hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
超高速船用新形式エアシップ型バルブの研究

高速船あるいは高速艇の研究が最近活発になっており、様々なコンセプトに基づく船型が提案されていて各々興味ある結果が得られつつある。しかし外洋型長距離航行用の決定的な高速船型といえるものはまだないのが実状である。従来の船型は排水量型船型であり、静的な浮力によって船体が支持されていて外洋航行に最も向いている。したがって排水量型を基本に理論あるいは実験をベースとして高速船型を追求して行くのも1つの有力な方法と考えられる。現在の排水量型船型ではほとんどの場合、船首バルブと呼ばれる突出形状が船首に採用されており、設計速力において造波抵抗が極小となるように設計されている。しかしバルブの位置は船首端に固定されていて設計上の自由度はない。バルブの位置に自由度をもたせ設計のファクターとして採用すれば造波抵抗を理論上さらに低減できる可能性がある。本研究は、エアシップ形状を有するバルブをストラットで支持し、主船体から準分離することによりその位置に自由度をもたせ、その大きさを主船体形状とともに非線形計画法によって最適化し、さらに実験的な検討を加えて造波抵抗極小の形状を得ようとするものである。まず非線形計画法による造波抵抗最小化、すなわち最適化シリーズ計算を実施し、得られた理論形状のうちの2船型(原型)について模型試験を実施した。さらにその結果を検討した上で、バルブや主船体の改造および高速域におけるトリムの抵抗特性への影響を実験的に検討した。その結果、本船型の抵抗特性は主要目比および排水容積長比の一致するテイラー船型より良好であり、従来の水中翼船より良好な揚抗比を確保できることが確認された。高速船あるいは高速艇の研究が最近活発になっており、様々なアイデアが提案されている。本研究は外洋型長距離輸送用として排水量型高速船を対象に、エアシップ形状を有するバルブをストラットで支持した準分離型船首バルブの研究を実施している。このバルブは主船体から準分離状態であるのでその位置に設計上の自由度がある。従ってその大きさと位置を非線形計画法による最適化することによって、理論造波抵抗最小の高速船型を得ることができる。初年度に実施した研究は次の通りである。1.既に開発済みのバルブ位置固定の最適化プログラムを、従来の極小造波抵抗理論と比較して精度が十分となるように改良した。2.バルブ位置と主船体との関係を変化させて最適化シリーズ計算を実施し、エアシップ型バルブの流力特性の理論的検討を行った。3.要目的に実用船型に近い数値について最適化計算を実施し、船体表面が級数表示で与えられる船型の模型を作成した。さらに曳航試験および波形解析をそれらの模型について実施し、流力特性の検討を行った。以上の研究結果をさらに検討した上で、バルブや主船体の改造および高速域におけるトリムの抵抗特性への影響を実験的に調べた。それらの実験的研究により次のような点がわかった。4.船尾水平フィンによりトリムを抑制した船型はエアシップ型バルブ付船型の抵抗特性を改善することができ、高速域ではトリムの影響が重要である。

現在の排水量型船型ではほとんどの場合、船首バルブと呼ばれる突出形状が船首に採用されており、設計速力において造波抵抗が極小となるように設計されている。しかしバルブの位置は船首端に固定されていて設計上の自由度はない。バルブの位置に自由度をもたせ設計のファクターとして採用すれば造波抵抗を理論上さらに低減できる可能性がある。本研究は、エアシップ形状を有するバルブをストラットで支持し、主船体から準分離することによりその位置に自由度をもたせ、その大きさを主船体形状とともに非線形計画法によって最適化し、さらに実験的な検討を加えて造波抵抗極小の形状を得ようとするものであり、初年度に引き続き次のような研究を実施した。まず本船型について実施された抵抗試験、波形解析試験、姿勢試験の結果をまとめさらに詳細に検討した。また従来の船型および他の交通機関との優劣の比較についてもより詳細に検討した。本船型については最適化すなわち造波抵抗極小化を線形理論に基づいて実施したが、高速域については流体力学的等価特異点の造波効果に疑問が残されたので、最後にランキンソース法による計算を本船型に適用し今後の研究へのデータとすることにした。
Autopsy imaging と法医学の知見を関連づける人工知能の開発

日本の解剖率の低さを補う手法として死亡時画像診断(Autopsy imaging: Ai)が期待されている.CT装置の普及率の高さも相まって多くの施設で実施されるようになったが,読影者不足などの理由から十分に活用されているとは言えない.そこで本研究は,Aiと法医学者の知見とを人工知能によって結びつけ,検視・検案の参考となる情報をコンピュータが提供するシステムの開発を目指す.日本の解剖率の低さを補う手法として死亡時画像診断(Autopsy imaging: Ai)が期待されている.CT装置の普及率の高さも相まって多くの施設で実施されるようになったが,読影者不足などの理由から十分に活用されているとは言えない.そこで本研究は,Aiと法医学者の知見とを人工知能によって結びつけ,検視・検案の参考となる情報をコンピュータが提供するシステムの開発を目指す.
挿入的クロマチン免疫沈降法によるエピジェネティック制御機構の解明

特定ゲノム領域を単離して生化学的解析を行うための新規方法論である挿入的クロマチン免疫沈降法(insertionalchromatinimmunoprecipitation: iChIP)を開発した。本研究班の支援を受けて、まず、ゲノム上の異なった領域間の「しきり」として、エンハンサー遮断機能及び位置効果抑制能を持つインスレーターに結合する新規蛋白質及びRNAの同定に成功した。さらに、iChIP法の最適化に取り組み、第二世代のタグ付きLexA蛋白質3xFNLDDを開発した。また、B細胞分化誘導とその維持に重要な役割を果たしているPax5転写因子遺伝子の発現調節に関わる制御領域・結合RNA・結合蛋白質の網羅的同定とその機能解析を行った。具体的には、ニワトリのB細胞株DT40細胞のPax5遺伝子の転写開始点近傍にLexAの認識配列を挿入した細胞を樹立した。この細胞に、3xFNLDDを発現した。この細胞(3xFNLDD: LexA-Pax5 (B))でのPax5蛋白・mRNAの発現は野生型DT40細胞と同等であり、この細胞を用いて、iChIP法により、Pax5遺伝子転写開始点近傍と相互作用している蛋白質・ゲノム領域・RNAを同定した。このうち、Pax5遺伝子転写開始点近傍と相互作用しているある核内蛋白質の発現がB細胞特異的であり、この蛋白質の発現を低下させるとPax5の発現が低下することを示し、この蛋白質がPax5遺伝子発現調節に重要な役割を果たしていることを明らかにした。さらに、iChIP-Seq解析の結果から、Pax5遺伝子転写開始点近傍が、多数の染色体内・染色体間相互作用をしていることを明らかにした。24年度が最終年度であるため、記入しない。1.インスレーター結合蛋白の網羅的同定とその機能解析iChIP法と質量分析法・RT-PCR法を組み合わせることにより、ニワトリβ-グロビン遺伝子上流のインスレーター配列cHS4中のコア領域(cHS4 core)に結合する分子として、p68/DDX5、マトリン3といった蛋白質、及びSRA1 RNAの同定に成功した。これは、細胞内で特定ゲノム領域に結合する蛋白質・RNAを直接的に同定した世界初の画期的な成果である。また、従来、インスレーター機能の発現には、インスレーターを核膜や核マトリックスに繋ぎ止めることが重要であることが示唆されており、我々が得た結果から、マトリン3は、インスレーターを核マトリックスに結合させることによって、インスレーター機能を発現させる可能性が示唆された。2.Pax5発現調節機構の解明iChIP法を用いて、B細胞分化の主要分化制御転写因子であるPax5遺伝子の発現誘導・維持機構を解明するために、ジーンターゲティング法を用いて、トリの成熟B細胞株DT40のPax5遺伝子の転写開始点近傍に最近のDNA結合蛋白質であるLexA蛋白質の結合配列を挿入した細胞株を作製した。さらに、この細胞にタグ付きLexA DNA結合ドメインを発現させた細胞株を樹立した。加えて、陰性対照細胞として、DT40細胞をB細胞から脱分化・trans-differentiateさせた細胞を樹立した。1.インスレーター結合蛋白の機能解析では、既に新規インスレーター蛋白の同定に成功し、その機能解析を進めている。2.Pax5発現調節機構では、既にiChIP用細胞株の樹立を終え、iChlP解析に進んでいる。1.インスレーター結合分子の同定とその機能解析に関しては、より多く(1,200コピー)のcHS4-coreを持つ細胞を樹立している。また、免疫沈降の効率が従来より6倍高い第二世代のタグ付きLexA DBを開発した。

これらを用いて、二次元電気泳動法やSILAC(stable isotope labeling by amino acids in cell culture)といった方法と質量分析法、もしくは次世代シークエンス法を組み合わせて、インスレーター結合分子の網羅的同定を目指す。また、こうして同定した分子が、インスレーター機能に果たす役割をloss-of-function実験を用いて検討する。2.Pax5発現調節機構の解析に関しては、樹立した細胞を用いて、iChIP解析と次世代シークエンス法もしくは質量分析法を組み合わせて、Pax5転写開始点近傍に結合している他のゲノム領域・蛋白質・RNAの網羅的な同定を行う。
大腸癌の進展における基質接着性スイッチ分子としてのCrumbs3の機能解析

前年度までに、Crb3に結合するタンパク質の候補を免疫沈降後の沈殿タンパク質をマススペクトル解析することにより同定した。今年度は候補タンパク質の中から、線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)に注目し、大腸癌細胞DLD-1における解析を行った。まず免疫沈降の結果を確認するため、HEK293T細胞にCrb3とFGFR1を共発現させ、FGFR1に付加したHISタグによりプルダウンし、ウェスタンブロットにより確認したところ、Crb3とFGFR1の結合が確認できた。さらに細胞内欠失変異を有するFGFR1を用いた実験では結合が見られないことから、Crb3は細胞内ドメインを介してFGFR1と結合していると考えられた。さらにCrb3ノックアウト大腸癌細胞にCrb3を強制発現させた際に、FGFR1とその下流シグナル因子であるERK1/2のリン酸化が亢進する事を見出した。このことは大腸癌細胞の移動性がERKの活性化因子であるMEKの阻害剤(U0126, SL327)により、細胞移動が抑制されることとよく一致した。また、Crb3遺伝子座からは、選択的スプライシングによりCrb3aとCrb3bの2つのアイソフォームが生成することが知られている。ノックアウト細胞にレンチウィルスベクターを用いてCrb3aまたはCrb3bをそれぞれ単独で発現させたところ、どちらのアイソフォームもFGFR1を活性化し、細胞移動を促進した。以上のことからCrb3は両アイソフォームの共通配列を介した未知のメカニズムにより、FGFR1を活性化していることを明らかにした。これまでの結果をまとめ、論文を国際誌に投稿した。免疫沈降の結果、興味深い接着分子が結合タンパク質の候補として得られなかったため、「接着性制御因子の解析」を行うという当初の目的からは若干内容が変化してきている。しかし、FGFRとCrb3との関連については解析が良く進み、現時点までの成果をまとめ国際誌に投稿できたため、おおむね順調と判断した。31年度はCrb3によるFGFRの活性化機構についてさらに詳細な解析を行い、論文にまとめる予定である。本研究では下記a-cの3ステップにより、Crb3が腫瘍形成を促進するメカニズムを明らかにすることを目標としている。a.接着性の制御に必要なCrb3のドメインの分子生物学的検索b.相互作用するタンパク質の生化学的な同定c.相互作用するタンパク質の腫瘍形成における役割のin vivo/in vitroの実験による解析1年目の本年度はまずエピトープタグを付加したCrb3のデリーション変異タンパク質を腫瘍細胞に発現させ、細胞の形態観察によって接着性の制御に必要と考えられるドメインの検索を行った。しかし欠失変異の部位によってはタンパク質の発現が全く見られなくなる場合があり、比較検討が困難であることが判明した。ショウジョウバエの発生遺伝学的な知見から、Crbの細胞外ドメインは大きな機能を果たさないと考えられている。そこで、細胞外ドメインにエピトープタグを付加した全長Crb3を作成し、Crb3ノックアウト大腸癌細胞に安定発現させたところ、親株であるCrb3ノックアウト細胞の移動性を野生型大腸癌細胞株の60%程度まで回復させることが判明した。このことは導入したタグ付きタンパク質が内在タンパク質の機能を代償していることを示す。そこで、この細胞株を培養し、エピトープタグ利用した免疫沈降を行い、SDS-PAGE、銀染色により解析し、Crb3に特異的に結合すると考えられるタンパク質のバンドを質量分析により分析した。現在得られた候補タンパク質のうち数種に関して、大腸癌における発現、Crb3との関連などを解析している。研究計画の最初のステップであるドメインの分子生物学的検索が困難であることが判明し一時期停滞したが、既に結合タンパク質を同定し、in vitroでのバリデーションも順調に進んでいるため。

しかし、FGFRとCrb3との関連については解析が良く進み、現時点までの成果をまとめ国際誌に投稿できたため、おおむね順調と判断した。今後は予定通り同定したタンパク質とCrb3の関連と腫瘍の進展における役割をin vitro/ i vivoの実験で確認する。具体的にはsiRNA等で結合タンパク質をノックダウン又は過剰発現大腸癌細胞株を作成し、細胞移動や増殖性のアッセイを行う。また野生型大腸癌細胞とCrb3ノックアウト細胞、過剰発現細胞を組み合わせて前述のアッセイを行うことで、Crb3との機能的相関を示す。また、質の良い抗体が利用できれば、ヒト腫瘍組織切片を用い免疫組織化学的な解析を行うことで、実際のヒトの腫瘍においてもCrb3と結合タンパク質が関連することを示す。31年度はCrb3によるFGFRの活性化機構についてさらに詳細な解析を行い、論文にまとめる予定である。
肺胞上皮細胞におけるABCA3トランスポータとイオンチャネルの機能連関の検討

ATP依存性チャネルゲート駆動のない変異体G551D-CFTRにGenisteinを投与し、さらにCurcuminを負荷すると、チャネルの活性はGenisteinで負荷した場合よりさらに高く、WT-CFTRの50%まで増強した。この発見は同じABC蛋白質であり、共にNBDを駆動エンジンとして持つABCA3トランスポータとCFTRチャネルの機能的連関を示唆した。また、Coherent Anti-Stokes Raman Scattering(CARS)顕微鏡を用い、初代培養した肺胞II型上皮細胞内を観察した。肺胞II型上皮細胞内にはABCA3トランスポータの発現しているlamellarbodyが多数存在し、今回のCARS顕微鏡によりlamellar bodyへの脂質のpacking、細胞外へのexocytosisを観察した。肺胞II型上皮細胞におけるCFTRチャネルの機能解析本年度は、lamellar body限界膜に発現しているイオンチャネルの同定の前段階として、肺胞II型上皮細胞由来のA549細胞でパッチクランプ実験を行い、CFTRチャネルの機能解析を行った。一般に、肺胞II型上皮細胞にはCFTRは発現していないと考えられていたが、一方、II型細胞にもCFTRの発現が認められるという報告もなされている[Brochiero et al,Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 287:382-392,2004など]。私の初年度のパッチクランプ実験では、ヒト肺胞II型上皮細胞由来のA549培養細胞にcAMP活性化Cl^-電流(CFTR電流)は観測できなかったが、A549細胞は細胞株樹立の過程においてCFTR発現能を失った可能性もあると考えられた。そこでA549細胞にCFTRを強制発現させたところ、ホールセルモードでForskolin投与(細胞内cAMP上昇)により活性化されるCFTR電流が得られた。またこのCFTR電流は、CHO細胞に発現させた場合と異なり、Forskolin投与中止により速やかに不活性化された。このことは、A549細胞ではCFTRはPKAとPhosphataseによって二重に活性制御されている、つまりA549細胞は本来のCFTRの活性制御機構を保っている可能性を示唆している。今後、マウスから肺胞II型細胞を採取し、パッチクランプ実験を行う予定である。ATP依存性チャネルゲート駆動が失われた変異体G551D-CFTRの薬剤ゲニステインgenisteinとクルクミンcurcuminによるゲーティングの回復とそのメカニズムについての研究[Yu,Miki et al 2011]を行った。クルクミンのG551D-CFTRのチャネル活性の増強効果(約10倍)は、ゲニステインのG551D-CFTRチャネル活性の増強効果(約20倍)より小さかったが、クルクミンは、ゲニステインによって最大限に活性化されたG551D-CFTRのチャネル活性をさらに増強(約40倍)させた。さらに5μM以下の低濃度領域では、クルクミンとゲニステインの同時投与は、それぞれの単独投与より遥かに大きな増強効果(相乗効果)を発揮した。この発見は同じNBDを駆動エンジンとして共通に持つABCA3トランスポータとCFTRチャネルの機能的連関についての重要なツールになり得ると考えられた。本年度は昨年度に引き続きATP依存性チャネルゲート駆動のない変異体G551Dを持ったCFTR(G551D-CFTR)にgenisteinとcurcuminを負荷し、チャネルゲーティングの回復を観察した[Yu,Miki eta1 2011]。GenisteinによるG551D-CFTRチャネルの活性増強効果は20倍だったのに対し、CurcuminによるG551D-CFTRのチャネルの活性増強効果は10倍であったが、CurcuminをGenisteinによって活性化されたG551D-CFTRに負荷すると、チャネルの活性はさらに40倍まで増強した。さらに、このCurcuminとGenisteinによる相互増強作用は5μM以下の低濃度領域で、遥かに大きな相乗増強効果を示した。また、マウスからの肺胞II型上皮細胞を安定して培養できるようになったことから、Coherent Anti-Stokes Raman Scattering(CARS)顕微鏡を用い、肺胞II型上皮細胞内を観察した。

肺胞II型上皮細胞内のlamellar bodyを生きた細胞で観察できる手段は今までになく、培養液の浸透圧変化や薬剤投与によりlamellar bodyのpackingやexocytosisに関わるABCA3トランスポータを含めた調節因子研究への重要なツールになり得る。
EBV感染胃癌のモデル作成と上皮細胞における感染のメカニズム解析

【対象と方法】(1)7週令雄性BALB/cマウスの胃内にアルコールを注入して急性粘膜障害を起こした後に、胃内にウイルスを注入した。尚、EBVの再活性化には高濃度のn-butylate(1500μg)を必要とした。マウスはウイルス注入後24時間から13カ月まで経時的に犠死せしめた。各種臓器を採取し、免疫組織法とEBEAプローブ(EBV-RNA)を用いたIn situハイブリト法でEBVの検索を行った。免疫組織染色の一次抗体は3種類のヒト血清と単クローン抗体として抗Lb1P-1、抗EA、抗NA-1、抗NA-2を用いた。(2)若年齢(6 week)と老齢(10 month)のヌードマウス(BALB/c)にGTC-5-EBVを週に1回、計8回接種して発癌が起こるかを検討した。【成績】(1)アルコールで粘膜が傷害されたマウスでは、EBV注入後24時間でNA-2、EBERを、72時間以後ではLPM-1、NA-1蛋白を胃上皮細胞を中心に認めた。9ケ月目では胃と腸組織の腺底部にEBER陽性細胞の増殖を認め、腺癌と考えられた。これらのLMP-1とEBV-DMAは陰性であった(2005消化器学会、2006年日本外科学会総会、2006年EBウイルスシンポジュウム)。13ヶ月目のマウスでは、肝臓、胃、脾臓に悪性腫瘍を認めたが、EBERは検出感度以下であった(2006年日本消化器学会)。(2)加齢ヌードマウスではEBV接種後すべてのマウスの胃、腸に腺癌を認め、何れも死亡した。一方若齢マウスでは6カ月の観察で、皮膚発疹、リンパ節と脾臓の腫大を認めたが腫瘍は形成されなかった(2006年日本外科学会、2006年日本消化器学会2006年EBウイルスシンポジュウム)。【まとめ】我々が樹立したGTC-細胞株が産生するEBVはマウスに感染し、胃・腸に腺癌を引き起すことが判明した。このEBV発癌モデルは、EBV関連発癌の機序の解明や、治療法開発を行う上で有用なモデルとなると考えられた。田島が樹立した胃癌組織由来のGTC-4細胞株は上皮系の培養細胞に感染する力価の高いEBウイスルを産生しておいることが判明した。In vivoの系でアルコール処理により胃に急性炎症を起したBALB/Cマウスの胃組織にGTC-4-EBウイルスを注入することで感染する結果を得た。(田島等2004年ヘルペス研究会報告)。さらに田島等がGTC-4細胞株より、特殊な条件下でクローニングした細胞株由来(GTC-5細胞株)のEBVはマウスの胃組織し、LMP-1蛋白を発現することが判明した(2004ウイルス学会)。感染初期には消化器の上皮細胞にEBV-NA2蛋白(活性化の指標)とLMP-1(発癌蛋白)の発現を認めた。

しかし感染後9ヶ月後にはEBV-NA2蛋白とLMP-1蛋白の発現は消失し、EBV遺伝子EBERのみが検出された。また感染初期には認められなかった脾臓と腹膜リンパ球にEBV遺伝手とEBV関連蛋白を認めた。このことはGTC-EBVはマウスで増殖することを示唆している。9ヶ月後のEBV感染マウスの胃と大腸組織に組織の構築の破壊と増殖が認められた。これら胃組織を(EBV遺伝子陽性)マウスに移植し、移植組織からEBV遺伝子の解析を行い、今後従来株との差を検討してゆく。Epstein-Barr virus(EBV)は伝染性単核症、バーキットリンパ腫、上咽頭癌などの要因ウイルスとして知られ、また一部の胃癌との関連も報告されている。我々はヒト胃癌組織からEBVを産生する上皮系の細胞株(GTC-4)を樹立し、その細胞株が産生するEBV(以下GTC-EBV)のin vivo消化器系への感染性について検討した。【対象と方法】7週令の雄性BALB/cマウスを用いた。マウスの胃内に異なる濃度のアルコールを注入して急性粘膜障害を起こし、4時間後に胃内にウイルスを注入した。対照としてアルコール非注入マウスを用いた。ウイルス液は、樹立初期の細胞株(GTC-4)とGTC-4を特殊な条件下でクローニングした細胞株(GTG-5)をEBV誘導因子で処理して作成した。マウスはウイルス注入後24、48、72時間、21、60、100日、9ケ月、11ケ月で犠死せしめた。各種臓器を採取し、免疫組織法とEBEAプローブ(EBV-RNA)を用いたIn situハイブリト法でEBVの検索を行った。免疫組織染色の一次抗体は3種類のヒト血清と単クローン抗体として抗LMP-1、抗EA、抗NA-1、抗NA-2を用いた。【成績】アルコールで粘膜が傷害されたマウスはEBV注入後24時間でNA-2、EBERを胃腺の中間層の胃上皮細胞を中心に認めた。72時間以後ではLPM-1、NA-1蛋白を認めたが、感染細胞は胃腺部に限局されていた。腸管リンパ節はEBV陰性であった。60日以後にはウイルス蛋白の発現減少を認めた。100日目のマウスは胃腺の上層と下層の上皮細胞にLMP-1陽性細胞の増殖を認め、増殖組織は限局されていた。9ケ月目では胃と腸組織の腺底部にEBER陽性細胞の増殖を認めたが、LMP-1とEBV-DNAは陰性であった。11ケ月目の胃組織は組織構築の乱れと、Brdu取り込み細胞塊を認めた。【考察】GTC-EBVはBALB/cマウスの胃上皮細胞に感染することが判明し、消化器系におけるEBV感染モデルとしての有用性が示唆された。再生と細胞増殖が活発な胃組織ではLMP-1が早期に消失してしまう。このことは免疫監視機構からの回避を示唆している。今回のマウスでの結果は、ヒトEBV胃癌組織でEBERのみが発現している結果と類似していた。
安全・快適、コストパフォーマンスを実現する清潔ケアキットの開発と推進戦略の構築

これまで,私は重症者に行われている清潔ケアが蒸した綿タオル数本で済まされていること,再利用の綿タオルは感染予防上安全な素材でないこと,綿タオルの代替素材として化繊タオルを導入した比較実験では,ほぼ同等の素材であることを実証した。但し,生地表面が滑らかな化繊タオルを用いた清拭では,生地表面に凹凸のあるタオルに比べ,心地よさが感じられず主観的,客観的な変化が乏しいことがわかった。そうしたことから,化繊タオルの生地表面の形状の違い(粗い目,細かい目)が清拭効果に及ぼす影響を,主観的,客観的評価指標で比較検討した。その結果,全身清拭効果を主観的評価で比較すると,両者ともに清拭終了後に覚醒度の低下とリラックス度の増大が有意に認められたが,粗い目タオルでは肌触りで1項目が高評価であり,POMSで4項目の評点が有意に減少したのに対して,細かい目タオルでは顕著な変化がなかった。客観的評価では,両者ともに清拭終了後に皮膚の水分量の増加,油分量・pH,清浄度の低下と,開始から終了15分後まで心拍数の減少,副交感神経の上昇,さらに開始から終了30分後まで深部温,皮膚温の上昇がいずれも有意に認められ,保湿性,保温性,快適性は同様であった。したがって,生地表面の形状の違いによる全身清拭効果を総合的に判断すると,粗い目タオルのほうが細かい目タオルに比べ若干ながら主観的心地よさをもたらす効果に優れていることがわかった。現在、健康者を対象に化繊タオルの生地表面の凹凸による主観的・客観的に心地よさを追求しているが,今後は,基礎的データを踏まえ臨床におけるデータ収集を予定している。これまで,化繊タオルにおける生地表面の凹凸程度を変えて,データ収集に多くの時間を費やしてきた。そのことから,心地よい生地表面の凹凸の程度が明確になってきており,今後は迅速に進めていくことを考えている。今後,臨床現場でデータ収集することを予定している。これまでの基礎的研究結果,臨床における研究結果をもとに,企業と提携し商品開発を目指すことを考えている。それと同時に,先進国の重傷者の化繊タオルを用いた全身清拭を視察し情報収集をする。具体的には,全身清拭に費やす時間,使用後のごみ処理,広報活動も含めて検討する。特に,広報活動については,企業との連携で看護技術学会等で普及させる対策を考えている。清潔ケア素材の先進国である欧米への視察を視野に入れている。視察に行った際には,清拭にに費やす時間,清拭素材とその使用方法の見学,使用後のごみ処理等の情報収集を考えている。また,清潔ケア素材については,アジア諸国におけるニーズがあり,国内・国外の発表を考えている。論文発表も検討しており,特に英語論文の投稿には翻訳料の費用がかかる。
臨床推論学習とコミュニケーション学習を融合した医療面接実習方略の構築とその評価

(目的)学生が外来実習で経験した実際の患者に基づくシナリオで演ずるピア・ロールプレイが、患者の視点学習にどのように影響するかを探索することを目的とする。(方法)総合診療科の医学部5年生の臨床実習の医療面接スキルトレーニングの実習後に医学生によるフォーカスグループを行い、逐語録を作成し、これを質的に分析した。(結果)患者役を演じた学生は、ロールプレイと自らの面接実習を比較しながら、外来での面接実習を深く振り返っていた。その振り返りは、学生のコミュニケーションスキルに関する理解を深め、その理解はディスカッションを通して周囲の学生に拡散していた。【平成25年度の研究実績】平成25年度は、前年度(平成24年度)名古屋大学医学部医学科5年生の臨床実習班に対して行ったフォーカスグループの音声データ(11グループ、計58名分)に関して、質的分析を行った。特に分析の際、本実習の特色である「外来実習プログラムとコミュニケーション実習プログラムを融合させ、臨床推論とコミュニケーションの学習を融合させるために、実際の患者情報をもとに学生に患者役を演技させて医療面接ロールプレイを行う方略」が、実際に学生の患者の視点の理解にどのような効果をもたらしているのかについて着目した。平成25年度中に全11グループの分析をほぼ終了し、本実習の教育的効果として測定する「患者の視点の理解」について理論構築を行った。「患者の視点の理解」に関する学生の認識の深化については、さらに追加して分析する必要が生じたため、平成25年度名古屋大学医学部医学科臨床実習班(17グループ)のうち1グループに追加インタビューを行った。同意を得られた学生計6名に対して、半構造化した質問をもとにフォーカスグループを行った。その際これまでの理論をふまえ、理論強化に直接的に反映可能なデータを収集するため、特に、本実習のロールプレイの際に実際の患者情報を用いることの意義やそれに影響しうる要素(実際の患者の特性や、学生の学習環境、学生自身の前提知識)に焦点化してフォーカスグループを行った。昨年度までに収集した音声データに関する分析の成果については第45回日本医学教育学会(平成25年7月、千葉大学、千葉県千葉市)にて発表を行った。1.本研究の背景調査および発表外来実習プログラムとコミュニケーション実習プログラムの融合させ、臨床推論とコミュニケーションの学習を融合させるために、実際の患者情報をもとに学生に患者役を演技させて医療面接ロールプレイを行う方略が世界的にどの程度行われているかを調査した。これらについては、実際の患者情報をもとに学生が患者役を演技することは世界的にほとんど行われておらず、また行われている場合もその教育的効果についてはほとんど検証されていない事が明らかになった。この成果については、第44回日本医学教育学会(平成24年7月、横浜市)にて発表を行った。2.新医療面接実習プログラムの妥当性検証・学生の認識探索本年度は、臨床推論とコミュニケーションを融合した本実習の妥当性検証・学生の認識探索を行った。本実習は平成24年度名古屋大学医学部医学科5年生の全臨床実習班(20グループ)に行われた。そのうち11グループに関して研究への参加を依頼し、各グループのうち同意を得られた学生計58名に対して、半構造化した質問をもとにフォーカスグループディスカッションを行った。その際、本実習の妥当性検証については教育的効果を測定することに設定し、さらに教育的効果については「患者の視点の理解」に関して本実習による学生の認識の深化を測定することとして探索した。11グループの音声データについては随時逐語録を作成し、これらの質的分析については現在3グループの分析を行っている。平成26年度は、平成24・25年度に行ったフォーカスグループ(全12グループ)のデータを質的に分析し、理論生成を行った。結果は以下の通りである。実際の患者情報に基づいてロールプレイを行うことによって、学生は、実際の症例についての情報が潜在させる「診断との関連性の不確かさ」という特性を認識し、リアリティを感じていた。しかしその限界に影響する要素として、学生が把握している患者情報の限定性や、指導医の言葉や学生自身の解釈によって実際の患者とは異なる患者像が形成されることがあげられた。これらに加えて、実際の患者情報に基づくロールプレイは、患者役学生に、患者の視点の構成要素である「患者としての感情」を自覚させるとともに、医師としての自他比較の機会を提供していた。それによって患者役学生は、メタ認知的な視点をロールプレイ中に意識し、自分自身が患者と行ったコミュニケーションをより深く省察することができていた。このように、学生自身が診察した特定の患者とのコミュニケーションに関する深い省察を行うことで、学生は患者一般に適応しうるコミュニケーションスキルについて学ぶことができていた。さらに、患者役学生の深い省察や、それによって得られたコミュニケーションスキルへの理解は、グループディスカッションを通じて周囲の学生に共有された。

ただし、学生の患者の視点に関する理解は、感情面に関する理解に限定されており、患者の社会的背景への理解も、医学生自身と異なる社会的背景を持つ患者に対する社会的優越感に基づく、偏った理解になる可能性が示唆された。現在、論文作成中である。尚、研究成果の一部は、研究協力者の高橋徳幸が、本研究における経験をベースに独力で論文発表を行ったので、研究代表者の名前は共著者として入れなかった。医療社会学現在までに医師役・患者役・聴衆役へのフォ-カスグループおよび逐語録による分析をほぼ終了している。平成25年には構築された理論をもとに追加フォーカスグループを行い、平成24年・25年を合わせて12回のフォーカスグループを行っている。これらのインタビューに関する逐語録からの質的分析の結果、以下のような理論が生成されている。患者役の学生は実際の外来において学生・実際の患者・指導医との相互行為をもとに実際の患者に関する視点(考え、関心、期待、感情)や行動特性について、言語的メッセージだけでなく非言語的メッセージもふまえて学習を深めている。この実際の外来での学習から、患者役学生は、聴取されるべき重要点を認識し、ロールプレイにおいて医師役から“聴取される期待"をする。その上でロールプレイによる相互作用を通じて、患者役学生は“聴取される期待"が達成される際の満足感や、達成不十分である際の不満足感を感じ、一般的な患者としての疑似体験を行っている。この疑似体験は、一般的な患者に生じうる感情や行動特性についての理解を深めるとともに、患者役自身の医療面接技術に関する振り返りを促している。さらに、実際の外来およびロールプレイにおける患者役の学習は、ディスカッションという患者役・医師役・聴衆役の相互作用によって、患者役から医師役・聴衆役に拡散していることが判明している。これらは我々が目的とした本実習の教育的効果の測定および理論生成に迫るものであり、おおむね順調に進展していると考えられる。現在までに医師役・患者役・参加者への半構造化インタビューを行い、予定していた10回のインタビューに到達した。現在逐語録から質的分析をすすめ、理論化を行う段階に至っている。理論は生成途中ではあるが、本実習プログラムは患者役の学生だけでなく医師役・聴衆役の学生に対して、患者の視点について具体的で現実味を帯びた情報に触れる機会を与えていることが判明した。さらには、グループディスカッションを通じて学生は実際の患者と一般的な患者というスペクトラムのなかで揺らぎながら、学生自身の解釈も含めて患者の感情や関心・期待を推測し、患者の視点に対する認識を深めていることが明らかになってきている。(概要)国内・国外の学会にて学会発表を行い、英語論文作成を行う。
アミノ酸残基置換がT4ファージ尾鞘蛋白のサブユニット間相互作用と機能に及ぼす影響

上記の課題について得た成果を以下項目別に報告する。1)アンバー部位へのアミノ酸残基の挿入:大腸菌sul(Ser)株で選択された遺伝子18に変異のある17株のT4アンバー変異株を、sull(Gln)及びsulll(Tyr)株大腸菌に感染させた処、多くの場合(10株)いずれのサプレッサー株でもサプレスされたが、3株ではsullでのみ、他の3株ではsulllでのみサプレスされ、1株(E646)ではいずれのサプレッサーでもサプレスされなかった。今後、各T4アンバー株の変異部位を正確に決定することによってアンバー部位のアミノ酸残基の構造上、機能上の役割を検討する手がかりとしたい。2)プロテアーゼ抵抗性領域のマッピング:gp18をインタクトな状態でトリプシン消化し、生じた27K断片をSDS-PAGEによって単離した後、アミノ酸分析及びペプチドマッピングを行なうことによって、同断片はlle115からLys316までを含むことが分かった。この27K断片でウサギを免疫することによって抗体を得た。この抗体を用いたウエスタンブロッティングで染色することにより、トリプシン消化の中間体として一時的に現れる62K及び31K断片はいずれも27K断片を含むこと、またリシルエンドペプチダーゼによって得られる42K及び31Kについては後者が強く染まることから、前者がC末端側、後者は27K断片の大部分を含むN末端側であることが明らかになった。3)塩酸グアニジン変性:gp18はpH9.0で塩酸グアニジンにより可逆的な3状態変性(2段階変性)を示す。222nmにおける残基楕円率を指標として上記トリプシン消化断片の変性をモニターした処、この変性は元のgp18における全変性の80%を占める第1段階の変性に一致した。トリプシン抵抗性断片は、全αヘリックスの75%を含み、上記の80%という値に近いことから考えて、Gu・HCLではむしろ変性しやすい方のドメインである可能性があるが、今後の検討を要する。
テーラーメード抗がん剤を目指したピロールイミダゾールポリアミド・アルキル化剤

今年度の研究の進展により、固相合成法と組み合わせたアルキル化ヘアピン型ポリアミドの実用的な分子設計と合成経路の確立に成功した。新しい分子設計に基づいて合成したアルキル化剤は、まだ認識能に改善の余地が残っているものの、10塩基対を認識し効率的なアルキル化を可能にした。実際に、アルキル化ポリアミドを用いて、がんの分子生物学的知見に基づいたターゲティングを行い、遺伝子機能(mRNAへの転写、蛋白質への翻訳)に与える効果や塩基配列特異的アルキル化との関連性を評価した結果、標的とする塩基配列をタンパク質の遺伝情報が集約されているコーディング領域に設計することに成功した。従って、蛋白コード領域を標的配列としたmRNAやタンパクの発現制御は、アルキル化ポリアミドの配列特異的アルキル化によって実現する可能性があることを提案した。また、ヒト肺ガン細胞に対する発現に対する効果を、強い抗細胞活性を示したアルキル化ポリアミド分子を用いた結果、2種の異なる配列特異性をもつアルキル化ポリアミド分子に対して、配列特異性の差異に由来する興味深い細胞増殖阻害活性の変化と遺伝子の制御が観察された。メサンギウム細胞を使ったポリアミド分子の細胞および核への透過性の確認も進んでおり、配列特異的DNAアルキル化剤としての分子設計の最適化がほぼ完結した。現在、これまでに得られた情報を総合的に解析し、特定がん細胞に対し特異的に作用する目的のテーラーメード抗がん剤に活かすための生物学的応用を試みている。
表皮および毛包形成におけるHair keratinの新規機能の解明

Hirosaki Hairless Rat(HHR)はSprague-Dawley Rat(SDR)から生じたHair keratin遺伝子群の一部が欠失した乏毛を呈するラットである。HHRの表皮は肥厚し、毛包の向きは不揃いで、形はいびつである。Hair keratinはこれまで単なる毛や爪などの構造タンパク質として考えられてきたが、HHRでの毛包の表現型から、Hair keratinは毛包形成において何らかの機能を担っていることが予想される。本研究では毛包形におけるHair keratinの機能解析を試みた。胎生16日、20日、生後1日目、7日目のラット表皮の組織標本を作成し、HE染色したところ、胎生16日か生後1日目では毛包の向きはSDRとHHRで差異は認められず、表皮の肥厚もなかったが、生後7日目になるとHHRの表皮はSDRよりも肥厚し、毛包の形もいびつに変形していることが明らかになった。走査型電子顕微鏡や実体顕微鏡で皮膚表面を観察したが、生後1日目では変化はなかった。各時期の胎児を抗Hair keratin Kb21抗体で免疫染色すると、表皮はわずかに染色されるものの、毛包は染色されなかった。よって、Hair keratinは生後の毛包が発達する時期において発現し始め、表皮や毛包形成に関与していることが示唆された。また、表皮以外にHair keratinが発現している組織は認められなかった。現在、表皮細胞の分化マーカーで免疫染色し、HHRでの分化の異常を基にHair keratinの機能を探っている。今後は、生後1日目ラット表皮からケラチノサイトを分離培養し、DNAマイクロアレイで遺伝子発現の解析を網羅的に解析するとともに、Kb21と相互作用するタンパク質を検索し、その機能を検討する。本研究では毛包形成におけるHair keratinの機能解析を試みた。本年度は、ラットの皮膚よりRNAを抽出し、エクソンマイクロアレイ解析によって、遺伝子の発現を検討するとともに、スプライシングバリアントの異常を検索した。SDRに対しHHRラットについて、t検定を行い、2群間に有意差のある(ρ値<0.05)遺伝子を抽出したところ、HHRで発現が低下した遺伝子は43、亢進した遺伝子は234検出された。その中でも数種類のKeratin associated protein(KRTAP)の発現が大幅に低下していた。これらのタンパクはHair keratinと相互作用することが考えられており、Hair keratinの欠失によりKRTAPの発現も低下することが毛包の形成に異常をきたす原因であると示唆された。また、マトリックスメタロブテアーゼの発現が大幅に亢進しており、HHRでは毛包が移動しやすい環境下にあることも形態の異常に関与していることが考えられた。以上の結果より、Hair keratinはKRTAPの遺伝子発現に大きく影響を与える可能性が示唆された。しかし、KRTAPに関しては不明な点が多いため、Hair keratinとの直接的な相互作用を解析している。
生体機能性ポリマーによる形状記憶合金の表面改質と医療用具への応用

1.超弾性合金特性について(1)最適な超弾性を示すチタンニッケル合金の組成について、引張試験およびDSCによって検討した結果、体温における最適組成はTi-50.85Ni(mol%)近傍であると評価された。(2)特性改良に有効な熱処理条件としては、713773K、0.9ks程度の中温処理が有効であることがわかった。(3)合金鋳造体の疲労特性を検討した結果、CPチタン、Ti-6Al-4V合金と同程度の疲労強さを有すると評価された。2.ステントの設計・加工についてチタンニッケル合金の超弾性による自己拡張型ステントの基本設計を行い、合金チューブを素材としてレーザ微細加工を施すことによってステントモデルを作製した。3.合金の生体機能性ポリマーコーティングについて(1)表面コーティングに適するMPCポリマーアロイとしてMPCユニットが30mol%のMPC-n-ブチルメタクリレート共重合体(PMB30)を合成した。(2)PMB30をチタンニッケル合金表面にスピンコーティングし、被覆層の性質をSEM、エリプソメトリー、XPSで解析した。その結果、コーティング直後は辺縁部に不均一な被覆状態が認められたが、生理食塩水72h浸漬後には15-20nmに減少し、安定した皮膜層を形成することが判明した。4.合金の表面改質について(1)チタンニッケル合金の電解処理による表面改質に関し、XPSおよびAESによる表面解析を実施した結果、電解処理によって表面酸化皮膜の厚さが増加し、酸化の進行が認められた。(2)さらに、乳酸-グリセリン-水系の電解液を用いた処理によって酸化皮膜表層中のNiを除去することに成功し、Ni溶出の抑制、耐食性向上との関連性が示唆された。本研究の成果を総合すると、力学的高機能性、血液適合性、耐食性に優れたステントの開発が可能であることが判明し、生体に対する安全性および性能に優れた新規医療用デバイスの開発に貢献すると評価された。1.装置の骨格となる合金の特性について(1)生体用デバイスに最適な超弾性を示すチタンニッケル合金の組成について、引張試験および示差走査熱量測定(DSC)によって検討した結果、体温付近の温度における最適組成はTi-50.85Ni(mol%)近傍であると評価された。(2)特性改良に有効なチタンニッケル合金の熱処理条件については、713773K、0.9ks程度の中温処理が有効であることがわかった。2.合金の表面処理およびMPCポリマーコーティングについて(1)合金の表面コーティングに適するMPCポリマーアロイとしてMPCユニットが30mol%のMPC-n-ブチルメタクリレート共重合体(PMB30)を合成し、鏡面研磨した合金表面における被覆層の耐久性についてSEM、エリプソメトリー、XPSにより評価した。その結果、生理食塩水中で72h振盪浸漬した後でも、ホスホリルコリン基を表層側にした16nm程度の安定なMPCポリマー被膜にコーティングされていることが判明した。(2)チタンニッケル合金の電解処理による表面改質に関し、イオン溶出試験およびXPSによる表面解析を実施した結果、特に乳酸-グリセリン-水系の電解液を用いた表面処理によって耐食性が向上し、Niの溶出が抑制されることがわかった。3.ステントの設計および加工方法について(1)チタンニッケル合金の超弾性による自己拡張型ステントの基本設計を行った。(2)基本設計に基づき、レーザ微細加工によるステントの試作を進めている。

4.力学的試験について(1)機能力測定試験装置の設計、治具作製、組立てを行い、試験運転、調整を実施した。(2)チタンニッケル合金鋳造体について、大気中310Kにおいて疲労試験を行った結果、報告されているCPチタン、Ti-6Al-4V合金と同程度の疲労強さを有すると評価された。1.ステント臨床モデルの試作について(1)前年度行った基本設計に基づき、ステント臨床モデルを試作した。体温における超弾性組成であるTi-50.85Ni(mol%)のチタンニッケル合金チューブを素材として用い、レーザ微細加工を施すことによって作製した。(2)試作モデルは心血管拡張用の標準的なサイズとしたが、3ユニットからなる幅0.1mmのW型ストラットでは、引張に対する抵抗が不十分であると評価された。2.チタンニッケル合金の電気化学処理について(1)チタンニッケル合金の電解処理による表面改質に関し、XPSおよびAESによる表面解析を実施した結果、電解処理により表面酸化皮膜の厚さが増加し、耐食性の向上との関連性が示唆された。(2)また、乳酸-グリセリン-水系の電解液を用いた処理によって酸化皮膜中のNiが減少し、Ni溶出の抑制との関連性が示唆された。3.チタンニッケル合金のMPCポリマーコーティングについて(1)前年度に合成したMPCユニットが30mol%のMPC-n-ブチルメタクリレート共重合体(PMB30)をチタンニッケル合金表面にスピンコーティングし、被覆層の性質をSEM、XPSで解析した。(2)SEM観察では、コーティング直後の試料辺縁部に不均一な被覆状態がされた。また、XPS解析により、膜厚はコーティング直後の辺縁部で80nm、中心部で30nm程度であり、生理食塩水浸漬後には、それぞれ20nm、15nmに減少して安定することが判明した。1.ステント臨床モデルの作製について(1)前年度行ったステントの試作結果を受けて設計の改良を行い、体温における超弾性組成であるTi-50.85Ni(mol%)のチタンニッケル合金チューブにレーザ微細加工を施すことにより、ステント臨床モデルを作製した。2.チタンニッケル合金の電気化学処理について(1)前年度の結果において、合金酸化皮膜中のNiが減少し、Ni溶出の抑制が可能な電解処理条件が示唆されたため、乳酸-グリセリン-水系の電解液の組成を変化させることにより、チタンニッケル合金表面の酸化皮膜の変化、特にNi濃度の変化について、XPSおよびAESによる表面解析を実施した。(2)その結果、乳酸7.1-グリセリン35.7-水57.2(vol%)の処理液で電圧50V、30分間の電解処理を施すことにより、酸化皮膜表層約6nmにおいて組成中のNiを除去することに成功した。3.チタンニッケル合金の耐食性について(1)前項の条件によって電解処理を施したチタンニッケル合金の耐食性について、アノード分極試験により耐食性を評価した(2)その結果、腐食電位の上昇、不動態保持電流密度の低下に加え、孔食の発生が消失し、耐食性の明確な改善が認められた。4.生体機能性ポリマーコーティングについて(1)血液適合性に優れたMPC-n-ブチルメタクリレート共重合体(PMB30)のコーティング層の安定性について検討した結果、生理食塩水に振畳条件で浸漬した場合でも、72h後に厚さ1520n皿で安定に被覆されることが判明した。
プロトンNMRによる脳代謝機能のin vivoでの研究ーアミノ酸のコンバ-トメンテ-ション

今年度は、本研究で開発したin vivo^<13>CNMR測定のための動物実験系により、安定同位体^<13>Cで標識したグルコ-スの代謝動態の追跡が可能であるとともに、血液ー脳関門を介したグルコ-ス輸送過程に関する情報が得られることを明らかにした。(1)24時間絶食後の体重200g前後のラットに、前年度作成した血中グルコ-ス濃度安定化インフュ-ジョン・スケジュ-ルに従って1ー^<13>C標識グルコ-スを投与した。同時に、本研究で開発したin vivo^<13>CNMR検出用高感度サ-フィスコイル・プロ-ブを用いて、大脳皮質領域を対象とし、5分間隔で^<13>CNMRスペクトルを測定した。(2)^<13>C標識されたグルコ-スの1位の炭素は、TCA回路の1回転目でグルタミン酸のCー4位に移行し、2回転目からCー2位、Cー3位に移行することが報告されており、脳代謝においてもこれを支持する結果を得た。(3)グルタミンへの標識の移行は、グルタミン酸を前駆体とすることを反映すると考えられる遅れを示した。(4)血中グルコ-ス濃度は1分以内に安定化されているにも関わらず、脳内より検出される標識グルコ-スのピ-クは、定常値に達するまでに20分を要する緩慢な時間変化を示した。(5)この遅延を、血液ー脳関門のグルコ-ス担体輸送過程の介在によるものと仮定し、過渡状態の解析から輸送過程の速度定数の推定を行い、放射性同位体を用いた実験の文献値とよく一致する結果を得た。(6)以上より、今回開発した方法によって、実験的に変化させた生理状態下での血液ー脳関門の調節機構をin vivo NMRを用いて研究することが可能となった。今年度は, NMRによる脳代謝機能の無侵襲計測の基盤となる方法論の確立を目指し,以下の3項目を研究目標とした.1.高感度^<13>CNMRsurfaceコイル・プローブの作製:^<13>Csurfaceコイル・プローブは市販されていなかった為,日本電子(株)に試作を依頼した.しかし,試作プローブは検出感度,プロトン・デカップルのための′H核照射用コイル等に致命的な問題を有し,本研究の目的に適さないことが明らかになった.この為,プローブの設計原理にたちかえり,生物試料がコイル・プローブに与える誘電損失や磁気損失を考慮しつつプローブの抜本的改良を行った.その結果,コイル・プローブ設計に直列同調の平衡回路を導入して感度を飛躍的に向上させ,更に生物試料に対しても極めて安定したプローブを作製することに成功した.2.実験動物における^<13>C安定同位体標識化合物投与法の確立:この為には,生体系の外部応答が線形であると仮定し,基質をパルス投与した後のwashout kineticsをラプラス解析することで,本研究に必要な任意の投与法が得られることを明らかにした.又,この投与法作成の為の非線形最小自乗法による最適化プログラムを含むwashout kinetics解析プログラムを作成した.3.多波元生理学的データの同時計測法の確立:EEG, EKG,動脈圧,血液ガス分析値(pH, pCO_2, pO_2),体温等のパラメーターが同時モニターできるシステムを作成した.63年度は,前年度に作製した^<13>CNMRsurfaceコイル・プローブを用いてラット脳の特定部位(大脳皮質)でのグルコース・アミノ酸代謝を正確に測定するための方法を確立する.このため, surfaceコイルの形状や種々のパルス系列を最適化するための解析プログラムを作成し,シグナル局在化法を確立する.必要に応じてコイル・プローブの改良・変更を行う.1.^<13>CNMRサーフィス・コイル・プローブによる^<13>CNMR測定法の最適化-in vivo NMRにおける多重パルスを系列解析プログラムの開発。空間的に不均一な高周波磁場をつくるサーフィス・コイルによるNMR測定の場合には、測定領域の形状、大きさ、位置がパルス幅、繰り返し時間、緩和時間、オフ・レゾナソス周波数、被測定物の空間的位置等に依存し、更に多重パルス系列によるスピン系の応答は、シグナル強度のみならず位相も空間的に変化する。本研究においては、任意の形状と大きさのコイルによる任意の多重パルス系列に対するスピン系の応答を、上述のパラメータを関数として空間分布を含めて解析できる方法を開発した。この方法を利用して、^<13>CNMR測定の最適化を行なった。2.血液中の^<13>Cグルコースの比活性及び血糖値を一定にするインフュージョン・プロトコールの作成。脳のグルコース代謝やアミノ酸代謝のキネティックスを研究する場合には、血液中の^<13>Cグルコースの比活性及び血糖値を一定時間一定に保つことが、そのキネティクスを解析する上で望ましい。本研究では、この目的のためのインフュージョン・プロトコールを前年度に作成したwash-out kinetics解析プログラムを用いて作成した。その結果、投与開始後1分以内に定常値に達し、その値を1時間以上維持することが可能であった。3.^<13>CNMRによる脳代謝の測定。本研究で開発したin vivo ^<13>

CNMR検出用高感度コイル・プローブと動物実験系の組合せにより、5分間の時間分解能で、ラット大能皮質領域における標識グルコースとその代謝物-アミノ酸の動態を追跡することが可能となった。これにより、正常脳及び虚血、低酸素状態における〔1-^<13>C〕グルコース代謝の変化を測定した。今年度は、本研究で開発したin vivo^<13>CNMR測定のための動物実験系により、安定同位体^<13>Cで標識したグルコ-スの代謝動態の追跡が可能であるとともに、血液ー脳関門を介したグルコ-ス輸送過程に関する情報が得られることを明らかにした。(1)24時間絶食後の体重200g前後のラットに、前年度作成した血中グルコ-ス濃度安定化インフュ-ジョン・スケジュ-ルに従って1ー^<13>C標識グルコ-スを投与した。同時に、本研究で開発したin vivo^<13>CNMR検出用高感度サ-フィスコイル・プロ-ブを用いて、大脳皮質領域を対象とし、5分間隔で^<13>CNMRスペクトルを測定した。(2)^<13>C標識されたグルコ-スの1位の炭素は、TCA回路の1回転目でグルタミン酸のCー4位に移行し、2回転目からCー2位、Cー3位に移行することが報告されており、脳代謝においてもこれを支持する結果を得た。(3)グルタミンへの標識の移行は、グルタミン酸を前駆体とすることを反映すると考えられる遅れを示した。(4)血中グルコ-ス濃度は1分以内に安定化されているにも関わらず、脳内より検出される標識グルコ-スのピ-クは、定常値に達するまでに20分を要する緩慢な時間変化を示した。(5)この遅延を、血液ー脳関門のグルコ-ス担体輸送過程の介在によるものと仮定し、過渡状態の解析から輸送過程の速度定数の推定を行い、放射性同位体を用いた実験の文献値とよく一致する結果を得た。(6)以上より、今回開発した方法によって、実験的に変化させた生理状態下での血液ー脳関門の調節機構をin vivo NMRを用いて研究することが可能となった。