hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
細胞分化における細胞間相互作用の変換機構

多細胞生物の細胞分化や組織形成は、自律的なプログラムに加えて、細胞間相互作用に依存したプログラムをもつ。本研究では、個体レベルの研究や分子遺伝学的アプローチに重点をおき、いくつかの細胞系譜について細胞分化・組織形成過程における細胞間相互作用とその質的な変換・分子機構を解明し、形態形成における役割を明らかにすること、そして細胞間相互作用を細胞分化や組織形成のなかで動的に捉えることにより、形態形成の仕組みに、新しい概念を加えることを目指した。とりまとめにあたっては、細胞分化や組織形成を誘導・制御する仕組みとして鍵となるいくつかの遺伝子を明らかにするとともに、次のような観点での討論をおこなった。また、公開シンポジウム・公開レクチャーの開催により、他分野の方々も交えた討論により議論を深めた。1)細胞分化に必要なnicheへの移動とそのプロセスに関与する細胞間シグナリングの存在2)組織形成の方向性や極性を規定する隣接組織からのシグナルの存在3)細胞の分化・遊走・組織形成に必要な細胞間シグナルの膜型から可溶型への変換や接着性の変化とそのプロセスにおけるADAMファミリーの役割4)組織形成、とりわけ上皮組織の再編における接着因子の細胞局在や強度の変化とそれを制御する様々な遺伝子の存在5)上皮組織構築や上皮分化の制御に必要な接着装置複合体形成6)分化できない細胞を殺す仕組み多細胞生物の細胞分化や組織形成は、自律的なプログラムに加えて、細胞間相互作用に依存したプログラムをもつ。1)細胞分化に必要なnicheへの移動とそのプロセスに関与する細胞間シグナリングの存在2)組織形成の方向性や極性を規定する隣接組織からのシグナルの存在3)細胞の分化・遊走・組織形成に必要な細胞間シグナルの膜型から可溶型への変換や接着性の変化とそのプロセスにおけるADAMファミリーの役割4)組織形成、とりわけ上皮組織の再編における接着因子の細胞局在や強度の変化とそれを制御する様々な遺伝子の存在5)上皮組織構築や上皮分化の制御に必要な接着装置複合体形成6)分化できない細胞を殺す仕組み我々は、筋形成にかかわる膜分子のスクリーニングの中で、ADAMプロテアーゼメルトリンα、β、γの遺伝子クローニングに成功し、その形態形成における役割を探ってきた。これまでに、これらが膜型プロテアーゼとして膜型ErbBリガンドの切断活性化を担うこと、ノックアウトマウス作成によりメルトリンαは骨格筋のみならず脂肪組織の形成にもかかわることなどを明らかにしてきた(Kurisaki et al., Mol Cell Biol., 2003).また、メルトリンβが心臓形成にかかわること、そして心内皮の分化にかかわることを明らかにした。メルトリンβノックアウトマウスは、その大部分が生後間もなく死んでしまうが、生き延びるものに関しては、Fallot四徴症の症状を示すことを見い出した(Kurohara et al. Developmental Biol. 2004)。Fallot四徴症は、極めて頻度の高い心疾患であるが、本モデルマウスで見られる神経系における異常や、心ドップラーエコーによる検討から得られつつある知見などを手がかりに、今後、人の疾患とのかかわりをさらに追求していきたい。本研究は、ADAMファミリーに属するメルトリン遺伝子群の関わる細胞間相互作用の解明を目的とする。1)メルトリンα遺伝子の役割まず、メルトリンα遺伝子欠損マウスを作成し、解析を行った。現在,BALB/c,C3H/He,C57BL6の3系統に戻し交雑を行って解析を行っている。いずれの系統(n=8)でもホモ個体の4050%が出生前に胎内で死亡することが明らかになった。また、成体の筋肉ではメルトリンは発現していないが,筋破壊後の再生過程では,再生部位に一過的にメルトリンαの発現が誘導されることを見いだした。2)メルトリンβ遺伝子の役割メルトリンβは発生過程において後根神経節など末梢神経の生ずる領域で発現が活性化されることを蛋白レベルで確認した。そして、メルトリンβのメタロプロテアーゼドメインが、神経分化にかかわる細胞膜貫通型増殖因子の膜型から可溶化型への変換に関わっている事を見い出した。一方、マウスメルトリンβ遺伝子を単離し、ES細胞を用いた遺伝子ノックアウトマウスを作成中である。現在、hoterozygoteが得られている。本年度は、メルトリンα・β遺伝子のノックアウトマウスの作成・解析を中心とする研究成果を得た。まず、メルトリンα遺伝子に関しては、筋形成不全を見い出した。特に、上半身の筋肉を中心とする筋萎縮と、おそらくそれに付随すると思われる骨の異常がみられることがわかった。次に、メルトリンβ遺伝子ノックアウトマウスを作成し、その解析をおこなった。このノックアウトマウスは、新生仔の段階で8090%が死んでしまうことがわかった。

詳しい解析から、これらのマウスでは心臓の心室中隔欠損がみられ、現在、これが致死の原因であると考えているが、その他の表現型に関して現在検討中である。このメルトリンβ遺伝子のノックアウトマウスの表現型や発生過程における発現パターンの類似性から、神経筋接合部の形成や神経分化に関与することが知られる細胞膜貫通型増殖因子ニューレギュリンが、メルトリンβの基質となりうる可能性が考えられたので検討した。その結果、ニューレギュリンのプロセシングが野生型メルトリンβを共発現する事により増強し、プロテアーゼ活性を持たない変異型メルトリンβを共発現すると抑制されること、細胞表面のニューレギュリンの発現が、野生型メルトリンβの共発現によって消失すること、などから、メルトリンβがニューレギュリンのプロセシング、すなわち蛋白分解による膜型から可溶化型への変換に関わっている事を示した。本研究は、ADAMファミリーに属するメルトリン遺伝子群の関わる細胞間相互作用の解明を目的とする。本年度は、メルトリンα・β遺伝子のノックアウトマウスの解析、新規ADAMのクローニング、メルトリンプロテアーゼ制御機簿を中心とする研究成果を得た。まず、メルトリンα遺伝子に関しては、ノックアウトマウス作成により、筋形成のみならず脂肪組織の形成にも関与することを見い出した。これは、筋に接する褐色脂肪組織の形成であることから、これら組織の形成に共通した機構にメルトリンαが関与することを示唆する。次に、メルトリンβ遺伝子ノックアウトマウスを作成し、その解析をおこなった。このノックアウトマウスは、新生仔の段階で8090%が死んでしまうことがわかった。詳しい解析から、これらのマウスでは心臓の心室中隔欠損がみられ、メルトリンβが、心臓に遊走する神経冠細胞で発現し、それが心内膜の形成に必要であることがわかった。現在、そのメカニズムやその他の表現型に関して検討中である。一方、このメルトリンβプロテアーゼが神経筋接合部の形成や神経分化に関与することが知られる細胞膜貫通型増殖因子ニューレギュリンのプロセシング、すなわち蛋白分解による膜型から可溶化型への変換に関わっている事は昨年度報告した。本年度はその知見をもとに、メルトリンβのプロテアーゼがどのように制御されているかを検討した。また、発生過程で興味深い発現を示す新規ADAM遺伝子をクローニングすることに成功した。現在その機能に関する研究を行っている。主にメルトリシα・メルトリンβ遺伝子9ノックアウトマウスの作成とその解析をおこない、メルトリンαは骨格筋形成および脂肪組織の形成に(Kurisaki et al. Mol. Cell Biol.2003)、メルトリンβは心臓形成・骨格筋形成・神経形成にかかわること(Kurohara et al. submitted)などを明らかにし、その公表に漕ぎ着けたところである。
血液細胞分化の転写因子スイッチにおける転写仲介因子の役割

遺伝子ターゲッティング実験により、造血幹細胞/前駆細胞の未分化な状態を維持する上で必須な転写因子のひとつとしてc-mybが、赤血球・巨核球へと分化していくために必要な転写因子のひとつとしてGATA-1が明らかになっている。この二つの転写因子はともにCBPをコアクチベーターとして利用するが、共通のコアクチベーターを利用することがどのような生理的役割を持つのかは不明であった。そこで、GATA-1、c-MybおよびCBPの相互作用を生化学的、機能的に解析し、血液細胞分化、特に赤血球細胞への分化における遺伝子発現調節機構を解明することを試みた。まず、GATA-1とc-Mybとが相互作用するかどうかをレポーターアッセイにより調べたところ、GATA-1とc-Mybとは互いの転写活性化能を抑制しあうことがわかった。この両転写因子の相互抑制の機構を調べるために試験管内結合実験を行った結果、CBPにおけるGATA-1の結合ドメインとc-Myb結合ドメインとがオーバーラップしているため、共通のコアクチベーターCBPに競合的に結合して、GATA-1とc-Mybのいずれか一方しかCBPを利用できないことか相互抑制の原因の一つであることが明らかとなった。また、MEL細胞を用いた遺伝子の強制発現実験において、CBPのC-Myb結合ドメインはDMSOによる分化誘導を促進し、GATA-1結合ドメインは抑制した。以上の結果は、分化の進行に従って順次発現してくる転写調節因子が相互に転写活性化能を抑制しあうことが正しい遺伝子発現に寄与していることを示唆している。すなわち、転写調節因子は分化段階の前後で発現する別の転写調節因子が誤って転写開始複合体に組み込まれ不適当な遺伝子発現が起きないようにする蛋白-蛋白相互作用が存在し、これが安全装置のように機能していると考えられる。
選択的内耳機能外科の開発に関する研究

モルモットを用いて半規管にアルゴンレーザーを照射して形態学的、生理学的変化を観察した。モルモットにネンブタールを腹腔内に注射し、麻酔下に中耳胞を開放し外側半規管にレーザーを照射した。外側半規管を選んだ理由は照射後の機能を温度眼賑反応で検査することができるためである。照射は200μm径のグラスファイバーを通して行われた。ファイバーの先端は照射野より0.5-1mm離し、1回に出力1.0W、照射時間0.5秒で行った。照射面積は0.0810.16mm^2、パワー密度は12.36.41W/mm^2、照射エネルギーは0.4980.513Jouleであった。照射後30日を経過して温度眼振検査を行うと照射前には正常にみられた反応が、みられないことが判明した。この際の外側半規管の形態学的変化をみると、前、後半規管は正常であること、外側半規管は照射野に限局して、エネルギーの少ない場合は膜半規管の収縮、および半規管の骨内膜に接して線維化が生じていること、またエネルギーが大きい場合は照射部位の半規管管腔が骨生に閉塞することが判明した。エネルギーの大小にかかわらず外側半規管が照射されると温度眼振反応が生じない。後半規管を照射した場合は同様な形態的学変化が生じても温度眼振反応は正常にみられることも判明した。半規管を照射した場合に蝸牛にどのような変化がおこるのか、蝸牛について形態学的に観察したが、照射1回-80回でも蝸牛は正常に保たれていた。またABRにより外側半規管照射の聴力に及ぼす影響をみたが、外半規管に1回1.0W×0.5秒を80回照射を行ってもABRには何ら影響をおよぼさないことが判明した。
合衆国東海岸都市部におけるイスラム系移民の文学・文化活動

本研究の出発点はアジア系アメリカ文学研究の一環としてパキスタン系、ムスリム系アメリカンについての作品を発表してきたAkhtar研究にあった。期間中の発表はAkhtar作品について中心的に行い、ムスリム系アメリカン、なかでも、そのジェンダーイシューに焦点を当てた。Akhtarはピューリツァー賞受賞作Disgracedの他、ムスリムに関する劇作を二点出版しており、ムスリム系アメリカンについて小説American Dervishも出版している。本期間中、これら計四作品全てについて発表または論文執筆した。Akhtar研究が現代演劇研究に繋がり、Vogel作品、Yazbek作品にも本課題に関連する要素を見出し発表した。更にムスリム系アメリカンををテーマにした最新作品を追い、ムスリム系、アラブ系アメリカ文学の領域では、同時多発テロ以降の度重なるテロにより先鋭化の一途をたどるアラブ系、ムスリム系、パレスチナ系移民の苦境は、むしろ文学・文化活動を活発化させ続けていることが明らかになった。ただし問題を更に複雑にしているのは、アラブ系、ムスリム系、パレスチナ系移民の間には確執と支援関係が同時に存在し、それが文学作品や、作家、アーティスト他、文化関係者による文芸活動にも少なからず反映されていることである。文芸誌についてはBanipalとMiznaに収録された作品を追うことにより最新作品の動向を確認できた。単行本として発表された作品ではEl Khalil作品、Alameddine作品、Alyan作品、また劇作についてはレバノン出身のKaram作品のほか、El Guindi作品、パレスチナ系のShamieh作品などを入手した。合衆国東海岸都市部のほか、2018年にはベイルートを中心にレバノンを訪れたが、上記諸領域の内、主にパレスチナ系アメリカン作品の背景について新たな知見を得る結果となった。ムスリム系アメリカンについての研究にあたり、南アジア系をめぐる諸問題やポストコロニアル状況についても研究する必要があり、本研究者の研究成果である南アジア系に関する研究を発展させるためにも英語圏文学としての英文学作品分析にも着手した。マードック作Jackson's Dilemmaにおける南アジア系出身と見られる主人公のディアスポラ状況とポストコロニアル状況について論文「ディアスポラとしてのジャクソンがもたらす攪乱と解放」を出した。Banipul編集者Khachan氏の薦めでレバノン出身Zena El KhalilのBeirut, I love You: Memoir以外の作品"May Rose"(内Beirut Noir)とレバノン内戦を題材にしたSalma Abdelnour作品を入手した。Banipulを評した「『バニパル』が拓く現代アラブ文学」が掲載されている入手不可能となっている『すばる』2014年12月号を一冊とBanipulシリア出身作家特集号を同氏より譲り受けた。29年度研究計画欄に記したYussef El Guindiの脚本Back of the ThroatをNYの演劇関係書専門店で入手した上、El Guindiの他三作品、30年度研究計画欄に記したアラブ系アメリカン最新文学作品、中でもパレスチナ系アメリカンの最新文学作品(Betty Shamieh作)等々も同書店で入手した。研究実績の概要に記したように、最新作品の入手については予定よりかなり早く多くの作品を入手することができた。しかし、28年度中にAyad Akhtarについての論文を1点所属機関以外の学会に投稿したものの12月末に不採用通知を受け取ったため、28年度中にAkhtarについての論文を発表するという目標には到達できなかった。しかし、口頭発表については予定通り日本アメリカ演劇学会でAkhtarの三作品について発表した上、この発表が当初予測していなかった現代演劇研究会への入会につながり、更に現代演劇研究会で入会後一年以内に29年度12月に日本ではまだ研究事例のないAkhtar作品The Invisible Handについて発表する予定が決まったことも予測していなかった発展である。また、12月に多民族研究学会参加時に創設者の一人で日本アメリカ演劇学会での本研究者の発表を9月に聞いた方より多民族研究学会でも発表するよう薦められたことも予想外の発展であった。上記五点を総合的に判断すると「区分(3)やや遅れている」に当たると考える。研究発表:2015年11月英米文化学会での発表を基に恵泉女学園大学紀要論文としてAkhtarの悲劇Disgracedと喜劇The Who & The Whatについて合わせて論じたものを発表した。12月には現代演劇研究会でAkhtarのThe Invisible Handについて発表した。最新作品情報の入手は予想以上に順調で急速に進展している。ムスリム系、アラブ系、パキスタン系アメリカンの生活や状況をテーマにしたムスリム系、アラブ系、パキスタン系アメリカンの作家による作品に関して近年および最新の作品の入手、観劇、情報収集がきわめて順調である。特に実績の概要に記したようAyad Akhtarの最新作品、またHammaad Chaudryのデビュー作の観劇のため本務校の授業担当に全く抵触しない日程で渡米できたことは最大の幸運であった。小説や観劇がかなわなかった演劇作品の脚本については入手はかなり順調である。今後それらの精読について更に進めていく。研究発表についてはおおむね順調であった。本務校の紀要論文にAkhtarの悲劇Disgracedと悲劇The Who & The Whatについて発表したことは、当初より集中的に進めてきたAkhtar研究をまとめた点で意義が大きかった。ただし本務校の紀要論文として発表するにとどまったことは今後の課題として残った。しかしながらAkhtar作品でオフブロードウェイNew York Theatre Workshopでも上演されたThe Invisible Handが現代演劇研究会で注目されたことと、これについての発表するよう求められ12月に行ったことはきわめて有意義であった。その例会の参加者であった他研究者らより啓発されるコメントを多く受けることができ、同研究会ではAkhtar研究第一人者として評価された。

本研究の出発点はアジア系アメリカ文学研究の一環としてパキスタン系、ムスリム系アメリカンについての作品を発表してきたAkhtar研究にあった。期間中の発表はAkhtar作品について中心的に行い、ムスリム系アメリカン、なかでも、そのジェンダーイシューに焦点を当てた。Akhtarはピューリツァー賞受賞作Disgracedの他、ムスリムに関する劇作を二点出版しており、ムスリム系アメリカンについて小説American Dervishも出版している。本期間中、これら計四作品全てについて発表または論文執筆した。Akhtar研究が現代演劇研究に繋がり、Vogel作品、Yazbek作品にも本課題に関連する要素を見出し発表した。更にムスリム系アメリカンををテーマにした最新作品を追い、ムスリム系、アラブ系アメリカ文学の領域では、同時多発テロ以降の度重なるテロにより先鋭化の一途をたどるアラブ系、ムスリム系、パレスチナ系移民の苦境は、むしろ文学・文化活動を活発化させ続けていることが明らかになった。ただし問題を更に複雑にしているのは、アラブ系、ムスリム系、パレスチナ系移民の間には確執と支援関係が同時に存在し、それが文学作品や、作家、アーティスト他、文化関係者による文芸活動にも少なからず反映されていることである。文芸誌についてはBanipalとMiznaに収録された作品を追うことにより最新作品の動向を確認できた。単行本として発表された作品ではEl Khalil作品、Alameddine作品、Alyan作品、また劇作についてはレバノン出身のKaram作品のほか、El Guindi作品、パレスチナ系のShamieh作品などを入手した。合衆国東海岸都市部のほか、2018年にはベイルートを中心にレバノンを訪れたが、上記諸領域の内、主にパレスチナ系アメリカン作品の背景について新たな知見を得る結果となった。変化発展した点は、日本アメリカ演劇学会での発表を機に現代演劇研究会に入会し、後者における研究に携わるようになったことである。後者においても、中東系アメリカンの諸作品とテーマ(中でもジェンダーのイシュー)を中心に研究を進める予定は今後も変わらない。29年度12月には同研究会において日本ではまだ研究事例がないAkhtar作品The Invisible Handについて発表することが決まっている。これに先立ち29年度9月渡航時にAkhtarにインタビューできれば望ましいが、劇作家に直接インタビューすることについては同研究会に経験者がいるので参考にしたい。課題は所属機関紀要以外の学会誌に掲載される論文の執筆に励み続けることである。
穿刺型超音波マイクロプローブによる深部組織の高分解能イメージングと組織性状診断

本研究では,穿刺型超音波マイクロプローブと,これを用いて生体深部組織の超音波断層像を取得するシステムを開発するとともに,生体組織の超音波減衰を測定することによる組織性状診断の可能性について検討し,以下の成果を得た.・穿刺型超音波マイクロプローブと画像取得システムの開発:16-20ゲージの留置針の先端に,0.8-1.0mm×1.2mm,中心周波数20MHz程度の超音波振動子を搭載したマイクロプローブを開発し,さらにこのプローブを機械的にスキャンして約6秒で2次元の超音波画像を取得できる画像取得システムを開発した.また,これを用いてウサギ肝臓の断層像を取得するin vivo実験を行い,本手法の有用性を確認した.・相関法による組織血流計測法に関する検討:生体深部の微小組織血流の検出を目的として,本研究室で従来から検討を行ってきた相関法の本手法への適用について検討し,微小血管ファントムおよびブタ腎臓を用いたin vitro実験を通じて,0.35mm程度の微小な流れを検出できることを確認した.また,ウサギを用いたin vivo実験でも,血流検出可能性を検討した.・複合共振型振動子を用いた減衰計測と生体組織の減衰機序の検討:生体組織の減衰特性から組織性状の変化を診断することを目的として,複合共振型振動子を用いて,5-40MHzの広い帯域で生体組織の減衰を計測するシステムを開発し,種々の生体組織の減衰を測定した.また,生体組織の性状と減衰特性の関連を明らかにすることを目的として,生体組織の減衰機序に関する検討を行ない,生体組織の減衰特性が,蛋白質や水などの生体構成物質自体の減衰と,筋繊維などのマクロな構造による減衰によって決定され,組織の基本構造である細胞構造の影響は比較的小さいことを示した.本研究では,穿刺型超音波マイクロプローブと,これを用いて生体深部組織の超音波断層像を取得するシステムを開発するとともに,生体組織の超音波減衰を測定することによる組織性状診断の可能性について検討し,以下の成果を得た.・穿刺型超音波マイクロプローブと画像取得システムの開発:16-20ゲージの留置針の先端に,0.8-1.0mm×1.2mm,中心周波数20MHz程度の超音波振動子を搭載したマイクロプローブを開発し,さらにこのプローブを機械的にスキャンして約6秒で2次元の超音波画像を取得できる画像取得システムを開発した.また,これを用いてウサギ肝臓の断層像を取得するin vivo実験を行い,本手法の有用性を確認した.・相関法による組織血流計測法に関する検討:生体深部の微小組織血流の検出を目的として,本研究室で従来から検討を行ってきた相関法の本手法への適用について検討し,微小血管ファントムおよびブタ腎臓を用いたin vitro実験を通じて,0.35mm程度の微小な流れを検出できることを確認した.また,ウサギを用いたin vivo実験でも,血流検出可能性を検討した.・複合共振型振動子を用いた減衰計測と生体組織の減衰機序の検討:生体組織の減衰特性から組織性状の変化を診断することを目的として,複合共振型振動子を用いて,5-40MHzの広い帯域で生体組織の減衰を計測するシステムを開発し,種々の生体組織の減衰を測定した.また,生体組織の性状と減衰特性の関連を明らかにすることを目的として,生体組織の減衰機序に関する検討を行ない,生体組織の減衰特性が,蛋白質や水などの生体構成物質自体の減衰と,筋繊維などのマクロな構造による減衰によって決定され,組織の基本構造である細胞構造の影響は比較的小さいことを示した.平成10年度においては,穿刺型超音波プローブ開発のための要素研究として下記の項目について検討を行った.●複合共振型振動子を用いたin vitro減衰計測装置の改良:申請者らが既に開発した5-40MHz帯域での生体組織減衰計測システムの広帯域化に関する検討として,発振周波数帯域を100MHzにまで拡張した複合共振型振動子を用いた減衰計測システムを構築した.これを用いた計測の結果,高い周波数領域での減衰が大きいことがら,実用的な計測帯域は10MHzから70MHz程度の範囲であった.また,従来の減衰測定システムでは,広帯域な減衰計測が可能な反面,低周波域では測定すべき減衰量が小さいために計測精度が低下していた.そこで,中心周波数5MHz,10MHzの2つの広帯域超音波振動子をさらに用いるとともに減衰測定の手順について検討を行い,低周波数帯域での減衰の計測精度の向上を図った.以上の検討により,高い精度で計測できる帯域が3MHz-70MHzに拡大された.●相関法による血流計測法の組織血流計測への拡張:血管内の血流や組織のエコーに比べて非常に小さい組織血流のエコーを検出するために,12bt精度のAD変換基板を導入し,これを用いた高精度超音波IF信号収集システムを作成した.また,微小血流の検出能検討のため,微小血管の血流を模擬するファントムを作成した.ファントムおよびブタ肝臓を用いて,相関法による血流検出能について検討したところ,微小欠陥血流の検出は可能であったが,明瞭かつ高い空間分解能の相関像を得るためには,さらにS/N向上のための検討が必要と考えられた.

平成11年度においては,穿刺型超音波プローブを用いた計測に関する要素研究として下記の項目について検討した.・生体組織の減衰計測と機序の解明:減衰特性の周波数依存性を決定するメカニズムに関する検討として,生体組織の減衰が生体の主構成要素である水溶性タンパク質と,細胞や繊維構造のようなマクロな構造の両方で決定されると仮定し,肝臓組織をタンパク質抽出液とそれ以外の部分とに分離して減衰を測定した.その結果,周波数10MHz付近を境界として,高周波域ではタンパク質水溶液の減衰が,低周波域では,それ以外のマクロな構造を持つ成分の減衰が支配的になることが示された.また,生体組織の後方散乱特性に関する検討のためのシステムとして,中心周波数50MHzの広帯域振動子を用いた計測システムを作成した.・相関法による血流計測法の組織血流計測への拡張:昨年度の課題であった相関像の改善を目的として,超音波送受信回路の改善を行なうとともに,Bモード,相関像作成のための超音波信号処理法を改善した.ブタ腎臓を用いてin vitroで画像の取得を行い改善効果を確認した上で,次にウサギの肝臓を対象にin vivoでの超音波像の取得を行った.その結果,肝臓の微小な血管と思われる像が観察されたものの,アーチファクトである可能性も残されており,さらにS/N改良のための検討が必要と考えられた.・超音波プローブの作成:微小プローブの作成に関して調査を行ない,穿刺型プローブに最適な数10MHz帯域の微小振動子を作成している米国企業が判明したことから,今後この振動子を利用したプローブの作成および評価を行う予定である.本年度は,穿刺型超音波マイクロプローブを用いたイメージング手法に関し,以下の検討を行った.1.生体組織の減衰機序の解明:細胞構造が超音波減衰に与える影響生体組織の基本構成要素である細胞が超音波の減衰特性に与える影響について検討するため,赤血球を用いて作成した試料の超音波減衰特性を計測した.その結果,赤血球を生理食塩水に浮遊させた試料では,赤血球内に含まれるヘモグロビン水溶液が示す減衰特性(減衰係数が周波数の1.3乗に比例して増加する特性)と異なる減衰特性を示したのに対し,赤血球のみを取り出した試料,すなわち一般の生体組織のように細胞が密接した試料では,ヘモグロビン水溶液と同様,減衰係数が周波数の1.3乗に比例して増加する特性を示した.これより,生体組織の減衰特性は,主として細胞を構成している物質自体の特性を強く反映する一方,細胞の構造自体の影響は小さいのもと考えられた.2.穿刺型プローブを用いた画像取得システム:in vivoでの実用性の向上これまでに開発した画像取得システムでは,2次元の画像を取得するために振動子をパルスモー夕によりスキャンしており,画像データの取得に60秒,相関像の計算に60秒程度の時間を要したことから,体動を考慮する必要があるin vivoでの実用性に問題があると考えられた.そこで,新しい画像取得システムでは振動子を手動でスキャンし,リニアエンコーダを用いて移動量を検出して超音波パルスを発生する方式を採用し,さらにデータ収集の制御ソフトと信号処理アルゴリズムを改善することにより,画像データの取得時間を3秒,相関像計算に要する時間を3秒程度に短縮した.さらに,本システムを用いてウサギを用いたin vivo実験を行い,穿刺型超音波マイクロプローブによるイメージングの実用性が格段に向上することを確認した.
クロマトグラフィーによる魚油グリセロ脂質の光学分割

イコサペンタエン酸(EPA)やドコサヘキサエン酸(DHA)など薬効・薬理作用のある高度不飽和脂肪酸を含む魚油グリセロ脂質(骨格としてのジアシルグリセロール)の光学異性体分離法を確立するために本研究を計画した。昨年度は、高度不飽和酸(リノール酸,リノレン酸,アラキドン酸,EPAおよびDHA)含有ジアシルグリセロール(DG)のラセミ体を微生物リパーゼを用いて合成し、これを光学活性カラムを装備したHPLC(キラル相HPLC)により光学分割する方法を確立した。本年度はこの方法を食用となる代表的な魚貝類(サンマ、カツオ、マグロ、イワシ、サケ、サバ、ウニ、ホタテ)のグリセロ脂質(リン脂質およびトリアシルグリセロール構成DG)に適用し、高度不飽和酸を含む光学異性体混合物の分離を検討した。はじめに、上記海産動物油よりトリアシルグリセロール(TG)とホスファチジルコリン(PC)を分離し、TGからはグリニヤール分解により、PCからは蛇毒由来ホスホリパーゼCを用いてそれぞれsn-1,2(2,3)-DGを調製した。これを3,5-ジニトロフェニルウレタン誘導体に変換したのち、キラルカラムを用いてさまざまな条件下でHPLC分析した結果、カツオ、マグロ、イワシ、ホタテのTGについては、sn-1,2-とsn-2,3-DGのエナンチオマー混合物がほぼ完全に分離され、光学純度ほぼ100%の各エナンチオマーを分画することができた。PCについてはsn-1,2-エナンチオマーのみが容易に得られた。これにGLCを併用してさらに詳細なエナンチオマー組成を求めることが可能であることを明らかにした。長鎖モノエン酸を多く含むサンマ、サケ、ウニのTG構成DGについても概ね良好なエナンチオマー分離が得られた。以上の結果より、高度不飽和酸含有魚グリセロ脂質の光学分割法として簡便で精度の高いキラル相HPLC法を確立にした。この方法は脂質加水分解酵素リパーゼの立体選択性決定にも有用であることを示した。魚油に含まれるイコサペンタエン酸(EPA)やドコサヘキサエン酸(DHA)など薬効・薬理作用のある高度不飽和脂肪酸は、生体内では通常トリグリセリドやリン脂質(グリセロ脂質)の形態で存在する。したがって、これら脂肪酸の生体内での役割を明らかにするためには光学異性体を区別して分子種レベルで研究されねばならないが、光学異性体を区別する高感度かつ実用的な方法は開発されていない。このため、本研究ではクロマトグラフィー(HPLCおよびGLC)による魚油グリセロ脂質(骨格としてのジグリセリド)の光学分割法の開発を試みた。平成4年度では、高度不飽和酸(リノール酸,リノレン酸,アラキドン酸,EPA,DHA)含有ジグリセリド(DG)を微生物リパーゼ(Candida cylindracea)を用いて合成し、これらを市販の光学活性カラムを装備したHPLC(キラル相HPLC)により光学分割する方法を検討した。その結果、EPA,DHAなど高度不飽和酸を含むDG(sn-1,2-およびsn-2,3-)は飽和およびモノエン酸含有DGと同様に短時間で完全に光学分割され、光学純度ほぼ100%の高度不飽和酸含有DGエナンチオマーを得ることができた。現在、得られたDGエナンチオマーを極性キャピラリーカラムを装備したGLCによって分析する方法を検討している。

平成5年度は、この方法を食用となる代表的な魚種(イワシ、サバ、ウニなど)のグリセロ脂質(トリグリセリドおよびリン脂質由来のDG)に適用し、光学純度ほぼ100%のエナンチオマー(sn-1,2-およびsn-2,3-ジグリセリド)を得たのち、両エナンチオマーを極性キャピラリーカラムを用いるGLC(極性GLC)によって分析し、各エナンチオマーの分子種組成を詳細に求める方法を確立する。イコサペンタエン酸(EPA)やドコサヘキサエン酸(DHA)など薬効・薬理作用のある高度不飽和脂酸を含む魚油グリセロ脂質(骨格としてのジアシルグリセロール)の光学異性体分離法を確立するために本研究を計画した。昨年度は、高度不飽和酸(リノール酸,リノレン酸,アラキドン酸,EPA,DHA)含有ジアシルグリセロール(DG)のラセミ体を微生物リパーゼを用いて合成し、これを光学活性カラムを装備したHPLC(キラル相HPLC)により光学分割する方法を確立した。本年度はこの方法を食用となる代表的な魚貝類(サンマ、カツオ、マグロ、イワシ、サケ、サバ、ウニ、ホタテ)のグリセロ脂質(リン脂質およびトリアシルグリセロール構成DG)に適用し、高度不飽和酸を含む光学異性体混合物の分離を検討した。はじめに、上記海産動物油よりトリアシルグリセロール(TG)とホスファチジルコリン(PC)を分離し、TGからはグリニヤール分解により、PCからは蛇毒由来ホスホリパーゼCを用いてそれぞれsn-1,2(2,3)-DGを調整した。これを3,5-ジニトロフェニルウレタン誘導体に変換したのち、キラルカラムを用いてさまざまな条件下でHPLC分析した結果、カツオ、マグロ、イワシ、ホタテのTGについては、sn-1,2-とsn-2,3-DGのエナンチオマー混合物がほぼ完全に分離され、光学純度ほぼ100%の各エナンチオマーを分画することができた。PCについてはsn-1,2-エナンチオマーのみが容易に得られた。これにGLCを併用してさらに詳細なエナンチオマー組成を求めることが可能であることを明らかにした。長鎖モノエン酸を多く含むサンマ、サケ、ウニのTG構成DGについても概ね良好なエナンチオマー分離が得られた。以上の結果より、高度不飽和酸含有魚油グリセロ脂質の光学分割法として簡便で精度の高いキラル相HPLC法を確立した。この方法は脂質加水分解酵素リパーゼの立体選択性決定にも有用であることを示した。
腎臓に存在するリン応答性転写調節因子の同定

生体におけるリン恒常性維持の分子メカニズムの解明は、骨粗鬆症および家族性低リン血症や腎性骨異栄養症などの電解質代謝異常症の病態解明において極めて重要である。血中の無機リン酸濃度は、腎近位尿細管におけるNa^+/リン酸共輸送担体による再吸収機構を、無機リン酸自身あるいは種々のホルモンが調節することにより維持されているが、その詳細な分子機構は明らかにはなっていない。本研究では、前年度の成果に基づき、無機リン酸により遺伝子発現調節を受けるヒトNa^+/リン酸共輸送担体遺伝子の転写調節領域における細胞外リン酸レベルに応答するシスエレメント(リン応答配列)に結合するリン応答性転写調節因子の同定行った。酵母のONE-HYBRID法を用い、マウス腎臓のcDNAライブラリーをスクリーニングした結果、NaPi-3遺伝子の5'-転写調節領域に存在する5′-CACGTG-3'に結合する転写因子としてすでに同定されていたUSF-1とTFE3の2つの遺伝子をクローニングすることができた。これらの組織特異的発現パターンを検討したところ、TFE3が腎臓で強く発現したことからその機能についてさらに検討した。ルシフェラーゼアッセイの結果、TFE3は、NaPi-3遺伝子の発現を促進させた。さらにゲルシフトアッセイの結果、TFE3は、細胞外リン濃度低下に伴い結合の増加したDNA-蛋白複合体の一部を担うものであることが明らかとなった。今後、細胞外リン濃度の変化がどのようなシグナルを介して転写を調節しているのかということについて検討を進めていく予定である。本研究では、無機リン酸により遺伝子発現調節を受けるヒトNa^+/リン酸共輸送担体遺伝子の転写調節領域における細胞外リン酸レベルに応答するシスエレメント(リン応答配列)およびリン応答性転写調節因子の同定を目的とした。ルシフェラーゼアッセイおよびゲルシフトアッセイによる解析の結果、NaPi-3遺伝子の5'-転写調節領域に存在する5'-CACGTG-3'に細胞外リン濃度の低下に応じて結合が増加する結合因子の存在を確認した。さらに本領域に結合する蛋白質のサイズをUVクロスリンクアッセイにより解析したところ、約50kDaの蛋白質であった。この結合因子は、リン応答性の転写調節因子であると考えられ、また、酵母と同様の配列を認識したことから、おそらく真核生物間で保存されているリン応答因子である可能性が考えられた。現在、本結合因子の精製およびTWO-HYBRID法を用いたクローニングを進めている。
アミロイド前駆体蛋白質の軸索小胞輸送と神経変性誘発に関わる新規遺伝子

アミロイド前駆体蛋白質(APP)は家族性アルツハイマー病の原因遺伝子であり、アルツハイマー病発症機構に深く関与すると考えられているが、いかにしてその病態および発症機構に関与するのかという点において、未だに未解明の部分がある。本研究では、研究代表者が最近同定した、APPと遺伝学的に相互作用するショウジョウバエ新規遺伝子(yata遺伝子と名付けた)の解析を通じて、この問題にアプローチすることを目指した。yata変異体は神経変性および早期死亡の表現型を示すが、早期死亡の表現型は、神経細胞特異的なelavプロモーターの制御下でyata遺伝子を外来性に発現させることによつて、著明にレスキューされた。このことから、yata遺伝子の神経細胞における機能に生じた何らかの異常が、早期死亡の原因になっていることが示唆された。また、yata変異体の早期死亡の表現型は、ショウジョウバエAPP遺伝子(App1遺伝子)のヌル変異を二重変異としてさらに導入することによって増悪した。逆に、yata変異体でelavプロモーターの制御下でApp1を過剰発現させると、早期死亡の表現型に対してレスキュー効果を示した。また、遺伝学的解析からYATA遺伝子産物は、APPL、HIGなどのいくつかの膜・分泌蛋白質のトラフィッキングを調節する機能を有していることが示唆されたが、それら標的蛋白質の過剰発現によっても、レスキュー効果が観察された。これらのことから、yata変異体においては、APPおよび関連蛋白質のトラフィッキング異常の加算的効果によって神経病理と早期死亡が引き起こされていることが示唆された。本研究では、研究代表者が最近同定した、APPと遺伝学的に相互作用するショウジョウバエ新規遺伝子(仮称:517遺伝子)の解析を通じて、この問題にアプローチすることを目指した。517変異体は早期死亡の表現型を示すが、この表現型は、ショウジョウバエAPP遺伝子(Appl遺伝子)のヌル変異をヘテロまたはホモでさらに導入することによって、dose dependentに増悪した。また、517変異体では、タウのリン酸化の上流制御因子であるdab遺伝子の発現が減少しており、リン酸化抗体を用いたウェスタン解析によって、タウのリン酸化が昂進していることが示唆されている。外来性に発現した517-HA融合蛋白質の細胞内局在を、蛹期の脳において、抗HA抗体による免疫染色によって調べたところ、小胞体の辺縁部にドット状に局在し、その局在はcisゴルジのマーカーとはオーバーラップしなかった。現在、517遺伝子産物がAPPおよび関連蛋白質の小胞体からのトラフィッキングを制御し、このプロセスに異常が生じることによって、タウのリン酸化の昂進などによって神経機能が損なわれていくという仮説を、遺伝学的に検証していこうとしている。
X線CTを用いた地下人工き裂の変形挙動及び透水現象の可視化

本研究は、水圧破砕き裂の力学的挙動の分析ならびにき裂内流体の岩盤内への浸透現象の分析にX線CTを用いる点にある。すなわち、これまでボアホール壁面でのみ直接計測が可能であったき裂の力学的挙動、形状、き裂内流体の浸透の定量的評価を、対象領域全体に渡って分析することが可能になる点に大きな特徴がある。本年度は、「き裂内流体浸透現象の可視化」および「水圧破砕き裂の力学的挙動計測試験」を計画通りに実施した。その成果として、比較的ポーラスな岩石内部への流体の浸透量と浸透の分布をX線CTにより可視化した。また、X線CTデータにより透水係数の定量的評価を行うとともに、透水特性の流入圧依存性について分析を行った。また、本年度は空隙の少ない岩盤での透水現象の可視化には必要不可欠である造影剤の開発を実施した。その結果、動粘度が溶質濃度に依存しない造影剤を用いるトレーサー実験法を世界に先駆けて開発するとともに、従来困難であった飽和材料内部流れの可視化、並びに溶質の保存則に基づく速度場解析に成功した。水圧破砕き裂の力学的挙動計測については、画像間差分を応用した亀裂開口量の新たな評価方法を開発した。この方法は、亀裂内に流体が進入する前後での画像間差分を実施することにより岩石の不均質性を除去出来るという特徴を持ち、花崗岩のように比較的粒径の大きい不均質な岩石材料についても亀裂の変形挙動の計測が可能であることを明らかにした。これらの成果は、資源素材学会誌「資源と素材」に論文として発表する予定である。さらに、平成15年11月6日7日に熊本で開催する「X線CTの地盤工学への応用に関する国際ワークショップ」においても成果発表する予定である。X線CTにより岩石や土など地質材料の内部における力学的挙動ならびに透水現象の可視化を実施し、これまでボアホール壁面でのみ直接計測が可能であったき裂の力学的挙動,形状,き裂内流体の浸透の定量的評価に関する基礎実験を実施した。平成13年度は,まず,亀裂性岩盤の力学的挙動解析ツールの開発を実施した。さらに,岩盤内亀裂の力学挙動ならびに流体の浸透現象に関するX線CTデータについて,有効な画像処理技術を開発するとともに,実験結果の解釈に必要な理論を構築した。具体的には、まず,亀裂性岩盤の力学的挙動解析に関しては,均質化手法も用いた岩盤の変形特性ならびに亀裂進展プロセスを解析手法の開発を行った。これにより,従来は均質等方弾性体による解析とは異なり,岩盤内の亀裂の力学的干渉を考慮した解析が可能になった。これらの結果を基に,実際にX線CTによる人口亀裂の変形特性解析を実施する予定である。次に,時系列画像の差分と局所領域平滑化手法が、空隙構造、体積含水率の定量に有効な手段であることを示した。また、岩盤内おける液体の移動および岩石内部における亀裂の成長進展などの画像処理に有用な高度ソフトウエアを新たに開発した。さらに,岩盤内浸透流解析などに不可欠な透水係数など物性定数の評価の理論と実際を明らかにした。透水実験に関しては、他段階加圧法と呼ばれる新しい実験方法を開発し、一次元透水実験により得られる時系列投影の差分から透水係数と有効拘束圧の関係、並びに透水フロントにおけるマトリックスサクションの同時定量を可能にした。以上より、X線CTは岩盤力学のモデル実験に有用かつ有望な観測方法であり、亀裂や透水現象の定量的解析に利用できることが明らかになった。以上の研究成果については,早期に学会誌に論文報告する予定である.本研究は、水圧破砕き裂の力学的挙動の分析ならびにき裂内流体の岩盤内への浸透現象の分析にX線CTを用いる点にある。
静電気力を用いた超クリーン非接触搬送システム

半導体製造工程や,液晶ディスプレイ等の製造工程においては,ウェハ・ガラス板等の接触支持に起因する傷付きや塵埃微粒子の付着が,電極パターンの微細化に伴い,より大きな問題となってきている.また,特に液晶ディスプレイ等の薄型ディスプレイの分野においては,基板の大型化と薄型化に伴い,基板のたわみの問題から,従来方法よるハンドリングは困難になる一方である.そこで,本研究では,上記の問題を解決すべく,液晶ガラスやシリコンウェハ等の薄板状部材を,非接触で搬送するシステムを開発した.主要な成果としては,次の2点が挙げられる.(1)薄板状部材を非接触浮上ハンドリングチャックを開発した.電極面を細かい多数個の電極ユニットに分割し,各部局の浮上ギャップを対応する電極ユニットで制御することで,薄板状部材を静電気力で非接触浮上ハンドリングすることに成功した.これにより278mm×78mm×0.05mmのアルミ板を浮上ハンドリングできた.また,独特の電極形状を考案したことによって,絶縁体である385mm×130mm×0.7mmのソーダ石灰ガラス板を安定に浮上ハンドリングすることにも成功した.(2)空気浮上と静電気推進力を組み合わせて長距離搬送に向く搬送手法を開発した.従来の空気浮上では,搬送時の基板の揺れや,搬送開始・終了時の応答の遅さが問題とされていたが,静電気推進力と組み合わせることにより,これらの問題を解決することに成功した.上記(1)でも用いた独特の電極形状を利用することで,52mm×52mm×0.7mmのソーダ石灰ガラス板を,左右の揺れを±0.5mm以下に抑えながら,150mm/sの搬送速度で安定に直進搬送することに成功した.半導体製造工程や,液晶ディスプレイ等の製造工程においては,ウェハ・ガラス板等の接触支持に起因する傷付きや塵埃微粒子の付着が,電極パターンの微細化に伴い,より大きな問題となってきている.また,特に液晶ディスプレイ等の薄型ディスプレイの分野においては,基板の大型化と薄型化に伴い,基板のたわみの問題から,従来方法よるハンドリングは困難になる一方である.そこで,本研究では,上記の問題を解決すべく,液晶ガラスやシリコンウェハ等の薄板状部材を,非接触で搬送するシステムを開発した.主要な成果としては,次の2点が挙げられる.(1)薄板状部材を非接触浮上ハンドリングチャックを開発した.電極面を細かい多数個の電極ユニットに分割し,各部局の浮上ギャップを対応する電極ユニットで制御することで,薄板状部材を静電気力で非接触浮上ハンドリングすることに成功した.これにより278mm×78mm×0.05mmのアルミ板を浮上ハンドリングできた.また,独特の電極形状を考案したことによって,絶縁体である385mm×130mm×0.7mmのソーダ石灰ガラス板を安定に浮上ハンドリングすることにも成功した.(2)空気浮上と静電気推進力を組み合わせて長距離搬送に向く搬送手法を開発した.従来の空気浮上では,搬送時の基板の揺れや,搬送開始・終了時の応答の遅さが問題とされていたが,静電気推進力と組み合わせることにより,これらの問題を解決することに成功した.上記(1)でも用いた独特の電極形状を利用することで,52mm×52mm×0.7mmのソーダ石灰ガラス板を,左右の揺れを±0.5mm以下に抑えながら,150mm/sの搬送速度で安定に直進搬送することに成功した.静電気力を用いた非接触搬送システムの研究として,本年度は非接触浮上を他の方式で行い,搬送力を静電気によって得るような方式の研究を行った.まず,円形の薄板ガラスを超音波で浮上させ,静電気力を用いて回転形のモータを試作し実験を行った.電極を工夫することにより表面抵抗の大きい薄板ガラスを,誘導モータと同様の原理で回転させることができた.電極は小さいだ円が多数寄り集めたものとし,その電極に3相交流を印加することによって駆動した.小さいだ円を用いたのは表面抵抗の大きいガラスに早く電荷を集めるためと,電極の数を多くして駆動力を大きくするためである.この実験装置での実験の結果,直径100mmのガラスを最高2000RPMという回転数で駆動することができた.次に,空気を床から吹き出させることにより長方形のガラスを浮上させ,静電気力によるリニアモータを構成した.電極は直線電極,V形電極,V形構成の円電極の3つのものを作り,それぞれに3相交流を印加し,実験結果を比較検討した.その結果,加速度,最高速度,駆動の安定性などすべてにおいて,V形構成の円電極のものが最もよい結果となることがわかった.これまでの実験は片側に電極を配置した形であったが,駆動力を大きくするため円形薄板ガラスの両側に電極を取付けた駆動装置を構成した.この実験装置では接触式の軸受を用いたが,支持部の剛性不足により面外振動が発生し十分なデータを取ることができず,片面より両面の駆動の方が駆動力が大きいという基本的な結果しか得られなかった.半導体製造工程や,液晶ディスレイ等の製造工程においては,ウェハ・ガラス板等の接触支持に起因する傷付きや塵埃微粒子の付着が,電極パターンの微細化に伴い,より大きな問題となってきている.また,特に液晶ディスプレイ等の薄型ディスプレイの分野においては,基板の大型化と薄型化に伴い,基板のたわみの問題から,従来方法によるハンドリングは困難になる一方である.

そこで,本研究では,上記の問題を解決すべく,液晶用ガラスやシリコンウェハ等の薄板状部材を,非接触で搬送するシステムを開発した.主要な成果としては,次の2点が挙げられる.(1)薄板状部材を非接触浮上ハンドリングする静電浮上ハンドリングチャックを開発した.電極面を細かい多数個の電極ユニットに分割し,各部局の浮上ギャップを対応する電極ユニットで制御することで,薄板状部材を静電気力で非接触浮上ハンドリングすることに成功した.これにより278mm×78mm×0.05mmのアルミ板を浮上ハンドリングできた.また,独特の電極形状を考案したことによって,絶縁体である385mm×130mm×0.7mmのソーダ石灰ガラス板を安定に浮上ハンドリングすることにも成功した.(2)空気浮上と静電気推進力を組み合わせて長距離搬送に向く搬送手法を開発した.従来の空気浮上では,搬送時の基板の揺れや,搬送開始・終了時の応答の遅さが問題とされていたが,静電気推進力と組み合わせることにより,これらの問題を解決すつことに成功した.上記(1)でも用いた独特の電極形状を利用することで,52mm×52mm×0.7mmのソーダ石灰ガラス板を,左右の揺れを±0.5mm以下に抑えながら,150mm/sの搬送速度で安定に直進搬送することに成功した.
ミジンコの形質転換系の開発と形態形成遺伝子群の機能解析

1)形質転換ベクターの構築ミジンコのアクチン及びvasa遺伝子を染色体DNAライブラリーから単離し、各クローンの全塩基配列た。プロモーターを含むと考えられるそれらの遺伝子上流域の下流に、ミジンコのヘモグロビン遺伝子、クラゲのGreen Fluoprescent Protein(GFP)大腸菌のLacZ遺伝子等の選択マーカー遺伝子を連結した形質転換ベクターのシリーズを、比較的広範囲の宿主で機能することが知られているpiggyBacベクターを元に遺伝子工学的に構築した。2)ミジンコの形質転換形確立の試みマイクロインジェクション法を用いて、ミジンコ卵内への形質転換ベクター導入を試みた。ミジンコ卵にDNA注入用の針を挿入すると同時に内圧により卵が破裂してしまうことから、親個体の背部からのインジェクションを試みた。形質転換ベクターの溶液や、形質転換ベクター溶液を含んだリポソームなどを様々な条件でインジェクションしてみたが、形質転換体は得られなかった。ミジンコ体液中においてDNAが分解されてしまう、体液で希釈されてしまうために生殖系列まで形質転換ベクターが到達しないなどの原因が考えられる。そこで現在は、生殖系列以外の細胞で合成され、その後生殖系列に特異的に蓄積する事が明らかになっているビテロゲニン(既にクローン化済み)タンパクの一部をリポソーム作製時に用いることによって、生殖系列の付近に形質転換ベクターを含んだリポソームを局在させられないか?というアイデアを検討しているところである。1)ミジンコVASAタンパク質の発現を指標とした生殖系列の分化時期および位置の同定ミジンコVASAタンパク質に対する特異抗体を用いたミジンコ全胚に対する免疫染色法により、ミジンコ胚発生過程における生殖系列の分化時期および位置を細胞レベルで詳細に同定した。また全胚に対するin situ hybridizationによりvasa mRNAの局在を解析し、その局在がタンパク質の挙動と同様であることを確認した。2)形質転換ベクターの構築ミジンコのレトロトランスポゾン遺伝子のプロモーター領域の下流に、ミジンコのヘモグロビン遺伝子、クラゲのGreen Fluoprescent Protein(GFP)大腸菌のLacZ遺伝子等の選択マーカー遺伝子を連結した形質転換ベクターのシリーズを遺伝子工学的に構築した。また生殖系列特異的に発現することが予想されるvasa遺伝子のプロモーター領域をクローン化し、その全塩基配列を決定した。3)ミジンコの形質転換系の確立マイクロインジェクション法を用いて、ミジンコ卵内への形質転換ベクター導入を試みた。残念ながら、ミジンコ卵にDNA注入用の針を挿入すると同時に内圧により卵が破裂してしまうことから、この方法をそのまま導入することは不可能であった。しかしながら、親個体の背部から色素をインジェクションした場合、親個体に対するダメージは少なく、また注入された色素は血液中を拡散し生殖系列付近まで到達することを見いだした。現在この方法を用いて、インジェクションの条件検討を行っている段階である。
DNAネットワーク組織体の構築と新機能発現

DNA二重らせんは特異な周期的高次構造を有しており、「分子のナノサイズ組織化」に新しい方法論を与える可能性がある。すなわちDNAは、分子間距離や繰り返し周期を制御し、分子種等を意図的に配列させるための土台(テンプレート)として極めて興味深い。筆者らは固定化遺伝子やDNAコンジュゲートの研究を通して、DNA修飾法の研究を行ってきた。今回、独自に開発した一連のDNA・ビニル高分子グラフト法を基礎に、DNA上に合成高分子を規則的あるいは意図的に配置することを試みた。すなわち、DNAの一次構造(塩基配列=遺伝情報)に従ったその部位特異的高分子修飾を試み、ナノレベルで構造の制御された高分子組織体の構築を示唆する基礎的知見を得た。ここでは末端にソラレンを導入したビニルポリマーを用いた。これでDNAとビニルポリマーのコンジュゲートを合成する際、ポリマー固定に先立ってDNA結合性分子である制限酵素を反応系に添加しておく。この酵素の結合はその部位におけるポリマー導入をブロックすると考えられる(マスキング)。縦軸にDNA切断率、横軸に光反応時のポリマー濃度をとり、マスキング系、非マスキング系それぞれについてプロットしたところ、マスキングを行っていない複合体ではポリマー濃度が増加するに従い切断効率が低下していっているが、一方マスキングを行った複合体では殆ど低下が見られない。これらのことより、通常はDNAの周りにグラフトされたビニルポリマー鎖が制限酵素の接近を阻害するのに対し、マスキング操作を行うとDNA鎖上の酵素認識部位が非常に高い効率で保存されることが明らかとなった。また、このインプリント時の酵素添加量を変化させて切断効率を検討したところ、EcoRI添加量が約20unitあたりから切断効率の差が大きくなり、マスキング操作時のEcoRI量を増やすに従ってインプリント効果が増大していることが明らかとなった。