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遺伝アルゴリズムによる最適化問題の多段階解法の開発

本研究では,遺伝アルゴリズムによる最適化問題の多段階解法の開発を行なった.具体的な最適化問題として,エネルギー計画問題の1つであるコージェネレーションシステム導入計画を取り上げた.この問題は,レイアウト問題およびネットワーク計画問題の両方の性質を伴う.本研究で得られた成果は以下の通りである.1.遺伝アルゴリズムによって複数の解空間を規定し,解空間単位で探索点を収束させるという,最適化問題に対する段階的な近似解法を開発した.2.開発した解法を現実問題へ適用することにより,その有効性を実証した.3.数理計画法による解法との比較により,開発した解法の特性を明確にした.本研究で開発した解法は,以下の3つの基本ステップからなる.Step1:遺伝アルゴリズムによってエネルギー供給のためのネットワーク構造を表現する.このネットワーク構造は,遺伝アルゴリズムの集団によって複数生成される.1つのネットワーク構造が1つの解空間を表現する.Step2:表現されたネットワーク構造に対して熱輸送量などの定量データを一意に決定する.Step3:各解空間における評価関数値を比較することによって,解空間単位で探索点を収束させる.さらに,開発した解法および数理計画法に基づく解法を実在地域に対して適用した.これにより,開発した解法の精度や有効性を実証し,定式化や問題設定など,両者の解法の差異や特性を明確にした.以上のように,本研究で開発した解法は,現実的な最適化問題に対する有効な近似解法として位置付けることができる.本研究では,遺伝アルゴリズムによる最適化問題の多段階解法の開発を行なった.具体的な最適化問題として,エネルギー計画問題の1つであるコージェネレーションシステム導入計画を取り上げた.この問題は,レイアウト問題およびネットワーク計画問題の両方の性質を伴う.本研究で得られた成果は以下の通りである.1.遺伝アルゴリズムによって複数の解空間を規定し,解空間単位で探索点を収束させるという,最適化問題に対する段階的な近似解法を開発した.2.開発した解法を現実問題へ適用することにより,その有効性を実証した.3.数理計画法による解法との比較により,開発した解法の特性を明確にした.本研究で開発した解法は,以下の3つの基本ステップからなる.Step1:遺伝アルゴリズムによってエネルギー供給のためのネットワーク構造を表現する.このネットワーク構造は,遺伝アルゴリズムの集団によって複数生成される.1つのネットワーク構造が1つの解空間を表現する.Step2:表現されたネットワーク構造に対して熱輸送量などの定量データを一意に決定する.Step3:各解空間における評価関数値を比較することによって,解空間単位で探索点を収束させる.さらに,開発した解法および数理計画法に基づく解法を実在地域に対して適用した.これにより,開発した解法の精度や有効性を実証し,定式化や問題設定など,両者の解法の差異や特性を明確にした.以上のように,本研究で開発した解法は,現実的な最適化問題に対する有効な近似解法として位置付けることができる.
心血管疾患におけるＲＯＣＫ活性の役割：トランスレーショナル研究

臨床研究では、白血球ROCK活性が血管機能を反映し、心血管イベント発症を予測するバイオマーカーとして有用であることを明らかにした。これらトランスレーショナル研究により、ROCK2が心血管疾患における新たな治療ターゲットとなり得ること、また白血球ROCK活性が血管機能バイオマーカーとして有用であることを示した。本研究は,ROCK活性の亢進がどのように動脈硬化の発症・維持・進展に影響を及ぼすかをトランスレーショナル研究によって検討するものである.(1)昨年度における遺伝子改変動物を用いた研究では,ROCK2ノックアウトマウスがROCK1ノックアウトと比して一過性中大脳動脈閉塞による脳虚血領域が有意に低下しており,またその機序は内皮細胞におけるeNOSの発現とリン酸化の亢進によるものであることを明らかにした.当該年度における研究では,ROCK2によるeNOS mRNAの安定化の制御について検討した。すなわち,ROCK2の阻害によってeNOSの発現と活性が共に亢進することで心血管疾患に対しては保護的に働くことが示されたが,その機序としてROCK2によるeEF1A1のリン酸化がeNOS mRNAの安定化を制御することを明らかにした。(2)当該年度における臨床研究においては,侵襲的な血管ROCK活性の代用として非侵襲的である白血球ROCK活性を用いて検討した。高血圧患者における検討において,アルドステロン阻害薬であるエプレレノン,アンジオテンシンII受容体拮抗薬(ARB)であるロサルタンの投与により血管内皮機能障害は改善したが,Ca拮抗薬であるニフェジピンでは改善しなかった.一方でROCK活性における検討では,エプレレノン,ニフェジピンの投与によりROCK活性は低下したが,ロサルタンでは低下しなかった.以上より,ROCK活性は血管機能を反映するバイオマーカーとしては有用であるが,内皮機能検査とは一部異なった血管機能を表している可能性を報告した(Clin Pharmacol Ther. 2012).白血球ROCK活性のバイオマーカーとしての有用性を示すために,冠危険因子や心血管疾患を有する対象群における更なるクロスセクショナル研究,生活習慣改善や種々の薬剤を用いた介入試験を施行中である.<内容>In vivo研究では、ROCK2 KOマウスが、ROCK1 KOおよびWTマウスと比して脳虚血領域が低下すること、その機序がROCK2阻害による内皮細胞eNOSの発現亢進によることを明らかにした。In vitro研究では、ROCK2によるeEF1A1のリン酸化を介したeNOS mRNAの不安定化が、その機序であることを明らかにした(投稿準備中)。さらに、マウス心肥大モデルを用いて、ROCK2がFHL2を介して心肥大を制御していることを明らかにした(FASEB. 2013)。臨床研究では、非侵襲的な白血球ROCK活性を用いて検討した。高血圧患者における検討では、エプレレノン(アルドステロン阻害薬)、ロサルタン(アンジオテンシンII受容体拮抗薬)の投与により血管内皮機能障害は改善したが、ニフェジピン(Ca拮抗薬)の投与では改善を認めなかった。一方、エプレレノン、ニフェジピンの投与によりROCK活性は低下したが、ロサルタンでは低下しなかった。これらより、ROCK活性は血管機能を反映するバイオマーカーとしては有用であるが、内皮機能検査とは異なった血管機能を示すことを明らかにした(Clin Pharmacol Ther. 2012)。さらに、ROCK活性が、心血管イベント発症を予測するバイオマーカーとしても有用であることを明らかにした(Hypertension. 2013)。<意義・重要性>動脈硬化の発症と進展において、ROCK2がメディエーターとして重要な役割を担っており、新たな治療ターゲットとなり得ることをトラスレーショナル研究によって示した。バイオマーカーとしても、白血球ROCK活性が心血管イベント発症予測に有用であることを示した。現在のROCK活性評価はラボユーズと限定的であるため、さらなる簡易的ROCK活性測定の開発が期待されており、現在検討中である。本研究は,ROCK活性の亢進がどのように動脈硬化の発症・維持・進展に影響を及ぼすかをトランスレーショナル研究によって検討するものである.(1)当該年度における遺伝子改変動物を用いた研究では,ROCK2ノックアウトマウスがROCK1ノックアウトと比して一過性中大脳動脈閉塞による脳虚血領域が有意に低下しており,またその機序は内皮細胞におけるeNOSの発現とリン酸化の亢進によるものであることを明らかにした.更に,eNOS発現の亢進がeNOS mRNAの安定化によることも確認したが,eNOS mRNA安定化の詳細機序については現在も検討中である.これまでの検討では,特にROCK2の阻害によってeNOSの発現と活性が共に亢進し,心血管疾患に対しては保護的に働くことが示された.(2)一方,当該年度における臨床研究では,白血球ROCK活性が血管ROCK活性の代用になることを確認し,また白血球ROCK活性は血管内皮機能のみならず,10年間の冠疾患の罹患と死亡のリスクスコアであるフラミンガムスコアと相関するという所見を得た(Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2011).現在,冠危険因子や心血管疾患を有する対象群におけるクロスセクショナル研究,そして生活習慣改善や薬剤を用いた介入試験を続けており,ヒト白血球ROCK活性のバイオマーカーとしての有用性を検討中である.

遺伝子改変動物であるROCK1およびROCK2ノックアウトマウスを用いた研究では既にin vivoにおける検討データは全て揃いつつあり,in vitroにおける検討データ,すなわちメカニズムにおける検討においても順調にデータが出ている.臨床研究においても,まずは介入試験を主として行っているが,仮説通り,あるいは仮説に准じた結果が得られている.理由:順調に検討が進んでいる理由として,共同研究者や研究分担者とのコミュニケーションが非常に充実していることが挙げられる.遺伝子改変動物を用いた研究では,ROCK1およびROCK2ノックアウトマウスを用いた研究における共同研究者や研究分担者との意見交換がとても上手く進行して充実していること,またそれぞれの分担バランスが良く,順調に結果が出ていることがあげられる。また臨床研究においては,まずは被験者サンプルを含めた被験者数が十分であること,続いて得られた結果が仮説と一致していることがあげられる.平成25年度は,1).ROCK1およびROCK2ノックアウトマウスより培養した内皮細胞を用いたin vitro検討,すなわちROCK2によるeNOS mRNA安定化の制御の機序について中心的に検討を行う予定である.2)臨床研究では,非侵襲的な白血球ROCK活性による検討を中心として行う予定である.引き続いて対象は心血管病リスクを有さない健常人,および冠危険因子を有する明らかな心血管合併症を有さない軽症動脈硬化症例にて検討を行うが,薬剤や生活習慣の改善といったインターベンションによる介入試験やクロスセクショナル研究も引き続き行う.平成24年度は,1).ROCK1およびROCK2ノックアウトマウスより培養した内皮細胞を用いたin vitro検討,そして一過性脳虚血再灌流障害(一過性中大脳動脈閉塞による) in vivo検討においては,全身性ROCK2ノックアウトマウスを用いた検討から,内皮特異的ROCK2ノックアウトマウスを用いた検討を中心にする予定である.2)臨床研究における,ヒト血管およびヒト白血球内ROCK活性の検討では,引き続き対象は心血管病リスクを有さない健常人,および冠危険因子を有する明らかな心血管合併症を有さない軽症動脈硬化症例にて検討を行うが,薬剤や生活習慣の改善といったインターベンションによる介入試験の場合には,プレチスモグラフィーによる侵襲的な血管ROCK活性の検討よりも,より非侵襲的な白血球ROCK活性による検討を中心とする.平成25年度は,ROCK1およびROCK2ノックアウトマウスより培養した内皮細胞を用いたin vitro検討によってROCK2によるeNOS mRNA安定化の制御機序の解明,および臨床研究における白血球内ROCK活性の検討を同時に進めて行くのであるが,研究費はin vitroを中心として使用する予定である.平成24年度は,1).ROCK
転写因子NRF2を介したミトコンドリア電子伝達系遺伝子の発現制御機構の解明

哺乳類転写因子NRF-2は、ミトコンドリアでのATP産生に関わる遺伝子の転写を制御することが知られる。本研究では、NRF-2の転写補因子を同定することを目的とし、NRF-2に複数のタグを付けたconstructをヒト培養細胞にて発現し、affinity精製によってNRF-2を含む転写複合体を精製することを目指したが、NRF-2に有意に結合する核内蛋白質は同定することができなかった。しかし、NRF-2の転写促進活性を担うβサブユニットとγサブユニット(両者は同一遺伝子座にコードされている)で、核内に局在する効率が異なることを見出し、それによりβ/γで転写促進活性に差が生じることを明らかにした。さらに、高効率の核局在にはβサブユニットにuniqueなC末leucinezippermotifが必要であることを示した。これまでの研究から、C末leucinezipperはβサブユニットのdimer化と転写促進の両方に必要であること、両者は機能的に同一であることが示唆されていたが、本研究では、GAL4 DNA binding domain融合NRF-2βの転写促進活性を調べる実験から、C末leucine zipperは、dimer化した後の転写促進には必要ではなく、NRF-2αβ複合体がheterodimerの状態で、つまりNRF-2βがdimerを形成していない状態でpromoterに結合しているときにのみ転写促進に寄与することを明らかにした(投稿準備中)。本研究により、NRF-2βのC末leucinezipperの核局在と転写促進の両側面での役割が明らかにされた。転写因子NRF-2に結合し、NRF-2を介した転写に影響を及ぼす因子を探索する実験を行った。ヒト腎臓由来の腫瘍細胞であるHEK293T細胞に、二種類の精製タグを付けたNRF-2のαサブユニットまたはβサブユニットを発現させ、細胞抽出液からタグによるアフィニティ精製(TAP法と呼ばれる)を行って、NRF-2αまたはNRF-2βの結合パートナーを同定する実験を試みた。まず、タグの選択を行った。タグの用件は二つ考えられ、立体障害などの問題をクリアして、精製がうまく行くかどうか、タグの付加によって蛋白質の機能が損なわれないかどうか、である。蛋白質の機能が保持されているかどうかは、NRF-2サイト依存的なプロモーター制御下のレポーターアッセイを行うことで確認した。その結果、NRF-2α、NRF-2βともに、N末にFLAGタグを、C末にprotein Aタグを付加するコンストラクトで、機能が保持され、タグによる精製がうまく行くことが確かめられた。次にタグ付き蛋白質の細胞内での発現量を調節し、生理的な条件下で結合パートナーと相互作用できるように工夫した。複数のウィルス由来のプロモーターを試し、タグ付きのNRF-2が内在性のNRF-2の10倍から50倍の発現量になるように条件を振ったが、いずれの場合もNRF-2α、NRF-2βともに有意な結合を示すパートナーは同定できなかった。問題点として、タグ付きNRF-2とパートナーの結合が、精製の過程でバッファ等によって希釈することで弱められることと、そもそも細胞内で一過性の相互作用しか起きていないことが考えられる。現在これらの問題点を解決するために、細胞培養液中にクロスリンカーを入れ、複合体を安定化してから精製を行う実験を試みている。哺乳類ミトコンドリアの翻訳因子の一つ、IF2mt遺伝子のプロモーターを同定し、転写因子NRF-2が転写促進に関与することを明らかにした(Hayashi R, et al. 2007Mitochondrion)。これまでに核ゲノムにコードされるミトコンドリアの遺伝子発現、即ちゲノム複製、転写、翻訳に関わる遺伝子の転写制御にNRF-2が関与することが明らかになったが、現在までのところNRF-2の転写補因子は同定されていない。本研究では、tandem affinity purification法を用いて、細胞内のNRF-2の転写複合体を精製し、複合体の構成因子を同定することを目指している。これまで、NRF-2のαもしくはβサブユニットにFLAGタグとproteinタグを付けたコンストラクトをヒト培養細胞、HEK293T細胞に一過的に発現させ、タグによる精製がうまく行なえることを確認したが、NRF-2と一緒に精製されてくる蛋白質を同定するには至っていない。タグ付き蛋白質が生理的レベルを超えて過剰に発現しているため、細胞内でパートナーとなる因子が相対的に枯渇してしまうことと、タグを利用した精製が立体的な障害となって複合体を不安定化していることが原因として考えられる。現在、前者についてはコンストラクトのプロモーターを変えて発現量を低く抑えることを検討しており、後者ではproteinAタグを削ってnativeな状態に近づけた蛋白質を発現させることを検討している。さらに、高効率の核局在にはβサブユニットにuniqueなC末leucine

zippermotifが必要であることを示した。これまでの研究から、C末leucinezipperはβサブユニットのdimer化と転写促進の両方に必要であること、両者は機能的に同一であることが示唆されていたが、本研究では、GAL4 DNA binding domain融合NRF-2βの転写促進活性を調べる実験から、C末leucine zipperは、dimer化した後の転写促進には必要ではなく、NRF-2αβ複合体がheterodimerの状態で、つまりNRF-2βがdimerを形成していない状態でpromoterに結合しているときにのみ転写促進に寄与することを明らかにした(投稿準備中)。本研究により、NRF-2βのC末leucinezipperの核局在と転写促進の両側面での役割が明らかにされた。
高分子材料の加熱分解・焼却過程解析のための新しい計測システムの開発

まずポリマー材料の加熱分解・焼却過程の解析を行うための基礎検討として、代表的なエンジニリアングプラスチックの一種であるポリカーボネート(PC)の加熱分解過程でポリマー鎖に形成される異常構造の分析を、有機アルカリの一種である水酸化テトラメチルアンモニウム(TMAH)共存下での反応熱分解ガスクロマトグラフィー(反応Py-GC)によって行った。ここでは、工業的に合成されたPCを300°Cで3時間あるいは400°Cで1時間、電気炉により空気中で加熱処理した試料を解析対象として用いた。こうして観測されたパイログラム上の各ピークの質量スペクトルを詳細に解析した結果、加熱処理したPC試料については、種々の分岐・架橋構造を反映する熱分解生成物のピーク群や、キサントン構造を反映する熱分解生成物のピークなどを観測し、PC中に形成される異常構造を詳細に解析することができた。つづいてシリコーン系難燃剤を添加したポリカーボネート樹脂(FR-PC)を加熱処理し、その化学構造を反応Py-GCにより解析することにより、加熱処理過程で起こる化学構造変化を追跡して、シリコーン系難燃剤の作用機構を解明することを試みた。得られたパイログラム上には、PC主鎖やその末端基に由来するピーク類に加えて、シリコーン系難燃剤からフェニル基が脱離して生成したケイ素ラジカルが、基材ポリマー分子と結合することにより形成した架橋構造に由来するピーク群がはっきりと観測された。この結果から、FR-PCでは、加熱によりシリコーンとPCの間で架橋が進行しており、FR-PCが実際に燃焼するときも、シリコーンとPCが架橋し、炭化層の形成を促進して熱分解を抑制することにより難燃効果の発現を招来していることが示唆された。本年度は基礎検討として、代表的なエンジニリアングプラスチックの一種であるポリカーボネート(PC)の加熱分解過程でポリマー鎖に形成される異常構造の解析を、有機アルカリの一種である水酸化テトラメチルアンモニウム(TMAH)共存下での反応熱分解ガスクロマトグラフィー(反応Py-GC)によって行った。また、試料中に分岐構造の前駆体構造として形成したキサントン単位から反応熱分解によって生じることが予想される、比較的分子量の大きな熱分解生成物を溶出させるために、金属キャピラリー分離カラムの温度を370°Cまで昇温して反応Py-GC測定を行った。こうして観測されたパイログラム上の各ピークの質量スペクトルを詳細に解析し、さらにキサントン構造を有するモデル化合物を使用した各ピークの保持指標の比較などにより、加熱処理したいずれのPC試料についても、種々の分岐・架橋構造を反映するピークに加えて、キサントン単位を含む熱分解生成物のピークを同定することができた。さらに、その相対ピーク強度から、PC試料中のキサントン構造の存在量は400°Cで加熱処理した試料では、1000モノマー単位あたり5個程度と推定され、300°C処理の場合の約1個に比べて、約4倍以上大きな値を示した。シリコーン系難燃剤は燃焼時にもほとんど有害物質を生成しない、環境調和型の難燃剤として注目されており、電子事務機器などに使用されているポリカーボネート(PC)樹脂に対して効果的な難燃剤として既に実用化されている。本年度は、シリコーン系難燃剤を添加したポリカーボネート樹脂(FR-PC)を加熱処理し、その化学構造を有機アルカリの一種である水酸化テトラメチルアンモニウム(TMAH)共存下での反応熱分解ガスクロマトグラフィー(反応Py-GC)により解析することにより、加熱処理過程で起こる化学構造変化を追跡して、シリコーン系難燃剤の作用機構を解明することを試みた。

ここでは、基材であるPC樹脂に、3官能のフェニルシロキサン単位90mol%と、2官能のジメチルシロキサン単位10mol%との共重合体であるシリコーン系難燃剤5重量%を基材ポリマーに混練することにより調製したFR-PC試料を、窒素流下、380°Cで2時間加熱処理したものを反応Py-GC測定に供した。得られたパイログラム上には、PC主鎖を構成するビスフェノールAのジメチルエーテルの主ピークや、末端基に由来するp-tert-ブチルアニソールのピークに加えて、シリコーン系難燃剤からフェニル基が脱離して生成したケイ素ラジカルが、基材ポリマー分子と結合することにより形成した架橋構造に由来するピーク群がはっきりと観測された。この結果から、FR-PCでは、加熱によりシリコーンとPCの間で架橋が進行しており、FR-PCが実際に燃焼するときも、シリコーンとPCが架橋し、炭化層の形成を促進して熱分解を抑制することにより難燃効果の発現を招来していることが示唆された。
キャピラリーを用いたクラスターイオンの収束

ガラスキャピラリー(出口径:10140μm)を用いてアルゴンクラスターイオンビームの収束特性を調べ、イオンビームの収束率(入口と出口におけるイオン密度の比率)、キャピラリー通過によるイオンの速度およびクラスターサイズ(構成原子数)の変化を明らかにした。(1)イオンビーム収束装置の試作:ガラスキャピラリー、入射イオンビームとキャピラリー入口の位置調整部(マニピュレーター)、および出射イオン電流検出部から構成されるイオンビーム収束装置を試作した。(2)キャピラリーの製作:生物学実験用ピペット作成のためのガラス管加工装置を利用して、入口径:800μm、出口径:1003μmの各種ガラスキャピラリーを作成した。(3)クラスターイオンビーム発生装置とイオンビーム収束装置の結合:アルゴンクラスターイオンビーム発生装置の後方に真空ゲートバルブを介してイオンビーム収束装置を結合した。クラスターイオンビームを収束実験に利用するときは当該ゲートバルブを開き、キャピラリー交換などで収束装置を大気に開放するとき、あるいはクラスターイオンビームを他の利用実験へ使用するときはゲートバルブを閉じた。この結果、クラスターイオンビームを有効にタイムシェアして利用することができる。装置の結合後、クラスターイオンビームをイオンビーム収束装置内に設置したイオン感応性ポリマー(レジスト薄膜)に照射し、イオンビームの照射位置を確認した。さらに、イオンビームの中心とキャピラリー入口の中心が一致するように、キャピラリーを設置したマニピュレーターを調整した。以上により、ガラスキャピラリーにクラスターイオンビームを通過させ、キャピラリーによる収束効果の評価実験を行う準備が整った。(1)キャピラリーによる収束効果の評価:クラスターイオンビームをガラス管(入口、出口径ともに800μm)に通過させたときの出射イオン電流を測定した。つぎに、キャピラリー(出口径:70μm)を通過させたときの出射イオン電流を測定し、これらの出射イオン電流値およびキャピラリー出口の面積比よりキャピラリーの収束率(σ)を求めた結果、σ=517であった。収束率がばらついている原因は、出射電流が経過時間とともに変動するためであった。この出射イオン電流の変動は、入射イオンがガラス管内壁に衝突して蓄積される電荷密度の影響、すなわち帯電効果によるものと推定される。(2)キャピラリーからの出射イオンビームを可視化するため、イオン検出器のマイクロチャネルプレートの後方に蛍光物質を塗ったガラス基板を設置した。イオンがマイクロチャネルプレートに衝突して発生する二次電子が加速されて蛍光物質に当たり発光することで、イオンビームの位置と形状を観測することが可能になった。本可視化技術を利用して、上記の出射イオン電流の変動を詳しく追跡した。この結果、入射イオン電流が低い場合(1 nA以下)には出射イオン電流は安定しているが、高くなると(1 nA→10 nA)、出射イオン電流は不安定になり、低電流値と高電流値の間を振動した。入射イオン電流が高い場合には、ガラス管内壁の充電と放電を繰り返しながらイオンが出射されているものと解釈される。今回得られた結果は、ガラスキャピラリーによるイオンビームの収束機構をより明確にしていくうえで極めて重要な知見となるものである。(1)前年度までに試作したガラスキャピラリーを用いて、アルゴン(Ar)クラスターイオンビームの通過特性を評価した。最小出口径:9.6μmまでのキャピラリーについてArイオンビームの通過を確認した(2)キャピラリー通過によるイオンの速度変化を測定した。イオンビーム途上に偏向電極を設け、偏向電極にパルス電圧を印加することによりイオンビームをパルス化し、飛行時間計測法によりイオンの速度を測定した。この結果、Arクラスターイオンの速度はキャピラリー通過(出口径:140μm)によって変化しないことが判明した。(3)キャピラリー通過によるArクラスターイオンの運動エネルギーの変化を測定した。イオンビームを蛍光板に衝突させてその蛍光スポットでビーム位置を計測できるようにしておき、ビーム途上に設置した偏向電極に電圧を印加したときの蛍光スポットのシフト量からイオンの運動エネルギーを見積もった。この結果、Arクラスターイオンの運動エネルギーは、キャピラリー通過(出口径:48μm)によって2030%減少することが判った。(2)の結果を合わせることにより、Arクラスターの質量(構成.原子数)がキャピラリー通過によって2030%減少することが明らかとなった。この質量減少は、イオンがキャピラリー内部の残留ガス(計算により圧力:1x10^<-2>Paと推定)と衝突することにより起きるものと考えられる。
フィールドワークに適した遠隔操作音声収録・分析装置の開発研究

本研究では、海外でのフィールドワークや国内での方言調査等に適した、野外調査にも携帯可能な小型で軽量かつネットワーク対応型の遠隔操作音声収録・分析装置の開発の基礎的研究を目的として研究を推進した。そのために、音声学・音韻論の知見と音声情報処理・画像情報処理などの技術を統合して研究代表者と研究分担者が協力して、研究の進展をはかった。コンピュータによる音声分析や音声認識等の音声情報処理技術を応用して、フィールドワークに威力を発揮すると共に研究室との連携が可能な音声分析支援システムの開発を目指した。音声収録・分析の基礎的な研究としては、各種諸言語の音声や方言の音声データの録音・収集・編集を行った。一部のデータに関しては、インフォーマントの発話時の音声と同時に顔面正面画像と顔面左横画像の映像収録も行い、発話時の口唇形状の動態変化の研究を行った。言語音の韻律情報、特にピッチパターンの提示を工夫して、聴覚印象を視認化する方法を工夫・改善した。声調言語のトーン分析等に応用して研究を発展させた。視覚的にもピッチの変化を視認が容易で、声調の比較に効果を発揮するように工夫を重ねた。また、音声分析で得られた知見を応用して、音韻論的分析に適用する研究も進めた。フィールドワークでの利用を念頭において、システムの頑健化・安定化を図る研究を推進した。研究成果の評価を試みたところ、音声収録や音声分析を利用して、外国語教育を含む応用言語学的研究への適用を薦められたので、外国語教育の現場でもフィールドワーク的に、外国語学習者を利用者として実験的に投入し、外国語音声の習得に適するように工夫を重ねた。その結果、声調の習得や気息音の習得に高い効果が得られた。これらの研究成果を論文形式に取りまとめると共に、国際会議や全国大会等で研究発表を行った。本年度は研究の初年度に当たるので、まず、フィールドワークに適した音声収録・分析の基礎的な研究として、各種諸言語の音声や方言の音声データの録音・収集・編集を行なった。音声データの一部は、マルチメディア音声データベースとして、コーパス利用が可能なように、インフォーマントの発話時の音声と同時に顔面正面画像と顔面左横画像の映像収録も行なった。発話時の口唇形状の動態変化の観察を可能にするための処理である。口唇形状の分析に関しては、円唇性対非円唇性の対立の判断基準として、発話時の静止画像や動画映像に基準点や基準線を付加する作業を行なった。インフォーマントの発話時の調音器官の分析に関しては、無線を利用した遠隔操作のCCDカメラを利用して、モニター上で声道上の一部調音器官の動態変化を観察する実験を行なった。入力音声の分析と認識の研究においては、フィールドワークでインフォーマントが発話した場合を想定して、発話音声の音響分析を施すと共に、音声認識技術を活用して、音声認識の処置を施し、音声デーダベース中の標準発音とのズレを確率統計的な手法で分析して、提示するシステムの基礎的な開発研究を行なった.。また、インフォーマントの発話音声の分析システムへの取り込みや音声データベースからのターゲット音声の切り出しと再生を、システムの他の機能とスムーズに連動して行なえるようなインターフェースの構築の研究を推進した。また、言語の音声ファイル化、音声ラベリング化の処理等が敏速に実行できるような環境の構築を試みた。これらの研究を通じて、今後はより精緻な音声分析が可能になるものと期待される。本年度は以下のような研究を推進した。

1.調音器官の状態を提示する研究では、従来行ってきた、子音の音響分析から声道予測図として、調音位置、調音法、口唇の形状、軟口蓋の状態、声帯の様子などの調音器官の状態図を改善してグラフィック処理し、提示する手法に、改善を加え理解度を高める効果を図った。2.ピッチ、基本周波数の処理の強化の研究では、従来の音響分析機器のように、単に物理的な基本周波数の値を表示するだけではなく、幾つかの言語学的に有効な単位として処理する研究を進めた。また、従来のピッチ、基本周波数の分析は不安定で倍音を拾ったり、ピッチの急激な変動についていけないことが多かったが、音声学的に有意な情報を提示できるように改良を加え、安定化を図った。3.基本周波数(ピッチ)、持続時間、強さ(インテンシティ)の相互作用の研究では、関連研究として、音声の高さ、長さ、強さをそれぞれ単独に表示するだけではなく、相互作用として聞き手にどの様な効果を与えるか研究し、階層性や複合単位として処理する方向でも研究を進めた。4.言語データ・文献データの継続収集と検討では、フィールドワークや音声分析・言語分析に関する検討を進め、研究を推進するために必要な分析対象の諸言語の音声データ、言語データ、文献データの収集、編集を継続して行なった。独自に収集、編集を図ると共に、既存のデータベースも活用した。5.音声インターフェースの構築の研究では、フィールドワーク携帯用の音声分析装置に適した音声入出力、音声分析、音声合成等を管理統合する音声インターフェースの構築の研究を行ない、入力音声の安定化を図った。また、上記の研究成果に基づいて試用し、基本的な問題点を洗い出し、研究開発にフィードバックし、システムの改善を図った。平成18年度は以下の研究を推進した。まず、フィールドワークや音声分析・言語分析に関する検討をさらに進展させるために、研究の推進に必要な分析対象の諸言語の音声データ、言語データ、文献データの収集、編集を継続して行なった。また、前年度までに構築してきた音声入出力、音声分析、音声合成等を管理統合する音声インターフェースの改善の研究を行なった。現有設備であるパソコンシステムに電子部品を付加することによって本研究に適した音声インターフェースの構築を試みた。ピッチ、基本周波数分析の改善の研究をおこなった。単に物理的な基本周波数の値を表示するだけではなく、声調(トーン)など幾つかの言語学的に有効な単位として処理する研究を進めた。また、従来のピッチ、基本周波数の分析は不安定で倍音を拾ったり、ピッチの急激な変動についていけなかったりしたが、音声学的に有意な情報を提示できるように改良を加え、安定化を図る研究の進展を図った。また、音声の高さ(基本周波数、ピッチ)、持続時間、インテンシティの相互作用の研究を推進した。調音器官の状態の提示の研究の進展を図った。従来行ってきた、子音の音響分析から声道予測図として調音器官の状態図をグラフィック処理して、提示する手法の改善を試みた。音声分析の言語教育への応用の研究を試みた。関係研究者との意見交換の結果、単に音声を収録して分析するだけでなく、研究成果を応用して、外国語教育を中心とする言語教育、特に発音教育への適用に関する研究を進めたほうが良いとの示唆を受け、声調言語である中国語教育への応用を試みた。さらに、上記の研究成果に基づき、実際に学生の声調分析や声調習得などに試用して、基本的な問題点を洗い出し、研究開発にフィードバックし、システムの改善を図った。
感性のナショナリズムとしての山岳風景論―明治文学を視座として

最大の成果は「ラスキン文庫」や諸処の美術館が所蔵する展覧会図録を足掛かりに、日本近代の山岳史と感受性の領域を橋渡しする有力な媒介項として「山岳風景画」とでも称すべきジャンルを抽出できたことである。吉田博、丸山晩霞、大下藤次郎ら「山岳ー渓流」を求めて日本アルプスを中心に各地を旅しては絵画をものする<登山する水彩画家>たちの存在であり、その多くが画題に選んだ山岳風景に因んだ鑑賞記の類も残している。当然のことながら、この一群は小島烏水の創設になる「日本山岳会」の系譜上に位置するものであるが、「日本山岳会」の主流が日本アルプスの山々を踏破し、頂上を極めることを旨とする「登山」および「登山」をめぐる紀行文学によって占められるのに対し、山岳風景画家たちの関心はあくまで画筆と言葉による風景描写とそれに託された風景美への感動を表出することにある。またこの一群の風景画家たちは、美術史上の分類としては黒田清輝の「白馬会」に圧倒されながらも、日本の西洋画壇を折半した「旧派ー太平洋画会」に属しており、他方、文化的交友圏としては「丸山晩霞ー島崎藤村」「吉田博ー夏目漱石」の密接な関係を指摘することができる。周知のように、小島烏水と「日本山岳会」は日本固有の火山の美を説いて日本近代のナショナリズムの表象とも言うべき郷土論の扉を開いた志賀重昂の『日本風景論』の輝かしい遺産であるが、「山岳風景画(家)」とそれに連接する明治の作家群の連なりが『日本風景論』的ナショナリズムの<感性・感受性の領域>として言わばその見えにくい裾野の部分を形成しているとの見解を得た。上記研究の副産物が、ジェンダー論を切口として漱石テクストから見えて来る「崇高(sublime)」の超越性と反ナショナリズム性である。「吉田博/義妹で夫人のふじお(藤遠)」ー『虞美人草』の「甲野欽吾/藤尾」のアナグラムをヒントに学会報告を予定している。平成30年度に試みにジャンル設定してみた「山岳風景画」群は、当初からの目標である「山岳風景論」を核としたナショナリズムの感性的側面を検証するための有効な補助線を意味するものであり、実際、ここを糸口に、近距離に位置しながら同時に反ナショナリズム的な批評性を持つ夏目漱石のテクスト論にまで射程を伸ばすことができた。その意味で研究はとりあえずは順調に進行していると判断している。但し、上記のような間テクスト的研究は当初は、主に次年度に予定していたものであり、逆に代償として初年度に実施予定していた既存の『日本風景論』及び奇景気勝を案内する田山花袋の紀行文集等の第一次テクストに関する分析を後手に回さざるをえない結果となった。その遅延を解消すべく、今年度の研究計画については変更を余儀なくされている。まず初年度に予定していた第一次テクスト『日本風景論』の相次ぐ改版と改変ー特に図版差し替えに関して緻密な論証を行う。また初年度、「山岳風景画」のジャンルを措定して解明を果たした『日本風景論』の裾野を構成する<感受性の領域>について更に綿密な発掘を継続する一方で、『日本風景論』の最も近傍に位置する田山花袋の膨大な紀行文テクスト群を山岳風景論に収斂させるべく分析と整理作業を行う。幸い、上記のラフスケッチを手にしたことで、日本近代におけるナショナリズムとしての郷土論が、淵源に仰ぐイギリスの場合とほぼ同じ構造を持つことを検証できた。つまり、イギリス文化史では検証済みのW.GilpinからW. Wordswortthへの展開に沿って生成する「絵の様な(picturesque)/崇高な(sublime)風景の探求ーナショナリズムの勃興ーロマン主義文学の目覚め」にほぼ同じ<三位一体構造>である。従来の文学史ではむしろロマン主義の系譜の外側に位置付けられてきた田山花袋ー島崎藤村ー夏目漱石について、ナショナリズムを機軸に差異のグラデーションを炙りだしながら『日本風景論』を頂点に戴く<ナショナリズムの感性史ー批評史>の形成を企てたい。また初年度にジェンダー論を切口に「漱石ー吉田博」「藤村ー丸山晩霞」のような「文学テクストー山岳風景画」間の有機的連環を抽出できたので、当初の予定よりも踏み込んだ研究を行いたい。英文化史研究においては、崇高ー超越性という主に男性に振り分けられてきた領域に女性が参入した場合に発揮する批評性が指摘されている(E.A.ボールズ『美学とジェンダー』)。漱石の崇高をめぐる超越論に反男性中心主義、反ロマン的ナショナリズムの外部性、「吉田兄妹ー甲野兄妹」の例のように「男女」の対項を「義兄妹・従兄妹(『彼岸過迄』)」へズラせるパターンにロマンチックラブに対する批評性を検証したい。

当然のことながら、この一群は小島烏水の創設になる「日本山岳会」の系譜上に位置するものであるが、「日本山岳会」の主流が日本アルプスの山々を踏破し、頂上を極めることを旨とする「登山」および「登山」をめぐる紀行文学によって占められるのに対し、山岳風景画家たちの関心はあくまで画筆と言葉による風景描写とそれに託された風景美への感動を表出することにある。またこの一群の風景画家たちは、美術史上の分類としては黒田清輝の「白馬会」に圧倒されながらも、日本の西洋画壇を折半した「旧派ー太平洋画会」に属しており、他方、文化的交友圏としては「丸山晩霞ー島崎藤村」「吉田博ー夏目漱石」の密接な関係を指摘することができる。周知のように、小島烏水と「日本山岳会」は日本固有の火山の美を説いて日本近代のナショナリズムの表象とも言うべき郷土論の扉を開いた志賀重昂の『日本風景論』の輝かしい遺産であるが、「山岳風景画(家)」とそれに連接する明治の作家群の連なりが『日本風景論』的ナショナリズムの<感性・感受性の領域>として言わばその見えにくい裾野の部分を形成しているとの見解を得た。上記研究の副産物が、ジェンダー論を切口として漱石テクストから見えて来る「崇高(sublime)」の超越性と反ナショナリズム性である。「吉田博/義妹で夫人のふじお(藤遠)」ー『虞美人草』の「甲野欽吾/藤尾」のアナグラムをヒントに学会報告を予定している。平成30年度に試みにジャンル設定してみた「山岳風景画」群は、当初からの目標である「山岳風景論」を核としたナショナリズムの感性的側面を検証するための有効な補助線を意味するものであり、実際、ここを糸口に、近距離に位置しながら同時に反ナショナリズム的な批評性を持つ夏目漱石のテクスト論にまで射程を伸ばすことができた。その意味で研究はとりあえずは順調に進行していると判断している。但し、上記のような間テクスト的研究は当初は、主に次年度に予定していたものであり、逆に代償として初年度に実施予定していた既存の『日本風景論』及び奇景気勝を案内する田山花袋の紀行文集等の第一次テクストに関する分析を後手に回さざるをえない結果となった。その遅延を解消すべく、今年度の研究計画については変更を余儀なくされている。まず初年度に予定していた第一次テクスト『日本風景論』の相次ぐ改版と改変ー特に図版差し替えに関して緻密な論証を行う。また初年度、「山岳風景画」のジャンルを措定して解明を果たした『日本風景論』の裾野を構成する<感受性の領域>について更に綿密な発掘を継続する一方で、『日本風景論』の最も近傍に位置する田山花袋の膨大な紀行文テクスト群を山岳風景論に収斂させるべく分析と整理作業を行う。幸い、上記のラフスケッチを手にしたことで、日本近代におけるナショナリズムとしての郷土論が、淵源に仰ぐイギリスの場合とほぼ同じ構造を持つことを検証できた。つまり、イギリス文化史では検証済みのW.GilpinからW. Wordswortthへの展開に沿って生成する「絵の様な(picturesque)/崇高な(sublime)風景の探求ーナショナリズムの勃興ーロマン主義文学の目覚め」にほぼ同じ<三位一体構造>である。従来の文学史ではむしろロマン主義の系譜の外側に位置付けられてきた田山花袋ー島崎藤村ー夏目漱石について、ナショナリズムを機軸に差異のグラデーションを炙りだしながら『日本風景論』を頂点に戴く<ナショナリズムの感性史ー批評史>の形成を企てたい。また初年度にジェンダー論を切口に「漱石ー吉田博」「藤村ー丸山晩霞」のような「文学テクストー山岳風景画」間の有機的連環を抽出できたので、当初の予定よりも踏み込んだ研究を行いたい。
SVCTによるアスコルビン酸輸送を介した歯周病態制御機構の解明と新規治療戦略

アスコルビン酸はコラーゲン代謝に関与する重要な水溶性ビタミンである。本研究は歯周組織の再生に重要な役割を持つ歯根膜においてアスコルビン酸代謝を司るアスコルビン酸輸送体であるSVCTが広く発現していることを見いだし、この結果は線維性結合組織である歯根膜の恒常性維持、さらには歯周病の病態形成に寄与していることが考えられる。歯周組織再生において重要な役割を有していると考えられる歯根膜細胞においてアスコルビン酸代謝を司るトランスポーターであるSVCT1,SVCT2の役割をin vitroにおいて検討した。まず、歯根膜において組織修復に重要である歯根膜幹細胞の培養を確立した。矯正治療のために便宜抜歯となった抜去歯より歯根膜組織を採取し、コラゲナーゼ/ディスパーゼにより組織を消化しSingle cell suspensionを得た。これを洗浄、ストレーナーにて細胞塊を除去し細胞培養皿上で培養し、コロニーを形成しながら増殖する細胞を得た。これらの細胞についてFACS解析を行ったところ間葉系幹細胞のマーカーであるCD146,CD90,CD44,CD105,CD73陽性であり、血管内皮細胞マーカーCD31陰性、白血球マーカーCD45陽性であった。さらにこれらの細胞を骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞へそれぞれ特異的な培養条件で分化誘導したところ、アリザリンレッド染色像を示す石灰化結節、Oil red 0染色陽性脂肪細胞、アルシアンブルー染色陽性軟骨組織の形成を示し、得られた細胞が多分化能を示すことが明らかとなった。また、FACS解析ではpericyteのマーカーであるNG2,CD140b陽性細胞が多く認められ、さらにマトリゲル上で血管内皮細胞と共培養すると歯根膜幹細胞は血管内皮細胞の形成するtube like構造に寄り添うように接着し、歯根膜細胞のpericyte様性質の可能性が示唆された。RT-PCR法によってSVCT1,SVCT2の遺伝子発現を検討したところ、歯根膜幹細胞はいずれのトランスポーターも発現する結果が得られた。現在ラット、マウスの切片上でSVCT1,SVCT2の免疫染色を行っており歯根膜における両タンパクの発現を示す傾向が見られており再現性を確認している段階である。歯周組織再生過程で重要な役割を有していると考えられる歯根膜細胞においてアスコルビン酸代謝を司るトランスポーターであるSVCT1,SVCT2の役割をin vitroで検討した。抜去歯より歯根膜組織を採取し、コラゲナーゼ/ディスパーゼにより組織を消化し、これを洗浄、ストレーナーにて細胞塊を除去しコロニーを形成しながら増殖する細胞を得た。これらの細胞についてFACS解析を行ったところ間葉系幹細胞のマーカーであるCD146,CD90,CD44,CD1O5,CD73陽性であり、血管内皮細胞マーカーCD31陰性、白血球マーカーCD45陽性であった。さらにこれらの細胞を骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞へそれぞれ特異的な培養条件で分化誘導したところ、全ての細胞への分化が認められ得られた細胞が多分化能を示す幹細胞であることが明らかとなった。また、FACS解析ではpericyteのマーカーであるNG2,CD140b陽性細胞が多く認められ、さらにマトリゲル上で血管内皮細胞と共培養すると血管内皮細胞の形成するtube like構造に寄り添うように接着し、歯根膜細胞のpericyte様性質の可能性が示唆された。RT-PCR法によってSVCT1,SVCT2の遺伝子発現を検討したところ、歯根膜幹細胞は両者を発現する結果が得られた。また、マウス歯周組織切片上でSVCT1,SVCT2の免疫染色を行ったところ、いずれも歯根膜に広く発現が見られる事が明らかとなった。さらに、動物実験を用いてSVCT1,SVCT2のin vitroでの再生における役割を検討する必要性からラットおいて実験的な歯周組織欠損モデルの確立を行った。免疫不全ラットの下顎臼歯頬側の歯周組織をラウンドバーで削除し歯周組織欠損を作製した。同部位へ歯根膜幹細胞を移植し4週間後に組織片を回収しCTと組織切片上で再生歯周組織を観察した。その結果、ラットにおいて歯根膜幹細胞移植による歯周組織再生が確認され、細胞移植による歯周組織再生モデルが確立した。再生歯周組織におけるSVCT1,SVCT2の発現についての検討を行う予定である。
骨・インプラント界面に及ぼすビスフォスフォネートの影響に関する組織形態学的研究

組織親和性の高い生体材料であり、特に骨組織との良好な結合が知られるハイドロキシアパタイト(HA)とチタン(Ti)についての数々の報告をこれまでに行った。我々の研究はラット脛骨にこれらのインプラント材を埋入し、骨組織との親和性を接触骨面積、平均厚さ、接触骨面積の3つのパラメータから分析する経時的な組織形態計測とインプラント一骨界面の微細構造の光学顕微鏡、電子顕微鏡レベルでの組織像の観察を基本としている。Tiインプラントは経時的に徐々に骨組織に被覆され、HAインプラントは埋入後初期の段階でほとんど完全に被覆されるという対照的な結果だった。形態計測学からはTiインプラントの骨接触率が漸増傾向にあるのに対し、HAインプラントは埋入初期から急上昇し、28日でプラトーに達した。これらの実験結果を受けてさらにラットの加齢や代謝性疾患である糖尿病がこれらの実験結果に与える影響を検討した。これらの実験条件は骨形成にネガティブに働くことが示唆された。電子顕微鏡での観察にあたり、表面が滑沢なTi棒は樹脂包埋後に標本を極力破壊せずにTi棒だけを除去し切片を作成することができるが、HA棒は表面が荒いため除去時に界面が破壊され微細構造が観察できない。そこでサンドブラストにて物理的にエポン棒に付着させHAコートインプラントを作ることにした。これならHAコートごと切片を作成できる。現在実験利用に向けさまざまな方法(吹き付け時間、ノズルと材料管の距離、吹き付け角度などの変化)でコートを試している。本研究の目的を達成するためにまずラット脛骨に埋入したハイドロキシアパタイト(HA)緻密体に対する骨組織反応を経時的に観察した。対照試料としたチタン(Ti)インプラントは経時的に徐々に骨組織に被覆されていくのに対し、HAインプラントは埋入初期からほぼ完全に骨組織に取り囲まれていた。組織形態学的には、HAインプラントの骨接触率は埋入初期から急上昇し、84日でプラトーに達した。これに対しTiインプラントは緩やかな増加を示した。骨標識法を使ってHAインプラント周囲における新生骨形成のパターンを経時的に観察した結果では、術後28日と比べ術後14日の標識が明瞭に観察された。これは術後14日の骨形成の活性の高さを示していると思われる。またHAインプラントの骨接触率の増加率が14日と比べて28日では低くなっていることから、骨標識法の所見を裏付けていると考えられた。この実験によって、TiインプラントとHAインプラントに対する骨組織反応の差が明らかになった。この結果を受けてさらにTi/HAインプラント・骨組織界面の微細構造学的観察が可能になるように実験試料を製作した。直径1.0mm、長さ1.5mmの円筒形エポキシ樹脂試料を製作した後で、表面にHA粉末をサンドブラスト器で吹き付け被膜を形成した。また同様にTi粉末をエポキシ樹脂試料表面に吹き付けた実験試料を製作した。これらの製作した実験試料の表面をSEMで観察するとともに表面粗さを計測した。次年度はこれらの試料をラット脛骨に埋入し組織形態学的観察を行うと共に界面の微細構造を観察する予定である。
ＡＬＳに対する新規治療技術の開発

筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、上位、並びに下位運動神経に特異的な神経変性疾患である。僅かな生存期間の延長が期待されるリルゾールや運動機能の改善が期待されるエダラボンの投与、リハビリテーション、食餌療法などがあるが、根本的な治療法がなく、約半数の例では発症後25年で主に呼吸障害によって死亡する。そのため、革新的な治療法の開発や詳細な発症メカニズムの解明が求められているが、最近、ALSの発症は運動神経と骨格筋をつなぐ神経筋接合部(NMJ)における運動神経軸索の離脱や退縮に始まるとするモデルが提唱された。そこで、発症後のALSモデルマウスにおいてNMJ形成促進タンパク質であるDok-7の発現を人為的に増強することによって、NMJからの運動神経の離脱・退縮を抑制し、その運動機能を改善する新規治療技術の有効性を着想し、その開発を本研究の目的とした。既に、当研究室ではヒトDOK7発現アデノ随伴ウイルスベクター(AAV-D7)の投与によるNMJの形成促進効果(拡張効果)を野生型マウスにおいて実証している。この知見を踏まえ、本研究では大量調製したAAV-D7を発症後のALSマウスに尾静脈投与し、全身性にヒトDOK7を発現させた。その後、ALS病態に対する効果をNMJの免疫蛍光染色、筋肉組織のHE染色、脊髄のニッスル染色、運動神経軸索の免疫染色による病理組織学的解析と生存期間や自発運動量の測定などにより検討した。その結果、治療群において有為な生存期間の延長効果、NMJの拡張効果、並びに筋委縮の改善効果を確認し、また、自発運動量の増加を見出した。これらのことはNMJ形成の人為的な増強がALSに対する有望な治療法となりうることを示唆している。28年度が最終年度であるため、記入しない。本年度は、発症後のALSマウスに対する治療効果の評価系の確立を主な目的として、実験を進めた。前年度の修士課程での予備的な実験において、発症後のALSマウスに対するDok-7発現アデノ随伴ウイルスベクター(AAV-D7)投与の有効性を示唆する結果が得られていたため、至適ウイルス量の検討および治療効果の詳細な評価が可能な解析系の確立を進めた。具体的には、投与ウイルス濃度を低濃度と高濃度に分け、個体ごとに発症時期を決めてウイルス感染を実施した。現時点では、神経筋接合部に対する拡張効果の免疫蛍光染色による解析系は確立できたものの、運動機能の改善については、ぶら下がり試験や握力試験に加えて、より高感度の解析系の必要性が判明した。そこで、次年度では運動機能の評価系の確立を進めながら、様々な投与時期での治療効果の検討を行う。運動機能の評価方法としては、前述の四肢の筋力測定に加えて、呼吸機能の評価を検討している。また、電気生理学的な手法での検討も進める。他方、より迅速に研究を推進するために、これまで共同研究先に依頼していたウイルス調製を所属研究室でも行えるように技術を習得し、具体的なウイルス産生細胞の培養条件、プラスミド遺伝子の導入条件、そしてウイルスの抽出および精製条件を設定した。さらに、AAV-D7の投与がALSマウスの運動神経に与える影響について評価するために、脊髄前角の細胞体のニッスル染色による可視化と免疫蛍光染色による軸索の可視化といった病理学的な実験手技を習得した。本年度は、ALSモデルマウスの治療を目的としたアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)の至適ウイルス量の検討および、前臨床試験のガイドラインに準拠し、統計学的に評価が可能な個体数での治療効果の検証を進めた。生存期間の延長効果においてはAAV投与群において良好な結果を得ており、神経筋接合部(NMJ)の増強に関しても免疫蛍光染色による可視化により検証し、その増強効果を確認することができた。また、昨年度の課題であった運動機能の改善効果の検証方法においては、赤外線レーザー式の自発運動測定機の導入により解決した。当該機器はこれまで運動機能の測定が困難であった病態の後期においても高感度に運動機能を評価することができ治療効果の検証に極めて有用であることも分かった。昨年度に習得済みの脊髄前角に存在する運動神経細胞体のニッスル染色技術や運動神経軸索の免疫蛍光染色技術による病理組織学的な解析については、統計学的な評価に必要な個体数に向けて着実に解析を進めており次年度中には計画していた治療効果の検証が完了する予定である。これらに加えて筋萎縮に関してもヘマトキシリンエオジン染色による評価を進めている。次なる研究段階として、NMJ増強療法で得られた知見を基に、さらに効果的な因子の探索を計画していたが、こちらについても既にDNAマイクロアレイによる網羅的な遺伝子発現プロファイルの取得を完了しており、次年度に解析を進める予定である。昨年度に確立した至適ウイルス投与量や治療効果の評価方法に基づき、統計学的解析が可能な個体数での治療効果の検証を行い、良好な結果を得ている。さらに、当初の研究計画に従い、治療メカニズムの解明と新たな治療技術の開発に向けたDNAマイクロアレイによる遺伝子発現解析を開始している。既に遺伝子発現プロファイルの取得に成功しており、次年度での研究の進展が期待されため。

そのため、革新的な治療法の開発や詳細な発症メカニズムの解明が求められているが、最近、ALSの発症は運動神経と骨格筋をつなぐ神経筋接合部(NMJ)における運動神経軸索の離脱や退縮に始まるとするモデルが提唱された。そこで、発症後のALSモデルマウスにおいてNMJ形成促進タンパク質であるDok-7の発現を人為的に増強することによって、NMJからの運動神経の離脱・退縮を抑制し、その運動機能を改善する新規治療技術の有効性を着想し、その開発を本研究の目的とした。既に、当研究室ではヒトDOK7発現アデノ随伴ウイルスベクター(AAV-D7)の投与によるNMJの形成促進効果(拡張効果)を野生型マウスにおいて実証している。この知見を踏まえ、本研究では大量調製したAAV-D7を発症後のALSマウスに尾静脈投与し、全身性にヒトDOK7を発現させた。その後、ALS病態に対する効果をNMJの免疫蛍光染色、筋肉組織のHE染色、脊髄のニッスル染色、運動神経軸索の免疫染色による病理組織学的解析と生存期間や自発運動量の測定などにより検討した。その結果、治療群において有為な生存期間の延長効果、NMJの拡張効果、並びに筋委縮の改善効果を確認し、また、自発運動量の増加を見出した。これらのことはNMJ形成の人為的な増強がALSに対する有望な治療法となりうることを示唆している。本研究に必須の至適ウイルス投与量の検討と治療効果の評価系の確立を進め、次年度における、多くの個体や様々な投与時期での検証実験の基礎を固めた。また、投与効果を評価するために必要な脊髄のニッスル染色や免疫蛍光染色による軸索の可視化といった病理学的な手技についてもすでに習得しているため。昨年度に取得した遺伝子発現プロファイルについて、個々の遺伝子の発現レベルやこれまでの文献情報と照らし合わせて神経筋接合部の増強や骨格筋から運動神経への逆行性因子の候補をリスト化する。そのうえでin vitro、in vivoでの過剰発現もしくは発現抑制により候補遺伝子の評価を実施する。28年度が最終年度であるため、記入しない。次年度では、今年度で得られた結果と習得した技術を基に多くの個体や様々な投与時期での検証実験を推進する。