hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
レーザー推進における部分電離プラズマの非平衡輻射流体計算

本年度の研究では,準定常状態を仮定した輻射の放射・吸収,およびその原子状態から電離度等の気体の状態量を計算するコードを開発し,レーザーの屈折・吸収計算とともに流体計算と結合することでレーザー駆動管内加速装置(LITA)におけるプラズマの生成,およびそれによるブラスト波の形成過程を再現することに成功した。まず,現在のLITAの実験は不活性な単原子気体を用いているので,既存のコードでエネルギー準位やレート係数を計算し,それをもとに準定常状態を仮定した各エネルギー状態の存在確率を計算した.輻射計算で得られる放射率を流体との結合計算に利用するために,広範囲の密度・温度に対応するようにテーブル化した.また,本年度の結合計算に組み込むことはできなかったが,三次元の輻射輸送計算を効率的に解くための手法についても調査を行い,宇宙機が大気圏突入時に経験する輻射流れ場に対して適用した.開発した輻射流体コードを用いてLITAの基礎実験に対応した数値シミュレーションを行い,実験データとの比較を行った.その結果,実験で得られている衝撃波の伝搬速度や,プラズマの生成過程の様子をよく再現することができた.さらに,発光スペクトルの比較を行ったが,こちらに関してはまだ完全に一致しておらず,非平衡なプラズマの状態を記述するための計算手法に課題を残した.これに関しては現在,プラズマの非定常な状態を時間依存のレート方程式を解くことで再現することを試みている.さらに,効率的なレーザー推進システムの運用を目指して,レーザーエネルギーからいかに効率良く推進力を得るかについても調査を行った.その結果,得られる推進力は飛翔体の形状や,充填圧力に依存し,最適な条件があることがわかった.また,その傾向は実験で示唆されているものとも一致し,実験では不明瞭であった最適条件の存在を支持する結果が得られた.本年度の研究では,準定常状態を仮定した輻射の放射・吸収,およびその原子状態から電離度等の気体の状態量を計算するコードを開発し,レーザーの屈折・吸収計算とともに流体計算と結合することでレーザー駆動管内加速装置(LITA)におけるプラズマの生成,およびそれによるブラスト波の形成過程を再現することに成功した。まず,現在のLITAの実験は不活性な単原子気体を用いているので,既存のコードでエネルギー準位やレート係数を計算し,それをもとに準定常状態を仮定した各エネルギー状態の存在確率を計算した.輻射計算で得られる放射率を流体との結合計算に利用するために,広範囲の密度・温度に対応するようにテーブル化した.また,本年度の結合計算に組み込むことはできなかったが,三次元の輻射輸送計算を効率的に解くための手法についても調査を行い,宇宙機が大気圏突入時に経験する輻射流れ場に対して適用した.開発した輻射流体コードを用いてLITAの基礎実験に対応した数値シミュレーションを行い,実験データとの比較を行った.その結果,実験で得られている衝撃波の伝搬速度や,プラズマの生成過程の様子をよく再現することができた.さらに,発光スペクトルの比較を行ったが,こちらに関してはまだ完全に一致しておらず,非平衡なプラズマの状態を記述するための計算手法に課題を残した.これに関しては現在,プラズマの非定常な状態を時間依存のレート方程式を解くことで再現することを試みている.さらに,効率的なレーザー推進システムの運用を目指して,レーザーエネルギーからいかに効率良く推進力を得るかについても調査を行った.その結果,得られる推進力は飛翔体の形状や,充填圧力に依存し,最適な条件があることがわかった.また,その傾向は実験で示唆されているものとも一致し,実験では不明瞭であった最適条件の存在を支持する結果が得られた.
「個性」創発メカニズム解明のための樹状突起スパインイメージング法の開発と応用

哺乳類のおける生後発達期(幼児期ー思春期)における親から受ける養育は、子供の「個性」創発に最も大きな影響を与える環境的要因の一つである。本研究では、不適切な養育行動が子供の脳神経回路やその後の「個性」創発に与える影響について明らかにするため、幼児期ー思春期において、生きた動物からニューロンの形態や活動を計測するための手法の確立をおこなった。平成30年度は生後発達期において、より正確な活動計測を実現するため、既存のセンサー(GCaMP6f)よりも高いS/N比を有する高感度・高速カルシウムセンサーを特定の細胞種に発導可能なトランスジェニックマウスの作製、ならびにそれらを用いた2光子励起顕微鏡による生体カルシウムイメージングをおこなった。新規トランスジェニックマウスを用いて大脳皮質2/3層の興奮性ニューロンの活動イメージングをおこなったところ、生後発達期においても感覚刺激(視覚刺激およびヒゲ刺激)に対する神経応答を高S/N比で検出可能であることを確認した。また、抑制性ニューロンの活動イメージングについてもおこなったところ、ソマトスタチン陽性ニューロンは興奮性ニューロンと比較して、活動同期性が有意に高いことも明らかとなった。さらには、これら確立した活動イメージング法を応用して、不適切な養育行動(早期母子分離)が生後発達脳のニューロンの形態や活動に与える影響について、経時的にイメージング可能な実験系の確立に成功した。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。前頭前皮質は、思考や認知などを司る脳の最高中枢であり、「個性」と最も関連ある脳領域である。したがって、前頭前皮質の細胞体および樹状突起スパインの形態や活動を明らかにすることは、「個性」創発のメカニズム解明につながると言える。本研究計画では、個性」創発のメカニズム解明のための技術として、生きた動物からニューロンの神経活動や形態を可視化するための手法の確立をおこなった。平成29年度は、生後発達脳におけるニューロンの細胞体および樹状突起スパインの形態や活動イメージングをおこなう方法を確立した。具体的には、神経活動を可視化可能なカルシウムセンサーおよび膜電位センサーを子宮内電気穿孔法によってマウス大脳皮質に遺伝子導入し、2光子励起顕微を用いた生体(in vivo)イメージングによって、生後発達期におけるニューロンの活動および形態を可視化することに成功した。さらには、Flp組み換え酵素依存的に高感度・高速カルシウムセンサーを発現し、生後発達期における生体活動イメージングに利用可能な新規遺伝子改変マウスの創出にも成功している。これら確立した活動イメージング法を応用して、不適切な養育行動が発達期における前頭前皮質のニューロン活動や形態に及ぼす影響への評価についても着手している。今後は母子分離することで母親マウスの仔に接する時間の制限をおこない、養育行動の制限が生後発達期の細胞体および樹状突起スパインの形態や活動、樹状突起の電位情報統合に及ぼす影響について明らかにする。平成29年度の目標であった生後発達期におけるニューロンの細胞体および樹状突起スパインの形態とその活動を可視化する方法を確立することができた。確立したイメージング技術を用いて、不適切な養育行動が発達期における前頭前皮質にどのような影響を及ぼすかを明らかにする。母子分離することで母親マウスの仔に接する時間の制限をおこない、養育行動の制限が生後発達期の細胞体および樹状突起スパインの形態や活動、樹状突起の電位情報統合に及ぼす影響について明らかにする。
細胞集団における放射線誘発突然変異の頻度分布に関する研究

本研究では、放射線誘発突然変異が集団内で不均一に起こりうる可能性に着目し、細胞一つ一つの生理状態と突然変異の関係性を明らかにすることを狙う。本研究では、まず細胞に放射線を照射した後の生理状態が細胞の生存や突然変異にどのように関わるかに迫りたいと考えている。具体的には、細胞増殖が速く解析結果が早く得られるモデル生物の大腸菌を用い、放射線照射後の生理状態の突然変異への影響や、影響がある場合どのようなメカニズムでその影響が生じるのかの解明を目指して研究を進める。本年度は、大腸菌の放射線照射後の放射線効果、及び、照射後の培養条件が生物効果へどのように影響するのかを明らかにすることを目標に研究を行った。まず大腸菌野生型をX線照射した後固体最少培地で培養し、生存率とlacI遺伝子における突然変異頻度の線量依存性を明らかにした。さらに、X線照射後に2時間液体富栄養培地(LB培地)で培養後固体最少培地で培養すると、直接固体最少培地で培養した場合や照射後に16時間液体富栄養培地で培養した場合に比べ、照射後の生存率が高くなることを見出した。また、同様に突然変異頻度の変化を調べると、液体富栄養培地で2時間培養した場合には、直接固体最少培地での培養や16時間液体富栄養培地で培養した場合に比べ、lacI突然変異頻度が非常に高くなることが分かった。本研究で明らかになった培地依存的な放射線生物効果は、放射線照射後の細胞の生理状態の変化が致死や突然変異に強く影響する可能性を示唆している。野生型の大腸菌に対するX線照射効果を明らかにするとともに、放射線の生物効果が照射後の培養条件に依存することを見出した。このことは照射後の大腸菌の生理状態が突然変異誘発に深く関与することを示唆している。研究はおおむね順調に進展していると考えている。放射線突然変異誘発の照射後の培地依存性の原因を詳しく調べるために、recAやlexAといった主要なDNA損傷応答遺伝子欠損株を用いて、どのような機構により現象が起因するかを明らかにする。また、この培地依存性が放射線の線質に依存するかを明らかにするため、イオンビームの照射効果を調べる実験を開始する。一方で、青白コロニーを用いて突然変異を可視化する系を確立し、mutator頻度を調べる実験系の構築を行う。さらに、開発した検出系を用いてX線誘発mutator頻度を調べる実験を進める。X線誘発mutator頻度の線量依存性を調べ、誘発された変異の分布に関する基礎的知見を得る予定である。本研究を進めるためには、細胞レベルではなく細胞集団レベルでの過程を考慮し、統計的な分布という研究視点を取り入れて突然変異の本質や全体像に迫る必要がある。具体的には、細胞増殖が速く解析結果が早く得られるモデル生物の大腸菌を用い、コロニー内での変異を調べることによりmutatorを検出し、細胞集団内の突然変異の頻度分布を調べ、さらには、得られるmutatorの特徴解明を目指して研究を進める。本年度は、用いる大腸菌の系統作製及び大腸菌の放射線照射手法の確立を中心に研究を行った。大腸菌の系統作成においては、特に突然変異生成に関わる因子がmutatorとどのように関連するのかを調べるための遺伝子欠損株の作製を進めた。突然変異誘発の主要な原因となるSOS応答の制御を司る遺伝子であるrecA遺伝子機能欠損株の作成を行うとともに、近年突然変異誘発に深く関わることが明らかとなったストレス応答制御機能を有するrpoS遺伝子の欠損株を作製した。また一方でlexA遺伝子sulA遺伝子の二重遺伝子欠損株を作製して、SOS応答が常に働く突然変異株系統を作製した。また、大腸菌に放射線(X線)を照射するための培養条件(富栄養・最少倍地、培養時間)を決めるとともに、照射方法を確立した。突然変異誘発に関与する遺伝子を欠損させた大腸菌系統を作製し、突然変異誘発頻度を調べるための大腸菌の培養条件、及び照射条件を決定することができた。

本研究で明らかになった培地依存的な放射線生物効果は、放射線照射後の細胞の生理状態の変化が致死や突然変異に強く影響する可能性を示唆している。野生型の大腸菌に対するX線照射効果を明らかにするとともに、放射線の生物効果が照射後の培養条件に依存することを見出した。このことは照射後の大腸菌の生理状態が突然変異誘発に深く関与することを示唆している。研究はおおむね順調に進展していると考えている。放射線誘発突然変異を調べるためにまず突然変異検出のための実験系を確立する。具体的には、復帰突然変異を用いる系、選択倍地を用いる系、青白コロニーとして可視化する系等など様々な培養条件で突然変異を検出できる実験系の構築を目指す。また、本年度確立した照射方法を用いて作製した各種突然変異株の放射線感受性を調べるとともに、開発した突然変異検出系を用いて放射線誘発突然変異頻度を調べる実験を開始する。放射線誘発突然変異頻度の線量依存性を調べ、変異分布測定のための基礎的知見を得る予定である。放射線突然変異誘発の照射後の培地依存性の原因を詳しく調べるために、recAやlexAといった主要なDNA損傷応答遺伝子欠損株を用いて、どのような機構により現象が起因するかを明らかにする。また、この培地依存性が放射線の線質に依存するかを明らかにするため、イオンビームの照射効果を調べる実験を開始する。一方で、青白コロニーを用いて突然変異を可視化する系を確立し、mutator頻度を調べる実験系の構築を行う。さらに、開発した検出系を用いてX線誘発mutator頻度を調べる実験を進める。X線誘発mutator頻度の線量依存性を調べ、誘発された変異の分布に関する基礎的知見を得る予定である。当初計画を効率的に進めた結果、物品費を節約できたため、未使用額が生じた。これにより、当初計画に追加して研究を実施し、本研究の目的をより精緻に達成することを図る。未使用額は、追加する実験に係る物品費として使用する。
レト・ロマンス諸語のマルチメディア言語地図作成のためのプログラム開発研究

本研究は,言語学的研究,特に言語地理学的研究の先端的な試みとしてスイス・ロマンシュ語方言をとりあげ,現地収集した資料を基礎データとして取込みコンピュータ処理することによって,音声・形態・統語・語彙の各レベルにおける干渉現象を統合的に再構築するマルチメディア型言語地図作成プログラムを開発することを目的とする。人文科学に於けるコンピュータ利用の一分野としては,言語・民族資料のディジタル化,三次元的コンピュータ・グラフィックスによる空間的イメージ化,時間軸上に展開するマルチメディア・データベース作成プログラムの開発などの先端的な研究に向かう可能性を持つ。本研究は3年計画で立案されているが,本年度は過去に蓄積していた言語・民族資料のデジタル化に多くの時間を費やした。従って,本年度の研究は,本格的なマルチメディア化は先送りにせざるを得なかったが,それに至る前の試行錯誤的な段階として,マルチメディア言語地図の簡略版を作成した。(1)地図の作成:アップル社マッキントッシュ・パソコンと多機能データベースソフトであるHyperCard2.3Jを使用して,そのBackgroundに基本的な地図を描き,言語地図上に各種情報(海岸線・国境線,川,道路,市町村名,調査地点名等)を選択的に記載させる作業を行った。言語地図の作成には多大な労力が必要であるので,この作業を自動化できないかどうかを試みる必要がある。来年度には,カラー・スキャナーと色補正ソフトを導入して必要なフィルタをかけ,有意味な線だけを取りだして識別させ,自動描画を試みるつもりである。(2)HyperCardのボタン機能を利用して,上記の文字情報だけでなく,音声や図像も埋め込んで,選択的に表示あるいは再生させ,マルチメディア的なプレゼンテーションがある程度可能になるようにプログラミングを行った。来年度以降の計画は,引き続きアナログ的な資料として蓄積されているこれまでのデータをディジタル化し,音響学的処理,静止画像処理,動画処理などを進める。準備段階としてスイス・アルプス地方の等高線を利用した三次元的グラフィックスの作成に従事する。言語資料のみならず,図像資料や民族資料を活用して,三次元的な空間表示のなかにコンピュータ・グラフィックスの技術によりイメージ化してゆく。特に,スイス・アルプス地方の自然地理・人文地理的環境におけるレト・ロマンス語諸方言の言語史を三次元的言語地図として時間軸の上に統合的に展開させるオーサリング・システムの開発を視野に入れたいと考えている。
骨芽細胞による破骨細胞活性化の加齢に伴う変化の解析

骨芽細胞が産生する破骨細胞活性化因子は、単独では弱い活性しか示さないが、複数の因子が加わることによって活性化が著しく亢進される。そこでヒト破骨細胞のヒトの骨芽細胞による活性化が加齢に伴なってどのように変化するのかを次のように明らかにした。これまでヒトの破骨細胞は、材料である骨髄が入手しずらいことや、前駆細胞からの形成が困難等からほとんど調べられていなかった。本研究においてまずヒト破骨細胞を効率よく形成する系の確立を試みた結果、骨髄より単核細胞を分離して10^7個の細胞を8cm^2ディッシュに播種して10^<-8>M1,25(OH)_2D_3および20%馬血清を含むα-MEMで2週間培養すると大量の破骨細胞が形成されることが判明した。つぎに材料が少ないことから少量の破骨細胞で感度よく吸収活性を調べる系を検討した。骨片では僅かな吸収しか得られなかった。しかし、骨塩成分であるヒドキシアパタイトを被覆した石英ガラス(osteologic)の中央に50μlの破骨細胞の懸濁液を置いて培養したところ、1,000-30,000個の細胞数に依存してまた1-12日の培養日数に依存して吸収活性が増加した。このosteologicにヒトI型コラーゲンを被覆して骨片に近い状態にして、骨芽細胞による破骨細胞の骨吸収調節を検討したところ破骨細胞と骨芽細胞の接触がない状態では吸収活性の亢進は見られずむしろ抑制された。一方両者の細胞が接触できる系では骨芽細胞によって骨吸収が亢進された。donor ageによる骨芽細胞の骨吸収促進作用の強さの順は20才,65才,88才であった。非常に若い10才のdonorの骨芽細胞はむしろ吸収を抑制した。これらのことから高齢者の骨芽細胞は骨吸収亢進作用が弱く骨代謝が低い可能性が示唆された。しかし若齢および閉経後の患者の骨芽細胞ではin vivoで見られるように骨代謝が高いことが示唆された。加齢における骨芽細胞による骨吸収活性の調節の変化機序を解明することが今後の課題である。
マイクロチャネルを利用した天然物由来の均一非球形マイクロ構造体の作製技術の開発

研究代表者が昨年度に開発した均一サイズ非球形マイクロ液滴の連続作製が可能なマイクロチャネル(MC)アレイデバイスを用いた単分散非球形脂質マイクロ粒子の作製を試みた。円盤状の均一径マイクロ油滴(平均直径約15μm、変動係数3%未満、高さ約8μm)が、単結晶シリコン製のMCアレイデバイス内部のテラス溝型MCアレイ(65°Cに加温)介して連続相である乳化剤水溶液で満たされた井戸部へ圧入することにより作製された。前述の均一径円盤状マイクロ油滴は、デバイス下流部で冷却されて扁平状の単分散固体マイクロ粒子が得られることを示した。このように、本研究課題で開発したMCアレイデバイスを用いることにより、形状が制御された均一径非球形マイクロ液滴の作製ならびに均一径非球形固体マイクロ粒子の作製が実現された。また、上述のMCアレイデバイスを用いて作製された均一径円盤状マイクロ油滴は、数時間の液滴作製実験の間は合一に対して安定であることも示された。上述のテラス溝型MCアレイを介した円盤状微小液滴(精製大豆油)の作製プロセスの詳細がハイスピードカメラを用いて観察された。分散相(精製大豆油)がMCとテラスを通過した後に井戸部で膨張を開始した。その後、テラス内部の分散相が井戸部に急激に流入し、なおかつテラス内部の油水界面が分裂することによって液滴化が起こることが分かった。井戸部を有する矩形MCアレイにおいて、MC幅と井戸部深さの影響について検討した結果、円盤状微小液滴(精製大豆油)の直径はMC幅に依存することが示されたとともに、円盤状微小液滴(精製大豆油)の直径は井戸部がしきい値よりも浅い必要があることも明らかとなった。非球形マイクロ液滴を作製可能なマイクロチャネル(MC)アレイの構造設計を計算機手法であるCFD (Computational Fluid Dynamics、数値流体力学)を利用して行った。その結果、矩形チャネル出口にチャネルと同程度の高さのステップを設けることで矩形チャネルを介して円盤状のマイクロ液滴が安定的に作製されることを見出した。そして、この知見に基づいてシリコン製のMCアレイ基板(MCA-A,チャネル幅27.2μm、チャネル高さ5.0μm、ステップ高さ4.8μm;MCA-B,チャネル幅10.2μm、チャネル高さ1.9μm、ステップ高さ4.6μm)をフォトリソグラフィ、高周波誘導結合プラズマエッチング、熱酸化等のプロセスにより製作した。MCA-Aを用いた場合では、矩形チャネルおよびステップを通過した分散相(精製大豆油)が連続相(1.0wt%ドデシル硫酸ナトリウム水溶液)で満たされている井戸部で円盤状の均一径微小油滴(平均直径28.3μm、平均高さ9.8pm、直径の変動係数2.4%)が作製された。またMCA-Bを用いた場合では、数ミクロン径かつ均一径の円盤状微小油滴(平均円盤径8.2μm、平均円盤高さ4.6μm、円盤径の変動係数2.8%)を作製することができた。以上より、サイズが制御された均一径の円盤状微小液滴が、本年度開発した微細構造が制御されたMCアレイを用いることで作製できることが示された。また、本年度は、液滴作製用のMCアレイおよび液滴変形用のMCアレイを有するシリコン製の基板も開発した。この基板に加工された液滴作製用のMCアレイから均一径の円盤状微小油滴が連続的に作製されることを示したとともに、前記微小液滴の形状が液滴変形用のMCアレイに進入して栓状に変形することも示した。
架空絶縁電線表面における沿面放電現象

高圧架空配電系統において、絶縁電線は、電柱にがいしとバインド線により支持されている。配電線の近傍に落雷が発生した場合、電線の心線には誘導雷サージ電圧が侵入する。このサージ電圧が、電線の支持点に到達すると、がいしの絶縁破壊に続きバインド線先端から電線表面に沿って沿面放電が準展する。この沿面放電が、電線溶断事故などの原因となる。このような災害を未然に防ぐためには、沿面放電現象の特性解明が重要となるが、現在では未解明な点が多く存在している。本研究では、誘導雷サージの波高値V_m(V_m≦80kV)、波頭長T_f(1.2≦T_f≦100.0μs)が、電線表面を進展する正、負極性沿面放電にどのような影響を及ぼすかを観測し、以下のような新しい知見を得た。1、正極性沿面放電(1)進展長についてT_fに関わらずV_mの上昇と共に単調に増加する。しかし、T_fの増加と共に進展長は抑制される。(2)進展様相についてV_m、T_fが変化しても影響を受けず、電線表面をジャンプしながら進展する。2、負極性沿面放電(1)進展長についてT_f=1.2μs程度であれば、V_mの上昇と共に進展長の増加、減少領域が現れる。しかし、T_fの増加と共に、進展長の減少領域は縮減する。8.0≦T_f≦100.0μsでは、V_mの上昇と共に進展長は単調に増加するようになる。しかし、T_fの増加と共に進展長は抑制される傾向を示す。(2)進展様相についてT_f=1.2μs程度であれば、V_m≧70kVでは、バインド線先端で電線表面に密着するが、放電先端では、電線表面からジャンプする様相となる。T_f≧8.0μsでは、ジャンプ現象は抑制され、V_mの値に関わらず放電先端でも電線表面に密着する様相が現れる。負極性沿面放電では、T_fの変化によって、進展様相が変化し、それが進展長に影響を与えていることが明確になった。配電線の近傍に落雷が生じた場合、電線の心線には誘導雷サージ電圧が侵入する。このサージ電圧が、電線支持点に到達すると、がいしの絶縁破壊に続きバインド線先端から電線表面に沿って沿面放電が進展する。この沿面放電が、電線溶断などの災害の原因となる。このような災害を未然に防ぐためには、沿面放電現象の特性解明が重要となる。今年度は、誘導雷サージの波頭長T_f(1.2≦T_f≦20.0μS)が電線表面を進展する正極性、負極性沿面放電にどのような影響を及ぼすかを観測し、以下のような新しい知見を得た。1、正極性沿面放電(1)進展長について波頭長が変化しても進展長は影響を受けず、印加電圧波高値の上昇とともに単調に増加する。(2)進展様相について波頭長が変化しても進展様相は影響を受けず、バインド線先端から放電先端まで電線表面をジャンプしながら進展する。2、負極性沿面放電

(1)進展長について波頭長が標準雷インパルス程度であれば、印加電圧波高値の上昇とともに進展長の増加する領域と減少する領域が明確に現れる。しかし、波頭長の増加とともに、進展長の減少する領域は減少する。波頭長が、8.0≦T_f≦20.0/μSの範囲では、進展長は波頭長によって変化せず、印加電圧波高値の上昇とともに単調に増加するようになる(2)進展様相について波頭長が標準雷インパルス程度であれば、印加電圧波高値が70kV以上では、バインド線先端で電線表面に密着するが、放電先端では、電線表面からジャンプする様相となる。しかし、波頭長が長くなるに連れて、放電先端のジャンプ現象は抑制され、波頭長が8μs以上では、放電先端でも電線表面に密着する様相が現れる。負極性沿面放電では、波頭長の変化に応じて、進展様相が変化し、それが進展長に影響を与えていることが明確になった。高圧架空配電系統において、絶縁電線は、電柱にがいしとバインド線により支持されている。配電線の近傍に落雷が発生した場合、電線の心線には誘導雷サージ電圧が侵入する。このサージ電圧が、電線の支持点に到達すると、がいしの絶縁破壊に続きバインド線先端から電線表面に沿って沿面放電が進展する。この沿面放電が、電線溶断事故などの原因となる。このような災害を未然に防ぐためには、沿面放電現象の特性解明が重要となるが、現在では未解明な点が多く存在している。今年度は、誘導雷サージの波高値V_m(V_m≦80kV)、波頭長T_f(20.0<T_f≦100.0μs)が電線表面を進展する正、負極性沿面放電にどのような影響を及ぼすかを観測し、以下のような新しい知見を得た。1、正極性沿面放電(1)進展長について波頭長の値に関わらず波高値の上昇とともに単調に増加する。しかし、波頭長の増加と共に進展長は抑制され、T_f=100.0μsの場合では、T_f=20.0μsの場合より約50%減少する。(2)進展様相について波高値、波頭長が変化しても影響を受けず、電線表面をジャンプしながら進展する。2、負極性沿面放電(1)進展長について波頭長の値に関わらず波高値の上昇と共に単調に増加し、T_f≦5.0μsで現れるような進展長の減少領域は見られない。また、波頭長の増加と共に進展長は抑制される傾向を示し、T_f=100.0μsの場合では、T_f=20.0μsの場合より約70%に減少する。(2)進展様相について波高値、波頭長の値に関わらず放電は電線表面に密着して進展し、T_f≦5.0μsで現れる放電先端のジャンプ現象は見られない。20.0<T_f≦100.0μsの範囲では、放電先端が電線表面に密着するため、進展長は、波高値の上昇と共に単調に増加することが判明した。
ハイブリット非線形光学イメージング法による気液熱流動界面の分子選択的輸送現象解明

熱流動を伴う界面における分子の選択的輸送現象に関する新たなダイナミクス理論の体系化を目的として,分子の微視的挙動を計測可能とするハイブリット非線形ラマン散乱イメージング法の開発を行う.今年度の研究成果を下記に述べる.1.前年度まで非共鳴バックグラウンドノイズとして処理していた現象が,異常ラマン散乱光であることが判ってきた.現在まで国内外の学術論文にて言及されていなかったので,異常ラマン散乱光の特定にはかなりの時間を要した.レーザ光をガラスに照射した際に,ガラスからのラマン散乱光が隣接している溶液に対しては励起光となるが,溶液からのラマン散乱光が,ガラス材質に依存して異常な散乱光となる.石英ガラスを用いた際には,異常ラマン散乱光は見られず,ホウケイ酸ガラスでは,3,000 /cm以下では,異常ラマン散乱光となることが明らかとなった.2.前年度までは,ポンプ光およびストークス光を直接全反射させ,エバネッセント波を界面に照射し,界面極近傍に存在する分子からのCARS光を取得可能とするシステムの開発を行ってきたが,時空間の位相を合わせることが困難であった.そこでコリニア型ではなく,交差型を採用し,界面近傍にCARS光を発生させるシステムの開発を行った.これにより非共鳴バックグラウンドノイズの低減化を行い,高SN比が実現できた.本システムを低濃度電解質溶液に適用し,濃度空間分布計測が可能となった.3.全反射させたレーザ光を石英ガラスに導入させ,溶液側にエバネッセント波を照射し,固体・液体界面極近傍に存在する溶液中の水分子の振動モードを直接計測可能とするシステムの開発を行った.界面極近傍の水分子の変角振動(2nu_2),対称伸縮振動(nu_1),そして非対称伸縮振動(nu_3)の割合を,バルクと比較検討し,変角振動の減少,そして対称伸縮振動の増加が顕著であることが明らかとなった.非線形ラマン散乱光を用いて,熱流動を伴う界面における分子の時空間選択的輸送現象の解明を目標として,異常ラマン散乱光に伴うノイズ評価法および低減法の提案,そして界面極近傍に存在する分子挙動の解明を行う計測システムの開発を行い,今年度の進捗状況は概ね良好である.1.ラマン散乱光の光路を分岐可能となるイメージング分光器に,高感度を有するEM-CCDカメラを2台装着し,一方のカメラには水分子の非水素結合のラマンスペクトルのみを透過するバンドパスフィルタを装着し,もう一方には,4種類のバンドパスフィルタを装着して,異常ラマン散乱光のイメージング検出システムの開発を行った.石英ガラスおよびホウケイ酸ガラスを選定し,異常ラマン散乱光のイメージング結果と,それぞれのガラスからのラマンスペクトルとを比較し,ホウケイ酸ガラスを用いた際には,ラマンシフトが1,6003,000 /cm付近において,異常ラマン散乱光が顕著であることを初めて明らかにした.これにより,非共鳴バックグラウンドノイズとともに,ガラス材質に依存する異常ラマン散乱光をも考慮しなければならないことが判った.2.実験では界面極近傍に存在する分子挙動の計測結果は,バルクとそれ程変わらないと思われてきたが,深さ方向のエバネッセント波照射領域が百ナノ以下であっても,分子挙動はバルクとは異なっていることが明らかとなった.溶液中の水分子を対象とした際,界面極近傍の3つの振動モードの中でも変角振動および対称伸縮振動の変化がバルクとは異なっていることから,エバネッセント波およびラマン散乱光を併用することにより,界面極近傍に存在する分子挙動の把握は充分可能であることを示すことができた.熱流動を伴う界面極近傍に存在する分子挙動を非侵襲にて計測が可能となることが今年度判り,更にノイズの特定および低減も可能となったことから,最終年度では,1.分子そのものの挙動の時空間分布イメージングを試みる.イメージング分光器を用いて,ホウケイ酸ガラスの異常ラマン散乱光の検出が初めて可能となったことから,2台のイメージング分光器に3台のEM-CCDカメラを装着し,異なるラマンシフトからのラマン散乱光のイメージング化を行い,分子挙動そのものを捉えることを試みる.具体的には,温度および濃度時空間分布をイメージング化し,膨大なラマン散乱光の画像から,分子そのものの挙動のイメージング化を行う.最初に水分子を対象とし,次に,水分子のラマンスペクトルの影響が少ないイオンを選定して行う予定である.2.ラマン散乱光は蛍光と比較すると微弱とは云え,カメラの露光時間やゲイン等を的確に設定すれば,例えば,水分子の動態,即ち,振動モードおよび水素・非水素結合そのものの計測は充分可能であることが判ってきた.そこで,電解質溶液,固体表面性状(親水性・疎水性)等のパラメータを多種選定し,ラマン不活性な分子やイオンの挙動を,水分子を介して,即ち,間接的に計測を可能とするシステムの開発を行う.具体的には,膨大なラマンスペクトルから特徴的な物理量を抽出,膨大なラマン散乱光の画像から多次元的な校正関数の導出を行う予定である.熱流動を伴う界面における分子の選択的輸送現象に関する新たなダイナミクス理論の体系化を目的として,分子の微視的挙動を計測可能とするハイブリット非線形ラマン散乱イメージング法の開発を4ヶ年に渡り行う.今年度の研究成果を下記に述べる.1現有のフェムト秒レーザシステムおよび光パラメトリック発振器からのポンプ光およびストークス光を,倒立顕微鏡,分光器およびEM-CCDカメラから成るCARS光受光システム,そして倒立顕微鏡,分光器および購入したEM-CCDカメラから成る偏光CARS

光受光システムに導入するハイブリッドCARS光計測システムの開発を行った.回転角度精度0.02度を有する偏光CARS光受光システムにより,取得した濃度分布結果が理論とほぼ一致することを確認した.2二酸化炭素および窒素のラマンシフトに一致するCARS光発生に対応したポンプ光およびストークス光を,Colinear CARSに適応するように対物レンズを介して気流に照射可能とするCARS光発生システムの開発を行った.平行してBox CARSも考慮しシステムの開発を行ったが,光学系の角度調整が非常に困難であることが判明し,レーザ光径の変換が容易なColinear CARSを今後は採用することとした.CARS光強度と非共鳴バックグラウンドノイズの強度との関係を明らかにし,レイノルズ数変化に応じて変化する気流濃度分布の取得を行った.3購入した全固体レーザを用いて,液体内にてレーザ光を全反射させ,気流側にエバネッセント波を発生させることは可能であったが,液体からの非共鳴バックグラウンドノイズが非常に大きく,CARS光取得が困難であることが明らかとなった.購入したレーザプロファイラにより,CARS光取得に及ぼす非共鳴バックグラウンドノイズの影響を定量的に把握することが可能となり,新たなエバネッセント波照射システムの開発が必要となってくる.非線形ラマン散乱光を用いて,熱流動を伴う界面における気体分子の時空間選択的輸送現象の解明を目標として,CARS光発生方式の違いによる非共鳴バックグラウンドノイズの定量的評価,ならびにハイブリッドCARS光計測システムの開発を行い,今年度の進捗状況は概ね良好である.1開発したハイブリッドCARS光計測システムをマイクロデバイス内電解質溶液に適用し, CARS光強度が濃度の二乗に比例することが明らかとなり,理論と一致することを確認した.これにより,ハイブリッドCARS光計測システムの有効性が確認できた.2非共鳴バックグラウンドノイズを考慮して,Colinear CARSおよびBox CARSの検証を行い,CARS光強度と非共鳴バックグラウンドノイズとの関係が容易に把握可能であるColinear CARSを採用することにより,二酸化炭素および窒素からなる混合気流濃度分布の計測が可能となった.熱流動を伴う界面における分子の選択的輸送現象に関する新たなダイナミクス理論の体系化を目的として,分子の微視的挙動を計測可能とするハイブリット非線形ラマン散乱イメージング法の開発を4ヶ年に渡り行う.今年度の研究成果を下記に述べる.1.前年度の結果より,光学系の角度調整が非常に困難なBox CARSではなく,レーザ光径の変換が容易なColinear CARSを採用し,前年度に開発したColinear CARS光受光システム,および偏光CARS光受光システムを,マイクロデバイス内に形成される液体・液体界面における化学反応に適用し,電解質溶液濃度分布の計測を行った.また,デバイスを構成する材質として,石英ガラスおよびホウケイ酸ガラスを選定し,ガラスからの非共鳴バックグラウンドノイズのCARS光強度に及ぼす影響を定量的に明らかにした.2.更に,二酸化炭素および窒素からなる気流混合場にも適用し,各気体の濃度分布計測を行った.デバイス材質として石英ガラスのみとし,ガラスからの非共鳴バックグラウンドノイズのCARS光強度に及ぼす影響の低減化を図った.
船型要素を考慮した実用的な船舶操縦性能推定法に関する研究

船舶の設計段階で操縦性能を推定するという社会的な強い要請があるにも拘らず、未だ船型要素を充分に考慮してこの性能を推定する方法は確立されていないのが現状である。本研究はこのような問題を背景に、出来るだけ船型形状を正確に取入れたより精度の高い実用的な推定法を開発することが目的である。そこでまず、操縦性能推定に不可欠な船体に作用する流体力に関して船体形状を考慮した流体力推定を細長体理論をベースに理論計算法の開発と共に数値計算を行った。大型タンカー2隻,一般貨物船1隻についての計算結果およびこれらの模型試験結果より比較検討した結果,渦の流出位置を表わすパラメータ(S)を選択することで形状の違いを考慮して主船体に働く流体力を推定出来ることが確認された。流体力に関する船体の形状影響を評価出来る点で有効な方法と考えられる。また,本計算法による船体流体力の推定には船型要素だけでなく運動によってもSを変えることが必要であるとの知見を得た。しかし大きな角速度を有す旋回運動時の船体に作用する流体力に関しては計算値と模型試験の値によい一致は見られず,今後更に渦モデルの改良が必要であると思われる。次に船体が静止状態から真横に運動を開始した時の船体横断面に働くCross Flow Dragの推定に際しては,渦モデルを用いて船体中央部付近のCross Flow Dragに及ぼす横断面のビルジ半径と船幅吃水比の影響を明らかにした。この場合自由渦の流出方向および流出直後の循環の変化を考慮すれば、現室に即した計算結果が得られる。またこのGross Flow Dragはビルジ半径が大きくなるにつれて小さくなることが判明した。船舶航行の安全性を確保する為に、国際海事機関(IMO)では操縦性基準を設定すべく検討を進めている。ところが、この基準を満足させる為には、船の設計の段階で操縦性をより精度良く推定することが不可欠となる。しかし現状では、船体の主要目程度の考慮が主となっており、局部的な船型の変化により操縦特性が異なる現象に対応した推定法は確立されているとは言い難い。また実際上、船の設計時に船型要素を正確に考慮して操縦性能を推定するとなると、数学モデルを用いた操縦運動のシミュレーション計算による方法が最も有効となる。しかしその推定精度にはまだ不十分な点が多く、実用に供するには充分な検討が必要である。さらにシミュレーション計算により操縦性能を推定する為には、その基礎となる船体に動く流体力を精度良く推定さることが必要不可欠であるが、現在のところ、一般の通常船型以外の船型に対して、船体流体力を理論的に精度良く推定することは困難である。そこで本年度は、船型要素を船体流体力に如何にして正確に取入れるのかについての研究開発を行った。即ち、船の横流れ角が小さく、船体に働く流体力の成分の中で揚力が支配的である場合については、船尾の肥大した針路不安定な船型を対象とし、細長体理論と伴流モデルを組合わせた方法を基に、船尾形状と船体流体力との相関について理論的に検討した。また船尾形状のみが異なる場合の模型船を製作し、船体流体力を計測することにより理論計算との比較検討を行った。一方、船の横流れの大きい場合については、クロスフローを基にした渦モデルを用いて、種々の形状を有する船体横断面に働く流体力の算定法を開発した。以上の結果、船体の船尾形状・各フレームライン形状、自由渦の流出位置・流出角および船体流体力との相互関係が明らかになった。前年度導いた渦モデルを用いた流体力の計算法において,船体に作用する横力についてはかなりの精度で計算が可能であるが,モ-メントについては実験値と比較して相異がみられる。この相異は渦の流出方向の違いと,流体力を求める理論計算において,内部領域と外部領域の問題をより正確にマッチングさせていないことによるものであることが判明した。

従って,本年度は渦モデルの改良として,船体から流出した自由渦は,船体の各断面に剥離点を仮定し,渦の流出位置を水平に且つ直線状に流出させる。またこの剥離点は斜航運動時の場合ビルジ付近に仮定するのが妥当であると考えられるが,旋回運動時に左右舷に複雑に変化することより,ここではKEEL線上に置くといった渦モデルを設けて計算を行った。この結果,操縦運動時の主船体流体力を3種類の船型について計算値と模型実験結果を比較すると,渦の位置を変えることで船体形状の違いを考慮した船体流体力を確認することが出来た。また偏角の大きい領域の運動では船体流体力の中ではcross flow dragが支配的になる。そこで船体が静止状態から直横に運動を開始した時の船体横断面に働くcross flow dragの推定に際しては,渦モデルを用いて船体中央部付近のcross flow dragに及ぼす横断面のビルジ半径と船幅吃水比の影響を明らかにした。この場合,自由渦の流出方向および流出直後の循環の変化を考慮すれば,現実に即した計算結果が得られる。またこのcross flow dragはビルジ半径が大きくなるにつれて小さくなることが判明した。
植物における転写因子相互作用による遺伝子発現調節機構

本研究では、コムギヒストンH3遺伝子の細胞周期S期特異的発現を規定するシスエレメントであるtype Iエレメントのヘキサマー配列に結合する転写因子、HBP-1a及びHBP-1bを中心に、これらと関連する他の転写因子の同定及びその構造・機能解析について研究を行った。以下に、2年間の研究成果の概要を示す。1.HBP-1a及びHBP-1bサブファミリーの性質について:HBP-1a及びHBP-1bがサブファミリーを形成していることは、既に明らかにされていたことであったが、本研究において、サブファミリーの各メンバーのbZIPドメインを介した2量体形成能とDNA結合能において、明らかな違いが見られた。このことから、これらファミリー転写因子群はその組み合せを変えることによって遺伝子の転写調節を行っている可能性が示唆された。2.OBRFの同定:type Iエレメントのもうひとつの構成要素であるオクタマー配列に結合する核蛋白質(OBRF)がコムギ培養細胞の核抽出液に存在することを、DNAmobility shift法によって同定した。OBRFは極めて不安定であるため、現在のところ詳細な解析は進んでいないが、この蛋白質のDNA結合活性は、ヒストンH3遺伝子の発現量と平行関係にあり、S期においてもっとも高かった。3.転写因子HALF-1の構造解析:HBP-1a(17)と蛋白質-蛋白質相互作用を介するDNA非結合型転写因子のcDNAをWest-westerm法によりクローン化した。cDNAの構造解析の結果から、この蛋白質は、構造的特徴において、HBP-1aサブファミリーのメンバーに非常によく似たものであり、ホモ2量体としてDNAに結合できなく、HBP-1a(17)とのヘテロ2量体となった時のみ、DNAに結合できることが明かとなった。このことから、WZF1はHBP-1aサブファミリーのメンバーの機能を、ヘテロ2量体形成を介して制御している可能性が示唆された。コムギのヒストンH3遺伝子の細胞周期のS期特異的発現をモデル系として,植物における遺伝子発現制御に関わるシスエレメントとトランス制御因子との関係及び因子間相互作用についての研究を進めた。ヒストンH3遺伝子のS期特異的発現を付与するシスエレメントとして推定されているヘキサマー配列とオクタマー配列に人為的突然変異を導入し,この改変遺伝子を持つイネ培養細胞の形質転換体を作出した。アフイディコリン処理法による細胞分裂の同調系における転写産物の解析からH3遺伝子のS期特異性は上記2つのシス配列の協調的な働きによっていることが明らかになった。ヘキサマー配列に結合する因子として,既にその構造を明らかにしているHBP-la(17)とHBP-lb(C38)について,その機能をリポーター遺伝子とエフェクター遺伝子のコトランスフェクションによる一過性的発現系を用いてしらべたところ,HBP-la(17)はH3遺伝子のプロモーター活性に抑制的に働くことが示された。一方,オクタマー配列に結合する核タンパク質として,ssDBP-1とssDBP-2が同定された。これらはいづれも単鎖DNAと結合し,前者はコード鎖を,後者は非コード鎖を認識した。ssDBP-2については,そのcDNAの塩基配列からタンパク質の一次構造として,RNA結合タンパク質に存在するRNPモチーフを2ヶとプロリンや酸性アミノ酸に富む領域を持つ特徴的な核タンパク質であることが明らかとなった。このタンパク質の転写因子としての機能解析は現在進行中である。また,ssDBP-1のcDNAのクローン化についても引続き努力している。

これまでの研究結果を総合的に考える時,HBP-1a及びHBP-1bとオクタマー結合因子との相互作用においてコファクターの存在が仮定された。このコファクターのcDNAをクローン化すべく、West-western法や酵母における発現系を利用したtwo-hybrid系などを使って研究中である。昨年度に引き続き、コムギヒストンH3遺伝子の細胞周期S期特異的発現を規定するシスエレメントであるtypeIエレメントのヘキサマー配列に結合する転写因子、HBP-1a及びHBP-1bを中心に、これらと関連する他の転写因子の同定及びその構造・機能解析の研究を行った。1.HBP-1a及びHBP-1bサブファミリーの性質について:HBP-1a及びHBP-1bがサブファミリーを形成していることは、既に明らかにしていたことであったが、今回、サブファミリーの各メンバーのbZIPドメインを介した2量体形成能とDNA結合能に、明らかなる違いが見られた。このことから、これらファミリー転写因子群はその組み合せを変えることによって遺伝子の転写調節を行っている可能性が示唆された。2.OBRFの同定:typeIエレメントのもうひとつの構成要素であるオクタマー配列に結合する核蛋白質(OBRF)が、コムギ培養細胞の核抽出液に存在することを、DNA mobility shift法によって同定した。OBRFは極めて不安定であるため、現在のところ詳細な解析は進んでいないが、この蛋白質のDNA結合活性は、ヒストンH3遺伝子の発現量と平行関係にあり、S期においてもっとも高かった。3.転写因子HALF-1の構造解析:HBP-1a(17)と蛋白質-蛋白質相互作用を介するDNA非結合型転写因子のcDNAをWest-western法によりクローン化した。cDNAの構造解析の結果から、この蛋白質は、構造的特徴において、HBP-1aサブファミリーのメンバーに非常によく似たものであったが、ホモ2量体やHBP-1a(17)とのヘテロ2量体としてはDNAに結合できないことが明らかとなった。このことから、HALF1はHBP-1aサブファミリーのメンバーの機能をヘテロ2量体形成を介して制御している可能性が示唆された。
新規低酸素誘導性初期化遺伝子GLIS1機能解析および診断・治療法開発研究

iPS細胞誘導において,新たな細胞初期化因子として証明されたGLIS1ですが,その制御・機能は全く明らかにされていません。そこで,GLIS1の詳細な制御機構,分子機能について検討することを本研究の目的としました。GLIS1を強制発現する乳がん細胞やsiRNAを用いた抑制実験の結果,GLIS1は,がん細胞の増殖能に対しては抑制的であるが,遊走能やSphere形成能(または幹細胞形質)に対しては促進的に機能していることが明らかとなった。一方,多くのがん細胞において,DNAメチル化により発現抑制されていることも示され,その機能ががん細胞において精密に制御されていると考えられた。そこで,この細胞初期化を促進する転写因子GLI-similar 1(GLIS1)の詳細な制御機構,分子機能,そして,口腔がんにおける機能的・臨床的意義について検討し,がん診断・治療法開発への応用展開することを目的として,本申請研究を開始しました。初年度は,口腔がん細胞株HSC2に加え,乳がん細胞株MDA-MB-231にGLIS1発現プラスミドベクターを遺伝子安定導入を試みました。まず,MDA-MB-231に3ラインの導入株が得られたので,細胞機能に関しての予備的な実験を開始しました。MDA-MB-231のGLIS1強制発現株では対照株に比べて,細胞増殖能は明らかに抑制されたが,創傷治癒実験による遊走能は明らかに増加していた。一方,ノンコーティング培養皿を用いた培養により,Sphere形成能が向上している様子が観察された。現在は,HSC2細胞に加え,肺がん細胞株A549も用いて導入細胞株を作製中であり,結果の再現性,普遍性を確認予定である。一方,口腔がん,肺がん,乳がん細胞株に5azaC処理後にGLIS1遺伝子発現解析を行った結果,幾つかの細胞株では,明らかな発現増加を認めました。これらの結果は,GLIS1遺伝子発現がDNAメチル化により抑制されている可能性を示唆するものであり,プロモーター解析とともに,比較検討を進めています。GLIS1強制発現細胞によるGLIS1機能解析はHSC2細胞では細胞作製に手間取ってはいますが,先に出来上がったMDA-MB-231において,明らかな細胞機能が表現型として観察されたことから,今後の解析にも期待が持たれます。また,GLIS1発現制御に関しても,DNAメチル化による発現抑制の可能性を示唆する結果を得たことから,今後の解析も,自信を持って進められます。一方,HIF-2とAP-1の相互作用の解析において,市販の抗体での解析が成功しないため予定通り進められていません。そこで,ゲノム編集技術を用いて,HIF2A(EPAS1)遺伝子の3'領域にGFPタグを挿入した細胞を作製しました。これにより内在性のHIF-2aタンパクがGFP融合タンパクとして発現し,IPなどの抗体使用実験も安定的に利用可能な抗GFP抗体を用いた実験が可能となります。初年度中に細胞株が作製できたため,次年度の解析に期待が持たれます。本年度までに,口腔がん細胞株HSC2に加え,肺がん細胞A549や乳がん細胞MDA-MB-231にGLIS1発現プラスミドベクターを遺伝子安定導入を試みました。最初に,MDA-MB-231に3ラインの導入株が得られたので,細胞機能に関しての実験を開始しました。一方,ノンコーティング培養皿を用いた培養により,Sphere形成能が向上している様子が観察されました。一方,siRNAによる抑制実験では,酸素分圧にかかわらず細胞増殖脳が観察されました。今後,様々な歳暮株での再現性,普遍性を確認予定である。さらに,RNAシークエンスの結果から,低酸素環境下において,p53シグナルの抑制や脂肪生成,フォスファチジルイノシトールシグナルや活性酸素応答の活性化などへの関与が示唆されました。同データのさらなる詳細な解析を進め,分子生物的,生化学的解析により検証し,論文作成に取り掛かります。細胞における機能などの概要がRNAシークエンスで明らかとなり,本年度中には論文作成に向けて詰めの実験に取りかかれる。そこで,この細胞初期化を促進する転写因子GLI-similar 1(GLIS1)の詳細な制御機構,分子機能について検討し,がん診断・治療法開発への応用展開することを目的として,本申請研究を開始しました。いくつかのがん細胞を用いて検討を重ねた結果,乳がん細胞MDA-MB-231において,GLIS1発現プラスミドベクターを遺伝子安定導入したクローンを複数確立し,細胞機能に関しての実験を開始しました。MDA-MB-231のGLIS

1強制発現株では対照株に比べて,細胞増殖能は明らかに抑制されたが,創傷治癒実験による遊走能は明らかに増加していました。一方,ノンコーティング培養皿を用いた培養により,Sphere形成能が向上している様子が観察されました。一方,siRNAによる抑制実験では,酸素分圧にかかわらず細胞増殖能の亢進が観察されました。これらの条件下で調製したtotal RNAを用いて,マイクロアレイ解析による網羅的遺伝子発現解析を行なった結果,組織のリモデリング,上皮間葉移行(EMT),脂質や糖質などの代謝,p53経路などに関わる遺伝子の発現変動が観察されました。さらに,様々な細胞株をDNAメチル化阻害剤5-azaCにて処理したところ,多くの乳がん細胞株口腔がん細胞株において,GLIS1遺伝子発現の増加が観察されました。これまでの結果から,GLIS1は,がん細胞の増殖能に対しては抑制的であるが,遊走能やSphere形成能(または幹細胞形質)に対しては促進的に機能していることが明らかとなった。一方,多くのがん細胞において,DNAメチル化により発現抑制されていることも示され,その機能ががん細胞において精密に制御されていると考えられました。iPS細胞誘導において,新たな細胞初期化因子として証明されたGLIS1ですが,その制御・機能は全く明らかにされていません。そこで,GLIS1の詳細な制御機構,分子機能について検討することを本研究の目的としました。GLIS1を強制発現する乳がん細胞やsiRNAを用いた抑制実験の結果,GLIS1は,がん細胞の増殖能に対しては抑制的であるが,遊走能やSphere形成能(または幹細胞形質)に対しては促進的に機能していることが明らかとなった。一方,多くのがん細胞において,DNAメチル化により発現抑制されていることも示され,その機能ががん細胞において精密に制御されていると考えられた。今年度は,引き続き,GLIS1導入株の作製,およびそれらを用いた細胞生物学的および生化学的解析,網羅的遺伝子発現解析を進めます。また,ゲノム編集によりGFPタグを挿入したHIF-2aを用いて,AP-1(JUNやFOS)との相互作用に関して,生化学的な解析を行います。さらに,GLIS1遺伝子のシークエンスやメチル化解析を進め,geneticやepigeneticな異常が見いだされた場合,将来的な臨床検体を用いた解析へ向けて,ハイスループットに解析する方法の開発を試みます。低コストなmutation-specific PCR,PCR-RFLPやmethylation-specific PCR法やprobe-based real-time PCR法などが候補となります。そして,HIF-2αやAP-1阻害剤による,HIF-2αとAP-1の機能変化,GLIS1発現変化,GLIS1発現と細胞応答(増殖,遊走,コロニー形成,薬剤感受性など)の関連性を比較検討し,治療法開発への応用展開の可能性を探ります引き続き,GLIS1導入株の作製,およびそれらを用いた細胞生物学的および生化学的解析,網羅的遺伝子発現解析を進めます。
ため池におけるセルロースの分解にベントスが果たす役割

ため池や水路のベントス20種から抽出した粗酵素を用い、セルロース・キシラン・マンナンを基質としたプレートアッセイ法で活性を調べた。その結果、ヤゴを除くすべてのベントスから、何らかの基質に対する酵素活性が示された。淡水貝類や水生ミミズ由来酵素は、3基質に対して強い活性を示し、なかでもスクミリンゴガイの活性は群を抜いていた。また、カゲロウやトビケラもセルロースに対する活性を示し、水生昆虫がセルロースの分解・同化を通してため池に蓄積される難分解多糖の系外持ち出しを担っている可能性が考えられる。セルロースを基質とした高感度ザイモグラフィーで、各ベントス粗酵素中のセルラーゼ分子量を測定したところ、固有のバンドパターンを示すことが多かった。この結果は、各生物が独自にセルラーゼを作っている可能性を示唆している。特に同所的に生息する貝類のセルラーゼのバンドパターンが大きく異なっていたことは、貝類のセルラーゼが生息場所からの持込細菌によるものではないことを示す有力な傍証と考えられる。分光光度計の購入が実現しなかったため、酵素活性の温度依存性を7°C、17°C、27°C、37°Cにおけるプレートアッセイの酵素反応面積比較により調べた。熱帯から進入したスクミリンゴガイは温度に比例して活性が強くなったが、それ以外の生き物は17°Cか27°Cで活性が最大となった。しかし低温でもさほど活性は落ちず、冬季においても活発にセルロースが分解されていることが予想される。4種の貝、2種の魚類の糞からセルラーゼ活性が確認された。酵素は糞に強く吸着(結合)しているようで、超音波破裁を行わねば活性がでなかった。ザイモグラフィーの結果から、貝はいずれも消化管内酵素と糞内酵素のバンドがほぼ一致したが、魚については異なっていた。今後さらに厳密な結果を得るため、糞から酵素を効率的に分離する方法を検討する必要がある。