hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
不死化ヒト肝細胞を用いたハイブリッド型人工肝臓の作製

2.組み替えウイルスベクター感染後の形質転換コロニー形成率:MOI 100で組み替えベクターをヒト肝細胞に感染させ1×10^6/flask(25cm^2)となるようにplatingした。この状態で34週間培養を続けると10^6個に対して約100個の形質転換コロニーが出現した。3.長期継代培養と不死化:SV40初期遺伝子導入ヒト肝細胞をbu1k状態で継代培養し続けたところ9か月以上にわたって良好に増殖を示しており不死化したと考えられる。このようにして継代培養した肝細胞にSV40T抗原の免疫染色を施行したところ、ほとんどの細胞でSV40T抗原が陽性であった。結語組み替えウイルスベクターを用いると効率よくヒト肝細胞へのSV40初期遺伝子導入、形質転換が可能であり、不死化が行えた。【目的】初代培養肝細胞を用いたハイブリッド型人工肝臓の研究開発が進んできている。しかし初代培養肝細胞は、通常の培養条件では数週間程度しか維持させることができず、次々と死滅していく。また初代培養肝細胞は安定供給も難しく、これらのことが初代培養肝細胞を用いたハイブリッド型人工肝臓作製にあたっての大きな制限となっている。私は、アデノウイルスベクターを用いるとラットおよびサル初代培養肝細胞にSV40初期遺伝子を導入、形質転換させ得ること、長期培養、不死化さらに大量培養が行えることを見いだした。今回同様の方法によりヒト肝細胞の不死化(平成9年度)およびこれを用いたハイブリッド型人工肝臓の作製を試みた。【方法および結果】1.in vitroでalbumin合成、Urea産生能、Tyrosineaminotransferrase(TAT)活性を測定した:長期継代培養していくと単層培養では経時的にalbumin合成、Urea産生能、TAT活性の低下が認められ肝細胞機能が減弱していくことが観察された。2.SCID(severecombined immuno deficiency)mouse移植しin vivoでの機能解析=10^2個、10^3個、10^4個の不死化ヒト肝細胞をSCID mouseの背部皮下に移植し4週間後にsacrificeし癌化していないことを確認した。3.不死化ヒト肝細胞をpoly-N-p-vinylbenzyl-β-D-lactonamide(PVLA)修飾シャーレ上で3次元培養を試みた:PVLAシャーレ上での単層培養は安定して行えているが3次元培養は、今年度まだ安定して行えていない。【結語】単層培養では経時的に肝細胞機能が減弱していくことがin vitroでの機能解析により明らかとなった。このため今後は、機能をよりよく温存する可能性が高い3次元培養を用いたハイブリッド型人工肝臓の作製を試みたい。
慣習国際法理論の再検討-その歴史的性格の究明と法源論再構築に向けて

(1)慣習法理論が重要性をもつようになったのは,それがすべての国を拘束する一般国際法を説明するための理論になった19世紀においてである.それまで,そうした理論は自然法理論であった.しかし,自然法理論の妥当性が失われると共に,欧米諸国の実行と考えに基づいた国際法を「非ヨーロッパ的」世界においても適用する必要が生じたため,一般国際法を説明するための新しい理論として慣習法理論が確立した.この意味で同理論は,基本的には,欧米諸国を中心にして形成された国際法の普遍的適用を維持していくという歴史的な性格をもっていたと考えられる.(2)慣習法理論の性格は,現在大きくかわりつつある.例えば,この理論の核心をなす「法的信念」は,従来は大国の意思を普遍的意思に擬制する役割を果たしたが,現在では逆に,国際社会の多数派となった中小国の意思を普遍的意思に高める役割を果そうとしている. 1970年以降の国際利例,特に国連総会決議に諸国の「法的信念」が示されることを認めた1986年のニカラグア事件判決からも,そうした方向性をうかがうことができる.(3)慣習法なる概念が消滅しない限り,慣習法の認定問題は重要な争点になりつづけるが,その場合,伝統的に問題とされた慣行の存否よりも,法を定立しようとする国家意思を検証することが重視される傾向にある.これは,検証の手段の発達とその機械の増大,また何よりも,国際社会の構造変化とそれに伴う国際法定立過程の変容に起因していると考えられる.以上の諸点は今年度の研究を通じて得られた知見であるが,上記の研究課題は単年度で達成しうる性格のものではないので,今年度の成果を最大限に生かしつつ,ひきつづき探求を行い,数年後に研究の完成を期す所存である.(1)慣習法理論が重要性をもつようになったのは,それがすべての国を拘束する一般国際法を説明するための理論になった19世紀においてである.それまで,そうした理論は自然法理論であった.しかし,自然法理論の妥当性が失われると共に,欧米諸国の実行と考えに基づいた国際法を「非ヨーロッパ的」世界においても適用する必要が生じたため,一般国際法を説明するための新しい理論として慣習法理論が確立した.この意味で同理論は,基本的には,欧米諸国を中心にして形成された国際法の普遍的適用を維持していくという歴史的な性格をもっていたと考えられる.(2)慣習法理論の性格は,現在大きくかわりつつある.例えば,この理論の核心をなす「法的信念」は,従来は大国の意思を普遍的意思に擬制する役割を果たしたが,現在では逆に,国際社会の多数派となった中小国の意思を普遍的意思に高める役割を果そうとしている. 1970年以降の国際利例,特に国連総会決議に諸国の「法的信念」が示されることを認めた1986年のニカラグア事件判決からも,そうした方向性をうかがうことができる.(3)慣習法なる概念が消滅しない限り,慣習法の認定問題は重要な争点になりつづけるが,その場合,伝統的に問題とされた慣行の存否よりも,法を定立しようとする国家意思を検証することが重視される傾向にある.これは,検証の手段の発達とその機械の増大,また何よりも,国際社会の構造変化とそれに伴う国際法定立過程の変容に起因していると考えられる.以上の諸点は今年度の研究を通じて得られた知見であるが,上記の研究課題は単年度で達成しうる性格のものではないので,今年度の成果を最大限に生かしつつ,ひきつづき探求を行い,数年後に研究の完成を期す所存である.
中途失明者の生活移行期における看護の方向性の探求

平成13年度の研究目的は、(1)中途失明者の生活移行期(受傷直後から生活自立までの期間)における体験とそのプロセスを明らかにすること、(2)そのプロセスで生じている現象をもとに受傷初期に看護職に求められるケアの方向性を明らかにすることであった。そのための研究の実施経過は、中途失明者の生活移行期にあたる生活訓練の場での参加観察およびインタビューによる追加データの収集、および平成12年度、13年度の収集したデータの分析を同時に進めていった。集められた事例は12例で、インタビューによる質的データは、複数の研究者で、1事例あたり約3回の分析と、事例間の比較検討をくり返し実施した。その結果、対象が語った内容は、「視覚障害にいたった経緯」「受傷前の生活と受傷後の生活」「受傷後の主観的な体験世界」「生活の立て直しに影響した要因」に分類された。このうち、主観的な体験世界では、主に受傷経緯によって左右される「障害者としての世界と健常者としての世界から見た自己」「受傷後の経緯に伴う揺らぎ」などのカテゴリーが、また、障害立て直しに影響した要因では、「生活の拡大を図る人の存在」「経済的な安定と保証」「残された視覚」「視覚障害者間の関係」などが抽出された。さらに比較検討によって、「受傷年齢」「価値観」「受傷前の生活」などの違いが、こうしたカテゴリーに関与していることが明らかになった。看護の方向性として、(1)視覚障害特性に対するケアとして環境調整、時間感覚を伝える調整、生活技術の調整、(2)受傷時期に対応したケア:初期症状出現期における生活の調整、発症直後からの安全の保障、生活技術の各時期における心理的サポート、(2)受傷年齢に応じたケアが必要であると考えられた。平成12年における研究の目的は、日本における中途失明者の障害の実態および失明から生活自立にいたるまでの体験とその間の看護職の関わりについて明らかにすることであった。そのために、以下の2点について検討を進めた。(1)中途失明者の生活実態に関する研究報告、障害を受ける前やその後の心理社会的な側面における研究の動向、(2)障害をある程度自分のものとして捉えることができる過程にある視覚障害をもつ人との交流の場(研究フィールド)の検討である。まず、障害、中途失明の二つの概念を中心に、視覚障害visual impairment、盲blind、弱視low visionなど関連ある概念を広く探索し、日本国内と海外の研究動向を探った。その結果、日本では看護学の研究は乏しく、内容は視覚障害に関する総説論文や糖尿病などの疾患に関連した事例報告が主であった。外国文献でも同様の検索を行ったが、海外の研究は専門誌の数も多く、過去5年間を検索しただけでもおおよそ120件の関連文献があった。この中から、中途失明者の心理社会的な問題として、self-esteemの変化、抑うつ傾向などがあがり、さらに中途失明者の生活の変化に関する実態も明らかになった。これらと比較すると、日本における問題は、医療から生活訓練,社会復帰施設へとつなげられる過程のなかに、「家にいる」時期がかなり長く存在し、十分な情報提供のない状態にさらされていると考えられた。現在,この時期にどのように過ごされているかを明らかにすること、医療の中での看護職者の関わりが明らかになると考え、1施設における生活訓練途上にある対象者からデータ収集を進め、視覚障害者の訓練期までに体験された現象の分析を行っている。
地震防災ダイナミックデータベースの構築に関する研究

地震断層のモデル化から、その活動によって地震波が放射され、注目当該地点での基盤地震動を推定するモジュール、その地震基盤加速度から地盤の応答解析を行い地表面の地震動を推定するモジュール、さらにその地表面加速度から計測震度を算定するモジュール、計測震度、あるいは地表面加速度を用いて算出する応答スペクトルから家屋の被害推定を行うモジュール、家屋被害から人的被害を推定するモジュールを完成させた。これによって地震発生から被害の推定までの一連の作業が自動的に行えるシステムを構築できた。またこれと並行して、宇部市、岩国市の地盤データ、人口データ、家屋データの整備を行っている。これらはオブジェクト指向の考えに基づいて構築しているので随時更新可能である。次に、意志決定支援システムを構築するに当たって、まず防災計画震災対策編をシステム分析し、構造モデル化を行って、これをソフトウェア化した。これはパソコン上で、震度の情報入力に対して各部署が何をどのようにどの時点で行うかを提示するシステムである。この中には時事刻々と入ってくる情報を蓄積する機能を持たせている。これを次の意志決定に利用するわけであるが、この点については、引き続き研究している。さらに、地震被害状況を既存の画像処理技術を用いて定量化することを試みた。処理対象の画像データは、阪神・淡路大震災後の建物の状況を路上より自由な角度で撮影した写真をスキャナーで640×400画素の256階調で取り込んで用いた。処理はエッジ抽出、細線化、線分の方向検出の順に行い、線分方向のヒストグラムを作成した。ヒストグラムには、建物の水平、垂直、奥行き方向を示す2つないし3つのピークが現れるが、それ以外の方向を示す線分の割合が被災状況の主観的評価とほぼ一致するという結果を得た。
高校情報科の実態調査

高校情報科は2003年度より学年進行で開始され、2009年3月の学習指導要領の改訂により2015年度から学年進行で実施されている。2008年度に(財)コンピュータ教育開発センターが実施した全国規模の情報科実態調査において情報科指導の課題が浮き彫りにされた。本研究では現時点での情報科の実態調査を行いこの結果と比較した。この結果、情報科教員の指導に対する自信の度合が安定したこと、問題解決に関する指導が増加したこと、多くの情報科教員がプログラミング教育の必要性を意識していることなどを明らかにすることができた。その他、次期学習指導要領改訂に資すると思われる事実が明らかになった。本研究の目的は、高校情報科における教員の指導実態および生徒の学習実態を調査することにある。調査手段として、教員に対するアンケート調査とインタビュー、生徒に対するアンケート調査と客観テストを想定している。平成24年度に、東京都、埼玉県、千葉県の協力者10名とミーティングを重ね、生徒が情報科で習得すべき学力の分類、それを指導するために必要な教員のスキルなどをまとめた。この過程で、参加者の改訂学習指導要領に対する理解と意識を深めることができ、地域の研究会への啓蒙に寄与することができた。平成25年度は、前年度の結果を基に作成した、教員対象のアンケート項目を利用してプレ調査を行った。対象者は協力者に声掛けしていただいた教員20名であったが、現任校における科目の実施状況が、旧課程の情報A、情報B、情報C(2年次、3年次)と、新課程の社会と情報、情報の科学(1年次)とが混在している状態で、アンケート項目を見直す必要が生じた。このため、指導している科目によらないアンケート項目を再構築することにし、教員対象アンケートの本調査および教員対象ヒアリングについては平成26年度に行うことにした。この見直しの過程で、高校情報科における改訂科目等による課題点を浮き彫りにすることができ、情報科そのものの目標と生徒が情報科で習得すべき不易な能力について検討することができた。また、生徒対象のアンケートについても、25年度中にプレ調査を実施したが、前述したように学校間で実施科目の差異が生じている関係で、本調査を平成26年度に実施することにした。この際、旧課程履修者と新課程履修者が混在した環境でも調査結果が生かされ、適切な分析が行えるような工夫をすることにした。本研究の目的は高校情報科における、教員の実態および生徒の状況を把握することにある。この目的を達成するために、教員に対するアンケート調査と生徒に対する学力テストを行う。平成24年度は高校情報科教員の協力によりアンケート設計を進めた。次年度が改訂学習指導要領開始年度であることから、高校現場では旧課程から新課程への切り替え準備が盛んに行われており、新学習指導要領の情報交換会を兼ねて、東京都、埼玉県、千葉県の協力者10名とミーティングを重ねた。教員に対するアンケート調査については、調査の時期、方法、対象、質問内容などについて、情報科の改訂学習指導要領および解説とそれに基づいて編集された複数の検定教科書を基に協議した。この結果、生徒が情報科で習得すべき学力の分類、それを指導するために必要な教員のスキルなどを明らかにすることができた。この作業の過程で、参加した高校教員の改訂学習指導要領に対する理解と意識を深めることができ、彼らが参加する地域の教科教育研究会への啓蒙に寄与することができた。また、一部の地方の協力者にも協力を依頼し、試作アンケートに対する改善策を提案していただいた。教員対象のアンケート調査は平成24年度中に実施する予定であったが、アンケート結果の信頼度を上げるために、プレ調査および本調査を平成25年度に実施することにした。一方、生徒に対するアンケート調査および学力テストについては、協力者の勤務校で調査を行うための時間を確保できなかったため、平成24年度中はフレームワークを作ることにとどまった。平成25年度にはその時間を確保していただくよう協力者に要請したところであり、生徒を対象とした調査が実行できると考えている。平成20年度末に当時の(財)コンピュータ教育開発センター(CEC)により全国規模で高校情報科の実態調査が行われ、様々な課題が浮き彫りになった。本研究では、その後の状況を把握することを目的に、前回と同様な質問項目を含んだ全国アンケートを実施した。アンケートは全国の国公立高校および私立高校を対象に行われ、最終的に582校から回答を得ることができた。指導教員の実態としては、情報科と他教科とを兼担する教員の割合が全体の60%未満で、前述のCECアンケート時と比べると減少したが、依然と兼担の教員の割合が高いことが明らかになった。情報科の学習内容を24個に分類し、それぞれについて、どの程度必要だと考えるか、どの程度重点を置いて指導しているか、どの程度自信を持って指導ができているかを質問した。

この結果、「他者の権利と法制度の理解」、「情報社会におけるコミュニケーション技能」、「情報社会における安全性の理解と基本的なセキュリティ技能」など、情報社会に参画する態度に属する内容が、いずれの観点においても高い割合を示した。また、中学校の技術・家庭科で履修する学習内容8個について、その学力が十分であるかについて質問したところ、「著作権や発信した情報に対する責任を知り、情報モラルについて考えること」、「情報処理の手順を考え、簡単なプログラムが作成できること」については、60%以上の教員が不足していると回答した。プログラミング教育の必要性につい質問したところ、約70%の教員が小中高のいずれかの課程で実施することが必要であると回答した。情報活用能力の定義について見直すべきかについて質問したところ、「この定義のままでよい」が77.1%、「この定義は見直すべき」が4.0%、「どちらともいえない」が18.9%であった。これらの結果は、次期学習指導要領改定の基礎資料として重要な意味を持つと考えられる。教育工学平成25年度までに教員対象のアンケート調査を完了する予定であったが、現場は旧課程と新課程の混在時期で、学校によっては異なる学年で新旧の課程を履修しているという状況にあった。このため、アンケート調査については再度見直すこととし、プレ調査を省略して平成26年度に本調査を行う方針に切り替えた。平成25年度における、教員対象のヒアリングについては、研究協力者およびその知人に対して、電子メール等により行うことができたため、実質的な経費が発生しなかった。また、生徒対象のアンケート調査と客観テストについても同様で、新旧教育課程が混在する環境で妥当な結果を得るために、アンケート項目およびテスト内容の見直しを行った。以上の理由で、当初の予定から遅れている状況である。教員に対するアンケートは平成24年度中にほぼ完成したが、プレ調査および本調査は平成25年度に実施することにした。生徒を対象としたアンケートと学力テストについては、平成24年度はフレームワークを決めるところでとどまっている。その理由として、アンケート設計に関わる協力者との協議に多くの時間を費やしたこと、生徒を対象としたプレ調査の時間を確保できなかったことが挙げられる。平成25年度までに、教員対象のアンケート調査を完了する予定であったが、高校現場が旧課程と新課程の混在時期であり、学校によっては異なる学年で新旧の課程を履修しているという状況にあった。このため、アンケート項目を再度見直すこととし、最終年度である平成26年度にプレ調査を省略して本調査を行う方針に切り替えた。教員対象のヒアリングについては、研究協力者とその知人に協力を得ることで、電子メール等を利用して平成25年度内に一定件数を行うことができた。最終年度である平成26年度は、各地の教育研究会に協力を依頼して、可能な限りの継続的なヒアリングを行う予定である。生徒対象のアンケート調査と客観テストについても、新旧教育課程が混在する環境で妥当な結果を得るために、アンケート項目およびテスト内容の見直しを行った。
知的流動体複雑系のパニック情報伝達系に対する流体力学的アプローチ

知的流動体の個体ポテンシャル,個体ポテンシャルのもつ指向性を関数で表現して,生物の持つ特性を分子運動論的に表現した.その関数は,単純な2個体間の運動,ならびに,100個体の集団運動,100個体同士の正面衝突,交差流動について評価し,本シミュレーション法が妥当な結果を与えることを確認した.集団の特性は熱力学的な状態変数量で表現され,知的流動体の集団特性を定量的に表現することを可能とした.本シミュレーションから,個体の運動の基本特性は,動機関数と個体ポテンシャルの指向性が重要であることが示され,更に,人の運動などの場合には,全体の系が極めて散逸的であることが結論付けられた.この結果は,人の運動などでは,時系列的な変化が,連続的でなく,非線形かつ大きな散逸を伴う系であることを意味しており,生物の集団の特徴を表現する非常に有効な手段であることが判明した.パニック情報は,様々な形式でシミュレーションに取り込まれ,集団の中心で発生した事故から回避行動に移る集団の運動を表現することが可能となった.パニック情報は,基本的には,近接の個体からのパニック情報伝達で十分に現実的な回避運動が表現されており,知的流動体のパニック情報は,基本的に近接場における個体間の干渉で伝達されるものが重要であるとの結論を得た.人の流れ,大型水槽内の魚群の運動,モデル化した小型水槽内の魚群の流れを対象に,パニック状態の形成に関して考察した.パニック的状態は,その状態を再現する事や発生させる事が困難なため,数多くの取材を通じて,データを収集することを試みた.データの収集に関しては,大型水槽内での魚群の運動をビデオカメラで撮影した映像を鳥羽水族館の協力を得て入手し,その分析を行った.人の流れの解析は過去に撮影した画像データの分析方法に関して考察した.データの解析については,個々の運動物体の運動解析には,流体力学でよく用いられているPIV法により,時系列データを取得する.ビデオカメラで記録された画像の各フレームデータ間の画像解析により,運動物体の重心位置の変化をPIVにより解析し,各時刻における速度ベクトルと運動物体の流跡線を求めた.これをもとに,各物体の速度変動の統計データを求めるとともに,速度が急激に変化する点を抽出しそのデータをまとめる作業を行った.パニック状態のシミュレーションとして人の運動解析を行うために,人の運動の力学を単純モデルにより表現するために,基本モデルについて検討した.人の運動を粒子モデルで表現するために,粒子の運動を規定するポテンシャル関数を仮定し,これによる二体衝突問題を,シミュレーションした.シミュレーションに最適なポテンシャル関数のパラメータの最適値について検討し,また,時間刻みによる計算の安定性について検討した.知的流動体の個体ポテンシャル,個体ポテンシャルのもつ指向性を関数で表現して,生物の持つ特性を分子運動論的に表現した.その関数は,単純な2個体間の運動,ならびに,100個体の集団運動,100個体同士の正面衝突,交差流動について評価し,本シミュレーション法が妥当な結果を与えることを確認した.集団の特性は熱力学的な状態変数量で表現され,知的流動体の集団特性を定量的に表現することを可能とした.本シミュレーションから,個体の運動の基本特性は,動機関数と個体ポテンシャルの指向性が重要であることが示され,更に,人の運動などの場合には,全体の系が極めて散逸的であることが結論付けられた.この結果は,人の運動などでは,時系列的な変化が,連続的でなく,非線形かつ大きな散逸を伴う系であることを意味しており,生物の集団の特徴を表現する非常に有効な手段であることが判明した.パニック情報は,様々な形式でシミュレーションに取り込まれ,集団の中心で発生した事故から回避行動に移る集団の運動を表現することが可能となった.パニック情報は,基本的には,近接の個体からのパニック情報伝達で十分に現実的な回避運動が表現されており,知的流動体のパニック情報は,基本的に近接場における個体間の干渉で伝達されるものが重要であるとの結論を得た.
生活習慣病と組織幹細胞老化の連関メカニズム解明とその制御による予防・治療法の開発

老化に伴って組織幹細胞の機能異常が惹起されるメカニズムと、それらを糖尿病が増悪させるメカニズムの解明を試みた。特に糖尿病発症・増悪に関わる遺伝・環境・エピゲノム制御因子と組織幹細胞の老化や機能低下との関係の解明を試みた。先ず、老化に伴って、肥満し易く、糖尿病になり易くなるメカニズムの解明を試みた。老化に伴って、エネルギーを消費する褐色脂肪やベージュ脂肪細胞らしさを特徴づける遺伝子の発現レベルが、褐色脂肪細胞やベージュ脂肪細胞そのものではなく、白色脂肪組織で低下することを見出した。興味深いことに、マウスの系統の違いによって、寒冷・薬剤刺激に伴う白色脂肪組織からのベージュ細胞の出現率が違うことも見出した。このことはDNAの配列、すなわち遺伝因子と、環境因子の両方が重要であることを示している。さらに重要なことに、エピゲノム解析により、ベージュ細胞らしさに重要な遺伝子発現のマウス系統間の違いを説明し得るオープンクロマチン領域を見出している。この系統間の違いは組織前駆細胞にまで保存されており、極めて重要な知見と考えられた。次に、これらの制御機構が、個体の糖・エネルギー代謝に与える影響を検討した。エネルギーを消費する褐色脂肪やベージュ脂肪細胞らしさを特徴づける遺伝子の遺伝子改変マウスは、予想されるような糖・エネルギー代謝異常を示すことを見出した。さらに肥満糖尿病の病態では、これらの制御機構が低下していることも見出している。次にこれらの制御機構への介入が、肥満糖尿病の予防法・治療法開発につながる可能性について、検討した。興味深いことに寒冷刺激・薬剤刺激によって、制御機構そのものを正に活性化することが出来ることが明らかとなった。これらのことから、本制御機構への介入が肥満糖尿病の予防法・治療法となり得る可能性が示唆された。28年度が最終年度であるため、記入しない。組織幹細胞老化と糖尿病を中心とした生活習慣病とは悪循環を形成していると考えられる。その連関メカニズムを明らかにし、その制御に基づいた予防・治療法を開発する。(1)老化に伴って組織幹細胞の機能異常が惹起されるメカニズムと、それらを糖尿病が増悪させるメカニズムの解明:コントロールとなる普通食の野生型マウス、肥満・インスリン抵抗性の糖尿病モデルとして高脂肪食負荷マウスを用いて、高齢において、骨格筋、褐色脂肪細胞、膵臓等を採取し、組織幹細胞の数と老化の程度と共に、増殖能や分化能、分化後のそれぞれの組織としての機能を評価した。(2)アディポネクチンとその受容体AdipoR経路の組織幹細胞の老化や機能に対する作用の解明:コントロールとなる普通食の野生型マウス、肥満・インスリン抵抗性の糖尿病モデルとして高脂肪食負荷マウスを用いて、高齢において、骨格筋、褐色脂肪細胞、膵臓等を採取し、AdipoR1、AdipoR2の発現量を検討し、アディポネクチンを添加した時の作用も検討した。さらに、AdipoR1、AdipoR2のノックダウンの影響も検討した。(3)糖尿病発症・増悪に関わる遺伝・環境・エピゲノム制御因子の組織幹細胞の老化や機能に対する作用の解明:コントロールとなる普通食の野生型マウス、肥満・インスリン抵抗性の糖尿病モデルとして高脂肪食負荷マウスを用いて、高齢において、骨格筋、褐色脂肪細胞、膵臓等を採取し、糖尿病発症・増悪に関わる遺伝・環境因子とエピゲノム制御因子に関して、発現量を検討すると共に、遺伝子過剰発現あるいはノックダウンした時の影響を検討した。(4)本新学術領域班で解明されていく組織幹細胞老化の各経路が糖尿病に及ぼす影響の解明と予防法・治療法開発:本新学術領域他研究により見出される組織幹細胞老化経路の糖尿病における意義を検討した。申請時、予定していた研究項目(1)老化に伴って組織幹細胞の機能異常が惹起されるメカニズムと、それらを糖尿病が増悪させるメカニズムの解明、(2)アディポネクチンとその受容体AdipoR経路の組織幹細胞の老化や機能に対する作用の解明、(3)糖尿病発症・増悪に関わる遺伝・環境・エピゲノム制御因子の組織幹細胞の老化や機能に対する作用の解明、(4)本新学術領域班で解明されていく組織幹細胞老化の各経路が糖尿病に及ぼす影響の解明と予防法・治療法開発のうち、それぞれ平成27年度に予定していた研究内容については、当初の計画通りに進展している。

エネルギーを消費する褐色脂肪やベージュ脂肪細胞らしさを特徴づける遺伝子の遺伝子改変マウスは、予想されるような糖・エネルギー代謝異常を示すことを見出した。さらに肥満糖尿病の病態では、これらの制御機構が低下していることも見出している。次にこれらの制御機構への介入が、肥満糖尿病の予防法・治療法開発につながる可能性について、検討した。興味深いことに寒冷刺激・薬剤刺激によって、制御機構そのものを正に活性化することが出来ることが明らかとなった。これらのことから、本制御機構への介入が肥満糖尿病の予防法・治療法となり得る可能性が示唆された。平成27年度については、当初予定していた計画内容について、ほぼ達成した上、さらに当初の計画通りに進展している。そのため、本研究の推進において、研究体制及び研究計画に大幅な変更の必要性は低いと思われ、当初の計画通り、研究を推進する予定である。本研究課題のさらなる進展・加速を目指すべく、研究連携者を含めた各人の実験の精度とスピードアップをはかり、目的を早期に達成したいと考えている。28年度が最終年度であるため、記入しない。
自然免疫によるヒトT細胞白血病ウイルスI型(HTLV－I)発現の生体内抑制機序

これまでの研究により我々は、in vitro実験系において、HTLV-I感染細胞との共培養により他の細胞のI型インターフェロン(IFN)応答が惹起されることを示した。ここで産生されたIFNは感染細胞自身のHTLV-I発現を抑制し、感染者生体内での可逆的であり、また、非常に低い発現状態と類似していた。このようなIFN応答が感染者生体内においても存在の有無を確認するために、我々はIFN応答を惹起するHTLV-I感染細胞内の責任因子の同定を試みた。現在のところ、ウイルス粒子形成とは無関係ながら、恒常的に発現しているユニークなRNA転写産物を見いだしている。しかしながら、IFN応答との因果関係は不明のままである。この研究とは別に、I型IFNの感染細胞のHTLV-I発現に対する影響を調べた。IFN-αの添加によりHTLV-I発現はmRNAレベル、タンパク質レベルにおいて共に有意な抑制を誘導した。これらの事は、細胞内Taxタンパクの減少に続いて逐次的に起こっていることが示唆された。さらに、IFN添加によって感染細胞は増殖抑制を起こし、ATL治療にも一部使用されているAZT(逆転写阻害剤)によりp53の活性化を介したアポトーシスを引き起こした。これらの研究は、現在多数報告されているATL(成人T細胞白血病)へのIFN治療効果の機序を基礎的に説明し得るものであり、この点から重要な研究であると考えられる。現在論文作成を完了しており、平成25年5月にアクセプトされた。Human Tcell leukemia virus type-I (HTLV-1)は成人T細胞白血病(Adult T cell leukemia : ATL)の原因ウイルスである。感染者生体内では、ウイルス遺伝子の転写が非常に低レベルであることが知られている。HTLV-I発現の低下は、感染細胞を獲得免疫から逃避させ、生涯にわたる持続感染を成立させる大きな要因と考えられる。このため、この現象はHTLV-I感染から種々の病態の発症に至る機序を理解する上で非常に重要であると考えられる。しかしながら、HTLV-I発現抑制機序は未だ解明されていない。我々は、HTLV-I感染がI型インターフェロン応答を誘導し、これによりウイルス発現が抑制される現象をin vitroの実験系で見いだした。しかしながら、感染者生体内における現象と同様であるかは不明である。生体内におけるHTLV-Iと自然免疫の相互関係を理解するために、我々はまず、HTLV-I感染細胞がどのような機序でI型インターフェロン産生を誘導しているかを解明する事が重要であると考えた。自然免疫に関する種々の研究により、TLR (Toll Like Receptor)やRIG-I (Retinoic Acid-Inducible Gene-I)等のPRR (Patten Recognition Receptors)によって種々のウイルス核酸が認識され、続いてI型インターフェロン産生が誘発される事が明らかとなっている。本研究課題において我々は、PRRによって認識される可能性のあるHTLV-I遺伝子由来の核酸を探索してきた。現在のところ、ウイルス粒子構成遺伝子とは無関係と思われる転写産物を見いだすことに成功している(論文準備中)。さらに、この転写産物の機能、詳細の特徴に関して現在、調査を進めている。Human Tcell leukemia virus type-I(HTLV-I)は成人T細胞白血病(Adult T cell leukemia: ATL)の原因ウイルスである。現在のところ、ウイルス粒子構成遺伝子とは無関係と思われる転写産物を見いだすことに成功した。本年度はこの新規転写産物の塩基配列を一部同定した。さらに、この転写産物の機能、詳細の特徴に関して解析したところHTLV-I感染T細胞株の生存維持に関わる可能性があることが判明した。以上のことに関して現在論文掲載に向けて準備中である。

これらの事は、細胞内Taxタンパクの減少に続いて逐次的に起こっていることが示唆された。さらに、IFN添加によって感染細胞は増殖抑制を起こし、ATL治療にも一部使用されているAZT(逆転写阻害剤)によりp53の活性化を介したアポトーシスを引き起こした。これらの研究は、現在多数報告されているATL(成人T細胞白血病)へのIFN治療効果の機序を基礎的に説明し得るものであり、この点から重要な研究であると考えられる。現在論文作成を完了しており、平成25年5月にアクセプトされた。現時点で、感染細胞株でのHTLV-Iによるインターフェロン応答の惹起機序を解明する予定であったが、RNAi法実験系の作成に困難が生じ、そのため、研究の進行が遅れてしまっている。本研究の完遂にあたって、新規転写産物を各感染細胞内でノックダウンして、その機能を解析することは重要事項であり、よって、RNAi法実験系の作成は不可欠である。対策としては、shRNAの塩基配列の種類を510種類程度設計し、そのベクターを作成する。よりRNAi効率の高いものを使用し、解析に使用する。
結晶性高分子膜表面に特有な秩序構造とその構造形成ダイナミクス

本研究では、研究題目にある"表面"という枠を超えて"薄膜"状態にある高分子鎖、すなわち、"狭い空間"に閉じ込められた高分子鎖が形成する秩序構造特性を分子レベルで明らかにするこどができた。本研究で行った放射光微小角入射小角X線散乱(SR-GISAXS)実験法は、SPring-8における新規構造物性研究手法として今後の発展が期待されている。以下にその概要を示す。1)シリコン基板上に高密度ポリエチレン(HDPE)の.p-xylene溶液からディップコート薄膜(膜厚:約400nm)およびそれを基板上で溶融後等温結晶化した試料の分子鎖パッキング構造を、ラボスケールおよび放射光(SR)を利用した微小角入射X線回折(GIXD)測定により.評価した。SR-GIXD測定は、大型放射光施設SPring-8のBL13XUビームラインを利用して行った。膜表面に対する入射角をPEの全反射臨界角以下および以上の低角でX線を照射して、膜表面近傍および膜全体(バルク)からの面内(In-plane)回折をそれぞれ検出した。GIXDプロファイル解析の結果、In-plane方向における斜方晶格子定数aおよびbは、膜表面近傍で膜バルクよりも短いことが明らかになった。ここで、aおよびb軸の長さは、分子鎖間距離に対応する。一方、同一PEの塊状試料の粉末回折プロファイルから結晶格子サイズを求めたところ、塊状試料の斜方晶格子定数aおよびbは薄膜表面のそれらより若干短い値が得られた。このことから、PEとシリコン基板の熱膨張係数の違いから、製膜時それらの界面近傍で面内方向に歪みが誘起され、薄膜バルクの結晶格子サイズに影響を与えたことが示唆された。2)GIXDデータに対してパラクリスタル解析を行い、膜バルクと比較して、膜表面近傍で結晶格子の乱れが大きいことを明らかにした。これと同様の傾向が、製膜条件、等温結晶化条件および熱処理条件を変えた薄膜で得られたことから、膜表面の自由エネルギーや潜熱の放熱と関係する表面に特有な現象であることが示唆された。3)結晶性高分子薄膜の分子およびメゾスケールの構造特性の関わりを解明するために、SPring-8のBL40B2ビームラインを利用したSR-GISAXS測定によりHDPE薄膜のラメラ積層構造を評価した。その結果、2D-GISAXSパターンで膜面内方向のみに数十nmの長周期に対応する反射が検出され、ラメラは膜面内方向に規則的に積層した状態であることが明らかになった。GIXD実験結果からラメラを構成している分子鎖は、相対的に基板に平行配向していることが示唆された。結晶性高分子材料の表面構造は、撥水性、接着性、摩耗や摩擦等の材料表面物性と密接な関係にある。

結晶性高分子固体表面の分子鎖凝集構造は、分子レベルで未解明であるため、それを明らかにすることは高分子材料表面の構造および物性制御に極めて重要である。本研究は、結晶性高分子固体膜表面に特有な秩序構造とその構造形成機構を分子レベルで明らかにする事を目的としている。平成15年度は、溶融状態から等温結晶化したポリエチレン固体膜表面領域の結晶格子サイズと結晶格子乱れを視斜角入射X線回折(GIXD)法に基づき評価した。試料として、高密度ポリエチレン(HDPE)を用いた。約400nmの膜厚を有するHDPE膜は、ディップコーティング法により製膜した後、溶融状態から窒素雰囲気下、種々の結晶化温度で24時間等温結晶化して調製した。調製したHDPE薄膜表面領域の結晶構造を、大型放射光施設SPring-8のBL13XUビームラインにおける面内GIXD測定で評価した。膜表面近傍およびバルク(内部)領域における膜表面に垂直な格子面からのブラッグ反射を、それぞれ0.11deg.および0.20deg.の低角で試料にX線を入射して検出した。その結果、HDPE膜表面近傍の面内GIXDプロファイルから求めた斜方晶格子定数aおよびbは、バルク領域のそれに比べて小さい値を示した。また、(110)反射とその高次の回折に対しパラクリスタル解析を行ったところ、膜表面近傍における結晶格子の長距離および短距離秩序性がバルク領域のそれと比較して低いことが明らかになった。これらのことから、HDPE膜表面近傍では、バルク領域と比較して結晶格子サイズが小さく面内方向の結晶格子乱れが大きいことが示唆された。以上のように、筆者らは高分子固体自由表面に特異な結晶構造を実験的に初めて明らかにすることに成功した。本研究は、結晶性高分子固体膜表面に特有な秩序構造とその構造形成機構を分子レベルで解明する事を目的としている。平成16年度は、シリコン基板上にディップコートした後熱処理を施した高密度ポリエチレン(HDPE)薄膜の分子鎖パッキング構造を放射光視斜角入射X線回折(SR-GIXD)法に基づき詳細に検討し、製膜条件が薄膜の表面および内部(バルク)構造に与える影響について考察した。実験には、窒素雰囲気下、HDPEのp-xylene溶液からディップコーティング法により製膜した後種々の温度で24時間熱処理して調製した薄膜(膜厚:約400nm)を用いた。HDPE薄膜の結晶構造は、大型放射光施設SPring-8のBL13XUビームラインを利用したin-plane SR-GIXD測定で評価した。HDPEに対するX線の臨界角以下および以上(0.11deg.および0.20deg.)の低角でX線を入射して、薄膜の表面近傍およびバルク領域における膜表面に垂直な結晶格子面からのブラッグ反射をそれぞれ検出した。その結果、ディップコーティング膜とそれを熱処理した試料において、膜表面近傍の斜方晶格子定数aおよびbがバルク領域のそれらに比べて短いことが明らかになった。また、(110)反射とその高次反射に対しパラクリスタル解析を行ったところ、膜表面近傍における結晶格子の長距離および短距離秩序性がバルク領域のそれと比較して低く、結晶の乱れが大きい事が明らかになった。これらの結果は、溶融状態から等温結晶化したHDPE薄膜に対する結果(平成15年度報告)と同様の傾向で製膜条件に依存しない。しかしながら、HDPEの薄膜状態の格子定数
ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ―３遺伝子治療による自己癌ワクチン化療法の基盤解析

癌治療遺伝子REIC/Dkk-3を用いた固形癌に対するin situ遺伝子治療では、「癌細胞の選択的アポトーシス」と「抗癌免疫の活性化」による相乗的効果増強作用(自己癌ワクチン化)が誘導されることが示されている。本申請研究では、当該治療による自己癌ワクチン化機序として、発現したREICタンパク質による骨髄系免疫抑制細胞(MDSC)の分化抑制機構と、その下流の現象としての細胞傷害性T細胞(CTL)の活性化が重要であることを明らかにした。REIC/Dkk-3遺伝子治療による次世代癌ワクチン化療法の免疫学的基盤を構築するために、本年度は、REICタンパク質が生体内において骨髄系免疫抑制細胞(MDSC:myeloid-derived suppresser cell)の分化にどのように関わるかを中心に解析を行った。具体的には、REICタンパク質投与によるMDSCの分化抑制に基づく抗癌免疫活性化の機序の解明のため、腎細胞癌マウスモデルをリコンビナント精製REICタンパク質で腹腔内投与により治療するin vivo実験を行った。結果として、REICタンパク質投与群の坦癌マウスにおいては、コントロール群と比べて有意な腫瘍増殖抑制効果が確認された。さらに、これらのマウスから採取された血液での各種免疫担当細胞(MDSC、樹状細胞、細胞傷害性T細胞、ナチュラルキラー細胞等)の出現頻度をフローサイトメトリーで解析した。結果、REICタンパク質投与群の坦癌マウスにおいては、抗癌免疫の活性を抑制するとされるMDSCの血中への出現頻度が有意に低下していた。一方、抗癌免疫の活性化に重要とされる樹状細胞、細胞傷害性T細胞については、REICタンパク質投与群において、血中への出現頻度の有意な上昇を確認した。これらの免疫担当細胞の血中への出現率の変化は、マウス生体内へのREICタンパク質投与により誘導されたものと推察される。今後も引き続き、REICタンパク質によるこれら免疫担当細胞の分化誘導の機序について解析を行う。癌治療遺伝子REIC/Dkk-3を用いた固形癌に対するin-situ遺伝子治療では、「癌細胞の選択的アポトーシス」と「抗癌免疫の活性化」による相乗的効果増強作用(自己癌ワクチン化)を誘導し、原発巣のみならず転移巣に対しても顕著な治療効果を示すことが担癌マウスモデルで示されている。我々の研究においてREICタンパク質が骨髄系免疫抑制細胞(MDSC: myeloid-derived suppresser cell)の分化を強力に抑制する機能を有することが明らかとなった為、本年度はこの点にフォーカスしてREIC/Dkk-3ノックアウトマウスの骨髄細胞等を用いて、各種条件下でのMDSC分化誘導に関する研究を遂行した。また昨年度までに、癌抗原としてのタンパク質マーカーを発現する癌細胞を移植する担癌マウスモデル実験系を樹立した。本年度は、我々が新たに作成した癌特異的ウイルス剤としてのAd-REICを腫瘍内投与した場合の、癌ワクチン化療法としての免疫学的な解析を実施した。当該Ad-REIC剤投与群の担癌マウスにおいては、コントロール群と比べて有意な腫瘍増殖抑制効果が認められ、さらに設定した癌抗原に特異的な細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の出現が治療部位である腫瘍内において確認された。これらの結果により、Ad-REIC剤投与により産生されたREICタンパク質によるMDSCの分化抑制作用が、MDSCの血中および腫瘍内での出現抑制に寄与している可能性が改めて示された。REIC/Dkk-3遺伝子治療による次世代癌ワクチン化療法の免疫学的基盤を構築するために、本年度は、REICノックアウト(KO)マウスを用いてREICタンパク質が生体内において骨髄系免疫抑制細胞(MDSC: myeloid-derived suppresser cell)の分化にどのように関わるかを解析した。結果として、担癌のREIC KOマウスにおいては、対照となる担癌の野生型(WT)マウスに比べて、血液中の循環MDSC細胞の出現頻度が有意に増加していた。興味深いことに、MDSC細胞により負に制御される樹状細胞や細胞傷害性Tリンパ球(CTL)等の抗癌免疫担当細胞については、担癌REIC KOマウスにおいて出現頻度が抑制されていた。すなわち腫瘍が増殖しつつある担癌マウスでは、REICタンパク質の生理学的な作用により、MDSCが分化抑制の方向で制御されていることが明らかになった。さらにREICタンパク質による生体内での抗癌免疫活性化の機序を解明するため、癌抗原としてのタンパク質マーカーを発現する癌細胞を移植した担癌マウスモデル実験系を樹立し、Ad-REIC剤の腫瘍内投与による癌ワクチン化療法の免疫学的な解析を実施した。Ad-REIC剤投与群の担癌マウスにおいては、コントロール群と比べて有意な腫瘍増殖抑制効果が認められ、さらに当該癌抗原に特異的なCTL細胞の出現が治療部位である腫瘍内において確認された。これらの結果は、Ad-REIC剤投与により発現したREICタンパク質によるMDSCの分化抑制作用により、各種の担癌マウスにおいてMDSCの血中および腫瘍内での出現が抑制される可能性を示唆している。

今後も引き続き、REIC/Dkk-3遺伝子治療による自己癌ワクチン化療法の免疫学的機序を、MDSCを含む各種免疫担当細胞の分化誘導の観点から解析する。本年度の研究により、坦癌マウスにおいてREICタンパク質を投与することにより抗腫瘍効果が認められ、また血中への骨髄系免疫抑制細胞(MDSC:myeloid-derived suppresser cell)の出現が抑制されることが明らかとなった。生体内でREICタンパク質がMDSCの分化を抑制している可能性が示唆される所見であり、研究は当初の予定通り順調に進展している。25年度が最終年度であるため、記入しない。本年度の研究により、担癌のREICノックアウト(KO)マウスにおいて、血中の骨髄系免疫抑制細胞(MDSC)の出現が有意に増強されていることが明らかとなった。生体内での生理的なREICタンパク質がMDSCの分化を抑制している可能性が改めて示唆された。REICタンパク質が、生体内において骨髄系免疫抑制細胞(MDSC:myeloid-derived suppresser cell)の分化を強力に抑制することが明らかとなったことから、本申請研究では引き続き、REIC/Dkk-3遺伝子治療を生体内における抗癌免疫の制御と活性化の両面から系統的に解析し、自己癌ワクチン化療法としての免疫学的基盤の確立を目指す。これまでの研究により、REICタンパク質が生体内において骨髄系免疫抑制細胞(MDSC)の分化を強力に抑制することが明らかとなった。本申請研究では、今後、独自に開発した癌抗原発現担癌マウスモデルを用いて、MDSCと癌抗原特異的CTLの両細胞の誘導の観点からの研究を実施することにより、自己癌ワクチン化療法としてのREIC/Dkk-3遺伝子治療の免疫学的基盤の確立を目指す。
放射線被ばく事故における迅速なトリアージのための生物線量評価方法の開発

放射線被ばく事故では被ばく線量から急性放射線症候群の重篤度や発症時期を予測する。適切に患者の振り分け(トリアージ)を行うには、被ばく線量を早期に推定することが急務となる。従来の生物学的線量評価法は48時間から72時間の細胞培養を要する。遺伝子発現変動を指標とした新しい評価法には検体採取の適合期間が短く、被ばく事故には必ずしも適さない。本研究では培養時間が不要な未成熟染色体凝縮技術と蛍光in situハイブリダイゼーション法を組み合わせ、血液検体受け入れ後約6時間でトリアージのための線量評価が可能な方法を開発した。適切に患者の振り分け(トリアージ)・治療方針決定・医療準備を行うには、患者候補者の被ばく線量を早期に推定することが急務となる。従来の生物線量評価法はいずれも48ないし72時間の細胞培養を要する。遺伝子発現を指標とした評価法は被ばく後の検体採取タイミングに左右される。本研究では培養時間が不要な「細胞融合で生じるpremature chromosome condensation (PCC)」に着目し、トリアージのための線量評価が、熟練なしに実施できる方法を確立する。平成26年度は細胞融合によるPCC法に蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)法を組み合わせることで、緊急時の大まかな線量評価に適した検査法を開発し、未成熟凝縮二動原体染色体分析法[prematurely condensed dicentric chromosome (PCDC) assay]と命名した。FISHで動原体とテロメアを識別する2種類のペプチド核酸(PNA)プローブを用いることにより、血液検体受け入れから5時間で染色体異常頻度を調べることが可能になった。DNA損傷の修復機構の影響をみるために、染色体断片と二動原体染色体の生成頻度について、ガンマ線4 Gy被ばく後の経時変化を調べたところ、染色体断片は被ばく後急激に減少した後に安定し、二動原体染色体は1個/細胞で推移した。さらに、観察細胞数がわずか50個であっても、染色体断片と二動原体染色体の頻度と線量の間には、それぞれ一定の直線関係と線形二次曲線関係がみられ、二動原体染色体頻度はポワソン分布をとることが明らかになった。事故時の血液検体入手までの時間のことも考慮すると、PCDC法は緊急被ばく医療における線量推定に実際に有望であるといえる。本研究では未成熟染色体凝縮という現象を利用し、細胞培養不要で放射線被ばく事故時のトリアージに有用な線量評価法を確立することを目標としている。前年度(研究計画1年目)には、細胞融合によるPCC法に動原体領域とテロメアを検出するためのFISH法を組み合わせた迅速な染色体分析法を確立した。動原体領域に対応するPNAプローブとテロメアに対応するPNAプローブにそれぞれ異なる蛍光標識をほどこし(一方を赤色、他方を緑色)用いる方法である。染色体異常のうち、不安定型染色体異常である二動原体染色体と染色体断片を指標に線量効果曲線を作成した。患者血液検体受け入れ後6時間で、50個のメタフェーズ観察によるトリアージ・レベルの線量評価が可能であることを示した。今年度(2年目)においては、さらに3色FISH法およびM-FISH法を導入し、安定型染色体異常である染色体転座を指標とする方法を開発した。具体的には、3色FISH法とは直接蛍光標識したヒト染色体第1番(テキサスレッド、赤色)、第2番(FITC、緑色)、第4番(テキサスレッドとFITCとの混合、黄色)のペインティングプローブを同時に染色体標本DNAにハイブリダイズさせ、DAPI(青色)で染色する手法である。M-FISH法はすべての染色体を判別する手法で、3色FISH解析でスクリーニングした結果に基づき、より詳細に異常パターンを調べる手法である。今年度は3色FISH法により、通常の染色体標本における転座・二動原体染色体・染色体断片等の出現頻度のバックグラウンド値(照射線量0 Gy)と50 mGyから300 mGyまでの低線量域の線量効果曲線を確立した。この手法により、過去の被ばく線量を推定することが可能になる。本研究において、同手法およびM-FISH法はPCC標本についても適用できることを示した。研究計画最初の2年間の内容の多くを1年目に終了させることができたので、国際標準化機構や国際原子力機関におけるバイオドシメトリー分野で今後メインとなっていく安定型染色体異常を指標とした線量評価を、本研究で開発を推し進めているPCC法においても適用させた。これにより将来の国際的な標準化の流れに合わせることができた。これまでにおいて、細胞融合により誘導される未成熟凝縮染色体に対して、PNA-FISH法によってテロメアと動原体の2領域を検出することで、二動原体染色体および染色体断片の出現頻度を明らかにし、被ばく放射線量の線量効果関係を明らかにした。本年度は新たにヒト染色体第1、2、4番染色体それぞれに特異的なDNAプローブを用いた3色FISHを成功させ、これにより、転座染色体の検出を可能にした。具体的には、1番染色体をテキサスレッド、2番染色体をFITC、4番染色体をテキサスレッドとFITCで標識し、背景のDNAをDAPIで染色することで、それぞれ赤色、緑色、黄色、青色の蛍光色として検出するものである。FISHにおいて標本DNAの変性法としてアルカリ変性法を確立した。

これにより、従来の熱変性では崩壊したPCCの形態がよく保持され、染色体異常の検出力が向上した。以上により、生体内で生じた被ばく影響についてより正確に検出することができるようになり、より多くの情報が得られることとなった。本手法は、放射線被ばく影響のみならず、そのほかの変異原の影響やがん研究にも応用できる。本年度はEUのバイオドシメトリー・ネットワークが主催する国際的なラボ間比較調査研究(第二回)に参加しアジア地区の中心となって実施・取りまとめを行った成果が論文化された[Int J Radiat Biol 93(1): 20-29, 2017; Int J Radiat Biol 93(1): 75-80, 2017]。今後も引き続きこのようなラボ間比較に参加して、品質管理と技術の向上や情報交換に努める。特に、細胞融合によるPCC法による線量評価の相互比較、二動原体染色体分析による同比較、転座染色体FISH分析による同比較には積極的、主体的に参加することを検討する。本年度は新たにヒト染色体第1、2、4番染色体それぞれに特異的なDNAプローブを用いた3色FISHを成功させ、これにより転座染色体の検出を可能にしたが、論文は準備中である。放射線被ばく事故では被ばく線量から急性放射線症候群の重篤度や発症時期を予測する。適切に患者の振り分け(トリアージ)を行うには、被ばく線量を早期に推定することが急務となる。従来の生物学的線量評価法は48時間から72時間の細胞培養を要する。遺伝子発現変動を指標とした新しい評価法には検体採取の適合期間が短く、被ばく事故には必ずしも適さない。本研究では培養時間が不要な未成熟染色体凝縮技術と蛍光in situハイブリダイゼーション法を組み合わせ、血液検体受け入れ後約6時間でトリアージのための線量評価が可能な方法を開発した。最終年度として、(1)細胞融合で用いるCHO細胞(Chinese Hamster Ovary cells)の長期保存可能性、(2)顕微鏡画像解析システム(Zeiss/MetaSystems社)の自動メタフェーズ検出・画像取り込み機能の有用性、の2点について検討した。(1)CHO細胞について、分裂中期の細胞数がピークとなるように培養細胞を回収し、1年間-80°Cで保存した。これを融解しヒト末梢血リンパ球とポリエチレングリコールを加えて細胞融合を行うことができた。CHO細胞を用事調整するのでなく、細胞分裂中期で凍結保存したものを用いることができる本手法は、発生時期が予測不能な放射線被ばく事故に対し十分な備えとなることを示した。(2)情報収集により、融合細胞(PCC像)の検出率は40%程度であること、異なる蛍光色素を標識したテロメア検出プローブと動原体領域検出プローブを混合して用いた蛍光in situハイブリダイゼーションにおける蛍光シグナル検出効率は100%ではないことが判明した。プローブに用いた反復配列は反復数が著しく異なることと、顕微鏡システムが共焦点式ではないことによるものとおもわれる。したがって、トリアージとしては50細胞の顕微鏡画像を目視によって判定することが精度と速さの観点からいって実際的であると考えられる。