hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ミクロおよびマクロトライボロジー問題の破壊力学による解明

1.サーモグラフィーによる非接触温度測定法によって,接触部の温度分布と疲労損傷の関係について調査した.また,サーモグラフィーを用いて接触表面の主応力和(応力の第一不変量)は計測することができるが,原理上主応力和から個々の応力成分は分離決定できないとこれまでいわれてきた.これに対して,研究代表者は応力成分の分離を可能にする基本的な条件を理論的に考察し,実際問題のほとんどについて上述の難点を解決できる手法を開発した.2.圧延ロールのスポーリング損傷に代表されるように接触荷重下の疲労き裂はせん断形で大きく成長することが指摘されてきた.しかし,せん断形疲労き裂進展を実験室レベルで再現することは非常に困難なため,特にワークロール鋼や軸受鋼などの硬い材料のせん断形疲労き裂進展に対する抵抗値はこれまで得られていなかった.本研究では,せん断形疲労き裂進展に対する抵抗値を硬い材料でも測定できる方法を開発し,実際にレール鋼,圧延用ロール鋼および軸受鋼などの値を測定した.その結果,せん断形の抵抗値は引張形の疲労き裂進展に対する抵抗値より大きいことが明らかになった.3.高真空や高温環境といった過酷な環境下で使用される高機能軸受の材料として期待されるセラミックスの接触疲労のメカニズムを解明するために,球圧子が平板上を往復するすべり接触応力下で疲労試験を行う機能を有する試験機を開発した.窒化ケイ素を用いた実験によって初期欠陥から進展するき裂の進展挙動を詳細に観察し,さらに球-平板接触荷重下の応力分布を用いてき裂進展挙動を力学的に評価した.(1)トライボロジー問題の解決のためには、物体どうしが接触するときの応力場を詳細に解析することが必要であり、そのための実験的手法としてサーモグラフィーによる非接触応力解析法が有望視されている。本年度はまず、サーモグラフィーを利用して接触部の温度分布測定と疲労損傷の関係について調査した。(2)サーモグラフィーでは表面の応力のみ測定可能であることや主応力和(応力の第1不変量)のみ計測され、個々の応力成分を分離決定できない原理上の欠点がある。これに対して、研究代表者は応力成分の分離を可能にする基本的な条件を理論的に考察し、実際問題のほとんどについて上述の難点を解決できる手法を開発した。(3)サーモグラフィーの原理的欠点を克服できたことは、接触応力場の計測法を確立する上で大きな意義がなる。なお、接触応力場の弾塑性応力解析プログラムはすでに開発済みのため、今後は解析と実験の両方からミクロとマクロのトライボロジー問題にアプローチできることになる。(4)圧延ワークロールのスポーリング損傷の事例を調査し,破壊力学的課題を明確にした.(5)繰返し接触応力下の材料の構成式を提案した.1.サーモグラフィーによる非接触温度測定法によって,接触部の温度分布と疲労損傷の関係について調査した.また,サーモグラフィーを用いて接触表面の主応力和(応力の第一不変量)は計測することができるが,原理上主応力和から個々の応力成分は分離決定できないとこれまでいわれてきた.これに対して,研究代表者は応力成分の分離を可能にする基本的な条件を理論的に考察し,実際問題のほとんどについて上述の難点を解決できる手法を開発した.2.圧延ロールのスポーリング損傷に代表されるように接触荷重下の疲労き裂はせん断形で大きく成長することが指摘されてきた.しかし,せん断形疲労き裂進展を実験室レベルで再現することは非常に困難なため,特にワークロール鋼や軸受鋼などの硬い材料のせん断形疲労き裂進展に対する抵抗値はこれまで得られていなかった.本研究では,せん断形疲労き裂進展に対する抵抗値を硬い材料でも測定できる方法を開発し,実際にレール鋼,圧延用ロール鋼および軸受鋼などの値を測定した.その結果,せん断形の抵抗値は引張形の疲労き裂進展に対する抵抗値より大きいことが明らかになった.3.高真空や高温環境といった過酷な環境下で使用される高機能軸受の材料として期待されるセラミックスの接触疲労のメカニズムを解明するために,球圧子が平板上を往復するすべり接触応力下で疲労試験を行う機能を有する試験機を開発した.窒化ケイ素を用いた実験によって初期欠陥から進展するき裂の進展挙動を詳細に観察し,さらに球-平板接触荷重下の応力分布を用いてき裂進展挙動を力学的に評価した.1.近年トライボロジー問題に破壊力学を応用することにより接触荷重下のき裂進展挙動の数値解析が可能となってきた.本年度は,熱間圧延加工や接触表面の摩擦が大きい場合に問題となる熱の影響を考慮できる数値解析法を開発し,実際の圧延ロールやセラミックコーティングロールを想定してき裂進展挙動を解析した.2.圧延ロールのスポーリング損傷に代表されるように接触荷重下の疲労き裂はせん断形で大きく成長することが指摘されてきた.しかし,せん断形疲労き裂進展を実験室レベルで再現することは非常に困難なため,特にワークロール鋼や軸受鋼などの硬い材料のせん断形疲労き裂進展に対する抵抗値はこれまで得られていなかった.本研究では,せん断形疲労き裂進展に対する抵抗値を硬い材料でも測定できる方法を開発し,実際にレール鋼,ワークロール鋼および軸受鋼などの値を測定した.その結果,せん断形の抵抗値は引張形の疲労き裂進展に対する抵抗値より大きいことが明らかになった.3.高真空や高温環境といった過酷な環境下で使用される高機能軸受の材料として期待されるセラミックスの接触疲労やメカニズムを解明するために,球圧子が平板上を往復するすべり接触

応力下で疲労試験を行う機能を有する試験機を開発した.窒化ケイ素を用いた実験によって初期欠陥から進展するき裂の進展挙動を詳細に観察し,さらに球一平板接触応力下の応力分布を用いてき裂進展挙動を力学的に評価した.
ベイツ型擬態の理論モデルの統合および時空間変動データによるモデル検証

毒をもたない種が毒を持つ種に姿を似せることで、捕食者をだまし、捕食を回避する例が多数知られている。この現象はベイツ型擬態と呼ばれており、進化の代表例として生物学的に重要である。しかしながら、ベイツ型擬態において有毒種と無毒種がどのような条件下で安定的に共存できるのかについては、不明な点も多い。そこで本研究では、ベイツ型擬態における共存メカニズムを、数理モデルを用いて明らかにすることを目指す。具体的には、ベイツ型擬態の地理的変異や季節変動パターンといった現象に着目し、数理モデルを用いた理論的予測と野外実証データによる予測の検証を行う。
線虫の低温耐性を改善する不凍タンパク質の生体内作用機序の解明

不凍タンパク質(Antifreeze Protein: AFP)は、氷結晶の成長阻害というユニークな性質をもつ一方、非凍結温度でも個体生物の低温耐性改善や細胞保護のために働くことがわかってきました。本課題では、非凍結温度におけるAFPの分子メカニズム解明を目指します。種々の変異AFPを発現する線虫を用いて、低温耐性の観察や、AFPの細胞内局在パターン、細胞内作用を蛍光イメージングにより可視化解析します。そして、AFP結晶構造や物理的特性に起因するAFP機能を分子レベルで明らかにします。
抗腫瘍性サイトカインIL-24遺伝子改変細胞を用いたがん転移抑制機序の解明

本研究では、新規抗腫瘍性サイトカインIL-24をIL-24受容体を有しない前立腺癌細胞に、レトロウイルスベクターを用いて導入したところ、細胞増殖抑制とともにアポトーシス誘導と上皮系マーカーの上昇などの抗腫瘍効果が有意に観察された。興味深いことに、これらの作用はリコンビナントIL-24蛋白質を添加した際には認められなった。今後詳細なメカニズムを解析する。1.遺伝子改変細胞C57-mIL-24の作製と抗腫瘍効果の評価MBL社にmouse IL-24遺伝子の人工合成を依頼し、レトロウイルスベクターpDon-5 Neoにクローニングを行い(pDon-mIL-24)、PT67細胞にトランスフェクションした。この細胞上清中に産生される組み換えレトロウイルスを、C57細胞に感染させ、G418で選択を行い、遺伝子改変細胞C57-mIL-24を5クローン作製した。C57-mIL-24細胞クローンよりそれぞれtotal RNAを抽出し、real time PCRを用いてIL-24遺伝子発現量を測定し、最も発現量の高いクローンを選別した。また抗mouse IL-24抗体を用いたウェスタンブロット法により、mIL-24蛋白を検出した。mIL-24の抗腫瘍効果を評価するため、in vitroにおいて、マウスメラノーマB16細胞にてMTTアッセイを行った。C57-mIL-24細胞の培養上清を添加したが、B16細胞の増殖に有意な変化が認められなかった。2.遺伝子改変細胞C57-IL-24の作製mouse IL-24において抗腫瘍効果が認められなかったことから、メラノーマや前立腺癌を初め複数の腫瘍において抗腫瘍効果が報告されている、human IL-24遺伝子を用いることとした。mIL-24遺伝子と同様に、MBL社にhuman IL-24遺伝子の人工合成を依頼し、レトロウイルスベクターにクローニングを行い、PT67細胞にトランスフェクションした。この細胞上清中に産生される組み換えレトロウイルスをC57細胞に感染させ、G418で選択を行い、遺伝子改変細胞C57-IL-24を5クローン作製した。C57-IL-24細胞クローンよりそれぞれtotal RNAを抽出し、real time PCRを用いてIL-24遺伝子発現量を測定し、最も発現量の高いクローンを選別した。3.学会発表中村綾香、香川理紗、前花祥太郎、中村正樹、北里英郎:IL-24産生遺伝子改変細胞を用いた悪性黒色腫に対する抗腫瘍効果の検討:第35回日本炎症・再生医学会.2014Sauane Mらの報告を基に、前立腺がん細胞PC-3, DU145,肺がん細胞A549, RERF-LC-AIに対してhIL-24リコンビナントを用いた抗腫瘍効果の検討を行った。しかしながらいずれのがん細胞株においても増殖抑制効果を認めることができなかった。2.がん細胞株へのhIL-24遺伝子導入hIL-24リコンビナントによる抗腫瘍効果が認められなかったことから、レトロウイルスベクターを用いてがん細胞に直接hIL-24遺伝子を導入した。hIL-24を導入したヒトがん細胞株DU145-hIL-24, PC-3-hIL-24, A549-hIL-24, RERF-LC-AI-hIL-24を作製した。DU145-hIL-24の解析を行うことにより、hIL-24がWSTアッセイ及びBrdU ELISAアッセイにより増殖を抑制、cell death detection ELISAによりアポトーシスを誘導すること明らかにした。またコロニー形成アッセイにて確認された細胞形態の変化から、IL-24はDU145に対して上皮マーカー遺伝子(E-cadherin等)の上昇と間葉系マーカー遺伝子(fibronectin 1等)の減少を伴う変化をもたらしていたことを確認した。現在これらの遺伝子変化がもたらす形態変化をファロイジン染色により確認している。3.学会発表(予定)松本優汰、前花祥太郎、中村正樹、小島史章、北里英郎:Interleukin-24により前立腺がん細胞に対する抗腫瘍効果の検討とその作用機序の解析:第37回日本炎症・再生医学会.2016平成27年度はhuman IL-24(hIL-24)産生遺伝子改変細胞を作製したが、リコンビナントhIL-24を用いた検討において、既知の論文から予測された抗腫瘍効果が示せなかったことから、hIL-24遺伝子を腫瘍細胞の直接導入した。前立腺癌細胞DU145にhIL-24遺伝子を導入した。DU145-hIL-24においては腫瘍増殖抑制が認められ、cell death detectionELISAによりアポトーシスが誘導されることを確認した。CASPASEおよぶBAXの誘導についても現在検討中である。また細胞治療の安全性を向上させたC57/tk細胞を作製し、ガンシクロビルによりC57/tk細胞が除去されることを確認した。Human IL-24(hIL-24)リコンビナントによる細胞増殖の抑制が認められなかったことから、hIL-24による従来報告されている受容体を介した癌細胞の細胞死が今回使用した癌細胞株では誘導されないことが示唆された。癌細胞株のIL-24受容体(IL20RA, IL-22RA, IL-20RB)の遺伝子発現を確認したところ、その発現は癌細胞株により異なっていたが、ヒト前立腺癌細胞DU145では発現が認められなった。

このことから、IL-24が受容体を介さない経路により癌細胞に影響を与えるか検討するため、IL-24受容体をも発現しないDU145細胞において、レトロウイルスベクターを用いて直接hIL-24遺伝子を導入することで癌細胞への抗腫瘍効果を解析した。hIL-24を導入したDU145-hIL-24は、WSTアッセイ及びBrdU ELISAアッセイにより増殖を抑制、cell death detectionELISAによりアポトーシスを誘導することが確認された。またコロニー形成アッセイにて細胞形態の変化が認められたことから、遺伝子発現をreal time PCRにて解析したところ、IL-24はDU145に対して上皮マーカー遺伝子(E-cadherin等)の上昇と間葉系マーカー遺伝子(fibronectin 1等)の減少を伴う変化をもたらしていた。hIL-24を発現することによりもたらされる形態変化をファロイジン染色により確認したところ、細胞の運動能に関係するアクリンフィラメントの形成がhIL-24導入により抑制されていることが確認された。これらのことより、前立腺癌DU145において、hIL-24発現が細胞増殖や細胞浸潤にかかわる遺伝子変化をもたらし、がんの悪性化を抑制する可能性が示唆された。癌細胞において発現誘導された間葉系遺伝子をhIL-24が抑制的に働く新たな知見が得られたため、論文投稿を予定している。本研究では、新規抗腫瘍性サイトカインIL-24をIL-24受容体を有しない前立腺癌細胞に、レトロウイルスベクターを用いて導入したところ、細胞増殖抑制とともにアポトーシス誘導と上皮系マーカーの上昇などの抗腫瘍効果が有意に観察された。興味深いことに、これらの作用はリコンビナントIL-24蛋白質を添加した際には認められなった。今後詳細なメカニズムを解析する。平成26年度の研究実施計画のうち遺伝子改変細胞C57-mIL-24及び対照であるC57-EVの作製を行った。マウスメラノーマ細胞B16への抗腫瘍効果を検討したが、有意差が認めら得なかったことから、human Il-24遺伝子からC57-IL-24を作製した。LLC-IL-24細胞は現在作成中である。またC57-IL-24におけるIL-24蛋白発現の確認実験をELISA法にて確認中である。総合領域1.C57-IL-24細胞の産生する分泌蛋白質の確認及びLLC-IL-24細胞の作製昨年度作製したC57-IL-24の細胞上清を回収し、産生される分泌蛋白を、ELISA法にて測定する。またLLC-IL-24細胞についてもC57-IL-24同様に、real time PCR及びELISA法を用いてIL-24遺伝子発現を確認する。2.IL-24の抗腫瘍効果の確認C57-IL-24、LLC-IL-24におけるアポトーシス誘導をcell death ELISA法により確認する。またアポトーシス関連蛋白をCASPASE、BAXを中心にwestern blot法にて確認する。対象としてC57-EV及びLLC-EVをそれぞれ用いる。3.In vivoにおけるIL-24抗腫瘍効果の検討
時間使用に与える教育の効果に関する研究〜生活時間調査によるアプロ-チ〜

本研究では、1.学校教育の非貨幣的効果、2.学校教育の間接効果と直接効果、3.学校教育と卒業後教育(生涯学習)、という3つの観点から、時間使用に与える教育の効果に関する分析を行った。主たる研究成果は次の3点にまとめられる。第1点は、高学歴であるほど忙しいにもかかわらず積極的に多様な自由時間を楽しんでいることである。高学歴者は、生理的必要時間やテレビ、休息などの時間を削ることで自由時間をつくりだし、忙しく自由時間を楽しんでいるのである。これを20年前のデ-タと比較すると、性格により変化の方向は異なっている。男性では学歴間格差が縮小したのに対し、女性では格差は拡大したのである。この他に、年間を通じて学歴が高いものほど多様な学習活動に参加していることなども明らかになった。第2の点は、学校教育は時間選好という価値観の内面化を通じて直接的に時間使用に影響を及ぼしていることである。学校教育は、職業などを通じて間接的に時間配分に大きな影響を及ぼしている。しかしながら、時間配分には間接効果だけでは説明できない大きな学歴間格差が存在しているのである。全体平均では学歴間格差の小さい男子でも、「職種」という教育の間接効果を通じて学歴間格差の拡大がみられた。さらに、教育の直接効果をもたらす要因について検討したところ、未来志向や余暇志向といった価値観が教育期間の延長に伴って強く内面化され、時間配分上の格差を生み出している、という知見を得た。第3番目に、卒業後教育(生涯学習)も時間配分に影響を及ぼしていることが明らかになった。学習活動を行っているものは、生理的必要時間やテレビ時間を減らすことで、多様な余暇活動を行っているのである。特に男性では、生涯学習の影響は学校教育の影響よりも強くなっている。
マウス新生仔の情動形成における多価不飽和脂肪酸の役割に関する研究

本研究は,脳の発達・形成期における多価不飽和脂肪酸,特にn-3系脂肪酸の重要性を検討するために,n-3系脂肪酸を含まないもしくは含んでいる人工乳でマウスを人工飼育して,情動行動と脳内モノアミン量の変化を測定した.人工乳による人工飼育は,母獣飼育よりも不安レベルを高めることが知られているが,本実験結果から,人工乳中のn-3系脂肪酸が脳内モノアミン産生とその代謝回転率を安定化させて,不安レベルを軽減している可能性が考えられた.本研究は,n-3系脂肪酸欠乏乳を調製して,マウス新生仔を人工飼育し,授乳・形成期に摂取した多価不飽和脂肪酸のバランスの違いによって生じる情動行動の違いを検証して,情動形成期における脂肪酸の役割を明確にするものである.平成27年度は,当初予定した以下に示す全項目について実施した.1. n-3系脂肪酸欠乏人工乳の調製:高圧ホモジナイザーによるn-3系脂肪酸欠乏ならびに正常人工乳の作製は問題なく終了した.2.マウスの誕生2日目から離乳までの人工乳による人工飼育: n-3系脂肪酸欠乏もしくは正常人工乳で離乳まで人工飼育し,以降,同様の組成飼料で成獣まで飼育した.3.人工飼育個体の情動行動評価:自発運動量,高架式十字迷路試験,新奇環境による摂食抑制試験を実施した.4.行動試験終了時に各個体から,血清,脳(視床下部,海馬,線条体,前頭皮質等)を採取保存した.平成27年度の実施項目については,大きな問題が生じることもなく,概ね予定項目を実施することができた.本研究は,n-3系脂肪酸欠乏乳を調製して,マウス新生仔を人工飼育し,授乳・形成期に摂取した多価不飽和脂肪酸のバランスの違いによって生じる情動行動の違いを検証して,情動形成期における脂肪酸の役割を明確にするものである.平成27年度のn-3系脂肪酸欠乏乳の調製,マウスの誕生2日目から離乳までの人工乳による人工飼育,.人工飼育個体の情動行動評価,行動試験終了時の組織採取を踏まえ,平成28年度は以下に示す全項目について実施した.1.行動試験の詳細な解析.2.脂肪酸組成の測定(脳内:海馬,線条体,前頭皮質等).3.脳内モノアミンの測定(視床下部,海馬,線条体,前頭皮質).結果の概要としては,人工乳中のn-3系脂肪酸が脳内モノアミン産生とその代謝回転率を安定化させて,不安レベルを軽減している可能性が考えられた.また,新生仔の成長に伴って増減が観察された海馬のMHPGや視床下部のドーパミンが,n-3系脂肪酸欠乏群ではその変化が鈍く,n-3系脂肪酸の欠乏により情動形成が遅延もしくは抑制されていることが推察されている.平成28年度の実施項目については,大きな問題が生じることもなく,概ね予定項目を実施することができた.本研究は,n-3系脂肪酸欠乏乳を調製して,マウス新生仔を人工飼育し,授乳・形成期に摂取した多価不飽和脂肪酸のバランスの違いによって生じる情動行動の違いを検証して,情動形成期における脂肪酸の役割を明確にするものである.平成27年度,28年度の実施内容を踏まえて,平成29年度は,この期間に得られた試験結果を総括した.新たな知見が得られたものの,外部発表に関しては再現性の確認を要する部分もあり,再検討を計画している.本研究は,脳の発達・形成期における多価不飽和脂肪酸,特にn-3系脂肪酸の重要性を検討するために,n-3系脂肪酸を含まないもしくは含んでいる人工乳でマウスを人工飼育して,情動行動と脳内モノアミン量の変化を測定した.人工乳による人工飼育は,母獣飼育よりも不安レベルを高めることが知られているが,本実験結果から,人工乳中のn-3系脂肪酸が脳内モノアミン産生とその代謝回転率を安定化させて,不安レベルを軽減している可能性が考えられた.平成28年度の実施予定項目は以下に示すとおりである.1.行動試験の解析:ビデオテープによる行動試験の詳細な解析を行う.2.脂肪酸組成の測定:実験で採取した血清ならびに脳内(海馬,線条体,前頭皮質等)の脂肪酸組成を測定する.3.脳内モノアミンの測定:脳内(視床下部,海馬,線条体,前頭脂質)のノルエピネフリン,セロトニン,ドーパミンとその代謝産物などのモノアミン類を測定する.平成29年度は,これまでの行動試験,脳内脂肪酸組成,脳内モノアミンの測定結果の精査と各項目間の関連性の検討を行う.研究成果の内容により,学会発表,論文投稿への展開を図る.脂質栄養学
マイクロＲＮＡによるウイルス複製と脂肪酸合成経路のクロストーク制御の分子機構

マイクロRNA(miRNA)による遺伝子発現制御が宿主細胞のみならずウイルスでも存在する。我々の解析により、C型肝炎ウイルス(HCV)増殖を抑制するmiR-199aが、宿主の脂肪酸合成酵素(FASN)の発現も直接抑制していることが判明した。HCVはFASNの発現を転写レベルで高めるが、一方でFASNはHCV複製に必要である為、両者の制御にクロストークが存在する可能性は示唆されていた。しかし、同一のmiRNAがウイルス遺伝子と宿主遺伝子の双方の発現を制御するクロストークの要であることは新たな発見であり、その分子機構の解明は大きな意義がある。マイクロRNA(miRNA)による遺伝子発現制御が宿主細胞のみならずウイルスでも存在することが報告されている。我々のこれまでの解析により、C型肝炎ウイルス(HCV)複製を抑制するmiR-199aは、宿主の脂肪酸合成酵素(FASN)の発現も直接抑制していることが判明した。HCVはFASNの発現を転写レベルで高めるが、一方でFASNはHCV複製に必要である為、両者の制御にクロストークが存在することは示唆されていた。しかし、同一のmiRNAがウイルス遺伝子と宿主遺伝子の双方の発現を制御するクロストークの要であることは新発見であり、その分子機構の解明は必須である。我々はまず、miR-199aの前駆体から生じる二種のmiRNA, miR-199a-5p及びmiR-199a-3pが、FASNに与える影響について解析した。その結果、人工合成した上記の二種のmiRNAが、培養細胞系において共にFASNの発現を抑制し、細胞内の中性脂質の量を低下させることを見出した。FASNの合成する脂肪酸は中性脂質の主な原料でもあることから、この結果は妥当であると考えている。我々はまた、miRNAの選択的な阻害剤であるTuD RNAを用いて、miR-199a-5p又はmiR-199a-3pのノックダウン解析を行った。これらのmiRNAに対するTuD RNAをレンチウイルスにより標的細胞へ導入して、miRNAの機能を阻害した結果、miR-199a-5p又はmiR-199a-3pのどちらを阻害してもFASNの発現が増加し、HCVの複製が活性化することが明らかとなった。二種のmiRNAを同時にノックダウンした場合は、FASNの発現もHCVの複製も更に上昇した。このノックダウン細胞で、FASNの発現をsiRNAにより特異的に抑制してみると、HCVの複製も抑制されたことから、HCVはFASNを介し複製を行うことが判明した。マイクロRNA(miRNA)による遺伝子発現制御が宿主細胞のみならずウイルスでも存在することは報告されている。今回我々の解析により、C型肝炎ウイルス(HCV)増殖を抑制するmiR-199aが、宿主の脂肪酸合成酵素(FASN)の発現も直接抑制していることが判明した。miR-199aは、前駆体であるプレmiRNAのプロセシングで、miR-199a-5pとmiR-199a-3pの二種の異なるmiRNAとして発現する。当該年度の研究により、miR-199a-5pとmiR-199a-3pは共にFASN蛋白質の発現を抑制して、肝細胞内の中性脂肪の量を減少させることを我々は見出した。しかし、更に詳細にmiRNAの効果を解析するために行ったレポーター・アッセイから、miR-199a-3pだけがFASNの3'UTR中の標的配列に直接作用することが判明した。miR-199a-5pは間接的にFASNの発現に影響を与えていると推測できる。また、HCVレプリコン細胞を用いた解析から、HCV複製依存にmiR-199a-5pは発現量が増加するが、miR-199a-3pは発現量が低下することも発見した。今後はHCV感染細胞と動物モデルを利用して、miR-199aとFASNとHCVの相互関係を明らかにしていく予定である。マイクロRNA(miRNA)による遺伝子発現制御は宿主細胞のみならずウイルスでも存在する。HCVはFASNの発現を転写レベルで高めるが、FASNはHCV複製に必要である為、両者の制御にクロストークが存在することは示唆されていた。まずmiR-199aの前駆体から生じる二種のmiRNA, miR-199a-5p及びmiR-199a-3pが、FASNに与える影響を解析した。その結果、人工合成した上記の二種のmiRNAが、培養細胞系にて共にFASNの発現を抑制し、細胞内の中性脂質の量を低下させることを見出した。FASNの合成する脂肪酸は中性脂質の主原料でもある為、この結果は妥当である。またmiRNAの選択的な阻害剤TuD RNAで、miR-199a-5p又はmiR-199a-3pのノックダウン解析を行った。

TuD RNAをレンチウイルスにより標的細胞へ導入し、miRNAの機能を阻害した結果、miR-199a-5p又はmiR-199a-3pのどちらを阻害してもFASNの発現が増加し、HCVの複製が活性化することが明らかとなった。二種のmiRNAを同時にノックダウンした場合、FASNの発現もHCVの複製も更に上昇した。このノックダウン細胞で、FASNの発現をsiRNAにより特異的に抑制してみると、HCVの複製も抑制されたことから、HCVはFASNを介し複製を行うことが判明した。しかし、FASNの3'UTRをルシフェラーゼ遺伝子の下流に挿入したレポーターで二種のmiR-199aの直接的な効果を検討したところ、片方しか発現抑制を示さなかった為、miR-199aの間接的な効果も考える必要がある。マイクロRNA(miRNA)による遺伝子発現制御が宿主細胞のみならずウイルスでも存在する。今回、C型肝炎ウイルス(HCV)増殖を抑制するmiR-199aが、宿主の脂肪酸合成酵素(FASN)の発現も直接抑制していることが判明した。HCVはFASNの発現を転写レベルで高めるが、一方でFASNはHCV複製に必要である為、両者の制御にクロストークが存在する可能性は示唆されていた。しかし、同一のmiRNAがウイルス遺伝子と宿主遺伝子の双方の発現を制御するクロストークの要であることは新たな発見であり、その分子機構の解明は必須である。HCV中にはmiR-199a-3pの標的配列しか発見されていないため、miR-199a-5pは間接的にHCVの複製とFASNの発現に影響を与えている。HCV依存にmiR-199a-3pの量が低下することは、ウイルス複製に有利に働く。今後はHCV感染の動物モデルを利用して、miR-199a、FASN、HCVの三者間の相互関係を明らかにしていく。我々の解析により、C型肝炎ウイルス(HCV)増殖を抑制するmiR-199aが、宿主の脂肪酸合成酵素(FASN)の発現も直接抑制していることが判明した。しかし、同一のmiRNAがウイルス遺伝子と宿主遺伝子の双方の発現を制御するクロストークの要であることは新たな発見であり、その分子機構の解明は大きな意義がある。miRNAによるウイルス複製と脂肪酸合成のクロストーク制御について新たな知見を得ることはできたが動物モデルを用いたin vivo解析が不十分であり、更なる解析を必要としている。ウイルス学miRNAを使用したHCV感染及び関連病態の治療が、本研究の臨床的な目標の一つである。miRNAで宿主因子を標的とすることで、ウイルスに入るエスケープ変異の影響を最小限に出来ると共に、siRNAと異なり、標的配列と100%マッチする必要が無い為,遺伝子型の変化にも対応できる。脂肪酸合成経路によるウイルス増殖の制御は、我々が解析をしてきたHCVのみならず、他のウイルスでも存在することが示されつつある。特に、インフルエンザウイルス研究において、FASNの阻害剤がウイルス粒子の産生を抑制することが報告されている。
RBM15 による mRNA 核外輸送機構に関する研究

RBM15はカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(KSHV)のORF57蛋白に結合し、ORF57によるORF59遺伝子発現増強に関与することが明らかになった。またRBM15はC末端のSPOC領域を介してmRNA受容体NXF1に直接結合し、mRNAをNXF1核外輸送経路へと導いていることが明らかになった。RBM15はNXF1核外輸送経路の構成蛋白として重要なmRNA核外輸送蛋白であることが示唆された。RBM15によるmRNA輸送および転写後調節機構について以下の研究を行った。カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(KSHV)ではウイルス蛋白ORF57がイントロンレス遺伝子ORF59の発現を転写後レベルで制御しているが、この転写後調節機構におけるRBM15の役割を検討した。RBM15を細胞に強発現させることによりORF59蛋白およびmRNAの発現が増強した。またRBM15をノックダウンすることによりORF59の発現が抑制されたことから、ORF59発現における内在性RBM15の重要性が明らかになった。またRBM15はORF57と細胞核内で共在し、共にnuclear speckle様の染色形態を示した。さらにORF57はRBM15のSPOC領域を含むC末端領域に直接結合することが共免疫沈降法およびpull down法により確認された。ORF57はKSHVの主に複製後期でその発現量が増加するが、この時ORF57はRBM15と相互作用することにより細胞質内のORF59-mRNAを増加させ、ORF59蛋白の発現を増強することを明らかにした。(J. Virology 2011)他方、RBM15およびホモログ蛋白OTT3によるマウスレトロエレメントRTE-mRNA発現機構についても現在解析を進めているところである。RBM15およびOTT3は共にRTE-mRNA依存性のレポーター遺伝子活性を増強し、またGST-RBM15およびGST-OTT3蛋白はGel shift法においてin vitroで作成したRTE-mRNAに選択的に結合することが確認された。またRBM15をノックダウンすることにより、RTE依存性のレポーター遺伝子発現は抑制されたことから、RTE-mRNAの発現における内在性RBM15の重要性が確認された。RBM15によるmRNA発現調節機構を解明するために、RBM15の機能領域の解析を行った。RBM15蛋白のC末端に存在するSPOC領域に着目し、その構造をin silicoにて解析した。その結果に基づいて、分子表面に存在すると予想されるアミノ酸をアラニンに変換した2種類のRBM15変異体(SPOC1,SPOC2)を作成した。レポーター遺伝子解析では、野生型RBM15はRTE-mRNA依存性のレポーター遺伝子発現を増強したが、SPOC1およびSPOC2ともにレポーター遺伝子発現の増強作用は認められなかった。SPOC1については野生型RBM15と比べて著しく蛋白発現量が低く、このためにレポーター遺伝子発現活性が見られなかった可能性があると考えられた。一方、SPOC2については発現ベクター量を調節することにより野生型とほぼ同レベルのRBM15蛋白発現量が確認され、変異させたSPOC領域内のアミノ酸がRBM15のmRNA発現機能に関与していると考えられた。また、免疫組織化学的解析ではSPOC1およびSPOC2ともに細胞核内に局在し、野生型RBM15と同様の細胞内局在を示した。さらにRBM15によるmRNA発現作用におけるSPOC領域全体の役割を明らかにするために、SPOC領域を欠損させた変異体RBM15ΔSPOCを作成した。予備実験の段階であるが、RBM15ΔSPOCによるレポーター遺伝子発現活性は野生型RBM15と比較して著しく低下した。RBM15ΔSPOCの蛋白発現量については野生型RBM15と同程度であった。このことから、SPOC領域がRBM15によるmRNA発現において重要な役割を果たしていることが示唆された。さらに生化学的解析により、mRNA受容体蛋白NXF1がRBM15のSPOC領域と直接結合することが明らかになった。これらの結果から、RBM15はSPOC領域を介してNXF1と結合することによりmRNAをNXF1核外輸送経路に導いていると考えられた。mRNA発現におけるRBM15の機能領域を解明するために、RBM15欠損変異体を作成した。レポーター遺伝子pNLgag-RTEを用いてRBM15変異体によるRTE-mRNA発現作用を解析した。これまで報告したように野生型RBM15は強いRTE-mRNA発現増強作用を示したが、C末端のSPOC領域を欠損させた変異体RBM15ΔSPOCは野生型に比較してレポーター遺伝子発現活性が著しく低下した。このことからSPOC領域はRBM15によるmRNA発現機能に重要な役割を果たしていることが明らかになった。

一方、RBM15のN末端にあるRNA結合領域(RRM)を欠損させた変異体RBM15 530-977ではmRNA発現作用は見られなかったことから、RNA結合領域はRBM15によるmRNA発現活性に必須であることが示唆された。また、これまでRBM15はそのC末端領域(RBM15 530-977)でmRNA受容体であるNXF1と結合することを報告してきたが、今回NXF1と結合するさらに詳細なRBM15の領域を生化学的に解析した。In vitroで合成したNXF1蛋白はプルダウン法において大腸菌から精製した蛋白GST-RBM15 777-977 (SPOC)に結合した。このことからNXF1はSPOC領域を介してRBM15と結合することが明らかになった。以上の結果から、RBM15はそのSPOC領域を介してmRNA受容体NXF1と直接結合することによりmRNAをNXF1核外輸送経路へと導いていることが示唆された。これまでの研究により、mRNA発現におけるRBM15の機能領域であるSPOC領域の重要性が明らかになった。またmRNA受容体蛋白NXF1がRBM15のSPOC領域と直接結合することが確認され、RBM15がmRNAをNXF1核外輸送経路へ導く分子機構の一部が解明された。24年度が最終年度であるため、記入しない。RBM15によるmRNA発現および転写後調節機構をさらに追及する。これまでの研究結果を踏まえて、RBM15の機能領域であるSPOC領域について解析を進める。複数のレポーター遺伝子を用いた機能解析によりmRNA発現におけるSPOC領域の重要性および役割について調べる。特にmRNA核外輸送蛋白との相互作用領域としてのSPOC領域の役割を明らかにする。さらに、RBM15と類似の機能を有するヒトホモログ蛋白OTT3についても同時に研究を進め、RBM15およびOTT3によるmRNA発現調節機構の全体像を明らかにする。
マルチモダリティーを用いた免疫グリア細胞のイメージング研究

活性化したミクログリアにはいくつかの特徴的な変化があり、そのうちの一つとして18kDaTranslocator protein (TSPO)へのリガンドの結合性の変化が病変部に関連したミクログリアの活性化状態と密接な関連性が示唆されている。これらの評価法は、あくまでも神経細胞のみを対象とするものであり、グリア細胞の活性については検討することは不可能であった。TSPO結合性リガンドを用いることで可能になったグリア細胞(特にミクログリア)のPETイメージング研究を行った。TSPO結合性リガンド(11C-PBR28)の臨床供給は他施設研究所からの協力もあり、比較的早期に臨床現場での薬剤供給が可能となった。8名の健常日本人の測定では、11C-PBR28の集積は投与2分前後で最大となり、脾臓、肺、心筋、膵臓、甲状腺、腸管、腎臓、肝臓の順に高く、骨髄への集積も上昇していた。心筋、肝臓、腸管への集積は投与15分以降も比較的安定していた。脳の最大集積は投与10分前後と他臓器に比べて遅く、かつ相対的に低かった。脳内の11C-PBR28は灰白質優位に広く分布しており、活性化ミクログリアに多く発現するTSPO発現が示唆された。また、11C-PBR28の被曝線量算出を目的とした健常人の臓器別投与量の経時的分布については過去に報告があるが、臓器別放射能濃度の推移については今回が初めての検討となる。脳以外の臓器については、心筋や膵臓、脾臓や骨髄などの造血臓器への集積も上昇しており、特に心筋や膵臓では長時間にわたって集積が安定していた。特発性心筋症や自己免疫性膵炎などの炎症関連疾患についても11C-PBR28画像による評価が期待できることが解明された。担癌モデル・免疫関連モデル動物を用いたin vivoイメージングを平成23年度に得られた基礎研究の結果を基にして、種々のポジトロン核種とも組み合わせたイメージングと比較検証する基礎研究を計画していた。ミクログリアのPETイメージング製剤として期待されている11C-PBR28において、免疫臨床応用に向けた合成環境整備としてヒトへの投与に関する安全性確認試験が予想以上に早く進める事が可能となり、並行して行っていた最終年度計画も可能となった。11C-PBR28を用いて、臨床用PET/CTで、健常人における全身イメージングを行った。海外では11C-PBR28が結合しない非結合症例(non-binder)が約10%程度存在することが報告されている。遺伝子多型やポルフィリン輸送との関連性等が示唆されているが明らかにされていない。当施設での健常アジア人での11C-PBR28体内分布を解析し、臨床研究や臨床診断に活用するための健常データベース作成を開始した。11C-PBR28のnon-binderの存在と正常体内分布と体内臓器における11C-PBR28放射能濃度の経時的変化について検討を行った。健常人8名(男:女=8:8、年齢:2440歳、平均年齢29.9±5.6歳)の体内分布測定を施行。PET装置はGemini GXL(Philip社製)を使用し、吸収補正用のCT撮影後に11C-PBR28平均296MBqを静注し、直後から頭頂部から鼠径部の範囲を30秒/frame×1012 positionの撮影条件で1時間に7回施行した。11C-PBR28投与時刻に合わせて時間減衰補正を行い、SUV(standardized uptake value:画像で計測される放射能濃度を投与量と体重で補正した定量値)画像を作成した。各臓器に円形の関心領域を設定し、SUV値の経時的変化を解析した。まず、アジア人種における11C-PBR28のnon-binderの存在と正常体内分布と体内臓器における11C-PBR28放射能濃度の経時的変化について検討を行った。現時点において、健常人8名(年齢:2440歳、平均年齢29.9±5.6歳)の体内分布測定を施行した。

活性化ミクログリアを可視できるTSPOイメージング製剤(11C-PBR28)の合成環境整備と毒性試験を行った。11C-PBR28合成の標識前駆体を用いたloop-SPE法により、最適な合成条件下で11C-PBR28を合成することに成功した。TSPOイメージング製剤は毒性試験においても問題なく、臨床応用への方向に本課題を遂行していける結果を得ることができた。研究施設における短寿命放射線性薬剤安全管理委員会でも臨床使用が認可されている。臨床応用への準備に平行してラットにおける受容体占拠試験も本年度行った。同条件下で合成した11C-PBR28の体内分布を正常ラット群と非放射性PK11195投与ラット群で比較した。11C-PBR28 5MBqを尾静脈から投与し、対向型ポジトロンプラナー装置(浜松フォトニクス製)にて体内全身分布の動態撮影を行った。非放射性PK11195投与ラットではPK11195 10mg/kgを前投与し、2分後に11C-PBR28 5MBqを尾静脈に静注し、直後から同様の体内分布撮影を行った。正常ラットの11C-PBR28の体内分布は脳、肺、心臓、腎臓に分布した。一方、非放射性PK11195投与ラットでは心臓や肺への特異的な11C-PBR28分布を認めず、軟部組織や腸管、肝臓への分布が観察された。以上の結果は過去の霊長類での検討結果に一致しており、本法で合成された11C-PBR28は非放射性PK11195により特異的集積が阻害されることが示され、TSPOへの特異的結合を反映することが明らかとなった。さらに、健常人での体内分布を評価するために参考となる動物実験データを本年度の研究を通じて得ることができた。活性化したミクログリアにはいくつかの特徴的な変化があり、そのうちの一つとして18kDaTranslocator protein (TSPO)へのリガンドの結合性の変化が病変部に関連したミクログリアの活性化状態と密接な関連性が示唆されている。これらの評価法は、あくまでも神経細胞のみを対象とするものであり、グリア細胞の活性については検討することは不可能であった。TSPO結合性リガンドを用いることで可能になったグリア細胞(特にミクログリア)のPETイメージング研究を行った。TSPO結合性リガンド(11C-PBR28)の臨床供給は他施設研究所からの協力もあり、比較的早期に臨床現場での薬剤供給が可能となった。8名の健常日本人の測定では、11C-PBR28の集積は投与2分前後で最大となり、脾臓、肺、心筋、膵臓、甲状腺、腸管、腎臓、肝臓の順に高く、骨髄への集積も上昇していた。心筋、肝臓、腸管への集積は投与15分以降も比較的安定していた。脳の最大集積は投与10分前後と他臓器に比べて遅く、かつ相対的に低かった。脳内の11C-PBR28は灰白質優位に広く分布しており、活性化ミクログリアに多く発現するTSPO発現が示唆された。また、11C-PBR28の被曝線量算出を目的とした健常人の臓器別投与量の経時的分布については過去に報告があるが、臓器別放射能濃度の推移については今回が初めての検討となる。脳以外の臓器については、心筋や膵臓、脾臓や骨髄などの造血臓器への集積も上昇しており、特に心筋や膵臓では長時間にわたって集積が安定していた。特発性心筋症や自己免疫性膵炎などの炎症関連疾患についても11C-PBR28画像による評価が期待できることが解明された。
暑い・寒いという印象が体温調節反応に与える効果およびその個人差の検討

本研究の目的は暑い・寒いという印象による視覚刺激が、実際の体温調節反応に影響を与えるかを明らかにすることを目的とした。その結果、常温環境下では暑い映像、寒い映像を呈示した時に、心拍変動や総末梢血管抵抗が有意に変化した。すなわち暑い映像条件では実際の暑熱曝露時の血管が拡張する傾向があり、寒い映像条件では血管が収縮、心拍数が低下する等の反応が見られた。さらに環境条件を寒くし、かつ暑い映像を呈示した場合、深部体温が寒い映像を提示した場合よりも有意に低下した。一方で、映像の効果が体温に見られない被験者もおり、印象の寄与には個人差があると考えられた。まず最初の実験として気温28°C湿度50%の環境下で、暑い印象及び寒い印象の映像を呈示し、呈示前と呈示中の被験者の生理反応を測定した。測定項目は心拍数、血圧、心拍出量等で、主に循環系の変化に注目した。その結果、28°Cの環境下では暑い映像、寒い映像を呈示した時に、心拍変動や総末梢血管抵抗が有意に変化した。これらのことから、印象の異なる暑さ・寒さの視覚刺激がヒトの生理反応に影響することが明らかになった。次の実験では、実際に暑い環境・寒い環境で映像を呈示した場合、末梢の温熱受容と中枢の視覚情報に齟齬が起こるかどうかを検討した。その結果、室温を低下させながら暑い映像を呈示した場合、深部体温が寒い映像を提示した場合よりも有意に低下したことから、中枢への視覚情報が体温調節反応に影響を及ぼしたことが示唆された。一方で、映像の効果が体温調節反応に見られない被験者もおり、印象の寄与には個人差があると考えられた。そこで遺伝的背景の一つとしてエネルギー代謝に影響を与えるとされるmtDNA多型との対応を探ったが、関連を明らかにすることはできなかった。本研究から、仮説通り体温調節反応が視覚情報によって影響を受けることが示唆された。一方で、影響を受ける個体とそうでない個体にもたらす要因は、今後さらに検討する必要があると考えられた。外界の温度変化に伴って我々は暑さ寒さを感じ、意識・無意識的にそれらに対応する。外界からの温度受容は末梢感覚神経が温度刺激を電気信号に変換して中枢へ伝達され体温調節反応が生じる。しかしヒトは高次の脳機能を有するため暑さ寒さをイメージする映像呈示においても、実際の暑熱寒冷刺激に類似した生理反応を示す。そこで本研究では暑熱・寒冷環境下で寒い印象と暑い印象を与える映像を提示し、両情報に齟齬が生じた場合はどちらの情報が優位なのかを検討し、視覚優位な人と末梢からの温度情報が優位な人の群において基礎体力や心理特性など共通する因子があるかを明らかにすることを目的とした。初年度では1暑い印象を与える映像と、2寒い印象を与える映像を呈示する。1及び2はゆるやかに風景が変化していく動画である。なお、いずれの映像にも音声は呈示しない。暑熱暴露実験では28°Cから60分間で36°Cまでゆるやかに変化させる。寒冷曝露実験では28°Cから80分間で16°Cまで緩やかに変化させる。両条件ともに相対湿度は常に50%、風速は0.3m/s以下とした。被験者の服装は灰色のTシャツとショートパンツとし、各種生理値・主観評価を測定した。その結果、寒冷曝露実験では暑い印象の映像(齟齬がある場合)、寒い印象の映像(齟齬がない場合)に比べ深部体温がより低下し、皮膚温が低下し難いという結果が得られた。すなわち、寒冷曝露時に暑い印象を提示すると、血管拡張が起こりより深部体温の放熱が促進されたことが考えられる。一方で、暑熱暴露時では全体の結果からは有意な差は無かったが、映像の違いにより、生理反応に差が出る被験者と出ない被験者がおり、暑熱刺激に対してはより視覚有意、末梢優位の群が存在することを示唆した。次年度ではこのような群が存在する要因をより詳細に探っていく。初年度の目的は達成された。さらに得られた結果の要因を検討する実験を進めていく。計画通り、視覚優位と末梢優位の個体がどのような要因によって形成されるのかを検討していく。追加の被験者への謝金や、成果発表の旅費として使用する。
ダントロレン誘導体を用いた細胞内カルシウム放出機構の解析

リアノジン受容体(RyR)は骨格筋の興奮収縮連関において、Ca^<2+>の細胞質への供給経路として重要な役割を果たしている。他方RyRは、CA^<2+>により開口するCA^<2+>によるCa^<2+>放出(CICR)チャネルの性質をも有するが、種々の実験結果からCICR機構は骨格筋の興奮収縮連関における生理的CA^<2+>放出機構としては機能しないものと考えられている。つまりRyRは、筋小胞体の膜上で、異なる刺激に対して異なる様式で開口可能なチャンネル蛋白質である可能性を有している。しかし、この2種の開口モードがそれぞれチャネル分子のどのような分子形態に基づくものかまだ明らかにされてはいない。本研究は、この二つの開口様式が細胞内でどのように調節されているのかを、ダントロレン(Dan)およびその誘導体のCa^<2+>放出への影響およびRyR1蛋白質への結合性を解析し、その分子レベルでの解明を目的とした。研究代表者は骨格筋の生理的Ca^<2+>放出をダントロレンと同様に強く抑制するものの、CICRに関してはDanとは異なり抑制効果をほとんど発揮しない誘導体を多数発見した。(Ikemoto et al.,2001)。さらに、これらの生理的Ca^<2+>特異的に抑制する誘導体が、骨格筋において特異なCa^<2+>放出を引き起こすClofibric acid(Ikemoto & Endo,2001)の作用を強く抑制することをも見出している。一方、その構造中にヨウ素およびアジド基を含む誘導体を用いた光親和性標識実験においては、筋小胞体上のRyR1とは異なる低分子蛋白質とともに膜画分ではなく可溶性画分にも特異的結合を示す蛋白質の存在も見出している。この可溶性分子はある条件下でRyR1と結合している情報も得ている。これらの実験結果はRyRの機能的調節機構を解明するための重要な情報であると思われる。骨格筋型RyR(RyR1)は骨格筋細胞における細胞内貯蔵Ca^<2+>の生理的Ca^<2+>放出チャネルとして機能するが、一方ではCa^<2+>によるCa^<2+>放出(CICR)チャネルの性質をも有する。本研究は、この二つの開口様式が生きた細胞内でどのように調節されているのかを、ダントロレンおよびその誘導体のCa^<2+>放出への影響およびRyR1蛋白質への結合性を解析し、その分子レベルでの解明を目的とするものである。研究代表者は骨格筋の生理的Ca^<2+>放出をダントロレンと同様に強く抑制するものの、CICRに関してはダントロレンとは異なり抑制効果をほとんど発揮しない誘導体を見出した。また、やはりCICRを抑制しないものの生理的Ca^<2+>放出のみを強く抑制する誘導体を多数発見し、その中でダントロレンのCICR抑制作用と拮抗する誘導体をも見出した(投稿中)。さらに、これらのこれらの生理的Ca^<2+>放出を特異的に抑制する誘導体が、骨格筋において特異なCa^<2+>放出を引き起こすClofibric acid(投稿中)の作用を強く抑制することをも見出している。一方、その構造中にヨウ素およびアジド基を含む誘導体を用いた光親和性標識実験においては、筋小胞体上のRyR1とは異なる低分子蛋白質とともに膜画分ではなく可溶性画分にも特異的結合を示す蛋白質の存在を確認した。予備的実験では、ダントロレン誘導体によって標識される可溶性分子が、ある条件下でRyR1と結合している可能性が示唆されている。これらの実験結果をもとに、筋小胞体上に存在する分子および可溶性画分に存在する分子のRyR1との機能的連関についてさらに解析を進めていく計画である。

一方、その構造中にヨウ素およびアジド基を含む誘導体を用いた光親和性標識実験においては、筋小胞体上のRyR1とは異なる低分子蛋白質とともに膜画分ではなく可溶性画分にも特異的結合を示す蛋白質の存在も見出している。この可溶性分子はある条件下でRyR1と結合している情報も得ている。これらの実験結果はRyRの機能的調節機構を解明するための重要な情報であると思われる。
スピン標識-イオンキャリヤーをプローブとする脂質=分子膜輸送系の構築

(石津向井)安定常磁性中心であるヒーブチルニトロオキシドでスピン標識したクラウンエーテル型のイオンキャリヤーを合成し、Na,K-錯体の液膜輸送について研究した。特にP-位にO【CH_5】基を有するメタシクロファン型クラウンエーテルのスピンラベル体はKイオンを選択的に輸送し、NOラジカル中心のESR強度より二層系の分配定数を精密に評価することが出来た。(石津田嶋)脂質二重膜にドープレE環状ポリアミンによる銅(【II】)イオンの取り込みの動的挙動について研究した。ラウリル基で置換した四座配位の環状ポリアミンをリポソームの脂質層にドープした系に外部より銅(【II】)-トリス錯体,テトラグリシン錯体を加へ、外層の錯体と脂質層の環状配位子との間の銅(【II】)イオンの交換反応をESRの線型及び強度の時間変化により研究した。チトラグリシン銅(【II】)錯体の場合には【K_1】=2×【10^(-3)】【S^(-1)】の早い取り込みと5×【10^(-4)】,1×【10^(-4)】【S^(-1)】の比較的遅い速度定数の3つのプロセスでは銅(【II】)イオンの取り込みが行われることが明らかとなった。最初の速度定数の大きい方の取り込みはリポソーム界面にある配位子による銅(【II】)イオンの交換であり、後者は脂質層内部における銅(【II】)の交換によるものと結論された。グリシルグリシン,トリグリシンについても同様な傾向が見られたが取り込みの速度はテトラグリシンが最も大きいことが明らかとなった。現在テトラグリシン錯体の脂質内輸送のメカニズムについて検討中である。