hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
単一細胞における遺伝子発現の新しい解析法の開発と医学的応用

1.細胞の分化・形態変化に伴う遺伝子発現の変化を単一細胞レベルで解析するために、効率の良い外来遺伝子導入法とルシフェラーゼ発現細胞の画像解析法を確立した。さらに、培養ヒトメラノサイトを用いて、チロシナーゼ遺伝子のプロモーター機能を初めて確認することができた。2.ヒトチロシナーゼ遺伝子の5′上流領域には、メラノサイト特異的転写に関与する3つの制御領域が存在し、各領域は1コピーのCATGTGモチーフを含んでいる。そこで、それぞれのCATGTGモチーフに塩基置換を導入することにより、チロシナーゼ遺伝子の転写への各制御領域の関与の程度を明らかにした。3.ヒトヘムオキシゲナーゼ1(HO-1)遺伝子のプロモーター領域には、熱ショックによる転写活性化に関与する熱ショックエレメント(HSE)が存在する。しかし、ヒトHO-1は必ずしも熱ショック蛋白質ではない。そこで、当該HSEの機能を解析した結果、HSEそれ自身は本来機能し得るのだが、in vivoでは何らかの理由によりその機能発現が抑制されていることが示唆された。さらに、当該HSEの下流の領域が、HSEの機能を抑制することを示唆した。4.マクロファージの分化に伴うHO-1と誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)の発現様式を比較検討する過程で、化学的性質の異なる3種のNO供与体のいずれもがHO-1mRNAの発現を著明に増加させた。よって、NOがHO-1mRNAの発現を誘導することが示唆される。しかし、HO-1とiNOSの両mRNAの発現量には、明らかな相関は認められなかった。さらに、摘出した8例のヒト脳腫瘍では、正常脳組織に比較して両mRNAとも発現量が増加していた。5.降圧ペプチドであるアドレノメデュリンが、脳派絡叢細胞由来のがん細胞より分泌されることを見いだした。細胞の分化・形態変化に伴う遺伝子発現の変化を単一細胞レベルで解析するために、ルシフェラーゼ発現細胞の半固定法と画像解析法を確立した。すなわち、ヒトチロシナーゼ遺伝子プロモーターとルシフェラーゼ遺伝子をレポーターとして持つ融合遺伝子を、MeWoヒトメラノーマ細胞で一時的に発現させ、同細胞を10%ホルマリンを含む生理食塩水で穏やかに固定した(4°C,30分)。このように半固定した細胞を、直ちに基質であるルシフェリン溶液(100μM)と反応させ(25°C,1030分)、細胞内の化学発光をフォトカウンテイングカメラにより解析した。その結果、半固定細胞内での発光を、二次元的に検出することに成功した。今後、確立したルシフェラーゼ発現細胞の画像解析法を利用することにより、細胞の形態を忠実に維持しながらレポーター遺伝子の発現を検出することが可能になった。MITFが、ヒトチロシナーゼ遺伝子のメラノサイト特異的転写に関与するエンハンサー(TDE)に結合することを確認した。特に、TDEの中央に存在するCATGTGモチーフが、MITFの結合に重要であることが示唆された。さらに、MITFが、マウスチロシナーゼとTRP1遺伝子のプロモーター領域のCATGTGモチーフにも結合し、それぞれの遺伝子の転写を活性化することを明らかにした。抗チロシナーゼモノクローナル抗体の作製に世界で初めて成功した。これまでに、多くの研究者が抗チロシナーゼモノクローナル抗体を作製しようと試みたが、未だに成功例はなかった。一方、破骨細胞への機能分化を解析するための培養系として、ヒト前骨髄球性の急性白血病細胞株であるHL-60細胞を活性型ビタミンD_3で3日間処理し、多核の破骨細胞の形成の有無を解析した。しかし、多核の破骨細胞の形成を確認できなかった。

さらに、培養条件を検討すると共に、別の培養細胞を試す必要がある。昨年度に確立した遺伝子導入法・画像解析法を用いて、平成8年度には以下の成果を得た。1.培養ヒトメラノサイトを用いて、チロシナーゼ遺伝子のプロモーター機能を初めて確認することができた。2.ヒトチロシナーゼ遺伝子の5'上流領域には、メラノサイト特異的転写に関与する3つの制御領域が存在する。各制御領域は1コピーのCATGTGモチーフを含んでいる。そこで、それぞれのCATGTGモチーフに塩基置換を導入することにより、チロシナーゼ遺伝子の転写への各制御領域の関与の程度を明らかにした。3.ヒトヘムオキシゲナーゼ1(HO-1)遺伝子のプロモーター領域には、熱ショックによる転写活性化に関与する熱ショックエレメント(HSE)が存在する。しかし、ヒトHO-1は必ずしも熱ショック蛋白質ではない。そこで、当該HSEの機能を解析した結果、HSEそれ自身は本来機能し得るのだが、in vivoでは何らかの理由によりその機能発現が抑制されていることが示唆された。さらに、当該HSEの下流の領域が、HSEの機能を抑制することを示唆した。4.マクロファージの分化に伴うHO-1と誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)の発現様式を比較検討する過程で、化学的性質の異なる3種のNO供与体のいずれもがHO-1 mRNAの発現を著名に増加させることを見いだした。よって、NOがHO-1 mRNAの発現を誘導することが示唆される。しかし、HO-1とiNOSの両mRNAの発現量には、明らかな相関は認められなかった。さらに、摘出した8例のヒト脳腫瘍では、正常脳組織に比較して両mRNAとも発現量が増加していたが、脳腫瘍組織における両酵素mRNAの発現量に明らかな正の相関は認められなかった。5.降圧ペプチドであるアドレノメデュリンが、脳脈絡叢細胞由来のがん細胞より分泌されることを見いだした。
次世代核酸医薬の細胞内デリバリーのためのナノキャリアの開発

本研究は、生体分子であるキトサンと無機材料のハイブリッドナノ粒子を開発し、日本人の代表的なアレルギー疾患である花粉症の予防および治療のための核酸医薬デリバリーに利用することを目的としている。これまで、キトサンの分子量が核酸医薬であるCpGオリゴデオキシヌクレオチドのデリバリーに及ぼす影響について調べ、キトサン分子量がCpGオリゴヌクレオチドによる炎症性サイトカイン誘導能に逆比例すること、キトサンの脱アセチル化度は炎症性サイトカイン誘導に影響しないことを明らかにした。当該年度は、キトサンとCpGオリゴヌクレオチドの複合体を作製し、ヒト抹消血単核細胞におけるサイトカイン誘導について検討した。キトサンとCpGオリゴヌクレオチドは、混合による複合化と、マイクロ流路による複合化の2通りの方法で調製した。マイクロ流路は3方向からの流路が合流し、真中の流路からCpGオリゴヌクレオチドを、両側の流路からキトサンを流し、合流点で混合させて複合化した。このマイクロ流路により調製したCpGオリゴヌクレオチド-キトサン複合体は、CpGオリゴヌクレオチドの凝縮が、単なる混合により調製した複合体よりも密であり、キトサンとCpGオリゴヌクレオチドの解離はほとんど観察されなかった。さらにマイクロ流路により調製した複合体は細胞への取り込み効率に優れ、その結果、高いサイトカイン誘導能を示した。本研究から、静電的相互作用によるCpGオリゴヌクレオチドとカチオン性ポリマーとの複合化において、マイクロ流路を利用した調製法が有効であることが示された。本研究の目的は、核酸医薬であるCpGオリゴデオキシヌクレオチドをキトサンハイブリッド粒子により免疫細胞である樹状細胞に送達し、炎症性サイトカインの効率的な誘導によりアレルギー治療のためのデリバリーシステムを構築することを目的としている。最終的にマイクロ流路によるCpGオリゴヌクレオチドとキトサンの複合化が有効であることを見出し、その成果を論文発表することができたので、おおむね順調に進展したと考える。科学研究費補助金における本研究は終了したが、マイクロ流路による複合化技術は、様々な核酸医薬とカチオン性ポリマーの組み合わせに応用できると思われる。今後は、この技術を他の核酸医薬へ展開するとともに、さらにマイクロ流路の改良に取り組む予定である。本研究は、生体分子であるキトサンと無機材料のハイブリッドナノ粒子を開発し、日:本人の代表的なアレルギー疾患である花粉症の予防および治療のための核酸医薬デリバリーに利用することを目的としている。当該年度は、キトサンの脱アセチル化度と分子量が核酸医薬であるCpGオリゴデオキシヌクレオチドのデリバリーに及ぼす影響について調べた。その結果、脱アセチル化度が98%の方が80%よりもCpGオリゴヌクレオチドの結合量が大きいことがわかった。これは、脱アセチル化度がが大きいと、アミノ基が多くなり、マイナスに荷電した核酸分子との結合を促進するためと考えられた。また、インターフェロンの誘導量は、結合したCpGオリゴヌクレオチドの量にほぼ比例していた。一方、キトサンの分子量が大きくなるとCpGオリゴヌクレオチドの結合量は多くなるが、インターフェロン誘導量は逆に減少した。この原因については、現在、不明であるが、キトサンの分子量の増加に依存した粘性、硬さ、結合力などが、CpGオリゴヌクレオチドの受容体であるToll-like receptor 9との相互作用に影響を及ぼしている可能性がある。これらは、当初、想定し得なかった現象であるが、非常に興味深い現象でもあるので、今後の解決するべき課題であると考える。これまで、キトサンの分子量が核酸医薬であるCpGオリゴデオキシヌクレオチドのデリバリーに及ぼす影響について調べ、キトサン分子量がCpGオリゴヌクレオチドによる炎症性サイトカイン誘導能に逆比例することを明らかにした。H24年度は、キトサンの脱アセチル化度がCpGオリゴヌクレオチドによる炎症性サイトカイン誘導に及ぼす影響について調べたが、脱アセチル化度の違いによる炎症性サイトカイン誘導の影響は観察されなかった。したがって、キトサンの分子量のみが炎症性サイトカイン誘導に影響しているが、これは分子量によるチャージの差に起因していると考えられる。すなわち、キトサンのチャージはCpGオリゴデオキシヌクレオチドの凝集状態を変化させる可能性がある。これまで、キトサンと無機材料のハイブリッドナノ粒子にCpGデリバリーに関して、炎症性サイトカイン誘導に関する検討を行ってきたが、このハイブリッド粒子はインターフェロン誘導を抑制していた。この抑制が、キトサンによるものかどうかを検討した結果、キトサンにはインターフェロンを抑制する作用があることを見出した。さらに、この抑制はTLR9を介したインターフェロン誘導に特異的であり、RNAによるTLR3,7/8あるいはリボ多糖によるTLR4、さらに細胞質DNAセンサーを介したインターフェロン誘導は抑制しないことを明らかにした。

これまで、キトサンの分子量が核酸医薬であるCpGオリゴデオキシヌクレオチドのデリバリーに及ぼす影響について調べ、キトサン分子量がCpGオリゴヌクレオチドによる炎症性サイトカイン誘導能に逆比例すること、キトサンの脱アセチル化度は炎症性サイトカイン誘導に影響しないことを明らかにした。当該年度は、キトサンとCpGオリゴヌクレオチドの複合体を作製し、ヒト抹消血単核細胞におけるサイトカイン誘導について検討した。キトサンとCpGオリゴヌクレオチドは、混合による複合化と、マイクロ流路による複合化の2通りの方法で調製した。マイクロ流路は3方向からの流路が合流し、真中の流路からCpGオリゴヌクレオチドを、両側の流路からキトサンを流し、合流点で混合させて複合化した。このマイクロ流路により調製したCpGオリゴヌクレオチド-キトサン複合体は、CpGオリゴヌクレオチドの凝縮が、単なる混合により調製した複合体よりも密であり、キトサンとCpGオリゴヌクレオチドの解離はほとんど観察されなかった。さらにマイクロ流路により調製した複合体は細胞への取り込み効率に優れ、その結果、高いサイトカイン誘導能を示した。本研究から、静電的相互作用によるCpGオリゴヌクレオチドとカチオン性ポリマーとの複合化において、マイクロ流路を利用した調製法が有効であることが示された。当該年度は、半年以下の期間しかなかったが、キトサンのデリバリーへの応用に関して、概ね当初の計画通りに達成されたと考えている。また、当該年度の研究において、予想し得なかった新たな課題も浮上した。本研究の目的は、核酸医薬であるCpGオリゴデオキシヌクレオチドをキトサンハイブリッド粒子により免疫細胞である樹状細胞に送達し、炎症性サイトカインの効率的な誘導によりアレルギー治療のためのデリバリーシステムを構築することを目的としている。低分子量キトサンハイブリッド粒子により、炎症性サイトカイン誘導量が約8倍向上するという結果を得、目的に対して順調に進展していると考える。最終的にマイクロ流路によるCpGオリゴヌクレオチドとキトサンの複合化が有効であることを見出し、その成果を論文発表することができたので、おおむね順調に進展したと考える。次年度は、平成23年度で得られた知見をもとに、キトサンとシリカあるいはシリコン等のナノ粒子との複合体形成し、TLR9との相互作用機序についての解析を行うとともに、ナノ粒子の最適化条件等について検討する予定である。キトサンとナノ粒子の複合体の細胞内での挙動を解析するために、シリコシ量子ドットを合成し、量子ドットから得られる蛍光からTLR9との相互作用機序についてのアプローチを行う。今年度の研究において、キトサンにはTLR9特異的なインターフェロン誘導抑制効果があることを発見した。TLR9は、ある条件下において自己のDNAと相互作用しインターフェロンを誘導することによって自己免疫疾患を引き起こすことが示唆されている。当初の目的にはなかったが、キトサンと無機材料のハイブリッド粒子は、TLR9を介した自己免疫疾患の治療にも応用できる可能性があり、炎症性サイトカイン誘導とともにインターフェロン抑制についても取り組む。
ランゲージングの効果とメカニズムの解明：学習者要因と長期的効果

「筆記ランゲージング」とは、外国語学習者が疑問に感じたことや自らの言語使用を書いて振り返ることで、言語に関する理解を深めるプロセスである。初年度は、様々な学習者要因の中でも言語適性が筆記ランゲージングに影響すると想定し、筆記ランゲージングと学習者要因の関係解明に取り組み、筆記ランゲージングが学習者の適性に関係なく学習を促進することを示唆する実験結果を得た。2年目は、言語適性と処遇(筆記ランゲージング)の交互作用には目標言語項目の難易度が影響すると想定し(Li, 2013)、初年度とは別の言語項目を用いて、事前テスト・処遇・事後テストのパラダイムで再度実験を行った。主な結果は、筆記ランゲージングを行わないグループでは事前事後テスト間の伸びと適性の相関が多数観察されたのに対し、行ったグループではほとんど見られなかったことである。これは筆記ランゲージングが適性の低い学習者の学びを促進すること、つまり、レメディアル指導になり得る可能性を示唆しており、初年度の実験結果を支持するものとなった。これらの結果・考察はこの夏第45回全国英語教育学会青森研究大会で発表予定である。また、筆記ランゲージングの量と質に注目し、事前事後テストとの相関関係を分析したところ、全体的に正の相関があること、量と質の間にも正の相関があることが観察された。つまり、豊かな筆記ランゲージングを行う学習者ほどよりテストの成績が高く、更には、筆記ランゲージングに励んで自分の考えを多く書くほど、理解が深まるということである。この結果はこの秋Symposiumon Second Language Writingアリゾナ大会で発表する予定である。更に、初年度の実験結果は、昨年度末アメリカ応用言語学会アトランタ大会で口頭発表を行い本研究課題の成果を広く発表するとともに、発表参加者から有意義な意見や助言を多数得ることが出来た。研究成果を国内学会・国際学会での口頭発表へとつなげられたから。最終年度にあたる今年度は、これまでの研究成果を教育現場で生かすべく「ランゲージングの教室実践への応用と長期的学習促進効果の解明」という課題に取り組んでいく予定である。「ランゲージング」(Swain, 2006)とは外国語学習者が疑問に感じたことや自らの言語使用を振り返る際に、それらについて話す、または、書いて理解を深める学習プロセスである。これまで口頭ランゲージングに関しては学習促進効果が多数報告されているが、筆記ランゲージングは近年研究が始まったばかりで(例えばIshikawa,2013, 2015; Suzuki, 2009, 2012)、まだ解明されていない点が多い。そこで、初年度は筆記ランゲージングと学習者要因(言語適性)の関係解明に焦点を当て、事前テスト・処遇・事後テストのパラダイムで実験を行い、筆記ランゲージング学習促進効果を検証した。主な結果は、筆記ランゲージングを行わないグループでは事前事後テスト間の伸びと適性の相関が多数見られたのに対し、行ったグループでは目立った相関が無かったことである。このことは筆記ランゲージングが学習者の適性に関係なく学習を促進すること、つまり、適性の低い学習者にとって筆記ランゲージングがレメディアル指導になり得る可能性を示唆しており、適性処遇交互作用の概念とも共通するものである。これらの結果・考察は第43回全国英語教育学会島根研究大会で口頭発表を行い、本研究課題の成果を広く発表するとともに、発表参加者から有意義な意見や助言を多数得ることが出来た。更に、筆記ランゲージングと学習者要因についての論文を執筆し、年度末には海外学術雑誌に掲載された(System, Elsevier出版)。また、筆記ランゲージングと各種テスト(文法、翻訳)の相関関係を分析したところ、全体的に正の相関が観察された。つまり、豊かな筆記ランゲージングを行う学習者ほど、よりテストの成績が高いということである。この結果は、平成30年度第44回全国英語教育学会京都研究大会で発表予定である。初年度の研究成果を国内学会での口頭発表、海外学術雑誌の掲載へとつなげられたから。

つまり、豊かな筆記ランゲージングを行う学習者ほどよりテストの成績が高く、更には、筆記ランゲージングに励んで自分の考えを多く書くほど、理解が深まるということである。この結果はこの秋Symposiumon Second Language Writingアリゾナ大会で発表する予定である。更に、初年度の実験結果は、昨年度末アメリカ応用言語学会アトランタ大会で口頭発表を行い本研究課題の成果を広く発表するとともに、発表参加者から有意義な意見や助言を多数得ることが出来た。研究成果を国内学会・国際学会での口頭発表へとつなげられたから。上でも述べたように、本研究では3つの大きな課題を掲げており、今後は「ランゲージングの第二言語習得促進効果メカニズムの解明」と「ランゲージングの教室実践への応用と長期的学習促進効果の解明」という残り2つの課題に取り組んでいく予定である。最終年度にあたる今年度は、これまでの研究成果を教育現場で生かすべく「ランゲージングの教室実践への応用と長期的学習促進効果の解明」という課題に取り組んでいく予定である。以下の事由により、予算を平成30年度に繰り越した。まず、設備や消耗品関係については、個人研究費等で購入したものを充てることができたため、当該科研費から支出しなかった。また、Storch教授の招聘は先方の都合によりかなわなかったため予算を繰り越し、平成30年度に研究分担者の宮城教育大学鈴木准教授が訪問することになった。以下の事由により、予算を平成31年度に繰り越した。また、Yang教授の招聘は先方の都合によりかなわなかったため予算を繰り越すことになった。
水溶性タキソール誘導体の合成研究

細胞毒性と水溶性がスペーサーの炭素鎖の長さの違いによってどのように影響されるのかを調べる目的で、炭素鎖長を変えた5種類のアシル化剤を合成した。2,3,4,6位をベンジル基で保護したガラクトースに種々のジオールを酸触媒下に反応させた。続いて1級水酸基を酸化してカルボン酸とした後、メチルエステルに変え精製した。再び加水分解してカルボン酸を得た。通算の収率は19-28%であった。一方、10-デアセチルバッカチン-IIIからドセタクセルを合成し、2',7位をトリエチルシリル基で保護した。これに前述の各種アシル化剤をEDCI/トルエン系でエステル化した。脱保護を行なって目的とする化合物を効率良く得ることができた。n=1である10-α-GAG-DT(482μg/ml),10-β-GAG-DT(301μg/ml)の水溶性と比較するため、5種類の誘導体の溶解度を測定したところ、意外なことに10-GAP-DT(n=4)が最大の水溶性を示した。これはスペーサーの長さがn=4のとき、バッカチン骨格に連結している親水性基(7-OH,2-OBz,4-OAc,2'-OH,3'-NBoc)が集中しているα-側にガラクトースが到達することが可能になって、水素結合などを通して水溶性を高めるコンフォメーション取り得るのではないかと推測できる。
CCDミット観測によるハービック・ハロー天体の広域探査

本研究の基本的な目的は、ハービック・ハロー(HH)天体を深く広く探査することにより、この現象の多様性と普遍性を明らかにすることにある。その具体的な実施計画として交付申請書において5つの目標をあげたが、これまでのところ3分の1程度しか完了していなくて、残りは来年度以降に持ち越すことになった。最初に掲げた、深いシュミット乾板(既に得られている)上でのHH天体候補検出作業が予想外に時間がかかったのが主な原因である。これとても論文発表までには至っていないものの、その結果としてOriA/L1641の12.7平方度の探査天域に1292個、OriB/L1630の12.1平方度に64個、NGC2264/MonOB1の6.9平方度に73個という多数のHH天体候補を検出した。いくつかの理由でこれらのうちのそれぞれ約25%・30%・40%、すなわち300個・20個・30個程度は真のHH天体であると推測される。それぞれの天域での既知のHH天体数は39個・24個・4個であることを考えると、驚くべき大きな数である。これらの候補天体の励起源を検出するためにIRAS Faint Source DataBaseと比較することも計画したところであるが、それまでに至らず、IRAS Point Source Catalogとの比較にとどまった。その結果はそれぞれ38個・7個・15個程度しか関連の可能性のあるものがなく、したがって多数の"超低質量"(1M以下)の原始星の存在とその活動性が予想される結果となった。さらに、これらのHH天体候補のなかに、既知のHHjetであるL1641のHH1/2およびNGC2264のHH124にそれぞれ伴う2対の巨大bow shock構造がみられ、木曽シュミットとCCDカメラによる観測でHH天体であることが確認された。これらはHH1/2とHH124の励起星が2万年程前にも激しい質量放出活動を起こしたこと、したがってHH天体活動は恒星の前主系列進化のある期間間欠的にみられることを示していて、きわめて注目される。このHH天体活動の起こる期間についても、L1641での予想されるHH天体数(約300個)と最近の近赤外撮像観測による雲に埋もれた若い星の数との比較から、1.5×10^5年程度と見積もられた。これも興味深い結果である。このほか、やはりCCDと干渉フィルターによる観測から数個の新しいHH天体を発見したが、そのうちの1つはこれまでかなりよく探査がなされているはずのおうし座暗黒星雲にあり、注目される。また南天でのHH天体探査の過程できわめて特異な星雲を2個発見し、その本性を論ずる論文2編を発表した。
原位置岩盤のダイレイタンシー特性とトンネルにおける支保工の最適化

山岳トンネルへのNATMの通用において最も重要なことは原位置岩盤の力学的特性を正しく評価することである。不連続面を多く含む原位置岩盤の力学的特性の中で特にダイレイタンシー特性が適切な支保工を決定する最も重要な因子となるが、まだ十分に明らかにされていないため設計方法が確立していない。これに対し、申請者は、自然のせん断面を扱い得る岩盤用一面せん断試験機を開発し、ダイレイタンシー特性を室内試験で明らかにした上で原位置岩盤の特性を評価する目的で本研究を遂行してきた。上記岩盤用一面せん断試験機は、サーボ機構を基本に設計したものであるが、不規則な不連続面を用いる場合、制御に若干の応答遅延が認められ、微調整に問題が残されたまま現在に至っている。マイコン制御を行っていても、厳密にいえば、少し高い油圧を作用させこれをサーボ機構でえに戻すことを細かくやっている訳で、不規則な不連続面では、細かい戻りが完全に行い得ない欠点がある。しかしながら現在の方法以外にはとり得ず、この欠点の影響を検討し、それに応じた補正方法を研究中である。原位置調査における不連続面の状況調査は、孔内載荷試験とボアホールスキャナーを組合わせれば所期の目的を果すことを確認し、研究は完成している。取扱う供試体については、流紋岩、凝灰岩、せん線岩、花崗岩についてはサンプリングを行い、岩盤用一面せん断試験機を用いて、ダイレイタンシー特性と弾性波伝播挙動特性との相関性を調査し、ダイレイタンシーと拘束圧の関係について従来線形関係が多く用いられてきたが、岩種により非線形であることが本研究にて明瞭となった。したがって、63年度交付申請書に記載した計画項目の中、(1)、(2)、および(4)については、研究を完了した。これにより基礎データは入手できたので、残り(3)項のまとめも短期間に完了し、公表できるもとと考える。土質材料の岩質材料の物性の差異を把握することは地盤工学上きわめて重要なことである.しかしながら,両者の変形・強度特性は広範囲にわたり,実験装置に要求される耐力・剛性・圧力等も異なり,両者を同じ試験装置で実験することは困難である.土質材料に比べ,約200倍の圧力まで取扱うことのできる一面せん断試験を実行することが一つの目的であるが,油圧制御に乱れがあり,変位制御を厳密に行いたい研究者らの期待に添わなかった部分があり,現在改良中である.孔内載荷試験,孔内き裂調査は順調に進み画像処理システムとして完成した.これについては,すでに数点の論文発表を予定している.トンネル支保工の最適化を計る上での施工の実体を調査することは必要な作業であり,12ヶ所のトンネルより新鮮なデータの提供を受け,支保圧力・変形量・非弾性域の進展・他山分類などの相関性についてもかなり多くの知見を得た.ダイレイタンシー特性が把握できれば実用的な分類として使用できる見通しがついている.弾性波の伝播挙動から不連続面の性状やダイレイタンシー特性を推定する検討もP波からS波に移り,周波数特性も分析していて,かなりまとまった.これも一部学会発表を行っている.第三記泥岩については,せん断試験用にブロックサンプリングを行ったがひじょうに脆弱で整形が難しく工夫が必要である.総じて,定変位せん断試験が予定通り機能すれば目的を達することができる状態にある.岩盤と支保工の相互作用を数値解析によりパラメトリックスタディを行う作業は,予定の60%位進捗したと思われる.山岳トンネルへのNATMの通用において最も重要なことは原位置岩盤の力学的特性を正しく評価することである。
心身症・神経症等を伴う不登校児の心理・行動特性及び指導法に関する研究

本研究の目的は、心身症・神経症を伴う不登校児の心理・行動特性及び指導法について明らかにすることであった。成果として、(1)心身症・神経症等の児童生徒の実態把握と教育的対応に関する文献研究を行い、(2)心身症・神経症等の児童生徒163名を対象に、米国のT.M.Achenbach博士らが開発し,国際的に通用している子ども用の情緒や行動の包括的な質問紙[親用のCBCL(=Child Behavior Checklist),教師用のTRF(=Teacher's Report Form)と本人用のYSR(=Youth Self Report)]を実施した結果、TRFでは63%の児童生徒が臨床域(治療を要する域)あるいは境界域(臨床域と正常域との間)にあることを明らかにした。(3)また、心身症・神経症等の児童生徒に対する自立活動を核とした指導内容、評価の視点について提言し、(4)CBCL,TRF、YSRのいずれかを実態把握に使用し、本人,親教師の評価が著しく乖離しているケースや重症のケースの事例研究を行い、学校適応への障壁,その再適応への過程を探った。その結果、病弱養護学校に適応してくると、CBCL等の検査の下位尺度(引きこもり、身体的訴え、抑うつ不安など)が臨床域、境界域にあった者が、数ヶ月後、本人、教師、親の3者の検査の値が低くなり、情緒面や行動面で安定したことを事例研究により明らかにしたなど、があげられる。これらの結果を報告書にまとめた。心身症・神経症等を伴う不登校の児童生徒に関する文献研究や心身症・神経症等を伴う不登校の児童生徒が多数在籍する病弱養護学校を訪問し、情報収集を行った。また、全国病弱養護学校教頭会や関東甲信越地区病弱教育研究連盟主催の研究会、九州地区病弱教育研究連盟主催の研究会に参加し、心身症等の児童生徒の心理・行動特性、教育課題に関する情報を収集した。また、心身症・神経症等で不登校の経験をもつ児童生徒が多く在籍する病弱養護学校5校(児童生徒数約60人)とそこに隣接する病院並びに保護者に研究協力を要請し,以下の調査を実施した。調査の方法は,面接と質問紙を用いて行った。(1)個々の児童生徒の不登校の背景や心理社会的因子による身体症状を面接と質間紙を使用して把握した。不登校の直接の原因やその発生時期,期間,経過についても病院からの情報や教師からの情報,保護者から情報を収集した。(2)T.M.Achenbachらが開発し,近年我が国においても標準化された子ども用の情緒や行動を評価する包括的な質問紙[親用のCBCL (=Child Behavior Checklist),教師用のTRF (=Teacher's Report Torm)と本人用のYSR (=Youth Self Report)]を使用し,三者の立場から多面的に情緒や行動を評価した。各協力校に事例提供を依頼し、来年度、引き続きデータを収集すると共に、事例研究を実施する予定である。心身症・神経症等を伴う不登校の児童生徒に関する文献研究や心身症・神経症等を伴う不登校の児童生徒が多数在籍する病弱養護学校を訪問し、心身症等の児童生徒の心理・行動特性、教育課題に関する情報を収集した。また、心身症・神経症等で不登校の経験をもつ児童生徒が多く在籍する病弱養護学校8校(児童生徒数約150人)とそこに隣接する病院並びに保護者に研究協力を要請し,以下の調査を実施した。(1)個々の児童生徒の不登校の背景や心理社会的因子による身体症状を面接と質問紙を使用して把握した。不登校の直接の原因やその発生時期・期間・経過についても病院からの情報や教師からの情報,保護者から情報を収集した。今後は、引き続き事例研究を進めながら、三者の立場から多面的な情緒や行動の客観的評価を参考にし、指導と児童生徒の変容と関連づけられるかどうかを検討することが課題である。

心身症・神経症等を伴う不登校の児童生徒に関する文献研究や心身症・神経症等を伴う不登校の児童生徒が多数在籍する病弱養護学校を訪問し、心身症等の児童生徒の心理・行動特性、教育課題に関する情報を収集した。また、心身症・神経症等で不登校の経験をもつ児童生徒が多く在籍する病弱養護学校7校(児童生徒数約163人)とそこに隣接する病院並びに保護者に研究協力を要請し,以下の調査を実施した。調査の方法は,面接と質問紙を用いて行った。(1)個々の児童生徒の不登校の背景や心理社会的因子による身体症状を面接と質問紙を使用して把握した。不登校の直接の原因やその発生時期,期間,経過についても病院からの情報や教師からの情報,保護者から情報を収集した。これらの結果を報告書にまとめた。
シェーグレン症候群におけるTLRを介した単球活性化分子機構の解明と治療標的の探索

申請者らはこれまでの知見よりSS単球のBAFFによるBR3を介した活性化が病態形成において極めて重要な役割を担っており、単球におけるBR3発現亢進が抑制されれば単球におけるBAFFシグナルが抑制されBAFFによる組織障害分子の産生が抑制されSSにおける組織障害の抑制及び改善につながると仮説した。さらにヒト単球細胞株をTLR ligandsで刺激した場合、細胞上のBR3発現が亢進すること、Toll様受容体(TLR)の発現がSS患者の単球において亢進していることを見出した。本研究ではSS患者単球におけるTLRを介したシグナルが関与するBR3発現亢進機序を解明し新規治療標的とその阻害剤の探索を行う。
食品成分による脂溶性栄養機能成分の腸管吸収調節に関する研究

生活習慣病予防に関与すると考えられているカロテノイドやビタミンK等の脂溶性栄養機能成分は植物性食品に豊富に含まれるが、これらの生体利用性は著しく低い。食餌脂質は,脂溶性栄養機能成分の消化管内での分散媒体,腸管混合ミセルの構成成分,カイロミクロンの構成材料として消化・吸収を改善すると考えられるが,その詳細な機構は未解明である。本研究では,食品成分として脂質や食物繊維に注目し,カロテノイド等の難吸収性脂溶性栄養機能成分の可溶化・吸収調節作用を腸管混合ミセルの生成(可溶化過程)と細胞への取り込み(吸収過程)の観点から解析した。脂溶性栄養機能成分の腸管混合ミセルへの可溶化に対する食餌脂質の影響を調べたところ,野菜からのβ-カロテンの可溶化は油脂の添加によって促進されたが,ルテインやα-トコフェロールの可溶化は促進されないことを見出した。油脂の促進効果は非極性のカロテン類の可溶化に現定されることが明らかとなった。中・長鎖の遊離脂肪酸及びこれらのアシルグリセロールに促進効果が認められ,油脂の消化産物にも可溶化促進効果があることを見出した。調べた緑黄野菜中のβ-カロテンについては油脂による可溶化促進効果が認められたが,一部の野菜は油脂の有無に拘わらず可溶化率が良好であった。緑葉野菜に含まれる主な複合脂質である糖脂質が混合ミセル可溶化カロテノイドの腸管モデル細胞への取り込み(吸収過程)に与える影響を解析した。リン脂質のホスファチジルコリンと同様に糖脂質のジアシル型は取り込みを抑制しリゾ型が取り込みを促進することを見出し,野菜中に含まれる糖脂質がカロテノイドの生体利用性に影響を与えることが示唆された。食餌脂質は,脂溶性栄養機能成分の消化管内での分散媒体,腸管混合ミセルの構成成分,カイロミクロンの構成材料としてその消化・吸収を改善する考えられるが,その詳細な機構は未解明である。本研究では,食品成分の中でも特に食餌脂質に注目し,カロテノイド等の難吸収性脂溶性栄養機能成分の消化・吸収調節作用を腸管混合ミセルの生成(消化過程)と細胞への取り込み(吸収過程)の観点から詳細に解析し,食品からの脂溶性栄養機能成分の効率的摂取法の確立を目指す。本年度は,主として,脂溶性栄養機能成分の腸管混合ミセルへの可溶化(消化過程)に対する食餌脂質の影響を解析した。ホウレン草ホモジネートに各種脂質を加えin vitro消化後,遠心上清を0.2ミクロンのフィルターで濾過し,得られた濾液中のカロテノイドとα-トコフェロールを分析し消化性を評価した。油脂がほぼ完全に加水分解される条件下では,ホウレン草β-カロテンの消化性は添加油脂量に依存して増大した。この油脂添加によるβ-カロテンの消化性増大効果は添加する油脂の種類によって異なっていた。ルテインやα-トコフェロールの消化性に対しては油脂添加の影響はほとんど認められなかった。モノアシルグリセロール及びジアシルグリセロールもトリアシルグリセロールと同様にβ-カロテンの消化性を高めた。遊離脂肪酸はトリアシルグリセロールに比べ大きく消化性を高めた。これらの結果から,消化過程においてトリアシルグリセロールの加水分解によって生成する脂肪酸がβ-カロテンの消化性に大きく寄与していることが示唆された。また,β-カロテンより極性の高いルテインやα-トコフェロールの消化には油脂は関与していないことが示唆された。

生活習慣病予防に関与すると考えられているカロテノイドやビタミンK等の脂溶性栄養・機能成分は植物性食品に豊富に含まれるが,これらの生体利用性は著しく低い。食餌脂質は,脂溶性栄養機能成分の消化管内での分散媒体,腸管混合ミセルの構成成分,カイロミクロンの構成材料としてその消化・吸収を改善すると考えられるが,その詳細な機構は未解明である。本研究では,食品成分の中でも特に食餌脂質に注目し,カロテノイド等の難吸収性脂溶性栄養機能成分の消化・吸収調節作用を腸管混合ミセルの生成(消化過程)と細胞への取り込み(吸収過程)の観点から詳細に解析する。18年度では,主として,脂溶性栄養機能成分の腸管混合ミセルへの可溶化(消化過程)に対する食餌脂質の影響を詳細に解析するため,アシル基鎖長の異なるトリアシルグリセロールや遊離脂肪酸にっいて検討した。ホウレン草ホモジネートに各種脂質を加えin vitro消化後,遠心上清を0.2ミクロンのフィルターで濾過し,得られた濾液中のβ-カロテン及びルテインとα-トコフェロールを分析し消化性を評価した。ミリスチン酸及びパルミチン酸以外の炭素数10以上の遊離脂肪酸にβ-カロテンの消化性の促進効果が認められ,一方,炭素数8以上の脂肪酸を結合するトリアシルグリセロールが消化性を促進することを認めた。また,油脂加水分解物の影響を定量的に解析した結果,消化性を高める効果は,トリアシルグリセロールくモノアシルグリセロールくジアシルグリセロール,遊離脂肪酸の順であった。これらのことから油脂の促進効果は長鎖の遊離脂肪酸に起因するものと考えられた。各種野菜のβ-カロテンの消化性を調べたところ,ニンジン以外の野菜では油脂の添加によって消化性が促進された。ニンジンのβ-カロテンの消化性は他の野菜に比べ著しく良好であったが,その原因究明は今後の課題である。生活習慣病予防に関与すると考えられているカロテノイドやビタミンK等の脂溶性栄養・機能成分は植物性食品に豊富に含まれるが、これらの生体利用性は著しく低い。食餌脂質は、脂溶性栄養機能成分の消化管内での分散媒体,腸管混合ミセルの構成成分、カイロミクロンの構成材料としてその消化・吸収を改善すると考えられるが、その詳細な機構は未解明である。本研究では、これまでに、油脂に関してカロテノイド等の難吸収性脂溶性栄養機能成分の消化過程における腸管混合ミセルへの可溶化に対する影響を明らかにしてきた。本年度は、食品に含まれる食物繊維や複合脂質がカロテノイドの消化過程における可溶化と腸管上皮細胞への取り込みに与える影響を調べた。可溶性食物繊維と油脂に溶解したβ-カロテンあるいはルテインをinvitroで消化させ、遠心上清を0.2ミクロンのフィルターで濾過し、得られた濾液中のカロテノイドを可溶化カロテノイドとして評価した。アルギン酸では粘度が高いものほどカロテノイドの可溶化を強く阻害した。また、ペクチンも可溶化を阻害した。すでに腸管上皮細胞へのカロテノイドの取り込みが可溶性繊維による粘度増加のため抑制されることを見出していたが、消化管内での可溶化の段階も抑制することが新たに明らかとなった。カロテノイドを含む緑葉野菜には主要な脂質成分として糖脂質が含まれる。これらの糖脂質がβ-カロテンの腸管上皮細胞への取り込みに与える影響をヒト腸管由来Caco-2細胞を用いて解析した。ジガラクトシルジアシルグリセロールなどの糖脂質はリン脂質のホスファチジルコリンと同様に取り込みを抑制することが分かった。
CYP3A4誘導を介した薬物間相互作用に関する薬物動態学的研究

CYP3A4の誘導による相互作用は、組み合わせにより10倍以上の濃度変動を引き起こすため、その予測は重要である。これまでに我々は、CYP3A4の誘導による薬物間相互作用の定量的予測法を構築し、代表的な誘導剤であるリファンピシン、フェニトイン、カルバマゼピンとの併用で、多数の基質で大幅な血中濃度の低下が起こることを予測した。そこで本研究では、重要なCYP3A4の基質薬について誘導薬と併用する場合の注意喚起を図るシステムを考察するとともに、東京大学医学部附属病院(当院)受診患者を対象としてリファンピシン等が含まれる処方の内容を精査し、併用状況を検証し、申請者らが報告した網羅的予測システムの予測精度を検証することを目的とした。当院においてリファンピシン等が処方された患者計90人を抽出し、その中からリファンピシン及びカルバマゼピン服用患者各20名、フェニトイン50名の併用薬を調査した。全併用薬に対する、併用注意〓の占める割合は、3剤ともに約15%であり、カルシウム拮抗薬、睡眠導入剤、ワルファリン等が併用されていた。以前申請者らが阻害薬について構築したPISCSシステム(Clin Pharmacokin 2009 ; 48 : 653)を誘導薬に拡張し、スタチン、Ca拮抗薬、ベンゾジアゼピン(BZD)について、誘導薬との網羅的な注意喚起を可能とするともに、本邦、米国、英国の添付文書の記載と比較した。その結果、添付文書では注意喚起が不十分な組合わせも多く、PISCSを利用することで、より合理的に注意喚起が可能であった。したがって、現在、処方監査等への適用を検討している。
配列相同性の高いタンパク質ファミリーを高度に識別可能な分子認識ナノ空間の創製

本研究では、構造類似性の高いタンパク質として血管内皮細胞増殖因子(VEGF)のアイソフォームVEGF165と189に着目し、高精度で識別可能な分子認識場をもつタンパク質認識人工高分子材料(分子インプリントポリマー;MIP)の創製を目指している。平成30年度では、MIP薄膜創製で重要な相互作用官能基として、VEGF165, VEGF189に存在するヘパリン結合ドメイン(HBD)を認識するヘパリンの誘導体合成に関して検討した。これまでは高分子量でかつ分子量分布の広い(Mw 1000012000)ヘパリンを用いていたが、より精密な分子認識を達成するために低分子量のヘパリンについて検討した。具体的には、分子量が約665、1800、および6001800の分子量分布をもつヘパリンの低分子量のヘパリン3種類に着目した。また本研究では、片末端を化学結合で金基板に固定したヘパリン分子によって標的VEGFを識別すること目指している。つまり、各VEGF認識に重要なヘリックス構造を保ったままヘパリンの片末端を機能化して固定化する必要がある。そこで、ヘパリンの還元性末端に対して、pーアミノチオフェノール基の導入する還元的アミノ化反応条件について検討した。反応温度、時間を検討したところ、室温、24hでは50%のチオール化率だったのに対し、40°Cで24h反応させるとほぼ定量的に反応が進行することが分かった。6001800の分子量分布をもつヘパリンのチオール誘導体に対してDOSY測定を行ったところ、p-アミノチオフェノール基はヘパリンの分子量にほぼ依存せず結合していることが分かった。また、円二色性スペクトル測定より、ヘパリンのヘリックス構造は反応後もほぼ保持されていることが分かった。以上から、分子量に依存せず、定量的にチオール化が可能な反応条件に関する基礎知見を得ることができた。平成30年度に予定していた「各VEGFの分子インプリントポリマー薄膜の作製」について詳細な検討には至らなかったが、これまで非効率的であった末端チオール化と低分子量のヘパリンのチオール誘導体の合成は達成した。より高性能のMIP薄膜を得るために重要な実験結果が得られたので、研究発展において大きな推進力になると考えられる。平成30年度においては、分子認識能向上のため、これまでより分子鎖長及び分子量分布の小さいヘパリンに着目し、効率的な誘導体合成のための基礎知見を得た。今後はそれらに対する分子認識能の評価と、各種機能性モノマー(蛍光分子を含むもの、あるいは含まないもの)の導入方法についてなどについても検討する。上記を総合的に検討して新たな知見を得ることにより、これまでに作製したMIPよりもさらなる高感度および高選択的な分子認識能の達成を目指す。本研究では、構造類似性の高いタンパク質として血管内皮細胞増殖因子(VEGF)のアイソフォームVEGF165と189に着目し、高精度で識別可能な分子認識場をもつタンパク質認識人工高分子材料(分子インプリントポリマー;MIP)の創製を目指す。29年度では、MIP創製で重要な相互作用官能基として、各VEGFに共通するドメインであるヘパリン結合ドメイン(HBD)を認識するヘパリンと、HBD以外のアミノ酸残基と相互作用する官能基をもつ機能性モノマーの検討を行い、VEGF165を標的としてMIP薄膜作製を試みた。精密な分子認識を達成するために、ヘパリンの分子鎖長・分子量分布がVEGF認識に与える影響について検討した。分子量1800-12000の範囲で分子量分布の異なる4種のヘパリンを準備し、これらを金基板に固定してVEGF165認識能を表面プラズモン共鳴(SPR)測定により評価したところ、分子量分布幅が最小のヘパリン(Mw1000012000)に対して最も高い結合親和性(解離定数:約70 nM)を示すことが分かった。このヘパリンと重合開始基を同時に固定した金基板にVEGF165を結合し、機能性モノマーとしてメタクリル酸をHBD以外の塩基性アミノ酸残基に相互作用させて複合体を形成した。親水性コモノマー、架橋剤を添加して膜厚が約10 nmとなるよう表面開始原子移動ラジカル重合を行った後、残存するVEGF165を除去してMIP薄膜を得た。SPR測定より、VEGF165の結合親和性は単なるヘパリン固定基板に比べて10倍以上向上し、さらに、ヘパリン固定基板ではVEGF165と189の識別能はなかったが、MIP薄膜はこれらを約50%の精度で識別した。以上からヘパリンとカルボキシ基といった2種の相互作用部位をもつ分子認識場の構築が構造類似性の高いタンパク質の識別に効果的である重要な知見が得られた。研究計画に沿ってほぼ予定通り研究は遂行しており、一定の成果が得られた。平成29年度に予定していた「機能性モノマーの設計と合成」について、蛍光検出を指向した蛍光分子を含む機能性モノマーの検討には至らなかったが、非蛍光性の機能性モノマーを用いて作製したMIP薄膜において、ある程度の実験結果が得られため、特に大きな遅延につながることはないと考えている。さらに、今後の実験遂行のための重要な基礎知見が得られたことからも、おおむね順調に進展していると考えている。

本研究では、構造類似性の高いタンパク質として血管内皮細胞増殖因子(VEGF)のアイソフォームVEGF165と189に着目し、高精度で識別可能な分子認識場をもつタンパク質認識人工高分子材料(分子インプリントポリマー;MIP)の創製を目指している。平成30年度では、MIP薄膜創製で重要な相互作用官能基として、VEGF165, VEGF189に存在するヘパリン結合ドメイン(HBD)を認識するヘパリンの誘導体合成に関して検討した。これまでは高分子量でかつ分子量分布の広い(Mw 1000012000)ヘパリンを用いていたが、より精密な分子認識を達成するために低分子量のヘパリンについて検討した。具体的には、分子量が約665、1800、および6001800の分子量分布をもつヘパリンの低分子量のヘパリン3種類に着目した。また本研究では、片末端を化学結合で金基板に固定したヘパリン分子によって標的VEGFを識別すること目指している。つまり、各VEGF認識に重要なヘリックス構造を保ったままヘパリンの片末端を機能化して固定化する必要がある。そこで、ヘパリンの還元性末端に対して、pーアミノチオフェノール基の導入する還元的アミノ化反応条件について検討した。反応温度、時間を検討したところ、室温、24hでは50%のチオール化率だったのに対し、40°Cで24h反応させるとほぼ定量的に反応が進行することが分かった。6001800の分子量分布をもつヘパリンのチオール誘導体に対してDOSY測定を行ったところ、p-アミノチオフェノール基はヘパリンの分子量にほぼ依存せず結合していることが分かった。また、円二色性スペクトル測定より、ヘパリンのヘリックス構造は反応後もほぼ保持されていることが分かった。以上から、分子量に依存せず、定量的にチオール化が可能な反応条件に関する基礎知見を得ることができた。平成30年度に予定していた「各VEGFの分子インプリントポリマー薄膜の作製」について詳細な検討には至らなかったが、これまで非効率的であった末端チオール化と低分子量のヘパリンのチオール誘導体の合成は達成した。より高性能のMIP薄膜を得るために重要な実験結果が得られたので、研究発展において大きな推進力になると考えられる。平成29年度においては、分子量分布1000012000のヘパリンとメタクリル酸を用いたVEGF165のMIP薄膜の形成により、約50%の精度で非標的であるVEGF189と識別可能であることが分かった。今後は、さらなる分子認識能向上のため、ヘパリンの分子鎖長についてさらに厳密に制御するとともに、機能性モノマーの導入方法などについても検討し、研究計画内容を遂行していく。研究を遂行する上で、ヘパリンの分子鎖長の制御が困難な場合はヘパリンに類似した構造を有し分子鎖長の制御が容易な分子についても検討することを考えている。上記を総合的に検討してあらたな知見を得ることにより、平成29年度に作製したMIPよりもさらなる高感度化および高選択的な分子認識能の達成を目指す。平成30年度においては、分子認識能向上のため、これまでより分子鎖長及び分子量分布の小さいヘパリンに着目し、効率的な誘導体合成のための基礎知見を得た。今後はそれらに対する分子認識能の評価と、各種機能性モノマー(蛍光分子を含むもの、あるいは含まないもの)の導入方法についてなどについても検討する。上記を総合的に検討して新たな知見を得ることにより、これまでに作製したMIPよりもさらなる高感度および高選択的な分子認識能の達成を目指す。
次世代口蓋裂治療のための口蓋癒合分子機構の解析

口蓋裂は先天異常であり、遺伝的要因と環境的要因が複雑に関係している。治療法としては、手術が主体であり、先進的な治療法の開発が期待されている。口蓋の発生機序は、両側の上顎突起から口蓋突起が発生し癒合する際に、口蓋板の成長と水平転移または挙上、上皮細胞の接着と自己分解、間葉の癒合という段階を経るとされている。発生段階において、いずれかで障害を生じると口蓋裂が発生する。胎仔マウスを用いて、口蓋癒合時に口蓋突起に著しく発現する遺伝子群を同定した。このデータベースを活用して、口蓋癒合のメカニズムを明らかにしようと研究を進めている。胎仔マウスの口蓋突起の癒合前、癒合中、癒合後の遺伝子発現をマイクロアレー法を用いて解析した。癒合前の遺伝子発現をコントロールとすると、Keratin13は、癒合中に112.6倍、癒合後に290.7倍に上昇することが確認された。Ceacam1は、癒合中に38倍、癒合後に106.1倍に上昇、car3は、癒合中に37.4倍、癒合後に17.2倍に上昇した。ノックアウトマウスを用いた解析では、Ceacam1が口蓋癒合に関与することが明らかになったが、Keratin13、car3との関係は不明であり、他の遺伝子との相互作用についても解析中である。我々のデータベースからTenascinCという細胞外マトリックス蛋白を見出した。リアルタイムPCRと免疫組織染色により、TenascinCが、口蓋の癒合中から癒合後にかけて軟口蓋部に強く発現していた。メカニズム解析を行うために、マウス胎仔口蓋から間葉系細胞を分離し、TGFβ3で間葉系細胞を刺激するとTenascinCの発現が著しく上昇した。以上の結果とノックアウトマウスを用いた解析から、口蓋形成時期の軟口蓋におけるTenascinCの発現は、TGFβシグナルに関与していることが明らかになった。口蓋裂は口蓋に披裂を生じる先天異常であり、遺伝的要因と環境的要因の両者が複雑に関係している。現在のところ、患者に対して、手術を行う治療法が主体である。新しい治療法が期待されているが、未だに発展していないのが現状である。口蓋の発生機序は両側の上顎突起より口蓋突起が発生し、癒合する際に、口蓋板の成長と水平転移または挙上、上皮細胞の接着と自己分解、間葉の癒合という段階を経ると言われているが、このうちのいずれかで障害が起こると口蓋裂が発生する。胎仔マウスをモデルとして用い、口蓋癒合時に口蓋突起に著しく発現する遺伝子群を同定した。このデータベースを活用して、口蓋癒合のメカニズムを明らかにする予定である。まず口蓋癒合に関わる遺伝子を同定し、それらの機能とメカニズムを解明するために、次の項目を予定している。1マウス胎仔の口蓋癒合時に強く発現する遺伝子をマイクロアレーデータから同定する。2RT-PCRや定量的real-time PCRにてmRNAレベルの発現量を確認する。膨大な遺伝子数であり、遺伝子の機能を予測しながら、解析を進めているところである。胎生期マウス口蓋突起の癒合時期に発現する複数の遺伝子を同定した。それぞれの機能を予測するため、免疫組織染色、in situ hybridization法を用いて、発現分布を確認している。引き続いて継続していきたいと考えている。口蓋癒合に関わる遺伝子を同定し、それらの機能とメカニズムを解明するために、胎生期マウスの口蓋突起の癒合前、癒合中、癒合後の遺伝子発現をマイクロアレー法を用いて同定し、Keratin13が、癒合前をコントロールの1とすると、癒合中に112.6倍、癒合後に290.7倍に上昇することが確認できた。現在、これらを含めて、さまざまな変化を有する遺伝子に着目して、RT-PCRや定量的real-time PCRにてmRNAレベルの発現量を確認している。口蓋突起癒合部に特異的に発現する遺伝子の発現分布をin situ hybridization法と免疫染色法を用いて確認し、器官培養を用いたRNA干渉(siRNA)法による阻害実験を用いて機能評価を行う予定である。本研究結果を国際口蓋裂学会等で報告し、様々な領域の研究者から意見をいただきながら、計画を推進しているところである。