hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
ヒストン修飾新規リーダータンパク質による転写機構解析

本研究では、血管内皮細胞における遺伝子転写制御機構に焦点をあて、特に血管内皮増殖因子(VEGF)刺激下での早期誘導遺伝子に着目して研究を行った。固形腫瘍内では細胞増殖の早さゆえ、血管からの酸素や栄養の不足が起こり、腫瘍細胞自身がVEGFを分泌することで新生血管を呼び寄せる。研究期間内に、VGEF刺激下での特徴的なヒストン修飾パターンを見出し、特にH3K4me3修飾に関与するタンパク質を阻害することで腫瘍が小さくなることをマウスモデルでも確認できた。本研究によって、ヒストン修飾阻害剤という新たな視点からの抗がん剤開発の基礎となる知見を提唱できた。本研究は、申請者が見出した新たなヒストン修飾変化に対する生物学的意義を解明し、その修飾が形成される分子機構、更に新規ヒストンリーダータンパクの同定を行う。申請者はこれまでに、血管内皮細胞を用いて次世代シークエンサーを用いた網羅解析から、血管内皮細胞活性化に寄与する転写因子、エピゲノム修飾を報告してきた(Kanki Y etal 2011MCB, EMBO Jなど)。そこで、本申請では、内皮細胞にとって最も重要な活性化シグナルであるVEGF (Vascular Endothelial Cell Growth Factor)に着目し、その下流の分子カスケード解析から、より副作用の少ない新たなエピゲノム創薬の標的を探索することを目的としている。次に、これら特徴的なヒストン修飾を媒介する酵素の探索を行った。その結果、H3K4のメチル化を修飾するMLL3に結合する新規タンパクを質を同定した。このタンパク質の機能を阻害すると、血管新生は顕著に阻害された。更に、マウスを用いて腫瘍移植実験を行い、このタンパク質の発現を阻害するとコントロール群と比較して腫瘍の増大は抑制された。本研究により、平成26年度は特にH3K4修飾に着目することで、血管新生に関与する新しいエピジェネティクス修飾因子を同定することが出来た。本研究は、申請者がこれまでに見出した新たなヒストン修飾変化に対する生物学的意義を解明し、その就職が形成される分子機構、更に新規ヒストンリーダー蛋白の同定を行う。申請者はこれまでに、ヒト血管内皮細胞を用いて次世代シーケンサーを用いた網羅的な解析から、血管内皮細胞活性化に寄与する転写因子、エピゲノム修飾を報告してきた(Kanki Y etal 2011EMBO J, MCBなど)。そこで、本研究では内皮細胞にとって最も重要なシグナルであるVEGF(Vascular Endothelial Cell Growth Factor)に着目し、その下流で駆動される分子カスケード解析から、より副作用の少ない新たなエピゲノム創薬の標的を探索することを目的としている。平成26年度の研究において、HUVECs(ヒト臍帯静脈内皮細胞)にVEGF刺激を行い、0分、15分、60分後のRNA-seq、ChIP-seq、FAIRE-seqの解析から、VEGF添加後早期に誘導される転写因子群に特徴的なヒストン修飾パターンがあることが分かった。そこで、平成27年度はそれぞれのヒストン修飾酵素をノックダウンした細胞でChIP-seqを行い、各種ヒストン修飾の変化を解析した。更に、平成27年度はH3K4me3、H3K27me3修飾のみならず新規ヒストン修飾解析も行い、新たな血管新生阻害エピジェネティクス因子を見出した。当初の予定では、平成27年度は、早期誘導遺伝子特異的なヒストン修飾に対して、H3K4me3修飾を入れる酵素であるMLL3の抗体を作成し、その複合体を解析することであった。MLL3は500kDaを超える巨大分子であるため抗体の作成には難航している。しかし、異なるアプローチによって、既にMLLを含む複合体構成タンパク質をいくつか同定した。更に、同定したH3K4me3修飾因子のノックダウンだけではなく、H3K27me3修飾を担うポリコーム複合体をノックダウンしても、血管新生が阻害されることを新たに確認しており、研究計画自体は概ね順調に進展している。本研究は、申請者がこれまでに見出した新たなヒストン修飾変化に対する生物学的意義を解明し、その修飾が形成される分子機構、更にモデルとして用いている血管内皮細胞の機能的意義を明らかにするものである。申請者はこれまでに、ヒト血管内皮細胞を用いて網羅的な遺伝子発現解析マイクロアレイや、網羅的なエピゲノム修飾解析ChIP-seqなどから、血管内皮細胞活性化に寄与する重要な転写因子、ヒストン修飾を報告してきた。そこで、本研究では内皮細胞にとって最も重要なシグナルであるVEGF (Vascular Endothelial Cell Growth Factor)に着目し、VEGF添加後非常に早いタイミングで誘導される転写因子のヒストン修飾解析を行った。平成26年度ー27年度の研究において、VEGF刺激後0分、15分、60分のRNA-seq, ChIP-seqなどの解析を行い、血管新生に重要な転写因子に特徴的なヒストン修飾が存在することを明らかにしていた。そこで、平成28年度は、それらヒストン修飾変化を可能にする複合体を同定するために、各種ヒストン修飾酵素複合体のノックダウン実験を行い、影響を受ける遺伝子発現解析を行った。その結果、H3K4me3、H3K27me3、H2AK119Ubなどに特徴的な変化が見られ、それらの修飾酵素を阻害することで血管新生も阻害できることが分かった。この3年間で明らかにした血管新生に重要な転写因子の新たな遺伝子発現制御機構は、特に固形腫瘍内血管新生に応用することの出来る知見であり、実際にマウスモデルで、見出した修飾酵素を阻害することで腫瘍が小さくなる知見が得られつつある。

本研究の成果は基礎医学的な側面のみならず、将来の抗がん剤創薬候補として非常に有益なものである。本研究では、血管内皮細胞における遺伝子転写制御機構に焦点をあて、特に血管内皮増殖因子(VEGF)刺激下での早期誘導遺伝子に着目して研究を行った。固形腫瘍内では細胞増殖の早さゆえ、血管からの酸素や栄養の不足が起こり、腫瘍細胞自身がVEGFを分泌することで新生血管を呼び寄せる。研究期間内に、VGEF刺激下での特徴的なヒストン修飾パターンを見出し、特にH3K4me3修飾に関与するタンパク質を阻害することで腫瘍が小さくなることをマウスモデルでも確認できた。本研究によって、ヒストン修飾阻害剤という新たな視点からの抗がん剤開発の基礎となる知見を提唱できた。当初の予定では、平成26年度は、早期誘導遺伝子特異的なヒストン修飾に対して、H3K4me3、H3K27me3それぞれの意義を検討するものであった。H3k4me3に関しては、これまでの予備実験からMLL3の関与が示唆されていたが、本研究ではそのMLL3に加えて更にMLL3と相互作用するタンパク質を同定している。このタンパク質をノックダウンするとH3K4me3の修飾レベルの低下、遺伝子の発現低下の両者が認められることから、血管内皮のVEGF刺激下の早期誘導遺伝子に関するH3k4me3の役割解析は予想以上に進行した。もう一つの修飾であるH3K27me3に関しては、これまでの文献からポリコーム複合体が関与していることが示唆されていた。本研究ではポリコーム複合体の1(PRC1)と複合体2(PRC2)どちらもその機能を阻害すると、血管新生阻害が引き起こされることを確認しており、こちらも当初の予想より進行している。平成27年度までの結果により、血管内皮細胞が活性化されて遺伝子が転写されるために必要なエピジェネティクス因子を複数同定した。血管内皮細胞の活性化は、癌の生育や糖尿病性網膜症など、新生血管が病態に関与する疾患において、その活性化を阻害することが治療法として期待されている。そこで平成28年度には、マウスに腫瘍を植え込み、これまでに見出した因子をノックダウンし、固形腫瘍内血管新生をin vivoで評価する。また、ここまでの成果をまとめ論文投稿を予定している。更に、本課題は国際共同研究課題の基課題でもあるため、平成28年度後半よりクロマチン複合体の立体構造解析も行う予定である。28年度が最終年度であるため、記入しない。血管生物学平成26年度の研究成果により、血管内皮細胞が活性化される際にはヒストン修飾酵素が重要であることが明らかとなった。ヒストン修飾酵素は血管内皮細胞のみならず、発生や分化、生活習慣病や癌などの病態にも深く関与している。将来の創薬を考える際に、正常細胞の機能は阻害せずに病的な血管新生のみを阻害するメカニズムを解明しなければならない。そこで、ヒストン修飾酵素が血管内皮細胞内でVEGF刺激下でのみ形成する複合体に着目している。これまでの研究で、VEGF刺激した際に早期誘導される転写因子は20個程度であることが分かっている。
地方都市における職業選択と就業移動の研究

本研究は、地方都市における学卒就職者の就業行動、とくに地域移動と職業移動の関連を追求するために、地理的に大都市圏から離れ歴史的に自律的な地域を選んでいくつかの調査を実施した。高度経済成長期に定着し、学校教育システムと労働市場との間で構造化された職業紹介・移動のパターンと、大都市圏に吸引されていた若年労働力の流出が、地域社会にもたらす諸影響、および当事者のこの問題への意識を明らかにすることが調査の目的であった。本研究では、研究期間中に岐阜県高山市および秋田県大館市を対象に3つの調査を行なった。地域住民を対象とする標本調査と、高校在学生徒を対象とする質問紙調査である。この結果、高山の場合は中京大都市圏への高卒段階での就業移動が構造化されていること、近年はUターンを含む地元への定着が増加する傾向が見られる。同時に大都市圏での生活経験がある場合と、そうでない場合、あるいは地元出身者である場合と、そうでない場合などの違いが、地域に対する態度や評価に影響を与える。また高校生の大都市志向は依然強いが、一方で飛騨地域への愛着も高く、将来展望と進学志向が関連してくる。大館市との比較は今後の課題となるが、パーソナルネットワーク分析や、時系列の移動分析などによって新たな知見が期待される。本年度は、この研究の初年度で、交付決定が10月であったため、当初準備していた現地での面接調査が本格的にはできず、予算の制約上計画を修正して可能な範囲の、フィールドワークとして岐阜県高山市の成人市民を対象とする800名規模の標本調査を配票留置方式で実施することとした。これは、本研究課題の全体的計画の上で、基礎的データを数量的に提供するものと位置づけられる。高山市民の過去から現在までの移動の事実、転出転入の時期、契機、動機などを中心に、実態と意識を質問している。既存の統計、現地での聴取などから、中京地区への学卒後の就職移動が半数ほどを占めるとみられるが、その後の移動状況は捕捉しているデータが乏しく、今回の調査データはその点を明らかにすることが期待される。しかし、調査の実施時期が2月下旬であったため、現在現地で不在等で郵送回収に切り換えた調査票が返送されている段階で、最終的に回収が完了していない。この種の方法による調査としては、対象者の好意的な協力が得られ、60%以上の回収率は確実の模様である。調査員による点検を行なっているが、内容の精度も比較的良いようである。集計分析はこれから次年度にかけて明治学院大学を中心に行なう予定であり、次年度末までには第1次の分析結果を発表したい。なお、明治学院大学の社会学部附属研究所自主研究プロジェクトとして進めてきた高山市の高校卒業生の進路に関する統計的分析について、同研究所「研究所年報」第26号(平成8年4月刊予定)に成果の一部を発表し本研究とリンクして、次年度以降の各研究分担者ごとの調査研究に資するものと思われる。本年度は、研究課題の職業選択と就業移動の実態を特定地域について明らかにするため、昨年度の最後2月中旬に、岐阜県高山市で実施した住民調査(対象サンプル800)のデータ集計と分析を進め、基本的な集計結果を第1次報告にまとめた。これは別記「研究所年報」27号としてまもなく発表予定である。これは年齢・性別を広くとった標本調査であり、飛騨地方からの就業移動の実態と意識を時系列的に捉えている。詳細な分析はこれからであるが、高山市民の域外居住とくに大都市生活経験と移動状況が現在の生活や意識とどう関係しているかが焦点となる。また、今年度は補足のために神岡町はじめ後背地域への補充調査を行った。また、これと並行して、高山市を中心とする飛騨地方にある高等学校の、在学生徒(2年生)を対象とする高校生調査を、9月から10月にかけて実施した。回収したサンプルは約900であり、現在整理集計中である。調査結果から、これから将来の職業や生活を展望する高校生が、飛騨という「地域」がもつ意味をどう捉えているのか、移動への指向は変化しているのか、などが明らかになると思われる。

なお、この2つの調査データを中心に、研究分担者による分析と討議を深めながら、最終年度である次年度での調査・研究計画と報告書への研究成果のとりまとめについて検討した。できれば、飛騨地域以外の同規模の地方都市で比較のための調査を行うことができればと考えている。今年度(平成9年度)は、本研究の最終年度にあたるため、これまで孤立型地方都市を対象(中心は岐阜県高山市および周辺の飛騨地方)に行ってきた現地調査結果、なかでも高山市住民調査と高校生調査の集計分析結果をとりまとめ、研究分担者による検討を加えながら、最終報告書の作成を進めた。また、比較のためにもうひとつの同規模の地方都市として秋田県大館市を選び、平成9年11月に郵送法による住民調査(対象サンプル1000)を実施した。調査項目は、高山市とほぼ同様で、学卒時の就業移動の実態と意識を中心にその後の居住地の移動までを把握しようとするものである。いわゆるUターン帰還者やIターン外来者がいかなる職業的あるいは社会的経歴を経ているのか、一貫して地元を離れない人々がどのような属性を持っているのか、などについて総合的に分析している。また名古屋を中心とする中京大都市圏との関係も、歴史的に密なものがあるが、近年の変化について、高校生の意識の面から追求している。大館調査は現在データの集計中で、分析結果はまだ明らかになっていないが、周辺後背地の農村地帯をもつ地域の中心都市で、これまで大都市圏への学卒就職者を多く輩出してきた地域であることから、高山市との比較は類似した条件の下での異なる特徴を発見できるものと期待している。高山市の調査結果からは、年齢と移動の時期による相違や、地域ネットワークと学校・就業の関係などが析出されてくる。今後早い時期に、大館調査との比較を含め、本研究のまとめとなる研究報告書を発行する予定である。
大名と江戸町名主の社会的・経済的関係の解明による明治維新史の新側面に関する研究

本研究は、譜代大名である宇都宮藩戸田家と江戸の名主である馬込家が、幕末維新期という激動の時代をいかに生きたのかを、金銭貸借関係をはじめとする両家の社会的・経済的関係に着目して明らかにしたものである。研究成果は以下の通りである。(1)戸田家と馬込家は、藩としての金銭貸借関係の解消後もつながりを維持した。(2)馬込家は現在の栃木県で養蚕製糸業などさまざまな新規事業に着手した。(3)戸田家のもう一人の江戸の金主である豪商川村家の特徴には、馬込家との共通点と相違点がみられた。(4)大名家と特殊な関係を形成した馬込家は、特有の歴史的背景や家の特徴を有した。本研究は、徳川将軍家を支える譜代大名の宇都宮藩戸田家と、徳川家とのつながりを自己の存在基盤とした江戸大伝馬町の名主(なぬし)である馬込家が、徳川時代が終わる幕末維新期をいかに生きたのかを、両者の社会的・経済的な関係に着目して検証し、明治維新史の一断面を新たな視点で明らかにしようとするものである。戸田家と馬込家との間には、江戸の馬込家が支配町内の豪商から金銭を調達し、それを宇都宮藩の戸田家に融通するという関係があったことが明らかになっているが、今年度は戸田家の側の史料調査を行った。本研究を開始する前段階では、東京都江戸東京博物館所蔵の馬込家文書をはじめとして、江戸の馬込家に関係する史料を中心に調査・分析を行ってきたが、本研究では『栃木県史』『宇都宮市史』『史料宇都宮藩史』などの活字史料や、栃木県立文書館に所蔵されている戸田家文書など、戸田家に関する史料の調査を実施した。また、宇都宮市立中央図書館や宇都宮大学附属図書館の学術情報リポジトリ(UU-AIR)などでも調査も行い、分析対象となる史料の幅を広げることができた。本研究は、大名あるいは名主それぞれの個別の歩みではなく、両者の関係を明らかにするところに特色があり、それぞれの史料の分析は不可欠である。本年度の研究において戸田家文書を収集したことで、次年度以降、馬込家文書と戸田家文書を読み合わせながら、両者の関係を解析することが可能になった。研究の初年度として、本研究の基盤となる重要な調査を行うことができたと考える。本研究は、大名の宇都宮藩戸田家と江戸町名主の馬込家が幕末維新期をいかに生きたのかを、両者の社会的・経済的な関係に着目して検証し、明治維新史の一断面を新たな視点で明らかにしようとするものである。本年度は、1.馬込家と戸田家の関係分析、2.周辺資料の調査分析、3.明治維新史の再構築、という3点に重点を置いて研究を行った。1については、おもに明治以降の馬込家文書の読解を進め、馬込家は戸田家との関係を維持しながら、栃木県内において養蚕製糸に取り組んだだけではなく、大谷石の東京移送や綿糸紡績など、さまざまな事業に挑戦したことが明らかになった。2については、馬込家とともに宇都宮藩戸田家の財政を支えた江戸の豪商川村伝左衛門の調査を行い、江戸期の川村伝左衛門と宇都宮藩戸田家・名主馬込家との関係や、明治期の川村迂叟(伝左衛門の号)による近代製糸工場(大嶹商舎)と馬込家による養蚕製糸との比較検討を行うことができた。3については、これまでの経済・金融関係の文献のほか、殖産興業に関する文献の収集・読み込みを進めた。以上の分析結果は、本研究の目的である、新たな明治維新史の一断面を明らかにする上で、重要な知見であると考える。3年間の研究期間の中間年度として、本年度は充実した成果をあげることができたと考える。本年度は、1.馬込家と戸田家の関係分析、2.周辺資料の調査、3.明治維新史の再構築、という3点に重点を置いて研究を進めた。1については明治初期の馬込家による栃木県での活動実態について史料収集を行うことができ、2については馬込家とともに宇都宮藩戸田家の財政を支えた江戸の豪商川村家の調査を実施することができた。また、3については、豪商の川村家と名主の馬込家が明治初期の栃木県で養蚕製糸に取り組み、馬込家はその他に大谷石の東京移送など、殖産興業にかかわる多様な事業にかかわったことから、これまでの経済・金融関係の文献のほか、殖産興業に関する文献の収集・読み込みを進めることができた。本研究は、大名の宇都宮藩戸田家と江戸町名主馬込家との社会的・経済的な関係を検討し、明治維新史を新たな視点で明らかにしようとするものである。最終年度にあたる本年度は、これまでに収集した史料の分析を進めながら、さらなる関連史料・周辺史料の発見につとめた。特に、これまでは、幕末維新期における宇都宮藩戸田家、江戸町名主馬込家、江戸豪商川村家という、人と人(家と家)とのつながりを解析してきたが、本年度は幕末維新期に至る時代のつながりに改めて着目することで、時代の流れの中に幕末維新期を位置付ける作業を行った。新たな関連史料の一つとして、本研究で分析の軸とした名主馬込家の娘が近世初期に英国人のウィリアム・アダムス(三浦按針)に嫁したとされる点に着目し、国内における英国側の史料を調査した。

この調査を通して、日本語文献だけではなく、The British Library発行のThe English Factory in Japanをはじめとする英語文献・史料(活字)を収集することができ、近世初期の馬込家がどのような環境下でどのような存在であったのかを検討した。近世初期の実態を明らかにすることで、大名家と特殊な関係を有する名主家がどのような特徴を有したのかを検討するだけではなく、馬込家が近世期を通していかに変化して幕末維新期に至ったのかを考究することが可能になり、明治維新期を時代の流れの中でとらえ、より客観的に位置付けるという目的を達成できたと考える。以上の通り、本研究のおもに初年度と次年度で幕末維新期における社会的なつながりを分析し、本年度では幕末維新期に至る時代のつながりを検討することで、明治維新史をより深く多角的に、そして独創的にとらえることが可能になったと考える。本研究は、譜代大名である宇都宮藩戸田家と江戸の名主である馬込家が、幕末維新期という激動の時代をいかに生きたのかを、金銭貸借関係をはじめとする両家の社会的・経済的関係に着目して明らかにしたものである。研究成果は以下の通りである。(1)戸田家と馬込家は、藩としての金銭貸借関係の解消後もつながりを維持した。(2)馬込家は現在の栃木県で養蚕製糸業などさまざまな新規事業に着手した。(3)戸田家のもう一人の江戸の金主である豪商川村家の特徴には、馬込家との共通点と相違点がみられた。(4)大名家と特殊な関係を形成した馬込家は、特有の歴史的背景や家の特徴を有した。本年度は、1.宇都宮藩戸田家の実態分析、2.江戸町名主馬込家の実態分析、3.明治維新史の再構築、という3つの柱を立てて研究を進めた。特に1については、戸田家文書の調査・収集を進め、『栃木県史』『宇都宮市史』『史料宇都宮藩史』などの活字史料を収集した。また、栃木県立文書館に所蔵されている戸田家文書はデジタルカメラによる撮影や複製版の電子複写で史料を収集し、解読・分析に着手した。また、宇都宮市立中央図書館や宇都宮大学附属図書館の学術情報リポジトリ(UU-AIR)の調査も実施した。しかし、戸田家文書の全体像を把握し、本研究の対象時期である幕末維新期史料の解読を終えるには至っていない。また、3の明治維新史の先行研究の整理についても、文献の収集は進んだが、その読み込みはやや遅れている。史料・文献とも、次年度は解読・読み込み作業を一層積極的に推進したい。次年度は本研究の最終年度にあたる。馬込家文書や戸田家文書をはじめとして、豪商川村家や明治初期の栃木県の史料など、これまでに収集・解読してきた古文書の分析の成果を、馬込家を中心にすえて総括する。そのなかで、名主の馬込家と大名の戸田家との関係を、江戸から明治への変化に着目して検証することで、本研究の目的である明治維新史の新たな側面を提示したい。以上の研究の総括を行うため、次年度は論文・著書の執筆を中心に研究を推進し、その過程で新たに生じる史料・文献の補助的な調査や、本研究テーマに関連する学会・研究会への出席を積極的に行う。日本近世史次年度は、東京都江戸東京博物館所蔵の馬込家文書の解読・分析を進めながら、幕末維新期の江戸・東京関係史料の中から本研究に関連する新たな史料を収集するため、県外での調査を行う。また、これらの作業と並行して、これまで収集した史料や文献の解読・読み込みを進め、内容の検討を行う。本年度は若干の残余額が生じているが、誤差の範囲内と考えている。前年度からの繰越額などを考慮に入れると、ほぼ満額使用できている。次年度は下記の通り経費の内訳の調整が必要となる可能性があるが、適切に使用していきたい。本年度は、宇都宮市内の戸田家文書の調査や解読に想定以上の時間を要したため、当初の予定ほど旅費を使用しなかった。
うつ病の再発・難治化と脳の脆弱性について脳画像と神経栄養因子を用いた前方視研究

初発・再発を含むうつ病患者12名の治療開始時の脳形態画像を撮影し、健常対照者27名の頭部MRIと比較した。Voxel-based morphometryを用いて比較した結果、うつ病患者群は治療開始時に既に両側帯状回前部、両側腹内側前頭皮質、両側腹内側前頭皮質、両側尾状核頭において灰白室の容積縮小を認めた。これを踏まえて、次にうつ病の治療効果がもたらす脳の変化を計測するために、脳血流SPECTや脳PET検査よりも侵襲の少ない機能的MRIによる評価方法を作成した。「自尊心」「非機能的思考」をうつ病の治療効果の指標とすることとした。「自尊心」課題を20名の健常者を対象に実施した。その結果、内側前頭前皮質、前部帯状回が自尊心の変動と関連する可能性が示唆された。再発例として入院し薬物療法を受けた患者2名、難治症例として認知行動療法をうけた患者3名を対象に、治療の各時期にfMRI課題を実施して、データ収集を行った。少数例の検討ではあるが、fMRI課題により治療開始後の経過とともに課題により賦活される部位が変化する結果であった。このことから、うつ病に特徴的な機能障害も治療とともに変化する事、また治療方法により違いがある可能性が考えられた。現在更なるデータを集積中である。研究開始にあたり、研究実施を安全かつ効率的に行うために、本研究に関して研究実施機関の倫理委員会に研究実施についての申請を行い、倫理委員会の承認を受けた。その後、研究参加者の募集を行った。目標とする被験者数に、年齢・性別の分布を合わせるために、新たに6名を健常対照群のデータベースに追加した。暫定的な結果ではあるが、うつ病と診断された患者12名(男性9名、女性3名)に対して治療開始時に測定した頭部MRIデータを解析した。これはうつ病患者群12名と健常対照群27名(男性20名、女性7名)の頭部MRIデータをvoxel-based morphometryを用いて比較検討をしたものである。その結果、うつ病群では両側帯状回前部、両側腹内側前頭皮質、両側尾状核頭において灰白質容積の縮小が認められた。過去に治療を受けた事のある症例も合わせた結果ではあるが、治療開始時にうつ病群において有意な容積縮小を示したこれらの領域がうつ病の生物学的脆弱性と関連している可能性があることを第29回日本生物学的精神医学会において発表した。本研究課題はうつ病における脳の脆弱性を器質的・機能的変化から評価し、治療と関連した進行性の変化を明らかにすることにある。本年度に行われた成果は、治療開始時におけるうつ病の脳形態の変化を報告したものであり、うつ病発症の生物学的脆弱性の解明にとって意義のあるものであると考える。また今後行われる治療による変化をみていく上で、比較対象となる情報が得られたと考える。前年度に引き続きうつ病と診断された患者の治療開始時の頭部MRIデータを収集した。うつ病における脳の脆弱性を脳機能の面から評価すべく、うつ病に関連した課題を作成し、fMRIにより健常者を対象として実験を行うことで機能的磁気共鳴撮像法(fMRI)を用いた評価方法を作成した。その結果を2nd WFSBP Asia-Pacific Congress、Neuroscience2008、第38回日本神経精神薬理学会において発表した。これらはうつ病患者に対して実施するための脳機能を評価する課題を、健常者を対象として実施し、その有用性・妥当性・侵襲の程度を評価したものである。作成されたfMRIによる課題を本研究課題への適用として、再発例として入院した患者あるいは、難治症例として通電療法をうけた患者に実施して、データ収集を開始した。本年度我々が作成して、有用性・妥当性を検討したfMRIを用いた手法は、被験者への侵襲性が低いため、うつ病患者に用いることが容易である。更にはうつ病に関連した脳機能の変化をより高い空間分解能で評価できるため、うつ病における脳の脆弱性を形態変化・機能変化など複数の視点から評価する場合に有用な手法であると考える。

今年度の検討を通じて、治療による変化をみていく上で有用な情報が得られたと考える。前年度に引き続きうつ病における脳の脆弱性を脳機能の面から評価すべく、うつ病に関連した課題を作成し、fMRIにより健常者を対象として実験を行うことで機能的磁気共鳴撮像法(fMRI)を用いた評価方法を作成した。作成されたfMRI課題(自尊心評価課題、非機能的思考評価課題)を、再発例として入院し薬物療法を受けた患者2名、難治症例として認知行動療法をうけた患者3名を対象に、治療の各時期にfMRI課題を実施して、データ収集を行った。少数例の検討ではあるが、fMRI課題により治療開始後の経過とともに課題により賦活される部位が変化する結果であった。このことから、うつ病に特徴的な機能障害も治療とともに変化していく可能性が考えられた。更には治療方法に特徴的な違いがある可能性が考えられた。本研究課題はうつ病における脳の脆弱性を器質的・機能的変化から評価し、治療と関連した進行性の変化を明らかにすることにある。本年度我々が作成・実施をしたfMRIを用いた手法は、被験者への侵襲性が低いため、うつ病患者に用いることが容易である。更にはうつ病に関連した脳機能の変化をより高い空間分解能で評価できるため、うつ病における脳の脆弱性を形態変化・機能変化など複数の視点から評価する場合に有用な手法であると考える。少数例ではあるが、本研究により治療による脳機能の変化を認める事が出来た事は、今後治療による脳形態・脳機能の変化をみていく上で有用な情報が得られたと考える。
超音波像高速3次元表示システムの開発と医学への新しい応用

我々は子宮内胎児の状態をより正しく把握するために、無侵襲的検査法である超音波断層法を基にした3次元表示の研究を行っている。本研究では、プローブからコンピュータまでオンラインで結んだ実用化を目指したシステムを構築し、胎児診断における超音波3次元像の有用性について検討した。さらに、カラードプラ装置との組合せによる胎盤血流の3次元表示、リアルタイムイメージプロセッサを用いての乳腺腫瘍の超音波像3次元表示にも成功した。1.胎児の超音波3次元像:超音波断層像では想像すら困難な胎児の顔の様子など、表面表示の有用性が確認された。また、指など3次元的に複雑で細かい部分の形態診断にも有用であることが確認された。2.胎盤血流の3次元像:カラードプラ診断装置との組み合わせにより、血流のある血管だけを抽出して、胎盤の血流分布を3次元的に表示することが可能になった。この事は、臨床上顧みられることがなかった断層像での胎盤血流情報が、胎盤の機能診断など、臨床的に意味のある検査法として活用される道を開くものである。3.乳腺腫瘍の超音波3次元像:乳腺腫瘍を対象に、リアルタイムイメージシグナルプロセッサを用いた前処理を試みた。乳腺腫瘍は乳腺組織に囲まれており、超音波像上、周りの組織から分離するのは容易ではないが、リアルタイムイメージシグナルプロセッサを用いた前処理により、羊水に囲まれた胎児の場合と同じように分離することが可能となった。乳腺腫瘍の超音波診断では、断層像だけでも良性悪性の診断はある程度可能であるが、3次元像は良性悪性の診断に一層重要な情報を含んでいる。また、3次元像では、腫瘍の広がりが客観的に評価される。今後の課題として、装置の小型化と処理の高速化があるが、急速な半導体および関連分野の発達により、近い将来、解決される問題であると期待される。超音波断層画像の統合による三次元情報を有効に利用し、より正確且つ詳細な胎児診断を可能とすることを目的に、実地臨床用の超音波三次元解析表示装置を開発を試み、臨床使用の有用性を検討した。1.装置の構成及び画像作製の方法:試作装置は、特性スキャナ-、超音波断層装置、グラフィック・プロセッサ-、カラ-モニタ-、光ディスク、コンソ-ルボ-ド、ビデオフィックスより構成される。スキャナ-としては、三次元専用電子コンベックス型振動子(3.5MHz)を水槽内で機械的に扇形走査する密閉型プロ-ブを作製し、アロカSSD680に接続、128枚の各断層画像情報をA/D変換しメモリ-ボ-ドへ転送する。CPUボ-ドを使用し解析に必要なデ-タを選び演算を行い、フレ-ムバッファ-ボ-ドに記憶してCTR上に表示する。胎児画像の表示法としては、(1)三次元断面表示法、(2)マルチ断面表示法、(3)表面表示法を検討した。2.臨床応用の成績:(1)三次元断面表示法では、縦断像、横断像及び水平断像が一画面に表示され、二断面を固定して残りの一断面を自由に移動させることができ、その断面の部位が他の二断面上に表示されることにより、胎児内臓の位置関係が明瞭に認識され胎児全体の立体イメ-ジ把握が容易となった。(2)マルチ断面表示法では、自由な角度で複数の部位で胎児を切断した塊状像が得られ、それを自由な方向から観察できることが、胎児各臓器の立体構築の把握に有用であった。

(3)表面表示法では、羊水腔側からのアプロ-チで、最初に到達する反射源を適当な閾値を設定することによって対象と認識し、視点よりの距離で画素の輝度を決定する方式で胎児の体表を立体的に抽出できた。特に、羊水量の充分な例では明瞭な胎児顔面像が得られた。今後、更に改良を加え、画像製作時間の短縮、より高度な診断情報の獲得を目指す。我々は子宮内胎児の状態をより正しく把握するために、無侵襲的検査法である超音波断層法を基にした3次元表示の研究を行っている。本研究では、プローブからコンピュータまでオンラインで結んだ実用化を目指したシステムを構築し、胎児診断における超音波3次元像の有用性について検討した。さらに、カラードプラ装置との組合せによる胎盤血流の3次元表示、リアルタイムイメージプロセッサを用いての乳腺腫瘍の超音波像3次元表示にも成功した。1.胎児の超音波3次元像:超音波断層像では想像すら困難な胎児の顔の様子など、表面表示の有用性が確認された。また、指など3次元的に複雑で細かい部分の形態診断にも有用であることが確認された。2.胎盤血流の3次元像:カラードプラ診断装置との組み合わせにより、血流のある血管だけを抽出して、胎盤の血流分布を3次元的に表示することが可能になった。この事は、臨床上顧みられることがなかった断層像での胎盤血流情報が、胎盤の機能診断など、臨床的に意味のある検査法として活用される道を開くものである。3.乳腺腫瘍の超音波3次元像:乳腺腫瘍を対象に、リアルタイムイメージシグナルプロセッサを用いた前処理を試みた。乳腺腫瘍は乳腺組織に囲まれており、超音波像上、周りの組織から分離するのは容易ではないが、リアルタイムイメージシグナルプロセッサを用いた前処理により、羊水に囲まれた胎児の場合と同じように分離することが可能となった。乳腺腫瘍の超音波診断では、断層像だけでも良性悪性の診断はある程度可能であるが、3次元像は良性悪性の診断に一層重要な情報を含んでいる。また、3次元像では、腫瘍の広がりが客観的に評価される。今後の課題として、装置の小型化と処理の高速化があるが、急速な半導体および関連分野の発達により、近い将来、解決される問題であると期待される。
放射線高感受性メダカ胚を用いた発生中の中枢神経で起こる貪食機構解明

脊椎動物の発達中の中枢神経は、化学物質や放射線などの悪影響に対して非常に感受性が高いことが知られている。外傷及び神経変性疾患によって脳や脊髄が損傷するとミクログリアが活性化され、損傷部位へ移動し、神経栄養因子やサイトカインを放出して神経保護作用を行うが、神経細胞の回復が不可能な場合には、細胞や残片を貪食して除去することが知られている。本実験ではメダカ胚をモデル生物として用いて、放射線被ばく後の神経細胞に誘発されるアポトーシスが照射時間経過とともにどのように変化するのかを調べた。さらに、これらのアポトーシス細胞の消化吸収を調べるため、ミクログリアの消化活性により発現が上昇するApoE遺伝子発現をwhole-mountinsituハイブリダイゼーションにより調べ、ミクログリア細胞の食胞にアポトーシス細胞が10-15個集められその後それらが消化されること、ApoE遺伝子の発現は、これらミクログリアの食胞に集められたアポトーシスの消化がかなり進行した段階で上昇することを明らかにした。さらに、貪食がほぼ終了した時点において、アポトーシスの消化が進行している時に認められたApoE陽性細胞の数よりも明らかにそれらが増えていること、p53遺伝子欠損型メダカ胚では放射線照射により誘発されたアポトーシスの数が野生型照射胚よりも明らかに少ないにも関わらず、貪食がほぼ終了した時点で観察されたApoE陽性細胞の数は両者同じ程度であったことから、ミクログリアの活性化にはアポトーシス貪食目的ではなく、貪食終了後に活性化される第二のシステムがプログラムされている可能性が示唆された。ヒト胎児の脳に対する放射線影響は、広島・長崎の疫学調査より、器官形成期が終了し大脳皮質が形成される妊娠8-15週に被爆した胎児に高頻度の精神遅滞や小頭症などの悪影響が認められ、この時期が最も高感受性であることが判明している。そこで、この時期(器官形成期が終了し、脳が飛躍的に発達する)に相当するメダカ胚発生ステージ28を用いて、発生に影響を及ぼさないような比較的低い線量(X線10Gy以下)で脳に誘発される悪影響について、組織形態変化、アクリジンオレンジ染色法によるアポトーシスの発生、in situハイブリダイゼーション法によるアポトーシスの貧食をTILLING法により作出されたp53ノックアウトメダカ胚を用いて実験を行い、野生型(Hd-rR)と比較し、アポトーシスとそれらの貧食にp53遺伝子の果たす役割を明らかにする目的で実験を行った。その結果、p53遺伝子欠損胚では、1)1アポトーシスの発生遅延、2)発生期間の短縮、3)発生数の減少が認められ、p53遺伝子がアポトーシスの発生に重要な役割を果たしていることを明らかにした。さらに、ミクログリア細胞に特異的に発現するApolipoproteinE(ApoE)遺伝子をプローブとしたin situハイブリダイゼーションを行い、放射線照射によるその発現変化を調べた。その結果、照射後にApoEの発現は大きく上昇することが判明した。この変化は、野生型・p53遺伝子欠損胚、共に同様であった。中枢神経の発生過程で不要となった神経線維の除去に関わるアポトーシスの食食に関する詳細な報告は、ゼブラフィッシュやショウジョウバエなど多数あるが、放射線誘発アポトーシスの食食に関わる報告は見当たらず、本研究において、放射線損傷細胞の除去におけるミクログリアが果たす役割に関する新たな知見が得られたと考えている。現在、whole-mountinsituハイブリダイゼーションで染色された胚の連続切片を作成し、その発現の詳細を解析中である。

そこで、この時期(器官形成期が終了し、脳が飛躍的に発達する)に相当するメダカ胚発生ステージ28を用いて、発生に影響を及ぼさないような比較的低い線量(X線10Gy以下)で脳に誘発される悪影響について、組織形態変化,アクリジンオレンジ染色法によるアポトーシスの発生、whole-mount in situハイブリダイゼーション法(WISH法)によるアポトーシスの貪食をTILLING法により作出されたp53ノックアウトメダカ胚を用いて実験を行い、野生型(Hd-rR)と比較することにより、アポトーシスとそれらの貪食にp53遺伝子が果たす役割を明らかにする目的で実験を行った。昨年度(平成22年度)、p53遺伝子欠禎胚では、1)アポトーシスの発生遮延、2)発生期間の短縮、3)発生数の減少が認められ、p53遺伝子が発生中の脳のアポトーシス発生に重要な役割を果たしていることを明らかにした。また、アポトーシスの貪食に関与していると考えられているミクログリア細胞に特異的に発現するApolipoproteinE(ApoE)遺伝子をプローブとしたWISHを行い、放射線照射後の発現変化を調べた結果、野生型・p53遺伝子欠損胚、共に照射後にApoEの発現が大きく上昇することが判明した。今年度、放射線照射後のアポトーシス形態の経時変化を電子顕微鏡を用いて詳細に調べ、WISHにより観察されるApoE遺伝子発現の経時変化とこれらアポトーシスの形態変化の関連を調べた。その結果、アポトーシス細胞が貪食細胞(ミクログリア)によりデブリスの状態に分解された後も、ApoEの発現上昇は継続していることが新たに知見として得られた。アポトーシスの一連の過程(核の凝縮、核の断片化、貪食)の中で、特に貪食は重要な過程であるが未だ不明な点も多い。中枢神経では、発達中の中枢神経形成過程で過剰に発生した神経細胞シナプスの除去に、ミクログリアが貪食細胞として働いていることが知られている。しかし、放射線などにより損傷を受けた神経細胞除去に、ミクログリア細胞がどのように働いているのか、その詳細については報告がない。そこで本研究では、アポトーシスに深く関わるp53遺伝子ノックアウトメダカ胚を用い、アクリジンオレンジアッセイによるアポトーシス全過程の可視化、電子顕微鏡観察、などの手法により、発達中の中枢神経で発生するアポトーシスを調べ、p53遺伝子がアポトーシス発生に果たす役割を調べた。さらに、これらのアポトーシスを除去する役割を果たすことが知られているミクログリア細胞に着目し、ミクログリア細胞に特異的に発現するApolipoproteinE (ApoE)遺伝子の発現変化をwhole-mount in situハイブリダイゼーション(WISH)によって放射線照射後12h, 24h, 42hにおいて調べた。その結果、アポトーシス細胞の貪食進行の状況によってApoEの発現がどのように変化するのか、その詳細を明らかにすることに成功した。本研究は胚の脳を可視化することが出来る上、その大きさが哺乳類と比較してかなり小さく脳全体を丸ごと観察することができるメダカ胚を用いることにより初めて得られた結果である。さらに、p53遺伝子ノックアウトメダカ胚では野生型胚と比較してアポトーシスの発生が遅延し、その数も少ないことが判明した。
斉国・魯国の成立過程の研究-殷周時代の中国山東半島に対する考古学的考察-

平成18年度から引き続いて、既に国学院大学に提出した博士学位論文、『早期王朝期海岱地区考古学研究』を出版するために改訂・補正する作業に従事した。先ず、4月15日から5月14日までは、北京の中国社会科学院研究生院(大学院)に宿泊しながら、資料の収集、そして著作原稿の校訂に従事した。次いで、日本本国での資料調査の期間をはさみながら、7月より3月までは、中央研究院に場所を借り、資料の収集と校訂作業を引き続き行った。北京の社会科学院、そして台北の中央研究院の教員・院生各位の助力により校訂作業は能率よく進行した。また、支那学(Sinology)に関して世界一のレベルを誇る中央研究院附属図書館を利用することによって、日本や中国では閲覧したことがないさまざまな新資料を利用することができた。これらの一年間の作業により、山東半島周辺の先史時代の諸集団の文明化について二年間行った諸考察について、より客観的、体系的な論証を実現できたと確信している。残念ながら、体調不良等の原因により、予定していた平成19年度の出版は達成できなかった。今後は少しでも早く出版し、この三年間の研究の研究成果を世に問えるよう、引き続き作業を継続したい。本年度は、二つの方向に対して研究活動を行った。第1は、大陸および台湾における資料調査・遺跡踏査、第2はこれまでの研究成果を再整理し、山東半島およびその周囲における考古学編年の枠組みを具体的に構築する仕事である。第1の活動として、7月に行った台湾台北市の中央研究院歴史語言研究所、歴史博物館等において中国の華北各地で出土した初期王朝時代(前2,000年頃771年)の青銅器・玉器・土器の調査を行った。11月には上海市・山東省・天津市において上記の時代の青銅器・玉器・土器の調査、および同時代の山東省の遺跡の踏査を行った。これらの調査により、初期王朝時代の黄河流域および山東半島の遺物・遺跡について多くの考古學的な情報を得た。特に中央研究院および山東大学東方考古研究中心における青銅器調査では多くの知見を得た。これらの成果については、現在執筆中の博士学位論文の中で数多く引用している。第2の活動として、中国の友人たちの助力を得ながら、これまで発表した幾つかの文章を整理し、華文に翻訳しながら改訂を進める形で、研究書の執筆を進めた。現在までのところ、全7篇のうち第1篇がほぼ完成した。また第3篇の第一章に相当する箇所を「探討岳石文化分期-二里頭文化期至商代的山東半島及其周圍之考古文化-」(中国語)と題して中国の山東大学の学術雑誌『東方考古』上で発表するために投稿し、第5篇の第二章に相当する部分を「斉国始封地考」(中国語)として河北省文物考古研究所の学術雑誌、『文物春秋』上で発表した。(なお、上述の『東方考古』は既に北京で発行されたと聞くが、黄川田は未だ原物を入手していない。)本年度は、二つの方向に対して研究活動を行った。第1は、山東省龍口市帰城遺跡群に対する研究、第2はこれまでの研究成果を再整理し、著書としてまとめ上げる仕事である。第1の活動として、12月に山口県立萩美術館・浦上記念堂で行われた《日本中国考古学会》平成18年度総会にて、「山東龍口帰城遺跡群考」と題する論文を、口頭で発表した。この中で、これまで中国国外であまり注目されてこなかった当該遺跡群を紹介・分析した上で、殷周時代の海岱地区を考える上できわめて重要な遺跡だと指摘した。なお、この論考は来年度中に華文にて完成させた上で、下記の著書中の一章として公表する計画である。第2の活動として、中国の友人たちの助力を得ながら、これまで発表した幾つかの文章を整理し、華文に翻訳しながら改訂を進める形で、著書の執筆を進めた。現在、既に初稿として:『早期王朝期海岱地区考古学研究』全二冊(華文)を脱稿し、9月に博士学位請求論文として国学院大学大学院に提出した。この書は、平成19年度中に台湾で刊行する予定である。なお本年度8月、この著作の一部の章を、「再論済南遺址群商周遺存分期」(華文)と改題した上で、商文明国際学術研討会(主催:山〓大学東方考古研究中心、中国殷商文化学会,於・中国山東大学済南キャンパス及び威海キャンパス)にて口頭発表した。

これらの一年間の作業により、山東半島周辺の先史時代の諸集団の文明化について二年間行った諸考察について、より客観的、体系的な論証を実現できたと確信している。残念ながら、体調不良等の原因により、予定していた平成19年度の出版は達成できなかった。今後は少しでも早く出版し、この三年間の研究の研究成果を世に問えるよう、引き続き作業を継続したい。
動画およびアニメーションでの可視化を使った機械工作教材の製作

研究の目的私が携わる機械工作の分野では,作業はするが作業ポイントを理解しないまま行動し失敗する者が多い.それは指導者の説明を理解する前に行動したり,ポイントとなる個所を間違って解釈しているからである.モノづくり初心者の学生に対し説明だけでは一人ひとりの解釈に差が出ることが有る.言葉だけで理解してもらうのではなく,説明しにくい個所や工作物内部の状態などは動画やアニメーションを使用した方が的確な作業ポイントを指示することができ,学生との意思疎通がはかれ,工作技術の習得時間の短縮も繋がるのではないだろうか.そこで,工作技術を可視化・映像化させることで,機械加工の原理をより深く理解しやすい教材を作り,モノづくりへの自信を高めさせることを目的とする.研究実施計画現在私が担当している鋳造実習では,わずかではあるが動画やアニメーションでの説明をおこなっており,学生達にも好評で他の実習より分かりやすいと言う声が上がっている.そこで画像や動画の編集ソフトを使い表現力を上げ,他の工作実習と共により分かり易く作り直し,作業動画マニュアルとして授業等に活用する.短時間で視聴出来る作業動画マニュアルができれば,作業中でもタブレットPCや携帯端末等で作業確認を行うことが出来るようになる.また、機械工作に興味をもつ一般の人向けには私が所属する熊本大学中央工場ホームページで外部公開して,モノづくりの裾野を広げたいと思う.成果専用のイラスト制作ソフトを使いアニメーションを製作したところ,随分見やすく作りなおすことができた.また,動画のファイルを増やし鋳造実習教材を作成したところ,座学の時間を10分程度短縮することができ,その分作業時間を増やせたことで,より丁寧で安全な鋳造実習を行えることになり,学生達も時間に追われず考えながら作業することで,今までより習得度も上がったように思われる.研究の目的私が携わる機械工作の分野では,作業はするが作業ポイントを理解しないまま行動し失敗する者が多い.それは指導者の説明を理解する前に行動したり,ポイントとなる個所を間違って解釈しているからである.モノづくり初心者の学生に対し説明だけでは一人ひとりの解釈に差が出ることが有る.言葉だけで理解してもらうのではなく,説明しにくい個所や工作物内部の状態などは動画やアニメーションを使用した方が的確な作業ポイントを指示することができ,学生との意思疎通がはかれ,工作技術の習得時間の短縮も繋がるのではないだろうか.そこで,工作技術を可視化・映像化させることで,機械加工の原理をより深く理解しやすい教材を作り,モノづくりへの自信を高めさせることを目的とする.研究実施計画現在私が担当している鋳造実習では,わずかではあるが動画やアニメーションでの説明をおこなっており,学生達にも好評で他の実習より分かりやすいと言う声が上がっている.そこで画像や動画の編集ソフトを使い表現力を上げ,他の工作実習と共により分かり易く作り直し,作業動画マニュアルとして授業等に活用する.短時間で視聴出来る作業動画マニュアルができれば,作業中でもタブレットPCや携帯端末等で作業確認を行うことが出来るようになる.また、機械工作に興味をもつ一般の人向けには私が所属する熊本大学中央工場ホームページで外部公開して,モノづくりの裾野を広げたいと思う.成果専用のイラスト制作ソフトを使いアニメーションを製作したところ,随分見やすく作りなおすことができた.また,動画のファイルを増やし鋳造実習教材を作成したところ,座学の時間を10分程度短縮することができ,その分作業時間を増やせたことで,より丁寧で安全な鋳造実習を行えることになり,学生達も時間に追われず考えながら作業することで,今までより習得度も上がったように思われる.
真核及び原核生物呼吸鎖電子伝達系の構造機能と進化

1)ウシ心筋ミトコンドリアよりチトクロムbc_1複合体を改良調製しその定常状態での速度論的解析から、QH_2からチトクロムcへの2電子移行はピンポン機作によることが判明した。2)この標品に庶糖を含むポリエチレングリコ-ルを加え室温で12週間放置すると12mm角の赤い平行六面体の結晶が折出した。再現性もよく、大量調製も可能である。3)この結晶のX線回折パタ-ンは8A分解能以上の解析が可能であることを示唆した。ただこの結晶は機械的衝撃に弱く、かつ空気中で除々に変性するので今一歩各種条件の改良が必要である。4)ユ-グレナのチトクロムcの精製は還元型で行なうと良好な結果をえたので、現在大量精製続行中で結晶化を試みる段階である。5)ユ-グレナのチトクロムc_1cDNAの全塩基配列を決定した。他の生物起源のc_1と比較し、鉄への配位子(His,Met)、膜結合部位の共通性を指摘した。また、ヘムCのペプチド鎖への結合部位はただ1ケ所のCysー42のみであり、他のc_1でみられるもう1所のCysー39はPheで置換されていることを確実にした。6)酵母のチトクロムc_1の部位特異的変異を鉄配位子に導入し(His44Phe,Tyr;Met164Leu,Lys)、それぞれがc_1の構造やbc_1複合体への組み込みに重要な役割を演じていることを示した。7)ペプチド部位欠損実験から酵母c_1でチトクロムcと接触すると考えられた2ケ所の酸性領域の1ケ所(70番附近)は必須ではないと結論できた。8)ウシ心筋ミトコンドリア複合体Iの13KDa(2種),30kDa,20KDaサブユニットを単離し、その全構造、部分構造を決定し、細菌フェレドキシンに類似の構造を見い出した。9)藍色細菌のチトクロムb_6fがチトクロム酸化酵素に電子を伝達し、その折チトクロムC_<553>が働いていることを示した。ウシ心筋のチトクロムC_1やbc_1複合体の粉末X線回析像をとることを試みた。bc_1複合体は2量体で存在することが示唆された。このチトクロムbc_1複合体の改良調製品を用いてQH_2からチトクロムCへの電子伝達反応をしらべたところ、まずQH_2がbc_1と反応し、Qが放出されてからCの結合と放出が2回行なわれるというピンポン機構が明らかとなった。いいかえれば、QH_2がbc_1に結合するとbc_1の構造が変化し、Cとの親和性が低下することが示唆された。また別の実験からチトクロムC_1が膜表面に露出しているという説を支持する結果もえた。一方酵母のチトクロムC_1の遺伝子の部位

特異的変異を起こさせたものをC_1遺伝子欠損株に導入し、酵母の生育やミトコンドリアのチトクロム成分の低温スペクトルの測定、そしてコハク酸ーチトクロムC還元活性の測定を行なうことにより、ヘム鉄への配位子がヒスチジン44とメチオニンー164であることを強く示唆しえた。このとき、メチオニンの代りにリジンを導入したものは僅か乍ら野生型に近い性質を示すことが判明した。また欠如実験から従来チトクロムCと接触する部位と考えられていた2ケ所の酸性部位は大した重要性を持たないのではないかと思われる結果となった。ユ-グレナのC_1のcDNAの全構造を解明し、ウシ、ヒト、酵母、アカパンカビ、細菌のC_1と相同性があること、配位子や膜結合部位の共通性が指摘できた。このC_1はシステインー39のみでヘムを結合していること、もう1つのシステインはフェニルアラニンに置換していることを確実に証明しえた。ウシ心筋のNADH脱水素酵素複合体の13K蛋白質は2成分であることを見出しその全構造を決定した。又30K蛋白質に鉄を配位しうる配列があることも見出した。藍色細菌のチトクロムb_6fがチトクロム酸化酵素に電子をわたすことを見出した。ウシ心筋ミトコンドリアよりチトクロムbc_1複合体をRieskeの改良法により抽出精製し,最終標品に含まれるコ-ル酸を非イオン界面活剤シュクロ-スモノラウレ-トにより置換した。これにシュクロ-スを含むポリエチレングリコ-ル4000を加えることにより,室温で約12週間後に大きい(1.4×2.1mm)赤い平行六面体の結晶をうろことに成功した。サブユニット構成,吸収曲線などすべて期待通りであった。再現性も高く,大量に調製が可能となり,各種の条件の検討を進めている。この結晶のX線回析パタ-ンを解析したところ38A^^°分解能以上に解析可能と判明した。ただし,この結晶は機械的衝撃に弱く,かつ空気中でも次第に変性するので,短時間内の実験を要する。C_1の2成分複合体の結晶化はその後進展しなかった。ユ-グレナのチトクロムCは不安定で漸く還元型で精製することにより安定化されることをつきとめた。一方酵母のチトクロムC_1の推定ヘム配位子Hisー44とMetー164をそれぞれPhe,Tyrー44とLeu,Lysー164に変異させそれの導入と生育,スペクトル,膜内分布をしらべ,予想通りHisとMetとがヘム鉄への配位子であろうと示唆することができた。また70番目近傍の酸性領域はチトクロムCとの結合には必ずしも重要な役割を果していないことが判明した。またウシNADH脱水素酵素複合体のサブユニット13kDaA,Bおよび30kDa,20kDaの全構造並びに部分構造を決定し,その中に鉄・硫黄クラスタ-を形成しうる構造を同定しえた。丁度細菌型フェレドキシンと類似のアミノ酸配列をしていることが判った。今后はbc_1複合体の結晶構造解析に力を入れることとなろう。