hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
自閉症児の関係障碍の形成要因検証：身近な他者の“心的状況の読みとり”能力を介して

子どもと養育者の関係性援助に関する研究として,養育者側の“子どもの心的状況を読み取る能力"の測定法の開発を行った。あいまいな情動表出の刺激,より明確な情動表出の刺激として,生後3か月児と9か月児とその養育者らの自由遊び場面のビデオ観察を行い,快場面,ニュートラル情動場面,ニュートラルだが曖昧さのある情動場面,不快場面の4種の情動表出場面を抽出した。作成したビデオクリップを用いて「内的状態の種類」,「内的状態の強さ」について予備調査を行い,3か月児,9か月児それぞれ5つずつ,計10個からなる子どもの心的状況を読み取る能力の測定検査を作成した。自閉症児と養育者の関係性援助の重要性の高さは広く知られるようになりつつあるが,自閉症児と身近な他者との関係性がもつ固有の特徴は十分に把握されておらず,関係性に影響を与える要因という微視的な視点から相互作用の内実を明らかにすることが,関係性の援助の質的向上において重要な課題である。そこで申請者は,子どもの心的状況を読みとる関わり手の能力に焦点を当て,“関わり手の能力"という観点から,関係障碍の形成・改善要因を検討することを主たる目的として研究を行った。H27年度は,重度の自閉症者を抱える養育者との個別のカウンセリングの過程と,発達の遅れを指摘される乳児とその養育者とのTheraplay的遊びを用いた母子合同面接の過程とをそれぞれ分析し,母子の関係性障碍の形成要因,およびその改善要因として,養育者のメンタライゼーションという機能の変容過程を質的研究により示した。子ども側に障碍特性と呼ばれる要因が強い場合や,養育者が置かれる環境そのものに強いストレス要因が存在する場合,子どもに心があると認識する機能や子どもからの非言語的コミュニケーションに気づく機能(対他的メンタライゼーション)や,自分自身の感情の動きに気づく機能(対自的メンタライゼーション)の抑制が見られることが明らかとなった。その一方で,“遊び心のある関係性"と呼ばれるようなプレイフルなやりとりや,養育者自身の感情を他者(関与者)が共感的に察して言葉にすること(メンタライズすること)が,ひいては養育者の対他的メンタライゼーション能力を向上・回復させることが推察された。またそうした事例研究に並行して,生後3か月児と9か月児とその養育者のやりとり遊び場面のビデオ観察を実施し,養育者のメンタライゼーション機能を測定する映像刺激の作成準備を開始している。H27年度の進捗状況としては,事例研究を中心にして,子どもの心的状況の読み取り能力に関してメンタライゼーションという概念が母子関係のアセスメント及びその支援に有用であることを示すことができ,その後の研究の基軸となる概念の選択がなされた。また,メンタライゼーションに関するアンケートの作者である山口氏より,アンケートの使用の許可を得ることができ,H28年度のビデオ刺激を用いた実験研究の準備がより充実したといえる。一方,ビデオ刺激に関しては,近年の母子合同セラピーであるTheraplayやCircle Of Security(COS)などの支援技法の知見を参考にして,当初の予定から一部内容を変更し,あいまいな刺激(3か月児の情動表出)や,喜怒哀楽の多様な感情場面の収集を追加で行うこととしたため,現在データの収集中である。申請者は近年発達障碍や被虐待児などの領域において着目されている子どもと養育者の“関係性援助"に関する基礎研究として,養育者側の“子どもの心的状況を読みとる能力"の測定法の開発及び,その能力に診断名という認知が与えるバイアスや,自閉症児との直接的関わりが与える影響を検討する研究を行った。研究iでは,上記の能力に関して,個別に観察法やインタビューが行われるなど,実施に多大な時間と労力を要していた従来に代わる簡易測定法の開発を試みた。曖昧な情報表出の刺激,より明確な情報表出の刺激として,生後3か月児と9か月児とその養育者らをそれぞれ6組ずつの自由遊び場面のビデオ観察を行った。聴取したビデオデータから,快場面,ニュートラル情動場面,ニュートラルだが曖昧さのある情動場面,不快場面の大きく分けて4種の情動表出場面を抽出し,計64個のビデオクリップを作成した。作成したビデオクリップを用いて「内的状態の種類」,「内的状態の強さ」についてそれぞれ7件法で女子大学生31名を対象に予備調査を行った。そしてそれぞれの評価点に関して,評定平均以上の強さを示していることと,評価点の分散の大きさという2つの観点から選定し,3か月児,9か月児それぞれ5つずつ,計10個からなる子どもの心的状況を読み取る能力の測定検査を作成した。研究iiでは,研究iで作成した測定検査と,同じく自他の言動を心の動きという視点から理解する能力であるメンタライゼーションの能力を測定する尺度(山口,2011)を用いて,女子大学生102名を対象に調査を行った。本研究は,別途,対照群として同測定検査の実施時に,映像が自閉症児であるという教示を行い,両群の結果に発達障碍という認知がもたらすバイアスが生じうるかどうかについて検証することを現在実施準備中である。

作成したビデオクリップを用いて「内的状態の種類」,「内的状態の強さ」について予備調査を行い,3か月児,9か月児それぞれ5つずつ,計10個からなる子どもの心的状況を読み取る能力の測定検査を作成した。研究計画に関しては,上述の通り,メンタライゼーションという概念を中心に,ビデオ刺激を用いた実験研究に加えて,メンタライゼーション尺度を用いたアンケート研究との併用研究を実施することを新たに予定している。ビデオ刺激の収集に関しては,子どもや養育者の顔が映像に映るという個人情報の露見という研究の性質上の課題があるため,協力者の募集には期間を要することが予想されている。特に生後3か月児の養育者とコンタクトを取ることは,9か月児の養育者の場合に比べてもより困難であり,また養育者が一過性の抑うつ的な状態に陥っているリスクも3か月児の場合の方が高いことを鑑みると,3か月児のデータはより入手が困難になる可能性がある。そのため,9か月児のデータ(より明確な刺激)による映像刺激の作成と,3か月児のデータ(あいまい刺激)による映像刺激の作成とにタイムラグが生じ,H28年度中には主に前者の刺激を用いた実験研究が中心となる可能性がある。28年度が最終年度であるため、記入しない。臨床心理学28年度が最終年度であるため、記入しない。
椎間板線維輪組織由来の前駆細胞の分離と組織再生への応用

変性椎間板の線維輪(AF)を修復するためAF由来前駆細胞の有効性を検討した。CD146は間葉系幹細胞のマーカーでありかつ、マウスAFの初代培養に発現があるためマーカーでソートしたCD146陽性細胞における間葉系への多分化能及びタンパク、遺伝子発現、コラーゲンゲル内での収縮能を検討した。結果、CD146陽性細胞はTGFβ-1により強く誘導され、平滑筋タンパク22αのmRNAを有意に高く発現した。コラーゲンゲル内での三次元培養ではCD146陰性群に比べ有意に高い収縮能を示した。CD146陽性細胞は前駆細胞ではなく分化した細胞であり機能的な線維輪組織再生に有用な細胞であることが判明した。変性椎間板への細胞移植療法の細胞資源として、線維輪由来の培養細胞を利用するため、本研究ではマウス線維輪由来培養細胞中に再生力に富む前駆細胞が存在すると仮定し、表面マーカーによりその分離同定を試みる。三年間の研究計画からなる二年次の実績としては、C57BL/6マウス尾椎線維輪由来細胞を培養し、細胞表面マーカーを解析した結果、CD146タンパク(以下CD146)が線維輪にとって重要な役割を果たしていることが判明し、第28回日本整形外科学会基礎学術集会で口頭発表をおこなった。具体的には、CD146発現の有無で細胞のソーティングを実施し、得られた二群の細胞の性質を遺伝子発現、免疫染色によるタンパク発現に基づいて比較したところ、CD146陽性細胞は、これまで知られていた軟骨や髄核の細胞と共通の細胞外基質を生産する一方で、よりフレキシブルな組織構造を構築するための細胞骨格形成やコラーゲン繊維の配向の制御に関わる因子であることが示唆された。さらに、培養液に添加する増殖因子を調節することで、線維輪細胞に効率的にCD146発現を増加させる方法を発見し、通常培養との比較から、CD146発現に至る前の前駆細胞のマーカーについても有力な手掛かりを得ることができた。変性椎間板への細胞移植療法として髄核由来の培養細胞を再挿入する臨床研究が実施されているが、近年ヒト線維輪細胞についても、in vitroで多分化能を示すとの報告があり(FengらJ Bone Joint Surg Am 2010)、椎間板再生医療の細胞資源として期待される。本研究ではマウス線維輪由来培養細胞中に再生力に富む前駆細胞が存在すると仮定し、表面マーカーにより、その分離同定を試みる。三年間の研究計画からなる初年度の実績としては、C57BL/6マウス尾椎線維輪由来細胞(mAF)の培養法を確立し、mAFが間葉系三系統の多分化能を有することをin vitroにて確認した。また主に間葉系幹細胞に特徴的な細胞表面マーカーを解析し、培養過程での経時変化を記録すると共に、予測される前駆細胞マーカーにて培養細胞のソーティングを実施し、得られた細胞の間葉系への多分化能を調査した。加えて、組織より細胞を分離した直後の初期の表面マーカー発現の解析や、これに基づくソーティングを実現するために、酵素処理法を改良し、10匹のマウス尾椎より分離した細胞を集めてソーティングに供することが可能となった。従来、コラーゲン繊維が緻密な層状構造を成す線維輪組織から、細胞を障害なくバラバラにすることは困難であった。そのため、フローサイトメーターを詰まらせずに実施するには、微細な組織塊や複数の細胞からなる集団を初代培養に持ち込み、一週後に培養皿から回収した細胞を解析するしかなかった。しかし今回、酵素処理法を改良し、障害なく単細胞集団を得ることで、培養前の初期のソーティングを可能にした。さらに、培養後の細胞の回収には、培養皿からの剥離困難、及び細胞間の強固な付着が、カルシウム依存性の接着であることが予測され、EDATを含む独自の酵素混合液を用いた良好な剥離分散法を開発した。【目的と実施計画】線維輪(AF)は椎間板の構造と耐荷重性の維持に不可欠であり椎間板変性における修復は重要な課題である.本研究では細胞移植を目的として,マウス尾椎AF培養細胞に発現する間葉系幹細胞マーカーであるCD146に着目し組織再生能を検討した.8週齢のC57BL/6マウス尾椎AF組織由来の細胞を3週培養し以下の実験を行った.1間葉系三系統への分化誘導,2Transforming growth factor β-1(TGFβ-1), Insulinlike growthfactor-1(IGF-1)の効果,3ソーティングで得たCD146+,CD146-におけるmRNAをリアルタイムPCR法,タンパク発現を蛍光抗体法により検討.4コラーゲンゲル内でのGel Contraction Assay,5AF組織切片を免疫染色しCD146+細胞の局在を調査.

【結果と考察】1未ソートのAF培養細胞は骨,軟骨,脂肪の三系統への多分化能を示したが, CD146-は骨・軟骨へ,CD146+は骨への分化を示した.2CD146発現はTGFβ-1,R3-IGF1の添加により増加した(3.43倍,P<0.05).3CD146+群において平滑筋(SM)22αmRNA発現が陰性群に対し2.3倍(P<0.05)と高く,蛍光抗体法でもCD146+群にてSM22α,直線状のF-アクチンの発達や,広範なタイプIコラーゲン分布が見られた.4Gel Contraction Assayの結果,CD146+はCD146-に比してゲル表面積が75%(P<0.05)と強い収縮能を示した.5組織染色ではCD146+細胞はAF組織再外層に局在を認めた.【結語】CD146分子はSM22αやF-アクチンを介した形質発現に寄与し,コラーゲンゲル内で高い収縮能を示す最外層AF細胞のマーカーであると判明した.整形外科学線維輪前駆細胞のマーカーを探し、前駆細胞を採取して椎間板再生への応用を試みるのが目的であるが、現段階で線維輪固有の形質発現と関わりを持つマーカー、すなわち分化マーカーを発見した。これらの分化型細胞の元になる、より未分化な細胞が前駆細胞と考えられるが、分化マーカー発現前後の他のマーカー変動についてもデータを取り続けてきたため、目指す前駆細胞を特定するマーカーについても有力なヒントを得ており、目的に近づいてきたと評価できる。H24年度、我々は髄核由来の培養細胞に特定の細胞表面マーカーで分離可能な髄核前駆細胞が存在することを解明し論文発表を行った(Nat Commun. 2012)。これに続き、C57BL/6マウスの尾椎線維輪由来の細胞より、細胞表面マーカーで前駆細胞を分離し再生医療への応用を目指す。今年度はマーカー調査のため、i)からiii)を繰り返した。表面マーカーで前駆細胞を分離する。iii.分離した前駆細胞を三次元培養で増殖、分化させECMを評価する。iv.最終的に、免疫不全マウスへの移植、評価をする。2組織より酵素処理直後の細胞を、CD105及びNG2 (melanoma chondroitin sulfate proteoglycan)によりソートし4分画を得た。いずれも三系統の分化能を示した。CD105+NG2+集団は、三週で4000倍を超える増殖率を示し、メチルセルロース培地に1000個播種すると70個の球状コロニーが観察され、コロニー形成率はソート前の約二倍であり、幹・前駆細胞の存在が期待された。以上の基礎的データを得られたため、おおむね順調と考えられる。まずCD146が線維輪にとって重要なマーカーであることを実証し論文発表するために、これまでに得られたデータに加えて機能との関連を裏付けるデータを得る実験を行う。コラーゲンゲル内にCD146発現の有無でソートした細胞を別々に同一の密度で播種し、より生体内の環境に近い三次元培養を行い差異を調査する。さらにCD146陽性細胞の前駆細胞についても調査を続け、動物への移植実験への準備を行う。その際、分化した細胞のマーカーであるCD146陽性で細胞を選ぶのか、その前段階の前駆細胞を、想定されるマーカーで選ぶのか、どちらが有利であるのかも合わせて検討し移植を試みる。ひき続き、C57BL/6マウスの尾椎線維輪
発達期における口腔の機能的健康に関する研究

〈研究目的〉口腔の機能的健康に関する現状把握および育児担当者らへの正しい情報提供を行い,母子歯科保健指導の基礎とする。〈研究計画・方法〉I.保健所歯科相談室におけるアンケート調査の実施II.口腔内診査の実施III.「食べ方相談」における実際の臨床症例の検討〈研究結果〉IおよびII;資料に不備のない648名の3歳児を対象として分析検討を行った。(1)哺乳方法(母乳,人工乳)の違いと口腔の形態(歯列,空隙,咬合状態)との間には統計学的に有意な関係は認められなかった。(2)哺乳方法の違いと食べ方(食物の貯留,咀嚼・嚥下の状態,チュチュ食べ,その他)との間には統計学的に有意な関係は認められなかった。III.実際の臨床症例50例の来所の主訴,それに関わると考えられる要因は以下のようなものであった。(1)主訴:(1)貯留,食事時間が長い(2)チュチュ食べ(3)かまない,食べ方が下手(4)汚す,食物を口に押し込む(5)その他(口唇口蓋裂など)(2)要因(重複)(1)形態(う蝕,歯列不正,口蓋裂)(2)機能(捕食,咀嚼,嚥下不全,口と手の非協調,習熟不足)(3)生活(食事,おやつ,他)(4)心理(家族関係,食事の強要,友人・遊び(特に外遊びの多少),性格傾向,環境変化,指しゃぶりの代用)(5)発達(身体・精神発達の遅れ,その他)〈考察および今後の課題〉研究I,II,IIIの結果から,一つの要因のみを取り上げて,乳幼児の口腔に生じているといわれる形態・機能の問題の原因とするのではなく,多角的・発達的視点を持って母子歯科保健指導にあたることが重要と思われた。また、当初研究計画に示した保健所に来所した健常乳幼児のビデオ撮影は困難であることから,今後口腔内状況把握のための印象採得や口唇圧測定などにより,口腔の機能的健康に関する客観的分析を継続する予定である。
11・12世紀フランスにおける文書史料の機能:カルチュレール編纂作業を手がかりに

本年度は、11・12世紀西欧における文書史料の多機能性を解明するために、修道院カルチュレールにおける「過去の管理」の背景を教会政策に注目して考察した。サン・シプリアン修道院のカルチュレールの場合、「過去の管理」は世俗的領主支配からの自由、修道院縁起などにみられる司教権の尊重を特徴とする。これは、修道院改革における自らの姿勢と修道院財産の管理への配慮、すなわち、11世紀半ば以降、グレゴリウス改革を支持する一方で、クリュニーの勢力伸張に抵抗したサン・シプリアン修道院の独自の改革方針と、聖俗両支配権を掌握するポワチエ司教に依存した修道院所領の保全策を反映している。ここから、「過去の管理」を通じてアイデンティティの拠り所を提供する記憶機能と、財産管理に貢献する実務機能をカルチュレールに指摘することができる。この知見は論文にまとめる一方で、一部を5月に開催された日本西洋史学会において発表した。6・7月にフランスに赴き、パリ大学のL・モレル教授、ボルドー大学のF・レネ教授のもとで研究報告を行った。パリでは国立図書館、ポワチエではヴィエンヌ県文書館、市図書館において、サン・シプリアン修道院関連の史料を追加収集した。県文書館と市図書館で存在が確認された未刊行の証書や行政文書、図像史料については、レネ教授同行のもとで史料調査を進めた。今回発見した史料の大半は中世後期・近世の作だったが、これらをもとに今まで知られていなかったサン・シプリアン修道院史をまとめた。カルチュレール研究も射程にいれた西欧中世史料論研究会(九州大学)に参加し、9月には「修道院カルチュレール史料論」という共通テーマのもとで、2で行った史料調査の結果を報告した。そこでは、ポワトゥ地方における伯・司教・修道院の関係の推移をもとに、11・12世紀のサン・シプリアン修道院にみられる歴史と過去認識との差異を指摘した。11・12世紀における文書史料の機能の解明を目的とする本研究では、11世紀後半からみられた修道院カルチュレール編纂の活発化に着目して、サン・シプリアン修道院のカルチュレールの構造や編纂の社会的背景の分析を行った。今年度の研究成果は以下に概記する。1.修道院カルチュレールについて、従来は財産管理・保全という実務的機能ばかりが強調されてきた。これに対して近年は、「記憶の管理」という観点から、実務系史料についても編纂の意図が議論されるようになっている。そこで、このような史料の典型として修道院カルチュレールを分析し、「記憶の選択・操作」と財産管理・保全という機能との関係を考察することで、修道院カルチュレールの機能を明らかにすることを考察の焦点とした。史料批判が不完全であったため、コディコロジックな史料分析や文書形式学的な史料分析からとりかかり、作成年代や内部構成など、サン・シプリアン修道院のカルチュレールの基本的な性格を明らかにした。ついで、収録証書のテクスト分析により、免属特権と修道院縁起を強調する「記憶の選択・操作」を、このカルチュレールの特徴として指摘した。なお、この研究成果の一部を、「カルチュレール編纂にみる11・12世紀の文書使用-サン・シプリアン修道院の場合-」と題し、広島史学会大会(2004年10月30日)において発表した。2.カルチュレール研究が日本ではほとんど知られていないので、積極的に研究会発表や論文執筆を行い、フランスでのカルチュレール研究の動向の紹介に努めた(「カルチュレールを読む」『史林』88巻2号掲載決定)。3.昨年12月にフランスへ赴き、パリ大学のL.モレル教授、ボルドー大学のF.レネ教授に研究報告を行い、指導を受けた。サン・シプリアン修道院の史料状況を把握する必要から、フランス国立図書館で関係するマニュスクリを網羅的に調査し、修道院史に関する史料を入手した。

そこでは、ポワトゥ地方における伯・司教・修道院の関係の推移をもとに、11・12世紀のサン・シプリアン修道院にみられる歴史と過去認識との差異を指摘した。
甲状腺系を撹乱する有機ハロゲン化合物のバイオアッセイ系開発のための基礎的研究

脊椎動物では、甲状腺ホルモンは中枢神経系の発達や両生類の変態のような胚発生後期に必須のホルモンである。本研究では、甲状腺ホルモンのシグナル伝達系を標的または標的とする疑いのある化学物質に焦点をあてた。そのために、3つのin vitroアッセイと一つのin vivoアッセイを構築した。それらは、血清蛋白質トランスサイレチンへのホルモン結合に競合する化学物質を検出するTTRアッセイ、核内受容体へのホルモン結合に競合する化学物質を検出するTRアッセイ、細胞内の甲状腺ホルモン応答レポーター遺伝子発現への影響を検出するLucアッセイ、両生類の変態時に甲状腺ホルモンに応答する遺伝子の発現を検出する変態アッセイから成る。いくつかの有機ハロゲン化合物は、これらのアッセイで異なった様式で影響を与えたが、TRに影響するものはあまり見いだせなかった。両生類の変態のある時期では、いくつかの化学物質に感受性が高かった。次にこれらのアッセイを日本とタイの環境水中の甲状腺ホルモン撹乱活性の検出に用いた。バイオアッセイは、製紙工場や下水処理場の浄化処理によって甲状腺撹乱活性物質が効率よく除去されていることを明らかにした。また、Lucアッセイでは日本の下水処理水では甲状腺ホルモン様活性を、タイの下水処理水では抗甲状腺ホルモン様活性を示した。3つのin vitroバイオアッセイは、環境水サンプルによって同じ物質を認識したりまたは異なる物質を認識しているようだ。われわれの実験結果は、これらのバイオアッセイを組み合わせて用いることで、環境中の甲状腺撹乱物質を迅速にスクリーニングし、汚染地域を同定できることを示している。内分泌撹乱化学物質は、内在性ホルモンの合成から受容体に至るステップのいずれかに影響を与え、本来行われるべきホルモン作用を撹乱するものと考えられる。いままで、甲状腺ホルモン輸送に関わる血漿タンパク質(トランスサイレチン,TTR)および核内受容体を標的として甲状腺ホルモン結合を競合阻害する化学物質を同定した。しかし、これらの実験は精製蛋白質を用いておこなわれため、実際の細胞でこれらの甲状腺系撹乱作用が再現できるかという疑問があった。また、ステロイドホルモン系の撹乱におけるほど、受容体を標的とした化学物質が見つかっていないのが現状である。そこで今年度は、レンチウイルスを用いてアフリカツメガエル培養細胞へ、甲状腺ホルモン応答配列とその下流にルシフェラーゼ遺伝子を導入し、安定したホルモン応答を示す培養細胞株の樹立を試みた。本細胞にはマーカーとしてEGFP遺伝子も導入したが、EGFPの発現とホルモン依存性のルシフェラーゼの発現は必ずしも対応しなかった。また、哺乳類の細胞に比べて、長い細胞培養を行うと安定した発現ではなかったため、高発現する細胞株のクローニングを行った。得られたクローン細胞は10^<-11>Mの甲状腺ホルモンに応答した。また、数ヶ月の継代培養においてもホルモン応答を維持した。現在、上記のTTRや核内受容体へのホルモン結合を阻害する化学物質や甲状腺系を撹乱する可能性が示唆されている化学物質を用いて、これらのアゴニスト活性およびアンタゴニスト活性を検討している最中である。内分泌撹乱化学物質は、ホルモンの合成から受容体に至るステップのいずれかに影響を与え、本来発揮されるホルモン作用が撹乱されるものと考える。本研究では、標的細胞での化学物質の作用に焦点を当て、甲状腺系に影響を与える疑いが示唆されている臭素化難燃剤である臭素化ビスフェノールAおよび臭素化フェノールを用いて、3つのin vitroアッセイと1つのin vivoアッセイを用いてその撹乱作用を検討した。in vitroアッセイには、ホルモンがトランスサイレチン(TTR)や受容体(TR)に結合する際の競合阻害を調べたTTRアッセイとTRアッセイ、さらにホルモン応答性のレポーター遺伝子の転写活性を培養細胞で調べたLucアッセイから成り、in vivoアッセイでは、甲状腺ホルモンによって制御される両性類の変態現象を利用した変態アッセイから成る。

臭素化ビスフェノールAおよび臭素化フェノールの多くはTTRアッセイとTRアッセイで活性を示し、TTRへの甲状腺ホルモン結合阻害はTRアッセイよりTTRアッセイのほうが高かった。また、ハロゲン化の程度が高い化学物質のほうが活性が高く、臭素化ビスフェノールAにおいては、甲状腺ホルモンと化学構造が類似しているものが高い活性を示し、活性構造相関が認められた。これらのうち活性の高かった臭素化ビスフェノールAをLucアッセイで調べたところ、その幾つかにおいて有意なアゴニストおよびアンタゴニスト活性が検出できた。しかし、TRアッセイ、TTRアッセイで活性を示したがLucアッセイで活性を示さない化学物質も存在し、幾つかのアッセイを組み合わせて甲状腺系撹乱作用を評価する必要があると思われた。また、Lucアッセイで活性を示した臭素化ビスフェノールAは、変態アッセイにおいてもアゴニストおよびアンタゴニスト活性を示したが、オタマジャクシの個体差によるばらつきが大きく、in vivoで甲状腺系撹乱作用評価による困難さを提示した。内分泌撹乱化学物質は、内在性ホルモンの合成から受容体にいたるステップのいずれかに影響を与え、本来行われるべきホルモンの作用を撹乱するものと考えられる。バイオアッセイによる甲状腺系撹乱化学物質のスクリーニングを下水処理水に適用し、化学物質の性状を明らかにする目的で、固相抽出後の有機溶媒による段階溶出、HPLCを用いた分画を行った。その結果、甲状腺ホルモン受容体へのホルモン結合に競合する活性及び培養細胞を用いたレポーターアッセイによる甲状腺ホルモン応答活性において陽性な成分が分離された。この活性物質は、甲状腺ホルモン様活性を示すが、甲状腺ホルモンより低い極性を示した。HPLC画分をGC/MSによって分析したが、いくつかの成分が含まれておりライブラリーによる同定はできなかった。下水処理水中の甲状腺ホルモン様活性は、原液では生物に影響を与える濃度には達していないが、4倍の濃度では両生類の甲状腺ホルモン応答遺伝子の発現に影響を与えた。排水中の活性物質濃度の変動に日周変動もあることから、人間活動と密接に関連のある物質の可能性が考えられる。内分泌撹乱化学物質は,内在性ホルモンの合成から受容体にいたるステップのいずれかに影響を与え,本来行われるべきホルモンの作用を撹乱するものと考えられる。バイオアッセイによる甲状腺系撹乱化学物質のスクリーニングを下水処理水に適用し,化学物質の性状を明らかにする目的で,固相抽出後の有機溶媒による段階溶出,HPLCを用いた分画を行った。その結果,甲状腺ホルモン受容体へのホルモン結合に競合する活性及び培養細胞を用いたレポーターアッセイによる甲状腺ホルモン応答活性において陽性な成分が分離された。この活性物質は,甲状腺ホルモン様活性を示すが,甲状腺ホルモンより低い極性を示した。HPLC
第一次世界大戦後のドイツにおける民族主義的読書共同体「ドイツ家庭文庫」とナチズム

本研究は、右翼商業職員労働組合「ドイツ民族商業補助者連合」によって1916年に設立された読書共同体「ドイツ家庭文庫」を取り上げ、その広報宣伝雑誌の綿密な分析を通じて、この読書共同体の出版活動および読書指導が第一次世界大戦後のドイツにおけるナショナリズムの隆昌に多大な貢献をなしたことを明らかにした。それによって、ナチズムと文学のかかわりを研究する上で重要な新しい基礎的資料と、文学的な研究対象を通じたナチズムの研究方法の一つのモデルが提示された。それと同時に、「ブッククラブ」という新しい重要な研究対象も見出された。本研究課題は、第一次世界大戦後のドイツにおける民族主義の高まりと文学のかかわりを、右翼商業職員団体「ドイツ民族商業補助者連合」(DHV)によって組織された読書共同体「ドイツ家庭文庫」の活動に基づいて解明することを目的としている。初年度にあたる平成22年度は、研究の遂行に必要な資料の収集に作業の重点を置きながら、入手済みの一次・二次資料の読解と分析も進めた。資料の収集に関しては、9月にドイツ国立図書館(ライプツィヒ)とフリードリヒ・エーベルト財団附属図書館(ボン)を訪れ、現地調査と資料収集を行うとともに、本研究課題と密接に関連する研究を行っているライプツィヒ大学のジークフリート・ロカティス教授の許で指導と助言を受けた。特筆すべき成果は、「ドイツ家庭文庫」の宣伝雑誌『かまどの火』の収集が総刊行数の約8割に達したことと、同文庫について、ドイツにおける初期の代表的な「ブッククラブ」として多数の先行研究が存在することがわかったことである。一方、研究実施計画で設定した課題に関しては、DHVの教育活動の全体像について、連合の内部で実施された活動(職業教育、一般教育、青少年教育)と連合の下部団体である「フィヒテ協会」の活動を中心に、重点的に検討した。その結果、DHVの教育活動が1900年代初頭から一貫してドイツにおける民族主義的な信条の普及に貢献し、資本主義的大経営の発展とプロレタリア運動の高まりの中で身分の低下に対する危機感を強めていた商業職員に強い影響を及ぼし、彼らのナチズムへの接近をもたらしたことを跡づけ、それによって、ドイツにおいて因習的な中間層イデオロギーがナチズムと合流した過程の一端を明らかにすることができた。この研究成果については、日本独文学会で口頭発表を行った上、3編の論文にまとめた。そのうち年度内に刊行できたのは1編だが、残る2編も今後順次公表する予定である。本研究の目的は、ワイマール時代からナチス時代のドイツにおける読書共同体「ドイツ家庭文庫」とナチズムのかかわりを明らかにすることであり、平成23年度には、研究実施計画に基づき、同文庫の「民族主義的な特色」に関する集中的な考察を行ない、次のような成果を得た。(1)ドイツにおける「ブッククラブ」の成立・発展、およびそれらに関する研究の観点を詳しく分析し、それを通して、「民族主義的なブッククラブ」としての「ドイツ家庭文庫」の特性を明らかにした。(2)1923年から20年間刊行された「ドイツ家庭文庫」の雑誌の変遷と記事を詳細に跡づけ、同文庫の雑誌が会員の間に「民族主義的な共同体意識」を形成するための重要な媒体であると同時に、新会員勧誘の有効な手段の一つでもあったことを明らかにした。(3)「ドイツ家庭文庫」の本の装丁における「総クロス装」の重視が、同文庫における「民族主義的信条」の重視と密接に関連し、会員への「民族主義的な価値観」の指導の一部をなしていたことを明らかにした。(4)「ドイツ家庭文庫」の図書提供システムを細かく分析し、「自由選択」の拡大という「営利的」な手法が取り入れられる一方で、実際の購入においては「自由選択」の権利の放棄が強く要請され、会員の側も進んでそれに従っていたことを突き止め、同文庫の図書提供システムが、経済的利点よりもむしろ、「民族主義」に基づく同文庫と会員の固い志操的結束によって成り立っていたことを明らかにした。以上の研究成果は、「ブッククラブ」の研究においても、「ドイツ家庭文庫」の研究においても、先駆的な意義を有する。これらのうち、(1)については、日本独文学会で口頭発表を行ない、反響を得た。また、(1)と(2)については、本年度印刷発表を行なった。(3)と(4)については、次年度中に印刷発表を行なう予定である。本研究の目的は、ワイマール共和国時代からナチス時代のドイツにおける読書共同体「ドイツ家庭文庫」とナチズムのかかわりを解明することであり、平成24年度には、研究実施計画に基づき、(1)未発表の研究成果の公表、(2)「ナチス政権下の活動」に関する集中的考察、(3)研究成果の総括を行った。(1)「ドイツ家庭文庫」の「民族主義的な特色」に関する研究成果のうち、本の装丁と図書提供システムに関連する内容を印刷発表した。また、前者については、国際学会「アジア・ゲルマニスト会議(北京)」においてドイツ語で口頭発表を行い、反響を得た。

(2)「ドイツ家庭文庫」の「ナチス政権下の活動」に関する考察からは、同文庫が、母体をなす「ドイツ民族商業補助者連合」がナチスによって統制・解体された後にもなお活動を継続・発展させることができたが、そこにはこれをナチズムの普及に利用しようとするナチスの意向が働いており、それだけに、ナチス政権成立以後、同文庫の出版活動は反ユダヤ主義的、民族主義的、ナチス的な特色を一層強め、ナチスの宣伝媒体としての役割を果たしたとの結論を得た。「ドイツ家庭文庫」に関する先行研究において、同文庫の活動は母体をなす連合の解体とともに終結したと考えられていたのに対し、同文庫がその後もナチス政権末期まで活動を継続し、ナチスの政権維持に役立ったことを明らかにしたことは、大きな成果と言える。この研究成果は、本年度中に印刷発表を行った。(3)以上の後、3年間の研究成果を総括し、「ドイツ家庭文庫」の活動は、ナチスやナチス政権の誕生以前より、保守的な商業職員を始めとするドイツ国民への民族主義的信条の普及に多大な影響を及ぼし、とりわけ第一次世界大戦後のドイツにおけるナショナリズムの隆昌とナチス政権の成立に大きく貢献し、ナチス政権下ではナチスの宣伝媒体として利用された、との結論が得られた。平成22年度における「ドイツ家庭文庫」とその母体である「ドイツ民族商業補助者連合」の定期刊行物の調査・収集が成果を得たことで、それらの団体の活動をある程度網羅的に分析できる体制が整ったことにより、研究は順調に進んでいる。また、同じく平成22年度の資料調査から、「ドイツ家庭文庫」と同じように特定の会員に本を安く販売する「ブッククラブ」と呼ばれる団体がドイツに多数存在することが明らかになり、同文庫の活動のあり方やその特色を相対化する視点が得られたことによって、当初の計画を上回るとまでは言えなくとも、大きな進展がもたらされてもいる。平成23年度に研究成果を発表する予定だった国際学会が中止となったが、平成24年度に予定していた全国学会での発表を前倒しすることで補った。24年度が最終年度であるため、記入しない。研究期間の最終年度にあたる平成24年度は、本研究の最終的な成果をまとめることを最優先する。そこで、当初の計画通り、「ドイツ家庭文庫」のナチス時代の活動を中心に分析を行なったうえで、これまでの成果を総合して同文庫の全体的な特色を明らかにし、その結果を踏まえて、この読書共同体とナチズムのかかわりについて詳細な考察を行ない、結論を出す。平成23年度に中止となった国際学会が平成24年度に開催されることになったので、参加して研究成果の一部を発表する。
水稲再生二期作栽培における再生茎発育の遺伝的変異と収量形成

水稲再生二期作は、一度植えて二度採る稲作栽培技術として古くから知られている。しかし、技術改良が行われなかったため収量は一期作よりも遥かに低い。今後の人口増加による食糧問題に対応するには、生産性の向上が必要不可欠である。本研究では、水稲再生二期作栽培で年間最多収記録を得るために、一度収穫した株から再生する茎の萌芽の発生・生長の生理生態機構を解明し、収量形成に対する再生茎の役割を明らかにする。
燃焼のサイクル変動予測モデルの開発

熱機関内のガス流動,混合気分布や燃焼のサイクル変動を定量的にかつ,実用に耐える時間内で予測できる数学モデルを提案することを目的に,フリーの汎用流体解析プログラムFrontFlow/Redにレイノルズ平均乱流モデル(RANS)に基礎を置いたサイクル変動予測モデルの組み込みを行った.その結果,ガス流動のサイクル変動ならびに燃料濃度場のサイクル変動を3次元に予測できるコードを完成させた.あわせて本コードの予測精度・信頼性の検査を実施し,エンジン流動場で十分に適用可能であることがわかった.熱機関内のガス流動,混合気分布や燃焼のサイクル変動を定量的にかつ,実用に耐える時間内で予測できる数学モデルを提案することを目的に,フリーの汎用流体解析プログラムFrontFlow/Redにレイノルズ平均乱流モデル(RANS)に基礎を置いたサイクル変動予測モデルの組み込みを行った.その結果,ガス流動のサイクル変動ならびに燃料濃度場のサイクル変動を3次元に予測できるコードを完成させた.あわせて本コードの予測精度・信頼性の検査を実施し,エンジン流動場で十分に適用可能であることがわかった.熱機関のさらなる熱効率改善案として,空気過剰率を2倍以上とする極リーン燃焼が提案されている。極リーン燃焼により熱効率の改善だけでなく燃焼温度の低下に伴う,有害排出物の発生を抑えることができる。しかしながら,極リーン燃焼をさせると燃焼のサイクルごとの変動が大きくなり実用化が難しいという問題が生じてくる。このサイクル変動を予測する方法の開発が強く望まれているが,まだ具体的な方法は提案されていない。そこで本研究では,燃焼のサイクル変動を予測できる数学モデルを提案し,実験による検証を行うことを目的としているベースコードとして,文部科学省次世代IT基盤構築のための研究開発「革新的シミュレーションソフトウェアの研究開発」において開発された高精度熱流体解析ソフトウェアであるFrontFlow/Redを採用した。本研究で導入した計算機においてもFrontFlow/Redが効率的かっ高速に動作することが実証され,次にエンジン解析に必要不可欠なALE移動格子法に基づくピストン動作を組み込み,さらにサイクル変動予測に最適なRANS型乱流モデルである2-scale k-εモデルを組み込んだ。これを用いてモータリング状態における理想的な初期条件(スワール比3,タンブル比0)におけるエンジン筒内の流れ解析を実施し,これらの結果をもとにサイクル変動予測を行い,実験値と比較することで検証を行った。次年度はDDM(Discrete Droplet Model)に基づく噴霧液滴の解析を導入し,噴霧のサイクル変動や燃料の時間、空間的な変動を予測できるように拡張することで,燃焼のサイクル変動予測へのつなげる予定である。昨年度はベースコードとして,文部科学省次世代IT基盤構築のための研究開発・「革新的シミュレーションソフトウェアの研究開発」において開発された熱流体解析ソフトウェアであるFrontFlow/Redの高速化およびエンジン筒内解析に必要不可欠なALE移動格子法に基づくピストン動作を組み込み並びにサイクル変動予測に最適なRANS型乱流モデルである2-scale k-eモデルを組み込みとこれらの予備検証を実施した.本年度は,これを用いてモータリング状態エンジン筒内の流れ解析を実施し,もとにサイクル変動予測を行ない,過去に提示された実験値と比較することで本研究で開発した解析コードの検証を行った.その結果,スワール比などの流動条件を変更した解析より,従来予測が難しいとされてきた旋回流についても実験値とよい一致を示し,またそのサイクル変動も精度良く予測できた.あわせて燃焼噴射を模した燃料気体の同時解析も行ない,ガス流動ならびに燃料の3次元的挙動およびそのサイクル変動や時間・空間的な変動を予測することに成功した.他にも乱流モデル,格子解像度など種々の変更を施した解析を実施し,実験結果と比較することでその予測精度や信頼性を提示することができた.またこの結果を得るために必要とする解析時間は,従前の解析とほぼ変わらず,一般工業用途における解析手法としても十分実用に耐えるものであることが確認できた.
体細胞胚の乾燥耐性機構の解明と乾燥系人工種子への利用

体細胞胚はABAによりしばしば乾燥耐性を獲得する。本研究はアブラナ属植物の花粉由来胚を用い乾燥耐性獲得の機構を解析するとともに、乾燥系人工種子として利用するために乾燥胚の特性を検討した。1.種子の乾燥耐性に関与していると推察されているLae遺伝子に着目して解析を行った。体細胞胚はABA処理で乾燥耐性を獲得することが既に明らかとなっているため、ABA処理時間と胚の乾燥耐性の獲得およびLea遺伝子の発現を調査した。その結果、乾燥耐性を誘導できた胚においてのみLea遺伝子の発現がみられ、Lea遺伝子の発現と乾燥耐性の獲得は12時間以内のABA処理で同時に起こることが明らかとなった。また、それらの胚からLea遺伝子を単離し構造解析を行ったところ、両者の間にはアミノ酸レベルで82%の相同性が認められ、さらに11アミノ酸残基の共通配列の繰り返しがナタネで11回、ハクサイで9回存在することが明らかとなった。ナタネのゲノムライブラリーからLea遺伝子を単離し、プロモーター領域の解析を行った。その結果、Lea遺伝子のプロモーター領域にはABAによって誘導される遺伝子においてみられるABRE領域が存在することが明らかとなった。2.Lea遺伝子Lea76をCaMV35Sプロモーター下につないだキメラ遺伝子を作り、タバコとナタネに遺伝子導入した。タバコで6個体、ナタネで2個体の形質転換体が得られ、それらの個体についてNaCl耐性をリ-フデスク法により調査したが、耐性は得られなかった。タバコのT1植物について、実生の段階でNaCl耐性を調査したところ、それらの中で若干のNaCl耐性がみられるものが見出された。3.乾燥系人工種子としての可能性をはかる目的で、乾燥胚の貯蔵性について調査した。その結果、乾燥胚は-80°Cの貯蔵条件下で3年間植物体再生能を保持し、また液体窒素による凍結保存も可能であることが明らかとなった。一方、テステープ法により乾燥胚の生死を簡便に判断できることが明らかとなった。1.体細胞胚の乾燥耐性の機構を明らかにするため、ABA処理により乾燥耐性を獲得したナタネ、白菜の花粉由来胚についてナタネ種子胚のLEA遺伝子であるLEA76をプローブとしてノーザン分析を行なった。両種とも乾燥耐性胚についてのみLEA遺伝子の発現が認められた。次に乾燥耐性胚からcDNAライブラリーを作成してLEA遺伝子の単離を行なった。ナタネ、白菜でそれぞれ3個のクローンを単離し、それぞれ1クローンについて塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列を決定したところ、アミノ酸配列についてLEA76とナタネでは95%、白菜では70%の相同性があることが明らかとなった。また、ナタネ、白菜、ブロッコリーのゲノムDNAについてサザン分析を行なった結果、LEA76は3種の間でRFLPを示し、それぞれゲノム内に12コピー存在することが明らかとなった。現在、ゲノムライブラリーからの遺伝子の単離を試み、数個のクローンが得られており、プロモーター領域の同定と構造解析を行っている。2.乾燥系人工種子としての実用化をはかる目的で、乾燥胚の貯蔵性について検討したところ、-20°Cおよび-80°Cの低温条件下で1年6カ月間貯蔵した後でも、植物体再生能を保持していることが明らかとなり、乾燥耐性胚は長期貯蔵性があることが示唆された。1.ABAによる不定胚の乾燥耐性獲得と種子の乾燥耐性に関与していると考えられているLEA遺伝子との関係を明らかにするため、ABA処理時間を変え、胚の乾燥耐性の獲得とLEA遺伝子の発現との関係をナタネと白菜で調査した。

その結果、ABA12時間処理で耐性の獲得は見られ、48時間以上の処理により耐性獲得の頻度は高まった。また、ノーザン分析によるLEA遺伝子の発現も同様の傾向にあり、12時間で発現が見られ、48時間でプラトーに達した。2.LEA遺伝子の乾燥耐性に対する関わりを明らかにするために、CaMV35SプロモーターにLEA遺伝子をセンスとアンチセンス方向につないだキメラ遺伝子を作成し、Tiプラスミド法を用いてタバコに遺伝子導入を行った。現在、形質転換体が数個体得られており、その植物の乾燥耐性ならびに種子形成を調査中である。3.LEA遺伝子以外に乾燥耐性に関与している遺伝子の単離をDDRT-PCR法で試みており、いくつかの特異的遺伝子を単離し、構造解析中である。4.ABAによる体細胞胚の乾燥耐性獲得が他の植物でも見られるかどうか明らかにするため、ダイズの未熟胚を誘導した。15系統供試し、いくつかの系統で高い胚形成が見られたが、それらかの2次胚、3次胚の形成効率が悪かったため、乾燥耐性の検討までは調査できなかった。来年度、もう一度調査したい。1.体細胞胚の乾燥耐性の機構を解析するため、Lea遺伝子に着目しナタネのLea遺伝子Lea76をCaMV35Sプロモーター下につないだキメラ遺伝子を作り、タバコとナタネに遺伝子導入した。タバコで6個体、ナタネで2個体の形質転換体が得られ、それらの個体についてNaCl耐性をリ-フデスク法により調査したが、耐性は得られなかった。タバコの形質転換体についてはT1植物を得て、その実生の段階でNaCl耐性を調査したところ、それらの中で若干のNaCl耐性がみられるものが見出された。2.ナタネのゲノムライブラリーからLea遺伝子を単離し、プロモーター領域の解析を行った。その結果、Lea遺伝子のプロモーター領域には、TATAボックスの上流にABAによって誘導される遺伝子においてみられる共通配列ABRE(ABA responsive element)領域が存在することが明らかとなった。3.乾燥系人工種子としての可能性をはかる目的で、乾燥胚の貯蔵性について調査を継続して行った。その結果、-80°Cの貯蔵条件下で3年間植物体再生能を保持していることが明らかとなた。また、乾燥胚は液体窒素による凍結保存も可能であることが明らかとなった。一方、糖検出試験紙テステープを用い乾燥胚から浸出してくる糖の有無を検出することで乾燥胚の生死の判断を試みたところ、乾燥感受性胚のみ糖が検出され乾燥胚の生死を簡便に判断できることが明らかとなった。
ナマコ類の卵成熟誘起機構の解明

棘皮動物ナマコ類のホルモンによる産卵の制御機構を解析した。卵巣内の濾胞組織を刺激して2次ホルモンを分泌させ、最終的に卵を受精可能に変化させ排卵させる神経ホルモンをニセクロナマコから精製し、その構造を明らかにした。多くのナマコ類に共通するホルモンである可能性を想定している。また、卵黄タンパク質がカプセル化され、体腔液を介して輸送される新たな卵黄輸送機構を見いだした。さらに、卵母細胞の卵成熟の有無に拘わらず、排卵のみを誘導するペプチド成分が存在することを見いだした。ナマコ類の卵成熟誘起機構を解明する為に、(1)クビフリン作用により誘導される2次物質(COS)精製の為の抽出液の作成を継続した。26年度に解析を行う予定である。(2)マナマコの卵巣の発達における卵黄蛋白質(MYP)の動態を解析した。従来、マナマコのMYPは体腔液中の可溶性成分として存在し、卵巣を経て卵母細胞に取り込まれることで卵黄形成が進むと考えられてきた。本研究では、MYPの存在様態が体腔液中の可溶性画分中には含まれておらず、超遠心操作により初めて沈降しうる直径1ミクロン以下の微小な小胞に含まれていることを明らかにした。また、MYPはナマコの体壁を構成する界面活性剤(ドデシル硫酸ナトリウム:SDS)により可溶化される蛋白質画分中の最も主要な構成成分である事を明らかにした。MYPの産生組織は未解明であるが、生合成されたMYPは小胞に集積された形で体腔液中に放出され、卵巣へと輸送されると考えられる。また、同時に体壁へも輸送・蓄積されていると考えられる。マナマコを無給餌状態で飼育しても、ある程度の卵巣の発達が観察されることから、MYP産生組織ー体壁ー卵巣間での貯蔵・輸送経路が存在する可能性があると考えられる。体腔液中の微小小胞はDAPI染色に陰性を示す事から、非細胞性の構造であると思われる。同小胞及び卵巣壁中のMYPのアミノ酸配列の解析から、これらの構造中にはMYP1とMYP2の2種類のMYP蛋白質が同時に存在していることが示されたが、その量的比率は未解析である。また、卵母細胞発達中のMYPはSDS電気泳動上で約200KDaの分子量を示すが、卵母細胞の直径が最大径を示す時期になると、卵成熟が誘起される前の未成熟な状態であっても、分子量が190KDaへと変化することが明らかとなった。卵母細胞発達の最終期を示す分子マーカーの一つとして捉えることが出来ると考えている。マナマコの神経系から分泌される神経ホルモン「クビフリン」は、マナマコの卵巣組織に作用して新たに2次成分を分泌させる事により卵の成熟・排卵を誘起しているが、その2次成分の化学的実体は不明である。本課題では、クビフリン作用後に卵巣組織で新たに分泌される2次成分の同定を軸として、マナマコのホルモンによる生殖の制御機構の解明を目指すものである。24年度の研究では、排卵誘発活性を指標にして、クビフリン刺激後に卵巣から培養液中に分泌される成分の精製・構造解析を進め、14アミノ酸からなる新規ペプチド断片を見いだした。過去の課題で作成済みのマナマコ卵巣ESTライブラリの探索から、20アミノ酸からなる単純ペプチドであると予想されたことから、同配列を化学合成して生理活性を確認したところ、10-5Mの投与で卵成熟を伴わない排卵現象のみを誘発する事が確認された。本課題の2年目である25年度春期において、同活性の確認実験を実施する予定である。これまで排卵の誘発機構の詳細は不明であったが、一般に卵成熟と連鎖した現象として考えられており、排卵のみを誘発する生理活性ペプチドの発見は初めてである可能性が高い。同ペプチドの詳細な作用機構の解明と共に、他動物種での類似ペプチドとその作用が見いだされれば、広く動物一般の排卵現象の理解が進むと思われる。培養液中の卵成熟誘起活性画分中に、クビフリン誘導体が見いだされた。クビフリン分子の酵素代謝物であると考えられる。25年度には、同代謝反応の阻害実験等を踏まえて、同代謝物が卵成熟誘起ホルモンの化学的実体である可能性を検討する予定である。本課題は棘皮動物ナマコ類の卵成熟誘起因子群の分子的実体の解明を目的とした。マナマコでは、主要神経系から分泌されるクビフリンが卵巣組織を刺激し未知の濾胞刺激物質を分泌させ、それにより刺激された濾胞細胞から分泌される卵成熟誘起ホルモンが卵母細胞に作用して、最終的な卵成熟とそれに続く排卵が誘起される。

最終年度(26年度)では、マナマコの濾胞刺激物質及び卵成熟誘起ホルモンの解明を目指したが、1ー3月期の異常海水温の影響で実験に用いる成熟個体を充分に入手出来ず、これらの解明には至らなかった。代わりに、熱帯性ナマコであるニセクロナマコを用いて、濾胞刺激物質の精製と構造解析を実施した。ニセクロナマコの濾胞刺激活性をHPLC精製し、最終活性画分に得られた成分の構造を解析することに成功した。中程度の分子量を持つペプチドである事を見いだし、現在、同ペプチドの生物活性の確認試験を準備している。また、マナマコ及びハネジナマコのゲノム解析データから、それぞれの相同ペプチド配列を見いだした。同ペプチドはナマコ類に広く保存されていると考えられる。(知的財産権申請の為、配列データは示さない)24年度では、マナマコの濾胞刺激物質探索の過程で、卵成熟を伴わず排卵のみを誘起するペプチド成分を見いだし、その構造を明らかにした。50%有効濃度が0.01mMと高濃度である事から、より詳細な解析が必要であるが、最終年度の材料調達の不備から実施していない。排卵のみを誘起する活性はこれまでに報告がなく、同活性の発見は、動物の排卵制御機構の理解に全く新たな視点を提議する。(知的財産権申請の為、配列データは示さない)25年度には、超遠心法を用いて、マナマコの主要卵黄タンパク質が体腔液中に溶けているのではなく微小胞に含まれていること見いだし、卵黄タンパク質輸送の為の特別な機構が存在することを発見した。比較内分泌マナマコの卵成熟は、神経ペプチドクビフリンが卵巣内の未知の組織に作用して新たに2次物質の産生を促し、その2次物質が卵濾胞に作用して誘導されると考えられる。本課題では、目的の一つとして、この2次物質の解明を目指している。手法としては、クビフリンで刺激した卵巣から培養液中に2次物質が漏出してくると考え、摘出した卵巣をクビフリンと共に培養した後に培養液(卵巣容量と等容の培養液を用いる)を回収し、その中に含まれる2次物質を単離・精製する計画である。これまでの先行研究から、その含有量は極めて低いと予想されており、十分量の培養液を集める必要がある。昨年度の予備的な解析を参考に、数リットル程度の培養液を収集する実験を進めている。現在、2リットル程度の培養液が蓄積できた。本年度末に入手できたマナマコ(約130匹)の卵巣発達度が不十分で、今期に予定した培養液の収集が不足する可能性を懸念している。収集した培養液からの2次物質の精製は26年度に進める予定である。卵成熟機構を考える上で、卵母細胞の肥大成長を支える卵黄形成の仕組みを明らかにすることも重要である。マナマコでは、既に2種類の卵黄蛋白質(MYP)遺伝子が明らかにされ、各々の蛋白質の発現も確認されている。本研究では、MYPの卵巣への輸送に関わると思われる体腔液中の微小な小胞の存在を明らかにした。また、体壁を構成する可溶性蛋白質の主成分がMYPから構成されることも明らかにした。MYPの産生組織はまだ特定できていないが、小胞を介した体腔内輸送機構の存在と体壁が貯蔵器官として働いている可能性を明らかにした。マナマコの卵黄蛋白質輸送機構の解明に繋がる新たな発見である。以上の2点から、おおむね順調に進展していると判断した。クビフリン分泌の下流で働いて、卵成熟・排卵を誘導するホルモンカスケードの内、排卵を司る生理活性ペプチドを発見する事ができた。様々な動物を用いたこれまでの長い卵成熟研究史において、排卵を誘発する生理活性ペプチドの存在の可能性は予想されていたかも知れないが、本研究で示されたように、「卵成熟の開始の有無に関わらず、未成熟な卵も含めて、それらの排卵のみを誘発する」ことは全く新奇の発見であった。