hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
Ｈｉｐｐｏパスウェイの腎癌悪性化に関わるメカニズムの解明

淡明細胞性腎癌の悪性化に関わることが報告されたSAV1遺伝子は、Hippoパスウェイのコンポーネントのひとつであるが、腎癌細胞株において増殖能を抑制した。またヒト腎癌症例でもSAV1の発現が抑制された症例はYAP1が核に集積していた。さらにSAV1を強制発現させた腎癌安定発現株をマウスに移植したところ、コントロールに比べて腫瘍サイズが有意に小さかった。パスウェイ解析により、これらの腫瘍ではTGFβパスウェイが抑制されていた。以上よりSAV1を含むHippoパスウェイは腫瘍抑制性に働き、SAV1の発現低下はTGFβパスウェイを介して淡明細胞性腎癌の悪性化に関与している可能性が示唆された。本研究では、SAV1遺伝子の腎癌細胞における機能を解明して、14q lossによって引き起こされるSAV1の発現低下が腎癌の悪性化を引き起こすメカニズムを解明することを目的とする。さらにSAV1はHippoパスウェイのシグナル分子であることから、腎癌において、SAV1発現低下がHippoパスウェイのシグナルにどのような影響をもたらすのか、腎癌の発症・悪性化にどう関わるのかを解明することを目的とするものである。平成24年度では、in vitroでの解析、すなわちSAV1遺伝子の組み換えレンチウイルスの作成と機能解析を行った。その結果、in vitroにおいて腎癌細胞株でSAV1の発現は増殖能を抑制し、下流のコンポーネントのシグナル伝達に影響を与えていることがわかった。そこで、平成25年度では、(1)ヒト腎癌症例でのSAV1の発現と下流のコンポーネントの発現状況を、症例レベルで検討した。腎癌75例のパラフィンブロックを用いて免疫染色したところ、SAV1の発現が抑制された症例はYAP1が核に集積し、悪性度の高い症例で認められる傾向にあった。(2)SAV1を強制発現させた腎癌細胞株の安定発現株(SAV1-1, SAV1-2)を樹立した。Empty vectorを導入した細胞株(control)とSAV1発現細胞株を用いて、YAPのリン酸化状態、YAP1のTEADの転写活性を調べたところ、SAV1-1ではcontrol細胞に比べてYAPの活性化が抑制されていた。これらの細胞株をSCID mouseに移植したところ、SAV1発現細胞株を移植した腫瘍はcontrolに比べてサイズが有意に小さかったことから、SAV1遺伝子はマウスの生体内でも腫瘍増殖の抑制に関わっていることがわかった。本研究では、SAV1遺伝子の腎癌細胞における機能を解明して、14q lossによって引き起こされるSAV1の発現低下が腎癌の悪性化を引き起こすメカニズムの解明することを目的とする。平成24年度は、まずSAV1遺伝子の組み換えレンチウイルスの作成と機能解析により、SAV1発現低下がHippoパスウェイのシグナルにどのような影響をもたらすのか、in vitroで解明した。また、ヒト腎癌症例でのSAV1の発現と下流のコンポーネントの発現状況を検討し、症例レベルでのシグナルの状態を確認した。これらの結果から腎癌の発症や悪性化にSAV1を含むHippoパスウェイがいかに関わっているかを知るうえで重要な知見を得ることができた。さらにSAV1はHippoパスウェイのシグナル分子であることから、腎癌において、SAV1発現低下がHippoパスウェイのシグナルにどのような影響をもたらすのか、腎癌の発症・悪性化にどう関わるのかを解明することを目的とする。平成24年度では、in vitroにおいて腎癌細胞株でSAV1の発現は増殖能を抑制し、下流のシグナル伝達に影響を与えていることがわかった。平成25年度では、ヒト腎癌症例ではSAV1の発現が抑制された症例はYAP1が核に集積し、悪性度の高い症例で認められる傾向にあった。またSAV1を強制発現させた腎癌細胞株を樹立しSCIDmouseに移植したところ、SAV1発現細胞株を移植した腫瘍は有意に小さかったことから、in vivoでも腫瘍増殖の抑制に関わっていることがわかった。そこで、平成26年度は、マウスへの移植モデルの腫瘍から抽出したRNAを用いて、増殖抑制のメカニズムを検討した。具体的には、control腫瘍と、SAV1-1を移植した腫瘍各々の腫瘍から抽出したRNAを用いてexpression arrayを行った。

SAV1発現細胞株を移植した腫瘍で有意に変動した遺伝子を抽出しパスウェイ解析したところ、TGFβパスウェイが有意に変動していることがわかった。Western blot法によりTGFβパスウェイを構成する分子の発現を調べたところ、SAV1発現細胞株を移植した腫瘍ではTGFβパスウェイが抑制されていることがわかった。これらの解析により、SAV1がvivoにおいて少なくとも一部ではTGFβパスウェイを介して腫瘍の増殖を抑制していることが示唆された。医歯薬学平成25年度では、(1)ヒト腎癌症例で75例のパラフィンブロックを、抗SAV1抗体および抗YAP1抗体で免疫染色し、SAV1の発現が抑制された症例はYAP1が核に集積し、それは悪性度の高い症例で認められる傾向であることを見出した。(2)SAV1を強制発現させた腎癌細胞株の安定発現株を樹立し、下流のシグナルの状態をYAPのリン酸化状態をウエスタンブロットで調べると、SAV1-1, SAV1-2はcontrolと比較してYAPのリン酸化が増加した。また、YAP1をcoactivatorとするTEADの転写活性をリポーターアッセイで調べたところ、TEAD3のリポーター活性はSAV1-1でcontrol細胞に比べて有意に低かった。これらの細胞株をSCID mouseに移植したところ、12週目で移植した腫瘍の大きさを比較すると、SAV1-1はcontrolに比べて有意に腫瘍サイズが小さかった。このことからSAV1遺伝子はマウスの生体内でも腫瘍増殖の抑制に関わっていることがわかった。これらは当初に計画していた内容に沿ったものであり、平成25年度に計画していた内容はほぼ達成でき、おおむね順調に進展している。平成24年度は、まずSAV1遺伝子の組み換えレンチウイルスの作成と機能解析により、SAV1発現低下がHippoパスウェイのシグナルにどのような影響をもたらすのか、in vitroで解明すること、また、ヒト腎癌症例でのSAV1の発現と下流のコンポーネントの発現状況を検討し、症例レベルでのシグナルの状態を確認することを計画した。そこで、SAV1遺伝子のcDNAをGateway system(Invitrogen)によりレンチウィルスベクターpLenti7.3/V5-DEST(Invitrogen)あるいはpLenti6.3/V5-DESTに組み込み、作製したプラスミドをLipofectamine2000 (Invitrogen)を用いてHEK293T細胞にトランスフェクションし、それぞれ超遠心により精製して組み換えウィルスとした。empty vectorをコントロールとして、腎癌細胞株に遺伝子導入し、細胞増殖能あるいはアポトーシス能を測定したところ、SAV1を導入した細胞株では増殖能が抑制され、アポトーシス能が亢進した。逆にsav1 siRNAでノックダウンした細胞では増殖能が亢進し、アポトーシス能が抑制された。遺伝子導入した細胞株からタンパク質を回収し、ウエスタン法でHippoパスウェイシグナル分子LATS1/2, YAPのリン酸化状態の変化を確認すると、SAV1を導入した細胞株ではLATS1/2のリン酸化が亢進し、YAPのリン酸化も亢進した。以上のことから、SAV1の発現がYAPの核移行やシグナル伝達にin vitro、ヒト腎癌症例で関わっていることが証明できた。
心不全における心筋細胞のheterogeneityの意義とその誘導因子の解明

本研究は、心臓に対する圧負荷応答およびその破綻によって生じる心不全において、心筋細胞に生じる不均一性を詳細に評価し、その疾患発症における意義の解明を目指したものである。我々は圧負荷心不全マウスの心臓から単離した心筋細胞の1細胞トランスクリプトーム解析、心臓切片の1分子レベルRNA in situ hybridization解析を行うことにより、心不全過程において心筋細胞の時空間的な挙動を分子レベルで明らかにし、心不全誘導に関連する特徴的な因子を同定した。本研究は、臓器を構成する細胞集団の不均一性を解明する手段を新たに構築するのみならず、その解析法の病態解明における有用性を実証している。本研究は、心不全における心筋細胞の1細胞トランスクリプトームを時空間的に解析することで、心筋細胞の不均一性を生み出す要因を明らかにし、心不全の病態形成に寄与する分子機構の解明につなげることを目的としている。まずマウス圧負荷心不全モデルマウスの心筋細胞を単離し、そこから抽出した心筋細胞から1細胞ごとにcDNAライブラリを作成するプロトコールを確立した。そして次世代シークエンサーを用いて1細胞ごとのRNAレベルを定量した(1細胞トランスクリプトーム)。そしてRNA定量を1分子RNA in situ hybridization法によっても確認し、心筋1細胞トランスクリプトーム解析の定量性を保証した。その後、コンピュータ解析によって特徴的な遺伝子発現の有無で細胞状態を分類することに成功し、圧負荷によって不均一に出現する細胞集団の存在を明らかにした。この細胞集団の存在は、蛍光免疫染色およびRNA in situ hybridization法によって確認した。そして重み付け共発現ネットワーク解析によって、この細胞集団で特異的に活性化するシグナルを同定し、そのシグナルを駆動する転写因子を明らかにした。さらにこの転写因子の心筋細胞特異的ノックアウトマウスを作成し、心機能を評価したところ、圧負荷をかけても心不全を生じないことがわかった。そしてこのマウスの心筋細胞を1細胞レベルで単離し、1細胞RNA-seq解析を行うことで、上記転写因子が不均一に心筋細胞内で活性化することによって乱れる遺伝子制御ネットワークを明らかにした。現在、圧負荷心不全によって心臓内で生じる非心筋細胞への影響も1細胞レベルの遺伝子発現解析により解析している。またヒトの心不全においても同様のことが生じているかを明らかにするため、ヒト心不全患者の心臓検体を用いて1細胞トランスクリプトーム解析を進めている。当初計画していた内容についてはほぼすべて遂行して結果が出つつあり、また予想以上に進行した部分が多かった。例えば遺伝子ネットワーク解析については、コンピュータ解析の進展が著しかったため、通常の統計解析に用いるアルゴリズム以外にも、重み付け共発現ネットワーク解析の使用にまで踏み切る事ができ、それにより非常に重要な結果を得た。さらに、重要な分子のノックアウトマウスも順調に作成するとともに、その解析も当初の予想を上まわる速度で進める事ができた。また当初は本研究の追加で行えると良いと考えていた、非心筋細胞の解析、ヒト心筋細胞の解析まで着手することができ、現在の進捗状況は計画以上と考えている。臓器を構成する細胞は均一な細胞集団ではなく、外部からのストレスを受ける際には、空間的・時間的に高度に組織化された応答を呈すると考えられるが、それを高い解像度で解析する手段がこれまで存在しなかった。本研究は、心臓に対する圧負荷応答およびその破綻によって生ずる心不全の過程において、心臓を構成する心筋細胞の間に時間的・空間的にどのような不均一性が生まれるかを明らかにし、それが疾患発症にどのように寄与するかを解明することを目指したものである。我々は圧負荷心不全マウスの心臓から心筋細胞を単離し、細胞レベルでトランスクリプトーム解析を行うことによって細胞応答の不均一性を評価し、空間情報を1分子レベルRNA in situ hybridizationを行うことによって再構築することを可能にした。また単一細胞レベルのトランスクリプトームから、細胞の時間的な不均一性(ダイナミクス)を再構築することが可能となり、これらの結果をもとに、心筋細胞の時間的・空間的に制御されたダイナミックな分子レベルの挙動を明らかにした。そしてこの解析において、心不全に特徴的な分子状態を明らかにし、これを移行する際に特異的に活性化するシグナルを同定したため、心筋細胞特異的にその因子のノックアウトマウスを作成して解析したところ、圧負荷をかけても心不全への移行が見られなくなった。これらの一連の研究は、臓器を構成する細胞集団の不均一性を解明する手段を新たに構築するのみならず、その解析法の病態解明における有用性を実証している。遺伝子ネットワーク解析については、重み付け共発現ネットワーク解析で様々な細胞集団を同定できることがわかったが、さらに遺伝子発現の因果関係を明らかにするような、ベイズネットワークへの展開を検討している。実際に1細胞RNA-seqデータへ応用可能なアルゴリズムを構築している。また圧負荷に伴った心筋細胞の肥大化が遺伝子発現とどう関連するかについても1細胞RNA-seqデータと形態的情報を統合することによって解析する。

そして作成した重要な分子のノックアウトマウスの解析をさらに進めるとともに、非心筋細胞解析およびヒト心不全患者の心筋細胞解析をさらに進める。循環器内科
高階エネルギーの近似最適化と学習

劣モジュラでない多値エネルギーを近似的に最小化するアルゴリズムを実現した。高階2値エネルギーを1階エネルギーに還元するアルゴリズムで、既存手法では変数を付加していたが、付加せずに還元することを可能にし、より少ないメモリでより高速な最適化を可能とした。これら高階エネルギー最小化法の応用として、肺の血管のCT画像を動脈と静脈に分けるセグメンテーションに高階エネルギーを使い、肺血管の形状をエネルギー中に表現することを可能にした。また、心臓の冠動脈中に生じるプラークと血管壁を区別したセグメンテーションを、血管内腔、プラーク、血管壁の3ラベルのラベル付け問題と考え高階エネルギーを使って高精度化した。エネルギー最小化は領域分割,ノイズ除去,ステレオなどの多種の問題において画像処理やコンピュータビジョンにおける標準的な手法となった.中でも最も一般的になったグラフカットは,最小切断アルゴリズムによる1階2値劣モジュラエネルギーの大域最小化を基本に,より困難なエネルギー最小化を目指して活発に研究されている.特に,非劣モジュラ,多値,高階のいずれかの性質を持つエネルギーの最小化のために様々な工夫がされてきた.本研究では今年度、劣モジュラでない2値エネルギーを近似的に最小化する方法として最近多用されるようになってきているQPBOアルゴリズムの多値版を与え,移動アルゴリズムのような繰り返しによらないで劣モジュラでない多値エネルギーを最小化するアルゴリズムを実現した.そのために,QPBOアルゴリズムの理論的基礎であるルーフ双対性の概念を3元以上のラベル集合が線形順序を持つ場合に拡張し、持続性(persistency)という性質が,線形順序を持つ多値の場合にも任意階で成り立つことを示した.これを基礎に,2値の場合と同様に,与えられたエネルギーの最小値の下界を最小値として与える劣モジュラ関数(劣モジュラ緩和関数)を構成し,それを代わりに最小化する方法を開発した.1階の場合にはこの劣モジュラ緩和関数のうち最小値が最大のもの(最適劣モジュラ緩和関数)が具体的に構成できることを示し,それにより劣モジュラでない多値エネルギーを部分的に最小化するQPBOの多値版ともいうべきアルゴリズムを与えた.高階エネルギー還元アルゴリズムが改良を待つ点として、階数について指数的に変数の数が増えるため、最小化可能なエネルギーの階数が最高56階程度にとどまることがある。本研究では今年度、高階2値エネルギーを1階エネルギーに還元するアルゴリズムの改良を行った。上記のように、既存手法では高階の2値エネルギーを1階の2値エネルギーに還元するために変数を付加していたが、今年度開発したアルゴリズムでは変数を加えずに還元することを可能にした。そのため結果として、既存手法より少ないメモリーでより高速な還元を可能とするアルゴリズムの開発に成功し、成果はIEEE CVPR2014に採択された。また一方で、高階エネルギーの応用として医用画像処理への応用の研究をすすめた。肺の血管のCT画像をを動脈と静脈に分けるセグメンテーションは、動脈・静脈間の見た目の違いがほとんどないため難しいことが知られている。そのため、血管の根元の、動脈と静脈の分類が既知の部分からの連続性によって血管全体を分類する手法を試みた。その際、動脈と静脈が接触していたりすれ違っていたりする部位でおいて、従来の1階エネルギーを使った手法では相互に浸食する問題があった。そこで高階エネルギーを使うことにより、肺血管が比較的まっすぐであるという性質をエネルギー中に表現することを可能にした。この成果はPIA2013で発表し、また、より多くの実証データを含めた拡大版を論文誌に投稿中である。また、心臓の動脈硬化の程度をCT画像を用いて測定するためには、冠動脈中に生じるプラークと血管壁を区別したセグメンテーションが必要だが、これを高階エネルギーを使って高精度化する研究も行った。この成果は国際会議に投稿中である。最後に、より野心的な、正解データから多臓器間の統計をとり高階エネルギーに反映する研究も継続中である。引き続き高階エネルギー最小化の応用できる問題に取り組んだ。特に医用画像のセグメンテーションにおける高階エネルギー最小化の応用をさらに検討した。多臓器セグメンテーションは多ラベルのラベル付け問題と考えることができるが、高階の多ラベルラベル付け問題はセグメンテーション問題としてはまだあまり応用例がない。エネルギーは正解データから統計を取ることにより作成するが、どのような統計を使うとセグメンテーションに効果があるかは未知であり、検討を要した。6つの高階エネルギーを提案し、実験を行った。直角三角錐状に並んだクリークを用いた高階ポテンシャル、離れたボクセルを用いたクリークのポテンシャル、高階平滑化項、CT画像の輝度勾配を考慮して全臓器に作用する高階ポテンシャル、エッジ周辺にのみ作用する高階ポテンシャルでは、良いセグメンテーション結果は得られなかった。

提案ポテンシャルを加えることで、セグメンテーション精度が悪くなる原因の一つとして、提案ポテンシャルがアトラス項の邪魔になっていることが考えられる。より良いポテンシャルを設計するには、アトラス項と共存できるポテンシャルを設計する必要がある。他方、CT画像の輝度勾配を考慮した高階ポテンシャルでは、全ての症例でセグメンテーション精度が向上するわけではないが、一部の症例では高階ポテンシャルの導入により、セグメンテーション精度の向上を確認することが出来た。症例間で高階ポテンシャルの導入によるセグメンテーション精度改善の有無が存在するので、今後は症例間でロバストな高階ポテンシャルを考える必要性がある。この成果はMVA2015で発表予定である。一方、高階エネルギー最適化アルゴリズムの改良として、既存手法より少ないメモリーでより高速な1階還元を可能とするアルゴリズムについて、CVPR2014で発表した。26年度が最終年度であるため、記入しない。コンピュータビジョン26年度が最終年度であるため、記入しない。予定通り高階エネルギーを近似的に最小化する方法を開発した。予定通り高階エネルギーを近似的に最小化する方法を開発し、また高階エネルギーをより効率的に1階エネルギーに還元する方法も開発した。またこれらを応用する研究も順調に進展している。予定通り、高階エネルギー最小化法の実用上の効率および最小化可能な階数をさらに向上する。また高階エネルギーの学習を検討することにより、今まで解くことが不可能だったコンピュータビジョンやパターン認識における高階問題に応用することをめざす。今年度開発した新還元法の並列計算による高速化を試みる。人件費が3年間雇用するに足るだけ交付されなかったため、2年度め、3年度目の2年間に人件費を使用する。予定通り使用する。
反応拡散系におけるパターンダイナミクスと漸近解析

反応拡散系に見られる様々な時空間ダイナミクスは,いろいろな自然現象に見られる自発的パターン形成のモデルとなっている.本研究では,解析学的手法と数値的手法を組み合わせて,以下の問題について研究を進めた.1.shadowsystemと呼ばれる縮約系に対して,無限次元力学系の手法を適用して,安定解の空間的単調性を示した.また歪勾配構造をもつ反応拡散系に対し,安定定常解の変分法的特徴付けを得た.2.ギーラーとマインハルトによって提唱された活性因子・抑制因子型の反応拡散系について,定常解の安定性を調べた.二つの同心球面に囲まれた領域において,抑制因子の拡散係数が無限大になった極限系の定常解のうち,境界上の一点でのみ極大となるものはいずれも適当な条件のもとで安定であることを証明した.3.反応拡散方程式の定常解は非線形楕円型方程式の解として与えられる.楕円型方程式の正値解の存在は,定常解の構造を理解するに当たってもっとも基本的な問題である.ここでは臨界べきを持つ非線形楕円型方程式の解の存在と分岐について明らかにした.4.反応拡散系に見られる複雑な時空間パターンのダイナミクスは,パルス状局在解が弱いあるいは強い相互作用をすることによって生じると解釈できるが,そのダイナミクスを漸近的手法を用いて解析する.5.生物の形態形成における活性化因子--抑制因子モデル方程式、熱対流におけるSwift-Hohenberg方程式などは勾配・歪勾配系の枠組みでとらえ,縞状のパターンには、Eckhaus不安定性とZigzag不安定性の2種類の不安定性が普遍的に観察されることが示された.反応拡散系に見られる様々な時空間ダイナミクスは,いろいろな自然現象に見られる自発的パターン形成のモデルとなっている.本研究では,解析学的手法と数値的手法を組み合わせて,以下の問題について研究を進めた.1.shadowsystemと呼ばれる縮約系に対して,無限次元力学系の手法を適用して,安定解の空間的単調性を示した.また歪勾配構造をもつ反応拡散系に対し,安定定常解の変分法的特徴付けを得た.2.ギーラーとマインハルトによって提唱された活性因子・抑制因子型の反応拡散系について,定常解の安定性を調べた.二つの同心球面に囲まれた領域において,抑制因子の拡散係数が無限大になった極限系の定常解のうち,境界上の一点でのみ極大となるものはいずれも適当な条件のもとで安定であることを証明した.3.反応拡散方程式の定常解は非線形楕円型方程式の解として与えられる.楕円型方程式の正値解の存在は,定常解の構造を理解するに当たってもっとも基本的な問題である.ここでは臨界べきを持つ非線形楕円型方程式の解の存在と分岐について明らかにした.4.反応拡散系に見られる複雑な時空間パターンのダイナミクスは,パルス状局在解が弱いあるいは強い相互作用をすることによって生じると解釈できるが,そのダイナミクスを漸近的手法を用いて解析する.5.生物の形態形成における活性化因子--抑制因子モデル方程式、熱対流におけるSwift-Hohenberg方程式などは勾配・歪勾配系の枠組みでとらえ,縞状のパターンには、Eckhaus不安定性とZigzag不安定性の2種類の不安定性が普遍的に観察されることが示された.(1)興奮抑制系の一般化である歪勾配系に対し,空間的に周期的な定常解がEckhaus不安定性を起こすための条件について考察した.その結果,ある種の積分のパラメータ微分の符号と時定数によって安定性が変化することを明らかにした.(2)形態形成のモデルとなるGierer-Meinhardt系に現れるスパイク状パターンに対し,高次元領域におけるもっともエネルギー準位の低いスパイク解の安定性について明らかにした.(3)時間的に周期的な外力項を含む反応拡散方程式では系の周期よりも長い周期の解(これを劣調和解という)の存在について調べ,ある種の高次元領域に対しては確かに劣調和解が存在することを証明した.また,空間依存の反応項を仮定すると,どんな領域であっても劣調和解が存在し得ることを示した.(4)ある種の非線形方程式の解で自己相似性を持つ解について調べ,その大域的な構造と分岐現象について明らかにした.(5)shadowsystemと呼ばれる非局所項を含む方程式に対し,領域が区間の場合には空間的に単調でない解は不安定となることを一般的な形で証明した.1.ギーラーとマインハルトによって提唱された活性因子・抑制因子型の反応拡散系について,定常解の安定性を調べた.二つの同心球面に囲まれた領域において,抑制因子の拡散係数が無限大になった極限系の定常解のうち,境界上の一点でのみ極大となるものはいずれも適当な条件のもとで安定であることを証明した.また,そのような安定定常解が安定性を失うとき,周期解が出現することも確かめた.2.時間的に周期的な外力項を含む反応拡散方程式では系の周期よりも長い周期の解(これを劣調和解という)の存在について調べ,空間依存の反応項を仮定すると,どんな領域であっても与えられた周期を持つ劣調和解が存在し得ることを示した.3.ある種の非線形拡散方程式において,定常解が層を成す場合について調べ,各定常解はある重み付き空間において大域的に安定であることを示した.その応用として,非有界な時間大域解の存在を示した.4.shadowsystemと呼ばれる非局所項を含む方程式に対し,高次元領域における定常解の安定性について調べた.その結果,対応する単独の方程式に対する2番目の固有値の符号が安定性と深く関わっていることを明らかにした.

5.さまざまなモデル方程式に見られるパルス状局在解の中には非常に複雑な挙動を示すものもあり,そのメカニズムは大変興味深い,そうしたより複雑な運動の解析に向けて,いくつかの退化のタイプが重複した形の特異点を考え,その近傍においてパルスがどのように振る舞うかを考察した.1べき乗の形の非線形項を含む非線形熱方程式においては,指数がある値を越えると解の構造が急激に変化する.この研究では,指数がある臨界値を超えたときに,定常解の大域的安定性を示した.また,その応用としてきわめて複雑な振る舞いを示す解の存在や,非有界大域解の存在を示した.さらに,解の増大度が初期値の無限遠での減衰率から決まることを明らかにした.2二つの勾配系を歪対称に結合した歪勾配系という概念を導入し,その基本的性質について調べた.特に,定常パルス解の安定性や周期定常解に対するEckhaus不安定性の基準を得るとともに,定常解に対する変分的性質と安定性の関係を明らかにした.3反応拡散系のある種の極限として得られるshadow systemと呼ばれる縮約系に対し,安定解の空間的構造について調べた.無限次元力学系の理論を拡張することによって,1次元領域においては安定解は空間的に単調なものに限ることを示した.また,非局所的方程式の理論を適用することによって,ある条件のもとで高次元へ拡張した.4 (時間周期的な非線形項を持つ反応拡散方程式においては,ほとんどの解は周期解に収束するが,その周期は非線形項の周期と必ずしも同じではなく,その整数倍になる可能性がある.このような長い周期を持つ解のことをを分数調波振動解というが,どのような場合に安定な分数調波振動解が存在するかは,系のダイナミクスを明らかにする上で重要な問題である.この研究では,任意の高次元領域に対し,空間依存する非線形項をうまく選ぶことによって,安定な分数調波振動解が構成できることを示した.
行動スクリーニング系の開発

1)前年度までに確立した化学物質を格子状にスポットする系を用いて、化学走性に必須な神経回路を同定する作業を行った。各神経のレーザー破壊の結果、ASE感覚神経およびAIZ介在神経がNaCIへの走性に必要であるが、AIA,AIY,AIB,RIA介在神経は必須ではないことがわかった(論文1)。2)当研究室で感覚神経に特異的に発現することのわかった哺乳類MIP-TI(TRAF3-interacting protein1)ホモログが、線虫のDYF-11と同一であることが明らかになった。DYFはdye-fillingの略であり、感覚神経の繊毛が壊れていることを示唆するものであった。この遺伝子を破壊したところ塩や匂いなど、さまざまな化学物質への走性が低下した。繊毛の異常はBardet-Biedl病やネフロン癆などの疾病に至る。解析の結果、DYF-11は繊毛内輸送、ひいては繊毛の維持に必須であることがわかった(論文2)。3)NaCIへの化学走性の可塑性に異常のある変異体のスクリーニングで得られた変異体のひとつを解析したところ、その原因遺伝子casy-1が哺乳類のカルシンテニンのホモログであることがわかった。カルシンテニンはアルツハイマー病の主要な原因遺伝子であるアミロイド前駆蛋白質(APP)と三者複合体を形成する膜貫通蛋白質である。CASY-1蛋白質もAPPと同様プロセシングを受け、化学走性の可塑性に必要なのは細胞外ドメインの一部分であることがわかった(論文3)。このように、行動スクリーニング系を用いて、化学走性の神経回路の決定と、化学走性やその可塑性に必須な遺伝子の同定がなされ、有効な系の開発に成功したといえるが、行動のコンピュータによる定量化と変異体解析とをリンクすることには未だ到らず、平成21年度以降に実施の予定としている。線虫C.エレガンスは体長約1mmと小型で神経細胞が少なく、また突然変異体の分離と解析が容易なため、行動を指標としたスクリーニングに有効なモデル生物であると考えられる。本研究はこのスクリーニング系の確立を目的としている。本年度は以下の結果が得られた。<行動アツセイの確立>線虫に化学走性を起こさせる化学誘引物質のひとつとして、NaClを用いてアッセイ系の検討を行った。NaClを寒天平板上に格子状にスポットし、線虫を中央からスタートさせる。無処理の線虫はNaClに誘引され、いずれかのスポットに到達する。一方、NaCl存在下、飢餓条件下で一定時間処理を行うと、線虫はNaClのスポットに誘引されなくなる(化学走性学習)。スポットする濃度と拡散させる時間を検討し、無処理の線虫は効率よく誘引され、学習後の線虫は積極的にスポットを避ける条件を決定した。また、複数の誘引物質に対する行動を比較する系の作成を目指し、匂い物質とNaClを交互にスポットするアッセイも検討した。NaClと匂い物質の濃度のバランスに応じて行動の差が検出できることを確認した。今後行動異常変異体のスクリーニングにも有効であると考えられる。<RNAi法の検討>多数の遺伝子について、神経機能への関わりを行動レベルで検討するためにはRNAi法が有望である。しかし、線虫の神経にはRNAiが、効きにくいことが知られているため、RNAi法の検討を行った。RNAiが効きやすいといわれる変異体のうち、rrf-3株を用い、餌として経口的にdsRNAを与えるfeeding RNAi法と、トランスジーンからヘアピンRNAを発現させるhpRNAi法の併用により最も効率よく神経機能の阻害ができることが見出された。これらの方法は今後実用に用いることが可能と考えられる。行動を指標としたスクリーニングを容易にするために、線虫C.エレガンスを用い、化学物質を格子状にスポットする行動アッセイ法を開発した。今年度はこの系をもとにして、化学走性行動に関わる神経回路の決定を行った。一匹の線虫でレーザーにより個々の神経を破壊し、それをNaClを格子状にスポットしたプレートに置きコンピュータを用いた追尾システムで行動を定量化した。感覚神経としてASE感覚神経が重要であり、右のASEが優位に働くことがわかった。介在神経RIA、AIZについても検討を行った。次に、機能遺伝子のスクリーニングのためのRNAi法の検討を行った。問題は、従来より神経細胞にはRNAiが効きにくいと言われている点である。二重鎖RNAを発現する餌を与えるfeeding RNAi法と、プロモーターから二重鎖RNAを発現するようにしたヘアピンRNAi法を検討し、RNAiが効きやすくなっている線虫のrrf-3変異体およびeri-1; lin-15変異体も試した。この結果、ヘアピンRNAi法が必須であること、rrf-3株が比較的効率がよいことがわかったが、遺伝子により効きが悪いものも多く、特に対象が単一細胞であるときは、わずかな効果しかなかった。ヘアピンRNA発現の煩雑さも考えると、スクリーニングには有用でないと判断した。

2)当研究室で感覚神経に特異的に発現することのわかった哺乳類MIP-TI(TRAF3-interacting protein1)ホモログが、線虫のDYF-11と同一であることが明らかになった。DYFはdye-fillingの略であり、感覚神経の繊毛が壊れていることを示唆するものであった。この遺伝子を破壊したところ塩や匂いなど、さまざまな化学物質への走性が低下した。繊毛の異常はBardet-Biedl病やネフロン癆などの疾病に至る。解析の結果、DYF-11は繊毛内輸送、ひいては繊毛の維持に必須であることがわかった(論文2)。3)NaCIへの化学走性の可塑性に異常のある変異体のスクリーニングで得られた変異体のひとつを解析したところ、その原因遺伝子casy-1が哺乳類のカルシンテニンのホモログであることがわかった。カルシンテニンはアルツハイマー病の主要な原因遺伝子であるアミロイド前駆蛋白質(APP)と三者複合体を形成する膜貫通蛋白質である。CASY-1蛋白質もAPPと同様プロセシングを受け、化学走性の可塑性に必要なのは細胞外ドメインの一部分であることがわかった(論文3)。このように、行動スクリーニング系を用いて、化学走性の神経回路の決定と、化学走性やその可塑性に必須な遺伝子の同定がなされ、有効な系の開発に成功したといえるが、行動のコンピュータによる定量化と変異体解析とをリンクすることには未だ到らず、平成21年度以降に実施の予定としている。
臨床検体を用いた次世代シークエンサーによる消化器癌の網羅的癌遺伝子解析

遺伝子解析技術の発達により様々ながんにおける原因遺伝子が次々と同定されているが、これらの臨床的意義を解明していくことが今後必要となる。本研究では、臨床教室である強みを生かし、詳細な臨床情報と遺伝子異常を組み合わせて解析し、肝細胞癌、早期食道癌、早期胃癌、そして膵癌の前がん病変とされる膵管内乳頭粘液性腫瘍の遺伝子解析を行い、生存期間などの悪性度との関連や進行癌との関連について研究を行った。遺伝子変異の検出には従来多くのDNA量を用いてごく一部の領域の変異しか検出できず、また高コストかつ結果が得られるまで長時間を要した。そのため、微量かつ腫瘍以外の細胞成分を含む臨床検体からいくつもの癌関連遺伝子変異を検出することは現実的でなかったが、最近開発された次世代シークエンサーでは、わずかなDNA量で一度に多くの癌関連遺伝子変異を高感度に検出することが可能となった。網羅的遺伝子解析は近年盛んにされているが、多くは疾患ごとの解析、つまり膵癌と遺伝子変異、肝癌と遺伝子変異、といった内容であり、検出された遺伝子変異の臨床的意義は不明であった。今後はただ単に網羅的遺伝子解析をするのではなく、詳細な臨床データと合わせ解析を行い、遺伝子変異の意義を見出すことから新たな診断法、治療法を見出していく必要がある。以上の考えに基づき、臨床教室であるがゆえに得ることが可能な、高精度な診療から得た臨床情報と臨床検体を用い、次世代シークエンサーにより得られた遺伝子変異の臨床的意義解明を目的とし研究を推し進めた。その結果現在二つの知見が得られつつある。ひとつは膵癌の前癌病変ともいわれる膵管内乳頭粘液性腫瘍(IPMN)ではGNAS遺伝子変異が約40ー70%の症例でみられることが知られているが、われわれの臨床情報と併せて解析した結果、膵管拡張の目立つ症例すなわち粘液が豊富なIPMNでGNAS変異がみられることが判明した。IPMNは病型により悪性度が異なり、われわれの知見が病型診断に有用な可能性が示唆された。二つ目は、近年切除不能な悪性腫瘍に対する様々な分子標的薬が登場しているが、すべての症例に有用というわけでないことから治療効果判定が事前になされることが期待される。われわれは膵神経内分泌腫瘍で使用されるmTOR阻害剤の有効性を、次世代シークエンサーによる腫瘍変異遺伝子との関連を解析中である。その結果以下の知見を得た。われわれは膵神経内分泌腫瘍で使用されるmTOR阻害剤の有効性を投与前に予測すべく、切除組織でmTOR活性化に寄与する遺伝子の同定を行った。三つめは、内視鏡的に切除した早期食道癌および胃癌から得た組織の遺伝子解析を行い、早期食道癌ではTP53変異が、早期胃がんではTP53変異とWntシグナル系の遺伝子変異が腫瘍化に関わる可能性を解明した。検体採取については、切除されたパラフィン包埋切片(FFPE)、膵液、内視鏡下生検検体などを用いているが、本研究に必要なこれらの臨床検体および臨床情報の取得は問題なく施行できている。各検体からのDNA抽出については、多量の検体を扱うために煩雑になるが、この過程には核酸抽出器が導入され半自動的にできている。また、本研究は遺伝子解析研究であるが、倫理委員会や研究内容の情報公開も問題なく遂行されている。遺伝子解析には計画通りにIon PGMシークエンサー(ライフテクノロジーズ社)を用い、50種類の癌関連遺伝子に含まれる約2800種類の変異検出に成功している。臨床データと遺伝子の関連についての解析については、臨床データの匿名化を行いつつ臨床因子と変異遺伝子の関連の解明に努めており、おおむね順調である。消化器現在消化器疾患と遺伝子変異の関連について、疾患種類、症例数を増やしつつ解析を継続中である。

当初の計画では癌関連の50遺伝子を中心に解析する予定であったが、今後得られる知見によってはさらに多くの遺伝子変異を追加で解析する可能性がある。
遺伝子改変SHIVを用いたHIV-1の病原性と宿主免疫応答の解析

本年度は、SHIV-アカゲザルの感染実験系をベースとし、エイズの予防・治療法開発のためのより有効な感染モデル系の確立と、HIV-1の病原性及び宿主免疫応答の遺伝子・細胞・個体レベルでの統合的解析を目指し、以下の研究を遂行した。エイズウイルスと宿主液性免疫因子との関連を調べる為、SHIVのnef遺伝子領域に各種サイトカイン・ケモカインを組込み、ウイルス増殖への影響を検討したところ、Th2サイトカインであるIL-5を組み込んだSHIVでは、培養細胞レベル、感染個体レベルともに増殖能が増強された。また、急性発症株SHIV-89.6Pと非発症株SHIV-NM-3rNについて、感染初期における各種サイトカイン・ケモカインの血漿中の動態を調べたところ、IL-2など病原性に関連して産生か影響される傾向が観察されたものがあったが、感度良く病原性のマーカーとして使用可能なものは得られなかった。ゲノムの3'半分がSHIV-89.6Pに由来する感染性クローンを作製し、サル感染実験を行ったところ、接種後2週目までの一過性のウイルスロードのピークとCD4陽性細胞数の減少が親株と同様に認められたが、親株と異なり、34週以降抗体が上昇し、血漿中のウイルス量が減少した。また、CD4陽性細胞が回復傾向を示し、親株の強毒性が再現されなかった。今後、クローンと親株の感染初期における自然免疫応答について詳細に調べる予定である。89.6PとNM-3rNについて培養細胞におけるアポトーシス誘導能について検討したところ、両者のアポトーシス誘導能はウイルスの増殖能に強く関係しており、質的な違いは認められなかった。
ピリミジン塩基合成系を標的とする抗トリパノソーマ薬開発モデルの確立

ピリミジン塩基合成系の第二酵素aspartate carbamoyltransferase(ACT)は、哺乳類では第1、第3酵素と融合した多機能蛋白として存在するが、クルーズトリパノソーマ(Tc)のACT(TcACT)は、単独の、調整サブユニットを持たない酵素として存在する。また、前年度の研究からTcACTは基質特異性が哺乳類酵素と大きく異なり(論文投稿中)、そのことから治療薬の標的候補としても有望であると考えられる。本年度はTcACTの高次構造解析のための結晶化を試みた。沈澱剤としてPEG及び硫安を用いて検討したが、現在のところ結晶は得られておらず、種々の条件について検討を進めている。またピリミジン合成経路のTcにおける特異性や哺乳類との相違点を、経路全体の分子進化の産物として位置付けた上で、ピリミジン合成に関わる全6酵素についてそれぞれ分子系統樹を作製した(投稿中)。その結果、第4、第6酵素を除く各酵素の系統樹上で、Tcは真核生物のごく初期に分岐したものと推定された。一方、Tcの第4酵素は酵母、乳酸菌のそれと同一のグループに属し、Tcが同酵素遺伝子を二次的に獲得したものと考えられた。この結果は第4酵素の生化学的性状と一致した。第6酵素は、Tcでは第6/第5の順に融合した蛋白(哺乳類では第5/第6の融合)で、トリパノソーマ科原虫に特徴的な細胞内小器官グリコソームに局在していると考えられている。第6酵素の分子系統樹を作製したところ、興味深いことにTcは好熱細菌や結核菌とのみグループを形成し、その起源が哺乳類型酵素とは異なること、生化学的にも哺乳類酵素とは異なる性質を持つことから、Tcの第6(第6/第5融合)酵素の、薬剤標的酵素としての可能性が示唆された。シャーガス病はクルーズトリパノソーマ(Tc)によって引き起こされる疾患であり、現在も有効な薬剤の開発が強く望まれている。本研究では、ピリミジン塩基合成系の初段酵素、カルバモイルリン酸合成酵素(CPSII)を薬剤の標的酵素として想定し、その大量発現及び結晶化を行い、X線解析によりその立体構造を同定後、薬剤スクリーニングのための実験系を確立することを目的とする。本年度はTcCPSIIの大腸菌を用いた大量発現を試み、得られた組換え体CPSIIの酵素学的特徴について検討した。TcCPSII遺伝子をコードする組換え体プラスミドを作製し、大腸菌を形質転換後、大腸菌内での組換え体TcCPSIIの発現について調べた。大腸菌としては組換え蛋白の高次構造を回復するのに有効であるとされるGroEL、もしくはチオレドキシンを共発現する株か、共発現しない通常の株を用いた。また、CPSIIと同様にピリミジン塩基合成系の第2酵素ACT(TcACT)を大腸菌を用いて発現させ、CPSII活性の測定に用いることとした。最初にTcACTの発現を試みたところ、予想される分子量約36kDのタンパクが得られた。アフィニティーカラムを用いて精製後、組換え体TcACTの酵素学的性状について調べたところ、虫体からの精製標品に比して比活性が高く、基質特異性については天然型酵素と同等であった(投稿準備中)。TcCPSIIについては、N端部のグルタミナーゼ活性を持つ領域を発現させた場合には大量発現が認められたが、全長を発現させた場合にはいずれの菌株を用いた場合でも発現量が極めて少なく、特異的抗TcGAT抗体を用いたウェスタン法によって予想される170kDのTcCPSIIを検出した。現在TcCPSIIの大量発現技術及び精製法の確立を進めると共に、真核生物では初めてとなる第2酵素ACTの結晶化及びX線解析を行っている。第6酵素の分子系統樹を作製したところ、興味深いことにTcは好熱細菌や結核菌とのみグループを形成し、その起源が哺乳類型酵素とは異なること、生化学的にも哺乳類酵素とは異なる性質を持つことから、Tcの第6(第6/第5融合)
マラリア感染防御におけるTリンパ球とサイトカインの役割

1.マラリア感染に伴うヘルパーT細胞サブセットの応答についてサイトカインの産生を指標として調べ、マウスにおけるPlasmodium yoelii 17X感染では、IFN-γ応答は弱毒株感染のみならず強毒株感染にも認められること、IL-10応答は強毒株感染にのみ認められることなどを明らかにした。これらは、感染初期のTh2応答がマラリアにおける憎悪、致死性に関与することを初めて示唆する結果であった。2.Th1,Th2由来サイトカイン応答をさらに詳細に検討するため、本原虫の強毒株(PyL)をC57BL/6マウスに接種後、経日的に採取した脾細胞のサイトカイン応答を調べた。その結果、強毒株感染後のTh1応答(IFN-γ産生を指標として)とTh2応答(IL-10産生を指標として)のpeakの時期に差は認められないこと、即ち、他の原虫感染などに認められるTh1-Th2のcross-regulationとは異なる応答と経過を、宿主が本原虫感染に対してとることが明らかとなった。IL-2、IL-4およびIL-5応答については、いずれもこの系では、有意な産生は認められず、これら2つのサイトカインが主要なものであると考えられた。3.抗IFN-γ抗体投与と抗IL-10抗体投与の感染経過に及ぼす影響について検討したところ、抗IFN-γ抗体投与によってマウスの死亡開始日が早まり、また、抗IL-10抗体投与によって半数以上のマウスが治癒した。さらに、脾細胞によるin vitro NO産生は、抗IFN-γ抗体により抑制され抗IL-10抗体により増大した。以上の結果より、本原虫感染では、Th1サイトカインであるIFN-γが防御に、Th2サイトカインであるIL-10が憎悪に関与すると考えられた。さらに、P. bergheiの弱毒株感染においてもこれらのサイトカインの拮抗的役割が明らかとなった。Plasmodiumyoelii17Xのlethal strain(PyL)あるいはnonlethal strain(PyNL)をC57BL/6マウスにそれぞれ接種し、PyLについては接種後マウスが死亡するまでの各時期に、また、PyNLについては接種後パラシテミアの上昇期、ピーク期、下降期の各時期に脾細胞を取り出し、マラリア感染に伴うhelper T細胞サブセットの応答について、IFN-gammaとIL-10産生を指標にして調べた。サイトカインについては、脾細胞をマラリア抗原またはマイトージェンで刺激した後、その培養上清中に産生されたものを、2種類のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチELISA法とバイオアッセイで調べた。その結果、強毒株の感染においても弱毒株と同程度或いはそれ以上のIFN-gamma応答が認められることが明らかとなり、本原虫に対するマウスの感受性の差(治癒か、致死か)がIFN-gamma産生の有無によって決定されるとした従来の考え方と異なる新知見を得た。次に、Th1由来のIFN-gammaをinhibitするIL-10応答について調べたところ、強毒性感染にのみ強いIL-10応答が認められることを明らかにした。これらの結果は、感染初期のTh2応答が、マラリアにおける増悪、致死性に関与する事を示唆する。このIL-10を産生する細胞について調べたところ、CD4+T細胞が主たる産生細胞であるが、non-T細胞もまた、その産生に関与することが明らかとなった。

マラリア感染に伴うヘルパーT細胞サブセットの応答についてサイトカインの産生を指標として調べ、マウスにおけるPlasmodium yoelii 17X感染では、IFN-γ応答は弱毒株感染のみならず強毒株感染にも認められること、IL-10応答は強毒株感染にのみ認められることなどを明らかにしてきた。これらは、感染初期のTh2応答がマラリアにおける増悪、致死性に関与することを初めて示唆する興味深い結果であった。そこでP.yoelii感染におけるTh1,Th2由来サイトカイン応答をさらに詳細に検討するため、本原虫の強毒株(PyL)をC57BL/6マウスに接種し、感染後経日的に採取した脾細胞をマラリア原虫抗原で刺激した後そのサイトカイン応答を調べた。その結果、強毒株感染後のTh1応答(IFN-γ産生を指標として)とTh2応答(IL-10産生を指標として)のpeakの時期に差は認められないことが明らかとなった。これは、他の原虫感染などに認められるTh1-Th2のcross-regulationとは異なる応答と経過を、宿主が本種感染に対してとることを示唆している。IL-2、IL-4およびIL-5応答については、いずれもこの系では、有意な産生は認められず、これら2つのサイトカインが主要なものであると考えられた。次に、強毒株感染において強い応答が認められるIFN-γとIL-10の意義について明らかにするため、抗IFN-γ抗体投与と抗IL-10抗体投与の感染経過に及ぼす影響について検討したところ、抗IFN-γ抗体投与によってマウスの死亡開始日が早まること、抗IL-10抗体投与によって半数以上のマウスが治癒することが明らかとなった。これらより、本原虫感染では、Th1サイトカインであるIFN-γが防御に、Th2サイトカインであるIL-10が増悪に関与すると考えられた。1.Plasmodiumyoelii 17X感染の強毒株感染と弱毒株感染における宿主ヘルパーT細胞サブセットの応答についてサイトカインの産生を指標として調べ,弱毒株感染ではTh1応答しか認められないのに対し、強毒株感染ではTh1応答とTh2応答の両方が認められること、即ち、感染初期のTh2応答がマラリアにおける増悪、致死性に関与することなどを明らかにしてきた.本感染におけるTh1サイトカイン、Th2サイトカインとして主要なIFN-γとIL-10の役割について明らかにするため、抗IFN-γ抗体投与と抗IL-10抗体投与が強毒株感染経過に及ぼす影響について検討したところ、抗IFN-γ抗体投与によってマウスの死亡開始日が始まり、抗IL-10抗体投与によって半数以上のマウスが治癒した。さらに、脾細胞によるin vitro NO産生は、抗IFN-γ抗体により抑制され抗IL-10抗体により増大した。これらのことから、本原虫感染では、Th1サイトカインであるIFN-γが防御に、Th2サイトカインであるIL-10が増悪に関与すると考えられた。しかし、これら拮抗するサイトカインの役割とその機序を詳細に検討するには、強毒株感染では症状の進展が急速でありすぎたため、異なる感染免疫応答モデルを開発することとした.2.Plasmodium bergheiの弱毒株をCBAマウスに感染させると一過性の原虫血症を示した後、自然治癒する。感染マウス脾細胞のサイトカイン産生量を経時的に調べると、IFN-γ,TNF-α,IL-4,IL-10などが感染初期に産生されることが明らかとなった。
マイクロ波加熱による連続的酸糖化システムの開発

本研究は木材を希酸の存在下でマイクロ波加熱し木材多糖を二次分解をおこさせることなく短時間内に糖化して低エネルギー消費のもとで低コストのグルコースを生産し、可及的にアルコールへ変換することを目的としている。得られた成果は次のとおりである。(1)装置の設置:酸を使用するので、耐酸性のステンレスを用いた配管系の装置を設置した。本装置には、酸の中和システム、水不溶物の除去のための遠心分離機、並びにアルコール発酵のための発酵槽が含まれている。(2)酸の種類の検討:酢酸、塩酸および硫酸を用いて種々の条件下でマイクロ波加熱したところ、セルロースの分解には希硫酸を用いるのが最適であることをみいだした。(3)酸糖化を一段で行うか二段で行うかの決定:木材を酸糖化して可及的にアルコールへ導く場合、非発酵性のペントース類の混入を可能な限り低下させることが望ましい。そこでペントース類の除去法を検討した。酸の非存在下でマイクロ波照射により220°C以上の温度まで加熱後水洗すれば木材中のペントースは95%以上除去することができることがわかった。従って、酸糖化は、まず水の存在下でマイクロ波加熱し、その残渣を硫酸の存在下でマイクロ波加熱する二段酸糖化が最適であることが明らかになった。(4)硫酸の濃度と加熱温度の決定:セルロースを酸糖化する場合、215°Cを越えると糖の二次分解を伴ない、フルフラールの生成が顕著になることをみいだした。また、フルフラールの生成量は硫酸の濃度が高くなっても増大することがわかったので、最適硫酸濃度、加熱温度として0.5%、215°Cと決定することができた。(5)アルコール発酵特性の決定:グルコースのアルコール発酵は初発グルコース濃度への依存性が極めて高く、グルコースの濃度を10%近く高めることにより,発酵効率約70%でアルコールを生産することが可能となった。