hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
光化学(PUVA)療法による自己免疫性糖尿病モデルマウス治療の試み

8-Methoxypsoralen(8-MOP)と長波長紫外線(UVA)併用による光化学(PUVA)療法は、強い免疫抑制作用を持つことが知られているが、近年、PUVA療法はphotopheresisという方法により、進行性全身性強皮症や慢性関節リウマチ、尋常性天庖瘡などの自己免疫疾患にも有効との報告がある。また、モデルマウス(MRL/lpr)でのSLE発症抑制作用も報告されている。これらの疾患に対する奏功機序は、疾患特異的なT細胞をPUVAでphotomodifyすることで、それに対する強力なcytotoxicityを誘導しようとするものであり、一種のT cell vaccination療法である。KK-Ayマウスは、生後5-6週で自然発症するII型糖尿病モデルマウスで、高血糖と高インスリン血症を来し、組織内インスリン作用抵抗性が認められる。このマウスで、上記photopheresisの治療効果を検討した。方法は、同系マウスの脾細胞をPUVA処理した後、レシピエントに経静脈投与した。耐糖能は主にintraperitoneal glucosetolerance testで測定した。発症前の生後4週令よりPUVA療法を開始すると、有意に耐糖能が軽減したものの、発症後(尿糖陽転後)よりPUVA療法を行っても、耐糖能の軽減は認められず、発症予防に有効であった。その他、PUVA療法の有効性を得るための条件は、i.経門脈ではなく、経静脈的な免疫が必要。iii.同系マウス牌細胞の投与が必要。iv.同系マウスならば、発症前のマウスの牌細胞でも有効。v. 1回の免疫で有効。II型糖尿病モデルであるKK-Ayマウスは、生後5-6週より自然発症し、尿糖陽性、高血糖、高インスリン血症を示す。同系マウスの脾細胞に対して、8-methoxypsoralen(8-MOP)と長波長紫外線(UVA)併用による光化学(PUVA)処置を行った後、発症前マウスに移入して発症の予防効果を検討した。効果判定は、0.5g/kgのグルコース腹腔内投与負荷試験前後(0,30,60,120分後)の血糖値並びに血清インスリン値を測定して、無処置群と比較検討した。1)発症前の4週からレシピエントマウスにPUVA処置した細胞で免疫を開始し、週1回4回施行し、発症予防への効果を検討した。PUVA群では、空腹時血糖の有意な低下に加えて、グルコース負荷試験後の異常な血糖上昇が緩やかとなった。また、負荷後の血糖の過上昇が抑えられると同時に、空腹時の無処置マウスで見られる異常に高いインスリン分泌は減少し、PUVA療法は糖毒性を抑制し、糖尿病進展予防に有効であることが判明した。この効果はコントロール群(無処置脾細胞投与群、8-MOP処置脾細胞投与群、UVAのみを照射した脾細胞投与群)では認められず、PUVA処置群に特異的なものであった。2)しかしながら、発症後のレシピエントマウスでは、同様の効果は認められなかった。3)発症前に免疫を開始した場合、PUVA施行回数を1回に減じても、空腹時血糖の有意な低下、並びにグルコース負荷後の血糖の過上昇と空腹時インスリンの異常高値が抑えられた。4)ドナー脾細胞を発症前の4週令より調整し、PUVA療法を施行しても、同様の効果が得られた。奏功機序として、PUVA処置されたT cellによるvaccination効果の可能性が考えられる。今年度は免疫するT細胞分画をさらに細分化して行い、本実験系におけるPUVA療法の有効性の機序解明をめざしたい。

このマウスで、psoralen (8-MOP)と長波長紫外線(UVA)併用による光化学(PUVA)療法のうち、photopheresisという方法の治療効果を検討した。発症前の生後4週令よりPUVA療法を開始すると、有意に耐糖能が軽減した。私たちの実験系で検索した有効なPUVA療法の条件は、1.発症前の生後4週令よりPUVA療法を開始すると有効であったが、発症後(尿糖陽転後)よりPUVA療法を行っても耐糖能の軽減はなく、PUVA療法は、発症予防に有効である。11. PUVA処理をした脾細胞の投与は、経門脈ではなく、経静脈がよい。ji.異系マウス脾細胞の投与は有効ではなく、同系マウス脾細胞の投与が必要である。iv.同系マウスならば、発症前のマウスの脾細胞でも有効である。V.繰り返す処置は必要ではなく、1回の免疫で有効である。vi.抗T細胞モノクローナル抗体と補体で処理した後、Percoll gradientで死細胞を取り除き投与しても無効で、免疫にはT細胞が重要であると考えられる。vii.脾細胞をPUVA処理すると、ICAM-1等の細胞表面接着因子の増強が認められた。接着因子の増強やサイトカインの分泌誘導がPUVA有効性の機序につながる可能性がある。私たちの結果は、PUVA療法がII型糖尿病モデルマウスの発症予防に有効であったという最初の報告である。
漢方薬「排膿散及湯」のＭＲＳＡ重症感染症に対する有効性の解析

抗菌剤治療の困難なメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)重症感染症に対する漢方薬・排膿散及湯の治療効果を検討した。排膿散及湯を添加したLB液体培地でMRSAを培養すると、無添加LB液体培地と比較して、二次元電気泳動での解析では、菌体外毒素の量が減少していた。MRSA皮下感染マウスに排膿散及湯を投与した場合、無投与マウスと比較して、有意な生存率の上昇、皮膚潰瘍径の減少を認めた。排膿散及湯投与マウスから採取した腹腔内マクロファージの、MRSAに対する貪食能は、無投与マウスと比較して、有意に上昇していた。排膿散及湯はMRSA重症感染症の新規治療薬として強く示唆された。抗菌剤に対して多剤耐性を示し、様々な菌体外毒素を分泌し、皮膚感染症から毒素性ショック症候群まで様々な重症感染症を引き起こす黄色ブドウ球菌(MRSA)が現在院内感染上特に問題であり、新規治療薬の開発が望まれている。排膿散及湯は江戸時代の漢方医、吉益東洞の考案した処方であり、患部が発赤、腫脹して疼痛をともなった化膿症が適応である。この排膿散及湯の適応疾患が、MRSAによる化膿性感染症疾患に一致するため、排膿散及湯がMRSA感染症治療薬となることが予想され、我々は2011年度に排膿散及湯のMRSA重症感染症に対する効果について、排膿散及湯の菌体外毒素分泌の抑制効果、排膿散及湯投与マウスのMRSA感染の生存率や局所病変の改善を明らかにした。2012年度は、MRSAに対する排膿散及湯投与マウス由来の腹腔内マクロファージの貪食能について検討を行った。排膿散及湯のエキス粉末をMilliQ水で溶解して、排膿散及湯を作成した。排膿散及湯投与と非投与のマウスを麻酔してから、冷却リン酸バッファー(PBS)を腹腔内に注入して、3時間後に回収したPBS液を遠心分離後、腹腔内マクロファージを分離した。腹腔内マクロファージとMRSA株に無処置マウス血清を加えて、共培養した。そして培養後30分ごとに、120分まで混合したサンプルから一部分をとり、血液寒天培地にまいて、培養した。培養後1日後の菌のコロニー数を計測比較した。排膿散及湯投与マウスでは、30分後から有意に、無投与マウスと比較して、血液寒天培地上のコロニー数が減少したことから、マクロファージ貪食能の増強が認められた。排膿散及湯は抗菌剤とは別の観点からの、マクロファージ貪食能を増強するMRSA感染症の治療薬の一つとなりうることが示唆された。黄色ブドウ球菌は、様々な菌体外毒素を分泌し、様々な重症感染症を引き起こす病原細菌である。この中で特に問題となるのが多剤耐性を示す黄色ブドウ球菌(MRSA)であり、新規治療薬の開発が望まれている。排膿散及湯は江戸時代の漢方医吉益東洞の作成した吉益東洞経験方に記載のある処方である。この排膿散及湯の適応疾患が、MRSAを含む黄色ブドウ球菌による化膿性感染症疾患に一致するため、排膿散及湯がMRSA感染症治療薬となりうることが予想される。前年度までに我々は排膿散及湯のMRSA重症感染症に対する効果について、排膿散及湯の直接的な抗菌効果、排膿散及湯の菌体外毒素分泌の抑制効果、排膿散及湯投与マウスのMRSA感染に対する影響について検討を行ない、排膿散及湯を添加したLB液体培地では、無添加培地と比較して、菌体外毒素の量が減少していたことや、排膿散及湯投与マウスでは、無投与マウスと比較して、生存率の上昇、皮膚潰瘍径の減少することを確認した。今回排膿散及湯マウス由来の腹腔内マクロファージを抽出して、MRSAと共培養し、60分後の混合サンプルを寒天培地にまき、24時間培養後に、菌のコロニー数を計測することで、腹腔内マクロファージの貪食能の効果を検討した。コントロールマウス由来の腹腔内マクロファージと比べて、排膿散及湯マウス由来の腹腔内マクロファージでは、有意に共培養したMRSAのコロニー数が減少したことから、排膿散及湯マウス由来の腹腔内マクロファージの貪食能が上昇していることが示唆された。このことから排膿散及湯は、細菌の菌体外毒素を減少させるだけでなく、宿主の免疫担当細胞を活性化することで、複数経路からの重症細菌感染症に対する治療効果を上昇させていると推測された。

この中で特に問題となるのが多剤耐性を示す黄色ブドウ球菌(MRSA)であり、新規治療薬の開発が望まれている。排膿散及湯は江戸時代の漢方医吉益東洞の作成した吉益東洞経験方に記載のある処方であり、患部が発赤、腫脹して疼痛をともなった化膿症が適応である。この排膿散及湯の適応疾患が、MRSAを含む黄色ブドウ球菌による化膿性感染症疾患に一致するため、排膿散及湯がMRSA感染症治療薬となりうることが予想された。そこで今回我々は排膿散及湯のMRSA重症感染症に対する効果について、排膿散及湯の直接的な抗菌効果、排膿散及湯の菌体外毒素分泌の抑制効果、排膿散及湯投与マウスのMRSA感染に対する影響について検討を行った。排膿散及湯のMRSA株に対する抗菌効果を微量液体希釈法で測定した。排膿散及湯を添加した、LB液体培地でMRSA株を1日培養し、培養上清をろ過濃縮して、二次元電気泳動法で分離されたタンパク質のスポットの増減の変化を比較検討した。MRSAを感染させた3週齢ICRマウスを用いて、経口的に排膿散及湯を投与した場合としない場合とでMRSA感染に対する治療効果を生存率の差で比較した。投与期間はMRSA感染前日から、感染3日後までとした。また局所感染の評価は、感染マウスの潰瘍径の大きさで比較検討した。排膿散及湯1g/Lの濃度でもMRSA菌株の抗菌活性は認めなかった。二次元電気泳動では、排膿散及湯を添加したLB液体培地では、無添加培地と比較して、菌体外毒素の量が減少していた。排膿散及湯投与マウスでは、無投与マウスと比較して、生存率の上昇、皮膚潰瘍径の減少を認めた。排膿散及湯は抗菌剤とは別の観点からのMRSA感染症の治療法の一つとなりうることが示唆された。計画通りに概ね研究は進行している。平成23年度施行予定の、排膿散及湯の薬剤感受性、タンパクマッピング、動物による感染実験で当初の予想通りの結果がでている。今後も計画通りに、進行させる予定である。平成24年度は、動物実験の再確認、抗菌剤と排膿散及湯の比較実験、排膿散及湯投与動物由来のマクロファージの貪食能の実験を予定通り施行していく予定である。PVLタンパク質の排膿散及湯投与マウス由来の免疫担当細胞に対するアポトーシス効果の検討を行う。大腸菌でGST融合PVLタンパク質を作成する。PCRで増幅したPVL遺伝子産物をタンパク質ベクターのpET21に組み込む。その組み換えタンパク質発現ベクターを大腸菌BL21に組み込んで、PVLタンパク質を発現させる。発現させたタンパク質を精製して、排膿散及湯投与と非投与マウスからそれぞれ分離した免疫担当細胞に加えて、共培養する。その後TUNNEL法のキットで、免疫担当細胞のアポトーシスの評価を行い、排膿散及等とアポトーシスとの関係を比較検討する予定である。
ニワトリおよびウシにおける日周リズム形成における松果体・網膜・副腎の役割

ニワトリの松果体および血漿メラトニン濃度は、明暗シグナルを第一の同調因子として明期に低く暗期に高い顕著な日周リズムを示す。本実験ては孵化後直ちに手術を施し、松果体除去区、眼球除去区、松果体・眼球除去区および松果体除去に対する偽手術区、無手術区を設け、それぞれ1,7,16,29,65ならびに100日齢において血漿メラトニン濃度を測定したところ、松果体除去区では若干日周リズムか認められたが、その暗期の値は何れの日齢においても対照区(無手術区、偽手術区)より低く、約30%であった。眼球除去区でも同様な日周リズムが認められたが、その暗期の値は1日齢ては対照区の約30%と低かったものの、7,16日齢と上昇し、29,65および100日齢では対照区とほぼ同等であった。松果体・眼球除去区ては血漿メラトニン濃度の日周リズムは不明瞭であった。これらより網膜からもメラトニンが血漿中にリズミカルに放出されるが、それは日齢の経過とともに減少すると推察された。さらに、常暗下、孵卵・孵化したニワトリヒナを、ひき続き常暗下で騒音源としてWhite noiseを用い、常騒音あるいは12時間(6:00-18:00)騒音の条件下で飼育し、それぞれ、1,7,13ならびに24日齢において松果体および血漿メラトニン量を測定した、常騒音条件てはすべての日齢を通して松果実体、血漿メラトニン量は日周リズムを示さなかった。それに対し12時間騒音条件では、松果体メラトニン量は全測定期間を通して騒音時間帯にピ-クが認められ、日周リズムを示した。しかし、その変動が明暗シグナルによるメラトニン日周リズムをに比べ不明瞭で、血漿メラトニン量は明確な日周リズムを示さなかった。これらより常暗下においては、音によるシグナルも、明暗によるシグナルよりはその力は小さいがメラトニン日周リズムの形成に対して同調因子となりうることが推察された。1.1週齢の雄雛の眼(網膜)のメラトニン含量は、日内リズムがあり暗期は明期の3倍になるの対し、松果体のそれは暗期は明期の10倍になる。暗期では、松果体のメラトニン含量は、網膜の約2倍である。2.1週齢のニワトリ雄雛の眼に2%オスミウム酸を0.1ml注射すると盲目になる。この盲目になった雛を12時間明、12時間暗(12L:12D)の光周期下に飼育して、2週齢で調べた所、血漿メラトニン量は対照雛に比べて明期では若干高く暗期では25%低い。対照区では明暗の振巾は約5倍あるのに対し、盲目区では3倍と2/3に縮少した。一方松果体のメラトニン含量は暗期では盲目区の方が若干高く、明期では盲目区が明らかに高かった。ニワトリでは血漿メラトニン濃度は松果体によって生産されるメラトニンによって主に支配されており、網膜の貢献はやや低い。3.常暗で孵化した雛を直ちに12Lー12D、常暗(DD)、常明(LL)の3つの光周期にさらして、24日齢まで飼育した。

12L:12Dでは1日齢で血漿・松果体メラトニンリズムが出現し、7、13、24日でも認められた。LL條件下では24日齢までこの"明暗"リズムは出現しなかった。DD條件下では、血漿では13、24日齢で本来の暗期に高いリズムが認められ、松果体では24日齢に始めてこのリズムが認められた。このDD條件下での概日リズムの出現は、未だ昼夜の騒静リズムが存在するので雛がこれを利用してリズムを形成した可能性がある。今年度は常時騒音を与えて実験する予定である。4.64日齢のニワトリ中雛の各臓器のメラトニンの昼夜の濃度差を調べた所、松果体、下垂体、網膜、筋肉に差が認められた。これはこれらの他脳、心臓でも認められた1週齢と、松果体網膜のみの400日齢のデータの中間のデータである。5.ウシ(黒毛和種)の血漿コルチゾールの1日間の変動を調べた所、明期に高く暗期に低い、メラトニンとは逆のリズムが認められた。ニワトリの松果体および血漿メラトニン濃度は、明期シグナルを第一の同調因子として明暗に低く暗期に高い顕著な日周リズムを示す。本実験では孵化後直ちに手術を施し、松果体除去区、眼球除去区、松果体・眼球除去区および松果体除去に対する偽手術区、無手術区を設け、それぞれ、1、7、16、29、65ならびに100日齢において血漿メラトニン濃度を測定したところ、松果体除去区では若干の日周リズムが認められたが、その暗期の値はいずれの日齢においても対照区(無手術区、偽手術区)より低く、約30%であった。眼球除去区でも同様な日周リズムが認められたが、その暗期の値は1日齢では対照区の約30%と低かったものの、7、16日齢と上昇し、29、65および100日齢では対照区とほぼ同等であった。松果体・眼球除去区では血漿メラトニン濃度の日周リズムは不明瞭であった。これらより網膜からもメラトニンが血漿中にリズミカルに放出されるが、それは日齢の経過とともに減少すると推察された。さらに、常暗下、孵卵・孵化したニワトリヒナを、ひき続き常暗下で騒音源としてWhite noiseを用い、常騒音あるいは12時間(6:00-18:00)騒音の条件下で飼育し、それぞれ、1、7、13ならびに24日齢において松果体および血漿メラトニン量を測定した、常騒音条件ではすべての日齢を通して松果体、血漿メラトニン量は日周リズムを示さなかった。それに対し12時間騒音条件では、松果体メラトニン量は全測定期間を通して騒音時間帯にピ-クが認められ、日周リズムを示した。しかし、その変動が明暗シグナルによるメラトニン日周リズムに比べ不明瞭で、血漿メラトニン量は明確な日周リズムを示さなかった。これらより常暗下においては、音によるシグナルも、明暗によるシグナルよりはその力は小さいがメラトニン日周リズムの形成に対して同調因子となりうることが推察された。
非平衡系における大自由度複雑力学系の理論的および数値実験的研究

1.オンオフ間欠性の自己相似性統計:カオス特解の不安定化に伴うオンオフ間欠性ゆらぎは不安定直後では相関時間は極めて長く,相関時間より小さな領域では強い相関をもつ.強相関に起因した自己相似な統計構造が存在することを見出した.さらに,この自己相似性を解析するために,強相関領域で成立する大偏差統計理論を構築し,数値実験とよく一致する結果を得た.2.雑音下のネマティック液晶の対流発生に伴う間欠性の確率モデルによる研究:雑音下のネマティック液晶系で実験的に観測されているオンオフ間欠的なパターン変化に対する相乗確率雑音をもつ確率論的モデルを提案した.モデルに基づき数値実験を行ない,間欠性の統計特性を詳しく解析した,さらに,実験的に不可避な熱雑音を相加的に取り込み,熱雑音のパターン変動に対する効果を調べた.3.発達した乱流における普遍統計則:速度差ゆらぎと粗視化エネルギー散逸率ゆらぎの統計量を乱流シェルモデルの数値実験的を用いて調べ,これまで知られているShe-Levequeモデルの結果によく一致することを見出した.また,近年実験的に見出されている拡張された自己相似性(ESS)の現象論的に導出することに成功した.4.周期的磁場下のイジングスピン系の動的相転移:周期的磁場下のランダウ理論を用いて,MCで見出されている動的相転移は,周期運動の対称性の破れに伴う転移であることを明らかにし,外場の振動数と振幅空間における相図を近似的に再現することに成功した.また,転移点近傍での逓減動力学を導くことにより,熱ゆらぎに関する統計量を導き,数値実験の結果とよく一致することを見出した.1.オンオフ間欠性の自己相似性統計:カオス特解の不安定化に伴うオンオフ間欠性ゆらぎは不安定直後では相関時間は極めて長く,相関時間より小さな領域では強い相関をもつ.強相関に起因した自己相似な統計構造が存在することを見出した.さらに,この自己相似性を解析するために,強相関領域で成立する大偏差統計理論を構築し,数値実験とよく一致する結果を得た.2.雑音下のネマティック液晶の対流発生に伴う間欠性の確率モデルによる研究:雑音下のネマティック液晶系で実験的に観測されているオンオフ間欠的なパターン変化に対する相乗確率雑音をもつ確率論的モデルを提案した.モデルに基づき数値実験を行ない,間欠性の統計特性を詳しく解析した,さらに,実験的に不可避な熱雑音を相加的に取り込み,熱雑音のパターン変動に対する効果を調べた.3.発達した乱流における普遍統計則:速度差ゆらぎと粗視化エネルギー散逸率ゆらぎの統計量を乱流シェルモデルの数値実験的を用いて調べ,これまで知られているShe-Levequeモデルの結果によく一致することを見出した.また,近年実験的に見出されている拡張された自己相似性(ESS)の現象論的に導出することに成功した.4.周期的磁場下のイジングスピン系の動的相転移:周期的磁場下のランダウ理論を用いて,MCで見出されている動的相転移は,周期運動の対称性の破れに伴う転移であることを明らかにし,外場の振動数と振幅空間における相図を近似的に再現することに成功した.また,転移点近傍での逓減動力学を導くことにより,熱ゆらぎに関する統計量を導き,数値実験の結果とよく一致することを見出した.1.数年前にモンテカルロ法を用いて,強交流磁場下のイジングスピン系で磁場の振動数を変化させることにより異なる振動間の転移が発見された.これは,通常の熱平衡系の相転移とは異なり強交流磁場下のスピン系に特有なものである.本研究では,この転移は空間的に一様な振動状態が,振動数の変化に伴って分岐を起こすために生じるものであることを見出し,転移点近傍で臨界動力学を導いてモンテカルロ法で得られている統計特性を説明することに成功した.2.最近,印可電場によって引き起こされたネマティック液晶の電磁流体力学的対流不安定点近傍で印可電場に乱雑性を加えることにより,オンオフ間欠性的な時間変動が観測されることが実験的に報告されている.本研究では,この実験を説明する数理モデルを提案し,数理的に解くことによって間欠性の特性を調べている.現在までの研究では,時間的なスペクトル強度のべき則などの特性はオンオフ間欠性に近い結果が得られているが,定量的なずれがあり,まだ同定することはできていない.次年度の研究で明らかにしていきたい.3.乱流の統計理論は,Kolmogorovによる自己相似カスケード描像を出発として,対数正規理論やベータモデルを典型として乱流の間欠性を取り込む研究が続いてきている.これらの研究の対象は,高Reynolds数を対象にしたものであるが,現在でも実験的には十分な高Reynolds数状態は実現されていない.1993年にBenzi等は中間Reynolds数でも成立する新しい統計則を実験的に発見した.これは,拡張された自己相似性とよばれている.これまで物理的にこの法則を導くことはなされていなかったが,本研究ではフラクタル描像をベースにしてこの法則の成立根拠を明らかにすることに成功した.1.オンオフ

間欠性の自己相似性統計:カオス特解の不安定化に伴うオンオフ間欠性ゆらぎは不安定直後では相関時間は極めて長く,相関時間より小さな領域では強い相関をもつ.強相関に起因した自己相似な統計構造が存在することを見出した.さらに,この自己相似性を解析するために,強相関領域で成立する大偏差統計理論を構築し,数値実験とよく一致する結果を得た.2.雑音下のネマティック液晶の対流発生に伴う間欠性の確率モデルによる研究:雑音下のネマティック液晶系で実験的に観測されているオンオフ間欠的なパターン変化に対する相乗確率雑音をもつ確率論的モデルを提案した.モデルに基づき数値実験を行ない,間欠性の統計特性を詳しく解析した.さらに,実験的に不可避な熱雑音を相加的に取り込み,熱雑音のパターン変動に対する効果を調べた.3.発達した乱流における普遍統計則:速度差ゆらぎと粗視化エネルギー散逸率ゆらぎの統計量を乱流シェルモデルの数値実験的を用いて調べ,これまで知られているShe-Levequeモデルの結果によく一致することを見出した.また,近年実験的に見出されている拡張された自己相似性(ESS)の現象論的に導出することに成功した.4.周期的磁場下のイジングスピン系の動的相転移:周期的磁場下のランダウ理論を用いて,MCで見出されている動的相転移は,周期運動の対称性の破れに伴う転移であることを明らかにし,外場の振動数と振幅空間における相図を近似的に再現することに成功した.また,転移点近傍での逓減動力学を導くことにより,熱ゆらぎに関する統計量を導き,数値実験の結果とよく一致することを見出した.
球面型トリカルベン配位子の開発と高次π空間を有するメタロフラーレンの創発

トリフェニレンにヘテロールが縮環した化合物であるトリヘテラスマネン合成の別法としてトリフェニレンの湾部が6箇所リチオ化されたヘキサリチオ体経由の合成法を活用してトリヘテラスマネン類の合成を行った。2,3,6,7,10,11-ヘキサブトキシトリフェニレンを出発原料として、TMEDA存在下、過剰量のn-BuLiを作用させ、加熱かくはんを行ったところ、効率よくヘキサリチオ体が発生することを見いだしていたので、このヘキサリチオ体に、各種典型元素試薬を反応させトリヘテラスマネンの合成を検討することとした。ヘキサリチオ体にフェニルジクロロホスフィンを作用させ、引き続いて単体硫黄を作用させることで、トリホスファスマネントリオキシドの合成に成功しており、生成物の構造異性体の分離構造決定を行った。また、別の典型元素源として、ジアルキルジクロロスタンナンを作用させることで、ヘキサスタンナスマネンの合成にも成功した。有機スズ化合物は、その他の典型金属元素と効率よくトランスメタル化が進行することが知られているため、このトリスタンナスマネンを新たな出発原料として、新たなトリヘテラスマネンへと誘導することを検討した。そこで、母体のスマネンと同様な骨格的歪みを持ち、かつ物性材料としても有用性が期待されるトリボラスマネンの合成を目指し、ホウ素原子とのトランスメタル化を検討した。その結果、各種NMRスペクトルより、少なくとも湾部の1箇所がホウ素化されたと思われる化合物の生成が示唆された。トリヘテラスマネン合成を目標として、分子内ラジカル環化反応を基盤とした新規なホスホール骨格構築法の開発を検討した。種々の条件検討の結果、ビフェニル基を有する2級のホスフィンオキシドに空気存在下、トリエチルボランを作用させることによって収率よくジベンゾボスホールオキシドが得られることがわかった。本反応を活用することにより、これまで合成例がほとんどなかったラダー型ジベンゾホスホールオキシドおよびスルフィドの合成に成功し、ラダー型ジベンゾホスホールオキシドが有機蛍光材料として優れた蛍光特性を示すことを明らかにした。さらに、本反応を用いてトリホスファスマネンの合成を試みたところ、目的化合物は得られなかったものの、トリフェニレンの湾部に2つのホスホール環が縮環したトリフェニレノジホスホールオキシドの合成に成功した。一方、トリフェニレンにヘテロールが縮環した化合物であるトリヘテラスマネン合成の別法としてトリフェニレンの湾部が6箇所リチオ化されたヘキサリチオ体経由の合成法を考案した。2,3,6,7,10,11-ヘキサエトキシトリフェニレンを出発原料として、TMEDA存在下、過剰量のn-BuLiを作用させたところ、効率よくヘキサリチオ体が発生することを見いだした。このヘキサリチオ体に、ジメチルジクロロシランを作用させたところ、トリシラスマネンが生成することがわかり、このヘキサリチオ体がトリヘテラスマネンのよい前駆体となることがわかった。続いてヘキサリチオ体にフェニルジクロロホスフィンを作用させ、引き続いて単体硫黄を作用させることで、トリホスマスマネントリオキシドの合成に成功した。このうちOs対称性を有する異性体については単離・構造解析に成功した。
国家承認の国際法上の効果

本年度は、以下の三点につき研究の進展が見られた。第一は近年の慣習法論研究である。これまでの研究で示されたように、国家承認は元来より第一義的には国家性の獲得と無関係の概念とされており、未承認国の法的地位を論ずるためには慣習法論の検討が不可欠である。慣習国際法の妥当性根拠を巡っては近年再び多数の論考が蓄積されており、従来なされてきた慣習法の形式的要件の検討のみならず実質的側面への着目の必要性が示されている。この成果を踏まえることで、承認以前から存在する国家性に内在する権利と、未承認国には認められない権利との区分論を現代的に再構成し得る。第二は、未承認国との条約締結の可否である。未承認国との条約締結の可否に関して通説は、承認は意志の問題であり、特段の否認の意志を付すことで承認を行うことなく可能であるとする。しかし、承認論の現代的権威であるTalmonは、承認を国家性の前提には据えずその意味で「宣言的効果説」を採るにもかかわらず、未承認国との条約締結は不可能であり、存在するにしても「法的な意味で条約であるか疑わしい」とする。ここでは、そもそも国家承認とは何か、より具体的には一定の法律行為を未承認主体との間でなす前提条件として位置づけられるのか否か、という国家承認の性質理解につき未だ争いが存する。条約締結の可否という論点自体は各論的なものであるが、その背景に看取される基本的理解の相違は、国家承認の法的効果を論ずる際にも影響を有する。第三は、第二次大戦以前の国家承認論に対し多大な影響力を有するGeorg Jellinekの学説研究である。国家論に関する確固たる理論を基盤として憲法学・行政法学・国際法学を論じたJellinekにおいてもやはり、承認に関する議論は法の拘束力根拠の問題と表裏一体であった。ここを参照することで、現在承認論をその基礎から論ずるに当たっての課題を析出した。29年度が最終年度であるため、記入しない。平成27年度は本研究の第一年度として、本研究の出発点となる検討、すなわち同主題の最初期の論者であるWheatonから戦間期学説までの議論枠組みの検討を行った。従来の研究は、国家承認の法的効果を被承認国の国家性獲得の文脈に限定し、承認が国家性を創設する(創設的効果説)のか、両者は無関係(宣言的効果説)なのか、という枠組みで同主題を捉え、承認が二国間関係に与える効果について十分な議論が存在しないが、宣言的効果説の依拠するモンテビデオ条約は承認以前に認められる権利をその他の(慣習国際法上の)権利と区別しており、同時期以前の学説において承認の効果が国家性の問題を離れ論じられていたと示唆されるためである。実際本研究により、戦間期以前の学説において国家承認の法的効果は、個別の権利義務関係に与える効果、という枠組みで議論されており、国家性の問題は付随的論点であったことが明らかになった。ここで重要なのは、各論者はその法源論から承認の効果を導いていた点である。Wheaton,Bonfilsら初期の論者は、実定国際法としての慣習法上の権利と区別して自然国際法上認められる国家の基本権を認め、後者は承認とは無関係だが前者は承認に依存するとしていた。自然法を否定し国際法の妥当根拠を意思に限定したAnzilottiやOppenheimらは、承認以前には国家間に合意が存在しないため権利義務関係も成立せず、従って承認以前の相手国は国際法主体ではないとするが、承認以前の国家にも合意を取り結ぶ能力を認めており、また承認の不在を国家性の欠如に論理的に直結させていたわけでもない。以上の検討により、本主題を論ずるに当たっては、国家承認に一切の法的効果を認めないにせよ、未承認国に一定の慣習法法上の権利を認めないにせよ、慣習法が承認以前の国家に何故妥当する(しない)のか、という根拠を伴う必要があることが明らかとなった。本主題を扱う初期の学説の実態を明らかにすることで、本研究を行うにあたっての基礎的視座を得られた。また、研究会発表等を通じて以上の研究を独立論文としてまとめ上げる作業も進展した。28年度は、集合的承認(不承認)の検討を主に行った。同主題を研究することの意義は以下のようである。国家承認論は、それが国際法上の論点として議論の対象とされてから第二次大戦直後までの期間、伝統的には個別的国家承認に焦点を当てて展開された(もっとも、集合的承認論の嚆矢は国際連盟期にまで遡ることはできる)が、その後の議論の中心は集合的承認及び不承認へと移ってきた。この要因としては、個別的承認について、承認以前には相手国の国家性は認められないとする「創設的効果説」が学説上退けられたものの、事実として多数国の国家承認を受けていない主体(未承認国)は他国との権利義務関係が限定的であり、なお国家性と国家承認との関係を同定する必要性が認められたためであるといえる。27年度の研究は、国家承認の法的性質はそもそもどのような議論枠組みにおいて論じられるべきであるか、近時の学説と第二次大戦期の学説・実行との乖離を手掛かりに、戦間期までの学説検討を行うものであったが、以上に述べた現在に至るまでの国家承認論の展開を踏まえれば、その現代的意義を提示するためには集合的承認(不承認)論を検討する必要があろう。

そこで、28年度は27年度の研究成果を踏まえた上で、集合的承認(不承認)に関する比較的近時の学説対立(Stefan Talmon, Jonh Dugard)を研究対象とした。明らかとなったのは、集合的承認の法的効果に関する対立の根底には、個別的承認の法的性質をどのように理解するか、が存在すること及び、集合的不承認を巡る対立は国際法上の国家性概念に関する理解の相違があることである。研究成果物としては、上記検討結果を7において提示した京都大学に於ける国際法研究会で発表した。それを踏まえ、論文の形で29年度中に公表する予定である。現代の集合的承認・不承認論を検討することで、19世紀以来の承認論を相対的に捉える視座が得られた。また、研究会発表等を通じて以上の研究を独立論文としてまとめ上げる作業も進展した。本年度は、以下の三点につき研究の進展が見られた。第一は近年の慣習法論研究である。これまでの研究で示されたように、国家承認は元来より第一義的には国家性の獲得と無関係の概念とされており、未承認国の法的地位を論ずるためには慣習法論の検討が不可欠である。慣習国際法の妥当性根拠を巡っては近年再び多数の論考が蓄積されており、従来なされてきた慣習法の形式的要件の検討のみならず実質的側面への着目の必要性が示されている。この成果を踏まえることで、承認以前から存在する国家性に内在する権利と、未承認国には認められない権利との区分論を現代的に再構成し得る。第二は、未承認国との条約締結の可否である。未承認国との条約締結の可否に関して通説は、承認は意志の問題であり、特段の否認の意志を付すことで承認を行うことなく可能であるとする。しかし、承認論の現代的権威であるTalmonは、承認を国家性の前提には据えずその意味で「宣言的効果説」を採るにもかかわらず、未承認国との条約締結は不可能であり、存在するにしても「法的な意味で条約であるか疑わしい」とする。ここでは、そもそも国家承認とは何か、より具体的には一定の法律行為を未承認主体との間でなす前提条件として位置づけられるのか否か、という国家承認の性質理解につき未だ争いが存する。条約締結の可否という論点自体は各論的なものであるが、その背景に看取される基本的理解の相違は、国家承認の法的効果を論ずる際にも影響を有する。第三は、第二次大戦以前の国家承認論に対し多大な影響力を有するGeorg Jellinekの学説研究である。国家論に関する確固たる理論を基盤として憲法学・行政法学・国際法学を論じたJellinekにおいてもやはり、承認に関する議論は法の拘束力根拠の問題と表裏一体であった。ここを参照することで、現在承認論をその基礎から論ずるに当たっての課題を析出した。平成27年度の研究成果から得られた視座に立ち、戦間期以後の学説の再検討、及び戦後新たな論点として成立した集合的(不)承認の問題の検討を行いたい。また、Verdrossや小森らの提示する慣習国際法の区分論についても、27年度の研究との関係で取り扱う必要がある。27年度及び28年度の研究結果を前提とし、戦間期以来の国家実行の検討及び、それらを構成要素とした博士論文の完成へ向けた作業を行う。29年度が最終年度であるため、記入しない。
常磁性化学種の観測による半導体粉末光触媒の反応機構の研究

半導体粉末の表面を用いる光触媒反応は、環境浄化の観点から最近注目されているが表面における反応の機構については必ずしも明確ではない。そこで、反応の途中に生じる常磁性中間体を観測することから、その光触媒反応の環境場について研究した。光照射した半導体に生じる常磁性化学種の低温での電子スピン共鳴(ESR)観測では、ZnS超微粒子を作成し光照射した場合には、普通の大きさのZnS粉末で生じる常磁性化学種のうち、電子供与体存在下で消失する物のみが観測され、それを表面に捕捉された正孔と同定した。ZnS光触媒における超微粒子化による活性増加が知られているが、その原因として、超微粒子化により表面捕捉正孔のみを生じ、再結合中心となる内部捕捉正孔の減少によることが分かった。常磁性不安定反応中間体のin situ ESR観測においては、酢酸の流通系光触媒反応で生成する二種類のラジカル(メチルラジカルとカルボキシメチルラジカル)の生成量の流速依存性から、固体表面における直接酸化かあるいは溶媒である水の酸化でできるOHラジカルを経由する酸化が区別できた。反応物の表面拡散が間に合えば、捕捉正孔による直接の酸化が大きな役割を果たす事が分かった。室温光触媒反応系で、重要な常磁性化学種である・OHラジカルやO_2^-は直接ESRで観測できないので、化学発光試薬を用いて高感度に検出する新しい試みを行った。TiO定常光照射直後にルミノールの発光が観測された。発光強度は、2段階で減衰し、遅い成分は、長時間照射あるいはH_2O_2添加で増加することから、H_2O_2が直接関与していることが分かった。
トランスリンの神経細胞におけるBC1RNA輪送と樹状突起内タンパク合成への関与

BC1RNAは神経細胞で発現し樹状突起へ輸送される。本研究はBC1RNAの樹状突起輸送cis配列に結合するトランスリンについて解析する事を目的としていた。しかし解析の結果、トランスリンのBC1RNAcis配列に対する結合特異性は低く、また微小管に結合する事も観察されなかった。更に、他の研究グループがトランスリンとしているタンパクについても、実際にはそれが違うものではないかと疑われた。我々は以上の点について最近の発表論文の中で指摘した。そのような経緯から本研究では、トランスリンに関する解析を断念し、研究の過程で見い出された別のBC1RNAのcis配列結合タンパクについて解析した。そのタンパクについて得られた結果を以下にまとめた。1BC1cis配列に特異的に結合した。2微小管に結合し、BC1RNAを微小管に結合させた。3BC1cisを使って精製しアミノ酸配列を決定した結果、それは転写因子のpur alphaであった。4特異抗体を用いてpur alphaがBC1RNAや微小管に結合する事を確認した。5免疫染色によってこのタンパクが樹状突起に見い出された。6細胞質ではポリソームに結合していた。また、その結合には、主に60Sサブユニットが関与していた。7免疫染色によってこのタンパクは中枢、末梢の神経細胞に非常に多いこと、非神経細胞では分泌上皮細胞に多い事が分った(投稿準備中)。8このタンパクはBC1cisおよび、BC1遺伝子の5'隣接配列にあるpur結合性配列の双方に結合して、in vitroにおける転写を促進した。9nascentBC1RNAはpurタンパクと複合体を形成した。この事は樹状突起輸送BC1cisが転写や核外への輸送反応に関与し得る事を示唆している。BC1RNAは神経細胞で選択的に発現し樹状突起へ輸送される。我々は、このRNAにトランスリンが結合する事を報告した。またそのタンパクが細胞骨格結合性であるとする他のグループの知見から、トランスリンがBC1RNAの樹状突起輸送に関与すると考えた。しかしながら、その後の我々の解析ではトランスリンの細胞骨格結合性を確認する事はできず、もう一つ別のBC1RNA結合タンパク(最近それがpurαとβである事がわかった)が細菌骨格に結合する事を見出した。それらpurαとβおよびトランスリンについて、今年度得られた結果は次の通りである。1トランスリン、purαとβは、ともにBC1にある樹状突起輸送シス配列に結合するが、後者の特異的結合性に対しトランスリンの結合特異性は低かった。2シス配列に対する結合は、両者の間で互いに競合した。現在トランスリンがpurαとβのBC1結合に対して及ぼす作用について解析している。3トランスリン、purαとβはともに神経細胞に最も多い。脳の成長過程における両者の量的変化について調べたところ、トランスリンの量には胎生期から成熟期まで変化が見られないのに対し、後者はBC1の増加と同様の時間経過で出生後10日目頃から増加した。トランスリンがBC1と結合しているのに対し、purαとβは細胞骨格に結合している。両者が樹状突起輸送で相互作用する可能性を示唆する結果と考えている。両者の相互作用についてイーストを用いて調べる準備を進めている。上に述べた理由で、purαとβの解析に時間を費やした事、トランスリンペプチドに対する抗体の特異性が低かった為、抗体を作り直した事などにより、現在のところトランスリン自体に対する知見は十分とは言えない。しかしながら、最近になって特異抗体を得る事ができた事、purαとβに関するデータが十分に得られて来た事などから、これら二つのタンパクがBC1の輸送にどのように関与するが、初代培養神経細胞を使い、取り組む予定でいる。

なお、purαとβの知見は、現在投稿中である事や本研究課題と直接関係するものではない事などから、本報告では最小限に止めてある。BC1RNAは神経細胞で発現し樹状突起へ輸送される。本研究はBC1RNAの樹状突起輸送cis配列に結合するトランスリンについて解析する事を目的としていた。しかし解析の結果、トランスリンのBC1RNAcis配列に対する結合特異性は低く、また微小管に結合する事も観察されなかった。更に、他の研究グループがトランスリンとしているタンパクについても、実際にはそれが違うものではないかと疑われた。我々は以上の点について最近の発表論文の中で指摘した。そのような経緯から本研究では、トランスリンに関する解析を断念し、研究の過程で見い出された別のBC1RNAのcis配列結合タンパクについて解析した。そのタンパクについて得られた結果を以下にまとめた。1 BC1cis配列に特異的に結合した。2微小管に結合し、BC1RNAを微小管に結合させた。3 BC1cisを使って精製しアミノ酸配列を決定した結果、それは転写因子のpur alphaであった。4特異抗体を用いてpur alphaがBC1RNAや微小管に結合する事を確認した。5免疫染色によってこのタンパクが樹状突起に見い出された。6細胞質ではポリソームに結合していた。また、その結合には、主に60Sサブユニットが関与していた。7免疫染色によってこのタンパクは中枢、末梢の神経細胞に非常に多いこと、非神経細胞では分泌上皮細胞に多い事が分った(投稿準備中)。8このタンパクはBC1cisおよび、BC1遺伝子の5'隣接配列にあるpur結合性配列の双方に結合して、in vitroにおける転写を促進した。9 nascentBC1RNAはpurタンパクと複合体を形成した。この事は樹状突起輸送BC1cisが転写や核外への輸送反応に関与し得る事を示唆している。
木質材料の高機能化を可能とする超音波振動付加薬剤含浸・圧密技術の開発

木材・木質材料の高機能化を可能とする超音波付加含浸・圧密技術の開発を目指し、液体注入に際して超音波振動の効果と熱分析に手法による木材の微細構造変化についての基礎的な検討を行った。その結果、水を注入する場合は、超音波振動の効果がある樹種と悪影響を及ぼす樹種があることがわかった。また、効果がある場合においては、その注入量の増加は最大で10%程度であった。細胞壁内への拡散を判断するためには、液体の凝固点降下が有効な手段の一つである可能性が見出せた。また、微細構造変化を検討するにあたり、温度変調型熱量測定により得られる動的熱容量の温度変化を把握することは、粘弾性挙動などと同様に有効な手段であることがわかった。これらの基礎的検討を踏まえると、良好な製品を創出するための薬液注入や圧密などの処理条件の導出が今後期待される。本研究では、持続的利用が可能であり、大気中の二酸化炭素の固定が可能である木質バイオマスの材料としての利用拡大のために、木材・木質材料の高機能化を可能とする超音波付加含浸・圧密技術の開発を目指す。そして、既存の含浸技術と比較して薬剤含浸量の向上が可能である超音波振動数や振動振幅、雰囲気温度などを変化させた実験的検討を行う。また、超音波振動を付加した圧密化技術に関して、超音波の作用下における木材の変形挙動の変化ならびに木材の乾燥や熱処理によって導入された木材構成分子の不規則な絡み合い(不安定状態)の解消への効果について検討する。さらに、含浸と圧密化の両方のプロセスを複合した、例えば積層強化木などの製造における超音波付加加工の有用性についても検討する。この技術開発によって、既存技術によって得られる様々な木質材料の高機能と高品質化が実現でき、工業材料としての木材・木質材料の可能性を拡大できると考えられる。本研究では,木質バイオマスの材料としての利用拡大のために,木質材料の高機能化を可能とする超音波付加含浸・圧密技術の開発を目指す。そして,既存含浸技術と比して薬剤含浸量が向上する超音波振動条件や雰囲気温度などを変化させた実験的検討を行う。また,木材の乾燥や熱処理によって導入された木材構成分子の不規則な絡み合いの解消に対する超音波振動の効果についても検討する。本年度は,上記の目的の下,木材の微細構造変化によって生じる熱的変化を捉えるために,導入したDSC装置を用いて乾燥時の昇・降温およびそれらの速度をパラメーターとしたDSC測定を行った。その結果,乾燥時においては,徐冷工程を考慮することによって,木材の微細構造が安定化し,次の昇温時におけるエンタルピーレベルが低下することがわかった。さらに,その安定化の度合は,徐冷時の速度を緩やかに設定することによって,大きく生じた。このことは,いわゆる鉄鋼材料などの焼入れ効果のように,木材においても微細構造が温度(速度)変化によって大きく影響を受けることを示唆している。このように,微細構造を安定化させる熱処理を施すことによって,使用時に不安定な物性の変化を防ぐことにつながる。当初計画していた,超音波振動付加による木材への薬液含浸量向上に関する検討課題については,装置の導入が遅れたため,装置を用いての実験には至っていない。しかし,予備的検討として,桐材(難浸透材)を対象として,着色水(パテントブルー)を注入させる含浸実験を行った。その結果,薬液の注入量は,含浸条件における減圧・加圧条件の影響を受け,それらの値が大きくなるほど注入領域は増加した。しかし,同時に加圧時の圧力によっては,材自体に変形が認められたため,加圧のみで内部にまで良好に注入することが困難であることが示された。次年度は,同様の実験を行い,超音波振動の効果について明らかにする。本研究では、木質バイオマスの材料としての利用拡大のために、木質材料の高機能化を可能とする超音波付加含浸・圧密技術の開発を目指す。そして、既存含浸技術と比して薬剤含浸量が向上する超音波振動条件や雰囲気温度などを変化させた実験的検討を行う。また、木材の乾燥や熱処理によって導入された木材構成分子の不規則な絡み合いの解消に対する超音波振動の効果についても検討する。本年度は、水分脱着によって生じる木材の微細構造変化を熱分析(DSC)によって捉えた。水の離脱によって木材微細構造に生じたひずみが一度の昇温によって解消することが明らかになった。その際、120°C付近から木材は微弱な発熱現象を生じた。

さらに、木材微細構造が活発に変化する飽水状態において200°CまでのDSC測定からも、乾燥状態と同じく100°C付近から発熱現象を伴う微細構造の安定化が検知された。また、この発熱現象が生じる温度域は、前の工程における冷却速度が緩慢な場合には、より低温側に生じることがわかった。この原因について現在検討中である。一方で、超音波振動を含浸時の液体(水)に作用させた場合には、その注入量にはあまり差は見られず、低粘度の液体の場合には超音波振動の効果はさほど多きく作用しないもとを思われた。しかしながら、超音波振動による液体(水)の温度上昇、液体の粘度、サンプルサイズおよび異方性など考慮すべき課題が多く生じたため、来年度はそれらを整理した注入実験を行う。本研究では、持続的利用が可能であり、大気中の二酸化炭素の固定が可能である木質バイオマスの材料としての利用拡大のために、木材・木質材料の高機能化を可能とする超音波付加含浸・圧密技術の開発を目指す。そして、既存の含浸技術と比較して薬剤含浸量の向上が可能である超音波振動数や振動振幅、雰囲気温度などを変化させた実験的検討を行う。また、超音波振動を付加した圧密化技術に関して、超音波の作用下における木材の変形挙動の変化ならびに木材の乾燥や熱処理によって導入された木材構成分子の不規則な絡み合い(不安定状態)の解消への効果について検討する。この技術開発のために、今年度は以下の研究課題(1)(2)を実施した。課題(1):超音波振動付加よる木材中の薬剤含浸量増加の効果とそのメカニズムの検討超音波発振装置を用いて最大出力下で一定時間において振動周波数を変化させた水含浸実験を木材試料に対して行った。超音波の作用による抽水性向上の効果については、本年度内では明らかにすることはできなかったが、既存の手法(浸漬のみ、減圧処理、減圧・加圧処理)と比較し、最終年度にその有用性について報告できる基礎データを収集した。課題(2):超音波振動付加による木材の微細構造変化とそのメカニズムの検討木材の微細構造変化は温度変調型示差走査熱量分析計により評価し、これまでに、その測定方法および温度領域の検討を行ってきた。特に、慣用のDSCで得られる熱流変化に加えて、温度変調によって得られるRHFおよびNHFに着目し、-80°C170°C領域において繰返し昇・降温を行い、温度変化速度が異なる乾燥木材の昇温時の熱的性質の変化について検討した。その結果、これまでに報告されていない微細構造変化に起因すると思われる特異領域を検知した。この特異領域に着目して、来年度は超音波作用による変化について検討を加える予定である。課題(1):超音波振動付加よる木材中への含浸量増加の効果の検討
酵母細胞における低分子量G蛋白質の時間、空間的制御機構の解明

分子スイッチであるG蛋白質が細胞機能発現に特異性と多様性をもたらす機構を解明するには、スイッチのオン、オフが細胞内の「いつ、どこで」起きるかを明らかにすることが必要である。本研究では、生細胞内蛋白質の活性変化に伴う構造変化や蛋白質間相互作用の解析に有効な研究手法であるFRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)の原理を利用して、酵母の蛋白質輸送経路で働く低分子量G蛋白質の時間・空間的相互作用を可視化することを目的としている。本年度は、2分子FRETの系を用いてYptファミリーの一員であるYpt31pとその標的分子であるSec2pとの相互作用を詳細に解析し、さらに酵母変異体を用いてこれらの相互作用がどのように他のYpt(Sec4p)活性化を空間的に制御しているかを調べた。本研究では、生細胞内蛋白質の活性変化に伴う構造変化や蛋白質間相互作用の解析に有効な研究手法である蛍光共鳴エネルギー移動(FRET-Fluorescence Resonance Energy Transfer)の原理を利用して、蛋白質輸送経路で働く低分子量G蛋白質であるArfファミリー、YptファミリーG蛋白質の時間・空間(3次元)的相互作用を可視化するすることを目的としている。系として出芽酵母を用いることで、精度の高い遺伝解析とFRETプローブを用いたG蛋白質活性の時空間情報解析と組み合わせて、各種制御因子や他のG蛋白質との相互作用などによるArfファミリー、YptファミリーG蛋白質の時間・空間制御機構を解明したい。本年度は、2分子FRETの系を用いてArfファミリーのSar1pとその活性化因子であるSec12pとの相互作用と、Yptファミリーの一員であるYpt31pとその標的分子であるSec2pとの相互作用の可視化をおこなった。Sec12pとSar1pにCFPとYFPを結合した融合蛋白質を出芽酵母へ同時に発現させた。Sec12pとSar1pはともに小胞体膜上に局在し、FRETにより小胞体上での結合が可視化できた。出芽酵母が極性増殖する際の母細胞及び娘細胞の小胞体上のFRET効率を比較したところ、同程度の効率であった。Ypt31pとSec2pにCFPとYFPを結合した融合蛋白質を出芽酵母へ同時に発現させ相互作用を可視化した結果、出芽部と分裂隔壁周辺で相互作用の効率が高いことが明らかとなった。