCaspase 3/7の細胞染色が有効であることを明らかにした。1卵巣がん細胞株(in vitro)ならびに卵巣癌臨床検体より分離された腫瘍細胞(ex vivo)を用いて同定したPTK6を阻害することで(siRNA、特異的阻害剤)、増殖抑制、細胞死が誘導されるか検証する(Oncogenic Kinase addictionの検討)。卵巣がん細胞株10種類を用いてPTK6蛋白発現とその阻害剤であるダサチニブ感受性(IC50)の間には相関がなかった。リン酸化酵素の活性度は実際の酵素活性を測定するのが理想であるが、実臨床では困難である。そこで我々はリン酸化型PTK6(p-PTK6(Tyr342))を用いて同様の検討を行った。p-PTK6の発現が高いほど感受性が高い傾向を示した。2初代三次元培養法と薬剤感受性評価系の確立25年度は下記の項目について研究を行った。1卵巣癌臨床検体を用いてPTK6の免疫組織学的染色を行い、組織型、予後、病期といった臨床病理学的因子との関連性兵庫県立がんセンターにおいて診断治療を行った68例の卵巣癌について検討を行ったところ、進行期III-IV期(進行例)においてPTK6陽性例が全生存期間に関して予後不良という傾向があった。(P=0.07 Log-ranktest)2初代三次元培養に関しては各種抗癌剤、分子標的薬(リン酸化酵素阻害剤を含む)に対する感受性試験を行い、卵巣癌におけるoncogenic kinaseを明らかにしていく。まず卵巣癌、子宮体癌細胞株を用いて新規三次元培養Cell-able 96穴プレートと通常の2次元培養での増殖抑制試験(パクリタキセル、シスプラチン、ゲムシタビン)を比較したところ、いずれの細胞株においても三次元培養の方が抵抗性を示した。つぎに3次元培養にて腫瘍造成能が保たれているかを検討するために、卵巣癌ならびに子宮体癌の手術検体を分散・3次元培養後に免疫不全マウス(ヌードマウス)に移植したところ、原腫瘍とほぼ同様の組織構築を有する腫瘍が形成された。次にoncogenic kinaseを同定するために各種リン酸化酵素阻害剤を添加したところ、症例によって増殖抑制効果が異なっており優位なリン酸化酵素が異なることが考えられた。3次元培養と各種分子標的薬剤添加のアッセイ系によって適切な薬剤選択ができることが示唆された。(1)網羅的メチル化解析から見出したリン酸化酵素PTK6は卵巣癌進行例において予後不良因子である:卵巣癌臨床検体4症例と正常組織4症例から抽出したゲノムを用いメチル化スクリーニングを行った結果、卵巣癌に特異的に脱メチル化しているリン酸化酵素PTK6を同定した。卵巣がん細胞10株中全例に発現が見られた。また卵巣がん臨床検体69例(粘液性15例、漿液性24例、明細胞14例、類内膜17例)のうち63.8%の症例に発現亢進が観察された。組織型別では明細胞(28.6%)に比べ、漿液性(66.7%)、類内膜(82.7%)で有意に高かった。全症例においてPTK6発現と予後に関して統計的な有意差は見られなかったが、進行症例である病期III,IV期で検討を行ったところ、PTK6陽性例において有意に全生存率について予後不良であることが分かった(p=0.048)。(2)卵巣癌臨床検体を用いた3次元初代培養+リン酸化酵素阻害剤評価系の確立:大阪府立成人病センター井上正宏博士らが開発したがん細胞抽出法ならびに新規低接着培養ディッシュを用いた三次元培養を組み合わせた初代培養法を確立し、そのうえで各種リン酸化酵素阻害剤を添加し増殖抑制を指標として活性化したリン酸化酵素を同定する手法を確立した。以下にその手法の要点を記載する。(1)がん組織をペースト状になるまでミンス。(3)Liberase DL(0.3 unit/ml)およびDNase I(100 U/ml)を加えて、37°Cで2時間旋回振盪。(4)300 μmのメッシュならびに70 μmのstrainerを通して細胞回収。(5)低接着ディッシュに播種し、24時間後に各種リン酸化酵素阻害剤を添加。

(6)72時間暴露後にEdUの取り込みを評価。本手法により現在卵巣癌臨床検体8例を評価しており、現在解析中である。1リン酸化酵素PTK6の総蛋白発現量ではなくリン酸化型(tyr342)がダサチニブに対する感受性に相関することを明らかにした点。2初代培養法において昨年度よりも適切な培地条件を決定することが出来、現在卵巣がん4症例、子宮体がん3例での初代培養に成功した点。3細胞増殖抑制効果に関して、EduというDNA合成を指標とする以外にCaspase3/7を指標とすることで評価が可能となった点。(1)卵巣癌で脱メチル化を起こしているリン酸化酵素PTK6を同定し、臨床検体で高頻度に過剰発現していることを明らかした点。(2)PTK6に対する阻害剤としてダサチニブが知られており、現在各種卵巣癌細胞株を用いてダサチニブに対する感受性を解析中である点。(3)初代培養法において、当初、細胞培養液の設定に難渋したが、現在は卵巣癌において適切な培地条件を決定することが出来た点。(4)細胞増殖抑制効果に関して、三次元培養では従来のWSTやMTT測定は細胞内への取りこみや吸光度が正確に測定できず、EduというDNA合成を指標とすることで評価が可能となった点。1臨床検体を用いてリン酸化型PTK6の免疫組織学的染色を行い、組織型、予後、病期といった臨床病理学的因子との関連を明らかにする。2初代三次元培養に関しては、さらに臨床検体の症例を増加させ、各種抗癌剤、分子標的薬(リン酸化酵素阻害剤を含む)に対する感受性データを蓄積される。その上で卵巣癌におけるoncogenic kinaseを明らかにしていく。当初の平成24年度の研究目標は「同定したリン酸化酵素が発癌、悪性化に寄与しているかどうか」であった。それに準じて(1)卵巣癌細胞株(in vitro)ならびに卵巣癌臨床検体より分離された腫瘍細胞(ex vivo)を用いて同定したPTK6を阻害することで(siRNA、特異的阻害剤)、増殖抑制、細胞死が誘導されるか検証する(Oncogenic Kinase addictionの検討)。(2)初代三次元培養系において卵巣癌(各組織型での)ではどのようなリン酸化酵素阻害剤が有効であるのか、裏を返せばその主たるOncogenicKinaseあるいは伝達経路を同定することを目標とする。細胞培養関連試薬、一般試薬、免疫不全マウス、抗体、DNA,RNA合成、研究打ち合わせ、研究補助に対する謝金細胞培養関連試薬、一般試薬、免疫不全マウス、抗体、DNA,RNA合成、研究打ち合わせ、研究補助に対する謝金
側鎖に配位子を有する多糖誘導体の合成と機能化

本研究は、強い配位能を持つ置換基を側鎖に有する新規セルロース誘導体を合成することで、極めて規則的に制御された高次構造を有する多糖に新しい機能を付与することを目的とするものである。本年度は昨年度に引き続き、ビピリジル基を全ての側鎖に、また、位置特異的に有する様々なセルロース誘導体の合成を行い、その光学分割能の評価や不斉合成への応用について検討を行った。本研究で合成した様々な誘導体についてHPLC用キラル固定相に用いて光学分割能を評価した結果、2,3位または6位に位置選択的にビピリジル基を導入したセルロース誘導体が比較的高い光学分割能を示した。またこれら誘導体をいくつかの不斉合成反応の触媒に用いてその効果を検討したところ、シクロプロパン化反応において、6位のみにビピリジル基を有するセルロース誘導体を銅のキラル配位子として用いたときに、二つの鏡像異性体が異なる割合で生成した。中でも、グルコース環の2,3位に3,5-ジメチルフェニルカルバメートを、6位にビピリジルのエステル基を有するセルロース誘導体で最も高い鏡像体過剰率(ee)が得られた。これは、6位のみに反応点を形成することで位置特異的に反応が進行し、多糖の規則的な構造を不斉合成に効果的に活かすことができたためと考えられる。また、ビピリジル基以外にもピリジル基を有する様々な誘導体の合成を行ったところ、ピリジル基にクロロ基を導入することで光学分割能が向上することがわかった。さらに、セルロースの4-ピリジルエステル誘導体が、塩酸水溶液の濃厚溶液でリオトロピック液晶性を示すことがわかった。セルロースやアミロースの水酸基を化学修飾して得られるフェニルカルバメートおよびベンゾエート誘導体は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)用のキラル固定相として高い光学分割能を有し、その能力はフェニル基上に導入した様々な置換基の種類や数、位置など、その側鎖の構造に大きく依存することを、我々はこれまでに見いだしてきた。本研究では、強い配位能を持つビピリジル基を側鎖に有する新規セルロース誘導体の合成を行い、HPLC用のキラル固定相に用いて光学分割能の評価を行った。さらに、ビピリジル基に金属を配位させることによる光学分割能の変化と、配位結合を利用する配位子交換クロマトグラフィーへの応用について検討を行った。ビピリジル基を側鎖に有する誘導体は、セルロースと2,2'-ビピリジン-5-カルボン酸クロライドを反応させることで合成し、ビピリジル基を2,3,6位の側鎖全てに有する誘導体と、2,3位もしくは6位のみに有する誘導体の5種類が得られた。これらをシリカゲルに担持してHPLC用のキラル充填剤とし光学分割能の評価を行ったところ、2,3位または6位に位置選択的にビピリジル基を導入したセルロース誘導体が比較的高い光学分割能を示すことがわかった。また、セルロース誘導体にCu(II)を配位させたところ光学分割能に変化がみられ、配位前には分割できなかったtrans-スチルベンオキサイドが、配位後はほぼ完全に分割された。これはCu(II)が配位することでセルロース誘導体の高次構造が変化したためと考えられる。また、溶離液の組成を変え、配位結合を優先的に作用させることで、これまで困難であった多糖誘導体によるアミノ酸の直接光学分割が可能になった。分割できたアミノ酸はいずれも芳香環を有していたことから、セルロース誘導体とのπ-π相互作用も分割に大きく関わっていると考えられる。
メタゲノム情報からの難培養菌が要求する因子の特定と利用による培養可能化

共生様式の解明ミカーレ属カイメンから得られる抗腫瘍抗生物質の生合成遺伝子をカイメン共生細菌メタゲノムから見出し、その生産菌を新規性の高い未同定細菌と明らかにしている。有用共生細菌の培養可能化のためにその共生様式の解明を試みた。まず、宿主であるミカーレ属カイメンの詳細な生活環解明のために、熊本県天草諸島において海中水族館の協力を得て年間を通じて観察を行った。その結果、ミカーレ属カイメンは単年生で初夏に幼生を放出し、数時間で着底する事、また初冬から顕著に成長し初春には最大化する事が明らかになった。初夏に成体、胚、幼生の各ステージのサンプルを取得する方法を確立し、固定および切片の作成を行った。また、既に明らかにしている生産菌に特異的な16S rRNA配列およびマイカロライド類の生合成遺伝子配列を指標にFISH解析を行った。しかし、カイメン宿主の自家蛍光のために、生産菌の検出は困難であった。そこで、カイメンから共生細菌懸濁液を取得し、それを用いてCARD-FISHの各種条件検討を行ったところ、特異的に染色される桿菌を見出すことに成功した。メタゲノム解析マイカロライド類の生合成遺伝子は既に明らかになったが、生産菌の全ゲノムおよび生産菌との化学的相互作用が推測される他の共生細菌のゲノムに関してはほとんどが不明である。そこで、日本各地および各季節に採取したミカーレ属カイメンメタゲノムの細菌叢解析およびロングリード解析を行った。その結果、いずれのミカーレ属カイメンからもマイカロライド生産菌を見出した。また、共生細菌群衆構造は季節や場所により変動するが、常に見出される常在細菌を検出した。ロングリード解析の結果から、マイカロライド生産菌ゲノム約3Mb分のドラフト配列を決定し、本種が16S配列から予想されていたVerrucomicrobium門には属さない可能性が示された。共生様式の解明これまでミカーレ属カイメンは一年間に数回、最も潮が引く日の限られた時間帯でのみ採集可能であったが、今年度の観察および採集の結果から、初冬までの期間でもサイズは小さいながらも採取可能である事がわかった。また、海中水族館の協力により年間を通じてサンプルの取得と維持が可能になり、今後の研究を進めるにあたり大きな前進であった。幼生および胚の取得と固定も方法を確立し、実験室へ持ち帰り各種検討が可能となった。現在まで個体レベルでの共生様式の観察はできていないが、共生細菌懸濁液での検討から、マイカロライド生産菌の染色条件を確立し、その細胞形態を明らかにでき今後の研究へ応用可能となった。上記の事から、本項目においては極めて大きな前進があったといえる。メタゲノム解析これまで次世代シーケンスの主力であったショートリード解析では、繰り返し配列が極めて多いマイカロライド生産菌のゲノムを決定するには限界があった。しかしながら、本年度から急速に普及してきた第三世代型のシーケンサーであるMinIONを導入する事で、繰り返し配列を乗り越えるロングリードデータを取得する事ができた。また、これまでは外部委託の形でDNA配列解析を行っていたが、MinIONを用いる事で研究室内で簡便かつ短時間でメタゲノムデータを収集する事ができる。これにより当初の想定を大きく超える早さでマイカロライド生産菌ゲノムのドラフト配列を得る事ができた。現在は生産菌の高精度なゲノム配列の決定とそれによる代謝機能解析を行っている。さらに、簡便にメタゲノム解析が可能になったことから、各季節および地域の近縁カイメンメタゲノムを解析する事で、マイカロライド生産菌以外の常在細菌を見出し、微生物間相互作用の検討を行う準備が整った。共生様式の解明本年度の検討により、マイカロライド生産菌を特異的に染色するためのプローブの設計、および染色条件の確立ができ、その細胞形態を明らかにできたことから、次年度においては個体レベルでの共生様式の確認を行う予定である。具体的には5月下旬から6月上旬にかけてのカイメンの世代交代の期間において、成体、胚、および幼生を採取し固定する。今年度は切片を作成せずにホールマウントFISHにより、マイカロライド生産菌が生活環の各ステージにおいてどこにどの様に共生しているのか、また次世代にどの様に伝播していくのかを明らかにすることで、分離および培養可能化に関わる情報を取得する予定である。さらに本年度は試験管に着底させて実験室で生きたままカイメンを維持する事で、解放環境では困難な遺伝子組換え実験や薬剤を用いた実験を実施する。メタゲノム解析三重県や神奈川県等の日本各地においてミカーレ属カイメンを採集し、メタゲノム解析を行う事で、マイカロライド生産菌ゲノムあるいは常在細菌ゲノムに共通する特徴を明らかにする。得られた情報から、代謝機能を明らかにし、欠損している遺伝子があれば、その代謝を補う培養条件、あるいは外来遺伝子導入を検討する。さらに、各地域季節で共通して存在する常在細菌とセットで培養するなど、マイカロライド生産菌の分離培養を検討する。また、実験室でカイメンの維持が可能になれば、抗生物質処理を行い、一旦共生細菌を除去した後に、水平伝播が可能かどうかや、薬剤耐性や蛍光タンパク質遺伝子を組み込んだ、組換え生産菌の共生実験を検討する。さらに、色素生産等のマーカー遺伝子を組み込み、フローサイトメーターで分離する事で、生産菌の濃縮と分離培養を試みる。

有用共生細菌の培養可能化のためにその共生様式の解明を試みた。まず、宿主であるミカーレ属カイメンの詳細な生活環解明のために、熊本県天草諸島において海中水族館の協力を得て年間を通じて観察を行った。その結果、ミカーレ属カイメンは単年生で初夏に幼生を放出し、数時間で着底する事、また初冬から顕著に成長し初春には最大化する事が明らかになった。初夏に成体、胚、幼生の各ステージのサンプルを取得する方法を確立し、固定および切片の作成を行った。また、既に明らかにしている生産菌に特異的な16S rRNA配列およびマイカロライド類の生合成遺伝子配列を指標にFISH解析を行った。しかし、カイメン宿主の自家蛍光のために、生産菌の検出は困難であった。そこで、カイメンから共生細菌懸濁液を取得し、それを用いてCARD-FISHの各種条件検討を行ったところ、特異的に染色される桿菌を見出すことに成功した。メタゲノム解析マイカロライド類の生合成遺伝子は既に明らかになったが、生産菌の全ゲノムおよび生産菌との化学的相互作用が推測される他の共生細菌のゲノムに関してはほとんどが不明である。そこで、日本各地および各季節に採取したミカーレ属カイメンメタゲノムの細菌叢解析およびロングリード解析を行った。その結果、いずれのミカーレ属カイメンからもマイカロライド生産菌を見出した。また、共生細菌群衆構造は季節や場所により変動するが、常に見出される常在細菌を検出した。ロングリード解析の結果から、マイカロライド生産菌ゲノム約3Mb分のドラフト配列を決定し、本種が16S配列から予想されていたVerrucomicrobium門には属さない可能性が示された。共生様式の解明これまでミカーレ属カイメンは一年間に数回、最も潮が引く日の限られた時間帯でのみ採集可能であったが、今年度の観察および採集の結果から、初冬までの期間でもサイズは小さいながらも採取可能である事がわかった。また、海中水族館の協力により年間を通じてサンプルの取得と維持が可能になり、今後の研究を進めるにあたり大きな前進であった。幼生および胚の取得と固定も方法を確立し、実験室へ持ち帰り各種検討が可能となった。現在まで個体レベルでの共生様式の観察はできていないが、共生細菌懸濁液での検討から、マイカロライド生産菌の染色条件を確立し、その細胞形態を明らかにでき今後の研究へ応用可能となった。上記の事から、本項目においては極めて大きな前進があったといえる。メタゲノム解析これまで次世代シーケンスの主力であったショートリード解析では、繰り返し配列が極めて多いマイカロライド生産菌のゲノムを決定するには限界があった。しかしながら、本年度から急速に普及してきた第三世代型のシーケンサーであるMinIONを導入する事で、繰り返し配列を乗り越えるロングリードデータを取得する事ができた。また、これまでは外部委託の形でDNA配列解析を行っていたが、MinIONを用いる事で研究室内で簡便かつ短時間でメタゲノムデータを収集する事ができる。これにより当初の想定を大きく超える早さでマイカロライド生産菌ゲノムのドラフト配列を得る事ができた。
大環状有機化合物のスタッキングを利用する新規な自己組織性認識場の構築

本研究では、芳香族系大環状化合物のπ-πスタッキング相互作用を利用して、カラムの中心軸に認識反応場を持つ新規な自己組織性分子集合体を構築することを目的とした。さらにこれらに液晶性を付与することにより、温度、濃度、溶媒等の変化に伴い、中間相での認識場の環境に摂動を与えることを試みた。種々の鎖長の長鎖アルコキシ基を有するm-ジエチニルベンゼン誘導体を各種合成し、これらをCu(II)イオン触媒存在下、酸化的カップリングを行うことにより、ブタジイニル基をスペーサーとする大環状化合物(環員数:4から7)を合成した。これら環状物は4量体が溶解性に乏しい以外は顕著な物性の違いが認められず、分離精製には排除体積高速液体クロマトグラフ装置を用いて単離することが出来た。各種環状物の熱的相転移挙動を検討するため示差走査熱量分析を行ったところ、オクチル基を有する環状5量体は、昇温過程において相転移に基づく3本の吸熱ピークが確認された。偏光顕微鏡による観察では、これらのピークは低温側からそれぞれ固体→固体、固体→固体、固体→液晶の相転移に対応しており、およそ200°C以上の温度で液晶状態を示すことが解った。これは剛直な平面構造を有する環構造がπ-π相互作用によりスタッキングしてディスコチックカラム液晶を示したものと思われる。さらに温度を上げると、ブタジイニル基の重合に基づくと思われる発熱が認められ、恐らく化合物が分解しているものと思われる。
肝炎高発系LECラットにおける劇症肝炎発症機構の免疫遺伝学および免疫病理学的研究

非近交系LongーEvansラットから分離された近交系LECラットは約4カ月齢でその40%以上が急性肝炎を発症し、そのうち約半数は死亡する。生存例は慢性肝炎を経てほば全例肝癌を発生することなどから、ヒト肝炎、肝癌の新しいモデル動物として注目されている。LECラットの急性肝炎は常染色体劣性遺伝形式で起こり、何らかの代識異常による可能性が考えられていた。最近、当研究グル-プによりLECラットの肝臓中に銅の異常蓄積が起こっており、血清中ではceruloplasminおよび銅の低下のあることが明らかにされた。LECラットの肝組織には生後2日齢より銅が蓄積し始め、肝炎発症前の3カ月齢に肝細胞毒性を示すレベルに達していることから、LECラットに先天性銅代謝異常が存在し、それによって肝へ銅が蓄積し、肝細胞障害及び劇症肝炎の発症になっているものと考えられる。さらに、劇症肝炎から生き残ったLECラットは胆管線維症を経てほぼ100%肝細胞癌を発症する。この事実は、LECラットにおける肝癌の発生に銅代謝異常が何らかの形で関与している可能性を示唆している。ヒトにおける先天性銅代謝異常疾患としてWilson病がよく知られている。Wilson病は常染色体劣性遺伝で起こり、大部分の患者は急性肝炎、肝硬変にて死亡し、一部の患者では肝癌の発生が報告されている。LECラット肝炎はWilson病と遺伝形式、臨床病理所見などがよく似ており、Wilson病の機序解析および診断・治療の恰好のモデル動物と言える。LECラットは肝炎・肝癌を自然発生し、その発癌の臨床経過はヒト肝癌に類似している。我々はLECラットの肝癌発症過程における細胞性癌遺伝子(c-myc、N-myc、c-fos、c-jun、p53、H-ras、c-raf、hst)および癌関連遺伝子(AFP、GST-P)さらにPCNA遺伝子の発現について解析した。急性肝炎発症前の群として5週齢、前癌状態の群として8カ月齢の各LECラット肝組織および18カ月齢のLECラットに発生した肝癌よりpoly(A)^+RNAを調整し検体とした。各群3個体以上のラットを使用し、対照としては8ヶ月齢のLEAラット肝組織より検体を調整した。またAFPの発現については生後3日のLECラット、LEAラットも加えて用いた。各検体の遺伝子発現をノ-ザンブロット法にて解析した。c-junは8カ月齢のLECラットで対照に比較して2.6倍の発現上昇を認めたが、肝癌では低下していた。GST-Pは8カ月のLECラットで対照に比較して6.4倍、肝癌で147.7倍の発現上昇を認め、その発現量の増大はLECラット肝癌の発症経過と平行していた。c-fosは4例中1例の肝癌に発現を認めたのみであった。c-myc、p53、H-ras、N-ras、c-raf、PCNAでは発現は認められたが各群の間に有意な差はなかった。N-myc、hstは発現を検出できなかった。AFPは生後3日のLECラット、LEAラットで共に強く発現されていたが、他には発現を検出できなかった。LECラットの肝癌発症過程においてc-jun、GST-Pの発現上昇が認められ両者がLECラットの発癌に関与している可能性が示唆された。しかし、LECラット肝癌では、ヒト原発性肝癌で高率に発現上昇が報告されているras癌遺伝子の発現上昇は認められなかった。LECラットの肝炎は常染色体劣性遺伝形式で発症し、また肝組織中への銅の蓄積、血清銅および血清セルロプラスミン値の低下、病理組織学的には巨大核を持つ巨大肝細胞の出現、肝細胞壊死などの特徴があり、ヒトのWilson病ときわめて類似した所見を示している。しかしながら、胆汁うっ滞などにおいても肝組織中への銅が蓄積することが知られている。

そこで、我々はLECラットの肝臓への銅の蓄積が肝炎の結果であるのか、あるいは原因となっているのかを、ヒトWilson病の治療薬であるdーpenicillamineをLECラットに投与し検討した。その結果、dーpenicillamineの投与によりLECの肝炎は完全に抑制され、肝組織中の銅含量も著明に低下していた。dーpenicillamineの作用機作として、銅をキレ-トとし尿中に排泄することにより、肝組織中への銅の蓄積を防ぐことが知られている。すなわち、dーpenicillamineをLECラットに投与することにより、銅がキレ-トされ排泄された結果、肝組織中への銅の蓄積が低下し、肝炎の発症が抑制されたと考えられる。このことより銅の肝組織への蓄積がLECラットの肝炎の原因であることが示された。今後、LECラットはヒトWilson病の発症メカニズム、特に銅代謝異常の解析に重要なモデル動物になりうるものと考える。
精巣における酸化ストレスによるアポトーシスの制御機構の解明

Monash UniversityにてMoira O'Bryan教授の指導の下、主に2つのプロジェクトに取り組んでいる。1精子形成におけるLRGUK1の機能:以前、当研究室ではLRGUK1のmutantマウスを樹立した。このマウスではアクロソーム、マンシェットの形成、精子の軸索形成異常が引き起こされる。そこでLrguk1の機能の解明を行うため、binding partnerの検索をYeast two hybridを用いて行った。Lrguk1の結合因子としていくらかの候補を確認したが、それらはいずれもtrans-GolginetworkからIntramanchette transport (IMT)の輸送にかかわる可能性の高い因子が得られた。現在それらの因子との結合に関して免疫沈降等を用いて解析しており、変異によりこれらの因子との結合に異常を生じているかについても調べている。2Katnb1ノックアウトマウスの機能解析:KATNB1はmicrotubuleの切断・調節因子として働いており、精子形成においても多くの過程でmicrotubuleが関与している。KATNB1遺伝子はmicrotubuleの切断活性を調節する因子として機能していると考えられている。以前Katnb1 mutant mouseを当研究室で樹立した。Katnb1 mutant mouseではマンシェットの形成や軸索形成異常、さらに減数分裂時にapoptosisが著名に誘導されていた。そこで、Katnb1が減数分裂にどのようにかかわっているのかを解析している。Katnb1 conditional knockout mouseも樹立した。Katnb1 conditional knockout mouseではmutant mouseに比べてさらにsevereな表現型を認めた。27年度が最終年度であるため、記入しない。1精巣における酸化ストレスによるアポトーシスの制御機構の解明1. Pgam5の精巣における発現の再検討以前使用していたPgam5抗体ではPgam5はEctoplastic specializationにシグナルを認めたが、別の様々なPgam5抗体を用いて、精巣における発現を再度検討したところ、Pgam5は精母細胞から初期の精子細胞に発現している可能性が考えられた。また精粗細胞の一部でも発現がみられるが、RT-PCRではGS細胞では発現を認めなかった。さらにミトコンドリア特異抗体COX4抗体との2重免疫染色では、ミトコンドリアに発現が集積していることが考えられた。2.マウスの精巣へのheatstressモデルを用いた解析マウスを42度の恒温槽へ半身浴後のPgam5及びKeap1-Nrf2経路の変化を解析している。mRNAの発現はPgam5では上昇しており、keap1-Nrf2経路の変化も認められてるが、タンパク発現レベルでは上昇はみられるが、著名な変化とまではいかない。またKeap1-Nrf2経路やBc12 familyの変化を解析しているが、著名な変化とは言えない状況である.2TRA98 monoclonal抗体の抗原遺伝子の精子幹細胞の複製・分化に与える影響上記のknockoutマウスのphenotypeを調べると、精巣においては精母細胞は認められるものの、それ以降の分化が停止しており、無精子症のモデルマウスが得られた。現在抗原遺伝子のどの部分がepitopeとしてTRA98 monoclonal抗体と反応しているかを確定するため、fragmenttation化したrecombinant proteinを作成し、抗体との反応性を検討しており、概ねそのepitopeの絞り込みはできている。1精巣における酸化ストレスによるアポトーシスの制御機構の解明1.Pgam5の精巣における発現の再検討:Pgam5抗体とミトコンドリア特異抗体COX4抗体との2重免疫染色で、ミトコンドリアに発現が集積していた。Pgam5の恒常発現した細胞株をレンチウイルスを使って作成した。Pgam5が細胞株で過剰発現していたが、アポトーシス系のタンパクであるBcl2系の転写やタンパク発現を調べたが、軽度の変化のみであった。使用細胞株の適正を含めた検討が必要であると考える。2TRA98 monoclonal抗体の抗原遺伝子(Nkapl)の精子幹細胞の複製・分化に与える影響1.抗原遺伝子(Nkapl)特異的抗体の作成:市販のNKAPL抗体を様々な条件検討を行って使用してきたが、マウスにおける内在性レベルのタンパクの検出には十分ではないことが判明したため、2種類のエピトープを作成し、NKAPL特異的抗体の作成を行った。2種類のうち1種類はマウスの抗原遺伝子への特異性の高い抗体であることがわかった。また精巣切片にこの抗体を用いて免疫染色をしたところ、Differentiating spermatogoniaとspermatocyteで発現を認めた。2.Germline Stem cell(GS)の培養確立とTRA98 monoclonal抗体の抗原遺伝子のノックアウトマウスの作成:ICR pupの精巣よりGS細胞を樹立し、NKAPLを発現するレンチウイルスを作成し、overexpressionさせたGS細胞株を作成した。この細胞株を検討すると増殖速度や形態学的には変化を認めなかったが、Notch signalingの下流遺伝子であるHes family遺伝子の発現が有意に変化していた。またspermatogoniaの増殖因子や分化に関与する遺伝子群においても有意な変化を認めた。次に本遺伝子のノックアウトマウスの表現型を精査すると、精巣で典型的なMaturation arrestを示し、pachytene spermatocyteで著名なアポトーシスを認めた。精細胞の増殖因子や分化に関与する遺伝子群の変化に著名な変化を認めた。

このマウスではアクロソーム、マンシェットの形成、精子の軸索形成異常が引き起こされる。そこでLrguk1の機能の解明を行うため、binding partnerの検索をYeast two hybridを用いて行った。Lrguk1の結合因子としていくらかの候補を確認したが、それらはいずれもtrans-GolginetworkからIntramanchette transport (IMT)の輸送にかかわる可能性の高い因子が得られた。現在それらの因子との結合に関して免疫沈降等を用いて解析しており、変異によりこれらの因子との結合に異常を生じているかについても調べている。2Katnb1ノックアウトマウスの機能解析:KATNB1はmicrotubuleの切断・調節因子として働いており、精子形成においても多くの過程でmicrotubuleが関与している。KATNB1遺伝子はmicrotubuleの切断活性を調節する因子として機能していると考えられている。以前Katnb1 mutant mouseを当研究室で樹立した。Katnb1 mutant mouseではマンシェットの形成や軸索形成異常、さらに減数分裂時にapoptosisが著名に誘導されていた。そこで、Katnb1が減数分裂にどのようにかかわっているのかを解析している。Katnb1 conditional knockout mouseも樹立した。Katnb1 conditional knockout mouseではmutant mouseに比べてさらにsevereな表現型を認めた。研究成果については、meiotic arrestを起こす新たなノックアウトマウスの系を確立し、さらにそのphenotypeの解析や分子レベルでの変化をNotch signaling pathwayに沿って解明し、論文を作成した。現時点では研究計画に沿って概ね予定通りに研究が進行していると考えられる。研究への取り組みに関してもこれまでの研究結果を十分に吟味し、考察を行ったうえで、綿密な計画を立て、懸命に取り組む予定である。27年度が最終年度であるため、記入しない。本研究にて確立したNkaplノックアウトマウスはApoptosisを伴うspermatocyteが非常に多く見られ、complete meiotic arrestを引き起こしていた。
パピルス文書による初期イスラーム時代行政制度研究

本年度には、主にアラビア語パピルス文書に関する基礎的研究を行った。第一に、既に刊行されているアラビア語パピルス文書のカタログから、公的文書に関するデータを集めて整理し、その形式に関する分析を行った。現在までに明らかになっているのは以下の二点である。第一に、初期イスラーム時代のアラビア語パピルス文書の宛名部分の書式については、公的な文書に関しては一定の書式が保たれ、ホラーサーンで作成された文書や年代記等に残された文書の書式と類似するということである。第二に、初期のアラビア語パピルス文書には人物名などに付される祈願文がほとんど見られず、それが年代を判断するてがかりになりうるということである。またエジプトのアレキサンドリア図書館およびドイツのハイデルベルク大学パピルス学研究所において調査を行った。アレキサンドリア図書館においては、ウィーン国立図書館をはじめとするパピルスコレクションのマイクロフィルムを閲覧、複製した。また、ハイデルベルク大学パピルス学研究所においては、未校訂の初期イスラーム時代の行政に関わると思しきアラビア語パピルス文書を実見し、解読を試みた。とりわけ、Heid.Arab.658は、残存している部分は必ずしも多くないが、「信徒の長」からの命令を伝える総督の文書と見られ、カリフから発せられた指示がどのような形で伝達、実行されていたかを窺うことのできる史料である。この文書については、ハイデルベルク大学パピルス学研究所よりデジタルイメージを譲り受け、現在解読を進めている途上である。
DNA塩基配列を正確に読み取るテーラーメード抗がん剤の開発

今年度、配列特異的アルキル化能を有したヘアピン型ピロール(Py)-イミダゾール(Im)ポリアミドの分子設計を確立し、Fmoc固相合成法と組み合わせることによって生物実験への供給経路を確立した。中でも、合成したアルキル化ポリアミドを用いて、標的配列特異的なアルキル化を行い、遺伝子機能発現に与える効果や細胞増殖阻害活性との相関性の評価を進めた。その結果、標的とする塩基配列をタンパク質の遺伝情報が集約されているコーディング領域に設定し、その標的配列に対する特異的アルキル化によるタンパクの発現制御をヒト細胞実験によって確認した。また、ヒトがん細胞に対する遺伝子発現に対する効果を、ヘアピン型Py-Imポリアミドを用いて、DNAチップによって解析した結果、配列認識能の違いによる遺伝子発現の抑制や活性化に変化が現れることを確認した。加えて、39種類のヒトがん細胞スクリーニングパネル評価をすすめることによって、分子量が1しか違わない非常に構造の類似した2種の異なる配列特異性をもつアルキル化ポリアミド間に、配列特異性の差異に由来する細胞増殖阻害活性の差が観察された。ラットを使ったポリアミド分子の細胞および核への透過性や臓器移行性の確認も進み、アルキル化ポリアミドを用いたゼノクラフトマウス実験による抗癌活性の評価も始めている。将来的には、薬剤としての最適化を進めながら、得られた生物活性情報を総合的に判断し、特定がんに対して特異的に作用するテーラーメード抗がん剤を実現する。これまでの研究により2本鎖DNAの塩基配列を正確に認識するピロール-イミダゾールポリアミドに、抗がん性抗生物質デュオカルマイシンの反応部位にビニルリンカーを介して結合させたポリアミドコンジュゲートがDNAに対して配列特異的にアルキル化することが明らかとなっている。本年度は認識配列を伸ばすことを目的とし、これらを共有結合でダイマーとした分子を合成し配列特異的なインターストランドクロスリンカーを設計した。これらの分子はパートナー存在下でのみ効率良く2本鎖DNAをインターストランドクロスリンクした。またヘアピン型ポリアミドについても認識部位と反応部位の間にビニルリンカーを挿入したコンジュゲートを合成した。ヘアピン型ピロール-イミダゾールポリアミドはビニルリンカーをもたないものと比べDNAに対する反応性も飛躍的に高まった。また認識配列の長い分子を簡便に合成する目的で、ポリアミドの固相合成法を確立することに成功した。また固相合成が確立したことによって、すべての可能な配列を読むポリアミドプールの合成についても原理的に可能になった。配列レベルでの分子標的をコンビナトリアル的に探索するためには、今後は特定のがん細胞に選択毒性を示すものを効率よく選び出すスクリーニング法を開発する必要がある。DNAアルキル化剤は1970年代の第一世代の抗がん剤と言われ、開発は頭打ちになっている。DNAアルキル化剤に正確な塩基配列特異性を付与することによって、副作用のないテーラーメードの抗がん剤を開発する糸口ができるものと考えている。1)配列特異的なアルキル化剤の開発ピロール-イミダゾールヘアピン型ポリアミド認識部位と反応部位の間にビニルリンカーを挿入したコンジュゲート類を多種合成し,これらはビニルリンカーをもたないものと比べ、DNAに対する反応性が約100倍ほど向上することが示された。またコンピューターモデリングの結果、反応部位の裏側にピロールやイミダゾールが重なり、反応点を支えることが反応性の向上には重要であることが示唆された。2)DNAチップを用いた配列特異的アルキル化剤による遺伝子発現への影響の解析ヒト肺ガン細胞に対する発現に対する効果を、我々が合成した中でも強い抗細胞活性を示したImPyLDu86を用いて、細胞に1時間作用させた後にDNAチップ(Gene Chip)を用いて解析した。その結果、特にRas、サイクリンB、CDK、Rat、vFos、cMicが抑制されていることから、ImPyLDu86の細胞増殖抑制はRasをとおして最終的にサイクリンBをおさえていることが示唆され、Bax deltaの発現増加に関してもアポトーシスを引き起こした徴候を示していると考えられる。3)ヒト培養がん細胞を用いた抗細胞活性パネル試験これらの化合物について癌研究会において39種類のヒト培養がん細胞に対する抗細胞活性(スクリーニングパネル)を検討し、ビニルリンカーをもつ高いアルキル化能を有するポリアミドは、持たないものと比べ非常に強い活性を示すことが明らかになった。また配列特異的アルキル化能とがん細胞の違いによって、よって著しい抗がん活性の違いが見られた。今年度、固相合成法と組み合わせたアルキル化ヘアピン型ポリアミドの実用的な分子設計に成功し、生物実験等で必要になる量の供給経路が確立した。そこで、アルキル化ポリアミドを用いて、がんの分子生物学的知見に基づいたターゲティングを行い、遺伝子機能(mRNAへの転写、蛋白質への翻訳)に与える効果や塩基配列特異的アルキル化との関連性を評価・検討した。その結果、標的とする塩基配列を、遺伝子のmRNA発現に共有されているプロモーター領域のみに限らず、タンパク質の遺伝情報が集約されているコーディング領域に拡張することに成功した。すなわち、その配列特異的アルキル化による蛋白コード領域を標的配列としたmRNAやタンパクの発現制御を実現した。また、ヒト肺ガン細胞に対する発現に対する効果を、強い抗細胞活性を示したアルキル化ポリアミド分子を用いて、DNAチップを用いて解析した結果、細胞増殖抑制に関して、Rasを通して最終的にサイクリンBを抑えながらアポトーシスが引き起こされることが示された。

さらに、2種の異なる配列特異性をもつアルキル化ポリアミド分子に対しても、DNAチップを用いて解析した結果、いくつかの遺伝子に関して、配列特異性の差異に由来する興味深い遺伝子の抑制が観察された。ラットを使ったポリアミド分子の細胞および核への透過性や経口投与による臓器移行性の確認もできた。従って、溶解性の改善など、薬剤としての最適化を進めながら、現段階までに得られた情報を総合的に解析し、小児がん、膀胱がん、前立腺がんなどの特定のがん細胞に対し特異的に作用する目的のテーラーメード抗がん剤の開発が進んだ。今年度、配列特異的アルキル化能を有したヘアピン型ピロール(Py)-イミダゾール(Im)ポリアミドの分子設計を確立し、Fmoc固相合成法と組み合わせることによって生物実験への供給経路を確立した。中でも、合成したアルキル化ポリアミドを用いて、標的配列特異的なアルキル化を行い、遺伝子機能発現に与える効果や細胞増殖阻害活性との相関性の評価を進めた。その結果、標的とする塩基配列をタンパク質の遺伝情報が集約されているコーディング領域に設定し、その標的配列に対する特異的アルキル化によるタンパクの発現制御をヒト細胞実験によって確認した。また、ヒトがん細胞に対する遺伝子発現に対する効果を、ヘアピン型Py-Imポリアミドを用いて、DNAチップによって解析した結果、配列認識能の違いによる遺伝子発現の抑制や活性化に変化が現れることを確認した。加えて、39種類のヒトがん細胞スクリーニングパネル評価をすすめることによって、分子量が1しか違わない非常に構造の類似した2種の異なる配列特異性をもつアルキル化ポリアミド間に、配列特異性の差異に由来する細胞増殖阻害活性の差が観察された。ラットを使ったポリアミド分子の細胞および核への透過性や臓器移行性の確認も進み、アルキル化ポリアミドを用いたゼノクラフトマウス実験による抗癌活性の評価も始めている。将来的には、薬剤としての最適化を進めながら、得られた生物活性情報を総合的に判断し、特定がんに対して特異的に作用するテーラーメード抗がん剤を実現する。
DNAの分子認識能を活用した新規分子認識ゲート膜の創製

本研究では、核酸の分子認識に伴うナノスケールの構造変化をマクロスケールへと変換する分子認識材料として、DNAと感温性ポリマー(pNIPAM)を複合化したDNA-pNIPAMについて研究を行い、標的分子認識に伴いDNAが標的分子を捕捉する標的分子捕捉モードを用いてDNA-pNIPAMの分散・凝集状態を制御した。標的分子捕捉前の初期状態での検討から、二本鎖(ds)DNAの余剰配列部の末端構造の有無により、分散・凝集挙動を制御できることが示された。続いて、標的分子であるトロンビンを添加した実験の結果、標的分子捕捉モードを用いたdsDNA-pNIPAMの分子認識が可能であることが示された。核酸による分子認識は、リボスイッチに代表されるように生体内における反応制御で重要な役割を果たしている。核酸の分子認識性をバイオセンサーやドラッグデリバリーシステムへ展開するためには、DNAの分子認識に伴うナノスケールの構造変化をマクロスケールの変化へ増幅する必要がある。本研究では、DNAの分子認識能を活用し、感温性ポリマーpoly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAM)のアクチュエータ機能と協調させた分子認識材料に関する研究を行う。DNAを側鎖へ化学的に結合した共重合ポリマーDNA-pNIPAMについて、これまでに本研究グループでは、標的分子の認識に伴うDNA二本鎖の解離をトリガーとして、DNA-pNIPAMが分散状態から凝集状態へと移行することを示している。本年度は、新しい分子認識モードの発現、すなわち、分子認識に伴いDNA-pNIPAMが凝集状態から分散状態へと移行する標的分子捕捉モードの発現へ向けた検討を行った。この標的分子捕捉モードでは、DNA-pNIPAMの初期状態は凝集状態にあり、標的分子を認識してもDNA二本鎖が解離せず、DNA-pNIPAMへ標的分子が捕捉されることにより、分散状態へと移行する。はじめに、初期状態の検討を行った。従来研究において、構造が剛直な二本鎖DNAではDNA-pNIPAMが凝集し、柔軟な一本鎖DNAでは分散することが分かっている条件下において、二本鎖が余剰な一本鎖を有している場合は分散状態を示したが、余剰な一本鎖内でグアニン(G)四重鎖構造を取る場合には、DNA-pNIPAMが凝集することを明らかにした。また、相補鎖形成部位の塩基数について検討し、標的分子を認識してもDNA二本鎖が解離しない条件を見出した。新しい分子認識モードである標的分子捕捉モードの発現へ向けて、必要となる初期状態の制御、および分子認識に伴うDNA二本鎖解離の抑制に成功したことから、概ね順調に進展していると判断した。核酸の分子認識性をマクロスケールの変化へ増幅できれば、多様な分子認識性を有するデバイス開発が可能となる。そこで本研究では、DNAの分子認識能を活用し、感温性ポリマーpoly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAM)のアクチュエータ機能と協調させた分子認識材料に関する研究を行う。DNAを側鎖へ化学的に結合した共重合ポリマーDNA-pNIPAMについて、これまでに本研究グループでは、標的分子の認識に伴う二本鎖DNA(dsDNA)の解離をトリガーとして、DNA-pNIPAMが分散状態から凝集状態へと移行することを示している。また、昨年度DNA単独で検討を行った結果、DNAが二本鎖を形成する配列位置を調整することで、標的分子の認識に伴い、dsDNAが解離するのではなく二本鎖のまま標的分子を捕捉するモードが存在することが明らかとなった。本年度は、新しい分子認識モード、すなわち標的分子補足モードの発現へ向けた検討を行った。本モードでは、標的分子解離モードとは異なり、初期状態では凝集状態にあるDNA-pNIPAMが、標的分子を認識して捕捉すると分散状態へ移行する分子認識性の発現を目指す。初期の凝集状態について、外部溶液濃度やポリマー中のDNA比率などの検討を行い、余剰な一本鎖部位を有するdsDNAについて、余剰な一本鎖部位の構造の有無で凝集状態を形成させるために必要な操作条件を明らかにした。新しい分子認識モードである標的分子捕捉モードの発現へ向けて、余剰な一本鎖部位を有するdsDNAについて、余剰な一本鎖部位の構造の有無でDNA-pNIPAMを凝集させるために必要な操作条件を明らかにしたことから、概ね順調に進展していると判断した。DNAを側鎖へ化学的に結合した共重合ポリマーDNA-pNIPAMについて、これまでに本研究グループでは、DNAが二本鎖を形成する配列位置を調整することで、標的分子の認識に伴う二本鎖DNA(dsDNA)の解離をトリガーとしてDNA-pNIPAMが分散状態から凝集状態へと移行するモードと、標的分子を認識してもdsDNAが解離せず二本鎖のまま標的分子を捕捉するモードが存在することを明らかにしている。また、標的分子補足モードでは、初期状態が凝集状態となる必要があるため、凝集状態をとる条件について検討を行ってきた。

本年度は、相補鎖形成比率や外部溶液塩濃度を制御したうえで、余剰な一本鎖部位でG四重鎖構造を形成する場合に、凝集状態となることを明らかにした。一方で、余剰な一本鎖部位で構造形成をしない場合には同条件で分散状態となったことから、余剰な一本鎖部位の構造が凝集・分散状態へ影響を与えることを明らかにした。また、G四重鎖構造を取り、たんぱく質を認識することが知られている相補鎖を用いたところ、標的分子添加時に凝集が抑制された。以上の結果、標的分子補足モードを用いても分子認識が可能であることが示された。本研究では、核酸の分子認識に伴うナノスケールの構造変化をマクロスケールへと変換する分子認識材料として、DNAと感温性ポリマー(pNIPAM)を複合化したDNA-pNIPAMについて研究を行い、標的分子認識に伴いDNAが標的分子を捕捉する標的分子捕捉モードを用いてDNA-pNIPAMの分散・凝集状態を制御した。標的分子捕捉前の初期状態での検討から、二本鎖(ds)DNAの余剰配列部の末端構造の有無により、分散・凝集挙動を制御できることが示された。続いて、標的分子であるトロンビンを添加した実験の結果、標的分子捕捉モードを用いたdsDNA-pNIPAMの分子認識が可能であることが示された。標的分子捕捉モードの発現へ向けた検討を継続し、H27年度の検討において初期状態で凝集状態をとることが明らかになった余剰一本鎖部位にG四重鎖構造を有するDNA-pNIPAMに対して、標的分子を添加して凝集・分散挙動へ与える影響を評価する。明瞭な分子認識挙動が得られない場合には、標的分子の認識へ影響するDNAの塩基配列や、DNA-pNIPAMの凝集・分散性へ影響するコンジュゲート比率および外部イオン濃度について検討を行う。標的分子捕捉モードの発現へ向けた検討を継続し、これまでの検討において明らかとなった初期状態で余剰一本鎖部位に構造を有する場合にDNA-pNIPAMが凝集状態をとる操作条件において、標的分子を添加して凝集・分散挙動へ与える影響を評価する。また、余剰一本鎖部位での構造形成について、蛍光分子等を用いた評価を行い、構造形成と分子認識の関係を明らかにする。化学工学交付内定が年度途中であったため、一年分を想定していた当初計画とは異なる資金執行となった。消耗品として、DNAオリゴマーや、ポリマー合成で用いる試薬類、ガラス器具、ガス類を購入する。また、成果発表のための旅費、印刷費、論文投稿時の英文校正費を計上している。
ステロイド系シクロファン"コーラファン"を用いた分子認識および光反応制御

コール酸により架橋されたシクロファンであるコーラファンを合成し、ヌクレオシド等の分子認識を目的とした。コーラファンのみでなく溝状ジポダント型コール酸誘導体による分子認識、および結晶場における新規チャンネル構造の構築についても研究した。また合成したコーラファンの光増感剤としての機能を検討した。1.コーラファンの合成および分子認識能:4種類の空孔のサイズの違うビシクロコーラファンを合成した所、10^2M^<-1>オーダーの結合定数でアミノ酸誘導体、グルコピラノシド誘導体を認識した。特記すべきはこのうちの一つでほとんど例を見ない選択的なヌクレオシドの認識に10^4M^<-1>オーダーの結合定数で成功した。2.ジポダント型溝状コール酸誘導体による分子認識:スペンサー部位にナフタレンテトラカルボキシイミド骨格を用い、両腕のポダント部位にコール酸を有する溝状ホスト分子を合成した。このホスト分子は10^2M^<-1>のオーダーで2,6-ナフタレンジメタノールを取り込み、温度可変^1HNMRによる立体配座解析の結果、取り込みいよりその立体配座を溝状に変換する事が判明した。3.コール酸誘導体の結晶場における新規チャンネル構造の創製:コール酸メチルエステルの3位にアントラセン環をエステル結合により導入したコール酸誘導体を合成し、ゲスト分子と再結晶する事によりクラスレート化合物を生成した。単結晶X線構造解析により従来とは全く異なる新規チャンネル構造見出した。4.ビジクロコーラファンによる光反応制御:ナフタレン系の[2+2]光環化反応にビシクロコーラファンを光増感剤として用い十分、増感剤として機能する事を見出した。しかしながら現在のところ不斉誘起には至っていない。今後、さらなる検討が必要である。コール酸分子を架橋部位とし、また芳香族化合物を蓋およ底部とすることにより単環性および2環性のコーラファンを合成しその分子認識能を検討した。1.単環性および2環性コーラファンの合成合成は2段階により行った。コール酸メチルエステル2分子または3分子を3位の水酸基とテレフタル酸クロリドまたはトリメジン酸クロリドと反応させる事によりジポダントまたはトリポダントを合成した。端末エステル期を選択的に還元した後、再び酸クロリドによりエステル化し閉環させコーラファンを合成した。2.溶液中におけるコーラファンによる分子認識合成したコーラファンをもちいて種々の有機分子の分子認識を試みた。糖、アミノ酸誘導体を結合定数10^2-10^3(M^<-1>)のオーダーで取り込むことに成功した。アミノ酸誘導体では中程度のエナンチオ選択性を見いだした。特記すべき点は、ヌクレオシドのうち、チミジンを選択的に、10^4(M^<-1>)のオーダーの結合定数で取り込んだことである。コーラファンの空孔サイズの影響も検討した。コール酸3位または24位をアントラセン骨格のような芳香環を持つエステル基に換え、π-π相互作用を利用したネットワーク構造を構築し有機分子の取り込みを検討した。現在単結晶X線回折による構造解析が進行中である。前年度は主に、コール酸3分子により架橋されたビシクロ、コーラファンを用いたアミノ酸誘導体、糖類、ヌクレオシド等の分子認識を行ったが本年度は閉環型ではなく鎖上のジポダント型コール酸誘導体による分子認識、および結晶場における新規チャンネル構造の解析について研究した。また合成したコーラフアンの光増感剤としての機能を検討した。1.ジポタント型溝状コール酸誘導体による分子認識:合成の簡便さを考え、ジポダント型のコール酸誘導体を合成し、分子認識能を検討した。スペーサー部位にナフタレンテトラカルボキシイミド

骨格を用い、両腕のポダント部位にコール酸を有する溝状ホスト分子を合成した。このホスト分子は10^2M^<-1>のオーダーで2,6-ナフタレンジメタノールを取り込み、温度可変^1HNMRによる立体配座解析の結果、取り込みによりその立体配座を溝状に変換する事が判明した。2.コール酸誘導体の結晶場における新規チヤンネル構造の創製:コール酸は結晶構造において層間にチャンネル構造を取ることが知られているが、新たな網目状チヤンネル構造の構築を目指した。コール酸メチルエステルの3位にアントラセン環をエステル組合により導入したコール酸誘導体を合成し、ゲスト分子と再結晶する事によりクラスレート化合物を合成した。単結晶X線構造解析により従来とは全く異なる新規チヤンネル構造見出した。4.ビシクロコーラファンによる光反応制御:ナフタレン系の[2+2]光環化反応にとビシクロコーラファンを光増感剤として用い十分、増感削として機能する事を見出した。しかしながら現在のところ不斉誘起には至っていない。今度、さらなる検討が必要てある。