hpprc/llmjp-kaken huggingface dataset:
DNAマイクロアレイを応用したチャネロパチーのハイスループット遺伝子解析

てんかん,片頭痛,ミオトニア,周期性四肢麻痺など多くの疾患において,チャネル分子の関与が明らかになってきており,テャネロパチーと総称されるようになってきている.これらは家族性の疾患が多く,確定診断のためには原因遺伝子解析が必要になる場合が多いが,個々の遺伝子のサイズが巨大であること,また遺伝的異質性を有することから,通常の方法では労力がかかり,スループットの高い遺伝子解析法の応用が必要であった.このような背景から,チャネル遺伝子を搭載したDNAマイクロアレイをデザインし,解析システムを構築した.具体的には,家族性片麻痺型片頭痛の原因遺伝子CACNAIA, ATPIA2の全エクソン及び周辺のイントロン配列を搭載したマイクロアレイをデザインした.各エクソンの特異的増幅の可能なプライマーをデザインし,スループットの向上のため,PCR条件を均一にした.さらに,多くのPCR産物のハンドリングを正確にかつ高速に行うために,ロボティックスの導入を行った.このような改良の結果,実質3日で上記遺伝子の全エクソンの解析が可能となった.構築したシステムの精度を検証し,99%以上の高い精度で塩基配列の判定が可能であった.また既知の変異を有する検体を用いて変異の検出感度を検討し,点変異においては100%の感度で検出可能であった.チャネロパチーは点変異が多いことから,マイクロアレイを用いた変異の検出の対象疾患としてはチャネロパチーは適していると考えられる.応用として実際に片麻痺型片頭痛の患者由来ゲノムDNAの解析を行った.明らかな変異は認められず,未知の原因遺伝子の存在が考えられた.今後本システムはチャネロパチーの遺伝子診断に有用である可能性が示唆された.臨床において迅速な遺伝子診断の必要性は高まっている.また,遺伝子解析の対象も家族例のみならず孤発例にまで広範になってきている.しかし従来の方法では多数の解析を行うととは非常に手間がかかり,特にチャネル分子のような巨大な遺伝子を解析するのは大変困難であった.このような背景から,DNAマイクロアレイを応用したチャネル遺伝子のハイスループット解析システムを構築するための研究を行っている.そのための準備段階として,当研究室で作成した神経変性疾患の原因遺伝子及び関連遺伝子を網羅したDNAマイクロアレイを用いて,スループリト及び塩基配列判定精度に関して検討を行った.ロボティックスを応用した分注システムを用いて,実働3日で約0.3Mbの解析が可能であった.また,塩基配列の判定精度も99.9%以上と高い解析速度及び精度を達成した.コストの面でも直接塩基配列決定法と同等かそれ以下のコストで解析可能であることが明らかになった.さらに既知の変異を有するゲノムDNAを用いて変異の検出効率を検討した結果,点変異はヘミ接合性,ホモ接合性,ヘテロ接合性いずれの変異においても全ての変異を検出でき,挿入・欠失変異についてもヘミ接合性の変異は検出可能であった.これらの結果からは,DNAマイクロアレイを用いた塩基配列解析システムは,ハイスループットな遺伝子診断に応用可能であることが明らかになった.本システムをチャネル遺伝子の解析に応用するためには,配列同士のクロスハイブリダイゼーションの可能性を排除した形のデザインを行うことが望ましいと考えられる.臨床において迅速な遺伝子診断の必要性は高まっている.しかし従来の方法では多数の解析を行うことは非常に手間がかかり,特にチャネル分子のような巨大な遺伝子を解析するのは大変困難であった.このような背景から,DNAマイクロアレイを応用したチャネル遺伝子のハイスループット解析システムを構築するための研究を行っている.DNAマイクロアレイを用いたハイスループット遺伝子解析システムは,実働3日で約0.3Mbの解析が可能であり,塩基配列の判定精度も99.9%以上と高い解析速度及び精度を達成した.コストの面でも直接塩基配列決定法と同等かそれ以下であった.さらに変異の検出精度に関しても,点変異はヘミ接合性,ホモ接合性,ヘテロ接合性いずれの変異においても全ての変異を検出でき,挿入・欠失変異についてもヘミ接合性の変異は検出可能であった.以上の事前検討に基づき,片頭痛の原因遺伝子を網羅的に解析可能なDNAマイクロアレイTKYMGNO1を作成した.このマイクロアレイには,電位依存性カルシウムチャネルCACNA1A, CACNG2,及びATP1A2遺伝子の全エクソン及び周辺のイントロンの配列が搭載されており,家族性片麻痺型片頭痛及び発作性失調症2型の遺伝子診断に応用可能である.これらの遺伝子を搭載する際には配列同士のクロスハイブリダイゼーションの可能性を排除する必要がある。特にチャネル分子は膜貫通構造において繰り返し構造が存在するため,配列同士の相同性を検討したが,明らかにクロスハイブリダイゼーションを起こしうると考えられる配列は認められなかったため,全ての配列をマイクロアレイに搭載した.現在特異的増幅のためのPCRプライマーを作成し,PCRシステムを構築中である。てんかん,片頭痛,ミオトニア,周期性四肢麻痺など多くの疾患において,チャネル分子の関与が明らかになってきており,テャネロパチーと総称されるようになってきている.これらは家族性の疾患が多く,確定診断のためには原因遺伝子解析が必要になる場合が多いが,個々の遺伝子のサイズが巨大であること,また遺伝的異質性を有することから,通常の方法では労力がかかり,スループットの高い遺伝子解析法の応用が必要であった.このような背景から,チャネル遺伝子を搭載したDNAマイクロアレイをデザインし,解析システムを構築した.

具体的には,家族性片麻痺型片頭痛の原因遺伝子CACNAIA, ATPIA2の全エクソン及び周辺のイントロン配列を搭載したマイクロアレイをデザインした.各エクソンの特異的増幅の可能なプライマーをデザインし,スループットの向上のため,PCR条件を均一にした.さらに,多くのPCR産物のハンドリングを正確にかつ高速に行うために,ロボティックスの導入を行った.このような改良の結果,実質3日で上記遺伝子の全エクソンの解析が可能となった.構築したシステムの精度を検証し,99%以上の高い精度で塩基配列の判定が可能であった.また既知の変異を有する検体を用いて変異の検出感度を検討し,点変異においては100%の感度で検出可能であった.チャネロパチーは点変異が多いことから,マイクロアレイを用いた変異の検出の対象疾患としてはチャネロパチーは適していると考えられる.応用として実際に片麻痺型片頭痛の患者由来ゲノムDNAの解析を行った.明らかな変異は認められず,未知の原因遺伝子の存在が考えられた.今後本システムはチャネロパチーの遺伝子診断に有用である可能性が示唆された.
HiCIAO用MEMS可変形鏡を用いたスペックル制御の研究

本研究は太陽系外の惑星を、すばる望遠鏡を使って直接撮像によって検出するための技術開発である。地球から見ると太陽系外惑星は極めて暗く、かつ明るい恒星のすぐ近くを回っているために、恒星の散乱光に埋もれてしまい検出が非常に難しい。この散乱光はスペックルと呼ぶ粒状の形状をしているが、これは星から来る光が地球大気の揺らぎによって波面が乱され、お互いに干渉することによって生じる。このスペックルは粒状のために、星との区別が付きにくいことが問題である。このスペックルは乱れた波面を高素子数の可変形鏡を用いて補正することによって低減することができる。平成20年度は実験室において、前年度までに開発してきた新しい半導体製造技術を利用した1000素子MEMS型可変形鏡を組込んだ試験装置を用いて、スペックル低減技術のアルゴリズム試験と性能試験を行い、系外惑星探査観測装置HiCIAOで必要とされている仕様を上回る性能を実現した。得られた結果としては、全散乱光を2e-7のレベルまで低減することができ、またコヒーレントな光に対する低減効果は1e-8にも達した。この結果は査読論文に投稿中である。また、実際の天体観測用のシステムとして、HiCIAOに組みこむMEMSスペックル低減装置の設計開発し、性能試験を行った。最終的なすばる望遠鏡への組み込みは、これと組み合わせて用いる究極補償光学系システム、HiCIAO用支持機構、制御ソフトウェアの完成を待って行い、2010年の観測開始を予定している。本研究はすばる望遠鏡で太陽系外の惑星を検出するための新技術に基く装置開発である。明るい恒星の周りにある暗い惑星を検出するためには、恒星の光の外側への影響を低減する技術が必要で、そのために中心に光を集中させる補償光学系と外側の光を効率よく低減するコロナグラフの開発を行ってきている。ここでは次の2つのテーマについての研究をおこなった。1)焦点面補償光学系の開発(アルゴリズム)これは焦点面の星の画像の情報を用いて光波面誤差を測定し、可変形鏡を制御して、波面補正を行う新しい補償光学系である。実際に撮像を行なう焦点面の情報を用いるために、極めて高い精度での波面補正ができることが特徴である。19年度は、これまでの逐次的な方法に変えて、高速で波面を補正することができるアルゴリズムの開発を行った。この新しいアルゴリズムの実証試験をすばる望遠鏡用試験装置に装備したMEMS型可変系鏡を用いて行なった。その結果、このアルゴリズムがすばる望遠鏡で用いられる補償光学系実機とほぼ同じ設計のシステムにおいて極めて良好な性能を発揮することがわかった。2)焦点面補償光学系の開発(ハードウェア)MEMS型可変形鏡を用いた焦点面補償光学系の光学・機械系の開発を行った。上記のアルゴリズムを用いた補償光学系を開発し、それをすばる望遠鏡に取り付けることを目的としている。19年度にはこれに必要な光学部品・機械部品を購入し、現在組み立て調整中である。また、MEMS型可変形鏡の性能試験を開始した。
緊急事態対応医学の体系化とシステム整備:院内救急からテロ・災害時の地域連携まで

災害時の医療対応に関する研究として、(1)災害現場での医療対応における構成員の役割を記述した英国のテキスト「大事故災害における管理システム」を共同翻訳者とともに出版した。これは以前に我々が翻訳を行った災害現場での医療対応に関するテキスト(「大事故災害への医療対応」、第二版)の活用マニュアルとして位置づけられるものである。(2)病院での医療対応に関する英国のテキスト(Major Incident Medical Management and Support(MIMMS): The Practical Approach in the Hospital、「大事故災害への医療対応:病院における実践的アプローチ」)の翻訳を行い、その内容について協同研究者らと評価を行っている。これは、災害現場での対応に関する上記のテキスト(大事故災害への医療対応、第二版)を補完する内容で、今日の日本の災害医療において有用性が高く、かつ社会的な要求にも合致するものである。(3)医療従事者が災害医療の基本を理解するための机上演習を開発し、大阪府DMAT研修において実践した。これは「大阪空港航空機事故」という地域の災害を想定したシミュレーションで、上記のMIMMSの原則に則った災害医療の基本を、画像を活用した参加型の演習によって学習するように企画したものである。地域における組織間連携に関する研究(勉強会活動)として、北摂地域において医療機関、消防、警察、保健所、中毒情報センターとともに勉強会を2001年より継続しているが、今年度は初めて核・放射性物質(N)災害に関するテーマをとりあげた。緊急事態対応に関する研究では、わが国においても大震災やテロ、火災などに伴った発生が懸念されている熱傷集団災害の事例と各国の対応体制について研究を行った(木所昭夫編、「熱傷治療マニュアル」(中外医学社)に掲載予定)。病院内急変事例に対する対応の分析と改善では、前年度に引き続き大阪大学医学部附属病院でのCPRコール事例の収集と対応の評価を行った。また、代表研究者が年度途中で異動した近畿大学医学部附属病院での院内救急対応システムについても収集と評価を開始した。特定の部署の電話を呼び出す方式と院内の一斉放送のシステムという違いに加えて、院内の担当部署の取り決めも異なっており、また、後者での収集期間が短いという制約はあるため現時点では断定はできないが、方式の相違よりも院内職員にシステムを広く認知させることが、活発な利用につながると考えられた。病院内、特に救命センターでのインシデントの発生とリスクマネジメントの効果を検証し、職員への普及と認知のための種々の活動によってインシデントが減少することを明らかにし、第35回日本救急医学会総会パネルディスカッションで発表を行った。災害時の医療対応に関する研究では、前年度に翻訳を行った「大事故災害への医療対応:病院における実践的対応」の検証を進め、10月には英国人講師を招いて2日間の講習会を開催した。講習を通じて、災害システムの一環として現場対応から連続した病院での受入を具体的に整備することの重要性が認識された。これら英国の災害医療システム(MIMMD)に関する研究を医学雑誌(救急医学)およびテキスト(分担執筆)に発表した。また、これら教材の一部を活用し、大阪府の災害研修(DMAT研修、2008年1月)においてシミュレーションを行ったところ、参加者から高い評価を受けた。1.病院内急変事例の収集と分析では、大阪大学および近畿大学医学部附属病院の事例を検討したところ、施設により発生頻度がかなり異なることが明らかとなった。これは、職員の認知、発動の基準、通報のシステム等によるものと考えられたが、今日世界中で注目されている病院内急変に対する迅速対応チーム(RRT)導入を考える上で大きな課題である。2.病院内での感染事例に対する緊急対応では、ノロウィルス感染事例を経験し、その問題点について分析を行い、感染症サーベイランスに救急部門が果たしうる役割と条件を評価し、日本救急医学会学術集会で報告を行った。3.災害に対する病院の対応体制の整備では、(1)近畿大学病院の既存の災害対応マニュアルを評価した上で、これまでの災害医療研究の成果を踏まえた暫定的な改訂版を作成した。また、院内での災害訓練(20名の患者受入を想定)を行い、院内の課題を職員の意識向上が得られた。今後は院内の多職種が参加する委員会を組織してマニュアルの改訂を継続する。また、(2)Hospital MIMMSについては、英語テキストの翻訳(永井書店、2009年3月)を出版した。また、講習会を3回(東京、三重、滋賀)で実施したところ、各地の医師会からの講習依頼を受けており、わが国の病院における災害対応への効果が大いに期待される。H-MIMMSの手法や考えは、災害現場での活動を主とする大阪府DMAT講習会でも応用可能であった。4.地域における活動としては、近畿大学周囲の住民への啓蒙(地震災害に関する講義)、院内職員への講習会(災害総論)、実技実施(トリアージ)を行った5.緊急事態対応医学に関する3年間の研究の成果の骨格となる概念と総論、災害対応、病院内急変対応に関する部分をまとめて近畿大学医学雑誌に投稿・出版した。
微分・代数方程式で表された非線形システムの制御

本研究では、微分・代数方程式(以下、DAE, differential-algebraic equation)で与えられた非線形システムの制御系設計問題について研究した。非線形の場合、線形のディスクリプタ形式と異なり行列演算だけで冗長度の無い常微分方程式系に変換することができず、非線形代数方程式を解いて冗長度を消去する作業は一般に困難である。そこで、本研究では非線形代数方程式を解くことなく、冗長度を持ったまま制御系設計を行う方法を示した。まず、index 1のDAEシステムに対し、入出力線形化・オブザーバ設計を行った。その際の大域的安定化条件を示した。そこでは冗長度が消えるように、オブザーバのダイナミクスにおいて代数方程式からなる不変多様体に有限時間整定する設計を採用した。次にhigh indexを持つ系に対し、インパルスモードを持つ場合を含めて、冗長な常微分方程式系に変換する方法を2つ示した。一つは、インパルスモードの数に応じた積分器を入力に付加し代数方程式を順次微分する方法である。もう一つは、状態フィードバックを用いるKumarらのrugularizingを改良した方法である。オブザーバを使う場合は、必然的に前者の方法を使わざるを得ない。これを用いてindex 1のDAEシステムと同様にhigh index DAEシステムに対し、入出力線形化・オブザーバ設計を行った。入出力線形化は冗長常微分方程式系に対してそのまま設計すればよい。入出力線形化に限らず、可制御性を要求しない制御手法であれば適用できるであろう。しかし、冗長常微分方程式系に対してオブザーバを設計すると、設計条件が厳しくなる。そこで、index 1の手法をhigh index DAEシステムに対し拡張し、さらに、付加積分器の状態変数が既知であることを用いて、設計条件を緩和した。得られたオブザーバは冗長な全ての状態量を推定し、かつ代数方程式の拘束を有限時間で満たすように動作する。非線形微分・代数方程式(DAE)で表されたシステムを制御する場合、非線形の代数方程式を解析的に解かねばならない場合が多い。しかし、多変数の非線形代数方程式を解析的に解くことは非常に困難である。そこで、我々は、非線形微分・代数方程式で表されたプラントに対して代数方程式を直接解くことなく非線形制御則を求める方法に関して研究し、以下の結果を得た。1.非線形微分・代数方程式系の出力の時間微分を、代数方程式を解くことなく求める方法を明らかにした。2.上記の出力の時間微分を用いて厳密な入出力線形化制御則を構成する方法を提案した。3.提案した制御則には、微分方程式で決定される状態変数だけではなく、それに代数的に従属な状態変数を含んでいるため、その2つを同時に推定するオブザーバが必須である。そこで、これら2種類の状態変数の推定値を同時に求めるオブザーバを提案した。このオブザーバによる推定値は、代数方程式を満たす超曲面に大域的に漸近し有限時間でその超曲面に整定する。その超曲面上の挙動を指定するオブザーバゲインはLMI(線形行列不等式)求めることができた。4.ある条件のもとで、このオブザーバの推定誤差が大域的に漸近安定であることを示した。また、条件をさらに追加することで、制御系全体の挙動が有界かつ追従誤差が0となることを示した。5.このようなシステムに対しては入力の数と等しい数の積分器を付加することが有効であることを明らかにした。

この積分器の役割は、代数方程式に入力変数を含むことを許容する、新たな入力に関して線形な系に変換できるようにする、多入力系のnormal formが定義できるようにする、オブザーバのエラーダイナミクスに入力が表れないようになる、の4つである。本年は、前年に得られたindex 1の非線形微分・代数方程式系に対するコントローラ及びオブザーバ設計に関する成果を、high indexの非線形微分・代数方程式系に拡張することを試みた。しかしながら、前年のIndex 1の結果をそのまま拡張するのは困難と思えたので、まず、前年の方法の別解釈を与えることとした。つまり、Index 1に対する前年の結果は、まず、系を制約つきの冗長な常微分方程式系に変換し、その変換後の系に対して制約をうまく考慮した上でコントローラとオブザーバを与えていることに相当している、ということを発見した。冗長でない常微分方程式系に変換する場合は計算上の困難さが現れるが、冗長度を許容した場合は微分と線形代数の計算で変換可能である。得られる系は、全ての変数に関して見かけ上は常微分方程式ですべて挙動が記述されるが、制約が付加されている。昨年度の結果は、その制約によって決まる不変多様体上での系の挙動を設計していることに相当していた。そのような視点から、high indexの系に対しても、制約つきの冗長な常微分方程式系に変換することで、冗長な情報を利用できる場合のコントローラが設計できた。またさらに、不変多様体の制約を満たすような状態推定が可能なオブザーバを構成する方法を考案することによって、index 1の場合と同様な結果が得られた。また、制約つきの冗長な常微分方程式系に変換する際に、得られる制約が不変多様体を構成するか否かを調べることで、微分・代数方程式系のi11-posednessが判定できることがわかった。これらの結果の大半に関しては公表準備中である。今年度は、特にhigh indexを持つDAE系の制御に着目して研究を進めた。2以上のindexを持つDAE系はレギュラーでなくなる場合があることが知られている。すなわち、インパルスモードを持つ可能性があり、プロパーな系ではなくなることがある。そのような場合に、従来用いられているフィードバックによるレギュラー化は、代数方程式が入力及び代数変数に関して線形であることを要請し、そのような系に変換するために積分器を追加する必要がある。また、レギュラー化には状態フィードバックが必要なので、分離定理が成り立たない非線形系ではオブザーバを用いた場合の安定性の保証が極めて難しくなる。そこで、われわれは必要な入力の滑らかさを確保するために、フィードバックをせずに、自動的に必要な数の積分器を入力に追加するアルゴリズムを提案した。また、high-index系に対してのオブザーバも、前年度までに求めた方法をさらに推し進め、LMIに帰着するサブシステムをさらに小さくとることができることを示した。その結果、昨年度までの設計法よりも大域的安定化のための条件が緩和された。
慢性炎症性気道疾患に特異的な塩素イオン電流の発現機構の解明

1.健常ウサギと亜硫酸ガス曝露慢性気管支炎モデルウサギの気道粘膜上皮細胞におけるCFTR(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)のmRNAの発現を比較した。気管支炎モデルウサギで強く発現し健常ウサギにはこれを認めなかった。CFTRは細胞内cAMP依存性の塩素イオンチャンネルであり、これが慢性気管支炎モデルウサギの気管粘膜上皮において新たに出現する塩素イオン電流の原因であると考えられた。慢性炎症性気道の過分泌の原因の一端を明らかにした。2.気道粘膜下腺で観察される塩素イオン電流は水分分泌の指標とされる。エリスロマイシンなどのマクロライド系抗生物質は、アセチルコリンによって惹起される塩素イオン電流を臨床的な濃度範囲において濃度依存性に抑制した。これら低濃度のマクロライド剤は単独では反応を起こさなかったが、mMオーダーの高濃度では単独でアセチルコリン様の電流反応を惹起した。この反応はムスカリン受容体拮抗剤であるアトロピンによって消失した。低用量マクロライドはしかし、ノルアドレナリン、カフェイン、イオノマイシンなどによる電流に影響しなかった。以上より、臨床用量のマクロライドには抗コリン作用があることが示された。3.気管支喘息は、慢性好酸球性気道炎症として認識されており、好酸球が放出するMajor Basic Protein(MBP)は気道上皮傷害や気管支平滑筋の収縮を惹起することが知られている。しかし気道平滑筋収縮を惹き起こす細胞機構についてはいまだ報告を見ない。MBP類似の多価陽イオシであるpoly L Arginineおよびpoly L Lysineを用いて、これらがカルシウム依存性カリウムチャンネルを阻害し、その開口確率ならびに電気伝導度を有意に減少させることにより、気道平滑筋細胞膜の脱分極を起こしこれが細胞外からのカルシウム流入をもたらす原因となることを見い出した。本年度(平成9年度)の研究計画調書に記載した研究項目のなかで、以下のものについてはすでに終了し発表した。すなわち、健常ウサギと亜硫酸ガス曝露ウサギの気道粘膜上皮細胞におけるCFTR(Cystic Fibrosis Transmembrane Conducatance Requlator)のmRNAの発現を比較した。健常ウサギではCFTR-mRNAの発現は殆ど認めず、高濃度亜硫酸ガスに46週曝露したウサギでは強く発現した。対象として膵組織を用いたが、膵ではいずれの場合も中等度の発現を認めた。CFTRには塩素イオンチャンネルとしての機能があり、これが気管支炎モデルウサギ気道上皮でのみ強く発現することは、電気生理実験で得られた慢性気管支炎モデルにおける新規の塩素イオン電流の出現を分子レベルで裏付けるものである。これは、気道の非特異的防御機構のひとつとして新たに発現されたものであり、また慢性気管支炎における気道過分泌の原因として治療の対象にもなりうるものである。また、次なる課題の、ヒト気道上皮における慢性気管支炎電流の発現については、正常および慢性気管支炎症例気道上皮の手術標本が少数例しか得られず、現在のところ結論的なデータは得られていない。マクロライド系の抗生物質が気道腺の塩素イオン電流を抑制するメカニズムについては、すでに実験を終了し現在投稿中である。結論としては、気道腺腺房細胞の膜表面にあるアセチルコリン受容体をマイクロライド系抗生物質が拮抗阻害するというものである。この効果は極めて急性に得られ、また可逆的である。マクロライドの好中球遊走阻止などの慢性的な効果と対比して分泌細胞に特異的なものと考えられた。

また、気道腺の生理的な水分分泌の機構と考えられる塩素イオン電流の振動現象のメカニズムに、新たなカルシウム遊離性セカンドメッセンジャーであるサイクリックADPリボースが重要な働きをしていることを見い出し、投稿中である。同様に、肺胞マクロファージのATPによる活性化の機序にサイクリックADPリボースが関与していることもすでに発表した。前回(平成9年度)の実績報告書において報告したように、本年度の研究項目の中で、ヒト気道上皮における慢性気管支炎に特異的な塩素イオン電流の発現については、正常および慢性気管支炎症例の手術標本が少数例しか入手できず、入手できたものでも量的に不十分であり結論的なデータを出すには至っていない。しかし、すでに報告したウサギで得られたデータ(J.Clin.Invest.1997)は、慢性炎症性気道疾患の気道過分泌のメカニズムとして極めて重要なものと考えられ、気道分泌の制御に直接関連するものであることから、今後も継続して例数を増やしていく予定である。粘膜上皮組織のほかにも平成10年度の研究期間内に、気道を構成する諸組織の電気生理的性質およびその病態についての知見が集積しており、ほぼ研究を終了し論文準備中の二件について略記する。一つは気道平滑筋の電気的性質に及ぼす多価陽イオン蛋白の影響についてである。気管支喘息は、慢性好酸球性気道炎症として認識されており、好酸球が放出するMajor Basic Protein(MBP)は気道上皮傷害や気管支平滑筋の収縮を惹起することが知られている。しかし気道平滑筋収縮を惹き起こす細胞機構についてはいまだ報告を見ない。MBP類似の多価陽イオンであるpoly L Arginineおよびpoly L Lysineを用いて、これらがカルシウム依存性カリウムチャンネルを阻害し、その開口確率ならびに電気伝導度を有意に減少させることにより、気道平滑筋細胞膜の脱分極を起こしこれが細胞外からのカルシウム流入をもたらす原因となることを見い出した。また、気道粘膜下腺の腺房細胞において、ホスホジエステラーゼ(PDE)5型の阻害剤が低濃度アセチルコリンによる電解質分泌を有意に増強させ、これが細胞内サイクリックGMPを介するものであることを認めた。
関数解析的諸問題の、位相的・代数的手法による研究と、工学上の問題への応用

共同研究者の良好な協力関係のもとで、表現論、直交多項式、組合せ論、整理論に関する分野でいくつかの成果が得られた。分担者田中のMITからの帰国を機に、若手を中心とする表現論・組合せ論のセミナ-が再開され、Stanley教授のもとで研鑚の成果が披露された。田中はA型Hecke環の正則表現とRobinsonーSchensted対応について大きな成果を得て、論文の脱稿も間近であり、また対称群の表現のqーanalogueについても構造が進展中である。最年少の分担者有木は馬力と計算力を駆使して多くの成果を得たが、その一班は京大RSM講究録の論文に見られる通り、Uq(Sl_2)の随伴表現の分解についてきれいな定理を得ている。両者の研究対象には共通点があり、互に啓発しあいながら仕事を進めている。また分担者中村はChebyshev多項式に関する多数の新しい公式を得て、それらの適用によりFibonacci数の諸公式を統一的に扱う道を開き、また微分という強力な手段をとり入れることができたのは特筆すべき成果と思われる。以上の3名に分担者松下を加えたセミナ-が新たに始まり、解析的・代数的な方法によってEulev定数を考察しており、年末度にかけて新しい知見が得られればと期待する。分担者彌永は従来からのテ-マである実2次体の基本単数についての研究を続け、コンピュ-タ計算を含むまとまった成果を得て論文(Quadratic Equations Over Finite Fields And Fundamental Units of Real Quadratic Number Fields)を執筆中である。代表者佐々木は、これらのセミナ-が円滑に進むように配慮するとともに、独自に工学上の問題、特に容器内に2層の媒質を含む場合の電位について考察してきたが、数値計算の手順などについて更に検討中である。
OK-432重合腫瘍ワクチン治療の基礎研究

1.OK-432重合腫瘍ワクチン作製B16メラノーマ・Sq1979扁平上皮癌・KLN205扁平上皮癌等に対してOK-432をグルタールアルデヒド(GA)を用いて重合しワクチンを作製した.重合条件では0.02%GAでも安全性がみられたが,さらに安全域をとり0.2%GAを重合条件とした.本ワクチンはトリパンブルーで染色され失活していることが確認された.また本ワクチンは抗OK-432抗体で染色され,抗原性が保持されていることが示唆された.B16ワクチン・Sq1979ワクチンをマウス側腹部に接種後,腫瘍チャレンジを行った結果,腫瘍特異的抗腫瘍効果を誘導することが示された.2.移植舌癌モデルの開発OK-432重合腫瘍ワクチンの抗腫瘍効果を解析するために,Sq1979およびKLN205の2種類の扁平上皮癌を用いて舌癌実験モデルを作製したところ,後者は移植舌癌モデルに適するが前者は接種可能な最大限の腫瘍細胞数でも腫瘍の自然退縮がありモデルとして適さないことがわかった(Yokohama Med Bull,49,25-33,2002).3.移植舌癌モデルにける抗腫瘍効果の解析KLN205ワクチンで3回免疫後,KLN205腫瘍チャレンジを行い,24時間・72時間・10日後の病理組織標本を作製したところ,生食群に比べて24時問で腫瘍周囲に著明なリンパ球の浸潤がみられ,ワクチン接種により腫瘍特異的免疫が誘導されていることが推定された.また経時的に標本を作製していったところ,予想に反して必ずしも長時間著明なリンパ球浸潤が見られるわけではないことがわかった.10日目には,全く腫瘍細胞が見られなかった標本も認めたが腫瘍が残存したケースでも,核の空胞変性や核濃縮が見られた(現在,論文作成中).4.移植舌癌モデルにおけるCTL誘導KLN205ワクチン群・GA処理後のKLN205腫瘍細胞群・GA処理後のOK-432群・OK-432群・生食コントロール群の5群で3回接種後1週間で屠殺,脾臓よりリンパ球を取り出した.MHC処理後のKLN205腫瘍細胞とともに5日問培養し,^<51>Cr release assayを施行した.KLN205ワクチン群では,E/T ratio 40/1で21%の%specific lysisであったがコントロール群では8.5%にとど幸つた。OK432群およびGA処理OK-432群では、ともにコントロール群と差はなかった.GA処理KLN-205腫瘍細胞群はコントロールよりわずかに高い%specificlysisが得られたが,優位の差はなかった(現在,論文作成中).1.OK-432重合腫瘍ワクチン作製B16メラノーマ・Sq1979扁平上皮癌・KLN205扁平上皮癌等に対してOK-432をグルタールアルデヒド(GA)を用いて重合しワクチンを作製した.重合条件では0.02%GAでも安全性がみられたが,さらに安全域をとり0.2%GAを重合条件とした.本ワクチンはトリパンブルーで染色され失活していることが確認された.また本ワクチンは抗OK-432抗体で染色され,抗原性が保持されていることが示唆された.B16ワクチン・Sq1979ワクチンをマウス側腹部に接種後,腫瘍チャレンジを行った結果,腫瘍特異的抗腫瘍効果を誘導することが示された.2.移植舌癌モデルの開発OK-432重合腫瘍ワクチンの抗腫瘍効果を解析するために,Sq1979およびKLN205の2種類の扁平上皮癌を用いて舌癌実験モデルを作製したところ,後者は移植舌癌モデルに適するが前者は接種可能な最大限の腫瘍細胞数でも腫瘍の自然退縮がありモデルとして適さないことがわかった(Yokohama Med Bull,49,25-33,2002).3.移植舌癌モデルにける抗腫瘍効果の解析KLN205ワクチンで3回免疫後,KLN205腫瘍チャレンジを行い,24時間・72時間・10日後の病理組織標本を作製したところ,生食群に比べて24時問で腫瘍周囲に著明なリンパ球の浸潤がみられ,ワクチン接種により腫瘍特異的免疫が誘導されていることが推定された.また経時的に標本を作製していったところ,予想に反して必ずしも長時間著明なリンパ球浸潤が見られるわけではないことがわかった.10日目には,全く腫瘍細胞が見られなかった標本も認めたが腫瘍が残存したケースでも,核の空胞変性や核濃縮が見られた(現在,論文作成中).4.移植舌癌モデルにおけるCTL誘導KLN205ワクチン群・GA処理後のKLN205腫瘍細胞群・GA処理後のOK-432群・OK-432群・生食コントロール群の5群で3回接種後1週間で屠殺,脾臓よりリンパ球を取り出した.MHC処理後のKLN205腫瘍細胞とともに5日問培養し,^<51>Cr release assayを施行した.KLN205ワクチン群では,E/T ratio 40/1で21%の%specific lysisであったがコントロール群では8.5%にとど幸つた。OK432群およびGA処理OK-432群では、ともにコントロール群と差はなかった.GA処理KLN-205腫瘍細胞群はコントロールよりわずかに高い%specificlysisが得られたが,優位の差はなかった(現在,論文作成中).1.OK

-432重合腫瘍ワクチンによる抗腫瘍効果の解析OK-432重合腫瘍ワクチンは,B16メラノーマやSq1979扁平上皮癌などのマウス悪性腫瘍に対して抗腫瘍効果を有することがわかってきたが,これらのモデルは側腹部での腫瘍摂取のため,組織学的な解析には解剖学的条件より不適切と考えられた.組織学的評価の理想的なモデルとして,移植舌癌のモデルを開発し,そこでOK-432重合腫瘍ワクチンの抗腫瘍効果の解析を行った.2.移植舌癌モデルの開発と特異免疫の誘導マウス舌への移植腫瘍として,Sq1979およびKLN-205の2種類の扁平上皮癌を用いて検討したところ,後者は移植舌癌モデルに適するが,前者は摂取可能な最大限の腫瘍細胞数でも腫瘍の自然退縮がありモデルとして適さないことがわかった(現在,論文作成中).したがって以後の研究は,KLN-205細胞を用いて行った.KLN-205腫瘍細胞をマウス舌へチャレンジする前に,同細胞から作製したOK-432重合腫瘍ワクチン(KLN205ワクチン)を1週毎に3回摂取した.同様にB16細胞から作製したOK-432重合ワクチン(B16ワクチン)やOK-432単独も3回摂取し,生食のコントロール群と共に4群を比較した.腫瘍チャレンジ後の腫瘍発生率・腫瘍増殖率・死亡率を測定したところ,KLN205ワクチン群は生食群に比べてこれら全てを有意に抑制したが,B16ワクチン群やOK-432単独群では抑制が軽度みられるものの有意の差は得られなかった.以上からOK-432重合腫瘍ワクチンは腫瘍特異的に抗腫瘍効果を誘導すると考えられた.次いで,KLN205ワクチンで3回免疫後,KLN-205腫瘍チャレンジを行い,24時間・72時間・10日後の組織病理標本を作製したところ,生食群に比べて24時間で腫瘍周囲に著明なリンパ球の浸潤がみられ,ワクチン摂取により腫瘍特異的免疫が誘導されていることが推定された.しかしこれらのリンパ球を抗CD3抗体・抗CD4抗体や抗CD8抗体で免疫染色しても染色されなかった.これは手技的な問題と考えており,再検の予定である.また経時的に標本を作製していったところ,予想に反して必ずしも長時間著明なリンパ球浸潤が見られるわけではないことがわかった.10日目には,全く腫瘍細胞が見られなかった標本も認めたが,腫瘍が残存したケースでも,核の空胞変性や核濃縮が見られ,抗腫瘍効果の機序としてアポトーシスが示唆された(第19回日本口腔腫瘍学会で発表).1.移植舌癌モデルにおける免疫組織学的評価昨年の研究で開発された移植舌癌モデル(Yokohama Med Bull, Vol49, in press)を用いて,KLN-205ワクチン群と生食のコントロール群とでKLN-205腫瘍チャレンジ後,24時間・5日・10日後の凍結連続切片から免疫組織標本を作製した.抗体は抗CD4抗体・抗CD8抗体・抗CD19抗体を用いた.リンパ球の浸潤はワクチン接種群の方が多く,とくに5日目ではワクチン接種群で抗CD8抗体陽性のリンパ球が多く観察された.このことよりワクチン接種群では,腫瘍に対する特異免疫が誘導された結果,早期のリンパ球浸潤とCD8陽性Tリンパ球の誘導が示唆された.2.移植舌癌モデルにおけるCTLの誘導KLN-205ワクチン群・グルタールアルデヒド処理後のKLN-205腫瘍細胞群・グルタールアルデヒド処理後のOK-432群・OK432群・生食コントロール群の5群で,^<51>Cr release assayを用いてcytolyticactivityの誘導について調べた.各群
肺癌細胞表面のHLA抗原と免疫応答に関する研究

1.原発性肺癌患者73症例について,切除標本の免疫組織染色を行うことにより,肺癌細胞のHLA発現及びリンパ球浸潤が患者予後にどのような影響を及ぼすかについて検討した.1)腫瘍組織においてHLA class Iおよびclass IIの発現およびリンパ球浸潤が見られた症例はそれぞれ51%,49%,67%であった.2)腫瘍の分化度が低下するほど,HLAの発現も低下する傾向にあったが有意ではなかった.また,HLA class IIとリンパ球浸潤の間にも有意な関係は見られなかった.3)HLAの発現および腫瘍内リンパ球浸潤それぞれの因子において陽性例と陰性例に有為な生存率の差は認めないものの,HLA class Iと腫瘍内リンパ球浸潤を組み合わせることにより,class I発現およびリンパ球浸潤両方が陽性の患者は,どちらかが陰性の患者と比較して有意に予後が良好であった.さらにこの2つを組み合わせた因子は多変量解析において有意な予後因子となった.2.肺癌培養細胞株を用いて低下したHLA class Iの発現をIFNγが回復させうるかどうかをフローサイトメトリーによる表面抗原の解析及びノーザンブロットによるmRNAの解析により検討した.1)肺癌細胞株であるPC3(腺癌),QG90(小細胞癌)にIFNγを作用させることにより,HLA class Iは蛋白レベルでも,遺伝子レベルでも容易に誘導することが可能であった.以上より癌免疫応答が成立すためにはHLA発現とリンパ球浸潤の両方が必須であり,この点でIFNγでの賦活は有益と考えられる.現在,遺伝子導入細胞を用いた実験を行っている.1.原発性肺癌患者73症例について,切除標本の免疫組織染色を行うことにより,肺癌細胞のHLA発現及びリンパ球浸潤が患者予後にどのような影響を及ぼすかについて検討した.1)腫瘍組織においてHLA class Iおよびclass IIの発現およびリンパ球浸潤が見られた症例はそれぞれ51%,49%,67%であった.2)腫瘍の分化度が低下するほど,HLAの発現も低下する傾向にあったが有意ではなかった.また,HLA class IIとリンパ球浸潤の間にも有意な関係は見られなかった.3)HLAの発現および腫瘍内リンパ球浸潤それぞれの因子において陽性例と陰性例に有為な生存率の差は認めないものの,HLA class Iと腫瘍内リンパ球浸潤を組み合わせることにより,class I発現およびリンパ球浸潤両方が陽性の患者は,どちらかが陰性の患者と比較して有意に予後が良好であった.さらにこの2つを組み合わせた因子は多変量解析において有意な予後因子となった.2.肺癌培養細胞株を用いて低下したHLA class Iの発現をIFNγが回復させうるかどうかをフローサイトメトリーによる表面抗原の解析及びノーザンブロットによるmRNAの解析により検討した.1)肺癌細胞株であるPC3(腺癌),QG90(小細胞癌)にIFNγを作用させることにより,HLA class Iは蛋白レベルでも,遺伝子レベルでも容易に誘導することが可能であった.以上より癌免疫応答が成立すためにはHLA発現とリンパ球浸潤の両方が必須であり,この点でIFNγでの賦活は有益と考えられる.現在,遺伝子導入細胞を用いた実験を行っている.
DNA脱メチル化におけるPARPの役割の解明

本研究において、マウスおよびヒトの未授精卵から初期胚期においてCCCH型Zinc fingerドメインを持つ2つのPARPファミリー遺伝子(TiparpおよびParp12)が特異的に高発現することを発見した。また、抗体染色によりADPリボシル化が受精後前核に特徴的な局在を示すことが確認できたため、PARPファミリーの遺伝子が受精後前核のエピゲノム再構成に何らかの機能を持つという仮説の元、CCCH型PARPファミリー遺伝子の初期胚における機能解析を計画した。そこで本研究では、TiparpおよびParp12ノックアウトマウスをゲノム編集技術により作成を試み、これまでにそれぞれのTiparpのFloxedマウスおよびParp12ノックアウトマウスを作製した。本研究成果により、CCCH型PARPファミリー遺伝子の機能解析のための基盤を整えたため、今後はこれらマウスの交配と卵特異的Cre発現マウス(Gdf9-Creマウス)との交配を経てCCCH型PARPファミリー遺伝子のエピゲノム再構成に対する機能が明らかになることが期待される。
メサンギウム細胞の可溶性サイトカインレセプター分泌.産生に関する研究

1)培養ヒトメサンギウム細胞(HMC)の可溶性インターロイキン6(sIL-6R)分泌Polyoonalhuman sIL-6R抗体を用いたWestern blotでは、HMCの培養上清(HMC-CM)中に約50kdのsIL-6Rの存在が示唆された。このsizeは、monosyteで報告されているsIL-6Rとほぼ同じであった。HMC-CM中のsIL-6Rは、ELISAにても検出可能であった。しかしHMCを1-10ng/mlのIL-1βまたはTGF-βで刺激しても分泌量に変化はみられなかった。尚、B9 cellを用いたBioassayでHMCのIL-6分泌を測定したところ、IL-1βで刺激された。またsIL-6R分泌量は、cyclohexamideを添加して培養しても減少しなかった。以上の成績より、1)sIL-6Rは、HMC増殖をIL-6の作用を増強することで促進し、2)IL-6RはIL-6と異なる機序で、HMCから分泌されることが明らかとなった。De novo合成は否定的で分泌機序についてはさらなる検討が必要である。尚、他のサイトカインレセプターとしてsIL-2Rも検討したが、HMC-CM中には検出されなかった。
慢性閉塞性肺疾患治療を目的とした新規機能性ペプチド及び粉末吸入製剤の戦略的開発

研究成果の概要(和文):COPDに治療効果が期待できるVIPについて構造改変を行い,安定性の改善した新しい誘導体を得た.また,本化合物を吸入製剤に応用し,COPDモデル動物においてその活性を精査したところ,新規製剤はモデル動物において非常に強い薬理作用を認め,なおかつその薬理作用は比較的持続する傾向にあった.今後の医薬応用が強く期待される興味深い知見を得ることが出来た.研究成果の概要(和文):COPDに治療効果が期待できるVIPについて構造改変を行い,安定性の改善した新しい誘導体を得た.また,本化合物を吸入製剤に応用し,COPDモデル動物においてその活性を精査したところ,新規製剤はモデル動物において非常に強い薬理作用を認め,なおかつその薬理作用は比較的持続する傾向にあった.今後の医薬応用が強く期待される興味深い知見を得ることが出来た.本研究は,慢性閉塞性肺疾患に対して有効かつ安全な治療法開発を目指すものであり,すなわち,強力な抗炎症ならびに抗アポトーシス活性を有する新規機能性ペプチドを開発し,それを粉末吸入製剤として応用することで新規メカニズムの治療薬創製に寄与しようとするものである.1)COPDモデル動物の構築ならびに血中バイオマーカーの探索Ovalbumin(OVA)をジェットミルによって粉砕し,分級済エリスリトールキャリアー(平均粒径50μm)と混和することでOVA粉末製剤を得た.本品をOVA感作ラットに気道内投与することによって,著しい気道炎症を誘発し,好酸球・好中球の肺浸潤を認めた.さらに,血中バイオマーカーの精査を行ったところ,特にミエロペルオキシダーゼ,エオジノフィルペルオキシダーゼがOVA投与後に変動し,さらに乳酸デヒドロゲナーゼが同様の推移を示したことから,炎症に伴う組織障害を強く示唆した.本検討よりOVA粉末吸入製剤を利用したCOPDモデル動物と,さらには薬効評価に利用可能なバイオマーカーを提示できた.2)VIP受容体アゴニストの開発種々構造活性相関研究によって見いだされた新規VIP誘導体数種はVIPと比して非常に高い化学的安定性を示し,またVIPと同程度の受容体結合活性が認められた.肺胞由来L2細胞を用いたin vitro試験ではCOPDの原因となるタバコ煙抽出液による細胞障害を有意に抑制し,そのメカニズムはcaspase-3とMMPの抑制が関与していることを明らかにした.今回得られたこれら基礎的情報を基に,現在,新規VIP誘導体吸入製剤の設計・評価を行っている.本研究は,その患者数急増が予期されているものの充分な治療法がまだ提示されていない慢性閉塞性肺疾患に対して有効かつ安全な治療法開発を目指すものである.強力な抗炎症作用ならびに抗アポトーシス活性を有する新規機能性ペプチドを開発し,それを粉末吸入製剤として喘息/慢性閉塞性肺疾患モデル動物に投与することで,「気道炎症改善」「肺胞アポトーシス抑制」「気管支拡張」の3者を同時に達成することにより,新規メカニズムの治療薬創製に寄与しようとするものである.1.COPDモデル動物の構築ならびに血中バイオマーカーの探索各種評価によって選定されたCOPDモデル動物を対象とし,肺・気道組織を摘出しアポトーシス関連物質の発現とCOPD様の病態形成が誘導を確認した.肺洗浄液中の細胞画分についても評価し,従来のモデル動物との相違点を明確にし,本モデルの有用性を網羅的に精査した.2.VIP受容体アゴニストを用いた吸入製剤設計化学合成された新規誘導体を粉末吸入製剤システムに適用して気道内投与用の製剤を得た.作製した製剤についてはレーザー回折法,粒度評価,カスケードインパクターによるin vitro動態予測を行い,製剤特性について各種精査を実施すると共に,その安定性についても併せて検証した.3.COPDモデル動物に対するVIP受容体アゴニストの効果作製した新規機能性ペプチド吸入製剤をCOPDモデル動物に投与し,炎症・アポトーシス関連各種血中バイオマーカーの変動ならびに肺組織形態変化を指標として新規誘導体の効果を評価し,新規機能性ペプチドによるCOPD治療の可能性を示唆する知見を得た.
古道・関塞遺址調査に基づく前近代中国主要交通路の研究

2018年度は、中国における現地調査を3回、研究推進のための会議を2回実施した。(1)現地調査の概要12018年8月調査:甘粛省敦煌市から玉門市・嘉峪関市にかけてレンタカーを借り上げて漢代唐代にかけての関所および古道に関連する史跡を踏査した(敦煌博物館、玉門関遺跡、河倉城遺跡、沙州古城遺跡、懸泉置遺跡、鎖陽城遺跡、嘉峪関関城)。22018年11月調査:陝西省咸陽市延安市にかけてレンタカーを借り上げて秦漢時代の古道(直道)およびそれに関連する史跡を踏査した(咸陽市博物館、鄭国渠遺跡、富県直道遺跡、甘泉県直道遺跡、子午道、沙河橋梁遺跡)。32019年2月調査:北京市・河北省内に展開する大行古道に関連する史跡を、レンタカーを借り上げて踏査した(西周燕都遺跡博物館、燕下都遺跡、紫荊関、飛狐峪、鷄鳴駅、秦漢上谷郡遺跡、居庸関)。(2)研究推進会議の概要12018年6月会議では、当該年度の活動内容を決定するとともに、研究分担者の小方登教授がアジア乾燥地帯における農耕(農地)・灌漑遺構および河西回廊のオアシス都市について、衛星画像の解析結果を中心に報告を行なった。また、研究協力者の宇都宮美生氏から、本科学研究費の研究成果として、一般向けの調査結果概説書の刊行について具体的な提案(黄河故道を事例に取ったプランの提示)があった。22018年9月会議では、同年11月に行う調査の最終打合せを行う都とともに3名から史跡に関する研究報告が行われた(宇都宮美生氏:鄭国渠、小方登:中国古代の灌漑・治水遺構、辻正博:武周期における潼関の廃置と神都の四面関)。中国における現地史跡調査については、前年度に繰り上げて実施した分があったため、本来次年度に実施予定の河西回廊方面の古道・関所調査を行うことができた。ただ、この地域の文化財に対する規制が事前に調査した以上に厳しくなっていたため、再度の補充調査は見送ることになりそうである。研究推進会議については、年3回開催予定のところ、研究メンバーの一人が在外研究で1年間上海に出張したため、2度の開催とした。その分、上海滞在のメンバーには、現地における文献資料収集・史跡の実地調査を精力的にやってもらい、その成果はグループによる現地調査に十分反映された。資料収集・整理の面でも、衛星写真画像の収集を中心に順調に進展している。現地調査について、当初予定していた調査地点を若干変更する可能性が出てきた。前項にも記したとおり、現在、中国の文化財保護当局は辺境における文化財保護を厳格化しつつあり、そのため外国人による史跡調査に支障が出てきている(事前申請の厳格化に加えて、縦割り行政による手続きの煩瑣化により、実質的に調査の実施が極めて困難になりつつある)。そのため、そのため、当初計画にはなかった河北ブロック(北京と洛陽を結ぶ地域)の調査を重点的に行う予定である。予算的には河西回廊調査よりも安上がりになる目算であり、調査実施に際しての手続きも簡素で済む見通しである。こうした計画変更に伴い、今年度は研究推進会議を3度開催し、現地調査実施が順調に進むように期することとする。衛星写真画像の収集など史料収集についても継続して行い、メンバー間での情報共有を行う。

中国における現地史跡調査については、前年度に繰り上げて実施した分があったため、本来次年度に実施予定の河西回廊方面の古道・関所調査を行うことができた。ただ、この地域の文化財に対する規制が事前に調査した以上に厳しくなっていたため、再度の補充調査は見送ることになりそうである。研究推進会議については、年3回開催予定のところ、研究メンバーの一人が在外研究で1年間上海に出張したため、2度の開催とした。その分、上海滞在のメンバーには、現地における文献資料収集・史跡の実地調査を精力的にやってもらい、その成果はグループによる現地調査に十分反映された。資料収集・整理の面でも、衛星写真画像の収集を中心に順調に進展している。2017年度は、中国における現地調査を2回、研究推進のための会議を2回実施した。(1)現地調査の概要12017年10月調査:レンタカーを借り上げて、陝西省西安市・宝鶏市・漢中市甘粛省平涼市に点在する中国古代近世の古道・関所関連の史跡を踏査した(石門関秦直道博物館および直道遺跡、平涼市博物館、大散関、連雲棧道、褒谷棧道、血池秦漢祭祀遺跡など)。22018年3月調査:河南省焦作市・済源市・安陽市山西省長治市河北省邯鄲市にかけて点在する漢代唐代の古道・関所関連の史跡を、レンタカーを借り上げて踏査した(焦作古道、碗子城、天井関、高平(長平)古戦場、ふ口けい、し関、沁河谷棧道遺址、水泉石窟、かん轅関など)。(2)研究推進会議の概要12017年5月会議(京都大学にて開催)では、研究代表者(辻)と研究分担者(塩沢・小方・小島・福原)・連携研究者(松浦)・研究協力者(宇都宮)が一堂に会し、本科研の目標と活動方針について認識を共有するとともに、当該年度の活動内容を決定した。また、本科研の研究成果の一つとして、古道と関津をテーマとした一般向けの書籍の刊行が提案され、その実現に向けて今後具体的に検討していくこととなった。22018年2月会議(法政大学にて開催)では、今年度実施の現地調査についての情報交換を行なった。また、研究分担者の塩沢が「秦の直道・馳道と鄭国渠遺跡」、小島が蜀道調査の要地」、研究協力者の宇都宮美生が「沙河古橋遺跡の調査」と題する報告をそれぞれ行い、現地調査に基づく知見を披露した。なお、現地調査の成果については構成メンバーで共有するよう心がけた。中国における現地史跡調査については、研究計画調書作成時に予定していた以上の調査を行うことができた。研究推進会議については、年3回開催予定のところ、研究メンバーの日程がうまく折り合わず、2度しか開くことができなかった。しかし、個々の内容は充実しており、結果として現地調査の実施には何ら支障が生じなかった。現地調査について、当初予定していた調査地点を若干変更する可能性が出てきた。前項にも記したとおり、現在、中国の文化財保護当局は辺境における文化財保護を厳格化しつつあり、そのため外国人による史跡調査に支障が出てきている(事前申請の厳格化に加えて、縦割り行政による手続きの煩瑣化により、実質的に調査の実施が極めて困難になりつつある)。そのため、そのため、当初計画にはなかった河北ブロック(北京と洛陽を結ぶ地域)の調査を重点的に行う予定である。予算的には河西回廊調査よりも安上がりになる目算であり、調査実施に際しての手続きも簡素で済む見通しである。こうした計画変更に伴い、今年度は研究推進会議を3度開催し、現地調査実施が順調に進むように期することとする。衛星写真画像の収集など史料収集についても継続して行い、メンバー間での情報共有を行う。現地調査について、当初予定していた以上に今年度内に行うことができたため、来年度以降、予定を若干前倒しして行うことができる見込みである。それに伴い、当初の計画立案時に見送った調査地点についても、可能な範囲で調査を行うことを考えている。