hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
活性化酸素種産生アントラサイクリンの発現誘導する遺伝子群の同定とその発現機序

筆者らは、RC-K8ヒト悪性リンパ腫細胞株とH69ヒト小細胞肺癌細胞株において活性化酸素種を誘導するアントラサイクリン系抗癌剤ドキソルビシン(doxo)がウロキナーゼ(uPA)の発現を誘導することを報告した(Int J Cancer.93:792-797,2001)。マイクロアレイ法を用いてdoxo刺激により発現誘導される遺伝子の同定を行ったところ、uPA以外にIL-8遺伝子が強く誘導された。IL-8の抗原量及びmRNAの発現量ともに上昇していることをH69とSBC-1ヒト小細胞肺癌細胞の2つの細胞株で確認した。IL-8プロモーター領域結合CATレポーター遺伝子を用いた遺伝子導入実験やGel shift assayによりdoxo刺激によるIL-8の遺伝子発現上昇にはPEA3転写因子結合領域が重要であることが判明した。新規アントラサイクリン系抗癌剤アムルビシンもdoxo同様にuPA、IL-8及びMCP-1を発現誘導することRT-PCRやELISAにて明らかにした。アムルビシンはdoxo強く遺伝子発現を誘導していたため、アムルビシン刺激後のH69細胞培養上清をウサギ皮下に投与したところ好酸球の優位な浸潤を認め、新たにeotaxin-3の発現誘導を確認した。また、RNase protection assayにより新たにdoxoによりmonocyte chemoattractant protein-1(MCP-1)遺伝子発現上昇が生じることも判明した。これらの研究結果はInt J Cancer.(103:380-386,2003)に報告した。doxo刺激により活性化されるシグナル伝達経路をwestern blotにて同定し、IL-8発現に関与する経路を様々なMAP kinases阻害剤を用いて検討して新たな知見を得た。マトリゲルチャンバーを用いた末梢血白血球浸潤活性を検討したところ、doxo刺激後のH69培養上清は優位に好中球や単球の浸潤活性を上昇させていることを確認した。平成12年度から平成13年度にかけ奨励研究(A)(代表者柴倉美砂子、課題番号12771476)の助成をうけ検討していた、RC-K8とH69におけるカンプトテシンによるuPA遺伝子発現誘導作用についてもActa Med Okayama. (56:223-227,2002)に掲載された。また、all-trans retinoic acidのPL-21及びNB4骨髄性白血病細胞株における細胞外マトリックスメタロプロティネースとIL-8の同時発現誘導作用についての論文はBr J Haematol. (118:419-425,2002)に掲載された。
構造実験に基づく鉄骨コンクリート合成構造の耐震性能評価法の開発

長期耐用型の新建築構造として提案したCES(Concrete Encased Steel)合成構造の実用化を目的として、CES柱、CES柱梁接合部およびCES架構の構造実験を実施し、何れにおいても損傷抑制効果に優れ、靭性に富む極めて耐震的な構造であることを明らかにした。また、耐震性能評価に必要な諸耐力、復元力特性モデルおよび等価粘性減衰定数の評価法を実験結果に基づいて提案すると共に、限界耐力計算によるCES造建築物の耐震性能評価法の基本的な枠組みをまとめた。本研究課題は、鉄骨とコンクリートのみから構成される鉄骨コンクリート(Concrete Encased steel :以下、CES)構造システムを対象とした限界耐力計算による耐震性能評価法の開発を目的としたものである。平成18年度においてはCES柱およびCES柱梁接合部の構造性能評価に関する研究を実施した。CES柱の構造性能評価に関する研究では、これまで研究してきた繊維補強コンクリート(FRC)を用いたCES構造に対して施工の合理化を図ることを目的として、プレキヤストFRCパネルで内蔵鉄骨を囲み、内部に普通コンクリートを打設したPCa-CES柱の構造実験を実施した。実験変数にはパネルの接合方法を選択し、(1)直交するパネル間をエポキシ系接着剤による接着接合としたもの、(2)接着接合に加え、パネルの内面にスタッドボルトを取り付けたもの、および(3)接着接合に加え、パネル内面の四隅にアングルを取り付け、長締めボルトを用いて接合したものの3種類の接合方法を比較検討した。その結果、外殻パネルにスタッド等を設けることにより、大変形時においても外殻パネル部分と内部コンクリートの一体性が維持され、一体打ちCES柱と同等の構造性能を有することを明らかにした。また、PCa-CES柱は、内蔵鉄骨、コンクリートおよびFRCパネルによる合成断面としての耐力を充分に有しており、特に応力状態の厳しい外殻部にFRCパネルを用いた構造的に合理的な構造であることを明らかにした。CES柱梁接合部の構造性能評価に関する研究では、接合部せん断余裕度の異なる内柱梁接合部2体の構造実験を実施した。その結果、CES柱の場合と同様に、大変形時においてもコンクリートの剥落はほとんど確認されず、安定した復元力特性を示すことを明らかにした。また、パネルのせん断耐力に関しては、鉄骨鉄筋コンクリート規準式を用いて概ね評価できることを確認した。本研究課題は,鉄骨とコンクリートのみから構成される鉄骨コンクリート(Concrete Encased Steel:以下,CES)構造システムを対象とした限界耐力計算による耐震性能評価法の開発を目的としたものである。平成19年度においてはCES柱梁接合部およびCES架構の構造性能評価,並びにCESを用いた耐震補強工法に関する研究を実施した。CES柱梁接合部の構造性能評価に関する研究では,接合部せん断余裕度の異なる外柱梁接合部2体の構造実験を実施した。その結果,CES柱の場合と同様に,大変形時においてもコンクリートの剥落はほとんど確認されず,安定した復元力特性を示すことを明らかにした。また,パネルのせん断耐力に関しては,鉄骨鉄筋コンクリート規準式を用いて概ね評価できることを確認した。一方,CES架構の構造性能評価に関する研究では,15層程度の純フレーム建築物を想定し,下部2.5層の2スパンを取り出した約1/2縮少モデルの架構試験体1体の静的載荷実験を実施し,破壊性状,復元力特性および接合部パネルの挙動等を明らかにした。さらに,正負交番の静的非線形解析を実施し,当該架構の荷重一変形関係を解析によって追跡できることを示した。また,CESを用いた耐震補強工法に関する研究については,CES架構を既存RC建築物の外側から装着する「CES外付け工法」と既存建築物の内部にCES架構を挿入する「CES内挿フレーム補強工法」という2つの工法を提案し,それぞれについて基礎実験を実施し,耐震補強工法としての有効性を確認した。来年度は,これらの工法の補強設計法の確立を目的とした研究を実施する予定である。本研究課題は、鉄骨とコンクリートのみから構成される鉄骨コンクリート(Concrete Encased Steel:以下、CES)構造システムを対象とした限界耐力計算による耐震性能評価法の開発を目的としたものである。平成20年度は本課題の最終年度にあたり、平成18年度および19年度に実施したCES柱、CES柱梁接合部およびCESフレームに関する研究の成果に基づいてCES造建築物の限界耐力計算による耐震性能評価法を検討した。具体的には、まず、当該耐震性能評価法に必須のCES部材の耐力評価式、復元力特性モデルおよび等価粘性減衰定数の評価法を既往の実験結果に基づいて検討した。次に、現在提案されているCES梁および柱の復元力特性モデルの妥当性を検証するため、10体のCES柱および梁試験体を用いた構造実験を実施し、実験結果と復元力特性モデルによる計算結果とを比較検討し、復元力特性モデルが概ね妥当なものであることを確認した。

さらに、4層CES造建築物の試設計を行い、当該試設計建築物に対して限界耐力計算による地震応答評価を実施した。これらの検討結果に基づいて、限界耐力計算によるCES造建築物の耐震性能評価法の枠組みを提案した。また、CES架構を既存RC建築物の外側から装着する「CES外付け耐震補強工法」の開発では、当該工法の補強設計法をまとめた。さらに、当該工法を豊橋技術大学の事務棟の耐震補強に適用した。
Wienerの一般調和解析に端を発する関数空間の深化と展開

Bσ-Campanato関数と特異積分作用素との多重線形交換子作用素の有界性について、ある程度の有界性の定式化を得た。関数空間のOrlicz versionと作用素の有界性については、特異積分作用素が強有界、弱有界となるための条件の結果が雑誌に掲載決定され、またRieszポテンシャルの有界性についても、強有界、弱有界となるための条件を見出すことができ、さらにその条件のOrlicz空間論的意味合いを示すことができたなど、当初計画した目的の達成度としてはおおむね順調に進展している。一般化Rieszポテンシャルとその有界性については、Bσ-Morrey空間上での有界性を示すことにより、Morrey空間上と非斉次central Morrey空間上の両方の有界性の結果が得られることを示し、また非斉次central Morrey type空間上での弱有界性を示したが、Campanato空間上とλ-CMO空間を含むcentral Campanato空間上での有界性の結果にはまだ至っていないことから、当初計画した目的の達成度としてはやや遅れている。これに対して、重み付き非斉次central Morrey空間や重み付きλ-CMO空間上の特異積分作用素の有界性については、その変動指数versionを導くための適切な空間の定義と有界となるための重みの条件を調べることについてまだ端緒についたばかりであり、またBσ-Campanato関数と特異積分作用素との多重線形交換子作用素の有界性については、ある程度の有界性の定式化が見いだされたばかりであり、これからBσ-Morrey空間上で有界となるための条件を吟味する状況である。以上のような状況から、当初計画した目的の全体としての進捗状況はやや遅れているということになる。研究分担者や研究協力者とこれまで以上に連絡を密にして、以下のようにして共同研究を推進していく。一般化Rieszポテンシャルとその有界性については、Campanato空間上とλ-CMO空間を含むcentral Campanato空間上での有界性を導くことを、適切な有界性の定式化をRieszポテンシャルの場合と比較することにより模索するとともに必要となる有界性の条件を見出すことにより、推進していく。重み付き非斉次central Morrey空間や重み付きλ-CMO空間上の特異積分作用素の有界性については、その変動指数versionを導くことを、重み付き非斉次変動指数central Morrey空間の適切な定義を重み付き非斉次central Morrey空間および変動指数Lebesgue空間の場合との比較により見出し、さらに有界となるための重みの条件を調べることにより、またBσ-Campanato関数と特異積分作用素との多重線形交換子作用素については、ある程度完成している有界性の定式化が適切であることを、Bσ-Morrey空間上で有界となるための条件をBσ-Morrey空間上での交換子作用素の有界性の結果と比較して見出すことにより、推進していく。として投稿した。Rieszポテンシャルの拡張とその有界性について,研究分担者の水田義弘との共同研究において,先ず非斉次central Morrey type空間,非斉次弱central Morrey type空間を定義し,極大作用素の非斉次central Morrey type空間上での弱有界性を示した。続いて,Rieszポテンシャルの拡張である一般化Rieszポテンシャル作用素を定義し,非斉次central Morrey type空間上で弱有界となるための条件を求め,京都大学数理解析研究所の講究録の掲載原稿として提出した。変動指数をもつ非斉次central Morrey type空間と極大作用素およびRieszポテンシャルの有界性についても,研究協力者として下村哲(広島大学)を加えて、研究分担者の水田義弘と共同研究を始めた。関数空間のOrlicz versionについては,特異積分作用素の有界性が示せたこと,Rieszポテンシャルの拡張についても,その定義とともに非斉次central Morrey type空間での弱有界性が示せたことなど,当初計画した目的の達成度としてはおおむね順調に進展している。これに対して,一般化λ-CMO空間および一般化Lipschitz空間上での一般化Rieszポテンシャルの有界性については,まだ端緒についたばかりであることから,当初計画した目的の全体としての進捗状況はやや遅れているということになる。これに対して、重み付き非斉次central Morrey空間や重み付きλ-

CMO空間上の特異積分作用素の有界性については、その変動指数versionを導くための適切な空間の定義と有界となるための重みの条件を調べることについてまだ端緒についたばかりであり、またBσ-Campanato関数と特異積分作用素との多重線形交換子作用素の有界性については、ある程度の有界性の定式化が見いだされたばかりであり、これからBσ-Morrey空間上で有界となるための条件を吟味する状況である。以上のような状況から、当初計画した目的の全体としての進捗状況はやや遅れているということになる。研究分担者や研究協力者との連絡をこれまで以上に密にして,先ず非斉次central Morrey-Orlicz空間上でのRieszポテンシャルの有界性について,続いて一般化λ-CMO空間,i.e.,一般化central Campanato空間,上での一般化Rieszポテンシャルの有界性,一般化特異積分作用素の定義と有界性について,さらに多重線形作用素のBσ-関数空間上での有界性についても,共同研究を推進していく。研究分担者や研究協力者とこれまで以上に連絡を密にして、以下のようにして共同研究を推進していく。一般化Rieszポテンシャルとその有界性については、Campanato空間上とλ-CMO空間を含むcentral Campanato空間上での有界性を導くことを、適切な有界性の定式化をRieszポテンシャルの場合と比較することにより模索するとともに必要となる有界性の条件を見出すことにより、推進していく。重み付き非斉次central Morrey空間や重み付きλ-CMO空間上の特異積分作用素の有界性については、その変動指数versionを導くことを、重み付き非斉次変動指数central Morrey空間の適切な定義を重み付き非斉次central Morrey空間および変動指数Lebesgue空間の場合との比較により見出し、さらに有界となるための重みの条件を調べることにより、またBσ-Campanato関数と特異積分作用素との多重線形交換子作用素については、ある程度完成している有界性の定式化が適切であることを、Bσ-Morrey空間上で有界となるための条件をBσ-Morrey空間上での交換子作用素の有界性の結果と比較して見出すことにより、推進していく。論文の掲載がまだ決まっていないため、オープンアクセスの論文投稿料が発生しなかったことと、授業の都合で研究打ち合わせのための国内旅費が使われなかったことが大きな要因である。そこで、翌年度分として請求した助成金と合わせて、論文投稿料を増額するとともに、計画的な研究打ち合わせを密にしていくための旅費の増額としたい。主に、年度末に必要となった購入分が翌年度購入分になってしまったために残額が生じてしまった。そこで、今年度掲載確定した論文のオープンアクセスのための論文投稿料が次年度必要となる予定であるため、残額分からの一部を投稿料の増額分として含めて使用したい。京都大学の数理解析研究所に於いて、2018年2月5日8日の期間で、研究集会RIMS共同研究(公開型)「関数空間の深化とその周辺」を、研究代表者として開催した。
高等動物でのメチルグリオキサールの生合成と代謝,及び病態との関係

1.メチルグリオキサール(MG)の定量法について。(1)オルトフェニレンジアミンとMGを反応させ生じる2-メチルキノキサリンを高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で定量した。このことについては、J.Chromatogr.-414,(1987)149-155.に発表した。(2)(1)の定量法を改良して電子捕獲検出器付ガスクロマトグラフィーでMGを定量する方法について、J.Chromatogr.(1987)in press.に発表した。2.MGの生成ルードについて。上記の2つの定量法を用いて今迄報告されているMGの生合成ルートを一つ一つ検討した。(1)アセト酢酸から生成すると云われるルートはミオグロビンと【Mn^(++)】から試験管中では生成することがわかった。しかし【Mn^(++)】がmM必要であり生理的でないことがわかった。(2)L-トレオニンからアミノアセトンを経由して生成すると云われるルートもほとんどMGが生成しなかった。(3)非酵素的にMGが生じると云う論文があり、それも申請者が追試したが、旧来の定量法では追試出来たが、我々の新定量法では全くMGは生成しなかった。この問題はMGの合成基質である三炭糖が旧定量法では発色していることがHPLC等でわかった。(4)糖質から生成するルートについては各種動物の各種臓器で追究した。ガラクトース投与ラットの心臓,肝臓でフルクトース1,6-2リン酸(F-1,6-dip)から710%の収率で、またヒト溶血赤血球ではF-1,6-bpから9%の収率で各々生成することがわかった。3.MGの代謝について、MGはD-乳酸になりピルビン酸になる経路とホルムアルデヒド脱水素酵素によりピルビン酸になる経路だけについて研究している。前者はD-乳酸の新定量法,後者はギ酸の新定量法を確立して研究を前進させている。4.病態との関係について、岡山国立病院院長,山内逸郎,同病院,瀬崎内科医長より血清等を得てD-乳酸の含量を測定し病態との関連を調べている。
光の力学作用を用いた極微光化学反応場の構築とマイクロファブリケーション

集光紫外レーザー光による誘起される局所的な光重合反応に放射圧を作用させると重合反応の空間選択性が格段に向上することを近年見出した。そのメカニズム解明のため放射圧発生用近赤外レーザー光の吸収に伴う樹脂・溶液の温度上昇度の定量的評価法を本研究初年度に確立した。本年度は、蛍光相関分光法(FCS)および計算機シミュレーションを用いて、近赤外光の放射圧が分子の並進拡散に与える影響を定量的に評価した。塩基数(即ち分子量)を変化させた一本鎖DNA数種類に対して水溶液中で近赤外レーザー光の放射圧を作用させ、放射圧ポテンシャル中のDNA分子数、分子が放射圧ポテンシャル中に滞在する平均の時間(平均滞在時間)の変化をFCSにより測定した。その結果、近赤外レーザー光強度の増加と共に平均分子数の上昇か確認され、その上昇度は分子量に依存した。一方、平均滞在時間は近赤外レーザー光強度の増加と共に減少した。この一見相矛盾する結果を理解するため、ブラウン動力学法に基づくプログラムを開発し、放射圧下の蛍光分子に対して得られる蛍光相関波形をシミュレートした。その際、初年度の研究で得られた、水の近赤外光吸収に起因する局所的な温度上昇を考慮しシミュレーションを行ったところ上記の実験結果を再現した。また、シミュレーションと実験結果を比較することで、塩基数数十個程度の一本鎖DNAには0.10.5kT_R(T_R=297K)程度の放射圧ポテンシャルが作用していることを明らかにした。本成果により分子系に働く放射圧の定量的評価が可能となり、初年度の局所温度測定法と合わせ、重合反応に対する放射圧効果を定量的に解析するための有効な手法が確立できた。光硬化性樹脂の局所的な光重合反応に放射圧を作用させると重合反応の空間選択性が格段に向上することを近年見出した。そのメカニズムの解明のため、(1)光圧発生用近赤外レーザー光の吸収に伴う樹脂・溶液の温度上昇度の定量的評価及び(2)近赤外光の放射圧が分子の並進拡散に与える影響の調査に主眼をおき研究を遂行した。目的達成のため、研究室自作の蛍光相関分光システム(励起光波長488nm)に近赤外レーザー(Nd: YVO_4レーザー)を組み込み、近赤外レーザー光の集光スポット内部の蛍光分子の拡散挙動を観測可能なシステムを構築した。水、エタノール、1-プロパノール、2-プロパノール、ブタノール、エチレングリコールにプローブとして低分子量の蛍光分子(Rhodamine6G、Rhodamine 123)を溶解させ試料とし、近赤外光照射下での蛍光相関分光測定からプローブ分子の拡散速度の近赤外光強度依存性を得た。オストワルド粘度系で測定した各溶液粘度の温度依存性とStokes-Einsteinの関係式から近赤外レーザー光照射下での局所温度を決定したところ、各溶媒の温度は入射近赤外レーザ光強度に対して線形に増加し、また単位レーザー光強度あたりの温度上昇度ΔT/ΔPは、溶媒の吸光係数αと熱伝導率λとの比α/λに対して線形に増加すること、及びその空間分布は観測時間内では集光位置近傍数脚の範囲ではほぼ一様であることが分かった。また項目(2)に関して、蛍光標識された種々の分子量のDNAを用いて放射圧下での蛍光相関分光測定を行ったところ近赤外レーザー光強度の増加に伴う平均分子数の増加が見られ、ストークス半径が数10nm程度の高分子においても放射圧の寄与により局所濃度が上昇することを示唆する結果が得られた。
超伝導重力計を用いたインドネシア・中国・日本の重力変化の比較研究

東アジアにおける超伝導重力計ネットワークを用いて島弧と大陸の下の地殻および上部マントルの構造の違いを明らかにすることを目的として、研究代表者らは、平成9年12月に京都大学が保有する2基の超伝導重力計のうち1基をインドネシアのバンドン市内にあるインドネシア火山調査所(VSI)内の地下室に移設し、観測を開始した。その後、平成10年4月に、落雷の直撃を受けて、データ集録装置と冷却用コンプレッサーが故障したため観測が中断していたが、平成10年12月に修理が完了し、観測が再開された。その後、観測は順調に継続され、平成11年2月、同8月及び平成12年1月に液体ヘリウムの充填を実施した。バンドン市の超伝導重力計で得られた観測データに基づき、潮汐定数を決定した後、地球潮汐の観測に及ぼす海洋潮汐の荷重影響を計算した。その結果を京都及び阿蘇における同様の計算結果と比較した。また、中国科学アカデミー地球物理学及び測地学研究所(武漢市)と中国計量科学院(北京市)が所有する絶対重力計を用いてバンドン市及び日本国内の超伝導重力計のキャリブレーションを実施する計画であったが、平成10年度、京都大学にFG5型絶対重力計が導入されたので、この計画を変更し、平成11年度に中国側研究者を日本に招聘し、京都大学の絶対重力計を用いて京都の超伝導重力計のキャリブレーションを共同して実施した。さらに、平成11年度に研究代表者(竹本修三)が訪中し、武漢市の超伝導重力計観測施設や北京市・中国計量科学院の絶対重力計開発室などを見学し、中国側研究者と意見交換を行った。その後、日中の研究者が協力して、京都及び武漢で得られた超伝導重力計観測データのノイズレベルについて比較検討を行い、得られた成果をJournal of Geodesy誌に投稿した。東アジアにおける超伝導重力計ネットワークを用いて島弧と大陸の下の地殼および上部マントルの構造の違いを明らかにすることを目的として、研究代表者らは、平成9年12月に京都大学が保有する2基の超伝導重力計のうちの1基をインドネシアのバンドン市内にあるイシドネシア火山調査所(VSI)構内の地下室に移設し、観測を開始した。バンドン市の超振導重力計で得られた3ヶ月間の観測データに基づき、潮汐定数を決定したのち、地球潮汐の観測に及ぼす海洋潮汐の荷重影響を計算した。その結果を京都及び阿蘇における同様の計算結果と比較し、平成10年秋の日本測地学会で発表した。また、中国科学アカデミー地球物理学及び測地学研究所(武漢市)と中国計量科学研究院(北京市)が所有する絶対重力計を用いてバンドン.市及び日本国内の超伝導重力計のキャリブレーションを実施する計画であったが、平成10年度に京都大学に絶対重力計が導入されることになったので、この計画を変更し、平成11年度に京都大学の絶対重力計を用いて超伝導重力計のキャリブレーションを実施することになった。日中の研究者は協力して、武漢市に設置されている超伝導重力計の観測データの整理・解析をすすめている。

その後、平成10年4月に、落雷の直撃を受けて、データ集録装置と冷却用コンプレッサーが故障したため観測が中断していたが、平成10年12月に修理が完了し、観測が再開された。その後、観測は順調に継続され、平成11年2月、同8月及び平成12年1月に液体ヘリウムの充填を実施した。バンドン市の超伝導重力計で得られた観測データに基づき、潮汐定数を決定した後、地球潮汐の観測に及ぼす海洋潮汐の荷重影響を計算した。その結果を京都及び阿蘇における同様の計算結果と比較した。また、中国科学アカデミー地球物理学及び測地学研究所(武漢市)と中国計量科学院(北京市)が所有する絶対重力計を用いてバンドン市及び日本国内の超伝導重力計のキャリブレーションを実施する計画であったが、平成10年度、京都大学にFG5型絶対重力計が導入されたので、この計画を変更し、平成11年度に中国研究者を日本に招聘し、京都大学の絶対重力計を用いて京都の超伝導重力計のキャリブレーションを共同して実施した。さらに、平成11年度に研究代表者(竹本修三)が訪中し、武漢市の超伝導重力計観測施設や北京市・中国計量科学院の絶対重力計開発室などを見学し、中国側研究者と意見交換を行った。その後、日中の研究者が協力して、京都及び武漢で得られた超伝導重力計観測データのノイズレベルについて比較検討を行い、得られた成果をJournal of Geodesy誌に投稿した。
板鰓類の系群解析に関する研究

板鰓類,特にサメ類3種の系群解析を形態的,生態的,遺伝的な形質を用いて解析した.ホシザメについては台湾海域を含む7ヵ所から合計1,514個体の標本を採集し,外部形態と脊椎骨による形態的な特徴,年齢と成長,繁殖,食性,寄生虫の寄生率などの生活史特性,遺伝子配列などにより,系群の識別を試みた.まず,正準判別分析を用いた解析では,形態に海域間で雌雄ともに有意な差が認められた.年齢と成長でも海域間に違いがみられ,台湾産がもっとも成長が悪く,青森産がもっとも成長がよかった.最大体長と最高齢も南から北に行くにつれ増加する傾向がみられた.成熟体長と成熟年齢は台湾から青森に行くにつれ増加する傾向がみられた.また,出生体長も同様な傾向が認められた.一腹の胎仔数は東京湾がもっとも少なく,台湾がもっとも多かった.青森近海産は他の海域と異なる繁殖サイクルを示した.食性にも違いがみられ,同一体長では台湾から青森に行くにつれ減少する傾向がうかがえた.寄生虫の種類や寄生虫にも地域的な特性が観察された.遺伝学的には,系群解析を試みたが,他の板鰓類同様多型は検出できなかった.以上の結果から,日本周辺には少なくとも5つ以上の系群が存在することが示唆された.ツマリツノザメについては,世界7海域から採集した合計133個体について,58の計量・計数形質を比較した.この結果,楯鱗と胸鰭の形態に海域間の差が認められ,地中海,南アフリカ,及び日本近海とオーストラリアの3グループに分けられた.またミトコンドリアDNAの塩基配列の解析結果からは,日本,オーストラリア,南アフリカ近海の3つに分けられた.以上の結果から,本種群は日本近海,オーストラリア近海,南アフリカ近海,地中海の4グループに分けられた.ヨゴレについては太平洋産の年齢と成長,繁殖形質を世界ではじめて明らかにし,系群解析の基礎を築くことができた.板鰓類,特にサメ類3種の系群解析を形態的,生態的,遺伝的な形質を用いて解析した.ホシザメについては台湾海域を含む7ヵ所から合計1,514個体の標本を採集し,外部形態と脊椎骨による形態的な特徴,年齢と成長,繁殖,食性,寄生虫の寄生率などの生活史特性,遺伝子配列などにより,系群の識別を試みた.まず,正準判別分析を用いた解析では,形態に海域間で雌雄ともに有意な差が認められた.年齢と成長でも海域間に違いがみられ,台湾産がもっとも成長が悪く,青森産がもっとも成長がよかった.最大体長と最高齢も南から北に行くにつれ増加する傾向がみられた.成熟体長と成熟年齢は台湾から青森に行くにつれ増加する傾向がみられた.また,出生体長も同様な傾向が認められた.一腹の胎仔数は東京湾がもっとも少なく,台湾がもっとも多かった.青森近海産は他の海域と異なる繁殖サイクルを示した.食性にも違いがみられ,同一体長では台湾から青森に行くにつれ減少する傾向がうかがえた.寄生虫の種類や寄生虫にも地域的な特性が観察された.遺伝学的には,系群解析を試みたが,他の板鰓類同様多型は検出できなかった.以上の結果から,日本周辺には少なくとも5つ以上の系群が存在することが示唆された.ツマリツノザメについては,世界7海域から採集した合計133個体について,58の計量・計数形質を比較した.この結果,楯鱗と胸鰭の形態に海域間の差が認められ,地中海,南アフリカ,及び日本近海とオーストラリアの3グループに分けられた.またミトコンドリアDNAの塩基配列の解析結果からは,日本,オーストラリア,南アフリカ近海の3つに分けられた.以上の結果から,本種群は日本近海,オーストラリア近海,南アフリカ近海,地中海の4グループに分けられた.ヨゴレについては太平洋産の年齢と成長,繁殖形質を世界ではじめて明らかにし,系群解析の基礎を築くことができた.本年はホシザメ、ツマリツノザメ、およびオオジロザメの3種について、形態学的、生態学的、遺伝学的な手法を用いて系群解析を試みた。ホシザメについては、八戸近海、東京湾、銚子沖合、若狭湾、下関近海、日向灘、および台湾の基隆近海から標本を集めて系群の解析を行った。形態解析では、脊椎骨数のうち、尾鰭前脊椎骨数に海域間で違いが認められ、特に基隆産や八戸産は平均値はもとよりモードの位置も異なり、他の海域のものとは異なった系群であることが示唆された。原鰭と尾鰭間の距離についても八戸産と下関産の標本とに違いが認められた。生態的には、成熟体長や交尾期にも海域産で顕著な違いがみられ、特に八戸産はほかの海域のものと大きく異なっていた。3種の寄生虫による寄生率を海域間で比較したところ、それぞれ特異な寄生率がみられ、クラスター分析による解析では、八戸産と銚子産さらに東京湾産の標本が近い関係にある一方、台湾産、下関産、日向灘産および舞鶴産が近い関係にあり、東日本系と西日本系の2つに大別されることが判明した。ミトコンドリアDNAを用いての海域間の遺伝的特性を検討したが、現在までのところ変異を検出できなかった。ツマリツノザメについては、日本近海、オセアニア、地中海および南アフリカから標本を厚め、形態および遺伝の両面から系群の解析を試みた。その結果、従来同種と考えられていた地中海産と南アフリカ産は、明らかに日本産やオセアニア産とは異なる形態を有するため別種とするのが妥当であるとの結論に達した。

また、日本近海産とオセアニア産との間にはオーバーラップはあるものの、95%の個体は識別可能であるため、一応亜種として区別することにした。遺伝学的にもこれらは区別可能であった。オオメジロザメではミトコンドリアDNAのDグループを用いて、太平洋産、大西洋産およびオーストラリア産との間に系群の違いが認められた。本年はホシザメにの系群解析,特に繁殖生態の解析を中心に研究を推進した.日本近海で定期的に標本採集が可能であった青森,東京湾,舞鶴,下関,台湾近海の5カ所の繁殖生態を比較した.雄の成熟年齢は台湾が最小で一部は既に1歳で性成熟にに達し,3歳で台湾,下関,舞鶴の大部分,東京湾のごく一部が成熟するが,東京湾では5歳,青森では7歳になって初めて成熟が完了した.雌では台湾産の一部が2歳で成熟してもっとも早く,5歳では台湾,下関,舞鶴,6歳では東京湾の雌のほぼすべてが成熟するが,青森産は6歳でも未熟の個体がみられ,成熟年齢はもっとも高いと推定された.成熟全長については,雄では台湾産がもっとも小さく,さらに台湾,下関,舞鶴の全個体および東京湾の大部分が成熟する701-800mmの全長で初めて青森産が成熟し始めた.雌では台湾産の半分が成熟する601-700mmで下関と舞鶴の一部が性成熟に達するが,東京湾では成熟体長がこれよりも大きく,さらに青森では901-1000mmでも未熟個体が出現した.おおむね成熟年齢と全長は雌雄とも台湾<下関=舞鶴<東京湾<青森の傾向が顕著であった.青森と東京の年齢差は約3歳,全長差はおよそ300mmに及んだ.青森を除く雌の繁殖サイクルは10-12ヶ月で毎年繁殖するものと推定されたが,青森だけは特定の交尾期を持たず,妊娠に休止期があるものと推測された.出生全長は東京湾では200-300mmと幅が広く,しかも初期の成長が早いという特異な初期生活史を有するが,台湾では250mm,下関・舞鶴では300mm,青森では300-350mmであった.一腹の退治数は母全長とともに増加するが,同一の母全長ではおおむね東京湾<青森<下関=舞鶴<台湾の傾向が見られた.このように,繁殖生態には顕著な地理変異が見られ,複数の系群の存在が示唆された.本年はホシザメの成長と寄生虫の寄生率を中心に研究を推進し,前年及び前前年の研究成果を総合して,日本周辺海域におけるホシザメの系群の存在を明らかにした.さらに,外洋性サメ類の系群解析の第1歩としてヨゴレの年齢,成長及び繁殖の研究を行った.まず,ホシザメについては日本近海で定期的に標本採集が可能であった青森,東京湾,舞鶴,下関,台湾近海の5カ所の年齢と成長を比較した.脊椎骨を用いた年齢解析では,輪紋の形跡時期に海域感の差は認められなかった.0歳時の推定体長では東京湾<下関<舞鶴<青森の順で,雌雄ともに明瞭な差がみられた.雄の成長は台湾がもっとも悪く,青森がもっともよかった.3歳を越えると下関が舞鶴を上回り,東京湾は4歳を越えると舞鶴を上回った.東京湾の成長量は3歳以降最大となったが,0歳時の体長が小さかったために,青森には及ばなかった.最高齢は台湾5歳,舞鶴・下関6歳,東京湾8歳,青森9歳と北に向かうにつれ,寿命が長くなる傾向がみられた.次に寄生虫の寄生率を比較したところ,粘液胞子虫,線虫,カイアシ類で寄生率に差が認められた.他の生活史特性で差が認められなかった舞鶴と下関でも寄生率では差がみられた.条虫類については東京湾と青森で比較したところ,8種のうち7種で寄生率に差が存在した.
ナノスケール生産基盤におけるコア計測技術に関する企画調査

知的ナノメートル計測を発展させ,ナノスケール生産基盤として日本の産業における「ものづくり」への適用を考えるためには,4つのコア計測技術における課題解決のための共同研究が必要となる.本企画調査では,これらの課題解決を目的とした特定領域研究設置のための調査研究を行った.以下のような4つのグループを作り,調査研究を行った.(1)知的計測技術研究グループ知的計測手法の基本的な技術を体系化し,これを産業界で応用する場合の方法を定式化した.(2)ナノメートル加工計測技術研究グループナノメートル加工計測技術に知的計測手法を応用するために最適な対象を調査した.(3)ナノメートル計測標準研究グループナノメートル計測の標準化により,産業界にナノメートル領域のトレーサビリティを確立するための方法を検討した.(4)ものづくりへの展開研究グループ本組織の母体となる精密工学会「知的ナノ計測専門委員会」の産業界からのメンバー(10社20社程度)を研究協力者として,産業界におけるものづくりへ知的ナノメートル計測技術を適用する手法について検討した.このような連携活動を有効的,効率的に行うために,上記専門委員会の活動を支援し連携して調査研究を行った.また,関連する国際会議8th International Symposium on Measurement Technology and Intelligent Instruments (ISMTII2007) (2007年9月25日27日,東北大学,委員長高教授)を支援することで,国際的な連携,動向調査を行った.この国際会議は,参加者:250人(23カ国),発表:214件,企業展示:15社と,計測分野の国際会議として大きな成功を収めた.このためにインターネットおよびホームページを有効に利用した情報収集,および国際的な情報発信やメールや郵送を利用した情報収集を行った.これらの連携,研究,調査の結果を特定領域研究の新規発足研究領域の準備に利用する.知的ナノメートル計測を発展させ,ナノスケール生産基盤として日本の産業における「ものづくり」への適用を考えるためには,4つのコア計測技術における課題解決のための共同研究が必要となる.本企画調査では,これらの課題解決を目的とした特定領域研究設置のための調査研究を行った.以下のような4つのグループを作り,調査研究を行った.(1)知的計測技術研究グループ知的計測手法の基本的な技術を体系化し,これを産業界で応用する場合の方法を定式化した.(2)ナノメートル加工計測技術研究グループナノメートル加工計測技術に知的計測手法を応用するために最適な対象を調査した.(3)ナノメートル計測標準研究グループナノメートル計測の標準化により,産業界にナノメートル領域のトレーサビリティを確立するための方法を検討した.(4)ものづくりへの展開研究グループ本組織の母体となる精密工学会「知的ナノ計測専門委員会」の産業界からのメンバー(10社20社程度)を研究協力者として,産業界におけるものづくりへ知的ナノメートル計測技術を適用する手法について検討した.このような連携活動を有効的,効率的に行うために,上記専門委員会の活動を支援し連携して調査研究を行った.また,関連する国際会議8th International Symposium on Measurement Technology and Intelligent Instruments (ISMTII2007) (2007年9月25日27日,東北大学,委員長高教授)を支援することで,国際的な連携,動向調査を行った.この国際会議は,参加者:250人(23カ国),発表:214件,企業展示:15社と,計測分野の国際会議として大きな成功を収めた.このためにインターネットおよびホームページを有効に利用した情報収集,および国際的な情報発信やメールや郵送を利用した情報収集を行った.これらの連携,研究,調査の結果を特定領域研究の新規発足研究領域の準備に利用する.
ロングリードシークエンサーによる先天異常症候群の新規発症メカニズムの解明

臨床診断確定例にも依然としてエクソーム・全ゲノム解析後も変異未検出例が存在する。未検出例では従来の短いシークエンスリードでは検出困難なゲノム構造異常が存在している可能性があり、ロングリードシークエンサーは現行のショートリード解析では検出不可能なゲノム構造を検出できる。未検出例の遺伝学的診断と発症メカニズムの解明を目的として、ロングリード解析による全ゲノム解析の臨床的有用性を検証することとした。変異未検出の臨床診断確定例に対するロングリード解析により診断アルゴリズムを構築し、臨床診断未確定例の探索的診断と疾患候補遺伝子の同定、疾患概念を確立する。(前年度より継続課題)ロングリードシークエンサーは従来のショートリードと比べてゲノム構造異常を検出することに優れている。ロングリードの臨床的有用性を検証するため、既知のゲノム構造異常のシークエンスを最初に行なった。異なる染色体の3カ所に中間部の重複をマイクロアレイ染色体検査で認めた症例についてNanoporeのMinIONで解析を行なった。得られたシークエンスデータは予想を上回り12Gb以上を得ることができたが、ゲノム構造異常を検出するためには十分なカバレッジではなかった。ヒトゲノムが3Gbであることを考慮するとより多くのシークエンスデータ出力が必要と考えられた。MinIONは1回あたりの解析費用は抑えられるが、複数回の解析を重ねるために多くのDNAサンプル量と解析費用が必要になるため本研究に用いるのに適切ではないことが明らかになった。MinIONと同じメカニズムでシークエンスを行え、より多くの出力を有するPromethION(Nanopore)による解析に変更した。PromethIONはMinIONと同じDNA量より5倍以上のシークエンス出力をもちゲノム構造解析に十分なカバレッジを得ることができた。NGMLR, Snifflesの解析ソフトを用いてマッピング、バリアントコールを行いRibbonを用いて閲覧した。解析した検体では、マイクロアレイによりコピー数異常は既知であったが、転座や重複の挿入方向については不明であった。ロングリード解析により3カ所中の2カ所はゲノムの正方向に沿って近接した重複(tandem duplication)であり、1カ所はゲノムの逆方向の重複(inverted duplication)であった。既知のゲノム構造異常症例2症例に対して、シークエンスにより切断点を塩基単位で決定することができた。1例目の3カ所重複においての切断点は、tandem duplicationの2カ所では切断を伴わなかったがinverted duplicationでは数塩基の欠失を伴っていた。これまでのFISH検査やサンガーシークエンスでは切断点解析や逆位などの空間的位置関係を正確に同定することが困難であったが、ロングリードにより解明することができた。2例目の染色体端部欠失では、欠失部位に他の染色体テロメア領域の断片が付加しており、染色体相互転座由来の不均衡転座であることがわかった。両親の染色体に均衡型相互転座は認めず、配偶子形成の過程で起こったものであった。現在転座部位の配列相同性を検討しており、転座が行った機序を検討中である。2症例の解析を通して、ある程度構造異常が予想されるものでも検出は容易ではないことが明らかになった。MinIONのロングリードシークエンサーは10kb前後のシークエンス長を有し、Mb単位の構造異常では組み替え構造の全長を読むことは不可能であり再構成による予測が必要であった。現時点の解析手法では、未知の構造異常を探索することは困難であった。マイクロアレイ染色体検査やFISHで検出することが困難である症例についてロングリードシークエンスで解析をすすめる予定である。均衡型相互転座の切断点の同定や、複雑なゲノム構造異常を伴う既知の症候群症例の構造同定を通して発症機序の解明を目指す。均衡型相互転座はコピー数異常を伴わないが切断点周辺の遺伝子発現が変化することが病態と考えられてきた。病態解明に必要な切断点同定は、G分染とFISHなどの従来の技術を組み合わせても困難な症例が多かった。ロングリードは、切断点周辺の繰り返し配列を含めて解析可能であり病態解明につながると考えられる。非典型的な発症機序が予想される既知症候群の症例についてもロングリードによる発症機序解明を行う予定である。発症にはゲノム構造異常が関与していることがFISHにより判明している症例であるが、原因遺伝子周辺に繰り返し配列があり解析困難であった。今後の解析をすすめるにあたり、データ解析やviewerの改善・工夫が必要である。解析検体にchromothripsisなどの複雑な染色体再構成を合併している可能性があり、ゲノム構造を俯瞰的にみるための取り組みを行う。

得られたシークエンスデータは予想を上回り12Gb以上を得ることができたが、ゲノム構造異常を検出するためには十分なカバレッジではなかった。ヒトゲノムが3Gbであることを考慮するとより多くのシークエンスデータ出力が必要と考えられた。MinIONは1回あたりの解析費用は抑えられるが、複数回の解析を重ねるために多くのDNAサンプル量と解析費用が必要になるため本研究に用いるのに適切ではないことが明らかになった。MinIONと同じメカニズムでシークエンスを行え、より多くの出力を有するPromethION(Nanopore)による解析に変更した。PromethIONはMinIONと同じDNA量より5倍以上のシークエンス出力をもちゲノム構造解析に十分なカバレッジを得ることができた。NGMLR, Snifflesの解析ソフトを用いてマッピング、バリアントコールを行いRibbonを用いて閲覧した。解析した検体では、マイクロアレイによりコピー数異常は既知であったが、転座や重複の挿入方向については不明であった。ロングリード解析により3カ所中の2カ所はゲノムの正方向に沿って近接した重複(tandem duplication)であり、1カ所はゲノムの逆方向の重複(inverted duplication)であった。既知のゲノム構造異常症例2症例に対して、シークエンスにより切断点を塩基単位で決定することができた。1例目の3カ所重複においての切断点は、tandem duplicationの2カ所では切断を伴わなかったがinverted duplicationでは数塩基の欠失を伴っていた。これまでのFISH検査やサンガーシークエンスでは切断点解析や逆位などの空間的位置関係を正確に同定することが困難であったが、ロングリードにより解明することができた。2例目の染色体端部欠失では、欠失部位に他の染色体テロメア領域の断片が付加しており、染色体相互転座由来の不均衡転座であることがわかった。両親の染色体に均衡型相互転座は認めず、配偶子形成の過程で起こったものであった。現在転座部位の配列相同性を検討しており、転座が行った機序を検討中である。2症例の解析を通して、ある程度構造異常が予想されるものでも検出は容易ではないことが明らかになった。MinIONのロングリードシークエンサーは10kb前後のシークエンス長を有し、Mb単位の構造異常では組み替え構造の全長を読むことは不可能であり再構成による予測が必要であった。現時点の解析手法では、未知の構造異常を探索することは困難であった。マイクロアレイ染色体検査やFISHで検出することが困難である症例についてロングリードシークエンスで解析をすすめる予定である。均衡型相互転座の切断点の同定や、複雑なゲノム構造異常を伴う既知の症候群症例の構造同定を通して発症機序の解明を目指す。
テストステロンによって脳に発現誘導される性分化決定遺伝子の同定

テストステロン処理によってラット雌新生児の脳の内側視索前野において発現誘導される遺伝子の同定を目的として、サブトラクションクローニング法によるスクリーニングを行った。テストステロン処理及び対照処理後のラット雌新生児から内側視索前野を単離し、それぞれに対応するcDNAを合成した。この2種類のcDNA産物を用いてビオチン化プライマー、ストレプトアビヂンならびにRDA法を用いたサブトラクションを行うことによって、テストステロン処理時に発現誘導されるcDNAの濃縮を行なった。ついで、上記サブトラクション後のcDNAをクローン化し、サザーンハイブリダイゼーションによるディファレンシャルスクリーニングを行い、テストステロン処理時に発現が上昇する遺伝子断片を持つクローンをさらにスクリーニングした。最終的に、in situ hybridization法を用いて、脳切片標本における各候補遺伝子の発現を検討した結果、候補遺伝子断片のうち現在のところ一種類において、雌新生児の内側視索前野におけるテストステロンによる発現誘導と無処理の雄新生児の内側視索前野における発現がみられた(2002年度分子生物学会発表)。これらの結果はラット新生児脳内側視索前野においてテストステロンによって発現誘導される特定のmRNAの存在を明らかにし、また今後、本mRNAの発現ならびにその蛋白質産物の機能解析を行うことによって、脳の性分化機構を明らかにするための一つの分子的手がかりを得たと言える。テストステロン処理によってラット雌新生児の脳が雄型に転換する際に内側視索前野において特異的に発現する遺伝子をサブストラクションクローニング(差引法)によって組織的に探索しテストステロンによる脳の雄性化に関与する遺伝子の同定を行うことを目的として研究してきた。現在までに、テストステロン処理後及び無処理のラット雌新生児各約150尾づつから内側視索前野を単離し、これに含まれるmRNAを精製し、それぞれに対応するcDNAライブラリーを合成した。この2種類のcDNAライブラリーを用いてビオチン化プライマー、ストレプトアビヂンならびにPCR法を用いた差引法を行うことによって、テストステロン処理時のみに発現しているcDNAの濃縮を行なった。人為的に加えたポジティブコントロールを用いた検定の結果、この差引法を3回繰り返すことによってテストステロン処理時のみに発現しているcDNAが現在までに約100倍濃縮されていることが推定できた。さらにRDA法による差引法を加えることによって、マーカー遺伝子を約10^5倍の濃縮することにに成功した。現在、上記差引法のcDNA産物をクローン化し、サザンハイブリダイゼーションによるディファレンシャルスクリーニングを行い有望クローンをスクリーニングしている。また、これと同様の差引法を逆向きに行うことによってテストステロン処理時に発現が失われるcDNAの探索も現在併行して行っている。
再集合培養系を用いたアフリカツメガエル未分化細胞からの歯牙及び顎顔面領域の誘導

アフリカツメガエルアニマルキャップアッセイ,再集合培養を行った。再集合体内にアルシアンブルー・PAS染色陽性の軟骨組織形成を認めた。次に再集合体をアフリカツメガエルの幼生腹部への移植実験を行った。変態完了後,脱灰標本にてPAS染色で染まるアメロジェニン抗体に陽性の歯胚様構造を認めた.さらに再集合体をSt23幼生の下顎部位を除去した幼生に移植したが,アルシアンブルー陽性の軟骨組織を得られなかった.アフリカツメガエルアニマルキャップアッセイ,再集合培養を行った。変態完了後,脱灰標本にてPAS染色で染まるアメロジェニン抗体に陽性の歯胚様構造を認めた.さらに再集合体をSt23幼生の下顎部位を除去した幼生に移植したが,アルシアンブルー陽性の軟骨組織を得られなかった.雌雄アフリカツメガエルに性腺刺激ホルモンを注射し,人工授精させ,受精卵を得る.実体顕微鏡下,アニマルキャップを切り出し,再集合培養を行った.培養の条件は,我々(Myoishi, et al. Int J DevBiol. 2004 Dec ; 48(10) : 1105-12)が確立した,アクチビンA 25ng/mlで1時間処理した処理群とアクチビンA未処理群の比率を1:5という条件(場合によっては、さらに均一な軟骨組織を誘導できる条件をアクチビンA処理群,未処理群の混合比率もしくはアクチビンAの処理濃度を変更することで検索)で行い,再集合体の培養は,我々が長期培養用に開発したRDX培地を用いて30日間および45日間培養を行った.培養期間終了後,固定,切片作成後,ヘマトキシリン・エオジン染色,アルシアンブルー・PAS染色を行い,再集合体内に口腔領域に相当する器官が形成されたか否かを検討したところ,再集合体内にアルシアンブルー・PAS染色陽性の軟骨組織の形成を認めた.アフリカツメガエル幼生では,軟骨組織は頭部にのみ存在しているため,今回再集合体で形成された軟骨組織は,頭部領域の軟骨組織であることが推測された.また歯牙特有タンパクとして広く知られているアメロジェニンに対する抗体を用いて免疫染色を行ったが,アメロジェニンの発現を確認することが出来なかった.雌雄アフリカツメガエルに性腺刺激ホルモンを注射し,人工授精させ,受精卵を得る.実体顕微鏡下,アニマルキャップを切り出し,再集合培養を行った.培養の条件は,我々(Myoishi, et al.Int J Dev Biol.2004 Dec;48(10):1105-12)が確立した,アクチビンA 25ng/mlで1時間処理した処理群とアクチビンA未処理群の比率を1:5という条件(場合によっては、さらに均一か軟骨組織を誘導できる条件をアクチビンA処理群,未処理群の混合比率もしくはアクチビンAの処理濃度を変更することで検索)で行い,再集合体の培養は,我々が長期培養用に開発したRDX培地を用いて30日間および45日間培養を行った.培養期間終了後,固定,切片作成後,ヘマトキシリン・エオジン染色,アルシアンブルー・PAS染色を行い,再集合体内に口腔領域に相当する器官が形成されたか否かを検討したところ,再集合体内にアルシアンブルー・PAS染色陽性の軟骨組織の形成を認めた.アフリカツメガエル幼生では,軟骨組織は頭部にのみ存在しているため,今回再集合体で形成された軟骨組織は,頭部領域の軟骨組織であることが推測された.また歯牙特有タンパクとして広く知られているアメロジェニンに対する抗体を用いて免疫染色を行ったが,アメロジェニンの発現を確認することが出来なかった.そこで、再集合体をアフリカツメガエルの幼生(St23)への移植実験を行った。竿集合体を幼生の腹部に移植し、飼育、母体の成長に伴い、再集合体も肥大を認めた。飼育後50日で変態完了したため、固定後脱灰標本を作成したところ、移植部にはPAS染色で赤紫色に染まる、骨組織および軟骨組織に摂取瑠、歯胚様構造を認めた。雌雄アフリカツメガエルに性腺刺激ホルモンを注射し、人工授精させ、受精卵を得る。実体顕微鏡下、アニマルキャップを切り出し、再集合培養を行った。培養の条件は、我々(Myoishi, et al.Int J Dev Biol.2004 Dec;48(10):1105-12)が確立した、アクチビンA 25ng/mlで1時間処理した処理群とアクチビンA未処理群の比率を1:5という条件で行い、再集合体の培養は、我々が長期培養用に開発したRDX培地を用いて30日間および45日間培養を行った。培養期間終了後、固定、切片作成後、再集合体内に口腔領域に相当する器官が形成されたか否かを検討したところ、再集合体内にアルシアンブルー・PAS染色陽性の軟骨組織の形成を認めた。アフリカツメガエル幼生では、軟骨組織は頭部にのみ存在しているため、今回再集合体で形成された軟骨組織は、頭部領域の軟骨組織であることが推測された。また歯牙特有タンパクとして広く知られているアメロジェニンに対する抗体を用いて免疫染色を行ったが、アメロジェニンの発現を確認することが出来なかった。そこで、再集合体をアフリカツメガエルの幼生(St23)への移植実験を行った。

再集合体を幼生の腹部に移植し、飼育、母体の成長に伴い、再集合体も肥大を認めた。飼育後50日で変態完了したため、固定後脱灰標本を作成したところ、移植部にはPAS染色で赤紫色に染まる、骨組織および軟骨組織に摂取瑠、歯胚様構造を認めた。さらに再集合体をstage23のアフリカツメガエル幼生の下顎部位を除去したアフリカツメガエル幼生移植し、捕食等の生理的機能を有するか否かの検討を行ったところ、再集合体は幼生の下顎部位に対して大きすぎ、正常に機能しないため、成長することができなかった。そのため、再集合体に用いるアニマルキャップの細胞を通常の半量にて再集合体を作成(処理群と未処理群の比率は同じ)し、器官形成を確認したが、目的とするアルシアンブルー陽性の軟骨組織を得ることができなかった。