hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
不斉求核触媒による高難度分子変換反応の深化と応用

申請者らは独自のアプローチでキラルなN,N-ジメチル-4-アミノピリジン(DMAP)の創製に成功し,さまざまなアシル化反応に適用できることを明らかにしている.しかしアルコールのエナンチオ選択性的アシル化では,使用できるアシル化剤はイソ酪酸無水物に限定されるなど,改善すべき課題もいくつか残されていた.そこで本研究の目的は「様々なアシル化剤を用いることができる汎用性のある反応を開発すること,および簡易型固定化触媒を創製すること」である.本研究の肝となるイオン対の構造に着目した系統的な検討はこれまで報告例はなく,学術的独自性を有すると考えられる.申請者らは独自のアプローチでキラルなN,N-ジメチル-4-アミノピリジン(DMAP)の創製に成功し,さまざまなアシル化反応に適用できることを明らかにしている.しかしアルコールのエナンチオ選択性的アシル化では,使用できるアシル化剤はイソ酪酸無水物に限定されるなど,改善すべき課題もいくつか残されていた.そこで本研究の目的は「様々なアシル化剤を用いることができる汎用性のある反応を開発すること,および簡易型固定化触媒を創製すること」である.本研究の肝となるイオン対の構造に着目した系統的な検討はこれまで報告例はなく,学術的独自性を有すると考えられる.
小胞体ストレス応答センサータンパク質ＰＥＲＫの活性化機構の解明

小胞体ストレス応答に関わるセンサータンパク質の一つであるPERKの活性化機構を明らかにするため、PERK小胞体内腔ドメインおよびPERKの活性制御因子である分子シャペロンBiPのX線結晶構造解析を目的とした実験を行なった。それぞれのタンパク質は大腸菌を用いて大量発現させ、高純度にまで精製することに成功した。さらに両者の複合体形成を確認したが、現在までに結晶構造解析が可能な良質な結晶を得ることはできていない。本研究は、小胞体ストレス応答に重要なセンサータンパク質の一つであるPERKタンパク質およびPERKと相互作用するBiPタンパク質を対象として、構造生物学的見地から機能発現機構を解明することを目的としている。昨年度は大腸菌発現系において不溶性画分に回収されるPERKタンパク質の小胞体内腔ドメイン(LD)を高圧処理によって巻き戻し、BiPとの相互作用を支持する結果を得た。本年度はこれと並行して、可溶性タンパク質を効率的に調整するための検討を行った。PERK LDは小胞体内腔に位置するため、ジスルフィド結合形成が予想される。そこで、大腸菌細胞質内での適切なジスルフィド結合形成を促進するチオレドキシン融合タグと宿主大腸菌Rosetta-gami2(DE3)を用いた発現系を構築した。これにより、可溶性画分にPERK LDタンパク質を回収することに成功した。本発現系はPERKとBiPの相互作用解析においてPERK変異体を調製する際に活用できる。可溶性画分のPERK LDタンパク質は各種カラムクロマトグラフィーによって精製し、単独およびBiPと混合した状態で結晶化条件を探索しているが、現在のところ結晶は得られていない。PERK LDタンパク質は高濃度溶液で容易に凝集し沈殿を形成することから、良質な結晶を得るために、安定性を向上させる緩衝液条件の検討およびドメイン長を変えるなどの発現コンストラクトの改変が必要であると考え、これらの実験を実施している。PERKタンパク質小胞体内腔ドメイン(LD)については、N末端のシグナル配列を除去し、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質の形で発現させ、BiPタンパク質はN末端・C末端のシグナル配列とC末端側に予想される多量体形成領域を除去し、ヒスチジンタグ融合タンパク質の形で、大腸菌において大量に発現させた。BiPタンパク質はNiカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーで高純度に精製可能であったが、PERK LDタンパク質は細胞破砕・遠心分離後の不溶性画分に回収された。発現条件や発現宿主を多数検討しても改善がみられなかったため、高圧処理による不溶性画分からの巻き戻し法の適用を検討した。PERK LDタンパク質を含む大腸菌封入体を洗浄し、凝集抑制効果のあるアルギニン、還元剤、BiPタンパク質の有無による条件下で、200 MPaの高圧処理を施したところ、アルギニンと還元剤を共に含む条件でPERK LDタンパク質の可溶化が認められた。このときBiPタンパク質の有無はPERK LDタンパク質の可溶化に影響を与えなかった。引き続き、高圧処理したPERK LDタンパク質試料をGlutathione Sepharoseカラムに吸着させ、BiPタンパク質を添加することでGST-プルダウン法により、両タンパク質の相互作用を確認した。GSTや樹脂への結合量と比較してGST-PERK LDタンパク質に対するBiPタンパク質の結合量が多かったため、GST-PERK LDタンパク質とBiPタンパク質は相互作用すると判断した。現在、PERK-BiP複合体状態での結晶化を進めている。PERK LDタンパク質が大腸菌において不溶性発現であったため、組換えタンパク質の発現条件を検討した。そのため試料調製に時間を要したが、高圧巻戻し法の適用により可溶化試料を得ることができた。現在のところ、X線結晶構造解析によって構造決定が可能なデータを収集するためのタンパク質結晶が得られていないが、継続的に結晶化を行なっている。BiPタンパク質については、高純度な精製標品の取得に成功しており、こちらも結晶化実験を継続している。昨年度と同様の試料調製を行い、PERK LD-BiPタンパク質複合体の結晶取得を目指す。また、これと並行して可溶性タンパク質を効率的に調製するための発現系の改変も行う。それぞれのタンパク質の単独での結晶化も推し進めるとともに、特にBiPタンパク質については、PERK LDタンパク質を構成する一部のペプチドとの複合体結晶の取得も目指す。これらの研究によりPERK LDタンパク質とBiPタンパク質との相互作用の構造基盤を明らかにするとともに、相互作用を抑制するような機能性分子の開発へとつなげる。該当なし
光機能性分子の発光阻害機構の理論化学的研究

発光性金属錯体の発光強度は三重項励起状態から一重項基底状態への発光の速度定数と項間交差の速度定数の比で特徴付けられる。発光の速度定数はスピン軌道相互作用を含めた遷移双極子モーメントから算出できるが、従来その理論計算は容易では無かった。我々は、本研究で、項間交差の速度論を以下のように求めた。状態間の無輻射失活はFermiのGolden ruleにより、状態間のエネルギー差が小さい領域で起こりやすい。そこで、三重項励起状態と一重項基底状態のエネルギーが等しくなるSeam Crossingの構造とエネルギーを算出することで項間交差の起こりやすい錯体と起こりにくい錯体の違いを定性的に議論することが可能になるはずである。この考えに基づいて、置換基の変更により大きく発光強度が変化する白金錯体を取り上げ、Seam Crossingの構造とエネルギーをDFT法で算出し、系間交差の容易さを評価し、その起源を明らかにした。具体的には、発光強度が小さい白金フェニルピリジン(ppy)・ジケトン錯体と・発光強度が強い白金チアゾルイリデン・ジケトン錯体を取り上げ、Seam CrossingをSingle Component Artificial Force Induced Reaction(SC-AFIR)法により探索した。ppy錯体はジケトン配位子が平面からずれた構造のSeam Crossingが低エネルギー領域に存在することにより容易に熱的に失活し発光性を失うのに対し、チアゾルイリデン錯体はエネルギー的に不利な配位子の歪みを伴うSeam Crossingしか存在せず、従って熱的な失活が起こりにくく、発光が強くなることがわかった。平成30年度が最終年度であるため、記入しない。有機発光ダイオードディスプレイには高効率の緑、赤、青の発光源が必要であるが、現段階で青色発光源の錯体が不安定であるため、より材料として適した発光材料の創成が望まれている。FIrpicは青色発光材料としてよく知られており、高い量子収率Φem (0.95)と長時間発光τem(1.74μs)を示すという特徴がある。発光機能の安定性を改善するためは強い配位子,及び無輻射遷移過程を避けることが必要である。本研究では、青色発光材料として応用が期待されているイリジウム錯体、Ir(4,6-dFppy)2(pic) (FIrpic)について分子内水素結合と量子収率の相関を理論化学計算により明らかにすることを目標とした。計算手法は、通常の密度汎関数法及び時間依存の密度汎関数法を用いた。また、無輻射遷移は3重項状態および1重項状態の交差点を通して進行することから、最もエネルギー的に低い交差点を効率的に求めることが必要であり、これらは(single component artificial induced reaction) SC-AFIR法を用いて行った。分子内水素結合の影響を調べるために、水素結合を持つ錯体及び持たない錯体について、構造、フロンティア軌道、吸収スペクトル、発光スペクトルの解析を行い、比較検討を行った。その結果、水素結合に有無により、交差点のエネルギーが大きく異なり、水素結合があると、エネルギーが高くなり、発光性能が向上することが明らかとなった。これまで、無放射緩和過程の反応経路として、異なる配位子間でのπ1*ー>π2*電子遷移に始まり(S0 ->S1)電子励起のあと、T1/S1の交差を経て、T1の最小エネルギー点に到達し、その後、T1/S0の交差点をへて、S0の最小値に到達することを明らかにした。ここで、T1の最小エネルギー点は、3重項MLCT状態、および、T1/S0交差点は、MC状態として特徴付けられた。高効率の青色発光を実現するためには,無放射緩和の過程を避ける必要、すなわち、T1/S0の交差点のエネルギーレベルが、高いことが望まれるが、水素結合の影響は、このT1/S0のエネルギーレベルに明らかに現れており、内部水素結合を保有する錯体のT1/S0レベルは、持たないものに比べて高いことがわかった。ただし、T1からT1/S0に至る過程で、T1面上に遷移状態がある可能性が考えられ、この遷移状態がT1/S0のエネルギー交差点より高い場合はさらにそれらの比較も重要となる。さらに、スピンー軌道相互作用の影響も考慮しなければならない。発光の速度定数はスピン軌道相互作用を含めた遷移双極子モーメントから算出できる。本研究では項間交差の速度論を以下のようにして考察する。そこで、三重項励起状態と一重項基底状態のエネルギーが等しくなるSeam Crossingの構造とエネルギーを算出することで項間交差の起こりやすい錯体と起こりにくい錯体の違いを定性的に議論することが可能である。そこで、置換基の変更により大きく発光強度の変化する白金錯体についてその起源を明らかにする。白金のフェニルピリジン(ppy)とジケトンとの錯体は発光強度が弱いのに対し、チアゾルイリデンとジケトンとの錯体はより強く発光する。その起源を探るためにSeam Crossingの違いを調べる。各錯体に対しSeam CrossingをSingle Component Artificial Force Induced Reaction(SC-AFIR)法により多数探索した。これまでにppy錯体とチアゾルイリデン錯体についてSeam Crossingとそこに至る遷移状態を特定した。

どちらのSeam Crossingも平面4配位から片方の配位子が軸方向に移動する構造をとることがわかっている。遷移状態もSeam Crossingも構造は似通っているにもかかわらず、バリアの高さは大きく異なっていた。このバリアの高さにより、錯体間の発光強度の違いは定性的に説明できた。Seam crossingと、そこに至るまでの遷移状態を算出し、バリアの高さと発光量子収率の間に相関があることがわかった。一方で、遷移状態のエネルギーの違いを生み出す電子的、構造的要因がまだはっきりしていない。配位子の違いに由来する電子状態の違いを精査し、遷移状態の安定性に影響する因子を特定することを目指す。まだ論文投稿に至っていないので、電子状態の解析が終わり次第取りまとめる計画である。発光性金属錯体の発光強度は三重項励起状態から一重項基底状態への発光の速度定数と項間交差の速度定数の比で特徴付けられる。発光の速度定数はスピン軌道相互作用を含めた遷移双極子モーメントから算出できるが、従来その理論計算は容易では無かった。我々は、本研究で、項間交差の速度論を以下のように求めた。状態間の無輻射失活はFermiのGolden ruleにより、状態間のエネルギー差が小さい領域で起こりやすい。そこで、三重項励起状態と一重項基底状態のエネルギーが等しくなるSeam Crossingの構造とエネルギーを算出することで項間交差の起こりやすい錯体と起こりにくい錯体の違いを定性的に議論することが可能になるはずである。この考えに基づいて、置換基の変更により大きく発光強度が変化する白金錯体を取り上げ、Seam Crossingの構造とエネルギーをDFT法で算出し、系間交差の容易さを評価し、その起源を明らかにした。具体的には、発光強度が小さい白金フェニルピリジン(ppy)・ジケトン錯体と・発光強度が強い白金チアゾルイリデン・ジケトン錯体を取り上げ、Seam CrossingをSingle Component Artificial Force Induced Reaction(SC-AFIR)法により探索した。ppy錯体はジケトン配位子が平面からずれた構造のSeam Crossingが低エネルギー領域に存在することにより容易に熱的に失活し発光性を失うのに対し、チアゾルイリデン錯体はエネルギー的に不利な配位子の歪みを伴うSeam Crossingしか存在せず、従って熱的な失活が起こりにくく、発光が強くなることがわかった。Pt(II)錯体は強いスピンー軌道相互作用とそのsquare planar構造のため優れた発光材料として知られている。先行するPt(II)錯体における理論化学計算では、無輻射緩和過程は、3重項のMC状態からMECPを経て、S0に緩和することが報告されている。さらに、三重項では、その他のいくつかのMLCT/LLCT最小エネルギー構造が認められ、このうち最もfrank-condon点の構造に近いT1エネルギー最小構造から放射減衰が起こる、一方でT1/S0
個体差が減量幅に与える影響を考慮したオーダーメイド減量プログラムの開発

本研究の目的は以下の2つの課題を遂行することであった。A.遺伝情報などのパラメータが減量の個体差に与える影響力を数値化する。B.個体差を考慮したオーダーメイド減量プログラムの有効性を検討する。本研究課題を達成するために,今年度だけで175名に対する減量介入を実施した。この3年間で構築したデータベースは,男性123名,女性467名,合計590名に達した。このうち350名については,140個の遺伝子に含まれる742個の一塩基遺伝子多型(SNP)の解析が終了している。さらに,性別,年齢,閉経の前後,形態,体組成,体脂肪分布,体力レベル等の減量前後の測定結果がデータベースに組み込まれている。このデータベースを用いて解析を進めた結果,以下のような新たな知見が得られた。1.体重減少によりメタボリックシンドローム構成因子は確実に改善する。体重の減少方法は,食事療法+運動療法,食事療法,運動療法の順に効果が大きい。減量目標の目安は初期体重の5%程度と言われているが,10%以上の体重減少で効果が拡大する。2.決定木分析(データを様々な条件を基準に木の枝葉のように分類していく分析手法)を用いることにより,メタボリックシンドローム構成因子改善のための体重減少率は8.4%以上であることを明らかにした。3.体重減少率の個体差を減量前の各指標(性,年齢,閉経の前か後か,形態,体組成,体脂肪分布,体力レベル)の個体差から予測することは困難である,との結論を導いた。4.肥満関連遺伝子のSNP情報によって,体重減少率の個体差を予測することは可能である,と考えられた。その具体的なSNPの特定については,今後のさらなる研究成果が待たれるところである。5.食事群と食事+運動群の体重減少率の差は,SNPの組み合わせによっては,45%に達することが示唆された。本研究は以下の2つの課題より構成される.課題A.遺伝情報などのパラメータが減量の個体差に与える影響力を数値化する.課題B.個体差を考慮したオーダーメイド減量プログラムの有効性を検討する.上記の研究目的を達成するために,今年度は研究分担者および従来の共同研究者の協力を得て,肥満者に対する減量介入を実施するとともに過去の研究参加者を再リクルートし,生体情報および遺伝情報のデータベース化を試みた.肥満者の減量介入は,男性60名,女性60名,計120名について,食事療法と運動療法による3か月間の減量指導をおこない,減量の前後に形態,体組成,体脂肪分布,体力レベル,血清脂質などを検査した.これらの検査値により定量化された減量効果を肥満関連遺伝子変異の情報とともに,データベースに組み込んだ.また,遺伝情報の収集のためにリクルートされた過去の研究参加者は女性120名であり,すでに構築済みのデータベースに遺伝情報を組み込んだ.さらに,研究分担者および共同研究者とともに,来年度に実施予定である減量介入および再リクルートの方法について打ち合わせをした.そして,研究内容について再度確認し,円滑な研究遂行の準備を整えた.来年度は,今年度同様,減量介入に関するデータを蓄積していくとともに,個別減量プログラムを作成し,その有効性を検証するための準備を整える.研究目的の達成に向けて,情報収集およびデータ解析作業を進めていく.本研究は以下の2つの課題により構成される。今年度は課題Aを達成するために,肥満者95名に対する減量介入を実施するとともに,肥満関連遺伝子として111個の遺伝子に含まれる642個の一塩基多型を解析した。さらに,性別,年齢,閉経の前後,形態,体組成,体脂肪分布,体力レベル等を測定した。これまでに構築してきたデータベースに今年度の結果を組みこむことにより,男性51名,女性460名が減量介入試験に参加し,男性44名(86%),女性421名(92%)が3ヵ月間の減量指導と減量前後の測定を完遂したことになる。遺伝子抽出については,男性51名,女性333名のDNA抽出が終了し,そのうち164名分については63個の遺伝子に含まれる188個のSNP解析を終了し,さらに99名分については111個の遺伝子に含まれる642個のSNP解析を終了した。これまでのデータ解析から,減量の個体差に影響を与える因子として,初期体重,運動療法併用の有無,持久性体力,暦年齢,閉経の前後が挙がっている。さらに,遺伝子解析の結果から,10個の遺伝子に含まれる一塩基多型が関連する可能性が示唆されている。来年度は不足している男性の減量介入データを蓄積するために,男性100名を対象とした介入研究を実施する。さらに,進行が遅れている遺伝子解析を進め,500名規模のデータセットを用いて,課題Aを達成する。その結果から,課題Bの準備段階として,個体差を考慮したオーダーメイド減量プログラムの作成システムを構築する。

このうち350名については,140個の遺伝子に含まれる742個の一塩基遺伝子多型(SNP)の解析が終了している。さらに,性別,年齢,閉経の前後,形態,体組成,体脂肪分布,体力レベル等の減量前後の測定結果がデータベースに組み込まれている。このデータベースを用いて解析を進めた結果,以下のような新たな知見が得られた。1.体重減少によりメタボリックシンドローム構成因子は確実に改善する。体重の減少方法は,食事療法+運動療法,食事療法,運動療法の順に効果が大きい。減量目標の目安は初期体重の5%程度と言われているが,10%以上の体重減少で効果が拡大する。2.決定木分析(データを様々な条件を基準に木の枝葉のように分類していく分析手法)を用いることにより,メタボリックシンドローム構成因子改善のための体重減少率は8.4%以上であることを明らかにした。3.体重減少率の個体差を減量前の各指標(性,年齢,閉経の前か後か,形態,体組成,体脂肪分布,体力レベル)の個体差から予測することは困難である,との結論を導いた。4.肥満関連遺伝子のSNP情報によって,体重減少率の個体差を予測することは可能である,と考えられた。その具体的なSNPの特定については,今後のさらなる研究成果が待たれるところである。5.食事群と食事+運動群の体重減少率の差は,SNPの組み合わせによっては,45%に達することが示唆された。
細胞老化制御タンパク質による新たな骨代謝調節機構の解明と治療への応用

骨粗鬆症や変形性関節症において加齢は重要な危険因子であるが、最近体内に蓄積した老化細胞が病態の原因となることがわかってきた。しかしながら、老化細胞がどのように老化した骨軟骨組織の病態に関与しているか不明な点が多い。申請者らは、細胞の老化制御に関わる2つの塩基性へリックスループヘリックス(bHLH)型転写因子が骨形成に関わる可能性を見出した。本研究では、bHLH型転写因子の骨代謝と骨の老化における役割及びその調節機構を、老齢や若齢の遺伝子欠損マウスを用いて明らかにすることを目的とした。2種類の遺伝子bHLH型転写因子のノックアウト(KO)マウスと野生型(WT)のマウスの大腿骨の海綿骨量を、μCTスキャナーを用いて解析した結果、どちらKOマウスの場合もWTマウスと比較して骨量が増加していた。まずbHLH-1 (Nupr1) KOマウスを用いて大腿骨の骨形態計測を行ったところ、骨面上の骨芽細胞数の増加や類骨量の増加が見られた。さらに、カルセイン及びテトラサイクリンを用いた2重骨標識を行い骨形成の動的な状態を調べたところ、bHLH-1 KOマウスはWTマウスと比較して骨形成が有意に亢進していた。そこで、bHLH-1 KOとWTの新生児マウスから骨芽細胞前駆細胞を単離して、in vitroにおける骨芽細胞の増殖及び分化能を比較した。その結果、bHLH-1 KOマウス由来の骨芽細胞前駆細胞は増殖能が高く骨芽細胞の分化したときにOsteocalcin, Osteopontin Bone sialoproteinなどの骨芽細胞特異的な遺伝子の発現が顕著に上昇していた。さらにアリザリン染色により骨芽細胞の石灰化能を比較したところ、bHLH-1 KOマウスの骨芽細胞において石灰化が亢進していた。2種類のbHLH型転写因子KOマウスにおいて、KOマウスの海綿骨骨量がWTマウスと比較し増加しているという結果を得たが、bHLH-1型転写因子KOマウスについては蛍光2重標識法により骨形成が促進していることと新生児マウスの頭蓋冠から単離した骨芽細胞を使用し、実際に骨芽細胞の分化の促進や石灰化が亢進しているということを確認することが出来た。また骨形成促進のメカニズムに関わる興味深い結果も得られている。現在bHLH-1型転写因子KOマウス及びWTマウスを維持しており、今後、老齢マウスの骨量などの解析を行う予定にしている。また、もう一方のbHLH-2 KOマウスについては、現在脛骨の海綿骨の骨形態計測を行っている。それぞれのマウスを使用して骨形成やその促進のメカニズム及び病態モデルを使用した実験などを行う予定としている。

それぞれのマウスを使用して骨形成やその促進のメカニズム及び病態モデルを使用した実験などを行う予定としている。bHLH-2型転写因子KOマウスについては、マウスの繁殖に困難を生じ当初の予定よりマウスの繁殖に時間を要したため、次年度使用額は現在行っている骨形態計測の解析の費用等に充てる。また、次年度もマウスの維持や病態解析、細胞培養関連器具類、培地等に使用する予定である。
生体膜マイクロドメインと膜受容体の可視化による揮発性麻酔薬の作用機序の解明

本課題は生細胞を用いたライブセルイメージング法(FRAP法)による揮発性麻酔薬の作用機序の研究である.細胞膜をマイクロドメインと非マイクロドメインという機能的成分に分類し,各々に対する蛍光標識を作成して,共焦点レーザー走査型顕微鏡で側方拡散の動態解析を行った.その結果,非マイクロドメインの蛍光標識(トランスフェリン受容体,膜貫通型タンパク質)の流動性のみがイソフルランによって増加した.膜貫通型タンパク質の側方拡散はシグナル伝達に影響を与えるため,揮発性麻酔薬による側方拡散促進は,薬物作用機序の一部を担っている可能性がある.本研究は、揮発性麻酔薬の作用機序解明の研究である。これまでの報告では、細胞膜脂質あるいや個々の受容体タンパク質の機能解析が中心となっていたが、本研究は細胞膜脂質と受容体タンパク質を1つの機能コンプレックスとして捉える「脂質マイクロドメイン(以下マイクロドメイン)」という概念にスポットを当てたものである。マイクロドメインは構造的に高密度のコレステロール、スフィンゴ脂質、受容体タンパク質から成っている。マイクロドメインを蛍光プローブによって標識し、可視化することで揮発性麻酔薬がマイクロドメインに与える影響を捉えることを目的とする。この研究は麻酔状態下における脂質タンパク機能相関を解析するユニークな試みであり、麻酔メカニズム研究に新たな切り口を与えることが期待される。平成27年度では、マイクロドメインおよび麻酔関連受容体タンパク質の標識設計を行う計画であった。用いる標識はHalotag, SNAPtag, CLIPtagを予定していた。これらのタグ・タンパク質は、それ自体は発光せず、発光用低分子リガンドが結合して初めて発光するものである。特徴としてはGFPよりも発光時間が長く、発光のタイミングや強度を調節しやすい。複数種類のタグ・タンパク質を用いることで、1つの細胞を複数色で発光させることができる。これらのタグ・タンパク質をマイクロドメイン分画もしくは非マイクロドメイン分画に特異的に発現しているタンパク質に付加し、生細胞の細胞膜上に発現させることが本研究を遂行するうえで最も重要な点となる。標識タンパク質が発現すれば、共焦点蛍光顕微鏡を用いて生細胞膜上での挙動を特異的且つリアルタイムに補足することが可能となる。マイクロドメインの標識には、そこに集積するGPI(glycosylphosphatidylinositol)アンカー型タンパク質を利用した。GPIアンカー型タンパク質はマイクロドメインの特異的マーカーとして知られている。また、マイクロドメイン分画と対を成す、非マイクロドメイン分画の標識にはトランスフェリン受容体タンパク質を用いた。Halotagを用いてGPIアンカー型タンパク質やトランスフェリン受容体を標識し、イソフルラン麻酔下の動態解析を行った結果は2015年日本麻酔下学会で報告を行った。麻酔関連受容体の標識については、GABAA受容体α1サブユニットにHalotagやSNAPtagを付加した標識遺伝子を作成した。これらの遺伝子をHEK293t細胞やラット胎児脳神経初代培養細胞にリポフェクション法により遺伝子導入を行ったが、発光が認められなかった。この原因として考えられるものに、標識遺伝子が細胞内に導入されていない、細胞内には取り込まれたが核内に移行できない、核内に移行できたが少量のため発現効率が極端に低いか、であると推測している。細胞密度、DNA量、リポソーム試薬量、反応時間等の実験条件を工夫して遺伝子導入を試みてみたが、現在のところGPIアンカーやトランスフェリン受容体タンパク質のような導入効率が得られていない。今後の方針として、エレクトロポレーション法、ウイルスベクターの利用等を検討したいと考えている。また、GABAA受容体サブユニットだけでなく、NMDA受容体といった他の麻酔関連受容体から着手することも検討している。本研究は揮発性麻酔薬の作用機序解明の研究である。揮発性麻酔薬は神経シグナル伝達を修飾することで麻酔作用を発揮すると考えられているが、詳細なメカニズムは不明なままである。我々は脂溶性が高い揮発性麻酔薬が脂質二重膜へ非特異的に分布するという性質に着目し、膜に存在するマイクロドメインを主たるターゲットに研究を進めている。マイクロドメインは構造的に高密度のコレステロールとスフィンゴ脂質、受容体タンパク質を内包している。このような構造的特徴から、近年では細胞外から細胞内へのシグナル伝達において、マイクロドメインが細胞機能の制御に重要な役割を持つことが多数報告されている。我々の研究手法としては、生きた細胞膜のマイクロドメイン成分、非マイクロドメイン成分、麻酔関連受容体を蛍光色素でラベリングし、麻酔薬を作用させたときの動態変化を解析するものである(=ライブセルイメージング)。ライブセルイメージングとは、文字通り生きた培養細胞を用いて、細胞膜上の蛍光標識した分子の動態を、共焦点レーザー走査型顕微鏡を使って薬物作用時にリアルタイムで観察する手法である。これまでの報告では、ライブセルイメージングを用いて麻酔作用機序を解析したものは見当たらない。従来からの人工膜を用いた報告により貴重な知見が蓄積されてきたが、複雑な生体膜への作用を理解する上ではライブセルイメージングが有効である。本研究計画では、3年間のうちに蛍光タンパクの標識設計と、ライブセルイメージングによる動態解析に大まかに分けていた。概ね順調に進展している。平成27年度にはマイクロドメイン成分と非マイクロドメイン成分の標識を使った研究発表を日本麻酔科学会第62回学術集会で行った。実験前の予想に反し、HEK293T細胞のマイクロドメイン成分の動態は揮発性麻酔薬によって変化せず、非マイクロドメイン成分のみに変化が認められた(=膜貫通受容体の流動性の増加)。

また、神経細胞を使った実験でも同様の傾向が認められたが、HEK293T細胞に比べると顕著であった。これらの結果は脂質二重膜の中でも揮発性麻酔薬に反応する成分とそうでない成分に分かれること、また細胞種によって反応性の大きさに違いがあることを示唆している。平成28年度は膜貫通受容体の流動性変化が揮発性麻酔薬によるものかを確認するために、分担研究者と共に可逆性確認実験に取り組んだ。この実験の特徴は、Y字型のマイクロ流体デバイスを用いていることである。これは半導体作製技術を応用してスライドグラス内に200マイクロメートル四方の断面を持つ微細流路を掘ったものであり、流路に置いた1つの細胞にフォーカスを当てて経時的に蛍光動態を追跡できるシステムである。麻酔薬を作用時と麻酔薬をウォッシュアウトした後の動態変化を1つの細胞を用いて経時的に測定できる。この実験結果は平成29年度日本麻酔科学会第64回学術集会で発表する予定である。これらの研究と同時進行でGABAA受容体αサブユニットに標識を行うべく遺伝子設計を連携研究者と行ってきた。出来上がった標識遺伝子を株化細胞HEK293TとA9に導入を試みたが、細胞膜上の蛍光を確認できなかった。この問題を検討したところ、遺伝子発現プロモーターが弱い可能性があり、現在はプロモーターの改良に取り組んでいる。本研究は揮発性麻酔薬の作用機序解明の研究である.揮発性麻酔薬は神経シグナル伝達を修飾することで麻酔作用を発揮すると考えられているが,詳細なメカニズムは不明なままである.これまでの報告では、人工膜を用いた実験系によって膜脂質あるいは個々の受容体タンパク質の機能解析が行われてきたが,本研究は細胞膜脂質と受容体タンパク質を1つの機能コンプレックスとして捉える「脂質マイクロドメイン(以下マイクロドメイン)」という概念にスポットを当てたものである.マイクロドメインは高密度のコレステロールとスフィンゴ脂質、受容体タンパク質を内包していることから,近年では細胞外から細胞内へのシグナル伝達において重要な役割を持つことが示唆されている.こうした事実から,マイクロドメインが揮発性麻酔薬の作用機序に関係しているのではないかと仮説を立てた.具体的な研究手法として,生きた細胞膜のマイクロドメイン成分,非マイクロドメイン成分を蛍光色素で標識し,麻酔薬を作用させたときの蛍光色素の動態変化を解析した(=ライブセルイメージング).この手法を用いることで,より臨床像に近い麻酔作用を視覚可でき,且つ動態解析によって数値化が可能になると考えた.これまでライブセルイメージングを用いて揮発性麻酔薬の作用機序を調べた報告は見当たらない.
超音波pulsed Doppler法による臍帯循環動態の検討

臍帯の走行条件により局所的に循環障害が生じ得る可能性を検討することを目的に,以下の検討を行った.臍帯は,胎児の栄養・呼吸をつかさどる胎盤と胎児とをつなぐ唯一の血管であり,文字道理胎児にとって生命線である.その循環障害は,胎児仮死や子宮内死亡につながるが,現在においてもなお,臍帯そのものの循環動態について検討した報告はほとんどみられない.臍帯静脈pulsationは,通常胎児心不全に伴って出現することが知られているが,我々は胎児心に異常を認めない例においても,一時的且つ局所的にpulsationが出現し得ることを報告,さらに臍帯循環障害の天与のmodelともいうべき臍帯過捻転の症例において心障害が認められないにもかかわらず,臍帯全長にわたってpulsationが出現することを明らかにした,今回,この局所的pulsationの出現を指標として,臍帯の局所的循環障害を評価し得るか否かにつき検討を加えた.臍帯静脈を超音波colour flow mapping法またはpower Doppler法を用いて描出し,臍帯静脈において生じる局所的拍動流(以下pulsation)の出現の有無と臍帯の走行条件との関係を検討した.対象は,臍帯静脈の局所的pulsationを認めた正常妊婦である.超音波pulsed Doppler法により検討した.臍帯の走行条件については,hard copy上において超音波pulsed Doppler法のsampling volumeの中心から各2cmの位置における臍帯静脈の走行方向に接線を引き,2本の接線の交角を臍帯局所における屈曲度とした.これを用い,臍帯の屈曲と循環への影響について検討した.さらに,臍帯が胎児・胎盤や子宮壁などにより圧迫されて走行している場合には,それらについても検討の対象とした.臍帯屈曲度が60°以上ある場合には,全例で臍帯静脈pulsationが観察された.また,屈曲度が59°以下30°以上の場合には47%,29°以下の場合には22%に認められ,屈曲度が小さくなるにつれて臍帯静脈pulsation出現の頻度が低下することが明らかとなった.さらに屈曲度が5930°でpulsation陽性の1例と29°以下の2例では,臍帯が子宮壁や胎児などにより挟圧されて走行しているのが観察された.超音波pulsedDoppler法による臍帯静脈血流評価により,臍帯の急激な屈曲部位や胎児などによる外部からの圧迫が生じている部位では,局所的なpulsationが出現していることが明らかとなった.今回の検討では,局所的なpulsationが認められていた妊婦を対象としていたため,Whalton′s jellyが少ないなど臍帯が脆弱な例が多くなっていた可能性はあるものの,超音波pulsed Doppler法により,局所的な臍帯循環障害の診断の可能性が示唆された.今後,分娩時の検討を行うことにより,より効率的な胎児monitoring systemの開発につながるものと考えられる.臍帯の走行条件により局所的に循環障害が生じ得る可能性を検討することを目的に,以下の検討を行った.臍帯は,胎児の栄養・呼吸をつかさどる胎盤と胎児とをつなぐ唯一の血管であり,文字道理胎児にとって生命線である.その循環障害は,胎児仮死や子宮内死亡につながるが,現在においてもなお,臍帯そのものの循環動態について検討した報告はほとんどみられない.臍帯静脈pulsationは,通常胎児心不全に伴って出現することが知られているが,我々は胎児心に異常を認めない例においても,一時的且つ局所的にpulsationが出現し得ることを報告,さらに臍帯循環障害の天与のmodelともいうべき臍帯過捻転の症例において心障害が認められないにもかかわらず,臍帯全長にわたってpulsationが出現することを明らかにした,今回,この局所的pulsationの出現を指標として,臍帯の局所的循環障害を評価し得るか否かにつき検討を加えた.臍帯静脈を超音波colour flow mapping法またはpower Doppler法を用いて描出し,臍帯静脈において生じる局所的拍動流(以下pulsation)の出現の有無と臍帯の走行条件との関係を検討した.対象は,臍帯静脈の局所的pulsationを認めた正常妊婦である.超音波pulsed Doppler法により検討した.臍帯の走行条件については,hard copy上において超音波pulsed Doppler法のsampling volumeの中心から各2cmの位置における臍帯静脈の走行方向に接線を引き,2本の接線の交角を臍帯局所における屈曲度とした.これを用い,臍帯の屈曲と循環への影響について検討した.さらに,臍帯が胎児・胎盤や子宮壁などにより圧迫されて走行している場合には,それらについても検討の対象とした.臍帯屈曲度が60°以上ある場合には,全例で臍帯静脈pulsationが観察された.また,屈曲度が59°以下30°以上の場合には47%,29°以下の場合には22%に認められ,屈曲度が小さくなるにつれて臍帯静脈pulsation出現の頻度が低下することが明らかとなった.さらに屈曲度が5930°でpulsation陽性の1例と29°以下の2例では,臍帯が子宮壁や胎児などにより挟圧されて走行しているのが観察された.超音波pulsed

Doppler法による臍帯静脈血流評価により,臍帯の急激な屈曲部位や胎児などによる外部からの圧迫が生じている部位では,局所的なpulsationが出現していることが明らかとなった.今回の検討では,局所的なpulsationが認められていた妊婦を対象としていたため,Whalton′s jellyが少ないなど臍帯が脆弱な例が多くなっていた可能性はあるものの,超音波pulsed Doppler法により,局所的な臍帯循環障害の診断の可能性が示唆された.今後,分娩時の検討を行うことにより,より効率的な胎児monitoring systemの開発につながるものと考えられる.
誤答フィードバックの学習促進効果を応用したCAI教材の開発

誤答フィードバックを活用したCAI教材の開発にあたって,学習時の反応形式の影響を検討するため,学習者の初期テスト学習の形式(用紙を用いての手書きテスト,PCを用いてのキーボードタイピング)がテスト効果に及ぼす影響を比較検証した。大学生36名を対象に,連想価の低いカタカナ語の対連合課題36対(各条件12対)を用いて,初期テスト学習の形式(3条件:手書き,キーボード,およびテスト学習を行わない読むだけの統制条件)×1週間後の最終テストの形式(2群:手書き,キーボード)の混合計画実験を行った。その結果,最終テストの成績は,どちらの群でも,初期テスト学習を行った条件の成績が統制条件よりも高く,テスト効果の存在が確認された。他方,初期テスト学習の形式間で比較すると,最終テストをキーボードで回答した群では差が見られなかったが,手書き群では,初期テスト学習の手書き条件が,キーボード条件よりも成績が高い傾向が見られた。これにより,キーボードで学習した場合,検索パフォーマンスが最終テストの状況に左右される可能性が示唆された。本計画の主目的である,視線測定機器を用いた注意配分仮説の検討が遅れている。その間接的な原因は,所属機関における他の業務に時間を割かれたためであるが,直接的な原因は,視線の測定が難航したことにある。視線の測定が難航した原因の一つは,被験者の顔の動きであったが,これについてはアゴ台の使用をやめ,背もたれの大きい椅子に深く腰掛けさせること,被験者には回答を口頭報告させ,実験者が回答を入力させることによって解決できた。もう一つの原因は,被験者の利き目の影響である。これについては,近赤外線カメラを追加購入し(現在は右目のみ),測定時に左右を選択できるようにして解決する予定である。前年度に大学生28名を対象に,誤答フィードバックの有無×確信度の2要因参加者内実験を行い,誤記憶の修正における注意配分仮説に関する検証を行った。統計的な有意差は見られなかったものの,FBの効果が低確信度領域において見られ,仮説を支持する方向のデータが得られた。このデータについて,平成28年10月の日本教育心理学会第58総会で「学習時の誤答の視覚的フィードバックが正答の学習に及ぼす影響ー漢字熟語の読み課題を用いてー」というテーマで発表した。また,同学会において「想起の学習促進効果ー学習機会としてのテストの効用ー」というテーマで自主シンポジウムを共同研究者とともに企画し,話題提供を行った。平成28年度は,前年度のデータについて,統計的な検討を行うために,12名の参加者を追加したが,それでも十分とは言えず,更に実験を続けている。平成28年度の当初予定では,アイカメラを用いて,FB時の参加者の視線を分析することで,注意配分仮説を検証する予定であったが,アイカメラの購入設置とその制御に予想以上の時間がかかり,未だに当初目的の実験を開始することができていない。アゴ台を用いて参加者の顔を固定し,キーボードでの入力を実験者側で行うようにしているが,予備実験では課題時の実験参加者の顔の動きを完全に制御することができず,視線を適切にデータ化することができなかった。このため,モニタの大きさと顔の距離を変化させ,妥当な課題状況を探るための予備実験を繰り返している最中である。それでもなお,試行単位で視線の動きによる分類はかなり困難であると予想されるので,参加者単位で視線の特徴による分類を行い,参加者間の分析に切り替えることも視野にいれている。平成29年度は具体的な学習教材の開発も行う予定であったが,まずはアイカメラを用いた注意配分仮説の検証実験の実施を優先させ,実施を急いでいく。本研究では,低い確信の誤答と高い確信の誤答を分析することが重要であるが,高い確信の誤答を十分に集めることが難しい。高い確信の回答は正答であることが多いので,これは必然的なことであり,当初から予想されていたことであったが,思った以上に集まらなかった。解決策としては,単純に参加者の人数を増やすことであるが,この実験は一人の参加者につき90分以上かかるため,その追加実験に時間を割かれている。また,平成29年度の主たる計画であったアイカメラを用いての視線による注意の分析については,アイカメラの購入設置とその制御に予想以上の時間がかかってしまった。平成29年度は,所属組織における改組等もあり,予備研究のみで具体的な実績を全く残すことができなかった。アイカメラによる視線分析が本研究であるが,測定がうまくいかないことが平成28年度より課題となっており,ピッチをあげて取り組んでいくことを宣言していたが,実際には全く進めることができなかった。当初の目的にはなかったが,誤答FBの学習促進効果を教育実践に応用する際,使用する媒体(コンピュータ,手書き,タッチパネル)の影響が大きいことが,予備実験や他の先行研究の調査から分かってきた。このため,29年度後期は,これを調べるための実験の準備を始めた。共同研究であるが,対連合学習を用いた場合の誤答の学習促進効果の実験,共同学習事態における他者による誤答の学習阻害効果に関する実験の課題作成および分析を担当した。基本的には自身の怠慢に帰されることである。強いて言えば,所属大学において所属学科を含む組織改編があり,これに伴う管理・運営に関わる仕事に多くの時間を割くこととになったことがある。

誤答フィードバックを活用したCAI教材の開発にあたって,学習時の反応形式の影響を検討するため,学習者の初期テスト学習の形式(用紙を用いての手書きテスト,PCを用いてのキーボードタイピング)がテスト効果に及ぼす影響を比較検証した。大学生36名を対象に,連想価の低いカタカナ語の対連合課題36対(各条件12対)を用いて,初期テスト学習の形式(3条件:手書き,キーボード,およびテスト学習を行わない読むだけの統制条件)×1週間後の最終テストの形式(2群:手書き,キーボード)の混合計画実験を行った。その結果,最終テストの成績は,どちらの群でも,初期テスト学習を行った条件の成績が統制条件よりも高く,テスト効果の存在が確認された。他方,初期テスト学習の形式間で比較すると,最終テストをキーボードで回答した群では差が見られなかったが,手書き群では,初期テスト学習の手書き条件が,キーボード条件よりも成績が高い傾向が見られた。これにより,キーボードで学習した場合,検索パフォーマンスが最終テストの状況に左右される可能性が示唆された。本計画の主目的である,視線測定機器を用いた注意配分仮説の検討が遅れている。その間接的な原因は,所属機関における他の業務に時間を割かれたためであるが,直接的な原因は,視線の測定が難航したことにある。1回の実験に90分以上の時間が必要なので,学生アルバイトを実験助手として用いて,実験を進めていく。アイカメラを用いた実験の課題状況を整えることについては,エフォートを費やし,急いでいく。これについても,予備実験に学生アルバイトを実験助手として用いて進めていく。これまでの卒業研究指導では,学生に自由にテーマを選ばせていたが,今年度は,学生に自身の研究テーマをよく説明し,指導教員とともに研究に取り組むことの学習効果を伝えた。これにより,4名の学生(3年生2名,4年生2名)が共に研究に取り組んでくれることを了承してくれた。彼らの協力と,助手アルバイト学生の力を借りることによって,研究を前に推し進める。視線の測定が難航した原因の一つは,被験者の顔の動きであったが,これについてはアゴ台の使用をやめ,背もたれの大きい椅子に深く腰掛けさせること,被験者には回答を口頭報告させ,実験者が回答を入力させることによって解決できた。もう一つの原因は,被験者の利き目の影響である。これについては,近赤外線カメラを追加購入し(現在は右目のみ),測定時に左右を選択できるようにして解決する予定である。旅費については,1つの学会出張は,所属機関での教育研究予算で賄ったため残額が生じた。人件費については,予定していた数の実験ができなかったことと,行った実験については所属機関での教育研究予算で賄ったため残額が生じた。研究状況の説明に記した通り,具体的な実験活動を行うことができなかった。費用は今年度の実験の実施(主として実験参加者の謝金,学生アルバイトへの謝金)に使用する。研究の進捗が遅れたため,研究期間の延長を申請した。2019年度は,近赤外線カメラの追加購入と,被験者に対する謝礼,学会出張費としての支出を予定している。出張費については,平成29年度の旅費に追加する。人件費については,実験参加者および実験助手への謝礼に充てる。
コラ-ゲン・アパタイト複合マトリックス内での細胞分化

血液細胞などの浮遊細胞を除けば多くの正常細胞は足場依存性であり適切な支持体を必要とする。従来の細胞培養法における支持体はプラスチック製シャ-レという二次元平面上でなされており、三次元支持体としてはコラ-ゲンなどのゲルが試みられているに過ぎない。我々は結合組織の細胞とくに骨芽細胞の分化には、コラ-ゲン線維とアパタイトの2大成分を主とした固体基質が生体内における支持体になっている事実に着目し、新しい三次元細胞支持体を考案してin vitroおよびin vivoの実験を行い次の結果を得た。1.骨芽細胞をコラ-ゲンゲル上にて培養するとプラスチック平板と同程度の分化速度〔アルカリホスファタ-ゼ(ALP)を指標とする〕を示し、約20日で骨様組織を形成した。ここに骨形成タンパク質(BMP)の粗抽出液を加えるとALP活性は2倍に上昇した。2.アパタイト顆粒をシャ-レ上に敷いて骨芽細胞を培養すると対照のシャ-レよりも数倍の細胞数に達し且、総ALP活性も増大した。3.このアパタイト顆粒にI型コラ-ゲンを配合すると、アパタイト単独よりもALP活性が約4倍も上昇した。さらに、両系にリコンビナントBMPー2を加えた結果はいずれも約20%ALP活性が上昇した。アパタイトにコラ-ゲンを添加すると、BMPの添加効果を上まわって分化を促進させたことは、この複合体が骨芽細胞の分化にきわめて効果的なin vitro用の支持体であることがわかった。4.多孔質顆粒状アパタイトおよびコラ-ゲン線維膜を調製し、これに精製BMPを含浸させてラットの皮下に埋植したところ、前者では直接骨形成(軟骨形成を経過せず)が起き、後者では膜内部に軟骨が、表面には骨が形成された。以上により、骨芽装胞の分化はコラ-ゲンとアパタイトから構成される支持体に大きく依存することが明らかにされた。近年、細胞外基質(ECM)が、細胞の機能発現に大きな役割を果たしていることが明らかとなってきた。骨基質は無機成分であるアパタイトと有機成分のコラ-ゲンがその大部分を占めているが、これらが骨芽細胞の機能発現にどのような影響を与えているかはほとんど知られていない。申請者らはこれらのECMが骨芽細胞の形質発現にとって必須の条件を提供すると考え、コラ-ゲンとアパタイトを用いて骨芽細胞の培養を行い、形質発現にどのような影響を与えるかを調べた。コラ-ゲンゲル上で骨芽細胞を培養すると、石灰化の遅延が認められたが、コラ-ゲンゲル内で培養すると石灰化が広範囲に認められた。このことはECM内で細胞がどのような3次元構造をとるかが機能発現にとって重要であることを示している。一方、アパタイト上で牛骨細胞を培養すると、牛骨由来の天然アパタイトそして合成アパタイトいずれの場合にも骨芽細胞のアルカリフォスファタ-ゼ活性が上昇し、細胞分裂の抑制が認められた。細胞分裂の抑制は、アパタイト上で培養した場合がコラ-ゲンゲル培養よりも顕著であり、両者の骨芽細胞へ及ぼす効果は異なったものと思われる。最近、細胞分裂に関与するプロトオンコジ-ンであるcーfosやcーjunの発現が細胞の形質発現を抑制していることが明らかとなり、細胞増殖と形質発現の関係が明らかになってきた。アパタイトやコラ-

ゲン培養で認められた分裂抑制も同様の機構によるものか現在のところ不明であるが、骨芽細胞がその機構を十分に発揮するためには、細胞増殖が抑制されていなければならないことは明らかである。今後、アパタイトとコラ-ゲンの複合体を用い、どのような条件が骨芽細胞の機能発現にとって最も効果的かを検討する予定である。血液細胞などの浮遊細胞を除けば多くの正常細胞は足場依存性であり適切な支持体を必要とする。従来の細胞培養法における支持体はプラスチック製シャ-レという二次元平面上でなされており、三次元支持体としてはコラ-ゲンなどのゲルが試みられているに過ぎない。我々は結合組織の細胞とくに骨芽細胞の分化には、コラ-ゲン線維とアパタイトの2大成分を主とした固体基質が生体内における支持体になっている事実に着目し、新しい三次元細胞支持体を考案してin vitroおよびin vivoの実験を行い次の結果を得た。1.骨芽細胞をコラ-ゲンゲル上にて培養するとプラスチック平板と同程度の分化速度〔アルカリホスファタ-ゼ(ALP)を指標とする〕を示し、約20日で骨様組織を形成した。ここに骨形成タンパク質(BMP)の粗抽出液を加えるとALP活性は2倍に上昇した。2.アパタイト顆粒をシャ-レ上に敷いて骨芽細胞を培養すると対照のシャ-レよりも数倍の細胞数に達し且、総ALP活性も増大した。3.このアパタイト顆粒にI型コラ-ゲンを配合すると、アパタイト単独よりもALP活性が約4倍も上昇した。さらに、両系にリコンビナントBMPー2を加えた結果はいずれも約20%ALP活性が上昇した。アパタイトにコラ-ゲンを添加すると、BMPの添加効果を上まわって分化を促進させたことは、この複合体が骨芽細胞の分化にきわめて効果的なin vitro用の支持体であることがわかった。4.多孔質顆粒状アパタイトおよびコラ-ゲン線維膜を調製し、これに精製BMPを含浸させてラットの皮下に埋植したところ、前者では直接骨形成(軟骨形成を経過せず)が起き、後者では膜内部に軟骨が、表面には骨が形成された。以上により、骨芽細胞の分化はコラ-ゲンとアパタイトから構成される支持体に大きく依存することが明らかにされた。