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大学教育改善の促進と教育イノベーション普及のための「大学教育コモンズ」の構築

マルチメディアポートフォリオを利用し、経験的教育実践知の蓄積・共有を促進する概念的モデルの実証的検証を行った結果、学問分野、教員や授業に依存する固有の文脈を超えて教育実践知を蓄積・共有するためのイノベーティブな方法と支援システムの効果が実証された。平成25年9月、大学教育コモンズの設計課程で行った授業実践の結果、異分野間の教授方法の理解のレベルやアプローチ・概念の差異という新たな知見が明らかとなった。研究遂行上、分野を越えて理解される内容と形式でDIYキットの実践事例を作成しなければ、目的とする大学教育コモンズの設計ができず、追加でDIYキット作成のための情報収集、データ分析、整理を行う必要が生じた。本年度中に大学教育コモンズの開発は完了したが、その限定公開的な運用や、教員コミュニティのメンバー等による試行には至らなかったためである。研究計画においては、マルチメディアポートフォリオ、教育評価方法やツール等の教育リソースの集合体として、テーマごとにDIYキットを開発することを意図していたが、本年度の実践コミュニティを通じた教育改善とDIYキットの形成的評価過程において、学問分野や個々の教員や授業に固有の文脈を超えて教育知を交換するためには、いったん教育的文脈を切り離すなどにより教育実践を細分化(モジュール化)し、そこから厳選されたモジュールを共有する場を設ける必要が生じたためである。27年度が最終年度であるため、記入しない。教育工学、教育イノベーション、高等教育システム今年度に予定していた「大学教育コモンズ」の設計及び開発をおこなうとともに、限定公開的に運用し、今年度に行った調査を踏まえ、大学教育コモンズの利用に関するラーニング・アナリティクス的なデータの収集・分析を行い、システムの改善に役立てる。今年度に開発したテーマごとの教育方法と教材をオンラインコンテンツ化(パッケージ化)し、授業実践に関するDIYキットとともに順次、大学教育コモンズ上で公開する。教育方法・教材開発については、テーマ別ワーキンググループ各々において、今年度に開発したマルチメディアポートフォリオやDIYキットを、大学教育コモンズ内に作られた教員コミュニティのメンバーに適用してもらい、広範に利用された教育改善実践の成果や課題などについてのフィードバックをコミュニティ開発グループから受け、大学教育コモンズ開発に還元してもらい、さらに、これらのフィードバックや新たに各教員コミュニティを通じて随時集められた実践事例などに基づき、DIYキットのさらなる改善・拡張をおこなう。
インドにおける選挙政治と政党政治に関する分析

本年度は、3年間の研究期間の最終年度にあたることもあり、これまでに収集した文献や資料の整理を引き続き行うともに、これらの文献・資料を用いた学会発表と論文執筆に重点を移した。本年度は2件の学会発表を行った。日本比較政治学会・自由企画4「一党優位政党制の形成要因と崩壊要因」(同志社大学、2007年6月)では、「インドにおける一党優位政党制」という題目で発表を行った。これは、インドの政党政治における変化とその要因について論じたものである。また、日本南アジア学会・全体シンポジウム「南アジア・日本・世界:グローバル化と南アジア認識の変貌」(大阪市立大学、2007年10月)では、「インド政治の現状と研究上の課題」という題目で発表を行った。これは、インドの国内政治における変化と、そのような変化をふまえた研究上の課題について論じたものである。また、3年間の研究成果の暫定的なとりまとめとして、「インドにおける政治システムの安定性に関する考察」(近藤則夫編『インド民主主義体制のゆくえ:多党化と経済成長の時代における安定性と限界』日本貿易振興機構アジア経済研究所、2008年3月)という題目の論文を発表した。さらに、研究成果の一部は、広瀬崇子他編著『現代インドを知るための60章』(明石書店、2007年10月)にも収録(第7章・第8章・第11章・第34章)された。この研究課題名による研究期間は本年度までであるが、来年度以降、これらの研究成果をとりまとめて、書籍としての出版を目指す予定である。本年度は、既存の文献を利用してインド国内政治に関する理論的な研究を行うとともに、8月21日9月5日、2月7日20日の2度にわたってインドのニューデリーに出張し、調査および資料収集を行った。出張では、インド中央選挙管理委員会、ネルー記念博物館付属図書館、インド公文書館(いずれもニューデリー市内)および主要政党の事務所において、インドの政党政治と選挙政治に関する文献・資料を収集した。これにより、インドの主要政党に関する一次資料をかなり網羅的に収集することができた。さらに、著名な社会調査・研究機関である「発展途上社会研究センター(Centre for the Study of Developing Societies : CSDS)」を訪問し、同センターに所属する研究員との間で、インドの国内政治の状況についてディスカッションを行った。これらの理論的研究と調査・資料収集の成果をもとに、10月2日には、日本南アジア学会全国大会(龍谷大学深草キャンパス)の小パネル「インド民主主義と第14回連邦下院選挙」において、「政党制の変遷と第14回連邦下院選挙」という題目で研究発表を行った。さらに、この研究発表の内容を土台として、「Transition of the Party System in India since the Independence(邦題:独立後のインドにおける政党システムの変遷)」と題する論文をまとめ、日本南アジア学会の学会誌『南アジア研究』に投稿した。同論文については現在、同学会による査読が行われている最中である。本年度は、これまでに収集した文献や資料の整理を進めるとともに、これらの文献・資料を用いて、インドの民主主義や選挙政治、政党政治に関する研究発表を行った。また、2月18日から24日にかけてインドのニューデリーに出張し、調査を行った。平成17年度に日本南アジア学会に投稿した学術論文(前年度報告書を参照)については、同学会による査読結果にしたがって、最新の研究動向なども踏まえて2度にわたって加筆・修正を行った。その結果、『南アジア研究』第18号(平成18年10月発行)において、「The Transition of Party System in India : From Polarized Pluralism to Moderate Pluralism(邦題:インドにおける政党システムの変化)」として発表することができた。また、10月7日には、日本比較政治学会第9回研究大会(立教大学)の分科会C「民主主義の質を問う」において、「インドにおける民主主義の現状」という題目で研究発表を行った。本報告は、現在のインドにおける選挙政治と政党政治について、民主主義の安定性という観点から論じたものである。2月18日24日のニューデリー出張では、財務省や外務省などの政府機関とインド工業連盟(CIIインドの2大経済団体のひとつ)を訪問し、主に官僚や経済界の立場から見た、インドの民主主義・選挙政治・政党政治について聞き取りを行なった。また、我が国の笹川平和財団とニューデリーの著名な研究機関である「インド国際経済関係研究所(ICRIER)」によって開催されたセミナーに出席し、同研究所に所属する研究員との間で、インドの民主主義などについてディスカッションを行った。

また、3年間の研究成果の暫定的なとりまとめとして、「インドにおける政治システムの安定性に関する考察」(近藤則夫編『インド民主主義体制のゆくえ:多党化と経済成長の時代における安定性と限界』日本貿易振興機構アジア経済研究所、2008年3月)という題目の論文を発表した。さらに、研究成果の一部は、広瀬崇子他編著『現代インドを知るための60章』(明石書店、2007年10月)にも収録(第7章・第8章・第11章・第34章)された。この研究課題名による研究期間は本年度までであるが、来年度以降、これらの研究成果をとりまとめて、書籍としての出版を目指す予定である。
膜タンパク質の小胞体トランスロコンを介した膜組み込みと小胞体回避機構

本研究では真核細胞小胞体の膜タンパク質の膜組み込み系に関する研究を推進した。小胞体での疎水性配列の膜組み込みがリボソームによって制御されている可能性を見出し、小胞体トランスロコンでの膜透過が正荷電残基によって一時停止した後再開可能なことを発見し、天然のマルチスパン膜タンパク質の組み込みに低疎水性配列の強制的膜組み込み機構が作動していることを実証し、膜コレステロールの膜透過に対する多面的効果を見出した。膜タンパク質の生合成と機能構造形成に関して下記の成果を得た。【1】ペルオキシソーム膜タンパク質ABC輸送体D3アイソフォーム(PMP70)の小胞体膜標的化の抑制について研究を続行し次の結果を得た。(1)厳密な配列特性を有するモチーフが、何らかの因子を介して小胞体組み込み抑制作用を発揮している。(2)小胞体標的化を抑制されたタンパク質はC-末端に存在するI-型ペルオキシソーム指向性シグチルによってペルオキシソームへ移行できる状態であり、凝集体の形成や特殊な部位に隔離されることなく健全な状態にある。【2】小胞体トランスロコンでの新生ポリペプチド鎖の生合成に共役した膜透過を詳細に解析し、膜コレステロールがトランスロコンに対して多面的作用を示すことを明らかにした。コレステロールはシグナル配列によるトランスロコン標的化を部分的に抑制するだけではなく、トランスロコンでの正電荷の動きを抑制すること、それに対して疎水性配列の動きは容易にすることを明らかにした。【3】膜タンパク質の極性局在化について、ABC輸送体C2アイソフォームを対象とする研究を続行した。C2は極性化した細胞の細胞膜頂端側に局在化し特定の物質の排出に寄与する。この極性局在化にカルボキシル末端77残基が関わることを明らかにし、この部分に結合する因子を探索し足場タンパク質であるPDZK1を同定した。さらに、別の部位に、最小5アミノ酸残基からなるモチーフがありこれが細胞膜頂端側への局在化を規定することを明らかにした。真核細胞には多数の細胞内オルガネラが存在し、それぞれには特定のタンパク質が局在化する。リボソームによって合成される膜タンパク質分子が、適切なオルガネラ膜を識別して移行し、膜内での機能的立体構造を形成するまでの一連の過程の理解を目的とし、本研究の今年度には以下の成果を得た。(1)複数の膜貫通部分を有する膜タンパク質(赤血球バンド3タンパク質および人工的モデルタンパク質)の膜への組み込みについて、組み込み途上でトランスロコンとリボソームの接合が一時的に解離し新生鎖が細胞質に露出しうること、1型シグナルアンカー配列による上流配列の動き阻止には高い親和力が必要なこと、1型シグナルアンカーによる強制的組み込み機構が分子内で作動していることなどを明らかにした。(2)小胞体トランスロコンを通したポリペプチド鎖の動きは、一方向的に単純に進行するのではなく、配列上に存在するアミノ酸残基によっては一時的に逆方向へ揺らぎながら内腔へと動くこと、その順方向への駆動要因の一つが小胞体内腔に存在することを明らかにした。ポリペプチド分子の動き原理の解明につながる成果である。(3)トランスロコンにおける疎水性配列の動き停止と安定的保持に対して、新生鎖合成途上のリボソームが影響することを明らかにした。リボソームは、疎水性配列を動ける状況に保持する。(4)小胞体の膜透過に対して、フォスファチジルセリン結合タンパク質(ラクトカドヘリン)が阻害的に作用することを明らかにした。(5)代表的な内在性膜タンパク質であるABC輸送体のペルオキシソームアイソフォーム(PMP70)の分子内に存在する、「膜タンパク質小胞体標的化抑制モチーフ(N12)」に結合するタンパク質因子の定量的アッセイ系を確立し、因子をクロマトグラフィーで分画後追跡可能とした。因子精製への道が開かれた。膜タンパク質の小胞体トランスロコンを介した膜組み込み機構と小胞体回避に関して下記の成果を得た。【1】ペルオキシソーム膜タンパク質ABC輸送体D3アイソフォーム(PMP70)の小胞体膜標的化の抑制について、厳密な配列特性を有するモチーフが、何らかのタンパク質因子を介して小胞体組み込み作用を発揮していることを明らかにした。この因子の単離同定を目指して、アフィニティー精製のためのモチーフ融合タンパク質の発現、精製を開始した。【2】小胞体トランスロコンでの新生ポリペプチド鎖の膜透過に対して、膜コレステロールが多面的な阻害作用を示すことを明らかにした。すなわち、コレステロールはシグナル配列によるトランスロコン標的化を部分的に抑制するだけではなく、標的化後のトランスロコンでの正電荷の動きを抑制すること、逆に疎水性配列の動きを促進することを明らかにした。疎水性配列に対する動き促進作用は、コレステロールによるトランスロコンチャネルの横方向への開放の阻害と考えられた。【3】小胞体でのタンパク質膜透過に対して、負電荷を持つリン脂質であるフォスファチジルセリンに結合するタンパク質であるラクトアドヘリンが阻害作用を示すことを明らかにした。

特定のリン脂質がトランスロコンの基本的機能に必要であることを示した新奇知見である。【4】小胞体におけるポリペプチド鎖の動きを解析する中で、膜結合リボソームが新生鎖を迅速に遊離するためには、伝令RNAの終止コドンの後方に10塩基以上のRNA配列が必要であることを明らかにした。タンパク質合成に伴った速い膜透過を測定するために資するとともに、リボソームの翻訳停止機構の理解に重要な知見となった。膜タンパク質の小胞体標的化抑制モチーフが作用した後にもオルガネラ移行可能状態であることを示し、トランスロコン機能に対するコレステロールの作用を系統的に明らかにし、細胞膜頂端側への新規局在化シグナルモチーフを発見するなど実質的な進展を見ている。25年度が最終年度であるため、記入しない。膜タンパク質の小胞体標的化抑制モチーフが特定のタンパク質性因子と相互作用することを確かなものとし、この未知因子の単離同定に向けた道筋を開くことができた。トランスロコン機能に対するコレステロールの多面的な阻害作用を明らかにし、さらに、フォスファチジルセリン結合タンパク質であるラクトアドヘリンの特異的な阻害作用を発見するなど実質的な進展を見ている。また、リボソームとトランスロコンの協働を迅速に測定する実験系の設定も実質的に進展している。小胞体でのポリペプチド鎖の輸送駆動要因を生物物理学的な手法を導入して解析し本質にせまりたい。また、ここで発見できた小胞体標的化抑制モチーフ及び、細胞膜頂端側局在化規定モチーフに作用する因子の同定を行い、それらの作用機構を明らかにする予定である。小胞体でのポリペプチド鎖の輸送駆動要因解明に向けて生物物理学的な手法を導入し、本質にせまりたい。特に、最近設定できた、リボソームとトランスロコンの協調を定量的に実測できる系を駆使して、膜タンパク質の膜組み込みに対するリボソームの作用を明らかにする。さらに、ここで発見できた小胞体標的化抑制モチーフに作用する因子の同定を行い、それらの作用機構を明らかにする計画である。
義歯安定剤使用者のための新規低生体為害性オーラルセルフケア法の開発

義歯洗浄剤10種(ホームケア用8種、プロフェショナル用2種)について、Candida albicansに対する抗菌力を測定した。ホームケア用製品はどれもプロフェッショナル用製品よりも抗菌力は弱いが、臨床的に用いる範囲では十分な抗菌力を持つことが示唆された。さらに、この実験に用いた中で、特にホームケア用5種について義歯安定剤溶解性を検討した。クリームタイプ義歯安定剤使用時には、18時間以上浸漬した時には、殆ど全ての義歯洗浄剤において、精製水より除去効果が認められた傾向にあった。しかし一般的には義歯洗浄剤の使用は長くても12時間程度であることから、より速く義歯安定剤を完全に除去できる洗浄剤が必要であると考えられた。不十分なオーラルケアは口内炎や誤嚥性肺炎を誘発する。現在市販されているオーラルセルフケア製品について、抗菌力を調べることによって、どの程度その疾病を予防できるか考える上での指標となるともいえる。市販義歯洗浄剤の様々な効力を測定するため、市販義歯洗浄剤5種、洗口剤2種についてのCandida albicansに対する抗菌力を測定した。ポジティブコントロールとして用いたamphotericin Bと比較して義歯洗浄剤についてはほぼ同程度の抗菌力を有する製品もあったが、菌種によって傾向が少し異なっており、今後も精査を要すると思われる。また、この実験に用いた義歯洗浄剤についてのCMC溶解性及び義歯安定剤溶解性などを含めた実験については申請書のとおり、JIS規格T6525-1:2005に準じて検討中である。本年度の研究を行う上で最も重要と思われる溶解成分の選定については、現在様々な成分を用いて検討中だが、市販義歯洗浄剤のpHは大きくばらついており、どのタイプの洗浄剤を選択するかによって、どの成分を選択するかが決まってしまうところがある。今後は至適pHなどの条件設定を行いながら、試作品の検討も行っていく予定である。今後の研究については、研究代表者の所属変更もあることから、薬理学的手法も含めた研究も考慮に入れて進めていく予定である。現在市販されているオーラルセルフケア製品について、まず抗菌力を調べることによって、どの程度その疾病を予防できるか考える上の指標とした。さらに、その実験に用いた製品の義歯安定剤の溶解性について検討を行い、2つの視点より最もオーラルケアに適した製品について検討した。市販義歯洗浄剤10種(ホームケア用8種、プロフェショナル用2種)についてのCandida albicansに対する抗菌力をディスク法で測定した。プロフェッショナル用2種については、どのホームケア用の製品よりも高い抗菌力を示した。ホームケア用製品についてはamphotericin Bとほぼ同程度の抗菌力を有する製品もあったが、全く阻止円を形成しない製品もあった。また、この実験に用いた義歯洗浄剤のうちホームケア用5種について義歯安定剤溶解性を検討した。粉末タイプ義歯安定剤よりもクリームタイプ義歯安定剤の方が除去には時間がかかる傾向にあった。クリームタイプ使用時には、浸漬時間が18時間より短いと、精製水よりも除去されづらい製品も多くあったが、18時間以上浸漬した時には、殆ど全ての義歯洗浄剤において、精製水より除去効果が認められた傾向にあった。しかし一般的には義歯洗浄剤の使用は12時間程度であることから、より早期に義歯安定剤を完全に除去できる洗浄剤が必要であると考えられた。これにより、義歯安定剤を溶解する製品の傾向を理解し、短時間で効果的に義歯安定剤を除去する方法について検討を行っていく予定である。
赤血球画分胆汁酸3位カルボニル基還元酵素のキャラクタリゼーション

胆汁酸は主に腸肝循環を行なっており、その代謝もこれを中心として営まれるとされていた。申請者らは、赤血球の細胞質画分に3-オキソ胆汁酸を3α-並びに3β-ヒドロキシ体へと還元する酵素を見いだし、通常血中には見られない3-オキソ胆汁酸を有する先天性胆道閉塞症、原発性胆汁性肝硬変症患者との関連に着目した。そこで、本酵素の特性、肝胆道疾患との関連、更に肝3-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼとの相同性を明らかにし、これら疾患の病態解明に寄与することを目的として以下の実験を行った。1.7及び12位にカルボニル基、水酸基を持つ5α-並びに5β-3-オキソ胆汁酸を合成した。2.カルボニル酸素の交換反応及びその還元反応を利用し、ステロイド核上水酸基に重酸素及び重水素を導入した安定同位元素標識胆汁酸を調製した。3.1.で合成した各種3-オキソ体及びその還元成績体である3α-、3β-ヒドロキシ体のカルボキシル基及び水酸基の誘導体化法を吟味し、負イオン検出ガスクロマトグラフィー(GC)/マススペクトロメトリー(MS)における分離系及び超高感度測定法を確立した。4.液・液抽出法、固相抽出法を組み合わせた生体試料中胆汁酸の効果的なクリーン・アップ法を確立した。5.種々3-オキソ胆汁酸を基質として用い、本酵素の基質特異性を精査した。6.α-、3β-ヒドロキシ体への還元酵素活性の至適pH、Km値はそれぞれ異なっており両異性体への変換には異なる酵素の関与が示唆された。7.3α-及び3β-ヒドロキシ体いずれからも3-オキソ体が生成することから本酵素がオキシドレダクターゼであることが示唆された。
遺伝的制御系の応答機構

昭和6163年度にわたり実施された特定研究「遺伝的制御系の応答機構」によって得られた研究成果をとりまとめることが本研究の目的である。この目的に従って二つの企画が計画され、実施された。1.公開シンポジウムの開催平成元年12月18日東京において公開シンポジウム「遺伝的制御系の応答機構」(文部省科研貴特定研究成果取りまとめ)を開催した。それぞれの計画研究班の班長が概要をまとめたのち、主要研究者8名が夫々の研究成果を具体的に発表し盛会であった。2.公表論文リストおよび英文論文集の作製特定研究課題「遺伝的制御系の応答機構」に係る各分担研究者の公表論文リストと各代表的英文論文2-3編の別刷をとりまとめて本特定研究3ケ年の研究成果報告書として配布した。論文リストと共に700頁を超える大部のものとなった。これらの計画に必要な連絡打合せ、公開シンポジウムの演者、討論者のための出張旅費、謝金、印刷費などに支出された。尚、本特定研究の計画研究班は以下の5班であった。i)刺激応答の遺伝的制御系(代表者飯野徹雄)ii)下等真核細胞の遺伝的制御系(代表者大嶋泰治)iii)オルガネラの遺伝的制御系(代表者小関治男)iv)染色体機能の制御因子(代表者杉山勉)v)機能発現の遺伝的制御(代表者大沢省三)昭和6163年度にわたり実施された特定研究「遺伝的制御系の応答機構」によって得られた研究成果をとりまとめることが本研究の目的である。i)刺激応答の遺伝的制御系(代表者飯野徹雄)ii)下等真核細胞の遺伝的制御系(代表者大嶋泰治)iii)オルガネラの遺伝的制御系(代表者小関治男)iv)染色体機能の制御因子(代表者杉山勉)v)機能発現の遺伝的制御(代表者大沢省三)
植物生産の基礎として窒素固定

全体会議を昭和61年9月1日に開催(出席者19名)し、各班員よりこれまで生物窒素固定に関する研究経過報告と将来研究すべき課題を提出し、それらについて討議した。その結果、生物窒素固定に関する研究は重要であり、協力して研究を強力に進める必要があるので、昭和63年度重点領域研究として申請することに決定した。東京在住の数名の班員によりこの問題につき討議し、全班員の重点領域研究に関する意見、具体的な研究内容、3、4年間で得られると思われる研究成果等を取りまとめた。また京都大学の班員などと数回会合を持った。これらの討議の結果、窒素固定の研究の中で最も遅れているのは植物生産等に対する有効利容の研究であるが、その主な原因は窒素固定能の発現が種々の要因により制御されていることによると考えられた。そこでこの制御機構の解明が重要であり、その課題を中心に多様な窒素固定生物を、目的に応じて自由に有効利用するための基礎的知見を得ることを目的とする以下の研究を計画した。(1)窒素固定遺伝子(nif)の探策、新窒素固定生物の探策(2)遺伝子、細胞、共生系、自然生態系レベルでの窒素固定能発現制御機構(3)窒素固定能の増進、新窒素固定生物の創作すなわち真核生物を含めた生物について、nifの探索、特性を有した新窒素固定菌の機能調節機構、ラン藻などの光合成窒素固定微生物の活性発現制御機構、共生窒素固定植物の共生機構調節、共生窒素固定能の発現調節機構、自然生態系における窒素固定能の発現調節機構、植物細胞でのnifの存在、導入とその発現機構等が具体的なテーマとして考えられた。
絨毛癌発症に関連する癌抑制遺伝子の局在部位の決定

1.絨毛癌6症例について,PCR法を用いたDNA多型解析により,その発生母地となった妊娠を同定することに成功した.絨毛癌DNAは,パラフィン包理ブロック(2例),ヌードマウス移植腫瘍(2例)新鮮手術標本(1例),樹立細胞株(1例)から抽出した.絨毛癌6例中4例が胞状奇胎より発生していたが,1例においては最後の正常妊娠ではなく,それ以前の胞状奇胎から絨毛癌が発生したことが明らかになった.これら胞状奇胎4例のうち1例はヘテロ奇胎であることが確定された.また,正常妊娠と全胞状奇胎の双胎妊娠4例のうち1例は絨毛癌を続発したが,発生母地となった胞状奇胎はヘテロ奇胎であった.2.反復塩基配例の数の相違(minisatellite・microsatellite)に由来するDNA多型が,情報量・検出の簡便性においてはるかに優れていることを認め,このタイプの多型部分をPCR法により増幅し,各試料間で比較検討した.とくに,反復塩基配例が3塩基以上のmicrosatelliteは,PCR・アクリルアミドゲル電気泳動・銀染色の組み合わせで,容易に多型を検出することができる点,また全染色体対において多数存在する点でとりわけ有用であった.3.本研究の期間内には,統計学的処理が可能な症例数を収集することができず,ヘテロ奇胎において常時ホモ接合を呈する染色体を同定するまでには至らなかった.これは,絨毛癌発症率の急減,ならびに治療の主体が化学療法となり手術例が限られていることに起因している.したがって,今後は自施設のみならず広く他施設に協力を求め,標本収集に努める必要性がある.1.絨毛癌6症例について,PCR法を用いたDNA多型解析により,その発生母地となった妊娠を同定することに成功した.絨毛癌DNAは,パラフィン包理ブロック(2例),ヌードマウス移植腫瘍(2例)新鮮手術標本(1例),樹立細胞株(1例)から抽出した.絨毛癌6例中4例が胞状奇胎より発生していたが,1例においては最後の正常妊娠ではなく,それ以前の胞状奇胎から絨毛癌が発生したことが明らかになった.これら胞状奇胎4例のうち1例はヘテロ奇胎であることが確定された.また,正常妊娠と全胞状奇胎の双胎妊娠4例のうち1例は絨毛癌を続発したが,発生母地となった胞状奇胎はヘテロ奇胎であった.2.反復塩基配例の数の相違(minisatellite・microsatellite)に由来するDNA多型が,情報量・検出の簡便性においてはるかに優れていることを認め,このタイプの多型部分をPCR法により増幅し,各試料間で比較検討した.とくに,反復塩基配例が3塩基以上のmicrosatelliteは,PCR・アクリルアミドゲル電気泳動・銀染色の組み合わせで,容易に多型を検出することができる点,また全染色体対において多数存在する点でとりわけ有用であった.3.本研究の期間内には,統計学的処理が可能な症例数を収集することができず,ヘテロ奇胎において常時ホモ接合を呈する染色体を同定するまでには至らなかった.これは,絨毛癌発症率の急減,ならびに治療の主体が化学療法となり手術例が限られていることに起因している.したがって,今後は自施設のみならず広く他施設に協力を求め,標本収集に努める必要性がある.1.絨毛癌2症例において,PCR法を用いたDNA polymorphism解析により,その発生母地となった妊娠を同定することに成功した.第1例は3回の正常妊娠後,第2例は2回の正常妊娠と1回の胞状奇胎後に絨毛癌を発症した症例であった.DNA polymorphism解析の結果,第1例では3回目の正常妊娠から,第2例では最後の正常妊娠ではなく,それ以前の胞状奇胎から絨毛癌が発生したことが明らかになった.第2例においては,発生母地となった胞状奇胎がヘテロ奇胎であることも判明した.絨毛癌DNAはいずれも,手術摘出標本のパラフィン包埋ブロックの切片から抽出されたものであり,本研究におけるPCR法の有用性が再確認された.この実績を基に今後,絨毛癌症例の収集,ならびに同様のDNA polymorphism解析を進め,絨毛癌を続発した胞状奇胎における各染色体の接合性を決定していく予定である.2.当初,制限酵素認識部位の有無,あるいはアレル特異的なオリゴプローブとのハイブリダイゼーションの有無によって検出されるpolymorphism部分をPCR法により増幅し,各試料間で比較検討していた.しかし,反復塩基配列の数の相違(minisatellite・microsatellite)に由来するDNA polymorphismが,情報量・検出の簡便性においてはるかに優れていることを認め,現在はこのタイプのDNA polymorphismを中心に解析を進めている.この新しいタイプのDNA polymorphism解析が,本研究の進行を大いに促進することが期待される.1.本年度においては,さらに絨毛癌4症例について,PCR法を用いたDNA解析を行いそれらの責任妊娠を同定した.絨毛癌DNAは,ヌードマウス移植腫瘍(2例),新鮮手術標本(1例),樹立細胞株(1例)から抽出した.これら4例中3例が胞状奇胎から発生した絨毛癌であった.ただし,いずれの例においても現在までのところ,ヘテロ接合を示す染色体対は認められておらず,ヘテロ奇胎か否かは決定されていない.2.同一妊娠において胎児部分と胞状奇胎部分を認めた場合,1)部分胞状奇胎あるいは,2)正常妊娠+全胞状

奇胎の組み合わせの双胎妊娠の2通りの可能性があるが,肉眼的・組織学的に両者を区別することはしばしば困難である.さらに,前者から絨毛癌を含む続発症が発生することは稀であるのに対し,後者からの発生は通常の全胞状奇胎と同様に高率である.したがって,遺伝学的に両者を正確に鑑別することは,臨床的に意義があるが,それのみならず本研究の方法論の確立ならびに対象症例の抽出の観点からみても重要である.そこで,胎児部分と胞状奇胎組織の共存する妊娠4症例について,同様のDNA多型解析を行った.その結果,全例で,臍帯・胎盤絨毛試料においては患者・夫双方由来のバンドを,奇胎試料においては夫由来のバンドのみを認め,正常妊娠と全胞状奇胎の双胎妊娠であることが明らかになった.これらのうち1例は絨毛癌を続発したが,発生母地となった胞状奇胎はヘテロ奇胎であった.3.我々が直面している問題は,絨毛癌組織の収集が非常に困難であるという点である.これは,絨毛癌発症率の急減,ならびに治療の主体が化学療法となり手術例が限られていることに起因している.したがって,今後は自施設のみならず広く他施設に協力を求め,標本収集に努める必要性がある.
ヒト遺伝子破壊株を用いた塩基除去修復と組換え修復の相互作用の遺伝的解析

本研究は、塩基除去修復(BER)に働くDNAポリメラーゼβ(POLβ)、2本鎖切断の相同組換え(HR)修復に働くRAD54、非相同末端連結(NHEJ)修復に働くDNAリガーゼIV(LIG4)の各遺伝子破壊株、およびPOLβとRAD54およびPOLβとLIG4の2重破壊株をヒトNalm-6細胞からジーンターゲティング法により作製し、これら破壊株を用いて、自然ないしアルキル化剤や過酸化水素等の処理によって生じる塩基損傷や1本鎖切断のBERによる修復、また損傷部位が複製フォークに衝突し生じる2本鎖切断のHRおよびNHEJによる修復を解析し、異なる修復経路間の連携と相互作用を細胞レベルで明らかにすることを目的として行った。作製した各遺伝子破壊株について、その増殖能やセルサイクル、染色体異常、SCE、などの比較・解析を行った。また、アルキル化剤であるMMSおよびMNNG、過酸化水素、1本鎖切断を生じるDNAトポイソメラーゼI阻害剤カンプトテシン、紫外線、X線、トポイソメラーゼII阻害剤エトポシドやICRF-193などのDNA傷害剤に対する感受性の解析を行った。また、DNA傷害剤で処理したときに細胞に生じたDNAダメージの程度とその修復過程を解析するとともに、ジーンターゲティング効率の比較を行った。以上の実験から、1本鎖切断に由来する2本鎖切断の修復には翼Rが重要であることがわかった。また、DNAポリメラーゼβとDNAリガーゼIVの問に何らかの遺伝的相互作用があることを初めて明らかにした。本研究では、塩基除去修復(BER)に働くDNAポリメラーゼβ(POLβ)、2本鎖切断の相同組換え(HR)修復に働くRAD54、非相同末端連結(NHEJ)修復に働くDNAリガーゼIV(LIG4)の各遺伝子破壊株、PoLβと,RAD54およびPOLβとLIG4の2重破壊株をヒトNalm-6細胞から作製する。これら破壊株を用いて、自然ないしアルキル化剤や過酸化水素等の処理による塩基損傷や1本鎖切断のBERによる修復、また損傷部位が複製フォークに衝突し生じる2本鎖切断のHRおよびNHEJによる修復を解析し、異なる修復経路間の相互作用と連携を明らかにすることを目的とする。すでに野生株Nalm-6からPOLβ、RAD54およびLIG4遺伝子の各破壊株の作製している。これらの株の増殖能を調べると、全ての破壊株で野生株と有意の差が見られなかった。また、アルキル化剤MMSに対してPOLβ破壊株のみ高感受性を示したが、過酸化水素に対して全破壊株で有意の差が見られなかった。他方、LIG4破壊株に2種類のPOLβターゲティングベクターを順次導入し、2重破壊株(POLβ^<-/->LIG4^<-/->)の作製に成功した。この2重破壊株の増殖能は野生株および単独破壊株より有意に低下し、MMSに対しPOLβ破壊株よりさらに高い感受性を示した。一方、POLβ破壊株にRAD54ターゲティングベクターを導入してヘテロ破壊株をすでに作製を終え、現在、ホモ2重破壊株の作製を行っている。この2重破壊株を取得できれば、上述の形質に加え、染色体異常、SCE、などを解析する。また、1本鎖切断を生じるDNAトポイソメラーゼ(TOP)I阻害剤カンプトテシン、2重鎖切断を生じるTOPII阻害剤VP-16やX線などに対する感受性を調べる。さらに、DNA傷害剤で生じる鎖切断レベルと、その修復能を生化学的に比較・解析する予定である。

本研究は、塩基除去修復(BER)に働くDNAポリメラーゼβ(POLβ)、2本鎖切断の相同組換え(HR)修復に働くRAD54、非相同末端連結(NHEJ)修復に働くDNAリガーゼIV(LIG4)の各遺伝子破壊株、およびPOLβとRAD54およびPOLβとLIG4の2重破壊株をヒトNalm-6細胞から作製し、これら破壊株を用いて、自然ないしアルキル化剤や過酸化水素等の処理によって生じる塩基損傷や1本鎖切断のBERによる修復、また損傷部位が複製フォークに衝突し生じる2本鎖切断のHRおよびNHEJによる修復を解析し、異なる修復経路間の連携と相互作用を細胞レベルで明らかにすることを目的とする。作製したそれぞれの遺伝子破壊株について、その増殖能、セルサイクル、染色体異常、SCE、などの比較・解析を行った。また、アルキル化剤であるMMSおよびMNNG、過酸化水素、1本鎖切断を生じるDNAトポイソメラーゼI阻害剤カンプトテシン、紫外線、X線、トポイソメラーゼII阻害剤エトポシドやICRF-193などのDNA傷害剤に対する感受性の解析を行った。また、DNA傷害剤で処理したときに細胞に生じたダメージの程度とその修復過程をコメットアッセイで解析するとともに、ジーンターゲティング効率の比較を行った。以上の実験から、1本鎖切断に由来する2本鎖切断の修復にはHRが重要であることを明らかにした。また、DNAポリメラーゼβとDNAリガーゼIVの間に何らかの遺伝的相互作用があることが初めて明らかとなった。
皮質ニューロンの配列を制御する分子機構の解析

リーラーミュ-タントマウスの原因遺伝子産物Reelinを特異的に認識し、かつその機能を阻害する効果をもつ抗体CR-50を分取し、皮質ニューロンの配置がReelinによって制御されていることを明らかにしてきた。Reelinは分泌性のタンパク質で、Reelin同士がCR-50認識部位を介して会合体を作ること、この会合体形成がReelinの機能に重要であることを示した。突然変異マウスヨタリの解析からDab1遺伝子の変異によってもリーラーとほぼ同じ表現型を示し、L1レトロトランスポゾンがDab1遺伝子内に挿入された結果スプライシング異常がおこってDab1蛋白質が完全に欠損することを明らかにした。ReelinがCajal-Retzius細胞で作られ分泌されるのに対して、Dab1はこの細胞に隣接するニューロンに発現し、非受容体型のチロシンリン酸化酵素に結合してシグナル伝達に関係する蛋白質である。同じ表現型を示すことから、Dab1はReelinシグナル伝達の下流の要として細胞移動/配置に直接に関係している。細胞外分子のReelinを感知し、細胞内のDab1のリン酸化に連結するような機能をもつReelin受容体の存在が予想された。先にチロシンリン酸化酵素Fynと結合する新規カドヘリン型受容体(CNRs)が八木らによって見い出されていた。またFynの欠損マウスにおいても皮質構造に異常が認められていた。そこで、CNRsがReelinの受容体に該当する可能性が予想され、この点を検討した結果、CNRsが、Reeinの受容体であること、またその結合サイトを明らかにした。CNRsに加えて、膜蛋白質であるapoER2およびVLDLRもReelin受容体であることが明らかにされている。このような複数のReelin受容体がどのように協調して機能しているのか、またDab1の下流において、細胞の移動/配置に関わる要因について現在検討している。哺乳類の脳皮質では,タイプの異なるニューロンがそれぞれ組織表面に並行して配列し層構造を構築する.私たちは,このような層構造が異常になるミュータント動物を対照にして,皮質における層形成の機構を検証している.本年度は,ミュータントマウスyotariの繁殖がある程度進んだので,reelerと併せて小脳の皮質構築を検討した.reelerとyotariは,それぞれ異なる遺伝子reelin(Reln)とmdab-1の突然変異によるが,両者はほぼ同じphenotypeを示し,小脳では正常動物のものに比べ,Purkinje細胞ならびに顆粒細胞が異所性に配置される.reelerの原因は顆粒細胞から分泌される細胞外分子Reelinの欠損によるものであり,これまでにPurkinje細胞の移動に伴う空間配列がReelinに依存していることを明らかにしてきた.一方,yotariはReelinの標的細胞(Purkinje細胞)に発現する細胞内分子Dab-1の欠損によるもので,この分子の作用機構は未解明であるが,リン酸化酵素のアダプター分子である.今回,reelerではmdab-1のmRNAは正常レベルであるのに対し,蛋白質Dab-1量が著しく増大していることを明らかにした.このことは,Dab-1がReelinシグナルキャスケードの下流に位置し,その結果ReelinならびにDab-1の欠損が同じphenotypeを生みだすものと考えられた.一方,reelerならびにyotariでは,小脳のサイズが小さく,また小葉構造が形成されない.これは,顆粒細胞が著しく少ないことに起因していると考えられ,この細胞の増殖と分化を正常動物と比較検討した.

ミュータントにおけるアポトーシスの度合をタンネル染色にて正常動物と比較したところ,ほぼ同程度の頻度であった.PCNA(proliferative cell nuclear antigen)免疫染色ならびにBrdU取り込みの実験を行ったところ,ミュータントでは外側胚芽層(external germinal layer,EGL)における顆粒細胞の産生率が,正常動物のものに比べて著しく低いことが示された.ReelinにはEGL細胞の増殖を直接的に促す作用は認められず,またmdab-1はEGLにほとんど発現しないことなどから,Reelinのシグナルを受容したPurkinje細胞からDab-1の下流産物として,EGLにおける顆粒細胞の増殖を促す因子が分泌されていると考えら,その同定を現在行っている.〔仲嶋〕ヨタリマウスは我々の研究室で単離された突然変異マウスであり、その表現型は、大脳皮質層構造逆転等、リーラーマウスと同様である。これまでに、ヨタリマウスにおいてはDisabled-1蛋白質が欠失していることを見いだしてきたが、本年度は更に、正常マウス及びヨタリマウスのdisabled-1遺伝子断片を単離し、そのゲノム構造の解析と比較を行った。その結果、機能的に重要なPTBドメイン付近の遺伝子構造を明らかにするとともに、ヨタリにおいては、disabled-1遺伝子にL1レトロトランスポゾンの挿入があり、ゲノムの一部を欠損していることが分かった。これにより、スプライシング異常が起こり、蛋白質が検出されないものと考えられた。この結果をもとに、PCRを用いたヨタリ変異の簡便な同定法も開発した。以上により、ヨタリマウスでみられる皮質形成異常の一次的原因が、確かにDisabled-1分子の欠損によることが確認できた。〔小川〕新規カドヘリン型受容体ファミリー(cadherin-related neuronal receptor, CNR)がリーリンの受容体であることを明らかにした。これまでに、細胞外分子のリーリンを感知し、その標的細胞の細胞内タンパクDisabled-1のリン酸化に連結するような機能をもつリーリン受容体の存在が予想されていた。Disabled-1はSrc, Fynなど非受容体型のチロシンリン酸化酵素に結合する分子として分離された。八木らは先にFynと結合する分子の解析からCNRを単離した。CNRがReelinの受容体である可能性が予想されたので八木らと共同して検討した。その結果、CNRがリーリンの標的細胞に発現し、リーリンと結合すること。CNRとリーリンの結合が、リーリン抗体CR-50ないしCNRの細胞外領域に対する抗体によって阻害されること。両抗体によって、皮質ニューロンのリーリンによるDisabled-1のリン酸化が阻害されることを示した。これらのことから、CNRが機能的なリーリン受容体として、皮質構築過程に関わっていることを明らかにした。大脳皮質では錐体ニューロンが、タイプごとに、表層に並行して脳室側へと、規則的に配列されている。皮質錐体ニューロンは決められた時間帯に脳室壁に誕生し、ついで表層側へと放射状に移動し、最後に適切な位置に配列されてくる。
看護師のキャリア・ストレスとワーク・ファミリー・バランスに関する実践的研究

本研究は働く女性の中でも、家庭生活との両立が難しいといわれる交代制勤務従事者である看護師を対象に、病院組織における仕事生活と家庭生活の実態を調べ、職場内でのワーク・ライフ・バランス(仕事と生活の両立)と看護師のキャリア・ストレスとの関係に着目した。そして、組織的介入としての組織開発の効果に関する考察を行った。結果として、大学病院に勤務する看護師は、さまざまなストレッサーを抱えているためワーク・ライフ・バランスが実現できていないことが明らかになった。そのため、看護師のキャリア開発や病院組織の活性化には、組織的介入としての組織開発が有効であることが明らかになった。看護組織の活性化のためには、各看護師が適切なキャリアを創造し、職業人生を充実させることが不可欠である。そのための介入は職場領域だけでなく、家庭領域へも行なわれる必要があるといえる。そこで、本研究では看護師を対象としたキャリア・ストレス・モデルを提示し、キャリア・ストレスとしてのワーク・ファミリー・コンフリクトの発生までの実証的研究を展開する。そして、職場と家庭の2つの領域への積極的な関与が重要であるという理論仮説を設定して、最適なワーク・ファミリー・バランスの構築に向けた、病院組織に対する組織的介入のガイドラインを開発することを目的とした。家庭及び職場環境ないしは労働条件といった状況要因から、キャリア・ストレスの発生までのプロセスを明確化し、看護師チームの活性化のために実施する組織開発のための有益な羅針盤を獲得する。本研究は、今後の医療現場に対する真に効果的な介入の視点を得るための重要な実践的研究である。研究方法としては、質問紙調査法を用いて、実証的に看護師のキャリア・ストレスのメカニズムを解明した。本研究では、2つの大学病院に勤務する看護師を対象に調査を行うため、一般の企業人を対象とする尺度を適宜修正して質問項目を編み、さらにキャリア意識に強く影響を及ぼすと思われる要素(パーソナリティー、家族、ストレス、など)を、広範に調査分析するために信頼性のある尺度を構成した。看護師のキャリア・ストレスに対する意識がどのようにワーク・ファミリー・バランスに影響を及ぼしているのか。また家族構成などの個人的属性や年齢および経験年数などの違いが、どのような相互作用関係にあるのかに関して、各項目を類型化することによって最適なキャリア形成の在り方を提示することを試みた。そして、役割期待と役割葛藤というワークファミリー・コンフリクト理論を用いた結論づけができるよう分析を展開した。看護師としての充実した人生を過ごすには、仕事と個人生活双方の充実が不可欠である。しかし、現状では職場のストレス、家庭のストレス、そしてそれらの間での葛藤により適切なキャリア開発が阻害されることも少なくない。看護組織の活性化のためには、各看護師が適切なキャリアを創造し、職業人生を充実させることが不可欠であろう。そのための介入は、職場領域だけでなく、家庭領域に対しても行なわれる必要があるといえる。よって本研究では、看護師のキャリア開発を阻害する要因を検討し、職場環境・労働環境の構築に資することを大命題とした。そこで本研究では、看護師を対象としたキャリア・ストレス・モデルを提示し、キャリア・ストレスとしてのワーク・ファミリー・コンフリクトの発生までの実証的研究を展開した。そして、職場と家庭の2つの領域への積極的な関与が重要であるという理論仮説を設定して、最適なワーク・ファミリー・バランスの構築に向けた、病院組織に対する組織的介入のガイドラインを開発するための基礎資料を得ることを目的とした。家庭及び職場環境ないしは労働条件といった状況要因から、キャリア・ストレスの発生までのプロセスを明確化し、看護師チームの活性化のために実施する組織開発のための有益な羅針盤を獲得することを試みた。主な尺度は、多次元的ワーク・ファミリー・コンフリクト尺度(仕事と家庭のバランスについての評価)、成人キャリア成熟度尺度(自分の人生や生き方、職業生活についての考えを評価)、職務ストレッサー尺度(看護職におけるストレッサーを評価)を用いた。その結果、ストレス反応は、勤務年数が短い看護師に高く見られる。さらに、一方で、ストレッサーおよびワーク・ファミリー・コンフリクトは勤務年数の長い看護師の方が高く認知している傾向にあるということなどが明らかとなった。
骨破壊に係る遺伝子ネットワーク解析による中耳真珠腫の分子病態解明

Th17細胞の活性化を介した骨破壊は、慢性関節リウマチにみられる現象であるが、申請者らは、真珠腫性中耳炎においても同じTh17細胞を介した骨破壊が発生していることを発見した。この結果から「IL-17により惹起される骨破壊」という新しい機序の可能性が導き出された。そこで本研究ではその分子病態を解明するために、真珠腫の骨破壊機序に重要なサイトカイン・キモカインの産生母地である構成細胞(表皮細胞と線維芽細胞)を分離・純化培養し、in-vitroでの培養実験系を構築する。真珠腫の骨破壊に関連する特異的遺伝子の発現解析に基づく遺伝子ネットワークプロファイルを決定する。本プロファイル結果を基盤に、真珠腫の新規治療戦略に役立てる。中耳真珠腫の発症は全国で年間3,500-4,000症例と推察されている。現在、真珠腫性中耳炎の治療の中心は手術であるが、本研究の成果によって新規の薬物治療を併用することによって骨破壊を未然に防ぎ、顔面神経麻痺、めまい、難聴、髄膜炎などの重篤な合併症を回避させることは、患者救済に著しく貢献する。この課題に対して、真珠腫性中耳炎の骨破壊の免疫学的分子機構の分子レベルで解明し、治療戦略に新たな分子基盤を提供することができることが本研究の独創的かつ高い学術的特色である。既に、リウマチにおいてはTNF-α阻害により患者の関節炎抑制とともに骨破壊が抑制されることが報告されてきている。今回の研究によって、真珠腫の骨破壊に関するターゲット遺伝子を解明することによって新規の創薬の開発に結び付き、手術を回避して保存的な治療が可能となり、臨床的に極めて意義深い研究となる。本研究では真珠腫の骨破壊機序に重要なサイトカイン・キモカインの産生母地である構成細胞(表皮細胞と線維芽細胞)を用いて、短期間で解析できる分離培養系を確立することにより、個々の患者の生体組織に近いin vitro評価系を確立することを目的とした。既に、我々の先行研究(Homma et al., Act Otolaryngol 2014; Shiozawa at al., Rhinology 2015)においては、鼻ポリープ組織より簡便に上皮細胞と線維芽細胞の検体分離、培養に成功し、同細胞が凍結保存により生体機能を保存した状態で実験を行えることを確認している。この実験技術を真珠腫組織培養に応用する。摘出された真珠腫から表皮細胞と線維芽細胞を分離し、各々を純化培養する。培養された表皮細胞と線維芽細胞の真珠腫に特異的な生物学的な特性を確認するために、IL-17を添加して表皮細胞から分泌されるフィラグリン量と線維芽細胞から分泌されるRANKL量を測定した。以上から、真珠腫を用いたin-vitroでの培養実験系を構築した。手術時採取した上皮下肉芽組織を含む真珠腫組織を細切し、摘出検体の酵素処理Ca free MEMをバッファーとし、MEM with DNAase and proteaseを用いた酵素処理時間・濃度による最適条件の検討を行った。細胞の抽出:酵素処理後の検体を撹拌し遠心(1000rpm×5min)し、上清を抽出後再び遠心(1000rpm×5min)し上清を吸引しMEMを加えた。表皮細胞と線維芽細胞の培養:培地としてFBS/DMEMに表皮細胞と線維芽細胞を細胞特異的な成長因子を用いて純化培養を行い、培地濃度、検体濃度及び培養期間の検討を行った。今後は真珠腫から培養された上皮細胞と線維芽細胞の培養系を確立構成細胞系では上皮細胞と線維芽細胞に分離し、各々を純化培養する。IL-17を培養系に非添加または添加し、細胞から核酸分子を抽出し、デジタルオミックスアナライザーによってPCR増幅なしに、800以上の炎症性・免疫性の関連遺伝子の挙動を短時間で正確かつ再現性をもってマルチプレックス解析して、多数の遺伝子が連動して複雑なネットワークを形成している遺伝子発現のプロファイルを作成する。IL-17非添加群と添加群から得られた遺伝子発現のプロファイルを遺伝子発現変異分析法によって解析し、関連する特異的遺伝子の発現プロファイルを決定する。

この課題に対して、真珠腫性中耳炎の骨破壊の免疫学的分子機構の分子レベルで解明し、治療戦略に新たな分子基盤を提供することができることが本研究の独創的かつ高い学術的特色である。既に、リウマチにおいてはTNF-α阻害により患者の関節炎抑制とともに骨破壊が抑制されることが報告されてきている。今回の研究によって、真珠腫の骨破壊に関するターゲット遺伝子を解明することによって新規の創薬の開発に結び付き、手術を回避して保存的な治療が可能となり、臨床的に極めて意義深い研究となる。本研究では真珠腫の骨破壊機序に重要なサイトカイン・キモカインの産生母地である構成細胞(表皮細胞と線維芽細胞)を用いて、短期間で解析できる分離培養系を確立することにより、個々の患者の生体組織に近いin vitro評価系を確立することを目的とした。既に、我々の先行研究(Homma et al., Act Otolaryngol 2014; Shiozawa at al., Rhinology 2015)においては、鼻ポリープ組織より簡便に上皮細胞と線維芽細胞の検体分離、培養に成功し、同細胞が凍結保存により生体機能を保存した状態で実験を行えることを確認している。この実験技術を真珠腫組織培養に応用する。摘出された真珠腫から表皮細胞と線維芽細胞を分離し、各々を純化培養する。培養された表皮細胞と線維芽細胞の真珠腫に特異的な生物学的な特性を確認するために、IL-17を添加して表皮細胞から分泌されるフィラグリン量と線維芽細胞から分泌されるRANKL量を測定した。以上から、真珠腫を用いたin-vitroでの培養実験系を構築した。手術時採取した上皮下肉芽組織を含む真珠腫組織を細切し、摘出検体の酵素処理Ca free MEMをバッファーとし、MEM with DNAase and proteaseを用いた酵素処理時間・濃度による最適条件の検討を行った。細胞の抽出:酵素処理後の検体を撹拌し遠心(1000rpm×5min)し、上清を抽出後再び遠心(1000rpm×5min)し上清を吸引しMEMを加えた。表皮細胞と線維芽細胞の培養:培地としてFBS/DMEMに表皮細胞と線維芽細胞を細胞特異的な成長因子を用いて純化培養を行い、培地濃度、検体濃度及び培養期間の検討を行った。今後は真珠腫から培養された上皮細胞と線維芽細胞の培養系を確立構成細胞系では上皮細胞と線維芽細胞に分離し、各々を純化培養する。IL-17を培養系に非添加または添加し、細胞から核酸分子を抽出し、デジタルオミックスアナライザーによってPCR増幅なしに、800以上の炎症性・免疫性の関連遺伝子の挙動を短時間で正確かつ再現性をもってマルチプレックス解析して、多数の遺伝子が連動して複雑なネットワークを形成している遺伝子発現のプロファイルを作成する。IL-17非添加群と添加群から得られた遺伝子発現のプロファイルを遺伝子発現変異分析法によって解析し、関連する特異的遺伝子の発現プロファイルを決定する。シミュレーション結果のデータ整理として謝金を計上していたが,今年度は大規模計算を行う回数が少なかったため,研究代表者自身で行った。そのため謝金は0となった。また,英語論文についての校正費は今年度末までに投稿準備が完了しなかったため計上しなかった。
プロティンホスファタ-ゼの活性調節機構の研究

プロテインホスファタ-ゼは蛋白性インヒビタ-により阻害されるタイプ1、されないタイプ2A、2B、2Cに分類される。この内2Aの活性調節機構はまだ明らかでない。我々はヒト赤血球細胞質可溶画分に2Aに属する基質特異性の異なるホスファタ-ゼI(Mr=180,000)、III(Mr=177,000)、IV(Mr=104,000)を見出し、これらを均質に精製した。サブユニット構造はIがα_1β_1λ_1、IIIがα_1β_1γ_1、IVがα_1β_1と推定された。SDS-PAGEで算出した分子質量はαが34KDa、βが63KDa、λが53KDa、δが74KDaである。αが触媒サブユニットで、β、λ、δは調節サブユニットとして各酵素に固有の基質特異性、2価金属イオン要求性を与える。ホスファタ-ゼI、III、IVをMg^<2+>、ATP共存下に、サイクリックAMP依存性プロテインキナ-ゼ(A-キナ-ゼ)、Ca^<2+>リン脂質依存性プロテインキナ-ゼ(C-キナ-ゼ)、Ca^<2+>-カルモジュリン依存性プロテインキナ-ゼII、ホスホリラ-ゼキナ-ゼ、ミオシン軽鎖キナ-ゼ、カゼインキナ-ゼIとそれぞれインキュベ-トすると、ホスファタ-ゼIのδサブユニットの特定のセリン残基のみが定量的にA-キナ-ゼとC-キナ-ゼによってリン酸化された。他のプロテインキナ-ゼはいづれのサブユニットもリン酸化しない。A-キナ-ゼによるリン酸化反応におけるホスファタ-ゼIに対するKm値は0.27μMで赤血球内ホスファタ-ゼIの推定濃度とほぼ等しい。δサブユニットのリン酸化により、ホスファタ-ゼIのホスホリラ-ゼa、P-H1ヒストン、P-H2Bヒストンの脱リン酸化活性は約1.5倍促進され、この酵素の活性調節にA-キナ-ゼとC-キナ-ゼの関与が示唆され、細胞内情報伝達終止の一機構と推測された。